(57)【要約】本発明は、ＰＫＢの基質を模倣するペプチド又はペプチド模倣基と結合しており、プロテインキナーゼのＡＴＰ結合部位と高い親和性がある小分子を提供する。本発明によるキメラ化合物は、改善された活性及び選択性をもつＰＫＢ阻害剤として働くことが好ましい。ペプチド又はペプチド模倣物質と結合している新規なＡＴＰ模倣化合物、特にイソキノリン誘導体は、プロテインキナーゼの阻害剤として、実験、医療、及び薬物設計用に有用である。さらに、これらのプロテインキナーゼ阻害剤を含む薬剤組成物、並びにこのような組成物を、癌、糖尿病、心血管疾患、出血性ショック、肥満症、炎症性疾患、中枢神経系疾患、及び自己免疫疾患の治療及び診断に使用する方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
【化１】
2005501047.tif 000049
Ｒ１及びＲ２が、それぞれ独立に、水素、低級アルキル基、低級アルコキシ基、置換した又は非置換のフェニル基、フェニル基、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、ニトロ、シアノ、又はアミノ基からなる群から選択される少なくとも１種の置換基で置換された低級アルキルからなる群から選択され、
ｍ及びｎが、それぞれ独立に０〜３であり、
Ｘが、ＳＯ２−ＮＨ、Ｓ及びＯからなる群から選択され、
Ｍが、１〜４個の炭素原子からなる置換した又は非置換のアルキレンを表し、
Ｙが、アミド、アミン、尿素、カルバメート、ヒドラジン又はスルホンアミドからなる群から選択され、
Ｗが、存在せず、あるいは１〜１８個の炭素原子からなる置換した又は非置換のアルキレン、脂肪族、芳香族又は複素環基からなる群から選択され、
Ｌが、存在せず、あるいはアミド、アミン、尿素、カルバメート、ヒドラジン又はスルホンアミドからなる群から選択され、及び
Ｚが、ＰＫＢの基質部位に結合可能な長さの４〜１２残基からなるペプチド又はペプチド模倣基である、
式Ｉの化合物。
【請求項２】
Ｒ１及びＲ２が、それぞれ独立に、メチル、エチル、エトキシ及びジメチルアミンからなる群から選択され、
ｍ及びｎが、それぞれ１であり、
Ｘが、ＳＯ２−ＮＨ及びＳからなる群から選択され、
Ｍが、２個の炭素原子からなる置換した又は非置換のアルキレンを表し、
Ｙが、アミド及びアミンからなる群から選択され、
Ｗが、存在せず、あるいは１〜５個の炭素原子からなる置換した又は非置換のアルキレン、脂肪族、芳香族又は複素環基からなる群から選択され、
Ｌが、存在せず、あるいはアミド及びアミンからなる群から選択され、及び
Ｚが、ＰＫＢの基質部位に結合可能な長さの６〜１０残基からなるペプチド又はペプチド模倣基である、
式Ｉの化合物。
【請求項３】
【化２】
2005501047.tif 000050
Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６が、それぞれ独立に、スレオニン、セリン、グルタミン酸アリルエステル、ホモシトルリン、リジン、メチオニン、ノルロイシン、オルニチン、アルギニン、グリシン、ジアミノプロピオン酸、ジアミノ酪酸、ＧｌｙＮＨ２、及びアラニンからなる群から選択され、あるいはグリシン、アラニン及びチロシンの群から選択されるアミノ酸のＮα−ω−官能化誘導体であり、
Ｒ７は、フェニルアラニン、ホモロイシン、ノルロイシン、グルタミン酸アリルエステルからなる群から選択され、
Ｗが、存在せず、あるいはＮ−（８−スルホンアミド−５−イソキノリン）エチレンジアミンであり、及び
Ｌが、存在しなくてよく、あるいはグリシン、β−アラニン、フェニルアラニン、アミノ酪酸及びアミノペンタン酸からなる群から選択される、
式ＩＩａの化合物。
【請求項４】
【化３】
2005501047.tif 000051
Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６が、それぞれ独立に、スレオニン、セリン、グルタミン酸アリルエステル、ホモシトルリン、リジン、メチオニン、ノルロイシン、オルニチン、アルギニン、グリシン、ジアミノプロピオン酸、ジアミノ酪酸、ＧｌｙＮＨ２、及びアラニンからなる群から選択され、あるいはグリシン、アラニン及びチロシンの群から選択されるアミノ酸のＮα−ω−官能化誘導体であり、
Ｒ７は、フェニルアラニン、ホモロイシン、ノルロイシン、グルタミン酸アリルエステルからなる群から選択され、
Ｗが、存在せず、あるいはＮ−（８−スルホンアミド−５−イソキノリン）エチレンジアミンであり、及び
Ｌが、存在しなくてよく、あるいはグリシン、β−アラニン、フェニルアラニン、アミノ酪酸及びアミノペンタン酸からなる群から選択される、
式ＩＩｂの化合物。
【請求項５】
【化４】
2005501047.tif 000052
Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６が、それぞれ独立に、スレオニン、セリン、グルタミン酸アリルエステル、ホモシトルリン、リジン、メチオニン、ノルロイシン、オルニチン、アルギニン、グリシン、ジアミノプロピオン酸、ジアミノ酪酸、ＧｌｙＮＨ２、及びアラニンからなる群から選択され、あるいはグリシン、アラニン及びチロシンの群から選択されるアミノ酸のＮα−ω−官能化誘導体であり、
Ｒ７は、フェニルアラニン、ホモロイシン、ノルロイシン、グルタミン酸アリルエステルからなる群から選択され、
Ｗが、存在せず、あるいはＮ−（８−スルホンアミド−５−イソキノリン）エチレンジアミンであり、及び
Ｌが、存在しなくてよく、あるいはグリシン、β−アラニン、フェニルアラニン、アミノ酪酸及びアミノペンタン酸からなる群から選択される、
式ＩＩｃの化合物。
【請求項６】
【化５】
2005501047.tif 000053
Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６が、それぞれ独立に、スレオニン、セリン、グルタミン酸アリルエステル、ホモシトルリン、リジン、メチオニン、ノルロイシン、オルニチン、アルギニン、グリシン、ジアミノプロピオン酸、ジアミノ酪酸、ＧｌｙＮＨ２、及びアラニンからなる群から選択され、あるいはグリシン、アラニン及びチロシンの群から選択されるアミノ酸のＮα−ω−官能化誘導体であり、
Ｒ７は、フェニルアラニン、ホモロイシン、ノルロイシン、グルタミン酸アリルエステルからなる群から選択され、
Ｗが、存在せず、あるいはＮ−（８−スルホンアミド−５−イソキノリン）エチレンジアミンであり、及び
Ｌが、存在しなくてよく、あるいはグリシン、β−アラニン、フェニルアラニン、アミノ酪酸及びアミノペンタン酸からなる群から選択される、
式ＩＩｄの化合物。
【請求項７】
配列Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−（ｂＡｌａ−５−メルカプトアミノプロピル−イソキノリン）−Ｓｅｒ−Ｐｈｅを含む請求項１記載の化合物。
【請求項８】
配列Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−（５−メルカプトアミノプロピル−イソキノリン）−Ｓｅｒ−Ｐｈｅを含む請求項１記載の化合物。
【請求項９】
配列Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｏｒｎ−Ｇｌｕ−（５−アミノエチルスルホンアミドイソキノリン）−Ｓｅｒ−Ｐｈｅを含む請求項１記載の化合物。
【請求項１０】
配列Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｇｌｕ−（５−メルカプトアミノプロピル−イソキノリン）−Ｓｅｒ−Ｐｈｅを含む請求項１記載の化合物。
【請求項１１】
配列Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ−（５−メルカプトアミノプロピル−イソキノリン）−Ｓｅｒ−Ｐｈｅを含む請求項１記載の化合物。
【請求項１２】
配列Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｏｒｎ−Ｇｌｕ−（Ｇｌｙ−５−アミノエチルスルホンアミド）−Ｄａｂ−Ｈｏｌ−を含む請求項１記載の化合物。
【請求項１３】
配列Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ−（Ｇｌｙ−５−アミノエチルスルホンアミド）−Ｄａｂ−Ｐｈｅを含む請求項１記載の化合物。
【請求項１４】
配列Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ−（Ｇｌｙ−５−アミノエチルスルホンアミド）−Ｄａｂ−Ｈｏｌを含む請求項１記載の化合物。
【請求項１５】
有効成分として、
【化６】
2005501047.tif 000054
Ｒ１及びＲ２が、それぞれ独立に、水素、低級アルキル基、低級アルコキシ基、置換した又は非置換のフェニル基、フェニル基、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、ニトロ、シアノ、又はアミノ基からなる群から選択される少なくとも１種の置換基で置換された低級アルキルからなる群から選択され、
ｍ及びｎが、それぞれ独立に０〜３であり、
Ｘが、ＳＯ２−ＮＨ、Ｓ及びＯからなる群から選択され、
Ｍが、１〜４個の炭素原子からなる置換した又は非置換のアルキレンを表し、
Ｙが、アミド、アミン、尿素、カルバメート、ヒドラジン又はスルホンアミドからなる群から選択され、
Ｗが、存在せず、あるいは１〜１８個の炭素原子からなる置換した又は非置換のアルキレン、脂肪族、芳香族又は複素環基からなる群から選択され、
Ｌが、存在せず、あるいはアミド、アミン、尿素、カルバメート、ヒドラジン又はスルホンアミドからなる群から選択され、及び
Ｚが、ＰＫＢの基質部位に結合可能な長さの４〜１２残基からなるペプチド又はペプチド模倣基である、
式Ｉの化合物、及び薬剤として許容される希釈剤又は担体を含む薬剤組成物。
【請求項１６】
Ｒ１及びＲ２が、それぞれ独立に、メチル、エチル、エトキシ及びジメチルアミンからなる群から選択され、
ｍ及びｎが、それぞれ１であり、
Ｘが、ＳＯ２−ＮＨ及びＳからなる群から選択され、
Ｍが、２個の炭素原子からなる置換した又は非置換のアルキレンを表し、
Ｙが、アミド及びアミンからなる群から選択され、
Ｗが、存在せず、あるいは１〜５個の炭素原子からなる置換した又は非置換のアルキレン、脂肪族、芳香族又は複素環基からなる群から選択され、
Ｌが、存在せず、あるいはアミド及びアミンからなる群から選択され、及び
Ｚが、ＰＫＢの基質部位に結合可能な長さの６〜１０残基からなるペプチド又はペプチド模倣基である、
請求項８に記載の薬剤組成物。
【請求項１７】
有効成分として、
【化７】
2005501047.tif 000055
Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６が、それぞれ独立に、スレオニン、セリン、グルタミン酸アリルエステル、ホモシトルリン、リジン、メチオニン、ノルロイシン、オルニチン、アルギニン、グリシン、ジアミノプロピオン酸、ジアミノ酪酸、ＧｌｙＮＨ２、及びアラニンからなる群から選択され、あるいはグリシン、アラニン及びチロシンの群から選択されるアミノ酸のＮα−ω−官能化誘導体であり、
Ｒ７は、フェニルアラニン、ホモロイシン、ノルロイシン、グルタミン酸アリルエステルからなる群から選択され、
Ｗが、存在せず、あるいはＮ−（８−スルホンアミド−５−イソキノリン）エチレンジアミンであり、及び
Ｌが、存在しなくてよく、あるいはグリシン、β−アラニン、フェニルアラニン、アミノ酪酸及びアミノペンタン酸からなる群から選択される、
一般式ＩＩａの化合物、及び薬剤として許容される希釈剤又は担体を含む薬剤組成物。
【請求項１８】
有効成分として、
【化８】
2005501047.tif 000056
Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６が、それぞれ独立に、スレオニン、セリン、グルタミン酸アリルエステル、ホモシトルリン、リジン、メチオニン、ノルロイシン、オルニチン、アルギニン、グリシン、ジアミノプロピオン酸、ジアミノ酪酸、ＧｌｙＮＨ２、及びアラニンからなる群から選択され、あるいはグリシン、アラニン及びチロシンの群から選択されるアミノ酸のＮα−ω−官能化誘導体であり、
Ｒ７は、フェニルアラニン、ホモロイシン、ノルロイシン、グルタミン酸アリルエステルからなる群から選択され、
Ｗが、存在せず、あるいはＮ−（８−スルホンアミド−５−イソキノリン）エチレンジアミンであり、及び
Ｌが、存在しなくてよく、あるいはグリシン、β−アラニン、フェニルアラニン、アミノ酪酸及びアミノペンタン酸からなる群から選択される、
一般式ＩＩｂの化合物、及び薬剤として許容される希釈剤又は担体を含む薬剤組成物。
【請求項１９】
有効成分として、
【化９】
2005501047.tif 000057
Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６が、それぞれ独立に、スレオニン、セリン、グルタミン酸アリルエステル、ホモシトルリン、リジン、メチオニン、ノルロイシン、オルニチン、アルギニン、グリシン、ジアミノプロピオン酸、ジアミノ酪酸、ＧｌｙＮＨ２、及びアラニンからなる群から選択され、あるいはグリシン、アラニン及びチロシンの群から選択されるアミノ酸のＮα−ω−官能化誘導体であり、
Ｒ７は、フェニルアラニン、ホモロイシン、ノルロイシン、グルタミン酸アリルエステルからなる群から選択され、
Ｗが、存在せず、あるいはＮ−（８−スルホンアミド−５−イソキノリン）エチレンジアミンであり、及び
Ｌが、存在しなくてよく、あるいはグリシン、β−アラニン、フェニルアラニン、アミノ酪酸及びアミノペンタン酸からなる群から選択される、
一般式ＩＩｃの化合物、及び薬剤として許容される希釈剤又は担体を含む薬剤組成物。
