(57)【要約】本発明は、Ｂ細胞媒介疾患、特にＢ細胞リンパ腫の診断及び／又は治療のためのワクチン、抗体及び診断ツールを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ細胞特異抗原（BLSA）（配列番号２）に結合する分子。
【請求項２】
アゴニストである請求項１記載の分子。
【請求項３】
アンタゴニストである請求項１記載の分子。
【請求項４】
抗体、ペプチド、リガンド、小さな分子又はオリゴヌクレオチドである請求項１ないし３のいずれか１項に記載の分子。
【請求項５】
抗体又はその結合性断片である請求項４記載の分子。
【請求項６】
モノクローナル、キメラ、ヒト、ヒト化、二重特異的又はヘテロコンジュゲートである請求項５記載の抗体。
【請求項７】
F(ab')2、F(ab)2、Fab'又はFabである請求項５記載の抗体断片。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項に記載の分子と、薬理的に許容できる担体、希釈剤、賦形剤及び／又は添加物とを含む組成物。
【請求項９】
請求項８記載の組成物を投与することを含む、Ｂ細胞媒介疾患の治療方法。
【請求項１０】
前記Ｂ細胞媒介疾患がＢ細胞リンパ腫である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｂ細胞媒介疾患が、小胞細胞リンパ腫、びまん性小リンパ球性リンパ腫／慢性リンパ球性白血球(CLL)、リンパ形質球様／ワルデンストレームマクログロブリン血症、周辺帯リンパ腫及びヘアリーセル白血病から成る群より選ばれる請求項９記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｂ細胞媒介疾患が、びまん性大細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫／びまん性小非開裂細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、外套細胞リンパ腫及びAIDS関連リンパ腫から成る群より選ばれる請求項９記載の方法。
【請求項１３】
配列番号２、配列番号２の変異体、及び配列番号２の断片からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するポリペプチドであって少なくとも１個のエピトープを有するポリペプチドを含む、Ｂ細胞リンパ腫の治療用ワクチン。
【請求項１４】
配列番号１、配列番号１の変異体、及び配列番号１の断片から成る群より選ばれるヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドであって、少なくとも１個のエピトープを有するポリペプチドを含む、Ｂ細胞リンパ腫の治療用ワクチン。
【請求項１５】
請求項１３又は１４記載のワクチンを投与することを含む、患者のＢ細胞リンパ腫又は他のＢ細胞媒介疾患に対して免疫する方法。
【請求項１６】
前記ワクチンを、同時に又は同期間内に、アジュバントと組み合わせて投与することをさらに含む請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記ワクチンを、同時に又は同期間内に、第２の抗原と組み合わせて投与することをさらに含む請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
前記第２の抗原はクラスII抗原である請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
BLSA又はその免疫原性断片を発現する核酸配列であって、プロモーターに動作的に連結された核酸配列を含むDNA構築物。
【請求項２０】
クラスII抗原をさらに含む請求項１９記載の構築物。
【請求項２１】
請求項１５記載の方法に応答して生産された、単離された抗体。
【請求項２２】
BLSAをコードするDNA分子であって、該DNA分子の発現を制御する調節配列に動作的に連結されたDNA分子を含む組成物を投与することを含み、BLSAが前記細胞中で発現され、免疫応答がBLSAに対して引き起こされる、哺乳動物内でBLSAに対する免疫応答を誘起する方法。
【請求項２３】
細胞障害性Ｔリンパ球(CTL)応答を誘起する少なくとも１個のエピトープを含むBLSAペプチド。
【請求項２４】
細胞障害性Ｔリンパ球(CTL)誘起ペプチドを投与することを含む、哺乳動物内においてBLSAに対する免疫応答を誘起する方法。
【請求項２５】
BLSAの細胞障害性Ｔリンパ球(CTL)誘起ペプチドを発現するベクターを投与することを含む、哺乳動物内においてBLSAに対する免疫応答を誘起する方法。
【請求項２６】
BLSAの細胞障害性Ｔリンパ球(CTL)誘起ペプチドを発現するベクターを含む宿主細胞。
【請求項２７】
Ｂ細胞リンパ腫細胞を、アンチセンス核酸又は前記RNA種若しくは該RNA種をコードするDNAにハイブリダイズするアンチセンス核酸模倣物にさらすことを含む、前記Ｂ細胞リンパ腫細胞中におけるBLSAの翻訳速度を減少させる組成物を投与することによりBLSAの発現を阻害する方法。
【請求項２８】
(a)  BLSAをコードする遺伝子を含む細胞を、BLSA遺伝子から転写されるmRNAのレベルの変調を可能にするのに十分な条件下で、候補剤と接触させる工程と、
(b)  mRNAを単離する工程と、
(c)  検出されたmRNAの量を、候補剤の非存在下で検出された量と比較し、それに基づいて、BLSAの発現を変調する候補剤の能力を決定する工程とを含む、BLSAの発現を変調する能力を有する剤のスクリーニング方法。
【請求項２９】
(a)  結合を可能にするのに十分な条件下でBLSAを候補剤と接触させる工程と、
(b)  BLSA／剤複合物の存在を検出する工程とを含む、BLSAに結合する能力を有する剤のスクリーニング方法。
【請求項３０】
前記候補剤は、小さな分子のコンビナトリアルライブラリー中に存在する請求項２８又は２９記載の方法。
【請求項３１】
BLSAを発現することができる細胞を、BLSAをコードするDNA又はRNAポリヌクレオチドの転写又は翻訳を干渉する分子に曝露することを含む、BLSAをコードするDNA又はRNAポリヌクレオチドの転写又は翻訳を干渉することによる細胞性BLSAの発現のブロック又は変調方法。
【請求項３２】
前記分子は、BLSAをコードするDNA又はRNAポリヌクレオチドの正しい転写又は翻訳を干渉するアンチセンス分子、RNAi分子又はリボザイム分子である請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記分子は、BLSAをコードするDNA又はRNAポリヌクレオチドの正しい転写又は翻訳を干渉するアンチセンスヌクレオチドである請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
患者から細胞、組織又は体液試料を採取し、
前記組織又は体液にBLSAが存在するか分析し、そして
前記組織又は体液中におけるBLSAの発現レベルに基づいて、患者のBLSA媒介疾患に対する疾病素質を予測することを含む、患者がBLSAの調節されない発現により引き起こされるBLSA媒介疾患を発達させる疾病素質を診断する方法。
【請求項３５】
定まったレベルのBLSAを含むことが知られている、細胞、組織又は体液試料を患者から採取し、
前記組織又は体液にBLSAが存在するか分析し、そして
該組織又は体液中のBLSAのレベルを分析し、正常な細胞、組織又は体液について確立された、定められた又は測定されたレベルと比較した、該組織又は体液中のBLSAの量の変化に基づいて患者のBLSA媒介疾患に対する疾病素質を予測することを含む、患者がBLSAの調節されない発現により引き起こされるBLSA媒介疾患を発達させる疾病素質を診断する方法。
【請求項３５】
疾患を予防又は治療できる量のBLSAアゴニスト又はアンタゴニストを哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物内でBLSAタンパク質媒介疾患を予防又は治療する方法。
【請求項３６】
前記BLSAアゴニスト又はアンタゴニストが抗体である請求項１９記載の方法。
【請求項３７】
単離したBLSA又はその抗原性断片を抗原として用いる方法、
組換えBLSAを発現する宿主細胞を抗原として用いる方法、及び
BLSAを発現するBLSA遺伝子を含むDNA発現ベクターを抗体産生のための抗原として用いる方法、から成る群より選ばれる方法を含む、BLSAに結合する抗体を生産する方法。
【請求項３８】
請求項３７記載の方法を用いて生産された抗体。
【請求項３９】
ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、ヒト、二重特異的及びヘテロコンジュゲート抗体から成る群より選ばれる請求項３８記載の抗体。
【請求項４０】
細胞、組織若しくは体液又はこれらの成分を請求項３８記載の抗体に曝露し、前記細胞、組織若しくは体液又はこれらの成分が前記抗体に結合するかどうかを調べることを含む、特定の細胞、組織又は体液中で発現されるBLSAを検出するための診断方法。
【請求項４１】
BLSA及び夾雑物を含む組成物を、BLSAに結合できる抗体に曝露し、
BLSAを前記抗体に結合させ、
前記夾雑物から抗体−BLSA複合物を分離し、そして
複合物からBLSAを回収することを含む、組換え細胞培養物、夾雑物及びネイティブの環境からBLSAを単離及び精製する方法。
【請求項４２】
前記抗体が、請求項３８記載の抗体である請求項２５記載の方法。
【請求項４３】
内発性BLSA遺伝子がヘテロ接合的又はホモ接合的に破壊されたゲノムを有し、生物学的に機能的なBLSAタンパク質の発現が抑制又は妨げられるトランスジェニックノックアウト動物。
【請求項４４】
BLSAに特異的なモノクローナル抗体を得る工程と、前記抗体を標識する工程と、前記標識抗体を、哺乳動物から得られた生物学的試料と接触させる工程と、前記標識をイメージ化する工程とを含む、あるリンパ腫に特徴的な病巣のイメージング方法。
【請求項４５】
定量的PCRを実施することを含む、細胞中のBLSAのレベルを測定する方法。
【請求項４６】
免疫蛍光染色を行なうことを含む、細胞中のBLSAの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、広く言えば、Ｂ細胞リンパ腫特異抗原（「BLSA」）と相互作用する分子、例えばペプチド及び抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性腫瘍は、腫瘍の予防、抵抗性又は治療のための機構を提供する特徴的な抗原、すなわち、「マーカー」をしばしば発現する。腫瘍に特徴的な抗原は、精製してワクチンに調製し得る。これは、腫瘍の成長を制御するのに有用な、抗体応答及び細胞性免疫応答を刺激する。これらの抗原に対して誘起された抗体は、少なくとも、宿主内のリンパ腫関連マーカーのレベルを監視して疾患の経路を追跡し、現在無徴候である当該疾患の早期の患者を同定し、又は治療の有効性を監視するための検出ツールとして用いることができる。
【０００３】
Ｂ細胞リンパ腫は、世界中で、癌による致死率に有意に寄与している。この病気は、段階的に進行する。早期では、Ｂ細胞リンパ腫は、しばしば、比較的長い半減期を有する、小さな成熟した機能的に不完全な悪性Ｂ細胞の蓄積により特徴付けられる無痛性の病気である。最終的に、悪性Ｂ細胞の倍増時間が減少し、患者は次第に徴候を示すようになる。治療により徴候を軽減することはできるが、患者の全体的な生存率は僅かに影響されるだけである。後期には、この病気は有意な貧血及び／又は血小板の減少により特徴付けられる。細胞性増殖の速度が極めて低いために、このタイプのＢ細胞リンパ腫はしばしば現在の治療に対して抵抗性を有し、従って、この病気は死を引き起こす。
【０００４】
Ｂ細胞リンパ腫の現在の診断方法は、典型的に針又は外科的バイオプシーにより組織試料を採り、該組織に癌細胞が存在するかどうかを分析することを包含する。一般的に血液試料を採取し、Ｂ細胞が悪性かどうかを病理学者が分析する。悪性細胞が存在すると、その患者がＢ細胞リンパ腫を有することが示される。
【０００５】
Ｂ細胞リンパ腫の現在の治療方法は、病気の段階及び悪性度に依存する。早期の病気を有する成人患者は、化学療法と共に又は化学療法なしに局所的な放射線治療を受ける。より進行しているが悪性度が低い病気を有する患者は、徴候がない限り又はリンパ腫関連臓器の和解(compromise)が起きる限り、治療を受けないこともある。監視及び待機作戦である。治療が必要になった時には、典型的な選択は、単剤のアルキル化剤化学療法、アントラサイクリンを用いない、低強度の併用化学療法、及び全身への放射線照射を包含する。これらの伝統的なＢ細胞リンパ腫の治療方法は、毒的な副作用の故にしばしばその有用性が限定される。モノクローナル抗体を用いて放射性核種、毒素又他の治療剤を癌細胞に誘導する、モノクローナル抗体療法として知られる方法は、薬剤の副作用及び正常組織に対する損傷を限定する代替法を提供する。
【０００６】
モノクローナル抗体は、それ自身で癌に対する患者の免疫応答を増大することができる。リンパ腫及び他の癌の抗体治療において、いくつかの抗腫瘍効果が観察されている。モノクローナル抗体はまた他の方法に用いることができる。抗体を化学療法剤に結合させ、これと組み合わせて投与することができる。この方法では、化学療法からの化学剤及び抗体からの免疫応答を細胞に結合させることが可能になる。また、細胞がモノクローナル抗体により弱められる場合には、化学療法がより効果的になり得る。さらに、放射線照射をモノクローナル抗体療法と組み合わせることもできる。この方法では、モノクローナル抗体は、癌細胞を標的にし、癌細胞を破壊する、放射性ヨウ素のような放射性物質を含む。この方法によると、腫瘍細胞が多量の放射を受け、正常組織は比較的少量の放射を受けることが可能になる。同様に、放射性同位体で標識されたモノクローナル抗体はまた、ある種の癌の診断にも有用であることがわかるかもしれない。さらに、モノクローナル抗体はまた、他の形態の生物学的応答修飾剤(BRMs)又は毒素と結合させることもできる。結合した抗体が癌細胞に結合すると、抗体はこれらの物質を腫瘍に対して直接的に送達し、そこで物質が望ましくは癌細胞を破壊する。
【０００７】
