(57)【要約】本発明は、生物学的膜を通した物質の輸送に使用するための粒子であって、前記粒子が、少なくとも1つの磁気的に誘導可能な材料と、前記生物学的膜に少なくとも1つの結合部位をもつ少なくとも1つの2官能性分子とを含むことを特徴とする粒子に関する。さらに本発明は、同一の粒子の生産とその適用に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的膜を通した物質の輸送に使用する粒子であって、前記粒子が、少なくとも1つの磁気的に誘導可能な材料と、前記物質のための少なくとも1つの結合部と前記生物学的膜のための少なくとも1つの結合部とを備えた少なくとも1つの2官能性分子とを含むことを特徴とする粒子。
【請求項２】
前記磁気的に誘導可能な材料が、酸化鉄、酸化水酸化鉄、ガンマFe203、Fe304、金属イオン（例えばCo、Ni、Mn、Be、Mg、Ca、Ba、Sr、Cu、Zn、Pt、Al、Cr、Bi、希土類金属またはこれらの混合物）を含む酸化鉄を含むことを特徴とする請求項1に記載の粒子。
【請求項３】
前記2官能性分子が、コンカナバリンAのようなレクチン、トランスフェリン、アビジン、セレクチン、DNA、RNA、抗生物質、ホルモン、高分子電解質、抗体、抗原、合成ペプチド、ペプチド、ウイルスタンパク質、ポリリシン、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、リガーゼ、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガー物質、リプレッサーまたはプロモーターであることを特徴とする請求項1または2に記載の粒子。
【請求項４】
前記2官能性分子が、次のユニット：コンカナバリンAのようなレクチン、トランスフェリン、アビジン、セレクチン、DNA、RNA、抗生物質、ホルモン、高分子電解質、抗体、抗原、合成ペプチド、ペプチド、ウイルスタンパク質、ポリリシン、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、リガーゼ、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガー物質、リプレッサー、またはプロモーター、の少なくとも2つの間での組換え型融合タンパク質または融合分子であることを特徴とする請求項1ないし3のいずれか1項に記載の粒子。
【請求項５】
前記粒子が、約1nm〜約10μmの範囲の平均直径をもつ粒子であることを特徴とする請求項1ないし4のいずれか1項に記載の粒子。
【請求項６】
前記粒子が、指示薬、例えば着色剤、蛍光物質、放射活性物質、化学発光物質または酵素を含むことを特徴とする請求項1ないし5のいずれか1項に記載の粒子。
【請求項７】
前記粒子が、例えばリン脂質および／またはコレステロールでできた2層膜成分を含むことを特徴とする請求項1ないし6のいずれか1項に記載の粒子。
【請求項８】
生物学的膜を通して物質を輸送する方法であって、請求項1ないし7のいずれか1項に記載の粒子を膜封入構造物と混合し、約1分〜約3時間にわたってインキュベートした後、形成された粒子膜複合体を交番磁場にさらす方法。
【請求項９】
交番磁場の周波数が、磁場強度が約1〜約100エルステッドの範囲にあり、かつ約10Hz〜約100MHzの範囲内にある請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
DNA、RNA、PNA、タンパク質またはこれらの部分、ペプチド、ウイルス、ポリマー、薬学的調製物およびステロイドのような物質の膜輸送のための、請求項1ないし7のいずれか1項に記載の粒子の使用。
【請求項１１】
