(57)【要約】本発明は、分子識別によって、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ基準種のなかの１つの細菌の検出方法に関する。本発明の方法は、配列番号：１１〜３９の配列と、逆行配列と、相補配列のなかから選ばれる１つのヌクレオチド配列を含む、前記細菌のｒｐｏＢ遺伝子の断片；または配列番号：７〜１０の配列（式中、ＮはイノシンおよびＡ，Ｔ，ＣまたはＧから選ばれる４つの異なるヌクレオチドの等モル混合物から選ばれるヌクレオチドのうちの１つに含まれる少なくとも１２の連続するヌクレオチドパターンを有する配列を含むオリゴヌクレオチドおよび逆行配列および相補配列のオリゴヌクレオチドからのオリゴヌクレオチドを使用することを特徴とする。
2005501565.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１１〜２９および３１〜３９の配列、その逆行配列および相補配列に記載されるような配列を含むことを特徴とする、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌のｒｐｏＢ遺伝子または遺伝子断片。
【請求項２】
配列番号：３〜６の配列に記載の配列の１つに相当する、請求項１に記載のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｒａｅおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓのうちの１つの細菌のｒｐｏＢ遺伝子。
【請求項３】
配列番号：１１〜３９の配列およびその逆行配列および相補配列のいずれか１つで構成されることを特徴とする、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌のｒｐｏＢ遺伝子の断片。
【請求項４】
配列番号：７〜１０の配列のいずれか１つに含まれる、少なくとも１２、好ましくは１２〜３５の連続ヌクレオチドパターンの配列を含み、前記配列番号の配列中、Ｎは、イノシンと、Ａ，Ｔ，ＣまたはＧのなかから選ばれる４つの異なるヌクレオチドの等モル混合物とのなかから選ばれるヌクレオチドを示すことを特徴とするオリゴヌクレオチド、ならびにその逆行配列および相補配列のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号：７〜１０の配列およびその逆行配列および相補配列であり、Ｎはイノシンを表すことを特徴とする請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の種のうちの１つに属する細菌の分子識別による検出方法であって、
請求項１〜３のいずれか一項に記載の前記細菌のｒｐｏＢ遺伝子、もしくは前記遺伝子の断片、または
請求項４もしくは５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド
を使用することを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項３に記載の前記細菌のｒｐｏＢ遺伝子の断片、または
請求項５に記載のオリゴヌクレオチド
を使用することを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項４または５に記載の前記オリゴヌクレオチドを含む少なくとも１つの属プローブを、少なくとも１つの前記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌の核酸を含むもしくは含む可能性のある試料と接触させる第１の工程と、
前記属プローブと試料の核酸との間でハイブリダイゼーション複合体が形成されるか否かを判定し、ハイブリダイゼーション複合体が形成されていれば試料中に前記細菌が存在すると判定する第２の工程と
からなる請求項６に記載の方法。
【請求項９】
請求項４または５に記載の前記オリゴヌクレオチドを含む増幅プライマーを、少なくとも１つの前記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌の核酸を含むもしくは含む可能性のある試料と接触させる第１の工程であって、
５’プライマーとして、配列番号：７もしくは９の配列、または相補配列のうちの１つに含まれる配列を含むオリゴヌクレオチドのなかから選ばれたオリゴヌクレオチド、好ましくは完全長の前記配列、および
３’プライマーとして、配列番号：１０もしくは８の配列、または相補配列のうちの１つにそれぞれ含まれる配列を含むオリゴヌクレオチド、好ましくは完全長の前記配列
を用いる工程と
酵素的重合反応によって核酸の増幅を行い、増幅産物の有無を判定し、これにより、増幅産物が生じていれば該試料中に前記細菌が存在すると判定する第２の工程と
からなる請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
５’プライマーとして、配列番号：７または９の配列、または相補配列のうちの１つを使用し、３’プライマーとして、配列番号：１０の配列、または相補配列をそれぞれ使用することを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｘｙｌｏｓｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｗａｒｎｅｒｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｉｍｕｌａｎｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｃｉｕｒｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｈｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｕｌｖｅｒｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｓｃａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｅｎｔｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｌｏｏｓｉｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｙｉｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｅｌｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｏｒｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｈｎｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｒｎｏｓｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｉｃｕｌａｒｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのａｕｒｅｕｓ亜種、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのａｎａｅｒｏｂｉｕｓ亜種、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｒｌｅｔｔａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｒａｅの種のなかから選ばれるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓグループの細菌の特定の種を特異的に検出することを目的とした請求項６に記載の方法であって、
少なくとも１つの前記細菌の核酸を含むか含む可能性のある試料を、請求項１または３に記載の遺伝子断片で構成される少なくとも１つの種プローブ、好ましくは配列番号：１１〜３９の前記配列、逆行配列および相補配列のうちの１つでそれぞれ構成されるオリゴヌクレオチドと接触させる第１の工程と、
前記プローブと試料の核酸との間でハイブリダイゼーション複合体が形成されているか否かを判定し、ハイブリダイゼーション複合体が形成されていれば該試料中に前記細菌が存在すると判定する第２の工程と
を特徴とする方法。
【請求項１２】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｘｙｌｏｓｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｗａｒｎｅｒｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｉｍｕｌａｎｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｃｉｕｒｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｈｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｕｌｖｅｒｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｓｃａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｅｎｔｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｌｏｏｓｉｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｙｉｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｅｌｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｏｒｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｈｎｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｒｎｏｓｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｉｃｕｌａｒｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのａｕｒｅｕｓ亜種、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのａｎａｅｒｏｂｉｕｓ亜種、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｒｌｅｔｔａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｒａｅの種のなかから選ばれるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌の特定の種を検出することを目的とした請求項６または７のいずれかに記載の方法であって、
５’プライマーとしての配列番号：７または９の配列および３’プライマーとしての配列番号：１０の配列に含まれる配列を含むオリゴヌクレオチド、好ましくは前記配列番号：７または９および１０の配列で構成されるオリゴヌクレオチド、ならびにその相補配列、で構成されるヌクレオチドプライマーを用いて、前記特定の細菌の増幅ｒｐｏＢ遺伝子断片のシーケンシング反応を実施する工程ａ）と、