モノクローナル抗体療法は、非ホジキンリンパ腫(NHL)のようないくつかのタイプのリンパ腫の治療に有望であることが示されている。例えば、Rituxan（商標）(IDEC Pharmaceuticals, Inc., 抗-CD20抗体)、Bexxar（商標）(Corixa/GlaxoSmithKline, 放射性ヨウ素131が結合した、NHLの治療のための抗-CD20抗体)及びOncolym（商標）(Peregrine Pharmaceuticals, Inc., ヨウ素131で放射標識された抗-HLA-Drl0 抗体)等の数種類のモノクローナル抗体が利用でき又は試験期間中である。モノクローナル抗体は、ヒト癌細胞をマウスに注射し、癌細胞に特異的なタンパク質に対する抗体をマウスの免疫系に作らせることにより作られる。抗体を産生する細胞を回収し、不死の細胞と融合させてハイブリドーマを作出する。これらのハイブリドーマは、当該癌細胞に特異的なタンパク質に結合する純粋なモノクローナル抗体を大量に生産する。Ｂ細胞リンパ腫の場合には、上記した抗体は、CD20タンパク質に対するものである。この型の治療の１つの欠点は、CD20が前Ｂ細胞リンパ腫では発現されず、成熟Ｂ細胞においてのみ発現されることである。
【０００８】
このように、この病気の診断及び治療のための新規な方法、特に前Ｂ細胞リンパ腫細胞において高度に発現される抗原の必要性が持続している。本発明は、このような抗原である、新たに同定されたＢ細胞特異的タンパク質、BLSAを提供する。我々は、BLSAがＢ細胞において特異的に発現し、前Ｂ細胞リンパ腫を包含するＢ細胞リンパ腫セルラインにおいて発現が大幅に増大することを見出した。従って、BLSAは、NHL及びびまん性大Ｂ細胞リンパ腫(BLBCL)のようなリンパ腫を包含する、悪性Ｂ細胞疾患の診断及び治療のための新規な標的である。
【発明の開示】
【０００９】
本発明は、低悪性度／小胞性非ホジキンリンパ腫(NHL)、小リンパ球性(SL)NHL、中悪性度／小胞性NHL、中悪性度びまん性NHL、高悪性度免疫芽性NHL、高悪性度リンパ芽球NHL、高悪性度小非開裂(non-cleaved)細胞NHL、粗大疾患(bulky disease)NHL、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫(BLBCL)、リンパ形質細胞性リンパ腫及びワルデンストレームマクログロブリン血症のようなＢ細胞リンパ腫を包含するがこれに限定されないＢ細胞媒介疾患の診断及び治療に関する。これらの異常Ｂ細胞疾患の治療は、単独で、又は、現在行なわれている例えばサイトカイン、放射療法、骨髄切除療法及び化学療法と組み合わせて行うことができる。
【００１０】
本発明の１つの局面は、Ｂ細胞リンパ腫又は他のＢ細胞媒介疾患の治療のための、BLSAに向けられたワクチンの生産及び投与を包含する。
【００１１】
本発明の他の局面は、患者内で免疫応答を誘起し、又はポリクローナル抗体若しくはモノクローナル抗体を製造するためのタンパク質抗原を生成させるための、生体内でのBLSAの発現をコードする核酸構築物を包含する。本発明はまた、BLSAの発現を調節するための核酸構築物を包含する。これらの核酸配列は、発現ベクター、アンチセンス構築物、結合物又はエピトープ含有断片の形態にあってもよい。
【００１２】
本発明の他の局面は、Ｂ細胞リンパ腫特異抗原（「BLSA」）と相互作用する化合物を提供することを包含する。この相互作用は、BLSAの存在を診断することに用いることができ、BLSAの存在は、Ｂ細胞媒介疾患を発達させている患者の存在又はその蓋然性と相関させることができる。前記相互作用は、該相互作用を用いて細胞を殺し又は他の治療法で治療した際に細胞をより死に易くすることに利用することにより、Ｂ細胞媒介疾患に罹患していると診断された患者の治療に用いることができる。BLSAと相互作用する抗体は、Ｂ細胞媒介疾患を診断し又は治療するために用いることができる。他の化合物は、BLSAに結合してその発現及び／又は機能を変化させる小さな分子を包含する。
【００１３】
本発明の他の局面は、BLSAと相互作用するアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニングを包含する。
【００１４】
本発明の他の局面は、患者をＢ細胞リンパ腫又は他のＢ細胞媒介疾患に対して免疫すること及びこのような方法に有用な抗原構築物を包含する。
【００１５】
本発明の他のさらなる目的、特徴及び利点は、当業者にとって直ちに明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
定義
「Ｂ細胞リンパ腫特異抗原」又は「BLSA」という語は、配列番号１に示す配列を有するポリペプチド又はその天然の変異体を意味する。
【００１７】
「Ｂ細胞リンパ腫」という語は、BLSAの存在、特に高レベルのBLSAの存在により特徴付けられる、１又は２以上のＢ細胞の悪性疾患を意味する。
【００１８】
「変異体」という語は、修飾、置換、挿入及び欠失を包含する態様でBLSAと１又は２以上のアミノ酸が相違し、かつBLSAと同一又は類似する生物学的機能を有するアミノ酸配列を意味する。
【００１９】
「アゴニスト」という語は、BLSAの正常な機能又はその発現を高め、促進し又は刺激するあらゆる分子を意味する。アゴニストの１つのタイプは、そのリガンドと同様にBLSAと相互作用する分子であり、抗体又は抗体断片を包含する。
【００２０】
「アンタゴニスト」という語は、BLSAの正常な機能又はその発現をブロックし、妨害し、阻害し又は中和するあらゆる分子を意味する。アンタゴニストの１つタイプは、BLSAとそのリガンドの相互作用を妨げる分子であり、抗体又は抗体断片を包含する。アンタゴニストの他のタイプは、ネイティブなBLSA活性化レセプターの適正な転写を阻害するアンチセンスヌクレオチドである。
【００２１】
ここで用いる「アンチセンス」という語は、特定のDNA又はRNA配列に相補的なヌクレオチド配列を含むあらゆる組成物を意味する。「アンチセンス鎖」という語は、「センス」鎖と相補的な核酸鎖を意味する。アンチセンス分子はペプチド核酸を包含し、合成又は転写を包含するいずれの方法により製造されたものであってよい。相補的ヌクレオチドは、一旦細胞に導入されると、細胞により生産される天然の配列に結合して二本鎖を形成し、転写又は翻訳をブロックする。アンチセンス鎖を示すために「ネガティブ」、センス鎖を示すために「ポジティブ」という表記をときどき使用する。
【００２２】
「ノックアウト」という語は、単一細胞、選択された複数の細胞又は哺乳動物の全細胞の内発性遺伝子によりコードされるポリペプチド（BLSAのような）の少なくとも一部の発現を部分的に又は完全に減少させることを意味する。哺乳動物は、内発性遺伝子のうち１個の対立遺伝子が破壊された「ヘテロ接合ノックアウト」、又は内発性遺伝子の両方の対立遺伝子が破壊された「ホモ接合ノックアウト」であり得る。
【００２３】
「抗体断片」という語は、F(ab')2、F(ab)2、Fab'及びFab等のような、抗体の一部分である。構造に関わらず、抗体断片は、完全な抗体により認識される抗原と同一の抗原に結合する。例えば、抗BLSAモノクローナル抗体断片は、BLSAのエピトープに結合する。「抗体断片」という語はまた、特異抗原に結合して複合体を形成することにより、抗体と同様に作用する、あらゆる合成された又は遺伝子工学的に生産されたタンパク質を包含する。例えば、抗体断片は、Ｌ鎖可変領域から成る単離された断片、Ｈ鎖及びＬ鎖の可変領域から成る「Fv」断片、Ｌ鎖及びＨ鎖の可変領域がペプチドリンカーにより結合された組換え単一鎖ポリペプチド分子（「sFvタンパク質」）、並びに超可変領域を模倣するアミノ酸残基から成る最小の認識単位を包含する。
【００２４】
ここに記載した特定の方法論、プロトコール、セルライン、ベクター及び試薬は、変わることがあるので、本発明は、これらに限定されるものではない。さらに、ここに記載した用語は、特定の具体例を記述するためにのみ用いており、本発明の範囲を限定することを意図しない。ここ及び添付の請求の範囲において用いる単数形の冠詞は、文脈から明らかにそうではない場合を除き、複数をも意味する。例えば、「１つの宿主細胞」は、複数のこのような宿主細胞をも包含する。
【００２５】
他に定義されている場合を除き、ここで用いる全ての技術及び科学用語並びに頭文字語は、当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本発明の実施において、ここに記載したのと類似する又は均等なあらゆる方法及び材料を用いることができるが、ここでは好ましい方法、装置及び材料を記載する。
【００２６】
ここに記載する全ての特許及び文献は、本発明に用いることができるかもしれない、そこに報告されたタンパク質、酵素、ベクター、宿主及び方法を記載し及び開示する目的で、法により許される範囲内でここに組み入れられたものとする。もっとも、これらの記述は、本発明が先行発明よりも前に発明されたものではないとの自認であると解釈されるものではない。
【００２７】
本発明
本発明は、Ｂ細胞リンパ腫ワクチン、BLSA特異的抗体及び診断ツールを提供する。BLSAの核酸配列を配列番号１に、アミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００２８】
Ｂ細胞リンパ腫ワクチンの活性成分は、Ｂ細胞リンパ腫特異抗原BLSA又は少なくとも１個のエピトープを有するその断片である。Ｂ細胞リンパ腫関連抗原は、細胞、組織、リンパ腫自体から精製することによって得ることができるし、遺伝子組み換え技術を用いて構成することもできる。BLSAはヒトにおけるネイティブのタンパク質であるので、Ｂ細胞のワクチン構築物は、該抗原に対する宿主の免疫トレランスを破るために、例えば、Ｔ細胞エピトープ又は他の抗原補助物を含むことがある。
【００２９】
BLSAに特異的な抗体は、KohlerとMilstein (Nature (London), 256: 495, 1975)により開示された、モノクローナル抗体の生産のための細胞融合のような従来の方法により作製することができるが、ポリクローナルでもモノクローナルでもよく、キメラ、ヒト化、ヒト、脱免疫化(deimmunized)、二特異的及びヘテロ結合体(heteroconjugate)を包含する。抗体はまた、遺伝子組換え技術により作製することもできる。抗体は、治療法又は診断法に用いるために投与することができる。抗体は、それ自身で、補体媒介溶解において治療目的のために用いることができるし、リシン、サイトカイン等のような毒素又は治療部分に結合して用いることもできる。
【００３０】
診断ツールは、疾患の経路を追跡し、早期の無徴候段階の該疾患の患者を同定し、又は治療の有効性を監視するための、宿主内におけるリンパ腫関連マーカーのレベルを監視するためのアッセイ及びキットを包含する。
【００３１】
本発明を一般的に記載したが、本発明は、ここに記載したより詳細な記述及び本発明を例示する目的のみに記載し他に断りがない限り限定的であることを意図しないある具体的な実施例を参照することによりさらに理解されるであろう。
【００３２】
診断ツール
我々は、Ｂ細胞媒介リンパ腫に罹患している患者をスクリーニング又は診断するための新たな標的を見出した。BLSAはＢ細胞リンパ腫、特に前Ｂ細胞リンパ腫において極めて高度に発現される（後述の表１及び表２参照）。
【００３３】
モノクローナル抗体によるリンパ腫の免疫表現型に基づく特徴付けは、組織学的診断の貴重な補助であることがわかっており、あるリンパ腫の系列の理解を容易にしてきた。種々の抗原を検出するモノクローナル抗体が、ヒト及び動物の白血病及びリンパ腫の研究及び診断試験において多くの目的のために使用され又は提案されている。用いられる技術は以下のものを包含するがこれらに限定されない。
１．  フローサイトメトリー、免疫蛍光、免疫酵素技術又は免疫電子顕微鏡を用いた、表現型による白血球の同定。
２．  フローサイトメトリー及びパンニングを包含する、白血球分離技術。
３．  リンパ腫の同定及び分類。
４．  動物及びヒトにおけるリンパ腫の放射免疫イメージング。
５．  動物及びヒトにおけるリンパ腫の放射免疫治療。
６．  実験モデル及びヒト疾患における白血球の分化、成熟及び機能の研究。
【００３４】
診断的な抗原抗体反応は、抗体又は抗原を標識するマーカーを用いて、この分野において知られた種々の方法により検出することができる。一般的に用いられているマーカーは、蛍光色素のような色原体、酵素、放射活性及び放射線不透性化合物である。蛍光色素は、例えば紫外線のような放射線を吸収し、それによって励起され、その結果、可視光を発する染料である。マーカーとして有用な蛍光色素は、タンパク分子と共有結合を形成することができ、可視光スペクトルにおいて、組織の色とは異なる色の蛍光を強く発することができるものである。一般的に用いられている蛍光色素はフルオレッセインイソチオシアネート(FITC)及びテトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)である。
【００３５】
蛍光色素マーカーで標識された抗体を用いる方法は、通常、免疫蛍光法と呼ばれる。いわゆる「直接法」では、対応する抗原を含む調製物に、蛍光色素で標識された抗体を適用する。「間接法」では、抗原は、対応する非標識抗体で処理され、第一工程において用いた非標識抗体を与えた動物種の免疫グロブリンに対する蛍光色素標識抗体で、得られた抗原抗体複合物を処理する。診断的免疫学では、抗原含有基質を患者の血清と共にインキュベートし、次いで、蛍光色素で標識した、抗ヒト免疫グロブリンマウス、ウサギ又はヤギ抗体で処理することができる。間接法は、より高い感度を与えることができる。免疫蛍光標本を検出するために、標準的な透過型光学顕微鏡を簡単に修飾した蛍光顕微鏡を用いることができる。必要ならば、結果を顕微鏡写真により記録することができる。
【００３６】
酵素は、もしその基質と相互作用した際に検出可能な沈殿を形成し又は可視光を発するならば、標識として用いることができる。免疫酵素法は、酵素標識抗体の助けを得て抗体の位置を特定するために用いることができる。セイヨウワサビペルオキシダーゼ及びアルカリフォスファターゼのような数種類の酵素がマーカーとして用いられている。酵素結合抗体による抗原の検出のための広く用いられているプロトコールは、直接法又はサンドイッチ法として実施することができる、酵素結合免疫吸着測定（ELISA）である。
【００３７】
