(57)【要約】多重系統キナーゼタンパク質を含む細胞を化合物と接触させ、化合物が多重系統タンパク質の活性を下げるかどうかを決定し、そして化合物が細胞の生存を促進するかどうかを決定する工程を含んで成る、多重系統キナーゼタンパク質の活性を調節し、そして細胞の生存または細胞死を促進する化合物の同定法を提供する。神経変性障害および／または炎症の処置に有用となり得る化合物の同定法も提供する。タンパク質またはタンパク質を含む細胞を、本発明のインデノ−またはインドロ−化合物と接触させることを含んで成る多重系統キナーゼの活性を調節する方法も提供する。神経変性障害および／または炎症の処置法も提供する。
2005503102.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多重系統キナーゼタンパク質を含有する細胞または細胞抽出物を化合物と接触させ、そして該化合物が該多重系統キナーゼタンパク質の活性を下げるかどうかを決定することを含んで成る、ＡＩＤＳ末梢ニューロパシーの処置に有用な化合物の同定法。
【請求項２】
多重系統キナーゼタンパク質が多重系統キナーゼ１、多重系統キナーゼ２、多重系統キナーゼ３、ロイシンジッパーを持つキナーゼ、二重ロイシンジッパーを持つキナーゼおよび多重系統キナーゼ６から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記タンパク質活性が、上記タンパク質の基質の活性またはリン酸化状態を測定することにより決定され、該基質がＪＮＫ１、ＪＮＫ２、ＪＮＫ３、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、ｐ３８α、ｐ３８β、ｐ３８γ、ｐ３８δ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４（ＳＥＫ１）、ＭＥＫ５、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ｊｕｎ、ＡＴＦ２、ＥＬＫ１およびＡＥＸ−３の哺乳動物相同体から成る群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
上記タンパク質活性が上記タンパク質の基質の活性、上記タンパク質の基質の量、または上記タンパク質の基質をコードするｍＲＮＡを測定することにより決定される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ヒトに、医薬的に許容される塩または希釈剤中の多重系統キナーゼタンパク質を阻害する化合物を投与することを含んで成る、ＡＩＤＳ末梢ニューロパシーを有するヒトの処置法。
【請求項６】
化合物が、式
【化１】
2005503102.tif 000025
式中、
ＢおよびＦは独立して、各々がそれらに結合している炭素原子と一緒に、
１〜３個の炭素原子（１つまたは複数）が窒素原子（１つまたは複数）に置き換わってもよい不飽和６員の炭素環式芳香族環；あるいは
１つの炭素原子が酸素、窒素もしくは硫黄原子と置き換わるか；または２つの炭素原子が硫黄および窒素原子、または酸素および窒素原子に置き換わるいずれかの不飽和５員の炭素環式芳香族環、
のいずれかを形成し；
Ａ１およびＡ２は一緒にＯを表し、そしてＢ１およびＢ２は一緒にＯを表し；
Ｒ１はＨ、１〜４個の炭素（すべて含めて）のアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールおよびヘテロアリールアルキル；ＣＯＲ９、ここでＲ９は１〜４個の炭素（すべて含めて）のアルキル、またはアリール、好ましくはフェニルもしくはナフチルである；−ＯＲ１０、ここでＲ１０はＨまたは１〜４個の炭素（すべて含めて）のアルキルである；−ＣＯＮＨ２、−ＮＲ７Ｒ８、−（ＣＨ２）ｎＮＲ７Ｒ８、ここでｎは１〜４（すべて含めて）の整数である；または−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＲ７Ｒ８であり；そして
Ｒ７およびＲ８は独立して、Ｈまたは１〜４個の炭素（すべて含めて）のアルキルであるか；あるいは
Ｒ７およびＲ８は一緒に結合して、一般式−（ＣＨ２）２−Ｘ１−（ＣＨ２）２−の連結基を形成し、ここでＸ１はＯ、ＳまたはＣＨ２である；
のいずれかであり；
Ｒ２はＨ、−ＳＯ２Ｒ９、−ＣＯ２Ｒ９、−ＣＯＲ９、１〜８個の炭素（すべて含めて）のアルキル、好ましくは１〜４個の炭素（すべて含めて）のアルキル、１〜８個の炭素（すべて含めて）のアルケニル、好ましくは１〜４個の炭素（すべて含めて）のアルケニル、または１〜８個の炭素（すべて含めて）のアルキニル、好ましくは１〜４個の炭素（すべて含めて）のアルキニル；あるいは５〜７個の炭素（すべて含めて）の単糖であり、ここで単糖の各ヒドロキシル基は独立して非置換であるか、またはＨ、１〜４個の炭素（すべて含めて）のアルキル、２〜５個の炭素（すべて含めて）のアルキルカルボニルオキシまたは１〜４個の炭素（すべて含めて）のアルコキシにより置換され；そして
１〜８個の炭素（すべて含めて）のアルキル、１〜８個の炭素（すべて含めて）のアルケニルまたは１〜８個の炭素（すべて含めて）のアルキニルの各々は非置換であるか；あるいは
１〜８個の炭素（すべて含めて）のアルキル、１〜８個の炭素（すべて含めて）のアルケニルまたは１〜８個の炭素（すべて含めて）のアルキニルの各々は独立して、６〜１０個の炭素（すべて含めて）の１〜３個のアリール、好ましくはフェニルまたはナフチル；ヘテロアリール、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＨ、−ＯＲ９、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＲ７Ｒ８、−ＯＣＯＲ９、−ＯＣＯＮＨＲ９、Ｏ−テトラヒドロピラニル、ＮＨ２、−ＮＲ７Ｒ８、−ＮＲ１０ＣＯＲ９；−ＮＲ１０ＣＯ２Ｒ９、−ＮＲ１０ＣＯＮＲ７Ｒ８、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−ＮＲ１０ＳＯ２Ｒ９、−Ｓ（Ｏ）ｙＲ１１、ここでＲ１１はＨまたは１〜４個の炭素のアルキル、６〜１０個の炭素のアリール、好ましくはフェニルもしくはナフチル、またはヘテロアリールであり、そしてｙは１または２である；−ＳＲ１１、−ＣＯ２Ｒ９、−ＣＯＮＲ７Ｒ８、−ＣＨＯ、ＣＯＲ９、−ＣＨ２ＯＲ７、−ＣＨ＝ＮＮＲ１１Ｒ１２、−ＣＨ＝ＮＯＲ１１、−ＣＨ＝ＮＲ９、−ＣＨ＝ＮＮＨＣＨ（Ｎ＝ＮＨ）ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＲ１２Ｒ１３、−ＰＯ（ＯＲ１１）２またはＯＲ１４（ここでＲ１４はカルボキシル基のヒドロキシル基が除去された後のアミノ酸で残基である）により置換されるかのいずれかであり、；そして
Ｒ１２およびＲ１３は独立してＨ、１〜４個の炭素（すべて含めて）のアルキル、６〜１０個の炭素のアリール、好ましくはフェニルもしくはナフチル、またはヘテロアリールであるか；あるいは
Ｒ１２およびＲ１３は一緒に結合して、連結基、好ましくは−（ＣＨ２）２−Ｘ１−（ＣＨ２）２を形成するいずれかであり；
各Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は独立して、Ｈ、アリール、好ましくは６〜１０個の炭素（すべて含めて）のアリール、より好ましくはフェニルもしくはナフチル；ヘテロアリール；Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＣＮ、ＣＦ３、−ＮＯ２、−ＯＨ、−ＯＲ９、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＲ７Ｒ８、−ＯＣＯＲ９、−ＯＣＯＮＨＲ９、ＮＨ２、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＯＲ１４、−ＮＲ７Ｒ８、−ＮＲ１０ＣＯＲ９、−ＮＲ１０ＣＯＮＲ７Ｒ８−、−ＳＲ１１、−Ｓ（Ｏ）ｙＲ１１、ここでｙは１または２である；−ＣＯ２Ｒ９、−ＣＯＲ９、−ＣＯＮＲ７Ｒ８、−ＣＨＯ、−ＣＨ＝ＮＯＲ１１、−ＣＨ＝ＮＲ９、−ＣＨ＝ＮＮＲ１１Ｒ１２、−（ＣＨ２）ｎＳＲ９、ここでｎは１〜４（すべて含めて）の整数である；−（ＣＨ２）ｎＳ（Ｏ）ｙＲ９、−ＣＨ２ＳＲ１５、ここでＲ１５は１〜４個の炭素（すべて含めて）のアルキルである；−ＣＨ２Ｓ（Ｏ）ｙＲ１４、−（ＣＨ２）ｎＮＲ７Ｒ８、−（ＣＨ２）ｎＮＨＲ１４、１〜８個の炭素（すべて含めて）のアルキル、好ましくは１〜４個の炭素（すべて含めて）のアルキル；１〜８個の炭素（すべて含めて）のアルケニル、好ましくは１〜４個（すべて含めて）の炭素のアルケニル；１〜８個（すべて含めて）の炭素のアルキニル、好ましくは１〜４個の炭素（すべて含めて）のアルキニルであり；そして
１〜８個の炭素（すべて含めて）のアルキル、１〜８個の炭素（すべて含めて）のアルケニルまたは１〜８個の炭素（すべて含めて）のアルキニルの各々は非置換であるか；あるいは
１〜８個の炭素（すべて含めて）のアルキル、１〜８個の炭素（すべて含めて）のアルケニルまたは１〜８個の炭素（すべて含めて）のアルキニルの各々は、上記のｄ）２）で記載したように置換されているかのいずれかであり；
Ｘは、１〜３個の炭素（すべて含めて）の非置換アルキレンであるか；あるいは
Ｘは、１つのＲ２基、好ましくはＯＲ１０、−ＳＲ１０、Ｒ１５（ここでＲ１５は１〜４個の炭素（すべて含めて）のアルキルである）；フェニル、ナフチル、７〜１４個の炭素（すべて含めて）のアリールアルキル、好ましくはベンジルで置換された１〜３個の炭素（すべて含めて）のアルキレンであるか；あるいは
Ｘは、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（＝Ｏ）−、−Ｓ（＝Ｏ）２−、−ＣＲ１０）２−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝ＮＯＲ１１）−、−Ｃ（ＯＲ１１）（Ｒ１１）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨＲ１５）−、−ＣＨＲ１５）Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝ＮＯＲ１１）ＣＨＲ１５）−、−ＣＨＲ１５）Ｃ（＝ＮＯＲ１１）−、−ＣＨ２Ｚ−、Ｚ−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＺＣＨ２−（ここでＺはＣ（ＯＲ１１）（Ｒ１１）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ（＝ＮＯＲ１１）またはＮＲ１１である）である、
のいずれかであるか；あるいは、
Ａ１およびＡ２は一緒に、各々独立して、Ｈ、Ｈ；Ｈ、−ＯＲ１１；Ｈ、−ＳＲ１１；Ｈ、−ＮＲ１１）２であるか；または一緒に＝Ｓまたは＝ＮＲ１１を表し；Ｂ１およびＢ２は一緒にＯを表し；そして各Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＸは上記に定義した通りであるか；あるいは
Ａ１およびＡ２は一緒にＯを表し、そしてＢ１およびＢ２は一緒に、各々独立してＨ、Ｈ；Ｈ、−ＯＲ１１、Ｈ、−ＳＲ１１、Ｈ、−ＮＲ１１）２であるか、または一緒に＝Ｓまたは＝ＮＲ１１を表し；そして各Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＸは上記に定義した通りである、
を有する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
Ａ１、Ａ２、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６が、Ｈであり；Ｂ１およびＢ２が一緒にＯを表し；Ｒ２がＣＨ２ＣＨ２ＯＨであり、そしてＸがＣＨ２である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
上記化合物が式
【化２】
2005503102.tif 000026
式中：
環Ｂおよび環Ｆは独立して、そして各々がそれらに結合している炭素原子と一緒に：
ａ）不飽和６員の炭素環式芳香族環、ここで１〜３個の炭素原子は窒素原子により置き換えられてもよい；
ｂ）不飽和５員の炭素環式芳香族環；および
ｃ）不飽和５員の炭素環式芳香族環、ここで
１）１個の炭素原子が酸素、窒素または硫黄原子に置き換わるか；
２）２個の炭素原子が硫黄および窒素原子、酸素および窒素原子、または２個の窒素原子に置き換わるか；あるいは
３）３個の炭素原子が３個の窒素原子に置き換わる、いずれかである、
から成る群から選択され、
Ｒ１は：
ａ）Ｈ、１〜４個の炭素を有する置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換アリールアルキル、置換もしくは非置換ヘテロアリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールアルキル：
ｂ）−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ９、ここでＲ９はアルキル、アリールおよびヘテロアリールから成る群から選択される；
ｃ）−ＯＲ１０、ここでＲ１０はＨおよび１〜４個の炭素を有するアルキルから成る群から選択される；
ｄ）−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２、−ＮＲ１１Ｒ１２、−（ＣＨ２）ｐＮＲ１１Ｒ１２、−（ＣＨ２）ｐＯＲ１０、−Ｏ（ＣＨ２）ｐＯＲ１０および−Ｏ（ＣＨ２）ｐＮＲ１１Ｒ１２、ここでｐは１〜４である；そして
１）Ｒ１１およびＲ１２は各々が独立して、Ｈおよび１〜４個の炭素を有するアルキルから成る群から選択されるか；または
２）Ｒ１１およびＲ１２は一緒に式−（ＣＨ２）２−Ｘ１−（ＣＨ２）２−の連結基を形成し、ここでＸ１は−Ｏ−、−Ｓ−および−ＣＨ２−から成る群から選択される、のいずれかである、
から成る群から選択され；
Ｒ２は、Ｈ、１〜４個の炭素を有するアルキル、−ＯＨ、１〜４個の炭素を有するアルコキシ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ９、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２、−Ｏ（ＣＨ２）ｐＮＲ１１Ｒ１２、−Ｏ（ＣＨ２）ｐＯＲ１０、６〜１０個の炭素を有する置換もしくは非置換アリールアルキルおよび置換もしくは非置換ヘテロアリールアルキルから成る群から選択され；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は各々が独立して：
ａ）Ｈ、アリール、ヘテロアリール、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＣＮ、ＣＦ３、−ＮＯ２、−ＯＨ、−ＯＲ９、−Ｏ（ＣＨ２）ｐＮＲ１１Ｒ１２、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ９、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ２Ｒ７、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２、−Ｏ（ＣＨ２）ｐＯＲ１０、−ＣＨ２ＯＲ１０、−ＮＲ１１Ｒ１２、−ＮＲ１０Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ９、−ＮＲ１０Ｃ（＝Ｏ）Ｒ９；
ｂ）−ＣＨ２ＯＲ１４、ここでＲ１４はカルボキシル基のヒドロキシル基が除去された後のアミノ酸残基である；
ｃ）−ＮＲ１０Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２、−ＣＯ２Ｒ２、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ２、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２、−ＣＨ＝ＮＯＲ２、−ＣＨ＝ＮＲ９、−（ＣＨ２）ｐＮＲ１１Ｒ１２、−（ＣＨ２）ｐＮＨＲ１４または−ＣＨ＝ＮＮＲ２Ｒ２Ａ、ここでＲ２ＡはＲ２と同じである；
ｄ）−Ｓ（Ｏ）ｙＲ２−（ＣＨ２）ｐＳ（Ｏ）ｙＲ９、−ＣＨ２Ｓ（Ｏ）ｙＲ１４、ここでｙは０、１または２である；
ｅ）１〜８個の炭素を有するアルキル、２〜８個の炭素を有するアルケニルおよび２〜８個の炭素を有するアルキニル、ここで
１）各アルキル、アルケニルまたはアルキニル基は非置換であるか；あるいは
２）各アルキル、アルケニルまたはアルキニル基は、６〜１０個の炭素を有するアリール、ヘテロアリール、アリールアルコキシ、ヘテロシクロアルコキシ、ヒドロキシアルコキシ、アルキルオキシ−アルコキシ、ヒドロキシアルキルチオ、アルコキシ−アルキルチオ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＨ、−ＯＲ９、−Ｘ２（ＣＨ２）ｐＮＲ１１Ｒ１２、−Ｘ２（ＣＨ２）ｐＣ（＝Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２、−Ｘ２（ＣＨ２）ｐＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２、−Ｘ２（ＣＨ２）ｐＣＯ２Ｒ９、−Ｘ２（ＣＨ２）ｐＳ（Ｏ）ｙＲ９、−Ｘ２（ＣＨ２）ｐＮＲ１０Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ９、−ＯＣＯＮＨＲ２、−Ｏ−テトラヒドロピラニル、−ＮＲ１１Ｒ１２、−ＮＲ１０Ｃ（＝Ｏ）Ｒ９、−ＮＲ１０ＣＯ２Ｒ９、−ＮＲ１０Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、ＮＲ１０Ｓ（Ｏ）２Ｒ９、−Ｓ（Ｏ）ｙＲ９、−ＣＯ２Ｒ２、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ２、−ＣＨ２ＯＲ１０、−ＣＨ＝ＮＮＲ２Ｒ２Ａ、−ＣＨ＝ＮＯＲ２、−ＣＨ＝ＮＲ９、−ＣＨ＝ＮＮＨＣＨ（Ｎ＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ２Ｒ２Ａ、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ１０）２、−ＯＲ１４および５〜７個の炭素を有する単糖（ここで単糖の各ヒドロキシル基は独立して非置換であるか、またはＨ、１〜４個の炭素を有するアルキル、２〜５個の炭素を有するアルキルカルボニルオキシ、または１〜４個の炭素を有するアルコキシにより置換されているかのいずれかである）から成る群から選択される１〜３個の基で置換される；
から成る群から選択され：
Ｘ２は、Ｏ、ＳまたはＮＲ１０であり；
Ｒ７およびＲ８は各々が独立して、Ｈ、１〜４個の炭素を有するアルキル、１〜４個の炭素を有するアルコキシ、６〜１０個の炭素を有する置換もしくは非置換アリールアルキル、置換もしくは非置換ヘテロアリールアルキル、−（ＣＨ２）ｐＯＲ１０、−（ＣＨ２）ｐＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２および−（ＣＨ２）ｐＮＲ１１Ｒ１２から成る群から選択されるか；あるいはＲ７およびＲ８は一緒に式−ＣＨ２−Ｘ３−ＣＨ２−（ここでＸ３はＸ２または結合である）の連結基を形成し；
ｍおよびｎは各々独立して、０、１または２であり；
Ｙは、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ１０）−、−Ｎ＋（Ｏ−）（Ｒ１０）−、−Ｎ（ＯＲ１０）−および−ＣＨ２−から成る群から選択され；
Ｚは、結合、−Ｏ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＣＨ（ＯＲ１０）−、−Ｎ（Ｒ１０）−、−Ｎ（ＯＲ１０）−、ＣＨ（ＮＲ１１Ｒ１２）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１７）−、−Ｎ（Ｒ１７）Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｎ（Ｓ（Ｏ）ｙＲ９）−、−Ｎ（Ｓ（Ｏ）ｙＮＲ１１Ｒ１２）−、−Ｎ（Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１７）−、−Ｃ（Ｒ１５Ｒ１６）−、−Ｎ＋（Ｏ−）（Ｒ１０）−、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ（ＯＨ）−および−ＣＨ（Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ９）ＣＨ（ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ９Ａ）−（ここでＲ９ＡはＲ９と同じである）から成る群から選択され；
Ｒ１５およびＲ１６は独立して、Ｈ、−ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１０、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ９、ヒドロキシアルキルおよび−ＣＯ２Ｒ１０から成る群から選択され；
Ｒ１７は、Ｈ、アルキル、アリールおよびヘテロアリールから成る群から選択され；
Ａ１およびＡ２は、Ｈ、Ｈ；Ｈ、ＯＲ２；Ｈ、−ＳＲ２；Ｈ、−Ｎ（Ｒ２）２；およびＡ１およびＡ２が一緒に＝Ｏ、＝Ｓおよび＝ＮＲ２から成る群から選択される部分を形成する基から成る群から選択され；
Ｂ１およびＢ２は、Ｈ、Ｈ；Ｈ、−ＯＲ２；Ｈ、−ＳＲ２；Ｈ、−Ｎ（Ｒ２）２；およびＢ１およびＢ２が一緒に＝Ｏ、＝Ｓおよび＝ＮＲ２から成る群から選択される部分を形成する基から成る群から選択され；
ただしＡ１およびＡ２、またはＢ１およびＢ２の少なくとも１つの対は＝Ｏを形成する、
を有する請求項５に記載の方法。
【請求項９】
上記化合物が式
【化３】
2005503102.tif 000027
式中、
Ｚ１がＨであり、Ｚ２がＨであるか、またはＺ１およびＺ２が一緒に＝Ｏを形成し；
Ｒ１が、
【化４】
2005503102.tif 000028
から成る群から選択され；そして
Ｒ２が、Ｈ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ、ＣＨ２Ｓ（ＣＨ２）２Ｎ（ＣＨ３）２、ＮＨＣＯＮＨＣ２Ｈ５、ＣＨ２ＳＣ２Ｈ５、ＣＨ２ＯＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２Ｓ［３−（１，２，４−トリアジン）］、ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３およびＣＨ２ＯＨから成る群から選択され；
Ｘが、
【化５】
2005503102.tif 000029
から成る群から選択され；そして
Ｒが、ＯＨおよびＯＣＨ３から成る群から選択される、
を有する請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
Ｚ１およびＺ２がＨであり；ＸがＣＯ２ＣＨ３であり；そしてＲがＯＨである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
Ｚ１およびＺ２がＨであり；ＸがＣＯ２ＣＨ３であり；そしてＲ１およびＲ２がＣＨ２ＳＣＨ２ＣＨ３であり；そしてＲがＯＨである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
上記化合物が式
【化６】
2005503102.tif 000030
式中：
Ｚ１がＨであり、そしてＺ２がＨであるか、またはＺ１およびＺ２が一緒に＝Ｏを形成し；
Ｒ１がＨまたはＢｒであり；
Ｒ２がＨであり；
Ｒ３がＨ、ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨまたは
【化７】
2005503102.tif 000031
であり、そして
Ｒ４がＨ、ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２またはＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨである、
を有する、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
発明の分野
本発明は、部分的には多重系統キナーゼ（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｌｉｎｅａｇｅ ｋｉｎａｓｅ：ＭＬＫ）ファミリーの員を調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ）する方法、多重系統キナーゼタンパク質を調節し、そして細胞の生存を促進するかまたは細胞死を促進する化合物を同定する方法、神経変性障害および／または炎症の処置に有用となり得る化合物を同定する方法、ならびに多重系統キナーゼタンパク質を阻害する化合物を用いて神経変性障害を処置する方法に関する。
発明の背景
ＭＬＫファミリーは、ファミリーの員のキナーゼドメインのタンパク質配列がＭＡＰＫＫＫに極めて似ているが、他のＭＡＰＫＫＫよりも互いにより大きな類似性を有するタンパク質群を含んで成る。ＭＬＫファミリーの員は、とりわけｃ−Ｊｕｎ Ｎ−末端キナーゼ（ＪＮＫ）の調節、これは次いでとりわけｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ２およびＥＬＫ−１を含む転写因子の調節に関与する例えばストレス−シグナル伝達カスケードのような大変複雑なキナーゼカスケードのタンパク質を含んで成る。ＪＮＫは米国特許第５，５３４，４２６号、同第５，５９３，８８４号、同第５，６０５，８０８号明細書および国際公開第９５／０３３２４号明細書に記載され、各明細書は引用により全部、本明細書に編入する。
【０００２】
ＭＬＫファミリーは一部には以下の群を含む：１）多重系統キナーゼ１（ＭＬＫ１）；２）多重系統キナーゼ２（ＭＬＫ２）；３）多重系統キナーゼ３（ＭＬＫ３）；４）ロイシンジッパーを持つキナーゼ（ＬＺＫ）；５）二重ロイシンジッパーを持つキナーゼ（ＤＬＫ）；および６）多重系統キナーゼ６（ＭＬＫ６）。ＭＬＫ１はＴｙｒおよびＳｅｒ／Ｔｈｒに特異的な両キナーゼに類似する触媒ドメインを有する。Ｄｏｒｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９３，２１３，７０１−７１０。またＭＬＫ２も、ＴｙｒまたはＳｅｒ／Ｔｈｒに特異的な両キナーゼに類似する触媒ドメインを有する。Ｄｏｒｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９３，２１３，７０１−７１０。ＭＬＫ２はまたＭＳＴとしても知られている。Ｋａｔｏｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９５，１０，１４４７−１４５１。ＭＬＫ３は、キナーゼドメインに加えて隣接するカルボキシ−末端塩基性領域およびプロリンリッチ領域を持つ２つのロイシンジッパーを含むタンパク質を含んで成る。Ｉｎｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９４，９，１７４５−１７５０。ＭＬＫ３はまたＳＰＲＫ（Ｇａｌｌｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９４，２６９，１５０９２−１５１００）、およびＰＴＫ１（Ｅｚｏｅ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９４，９，９３５−９３８）としても知られている。ＬＺＫはロイシンジッパーを持つキナーゼである。Ｓａｋｕｍａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，２７２，２８６２２−２８６２９。ＤＬＫはキナーゼドメインおよび２つの推定上のロイシンジッパーモチーフを有する。Ｈｏｌｚｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９４，２６９，３０８０８−３０８１７。ＤＬＫはまたはＺＰＫ（Ｒｅｄｄｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１９９４，２０２，６１３−６２０）およびＭＵＫ（Ｈｉｒａｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９６，１２，６４１−６５０）として知られている。ＭＬＫファミリーの員は、例えば米国特許第５，６７６，９４５号、同第５，５５４，５２３号明細書、国際公開第９３／１５２０１号明細書、カナダ国特許第２，１４８，８９８号明細書、Ｄｉｅｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９７，９４，９６８７−９６９２， ＤｅＡｉｚｐｕｒｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，２７２，１６３６４−１６３７３，Ｔｕｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９７，１４，６５３−６５９，Ｓｅｌｌｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１９９７，７，１６１−１６７，Ｍａｔａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，２７１，１６８８８−１６８９６，Ｈｉｒａｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，２７２，１５１６７−１５１７３，Ｆａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，２７１，２４７８８−２４７９３，Ｂｌｏｕｉｎ，ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１９９６，１５，６３１−６４２，Ｐｏｍｂｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９５，３７７，７５０−７５４，Ｋｉｅｆｅｒ，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１９９６，１５，７０１３−７０２５，Ｈｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ＆ Ｄｅｖ．，１９９６，１０，２２５１−２２６４，Ｓｕ，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９７，１６，１２７９−１２９０、およびＤｏｒｏｗ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９５，２３４，４９２−５００にも記載されている。最近、別のＭＬＫ−関連キナーゼがＥＳＴデータベースで同定された。このクローン、ＭＬＫ６のＤＮＡ配列は７種の重複する登録で記載されている。それらのクローンＩＤ番号は：１００７４８９、１４６００８５、５１０９１５、６６６３２３、Ｆ５５５５、４８２１８８および１７８５２２であり、その各配列は全部、引用により本明細書に編入する。この段落で引用した各技術文献は引用により全部、本明細書に編入する。
【０００３】
最近、ＺＰＫの安定な発現は、コロニー形成アッセイにより測定した時、ＮＩＨ ３Ｔ３繊維芽細胞の増殖能を低下させることが示された。Ｂｅｒｇｅｒｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１９９７，２３１，１５３−１５５。しかしＢｅｒｇｅｒｏｎ，ｅｔ ａｌ．は、ＺＰＫがＺＰＫ基質の活性を調節したこと、またはＺＰＫが細胞死を促進したかどうかを示すことはできなかった。
【０００４】
Ｍｙｃ−ＭＬＫ２をコードする構築物のＳｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞中での発現は、注射から約２０時間後にアポトーシスを引き起こすことが示された。Ｎａｇａｔａ，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９８，１７，１４９−１５８。