前記得られた断片の配列を、それぞれ配列番号：１１〜３９の前記配列および相補配列を含む、前記細菌の完全長ｒｐｏＢ遺伝子の配列または前記細菌のｒｐｏＢ遺伝子断片の配列と比較することにより、前記細菌の特定の種の有無を判定する工程であって、得られた断片の配列が前記細菌のｒｐｏＢ遺伝子または遺伝子断片の既知の配列と同じであれば、該試料中に前記細菌が存在すると判定する工程ｂ）と
を実施することを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、
工程ａ）において、
配列番号：７の配列およびそれぞれ配列番号：１０の配列をそれぞれ含むオリゴヌクレオチド、好ましくは前記配列番号：７および１０の配列で構成されるオリゴヌクレオチド、または相補配列のなかから選ばれる５’および３’プライマー対によって、前記試料の核酸を最初に増幅し、増幅産物が生じたか否かを判定する第１工程と、
配列番号：９およびそれぞれ配列番号：１０の配列を含むオリゴヌクレオチド、または相補配列、好ましくは前記配列番号：９および１０の配列またはそれらの相補配列で構成されるオリゴヌクレオチド、で構成される５’および３’プライマーを用いて、工程１で判定されたアンプリコンのシーケンシング反応を行う第２工程とを実施し、
工程ｂ）において、得られた配列をそれぞれ配列番号１１〜３９の配列またはそれらの相補配列のうちの１つと比較することを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項３〜５のいずれか一項に記載の前記オリゴヌクレオチドまたは遺伝子断片を少なくとも１つ含むことを特徴とする、請求項６の方法において用いることのできる診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は診断の分野に関する。より詳細には、本発明はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌の分子識別方法であって、該細菌属の株に適用されるプローブまたはオリゴヌクレオチドプライマーによる検出および／または増幅およびシーケンシング技術を用いた方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌は、グラム陽性かつカタラーゼ陽性の球菌であり、亜種９種を含めた３６種が現在のところ知られている（非特許文献１）。上記の種は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｌｐｈｉｎｉｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉのｃｏａｇｕｌａｎｓ亜種、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｙｉｃｕｓの数株を除いて、コアグラーゼ陰性である（非特許文献２）。これらの種は、環境試料、獣医臨床試料およびヒト臨床試料から容易にかつ常套的に単離、培養される（非特許文献３）。ヒトにおいては、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓは、エンテロトキシンの産生に関連した食中毒、ブドウ球菌毒素性ショック症候群、および初期感染部位から離れた場所での伝染性転移を特徴とする化膿性感染に関与するコアグラーゼ陽性種である。感染と闘うための第一選択抗生物質であるメチシリンに耐性をもつＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの株は、院内感染、すなわち、病院や他の養護施設内の患者への感染に関して、公衆衛生上の大きな問題を引き起こす。コアグラーゼ陰性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の種に属する細菌は、ヒトにおける正常細菌叢の一部を成している。これらの種も、特に移植された外来材料、とりわけプロテーゼからの感染を通して、院内感染に関与している（非特許文献４）。
【０００３】
これらの様々な種には、それらの識別に関する問題が生じる。従来の表現型識別方法は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の種に属する細菌を識別するために最も多く使われており（非特許文献５）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌の表現型識別を支援するためのいくつかの識別キットや自動化装置が開発されてきた。しかしながら、常套的な手法における識別の程度にはばらつきがあり（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８）、例えばこれらの系の殆どは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｍｉｎｉｓ種およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｗａｒｎｅｒｉ種に属する細菌間を２７〜３６％の誤差率で混同してしまう（非特許文献９；非特許文献１０）。同様に、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉは、自動化識別装置によって誤って識別されてしまうこともある（非特許文献１１）。理論的には、分子的方法はその感度と特異性により、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌を識別する場合により良好な結果を与えうる。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌の分子識別のために現時点で提案されている分子標的には、リボゾームＲＮＡの１６Ｓサブユニットをコードする１６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子（非特許文献１２）、転移ＲＮＡをコードする遺伝子間スペーサー（非特許文献１３）、熱ショックタンパク質６０をコードするｈｓｐ６０遺伝子（非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６）、およびｆｅｍＡ遺伝子（非特許文献１７）が含まれる。オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、一般にこれらの識別領域を標的とした技術である。ｎｕｃ遺伝子の検出は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ種の細菌に限られており（非特許文献１８）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ種の細菌を識別するための染色体断片も報告されている（非特許文献１９）。細菌学実験室において常套的に用いることのできるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種の細菌に対する分子識別ツールがまだなお求められている（非特許文献２０）。
【非特許文献１】
Ｅｕｚｅｂｙ  ＪＰ．（１９９７年）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、第４７巻、５９０〜５９２頁
【非特許文献２】
Ｋｌｏｏｓ  ＷＥ（１９９５年）Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２８２〜２９８頁、ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ
【非特許文献３】
Ｋｌｏｏｓ  ＷＥ（１９８６年）Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１０１３〜１０３５頁、ＷｉｌｌｉａｍｓとＷｉｌｋｉｎｓ
【非特許文献４】
Ｋｌｏｏｓ  ＷＥ（１９９４年）Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．、第７巻、１１７〜１４０頁
【非特許文献５】
Ｋｌｏｏｓ  ＷＥ（１９９１年）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、第２９巻、７３８〜７４４頁
【非特許文献６】
Ｇｒａｎｔ  ＣＥ（１９９４年）、Ｄｉａｇｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、第１８巻、１〜５頁
【非特許文献７】
Ｐｅｒｌ  ＴＭ（１９９４年）Ｄｉａｇｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、第１８巻、１５１〜１５５頁
【非特許文献８】
Ｒｅｆｓｈａｌ  Ｋ（１９９２年）Ｊ．Ｈｏｓｐ．Ｉｎｆｅｃｔ．、第２２巻、１９〜３１頁
【非特許文献９】
Ｇｒａｎ  ＣＥ（１９９４年）、Ｄｉａｇｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．第１８巻、１〜５頁
【非特許文献１０】
Ｌｅｖｅｎ  Ｍ（１９９５年）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、第３３巻、１０６０〜１０６３頁
【非特許文献１１】
Ｃａｌｖｏ  Ｊ．（２０００年）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、第３８巻、３８８７〜３８８９頁
【非特許文献１２】
B ｉａｌｋｏｗｓｋａ−Ｈｏｂｒｚａｎｓｋａ  Ｈら（１９９０年）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、第９巻、５８８〜５９４頁
【非特許文献１３】
Ｍａｅｓ  Ｎ．ら（１９９７年）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、第３５巻、２４７７〜２４８１頁
【非特許文献１４】
Ｇｏｈ  ＳＨら（１９９６年）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、第３４巻、８１８〜８２３頁
【非特許文献１５】
Ｇｏｈ  ＳＨら（１９９７年）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、第３５巻、３１１６〜３１２１頁
【非特許文献１６】
Ｋｗｏｋ  ＡＹ（１９９９年）、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、第４９巻、１１８１〜１１９２頁
【非特許文献１７】
Ｖａｎｎｕｆｆｅｌ  Ｐら、Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．第１５０巻、１２９〜１４１頁
【非特許文献１８】
Ｂｒａｋｓｔａｄ  ＯＧ（１９９２年）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．第３０巻、１６５４〜１６６０頁
【非特許文献１９】
Ｍａｒｔｉｎｅａｕ  Ｆ（１９９６年）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．第３４巻、２８８８〜２８９３頁
【非特許文献２０】
Ｋｌｅｅｍａｎ  ＫＴ（１９９３年）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．第３１巻、１３１８〜１３２１頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌の分子識別方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明において発明者らは、ｒｐｏＢ遺伝子が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の各種の細菌の検出および特異的識別を可能にする遺伝的マーカーを構成することを示した。