放射活性マーカーとしては、周知の医薬放射性核種のいずれをも用いることができる。適切な放射性核種は、Tc-99m、I-123、In-111、In-113m、Ga-67及び他の適当なγ線放射源を包含する。放射性核種は、従来技術により本発明のモノクローナル抗体に結合することができる。例えば、ヨウ素化は、S. Mills, et al. 123I-Radiolabeling of Monoclonal Antibodies for In Vivo Procedures, Hybridoma 5, 265-275 (1986)に記載されたクロラミン−Ｔ法を用いて行うことができる。この技術は、抗体を放射線不透性にするためのヨウ素化又はI125又はI131のような放射線核種を結合するためのヨウ素化を行なうために用いることができる。他の放射線核種は、ベンジルEDTA又はDPTA結合法によりキレート化により抗体に結合することができる。さらに他の適切な技術は、M. Pimm, et al., In Vivo Localization of Anti-Osteogenic Sarcoma 791T Monoclonal Antibody, Int. J. Cancer. 30, 75 (1982)により開示されたヨードゲン(iodogen)法、及び放射性ヨウ化ナトリウムによる直接的なヨウ素化を包含する。
【００３８】
抗体の標識に適した放射線不透性材料は、ヨウ素化合物、バリウム化合物、ガリウム化合物及びタリウム化合物等を包含する。放射線不透性材料の具体例は、バリウム、ジアトリゾ酸塩、エチオダイズド(ethiodized)オイル、クエン酸ガリウム、ヨーカーミック(iocarmic)酸、ヨーセタミック(iocetamic)酸、ヨーダミド、ヨージパミド(iodipamide)、ヨードキサミック(iodoxamic)酸、ヨーグラミド(iogulamide)、イオヘキソール、イオパミドール、イオパノ酸、ヨープロセミック(ioprocemic)酸、ヨーセファミック(iosefamic)酸、酸、ヨースラミド(iosulamide)メグルミン、ヨースメティック(iosumetic)酸、ヨータスル(iotasul)、ヨーテトリック(iotetric)酸、ヨータルミック(iothalmic)酸、イオトロクス酸、イオキサグル酸、ヨーキソトリゾイック(ioxotrizoic)酸、イポデート(ipodate)、メグルミン、メトリザミド、メトリゾエート(metrizoate)、プロピリドン(propylidone)及び塩化第一タリウムを包含する。
【００３９】
他の局面において、本発明は、病巣のイメージング方法に関する。あるリンパ腫の特徴的な病巣のイメージング方法は、BLSAに特異的なモノクローナル抗体を得る工程、該抗体を標識する工程、該標識抗体を、哺乳動物から得られた生物学的試料と接触させる工程、及び前記標識をイメージングする工程を含み得る。この目的のために、抗BLSA抗体を標識することができる。適切な標識は、例えば、放射標識、放射線不透性材料及び磁気共鳴促進材料を包含する。放射標識及び放射線不透性材料は上記した。抗体を発現する組織に局在化した標識をイメージングする適切な技術はこの分野において公知である。例えば、標識がガンマ線を発する放射性核種の場合には、適切なイメージング技術は、γ線カメラ及び単一光子発射コンピュータートモグラフィー(SPECT)を包含する。抗体が放射線不透性材料で標識された場合には、放射線イメージング技術を適用することができる。他の適切な技術は、コンピューターアキシャルトモグラフィー(CAT)スキャン、蛍光透視及び従来のＸ線イメージングを包含する。
【００４０】
磁気共鳴イメージング装置により検出することができ又はその効果を高める材料もまた、抗体に結合することができる。適切な従来の磁気共鳴促進化合物は、ガドリニウム、銅、鉄及びクロムを包含する。これらの金属原子は従来の有機金属キレートの形態で調製することができ、次いでこれを抗体に結合する。上記した方法及び免疫診断の他のルーチンな技術は、標準的な実験教科書に開示されている。例えば、Rose, N. R.及びPierluigi, E. B. in Methods in Immunodiagnosis, Second Edition, John Wiley & Sons, Publishers, New York, Chichester, Brisbane, Toronto, 1980; Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, 1987を参照のこと。
【００４１】
本発明はまた、患者内におけるBLSAの存在又はBLSAの増加したレベルを検出するための方法をも提供する。該方法は、患者がＢ細胞リンパ腫に罹患しているかどうか、該疾患の進行若しくは段階の監視、又は該疾患の治療の有効性の監視に有用である。該方法は、患者から試料を採取し、該試料を、BLSAと相互作用する分子に曝露し、BLSAと該分子の間の相互作用の存在を検出し又は形成された生産物の量を測定することを含む。
【００４２】
試料は、Ｂ細胞を含むいずれの生物学的流体又は組織であってもよく、血液を包含する。試料は、バイオプシーや患者から単に血液を採取するなどの、周知のいずれかの手段によって採取される。
【００４３】
BLSAと相互作用する分子は、例えば、小さな分子、タンパク質、ペプチド、抗体、オリゴヌクレオチド又はリガンドであり得る。好ましくは、該分子は、BLSAに特異的に結合する抗体である。該分子とBLSAの間の相互作用は、例えば蛍光測定法、化学発光法、ELISA、FACS分析、固相RIA等の周知のいずれの方法によっても検出することができる。該分子がBLSAに結合する抗体である場合には、好ましい検出方法はELISAである。
【００４４】
BLSAの発現のレベルを検出する方法は、例えばリアルタイム定量PCRのようなPCRによる測定を包含する。この方法は、次のようなオリゴヌクレオチドプライマーを用いて行うことができる。
F: CAGAGCCCCCAGCTAGAGATC     （配列番号３）
R: GTGCAGCAGAGCTGGAAGC       （配列番号４）
F: GCAGTGGCATCTTCCAGAGC      （配列番号５）
R: CAGATGCTGTTTCTGGGATCC     （配列番号６）
F: GATCAGAGTGCAGGGTGCTTC     （配列番号７）
R: GGATTCAATGTGGGAGGTGC      （配列番号８）
F: GTGAGGGACCTGTCTGCACTG     （配列番号９）
R: AGTCATCCTCCGTGTGGCA       （配列番号１０）
F: GAATTCCAGATCCCCACAGCT     （配列番号１１）
R: ACACCAGTATGACCCGGAGTG     （配列番号１２）
F: CGGGCCTAACAGGGAATTCT      （配列番号１３）
R: CCCGCTGTCTGCCTTTTGTA      （配列番号１４）
F: CCTCCCACATTGAATCCAGC      （配列番号１５）
R: GAGCAGTTCCTGGAGCAGCT      （配列番号１６）
F: TGTGAGGGACCTGTCTGCAC      （配列番号１７）
R: AGTCATCCTCCGTGTGGCA       （配列番号１８）
F: GGCTGATCCTCCAAGGTCC       （配列番号１９）
R: ACCAGCAGGTCCCCTTCAA       （配列番号２０）
他のプライマーセットは、周知の技術により当業者が容易に決定することができる。該方法はまた、患者内の発現レベルを正常組織における発現レベルと比較することにより、BLSAの相対的な発現量を測定することを包含する。
【００４５】
本発明はまた、例えばBLSAに特異的な抗体又はBLSAの発現レベルを検出するためのプライマーを含む、診断キットを包含する。
【００４６】
アゴニスト及びアンタゴニスト
他の局面では、本発明は、BLSAに特異的に結合し、その発現又は作用を阻害し又は活性化するアゴニスト及びアンタゴニストを提供する。アゴニスト及びアンタゴニストのタイプは、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖類、少糖類、ヌクレオチド、有機分子、生物有機分子、ペプチド模倣物、薬剤及びその代謝物、並びに転写及び翻訳制御配列を包含するがこれらに限定されるものではない。
【００４７】
１つの具体例においては、アゴニスト及びアンタゴニストは、BLSAをコードする核酸分子の機能を変調し、究極的には生産されるBLSAの量を変調するために用いることができるアンチセンスオリゴヌクレオチド又は他の核酸構築物である。これは、BLSAをコードする１又は２以上の核酸と特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物を提供することにより達成される。オリゴマー化合物とその標的核酸との特異的なハイブリダイゼーションは、該核酸の正常な機能を妨げる。妨げられるDNAの機能は、複製及び転写を包含する。妨げられるRNAの機能は、例えば、タンパク翻訳部位へのRNAの移行、RNAからのタンパク質の翻訳、１又は２以上のmRNA種を生成する、RNAのスプライシング、RNAにより行なわれ又は容易にされ得る触媒活性等の全ての生体機能を包含する。このような標的核酸機能の妨害の全体的な効果は、BLSAの発現の変調である。本発明の文脈において、「変調」とは、遺伝子の発現の増大（刺激）又は減少（阻害）の両方を意味する。本発明の文脈において、阻害が遺伝子発現の変調の好ましい形態であり、mRNAが好ましい標的である。BLSAをアンチセンス化合物の「標的」にすることは、例えばタンパク質の発現の検出又は変調のような望ましい効果が得られるアンチセンス相互作用を起こすための、この遺伝子内の１又は２以上の部位を決定することを包含する。好ましい遺伝子内領域は、BLSAのオープンリーディングフレーム(ORF)の翻訳開始又は終止コドンを含む領域である。アンチセンス技術の方法論は、例えば、Crooke ST: Basic Principles of antisense technology. In Antisense Drug Technology - Principles, Strategies and Applications. Edited by Crooke ST. New York: Marcel Dekker, Inc.; 2001: 1-28に開示されている。
【００４８】
他の具体例では、アンタゴニストは、短い（一般的に２１〜２３塩基対）二本鎖RNAを用い、BLSAを標的として分解し、それによってその発現を沈黙させる、RNA干渉(RNAi)法による、小さな干渉RNA(siRNA)であり得る。siRNA二本鎖は、記載されたガイドライン(Elbashir, SM, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A, Weber K, and Tuschl T. (2001), Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells, Nature 411, 494-498) に従って設計することができ、ウイルス媒介戦略のような複数の方法で用いられる (Xia, H. et al. (2002) siRNA-mediated gene silencing in vitro and in vivo. Nature Biotechnology 20: 1006)。
【００４９】
アゴニスト及びアンタゴニストは、BLSAに特異的に結合する抗体であり得、例えばBLSAの生産を活性化し又は阻害するような、その生物学的作用及び／又は機能に影響し得る。抗体はポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であり得るが、好ましくはモノクローナル抗体である。
【００５０】
アゴニスト抗体は、非疾患状態に比較してBLSAの発現レベルが比較的低いことにより特徴付けられる疾患の予防又は治療に用いられる。アンタゴニスト抗体は、非疾患状態に比較してBLSAの発現レベルが比較的高いことにより特徴付けられる疾患の予防又は治療に用いられる。
【００５１】
本発明のアゴニスト及びアンタゴニスト並びに方法は、低悪性度／小胞性非ホジキンリンパ腫(NHL)、小リンパ球性(SL)NHL、中悪性度／小胞性NHL、中悪性度びまん性NHL、高悪性度免疫芽性NHL、高悪性度リンパ芽球NHL、高悪性度小非開裂(non-cleaved)細胞NHL、粗大疾患(bulky disease)NHL及びワルデンストレームマクログロブリン血症を包含する、種々のＢ細胞リンパ腫の治療に用いることができる。これらのリンパ球は、分類システムの変更により、しばしば異なる名前を有することになること、及び異なる名前に分類されるリンパ腫の患者もまた、本発明の併用療法により利益を受けるかもしれないことは当業者にとって明らかである。
【００５２】
例えば、欧州及び米国の病理学者により提唱される最近の分類システムは、改定欧州米国リンパ腫(REAL)分類と呼ばれる。この分類システムは、他の周辺Ｂ細胞新生物から外套細胞リンパ腫及び周辺細胞リンパ腫を認定し、細胞学に基づきいくつかの分類をグレードに分ける、すなわち、小細胞、混合小及び大細胞、並びに大細胞に分ける。全てのこのように分類されたリンパ腫は、本発明の併用療法から利益を受けるかもしれないことが理解されるであろう。
【００５３】
米国国立癌協会(NCI)は、次に、いくつかのREALのクラスを、臨床的により有用な「無痛性」又は「攻撃的」リンパ腫に分類した。無痛性リンパ腫は、細胞学的「グレード」に分離された、小胞細胞リンパ腫、びまん性小リンパ球性リンパ腫／慢性リンパ球性白血球(CLL)、リンパ形質球様／ワルデンストレームマクログロブリン血症、周辺帯リンパ腫及びヘアリーセル白血病を包含する。攻撃的リンパ腫は、びまん性混合大細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫／びまん性小非開裂細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、外套細胞リンパ腫及びAIDS関連リンパ腫を包含する。これらのリンパ腫もまた、本発明の併用療法から利益を受け得る。
【００５４】
非ホジキンリンパ腫はまた、低悪性度、中悪性度及び高悪性度リンパ腫を包含する、他の疾患特徴に基づく「悪性度」に基づいて分類されている。低悪性度リンパ腫は通常、結節疾患を提示し、しばしば無痛又は増殖が遅い。中悪性度及び高悪性度疾患は、通常、大きな結節外粗大腫瘍を伴う、はるかに攻撃的な疾患を提示する。中悪性度および高悪性度疾患、並びに低悪性度NHLは、本発明の併用療法から利益を受け得る。
【００５５】