生化学的操作、トランスフェクション、トランスフォーメーション、遺伝子輸送、遺伝子発現制御、細胞分化制御、タンパク質発現制御、タンパク質合成、インビボタンパク質活性測定、ウイルス／原生動物／カビ／細菌および／またはこれらの細胞小器官／バクテリオファージ／植物細胞および／またはその細胞小器官／哺乳類細胞／初代細胞／幹細胞の遺伝子修飾のための、請求項1ないし7のいずれか1項に記載の粒子の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、生物学的膜を通した物質の輸送を目的とした磁気的に誘導可能な材料を含む粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物学的細胞は、それがヒトの細胞であろうと細菌あるいは他の種類の細胞であろうと、細胞膜によって囲まれている。この膜は多くの場合リン脂質の二重層で作られている。脂質のより疎水性の部分が膜の内側を形成する一方、親水性の部分が細胞の内部と周囲環境に向けて配置されている。さらに、細胞膜は多くの異なるタンパク質を含む。細胞膜中の異なる種類のタンパク質は、細胞の生活環にとって重要な異なる実際的な役割を果たしている。幾つかのタンパク質は、異なる種類のイオン物質および小さな代謝物質のための輸送チャネルとして役立つ。他のタンパク質（受容体）は、外界からの異なる生物学的シグナルを細胞に登録させる性質を膜に与える。膜は周囲環境から細胞を保護し、細胞内外への分子の流れの選択的調節を行う。
【０００３】
特定のレシピエント細胞に、通常は細胞によって許容されない分子を強制的に受容させるために、研究者は様々な方法を使用している。あまり大きくない分子は、修飾し覆い隠すことで細胞によって自動的に許容される分子に似せることができる。より大きな分子、例えばタンパク質やDNA分子については、細胞膜を開く物理学的方法かまたはウイルス粒子が使用される。ウイルスは比較的大きなDNA分子を運ぶことができる。ウイルスは特定の種類の細胞を認識し、ウイルスが運ぶDNA分子を細胞膜を通して導入することができる。ウイルス自体は研究員にとって潜在的危険性があるので、DNAを導入するウイルスの能力を模倣しようとして、新規なウイルス様の粒子がリポソームで作られてきた。さらに、現存するウイルスは、実験室環境内での取扱いの危険を低減するように改変されている。細胞の物理学的処理、例えば電気的ショック、熱ショックまたは遺伝子弾または遺伝子砲の使用は、一時的に細胞膜を破壊または広げ、膜は、より大きな分子の流入のために一時的に開くであろう。物理学的方法は特異的ではなく、サンプル中の全ての細胞を対象とする。また、このような方法は大量の細胞を殺してしまうのが一般的である。1つの細胞に高い精度でDNAまたはタンパク質材料を導入するために、顕微鏡下でのマイクロインジェクション法があるが、一度にたった1つの細胞を処理することができるにすぎない。DNAの細胞への導入のための新しい技術の開発は、我々の遺伝子についての知識が増えつつあるここ10年の間に加速した。あまり分裂しないかまたは全く分裂しない、いわゆる幹細胞およびその他の細胞株の開発は、DNA分子が核まで到達するように細胞膜のみならず核膜を通してDNAを導入することができる方法の必要性を増加させた。
【０００４】
細胞膜に影響を与える方法は以前から存在する。Fredriksson S.およびKriz D.W001/18168「生物学的材料へ細孔を導入するための装置」を参照されたい。マグネットポレーションと呼ばれるこの方法は強磁性の粒子を使用する。これらの粒子は、1〜100nmの直径をもつ。これらの表面の修飾によって、粒子は細胞膜に結合することができるようになる。その後、細胞と粒子との複合体を交番磁場にさらす。すると、強磁性の粒子は熱を放射し、わずかに振動する。粒子近傍の細胞膜はより透過的になり、DNAのような分子は膜を通して拡散することができる。また、粒子全体が膜を貫通することができる。
【０００５】
本発明は、1以上の膜を通してある分子を輸送する粒子（前記粒子自体は必ずしも膜を通して輸送されない）として上述の強磁性の粒子について記述する。
【０００６】
10ナノメートルから数マイクロメートルまでの大きさであって、修飾された表面をもつ磁気的に誘導可能な粒子は、様々な目的、例えばMRI(核磁気共鳴映像法)のための造影剤、RNA(リボ核酸)およびDNA(デオキシリボ核酸)の調製、固相上でのcDNAライブラリの合成、タンパク質精製、免疫学的分析における担体、免疫学的分析におけるマーカー、イオン交換およびアフィニティークロマトグラフィー、ならびに細胞、ウイルスおよび細胞小器官の精製または分取のために商業的に利用することができる。