【請求項２０】
有効成分として、
【化１０】
2005501047.tif 000058
Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６が、それぞれ独立に、スレオニン、セリン、グルタミン酸アリルエステル、ホモシトルリン、リジン、メチオニン、ノルロイシン、オルニチン、アルギニン、グリシン、ジアミノプロピオン酸、ジアミノ酪酸、ＧｌｙＮＨ２、及びアラニンからなる群から選択され、あるいはグリシン、アラニン及びチロシンの群から選択されるアミノ酸のＮα−ω−官能化誘導体であり、
Ｒ７は、フェニルアラニン、ホモロイシン、ノルロイシン、グルタミン酸アリルエステルからなる群から選択され、
Ｗが、存在せず、あるいはＮ−（８−スルホンアミド−５−イソキノリン）エチレンジアミンであり、及び
Ｌが、存在しなくてよく、あるいはグリシン、β−アラニン、フェニルアラニン、アミノ酪酸及びアミノペンタン酸からなる群から選択される、
一般式ＩＩｄの化合物、及び薬剤として許容される希釈剤又は担体を含む薬剤組成物。
【請求項２１】
有効成分として、配列Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−（ｂＡｌａ−５−メルカプトアミノプロピル−イソキノリン）−Ｓｅｒ−Ｐｈｅを含む化合物、及び薬剤として許容される希釈剤又は担体を含む請求項１５記載の薬剤組成物。
【請求項２２】
有効成分として、配列Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−（５−メルカプトアミノプロピル−イソキノリン）−Ｓｅｒ−Ｐｈｅを含む化合物、及び薬剤として許容される希釈剤又は担体を含む請求項１５記載の薬剤組成物。
【請求項２３】
有効成分として、配列Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｏｒｎ−Ｇｌｕ−（５−アミノエチルスルホンアミドイソキノリン）−Ｓｅｒ−Ｐｈｅを含む化合物、及び薬剤として許容される希釈剤又は担体を含む請求項１５記載の薬剤組成物。
【請求項２４】
有効成分として、配列Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−Ｇｌｕ−（５−メルカプトアミノプロピル−イソキノリン）−Ｓｅｒ−Ｐｈｅを含む化合物、及び薬剤として許容される希釈剤又は担体を含む請求項１５記載の薬剤組成物。
【請求項２５】
有効成分として、配列Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ−（５−メルカプトアミノプロピル−イソキノリン）−Ｓｅｒ−Ｐｈｅを含む化合物、及び薬剤として許容される希釈剤又は担体を含む請求項１５記載の薬剤組成物。
【請求項２６】
有効成分として、配列Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｏｒｎ−Ｇｌｕ−（Ｇｌｙ−５−アミノエチルスルホンアミド）−Ｄａｂ−Ｈｏｌを含む化合物、及び薬剤として許容される希釈剤又は担体を含む請求項１５記載の薬剤組成物。
【請求項２７】
有効成分として、配列Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ−（Ｇｌｙ−５−アミノエチルスルホンアミド）−Ｄａｂ−Ｐｈｅを含む化合物、及び薬剤として許容される希釈剤又は担体を含む請求項１５記載の薬剤組成物。
【請求項２８】
有効成分として、配列Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ−（Ｇｌｙ−５−アミノエチルスルホンアミド）−Ｄａｂ−Ｈｏｌを含む化合物、及び薬剤として許容される希釈剤又は担体を含む請求項１５記載の薬剤組成物。
【請求項２９】
有効成分として、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の化合物、及び薬剤として許容される希釈剤又は担体を含む、プロテインキナーゼを阻害する薬剤組成物。
【請求項３０】
治療を必要とする患者に、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の化合物を治療有効量含む薬剤組成物を投与することを含む、疾患の治療法。
【請求項３１】
前記疾患が、癌、糖尿病、心血管疾患、出血性ショック、肥満症、炎症性疾患、中枢神経系疾患、及び自己免疫疾患を含む群から選択される請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
診断を必要とする患者に、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の化合物を診断上有効な量含む薬剤組成物を投与することを含む、疾患の診断方法。
【請求項３３】
疾患を治療するための医薬品を調製するための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項３４】
前記疾患が、癌、糖尿病、心血管疾患、出血性ショック、肥満症、炎症性疾患、中枢神経系疾患、及び自己免疫疾患を含む群から選択される請求項３３記載の使用。
【請求項３５】
診断薬を調製するための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド又はペプチド模倣物質と結合したＡＴＰ模倣物質、特にイソキノリン誘導体、そのイソキノリン誘導体及び結合体を含む薬剤組成物、プロテインキナーゼの阻害剤としてのそれらの使用、並びにこうした分子の調製方法及び使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテインキナーゼは、正常な状態下においても病的な状態下においても、増殖因子、ホルモン及び他の細胞調節分子を、細胞の増殖、生存及び代謝に関連付けるシグナル伝達経路に関与している。プロテインキナーゼのスーパーファミリーには、プロテインキナーゼＡ及びプロテインキナーゼＣ、並びについ最近発見されたプロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）がある。
【０００３】
ＰＫＢは、ヒト悪性腫瘍中でその活性が激しく高い、新しく確認された抗アポトーシスプロテインキナーゼである。ＰＫＢは最初に、ラットＴ細胞白血病中のウィルスの癌遺伝子ｖ−Ａｋｔとして発見された。後に、ｖ−Ａｋｔは、切断されたウィルスグループ特異抗原、ｇａｇが完全長Ａｋｔ−１にフレームを合わせて融合している、細胞酵素ＰＫＢ／ｃ−Ａｋｔの癌遺伝子変種であり、膜結合型であるが、ＰＫＢ／ｃ−Ａｋｔは細胞質型であることが証明された。Ａｋｔの配列決定により、ＰＫＡ（〜７５％）及びＰＫＣアイソザイム（〜５０％）に対する高度な相同性が明らかになり、このことからＰＫＢへの名称変更に至った。
【０００４】
ＰＫＢ活性化には、２つのアミノ酸残基、Ｓｅｒ４７３及びＴｈｒ３０８のリン酸化を要する。この酵素は、ＰＩ’−３−キナーゼによって生成される二次メッセンジャーＰＩＰ３により活性化される。ＰＩＰ３は、ＰＫＢのプレクストリン相同（ＰＨ）ドメインに結合し、ＰＫＢを膜に補充し、そこでＰＫＢはリン酸化され、その活性型に変換される。ＰＫＢ活性化はＰＩ’−３−キナーゼ依存性なので、ＩＧＦ−１受容体、ＥＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受容体、ｐｐ６０ｃ−Ｓｒｃなどのある種のプロテインチロシンキナーゼの持続的活性化により、多くの腫瘍で実際に生じるＰＫＢの持続的活性化がもたらされる。癌抑制遺伝子ＰＴＥＮをコードする遺伝子に欠失があると、ＰＫＢ／ｃ−Ａｋｔの持続的活性化も誘導される。というのは、ＰＴＥＮがこの酵素の負の調節遺伝子であるからである。又、ＰＫＢは卵巣癌の１５％、膵臓癌の１２％及び乳癌の３％で過剰発現され、アポトーシスから細胞を保護し、したがって化学療法への耐性に寄与する生存シグナルを生成することが示された。
【０００５】
ＰＫＢは、アポトーシス、増殖、分化及び代謝を含む広く多岐にわたる細胞プロセスの重要な調節因子として明らかになった。今や正常なＰＫＢ／Ａｋｔシグナル伝達の破壊は様々なヒト癌における高頻度の出来事として記載されており、この酵素がそれらの進行に重要な役割を演じるように思われる（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ及びＡｎｄｅｒｓｏｎ、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  １４、３８１、２００２）。したがって、ＰＫＢは、基本的には、癌の治療に関する魅力的な薬物標的である。理想的には、ＰＫＢを阻害する薬物は、細胞周期の停止とアポトーシスの促進のどちらも引き起こすべきである。このような活性の結果、ＰＫＢが高い腫瘍組織の細胞死が増大し、化学療法剤への耐性が低減するはずである。
【０００６】
ＰＫＢのこれらの分子特性及び腫瘍形成におけるその主要な役割から、このプロテインキナーゼが新規な抗癌剤の魅力的な標的であり得ることが示唆される。これまで、当技術分野でＰＫＢの特異的な阻害剤は知られておらず、又開示されているプロテインキナーゼＡ及びＣの阻害剤のいずれもＰＫＢに作用することは知られていない。
【０００７】
Ｈｉｄａｋａ  Ｈ．ら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３２、５０３６、１９８４）は、環状ヌクレオチド依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ及びＰＫＧ）及びプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）に対する阻害活性を有する、あるクラスのイソキノリンスルホンアミドについて記載している。同一クラスの化合物が欧州特許第０６１６７３号に特許請求されており、そこでは前記化合物を心血管活性を有するものとして開示している。イソキノリンスルホニルの別の誘導体が、Ｈｉｄａｋａによって欧州特許第１０９０２３号、米国特許第４４５６７５７号、第４５２５５８９号、及び第４５６０７５５号に開示されている。
【０００８】
抗腫瘍活性が、これらのイソキノリンスルホンアミドのあるものについて示唆されている。Ｍａｒｔｅｌｌ  Ｒ．Ｅ．ら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．、３７、６３５、１９８８）は、それぞれＰＫＣ及び環状ヌクレオチド依存性プロテインキナーゼに対してある種の選択性がある２種のイソキノリンスルホンアミド、すなわち１−（５−イソキノリンスルホニル）−２−メチルピペラジン（Ｈ−７）及びＮ−［２−グアニジノエチル］−５−イソキノリンスルホンアミド（ＨＡ−１００４）のカルシトリオール誘発性細胞分化に対する作用を発見した。さらに、Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  Ｍ．ら（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．、３９、１１０１、１９８６）は、同一の化合物Ｈ−７が、ホルボールジエステルによって誘発された細胞分化を阻害することを実証している。
【０００９】
国際ＰＣＴ出願公開ＷＯ９３／１３０７２は、５−イソキノリンスルホンアミド誘導体をプロテインキナーゼ阻害剤として開示している。その中で特許請求されている化合物はすべて２種のスルホニル基を含む。
【００１０】
従来技術（欧州特許ＥＰ−Ａ−３９７０６０、ドイツ特許ＤＥ−Ａ−３９１４７６４及び欧州特許ＥＰ−Ａ−３８４３４９）で周知の他のクラスの化合物はプロテインキナーゼを阻害する能力を示したが、前記化合物は、本発明の化合物のものと完全に異なる化学構造を有する。さらに、国際ＰＣＴ出願公開ＷＯ９８／５３０５０は、セリン／スレオニンキナーゼの活性を調節するセリン／スレオニンキナーゼのＨＪループから誘導された短いペプチドについて開示している。
【００１１】
ＰＫＢによる効率的なリン酸化のための最小コンセンサス配列がＡｌｅｓｓｉら（Ｆｅｄ．Ｅｕｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、３９９、３３３、１９９６）によって発見された。これは、配列Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅを有する最も活性なペプチド基質を含む７量体モチーフである。国際出願公開ＷＯ９７／２２３６０は、ＰＫＢ活性を測定するための基質として有用な、７アミノ酸長のある種のＰＫＢ基質ペプチドについて開示している。
【００１２】
Ｏｂａｔａら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１７、３６１０８、２０００）は、ＰＫＢ基質の最適なアミノ酸配列を決定するための配向ペプチドライブラリ手法の使用について記載している。同定されたすべての基質には、配列Ａｒｇ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ｘａａ−Ｓａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒを有する既知のモチーフが含まれていた。
【００１３】
Ｒｉｃｏｕａｒｔら（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９１、３４、７３〜７８）は、ＰＫＡを阻害するイソキノリンスルホンアミドとペプチドの結合体について記載している。Ｌｏｏｇら（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １９９９、９、１４４７〜１４５２）は、ＰＫＡ及びＰＫＣを阻害する、アデノシン及びペプチドを含むキメラについて記載している。この開示された化合物で得られる阻害作用は非常に弱い。Ｓｃｈｌｉｔｚｅｒら（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０００、１９９１〜２００６）は、基質のペプチド部分を置換すると想定される非ペプチド系長鎖基に連結した小分子を扱っている。この開示された化合物は、弱い阻害活性を示す。
