(57)【要約】  本発明は、化学的及び／または生物学的試料中の測定体積のサイズ及び／または形状を補正するための方法に関し、より詳細には蛍光分光法の分野で使用され得るものである。この方法によれば、観察レンズ（３２）の助けにより、試料（１４）内に配置した測定体積（１８）を検出装置（４４）に結像する。結像は、試料（１４）を保持する試料担持体（１２）の壁（１６）を通して行う。次のステップで、試料担持体壁（１６）の厚さを自動的に決定する。次いで、試料担持体壁（１６）の厚さに応じて測定体積（１８）のサイズ及び／または形状を補正するために、少なくとも１つのレンズ（２８）を観察レンズ（３２）の光軸方向に自動的に変位する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
特に蛍光分光法で化学的及び／または生物学的試料（１４）中の測定体積（１８）のサイズ及び／または形状を補正するための方法であって、
試料（１４）を含む試料担持体（１２）の試料担持体壁（１６）を通して、試料（１４）内に位置する測定体積（１８）を、観察光学系（３４）を使用して検出器手段（４４）に結像するステップと、
試料担持体壁（１６）の厚さを自動的に決定するステップと、
観察光学系（３４）の光軸に沿って少なくとも１つのレンズ（２８）を自動的に変位させて、測定体積（１８）のサイズ及び／または形状を試料担持体壁（１６）の厚さの関数として補正するステップとを有することを特徴とする方法。
【請求項２】
光学的厚さを決定することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
光学手段（３２）を使用して、試料担持体壁（１６）を通して照明フォーカス（２０）を移動させ、照明フォーカス（２０）を移動させる際に、試料担持体（１６）の界面に発生する反射を検出することにより、試料担持体壁（１６）の厚さを決定することを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
照明フォーカス（２０）を観察光学系（３２）によって移動させることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
照明フォーカス（２０）を試料担持体壁を通して増分的または連続的に移動させることを特徴とする請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
観察光学系（３２）のフォーカス（２０）が測定体積（１８）を画定することを特徴とする請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
高精度電動ドライブ（４０）を使用してレンズ（２８）を変位させることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８】
試料（１０）に電磁放射線を照射して、試料（１４）中に存在する粒子の蛍光を励起することを特徴とする請求項１〜７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９】
電磁放射線を使用して、試料担持体壁（１６）の厚さ及び／または光学的厚さを決定することを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
特に高スループットスクリーニングまたは中スループットスクリーニングのスクリーニングプロセスで、各試料担持体（１２）の試料担持体壁（１６）の厚さを、少なくとも１回、好ましくは少なくとも３回、最も好ましくは少なくとも５回決定することを特徴とする請求項１〜９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１】
特に蛍光分光法で化学的及び／または生物学的試料（１４）中の測定体積（１８）のサイズ及び／または形状を補正するための方法であって、
試料担持体（１２）内に配設された試料（１４）に電磁放射線を照射して、試料（１４）中に存在する粒子の蛍光を励起するステップと、
試料（１４）を含む試料担持体（１２）の試料担持体壁（１６）を通して、試料（１４）内に位置する測定体積（１８）を、観察光学系（３２）を使用して検出器手段（４４）に結像するステップと、
観察光学系（３２）の光軸に沿って少なくとも１つのレンズ（２８）を自動的に変位させて、測定体積（１８）のサイズ及び／または形状を変化させるステップと、