【０００７】
商業的に利用可能な磁気的に誘導可能な粒子は、ほとんどの場合フェライト/磁鉄鉱(すなわち、磁気特性をもつ特定の種類の酸化鉄)である。その比透磁率は非常に高い。粒子は、酸化鉄および／または酸化水酸化鉄、および時には1以上の金属およびその酸化物を含む。これらの常磁性体の核はそれ自体は永久磁石ではないが、これらの粒子の核にある磁区が磁場にさらされると、それらは磁場の方向に合わせて調節しようとする。磁場の影響が減少するとともに、磁区はその方向性を除々に失う。常磁性の粒子が1MHz程度の周波数で方向性を変える磁場にさらされると、磁場の方向の各変化ごとに、粒子は、磁区が方向を変える前の磁場の方向とは逆方向の初期反作用力をもたらす。上記に概略的に説明したこの現象は、強磁性材料についてのヒステリシス曲線に由来し、粒子からの熱発生の形態で認知されるエネルギーの喪失を生じる。
【０００８】
各核は、1つの磁区からなるかまたは凝集して幾分大きな複合体を形成した多数の磁区からなる。商業的に利用可能な粒子の核の大半は、2以上の磁区からなる。粒子の核の大きさによって、磁場をかけて(多くの場合は単純な永久磁石で)磁性粒子を異成分からなる混合物から迅速かつ容易に分けることができるかどうかが決定される。多数の他の成分からの特定の成分の精製または分取を伴う磁性粒子の全ての用途に関して、これは非常に実用的であり、これらの粒子は多くの場合200nmを越える直径をもつ。しかしながら、本発明による粒子については、粒子を水系懸濁液中に分取したときに、粒子が非常に小さく重力によって沈降せず、隣接した粒子と凝集せず、より大きい複合体を形成しないことが重要である。また、本発明による粒子が、ある種類の感染を標的細胞内で引き起こすことなく取り扱うことができることが最も重要である。従って、粒子は、100〜200nmの大きさをもつ無菌フィルタを通過することが困難であってはならない。本発明による粒子は、安定な強磁性流体（Massart et al 米国特許4,329,241を参照）、すなわち強磁性粒子の安定なコロイド状の懸濁液を形成する。これは、前記粒子が懸濁液中に留まることを意味し、かつ、これらが拡散によって細胞懸濁液中を動き回ってこれらの標的を見つけ出すことができることを意味する。
【０００９】
商業的に利用可能な粒子の核を、ポリマー、例えばデキストランもしくはタンパク質で包み込むかもしくはこれと混合する、または両親媒性分子、例えば脂肪酸またはその誘導体の外側単層もしくは二重層によって包み込むことがよくある。この外側エンベロープは、これがなければ起こるであろう隣接した核の凝集を阻止する。外側エンベロープはまた、粒子の広がり(extension)を促進し、かつ、他の分子（例えば受容体、レクチン、酵素、および抗体）を、磁気的に誘導可能な粒子の表面と化学的に結合させ、これによって選択的な結合性質を得るために使用されてきた。この結合性質は粒子を標的対象物に結合させる。粒子が凝集しないということが本発明による粒子にとって大変重要である。なぜなら、粒子が懸濁液中で安定性を保って沈降しないように、また無菌フィルタが望まれる場合において無菌フィルタに対してシンプル(simple)であるために、各粒子の大きさが約1〜約200nm程度になければならないからである。従って、凝集を阻止する外側エンベロープが必要である。同時に、粒子の核から放出された熱が周囲に届くことが重要である。本発明では、ポリマーによって混合または封入されず、かつ両親媒性分子の単層または二重層でも被覆されず、水ベースの系において生成された核で作られた粒子によってこの矛盾を解決した（Massart et al 米国特許4,329,241を参照）。いかなる種類の分子が前記粒子と結合して、そこに粒子の選択的結合部およびエフェクター搬送部を構成するかということに依存しながら、前記核は2つの異なる方法で安定化される（下記を参照）。前記核は、ファンデルワールス力を介して直接的に金属酸化物／水酸化物の核と結合した前記分子によって安定化されるか、あるいは、有機シラン化分子、コハク酸およびその誘導体、またはアミノ酸によって例示されるより小さな分子によって安定化される。従って、選択的結合部およびエフェクター搬送分子は、このより小さな分子と共有結合する。