BLSAに特異的な抗体は、病気の細胞を直接殺す他の化合物、例えば貪食作用のような殺滅に対する、病気の細胞の感受性を高める他の化合物、又は病気の細胞にアポトーシスを引き起こす他の化合物に結合することもできる。抗体は、例えば、化学療法剤、放射性療法剤、アンジオポエチン、アンジオスタチン、バスキュロスタチン、カンスタチン又はマスピンのような抗血管新生剤、アポトーシス誘導剤、ステロイド、抗代謝物、アントラサイクリン、ツルニチニチソウアルカロイド、コルヒチン、タキソール、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン及びコンブレタスタチンのような抗チューブリン薬、抗生物質、サイトカイン、アルキル化剤若しくは凝固剤、リンパ腫細胞を殺し又はその成長若しくは細胞分裂を抑制することができる、細胞障害性、細胞増殖抑制性又は抗細胞性剤、リシンＡ鎖、脱糖リシンＡ鎖、リボソーム不活化タンパク、α−ザルシン、ゲロニン、アスペルジリン、レストリクトシン、リボヌクレアーゼ、エピプドフィルトキシン、ジフテリア毒素若しくはシュードモナス外毒素のような、植物、菌類若しくは細菌由来毒素に機能的に結合することができる。
【００５６】
BLSAアゴニスト又はアンタゴニストの投与量は、当該哺乳動物の年齢、大きさ及び特徴並びに疾患により異なる。当業者は、これらの因子に基づき投与量を決定することができる。アゴニスト又はアンタゴニストは、例えば、疾患の状態を緩和するために２、３日にわたって１回若しくは数回投与したり、又はアレルギーや喘息の予防のために長期間にわたって定期的に投与したりするような、当該疾患に合った治療計画に沿って投与することができる。
【００５７】
アゴニスト及びアンタゴニストは、注射及びインプラントを用いた方法等を包含する、いずれの許容できる方法によっても哺乳動物に投与することができる。注射及びインプラントが好ましい。なぜなら、これらは、投与のタイミング及び投与量を精密に制御することができるからである。アゴニスト及びアンタゴニストは、好ましくは皮下投与されるが、静脈内、筋肉内若しくは腹腔内注射は皮下インプラントにより投与することもできる。
【００５８】
注射により投与する場合には、アゴニスト及びアンタゴニストは、種々の賦形剤、アジュバント、添加剤及び希釈剤のようないずれかの生物適合性並びにアゴニスト及びアンタゴニストに対する適合性を有する担体を含む注射可能な製剤として哺乳動物に投与することができる。非揮発性発熱物質を有さない水、滅菌水及び静菌水のような水性担体も、注射可能な溶液を形成するのに適している。これらの形態の水に加え、数種類の他の水性担体を用いることができる。これらは、塩化ナトリウム、リンゲル、デキストロース、デキストロースと塩化ナトリウム、及び乳酸化リンゲルのような、滅菌可能な等張性注射組成物を包含する。綿実油、ゴマ油又は落花生油のような非水性担体、及びミリスチン酸イソプロピルのようなエステルもまた、該組成物のための溶媒系として用いることができる。さらに、抗菌保存料、酸化防止剤、キレート化剤及び緩衝剤を包含する、組成物の安定性、滅菌性及び等張性を高める種々の添加物を添加することができる。もっとも、用いられるいずれの担体、希釈物又は添加物も、生物適合性並びに本発明のアゴニスト及びアンタゴニストとの適合性を有している必要がある。
【００５９】
抗体及び抗体生産
他の局面では、本発明は、ネイティブのBLSAアゴニスト又はアンタゴニストとして機能する抗体を包含する、本発明のBLSAに結合する抗体及びその生産方法を提供する。１つの具体例では、該方法は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を包含する、抗原に対する抗体の生産のための公知のプロトコールにおいて、本発明のBLSAに結合する抗体を生産するために、単離されたBLSA又はその抗原性断片を抗原として用いることを含む。他の具体例では、該方法は、組換えBLSAを発現する宿主細胞を抗原として用いることを含む。さらなる具体例では、該方法は、BLSA遺伝子を含むDNA発現ベクターを用いて、抗体を生産するための抗原としてのBLSAを発現することを含む。
【００６０】
ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一価抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、二特異的抗体及びヘテロ結合抗体を包含する抗体の生産方法は、当業者に周知である。
【００６１】
ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、免疫原を単独で又はアジュバントと共に注射することにより哺乳動物中で生産することができる。典型的には、１回又は２回以上の皮下又は腹腔内注射を用いて哺乳動物に免疫原を注射することができる。免疫原は、目的のポリペプチド、又は、該ポリペプチドと、免疫される哺乳動物中で免疫原性を有することが知られている他のポリペプチドとを含む融合タンパク質を包含し得る。免疫原はまた、BLSA遺伝子を含む組換えベクター又はDNA発現ベクターを発現する細胞を包含し得る。このような免疫原性タンパク質の例として、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及びダイズトリプシンインヒビターが挙げられるが、これらに限定されるものではない。アジュバントの例として、フロインドの完全アジュバント、MPL-TDMアジュバント（モノリン酸化リピッドＡ、合成トレハロースジコリノマイコレート(dicorynomycolate)及びCpG関連オリゴヌクレオチドを包含する。免疫化プロトコールは、過度な実験なしに当業者によって選択され得る。
【００６２】
モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)により記載されたような、ハイブリドーマ法を用いて生産することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適当な宿主哺乳動物を免疫原で免疫し、該免疫原に特異的に結合するであろう抗体を産生する又は産生することができるリンパ球を誘起する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。免疫原は典型的には、目的のポリペプチド又は該ポリペプチドを含む融合タンパク質を包含する。ヒト由来の細胞が望まれるならば、一般的に、末梢血リンパ球（「PBLs」）細胞が用いられる。非ヒト哺乳動物由来の細胞が望まれるならば、脾細胞又はリンパ節細胞が用いられる。リンパ球は次いで、例えばポリエチレングリコールのような適切な融合剤を用いて不死化セルラインと融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp 59-103 (Academic Press, 1986))。不死化セルラインは、通常、癌化された哺乳動物細胞であり、特に齧歯動物、ウシ又はヒトのミエローマ細胞である。通常、ラット又はマウスのミエローマセルラインが用いられる。ハイブリドーマ細胞は、融合しなかった不死化細胞の増殖又は生存を阻害する１又は２以上の物質を好ましく含む、適切な培地中で培養することができる。例えば、親細胞が、ヒポキサンチングアニンホスフォリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT)酵素を欠損している場合には、ハイブリドーマのための培地は典型的にはヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む(HAT培地）であろう。HAT培地は、HGPRT欠損細胞の増殖を防止する。
【００６３】
好ましい不死化セルラインは、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの発現を支持し、HAT培地のような培地に感受性であるものである。より好ましい不死化セルラインは、米国カリフォルニア州San Diego のSalk Institute Cell Distribution Centerから入手可能なMOPC-21及びMPC-11マウス腫瘍から誘導されたようなマウスミエローマライン並びに米国メリーランド州RochvilleのAmerican Type Culture Collectionから入手可能なSP2/0又はX63-Ag8-653である。ヒトミエローマ及びマウス−ヒトヘテロミエローマセルラインもまた、ヒトモノクローナル抗体の生産に用いられることが記載されている(Kozbor, J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。マウスミエローマセルラインNS0もまた用いることができる(European Collection of Cell Cultures, Salisbury, Wiltshire UK)。ヒトミエローマ及びマウス−ヒトヘテロミエローマセルラインは、この分野において周知であり、また、ヒトモノクローナル抗体を生産するために用いることができる。
【００６４】
次に、ハイブリドーマ細胞の培養に用いた培地中に目的のポリペプチドに対する抗体が存在するかどうかを分析する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により生産されるモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降又は例えば放射免疫測定(RIA)若しくは酵素結合免疫吸着測定 (ELISA)により測定する。このような技術及びアッセイはこの分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)のScatchard解析により測定することができる。
【００６５】
所望のハイブリドーマ細胞を同定した後、該クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、常法により増殖させることができる。この目的のための好ましい培地は、ダルベッコの修飾イーグル培地及びRPMI-1640培地を包含する。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物中で腹水として生体内で増殖させることもできる。
【００６６】
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィーのような従来の免疫グロブリンの精製方法により培地又は腹水から単離又は精製される。
【００６７】
モノクローナル抗体はまた、例えば米国特許第4,816,567に記載されたような組換えDNA法によっても生産することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするDNAは、例えば、マウス抗体のＨ鎖及びＬ鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブ(Innis M. et al. In "PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications", Academic, San Diego, CA (1990), Sanger, F.S, et al. Proc. Nat. Acad. Sci. 74:5463-5467 (1977))を用いることにより、従来方法を用いて容易に単離し配列決定することができる。ここに記載するハイブリドーマ細胞は、このようなDNAの好ましい供給源として役立つ。DNAは、一旦単離すると、発現ベクター中に入れることができる。該ベクターは次いで、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞又は本来免疫グロブリンタンパク質を生産しないミエローマ細胞のような宿主細胞中にトランスフェクトする。組換え宿主細胞は、所望のモノクローナル抗体を生産するために用いられる。DNAはまた、例えば、相同マウス配列に代えてヒトのＨ鎖及びＬ鎖定常領域をコードする配列で置換し又は非免疫グロブリンポリペプチドをコードする配列の部分を置換することにより修飾することもできる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常領域を置換し又は抗体の抗原結合部位の可変領域を置換してキメラ２価抗体を創製することができる。
【００６８】
１価抗体は、免疫グロブリンＬ鎖及び修飾Ｈ鎖の組換え発現を用いて生産することができる。Ｈ鎖は一般的にFc領域中のいずれの点においても切断してＨ鎖架橋を防止することができる。あるいは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換し又は欠失させて架橋を防止することができる。同様に、１価抗体を生産するためにインビトロ法を用いることができる。公知の方法を用いる、抗体の消化は、抗体断片、好ましくはFab断片を生産するために用いることができる。
【００６９】
抗体及び抗体断片は、McCafferty, et al., Nature 348:552-554 (1990) に記載された技術を用いて生成された抗体ファージライブラリーを用いて生産することができる。Clackson, et al., Nature 352:624-628 (1991) 及びMarks, et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリーを用いた、マウス及びヒト抗体の単離をそれぞれ記載している。続いて発行された文献には、チェインシャフリングによる高親和性(nM範囲）ヒト抗体の生産(Marks, et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992))並びに極めて大きなファージライブラリーを構築するための戦略としてのコンビナトリアル感染及びインビボ組換え(Waterhouse, et al., Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 (1993))が記載されている。このように、これらの技術は、モノクローナル抗体を単離するための伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術の実行できる代替技術である。また、DNAは、例えば、相同マウス配列をヒトＨ鎖及びＬ鎖定常領域をコードする配列で置換する（米国特許第4,816,567; Morrison, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 81:6851 (1984))ことにより、又は非免疫グロブリンポリペプチドをコードする配列の全部若しくは一部を、免疫グロブリンコード配列に共有結合することにより修飾することができる。典型的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常領域を置換し、又は抗体の１つの抗原結合部位の可変領域を置換して、１つの抗原に対して特異性を有する１つの抗原結合部位と、異なる抗原に対して特異性を有する他の抗原結合部位を含む、キメラ２価抗体を創製することができる。
