(57)【要約】本発明の方法及び装置（１，２）は、流体流路（１０）を通過する流体フローの方向及び速度を制御することによって、１個以上の磁界内の磁性物質を収集して、粒子を分散媒体中に再懸濁させ、場合によっては同一又は異なる媒体中で収集／再懸濁を１回以上繰り返すために有用である。本方法は、とりわけ、変性粒子を被験サンプル及び試薬と接触させ、過剰の試薬を除去し、磁性物質を洗浄し、検体を再懸濁させる。本方法は、例えば、細胞、ウィルス、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ホルモン、レセプター−リガンド複合体、環境汚染物質など、磁気標識の影響を受けやすい広い範囲の化学物質及び生物学的物質に適用可能である。
2005528584.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の端部及び第２の端部を有する流体流路と、該流体流路に正圧又は負圧を可変的に付与して、該流体流路を通過する流体フローを所定速度で第１若しくは第２の方向に制御するに有効な流体フローコントローラと、該第１及び第２の端部の間の捕捉ゾーンであって固定磁界が該捕捉ゾーンにおける該流体流路を遮断する捕捉ゾーンと、を設ける工程と、
該流体流路に、キャリア媒体中に分散している複数の固体磁性粒子を含む第１の混合物を提供する工程と、
該第１の混合物を該捕捉ゾーンに、磁界の力で該磁性粒子の大部分が該捕捉ゾーンにトラップされるようになる第１の所定捕捉速度にて通過させ、こうして該キャリア媒体から該磁性粒子を分離させて、第１の磁性粒子単離物を形成する工程と、
該第１の磁性粒子単離物に第１の分散媒体を散布する工程と、
該第１の磁性粒子単離物を該捕捉ゾーンから取り除き、磁性粒子を該磁界から移動させ、該磁性粒子を該第１の分散媒体中に懸濁させて、第２の混合物を提供するために有効な第１の所定分散速度で、該捕捉ゾーンを通して該第１の分散媒体を脈動させる工程と、
を含む方法。
【請求項２】
前記固定磁界は、前記第１の混合物の通過、散布、脈動及び第２の混合物の通過の間、実質的に一定強度を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記固定磁界は、前記流体流路に対して固定された関係にある永久磁石により与えられる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記固定磁界は、前記流体流路に対して固定された関係にあり且つ固定磁界を発生させる電磁石により与えられる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記磁性粒子は、ターゲット物質に対する選択親和性を特徴とする表面結合選択剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記表面結合選択剤を含む磁性粒子は、サンプル中の化学種もしくは生物学種を選択的に保持するに有効である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記磁性粒子は、非特異的相互作用を介する複数のターゲット物質の吸着に適する特性を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記非特異的相互作用は、静電気的相互作用、ファンデルワールス相互作用、双極−双極相互作用及び水素結合相互作用からなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第１の分散媒体は、サンプルを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記選択剤は、サンプル中に生物学的種を保持するに有効であり、抗原、抗体、タンパク質レセプター、リガンド、オリゴヌクレオチド、ストレプトアビジン（streptavidin）、アビジン、ビオチン及びレクチンからなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記選択剤は、抗体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
サンプルは、ELISAアッセイ用の検体サンプルを含み、前記選択剤は該検体を選択的に保持する抗体であり、サンプルはさらに検体−酵素コンジュゲートを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
前記検体−酵素コンジュゲートは、特異的触媒活性及び分析試薬に対する特異性を有する酵素を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記キャリア媒体は、サンプルを含む請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
前記混合物は、前記選択剤を前記種と接触させて該種を保持させるに有効な第１の所定時間にわたり培養される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１の分散媒体は第１の洗浄溶液である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
さらに、磁界の力により前記磁性粒子の大部分が、前記捕捉ゾーンにトラップされるようになり、前記第１の分散媒体から除去されて、第２の磁性粒子単離物を形成する第２の所定捕捉速度にて、前記捕捉ゾーンに前記第２の混合物を通過させる工程を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記第２の磁性粒子単離物に第２の分散媒体を散布する工程と、
前記捕捉ゾーンから前記第２の磁性粒子単離物を取り除き、前記磁界から前記磁性粒子を移動させ、該磁性粒子を第２の分散媒体中に懸濁させて、第３の混合物を形成するに有効な第２の所定分散速度にて、前記捕捉ゾーンを通して前記第２の分散媒体を脈動させる工程と、
をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第２の分散媒体は、分析試薬を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
さらに、磁界の力により前記磁性粒子の大部分が前記捕捉ゾ−ンにトラップされるようになり、第２の分散媒体から除去されて第３の磁性粒子単離物を形成する第３の所定捕捉速度にて、前記第３の混合物を前記捕捉ゾーンに通過させる工程を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記流路は、さらに検出ゾーンを含み、該検出ゾーン中には流体の物理的特性若しくは化学的特性を検出するように検出器が位置づけられており、前記第３の混合物が前記捕捉ゾーンを通過した後、第２の分散媒体及び第３の磁性粒子単離物からなる群より選択される一員の物理的特性若しくは化学的特性を検出する工程をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記分析試薬は着色剤であり、前記検出器は光学検出器である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
さらに、第２の溶液を前記検出ゾーンに通過させる工程と、該第２の溶液の特性を計測する工程と、をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記第２の分散媒体は、第２の洗浄溶液を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
磁界の力により前記磁性粒子の大部分が前記捕捉ゾーンにトラップされるようになり、前記第２の分散媒体から除去されて、第３の磁性粒子単離物を形成する第３の所定捕捉速度にて、前記第３の混合物を前記捕捉ゾーンに通過させる工程をさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記第３の磁性粒子単離物に第３の分散媒体を散布する工程と、
該第３の磁性粒子単離物を該捕捉ゾーンから取り除き、磁性粒子を磁界から移動させ、磁性粒子を該第３の分散媒体に懸濁させて第４の混合物を与える第３の所定分散速度にて、前記捕捉ゾーンを通して該第３の分散媒体を脈動させる工程と、
をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
磁界の力により磁性粒子の大部分が前記捕捉ゾーンにトラップされるようになり、前記第３の分散媒体から除去されて、第４の磁性粒子単離物を形成する第４の所定捕捉速度にて、前記第４の混合物を前記捕捉ゾーンに通過させる工程をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記流路は、検出ゾーンをさらに含み、該検出ゾーンには流体の物理的特性若しくは化学的特性を検出するように検出器が位置づけられており、前記捕捉ゾーンに前記第４の混合物を通過させた後、第３の分散媒体及び第４の磁性粒子単離物からなる群より選択される一員の物理的特性若しくは化学的特性を検出する工程をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記第２の分散媒体は、分析試薬を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記分析試薬は着色剤であり、前記検出器は光学検出器である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記磁界は、約０．１〜約２ｋＧａｕｓｓ／ｃｍの捕捉ゾーンにおける磁界勾配を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記流路は、約０．０１〜約５０μＬの容積を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記流路は、約０．００１〜約５ｍｍの平均直径を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記第１の所定捕捉速度は、約１．０〜約１３ｍｍ／ｓである、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記第１の所定分散速度は、約２５０〜約２５００ｍｍ／ｓである、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記流路はマイクロチャネルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
前記第１の混合物を通過させる工程は第１の方向への通過を含み、前記第１の分散媒体を通過させる工程は該第１の方向とは反対の第２の方向への通過を含み、前記第２の混合物を通過させる工程は第１の方向への通過を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
前記フローコントローラは、
１個の主ポート及び複数の副ポートとを含み、第１の副ポートは前記流体流路の入口と流体的に接続されている、多重ポート選択バルブと、
先端部、及び該選択バルブの主ポートと流体的に接続されている基端部を有する保持コイルと、
該保持コイルの先端部と流体的に接続されている第１ポート、可変速度可逆ポンプと流体的に接続されている第２ポート、及び洗浄組成物源と流体的に接続されている第３ポートを有する３方向バルブと、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
前記可変速度可逆ポンプは、ステッピングモーター駆動型シリンジポンプである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記多重ポート選択バルブ、前記３方向バルブ及び前記ポンプは、予めプログラムされたコンピュータにより制御される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記捕捉ゾーン中の流路は、固定された磁化可能な固体マトリックス構造物を実質的に含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
第１及び第２の端部、並びに該第１及び第２の端部の間の捕捉ゾーンを有する流体流路と、
該流路に正圧若しくは負圧を可変的に付与して、該流体流路中に第１若しくは第２の方向に所定速度にて制御された流体フローを通過させるに有効な流体フローコントローラと、
該流体流路に対して固定された関係にて位置づけられており、該捕捉ゾーン中の該流体流路を遮断する固定磁界を発生させる磁界源と、
該流路中の流体の物理的特性若しくは化学的特性を検出するように位置づけられた検出器と、
を含む装置。
【請求項４３】
前記検出器は、光学検出器である、請求項４２に記載の装置。
【請求項４４】
前記固定磁界源は、永久磁石を含む、請求項４２に記載の装置。
【請求項４５】
前記固定磁界源は、電磁石を含む、請求項４２に記載の装置。
【請求項４６】
前記磁界は、約０．１〜約２ｋＧａｕｓｓ／ｃｍの磁界強度を有する、請求項４２に記載の装置。
【請求項４７】
前記捕捉／分散領域中の前記流路は、約１〜約５０μＬの容積を有する、請求項４２に記載の装置。
【請求項４８】
前記流路は、約０．１〜約５ｍｍの平均直径を有する、請求項４２に記載の装置。
【請求項４９】
前記流体フローコントローラは、いずれかの方向に、約２５００ｍｍ／ｓ以下の流体流路中の流速を提供するに有効である、請求項４２に記載の装置。
【請求項５０】
前記コントローラは、前記流体流路と流体連通状態にある可逆ポンプである、請求項４２に記載の装置。
【請求項５１】
前記流体フローコントローラは、
主ポート及び複数の副ポートを含み、第１の副ポートは前記流体流路の入口と流体的に接続している、多重ポート選択バルブと、
先端部、及び該選択バルブの主ポートと流体的に接続している基端部を有する保持コイルと、
該保持コイルの先端部と流体的に接続している第１ポート、可変速度可逆ポンプと流体的に接続している第２ポート、及び洗浄組成物源と流体的に接続している第３ポートを有する３方向バルブと、
