(57)【要約】  本明細書に記載したのは、遺伝子リポーターアッセイにおいてマクロファージ阻害因子（ＭＩＦ）プロモーターの活性に機能的に影響を及ぼすヒトＭｉｆ遺伝子の−８１７位における新規ＣＡＴＴ−テトラヌクレオチド反復多型である。５、６、７、または８−ＣＡＴＴ反復単位を含む４つの遺伝子型を記載する。これらの中で、５−ＣＡＴＴ対立遺伝子は、最も低いレベルの基礎および刺激ＭＩＦプロモーター活性をインビトロで示す。発現の低い５−ＣＡＴＴ反復対立遺伝子の存在は、関節リウマチ患者の集団における疾患重症度の低さと相関していた。ヒトＭｉｆ遺伝子の−８１７位におけるこのＣＡＴＴ−テトラヌクレオチド反復多型を検出するための、および、重度の炎症疾患に対する素因を評価するために同物を使用するための、方法、組成物および装置も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非感染性炎症疾患の重症度、または、非感染性炎症疾患の重症度に対する素因を診断する方法であって、前記方法が、ＭＩＦポリペプチド発現の増加または減少に相関したヒトＭｉｆプロモーターにおける多型を検出することを含み、前記多型の検出が、前記疾患の重症度または前記疾患の重症度に対する素因の指標である、前記方法。
【請求項２】
非感染性炎症疾患が、自己免疫、関節リウマチ、および移植片対宿主疾患からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ヒトＭｉｆプロモーターにおける多型が、ヒトＭｉｆ遺伝子の−８１７位におけるＣＡＴＴ−テトラヌクレオチド反復多型である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
ヒトＭｉｆ遺伝子の−８１７位におけるＣＡＴＴ−テトラヌクレオチド反復多型が、５、６、７、および８反復単位からなる群より選択され、少なくとも1つの対立遺伝子における５反復単位の存在が、低い疾患重症度の存在または素因を示す、請求項３記載の方法。
【請求項５】
ＰＣＲ技術を使用してＭｉｆプロモーターを増幅することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
ヒトＭｉｆプロモーターの領域を増幅するように選択されたＰＣＲプライマーセットであって、前記ＰＣＲプライマーセットが、（ｉ）ＭＩＦ−Ｆ（−１０２４）およびＭＩＦ−Ｒ（−４２１）；（ii）ＭＩＦ−Ｆ（−４４１）およびＭＩＦ−Ｒ（＋４）；（iii）ＭＩＦ−Ｆ（−１３）およびＭＩＦ−Ｒ（＋３９５）；および（iv）ＭＩＦ−Ｆ（＋３７９）よびＭＩＦ−Ｒ（＋１０４３）からなる群より選択される、前記ＰＣＲプライマーセット。
【請求項７】
請求項６記載のプライマーセットを使用することを含む、ヒトＭｉｆプロモーター領域における多型を検出する方法。
【請求項８】
請求項６記載のＰＣＲプライマーセットを含む製造品。
【請求項９】
ヒトＭｉｆプロモーターを含む単離した核酸分子。
【請求項１０】
ゲノムＤＮＡ断片である、請求項９記載の単離した核酸分子。
【請求項１１】
ゲノムＤＮＡ断片が、ヒト被験者のＤＮＡ試料から増幅されている、請求項１０記載の単離した核酸分子。
【請求項１２】
ヒトＭｉｆ遺伝子の−８１７位におけるＣＡＴＴ−テトラヌクレオチド反復多型を含むヒトＭｉｆプロモーターの一部を含む、請求項９記載の単離した核酸分子。
【請求項１３】
ヒト被験者において、ＭＩＦポリペプチド発現の増加または減少と相関するヒトＭｉｆプロモーターの多型を検出することであって、前記多型の検出が、疾患の重症度または前記疾患の重症度に対する素因の指標であり；
前記ヒト被験者を処置して、炎症疾患の重症度を予防もしくは低下、または、前記炎症疾患の発症を遅延させること、
を含む、非感染性炎症疾患の重症度または非感染性炎症疾患の重症度に対する素因について個体をスクリーニングすることを含む、炎症疾患治療の方法。
【請求項１４】
ＭＩＦ阻害剤、抗ＴＮＦα抗体、抗ＩＬ１抗体、および抗ＩＦＮ−γ抗体、ＩＬ−１ＲＡ、ステロイド、グルココルチコイド、およびＩＬ−１０からなる群より選択される少なくとも１つの薬剤の有効量を投与することによりヒト被験者を処置することを含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