【００１４】
Ｐａｒａｎｇら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８、３７、２００１）は、ＡＴＰがプロテインキナーゼペプチド基質に連結した、プロテインキナーゼＡ阻害剤のペプチド−ＡＴＰ二基質類似体について記載している。それにもかかわらず、この手法には、薬物動態学的特性が最適でないという制限がある。ＷＯ０１／７０７７０は、インシュリン受容体チロシンキナーゼの二基質阻害剤、及び２個の炭素スペーサーを介してペプチド基質類似体に連結したＡＴＰ−γ−Ｓを含む特異的な強力で選択的な阻害剤について開示している。
【００１５】
背景技術及び本発明者らの１人による同時係属の国際特許出願公開ＷＯ０１／９１７５４における多くの開示は、ＰＫＢ阻害剤である特異的なイソキノリン誘導体に関するものである。本発明は、新規なイソキノリン誘導体、より具体的にはイソキノリン結合体を対象としており、ＰＫＢを阻害するそれらの能力に関してすでに特許請求されているすべての既知の化合物を除外している。
【００１６】
本発明は、タンパク質標的特異性をもつＡＴＰ代用物及びペプチド模倣物質を生成することにより、既知の阻害剤の制限を克服している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
医療、治療及び薬物設計用のプロテインキナーゼの特異的な阻害剤を提供することが、本発明の目的である。プロテインキナーゼＢの選択的な阻害剤であるこのような分子を提供することが、本発明のさらに別の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明の一態様は、プロテインキナーゼの活性を阻害する新規な化合物の調製を含む。プロテインキナーゼ阻害剤であるイソキノリンスルホンアミドのある種の新規な誘導体は、ペプチド又はペプチド模倣物質と結合すると、予想外に、特定のタイプのプロテインキナーゼ、すなわちプロテインキナーゼＢに対して活性であることが今回判明した。
【００１９】
本発明は、ＰＫＢの基質を模倣するペプチド又はペプチド模倣基と結合している、ＰＫＢのＡＴＰ結合部位と高い親和性がある小分子を提供する。これらの化合物は、本明細書で「キメラ」化合物と称されている。本発明によるキメラ化合物は、改善された活性及び選択性をもつＰＫＢ阻害剤として働くことが好ましい。
【００２０】
本発明の別の態様は、有効成分としてプロテインキナーゼの新規な阻害剤を含む薬剤組成物並びにプロテインキナーゼのこれらの新規な阻害剤を含む薬剤組成物の調製方法及び使用を対象とする。
【００２１】
本発明の別の態様は、疾患及び障害の治療又は診断に有用な医薬品を製造するためのこれらのプロテインキナーゼ阻害剤を含む薬剤組成物の使用を対象とする。本発明は、癌、心血管疾患、出血性ショック、肥満症、炎症性疾患、中枢神経系疾患、及び自己免疫疾患を含むがそれだけには限定されない、プロテインキナーゼに関与する障害の治療方法について開示する。
【００２２】
本発明はさらに、治療有効量のプロテインキナーゼ阻害剤を投与することを含む、被験体中のプロテインキナーゼ活性を調節する方法を提供する。
【００２３】
本発明のさらなる態様は、本発明の化合物を用いたｉｎ−ｖｉｔｒｏ診断、及び本発明の原理によって調製した診断上有用な量のプロテインキナーゼ阻害剤を含む薬剤組成物を投与することを含むｉｎ−ｖｉｖｏ診断を含めた疾患の診断方法を対象とする。
【００２４】
改善された安定性及び細胞透過性を有するペプチド模倣化合物を含むプロテインキナーゼ阻害剤を提供することが、本発明のさらに別の目的である。こうした化合物の非限定的な例には、選択したペプチド残基のＮ−アルキル化、選択したペプチド残基、非天然アミノ酸の副鎖修飾、ペプチド結合置換のためのカルバメート、尿素、スルホンアミド及びヒドラジンの使用、並びにペプチド又は非ペプチド結合による、ピペリジン、ピペラジン及びピロリジンを含むがそれだけには限定されない非ペプチド基の取り込みが含まれる。これらのペプチド模倣化合物は、本発明に基づき、キメラ化合物のペプチド基質部分として使用することができる。さらに、これらのペプチド模倣化合物は、それ自体プロテインキナーゼ阻害剤として使用することができる。
【００２５】
本発明による好ましい実施形態は、スペーサーによって連結されたＡＴＰ模倣基とペプチド基質模倣基のどちらも含むキメラ化合物を含む。
【００２６】
ＡＴＰ模倣コアは、ダンシル、イソキノリン、キノリン及びナフタレンを含むがそれだけには限定されない。スペーサーは、様々な長さ及びアミン、アミド、チオエーテル、オキシエーテル、スルホンアミド結合などを含むがそれだけには限定されない任意の適当な化学構造からなる。こうしたスペーサーの非限定的な例には、スルホンアミド誘導体、アミノチオール誘導体及びアミノアルコール誘導体がある。ペプチド基は、ペプチド又はペプチド模倣物質を含む。こうした阻害性ペプチドは、ＰＫＢ基質として働くことができる任意のペプチドに基づいて設計される。
【００２７】
本発明のより好ましい実施形態は、式Ｉ
【化１】
2005501047.tif 000002
（式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、水素、低級アルキル基、低級アルコキシ基、置換した又は非置換のフェニル基、フェニル基、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、ニトロ、シアノ、又はアミノ基からなる群から選択される少なくとも１種の置換基で置換された低級アルキルからなる群から選択され、
ｍ及びｎは、それぞれ独立に０〜３であり、
Ｘは、ＳＯ２−ＮＨ、Ｓ及びＯからなる群から選択され、
Ｍは、１〜４個の炭素原子からなる置換した又は非置換のアルキレンを表し、
Ｙは、アミド、アミン、尿素、カルバメート、ヒドラジン又はスルホンアミドからなる群から選択され、
Ｗは、存在せず、あるいは１〜１８個の炭素原子からなる置換した又は非置換のアルキレン、脂肪族、芳香族又は複素環基からなる群から選択され、
Ｌは、存在せず、あるいはアミド、アミン、尿素、カルバメート、ヒドラジン又はスルホンアミドからなる群から選択され、
Ｚは、ＰＫＢの基質部位に結合可能な長さの４〜１２残基からなるペプチド又はペプチド模倣基である）
の化合物を含む。
【００２８】
好ましくは、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、メチル、エチル、エトキシ及びジメチルアミンからなる群から選択され、
ｍ及びｎは、それぞれ１であり、
Ｘは、ＳＯ２−ＮＨ及びＳからなる群から選択され、
Ｍは、２個の炭素原子からなる置換した又は非置換のアルキレンを表し、
Ｙは、アミド及びアミンからなる群から選択され、
Ｗは、存在せず、あるいは１〜５個の炭素原子からなる置換した又は非置換のアルキレン、脂肪族、芳香族又は複素環基からなる群から選択され、
Ｌは、存在せず、あるいはアミド及びアミンからなる群から選択され、
Ｚは、ＰＫＢの基質部位に結合可能な長さの６〜１０残基からなるペプチド又はペプチド模倣基である。
【００２９】
現在のある種のより好ましい実施形態によれば、式ＩでＺとして表されるペプチド基質模倣物質は、本明細書でＡＡ１〜ＡＡ７と称される７種の残基の配列を含む。それぞれのＡＡは、配列に組み込まれて改善された薬理学的特性をもつペプチド模倣基を形成するアミノ酸、アミノ酸類似体、あるいは脂肪族、芳香族又は複素環基からなる群から選択される。
【００３０】
ＡＡ１及びＡＡ３は、それぞれ独立に、アルギニン又はアルギニン類似体、リジン又はリジン類似体、オルニチン又はオルニチン類似体、あるいはアミン、グアニジン又はアミジン、ホモアルギニン、アルギニノールなど生理的ｐＨで正に帯電した基を含む脂肪族、芳香族、又は複素環基からなる群から選択される。
【００３１】
ＡＡ２は、プロリン、プロリン類似体あるいは脂肪族、芳香族又は複素環基、ヒドロキシプロリン、ニペコ酸、アラニン、アミノ酪酸からなる群から選択される。
【００３２】
ＡＡ４、ＡＡ５、ＡＡ６は、それぞれ独立に、ジアミノプロピオン酸、ジアミノ酪酸、オルニチン、ＧｌｙＮＨ２、Ｔｙｒ又はＴｙｒ類似体、Ｔｈｒ又はＴｈｒ類似体、Ｓｅｒ又はＳｅｒ類似体、Ａｌａ又はＡｌａ類似体、Ｇｌｕ又はＧｌｕ類似体、Ｇｌｙ又はＧｌｙ類似体、アルキル、ベンジル、ヒドロキシ、フェノキシアルコキシ、スルホン、スルホキシド、ホスホン酸塩、ホスホン酸エステル、アミド又はカルバモイル官能基、アミノ酪酸、シトルリン、セリノール、ホスホチロシン及びホスホチロシンジメチルエステルを含む脂肪族、芳香族又は複素環残基からなる群から選択される。
【００３３】
ＡＡ７は、Ｐｈｅ又はＰｈｅ類似体、Ｔｒｐ又は類似体、Ｔｙｒ又は類似体、Ｌｅｕ又は類似体、ホモロイシン又は類似体、Ｉｌｅ又は類似体、アミノ酸の芳香族基エステル又は芳香族置換基、芳香族、複素環基又は分枝状脂肪族基、ホモフェニルアラニン、ホモロイシン、グルタミン酸ベンジルエステル、ナフチルアラニンからなる群から選択される。
【００３４】
本発明による好ましい実施形態はペプチド模倣の性質をもつため、ＡＡ間の結合は、アミド、尿素、カルバメート、ヒドラジン又はスルホンアミド結合からなる群から選択することができる。現在のより好ましい実施形態では、特に明記しない限り、ＡＡ間の結合はすべてアミド結合である。
【００３５】
本発明の別の好ましい実施形態は、式ＩＩａ〜ＩＩｄ
【化２】
2005501047.tif 000003
【化３】
2005501047.tif 000004
【化４】
2005501047.tif 000005
【化５】
2005501047.tif 000006
［式中、
Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は、それぞれ独立に、スレオニン、セリン、グルタミン酸アリルエステル、ホモシトルリン、リジン、メチオニン、ノルロイシン、オルニチン、アルギニン、グリシン、ジアミノプロピオン酸、ジアミノ酪酸、ＧｌｙＮＨ２、及びアラニンからなる群から選択され、あるいはグリシン、アラニン及びチロシンの群から選択されるアミノ酸のＮα−ω−官能化誘導体であり、
Ｒ７は、フェニルアラニン、ホモロイシン、ノルロイシン、グルタミン酸アリルエステルからなる群から選択され、
Ｗは、存在せず、あるいはＮ−（８−スルホンアミド−５−イソキノリン）エチレンジアミンであり、
Ｌは、存在しなくてよく、あるいはグリシン、β−アラニン、フェニルアラニン、アミノ酪酸及びアミノペンタン酸からなる群から選択される］
の化合物を含む。式ＩＩｂに記載のように、ＷはＲ５に連結していることが好ましい。
【００３６】
本発明の現在最も好ましい実施形態は、式ＩＩＩ〜ＶＩＩのキメラ化合物である。
【００３７】
【化６】
2005501047.tif 000007
【００３８】
【化７】
2005501047.tif 000008
【００３９】
【化８】
2005501047.tif 000009
【００４０】
【化９】
2005501047.tif 000010
【００４１】
【化１０】
2005501047.tif 000011
【００４２】
以下のものから選択される配列を有する化合物が現在最も好ましい。
2005501047.tif 000012
【００４３】
プロテインキナーゼ阻害剤の、従来技術で周知の又は考えられる本質的にすべての用途は、本発明の分子を用いて達成することができる。これらの用途には、治療及び診断技術が含まれる。
【００４４】
例示として、プロテインキナーゼＢを阻害するために本発明で開示した化合物を選択した。本明細書で開示した調製物及び方法を用いることにより、他のタイプのプロテインキナーゼの活性を阻害する化合物を得ることが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
本発明によるキメラ化合物が、プロテインキナーゼの阻害剤であることを今回開示した。ある種の構造モチーフが共通する小分子が「ＡＴＰ模倣」阻害剤として働くことができることが知られている。こうした基が、本発明によるプロテインキナーゼ、特にＰＫＢの強力な阻害剤である基質模倣基も含むキメラ化合物の一部であり得ることを今回発見した。
【００４６】
開示したプロテインキナーゼ阻害剤は、ある種のプロテインキナーゼサブタイプに対して高い親和性を示すキメラ分子である。基本的には、本発明はプロテインキナーゼＢの極めて活性な（ナノモル範囲において）阻害剤を初めて提供する。好ましい分子の分子量は、一般に約１１００ダルトン未満である。背景技術に勝る上記及びさらなる利点は、本発明の現在好ましい実施形態の詳細から明らかになるであろう。
【００４７】
本発明による好ましい化合物は、ＰＫＢの基質を模倣するペプチド又はペプチド模倣基と結合している、ＰＫＢのＡＴＰ結合部位と高い親和性を有する小分子から構成される。本発明によるキメラ化合物は、改善された活性及び選択性をもつＰＫＢ阻害剤として働くことが好ましい。
【００４８】
本発明による組成物の効用は、当技術分野でよく知られている様々な検定を用いて証明することができる。本発明の好ましい化合物は、プロテインキナーゼの活性阻害及び癌細胞のアポトーシスの誘発に関して、ｉｎ−ｖｉｔｒｏ検定のパネルで活性であることが判明した。
【００４９】
薬理学的に活性なプロテインキナーゼ阻害剤及び薬剤として許容される担体又は希釈剤を含む本発明による薬剤組成物は、本発明の別の実施形態を表し、有効量の本発明によるプロテインキナーゼ阻害剤を含む薬剤組成物を用いて、治療を必要とする哺乳動物を治療する方法も同様である。本発明の組成物を用いた治療方法は、こうした組成物を用いた癌、糖尿病、心血管疾患、出血性ショック、肥満症、炎症性疾患、中枢神経系疾患、及び自己免疫疾患の治療に有用である。
