(57)【要約】印刷されたマイクロアレイを直接可視化する方法およびそのための装置が開示される。１つの実施態様において、この方法は、（ａ）第１の標識で標識された標識プローブを作製する工程、（ｂ）標識プローブを有するマイクロアレイであって、多数のプローブスポットを含むマイクロアレイを構築する工程、および（ｃ）各プローブスポットにおいて存在するプローブの量を測定するためにマイクロアレイを検査する工程を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロアレイを直接可視化する方法であって、
ａ）第１の標識で標識された標識プローブを作製する工程、
ｂ）標識プローブを有するマイクロアレイであって、多数のプローブスポットを含むマイクロアレイを構築する工程、および
ｃ）各プローブスポットにおいて存在するプローブの量を測定するためにマイクロアレイを検査する工程
を含む方法。
【請求項２】
プローブがDNA分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
プローブが、cDNAおよびオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
プローブが、タンパク質および抗体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
標識プローブが静電的結合および共有結合的結合によってマイクロアレイ表面に結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
第１の標識が蛍光性である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
標識プローブがフルオレセインで標識される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
標識が、蛍光性標識、放射性標識、リン光性標識および発光性標識からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｃ）の検査が、相対的蛍光単位の検出によるものであり、共焦点レーザースキャナーの使用によって行われる、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
好ましい量のプローブが決定されており、そしてマイクロアレイが、この事前設定量を使用して評価される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ａ）の蛍光標識プローブが標識プライマーによって作製される、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
標識プローブは長さが10塩基対〜100,000塩基対の間である、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
プローブは平均してDNA鎖あたり1個の標識分子を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
（ｄ）第２および第３の標識で標識されている標識標的分子にマイクロアレイをさらす工程
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
（ｅ）プローブに結合した標的の量を測定するためにマイクロアレイを検査するさらなる工程
を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
マイクロアレイがポリリシン被覆ガラススライドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
プローブをマイクロアレイに結合させているとき、DMSO／1.5Mベタインが使用される、請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
工程（ｃ）が、スポット検出およびシグナル分割のために空間および強度に依存するアルゴリズムを用いるソフトウエアによって評価されるような画質の測定を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
マイクロアレイがスライドあたり3,000個〜10,000個のプローブ密度を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
ａ）表面、および
ｂ）多数のスポットで表面に結合した標識プローブ
を含み、各プローブが第１の標識で標識され、かつ、プローブが、スポットされたオリゴヌクレオチド、cDNA、タンパク質および抗体からなる群から選択される、印刷されたマイクロアレイ。
【請求項２１】
プローブがDNAである、請求項２０に記載のマイクロアレイ。
【請求項２２】
プローブが、核酸、タンパク質および抗体からなる群から選択される、請求項２０に記載のマイクロアレイ。
【請求項２３】
表面がガラススライドである、請求項２０に記載のアレイ。
【請求項２４】
表面が、ポリ-L-リシン、アミノサリン、エポキシおよびアミノアリルからなる群から選択されるコーティング剤で被覆される、請求項２０に記載のアレイ。
【請求項２５】
第１の標識が蛍光性である、請求項２０に記載のアレイ。
【請求項２６】
第１の蛍光性標識がフルオレセインである、請求項２５に記載のアレイ。
【請求項２７】
第１の標識が、蛍光性標識、発光性標識、放射性標識またはリン光性標識からなる群から選択される、請求項２０に記載のアレイ。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、米国特許出願第60/314,005号（2001年8月21日出願；これは参考として組み込まれる）に対する優先権を主張する。
【連邦政府により援助を受けた研究または開発に関する記述】
【０００２】
【発明の背景】
【０００３】
cDNAマイクロアレイプラットホームは、ヒト疾患に対する新しい見通しをもたらす大きな潜在的可能性を有している（ダナセカランら(Dhanasekaran, et al.)、2001；ガーバーら(Garber, et al.)、2001；ヘデンフォークら(Hedenfalk, et al.)、2001；ヘグデら(Hegde, et al.)、2001；シェナら(Schena, et al.)、1995；シェナら(Schena, et al.)、1996；ソーリーら(Sorlie, et al.)、2001）。cDNAマイクロアレイの使用は、アレイを構築することから始まるが、この場合、典型的には、数百個から数千個のcDNAプローブがPCRによって増幅され、精製され、（典型的には、ポリ-L-リシンまたはアミノサリン（amino saline））被覆されたガラススライドに印刷される。典型的な実験において、スライドは固定処理され、ブロッキングされ、そして最後に、示差的な遺伝子発現について比較されている２つの生物学的サンプルに由来するCy3標識cDNA標的およびCy5標識cDNA標的とのハイブリダイゼーションに付される。ハイブリダイゼーション後、アレイは蛍光スキャナーで分析され、元の２つのサンプルにおけるmRNA種の相対的な量が、特別に設計されたソフトウエアを使用して相同的な(homologous)アレイ構成要素(element)における２つの蛍光団の間での比率として規定される（エイセン(Eisen)およびブラウン(Brown)、1999；ヘグデら(Hegde, et al.)、2000；シェナら(Schena, et al.)、1995；シェナら(Schena, et al.)、1996；ワンら(Wang, et al.)、2001）。
【０００４】
しかしながら、この有用な技術には、認識されたデータの品質／再現性の問題があり、このため、複雑な生物学的システムに対するその適用が制限され得る（ケル(Kerr)およびチャーチル(Churchill)、2001；リーら(Lee, et al.)、2000）。大きい実験的変動性が、通常の生物学的変動だけでなく、実験室での技術的問題によって生じ得る（プリチャードら(Pritchard, et al.)、2001）。ユら(Yue, et al.)、（2001）は、サッカロミセス・セレビジアエ（Sccharomyces cerevisiae）のプローブおよび相補的なインビトロ転写物を使用して、ガラススライドに結合したDNAの量が、部分的には、印刷されたDNAの濃度に依存すること、そしてスライドによって保持される量が、良好な示差的発現データのためには非常に重要であることを明らかにした（ユら(Yue, et al.)、2001）。知られている転写物比の検出値範囲が、構成要素が水において100ng/ul未満の濃度で印刷されたときには狭くなった。より希薄な印刷濃度で印刷されたとき、比率の狭域化が、30:1または1:30の入力転写物比が1:1に近い出力比として検出されるところにまで悪化した。このことは、結合したプローブを制限することは、示差的な遺伝子発現を検出するために過小評価または失敗をもたらすことを例示している（ユら(Yue, et al.)、2001）。印刷されたDNAの濃度、選択された印刷用緩衝液、およびガラス被覆は、処理後のスライドによって保持されるDNAの量に影響を及ぼす。一般的に使用されている印刷用溶液には、3X SSC（生理的食塩水クエン酸ナトリウム）、50％ジメチルスルホキシド（DMSO）および水が含まれる（エイセン(Eisen)およびブラウン(Brown)、1999；ユら(Yue, et al.)、2001）。ディールら(Diehl, et al.)、（2001）は、塩基対安定性の差を正常化することが知られているPCR添加剤のベタインの添加が溶液の粘度を増大させ、蒸発速度を低下させ、そしてまた、ポリ-L-リシン被覆スライドに対するプローブ結合を大きく高めることを見い出した（ディールら(Diehl, et al.)、2001；ヘンケら(Henke, et al.)、1997；リースら(Rees, et al.)、1993）。さらに、ガラススライドのプローブ飽和が、ベタインが存在しない印刷用溶液では500ng/ulを越えるのに対して、ベタインが存在したときには250ng/ulのより低い印刷濃度で得られ、１つのライブラリー増幅物から製造される潜在的なスライドの数を大きく増大させることができる（ディールら(Diehl, et al.)、2001）。