検出器手段（４４）及び／またはそれに連結された制御手段（４２）を使用して、少なくとも１つのレンズ（２８）の位置の関数として放射線量を決定するステップと、
レンズ（２８）の位置を最大放射線量に調整して、試料担持体壁（１６）の厚さを補正するステップとを有することを特徴とする方法。
【請求項１２】
放射線強度に加えて、またはその代わりに、強度の変化を決定することを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
強度の変化が最大になったときに、測定体積（１８）の位置を設定することを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
放射線強度に加えて、またはその代わりに、強度の変化の振幅を決定することを特徴とする請求項１１〜１３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１５】
振幅が最大になったときに、測定体積（１８）の位置を設定することを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
測定体積（１８）の位置を、下記式に基づいて計算することを特徴とする請求項１４または１５に記載の方法。
【数１】
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【請求項１７】
測定体積（１８）の位置を増分的または連続的に変化させることを特徴とする請求項１１〜１６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１８】
特にスクリーニングプロセスで、各試料担持体（１２）の試料担持体壁（１６）の厚さを、少なくとも１回、好ましくは少なくとも３回、最も好ましくは少なくとも５回決定することを特徴とする請求項１１〜１７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか１つに記載の方法を実行するための装置であって、
測定体積（１８）を観察するための観察光学系（３２）と、
試料（１４）によって放射される放射線または試料担持体壁（１６）によって生じる反射を検出するための検出装置（４４）と、
観察光学系（３２）の光軸に沿って少なくとも１つのレンズ（３８）を自動的に変位させるための調整手段（４０）と、
検出器手段（４４）によって捕獲された放射線に応じて、調整手段（４０）を制御するための制御手段（４２）とを備えることを特徴とする装置。
【請求項２０】
観察光学系（３２）はレンズ（２８）を変位させるための調整リング（４６）を有し、該リングが調整手段（４０）によって作動可能であることを特徴とする請求項１９に記載の装置。
【請求項２１】
調整手段（４０）は伝達手段（４４）、特に調整リング（４６）の歯に係合するスクリュドライブを有し、伝達手段（４４）が調整手段（４０）に連結されていることを特徴とする請求項２０に記載の装置。
【請求項２２】
調整リング（４６）及び／または伝達手段に停止スイッチ（５０，５２）が連結されていることを特徴とする請求項２０または２１に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に蛍光分光法で化学的及び／または生物学的試料の測定体積のサイズ及び／または形状を補正するための方法に関する。本発明はさらに、該方法を実行するための装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
試料の検査はしばしば顕微鏡または同様の適切な光学装置を使用して実行される。ここで、試料はスライドまたは他の適切な、例えばタイタープレート等の試料担持体上に配設される。試料の観察及び検査はしばしば、試料担持体の透明な底を通して実行される。試料担持体の底を通しての観察は、例えば観察用対物レンズを試料担持体の下に配設することができる一方、例えば試料を供給するためのピペット手段または他の手段を試料担持体の上に配設することができる点で有利である。
【０００３】
しかし、特に例えば０．７を超える開口数を持つ高性能対物レンズを使用する精密検査法では、試料担持体の透明な底を通して試料を検査することは、試料担持体の底の厚さ及び屈折率の両方が光線の経路に影響を及ぼす点で不利である。そのような影響のため、例えば液体試料中に存在する測定体積のサイズ及び／または形状は変化することがある。これは測定結果の不正をもたらす。
【０００４】