炎症疾患が関節リウマチであり、ヒトＭｉｆプロモーターの多型が、ヒトＭｉｆ遺伝子の−８１７位におけるＣＡＴＴ−テトラヌクレオチド反復多型である、請求項１４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００１年１２月２１日に提出された米国仮特許出願番号第６０/３４１,８３２号の優先権を主張する。その仮出願の全体を参照して本明細書に取り込む。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明は、マクロファージ遊走阻害因子（ＭＩＦ）をコードする遺伝子のプロモーターにおける機能的多型に基づいた診断法および装置に関する。より具体的には、本発明は、このプロモーター多型の存在についてスクリーニングすることにより、特定の疾患状態に対する素因を診断する方法に関する。本発明はまた、多型についてスクリーニングする装置、多型を含むＭＩＦ遺伝子、およびそのためのプローブに関する。
【背景技術】
【０００３】
技術の背景
多くの実験研究により、マクロファージ遊走阻害因子（ＭＩＦ）は免疫系内のグルココルチコイド作用の生理的対抗調節因子として機能するという概念がもたらされた。この役割では、サイトカインカスケード内のＭＩＦの位置は、内因性グルココルチコイドと協奏的に作用して、炎症応答のセット点および大きさを制御することである（１）。ＭＩＦはまた、関節リウマチ（２）、敗血症（３、４）、急性呼吸窮迫症候群（５）、および糸球体腎炎（６）などの炎症疾患において、いくつかの直接的で炎症誘発性の役割を有する。
【０００４】
ＭＩＦは、元々、腹膜マクロファージの遊走を阻害するＴリンパ球由来因子として３０年前から記載されていたが（７）、現在では、マクロファージ自体を含むいくつかの他の細胞型がＭＩＦの重要な起源であることが知られている（８）。ＭＩＦレベルは、関節リウマチ患者の血清および滑液で上昇しており（２、９）、滑膜関節内ではＭＩＦ免疫染色は、滑膜裏打ちＣＤ１４＋マクロファージおよび線維芽細胞様の滑膜細胞に局在できる。放出時に、ＭＩＦは、サイトカイン発現（ＴＮＦα（８、１０）、ＩＬ−１β、ＩＬ−２（１１）、ＩＬ−６（８、１２）、ＩＬ−８（１３）およびＩＦＮγ（１１、１４））、一酸化窒素放出（１５）、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）発現（１６、１７）、およびシクロオキシゲナーゼ−２（Ｃｏｘ−２）経路（１８）の誘導を活性化または促進することにより、直接的に炎症誘発性である。ＭＩＦが、ｐ４４/ｐ４２（ＥＲＫ−１２）ＭＡＰキナーゼ経路の持続活性化を誘導する能力（１８）およびｐ５３依存的アポトーシスを阻害する能力により（１９、２０）、このメディエーターが、リウマチパンヌスの開始に鍵となる役割を果たし得ることが示唆される。
【０００５】
Bucalaらの米国特許第６,０３０,６１５号は、（ａ）約１２.５ｋＤａの分子量を有するＭＩＦポリペプチドに結合する抗体などのＭＩＦ阻害剤の有効量を（ｂ）抗ＴＮＦα、抗ＩＬ−１、抗ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１ＲＡ、ステロイド、グルココルチコイド、またはＩＬ−１０と組み合わせて投与することを含む、サイトカインにより媒介される毒性により引き起こされる疾患を処置する組合せ法を開示している。
【０００６】
免疫応答遺伝子の多型が、一部のヒト自己免疫／炎症疾患の病因発生に寄与するという概念は、過去数年間におよんで関心が高まっている。現在では、非常に僅かな遺伝子多型が機能的に重要であることが示され、特定の疾患状態において予測価値があることが示されている。以前に規定された例には、マラリアおよび虚血性心疾患において特定の予測意義があることが示されたそれぞれＴＮＦαおよびＩＬ−１ｒａの多型が含まれる（２４、２５）。同様に、ＴＮＦαおよびＩＬ−βの多くの多型は、関節リウマチの重症度に関連していると報告されている（２６〜２８）。
【０００７】
発明の要約
本発明は、一部、Ｍｉｆプロモーターの−８１７位に位置するテトラ−ヌクレオチドＣＡＴＴ反復からなる、ヒトＭｉｆ遺伝子の新規多型の同定に基づく。本明細書に開示したように、このプロモーター多型は、インビトロで機能的に重要であり、関節リウマチ患者集団の解析により、このＣＡＴＴ反復は疾患重症度に関連していることが示される。
