(57)【要約】  ヒトＨ３プレプロレラキシン、ヒトＨ３プロレラキシン、ヒトＨ３レラキシン、修飾されたＡ鎖および／またはＢ鎖を持つヒトレラキシン類似体について述べる。また、ヒトＨ３プレプロレラキシン、ヒトＨ３プロレラキシン、ヒトＨ３レラキシン、ヒトレラキシン類似体をコードする核酸配列について開示する。さらに、Ｈ３レラキシンまたはその類似体の投与に応答する状態の処置のための方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管疾患;動脈性高血圧症の処置;無制御または異常なコラーゲンあるいはフィブロネクチン形成と関連する疾患；腎臓疾患;精神障害;うつまたは抑うつ障害;神経疾患または神経変成疾患;学習力、注意力および意欲の障害;中毒障害;活動および運動障害;免疫疾患;乳腺疾患;子宮内膜疾患;内分泌障害;分娩開始遅延、子宮頚部成熟損傷;および胎児性難産による長期分娩の予防；洞性徐脈;脱毛;脱毛症;バソプレッシンの減少または不適当な分泌を含む水分平衡障害;または胎盤不足；の１つまたはそれ以上を処置するための方法であって、任意に1つまたはそれ以上の製薬的に許容される担体および／希釈剤および／または賦形剤とともに、ヒトＨ３レラキシン、または本明細書にて定義するその類似体の治療上有効な量をそのような処置を必要とする被験者に投与する方法。
【請求項２】
Ｈ３レラキシンまたはその類似体が、ヒトＨ３レラキシン、ヒトＨ３プロレラキシン、ヒトＨ３プレプロレラキシン、またはその構成成分Ａ、ＢまたはＣペプチド鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ヒトＨ３レラキシンまたはそのヒトＨ３レラキシン類似体が、
以下のアミノ酸配列：
【数１】
2005508944.tif 000038
（配列番号４）  
を有するＡ鎖、またはＮ−末端から約9アミノ酸以下が切断されたアミノ酸配列、および
以下のアミノ酸配列：
【数２】
2005508944.tif 000039
を有するＢ鎖、またはアミノ末端から９アミノ酸以下および／またはカルボキシル末端から約５アミノ酸以下が切断されたアミノ酸配列を含み、
ここに該Ａ鎖およびＢ鎖は、A11-B10およびA24-B22間ジスルフィド結合によって連結し、該ヒトＨ３レラキシンまたはその類似体はレラキシン生物活性を持つ、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ヒトＨ３レラキシン類似体が修飾されたＡ鎖および／または修飾されたＢ鎖を含み、該Ｈ３レラキシンＡ鎖はアミノ酸配列：
【数３】
2005508944.tif 000040
（配列番号４）  
（ここに、カルボキシル末端はアミド誘導体であり、および／または12位のLysはGluに置換されており、および／または19位のGluはGlnに置換されている）を有し、
該Ｈ３レラキシンＢ鎖はアミノ酸配列：
【数４】
2005508944.tif 000041
（配列番号２）  
（ここに、カルボキシル末端はアミド誘導体であり、および／または2位のAlaはProに置換されており、および／または8位のArgはLysに置換されている）を有し、
該Ａ鎖およびＢ鎖は、A11-B10およびA24-B22間ジスルフィド結合によって連結し、該ヒトＨ３レラキシン類似体はレラキシン生物活性を持つ、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
動脈性高血圧症の処置のための方法である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
冠状動脈疾患、末梢血管障害を含む末梢血管障害、レイノー症候群を含む血管痙攣、中枢および末梢神経系、腎臓、眼および他の器官に関する微小血管疾患の処置のための方法である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
血管障害、間質性線維症、糸球体硬化症、または他の腎臓疾患を含む腎臓疾患の処置のための方法である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
パニック性発作、広場恐怖症、広域不安症、恐怖状態を含む不安症状態を含む精神疾患の処置のための方法である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
主要なうつ病、気分変調症、双極性および単極性のうつ病；神経障害または神経変成疾患(記憶喪失または他の記憶障害、痴呆、アルツハイマー病を含む)を含むうつ病または抑うつ障害の処置のための方法である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
注意欠陥多動性障害、トゥレット症候群、衝動性、反社会性および人格障害、統合失調症に起因するものを含む精神疾患の陰性症状、獲得脳障害および前頭葉傷害を含む学習力、注意力および意欲の障害の処置のための方法である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
薬物、アルコールおよびニコチン依存症を含む脱毛症の処置のための方法である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
記憶喪失または他の記憶障害、痴呆、アルツハイマー病を含む神経障疾患または神経変成疾患の処置のための方法である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
パーキンソン病、ハンチントン病、および食事後の運動不足、頭部外傷、外科、腫瘍または脊髄損傷を含む活動および運動障害の処置のための方法である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
肺、心臓および心臓血管系、腎臓および尿生殖路、胃腸システム、皮膚、リウマチ性および肝胆汁性システムの繊維症を含む無制御または異常なコラーゲンあるいはフィブロネクチン形成と関連する疾患の処置のための方法である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
分娩開始遅延、子宮頚部成熟損傷、および胎児性難産による長期分娩の予防の処置のための方法である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ステロイドまたはペプチドホルモン生産に関連する副腎、卵巣および睾丸障害を含む内分泌障害の処置のための方法である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
繊維嚢胞性疾患、乳汁分泌障害およびがんを含む乳腺疾患の処置のための方法である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
免疫不全症、血液疾患および網内皮系悪性腫瘍を含む免疫障害の処置のための方法である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
着床障害による不妊症を含む子宮内膜性疾患の処置のための方法である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
ステロイドまたはペプチドホルモン生産に関係のある副腎障害、卵巣障害および睾丸障害を含む内分泌障害の処置のための方法である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
バソプレッシンの減少または不適当な分泌を含む水分平衡に関連する疾患の処置のための方法である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
胎盤機能不全の処置のための方法である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
血管疾患;動脈性高血圧症の処置;無制御または異常なコラーゲンあるいはフィブロネクチン形成と関連する疾患；腎臓疾患;精神障害;うつ病または抑うつ障害;神経疾患または神経変成疾患;学習力、注意力および意欲の障害;中毒障害;活動および運動障害;免疫疾患;乳腺疾患;子宮内膜疾患;内分泌障害;分娩開始遅延、子宮頚部成熟損傷;および胎児性難産による長期分娩の予防；洞性徐脈;脱毛;脱毛症;バソプレッシンの減少または不適当な分泌を含む水分平衡障害;または胎盤不足；の１つまたはそれ以上を処置するための薬剤の製造およびＨ３レラキシンまたはその類似体の使用であって、任意に1つまたはそれ以上の製薬的に許容される担体および／希釈剤および／または賦形剤とともに、ヒトＨ３レラキシン、または本明細書にて定義するその類似体の治療上有効な量をそのような処置を必要とする被験者に投与する。
【請求項２４】
Ｈ３レラキシンまたはその類似体が、ヒトＨ３レラキシン、ヒトＨ３プロレラキシン、ヒトＨ３プレプロレラキシン、またはその構成成分Ａ、ＢまたはＣペプチド鎖である、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
ヒトＨ３レラキシンまたはそのヒトＨ３レラキシン類似体が、
以下のアミノ酸配列：
【数５】
2005508944.tif 000042
（配列番号４）  
を有するＡ鎖、またはＮ−末端から約9アミノ酸以下が切断されているアミノ酸配列、および
以下のアミノ酸配列：
【数６】
2005508944.tif 000043
を有するＢ鎖、またはアミノ末端から９アミノ酸以下および／またはカルボキシル末端から約５アミノ酸以下が切断されているアミノ酸配列を含み、
ここに該Ａ鎖およびＢ鎖は、A11-B10およびA24-B22間ジスルフィド結合によって連結し、ヒトＨ３レラキシンまたはその類似体はレラキシン生物活性を持つ、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
ヒトＨ３レラキシン類似体が修飾されたＡ鎖および／または修飾されたＢ鎖を含み、該Ｈ３レラキシンＡ鎖はアミノ酸配列：
【数７】
2005508944.tif 000044
（配列番号４）  
（ここに、カルボキシル末端はアミド誘導体であり、および／または12位のLysはGluに置換されており、および／または19位のGluはGlnに置換されている）を有し、
該Ｈ３レラキシンＢ鎖はアミノ酸配列：
【数８】
2005508944.tif 000045
（配列番号２）  
（ここに、カルボキシル末端はアミド誘導体であり、および／または2位のAlaはProに置換されており、および／または8位のArgはLysに置換されている）を有し、
該Ａ鎖およびＢ鎖は、A11-B10およびA24-B22間ジスルフィド結合によって連結し、該ヒトＨ３レラキシン類似体はレラキシン生物活性を持つ、請求項２３に記載の使用。
【請求項２７】
動脈性高血圧症の処置のための請求項２３に記載の使用。
【請求項２８】
冠状動脈疾患、末梢血管障害を含む末梢血管障害、レイノー症候群を含む血管痙攣、中枢および末梢神経系、腎臓、眼および他の器官に関連する微小血管疾患の処置のための請求項２３に記載の使用。
【請求項２９】
血管障害、間質性線維症、糸球体硬化症、または他の腎臓疾患を含む腎臓疾患の処置のための請求項２３に記載の使用。
【請求項３０】
パニック性発作、広場恐怖症、広域不安症、恐怖状態を含む不安症状態を含む精神疾患の処置のための請求項２３に記載の使用。
【請求項３１】
主要なうつ病、気分変調症、双極性および単極性のうつ病；神経障害または神経変成疾患(記憶喪失または他の記憶障害、痴呆、アルツハイマー病を含む)を含むうつ病または抑うつ障害の処置のための請求項２３に記載の使用。
【請求項３２】
注意欠陥多動性障害、トゥレット症候群、衝動性、反社会性および人格障害、統合失調症に起因するものを含む精神疾患の陰性症状、獲得脳障害および前頭葉傷害を含む学習力、注意力および意欲の障害の処置のため請求項２３に記載の使用。
【請求項３３】
薬剤、アルコールおよびニコチン依存症を含む脱毛症の処置ための請求項２３に記載の使用。
【請求項３４】
記憶喪失または他の記憶障害、痴呆、アルツハイマー病を含む神経疾患または神経変成疾患の処置のための請求項２３に記載の使用。
【請求項３５】
パーキンソン病、ハンチントン病、および食事後の運動不足、頭部外傷、外科、腫瘍または脊髄損傷を含む活動および運動障害の処置のための請求項２３に記載の使用。
【請求項３６】
肺、心臓および心臓血管系、腎臓および尿生殖路、胃腸システム、皮膚、リウマチ性および肝胆汁性システムの繊維症を含む無制御または異常なコラーゲンあるいはフィブロネクチン形成と関連する疾患の処置のための請求項２３に記載の使用。
【請求項３７】
分娩開始遅延、子宮頚部成熟損傷、および胎児性難産による長期分娩の予防の処置のための請求項２３に記載の使用。
【請求項３８】
ステロイドまたはペプチドホルモン生産に関連する副腎、卵巣および睾丸障害を含む内分泌障害の処置のための請求項２３に記載の使用。
【請求項３９】
繊維嚢胞性疾患、乳汁分泌障害およびがんを含む乳腺疾患の処置のための請求項２３に記載の使用。
【請求項４０】
免疫不全症、血液疾患および網内皮系の悪性腫瘍を含む免疫障害の処置のための請求項２３に記載の使用。
【請求項４１】
着床障害による不妊症を含む子宮内膜性疾患の処置のための請求項２３に記載の使用。
【請求項４２】
ステロイドまたはペプチドホルモン生産に関連する副腎障害、卵巣障害および睾丸障害を含む内分泌障害の処置のための請求項２３に記載の使用。
【請求項４３】
バソプレッシンの減少または不適当な分泌を含む水分平衡に関連する疾患の処置のための請求項２３に記載の使用。
【請求項４４】
胎盤機能不全の処置のための請求項２３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト３レラキシン（以下、「Ｈ３レラキシン」という。）に関する。より詳細には、本発明は、治療における使用および処置の方法のみならず、Ｈ３レラキシン、プロ−およびプレプロ−Ｈ３レラキシン、これらの配列を含む個々のペプチド鎖、Ｈ３レラキシンの類似体、医薬組成物を含む組成物に関する。さらに、本発明は、Ｈ３レラキシン、Ｈ３プロ−およびプレプロ−レラキシン、Ｈ３レラキシン類似体、およびこれらの配列を含む個々のペプチド鎖をコードする核酸に関する。