【発明の要約】
【０００５】
１つの実施態様において、本発明は、印刷されたマイクロアレイを直接視覚化する方法であり、この方法は、(a)第１の標識で標識された標識プローブを作製する工程、(b)標識プローブを有するマイクロアレイであって、多数のプローブスポットを含むマイクロアレイを構築する工程、および(c)各プローブスポットにおいて存在するプローブの量を測定するためにマイクロアレイを検査する工程を含む。本発明の１つの好ましい形態において、標識プローブはcDNAまたはオリゴヌクレオチドのいずれかであり、第１の標識は蛍光性である。別の実施態様において、標識プローブはタンパク質または抗体である。
【０００６】
１つの実施態様において、標識プローブは、フルオレセインなどの蛍光性プローブで標識され、工程(c)の検査は相対的蛍光単位の検出によるものであり、共焦点レーザースキャナーの使用によって行われる。
【０００７】
本発明の１つの実施態様において、標識されたDNAプローブは長さが10塩基対〜100,000塩基対の間であり、プローブは平均してDNA鎖あたり1個の蛍光性標識分子を含む。
【０００８】
別の実施態様において、本発明は、(d)第２および第３の標識（好ましくは蛍光性標識）で標識されている標識標的分子にマイクロアレイをさらす工程、および(e)プローブにハイブリダイゼーションした標的の量を測定するためにアレイを検査する工程をさらに含む上記に記載された方法を含む。
【０００９】
別の実施態様において、本発明は、(a)表面と、(b)多数のスポットで表面に結合した標識DNAプローブとを含むマイクロアレイで、各プローブが第１の蛍光性標識で標識されているマイクロアレイである。
【発明の説明】
【００１０】
アレイ製造の変数を制御することは、アレイの印刷が典型的にはハイブリダイゼーション後まで見ることができないので困難である。本発明において、本発明者らは、ハイブリダイゼーション前のスライドにおいて、構成要素／アレイ形態学（エレメント／アレイモルホロジー(element/array morphology)）を可視化し、かつDNA付着／保持を定量する手段として標識プローブのアレイを作製している。プローブを直接標識することにより、スライドの被覆、印刷および処理がハイブリダイゼーションから分離され、そして方法の評価および最適化が容易になる。本発明者らは、被覆、印刷および処理が連続して行われたスライドは必ずしも等価ではなく、そしてプレハイブリダイゼーションの画像化により、ハイブリダイゼーション性能が予測されるという観測結果を得ている。従って、プレハイブリダイゼーションスライドの評価および選択により、最低限の基準を満たさないスライドを避けることができるので、データの再現性および品質が改善され得る。
【００１１】
数多くの方法が、DNA付着／保持およびアレイ構成要素形態学をスライドの実験使用に先立って明らかにするという問題に取り組むために記載されている。ハイブリダイゼーション前の固定処理されたスライドをSYBRグリーンIIまたはSYTO 61などのDNA結合性の蛍光性色素で染色することが可能である（バッタグリアら(Battaglia, et al.)、2000；ユら(Yue, et al.)、2001）。しかし、品質管理分析後のスライドを研究で使用することには、脱染色することが必要であり、脱染色後のスライド性能の潜在的な変化を考慮しなければならない。マイクロアレイのどの構成要素に対してもハイブリダイゼーションする「万能的」標的の使用もまた報告されている（ユら(Yue, et al.)、2001）。ハイブリダイゼーションに基づくこれらの技術は、アレイの各構成要素内に存在するDNAの量に関する情報を提供するが、そのような技術では、印刷されたスライドのバッチに由来するスライドを品質管理分析のために犠牲にすることが必要であり、そして実験のために実際に使用されるアレイが、品質管理時に評価されたアレイと同等であることを試験者に完全には保証しない。最も最近には、ラマクリシュナンら(Ramakrishnan, et al.)、（2002）が、アレイ製造の機械的局面をモニターするために印刷用緩衝液の成分として蛍光性色素を同時にスポットすることを記載している。この方法では、標識はプローブに共有結合的に結合されておらず、添加された色素は、おそらくは、ブロッキング工程および固定処理工程のときに洗い流され、従って、どのくらいのプローブがアレイに保持されていたかが分からない。これは、アレイが再び不可視になるからである。
【００１２】
この問題を回避するために、本発明者らは、第１の標識で標識されたプローブ、好ましくは、蛍光標識プライマーで標識されたプローブ、例えば、GSI Luminonics ScanArray 5000共焦点レーザースキャナーを使用したとき、標的を標識するために典型的に使用されるCy5色素およびCy3色素（Cy3の励起543nm／発光(emission)570nm；Cy5の励起633nm／発光670nm）と分光的に適合し得るフルオレセイン標識プライマー（励起488nm／発光508nm）など）で標識されたプローブを作製することによって印刷アレイを直接可視化する手段を開発した。この装置の狭い10nmのバンド幅は、Cy3の発光にその広い放射テールが重なる(contaminate)フルオレセインを同時に励起させることなく、Cy3を543nmで励起することができる。発光性色素またはリン光性色素を使用することもまた望まれる場合がある。放射性色素を使用することが望まれることがある。第１の標識がプローブに共有結合的に結合されること、そして第１の標識が検出可能であり、かつ分光的に適合し得ることが必要である。これらのプローブは、好ましくは下記に記載されるように、マイクロアレイ表面（好ましくは、被覆されたガラススライド）におけるスポットで付けられる。「スポット(spot)」により、本発明者らは、離れた特定領域におけるプローブの付着（または「印刷」）、その結果、その特定領域に対する標識標的のハイブリダイゼーションが検出され得るようになることを意味する。
【００１３】
「分光的に適合し得る(spectrally compatible)」によって、本発明者らは、三つ組の色素が共焦点レーザースキャナーで検出可能であり、かつ互いに異なることを意味する。フルオレセイン、Cy5およびCy3は、GSI Luminonics ScanArray 5000共焦点レーザースキャナーを使用したとき、分光的に適合し得る。他の三つ組の色素も、この走査システムおよび他の走査システムに関して同等に好適である。他の三つ組には、Alexafluor 488（Molecular Probes、Eugene、OR）を含む、最低波長色素に対するフルオレセイン誘導体の任意の組み合わせが含まれる。Cy3およびCy5に対するAlexafluor同族体もまた、中間波長色素および高波長色素のために使用することができる。
【００１４】
本発明者らの方法では、スライドの被覆、印刷および処理がハイブリダイゼーションの分析から分離しているので、１）プローブ増幅コントロール、２）アレイ／構成要素形態学の直接的な検査、３）後処理されたプローブの保持の測定、および４）結合したプローブの量的品質管理の手段に関する方法が、改善された示差的な遺伝子発現分析のために提供される。
【００１５】
この方法の利点の１つは、取り込まれなかったプライマーが増幅プローブから除かれたとき、直接的な関係が、検出された相対的蛍光単位（RFU）と、スライドに存在するDNAプローブとの間に存在することであり、これにより、DNA保持研究が可能になる。
【００１６】
本発明は、マイクロアレイ分析を行うための方法および装置である。１つの実施態様において、本発明の方法は、cDNAが第１の標識（好ましくは、蛍光性の標識）で標識されるcDNAマイクロアレイを作製することを含む。好ましくは、この第１の標識はフルオレセインである。第１の標識は、第２および第３の標識と分光的に適合しなければならない。標的分子が、第２の標識または第３の標識のいずれかで標識される。
【００１７】
様々なマイクロアレイを、プローブ材料の供給源としての増幅されたcDNA、あるいは合成オリゴヌクレオチドのいずれかを使用して製造することができる。オリゴヌクレオチドアレイは、現在、２つのカテゴリーに分けられる。その場(in situ)での合成によって製造されるアレイ、この場合、オリゴヌクレオチドプローブがアレイ表面において直接合成される（例えば、Affymetrix GeneChip、これは25mer体を使用する）；または、スポットされたオリゴヌクレオチドのアレイ、この場合、全合成されたオリゴがアレイ表面にスポットされ、様々な異なる化学反応によって結合させられる（このようなオリゴは、典型的には、より長く、すなわち、70merである）。スポットされたオリゴのアレイは、多くの場合、アレイに実際に結合しているプローブを精製することができるという利点（すなわち、合成時に失敗した短い分子の除去）を提供し、設計においてより大きな柔軟度を現在では提供し、そして研究室で製造することができる。本発明者らは、本発明には、「スポットされたオリゴヌクレオチド」のアレイが包含されることを想定している。本発明者らが、「オリゴヌクレオチド」を含むマイクロアレイを参照するとき、本発明者らは、アレイにその後スポットされる全長オリゴヌクレオチドの作製を示している。
