(57)【要約】  本発明は、第１酵素および第２酵素を含む酵素混合物を含む組成物に関連する。ここで第１酵素はＤＮＡ重合活性を備え、そして第２酵素は３’−５’エキソヌクレアーゼ活性および低下したＤＮＡ重合活性を備える。本発明はさらに、本発明の組成物を使用する高忠実度ＤＮＡ合成のためのキット構成内の上記組成物および方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１酵素および第２酵素を含む酵素混合物であって、前記第１酵素はＤＮＡ重合活性を備え、そして前記第２酵素はＤ４０５、Ｙ４１０、Ｔ５４２、Ｄ５４３、Ｋ５９３、Ｙ５９５、Ｙ３８５、Ｇ３８７、およびＧ３８８からなる群から選択されるアミノ酸位置で１つ以上の突然変異を含む変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼである酵素混合物。
【請求項２】
前記第１酵素がＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素である、請求項１の酵素混合物。
【請求項３】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＵｌＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＧＢ−Ｄ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＰ１／ＤＰ２  ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択される、請求項２の酵素混合物。
【請求項４】
前記変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼが、Ｄ４０５Ｅ、Ｙ４１０Ｆ、Ｔ５４２Ｐ、Ｄ５４３Ｇ、Ｋ５９３Ｔ、Ｙ５９５Ｓ、Ｙ３８５Ｑ、Ｙ３８５Ｓ、Ｙ３８５Ｎ、Ｙ３８５Ｌ、Ｙ３８５Ｈ、Ｇ３８７Ｓ、Ｇ３８７Ｐ、およびＧ３８８Ｐからなる群から選択される１つ以上の突然変異を含む、請求項１の酵素混合物。
【請求項５】
前記変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼがＧ３８７Ｐの突然変異を含む、請求項４の酵素混合物。
【請求項６】
ＰＣＲ促進因子および／または添加剤をさらに含む、請求項５の酵素混合物。
【請求項７】
ＰＣＲ促進因子および／または添加剤をさらに含む、請求項１の酵素混合物。
【請求項８】
前記酵素混合物が（２．５−５Ｕ）／（０．０２−５Ｕ）の重合活性／エキソヌクレアーゼ活性の比率を有する、請求項１の酵素混合物。
【請求項９】
前記酵素混合物が（２．５Ｕ）／（０．０４−０．０８Ｕ）の重合活性／エキソヌクレアーゼ活性の比率を備える、請求項８の酵素混合物。
【請求項１０】
第１酵素および第２酵素を含む酵素混合物であって、前記第２酵素がＤ４０４、Ｙ４０９、Ｔ５４１、Ｄ５４２、Ｋ５９２、Ｙ５９４、Ｙ３８４、Ｇ３８６、およびＧ３８７からなる群から選択されるアミノ酸位置で１つ以上の突然変異を含む変異型Ｔｇｏ  ＤＮＡポリメラーゼ；Ｄ４０４、Ｙ４０９、Ｔ５４１、Ｄ５４２、Ｋ５９２、Ｙ５９４、Ｙ３８４、Ｇ３８６、およびＧ３８７からなる群から選択されるアミノ酸位置で１つ以上の突然変異を含む変異型ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ；Ｄ４０７、Ｙ４１２、Ｔ５４４、Ｄ５４５、Ｋ５９５、Ｙ５９７、Ｙ３８７、Ｇ３８９、およびＧ３９０からなる群から選択されるアミノ酸位置で１つ以上の突然変異を含む変異型Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ；Ｄ４０５、Ｙ４１０、Ｔ５４２、Ｄ５４３、Ｋ５９３、Ｙ５９５、Ｙ３８５、Ｇ３８７、およびＧ３８８からなる群から選択されるアミノ酸位置で１つ以上の突然変異を含む変異型Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、からなる群から選択された変異型ＤＮＡポリメラーゼである酵素混合物。
【請求項１１】
前記第１酵素がＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素である、請求項１０の酵素混合物。
【請求項１２】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＵｌＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＧＢ−Ｄ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＰ１／ＤＰ２  ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択される、請求項１１の酵素混合物。
【請求項１３】
第１、第２、および第３酵素を含む酵素混合物であって、前記第２酵素および第３酵素が変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、変異型Ｔｇｏ  ＤＮＡポリメラーゼ、変異型ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、変異型Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、および変異型Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼの群から選択される酵素であり、前記変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼがＤ４０５，Ｙ４１０，Ｔ５４２，Ｄ５４３，Ｋ５９３，Ｙ５９５，Ｙ３８５，Ｇ３８７、およびＧ３８８からなる群から選択されたアミノ酸位置で１つ以上の突然変異を含み；前記変異型Ｔｇｏ  ＤＮＡポリメラーゼがＤ４０４、Ｙ４０９、Ｔ５４１、Ｄ５４２、Ｋ５９２、Ｙ５９４、Ｙ３８４、Ｇ３８６、およびＧ３８７からなる群から選択されたアミノ酸位置で１つ以上の突然変異を含み；前記変異型ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼがＤ４０４、Ｙ４０９、Ｔ５４１、Ｄ５４２、Ｋ５９２、Ｙ５９４、Ｙ３８４、Ｇ３８６、およびＧ３８７からなる群から選択されたアミノ酸位置で１つ以上の突然変異を含み；前記変異型Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼがＤ４０７、Ｙ４１２、Ｔ５４４、Ｄ５４５、Ｋ５９５、Ｙ５９７、Ｙ３８７、Ｇ３８９、およびＧ３９０からなる群から選択されたアミノ酸位置で１つ以上の突然変異を含み；前記変異型Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼがＤ４０５、Ｙ４１０、Ｔ５４２、Ｄ５４３、Ｋ５９３、Ｙ５９５、Ｙ３８５、Ｇ３８７、およびＧ３８８からなる群から選択されたアミノ酸位置で１つ以上の突然変異を含む酵素混合物。
【請求項１４】
前記第１酵素が野生型ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１３の酵素混合物。
【請求項１５】
前記第１酵素が３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有していないＤＮＡポリメラーゼまたは３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼである、請求項１４の酵素混合物。
【請求項１６】
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有していない前記ＤＮＡポリメラーゼがＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１５の酵素混合物。
【請求項１７】
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する前記ＤＮＡポリメラーゼがＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｇｏ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、およびＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択される、請求項１５の酵素混合物。
【請求項１８】
前記第２酵素が変異型ＪＤＦ−３または変異型ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼであり、第３酵素が変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１３の酵素混合物。
【請求項１９】
前記変異型ＪＤＦ−３、ＫＯＤまたはＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼがＧ３８７Ｐの突然変異を含む、請求項１８の酵素混合物。
【請求項２０】
第１酵素および第２酵素を含む酵素混合物であって、前記第１酵素は野生型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼであり、前記第２酵素は３’−５’エキソヌクレアーゼ活性および低下したＤＮＡ重合活性を備える変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼである酵素混合物。
【請求項２１】
前記変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼがその分割ドメインまたはポリメラーゼドメインにおいて突然変異を含む、請求項２０の酵素混合物。
【請求項２２】
第１酵素および第２酵素を含む酵素混合物であって、前記第１酵素が古細菌ＤＮＡポリメラーゼであり、前記第２酵素が３’−５’エキソヌクレアーゼ活性および低下したＤＮＡ重合活性を備える変異型古細菌ＤＮＡポリメラーゼである酵素混合物。
【請求項２３】
前記変異型古細菌ＤＮＡポリメラーゼが、ＵｌＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＧＢ−Ｄ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＰ１／ＤＰ２  ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択されるＤＮＡポリメラーゼに由来する、請求項２２の酵素混合物。
【請求項２４】
前記第１酵素が野生型Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼまたは野生型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１の酵素混合物。
【請求項２５】
３つ以上の酵素を含む酵素混合物であって、前記酵素混合物中の少なくとも１つの酵素が３’−５’エキソヌクレアーゼ活性および低下したＤＮＡ重合活性を備える変異型酵素である酵素混合物。
【請求項２６】
前記変異型酵素が変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼである、請求項２５の酵素混合物。
【請求項２７】
前記変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼが、Ｄ４０５Ｅ、Ｙ４１０Ｆ、Ｔ５４２Ｐ、Ｄ５４３Ｇ、Ｋ５９３Ｔ、Ｙ５９５Ｓ、Ｙ３８５Ｑ、Ｙ３８５Ｓ、Ｙ３８５Ｎ、Ｙ３８５Ｌ、Ｙ３８５Ｈ、Ｇ３８７Ｓ、Ｇ３８７Ｐ、およびＧ３８８Ｐからなる群から選択される１つ以上の突然変異を含む、請求項２６の酵素混合物。
【請求項２８】
前記変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼがＧ３８７Ｐの突然変異を含む、請求項２７の酵素混合物。
【請求項２９】
前記酵素混合物中の少なくとも２つの酵素が前記酵素混合物へ添加される前に１つの酵素ブレンドとして混合される、請求項２６または２７の酵素混合物。
【請求項３０】
前記酵素ブレンドが野生型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼおよび野生型Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項２９の酵素混合物。
【請求項３１】
前記酵素ブレンドがＰＣＲ促進因子をさらに含む、請求項３０の酵素混合物。
【請求項３２】
低下したＤＮＡ重合活性を備える変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼであって、前記変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼがＴ５４２、Ｄ５４３、Ｋ５９３、Ｙ５９５、Ｙ３８５、Ｇ３８７、およびＧ３８８からなる群から選択されるアミノ酸位置で１つ以上の突然変異を含む、変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３３】
前記変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼがＴ５４２Ｐ、Ｄ５４３Ｇ、Ｋ５９３Ｔ、Ｙ５９５Ｓ、Ｙ３８５Ｑ、Ｙ３８５Ｓ、Ｙ３８５Ｎ、Ｙ３８５Ｌ、Ｙ３８５Ｈ、Ｇ３８７Ｓ、Ｇ３８７Ｐ、およびＧ３８８Ｐからなる群から選択される１つ以上の突然変異を含む、請求項３２の変異型ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３４】
変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを含む組成物であって、前記変異型ＤＮＡポリメラーゼがＴ５４２、Ｄ５４３、Ｋ５９３、Ｙ５９５、Ｙ３８５、Ｇ３８７、およびＧ３８８からなる群から選択されるアミノ酸位置で１つ以上の突然変異を含む組成物。
【請求項３５】
前記変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔ５４２Ｐ、Ｄ５４３Ｇ、Ｋ５９３Ｔ、Ｙ５９５Ｓ、Ｙ３８５Ｑ、Ｙ３８５Ｓ、Ｙ３８５Ｎ、Ｙ３８５Ｌ、Ｙ３８５Ｈ、Ｇ３８７Ｓ、Ｇ３８７Ｐ、およびＧ３８８Ｐからなる群から選択される１つ以上の突然変異を含む、請求項３４の組成物。
【請求項３６】
Ｔ５４２、Ｄ５４３、Ｋ５９３、Ｙ５９５、Ｙ３８５、Ｇ３８７、およびＧ３８８からなる群から選択されるアミノ酸位置で１つ以上の突然変異を含む変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを産生するために、野生型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド内へ１つの突然変異を導入することにより産生した変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３７】
低下したＤＮＡ重合活性を備える変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼであって、以下のステップによって産生される変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ：
（ａ）野生型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドを提供するステップ；
（ｂ）前記変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼをコードする変異型ポリヌクレオチドを産生するために前記ポリヌクレオチド内へ１つ以上のヌクレオチド突然変異を導入するステップ；および
（ｃ）前記変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを産生するために前記変異型ポリヌクレオチドを発現させるステップであって、ここで変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼがＴ５４２、Ｄ５４３、Ｋ５９３、Ｙ５９５、Ｙ３８５、Ｇ３８７、およびＧ３８８からなる群から選択されるアミノ酸位置で１つ以上の突然変異を含む。
【請求項３８】
前記変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼがＴ５４２Ｐ、Ｄ５４３Ｇ、Ｋ５９３Ｔ、Ｙ５９５Ｓ、Ｙ３８５Ｑ、Ｙ３８５Ｓ、Ｙ３８５Ｎ、Ｙ３８５Ｌ、Ｙ３８５Ｈ、Ｇ３８７Ｓ、Ｇ３８７Ｐ、およびＧ３８８Ｐからなる群から選択される１つ以上の突然変異を含む、請求項３７の変異型ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３９】
低下したＤＮＡ重合活性を備えるＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドを発現させることによって産生した変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを含む組成物であって、前記Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼがＴ５４２、Ｄ５４３、Ｋ５９３、Ｙ５９５、Ｙ３８５、Ｇ３８７、およびＧ３８８からなる群から選択されるアミノ酸位置で１つ以上の突然変異を含む組成物。
【請求項４０】
低下したＤＮＡ重合活性を備える変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを含む組成物であって、以下のステップによって産生される変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを含む組成物：
（ａ）Ｔ５４２、Ｄ５４３、Ｋ５９３、Ｙ５９５、Ｙ３８５、Ｇ３８７、およびＧ３８８からなる群から選択されるアミノ酸位置で１つ以上の突然変異を含む変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼをコードする変異型ポリヌクレオチドを産生するために野生型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド内に１つの突然変異を導入するステップ；
（ｂ）前記変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを含む前記組成物を産生するために前記変異型ポリヌクレオチドを発現させるステップ。
【請求項４１】
前記変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔ５４２Ｐ、Ｄ５４３Ｇ、Ｋ５９３Ｔ、Ｙ５９５Ｓ、Ｙ３８５Ｑ、Ｙ３８５Ｓ、Ｙ３８５Ｎ、Ｙ３８５Ｌ、Ｙ３８５Ｈ、Ｇ３８７Ｓ、Ｇ３８７Ｐ、およびＧ３８８Ｐからなる群から選択される１つ以上の突然変異を含む、請求項３９または４０の組成物。
【請求項４２】
第１酵素、第２酵素、およびそれらのための包装材料を含むキットであって、前記第１酵素がＤＮＡ重合活性を備え、前記第２酵素はＤ４０５、Ｙ４１０、Ｔ５４２、Ｄ５４３、Ｋ５９３、Ｙ５９５、Ｙ３８５、Ｇ３８７、およびＧ３８８からなる群から選択されるアミノ酸位置で１つ以上の突然変異を含む変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼであるキット。
【請求項４３】
前記第１酵素がＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素である、請求項４２のキット。
【請求項４４】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＵｌＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＧＢ−Ｄ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＰ１／ＤＰ２  ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択される、請求項４３のキット。
【請求項４５】
前記第１酵素が野生型Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼまたは野生型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼである、請求項４２の組成物。
【請求項４６】
第１酵素と第２酵素、およびそのための包装材料を含むキットであって、前記第１酵素が野生型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼであり、第２酵素は３’−５’エキソヌクレアーゼ活性および低下したＤＮＡ重合活性を備える変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼであるキット。
【請求項４７】
デオキシヌクレオチド、反応バッファー、ＰＣＲ促進因子および／または添加剤、対照ＤＮＡ鋳型および対照プライマーからなる群から選択される１つ以上の成分をさらに含む、請求項４２または４６のキット。
【請求項４８】
前記変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼが、Ｄ４０５Ｅ、Ｙ４１０Ｆ、Ｔ５４２Ｐ、Ｄ５４３Ｇ、Ｋ５９３Ｔ、Ｙ５９５Ｓ、Ｙ３８５Ｑ、Ｙ３８５Ｓ、Ｙ３８５Ｎ、Ｙ３８５Ｌ、Ｙ３８５Ｈ、Ｇ３８７Ｓ、Ｇ３８７Ｐ、およびＧ３８８Ｐからなる群から選択される１つ以上の突然変異を含む、請求項４２のキット。
【請求項４９】
前記酵素混合物が（２．５−５Ｕ）／（０．０２−５Ｕ）の重合活性／エキソヌクレアーゼ活性の比率を有する、請求項３６のキット。
【請求項５０】
前記酵素混合物が（２．５Ｕ）／（０．０４−０．０８Ｕ）の重合活性／エキソヌクレアーゼ活性の比率を有する、請求項４９のキット。
【請求項５１】
前記変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼがＧ３８７Ｐの突然変異を含む、請求項４７のキット。
【請求項５２】
低下したＤＮＡ重合活性を備える変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼおよびそのための包装材料を含むキットであって、前記変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼがＴ５４２、Ｄ５４３、Ｋ５９３、Ｙ５９５、Ｙ３８５、Ｇ３８７、およびＧ３８８からなる群から選択されるアミノ酸位置で１つ以上の突然変異を含むキット。
【請求項５３】
前記変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔ５４２Ｐ、Ｄ５４３Ｇ、Ｋ５９３Ｔ、Ｙ５９５Ｓ、Ｙ３８５Ｑ、Ｙ３８５Ｓ、Ｙ３８５Ｎ、Ｙ３８５Ｌ、Ｙ３８５Ｈ、Ｇ３８７Ｓ、Ｇ３８７Ｐ、およびＧ３８８Ｐからなる群から選択される１つ以上の突然変異を含む、請求項５２のキット。
【請求項５４】
変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼをコードする単離ポリヌクレオチドであって、前記変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼがＴ５４２、Ｄ５４３、Ｋ５９３、Ｙ５９５、Ｙ３８５、Ｇ３８７、およびＧ３８８からなる群から選択されるアミノ酸位置で１つ以上の突然変異を含む単離ポリヌクレオチド。
【請求項５５】
前記変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼが、Ｙ４１０Ｆ、Ｔ５４２Ｐ、Ｄ５４３Ｇ、Ｋ５９３Ｔ、Ｙ５９５Ｓ、Ｙ３８５Ｑ、Ｙ３８５Ｓ、Ｙ３８５Ｎ、Ｙ３８５Ｌ、Ｙ３８５Ｈ、Ｇ３８７Ｓ、Ｇ３８７Ｐ、およびＧ３８８Ｐからなる群から選択される１つ以上の突然変異を含む、請求項５４の単離ポリヌクレオチド。
【請求項５６】
第１および第２ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド対であって、前記対の前記第２ポリヌクレオチドがＤ４０５、Ｙ４１０、Ｔ５４２、Ｄ５４３、Ｋ５９３、Ｙ５９５、Ｙ３８５、Ｇ３８７、およびＧ３８８からなる群から選択されるアミノ酸位置で１つ以上の突然変異を含む変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド対。
【請求項５７】
前記対の前記第２ポリヌクレオチドがＤ４０５Ｅ、Ｙ４１０Ｆ、Ｔ５４２Ｐ、Ｄ５４３Ｇ、Ｋ５９３Ｔ、Ｙ５９５Ｓ、Ｙ３８５Ｑ、Ｙ３８５Ｓ、Ｙ３８５Ｎ、Ｙ３８５Ｌ、Ｙ３８５Ｈ、Ｇ３８７Ｓ、Ｇ３８７Ｐ、およびＧ３８８Ｐからなる群から選択される１つ以上の突然変異を含む変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含む、請求項５６のポリヌクレオチド対。
【請求項５８】
ＤＮＡ合成のための、以下のステップを含む方法：
（ａ）酵素混合物を提供するステップであって、前記酵素混合物がＤＮＡ重合活性を備える第１酵素と、Ｄ４０５、Ｙ４１０、Ｔ５４２、Ｄ５４３、Ｋ５９３、Ｙ５９５、Ｙ３８５、Ｇ３８７、およびＧ３８８からなる群から選択されるアミノ酸位置で１つ以上の突然変異を含む変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼである第２酵素と、を含むステップ；および
（ｂ）前記酵素混合物を核酸鋳型と接触させるステップであって、前記酵素混合物がＤＮＡ合成を可能にするステップ。
【請求項５９】
前記核酸鋳型がＤＮＡ分子である、請求項５８の方法。
【請求項６０】
前記第１酵素がＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素である、請求項５８の方法。
【請求項６１】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＵｌＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＧＢ−Ｄ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＰ１／ＤＰ２  ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択される、請求項６０の方法。
【請求項６２】
ＤＮＡ合成産物のＴＡクローニングのための、以下のステップを含む方法：
（ａ）酵素混合物を提供するステップであって、前記酵素混合物が第１酵素としてのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ならびに３’−５’エキソヌクレアーゼ活性および低下したＤＮＡ重合活性を備える第２酵素としての変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを含むステップ；
（ｂ）前記酵素混合物を核酸鋳型と接触させるステップであって、前記酵素混合物が合成ＤＮＡ産物を生成するためにＤＮＡ合成を可能にするステップ；および
（ｃ）ＴＡクローニングベクター内へ合成ＤＮＡ産物を挿入するステップ。
【請求項６３】
前記変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼがＤ４０５、Ｙ４１０、Ｔ５４２、Ｄ５４３、Ｋ５９３、Ｙ５９５、Ｙ３８５、Ｇ３８７、およびＧ３８８からなる群から選択されるアミノ酸位置で１つ以上の突然変異を含む、請求項６２の方法。
【請求項６４】
前記変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼが、Ｄ４０５Ｅ、Ｙ４１０Ｆ、Ｔ５４２Ｐ、Ｄ５４３Ｇ、Ｋ５９３Ｔ、Ｙ５９５Ｓ、Ｙ３８５Ｑ、Ｙ３８５Ｓ、Ｙ３８５Ｎ、Ｙ３８５Ｌ、Ｙ３８５Ｈ、Ｇ３８７Ｓ、Ｇ３８７Ｐ、およびＧ３８８Ｐからなる群から選択される１つ以上の突然変異を含む、請求項６３の方法。
【請求項６５】
前記反応混合物がＰＣＲ促進因子および／または添加剤をさらに含む、請求項５８または６２の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高忠実度ポリヌクレオチド合成の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡの合成を触媒し、すべての細胞内で見いだすことができ、そして多数のウイルス内でもコードされ得る。ＤＮＡポリメラーゼはすべてが５’−３’ＤＮＡ重合活性を有するが、ＤＮＡポリメラーゼは他の多数の特性において相互に異なる。例えば、一部のＤＮＡポリメラーゼは有するのに他のＤＮＡポリメラーゼには存在しない一部の酵素活性には、二本鎖ＤＮＡ５’−３’エキソヌクレアーゼ活性、一本鎖ＤＮＡ３’−５’エキソヌクレアーゼ活性、二本鎖ＤＮＡ３’−５’ＤＮＡエキソヌクレアーゼ活性、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性、逆転写酵素活性等が含まれる。さらに、異なるＤＮＡポリメラーゼは活性のために異なる最適のｐＨおよび温度範囲を有する可能性がある。しかも、ＤＮＡポリメラーゼはそれらがＤＮＡ合成を触媒する速度に関して異なる可能性がある。
【０００３】
精製ＤＮＡポリメラーゼは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて多数の使用を有する。それらの単離方法を含むＤＮＡポリメラーゼについての詳細な説明は、特にＫｏｒｎｂｅｒｇとＢａｋｅｒによる「ＤＮＡ複製（ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）第２版」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏｍｐａｎｙ，ニューヨーク，ニューヨーク州），１９９１年，の中に見いだすことができる。ＤＮＡポリメラーゼのｉｎ  ｖｉｔｒｏ使用には、例えばハイブリダイゼーションプローブの標識化および合成、ＤＮＡ配列決定、ならびにＤＮＡ増幅が含まれる。ＤＮＡポリメラーゼを利用する特に有用であったＤＮＡ増幅法は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの使用を利用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術である。
【０００４】
ＤＮＡ増幅のために広く使用されている最初の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、耐熱性好気性細菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓから単離されたＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである。高温でのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性は、複雑な二次構造を備えるポリヌクレオチド鋳型のプライマー伸長および配列決定を可能にする（すなわち、ＰＣＲ増幅法によって）。しかし、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼはヌクレオチドを組み込んだときに３’−５’エキソヌクレアーゼ活性（すなわち、プルーフリーディング（校正）活性）が欠如するために重大なエラー率を有するので、このために増幅した配列をその後の遺伝子構造／機能試験またはクローニングに使用する場合は適切ではない可能性がある。
