(57)【要約】イヌ、霊長類、ブタおよび魚のプレグナンＸ受容体（PXR）のポリヌクレオチドおよびポリペプチド、ならびに、これらPXR受容体の発現用の発現ベクターおよび宿主細胞が提供される。また、これらのPXR受容体のモジュレーターをスクリーニングする方法、ならびに、比較薬理学のために、および、ヒトPXR活性を予測できる適切な前臨床モデル動物の選択において、これらの受容体を用いる方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号２、４、６もしくは８のアミノ酸配列；
（ｂ）P450 3A4レベルまたは活性をモジュレートする（ａ）で特定したアミノ酸配列の変異体；または
（ｃ）P450 3A4レベルまたは活性をモジュレートする（ａ）もしくは（ｂ）の断片；
を含んでなる、単離されたプレグナンＸ核受容体ポリペプチド。
【請求項２】
前記変異体（ｂ）が、配列番号２、４、６もしくは８のアミノ酸配列に対して少なくとも80％の同一性を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
cDNA配列である、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
（ａ）配列番号１、３、５もしくは７の核酸配列；
（ｂ）（ａ）で特定した核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列；
（ｃ）遺伝暗号の結果として、（ａ）もしくは（ｂ）で特定した核酸配列に縮重している核酸配列；または
（ｄ）（ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）で特定した核酸配列に対して少なくとも60％の同一性を有する核酸配列；
を含んでなる、P450 3A4レベルまたは活性をモジュレートするプレグナンＸ受容体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号４に示すアミノ酸106〜434をコードする、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号４に示すアミノ酸41〜105をコードする、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号４に示すアミノ酸１〜40をコードする、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
（ａ）請求項１に記載のプレグナンＸ受容体のDNA結合またはリガンド結合ドメイン；および
（ｂ）プレグナンＸ受容体以外に由来するアミノ酸配列；
を含んでなる融合タンパク質。
【請求項１０】
請求項９に記載の融合タンパク質をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項３〜８または１０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載の発現ベクターを含有する宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１に記載のポリペプチドに特異的な抗体。
【請求項１４】
プレグナンＸ受容体の活性および／または発現をモジュレートする化合物を同定する方法であって、
（ａ）イヌ、ブタ、霊長類もしくはゼブラフィッシュのプレグナンＸ受容体ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと試験化合物とを接触させ；
（ｂ）該試験化合物が該ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性および／または発現に及ぼす効果を調べる；
ことを含んでなる方法。
【請求項１５】
前記ポリペプチドが細胞において発現される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載の方法により同定することが可能な、プレグナンＸ受容体の活性をモジュレートする物質。
【請求項１７】
請求項１に記載のPXRポリペプチドまたはその変異体を発現する非ヒト・トランスジェニック動物。
【請求項１８】