を含む、請求項４２に記載の装置。
【請求項５２】
前記可変速度可逆ポンプは、ステッピングモーター駆動型シリンジポンプである、請求項４２に記載の装置。
【請求項５３】
前記多重ポート選択バルブ、前記３方向バルブ、及び前記ポンプは、予めプログラムされたコンピュータにより制御される、請求項４２に記載の装置。
【請求項５４】
前記捕捉ゾーン中の流路は、固定された磁化可能な固体マトリックス構造物を実質的に含まない、請求項４２に記載の装置。
【請求項５５】
第１及び第２の端部、並びに該第１及び第２の端部の間の複数の捕捉ゾーンを有する流体流路と、
該流路に正圧若しくは負圧を可変的に付与して、制御された流体フローを第１若しくは第２の方向で所定速度にて該流体流路に通過させる流体フローコントローラと、
該流体流路に対して各々が固定された関係にて位置づけられていて、各々が該捕捉ゾーン中の該流体流路を遮断する固定磁界をそれぞれ発生させる複数の磁界源と、
を含み、各捕捉ゾーンは、実質的に磁界を含まないゾーンによって他の１個以上の捕捉ゾーンから隔離されている、装置。
【請求項５６】
第１及び第２の端部、並びに該第１及び第２の端部の間の捕捉ゾーンを有する流体流路手段と、
該流体流路手段に、キャリア媒体中に分散されている複数の固体磁性粒子を含む第１の混合物を提供する手段と、
該流体流路手段に正圧若しくは負圧を可変的に付与して、該流体流路手段を通して第１若しくは第２の方向で所定速度にて制御された流体フローを通過させる手段と、
該捕捉ゾーン中の該流体流路手段を遮断する固定磁界を提供する手段と、
を含む装置。
【請求項５７】
キャリア媒体に分散されている複数の固体磁性粒子を含む混合物を、磁性粒子が磁界にトラップされるようになり、該キャリア媒体から分離されて磁性粒子単離物を形成する第１の所定捕捉速度にて、固定磁界を貫通して延在する導管に通過させる工程と、
分散媒体を導管に通過させて、該磁性粒子単離物と接触させる工程と、
磁性粒子を磁界から移動させて、該磁性粒子を該分散媒体中に懸濁させるに有効な第１の所定速度にて、導管を通して該分散媒体を脈動させる工程と、
を含む方法。
【請求項５８】
キャリア媒体に中に分散されている複数の固体磁性粒子を含む第１の混合物を、該磁性粒子が磁界にトラップされるようになり該キャリア媒体から分離されて磁性粒子単離物を形成する第１の所定捕捉速度にて、磁界を貫通して延在する導管に通過させる工程と、
該磁性粒子を磁界から移動させ、分散媒体に懸濁させて第２の混合物を与える第１の所定分散速度にて、導管を通して分散媒体を脈動させることにより、該磁界から該磁性粒子単離物を解放する工程と、
磁性粒子が磁界にトラップされるようになり該キャリア媒体から分離されて磁性粒子単離物を形成する第２の所定捕捉速度にて、該第１の混合物の通過とは反対方向で、該第２の混合物を磁界に通過させることにより、該磁性粒子を再捕捉する工程と、
を含む方法。
【請求項５９】
前記第１の混合物は、前記第２の混合物とは異なる組成を有する、請求項５８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、磁気応答性の粒子（本明細書では、「磁性粒子」という）の磁気収集、及び該粒子の逐次制御分散のためのシステムに関する。特に、本発明は、例えば、化学物質及び／又は生化学物質、細胞、細胞成分、バクテリア、ウィルス、毒素、核酸、ホルモン、タンパク質、レセプター−リガンド複合体、他の複合分子、又はこれらの組み合わせなどの生物学的物質などのターゲット物質の磁性粒子との選択的相互作用による検出、単離、分離及び／又は操作に関し、これらは媒体から分離されて、さらなる分析、単離又は他の用途のために逐次的に再懸濁される。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景として、従来技術において、体液、培養流体若しくは環境からのサンプルなどの流体媒体中での細胞若しくは微生物などのターゲット実体の単離、分離、及び／又は操作を含む多くの技術が知られており、用いられている。このような技術が多数回の洗浄工程及び結合工程をしばしば必要とすることは容易に理解される。これらの工程は、多くのこのような技術において、単調で退屈なピペットによる採取手順及び傾瀉工程によりなされるか、又は大型で現場での持ち運びができない自動化ロボットシステムによりなされる。このような単離、分離及び／又は操作技術は、例えば、特定の汚染物質、毒素若しくは他の物質が存在するか否かを決定するためにサンプルを分析すること、及び存在する場合にはいかなる量で存在するかを決定するためにサンプルを分析すること；次の処理に供するか又は利用するために、核酸フラグメント、タンパク質、酵素などの特定のターゲット物質をサンプルから抽出すること；などを含むかもしれない。このような技術は、特にターゲット物質が痕跡量で存在する場合に、正確で有用な情報を提供するため又は単離技術における適切な被検物を提供するために、しばしば顕著な感応性を示さなければならないことは容易に理解される。
【０００３】
痕跡量の有機分子の分離、単離又は他の操作を含む技術の一例は、分析試薬として抗体を用いるイムノアッセイ技術である。イムノアッセイの理論は、よく理解されている。抗体は、特異的な相互作用を伴う特異的な検体であると認められている。薬剤又は代謝物などの低分子量検体に対して、競合イムノアッセイを行うことが慣習的である。典型的には、固定された有限量の特定の抗体を、既知濃度の標識検体及び未知濃度の検体を含む可能性のあるサンプルで培養する。抗体に対して結合した標識の量は、被検物中の検体の量に反比例する。
【０００４】
非常に多数のイムノアッセイ技術があるが、わずか２，３の技術が広く用いられているに過ぎない。これらは、免疫試薬（immunoreagent）の１種と共役している標識種を通して検体を測定する間接技術である。定量のために、結合体／遊離体分離（Ｂ／Ｆ分離）を行い、抗体に関連する検体を標識化することが慣用的に行われている。イムノロジック反応の成分の１種を固相上に固定する場合（不均質アッセイ）には、実験手順は簡略化される。検体と酵素標識化された検体との抗体への競合結合を含む不均質イムノアッセイは、エンザイムリンクドイムノソーベントアッセイ（Enzyme Linked Immunosorbent Assay）（ELISA）と呼ばれる。
【０００５】
少なくとも２個の識別可能な抗原決定基を有する検体について、より簡単でより正確なアプローチは、捕捉抗体（capture antibody）として１個の抗原サイトに関する第１の抗体及びシグナル発生抗体として別の特長的決定基に関する第２の抗体を用いるサンドウィッチイムノアッセイを行うことである。よって、捕捉抗体が溶液から分離されると、もしくはある種の固体担体に結合すると、シグナル抗体が固体担体に結合し得るか又は溶液から分離され得るただひとつの方法は、検体を介してのものである。サンドウィッチアッセイの利点は、（１）シグナルが、検体曲線の低端部における検体の濃度に比例すること、（２）低濃度端部において、非常に高い感応性が得られること、（３）捕捉抗体及び標識抗体が典型的には検体よりも多量に存在するので、サンドウィッチアッセイは「過剰」アッセイであり、誤差は主としてサンプルインプットの正確さに関連すること、及び（４）広いダイナミック検体検出範囲（４〜５log程度に大きい）が可能であること、である。サンドウィッチアッセイ技術は、競合アッセイ同様、結合体／遊離体分離（Ｂ／Ｆ分離）を行うためにシステムの広いレンジを用いる。典型的には、このようなアッセイにおいて、問題となる検体に対する抗体は、検体結合が結合した抗体上で起こるように、固体担体上に非常に正確に置かれる。次に、溶液を添加して、未結合検体及び非特異的に結合した検体を結合領域から運ばせる。次いで、第２の標識化抗体を添加し、溶液を添加して未結合の第２の抗体を洗い流す。第２の抗体が酵素標識化されると、酵素物質を添加して、特異的に結合した酵素（したがって検体）の量に比例する検出可能なシグナル（たとえば、色の変化、蛍光、導電率の変化）を得る。
【０００６】
特異的結合物質を利用して結合体／遊離体分離（Ｂ／Ｆ分離）を行うための多くの方法がある。たとえば、管の内部に吸着された若しくは共有結合した抗体（被覆管アッセイ）などの固相上に固定された特異的結合物質を利用するＢ／Ｆ分離、より最近では、たとえば液体に浸漬して次いで引き出すことができる細長い構造体又は遠心分離又は濾過により若しくは磁気的に分離することができるビーズなどの移動可能な固相に付着させた特異的結合物質を利用するＢ／Ｆ分離を行う方法などがある。典型的には、分離システムは、分離を容易に行うことができ、過剰の試薬を容易に除去することができ、特異的に結合した標識化検体を伴う固定された抗体を含まないように、非特異的に結合した検体を洗浄することができる、という特徴を有するべきである。
【０００７】
上述のようなアッセイにおけるシグナル若しくは放射エネルギー応答の検出は、種々の技術を通して達成され得る。一例として、蛍光標識化抗体、検体又は検体に関連し得る他の小さな分子の蛍光検出がある。システム成分が検出された放射性放射のタイプに対して不浸透性である場合には、放射能検出もまた可能である。リポゾ−ムに包囲されているかもしれない抗体若しくは検体に付着した染料の着色検出もまた可能である。結合体／遊離体分離（Ｂ／Ｆ分離）の後に、検出反応用の物質が得られるようになることを条件として、ケミルミネッセント、バイオルミネッセント、エレクトロケミルミネッセント又は酵素検出もまた可能である。このように、読み出し可能なシグナル若しくは他の放射エネルギー応答を得るために、種々の方法が存在する。
【０００８】
固定された結合性物質（binding substance）を用いる際の主な課題は、化学的に選択性である表面、特にバイオ分子（しばしば、「バイオセンサー」と呼ばれる）を含む表面の有限寿命である。室温にて水溶液中の多くのバイオ分子は、経時的に化学分解され、典型的には数時間から最大でも約１週間の範囲の寿命を有する。したがって、水溶液中に浸漬されたバイオセンサー表面を長時間にわたって連続的に使用状態に維持することは実現可能ではない。溶液組成もまた、バイオセンサーの寿命に影響を与える。バイオ分子及び生物学的物質の構造及び機能は、塩濃度、pH及び温度などの環境条件に感応性である。溶液組成及び温度の変化は、蛋白質を不可逆的に変性させるので、もはや特定のリガンド類に結合しなくなるであろう。細胞は、生育可能のままでいるために代謝物質の正確な混合を必要とし、溶液組成及び溶液の流速は生育可能な細胞の成長速度に影響を与えるので、センサーシステム中の全細胞を使用することもまた試みられている。特異性、したがって多くのバイオ特異的相互作用の不可逆性もまた、バイオセンシング表面の有限寿命の要因となる。抗体−抗原相互作用などの選択的相互作用は、数分の時間経過で基本的に不可逆性となる。Harsh試薬が、結合した抗原（及び非特異的に結合した分子）を除去するために用いられるかもしれないが、これは抗体自身の連続結合活性を減少させるので、再生された検出表面は新鮮な検出表面ほど効果的ではなく、アッセイの正確さ及び信頼性に負の影響を与える。加えて、バイオセンサーの寿命は、サンプルマトリックス中の物質のバイオセンサー表面上への非特異的結合により引き起こされるセンサー表面の「汚染」ゆえに、制限されることが多い。
【０００９】
これらの問題は、化学的選択性化学物質が小さな粒子の表面上にあるバイオセンシング用の再生可能な表面の使用の増加という結果をもたらしている。それゆえ、変性粒子の新鮮なアリコートを各分析に用いることができる。このような分析の後、変性粒子をシステムからフラッシュ洗浄して、新しい粒子が次の分析のために用いられる。
【００１０】
変性粒子が磁性粒子である場合、分析中、粒子の媒体からの単離は、磁気分離すなわち急勾配磁選（HGMS）を用いて達成することができる。本明細書において、用語「磁気（磁性）」とは、粒子に磁界を与えることにより力が励起される粒子の特性を意味することを意図する。磁気分離において、比較的大きな寸法の粒子（すなわち、直径が約０．５ミクロン以上）は、HGMSにて捕捉又は分離され、より小さな粒子、たとえばコロイド状磁性粒子は分離される。
【００１１】
過去数年にわたり、サブ−ミリメータ−規模の自動化フローに基づく分析器及び化学検出器は、商業化に必要とされる技術レベルを定常的にアプローチしてきた。自動化イムノアッセイ、DNA精製及び増幅、細胞分離、環境汚染物質検出などのより小型の診断用分析器が開発され続けている。
【００１２】
このような背景に鑑みて、磁性粒子の磁気収集、及びその後の粒子の制御された再懸濁のためのシステムの更なる開発がいまだ必要とされている。特に、特異的検出、単離、分離及び／又は媒体から分離することができ、及びさらなる分析、単離その他の用途のために続いて再懸濁され得る磁性粒子との選択的相互作用によるターゲット物質の操作のためのシステムの更なる開発が必要とされている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、磁性粒子分離及び１種以上の流体媒体中への再懸濁を行うための新規なシステムを提供する。本発明の一側面によれば、磁性粒子捕捉及び解放は、固体磁界を通過する捕捉ゾーンを通る流体の流速を制御することにより制御される。低い捕捉ゾーン通過流速では、粒子は再生可能に及び多量に捕捉され得る。高い捕捉ゾーン通過流速は、粒子を磁界から移動させる。
【００１４】
本発明は、磁性粒子上へのターゲット物質の結合の間及び結合後の両方で、磁性粒子を操作する方法を提供することにより、ターゲット物質の単離を促進するシステムを提供する。ターゲット物質は、次いで、所望により、ルミネッセンス検出器、分光光度分析、光度計、質量分析計、フローサイトメーター、血液学分析器、又は他の細胞計数もしくは分析機器などの１種以上の検出システムもしくは分析システムを用いて、試験されてもよい。
【００１５】