【００１０】
本発明に記載された粒子に求められるさらなる必要条件は、該粒子が、ある分子をその標的対象物へと運ぶことができるということである。この分子は基本的にはどんな分子でもよいが、DNA、RNAおよびタンパク質、および本明細書中でエフェクター分子と呼ばれるものによって例示される。このエフェクター分子（図1AのユニットIII）は、前記粒子の核上にある選択的結合分子(図1AのユニットII)の近くに位置しなければならない。その結果、前記の選択的結合分子と前記のエフェクター搬送分子とは、両方の性質を示す全く同一の分子であるか、または2つのユニットが化学的に一緒に結合するかもしくは遺伝子融合によって1つの分子になっていなければならない。この狙いは、図1Bにあるように、膜上にある選択的分子が結合する場所（図1BのユニットIV）に近接して前記エフェクター分子を配置させることにある。膜上のこの場所は、膜が次々に交番磁場にさらされるときに、膜が粒子からの熱と振動に応答するであろう唯一与えられた場所である。次いで、膜中に形成される一時的な細孔と、熱の発生による局所的拡散の増加によって、たとえ粒子の全体が膜を通して入らなくても、前記エフェクター分子は膜を通して拡散される。この効果は、膜を通して粒子の全体を導入したくないとき、例えば、必要以上に生存細胞または核を障害しないために重要である。この構成は、以前に開示されている常磁性粒子と比較して、当該粒子をさらに独特なものにする。米国特許4,329,241、米国特許5,928,958、米国特許6,150,181、PCT/EP00/09004、PCT/US01/03738およびPCT/US97/12657を参照されたい。エフェクター分子を粒子と結合させる方法を選択し、かつ周波数、磁場の強さ、パルスの長さ、およびパルスの数を交番磁場から選択することによって、粒子全体を伴ったあるいはこれを伴わない膜を通した輸送を制御することができる。親和性結合によって例示されるより強い力での結合は、膜を通した粒子全体の輸送をより一層導き、一方、静電結合またはファンデルワールス結合は、エフェクター分子のみが膜を通して輸送されるように膜輸送を制御する可能性を増加させる。
【００１１】
有機分子（多くの異なる分子がこの有機分子に結合することができる）によって封入された酸化鉄の核からなる3〜1000nmの大きさの超常磁性粒子を、様々な目的に適うように生成できる方法は既に知られている（米国特許5,928,958）。また、米国特許5,928,958は、このタイプの粒子を腫瘍破壊剤として使用して、粒子表面と結合した分子についての免疫応答を増加させ、永久磁石または電磁場によって特定の薬理物質を標的器官に導く方法を開示すると共に、融合細胞を精製し、粒子に結合した遺伝子材料を有する細胞を、インビトロでの診断用の造影剤として、および磁性担体または吸着体として精製するためにも使用できることを開示する。用途とは無関係に、およびどのくらいの数の分子がこの粒子の表面と結合しているかとは無関係に、これらの分子がお互いに関してどのように配向されるかについては記載がない。この配向性は本発明による粒子を独特なものにする。さらに、米国特許5,928,958は、交番磁場における膜輸送のために使用される粒子を設計する方法についての記載がない。
【００１２】
さらに、前記磁性粒子で分子または細胞を標識するように設計された、二段階でアネキシンに結合されるコハク酸誘導体で被覆したナノサイズの粒子が既に記載されている。本発明においては、粒子の表面上の特別な相対的位置に少なくとも2つの特有の性質をもつ粒子について記載している。Bahr et al, PCT/EP00/09004は、生物学的適合基体によって包まれた酸化鉄の核で作られた粒子を開示する。本発明による粒子は、その特定の用途のために核の外側に分子の最小の層をもち、従って、Bahr et alによる粒子とは著しく異なる。
【００１３】