【００１８】
合成オリゴヌクレオチドは3'から5'の方向で作製されるので、適合し得る色素を最も5'端の位置(5'-most position)に付加することにより、全長分子のみの標識化がもたらされる。この性質の標識は、全長オリゴヌクレオチドがアレイの各位置にどのくらい存在したかを決定することができ、そしてまた他のアレイパラメーター（スポット形状など）を評価することができるので、スポットされたアレイにとって有用である。スポットされたオリゴのアレイの場合、cDNAアレイについて本発明者らが記載しているように、プローブがブロッキング工程のときにアレイ全体にどのくらい再分配されたかを測定することが可能である。
【００１９】
タンパク質をこの同じ目的のために色素（放射性色素を含む）で標識することが可能である。従って、本発明はタンパク質アレイおよび抗体アレイを含む。タンパク質が存在すること、その量、スポットの形状、およびタンパク質がスポット内にどのくらい含有されるかを確認することができる。
【００２０】
本発明の１つの実施態様において、標識されたマクロアレイが検査され、そして結合したプローブが、第１の標識を検出することによって直接測定される。下記の実施例には、この分析に対する好ましい方法が記載される。プローブはすべてが標識されなければならない。cDNAが、典型的には、プラスミドクローンからのPCRによって作製される。このPCR産物の標識化が、第１の標識で5'末端が標識されているオリゴヌクレオチドプライマーの使用によって達成される。プライマーはPCR産物の一部になるので、cDNAは、本質的には、それぞれの5'末端において一度だけ共有結合的に標識される。PCR配列決定などにおいて使用されるそのようなプライマーをオリゴヌクレオチド供給者から容易に入手することができる。分析後、事前に設定された品質管理基準と一致しないマイクロアレイを廃棄することができる。一般に、高密度アレイ全体での再現性が大きい結果を得るためにどのくらいの結合体が必要であるかを確認することができる。しかしながら、重要な実験のためには、本発明者らは、0.90を越えるシグナル対ノイズ比、3,000を越える平均構成要素フルオレセイン強度、および10％未満の構成要素フルオレセイン強度のCV（変動係数）を有するアレイを選択している。
【００２１】
本発明の別の実施態様において、上記に記載されるマイクロアレイは、標識された標的にさらされ、マイクロアレイ結合アッセイが行われる。
【００２２】
本発明の別の実施態様において、プローブが第１の標識で標識されているマイクロアレイが提供される。好ましくは、この標識はフルオレセインであり、アレイはcDNAアレイまたはオリゴヌクレオチドアレイのいずれかである。本発明の別の実施態様において、アレイはタンパク質アレイまたは抗体である。
【００２３】
本発明のアレイは、好ましくは、下記の工程によって作製される。cDNAアレイが、典型的には、PCRによってcDNAクローンの挿入物をそれらのプラスミドベクターから最初に増幅することによって調製される。これは、96ウエル形式または384ウエル形式において行うことができる。本発明者らは、PCRおよびすべてのその後の工程のために384形式を使用している。cDNAテンプレートの供給源として役立つクローンは、Research GeneticsもしくはI.M.A.G.E.コンソーシアムなどの市販のcDNAライブラリー、または個人のcDNAライブラリーであり得る。これらのcDNAクローンの挿入物を増幅するためのPCR反応は、細菌培養物から、または精製されたプラスミドテンプレートから直接行うことができる。いずれの場合でも、オリゴヌクレオチドプライマーが第１の蛍光性標識で標識される。本発明者らは、本発明者の装置ならびに本発明者の装置におけるCy3およびCy5とのその適合性のためにフルオレセインを選択している。チップ上に印刷されることになる20,000個を越えるクローンのPCRの後、PCR反応物は精製されなければならない。これは、PCR反応成分および緩衝液を除去することを含む多くの理由のために行われる。本発明者らは、取り込まれなかった標識オリゴヌクレオチドのほとんどが除かれるので、サイズ排除ろ過法を選んでいる。精製後、384ウエルプレートが定量され、下向きで乾燥され、そして印刷のために1.5Mベタイン／3％DMSOにおいて再構成される。その後、プローブ材料が被覆ガラススライドに「スポット」として印刷される。PCR産物は精製され、取り込まれなかった標識プライマーが除かれているので、アレイにおける測定された蛍光は、PCR産物＋プライマーによる蛍光に対して、スライドに存在するPCR産物の量に比例する。この方法は、染色相互作用またはハイブリダイゼーションに対して、プローブが標識に共有結合的に結合しているので、他の可視化方法とは異なる。この方法により、すべてのスライドが使用前にQC分析を受けることが可能になる。
【００２４】
好ましい第１の標識はフルオレセインまたはフルオレセイン誘導体である。フルオレセイン誘導体は、生物学的分子のために最も一般的に使用されている標識である。その相対的に大きい吸収特性、優れた蛍光量子収量および良好な水溶性に加えて、フルオレセインは、アルゴンイオンレーザーの488nmのスペクトル線に非常に近い励起極大（494nm）を有しており、このため、フルオレセインは共焦点レーザー走査顕微鏡観察適用のための有用なフルオロフォア(fluorophore)になっている。「第１の標識」としてのフルオレセインの本発明者らの選択は、第１に、ScanArray 5000を使用したとき、フルオレセインがCy3およびC5と適合し得るという事実によって、そして第２に、このフルオロフォアが、オリゴヌクレオチドプライマーにおける5'末端標識として比較的安価であり、かつ容易に入手することができるという事実によって行われた。
【００２５】
残念ながら、多くの共焦点レーザースキャナーは、フルオレセインを使用して本明細書に記載されるような三色システムの使用を支持するための性能仕様を有していない。本発明者らのシステムでは、下記の励起／発光波長が使用される。フルオレセイン、488nm/508nm；Cy3、543nm/570nm；Cy5、633nm/670nm。３つの色素を可能にするScan Array 5000装置の重要な特徴は、この装置が、フルオレセインを488nmで励起させるために必要とされるレーザーを有するという事実のほかに、非常に狭いバンド幅（+/-5nm）でこれらの波長を励起させ、かつ読み取ることができるという事実である。実際、このことは、Cy3が、フルオレセインを同時に励起させることなく励起され得ることを意味する。フルオレセインはそのような広い発光スペクトルを有するので、Cy3を励起させようとしたときにフルオレセインが励起されることになる場合、Cy3の発光スペクトルが重なる。この状況は、蛍光性標識および装置の両方が引き続き改善されているので変化すると考えられ、これにより、三色適用における色素および装置の選択のより大きな柔軟性が可能になる。それにもかかわらず、本報告で記載されるような方法は十分な性能をもたらしている。本発明者らは、プローブの蛍光標識化は、第２の標識および第３の標識（Cy3およびC5）のハイブリッドのその後の検出を妨害しないことを確信している。これは、(1)ハイブリダイゼーションに先立つスライドの走査は、第２の標識または第３の標識（本発明者らの実施例ではCy3またはCy5）のいずれかに対するシグナルを全く示さない；そして(2)第２／第３の標識（Cy3／Cy5）の散布図は原点を通っており、検出された第２の標識または第３の標識（Cy3またはCy5）のシグナルが、消光作用による負の影響を受けているか、またはキャリーオーバーシグナルによる正の影響を受けているという証拠がないからである。さらに、（図２、図４、図６Ａおよび図６Ｂに示されるアレイを含む）本発明者らのアレイはすべてが、（相同的なインビトロ転写物との組み合わせでの）陽性コントロールと、陰性コントロールとして使用されることになる一連のフルオレセイン標識シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）プローブとを有している。これらのプローブは、標識されたインビトロ転写物の非存在下でのハイブリダイゼーションの前または後のいずれでも、第２の標識または第３の標識（本発明者らの実施例ではCy3またはCy5）の走査条件のもとでシグナルを生じさせない。
【００２６】
ハイブリダイゼーションのために利用可能な結合したプローブの直接的な測定は、他の重要な利点を有している。失敗したPCRがフルオレセインのシグナル強度の分析によって同定および記録され得るので、プローブ増幅効率の電気泳動的分析を大きく減らすことができる。品質の悪いスライドを避けることができるので、貴重な臨床標的材料を、必要な複製体の削減によって保存することができる。品質に基づくプレハイブリダイゼーション選択は、成功的な実験の確率をより大きくし、かつ全体的なコストの削減をもたらす。好ましくは、本発明者らは、0.90を越えるシグナル対ノイズ比、3,000を越える平均構成要素フルオレセイン強度、および10％未満の構成要素フルオレセイン強度のCV（変動係数）を有するアレイを選択する。
【００２７】