【０００８】
それ故、本発明の１つの目的は、ヒトＭｉｆプロモーターの遺伝子型を決定することを含む、診断法を提供することである。
【０００９】
本発明の別の目的は、ヒトＭｉｆプロモーターの遺伝子型を決定する手段を含む、診断手段を提供することである。
【００１０】
従って、本発明は、ＭＩＦポリペプチド発現の増加または減少に相関したヒトＭｉｆプロモーターの多型を検出することを含む、非感染性炎症疾患の重症度、または、非感染性炎症疾患の重症度に対する素因を診断する方法に関する。この方法では、非感染性炎症疾患は、例えば、自己免疫、移植片対宿主疾患、または好ましくは関節リウマチであり、好ましくは、多型の検出は、疾患の重症度または疾患の重症度に対する素因の指標となる。好ましくは、ＭＩＦポリペプチド発現の増加または減少に関連したヒトＭｉｆプロモーターのこの多型は、５、６、７、および８反復単位からなる群より選択された、ヒトＭｉｆ遺伝子の−８１７位におけるＣＡＴＴ−テトラヌクレオチド反復多型であり、５反復単位の存在により、低い疾患重症度の発生または素因が示される。
【００１１】
本発明の診断法は、好ましくは、ＰＣＲ技術を使用したＭｉｆプロモーターを増幅するステップを含む。この目的のために、本発明は、ヒトＭｉｆプロモーターの領域を増幅するように選択されたＰＣＲプライマーセットを提供する。例えば、ＰＣＲプライマーセットは、下の表１に示すように、（ｉ）ＭＩＦ−Ｆ（−１０２４）およびＭＩＦ−Ｒ（−４２１）；（ii）ＭＩＦ−Ｆ（−４４１）およびＭＩＦ−Ｒ（＋４）；（iii）ＭＩＦ−Ｆ（−１３）およびＭＩＦ−Ｒ（＋３９５）；および（iv）ＭＩＦ−Ｆ（＋３７９）およびＭＩＦ−Ｒ（＋１０４３）からなる群より選択し得る。本発明はまた、ヒトＭｉｆプロモーター領域の多型を検出するために本発明のプライマーセットを使用する方法、および、本発明のＰＣＲプライマーセットを含む製造品（診断キットなど）に関する。
【００１２】
本発明はさらに、−８１７位のＣＡＴＴ−テトラヌクレオチドが５、６、７、または８回繰り返されている、ヒトＭｉｆプロモーター配列を含む核酸分子に関する。好ましくは、核酸分子は、単離ＤＮＡ分子、特にヒト被験者のＤＮＡ試料から増幅した単離ゲノムＤＮＡ断片である。好ましい実施形態において、本発明の単離核酸分子は、ヒトＭｉｆ遺伝子の−８１７位にＣＡＴＴ−テトラヌクレオチド反復多型を含む、ヒトＭｉｆプロモーターの一部を含む。
【００１３】
本発明の別の態様は、非感染性炎症疾患の重症度、または、非感染性炎症疾患の重症度に対する素因について個体をスクリーニングすることを含む、炎症疾患療法に関する。この方法は、ヒト被験者において、ＭＩＦポリペプチド発現の増加または減少に関連したヒトＭｉｆプロモーターの多型を検出することを含み、多型の検出は、疾患の重症度または疾患の重症度に対する素因の指標である。炎症疾患療法のこの方法はさらに、ヒト被験者を処置して、炎症疾患の重症度を予防または低下するか、または、炎症疾患の発症を遅延させることを含む。例えば、療法は、ＭＩＦ阻害剤、抗ＴＮＦα抗体、抗ＩＬ１抗体、および抗ＩＦＮ−γ抗体、ＩＬ−１ＲＡ、ステロイド、グルココルチコイド、およびＩＬ−１０からなる群より選択された少なくとも１つの薬剤の有効量を投与することにより、ヒト被験者を処置することを含み得る。
【００１４】
炎症疾患療法の本発明の方法の好ましい実施形態において、炎症疾患は関節リウマチであり、ヒトＭｉｆプロモーターの多型は、ヒトＭｉｆ遺伝子の−８１７位のＣＡＴＴ−テトラヌクレオチド反復多型である。
【００１５】
発明の詳細な説明
本明細書で同定された新規Ｍｉｆ遺伝子多型は、ＭＩＦプロモーター活性減少に関連しており、ホモ接合状態におけるこの遺伝子型の存在は、重度の関節リウマチのリスクの低下に関連しているようである。
【００１６】
ＭＩＦは、ＴＮＦα分泌を促進し、マクロファージからのＩＦＮγにより誘導される一酸化窒素分泌を増強することが示された（８）。さらに、ＭＩＦは、マクロファージ（８）、Ｔ細胞（１１）および線維芽細胞活性化（１８）の重要な自己分泌調節因子である。これらのデータにより、関節リウマチなどの慢性炎症容態におけるＭＩＦの可能性ある役割が数多く調査されてきた。