より詳細には、本発明は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の各種の特異的核酸配列であって、当該細菌のｒｐｏＢ遺伝子から取り出したヌクレオチド配列を有する特異的核酸配列に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
ラズカノ（Ｌａｚｃａｎｏ）ら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．（１９９８年）、第２７巻、３６５〜３７６頁）によれば、ＲＮＡポリメラーゼはその起源によって２つのグループに分類され、一方のグループはウィルスＲＮＡまたはＤＮＡ依存性のＲＮＡポリメラーゼで構成され、他方のグループは真核生物または原核生物（古細菌および真正細菌）起源のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼで構成される。真正細菌のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、αββ’で表される「コア酵素」またはαββσで表される「ホロ酵素」と呼ばれる単純な多量体の保存構造を特徴とする（ユラ（Ｙｕｒａ）およびイシハマ（Ｉｓｈｉｈａｍａ）、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．（１９７９年）、第１３巻、５９〜９７頁）。真正細菌ＲＮＡポリメラーゼのβサブユニットの、多量体酵素複合体内における機能的役割に照準を当てた多くの研究がなされてきた。古細菌および真核生物のＲＮＡポリメラーゼについては、おそらく１２個か３０個程度にのぼるサブユニットから成るさらに複雑な構造を有している（プーレ（Ｐｕｅｈｌｅｔ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８９年）、第８６巻、４５６９〜４５７３頁）。
【０００７】
真正細菌においてＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの様々なαββ’σサブユニットをコードする遺伝子、ｒｐｏＡ、ｒｐｏＢ、ｒｐｏＣおよびｒｐｏＤ遺伝子は、リボゾームサブユニットを構成するタンパク質をコードする遺伝子群と、ゲノムの複製と修復に関与する酵素をコードする遺伝子群との異なる群に分類される（ユラ（Ｙｕｒａ）およびイシハマ（Ｉｓｈｉｈａｍａ）、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．（１９７９年）、第１３巻、５９〜９７頁）。ｒｐｏＢおよびｒｐｏＣ遺伝子の配列を用いて、生物界の様々な枝や小枝の分類を行える系統樹を構築することができることも証明されている（ローランド（Ｒｏｗｌａｎｄ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．（１９９２）、第２１巻：４０Ｓ）。
【０００８】
本発明をさらに詳細に説明する前に、本明細書および特許請求の範囲において用いる様々な用語について定義しておく。
「細菌から抽出した核酸」とは、全核酸、またはゲノムＤＮＡ、またはメッセンジャーＲＮＡ、またはメッセンジャーＲＮＡの逆転写によって得られるさらに別のＤＮＡを意味する。
【０００９】
「ヌクレオチド断片」または「オリゴヌクレオチド」は同義語であって、所定の高い緊縮（ストリンジェントな）条件下において、天然の核酸と同様に、相補的または実質的に相補的なヌクレオチド断片とハイブリダイズすることのできる天然の（または随意で修飾された）核酸の情報配列によって特徴づけられるヌクレオチドパターンの鎖を表す。この鎖は天然の核酸のものとは異なる構造のヌクレオチドパターンを含んでいてもよい。ヌクレオチド断片（またはオリゴヌクレオチド）は、例えば１００個までのヌクレオチドパターンを含んでいてもよい。ヌクレオチド断片は一般には少なくとも１０個、特に少なくとも１２個のヌクレオチドパターンを含んでおり、天然の核酸分子から得たものであってもよいし、および／または、遺伝子組み換えによって、および／または化学合成によって得たものであってもよい。
【００１０】
「ヌクレオチドパターン」とは、糖、リン酸基、およびアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、ウラシル（Ｕ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）から選ばれる窒素性塩基を構成部分とする核酸の天然のヌクレオチドであってもよいモノマーから得られるか；あるいは該モノマーは、上記３つの構成部分の少なくとも１つが修飾されたヌクレオチドであり、その一例として、修飾は、Ａ，Ｔ，Ｕ，ＣまたはＧ塩基とハイブリダイズすることのできるイノシンなどの修飾塩基、メチル−５−デオキシシチジン、デオキシウリジン、ジメチルアミノ−５−デオキシウリジンまたはハイブリダイズ可能な他の任意の修飾塩基によって、塩基において行われるか、あるいは糖のレベルで、例えば少なくとも１つのデオキシリボースがポリアミドによって置換されるか（ニールセン  ピーイー（Ｎｉｅｌｓｅｎ  ＰＥ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１年）、第２５４巻、１４９７〜１５００頁）、さらにはリン酸基のレベルにおいて、例えば、特に二リン酸エステル、アルキルリン酸エステルおよびジチオリン酸エステルから選ばれるエステルによって置換されてもよい。
【００１１】
「ハイブリダイゼーション」は、適当な条件下において、十分に相補的な配列を有する２つのヌクレオチド断片が、安定かつ特異的な水素結合によって互いに会合することができ、二本鎖を形成するプロセスのことをいう。ハイブリダイゼーション条件は、「緊縮性（ストリンジェンシー）」、すなわち操作条件の厳密性によって決まる。ハイブリダイゼーションはその特異性が高いほど緊縮性の高い条件で実施される。緊縮性は、特にプローブ／標的複合体の塩基組成に関係し、２つの核酸間のミスマッチの程度によっても変わる。緊縮性は、ハイブリダイゼーション溶液中に存在するイオン種の濃度や種類、変性剤の種類や濃度、および／またはハイブリダイゼーション温度などのハイブリダイゼーション反応のパラメータにも依存する。ハイブリダイゼーション反応を実施すべき条件の緊縮性は、特に使用するプローブに依存する。上記データはすべて既知であり、常套的な実験を通してそれぞれのケースにおいて適切な条件を決定することができるであろう。一般に、使用するプローブの長さに応じて、ハイブリダイゼーション反応の温度は、約２０〜６５℃であり、特に約０．８〜１Ｍの濃度の生理食塩溶液においては３５〜６５℃である。
【００１２】
「プローブ」とは、所定の条件下においてハイブリダイゼーション特異性を有し、本件においては、メッセンジャーＲＮＡか、前記メッセンジャーＲＮＡの逆転写によって得られるＤＮＡ、すなわち転写産物のいずれかに含まれるヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイゼーション複合体を形成するヌクレオチド断片であって、プローブは診断的目的（特に捕捉プローブもしくは検出プローブ）または治療的目的で用いることができる。
【００１３】
「捕捉プローブ」とは、任意の適当な手段を用いて、固体上への吸着または直接合成によって、例えば共有結合により固体担体上に固定化されているか、固定化することのできるプローブである。担体としては、例えばマイクロタイタープレートおよびＤＮＡチップが挙げられる。
【００１４】
「検出プローブ」は、例えば、放射性同位体元素、酵素、特に発色性、蛍光性または発光性基質（特にペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ）と反応することのできる酵素、発色化学化合物、発色性、蛍光性または発光性化合物、ヌクレオチド塩基のアナログ、およびビオチンなどのリガンドから選択されるマーキング物質で標識したプローブである。
【００１５】
「種プローブ」とは、細菌の種の特異的識別を可能にするプローブである。
「属プローブ」とは、細菌の属の特異的識別を可能にするプローブである。
「プライマー」とは、例えば１０〜１００個のヌクレオチドパターンを含み、酵素的増幅反応に対する所定の条件下においてハイブリダイゼーション特異性を有するプローブである。
【００１６】
「増幅反応」は、プライマーオリゴヌクレオチドによって開始されるＤＮＡポリメラーゼを用いた例えばＰＣＲなどの増幅技術における、酵素的重合反応のことを意味する。
「シーケンシング反応」は、オリゴヌクレオチドプライマーによる不完全重合法を用い、かつ前記ジデオキシヌクレオチドを用いて（Ｓａｎｇｅｒ  Ｆ、Ｃｏｕｌｓｏｎ  ＡＲ（１９７５年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第９４巻、４４１頁）、あるいは、例えばＤＮＡチップにおいて用いられるような固体担体に固定した複数のプローブを用いた複数のハイブリダイゼーションによって、全遺伝子の配列または核酸断片の配列を得ることを意味する。
【００１７】
本願発明者は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の４つの細菌種のｒｐｏＢ遺伝子の完全配列を決定した。これらの４つの種は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属細菌における１６Ｓ遺伝子の研究に基づいて決定された４つの大きな遺伝的グループを代表するもの、すなわち、当該属において現在記載されているすべての種のなかで最も系統発生的に分岐した種として、発明者が選んだものである。したがって、これらの４つの種において得られたｒｐｏＢ配列のアライメントは、当該細菌属の全ての種のすべてのｒｐｏＢ配列を系統発生的に包含する可能性が最も高い。
【００１８】
本願発明者は、コンセンサス配列かつ特異的配列である、配列表に記載した配列番号：７〜１０を明らかにした。本願発明者は、配列番号：７〜１０の前記配列が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の全ての細菌間でコンセンサスを有する（共通している）だけでなく、配列番号：８の配列に関するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉを除いて、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌のファミリーに特異的であることを見いだした。
【００１９】
上記配列はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属のすべての細菌のｒｐｏＢ遺伝子に存在しており、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌に特異的であることから、配列番号：８の配列についてＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉを除いた、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属のあらゆる細菌を検出するための属プローブとして用いることができる。
【００２０】