本発明の１つの態様において、第２の標識および第３の標識で標識された標的が導入される。好ましい実施態様において、この方法は下記の工程を含む。RNAサンプルが、遺伝子発現について比較されている組織から単離される。標識されたcDNA標的は、Cy3が１つのサンプルに取り込まれ、かつCy5がそれ以外のサンプルに取り込まれる逆転写によってこれらのサンプルから得られる。これらの２つの標識されたサンプルの等量がアレイにハイブリダイゼーションさせられ、これにより、標識された標的がアレイ上のそれらのそれぞれの相同的なプローブと塩基対形成させられる。その後、アレイは洗浄され、共焦点レーザースキャナーで両方の波長について走査され、そして画像がソフトウエアによって分析される。両方のサンプルにおける等量の転写物は「1」の色素比を生じさせ、これに対して、他方のサンプルと比較して多くまたは少なく発現した転写物は、1からずれた比を生じさせる。
【実施例】
【００２８】
実施例１：三色cDNAマイクロアレイ：フルオレセイン標識プローブの使用による定量的評価
結果：
グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ-1（GAPDH）、B-アクチンおよびグルタミン酸受容体-2（HBGR-2）に対するヒトプローブ（それぞれ、IMAGEコンソーシアム50117、同34357および同43622）を連続希釈して、50％DMSO、3X SSC、水、1.5Mベタイン、1.5Mベタイン／3X SSC（ディールら(Diehl, et al.)、2001）、および1.5Mベタイン／3.1％DMSOで印刷した。アレイをスポットモルホロジー（サイズ／形状）について評価し、DNA保持を、印刷後直ちに、そして再び後処理の後、アレイを走査することによって測定した。プローブの30％のみが、一般に使用されている印刷用溶液（水、50％DMSOまたは3X SSC）が使用されたときには、後処理の後、ポリ-L-リシン被覆ガラススライドによって保持されるだけである［図１Ａおよび図１Ｂ］。50％DMSOで印刷されたプローブは、（1.5Mベタインの存在下または非存在下）水または3X SSCで印刷されたアレイについて直径が120.6±5.4ミクロンである構成要素と比較して、直径が151.1±5.9ミクロンであるアレイ構成要素をもたらした。従って、DMSOは、スポットサイズを抑制しようとして加えられた。3％DMSO／1.5Mベタインの使用は、スライドにおける最高の平均プローブ保持（>70％）（これは、一般に使用されている印刷用溶液に関して観測される値の2倍を越えている）をもたらし、そしてまた、最適な平均スポットサイズ（130ミクロン未満）をもたらした［図１Ｃ］。DNAプローブの調製は、高密度アレイ構築の、時間および費用が最も多くかかる構成部分であり、従って、保持が大きいことによる調製されたプローブの効率的な使用は重要な今も続く問題になっている。
【００２９】
アレイ形成後の重要なブロッキングプロセスは、この場合には未反応の一級アミンがカルボン酸基に変換されるが、典型的には、水性のホウ酸塩緩衝化1-メチル-2-ピロリジノンにおける無水コハク酸を用いて行われる（ドランら(Dolan, et al.)、2001；エイセン(Eisen)およびブラウン(Brown)、1999；シェナら(Schena, et al.), 1995；シェナら(Schena, et al.), 1996）。フルオレセインで標識されたアレイの作製により、非極性かつ非水性の溶媒である1,2-ジクロロメタンにおける無水コハク酸を用いたブロッキングに対するこの従来のブロッキングプロセスの直接的な非ハイブリダイゼーション比較が可能になった（ディールら(Diehl, et al.)、2001）。非水性方法を用いた処理は、水性ブロッキング方法と比較して、バックグラウンドのフルオレセインシグナルレベルが非常に低いアレイをもたらし［図２Ａ２対図２Ａ５］、この場合、バックグラウンドレベルは、印刷されたDNA濃度の関数として増大した（データは示されず）。プレハイブリダイゼーションの画質により、UACC903 RNAを用いた同型ハイブリダイゼーションにおけるスライド性能が予測され、この場合、非水性方法で処理されたアレイは、全体的なシグナル強度がより大きく、かつ異常値がより少ない画像をもたらした［２Ａ３対２Ａ６、２Ｂ］。
【００３０】
画質を、スポット検出およびシグナル分割のために空間および強度に依存するアルゴリズムを用いるMatarrayソフトウエアを用いて評価した（ワンら(Wang, et al.)、2001）。Matarrayはまた、サイズ、シグナル対ノイズ値（シグナル／シグナル＋ノイズ）、バックグラウンド均一性、および飽和状態に従ってアレイ上の各スポットについて定義される合成品質スコア（qcom）をもたらす（ワンら(Wang, et al.)、2001）。Cy5／Cy3強度比の値の変動は、フルオレセインのqcomスコアと相関し、そして、データの品質に影響する非水性方法の場合、全体的により低いスポット品質を明らかにした［図２Ｃ］。同時に製造された10,000プローブアレイを使用したとき、構成要素あたり、0.93±0.04（n＝15）の平均シグナル対ノイズ品質スコア（シグナル／［シグナル＋ノイズ］）が非水性方法の場合には観測され、これに対して、水性方法の場合には0.71±0.02（n＝15）であった。ノイズを上回る6倍〜9倍のプローブシグナル測定値が非水性ブロッキング方法で処理されたアレイで観測され、値は、水性処理されたそのようなアレイについてはわずかに小さかったが、これらの値は、結合したプローブの信頼できる測定のためには十分である。これらの観測結果は、水性ブロッキング方法が、印刷されたDNAの部分的な再溶解および再付着をもたらし、それにより、より大きいバックグラウンドを生じさせるという考えと一致している。
【００３１】
被覆、印刷および処理が連続して行われたスライドは、同等なアレイを必ずしももたらさない。10,000個のヒトプローブのアレイをそれぞれが有する100枚のスライドが同時に印刷され、非水的に処理され、そして評価された。スライドあたりの平均フルオレセインシグナルは、処理されたスライドの間で4,500RFUから20,000RFUまで変化した（10,770±4,202）。一方、スライドの全体的なシグナル対ノイズ値は0.85〜0.95の範囲であった（平均値＝0.92±0.03）。アレイにおけるUACC903 cDNAとJurkat cDNAとの間における競合的ハイブリダイゼーションが、DNA／構成要素の大きい値および低いバックグラウンド値を有する同じプローブセットの３つの独立した印刷から選択された後、DNA／構成要素の低い値および大きいバックグラウンド値を有するアレイについて行われた競合的ハイブリダイゼーションと比較された。品質が異なる複製体対（n＝50）の間でハイブリダイゼーション結果を比較したとき、直接的かつ有意な関係（R2＝0.80、p<0.001）が、プレハイブリダイゼーションのフルオレセイン画質と複製体の一致度との間に観測された。このことは、マイクロアレイのデータ品質が、品質分析に基づくプレハイブリダイゼーションスライドの選択によって改善され得ることを例示している。プレハイブリダイゼーションの画像／データ品質とハイブリダイゼーション後の画像／データ品質との間の関係が観測されたことは、低いシグナル対ノイズスコアを有するプレハイブリダイゼーションアレイが、低いシグナル対ノイズスコアを有するハイブリダイゼーションアレイをもたらし、そしてそのようなアレイから得られるハイブリダイゼーションデータは相互に良く相関しないという点で本発明者らの以前の報告と一致している（ワンら(Wang, et al.)、2001）。高品質アレイの選択は、複製体のCy5／Cy3比の大きい相関を必ずしも保証しない。これは、RNAサンプル、標的の標識化、ハイブリダイゼーション、洗浄、実験室技術、および画像収集が、図３で観測された３つの異常値によって示されるように、変動の原因であるからである。図３に示される100個のハイブリダイゼーションは、同じRNAの多数の標識反応を利用して、多数の実験室の研究者によって行われたことは強調しなければならない。
【００３２】
方法：
配列が確認されているResearch Genetics（Huntsville、AL）のヒトライブラリー（これは41,472個のクローンからなる）がプローブDNAの供給源として使用された。このライブラリーは96形式〜384形式に再配置され、続いて、0.5μlおよび5μlの容量の96スロットピンレプリケーター用具および384スロットピンレプリケーター用具（VP Scientific、San Diego、CA）を使用して操作された。クローンの挿入物を、10mMのTris-HCl（pH8.3）、3.0mMのMgCl2、50mMのKCl、0.2mMの各dNTP（Amersham、Piscataway、NJ）、1Mのベタインおよび0.25UのTaqポリメラーゼ（Roche、Indianapolis、IN）からなる20μlの反応液において0.26μMの各ベクタープライマー［アレイF：5'-フルオレセイン-CTGCAAGGCGAT-(フルオレセイン)TAAGTTGGGTAAC-3'（配列番号１）およびアレイR：5'-フルオレセイン-GTGAGCGGAT-(フルオレセイン)AACAATTTCACACAGGAAACAGC-3'（配列番号２）］（Integrated DNA Technologies、Coralville、IA）を使用して0.5μlの細菌培養物から384ウエル形式で直接増幅した。反応液は、95℃で5分間、その後、95℃で1分間、55℃で1分間および72℃で1分間の35サイクルでインキュベーションされ、そして72℃で7分間保持されて終了した。PCR産物を1％アガロースゲル電気泳動分析によって品質について常法に従って分析した。生成物は、取り込まれなかったプライマーおよびPCR反応成分を除くためにMultiscreen384PCRフィルタープレート（Millipore、Bedford、MA）を使用してサイズ排除ろ過によって精製された。各384ウエルプローブプレートの40個のウエルを製造者の説明書に従ってPicoGreenアッセイ（Molecular Probes、Eugene、OR）によって定量し、下向きで乾燥し、そして3％DMSO／1.5Mベタインにおいて125ng/μlで再構成した。