【発明の背景】
【０００２】
１９２６年のヒサウ(Hisaw)の先駆的な研究により、動物でのペプチドホルモンであるレラキシンが、その恥骨結合弛緩作用の効果により重要な役割を果たし、こうして出生過程を促進することが示唆された。レラキシンは、妊娠中に卵巣の黄体中で合成され、分娩に先立って血流中に放出される。卵巣組織を得ることにより、ブタ（James et al (1977),Nature,267,554-546）、ラット（John et al (1981), Endocrinology 108,726-729）、およびサメ（Schwabe et al (1982),Ann. N.Y. Acid.Sci.380,6-12）のレラキシンの分離およびアミノ酸配列の決定が可能となった。
【０００３】
レラキシン遺伝子およびコードされたレラキシンポリペプチドは、ヒト、ブタ、ラット、ヒツジ、およびサメを含む多くの種にて同定されている。２つの別個の遺伝子が報告されているヒトおよび高等霊長類を例外とし、これらすべての種ではたった１つのレラキシン遺伝子しかほ乳類にて特性化されていない。個々のヒトの遺伝子は、本発明者らによって同定され、H1(Hudson et al (1983) Nature 301,628-631)およびH2(Hudson et al (1984) Embo. J. 3,2333-2339)と命名した。
【０００４】
Ｈ２遺伝子にコードされているペプチドは、ヒトにて大部分は貯蔵され、循環形状である(Winslow et al(1992)Endrocrielology 130,2660-2668)。H1レラキシンの発現は、脱落膜、胎盤および前立腺に限定されているが(Hansell et al(1991) J. Clirt. Endocrinol. Metab. 72, 899-904)、H1ペプチドは、ラット心房性生物検定にてH2レラキシンのそれと同様の生物活性を持つ。
【０００５】
レラキシンの作用は、子宮筋層収縮阻害能、結合組織の再構築刺激能、および産道の組織の軟化誘引能を含む。さらに、レラキシンは、乳腺の増殖および分化を増進し、結合組織の主要な要素の１つであるコラーゲンの破壊を引き起こす。レラキシンは、コラーゲン合成を減少させ、コラゲナーゼの放出を増加させる(Unemori et al (1990) J.Biol. Chem. 265,10682-10685)。これらの発見は、近年多くの妊娠に関連した表現型特性を示した、レラキシン遺伝子ノックアウトマウス(Zhao et al (1999) Endocrinology 140,445-453)の樹立によって確認された。機能的に活性なレラキシン遺伝子を欠いたメスのマウスは、恥骨結合の恥骨間靭帯の弛緩および伸縮できず、自らの子供に乳を飲ませることができず、子供はレラキシン野生型またはレラキシンヘテロ接合型の母親に養育させなければ、次々に24時間以内に死んだ。
【０００６】
レラキシンが、妊娠のホルモンのみでなく、女性の生殖システムの細胞および組織以外に作用することを示唆する証拠が蓄積している。レラキシンは、腎臓、中脳、肺および抹消血管系の血管拡張（血管拡張）を引き起こし、これらの組織にて血流または血液還流の増加を導く(Bani et al (1997) Gen. Pharmacol. 28,13-22)。レラキシンは、また、心拍数および冠状動脈血流の増加を促し、糸球体ろ過率および腎血漿流量の両方を増加させる(Bani et al (1997) Gen. Pharmacol. 28,13-22)。脳は、レラキシンペプチドが血圧および飲酒に影響する脳室周囲器官(Parry et al (1990)JNeuroeyadocrinol. 2,53-58 ; Summerlee et al(1998)Endocrinology 139,2322- 2328;Sinnahay et al (1999)Endocrinology 140,5082-5086)の受容体に結合することが示されており(Osheroff et al (1991) Troc. Nal.Acad. Sci. U. S. A. 88, 6413-6417; Tan et al (1999) Br. J. Pharmacol 127, 91-98)、レラキシンのもう１つの標的組織である。
【０００７】
冠状動脈疾患、末梢血管障害、動脈硬化に関連した腎臓疾患、または他の腎臓毛細管狭窄、あるいは眼または指先、中脳、肺および末梢血管のような体内における血管狭窄といった血管拡張に対応した様々な疾患におけるレラキシンの重要な臨床用途が生じる。
【０００８】
約２０年前の２つのヒトレラキシン遺伝子およびコードされたヒトレラキシンペプチド産物の発見は、それ自体が大きな驚きであった。
【０００９】
国際的なレラキシン生物学の２０年近くのさらなる研究および開発の利益には驚きではあったが、それよりも本発明者らは、３番目のヒトレラキシン遺伝子(Ｈ３)をコードする核酸配列、コードされたＨ３レラキシンペプチドおよびその構成ペプチド鎖を同定、分離および特性化した。Ｈ３レラキシンおよびその類似体の生産が、その利用および治療上の処置方法とともに可能となった。
【００１０】
（発明の概要）
本発明の第１の態様は、ヒトＨ３レラキシン、Ｈ３プロレラキシン、およびＨ３プレプロレラキシンのペプチド、これらの配列を含む個々のペプチド鎖およびその類似体、具体的には切断および／またはアミノ酸置換修飾の類似体に関する。より好ましくは、ペプチドは、様々な治療法によってヒトまたは動物に投与するための製薬的に許容される組成物として提供される。ペプチドは好ましくは、ペプチドおよび蛋白質の混入のない精製された、または均質な形態で、あるいは約90-99%純度の形態で単離される。
【００１１】
本発明の第２の態様では、Ａ鎖およびＢ鎖を有するヒトＨ３レラキシンまたはヒトＨ３レラキシン類似体が、
以下のアミノ酸配列：
【数１】
2005508944.tif 000002
（配列番号４）  
を有するＡ鎖、またはＮ−末端から約9アミノ酸以下が切断されたアミノ酸配列、および
以下のアミノ酸配列：
【数２】
2005508944.tif 000003
（配列番号２）  
を有するＢ鎖、またはアミノ末端から９アミノ酸以下および／または該カルボキシル末端から約５アミノ酸以下が切断されているアミノ酸配列を含み、
ここに該Ａ鎖およびＢ鎖は、A11-B10およびA24-B22間ジスルフィド結合によって連結し、該ヒトＨ３レラキシンまたはその類似体は、レラキシン生物活性を持つ組成物を提供する。
【００１２】
本発明の第３の態様は、修飾されたＡ鎖および／または修飾されたＢ鎖を有するヒトＨ３レラキシン類似体が、
該Ｈ３レラキシンＡ鎖はアミノ酸配列：
【数３】
2005508944.tif 000004
（配列番号４）  
（ここに該カルボキシル末端が、アミド誘導体であって、および／または12位のLysはGluに置換されており、および／または19位のGluはGlnに置換されている）を有し、
該Ｈ３レラキシンＢ鎖のはアミノ酸配列：
【数４】
2005508944.tif 000005
（配列番号２）  
（ここに、該カルボキシル末端はアミド誘導体であり、および／または2位のAlaはProに置換されており、および／または8位のArgはLysに置換されている）を有し、
該Ａ鎖およびＢ鎖は、A11-B10およびA24-B22間ジスルフィド結合によって連結し、該ヒトＨ３レラキシン類似体は、レラキシン生物活性を持つ組成物を提供する。
【００１３】
本発明の第４の態様は、ヒトＨ３プレプロレラキシンまたはヒトＨ３プロレラキシンを含む組成物を提供し、ヒトＨ３プレプロレラキシンに関してシグナル、Ａ鎖、Ｂ鎖およびＣ鎖を有し、かつヒトＨ３プロレラキシンに関してＡ鎖、Ｂ鎖およびＣ鎖を有し、該アミノ酸鎖はアミノ酸配列：
該Ａ鎖：
【数５】
2005508944.tif 000006
（配列番号４）  
を含み、
該Ｂ鎖：
【数６】
2005508944.tif 000007
（配列番号２）  
を含み、
該シグナル配列：
【数７】
2005508944.tif 000008
（配列番号１）  
を含み、
および該Ｃ鎖：
【数８】
2005508944.tif 000009
（配列番号３）  
を含む組成物を提供する。
【００１４】
本発明の第５の態様は、Ｈ３レラキシンの該Ｃ鎖を含む組成物を提供し、該Ｃ鎖はアミノ酸配列：
【数９】
2005508944.tif 000010
（配列番号３）  
を有する組成物を提供する。
【００１５】
本発明の第６の態様は、ヒトプレプロ−Ｈ３レラキシンをコードする核酸配列：
【数１０】
2005508944.tif 000011
（配列番号６）  
【数１１】
2005508944.tif 000012
を有する核酸配列を提供する。
【００１６】
本発明の第７の態様は、ヒトプロ−Ｈ３レラキシンをコードする核酸配列はＡ鎖、Ｂ鎖およびＣ鎖配列を含み、
該Ａ鎖配列：
【数１２】
2005508944.tif 000013
（配列番号７）  
を含み、
該Ｂ鎖配列：
【数１３】
2005508944.tif 000014
（配列番号８）  
を含み、
該Ｃ鎖配列：
【数１４】
2005508944.tif 000015
（配列番号９）  
を含む核酸配列を提供する。
【００１７】
本発明の第８の態様は、Ａ鎖およびＢ鎖を有するヒトＨ３レラキシンをコードする核酸配列であり、
該Ａ鎖配列：
【数１５】
2005508944.tif 000016
（配列番号７）  
を含み、
および該Ｂ鎖配列：
【数１６】
2005508944.tif 000017
（配列番号８）  
を含む、核酸配列を提供する。
【００１８】
本発明の第９の態様は、ヒトＨ３レラキシンのＡ、ＢまたはＣペプチド鎖をコードする核酸配列であり：
Ａ鎖：
【数１７】
2005508944.tif 000018
（配列番号７）  
Ｂ鎖：
【数１８】
2005508944.tif 000019
（配列番号８）  
およびＣ鎖：
【数１９】
2005508944.tif 000020
（配列番号９）  
をコードする核酸配列を提供する。
【００１９】
核酸配列は、プラスミド、バクテリオファージまたはウイルスＤＮＡあるいはＲＮＡのようなベクターに含まれ、一重鎖または二重鎖であり、かつ、バクテリア細胞のような宿主システムにおける発現を高め、増強または他の効果を与えるようなプロモーター、またはエンハンサーあるいは他の配列を含むことができ、分離、精製された核酸である。
【００２０】
核酸の三塩基コドンは、特定のアミノ酸をコードしている。当業者に周知のように、１つ以上のコドンが同じアミノ酸をコードしている。さらに、核酸配列の修飾または変更の方法は、当業者に周知である。ヒトＨ３レラキシン、プロ−Ｈ３レラキシン、プレプロ−Ｈ３レラキシンおよびその構成ペプチド鎖をコードする核酸のその様々な態様に関する本発明の限りでは、本発明は、同じ蛋白質産物をコードする核酸変異型、またはレラキシン生物活性を持つ蛋白質産物を含む。
【００２１】
本発明のヌクレオチド配列態様は、ストリンジェントなハイブリダイゼーションによって規定される密接に関連する核酸配列を含む：この条件は、65℃で一晩、0.25MH2P04 pH 7.2、lmmol EDTA、20%SDSの条件下で相補配列のアニーリングを行い；つづいて室温で2xSSC、0.1%SDSにて5分間の洗浄を３回行い；そして最後に、6xSSCは0.9MNaCl pH 7.0、0.3MNa3C02H20である、0.1%SSC中にて65℃で30分洗浄する。そのような配列は、Ｈ３レラキシンに反応する生物学的または免疫学的、あるいは他の活性を持つＨ３レラキシンポリペプチドをコードするだろう。
【００２２】
本発明の他の態様では、以下の１つまたはそれ以上の疾患の処置のための方法を提供している：冠状動脈疾患、末梢血管障害を含む末梢血管障害、レイノー症候群を含む血管痙攣、中枢および末梢神経系、腎臓、眼および他の器官に関する微小血管の疾患；（肺、心臓および心臓血管系、腎臓および尿生殖路、胃腸システム、皮膚、リウマチ性および肝胆汁性システムの繊維症を含む）繊維性疾患のような無制御または異常なコラーゲンあるいはフィブロネクチン形成と関連する疾患；血管障害、間質性線維症、糸球体硬化症、または他の腎臓疾患に関連する腎臓疾患；パニック性発作、広場恐怖症、広域不安症、恐怖状態を含む不安症状態；主要なうつ病、気分変調症、双極性および単極性のうつ病を含むうつ病または抑うつ障害；神経障害または神経変成疾患(記憶喪失または他の記憶障害、痴呆、アルツハイマー病を含む)；学習力、注意力および意欲の障害（注意欠陥多動性障害、トゥレット症候群、衝動性、反社会性および人格障害、統合失調症に起因するものを含む精神疾患、獲得脳障害および前頭葉傷害の陰性症状を含む）；中毒症状（薬剤、アルコールおよびニコチン中毒を含む）；活動および運動障害（パーキンソン病、ハンチントン病、および食事後の運動不足、頭部外傷、外科、腫瘍または脊髄損傷を含む）；免疫障害（免疫不全症、血液疾患および網内皮系悪性腫瘍を含む）；乳腺疾患（繊維嚢胞性疾患、乳汁分泌障害およびがんを含む）；着床障害による不妊症を含む子宮内膜性疾患；内分泌障害（ステロイドまたはペプチドホルモン生産に関連する副腎障害、卵巣障害および睾丸障害を含む）；分娩遅延、子宮頚部成熟損傷;および胎児性難産による長期分娩の予防；洞性徐脈;脱毛;脱毛症;バソプレッシンの減少または不適当な分泌を含む水分平衡障害;または胎盤不足；の１つまたはそれ以上を処置するための方法であり、任意に1つまたはそれ以上の製薬的に許容される担体および／希釈剤および／または賦形剤とともに、ヒトＨ３レラキシン、または本明細書にて定義するその類似体の治療上有効な量をそのような処置を必要とする被験者に投与する方法を提供する。
【００２３】