配列番号：７および１０の配列において、配列表に記載したヌクレオチドＮは、定義に記載したように本発明によるオリゴヌクレオチドまたは核酸の断片が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）の形態（この場合にはＴがＵに置換される）である限りにおいて、イノシンまたは、Ａ，Ｔ，ＣおよびＧ、もしくはＡ，Ｕ，ＣおよびＧの中からそれぞれ選ばれる４つの異なるヌクレオチドの等モル混合物を表していてもよい。
【００２１】
ある特定の部位において「Ｎ」が前記ヌクレオチドの等モル混合物を表す場合には、これは、その特定の部位にあるヌクレオチドが、無差別にＡ，Ｔ，ＣまたはＧ（あるいは適用可能である場合には、それぞれ、Ａ，Ｕ，ＣまたはＧ）を表すこと、および本発明のオリゴヌクレオチドがより厳密には４つのグループのオリゴヌクレオチドの等モル混合物で構成され、その各グループにおいてＮは前記特定の部位において異なる意味を有し、それぞれ４つの塩基Ａ，Ｔ，ＣまたはＧ（あるいはＡ，Ｕ，ＣまたはＧ）のそれぞれを表す。
【００２２】
検討中の細菌種の相補的標的配列において、配列番号：７および１０の配列のヌクレオチドＮに対応する部位には様々なヌクレオチドが発見されているが、その他のすべてのヌクレオチドはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌のすべての種において保存されている。「Ｎ」は、任意の塩基とハイブリダイズすることのできるイノシン、または４つの塩基Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇの等モル混合物を表すので、配列番号：７および１０は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属のすべての細菌のｒｐｏＢ遺伝子に含まれる相補的配列とハイブリダイズ可能である。
【００２３】
さらに、コンセンサス配列である配列番号：９および１０は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の各細菌種に特異的な配列を有する高頻度可変性配列に隣接している。従って、配列番号：９および１０が隣接する配列は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌に対する種プローブとして用いられる。
【００２４】
また、配列番号：９および１０は、可変長が約５００塩基対でありＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の各細菌種に特異的な最短の配列を形成するゾーンからなるｒｐｏＢ遺伝子断片に隣接していることを確認した。
【００２５】
したがって、本願発明者は、配列番号：９および１０のコンセンサス配列が隣接する配列番号：１１〜３９に相当する、調べた２９種のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属細菌のそれぞれに対する種プローブを同定することができた。
【００２６】
本発明において同定された配列番号：７〜１０のコンセンサス配列は、分子識別によってＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌を検出する方法において増幅またはシーケンシング反応のプライマーとして用いることができる。
【００２７】
したがって、配列番号：７〜１０の配列は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌に対する属プローブの調製を可能にするだけでなく、該配列をプライマーとして用いる増幅およびシーケンシングによって前記細菌の種を検出し識別することも可能にする。
【００２８】
より詳細には、本発明は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の種の細菌を識別によって検出する方法を提供し、該方法は以下のものを用いることを特徴とする。
−配列番号：１１〜２９および３１〜３９の配列、逆行配列および相補配列の１つから選ばれるヌクレオチド配列からなる、前記細菌のｒｐｏＢ遺伝子または前記細菌の前記ｒｐｏＢ遺伝子の断片、
−配列番号：３９のヌクレオチド配列、逆行配列および相補配列で構成される、前記細菌の前記ｒｐｏＢ遺伝子の断片、または
−配列番号：７〜１０の配列（ＮはイノシンまたはＡ，Ｔ，ＣもしくはＧのなかから選ばれる４つの異なるヌクレオチドの等モル混合物を表す）、逆行配列および相補配列の１つに含まれる、少なくとも１２の連続ヌクレオチドパターンの配列からなるオリゴヌクレオチド。
【００２９】
前記オリゴヌクレオチドは、好ましくは１２〜３５のヌクレオチドパターンからなり、さらに好ましくは、前記オリゴヌクレオチドは、配列番号：７〜１０の配列と、逆行配列と、相補配列とで構成される。
【００３０】
本発明に従う検出方法の第１の実施形態では、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌の存在を示すことを目的としており、第１の変形形態において、以下の工程が実施される。
【００３１】
１．配列番号：７〜１０の配列、逆行配列および相補配列のうちの１つに含まれる配列を含む前記オリゴヌクレオチドからなる少なくとも１つの属プローブを接触させる工程、および
２．前記属プローブと試料の核酸との間でハイブリダイゼーション複合体が形成されているか否かを判定し、ハイブリダイゼーション複合体が形成されている場合にはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の前記細菌が存在すると判定する工程。
【００３２】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌に対する検出方法の第２の変形実施形態において、次の工程が実施される。
１．配列番号：７〜１０、逆行配列および相補配列から取り出した少なくとも２つの配列中に含まれる少なくとも１２のヌクレオチドパターンの配列を含む前記オリゴヌクレオチドからなる増幅プライマーを、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の少なくとも１つの前
記細菌の核酸を含むか、含む可能性のある試料と接触させる工程であって、
５’プライマーとして、配列番号：７〜９の配列または相補配列のうちの１つに含まれる配列を含むオリゴヌクレオチドのなかから選ばれたオリゴヌクレオチド、好ましくは完全長の前記配列で構成されるオリゴヌクレオチド、および
３’プライマーとして、配列番号：１０もしくは８の配列または相補配列のうちの１つにそれぞれ含まれる配列からなるオリゴヌクレオチド、好ましくは完全長の前記配列で構成されるオリゴヌクレオチド
を用いる工程。
【００３３】
２．酵素的重合反応によって核酸の増幅を行い、増幅産物の有無を決定し、増幅産物が生じていれば該試料中に前記細菌が存在すると判定する工程。
より詳細には、第１の実施形態の上記第２の変形形態において、５’プライマーとしては配列番号：７または９の配列または相補配列をもつオリゴヌクレオチドを使用し、３’プライマーとしては、配列番号：１０またはそれぞれ相補配列のオリゴヌクレオチドを使用する。
【００３４】
本発明に従う細菌検出方法の第２の実施形態では、以下の種より選ばれるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の特定の種の細菌を特異的に検出することを目的としている。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｘｙｌｏｓｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｗａｒｎｅｒｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｉｍｕｌａｎｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｃｉｕｒｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｈｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｕｌｖｅｒｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｓｃａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｅｎｔｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｌｏｏｓｉｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｙｉｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｅｌｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｏｒｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｈｎｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｒｎｏｓｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｉｃｕｌａｒｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのａｕｒｅｕｓ亜種、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのａｎａｅｒｏｂｉｕｓ亜種、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｒｌｅｔｔａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｒａｅ。
【００３５】
本発明の方法の上記第２の実施形態の第１変形形態において、以下の工程を実施する。
１．少なくとも１つの前記細菌の核酸を含むか、含む可能性のある試料を、配列番号：１１〜３９の配列、逆行配列および相補配列のうちの１つに含まれる配列を含む前記遺伝子断片、好ましくは配列番号：１１〜３９の前記配列のうちの１つで構成されるオリゴヌクレオチドまたは逆行もしくは相補配列のオリゴヌクレオチド、で構成される少なくとも１つの種プローブと接触させる工程、および
２．前記プローブと試料の核酸との間でハイブリダイゼーション複合体が形成されているか否かを判定する工程。
【００３６】
上記２９種の中から選ばれたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属細菌の特定の種を特異的に検出することを目的とした、本発明の方法の前記第２の実施形態の第２変形形態では、該方法は、少なくとも１つの前記細菌の核酸を含むか含む可能性のある試料における、次の工程を含む。
【００３７】
ａ）５’プライマーとして配列番号：７もしくは９の配列、および３’プライマーとして配列番号：１０に含まれる配列を含むオリゴヌクレオチド、好ましくは配列番号：７もしくは９および１０の配列で構成されるオリゴヌクレオチド、またはそれらの相補配列、で構成されるヌクレオチドプライマーを用いて、前記特定の細菌の増幅ｒｐｏＢ遺伝子断片のシーケンシング反応を実施する工程、および
ｂ）前記得られた断片の配列と、それぞれ前記配列番号：１１〜３９の配列および相補配列を含む、前記細菌の完全長ｒｐｏＢ遺伝子の配列または前記細菌のｒｐｏＢ遺伝子断片の配列とを比較することによって、前記細菌の特定の種の有無を判定する工程であって、これにより、得られた断片の配列が、当該属の既知の配列または、前記細菌のｒｐｏＢ遺伝子断片の既知の配列と同一である場合には、該試料中に前記細菌が存在すると判定する工程。