【０００５】
出願人はとりわけ過増殖状態に伴う細胞の成長を阻害し、そして脊髄神経節、線条体、上頸神経節および運動ニューロンのような種々の胚性カルチャーにおける死亡を阻害する多数のインドロおよびインデノ化合物を開発した。米国特許第５，４７５，１１０号、同第５，５９１，８５５号、同第５，５９４，００９号、同第５，４６１，１４６号、同第５，６２１，１００号、同第５，６２１，１０１号、同第５，７０５，５１１号および同第５，７５６，４９４号明細書、これらの各々は本願の譲受人に譲受され、そして各々は引用により全部、本明細書に編入する。式Ｇを有する米国特許第５，７０５，５１１号明細書に述べられている化合物は、本出願では式Ｉを有する化合物を指す。また出願人は運動ニューロンのアポトーシスがＫ−２５２ａの誘導体、ストレスシグナル伝達カスケードも調節するインドロカルバゾールにより阻害されることも示した。Ｍａｒｏｎｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１９９８，１８，１０４−１１１、これは引用により全部、本明細書に編入する。
【０００６】
ストレスシグナル伝達カスケードの員を調節し、そして細胞死または細胞生存のいずれかを促進する化合物のスクリーニングが不十分であるために、化合物の新たな、選択的なスクリーニング法が未だに必要である。さらに炎症および神経変性障害の処置に有用となり得る治療薬のためのスクリーニングアッセイが引き続き必要である。本発明はこれらのならびに他の重要な目的を対象とする。
発明の要約
本発明は、多重系統キナーゼタンパク質の活性を調節し、そして細胞の生存を促進する化合物を同定する方法を提供し、この方法は多重系統キナーゼタンパク質を含有する細胞を化合物と接触させ、化合物が多重系統キナーゼタンパク質の活性を下げるかどうかを決定し、そして化合物が細胞の生存を促進するかどうかを決定する工程を含んで成る。
【０００７】
また本発明は、多重系統キナーゼタンパク質の活性を調節し、そして細胞死を促進する化合物を同定する方法を提供し、この方法は多重系統キナーゼタンパク質を含有する細胞を化合物と接触させ、化合物が多重系統キナーゼタンパク質の活性を上げるかどうかを決定し、そして化合物が細胞死を促進するかどうかを決定する工程を含んで成る。
【０００８】
また本発明は、神経変性障害の処置に有用となり得る化合物を同定する方法を提供し、この方法は多重系統キナーゼタンパク質を含有する細胞または細胞抽出物を化合物と接触させ、そして化合物が多重系統キナーゼタンパク質の活性を下げるかどうかを決定することを含んで成る。
【０００９】
また本発明は、炎症の処置に有用となり得る化合物を同定する方法を提供し、この方法は多重系統キナーゼタンパク質を含有する細胞または細胞抽出物を化合物と接触させ、そして化合物が多重系統キナーゼタンパク質の活性を下げるかどうかを決定することを含んで成る。
【００１０】
また本発明は、神経変性障害を有する、または有すると疑われる哺乳動物を処置するための方法を提供し、この方法は該哺乳動物に多重系統キナーゼタンパク質活性を阻害または下げる化合物を投与することを含んで成る。
【００１１】
また本発明は、炎症を有する哺乳動物を処置するための方法を提供し、この方法は該哺乳動物に多重系統キナーゼタンパク質活性を阻害または下げる化合物を投与することを含んで成る。
【００１２】
また本発明は、多重系統キナーゼタンパク質の活性を調節する方法を提供し、この方法はタンパク質またはタンパク質を含む細胞を、式ＩＩ：
【００１３】
【化８】
2005503102.tif 000003
【００１４】
式中：
環Ｂおよび環Ｆは独立して、そして各々がそれらに結合している炭素原子と一緒に：
不飽和６員の炭素環式芳香族環、ここで１〜３個の炭素原子は窒素原子により置き換えられてもよい；
不飽和５員の炭素環式芳香族環；および
不飽和５員の炭素環式芳香族環、ここで
１個の炭素原子が酸素、窒素または硫黄原子に置き換わるか；
２個の炭素原子が硫黄および窒素原子、酸素および窒素原子、または２個の窒素原子に置き換わるか；あるいは
３個の炭素原子が３個の窒素原子に置き換わる、いずれかである、
から成る群から選択され、
Ｒ１は：
Ｈ、１〜４個の炭素を有する置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換アリールアルキル、置換もしくは非置換ヘテロアリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールアルキル：
−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ９、ここでＲ９はアルキル、アリールおよびヘテロアリールから成る群から選択される；
−ＯＲ１０、ここでＲ１０はＨおよび１〜４個の炭素を有するアルキルから成る群から選択される；
−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２、−ＮＲ１１Ｒ１２、−（ＣＨ２）ｐＮＲ１１Ｒ１２、−（ＣＨ２）ｐＯＲ１０、−Ｏ（ＣＨ２）ｐＯＲ１０および−Ｏ（ＣＨ２）ｐＮＲ１１Ｒ１２、ここでｐは１〜４である；そして
Ｒ１１およびＲ１２は各々が独立して、Ｈおよび１〜４個の炭素を有するアルキルから成る群から選択されるか；あるいは
Ｒ１１およびＲ１２は一緒に式−（ＣＨ２）２−Ｘ１−（ＣＨ２）２−の連結基を形成し、ここでＸ１は−Ｏ−、−Ｓ−および−ＣＨ２−から成る群から選択される、のいずれかである、
から成る群から選択され；
Ｒ２は、Ｈ、１〜４個の炭素を有するアルキル、−ＯＨ、１〜４個の炭素を有するアルコキシ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ９、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２、−Ｏ（ＣＨ２）ｐＮＲ１１Ｒ１２、−Ｏ（ＣＨ２）ｐＯＲ１０、６〜１０個の炭素を有する置換もしくは非置換アリールアルキルおよび置換もしくは非置換ヘテロアリールアルキルから成る群から選択され；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は各々が独立して：
Ｈ、アリール、ヘテロアリール、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＣＮ、ＣＦ３、−ＮＯ２、−ＯＨ、−ＯＲ９、−Ｏ（ＣＨ２）ｐＮＲ１１Ｒ１２、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ９、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ２Ｒ７、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２、−Ｏ（ＣＨ２）ｐＯＲ１０、−ＣＨ２ＯＲ１０、−ＮＲ１１Ｒ１２、−ＮＲ１０Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ９、−ＮＲ１０Ｃ（＝Ｏ）Ｒ９；
−ＣＨ２ＯＲ１４、ここでＲ１４はカルボキシル基のヒドロキシル基が除去された後のアミノ酸残基である；
−ＮＲ１０Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２、−ＣＯ２Ｒ２、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ２、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２、−ＣＨ＝ＮＯＲ２、−ＣＨ＝ＮＲ９、−（ＣＨ２）ｐＮＲ１１Ｒ１２、−（ＣＨ２）ｐＮＨＲ１４または−ＣＨ＝ＮＮＲ２Ｒ２Ａ、ここでＲ２ＡはＲ２と同じである；
−Ｓ（Ｏ）ｙＲ２−（ＣＨ２）ｐＳ（Ｏ）ｙＲ９、−ＣＨ２Ｓ（Ｏ）ｙＲ１４、ここでｙは０、１または２である；
１〜８個の炭素を有するアルキル、２〜８個の炭素を有するアルケニルおよび２〜８個の炭素を有するアルキニル、ここで
各アルキル、アルケニルまたはアルキニル基は非置換であるか；あるいは
各アルキル、アルケニルまたはアルキニル基は、６〜１０個の炭素を有するアリール、ヘテロアリール、アリールアルコキシ、ヘテロシクロアルコキシ、ヒドロキシアルコキシ、アルキルオキシ−アルコキシ、ヒドロキシアルキルチオ、アルコキシ−アルキルチオ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＨ、−ＯＲ９、−Ｘ２（ＣＨ２）ｐＮＲ１１Ｒ１２、−Ｘ２（ＣＨ２）ｐＣ（＝Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２、−Ｘ２（ＣＨ２）ｐＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２、−Ｘ２（ＣＨ２）ｐＣＯ２Ｒ９、−Ｘ２（ＣＨ２）ｐＳ（Ｏ）ｙＲ９、−Ｘ２（ＣＨ２）ｐＮＲ１０Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ９、−ＯＣＯＮＨＲ２、−Ｏ−テトラヒドロピラニル、−ＮＲ１１Ｒ１２、−ＮＲ１０Ｃ（＝Ｏ）Ｒ９、−ＮＲ１０ＣＯ２Ｒ９、−ＮＲ１０Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、ＮＲ１０Ｓ（Ｏ）２Ｒ９、−Ｓ（Ｏ）ｙＲ９、−ＣＯ２Ｒ２、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ２、−ＣＨ２ＯＲ１０、−ＣＨ＝ＮＮＲ２Ｒ２Ａ、−ＣＨ＝ＮＯＲ２、−ＣＨ＝ＮＲ９、−ＣＨ＝ＮＮＨＣＨ（Ｎ＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ２Ｒ２Ａ、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ１０）２、−ＯＲ１４および５〜７個の炭素を有する単糖（ここで単糖の各ヒドロキシル基は独立して非置換であるか、またはＨ、１〜４個の炭素を有するアルキル、２〜５個の炭素を有するアルキルカルボニルオキシ、または１〜４個の炭素を有するアルコキシにより置換されているかのいずれかである）から成る群から選択される１〜３個の基で置換される；
から成る群から選択され：
Ｘ２は、Ｏ、ＳまたはＮＲ１０であり；
Ｒ７およびＲ８は各々が独立して、Ｈ、１〜４個の炭素を有するアルキル、１〜４個の炭素を有するアルコキシ、６〜１０個の炭素を有する置換もしくは非置換アリールアルキル、置換もしくは非置換ヘテロアリールアルキル、−（ＣＨ２）ｐＯＲ１０、−（ＣＨ２）ｐＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２および−（ＣＨ２）ｐＮＲ１１Ｒ１２から成る群から選択されるか；あるいはＲ７およびＲ８は一緒に式−ＣＨ２−Ｘ３−ＣＨ２−（ここでＸ３はＸ２または結合である）の連結基を形成し；
ｍおよびｎは各々独立して、０、１または２であり；
Ｙは、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ１０）−、−Ｎ＋（Ｏ−）（Ｒ１０）−、−Ｎ（ＯＲ１０）−および−ＣＨ２−から成る群から選択され；
Ｚは、結合、−Ｏ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＣＨ（ＯＲ１０）−、−Ｎ（Ｒ１０）−、−Ｎ（ＯＲ１０）−、ＣＨ（ＮＲ１１Ｒ１２）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１７）−、−Ｎ（Ｒ１７）Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｎ（Ｓ（Ｏ）ｙＲ９）−、−Ｎ（Ｓ（Ｏ）ｙＮＲ１１Ｒ１２）−、−Ｎ（Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１７）−、−Ｃ（Ｒ１５Ｒ１６）−、−Ｎ＋（Ｏ−）（Ｒ１０）−、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ（ＯＨ）−および−ＣＨ（Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ９）ＣＨ（ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ９Ａ）−（ここでＲ９ＡはＲ９と同じである）から成る群から選択され；
Ｒ１５およびＲ１６は独立して、Ｈ、−ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１０、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ９、ヒドロキシアルキルおよび−ＣＯ２Ｒ１０から成る群から選択され；
Ｒ１７は、Ｈ、アルキル、アリールおよびヘテロアリールから成る群から選択され；
Ａ１およびＡ２は、Ｈ、Ｈ；Ｈ、ＯＲ２；Ｈ、−ＳＲ２；Ｈ、−Ｎ（Ｒ２）２；およびＡ１およびＡ２が一緒に＝Ｏ、＝Ｓおよび＝ＮＲ２から成る群から選択される部分を形成する基から成る群から選択され；
Ｂ１およびＢ２は、Ｈ、Ｈ；Ｈ、−ＯＲ２；Ｈ、−ＳＲ２；Ｈ、−Ｎ（Ｒ２）２；およびＢ１およびＢ２が一緒に＝Ｏ、＝Ｓおよび＝ＮＲ２から成る群から選択される部分を形成する基から成る群から選択され；
ただしＡ１およびＡ２、またはＢ１およびＢ２の少なくとも１つの対は＝Ｏを形成する、
を有する化合物と接触させることを含んで成る。
【００１５】
また本発明は、多重系統キナーゼタンパク質の活性を調節するための方法を提供し、この方法はタンパク質をまたはタンパク質を含む細胞を、式ＩＩＩ
【００１６】
【化９】
2005503102.tif 000004
【００１７】
式中、
Ｚ１はＨであり、そしてＺ２はＨであるか、またはＺ１およびＺ２は一緒に＝Ｏを形成し；
Ｒ１は、
【００１８】
【化１０】
2005503102.tif 000005
【００１９】
から成る群から選択され；
Ｒ２は、Ｈ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ、ＣＨ２Ｓ（ＣＨ２）２Ｎ（ＣＨ３）２、ＮＨＣＯＮＨＣ２Ｈ５、ＣＨ２ＳＣ２Ｈ５、ＣＨ２ＯＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２Ｓ［３−（１，２，４−トリアジン）］、ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３およびＣＨ２ＯＨから成る群から選択され；
Ｘは、
【００２０】
【化１１】
2005503102.tif 000006
【００２１】
の１つから成る群から選択され；そして
Ｒは、ＯＨおよびＯＣＨ３から成る群から選択される、
を有する化合物と接触させることを含んで成る。
【００２２】
また本発明は、多重系統キナーゼタンパク質の活性の調節法を提供し、この方法はタンパク質またはタンパク質を含む細胞を、式ＩＶ
【００２３】
【化１２】
2005503102.tif 000007
【００２４】
式中：
Ｚ１はＨであり、そしてＺ２はＨであるか、またはＺ１およびＺ２は一緒に＝Ｏを形成し；
Ｒ１はＨまたはＢｒであり；
Ｒ２はＨであり；
Ｒ３はＨ、ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨまたは
【００２５】
【化１３】
2005503102.tif 000008
【００２６】
であり、そして
Ｒ４はＨ、ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２またはＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨである、
を有する化合物と接触させることを含んで成る。
発明の好適な態様の説明
上記および本明細書を通して使用するように、以下の用語は特に示さない限り以下の意味を有すると理解される。
【００２７】
「アポトーシス」は細胞およびそれらの核の膜に閉ざされた粒子への断片化を特徴とする細胞死の特別な形態学的状態を称する。アポトーシスは例えばエトポシド、スタウロスポリン、腫瘍壊死因子−α、セラミド等のようなアポトーシスを誘導する化合物を用いた処理により、またはｘ−線照射のような条件により誘起することができる。
【００２８】
用語「細胞死」とは、アポトーシス、ネクローシスまたは当業者に広く知られている手段による他の細胞死を称する。「細胞死」は例えば細胞の総細胞数の低下、または未処理の対照細胞群に比べて細胞生存能の低下として特徴付けることができる。「細胞死を促進する」化合物は、細胞数の低下、または対照群に比べて細胞生存能の低下をもたらす。対照的に「細胞の生存を促進する」化合物は、細胞数または細胞生存能の増加をもたらすか、または細胞死亡率の低下を示す。
【００２９】
用語「選択的に反応する」または「特異的に結合する」とは、ＭＬＫタンパク質と物理的または化学的に直接相互作用する化合物を説明する。対照的に「選択的に反応しない」または「特異的に結合しない」化合物は、ＭＬＫタンパク質の下流または上流のタンパク質に影響を及ぼし、すなわちＭＬＫタンパク質の活性に効果を及ぼすがＭＬＫタンパク質とは物理的または化学的に直接相互作用しない。
【００３０】
用語「調節する」とは、特定のタンパク質またはそれらの基質の活性を上げるかまたは下げることを称する。
【００３１】
本発明は部分的にはＭＬＫタンパク質の活性を調節し、そして細胞の生存または細胞死のいずれかを促進する化合物を同定する方法を対象とする。ＭＬＫタンパク質活性の上昇をもたらす化合物は細胞死を促進し、一方ＭＬＫタンパク質活性の低下をもたらす化合物は細胞の生存を促進することができる。
【００３２】
ＭＬＫタンパク質はタンパク質のＭＬＫクラスに属すると同定される任意のタンパク質であることができる。好ましくはＭＬＫタンパク質は上記のＭＬＫ１、ＭＬＫ２、ＭＬＫ３（ＳＰＲＫ、ＰＴＫ１）、ＬＺＫ、ＤＬＫ（ＺＰＫ、ＭＵＫ）およびＭＬＫ６から成る群から選択される。本発明の好適な態様では、この方法は結合アッセイ、キナーゼアッセイまたは他の均等なアッセイにより測定される、ＭＬＫタンパク質と直接相互作用または結合する化合物を同定する。
【００３３】
ＭＬＫタンパク質活性を調節し、そして細胞の生存または細胞死を促進する化合物を同定するために、ＭＬＫタンパク質を含有する細胞（１つまたは複数）を試験化合物と接触させる。この接触は当業者には周知なバッファーまたは媒質中で生じることができる。あるいは接触はインビボで起こることができ、ここで動物、例えばマウスまたは当業者に知られている他の適当な動物は、試験化合物および医薬的に許容される塩、キャリアーまたは希釈剤を含んで成る医薬組成物を投与することにより接触させられる。さらに細胞数および試験化合物濃度を変動させて使用することができる。試験化合物がＭＬＫタンパク質の活性を上げるかまたは下げるかを決定する。さらに試験化合物が細胞の生存または細胞死を促進するかどうかも決定する。
【００３４】
試験化合物と接触させる細胞は、任意の哺乳動物細胞でよい。好ましくは細胞は神経細胞である。好ましくは細胞は神経変性疾患に関与する。本発明の目的に関して、「神経変性疾患」、「神経変性障害」および「神経変性状態」は、互換的であり、そして神経細胞または神経系に含まれる細胞が関与する任意の疾患または障害を説明し、それらには限定するわけではないがアルツハイマー病、運動ニューロン疾患、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、大脳血管疾患、虚血状態、ＡＩＤＳ痴呆、癲癇、ハンチントン病、および脳または脊髄に対する振盪的または貫通的損傷を含む。
【００３５】
ＭＬＫタンパク質活性は多数の技法により決定することができる。例えばＭＬＫ活性はＭＬＫタンパク質の基質の活性を測定することにより決定することができる。そのような基質は当業者には周知であり、そして容易に識別可能である。好ましくは基質はマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼファミリーまたはマイトジェン活性化プロテインキナーゼファミリーの員、またはかなり下流の基質であり、これらには限定するわけではないがＪＮＫ１、ＪＮＫ２、ＪＮＫ３、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、ｐ３８α、ｐ３８β、ｐ３８γ、ｐ３８δ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４（ＳＥＫ１）、ＭＥＫ５、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ｊｕｎ、ＡＴＦ２、ＥＬＫ１およびＡＥＸ−３の哺乳動物相同体、ならびにまたミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）のようなＳｅｒ／Ｔｈｒプロテインキナーゼの一般的基質から成る群から選択されるタンパク質を含む。基質の活性を測定するための試薬および方法も当業者には既知である。
【００３６】
ＭＬＫの存在はＭＬＫタンパク質またはＭＬＫタンパク質をコードするｍＲＮＡの量を測定することにより決定することもできる。抗体およびオリゴヌクレオチドプローブを含む試薬、ならびにノーザンおよびウエスタンブロットを含むＤＮＡまたはタンパク質の量を測定する方法は当業者には周知である。ＭＬＫタンパク質活性はインビトロキナーゼアッセイにより決定することもできる。インビトロキナーゼアッセイは、当業者には周知である。タンパク質活性を測定するための他の技法を当業者は既知であり、そして本発明に網羅されるものとする。このように当業者は試験化合物がＭＬＫタンパク質活性を調節するかどうか、すなわち上げるか、または下げるかを決定することができる。
【００３７】
試験化合物が細胞の生存または細胞死を促進するか否かは、多数の方法により決定することができる。好ましくは細胞の生存または細胞死の促進は死ぬ危険性にある細胞を使用し、そして試験化合物と接触し、そして生存したままの細胞の量を、試験化合物とは接触せず、そして生存したままである細胞の量と比較することにより決定する。好ましくは細胞は、予め死ぬようにプログラムされた一次（ｐｒｉｍａｒｙ）胚運動ニューロン細胞である。一次胚運動ニューロン細胞は、Ｍａｒｏｎｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１９９８，１８，１０４−１１１に記載され、これは引用により全部、本明細書に編入する。一次胚運動ニューロン細胞は試験化合物に救助されなければ死ぬ。このように試験化合物で処理しなかった運動ニューロン細胞群中の運動ニューロン細胞数と比べた時、試験化合物で処置した運動ニューロン細胞群中に生きている運動ニューロン細胞数がより多ければ、細胞生存を促進する試験化合物であることを示す。対照的に、試験化合物で処理しなかった運動ニューロン細胞群中の生きている運動ニューロン細胞数と比べた時、試験化合物で処置した運動ニューロン細胞群中に生きている運動ニューロン細胞数がより少なければ、細胞死を促進する試験化合物であることを示す。
【００３８】
本発明の別の態様では、正常細胞または野生型細胞を以下の実施例に記載するようにＭＬＫタンパク質を過剰発現させることにより死ぬ危険性のある細胞に転換し、そして次いで試験化合物と接触させる。ＭＬＫタンパク質を過剰発現している細胞は、試験化合物により救済されなければ死ぬかもしれない。ＭＬＫタンパク質の過剰発現は、細胞の内側の特定タンパク質を発現できるベクターを使用して達成することができる。発現ベクターは当業者には周知である。さらに発現ベクターの調製法も当業者には周知である。任意のＭＬＫタンパク質を発現する発現ベクターは、実施例に記載されている様式に準じて調製することができる。試験化合物で処理しなかった過剰発現している細胞群中の生きている細胞数と比べた時、試験化合物で処置した過剰発現している細胞群中の生きている細胞数がより多ければ、細胞の生存を促進する試験化合物であることを示す。対照的に、試験化合物で処理しなかった過剰発現している細胞群中の生きている細胞数と比べた時、試験化合物で処置した過剰発現している細胞群中の生きている細胞数がより少なければ、細胞死を促進する試験化合物であることを示す。
【００３９】
本発明の別の態様では、細胞生存の促進がアポトーシスの低下を観察または測定することにより決定される。細胞質の縮小および核の凝縮がアポトーシスに伴う。このように当業者は、細胞質の縮小および／または核の凝縮の低下を測定または観察することによりアポトーシスにおける低下を測定することができる。さらに当業者は従来の染色技術を採用することによりアポトーシスを測定することができる。
【００４０】
本発明の１つの態様では、正常、野生型神経細胞を使用して細胞死を促進する化合物を同定することができる。正常な神経細胞は試験化合物により死を誘導されなければ生存するだろう。試験化合物で処理しなかった正常細胞群中に生きている細胞数と比べた時、試験化合物で処置した正常細胞群中の生きている細胞数がより少なければ、細胞死を促進する試験化合物であることを示す。対照的に試験化合物で処理しなかった正常細胞群中の生きている細胞数と比べた時、試験化合物で処置した正常細胞群中の生きている細胞数がより多いかまたは等しければ、細胞死を促進する試験化合物を示さない。
【００４１】
また本発明は一部はＭＬＫタンパク質の活性を調節する方法を対象とし、この方法はタンパク質またはタンパク質を含有する細胞を、米国特許第５，７０５，５１１号明細書（これは本出願の代理人に割り当てられ、そして引用により全部、本明細書に編入する）に説明されている式Ｇ（本明細書では式Ｉ）を有する化合物と接触させることを含んで成る。
【００４２】
また本発明は一部はＭＬＫタンパク質の活性を調節するための方法を対象とし、この方法はタンパク質をまたはタンパク質を含有する細胞を、以下の式ＩＩＩ：
【００４３】
【化１４】
2005503102.tif 000009
【００４４】
式中、
Ｚ１はＨであり、そしてＺ２はＨであるか、またはＺ１およびＺ２は一緒に＝Ｏを形成し；
Ｒ１は、
【００４５】
【化１５】
2005503102.tif 000010
【００４６】
から成る群から選択され；そして
Ｒ２は、Ｈ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ、ＣＨ２Ｓ（ＣＨ２）２Ｎ（ＣＨ３）２、ＮＨＣＯＮＨＣ２Ｈ５、ＣＨ２ＳＣ２Ｈ５、ＣＨ２ＯＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２Ｓ［３−（１，２，４−トリアジン）］、ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３およびＣＨ２ＯＨから成る群から選択され；
Ｘは、
【００４７】
【化１６】
2005503102.tif 000011
【００４８】
の１つから成る群から選択され；そして
Ｒは、ＯＨおよびＯＣＨ３から成る群から選択される、
を有する化合物と接触させることを含んで成る。
【００４９】
本発明の好適な態様では、Ｚ１およびＺ２がＨであり、ＸがＣＯ２ＣＨ３であり、Ｒ１がＮＨＣＯＮＨＣ２Ｈ５であり、Ｒ２がＣＨ２ＣＨ２（２−ピリジル）であり、そしてＲがＯＨである。本発明の別の好適な態様では、Ｚ１およびＺ２がＨであり、ＸがＣＯ２ＣＨ３であり；Ｒ１およびＲ２がＣＨ２ＯＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ３であり、そしてＲがＯＨであるか；あるいはＺ１およびＺ２がＨであり、ＸがＣＯ２ＣＨ３であり、Ｒ１およびＲ２がＣＨ２ＳＣＨ２ＣＨ３であり、そしてＲがＯＨであるか；あるいはＺ１、Ｚ２、Ｒ１およびＲ２がＨであり、ＸがＣＯ２ＣＨ３であり；そしてＲがＯＨであるか；あるいはＺ１、Ｚ２、Ｒ１およびＲ２がＨであり、ＸがＣＯ２（ＣＨ２）４ＣＨ３であり、そしてＲがＯＨであるか；あるいはＺ１、Ｚ２およびＲ１がＨであり、Ｒ２がＣＨ２ＯＨであり、ＸがＣＯ２ＣＨ３であり、そしてＲがＯＨであるか；あるいはＺ１およびＺ２がＨであり、Ｒ１およびＲ２がＨ２Ｓ［３−（１，２，４−トリアジン）］であり、ＸがＣＯ２ＣＨ３であり、そしてＲがＯＨであるか；あるいはＺ１およびＺ２がＨであり、Ｒ１がＢｒであり、Ｒ２がＩであり、ＸがＣＯ２ＣＨ３であり；そしてＲがＯＨであるか；あるいはＺ１およびＺ２がＨであり、Ｒ１およびＲ２がＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３であり、ＸがＣＯ２ＣＨ３であり、そしてＲがＯＨであるか；あるいはＺ１、Ｚ２、Ｒ１およびＲ２がＨであり、ＸがＣＯ２ＣＨ３であり、そしてＲがＯＣＨ３であるか；あるいはＺ１およびＺ２が一緒に＝Ｏを形成し、Ｒ１およびＲ２がＢｒであり、ＸがＣＯ２ＣＨ３であり、そしてＲがＯＨである。
【００５０】
また本発明は一部はＭＬＫタンパク質の活性を調節するための方法を対象とし、この方法はタンパク質またはタンパク質を含有する細胞を、以下の式ＩＩ
【００５１】
【化１７】
2005503102.tif 000012
【００５２】
式中：
環Ｂおよび環Ｆは独立して、そして各々がそれらに結合している炭素原子と一緒に：
ａ）不飽和６員の炭素環式芳香族環、ここで１〜３個の炭素原子は窒素原子により置き換えられてもよい；
ｂ）不飽和５員の炭素環式芳香族環；および
ｃ）不飽和５員の炭素環式芳香族環、ここで
１）１個の炭素原子が酸素、窒素または硫黄原子に置き換わるか；
２）２個の炭素原子が硫黄および窒素原子、酸素および窒素原子、または２個の窒素原子に置き換わるか；あるいは
３）３個の炭素原子が３個の窒素原子に置き換わる、いずれかである、
から成る群から選択され、
Ｒ１は：
ａ）Ｈ、１〜４個の炭素を有する置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換アリールアルキル、置換もしくは非置換ヘテロアリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールアルキル：
ｂ）−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ９、ここでＲ９はアルキル、アリールおよびヘテロアリールから成る群から選択される；
ｃ）−ＯＲ１０、ここでＲ１０はＨおよび１〜４個の炭素を有するアルキルから成る群から選択される；
ｄ）−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２、−ＮＲ１１Ｒ１２、−（ＣＨ２）ｐＮＲ１１Ｒ１２、−（ＣＨ２）ｐＯＲ１０、−（ＣＨ２）ｐＯＲ１０および−Ｏ（ＣＨ２）ｐＮＲ１１Ｒ１２、ここでｐは１〜４である；そして
１）Ｒ１１およびＲ１２は各々が独立して、Ｈおよび１〜４個の炭素を有するアルキルから成る群から選択されるか；または
２）Ｒ１１およびＲ１２は一緒に式−（ＣＨ２）２−Ｘ１−（ＣＨ２）２−の連結基を形成し、ここでＸ１は−Ｏ−、−Ｓ−および−ＣＨ２−から成る群から選択される、のいずれかである、
から成る群から選択され；
Ｒ２は、Ｈ、１〜４個の炭素を有するアルキル、−ＯＨ、１〜４個の炭素を有するアルコキシ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ９、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２、−Ｏ（ＣＨ２）ｐＮＲ１１Ｒ１２、−Ｏ（ＣＨ２）ｐＯＲ１０、６〜１０個の炭素を有する置換もしくは非置換アリールアルキルおよび置換もしくは非置換ヘテロアリールアルキルから成る群から選択され；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は各々が独立して：
ａ）Ｈ、アリール、ヘテロアリール、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＣＮ、ＣＦ３、−ＮＯ２、−ＯＨ、−ＯＲ９、−Ｏ（ＣＨ２）ｐＮＲ１１Ｒ１２、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ９、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ２Ｒ７、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２、−Ｏ（ＣＨ２）ｐＯＲ１０、−ＣＨ２ＯＲ１０、−ＮＲ１１Ｒ１２、−ＮＲ１０Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ９、−ＮＲ１０Ｃ（＝Ｏ）Ｒ９；