本発明のもう一つの態様は、以下の１つまたはそれ以上の疾患の処置のための薬剤の製造におけるヒトＨ３レラキシンまたはその類似体の使用を提供する：冠状動脈疾患、末梢血管障害を含む末梢血管障害、レイノー症候群を含む血管痙攣、中枢および末梢神経系、腎臓、眼および他の器官に関する微小血管の疾患；（肺、心臓および心臓血管系、腎臓および尿生殖路、胃腸システム、皮膚、リウマチ性および肝胆汁性システムの繊維症を含む）繊維性疾患のような無制御または異常なコラーゲンあるいはフィブロネクチン形成と関連する疾患；血管障害、間質性線維症、糸球体硬化症、または他の腎臓疾患に関連する腎臓疾患；パニック性発作、広場恐怖症、広域不安症、恐怖状態を含む不安症状態；主要なうつ病、気分変調症、双極性および単極性のうつ病を含むうつ病または抑うつ障害；神経障害または神経変成疾患(記憶喪失または他の記憶障害、痴呆、アルツハイマー病を含む)；学習力、注意力および意欲の障害（注意欠陥多動性障害、トゥレット症候群、衝動性、反社会性および人格障害、統合失調症に起因するものを含む精神疾患、獲得脳障害および前頭葉傷害の陰性症状を含む）；中毒症状（薬剤、アルコールおよびニコチン中毒を含む）；活動および運動障害（パーキンソン病、ハンチントン病、および食事後の運動不足、頭部外傷、外科、腫瘍または脊髄損傷を含む）；免疫障害（免疫不全症、血液疾患および網内皮系悪性腫瘍を含む）；乳腺疾患（繊維嚢胞性疾患、乳汁分泌障害およびがんを含む）；着床障害による不妊症を含む子宮内膜性疾患；内分泌障害（ステロイドまたはペプチドホルモン生産に関係のある副腎障害、卵巣障害および睾丸障害を含む）；分娩遅延、子宮頚部熟成損傷;および胎児性難産による長期分娩の予防；洞性徐脈;脱毛;脱毛症;バソプレッシンの減少または不適当な分泌を含む水分平衡障害;または胎盤不足；の１つまたはそれ以上を処置するための薬剤の製造における使用であり、任意に1つまたはそれ以上の製薬的に許容される担体および／希釈剤および／または賦形剤とともに、ヒトＨ３レラキシンまたは本明細書にて定義するその類似体の治療上有効な量をそのような処置を必要とする被験者に投与する使用を提供する。
【００２４】
ヒトレラキシンの同定、および２つのヒトレラキシン遺伝子の当時の驚異的な同定後２０年で思いがけず、さらに１つのレラキシン遺伝子が同定された。その種々の態様にて、本発明は：ヒトＨ３レラキシンをコードする核酸配列の特性化；精製核酸物質の分離；Ｈ３レラキシンをコードする核酸配列（ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびＤＮＡ）の増幅；Ｈ３レラキシン配列の核酸のクローニング；核酸配列の同定、かつヒトＨ３プレプロレラキシン、Ｈ３プロレラキシンおよびＨ３レラキシンをコードするペプチド配列の同定を提供した。
【００２５】
ヒトＨ３レラキシンポリペプチドは、Ａ鎖およびＢ鎖のジスルフィド架橋からなる。ヒトＨ３レラキシンのアミノ酸配列は、配列番号4に記載する。ヒトレラキシンのＢ鎖のアミノ酸配列は、配列番号2に記載する。
ヒトＨ３レラキシンの該ＡおよびＢ鎖は、A11-B10、A24-B22ジスルフィド結合型がこれらのシステイン結合間で起こる、システイン残基で結びついている。
ここで、ヒトＨ３レラキシンＡおよびＢ鎖のアミノ酸配列を、以下に示す：
Ａ鎖：
【数２０】
2005508944.tif 000021
（配列番号４）  
Ｂ鎖：
【数２１】
2005508944.tif 000022
（配列番号２）  
であり、該Ａ鎖およびＢ鎖はA11-B10、A24-B22間ジスルフィド結合によって連結している。
【００２６】
ヒトＨ３レラキシンは、古典的なレラキシン生物活性を持つ。ヒトレラキシン、Ｈ１およびＨ２レラキシンは、ＴＨＰ−１細胞(Parsell et al (1996)J.Biol. Chem. 271,27936-27941)のような、レラキシン受容体を発現している細胞に結合する。Ｈ２レラキシンは、これらの細胞のｃＡＭＰ産物の濃度依存的に増加調製する。本発明に関連して調製される合成Ｈ３レラキシンは、ヒトＨ２レラキシンを維持し、ｃＡＭＰの濃度依存的な増加を刺激する。Ｈ３レラキシンによって阻害されるようなヒトレラキシン受容体に関連する標的細胞における応答の特異性は、ＴＨＰ−１細胞にて1μｍ濃度増加でのｃＡＭＰ刺激応答のための牛インスリン(bINSL)またはヒトインスリン(hINSL3)の不活化によって明らかにされる。
【００２７】
ヒトＨ３レラキシンを備えたヒトレラキシン受容体の刺激によるセカンドメッセンジャー応答(cAMP)の誘導は、ヒトＨ３レラキシンが、古典的なレラキシン生物活性を持つという決定的な証拠を提供する。レラキシン受容体を含む細胞、例えば、前記ＴＨＰ−１細胞におけるそのような分析は、レラキシン生物活性を決定する簡易な方法を提供する。加えて、細胞に発現するレラキシン受容体のレラキシン結合部位への結合にてＰ３２−標識したＨ２レラキシンと競合させたヒトＨ３レラキシンの活性は、さらにレラキシン生物活性の確実な立証を提供する。
【００２８】
レラキシン生物活性の決定のための他の生物活性／分析は、当業者に周知である。例えば、妊娠または非妊娠期の活性レラキシンの測定に用いられるバイオアッセイには、モルモット恥骨間結合分析（guinea pig interpubic ligament assay）のような方法が使われる。(Steinetz et al (1960) Endocrinology 67,102-115, and Sirosi et al (1983)Americasl Journal of Obstetrics and Gynaecology 145: 402-405)。他のバイオアッセイは、ＴＨＰ−１細胞のｃＡＭＰ産物を含む。(Parsell et al (1996) J. Biol. Chem 271,27936-27941)。
【００２９】
本発明者らは、9つのアミノ酸以下をＡ鎖のＮ−末端から切断され、9つのアミノ酸以下をＢ鎖のＮ−末端から切断され、かつ、5つのアミノ酸以下をＢ鎖のＣ−末端から切断され調製された、Ｈ３レラキシン類似体を発見した。
結果、レラキシン類似体は、Ｈ３レラキシンＡおよびＢ鎖からなり、Ａ鎖はアミノ酸配列
【数２２】
2005508944.tif 000023
（配列番号４）  
を有し、アミノ末端から９アミノ酸以下が切断され、
およびＢ鎖はアミノ酸配列：
【数２３】
2005508944.tif 000024
（配列番号２）  
を有し、アミノ末端から９アミノ酸以下および／またはカルボキシル末端から約５アミノ酸以下が切断され、
該Ａ鎖およびＢ鎖はA11-B10、A24-B22間ジスルフィド結合により連結し、該ヒトＨ３レラキシンまたはその類似体は、レラキシン生物活性を持つ。ヒトＨ３レラキシンの該Ａ鎖は、１０番および１５番のＣｙｓ残基間の鎖内ジスルフィド結合を含む。
【００３０】
ヒトレラキシン受容体を有する細胞においてセカンドメッセンジャーの誘導を観察する標準的な分析にて、全長の切断されていないヒトＨ３レラキシンおよび本物のヒトＨ２レラキシンに特徴的な態様にて上述のＨ３レラキシン類似体のすべてがサイクリックＡＭＰ生産を誘導した。従って、上述の切断されたＨ３レラキシン類似体は、レラキシン生物活性を持つ。
【００３１】
本発明の他の態様は、修飾されたＡ鎖および／または修飾されたＢ鎖を有するヒトＨ３レラキシン類似体を含む構成物に関する。Ａ鎖、および／またはＢ鎖のカルボキシル末端は、アミド誘導体であってもよい。Ａ鎖の１２位のＬｙｓをＧｌｕに置換し、および／または１９位のＧｌｕを、Ｇｌｎに置換してもよい。Ｂ鎖にて、２位のＡｌａをＰｒｏに置換し、および／または８位のＡｒｇをＬｙｓに置換してもよい。結果、修飾されたアミノ酸を有するＨ３レラキシン類似体は、以下に示すようなアミノ酸配列を有する：
【００３２】
本発明の他の態様では、修飾されたＡ鎖および／または修飾されたＢ鎖を有するヒトＨ３レラキシン類似体を提供し、
該Ｈ３レラキシンＡ鎖はアミノ酸配列：
【数２４】
2005508944.tif 000025
（配列番号４）  
（ここに、カルボキシル末端がアミド誘導体であり、および／または１２位のＬｙｓをＧｌｕに置換し、１９位のＧｌｕをＧｌｎに置換されている）を有し、
該修飾されたＢ鎖はアミノ酸配列：
【数２５】
2005508944.tif 000026
（配列番号２）  
（ここに、カルボキシル末端がアミド誘導体であり、および／または２位のＡｌａをＰｒｏに置換し、８位のＡｒｇをＬｙｓに置換されている）を有し、
該ＡおよびＢ鎖はA11-B10およびA24-B22間ジスルフィド結合により連結し、かつ、ヒトＨ３レラキシン類似体はレラキシン生物活性を持つ。
ヒトＨ３レラキシンをコードする核酸配列の単離、精製および特性化は、ヒトＨ３レラキシンのシグナル配列およびヒトＨ３レラキシンのプロ配列の特性および産生を可能にする。
ヒトＨ３レラキシンのシグナル配列およびＣ鎖の同定、精製、特性化は、プレプロ−およびプロ−ヒトＨ３レラキシンの産生を可能にする。
【００３３】
本発明の他の態様は、ヒトＨ３プレプロレラキシンに関してシグナル、Ａ鎖、Ｂ鎖およびＣ鎖を有し、ヒトＨ３プロレラキシンに関してＡ鎖、Ｂ鎖およびＣ鎖を有する、ヒトＨ３プレプロレラキシンまたはヒトＨ３プロレラキシンを含む組成物を提供し、該アミノ酸鎖はアミノ酸配列：
該Ａ鎖：
【数２６】
2005508944.tif 000027
（配列番号４）  
を含み、
該Ｂ鎖：
【数２７】
2005508944.tif 000028
（配列番号２）  
を含み、
該シグナル配列：
【数２８】
2005508944.tif 000029
（配列番号１）  
を含み、
および該Ｃ鎖は：
【数２９】
2005508944.tif 000030
（配列番号３）  
を含む、組成物を提供する。
【００３４】
本発明のさらなる態様は、ヒトＨ３レラキシンのＣ鎖を提供し、該Ｃ鎖はアミノ酸配列：
【数３０】
2005508944.tif 000031
（配列番号３）  
を有し、ヒトＨ３プロレラキシンは特徴的なレラキシン生物活性を持つ。
【００３５】
ヒトＨ３レラキシン、プロレラキシン、プレプロレラキシンおよび構成ペプチド鎖は、米国特許番号US5,991,997、米国特許番号US4,758,516、米国特許番号US4,871,670、米国特許番号US4,835,251、PCT/US90/02085およびPCT/US94/0699に開示されているようなレラキシンの生産における有用な従来技術を用いて作成することができる。
【００３６】
アミノ酸が前記のように置換されたレラキシン類似体および誘導体は、例えば、Tsurushita et al (1988) Gene Tissue : 135-139.に開示のある部位特異的変異導入技術を用いて組換え手法により生産できる。
【００３７】
１つまたはそれ以上のアミノ酸が該Ａおよび／またはＢ鎖のＮ−および／またはＣ−末端を切断したヒトＨ３レラキシン、その類似体あるいは前記のようなアミノ酸置換を有するヒトＨ３レラキシン類似体の開示された配列情報は、レラキシン合成のためのBllesbach (1991)J. Biol. Chem. 266,10754- 10761の方法によって合成できる。さらに、ペプチド合成のよく知られている方法が、ここに引用された様々なＨ３レラキシン型を生産するために利用できる。
【００３８】
従って、レラキシンは、様々な疾患および障害の処置および診断に用いられる。例えば、レラキシンは、強皮症、鼻腔徐脈、心臓血管疾患、神経変成および神経疾患、脱毛症、うつ病の処置に有効であるという証拠が研究によって明らかとなった。米国特許番号US5,166, 191 および国際特許出願番号PCT/US92/069を参照のこと。該証拠はまた、慢性関節リウマチ性のような、コラーゲンまたはフィブロネクチンの異常な発現に関連する疾患および障害におけるレラキシンの使用を示唆する。
【００３９】
ヒトＨ３レラキシン、ヒトＨ３レラキシン不完全類似体、アミノ酸修飾されたＨ３レラキシン類似体およびヒトプロレラキシンは、本発明のレラキシン受容体への結合およびレラキシン生物活性の保有によって提供した。それは、これらのレラキシン生物活性を持つヒトＨ３レラキシン型が、前記のような疾患および障害の処置のために使用されうることを直接的に示唆している。
【００４０】
本発明の別の態様では、以下の１つまたはそれ以上の疾患の処置のための方法を提供する。：冠状動脈疾患、末梢血管障害を含む末梢血管障害、レイノー症候群を含む血管痙攣、中枢および末梢神経系、腎臓、眼および他の器官に関連する微小血管疾患；（肺、心臓および心臓血管系、腎臓および尿生殖路、胃腸システム、皮膚、リウマチ性および肝胆汁性システムの繊維症を含む）繊維性疾患のような無制御または異常なコラーゲンあるいはフィブロネクチン形成と関連する疾患；血管障害、間質性線維症、糸球体硬化症、または他の腎臓疾患に関連する腎臓疾患；パニック性発作、広場恐怖症、広域不安症、恐怖状態を含む不安症状態；主要なうつ病、気分変調症、双極性および単極性のうつ病を含むうつ病または抑うつ障害；神経障害または神経変成疾患(記憶喪失または他の記憶障害、痴呆、アルツハイマー病を含む)；学習力、注意力および意欲の障害（注意欠陥多動性障害、トゥレット症候群、衝動性、反社会性および人格障害、統合失調症に起因するものを含む精神疾患、獲得脳障害および前頭葉傷害の陰性症状を含む）；中毒症状（薬剤、アルコールおよびニコチン中毒を含む）；活動および運動障害（パーキンソン病、ハンチントン病、および食事後の運動不足、頭部外傷、外科、腫瘍または脊髄損傷を含む）；免疫障害（免疫不全症、血液疾患および網内皮系の悪性腫瘍を含む）；乳腺疾患（繊維嚢胞性疾患、乳汁分泌障害およびがんを含む）；着床障害による不妊症を含む子宮内膜性疾患；内分泌障害（ステロイドあるいはペプチドホルモン生産に関係のある副腎障害、卵巣障害および睾丸障害を含む）；分娩開始遅延、子宮頚部成熟損傷;および胎児性難産による長期分娩の予防；洞性徐脈;脱毛;脱毛症;バソプレッシンの減少または不適当な分泌を含む水分平衡障害;または胎盤不足；の１つまたはそれ以上を処置するための方法であって、任意に1つまたはそれ以上の製薬的に許容される担体および／希釈剤および／または賦形剤とともに、ヒトＨ３レラキシンまたは本明細書にて定義するその類似体の治療上有効な量をそのような治療を必要とする被験者に投与する方法を提供する。
【００４１】