【００３３】
10,000プローブ／スライドの密度を有するマイクロアレイを、8個のTelechem International SMP3ピン（Sunnyvale、CA）を用いたGeneMachines Omni Gridプリンター（San Carlos、CA）を使用してポリ-L-リシンスライドに印刷した。スライドを、以前に記載された水性プロトコル（エイセン(Eisen)およびブラウン(Brown)、1999）および非水性プロトコル（ディールら(Diehl, et al.)、2001）を使用して後処理した。スライド被覆、mRNAの単離、標識化およびハイブリダイゼーションは、ヘグデら(Hegde, et al.),（2000）、シェナら(Schena, et al.),（1995）およびユら(Yue, et al.)、（2001）に以前に記載される通りに行われた。ハイブリダイゼーション後、アレイをScanArray 5000（GSI Luminonics、Billerica、MA）で走査し、画像ファイルを得た。アレイの画像ファイルをMatarrayソフトウエア（ワンら(Wang, et al.)、2001）で分析した。
【００３４】
実施例２：改善されたデータ品質および再現性のために、入手可能な結合プローブを測定および管理するための三色cDNAアレイプラットホームの使用
本発明者らは、ハイブリダイゼーションした複製体のデータ相関について結合プローブの量が異なることの影響を直接的に評価し、そして異なる供給者により供給される15枚の被覆スライドの性能をDNA保持およびハイブリダイゼーション性能に関して調べた。さらに、本発明者らの三色cDNAマイクロアレイプラットホームを利用して、本発明者らは、培養増殖、増幅および精製から、プローブのアレイ上への印刷までの適正なプレート順序および配向を確認するための新しいプローブ追跡システムを開発し、本実施例に記載する。
【００３５】
方法および材料：
ライブラリーの増殖および追跡
配列が確認されているResearch Genetics（Huntsville、AL）のヒトライブラリー（これは41,472個のクローンからなる）がプローブDNAの供給源として使用された。このライブラリーは96形式〜384形式に再配置され、続いて、0.5μlおよび5μlの容量の96スロットピンレプリケーター用具および384スロットピンレプリケーター用具（VP Scientific、San Diego、CA）を使用して操作された。培養物を、通気テープシート（Qiagen、Valencia、CA）でシールされ、振とうしながら16時間〜18時間インキュベーションされた384深ウエルプレート（Matrix Technologies、Hudson、NH）において、100mg/mlのアンピシリンが補充された150ulのTerrific培養液（Sigma、St. Louis、MO）で増殖させた。1枚の384ウエル培養プレートについて2個の陰性コントロールからなる特徴的な非対称パターンを、選択されたウエルの内容物を新しい384ウエルプレートに移し、クローン追跡データベースをそれに従って更新することによって作製した。このプレート特異的な陰性コントロールパターンは、（配向マーカーを明らかにするための）A1位置と、１つのさらなるプレート特異的なウエルA2と除くことによって作製された（図４）。
【００３６】
クローン挿入物を、10mMのTris-HCl（pH8.3）、3.0mMのMgCl2、50mMのKCl、0.2mMの各dNTP（Amersham、Piscataway、NJ）、1Mのベタイン（ヘンケら(Henke, et al.)、1997；リースら(Rees, et al.)、1993）および0.50UのTaqポリメラーゼ（Roche、Indianapolis、IN）からなる20μlの反応液において0.26μMの各ベクタープライマー｛SK865：5'-フルオレセイン-GTC CGT ATG TTG TGT GGA A-3'（配列番号３）およびSK536：5'-フルオレセイン-GCG AAA GGG GGA TGT GCT G-3'（配列番号４）（ユら(Yue, et al.)、2001）｝（Integrated DNA Technologies、Coralville、IA）を使用して、滅菌水で1：8で希釈された0.5ulの細菌培養液から、または0.5ulの精製されたプラスミド（コントロールのみ）から384ウエル形式において二連で増幅した。反応液は、94℃で5分間、その後、94℃で1分間、60℃で1分間（サイクルあたり0.5℃下げる）および72℃で1分間の20サイクル、そして94℃で5分間の15サイクル、94℃で1分間、55℃で1分間および72℃で1分間の20サイクルからなるタッチダウンサーマルプロフィルで増幅され、72℃で7分間保持されて終了した（ドンら(Don, et al.)、1991；ヘッカー(Hecker)およびルークス(Roux)、1996；ルークス(Roux)およびヘッカー(Hecker)、1997）。PCR産物を1％アガロースゲル電気泳動分析によって品質について常法に従って分析した。複製体プレートから得られる生成物をまとめ、そして、取り込まれなかったプライマーおよびPCR反応成分を除くためにMultiscreen384PCRフィルタープレート（Millipore、Bedford、MA）を使用してサイズ排除ろ過によって精製した。各384ウエルプローブプレートの40個のウエルを製造者の説明書に従ってPicoGreenアッセイ（Molecular Probes、Eugene、OR）によって定量した。あるいは、384ウエルプレートの各ウエルの1ulをまとめて、260nmにおける吸光度を、直接、定量のために読み取った。定量後、すべてのプレートを下向きで乾燥し、そして3％DMSO／1.5Mベタインにおいて125ng/μlで再構成した。
【００３７】
ポリ-L-リシン被覆スライドを以前の記載（エイセン(Eisen)およびブラウン(Brown)、1999）の通りに研究室(in-house)で調製した。９つの異なる市販のアミノサリン（aminosaline）被覆スライド（Apogent Discoveries、Waltham、MA；Asper Biotech、Redwood City、CA；Bioslide Technologies、Walnut、CA；Corning Inc.、Corning、NY；Erie Scientific、Portsmouth、NH；Genetix、St. James、NY；Sigma、St. Louis、MO；Telechem International Inc、Sunnyvale、CA）および３つの異なる市販のポリ-L-リシン被覆スライド（Cel-Associates、Pearland、TX；Electron Microscopy Sciences、Fort Washington、PA；Polysciences Inc.、Warrington、PA）を評価のために得た。最後に、２つのタイプのエポキシ被覆スライド（Telechem International Inc、Sunnyvale、CA）、およびFull Moon Biosystems（Sunnyvale、CA）から得られる特許化学反応で被覆されたスライドを得た。研究室で調製されたポリ-L-リシンスライドを含む合計で16のスライド供給源において、３つの一般的なカテゴリーに属するこれらをスポットモルホロジーおよびDNA保持に関して評価した。
【００３８】
9,600ヒトプローブ／スライドの密度を有するマイクロアレイを、16個のTelechem International SMP3ピン（Sunnyvale、CA）を伴うGeneMachines Omni Gridプリンター（San Carlos、CA）を使用して、40％の湿度および22℃（72oF）で被覆スライドに印刷した。ピンの接触力および持続時間を制御するために、装置は下記のZ運動パラメーターで設定された：速度：7cm/sec、加速度：100cm／sec2、減速度：100cm／sec2。
【００３９】
スライドを、以前に記載された非水性プロトコル（ディールら(Diehl, et al.)、2001）を使用して後処理した。スライド被覆、mRNAの単離、標識化およびハイブリダイゼーションは、ヘグデら(Hegde, et al.),（2000）、シェナら(Schena, et al.),（1995）およびユら(Yue, et al.)、（2001）に以前に記載される通りに行われた。すべてのアレイに対する画像ファイルを、ScanArray 5000（GSI Luminonics、Billerica、MA）を用いて、印刷後（フルオレセイン）、ブロッキング後（フルオレセイン）、そして再びハイブリダイゼーション後（Cy3およびCy5）に集めた。アレイの画像ファイルをMatarrayソフトウエアで分析した（ワンら(Wang, et al.)、2001）。
【００４０】