ｂ）−ＣＨ２ＯＲ１４、ここでＲ１４はカルボキシル基のヒドロキシル基が除去された後のアミノ酸残基である；
ｃ）−ＮＲ１０Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２、−ＣＯ２Ｒ２、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ２、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２、−ＣＨ＝ＮＯＲ２、−ＣＨ＝ＮＲ９、−（ＣＨ２）ｐＮＲ１１Ｒ１２、−（ＣＨ２）ｐＮＨＲ１４または−ＣＨ＝ＮＮＲ２Ｒ２Ａ、ここでＲ２ＡはＲ２と同じである；
ｄ）−Ｓ（Ｏ）ｙＲ２−（ＣＨ２）ｐＳ（Ｏ）ｙＲ９、−ＣＨ２Ｓ（Ｏ）ｙＲ１４、ここでｙは０、１または２である；
ｅ）１〜８個の炭素を有するアルキル、２〜８個の炭素を有するアルケニルおよび２〜８個の炭素を有するアルキニル、ここで
１）各アルキル、アルケニルまたはアルキニル基は非置換であるか；あるいは
２）各アルキル、アルケニルまたはアルキニル基は、６〜１０個の炭素を有するアリール、ヘテロアリール、アリールアルコキシ、ヘテロシクロアルコキシ、ヒドロキシアルコキシ、アルキルオキシ−アルコキシ、ヒドロキシアルキルチオ、アルコキシ−アルキルチオ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＨ、−ＯＲ９、−Ｘ２（ＣＨ２）ｐＮＲ１１Ｒ１２、−Ｘ２（ＣＨ２）ｐＣ（＝Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２、−Ｘ２（ＣＨ２）ｐＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２、−Ｘ２（ＣＨ２）ｐＣＯ２Ｒ９、−Ｘ２（ＣＨ２）ｐＳ（Ｏ）ｙＲ９、−Ｘ２（ＣＨ２）ｐＮＲ１０Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ９、−ＯＣＯＮＨＲ２、−Ｏ−テトラヒドロピラニル、−ＮＲ１１Ｒ１２、−ＮＲ１０Ｃ（＝Ｏ）Ｒ９、−ＮＲ１０ＣＯ２Ｒ９、−ＮＲ１０Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−ＮＲ１０Ｓ（Ｏ）２Ｒ９、−Ｓ（Ｏ）ｙＲ９、−ＣＯ２Ｒ２、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ２、−ＣＨ２ＯＲ１０、−ＣＨ＝ＮＮＲ２Ｒ２Ａ、−ＣＨ＝ＮＯＲ２、−ＣＨ＝ＮＲ９、−ＣＨ＝ＮＮＨＣＨ（Ｎ＝ＮＨ）ＮＨ２、−Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ２Ｒ２Ａ、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ１０）２、−ＯＲ１４および５〜７個の炭素を有する単糖（ここで単糖の各ヒドロキシル基は独立して非置換であるか、またはＨ、１〜４個の炭素を有するアルキル、２〜５個の炭素を有するアルキルカルボニルオキシ、または１〜４個の炭素を有するアルコキシにより置換されているかのいずれかである）から成る群から選択される１〜３個の基で置換される；
から成る群から選択され：
Ｘ２は、Ｏ、ＳまたはＮＲ１０であり；
Ｒ７およびＲ８は各々が独立して、Ｈ、１〜４個の炭素を有するアルキル、１〜４個の炭素を有するアルコキシ、６〜１０個の炭素を有する置換もしくは非置換アリールアルキル、置換もしくは非置換ヘテロアリールアルキル、−（ＣＨ２）ｐＯＲ１０、−（ＣＨ２）ｐＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２および−（ＣＨ２）ｐＮＲ１１Ｒ１２から成る群から選択されるか；あるいはＲ７およびＲ８は一緒に式−ＣＨ２−Ｘ３−ＣＨ２−（ここでＸ３はＸ２または結合である）の連結基を形成し；
ｍおよびｎは各々独立して、０、１または２であり；
Ｙは、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ１０）−、−Ｎ＋（Ｏ−）（Ｒ１０）−、−Ｎ（ＯＲ１０）−および−ＣＨ２−から成る群から選択され；
Ｚは、結合、−Ｏ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＣＨ（ＯＲ１０）−、−Ｎ（Ｒ１０）−、−Ｎ（ＯＲ１０）−、ＣＨ（ＮＲ１１Ｒ１２）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ１７）−、−Ｎ（Ｒ１７）Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｎ（Ｓ（Ｏ）ｙＲ９）−、−Ｎ（Ｓ（Ｏ）ｙＮＲ１１Ｒ１２）−、−Ｎ（Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１７）−、−Ｃ（Ｒ１５Ｒ１６）−、−Ｎ＋（Ｏ−）（Ｒ１０）−、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ（ＯＨ）−および−ＣＨ（Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ９）ＣＨ（ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ９Ａ）−（ここでＲ９ＡはＲ９と同じである）から成る群から選択され；
Ｒ１５およびＲ１６は独立して、Ｈ、−ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１０、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ９、ヒドロキシアルキルおよび−ＣＯ２Ｒ１０から成る群から選択され；
Ｒ１７は、Ｈ、アルキル、アリールおよびヘテロアリールから成る群から選択され；
Ａ１およびＡ２は、Ｈ、Ｈ；Ｈ、ＯＲ２；Ｈ、−ＳＲ２；Ｈ、−Ｎ（Ｒ２）２；およびＡ１およびＡ２が一緒に＝Ｏ、＝Ｓおよび＝ＮＲ２から成る群から選択される部分を形成する基から成る群から選択され；
Ｂ１およびＢ２は、Ｈ、Ｈ；Ｈ、−ＯＲ２；Ｈ、−ＳＲ２；Ｈ、−Ｎ（Ｒ２）２；およびＢ１およびＢ２が一緒に＝Ｏ、＝Ｓおよび＝ＮＲ２から成る群から選択される部分を形成する基から成る群から選択され；
ただしＡ１およびＡ２、またはＢ１およびＢ２の少なくとも１つの対は＝Ｏを形成する、
を有する化合物と接触させることを含んで成る。
【００５３】
また本発明は一部はＭＬＫタンパク質の活性を調節する方法を対象とし、この方法はタンパク質またはタンパク質を含有する細胞を、以下の式ＩＶ：
【００５４】
【化１８】
2005503102.tif 000013
【００５５】
式中：
Ｚ１はＨであり、そしてＺ２はＨであるか、あるいはＺ１およびＺ２が一緒に＝Ｏを形成し；
Ｒ１はＨまたはＢｒであり；
Ｒ２はＨであり；
Ｒ３はＨ、ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨまたは
【００５６】
【化１９】
2005503102.tif 000014
【００５７】
であり、そして
Ｒ４はＨ、ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２またはＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨである、
を有する化合物と接触させることを含んで成る。
【００５８】
本発明の好適な態様では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｚ１およびＺ２がＨであり、そしてＲ３がＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２である。本発明の他の好適な態様では、Ｒ１がＢｒであり、そしてＲ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｚ１およびＺ２がＨであるか；あるいはＲ１、Ｒ２、Ｚ１およびＺ２がＨであり、そしてＲ３およびＲ４がＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２であるか；あるいはＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｚ１およびＺ２がＨであり、そしてＲ４がＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２であるか；あるいはＲ１、Ｒ２、Ｚ１およびＺ２がＨであり、そしてＲ３およびＲ４がＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨであるか；あるいはＲ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｚ１およびＺ２がＨであり、そしてＲ３が
【００５９】
【化２０】
2005503102.tif 000015
【００６０】
である。
【００６１】
また本発明は神経変性障害の処置に有用となり得る化合物の同定法を提供し、この方法は多重系統キナーゼタンパク質を含む細胞または細胞抽出物を化合物と接触させ、そして化合物が多重系統キナーゼタンパク質の活性を下げるかどうかを決定することを含んで成る。細胞およびそれらに由来する抽出物には上記のものを含む。本発明の方法により見いだされた化合物（すなわち多重系統キナーゼタンパク質の活性を阻害または下げる化合物）は、神経変性障害を処置するために有用となり得る。タンパク質は好ましくは多重系統キナーゼ１、多重系統キナーゼ２、多重系統キナーゼ３、ロイシンジッパーを持つキナーゼ、二重ロイシンジッパーを持つキナーゼおよび多重系統キナーゼ６から成る群から選択される。細胞はインビトロまたはインビボで接触させる。好ましくはタンパク質活性は該タンパク質の基質の活性またはリン酸化状態を測定することにより決定する。好ましくは基質は、ＪＮＫ１、ＪＮＫ２、ＪＮＫ３、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、ｐ３８α、ｐ３８β、ｐ３８γ、ｐ３８δ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４（ＳＥＫ１）、ＭＥＫ５、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ｊｕｎ、ＡＴＦ２、ＥＬＫ１およびＡＥＸ−３の哺乳動物相同体、ならびにまた例えばミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）のような一般的なＳｅｒ／Ｔｈｒ基質から成る群から選択される。またタンパク質活性は、タンパク質の基質の活性、タンパク質の基質の量、またはタンパク質の基質をコードするｍＲＮＡを測定することにより決定することができる。タンパク質活性はインビトロキナーゼアッセイまたは結合アッセイにより決定することもできる。細胞は好ましくは１次胚運動ニューロン細胞、多重系統キナーゼタンパク質を過剰発現する細胞または神経細胞であるが、任意の細胞またはそれらの抽出物でよい。好ましくは上記のように多重系統キナーゼタンパク質に直接結合する化合物を同定する。
【００６２】
また本発明は、炎症の処置に有用となり得る化合物の同定法を提供し、この方法は多重系統キナーゼタンパク質を含む細胞または細胞抽出物を化合物と接触させ、そして化合物が多重系統キナーゼタンパク質の活性を下げるかどうかを決定することを含んで成る。細胞およびそれらからの抽出物には上記のものを含む。本発明の方法により見いだされた化合物（すなわち多重系統キナーゼタンパク質の活性を阻害または下げる化合物）は、炎症を処置するために有用となり得る。タンパク質は好ましくは多重系統キナーゼ１、多重系統キナーゼ２、多重系統キナーゼ３、ロイシンジッパーを持つキナーゼ、二重ロイシンジッパーを持つキナーゼおよび多重系統キナーゼ６から成る群から選択される。細胞はインビトロまたはインビボで接触させる。好ましくはタンパク質活性は該タンパク質の基質の活性またはリン酸化状態を測定することにより決定する。好ましくは基質は、ＪＮＫ１、ＪＮＫ２、ＪＮＫ３、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、ｐ３８α、ｐ３８β、ｐ３８γ、ｐ３８δ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４（ＳＥＫ１）、ＭＥＫ５、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ｊｕｎ、ＡＴＦ２、ＥＬＫ１およびＡＥＸ−３の哺乳動物相同体、ならびにまた例えばミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）のような一般的なＳｅｒ／Ｔｈｒ基質から成る群から選択される。またタンパク質活性は、タンパク質の基質の活性、タンパク質の基質の量、またはタンパク質の基質をコードするｍＲＮＡを測定することにより決定することができる。タンパク質活性はインビトロキナーゼアッセイまたは結合アッセイにより決定することもできる。
【００６３】
細胞は好ましくは１次胚運動ニューロン細胞、多重系統キナーゼタンパク質を過剰発現する細胞または神経細胞であるが、任意の細胞またはそれらの抽出物でよい。細胞はまた限定するわけではないが、例えばリンパ球、マクロファージおよび当業者に周知の他の白血球細胞のような炎症に関与するものを含む。好ましくは多重系統キナーゼタンパク質に直接結合する化合物を同定する。
【００６４】
また本発明は神経変性障害を有するまたは有すると疑われる哺乳動物を処置する方法を提供し、この方法は哺乳動物に多重系統キナーゼタンパク質活性を阻害または低下させる化合物を投与することを含んで成る。多重系統キナーゼタンパク質活性を阻害または低下させる化合物には限定するわけではないが、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶを有する化合物を含む。好適な化合物は、多重系統キナーゼタンパク質活性を調節し、そして細胞生存または細胞死のいずれかを促進する化合物をスクリーニングするための方法に関して上に記載したものを含む。好適な哺乳動物はヒトである。個体が特定の神経変性疾患の症状を有する場合、神経変性疾患を有すると疑うことができる個体は、神経変性疾患の高リスク群にあるか、または神経変性疾患の家系である。
【００６５】
また本発明は、炎症を有する哺乳動物を処置する方法を提供し、この方法は該哺乳動物に多重系統キナーゼタンパク質活性を阻害または低下させる化合物を投与することを含んで成る。多重系統キナーゼタンパク質活性を阻害または低下させる化合物には限定するわけではないが、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶを有する化合物を含む。好適な化合物は、多重系統キナーゼタンパク質活性を調節し、そして細胞生存または細胞死のいずれかを促進する化合物をスクリーニングするための方法に関して上に記載したものを含む。好適な哺乳動物はヒトである。
【００６６】
式Ｉ〜ＩＶを有する化合物との接触は、当業者に周知なバッファーまたは媒質中で起こることができる。あるいは接触は試験化合物および医薬的に許容される塩、キャリアーまたは希釈剤を含有する医薬組成物を、動物または哺乳動物、例えばマウスまたは当業者には既知の他の適当な動物に投与することにより生じ得る。さらに細胞数および化合物濃度を変動させて使用することができる。試験化合物と接触する細胞は、任意の哺乳動物細胞でよい。好ましくは細胞は神経細胞である。好ましくは細胞は例えばアルツハイマー病、運動ニューロン疾患、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、大脳血管疾患、虚血状態、ＡＩＤＳ痴呆、癲癇、ハンチントン病、および脳または脊髄に対する振盪的または貫通的損傷のような神経変性疾患に関与する。式Ｉを有する化合物およびその製造法は、米国特許第５，７０５，５１１号明細書に記載され、これは全部、引用により本明細書に編入する。式ＩＩＩを有する化合物およびその製造法は、米国特許第５，７４１，８０９８号、同第５，６２１，１００号、同第５，６２１，１０１号、同第５，４６１，１４６号および同第５，７５６，４９４号明細書および国際公開第９７／４６５６７号明細書に記載され、これらは全部、引用により本明細書に編入する。式ＩＶを有する化合物およびその製造法は、米国特許第５，７４１，８０９８号、同第５，６２１，１００号、同第５，６２１，１０１号、同第５，４６１，１４６号および同第５，７５６，４９４号明細書および国際公開第９７／４６５６７号明細書に記載され、これらは全部、引用により本明細書に編入する。
【００６７】
式ＩＩを有する化合物には、置換基Ｒ２、Ｒ７およびＲ８が結合した炭素原子に関するジアステレオマーおよびエナンチオマーを含む。
【００６８】
好適な架橋化インデノピロロカルバゾールは式ＩＩ：
【００６９】
【化２１】
2005503102.tif 000016
【００７０】
により表される。
【００７１】
式ＩＩの化合物の幾つかの好適な態様では、Ｒ１はＨである。さらに好適な態様では、Ｒ２はＨ、ヒドロキシルまたは置換もしくは非置換アルキルである。
【００７２】
他の好適な態様では、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は独立してＨ、置換もしくは非置換アルキル、ハロゲン、置換もしくは非置換アルコキシ、置換もしくは非置換アミノ、または置換もしくは非置換アリールである。さらに好適な態様では、Ｒ７およびＲ８は独立してＨ、または置換もしくは非置換アルキルである。
【００７３】
幾つかの好適な態様では、ＹはＯである。さらに好適な態様では、Ｚは結合、Ｏ、Ｓまたは置換もしくは非置換Ｎである。さらに一層好適な態様では、ｍおよびｎは独立して１または２である。幾つかの特に好適な態様ではＹはＯであり、Ｚは結合またはＯであり、そしてｍおよびｎは独立して１または２である。
【００７４】
さらに好適な態様では、Ａ１Ａ２およびＢ１Ｂ２は＝ＯまたはＨ、Ｈである。
【００７５】
幾つかの特に好適な態様では、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ６およびＲ７は各々、Ｈであり、Ｙは＝Ｏであり、ｎは１であり、Ａ１Ａ２およびＢ１Ｂ２は＝ＯまたはＨ、Ｈであり、Ｒ２はＨ、ＯＨまたは低級アルキルであり、Ｒ３はＨまたは置換アルキルであり、Ｒ５およびＲ８は各々、Ｈまたはアルコキシであり、メトキシが好ましく、Ｚは結合またはＯであり、そしてｍは１または２である。
【００７６】
式ＩＩの化合物の幾つかの特に好適な態様は、以下の表１に説明する化合物ＩＩ−１、ＩＩ−２、ＩＩ−３、ＩＩ−４ａ、ＩＩ−４ｂ、ＩＩ−５、ＩＩ−６、ＩＩ−７ａ、ＩＩ−７ｂ、ＩＩ−８、ＩＩ−９、ＩＩ−１０、ＩＩ−１１およびＩＩ−１２である。
【００７７】
式ＩＩにより表される化合物は、今後化合物（ＩＩ）と称する。
【００７８】
本明細書で使用する用語「炭素環式」とは、環の部分が炭素原子のみにより構成されている環式基を称する。用語「ヘテロシクロ」および「複素環式」とは、環の部分がＯ、ＮまたはＳのような少なくとも１つのヘテロ原子を含む環式基を称する。
【００７９】
本明細書で使用する用語「アルキル」は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソアミル、ネオペンチル、１−エチルプロピル、ヘキシル、オクチル、シクロプロピルおよびシクロペンチルのような１〜８個の炭素原子を有する直鎖、環式または分枝アルキル基を意味する。アルコキシ、アルコキシカルボニルおよびアルキルアミノカルボニル基のようなアルキルを含有する基のアルキル部分は、上記に定義したアルキルと同じ意味を有する。好適である低級アルキル基は、１〜４個の炭素を含む上記定義のアルキル基である。用語「アルケニル」は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する直鎖もしくは分枝炭化水素鎖を含むことを意図する。アルケニル基の例には、エテニルおよびプロペニル基を含む。本明細書で使用する用語「アルキニル」は、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する直鎖もしくは分枝炭化水素鎖を含むことを意図する。アルキニル基の例には、エチニルおよびプロピニル基を含む。
【００８０】
アシルオキシ基のようなアシルを含有する基のアシル部分は、ホルミル、アセチル、プロパノイル、ブチリル、バレリル、ピバロイルまたはヘキサノイルのような１〜６個の炭素原子を有する直鎖または分枝アルカノイル基を含むものとする。
【００８１】
本明細書で使用する用語「アリール」は、フェニル、ビフェニルおよびナフチルのような６〜１２個の炭素原子を有する基を意味する。好適なアリール基には非置換または置換フェニルおよびナフチル基を含む。本明細書で使用する用語「ヘテロアリール」は、環の１以上の炭素原子がＯ、ＮまたはＳのようなヘテロ（すなわち非炭素）原子により置き換えられているアリール基を表す。好適なヘテロアリール基には、ピリジル、ピリミジル、ピロリル、フリル、チエニル、イミダゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、キノリル、イソキノリル、ベンゾイミダゾリル、チアゾリル、ピラゾリルおよびベンゾチアゾリル基を含む。
【００８２】
用語「アラルキル」（または「アリールアルキル」）は、アリール基を持つアルキル基から成る７〜１５個の炭素を有する基を表すことを意図する。アラルキル基の例には、ベンジル、フェネチル、ベンズヒドリルおよびナフチルメチル基を含む。
【００８３】
アラルキル、アルコキシ、アリールアルコキシ、ヒドロキシアルコキシ、アルコキシ−アルコキシ、ヒドロキシ−アルキルチオ、アルコキシ−アルキルチオ、アルキルカルボニルオキシ、ヒドロキシアルキルおよびアシルオキシ基のような置換基内に含まれるアルキル基およびアルキル部分は、置換または非置換でよい。置換アルキル基は１〜３個の独立して選択される置換基、好ましくはヒドロキシ、低級アルコキシ、低級アルコキシ−アルコキシ、置換もしくは非置換アリールアルコキシ−低級アルコキシ、置換もしくは非置換ヘテロアリールアルコキシ−低級アルコキシ、置換もしくは非置換アリールアルコキシ、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルコキシ、ハロゲン、カルボキシル、低級アルコキシカルボニル、ニトロ、アミノ、モノ−もしくはジ−低級アルキルアミノ、ジオキソラン、ジオキサン、ジチオラン、ジチオン、フラン、ラクトンまたはラクタムを有する。
【００８４】
置換アリール、置換ヘテロアリールおよび置換アラルキル基は各々、好ましくは低級アルキル、ヒドロキシ、低級アルコキシ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、ニトロ、アミノ、モノ−またはジ−低級アルキルアミノおよびハロゲンである１〜３個の独立して選択される置換基を有する。
【００８５】
窒素原子を用いて形成される複素環式基には、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペリジノ、モルホリニル、モルホリノ、チオモルホリノ、Ｎ−メチルピペラジニル、インドリル、イソインドリル、イミダゾール、イミダゾリン、オキサゾリン、オキサゾール、トリアゾール、チアゾリン、チアゾール、ピラゾール、ピラゾロンおよびトリアゾール基を含む。酸素原子を用いて形成される複素環式基には、フラン、テトラヒドロフラン、ピランおよびテトラヒドロピラン基を含む。
【００８６】
「ヒドロキシアルキル」基は、それらに結合したヒドロキシル基を有するアルキル基である。
【００８７】
ハロゲンにはフッ素、塩素、臭素およびヨウ素を含む。
【００８８】
本明細書で使用する用語「ヘテロアリールアルキル」は、ヘテロ原子を含むアリールアルキル基を意味する。用語「オキシ」は、酸素原子の存在を表す。すなわち、「アルコキシ」基は酸素原子を通して結合しているアルキル基であり、そして「カルボニルオキシ」基は、酸素原子を通して結合しているカルボニル基である。
【００８９】
用語「ヘテロシクロアルコキシ」とは、それらのアルキル部分に結合したヘテロシクロ基を有するアルコキシ基を意味し、そして用語「アリールアルコキシ」はそれらのアルキル部分に結合したアリール基を有するアルコキシ基を意味する。用語「アルキルカルボニルオキシ」は、式−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−アルキルの基を意味する。
【００９０】
本明細書で使用する用語「アルキルオキシ−アルコキシ」は、そのアルキル部分に結合したアルキルオキシ置換基を含むアルコキシ基を表す。用語「アルコキシ−アルキルチオ」とは、そのアルキル部分に結合したアルコキシ置換基を含むアルキルチオ基（すなわち式−Ｓ−アルキルの基）を意味する。用語「ヒドロキシ−アルキルチオ」とは、そのアルキル部分に結合したヒドロキシ置換基を含むアルキルチオ基（すなわち式−Ｓ−アルキルの基）を意味する。
【００９１】
本明細書で使用する用語「単糖」は、その単糖としてその通例の意味を有する。
【００９２】
本明細書で使用する用語「アミノ酸」とは、アミノ基およびカルボキシル基の両方を含む分子を表す。アミノ酸の態様には、α−アミノ酸：すなわち一般式ＨＯＯＣ−ＣＨ（ＮＨ２）−（側鎖）のカルボン酸を含む。
【００９３】
アミノ酸の側鎖には自然に存在する、および自然には存在しない部分を含む。自然には存在しない（すなわち非天然）アミノ酸側鎖は、自然に存在するアミノ酸側鎖の代わりに使用され、例えばアミノ酸同族体中の部分である。例えばＬｅｈｎｉｎｇｅｒ，生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２版、ワース（Ｗｏｒｔｈ）出版社、１９７５、第７３〜７５頁（引用により本明細書に編入する）を参照にされたい。
【００９４】
好適なα−アミノ酸には、Ｄ配置、Ｌ配置、またはラセミ体を有するグリシン、アラニン、プロリン、グルタミン酸およびリシンを含む。
【００９５】
さらに代表的なα−アミノ酸の側鎖を以下の表１に示す。
【００９６】
【表１】
2005503102.tif 000017
【００９７】
幾つかの好適な態様では、式ＩＩの化合物の置換基にはアミノ酸のカルボキシル基のヒドロキシル部分を除去した後のアミノ酸残基、すなわち式−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ（ＮＨ２）−（側鎖）を含む。
【００９８】
式ＩＩの化合物上に存在する官能基は、保護基を含んでよい。例えば式ＩＩの化合物のアミノ酸側鎖置換基は、ベンジルオキシカルボニルまたはｔ−ブトキシカルボニル基のような保護基により置換され得る。保護基自体はヒドロキシル基およびカルボキシル基のような官能基に選択的に結合でき、そして除去することができる化学官能基として知られている。これらの基はそのような官能基を化合物が暴露される化学反応条件に対して不活性とするために化学的化合物中に存在する。任意の種々の保護基を本発明に使用することができる。１つのそのような保護基はベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ；Ｚ）基である。本発明に従い他の好適な保護基は、Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔ．Ｗ．ａｎｄ Ｗｕｔｓ，Ｐ．Ｇ．Ｍ．，「有機合成における保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、第２版、ウィリー ＆ サンズ（Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）、１９９１に見いだすことができる。
【００９９】
架橋化インデノピロロカルバゾール化合物は、研究および治療領域の両方を含むさまざまな状況で用途が見いだされる重要な機能的薬理学活性を現した。これらの誘導体は治療薬として有用である。化合物の活性は栄養因子応答細胞の機能および／または生存に及ぼす正の効果を示す。栄養因子応答細胞、例えば神経系統の細胞の機能および／または生存に及ぼす効果は、以下のアッセイを使用して証明した：（１）培養した脊髄のコリンアセチルトランスフェラーゼ（”ＣｈＡＴ”）アッセイ；または（２）培養した基底前脳ニューロンのＣｈＡＴ活性アッセイ。
【０１００】
本明細書で使用する用語「効果」は用語「機能」および「生存」を修飾するために使用する時、正または負の改変または変化を意味する。正の効果は本明細書では「増大」または「増大する」ことを称し、そして負の効果は本明細書では「阻害」または「阻害する」ことを称する。
【０１０１】
本明細書で使用する用語「増大」または「増大する」は用語「機能」および「生存」を修飾するために使用する時、架橋化インデノピロロカルバゾール化合物の存在が化合物の不存在における細胞と比べて、栄養因子応答細胞の機能および／または生存に対して正の効果を有することを意味する。例えば限定するわけではないが、例えばコリン作用性ニューロンの生存に関して、化合物は化合物が与えられないコリン作用性ニューロン群と比べた時、処置群が非処置群よりも比較的長期間の機能性を有するならば、死の危険性（例えば損傷、疾病状態、変性状態または自然な進行による）にあるコリン作用性ニューロン群の生存の増大を示す。
【０１０２】
本明細書で使用する「阻害」および「阻害する」ことは、指定した材料の特異的応答（例えば酵素活性）が架橋化インデノピロロカルバゾール化合物の存在下で相対的に低下することを意味する。
【０１０３】
本明細書で使用する用語「ｔｒｋ」は、現在ｔｒｋＡ、ｔｒｋＢおよびｔｒｋＣおよびニューロトロフィンが結合できる他の膜結合タンパク質から成る高親和性ニューロトロフィンレセプターのファミリーを称する。
【０１０４】
本明細書で使用するＶＥＧＦＲの阻害は、充実性腫瘍のガン、子宮内膜症、糖尿病網膜症、乾癬、血管芽腫ならびに他の目の疾患およびガンのような例えば血管新生が重要な役割を果たす疾患における用途を意味する。
【０１０５】
ｔｒｋの阻害は例えば、前立腺ガンおよび良性の前立腺過形成のような疾患、および炎症痛の処置における用途を意味する。
【０１０６】
血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）の阻害は、例えば種々の形態の新形成、慢性関節リュウマチ、肺線維症、骨髄線維症、異常な創傷治癒、アテローム硬化症、再狭窄、新脈管形成術後の再狭窄のような心血管末端を含む疾患における用途を意味する。
【０１０７】
本明細書で使用する用語「ガン」および「ガン性」とは、哺乳動物の細胞の任意の悪性増殖を称する。例には前立腺、良性前立腺過形成、卵巣、胸部、脳、肺、膵臓、結腸直腸、胃腸、胃部、充実性腫瘍、頭および首、神経芽腫、網膜細胞癌腫、リンパ腫、白血病、他の認識されている造血系の悪性化、および他の認識されているガンを含む。
【０１０８】
本明細書で使用する用語「ニューロン」、「神経系列の細胞」および「神経細胞」には限定するわけではないが、１つのまたは多くの伝達物質および／または１つのまたは多数の機能を有するニューロン型の異質な群を含み；好ましくはこれらはコリン作用性（ｃｈｏｌｉｇｅｎｉｃ）および感覚ニューロンである。本明細書で使用する句「コリン作用性ニューロン」は、神経伝達物質がアセチルコリンである中枢神経系（ＣＮＳ）および末梢神経系（ＰＮＳ）のニューロンを意味する；例は基底前脳および脊髄ニューロンである。本明細書で使用する句「感覚ニューロン」には、例えば皮膚、筋肉および関節からの環境的合図（ｃｕｅ）（例えば温度、運動）に応答するニューロンを含む；例は脊髄神経節に由来するニューロンである。