本発明の別の態様では、以下の１つまたはそれ以上の疾患の処置のための薬剤の製造におけるヒトＨ３レラキシンまたはその類似体の使用を提供する。：冠状動脈疾患、末梢血管障害を含む末梢血管障害、レイノー症候群を含む血管痙攣、中枢および末梢神経系、腎臓、眼および他の器官に関連する微小血管疾患；（肺、心臓および心臓血管系、腎臓および尿生殖路、胃腸システム、皮膚、リウマチ性および肝胆汁性システムの線維症を含む）繊維性疾患のような無制御または異常なコラーゲンあるいはフィブロネクチン形成と関連する疾患；血管障害、間質性線維症、糸球体硬化症、または他の腎臓疾患に関連する腎臓疾患；パニック性発作、広場恐怖症、広域不安症、恐怖状態を含む不安症状態；主要なうつ病、気分変調症、双極性および単極性のうつ病を含むうつ病または抑うつ障害；神経障害または神経変成疾患(記憶喪失または他の記憶障害、痴呆、アルツハイマー病を含む)；学習力、注意力および意欲の障害（注意欠陥多動性障害、トゥレット症候群、衝動性、反社会性および人格障害、統合失調症に起因するものを含む精神疾患、獲得脳障害および前頭葉傷害の陰性症状を含む）；中毒症状（薬、アルコールおよびニコチン中毒を含む）；活動および運動障害（パーキンソン病、ハンチントン病、および食事後の運動不足、頭部外傷、外科、腫瘍または脊髄損傷を含む）；免疫障害（免疫不全症、血液疾患および網内皮系の悪性腫瘍を含む）；乳腺疾患（繊維嚢胞性疾患、乳汁分泌障害およびがんを含む）；着床障害による不妊症を含む子宮内膜性疾患；内分泌障害（ステロイドまたはペプチドホルモン生産に関連する副腎障害、卵巣障害および睾丸障害を含む）；分娩開始遅延、子宮頚部成熟損傷;および胎児性難産による長期分娩の予防；洞性徐脈;脱毛;脱毛症;バソプレッシンの減少または不適当な分泌を含む水分平衡障害;または胎盤不足；の１つまたはそれ以上を処置するための薬剤の製造における使用であって、任意に1つまたはそれ以上の製薬的に許容される担体および／希釈剤および／または賦形剤とともに、ヒトＨ３レラキシンまたは本明細書にて定義するその類似体の治療上有効な量をそのような処置を必要とする被験者へ投与する使用を提供する。
【００４２】
作用機序にとらわれることを意図しないが、発明者らは、Ｈ３レラキシンは脳、および神経を含む体の他の部分において、例えば細胞でのｃＡＭＰ生産の誘導を介して神経伝達物質または神経調節物質として作用すると考えている。
【００４３】
以下に定義するように、Ｈ３レラキシンは驚くことに、別名で核不確体（nucleus incertus)と呼ばれる、背側被蓋核の腹側正中部（ｖｍＤＴｇ）の神経構造部位において発現していることが明らかとなった(Goto et al (2001) Journal of Comparative Neurology 438: 86-122)。核不確体（nucleus incertus)からの遠心性神経および求心性神経を重要前脳部との間でやりとりする広範囲なパターンから、この領域は注意力、意欲、運動力、および学習(Goto et al)に対する影響を以て行動活性化を調節でき、本明細書中に記載する治療の処置様相を起こすことができる脳幹ネットワークの一部として提示される。これは、大脳皮質および他の相当する脳領域における豊富に分布するレラキシン結合部位と一致する。(Osheroff and Phillips (1991)Proc.Natl. Acad. Sci. USA88, 6413-6417; and Tan et al (1999)Br.J. Pharmacol. 127,91-98)。
【００４４】
Ｈ３レラキシンは血液脳関門を通過でき、あるいは、例えばPCT/WO89/10134に開示の方法の脂肪親和性賦形剤の使用、フロイ(Frey)の方法による鼻腔内投与(米国特許番号US6,313, 093)によって、血液脳関門を開くあるいはＨ３レラキシンの共同投与／時の投薬によって漏出を可能にする、1つまたはそれ以上の糖類またはアミノ酸あるいは他の物質 (例えば、Naito US Patent 6,294, 520を参照)の使用を含む当業者によって周知の方法によって、血液脳関門を通過することを促進するように処理できる。
【００４５】
本明細書中で述べるＨ３レラキシンおよび類似体は、精神障害、学習障害、注意および記憶の障害、中毒障害および活動および運動障害を含む、神経性疾患のような広く表現できる広い範囲の処置に有用になりうる。
【００４６】
Ｈ３レラキシンは、以下に述べるようなレラキシン受容体に結合する。
便宜上、特に示さない限り、ヒトＨ３レラキシン、1つまたはそれ以上のアミノ酸がヒトＨ３レラキシンの該ＡおよびＢ鎖の該Ｎ−および／またはＣ−末端以下を切断したヒトＨ３レラキシンの類似体、１つまたはそれ以上のアミノ酸がここで述べたような修飾または他のアミノ酸の置換を受けたヒトＨ３レラキシンの類似体、およびまとめてヒトＨ３レラキシンと呼ばれるヒトＨ３プレプロレラキシンを含む。
【００４７】
本発明にて使用する好適な医薬組成物は、所望の目的を達成するために有効な量を含有する活性成分を含む。より明確には、治療上有効な量とは、処置中の被験者の進行阻害または既存の症状の緩和をするための有効な量を意味する。有効な量の決定は、特にここに提供した詳細な開示に照らして、当業者であれば可能である。
【００４８】
本発明の方法にて使用される任意の組成物に関して、治療上の有効濃度は、細胞培養分析にてまず評価することができる。例えば、その服用量は、細胞培養において決定されるようなIC. sub. 50を含む循環濃度範囲を達成するための動物モデルにて策定することができる。そのような情報は、ヒトにてより正確に有用な服用量を決定するために使用することができる。
【００４９】
治療上の有効濃度は、患者の症状の改善または生存期間の延長に帰着する組成物の量を参考にする。そのような組成物の毒性および治療効果は、例えば、LD. sub. 50 (集団の50%の致死量)およびED. sub. 50 (集団の50%の治療上効果のある量)判定などの、細胞培養または実験動物の標準の製薬的処置によって決定することがでる。毒性および治療効果間の量比は、治療指数であり、LD. sub. 50およびED. sub. 50間の比率として表すことができる。高い治療評価を示す組成物が好まれる。これらの細胞培養分析および動物実験から得られたデータは、ヒトに使用する投薬量の範囲の公式化に使用することができる。そのような組成物の投薬量は、好適には毒性のほとんどないまたは全くないED. sub. 50を含む循環濃度範囲内にする。投薬量は、使用した投与剤形および利用した投薬ルートに依存するこの範囲内で変化しうる。正確な剤形、投薬ルートおよび投薬量は、患者の状態を診る個々の内科医によって選択することができる。( Fingl et al. , 1975, in"The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1pl参照)。
【００５０】
投薬量および投薬間隔は、レラキシン生物活性および効果を維持するために十分な、活性部分の血清レベルを提供するために個々に調節することができる。
Ｈ３レラキシンの投与は、同様の効用を持つ薬剤のための投与の許容可能な様態のうちのどれによってでも可能であり、好適には全身性投与によって可能である。
【００５１】
疾患および障害に関連する上記の同定したレラキシンの多くの処置のためのヒト投薬量は、未だＨ３レラキシン全体に最適化されていないが、日々の投薬量は、体重の約０．０５〜５００．０mu.g/kg/日であり、好適には約５．０〜２００．０mu.g/kg/日であり、より好適には約１０．０〜１００．０mu.g/kg/日である。一般に、それはＨ３レラキシンの血清濃度に近似または妊婦でのレラキシンの正常循環レベルより多い、すなわち1.0ng/ml、1.0〜20ng/mlのような、好適には1.0〜20ng/mlを得るようにする。
【００５２】
７０kgの人に対する投与のための投与量範囲は、約７．０mu.g〜３．５mg／日であり、好適には約４２．０mu.g〜２．１mg／日であり、最適には８４．０〜７００．０mu.g／日である。投与したＨ３レラキシンの量は、もちろん、被験者および症状の度合い、投与の方法および予定、かつ内科医の判断およびそのような類似体または誘導体の生物活性に依存するだろう。１つの処置計画は、より高い初期投薬レベル(たとえば、100〜200mu.g/kg/日)を用いた後、約１．０ng/mlの安定したＨ３レラキシン血清濃度を達成するために投薬量を減少することができる。他の処置計画は、特に分娩後のうつ病には、レラキシンの正常妊娠レベル(約1.0ng/ml)に達するのに十分なＨ３レラキシンの量の投与を要し、続いてＨ３レラキシン血清レベルが検知できなくなるまで徐々に減少する投薬量で（例えば、約20ピコグラム/ml未満)、任意にその投薬レベルに達する処置を中止する。
【００５３】
任意の投薬の製薬的に許容される様態が、使用されうる。Ｈ３レラキシンは、単独または例えば錠剤、カプセル、粉末、液体、ゲル、懸濁液、坐薬、エアゾルなどのような固体、半固体、液体あるいはエアゾル投与剤形を含む他の製薬的に許容される賦形剤との組合せの投与が可能である。そのようなタンパク質は、正確な投薬量の単一の投与にふさわしい単一投与剤形において所定の比率での延長投与のための、蓄積注射、浸透圧ポンプ(Alzaによって作製されたAlzet挿入のような)、錠剤、経皮的(電気輸送を含む)パッチなどを含む、(例えば、遅い放出の生物浸食可能なデリバリーシステムの使用)、持続または制御放出投薬形にて投与され、組成物は、一般に便利な製薬的担体または賦形剤および／またはＨ３レラキシン、Ｈ３プロレラキシンおよびＨ３プレプロレラキシンまたはその誘導体を含む。さらに、これらの組成物は、他の活性成分、担体、補助剤などを含む。
【００５４】
本発明の好適な態様としての、持続／制御放出Ｈ３レラキシン製剤は、薬物分散を開始させる選択的な浸透性外部バリアー、および予め決定した比率で徐々に減少するＨ３レラキシンの供給投与量になるように設計した内部Ｈ３レラキシン含有部分である。 (例えば、初め約５００mu.g/日で供給し、１０mu.g/日の比率で減少させるためのマトリックスにＨ３レラキシンを約３０mgを含む。）。
【００５５】
本発明のもう１つの好適な態様としての、持続／制御放出型Ｈ３レラキシンが、薬剤投与開始にて選択的浸透可能な外部バリアー、治療に効果的な日々の投与量のＨ３レラキシンの供給投与量になるように設計した部分を含む第１の内相Ｈ３（例えば、約500 mu.g/日の継続的な供給のためのマトリックスにてＨ３レラキシンの約50mgを含む）、かつ第1の内相からＨ３レラキシンの枯渇に始まる、前もって定義した割合（例えば、50 mu.g/日で減少する約500 mu.g/日の開始供給のためのマトリックスにＨ３レラキシンの約３ｍｇを含む）で次第に減少するＨ３レラキシンの供給投薬を目指した、第２の内相Ｈ３レラキシン部分を持つ。
【００５６】
一般に、投与の所望の様態に依存して、製薬的に許容される構成は、Ｈ３レラキシンの重量の約0.1%〜90%を、好適には約0.5%〜50%を含み、単独またはＨ３レラキシンとの組み合わせであり、残りは、適切な製薬的賦形剤、担体などを含む。実際、そのような投与剤形を調製する方法は、当業者によって周知である；例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa.,15th Edition, 1975を参照。
【００５７】
局所投与または選択的摂取の場合は、薬の効果的な局所濃度は、血漿濃度と関係がない。
投与した組成物の量は、もちろん、処置された被験者、被験者の体重、疾患の程度、投与の方法および内科医の判断に依存するだろう。
【００５８】
投与の好適なルートは、例えば、経口、直腸、粘膜側または腸内投与を含むことができる。非経口投与は、一般に皮下、皮内、筋肉内または静脈内のどれか、より好適には皮下への注入によって特徴づけられる。注入物質は、液状の溶液または懸濁液のどちらか、注入前の液体に溶解または懸濁するために適した固形、あるいは乳剤ような従来の形で準備することができる。好適な賦形剤としては、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロース、エタノールなどがある。さらに、所望であれば、投与される医薬組成物は、湿潤または乳化物質、ｐＨ緩衝剤、可溶性増進剤などのような少量の無毒な補助剤を含んでいてもよく、例えば、酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミン、オレイン酸塩、シクロデキストリンなどである。
【００５９】
非経口投与のためのより最近考案された方法として、投薬の一定のレベルが維持されるような遅い放出または持続放出性システムの注入を採用している。例えは、米国特許番号US3,710, 795.を参照。
【００６０】
別法として、１つは、例えば、多くは蓄積または持続放出型剤形での、固形腫瘍への直接の組成物の注入による、システム化された方法よりむしろ局所へのＨ３の投与が可能である。
【００６１】
さらに、１つは、例えば、腫瘍特異的抗体でコートしたリポソーム中の標的の薬物送達システムにおける薬物の投与が可能であり、リポソームは、標的とされ、腫瘍によって選択的に取り上げられるだろう。
【００６２】
本発明の医薬組成物は、例えば、従来の混合、溶解、粒状化、糖衣錠形成、ゲル状、乳化、カプセルに入れる、取り込むまたは凍結乾燥する工程によって、それ自体知られている方法で製造される。
【００６３】
こうして本発明に従って使用される医薬組成物は、製薬的に使用できる調合薬での活性な組成物の処理を促進する補形剤および補助剤を含む1つまたはそれ以上の製薬的に許容される担体を使用する従来方法にて公式化することができる。適切な剤形は、選択した投与ルートに依存する。
【００６４】
組成物は、例えば、ボーラス注入または継続的投入、注入によって非経口投与のために策定することができる。注入の剤形は、投与剤形の単位に存在し、例えば、アンプル中または追加予防薬を備えた多重薬剤コンテナー中に存在することができる。組成物は、油性または水性媒体中に懸濁、溶解あるいは乳化のような剤形で保持され、懸濁、安定化および／または分散剤ような決まった物質を含んでもよい。
【００６５】