【０００５】
過去１０年間に、数多くの試験で耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのエラー率が定量されており、数種の酵素はＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼより正確にＤＮＡをコピーすることが見いだされている（高忠実度ＤＮＡポリメラーゼと呼ばれる）。ＤＮＡポリメラーゼについて記載している米国特許には、第４，４９２，１３０号；第４，９４６，７８６号；第５，２１０，０３６号；第５，４２０，０２９号；第５，４８９，５２３号；第５，５０６，１３７号；第５，５４５，５５２号；第５，６１８，７１１号；第５，６２４，８３３号；第６，２３８，９０５号；第６，１００，０７８号；第６，０７７，６６４号；第５，９６８，７９９号；第５，９４８，６６３号；第５，８８５，７１３号；第５，８３４，２８５号；第５，７５６，３３４号；第５，７４７，２９８号；第５，７４４，３１２号；第５，６２４，８３３号；第５，６０２，０１１号；第５，５５６，７７２号が含まれる。
【０００６】
高忠実度ポリメラーゼは単独で忠実度を明確に増加させるはずであるが、通常は長いフラグメントを３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が欠如するＤＮＡポリメラーゼ（例、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ）と同等に効率的には増幅させない。標準ポリメラーゼと少量のプルーフリーディングポリメラーゼとを結合する酵素混合物は、忠実度と収率との平衡を提供する可能性がある。１９９４年に公表された試験は、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が欠如する高レベルのＤＮＡポリメラーゼ（ｅｘｏ−ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｔａｑ−１）と３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示す極めて低レベルの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ、Ｖｅｎｔ、もしくはＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ等のｅｘｏ＋ＤＮＡポリメラーゼ）とを使用すると、１ｎｇのλＤＮＡ鋳型から３５ｋｂ  ＤＮＡの最高収率で塩基対忠実度が増加した産物が生成することを明らかにした（Ｂａｒｎｅｓ，「全米科学アカデミー要旨集（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」，９１：２２１６−２０，１９９４年）。同様に、米国特許第５，４３６，１４９号および第６，００８，２０５号は、実質的に３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が欠如する第１酵素と３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を備える第２酵素とを含むＤＮＡポリメラーゼ組成物を使用してＤＮＡ増幅忠実度を向上させる方法を開示した。これらのような混合物中では、ｅｘｏ＋酵素はｅｘｏ−ＤＮＡポリメラーゼによって生じた重合エラーを補正するように機能する。
【０００７】
２種のＤＮＡポリメラーゼの混合物を含む上記の組成物に固有の問題は、２種のＤＮＡポリメラーゼを結合させた結果として生じる高い重合活性が増幅反応の効率そしてそのために収率を抑制する可能性がある点である。このため、ＰＣＲ産物の収率を落とすことなくプルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼの比率を増加させることによって忠実度を増加させることはできない。増幅忠実度は高いＤＮＡポリメラーゼ濃度によって影響を受ける可能性があることも知られている（例えば、Ｍａｔｔｉｌａら、１９９１年，Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９：４９６７−７３を参照されたい）。
【０００８】
このため、当技術分野においては重合忠実度を改善し、反応において高い重合活性を有する結果として生じる副作用を低下させる新規の方法および組成物に対する必要がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、第１酵素および第２酵素を含む酵素混合物を提供するが、ここで第１酵素はＤＮＡ重合活性を備え、そして第２酵素は３’−５’エキソヌクレアーゼ活性および低下したＤＮＡ重合活性を備える。
【００１０】
本発明は、第１酵素および第２酵素を含む酵素混合物をさらに提供するが、ここで第１酵素は野生型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼであり、第２酵素は３’−５’エキソヌクレアーゼ活性および低下したＤＮＡ重合活性を備える変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼである。
【００１１】
本発明は、第１酵素および第２酵素を含む酵素混合物をさらに提供するが、ここで第１酵素はＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼであり、第２酵素は３’−５’エキソヌクレアーゼ活性および低下したＤＮＡ重合活性を備える変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼである。
【００１２】
本発明は、第１酵素および第２酵素を含む酵素混合物をさらに提供するが、ここで第１酵素はＤＮＡ重合活性を備える野生型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼまたは野生型Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼであり、そして第２酵素は３’−５’エキソヌクレアーゼ活性および低下したＤＮＡ重合活性を備える変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼである。
【００１３】
本発明は、２種以上の酵素を含む酵素混合物を提供するが、ここで該酵素混合物中の少なくとも第１酵素はＤＮＡ重合活性を備え、そして該酵素混合物中の少なくとも第２酵素は３’−５’エキソヌクレアーゼ活性および低下したＤＮＡ重合活性を備える。
【００１４】
本発明は、低下したＤＮＡ重合活性を備える変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼをさらに提供するが、ここで変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼはＴ５４２、Ｄ５４３、Ｋ５９３、Ｙ５９５、Ｙ３８５、Ｇ３８７、およびＧ３８８からなる群から選択されるアミノ酸位置で１つ以上の突然変異を含む。
【００１５】
本発明は、変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを含む組成物をさらになお提供するが、ここで変異型ＤＮＡポリメラーゼはＴ５４２、Ｄ５４３、Ｋ５９３、Ｙ５９５、Ｙ３８５、Ｇ３８７、およびＧ３８８からなる群から選択されるアミノ酸位置で１つ以上の突然変異を含む。
【００１６】
本発明は、Ｔ５４２、Ｄ５４３、Ｋ５９３、Ｙ５９５、Ｙ３８５、Ｇ３８７、およびＧ３８８からなる群から選択されるアミノ酸位置で１つ以上の突然変異を含む変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを産生するために、野生型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド内へ１つの突然変異を導入することにより産生する変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを提供する。
【００１７】
本発明は、低下したＤＮＡ重合活性を備える変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼをさらに提供するが、ここで変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼは：
（ａ）野生型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドを提供するステップと；
（ｂ）変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼをコードする変異型ポリヌクレオチドを産生するためにポリヌクレオチド内へ１つ以上のヌクレオチド突然変異を導入するステップと；および
（ｃ）変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを産生するために変異型ポリヌクレオチドを発現させるステップであって、ここで変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼはＴ５４２、Ｄ５４３、Ｋ５９３、Ｙ５９５、Ｙ３８５、Ｇ３８７、およびＧ３８８からなる群から選択されるアミノ酸位置で１つ以上の突然変異を含むステップ
によって産生する。
【００１８】
本発明は、低下したＤＮＡ重合活性を備えるＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドを発現させることによって産生する変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを含む組成物を提供するが、ここで変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼはＴ５４２、Ｄ５４３、Ｋ５９３、Ｙ５９５、Ｙ３８５、Ｇ３８７、およびＧ３８８からなる群から選択されるアミノ酸位置で１つ以上の突然変異を含む。
【００１９】
本発明は、低下したＤＮＡ重合活性を備える変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを含む組成物をさらに提供するが、ここで変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼは（ａ）Ｔ５４２、Ｄ５４３、Ｋ５９３、Ｙ５９５、Ｙ３８５、Ｇ３８７、およびＧ３８８からなる群から選択されるアミノ酸位置で１つ以上の突然変異を含む変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼをコードする変異型ポリヌクレオチドを産生するために、野生型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド内に１つの突然変異を導入するステップと；（ｂ）変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを含む組成物を産生するために変異型ポリヌクレオチドを発現させるステップと、によって産生する。
【００２０】
本発明は、第１酵素および第２酵素、ならびにそのための包装材料を含むキットをさらに提供するが、ここで第１酵素はＤＮＡ重合活性を備え、第２酵素は３’−５’エキソヌクレアーゼ活性および低下したＤＮＡ重合活性を備える。
【００２１】
本発明は、第１酵素および第２酵素、ならびにそのための包装材料を含むキットをさらに提供するが、ここで第１酵素は野生型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼであり、第２酵素は３’−５’エキソヌクレアーゼ活性および低下したＤＮＡ重合活性を備える変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼである。
【００２２】
本発明は、第１酵素と第２酵素、ならびにそのための包装材料を含むキットをさらに提供するが、ここで第１酵素はＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼであり、第２酵素は３’−５’エキソヌクレアーゼ活性および低下したＤＮＡ重合活性を備える変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼである。
【００２３】
本発明は、第１酵素および第２酵素を含む酵素混合物、ならびにそのための包装材料を含むキットをさらに提供するが、ここで第１酵素はＤＮＡ重合活性を備える野生型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼまたは野生型Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼであり、そして第２酵素は３’−５’エキソヌクレアーゼ活性および低下したＤＮＡ重合活性を備える変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼである。
【００２４】
本発明は、低下したＤＮＡ重合活性を備える変異型ＤＮＡポリメラーゼおよびそのための包装材料を含むキットをさらに提供するが、ここで変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼはＴ５４２、Ｄ５４３、Ｋ５９３、Ｙ５９５、Ｙ３８５、Ｇ３８７、およびＧ３８８からなる群から選択されるアミノ酸位置で１つ以上の突然変異を含む。
【００２５】
１つの実施態様では、本発明の第１酵素はＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素である。
【００２６】
好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＵｌＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＧＢ−Ｄ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＰ１／ＤＰ２  ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択される。
【００２７】
本発明の１つの実施態様では、第２酵素は変異型ＤＮＡポリメラーゼである。
【００２８】
好ましくは、変異型ＤＮＡポリメラーゼは、第１酵素とは異なるＤＮＡポリメラーゼに由来する。
【００２９】
より好ましくは、変異型ＤＮＡポリメラーゼは、ＵｌＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＧＢ−Ｄ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＰ１／ＤＰ２  ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択されるＤＮＡポリメラーゼに由来する。
【００３０】
好ましくは、変異型ＤＮＡポリメラーゼは、その分割ドメインまたはポリメラーゼドメインにおいて突然変異を含む。
【００３１】
より好ましくは、変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼはＤ４０５、Ｙ４１０、Ｔ５４２、Ｄ５４３、Ｋ５９３、Ｙ５９５、Ｙ３８５、Ｇ３８７、およびＧ３８８からなる群から選択されるアミノ酸位置で１つ以上の突然変異を含む。
【００３２】
より好ましくは、変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼはＤ４０５Ｅ、Ｙ４１０Ｆ、Ｔ５４２Ｐ、Ｄ５４３Ｇ、Ｋ５９３Ｔ、Ｙ５９５Ｓ、Ｙ３８５Ｑ、Ｙ３８５Ｓ、Ｙ３８５Ｎ、Ｙ３８５Ｌ、Ｙ３８５Ｈ、Ｇ３８７Ｓ、Ｇ３８７Ｐ、およびＧ３８８Ｐからなる群から選択される１つ以上の突然変異を含む。
【００３３】
本発明の好ましい実施態様では、変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼはＧ３８７Ｐの突然変異を含む。
【００３４】
本発明の酵素混合物、組成物、またはキットは、ＰＣＲ促進因子および／または添加剤をさらに含んでいてよい。
【００３５】
好ましくは、酵素混合物、組成物、または酵素混合物を含むキットは、重合活性／エキソヌクレアーゼ活性の（２．５−５Ｕ）／（０．０２−５Ｕ）の比率を備える。
【００３６】
より好ましくは、酵素混合物、組成物、または酵素混合物を含むキットは、（２．５Ｕ）／（０．０４−０．０８Ｕ）の重合活性／エキソヌクレアーゼ活性の比率を備える。
【００３７】
本発明の酵素混合物では、第１酵素は酵素ブレンドの酵素であってよいが、ここで酵素混合物は酵素ブレンドおよび第２酵素を混合することによって生成される。
【００３８】
好ましくは、酵素ブレンドは野生型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼおよび野生型Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含む。
【００３９】
同様に好ましくは、酵素ブレンドはさらにＰＣＲ促進因子を含んでいてよい。
【００４０】
本発明の変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔ５４２Ｐ、Ｄ５４３Ｇ、Ｋ５９３Ｔ、Ｙ５９５Ｓ、Ｙ３８５Ｑ、Ｙ３８５Ｓ、Ｙ３８５Ｎ、Ｙ３８５Ｌ、Ｙ３８５Ｈ、Ｇ３８７Ｓ、Ｇ３８７Ｐ、およびＧ３８８Ｐからなる群から選択される１つ以上の突然変異を含んでいてよい。
【００４１】
好ましくは、変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔ５４２Ｐ、Ｄ５４３Ｇ、Ｋ５９３Ｔ、Ｙ５９５Ｓ、Ｙ３８５Ｑ、Ｙ３８５Ｓ、Ｙ３８５Ｎ、Ｙ３８５Ｌ、Ｙ３８５Ｈ、Ｇ３８７Ｓ、Ｇ３８７Ｐ、およびＧ３８８Ｐからなる群から選択される１つ以上の突然変異を含む。
【００４２】
本発明は、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性および低下したＤＮＡ重合活性を備える変異型酵素をコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドを提供する。
【００４３】
好ましくは、本発明の単離ポリヌクレオチドによってコードされる３’−５’エキソヌクレアーゼ活性および低下したＤＮＡ重合活性を備える変異型酵素は、変異型ＤＮＡポリメラーゼまたは変異型逆転写酵素である。
【００４４】
より好ましくは、単離ポリヌクレオチドは変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼをコードする。
【００４５】
より好ましくは、単離ポリヌクレオチドは、Ｔ５４２、Ｄ５４３、Ｋ５９３、Ｙ５９５、Ｙ３８５、Ｇ３８７、およびＧ３８８からなる群から選択されるアミノ酸位置で１つ以上の突然変異を含む変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼをコードする。
【００４６】
より好ましくは、単離ポリヌクレオチドは、Ｙ４１０Ｆ、Ｔ５４２Ｐ、Ｄ５４３Ｇ、Ｋ５９３Ｔ、Ｙ５９５Ｓ、Ｙ３８５Ｑ、Ｙ３８５Ｓ、Ｙ３８５Ｎ、Ｙ３８５Ｌ、Ｙ３８５Ｈ、Ｇ３８７Ｓ、Ｇ３８７Ｐ、およびＧ３８８Ｐからなる群から選択される１つ以上の突然変異を含む変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼをコードする。
【００４７】
本発明は、１組の単離ポリヌクレオチド対をさらに提供するが、ここで該対の第１ポリヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼ活性を備える第１酵素をコードするポリヌクレオチド配列を含み、そして該対の第２ポリヌクレオチドは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性および低下したＤＮＡ重合活性を備える酵素をコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【００４８】
本発明は、１組の単離ポリヌクレオチド対をさらに提供するが、ここで該対の第１ポリヌクレオチドは、野生型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼまたはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含み、そして該対の第２ポリヌクレオチドは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性および低下したＤＮＡ重合活性を備える変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【００４９】
好ましくは、該対の第２ポリヌクレオチドは、Ｄ４０５、Ｙ４１０、Ｔ５４２、Ｄ５４３、Ｋ５９３、Ｙ５９５、Ｙ３８５、Ｇ３８７、およびＧ３８８からなる群から選択されるアミノ酸位置で１つ以上の突然変異を含む変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【００５０】
同様に好ましくは、該対の第２ポリヌクレオチドは、Ｄ４０５Ｅ、Ｙ４１０Ｆ、Ｔ５４２Ｐ、Ｄ５４３Ｇ、Ｋ５９３Ｔ、Ｙ５９５Ｓ、Ｙ３８５Ｑ、Ｙ３８５Ｓ、Ｙ３８５Ｎ、Ｙ３８５Ｌ、Ｙ３８５Ｈ、Ｇ３８７Ｓ、Ｇ３８７Ｐ、およびＧ３８８Ｐからなる群から選択される１つ以上の突然変異を含む変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【００５１】
本発明は、ＤＮＡ合成方法であって：（ａ）ＤＮＡ重合活性を備える第１酵素、ならびに３’−５’エキソヌクレアーゼ活性および低下したＤＮＡ重合活性を備える第２酵素を含む酵素混合物を提供するステップと；および（ｂ）酵素混合物を核酸鋳型と接触させるステップであって、ここで酵素混合物がＤＮＡ合成を可能にするステップと、を含む方法を提供する。
【００５２】
好ましくは、核酸鋳型はＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子である。
【００５３】
本発明は、ＤＮＡ合成方法であって：（ａ）本発明の酵素混合物を提供するステップであって、酵素混合物が第１酵素としての野生型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、ならびに３’−５’エキソヌクレアーゼ活性および低下したＤＮＡ重合活性を備える第２酵素としての変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを含んでいるステップと；および（ｂ）酵素混合物を核酸鋳型と接触させるステップであって、ここで酵素混合物がＤＮＡ合成を可能にするステップと、を含む方法を提供する。
【００５４】
本発明は、ＤＮＡ合成産物のＴＡクローニング方法であって：（ａ）本発明の酵素混合物を提供するステップであって、酵素混合物が第１酵素としてのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ならびに３’−５’エキソヌクレアーゼ活性および低下したＤＮＡ重合活性を備える第２酵素としての変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを含んでいるステップと；（ｂ）酵素混合物を核酸鋳型と接触させるステップであって、ここで酵素混合物が合成ＤＮＡ産物を生成するためにＤＮＡ合成を可能にするステップと；および（ｃ）ＴＡクローニングベクター内へ合成ＤＮＡ産物を挿入するステップと、を含む方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５５】
本発明は、高忠実度ポリヌクレオチド合成、特にＤＮＡ合成のための新規組成物を提供する。本発明は、ＤＮＡ合成のための第１酵素および第２酵素を含む酵素混合物を提供するが、ここで第１酵素はＤＮＡ重合活性を備え、そして第２酵素は３’−５’エキソヌクレアーゼ活性および低下したＤＮＡ重合活性を備える。ＤＮＡ合成のための高忠実度を提供することに加えて、本発明の組成物は高い重合活性の副作用を防止し、このために両方のＤＮＡポリメラーゼが野生型重合活性を有する混合物と比較して増幅の効率を増加させる。
【００５６】
用語の定義
本明細書で使用する「合成」とは、ポリヌクレオチドの新規ストランドを作製する、または既存ポリヌクレオチド（すなわち、ＤＮＡもしくはＲＮＡ）を伸長させるあらゆるｉｎ  ｖｉｔｒｏ法を意味する。本発明による合成には、ポリメラーゼを使用してポリヌクレオチド鋳型配列の多数のコピーを増加させる増幅が含まれる。ポリヌクレオチド合成（例、増幅）は、ポリヌクレオチド（すなわち、プライマー）内へのヌクレオチドの取り込みを生じさせ、それによって該ポリヌクレオチド鋳型に相補的な新規ポリヌクレオチド分子を形成する。形成されたポリヌクレオチド分子およびその鋳型は、追加のポリヌクレオチド分子を合成するための鋳型として使用できる。
【００５７】
本発明による「ＤＮＡ合成」には、ＰＣＲ、逆転写、ポリヌクレオチドの標識化（すなわち、プローブおよびオリゴヌクレオチドプライマーに対して）、ポリヌクレオチド配列決定が含まれるが、それらに限定されない。
【００５８】
本明細書で使用する用語「鋳型依存性方法」とは、プライマー分子の鋳型依存性伸長（例、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成）を含む工程を意味すると意図されている。用語「鋳型依存性方法」とは、ＲＮＡもしくはＤＮＡのポリヌクレオチド合成を意味するが、ここでポリヌクレオチドの新規合成ストランドの配列は相補的塩基対合のよく知られている規則によって決定される（例えば、Ｗａｔｓｏｎ  Ｊ．Ｄ．らの「遺伝子の分子生物学（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ．）第４版」，Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｉｎｃ．，メンロパーク，カリフォルニア州（１９８７年）を参照されたい）。
【００５９】
本明細書で使用する「ポリヌクレオチドポリメラーゼ」とは、ヌクレオチドの重合を触媒する（すなわち、ポリメラーゼ活性）酵素を意味する。一般に、該酵素はポリヌクレオチド鋳型配列にアニーリングされたプライマーの３’末端で合成を開始し、そして鋳型ストランドの５’末端に向かって進行する。「ＤＮＡポリメラーゼ」は、デオキシヌクレオチドの重合を触媒する。
【００６０】
本明細書で使用する「ポリメラーゼドメイン」とは、その重合活性にとって極めて重要であるＤＮＡポリメラーゼの１つ以上のドメインを意味する。ポリメラーゼドメインの位置は変化し、例えばＰｆｕ、Ｔｇｏ、ＫＤＯ、Ｔｌｉ（Ｖｅｎｔ）およびＰＧＢ−Ｄ（ｄｅｅ  Ｖｅｎｔ）のためのポリメラーゼドメインは表２Ｂに記載したアミノ酸位置に位置する。
【００６１】
本明細書で使用する「分割ドメイン」とは、ＤＮＡ鎖の合成と分解との平衡を調整することに極めて重要な役割を果たすＤＮＡポリメラーゼのドメインを意味する。一般に、分割ドメインはＹＸＧＧモチーフを特徴とする（Ｔｒｕｎｉｇｅｒら、１９９６年，ＥＭＢＯ  Ｊ．１５：３４３０−３４４１）。この領域は、３’−５’エキソヌクレアーゼドメインとポリメラーゼドメインとを結び付ける接近可能なループ内に位置する。分割ドメインの位置は変動する。例えば、Ｐｆｕ、Ｔｇｏ、ＫＤＯ、Ｔｌｉ（Ｖｅｎｔ）およびＰＧＢ−Ｄ（ｄｅｅ  Ｖｅｎｔ）のための分割ドメインは、各々アミノ酸位置３８４−３８９、３８３−３８８、３８３−３８８、３８６−３９１、および３８４−３８９に位置する。
【００６２】
本発明によると、別のクラスのＤＮＡポリメラーゼは「ＲＴ」とも呼ばれる「逆転写酵素」であり、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、ＦｅＬＶ、ＦＩＶ、ＳＩＶ、ＡＭＶ、ＭＭＴＶ、およびＭｏＭｕＬＶを含む全レトロウイルスに対するウイルスＲＮＡ由来ｃＤＮＡの合成に責任を担う極めて重要な酵素である。詳しい説明については、例えばＬｅｖｉｎ，１９９７年，Ｃｅｌｌ，８８：５−８；Ｂｒｏｓｉｕｓら、１９９５年，Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  １１：１６３−７９を参照されたい。用語「逆転写酵素（ＲＴ）活性」とは、ＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡを合成する能力を意味する。ＲＴ活性を測定する方法は当技術分野においてよく知られており、例えばＱｕａｎ−Ｔ−ＲＴアッセイシステムはアマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社（アーリントンハイツ，イリノイ州）から市販で入手でき、Ｂｏｓｗｏｒｔｈら、Ｎａｔｕｒｅ  １９８９年，３４１：１６７−１６８に記載されている。
【００６３】
本明細書で使用する「低下したＤＮＡ重合活性」を備える変異型ＤＮＡポリメラーゼは、例えば野生型酵素の重合活性の１０％（例えば、８％、６％、４％、２％未満、もしくは１％未満）のＤＮＡ重合活性を備えるような、野生型酵素のＤＮＡ重合活性より低いＤＮＡ重合活性を備えるＤＮＡポリメラーゼ変異体である。
【００６４】
本明細書で使用する「エキソヌクレアーゼ」とは、結合、好ましくはヌクレオチド間のホスホジエステル結合をＤＮＡ分子の末端から１つずつ切断する酵素を意味する。エキソヌクレアーゼはＤＮＡ分子の５’または３’末端に対して特異的であってよく、そして本明細書では５’から３’エキソヌクレアーゼまたは３’から５’エキソヌクレアーゼと呼ぶ。本発明による有用なエキソヌクレアーゼは、ポリヌクレオチドの３’末端から連続ヌクレオチドを切断することによりＤＮＡを分解する３’から５’エキソヌクレアーゼである。ポリヌクレオチド鋳型の合成または増幅中に、３’から５’エキソヌクレアーゼ活性を備えるＤＮＡポリメラーゼ（ｅｘｏ＋）は誤対合塩基を取り除く能力（プルーフリーディング活性）を有しており、このために３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を備えないＤＮＡポリメラーゼ（ｅｘｏ−）よりエラーが発生しにくい。エキソヌクレアーゼ活性は、当技術分野においてよく知られている方法によって定義できる。例えば、１単位のエキソヌクレアーゼ活性は、３７℃、１時間で１μｇのＤＮＡ標的を切断するために必要な酵素の量を意味する。野生型ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼおよびＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは３’から５’エキソヌクレアーゼ活性を有していないために「ｅｘｏ−」であるが、野生型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＪＤＦ  ＤＮＡポリメラーゼ、およびＰＧＢ−Ｄ  ＤＮＡポリメラーゼは、それらすべてが３’から５’エキソヌクレアーゼ活性を示すので「ｅｘｏ＋」である。