【００５０】
本発明による薬剤組成物は、乳癌（Ｐｅｒｅｚ−Ｔｅｎｏｒｉｏ及びＳｔａｌ、Ｂｒ．Ｊ．ｃａｎｃｅｒ  ２００２  ８６、５４０〜４５、Ｓａｌｈら、Ｉｎｔ．Ｊ．ｃａｎｃｅｒ  ２００２  ９８、１４８〜５４）、卵巣癌（Ｌｉｕら、ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓ．１９９８  １５、２９７３〜７）、前立腺癌（Ｚｉｎら、Ｃｌｉｎ．ｃａｎｃｅｒ．ｒｅｓ．２００１  ７、２４７５〜９）、大腸癌（Ｓｅｍｂａら、ｃｌｉｎ．ｃａｎｃｅｒ．ｒｅｓ．２００２  ８、１９５７〜６３）、黒色腫及び皮膚癌（Ｗａｌｄｅｒｍａｎ、Ｗｅｃｋｅｒ及びＤｉｅｃｈｍａｎｎ、Ｍｅｌａｎｏｍａ  ｒｅｓ．２００２  １２、４５〜５０）、肺癌（Ｚｉｎら、Ｃｌｉｎ．ｃａｎｃｅｒ．ｒｅｓ．２００１  ７、２４７５〜９）、並びに肝臓癌（Ｆａｎｇら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００１  ２６８、４５１３〜９）の群から選択される悪性腫瘍の予防及び治療に使用することが最も好ましいかもしれない。
【００５１】
本発明による薬剤組成物は、少なくとも１種のプロテインキナーゼ阻害剤を含むと有利である。これらの薬剤組成物は、局所又は全身を含めて、どんな適当な投与経路によっても投与することができる。好ましい投与モードは、静脈内及び筋肉内注射などの非経口経路、並びに経鼻又は経口摂取による経路を含むがそれだけには限定されない。
【００５２】
当業者に周知のように、薬剤組成物は、治療すべき症状に対して、そのもの単独で又は追加の治療薬と併用して投与することができる。
【００５３】
用語及び定義
本明細書及び特許請求の範囲において、「プロテインキナーゼ」という用語は、上記の１種又は複数のタンパク質をリン酸化させるように機能する酵素スーパーファミリーのメンバーを意味する。
【００５４】
本明細書及び特許請求の範囲では、「阻害剤」という用語は、「拮抗薬」を意味するものとして同義で用いられ、これらの用語は、ある種の酵素活性を低減させる能力、あるいは前記酵素基質の活性又は機能と競合する能力を有する組成物を定義している。
【００５５】
本明細書及び特許請求の範囲では、「キメラ化合物」又は「キメラ分子」という用語は、ＰＫＢ基質模倣部分と結合したＡＴＰ模倣基を意味する。こうしたキメラ化合物又は結合体の例は、ＰＫＢ基質模倣物質であるペプチド又はペプチド模倣基と結合した、ＰＫＢのＡＴＰ分子を模倣する小分子（及びより特異的なイソキノリン誘導体）である。これらの分子は、好ましくは、改善された活性及び選択性をもつＰＫＢ阻害剤として働くことができる。
【００５６】
本明細書では、「ペプチド」は、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸配列を示す。本発明のペプチド類似体は、３〜１５アミノ酸残基、好ましくは４〜１２残基、より好ましくは５〜１０アミノ酸の配列を含み、それぞれの残基は、アミノ末端及びカルボキシ末端を有することを特徴とする。
【００５７】
「ペプチド模倣物質」という用語は、本発明によるペプチドが、少なくとも１種の非コード残基又は非ペプチド結合を含むように改変されていることを意味する。このような改変には、例えば、１種又は複数の残基のアルキル化及びより特異的なメチル化、非天然アミノ酸の挿入又は非天然アミノ酸による天然アミノ酸の置換、アミド結合の他の共有結合との置換がある。本発明によるペプチド模倣物質は、任意選択で少なくとも１種の結合を含むことができ、それは、尿素結合、カルバメート結合、スルホンアミド結合、ヒドラジン結合などのアミド置換結合、又は任意の他の共有結合である。適切な「ペプチド模倣物質」の設計は、コンピューターで支援することができる。
【００５８】
「ペプチド類似体」という用語は、１種又は複数のアミノ酸変更あるいはアミド結合の１種又は複数の改変／置換を施したものを除き、本発明によるアミノ酸配列を有する分子を示す。
【００５９】
本明細書及び特許請求の範囲では、「治療有効量」という用語は、宿主に投与して、それだけには限らないが、癌、糖尿病、心血管疾患、出血性ショック、肥満症、炎症性疾患、中枢神経系疾患、及び自己免疫疾患など本明細書に記載の適応症に対して望ましい結果が得られるのと同じ量を含む、プロテインキナーゼ阻害剤又は組成物の量を意味する。
【００６０】
本発明並びにその製造及び使用方法を説明するために、本明細書ではいくつかの略語を使用している。例えば、ＡＴＰはアデノシン三リン酸を意味し、ＢＳＡはウシ血清アルブミンを意味し、ＢＴＣはビス−（トリクロロメチル）カーボネート又はトリホスゲンを意味し、ＤＣＭはジクロロメタンを意味し、ＤＩＥＡはジイソプロピル−エチルアミンを意味し、ＤＭＦはジメチルホルムアミドを意味し、ＥＤＴはエタンジチオールを意味し、ＥＤＴＡはエチレンジアミン四酢酸を意味し、ＥＬＩＳＡは酵素結合免疫吸着検定法を意味し、ＥＧＦは上皮成長因子を意味し、ＦＡＣＳは蛍光標示式細胞分取器を意味し、ＨＡは赤血球凝集素を意味し、ＨＢＴＵは１−ヒドロキシベンズトリアゾリルテトラメチル−ウロニウムを意味し、ＨＥＰＥＳは４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸を意味し、ＨＯＢＴは１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを意味し、ＨＲＰは西洋わさびペルオキシダーゼを意味し、ＩＧＦはインシュリン成長因子を意味し、ＭＯＰＳは４−モルホリンプロパンスルホン酸を意味し、ＭＰＳは多重並行合成を意味し、ＮＭＰはＮ−メチルホルムアミドを意味し、ＯＰＤはｏ−フェニレンジアミンを意味し、ＰＢＳはリン酸緩衝塩類溶液を意味し、ＰＫＡはプロテインキナーゼＡを意味し、ＰＫＢはプロテインキナーゼＢを意味し、ＰＫＣはプロテインキナーゼＣを意味し、ｒｐｍは毎分回転数を意味し、ＳＡＲは構造活性相関を意味し、ＴＨＦはテトラヒドロフランを意味し、ＴＩＳはトリ−イソプロピル−シランを意味し、ＴＦＡはトリフルオロ酢酸を意味する。
【００６１】
本発明で使用するアミノ酸は、市販されているもの又は通常の合成方法で入手可能なものである。ある種の残基は、ペプチドに組み込むための特殊な方法を必要とするかもしれない。又ペプチド配列に対する逐次、発散又は収束合成手法のいずれかが本発明で有用である。コードされた天然アミノ酸及びその誘導体は、ＩＵＰＡＣ規則に基づく３文字表記によって表している。指示がない場合、Ｌ異性体を使用した。Ｄ異性体は、残基の略語の前の「Ｄ」で表している。
【００６２】
当業者に周知のアミノ酸の保存的置換は、本発明の範囲内である。保存的アミノ酸置換には、例えば脂肪族、芳香族、正に帯電、負に帯電した同じタイプの官能基又は側鎖を有する一方のアミノ酸をもう一方のアミノ酸と置換することが含まれる。
【００６３】
本発明で使用される非コードアミノ酸の非限定的な例のリストは以下の通りである。Ａｂｕは２−アミノ酪酸を意味し、Ａｐｅ５はアミノペンタン酸を意味し、ＡｒｇＯｌはアルギニノールを意味し、ｂＡｌａはβ−アラニンを意味し、Ｂｐａは４−ベンゾイルフェニルアラニンを意味し、Ｂｉｐはβ−（４−ビフェニル）−アラニンを意味し、Ｄａｂはジアミノ酪酸を意味し、Ｄａｐはジアミノプロピオン酸を意味し、Ｄｉｍはジメトキシフェニルアラニンを意味し、Ｄｐｒはジアミノプロピオン酸を意味し、Ｈｏｌはホモロイシンを意味し、ＨＰｈｅはホモフェニルアラニンを意味し、Ｇａｂａはγ−アミノ酪酸を意味し、ＧｌｙＮＨ２はアミノグリシンを意味し、Ｎｌｅはノルロイシンを意味し、Ｎｖａはノルバリンを意味し、Ｏｒｎはオルニチンを意味し、ＰｈｅＣａｒｂｏｘｙはｐ−カルボキシフェニルアラニンを意味し、ＰｈｅＣｌはｐ−クロロフェニルアラニンを意味し、ＰｈｅＦはｐ−フルオロフェニルアラニンを意味し、ＰｈｅＭｅはｐ−メチルフェニルアラニンを意味し、ＰｈｅＮＨ２はｐ−アミノフェニルアラニンを意味し、ＰｈｅＮＯ２はｐ−ニトロフェニルアラニンを意味し、Ｐｈｇはフェニルグリシンを意味し、Ｔｈｉはチエニルアラニンを意味する。
【００６４】
薬理学
本発明の化合物は、当技術分野でよく知られているいくつかの方法で被験体に投与することができる。以下、「被験体」という用語は、本発明の化合物を投与するヒト又は下等動物を意味する。
【００６５】
本発明の新規な薬剤組成物は、有効成分の他に通常の薬剤として許容される担体、希釈剤などを含む。経口投与のための錠剤、丸剤、カプセル剤などの固体組成物は、有効成分を、薬剤として許容される希釈剤を含むコーンスターチ、ラクトース、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム及びガムなど通常の薬剤として許容される成分と一緒に混合することによって調製することができる。錠剤又は丸剤は、コーティングして、あるいはその他の方法で当技術分野で周知の薬剤として許容される物質と一緒に混ぜ合わせて、長期作用又は徐放をもたらす剤形を得ることができる。他の固体組成物は、直腸投与のための坐剤として調製することができる。
【００６６】
液体形態は、経口投与又は注射用に調製することができ、注射という用語には、皮下、経皮、静脈内、くも膜下腔内、及び他の非経口投与経路が含まれる。液体組成物には、有機補助溶剤を含む又は含まない水性液剤、水性又は油性懸濁剤、食用油を含む乳剤、並びに他のミセル分散剤及び同様の薬剤担体が含まれる。さらに、本発明の組成物は、鼻腔内などへの投与のためのエアロゾール剤として形成することができる。より好ましい製剤には、定常状態の薬物動態学的特徴をもたらし得る徐放性又は持効性製剤が含まれる。
【００６７】
しかし、治療する疾患、投与方法、患者の年齢、体重、禁忌などに応じて、担当の医師によって投与量が決定されるであろうことは当業者には明らかである。
【００６８】
上記で定義したすべての化合物は、プロテインキナーゼの阻害剤として有効であり、１種、又は同時に数種の、上記で定義した障害の症状を治療するための薬剤組成物の有効成分として使用することができる。
【００６９】
本発明の化合物は、上記で定義した目的のために、生理学的に許容される製剤を生成するために必要とされる溶剤、希釈剤、賦形剤などを含む通常の剤形で投与する。これらは、通常の投与経路のいずれかによって投与することができる。
【００７０】
本発明の薬剤組成物の最も適切な投与が、治療している障害又は疾患の種類によって決まるであろうことが理解されよう。
【００７１】
化学的手法
いくつかの本発明の好ましい化合物を、好都合には溶液相合成法を用いて調製することができる。当技術分野で周知の、本発明のようなイソキノリン化合物を調製するための他の方法も使用することができ、かつ本発明の範囲に含まれている。本発明による好ましいペプチドは、ペプチド模倣物質法を含めた、当技術分野で周知のどんな方法を用いて合成することもできる。これらの方法には、固相並びに溶液相合成法が含まれる。ペプチド基及び小分子基の結合は、固相又は溶液相化学的手法のいずれかによって、当技術分野で周知のどんな方法を用いて行うこともできる。これらの方法の非限定的な例をここに記載する。
【００７２】
本発明の原理の例示として、ある種の分子のＳＡＲ試験を重視した阻害性ＰＫＢキメラ化合物に関する調査を以下に例示した。
【００７３】
好ましい実施形態
プロテインキナーゼは２つ以上の活性部位を有し、それらはＡＴＰの触媒部位及び基質結合部位をもつ。本発明による好ましい化合物は、両方の部位に同時に結合でき、特異的な効力及び選択特性が得られる相乗効果があるかもしれない。これらの好ましい化合物は、様々なスペーサーによって基質模倣部分と連結したＡＴＰ模倣分子を含むように設計されたキメラ分子である。
【００７４】
本発明による好ましい実施形態は、以下のスキームＩに記載のように、スペーサーによって連結されたＡＴＰ模倣基とペプチド基質模倣基のどちらも含むキメラ化合物を含む。
【００７５】
【化１１】
2005501047.tif 000013
【００７６】
ＡＴＰ模倣コアは、ダンシル、イソキノリン、キノリン及びナフタレンを含むがそれだけには限定されない。スペーサーは、様々な長さ及びアミン、アミド、チオエーテル、オキシエーテル、スルホンアミド結合などを含むがそれだけには限定されない任意の適当な化学構造からなる。こうしたスペーサーの非限定的な例には、スルホンアミド誘導体、アミノチオール誘導体及びアミノアルコール誘導体がある。ペプチド基は、ペプチド又はペプチド模倣物質を含む。こうした阻害性ペプチドは、ＰＫＢ基質として働くことができる任意のペプチドに基づいて設計される。
【００７７】
本発明の別のより好ましい実施形態は、式Ｉ
【化１２】
2005501047.tif 000014
（式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、水素、低級アルキル基、低級アルコキシ基、置換した又は非置換のフェニル基、フェニル基、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、ニトロ、シアノ、又はアミノ基からなる群から選択される少なくとも１種の置換基で置換された低級アルキルからなる群から選択され、
ｍ及びｎは、それぞれ独立に０〜３であり、
Ｘは、ＳＯ２−ＮＨ、Ｓ及びＯからなる群から選択され、
Ｍは、１〜４個の炭素原子からなる置換した又は非置換のアルキレンを表し、
Ｙは、アミド、アミン、尿素、カルバメート、ヒドラジン又はスルホンアミドからなる群から選択され、
Ｗは、存在せず、あるいは１〜１８個の炭素原子からなる置換した又は非置換のアルキレン、脂肪族、芳香族又は複素環基からなる群から選択され、
Ｌは、存在せず、あるいはアミド、アミン、尿素、カルバメート、ヒドラジン又はスルホンアミドからなる群から選択され、