本明細書において、用語「ターゲット物質」とは、個体として若しくは群として計測可能な生物学的、医学的もしくは環境学的に関心のある広範囲の物質を意味する。例として、細胞、真核生物（たとえば、白血球、赤血球又は菌類）及び原核生物（たとえば、バクテリア、原生動物又はマイクロプラズマ）の両者、ウィルス、細胞成分、分子（たとえば、蛋白質）、マクロ分子（たとえば、核酸−RNA、DNA）、及び化学物質（たとえば、殺虫剤、除草剤、爆薬）を挙げることができる。細胞関連ターゲット物質としては、たとえば、細胞膜、細胞質又は核の成分を挙げることができる。このような細胞関連構造物には、ホスト細胞又はウィルス由来（viral origin）のいずれかの細胞表面抗原を含む膜結合蛋白質もしくは糖蛋白、組織適合抗原、又は膜レセプターがある。これらのターゲット物質は、個別の実体（discrete entities）として、又は複合体若しくは凝集体の形態で、結合していてもよい。このような分離は、結合性物質と問題の少なくとも１種の特長的ターゲット物質すなわち検体との相互作用に依存する本発明の方法を用いて、達成される。
【００１６】
磁性粒子へのターゲット物質の結合は、磁性粒子の表面化学により制御される。磁性粒子の化学は、たとえば、静電気相互作用、ファンデルワールス相互作用、双極−双極相互作用及び／又は水素結合相互作用など、非特異的相互作用を介してターゲット物質を結合させるために用いてもよい。たとえば、サンプル中の正電荷に帯電した蛋白質の全部又は実質的に全部を単離することが望ましい場合には、負電荷に帯電した磁性ビーズを用いる本発明により達成することができる。同様に、サンプル中のDNA（負電荷に帯電している）の全部又は実質的に全部を結合させるために、正電荷に帯電した磁性ビーズを用いることができる。あるいは、磁性粒子は、ターゲット物質と選択的に相互作用する特異的結合性物質を含むように化学装飾されていてもよい。本発明において用いることができる結合性物質の代表例としては、抗原、抗体、プロテインレセプター、リガンド、オリゴヌクレオチド、ストレプトアビジン（streptavidin）、アビジン、ビオチン及びレクチンを挙げることができる。ターゲット物質と選択的に相互作用するために用いられる特異的結合性物質の一分類は、抗原を免疫特異的に認識することができる抗体の分類である。本明細書において用いられる用語「抗体」は、イムノグロブリン類、モノクローナル若しくはポリクローナル、及び免疫反応性イムノグロブリンフラグメントを含む。よって、特長的ターゲット物質及びそれらの特異的結合性物質の例としては、レセプター−ホルモン、レセプター−リガンド、アゴニスト−アンタゴニスト、RNA若しくはDNAオリゴマー−相補的シーケンス、マウスIgGのFcレセプター−プロテインA、アビジン−ビオチン、及びウィルス−レセプターを挙げることができる。本発明の方法を用いて決定することができる他の特異的結合対の組み合わせは、当業者には自明であろう。
【００１７】
イムノアッセイに用いる場合、本発明は、高度に感応性であるが比較的小規模の検体収集システムを提供する。収集及び再懸濁の速度及び再現性は、検体に対する比較的低コストの試験を達成するために、小容量を用いる場合に必要とされる結合、洗浄及び混合工程の全てを自動化するために重要な特性である。イムノアッセイ又は他のこのような分析を行うために用いる場合、本発明は、全タイプのサンプルの容量を顕著に減少させることができ、結果的にターゲット実体をより高濃度にすることができ、よって、分析時間を短縮することができる。これは、磁性粒子を捕捉するために用いる磁界を除去、逆転又は最小化する必要なく、達成し得る。
【００１８】
このように、本発明の一側面によれば、磁性粒子を含む非磁性キャリア媒体から磁性粒子を分離し、次いで、分離された磁性粒子を適切な分散媒体に再懸濁させる方法が提供される。キャリア媒体及び分散媒体は、同一又は異なるものでもよい。本方法は、最初に磁界源を通して延在する流体流路を提供し、この流体流路にキャリア媒体／磁性粒子混合物を導入することを含む。磁界は、混合物が所定の捕捉速度で捕捉ゾーンを通過する際に、流体流路を中断させ、流体流路中の磁性粒子を捕捉する。磁性粒子は、捕捉ゾーンから磁性粒子を除去するに有効なより高い流速で同一又は異なる媒体が捕捉ゾーンを流通させられる場合にのみ、解放される。
【００１９】
本発明による方法は、（１）第１及び第２の終端を有する流体流路と、該流路に正又は負の圧力を可変的に付与して、所定速度で第１又は第２の方向に流体流路を流通する流体フローを制御するに有効な流体フローコントローラと、第１及び第２の終端の間にあって固定磁界が流体流路を中断する捕捉ゾーンと、を準備し、（２）流体流路中に、キャリア媒体中に分散された複数の固体磁性粒子を含む第１の混合物を提供し、（３）第１の混合物を第１の所定捕捉速度にて捕捉ゾーンに通過させて、磁界の力により磁性粒子の大部分を捕捉ゾーンにトラップさせてキャリア媒体から分離させ、第１の磁性粒子単離物を形成させ、（４）第１の磁性粒子単離物を第１の分散媒体に散布して、（５）第１の磁性粒子単離物を捕捉ゾーンから取り除き、磁性粒子を磁界から移動させ、磁性粒子を第１の分散媒体中に懸濁させるに有効な第１の所定分散速度にて、捕捉ゾーンを通して第１の分散媒体を脈動させて、第２の混合物を提供する、ことを含む。所望であれば、磁性粒子を複数回、捕捉・解放してもよい。この手順を用いることで、混合を強めて、よって少容量の流体からの分子捕捉の効率を高めることができる。加えて、同じ流体をキャリア媒体及び分散媒体として用いることもできる。ゆえに、第１及び第２の混合物は同一であってもよい。捕捉及び解放は、捕捉及び解放作用中に、捕捉ゾーンを通る流体フロー方向を逆転させることによって、同じ流体内で生じさせることもできる。あるいは、捕捉及び解放は、捕捉ゾーンを移動している新しい流体中に生じさせてもよい。
【００２０】
本発明の別の側面によれば、磁性粒子を含む非磁性流動媒体から磁性粒子を分離する装置が提供される。本装置は、（１）第１及び第２の終端、及び第１及び第２の終端の間の捕捉ゾーンを有する流体流路と、（２）所定速度にて第１又は第２の方向に流体流路を流れる流体フローを制御するために、流路に正又は負の圧力を可変的に付与するに有効な流体フローコントローラと、（３）流体流路に対して固定位置に位置付けられていて、捕捉ゾーン中で流体流路を中断させる固定磁界を発生させる磁界源と、（４）流路内の流体の物理的若しくは化学的特性を検出するために位置付けられている検出器と、を含む。
【００２１】
本発明の目的は、従来のシステム及び方法の代替となる磁性粒子を捕捉し再懸濁させる新規な装置及び方法を提供することにある。
本発明の更なる形態、実施形態、目的、効果、利点、側面及び特徴は、添付図面及び以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。
【好ましい実施形態の説明】
【００２２】
本発明の特徴は、特許請求の範囲に特に指摘されているが、本発明自体、本発明がなされる態様及び用いられる態様は、添付図面を参照しながら以下の説明を読むことにより、より良く理解されるであろう。
【００２３】
本発明の原理の理解を促進する目的で、好ましい実施形態及びこれを記載するために用いる特定の言葉を参照されたい。しかし、本発明は、これらに限定されるものではなく、当業者が通常なすであろう本発明の変形例及びさらなる態様、及び本発明の原理のさらなる用途も含むものであることは理解されたい。
【００２４】
本発明は、捕捉ゾーンを通過する流体フローの速度を制御することにより、流動媒体から磁性粒子を分離し、この粒子を同一又は異なる媒体に、１回以上、再懸濁させる流体フローシステムに具現化される。本発明によれば、磁界は、捕捉ゾーンにて流体流路を中断させて、分離を効果的に行わせる。いくつかの好ましい実施形態における磁界は、固定磁界（以後、磁性粒子の捕捉及び再懸濁中に実質的に不変である磁界を意味するために、この用語を用いる）である。いくつかの実施形態において、固定磁界は、永久磁石を流体流路に対して固定関係に位置付けることにより提供される。この関係は、たとえば、流路を画定する導管に永久磁石を直接、取り付けることにより、あるいは流路に対して動かない構造体に永久磁石を取り付けることにより、達成することができる。別の実施形態において、固定磁界は、流体流路に対して固定関係に位置付けられ、本発明のシステムにおける磁性粒子の捕捉及び再懸濁中に、実質的に一定の磁界強度を有する磁界を発生させるように構成された電磁石により提供される。
【００２５】
本発明のシステムは、媒体からの磁性粒子の分離ばかりでなく、１回以上の次の工程において同一又は異なる媒体への粒子の再懸濁をも含む手順を行うために非常に有用である。流体流路に入る流体の選択並びに流体フローの速度及び方向を制御することにより、本発明のシステムは、所定シーケンス中で種々の流体と接触すべき物質を必要とする広範囲なアッセイ及び他の技術における有益な用途を見出す。本発明は、限定されるものではないが逐次注入分析（SIA）と呼ばれる手順などの自動化流体フローシステムに関して使用することが特に適切である。本発明の流体フロー分離システムを自動化することにより、正確な測定が迅速に且つ比較的少量の試薬及び他の物質を用いる反復可能な態様で得られ得る。
【００２６】
図１を参照すれば、システム１は、第１の終端２０と第２の終端３０とを有する流体流路１０、及び流体フローコントローラ５０を含む、システム１は、さらに、第１の終端２０と第２の終端３０との間に捕捉ゾーン４０を含む。捕捉ゾーン４０は、磁界が捕捉ゾーン４０内で流体流路１０を中断するように、流体流路１０の残りの部分から区別されている。磁界は、磁界源４２を流路１０に対して固定関係に位置付けることによって提供される。コントローラ５０は、流路に正又は負の圧力を可変的に付与して、流体流路１０を通る流体フローを可変速度にて第１又は第２の方向に制御するために有効である。いくつかの実施形態におけるコントローラ５０は、さらに、異なる源から流路１０に媒体を吸引するように構成されている。流体流路１０は、実施例に記載する実施形態におけるように管によって画定されても、あるいはマイクロチャネルであってもよい。約１００ミクロン未満の内径を有することが多いマイクロチャネルは、たとえば、当該分野で公知の機械加工、微細加工（microfabrication）又は成形技術により形成することができる。マイクロチャネルを形成するプロセス及び技術は、たとえば、米国特許U. S. Patent No. 5,611,214、5,811,062、6,129,973、6,192,596及び6,200,536に記載されている。
【００２７】
システム１を用いる態様において、第１の混合物は流路内に提供され、この混合物はキャリア媒体中に分散されている複数の固体磁性粒子を含む。懸濁液又はスラリーとも呼ばれることもある第１の混合物は、流路内で広範な方法で提供され得る。非限定的な例を後ほど詳細に述べる。第１の混合物を流体流路１０内に位置付けたら、フローコントローラ５０は、混合物に正圧又は負圧をかけて、混合物が所定速度（以後、「捕捉速度」という）にて捕捉ゾーン４０を通過するようにさせる。こうして、磁性粒子の大部分が捕捉ゾーン４０内で磁界の力によりトラップされるようになり、キャリア媒体から分離させられて、第１の磁性粒子単離物を形成する。本明細書において、用語「大部分」とは、正確さの許容可能な範囲内で所定の分離手順における所望の結果を達成するために必要な部分を意味する。たとえば、本発明のシステムをELISAアッセイを行うために用いる場合（例は後ほど詳述する）には、アッセイ結果が許容可能な誤差内であることを保証するために、混合物が捕捉ゾーンを通過する際に、少なくとも約９０wt％、より好ましくは少なくとも約９５wt％の磁性粒子が磁界の力により捕捉されることが好ましい。本発明のシステムを異なるタイプの手順に用いる場合には、捕捉効率の異なる範囲が好ましいことは理解されるべきである。
【００２８】
所定の捕捉流速は、混合物中の粒子に対する磁気引力がキャリア媒体の移動により付与される粘度及び重力を超える、十分に低い流速である。この流速にて、これらの粒子は、捕捉ゾーン内に保持又は捕捉され、一方、キャリア流体は捕捉ゾーンを出る。たとえば、以下の実施例に記載されるシステムにおいて、流体流路は約０．０２インチ（〜０．５ｍｍ）の内径を有し、粒子は直径約０．５μｍであるが、この例に対する好ましい捕捉速度は、約１３ｍｍ／ｓ（２．５μｌ／ｓ）以下である。より好ましくは、この例に対する捕捉速度は、約１．０〜１３ｍｍ／ｓである。当業者は、好ましい速度が所定のシステムの種々の特性、たとえば粒子寸法、粒子の磁化率、磁界強度、磁界源の位置、及び流路形状（直径、壁厚、管又はチャネル材料など）に依存して変動し得ることを容易に認めるであろうし、必要であれば、適切な程度の粒子捕捉を達成する捕捉流速に調節し得るであろう。
【００２９】
磁性粒子単離物が捕捉されると、分散媒体が捕捉ゾーン４０に導入され、磁性粒子単離物を分散媒体に散布する。散布後、分散媒体は、捕捉ゾーンから磁性粒子単離物を取り除き、磁性粒子を磁界から移動させ、磁性粒子を分散媒体に懸濁させるに有効な所定速度（以後、「分散速度」という）で、捕捉ゾーン４０を通して磁性粒子を脈動させ、第２の混合物を提供する。所定の分散流速において、流体流路を通るより高速のフローは、流体の粘性力で、捕捉された粒子を捕捉ゾーンから除去させる。いくつかの実施形態における本発明のシステムは、たとえば無傷の血液細胞などの壊れやすい粒子でさえも、キャリア流体から非分解的に分離することができる。種々の実施形態において、脈動（パルス）が磁性粒子を捕捉ゾーン内でいずれかの方向に移動させることができる、ことは理解されるべきである。
【００３０】
たとえば、詳細は後述するが、流体流路が約０．０２インチの直径を有するシステムにおいて、好ましいパルス流速は約２５０〜約２５００ｍｍ／ｓ（記載されたシステムにおいて２００μｌ／ｓ＝１０１８ｍｍ／ｓ；５００μｌ／ｓ＝２５００ｍｍ／ｓ、５０μｌ／ｓ＝２５０ｍｍ／ｓ）である。より好ましくは、この直径の流路におけるパルス流速は、約７５０〜約１２５０ｍｍ／ｓである。当業者は、好ましい速度が所定のシステムの他の特性に依存して変動し得るものであることを容易に認めるであろうし、粒子分散の適切な程度を達成する分散速度に調節することができるであろう。
【００３１】