【０１０９】
本明細書で定義する「栄養因子−応答細胞」は、栄養因子が特異的に結合することができる受容体を含む細胞である：例はニューロン（例えばコリン作用性および感覚ニューロン）および非−神経細胞（例えば単球および新形成細胞）を含む。
【０１１０】
本明細書に記載する架橋化インデノピロロカルバゾール化合物は、研究および治療的状況の両方で例えば酵素活性の阻害に用途が見いだされる。例えば研究的環境では、化合物はセリン／トレオニンまたはチロシンプロテインキナーゼ（例えばＰＫＣ、ｔｒｋチロシンキナーゼ）の阻害が、関係する障害および疾患の作用機作的観点に果たす役割の理解をさらに増大するアッセイおよびモデルの開発に使用することができる。治療的状況では、酵素活性を阻害する化合物を使用してガンのような障害に関してこれらの酵素の有害な結果を阻害することができる。
【０１１１】
以下の例で示すように、架橋化インデノピロロカルバゾール化合物を使用した酵素活性の阻害は、例えば以下のアッセイを使用して決定することができる：
１．ｔｒｋＡチロシンキナーゼ活性阻害アッセイ；
２．全細胞調製物におけるＮＧＦ−刺激ｔｒｋリン酸化の阻害
３．血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）キナーゼ阻害アッセイ；
４．ＰＫＣ活性阻害アッセイ；
５．ＰＤＧＦＲ阻害アッセイ；
開示した架橋化インデノピロロカルバゾール化合物は哺乳動物、例えばヒトの神経系列の細胞の機能および／または生存を増大するために使用することができる。これらの内容において、化合物は個別にまたは他の縮合ピロロカルバゾールおよび／またはインドロカルバゾールと共に、あるいは指定した細胞の機能および／または生存に効果を及ぼす能力を示す他の有益な分子と組み合わせて使用できる。
【０１１２】
種々の神経的障害は、死にかけている、損傷した、機能的に抑制された（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ）、軸索変性を受けている、死の危機にある等の神経細胞を特徴とする。これらの障害には限定するわけではないが：アルツハイマー病；運動ニューロン障害（例えば筋萎縮性側索硬化症）；パーキンソン病；大脳血管障害（例えば発作、虚血）；ハンチントン病；ＡＩＤＳ痴呆；癲癇；多発性硬化症；末梢ニュロパシー（例えば化学療法に伴う末梢ニューロパシーにおいてＤＲＧニューロンに影響を及ぼすもの）、糖尿病ニューロパシーおよびＡＩＤＳ末梢ニューロパシー；興奮性アミノ酸により誘導される障害；および脳または脊髄の振盪的または貫通的損傷に伴う障害を含む。
【０１１３】
ＣｈＡＴは神経伝達物質であるアセチルコリンの合成を触媒し、そして機能的コリン作用性ニューロンの酵素的マーカーであると考えられている。機能的ニューロンは生存することもできる。ニューロンの生存は生きているニューロンによる色素（例えばカルセインＡＭ）の取り込みおよび酵素的転換の定量によりアッセイされる。
【０１１４】
それらの価値ある用途により、本明細書に記載する方法により同定される化合物を含む本明細書に記載する化合物は、さまざまな状況に用途が見いだせる。化合物は神経細胞の生存、機能、同定のインビトロモデルの開発に、あるいは本明細書に記載する化合物に類似する活性を有する他の合成化合物または本明細書に記載する方法により同定される化合物のスクリーニングのために使用することができる。本明細書に記載する化合物ならびに本明細書に記載する方法を使用して同定される化合物は、機能的応答に関連する分子標的を調査し、定義し、そして決定するための研究的環境に用途を有することができる。例えば架橋化インデノピロロカルバゾール化合物、または特異的な細胞的機能（例えば有糸分裂生起）に関連する本明細書に記載の方法により同定される化合物を放射性標識することにより、誘導体が結合する標的物体を同定し、単離し、そして特性決定のために精製することができる。
【０１１５】
本明細書に記載する化合物、ならびに本明細書に記載の方法を使用して同定される化合物は、とりわけ栄養的応答性細胞、例えばコリン作用性ニューロンの栄養因子が誘導する活性を増大するだけでなく、他の神経細胞型（例えばドパミン作用性またはグルタミン酸作用性）のための生存促進作用物質としても有用である。増殖因子は、限定するわけではないがｒａｓ、ｒａｃおよびｃｄｃ４２（Ｄｅｎｈａｒｄｔ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１９９６，３１８，７２９）を含む小さいＧＴＰ結合タンパク質の下流のシグナル伝達カスケードによりニューロンの生存を制御することができる。具体的にはｒａｓの活性化は細胞外受容体−活性化キナーゼ（ＥＲＫ）のリン酸化および活性化を導き、これが生物学的成長および分化プロセスと関連した。ｒａｃ／ｃｄｃ４２の刺激はＪＮＫおよびｐ３８の活性化、ストレス、アポトーシスおよび炎症に関連する応答の上昇をもたらした。増殖因子応答は主にＥＲＫ経路を介するが、これら後者のプロセスに影響することは、生存特性を増大する増殖因子を模することができるニューロン生存の別のメカニズムを導くことができる（Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，２７０，１３２６）。化合物は増殖因子が媒介する生存に関連するがそれとは異なるメカニズムにより（アポトーシスによる細胞死プロセスの阻害により生存を導くことができる例えばＪＮＫおよびｐ３８経路の阻害）、ニューロンおよび非神経細胞の生存促進剤としても機能し得る。
【０１１６】
本発明の化合物は低下したＣｈＡＴ活性または死、脊髄運動ニューロンに対する損傷に関連する疾患の処置に有用であり、そしてまた例えば中枢神経系または末梢神経系、免疫系のアポトーシスによる細胞死に伴う疾患および炎症疾患に用途を有する。
【０１１７】
本明細書に記載する化合物は、多くのガンのような悪性の細胞増殖に関与する疾患状態の処置にも用途が見いだされる。
【０１１８】
本明細書に記載する化合物ならびに本方法により同定される化合物の医薬的に許容される塩には、医薬的に許容される酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、およびアミノ酸付加塩を含む。酸付加塩の例は、塩酸塩、硫酸塩およびリン酸塩のような無機酸付加塩、ならびに酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩および乳酸塩のような有機酸付加塩である；金属塩の例は、リチウム塩、ナトリウム塩およびカリウム塩のようなアルカリ金属塩、マグネシウム塩およびカルシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩および亜鉛塩である；アンモニウム塩の例は、アンモニウム塩およびテトラメチルアンモニウム塩である；有機アミン付加塩の例は、モルホリンおよびピペリジンとの塩である；そしてアミノ酸付加塩の例は、グリシン、フェニルアラニン、グルタミン酸およびリシンとの塩である。
【０１１９】
本方法により同定される化合物を含む本明細書で提供する化合物は、医薬的に許容される非毒性の賦形剤およびキャリアーとの混合により医薬組成物に製剤することができる。そのような組成物は非経口投与、特に液体溶液または懸濁液の状態；あるいは経口投与、特に錠剤またはカプセルの状態；あるいは鼻内投与、特に粉末、点鼻またはエアゾールの状態；あるいは例えば経皮パッチを介して皮膚に投与する状態で使用するために調製することができる。
【０１２０】
組成物は単位剤形で都合よく投与することができ、そして例えばレミングトンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）（マック（Ｍａｃｋ）出版社、イーストン、ペンシルバニア州、１９８０）に記載されているように、製薬分野で周知な任意の方法により調製することができる。非経口投与用の製剤は、通例の賦形剤として、滅菌水または塩溶液、ポリエチレングリコールのようなポリアルキルレングリコール、油および植物起源の物質、水素化ナフタレン等を含むことができる。特に生物適合性の生分解性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコライドコポリマー、またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーは活性化合物の放出を制御するために有用な賦形剤となり得る。これらの活性化合物に特に有用な非経口送達系は、エチレン−ビニルアセテートコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、移植可能な注入システムおよびリポソームを含む。吸入投与のための製剤は、賦形剤として例えばラクトースを含むか、または例えばポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリココーレートおよびデオキシコーレートを含有する水溶液、あるいは点鼻薬の状態で投与する油性溶液、または鼻内に適用するゲルでよい。非経口投与用の製剤はバッカル投与用のグリココーレート、直腸投与用のサリチレート、または膣内投与のためのクエン酸を含むこともできる。経皮パッチ用の製剤は、好ましくは親油性乳液である。
【０１２１】
本発明の化合物は単一の活性剤として医薬組成物中に使用することができる。あるいはそれらは他の有効成分、例えば疾患または障害におけるニューロンの生存または軸索の再生を助長する他の増殖因子と組み合わせて使用することができる。
【０１２２】
本発明の化合物およびそれらの医薬的に許容される塩は、経口的または非経口的（例えば軟膏または注射）に投与することができる。治療用組成物中の本発明の化合物濃度は変動することができる。濃度は投与する薬剤の全投薬用量、使用する化合物の化学的特性（例えば疎水性）、投与経路、患者の年齢、体重および症状等のような因子に依存するだろう。本発明の化合物は、非経口投与のためには典型的には約０．１〜１０重量／容量％の化合物を含む水性の生理緩衝溶液で提供される。典型的な用量範囲は１日あたり約１μｇ／ｋｇ〜約１ｇ／ｋｇ体重であり；好適な用量範囲は１日あたり約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重であり、そして好ましくは１日に１〜４回、約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇである。投与する薬剤の好適な投薬範囲も、疾患または障害の種類および進行度、特定患者の全体的な健康状態、選択した化合物の相対的な生物学的効力、および化合物賦形剤の組成、およびその投与経路のような変数に依存するだろう。
【０１２３】
試験化合物および本発明の方法により同定される化合物を含む本発明の化合物、およびそれらの医薬的に許容される塩は薬理学的活性および投与目的に従い、単独で、または種々の医薬的組成物の状態で投与することができる。本発明による医薬組成物は、有効成分として効果的な量の化合物またはそれらの医薬的に許容される塩を医薬的に許容されるキャリアーと均一に混合することにより調製することができる。キャリアーは投与に適当な組成物の形態に従い、広い範囲の形態をとることができる。そのような医薬的組成物は経口または非経口投与に適する単位剤形に調製することが望ましい。非経口投与のための形態には軟膏および注射を含む。
【０１２４】
錠剤は、ラクトース、グルコース、シュクロース、マンニトールおよびメチルセルロースのような賦形剤、澱粉、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウムおよび結晶質セルロースのような崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムおよびタルクのような潤滑剤、ゼラチン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ビトロキシプロピルセルロースおよびメチルセルロースのような結合剤、シュクロース脂肪酸エステルおよびソルビトール脂肪酸エステルのような表面活性剤等を使用して従来の様式で調製することができる。各錠剤は１５〜３００ｍｇの有効成分を含むことが好ましい。
【０１２５】
粒剤は、ラクトースおよびシュクロースのような賦形剤、澱粉のような崩壊剤、ゼラチンのような結合剤等を使用して従来の様式で調製することができる。粉剤はラクトースおよびマンニトールのような賦形剤等を使用して従来の様式で調製することができる。カプセルはゼラチン、水、シュクロース、アラビアゴム、ソルビトール、グリセリン、結晶質セルロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク等を使用して従来の様式で調製することができる。各カプセルは１５〜３００ｍｇの有効成分を含むことが好ましい。
【０１２６】
シロップ調製物はシュクロースのような糖、水、エタノール等を使用して従来の様式で調製することができる。
【０１２７】
軟膏は、ワセリン、液体パラフィン、ラノリンおよびマクロゴールのような軟膏基材、ラルリル乳酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、ソルビタンモノ−脂肪酸エステル、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよびアラビアゴム等のような乳化剤を使用して従来の様式で調製することができる。
【０１２８】
注入可能な調製物は、水、生理食塩水、植物油（例えばオリーブ油およびピーナッツ油）、オレイン酸エチルおよびプロピレングリコールのような溶媒、安息香酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウムおよびウレタンのような安定化剤、塩化ナトリウムおよびグルコースのような等張剤、フェノール、クレゾール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルおよびクロロブタノールのような保存剤、アスコルビン酸およびピロ亜硫酸ナトリウム等のような酸化防止剤を使用して従来の様式で調製することができる。
【０１２９】
本発明をさらに以下の本発明を解説する実施例により具体的に説明する。これらの実施例は本開示の範囲を限定するとは意図せず、そして解釈もしない。
【０１３０】
【実施例】
実施例１．合成法および例の一般的説明
式ＩＩを有する本発明の架橋化インデノピロロカルバゾールを調製するために使用する一般的な合成経路は、図１および２に示す。インデノピロロカルバゾール（ＩＩＩ）／（ＶＩＩＩ）の合成に関する一般的手順は、米国特許第５，７０５，５１１号明細書に記載されているように行うことができ、その開示は全部、引用により本明細書に編入する。Ｒ１がＨである時、インデノピロロカルバゾール（ＩＩＩ）／（ＶＩＩＩ）のラクタム窒素は、（ＩＶ）／（ＩＸ）を導く適切な保護基で保護される。保護した化合物は無水有機溶媒（１つまたは複数）中の適切な塩基で処理し、これはカルボアニオンと考えられる暗赤色の溶液を生じる。カルボアニオンと二官能性試薬（Ｖ）との反応により、（Ｖ）のＣ＝Ｙ結合に求電子付加を生じ、最初の中間体（ＶＩ）／（Ｘ）を導く。中間体（１つまたは複数）（ＶＩ）／（Ｘ）および／または（ＶＩＩ）／（ＸＩ）のスルホン酸もしくはルイス酸（例えば三弗化硼素エーテル錯化合物）のいずれかを用いた処置で架橋化インデノピロロカルバゾール（Ｉ）／（ＩＩ）を与える。
【０１３１】
ラクタムの窒素保護法（図３および４を参照にされたい）は、酸または塩基−触媒化法のいずれかで行うことができる。酸−触媒化反応は、インデノピロロカルバゾール（ＩＩＩ）／（ＶＩＩＩ）をポリスチレン−ビーズ化、Ｒｉｎｋ酸樹脂（ＸＩＩ）（図３）のような重合性支持体に固定化させることができる樹脂に結合した試薬を用いて行うことができ、（ＸＩＩＩ）を与える。あるいは酸−触媒化反応は可溶性試薬を用いて行い、化合物（ＸＩＶ）を与えることができる（図４）。シリル−保護化合物（ＸＶ）は塩基触媒反応下で生成される（図４）。
【０１３２】
図５は中間体（Ｖ）を調製するための幾つかの方法を記載する。手順（ａ）は種々のアセタール（ＸＶＩ）の（ＸＶＩＩ、Ｚ＝結合）への変換を記載する。例えばエステル−アセタール／ケタール（ＸＶＩ、Ｄ＝ＣＯＯＲ）は対応するアルコールに完全に還元され、そして続いてアルデヒド−アセタール／ケタール（ＸＶＩＩ、Ｒ８＝Ｈ）に酸化される（例えばＳｗｅｒｎまたはＤｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎ酸化）。あるいはエステル−アセタール／ケタール（ＸＶＩ、Ｄ＝ＣＯＯＲ）はＤＩＢＡＬを用いて部分的に還元されて直接アルデヒド（ＸＶＩＩ、Ｒ８＝Ｈ）を与える。同様にニトリル−アセタール（ＸＶＩ、Ｄ＝ＣＮ）のＤＩＢＡＬを用いた還元によりアルデヒド（ＸＶＩＩ、Ｒ８＝Ｈ）を与える。ケト−アセタール／ケタールは、グリニャール試薬をＷｅｉｎｒｅｂ アミド−アセタール／ケタール（ＸＶＩ、Ｄ＝ＣＯＮ（ＯＭｅ）Ｍｅ）に付加することにより調製される。
【０１３３】
中間体（ＸＶＩＩ、Ｚ＝結合）も、手順（ｂ）で概説する２段階法により得ることができる。有機金属性試薬（ＸＩＸ）のアセタール／ケタールへの付加により、アルケン（ＸＸ）を与え、これはオゾン分解、続いて還元的後処理によりケト−アセタール／ケタール（ＸＶＩＩ）を与える。２段階法による中間体（ＸＶＩＩ、Ｚ＝ヘテロ原子）の調製は、手順（ｃ）により概説される。アセタール（ＸＸＩＩ）をアルケン（ＸＸＩ）にカップリングし、続いて生じたアルケンをオゾン分解すると（還元的後処理で）、ケト−アセタール／ケタール（ＸＶＩＩ）を与える。あるいは中間体（ＸＶＩＩ、Ｚ＝ヘテロ原子）は、手順（ｄ）に概略する２段階法により調製される。化合物（ＸＸＩＶ）とアセタール／ケタール（ＸＶＩＩＩ）との反応により（ＸＸＶ）を与え、これは手順（ａ）に記載する方法によりケト−アセタール／ケタール（ＸＶＩＩ）に変換される。ケト−アセタール／ケタール（ＸＶＩＩ）のヒドロキシルアミン、ヒドラジン、Ｎ−アルキル−Ｎ−アルコキシアミンおよびアミンを用いた縮合により、求電子的Ｃ＝Ｎ官能性を持つ中間体（ＸＸＶＩ）を与える。
【０１３４】
樹脂に結合したインデノピロロカルバゾール（ＸＩＩＩ）（図６、方法Ａ）は、塩基として過剰なグリニャール試薬を用いて処理し、これによりカルボアニオンの暗赤色溶液を生成する。続いて（Ｖ）を用いた反応によりＣ＝Ｙ基への求電子付加から誘導される生成物を導く。水性後処理および希釈した酸（塩化メチレン中の１％ＴＦＡ）による樹脂からの生成物（１つまたは複数）の開裂で、化合物（１つまたは複数）（ＸＸＶＩＩ）および／または（ＸＸＶＩＩＩ）の単離をもたらす。スルホン酸またはルイス酸（例えば三弗化硼素エーテル錯化物）のいずれかを用いて中間体（ＸＸＶＩＩ）および／または（ＸＸＶＩＩＩ）を処理すると、架橋化インデノピロロカルバゾール（ＩＩ）を与える。
【０１３５】
可溶性ラクタム保護中間体、例えば（ＸＶ）の反応には同様な方法を使用する（図７、方法Ｂ）。しかしこの場合中間体（ＸＶ）は、グリニャール試薬の代わりに塩基としてピリジン中のＴｒｉｔｏｎ Ｂを用いて処理する。中間体（１つまたは複数）（ＸＸＩＸ）および／または（ＸＸＸ）は、クロマトグラフィー的精製に影響を受けやすいラクタム保護基を完全なままで単離することができる。方法Ａにおけるように（図６）、ルイス酸（例えば三弗化硼素エーテル錯化物）を用いた処理により、架橋化インデノピロロカルバゾール（ＩＩ）（ここでＲ１＝Ｈ）を提供する。
【０１３６】
基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６の導入は、米国特許第５，７０５，５１１号および同第４，９２３，９８６号明細書（これらは全部、引用により本明細書に編入する）に記載されているように行うことができる。あるいはＲ３置換基は図８に示すように、架橋化インデノピロロカルバゾールの構築後に導入することができる。Ｂ環の３位はＮＢＳにより臭素化され化合物（ＸＸＸＩ）を与える。炭素フラグメントは続いてパラジウム−触媒化Ｓｔｉｌｌｅ、Ｓｕｚｕｋｉ、Ｈｅｃｋ、ＫｕｍａｄａまたはＣａｓｔｒｏ−Ｓｔｅｐｈｅｎｓ反応を使用することにより導入されて、型（ＸＸＸＩＩ）、（ＸＸＸＩＩＩ）等の化合物を提供する。さらに化合物（ＸＸＸＩ）は、臭素基がヘテロ原子に置き換えられた化合物への取り組みを提供することができる（例えばＢｕｃｈｗａｌｄのパラジウム触媒化アミノ化化学を利用することによるアミンに基づく基）。
【０１３７】
酸化的方法により、酸素連結基を図９に示すようにＥ環のインデン炭素に導入することができる、化合物（ＸＸＸＩＶ）。この化学はまた、ラクタム（Ａ環）のメチレン基の酸化をもたらし、示すようなイミド誘導体を提供する。
実施例２：Ｒｉｎｋ樹脂に結合した中間体：（ＸＩＩＩ−Ａ）、（ＸＩＩＩ−Ｂ）および
（ＸＩＩＩ−Ｃ）の調製、（図３）
実施例２−Ａ
頭頂の機械的スターラーおよびＤｅａｎ−Ｓｔａｒｋトラップを備えた３首丸底フラスコに、Ｒｉｎｋ酸樹脂ＸＩＩ（１０．００ｇ、０．６４ミリモル／ｇ）、１−メチル−２−ピロリジノン（８０ｍＬ）、ベンゼン（３５０ｍＬ）、ＶＩＩＩ−Ａ（Ａ１、Ａ２＝Ｈ２、Ｂ１、Ｂ２＝Ｏ、Ｒ３＝Ｒ４＝Ｒ５＝Ｒ６＝Ｈ）（３．００ｇ）およびｐ−トルエンスルホン酸（１．００ｇ）を連続的に付加した。反応混合物を２０時間、還流して暖め、そして次に濾過した。樹脂をＴＨＦ（５×１７５ｍＬ）で洗浄し、そして濾液を取っておいた。次いで樹脂をＤＭＳＯ（４×１００ｍＬ）、２％水性ＮａＨＣＯ３（４×１００ｍＬ）、水（４×１００ｍＬ）、ＤＭＳＯ（２×２００ｍＬ）、ＴＨＦ（４×１００ｍＬ）、そして酢酸エチル（４×１００ｍＬ）で連続して洗浄した。樹脂を真空下で乾燥させて（２４時間）、１１．７０（０．４７ミリモル／ｇ）の樹脂に結合したＶＩＩＩ−Ａ、（ＸＩＩＩ−Ａ）を得た。
【０１３８】
元のＴＨＦ洗浄液を蒸発させ、残渣を水（７５０ｍＬ）で希釈し、そして生成した沈殿物を濾過し、そして水、２％水性ＮａＨＣＯ３（４×１００ｍＬ）、そして水（４×１００ｍＬ）で連続して洗浄した。真空下で乾燥させた後、ＶＩＩＩ−Ａ（１．２８ｇ）を回収した。
実施例２−Ｂ
同様な様式で、ＶＩＩＩ−Ｂ（Ａ１、Ａ２＝Ｏ、Ｂ１、Ｂ２＝Ｈ２、Ｒ３＝Ｒ４＝Ｒ５＝Ｒ６＝Ｈ）、（０．５ｇ）をＲｉｎｋ酸樹脂ＸＩＩ（１．５２ｇ）にカップリングして１．５８ｇの樹脂に結合したＶＩＩＩ−Ｂ（ＸＩＩＩ−Ｂ）を得た。
実施例２−Ｃ
同様な様式で、ＶＩＩＩ−Ｃ（Ａ１、Ａ２＝Ｈ２、Ｂ１、Ｂ２＝Ｏ、Ｒ３＝Ｒ４＝Ｒ５＝Ｈ、Ｒ６＝１０−ＯＭｅ）、（１．０２ｇ）をＲｉｎｋ酸樹脂ＸＩＩ（１．５２ｇ）にカップリングして３．７０ｇ（０．４６ミリモル／ｇ）の樹脂に結合したＶＩＩＩ−Ｃ（ＸＩＩＩ−Ｃ）を回収した化合物ＶＩＩＩ−Ｃ（０．４４ｇ）と共に得た。
実施例３：化合物（ＩＩ−１）、化合物（ＩＩ−２）、化合物（ＩＩ−３）、化合物（ＩＩ−４ａ）、化合物（ＩＩ−４ｂ）、化合物（ＩＩ−６）および化合物（ＩＩ−８）の調製（方法Ａ、図６）
実施例３−Ａ
（ＸＩＩＩ−Ａ）（１．２５ｇ）懸濁液（ＴＨＦ：２４ｍＬ）中に、１．０ＭのＥｔＭｇＢｒ（ＴＨＦ中の６．２５ｍＬ）を加え、そして反応物を１時間撹拌した後、ＨＭＰＡ（５．０ｍＬ）を加えた。１０分間撹拌した後、ジエトキシブチルアルデヒド（３．０ｇ）（これはＰａｑｕｅｔｔｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９７，１１９，９６６２−７１の文献手法に従い調製した）を加え、そして反応物を２０時間撹拌した。反応を１０％水性ＮＨ４Ｃｌ（５ｍＬ）で停止し、そして濾過した。樹脂は１０％水性ＮＨ４Ｃｌ（３×１０ｍＬ）、水（３×１０ｍＬ）、ＴＨＦ（３×１０ｍＬ）、ＤＭＦ（３×１０ｍＬ）、水（３×１０ｍＬ）、ＴＨＦ（３×１０ｍＬ）、そしてエーテル（３×１０ｍＬ）で連続して洗浄した。樹脂を真空下で乾燥させ、塩化メチレン（１５ｍＬ）に溶解し、そしてトリフルオロ酢酸（０．１５ｍＬ）で処理した。１時間撹拌した後、反応物を濾過し、そして濾液を蒸発させた。生成した残渣を塩化メチレン（２０ｍＬ）に溶解し、そしてピリジニウムトシラート（５０ｍｇ）で処理し、そして生成した溶液を４時間撹拌した。この時点で反応物を飽和水性ＮａＨＣＯ３そしてブラインで洗浄し、そしてＭｇＳＯ４上で乾燥させた。
【０１３９】
濾過そして溶媒を蒸発させた後、残渣を調製用ＨＰＬＣ（Ｚｏｒｂａｘ ＲＸ−８、４×２５ｃｍ、６０％ＭｅＣＮ／水 ｗ／０．１％トリフルオロ酢酸で溶出）で精製した。適当な画分をＮａＨＣＯ３で中和し、そして塩化メチレン（３×５０ｍＬ）に抽出し、そしてＭｇＳＯ４上で乾燥させた。濾過そして溶媒を蒸発させた後、７０．２ｍｇの化合物ＩＩ−１を白色粉末として得、これは以下の特性を有した：１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１７１．８， １４３．３， １４２．４， １４１．４，１４０．１，１４０．０，１３６．６， １２９．２， １２７．９， １２７．４， １２７．１， １２６．８， １２４．１（２Ｃ）， １２２．７， １２１．６， １２１．５， １１８．３， １１２．１， ８８．１， ７９．２， ５６．６， ４５．６， ３３．４， ２４．８；１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）ｄ ９．２１（ｄ，Ｊ＝７．５，１Ｈ），８．６２（ｓ，１Ｈ），７．９８（ｄ，Ｊ＝７．７，１Ｈ），７．８６（ｄ，Ｊ＝８．３，１Ｈ），７．７１（ｄ，Ｊ＝７．３，１Ｈ），７．４９（ｄｄ，Ｊ＝７．９，７．４，１Ｈ），７．４１（ｄｄ，Ｊ＝７．５，７．４，１Ｈ），７．３６−７．２７（ｍ，２Ｈ），６．８６（ｄ，Ｊ＝６．０，１Ｈ），５．６３−５．５８（ｍ，１Ｈ），４．９１（ｓ，２Ｈ），４．５３（ｄ，Ｊ＝３．３，１Ｈ），２．２３−２．１４（ｍ，１Ｈ），１．９６−１．９２（ｍ，１Ｈ），０．９６−０．８８（ｍ，１Ｈ），０．６０−０．５７（ｍ，１Ｈ）；ＭＳ ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）計算値 ３７９， 測定値 ３７９。
【０１４０】
またこの反応生成物の混合物の調製用ＨＰＬＣにより単離されたのは、化合物ＩＩ−２（０．５ｍｇ）であり、これは以下の特性を有した：１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．１７（ｄ，Ｊ＝８．１，１Ｈ），８．６２（ｓ，１Ｈ），７．９８（ｄ，Ｊ＝７．０，１Ｈ），７．８５（ｄ，Ｊ＝６．８，１Ｈ），７．５７（ｄ，Ｊ＝６．８，１Ｈ），７．４９（ｄｄ，Ｊ＝７．９，７．４，１Ｈ），７．４４−７．２６（ｍ，３Ｈ），６．８１（ｄ，Ｊ＝６．０，１Ｈ），５．４３−５．３３（ｍ，１Ｈ），４．４３（ｓ，２Ｈ），２．２３−２．１４（ｍ，１Ｈ），１．９６−１．９２（ｍ，１Ｈ），１．４５−１．５５（ｍ，２Ｈ），０．９６−０．８８（ｍ，１Ｈ），０．６０−０．５７（ｍ，１Ｈ），０．２９（ｔ，Ｊ＝７．０，３Ｈ）；（ＭＳ ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）計算値 ４０７， 測定値 ４０７。
実施例３−Ｂ
化合物ＩＩ−１について上に記載した様式と同様に、樹脂（ＸＩＩＩ−Ａ）（７０．３ｍｇ）を１，１−ジエトキシ−２−ペンタノン（０．７５ｍＬ）（これはＳｗｏｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９８８，５３，４８９４−６の文献手法に従い製造した）で処理して化合物ＩＩ−３（３．５ｍｇ）を得、これは調製用ＴＬＣ（シリカゲル、５０％ＥｔＯＡｃ／トルエンで溶出）により単離し、そして以下の特性を有した：１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．４２（ｄ，Ｊ＝８．２，１Ｈ），８．５８（ｓ，１Ｈ），７．９５（ｄ，Ｊ＝７．４，１Ｈ），７．７９（ｄ，Ｊ＝８．３，１Ｈ），７．７１（ｄ，Ｊ＝７．１），７．５０−７．２０（ｍ，４Ｈ），６．８１（ｄ，Ｊ＝５．９，１Ｈ），４．９０（ｓ，２Ｈ），４．４６（ｓ，１Ｈ），２．３５−２．２０（ｍ，１Ｈ），１．９８（ｓ，３Ｈ），１．７５−１．６０（ｍ，１Ｈ），１．２５−１．００（ｍ，１Ｈ），０．３５−０．１５（ｍ，１Ｈ）；ＭＳ ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）計算値 ３９３， 測定値 ３９３。
実施例３−Ｃ
同様な様式で、（ＸＩＩＩ−Ａ）（７４．３ｍｇ）を１，１−ジエトキシ−２−ヘキサノン（これはＢｒｅｎｎｅｒ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９６１，２６，２２−７の文献手法に従い製造した）（０．７５ｍＬ）で処理して化合物ＩＩ−４ａ（２．１０ｍｇ）および化合物ＩＩ４ｂ（１．０６ｍｇ）を得、これらは調製用ＨＰＬＣ（Ｚｏｒｂａｘ ＲＸ−８、４×２５ｃｍ、６５％ＭｅＣＮ／水 ｗ／０．１％トリフルオロ酢酸）により別個に単離した。化合物ＩＩ−４ａは以下の特性を有した：１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．３０（ｄ，Ｊ＝８．３，１Ｈ），８．５５（ｓ，１Ｈ），７．９７（ｄ，Ｊ＝７．２，１Ｈ），７．６５（ｄ，Ｊ＝８．５，１Ｈ），７．５９（ｄ，Ｊ＝７．５），７．４８（ｄｄ，Ｊ＝７．８，７．２，１Ｈ），７．３９−７．１５（ｍ，３Ｈ），６．３１（ｄｄ，Ｊ＝５．９，５．５，１Ｈ），５．０２（ｓ，１Ｈ），４．８８（ｓ，２Ｈ），０．８８（ｓ，３Ｈ），他の脂肪族シグナルは溶媒ピーク下に見失った；ＭＳ ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）計算値 ４０７， 測定値 ４０７。化合物ＩＩ−４ｂは以下の特性を有した。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）ｄ ９．４３（ｄ，Ｊ＝８．１，１Ｈ），８．５９（ｓ，１Ｈ），７．９９（ｄ，Ｊ＝７．３，１Ｈ），７．７５−７．６５（ｍ，２Ｈ），７．４９（ｄｄ，Ｊ＝７．０，６．４，１Ｈ），７．４３（ｄｄ，Ｊ＝８．２，８．１，１Ｈ），７．３６−７．２５（ｍ，２Ｈ），６．７５（ｓ，１Ｈ），４．９１（ｓ，２Ｈ），４．５０（ｓ，１Ｈ），１．９５（ｓ，３Ｈ），他の脂肪族シグナルは溶媒ピーク下に見失った；ＭＳ ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）計算値 ４０７， 測定値 ４０７。
実施例３−Ｄ
同様な様式で、（ＸＩＩＩ−Ｃ）（１．００ｇ）をジエトキシブチルアルデヒド（３．６５ｇ）で処理して化合物ＩＩ−６（８７．８ｍｇ）を得、これは調製用ＨＰＬＣ（Ｚｏｒｂａｘ ＲＸ−８、２．５×２５ｃｍ、６５％ＭｅＣＮ／水 ｗ／０．１％トリフルオロ酢酸）により単離し、そして以下の特性を有した：１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．０９（ｄ，Ｊ＝８．６，１Ｈ），８．６０（ｓ，１Ｈ），７．９５（ｄ，Ｊ＝７．４，１Ｈ），７．８４（ｄ，Ｊ＝８．３，１Ｈ），７．４７（ｄｄ，Ｊ＝７．２，７．０，１Ｈ），７．３５（ｓ，１Ｈ），７．２９（ｄｄ，Ｊ＝７．０，７．０，１Ｈ），６．９８（ｄｄ，Ｊ＝８．６，１．９，１Ｈ），６．８３（ｄ，Ｊ＝６．０，１Ｈ），５．６５−５．５５（ｍ，１Ｈ），４．８８（ｓ，２Ｈ），４．４８（ｄ，Ｊ＝３．９，１Ｈ），３．８２（ｓ，３Ｈ），２．２５−２．１０（ｍ，１Ｈ），２．０８−１．８５（ｍ，１Ｈ），０．９６−０．７５（ｍ，１Ｈ），０．６５−０．５０（ｍ，１Ｈ）；ＭＳ ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｎａ）計算値 ４３１， 測定値 ４３１。
実施例３−Ｅ