Ｚは、ＰＫＢの基質部位に結合可能な長さの４〜１２残基からなるペプチド又はペプチド模倣基である）
の化合物を含む。
【００７８】
好ましくは、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、メチル、エチル、エトキシ及びジメチルアミンからなる群から選択され、
ｍ及びｎは、それぞれ１であり、
Ｘは、ＳＯ２−ＮＨ及びＳからなる群から選択され、
Ｍは、２個の炭素原子からなる置換した又は非置換のアルキレンを表し、
Ｙは、アミド及びアミンからなる群から選択され、
Ｗは、存在せず、あるいは１〜５個の炭素原子からなる置換した又は非置換のアルキレン、脂肪族、芳香族又は複素環基からなる群から選択され、
Ｌは、存在せず、あるいはアミド及びアミンからなる群から選択され、
Ｚは、ＰＫＢの基質部位に結合可能な長さの６〜１０残基からなるペプチド又はペプチド模倣基である。
【００７９】
キメラ化合物の一部を形成する、本発明による好ましいペプチド基質及びペプチド基質模倣物質を以下のスキームに記載する。
【００８０】
【化１３】
2005501047.tif 000015
【００８１】
このスキームによれば、ＡＡは、配列に組み込まれて改善された薬理学的特性をもつペプチド模倣基を形成するアミノ酸、アミノ酸類似体、あるいは脂肪族、芳香族又は複素環基からなる群から選択される。
【００８２】
ＡＡ１及びＡＡ３は、それぞれ独立に、アルギニン又はアルギニン類似体、リジン又はリジン類似体、オルニチン又はオルニチン類似体、あるいはアミン、グアニジン又はアミジン、ホモアルギニン、アルギニノールなど生理的ｐＨで正に帯電した基を含む脂肪族、芳香族、又は複素環基からなる群から選択される。
【００８３】
ＡＡ２は、プロリン、プロリン類似体あるいは脂肪族、芳香族又は複素環基、ヒドロキシプロリン、ニペコ酸、アラニン、アミノ酪酸からなる群から選択される。
【００８４】
ＡＡ４、ＡＡ５、ＡＡ６は、それぞれ独立に、ジアミノプロピオン酸、ジアミノ酪酸、オルニチン、ＧｌｙＮＨ２、Ｔｙｒ又はＴｙｒ類似体、Ｔｈｒ又はＴｈｒ類似体、Ｓｅｒ又はＳｅｒ類似体、Ａｌａ又はＡｌａ類似体、Ｇｌｕ又はＧｌｕ類似体、Ｇｌｙ又はＧｌｙ類似体、アルキル、ベンジル、ヒドロキシ、フェノキシアルコキシ、スルホン、スルホキシド、ホスホン酸塩、ホスホン酸エステル、アミド又はカルバモイル官能基、アミノ酪酸、シトルリン、セリノール、ホスホチロシン及びホスホチロシンジメチルエステルを含む脂肪族、芳香族又は複素環残基からなる群から選択される。
【００８５】
ＡＡ７は、Ｐｈｅ又はＰｈｅ類似体、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、ホモロイシン、Ｉｌｅ、及びこれらの類似体、アミノ酸の芳香族基エステル又は芳香族置換基、芳香族、複素環基又は分枝状脂肪族基、ホモフェニルアラニン、ホモロイシン、グルタミン酸ベンジルエステル、ナフチルアラニンからなる群から選択される。
【００８６】
本発明による好ましい実施形態はペプチド模倣の性質をもつため、ＡＡ間の結合はペプチド結合だけではなく、アミド、尿素、カルバメート、ヒドラジン又はスルホンアミド結合からなる群から選択することができる。
【００８７】
本発明の別の好ましい実施形態は、式ＩＩａ〜ＩＩｄ
【化１４】
2005501047.tif 000016
【化１５】
2005501047.tif 000017
【化１６】
2005501047.tif 000018
【化１７】
2005501047.tif 000019
［式中、
Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は、それぞれ独立に、スレオニン、セリン、グルタミン酸アリルエステル、ホモシトルリン、リジン、メチオニン、ノルロイシン、オルニチン、アルギニン、グリシン、ジアミノプロピオン酸、ジアミノ酪酸、ＧｌｙＮＨ２、及びアラニンからなる群から選択され、あるいはグリシン、アラニン及びチロシンの群から選択されるアミノ酸のＮα−ω−官能化誘導体であり、
Ｒ７は、フェニルアラニン、ホモロイシン、ノルロイシン、グルタミン酸アリルエステルからなる群から選択され、
Ｗは、存在せず、あるいはＮ−（８−スルホンアミド−５−イソキノリン）エチレンジアミンであり、
Ｌは、存在しなくてよく、あるいはグリシン、β−アラニン、フェニルアラニン、アミノ酪酸及びアミノペンタン酸からなる群から選択される］
の化合物を含む。式ＩＩｂに記載のように、ＷはＲ５に連結していることが好ましい。
【００８８】
本発明の現在最も好ましい実施形態には、以下に記載の式ＩＩＩ〜ＶＩＩの化合物から選択されるキメラ化合物がある。
【００８９】
【化１８】
2005501047.tif 000020
【００９０】
【化１９】
2005501047.tif 000021
【００９１】
【化２０】
2005501047.tif 000022
【００９２】
【化２１】
2005501047.tif 000023
【００９３】
【化２２】
2005501047.tif 000024
【００９４】
ＰＫＢ及びＰＫＡ活性を阻害する、式ＩＩＩ〜ＶＩＩに基づく最も好ましい化合物並びに本発明の追加の最も好ましい実施形態の活性を、表１に記載する。
【００９５】
以下のものから選択される配列を含む化合物が現在最も好ましい。
2005501047.tif 000025
【００９６】
【表１】
2005501047.tif 000026
【００９７】
図１は、ＰＫＢを不十分にしか阻害しないＡＴＰ模倣部分と、活性が４μＭのペプチド基質部分を結合させて、活性が０．９μＭ活性のキメラ化合物ＰＴＲ６０１６を得るという相乗効果を示している。
【００９８】
追加のキメラ化合物は、活性なペプチドを含み様々なリンカーでそのペプチド基領域をスペーサーに連結させている（スキームＩに基づく）。有利なリンカーは、ペプチド及びＡＴＰ模倣物質の両方を、それらの基質及びＡＴＰ結合部位に同時に適合できるようにし、活性及び特異性の改善を可能にする。
【００９９】
本発明による追加の好ましいペプチドは、キメラの基質ドメイン及びペプチド模倣物質設計の基準として使用することができる。例えば、ＰＫＢに対するＩＣ５０が４〜５μＭの直鎖状７量体ペプチドを、参考文献のＫｍが１５μＭの７量体基質と比較して開示している。これらのペプチドは、ＰＫＢに特異的であり、６０μＭにおいてＰＫＡ活性を阻害しない。開示した追加のペプチドは、ＰＫＢの阻害に対して０．５〜１０μＭの活性を示し、約１００ｎＭのＩＣ５０でＰＫＡを阻害する。
【０１００】
改善された安定性及び細胞透過性を有するペプチド模倣化合物は、本発明の別の実施形態である。こうした化合物を生成する非限定的な例には、選択したペプチド残基のＮアルキル化、カルバメート、尿素及びヒドラジン結合の置換、並びにペプチド又は非ペプチド結合によるピペリジン、ピペラジン、ピロリジンなどの複素環式非ペプチド基の取り込みがある。
【０１０１】
一般的な方法
合成法：
ペプチド合成及びカルバメート結合形成のための一般的な方法
以下の手順は、カルバメート形成にはビス−（トリクロロメチル）カーボネート（ＢＴＣ）、又通常のカップリングにはＨＢＴＵ／ＨＯＢＴを用いた、１ウェル当り６μｍｏｌのスケールにおける、９６ウェルプレート（ＭＰＳプレート）中、Ｒｉｎｋアミド樹脂上でのペプチド合成について説明している。
【０１０２】
０．６ｍｍｏｌ／ｇのＲｉｎｋアミド１ｇを、穏やかに振盪させながらＮＭＰ中で終夜膨潤させた。この樹脂を９６ウェルプレート（１ウェル当り約１０ｍｇ）に分けた。
【０１０３】
Ｆｍｏｃ脱保護は、２５％ピペリジンのＮＭＰ溶液５００μｌをそれぞれのウェルに加え、６５０ｒｐｍで１５分混合することによって行い、ピペリジン溶液を窒素圧によって除去し、ピペリジン溶液の別の一部を加え、１５分間振盪させる。Ｆｍｏｃ脱保護後及びカップリング後の樹脂洗浄は、それぞれのウェルにＮＭＰ６００μｌを入れ、２分間混合し、窒素圧によってＮＭＰを除去することによって行う。この洗浄手順を４回繰り返す。
【０１０４】
通常のカップリングは、樹脂にＦｍｏｃ保護アミノ酸のＨＯＢＴ／ＮＭＰ溶液（１５０μｌ、０．２Ｍ）を加え、続いてＨＢＴＵのＤＭＦ溶液（１５０μｌ、０．２Ｍ）及びＤＩＥＡのＮＭＰ溶液（１５０μｌ、０．４Ｍ）を加えることによって行う。反応器ブロックを６５０ｒｐｍで１時間混合し、次いで窒素圧によって除去する。この手順を１回繰り返す。
【０１０５】
ＢＴＣを用いたカルバメート形成は、Ｆｍｏｃ保護アミノアルコールのジオキサン溶液（１５０μｌ、０．２Ｍ）を予備活性化ディープウェルプレートに加え、続いてＢＴＣ（０．０７Ｍ）の１，３−ジクロロプロパン溶液１５０μｌ、コリジン（０．６Ｍ）の  １，３−ジクロロプロパン溶液１５０μｌ及びＣＨ２Ｂｒ２２００μｌを加えることによって行う。次いで、イソシアネート溶液を反応器ブロック中に移し、６０℃で４０分間混合する。４０分後に反応混合物を窒素圧で除去し、続いてＣＨ２Ｃｌ２洗浄を行う（３×４００μｌ）。この手順をさらに２回繰り返す。
【０１０６】
切断及び完全な脱保護は、樹脂を反応器ブロックからディープウェルマイクロタイタープレート（切断プレート）に移すことによって行う。このプレートに、９２．５％ＴＦＡ、２．５％Ｈ２Ｏ、２．５％ＴＩＳ、２．５％ＥＤＴの溶液３５０μｌを加える。このプレートを１０００ｒｐｍで１時間混合し、次いでＴＦＡ溶液を蒸発乾固させる。
【０１０７】
Ｓｅｐ−Ｐａｋによる精製は、ペプチドを含む樹脂の残基を溶液Ａ（０．１％ＴＦＡ水溶液）９００μｌに溶解させ、Ｃ−１８Ｓｅｐ−Ｐａｋカラムに加えることによって行う。ペプチドは、溶液Ａ＋ＣＨ３ＣＮ  １：１  ９００μｌを加えることによって、Ｃ−１８カラムからディープウェルプレートに溶出させる。プレートを液体窒素中で少なくとも１５分間凍結させ、ペプチドを凍結乾燥する。
【０１０８】
ＭＰＳフォーマットでキメラを合成するための一般的な方法
以下の手順は、通常のカップリングにＨＢＴＵ／ＨＯＢＴを用いた、１ウェル当り６μｍｏｌのスケールにおける、９６ウェルプレート（ＭＰＳプレート）中、Ｒｉｎｋアミド樹脂上でのペプチド合成について説明している。
【０１０９】
０．６ｍｍｏｌ／ｇのＲｉｎｋアミド１ｇを、穏やかに振盪させながらＮＭＰ中で終夜膨潤させた。この樹脂を９６ウェルプレート（１ウェル当り約１０ｍｇ）に分けた。
【０１１０】
Ｆｍｏｃ脱保護は、２５％ピペリジンのＮＭＰ溶液５００μｌをそれぞれのウェルに加え、６５０ｒｐｍで１５分混合することによって行い、ピペリジン溶液を窒素圧によって除去し、ピペリジン溶液の別の一部を加え、１５分間振盪させる。Ｆｍｏｃ脱保護後及びカップリング後の樹脂洗浄は、それぞれのウェルにＮＭＰ６００μｌを入れ、２分間混合し、窒素圧によってＮＭＰを除去することによって行った。この洗浄手順を４回繰り返す。
【０１１１】
通常のカップリングは、樹脂にＦｍｏｃ保護アミノ酸の  ＨＯＢＴ／ＮＭＰ溶液（１５０μｌ、０．２Ｍ）を加え、続いてＨＢＴＵのＤＭＦ溶液（１５０μｌ、０．２Ｍ）及びＤＩＥＡのＮＭＰ溶液（１５０μｌ、０．４Ｍ）を加えることによって行う。反応器ブロックを６５０ｒｐｍで１時間混合し、次いで窒素圧によって除去する。この手順を１回繰り返す。この構築に使用する最後のアミノ酸は、Ｎ−Ｂｏｃ保護されている。構築の終了時に、５％ＡｃＯＨ＋２．５％ＮＭＭを含むＰｄ（Ｐｐｈｅ３）４（０．０２Ｍのクロロホルム溶液５００μｌを入れ、１時間混合することによって、アリル脱保護を行う（Ｇｌｕ（ＯＡｌｌｙｌ）又はＣ−構築単位から）。この手順を１回繰り返す。クロロホルム６００μｌをそれぞれのウェルに加え、５分間混合することによって、アリル脱保護後の樹脂洗浄を行う。溶媒を窒素圧によって除去する。この洗浄をさらに４回繰り返す。アリル保護リンカーとペプチド−樹脂のカップリングは、アリル保護リンカー（１５０μｌ、ＮＭＰ中０．２Ｍ）を入れ、続いてＰｙＢｏＰ（ＮＭＰ中０．２Ｍ）及びＤＩＥＡ（ＮＭＰ中０．４Ｍ）を加えることによって実施する。反応器ブロックを１時間混合し、溶液を窒素圧によって除去する。この手順を１回繰り返す。それぞれのウェルにＮＭＰ５００μｌを加えることによって、カップリング後の樹脂を洗浄する。リンカーからのアリル除去を、上記と同じ手順に従って行う。アリル脱保護後、イソキノリン誘導体溶液（１５０μｌ、ＮＭＰ中０．２Ｍ）を加え、続いてＢｙＢｏＰ（１５０μｌ、ＮＭＰ中０．２Ｍ）及びＤＩＥＡ（１５０μｌ、ＮＭＰ中０．４Ｍ）を加える。この反応ブロックを２時間混合する。
【０１１２】
ＮＭＰ  ６００μｌをそれぞれのウェルに加え、２分間混合することによって、このカップリング後の樹脂洗浄を行う。溶媒を窒素圧によって除去する。この洗浄をさらに４回繰り返す。
【０１１３】
切断及び完全な脱保護は、樹脂を反応器ブロックからディープウェルマイクロタイタープレート（切断プレート）に移すことによって行う。このプレートに、９２．５％ＴＦＡ、２．５％Ｈ２Ｏ、２．５％ＴＩＳ、２．５％ＥＤＴの溶液３５０μｌを加える。このプレートを１０００ｒｐｍで１時間混合し、次いでＴＦＡ溶液を蒸発乾固させる。
【０１１４】
Ｓｅｐ−Ｐａｋによる精製は、ペプチドを含む樹脂の残基を溶液Ａ（０．１％ＴＦＡ水溶液）＋ＣＨ３ＣＮ  １：１  ９００μｌに溶解させ、Ｃ−１８Ｓｅｐ−Ｐａｋカラムに加えることによって行う。この手順をもう１回繰り返す。プレートを液体窒素中で少なくとも１５分間凍結させ、ペプチドを凍結乾燥する。
【０１１５】
プロテインキナーゼ活性の阻害についての生物学的スクリーニング検定
無細胞系による方法
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＰＫＡキナーゼ活性検定：