結果および考察。高品質のアレイを組み立てることには、適量の高濃度プローブを作製すること、および既知の順序だった様式でプローブを被覆ガラススライドに印刷することが必要である。本発明者らは、培養物の増殖／収容、PCR、精製および印刷のために96形式から384形式までライブラリーを再編成する方を選んだ。これにより、本発明者らの41,472個のヒトクローンライブラリーのプレート数が、432枚から、より管理しやすい108枚に減っている。非常に最適化されたタッチダウンPCRプロトコルが開発され、それにより、1ug〜2ugの精製されたプローブ材料が、２つの、まとめられ、かつ精製された20ulのPCR反応物から回収される。二連の反応物により、ランダムなPCR失敗が補償され、これにより、ゲル分析に基づいて約90％の全体的なPCR成功率が可能となる。1ugを越える精製されたプローブの回収は、1回の増幅あたり2000を越えるアレイを印刷することを可能にする（TeleChem SMP3ピンを使用したとき、4ulのプレート死容量、150ng/ulで印刷、および250nl／ピックアップ／100スライドを仮定する）。アレイがハイブリダイゼーション前に可視化され得るという事実は、PCRの失敗または機械的な問題（詰まったピン）のためにアレイ上に存在しないスポットを突き止めることが可能になり、これにより、複製体スライドの間における誤差／変動の潜在的な原因が除かれる。このことは、それぞれのクローン供給源プレートに対する陰性コントロールの特徴的なパターンを利用する追跡システムの開発をもたらし、これにより、すべてのプレートが、増殖、PCR、プール化、精製、および最終的には印刷によってクローン供給源プレートから維持された順序および配向を有することを評価するための手段が可能になる（図４）。
【００４１】
DNA濃度、印刷用緩衝液、スライド表面、温度、湿度、およびプリントヘッド速度を含む数多くの重要なパラメーターが、スライド表面に付着し、保持され、そして最終的にはハイブリダイゼーションのために利用可能なDNA量に影響を及ぼし得る（ディールら(Diehl, et al.)、2001；ユら(Yue, et al.)、2001；ヘグデら(Hegde, et al.), 2000）。以前に、本発明者らは、50％DMSO、3X SSC、水、1.5Mベタイン、1.5Mベタイン／3X SSC、および1.5Mベタイン／3.1％DMSOの保持特性を、本発明者ら自身の研究室で調製されたポリ-L-リシン被覆スライドに対して評価し、そして、この表面において、1.5Mベタイン／3％DMSOが、方法の節で記載された条件のもとで最も良い保持（約70％）をもたらしたことを見出した。標識プローブの印刷は、DNAの付着および保持を直接的に測定することを可能にするので、本発明者らは、Cy3およびCy5で標識されたJurkat cDNAおよびUACC903 cDNAを使用して、バックグラウンド蛍光、スポットモルホロジー、ハイブリダイゼーションのために最終的に利用可能なDNAの量、および競合的なハイブリダイゼーション性能に関して最も良い性能を提供する表面を同定しようとして、15枚の異なる市販の被覆スライドを評価した。本発明者らの自家調製された(in-house prepared)スライドを含めて、18枚の異なる調製された表面を比較のために入手することができた：ポリ-L-リシン（n＝4）、アミノサリン（n＝9）、エポキシ（n＝2）、および１つの不明な特許化学性（Full Moon Biosystems；Sunnyvale、CA）。9600個の構成要素の単一ヒトcDNAアレイを1.5Mベタイン／3％DMSOにおいて各スライドにスポットした。また、市販品の表面のいくつかが、これらのより一般的に使用されている溶液を用いたスポッティングのために最適化されているとい可能性を考慮に入れるために、水、3X SSC、および50％DMSOにおけるヒトcDNAプローブの384プレートを各スライドにスポットした。それぞれのスライドタイプに対する５つの複製体アレイを作製した。これらの５つの複製体を、印刷順序における配置（すなわち、最初対最後）によって持ち込まれる何らかの変動を説明するために18枚の5群にスライドを配置することによってアレイヤー装置デッキ（容量、100枚のスライド）に均一に分布させた。印刷に先立って、Cy3、Cy5およびフルオレセインのバックグラウンド蛍光を測定した。フルオレセインのバックグラウンドが、研究室で作製されたポリ-L-リシンスライドを除くすべてのポリ-L-リシンスライドで観測された。フルオレセインのバックグラウンドはまた、アミノサリンスライドの６つ（Asper Biotech、Corning、Erie Scientific、Genetix、Telechem）で、そしてまた、Full Moon Biosystemsから得られる特許製法表面で観測された。Cy3のバックグラウンドが、３つの市販のポリ-L-リシンスライドのすべてで再び観測されたが、研究室で調製されたスライドでは観測されなかった。Cy3のバックグラウンドはアミノサリンスライドまたはエポキシスライドのいずれにおいても観測されなかった。わずかなCy5のバックグラウンドが２つの市販のポリ-L-リシンスライドで観測されただけであった（Electron Microscopy Sciences、Polysciences Inc.）。
【００４２】
フルオレセイン画像を、付着および保持されたDNAを測定するために、印刷直後、そして再び後処理の後に得た。これには、共焦点レーザースキャナー校正方法が必要であった。従って、一貫した画像収集を確実にするために、本発明者らは、光電子増倍管（PMT）のパラメーターを一定（80％）に保ちながら、フルオレセイン、Cy5およびCy3の画像収集のための非漂白性で再使用可能な校正／基準化ツールであるFluorlS（CLONDIAG、Jena、ドイツ）に対する装置でのレーザー出力（典型的には約70％）を設定した。これらの条件のもとで、同じアレイの多数回の走査が、検出可能なフルオレセインシグナルの劣化をほとんど伴うことなく可能である。
【００４３】
単一標識のオリゴヌクレオチドプライマーを使用してcDNAクローンから増幅されたPCR産物は、二本鎖産物あたり２つの色素を有し、生成物のサイズは、典型的には約500bp〜約2000bpの範囲である。従って、増幅および精製されたPCR産物の1ピコグラムあたりの生じた蛍光量を数学的に予測することが可能である。しかしながら、直接的な測定では、フルオレセイン−フルオレセインの近接消光効果などの変数により持ち込まれる誤差が避けられる。これを達成するために、水における多数（n＝4）の連続希釈物（ｘng/ml〜ｙng/ml）を、種々のクローンサイズの原因となる384個の異なるcDNAクローン増幅物に由来するプールされたDNAサンプルから作製した。既知量のDNAを有する既知容量をポリ-L-リシンスライドにスポットし、乾燥し、画像化した。フルオレセインの相対的蛍光単位（RFU）をDNAのピコグラム数に対してプロットして（図５）、Packard ScanArray 5000（レーザー出力、70％；PMT、80％）を用いた場合には、約Zピコグラム/RFUが存在することが明らかにされた。
【００４４】
図６には、10％DMSO／1.5Mベタインを印刷用緩衝液として使用して16枚の異なる被覆スライドにスポットされた9600個の構成要素を有するヒトcDNAアレイの画像が例示される。印刷直後のアレイ画像（図６Ａ）、処理後のアレイ画像（図６Ｂ）、そしてJurkatおよびUACC903の標識cDNAに対する競合的ハイブリダイゼーションの後のアレイ画像（図６Ｃ）が示される。すべてのハイブリダイゼーション物は、個々の逆転写反応によって持ち込まれる何らかの変動を正規化するために、標識cDNAの１つだけのプールから調製された。この実験は、供給者により供給された被覆スライドは必ずしもすべてが等価でないこと、そしてプローブの標識化は、アレイ表面における利用可能な物質量を測定するために使用することができることを例示している。
【００４５】
cDNAマイクロアレイから得られる遺伝子発現データの全体的な品質に対する得られる結合プローブの量の影響をさらに評価するために、200個の9600構成要素ヒトcDNAプローブを、プローブあたり１つのピン負荷を用いて100枚のスライドに印刷した。これにより、ハイブリダイゼーションのために利用可能な構成要素あたりの平均結合プローブが構成要素あたりＸpg〜構成要素あたりＹpgの範囲である一連のアレイが得られた。この実験の全体的な目標は、標準的なマイクロアレイ実験において遭遇し得る大部分の転写物に対する標識標的に対してプローブが過剰に存在することを保証するために、どのくらいのDNAが構成要素あたり必要とされるかに関して、一般的な指針を確立することであった。これにより、実験変動性を複製体として持ち込む不十分な結合プローブを有するそのようなアレイを将来同定することが可能になる。この一連のアレイは、個々の標的標識反応の間における何らかの差を正規化するために、JurkatおよびUACC903の標識cDNAのプールに対して再びハイブリダイゼーションされた。
【００４６】
参考文献：
バッタグリア(Battaglia, C.)、サラニ(G. Salani)、コンソランディ(C. Consolandi)、ベルナルディ(L.R. Bernardi)およびベリス(G. De Bellis)、2000、SYBRグリーンIIを使用する非破壊的蛍光染色によるDNAマイクロアレイの分析、Biotechniques、29:78-81。
ダナセカラン(Dhanasekaran, S.M.)、バレット(T.R. Barrette)、ゴーシュ(D. Ghosh)、シャー(R. Shah)、バランバリー(S. Varambally)ら、2001、前立腺ガンにおける予後バイオマーカーの描写、Nature、412:822-826。