ヒトにおけるP450 3A4に対する試験化合物の効果を予測できる前臨床モデル動物を選択する方法であって、試験化合物の存在下でのヒトPXRのin vitro活性化と、試験化合物の存在下での前臨床モデル動物由来のPXRのin vitro活性化とを比較することを含んでなり、その際、前臨床モデル動物由来のPXRがヒトPXRと類似したin vitro活性化を示す場合、その前臨床モデル動物はヒトにおけるP450 3A4に対する試験化合物の効果を予測できる前臨床モデル動物であることを示している、上記方法。
【請求項１９】
前記前臨床モデル動物由来のプレグナンＸ受容体が、イヌ、ブタ、霊長類もしくはゼブラフィッシュのプレグナンＸ受容体である、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、魚、イヌ、ブタおよび霊長類から単離した非ヒト・プレグナンＸ受容体（PXR）ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列、ならびに、比較薬理学におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘムタンパク質のシトクロムP450ファミリーのメンバーは、様々な発癌物質や毒素を含めて、非常に多様な内因性物質および生体異物の酸化的代謝において重要である（Nebertら（1987）Ann. Rev. Biochem. 56:945-993）。ヒトでは、P450 3A4モノオキシゲナーゼ（CYP3A4モノオキシゲナーゼとも呼ばれる）が、肝臓や腸におけるその豊富な存在およびその広範な基質特異性によって、薬物の生体変換に主要な役割を果たしている。P450 3A4は、ステロイド、免疫抑制薬、イミダゾール抗真菌剤、およびマクロライド系抗生物質など、使用されている全薬物の60％を上回る代謝を触媒している（Maurel, P. in Cytochrome P450: metabolic and toxicological aspects（Ioannides, C編.）241-270（CRC Press, Inc. Boca Raton, FL 1996）。
【０００３】
P450 3A4の発現は、各種化合物による処理に応答して、in vivoおよび一次肝細胞の両方で誘導されるが、このような化合物として、限定するものではないが、グルココルチコイドのデキサメタゾン、抗生物質リファンピシン、抗真菌剤クロトリマゾール、および低コレステロール血症薬ロバスタチンのような一般に用いられている薬物が挙げられる（Maurel, P. in Cytochrome P450: metabolic and toxicological aspects（Ioannides, C編.）241-270（CRC Press, Inc. Boca Raton, FL 1996）；Guzelian, P.S. in Microsomes and Drug Oxidation（Miners, J.O.、Birkett, D.J., Drew, R. & McManus, M.編）148-155（Taylor and Francis、ロンドン、1988））。P450 3A4発現レベルの誘導可能性は、その広範な基質特異性と結びついて、組合せ療法を受けている患者における多数の薬剤の相互作用についての基礎を提供する。こうして、新しい化合物がP450 3A4遺伝子発現に及ぼす効果を分析することは、薬物開発における重要な局面となる。
【０００４】
P450 3A4発現レベルに対する化合物の効果をプロファイリングするのに用いるin vivoおよびin vitroアッセイを開発する試みがなされてきたが、種特異的変異の理解が低いため、試験目的で動物やそれらの組織を用いる有用性が制限されていた。従って、P450 3A4発現レベルに対する新規化合物の効果の分析は、主として、ヒト肝臓組織を必要とする面倒なアッセイに限定されていた。
【０００５】
核ホルモン受容体は、リガンドによりモジュレートされる転写因子の大きなスーパーファミリーを構成し、これらの因子は、ステロイド、レチノイド、および甲状腺ホルモンに対する応答を部分的に媒介する（詳しくは、Beatoら、（1995）Cell 83: 851-857；Kastnerら、（1995）Cell 83: 859-869；MangelsdorfおよびEvans、（1995）Cell 83: 841-850を参照されたい）。受容体、特に、ステロイドクラスの受容体の詳細な分析によって、一般化した機能特徴を示す該ファミリー内の多数の明確に異なる機能モジュールが明らかにされた（Tzukermanら、（1994）Mol. Endocrinol. 8:21-30）。