１．ＰＫＡ酵素をＰｒｏｍｅｇａから購入した。ＰＫＡ活性を、ケムプチドとして知られている７量体ペプチド、ＬＲＲＡＳＬＧについて検定した。この検定は、９６ウェルプレート中で１ウェル当りの最終体積５０μｌで行う。反応混合物には、様々な濃度の阻害剤、５０ｍＭ  ＭＯＰＳ、１０ｍＭ  ＭｇＡｃ、０．２ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１０μＭ  ＡＴＰ、２０μＭ  ケムプチド及び１μＣｉγ３２Ｐ  ＡＴＰが含まれている。反応は、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ中に希釈したＰＫＡの触媒サブユニット１５μｌ、０．４Ｕ／ウェルを加えて開始させる。すべての検定に、酵素を含まない２つのブランク用ウェルを含める。プレートを、連続して３０℃で１０分間又は２７℃で１時間攪拌する。２００ｍＭ  ＥＤＴＡ  １２μｌを加えることによって反応を停止させる。検定混合物のアリコート２０μｌを、２ｃｍ２ホスホセルロースストリップ（例えばワットマンＰ８１）上にスポットし、７５ｍＭ  リン酸（１試料当り１０ｍｌ）に浸す。ホスホセルロースストリップを６回洗浄する。５分間連続的にかき混ぜて洗浄し、最終的な洗浄はアセトン中で行う。ストリップを空気乾燥させた後、シンチレーション分光測定によって放射線を測定する。
【０１１６】
２．ＰＫＡを阻害する化合物のスクリーニングを、ＰＫＢについて以下に説明するように、下記の変更を加えて、ＳＰＡビーズを用いて９６ウェルプレート中で行った。
酵素基質は、５μＭビオチン標識−ケムプチドペプチド（ビオチン−ＫＬＲＲＡＳＬＧ）であった。キナーゼ緩衝液は、５０ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７、０．２ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１０ｍＭ  酢酸マグネシウムであった。０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ中に希釈したＰＫＡ（０．４ユニット）をそれぞれのウェルに加えた。
【０１１７】
ＰＫＢ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼ活性検定
１．ＰＫＢ活性を、Ａｌｅｓｓｉら（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３９９、３３３、１９９６）によって記載されているように、下記の変更を加えて検定する。すなわち、ニッケルカラムでの沈降後、ビーズに結合したＨＡ−ＰＫＢの代わりに可溶性Ｈｉｓ−ＨＡ−ＰＫＢを使用する。酵素活性測定は、ＰＫＡについての検定に記載の通りに行う。
【０１１８】
２．すでに記載の方法（Ｋｕｍａｒら、ＢＢＡ、１５２６：２５７〜２６８、２００１）を、変更を加えて用いて、９６ウェルプレート中でＰＫＢを阻害する化合物のスクリーニングを行った。キナーゼ反応を最終体積５０μｌで実施した。それぞれのウェルは、２．５μＭビオチン標識−ｃｒｏｓｓｔｉｄｅペプチド（ビオチン−ＫＧＲＰＲＴＳＳＦＡ）を溶かしたキナーゼ緩衝液［５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ及び０．１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、０．０１％トリトンＸ−１００及び２％ジメチル（Ｍｅ２ＳＯ）］、Ｈｉｓ−ＰＫＢ酵素並びに潜在的阻害性化合物を含んでいた。キナーゼ反応は、２μＭ冷ＡＴＰ及び０．２５μＣｉの［γ３３Ｐ］−ＡＴＰを溶かしたキナーゼ緩衝液１０μｌを加えることによって開始させた。プレートを２７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション終了時に、０．１％トリトンＸ−１００、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＡＴＰ及び０．３ｍｇ／ｍｌのストレプトアビジン被覆ＳＰＡビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を含むＰＢＳ２００μｌで反応を停止させた。室温での１５分間のインキュベーション後、パッカードＧＦ／Ｂ９６ウェルプレートを用いて反応混合物をろ過した。プレートを２Ｍ  ＮａＣｌ及び１％オルトリン酸で２回洗浄し、続いてエタノール洗浄し、１時間空気乾燥させた。放射能は、マイクロプレートカウンターのパッカード社製トップカウントを用いてカウントした。
【０１１９】
ＰＫＢ活性及び阻害を測定するためのトランスファーＥＬＩＳＡ検定
試験する阻害剤を水に溶解させて所望の濃度にする。阻害剤溶液５μｌを、Ｖ型ポリプロピレンマイクロプレートのウェルに加える。次いで、濃度３００μＭの基質ペプチド（ビオチン−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ）水溶液５μｌをウェルに加える（最終検定濃度は１００μＭ）。次いで、ＰＫＢ酵素を溶解させた３×反応混合物（５０ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ７．５、０．１％βメルカプトエタノール、１μＭ  ＰＫＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、ＡＴＰ５μＭ）を、あらかじめ較正した量でウェルに加える。質量スペクトル分析によって評価して、反応が終わるまでに基質の１０％未満がリン酸化されるように、酵素の量を較正する。プレートを接着テープで覆い、３０℃で１ｍｍＩＤボルテックス上に置き、必要に応じて３０分〜１時間インキュベートする。インキュベーション期間終了時に、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ二ナトリウム５μｌを加え、続いてＰＢＳ１８０μｌを加える。
【０１２０】
ＥＬＩＳＡのために、１０μｇ／ｍｌアビジンのＰＢＳ溶液２０μｌでマイクロプレート（Ｃｏｓｔａｒ  Ａ／２）を被覆する（１ｍｍＩＤボルテックス上で、４℃で終夜又は３７℃で３０分間）。次いで、プレートを脱イオン水で数回洗浄し、ペーパータオルで叩いて乾燥させる。ウェルをＰＢＴ（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋０．０５％ツイーン２０）２０μｌで充填する。酵素反応プレートから５μｌをＥＬＩＳＡプレートに移す。ＥＬＩＳＡプレートを１ｍｍ  ＩＤボルテックス上に置き、室温で１０分間インキュベートする。次いで、このプレートをすでに述べたように水で洗浄する。それぞれのウェルに、抗ホスホペプチド抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を１：１０００に希釈したＰＢＴ溶液２０μｌを加える。このプレートを又ボルテックス上に置き、３０分間インキュベートし、すでに述べたように水で洗浄する。それぞれのウェルに、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合したヤギ抗ウサギＩｇ  ２０μｌを加える。このプレートをボルテックス上に置き、２０分間インキュベートし、すでに述べたように水で洗浄する。それぞれのウェルにＨＲＰ基質（Ｓｉｇｍａｆａｓｔ  ＯＰＤ）２０μｌを加える。十分に発色した後（最大で約３０分間の発色時間）、１ウェル当り４Ｍ  ＨＣｌの水溶液２０μｌを加えることによって反応を停止させる。次いで、ＥＬＩＳＡリーダーを用いてこのプレートを４９０ｎｍで読み取る。潜在的阻害剤を含むウェルから得られるシグナルを、酵素だけを含み阻害剤を含まないウェル（最大シグナル）及び酵素を含まないウェル（最小シグナル）から得られるシグナルと比較する。
【０１２１】
リン酸化ペプチドの画分をｚｉｐｔｉｐ（Ｃ１８、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ｉ）で脱塩した後、質量スペクトルによって分析することもできる。二重荷電基質ペプチドの質量は７５９．３ダルトンであり、二重荷電リン酸化ペプチドの質量は７９９．３ダルトンである。
【０１２２】
ＰＫＣ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼ検定
ＰＫＣをＰｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．から入手し、このメーカーの説明書に従って、同じメーカーのキットを用いてリン脂質を含めて又含めずに検定した。ＰＫＣ活性は、リン脂質を含む場合の活性からリン脂質を含まない場合の活性を引き算することによって決定した。検定でのＡＴＰ濃度は１０μＭであった（ＡＴＰ＝５０μＭにおけるＫｍ）。
【０１２３】
無傷細胞でのＰＫＢ活性の阻害に関する検定
いくつかの癌細胞系を用いて、無傷細胞でのＰＫＢ阻害剤の活性を測定した。例えば、ＯＶＣＡＲ３は、ＰＫＢ遺伝子が増幅された卵巣癌の細胞系であり、Ｕ８７ＭＧは、高ＰＫＢ活性を引き起こすＰＴＥＮ遺伝子を欠失した神経膠腫細胞系であり、ＰＡＮＣ１は、ＰＫＢ遺伝子が増幅された膵癌細胞系であり、ＰＣ−３、ＤＵ−１４５及びＬＮＣａＰは、ＰＫＢ活性が変化した前立腺癌細胞系である。
【０１２４】
ａ．アネキシンＶ−アポトーシス検定
アネキシンＶ（Ｂｅｎｄｅｒ  ｍｅｄｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、アポトーシスについて細胞を検定した。６ウェルプレート（０．３×１０６／ウェル）に細胞を播き、異なる濃度の阻害剤で処理した。異なる時点で、細胞を、ラバーポリスマンを用いて掻き取り、注射針を通して分配し、ＰＢＳで２回洗浄し、アネキシンＶ結合緩衝液（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ／ＮａＯＨ  ｐＨ７．４、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ及び２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２）中に懸濁させた。アネキシンＶを１：４０に希釈し、１μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム（ＰＩ）と一緒にそれぞれの試料に加えた。アポトーシスを測定するためのＦＡＣＳ分析のために、１試料当り０．５×１０６細胞を利用した。
【０１２５】
代替法では、１０ｃｍプレート（２×１０６細胞／プレート）に細胞を播き、異なる濃度の阻害剤で処理した。処理の４０時間後、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで２回洗浄し、アネキシンＶ緩衝液中に懸濁させた。アネキシンＶ（Ｒｏｃｈｅ）を、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２及び０．２ｎＭヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含む緩衝液中に１：２５０に希釈する。ＦＡＣＳ分析によってアポトーシス測定を行った。
【０１２６】
ｂ．ｓｓＤＮＡを検出するためのＥＬＩＳＡ検定−アポトーシス検定
ｓｓＤＮＡアポトーシスＥＬＩＳＡキット（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ）を用いて、アポトーシスについて細胞を検定した。９６ウェルプレート（５０００細胞／ウェル）に細胞を播き、異なる濃度の阻害剤で処理した。異なる時点で、プレートを２００ｇで５分間遠心分離し、培地を除去し、細胞を室温で３０分間、８０％メタノールのＰＢＳ溶液で固定した。３７℃で２０分間、水浴中で浮遊させることによってプレートを乾燥させた。それぞれのウェルにホルムアミド５０μｌを加え、室温で１０分間インキュベートした。プレートを７５℃で１０分間、循環式水浴中で加熱し、冷蔵庫で５分間冷却し、次いでホルムアミドを除去した。３％脱脂粉乳を溶かした蒸留水（ｗ／ｖ）によって、プレートを３７℃で１時間ブロックした。ブロッキングを除去し、抗体混合物（ｓｓＤＮＡに対する一次モノクローナル抗体及びＨＲＰ標識抗マウスＩｇＭ）１００μｌをそれぞれのウェルに加えた。マイクロプレートリーダーを用いて、４０５ｎｍでＡＢＴＳによる発色についてプレートをモニターした。
【０１２７】
ｃ．細胞生存度検定
９６ウェルプレートに細胞を播いた。培養７２時間後、１〜６日間３通りで、細胞を異なる濃度（１、５、１０、２５、５０、１００μＭ）の阻害剤で処理し、あるいは処理しなかった。３つの方法、すなわちＡ．メチレンブルーによる生細胞の染色、Ｂ．ＷＳＴ−１試薬を用いた生細胞のミトコンドリア脱水素酵素活性の測定、ｃ．３Ｈ−チミジンの取り込みを用いて細胞生存度を試験した。
【０１２８】
メチレンブルーによる生細胞の染色：細胞を０．５％グルタルジアルデヒドで固定し、続いて１％メチレンブルーを溶かしたホウ酸塩緩衝液（Ｓｉｇｍａ）で１時間染色した。次いで、細胞を蒸留水で数回洗浄し、空気乾燥し、３７℃で１時間、０．１Ｍ  ＨＣｌを加えて色を抽出した。ＥＬＩＳＡリーダーによる６２０ｎｍにおける光学密度の測定によって、発色強度の定量化を行った。
【０１２９】
細胞増殖試薬ＷＳＴ−１：培養中の適切な時間に培地を廃棄し、ＷＳＴ−１試薬（Ｂｏｅｈｅｒｉｎｇｅｒ  ｍａｎｎｈｅｉｍ）を１：１０に希釈した増殖培地１００ｕｌを３７℃で１〜２時間加えた。マイクロプレートＥＬＩＳＡリーダーによって、基準波長６９０ｎｍで４５０ｎｍにおいてホルマザン生成物の吸光度を測定した。
【０１３０】
３Ｈ−チミジンの取り込み：培養中の適切な時間に、３Ｈ−チミジン（５Ｃｉ／ミリモルのストック、Ａｍｅｒｓｈａｍ）１ｕｃｉを、培地１００ｕｌを含むそれぞれのウェルに５時間加えた。培養終了時に、細胞をＰＢＳで数回洗浄し、数時間空気乾燥し、シンチレーション液５０ｕｌを加えた。放射能は、マイクロプレートカウンター、パッカード社製トップカウントを用いてカウントした。