非経口投与のための医薬的剤形は、水溶性の剤形にて活性な組成物の水溶液を含む。加えて、活性な組成物の懸濁液は、適当な油性注入懸濁液として調製することができる。好適な脂肪親和性溶剤または媒体は、胡麻油のような脂肪油、またはオレイン酸エチルあるいはトリグリセリド、またはリポソームような合成脂肪酸エステルを含む。水性注入懸濁液は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランのような懸濁液の粘性を増加させる物質を含んでいてもよい。任意に、該懸濁液が、高濃度溶液の調製を可能にするための組成物の可溶性を増加する、適切な安定剤または賦形剤をも含んでいてもよい。
【００６６】
または、該活性成分が、例えば使用前の滅菌性無発熱物質水といった、適切な媒体を備えた構成のための粉末剤形中にあってもよい。
【００６７】
該組成物を、例えば、ココアバターまたは他のグリセリドのような従来の坐薬基剤を含む、坐薬または保持浣腸剤のような直腸組成物中に形成してもよい。
【００６８】
さらに上述した剤形の組成物を、持続性薬剤調製液として形成してもよい。そのような長時間作用性剤形を、移植（例えば、皮下または筋肉内）または筋肉内注入によって投与してもよい。こうして、例えば、組成物は、適した複合体または疎水性物質（例えば、許容される油液中の乳剤のような）またはイオン交換樹脂、あるいは、例えば難溶性の塩のような、難溶性の誘導体と一緒に形成してもよい。
【００６９】
本発明の疎水性組成物のための製薬的担体は、ベンジルアルコール、非極性界面活性剤、水混和性有機ポリマー、および水相を含む共溶媒システムである。該共溶媒システムは、VPD共溶媒システムであってよい。VPDは、3％w/vのベンジルアルコール溶液、8％w/vの無極性界面活性剤ポリソルベート80、および65％w/vポリエチレングリコール300の溶液であり、無水エタノール中にて容量増加した。VPD共溶媒システム（VPD：5W）は、水中にてVPDを5％デキストロースで１：１に希釈したものからなる。本共溶媒システムは、疎水性組成物をよく溶解し、それ自体がシステム化された投与での低い毒性を実現する。必然的に、共溶媒システムの比率は、その溶解性および毒性特性の無効化なしに大幅に変更してもよい。さらに、共溶媒組成物の属性は変化しても良い。：例えば、他の低毒性無極性界面活性剤を、ポリソルベート80の代わりに用いてもよく；ポリエチレングリコールの画分サイズを、変更しても良く；生物適合性ポリマーを、ポリエチレングリコール、例えばポリビニルピロリドンに置換してもよく;および他の糖類または多糖を、デキストロースの代わりにしても良い。
【００７０】
または、疎水性の製薬的組成物の他の配達システムを、用いることができる。リポソームおよび乳剤は、疎水性の薬剤の配送媒体または担体の例としてよく知られている。ジメチルスルホキシドのようなある有機溶媒を通常、より強い毒性を犠牲にするが、用いてもよい。加えて、該組成物を、例えば、治療上の薬剤を含む固形疎水性ポリマーの半透性マトリックスのような継続放出システムを利用して配達してもよい。様々な継続放出マトリックスが確立され、当業者に周知である。継続放出性カプセルは、その化学的性質に依存し、数週間から100日以上の期間にて組成物を放出できる。治療薬の化学的性質および生物学的安定性に依存した、タンパク質安定化の付加戦略を採用できる。
【００７１】
医薬組成物は、安定な固体またはゲル相担体あるいは賦形剤をも包含できる。そのような担体または賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖類、スターチ、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコールを含むが、それに制限されない。
【００７２】
ヒトＨ３レラキシンを含む剤形は、単独またはラクトースのような不活性担体との組合せ、あるいは他の製薬的に許容される賦形剤と共に、鼻または肺の吸入エアゾルまたは霧状の溶液として、あるいは吸入のためのミクロ粉末として、呼吸器系器官に投与される。そのような場合、剤形の粒子は、有利に50ミクロン未満の直径、好適には10ミクロン未満の直径を持つことができる。Ｈ３レラキシンの投与に適合することができるインスリンのための投与方法を開示している、米国特許番号US5,364,838を参照。
【００７３】
脱毛症のような疾患の治療のためのＨ３レラキシンは、(例えば、米国特許番号US4,938,953に開示のある、蛋白質成分の包含に必要な、当業者に周知の方法によって適合した)シャンプーまたは任意に吸収を促進するためにＨ３レラキシン濃度を増加したゲル(例えば、米国番号08/050,745に開示されている)のような頭皮への使用される剤形の局所投与である。
【００７４】
経口投与にて、組成物は、当業者に周知の製薬的に許容される担体と活性な組成物の組合わせにより容易に剤形化することができる。そのような担体は、本発明の組成物を処置される患者による経口摂取のために、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして剤形化することができる。用いる経口のための製薬的調製液は、任意に生じる混合物を挽き、顆粒の混合物を処理し、適切な補助物を加えた後、所望であれば、錠剤または糖衣錠の核を得る固形賦形剤を入手してもよい。好適な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトール；例えば、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ポテトデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロースおよび／またはポリビニルピロリドン(PVP)のようなセルロース調合液を含む糖類のような充填剤である；である。所望であれば、崩壊剤は、クロスリンクしたポリビニルピロリドン、寒天またはアルギン酸あるいはアルギン酸ナトリウムのようなその塩を加えることができる。
【００７５】
糖衣剤の核には、適したコーティングを施している。本目的のために、濃縮した糖溶液を、使用し、任意にガムアラビン酸、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタニウム、ラッカー溶液、および適した有機溶媒または溶媒混合液を含むことができる。染料または色素は、識別または活性な組成物投薬量の異なる組合わせの特性化のための錠剤または糖衣錠コーティングを加えてもよい。
【００７６】
経口で使用することができる製薬的調製液は、グリセロールまたはソルビトールのようなゼラチンまたは可塑剤で作られた柔軟で密閉したカプセルはもちろん、ゼラチンで作られた押し込み型カプセルを含む。押し込み型カプセルは、ラクトースのような充填剤、デンプンのような接着剤、および／またはタルクまたはステアリン酸マグネシウム、および任意の安定剤のような潤滑剤を備えた混和剤中に活性成分を含むことができる。柔軟なカプセルにて、活性な成分を、脂肪油、流動パラフィン、または液体のポリエチレングリコールのような適切な液体中に懸濁または溶解することができる。さらに、安定剤を加えることができる。すべての経口投与のための剤形は、そのような投薬にふさわしい投与剤形にしなければならない。
【００７７】
吸入による投薬のために、本発明にて使用する組成物は、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガスといった、適した高圧ガスの使用と共に、加圧したパックまたは噴霧器からエアゾールスプレー提示の形状にて都合良く配送される。加圧したエアゾル投薬単位の場合は、一定量にするために弁を提供することにより解決できる。カプセルおよびカートリッジ、例えば、吸入器か通気器で使用するためのゼラチンは、組成物の粉末・ミックスおよびラクトースまたはデンプンのような適切な粉末・ベースを含む剤形にすることができる。
【００７８】
本発明の様々な態様として、以下に実施例を挙げて詳しく説明するが、それらに限定されるものではない。
【００７９】
以下の例にて、ラットは、ヒト脳での発現の位置づけを可能にした、ラット脳におけるmRNAおよびタンパク質レベルでのH3レラキシン発現を位置づけるための実験モデルとして用いた。この点にて、ラット脳は、ヒト脳の標準的相対的な解剖モデルである(Goto et al (2001) The Journal of Comparative Neurology 438: 86-122)。
【００８０】
（実施例１）
核酸配列の同定、特性化、精製および操作
組織ＲＮＡ／ＤＮＡ抽出およびRT-PCR−ヒトゲノムＤＮＡは、標準プロトコールを用いてヒトＣＬより抽出した(Sambrook et al 1989)分子クローニング中: 実験マニュアル、第２版 、 Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY)。ヒトＣＬおよびマウス組織を、液体窒素の存在状態にてきれいにさいの目に切断し、直ちにRNA Wiz 試薬(AmbionInc., Austin, TX) で均質化し、RNAを製造元の取り扱い説明書に従って抽出した。個々のサンプルからの全ＲＮＡ（５μｇ）は、逆転写（ＲＴ）反応に用い、製造元の取り扱い説明書によれば２０μｇ量にSuperscript II RT-PCR kit (Gibco-BRL, Rockville, MD)を用いて行った。100ngのプライマーおよび150ngのcDNA鋳型を含む５０μl反応液を、すべてＰＣＲ反応に利用した。マウス組織を、特異的フォワード[5'TGCGGAGGCTCACGATGGCGC 3']およびリバース[5'GACAGCAGCTTGCAGGCACGG 3']プライマーを用いて、３１９bpの産物の生成によってＭ３レラキシン発現の選別をした。マウスレラキシン（Ｍ１）発現は、公開された配列(Evans et al (1993)J. Mol.Endocrinol. 10,15-23)に基づく特異的フォワード[5'GTGAATATGCCCGTGAATTGATC3']およびリバース[5' AGCGTCGTATCGAAAGGCTCT 3'] プライマーを用いて、１５０ｂｐ産物の生成によって判断した。
【００８１】
ヒトＣＬcDNAは、フォワード１[5'ACGTTCAAAGCGTCTCCGTCC 3']、 フォワード２[5' CGGTGGAGACGATCAGACATC3']、およびリバース[5' ATGGCAGGACTGGGGCATTGG 3']の、Ｈ３レラキシンの特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ反応に用い、フォワード１／リバースおよびフォワード２／リバースのそれぞれで５０４ｂｐおよび３１０ｂｐの産物を生成した。我々が以下に示す、すべてのプライマーの組合せは、ゲノムＤＮＡの混入を制御するために、それぞれマウスおよびヒトのレラキシン配列にて１つのイントロンを交配した。すべての実験にてGAPDHフォワード[5'TGATGACATCAAGAAGGTGG 3']およびリバース[5' TTTCTTACTCCTTGGAGGCC 3']プライマーによる２４６ｂｐの産物は、質およびcDNAの等価ローディングの制御のために分離ＰＣＲ反応にて用いた。ＲＴ−ＰＣＲによるＭ３レラキシンの発現は、単に1つの代表的な実験が示す結果であるが、少なくとも２つの動物から抽出されたcDNA試料にて行った。マウスPCR反応は、以下の(タッチダウン)アニーリング温度を用いてPerkin Elmer遺伝子増幅装置にて達成した。：64℃(2 cycles)、63 ℃(2 cycles)、62 ℃(2 cycles)、61 ℃(2 cycles)、60℃(32 cycles)。ヒトＣＬcDNAにおけるＨ３レラキシン発現は、以下のアニーリング温度にてＲＴ−ＰＣＲによって行った。：60 ℃(2 cycles)、59℃(2 cycles)、58℃(2 cycles)、57℃(2 cycles)、56 ℃(32 cycles)。ＰＣＲ産物のアリコートを、エチジウムブロマイドで汚染した2%(w/v)のアガロース・ゲル上で電気泳動にかけ、撮影した。マウス組織試料は、サザンブロット分析のために、Hybond NX薄膜(Amersham International, Aylesbury, UK)に転写した。
【００８２】
付加的ＰＣＲ反応は、マウス脳およびリバースＭ３プライマー(上記)およびＡＴＧ開始コドンの前からのフォワードプライマー(5'GGG TCGCAGGCATCTCAACTG'3)を用いて、マウス脳および卵巣ｃＤＮＡを用いて行った。結果物は、全長Ｈ３レラキシンのコーディング配列を含む。ＰＣＲは、上記のように行なったが、以下に示すアニーリング温度にて行った。：60℃(2 cycles)、59℃(2 cycles)、58℃(2 cycles)、57 ℃(2 cycles)、56℃(32 cycles)。３２Ｐ−標識した特異的Ｈ３レラキシンcDNAプローブを生成するためおよびヒト複合組織分析の後発プローブとして活用するために、ＲＴ−ＰＣＲは、ヒトゲノムＤＮＡ(50ng)で行った。該Ｈ３レラキシン遺伝子のエクソン配列の特異的なフォワード(5'CGGATGCAGATGCTGATGAAG 3')およびリバース(5'GTGCCTGAGCCCACAGTGCCT 3’) プライマーは、以下のアニーリング温度にて使用した。: :60℃(2 cycles)、59 ℃(2 cycles)、58℃(2 cycles)、56℃(2 cycles)、54 ℃(32 cycles)。これらの産物は、前記のマウスＰＣＲ産物と同様に、2%(w/v)のアガロース・ゲル上で分離した。バンドは、ＵＶライト下で期待するサイズで検出され（マウス３１９bp、４７８bp、ヒト３７４bp）、超清浄TM 15 DNA精製キット(Geneworks Pty Ltd, Adelaide, Australia)を用い、ゲルから切り出し溶出した。バンドは、該pGEM-T ベクター(Promega, Madison, WI)にサブクローニングし、その後、多数のサブクローンを、製造元の取り扱い説明書に従ってABI PRISM 377 自動DNAシークエンサー(Biosystems提供, Melbourne, Australia)を用いて両鎖をシークエンスした。
【００８３】