さらに分散媒体から磁性粒子を分離することも望ましい場合には、次いで、第２の混合物を所定捕捉速度にて捕捉ゾーンに通過させて、再び、磁性粒子の大部分を捕捉ゾーン中にトラップさせ、こうして、第１の分散媒体から除去して、第２の磁性粒子単離物を形成させる。ただ一つの捕捉ゾーンを有する流路において、第２の混合物を捕捉ゾーンに通過させるには、流体流路における流体フローの方向を逆転させる必要があることは容易に理解されるべきである。この流体フローの逆転は、所定速度で流路を通して逆の方向に流体を流すように、混合物に逆の圧力を付与するフローコントローラ５０によって効果的になされる。
【００３２】
上述のように、捕捉ゾーン４０内の固定磁界を通る流体流速を制御することにより、本発明は、流路から永久磁石を取り外す物理的移動などの磁界の除去の必要性を排除し、あるいは電磁石が用いられる場合には電磁石の電源を切ったり又は磁界変動もしくは反転を行ったりすることで、従来の分離／再懸濁とは異なるシステムを提供する。さらに、本発明のシステムにおける正確に制御された流体フローゆえに、試薬、サンプル、選択的表面などを著しく少量で用いて、正確な結果を迅速に得ることができる。いくつかの好ましい実施形態において、捕捉ゾーンにおける流体流路は、足場、ロッド又は他の磁化可能なマトリックス構造体により本質的に中断されず、粒子は流路導管の側部に単純に捕捉される。別の好ましい実施形態において、強磁性構造体が流路内に位置付けられて、高磁界勾配を提供する。このような構造体は、たとえばナノ粒子捕捉などにしばしば有用である。
【００３３】
キャリア流体及び磁性粒子の組成は、行われている手順の詳細に依存して変動し得る。たとえば、所定のアッセイに用いるための他の試薬と一緒に、選択的化学（固定された抗体）を有する磁性粒子を含む多くの商業的なELISA試験キットが入手可能である。ゆえに、一実施形態において、キャリア流体及び磁性粒子は、ELISAアッセイ物質を含む。一つの代表例として、TNT RaPID Assay（商標）キットが、Strategic Diagnostics（Newark, Delaware）から入手可能であり、これは、TNT-セイヨウワサビペルオキシダーゼ（TNT-HRP）、着色溶液（3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン及びH2O2）、及び固定された抗-TNT抗体との不規則な０．５μｍ直径の磁性粒子の懸濁液を含む。別の例として、特定のオリゴヌクレオチド捕捉プローブに共有結合した粒子を得ることができる。このような粒子は、生物学的サンプルからの核酸フラグメントの選択的精製に利用することができる。本明細書において用いられる用語「核酸」とは、DNAヌクレオチド又はRNAヌクレオチド、並びにDNAヌクレオチド又はRNAヌクレオチドを含む任意の長さのポリマーを意味する。
【００３４】
上述のキャリア媒体は、捕捉ゾーンへの磁性粒子の移動のみのために選択された不活性媒体であってもよいが、本発明のいくつかの実施形態においては、キャリア媒体は、被験サンプル、すなわち特定の検体の存在及び／又は量が決定されるべきサンプルを含む。そこで、粒子とキャリア媒体との最初の接触は培養期間を開始させ、培養期間は磁性粒子がキャリア媒体から上述のように分離された時にのみ終了する。もちろん、たとえば競合イムノアッセイなどのいくつかのアッセイにおいては、キャリア媒体もまた１種以上の追加の試薬を含むこともある。
【００３５】
許容可能な結果を得るために、多くの化学的アッセイ及び生物学的アッセイが、磁性粒子に結合していない未反応試薬及び／又はターゲット物質を粒子から洗浄する１種以上の洗浄工程を必要とする、ことは当業者に容易に理解される。そこで、上述の手順における分散媒体は、洗浄溶液であってもよい。試験又はアッセイの正確さを改良するために、多数回の洗浄工程を行うことが望ましいことが多いこともまた容易に理解される。そこで、本発明のいくつかの実施形態においては、磁性粒子の再懸濁及び再捕捉が、一般に上述したように複数回行われてもよい。
【００３６】
多くのこのような試験又はアッセイは、特定の試薬（以後、「分析試薬」という）中に単離物の懸濁を必要とする。たとえば、いくつかの酵素結合イムノアッセイ手順において、単離された物質は、結合した酵素の作用を受ける場合に着色を生じる物質と接触又はこのような物質中に懸濁する。そこで、本発明の方法は、分析試薬を含む分散媒体に磁性粒子を散布し、捕捉ゾーンを通して媒体を脈動させて、磁性粒子単離物を捕捉ゾーンから取り除き、磁性粒子を磁界から移動させ、磁性粒子を分析試薬含有媒体中に懸濁させることを含む。懸濁液を所定期間にわたり培養した後、次いで、この懸濁液を捕捉ゾーンに通過させて、もう一度、磁性粒子を懸濁液から捕捉し、分析試薬を含む媒体若しくは磁性粒子単離物自身の１種以上の物理的及び／又は化学的特性を測定することができる。
【００３７】
さて、図２を参照すると、流体フローシステム２は、検出ゾーン６０及び検出器６２を含むものとして示されている。検出器６２は、流体流路と流体連通状態にあるか、又は流体流路の一部を形成しており、検出ゾーン内の流体の物理的又は化学的特性を検出するように位置付けられている。検出ゾーン６０は、捕捉ゾーン４０から離れていてもよく（図2に概略的に示されている）、又は検出ゾーンと捕捉ゾーンとが部分的に又は全体的に重なっていてもよい。本発明は、限定されるものではないが、光学検出器、pH検出器、放射線検出器、粘度検出器などを含む広範囲の検出器を種々の用途において用いることを意図する。
【００３８】
本発明に用いられる検出器のタイプは、行われている分析の特定のタイプに依存して変えることができ、本発明に使用するための適切な検出器を選択し、構成することは、当業者の常識範囲である。たとえば、種々のアッセイは、検体の識別及び定量用の分析試薬における着色に依存する。このようなアッセイのために、検出器は、分光光度計又は光もしくは他の所定波長の電磁放射線を溶液に通過させて着色の程度を測定するように構成された他の光学検出器でもよい。一例として、検出器（後ほどより詳細に説明する）は、FEP（McMaster-Carr、Los Angels、CA）から機械加工され、トラップされた磁性粒子の下流で吸光度測定に用いられるU字形透過率フローセルを含む。光路長は１ｃｍ長さであり、吸光度測定は、Ocean Optics（Dunedin、FL）ファイバー光分光光度計及びタングステンハロゲンランプを用いてなされた。検出のために、４００μｍ水晶ファイバーを用いた。永久磁石及び光学検出器を含む実施形態は、図８に示されている。
【００３９】
追加の感応性が必要とされるアッセイのために、ケミルミネッセンス又は感度強度を数桁増加させるリポゾームベースイムノアッセイなどの他の検出スキームを利用するようにアッセイを修正することを望むかもしれない。広範囲の標識（すなわち、放射性同位体、発色基又は発光基など）を用いることができ、当業者は、広範囲のこのようなアッセイ用の適切な検出器を選択し実装することができる。
【００４０】
流体フローコントローラ５０は、本発明にしたがって広範囲の種々の形状を有することができる。図３に示した一実施形態において、フローコントローラ５０は、多重ポート選択バルブ５１と、保持コイル５４と、可変速度リバーシブルポンプと、を含む。この実施形態において、多重ポート選択バルブ５１は、１個の一次ポート５２と複数の第２ポート５３と、を含む。第２ポートの一つは、流体流路１０と流体的に接続されており、一次ポート５２は、保持コイル５４と流体的に接続されておいる。他の第２ポート５３は、場合によっては、所定の分離／再懸濁手順に用いるべき種々の流体源に、それぞれ流体的に接続されている。詳細は後述するが、空気を保持コイルに引き込むために、あるいはシステムから廃棄物を消散させるために、また別のポートを用いることもできる。保持コイル５４の基端５５は、可変速度リバーシブルポンプ５８に流体的に接続されている。一実施形態において、ポンプ５８は、ステッピングモータを含むシリンジポンプであり、このようなポンプは当該分野で周知である。もちろん、本発明はこのタイプのポンプに限定されるものではなく、当業者には当然のことながら、別のポンプ設計を用いることができることは理解されたい。保持コイル５４は、サンプル、抽出物質又は試薬を保持するためのリザーバとして用いられる。逐次注入手順の各工程において、液体もしくはスラリーは、選択されたバルブポートを介して保持コイルに吸引され、次いで、バルブを流路ポートに切り替えて、コイル内容物を流路に注入する。空気分離器は、ビーズスラリー、サンプル及び他の溶液が保持コイル内で混合もしくは分散することを防止する。
【００４１】
図４〜６に示した別の実施形態において、フローコントローラ５０は、保持コイル及び可変速度リバーシブルポンプの間に位置づけられていて、これらと流体的に接続している多重ポートバルブ５７を含む。この実施形態において、保持コイル５４の基端５５は、バルブの第１ポートに接続されていて、バルブの第２ポートは可変速度リバーシブルポンプに流体的に接続されている。バルブの第３ポートは、所定のアッセイの完了時に、流体流路をフラッシュ洗浄及び／又は洗浄するために用いられる洗浄溶液もしくは他の試薬の源５９と簡便に接続されていてもよい。よって、この実施形態においては、分離／再懸濁の所定のシリーズの後、バルブ５７を切り替えて、ポンプ５８と源５９とを流体的に接続させ、ポンプ５８は、源５９からリザーバ５９ａに流体を抜き出す。所望容量の流体を抜き出した後、バルブ５７を切り替えて、再び、ポンプ５８と保持コイル５４とを流体的に接続させ、ポンプ５８は保持コイル、選択バルブ５１及び流路１０を通して流体を進ませ、こうして任意の残留磁性粒子及び／又は試薬をフラッシュ洗浄する。
【００４２】
このシステムを用いる分離／再懸濁手順を行う一態様において、第２ポート５３の一つをキャリア媒体中の磁性粒子源と流体的に接続させる。一次ポート５２及び粒子／媒体混合源との間に流体連通を提供するように選択バルブ５１を位置づけて、ポンプ５８は負圧を作用させて、こうして多量の混合物を保持コイル５４内に引き込む。次いで、保持コイル５４及び流体流路１０の間に流体連通を提供するように、選択バルブ５１を移動させる。更なる培養を所望時間行った後（所定手順に追加の時間が必要である場合）、ポンプ５８は正圧を作用させて、こうして混合物を選択バルブ５１を通して流体フローセル１０に進ませ、及び捕捉ゾーン４０を通過させる。捕捉ゾーンを通過する流速は、混合物中の磁性粒子の大部分が、磁界の力によって捕捉ゾーン４０に捕捉され、磁性粒子単離物を提供するに十分に緩慢である。磁性粒子が変性磁性粒子であり、キャリア媒体が特定の検体の存在及び／又は定量用の被験サンプルを含む場合、許容可能なアッセイ結果を提供するように慎重に制御された期間中、粒子は媒体と接触したままでいなければならないことが理解される。したがって、粒子とサンプルとの接触が特定の長さの時間にわたり維持されるべき手順において、最初の接触の時間からタイミングシーケンスを開始することは重要である。
【００４３】
自動化システムにおいて、キャリア媒体は不活性キャリアであり、保持コイル内又は流体フローセル内で混合が生じるまで、被験サンプルから磁性粒子は分離されたままである。この実施形態において、被験サンプル及び必要に応じて他の試薬は、別個にもしくはあらかじめ混合された溶液内で、他の第２ポート５３の１個以上と流体連通状態に置かれる。
【００４４】
磁性粒子及び被験サンプルの混合が保持コイル内で生じるべき場合には、磁性粒子懸濁液、被験サンプル及び他の試薬は、別個に又は同じあらかじめ混合された組み合わせで、選択バルブ５１及びポンプ５８の調和動作により、保持コイル内に交互に引き込まれる。それぞれの量が交互に保持コイルに引き込まれるので（「スタックゾーン」を形成する）、量は相互に混合するようになり、こうして、保持コイルの「スタック」中に培養期間を開始する。粒子／サンプル／試薬が保持コイル中にスタックされた後（この場合には空気分離なし）、及び場合によっては更なる培養の所望期間の後（追加の時間が所定の分析に必要である場合）、保持コイル５４及び流路１０の間に流体連通を提供するように選択バルブ５１を移動させ、ポンプは流体に対する圧力を逆転させて、選択バルブ５１を通して、及び他の流体から磁性粒子を分離するために上述の所定捕捉速度にて捕捉ゾーンを通して、流路１０に流体を移動させる。
【００４５】
混合をフローセル内で生じさせるべき場合には、選択バルブ５１及びポンプ５８の協働によって、不活性キャリア中磁性粒子懸濁液を最初に保持コイルに引き込み、最初に流路に吸引し所定の捕捉速度にて捕捉ゾーンを通して、粒子の選択性表面がまだ未反応である磁性粒子単離物を提供する。続いて、被験サンプル及び他の試薬を別個に又は予め混合された組みあわせとして、流路１０に通過させて、単離物を散布して、粒子を再懸濁させる。所定の分析のために、特定の順番の接触が望ましい場合には、流体が流路１０内に吸引される順番は、選択バルブ５１及びポンプ５８の協働制御により、容易に制御されることはもちろん理解されるべきである。さらに、本発明の中間工程として、流体の追加の混合が望ましい場合には、一般には上述のように、選択バルブ５１及びポンプ５８の協働制御により保持コイル54内に「スタックゾーン」を創製することによって、再懸濁した磁性粒子混合物又は他の流体を保持コイル内で混合することができることも理解されるべきである。
【００４６】