可変アミノ末端ドメイン（A/B）が存在するが、これは典型的には強力かつ自律的な活性化機能（AF1）を含み、この機能は、細胞および標的遺伝子特異性にとって極めて重要であることが証明されている（Toraら、（1988）Nature 333: 677-684）。よりカルボキシ末端側の中心領域は２つのC4型ジンクフィンガーを特徴とするDNA結合ドメイン（DBD）を含む。DBDは特定のゲノム応答エレメントと結合し、これによって、該応答エレメントを含む選択（select）遺伝子の転写活性を調節する。遠位カルボキシ末端には、高度に保存された第２のトランス活性化機能（AF2）を含むリガンド結合ドメイン（LBD）が存在し、この機能はホルモン依存性転写トランス活性化にとって重要である（LanzおよびRusconi、（1994）Endocrinology 135: 2183-2195）。また、核局在化、受容体の二量体化、ならびに、熱ショックタンパク質との相互作用において機能する配列（GronemeyerおよびLaudet、（1995）CCQ 2: 1173-1308）も核受容体下部構造内に存在する。これら個別の機能ドメインの共同作用により、リガンドによる核受容体活性化は、最後には標的遺伝子発現をモジュレートするようになり（TsaiおよびO’Malley、（1994）Ann. Rev. Biochem. 63: 451-486）、場合によっては、NF-kB（SteinおよびYang、（1995）Mol. Cell. Biol. 15: 4971-4979）およびAP-1（Paechら、（1998）Science 277: 1508-1510）のような他の細胞シグナル伝達経路とクロストークすることもある。最終的に、リガンドは、その受容体が関与するタンパク質−タンパク質相互作用の立体配座を改変することにより、核受容体機能を改変する（詳しくは、Freedman、（1999）Cell 97: 5-8を参照されたい）。核受容体が媒介する細胞の多様な作用の基礎となる分子詳細は、熱心な研究活動の主題となっている。
【０００６】
プレグナンＸの核受容体（本明細書では、PXRと呼ぶ）（合同命名委員会（Unified Nomenclature Committee）の名称：NR1I2）については、PXR細胞に基づくアッセイおよび結合アッセイが、シトクロムP450 3A4遺伝子に対するin vivo効果を予測できることがわかっている（Kliewerら（1998）Cell 92, 73-8273-82；Lehmannら（1998）J. Clin. Invest. 102, 1016-1023；Jonesら（2000）Mol. Endo. 27-39）。
【０００７】
WO 99/48915には、シトクロムP450 3A4におけるCYPプロモーターリファンピシン／デキサメタゾン応答エレメントと結合するヒトPXRが開示されている。また、ヒトPXRをコードする核酸配列、さらには、ヒト受容体の発現のためのベクターおよび宿主細胞、ならびに、この受容体をin vitroで用いて、ヒトにおけるP450 3A4発現をモジュレートする能力について化合物をスクリーニングする方法も開示されている。
【０００８】
しかし、ヒト以外の動物PXR、特に、前臨床試験での使用が十分に許容される動物のPXRは、P450 3A4発現レベルに対する化合物の効果をプロファイリングするためのin vitroおよびin vivoモデル動物の開発において、また、ヒトにおける効果を予測できる前臨床モデル動物を選択する上でも有用であるだろう。加えて、シトクロムP450遺伝子誘導を超えた、さらに広範なPXRの生物学的生理学的役割の詳細な分析は、対象のモデル動物においてどの化合物がPXRを活性化するかを理解することで、さらに容易になる。従って、PXRの比較薬理学は、薬物開発および毒性アッセイにおけるPXRの有用性を高めると同時に、この受容体を疾患の有用な標的として認める可能性を切り開くものである。
【０００９】
マウスPXRのクローニングおよび配列決定はすでに行われている（Kliewerら（1998) Cell 92: 73-82）。ラットおよびウサギPXRも、クローニングおよび配列決定がなされている（Jonesら（2000）Molecular Endocrinology 14(1): 27-39；Zhangら（1999）Archives of Biochemistry and Biophysics 368(1): 14-22）。
【００１０】
本発明は、その他の非ヒト動物のPXRに関する。