サザンブロット解析−膜上のＰＣＲ産物は、Ｍ１レラキシン(5' CAAGCAGAGCTGGCTCCTCCTGGCT CAAAGCCAATCTTC 3')およびＭ３レラキシン(5' AATTTGGCTCTTGCTACAGCCCCACTCG CAGCAACTGCT 3') cDNA配列に対して特異的内在性オリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせ、T4ポリヌクレオチドキナーゼおよび[γ-32P] ATPを用いて標識した。ハイブリダイゼーションを、５ｘＳＳＣ(1ｘSSC； 0.15 MNaCI、15 mM sodium citrate、pH 7)、５ｘDenhardts、１％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌの超音波分解したニシン精子中で５５℃にて一晩行った。メンブレンは、室温で２４時間BioMAX MRフィルム(EastmanKodak Co. , Rochester, NY)に感光する前に、室温で2ｘＳＳＣ、0.2％ＳＳＣ中で５分間３回洗浄後、0.1ｘSSC, 0.1% SDSにて５５℃で３０分洗浄した。
【００８４】
ノーザンブロット解析−さらにＭ３レラキシンｍＲＮＡの発現を検討し、
心臓、脳、肺、オスマウスの胸腺および脾臓、および卵巣、子宮内膜、子宮筋層、メスマウスの子宮頚管および膣からの全ＲＮＡ(５−２５μｇ)を、妊娠7.5日、10.5日および18.5日から集め、標準化ＭＯＰＳ/ホルムアルデヒドゲル上で泳動した。その後、ＲＮＡを、最適化Hybond-NX膜にトランスファーし、Ｍ３レラキシンの特異的プライマー（上記参照）によって生じた、３１９bpのＰＣＲ産物に対応する３２Ｐ−標識したプローブを備えたＭ３レラキシンｍＲＮＡのプローブとした。この産物を、特異的リバースプライマー（上記）および、前記の（３１）に開示されているＴ７ポリメレースを用いて[α−３２Ｐ]ｄＣＴＰにて標識した。膜を、0.25M NaH2P04、pH 7.2、1mM EDTA、 20% SDS中にて６５℃で一晩ハイブルリダイズ後、室温で2ｘSSC、0.1% SDSにて５分間３回洗浄し、最後に0.1ｘSSC、0.1% SDS中にて６５℃で３０分間洗浄した。膜を、FujiX 2000 Phosphoimager(Fuji Photo Company, Japan)で分析する前に、室温で48時間phosphoimager プレートにまず感光し、その後８０℃でHyperscreen (Amersham Pharmacia, Sydney, Australia)と共にBioMAX MSフィルム(Integrated Sciences, Melbourne, Australia)に感光した。個々の実験にて、脳、脾臓、肝臓および精巣からの全RNA(200μg)は、mRNA精製キット(Amersham Pharmacia)を用いて、ポリA−RNAを精製し、上述のようにノーザンブロットを行った。ヒト複合組織発現アレイ(CLONTECH laboratories, Palo Alto, CA)は、製造元の奨励する３２Ｐ−標識したＨ３レラキシン特異的プローブをハイブルリダイズした。ゲノムＤＮＡから分離したＨ３レラキシン配列の３７４ｂｐ断片は、Ｈ３レラキシン特異的リバースプライマー（上述の）、およびＴ７ポリメレース(Bathgate et al (1999)Biol. Reprod. 61,1090-1098)を用いて[α-32P]ｄＣＴＰで標識した。膜を、上記のphosphoimager plateおよびBioMAX filmにて感光した。
【００８５】
in situ ハイブリダイゼーション組織化学−冠状断片（１４μｍ）を、低温保持装置上にて１６℃で切断し、シランコートしたスライド上にマウントした。断片を、１０分間クロロホルム中で脱脂し、すすぎ、４℃にて100%エタノール中に保存した。Ｍ３レラキシンｍＲＮＡ配列の３つのオリゴヌクレオチド（３９mer）[5' GGTGGTCTGTATTG GCTTCTCCATCAGCGAAGAAGTCCC3]；[5' AATTTGGCTCTTGCTACAGCCCCACTC GCACGAACTGCT 3'] および[5' TAAGGAGACAGTGGACCCCTTGGTGCCTCGCCTGT AGGA 3']、および既知のＭ１レラキシン配列（Evans et al (1993) J. Mol. Endocrinol. 10, 15-23）の３つのオリゴヌクレオチド [5' GCACATCCGAATGAATCCGTCCATCCACTCCTCCGAGAC3]、[5' CAAGCAGAGCTGGCTCCTCCTGGCTCAAAGCCAATCTTC 3'] および[5' GTTGTAGCTCTGGGAGCGAGGCCTGAGCCTCAGACAGTA 3']は、商業的に調製されている（Geneworks Pty Ltd.）。プローブを、末端デオキシヌクレオチド転移酵素を用いて、１ｘ１０９d.p.m./μgの特異的活性のために[α-32Ｓ]ｄＡＴＰ(1200Ci/mmol;NEN, AMRAD-Biotech, Melbourne, Australia)で標識した(Roche Diagnostics; Wisden et al(1994) 脳のin situ ハイブリダイゼーションプロトコール中にて(Wisden, W. and Morris, B. j. eds), pp 9-34, Academic Press, London)。遺伝子配列データベース(Celera, EMBL and Genbank; NCBI/NIH Blast Service)に対して用いた配列のスクリーニングでは、適当なＭ１およびＭ３レラキシンｍＲＮＡとのみホモロジーを示した。
【００８６】
断片は、５０％ホルムアルデヒド、４ｘＳＳＣ、１０％デキストラン硫酸塩および０．２Ｍジチオスレイトールを含むハイブリダイゼーションバッファー中で複合３５Ｓ−標識したプローブ(各30fmolプローブ/スライド)で４２℃にて一晩インキュベートした。スライドを、５５℃で１時間１ｘＳＳＣ中にて洗浄し、０．１ｘＳＳＣ中にてすすぎ、その後Kodak BioMAX MRに１０日間並べ乾燥した。
【００８７】
ハイブリダイゼーションの信頼性は、ハイブリダイゼーションバッファーに対して無標識のプローブの100倍過剰の付加によってすべての領域で確実にシグナルをブロックすることができるという実証によって確認し、非特異性またはバックグラウンドハイブリダイゼーション(データ掲載せず)に相当するものをのぞいた。さらに、３つのオリゴヌクレオチドプローブを、Ｍ３レラキシン遺伝子配列の非重複部位であり、完全に異なるものを使用した。
【００８８】
ヒトレラキシン（Ｈ３）研究：
固相合成−Ｈ３遺伝子にコードされた推定ペプチド配列を、シグナルペプチドおよびＢ鎖、およびＨ３レラキシンプロホルモンのB/CおよびC/A鎖結合間の推定シグナルペプチドおよび蛋白質分解酵素切断部位に基づく固相合成方法によって作製した(詳細な結果を参照)。簡易な合成として、我々は、そのカルボキシル末端アミド誘導体として該ＡおよびＢペプチドの調製を選択した。選択的Ｓ−保護したＡおよびＢ鎖は、前記Dawson et al (1999)J.Pept. Res. 53,542-547の連続フローFmoc固相法によって0.1mmol規模で合成した。選択的Ｓ−保護は、以下のシステイン残基に対して行った。: A１０,１５およびB２２のトリチル(Trt)、A２４の第３-ブチル、およびＡ１１およびＢ１０のアセトアミドメチル (Acm) (アミノ酸残基の番号に関しては図2Ａを参照)。
【００８９】
合成の完了にて、Ｓ−保護したＡおよびＢ鎖を、固相担体から離し、同時に側鎖を、捕捉剤の存在下でＴＦＡを処理することによって脱保護した。選択的ジスルフィド結合形成は、特にMaruyama et al(1992)J.Prot.Claim. 11,1-12のボンビキシンの合成に記載のあるように成した。
【００９０】
ペプチド特性化−ペプチドは、GBC自動分析機 (Melbourne, Australia)にて24時間酸性水解物の複製アミノ酸分析によって測定した。MALDITOF質量分析(MS)は、遅延イオン抽出を備えたBruker Biflex 機器 (Bremen, Germany)上で19.5kvで線状モードにて行った。
【００９１】
他のレラキシンおよびインスリンペプチドーヒトＩＮＳＬ３を、ヒツジINSL3(Dawson et al (1999) J. Pept. Res. 53,542-547)に使用する方法と同様の方法で合成し、上記に概説したようなMSおよびアミノ酸分析にて特性化した。Ｈ１レラキシンは、前記のように合成し(Wade et al (1996)Biomed. Pept. Prot. Nucl. Acids 2,27-32)、合成Ｈ２レラキシンは、Connetics Corporation (Palo Alto, CA)から頂き、および牛インスリンは、Roche Diagnostics (Sydney, Australia)の製品を購入した。
【００９２】
ＴＨＰ−１細胞生物アッセイ−ヒト単球性細胞株（ＴＨＰ−１）にてｃＡＭＰ生産を誘導するＨ３レラキシンの能力は、以下の修飾を持ち、Parsellと同僚の方法による(Parsell et al (1996) J. Biol. Chem. 271,27936-27941)Ｈ１およびＨ２レラキシンと同等であった。；トリパンブルーを用いた生存テストしたTHP-1細胞を、培地に懸濁し、60,000 細胞/ウェル.濃度で96ウェルプレートに移植した。ペプチド（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３レラキシン、ヒトＩＮＳＬ３および牛インスリン）を、RPMI培地中に1μＭ フォルスコリンおよび50μＭイソブチルメチルキサンチン(IBMX)と共にウェルに付加し、37℃で30分間インキュベートした。その後プレートを、短く遠心し、培地を取り除き、リシスバッファーに細胞を懸濁した。ｃＡＭＰレベルは、cAMP Biotrak EIA システム (Amersham International, Aylesbury, UK)を用いて溶解液中で測定した。結果を、H2レラキシンで達成されたcAMPの最大刺激との比較での最大レラキシン応答(%)として示した。データを、４通り行った３つの実験の平均値±SEMで表わし、PRISM (GraphpadInc., San Diego, CA)を使用してプロットした。
【００９３】
ＴＨＰ−１細胞結合アッセイ−ＴＨＰ−１細胞を、スピンダウンし、結合バッファー(20mM HEPES、50mM NaCl、1.5mM CaCl2、1% BSA、0.1mg/ml lysine、0.01% NaN4、pH 7.5) (Parsell et al (1996) J. Biol. Chez. 271,27936-27941)中にて、９６ウェルプレートに２ｘ１０６細胞/ウェルになるように再懸濁した。細胞を、無標識のＨ１、Ｈ２およびＨ３レラキシン(100pM〜30nM)の増加濃度の非存在下または存在下にて、２５℃で９０分間、３３Ｐ−標識したＨ２（Ｂ３３）レラキシン(100 pM: 前記(Tan et al (1999) Br. J. Pharmacol. 127,91-98)のように標識したもの)と結合バッファー中にてインキュベートした。非特異的な結合は、Ｈ２レラキシン（１μＭ）を示す。細胞を、パッカード96ウェルプレート細胞ハーベスタ（Packard 96 well plate cell harvester）および0.5%のポリエチレンアミンで処理したワットマン GF/C ガラスファイバーフィルター（Whatman GF/C glass fibre filters）を用いて集めた。フィルターを、処理済みの結合バッファー(20mM HEPES、50mM NaCl、1.5mM CaCl2)で3回洗浄し、３７℃オーブンで乾燥し、液体シンチレーション分光測定法(TopCount, Canberra Packard, Australia)にて放射活性を測定した。
【００９４】
抗体交差反応−Ｈ３レラキシンを認識するよく特性化したヒトレラキシン抗体の能力は、ラジオイミノアッセイによってＨ１およびＨ２レラキシンと比較してテストした。簡単には、ヤギ抗Ｈ２レラキシン(Lucas et al(1989) J.Endocrinol. 120, 449-57)を、４℃で一晩、０．０５Ｍ炭酸ナトリウムバッファーで1:1000希釈し、96ウェルELISAプレート(使い捨ての製品, Adelaide, Australia)上にコートした。５０μｌの分析バッファー(1% BSAを含むPBS-T)中に溶解したヒトレラキシンペプチドのＰＢＳ−Ｔ(リン酸緩衝生理食塩水 ; 0.05% Tween 20、pH 7.4)希釈液にて２回洗浄後、前記に５０μｌの分析バッファー中で50,000cpmの125Ｉ−標識したレラキシンを共に加えた。Ｈ２レラキシンは、１２５Ｉ−標識し、ＨＰＬＣ(Palejwala et al (1998) J. Endocrinology 139,12018-1212)によって精製した。４℃のプレートで一晩インキュベーション後、PBS-Tで２回洗浄した。該抗体結合１２５Ｉ−標識したＨ２レラキシンを、1MNaOHの付加によって集め、Packard 5010 gamma counter (Canberra Packard)で計測するためにチューブに注いだ。実験は、少なくとも２度行い、同様の結果を得た。データは、３通り行われた１つの代表的な実験の平均値±SEMとして示し、PRISMを用いて示した。
【００９５】
マウスレラキシン(M3)研究：
動物−これらの研究に使用したすべてのオスおよびメスマウスは、年齢を揃え、同じ系統(C57BLK6J)のものを用いた。動物は、制御した環境にて飼育し、げっ歯動物実験のえさ(Barastock Stockfeeds, Melbourne, Australia)および水への到達を備えた１４時間の明期、１０時間の暗期管理を維持した。メスマウス(3.5月齢)を、交尾させ、膣のプラグの識別から妊娠時期を計った。妊娠7.5日、10.5日および18.5日にて、マウスを組織収集のために犠牲にした。組織を、非妊娠のオスおよびメスマウス(4月齢)からも集めた。これらの実験は、科学的な目的のための実験動物の世話および方法に関するオーストラリア規約に従って、ハワード・フロリー動物研究倫理委員会（Howard Florey Institute's Animal Experimental Ethics Committee）によって承認された。