特に、例えばレーザまたは他の光源によって照射される物体の蛍光を使用して測定結果を得る蛍光分光法では、測定体積のサイズ及び／または形状の非常に小さい変化でも、測定結果の劣化をもたらす。試料担持体の透明な底の厚さが５μｍ以上変化した場合、及び／または試料担持体の底の屈折率が小数点第三位で変化した場合、フォーカス品質はすでに劣化しており、測定結果の劣化が発生することが、試験で示されている。
【０００５】
試料担持体底の厚さを補正するために、対物レンズの調整リングで試料担持体底の公称厚さを手動で設定することが知られている。このために、対物レンズの対応する調整リングには目盛が設けられ、試料担持体底の厚さを、試料担持体の製造者の指摘に従って調整することができる。許容可能な測定結果を得るために、装置の操作者は、製造者によって指摘された厚さが変化したか否か、各試料担持体底を調べなければならないので、これはかなり面倒なプロセスである。この手順の他の不利な点は、製造者による不正確な指摘が検出されず、したがって知覚されない不正が測定結果に発生し得ることである。特に、対物レンズにおける調整リングを使用しての手動調整は、試料担持体底内の厚さの変化を補正するためには適さない。他の不利な点は、試料担持体底の公称厚さを調整する際に、試料担持体底の屈折率が考慮されないことである。したがって、屈折率の関連変化をすでに引き起こしているかもしれない試料担持体底のわずかな材料変化は、調整リングを使用することによって対処することができない。
【特許文献１】ＷＯ  ００  ４６５９０
【特許文献２】ＷＯ  ９９  ４７９６３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、試料担持体底によって生じる、特にその厚さ及び屈折率の変化によって生じる負の影響を補正する、化学的及び／または生物学的試料の測定体積のサイズ及び／または形状を補正するための方法を提供することである。本発明の他の目的は、該方法を実行するための装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明によると、その目的は請求項１、１１及び１９それぞれの特徴によって解決される。
【０００８】
本方法の第１実施形態では、試料内に位置する測定体積は、観察光学系を使用して検出器手段上に結像される。特に、例えば高スループットスクリーニングで使用される蛍光分光法では、測定体積のサイズは２０ｆｌ未満、特に１０ｆｌ未満が好ましい。本方法の次のステップで、そこを通して測定が行われる試料担持体底のような、試料担持体壁の厚さが自動的に評価される。試料担持体壁の厚さの決定は、例えば超音波厚さ測定、渦電流厚さ測定、または容量性厚さ測定によって達成することができる。次のステップで、少なくとも１つのレンズが観察光学系の光軸に沿って自動的に変位される。変位の程度は、予め決定された試料担持体壁の厚さに依存する。こうして、測定体積のサイズ及び／または形状は、試料担持体壁の光学的厚さに応じて補正される。
【０００９】
レンズが変位する程度は、特にその光学的厚さの観点から、すなわち屈折率を考慮して、試料担持体の厚さの変化を含むことが好ましい。したがって、試料担持体壁の物理的厚さだけでなく、光学的厚さをも考慮することが特に好ましい。そうするために、上記の方法によって決定された物理的厚さから、例えば屈折率を考慮に入れて、光学的厚さを算出することができる。これは、例えば屈折率が分かれば可能である。しばしば、屈折率は、ガラス製として使用される試料担持体壁の製造者によって指摘される。さらに、屈折率を直接決定することが可能である。製造者の指摘からの誤差も考慮することができるので、これは有利である。これは、例えば、試料担持体底を通過するビームの側方偏向を決定することによって行うことができる。屈折率をより精密に決定するために、ビームを試料担持体底に数回通過させることができる。これは、さらに、ビームの側方変位を決定するための検出器を、試料担持体の、ビームを発生する照明手段と同じ側に設けることができるので有利である。
【００１０】
測定体積のサイズ及び／または形状を補正するための本発明は、各試料担持体に実行することが好ましい。特に、多数の試料、例えば１，５３６個または２，０８０個の試料を持つタイタープレートが測定される高スループットスクリーニングまたは中スループットスクリーニング等のスクリーニングでは、該方法を各タイタープレートにつき少なくとも１回、好ましくは数回実行する。チャネル構造等を持つチップも試料担持体として使用することができる。
【００１１】