【００６５】
本明細書で使用する用語「忠実度」とは、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ重合の正確度を意味する。ＤＮＡポリメラーゼの忠実度は、エラー率によって測定する（不正確なヌクレオチド、すなわち、鋳型依存性方法で取り込まれたのではないヌクレオチドを取り込む頻度）。ＤＮＡ重合の正確度もしくは忠実度は、ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の両方によって維持される。用語「高忠実度」とは、１塩基対当たり５×１０−６以下のエラー率を意味する。ＤＮＡポリメラーゼの忠実度もしくはエラー率は、当技術分野において知られているアッセイを使用して測定できる（例えば、Ｌｕｎｄｂｕｒｇら、１９９１年  Ｇｅｎｅ，１０８：１−６を参照されたい）。
【００６６】
本明細書で使用する「増幅産物」とは、ＰＣＲ増幅反応終了時の二本鎖ポリヌクレオチド集団を意味する。増幅産物は、最初のポリヌクレオチド鋳型およびＰＣＲ反応中にポリヌクレオチド鋳型を使用してＤＮＡポリメラーゼによって合成されたポリヌクレオチドを含有する。
【００６７】
本明細書で使用する「ポリヌクレオチド鋳型」または「標的ポリヌクレオチド鋳型」とは、増幅領域を含有するポリヌクレオチドを意味する。本明細書で使用する「増幅領域」とは、逆転写によって合成された、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅されたポリヌクレオチドの領域である。例えば、ポリヌクレオチド鋳型の増幅領域は、それに対して２種のＰＣＲプライマーが相補的である２つの配列間に存在する。
【００６８】
本明細書で使用する用語「プライマー」とは、ポリヌクレオチド鋳型にハイブリダイズして第２ポリヌクレオチドストランドの酵素的合成をプライミングすることのできる一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を意味する。本発明により有用なプライマーは、長さが１０から１００ヌクレオチド、好ましくは長さが１７から５０ヌクレオチド、およびより好ましくは長さが１７から４５ヌクレオチドである。
【００６９】
「相補的」とは、塩基対合を通して２本のポリヌクレオチドストランドの領域間または２つのヌクレオチド間の配列相補性についての広範囲の概念を意味する。アデニンヌクレオチドが、チミンまたはウラシルであるヌクレオチドとの特異的水素結合（「塩基対合」）を形成できることは知られている。同様に、シトシンヌクレオチドはグアニンヌクレオチドと塩基対合できることは知られている。
【００７０】
用語「野生型」とは、天然起源から単離された遺伝子または遺伝子産物の特徴を有する遺伝子または遺伝子産物を意味する。これとは対照的に、用語「修飾（された）」または「変異型」とは、野生型遺伝子または遺伝子産物と比較して変化した特徴を示す遺伝子または遺伝子産物に適用する。例えば、本発明における変異型ＤＮＡポリメラーゼは低下したＤＮＡ重合活性を示すＤＮＡポリメラーゼである。
【００７１】
本明細書で使用する本発明による「酵素混合物」は、ＤＮＡ重合活性を備える第１酵素、ならびに３’−５’エキソヌクレアーゼ活性および低下したＤＮＡ重合活性を備える第２酵素を含む。該酵素混合物中のＤＮＡポリメラーゼ活性対エキソヌクレアーゼ活性の比率は約（２．５−５ＵのＤＮＡ重合活性）／（０．０５−１０Ｕの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性）である。
【００７２】
本明細書で使用する用語「酵素ブレンド」とは、２種以上のプレミックス酵素を含む酵素組成物を意味する。「酵素ブレンド」はさらに、ＰＣＲ促進因子、酵素保存バッファー、または反応バッファー等の他の試薬を含んでいてよい。
【００７３】
有用なＤＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素
ＤＮＡポリメラーゼおよびそれらの特性は、特に「ＤＮＡ複製  第２版」ＫｏｒｎｂｅｒｇとＢａｋｅｒ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏｍｐａｎｙ，ニューヨーク，ニューヨーク州（１９９１年）の中に詳細に記載されている。
【００７４】
知られている従来型ＤＮＡポリメラーゼには、例えばＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｕｎｄｂｅｒｇら、１９９１年，Ｇｅｎｅ，１０８：１，ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社製）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｏｅｓｅｉ（Ｐｗｏ）  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｈｉｎｎｉｓｄａｅｌｓら、１９９６年，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２０：１８６−８，ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）社製）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）  ＤＮＡポリメラーゼ（ＭｙｅｒｓとＧｅｌｆａｎｄ  １９９１年，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：７６６１）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＳｔｅｎｅｓｈとＭｃＧｏｗａｎ，１９７７年，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ４７５：３２）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（Ｔｌｉ）  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼとも呼ばれる、Ｃａｒｉｅｌｌｏら、１９９１年，Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｒｅｓ，１９：４１９３，ニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）社製）、９°Ｎｍ  ＤＮＡポリメラーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブズ社の製造中止製品）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ（Ｔｍａ）  ＤＮＡポリメラーゼ（ＤｉａｚとＳａｂｉｎｏ，１９９８年，Ｂｒａｚ  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ，３１：１２３９）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｈｉｅｎら、１９７６年，Ｊ．Ｂａｃｔｅｏｒｉｏｌ，１２７：１５５０）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  Ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｇｉら、１９９７年，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：４５０４）、ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼ（ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種のＪＤＦ−３由来、特許出願国際公開公報第０１３２８８７号）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ＧＢ−Ｄ（ＰＧＢ−Ｄ）  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｄｅｅｐ−Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼとも呼ばれる、Ｊｕｎｃｏｓａ−Ｇｉｎｅｓｔａら、１９９４年，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１６：８２０，ニュー・イングランド・バイオラブズ社製）、ＵｌＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ（好熱菌Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａから；ＤｉａｚとＳａｂｉｎｏ，１９９８年，Ｂｒａｚ  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ，３１：１２３９；ＰＥアプライド・バイオシステムズ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製）、Ｔｇｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ由来、ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）社製）、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（ＬｅｃｏｍｔｅとＤｏｕｂｌｅｄａｙ，１９８３年，Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｒｅｓ．１１：７５０５）、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｒｄｓｔｒｏｍら、１９８１年，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：３１１２）、および古細菌ＤＰ１／ＤＰ２  ＤＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｃａｎｎら、１９９８年，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃ���  ＵＳＡ  ９５：１４２５０−５）が含まれる。上記の酵素の重合活性はいずれも、当技術分野においてよく知られている方法によって定義できる。本発明による従来型ＤＮＡポリメラーゼの１単位のＤＮＡ重合活性は、最適温度（例、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼの場合は７２℃）で３０分間中に重合体形への１０ｎＭの全デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）の取り込みを触媒する酵素の量であると定義されている。ＤＮＡポリメラーゼ活性と３’−５’エキソヌクレアーゼ活性についてのアッセイは、「ＤＮＡ複製  第２版」，ＫｏｒｎｂｅｒｇとＢａｋｅｒ（上記）；「酵素（Ｅｎｚｙｍｅｓ）」，ＤｉｘｏｎとＷｅｂｂ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，サンディエゴ，カリフォルニア州（１９７９年）ならびに当業者が入手できる他の出版物の中に見いだすことができる。
【００７５】
例えばＰＣＲ技術中のように高温に曝露させられる反応混合物中で本組成物を使用する場合は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの使用が好ましい。
【００７６】
本発明により有用な逆転写酵素には、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−ＩＩ、ＦｅＬＶ、ＦＩＶ、ＳＩＶ、ＡＭＶ、ＭＭＴＶ、ＭｏＭｕＬＶおよびその他のレトロウイルス由来の逆転写酵素が含まれるがそれらに限定されない（詳細な説明については、例えばＬｅｖｉｎ，１９９７年，Ｃｅｌｌ，８８：５−８；Ｖｅｒｍａ，１９７７年，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．４７３：１−３８；Ｗｕら、１９７５年，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．３：２８９−３４７を参照されたい）。
【００７７】
ＤＮＡ重合活性を備える有用な第１酵素
本発明によるＤＮＡ重合活性を備える酵素には、ＤＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素等の酵素が含まれる。
【００７８】
本組成物中で使用される第１酵素は、プルーフリーディング活性を備える、または備えないあらゆるＤＮＡポリメラーゼであってよい。好ましくは、野生型ＤＮＡポリメラーゼを使用する。しかし、変異型ＤＮＡポリメラーゼもまた、それが増幅反応のために必要な十分なＤＮＡ重合活性を提供する限り使用できる。
【００７９】
好ましい実施態様では、ＤＮＡ重合活性を備える第１酵素は野生型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼである。第１酵素としてＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを含む酵素混合物は、本明細書では以下ではＰｆｕブレンドとも呼ぶ。
【００８０】
本発明の好ましい実施態様では、Ｐｆｕブレンド酵素混合物は例えばＰＣＲ反応のようなＤＮＡ合成反応のために使用される。
【００８１】
また別の好ましい実施態様では、ＤＮＡ重合活性を備える第１酵素は野生型Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである。第１酵素としてＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含む酵素混合物は、本明細書では以下ではＴａｑブレンドとも呼ぶ。
【００８２】
本発明の好ましい実施態様では、Ｔａｑブレンド酵素混合物は例えばその後にＴＡクローニングが続くＰＣＲ反応のようなＤＮＡ合成反応およびその後の直接的クローニングのために使用される。
【００８３】
１つの実施態様では、第１酵素は酵素ブレンドの形態で存在する。この酵素ブレンドは、本発明の酵素混合物を生成するために低下した重合活性を備える第２酵素と混合される。
【００８４】
好ましい実施態様では、酵素ブレンドは登録商標Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ（商標）Ｅｎｈａｎｃｅｄまたは登録商標Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ（商標）ホットスタート（Ｈｏｔｓｔａｒｔ）ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製、製品番号６００３１０もしくは６００２６０）である。酵素ブレンドはさらに例えばＥＸＬ  ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製、製品番号６００３４２０／２／４）、ＹｉｅｌｄＡｃｅ  ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製、６００２９０／２／４）、ＴａｑＰｌｕｓ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＰＣＲシステム（ストラタジーン社製、製品番号６００２１０／１／２）、ＴａｑＰｌｕｓ  Ｌｏｎｇ  １００Ｕ（ストラタジーン社製、製品番号６００２０３／４／５）、アドバンテージ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ）２  ＰＣＲ酵素系（ＢＤバイオサイエンス・クロンテック（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社製、製品番号８４３０−１）、アドバンテージ−ＧＣ２（ＢＤバイオサイエンス・クロンテック社製、製品番号８４３３−１）、アドバンテージ−ＨＦ２（ＢＤバイオサイエンス・クロンテック社製、製品番号Ｋ１９１４−ｙ／１）、ＢＩＯ−Ｘ−ＡＣＴ  ＤＮＡポリメラーゼ（バイオライン（Ｂｉｏｌｉｎｅ）社製、製品番号ＢＩＯ−２１０４９／５０）、トリプルマスター（ＴｒｉｐｌｅＭａｓｔｅｒ）ＰＣＲシステム（ブリンクマン（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ）社製、製品番号００３２−００８−２１６／２４／３２）、フェールセーフ（ＦａｉｌＳａｆｅ）ＰＣＲシステム（エピセンター（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）社製、製品番号ＦＳ９９０６０／１００／２５０／１Ｋ）、マスターアンプ・エクストラロング（ＭａｓｔｅｒＡｍｐ  Ｅｘｔｒａ−Ｌｏｎｇ）ＰＣＲキット（エピセンター社製、製品番号ＭＨＦ９２２０／ＱＵ９２１２５／ＱＵ９２５００ＱＵ９２０１Ｋ）、シナジー（Ｓｙｎｅｒｇｙ）ＤＮＡポリメラーゼ（ジーンクラフト（ＧｅｎｅＣｒａｆｔ）社製、製品番号ＧＣ−００５）、シナジーＮ  ＤＮＡポリメラーゼ（ジーンクラフト社製、製品番号ＧＣ−０２８）、シナジープラス（ＳｙｎｅｒｇｙＰｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ（ジーンクラフト社製、製品番号ＧＣ−０４８）、タカラＥｘＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（インタージェン（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ）社製、製品番号ＲＲＯＯｌＡ／Ｂ／Ｃ）、ＰＣＲスーパーミックス高忠実度（ＳｕｐｅｒＭｉｘ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製、製品番号１０７９００２０）、エロンガーゼ（Ｅｌｏｎｇａｓｅ）酵素ミックス（インビトロジェン社製、製品番号１０４８１０１８）、タカラＥｘＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（パンベラ（Ｐａｎ  Ｖｅｒａ）社製、製品番号ＴＡＫ  ＲＲ００１Ａ／Ｂ／Ｃ）、タカラＬＡＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（パンベラ社製、製品番号ＴＡＫ  ＲＲ００２Ｍ／Ｂ／Ｃ）、エキスパンド高忠実度（Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ）ＰＣＲシステム（ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ社製、製品番号１７３２  ６４１／６５０／０７８）、エキスパンド・ロングテンプレート（Ｅｘｐａｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ）ＰＣＲシステム（ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ社製、製品番号１６８１  ８３４／���４２；１７６５９  ０６０）、エキスパンド２０ｋｂプラス（Ｅｘｐａｎｄ  ２０ｋｂ  ＰＬＵＳ）ＰＣＲシステム（ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ社製、製品番号１８１１  ００２）、ＧＣ−ＲＩＣＨ  ＰＣＲシステム（ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ社製、製品番号２１４０  ３０６）、ＡｃｃｕＴａｑ  ＬＡ  ＤＮＡポリメラーゼ（シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）社製、製品番号Ｄ８０４５）、ＫｌｅｎＴａｑ  ＬＡ  ＤＮＡポリメラーゼミックス（シグマ・アルドリッチ社製、製品番号Ｄ５０６２）、プルーフスプリンター（ＰｒｏｏｆＳｐｒｉｎｔｅｒ）ＤＮＡポリメラーゼミックス（サーモハイベイド（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｈｙｂａｉｄ）社製、製品番号ＰＲＯＯＦＭＩＸ１００／３００／６００）およびプルーフエキスパンダー（ＰｒｏｏｆＥｘｐａｎｄｅｒ）ＰＣＲキット（サーモハイベイド社製、製品番号ＥＸＰＡＮＤ１００）からなる群からのような市販で入手できる酵素ブレンドから選択できる。
【００８５】
本発明の酵素混合物は、第１、第２および第３ＤＮＡポリメラーゼを含む３種のＤＮＡポリメラーゼを含んでいてよい。第１ＤＮＡポリメラーゼは、例えば野生型Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼまたは野生型古細菌ＤＮＡポリメラーゼのような野生型ＤＮＡ重合活性を備えるＤＮＡポリメラーゼである。第２および第３ＤＮＡポリメラーゼは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性および低下したＤＮＡ重合活性を備える変異型ＤＮＡポリメラーゼである。好ましくは、第２および第３ＤＮＡポリメラーゼは異なるＤＮＡポリメラーゼである。より好ましくは、第２および第３ＤＮＡポリメラーゼは変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、変異型Ｔｇｏ  ＤＮＡポリメラーゼ、変異型ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、変異型Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、および変異型Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択される、異なったＤＮＡポリメラーゼである。より好ましくは、変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼはＤ４０５、Ｙ４１０、Ｔ５４２、Ｄ５４３、Ｋ５９３、Ｙ５９５、Ｙ３８５、Ｇ３８７、およびＧ３８８からなる群から選択されるアミノ酸位置で１つ以上の突然変異を含む；変異型Ｔｇｏ  ＤＮＡポリメラーゼはＤ４０４、Ｙ４０９、Ｔ５４１、Ｄ５４２、Ｋ５９２、Ｙ５９４、Ｙ３８４、Ｇ３８６、およびＧ３８７からなる群から選択されるアミノ酸位置で１つ以上の突然変異を含む；変異型ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼはＤ４０４、Ｙ４０９、Ｔ５４１、Ｄ５４２、Ｋ５９２、Ｙ５９４、Ｙ３８４、Ｇ３８６、およびＧ３８７からなる群から選択されるアミノ酸位置で１つ以上の突然変異を含む；変異型Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼはＤ４０７、Ｙ４１２、Ｔ５４４、Ｄ５４５、Ｋ５９５、Ｙ５９７、Ｙ３８７、Ｇ３８９、およびＧ３９０からなる群から選択されるアミノ酸位置で１つ以上の突然変異を含む；変異型Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼはＤ４０５、Ｙ４１０、Ｔ５４２、Ｄ５４３、Ｋ５９３、Ｙ５９５、Ｙ３８５、Ｇ３８７、およびＧ３８８からなる群から選択されるアミノ酸位置で１つ以上の突然変異を含む。３’−５’エキソヌクレアーゼ活性および低下したＤＮＡ重合活性を備える２種の変異型ＤＮＡポリメラーゼは、好ましくは異なる３’−５’エキソヌクレアーゼ特異性を有する。例えば、それらは変異型ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼ（例、Ｇ３８７）および変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（例、Ｇ３８７）であってよい。そのような２種の変異型ＤＮＡポリメラーゼを備える混合物は、ＪＤＦおよびＰｆｕが増幅反応のより優れた忠実度を達成するために相互に相補できるように異なるプルーフリーディングスペクトルを有するために、該混合物のプルーフリーディング活性を亢進するであろう。本発明の混合物中の第２および第３酵素の組み合わせはこの例に列挙した３種の酵素に限定されないことは理解されている。本発明の範囲を用いると、いずれかの２種の変異型古細菌ＤＮＡポリメラーゼは第１ＤＮＡポリメラーゼ（古細菌または非古細菌ＤＮＡポリメラーゼ）を備える同一混合物において使用できる。このような３種の酵素からなる混合物の一部の非限定的例には、野生型Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＪＤＦ−３変異型およびＰｆｕ変異型；野生型Ｔ���ｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ変異型およびＰｆｕ変異型；野生型ＪＤＦ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＪＤＦ−３変異型およびＰｆｕ変異型；野生型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＪＤＦ−３変異型およびＰｆｕ変異型；野生型ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＪＤＦ−３変異型およびＰｆｕ変異型；野生型ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ−３変異型およびＰｆｕ変異型；野生型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＪＤＦ−３変異型およびＰｆｕ変異型；野生型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ変異型およびＰｆｕ変異型が含まれる。
【００８６】
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を備える有用な第２酵素
本発明による３’−５’エキソヌクレアーゼ活性（すなわち、プルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼ）を備える酵素には、ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌エキソヌクレアーゼＩ、大腸菌エキソヌクレアーゼＩＩＩ、大腸菌ｒｅｃＢＣＤヌクレアーゼ、大豆ヌクレアーゼ等が含まれるが、それらに限定されない（例えば、Ｋｕｏ，１９９４年，Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．，７２６：２２３−３４を参照されたい）。
【００８７】
あらゆるプルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ活性を低下／排除するために突然変異させて本発明の酵素反応に使用することができよう。その例は、以下に記載のものを含むがそれらに限定されない多数のＤＮＡポリメラーゼファミリーの中で見いだすことができる。
【００８８】
ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼ
バクテリオファージＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ、φ２９ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ；大腸菌ｐｏｌ  ＩＩＤＮＡポリメラーゼ；ヒトＤＮＡポリメラーゼσ、ヒトＤＮＡポリメラーゼγ、古細菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（表１）。
【００８９】
真性細菌ファミリーＡ  ＤＮＡポリメラーゼ（プルーフリーディング活性あり）
大腸菌ＤＮＡ  ｐｏｌ  Ｉ（クレノウフラグメント）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ（ＵｌＴｍａフラグメント）。
【００９０】
ファミリーＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（ファミリーＡ、Ｂ、Ｃと非関連性）
例えば、Ｃａｎｎら（１９９８年）ＰＮＡＳ  ９５：１４２５０−５に記載されている古細菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩ（ＤＰ１／ＤＰ２）。
【００９１】
表１．クローン化ファミリーＢポリメラーゼについての目録情報
Ｖｅｎｔ  Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ
受入番号ＡＡＡ７２１０１
ＰＩＤ  ｇ３４８６８９
バージョンＡＡＡ７２１０１．１  ＧＩ：３４８６８９
ＤＢＳＯＵＲＣＥ  遺伝子座ＴＨＣＶＤＰＥ  受入番号Ｍ７４１９８．１
ＴＨＥＳＴ  ＴＨＥＲＭＯＣＯＣＣＵＳ種（ＴＹ系統）
受入番号Ｏ３３８４５
ＰＩＤ  ｇ３９１３５２４
バージョンＯ３３８４５  ＧＩ：３９１３５２４
ＤＢＳＯＵＲＣＥ  ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：遺伝子座ＤＰＯＬ＿ＴＨＥＳＴ、受入番号Ｏ３３８４５
Ｐａｂ  Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ
受入番号Ｐ７７９１６
ＰＩＤ  ｇ３９１３５２９
バージョンＰ７７９１６  ＧＩ：３９１３５２９
ＤＢＳＯＵＲＣＥ  ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：遺伝子座ＤＰＯＬ＿ＰＹＲＡＢ、受入番号Ｐ７７９１６
ＰＹＲＨＯ  Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ
受入番号Ｏ５９６１０
ＰＩＤ  ｇ３９１３５２６
バージョンＯ５９６１０  ＧＩ：３９１３５２６
ＤＢＳＯＵＲＣＥ  ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：遺伝子座ＤＰＯＬ＿ＰＹＲＨＯ、受入番号Ｏ５９６１０
ＰＹＲＳＥＰＹＲＯＣＯＣＣＵＳ種（ＧＥ２３系統）
受入番号Ｐ７７９３２
ＰＩＤ  ｇ３９１３５３０
バージョンＰ７７９３２  ＧＩ：３９１３５３０
ＤＢＳＯＵＲＣＥ  ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：遺伝子座ＤＰＯＬ＿ＰＹＲＳＥ、受入番号Ｐ７７９３２
ＤｅｅｐＶｅｎｔ  Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ種
受入番号ＡＡＡ６７１３１
ＰＩＤ  ｇ４３６４９５
バージョンＡＡＡ６７１３１．１  ＧＩ：４３６４９５
ＤＢＳＯＵＲＣＥ  遺伝子座ＰＳＵ００７０７、受入番号Ｕ００７０７．１
Ｐｆｕ  Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｕｓ
受入番号Ｐ８００６１
ＰＩＤ  ｇ３９９４０３
バージョンＰ８００６１  ＧＩ：３９９４０３
ＤＢＳＯＵＲＣＥ  ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：遺伝子座ＤＰＯＬ＿ＰＹＲＦＵ、受入番号Ｐ８００６１