【００９６】
組織収集−動物を、イソフルオレンの薬剤過剰摂取で殺した(Abbott Australasia Pty Ltd, Sydney, Australia)。脳、心臓、胸腺、脾臓、肺、肝臓、腎臓、皮膚および腸を、メスマウスの生殖器 (卵巣、子宮内膜、子宮筋層、頚部、膣；おのおのの妊娠期にてn = 2)およびオスマウスの生殖器（精巣、副睾丸、前立腺； n = 3）と一緒に集めた。追加した動物から、オスの脳(n = 3)を、視床下部、皮質、海馬、視床、骨髄および小脳を含む特定領域の解剖を行い、即時に液体窒素中に置き、RNA調製のために使用するまで−８０℃にて貯蔵した。メスの脳(n = 3)を集め、in situ ハイブリダイゼーション・組織化学のために即時にドライアイスで凍結した(Burazin et al (2001)J.NeuroendocrinoL 13 358-370)。子宮外妊娠の外科手術を受けている妊娠初期の女性のヒトCLは、ハワード・フロリー人間倫理委員会（Howard Florey Institute Human Ethics Committee）の承認および患者の書面による承諾を以て利用した。
【００９７】
（実施例２）
ヒトおよびマウスのヒトＨ３レラキシン遺伝子
ヒトおよびマウスのＨ３レラキシン配列は共に、機能的遺伝子の典型的な特徴を含む（図１Ａは、ヒト；図１Ｂは、マウス）。それぞれ、ヒトおよびマウス各々の推定ＡＴＧ開始コドンの上流６５、および５９ｂｐに転写の開始のための推定ＴＡＴＡボックスを含む。ポリアデニル化シグナルは、ヒトおよびマウス遺伝子それぞれのインフレームＴＡＧ停止コドンから582および448bp下流部位にて、両遺伝子の3'非翻訳領域中存在する。シグナルイントロンは、他のレラキシンおよびインスリンファミリーメンバーのそれと同様の位置に対応する、両遺伝子の配列中の同一部位にてコーディング部位に挿入する(Hudson et al (1983) Nature 301,628-631 ; Evans et al (1993)J. Mol.Endocrinol. 10,15-23 ; Ivell, R (1997) Rev.Reprod. 2,133- 138)。Ｈ３レラキシン遺伝子は、第１９番染色体上の１９ｐ１３．３に位置し、該マウスの遺伝子は、第８番染色体の８Ｃ２に位置している。Ｈ３およびＭ３レラキシン遺伝子の派生コーディング部位は、それぞれ142および141アミノ酸であった。
【００９８】
ジスルフィド結合形成に必要なシステイン残基は、システイン結合のまわりの柔軟性に必要な保存されたグリシン残基と共に正確な位置に保持されている(Biillesbach et al (2000)Int. J. Pept. Prot. Res. 46,238-243)。重要なことに、Ｂ鎖(R-X-X-X-R-X-X-I)の核中に結合するレラキシン受容体にとって不可欠であると明らかになった残基(Biillesbach et al (2000)J.Biol.Chem. 275, 35276-35280)は、ヒトおよびマウスの両方に保持されている。従って、ヒトの配列は直接アミノ酸相同性上のhINSL5ペプチド配列に最も密接に似ているが、この結合モチーフの存在が、ペプチドがレラキシンペプチドにより似ていることを示唆する。面白いことに、Ｍ３レラキシンＡ鎖は、既特性化されたＭ１レラキシン配列が、最終システイン残基の前のエクストラチロシン残基を含むような、ファミリーメンバーのシステイン・パターンに一致する (Fig. 2A)。
【００９９】
該Ｈ３（ヒトＨ３）およびＭ３（マウス「３」レラキシン）配列は、核酸レベルでのコーディング部位にて７０％以上の相同性を共有している。しかしながら、相同性は、派生アミノ酸配列にて最も著しい。両派生プロ−ホルモン配列は、両ヒトおよびマウスペプチド中のアラニンおよびアルギニン間の同一部位で開裂するようなATG開始コドンの後方に典型的なシグナル配列を含む(Nielsen et al (1997) Prot. Engineer. 10,1-6)。レラキシンファミリーの他のメンバーと強力に共に発見されたＢ／Ｃ連結部の基本アミノ酸のアルギニン−アルギニンペアは、トリプトファンおよびアルギニン間での開裂を明らかにしている。同様に、Ｃ／Ａ連結部の開裂は、これが弱いフリン(プロタンパクコンバターゼ)分裂サイト(Nakayama, K. (1997)Biochefsa. JI. 327,625-635)に相当するような、図１Ａおよび図１Ｂに示したようなアルギニンおよびアスパルギン酸間で最もよく起こる可能性がある。従って、両Ｈ３およびＭ３レラキシンは、27アミノ酸のB鎖、66アミノ酸のC-ペプチドおよび24アミノ酸のA鎖を含むと考えられる。
【０１００】
Ｈ１、Ｈ２およびＭ１レラキシンとＨ３およびＭ３レラキシンのＡおよびＢ鎖配列の比較を図２Ａに概説する。３つの変異体が保存されている、Ｍ３およびＨ３配列間の両ＡおよびＢ鎖にて２つのアミノ酸の相違しかない。対して、Ｍ１およびＨ２レラキシン間の相同性は、ＡおよびＢ鎖それぞれにて、４２％および４５％しかない。さらに、Ｂ鎖の重要な核成分およびＡ鎖の重要な構造成分以外に、Ｈ２およびＨ３レラキシン間、およびＭ１およびＭ３レラキシン間ではほとんど相同性がない。興味深いことに、Ｈ３およびＭ３レラキシンは、他のインスリン／レラキシンファミリーメンバーのＣペプチドドメインの相同性は２０％未満であることと比較すると、この部位の高い相同性を示す（７３％）。Ｈ３およびＭ３レラキシンのＣペプチド全長は、それぞれ６５および６６アミノ酸であり、他のレラキシンのそれと比べて非常に短い（Ｈ１およびＨ２では１０２アミノ酸、Ｍ１レラキシンでは９９アミノ酸）。Ｃペプチド鎖全長および配列相同性は、INSL5 (24%)と最も類似している。
【０１０１】
２つの遺伝子の全長アミノ酸配列は、インスリン/レラキシンファミリーおよび作製した系統発生樹の他のメンバーと並べた(図２Ｂ)。さらに、Ｈ３およびＭ３レラキシン配列は、進化の初期に他のレラキシンから分岐したこれらの特定のレラキシンの進化を示し、別系統下に分類した。これは、本分析にてＨ３レラキシンと最も近い主要構造の類似を共有する、INSL5の事例でもある。
【０１０２】
（実施例３）
ペプチド合成
Ｈ３レラキシンは、低収率での固相合成によって調製した(0.7%)。MALDITOF MSは、5,494. 7のMH+のシグナル産物を示した(理論価値: 5,497. 5)。アミノ酸分析においても、その正確な組成物を確認した。
【０１０３】
ヒトレラキシンＨ３[hRlx-3 A(1-24) アミド-B (1-27) アミド]の化学合成
分離したＨ３レラキシンペプチド鎖のアミノ酸配列に相当する、選択的Ｓ−保護したＡおよびＢ鎖は、Atherton, E and Sheppard, RC. (固相ペプチド合成。IRL Press at Oxford University Press, Oxford, United Kingdom,1989)に記載のある一般的な手法を用いた連続フロ−型9-フルオレニルメトキシカルボニル固相合成法によって合成した(Fmoc)。両ペプチドを、Fmocペプチドアミド連結ポリエチレングリコールポリスチレン(Fmoc-PAL-PEG-PS)支持体(Biosystems提供)を用いて、ペプチド−カルボキシル末端アミドとして0.1 mmol規模で調製した。Ａ鎖会合のために、Fmoc−アミノ酸の４倍過剰量を (Auspep, Melbourne, Australia)、ジメチルホルムアミド (DMF)中にて1,3-ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)および1-ヒドロキシベンゾトリアゾール (HOBt)によって活性化し、Ｂ鎖合成の間それぞれの残基を、DMF中にて2- (1H-ベンゾトラゾール-1-yl)-1, 1,3, 3-テトラメチルウロニウムヘキサフルロホスフェート(HBTU)およびジイソプロピルエチルアミン(DIEA)によって活性化した。両鎖合成のためのNα-Fmoc脱保護は、DMF中にて20%のピペリジンと共に行った。カップリングは、ダブルカップリングを除き一般に30分間行い、A鎖残基のSer７，８，２１およびすべてのシステイン、およびB鎖残基のArg1,12,16、Ala2,3,17およびCys10のダブルカップリングのための時間を拡張した。側鎖保護は、第３ブチルエステルおよびAsp、Glu、ThrおよびSerのためのエーテル、LysおよびTrpのためのブトキシカルボニル(Boc)、Argのための2,2,4,6,7-ペンタメチルジヒドロベンゾフラン-5-スルホニル基(Pbf)およびＢ鎖Gly11のためのアミド結合保護Nα−(2- Fmoc-オキシ-4-メトキシベンジル)[FmocHmb]によって行った。選択的Ｓ−保護は、以下のシステイン残基のために行った。：Ａ鎖中のCys10,15のトリチル(Trt)、およびＢ鎖中のCys22、Ａ鎖中のCys24第４-ブチル (tBu)、およびＡ鎖Cys11およびＢ鎖 Cys10のアセトアミドメチル(Acm)である。
【０１０４】
(i)ヒトレラキシンＨ３、Ａ鎖[Cys11(Acm), Cys24(tBu)](1-24)アミドの合成
[1]
合成の組成物にて、チオールの急冷を助長するために、保護したＡ鎖樹脂を、95%トリフルオロ酢酸(TFA)／2.5%エタンジチオール(EDT)／2.5%水に４滴のトリエチルシランを加えたものと２．５時間室温で処理した。TFAを、窒素気流下で最小容量になるまで除き、冷却したジエチルエーテルから2度沈殿した。その後、沈殿物を０．１％TFA溶液に溶解し、凍結乾燥した。該天然のS−縮小した[チオール-Cys10,15, Cys11(Acm), Cys24(t-Bu)]Ａ鎖を、室温で4時間0.1M Gly-NaOH, pH 8.3中にて直接空気酸化した。分析的逆過程高性能液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)モニタリングで、分子内ジスルフィド結合構成の完全性を確認し、その後きれいなTFAを数滴加え、粗酸化した物質を直接凍結乾燥した。
【０１０５】
(ii)ヒトレラキシンＨ３、Ｂ鎖[Cys10 (Acm)](1-27)アミドの合成[2]
合成の組成物にて、チオールの急冷を助長するために、保護したＢ鎖樹脂を、82. 5% TFA／5% フェノール／5% 水／5% チオアニソール／2.5% エタンジチオールに４滴のトリエチルシランを加えたもので２．５時間室温で処理した。TFAを、窒素気流下で最小容量になるまで除き、冷却したジエチルエーテルから2度沈殿した。その後、沈殿物を０．１％TFA溶液に溶解し、凍結乾燥した。その後、該天然のＢ鎖を、以下に記載のようにRP-HPLCによって精製した。
【０１０６】
(iii)ヒトレラキシンＨ３、Ａ鎖[Cys11 (Acm), Cys24(Pyr)](1-24)アミドの合成[3]
ペプチド１の２５ｍｇ(9.65μmol)および2,2'-ジピリジルジスルフィド(DPDS)の３５ｍｇ(158.86 μmol)を、4.5 mlのTFAおよび0.5 mlのチオアニソール中に共に溶解し、その後生じた溶液を冷却した。これに、5mlのトリフルオロメタン硫酸(TFMSA)／TFA(1: 5 v/v)を加え、全混合物を３０分間０℃以下にて攪拌しておいた。該 [Cys11 (Acm), Cys24 (Pyr) ] Ａ鎖アミドペプチドを、冷エーテルから沈殿し、その後、遠心して得た該沈殿物を、６M グアニン塩酸塩(GdHCI) pH 8.0に懸濁し、RP-HPLCによって精製した (生成ペプチド 3: 4%)。(RP-HPLC精製に代わる方策として、ペプチド3を、２０％酢酸溶液中でセファデックスG-25ゲルろ過カラム上にて脱塩した。）
【０１０７】
(iv) ヒトレラキシンＨ３、A[Cys11 (Acm)](1-24)アミド-B[Cys10 (Acm)] (1-27)アミドの合成[4]
精製したＡ鎖ペプチド３(1.0 mg、0.38 μmol)および精製したＢ鎖ペプチド２(1.2 mg、0.38 μmol)を、それぞれ1.0 mlおよび0.5 mlの0.1M NH4HC03に別々に溶解した。その後、該Ｂ鎖溶液にＡ鎖をゆっくり加え、反応混合物を室温で３０分間強力に攪拌した。溶液を、詳細を以下に示すように0.5mlの氷酢酸で酸性化し、続いてRP-HPLCを行い、ビスージスルフィド結合鎖結合産物を分離した。(RP-HPLC精製に代わる方策として、生じたＡ／Ｂ産物であるペプチド4を、２０％酢酸溶液中でセファデックスG-25ゲルろ過カラム上にて脱塩した。)。
【０１０８】
（Ｂ鎖可溶性を高める、鎖組合せのための代替方法は、以下のとおりである：ペプチド３および精製した[Cys10 (Acm) ] Ｂ鎖をそれぞれ8M GdHCl、pH 4.5溶液中に1.0 ml/mgの濃度にて溶解した。Ｂ鎖溶液にＡ鎖をゆっくり加え、反応混合物を３７℃で２４時間強力に攪拌した。）
【０１０９】
(v) ヒトレラキシンＨ３ [hRlx-3A(l-24)アミド-B(l-27) アミドの合成
精製した４つのペプチドすべてを、第３および最後のジスルフィド結合を形成するために使用した(１００％回収を仮定し, 0.39 μmolと予測した)。ペプチドを、80mM HClおよび酢酸の溶液中に溶解した。その後、９５％酢酸溶液中の２０ｍＭヨウ素に滴下し加えた(Acm群に対してヨウ素の２５倍量)。該反応は、過酸化物を20mMのアスコルビン酸水溶液で急冷後、室温にて暗中で1時間行った。レラキシンの精製は、RP-HPLCによって行い、ペプチド３開始物質と比較して０．７４％の最終産物のを得た。
【０１１０】
精製 