試料担持体の厚さは、試料担持体壁を通して照明のフォーカスすなわち光学手段の焦点を移動させることによって決定することが好ましい。この移動は、試料担持体を移動させることによって、及び／または光学手段を使用して照明のフォーカスを移動させることによって達成することができる。試料担持体壁を通して照明のフォーカスを移動させる際、試料担持体の境界面における反射が検出される。発生する反射から、試料担持体壁の厚さを決定することができる。この厚さは試料担持体壁の屈折率を考慮に入れるので、非常に優れた補正をすでに達成することができている。しかし、発生する反射によって決定される試料担持体壁の厚さは、必ずしも試料担持体壁の光学的厚さではない。一般的に、光学的厚さを決定するには、試料担持体壁の屈折率を考慮するさらなる計算が必要である。屈折率は既知であるか、または上述した通り決定することができる。試料担持体壁の測定された厚さにより、次いで、測定体積のサイズ及び／または形状が補正されるように、少なくとも１つのレンズが観察光学系の光軸に沿って自動的に変位される。
【００１２】
試料担持体の厚さの決定は、別個の観察光学系を通して行うことができる。しかし、顕微鏡または他の観察手段の所定の光学系を使用することが好ましい。特に高スループットスクリーニング法では、検査対象の試料を蛍光励起するレーザ等の照明手段を使用して、試料担持体底の厚さを決定することもできる。そうするために、例えば、観察光学系のビーム経路にビームスプリッタを設け、そのビームスプリッタを通して、試料担持体壁によって反射した光を測定ビーム経路から分離して適切な検出器に向かわせる。特に、反射したビームの軸方向解像力を与えるために、検出器の前にピンダイヤフラムを配設する。
【００１３】
照明フォーカスは、試料担持体壁を通して、増分的または連続的に変位することが好ましい。
【００１４】
実行した測定によっては、測定体積は比較的大きい体積になることがある。しかし、特に、測定体積は観察光学系のフォーカスである。ここで、観察光学系の焦点は、試料内の測定体積として配置される。これは、非常に小さいフォーカスのため、ウェルの内壁で発生する反射を妨げることなく、タイタープレートの試料受容部（ウェル）内の数μｌの試料を検査することが可能であるので、特に高スループットスクリーニングで使用される。      
【００１５】
特に蛍光分光法または物体の蛍光を使用する他の方法では、電磁放射を使用することが可能であり、それは試料の蛍光粒子を励起し、試料担持体の厚さを決定するためにも役立つ。
【００１６】
測定体積のサイズ及び／または形状を補正する際に、試料担持体壁の光学的厚さを考慮することは特に好ましい。
【００１７】
第２の好適な実施形態では、化学的及び／または生物学的試料の測定体積のサイズ及び／または形状が、試料の測定／検査が行われる関連試料担持体壁の厚さを直接測定することによって補正されるのではなく、測定された体積のサイズを検出することによって即座に補正される。ここで、試料担持体壁の厚さは、試料担持体壁の実際の屈折率に関係なく、同時に補正される。この方法は、特に蛍光分光法で、特に好ましくは、高スループットスクリーニング及び中スループットスクリーニング等のスクリーニングで、非常に微小な試料体積を検査するのに適している。
【００１８】
本発明によれば、タイタープレートのウェルまたはチップのチャネル等のような試料担持体に配設された試料は、試料内の粒子の蛍光を励起するために、電磁放射線を照射される。粒子は蛍光マーカ、カラーマーカ、またはマーカを提供することなく、即座に蛍光を発する試料の物質とすることができる。電磁放射による励起は、相応して励起された粒子による蛍光放射線の射出を引き起こす。次のステップで、観察光学系を使用して、試料内に位置する測定体積が、ＣＣＤカメラ等の検出器手段、好ましくは例えばＰＭＴまたはＡＰＤ検出器等の単光子解像度を持つ検出器に結像される。ここで、結像は、例えばガラス製または透明なプラスチック材料製とすることができる、試料担持体底等の試料担持体壁を通して行われる。
【００１９】
この好適な実施形態の次のステップで、測定体積のサイズ及び／または形状が変化するように、少なくとも１つのレンズが観察光学系の光軸に沿って自動的に変位される。測定体積のサイズを変化することにより、検出器手段によって検出される放射線の量が変化する。これは、粒子、例えば分子からの蛍光が照度に比例するという見識に基づく。測定体積が小さければ小さいほど、測定体積の照明濃度が高くなる。その結果、個々の粒子または分子の放射線強度が増大する。
【００２０】