【００３８】
より詳細には、上記第２の変形形態において、
工程ａ）においては、
１．配列番号：７およびそれぞれ配列番号：１０の配列をそれぞれ含むオリゴヌクレオチド、またはそれらの相補配列の中から選ばれる５’および３’プライマー対によって、前記試料の核酸を最初に増幅する工程と、工程１において増幅産物が生じたか否かを判定する工程、および
２．それぞれ配列番号：９および配列番号：１０の配列を含むオリゴヌクレオチド、好ましくは配列番号：７および１０の前記配列またはそれらの相補配列で構成されるオリゴヌクレオチド、好ましくは配列番号：９および１０の前記配列またはそれらの相補配列で構成されるオリゴヌクレオチド、で構成される５’および３’プライマー対を用いて工程１において判定されたアンプリコンのシーケンシング反応を実施する工程を実施し、かつ
工程ｂ）においては、得られた配列と、それぞれ配列番号：１１〜３９の配列またはそれらの相補配列のうちの１つとの間で比較を行う。
【００３９】
本発明のさらなる対象は、配列番号：１１〜２９、および３０〜３９の配列に記載されているような配列を含むことを特徴とする、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌のｒｐｏＢ遺伝子または遺伝子断片である。
【００４０】
本発明のさらなる対象は、配列番号：３〜６に記載されているような、細菌Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｒａｅおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓのｒｐｏＢ遺伝子の完全配列であり、上述のように、これらｒｐｏＢ遺伝子断片および完全遺伝子は、特に本発明の方法のために使用することができる。
【００４１】
ｒｐｏＢ遺伝子の完全配列は、該遺伝子の一次配列を調べることによってだけでなく、完全なＤＮＡ配列の転写によって得られたメッセンジャーＲＮＡの二次および三次構造を調べることによっても、細菌の識別のために用いることができる。
【００４２】
本発明のさらなる対象は、配列番号：１１〜３９の配列中に含まれる配列を有するオリゴヌクレオチド、ならびに上記定義したような逆行配列および相補配列のオリゴヌクレオチドの中から選ばれる、前記ｒｐｏＢ遺伝子断片またはオリゴヌクレオチドである。
【００４３】
本発明のさらなる対象は、配列番号：７〜１０の配列（Ｎは、イノシンおよび、Ａ，Ｔ，ＣまたはＧのなかから選ばれる４つの異なるヌクレオチドの等モル混合物から選ばれるヌクレオチドを表す）のうちの１つに含まれる少なくとも１２、好ましくは１２〜３５の連続するヌクレオチドパターンの配列からなるオリゴヌクレオチド、ならびに、好ましくは配列番号：７および１０の配列（Ｎはイノシンを示す）および逆行配列および相補配列で構成される逆行配列および相補配列のヌクレオチドである。
【００４４】
配列番号：７〜３９の配列は、例えば、イタクラ（Ｉｔａｋｕｒａ．Ｋ）らによる論文（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第５３巻、３２３頁、１９８４年）に記載されているような、当業者周知の技法を用いた化学合成によって調製してもよい。
【００４５】
本発明のオリゴヌクレオチドの第１の用途は、生物試料中において、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の１つの種の細菌を検出するためのプローブとして用いることであり、このプローブは、配列番号：７〜３９の配列、およびそれらの逆行配列または相補配列のうちの１つに含まれる少なくとも１２の連続したヌクレオチドパターンのヌクレオチド配列を含む。
【００４６】
配列番号：７〜１０の配列からなるプローブは、属プローブとして使用され、配列番号：１１〜３９の配列のうちの１つからなるプローブは種プローブとして使用される。
本発明のプローブは、あらゆる既知のハイブリダイゼーション技法、特にドット・ブロット技法（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、コールドスプリングハーバー（１９８２年））、サザンブロットと呼ばれるＤＮＡトランスファー技法（サザン  イー．エム．（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｅ．Ｍ．）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．（１９７５年）、第９８巻、５０３頁）、ノーザンブロットと呼ばれるＲＮＡトランスファー技法、またはいわゆる「サンドイッチ」技法を用いて、プローブと試料中の標的核酸との間のハイブリダイゼーション複合体の形成の有無を判定することにより、前述のように診断の目的のために使用することもできる。「サンドイッチ」技法は特に捕捉プローブおよび／または検出プローブを使用し、これらのプローブは、標的核酸の２つの異なる領域にハイブリダイズすることができ、前記プローブの少なくとも一方（一般に検出プローブ）は、種に特異的な標的領域とハイブリダイズすることができ、捕捉プローブと検出プローブは、明らかに、少なくとも部分的に異なるヌクレオチド配列を有している。
【００４７】
検出しようとする核酸（標的）は、ＤＮＡであってもよいしＲＮＡであってもよい（前者はＰＣＲ増幅後に得られる）。二本鎖型の核酸の標的を検出するためには、検出方法を実施する前に該核酸を変性させておく必要がある。
【００４８】
標的核酸は、試料中の核酸を調べるための既知の方法を用いて抽出によって得てもよい。二本鎖核酸の変性は、既知の化学的、物理的または酵素的変性方法を用いて、特に約８０℃を超える適当な温度まで加熱することによって行うことができる。
【００４９】
上記ハイブリダイゼーション技法、特に「サンドイッチ」技法を実施するために、本発明の捕捉プローブと呼ばれるプローブを固体担体上に固定化し、本発明の検出プローブと呼ばれるもう一方のプローブをマーキング剤で標識する。担体およびマーキング剤の例は上述の通りである。
【００５０】
種プローブを固体担体上に固定化し、別の種プローブをマーカーで標識すると有益である。
本発明のオリゴヌクレオチドのさらなる用途は、配列番号：７〜３９の配列のうちの１つに含まれる少なくとも１２のヌクレオチドパターンの配列を有するオリゴヌクレオチドから選ばれたモノカテナリー（ｍｏｎｏｃａｔｅｎａｉｒｅ）オリゴヌクレオチドを含むヌクレオチドプライマーとしての用途であり、このヌクレオチドプライマーは、それ自体は既知の方法を用いたポリメラーゼ存在下における核酸の合成において、特にポリメラーゼの存在下における上記合成による増幅（ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲなど）において用いることができる。特に、本発明のプライマーは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の種に属する細菌のメッセンジャーＲＮＡ配列を特異的に逆転写して、対応する相補ＤＮＡ配列を得るために用いることもできる。前記逆転写はＲＴ−ＰＣＲ技法の第１段階を構成可能であり、後続の段階では得られた相補ＤＮＡのＰＣＲ増幅が行われる。本発明のプライマーを、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の種のｒｐｏＢ遺伝子の全ＤＮＡ配列のポリメラーゼ連鎖反応による特異的増幅のために用いることもできる。
【００５１】
ある特定の場合において、本発明のオリゴヌクレオチドからなる前記プライマーは、ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーター（例えばプロモーターＴ７，Ｔ３，ＳＰ６（ステューディエ  エフ・ダブリュ（Ｓｔｕｄｉｅｒ  ＦＷ）、ビー・エイ  モファット（ＢＡ  Ｍｏｆｆａｔｔ）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第１８９巻、１１３頁（１９８６年））のセンス鎖またはアンチセンス鎖をも含んでおり、前記プライマーを、転写工程を伴う核酸増幅方法、例えばＮＡＳＢＡや３ＳＲ技法などにおいて用いることができる（ファンゲーメン  ベー（Ｖａｎ  Ｇｅｍｅｎ  Ｂ．）ら、要旨ＭＡ  １０９１、第７回ＡＩＤＳ国際会議（１９９１）、イタリア、フローレンス）。
【００５２】
本発明のさらなる対象は、配列番号：１１〜２９、３１〜３９の配列のうちの１つからなり、好ましくは配列番号：１１〜３９の配列のうちの１つで構成される配列を有するオリゴヌクレオチドから選ばれるモノカテナリーオリゴヌクレオチドからなるヌクレオチドプライマーであって、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の種の任意の株のｒｐｏＢ遺伝子の全体または部分シーケンシングのために用いることのできるヌクレオチドプライマーである。
【００５３】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の任意の細菌におけるｒｐｏＢ遺伝子の部分または完全シーケンシングにより、当該配列の生物計算解析を介した任意のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌の識別と、新規な未知のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌種の認識とを行えるようになる。
【００５４】
好ましくは、プライマーとして、あるいはｒｐｏＢ遺伝子のシーケンシングのために用いる場合には、配列番号：７〜１０の配列を用いるが、配列番号：７および１０の配列中、Ｎは、イノシンが選ばれる。
【００５５】
本発明のさらなる対象は、本発明の方法において用いることのできる診断キットであって、上記定義したような、配列番号：７〜３９の配列および逆行配列および相補配列で構成される前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つの前記遺伝子断片、あるいは配列番号：７〜１０の配列のいずれか１つに含まれる配列からなる前記オリゴヌクレオチド、および／または配列番号：１１〜３９の配列からなる前記細菌の少なくとも１つの前記ｒｐｏＢ遺伝子断片と、逆行配列および相補配列のオリゴヌクレオチドおよび遺伝子断片を含むキットである。
【００５６】
本明細書において、「逆行配列および相補配列」という表現は、以下の配列、すなわち
前記配列の逆行配列、
前記配列の相補配列、および
前記配列の逆行配列の相補配列。
を意味するものとする。
【００５７】
最後に、本発明の最後の対象は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の種に属する菌株による感染を治療するための遺伝子治療プローブであり、前記プローブは、定規定義したようなオリゴヌクレオチドからなる。前記細菌のメッセンジャーＲＮＡ上および／またはゲノムＤＮＡ上にハイブリダイズ可能な、この遺伝子治療プローブは、翻訳および／または転写および／または複製の現象を阻止することができる。
【００５８】
遺伝子治療方法の原理は既知であり、特にアンチセンス鎖に相当するプローブを用いることに基づいており、プローブとセンス鎖との間のハイブリッド形成により、遺伝情報の解読の少なくとも１工程を妨害することができる。したがって遺伝子治療プローブは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の種の細菌による感染を治療するための抗菌薬として用いることができる、