キャリア媒体からの磁性粒子の分離により磁性粒子単離物が形成されると、磁性粒子単離物は、例えば洗浄溶液などの分散媒体に散布される。いくつかの実施形態において、分散媒体は、リザーバ５９ａ内にすでに存在しているか、又は混合物に「隠れて」保持コイル５４内に存在する。図４に示すような他の実施形態において、分散媒体源は、ポンプ５８と源５９との間に流体連通を与えるバルブ５７の移動、リザーバ５９ａへの分散媒体の吸引、ポンプ５８と保持コイル５４との間に流体連通を与えるバルブ５７の移動、及び分散媒体をコイル５４を通して、選択バルブ５１を通して流路１０に流通させるようにポンプ５８によって与えられる圧力の反転によってアクセス可能である。このような実施形態において、分散媒体は、選択バルブ５１の更なる移動なしに、フローセル１０に吸引され分散される。別の実施形態において、分散媒体源は、選択バルブ５１の第２ポート５３のひとつを通してアクセス可能である。このような実施形態において、最初に分散媒体を保持コイル５４に引き込むことによって、分散媒体はフローセル１０に吸引される。このような実施形態において、保持コイル５４と分散媒体源との間の流体連通は、選択バルブ５１の移動により提供され、ポンプ５８は負圧を作用させ、こうして大量の分散媒体を保持コイル５４に引き込む。次いで、選択バルブ５１を移動させて、保持コイル５４と流体流路１０との間に流体連通を再び与え、ポンプ５８は正の圧力を作用させ、こうして媒体は選択バルブ５１を通って、流体フローセル１０に入り及び捕捉ゾーン４０を通過するように進められる。捕捉ゾーンを通過する流速は、最初は、磁性粒子単離物の崩壊を防止するに十分緩慢である。分散媒体の幾分かに単離物を散布した後、ポンプ５８はより大きな圧力（正又は負）を短時間だけ作用させて、磁性粒子単離物を捕捉ゾーンから取り除き、磁性粒子を磁界から取り除き、磁性粒子を分散媒体に懸濁させて、第２の混合物を与えるに十分な速さの流速を有する流体フロー脈動（パルス）を捕捉ゾーン内に生じさせる。
【００４７】
磁性粒子は、一般には上述のように、分散液から分離されて、同一又は異なる媒体中で、１回以上、再び懸濁されて、再び分離されてもよい。あるいは、第２の混合物を１種以上の物理的又は化学的特性を検出するための検出ゾーン６０に通過させることもできるし、あるいは別のタイプの更なる処理のために集めることもできる。
【００４８】
本発明の特に好ましい実施形態において、選択バルブ５１、ポンプ５８及びバルブ５７（存在する場合）は、図７に概略的に示されている予めプログラムされたシーケンサー７０の制御下にある。シーケンサー７０は、バルブの移動を制御して所望のフローセル間の流体連通を与え、ポンプを制御して上記に例示したような所望の大きさの正又は負の圧力を適切な回数与え、こうして流体流路１０を通過する流体の移動を調整する。例えばシーケンサー７０がコンピュータであるような別の実施形態において、コンピュータは、検出器６２からの情報を受け取り、このような情報を解析し、表にし、解釈し及び／又は表示するように構成されていてもよい。
【００４９】
シーケンサー７０は、単一ユニットとして構成された１個以上のコンポーネントからなるものでもよい。あるいは、多重コンポーネント形態の場合、シーケンサー７０は、他方に関して遠隔位置に置かれた１個以上のコンポーネントを有するものでも、もしくはシステム全体に分配されたコンポーネントを有するものでもよい。シーケンサー７０は、プログラム可能であり、状態論理機械（state logic machine）もしくは他のタイプの専用ハードウェア、又はプログラム可能及び専用ハードウェアのハイブリッドの組み合わせでもよい。シーケンサー７０の１個以上のコンポーネントは、デジタル回路、アナログ回路又は両者を規定する電子種（electronic variety）であってもよい。電気回路に加えて又は電気回路に代えて、シーケンサー７０は、１個以上の機械的要素、水圧要素、油圧要素、又は光学制御要素を含むものでもよい。
【００５０】
電気回路を含む一実施形態において、シーケンサー７０は、１個以上の固体メモリデバイス（図示せず）へのアクセスを有する固体集積マイクロプロセッサ又はマイクロコントローラに基づく。このメモリは、マイクロプロセッサ又はマイクロコントローラにより実行されるべきプログラム指示を含み、シーケンサー７０によって実行される１個以上のルーチンに従ってデータの読み出し及び書き出しのために配列されることが好ましい。さらに別の実施形態において、シーケンサー７０は、本発明を実施するようにカスタマイズされたソフトウェア及びハードウェアを有する産業用向けに堅牢化されたプログラム可能なパーソナルコンピュータである。この好ましい構成は、モデム又はネットワークリンクなどの通信インターフェース、及びコンパクトディスク（CD）又はフロッピィディスクなどのリムーバブル媒体を収納するサブシステムを含むこともできる。プロセッサは、ソフトウェアにより容易に再プログラム可能であることが好ましいけれども、ファームウェアによりプログラムされてもよいし、集積状態機械（integrated state machine）として構成されていてもよいし、あるいはこれらの技術の組み合わせを用いてもよい。さらに別の形態において、シーケンサー７０は、１個以上のプログラム可能なロジックコントロール（PLC）ユニットを具備している。
【００５１】
シーケンサー７０に関連する任意のメモリは、１種以上の固相電子メモリを含むものでもよく、追加的に又は代替的に磁性種又は光学種を含むものでもよい。例えば、メモリとしては、固相電子ランダムアクセスメモリ（RAM）、逐次アクセス可能メモリ（SAM）（ファースト−イン  ファースト−アウト（First-In, First-Out）(FIFO)種又はラスト−イン  ファースト−アウト（last-In, First-Out）(LIFO)種など）、プログラム可能な読出し専用メモリ（PROM）、電気的プログラム可能な読出し専用メモリ（EPROM）又は電気的消去／書込み可能な読出し専用メモリ（EEPROM）；光ディスクメモリ（CD ROMなど）；磁気エンコードハードディスク、フロッピィディスク、テープもしくはカートリッジ媒体；又はこれらのタイプの任意の組み合わせを挙げることができる。さらに、メモリは揮発性でも不揮発性でもあるいは揮発性種及び不揮発性種のハイブリッド組み合わせでもよい。
【００５２】
シーケンサー７０は、本発明を実行するために当業者がなすであろうように、コントロールクロック、インターフェース、シグナルコンディショナー、フィルター、リミッター、アナログ−デジタル（Ａ／Ｄ）コンバータ、デジタル−アナログ（Ｄ／Ａ）コンバータ、通信ポート、その他のタイプのオペレーターを含むこともできる。
【００５３】
上述のフローコントローラーを逐次注入に用いることで、イムノアッセイに幾つかの利点を提供する。逐次注入により得られる高度に再現可能なタイミングは、手動技術によっては通常考えられず達成できない非常に短い時間枠で、所望であれば非平衡測定にまで展開できる正確な分析を可能とする。注入されるサンプル容量は、非常に少量であり、試薬消費量も非常に少量である。
【００５４】
上述のように、捕捉ゾーン４０を中断させる固定磁界は、流路１０に対して固定関係を有する永久磁石により、又は流路１０に対して固定関係を有し且つ実質的に一定の磁界強度を発生する電磁石により与えることができる。永久磁石の利点の一つは、運転中に、分析に影響するかもしれない熱を発生しないことである。磁界が永久磁石により与えられる場合には、磁石は、通常、馬蹄形といわれる矩形又は標準的な棒形状などを含む広範囲の形状を有するものでよい。例えば、１個の永久磁石又は複数個の永久磁石は、断面矩形であってもよく、ある実施形態において、流体流路導管に対して接着されてもあるいは機械的手段によって固定されてもよく、あるいは非磁性保持サポートに接着されあるいは機械的手段によって固定されて永久磁石アセンブリを形成してもよい。また別の実施形態において、アセンブリは、１個の磁石又は複数個の永久磁石を収容して磁界を強めて集中させる強磁性ハーネスを含むものでもよい。磁石は、好ましくは、磁力線が流路に対して直交するように方向付けられる。別の断面形状、方向及び容器に対する磁極方向もまた考えられる。
【００５５】
加えて、永久磁石は、種々の組成を有するものでよい。数百ガウスから数千ガウスの範囲の表面磁界強度を有する希土類合金の永久磁石が好ましい。一実施形態において、永久磁石は、ネオジウム−鉄−硼素又はサマリウム−コバルトから作られた高エネルギー永久磁石である。このような磁石、及び本発明に適切に用いることができる広範囲の別の永久磁石は、商業的に入手することができる。このような広範囲の形状及び組成は、本明細書にて用いられる用語「永久磁石」の意味に含まれる。
【００５６】
標準的な棒磁石において、図６及び８に概略的に示すように、磁力線は非線形経路を辿り、磁力線が北から南へ移動するにつれて「扇形に展開する」すなわち膨らむので、勾配が存在する。これらの効果は、典型的には、高品質実験用磁石に約０．１〜１．５ｋＧａｕｓｓ／ｃｍの勾配を作り出す。本発明に必要なことではないが、当業者は、磁力線密度を圧縮するか又は拡幅するように磁気回路を操作することにより、これらの勾配が増加し得るものであることを認めるであろう。例えば、棒磁石の一極における勾配が不十分な強度である場合には、同一の反対磁界を有する第２の棒磁石を第１の棒磁石に向けて移動させると、２個の磁石の間に斥力が生じる。磁力線の数は同じままであるが、２個の磁石が共に近づけられるにつれ、磁力線は圧縮されるようになる。よって、増加した勾配が得られる。この双極子構成に反対の磁界を追加して四重極を形成すると、高勾配の領域の寸法をさらに増加させることができる。反対磁界の隣接する磁石などの別の構成もまた、等しい強度の棒磁石に見られるよりも高い勾配を作り出すであろう。外部磁界装置における勾配を増加させるまた別の方法は、磁極片設計を適応させることである。例えば、一方の磁石を尖頭磁石にすることによって、標準的な双極子磁石の形状を変化させると、すべての磁力線は尖頭に向かって流れ、その領域の周囲の勾配を劇的に増加させるであろう。
【００５７】
本発明により、流体流路の捕捉ゾーン内の磁界は、比較的低い流速（すなわち、約１〜約１３ｍｍ／ｓの流速）にて本発明により用いられるように選択された磁性粒子を捕捉する強度であろうが、比較的高い流速（すなわち約２５０〜約２５００ｍｍ／ｓの流速）を有する流体フロー内に磁性粒子を保持するには十分ではない強度を有する。好ましい磁界強度は、限定されるものではないが、捕捉ゾーン内及び他の位置でのフローセルの内径、所定の手順に用いられる磁性粒子の寸法及び磁化率、及び所定の手順が必要とする場合には分離及び散布の所望速度を含む種々の因子に依存して変動し得ることは容易に理解される。本明細書の記載からみて、永久磁石種であろうが電磁石種であろうが、広範囲な本発明のシステムについて磁界強度を選択し及び適切な磁界源を選択することは、当業者の常識でよくなされることである。一実施形態において、捕捉ゾーンは、０．１〜２ｋｇａｕｓｓ／ｃｍの平均磁界勾配を含む。別の好ましい実施形態において、強磁性物質は、流路内に又は流路に近接して置かれて、より小さくて弱い磁性粒子を捕捉するための高磁界勾配の局部領域を形成する。
【００５８】
さて、磁性粒子そのものに目を向けると、本願明細書で用いる用語「磁性粒子」とは、磁界応答性である粒子を意味する。本発明により用いるために選択される磁性粒子は、好ましくは強磁性物質を含み、より好ましくは超常磁性物質を含む。超常磁性物質は、寸法（すなわち、２５ｎｍ〜１００ミクロンの範囲であることが多い）にかかわらず、磁界に置かれると、磁性のみを示すという特性を有する。磁界が除かれると、超常磁性物質は、磁性になり、通常は懸濁液に分散し得る。超常磁性挙動の基本は、このような物質が、磁区の寸法よりも小さいと見積もられる２０〜２５ｎｍ以下の単位寸法にある磁性物質を含むことである。磁区は、存在するために永久磁石双極に対して最小の容積である。よって、これらの物質は、磁石双極を保持することができない単位のアセンブリ１種以上から形成される。このような磁性粒子は、一般的に、磁界により捕捉されるべき例えばマグネタイト、遷移金属若しくは希土類元素などの鉄系酸化物などの強磁性物質を少量含むポリマー物質である。他の遷移元素酸化物及びこれらの混合物を用いることもできるが、選択された磁性物質はマグネタイトである。
【００５９】
本発明の多くの好ましい用途に対して、磁性粒子の表面は、抗体、レクチン、オリゴヌクレオチド又は他の生物反応性分子などのリガンド又はレセプターで被覆されていて、他の物質との混合物中のターゲット物質と選択的に結合することができる。磁性粒子の表面化学は、ターゲット物質と磁性粒子の表面との間の静電気相互作用、ファンデルワールス相互作用、双極−双極相互作用又は水素結合相互作用ゆえに、ターゲット物質を捕捉するためにも用いることができる。磁性粒子は、種々の用途、特に健康管理、例えばイムノアッセイ、細胞分離及び分子生物学に用いられており、これらの粒子の多くは商業的に入手可能である。このような手順を行うために有用な超常磁性粒子は、特定の親和性結合対の一方の員、すなわちリガンド又はレセプターの吸着又は共有結合に対する適切な結合表面容量を提供する。
【００６０】
幾つかの磁性粒子は、磁性結晶が堆積している球状ポリマー物質から構成される。これらの物質は、そのマグネタイト含量及び寸法ゆえに、オープン磁界勾配で容易に発生され得る比較的低い磁界（０．５〜２ｋＧａｕｓｓ／ｃｍ）中で容易に分離される。物質の別の同様な分類は、典型的には約０．５〜約０．７５ミクロンの寸法範囲で製造される粒子である。適切な物質の別の分類は、基本的に、約１ミクロン寸法のマグネタイト結晶のクラスターであり、バイオレセプターが結合し得るアミノポリマーシランで被覆されている。これらの高度磁性物質は、比較的低い勾配（すなわち、０．５ｋＧａｕｓｓ／ｃｍ程度に低い勾配）で容易に分離され、その寸法ゆえに長時間懸濁したままとすることができる。
【００６１】
本発明に従って用いられる磁性粒子の好ましい直径は、０．１〜３００ミクロンの間の範囲にある。磁性粒子は、今日、抗体若しくはＤＮＡ分子と結合可能な官能基又はサンプル精製用の他の結合サイトを含む官能基を伴い又は伴わず、広範囲に商業的に入手可能である。適切な磁性粒子は、Dynal Inc. (Lake Success, N. Y.)；PerSeptive Diagnostics, Inc. (Cambridge, Mass)；及びCortex Biochem Inc. (San Leando, Calif.)から商業的に入手可能である。
【００６２】