【００１７】
ＭＩＦタンパク質レベルは、関節リウマチ患者の血清中に高レベルで循環しており、細胞のＭＩＦ発現は、滑膜内で増強している（２、９）。関節リウマチ患者から得られた培養した滑膜線維芽細胞は、培養液中に有意な量のＭＩＦを自発的に分泌し、分泌は、炎症誘発性刺激後にさらに増加する（２）。リウマチ滑膜線維芽細胞のＭＩＦによる刺激により、マトリックスメタロプロテイナーゼの発現は増加し、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）およびＣＯＸ−２発現が誘導される。滑膜細胞培養液におけるＭＩＦ活性の免疫中和もまた、ＣＯＸ−２およびＰＬＡ２ｍＲＮＡのＩＬ−１β誘導性発現を阻害することが示された（２９）。中和抗ＭＩＦ抗体の投与もまた、マウスにおけるＩＩ型コラーゲン誘導性関節炎の開始を遅延し、その重症度を減少させ（３０）、ラットにおけるアジュバント誘導性関節炎の発達を大いに阻害する（３１）。従って、炎症関節炎の病理発生においてＭＩＦが関与している証拠はかなりある。
【００１８】
本明細書に開示したのは、発現の低い５−ＣＡＴＴ対立遺伝子に関するホモ接合性である患者と、より悪性の低い関節リウマチ疾患である患者との間の有意な関連である。重度な関節リウマチに罹患する僅か７９中１名（１.２％）の患者がこの遺伝子型を遺伝し、これに対し、より軽度の非進行的な疾患の患者は１０１１０５（９.５％）である。これにより、ＭＩＦの低い発現に対する遺伝子的素因は、持続的な炎症および／または関節破壊に対して保護することが示唆される。現在では、どの転写因子が多型領域の転写効果の変調に関与し得るか不明であるが、５−ＣＡＴＴ対立遺伝子は、血清およびフォルスコリン刺激の両方に対してインビトロで応答の減少、ならびに、基礎活性の減少を示す。ＣＡＴＴ反復エレメントはまた、ヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のプロモーターに存在し、プロモーター活性に必要とされる（３２、３３）。核因子ＹＹ１34、より近年では因子ＡＰ−１およびＳＰ−１は、ＧＭ−ＣＳＦプロモーターのこの領域と複合体を形成できることが示された（３５）。これらの同じ因子のいずれがＭＩＦのＣＡＴＴ反復の活性に影響を及ぼすかどうかがまた引き続き決定され続けている。
【００１９】
Ｍｉｆ遺伝子内のＣＡＴＴ反復領域は、数個の推定Ｐｉｔ−１転写因子結合部位を含む。Ｐｉｔ−１は、プロラクチンおよび成長ホルモンなどの下垂体ホルモンの発現に必須である下垂体特異的転写因子である（３６）。脳下垂体前葉は、げっ歯類において重要なＭＩＦ源であり（３）、生理的または感染性ストレスに応答してＭＩＦを分泌する（３７）。コルチコトロピン放出因子（ＣＲＦ）もまた、培養下垂体細胞におけるＭＩＦ発現の強力な誘導因子であることが示された。ラット下垂体細胞および下垂体細胞株ＡｔＴ−２０を使用してネズミＭＩＦ遺伝子−プロモーターの近年の機能的解析により、ＣＲＦ誘導性遺伝子発現は、ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質に依存していることが実証された（３８）。興味深いことに、関節リウマチに対するＣＲＦ遺伝子座の連鎖の報告が近年文献に出現しており、視床下部下垂体−副腎（ＨＰＡ）軸は、一部の患者の関節リウマチの病理発生に役割を果たし得るといういくつかの証拠がある。活動性関節リウマチ患者は、正常な下垂体および副腎機能にも関わらず異常に低い日周のコルチゾールレベルを有することが示され、視床下部レベルでの欠陥が示唆される（４０）。ＭＩＦが、免疫系内のグルココルチコイド作用を対抗調節する能力を考えると（Bucalaにより総説（１））、脳下垂体前葉によるＭＩＦ発現は、関節リウマチなどの炎症疾患の発達に重要であり得る。
【００２０】
これらの研究開始以来、Ｍｉｆ遺伝子プロモーターにおける−１７３＊Ｇ／Ｃ単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）がDonnらにより報告されており（４１）、全身開始若年型特発性関節炎（全身開始ＪＩＡ）に関連していることが示された。少なくとも１つの１７３＊Ｃ対立遺伝子の保有は、全身開始ＪＩＡ患者の３６.８％で見られ、これに対し正常個体群では２０.３％で見られた（４１）。しかし、遺伝子発現に対するこのＳＮＰの効果に関する情報はない。本発明者らによる予備解析により、１７３＊Ｃ対立遺伝子は、本関連データまたはプロモーターアッセイの結果を説明できず；実際に、１７３＊Ｃ対立遺伝子と５−ＣＡＡＴ対立遺伝子の間の正の連鎖不均衡の証拠はない（データは示してない）。