本発明は、本発明を実施するために行われた実験に関する以下の各実施例の記載によってより理解しやすくなるであろう。これらの実施例は説明のためだけに提供するものである。
【実施例１】
【００５９】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の次の４つの種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｒａｅおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）のｒｐｏＢ遺伝子の配列。
【００６０】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｒａｅおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓに属する細菌のｒｐｏＢ遺伝子の完全配列を、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｘ６４１７２）およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｌ４３５９３）のｒｐｏＢ遺伝子の配列間でのコンセンサスプライマーを用いた酵素的増幅と自動化ダイレクト・シーケンシングによって決定した。後者の細菌種は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の種に最も近い（１６ＳｒＤＮＡ遺伝子の配列の比較に基づいた系統発生的関係）、グアノシン＋シトシン含量（ＧＣ含量）の低いグラム陽性種として選んだ。
【００６１】
一連の特異的プライマーからの連続的伸長を介してｒｐｏＢ遺伝子の完全配列を導くことのできる断片を得るために、いくつかの潜在的なコンセンサスプライマーを調べた。
これらのコンセンサスプライマーは以下の配列
配列番号：１  ５’−ＡＡＡ  ＣＴＴ  ＡＡＴ  ＡＧＡ  ＡＡＴ  ＴＣＡ  ＡＡＣ  ＴＡＡ  Ａ−３’
配列番号：２  ５’−ＡＴＣ  ＴＧＧ  ＴＡＡ  ＡＧＣ  ＡＴＴ  ＡＣＣ  ＡＡ−３’を有しており、これらの共通プライマーによって、上記４つの種において１００７塩基対の長さを有する第１の断片Ｆ１を得ることができた。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓとＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓの配列上でこの第１の断片Ｆ１の配列のアライメントを行ったところ、理論的または潜在的に適切であったプライマーを用いた試みの多数が失敗に終わり、最終的に、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｒａｅおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓの４種におけるｒｐｏＢ遺伝子の全体を連続した工程で増幅かつシーケンシングできる一連のオリゴヌクレオチドプライマーを決定することができた。これらのプライマーの配列、ＧｅｎＢａｎｋ（アクセス番号Ｘ６４１７２）にあるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのｒｐｏＢ遺伝子の配列上の位置、およびハイブリダイゼーション温度を、下表に示す。
【００６２】
【表１】
2005501565.tif 000003
増幅は、２．５×１０２ＵのＴａｑポリメラーゼ、１×Ｔａｑバッファおよび１．８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００μＭのｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰおよび０．２μＭの各プライマーを含む最終体積５０μＬの条件で実施した。増幅は以下のプログラムに従って実施した。９４℃３０秒間の変性ステップ、５２℃３０秒間のプライマーハイブリダイゼーション、および７２℃６０秒間の伸長からなるサイクルを３５サイクル。増幅産物はカラム上で精製し、下表に示したオリゴヌクレオチドシーケンシングプライマーを用いてシーケンシングを行った。
【００６３】
【表２】
2005501565.tif 000004
シーケンシング反応は、ＡＢＩのキット：Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（パーキンエルマーアプライドバイオシステムズ社（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））の中の試薬を用いて、販売元の推奨と以下のプログラムに従って実施した。９４℃１０秒間の変性ステップ、５０℃１０秒間のプライマーハイブリダイゼーション、および６０℃２分間の伸長からなるサイクルを３０サイクル。シーケンシング産物は、３７７ＤＮＡシーケンサー（Ｐｅｒｋｉｎ）を用いてポリアクリルアミドゲル上で電気泳動によって分離し、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｅｒソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてコンセンサス配列を構成しているかどうかを解析した。この手法によって、我々は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の４つの種において、ｒｐｏＢ遺伝子の完全配列を決定することができた。
【００６４】
配列番号：３
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓのｒｐｏＢ遺伝子の配列。３７９１塩基対の長さのこの配列は、３６．８％のＧＣ含量を有し、Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号ＡＦ３２５８７１としてＧｅｎＢａｎｋに寄託した。
【化１】
2005501565.tif 000005
2005501565.tif 000006
2005501565.tif 000007
【００６５】
配列番号：４
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓのｒｐｏＢ遺伝子の配列。３８５５塩基対の長さのこの配列は、３６．４％のＧＣ含量を有し、Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号ＡＦ３２５８７０としてＧｅｎＢａｎｋに寄託した。
【化２】
2005501565.tif 000008
2005501565.tif 000009
2005501565.tif 000010
【００６６】
配列番号：５
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｒａｅのｒｐｏＢ遺伝子の配列。３６９８塩基対の長さのこの配列は、３７．４％のＧＣ含量を有し、Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号ＡＦ３２５８６８としてＧｅｎＢａｎｋに寄託した。
【化３】
2005501565.tif 000011
2005501565.tif 000012
2005501565.tif 000013
【００６７】
配列番号：６
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓのｒｐｏＢ遺伝子の配列。３８５１塩基対の長さのこの配列は、３９．２％のＧＣ含量を有し、Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号ＡＦ３２５８６９としてＧｅｎＢａｎｋに寄託した。
【化４】
2005501565.tif 000014
2005501565.tif 000015
2005501565.tif 000016
【００６８】
この配列は３８５２塩基対の長さを有し、３９．２％のＧＣ含量を有し、Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号ＡＦ３２５８６９としてＧｅｎＢａｎｋに寄託された。
【実施例２】
【００６９】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の２６の種のｒｐｏＢ遺伝子の部分シーケンシング
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ（ＧｅｎＢａｎｋアクセスＡＦ３２５８７０）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ（ＧｅｎＢａｎｋアクセスＡＦ３２５８６９）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ（ＧｅｎＢａｎｋアクセスＡＦ３２５８７１）、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｒａｅ（ＧｅｎＢａｎｋアクセスＡＦ３２５８６８）の各種の細菌において決定されたｒｐｏＢ配列のアライメントにより、それぞれＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのｒｐｏＢ遺伝子の２４９１〜２５１１位および３５５４〜３５７３位に位置する以下のオリゴヌクレオチドのコンセンサス配列、
配列番号：７  ５’−ＡＡＣＣＡＡＴＴＣＣＧＴＡＴＮＧＧＴＴＴ−３’（式中、Ｎはイノシンを表す）
配列番号：８  ５’−ＣＣＧＴＣＣＣＡＡＧＴＣＡＴＧＡＡＡＣ−３’
を決定することができたが、これらは理論上Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属のすべての種における１０６３塩基対の断片を増幅を決定付けるものである。
【００７０】
配列番号：８は３’プライマーとして使用するものであり、したがって、配列番号：３〜６の配列中に表されるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの３５５４〜３５７３位の直行鎖の相補的逆行配列を示す。
【００７１】
発明者らは、以下の基準に留意して上記２つのプライマー配列番号：７および配列番号：８の位置を決定した。
１．これらの２つのプライマーに隣接する細菌の種に特異的な配列。この条件は、１０６３塩基対断片をコンピュータデータバンクにおいて入手できるｒｐｏＢ細菌遺伝子の全ての配列とアライメントして確認された。
【００７２】
２．分子検出の感度をできるだけ上げるために、最も短い識別領域と思われる領域を探す。
３．真正細菌の分野において発明者が以前に研究した領域（モレ  シー．（Ｍｏｌｌｅｔ  Ｃ．）、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、第２６巻、１００５〜１０１１頁（１９９７年））と近い領域を探して、これらの２つの細菌の属および科に共通の作業領域につなげるようにする。
【００７３】
４．１８〜２２塩基対のプライマー長
５．近い融点を有するプライマー配列
６．自己ハイブリダイゼーションしない、または自己相補性のないプライマー配列