ＪＤＦ−３  Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種
未公表
米国特許第５６０２０１１号からのＢａｒｏｓｓ  ｇｉ｜２０９７７５６｜ｐａｔ｜ＵＳ｜５６０２０１１｜１２配列１２
９ｄｅｇＮ  ＴＨＥＲＭＯＣＯＣＣＵＳ種（９０Ｎ−７系統）
受入番号Ｑ５６３６６
ＰＩＤ  ｇ３９１３５４０
バージョンＱ５６３６６  ＧＩ：３９１３５４０
ＤＢＳＯＵＲＣＥ  ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：遺伝子座ＤＰＯＬ＿ＴＨＥＳ９、受入番号Ｑ５６３６６
ＫＯＤ  Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ種
受入番号ＢＡＡ０６１４２
ＰＩＤ  ｇ１６２０９１１
バージョンＢＡＡ０６１４２．１  ＧＩ：１６２０９１１
ＤＢＳＯＵＲＣＥ  遺伝子座ＰＹＷＫＯＤＰＯＬ受入番号Ｄ２９６７１．１
Ｔｇｏ  Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ．
受入番号４６９９８０６
ＰＩＤ  ｇ４６９９８０６
バージョンＧＩ：４６９９８０６
ＤＢＳＯＵＲＣＥ  ｐｄｂ：鎖６５，１９９９年２月２３日リリース
ＴＨＥＦＭ  Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｍｉｃｏｌａｎｓ
受入番号Ｐ７４９１８
ＰＩＤ  ｇ３９１３５２８
バージョンＰ７４９１８  ＧＩ：３９１３５２８
ＤＢＳＯＵＲＣＥ  ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：遺伝子座ＤＰＯＬ＿ＴＨＥＦＭ、受入番号Ｐ７４９１８
ＭＥＴＴＨ  Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ
受入番号Ｏ２７２７６
ＰＩＤ  ｇ３９１３５２２
バージョンＯ２７２７６  ＧＩ：３９１３５２２
ＤＢＳＯＵＲＣＥ  ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：遺伝子座ＤＰＯＬ＿ＭＥＴＴＨ、受入番号Ｏ２７２７６
Ｍｅｔｊａ  Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｉｍａｓｃｈｉｉ
受入番号Ｑ５８２９５
ＰＩＤ  ｇ３９１５６７９
バージョンＱ５８２９５  ＧＩ：３９１５６７９
ＤＢＳＯＵＲＣＥ  ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：遺伝子座ＤＰＯＬ＿ＭＥＴＪＡ、受入番号Ｑ５８２９５
ＰＯＣ  Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ  ｏｃｃｕｌｔｕｍ
受入番号Ｂ５６２７７
ＰＩＤ  ｇ１３６３３４４
バージョンＢ５６２７７  ＧＩ：１３６３３４４
ＤＢＳＯＵＲＣＥ  ｐｉｒ：遺伝子座Ｂ５６２７７
ＡｐｅＩ  Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ
受入番号ＢＡＡ８１１０９
ＰＩＤ  ｇ５１０５７９７
バージョンＢＡＡ８１１０９．１  ＧＩ：５１０５７９７
ＤＢＳＯＵＲＣＥ  遺伝子座ＡＰ００００６３、受入番号ＡＰ００００６３．１
ＡＲＣＦＵのＡｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ
受入番号Ｏ２９７５３
ＰＩＤ  ｇ３１２２０１９
バージョンＯ２９７５３  ＧＩ：３１２２０１９
ＤＢＳＯＵＲＣＥ  ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：遺伝子座ＤＰＯＬ＿ＡＲＣＦＵ、受入番号Ｏ２９７５３
Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ種  Ｔｏｋ．
受入番号６４３５７０８
ＰＩＤ  ｇ６４３５７０８９
バージョンＧＴ：６４３５７０８
ＤＢＳＯＵＲＣＥ  ｐｄｂ鎖６５、１９９９年６月２日リリース
【００９２】
本組成物および方法において使用するための３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素は、自然源から単離できる、または組み換えＤＮＡ技術を通して産生することができる。好ましくは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素はＤＮＡポリメラーゼである。
【００９３】
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性（ｅｘｏ＋と呼ばれる）を備えるＤＮＡポリメラーゼは、その特有の重合活性によって産生した、組み込まれたヌクレオチドをプルーフリーディングすることができる。多数の適用の中でも特に、ｅｘｏ＋ＤＮＡポリメラーゼはポリヌクレオチド配列の特性付けであるＰＣＲ産物のクローニングのために特に適合する。有用なｅｘｏ＋ＤＮＡポリメラーゼには、Ｐｗｏ  ＤＮＡポリメラーゼ；Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ；Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ；９°Ｎｍ  ＤＮＡポリメラーゼ；ＵｌＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ；Ｔｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ；Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ；ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼ；Ｔｇｏ  ＤＮＡポリメラーゼ；ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ；およびＰＧＢ−Ｄ  ＤＮＡポリメラーゼが含まれるがそれらに限定されない。
【００９４】
本発明の好ましい実施態様では、低下したＤＮＡ重合活性を備えるｅｘｏ＋ＤＮＡポリメラーゼが第２酵素として使用される。
【００９５】
低下したＤＮＡ重合活性を備えるｅｘｏ＋ＤＮＡポリメラーゼの調製
クローン化した野生型ｅｘｏ＋ＤＮＡポリメラーゼは、低下した重合活性を示す形態を生成するために多数の方法によって修飾することができる。これらには、以下に記載した方法および当技術分野において知られている方法が含まれる。本発明における低下したＤＮＡ重合活性を備えるｅｘｏ＋ＤＮＡポリメラーゼを調製するためにはあらゆるｅｘｏ＋ＤＮＡポリメラーゼを使用できる。
【００９６】
Ａ．遺伝子組み換え−突然変異誘発
低下したＤＮＡ重合活性を備えるＤＮＡポリメラーゼを調製する好ましい方法は遺伝子組み換えによる方法である（例えば、野生型ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ配列を修飾することにより）。ｅｘｏ＋ＤＮＡポリメラーゼの配列内では、遺伝子組み換えのために好ましい配列は重合ドメインをコードするＤＮＡ配列である。多数のＤＮＡポリメラーゼの重合ドメインおよびエキソヌクレアーゼドメイン（すなわち、それらの結晶構造）は、当技術分野において知られている（例えば、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら、２０００年，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９９：４４７−６２；Ｚｈａｏら、１９９９年，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｆｏｌｄ  Ｄｅｓ．７：１１８９−９９；Ｂａｋｅｒら、１９９８年，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９５：３５０７−１２；Ｋｉｅｆｅｒら、１９９７年，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５：９５−１０８；Ｋｉｍら、１９９５年，Ｎａｔｕｒｅ，３７６：６１２−６；Ｋｏｎｇら、１９９３年，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６８：１９６５−７５を参照されたい）。
【００９７】
ＤＮＡ重合ドメインの一般的な構造的特徴は、当技術分野において知られている。例えば、Ｂｌａｎｃｏら（１９９１年，Ｇｅｎｅ，１００：２７−３８）は、重要なアミノ酸（ａａ）配列類似性が次の２つの主要スーパーファミリーに属する２７種のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼのＣ−末端部分で見いだされたことを開示している：（ｉ）大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（ＰｏｌＩ）−様原核生物ＤＮＡポリメラーゼ、および（ｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼα−様原核生物および真核生物（ウイルスおよび細胞）ＤＮＡポリメラーゼ。およそ３４０アミノ酸に及ぶ６つの最も保存されたＣ−末端領域は、同一の線状配列で位置しており、重合化機能に関係する高度に保存されたモチーフおよび重要な残基を含有している。
【００９８】
ＰｏｌＩｋ（クレノウフラグメント）の三次元モデルによると、これら６つの保存領域は提案された重合ドメイン内に位置し、金属およびｄＮＴＰ結合部位ならびにＤＮＡ鋳型を保持するためのクレフト（切れ目）を形成する。部位特異的突然変異誘発試験は、これらの構造的予測を支持している。
【００９９】
大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性部位は、アミノ酸配列相同性に基づいて、原核生物および真核生物ＤＮＡポリメラーゼの両方について保存されていると予測されている（Ｂｅｒｎａｄら、１９８９年，Ｃｅｌｌ，５９：２１９−２８）。金属結合、一本鎖ＤＮＡ結合、およびエキソヌクレアーゼ反応の触媒反応に関係する大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩにおける重要な残基を含有する３つのアミノ酸領域は、数種の原核生物および真核生物ＤＮＡポリメラーゼにおいてアミノ末端側の半分に同一の線状配列で位置する。原核生物および真核生物α−様ＤＮＡポリメラーゼのためのモデル酵素であるφ２９ＤＮＡポリメラーゼの予想エキソヌクレアーゼ活性部位での部位特異的突然変異誘発は、該酵素の３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を特異的に不活化した。これらの結果は、この触媒ドメインの高度の進化的保存を反映している。
【０１００】
ＤＮＡポリメラーゼ由来の配列を極めて入手し易くなってきたため、様々なポリメラーゼタイプについて小数の高度に保存された領域を詳細に描出することが可能になってきた（詳細な説明については、例えばＪｏｈｎｓｏｎ，１９９３年，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：６８５−７１３を参照されたい）。Ｄｅｌａｒｕｅらは、ＤＮＡポリメラーゼの構造を統一するためのアプローチ法を報告した（１９９０年，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，３：４６１−７）。この推論的仮説は、低下した重合活性を備えるＤＮＡポリメラーゼを調製するための遺伝子組み換えを目指す有用なモデルを提供するはずである。
【０１０１】
好ましくは、低下した重合活性を備えるｅｘｏ＋ＤＮＡポリメラーゼを調製するための遺伝子組み換えは、その３’−５’エキソヌクレアーゼ活性（すなわち、プルーフリーディング活性）を有意には低下させない。
【０１０２】
ＤＮＡ重合活性を選択的に低下させることが知られているＤＮＡポリメラーゼ変異体は、例えばＢｌａｎｃｏら、１９９５年，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６２：２８３−２９４（（バクテリオファージφ２９）；Ｔｒｕｎｉｇｅｒら、１９９６年，ＥＭＢＯ  Ｊ．１５：３４３０−３４４１（バクテリオファージφ２９）；Ａｂｄｕｓ  Ｓａｔｔａｒら、１９９６年，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：１６６２１−９（バクテリオファージＴ４）；Ｔｕｓｋｅら、２０００年，Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７５：２３７５９−６８（クレノウフラグメント）；Ｂｏｈｌｋｅら、２０００年，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２８：３９１０−３９１７（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇｇｒｅｇａｎｓ）；Ｐｉｓａｎｉら、１９９８年，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７：１５００５−１５０１２（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）；Ｋｏｍｏｒｉら、２０００年，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １３：４１−７（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｕｓ）；Ｓｈｅｎら、２００１年，Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７６：２７３７６−８３（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ  ファミリーＤ）に記載されているように、当技術分野において見いだすことができる。
【０１０３】
バクテリオファージφ２９ＤＮＡポリメラーゼの部位特異的突然変異誘発は、ＤＮＡポリメラーゼ活性を低下させるが、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性にはほんのわずかな影響しか及ぼさないポリメラーゼドメインにおける突然変異の同定をもたらす（Ｂｌａｎｃｏ，Ｌ．とＳａｌａｓ，Ｍ．１９９５年，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２６２：２８３−２９４）。本発明の１つの実施態様では、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ内の１つ以上の対応するアミノ酸が突然変異させられる（例えば、Ｄ４０５Ｅ、Ｙ４１０Ｆ、Ｔ５４２Ｐ、Ｄ５４３Ｇ、Ｋ５９３Ｔ、Ｙ５９５Ｓの置換によって）。これらの同一部位での他のアミノ酸側鎖の置換もまた選択的にＤＮＡポリメラーゼ活性を低下させるであろうことは理解されている。
【０１０４】
φ２９ＤＮＡポリメラーゼ突然変異誘発試験は、高度に保存されたファミリーＢモチーフ内のアミノ酸残基（ＤＸＸＳＬＹＰ［配列番号１］、ＫＸＸＸＮＳＸＹＧ［配列番号２］、ＴＸＸＧＲ［配列番号３］、ＹＸＤＴＤＳ［配列番号４］、およびＫＸＹ［配列番号５］）を標的としたが、タンパク質の他の領域は選択的にＤＮＡポリメラーゼ活性を低下させるためにおそらく突然変異誘発することができる。そのような領域の１つは、ＹＸＧＧ［配列番号６］モチーフを特徴とする分割ドメインである（Ｔｒｕｎｉｇｅｒら、１９９６年，ＥＭＢＯ  Ｊ．１５：３４３０−３４４１）。この領域は、３’−５’エキソヌクレアーゼドメインとポリメラーゼドメインとを結び付ける接近可能なループ内に位置する。分割ドメインは、ＤＮＡ鎖の合成と分解との平衡を調整することに極めて重要な役割を果たす。この領域内の突然変異は重合とプルーフリーディングとの平衡を崩壊させ、重合（低下したプルーフリーディング）またはプルーフリーディング（低下した重合）のどちらかに好都合な表現型を生じさせる。
【０１０５】
古細菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇｇｒｅｇａｎｓ  ＤＮＡポリメラーゼの分割ドメインにおけるＹ３８７（Ｐｆｕ内のＹ３８５と同等）での非保存的（Ｓ，Ｎ）置換は、ＤＮＡポリメラーゼ活性の重大な低下およびエキソヌクレアーゼ活性の亢進を引き起こし、向上した酵素忠実度を生じさせる（ＰＣＲで単独に使用された場合）（Ｂｏｈｌｋｅ  Ｋ．ら（２０００年）ＮＡＲ  ２８：３９１０−３９１７）。これとは対照的に、Ｙ３８７での保存的置換（Ｆ、Ｗ、Ｈ）は野生型様忠実度およびＰＣＲ性能の亢進を引き起こし、これは重合の向上に関連する可能性がある。Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇｇｒｅｇａｎｓ  ＤＮＡポリメラーゼにおけるＧ３８９Ａ突然変異（Ｐｆｕ  Ｇ３８７と同等）は、低下したＤＮＡポリメラーゼ活性（１０％  ｗｔ）、増加したエキソヌクレアーゼ活性（２３６％  ｗｔ）、およびＰＣＲにおける産物合成の消失を引き起こす（Ｂｏｈｌｋｅ  Ｋ．ら（２０００年）ＮＡＲ  ２８：３９１０−３９１７）。類似の突然変異は、バクテリオファージφ２９ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｒｕｎｉｇｅｒ  Ｖ．ら（１９９６年）ＥＭＢＯ  Ｊ．１５：３４３０−３４４１）および古細菌Ｓｏｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ（Ｓｓｏ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｉｓａｎｉ  Ｆ．Ｍ．，ＤｅＦｅｌｉｃｅ，Ｍ．，およびＲｏｓｓｉ，Ｍ．（１９９８年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７：１５００５−１５０１２）において調査されているが、ここでＧ→Ａ突然変異はエキソヌクレアーゼ活性に比較してＤＮＡポリメラーゼ活性を低下させる（Ｓｓｏに対してｐｏｌ／ｅｘｏ＝０．６）、または増加させる（φ２９に対してｐｏｌ／ｅｘｏ＝９１）。
【０１０６】
本発明の１つの実施態様では、低下したＤＮＡ重合活性を備えるＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを入手するためにＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼをアミノ酸３８４−３８９（ＳＹＴＧＧＦ［配列番号７］）での分割ドメイン内で突然変異させた。例えば位置Ｙ３８５、Ｇ３８７、Ｇ３８８のような分割ドメイン内の他のアミノ酸側鎖置換もまた、エキソヌクレアーゼ活性にはほんのわずかな影響しか及ぼさずに選択的にＤＮＡポリメラーゼ活性を低下させるであろうことは理解されている。
【０１０７】
また別の実施態様では、高レベルのプルーフリーディング活性を保持しながらＤＮＡポリメラーゼ活性を効果的に排除するために２つ以上の突然変異が組み合わされる（例えば、変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ内に追加の部位特異的突然変異を導入することによって）。
【０１０８】
米国特許第５，６９１，１４２号、第５，６１４，４０２号および第５，５４１，３１１号（これにより参照して組み込まれる）は、標的ポリヌクレオチド分子を検出するために耐熱性ＤＮＡポリメラーゼから５’−３’ヌクレアーゼを取り出す方法を開示している。これらの方法は、低下した重合活性とともに３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を備えるＤＮＡポリメラーゼを調製するために本発明に適用できる。遺伝子組み換えのためのその他の技術は、当技術分野においてよく知られている（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、「分子生物学における短いプロトコル（Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（１９９５年）第３版」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照されたい）。
【０１０９】
翻訳中に配列内へ組み込まれたアミノ酸の欠失、付加、または改変による野生型酵素の一次構造の修飾は、タンパク質の高温ＤＮＡポリメラーゼ活性を破壊することなく実施できる。そのような置換または他の改変は、本発明の方法において有用なタンパク質を生じさせる。これらの配列をコードするＤＮＡの入手可能性は、低下した重合活性を備える変異型酵素を生成するようにコドン配列を修飾する機会を提供する。ＤＮＡ配列を改変するための小数の方法を以下に提供するが、当技術分野において知られているあらゆる他の方法もまた使用できる。
【０１１０】
ＤＮＡポリメラーゼの重合ドメインの配列に基づいて、直接的に特定部位または領域を突然変異させることを可能にする当技術分野において知られている多数の部位特異的突然変異方法がある。部位特異的突然変異誘発を実施するためには、従来型方法およびＰＣＲに基づく方法の両方を含む、市販で入手できる多数のキットがある。その例には、ストラタジーン社から入手できる商標ＥＸＳＩＴＥ（登録商標）ＰＣＲに基づく部位特異的突然変異誘発キット（製品番号２００５０２）およびストラタジーン社から入手できる商標ＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（登録商標）部位特異的突然変異誘発キット（製品番号２００５１８）、ならびに同様にストラタジーン社から入手できる登録商標ＣＨＡＭＥＬＥＯＮ（商標）二本鎖部位特異的突然変異誘発キット（製品番号２００５０９）が含まれる。
【０１１１】
当技術分野において知られている以前の部位特異的突然変異誘発方法は、一本鎖ＤＮＡ鋳型の単離を可能にする、Ｍ１３バクテリオファージベクター等のベクター内へ突然変異させられる配列のサブクローニングに依存していた。これらの方法では、変異原性プライマー（すなわち、突然変異させられる部位へアニーリングできるが、突然変異させられる部位で１つのヌクレオチドまたは複数のミスマッチヌクレオチドを有することのできるプライマー）を一本鎖鋳型へアニーリングし、その後その変異原性プライマーの３’末端から始まる鋳型の相補体を重合する。結果として生じる二本鎖をその後、宿主細菌内に形質転換させ、所望の突然変異についてプラークをスクリーニングする。
【０１１２】
より最近では、部位特異的突然変異誘発は一本鎖鋳型を必要としないという長所があるＰＣＲ法を利用してきた。さらに、サブクローニングを必要としない方法が開発されている。ＰＣＲに基づく部位特異的突然変異誘発を実施する場合は、幾つかの問題を考察しなければならない。第１に、これらの方法では、ポリメラーゼによって導入された望ましくない突然変異の拡大を防止するためにＰＣＲサイクル数を低下させることが望ましい。第２に、反応において遺残する突然変異しなかった親分子の数を減少させるために選択を利用しなければならない。第３に、単一ＰＣＲプライマーセットを使用できるようにするために長さ延長ＰＣＲ法が好ましい。そして第４に、一部の耐熱性ポリメラーゼの非鋳型依存性末端延長活性のために、ＰＣＲで生成した変異産物の平滑末端ライゲーションに先行して手技に末端研磨ステップを組み込むことがしばしば必要になる。
【０１１３】
以下に記載するプロトコルは、下記のステップを経由してこれらの考察に適合する。第１に、使用する鋳型の濃度は従来型ＰＣＲ反応において使用される濃度よりおよそ１，０００倍高く、これは産物の収率を劇的に低下させることなく２５〜３０から５〜１０へサイクル数の低下を可能にする。第２に、親ＤＮＡに対して選択するために制限エンドヌクレアーゼＤｐｎＩ（Ａ残基がメチル化されている場合は、認識標的配列：５−Ｇｍ６ＡＴＣ−３）が使用されるが、それは大腸菌Ｄａｍの最も一般的な菌株は配列５−ＧＡＴＣ−３でそれらのＤＮＡをメチル化するためである。第３に、長い（すなわち、完全プラスミド長）ＰＣＲ産物の比率を増加させるために、ＴａｑエキステンダーがＰＣＲミックス中で使用される。最後に、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用して分子内ライゲーションに先立ってＰＣＲ産物の末端を研磨するためにＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼが使用される。
【０１１４】
この方法のための非限定的例を以下のように詳細に説明する。
【０１１５】
プラスミド鋳型ＤＮＡ（およそ０．５ｐＭ）は、１×突然変異誘発バッファー（２０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５；８ｍＭのＭｇＣｌ２；４０μｇ／ｍＬのＢＳＡ）；１２−２０ｐＭの各プライマー（当業者であれば必要に応じて、塩基組成、プライマー長およびオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング特徴に影響を及ぼす意図されるバッファーの塩濃度を考慮に入れて突然変異誘発バッファーを設計することができる；１種のプライマーは所望の突然変異を含有していなければならず、そして１種（同一または別の）プライマーは後期のライゲーションを促進するために５’リン酸塩を含有していなければならない）、２５０μＭの各ｄＮＴＰ、２．５ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、および２．５ＵのＴａｑエキステンダー（ストラタジーン社から入手できる；Ｎｉｅｌｓｏｎら（１９９４年）Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ７：２７、および米国特許第５，５５６，７７２号を参照）を含有するＰＣＲカクテルに添加される。プライマーは、参照して本明細書に組み込まれるＭａｔｔｅｕｃｃｉら、１９８１年，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５−３１９１のトリエステル法を使用して調製できる。あるいは、例えばシアノエチルホスホロアミダイト化学反応を使用するバイオサーチ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）８７００  ＤＮＡ合成装置上での全自動合成が好ましいことがある。
【０１１６】
ＰＣＲサイクリングは次の通りに実施される：９４℃で４分間、５０℃で２分間および７２℃で２分間の１サイクル；その後に９４℃で１分間、５４℃で２分間、および７２℃で１分間の５〜１０サイクル。親鋳型ＤＮＡおよび変異原性プライマーを組み込んだ線状のＰＣＲで生成したＤＮＡをＤｐｎＩ（１０Ｕ）およびＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ）により処理する。これは、ｉｎ  ｖｉｖｏメチル化親鋳型およびハイブリッドＤＮＡのＤｐｎＩ消化ならびにＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼによる線状ＰＣＲ産物上の１つ以上の非鋳型依存性Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ伸長塩基の除去を生じさせる。この反応液を３７℃で３０分間インキュベートし、その後７２℃へ移してさらに３０分間にインキュベートする。０．５ｍＭのＡＴＰを含有する突然変異誘発バッファー（１×の１１５μｌ）をＤｐｎＩ消化Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ研磨ＰＣＲ産物に添加する。この溶液を混合し、１０μＬを新しいマイクロフュージチューブへ取り出し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（２−４Ｕ）を添加する。このライゲーションを３７℃で６０分間を超えてインキュベートする。最後に、この処理溶液を標準方法によってコンピーテント大腸菌内へ形質転換させる。
【０１１７】
当技術分野には１つ以上のランダムに位置する突然変異を有する１団の変異体を生じさせる複数のランダム突然変異誘発方法が存在する。そのような１団の変異体はその後、それらが野生型ポリメラーゼと比較して低下した重合を示すものについてスクリーニングすることができる（例えば、所定のＤＮＡポリメラーゼにとって最適温度で３０分間での１０ｎＭのｄＮＴＰの重合体形態への取り込みを測定することによって）ランダム突然変異誘発方法の例は、いわゆる「誤りがちＰＣＲ法」である。その名前が暗示するように、この方法はＤＮＡポリメラーゼが高忠実度取り込みを支持しない条件下で所定の配列を増幅させる。様々なＤＮＡポリメラーゼにとって誤りがちな取り込みを促進する条件は様々であるが、しかし当業者であれば所定の酵素にとっての当該条件を決定することができる。増幅の忠実度における多数のＤＮＡポリメラーゼにとって重要な変量は、例えばバッファー中の二価金属イオンのタイプおよび濃度ならびにＰＣＲ酵素の遺伝性忠実度である。ポリメラーゼのエラー率に影響を及ぼすために、マンガンイオンの使用および／またはマグネシウムまたはマンガンのイオン濃度の変化を適用することができる。
【０１１８】
好ましい実施態様では、低下した重合活性を備える第２酵素はＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ由来である。
【０１１９】
野生型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡコーディング配列は、例えばＧｅｎｂａｎｋ（受入番号Ｕ８４１５５）からのように、当技術分野において見いだすことができる。Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼの構造および機能に関する詳細な説明は特に、すべてがこれにより参照して本明細書に組み込まれる米国特許第５，９４８，６６３号；第５，８６６，３９５号；第５，５４５，５５２号；第５，５５６，７７２号の中に見いだすことができる。低下した重合活性を備えるＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを調製するための非限定的な手法は、実施例１に提供されている。
【０１２０】
本開示を利用する当業者は、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｇｏ  ＤＮＡポリメラーゼ等を含む他のｅｘｏ＋ＤＮＡポリメラーゼ由来の低下した重合活性を備えるポリメラーゼを本組成物中で適切に使用できることを認識するであろう。
【０１２１】
本組成物の第１または第２酵素は、まだ単離されていないＤＮＡポリメラーゼを含んでいてよい。ＤＮＡ重合活性と３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の両方についてのアッセイは、本明細書および「ＤＮＡ複製  第２版」，ＫｏｒｎｂｅｒｇとＢａｋｅｒ（前記）；「酵素」，ＤｉｘｏｎとＷｅｂｂ（前記）ならびに当業者が入手できる他の出版物の中に見いだすことができる。