本発明に従って用いられる他のタイプの磁性物質は、ナノサイズのコロイドである（例えば、Moldayの米国特許U. S. Patent No. 4,452,773；Owenらの同4,795,698；Yudelsonの同4,965,007；及びLibertiらの米国特許出願U. S. Patent Application Ser. No. 07/397,106参照）。ナノサイズコロイドは、典型的には、ポリマー物質で被覆されているマグネタイトの単結晶ないし多結晶の凝集物から構成される。ここで、ポリマー物質は、凝集物を親水性とする。個々の結晶は、約８〜約１５ｎｍの寸法の範囲であってよい。これらの物質のコーティングは、たとえ永久的ではないにしてもほぼ永久的にコロイド状態に維持するための水性溶媒との十分な相互作用を有する。当業者は、それらの寸法及び溶媒水との相互作用ゆえに、ナノサイズのコロイドを分離するために実質的な磁気勾配が必要となることを認めるであろう。したがって、このようなコロイドが用いられるシステムにおいて、より大きな強度の磁界が好ましい。
【００６３】
本発明の一つの利点は、磁性粒子が所定の試薬中若しくは他の媒体中に懸濁する間の時間を正確に制御できるということである。加えて、本発明のアプローチは、マイクロモル濃度範囲で迅速で且つ感応的である自動化イムノアッセイを実現できるということである。本発明の特に有利な用途は、競合イムノアッセイにより被験サンプル中の検体の量を決定するために表面変性磁性粒子を利用する、自動化逐次注入手順を用いるELISAアッセイを行うことである。
【００６４】
磁性粒子結合抗体と酵素増幅検出を伴う競合イムノアッセイは、幾つかの工程を含む。例えば、検体としてTNTを用いる場合、第１の工程はTNTサンプルと、TNT−酵素コンジュゲートと、不動化抗体とを混合することである。本発明による半自動化手順において、これらの成分を、例えば、競合結合させるためにポリプロピレンバイアル中で混合することができる。磁性粒子上に不動化された抗体を用いることは、次の工程において、抗体結合成分からの溶液成分の分離を促進する。粒子を分離して洗浄した後、分析用着色溶液を添加する。これは、酵素との接触により物質を検出用着色生成物に変換するための試薬を含む。正確な反応時間の経過後、吸光度測定を行う。
【００６５】
典型的なシーケンスは以下の通りである。（１）検体に対する抗体で被覆された磁性粒子を、検体及び検体−酵素コンジュゲート（酵素は着色試薬上で作用して発色する）を含む被験サンプルと混合して、所定時間培養する、（２）この混合物を流体フローセル中に及び固定磁界中の捕捉ゾーンを通して吸引すると、磁界が流路中の粒子をトラップして磁性粒子単離物を形成する、（３）磁性粒子単離物を、洗浄溶液の吸引及び脈動により、１回以上、洗浄溶液中に再懸濁させ、捕捉流速にて捕捉ゾーンを貫通する再懸濁した粒子のフローの逆転及び通過により捕捉ゾーン中に交互に再捕捉させる、（４）洗浄した磁性粒子単離物を、試薬の吸引及び脈動により、着色試薬中に再懸濁させる、（５）所定の長さの反応時間の経過後、磁性粒子を、捕捉流速にて捕捉ゾーンを貫通する試薬及び粒子のフローの逆転及び通過により、捕捉ゾーン中に再捕捉させる、（６）着色試薬を、着色検出用光学セルに通過させる、（７）洗浄溶液を、比較的高速でフローセルに通過させて、残留粒子及び／又は試薬をフローセルから洗い流して、システムを次の手順に調整する。
【００６６】
このように、一実施形態において、本発明は、オペレータの関与を最小化する自動化ELISA機器を提供する。自動化ELISAシステムは、人手による手順と同じように作用するが、より少量の試薬及びより短い反応時間で済み、よって、被験サンプルを信頼性良く且つ再現性よく分析し得る持ち運び可能な機器を提供するように構成することができる。本方法は、汎用性があり自由度があるので、多くの異なる用途に適用し得る。使用済み磁性粒子は、各分析後に廃棄されてもよい。これは、反応表面の不安定性の問題を排除し、時間を節約しサンプリング頻度を増加させるばかりでなく新鮮で均一な磁性粒子の部分を用いて各個別のサンプリングサイクルを提供するために固体反応相の再生に慣用的に必要とされていた追加の時間の必要性を排除する。使用済み磁性粒子は、オフラインで集められて、後ほど再生されてもよい。本発明の手順は、必要とされる容量が少なく、サンプルの取り扱いが少なく、正確な再現性を有するので、扱いにくく時間消費型で労働集約型で半定量的な伝統的なイムノアッセイを改良する為に有用であることがわかる。
【００６７】
上述の実施形態に加えて、記載されたシステムの種々の別の形状も本発明の範囲内にある。一例として、本発明は、流路が多重捕捉ゾーンを含むシステムをも意図する。このような実施形態において、手順は、流体流路内の流体フローが一方向性であるように実施されてもよい。多重捕捉ゾーンを含むシステムにおいて、磁性粒子は、一般には上述のように、第１の捕捉ゾーン中でキャリア媒体から分離されて、第１の磁性粒子単離物を提供してもよい。第１の単離物は、次いで、第２の捕捉ゾーンの方向での分散媒体の脈動により、再懸濁されて、第２の混合物を提供してもよい。フローは、次いで、所望により停止されて、捕捉ゾーン間での培養時間を提供し、次いで、第２の混合物の第２の捕捉ゾーンでの同じ方向での通過を再開して、磁性粒子を分散媒体から分離させて、こうして第２の磁性粒子単離物を形成してもよい。次いで、流体流路中の別の捕捉ゾーンにて若しくは同じ捕捉ゾーンにて、流体フローの反転を利用して、さらなる再懸濁／再捕捉工程を行うこともできる。このようなシステムは、例えば、所定のアッセイ又は他の手順の為に数回の捕捉／再懸濁工程が必要となる場合に用いることができる。
【００６８】
別の実施形態において、多重ポート選択バルブ５１の第２ポート５３と流体連通関係にある多重アッセイ用の試薬を含み、同じサンプルの定量に関する異なるアッセイを連続的に行うことで、同じ被験サンプルで多重アッセイを行うことができる。例えば、１のサンプル上で一つのアッセイを行い、次いで、同じサンプル上で異なる分析を行うことが望ましいかもしれない。この実施形態において、アッセイ及び洗浄溶液又は他の洗浄試薬でのフラッシュ洗浄の完了後、被験サンプルと、被験サンプルに結合する異なる選択基、そしておそらくは別のアッセイを逐次的に行うための他の試薬を有する磁性粒子と、を自動的に混合するようにシステムを構築してもよい。
【００６９】
ある種のアッセイの特定の要求を満たすために、追加の変更が想像される。例えば、ある種の着色溶液は露光時に光触媒作用を受けることは理解される。このように、着色試薬を利用する実施形態において、着色試薬が通過する流体流路及び他の流体移動経路を画定する導管は、不透明な物質で作られているか又は例えばテープの層など不透明な物質で被覆されていて、着色試薬が露光又は他の電磁放射線に暴露されないようにする。テープ又は他の不透明な物質は、さらに、他の感光性試薬を含むか又は移動させるかもしれないフローラインをカバーするためにも使用することができることも理解される。
【００７０】
同様に、本発明のある種の用途は、限定されるわけではないが、温度感応性であるＤＮＡ、タンパク質及びこれらの組み合わせを含む物質を含む。このように、本発明のシステムは、場合によっては、生物分子を扱うサンプルのための温度制御を含むこともできる。温度制御は、ＤＮＡハイブリダイゼーション及び溶出の結合速度及び溶出速度の最適化、並びに重合鎖反応（ＰＣＲ）を用いるＤＮＡ増幅又は熱循環を必要とする他の酵素増幅方法に有用である。昇温された温度は、サンプルからの検体抽出中又は続く洗浄工程中のいずれかで干渉物質を排除することで、サンプル精製を補助することができる。本発明の装置に温度制御要素を含むこと及び所定の制御された温度にて本発明の手順を行うことは、当業者の常識範囲内である。
【００７１】
以下の特別の実施例を参照しながら本発明をさらに説明する。これらの実施例は本発明を説明するだけであって、本発明を限定するものではないことは理解されるであろう。
【実施例】
【００７２】
［実施例１］  エンザイムリンクドイムノソーベントアッセイを使用する水中TNTの逐次注入分析
本実施例は、本発明のシステムにおける磁性粒子の捕捉及び再懸濁を決定するために、下記のように行った。
【００７３】
化学物質：TNT RaPIDアッセイ（商標）キットをELISA試薬（Strategic Diagnostics, Newark, DE）とした。用いた試薬は、TNT−セイヨウワサビペルオキシダーゼ（TNT-HRP）コンジュゲート、着色溶液（3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン及びH2O2）、及び不動化抗TNT抗体を有する不規則な０．５μｍ直径の磁性粒子の懸濁液であった。着色試薬溶液は、発色性物質（chromogenic substrate）3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン（TMB）及びH2O2を含んでいた。正確な配合は独自のものであるが、しかし、最適化された試薬配合物は、HRP−アトラジン（atrazine）コンジュゲート及びTMBを用いるものとして、同様のアトラジン（atrazine）ELISAについて公開されている。C. S. Hottenstein、F. M. Rubio、D. P. Herzog、J. R. Fleeker及びT. S. Lawrunk "Determination of trace atrazine levels in water by a sensitive magnetic particle-based enzyme immunoassay"、J. Agric. Food Chem., 44(11), (1996)3576-3581。
【００７４】
洗浄溶液は、pH６．２で、０．０３３M ホスファート、０．０３３Ｍ NaCl及び０．１％ポリソルベート 20(P20)(BiaCore, Piscataway, NJ)非イオン性界面活性剤であった。洗浄溶液は、フローシステム中でのキャリア溶液としても作用した。DNA Zap（商標）溶液は、Ambion（Austin, TX）からのものであった。アセトニトリル中１０００μg/ml TNTのSupelcoからのＴＮＴの標準溶液を希釈して、pH６．２で０．０３３Ｍ ホスファート、０．０３３Ｍ NaCl及び０．００７％のP20のTNT標準を調製した。
装置：FiaLab 3000システム（FIAlab Instruments, Inc., Bellevue, WA）が、ビルトインタイプ３方向バルブ（Cavro, Sunnyvalve, CA）及び１０ポートCheminert（登録商標）選択バルブ（Valco, Houston, TX）付のステッピングモーター駆動シリンジを提供する、図９に示すフローシステムを用いた。洗浄液入口、着色剤入口、廃棄物出口は、内径０．０３０インチのフッ化エチレン−プロピレン（FEP）チューブ（Valco）であった。着色剤入口は、収縮ラップチューブにより、光からシールドされていた。保持コイル及びセル出口もまた、光からシールドされていた。６００μｌの保持コイルは、Upchurch Scientific（Oak Harbor, WA）からの内径０．０３０インチのポリエーテルエーテルケトン（PEEK）であった。磁石に接触して、バルブから光学セルまで延在するフローラインは、内径０．０２インチのPEEKであった。バルブから磁性ゾーンの中心までの容積は２２μｌであり、磁石の中心から光学セルまでの容積は１８μｌであった。
【００７５】
1/2×1/4×5/8インチのNbFeB永久磁石は、Dexter Magnetic Technologies（Windsor Locks, CT）から入手した。磁石の1/4×5/8インチ面は、極であった。一つの極を、5/8インチ長さに沿って延びる磁性ゾーンチューブに対向して置いた。チューブは、外径0.062インチ及び内径0.02インチPPEKチューブの一方の側面を総厚が0.045インチとなるまでヤスリ仕上げすることによって、薄くして、磁石に対する平坦な表面を作った。理論的には、これは、チャネルと磁石との間にチューブ壁０．００４インチを残すが、実際の距離は、チューブ内のチャネルの中心位置付けの変動ゆえに、いくらか大きかったり小さかったりする。
【００７６】
透過率セル検出器をFEP（McMaster-Carr, Los Angeles, CA）から切削した。図9に示すように、検出器の入口、出口及び光路はU字形チャネルを形成した。入口及び出口は、Upchurchチューブ取り付け具を収容するようにテーパー付けされていた。光路を貫通するフローチャネルは、１ｃｍ長さで１ｍｍ直径であった。イルミネーションファイバーは４００μｍで、コレクションファイバーは２００μｍであった。両方のファイバーは、端部に、外径０．０６２インチのステンレススチール中に内包される水晶であった。ファイバー端部は、フローセルに嵌合されていた。FEPが透明なので、方法進行中、フローチャネルを肉眼で見ることができた。実際の実験中は、セルをテープで覆って、着色溶液の光触媒を防止した。LS-1タングステンハロゲンランプ及びSD-2000 CCDアレイ分光光度器は、Ocean Optics（Dunedin, FL）から入手した。NG5型光ファイバー（Schott Glass Technologies, Inc., Duryea, PA）は、ランプを弱くすることが必要であった。このフィルターで、CCDの積分時間は、１走査あたり７５ミリ秒に設定して、６３０ｎｍにおける光飽和から十分な安全域を維持した。吸光度は、光路中でミキシングされる機器変動及び屈折率を修正するため７３０ｎｍにてモニターしたベースラインに対して、酵素生成物のλmax６３０ｎｍにてモニターした。
【００７７】
Visual C++（Microsoft, Redmond, WA）及びOOIWinIP ダイナミックリンクライブラリ（Ocean Optics）を用いて、CCD分光光度器を制御するためのシステムソフトウェアを書いた。
原理体系、半自動化手順：流体及び磁性粒子取り扱い
酵素触媒増幅による磁性粒子における競合イムノアッセイは、いくつかの流体及び粒子取り扱い工程を伴う。検体を含むサンプル１００μｌと、表面不動化抗体を含む磁性粒子懸濁液２００μｌと、検体−酵素コンジュゲート１００μｌとを、この順序で添加することにより、競合アッセイをバイアル内にセットアップする半自動化工程を以下に記載する。
【００７８】