【発明の開示】
【００１１】
魚、イヌ、ブタおよび霊長類から単離されたプレグナンＸ受容体（PXR）のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列が提供される。新規PXR配列は、選択的PXR化合物の同定および開発用のスクリーニング標的として有用である。これらの物質は、特に、PXR比較薬理学において、また、ヒトでの効果を予測できる前臨床試験に適したモデル動物を選択する上で有用である。
【００１２】
従って、本発明は、
（ａ）配列番号２、４、６もしくは８のアミノ酸配列；
（ｂ）P450 3A4レベルまたは活性をモジュレートする（ａ）で特定したアミノ酸配列の変異体；または
（ｃ）P450 3A4レベルまたは活性をモジュレートする（ａ）もしくは（ｂ）の断片；
を含む、単離されたPXRポリペプチドを提供する。
【００１３】
本発明の別の態様によれば、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供され、このポリヌクレオチドは、
（ａ）配列番号１、３、５もしくは７の核酸配列；
（ｂ）（ａ）で特定した核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列；
（ｃ）遺伝暗号の結果として、（ａ）もしくは（ｂ）で特定した核酸配列に縮重している核酸配列；または
（ｄ）（ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）で特定した核酸配列に対して少なくとも60％の同一性を有する核酸配列；
を含む。
【００１４】
本発明の他の関連した態様としては、本発明のポリペプチドを発現することができる本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクター；本発明の発現ベクターを含む宿主細胞；上記ポリペプチドの発現を達成するのに好適な条件下で本発明の宿主細胞を維持し、該ポリペプチドを単離することを含んでなる、本発明のポリペプチドの生産方法；本発明のポリペプチドに特異的な抗体；ならびに、突然変異PXRもしくは別の種由来のPXRを発現するトランスジェニック非ヒト動物が挙げられる。
【００１５】
本発明はまた、PXR活性および／または発現をモジュレートする物質の同定方法も提供する。一実施形態では、この方法は、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、発現ベクターまたは宿主細胞を試験物質と接触させ、該ポリペプチドの活性および／または発現に対する試験物質の効果を調べることにより、試験物質がPXR活性および／または発現をモジュレートするか否かを判定することを含む。別の実施形態では、突然変異PXRまたは別の種由来のPXRを発現する非ヒト・トランスジェニック動物に試験物質を投与し、該受容体の発現および／または活性に及ぼす試験物質の効果を調べる。
【００１６】
さらに、本発明は、前述した方法により同定可能な、PXR活性をモジュレートする化合物に関する。
【００１７】
配列の簡単な説明
配列番号１は、イヌプレグナンＸ受容体のリガンド結合ドメインのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。
【００１８】
配列番号２は、配列番号１に記載したイヌプレグナンＸ受容体のリガンド結合ドメインのアミノ酸配列を示す。
【００１９】
配列番号３は、霊長類プレグナンＸ受容体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。
【００２０】
配列番号４は、配列番号３に記載した霊長類プレグナンＸ受容体のアミノ酸配列を示す。
【００２１】
配列番号５は、ブタプレグナンＸ受容体のリガンド結合ドメインのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。
【００２２】
配列番号６は、配列番号５に記載したブタプレグナンＸ受容体のリガンド結合ドメインのアミノ酸配列を示す。
【００２３】
配列番号７は、ゼブラフィッシュプレグナンＸ受容体のリガンド結合ドメインのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。
【００２４】
配列番号８は、配列番号７に記載したゼブラフィッシュプレグナンＸ受容体のリガンド結合ドメインのアミノ酸配列を示す。
【００２５】
発明の詳細な説明