【００２１】
ＴＮＦαは、関節リウマチにおいて重要なエフェクターサイトカインであると考えられ、抗ＴＮＦα療法が、この疾患の処置において高い効力があるとして出現した（４２）。注記すべきことに、ＭＩＦとＴＮＦαの間に密接な関係がある。ＭＩＦは、ＴＮＦα発現の重要な上流調節因子として作用するようである。ＭＩＦは、マクロファージからのＴＮＦαの分布を促進し、マクロファージＴＮＦα産生を抑制するグルココルチコイドの能力を無効にする（４３）。ＭＩＦの免疫中和もまた、ＴＮＦαの循環レベルを減少させる（３）。臨床設定では、ＭＩＦ多型の解析により、特に炎症疾患、およびより具体的には関節リウマチ疾患における疾患重症度の予測因子が提供され、介入療法の選択を支援できる。本明細書のデータはまた、関節リウマチおよびおそらく他の炎症疾患における治療標的としてＭＩＦの潜在的重要性を再確認する。
【００２２】
実験
材料および方法
患者：ＤＮＡ試料は、ウィチタリウマチ疾患データバンク（Wichita Rheumatic Disease Data Bank）から入手し、１９７４年以来リウマチ学的診療をフォローしてきた白人患者を代表するものであった。関節リウマチ患者を、以下の基準を使用して２群に分けた：Ａ）重度（ｎ＝７９）；平均発症年齢５５歳、平均疾患持続期間１３年間、平均Larsenスコア４.０、平均ＲＦ力価３３９.２４、および平均ＨＡＱスコア１.３６。Ｂ）軽度（ｎ＝１０５）；平均発症年齢４５歳、平均疾患持続期間１５年間、平均Larsenスコア１.０、平均ＲＦ力価３６２.８４、および平均ＨＡＱスコア０.９３。健康な白人試験志願者は、正常な対照群として使用するゲノムＤＮＡを提供した（ｎ＝１５９）。
【００２３】
ＤＮＡ抽出：ＤＮＡは、ＧＮｏｍｅキット（Bio101 Inc.、CA、米国）を使用して全血から、Pure Geneキット（登録商標）（Gentra Systems Inc.、MN、米国）を使用して口内をブラシしたものから抽出した。
【００２４】
Ｍｉｆ遺伝子シークエンスおよび多型解析：Ｍｉｆ遺伝子（GenBankアクセッション番号：Ｌ１９６８６、その全体を参照として本明細書に取り込む）は、染色体２２ｑｌｌ.２に位置している（４４）。遺伝子は２１６７ｂｐ長であり、１８９ｂｐと９５ｂｐの２つのイントロンにより離された３つのエキソンを有する。４セットのプライマーを使用して全遺伝子を網羅した（表１、以下）。
【００２５】
【表１】
2005514932.tif 000002
【００２６】
ＰＣＲ反応は、１×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ（パーキンエルマー、CA、米国）、２０ｎｇのＤＮＡ、１.５ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｐｍｏｌの各々の正および逆プライマー、および０.５単位のAmplitaq Gold（登録商標）ポリメラーゼ（パーキンエルマー−アプライド・バイオシステムズ、CA、米国）から構成された。ｄＮＴＰは、セット３を除いて０.２ｍＭの濃度で使用し、セット３の０.２ｍＭ ｄＮＴＰは、２０μｌのＰＣＲ反応で０.０５ｍＭの７−DeazaGTPを有していた。ＰＣＲ条件は以下の通りであった：９５℃／１２分間、その後、９５℃／３０秒間、アニーリング温度（表１）／３０秒間、７２℃／６０秒間を４０サイクル、および７２℃／１０分間。ＰＣＲ産物は、臭化エチジウムで染色した１％アガロースゲルを使用して分離した。
【００２７】
６名の正常対照および６名の関節リウマチ患者からのＰＣＲ産物を、BigDye Terminator（登録商標）サイクルシークエンスレディ反応キット（パーキンエルマー−アプライド・バイオシステムズ）を使用してシークエンスした。４つの全てのプライマーセットからの配列を編集して全Ｍｉｆ遺伝子を提示し、関節リウマチ群と正常対照の間の差異を解析するために比較した。