同様な様式で、樹脂（ＸＩＩＩ−Ｂ）（１５３．２ｍｇ）をジエトキシブチルアルデヒド（１．５ｍＬ）で処理して化合物ＩＩ−８（３．６ｍｇ）を得、これは調製用ＨＰＬＣ（Ｚｏｒｂａｘ ＲＸ−８、２．５×２５ｃｍ、６５％ＭｅＣＮ／水 ｗ／０．１％トリフルオロ酢酸）により単離し、そして以下の特性を有した：１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．０９（ｄ，Ｊ＝７．９，１Ｈ），８．８１（ｓ，１Ｈ），７．８１−７．７３（ｍ，３Ｈ），７．４８−７．３５（ｍ，３Ｈ），７．２４（ｄｄ，Ｊ＝７．６，７．５，１Ｈ），６．８５（ｄ，Ｊ＝６．２，１Ｈ），５．６３−５．５９（ｍ，１Ｈ），４．８６（ｓ，２Ｈ），４．６１（ｄ，Ｊ＝３．６，１Ｈ），３．８２（ｓ，３Ｈ），２．２１−２．１３（ｍ，１Ｈ），１．９６−１．９０（ｍ，１Ｈ），０．８７−０．７９（ｍ，１Ｈ），０．６１−０．５６（ｍ，１Ｈ）；ＭＳ ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）計算値 ３７９， 測定値 ３７９。
実施例４：化合物ＩＩ−７ａおよび化合物ＩＩ−７ｂの調製（方法Ａ、図６）
実施例４−Ａ
（１，１−ジエトキシエトキシ）アセトンの調製
ＮａＨ（２．６８ｇ、６０％）の冷却（０℃）懸濁液（１５０ｍＬのＴＨＦ中）に、１，１−ジエトキシエタノール（これはＺｉｒｋｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９６１，２６，３９５−４０７の文献手法に従い調製した）（９．００ｇ）の溶液（２０ｍＬのＴＨＦ中）を加え、そして反応混合物を室温で１時間撹拌した後、メトアリルクロライド（８．０ｍＬ）を加えた。反応混合物を一晩、加熱還流し、冷却し、そしてセライトのプラグを通して濾過した。溶媒はロータリーエバポレーションにより除去し、そして残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ、２０％エーテル／ヘキサン）により精製して、１，１−ジエトキシエチルメトアリルエーテル（１１．５、９０％）を得た。このエーテル（６．００ｇ）の冷却（−３０℃）溶液（８０ｍＬのＥｔＯＡｃ中）のオゾン分解を、出発材料がＴＬＣにより検出できなくなるまで行った（１時間）。この時点で反応物を酸素でパージし、そしてＰｄ（ＯＨ）２（１５０ｍｇ）で処理し、そして水素の雰囲気下で一晩撹拌した。触媒を濾去し、そして濾液をロータリーエバポレーションにより濃縮した。生じた残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ、２０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製して表題化合物を得た（４．５３ｇ、８２％）。
実施例４−Ｂ
方法Ａ（図６）に従い、樹脂（ＸＩＩＩ−Ａ）（２３０．２ｍｇ）をＥｔＭｇＢｒ（１．２５ｍＬ）、続いて（１，１−ジエトキシエトキシ）アセトン（実施例３−Ａ）（１．２ｍＬ）で処理した。後処理そして樹脂からの開裂後、粗反応生成物の混合物を一部（１０．５ｍｇ）を塩化メチレン（２０ｍＬ）に溶解し、そしてＢＦ３エーテル錯化合物（２０μＬ）で処理した。２．５時間撹拌した後、溶液を飽和水性ＮａＨＣＯ３そしてブラインで洗浄した後、ＭｇＳＯ４上で乾燥させた。濾過そして溶媒を除去した後、生成した残渣を調製用ＨＰＬＣ（Ｚｏｒｂａｘ ＲＸ−８、４×２５ｃｍ、６５％ＭｅＣＮ／水 ｗ／０．１％トリフルオロ酢酸）により精製して化合物ＩＩ−７ａ（２．３４ｍｇ）および化合物ＩＩ−７ｂ（１．３４ｍｇ）を得た。化合物（ＩＩ−７ａ）は以下の特性を有した：１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ９．３５−９．２０（ｍ，１Ｈ），７．８７（ｄ，Ｊ＝７．６，１Ｈ），７．６２（ｄ，Ｊ＝７．０，１Ｈ），７．６０−７．４５（ｍ，１Ｈ），７．４９（ｄｄ，Ｊ＝７．７，７．５，１Ｈ），７．４０（ｄ，Ｊ＝８．１，１Ｈ），７．３７−７，２６（ｍ，３Ｈ），６．２２（ｓ，１Ｈ），５．２０−４．８５（ｍ，１Ｈ），４．４７（ｓ，１Ｈ），３．６７（ｄ，Ｊ＝１２．７，１Ｈ），３．５２（ｄ，Ｊ＝１１．８，１Ｈ），３．４０（ｄ，Ｊ＝１２．７，１Ｈ），３．３８（ｄ，Ｊ＝１１．８，１Ｈ），１．９１（ｓ，３Ｈ）；ＭＳ ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）計算値 ４０９， 測定値 ４０９。化合物ＩＩ−７ｂは以下の特性を有した：１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ９．５８−９．２２（ｍ，１Ｈ），７．８２（ｄ，Ｊ＝７．４，１Ｈ），７．６０−７．４０（ｍ，３Ｈ），７．３７−７．２７（ｍ，３Ｈ），７．２１（ｄ，Ｊ＝８．１，１Ｈ），５．８１（ｓ，１Ｈ），５．２１（ｓ，１Ｈ），５．１０−４，８０（ｍ，１Ｈ），４，５９（ｄ，Ｊ＝１３．５，１Ｈ），４．３８（ｄｄ，Ｊ＝１３．５，５．３，１Ｈ），４．２１（ｄ，Ｊ＝１３．１，１Ｈ），３．８２（ｄ，Ｊ＝１３．２，１Ｈ），１．１３（ｓ，３Ｈ）；ＭＳ ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）計算値 ４０９， 測定値 ４０９。
実施例５：化合物ＩＩ−５の調製（図８）
化合物ＩＩ−１（８．１ｍｇ）の溶液（２ｍＬのＴＨＦ中）にＮＢＳ（４．６ｍｇ）を加え、そして反応物を一晩撹拌した。さらにＮＢＳ（４．５ｍｇ）を加え、そして反応物を２．５時間撹拌した。不溶性物質を濾去し、そして濾液をロータリーエバポレーションにより濃縮した。生成した残渣をカラムクロマトグラフィー（Ｃ−１８、６５％ＭｅＣＮ／水 ｗ／０．１％トリフルオロ酢酸）により精製した。適切な画分をＮａＨＣＯ３で中和し、そして塩化メチレンに抽出し（３×２０ｍＬ）、そしてＭｇＳＯ４上で乾燥させた。濾過し、そして溶媒を蒸発させた後、化合物ＩＩ−５（５．１ｍｇ）を白色粉末として得、これは以下の特性を有した：１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．２２（ｄ，Ｊ＝７．４，１Ｈ），８．６７（ｓ，１Ｈ），８．１４（ｓ，１Ｈ），７．８６（ｄ，Ｊ＝８．７，１Ｈ），７．７２（ｄ，Ｊ＝７．０，１Ｈ），７．６３（ｄ，Ｊ＝７．８，１Ｈ），７．４２（ｄｄ，Ｊ＝７．５，７．３，１Ｈ），７．３５（ｄｄ，Ｊ＝７．３，７．２，１Ｈ），６．８６（ｄ，Ｊ＝６．０，１Ｈ），５．６３−５．５８（ｍ，１Ｈ），４．９４（ｓ，２Ｈ），４．５４（ｄ，Ｊ＝３．１，１Ｈ），２．３０−２．１４（ｍ，１Ｈ），２．００−１．８２（ｍ，１Ｈ），０．９６−０．８８（ｍ，１Ｈ），０．６２−０．５０（ｍ，１Ｈ）；ＭＳ ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）計算値 ４５７／９（１：１）， 測定値 ４５７／９（１：１）。
実施例６：中間体ＸＶの調製（図４）
ＶＩＩＩ−Ａ［Ａ１、Ａ２＝Ｈ２、Ｂ１、Ｂ２＝Ｏ、Ｒ３＝Ｒ４＝Ｒ５＝Ｒ６＝Ｈ）］（１．０５ｇ）の溶液（２５ｍＬのＤＭＦ中）にトリエチルアミン（０．７５ｍＬ）およびｔ−ブチルジメチルシリルクロライド（ＴＢＳ−Ｃｌ）（０．６５ｇ）を加えた。３時間撹拌した後、反応を飽和水性ＮａＨＣＯ３で停止し、そしてＥｔＯＡｃに抽出した。有機層を水そしてブラインで洗浄し、そしてＭｇＳＯ４上で乾燥させた。濾過し、そして溶媒を蒸発させた後、生成した残渣をエーテルでトリチュレートして化合物ＸＶ（８４８ｍｇ）を与えた。洗浄液を蒸発させて残渣を残し、これをカラムクロマトグラフィー（シリカ、１％ＥｔＯＡｃ／ＣＨ２Ｃｌ２）により精製し、そしてさらなる生成物（５０２ｍｇ、合わせた収率９４％）を与え、これは以下のスペクトル特性を有した：１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１１．９４（ｓ，１Ｈ），９．３２（ｄ，Ｊ＝７．６，１Ｈ），８．０３（ｄ，Ｊ＝７．７，１Ｈ），７．６４（ｄ，Ｊ＝７，２，１Ｈ），７．５８（ｄ，Ｊ＝８．１，１Ｈ），７．４４（ｄｄ，Ｊ＝７．７，７．６，１Ｈ），７．３９（ｄｄ，Ｊ＝７．７，７．６，１Ｈ），７．３２（ｄ，Ｊ＝７．３，１Ｈ），７．２５（ｄｄ，Ｊ＝７．６，７．３，１Ｈ），５．００（ｓ，２Ｈ），４．１４（ｓ，２Ｈ），０．９９（ｓ，９Ｈ），０．４６（ｓ，６Ｈ）；ＭＳ ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）計算値 ４２５， 測定値 ４２５。
実施例７：方法Ｂを介する化合物ＩＩ−１の調製（図７）
Ｔｒｉｔｏｎ Ｂの溶液（０．４５Ｍ、ピリジン中）は、４０％のＴｒｉｔｏｎ Ｂ溶液（１０ｍＬのメタノール中）をピリジン（１０ｍＬ）に溶解することにより調製した。溶媒を減圧下（２０ｍｍＨｇ）で最終容量〜８ｍＬまで除去した。残渣をピリジンで５０ｍＬまで希釈し、濾過し、そして窒素下に保存した。ＸＶ（２０．３ｍｇ）の溶液（２．０ｍＬのピリジン中）にアルゴンを流し、そして３００μＬのＴｒｉｔｏｎ Ｂ（０．４５Ｍ、ピリジン中）およびジエトキシブチルアルデヒド（５０μＬ）で処理した。２時間撹拌した後、反応物をＥｔＯＡｃに抽出し、１Ｎ水性ＨＣｌ、ブラインで洗浄し、そしてＭｇＳＯ４上で乾燥させた。濾過し、そして溶媒を蒸発させた後、付加物をＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）に溶解し、そしてＢＦ３エーテル錯化合物（１０μＬ）で処理した。２．０時間撹拌した後、溶液を飽和水性ＮａＨＣＯ３、そしてブラインで洗浄した後、ＭｇＳＯ４上で乾燥させた。溶媒をロータリーエバポレーションで除去して残渣を与え、これを調製用ＨＰＬＣ（Ｚｏｒｂａｘ ＲＸ−８、２．５×２５ｃｍ、６５％ＭｅＣＮ／水 ｗ／０．１％トリフルオロ酢酸）により精製した。適当な画分をＮａＨＣＯ３で中和し、そして塩化メチレンに抽出し（３×２０ｍＬ）、そしてＭｇＳＯ４上で乾燥させた。濾過し、そして溶媒を蒸発させた後、ＩＩ−１（１１．８ｍｇ、６５％収率）を得、この１Ｈ ＮＭＲおよびＭＳスペクトルおよびＨＰＬＣ保持時間は、実施例３−Ａに記載した方法Ａにより調製し、単離した物質と同一であった。
実施例８：化合物ＩＩ−９の調製（図８）
ブロモ化合物ＩＩ−５（６．２ｍｇ）の懸濁液（４．０ｍＬの１−プロパノール中）に、３−アミノフェニル硼酸（３．８ｍｇ）を加えた。０．２５時間撹拌した後、Ｐｄ（ＯＡｃ）２（２．０ｍｇ）、Ｐｈ３Ｐ（４．８ｍｇ）、Ｎａ２ＣＯ３（２．８ｍｇ）および水（２．０ｍＬ）を連続して加えた。混合物を０．７５時間、加熱還流し、冷却し、ＣＨ２Ｃｌ２に抽出し、そして水およびブラインで洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、そして溶媒をロータリーエバポレーションにより除去して残渣を得、これを調製用ＨＰＬＣ（Ｚｏｒｂａｘ ＲＸ−８、２．５×２５ｃｍ、５０％ＭｅＣＮ／水 ｗ／０．１％トリフルオロ酢酸）により精製した。適当な画分をＮａＨＣＯ３で中和し、そして塩化メチレンに抽出し（３×２０ｍＬ）、そしてＭｇＳＯ４上で乾燥させた。濾過し、そして溶媒を蒸発させた後、化合物ＩＩ−９（３．１ｍｇ、４９％収率）および以下のスペクトル特性を得た：１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．２２（ｄ，Ｊ＝７．５，１Ｈ），８．６６（ｓ，１Ｈ），８．００−７．２５（ｍ，８Ｈ），７．１２（ｄｄ，Ｊ＝７．１，７．０，１Ｈ），６．９５−６．８０（ｍ，３Ｈ），６．５３（ｄ，Ｊ＝６．０，１Ｈ），５．６３−５．５８（ｍ，１Ｈ），４．９９（ｓ，２Ｈ），４．５５（ｓ，１Ｈ），２．２５−２．１０（ｍ，１Ｈ），１．９５−１．９０（ｍ，１Ｈ），０．９８−０．８８（ｍ，１Ｈ），０．６５−０．５７（ｍ，１Ｈ）；ＭＳ ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）計算値 ４７０， 測定値 ４７０。
実施例９：化合物ＩＩ−１０の調製（図９）
化合物ＩＩ−１（５．０ｍｇ）の溶液（１ｍＬのＤＭＳＯ中）にＮａＣＮ（４．３ｍｇ）を加え、そして混合物を１４５Ｃに１時間暖めた。混合物を冷却し、ＥｔＯＡｃに抽出し、そして水（３×２０ｍＬ）およびブラインで洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、そして蒸発させて残渣を得、これを調製用ＨＰＬＣ（Ｚｏｒｂａｘ ＲＸ−８、２．５×２５ｃｍ、５５％ＭｅＣＮ／水 ｗ／０．１％トリフルオロ酢酸）により精製した。適当な画分をＮａＨＣＯ３で中和し、そして塩化メチレンに抽出し（３×２０ｍＬ）、そしてＭｇＳＯ４上で乾燥させた。濾過し、そして溶媒を蒸発させた後、化合物ＩＩ−１０（２．７ｍｇ、５０％収率）を得、そして以下のスペクトル特性を有した：１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１１．４（ｓ，１Ｈ），８．８６（ｄ，Ｊ＝７．９，１Ｈ），８．７９（ｄ，Ｊ＝７．６，１Ｈ），７．９０（ｄ，Ｊ＝８．３，１Ｈ），７．６２−７．５５（ｍ，２Ｈ），７．４９（ｄｄ，Ｊ＝７．６，７．４，３Ｈ），７．４０（ｄｄ，Ｊ＝７．４，７．３，１Ｈ），７．３５（ｄｄ，Ｊ＝７．５，７．４，１Ｈ），６．８６（ｄ，Ｊ＝６．０，１Ｈ），６．０３（ｓ，１Ｈ），５．４０−５．３０（ｍ，１Ｈ），２．２５−２．１４（ｍ，１Ｈ），２．０３−１．９０（ｍ，１Ｈ），１．１０−０．９８（ｍ，１Ｈ），０．８２−０．７７（ｍ，１Ｈ）。
実施例１０：化合物ＩＩ−１１の調製（方法Ａ、図６）
方法Ａに従い、樹脂（ＸＩＩＩａ）（１５０．２ｍｇ）をＥｔＭｇＢｒ（１．０ｍＬ）、続いてエチル２，５−ジオキソペンタノエートと反応させた（Ｓｃｈｍｉｄｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９９３，８０９）（１．５ｍＬ）。後処理および樹脂からの開裂後、粗反応生成物の混合物を塩化メチレン（２０ｍＬ）に溶解し、そしてＢＦ３エーテル錯化合物（２０μＬ）で処理した。２．５時間撹拌した後、溶液を飽和水性ＮａＨＣＯ３およびブラインで洗浄した後、ＭｇＳＯ４上で乾燥させた。濾過し、そして溶媒を蒸発させた後、生成した残渣を調製用ＨＰＬＣ（Ｚｏｒｂａｘ ＲＸ−８、４×２５ｃｍ、５５％−７５％勾配 ＭｅＣＮ／水 ｗ／０．１％トリフルオロ酢酸）により精製して化合物ＩＩ−１１（６．４ｍｇ）を得、これは以下の特性を有した：１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．３６（ｄ，Ｊ＝７．７，１Ｈ），８．６８（ｓ，１Ｈ），８．００（ｄ，Ｊ＝７．７，１Ｈ），７．８３（ｄ，Ｊ＝８．３，１Ｈ），７．５８−７．１５（ｍ，５Ｈ），６．９７（ｄ，Ｊ＝５．９，１Ｈ），４．９３（ｓ，２Ｈ），４．８２（ｓ，１Ｈ），４．４８（ｑ，Ｊ＝７．１，２Ｈ），２．４２−１．９１（ｍ，２Ｈ），１．３７（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．１），１．２５−０．６３（ｍ，２Ｈ）。
実施例１１：化合物ＩＩ−１２の調製
化合物ＩＩ−１１（３．４ｍｇ）の溶液（２ｍＬのＴＨＦ中）を、２Ｍ ＬｉＢＨ４溶液（ＴＨＦ中の１．０ｍＬ）で処理し、そして反応を１．５時間撹拌した。反応は１Ｎ水性ＨＣｌ（４ｍＬ）を加えることにより停止した。２０分間撹拌した後、１０％水性ＮａＯＨ（１５ｍＬ）を加え、そして混合物を塩化メチレン（３×１０ｍＬ）に抽出した。ＭｇＳＯ４上で乾燥させた後、混合物を濾過し、そして溶媒を蒸発させて化合物ＩＩ−１２（０．３２ｍｇ）を得、これは以下の特性を有した：１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．３５（ｄ，Ｊ＝７．７，１Ｈ），８．６２（ｓ，１Ｈ），７．９８（ｄ，Ｊ＝７．７，１Ｈ），７．８３（ｄ，Ｊ＝８．２，１Ｈ），７．７５（ｄ，Ｊ＝８．２，１Ｈ），７．５０−７．２５（ｍ，４Ｈ），６．８４（ｄ，Ｊ＝７．７，１Ｈ），６．１１（ｓ，１Ｈ），４．９１（ｓ，２Ｈ），４．７１（ｓ，１Ｈ），４．５０−４．４０（ｍ，１Ｈ），４．３０−４．２０（ｍ，１Ｈ），２．４２−１．９１（ｍ，２Ｈ），１．２５−０．６３（ｍ，２Ｈ）；ＭＳ ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）計算値 ４０９， 測定値 ４０９。
実施例１２：脊髄ＣｈＡＴ活性の増大
ＣｈＡＴは機能的なコリン作用性ニューロンの特異的な生化学的マーカーである。コリン作用性ニューロンは海馬形成、嗅覚核、脚間核、皮質、扁桃および視床の一部に対して主要なコリン作用性のインプットを表す。脊髄では、運動ニューロンはＣｈＡＴを含むコリン作用性ニューロンである（Ｐｈｅｌｐｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１９８８，２７３，４５９−４７２）。ＣｈＡＴ活性はニューロトロフィン（例えばＮＧＦまたはＮＴ−３）がコリン作用性ニューロンの生存および／または機能に及ぼす効果を研究するために使用されてきた。ＣｈＡＴアッセイもコリン作用性ニューロン内のＣｈＡＴレベルの調節の指標としても役立つ。
方法：胎児ラットの脊髄細胞を分離し、そして実験を記載されているように行った（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９８５，１０１，１６０８−１６２１；Ｇｌｉｃｋｓｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，１９９３，６１，２１０−２２１）。分離する細胞は、標準的なトリプシン分離法によりラットから摘出した脊髄から調製した（１４〜１５日胚）（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，同上）。細胞は６×１０５細胞／ｃｍ２で、ポリ−１−オルニチンをコートしたプラスチック製の組織培養ウェル上の無血清Ｎ２培地中（０．０５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補充した）（Ｂｏｔｔｅｎｓｔｅｉｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９７９，７６，５１４−５１７）にまいた。培養は３７℃で５％ＣＯ２／９５％空気の湿潤雰囲気中で４８時間インキューベーションした。ＣｈＡＴ活性は２日後、インビトロでＭｃＭａｎａｍａｎ，ｅｔ ａｌ．およびＧｌｉｃｋｓｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（ＭｃＭａｎａｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｂｉｏｌ．，１９８８，１２５，３１１−３２０；Ｇｌｉｃｋｓｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，同上）に従うＦｏｎｎｕｍ法の変法を使用して測定した。
【０１４１】
実施例中、式ＩＩを有する化合物を表２に掲げる。Ｒ１、Ｒ４、Ｒ６およびＲ７に関する値はＨ；ＹはＯであり；そしてｎは１である。
【０１４２】
【表２】
2005503102.tif 000018
【０１４３】
実施例１３：ｐＣＤＮＡ３−ＥＥ−ＭＬＫ３、ｐｃＤＮＡ３−ＥＥ−ＭＬＫ３（Ｋ１４４Ｒ）
ＭＬＫ３を記載されているようにクローン化した（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９３，８，３４０３−３４１０；Ｅｚｏｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９４，９，９３５−９３８）。ｃＤＮＡは２００ｎｇのポリアデニル化メラノサイトｍＲＮＡから調製し、そして反応の５％を鋳型として使用して、既知のＰＴＫの保存されたＶＩｂおよびＩＸサブドメインのコンセンサス配列に由来する２または４種の高度に縮重したオリゴヌクレオチドプライマーの混合物を用いて、ＰＴＫ ｃＤＮＡのレパートリーを増幅した：ＰＫＴ１、５′−ＣＧＧＡＴＣＣＡＣＭＧＩＧＡＹＹＴ−３′（配列番号１）；ＰＴＫ２，５′−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＷＡＧＧＡＣＣＡＳＡＣＲＴＣ−３′（配列番号２）；ＰＴＫ３，５′−ＣＧＧＡＴＣＣＲＴＩＣＡＹＭＧＩＧＡＹＹＴＩＧＣＩＧＣＩＭＧＩＡＡ−３′（配列番号３）；ＰＴＫ４，５′−ＧＧＡＡＴＴＩＡＹＩＧＧＡＷＡＩＧＷＣＣＡＩＡＣＲＴＣＩＳＷ−３′（配列番号４）。４０サイクルのＰＣＲは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ：パーキン−エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）／シータス（Ｃｅｔｕｓ））および自動化ＤＮＡ熱循環器を使用して行った；各サイクルは９４℃で４０秒、３７℃で２分、そして６３℃で３分から成った。８つのＰＣＲ産物をプールし、ＤＮＡポリメラーゼ（クレノー）で処理し、ＢａｍＨ１に加えてＥｃｏＲ１で開裂し、そして５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。エチジウムブロミドによる染色で主要な２００〜２３０ｂｐバンドを同定し、これを切り出し、溶出し、そしてＭ１３ｍｐ１８にクローン化した。１つの実験では、ＰＣＲ増幅したｃＤＮＡの一部を開裂せず、しかし代わりにＳｍａ１で開裂したＭ１３ｍｐ１８に平滑末端にクローン化した。ヌクレオチド配列は、チェーン−ターミネーションシークエンシング法により決定した。
【０１４４】
ＰＴＫ１と同定された１つのｃＤＮＡをプローブとして使用して、ヒトの黒色腫およびメラノサイトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。ＰＴＫ１−３．２と命名した１つのクローンが８４７アミノ酸のタンパク質をコードする２５４１ｎｔの全オープンリーディングフレイムを含んだ。このｃＤＮＡをＮｃｏ１で切断し、ＤＮＡポリメラーゼ（クレノー）で平滑化し、ＥｃｏＲ１で再度切断し、そしてＢａｍＨ１で切断したベクターｐＣＤＮＡ３−ＥＥに連結し、平滑化し、そしてＥｃｏＲＩで切断した。ベクターｐＣＤＮＡ３−ＥＥは、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨ１部位に開始コドン続いてＥＥエピトープをコードするオリゴＭＥＥＥＹＭＰＭＥ（配列番号５）（Ｇｒｕｓｓｅｎｍｅｙｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８５，８２，７９５２−７９５４）を挿入することにより構築した。キナーゼが不活性化された（ｄｅａｄ）ＭＬＫ３の変更体は、既に公開された技術（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９４，１７，６５７−５６９）を採用してＰＣＲを使用して突然変異Ｋ１４４Ｒを作成することにより作った。第１の突然変異性オリゴは５′−ＧＴＧＧＣＴＧＴＧＣＧＧＧＣＡＧＣＴＣＧＣＣＡＧ−３′（配列番号６） であり、そして第２のオリゴは５′−ＧＡＧＡＣＣＣＴＧＧＡＴＣＴＣＧＣＧＣＴＴ−３′（配列番号７）であった。鋳型としてＭＬＫ３を使用して、これらのオリゴをＰＣＲに使用して８０６ｂｐのフラグメントを生成し、そして他のアンプリマーとしてＴ７プライマーおよび鋳型としてＭＬＫ３を使用する第２のＰＣＲ反応に採用して、１２８５ｂｐのフラグメントを生成した。このフラグメントはアガロースゲル電気泳動により分離し、単離し、ｐＧＥＭ−５（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））にクローン化し、そしてシークエンシングした。フラグメントはＨｉｎｄＩＩＩおよびＨｐａＩで切り出し、そしてＨｉｎｄＩＩＩおよびＨｐａＩで切断したｐＣＤＮＡ３−ＥＥ−ＭＬＫ３に挿入した。さらに点突然変異がヌクレオチド１３４２位で検出された。これを正すために、Ｐｆ１Ｍ１フラグメント（ｎｔ１０９３−１４１８）を野生型ＭＬＫ３から切り出し、そしてＫ１４４Ｒ突然変異ＭＬＫ３中の同一フラグメントと置き換えるために使用した。
実施例１４：ｐＦＢ−ＦＬＡＧ−ＭＬＫ３
ＭＬＫ３タンパク質を得るために、ｃＤＮＡをバキュロウイルスの発現ベクターｐＦＢ−ＦＬＡＧにクローン化した。ＭＬＫ３をＰＴＫ１−３．２からＮｃｏ１での消化により切り出し、ＤＮＡポリメラーゼ（クレノー）で平滑化し、Ｎｏｔ１で再び切断し、そしてＳｔｕ１およびＮｏｔ１で消化したｐＦＢ−ＦＬＡＧに連結した。ｐＦＢ−ＦＬＡＧはｐＦＢ（ライフテクノロジーズ：Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に由来し、そしてポリリンカーのＢａｍＨ１部位に付加された出発コドンを含むＦＬＡＧエピトープ（Ｈｏｐｐ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９８８，６，１２０５−１２１０）のコード配列、 ＭＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号８）を有する。
実施例１５：ｐＦＢ−ＧＳＴ−ＭＬＫ３（ＫＤ）
ＭＬＫ３のキナーゼドメインのバキュロウイルス発現ベクターを、ＥｃｏＲ１およびＸｈｏ１を使用してｐＧＥＸＫＧ−ＭＬＫ３（ＫＤ）からＭＬＫ３フラグメントを切り出し、そしてＥｃｏＲ１およびＸｈｏ１で切断した、中にグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のコード配列が上流にクローン化されているｐＦＢベクターに連結することにより作成した。これはＧＳＴコード配列およびｐＧＥＸＫＧベクターに由来するポリリンカーを、鋳型としてベクターを使用することによるＰＣＲにより得ることにより行った（Ｇｕａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈ．，１９９１，１９２，２６２−２６７）。ＰＣＲ用の５’オリゴは、フラグメントの５’末端にＢｇｌ２制限部位を作成した。この単離されたフラグメントをＢｇｌ２およびＨｉｎＤ３で消化し、そしてＢａｍＨ１およびＨｉｎＤ３で消化したｐＦＢに連結した。
実施例１６：ｐＧＥＸＫＧ−ＭＬＫ３（ＫＤ）
ＭＬＫ３キナーゼドメインおよびロイシンジッパーの部分の両方を含んだｃＤＮＡフラグメント（ｎｔ７３６−１７９１）は、ＰＴＫ１ ｃＤＮＡを使用してＰＣＲにより得た。単離したフラグメントは、ＰＣＲオリゴに含まれる制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏ１部位で消化し、そしてＥｃｏＲＩおよびＸｈｏ１で消化したｐＧＥＸ−ＫＧにクローン化した。次いでｐＧＥＸ−ＫＧ中のこのフラグメントはＰＣＲにより短くして、キナーゼドメイン（ｎｔ７３６−１６３８）のみを含むようにした。
実施例１７：ｐＫＨ３−ＭＬＫ２、ｐＫＨ３−ＭＬＫ２（ＫＡ）
ＭＬＫ２は縮重ＰＣＲ（Ｄｏｒｏｗ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９３，２１３，７０１−７１０；Ｄｏｒｏｗ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９５，２３４，４９２−５００）を使用してクローン化した。上皮腫瘍細胞系Ｃｏｌｏ１６中に発現するプロテインキナーゼの触媒サブドメインをコードするｃＤＮＡのセグメントは、逆転写酵素ＰＣＲによりＲＮＡから増幅した。縮重ＰＣＲプライマーは、上皮増殖因子受容体ファミリーのキナーゼ触媒ドメインのサブドメインＶｉｂおよびＶＩＩＩ中に保存されたモチーフをコードする配列に基づいた。プライマーの配列は以下のとおりである：前部プライマー、５′−ＣＧＧＡＴＣＣＧＴＧ（Ａ）ＣＡＣＣ（Ａ）ＧＴ（ＣＧ）Ｇ（Ａ）ＡＣＣ（Ｔ）Ｔ−３′（配列番号９）、逆プライマー、５′−ＧＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡ（Ｇ）ＴＡＡ（Ｇ）ＣＴＣＣＡＧ（Ｃ）ＡＣＡＴＣ−３′（配列番号１０）。幾つかのＰＣＲ産物をＭ１３にクローン化し、そしてＴ７ Ｓｕｐｅｒ−Ｂａｓｅシークエンシングキット（ブレサテック：Ｂｒｅｓａｔｅｃ）を使用してシークエンシングした。１つの２１６ｂｐのＰＣＲ産物をプローブとして使用してヒト結腸λｇｔ１１ ｃＤＮＡライブラリー（クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｋ）、カタログ＃ＨＬ１０３４６）をスクリーニングした。フラグメントを無作為にプライミング標識し、ハイブリダイゼーションを６５℃で行い、そしてフィルターを０．２Ｘ ＮａＣｌ／クエン酸塩（１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）および０．５％ ＳＤＳのストリンジェンシーに対して６５℃で洗浄した。フィルターを−７０℃で１６時間、コダック（Ｋｏｄａｋ）ＸＡＲ−５フィルムでオートラジオグラフィーにかけた。４つのクローンを単離し、そして最長の１．２ｋｂを使用して同じライブラリーを同じ条件を使用して再度プローブで釣り上げた。さらに４つのクローンを選択し、そしてこれらの１つのクローンがＭＬＫ２の１０３４ｂｐフラグメントを表した。このクローンを使用して、ヒト脳のλｇｔ１０ライブラリーをプローブで釣り上げた。約５００，０００個のクローンがスクリーニングされ、そしてＭＬＫ２の全コード領域を表す１つの３４５４ｂｐのクローンを単離した。
【０１４５】
ＭＬＫ２は、ＢａｍＨ１部位がＭＬＫ２配列の中央にあるので、２段階でＢａｍＨ１とＥｃｏＲ１との間にＡＴＧからポリＡ尾まで、ベクターｐＫＨ３中にクローン化した。ベクターｐＫＨ３は、ＨＡエピトープタグの３コピー、続いてＢａｍＨ１部位をｐＲＫポリリンカーのＸｂａ１とＥｃｏＲＩ部位との間に挿入することにより構築した。突然変異した変更体、Ｋ１２５Ａを作成するために、ＭＬＫ２の５’ＢａｍＨ１フラグメントをプロメガｐＡｌｔｅｒベクターにクローン化し、そして製造元の推薦により突然変異させた。次いでこのフラグメントをＭＬＫ２ ｐＫＨ３ベクターに戻してクローン化を行った。
実施例１８：ｐｃＤＮＡ３−ＨＡ−ＪＮＫ１
ＪＮＫ１ ｃＤＮＡは記載されているように得た（Ｃｏｓｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１９９５，８１，１１３７−１１４６）。このｃＤＮＡは鋳型としてヒト骨格筋ｃＤＮＡ（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を使用するＰＣＲにより得、そしてＨＡエピトープをコードする修飾されたｐｃＤＮＡ３発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３−ＨＡ（Ｗｉｌｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１９８４，３７，７６７−７７８）のＢｇｌ２／Ｓａｌ１部位にクローン化した。ついでこれをｐｃＤＮＡ３から切り出し、ＨＡエピトープを含め、そしてｐＧＥＸ−４Ｔ３（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））に連結した。ＪＮＫ１ ｃＤＮＡはｐＧＥＸ−４Ｔ３構築物からＢｇｌ２／Ｓａｌ１フラグメントとして切り出し、そしてｐｃＤＮＡ３−ＨＡ（ｐｃＤＮＡ３のＨｉｎＤ３／ＢａｍＨ１部位に付加したＨＡエピトープを持つベクター）に連結した。
実施例１９：ｐＦＬＡＧ−ＤＬＫ