記載されるべき半自動化アプローチは、競合アッセイ混合物がテストバイアル内で混合された後に開始する。機器は培養時間を計時するので手動タイミングが必要ではなく、冗長な手動分離は、洗浄溶液及び続く着色溶液の流体デリバリを伴う、磁性流体フローセル内での自動粒子捕捉により置き換えられる。着色反応時間は、手動タイミングに依存せず、停止溶液を用いる必要がない。代わりに、機器は、正確な時間経過後、自動的に着色生成物を検出器に送る。
【００７９】
半自動化手順において、最初の手動工程は、TNT溶液、磁性粒子懸濁液及び酵素コンジュゲートを、この順番で、ポリプロピレンバイアルに注入し、１０秒間の混合を行うために用いた。４分間の培養時間経過後、図９に示す逐次注入システムを用いて、Table 1に示す逐次注入方法を行った。明瞭にするために、標準備品の詳細は省略するが、流体の間に１０Lの空気分離器を用い、各注入の前に保持コイルに流体を装填した。圧力平衡にするために各シリンジを移動させた後、選択バルブを切り替える前に、少なくとも０．５秒の遅れを予定した。これは、空気セグメントを周囲圧力に維持することを補助する。フローシステム中のキャリア溶液は、洗浄溶液と同一とした。フローコントローラ内のキャリア溶液から試薬を単離するために、小さな空気セグメントを用いることが好ましいが、気泡が光学的検出に影響するので、試薬の最終部分及び空気分離器を流路に散布しないように注意する。
【００８０】
プログラムされた工程を用いて、競合アッセイ混合物をシステム内に引いて、TNT及び抗TNT抗体に結合した酵素コンジュゲートの混合物を有する磁性粒子を捕捉し、粒子を洗浄し、粒子と着色生成物の酵素触媒発生用試薬とを混合させ、正確な着色時間中、粒子を保持し、粒子を再捕捉し、着色溶液を吸光度測定用透過セルに送った。吸光度測定のピーク面積を定量化のために用いた。Table 1は、標準物質半自動化手順をより詳細に記載する。この手順における着色時間は、４分であった。１実験に対する総所要時間は、混合物培養時間から開始して、粒子を捨てて、混合物及び着色剤入口を空気で洗浄して、吸光度測定の完了まで、１７．２分であった。これは、手動手順に対する４０分を超えるアッセイ時間に匹敵する。
【００８１】
【表１】
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【００８２】
初期状態及び入口ライン準備
アッセイ実験の開始時に、入口をバルブポート側から延出して洗浄溶液２０μｌを含むようにセットアップして（バルブ切り替え中に、望ましくない空気の取り込みを防止するため）、チューブの残りは空気を含むようにした。保持コイルに溶液を引き込む前に、ポートを初期化するために、チューブの容積（あらかじめ計測してあり、プログラムのパラメータである）よりも５μｌ多い容積を保持コイル内に引き込んで、次いでこの容積に更に３０μｌの洗浄溶液を加えた容積を追い出して廃棄した。こうして、入口チューブを溶液で満たした。アッセイ後、混合物及び着色剤ポートを初期状態に再生した。
【００８３】
競合混合物取り扱い及び磁性粒子捕捉
混合物又は着色溶液を引き込む前に、空気セグメント１０μｌを保持コイル内に引き込んだ。競合混合物溶液用に、キャリア溶液から混合物を分離するために空気セグメント１０μｌを用いて、混合物３２５μｌを４０μｌ／ｓで保持コイル内に引き込んだ。次いで、サンプル３２０μｌを２．５μｌ／ｓで前方に押して、磁性粒子を磁性粒子捕捉セルのチューブ壁上に捕捉させた。空気セグメント及び追従する洗浄溶液を２００μｌ／ｓで、混合物ポートから捨てた。２００μｌ／ｓ未満の速度は、０．０３インチのFEPチューブ壁、すなわちチューブから空気を除くために信頼できるものではなかった。P20等の界面活性剤を少なくとも０．００７％存在させることで、疎水性表面上での空気の破壊を防止する。
【００８４】
洗浄工程
捕捉された磁性粒子を、多重ポートバルブに粒子を引き戻す、２００μ／ｌにおける１５μｌパルスを用いて、溶液中に最初に再懸濁させることで洗浄した。こうして、粒子懸濁液をバルブと磁性粒子捕捉ゾーンとの間の２２μｌゾーン内に滞在させた。次いで、粒子懸濁液を２．５μｌ／ｓで磁性粒子捕捉ゾーンに押し戻して、粒子を捕捉して、洗浄溶液を散布した。洗浄工程は、溶液１１５μｌを前方に押し出した。標準的な手順には、このような洗浄工程が２回ある。これらの工程の最初の工程は、競合混合物溶液を磁性粒子セルに押し出して、次いで洗浄溶液を押し出し、第２の工程は、粒子を洗浄溶液に再懸濁させ、再捕捉し、洗浄溶液を散布する。
【００８５】
着色及び検出
２００μｌ／ｓにて、５μｌパルスで、粒子を磁性粒子セルとバルブとの間に再懸濁させた。着色剤ポートを初期化して、空気セグメントを上述のようにセットアップした。次いで、着色試薬２００μｌを保持コイル内に引き込んだ。着色試薬８０μｌを２．５μｌ／ｓにて保持コイルからフローセルに向かって押し出して、磁性粒子を再捕捉して、溶液を散布した。次いで、２００μｌ／ｓにおける１５μｌのパルスを用いて、粒子を試薬溶液中に再懸濁させ、再び粒子をバルブと磁性粒子捕捉ゾーンとの間の２２μｌゾーン内に滞在させた。粒子は、着色時間の間、ここに滞在し、その後、磁性粒子セル内に自動的に再捕捉され、溶液は１μｌ／ｓにて透過率光学セルに押し出される。（後者の工程は、残っている着色試薬のほとんどを用いて光学セルに着色ピークを押し出す、１５７μｌ注入を用いた。）
洗浄及び再生工程
各半自動化工程の終わりに、混合物ポート及び着色剤ポート用の入口ラインを、空気を押し出すことにより洗浄した。実験と実験との間に、入口を上述の初期状態にセットアップし、追加のキャリア（洗浄）溶液を追い出すことによって保持コイルをリンスした。
【００８６】
図１０は、TNTのいくつかの標準濃度に対するピークを示す。この競合アッセイにおいて、最大ピークを導くサンプルTNTはなく、TNT濃度の増加はより小さなピークを導いた。５２７ng/ml及び５０００ng/mlの実験は区別できず、∞濃度と考えられる。∞ピーク面積は、ゼロではないことに留意すべきである。TNT-HRPコンジュゲートの代わりにバッファ溶液を用いて行った実験は、∞ベースラインが残留酵素活性に起因しないことを条件として、半自動化方法の∞ピーク面積に等しいピーク面積であった。粒子は、H2O2を含む着色溶液中でのFenton反応を通じて、ある種の染料形成に応答性であるべき鉄種を含む。対照実験において、粒子懸濁液に代えてバッファ溶液を用いた場合には、ピークがなかった。
【００８７】
図１１は、４３日のタイムスパンにわたる個別の８日での１１８種の半自動化手順実験に対するTNT標準濃度の関数としてのピーク面積を示す。これらは、較正曲線の予想されたS字形であり、長時間にわたる較正曲線の安定性を示す。
【００８８】
このタイプのイムノアッセイデータに対する吸光度ピーク面積Bは、式１及び２のS字形関係に慣習的に一致する。Fare, T. L,; Sandberg, R. G.; Herzog, D. P.; "Considerations in immunoassay calibration"; In Enviromental Immunocheical Methods; Emon, J. M. V., Gerlach, C. L., Johnson, J. C.; American Chemical Society: Washington, DC, 1996; ACS Symposium Series 646; pp. 240-253
【００８９】
【数１】
2005528584.tif 000004
【００９０】
パラメータB0は、対照のピーク面積を示す。よって、B/B0は、応答性の基準として用いられるサンプルと対照とのピーク面積比である。Cはサンプル濃度であり、C0.5はB/B0が５０％である場合の濃度である。パラメータｂは、曲線の直線領域の傾きに関連した当てはめパラメータ（fitting parameter）である。図１０に示す場合のように、無限大濃度におけるピーク面積がゼロではない場合には、式２の関係を用いる。左辺は「修正された」B/B0である。パラメータｄは、無限大濃度ピークのピーク面積に対する当てはめ値（fitted parameter）であり、ａはB0に対する当てはめ値である。図１１は、半自動化点順を用いて得られたこれらのデータに対して当てはめた曲線をプロットしたものである。
【００９１】
我々の結果は、特に、イムノアッセイにおけるあてはめＳ字形較正曲線における認識されている不確実さを考慮すると、供給元との非常に合理的な一致を見た。我々の手順は、抗体（磁性粒子上）とTNT-HRPコンジュゲートとを供給元が推奨する手順と同じ比率で混合する。我々の当てはめは、供給元の文献値である１．４４ng/mlの値と比較して、ピーク面積が対照ピーク面積（無限濃度ピーク面積について較正した）の５０％である場合のTNT濃度に対して１．５１ng/mlの値を与える。ピーク面積が９０％である場合のTNT濃度は、供給元により与えられた０．０７ng/mlと比較して、０．１６ng/mlである。供給元は、この基準を用いて、他にもあるが、より低い検出限界を規定する。C. S. Hottenstein, F. M. Rubio, D. P. Herzog, J. R. Fleeker及びT. S. Lawrukの"Determination of trace atrazine levels in water by a sensitive magnetic particle-based enzyme immunoassay"、J. Agric. Food Chem., 44(11), (1996)3576-3581。
【００９２】
各テスト濃度に対する標準偏差及び相対的標準偏差をTable 3に示す。
【００９３】
【表２】
2005528584.tif 000005
【００９４】
反復対照実験の平均からの２種の標準偏差は、検出限界を規定するために用いられる別の手段であり、C. S. Hottenstein, F. M. Rubio, D. P. Herzog, J. R. Fleeker及びT. S. Lawrukの"Determination of trace atrazine levels in water by a sensitive magnetic particle-based enzyme immunoassay", J. Agric. Food Chem., 44(11), (1996)3576-3581、産業標準方法とすべきであると報告されている。Deshpande, S. S. Enzyme Immunoassays: From Concept to Product Development; Chapman & Hall: New York, 1996, p.323。対照実験及び標準実験に対する我々のデータの非常に多くは、平均の２種の標準偏差内にある。この基準を用いて、我々のデータは、検出限界として０．４ng/mlの値を得た。我々の結果は、単日の反復実験に基づくものではなく、４３日間にわたって採取したデータに基づくものであることに、再度、注目すべきである。
【００９５】
４３日の再現性テストは非常に厳格なものである。このTNTアッセイキットについて、供給元は、各５日間の５回の反復実験（２５サンプル）に対する３〜８％のアッセイ内及びアッセイ間での％ＣＶ値を報告し、１０％の％ＣＶを特定する。％ＣＶは、変動係数（標準偏差／平均×１００）であり、イムノアッセイ文献に用いられている相対的標準偏差に対する用語である。Desphande, S. S. Enzyme Immunoassys: From Concept to Product Development; Chapman & Hall: New York, 1996, p.314。典型的には４３日間にわたり６〜９％の値である我々の結果（Table 3）は、極めて良好で、供給元の規格と合理的な一致を見る。１つの濃度（２５％標準偏差で１．８ng/ml）は、明らかに異常値であり、数種の濃度は３〜４％である。さらに比較するために、自動化マイクロプレートシステムを用いるアラクロールに対するELISAアッセイにおいて、Youngらは（Young, B. S. : Parsons, A.; Vampola, C.; Wang, H. ; "Evaluation of an automated immunoassay system for quantitative analysis of atrazine and alachlor in water samples"; In Environmental Immunochemical Methods; Emon, J. M. V., Gerlach, C. L., Johnson, J. C.; American Chemical Society: Washington, DC, 1996; ACS Symposium Series 646; pp 183-190）、各５日間の２種の標準に対して、２〜９％の範囲にある％ＣＶ値を報告する。別個の５日間の３種のスパイクドMili-Q水サンプル（triplicate spiked Milli-Q water samples）について、％ＣＶ値は、７％を越えていた。５日間にわたる反復実験についての５〜１０％の％ＣＶ値は、アトラジンについての磁性粒子に基づくイムノアッセイについて報告されている。C. S. hottenstein, F. M. Rubio, D. P. Herzog, J. R. Fleeker及びT. S. Lawruk, "Determination of trace atrazine levels in water by a sensitive magnetc particle-based enzyme immunoassay", Journal of Agricultural and Food Chemistry, 44(1996)3576-3581。４３日間にわたる我々の精度は非常に良好であったと結論する。
【００９６】
手動手順との対比
上述の手順は、手動手順に似た作業を行うために設計されたものであるが、より少量の試薬及びより短時間の反応時間を伴うものであった。抗体の酵素コンジュゲートに対する比率は、手動手順におけるものと同じであったが、手動手順における粒子懸濁液５００μｌ及びTNT-HRPコンジュゲート２５０μｌの容積とは対照的に、粒子懸濁液２００μｌ及びTNT-HRPコンジュゲート１００μｌを用いた。各４分間の培養時間及び着色時間は、１５分間の培養時間及び２０分間の着色時間を要する手動方法手順よりも大幅に短い。我々のより短い時間は、全体の分析時間を顕著に短縮しないが、適切なピーク面積を得るために十分であった。