【００２８】
ＣＡＴＴ反復多型についての迅速なスクリーニング：セット１（配列番号１）からの正プライマーを、逆プライマーＭＩＦ−Ｒ−７２８（５’−ＡＡＴＧＧＴＡＡＡＣＴＣＧＧＧＧＡＣ−３’；配列番号９）と共に使用した。逆プライマーはＴＥＴで蛍光標識して、キャピラリー電気泳動を使用したＰＣＲ産物の検出を可能とした（４５）。
【００２９】
ＰＣＲ条件は、１０μｌのＰＣＲ反応中の、１×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ、１.５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０.２ｍＭ ｄＮＴＰ、０.７５ｐｍｏｌの各プライマー、１ｎｇ ＤＮＡ、０.０５μｌ Ampli Taq Gold（登録商標）ポリメラーゼであった。使用したＰＣＲサイクリング条件は、５３.８℃／３０秒間というアニーリング条件を除いて前記と同じであった。１μｌの希釈ＰＣＲ産物を、０.５μｌのＧＳ−５００ＴＡＭＲＡサイズ標準（パーキンエルマー−アプライド・バイオシステムズ）を含む１２μｌの脱イオン化ホルムアミドに加えた。試料を、ＡＢＩ３１０ジェネティックアナライザー（パーキンエルマー−アプライド・バイオシステムズ）を使用して分離する前に変性した。以前に完全にシークエンスしておいたホモ接合性個体からのＤＮＡ試料を、キャピラリー電気泳動により得られた反復サイズの対照として使用した。
【００３０】
ＭＩＦプロモータークローニングおよびリポーターアッセイ：５、６、７、または８−ＣＡＴＴテトラヌクレオチド反復多型を含む一次スクリーニングから得られたゲノムＤＮＡを、ｐＣＲ２.１−ＴＯＰＯベクター（インビトロゲン、ＣＡ、米国）に初回クローニングするためのＰＣＲ鋳型として使用した。以下のプライマーを使用して、ＭＩＦコード配列の上流フランキング領域とエキソンＩの最初の１０２ｂｐの１０７１〜１０８７ｂｐを示す１１７３〜１１８９ｂｐのＰＣＲ産物を作製した（図１参照）。
正プライマー：５’−ＣＴＣＧＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＣＣＡＡＴＡＣＣＣＡＴ−３’（配列番号１０）；
逆プライマー：５’−ＡＡＧＣＴＴＧＧＣＡＴＧＡＴＧＧＣＡＧＡＡＧＧＡＣＣ−３’（配列番号１２）。
【００３１】
完全なシークエンス後、プロモーター領域を、ｐＣＲ２.１ベクターから切り出し、ｐＧＬ３−基礎ルシフェラーゼベクター（プロメガ、ＷＩ、米国）のＸｈｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングした。このベクターは、真核エンハンサーまたはプロモーターエレメントの非存在下で改変型のホタルルシフェラーゼをコードするＣＤＮＡを含む。５、６、７、または８−ＣＡＴＴ多型を含む、ＭＩＦプロモーターにより直接調節されるルシフェラーゼ構築物を作成した。一過性トランスフェクションを、製造業者の指示に従って、６ウェルプレートの１ウェルあたり、３μｌのＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ、ＮＪ、米国）および１μｇのＤＮＡを使用して実施した。使用した細胞系には、Ｃｏｓ−７（サル腎臓線維芽細胞）、Ａ５４９（ヒト肺上皮細胞）、およびＣＣＤ−１９ＬＵ（初代ヒト肺線維芽細胞）が含まれていた。データは、ヘルペス単純ウイルスチミジンキナーゼプロモーター（ＰＲＬ−ＴＫベクター−プロメガ、ＷＩ、米国）により調節されるウミシイタケルシフェラーゼの内部対照に対して標準化した。その後、各トランスフェクションは、２００ｎｇのＰＲＬ−ＴＫ対照ベクターＤＮＡと組み合わせた８００ｎｇの試験ＤＮＡ（ＭＩＦ−プロモーター調節ルシフェラーゼ遺伝子）から構成された。ルシフェラーゼアッセイは、ＴＤ−２０／２０ルミノメーター（Turner Designs、CA、米国）および二重ルシフェラーゼリポーターシステム（プロメガ、ＷＩ、米国）を使用して測定した。基礎プロモーター活性は、トランスフェクションの３６時間後にルシフェラーゼ活性を測定することにより決定した。いくつかの場合では、細胞を、プロモーター活性の測定前に、最後の２０時間の培養で刺激した。
【００３２】