ＤＬＫは、ＦＬＡＧエピトープを記載したように加えた発現ベクターｐｃＤＮＡ３にクローン化した（Ｈｏｌｚｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９４，２６９，３０８０８−３０８１７）。ＤＬＫに関するｃＤＮＡのフラグメントは、縮重オリゴヌクレオチドに基づくＰＣＲクローニングにより単離した。全ＲＮＡは、製造元の指示に従い（ＴＲＩｚｏｌ試薬、ライフテクノロジーズ社）、市販の調製されたフェノール／グアニジンイソチオシアネート試薬法を使用して、１３．５日胚の腎臓（３２器官）および１７．５日胚の腎臓（１６器官）から抽出した。ＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅＩで消化した後、全ＲＮＡをＲＮａｓｅＨ−逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ、ライフテクノロジーズ社）を用いてオリゴ（ｄＴ）合成オリゴヌクレオチドプライマーから１本鎖ｃＤＮＡまで逆転写した。Ｗｉｌｋｓにより最初に命名されたタンパク質チロシンキナーゼ触媒サブドメインＶｉｂおよびＩＸ（Ｗｉｌｋｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６，１６０３−１６０７）に対応する縮重オリゴヌクレオチドプライマーを、それぞれ５’ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位に対して修飾した（５′−ＡＴＡＡＴＴＣ（ＧＴ）ＧＣ（ＴＡＧＣ）ＧＣＣＡ（ＧＡ）ＧＴＣ（ＴＡＧＣ）ＣＧＧＴＧ−３′（配列番号１１）、５′−ＡＴＡＡＧＣＴＴＣＣ（ＴＣ）（ＡＧ）Ｔ（ＧＣ）ＡＡＧＴＧＧＡ（ＴＣ）（ＧＣ）ＧＣ（ＡＧＣ）ＣＣ（ＣＴ）ＧＡ−３′（配列番号１２）。４０サイクルのＰＣＲを、９４℃で１．５分間、３７℃で２分間、そして６３℃で３分間行った。新しい試薬を加え、そしてさらに４０サイクルを完了した後に最後に７２℃で１０分間の伸長を行った。生成した２００〜２１０ｂｐ ＤＮＡ増幅産物をゲルで分離し、調製したｐＧＥＭ７ｚｆ（＋）プラスミド（プロメガ）にサブクローン化し、そして大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に形質転換した。Ｍｉｎｉｐｒｅｐ プラスミドＤＮＡを形質転換した細菌から調製し、そして一部をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した；挿入物を含むクローンをシークエンシングした。
【０１４６】
縮重ＰＣＲから得た１９５−ｂｐ ＤＬＫ ｃＤＮＡフラグメントを放射性標識し、そしてＵｎｉ−ＺＡＰＩＩ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ラジョラ、カリフォルニア州）の約１×１０６の組換え体、オリゴ（ｄＴ）−でプライミングした成体マウス脳のｃＤＮＡライブラリー（Ｈｏｌｚｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，１０，５８３０−５８３８）をスクリーニングするために使用した。フィルターは、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、３×デンハーツ溶液、０．２５％ ＳＤＳ、１ｍｇ／ｍｌ ポリアデニル酸および２００ｍｇ／ｍｌ サケ精巣ＤＮＡから成るバッファー中で４２℃でハイブリダイゼーションした。フィルターを室温で２×ＳＳＣ、０．２％ ＳＤＳで１回、そして３０分間、６５℃で２回洗浄した。２５個の独自なクローンを同定した；１０個のクローンは均一に精製し、製造元のプロトコールに従いインビボ切り出しを行い、そして制限地図を作成した。２つの最長クローン（それぞれ３４０１および３３９７ｂｐ、それらの５’末端のみが異なる）を、それらの全長にわたり両鎖に沿ってシークエンシングした。
【０１４７】
完全長ＮｏｔＩ−ＸｈｏＩ ＤＬＫ ｃＤＮＡフラグメント（３４０１ｂｐ）を、サイトメガロウイルスのプロモーターに基づく真核生物発現ベクターｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン、サンディエゴ、カリフォルニア州）（ｐｃＤＮＡ３−ＤＬＫと命名した構築物）にサブクローン化した。次にＮＨ４−Ｍｅｔ ＦＬＡＧエピトープ（ＤＹＫＤＤＤＫ）（配列番号１３）を付けた構築物（ｐＦＬＡＧ−ＤＬＫ）を作成した。ＰＣＲを使用してｃＤＮＡフラグメントを増幅し、このフラグメントは５’ＨｉｎｄＩＩＩ部位、ＤＬＫ’ｓＫｏｚａｋ’ｓコンセンサス配列（ヌクレオチド８８からヌクレオチド７５８の内部ＥｃｏＲＩ部位に延長する、開始ＡＴＧ、ＦＬＡＧエピトープおよびＤＬＫ ｃＤＮＡオープンリーディングフレイム配列を含む）をコードした。（ＨＰＬＣで精製した合成オリゴヌクレオチドを等モル量で使用した：ＦＬＡＧ構築物センスプライマーについては５′−ＡＴＡＡＡＧＣＴＴＣＣＡＧＡＧＧＣＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＧＧＣＣＴＧＣＣＴＣＣＡＴＧＡＡＡＣＣＣＧＡＡＣＡ−３′（配列番号１４） 、そしてアンチセンスプライマーについては５′−ＧＡＣＡＧＧＧＣＧＧＣＣＧＧＣＴＣＴ−３′（配列番号１５））。ゲルで精製したＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ−消化した増幅フラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩにサブクローン化して、ｐｃＤＮＡ３−ＤＬＫプラスミドを調製した。構築物は両鎖に沿ってシークエンシングしてＴａｑポリメラーゼの忠実度およびリーディングフレイムの維持を確認した。
実施例２０：ｐｃＤＮＡ３−ＭＬＫ１
ＭＬＫ１の５’部分は、ＥＳＴデータベース（受託＃ＡＡ１６０６１１）から得た。このクローンは、ＭＬＫ１と同一性が未知の別のｃＤＮＡとの間の融合であった。これはこれまでに公開されていないＭＬＫ１の５’配列を、これまでに公開されたＭＬＫ１のキナーゼドメインの一部と一緒に含んだ（Ｄｏｒｏｗ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９３，２１３，７０１−７１０）。ＥＳＴクローンに由来するＭＬＫ１ ｃＤＮＡ配列は以下の通りである：
【０１４８】
【表３】
2005503102.tif 000019
【０１４９】
これを：
【０１５０】
【表４】
2005503102.tif 000020
【０１５１】
に翻訳した。
【０１５２】
ＭＬＫ１の３’部分は、すでに公開されているように縮重ＰＣＲにより最初にクローン化した（Ｄｏｒｏｗ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９３，２１３，７０１−７１０）。ＭＬＫ１の３’部分をクローニングするためのプロトコールは、以下の点を除きＭＬＫ２について上に記載したように行った。１．２ｋｂクローンを用いたライブラリーの再スクリーニングから得た４個のクローンの、４個のうちの３個がＭＬＫ１を表した。いずれのクローンも全キナーゼドメインを含まず、これはＰＣＲにより得られた。
【０１５３】
増幅したライブラリーの１μｌアリコートからのファージ（λ Ｕｎｉ−ＺＡＰＸＲ中の正常ヒト結腸上皮およびヒトＴ８４結腸癌腫細胞系ｃＤＮＡ（ストラタジーン、ｃａｔ＃９３７２０４））は、２０μｌの水中で懸濁することにより溶解し、そしてスナップ凍結した。５μｌの溶解ファージサンプルは各ライブラリーに関する２反応においてＰＣＲ鋳型として使用した。ベクターを表すプライマーは、クローニング部位を挟むヌクレオチド配列から取った。Ｔ８４結腸細胞系ライブラリーの場合は、Ｔ３およびＴ７シークエンシングプライマー（プロメガ）を使用した。各反応において、１つのプライマーは既知の配列の５’末端から約１００ｂｐのＭＬＫ１遺伝子の３’−５’鎖に由来した。第２プライマーは２つのベクタープライマーの１つであった。ＰＣＲ反応には１×ＰＣＲバッファー、２．５ｍＭ 塩化マグネシウム、１Ｕ Ｔａｑポリメラーゼ（すべてブレサテックから）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰおよび０．４ｍＭ 各プライマーを全部で５０μＬ中に含んだ。反応条件は９５℃で６０秒、５２℃で９０秒、７２℃で９０秒を３０サイクルであり、最終サイクルに１５分間の延長時間を含んだ。ＰＣＲ産物をクローン化し、そして上記のようにシークエンシングした。ライブラリーのスクリーニングからの最長のクローンおよびさらなるＭＬＫ１配列を含んだＰＣＲフラグメントを、一緒に連結して１．０８ｋｂのＭＬＫ１ ｃＤＮＡをｐＵＣ１８中に作成した。
【０１５４】
ＥＳＴデータベースに由来するＭＬＫ１クローンは、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン）中に提供した。結腸ライブラリーに由来するＭＬＫ１ ｃＤＮＡは、これをＥｃｏＲＩで消化し、クレノーで平滑化し、次いでＡｆＩＩＩで切断することによりＥＳＴクローンに連結した。この単離されたフラグメントは、ＸｈｏＩで切断し、クレノーで平滑化し、そしてＡｆＩＩＩで切断したＥＳＴに由来するＭＬＫ１ ｃＤＮＡにクローン化した。この新たな構築物はＮｏｔ１およびＡｐａ１を用いた消化によりｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔから切り出し、そしてこれもまたＮｏｔ１およびＡｐａ１を用いて切断したｐｃＤＮＡ３−ＥＥに連結した。すべてのクローニング連結部の配列を確認した。
実施例２１：ＧＳＴ−ＭＬＫ３ＫＤの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現
ｐＧＥＸＫＧ−ＭＬＫ３（ＫＤ）は、エレクトロポレーションにより大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１株に形質転換した。プラスミドを含む細菌は、１５リットルのＡｐｐｌｉｋｏｎ発酵槽中の１０リットル容量の以下のリッチ培地に接種した：１．９５ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、０．９ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、０．１ｇ／Ｌ アンピシリン、０．３ｇ／Ｌ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．９２ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４２．７ｍｇ／Ｌ クエン酸Ｎａ、２１．８ｍｇ／Ｌ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｍＬ ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）微量金属（Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９８８，１０３，１４９−１７７）、２０ｇ／Ｌ カザミノ酸、４０ｇ／Ｌ グリセロール、２５．５ｍｇ／Ｌ ＣａＣｌ２。細菌を一晩、８００ｒｐｍ／６８％溶存酸素／３０℃で、カルチャーがＯＤ６００＝４．４に達するまで成長させた。組換えタンパク質生産は、１ｍＭ イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドの添加により誘導し、２５℃で６時間まで発酵を続けた。次いで細菌を遠心により回収し、そして細胞ペーストを精製するまで−２０℃で凍結した。
実施例２２：細菌ＧＳＴ−ＭＬＫ３ＫＤの精製
部分精製したＧＳＴ−ＭＬＫ３ＫＤは１００ｇｍの細菌細胞ペーストを１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ｐＨ７．５（バッファーＡ）中で超音波処理することにより調製した。溶液は Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で１％とし、次いで氷上で１時間撹拌した。２０，０００×ｇで４５分間遠心した後の上清溶液をバッファーＡで平衡化した１０ｍＬのグルタチオンＳｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ樹脂（ファルマシア）と１時間、氷上で混合した。ペレット化した樹脂を１２．５×容量のバッファーＡで２回洗浄し、次いで２０ｍＭ グルタチオンを含む２０ｍＬの１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＤＴＴ（バッファーＢ）、ｐＨ７．５で溶出した。タンパク質をバッファーＢに対して一晩透析し、そしてアリコートで−８０℃にて保存した。
実施例２３：ＦＬＡＧ−ＭＬＫ３およびＧＳＴ−ＭＬＫ３ＫＤのバキュロウイルス発現
ＦＬＡＧ−ＭＬＫ３およびＧＳＴ−ＭＬＫ３ＫＤを発現する組換えバキュロウイルスは、使用説明書に従いＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣシステム（ライフテクノロジーズ）を使用して、それらの各転移ベクターであるｐＦＢ−ＭＬＫ３およびｐＦＢ−ＭＬＫ３ＫＤから生成した。Ｓｆ２１細胞の懸濁培養物（Ｖａｕｇｈｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ，１９７７，１３，２１３−２１７）は２７℃／１２０ｒｐｍで、１０％熱−不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む補足Ｇｒａｃｅ培地（Ｈｉｎｋ，Ｎａｔｕｒｅ，１９７０，２２６，４６６−４６７）で成長させた。組換えＦＬＡＧ−ＭＬＫ３を生産させるために、１．５×１０６細胞／ｍＬ（５％ＦＢＳを含む補足Ｇｒａｃｅ培地）の密度のＳｆ２１細胞を、３．１の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させ、そして感染から３９時間後に回収した。組換えＧＳＴ−ＭＬＫ３ＫＤを生産させるために、１．５×１０６細胞／ｍＬ（５％ＦＢＳを含む補足Ｇｒａｃｅ培地）の密度のＳｆ２１細胞を、２のＭＯＩで感染させ、そして感染から４１時間後に回収した。両方の場合で、ペレット化した細胞を１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ Ｐｅｆａｂｌｏｃ ＳＣ、５μＭ ペプスタチン、１０μｇ／ｍＬ アプロチニン、１０μｇ／ｍＬ ロイペプチン、ｐＨ７．４から成るバッファーに再懸濁した。１４７，０００×ｇで１時間遠心した後の上清溶液は３Ｍ Ｔｒｉｓ塩基を用いてｐＨ７．４に再調整し、そして−７０℃に保存した後に精製した。
実施例２４：バキュロウイルスＧＳＴ−ＭＬＫ３ＫＤの精製
部分精製したバキュロウイルスＧＳＴ−ＭＬＫ３ＫＤは、グルタチオンアフィニティクロマトグラフィーにより調製した。１０ｍｌの細胞抽出物について（２６．６ｍｇの全タンパク質）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４（バッファーＣ）で平衡化した１ｍＬのグルタチオンＳｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ樹脂（ファルマシア）を加え、そしてタンパク質を４℃で４５分間結合させた。次いで樹脂をカラム形式で３０カラム容量のバッファーＣで洗浄し、そして５カラム容量の２０ｍＭのグルタチオンを含有するバッファーＣで溶出させた。プールした最終産物は、バッファーＣに対して一晩透析し、そしてアリコートで−７０℃にて保存した。
実施例２５：バキュロウイルスＦＬＡＧ−ＭＬＫ３の精製
部分精製したバキュロウイルスＦＬＡＧ−ＭＬＫ３は、抗体アフィニティクロマトグラフィーにより調製した。さらに０．１Ｍ ＮａＣｌを含む１５ｍＬの抽出物（１９．５ｍｇの全タンパク質）からのタンパク質を、アガロース樹脂（シグマ（Ｓｉｇｍａ））に結合したＭ２モノクローナルＦＬＡＧペプチド抗体の０．２５ｍＬカラムに繰り返し添加することにより（全部で３回）結合させた。樹脂は５カラム容量の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４（ＴＢＳ）の洗浄、３カラム容量の０．１Ｍ グリシン、ｐＨ３．５の洗浄、続いてさらに５容量のＴＢＳの洗浄により平衡化した後、クロマトグラフィーにかけた。組換えタンパク質は主に５カラム容量の０．２ｍＭ ＦＬＡＧペプチド（Ｎ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｃ）（配列番号１８）（ＴＭＳ中）により溶出した。タンパク質はアッセイ前にアリートで−８０℃にて保存した。
実施例２６：ドミナントネガティブ突然変異体：ＭＬＫファミリーのドミナントネガティブ突然変異体は、神経成長因子の除去後に分化したＰＣ１２細胞の死を遮断する
ニューロンの死を導く分子的出来事を調査するための神経細胞モデルとして、ラット褐色細胞腫に由来するＰＣ−１２細胞系を徹底的に使用した（総説については、Ｔｒｏｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，１９９７，１０３−１１１を参照されたい）。神経成長因子（ＮＧＦ）はＰＣ−１２細胞の交感神経表現型への分化を誘導する（Ｇｒｅｅｎｅ，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１９７８，７８，７４７−７５５）。ＮＧＦが分化したＰＣ−１２細胞は生存に関してはＮＧＦに依存的であり、そして培養基からＮＧＦを除去すると形態的に説明されるアポトーシス死を受ける。混合多重キナーゼファミリーの員がＮＧＦ離脱後にＰＣ−１２細胞死に及ぼす効果を決定するために細胞系を開発した。ＰＣ−１２細胞は、製造元（インビトロゲン、カールバッド、カルフォルニア州）に推薦されるようにＰｆｘ脂質転移系を使用して、ＭＬＫ３のドミナントネガティブ（ＤＮ）突然変異体をコードするｃＤＮＡでトランスフェクションした。ＤＮ−ＭＬＫ−３を発現しているトランスフェクション体の安定なプールは、Ｇ４１８スルフェート（メディアテック（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、ヘルンドン、バージニア州）を使用して選択した。免疫組織化学により決定した時、これらのプールのうち約３０％の細胞がＤＮ ＭＬＫ３を発現する。突然変異体キナーゼを安定に発現している細胞のプールを、ポリオルニチン／ラミニン（１０μｇ／ｍｌ、リン酸緩衝化生理食塩水中）をコートした組織培養９６−ウェル形式のプレートに２×１０４細胞／ウェルでまき、そして１００ｎｇ／ｍｌのＮＧＦで７日間処理した。ＮＧＦを含有する培地を除去し、細胞単層をリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄し、そして１：１０００の最終希釈の中和ＮＧＦ抗体（ｃａｔ＃Ｎ６６５５；シグマ、セントルイス、モンタナ州）を含有する培地に１〜５日間置き換えた。細胞の生存能は、製造元（プロメガ、マジソン、ウィスコンシン州）により推薦されるようにＣｙｔｏＦｌｕｏｒ ２３５０（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ベッドフォード、マサチューセッツ州）で５７０ｎｍの吸収を読む発色したホルマザンへのテトラゾリウム塩、ＭＴＳの転換を使用した細胞生存能アッセイにより定量した。ＤＮ−ＭＬＫ−３を発現する安定なプールは、ＮＧＦ離脱により引き起こされる細胞死から一部救済された（図１０）。
実施例２７：組換えＭＬＫタンパク質の酵素活性に関するアッセイ
バキュロウイルスまたは細菌発現系のいずれかで発現したＭＬＫタンパク質が酵素的に活性であることを証明するために、幾つかのアッセイ形式を利用することができる。ＭＬＫタンパク質は、バキュロウイルスまたは細菌発現系のいずれかで発現した完全長の構築物またはキナーゼドメインであり得る。このアッセイは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、時間−解像（ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ）蛍光または蛍光分極（ＦＰ）のように抗体に基づことができる。抗体はホスホセリン、ホスホトレオニンまたはホスホ−特異的基質に対して反応性を持つモノクローナルまたはポリクローナル抗体でよい。あるいは放射活性ゲルに基づくアッセイ（図１１を参照にされたい）、マルチスクリーン トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈殿アッセイ（図１３）、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）、フラッシュプレート法またはホスホセルロースフィルターアッセイ形式（図１３）のような抗体に基づかない方法も使用することができる。アッセイは基質の直接的なリン酸化を監視するように設計するか、またはシグナル伝達経路の下流キナーゼを利用する共役アッセイ系であることができる。基質はＳＥＫ−１のような特異的基質であるか、またはミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）のような比較的非特異的な基質であることができる。
実施例２８：キナーゼアッセイ：
（１）放射活性ゲルに基づくキナーゼアッセイ
ＭＬＫ−３のキナーゼ活性は、［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰの３２ＰのＭＬＫ基質（例えばキナーゼ不活性化ＳＥＫ−１；ミエリン塩基性タンパク質）への取り込みを監視することによりアッセイした。５０μｌのアッセイ混合物は、バッファーＡ（２０ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ７．２、２５ｍＭ β−グリセロール ホスフェート、５ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ オルトバナジウム酸ナトリウム、１ｍＭ ジチオスレイトール）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００μＭ ＡＴＰ、１０μＣｉ［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰ、および０．１μｇキナーゼ不活性化ＳＥＫ−１基質（ストレッセゲン（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ）社；結合したグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ−ＳＥＫ−１（ＧＳＴ−ＳＥＫ−１）が１０ｍＭ グルタチオン、ｐＨ８．０でアガロースゲルから放出される）または２５μｇ ＭＢＰ（シグマケミカル社）を含んだ。反応はＭＬＫタンパク質（キナーゼドメインまたは完全長およびキナーゼドメインの両方を含む調製物）または対照タンパク質を加えることにより開始した。混合物は３０℃で３０分間インキューベーションした。反応の終わりに、２×還元バッファーを加えた。混合物を５分間煮沸し、１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（基質としてＭＢＰを使用する）または８％ゲル（基質としてＳＥＫ−１）のいずれかに乗せた。電気泳動後、ゲルを乾燥させた。基質ＳＥＫ−１へ取り込まれたホスフェートの定量は、モレキュラーダナミックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（サニーバレ、カリフォルニア州）で行った。基質としてキナーゼ不活性化ＧＳＴ−ＳＥＫ−１またはＭＢＰを使用して、バキュロウイルスが発現したＭＬＫ−３（ＦＬＡＧを付けた完全長またはＧＳＴを付けたキナーゼドメイン）の酵素活性を示すために計画した実験の結果を、図１１Ａおよび１１Ｂに示す。
（２）ウエスタンブロット分析
バキュロウイルスが発現したＭＬＫ−３のキナーゼ活性は、イムノブロット分析で調査した。２０μｌのアッセイ混合物は、バッファーＡ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００μＭ ＡＴＰおよび０．１μｇキナーゼ不活性化ＳＥＫ−１基質を含んだ。反応は３０℃で３０分間すすめ、次いで１０μｌの４×還元サンプルバッファーで停止した。タンパク質は８％Ｔｒｉｓ−グリシンゲルで分離し、そして電気的にＩｍｍｏｂｉｌｏｎ ＰＶＤＦ膜に移した。膜をホスホ−特異的ＳＥＫ−１（Ｔｈｒ２２３）抗体（ニューイングランドバイオラボス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）社）、続いて西洋ワサビペルオキシダーゼ−標識ヤギ抗−ウサギＩｇＧ（バイオ−ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））とインキューベーションした。免疫反応性バンドの検出は、増大した化学発光（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））を介して行った。ＦＬＡＧ−ＭＬＫ３タンパク質（完全長およびキナーゼドメインの両方を含有するバキュロウイルス調製物）によるキナーゼ不活性化ＧＳＴ−ＳＥＫ−１のリン酸化は、図１２に具体的に説明する。
（３）マルチスクリーン トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈殿アッセイ
細菌が発現したＧＳＴ−ＭＬＫ−３キナーゼドメインのキナーゼ活性は、Ｐｉｔｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，１９９６，１，４７−５４１）に記載されているようなマルチスクリーン トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）“プレート内”アッセイを使用して評価した。アッセイは９６−ウェル Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ Ｄｕｒａｐｏｒｅ プレート（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））内で行った。各５０μｌアッセイ混合物は、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ ＭｎＣｌ２、２ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１μＣｉ［γ−Ｐ３２］ＡＴＰおよび３０μｇ ＭＢＰ基質を含んだ。反応はＭＬＫタンパク質を加えることにより開始し、そして３７℃で１５分間すすめた。反応は２５μｌのＴＣＡを加えることにより停止した。プレートを４℃で３０分間平衡化し、次いで氷冷２５％ＴＣＡで洗浄した。シンチレーションカクテルをプレートに加え、そして放射活性はＷａｌｌａｃ ＭｉｃｒｏＢｅｔａ １４５０ＰＬＵＳ シンチレーションカウンターを使用して測定した。タンパク質用量対３２Ｐ標識ＭＢＰの形成は、図１３に示す。
（４）ホスホセルロースフィルターアッセイ
キナーゼアッセイは、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ ＭｎＣｌ２、２ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１μＣｉ［γ−Ｐ３２］ＡＴＰおよび３０μｇ ＭＢＰを含む５０μｌの反応混合物中で行った。反応はＭＬＫタンパク質を加えることにより開始し、そして３７℃で１５分間すすめた。反応は７５μｌの７５ｍＭ リン酸を加えることにより停止した。停止した溶液のアリコートをホスホセルロース膜（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ））に直接乗せた。あるいは９６−ウェルホスホセルロースマルチスクリーンプレート（ミリポア）を使用してもよい。膜を７５ｍＭ Ｈ３ＰＯ４で洗浄した。結合した３２Ｐ−標識リン酸化ＭＢＰは、１Ｍ 水酸化ナトリウムを加えることにより回収管に溶出した。放射活性はベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）のシンチレーションカウンター（ソマーセット、ニュージャージー州）中でＣｅｒｅｎｋｏｖ計数により測定した。細菌が発現したＧＳＴ−ＭＬ−３キナーゼドメインの濃度上昇に伴うリン酸化ＭＢＰの形成を図１３に示す。
実施例２９：化合物の組換えＭＬＫファミリーへの結合を測定するためのアッセイ
Ｋ−２５２ａ（化合物ＩＩＩ−３；表４を参照にされたい）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）種のインドロカルバゾール代謝産物は、種々のセリン／トレオニンおよびチロシンキナーゼに結合する（Ａｎｇｅｌｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９６，２３６，４９−５５；Ｋｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９７，２４７，３７６−３８１）。トリチウム処理したＫ−２５２ａリガンドを使用して、バキュロウイルス感染細胞の粗調製物に由来するヒト組換え完全長ＭＬＫ−３への結合を評価した。［３Ｈ］Ｋ−２５２ａは、ＮＥＮ リサーチプロダクツ（ビルエリカ、マサチューセッツ州）との契約を通して３および９位でトリチウムを用いて特異的に標識し、そして４０Ｃｉ／ミリモルの比活性を有した。結合反応は９６ウェルプレート中の１ｍｌで行った。反応混合物は５０ｍＭ ＭＯＰＳバッファー、ｐＨ７、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｎＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１％ＤＭＳＯおよび０．２５ｎＭ ［３Ｈ］Ｋ−２５２ａを含んだ。サンプルは５μｇ／ｍｌ濃度の粗バキュロウイルス由来ＭＬＫ−３を用いて３連で行った。非特異的結合は、非標識の１．２μＭ Ｋ２５２ａの存在下での結合と定め、そして全結合から引いて特異的結合を与えた。この希釈で、全カウントの１２〜１５％がタンパク質に非特異的に結合し、そしてこれらのカウントの７５〜８５％がＭＬＫ−３に特異的に結合した（図１４）。すべての実験は４℃にて２時間行った。［３Ｈ］Ｋ２５２ａ／ＭＬＫ−３複合体はブランデル（Ｂｒａｎｄｅｌ）回収器を使用してＧＦ／Ｃワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）フィルター上に集め、冷ＭＯＰＳ／ＮａＣｌバッファーで洗浄し、そしてワラックのＭｉｃｒｏ Ｂｅｔａ カウンターで計数した。飽和結合実験を行ってＫ２５２ａに関するＫｄを得た。これらの実験の１つからの結果の例を示す（図１４）、０．８９ｎＭのＫｄ（信頼限界：０．２〜１．５ｎＭ）が得られた。
実施例３０：完全な細胞のアッセイ
（Ａ）Ｃｏｓ７過剰発現系
材料
Ｋ−２５２ａおよびこの化合物を誘導体は、協和発酵工業株式会社（Ｋｙｏｗａ−Ｈａｋｋｏ Ｋｏｇｙｏ Ｃｏ．）（東京、日本）（Ｋａｎｅｋｏ ｅｔ ａｌ．，１９９７）から提供された。化合物は細胞培養級のジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、そして暗中４℃で保管した。化合物のすべての希釈は、１％ウシ血清アルブミンを含むダルベッコの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に作成した。ヘモアグルチニン（ＨＡ）抗体は、ＢＡｂｃｏ（リッチモンド、カリフォルニア州）から購入した。ＡＰ−１（ｃ−ｊｎ）基質は、プロメガ（マジソン、ウィスコンシン州）から購入した。［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（６０００Ｃｉ／ミリモル）はアマーシャム（アーリントンハイツ、イリノイ州）から購入した。
Ｃｏｓ７細胞培養
ミドリザルの腎臓Ｃｏｓ７細胞は、メリーランド州、ロックビルのＡＴＣＣから得（ＣＲＬ１６５１）、そして１０％ウシ血清アルブミン、２ｍＭ グルタミン、１ｍＭ ピルビン酸塩、５０Ｕ／ｍｌ ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中に、３７℃で１０％ＣＯ２、９０％大気雰囲気中で維持した。Ｃｏｓ７細胞は継代するために０．２５％トリプシンを加えることにより剥がした。
【０１５５】
（１）Ｃｏｓ７細胞でのＭＬＫファミリーの員およびＪＮＫ１の過剰発現