分離した天然の鎖および中間ペプチドは、モデル996フォトダイオード配列検知器（model 996 photodiode array detector）に関連したウオーター６００多溶解性配達システム（Waters 600 multisolvent delivery system）を使用し、RP-HPLCによって精製した。C4 シリカゲルが詰まった10ｘ250mm Vydac 218 TPカラム (330A 穴サイズ,10μm 粒子サイズ)を用いた。ペプチドは、線形勾配モード中に(A)0.1％TFA (v/v)溶液および(B)アセトニトリル(v/v)中の0.1％TFAの溶解システムで溶出した(25-50% B ３０分以上)。所望画分を、マトリックス−支持したレーザー脱着電離質量分析(MALDI-TOF MS)によって収集および同定し、凍結乾燥した。
【０１１１】
（ペプチド特性）
ペプチド定量を、GBC自動分析機(Melbourne, Aust)にて２４時間の酸加水分解物の複製アミノ酸分析によって行った。MALDITOF MSは、遅延イオン抽出を備えたBruker Biflex機器(Bremen, Germany)にて19.5kvの線状モードで行った。
【０１１２】
（実施例４）
レラキシン生物活性
合成Ｈ３レラキシンのレラキシン生物活性の証明−合成Ｈ３レラキシンＣ末端アミド誘導体を、レラキシン受容体発現細胞株ＴＨＰ−１(Parsell et al (1996) J.Biol. Chem. 271,27936-27941)にてレラキシン生物活性の検討をした。Ｈ２レラキシンは、これらの細胞からのｃＡＭＰ生産にて濃度依存的に生産増加した（図３A）。合成Ｈ３レラキシンもまた、Ｈ１(pEC50 = 9.10 ± 0.05 [0.794 ｎM] ;n=3)およびＨ２(pEC50 = 9.67 ± 0.11 [0.214 nM] ;n=3) レラキシンよりわずかに低い活性ではあるが、ｃＡＭＰ(pEC50 = 8.68 ± 0.08 [2.11nM] ;n=3)の濃度依存的に刺激増加した。この応答の特異性を、１μＭ以内の濃度上昇にてｃＡＭＰ応答を刺激するためのウシインスリン(bINSL)、またはヒトインスリン３(hINSL3)の不活化により証明した。
【０１１３】
合成Ｈ３レラキシンを、親和性のＨ２レラキシン(pKi= 8. 74 + 0. 11;n = 11)およびＨ１レラキシン(pKi= 8. 9 + 0. 11;n = 7)のそれより低い(pKi= 7.5 ± 0.16 ;n = 3)、ＴＨＰ−１細胞のレラキシン結合部位へ結合する３３Ｐ−標識したＨ２レラキシンの競合能力の検討も行った（図３Ｂ）。しかしながら、これらのデータは、合成Ｈ３レラキシンペプチドの結合、およびヒトレラキシン受容体の刺激によるセカンドメッセンジャー応答を誘導するという決定的な証拠を提供する。
【０１１４】
Ｈ３レラキシンを認識する、よく特性化したＨ２レラキシン抗体の能力−Ｈ１およびＨ３レラキシンを認識する、よく特性化した抗−Ｈ２レラキシン抗体の能力を、放射免疫測定によって検討した。図４に示したように、Ｈ２レラキシンは、高い特異性を備えた抗Ｈ２レラキシン抗体に結合する１２５Ｉ−標識したＨ２レラキシンに置換することができる。対して、Ｈ１およびＨ３レラキシンは、置換された１２５Ｉ−標識したＨ２レラキシン結合の弱い置換能力によって決定されるような抗血清を備えた弱い交叉反応を示した。さらに、置換曲線の非類似は、すべての抗体エピトープが２つのペプチドによって認識されるとは限らないことを示す。
【０１１５】
（実施例５）
Ｈ３レラキシンの発現
マウスでのレラキシン遺伝子の発現−Ｍ３レラキシンｍＲＮＡの発現を、RT-PCR産物のサザンブロッティングを用いてＭ１レラキシンｍＲＮＡ発現と比較した。本技術は単に半量的であるが、我々にＭ１レラキシンと比較して、Ｍ３レラキシン発現の潜在部位を決定することを可能にした。発現実験および複製実験の結果が、同じ結果であった。Ｍ３レラキシンｍＲＮＡは、Ｍ１レラキシンが発見されたC57BLK6Jマウスの多くの組織で発現しているが、２つのマウスレラキシン間の発現パターンは、違っている。オスの非再生組織にてＭ１レラキシン発現の最も高いレベルは、脳にて見られ、胸腺、心臓および腎臓で中程度のレベル、肺、脾臓および皮膚でより低いレベルの発現が見られ、腸での発現は見られなかった。興味深いことに、Ｍ３レラキシン発現は、脳で最も高いレベルで検知されたが、胸腺、肺および脾臓で中程度のレベルが発現し、心臓および肝臓ではほんの低レベルでのみであり、かつ腎臓、皮膚および腸にて全く発現しない。メスのマウスでは、これらの組織での両遺伝子の発現のほぼ同じパターンを示した。オスの再生組織にてＭ３レラキシンｍＲＮＡは、精巣でのみ著しく発現するが、Ｍ１レラキシンｍＲＮＡは、精巣、副睾丸および前立腺にて検知した。両レラキシンとも、乳腺、非妊娠、妊娠および授乳中のマウスの卵巣、および妊娠マウスの子宮内膜および子宮筋層中の女性生殖器に検出した。Ｍ１レラキシン発現が、非妊娠および授乳中のマウスからの卵巣と比較して妊娠後期の卵巣においてより高かったが、Ｍ３レラキシンｍＲＮＡのかなりの発現を、すべての卵巣の段階にて観察した。Ｍ３レラキシンｍＲＮＡの高レベルが、脳にて検出され、さらにこの組織の詳しい分析が、両レラキシンがいくつかの異なる部位で発現することを明らかにした。一方、Ｍ１レラキシンｍＲＮＡは、常に視床下部、海馬、皮質、視床、脳橋/骨髄および小脳に発現し、Ｍ３レラキシンｍＲＮＡは、視床および脳橋/骨髄に高発現することが明らかとなり、よって２つのレラキシンは、マウスにて別の役割を果たすかもしれないことが示唆された。
【０１１６】
ノーザン解析−Ｍ３レラキシンｍＲＮＡがＲＴ−ＰＣＲおよびサザンブロット分析によって明確に同定された組織を、ノーザンブロットによりさらに検討した。心臓、脳、肺、胸腺、脾臓、卵巣、子宮内膜、子宮筋層、子宮頚部および膣からの全ＲＮＡ(5-25μｇ)を、３２Ｐ−標識したＭ３レラキシン特異的プローブでまず調査したが、非特異的なハイブリダイジングバンドが様々な組織にて検出される。その後、脳(15μｇ)、脾臓(5μｇ)、肝臓(5μｇ)および睾丸(25μｇ)からのポリＡ−ＲＮＡを分析し、ＲＴ−ＰＣＲおよびサザンブロット分析によって検出したＭ３レラキシン発現と合わせて、特定の〜１．２ｋｂのハイブリダイジングバンドを脳にて同定した。得た転写産物サイズは、Ｍ３レラキシン転写配列(〜１ｋｂ)とポリＡテイル(〜２００bp)に基づく、予想サイズと一致した。
【０１１７】
ヒト組織におけるＨ３レラキシンの発現−Clonetechの複合組織発現アレイを、ヒト組織にてＨ３レラキシンの発現の検討部位に用いた。該アレイは、８つの異なる対照ＲＮＡおよびＤＮＡを含む７６の異なるヒト組織からの標準化ポリＡ−ＲＮＡ(50-750 ng)を含み、ナイロン膜状にスポットした。該アレイでは、ゲノムＤＮＡから調製したＨ３レラキシン転写産物の３’末端からの３２Ｐ−標識した３７４ｂｐのＨ３レラキシン特異的遺伝子断片で調査した。このＤＮＡ断片は、両ストランド上に配列していた。非常に弱いハイブリダイジングシグナルが、脾臓、胸腺、周辺血中白血球、リンパ節および精巣にて観察されたが、これらのシグナルはバックグラウンドよりかろうじて認識可能であり、よってデータは示さない。ＲＴ−ＰＣＲもまた、Ｈ３レラキシン配列に基づく２つの異なるプライマーの組合せを用いて、妊娠初期からのヒトＣＬにて行った。Ｈ２レラキシンおよびＧＡＰＤＨの転写産物が、容易に増幅した(データ非表示)ようなＰＣＲ条件の変更後でさえ、任意のPCR反応にて特異的なバンドは観察されず、cDNAの完全性を確認した。
【０１１８】
マウス脳におけるレラキシンｍＲＮＡの分布−脳にてＲＴ−ＰＣＲおよびノーザンブロットによってＭ３レラキシンｍＲＮＡの高レベルな発現が検出され、その分布を、インサイチュウハイブリダイゼーション組織化学(Burazin et al (2001) J Neuroendocrinol. 13, 358-370)を用いて、さらに検討した。多数の特異的３５Ｓ標識したオリゴヌクレオチドプローブを、メスC57BLK6Jマウス脳の上下全体にわたるＭ３レラキシンｍＲＮＡの細胞分布を決定するために用いた。Ｍ３レラキシンｍＲＮＡは、脳核では全体にわたって検出されなかったが、脳橋/骨髄にて最も強く検出された（図７）。Ｍ３レラキシンｍＲＮＡの最も強いレベルが、背側被蓋交叉の核の腹内側縁部に存在した。加えて、Ｍ３レラキシンｍＲＮＡは、海馬および嗅覚部位にても、はるかに低いレベルだが検知した。Ｍ３レラキシンをコードするｍＲＮＡの低レベルを含む脳部位は、インサイチュウハイブリダイゼーション組織化学に関連した感度制限により本研究にて検知されなかったかもしれない。Ｍ１レラキシンｍＲＮＡが、背側被蓋交叉核の腹内側縁部に検出されなかったため、脳でのＭ３レラキシンｍＲＮＡの分布はＭ１レラキシンｍＲＮＡのそれと異なる(データ非表示)。
【０１１９】
（実施例６）
ヒト、マウスおよびラットの前駆レラキシンＨ３cDNA配列は、好適な発現トランスファーベクターを用いて原核性および真核性両方の細胞システムにて発現している。これらのシステムは、バクテリアおよび酵母発現システムのみならず昆虫細胞、植物細胞および鳥類細胞を含む他の高等真核細胞および適したほ乳類宿主細胞を含む。さらに、これらの３つの配列の融合タンパク産物は、宿主細胞の原核性および真核性蛋白質特性の関連部分によって生産される。融合産物は、融合産物が続いて取り除かれうる蛋白質産物の精製を促進する。すべてのトランスファーベクターを、修飾されたＣペプチド配列の除去を促進するためにＢ／ＣおよびＣ／Ａ結合修正を備えた短いＣペプチド前駆レラキシンを生じる修正を備えたコドン置換/削除/付加産物によって修飾することもできる。
【０１２０】
短いＣペプチド置換産物およびＢ／ＣおよびＣ／Ａ結合修正を用いたレラキシン合成は、米国特許番号ＵＳ5,759,807に記載されており、そのような方法は、Ｈ３レラキシンの生産のために使用することができる。
【０１２１】
本明細書および特許請求の範囲の全体にわたって、「含む」という単語、または「含む」あるいは「含むんでいる」のような変形は、特に記載がなければ、規定の文字列または段階あるいは文字列のグループまたは段階の除去ではなく、規定の文字列または段階あるいは文字列のグループまたは段階の包括を示すと理解される。
【０１２２】
本明細中の任意の先行技術文献が、知識あるいはオーストラリアで通例の一般的な知識を形成することを示唆するいずれの形態ではなく、そのように解釈してはならない。
【０１２３】
配列リスト表
配列番号１       シグナルペプチド配列 
配列番号２        B鎖ペプチド配列  
配列番号３        C鎖ペプチド配列
配列番号４        A鎖ペプチド配列 
配列番号６        ゲノムDNA配列 
配列番号７        A鎖核酸配列 
配列番号８        B鎖核酸配列 
配列番号９        C鎖核酸配列
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】Ｈ３（Ａ）およびＭ３（Ｂ）遺伝子のＤＮＡ配列の構築  予測ＴＡＴＡボックスおよびポリアデニル化配列のみでなく、開始および停止コドンには、アンダーラインを付した。推定されるシグナルペプチド、およびＢ−、Ｃ−およびＡ−鎖ペプチド配列の位置を、矢印で示した。Ａ−およびＢ−鎖配列を箱で囲み、レラキシン受容体結合も関与する残基には、影を付した。ヒト（Ａ）およびマウス（Ｂ）の両配列におけるＣ−鎖の同一位置であるイントロン配列は、一番下に文字で示し、イントロンの正確なサイズを示した。
【０１２５】
【図２】Ｈ３およびＭ３レラキシンと他のレラキシンおよびインスリンファミリーメンバーの配列比較  （Ａ）は、Ｈ３およびＭ３レラキシンと他のヒトおよびマウスレラキシン配列からのＡ−鎖およびＢ−鎖配列の配列である。コンセンサス配列を、箱で囲んだ；Cons 1,2,3は：ヒトレラキシン１、２および３のコンセンサス配列である。Cons 3は：Ｂ鎖のＨ３およびＭ３レラキシンおよびＡ鎖のＨ３、Ｒ３およびＭ３レラキシンのコンセンサス配列である。Cons マウスは：Ｍ１およびＭ３レラキシンのコンセンサス配列である。ラットの配列は、ESTクローンに由来する（詳細な結果を参照。）。「+」は、同類の置換を示し、「・」は、類似性のないものを示す。(B)は、ヒトのレラキシン/インスリン/IGFスーパーファミリーのヒトの配列と、Ｈ３およびＭ３レラキシンの全長配列の、進化系統樹を示す。
【０１２６】
【図３】ヒトレラキシン受容体発現細胞株におけるＨ１およびＨ２レラキシンと比較したＨ３の生物活性  （Ａ）は、ＴＨＰ−１細胞のペプチド刺激によるｃＡＭＰの蓄積を示す。データは、Ｈ２レラキシン（ｎ＝３）の最大応答（％）の平均値で示す。牛インスリン(bINSL) およびヒトインスリン３(hINSL3)への応答も、分析の特異性を強調表示している。Ｈ１、Ｈ２およびＨ３は；それぞれヒト１、２および３レラキシンを示す。（Ｂ）は、Ｈ１（ｎ＝７）、Ｈ２（ｎ＝１１）およびＨ３（ｎ＝３）レラキシンペプチドとＴＨＰ−１細胞に結合する３３Ｐ−標識したＨ２レラキシン（Ｂ３３）の活性を比較したものである。データは、特異的な結合の平均値（％）で示す。
【０１２７】
【図４】Ｈ３レラキシンを認識するよく特性化されたＨ２レラキシン抗体の活性  Ｈ２レラキシン抗体は、ＥＬＩＳＡプレート上に固定され、１２５Ｉ−標識したＨ２レラキシンに対して、Ｈ１、Ｈ２およびＨ３レラキシンを作用させ競争実験を行った。結果を、典型的な分析の３通り測定の特異的結合の平均値（％）で示す。
【配列表】
2005508944.tif 000032
2005508944.tif 000033
2005508944.tif 000034
2005508944.tif 000035
2005508944.tif 000036
2005508944.tif 000037
【図１Ａ】
2005508944.tif 000046
【図１Ｂ】
2005508944.tif 000047
【図２Ａ】
2005508944.tif 000048
【図２Ｂ】
2005508944.tif 000049
【図３】
2005508944.tif 000050
【図４】
2005508944.tif 000051
【手続補正書】
【提出日】平成16年6月8日(2004.6.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005508944000001.app
【国際調査報告】
2005508944.tif 000052
2005508944.tif 000053