【００９７】
例えば、培養時間及び着色時間などの手動手順において生じる不整合ゆえに、自動化は変動性を減少させた。本実験は、半自動化及び自動化手順が、４３日間にわたり優れた結果を発現することを示す。
【００９８】
着色データの分析
着色時間を増長させると、予想されたように、対照実験（標準物質半自動化手順にて）についてのデータに示されるように、Table 4における着色時間の関数として、生成物の発生も増加する。
【００９９】
【表３】
2005528584.tif 000006
【０１００】
より長い着色時間では、より大きなピーク面積を得ることができるが、そうすることに利点はないようにみえる。手動手順において、着色溶液５００μｌが用いられるが、これは追加の５００μｌの停止溶液で希釈されることに留意すべきである。着色生成物は、１ｍｌ中に均一に分布する。フローシステムにおいて、コンジュゲートした酵素を有する磁性粒子は、２２μｌのチューブゾーン内に位置づけられ、着色ピークは約５０μｌの揚水容積での光学セルを通過する。疑いなく、０．０２インチチューブから１ｍｍ（０．０４インチ）フローセル直径に進むにつれて、ある分散が生じる。よって、着色生成物は、手動手順におけるよりも、少なくとも２０倍の濃度である。加えて、我々は、中性pHにおける青色着色生成物が、酸性溶液中での黄色形態よりも、より高い吸光度ピークを有することを観察した。
【０１０１】
培養時間を増長させると、Table 5に示すように、対照サンプル及び標準サンプルの両者について、ピーク面積が増加する。
【０１０２】
【表４】
2005528584.tif 000007
【０１０３】
Ｂ／Ｂ0における応答性は、Table 5に示すように、１分間よりも長い培養時間にて、時間と共に幾らか減少する。例えば、用いた４．３ng/mlサンプルについて、Ｂ／Ｂ0値は、これらの実験において４分間の０．３２から８分間の０．２９に変化した。勾配は、４分間から１６分間で変化しない。アッセイは、供給元が推奨する１５分間の培養時間内に平衡に達しないので、競合混合時間の選択は幾らか任意である。非平衡アッセイの使用を増加させることはなされていない。Deshpande, S. S. Emyme Immunoassays: From Concept to Product Development; Chapman & Hall: New York, 1996, p.309。培養時間を制御しないと、分析の再現性に影響を与え得る。我々の半自動化アッセイにおいて、培養時間は自動的に計時される。
【０１０４】
我々は、較正の再現性に影響し得る他の多くの因子を試験した。手順の全工程を通して、着色溶液を遮光することは、分析ピーク面積における測定可能な差異を作り出し、再現性に重要であった。室内照明は、光学的に透明なチューブを用いた場合に、着色溶液の光反応によるアッセイベースラインに影響を与えることを示した。必要ではなかったが、抗体変性磁性粒子、TNT−酵素コンジュゲート、及び着色試薬溶液は、念のため、０℃に維持した。試薬供給元は、実際、酵素コンジュゲート及び粒子を使用前に室温に達するようにしなければならないと述べている。テストとして、酵素及び抗体溶液を８．２５時間にわたり、故意に室温に放置して、室温にて使用した。対照及び４．２６５ng/ml TNTについてのピーク面積は、後述し図１１にプロットするように、較正反復実験の誤差範囲内に良好に収まった。（この図は、これらの室温実験を実際に含む）
［実施例２］  アッセイ間の装置の洗浄
キャリーオバー洗浄
１つのサンプルからの次のサンプルへのキャリーオーバーを排除するために、Table 2に示す工程を用いて、アセトンでシステムを洗浄した。この洗浄手順は２分間を要した。
【０１０５】
【表５】
2005528584.tif 000008
【０１０６】
Table 2に概要を示した自動化アセトン洗浄手順は、５０００ng/mlのTNTの最大試験濃度以下の半自動化方法からのTNTキャリーオーバーを除くに効果的であった。洗浄なしの場合のキャリーオーバー誤差は、標準及び対照のシーケンス：９．３ng/ml、対照、１１０ng/ml、対照、５２７ng/ml、対照、５０００ng/ml、対照、を実験することで特徴づけられた。得られるピーク面積に基づいて、対照の見かけ濃度は０．１ng/ml、０．６ng/ml、１．２ng/ml及び１．１ng/mlであった。アセトン洗浄工程を用いると、測定可能なキャリーオーバーは見られなかった。
【０１０７】
［実施例３］  方法論、完全自動化手順
自動化方法は、サンプル、粒子懸濁液、及びTNT-HRP溶液を保持コイルへスタックされたゾーンとして引き込むことによって、サンプル及び試薬の混合を自動化した点を除いて、半自動化方法と同じであった。サンプル、粒子及びTNT-HRPのゾーン容積は、それぞれ、１０μｌ、１５μｌ及び１５μｌであった。ゾーンのスタックを１０回繰り返して、１００μｌ、１５０μｌ及び１５０μｌの総溶液容積を得た。半自動化手順と自動化手順との重要な相違点は、自動化手順において、サンプルを含まないTNTをフローシステム中に引き込んで、チューブ又はバルブ表面に吸収させることができる点である。半自動化手順においては、TNTはフローシステム内で扱われる前に、磁性粒子と結合する機会を有する。
【０１０８】
ゾーンをスタックした直後に、３部の混合物を捕捉セルに注入した。したがって、自動化方法の競合アッセイ培養時間は、ゾーンをスタックするために必要な時間と磁石に粒子を捕捉させるために必要な時間とを加えた時間として定義され、全体で４．５分であった。全体の手順は、溶液を保持コイルに吸引することから始めて、粒子を廃棄するまで、１５．８分を必要とした。
【０１０９】
較正安定性試験−自動化手順
自動化手順を評価して、較正安定性を試験するために、１４日間のタイムスパンでの自動化手順により、対照から１００ng/mlまで８３個の較正標準を実験した。これらの自動化較正データは、図１２に示す。
【０１１０】
較正は、２週間の試験期間中、基本的に安定であったが、最高の試験濃度、１００ng/mlにおける幾つかのテストの後のキャリーオーバーが、次の標準に対して予想された結果よりも低く現れた。これらのポイントは、図１２に、プロット上に記号「×」で含まれており、１００ng/ml標準の後の対照実験について特に顕著である。これらのポイントは、統計には含めなかった。
【０１１１】
洗浄なしのテストにおいて、１００ng/mlは、次の対照にキャリーオーバー効果を引き起こしたが、より低濃度では生じなかった。自動化手順は、洗浄溶液としてアセトンよりもむしろDNA-zapを用いて実験したが、これじゃ１００ng/mlでのキャリーオーバー問題を防止しなかった（DNA-zap（商標）は、混合前及び反応後に無害な２部の試薬であり、フローシステム洗浄剤として非常に魅力的である。ホスフェート−糖結合の開裂による重合鎖反応の増幅に先立ち、表面上DNA汚染物を破壊するための独自の配合物である）。
【０１１２】
２週間の較正セットの終わりに、５０００ng/ml標準を実験したところ、頑固なキャリーオーバーを引き起こし、これはDNA-zap若しくはアセトン洗浄のいずれでも取り除くことができなかった。このキャリーオーバーを解決するために、バルブを解体して洗浄することが必要であった。これは、５０００ng/ml標準をルーチン的にアセトン洗浄することができ、洗浄なしの次の対照中のTNTみかけ濃度がわずかに１．１ng/mlであった半自動化方法と明瞭なコントラストをなす。
【０１１３】
方法の進展中に、水酸化物と亜硫酸塩とを有する可溶性アニオン性TNT付加物を形成することによって、TNTキャリーオーバーを排除するために、０．３Ｍ  ＫＯＨ及び０．０３Ｍ  Ｎａ2ＳＯ3の水性混合物を少なくとも９６回用いた。この方法は、一般に満足できるものであったが、これに代えたアセトン手順はより信頼できるものであった。
【０１１４】
［実施例４］  粒子捕捉及び再懸濁評価
粒子懸濁液の５０μｌゾーンを種々の流速にて磁性粒子捕捉ゾーンを通過させ、下流の吸光度を測定することによって、粒子捕捉を評価した。磁性粒子が存在しないピーク面積に対して、流速の変化を補正した後、濁度ピーク面積は２．５μｌ／ｓで０．６％、５μｌ／ｓで７％、１０μｌ／ｓで６０％であった。ゆえに、磁性粒子の９９％が２．５μｌ／ｓにて捕捉されたことになる。粒子捕捉及び解放の繰り返し精度は、後述する較正安定性結果に現れる。
【０１１５】
ゼロから２００μｌ／ｓへの流速の突然の変化を用いて、捕捉された粒子を磁気セルチューブ壁から移動させた。２００μｌ／ｓ及び４００μｌ／ｓの流速の両方が、次の対照実験におけるキャリーオーバー酵素活性を有さないことで決定されるように、粒子解放に効果的であることが知見された。しかし、２００μｌ／ｓは、４００μｌ／ｓパルス未満の粒子を分散し、好ましかった。粒子解放は、２方向においてなされた。アッセイの完了後、粒子は解放されて、透過率光学セルを通過して前方に移動し、廃棄された。手順の間、粒子は、２００μｌ／ｓにて５μｌ若しくは１５μｌパルスのいずれかで、バルブに向かって後方に解放され、磁石とバルブとの間の２２μｌゾーンにて再懸濁した。この手順は、着色のために、粒子を試薬溶液中に懸濁させるに特に有用であるが、洗浄工程においても用いることができる。着色の後、粒子は、溶液が１μｌ／ｓにて光学透過率セルを通過して押しだされた際に、捕捉ゾーン内で再捕捉された。粒子を再懸濁させることで、磁性セル壁に対する層内に粒子を残す場合よりも、洗浄工程及び接触工程に対するより良好な表面アクセス性を与える。加えて、再懸濁は、磁性粒子が磁性ゾーンに長すぎる時間にわたり残される場合に問題となり得る粒子の凝集物が形成されることを防止する。これが、空気セグメント廃棄及び着色剤入口初期化工程の直前に、Table 1の工程４及び１０にて５μｌパルスで粒子が再懸濁された理由である。空気セグメントは、上述のように、保持コイル内に引き込まれた溶液（競合混合物及び着色試薬溶液）を分離するために用いられた。
【０１１６】
［実施例５］  別の手順
２種の別のアプローチを考えた。一方のアプローチにおいて、標識化されていない検体を最初に添加した。感応度を増加させるために時々用いられる逐次アプローチである。Deshpande, S. S. Enzyme Immunoassays: From Concept to Product Development; Chapman & Hall: New York, 1996, p. 309。TNT-HRPの添加前に、４．２６５ng/mlのTNT標準を抗体粒子で１６分間培養し、得られたピーク面積は、追加の培養なしに３種の試薬を混合した場合と同じであった。この別の４．２６５ng/mlの実験に対して、ピーク面積は４．３ng/mlと予想した。
【０１１７】
逆の実験において、粒子をTNT-HRPと一緒に培養し、３回洗浄し、TNTで培養した。アッセイの着色部分は、培養後に残る結合TNT-HRPの基準として用いた。TNT-HRPの変位は、TNT標準を１６分間培養した場合に、μg/ml範囲でのみ、顕著であった。５０００ng/mlのTNT標準は、対照ピーク面積の７１．７％であった（３回の実験の平均）。競合アッセイにおいて、この濃度は、着色工程におけるHRP活性を完全に排除する無限のTNT濃度を示した。
【０１１８】
別の実験を行った。ここで、アトラジン-HRPコンジュゲート（Strategic Diagnosticsからのもの）をTNT-HRPに代えて対照実験に用い、得られたTNT-HRP面積の対照ピーク面積の１７％を得た。これらの結果は、抗体被覆磁性粒子がアトラジン-HRPとも結合し得ることを示し、コンジュゲートした検体又は検体類似体にかかわらず、HRPに対する幾らかの親和性があることを示唆する。
【０１１９】
本明細書中に引用又は表示した刊行物、特許及び特許出願を含むすべての参照文献は、その全体を本明細書に参照として組み入れるべきとして各個別の参照文献が特別に及び個別に示されているように、参照として組み入れられる。さらに、本明細書に述べられている如何なる理論も、提案された操作の機構も、あるいは知見も、本発明の理解を深めるためであって、本発明がそのような理論、提案された操作の機構又は知見に限定されるものではない。
【０１２０】
本発明を図面及び上記説明に詳細に説明し記載しているが、これらは説明のためであって、特徴を限定するものではなく、好ましい実施形態だけが示されて記載されており、本発明の技術的範囲内にあるすべての変更及び変形を保護すべきことが望まれることは理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】図１は、本発明によるシステムの第１の実施形態の概略図である。
【図２】図２は、本発明によるシステムの第２の実施形態の概略図である。
【図３】図３は、本発明によるフローコントローラの実施形態の概略図である。
【図４】図４は、本発明によるフローコントローラの別の実施形態の概略図である。
【図５】図５は、本発明によるシステムの第３の実施形態の概略図である。
【図６】図６は、本発明によるシステムの第４の実施形態の概略図である。
【図７】図７は、本発明によるシステムの第５の実施形態の概略図である。
【図８】図８は、本発明によるシステムの第６の実施形態の概略図である。
【図９】図９は、本発明によるシステムの第７の実施形態の概略図である。
【図１０】図１０は、実施例に記載したTNTの数種類の標準濃度のピークのプロットである。
【図１１】図１１は、実施例に記載した、４３日間のスパンで８分離日での１１８の半自動化手順実験に対するTNT標準濃度の関数としてのピーク面積のプロットである。
【図１２】図１２は、実施例に記載した自動化較正データのプロットである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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