Ｃｏｓ７細胞は８０％の集密度でプレートにまき、そして提供者（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ、ゲチスバーグ、メリーランド州）に推薦されるリポフェクタミンを使用して各２μｇのｃＤＮＡ構築物でトランスフェクションした。ヒトＭＬＫ−３、ＭＬＫ−２またはマウスＤＬＫの完全長ｃＤＮＡ、または上記の部分的なヒトＭＬＫ−１、およびＪ．Ｓｉｌｖｉｏ Ｇｕｔｋｉｎｄ（ＮＩＨ、ベセスダ、メリーランド州）の好意により提供された完全長ヘモアグルチニンＡ−付加ヒトＪＮＫ１を、ｐｃＤＮＡ３ベクター（インビトロゲン、サンディエゴ、カリフォルニア州）にサブクローン化した。トランスフェクションから４８時間後、細胞を０．０２５％ ＤＭＳＯまたは５００ｎＭの示した化合物で２時間処理し、続いて０．４ｍｌのＴｒｉｔｏｎ バッファー（１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、０．１％ウシ血清アルブミン、３０μＭ ピロリン酸ナトリウム、５０ｍＭ 弗化ナトリウム、２０μｇ／ｍｌ アプロチニン、１ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオリド、１ｍＭ バナジウム酸ナトリウム）中で溶解した。溶解物に由来するＪＮＫ活性は、以下に記載する免疫沈降／キナーゼアッセイによりアッセイした。
【０１５６】
（２）全細胞からの免疫沈降／キナーゼアッセイ
Ｃｏｓ７細胞由来の溶解物は、ピアス（ロックフォード、イリノイ州）からのＭｉｃｒｏ ＢＣＡキットを使用してタンパク質濃度について測定し、そして等量のタンパク質をＨＡ抗体と４℃で１時間、免疫沈降させた。免疫沈降物はマイクロフュージ遠心で２０秒間遠心することによりペレットとし、Ｔｒｉｔｏｎバッファー中に再懸濁し、２回以上遠心することにより洗浄し、続いて最後にキナーゼバッファー（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ ジチオスレイトール、０．１ｍＭ バナジウム酸ナトリウム）中で洗浄した。免疫沈降物は、１μＭ ＡＴＰおよび５μＣｉ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰおよび基質（１μｇ／ＡＰ−１のサンプル）を含有するキナーゼバッファー中に再懸濁し、そして３０℃で１５分間インキューベーションした。キナーゼ反応は還元サンプルバッファー（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ １９７０：２２７；６８０−６８５）を加えることにより停止した。サンプルを８０℃で５分間加熱し、そして１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにのせた。タンパク質を電気泳動により分離した。ゲルを乾燥させ、そしてＡＰ−１基質中の放射活性の定量はモレキュラー ダイナミックスＰｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（サニーバレ、カリフォルニア州）で行った。ＭＬＫ−３、ＭＬＫ−２およびＤＬＫがＨＡ−ＪＮＫ１と同時に発現し（ｃｏ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）、そしてＫ−２５２ａの不存在または存在下でインキューベーションする実験結果を、図１５Ａおよび１５Ｂに示す。対照的に、化合物ＩＩＩ−３と命名した（表４を参照にされたい）元のＫ−２５２ａ化合物の誘導体（これはより選択的なキナーゼインヒビターである）は、ＪＮＫの上流の別のＭＡＰＫＫＫ、ＭＥＫＫ１により活性化されるＪＮＫ経路を妨害しなかった（図１５Ｃ）。
（Ｂ）ＭＬＫ活性化ＫＮＫに関する全−細胞レポーターアッセイ
クローンからのＭＬＫファミリーの構成的発現を引き出す試みは成功しなかったことは、ＭＬＫの過剰発現が細胞の生存に影響し得ることを示唆する（Ｂｅｒｇｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９７，２３１，１５３−１５５；Ｎａｇａｔａ，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９８，１７，１４９−１５８）。したがって、ＭＬＫが誘導する生物化学的な出来事を追跡するための全細胞アッセイの開発には、目的のキナーゼの遺伝的に操作した誘導性の発現系を含む細胞系が必要である。例えばテトラサイクリンが制御するトランスアクチベーターでトランスフェクションしたＰＣ−１２細胞系。細胞がさらに誘導性プロモーターｔｅｔＯにより駆動する目的の遺伝子でトランスフェクションされる時、その遺伝子の発現は培地中のテトラサイクリンにより強力に制御される（Ｓｈｏｃｋｅｔｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９５，９２，６５２２）。
【０１５７】
ＭＬＫの活性化を定量するために、上記のような多くのアッセイ形式においてＭＥＫ４、ＪＮＫまたはｃ−ｊｕｎのような下流の基質のリン酸化を測定することができる。全細胞中のＭＬＫ活性化を定量するための別の取り組みは、ＰａｔｈＤｅｔｅｃｔ（商標）系（ストラタジーン、ラジョラ、カリフォルニア州）を通じて市販されているｃ−ｊｕｎルシフェラーゼレポーター系のようなレポーター酵素活性を使用することである。この系では、テトラサイクリン誘導性の細胞系を２つのプラスミドでトランスフェクションする。１つのプラスミドは、ｃ−Ｊｕｎ ＮＨ２−末端トランス活性化因子と酵母ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインとの融合（ｃＪｕｎ−ＤＢＤ融合タンパク質）を構成的に発現する。もう１つのプラスミドは、５つの並んだＧＡＬ４結合部位の反復により駆動されるホタルのルシフェラーゼのコード配列を持つ。ＭＬＫの活性化で、ＪＮＫの下流基質、ｃＪｕｎ−ＤＢＤ融合タンパク質がリン酸化され、ＧＡＬ４結合部位に結合し、そしてルシフェラーゼ遺伝子転写を誘導する。ルシフェラーゼは基質（プロメガ、マジソン、ウィスコンシン州）の添加および化学発光により細胞溶解物中で容易にアッセイされる。
実施例３１：ＭＬＫファミリーの員の阻害と運動ニューロン生存の関係
運動ニューロンが豊富なラット脊髄カルチャーの生存
脊髄は、１４．５〜１５の胚齢（Ｅ）のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの胎児（チャールズリバーラボラトリーズ、ウィルミントン、マサチューセッツ州）から摘出した。脊髄の腹部のみに由来する細胞を分離し、そしてさらにすでに記載されているように（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９３）、６．５％段階のメトリズアミド勾配で遠心することにより運動ニューロンについてさらに濃縮し、そして低親和性ニューロトロフィン受容体抗体（ＩｇＧ−１９２、ベーリンガー−マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ））を用いた染色により純度を分析した（データは示さず）。細胞は、前以てポリ−ｌ−オルニチンおよびラミニン（各５μｇ／ｍｌ）をコートした９６−ウェルプレートに、６×１０４細胞／ｃｍ２（化学的に定められた無血清Ｎ２培地中（Ｂｏｔｔｅｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，１９７９，同上）の密度でまいた。生存効果から付着を分けるために、カルチャーへの化合物の添加を最初の１〜３時間の付着後に行った。神経生存は、蛍光計生存能アッセイでカルセインＡＭ（モレキュラープローブズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、ユージーン、オレゴン州）を使用して評価した（Ｂｏｚｙｃｚｋｏ−Ｃｏｙｎｅ，ｅｔ ａｌ．，１９９３，同上）。ニューロンの顕微鏡によるカウントは、相対的な蛍光値に直接相関した。簡単に説明すると、培養基を連続的にＤＰＢＳ（ダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水）中で希釈し、そして最終濃度の６μＭカルセインＡＭストックを各９６−ウェルに加えた。プレートを３７℃で３０分間インキューベーションし、続いてＤＰＢＳ中で連続希釈で洗浄した。蛍光シグナルは、励起＝４８５ｎｍおよび発光＝５３８ｎｍでミリポアのプレートリーディング蛍光計（Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ２３５０）を使用して読んだ。各プレートについて、カルセインＡＭを受容したが、細胞は含まなかったウェルからの平均バックグラウンドをすべての値から引いた。蛍光シグナルの直線性は、３回の実験で細胞密度の範囲について濃度およびインキューベーション時間について確認した。２５０ｎＭの試験化合物の存在下で、対照運動ニューロンより高い生存パーセントの例を、表３に示す。
皮質ニューロンの生存
大脳皮質は、ラット胎児の１８日胚から摘出し、そして酵素的に消化して単一細胞懸濁物を得た。細胞は、ポリ−オルニチン／ラミニンをコートした９６ウェル組織培養プレート上のＢ２７補足物を含有する無血清神経基礎培地（Ｎｅｕｒａｌ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）中に、１．５６×１０５／ｃｍ２の密度でまいた。プレートは、ＰＢＳ中に作成したポリ−オルニチン／ラミニン溶液（各８μｇ／ｍｌ）で３７℃にて少なくとも２時間覆った。インビトロで５〜７日に、皮質ニューロンを試験化合物の存在または不存在下でＡｂ２５−３５（２０μＭ）に暴露した。Ａｂ２５−３５（シグマ、セントルイス、モンタナ州）スストック溶液（１ｍＭ）は、脱イオン化蒸留滅菌Ｈ２Ｏ中に調製した。相対的なニューロンの生存は、ペプチドを添加してから４８時間に、形質膜の完全性／細胞生存能の指標としてラクトースデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出を使用して決定した。ＬＤＨは細胞傷害性検出キット（ベーリンガー−マンハイム、インディアナポリス、イリノイ州）を使用して製造元の指示に従い測定した。データはＡｂ２５−３５単独で処理したカルチャーに対するＤＬＨ放出の阻害パーセントとして表す。
【０１５８】
【表５】
2005503102.tif 000021
【０１５９】
１化合物は式ＩＩＩを有し、式中、Ｚ１、Ｚ２、Ｒ１およびＲ２はＨであり；ＸはＣＯ２ＣＨ３であり；そしてＲはＯＨである。
２化合物は式ＩＩＩを有し、式中、Ｚ１およびＺ２はＨであり；ＸはＣＯ２ＣＨ３であり；そしてＲ１およびＲ２はＣＨ２ＳＣＨ２ＣＨ３であり；そしてＲはＯＨである。
３化合物は式Ｉを有し、式中、Ａ１、Ａ２、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はＨであり；Ｂ１およびＢ２は一緒にＯを表し；Ｒ２はＣＨ２ＣＨ２ＯＡｃであり；Ｒ４はＣＨ２ＣＨ２（２−ピリジル）であり；そしてＸはＣＨ２である。
４化合物は式Ｉを有し、式中、Ａ１、Ａ２、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はＨであり；Ｂ１およびＢ２は一緒にＯを表し；Ｒ２はＨであり；Ｒ４はＣＨ２ＣＨ２（２−ピリミジニル）であり；そしてＸはＣＨ２である。
実施例３２：インドロカルバゾールまたは融合ピロロカルバゾールの不存在または存在下での運動ニューロンカルチャーに由来する内因性ＪＮＫ活性の免疫沈降
精製した運動ニューロンは、１６ｍｍ直径のウェルに６×１０４細胞／ｃｍ２の密度でまいた。細胞は処理前に２時間、付着させた。細胞は、Ｎ２規定培地中、０．０１２５％ ＤＭＳＯまたは５００ｎＭ 化合物のいずれかで２時間処理した。次いで細胞を氷冷リン酸緩衝化生理食塩水ですすぎ、続いて上記実施例３０に記載した０．４ｍｌ Ｔｒｉｔｏｎバッファーに溶解した。運動ニューロンカルチャーからの溶解物を細胞数について標準化し、そしてサンタ クルズ バイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（サンタ クルズ、カリフォルニア州）から購入したＪＮＫ１抗体（ｃａｔ．＃ｓｃ−４７４）と免疫沈降させた。免疫沈降物に由来するＪＮＫ活性は、３２Ｐ−ＡＴＰおよびｃ−ｊｕｎ基質の存在下で上記のようにアッセイした。４種の試験化合物の阻害活性のプロフィールは、運動ニューロンおよびＤＬＫ、ＭＬＫ−１、ＭＬＫ−２またはＭＬＫ−３のいずれかを過剰発現するＣｏｓ７細胞中で比較した。
実施例３３：Ｃｏｓ７細胞中のＭＬＫ−３が誘導するＪＮＫ活性の阻害と、１次胚カルチャー中のコリアセチルトランスフェラーゼ活性との間の相関
これらのキナーゼにより調節されるＪＮＫ経路の阻害が、神経栄養化合物と相関するかどうかを決定するために、我々はＨＡ−ＪＮＫおよびＭＬＫ３を過剰発現するＣｏｓ７細胞中のＪＮＫ活性に及ぼす化合物の効果を評価した。４８時間のトランスフェクション期間後、細胞を５００ｎＭの化合物と２時間インキューベーションし、続いて細胞を溶解した。溶解物を免疫沈降させ、そしてキナーゼ活性を既に記載したように測定した。結果は対照サンプルの阻害パーセントとして報告し、ここで対照はＤＭＳＯ存在下でのＪＮＫ活性である。表４に見られるように、脊髄および／または基底前脳ＣｈＡＴ活性に活性なほとんどの化合物が、ＪＮＫのＭＬＫ−３活性化の有力なインヒビターであった。
【０１６０】
【表６】
2005503102.tif 000022
【０１６１】
１Ｚ１およびＺ２はＨであり；ＸはＣＯ２ＣＨ３であり；Ｒ１はＮＨＣＯＮＨＣ２Ｈ５であり；Ｒ２はＣＨ２ＣＨ２（２−ピリジル）であり；そしてＲはＯＨである式ＩＩＩを有する化合物。
２Ｚ１およびＺ２はＨであり；ＸはＣＯ２ＣＨ３であり；Ｒ１およびＲ２はＣＨ２ＯＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ３であり；そしてＲはＯＨである式ＩＩＩを有する化合物。
３Ｚ１およびＺ２はＨであり；ＸはＣＯ２ＣＨ３であり；Ｒ１およびＲ２はＣＨ２ＳＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ３であり；そしてＲはＯＨである式ＩＩＩを有する化合物。
４Ａ１、Ａ２、Ｒ１、Ｒ３およびＲ４はＨであり：Ｂ１およびＢ２は一緒にＯを表し；Ｒ２はＣＨ２ＣＨ２ＯＨであり；Ｒ５およびＲ６はＯＣＨ３であり；そしてＸはＣＨ２である式Ｉを有する化合物。
５Ａ１、Ａ２、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はＨであり：Ｂ１およびＢ２は一緒にＯを表し；Ｒ２はＣＨ２ＣＨ２ＯＡｃであり；Ｒ４はＢｒであり；そしてＸはＣＨ２である式Ｉを有する化合物。
６Ａ１、Ａ２、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はＨであり：Ｂ１およびＢ２は一緒にＯを表し；Ｒ２はＣＨ２ＣＨ２ＯＡｃであり；Ｒ４はＣＨ２ＣＨ２（２−ピリジル）であり；そしてＸはＣＨ２である式Ｉを有する化合物。
７Ａ１、Ａ２、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６はＨであり：Ｂ１およびＢ２は一緒にＯを表し；Ｒ２はＣＨ２ＣＨ２ＯＨであり；そしてＸはＣＨ２である式Ｉを有する化合物。
８Ａ１、Ａ２、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６はＨであり：Ｂ１およびＢ２は一緒にＯを表し；Ｒ２はＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨであり；そしてＸはＣＨ２である式Ｉを有する化合物。
９Ａ１、Ａ２、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６はＨであり：Ｂ１およびＢ２は一緒にＯを表し；そしてＸはＳである式Ｉを有する化合物。
１０Ａ１、Ａ２、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６はＨであり：Ｂ１およびＢ２は一緒にＯを表し；Ｒ２はＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＯ（（４−ＯＨ）Ｐｈ）であり；そしてＸはＣＨ２である式Ｉを有する化合物。
１１Ｚ１、Ｚ２、Ｒ１およびＲ２はＨであり；ＸはＣＯ２（ＣＨ２）４ＣＨ３であり；そしてＲはＯＨである式ＩＩＩを有する化合物。
１２Ｚ１、Ｚ２およびＲ１はＨであり；Ｒ２はＣＯ２ＯＨであり；ＸはＣＯ２ＣＨ３であり；そしてＲはＯＨである式ＩＩＩを有する化合物。
１３Ｚ１およびＺ２一緒に＝Ｏを形成し；Ｒ１およびＲ２はＢｒであり；ＸはＣＯ２ＣＨ３であり；そしてＲはＯＨである式ＩＩＩを有する化合物。
１４Ａ１、Ａ２、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はＨであり：Ｂ１およびＢ２は一緒にＯを表し；Ｒ２はＨであり；Ｒ４はＣＨ２ＣＨ２（２−ピリミジニル）であり；そしてＸはＣＨ２である式Ｉを有する化合物。
１５Ｚ１およびＺ２はＨであり；Ｒ１はＢｒであり；Ｒ２はＩであり；ＸはＣＯ２ＣＨ３であり；そしてＲはＯＨである式ＩＩＩを有する化合物。
１６Ｚ１、Ｚ２、Ｒ１およびＲ２はＨであり；ＸはＣＯ２ＣＨ３であり；そしてＲはＯＨである式ＩＩＩを有する化合物。
１７Ｚ１およびＺ２はＨであり；Ｒ１およびＲ２はＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３であり；ＸはＣＯ２ＣＨ３であり；そしてＲはＯＨである式ＩＩＩを有する化合物。
１８Ａ１、Ａ２、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はＨであり；Ｂ１およびＢ２は一緒にＯを表し；Ｒ４はＣＨ２ＣＨ２（２−ピリダジニル）であり；そしてＸはＣＨ２である式Ｉを有する化合物。
１９Ａ１、Ａ２、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はＨであり；Ｂ１およびＢ２は一緒にＯを表し；Ｒ２はＨであり；Ｒ４はＣＨ２ＣＨ２（２−ピリジル）であり；そしてＸはＣＨ２である式Ｉを有する化合物。
２０Ｚ１、Ｚ２、Ｒ１およびＲ２はＨであり；ＸはＣＯ２ＣＨ３であり；そしてＲはＯＣＨ３である式ＩＩＩを有する化合物。
２１Ａ１、Ａ２、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６はＨであり；Ｂ１およびＢ２は一緒にＯを表し；Ｒ２は（ＣＨ２）３−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−３，５−ジヒドロキシフェニルであり；そしてＸはＣＨ２である式Ｉを有する化合物。
２２Ａ１、Ａ２、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６はＨであり；Ｂ１およびＢ２は一緒にＯを表し；Ｒ２はベンゾイルであり；そしてＸはＣＨ２である式Ｉを有する化合物。２３Ａ１、Ａ２、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はＨであり；Ｂ１およびＢ２は一緒にＯを表し；Ｒ４はＣＨ＝ＣＨ−Ｃ≡Ｎであり；そしてＸはＣＨ２である式Ｉを有する化合物。
実施例３４：ＭＬＫ活性化のゲルシフトアッセイ
ＭＬＫの活性化はｃ−ｊｕｎ転写の誘導を導き、ｃ−Ｊｕｎタンパク質の上昇をもたらすことができる。ｃ−Ｊｕｎタンパク質量の上昇は、ゲルシフトアッセイと認識されている標準的なアッセイにより測定することができる。Ｇａｒｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９８１，９，３０４７−３０６０、これは全部、引用により本明細書に編入する。ｃ−Ｊｕｎ ＤＮＡ−結合部位をコードする放射性標識した二重鎖ＤＮＡオリゴマーを、核細胞抽出物とインキューベーションし、続いてアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、そして放射性標識したＤＮＡのより遅い移動度へのシフトを定量する。これはｃ−Ｊｕｎタンパク質に結合したＤＮＡの部分を表し、そして抽出物中のｃ−Ｊｕｎタンパク質の量に直接的に比例する。
【０１６２】
ＭＬＫの活性化はｃ−Ｊｕｎリン酸化も誘導することができる。これは例えばウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡのような検出系においてタンパク質のリン酸化形態を特異的に認識する抗体を使用して検出することができる。
実施例３５：ヒナの胚性ニューロンの生存
材料
ＬｅｉｂｏｖｉｔｚのＬ１５培地、グルコース、重炭酸ナトリウム、トリプシンおよび抗体はギブコからであった。筋肉抽出物は記載されているように調製した（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８３，３０２，６０９−６１１、これは全部、引用により本明細書に編入する）。他のすべての試薬は特に示さない限りシグマからであった。
細胞培養
運動ニューロン（５．５胚日）は、Ｂｌｏｃｈ−Ｇａｌｌｅｇｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１９９１，１１１，２２１−２３２（これは全部、引用により本明細書に編入する）に説明されている手順に従うが、Ｗｅｎｇ，ｅｔ ａｌ．，ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ，１９９６，７，１０７７−１０８１（これは全部、引用により本明細書に編入する）に記載されているように変更して免疫学的方法で単離した。精製した運動ニューロンは、ポリ−ＤＬ−オルニチンおよびラミニン（１μｇ／ｍｌ、アップステート バイオテック（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃ））を前以てコートした３５ｍｍの組織培養皿（ヌンク（Ｎｕｎｃ））にまいた。培養基は、重炭酸ナトリウム（２２．５ｍＭ）、グルコース（２０ｍＭ）、プロゲステロン（２×１０−８Ｍ）、亜セレン酸ナトリウム（３×１０−８Ｍ）、コンアルブミン（０．１ｍｇ／ｍｌ）、インスリン（５μｇ／ｍｌ）、ペニシリン−ストレプトマイシンおよび１０％熱不活化ウマ血清を含むＬ１５であった。筋肉抽出物を３０μｇ／ｍｌで補足した。化合物ＩＩＩ−３はＤＭＳＯ中に４ｍＭストック溶液として調製し、そして４℃で遮光して保存した。処理および対照カルチャーにおけるＤＭＳＯの最終濃度は、０．１２５％であった。
【０１６３】
脊椎傍交感神経節（ＳＧ；１２胚日（Ｅ１２））、脊髄神経節（ＤＲＧ；Ｅ９）および毛様体神経節（ＣＧ；Ｅ８）は、Ｌｉｎｄｓａｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１９８５，１１２，３１９−３２８（これは全部、引用により本明細書に編入する）に記載されているように、ヒナの胚から示した胚日に摘出した。トリプシン処理および分離後、神経細胞懸濁液はポリオルニチン−ラミニンをコートした皿上の、１０％ウマ血清を補足したＨａｍのＦ１４培養基にまいた。まいた直後に、生存因子を以下の濃度で加えた：神経成長因子（ＮＧＦ）、２０ｎｇ／ｍｌ；毛様体栄養因子（ＣＮＴＦ）、１０ｎｇ／ｍｌ。培養は湿潤環境中、３７℃および５％ＣＯ２に維持した。
細胞計数
ニューロンはグリット（ヌンク）を使用して３５ｍｍ培養皿にまいた。約１０％の表面を一緒に含んで成る各皿の選択された領域は、まいた直後および４８時間後の生存率を評価するために、相が明るい細胞の存在について走査した。細胞の生存はトリパンブルーを用いた生存染色により確認した（示さず）。
完全なＤＲＧ
神経節は、０．０５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む無血清Ｎ２培地（Ｂｏｔｔｅｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９７９，７６，５１４−５１７、これは引用により全部、本明細書に編入する）中のポリ−１−オルニチンおよびラミニン（各５μｇ／ｍｌ リン酸緩衝化生理食塩水）で前以てコートした９６ウェルプレートにまき、そして湿潤環境中、３７℃および５％ＣＯ２に４８時間維持した。処理した神経節は２５０ｎＭ化合物ＩＩＩ−３または２０ｎｇ／ｍｌ ＮＧＦをまいてから２時間後に受容した。
化合物ＩＩＩ−３はヒナの胚の末梢ニューロンの生存を濃度依存的様式で支持する
Ｅ９脊髄神経節感覚ニューロン（ＤＲＧ）およびＥ１２交感神経節ニューロン（ＳＧ）の分離カルチャーからＮＧＦを離脱すると、４８時間以内にカルチャーがＰＣＤを受けることを引き起こす。これはＮＧＦ離脱時に化合物ＩＩＩ−３を培養基に加えることにより防止された。１μＭで、４８時間後に化合物ＩＩＩ−３はＳＧニューロンの９４％およびＤＲＧニューロンの８９０％を生かした（ＮＧＦ−処理対照：ＳＧ ６５％、ＤＲＧ ６６％）。同様に化合物ＩＩＩ−３は、２４時間後にＣＮＴＦ−依存的毛様体神経節（ＣＧ）ニューロンの７６％の生存を促進した（ＣＮＴＦ−処理対照６７％）。１０％血清の存在下で化合物ＩＩＩ−３の生存効果は濃度依存的であり、すべての３種のニューロン群について約１μＭでプラトーに達した（図１６Ａ〜Ｃ）。生存するニューロンは対照カルチャーに比べてより広範囲の太い神経突起の成長およびより曲がった神経突起を示した（図１７Ｅ〜Ｈ）。４日後も、生存促進活性は完全であった：ＤＲＧ：化合物ＩＩＩ−３ ５２％、成長因子−処理対照 ４１％；ＳＧ：化合物ＩＩＩ−３ ８３％、ＮＧＦ−処理対照 ５５％；ＣＧ：化合物ＩＩＩ−３ ５８％、ＣＮＴＦ−処理対照 ５０％）。最適条件下で、培養物は化合物ＩＩＩ−３を用いて１週間以上維持することができた（示さず）。
化合物ＩＩＩ−３はヒナの胚の運動ニューロンの生存を濃度依存的様式で支持する
培養したヒナの運動ニューロンは、筋肉抽出物の存在下で生存し、そしてプロセスを広げることができるが、それらはその不存在下では急速に死ぬ。我々の実験では、４８時間後、１４％の非処理対照とは対照的に６５％の運動ニューロンが筋肉抽出物の存在下で生存した。無血清条件では、化合物ＩＩＩ−３の生存効果は３００ｎＭで最大であり、そして筋肉抽出物による誘導よりも幾分高かった（７９％）。この系における化合物ＩＩＩ−３の生存効果の濃度依存性は、３００ｎＭより高い化合物ＩＩＩ−３の濃度が進行的に低下する効果を示したので、末梢ニューロンにおける効果とは異なる（図１６Ａ）。これは運動ニューロンの化合物ＩＩＩ−３の幾つかの観点に対する特定の感受性を示しているのかもしれない。形態学的には、化合物ＩＩＩ−３により救済された運動ニューロンは、相が明るい細胞体を表し、そして長い神経突起を伸ばすことができ、これは筋肉抽出物により誘導されるものよりもわずかに太いようであった（図１７）。培養４日後、筋肉抽出物での４２％に比べて５６％の運動ニューロンが化合物ＩＩＩ−で生存した。３００ｎＭでは、化合物ＩＩＩ−で処理したニューロンはインビトロで少なくとも１週間生存した（示さず）。
化合物ＩＩＩ−３は完全な脊髄神経節から神経突起の成長を促進する
上記実験の結果は、化合物ＩＩＩ−３が末梢および中枢神経系に由来する胚のニューロンの生存を促進するだけでなく、がっしりした（ｒｏｂｕｓｔ）神経突起の成長ももたらすことを証明する。これらの伸長の多くが成長因子の存在下で現れる伸長よりも太いようであった（図１７Ａ〜Ｄから図１７Ｅ〜Ｈを比較されたい）。またこの効果は、２５０ｎＭの化合物ＩＩＩ−３の存在下で培養した完全な胚の脊髄神経節から現される神経突起の伸長でも観察された（図１８Ｃ）。神経突起はＮＧＦ（図１８Ｂ）および化合物ＩＩＩ−３の両方に応答して成長した；化合物ＩＩＩ−３の存在下での太く、おそらく繊維束である成長よりもＮＧＦにより現される成長は細く、そして分枝していた。
実施例３６：インビボ処理
ヒナの胚において発生的に調節された運動ニューロンの死
本実施例はＧｌｉｃｋｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１９９８，３５，３６１−３７０に詳細に記載されており、これは引用により全部、本明細書に編入する。Ｅ６で、ヒナの卵殻（スパファス（Ｓｐａｆａｓ）、プレストン、コネチカット州）に窓を作り、そして賦形剤（５％ Ｓｏｌｕｔｏｌ（商標）ＨＳ１５、ポリエチレングリコール６６０ヒドロキシステアレート；ＢＡＳＦ株式会社、ルートヴィヒスブルグ、ドイツ（リン酸緩衝化生理食塩水中、ｐＨ７．２））または賦形剤中の特定用量の化合物ＩＩＩ−３のいずれかを、Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５１，１６１６−１６１７（これは引用により全部、本明細書に編入する）に記載されたようにＥ６からＥ９にわたり１日１回、脈管化した漿尿膜に直接投与した。胚はＥ１０に殺し、そしてそれらの脊髄を摘出し、Ｃａｒｎｏｙの溶液（１０％氷酢酸、６０％無水エタノール、３０％クロロホルム）中に固定し、連続パラフィン切片に処理し、そしてチオニンで染色した。腰セグメント１〜８の２０番目毎の切片を、以前に記載された基準に従い計数した（Ｃｌａｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，細胞生物学の方法：細胞死（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ）、１９９５，Ｓｃｈｗａｒｔ ＆ Ｏｓｂｏｒｎｅ編集、アカデミック出版、ニューヨーク、第２７７〜３２１、これは引用により全部、本明細書に編入する）。
新生児ラットにおいて発生的に調節された運動ニューロンの死
不時の妊娠Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットは、ハレンラボラトリーズ（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（インディアナポリス、インディアナ州）から得た。メスのラットの子供には、５％Ｓｏｌｕｔｏｌ（ＴＭ）ＨＳ１５中の化合物ＩＩＩ−３または賦形剤を標的会陰筋肉上に、出生時（Ｐ１）から初めて５日間（Ｐ５）まで続けて、毎日皮下注射（ＳＣ）した。Ｐ１０またはＰ６０に子供を断頭し、血液をヘパリン処理した毛細管内に集め、そして球海綿体筋肉（ＳＮＢ）の性的に二形性の脊髄核を含む脊髄の領域および球海綿体筋（ＢＣ）および肛門挙（ＬＡ）筋を含む会陰領域を、動物に塩水／ホルマリンを潅流した後に切開した。ＳＮＢを含む脊髄の領域を後固定し（ｐｏｓｔｆｉｘｅｄ）、Ｐａｒａｐｌａｓｔに包埋し、１０μｍの切片とし、そしてＣｒｅｓｌｅｃｈｔバイオレットで染色した（Ｎｏｒｄｅｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２９，６７１−６７３、これは引用により全部、本明細書に編入する）。運動ニューロンは、以前に記載されたように（Ｎｏｒｄｅｅｎ，ｅｔ ａｌ．、同上）脊髄の腰５から仙骨部１領域まで、Ｘ５００で連続切片を計数した。顕微鏡の計数は、処置群に対して知らない観察者によりコード化した区分について行った。運動ニューロンの計数は細胞のサイズおよび切片の厚さについて補正し（Ｋｏｎｉｓｇｓｍａｒｋ、神経解剖学における最新の研究法（Ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏａｎａｔｏｍｙ）、Ｎａｕｔａ ＆ Ｅｂｂｅｓｓｏｎ編集、１９７０、スプリンガーファーラーク、ニューヨーク、第３１５−３４０頁、これは引用により全部、本明細書に編入する）、そして統計分析は分散分析（ＡＮＯＶＡ）であった。会陰筋肉組織を後固定し、脱石灰し、Ｐａｒａｐｌａｓｔに包埋し、１０μｍの切片とし、そしてＭｉｌｌｉｇａｎのＴｒｉｃｈｒｏｍｅで染色した。明視野顕微鏡を使用して（Ｘ２５０）、正常なメスおよび化合物ＩＩＩ−３で処理したメス（４０５動物／群）のＢＣおよびＬＡ筋肉は、それらの位置および横紋筋繊維の存在により陽性と同定された。筋肉組織の外形は投影型顕微鏡（６２．５）を使用して別の切片から追跡し、そして断面積はデジタル化パッドおよびコンピューターに基づく形態計測システム（Ｓｉｇｍａｓｃａｎ、ジャンデル サイエンティフィック（Ｊａｎｄｅｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を使用して測定した。筋肉容量は全断面積をデータ通信し、そしてそれに切片厚をかけ、そしてサンプリングした構造の割合について補正することにより算出した。
【０１６４】
集めた血液は室温で５分間遠心した；次いで血漿を除去し、そして−２０℃で凍結した。血清テストステロンレベル（６〜７動物／群）は、Ｗｉｎｇｆｉｅｌｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｒｏｉｄｓ，１９７５，２６，３１１−３２７（これは引用により全部、本明細書に編入する）に説明されている手順に従いラジオイムノアッセイにより測定した。