【０１２２】
本発明の好ましい実施態様では、変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼはＤ４０５、Ｙ４１０、Ｔ５４２、Ｄ５４３、Ｋ５９３、Ｙ５９５、Ｙ３８５、Ｇ３８７、およびＧ３８８からなる群から選択されるアミノ酸位置で１つ以上の突然変異を含む。
【０１２３】
より好ましくは、変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼはＤ４０５Ｅ、Ｙ４１０Ｆ、Ｔ５４２Ｐ、Ｄ５４３Ｇ、Ｋ５９３Ｔ、Ｙ５９５Ｓ、Ｙ３８５Ｑ、Ｙ３８５Ｓ、Ｙ３８５Ｎ、Ｙ３８５Ｌ、Ｙ３８５Ｈ、Ｇ３８７Ｓ、Ｇ３８７Ｐ、およびＧ３８８Ｐからなる群から選択される１つ以上の突然変異を含む。
【０１２４】
本発明は、関連する古細菌ＤＮＡポリメラーゼの変異体がプルーフリーディング活性を保持しながら低下した（例えば、欠失する）ポリメラーゼ活性を備える組成物および方法を包含する。そのような突然変異は、ＤＮＡポリメラーゼの分割ドメインまたはポリメラーゼドメイン内であってよい。表２（ＡおよびＢ）ならびに図７は、様々なＤＮＡポリメラーゼ内のそうした突然変異の非限定的例を提供する。本発明の変異型ＤＮＡポリメラーゼは、表２に示したような単一突然変異、またはいずれかの２つ以上の突然変異の組み合わせを含んでいる可能性がある。
【０１２５】
表２Ａ  様々なＤＮＡポリメラーゼ内の分割ドメイン突然変異
【表１Ａ】
2005514072.tif 000002
表２Ｂ  様々なＤＮＡポリメラーゼ内のポリメラーゼドメイン突然変異
【表１Ｂ】
2005514072.tif 000003
【０１２６】
Ｂ．変異体を低下した重合について評価する方法
当技術分野において知られている、または本明細書で記載した通りに生成して細菌内で発現させたランダムもしくは部位特異的突然変異誘発は、低下した重合について数種のアッセイ法によってスクリーニングすることができる。変異型および野生型酵素の発現についての実施態様は、下記の第Ｃ章で記載する。１つの方法では、例えば、登録商標λＺａｐＩＩ（商標）に基づく発現ベクターを用いた宿主細菌の感染によって生成した溶菌性λファージプラーク内で発現したｅｘｏ＋ＤＮＡポリメラーゼタンパク質を膜支持体へ移す。固定化タンパク質をその後、ＤＮＡ鋳型および取り込みについて監視される非従来型ヌクレオチドを含有するバッファー中に膜を浸漬することにより膜上でポリメラーゼ活性について検査する。
【０１２７】
変異型ポリメラーゼライブラリーは、Ｓａｇｎｅｒらが使用した技術（Ｓａｇｎｅｒ  Ｇ．，Ｒｕｇｅｒ  Ｒ．，およびＫｅｓｓｌｅｒ  Ｃ．（１９９１年）Ｇｅｎｅ  ９７：１１９−１２３）の変法を使用してスクリーニングすることができる。このアプローチのためには、λファージクローンを１ｃｍ２につき１０〜２０プラークの密度でプレーティングする。プラーク内に存在するタンパク質をフィルターへ移し、ポリメラーゼスクリーニングバッファーを用いて湿らせる（５０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、７ｍＭのＭｇＣｌ２，３ｍＭのβＭＥ）。これらのフィルターをラップフィルムとガラスの層間に保持し、その間に宿主細胞タンパク質を６５℃、３０分間でのインキュベーションにより熱不活化する。次に熱処理フィルターを新しいラップフィルムへ移し、フィルター１ｃｍ２につき約３５Ｌのポリメラーゼアッセイ用カクテルを添加する。アッセイ用カクテルは、１×クローン化Ｐｆｕ（ｃＰｆｕ）マグネシウムフリー・バッファー（１Ｘバッファーは２０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８．８）、１０ｍＭのＫＣＬ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２Ｓ０４、１００μｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、および０．１％のトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００である；Ｐｆｕマグネシウムフリー・バッファーはストラタジーン社から入手できる（製品番号２００５３４））、１２５ｎｇ／ｍＬの活性化コウシ胸腺またはサケ精子ＤＮＡ、１．２９μＣｉ／ｍＬのαα−３３ＰのｄｄＮＴＰからなる。フィルターをラップフィルムとガラスプレートの間に入れ、次に６５℃で１時間、さらにその後７０℃で１時間１５分間インキュベートする。フィルターを２×ＳＳＣ中で洗浄１回につき５分間にわたり３回洗浄し、次に１００％エタノール中で２回すすぎ洗いし、真空乾燥した。次にフィルターをＸ線フィルムに曝露させ（約１６時間）、そしてファージクローンを有する最初のプレートとフィルターをアライメントすることにより標識を取り込んだプラークを同定する。この方法で同定したプラークをより薄い濃度で再度プレーティングし、精製プラークを単離できるように類似条件下で検査する。
【０１２８】
上記に記載したアッセイ等のアッセイでは、標識により発生するシグナルはポリメラーゼの重合活性の直接的尺度である。野生型酵素と比較して低下したＤＮＡ重合活性を備える変異型ＤＮＡポリメラーゼを含むプラークを選択することができる。
【０１２９】
ヌクレオチドの取り込みもまた、例えば適切に希釈した細菌抽出液（すなわち、クローン化ポリメラーゼまたは突然変異したクローン化ポリメラーゼを発現する細菌細胞の熱処理および清浄化抽出液）１μＬを１０μＬの各ヌクレオチドカクテルへ添加し、次に例えばＨｏｇｒｅｆｅら、２００１年，「酵素学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」，３４３：９１−１１６に記載されたように最適温度（例、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼに対しては７３℃）で３０分間インキュベーションすることにより伸長反応で測定することができる。伸長反応は氷上で停止させ、次に５μＬの一定分量を直ちにＤＥ８１イオン交換フィルター（２．３ｃｍ；ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）社製、製品番号３６５８３２３）上でスポットする。取り込まれなかった標識は、２×ＳＳＣ（０．３ＭのＮａＣｌ、３０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）中での６回の洗浄、その後の１００％エタノール中での短時間の洗浄によって除去する。取り込まれた放射能は、シンチレーション計数により測定する。酵素が欠如する反応も、「総ｃｐｍ」（除去フィルター洗浄ステップ）および「最小ｃｐｍ」（上記の洗浄フィルター）を決定するためにサンプルインキュベーションを含めて構成する。結合したｃｐｍは、細菌抽出液の単位体積当たりに存在するポリメラーゼ活性の量と比例している。
【０１３０】
野生型（ｗｔ）に比較したＤＮＡポリメラーゼの重合活性を決定する非限定的方法を以下に提供する。ＤＮＡポリメラーゼの相対重合活性を表示する取り込まれた放射能の相対比率は、以下の通りに決定できる：
（変異型ＤＮＡポリメラーゼについて修正されたｃｐｍ）×（野生型ＤＮＡポリメラーゼのｎｇ）
―――――――――――――――――――――――――――――――――――――――
（野生型ＤＮＡポリメラーゼについて修正されたｃｐｍ）×（変異型ＤＮＡポリメラーゼのｎｇ）
【０１３１】
より精密に活性率（％）を定量するためには、組み込まれたｃｐｍをＤＮＡポリメラーゼ活性の単位に転換しなければならない。１単位のポリメラーゼ活性は、最適温度で３０分間でのポリマー形への１０ｎＭの全ｄＮＴＰの組み込み（例えば、ＤＥ−８１紙へ結合する）を触媒する酵素の量であると定義されている。ＤＮＡポリメラーゼ活性の単位は、以下の式を使用して計算できる：
(修正されたサンプルのｃｐｍ)×(８ｎＭのｄＮＴＰ)×        (１単位)            
総ｃｐｍ                      反応      (取り込まれた１０ｎＭのｄＮＴＰ）
【０１３２】
ポリメラーゼ比活性（Ｕ／ｍｇ）は、単位対酵素量のプロットの直線状部分の勾配から外挿できる。タンパク質濃度は、比色アッセイ（例えば、ピアースのクーマジー・プラス・タンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ’ｓ  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ）においてＢＳＡ標準物質（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）に比較して決定できる。あるいは、タンパク質の量が限定される場合（または、限定された純度のため）、相対タンパク質濃度はＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって検証できる。１〜２０ｎｇの範囲に及ぶ全タンパク質である各ＤＮＡポリメラーゼ調製物のいくつかの一定分量にＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法を受けさせ、シルバー・オレンジおよび／またはＳｙｐｒｏ  ｏｒａｎｇｅ（モレキュラー・プローブズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）社製）染色バンドの強度を標準物質と比較する。最後に、活性率（％）は下記の通りに決定できる：
変異型ＤＮＡポリメラーゼの特異的ポリメラーゼ活性（Ｕ／ｍｇ）
野生型ＤＮＡポリメラーゼの特異的ポリメラーゼ活性（Ｕ／ｍｇ）
【０１３３】
本発明の低下した重合活性を備えるポリメラーゼはそれらのプルーフリーディング活性（すなわち、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性）を維持するのが好ましい。このため低下したＤＮＡ重合活性を備える変異型ＤＮＡポリメラーゼもまた３’−５’エキソヌクレアーゼ活性についてアッセイされる。
【０１３４】
適切なエキソヌクレアーゼ活性アッセイには、Ｈｏｇｒｅｆｅら（前記、および実施例３に記載）に記載されているアッセイが含まれる。また別のアッセイは、二本鎖λＤＮＡを利用するが、これは３Ｈ  Ｓ−アデノシルメチオニン（ＮＥＮ  ＃ＮＥＴ−１５５）およびＳｓｓ  Ｉメチラーゼ（ＮＥＢ）を用いて一様に標識され、そしてその後にＰａｌ  Ｉを用いて制限消化されている（Ｋｏｎｇら、１９９３年，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１９６５）。二本鎖標識化ＤＮＡ鋳型を使用すると、ｄＮＴＰ（１０〜１００μＭ）の添加によりｃｐｍが低下するか（３’−５’エキソヌクレアーゼ）どうかを測定することにより特異性を決定することができる。典型的なエキソヌクレアーゼ反応カクテルは、１×反応バッファーおよび（Ｋｏｎｇら、前記）に記載された通りに調製した２０ｐｇ／ｍＬの３Ｈ−標識消化二本鎖λＮＤＡ（〜１０６ｃｐｍｓ／ｍＬ）からなる。エキソヌクレアーゼ活性は、適切なＰＣＲバッファー中または７０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８．８）、２ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１％のトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）−Ｘ、および１００ｐｇ／ｍＬ  ＢＳＡ等の万能アッセイバッファー中で測定することができる。
【０１３５】
エキソヌクレアーゼ活性率（％）は下記の通りに決定できる：（変異体について修正されたｃｐｍ）／（野生型ＤＮＡポリメラーゼについての修正されたｃｐｍ）。より精密に活性率（％）を定量するためには、放出されたｃｐｍをエキソヌクレアーゼ活性の単位に転換することができる。１単位のエキソヌクレアーゼ活性は、規定温度で３０分間での１０ｎＭの全ｄＮＴＰの酸可溶化を触媒する酵素の量であると定義されている。単位を決定するために、最初にバックグラウンド（平均「最小Ｃｐｍ」値）を平均サンプルｃｐｍ値から減じる。以下の方程式を使用して、放出されたｄＮＭＰのｎＭを計算する：
(修正されたサンプルのｃｐｍ)×(ＤＮＡのｎｇ)×  （１ｎＭのｄＮＭＰ)
全Ｃｐｍ                  反応      （３３０ｎｇ  ｄＮＭＰ）
エキソヌクレアーゼ活性率の単位（３０分間で）は下記の通りに決定できる：
（１時間当たりに放出されたｄＮＭＰのｎＭ）×          （１単位）            
２                      （放出された１０ｎＭのｄＮＭＰ）
エキソヌクレアーゼ比活性（Ｕ／ｍｇ）は、単位対酵素量のプロットの直線状部分の勾配から外挿できる。最後に、活性率（％）は下記の通りに決定できる：
変異型ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ比活性（Ｕ／ｍｇ）
野生型ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ比活性（Ｕ／ｍｇ）
【０１３６】
上述の基質に加えて、エキソヌクレアーゼ活性はさらにまた市販で入手できる基質［３Ｈ］−大腸菌ゲノムＤＮＡ（ＮＥＮ  ＃；ＮＥＴ５６１；５．８μＣｉ／μｇ）を使用して定量できる。典型的なエキソヌクレアーゼ反応カクテルは、１×反応バッファー中の２５ｎｇ／ｍＬの３Ｈ−標識化大腸菌ゲノムＤＮＡおよび９７５ｎｇ／ｍＬの低温大腸菌ゲノムＤＮＡからなる。アッセイは上記に記載した通りに実施する。
【０１３７】
突然変異誘発によって生成した所望の変異型ＤＮＡポリメラーゼについての遺伝子は、突然変異の部位および数を同定するために配列決定することができる。１つ以上の突然変異を含むそれらの変異体について、所定の突然変異の作用は特定変異体により生まれた他の突然変異からの単離における部位特異的突然変異誘発による野生型遺伝子への同定された突然変異の導入によって評価できる。このようにして産生した単一変異体のスクリーニングアッセイは、その突然変異単独の作用の決定を可能にするであろう。
【０１３８】
１つの実施態様では、５〜２５ｎｇ／５０μＬの反応液で添加したときにＰｆｕブレンド中での野生型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼのエラー率を３分の１に低下させる。Ｐｆｕ  Ｇ３８７Ｐ変異体はさらに、６／６０ｎｇ／５０μＬ反応液で添加したときにブレンド中でＴａｑのエラー率を約５〜１０分の１に低下させる。Ｐｆｕ  Ｇ３８７Ｐは、ニッケルカラムから溶出させた部分的に精製した（〜５０％純度）Ｈｉｓ−標識化タンパク質の予備スクリーンにおいて０．４％  ＤＮＡポリメラーゼ活性および５７％エキソヌクレアーゼ活性（すなわち野生型Ｐｆｕに比較して）を示した（表１）。カラムクロマトグラフィー後（〜９５％純度）、Ｈｉｓ−標識化Ｐｆｕ  Ｇ３８７Ｐ変異体には、検出可能なＤＮＡポリメラーゼ活性が欠如することが見いだされた（野生型Ｐｆｕに比較して＜０．０１％）（表３）。
【０１３９】
Ｃ．本発明による野生型または変異型酵素の発現
当技術分野において知られている方法を適用すると、本発明によるＤＮＡポリメラーゼの突然変異形（すなわち、第２酵素）を発現および単離することができる。本明細書に記載した方法はさらに、本発明において有用な野生型酵素（例、第１酵素）の発現に対しても適用することができる。多数の細菌発現ベクターは、異種配列によってコードされたタンパク質の高レベル誘導性発現を可能にする配列エレメントまたは配列エレメントの組み合わせを含有する。例えば、上記で言及したように、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の統合された誘導性形を発現する細菌は、Ｔ７プロモーターへ連結した変異ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を有する発現ベクターを用いて形質転換させることができる。例えばｌａｃ−誘導性プロモーターのためのイソプロピル−β―Ｄチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）のような適切な誘導因子の添加によるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの誘導は、Ｔ７プロモーターからの変異遺伝子の高レベル発現を誘導する。
【０１４０】
適切な細菌の宿主菌株は、当業者が当技術分野において入手できる菌株から選択できる。非限定的例として、大腸菌株ＢＬ−２１は一般に他の大腸菌株に比較してプロテアーゼが欠如するので、外因性タンパク質の発現のために使用される。誘導性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を有するＢＬ−２１菌株には、ＷＪ  ５６およびＥＲ２５６６が含まれる（Ｇａｒｄｎｅｒ＆Ｊａｃｋ，１９９９年，前記参照）。特定ポリメラーゼ遺伝子のためのコドン使用が大腸菌遺伝子において通常所見されるコドン使用とは異なる状況については、例えばクローン化古細菌酵素遺伝子（珍しいコドンｔＲＮＡを有する数種のＢＬ−２１−ＣＯＤＯＮ  ＰＬＵＳＴＭ細胞菌株は、例えばストラタジーン社から入手できる）のようなクローン化タンパク質遺伝子の高効率発現を許容するより珍しいアンチコドン（例えば、ａｒｇＵ、ｉｌｅＹ、ｌｅｕＷ、およびｐｒｏＬ  ｔＲＮＡ遺伝子）を備えるｔＲＮＡをコードするｔＲＮＡ遺伝子を有するように修飾されたＢＬ−２１の菌株がある。
【０１４１】
当業者には、本発明の修飾されたＤＮＡポリメラーゼの精製に適切な多数の方法が知られている。例えば、Ｌａｗｙｅｒらの方法（１９９３年，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈ．＆Ａｐｐ．２：２７５）は、最初はＴａｑポリメラーゼを単離するために設計されたので、大腸菌中で発現したＤＮＡポリメラーゼの単離のために良好に適合している。あるいは、宿主タンパク質を破壊するために熱変性ステップ、ならびに高活性および約８０％純粋のＤＮＡポリメラーゼを単離するための２つのカラム精製ステップ（ＤＥＡＥ−セファロースカラムおよびヘパリン−セファロースカラム）を利用するＫｏｎｇらの方法（１９９３年，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１９６５を参照して本明細書に組み込む）を使用できる。さらに、ＤＮＡポリメラーゼ変異体は硫酸アンモニウム分別、その後のＱセファロースおよびＤＮＡセルロースカラムによって、またはハイトラップ（ＨｉＴｒａｐ）Ｑカラム上での汚染物質の吸収、その後にハイトラップ（ＨｉＴｒａｐ）ヘパリンカラムからの勾配溶離によって単離することができる。
【０１４２】
１つの実施態様では、Ｐｆｕ変異体は、その全体が参照して本明細書に組み込まれる米国特許第５，４８９，５２３号に記載された通りに発現させて精製される。
【０１４３】
Ｄ．重合活性を低下させるための他の方法
増幅反応において高いＤＮＡ重合活性を有する副作用を防止するために、本発明の組成物の重合活性はさらに物理的および／または化学的修飾および／または阻害によって低下させることができる。
【０１４４】
本組成物の重合活性は、化学的および／または物理的手段によって低下させることができる。ＤＮＡポリメラーゼの重合活性を優先的に阻害する条件は当技術分野において知られている（詳細な説明については、Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９９３年，前記；Ｗｒｉｇｈｔ，１９９６年，Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｐｏｌ．４３：１１５−２４；Ｅｌｉｏｎ，１９８２年，Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ．，７３：７−１３を参照されたい）。重合活性のレベルは、増幅反応を妨害しない（例えば、組成物のｅｘｏ＋活性または増幅反応の効率収率に有意な影響を及ぼさない）活性のレベルまで低下すれば十分である。
【０１４５】
５ｍＭを超えるＭｇ２＋の濃度はＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼの重合活性を阻害する。所定のＤＮＡポリメラーゼに対するＭｇ２＋の所定濃度の作用は、重合の効率および特異性の定量によって決定することができる。
【０１４６】
その他のイオン、ポリアミド、尿素、ホルムアミド、ジメチルスルホキシド、グリセロールおよび非イオン性界面活性剤（トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００およびトウィーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０）等の変性剤、アクチノマイシンＤ、臭化エチジウム、ソラレン等のポリヌクレオチド結合化学薬品の阻害作用は、それらを標準反応バッファーへ添加することによりポリヌクレオチド増幅について試験することができる（例、ＰＣＲ）。ＤＮＡポリメラーゼの重合活性へは優先的阻害作用を及ぼすが３’−５’エキソヌクレアーゼ活性には重大な影響を及ぼさないそれらの化合物は、重合活性を低下させながら３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が保持される反応条件を作製するために使用される。
【０１４７】
物理的手段を使用すると、ポリメラーゼの重合活性を優先的に阻害することができる。例えば、耐熱性ポリメラーゼの重合活性は、ポリメラーゼを長時間（２０分間以上）にわたり極度の熱（典型的には９６〜１００℃）へ曝露させることによって破壊される。各酵素毎に特異的耐熱性に関してはわずかな相違があるが、これらは容易に決定できる。低下した重合活性を備える本発明のポリメラーゼ混合物または第２酵素として使用されるｅｘｏ＋ＤＮＡポリメラーゼは、様々な時間に渡り熱処理することができ、重合および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性に及ぼす熱処理の作用を決定する。ＤＮＡポリメラーゼ活性を低下させるが３’−５’エキソヌクレアーゼ活性には有意な影響を及ぼさない条件を使用すると、本発明における低下した重合活性を備えるポリメラーゼ混合物または第２酵素として使用されるｅｘｏ＋ＤＮＡポリメラーゼを前処理することができる。
【０１４８】
酵素混合物
本酵素混合物組成物は、ＤＮＡ重合活性を備える第１酵素、ならびに３’−５’エキソヌクレアーゼ活性および低下したＤＮＡ重合活性を備える第２酵素を含む。
【０１４９】
１つの実施態様では、第１酵素は３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を備えるＤＮＡポリメラーゼである。ＤＮＡ増幅のための第１酵素の忠実度は、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性も有する第２酵素の使用によってさらに増加する。第１酵素として３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を備える好ましいＤＮＡポリメラーゼは、野生型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼである。
【０１５０】
また別の実施態様では、第１酵素は３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を備えないＤＮＡポリメラーゼである。増幅反応の忠実度は、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する本発明の第２酵素によって提供される。第１酵素として３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を備えない好ましいＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである。
【０１５１】
また別の実施態様では、第１酵素はＤＮＡ重合活性を備える逆転写酵素である。ｃＤＮＡ合成における逆転写酵素の忠実度は、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する第２酵素の使用によって増加する。
【０１５２】
Ａ．第１および第２酵素の対の選択
ＤＮＡ合成のための本方法では、ＤＮＡ重合活性を備える酵素は、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性および低下したＤＮＡ重合活性を備える第２酵素と混合することができる。
【０１５３】
混合物中の第１酵素および第２酵素の両方が３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を備える場合は、異なるプルーフリーディング活性を備える２種の酵素を結合することが望ましいことがある。「異なるプルーフリーディング活性」とは、２種の３’−５’エキソヌクレアーゼ活性がヌクレオチドに対する異なるプルーフリーディング優先傾向を示すことを意味する。例えば、１つの３’−５’エキソヌクレアーゼはＡ−Ａ誤対合より効率的にＧ−Ｔ誤対合をプルーフリーディングすることができ、異なるプルーフリーディング優先傾向を有する別のエキソヌクレアーゼはＧ−Ｔ誤対合より効率的にＡ−Ａ誤対合をプルーフリーディングすることができる。本組成物の第１酵素とは異なるプルーフリーディング優先傾向を備える第２酵素を使用することによって、第１酵素が認識および切断を効率的にできない誤対合へのプルーフリーディングを提供することによって第１酵素のプルーフリーディングを増強することができる。
【０１５４】
本発明の第１および第２酵素を選択するときに考慮に入れなければならないもう１つの要素は、各酵素が必要とする反応条件（例、ｐＨ、バッファー組成物、温度要件等）の適合性である。
【０１５５】
好ましい実施態様では、本組成物は第１酵素として野生型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼおよび第２酵素として低下したＤＮＡ重合活性を備える変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを含む。好ましくは、混合物は、＜０．０１ＵのＤＮＡポリメラーゼ活性および０．００７Ｕ−０．０４Ｕの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性（またはおよそ０．５−１０Ｕ野生型Ｐｆｕ内を含有するエキソヌクレアーゼ活性の量）に対応する２．５−５ＵのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ＋ある量のポリメラーゼが減少した変異体の比率を備える。より好ましくは、混合物は、＜０．０１ＵのＤＮＡポリメラーゼ活性および０．０２Ｕの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性（または２−３Ｕ野生型Ｐｆｕ内を含有するエキソヌクレアーゼ活性の量）に対応する２．５−５ＵのＤＮＡポリメラーゼ＋ある量の変異体が減少したポリメラーゼの比率を備える。ある好ましい実施態様では、本酵素混合物組成物は、第１酵素として２．５ＵのＤＮＡ重合活性および０．０２Ｕの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を備える野生型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼおよび第２酵素として０．０２Ｕの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性とともに低下したＤＮＡ重合活性（例、Ｇ３８７Ｐ）を備える変異型ＤＮＡポリメラーゼを含む。
【０１５６】
また別の好ましい実施態様では、本組成物は第１酵素として野生型Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよび第２酵素として低下したＤＮＡ重合活性を備える変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを含む。好ましくは、酵素混合物は、＜０．１ＵのＤＮＡポリメラーゼ活性および０．０１−０．２Ｕの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性（または１−２０Ｕの野生型Ｐｆｕ内を含有するエキソヌクレアーゼ活性の量）に対応する２．５ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ＋ある量の変異体が欠如するポリメラーゼの比率を備える。より好ましくは、酵素混合物は、＜０．０１ＵのＤＮＡポリメラーゼ活性および０．０８Ｕの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性（または１０−１２Ｕの野生型Ｐｆｕ内を含有するエキソヌクレアーゼ活性の量）に対応する２．５ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ＋ある量の変異体が欠如するポリメラーゼの比率を備える。ある好ましい実施態様では、本酵素混合物組成物は第１酵素として２．５ＵのＤＮＡ重合活性を備える野生型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼおよび０．０８Ｕの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性とともに低下したＤＮＡ重合活性（例、Ｇ３８７Ｐ）を備える変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを含む。
【０１５７】
好ましくは、低下したＤＮＡ重合活性を備える変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼは、Ｄ４０５、Ｙ４１０、Ｔ５４２、Ｄ５４３、Ｋ５９３、Ｙ５９５、Ｙ３８５、Ｇ３８７、およびＧ３８８からなる群から選択されるアミノ酸位置で１つ以上の突然変異を含む。
【０１５８】
より好ましくは、変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼは、Ｄ４０５Ｅ、Ｙ４１０Ｆ、Ｔ５４２Ｐ、Ｄ５４３Ｇ、Ｋ５９３Ｔ、Ｙ５９５Ｓ、Ｙ３８５Ｑ、Ｙ３８５Ｓ、Ｙ３８５Ｎ、Ｙ３８５Ｌ、Ｙ３８５Ｈ、Ｇ３８７Ｓ、Ｇ３８７Ｐ、およびＧ３８８Ｐからなる群から選択される１つ以上の突然変異を含む。
【０１５９】
Ｂ．酵素混合物中の重合活性対エキソヌクレアーゼ活性の比率
様々なＤＮＡ合成および増幅手法では、本発明の組成物は、単一ＤＮＡポリメラーゼまたは２種の野生型ＤＮＡポリメラーゼを含む混合物を用いて得られる合成結果と比較して、はるかに優れた合成結果（例えば、より高い忠実度および効率）を提供する。本組成物を使用する場合は、酵素混合物中の全重合活性および全エキソヌクレアーゼ活性の比率はＤＮＡ合成の最適の効率および忠実度にとって極めて重要である。
【０１６０】