コンピュータを利用した（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）解析では、配列番号：７および配列番号：８のこれらの２つのオリゴヌクレオチドを用いて、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の全ての種のｒｐｏＢ遺伝子の１０６３塩基対断片をＰＣＲ増幅できるに違いないと予測されていた。実際には、配列番号：８の配列のプライマーは、理由は判らないがごく一部の種には付着しなかった。実験結果から、この属のなかのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉ種は、このオリゴヌクレオチドプライマー対によって増幅されず、プライマーに対してなされた予測が不確かなものであることが実証された。したがって、発明者は試行錯誤によって、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓにおける３２４１〜３２６１位に位置する配列番号：１０の配列の新しいオリゴヌクレオチドを決定した。このヌクレオチドを、ＰＣＲ増幅反応において配列番号：７のオリゴヌクレオチドと組み合わせることにより、発明者が調べたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の２９種において、７７１塩基対の大きさ（基準種Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓについての大きさ）を有するｒｐｏＢ遺伝子のアンプリコンが得られることが判った。
【００７４】
配列番号：１０  ５’−ＧＣＩＡＣＩＴＧＩＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧＴ−３’
配列番号：１０は、３’プライマーとして用いる。これは、このプライマーが配列番号：３〜６上に表された直行鎖の配列の相補的逆行配列に相当するからである。
【００７５】
次に、配列番号：９（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ種の細菌におけるｒｐｏＢ遺伝子の２６４３〜２６６０位に位置）および配列番号：１０の２つのシーケンシングプライマーを用いることにより、増幅産物のシーケンシングを行う。
【００７６】
配列番号：９  ５’−ＣＡＡ  ＴＴＣ  ＡＴＧ  ＧＡＣ  ＣＡＡ  ＧＣ−３’
この最後のプライマーは、シーケンシングプライマーの制約に留意して、すなわち１５塩基長を超える大きさであり、シーケンシング用の第２のプライマーとハイブリダイズせず、一般にＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の各種に特異的な配列をもつ約５００塩基対のゾーンに隣接するということに留意して決定した。
【００７７】
この第２のオリゴヌクレオチド配列セット、配列番号：９／配列番号：１０を用いることにより、発明者は、下記に列挙する（配列番号：１１〜配列番号：３９）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の２９の種においてｒｐｏＢ遺伝子の部分配列を決定することができた。
【００７８】
ｒｐｏＢ遺伝子の断片は、９４℃１０秒間の変性段階と、５２℃で２０秒間の配列番号：７と８または配列番号：７と１０のプライマー対のハイブリダイゼーション段階と、７２℃６０秒間の伸長段階とからなる増幅サイクルを３５サイクル用いるＰＣＲ技法によって増幅した。増幅産物は臭化エチジウム染色後に可視化した。
【００７９】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属のこれら２９種の細菌は以下の通りである。
【表３】
2005501565.tif 000017
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の各種に特異的な配列を有し、試験した２９種の細菌の分子識別を可能にする、一般に約５００塩基対の長さの、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属に属する種の細菌のｒｐｏＢ遺伝子の断片を以下に示す。
【００８０】
配列番号：１１  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｘｙｌｏｓｕｓにおけるｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（５１８塩基対）
【化５】
2005501565.tif 000018
【００８１】
配列番号：１２  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｗａｒｎｅｒｉにおけるｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（５０７塩基対）
【化６】
2005501565.tif 000019
【００８２】
配列番号：１３  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｉｍｕｌａｎｓにおけるｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（５１８塩基対）
【化７】
2005501565.tif 000020
【００８３】
配列番号：１４  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｃｉｕｒｉにおけるｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（５０７塩基対）
【化８】
2005501565.tif 000021
【００８４】
配列番号：１５  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉにおけるｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（５１８塩基対）
【化９】
2005501565.tif 000022
【００８５】
配列番号：１６  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓにおけるｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（５１８塩基対）
【化１０】
2005501565.tif 000023
【００８６】
配列番号：１７  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓにおけるｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（５５６塩基対）
【化１１】
2005501565.tif 000024
【００８７】
配列番号：１８  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｕｌｖｅｒｉｓにおけるｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（５０８塩基対）
【化１２】
2005501565.tif 000025
【００８８】
配列番号：１９  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｓｃａｅにおけるｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（５１８塩基対）
【化１３】
2005501565.tif 000026
【００８９】
配列番号：２０  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓにおけるｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（５５６塩基対）
【化１４】
2005501565.tif 000027
【００９０】
配列番号：２１  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｅｎｔｕｓにおけるｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（５０７塩基対）
【化１５】
2005501565.tif 000028
【００９１】
配列番号：２２  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｌｏｏｓｉｉにおけるｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（５０５塩基対）
【化１６】
2005501565.tif 000029
【００９２】
配列番号：２３  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓにおけるｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（５５６塩基対）
【化１７】
2005501565.tif 000030
【００９３】
配列番号：２４  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｙｉｃｕｓにおけるｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（５１８塩基対）
【化１８】
2005501565.tif 000031
【００９４】
配列番号：２５  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｍｉｎｉｓにおけるｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（５１８塩基対）
【化１９】
2005501565.tif 000032
【００９５】
配列番号：２６  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓにおけるｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（５０７塩基対）
【化２０】
2005501565.tif 000033
【００９６】
配列番号：２７  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍにおけるｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（５０７塩基対）
【化２１】
2005501565.tif 000034
【００９７】
配列番号：２８  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｅｌｉｓにおけるｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（５１８塩基対）
【化２２】
2005501565.tif 000035
【００９８】
配列番号：２９  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｏｒｕｍにおけるｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（５０７塩基対）
【化２３】
2005501565.tif 000036
【００９９】
配列番号：３０  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓにおけるｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（５１８塩基対）
【化２４】
2005501565.tif 000037
【０１００】
配列番号：３１  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｈｎｉｉにおけるｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（５０７塩基対）
【化２５】
2005501565.tif 000038
【０１０１】