観察光学系の少なくとも１つのレンズを変位することにより決定される試料内の粒子／分子の放射線強度、すなわち放射線の量の変化により、レンズを自動的に、最大放射線強度が生じる位置に変位させることができる。粒子／分子の最大放射線強度により測定体積は最小限になるので、これは試料担持体壁の厚さを補正させる。ここで、追加計算無しに、試料担持体壁の光学的厚さと同様に屈折率も自動的に考慮される。本方法のこの実施形態は特に、試料担持体壁上に存在する放射媒体等をも考慮に入れる。
【００２１】
例えば最小サイズの測定体積を希望する場合、最小測定体積の設定は、所定の範囲内で行うことができる。フォーカスが測定体積に一致し、本方法を使用して最小化することができるように、観察光学系のフォーカスは、測定対象の試料内に配置されることが好ましい。
【００２２】
放射線強度を決定する際、測定体積のサイズの変化にもかかわらず、検出される光子（放射線量）に有意の変化が生じないことが起こり得る。例えば、測定体積の縮小により、分子の数は減少するが、照度の増加のために、同じもの〕より強く励起される場合がこれにあたる。両方の効果が相殺されるので、測定体積の最適または最小サイズの厳密な決定が不可能になる。したがって、放射線強度に加えて、またはその代わりに、強度の変化を決定することが好ましい。経時的な強度の変化を決定することによって、測定体積のサイズをより厳密に決定することができる。比較的大きい測定体積では、大きい測定体積は多数の蛍光粒子を含み、単分子の入出は測定体積内の粒子の百分率にほとんど変化をもたらさないので、例えば個々の分子または蛍光粒子の入出は大きい変化をもたらさない。したがって、大きい測定体積では、強度の変化が比較的小さい。対照的に、小さい測定体積では、入出する流体によって生じる変化は実質的に大きくなる。例えば、３個の蛍光粒子しか含まない測定体積に４番目の粒子が入ると、強度は約１／３増大する。強度の変化が最大の場合に、測定体積のサイズは最小になるので、そのときに、測定体積、好ましくは測定フォーカスの位置を調整することが好ましい。強度の変化の振幅を決定することが好ましい。
【００２３】
測定体積のサイズ／形状は、算出手段を使用して、以下の式に基づいて算出することが好ましい。
【００２４】
【数１】
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【００２５】
式中、
＜Ｉ2 （ｔ）＞は二乗関数の平均値であり、
＜Ｉ（ｔ）＞2 は関数の平均値の二乗であり、
Ｉ（ｔ）は関数の時間の経過であって、Ｉ＝時間ｔの関数の強度であり、
＜＞は平均値を意味する。
【００２６】
本発明はさらに、本方法を実行するための装置に関する。そうするために、該装置は、例えばタイタープレートのウェルに配設することができる測定体積を観察するための観察光学系を備える。さらに、試料から放射される放射線、及び／または試料担持体壁によって生じる反射を検出するための検出器手段を備える。さらに、少なくとも１つのレンズを観察光学系の光軸に沿って自動的に変位させるための調整手段を備える。したがって、測定体積のサイズの変化、または試料担持体壁を通してのフォーカスの移動を実行することができる。制御手段を使用して、検出器手段によって捕獲される放射線に応じて、調整手段を制御し、したがって観察手段の光軸に対する少なくとも１つのレンズの位置を制御する。
【００２７】
観察光学系は、好ましくは、少なくとも１つのレンズを変位させるための調整手段によって作動可能な調整リングを備える。これは、例えば補正値の手動設定から公知の補正リングとすることができ、該リングは適切な調整手段を介して自動的に作動する。既存の検査手段を改造した後で本自動的方法を実行することができるように、既存の観察光学系を改造することができるので有利である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下、添付の図面を参照しながら、好適な実施形態について詳細に説明する。
【００２９】
ウェル１０、すなわちタイタープレート１２のほぼ円筒状の凹部に、検査対象の化学的及び／または生物学的試料液１４を配置する。タイタープレート１２は、好ましくはガラス製の透明な試料担持体底１６により閉鎖されている。試料１４の検査に可視光を使用しない場合、試料担持体底が透明である必要は無い。その場合、試料担持体底１６は、使用する放射線を透過可能であれば十分である。
【００３０】