成体ラットにおいて軸索切断が誘導する運動ニューロン脱分化
Ｎｅｕｍｂｕｔｏｌの麻酔下、メスの成体Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（１２０〜１８０ｇ）の首で左舌下神経を切開し、そして５０μｌの化合物ＩＩＩ−３またはその賦形剤（５％Ｓｏｌｕｔｏｌ（商標）ＨＳ１５）を１片のＧｅｌｆｏｒｍ（商標）（ＡＪＢｕｃｋ、オイングスミル、メリーランド州）に適用し、次いで切開した神経の近位末端の回りに巻いた。７日後、動物に麻酔をかけ、そして４％パラホルムアルデヒド（Ｓｏｒｅｎｓｏｎのバッファー、０．０７Ｍ リン酸塩、ｐＨ７．２中）を潅流した 。脳幹を摘出し、そして４０μｍ厚の連続冠合縫合切片をクリオスタット上で切断した（Ｃｈｕｉ，ｅｔ ａｌ．，ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ，１９９４，５，６９３−６９６、これは引用により全部、本明細書に編入する）。各５番目の切片はケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）から得た抗−ＣｈＡＴモノクローナル抗体の１：３５０希釈を使用して、以前に記載されたようにＣｈＡＴ免疫組織化学用に処理した（Ｃｈｕｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１９９３，３２８，３５１−３６３、これは引用により全部、本明細書に編入する）。明らかにバックグラウンドより高く染色された細胞を染色された切片で計数した：数えた細胞数は、舌下核の軸索切断側のＣｈＡＴ−免疫反応性細胞数 対 対照（非創傷）側の免疫反応性細胞数の比率として表した。
【０１６５】
化合物ＩＩＩ−３はラットの胚の運動ニューロンをインビトロでアポトーシス死から救済し、そしてこれらの細胞にＪＮＫ活性化をもたらすシグナル伝達経路を阻害した（Ｍａｒｏｎｅｙ，，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１９９８，１８，１０４−１１１、これは引用により全部、本明細書に編入する）。インビボで活性の可能性を決定するために、化合物ＩＩＩ−３は、発生的に調節されたプログラムされた運動ニューロンの死の２つのモデルおよび成体の運動ニューロンに軸索切断が誘導する脱分化のモデルで評価した。ヒナでは、約５０％の脊髄運動ニューロンが、Ｅ５〜１０中にＰＣＤを受ける（Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１９８２，１，３８−５５；Ｐｕｒｖｅｓ ｅｔ ａｌ．，身体および脳：神経連結の栄養理論（Ｂｏｄｙ ａｎｄ Ｂｒａｉｎ；Ａ Ｔｒｏｐｈｉｃ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｎｅｕｒａｌ Ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ）、１９８８、ハーバード大学出版、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、両方とも引用により全部、本明細書に編入する）。この期間中、化合物ＩＩＩ−３の漿尿膜への適用は運動ニューロンの死亡を用量依存的様式で防止した（図１９）。通常死ぬ運動ニューロンの４０％が試験した最高用量で救済され（２．３および７μｇ／日）、一方２５％の運動ニューロンがより低用量で救済された（１．２および１．８μｇ／日）（図１９）。
【０１６６】
メスのラットの初期周産期中（出生後（ＰＮ）４日までの後期胚段階）、ＳＮＢの５０％より多くの運動ニューロンがＰＣＤを介して排除される（Ｂｒｅｅｄｌｏｖｅ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１９８６，１７，１５７−１７６、これは引用により全部、本明細書に編入する）。オスでは、この核の運動ニューロンがＩ性交反射に関与する陰横筋（ｓｔｒｉａｔｅｄ ｐｅｎｉｌｅ ｍｕｓｃｌｅ）に神経を分布する。アンドロゲン系ステロイドの精巣分泌はオスのＳＮＢ運動ニューロン死を低下し、そしてニューロンにより神経が分布されるＢＣおよびＬＡ筋肉の萎縮性を一層防止する。テストステロンをメスの子供に投与すると、ＳＮＢ運動ニューロンの完全な男性数をもたらし（Ｎｏｒｄｅｅｎ，ｅｔ ａｌ．、同上）、そしてＢＣおよびＬＡ筋肉の萎縮を防止した（Ｗａｉｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１９４１，２９，９５５−９７８、これは引用により全部、本明細書に編入する）。化合物ＩＩＩ−３をメスのラットへ毎日ｓｃ投与すると（ＰＮ １−５）、運動ニューロン死が有意に弱められた（図２０Ａ）。化合物ＩＩＩ−３によるＳＮＢ運動ニューロン死の救済は、２つの用量で起こった（１日あたり０．５および１ｍｇ／ｋｇ）。１日あたり０．５および１ｍｇ／ｋｇの最も効果的な用量で、化合物ＩＩＩ−３の投与は運動ニューロンの生存に７０％の増大を生じ、これはテストステロンの効果に等しかった（図２０Ａ）。化合物ＩＩＩ−３は処置したメスの血漿テストステロンレベルを変えなかった。１日あたり１−ｍｇ／ｋｇ群の血漿テストステロンレベルの放射免疫測定は、賦形剤対照群と比較した時に有意な差異をもたらさなかった（それぞれ０．０１６±０．００８ｎｇ／ｍＬおよび０．０１９±０．０１５ｎｇ／ＭＬの平均標準偏差（Ｓ．Ｅ．Ｍ））。
【０１６７】
化合物ＩＩＩ−３処置が運動ニューロン生存の長期維持に効果的かどうかを決定するために、メスを化合物ＩＩＩ−３（１日あたり０．５および１ｍｇ／ｋｇ）で同じ期間ＰＮ（１−５）処置した。賦形剤および両処置群の動物の半分をＰＮ１０で屠殺した。次いで残りの動物はＰＮ６０で屠殺するまでさらなる化合物ＩＩＩ−３無しで維持した。すでに観察されたように（図２０Ａ）、化合物ＩＩＩ−３の処置は運動ニューロンの生存に７０％の増大をもたらした（図２０Ｂ）。さらにこれらの救済された運動ニューロンの１００％が、化合物ＩＩＩ−３で最後に処置してから５５日後に形態学的に同定可能であった（図２０Ｂ）。新生児期間における化合物ＩＩＩ−３の運動ニューロン死の阻害は、成体まで運動ニューロンの生存を可能とした。
【０１６８】
筋萎縮性硬化症のようなヒト成体の疾患における運動ニューロンの損失の明白な証明および破壊的効果にもかかわらず、運動ニューロン損傷のほとんどの動物モデルにおいて成体の運動ニューロンは死に対して抵抗する。しかし変性している運動ニューロンでは変性的な変化が病死に進行することを模することができる成体の運動ニューロンにおいて、軸索損傷は形態的（Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ，ｅｔ ａｌ．，同上）ならびに生物化学的（Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ，ｅｔ ａｌ．，同上；Ｒｅｎｄｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１９９２，３１９，２８５−２９８、これは引用により全部、本明細書に編入する；Ｃｈｉｕ， ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１９９３，３２８，３５１−３６３、これは引用により全部、本明細書に編入する）変化をもたらす。この種の変化の１例は、舌に神経を分布する舌下神経の軸索切断から生じる。成体ラットでこの神経の片側切断は、７日後に同側核のＣｈＡＴ−免疫反応性舌下運動ニューロンに９５％の喪失をもたらした（Ｃｈｉｕ， ｅｔ ａｌ．，ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ，１９９４，５，６９３−６９６、これは引用により全部、本明細書に編入する）。ＣｈＡＴ−免疫反応性の喪失は、永久的ではなかった。軸索切断から４週間後、１００％の運動ニューロンが対照レべルのＣｈＡＴ−免疫反応性を回復した（Ｂｏｒｋｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌ．，１９９３，２２，１４１−１５３、これは引用により全部、本明細書に編入する）。反対側の舌下運動ニューロンのＣｈＡＴ−免疫反応性は影響を受けなかった（Ｃｈｉｕ， ｅｔ ａｌ．、同上）（図２１および表５）。
【０１６９】
Ｇｅｌｆｏａｍ（商標）を舌下神経の近位末端に適用した時、化合物ＩＩＩ−３は軸索切断から７日後に評価した同側舌下運動ニューロンにおいてＣｈＡＴ−免疫反応性を用量依存的に弱めた。最も効果的な用量（５０μｇ）で、軸索切断した非処置対照と比べて４０％より多くのＣｈＡＴ−免疫反応性運動ニューロンをもたらした（図２１Ｂおよび表５）。より低いまたは高い用量でべル型の用量依存性があり、非処置対照よりも高い生存をもたらしたが、５０μｇで達成された生存よりは少なかった。ＳＮＢモデルでも示されたように、関連した体重の減少、致死率または大きな組織傷害は試験したどの用量でもこれらの動物になかった。
【０１７０】
インビボの運動ニューロン変性の３つの別のモデルで、化合物ＩＩＩ−３は神経保護的活性を示した：胚の腰の脊髄運動ニューロンの発生的に調節されるＰＣＤ（図１９）、出生後ＳＮＢ運動ニューロンのアンドロゲン−感受性死（図２０）、および成体の舌下運動ニューロンにおける軸索切断が誘導する機能的マーカー、ＣｈＡＴの喪失（図２１および表５）。化合物ＩＩＩ−３はｓｃ注射により末梢的に投与した時、神経の切断末端に局所的に適用した時、またはヒナの胚の漿尿膜上に直接のせた時、効果的であった。元の分子Ｋ−２５２ａとは対照的に、化合物ＩＩＩ−３は運動ニューロンが濃縮されたカルチャー中での生存の媒介に約５倍以上効力があり（データは示さず）、そしてｔｒｋＡチロシンキナーゼおよび数種のセリントレオニンキナーゼに対する阻害活性を現さなかった（Ｍａｒｏｎｅｙ，ｅｔ ａｌ．，同上；Ｋａｎｅｋｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，４０，１８６３−１８６９、これは引用により全部、本明細書に編入する）。
【０１７１】
【表７】
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【０１７２】
化合物ＩＩＩ−３または賦形剤をゲル発泡状で切開直後の舌下神経の近位末端に加えた。７日後、動物を屠殺し、そして舌下核を通して連続的に切片とし、そして５番目毎の切片を抗−ＣｈＡＨ抗体で免疫的に染色した。ＣｈＡＨ−陽性ニューロンの計数は、核の同側（実験）および反対側（対照）で行った。
＊ｐ＜０．０５、対照の賦形剤−処置動物に比べて統計的に有意。
ＭＬＫ−３経路の阻害はインビボ効力を証明し、そしてＭＰＴＰモデルにおけるＭＬＫ−３の下流のリン酸化反応を遮断する
ＭＰＴＰは、線条体のドパミン作用性末端および黒質の細胞体の損失を生じる用量（４０ｍｇ／ｋｇ）で投与した。チロシンヒドロキシラーゼを黒質内のドパミン作用性神経末端のマーカーとして使用した。全身的に投与した化合物ＩＩＩ−３は、ＭＰＴＰ損傷後に黒質チロシンヒドロキシラーゼ免疫反応性ニューロンの損失を弱めた（図２２Ａ；Ｓａｐｏｒｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。化合物ＩＩＩ−３はＭＬＫ−３の既知のインヒビターであるので、ＭＬＫ−３の下流基質の活性化をＭＰＴＰ−処置マウスで測定した。リン酸化されたＭＫＫ４のレベルは、イムノブロット（図２２Ｂ）またはＥＬＩＳＡ（図２２Ｃ）のいずれかによりＭＫＫ４のモノリン酸化状態を認識するホスホ−ＭＫＫ４特異的抗体（ニューイングランドバイオラボズ、ベバリー、マサチューセッツ州）を使用して測定した。ＭＰＴＰの投与は、対照レベルの５倍まで黒質中のリン酸化ＭＫＫ４レベルを上昇させた（図２２Ｂ）。ピーク上昇はＭＰＴＰの投与から４時間後に起こり、そしてＭＰＰ＋のピークＣＮＳレべルと一致した。ＭＰＴＰが媒介するＭＫＫ−４リン酸化は、１−デプレニルの前処置により弱められ、これらのリン酸化反応がＭＰＰ＋により媒介されることを示唆した（図２２Ｃ）。さらにＭＫＫ４リン酸化は、ＭＰＴＰが誘導する黒質のドパミン作用性の損失に対して保護を生じる化合物−ＩＩＩの前処置用量（１ｍｇ／ｋｇ）で部分的に阻害された（図２２Ｃ）。これらのデータはＭＰＴＰ（ＭＰＰ＋）がＭＫＫ４（ＭＬＫ−３の下流基質）を活性化することを示す。さらにこれらのデータは既知のＭＬＫ−３のインヒビターがこのキナーゼ経路の活性化をインビボで阻害することを示す。
実施例３７：炎症
ＴＨＰ−１細胞におけるＬＰＳによるＩＬ−１およびＴＮＦ−αの誘導およびそれらの誘導に及ぼすインドロカルバゾールおよびピロロカルバゾールの効果
多くのキナーゼが多数の免疫学的機能の調節、例えばサイトカインの合成誘導およびサイトカインの生物学的応答の誘導に関与しているので、免疫系の細胞を選択した。最近の報告（Ｈａｍｂｌｅｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９６，９３，２７７４−２７７８、これは引用により全部、本明細書に編入する）は、ＬＰＳを用いた単球由来細胞の処理がＪＮＫ活性の急速な活性化を引き起こすことを示した。単球がリポポリサッカライド（ＬＰＳ）のような細菌のエンドトキシンに接触すると、それらは炎症性サイトカインであるＩＬ−１およびＴＮＦ−αを生産する。これら２種のサイトカインの生産を阻害することは、免疫系の特定の炎症性障害の有用な処置となり得る。これらのサイトカインは市販のＥＬＩＳＡキットにより容易に測定することができる。我々は（１）インドロ−および縮合ピロロカルバゾールがＩＬ−１およびＴＮＦ−αの合成を我々の単球細胞系ＴＨＰ−１で阻害することができるかどうか、（２）ＴＨＰ−１細胞でＬＰＳによりＪＮＫが活性化されるかどうか、（３）ＬＰＳによるＪＮＫの活性化がインドロ−および縮合ピロロカルバゾールにより阻害できるかどうかを決定するための実験を計画した。
実験手順
ＴＨＰ−１細胞は、１０％ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ １６４０培地で成長させた。ＬＰＳ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型０１１１．Ｂ４、ＴＣＡ抽出した）はシグマから購入し、そしてＰＢＳに溶解した。ＩＬ−１およびＴＮＦ−αをアッセイするＥＬＩＳＡキットはベーリンガー−マンハイムから購入し、そしてＴＨＰ−１培養基のアッセイは製造元の指示どおりに行った。指示に従う標準曲線は、各アッセイで得た。
【０１７３】
実験は４×１０５細胞／ｍｌの１または２ｍｌのＴＨＰ−１細胞のいずれかを用いて、１２ウェル培養プレート中で行った。ＩＬ−１およびＴＮＦ−αはＬＰＳを培養基に加えることにより誘導し、そしてその後のサイトカインアッセイのために種々の時間で培地を集めた。細胞は遠心により除去し、そして上清をアッセイするまで−７０℃で凍結した。経費を最小にするために、実験は２連の培養で行い、そして２連の上清を遠心後にプールした。各プール上清を２連でアッセイした。１００％ＤＭＳＯ中のインドロ−および縮合ピロロカルバゾールのストック溶液は、１０％ウシ胎児血清を含有する培地または０．５ｍｇ／ｍｌＢＳＡを含有する培地のいずれかで所望の濃度に希釈した。特に言及しない限り、化合物はＬＰＳの添加１時間前にＴＨＰ−１細胞に加えた。
【０１７４】
ＪＮＫ活性に関するアッセイは溶解したＴＨＰ−１細胞の抽出物に由来するＪＮＫタンパク質を免疫沈降させた後に行った。ペレット化したＴＨＰ−１細胞は氷上で１５分間、５００μｌのＦｒａｃ バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＮａＣｌ、３０μＭ ピロリン酸ナトリウム、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）中で溶解した。抽出物は１４Ｋで１０分間遠心し、そして５μｌのＪＮＫ抗体（サンタ クルズ）を上清に加えた。抽出物は４℃で６０分間回転し、７５μｌの洗浄したプロテインＡＳｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｆｒａｃ中の２０重量／容量％）を加え、そして抽出物をさらに３０分間回転させて、抗体複合体をプロテインＡＳｅｐｈａｒｏｓｅに結合させた。プロテインＡＳｅｐｈａｒｏｓｅをＦｒａｃ バッファーで２回洗浄し、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．６、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ ＤＴＴで１回洗浄し、次いで３０μｌのキナーゼバッファー（２０ｍＭ ｈｅｐｅｓ、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ＭＭ ＤＴＴ、１μｇ組換えｃ−ｊｕｎおよび２μＭ ＡＴＰ−γ３２Ｐ、２μＣｉ）中で３０℃で１５分間インキューベーションした。反応は１０μｌの４×ＳＤＳゲル添加バッファーを加えて停止し、そして８０℃で３分間加熱し、そしてタンパク質を１０％ ＳＤＳゲルで分析した。ゲルを乾燥させ、Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒプレートに暴露し、そして放射性バンドをＰｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ上で分析した。
【０１７５】
最初の実験結果は、ＬＰＳが２μｇ／ｍｌでＩＬ−１の最大収量を与えることを示し、そしてこの濃度のＬＰＳをその後のすべての実験に使用した。サイトカインの最大収量 のためにＬＰＳを添加した後の最短時間は、ＬＰＳの添加後のさまざまな時間にアッセイ用の培地のアリコートを取ることにより決定した。第１実験で、ＩＬ−１およびＴＮＦ−αの両方がＬＰＳの添加から５時間以内に最大の収量に達したことが示された。第１実験での最短回収時間は２．４時間であったので、第２実験はＬＰＳの添加から１５分後に培地回収を始めて行った。ＴＮＦ−αのみをアッセイしたこの実験結果は、これがＬＰＳを添加してから３時間後に最大収量に達したことを示した。ＬＰＳ添加から９０分以内には、培地中に有意なＴＮＦ−αは見られなかった。
【０１７６】
最大収量の迅速な達成は２種類のサイトカインの合成の大変強力な調節−迅速な合成および迅速なダウンレギュレーションを示していた。細胞のカルチャーはＬＰＳの添加３０分前に、アクチノマイシンＤ（ＲＮＡ合成インヒビター）またはシクロヘキシミド（タンパク質合成インヒビター）のいずれかで処理した。培地はＬＰＳの添加から３時間後に集め、そしてＴＮＦ−αをアッセイした。いずれのインヒビターで処理した培地中にもＴＮＦ−αは見られなかったので、新規ＲＮＡおよび新規タンパク質合成のいずれもＴＮＦ−αの誘導を必要とする。次の実験は化合物ＩＩＩ−３がＩＬ−１およびＴＮＦ−αの誘導を阻害するかどうかを決定するために行った。化合物ＩＩＩ−３は、ＩＬ−１およびＴＮＦ−αの両方の誘導をそれぞれ２６７ｎＭおよび１３９ｎＭのＩＣ５０値で阻害した。これらの実験結果は、１０％ウシ胎児血清を含む培地中での細胞を用いて得られた。化合物の神経栄養的活性について脊髄組織および基底前脳組織を用いたアッセイは無血清培地（５００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ）で行うので、無血清培地でのＩＬ−１およびＴＮＦ−αの阻害についてＩＣ５０値を決定することは興味深かった。ＴＨＰ−１細胞を無血清培地（５００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ）中の化合物ＩＩＩ−３で処理した時、ＩＣ５０値は２６９ｎＭから２３ｎＭへと１０倍低下した。特に言及しない限り、これから行うすべての実験は無血清培地で行った。ＴＨＰ−１細胞における化合物ＩＩＩ−３によるＩＬ−１およびＴＮＦ−α誘導の阻害は、化合物ＩＩＩ−３がこれらサイトカインの正常量を越えた生産により引き起こされる病理学的症状の処置に治療薬として有用となるかもしれないことを示唆している。敗血症ショックはそのような症状である。敗血症ショックは、循環しているグラム陰性細菌が増殖し、次いでこれが大量のエンドトキシン、ＬＰＳを放出することにより引き起こされる。次いでＬＰＳは主に単球を刺激し、そしてマクロファージが大量のＩＬ−１およびＴＮＦ−αを生産し、これは大きな組織傷害、そして多くの場合で死を引き起こす。
【０１７７】
数種の化合物について、それらがＴＮＦ−αを阻害する能力を試験し、そしてＪＮＫを阻害する能力と比較した。結果を表６に示す。
【０１７８】
【表８】
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【０１７９】
化合物ＩＩＩ−３がＪｕｒｋａｔ細胞中のＩＬ−２誘導に及ぼす効果
実験は化合物ＩＩＩ−３がＪｕｒｋａｔ細胞中のＩｌ−２誘導を阻害するかどうかを決定するために行った。
実験手順
Ｊｕｒｋａｔ細胞は１０％ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ １６４０培地で成長させた。ＴＮＦ−αはプロメガから、そして抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体はファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）からであった。Ｊｕｒｋａｔ実験は９６ウェルプレート中の２００μｌで行った。ＩＬ−２はベーリンガー−マンハイムから購入したＥＬＩＳＡキットで測定した。ＣＤ３およびＣＤ２８に対する抗体は、Ｊｕｒｋａｔ細胞を加える前に９６ウェルプレートのプラスチックに結合させた（ＰＢＳ中で１８時間）。細胞は抗体をコートしたプレートに加える前に１時間、化合物で処理した。ＣＤ３およびＣＤ２８に対する抗体は、Ｔ細胞受容体を活性化し、そしてＩＬ−２を誘導するために使用した。ＩＬ−２は誘導の開始６から２４時間の間に、Ｊｕｒｋａｔ細胞から放出された（図２３Ａ）。ＩＬ−２は構成的には作成されなかった（図２３Ａ ＣＮＴ）。化合物ＩＩＩのＩＬ−２誘導に及ぼす効果（誘導前に化合物ＩＩＩ−３で１時間処理）を次に評価した（図２３Ｂ）。５００ｎＭ濃度の化合物ＩＩＩ−３は、ＩＬ−２誘導を８０％より以上まで阻害した（図２３Ｂ）。より徹底的な用量応答実験を化合物ＩＩＩ−３および化合物Ｉ−４で行い、化合物ＩＩＩ−３については１３９ｎＭ、そして化合物Ｉ−４については２０７ｎＭのＩＣ５０値を与えた（図２３Ｃ）。
【０１８０】
本明細書中で言及した各特許、特許出願および印刷された公報は全部、引用により本明細書に編入するものとする。
【０１８１】
当業者は、本発明の精神から逸脱することなく本発明の好適な態様に対する多数の変更または修飾を行うことができると考えるだろう。そのようなすべての変更は本発明の範囲内にあるものとする。
【図面の簡単な説明】
本発明の態様を具体的に説明する目的で、図面に特定の特徴を示す。しかし本発明は示した正にその態様に限定されると考えるべきではない。
【図１】
架橋化インデノピロロカルバゾールの一般的調製法を示す該略図である。
【図２】
架橋化インデノピロロカルバゾールの一般的調製法を示す該略図である。
【図３】
樹脂に結合したインデノピロロカルバゾールの調製を示す該略図である。
【図４】
保護された可溶性インデノピロロカルバゾールの調製を示す該略図である。
【図５】
中間体Ｖの調製を示す該略図である。
【図６】
方法Ａを使用した架橋化インデノピロロカルバゾールの調製を示す該略図である。
【図７】
方法Ｂを使用した架橋化インデノピロロカルバゾールの調製を示す該略図である。
【図８】
Ｂ環が置換された架橋化インデノピロロカルバゾールの調製を示す該略図である。
【図９】
架橋化インデノピロロカルバゾールのＥ環の誘導化を示す該略図である。
【図１０】
ＮＧＦの不存在下で培養５日後に残る、生きているニューロンに分化したＰＣ１２細胞の量を表す２つの別個の実験のグラフを示す。結果は各群内のＮＧＦ対照のパーセントとして表す（ＮＧＦの不存在下でのベクター対照、ｎ＝１２；すべての他の群、ｎ＝３）。ベクター対照とＮＧＦの不存在下でドミナントネガティブＭＬＫ３突然変異体を発現する細胞の安定なプールとの間の差異は、両側検定Ｔ−検定により決定されるように統計的に有意である（ｐ＜０．０５）。
【図１１】
図１１Ａは、放射活性ゲルに基づくアッセイを使用して、バキュロウイルスが発現したＦＬＡＧ−ＭＬＫ−３（完全長およびキナーゼドメインの混合物）によるキナーゼが不活性化されたＧＳＴ−ＳＥＫ−１のリン酸化を示す。
図１１Ｂは、バキュロウイルスが発現したＦＬＡＧ−ＭＬＫ−３（完全長およびキナーゼドメインの混合物）またはＧＳＴ−ＭＬＫ−３キナーゼドメインにより触媒されるキナーゼ反応の結果として形成された３２Ｐ−標識リン酸化ミエリン塩基性タンパク質産物を示す。
【図１２】
ホスホ−特異的ＳＥＫ−１抗体により検出されるバキュロウイルスが発現したＦＬＡＧ−ＭＬＫ−３（完全長およびキナーゼドメインの混合物）によるキナーゼが不活性化したＳＥＫ−１のリン酸化を示すイムノブロット分析である。
【図１３】
（ｏ）マルチスクリーントリクロロ酢酸沈殿アッセイまたは（・）ホスホセルロース膜法を使用した、細菌が発現したＧＳＴ−ＭＬＫ−３によるミエリン塩基性タンパク質のリン酸化を示す。
【図１４】
ＭＬＫ−３バキュロウイルス感染昆虫細胞の溶解物とインキューベーションした［３Ｈ］Ｋ２５２ａの飽和結合曲線を表す。
【図１５】
図１５Ａは、ＭＬＫ−３、ＭＬＫ−２またはＤＬＫを過剰発現し、そして０．０２５％ＤＭＳＯまたは５００ｎＭ Ｋ−２５２ａのいずれかで処理した細胞からの免疫沈降／キナーゼ反応における３２Ｐ−標識ｃ−ｊｕｎの量を示す。
図１５Ｂは、図１５Ａに記載したサンプルに由来する免疫沈降／キナーゼ反応に残る活性を定量するグラフを表す。カラムは２連のサンプルの平均を表し、ここで誤差棒は平均の範囲を示す。
図１５Ｃは、示した種々の量のｃＤＮＡでＨＡ−ＪＮＫ１単独またはＭＥＫＫ１を過剰発現し、そして０．０２５％ＤＭＳＯ（対照）または５００ｎＭの化合物ＩＩＩ−３のいずれかで処理した細胞からの免疫沈降／キナーゼ反応における３２Ｐ−標識ｃ−ｊｕｎの量を示す（表３を参照にされたい）。カラムは２連のサンプルの平均を表し、ここで誤差棒は平均の範囲を示す。
【図１６】
化合物ＩＩＩ−３が濃度依存的様式でニューロンの生存を促進することを示す。分離したニューロンは、示した栄養因子の存在または不存在下で交感神経節（ＳＧ）（Ａ）、脊髄神経節（ＤＲＧ）（Ｂ）、毛様体神経節（ＣＧ）（Ｃ）および運動ニューロン（ＭＮ）（Ｄ）から培養した。細胞は材料および方法に記載したように、プレートにまいてから４８時間後に計数した。データは、３連または４連の測定の平均±ＳＤを表す。示したのは３回の実験のものである。
【図１７】
各神経栄養因子（交感および感覚ニューロンには２０ｎｇ／ｍｌ ＮＧＦ、毛様体ニューロンには１０ｎｇ／ｍｌ ＣＮＴＦ、運動ニューロン（Ａ−Ｄ）には３０μｇ／ｍｌの筋肉抽出物（ＭＥＸ）の存在下）、あるいは１μＭの化合物ＩＩＩ−３の存在下（Ｅ−Ｈ）の培養で、４８時間後（毛様体ニューロンについては２４時間）のＥ１２ ＤＲＧ（Ａ、Ｅ）、Ｅ９交感（Ｂ、Ｆ）、Ｅ８毛様体（Ｃ、Ｇ）およびＥ５運動ニューロン（Ｄ、Ｈ）のカルチャーの位相差顕微鏡写真である。棒＝２００ｎｍ。
【図１８】
インビトロで脊髄神経節エクスプラントの顕微鏡写真を表す。ヒナのＤＲＧ（Ｅ９）のエクスプラントは、０．０５％ ＢＳＡを含有する９６−ウェルプレート培地にまいた。２時間の付着時間後、添加を行った：（Ａ）対照ＤＭＳＯ；（Ｂ）２０ｎｇ／ｍｌ ＮＧＦ；（Ｃ）２５０ｎＭ 化合物ＩＩＩ−３。４８時間後、培地を除去し、そしてエクスプラントを４％のパラホルムアルデヒド（リン酸緩衝化生理食塩水中）に固定した。
【図１９】
特別用量の化合物ＩＩＩ−３で毎日処理（Ｅ５−９）した後にＥ１０に関するヒナの腰部運動ニューロンの生存数を示す。示したデータは、５〜６匹の動物／処置群の平均±Ｓ．Ｄ．である。報告した実験は２回繰り返した。データは１つの代表的実験からのものであり、そして腰部カラムの片側を表す。＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．００１。ボンフェローニの補正を用いた化合物ＩＩＩ−３と対照群との間のスチューデントｔ検定。
【図２０】
化合物ＩＩＩ−３または対照賦形剤（５％Ｓｏｌｕｔｏｌ（商標））で毎日処置した（ＰＮ１−５）後にＰＮ１０またはＰＮ６０で生存する球海綿体筋（ＳＮＢ）のメスのラット脊髄核中の運動ニューロンの数を示す。ＰＮ１０（Ａ、Ｂ）またはＰＮ６０（Ｂ）でラットを屠殺し、そしてＳＮＢを含む脊髄の領域を分離し、そして組織学用に処理した；Ｃｒｅｓｙｌｅｃｈｔ バイオレットで染色した運動ニューロンは、すでに記載（Ｗｉｎｇｆｉｅｌｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｒｏｉｄｓ，１９７５，２６，３１１−３２７）されたように脊髄の腰部５−仙骨１領域の連続切片中を計数した。実験データは４〜８匹の動物／処置群の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である。
【図２１】
化合物ＩＩＩ−３で処置した後の成体ラットにおいて舌下軸索切断後のＣｈＡＴ免疫活性の損失を示す。舌下神経の切断、そして（Ａ）賦形剤溶液単独（５％Ｓｏｌｕｔｏｌ（商標））および（Ｂ）２００μｇの化合物ＩＩＩ−３を切開部位に適用した後の舌下核の顕微鏡写真。（Ｃ）上記の（Ａ）および（Ｂ）に記載した処理後のＣｈＡＴ免疫反応性舌下運動ニューロンの数。結果は、ＣｈＡＴ−免疫反応性運動ニューロンのパーセントとして表し、対側、片側舌下核におけるＣｈＡＴ−免疫反応性運動ニューロンの数を１００％と定めた。
【図２２】
ＭＬＫ−３経路の阻害がイノビボ効力および下流のリン酸化反応の遮断を示すことを表す。図２２Ａは、化合物ＩＩＩ−３の全身投与でＭＰＴＰ損傷後に、黒質チロシンヒドロキシラーゼ免疫応答性ニューロンの上昇を示す。図２２Ｂは、ＭＰＴＰがリン酸化ＭＫＫ４レベルの上昇を誘導したことを示す代表的なイムノブロットである。図２２Ｃは、化合物ＩＩＩ−３の存在下でＭＰＴＰが誘導するリン酸化ＭＫＫ４の弱化を示す代表的なイムノブロットおよびＥＬＩＳＡを表す。
【図２３】
Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＩＬ−２の誘導を示す。図２３ＡはＩＬ−２誘導のタイムコースを示す。図２３Ｂは化合物ＩＩＩ−３によるＩＬ−２誘導の阻害を示す。図２３Ｃは化合物ＩＩＩ−３および化合物Ｉ−４によるＩＬ−２誘導の阻害を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2005503102.tif 000042
【図１２】
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【図１３】
2005503102.tif 000044
【図１４】
2005503102.tif 000045
【図１５ＡＢ】
2005503102.tif 000046
【図１５Ｃ】
2005503102.tif 000047
【図１６ＡＢ】
2005503102.tif 000048
【図１６ＣＤ】
2005503102.tif 000049
【図１８】
2005503102.tif 000050
【図１９】
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【図２０】
2005503102.tif 000052
【図２１】
2005503102.tif 000053
【図２２ＡＢ】
2005503102.tif 000054
【図２２Ｃ】
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【図２３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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