本発明の酵素混合物中では、ＤＮＡポリメラーゼを第１および第２酵素として使用した場合、どちらの酵素も重合活性および／または３’−５’エキソヌクレアーゼ活性に寄与することができる。従来型ＤＮＡポリメラーゼ以外の酵素を第１酵素（例、逆転写酵素）として使用した場合、どちらの酵素もＤＮＡ重合活性に寄与する可能性があるが、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性に寄与するのは第２酵素だけである。ＤＮＡポリメラーゼ以外の酵素を第２酵素（例、大腸菌エキソヌクレアーゼＩ）として使用した場合、どちらの酵素も３’−５’エキソヌクレアーゼ活性に寄与する可能性があるが、酵素混合物のＤＮＡ重合活性に寄与するのは第１酵素だけである。
【０１６１】
本組成物中の第１および第２酵素の比率は、相互に対して変化させることができる。所定の合成手法で利用される本組成物中に存在するＤＮＡ重合活性対３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の比率は、反応混合物中のＤＮＡ重合活性対エキソヌクレアーゼ活性の比率を相互に関して系統立てて変化させ、合成形結果を比較する一連の単純な実験を実施することによって容易に最適化することができる。
【０１６２】
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性はアニーリングしていないプライマーを分解することが証明されている。分解されたプライマーはその後のＤＮＡ増幅ラウンドでは利用できないので、このためＰＣＲ反応の効率には影響を及ぼさないであろう。このため極めて高い産物収率を必要とする適用では、この作用を低下させて産物収率を増加させるＤＮＡ重合活性に比較して低濃度のエキソヌクレアーゼ活性を有することが望ましいことがある。しかし、収率より忠実度の方が重要である場合は、重合活性のレベルが増幅の効率を有意に阻害しない限りにおいて、合成もしくは増幅の正確度を増加させるＤＮＡ重合活性に比較して高濃度のエキソヌクレアーゼ活性を有する方が望ましい可能性がある。
【０１６３】
好ましい実施態様では、該酵素混合物中のＤＮＡポリメラーゼ活性対エキソヌクレアーゼ活性の比率は、約（２．５−５ＵのＤＮＡ重合活性）／（０．０２−５Ｕの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性）、例えば約（２．５ＵのＤＮＡ重合活性）／（０．０４−０．０８Ｕの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性）である。
【０１６４】
本発明の適用
１つの態様では、本発明は本発明の組成物を使用するＤＮＡ合成方法を提供する。本組成物は、本組成物中に存在するＤＮＡポリメラーゼまたは他の合成酵素と本質的に同一方法で様々なポリヌクレオチド合成方法で使用することができる。典型的には、ポリヌクレオチドの合成には、合成プライマー、合成鋳型、新規合成ポリヌクレオチドに取り込むためのポリヌクレオチド前駆体を必要とする（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）。ポリヌクレオチド合成を実施するための詳細な方法は当業者にはよく知られており、例えば「分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）第２版」，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，コールドスプリングハーバー，ニューヨーク州（１９８９年）の中で見いだすことができる。
【０１６５】
Ａ．増幅反応における適用
「ポリメラーゼ連鎖反応」もしくは「ＰＣＲ」とは、特異的なポリヌクレオチド鋳型配列を増幅させるｉｎ  ｖｉｔｒｏ法を意味する。ＰＣＲの技術は、「ＰＣＲ：実際的アプローチ（ＰＣＲ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）」，Ｍ．Ｊ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら、ＩｎｎｉｓらによるＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１年），「ＰＣＲプロトコル：方法および適用に関する指針（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０年）および「ＰＣＲテクノロジー：ＤＮＡ増幅のための原理および適用（ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐａｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」，Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）を含む多数の出版物に記載されている。ＰＣＲについては、各々が参照して本明細書に組み込まれる米国特許第４，６８３，１９５号；第４，６８３，２０２号；第４，８００，１５９号；第４，９６５，１８８号；第４，８８９，８１８号；第５，０７５，２１６号；第５，０７９，３５２号；第５，１０４，７９２号；第５，０２３，１７１号；第５，０９１，３１０号；および第５，０６６，５８４号を含む多数の米国特許にも記載されている。
【０１６６】
本発明によって提供される長所をより容易に理解できるように、ＰＣＲの概要を提供する。ＰＣＲ反応は、繰り返しの一連の温度サイクルを含み、典型的には５０−１００μＬの用量で実施される。反応ミックスは、ｄＮＴＰ（各々が４種のデオキシヌクレオチドであるｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ）、プライマー、バッファー、ＤＮＡポリメラーゼ、およびポリヌクレオチド鋳型を含む。ＰＣＲは、増幅させられる二本鎖標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする２種のプライマーとを必要とする。ＰＣＲでは、この二本鎖標的配列が変性させられ、１種のプライマーは変性した標的の各鎖へアニーリングされる。これらのプライマーは、１種のプライマーの伸長産物が、その相補体から分離したときに、相互から除去された部位で、他のプライマーへハイブリダイズできるような方向で標的ポリヌクレオチドへアニーリングする。所定のプライマーが標的配列へハイブリダイズすると、該プライマーはＤＮＡポリメラーゼの作用によって伸長させられる。伸長産物はその後、標的配列から変性させられ、そしてこの工程が繰り返される。
【０１６７】
この工程の連続サイクルでは、初期のサイクルで生成した伸長産物はＤＮＡ合成のための鋳型として機能する。第２サイクルで始まって、増幅産物は対数比率で蓄積し始める。増幅産物は、最終的には第２プライマーに相補的な配列が続く第１プライマーの配列を含有する第１ストランドと、第１ストランドに相補的である第２ストランドとを含む別個の二本鎖ＤＮＡ分子である。
【０１６８】
ＰＣＲ工程を用いると極めて大きな増幅が可能であるために、高ＤＮＡレベルを備えるサンプル、陽性対照鋳型または以前の増幅からの低レベルのＤＮＡキャリーオーバーは、意図的に添加された鋳型ＤＮＡの不在下でさえ、ＰＣＲ産物を生じさせる可能性がある。可能であれば、すべての反応ミックスはＰＣＲ産物解析および産物調製とは離れた領域で準備される。ＲＮＡ／ＤＮＡ調製、反応物混合、およびサンプル分析のための専用もしくはディスポーザブルの容器、溶液、およびピペット（好ましくは、容積式ピペット）の使用は交差汚染を最小限に抑えるであろう。さらに参照して本明細書に組み込まれるＨｉｇｕｃｈｉとＫｗｏｋ，１９８９年，Ｎａｔｕｒｅ，３３９：２３７−２３８およびＫｗｏｋとＯｒｒｅｇｏ，Ｉｎｎｉｓら編集，１９９０年，「ＰＣＲプロトコル：方法および適用についての指針（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．サンディエゴ，カリフォルニア州）も参照されたい。
【０１６９】
１．耐熱性酵素
ＰＣＲ増幅のために、本発明で使用された酵素は、好ましくは耐熱性である。本明細書で使用する「耐熱性」とは、熱に対して安定性である、熱抵抗性である、そして例えば５０〜９０℃のような高温で機能する酵素を意味する。本発明による耐熱性酵素は増幅反応のために有効な単一の基準を満たさなければならない、すなわち、酵素は二本鎖ポリヌクレオチドの変性を実行するために必要な時間に渡り高温に曝露させたときに不可逆性に変性（不活化）されてはならない。この関連で本明細書で使用する「不可逆性変性」とは、酵素活性の永久的かつ完全な消失をもたらす工程を意味する。変性のために必要な加熱条件は、例えばバッファー塩濃度および変性させられるポリヌクレオチドの長さおよびヌクレオチド組成に依存し、典型的には主としてより短いポリヌクレオチドに対する０．２５分間からより長いＤＮＡ片についての４．０分間の範囲内である時間に依存して、より短いポリヌクレオチドに対しては、典型的には８５℃〜１０５℃の範囲に及ぶ。バッファー塩濃度および／またはポリヌクレオチドのＧＣ組成が増加するにつれてより高い温度を許容することができる。好ましくは、酵素は９０〜１００℃では不可逆的には変性しないであろう。本発明による、不可逆性に変性しない酵素は、増幅反応中に少なくとも１０％、もしくは少なくとも２５％、または少なくとも５０％以上の機能もしくは活性を保持する。
【０１７０】
２．ＰＣＲ反応混合物
本酵素混合物に加えて、当業者はさらに合成／増幅反応の忠実度を増加させるために他のＰＣＲパラメータを利用することができる。ＰＣＲ忠実度は、ｄＮＴＰ濃度、ｐＨ、反応１回につき使用する酵素の単位、および反応内に存在するＭｇ２＋対ｄＮＴＰの比率における変化等の要素によって影響を受ける可能性がある（Ｍａｔｔｉｌａら、１９９１年，前記）。
【０１７１】
Ｍｇ２＋濃度は、プライマー−鋳型相互作用を安定化させることによってオリゴヌクレオチドプライマーの鋳型ＤＮＡへのアニーリングに影響を及ぼし、これはさらに鋳型−プライマーを用いたポリメラーゼの複製複合体を安定化させる。このため、これはさらに非特異的アニーリングを増加させ、そして望ましくないＰＣＲ産物も産生する可能性がある（ゲル内で複数のバンドを生じさせる）。非特異的増幅が発生した場合、Ｍｇ２＋を低下させる必要がある、またはＭｇ２＋をキレート化して増幅の正確度および特異性を増加させるためにＥＤＴＡを添加することができる。
【０１７２】
Ｍｎ２＋またはＣｏ２＋等の他の二価カチオンもまたＤＮＡ重合に影響を及ぼす可能性がある。各ＤＮＡポリメラーゼのために適切なカチオンは当技術分野において知られている（例、前記の「ＤＮＡ複製  第２版」）。二価カチオンは、ＭｇＣｌ２、Ｍｇ（ＯＡｃ）２、ＭｇＳ０４、ＭｎＣｌ２、Ｍｎ（ＯＡｃ）２、またはＭｎＳ０４等の塩の形態で供給される。トリス塩酸バッファー中の有用なカチオン濃度は、ＭｎＣｌ２については０．５〜７ｍＭ、好ましくは０．５〜２ｍＭであり、そしてＭｇＣｌ２については０．５〜１０ｍＭである。ビシン／ＫＯＡｃバッファー中の有用なカチオン濃度はＭｎ（ＯＡｃ）２については１〜２０ｍＭ、好ましくは２〜５ｍＭである。
【０１７３】
ＤＮＡポリメラーゼによって必要とされる一価カチオンは、塩化物または酢酸塩いずれかのカリウム、ナトリウム、アンモニウム、またはリチウム塩によって供給することができる。ＫＣｌについては、濃度は１〜２００ｍＭであり、好ましくは濃度は５〜１００ｍＭであるが、最適濃度は反応において使用されるポリメラーゼに依存して変動することがある。
【０１７４】
デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）は、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰ、およびｄＴＴＰの二ナトリウム塩またはリチウム塩等の塩溶液として添加される。本発明の方法では、各々、１μＭ〜２ｍＭの範囲内の最終濃度が適切であり、そして１００〜６００μＭが好ましいが、ヌクレオチドの最適温度は、全ｄＮＴＰおよび二価金属イオン濃度、ならびにバッファー、塩、特定プライマー、および鋳型に依存して逆転写反応において変動する可能性がある。長い、すなわち１５００ｂｐ超の産物に対しては、トリス塩酸バッファーを使用する場合は５００μＭの各ｄＮＴＰが好ましい可能性がある。
【０１７５】
ｄＮＴＰは二価カチオンをキレート化する、このため使用した二価カチオンの量は反応におけるｄＮＴＰ濃度によって変化させることが必要になる。過剰な量（例、１．５ｍＭ超）のｄＮＴＰは、エラー率を増加させることができ、そしてもしかするとＤＮＡポリメラーゼを阻害する。このためｄＮＴＰを低下させると（例、１０〜５０μＭ）、エラー率が低下する可能性がある。よりサイズの大きな鋳型を増幅させるためのＰＣＲ反応はより多くのｄＮＴＰを必要とすることがある。
【０１７６】
１つの適切なバッファー剤は、好ましくはｐＨ８．３のトリス塩酸であるが、ｐＨは８．０〜８．８の範囲内であってよい。トリス塩酸濃度は５〜２５０ｍＭであるが、最も好ましいのは１０〜１００ｍＭである。１つの好ましいバッファー剤は、好ましくはｐＨ８．３のビシン−水酸化カリウムであるが、ｐＨは７．８〜８．７の範囲内であってよい。ビシンは、ｐＨバッファーおよび金属バッファーの両方として機能する。
【０１７７】
ＰＣＲはＤＮＡ増幅にとって極めて強力なツールであるため、極めて小さな鋳型ＤＮＡが必要とされる。しかし一部の実施態様では、エラーの確率を低下させるために高いＤＮＡ濃度を使用できるが、鋳型数が多過ぎると汚染物質の量が増加して効率が低下する可能性がある。
【０１７８】
通常は、３μＭまでのプライマーを使用できるが、もっと高いプライマー対鋳型比は結果として非特異的な増幅およびプライマー−ダイマー形成を生じさせる。そこで通常はプライマー−ダイマー形成を回避するため、プライマー配列をチェックすることが必要である。好ましい実施態様では、０．１〜０．５μＭのプライマーが使用される。
【０１７９】
３．サイクリングパラメータ
鋳型ＧＣ含量が高いと、変性時間が増加する可能性がある。高いＧＣ含量を備えるプライマーまたはより長いプライマーのためには、より高いアニーリング温度が必要になることがある。グラジエントＰＣＲは、アニーリング温度を決定するための有用な方法である。より大きなＰＣＲ産物増幅のためには、伸長時間を伸ばさなければならない。しかし、酵素に対する損傷を制限するために可能な場合は常に、伸長時間の短縮が必要なことがある。
【０１８０】
サイクル数は、鋳型ＤＮＡの数が極めて小さい場合は増加させることができ、そして大きな数の鋳型ＤＮＡを使用した場合は低下させることができる。
【０１８１】
４．ＰＣＲ促進因子および添加剤
ＰＣＲ促進因子は、増幅の効率を改善するためにも使用できる。本明細書で使用する「ＰＣＲ促進因子」もしくは「ポリメラーゼ促進因子」（ＰＥＦ）とは、ポリヌクレオチド有する複合体またはタンパク質のポリメラーゼ促進活性を意味する（どちらもこれにより参照して本明細書に組み込まれるＨｏｇｒｅｆｅら、１９９７年，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  １０：：９３−９６；および米国特許第６，１８３，９９７号）。Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼについては、ＰＥＦは自然形でのＰ４５（Ｐ５０とＰ４５の複合体として）または組み換えタンパク質のどちらかを含む。Ｐｆｕ  Ｐ５０およびＰ４５の自然複合体では、Ｐ４５だけがＰＣＲ促進活性を示す。Ｐ５０タンパク質は構造が細菌フラビンタンパク質と類似している。Ｐ４５タンパク質は、その構造がｄＣＴＰデアミナーゼおよびｄＵＴＰａｓｅと類似するが、ｄＵＴＰをｄＵＭＰおよびピロリン酸塩へ転換するｄＵＴＰａｓｅとしてのみ機能する。本発明によるＰＥＦは、さらに古細菌起源（例、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）から入手したタンパク質を増強する単離もしくは精製天然型ポリメラーゼ；Ｐｆｕ  Ｐ４５と同一アミノ酸配列を有する完全もしくは部分合成タンパク質もしくはポリメラーゼ促進活性を有するそのアナログ；１つ以上の前記天然型または完全もしくは部分合成タンパク質のポリメラーゼ促進混合物；１つ以上の前記天然型または完全もしくは部分合成タンパク質のポリメラーゼ促進タンパク質複合体；または１つ以上の前記天然型タンパク質を含有するポリメラーゼ促進部分精製細胞抽出液、からなる群から選択することもできる（前記の米国特許第６，１８３，９９７号）。ＰＥＦのＰＣＲ促進活性は、当技術分野においてよく知られている手段によって定義される。ＰＥＦについての単位の定義は、ＰＥＦのｄＵＴＰａｓｅ活性（Ｐ４５）に基づいており、これはｄＵＴＰからのピロリン酸塩（ＰＰｉ）の産生を監視することによって決定される。例えば、ＰＥＦは、ｄＵＴＰ（１×クローン化Ｐｆｕ  ＰＣＲバッファー中の１０ｍＭのｄＵＴＰ）とともにインキュベートされ、その時間内にＰＥＦはｄＵＴＰをｄＵＭＰおよびＰＰｉへ加水分解する。形成されたＰＰｉの量は、シグマ（Ｓｉｇｍａ）社から市販で入手できる結合酵素アッセイシステム（製品番号Ｐ７２７５）を使用して定量される。１単位の活性は、１時間当たりに（８５℃で）形成される４．０ｎＭのＰＰｉであると機能的に定義されている。
【０１８２】
その他のＰＣＲ活性も、ＰＣＲ反応の正確度および特異性に影響を及ぼす可能性がある。０．５ｍＭ未満のＥＤＴＡが増幅反応ミックス中に存在することがある。トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０およびノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ−４０等の界面活性剤は、酵素希釈バッファー中に存在する。非イオン性界面活性剤の適切な最終濃度はおよそ０．１％以下であるが、０．０１〜０．０５％が好ましく、ポリメラーゼ活性を妨害しないであろう。同様に、酵素調製物中にはグリセロールが頻回に存在し、反応ミックス中では一般に１〜２０％の濃度へ希釈される。ＧＣ含量が高いまたは長さが長い（例、＞１ｋｂ）鋳型ＤＮＡのためには、ＰＣＲではグリセロール（５〜１０％）、ホルムアミド（１〜５％）またはＤＭＳＯ（２〜１０％）を添加することができる。これらの添加剤は、プライマー−鋳型・ハイブリダイゼーション反応のＴｍ（融解温度）およびポリメラーゼ酵素の熱安定性を変化させる。ＢＳＡ（０．８μｇ／μＬまで）は、ＰＣＲ反応の効率を改善することができる。ベタイン（０．５〜２Ｍ）もまた、ＤＮＡの高いＧＣ含量および長いフラグメントにわたりＰＣＲにとって有用である。塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ、＞５０ｍＭ）、塩化テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡＣ）、およびトリメチルアミン−Ｎ−オキシド（ＴＭＡＮＯ）もまた使用できる。ＰＣＲ反応の試験を実施すると、上記で言及した各添加剤の最適濃度を決定することができる。
【０１８３】
様々な特異的ＰＣＲ増幅の適用は、当技術分野において利用できる（詳細な説明については、例えばその各々が参照して本明細書に組み込まれるＥｒｌｉｃｈ，１９９９年，Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．，１：１２７−３４；Ｐｒｅｄｉｇｅｒ  ２００１年，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６０：４９−６３；Ｊｕｒｅｃｉｃら、２０００年，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３：３１６−２１；Ｔｒｉｇｌｉａ，２０００年，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３０：７９−８３；ＭａＣｌｅｌｌａｎｄら、１９９４年，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．４：Ｓ６６−８１；ＡｂｒａｍｓｏｎとＭｙｅｒｓ，１９９３年，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：４１−４７を参照されたい）。
【０１８４】
本発明は、ｉ）非特異的増幅を減少させるホットスタートＰＣＲ；ｉｉ）高アニーリング温度で始動し、その後に非特異的ＰＣＲ産物を減少させるために段階的にアニーリング温度を低下させるタッチダウンＰＣＲ；ｉｉｉ）アウターセットのプライマーおよびインナーセットのプライマーを使用してより信頼性の高い産物を合成するネステッドＰＣＲ；ｉｖ）既知の配列を挟む領域を増幅するためのインバースＰＣＲ、を含むがそれらに限定されないＰＣＲ適用において使用できる。この方法では、ＤＮＡが消化され、所望のフラグメントがライゲーションによって環状にされ、その後外向きに伸長する既知の配列に相補的なプライマーを使用してＰＣＲが行われる；ｖ）ＡＰ−ＰＣＲ（任意にプライミングされる）／ＲＡＰＤ（ランダムに増幅した多形性ＤＮＡ）。これらの方法はほとんど知られていない標的配列を備える種から任意のオリゴヌクレオチドを使用して増幅させることによりゲノムフィンガープリントを作製する；ｖｉ）その後でＰＣＲのために使用されるｃＤＮＡを合成するためにＲＮＡ−特異的ＤＮＡポリメラーゼ（例、逆転写酵素）を使用するＲＴ−ＰＣＲ。この方法は、組織または組織内での特定配列の出現を検出するために極めて高感受性である。これは、ｍＲＮＡ転写産物を定量するためにも使用できる；ｖｉｉ）ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）。これはＤＮＡ／タンパク質配列についての情報が限られる場合に使用される。この方法は、各１種の特異的プライマーだけ（１種のアダプタープライマーを加えて）を用いてｃＤＮＡのフラグメントを生成することでｃＤＮＡの３’または５’末端を増幅させる。その後、オーバーラッピングＲＡＣＥ産物は全長ｃＤＮＡを生成するために結合することができる；ｖｉｉｉ）種々の組織内で別々に発現した遺伝子を同定するために使用されるＤＤ−ＰＣＲ（ディファレンシャル・ディスプレイＰＣＲ）。ＤＤ−ＰＣＲにおける第１ステップはＲＴ−ＰＣＲを含んでおり、その後増幅は短い、故意に非特異的プライマーを使用して実施される；ｉｘ）同一試料内のＤＮＡ配列の２つ以上のユニークな標的が同時に増幅させられるマルチプレックス−ＰＣＲ。１つのＤＮＡ配列はＰＣＲの品質を検証するための対照として使用できる；ｘ）同一プライマーセットに対して標的ＤＮＡ（コンペティティブＰＣＲ）と競合する内部対照ＤＮＡ配列（しかし異なるサイズの）を使用するＱ／Ｃ−ＰＣＲ（定量的比較）；ｘｉ）遺伝子を合成するために使用される反復的ＰＣＲ。本方法に使用されるオリゴヌクレオチドは遺伝子のストレッチ（＞８０塩基）、あるいは重複する末端（〜２０塩基）を備えるセンスおよびアンチセンスストランドに対して相補的である；ｘｉｉ）非対称ＰＣＲ；ｘｉｉｉ）ｉｎ  ｓｉｔｕＰＣＲ；ｘｉｖ）部位特異的ＰＣＲ突然変異誘発。
【０１８５】
本発明はいずれかの特定増幅系に限定されないと理解すべきである。他の系が開発されるにつれて、それらの系は本発明の実践により利益が得られる可能性がある。増幅系についての最近の調査は公表されている。
【０１８６】
Ｂ．逆転写における適用
用語「逆転写酵素」とは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとして特徴付けられたポリメラーゼのクラスを説明する。知られているすべての逆転写酵素は、ＲＮＡ鋳型からＤＮＡ転写産物を合成するためのプライマーを必要とする。歴史的に見ると、逆転写酵素は主としてその後の操作（例、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲ増幅）のためのベクター内へクローン化することのできるｃＤＮＡ内へｍＲＮＡを転写するために使用されてきた。
【０１８７】
鳥類骨髄芽球症ウィルス（ＡＭＶ）逆転写酵素は、初めて広範に使用されたＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであった（Ｖｅｒｍａ，１９７７年，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ４７３：１）。この酵素は、５’−３’ＲＮＡ特異的ＤＮＡポリメラーゼ活性、５’−３’ＤＮＡ特異的ＤＮＡポリメラーゼ活性、およびＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する。ＲＮａｓｅ  Ｈは、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡストランドに対して特異的な前進型５’および３’リボヌクレアーゼである（Ｐｅｒｂａｌ，１９８４年，「分子クローニング解説書（Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）」，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク）。転写におけるエラーは逆転写酵素によって補正することができないが、これは知られているウイルス逆転写酵素にはプルーフリーディングのために必要な３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が欠如するためである（ＳａｕｎｄｅｒｓとＳａｕｎｄｅｒｓ，１９８７年，「生命工学に適用された微生物遺伝学（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ａｐｐｌｉｅｄ  ｔｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」，Ｃｒｏｏｍ  Ｈｅｌｍ，ロンドン）。本組成物中の第２酵素の使用は、逆転写反応のためのプルーフリーディングを提供する。ＡＭＶ逆転写酵素の活性およびその関連ＲＮａｓｅ  Ｈ活性についての詳細な試験は、Ｂｅｒｇｅｒら、１９８３年，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２２：２３６５−２３７２によって提示されている。
【０１８８】
逆転写のための反応混合物には、通常は酵素、水性バッファー、塩、オリゴヌクレオチドプライマー、標的ポリヌクレオチド、およびヌクレオシド三リン酸塩が含まれる。状況に依存して、その混合物は完全または不完全逆転写反応混合物のいずれかであってよい。反応混合物は、本組成物の第２酵素によって必要とされる条件によって修飾することができる。ｃＤＮＡが逆転写酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏでｍＲＮＡから入手できることは知られている。順に産生した全長ｃＤＮＡストランドは、その後の増幅反応（例、ＰＣＲ）等のための鋳型として使用できる。
【０１８９】
ＰＣＲと組み合わせた逆転写（ＲＴ−ＰＣＴ）は、サンプル中に存在する可能性がある１つまたは多数の特異的ＲＮＡ分子の存在を検出するために利用される。この方法は、例えば様々な生物（ウイルス、細菌、真菌、植物、および動物等）からＲＮＡを検出するため、または感染症、疾患状態、もしくは疾患に対する素因を表示するＲＮＡを検出するために使用できる。例えば、腫瘍細胞に特異的なｍＲＮＡを検出できる。この方法は、１クラスの微生物または１群の関連疾患状態を検出するためにもまた有用である。
【０１９０】
逆転写は、一般に逆転写酵素の機能的温度範囲内のあらゆる温度で実施できる。好ましくは、インキュベーションの温度は、逆転写酵素が機能的であり、プライマーがＲＮＡ分子へハイブリダイズしたままとなるあらゆる温度である。非耐熱性逆転写酵素については、好ましい温度は逆転写酵素のための最適温度またはほぼ最適温度である温度である。大多数の非耐熱性逆転写酵素のためには、この温度は約２５℃〜４５℃であろう。
【０１９１】
米国特許第５，９９４，０７９号（参照して組み込まれる）は、耐熱性逆転写酵素を開示している。Ｍｎ２＋は二価カチオンとして好ましく、典型的には例えば塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）、酢酸マンガン（Ｍｎ（ＯＡｃ）２）、または硫酸マンガン（ＭｎＳ０４）が塩として含有されている。ＭｎＣｌ２が１０ｍＭのトリスバッファーを含有する反応液中に含まれる場合、例えばＭｎＣｌ２は一般に０．５〜７．０ｍＭの濃度で存在する；２００μＭの各ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、およびｄＣＴＰが利用された場合は０．８〜１．４ｍＭが好ましい；そして１．２ｍＭのＭｎＣｌ２が最も好ましい。
【０１９２】
耐熱性逆転写酵素は、５０℃を超えるあらゆる温度でその最高活性の少なくとも５％を保持できる、または少なくとも５０℃の最適温度を有する。耐熱性逆転写酵素が機能的である最高温度は極めて高い可能性がある。この理由から、耐熱性逆転写酵素が使用される場合の逆転写のために好ましい温度範囲は、最も便宜的には当該ＲＮＡ分子とプライマーとの間のハイブリッドの計算融解温度に関して記載される。このような融解温度は、本明細書ではＲＮＡ／プライマー融解温度（Ｒ／Ｐ  Ｔｍ）と呼ぶ。好ましい範囲には、当該ＲＮＡ分子とプライマーとの間のハイブリッドの融解温度を２０℃下回る温度から当該ＲＮＡ分子とプライマーとの間のハイブリッドの融解温度を５℃超える温度までの温度が含まれる。一般に、温度がＲ／Ｐ  Ｔｍに近づくほど、ＲＮＡの特異的および非特異的ハイブリッドとプライマーの間の識別度が大きくなるであろう。しかし温度がＲ／Ｐ  Ｔｍに近い場合は、特異的ハイブリッドの減少した安定性はプライミングをより非効率的にさせる可能性がある。
【０１９３】
Ｒ／Ｐ  Ｔｍは、計算または経験的測定のどちらかによって決定できる。Ｒ／Ｐ  Ｔｍを計算するためには、ポリヌクレオチドハイブリッドの安定性を計算するために確立されたあらゆる式を使用できる。Ｒ／Ｐ  Ｔｍを計算するために好ましい式はＴｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ  Ｍ）＋０．４１（％（Ｇ＋Ｃの含有率））−０．７２（％（ホルムアミドの含有率））であるが、これは完全にマッチしたＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの安定性に関する試験から引き出された。ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドについては、ホルムアミド濃度とＴｍの低下との関係が線形ではないので、式にホルムアミド濃度を組み込むのは有効ではない。８０％のホルムアミドでは、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドはＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドより安定性であり、Ｔｍは配列に依存して約１０〜３０℃上昇する（Ｈａｍｅｓ＆Ｈｉｇｇｉｎｓ，「ポリヌクレオチド・ハイブリダイゼーション：実践的アプローチ（Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）」，（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，オックスフォード，英国，１９８５年））。このため８０％のホルムアミド中での反応の実施は、ＤＮＡ：ＤＮＡ二本鎖の形成を抑制するため、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを優先的に選択するため、そしてＲ／Ｐに対するＴｍを推定するためにも使用できる。ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＴｍを推定するために経験的に引き出された式は短いＤＮＡプライマーにとって正確ではない可能性があるので、ハイブリダイゼーション温度は、好ましくは４０〜６０℃の範囲内の温度で０．１〜０．４Ｍの一価カチオン中のハイブリッド安定性を評価することによって決定される。Ｒ／Ｐ  Ｔｍは、さらに経験的に決定することもできる（ＬｅｓｎｉｃｋとＦｒｅｉｅｒ，１９９５年，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：１０８０７−１０８１５，ＭｃＧｒａｗら、１９９０年，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ８：６７４−６７８；およびＲｙｃｈｌｉｋら、１９９０年，Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｒｅｓ．１８：６４０９−６４１２）。