ナノサイズの粒子を使用して、交番電磁場における加熱によって腫瘍細胞を殺すことができる温熱療法と呼ばれる方法が既に知られている。この目的のために、特定の標的細胞のための安定化エンベロープおよび認識分子で粒子を修飾する。細胞と粒子の複合体は、攻撃された標的細胞の熱が非常に高くなり、細胞が死んでしまうまで交番磁場の中に置かれる。この出願は、熱を使って細胞を完全にノックアウトしてしまうことを目的としている。本発明では、全体的な温度上昇で細胞全体に影響することなく、まったく異なる目的(すなわち膜輸送)のために磁気的に誘導可能な核からの熱を利用できる粒子が記載されている。
【００１４】
エフェクター分子の標的が細胞内部の細胞小器官である場合、2以上の膜を通過する必要がある。上記した粒子の変形は、リポソームを形成する脂質エンベロープによって覆われている。第1の工程において、この磁性リポソームは細胞膜と融合することができる。次の工程において、細胞内部に移行したリポソーム外被を伴わない粒子は、核膜に例示されるような標的膜を見つけ出すことができる。その後、細胞は1度または繰り返し交番磁場にさらされる。この粒子の設計は、分裂しない生存細胞内の核内にDNAを導入するときに特に重要である。
【００１５】
生物学的材料の標的特異的処理のための磁性リポソームは、特許文献PCT/EP00/09004に記載されている。これらのリポソームの磁性部分は、磁場によってリポソームを正しい標的対象物に導くために使用される。活性磁性粒子を外側細胞膜を通して輸送する。その後、磁性粒子が1以上の膜輸送のために使用される。細胞分取の際に細胞を特異的に標識化するための磁気蛍光リポソームがPCT/US97/12657に記載されているが、本発明との関連性はない。 
【発明の概要】
【００１６】
本発明は、物質の磁場誘導膜輸送に適した粒子に関する。前記粒子は、一方では磁気的に誘導可能な成分を含み、もう一方では膜結合成分を含む。前記膜結合成分は、物質結合成分を同時に構成する。好ましくは、前記粒子の直径は約1nmより大きく、約1μmより小さい。
【００１７】
前記粒子の1つの実施形態では、前記磁気的に誘導可能な成分は、少なくとも1つの金属またはその誘導体、例えば酸化物を含む。
【００１８】
前記粒子の他の実施形態では、前記粒子の膜輸送効果は、約10Hz〜約100MHzの範囲の振動周波数と約1〜約1000エルステッドの範囲の磁場強度とをもつ交番磁場を印加することによって誘導することができる。
【００１９】
前記粒子のさらに他の実施形態では、それは指標材料および／またはリポソーム構造を形成する二重層膜成分を含む。
【００２０】
本発明による粒子は、実験室での分析、調製および調査における生化学的取組みのために使用することができる。最初に粒子の懸濁液を膜封入構造剤と混合し、形成された粒子膜複合体が交番磁場にさらされる約3時間前までに約1分間インキュベートする方法によって、粒子の効果をさらに強化することができる。
【発明の詳細な説明】
【００２１】
本発明による粒子は、2つの成分によって特徴づけられる。1つは、磁気的に誘導可能な核であり、もう一方は、2つの性質をもつ分子であって、全く同一の分子（すなわち2官能性分子）である。前記分子が規定するその性質は、特に標的対象物を認識しこれと結合する能力と、エフェクター分子を引きつけて、このエフェクター分子を本発明による粒子と一緒に輸送する能力である。
【００２２】
磁気的に誘導可能な核は、酸化鉄または酸化水酸化鉄またはこれらの混合物からなり得、他の材料、例えばCo、Ni、Mn、Be、Mg、Ca、Ba、Sr、Cu、Zn、Pt、Al、Cr、Bi、希土類金属またはこれらの混合物の酸化物を含んでもよい。核は、約1〜約100ナノメートルの大きさをもち、粒子全体では約1ナノメートル〜約1マイクロメートルの直径をもつ。
【００２３】