本明細書および添付の特許請求の範囲全体を通じて、「含んでなる」および「含む」の用語、ならびに「含んでいる」、「含めて」のような変形の表現は、包括的に解釈されるべきである。すなわち、これらの用語は、その状況が許す限り、特に列挙していない他の要素または整数を包含する可能性があることを意味するものとする。
【００２６】
本発明は、プレグナンＸ受容体（本明細書ではPXRと呼ぶ）の非ヒト動物オーソログ、およびその変異体に関する。さらに具体的には、本発明は、イヌ、ブタ、霊長類または魚から単離されたPXRに関する。本発明の全長サルPXRについてのヌクレオチド配列情報を配列番号３に示す。また、サルPXRのポリペプチド配列を配列番号４に示す。本発明のイヌ、ブタおよびゼブラフィッシュPXRのリガンド結合ドメインについての配列情報を、それぞれ配列番号１、５および７（ヌクレオチドおよびアミノ酸）に示す。イヌ、ブタおよびゼブラフィッシュPXRのリガンド結合ドメインのポリペプチドもそれぞれ配列番号２、６、および８に示す。
【００２７】
本発明のポリペプチドは、本質的に配列番号２、４、６もしくは８のアミノ酸配列、該配列の変異体、またはそのいずれかの断片からなる。本発明のポリペプチドは、実質的に単離された形態でありうる。ポリペプチドは、該ポリペプチドの意図する目的を妨害しない担体もしくは希釈剤と混合してもよく、その場合でも実質的に単離されたものとみなされることが理解されるだろう。本発明のポリペプチドは実質的に精製された形態とすることができ、その場合、それは一般的に調製物中に該ポリペプチドを含んでなり、該調製物中のポリペプチドの50重量％以上、例えば、80重量％、90重量％、95重量％または99重量％以上が本発明のポリペプチドである。ルーチンな方法を用いて、本発明のポリペプチドを精製および／または合成することができる。このような方法は当業者に十分理解されており、例えば下記の文献に開示されたものを含む技法がある：Sambrookら、Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 第２版、CSH Laboratory Press, 1989（この文献の開示内容はその全文を参考として本明細書に組み入れるものとする）。
【００２８】
用語「変異体」とは、選択したPXRと同じ本質的特徴または基本的生物学的機能を有するポリペプチドを意味する。本明細書に示すように、非ヒトPXRの生物学的機能は種によって違ってくる。本明細書で用いる「選択したPXR受容体」とは、本明細書に記載するイヌ、霊長類、ブタまたは魚PXRを意味する。さらに、本発明の目的のために、変異ポリペプチドは、本明細書に記載した１以上の非ヒト動物PXRと同じリガンドに結合するものであることが好ましい。好ましくは、ポリペプチドは霊長類、イヌ、ブタおよび／または魚においてP450 3A4発現をモジュレートする。本発明の選択したPXRと同じ本質的特徴を有するポリペプチドは、P450 3A4の誘導物質による選択したPXRの活性化をモニタリングすることによって同定することができる。好ましくは、全長の変異ポリペプチドは、選択したPXRの全リガンド結合ドメインを含むものである。
【００２９】
本発明の別の態様では、変異体は選択したPXRと同じ活性を示さず、むしろ該PXRの基本的機能を阻害するものである。例えば、変異ポリペプチドは、P450 3A4の誘導物質に曝露した際に選択したPXRの活性化を（例えば、PXRリガンドと結合して、選択したPXRへのリガンド結合により媒介される活性を阻止することによって）阻害するものである。
【００３０】
典型的には、配列番号２、４、６もしくは８のアミノ酸配列に対して約65％以上の同一性、好ましくは、少なくとも80％、少なくとも85％または少なくとも90％、特に好ましくは、少なくとも95％、少なくとも97％または少なくとも99％の同一性を有するポリペプチドが前記タンパク質の変異体とみなされる。同一性は、BLAST配列アラインメントプログラムのようなプログラムを用いて、決定することができる。このような変異体は対立遺伝子変異体、ならびに、前記タンパク質配列内の単一アミノ酸もしくはアミノ酸のグループの欠失、置換または付加を含むことができる。ただし、そのペプチドは選択したPXRの基本的な生物学的機能を維持する必要がある。
【００３１】
アミノ酸置換は、例えば１、２または３個から10、15、20または30個までの置換を行うことができる。改変したポリペプチドは、一般に、選択したPXRと同じ活性を保持する。保存的置換は、例えば、以下の表１に従って実施される。第２列の同じブロック内のアミノ酸、好ましくは第３列の同じ行にあるアミノ酸は、相互に置換可能である。