ディール(Diehl, F.)、グラールマン(S. Grahlmann)、ベイヤー(M. Beier)およびホーヘイセル(J. Hoheisel)、2001、スポット均一性が大きく、バックグラウンドシグナルが低下したDNAマイクロアレイの製造、Nucleic Acids Research、29:e38。
【００４７】
ドラン(Dolan, P.L.)、ウー(Y. Wu)、イスタ(L.K. Ista)、メッツェンベルグ(R.L. Metzenberg)、ネルソン(M.A. Nelson)ら、2001、DNAマイクロアレイを形成させるための、変動に強い効率的な合成方法、Nucleic Acids Res、29:E107-107。
ドンら(Don, R.H., et al.)、遺伝子増幅時の誤った開始を避けるための「タッチダウン」PCR、Nucleic Acids Res、1991、19(14):4008。
エイセン(Eisen, M.)およびブラウン(P. Brown)、1999、遺伝子発現を分析するためのDNAアレイ、Methods in Enzymology、303:179-205。
【００４８】
ガーバー(Garber, M.E.)、トロヤンスカヤ(0.G. Troyanskaya)、スクルーエンス(K. Schluens)、ペターセン(S. Petersen)、タエスラー(Z. Thaesler)ら、2001、肺の腺ガンにおける遺伝子発現の多様性、Proc Natl Acad Sci USA、98:13784-13789。
ヘッカー(Hecker, K.H.)およびルークス(K.H. Roux)、高いアニーリング温度および低いアニーリング温度はタッチダウンPCRおよびステップダウンPCRにおける特異性および収率の両方を増大させる、Biotechniques、1996、20(3):478-85。
ヘデンフォーク(Hedenfalk, I.)、ダガン(D. Duggan)、チェン(Y. Chen)、ラドマッカー(M. Radmacher)、ビトナー(M. Bittner)ら、2001、遺伝性乳ガンにおける遺伝子発現プロフィル、N EngI J Med、344:539-548。
【００４９】
ヘグデ(Hegde, P.)、クィ(R. Qi)、アベルナティ(K. Abernathy)、ガイ(C. Gay)、ダラップ(S. Dharap)ら、2000、cDNAマイクロアレイ分析のための簡潔な指針、Biotechniques、29:548-550、552-544、556の随所。
ヘグデ(Hegde, P.)、クィ(R. Qi)、ガスパード(R. Gaspard)、アベルナティ(K. Abernathy)、ダラップ(S. Dharap)ら、2001、19,200構成要素の相補的DNAマイクロアレイを使用するヒト結腸直腸ガンのモデルにおける腫瘍マーカーの同定、Cancer Res、61:7792-7797。
ヘンケ(Henke, W.)、ヘーデル(K. Herdel)、ジュン(K. Jung)、スクノール(D. Schnorr)およびローニン(S. Loening)、1997、ベタインは富GC配列のPCR増幅を改善する、Nucleic Acids Research、25:3957-3958。
【００５０】
ヘスナー(Hessner, M.J.)、ドーリング(K. Dowling)、コカノビック(0. Kokanovic)、メイヤー(L. Meyer)、ニェ(S.H. Nye)、ワン(X. Wang)、ワウカウ(J. Waukau)、ゴーシュ(S. Ghosh)、cDNAマイクロアレイに対する品質管理ツールとしてのフルオレセイン標識プローブの使用、The American Journal of Human Genetics、2001、増刊、69:468。
ヘスナーら(Hessner, M.J., et al.)、三色cDNAマイクロアレイ：フルオレセイン標識プローブの使用による定量的評価、投稿中、2002。
ケル(Kerr, M.)およびチャーチル(G. Churchill)、2001、ブートストラッピングクラスター分析：マイクロアレイ実験からの結論の信頼性を評価すること、Proc Natl Acad Sci、98:8961-8965。
【００５１】
リー(Lee, M.)、クオ(F. Kuo)、ウィットモア(G. Whitmore)およびスクラー(J. Sklar)、2000、マイクロアレイ遺伝子発現研究における複製の重要性：反復的なcDNAハイブリダイゼーションからの統計学的方法および証拠、Proc Natl Acad Sci、97:9834-9839。
プリチャード(Pritchard, C.C.)、スー(L. Hsu)、デルロー(J. Delrow)およびネルソン(P.S. Nelson)、2001、プロジェクトノーマル：マウスの遺伝子発現における正常な変動を明らかにすること、Proc Natl Acad Sci USA、98:13266-13271。
ラマクリシュナンら(Ramakrishnan, et al.)、Nucleic Acid Res、30:e30、2002。
【００５２】
リース(Rees, W.)、イエーガー(T. Yager)、コルテ(J. Korte)およびフォンヒッペル(P. Von Hippel)、1993、ベタインはDNA融解の塩基対組成依存性を除去し得る、Biochemistry、32:137-144。
ルークス(Roux, K.H.)およびヘッカー(K.H. Hecker)、タッチダウンPCRおよびステップダウンPCRを使用するワンステップ最適化、Methods Mol Biol、1997、67:39-45。
シェナ(Schena, M.)、シャロン(D. Shalon)、デイビス(R.W. Davis)およびブラウン(P.0. Brown)、1995、相補的DNAマイクロアレイを用いた遺伝子発現パターンの定量的モニターリング、Science、270:467-470。
【００５３】
シェナ(Schena, M.)、シャロン(D. Shalon)、ヘラー(R. Heller)、チャイ(A. Chai)、ブラウン(P.0. Brown)ら, 1996、平行したヒトゲノム分析：マイクロアレイに基づく1000個の遺伝子の発現モニターリング、Proc Natl Acad Sci USA、93:10614-10619。
ソーリーら(Sorlie, T., et al.), 2001、乳ガンの遺伝子発現パターンは臨床的関与により腫瘍サブクラスを区別する、Proc Natl Acad Sci、98:10869-10874。
ワン(Wang, X.)、ゴーシュ(S. Ghosh)およびグオ(S.-W. Guo)、2001、マイクロアレイの画像処理およびデータ取得における定量的な品質管理、Nucleic Acids Research、29:E75-82。
ユ(Yue, H.)、イーストマン(P.S. Eastman)、ワン(B.B. Wang)、マイナー(J. Minor)、ドクトレロ(M.H. Doctolero)ら、2001、全体的なmRNA発現における変化を検出するためのcDNAマイクロアレイの性能評価、Nucleic Acids Res、29:E41-41。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】ブロッキング後のプローブ保持に対するスポット用溶液の評価である。希釈系列のフルオレセイン標識cDNAプローブを５つの異なる印刷で印刷した。図１Ａ：印刷直後のフルオレセイン画像。図１Ｂ：水性後処理の後でのフルオレセイン画像（パネルＡと同じアレイ）。図１Ｃ：６つの印刷用溶液について３つの遺伝子のそれぞれに対して100ng/μlの希釈構成要素から測定された保持率の値がプロットされる（n＝35構成要素、35枚のスライドについての分布）。棒グラフの順序：GAPDH、B-アクチン、HBGR2。3％DMSO／1.5Mベタインが優れていた。
【図２】処理されたアレイのフルオレセイン画像は、ハイブリダイゼーション後のアレイの性能を反映することを示す。実験では、ヒトの10KプローブcDNAアレイが用いられる。図２Ａ１〜Ａ３（非水性ブロッキング）／Ａ４〜Ａ６（水性ブロッキング）：印刷直後のアレイ画像（Ａ１、Ａ４）、後処理の後でのアレイ画像（Ａ２、Ａ５）、そしてCy5およびCy3で直接標識されたUACC903 RNAとの同型ハイブリダイゼーションの後でのアレイ画像。図２Ｂ：非水性法（上段）および水性法（下段）で処理されたアレイにおける同型ハイブリダイゼーション散布図。図２Ｃ：Cy3／Cy5強度比測定の変動性（ｙ軸）がフルオレセインのシグナル対ノイズ比（ｘ軸）と相関する；非水性法（上段）および水性法（下段）。画像は、同じレーザー条件およびPMT条件を使用して集められ、そしてGenePix Proソフトウエアを使用して同じパラメーターのもとで例示される［注：処理工程後でのDNAの喪失（Ａ１対Ａ２；Ａ４対Ａ５）；パネルＡ１およびパネルＡ４における白色の構成要素は飽和している］。
【図３】50個の複製体対（100枚のスライド）のフルオレセインのシグナル対ノイズスコア（ｘ軸）は、ハイブリダイゼーションした複製体対の間におけるCy3／Cy5比データの相関係数（ｙ軸）を予測することを明らかにする。すべてのハイブリダイゼーションはJurkat cDNAとUACC903 cDNAとの間である。