遺伝子型および統計解析：データは、Genotyper（登録商標）２.１ソフトウェア（パーキンエルマー−アプライド・バイオシステムズ、ＣＡ、米国）を使用して解析した。遺伝子型と疾患状態（正常、軽度、または重度）の間の関係は、カイ二乗検定およびフィッシャーの直接確率検定を使用して調べた。遺伝子リポーターアッセイは二重に３〜１０回繰り返した。データは平均±ＳＴＤＥＶとして提示し、ノンパラメトリック・マンホイットニーＵ検定により比較した。有意性はＰ＜０.０５として定義した。
【００３３】
結果
Ｍｉｆプロモーターにおけるマイクロサテライト反復の同定
６名の正常な試験志願者および６名のリウマチ患者からのゲノムＤＮＡを、Ｍｉｆ遺伝子の完全なシークエンスに使用した。この遺伝子のＧＣ含量が高いために、解析は４つの区画で実施した。１２の全ての配列のアラインメントにより、−８１７位における上流プロモーター領域におけるテトラ−ヌクレオチドＣＡＴＴ反復多型が同定された（図１）。配列に５、６、７、または８−ＣＡＴＴ反復対立遺伝子を有する個体を見出した。７−ＣＡＴＴホモ接合体は正常個体群には全く見出されず、８−ＣＡＴＴホモ接合体は試験したいずれの個体群にも見出されなかったが、個体はこれらの対立遺伝子にヘテロ接合性またはホモ接合性であった。
【００３４】
プロモーター多型の迅速なスクリーニングのために、テトラヌクレオチド反復単位に近位にある蛍光標識逆プライマーを、より小さなＰＣＲ断片を増幅するために設計した（３４０〜３５２ｂｐ）。その後、この断片は、ＡＢＩ３１０ジェネティックアナライザーでのキャピラリー電気泳動を使用して解析した。以前にシークエンスした個体のＤＮＡを鋳型として使用し対照ＤＮＡ断片を作成し、ＡＢＩ３１０アナライザーで観察された断片サイズを、試験試料中のＣＡＴＴ反復数と相関させた。従って、４つのＰＣＲ産物サイズは、３４０、３４４、３４８、および３５２ｂｐ長であり、これらはそれぞれ、５、６、７、および８のＣＡＴＴ反復に対応した。観察された遺伝子型は：５,５；５,６；５,７；６,６；６,７；７,７；５,８；および６,８であった。８,８遺伝子型は、正常（ｎ＝１５９）または患者（ｎ＝１８４）個体群では見られず；７,７遺伝子型は正常個体群では見られなかったが、関節リウマチ群内の１名の患者では観察された。
【００３５】
正常対照および関節リウマチ患者におけるＭｉｆ対立遺伝子の分布
正常対照、軽度関節リウマチ、および重度関節リウマチ患者における各種Ｍｉｆ対立遺伝子の分布を以下の表２に示す。
【００３６】
【表２】
2005514932.tif 000003
【００３７】
正常対照ではHardy-Weinberg平衡からの偏差はなかった（ｐ＝０.６９）。５、６、７、および８対立遺伝子の頻度は、それぞれ、０.２７７、０.６０７、０.１１、および０.００６であることが判明した。
【００３８】
少なくとも１つの５−ＣＡＴＴ対立遺伝子を有する個体の数は、正常個体群の５０.３１％から、重度な関節リウマチ個体群の３１.６５％まで減少する（表２）。重度の関節リウマチ患者と対照の間の差異は統計学的に有意である（ｐ＜０.０２）。この研究で解析した事例および対照は、地理的および民族的起源に密接に適合しておらず、従って、データは幾分注意して解釈しなければならない。それ故、軽度関節リウマチ個体群と重度関節リウマチ個体群の間の特異的遺伝子型の比較を、表２に示したように実施した。５,５遺伝子型が、軽度関節リウマチ患者の９.５％に観察されるが、重度疾患の患者では１.３％まで有意に減少している（フィッシャーの直接確立検定によるとｐ＝０.０２５２）。これらのデータにより、ホモ接合性５−ＣＡＴＴ対立遺伝子は、重度疾患への進行に保護的であることが示される。
【００３９】
ＭＩＦプロモーター活性に対するＣＡＴＴ反復多型の効果
ＣＡＴＴ反復多型が、ＭＩＦ発現の機能的調節に関連しているかどうかを調べるために、遺伝子リポーターアッセイを開発し、インビトロで規定の条件下で試験した。遺伝子リポーターアッセイは、転写調節を研究するために、または、転写因子をモニタリングするための計測値として幅広く使用されている（２１、２２）。
【００４０】