配列番号：３２  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓにおけるｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（５０７塩基対）
【化２６】
2005501565.tif 000039
【０１０２】
配列番号：３３  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｒｎｏｓｕｓにおけるｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（１０２５塩基対）
【化２７】
2005501565.tif 000040
【０１０３】
配列番号：３４  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓにおけるｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（５１８塩基対）
【化２８】
2005501565.tif 000041
【０１０４】
配列番号：３５  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｉｃｕｌａｒｉｓにおけるｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（５０７塩基対）
【化２９】
2005501565.tif 000042
【０１０５】
配列番号：３６  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓにおけるｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（５１８塩基対）
【化３０】
2005501565.tif 000043
【０１０６】
配列番号：３７  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ａｎａｅｒｏｂｉｕｓにおけるｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（５０７塩基対）
【化３１】
2005501565.tif 000044
【０１０７】
配列番号：３８  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｒｌｅｔｔａｅにおけるｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（５１８塩基対）
【化３２】
2005501565.tif 000045
【０１０８】
配列番号：３９  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｒａｅにおけるｒｐｏＢ遺伝子の部分配列（５５６塩基対）
【化３３】
2005501565.tif 000046
【実施例３】
【０１０９】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属に属する１０菌株を含む２０菌株の集団のブラインド識別。
以下の細菌種に属する２０菌株の集団を、本特許出願に記載した方法を用いて、菌株のブラインド分子識別（実験者には菌株がどの菌株であるか分からない）を実施するために符号化した。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（リファンピシン感受性株）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（リファンピシン耐性株）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｏｒｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｙｃｏｌａｔｕｍ、Ｇｅｍｅｌｌａ  ｍｏｒｂｉｌｏｒｕｍ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｎｔｉｔｒａｔｕｓ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓおよびＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ。実施例２に記載したように、ＰＣＲ増幅（図１）において、配列番号：７（５’プライマーとして）と配列番号：１０（３’プライマーとして）を使用して、核酸抽出とｒｐｏＢ遺伝子の７５１塩基対断片の増幅を行った。これらの１０のアンプリコンのシーケンシングは、シーケンシング反応中に、実施例２に記載のように配列番号：９（５’プライマー）と配列番号：１０（３’プライマー）のプライマーを使用することにより実施した。得られた配列と、配列番号：１１〜３９の配列に関するデータバンクの配列とを比較することにより、増幅された１０菌株が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｏｒｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍであると識別することができた。上記２０菌株の符号を解読したところ、本発明の方法に従う分子識別と、標準的な表現型法を用いる、以前に確立された識別との間で１００％の一致が認められた。この結果は、本研究に用いられた配列番号：７／配列番号：１０のプライマーセットおよび配列番号：９／配列番号：１０のプライマーセットが特異性を持つこと、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株のリファンピシン感受性レベルはこれらの菌株の識別の邪魔をしないことを示している。
【０１１０】
ヒトまたは動物の臨床試料において頻繁に単離され、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌を含む可能性のあるものとして選択した他の細菌は、増幅されなかったため、本発明の方法を用いたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌検出の条件下において、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属のために用いたプライマーは、他の属の細菌に相対する特異性を有することが実証された。
【０１１１】
図１は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属に属する１０菌株（第２〜５，８，９，１１〜１３および１６レーン）と、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ以外の属の細菌の５菌株（第６，７，１０，１４および１５レーン）とを含む符号化した１５菌株から得たＰＣＲ増幅産物を示す。第１レーンおよび第１７レーンは、分子量マーカーを示す。負の増幅対照（滅菌水）およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ以外の菌株に対応するレーンは示されていない。本発明の配列番号：７および配列番号：１０のプライマーを用いて増幅産物を得て、アガロースゲル上で電気泳動した後に臭化エチジウム染色によって可視化した。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】実施例３において得られた増幅産物を、アガロースゲル電気泳動後の臭化エチジウム染色により可視化したことを示す図。
【国際公開パンフレット】
2005501565.tif 000047
2005501565.tif 000048
2005501565.tif 000049
2005501565.tif 000050
2005501565.tif 000051
2005501565.tif 000052
2005501565.tif 000053
2005501565.tif 000054
2005501565.tif 000055
2005501565.tif 000056
2005501565.tif 000057
2005501565.tif 000058
2005501565.tif 000059
2005501565.tif 000060
2005501565.tif 000061
2005501565.tif 000062
2005501565.tif 000063
2005501565.tif 000064
2005501565.tif 000065
2005501565.tif 000066
2005501565.tif 000067
2005501565.tif 000068
2005501565.tif 000069
2005501565.tif 000070
2005501565.tif 000071
2005501565.tif 000072
2005501565.tif 000073
2005501565.tif 000074
2005501565.tif 000075
2005501565.tif 000076
2005501565.tif 000077
2005501565.tif 000078
2005501565.tif 000079
2005501565.tif 000080
2005501565.tif 000081
2005501565.tif 000082
2005501565.tif 000083
2005501565.tif 000084
2005501565.tif 000085
2005501565.tif 000086
2005501565.tif 000087
2005501565.tif 000088
2005501565.tif 000089
2005501565.tif 000090
2005501565.tif 000091
2005501565.tif 000092
2005501565.tif 000093
2005501565.tif 000094
2005501565.tif 000095
2005501565.tif 000096
2005501565.tif 000097
2005501565.tif 000098
2005501565.tif 000099
2005501565.tif 000100
2005501565.tif 000101
2005501565.tif 000102
2005501565.tif 000103
2005501565.tif 000104
2005501565.tif 000105
2005501565.tif 000106
2005501565.tif 000107
2005501565.tif 000108
2005501565.tif 000109
2005501565.tif 000110
2005501565.tif 000111
2005501565.tif 000112
2005501565.tif 000113
2005501565.tif 000114
2005501565.tif 000115
2005501565.tif 000116
2005501565.tif 000117
2005501565.tif 000118
2005501565.tif 000119
2005501565.tif 000120
2005501565.tif 000121
2005501565.tif 000122
2005501565.tif 000123
2005501565.tif 000124
【国際調査報告】
2005501565.tif 000125
2005501565.tif 000126
2005501565.tif 000127
2005501565.tif 000128
2005501565.tif 000129
2005501565.tif 000130