【０１３１】
ｄ．リン酸化の阻害
細胞（２×１０６）を２５ｃｍ２フラスコに播き、通常の培地条件で２日間増殖させ、次いで飢餓条件（ＦＣＳなし）でさらに２４時間増殖させた。この時点で、飢餓条件下において、ＧＳＫ−３及びＰＫＢリン酸化に対する作用を分析するために阻害性化合物を加えた。処理の終了時に、細胞を１０分間１５０ｎｇ／ｍｌ  ＩＧＦ−１で刺激し、溶解緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％トリトン−ｘ１００、２５ｍＭ  ＮａＦ、２ｍＭ  ＡＥＢＳＦ、１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、１０ｍＭβ−グリセロリン酸、１μｇ／ｍｌアプロトニン（ａｐｒｏｔｏｎｉｎ）及び５μｇ／ｍｌロイペプチン）を用いて溶解させた。等量の細胞タンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＰＶＤＦ膜にエレクトロブロットした。Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手したｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ１（Ｓｅｒ４７３）、又は（Ｔｈｒ３０８）及びｐｈｏｓｐｈｏ−ＧＳＫ３α（Ｓｅｒ２１）に対する抗体を用いて、ウェスタンブロット分析を行った。
【０１３２】
代替法では、６ウェルプレートに細胞を播き、異なる濃度の阻害剤で処理した。血清含有培地下又は飢餓下で異なる期間処理を行った。処理後、細胞を１０分間ＩＧＦ−１（ＨＥＫ−２９３及びＰＡＮＣ１細胞）又はＥＧＦ（ＯＶＣＡＲ３及びＵ８９ＭＧ細胞）で刺激する。煮沸した試料緩衝液を用いて細胞可溶化物を調製する。αｐｈｏｓｐｈｏ−ＧＳＫ３を用いたウェスタンブロット分析では、ＧＳＫ３リン酸化の低下が示された。ＨＥＫ−２９３細胞におけるｋｉｎａｓｅ−ｄｅａｄ−ＰＫＢの発現により、ＧＳＫ３リン酸化に対する作用についての試験も行った。
【０１３３】
ＰＫＢ阻害剤の活性を評価するためのｉｎ  ｖｉｖｏモデル
本発明の化合物を、腫瘍増殖及び退縮に対して影響があるかどうか、
１．ヌードマウスの前立腺癌細胞ＰＣ３、ＬＮＣＡＰ及びＤＵ１４５、
２．ヌードマウスの卵巣癌細胞（ＯＶＣＡＲ）、
３．ヌードマウスの膵臓癌細胞（ＰＵＮＣ１）
などの癌性細胞系由来の異種移植片中で試験する。
【０１３４】
簡単に言えば、細胞を動物の皮下に移植し、腫瘍を約０．５ｍｍまで増殖させる。急性毒性試験によって実験的に決定される適切な投与量の化合物を、腫瘍に、その増殖の様々な段階で注入することになる。初期段階での注入では、腫瘍増殖に対する化合物の影響が反映されるはずであり、定着腫瘍への注入では、退縮に対する影響が決定されるはずである。さらに、ＰＫＢ阻害によってアポトーシスが増大することから化学療法に対する腫瘍の感受性が増大することによって生じる相乗効果を評価するために、化合物を既知の化学療法剤と共に腫瘍に注入する相乗作用試験を計画している。
【０１３５】
以下の実施例は例示するためのものに過ぎず、本発明の原理の非限定的な例示であり、かつ下記の特許請求の範囲によって定義される現在特許請求している発明の範囲内で多くの変形形態及び変更形態が可能であることが当業者には理解されよう。
【実施例】
【０１３６】
実施例１．ＰＫＢ阻害についてのＰＫＡ阻害剤のスクリーニング
既知のＰＫＢ阻害剤がないので、ＰＫＢと他のプロテインキナーゼの間の構造類似性を利用して、他のプロテインキナーゼ、例えば、ＰＫＡ及びＰＫＣの市販の阻害剤をＰＫＢ阻害についてスクリーニングした。候補化合物のコンビナトリアルライブラリーの初期設計の助けとなるはずの活性化合物中のいくつかの構造モチーフを定義するために、予備的なスクリーニングを行った。
【０１３７】
ただし、この手段は主要な分子の迅速な同定に非常に有用であるが、同定された分子が他のキナーゼに対しても同様に阻害活性をもつであろうことに留意されたい。すなわち、この手法では、阻害活性の最適化を対象とした研究だけでなく、又、おそらく最も重要なことには、特異性を指向した研究が必須となる。すなわち、ＰＫＢに対する選択性又は特異性のプロフィルを得るために、選択性のプロフィルを改変することに大きな労力が実際に払われている。
【０１３８】
スクリーニングにより、２〜３μＭ範囲でＰＫＢを阻害する２つの化合物が得られた。既知のＰＫＡ阻害剤であるＨ−８９を、その構造並びに合成及び特異性の考慮に基づき、第１のライブラリの設計のための基礎として選択した。
【０１３９】
イスラエル出願第１３６４５８号に記載の合理的な設計及び並行合成法を用いて、Ｈ−８９をさらに最適化した。５−イソキノリン−スルホンアミドエチレンジアミンコアが活性に不可欠であり、スルホンアミド又はカルボキサミド誘導体である任意の他のコアで置換すると活性がなくなると結論付けられた。基質模倣領域Ｃも調べ、この領域は、疎水性基又は複素環基あるいはＰＫＢと結合できるペプチドを含むことができると結論付けられた。これらの発見の概要を以下の実施例に示す。これらの化合物を、本発明によるキメラ化合物のＡＴＰ模倣基の設計の基礎として使用した。
【０１４０】
実施例２．ＡＴＰ及び基質模倣部位を有するキメラ化合物
キメラ分子は、架橋によって連結させたＡＴＰ模倣領域と基質模倣領域を共に含むように設計する。これらのキメラ分子は、同時にプロテインキナーゼの触媒部位と基質部位の両方に結合でき、特異的な効力及び選択特性をもたらす相乗効果を有する可能性がある。これらの化合物は、様々なスペーサーによって基質模倣部分と連結したＡＴＰ模倣分子を含むように設計する。
【０１４１】
これらの化合物は、合成及びそれぞれのライブラリが上記のスキームＩに基づく異なる領域における改変を検討するコンビナトリアルライブラリーのスクリーニングサイクルの後に同定する。
【０１４２】
ＡＴＰ模倣コアは、ダンシル、イソキノリン、キノリン及びナフタレンを含むがそれだけには限らない。スペーサーは、様々な長さ及びアミン、アミド、チオエーテル、オキシエーテル、スルホンアミド結合などを含むがそれだけには限らない任意の適当な化学構造からなる。こうしたスペーサーの非限定的な例には、スルホンアミド誘導体、アミノチオール誘導体及びアミノアルコール誘導体がある。ペプチド基は、ペプチド又はペプチド模倣物質を含む。こうした阻害性ペプチドは、ＰＫＢ基質として働くことができる任意のペプチドに基づいて設計することができる。
【０１４３】
実施例３．キメラ化合物の詳細な合成
ＰＴＲ６０１３
振盪機に取り付けた焼結ガラス底面を備えた反応器中で、４−（４−ホルミル−３−メトキシフェノキシ）ブチリル（ＮｏｖａＧｅｌ  ＨＬ）４００ｍｇをジクロロエタン／オルトギ酸トリメチル（１：１）中で１．５時間膨潤させた。Ｎ−（８−スルホンアミド−５−イソキノリン）エチレンジアミン３５２ｍｇ（９当量）のＤＭＦ溶液１２ｍｌを樹脂に加え、続いてＮａＢＨ（ＯＡｃ）３を加え、終夜振盪し続けた。樹脂をＤＭＦ、続いてＤＣＭで洗浄した。ＢＴＣ（７７ｍｇ、１．６６当量）及び２，４，６−コリジン（２９０μｌ、１４当量）のＴＨＦ溶液を用いて５０℃で２回予備活性化させたＦｍｏｃ−フェニルアラニノール（２９１ｍｇ、５当量）を加えることによって、カルバメート結合の形成を行った。２５％ピペリジンのＮＭＰ溶液（３ｍｌ）を用いて１５分間、２回Ｆｍｏｃを樹脂から除去し、続いてＮＭＰ（５ｍｌ）で７回、それぞれ２分間慎重に洗浄した。Ａｂｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ａｒｇの構築は、それぞれＦｍｏｃ−Ａｂｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ、及びＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨを用いてカップリングサイクルによって実施した。各カップリングサイクルにおいて、アミノ酸（３当量）をＮＭＰに溶解させ、ＰｙＢｒｏＰ（３当量）及びＤＩＥＡ（６当量）で活性化させた。第１のカップリングについて上記で説明したように、カップリングに続いて、ペプチド−樹脂を洗浄し、次いでＦｍｏｃを除去し、続いてＮＭＰで大幅に洗浄した。構築の終了時に、６５％ＴＦＡ、２０％ＤＣＭ、５％チオアニソール、３％ＥＤＴ、２％ＴＩＳ及び５％水の全体積７ｍｌの反応混液を用いて、アルゴン下で０℃で１５分間、次いで室温で２時間、ペプチドを樹脂から切断した。溶液を抽出フィルターを通してポリプロピレン管にろ過し、樹脂を６０％ＴＦＡのＤＣＭ溶液３ｍｌで洗浄し、Ｎ２流によって混合溶液を蒸発させて、冷Ｅｔ２Ｏで処理すると凝固する油性残基を得た。Ｅｔ２Ｏ層の遠心分離及びデカンテーション並びに冷Ｅｔ２Ｏの追加部分による処理とそれに続く遠心分離、デカンテーション及び白色固体の真空下での終夜乾燥によって、ＰＴＲ６０１３と名付ける以下の構造を有する粗製材料が得られた。
【０１４４】
【化２３】
2005501047.tif 000027
【０１４５】
ＰＴＲ６０１４
振盪機に取り付けた焼結ガラス底面を備えた反応器中で、ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂（０．５５ｍＭｏｌ／ｇ）５００ｍｇをＮＭＰ中で２時間膨潤させた。２５％ピペリジンのＮＭＰ溶液（４ｍｌ）を用いて１５分間、２回Ｆｍｏｃを樹脂から除去し、続いてＮＭＰ（５ｍｌ）で７回、それぞれ２分間慎重に洗浄した。Ｐｈｅ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ａｒｇの構築は、それぞれＦｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＡｌｌｙｌ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ、及びＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨを用いてカップリングサイクルによって実施した。各カップリングサイクルにおいて、アミノ酸（３当量）をＮＭＰに溶解させ、ＰｙＢｒｏＰ（３当量）及びＤＩＥＡ（６当量）で活性化させた。構築の終了時に、５％ＡｃＯＨ及び２．５％ＮＭＭを含むＰｄ（ＰＰｈ３）４のＣＨ２Ｃｌ２溶液を用いてアリル脱保護を行った。ＰｙＢｏＰ  ３当量及びＤＩＥＡ  ３．１当量のＮＭＰ溶液によって、２０分間遊離酸を活性化させ、続いてＮＭＰで洗浄した。予備活性化後、小分子（３当量）及びＤＩＥＡ（４．５当量）のＮＭＰ溶液を樹脂に加え、室温で１時間振盪させた。上記の第１のカップリングについて上記で説明したように、カップリングに続いて、ペプチド−樹脂をＮＭＰで洗浄し、次いでＦｍｏｃを除去し、続いてＮＭＰで大幅に洗浄した。合成の終了時に、８５％ＴＦＡ、５％チオアニソール、３％ＥＤＴ、２％ＴＩＳ及び５％水の全体積５ｍｌの反応混液を用いて、アルゴン下で０℃で１５分間、次いで室温で２時間、ペプチドを樹脂から切断した。溶液を抽出フィルターを通してポリプロピレン管にろ過し、樹脂をＴＦＡ  ２ｍｌで洗浄した。Ｎ２流によって混合溶液を蒸発させて、冷Ｅｔ２Ｏで処理すると凝固する油性残基を得た。Ｅｔ２Ｏ層の遠心分離及びデカンテーション並びに冷Ｅｔ２Ｏの追加部分による処理とそれに続く遠心分離、デカンテーション及び白色固体の真空下での終夜乾燥によって、ＰＴＲ６０１４と示した以下の構造を有する粗製材料が得られた。
【０１４６】
【化２４】
2005501047.tif 000028
【０１４７】
ＰＴＲ６０２０
振盪機に取り付けた焼結ガラス底面を備えた反応器中で、ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂（０．５５ｍＭｏｌ／ｇ）５００ｍｇをＮＭＰ中で２時間膨潤させた。２５％ピペリジンのＮＭＰ溶液（４ｍｌ）を用いて１５分間、２回Ｆｍｏｃを樹脂から除去し、続いてＮＭＰ（５ｍｌ）で７回、それぞれ２分間慎重に洗浄した。Ｐｈｅ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ａｒｇの構築は、それぞれＦｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＡｌｌｙｌ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ、及びＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨを用いてカップリングサイクルによって実施した。各カップリングサイクルにおいて、アミノ酸（３当量）をＮＭＰに溶解させ、ＰｙＢｒｏＰ（３当量）及びＤＩＥＡ（６当量）で活性化させた。構築の終了時に、５％ＡｃＯＨ及び２．５％ＮＭＭを含むＰｄ（ＰＰｈ３）４のＣＨ２Ｃｌ２溶液を用いてアリル脱保護を行った。ＰｙＢｏＰ  ３当量及びＤＩＥＡ  ３．１当量のＮＭＰ溶液によって、２０分間遊離酸を活性化させ、続いてＮＭＰで洗浄した。予備活性化後、γ−アミノ酪酸アリル（５当量）及びＤＩＥＡ（６当量）のＮＭＰ溶液を加え、室温で１時間振盪させた。上記と同じ手順によって、アリル脱保護及び予備活性化を行った。小分子（３当量）及びＤＩＥＡ（４．５当量）のＮＭＰ溶液を予備活性化ペプチド−樹脂に加え、室温で１時間振盪させた。第１のカップリングについて上記で説明したように、カップリングに続いて、ペプチド−樹脂をＮＭＰで洗浄し、次いでＦｍｏｃを除去し、続いてＮＭＰで大幅に洗浄した。合成の終了時に、８５％ＴＦＡ、５％チオアニソール、３％ＥＤＴ、２％ＴＩＳ及び５％水の合計５ｍｌの反応混液を用いて、アルゴン下で０℃で１５分間、次いで室温で２時間、ペプチドを樹脂から切断した。溶液を抽出フィルターを通してポリプロピレン管にろ過し、樹脂をＴＦＡ  ２ｍｌで洗浄し、Ｎ２流によって混合溶液を蒸発させて、冷Ｅｔ２Ｏで処理すると凝固する油性残基を得た。Ｅｔ２Ｏ層の遠心分離及びデカンテーション並びに冷Ｅｔ２Ｏの追加部分による処理とそれに続く遠心分離、デカンテーション及び白色固体の真空下での終夜乾燥によって、ＰＴＲ６０２０と示した以下の構造を有する粗製材料が得られた。