2官能性分子は、標的対象物に対する本来的かつ強力な親和力をもつ、タンパク質、ペプチド、ホルモン、有機分子、DNAまたはRNA分子であることができる。この2官能性分子は、レクチンおよび細胞膜のタンパク質上の炭水化物に対するその親和力、または抗体および特定の抗原に対するその親和力によって例示することができる。これらのタンパク質分子は、多くの場合静電結合によって分子を結合できる十分な電荷、またはファンデルワールス相互作用によって他の分子と結合できる疎水性部分を含む。一般に、既知の分子のこの能力は知られておらず、多くの場合文献中に記載がない。我々は、例えばレクチンであるコンカナバリンAおよびウサギIgG分子がプラスミドDNAと結合し、磁気的に誘導可能な分子が結合する炭水化物含有細胞膜へと、プラスミドDNAを十分に輸送することができることを発見した（以下の例IVを参照）。2価の官能基が1つの分子内で利用できない場合は、少なくとも2つの異なる分子またはその部分の間を共有結合または遺伝子融合によって結合することによってこれを提供することができる。レクチンと融合したテトラリシンペプチドは、レクチンにDNA会合部を与える（以下の例IIIを参照）
本発明による粒子を膜輸送に適用するためには、粒子の進路とその細胞内または外での位置を追跡および実証できることが重要である。粒子の1つの実施形態においては、標識（例えば着色剤、蛍光物質、放射性物質、化学発光物質、または酵素）が、磁気的に誘導可能な粒子に結合している。以下の例IIでは、種々の粒子と大腸菌の外側細胞膜に結合するその能力を実証するためにルシフェラーゼ酵素がどのように使用されるかについて説明する。
【００２４】
粒子の他の設計では、粒子をリン脂質層によって覆い、磁気的に誘導可能な核とこれに結合した2官能性分子の周囲にリポソームを形成させる。この方法では、生存細胞内の細胞小器官に粒子を到達させることができ、核膜、ミトコンドリア膜または葉緑体膜によって例示される細胞小器官の膜を通してエフェクター分子を輸送することができる。
【００２５】
粒子の生成および膜輸送における粒子の適用の例は、以下の限定のない例によって詳細に例示される。
【００２６】
例I. 表面上の2官能性分子としてConAをもつ粒子についての製造プロセス
凝集した酸化鉄の核の水ベースのスラリーを、Massart,米国特許4,329,241によって記載された方法によって調製した。その後、スラリーを希釈水で処理し、超音波処理中にHCL(清浄溶液)でpH3.0に調節した。スラリーを遠心処理した後(500g、10分間)、過剰溶液を排出した。ペレットを清浄溶液中で再懸濁および超音波処理、続いて遠心処理を、粒子が沈降しなくなるまで繰り返した。その後、粒子の懸濁液が、22,000gで少なくとも1時間の遠心処理中に沈殿を生じずに安定化するまで、遠心工程のg数を工程毎に徐々に増加させた。粒子を無菌ろ過した。懸濁液（1%、10mg/ml）は、μr＝1.9の透磁率を示した。鉄含量を原子吸光によって49%と測定した。この懸濁液をFFlと呼ぶ。0.1ml FFlを清浄溶液中で10倍希釈した。清浄溶液中の75μg/mlのコンカナバリンAの溶液を、脱塩カラム(Pharmacia)を通してろ過した。その後、0.5ml希釈FFlと0.5mlコンカナバリンA溶液とを試験管の中で混合し、ロッキングテーブル上において室温で30分間インキュベートした。250μg/mlのウシ血清アルブミン溶液1ml(上記コンカナバリンAのように処理)をサンプルに添加し、粒子表面全体をタンパク質で被覆し、これを室温で30分間インキュベートした。
【００２７】
0.5Mの最終濃度になるまでNaClをサンプルに添加し、粒子がタンパク質で完全に被覆されたことを確実にし、酸化鉄粒子とタンパク質分子との間でファンデルワールス相互作用を強制的に作用させた。最終サンプルをPMS緩衝液中でゲルろ過し、過剰なBSA分子を除去し、緩衝液を交換した。最後に、強磁性流体を無菌ろ過した(0.2μm)。
【００２８】
例II−ルシフェラーゼで標識化することによる粒子の可視化
上述したように粒子を生成するが、本ケースでは、コンカナバリンA溶液を50μg/mlのルシフェラーゼ(ホタル)と混合した。調製混合物ルシフェラーゼ／コンカナバリンA強磁性流体を、μr＝1.0020を示すまで希釈した。上記したような20μlの希釈強磁性流体を、10μの大腸菌スラリー（OD600＝0.4、PBS緩衝液中で10倍に濃縮）と共に、1 mM CaCl2および1 mM MnCl2を補充した370μl PBS緩衝液(PBS2)の中でインキュベートした。この細胞と強磁性流体の懸濁液を30分間インキュベートした後、細胞を3000gで5分間にわたって遠心処理し、PBS2で2回洗浄した。細胞−粒子のペレットを、PROMEGAからの甲虫ルシフェリン基質50μl中に再懸濁してルシフェラーゼアッセイを行う一方、顕微鏡下で細胞の研究を行った。