Ｍｉｆプロモーター調節ルシフェラーゼ構築物のＣｏｓ−７細胞、Ａ５４９細胞、およびＣＣＤ−１９Ｌｕ細胞へのトランスフェクションは、対照ベクター（ｐＧＬ３−基礎）と比べた場合に、高いルシフェラーゼ産生により示されるように、強力な基礎プロモーター活性を伴っていた（図２、データは示していない）。プロモーター活性は、フォルスコリン（ＣＡＭＰ合成の誘導因子、２３）および血清刺激（図３）、ならびに、ホルボールエステル刺激（データは示していない）により増加した。一般に、基礎プロモーター活性は、負（空のｐＧＬ３ベクター）および正（ｐＲＬ−ＴＫ）対照と比べた場合に、試験した各細胞系で高く、これらのデータは、これらの細胞系で観察された高いレベルの内因性ＭＩＦタンパク質発現と相関しているようであった（データは示していない）。注記すべきことには、試験した各細胞系では、５−ＣＡＴＴ反復ＭＩＦプロモーター構築物は、６、７、または８−ＣＡＴＴ反復プロモーター構築物と比較した場合に有意に低い転写活性を示した。
【００４１】
【表３】
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【００４２】
本明細書に記載されたすべての特許、特許出願及び刊行物は、全てを参照することで本明細書に取り込まれる。先行技術を、明りょう性と理解を目的として詳細に記載しているが、形態や細部における各種変化を本発明及び添付の特許請求の範囲の真の範囲から離れることなく成すことができることは、当業者が本開示を読むことで理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、ヒトＭｉｆプロモーター領域の図解を示す。推定転写因子結合部位および目的の領域を囲んでいる。多型ＣＡＴＴ反復領域（−８１７〜−７９７／−７８５）は、影が無いことにより示される。
【図２】図２は、Ｃｏｓ−７細胞におけるヒトＭｉｆプロモーター多型変異体の基礎転写活性を示す。ＭＩＦプロモーター活性は、結果が相対光単位（ＲＬＵ）として表現される二重ルシフェラーゼアッセイにより決定された。Ｃｏｓ−７細胞を、８００ｎｇの試験ＤＮＡベクター：ｐＧＬ３−基礎（陰性対照）、ｐＭＩＦ−５、ｐＭＩＦ−６、ｐＭＩＦ−７、またはｐＭＩＦ−８（５、６、７、または８−ＣＡＴＴ反復多型特異的ＭＩＦプロモーター−ルシフェラーゼ構築物）および２００ｎｇの対照ｐＲＬＴＫベクターで一過性にコトランスフェクトした。４８時間後に、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を、二重ルシフェラーゼキット（プロメガ）およびＴＤ２０／２０ルミノメーターを使用してウミシイタケの活性に対して決定した。データは、各々二重に実施した４回の個々の実験の平均±ＳＴＤＥＶを示す。＊は、ｐＭＩＦ−５構築物の活性に対してＰ＜０.０３であることを示す。
【図３】図３は、Ｃｏｓ−７細胞における血清およびフォルスコリン（forskolin）刺激に対するＭｉｆプロモーター応答に対する、ＣＡＴＴ−反復多型変異の効果を示す。ＭＩＦプロモーター活性は、結果が相対光単位（ＲＬＵ）として表現される二重ルシフェラーゼアッセイにより決定された。Ｃｏｓ−７細胞を、８００ｎｇの試験ＤＮＡベクター：ｐＧＬ−３基礎（陰性対照）、ｐＭＩＦ−５、ｐＭＩＦ−６、ｐＭＩＦ−７、またはｐＭＩＦ−８（５、６、７、または８−ＣＡＴＴ反復多型特異的ＭＩＦプロモーター−ルシフェラーゼ構築物）および２００ｎｇの対照ｐＲＬＴＫベクターで一過的にコトランスフェクトした。２４時間のトランスフェクト後、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、その後、血清非含有培地中で一晩培養した。その後、細胞を非刺激のまま（血清枯渇）または２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）または１μＭフォルスコリン（「１μＭのＦＳＫ」）で処理した。さらに１２時間インキュベートした後、ルシフェラーゼ活性を図２のように決定した。データは、各々二重に実施した４回の個々の実験の平均±ＳＴＤＥＶを示す。＊は、ｐＭＩＦ−５構築物の活性に対してＰ＜０.０３であることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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