【０１４８】
【化２５】
2005501047.tif 000029
【０１４９】
実施例４．キメラ化合物の生体活性
４個のキメラ化合物を、ＰＫＢ阻害活性についてスクリーニングした。表２は、それらの構造及び阻害活性を示している。Ｂ−１１−１と示される化合物と同様に、これらの化合物はＰＫＡに特異的ではない。
【０１５０】
【表２】
2005501047.tif 000030
【０１５１】
ＰＴＲ６０１３、６０１４、及び６０２０の構造を実施例１１に示す。ＰＴＲ６０１６の構造は以下の通りである。
【０１５２】
【化２６】
2005501047.tif 000031
【０１５３】
図１は、ＰＫＢを阻害しないＡＴＰ模倣部分と、活性が４μＭのペプチド基質部分を結合させると、活性が０．９μＭ活性のキメラ化合物ＰＴＲ６０１６が得られるという相乗効果を示している。
【０１５４】
実施例５．追加のキメラ化合物
ペプチドと小分子（式ＩＩのＷ）を連結している多様なリンカー（式ＩＩのＬ）を含む、プレート６０００２、６０００３由来の活性なペプチドの９６個のキメラ化合物の多重並行合成を行った。これらのペプチドは、ペプチド及びＡＴＰ模倣物質の両方を、それらの基質及びＡＴＰ結合部位に同時にはまり込むことができるようにして、活性及び特異性の改善を可能にする、適切なリンカーを解明するために設計した。
【０１５５】
合成した化合物は、上記で指定した式ＩＩａ〜ＩＩｄに記載されている。
【０１５６】
実施例６．ペプチド
追加のペプチドは、キメラの基質ドメインで使用するため、又ペプチド模倣物質を設計するために設計する。直鎖状７量体ペプチドの２つのプレートを合成し精製した。第１のプレート（６００２）由来の４個のペプチドは、ＰＫＢに対するＩＣ５０が４〜５μＭで活性であることが判明した（参考文献の７量体基質のＩＣ５０は１５μＭである）。これらすべてのペプチドは、６０μＭにおいてＰＫＡ活性を阻害しない。第２のプレート（６００３）から約２４個の活性ペプチドを同定し、６０％より高い阻害を示すペプチドを再度試験すると、ＰＫＢに対して０．５〜１０μＭの活性を示した。ＰＫＡに対する特異性はまだ試験していない。マクロビーズライブラリ由来の追加の１１５２個のペプチドをスクリーニングし、１５０個が１０μＭにおいて５０％より高い阻害を示した。次いで、３つの多重並行合成プレートを平らにし合成した。選択した結果を以下の表に示す。
【０１５７】
【表３】
2005501047.tif 000032
【０１５８】
ＥＬＩＳＡで決定したペプチドＡＲ−６０００３−５２のＰＫＢ阻害活性を図２に示す。
【０１５９】
実施例７．活性ペプチドに基づくペプチド模倣化合物
ペプチド結合を置換するカルバメート及び／又は尿素結合を含む以下のペプチド模倣化合物を合成した。
2005501047.tif 000033
【０１６０】
実施例８．尿素結合を含む７量体ＰＴＲ６０４６の詳細な合成
振盪機に取り付けた焼結ガラス底面を備えた反応器中で、Ｒｉｎｋアミド樹脂１００ｍｇ（０．０５５μｍｏｌ）をＮＭＰ中で１．５時間膨潤させた。２５％ピペリジンのＮＭＰ溶液（３ｍｌ）を用いて１５分間、２回Ｆｍｏｃを樹脂から除去し、続いてＮＭＰ（２ｍｌ）で７回慎重に洗浄した。Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌの構築は、それぞれＦｍｏｃ−Ｈｏｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨを用いてカップリングサイクルによって実施した。各カップリングサイクルにおいて、アミノ酸（３当量）をＮＭＰに溶解させ、ＰｙＢｒｏＰ（３当量）及びＤＩＥＡ（６当量）で活性化させた。カップリングに続いて、ペプチド−樹脂を洗浄し、次いでＦｍｏｃを除去し、続いてＮＭＰで大幅に洗浄した。
【０１６１】
尿素結合の形成：
【化２７】
2005501047.tif 000034
Ｎ−フルオレニルメトキシカルボニル−Ｎ’−ニトロフェノキシカルボニル−ジアミノエタン５０ｍｇ（２当量）、ＤＩＥＡ  ２５μｌ（２．５当量）を溶かしたＮＭＰ  ２ｍｌを樹脂に加え、１．５時間振盪し続けた。樹脂をＮＭＰ（５回、それぞれ２分間）で洗浄した。尿素結合を形成した後、上記のようにＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨのカップリングを行い、続いてＦｍｏｃ脱保護を行った。構築の終了時に、９２．５％ＴＦＡ、２．５％ＥＤＴ、２．５％ＴＩＳ及び２．５％水の全体積５ｍｌの反応混液を用いてペプチドを樹脂から切断し、１時間振盪し続けた。溶液を抽出フィルターを通してポリプロピレン管にろ過し、樹脂をＴＦＡ  ２ｍｌで洗浄し、Ｎ２流によって混合溶液を蒸発させて、冷Ｅｔ２Ｏで処理すると凝固する油性残基を得た。Ｅｔ２Ｏ層の遠心分離及びデカンテーション並びに冷Ｅｔ２Ｏの追加部分による処理とそれに続く遠心分離及びデカンテーション及び白色固体の真空下での終夜乾燥によって、以下の構造を有する粗製ＰＴＲ６０４６が得られた。
Ｈ−Ａｒｇ−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＣＯ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｄａｐ−Ｈｏｌ−ＮＨ２
【０１６２】
実施例９．ＭＰＳフォーマットにおける９６個のキメラ化合物の合成及びスクリーニング
上記の合成法に基づき以下の配列（ＴＹ−６００２０−と表し表４に示す）をＭＰＳフォーマットで合成した。
【０１６３】
【表４】
2005501047.tif 000035
2005501047.tif 000036
2005501047.tif 000037
2005501047.tif 000038
2005501047.tif 000039
【０１６４】
ＰＫＢ及びＰＫＡ活性阻害（キナーゼ活性の阻害％）について、化合物濃度１μＭ（上記の方法に基づき）で９６個の化合物をスクリーニングし、その結果を表５にまとめて示す。
【０１６５】
【表５】
2005501047.tif 000040
2005501047.tif 000041
【０１６６】
【表６】
2005501047.tif 000042
【０１６７】
実施例１０．１９個のキメラ化合物の合成
アミノ酸側鎖ではなくＮ−誘導体化アミノ酸に連結させることによって、互いに関連するペプチド及び小分子の空間的位置を調整するために取り込んだ位置５のアミノ酸のＮα−ω−官能化誘導体を含む、追加の１９個の化合物を合成した（ＢＰ−６００２３−と表す）。この配列を表７に示す。
【０１６８】
【表７】
2005501047.tif 000043
【０１６９】
実施例１１．キメラＰＴＲの構造及び活性
【０１７０】
【表８】
2005501047.tif 000044
【０１７１】
実施例１２．基質模倣阻害剤として働く選択したペプチド及びペプチド模倣化合物
いくつかのペプチド及びペプチド模倣化合物プレートを、ＰＫＢ及びＰＫＡ阻害についてスクリーニングした。（これらの結果は、小分子との結合を含まない、ペプチド基だけに関するものである。）選択した結果を表９に示す。
【０１７２】
【表９】
2005501047.tif 000045
【０１７３】
上記のスクリーニングから最も有望なペプチドを、正確なＩＣ５０曲線を得るために検定した。さらに、スクリーニング結果に基づきいくつかのＰＴＲ化合物を設計し、同様に検定した。ＩＣ５０評価の結果を表１０にまとめた。
【０１７４】
【表１０】
2005501047.tif 000046
【０１７５】
図３は、６００１８−１６と名付ける活性で選択的なペプチドのＰＫＢ及びＰＫＡ阻害曲線（ＩＣ５０）を示す。
【０１７６】
最も優れたペプチドＰＴＲ６１５８に基づき、表１１に示した疎水性基を含むいくつかの類似体を合成した。さらに、表１１のペプチド配列を含む、ＢＰ６００２３  ２０〜２４と表される５個の化合物を合成した。これらは、細胞透過性の改善を目的とした、疎水性基をもつペプチドである。
【０１７７】
ペプチド単独では、１ｕＭ程度の活性を示し、選択性ＰＫＢ／ＰＫＡが１００倍であった。ペプチド単独では、基質部位に結合する。ＡＴＰ基と結合している場合、ＡＴＰがまず結合し、ペプチドは転位し、したがって親和性はより高く、選択性はより低くなる。活性に対する相乗効果。ＡＴＰ基は、ＰＫＡ／ＰＫＢ部位を区別せず、したがってＡＴＰドメインは選択的ではない。
【０１７８】
【表１１】
2005501047.tif 000047
【０１７９】
実施例１３．前立腺癌細胞におけるアポトーシスの誘導
アポトーシス細胞のＤＮＡは、ネクローシス細胞とは対照的に、ホルムアミドによる変性に対して感受性がある。この感受性は、アポトーシス細胞染色質の変化が原因である。一本鎖ＤＮＡに対するモノクローナル抗体で特異的な変性が検出された。ｓｓＤＮＡアポトーシスＥＬＩＳＡキット（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ．）を用いて、既知のアポトーシス剤（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）のＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド）と比較して、ＰＣ−３細胞でアポトーシスを誘導する潜在能力があるかどうかキメラ化合物を分析した。処理した細胞及び未処理の細胞の光学密度を割り算することによって計算したアポトーシス指数の値で結果を示した。
【０１８０】
【表１２】
2005501047.tif 000048
【図面の簡単な説明】
【０１８１】
【図１】ＡＴＰ模倣物質とペプチド基質から構成されるキメラ化合物ＰＴＲ６０１６の相乗効果を示す図である。
【図２】実施例６に記載したＡＲ−６０００３−５２の阻害活性曲線を示すグラフである。
【図３】６００１８−１６と名付ける活性で選択的なペプチドのＰＫＢ及びＰＫＡ阻害曲線（ＩＣ５０）を記載したグラフである。
【図１】
2005501047.tif 000059
【図２】
2005501047.tif 000060
【図３】
2005501047.tif 000061
【国際公開パンフレット】
2005501047.tif 000062
2005501047.tif 000063
2005501047.tif 000064
2005501047.tif 000065
2005501047.tif 000066
2005501047.tif 000067
2005501047.tif 000068
2005501047.tif 000069
2005501047.tif 000070
2005501047.tif 000071
2005501047.tif 000072
2005501047.tif 000073
2005501047.tif 000074
2005501047.tif 000075
2005501047.tif 000076
2005501047.tif 000077
2005501047.tif 000078
2005501047.tif 000079
2005501047.tif 000080
2005501047.tif 000081
2005501047.tif 000082
2005501047.tif 000083
2005501047.tif 000084
2005501047.tif 000085
2005501047.tif 000086
2005501047.tif 000087
2005501047.tif 000088
2005501047.tif 000089
2005501047.tif 000090
2005501047.tif 000091
2005501047.tif 000092
2005501047.tif 000093
2005501047.tif 000094
2005501047.tif 000095
2005501047.tif 000096
2005501047.tif 000097
2005501047.tif 000098
2005501047.tif 000099
2005501047.tif 000100
2005501047.tif 000101
2005501047.tif 000102
2005501047.tif 000103
2005501047.tif 000104
2005501047.tif 000105
2005501047.tif 000106
2005501047.tif 000107
2005501047.tif 000108
2005501047.tif 000109
2005501047.tif 000110
2005501047.tif 000111
2005501047.tif 000112
2005501047.tif 000113
2005501047.tif 000114
2005501047.tif 000115
2005501047.tif 000116
2005501047.tif 000117
2005501047.tif 000118
2005501047.tif 000119
2005501047.tif 000120
2005501047.tif 000121
2005501047.tif 000122
2005501047.tif 000123
2005501047.tif 000124
2005501047.tif 000125
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005501047.tif 000126
【国際調査報告】
2005501047.tif 000127
2005501047.tif 000128
2005501047.tif 000129