【０１９４】
ＡＭＶ−ＲＴおよびＭｏＭｕＬＶ−ＲＴ等のウイルス逆転写酵素の忠実度は、米国特許第５，９９４，０７９号（前記）に記載された直接的アッセイ手法による熱活性逆転写酵素と比較することができる。プラスミドＢＳ＋（ストラタジーン社製）はこのようなアッセイのために使用できる。このプラスミドはα−相補的β−ガラクトシダーゼ活性をコードし、ＮｄｅＩを用いて線形化することができる。Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼは、α−ドナー領域のｃＲＮＡ転写産物を調製するために使用される。ＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅを用いたｃＲＮＡの処理およびｃＲＮＡの単離後、ｃＲＮＡは逆転写／増幅反応のための鋳型として使用される。その５’末端でＮｄｅＩ配列を含有するｃＤＮＡの３‘末端に相補的な逆転写プライマー、および５’末端でＰｓｔＩ配列を含む上流ＰＣＲプライマーは７５２ｂｐのＰＣＲ産物を提供する。次にＰＣＲ産物およびｐＢＳ＋ベクターは、ＮｄｅＩおよびＰｓｔＩを用いて消化され、その後にベクター内へのＰＣＲ産物のライゲーションおよび適切な宿主内への形質転換が行われる。白色コロニーの存在は、ＲＴまたはＰＣＲ増幅中に突然変異が発生したことを表示する。このアッセイは、様々な酵素の逆転写活性の忠実度へ相対値を指定する手段を提供する。特異的突然変異は、配列解析によって決定できる。
【０１９５】
ＲＮＡの逆転写に続いて、ＲＮＡは熱変性によって、またはアルカリ処理、熱処理もしくは酵素処理等の他の多数の知られている手段によってＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドから除去することができる。酵素処理は、例えばＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドをＲＮａｓｅを用いて処理することから構成されてよい。ＲＮａｓｅ  Ｈは、ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖分子内のＲＮＡストランドに対して特異的である。
【０１９６】
本組成物は、多数の起源からのＲＮＡを高忠実度転写および増幅するために適している。ＲＮＡ鋳型は、生物、例えばウイルスもしくは細菌ポリヌクレオチド調製物からのポリヌクレオチド調製物内に含まれていてよい。この調製物は、細胞破片およびその他の成分、精製全ＲＮＡ、または精製ｍＲＮＡを含んでいてよい。ＲＮＡ鋳型は、サンプルまたは特定標的ＲＮＡ分子内の異種ＲＮＡ分子の集団であってよい。
【０１９７】
本方法に使用するために適したＲＮＡは、特定標的ＲＮＡを含有することが疑われる生物学的サンプル中に含まれていることがある。生物学的サンプルは、例えば血液サンプルもしくは生検組織サンプル中と同様にＲＮＡがサンプルの小部分である異種サンプルであってよい。そこで、本組成物は臨床的検出および診断のために有用である。ＲＮＡ標的は、特定疾患または感染性物質を表示する可能性がある。
【０１９８】
ＲＮＡは、当技術分野において知られている多数の方法によって調製できる；その選択はサンプルの起源および利用可能性に依存する。ＲＮＡを調製する方法は、そのすべてが参照して本明細書に組み込まれるＤａｖｉｓら、１９８６年，「分子生物学における基本的方法（Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ニューヨーク州，第１１章；Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８７年，「分子生物学における最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」第４章，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，ニューヨーク州；ＫａｗａｓａｋｉとＷａｎｇ，１９８９年，「ＰＣＲテクノロジー（ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」Ｅｒｌｉｃｈ編，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ  ニューヨーク州；Ｋａｗａｓａｋｉ，１９９０年，「ＰＣＲプロトコル：方法および適用に関する指針」Ｉｎｎｉｓら編集，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，サンディエゴ、の中に記載されている。
【０１９９】
Ｃ．増幅産物の検出
増幅したポリヌクレオチド産物の検出は、よく知られている様々な技術のいずれかによって実施できる。好ましい実施態様では、増幅産物はゲル電気泳動法により分子量に基づいて分離され、そして分離した産物はゲル内に存在する溶解した増幅産物の別個の種を観察することを可能にするポリヌクレオチド特異的染色を使用して可視化される。電気泳動法により分離されたポリヌクレオチドを可視化するために適する多数のポリヌクレオチド特異的染色が存在するが、好ましいのは臭化エチジウムである。
【０２００】
増幅したポリヌクレオチド産物を検出するために適する代替法には、増幅産物へハイブリダイズできる標識化ポリヌクレオチドプローブを使用するハイブリダイゼーションに基づく検出手段が含まれる。そのような検出手段の例には、サザンブロット解析、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ標識化ポリヌクレオチドプローブを使用するリボヌクレアーゼ保護解析、および特定ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを検出するための類似方法が含まれる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、「分子生物学における最新プロトコル」，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９８７年，を参照されたい。
【０２０１】
本発明の本組成物を使用した増幅産物（例、ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲによって）は、配列決定またはクローニング等のその後の解析のために使用できる。
【０２０２】
Ｄ．ＰＣＲ増幅産物の直接クローニングにおける適用
その上、本組成物を使用した増幅産物が当技術分野において知られているあらゆる方法によってクローニングできることは理解されている。１つの実施態様では、本発明はＰＣＲ増幅産物の直接クローニングを可能にする組成物を提供する。
【０２０３】
ＰＣＲ産物をクローニングするために最も一般的な方法には、プライマー分子の末端へのフランキング制限部位の取り込みが含まれる。ＰＣＲサイクリングが実施され、次に増幅したＤＮＡが精製され、適切な１つ以上のエンドヌクレアーゼを用いて制限され、適合するベクター調製物へ連結させられる。
【０２０４】
ＰＣＲ産物を直接的にクローニングする方法は、制限認識配列を有するプライマーを調製する必要を排除し、クローニング用のＰＣＲ産物を調製するための制限ステップの必要をさらに除去するであろう。さらに、そのような方法は、好ましくは精製ステップを妨害することなくＰＣＲ産物を直接クローニングすることを可能にするであろう。
【０２０５】
米国特許第５，８２７，６５７号および第５，４８７，９９３号（それらの全体が参照して組み込まれる）は、ＰＣＲで生成した核酸の３’末端に付加された単一３’−デオキシ−アデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）残基を利用するＤＮＡポリメラーゼを使用するＰＣＲ産物の直接クローニング法を開示している。ベクターは、適切な制限酵素を用いた反応後に単一の３’−末端デオキシ−チミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）残基を生じる認識配列を用いて調製される。そこで、ＰＣＲで生成した遺伝子のコピーは、その中に適切な制限部位を有していないプライマーを調製する必要なくベクター内へ直接的にクローニングすることができる。
【０２０６】
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、鋳型の不在下でＰＣＲ産物の３’末端へ単一ｄＡＴＰを付加する末端トランスフェラーゼ活性を示す。この活性は、Ｔａｑを用いて増幅させたＰＣＲ産物が単一３’ｄＴオーバーハングを含有するベクター内へ直接にライゲーションされるＴＡクローニング法の基礎である。他方、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼは末端トランスフェラーゼ活性が欠けており、そこで平滑末端ベクター内へ効率的にクローニングされる平滑末端ＰＣＲ産物を産生する。
【０２０７】
１つの実施態様では、本組成物は第１酵素としてＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよび第２酵素として低下したＤＮＡ重合活性を備える変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを含む。組成物中のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは３’−ｄＡＭＰを備える増幅したＤＮＡ産物を産生して増幅産物の直接クローニングを可能にするが、他方変異型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼは増幅についての忠実度を提供する。
【０２０８】
キット
本発明は、本組成物の１つ以上の容器を有するパッケージユニット、および一部の実施態様ではＰＣＲにおける合成を含むポリヌクレオチド合成のために使用される様々な試薬の容器を含むキット構成もまた予期している。このキットは、次の品目の１つ以上をさらに含有していてよい：ポリヌクレオチド合成前駆体、プライマー、バッファー、取扱説明書、および対照。キットは、本発明による方法を実施するために適切な比率で一緒に混合される試薬容器をさらに含んでいてよい。試薬容器は、好ましくは本方法を実施する際の測定ステップを不要にする単位量で試薬を含有している。
【実施例】
【０２０９】
以下の実施例は、本発明を限定するためではなく具体的に説明するために提供されている。
【０２１０】
（実施例１．低下したＤＮＡポリメラーゼ活性を備えるＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼの変異体の構築）
本発明者らは、ＤＮＡポリメラーゼ活性を低下または排除する可能性があるがプルーフリーディング活性にはほんの小さな作用しか及ぼさないＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ内に突然変異を導入した。選択した突然変異は、関連ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼを使用して実施された以前の突然変異誘発試験から同定した。本発明者らは、Ｐｆｕ中の次の残基で重合ドメインにおいて同一アミノ酸側鎖置換を作製した（Ｄ４０５Ｅ、Ｙ４１０Ｆ、Ｔ５４２Ｐ、Ｄ５４３Ｇ、Ｋ５９３Ｔ、Ｙ５９５Ｓ）（表１）。
【０２１１】
突然変異は、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ内のアミノ酸３８４−３８９（ＳＹＴＧＧＦ）での分割ドメイン内にもさらに導入した（表１）。
【０２１２】
突然変異誘発のために使用したＤＮＡ鋳型は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ内へクローン化され、アフィニティー精製のためにＮ−末端Ｈｉｓ６標識を用いて発現させたＰｆｕ  ｐｏｌ遺伝子を含有していた。変法ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（ストラタジーンプロトコルを使用して、Ｐｆｕ  ｐｏｌ遺伝子の５’末端のイニシエーターＡＴＧの直後にＨｉｓ６標識を挿入した。挿入反応は２つのステップで実施した。第１ステップでは、Ｈｉｓ６フォワードプライマーだけを使用してＴｔｈリガーゼ（１０Ｕ／ＲＸＮ）の存在下で標準ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ反応を実施した。１８サイクル後、この反応液を３７℃で１時間かけてＤｐｎＩ消化させ、その後、登録商標ストラタプレップ（Ｓｔｒａｔａ  Ｐｒｅｐ（商標））プラスミドミニプレップ・キット（Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ）（ストラタジーン社製）を用いて精製した。精製物質は、Ｈｉｓ６リバースプライマーだけを使用した第２ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ反応において鋳型として機能した。１８サイクル後、第２反応液を３７℃で１時間かけてＤｐｎＩ消化させ、その後形質転換させた。Ｈｉｓ６−Ｐｆｕ  ｐｏｌ構築物は、ＰＣＲ増幅およびビッグダイ（Ｂｉｇ  Ｄｙｅ）配列決定キットを使用する配列決定の両方によって確認した。
【０２１３】
点突然変異は、クイックチェンジ（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ）部位特異的突然変異誘発キット（ストラタジーン社製）を使用してＰｆｕ  ｐｏｌ遺伝子内へ導入した。所望の突然変異の取り込みを検証するために、クローンを配列決定した。
【０２１４】
表１：部分精製Ｈｉｓ標識付きＰｆｕ変異体（ニッケル樹脂溶出液）の活性：
【表２】
2005514072.tif 000004
2005514072.tif 000005
【０２１５】
（実施例２．Ｈｉｓ標識付きＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ変異体のアフィニティー精製）
Ｐｆｕ突然変異体の細菌発現。プラスミドＤＮＡは、登録商標ストラタプレップ（ＳｔｒａｔａＰｒｅｐ（商標））プラスミド・ミニプレップキット（Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ）（ストラタジーン社製）を使用して精製し、そしてＸＬ−１０  Ｇｏｌｄ細胞を形質転換させるために使用した。中等度のエアレーションを行いながら３７℃で商標ターボアンプ（Ｔｕｒｂｏ  Ａｍｐ（登録商標））抗生物質（１００μｇ／μＬ）を含有する１〜５ＬのＬＢ培地中でアンピシリン耐性コロニーを増殖させた。細胞は遠心分離により収集し、−２０℃で保存した。
【０２１６】
精製（Ｈｉｓ６標識プロトコル／バッチ結合法）：細胞ペレットを自然結合バッファー（２０ｍＭのリン酸塩（ｐＨ７．８）、５００ｍＭのＮａＣｌ）中に再懸濁させた。卵白リゾチーム（１００μｇ／ｍＬ）を添加し、細胞を氷上で１５分間インキュベートした。細胞懸濁液は４５秒間にわたり８０％のデューティーサイクルおよび出力レベル５でＢｒｏｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ２５０を用いて超音波処理に３回かけた。超音波処理イベント間は、冷却するためにこの懸濁液を氷上に置いた。溶解液を２６，８９０ｇでの遠心により清浄化した。清浄化した溶解液を５ｍＬのプロボンド・ニッケル（ＰｒｏＢｏｎｄ  Ｎｉ）樹脂（インビトロジェン社製）に添加し、天然結合バッファー中で平衡化し、そしてスラリーを４℃で静かに撹拌しながら２時間インキュベートした。この樹脂を低速遠心分離（８００×ｇ）により沈降させた。樹脂を再懸濁させ、２分間にわたりスラリーを振とうし、その後で重力遠心分離により上清から樹脂を分離することにより、４ｍＬの天然結合バッファー（ｐＨ７．８）を用いてこの樹脂を３回洗浄した。樹脂をさらに、自然洗浄バッファー（２０ｍＭのリン酸塩（ｐＨ６．０）、５００ｍＭのＮａＣｌ）を用いて同一方法で洗浄した。樹脂を再懸濁させ、５分間にわたりスラリーを振とうし、その後で重力遠心分離により上清から樹脂を分離することによって、３５０ｍＭのイミダゾール溶離バッファー（２０ｍＭのリン酸塩、５００ｍＭのＮａＣｌ、３５０ｍＭのイミダゾール（ｐＨ６．０））５ｍＬを２回添加してタンパク質を溶出した。溶出したタンパク質は、セントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）３０遠心分離フィルター装置（アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）社製）を使用してスピン濃縮した。トリス−グリシン４〜２０％アクリルアミド勾配ゲルを使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、タンパク質サンプルをサイズおよび純度について評価した。ゲルは、銀染色またはＳｙｐｒｏ  Ｏｒａｎｇｅ（モレキュラー・プローブズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）社製）を用いて染色した。
【０２１７】
代替発現／精製：あるいは、カルモデュリンアガロースを用いて融合タンパク質を精製するために上流フレーム内カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）を含有するｐＣＡＬ−ｎ−ＥＫベクター（商標Ａｆｆｉｎｉｔｙ（登録商標）タンパク質発現／精製系）内にＰｆｕ変異体をサブクローニングした。プラスミドＤＮＡは、登録商標ストラタプレップ（ＳｔｒａｔａＰｒｅｐ（商標））プラスミド・ミニプレップキット（Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ）（ストラタジーン社製）を使用して精製し、そして登録商標ＢＬ２１（ＤＥ３）コドンプラス（ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（商標））細胞を形質転換させるために使用した。中等度のエアレーションを行いながら３０℃で商標Ｔｕｒｂｏ  Ａｍｐ（登録商標）抗生物質（１００μｇ／μＬ）を含有する１〜５ＬのＬＢ培地中でアンピシリン耐性コロニーを増殖させた。培養がＯＤ６００で０．６〜１．０の吸光度に到達したとき、１ｍＭのＩＰＴＧを用いて細胞を誘導し、同一方法で２時間から一晩（１６時間）かけてインキュベートした。細胞は遠心分離により収集し、−２０℃で保存した。
【０２１８】
細胞ペレットをカルシウム結合バッファー（５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭの酢酸マグネシウムおよび２ｍＭのＣａＣｌ）と同一または類似のバッファー中で約０．２５ｇ／ｍＬの濃度へ再懸濁させた。卵白リゾチーム（１００μｇ／μＬ）を添加し、細胞を氷上で１５分間インキュベートした。細胞懸濁液は４５秒間にわたり８０％のデューティーサイクルおよび５の出力レベルでＢｒｏｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ２５０を用いて超音波処理に３回かけた。超音波処理イベント間は、冷却するためにこの懸濁液を氷上に置いた。溶解液を２６，８９０ｇでの遠心により清浄化した。
【０２１９】
清浄化した溶解液を１ｍＬのカルモデュリンアガロース（ＣＡＭアガロース（ＣＡＭ  ａｇａｒｏｓｅ）社製）に添加し、天然結合バッファー中で平衡化し、そしてスラリーを４℃で静かに撹拌しながらインキュベートした。２時間後、ＣＡＭアガロースおよび組み換えタンパク質を収集するためにこの反応液を３，０００ｇで５分間遠心分離した。この溶解液の上清を除去し、ＣＡＭアガロースは５０ｍＬのカルシウム結合バッファー中に樹脂を再懸濁させることにより少なくとも１回洗浄し、その後に上記に記載したように遠心分離によりＣＡＭアガロースを収集した。ＣＡＭアガロースをディスポーザブルの１５ｍＬのカラムへ移し、パックし、その後少なくとも２００ｍＬのカルシウム結合バッファーを用いて洗浄した。組み換えタンパク質は、５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１ＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＧＴＡに類似または同一のバッファーを使用することによりカラムから溶出した。
【０２２０】
トリス−グリシン４〜２０％アクリルアミド勾配ゲルを使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、タンパク質サンプルのサイズおよび純度について評価した。ゲルは、銀染色またはＳｙｐｒｏ  Ｏｒａｎｇｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）を用いて染色した。
【０２２１】
（実施例３．Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ変異体のＤＮＡポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性のアッセイ）
Ｐｆｕ変異体調製物をＤＮＡポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性について下記の通りに検査した。
【０２２２】
ＤＮＡポリメラーゼ。ＤＮＡポリメラーゼ活性は、活性化コウシ胸腺ＤＮＡ内への放射性標識ＴＴＰの取り込みを監視することによって測定した。適切なＤＮＡポリメラーゼ反応カクテルは、１×ＰＣＲ反応バッファー、各２００ＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰ、１９５μＭのＴＴＰ、５μＭの［３Ｈ］ＴＴＰ（ＮＥＮ  ＃ＮＥＴ−２２１Ｈ、２０．５Ｃｉ／ｍＭ；エタノールを除去するために部分的に蒸発させた）、および２５０μｇ／ｍＬの活性化コウシ胸腺ＤＮＡ（例、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）製品番号２７−４５７５−０１）を含有していた。ＤＮＡポリメラーゼ（野生型ＰｆｕまたはＰｆｕ変異体）は、Ｐｆｕ保存バッファー中で希釈し、各酵素希釈液１μＬをポリメラーゼカクテルの１０μＬ一定分量に添加した。重合反応は、７２℃で３０分間にわたり２回ずつ、または３回ずつ実施した。伸長反応は氷上で停止させ、次に５μＬの一定分量を直ちにＤＥ８１イオン交換フィルター（径２．３ｃｍ；ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）社製、製品番号３６５８３２３）上でスポットした。取り込まれなかった［３Ｈ］ＴＴＰは、２×ＳＳＣ（０．３ＭのＮａＣｌ、３０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）中での６回の洗浄、その後の１００％エタノール中での短時間の洗浄によって除去した。取り込まれた放射能は、シンチレーション計数により測定した。
【０２２３】
酵素が欠如する反応液は、「総ｃｐｍ」（フィルター洗浄ステップを省略する）および「最小ｃｐｍ」（上記の通りにフィルターを洗浄する）を決定するためにサンプルインキュベーションと一緒に構成した。各ＤＮＡポリメラーゼについて「修正ｃｐｍ」を決定するためにサンプルｃｐｍを最小ｃｐｍから減じた。
【０２２４】
野生型Ｐｆｕと比較した活性率（％）を決定するために、アッセイの線形範囲にわたって連続的に希釈した野生型Ｐｆｕと一緒に、〜５０〜５００ｎｇの精製Ｐｆｕ変異体をヌクレオチド取り込みアッセイにおいて検査した（５０〜５００ｐｇ；０．００３−０．０３Ｕ）。
【０２２５】
エキソヌクレアーゼアッセイ。希釈したＤＮＡポリメラーゼ（０．２５−１０Ｕ野生型Ｐｆｕ；５〜２００ｎｇ）の一定分量４μＬを４６μＬの反応カクテルへ添加することによって、エキソヌクレアーゼ反応を実施した（３回ずつ）。反応液は７２℃で１時間インキュベートした。酵素が欠如する反応も、「総ｃｐｍ」（ＴＣＡ沈降なし）および「最小ｃｐｍ」（ＴＣＡ沈降あり、下記参照）を決定するためにサンプルインキュベーションと一緒に構成した。
【０２２６】
エキソヌクレアーゼ反応は、チューブを氷上へ移すことにより停止させた。超音波処理サケ精子ＤＮＡ（１５０  μｌ；２．５ｍｇ／ｍＬストック）およびＴＣＡ（２００１年；１０％ストック）を「総ｃｐｍ」チューブ以外の全チューブへ添加した。沈降反応は氷上で＞１５分間インキュベートし、次に１４，０００ｒｐｍで１０分間、微量高速遠心機中で回転させた。ペレットを乱さないように注意を払いながら上清２００μＬを除去し、シンチレーション液（商標Ｂｉｏ−Ｓａｆｅ  ＩＩ（登録商標），リサーチプロダクツ・インターナショナル（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐ．）社製）へ移した。反転させることによりサンプルを完全に混合し、シンチレーションカウンターで計数した。
【０２２７】
野生型Ｐｆｕに比較してエキソヌクレアーゼ活性率（％）を決定するために、同等量のＰｆｕおよび精製Ｐｆｕ変異体（アッセイの線形範囲に含まれる；〜５〜２００ｎｇ  Ｐｆｕ）をエキソヌクレアーゼアッセイで検査した。
【０２２８】
結果：数種のＰｆｕ変異体は、ニッケル樹脂から溶出した部分精製（純度〜５０％）調製物として試験したときに、野生型Ｐｆｕに比較してＤＮＡポリメラーゼ活性の低下を示した（表１）。＜１０％ＤＮＡポリメラーゼ活性および少なくとも１０％エキソヌクレアーゼ活性を示したＰｆｕ変異体には、分割ドメイン変異体：Ｙ３８５ＱＳＮＬＨ、Ｇ３８７ＳＰ、およびＧ３８８Ｐならびにポリメラーゼドメイン変異体：Ｄ４０５Ｅ、Ｔ５４２Ｐ、Ｄ５４３Ｇ、およびＫ５９３Ｔが含まれる。表１に示したＤＮＡポリメラーゼ活性率（％）の初期測定値は、試験したタンパク質サンプルの純度および試験したすべてのタンパク質量がアッセイの線形範囲内にあるかどうかに関する不確実さのために、近似推定値と見なした。
【０２２９】
（実施例４．従来型カラム・クロマトグラフィーによるＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ変異体の精製）
Ｐｆｕ  Ｋ５９３ＴおよびＧ３８７Ｐ変異体の非標識化またはアフィニティー標識化融合物を以下の通りに精製した。細胞ペレット（１２〜２４ｇ）は、３容量の溶解バッファー（バッファーＡ：５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８．２）、１ｍＭのＥＤＴＡ、およびｌＯｍＭのβＭＥ）中に再懸濁させた。リゾチーム（１ｍｇ／ｇ  細胞）およびＰＭＳＦ（１ｍＭ）を添加し、細胞を４℃で１時間溶解させた。細胞混合液を超音波処理し、１５，０００ｒｐｍでの３０分間（４℃）の遠心分離により細胞破片を除去した。トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０およびＩｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０を最終濃度０．１％へ添加し、上清を７２℃で１０分間加熱した。その後、熱変性大腸菌タンパク質は、１５，０００ｒｐｍでの３０分間（４℃）の遠心分離により除去した。
【０２３０】
上清を商標Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）高流速カラム（〜５ｍＬカラム）上でクロマトグラフィーにかけ、バッファーＢ（バッファーＡに０．１％（ｖ／ｖ）のＩｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０、および０．１％（ｖ／ｖ）のトウィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０を加えたもの）中で平衡化させた。流動フラクションを収集し、次にＰ１１ホスホセルロースカラム上へ直接に装填し、バッファーＣ（ｐＨ７．５である以外は、バッファーＢと同一）中で平衡化させた。カラムを洗浄し、０〜０．７ＭのＫＣｌ勾配／バッファーＣを用いて溶出した。Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ変異体を含有するフラクション（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによると９５ｋＤ）はバッファーＤ（５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．５）、５ｍＭのβＭＥ、５％（ｖ／ｖ）のグリセロール、０．２％（ｖ／ｖ）のＩｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０、０．２％（ｖ／ｖ）のトウィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０、および０．５ＭのＮａＣｌ）に対して一晩透析し、その後バッファーＤ中で平衡化させたヒドロキシアパタイトカラム（１．０ｘ１．３ｃｍ；〜１ｍＬ）へ適用した。このカラムを洗浄し、４００ｍＭのＫＰ０４（ｐＨ７．５）、５ｍＭのβＭＥ、５％（ｖ／ｖ）のグリセロール、０．２％（ｖ／ｖ）のＩｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０、０．２％（ｖ／ｖ）のトウィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０、および０．５ＭのＮａＣｌを含有するバッファーＤ２を用いて溶出した。精製したタンパク質は、セントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）ＹＭ３０装置を使用して回転濃縮し、このカラムを洗浄し、Ｐｆｕ最終透析バッファー（５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８．２）、Ｏ．１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）、５０％（ｖ／ｖ）のグリセロール、０．１％（ｖ／ｖ）のＩｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０、および０．１％（ｖ／ｖ）トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０）内へ交換した。