【００７０】
抗体はまた、化学的融合ではなく電気的融合を用いて生産することもできる。この技術はよく確立されている。融合に代えて、例えばエプシュタインバールウイルス又は癌化遺伝子を用いて、Ｂ細胞を癌化して不死化させることもできる「Continuously Proliferating Human Cell Lines Synthesizing Antibody of Predetermined Specificity," Zurawaki, V. R. et al, in "Monoclonal Antibodies,」Kennett R. H. et al監修、Plenum Press, N.Y. 1980, pp 19-33。
【００７１】
ヒト化抗体
ヒト化抗体は、Winter in Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327(1988); 及びVerhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)により記載された方法を用いて生産することができる。ヒト化は、齧歯動物のCDR配列をヒト抗体の対応する配列で置換することにより達成される。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒト供給源から導入された１又は２以上のアミノ酸を有する。このような「ヒト化」抗体は、無損のヒト可変領域よりも実質的に少ない部分が非ヒト種からの対応配列により置換されている、キメラ抗体である。実際には、ヒト化抗体は、典型的にはいくつかのCDR残基及びおそらくいくつかのFR残基が齧歯動物抗体の類似の部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。非ヒト（例えばマウス又はウシ）抗体のヒト化形態は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はFv、Fab、Fab'、F(ab')2若しくは非ヒト免疫グロブリン由来の最小の配列を含む他の抗原結合配列のような免疫グロブリン断片である。ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域(CDR)からの残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット又はウサギのような非ヒト種（ドナー抗体）のCDRからの残基によって置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を包含する。ときどき、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基により置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体又は移入されたCDR又はフレームワーク配列のいずれにも見出されない残基を含む。一般に、ヒト化抗体は、全て又は実質的に全てのCDR領域が非ヒト免疫グロブリンのCDR領域に対応し、全て又は実質的に全てのFR領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のFR領域である、実質的に全て又は少なくとも１つ、典型的には２個の可変領域を含む。ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。
【００７２】
ヒト抗体
ヒト抗体は、例えば、Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)に記載されたファージディスプレイライブラリーなどの、この分野で知られた種々の技術を用いて生産することができる。ヒトモノクローナル抗体は、Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)及びBoemer et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)に記載された技術を用いて生産することができる。あるいは、免疫すると内発性免疫グロブリンの生産なしにヒト抗体の全レパートリーを産生することができる、例えばマウスのような、トランスジェニック動物が利用可能である。このようなトランスジェニックマウスは、カリフォルニア州FremontのAbgenix, Inc.及びニュージャージー州AnnandaleのMedarex, Inc.から入手可能である。キメラ及び生殖系列突然変異マウスの抗体Ｈ鎖ジョイニング(joining)領域(JH)遺伝子をホモ接合欠損させることにより、内発性抗体生産の完全な阻害がもたらされる。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイをこのような生殖系列突然変異マウスに導入し、抗原で攻撃するとヒト抗体を生産するであろう。例えば、Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); 及びDuchosal et al. Nature 355:258 (1992)を参照のこと。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーから誘導することもできる(Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991); Vaughan, et al., Nature Biotech 14:309 (1996))。
【００７３】
二重特異的抗体
二重特異的抗体は、２個のＨ鎖が異なる特異性を有する、２個の免疫グロブリンＨ鎖／Ｌ鎖ペアの組換え共発現により生産することができる。二重特異的抗体は、少なくとも２個の異なる抗原に対して結合特異性を有する、モノクローナルの、好ましくはヒト又はヒト化抗体である。本発明では、結合特異性のうちの１つはBLSAに対するものであり、もう一方は、他のいずれの抗原に対するものでもよく、好ましくは細胞表面レセプター又はレセプターサブユニットに対するものである。免疫グロブリンのＨ鎖及びＬ鎖はランダムに組み合わされるので、これらのハイブリドーマは可能な１０種類の異なる抗体の混合物を生産する。しかしながら、これらの抗体の１個のみが正しい二重特異的構造を有する。正しい分子の回収及び生成は、通常、アフィニティクロマトグラフィーにより達成される。
【００７４】
所望の結合特異性を有する抗体の可変領域（抗原抗体結合部位）は、免疫グロブリン定常領域配列に融合することができる。融合は、好ましくは、ヒンジ、CH2及びCH3領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリンＨ鎖定常領域との間で行なわれる。好ましくは、Ｌ鎖結合に必要な部位を含む、第１のＨ鎖定常領域(CH1)が、融合の少なくとも１つに存在する。免疫グロブリンＨ鎖、及び、所望ならば、免疫グロブリンＬ鎖をコードするDNAを、別々の発現ベクターに挿入し、適切な宿主生物に共トランスフェクトする。二重特異的抗体を生産するのに適した技術は、Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)に記載されている。
【００７５】
ヘテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体は、例えば、１つの抗体のアミノ基を、他の抗体又は他のポリペプチドのチオール基に結合することにより、公知のタンパク質融合法により生産することができる。必要ならば、チオール基は、公知の方法により導入することができる。例えば、抗体又は抗体断片とポリペプチド毒素とを含む免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を用いて、又はチオエーテル結合を形成することにより生産することができる。この目的のための適切な試薬の例として、イミノチオレート及びメチル-4-メルカプトブチルイミデートを挙げることができる。このような抗体は、免疫系細胞に、不所望の細胞を標的とさせるため又はHIV感染を治療するために用いることができる。
【００７６】
ポリヌクレオチド
他の局面において、本発明は、配列番号１、配列番号１の変異体及び配列番号１の断片並びに配列番号２、配列番号２の変異体及び配列番号２の断片から成る群より選ばれるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列から成る群より選ばれるヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを包含する。
【００７７】
本発明の単離されたポリヌクレオチドは、好ましくはBLSAのコード配列である。本発明の１つの局面では、BLSAに特異的に結合し、BLSA機能の作用の発現を阻害又は活性化するアゴニスト及びアンタゴニスト抗体の生産に用いられる方法において抗原として機能するBLSAを生産するためにポリヌクレオチドは用いられる。本発明の他の局面では、ポリヌクレオチドは、DNA免疫技術のためのワクチンとして用いることができる。BLSAの発現のために、ポリヌクレオチドを利用する、記載された種々の他の方法もまた意図される。
【００７８】
ベクター及び宿主細胞
他の局面では、本発明は、本発明のBLSAをコードするヌクレオチド配列を含むべく、及びこのようなベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００７９】
例えば、宿主細胞は哺乳動物細胞（例えばCHO細胞）、原核細胞（例えば大腸菌）又は酵母細胞（例えばサッカロミセス・セレビシエ）であり得る。脊椎動物の融合ポリペプチドを生産する方法がさらに提供され、これは、脊椎動物の融合ポリペプチドが発現するのに適切な条件下で宿主細胞を培養し、細胞培養物から融合ポリペプチドを回収することを含む。
【００８０】
ワクチン
外来物から自己を識別する免疫系の故障により引き起こされる疾患を治療する理想的な方法は、この系を促進して自己保護免疫を誘起し、それ自身の有害な反応性を、このような応答が必要な時まで抑制することである。この課題は、DNAワクチン接種を用いることにより達成されている。DNA接種は、ワクチン及び免疫治療開発へのアプローチである。DNAワクチンは、体液性及び細胞性免疫応答の両方の生成のためにインビボで抗原を発現する新規な手段である。この技術は、外来の抗原及び腫瘍に対する免疫だけではなく、Ｔ細胞レセプター遺伝子又は自己サイトカインのような自己抗原に対する免疫を得るためにも成功的であることがわかっている。DNAワクチン接種は、ある構築物の生産物に対する細胞性及び体液性応答の両者を誘起するので、病気の細胞を根絶するのに極めて有効なツールである。遺伝子発現カセットを生きた宿主に直接注射することにより、多くの細胞を、導入された遺伝子の産物の生産のための工場に形質転換する。これらの送達された遺伝子の発現は、重要な免疫学的結果をもたらし、新規に発現された抗原に対する宿主の特異的免疫活性化をもたらし得る。免疫化へのこのユニークなアプローチは、伝統的な抗原に基づくアプローチの欠点を克服することができ、安全で有効な予防的及び治療的ワクチンを提供する。宿主の正常細胞（非造血性）は、腫瘍抗原を発現し、免疫系に提示することができる。トランスフェクトされた細胞は、クラスI又はクラスII主要組織適合性複合物(MHCI, MHCII)と共に、該抗原の断片を細胞表面上に提示する。MHCIの提示は、トランスフェクトされた細胞を破壊するCTLを送る細胞媒介免疫応答への遭難信号として働く。CTLは腫瘍の後退にとって重要である。一般的に、細胞変性ウイルスが宿主の正常細胞に感染すると、ウイルスのタンパク質が内発的に処理され、MHC分子により細胞の表面上にそのまま又は断片化されて提示される。
【００８１】
ここに記載するベクター上にコードされる免疫原性融合ポリペプチドは、Ｔ細胞エピトープ部分とＢ細胞エピトープ部分とを含む。このベクターにコードされるＴ細胞エピトープ部分は、複数（すなわち、２、３、４、５、６又はそれ以上）のクラスII主要組織適合性(MHC)分子の抗原提示部位に結合してMHC抗原：Ｔ細胞抗原レセプターとの３成分複合物をＴ細胞抗原レセプターと形成することができる、広範囲又は「ユニバーサル」なヘルパーＴ細胞エピトープを含む。「非内発性タンパク質」とは、処置される個人にとって内発性ではないタンパク質を意味する。免疫原性融合ポリペプチドのＴ細胞エピトープ部分として有用な、このような非内発性タンパク質又はその断片は、破傷風トキソイド；ジフテリア毒素；クラスII MHC関連不変鎖；インフルエンザ赤血球凝集Ｔ細胞エピトープ；キーホールリンペットヘモシアニン(KLH);百日咳ワクチン、バシレカルメッテ−グエリン(BCG)結核ワクチン、ポリオワクチン、はしかワクチン、おたふくかぜワクチン、風疹ワクチン及びツベルクリンの精製タンパク質誘導体(PPD)を包含する公知のワクチンからのタンパク質；並びにAlexander et al. (Immunity, 1: 751-761 (1994))により記載された天然のアミノ酸を含む分子のような、複数のクラスII組織適合性分子の抗原提示部位に結合する合成ペプチドを包含する。BLSAＢ細胞エピトープ部分に結合されると、Ｔ細胞エピトープ部分は、免疫寛容を破って抗体が内発性BLSAと反応するようにすることができる。「免疫寛容を破る」とは、生物が通常は免疫原性であると認識しない、内発性BLSAのようなタンパク質に対する免疫応答を、生物が行なうように強制することを意味する。
【００８２】
DNAワクチンは、細菌は、種々の感染症に対する免疫化のための有望なアプローチであることが示されている。Michel, M L et al., Huygen, K, et al., and Wang, B, et al.微生物抗原遺伝子を含む裸のDNAを送達することにより、宿主内での抗原特異的免疫応答が誘起される。DNA系ワクチンを用いた抗原特異的免疫応答の誘起は、いくつかの有望な効果を示す。Wolff, J. A., et al.最近の研究により、CEA及びMUC-1のためのDNA媒介ワクチンを用いた免疫化の潜在的な実行容易性が示された。Conry, R. M., et al. and Graham, R. A., et al.