照明手段によって、及び光学手段を通して試料１４中に生成される、観察手段のフォーカス２０の形状を有する測定体積は、理想的には極めて小さく、ほぼ点状のサイズである。フォーカスまたは焦点２０は、試料１４内に位置されなければならない。フォーカス自体は、試料担持体底１６に生じるビーム経路の屈折によって変化する特定の寸法を有する。
【００３１】
影響されないビーム経路を図１に破線で示す。これより、フォーカス２０としての測定体積の提示サイズが得られる。界面、すなわち例えば空気とガラスとの間の媒体遷移部、すなわち点２２で、試料担持体底がビームを屈折させる。試料担持体底から出射する際、２つの異なる媒体（例えばガラスと試料液）の存在により、点２４でビームは再び屈折する。この結果、実線２６によって表される拡大された測定体積が得られる。測定体積の拡大は、上述した屈折の結果、フォーカス２０の領域２０′への変位及び歪曲によってなされる。しかし、観察光学系は図１の焦点２０または対応する水平面をそれぞれ見るので、拡大されたフォーカス２６が感知される。
【００３２】
レンズ２８（図２）を矢印３０に沿って、すなわち観察光学系３２の光軸に沿って変位させることにより、フォーカス２０のサイズを変化させることができる。
【００３３】
測定体積のサイズの好適な最適化は、好ましくは高レベルモーメント解析を使用して、フォーカス２０内の強度の変化を測定することによって達成される。
【００３４】
図３は、大小のフォーカスまたは測定体積間の基本的な相違を示す２つの曲線３４、３６を示す。かなり大きいフォーカスの場合、曲線３４のように強度の変化は、かなり小さい振幅をもつ。これは、例えば２０個の蛍光粒子が存在する比較的大きいフォーカスの場合、粒子数が１個または２個の蛍光粒子だけ変化しても、ほとんど影響が無いという事実による。
【００３５】
小さいフォーカスでは、基本的に破線の曲線３６で示すように、強度の変化が生じる。この場合、例えば蛍光粒子を３個しか含まない小さいフォーカスでは、１個の粒子が出入りするだけでも、蛍光は実質的に増加するので、強度の変化は実質的に大きい。強度の変化を検査するための高レベルのモーメント解析をここで実現することにより、測定体積１８のサイズを設定するように、好ましくは最小サイズの測定体積１８を設定するように、レンズ２８（図２）は、制御部を使用して簡単に変位させることができる。
【００３６】
観察光学系３２に対応する対物レンズ３８（図４）に配置したレンズ２８を変位させるために、制御手段４２に連結された調整手段４０を使用することが好ましい。検出器４４（図２）に連結された制御手段４２を介して、対物レンズ３８内のレンズ２８の必要な変位が決定される。制御手段４２は、スクリュードライブの形の伝達手段４４を備えることが好ましい調整手段を制御する。スクリュードライブは調整リング４６と係合する。調整リング４６は、公知の対物レンズの調整リングとすることができ、該リングは例えばローレット切りすることができ、試料担持体底１６の厚さを補償するように、調整リングを使用して、レンズ２８を手動で変位させることができる。調整リング４６と係合するスクリュードライブ４４を回すことによって、調整リング４６が回転し、したがって対物レンズ３８に配設されたレンズ２８が変位する。これにより、上述したように、フォーカス２０のサイズが変化する。
【００３７】
したがって、試料によって放射される放射線とは関係なく試料担持体底１６の厚さを決定する本方法のみならず、フォーカス２０のサイズを放射線強度及び／または強度の変化によって調整する本方法でも、図４に示した装置を使用することができる。
【００３８】
対物レンズ３８が、調整リング４６を回転すると出口レンズ４８が移動する対物レンズである場合、対物レンズ機構の破損を防止するために、停止スイッチ５０を設けることが好ましい。停止スイッチは例えば、対物レンズ３８に対して光線を放射する適切なセンサとすることができる。対物レンズ３２に取り付けられた反射基準面５２がセンサ５０の領域内に入ると同時に、センサ５０は信号を発生し、その信号が線５４を介して調整手段４０に送信される。その信号はスクリュードライブ４４を停止させる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】試料体積内に配設された測定体積の概略図である。
【図２】本装置の原理的構造を示す概略図である。
【図３】強度と時間と関係の概略図である。
【図４】本装置の好適な実施形態の概略斜視図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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