【０２３１】
結果：Ｈｉｓ標識化および非標識化Ｐｆｕ  Ｇ３８７ＰおよびＫ５９３Ｔをイオン交換／ヒドロキシアパタイト（ＩＥ／ＨＡ）クロマトグラフィーにより精製した。精製したタンパク質調製物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析して、純度≧９５％と決定された。残っているＤＮＡポリメラーゼ活性率（％）をより正確に定量するために、ＩＥ／ＨＡ精製変異体をヌクレオチド取り込みアッセイにおいて試験した。表３に示したように、Ｐｆｕ  Ｇ３８７Ｐ変異体は、１．１μｇまでのタンパク質を検査した場合は有意なＤＮＡポリメラーゼ活性を示さない（バックグラウンドを＜１００ｃｐｍｓしか超えない）。これらの結果は、Ｐｆｕ  Ｇ３８７Ｐ変異体が野生型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼによって示されるＤＮＡポリメラーゼ活性の＜０．０１％しか示さないことを表示している。これと比較して、Ｐｆｕ  Ｋ５９３Ｔ変異体は野生型ＰｆｕのＤＮＡポリメラーゼ活性のおよそ１〜２％を保持している。
【０２３２】
表３．ＩＥ／ＨＡ精製Ｐｆｕ変異体調製物中の残留ポリメラーゼ活性：
【表３】
2005514072.tif 000006
【０２３３】
（実施例５．ＰＣＲ条件下でのＰｆｕ変異体内のプルーフリーディング活性の存在の検証）
定性的アッセイを使用して、Ｈｉｓ６−標識化Ｐｆｕ変異体がＰＣＲ条件下で３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を保持することを検証した。このアッセイでは、ＤＮＡ鋳型へアニーリングするとｄＧ／ｄＧミスマッチを産生する３‘ｄＧを含有するフォワードプライマーを使用して、ｅｘｏ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ／５０μＬ）を用いて９００ｂｐのＨα１ＡＴ標的を増幅させた。このアプリコンは、フォワードプライマー：５’−ＧＡＧ．ＧＡＧ．ＡＧＣ．ＡＧＧ．ＡＡＡ．ＧＧＴ．ＧＧＡ．ＡＧ−３’［配列番号８］（１００ｎｇ／５０μＬ  ｒｘｎ）およびリバースプライマー：５’−ＧＡＧ．ＧＴＡ．ＣＡＧ．ＧＧＴ．ＴＧＡ．ＧＧＣ．ＴＡＣＴ．Ｇ−３’［配列番号９］（１００ｎｇ／５０μＬ  ｒｘｎ）を使用して、ヒトゲノムＤＮＡから増幅させた。増幅は、次のプログラムを用いて様々な量のＨｉｓ６−標識化Ｐｆｕ変異体の不在下または存在下において、パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ／Ｅｌｍｅｒ）９６００サーマルサイクラー上で実施した：（１サイクル）９５℃で２．５分間；（３０サイクル）９５℃で４０秒間、６１℃で１０秒間、７２℃で２．５分間；（１サイクル）７２℃で７分間。プルーフリーディング活性が不在であると、この酵素ｅｘｏ−ＰｆｕはおそらくｄＧ／ｄＧミスマッチを効率的に伸長させることができないので、低収率の産物を産生する。プルーフリーディング活性を備えるＰｆｕ変異体の存在下では、３’ｄＧはプライマーから切断され、ｅｘｏ−Ｐｆｕが高収率で標的を増幅させることが可能になるはずである。このＰＣＲアッセイを使用して、忠実度アッセイで試験したＰｆｕ変異体がミスマッチＰＣＲプライマーを切断するためのＰＣＲ条件下で十分なプルーフリーディング活性を保持することを確認した。さらに、このアッセイにより、本発明者らは増幅を阻害させずにＰＣＲ反応に添加できるタンパク質の濃度範囲を決定することが可能になった。
【０２３４】
結果：図１に示したように、ｅｘｏ−Ｐｆｕを用いて実施した増幅は、ｄＧ／ｄＧミスマッチの不良な伸長のために単独で低収率の産物を産生した。産物収率は、Ｈｉｓ６−標識化ＰｆｕＧ３８７ＰおよびＫ５９３Ｔ変異体の存在下では、おそらくこれらの変異体はプライマーから３‘ｄＧを切断し、それによってｅｘｏ−Ｐｆｕが標的を効率的に増幅させることを可能にするため、有意に高かった。追加の実験は、ポリメラーゼが欠如するＰｆｕ  Ｇ３８７ＰおよびＫ５９３Ｔ変異体はｅｘｏ−Ｐｆｕ（または野生型Ｐｆｕ）の不在下では標的を増幅させることができないことを証明した。
【０２３５】
（実施例６．Ｐｆｕ変異体を含有するＰｆｕまたはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼブレンドを用いてのＰＣＲ増幅）
Ｐｆｕブレンド。２．５−５ＵのＰｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ／μＬのクロ−ン化Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ＋１Ｕ／μＬの自然または２Ｕ／μＬのクロ−ン化Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ  ｄＵＴＰａｓｅ（ＰＥＦ））および様々な濃度のポリメラーゼが欠如するＰｆｕ変異体を備えるクロ−ン化Ｐｆｕ  ＰＣＲバッファー（１０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８．８）、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、および１００ｇ／ｍＬのＢＳＡ）中において、ＰＣＲ反応を標準条件下で実施した。長さが０．３〜９ｋｂのゲノム標的については、ＰＣＲ反応液は２．５ＵのＰｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼ、１００ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ、２００μＭの各ｄＮＴＰ、および１００ｎｇの各プライマーを含有していた。長さが１１．９ｋｂおよび１７ｋｂのゲノム標的については、ＰＣＲ反応液は５ＵのＰｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼ、２５０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ、５００μＭの各ｄＮＴＰ、および２００ｎｇの各プライマーを含有していた。
【０２３６】
Ｔａｑブレンド。２．５Ｕのクロ−ン化Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、１Ｕの自然または２Ｕのクロ−ン化Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ  ｄＵＴＰａｓｅ（ＰＥＦ））、および様々な濃度のポリメラーゼが欠如するＰｆｕ変異体を備えるＨｅｒｃｕｌａｓｅ  ＰＣＲバッファー（５０ｍＭのトリシン（ｐＨ９．１）、８ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２．３ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１％のトウィーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０、および７５μｇ／ｍＬのＢＳＡ）中において、ＰＣＲ反応を標準条件下で実施した。
【０２３７】
サイクリング条件（表４）：
【表４】
2005514072.tif 000007
【０２３８】
結果（ＰｆｕブレンドのＰＣＲ性能）：図２に示したように、ＰｆｕへのＨｉｓ６−標識化ＰｆｕＧ３８７Ｐ変異体０．５μＬの添加（ＰＥＦ／ｄＵＴＰａｓｅの存在下で）は、ＰＣＲ産物収率にほんのわずかな作用しか及ぼさない。追加の実験は、１．５μＬまでのＨｉｓ６−標識化ＰｆｕＧ３８７Ｐ変異体調製物は、ＰＣＲ産物収率を有意に低下させずに添加できることを証明した。
【０２３９】
結果（ＴａｑブレンドのＰＣＲ性能）：図３に示したように、ＰＥＦ／ｄＵＴＰａｓｅの存在下でのＴａｑへのＨｉｓ６−標識化ＰｆｕＧ３８７Ｐ変異体の添加は、ＴａｑおよびＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼの両方の活性を支持する反応バッファー中で増幅を実施した場合に、ＰＣＲ産物収率を有意に増加させる。そのようなバッファーの１つは、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ促進ＤＮＡポリメラーゼ（３．３３  Ｕ／μＬのクローン化Ｐｆｕ、１．６７Ｕ／μＬのクローン化Ｔａｑ、２Ｕ／μＬのクローン化Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ  ｄＵＴＰａｓｅ）のために特別に開発されたＨｅｒｃｕｌａｓｅ  ＰＣＲバッファーである。図３に示した実施例では、４ｋｂの標的は、Ｔａｑ、Ｐｆｕ、またはＨｅｒｃｕｌａｓｅ  ＰＣＲバッファー中ではＴａｑ単独を使用して高収率で増幅させることはできなかった。Ｈｉｓ６−標識化ＰｆｕＧ３８７Ｐ変異体（およびｄＵＴＰａｓｅ）の存在下では、４ｋｂの標的はＰｆｕＧ３８７Ｐ変異体のバッファー優先傾向と一致して、クローン化Ｐｆｕバッファー（中等度の収率）では増幅させることができたが、Ｔａｑバッファー中では増幅させることができなかった。他の実験はＰｆｕＧ３８７Ｐ変異体がＴａｑ  ＰＣＲバッファー中でＴａｑを用いて実施したＰＣＲ反応を阻害することを証明したが、これはＰｆｕＧ３８７Ｐ変異体がミスマッチを切断して分離することなくＰＣＲ産物の３’末端を結合し（Ｔａｑバッファー中での不活性のために）、そしてさらに産物伸長を遮断することを示唆している。予想されたように、最高産物収率はＨｅｒｃｕｌａｓｅバッファーの存在下でＴａｑ＋ＰｆｕＧ３８７Ｐブレンドを用いて入手されるが、それはこれら２種の酵素がこの特定バッファー中で高度に活性であるためである。ＰｆｕＧ３８７Ｐ変異体は、さもなければＴａｑを閉じ込めるであろう誤対合を切断することによってＴａｑ  ＰＣＲ反応（Ｐｆｕが活性であるバッファー中で）の収率を促進すると思われる。
【０２４０】
（実施例７．Ｈｉｓ６−標識化Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ変異体を含有するＤＮＡポリメラーゼブレンドの忠実度の測定）
Ｈｉｓ６−標識化ＰｆｕＧ３８７ＰおよびＫ５９３Ｔ変異体を含有するＰｆｕおよびＴａｑブレンドのエラー率をＣｌｉｎｅ  Ｊ．，Ｂｒａｍａｎ，Ｊ．Ｃ．，およびＨｏｇｒｅｆｅ  Ｈ．Ｈ．（９６），ＮＡＲ  ２４：３５４６−３５５１に記載されたｌａｃＩ  ＰＣＲ忠実度アッセイにおいて試験した。手短には、ｌａｃＩＯｌａｃＺα標的遺伝子をコードする１．９ｋｂのフラグメントを、クローン化Ｐｆｕ  ＰＣＲバッファー中の２．５ＵのＰｆｕ  ＴｕｒｂｏまたはＴａｑもしくはＨｅｒｃｕｌａｓｅ  ＰＣＲバッファー中の２．５ＵのＴａｑを使用してｐＰＲＩＡＺプラスミドＤＮＡから増幅させた。一定の反応液へ様々な量のＰｆｕ  Ｇ３８７ＰおよびＫ５９３Ｔ変異体を添加した。比較のために、ｌａｃＩ標的もまた製造業者が推奨するＰＣＲバッファーを使用して、Ｐｆｘ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ；インビトロジェン社製）およびＴｇｏ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ；ロシュ社製）を用いて増幅させた。ｌａｃＩを含有するＰＣＲ産物をその後、λＧＴ１０腕内にクローン化し、そして（Ｌｕｎｄｂｅｒｇ  Ｋ．Ｓ．，Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ  Ｄ．Ｄ．，Ａｄａｍｓ  Ｍ．Ｗ．Ｗ．，Ｓｈｏｒｔ  Ｊ．Ｍ．，Ｓｏｒｇｅ  Ｊ．Ａ．，およびＭａｔｈｕｒ，Ｅ．Ｊ．（１９９１年），Ｇｅｎｅ  １８０：１−８）に記載されているように、カラースクリーニングアッセイでｌａｃＩ変異体のパーセンテージを決定した（ＭＦ、突然変異発生頻度）。エラー率は、１複製当たり１ｂｐ当たりの突然変異発生頻度（ＭＦ／ｂｐ／ｄ）として表示されるが、ここでｂｐはｌａｃＩ遺伝子配列において検出可能な部位数（３４９）であり、ｄは効率的な標的倍加の数である。各酵素について、少なくとも２回の独立したＰＣＲ増幅を実施した。
【０２４１】
エラー率測定は、ＰｆｕおよびＰｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼがＶｅｎｔ、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ、およびＰｆｘ（ＫＯＤ）  ＤＮＡポリメラーゼの２分の１以下、ＤＮＡポリメラーゼ混合物の３〜６分の１以下、そしてＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの６〜１２分の１である平均エラー率を示すことを証明した。
【０２４２】
結果（Ｐｆｕブレンド）：表５に示したように、０．５−３μＬのＩＥ／ＨＡ精製Ｈｉｓ６−標識化Ｐｆｕ  Ｇ３８７Ｐ変異体は、２回の独立した忠実度アッセイにおいて、Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼのエラー率を３．２〜３．５分の１（アッセイ１）および１．８〜２．８分の１（アッセイ２）へ低下させた。実施例５で考察したように、１．５μＬまでのＥ／ＨＡ精製Ｈｉｓ６−標識化ＰｆｕＧ３８７Ｐ変異体は、ＰＣＲ産物収率を有意に低下させずにＰＣＲ反応へ添加することができた。
【０２４３】
これと比較して、０．５μＬのＰｆｕ  Ｋ５９３Ｔ変異体の添加はＰｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼのエラー率をわずかに低下させたが（４０％）、１．５μＬおよび３．０μＬの添加はエラー率を各々２．８倍および７．３倍増加させた。これらの量では、約０．５−１Ｕの追加のＤＮＡポリメラーゼ活性がＰＣＲ反応へ添加される（Ｐｆｕ  Ｋ５９３Ｔ  変異体は１〜２％のポリメラーゼ活性を示す）。Ｋ５９３Ｔ突然変異は、Ｐｆｕの誤った取り込みまたは誤対合伸長率を有意に増加させ、そして高度の（＞０．５Ｕに対応する）量が添加された場合は、Ｐｆｕ  Ｋ５９３Ｔ変異体は野生型Ｐｆｕのエラー率を劇的に増加させる。
【０２４４】
結果（ｔａｑブレンド）：表６に示したように、０．５μＬおよび３．０μＬのＰｆｕ  Ｇ３８７Ｇ変異体の添加は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのエラー率を各々５．１分の１および８．３分の１に減少させた。このため、Ｐｆｕ  Ｇ３８７Ｐ変異体の存在下でのＴａｑのエラー率は、Ｐｆｕ単独のエラー率と同等である可能性がある。
【０２４５】
図６．ＩＥ／ＨＡ精製Ｈｉｓ６−標識化Ｐｆｕ変異体を含有するＰｆｕブレンドの忠実度：
【表５】
2005514072.tif 000008
【０２４６】
表６．ＩＥ／ＨＡ精製Ｐｆｕ変異体を含有するＴａｑブレンドの忠実度：
【表６】
2005514072.tif 000009
【０２４７】
（実施例８．Ｐｆｕ変異体の存在下でＴａｑを用いて増幅させたＰＣＲ産物のＴＡクローニング効率の決定）
Ｔａｑの末端トランスフェラーゼ活性にポリメラーゼが欠如するＰｆｕ変異体が及ぼす作用を決定するために、本発明者らは、一連のアプリコンをＰｆｕ  Ｇ３８７Ｐ変異体（Ｔａｑ  ＰＣＲバッファー中）の不在下またはＰｆｕ  Ｇ３８７Ｐ変異体の存在下（Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ  ＰＣＲバッファー中）でＴａｑを用いて増幅させた。同様の増幅は、Ｐｆｕ  ＴｕｒｂｏおよびＨｅｒｃｕｌａｓｅを使用してそれらの推奨ＰＣＲバッファー中で実施した。ＰＣＲ産物収率は、ＳＹＢＲ金を用いて染色した１％アガロースゲル上で産物を分析することによって定量した。同量の各ＰＣＲ産物は、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（＃Ｋ４５００−０１）の取扱説明書にしたがって、６μＬの最終反応容量中の１μＬのｐＣＲ  ２．１−ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン社製）へ添加した。この反応液を室温で５分間インキュベートし、次に氷上へ移した。この反応液を製造業者の推奨にしたがって、ワンショット（Ｏｎｅ−Ｓｈｏｔ）セル（インビトロジェン社製）内へ変換させた。各形質転換の一定分量はインビトロジェン社製ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングの取扱説明書に記載されている通りに調製したアンピリシン／ＩＰＴＧ／Ｘ−ｇａｌプレート上でプレーティングした。所望のインサートを含有するクローンの頻度（クローニング効率（％））は、（白色コロニー）／（プレーティングしたコロニーの全数）の数として定量した。
【０２４８】
結果：図７に示したように、ＰｆｕＧ  ３８７Ｐ変異体の存在下でＴａｑを用いて増幅したＰＣＲ産物は、Ｔａｑ単独を用いて増幅したＰＣＲ産物と同等に効率的にＴＯＰＯ  ＴＡクローニングベクター内へクローニングされた。これとは対照的に、Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅したＰＣＲ産物は、おそらく３’ｄＡが欠如するために、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングベクター内へはるかに低効率的にクローニングされる。実施例７で考察したように、ＰｆｕＧ  ３８７Ｐ変異体を含有するＴａｑブレンドを用いて増幅したＰＣＲ産物は、Ｔａｑを用いて増幅したＰＣＲ産物に比較して同様により少ないエラー率（５〜８分の１以下）を示すはずである。このため、Ｐｆｕ  Ｇ３８７Ｐ変異体を含有するＴａｑブレンドは、ＴＡクローニング法を使用はするがインサートの高忠実度増幅を望む研究者にとって有用なはずである。Ｐｆｕ  Ｇ３８７Ｐ変異体の存在下で入手される高度のＴＡクローニング効率は、ＰＣＲ中にＴａｑによって添加された３’ｄＡがヌクレオチド鎖分解性分解に対して予想外に抵抗性であることを表示している。おそらく、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼは、ヌクレオチドの存在下では二本鎖ＰＣＲ産物から３’ｄＡ残基を切断することについてはそれほど効率的ではない。
【０２４９】
表７．ＴＯＰＯ  ＴＡクローニング効率：
【表７】
2005514072.tif 000010
【０２５０】
（実施例９．非標識化Ｐｆｕ変異体の発現および活性）
Ｈｉｓ６−標識をＨｉｓ６−標識化ＰｆｕＧ３８７Ｐクローンから削除し、非標識化変異体を発現させ、実施例４に記載した通りに精製した。４つのＰｆｕ  Ｇ３８７Ｐ変異体サンプルを調製し、それらのタンパク質濃度をアミノ酸分析により決定した。基質として３Ｈ−大腸菌ゲノムＤＮＡを使用してエキソヌクレアーゼ活性を測定し、表８において変異体調製物のエキソヌクレアーゼ比活性を野生型Ｐｆｕのエキソヌクレアーゼ比活性と比較した。Ｐｆｕ  Ｇ３８７Ｐ変異体変異体調製物のエキソヌクレアーゼ比活性は１，３００−２，２００Ｕ／ｍｇの範囲に及び、野生型Ｐｆｕのエキソヌクレアーゼ比活性（３５０−９５０Ｕ／ｍｇ）よりいくらか高いと思われた。
【０２５１】
表８．Ｐｆｕ  Ｇ３８７Ｐ調製物のエキソヌクレアーゼ比活性
【表８】
2005514072.tif 000011
【０２５２】
（実施例１０．非標識化Ｐｆｕ  Ｇ３８７Ｐ変異体を含有するＤＮＡポリメラーゼブレンドの忠実度の測定）
実施例７に記載した通りに、非標識化ＰｆｕＧ３８７Ｐ変異体を含有するＰｆｕおよびＴａｑブレンドのエラー率をｌａｃＩ  ＰＣＲ忠実度アッセイで試験した。図４に示したように、エラー率における最高低下（３分の１未満）は、６〜１０ｎｇのＰｆｕ  Ｇ３８７Ｐ調製物Ｊを２．５ＵのＰｆｕ（５０μＬの反応液）へ添加したときに観察された。予想外にも、忠実度はＰｆｕ  Ｇ３８７Ｐ変異体の量（＞１０ｎｇ）が増加するに伴って低下するように思われた。ｌａｃＩアンプリコンの収率もまたＰｆｕ  Ｇ３８７Ｐ変異体の量の増加に伴って低下し、これはより低い忠実度が低下した収率と相関している可能性があることを示唆している。調製物Ｊを使用すると、最適忠実度（最低エラー率）は、−１−３Ｕの野生型Ｐｆｕによって示された３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の量である０．０１２５Ｕから０．０２０８Ｕのエキソヌクレアーゼ活性（調製物Ｊ；２０９０Ｕ／ｍｇ）を添加することによって達成された。これらの推定は、３４８−９５０Ｕのエキソヌクレアーゼ／ｍｇの比活性および０．０１７４Ｕ／２．５Ｕ−０．０２１７６Ｕ／２．５Ｕのｅｘｏ／ｐｏｌ比を示すＰｆｕに基づいている。表７を参照されたい。
【０２５３】
Ｇ３８７Ｐ調製物ＳＣＳ  １〜３を用いた追加の試験は、６〜２４ｎｇまたは０．０１２５Ｕ、０．０２０９Ｕ、もしくは０．０３１４Ｕの調製物Ｊに等価量のタンパク質が一貫してＰｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼのエラー率を３分の１未満へ低下させることを証明した（図５）。使用したロットのＰｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（ロット番号：５９、６１、６３）を用いた場合のエラー率は、ほんのわずかしか変動しなかった。
【０２５４】
図６に示したように、６〜６０ｎｇのＰｆｕ  Ｇ３８７Ｇ調製物Ｊの添加はＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのエラー率を４．４分の１から１２．６分の１へ減少させた。エラー率における最高低下は、４０ｎｇの調製物Ｊ、または０．０８３６Ｕのエキソヌクレアーゼ活性の等価物の添加によって達成された。このアッセイでは、Ｔａｑ＋４０ｎｇのＰｆｕ  Ｇ３８７Ｐブレンドの正確度は、Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼより５０％高かった。
【０２５５】
（実施例１１．ブレンド中で使用するためのエキソヌクレアーゼ活性対ポリメラーゼ活性の比率範囲）
【表９】
2005514072.tif 000012
【０２５６】
（その他の実施態様）
前記の実施例は、本発明を作製および実行する際に本発明者らが実施および意図した実験を示したものである。これらの実施例には、本発明の実践の技術を通知し、そしてその有用性を証明する両方のために役立つ技術の開示が含まれている。当業者には、同様の結果を達成するために一般に多数の等価の方法および技術を利用できることを前提に、本明細書に開示した技術および実施態様は好ましい実施態様であることが理解されるであろう。
【０２５７】
本明細書において前記に同定した参考文献のすべては、これにより本発明の１つ以上の実施態様を実践するために重要な可能性がある根拠または可能な組成物および／または方法を記載し、陳述し、提供する程度に本明細書に参照して明示的に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０２５８】
【図１】本発明の一部の実施態様によるＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ変異体を使用したＰＣＲプルーフリーディング活性アッセイを示した図である。
【図２】本発明の一部の実施態様によるＰｆｕ＋Ｐｆｕ  Ｇ３８７Ｐ変異体ブレンドのＰＣＲ性能を示した図である。
【図３】本発明の一部の実施態様によるＴａｑ＋Ｐｆｕ  Ｇ３８７Ｐ変異体ブレンドのＰＣＲ性能を示した図である。
【図４】本発明の一部の実施態様による異なるの量のＰｆｕ  Ｇ３８７Ｐを用いたＰｆｕＴｕｒｂｏのＰＣＲの正確度を示した図である。
【図５】本発明の一部の実施態様によるＰｆｕＴｕｒｂｏ＋Ｐｆｕ  Ｇ３８７ＰのＰＣＲの正確度を示した図である。
【図６】本発明の一部の実施態様によるＴａｑ＋Ｐｆｕ  Ｇ３８７Ｐのエラー率を示した図である。
【図７】本発明の一部の実施態様による野生型ＤＮＡポリメラーゼおよび変異型ＤＮＡポリメラーゼのポリペプチド配列およびポリヌクレオチド配列を示した図である。
【図１】
2005514072.tif 000013
【図２】
2005514072.tif 000014
【図３】
2005514072.tif 000015
【図４】
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【図５】
2005514072.tif 000017
【図６】
2005514072.tif 000018
【図７−１】
2005514072.tif 000019
【図７−２】
2005514072.tif 000020
【図７−３】
2005514072.tif 000021
【図７−４】
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【図７−５】
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【図７−６】
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【図７−７】
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【図７−８】
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【図７−９】
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【図７−１０】
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【図７−１１】
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【図７−１２】
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【図７−１３】
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【図７−１４】
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【図７−１５】
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【図７−１６】
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【図７−１７】
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【図７−１８】
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【図７−１９】
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【図７−２０】
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【図７−２１】
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【図７−２２】
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【図７−２３】
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【図７−２４】
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【図７−２５】
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【図７−２６】
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【図７−２７】
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【図７−２８】
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【図７−２９】
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【図７−３０】
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【図７−３１】
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【図７−３２】
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【図７−３３】
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【図７−３４】
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【図７−３５】
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【図７−３６】
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【図７−３７】
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【図７−３８】
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【図７−３９】
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【図７−４０】
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【図７−４１】
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【図７−４２】
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【図７−４３】
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【図７−４４】
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【図７−４５】
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【図７−４６】
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【図７−４７】
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【図７−４８】
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【図７−４９】
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【図７−５０】
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【図７−５１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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