【００８３】
DNA系ワクチン接種は、生きた弱毒化ウイルスによる免疫化よりも、抗原の発現、毒性及び病原性の制御の程度が大きいことが示されている。前記薬理的に許容できる、DNAワクチン接種のための担体及び前記送達担体の構築、操作及び使用は、「Ｔ細胞調節のための遺伝子治療」と題する抗癌治療についてのDowへの米国特許第5,705,151号に詳細にされており、この特許は、その全体がここに記載されているのと同様にここに組み入れられたものとする。
【００８４】
他の局面では、本発明は、BLSA又はその免疫原性断片を患者に注射することを含む、Ｂ細胞リンパ腫又は他のＢ細胞媒介疾患に対する、患者の免疫方法を提供する。BLSA又はその免疫原性断片は、単独で、又は適切なアジュバント及び／又は他の抗原並びに他の治療剤と共に注射することができる。
【００８５】
一般的に、抗原は、主要組織適合性複合物(MHC)分子、すなわち、MHCクラスI分子及びMHCクラスII分子を用いて免疫系に提示される。BLSAのような腫瘍抗原のような内発性又は自己抗原は、通常、MHCクラスI分子に結合され、細胞障害性Ｔ細胞(CTL)に対して提示される。ウイルス抗原のような外来性抗原は、通常、MHCクラスII分子に結合し、Ｂ細胞と相互作用して抗体を産生するＴ細胞に対して提示される。
【００８６】
MHCクラスII限定抗原又はクラスII抗原として知られる、クラスII経路を介して提示される抗原は、Ｔ細胞により認識され、Ｔ細胞を活性化する。これらの活性化されたＴ細胞は、クラスII抗原に対する完全な免疫応答を引き起こす。自己抗原は通常、MHCクラスII経路を介して免疫系に提示されないので、免疫系はこれらの自己抗原を外来抗原であると認識せず、このような抗原に対する完全な免疫応答を形成しない。
【００８７】
本発明の１具体例では、BLSA抗原は、免疫応答を刺激又は操作するように設計された他の抗原と共に同時に又は同期間内に投与される。好ましくは、BLSA抗原は、BLSA抗原及び細胞性免疫応答を誘起するように設計された他の抗原を含む構築物の一部として注射される。このような他の抗原は、Ｔ細胞への抗原提示を促進し、免疫系によって外来抗原と認識されないので典型的には不完全な免疫応答を誘起する、BLSAのような抗原に対するより高い免疫応答を引き起こすように設計される。
【００８８】
典型的には、BLSAはクラスII抗原と共に注射される。免疫系により自己抗原であると認識され、弱い又は不完全な免疫応答を誘起する、BLSA抗原と共に、MHCクラスII経路を介して免疫系を刺激する他の抗原を用いることは、BLSA抗原が免疫系により外来抗原であるとして扱われ、完全な免疫系応答を誘起することを確実にすることを助長する。好ましくは、BLSA抗原及びクラスII抗原は、該抗原が単一分子の部分である構築物の一部である。好ましくは、他の抗原はクラスII抗原である。
【００８９】
発現ベクター
前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターは、周知の技術により作製することができる。発現ベクターは、哺乳動物、微生物、ウイルス又は昆虫遺伝子から誘導されたような、適切な転写又は翻訳調節ヌクレオチド配列と動作的に連結されたヌクレオチド配列を含む。調節配列の例として、転写プロモーター、オペレーター、エンハンサー、mRNAリボソーム結合部位、並びに転写及び翻訳の開始及び終止を制御する適切な配列を挙げることができる。ヌクレオチド配列は、適切なポリペプチドのために、調節配列が該ヌクレオチド配列と機能的に関連しているときに「動作的に連結」されている。従って、プロモーターヌクレオチド配列は、該プロモーターヌクレオチド配列が、適切なヌクレオチド配列の転写を制御するならば、BLSA配列に動作的に連結されている。
【００９０】
通常複製開始点により与えられる、所望の宿主細胞中で複製する能力と、形質転換体を同定することができる選択遺伝子を追加的に発現ベクターに組み込んでもよい。
【００９１】
さらに、天然にはBLSAに付随しない、適切なシグナルペプチドをコードする配列を発現ベクターに組み込むこともできる。例えば、シグナルペプチド（分泌リーダー）のためのヌクレオチド配列を、ポリペプチドが最初は該シグナルペプチドを含む融合タンパク質として翻訳されるように、フレームを併せてポリペプチド配列に融合することができる。意図する宿主細胞中で機能するシグナルペプチドは、適切なポリペプチドの細胞外分泌を促進する。シグナルペプチドは、ペプチドが細胞から分泌された後、ペプチドから切り離すことができる。
【００９２】
宿主細胞
BLSAの発現のための適切な宿主細胞は、原核生物、酵母、古細菌及び他の真核生物細胞を包含する。細菌、菌類、酵母及び哺乳動物細胞宿主に使用するための適切なクローニング及び発現ベクターはこの分野において周知である。例えば、Pouwels et al. Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York (1985)。ベクターは、プラスミドベクター、一本鎖若しくは二本鎖ファージベクター、又は一本鎖若しくは二本鎖RNA若しくはDNAウイルスベクターであり得る。このようなベクターは、DNA及びRNAを細胞内に導入するための周知の技術によって、ポリヌクレオチド、好ましくはDNAとして細胞内に導入することができる。ファージ及びウイルスベクターの場合には、ベクターもまた、感染及び形質導入のための周知の技術によって、パッケージ化又はカプセル化ウイルスとして細胞内に導入することができ、このように導入することが好ましい。ウイスルベクターは、複製可能又は複製不能であり得る。後者の場合には、ウイルスの増殖は、一般的に相補的な宿主細胞内のみで起きる。本DNA構築物から誘導されるRNAを用い、無細胞翻訳系を用いて該タンパク質を生産することもできる。
【００９３】
本発明において宿主細胞として有用な原核生物は、大腸菌又はバチルスのような、グラム陰性又はグラム陽性生物を包含する。原核生物宿主細胞内では、ポリペプチドは、原核宿主細胞内での組換えペプチドの発現を容易にする、Ｎ末端のメチオニン残基を含んでいてもよい。Ｎ末端のMetは、発現された組換えBLSAペプチドから切り離してもよい。組換え原核宿主細胞発現ベクターのために一般的に用いられるプロモーター配列は、β−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系を包含する。
【００９４】
原核宿主細胞に用いられる発現ベクターは、一般的に１又は２以上の表現型選択マーカー遺伝子を含む。表現型選択マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質耐性を与えるタンパク質をコードする遺伝子又は自己栄養要求を供給するタンパク質をコードする遺伝子である。原核宿主細胞のための有用な発現ベクターの例として、クローニングベクターpBR322 (ATCC 37017)のような市販のプラスミドから誘導される発現ベクターを挙げることができる。pBR322は、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性遺伝子を含む、従って、形質転換された細胞を同定する単純な手段を提供する。pBR322を用いて発現ベクターを構築するために、適切なプロモーター及びDNA配列がpBR322ベクターに挿入される。他の市販のベクターは、例えば、pKK223-3(スウェーデン国UppsalaのPharmacia Fine Chemicals)、pGEM1 (米国ウィスコンシン州Madison のPromega Biotec)、pET (米国ウィスコンシン州Madison のNovagen)、pRSETシリーズベクター (米国カリフォルニア州Carlsbad のInvitrogen Corporation) を包含する(Studier, F.W., J. Mol. Biol. 219: 37 (1991); Schoepfer, R. Gene 124: 83 (1993))。
【００９５】
組換え原核宿主細胞発現ベクターに一般的に用いられるプロモーター配列は、T7(Rosenberg, A.H., Lade, B. N., Chui, D-S., Lin, S-W., Dunn, J. J., and Studier, F. W. (1987) Gene (Amst.) 56, 125-135)、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモーター系(Chang et al., Nature 275:615, (1978)及びGoeddel et al., Nature 281:544, (1979))、トリプトファン(trp)プロモーター系(Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8:4057, (1980))及びtacプロモーター (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 412 (1982))を包含する。
【００９６】
本発明における宿主細胞として有用な酵母は、Saccharomyces, Pichia, K. Actinomycetes及びKluyveromyces属の酵母を包含する。酵母ベクターはしばしば、2μ酵母プラスミドからの複製開始点配列、自発的複製配列(ARS)、プロモーター領域、ポリアデニル化配列、転写終止のための配列、及び選択マーカー遺伝子を含むであろう。酵母ベクターのために適したプロモーター配列は、とりわけ、メタロチオネイン、3-ホスフォグリセレートキナーゼ(Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073, (1980))又はエノラーゼ、グリセロアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスフォフルクトキナーゼ、グルコース-6-ホスフェートイソメラーゼ、3-ホスフォグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスフォグルコースイソメラーゼ及びグルコキナーゼのような他の糖分解酵素(Holland et al., Biochem. 17:4900, (1978))のプロモーターを包含する。酵母発現に用いるのに適した他のベクター及びプロモーターは、Fleer et al., Gene, 107:285-195 (1991)にさらに記載されている。酵母及び酵母形質転換プロトコールのために適した他のプロモーター及びベクターは、この分野において周知である。
【００９７】
酵母形質転換プロトコールは、当業者に知られている。このようなプロトコールの１つは、Hinnen et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 75:1929 (1978)により記載されている。Hinnenのプロトコールは、選択培地中でTrp+形質転換体を選択するものであり、該選択培地は、0.67% 酵母窒素塩基、0.5% カザミノ酸、2%グルコース、10μg/mlアデニン及び20μg/mlウラシルから成る。
【００９８】
この分野において周知の哺乳動物又は昆虫宿主細胞培養系もまた組換えBLSAの発現のために用いることができる。例えば、昆虫細胞中での外来タンパク質の生産のためのバキュロウイルス系(Luckow and Summers, Bio/Technology 6:47 (1988))又は哺乳動物発現のためのチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を用いることができる。哺乳動物宿主細胞発現ベクターのための転写及び翻訳制御配列は、ウイルスゲノムから切り出すことができる。一般的に用いられているプロモーター配列及びエンハンサー配列は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、サルウイルス40(SV40)及びヒトサイトメガロウイルスから誘導される。SV40ウイルスゲノムから誘導されるDNA配列は、例えばSV40開始点、初期及び後期プロモーター、エンハンサー並びにスプライス及びポリアデニル化部位のような、哺乳動物宿主細胞中での構造遺伝子配列の発現のための他の遺伝子要素を提供するために用いることができる。ウイスル初期及び後期プロモーターは、両方とも、ウイルスの複製開始点をも含むかもしれない断片としてウイルスゲノムから容易に得られるので特に有用である。哺乳動物宿主細胞に用いるための発現ベクターの例は、この分野において周知である。