【図４】フルオレセイン標識プローブを使用する、クローン供給源プレートから印刷アレイへのプレートの順序および配向を確認するための追跡スキームが示される。パネルＡ：最初の４つのクローン供給源プレートに対する非対称的なプレート特異的陰性コントロールの配置。各プレートのA1位置は、配向マーカーとして使うために除かれる；別の陰性コントロールがプレート識別子として使用される。パネルＢ：研究室で調製されたポリ-L-リシン被覆スライドに16ピン（セットバック）を使用して印刷された9600構成要素のヒトcDNAアレイ。各ピンによって作製された部分アレイ(subarray)が標識される。部分アレイ1は、それぞれの供給源プレートからのA1位置を有する（A1の陰性コントロールは、最初（最も左側）のカラムにおいて、25個の構成要素中24個の非存在をもたらす）。部分アレイ9（拡大）は、示されたプレートに対する陰性コントロールの正しい系列を示す；他のプローブプレートは他の部分アレイに示される。アレイ構築時のいずれかの点でいずれかのプレートが不適切に操作されると、このパターンが破壊される。注：ピン２についてはピンの閉塞問題を認めることができる。
【図５】スライドに付着した標識DNAの量（ｘ軸）と検出された蛍光（ｙ軸）との間における線形関係を示す。これを達成するために、水における多数（n＝4）の連続希釈物（400ng/ul〜0.049ng/ul）を、種々のクローンサイズの原因となる384個の異なるcDNAクローン増幅物に由来するプールされたDNAサンプルから作製した（例えば、単一のクローン、500bpのクローンおよび2000bpのクローンは、それぞれが150ng/ulの濃度であるとき、4倍のモル濃度差があり、従って、4倍の蛍光差がある）。既知量（0.5ul）のDNAを有する既知容量をポリ-L-リシンスライドに手でスポットし、乾燥して、画像化した。フルオレセインの相対的蛍光単位（RFU）をDNAのピコグラム数に対してプロットして（図２）、Packard ScanArray 5000（レーザー出力、70％；PMT、80％）を用いた場合には、1ピコグラムのDNAあたり約25RFUがこの実験で検出されたことが明らかにされた。この実験での平均スポットサイズは、直径が1500ミクロンを越え、付着した総DNAは、示された点について、50pg、100pg、200pg、400pgおよび800pgであった。150ng/ulの印刷濃度、0.6nlのプローブ付着容量、および本発明者らの新しい緩衝液による80％の保持率に基づいて、本発明者らは、およそ約75pgのDNAが保持され、ハイブリダイゼーションのために利用可能であると推定している。直径が約120ミクロンであるこれらのアレイ構成要素から、本発明者らは、典型的には、約5倍の不一致ではあるが、1ピコグラムあたり10,000RFUまたは133RFUを検出している。本発明者らは、非常に接近したとき、フルオレセインが自己消光することを知っている。おそらくは、このために、機械的に作製されたスポットにおける検出された蛍光が、この実験に基づいて本発明者らが予想するよりも小さくなっていると考えられる。
【図６】図６Ａには、自家調製品対市販品について、印刷後、そして固定処理およびブロッキングの後におけるスポット／アレイ形態学を評価するためのフルオレセイン標識cDNAプローブの使用が示される。スポット形態学およびプローブ保持は異なることには留意すること。アレイ1〜4は、Medical College of Wisconsin、Electron Microscopy Sciences（Fort Washington、PA）、Polysciences Inc.（Warrington、PA）、Cel-Associates（Pearland、TX）においてそれぞれ製造されたポリ-L-リシン被覆スライドに印刷された。アレイ5〜13は、Asper Biotech（Redwood City、CA）、Apogent Discoveries（Waltham、MA）、Bioslide Technologies（Walnut、CA）、Erie Scientific（Portsmouth、NH）、Genetix（St. James、NY）、Corning Inc.（Corning、NY；GAPS）、Corning Inc.（Corning、NY；GAPS II）、Sigma（St. Louis、MO）、Telechem International Inc.（Sunnyvale、CA）によってそれぞれ製造されたアミノサリン（aminosaline）被覆スライドに印刷された。アレイ14〜15は、Telechem International Inc.（Sunnyvale、CA）によって製造されたエポキシ被覆スライドに印刷された（それぞれ、エポキシおよびスーパーエポキシ）。図６Ｂには、16枚の異なる被覆スライドに印刷された10KヒトアレイにハイブリダイゼーションしたJurkat（Cy5）およびUACC903（Cy3）の標識cDNA（Cy5-dUTPまたはCy3-dUTPの取り込みにより標識された30ugの総RNA）の間における競合的ハイブリダイゼーションが示される。アレイ1〜4は、MCW、Electron Microscopy Sciences（Fort Washington、PA）、Polysciences Inc.（Warrington、PA）、Cel-Associates（Pearland、TX）によってそれぞれ製造されたポリ-L-リシン被覆スライドに印刷された。アレイ5〜13は、Asper Biotech（Redwood City、CA）、Apogent Discoveries（Waltham、MA）、Bioslide Technologies（Walnut、CA）、Erie Scientific（Portsmouth、NH）、Genetix（St. James、NY）、Corning Inc.（Corning、NY；GAPS）、Corning Inc.（Corning、NY；GAPS II）、Sigma（St. Louis、MO）、Telechem International Inc.（Sunnyvale、CA）によってそれぞれアミノサリン被覆スライドに印刷された。アレイ14〜15は、Telechem International Inc.（Sunnyvale、CA）によって製造されたエポキシ被覆スライドに印刷された（それぞれ、エポキシおよびスーパーエポキシ）。
【図７】３つの異なるスポット用溶液（Ａ：1.5Mベタイン／3％DMSO；Ｂ：3X SSC；Ｃ：50％DMSO）での、印刷後（１Ａ、２Ａ、３Ａ）および固定処理／ブロッキング後（２Ａ、２Ｂ、２Ｃ）におけるフルオレセイン標識オリゴヌクレオチド（70mer）の画像化が示される。第３の色の付加は、cDNAアレイならびにスポットされたオリゴヌクレオチドアレイの品質管理に対して有用である。
【図１Ｃ】
2005501237.tif 000002
【図２Ｂ】
2005501237.tif 000003
【図２Ｃ】
2005501237.tif 000004
【図３】
2005501237.tif 000005
【図５】
2005501237.tif 000006
【図１Ａ】
2005501237.tif 000007
【図１Ｂ】
2005501237.tif 000008
【図２Ａ】
2005501237.tif 000009
【図４Ａ】
2005501237.tif 000010
【図４Ｂ】
2005501237.tif 000011
【図６Ａ】
2005501237.tif 000012
【図６Ｂ】
2005501237.tif 000013
【図７】
2005501237.tif 000014
【国際公開パンフレット】
2005501237.tif 000015
2005501237.tif 000016
2005501237.tif 000017
2005501237.tif 000018
2005501237.tif 000019
2005501237.tif 000020
2005501237.tif 000021
2005501237.tif 000022
2005501237.tif 000023
2005501237.tif 000024
2005501237.tif 000025
2005501237.tif 000026
2005501237.tif 000027
2005501237.tif 000028
2005501237.tif 000029
2005501237.tif 000030
2005501237.tif 000031
2005501237.tif 000032
2005501237.tif 000033
2005501237.tif 000034
2005501237.tif 000035
2005501237.tif 000036
2005501237.tif 000037
2005501237.tif 000038
2005501237.tif 000039
2005501237.tif 000040
2005501237.tif 000041
2005501237.tif 000042
2005501237.tif 000043
2005501237.tif 000044
2005501237.tif 000045
2005501237.tif 000046
2005501237.tif 000047
2005501237.tif 000048
2005501237.tif 000049
2005501237.tif 000050
2005501237.tif 000051
2005501237.tif 000052
2005501237.tif 000053
2005501237.tif 000054
2005501237.tif 000055
2005501237.tif 000056
2005501237.tif 000057
2005501237.tif 000058
【国際調査報告】
2005501237.tif 000059