【００２９】
例III. ConA-テトラリシンと結合したプラスミドDNA pUC18を使ったE.大腸菌LB121のトランスフェクション
本発明による懸濁液20μl{細胞結合成分がconAからなり、遺伝子融合によって細胞結合成分が物質結合成分(合成ポリリシンペプチド(4アミノ酸)からなる)とともにタンパク質として発現し(大腸菌内で発現させた)、かつ磁気的に誘導可能な成分の濃度が前記懸濁液に1.002の比透磁率を与える}を、10μl PBS中の0.5μg pUC18プラスミドDNAに加えた。サンプルを20分間にわたってインキュベートした。10倍に濃縮されたOD(600 nm)=0.4の細胞密度まで10μlの細胞を増殖させ、0.15M NaClを含む0.1M PBS緩衝液中に再懸濁された細胞溶液を前記強磁性流体に加えた。30分間インキュベーションした後、1MHzの周波数と100 Oeの磁場強度をもつ交番磁場に20秒間サンプルをさらした。1ml無菌LB培地を加えた後、サンプルを45分間37℃でインキュベートした。10μlのサンプルを寒天プレート（LB培地、75μg/mlアンピシリン、50μg/mlおよび25μg/ml X-gal）上に散布した。プレートを37℃で終夜インキュベートした。そして、寒天プレート当りの青色コロニーの数を数えることによってトランスフェクション効率2.5×107個のコロニー／mg DNAが測定された。
【００３０】
例IV. 異なる磁気的に誘導可能な粒子を用いたプラスミド-DNA pUC18での大腸菌LB121のトランスフェクション−異なる2官能性分子間での比較
本発明による粒子の異なる懸濁液20μl（各懸濁液における2価の成分が、OmpA、コンカナバリンA、アミノ基およびカルボキシル基を対象とした抗体からなり、かつ磁気的に誘導可能な成分の濃度が前記懸濁液を1.002の比透磁率をもつように特徴づける）を、0.5μg pUC18プラスミドDNAに添加した。サンプルを20分間インキュベートした後、10μlの細胞を加え、10倍に濃縮されたOD(600nm)＝0.4の細胞密度まで増殖させ、0.15M NaClを含む0.1M PBS緩衝液中に再懸濁した。30分間インキュベーションした後、1 MHzの周波数と100 Oeの磁場強度をもつ交番磁場に20秒間サンプルをさらした。1mlの無菌LB培地を添加し、その後、45分間37℃でサンプルをインキュベーションした。10μlのサンプルを寒天培地上に散布した（LB培地、75μg/mlアンピシリン、50μg/mlおよび25μg/ml X-gal）。プレートを37℃で終夜インキュベーションした。
【００３１】
異なる懸濁液は次の結果を与えた：
【００３２】
強磁性流体                                  寒天プレート毎の陽性コロニーの数
対照（強磁性流体を含まないサンプル）        11
ff-NH3+                                      6
ff-COO-                                      3
ff-AntiOmpA                                  20
ff-コンカナバリンA                          97
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明に係る粒子およびその膜上への結合を示した模式図。
【図１】
2005538714.tif 000003
【国際調査報告】
2005538714.tif 000004
2005538714.tif 000005
2005538714.tif 000006
2005538714.tif 000007