【００９９】
利益がある場合には、BLSAは、融合部分に結合されたBLSAを有する融合タンパク質として発現させてもよい。融合部分は、しばしば、例えば、アフィニティクロマトグラフィーによる、融合タンパク質の単離及び精製を可能にすることによりタンパク質の精製に役立つ。融合タンパク質は、タンパク質のカルボキシル末端及び／又はアミノ酸末端に結合された融合部分を含むタンパク質をコードする、融合核酸配列で形質転換された組換え細胞を培養することにより生産することができる。好ましい融合部分は、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、２価の金属イオンに結合することができるポリヒスチジン部分及びマルトース結合タンパク質を包含するがこれらに限定されるものではない。
【０１００】
発現及び回収
本発明によると、単離及び精製されたBLSAを上記した組換え発現系により生産することができる。該方法は、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を、ポリペプチドの発現を促進するのに十分な条件下で培養することを含む。該ポリペプチドは、次いで、用いる発現系に応じ、培地又は細胞抽出物から回収される。当業者に知られているように、用いる宿主細胞及び組換えペプチドが培地中に分泌されるか否かなどの因子に応じ、組換えポリペプチドを精製するための方法は異なるであろう。組換えポリペプチドを分泌する発現系を用いる場合には、先ず培地を濃縮する。濃縮工程に続き、濃縮物を、ゲルろ過媒体のような精製マトリックスに施すことができる。あるいは、例えば、ペンダントジエチルアミノエチル(DEAE)基を有するマトリックス又は基体のような、陰イオン交換樹脂を用いることもできる。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、又はタンパク質精製に一般的に採用される他のタイプであり得る。また、陽イオン交換工程を用いることもできる。適切な陽イオン交換体は、スルホプロピル又はカルボキシメチル基を含む種々の不溶性マトリックスを包含する。さらに、疎水性RP-HPLC媒体（例えばペンダントメチル若しくは他の脂肪族基を有するシリカゲル）を用いた逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)工程、イオン交換HPLC(例えば、ペンダントDEAE又はスルホプロピル(SP)基を有するシリカゲル）、又は疎水性相互作用HPLC(例えば、ペンダントフェニル、ブチル、又は他の疎水性基を有するシリカゲル）を用いて該タンパク質をさらに精製することができる。上記した精製工程のいくつか又は全てはこの分野において周知であり、これらを採用して単離及び精製された組換えポリペプチドを提供することができる。
【０１０１】
細菌培養において生産される組換えポリペプチドは、通常、先ず宿主細胞を破砕し、遠心し、不溶性ポリペプチドの場合には細胞ペレットから、可溶性ポリペプチドの場合には上清から抽出し、次いで、濃縮、塩析及びイオン交換アフィニティ精製の１若しくは２以上、又はサイズ排除クロマトグラフィー工程により単離される。最後に、RP-HPLCを最終精製工程のために採用することができる。微生物細胞は、凍結−解凍サイクル、音波処理、機械的破砕又は細胞溶解剤の使用を包含する、いずれの便利な方法によっても破砕することができる。
【０１０２】
アゴニスト及びアンタゴニストスクリーニング
他の局面では、本発明は、BLSAアゴニスト及びアンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法を提供する。スクリーニング方法は、BLSAを、潜在的BLSAアゴニスト／BLSAアンタゴニストに曝露し、潜在的アゴニスト／アンタゴニストがBLSAに結合するか否かを調べることを含む。もし潜在的なアゴニスト／アンタゴニストが結合するならば、患者に生体内投与され、ネイティブのBLSAに曝露されたときに実際にアゴニスト又はアンタゴニストとして機能するであろうことが強く推測される。上記方法を用いて同定されたBLSAアゴニスト及びBLSAアンタゴニストは、サイトカインを生産することができる細胞を該アゴニスト／アンタゴニストに曝露し、非曝露細胞と比較してサイトカインの生産を測定することにより、アゴニスト又はアンタゴニストとして特徴付けることができる。他のスクリーニング方法は、BLSA DNA結合配列を含むレポーター遺伝子構築物で細胞をトランスフェクトすることを含む。好ましくは、潜在的アゴニスト／アンタゴニストは、有機化合物、又は抗体を包含するポリペプチドである。該スクリーニング法は、疾患、特に非疾患状態に比べて、サイトカインの生産が比較的低い又は比較的高いことにより特徴付けられる疾患の予防又は治療のために薬剤として機能するかもしれない化合物を同定するのに有用である。
【０１０３】
BLSA発現変調
さらに他の局面では、本発明は、BLSAをコードするDNA又はRNAポリヌクレオチドの転写又は翻訳を干渉することにより細胞性BLSAの発現をブロック又は変調するための方法を提供する。該方法は、BLSAを発現することができる細胞を、BLSAをコードするDNA又はRNAポリヌクレオチドの転写又は翻訳を干渉する分子に曝露することを含む。該分子は、有機分子、生物有機分子、アンチセンスヌクレオチド、RNAiヌクレオチド又はリボザイムであり得る。
【０１０４】
好ましい具体例では、該方法は、BLSA DNA又はBLSAの発現を調節するDNAと三重らせんを形成するアンチセンスであるポリヌクレオチドに細胞を曝露することにより、細胞性BLSAの発現をブロック又は変調することを含む。細胞は、BLSA活性化レセプターの発現を阻害又は制御するのに十分な量のアンチセンスポリヌクレオチド又は三重らせん形成性ポリヌクレオチドに曝露される。また、本発明は、BLSAをコードする DNA又はBLSAをコードするDNAの発現を調節するDNAと三重らせんを形成するアンチセンスであるポリヌクレオチドを動物に投与することにより、動物内でのBLSAの発現をブロック又は変調する方法を提供する。動物は、該動物内においてBLSAの発現を阻害又はブロックするのに十分な量のアンチセンスポリヌクレオチド又は三重らせん形成性ポリヌクレオチドを投与される。好ましくは、アンチセンスポリヌクレオチド又は三重らせん形成性ポリヌクレオチドはDNA又はRNAポリヌクレオチドである。
【０１０５】
細胞をアンチセンスポリヌクレオチドに曝露する方法及びアンチセンスポリヌクレオチドを動物に投与する方法は、この分野において周知である。好ましい方法では、該ポリヌクレオチドは、公知の方法を用いて細胞性ゲノム内に組み込まれ、細胞内で発現することを許される。発現されたアンチセンスポリヌクレオチドは、BLSAをコードするポリヌクレオチドに結合し、それらの転写又は翻訳を干渉する。
【０１０６】
疾病素質診断
他の局面では、本発明は、BLSAの調節されない発現により引き起こされる疾病を発達させる、患者の疾病素質を診断する方法を提供する。該発明は、患者のある細胞、組織又は体液中にBLSAが存在し又はその量が増大していることは、該患者がある免疫疾患に対する疾病素質を有していることを示しているという発見に基づく。１つの具体例では、該方法は、BLSAを含むことが知られている細胞、組織又は体液試料を患者から採取し、該組織又は体液について、組織中のBLSAのレベルを分析し、BLSAのレベルに基づいてある免疫疾患に対する患者の疾病素質を予測することを含む。他の具体例では、該方法は、定まったレベルのBLSAを含むことが知られている、細胞、組織又は体液試料を患者から採取し、該組織又は体液について、組織中のBLSAのレベルを分析し、正常な細胞、組織又は体液について確立された、定められた又は測定されたレベルと比較した、該組織又は体液中のBLSAの量の変化に基づいてある免疫疾患に対する患者の疾病素質を予測することを含む。BLSAの定められたレベルは、文献値に基づいて知られた量又は正常な細胞、組織若しくは体液中の量を測定することにより事前に定められた量であり得る。特に、ある組織又は体液中のBLSAレベルを測定することにより、患者における免疫疾患を、特異的かつ早期に、好ましくは疾患が起きる前に検出することを可能にする。該方法を用いて診断することができる免疫疾患は、ここに記載した免疫疾患を包含するがこれらに限定されるものではない。好ましい具体例では、組織又は体液は、末梢血、末梢血白血球、肺又は皮膚バイオプシーのようなバイオプシー組織、並びに滑液及び滑液膜組織である。
【０１０７】
疾患の予防及び治療
BLSAアゴニスト又はアンタゴニストの投与量は、当該哺乳動物の年齢、大きさ及び性質並びに疾患により変化する。当業者は、これらの因子に基づき投与量を決定することができる。アゴニスト又はアンタゴニストは、例えば、疾患の状態を緩和するために２、３日にわたって１回若しくは数回投与したり、又はアレルギーや喘息の予防のために長期間にわたって定期的に投与したりするような、当該疾患に合った治療計画に沿って投与することができる。
【０１０８】
アゴニスト及びアンタゴニストは、注射及びインプラントを用いた方法等を包含する、いずれの許容できる方法によっても哺乳動物に投与することができる。注射及びインプラントが好ましい。なぜなら、これらは、投与のタイミング及び投与量を精密に制御することができるからである。アゴニスト及びアンタゴニストは、好ましくは非経口投与される。ここで、非経口投与とは、静脈内、筋肉内若しくは腹腔内注射又は皮下インプラントを意味する。
【０１０９】
注射により投与する場合には、アゴニスト及びアンタゴニストは、種々の賦形剤、アジュバント、添加剤及び希釈剤のようないずれかの生物適合性並びにアゴニスト及びアンタゴニストに対する適合性を有する担体を含む注射可能な製剤として哺乳動物に投与することができる。非揮発性発熱物質を有さない水、滅菌水及び静菌水のような水性担体も、注射可能な溶液を形成するのに適している。これらの形態の水に加え、数種類の他の水性担体を用いることができる。これらは、塩化ナトリウム、リンゲル、デキストロース、デキストロースと塩化ナトリウム、及び乳酸化リンゲルのような、滅菌可能な等張性注射組成物を包含する。綿実油、ゴマ油又は落花生油のような非水性担体、及びミリスチン酸イソプロピルのようなエステルもまた、該組成物のための溶媒系として用いることができる。さらに、抗菌保存料、酸化防止剤、キレート化剤及び緩衝剤を包含する、組成物の安定性、滅菌性及び等張性を高める種々の添加物を添加することができる。もっとも、用いられるいずれの担体、希釈物又は添加物も、生物適合性並びに本発明のアゴニスト及びアンタゴニストとの適合性を有している必要がある。
【０１１０】
BLSAポリペプチド診断薬
本発明の抗体はまた、特定の細胞、組織若しくは体液又はこれらの成分中で発現されるBLSAを検出する診断方法に用いることもできる。該方法は、細胞、組織若しくは体液又はこれらの成分を本発明の抗体に曝露し、該細胞、組織若しくは体液又はこれらの成分が該抗体に結合するかどうかを調べることを含む。該抗体に結合する細胞、組織若しくは体液又はこれらの成分は、BLSAを含む細胞、組織若しくは体液又はこれらの成分であると診断される。このような方法は、特定の細胞、組織又は体液が、BLSAを含むことが前から知られているあるタイプの細胞、組織又は体液であるかどうかを決定するのに有用である。例えば、競合的結合アッセイ、直接又は間接サンドイッチアッセイ、及び異質又は均質段階で行なわれる免疫沈降アッセイのような、この分野において知られた種々の診断方法を用いることができる。
【０１１１】
ノックアウト動物
他の局面では、本発明は、内発性BLSA遺伝子がヘテロ接合的又はホモ接合的に破壊されたゲノムを有し、生物学的に機能的なBLSAタンパク質の発現が抑制又は妨げられたノックアウト動物を提供する。好ましくは、本発明のノックアウト動物は、内発性BLSA遺伝子がホモ接合的に破壊されたものである。好ましくは、本発明のノックアウト動物はマウスである。ノックアウト動物は、当業者に知られた技術を用いて容易に作製することができる。遺伝子破壊は、生物学的に不活性なポリペプチドをもたらす、ポリペプチドコード領域のいずれかの部分への停止コドンの導入、ポリペプチドの発現を抑制し又は妨げる、プロモーター又は他の調節配列中への突然変異の導入、遺伝子を不活化する、該遺伝子中への外来配列の挿入、及び該遺伝子からの配列の欠失を包含する、数種類の方法により達成することができる。
【０１１２】
哺乳動物の生殖系列中に特定のDNA配列を導入し、これらの配列（導入遺伝子）の各次世代への安定な伝達を達成する、数種類の技術が利用可能である。最も一般的に用いられている技術は、受精した卵母細胞の前核にDNAを直接マイクロインジェクションすることである。これらの卵母細胞から誘導されたマウス又は他の動物は、約１０〜２０％の頻度で、育種により異なるトランスジェニックマウスラインをもたらすであろうトランスジェニックファウンダーである。胚の操作及びマイクロインジェクションを介して、マウスのようなトランスジェニック動物を発生させることはこの分野において常套化された。例えば、米国特許第4,736,866号、第4,870,009号及び第4,873,191号並びにHogan, B., Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)。同様な方法が、他のトランスジェニック動物の生産にも用いられる。
【０１１３】
胚性幹細胞（「ES細胞」）技術は、特異的に欠失された遺伝子を有するノックアウトマウス（及び他の動物）を創製するために用いることができる。インビトロで培養でき遺伝的に修飾できる全能性胚性幹細胞を、マウス胚と凝集させるか又はこれにマイクロインジェクションし、該遺伝的修飾をその新生仔に伝えることができるキメラマウスを作出する。直接育種を介して、この遺伝子を欠失するマウスを得ることができる。遺伝的に修飾された動物の作出に数種類の他の方法が利用可能である。例えば、トランスジェニックマウスの作出のために、細胞質内精子注入技術(ICSI)を用いることができる。この方法は、精母細胞の頭を未受精卵母細胞にマイクロインジェクションし、卵母細胞の受精及びその後の着床胚の適切な細胞分裂の活性化を引き起こすことが必要である。このようにして得られたマウス胚は、偽妊娠受容雌に移入される。該雌は、同腹のマウスを産むであろう。トランスジェニックマウスの作出に適用されるICSIでは、精子又は精母細胞の頭の懸濁液を、所望のDNA分子（導入遺伝子）を含む溶液とインキュベートする。これらは精子と相互作用し、一旦マイクロインジェクションされると、外来DNAのための担体として働く。卵母細胞の中に一旦入ると、該DNAはゲノムに組み入れられ、トランスジェニックマウスを与える。この方法は、伝統的な前核マイクロインジェクションプロトコールを用いた、これまでに得られているトランスジェニックマウスの収率よりも、高い収率（８０％超）をもたらす。
【０１１４】
遺伝子治療
BLSAは数種類のヒト異常Ｂタイプ白血病セルラインにおいて高度に発現されているので、BLSAは、種々のタイプのＢ細胞白血病（例えばバーキットリンパ腫及び免疫芽細胞性Ｂ細胞リンパ腫等）の遺伝子治療の分野において標的として用いることができる。遺伝子治療は、生体外においても生体内においても適用することができ、BLSAはDNA、RNA又はそのタンパク産物のレベルで標的とすることができる。例えば、BLSA特異的オリゴデオキシヌクレオチドを用い、プリンリッチな二本鎖DNA配列と三重らせんを形成して癌鎖脂肪内部のBLSA遺伝子を不活化することができる。RNAレベルでは、相補的RNA分子を提供することにより、BLSAの移送及び翻訳を妨害するアンチセンス技術を用いることができる。（例えば、Collins, J., Herman, P., Schuch, C. and Babgy G. (1992)) c-myc antisense oligonucleotides inhibit the colony-forming capacity of Colo 320 colonic carcinoma cells. Journal of Clinical Investigation 89:1523-1527; Ebbinghouse, S., Gee, J., Rodu, B., Mayfield, C. and Miller, D. (1993) Triplex formation inhibits HER2/neu transcription in vitro. Journal of Clinical Investigation 92:2433-2439.
【０１１５】
実施例
本発明を、以下の好ましい具体例の実施例によりさらに例示する。もっとも、これらの実施例は、単に例示のために記載するものであり、他に断りがない限り本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例１】
【０１１６】
BLSAは、免疫グロブリン(Ig)ドメインのHidden Markov Model (HMM)を用いてヒトESTデータを検索することにより同定された。HMMは、１１３個の確認されたIgドメインの整列から構築され、HMMER プログラム(S.R. Eddy. Profile hidden Markov models. Bioinformatics 14:755-763, 1998)を用いて校正された。HMMは、Pfam(バージョン6.6、http://pfam.wustl.edu/)データベースから得られ、ヒトESTデータを検索するために用いた。Ig HMM検索時間を短縮するために、我々は、関連データベースシステムを用いて蓄積され組織化された２９０万の公共のEST配列から合計189,623個のESTコンティグ／コンセンサス配列を生成した。
【０１１７】
検索は、工程の自動化を可能にする、ユニークなソフトウェアシステムを用いて行なった。短く述べると、全てのヒトESTコンティグを含むfasta形式のファイルを生成し、次いで、estwisedbプログラム(http://www.sanger.ac.uk/Software/Wise2)を用いてIg HMMにマッチするものをこれらから検索した。結果を処理及び評価した。予測E-値の生スコアの閾値は、偽陰性及び偽陽性の両者の割合が最少化されるように選択した。５５５個のESTコンティグをさらなる分析のために選択した。５５５個のESTコンティグの全てを、全ての種から蓄積された非重複タンパク質データベースに対してブラスト(blast)化した。得られたヒットについて、配列の新規性及びIgドメインとの配列類似性に基づいて、興味のある候補を検索した。各Igドメイン含有候補について、ゲノム内での位置の特定及び隣接配列との関係、UniGeneクラスターアノテーション、コード領域同定及び確認、該ドメインがESTであるか又はESTを含み、異なる組織及びセルラインで発現されるという複数の起源からの証拠を包含する、一連のコンピューターによる特徴付けを行なった。さらなる実験的特徴付けのために合計１０個の候補を選択した。
【実施例２】
【０１１８】
DaudiセルラインcDNAを鋳型として用いたPCRにより、予測されたBLSAのコード領域を、3' V5及びHisタグ配列と共に、フレームを合わせてpCR3.1-Topoベクター(Invitrogen)にクローニングした。このcDNAで次に、発現のために一時的にLipofectamine 2000で293T細胞にトランスフェクションした。3 x 105細胞を100μLの脱イオン蒸留水中に再懸濁し、同体積の2Xローディングバッファーを添加した後、９８℃で５分間加熱することにより全細胞タンパク質試料を調製した。これらのタンパク質を15% SDS-PAGEで分離し、膜に転写した。タグを付されたBLSAタンパクは、抗V5モノクローナル抗体を用いたウェスタンブロットにより約50kDのタンパクバンドとして検出される。このタンパクバンドは、プラスミドベクターのみでトランスフェクトした細胞中には存在しなかった。
【実施例３】
【０１１９】
BLSA mRNA発現の定量的リアルタイムPCR分析
Primer Express 2.0 (Applied Biosystems, Inc.)を用い、BLSAヌクレオチド配列から、２組のオリゴヌクレオチドプライマー、すなわち、
(5'-GTGAACCCTTCCACCTGATTGT (配列番号21)と5'-GACCTTGGAGGATCAGCCAGT (配列番号22; 5'-CGGGCCTAACAGGGAATTCT (配列番号23) と5'-CCCGCTGTCTGCCTTTTGTA (配列番号24))を選択し、合成し、リアルタイムPCRに用いてBLSAの発現を測定した。次の細胞中でのBLSAの発現レベルを測定するためにRNAを単離した。バーキットリンパ腫セルラインであるDaudi; Ｂリンパ球バーキットリンパ腫であるRamos; Ｂリンパ球バーキットリンパ腫セルラインであるRaji; ミエローマセルラインであるSKO-007; 急性前骨髄性白血病セルラインであるHL-60のクローン15;前Ｂリンパ芽球リンパ腫セルラインであるJM1; プロＢ急性リンパ球性白血病セルラインであるREH;急性単球性白血病であるTHP-1; 未熟ヒトマスト細胞セルラインであるHMC-1; 一次ヒト血管内皮細胞であるHUVEC; 一次Ｂ細胞; CD34+前駆細胞; 一次好塩基球; 好中球;単球;及びＴ細胞白血病セルラインであるHPB-ALL。
【０１２０】
ABI Prism 7900 (Applied Biosystems, Inc.)配列検出システムを用い、製造者の指示に従って、リアルタイム定量PCR(Taqman)を行なった。上記したセルラインからの各等量のRNAをPCRの鋳型として用い閾値サイクル(Ct)を得、18S RNAからの公知のCtを用いてCtを正規化してΔCtを得た。異なるセルライン間のBLSAの遺伝子発現の相対レベルを比較するために、最低の発現レベルを基準に用いてΔΔCt値を計算し、次にこれをリアルフォールド発現差異値(real fold expression difference value)に転換した。
【０１２１】
BLSA mRNAは、Ｂ細胞リンパ腫セルライン、すなわち、Daudi、Ramos及びRaji、並びにJM1と命名された前Ｂリンパ腫細胞中で高度に発現していることがわかった。プロＢ細胞であるREH及び一次Ｂ細胞中での発現は極めて少ないことがわかった。HPB-ALL、THP-1、末梢血リンパ球、単球、ヒト内皮細胞、CD34+前駆細胞、マスト細胞、好塩基球及び好中球中での発現レベルは無視できるものであった。
【０１２２】
【表１】
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【０１２３】
【表２】
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【実施例４】
【０１２４】
抗BLSAモノクローナル抗体の生成
抗BLSAモノクローナル抗体は、遺伝子銃を用いて、BLSAをコードするプラスミドをマウスに免疫することにより生成した。個々の抗BLSAモノクローナル抗体は、組換えBLSAタンパク質を用いたELISA及びウェスタンブロットにより特徴付けた。
【実施例５】
【０１２５】
Ｂ細胞リンパ腫セルライン中でのBLSAタンパク質の発現
BLSAがＢ細胞リンパ腫セルライン中で発現しているかどうかを決定するために、我々は免疫蛍光実験を行なった。短く述べると、25000個の細胞をガラススライド上にサイトスピン(cytospin)し、風乾した。細胞を、室温で１０分間、カルノア固定液(60%エタノール、30%クロロホルム及び10%酢酸）で固定し、PBSで３回洗浄した。細胞を、氷上で３０分間ブロック溶液(1%ウマ血清、1% TRITON X-100、2%ウサギ血清、 1% BSA及びPBS中1%ヤギ血清）で予めブロックし、抗BLSAモノクローナル抗体(PBS中1% BSA中１μg/ml)と共に室温で３０分間インキュベートした。次に細胞を３回洗浄し、ヤギ抗マウスIgG (H+L)-FITC (Jackson Immuno Lab)と1:100希釈で３０分間室温でインキュベートした。細胞を洗浄し、風乾し、カバーガラスで被覆した。蛍光顕微鏡を用いて蛍光染色を調べ、Snap-Shotソフトウェアを用いて結果を記録した。BLSAはＢ細胞リンパ腫Daudi並びにヒト前Ｂリンパ芽球CRL10423及び1596中で検出されたが、Ｔ細胞セルラインJurkat又はマストセルラインHMC-1中では検出されないことがわかった（表３）。
【０１２６】
【表３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2005508171.tif 000048
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