【表１】
2005503776.tif 000002
【００３２】
置換例を表２に示す。
【表２】
2005503776.tif 000003
【００３３】
より短いポリペプチド配列（本明細書では「断片」とも呼ぶ）も本発明の範囲に含まれる。例えば、長さが15、20もしくは30アミノ酸以上、または50、60、70、80、100、150もしくは200アミノ酸以下のペプチドは、それらが選択したPXRの基本的な生物学的機能を示す限り、本発明の範囲に含まれるものとする。特に、しかし排他的ではないが、本発明のこの態様は、タンパク質が完全なタンパク質配列の断片である場合、特に、A/Bドメイン（例えば、配列番号４のおよそアミノ酸１〜40）、DBD（例えば、配列番号４のおよそアミノ酸41〜105）、またはLBD（例えば、配列番号４または配列番号２、６もしくは８のおよそアミノ酸106〜434）を、単独でまたは組合せで、表す場合も包含する。このような断片は、好ましくは別の核受容体との、より好ましくはPA450 3A4調節に関与する核受容体のファミリーの別のメンバー（例えば、CAR核受容体）とのキメラ受容体を構築するために使用することができ、または、全長配列を調製する際に中間体として用いることができる。
【００３４】
PXRのこのような断片またはその変異体は、抗PXR抗体を誘導するためにも用いることが可能である。この実施形態において、上記断片は、選択したPXRポリペプチドのエピトープを含むものであり、それを別にすれば、選択したPXRのリガンド結合特性またはその他の特性を示さなくてもよい。
【００３５】
本発明のポリペプチドは化学的に改変することができ、例えば翻訳後修飾を受けてもよい。例えば、ポリペプチドはグリコシル化されてもよいし、修飾されたアミノ酸残基を含有させてもよい。また、ポリペプチドの精製を助けるためにヒスチジン残基を付加したり、あるいは、細胞膜への挿入を促進するためにシグナル配列を付加したりして、上記ポリペプチドを改変することも可能である。このような改変されたポリペプチドも、本発明の「ポリペプチド」という用語が意味する範囲に含まれる。
【００３６】
本発明はまた、イヌ、霊長類、ブタもしくは魚PXRをコードするヌクレオチド配列、またはそれらの変異体、ならびに、該配列に相補的なヌクレオチド配列も包含する。ヌクレオチド配列はRNAであっても、DNA（ゲノムDNA、合成DNAもしくはcDNAを含む）であってもよい。好ましくは、ヌクレオチド配列はDNA配列であり、最も好ましくは、cDNA配列である。本発明のイヌ、霊長類、ブタおよびゼブラフィッシュPXRのヌクレオチド配列情報をそれぞれ配列番号１、３、５および７に記載する。このようなヌクレオチドは、選択した種、すなわち、イヌ、霊長類、ブタまたはゼブラフィッシュの細胞から単離することができ、また、例えば、Sambrookら（1989）に記載されるような当業者には公知の方法により合成してもよい。
【００３７】
典型的には、本発明のポリヌクレオチドは、選択条件下で、配列番号１、３、５もしくは７のいずれかのコード配列または該コード配列の相補体とハイブリダイズすることができる連続したヌクレオチド配列を含む。
【００３８】
ポリヌクレオチドは一本鎖、二本鎖または三本鎖の形態でありうる。加えて、本明細書で用いるポリヌクレオチドは、RNAもしくはDNAまたはその両方を含む三本鎖領域を意味することもある。このような領域の鎖は、同じ分子または異なる分子からのいずれに由来するものでもよい。本明細書で用いる用語「ポリヌクレオチド」には、１個以上の改変された（例えば、トリチル化された）または普通でない（例えば、イノシン）塩基を含む核酸が含まれる。従って、安定性またはその他の理由で改変されたバックボーンを含むDNAまたはRNAも、本明細書で意味するポリヌクレオチドに含まれる。
【００３９】
本発明のポリヌクレオチドは、バックグラウンドを有意に超えるレベルで、配列番号１、３、５もしくは７のコード配列または該コード配列の相補体とハイブリダイズすることができる。バックグラウンドハイブリダイゼーションは、例えば、cDNAライブラリー中に存在する他のcDNAが原因で起こることがある。本発明のポリヌクレオチドと配列番号１、３、５もしくは７のコード配列または該コード配列の相補体との相互作用により生成されるシグナルレベルは、他のポリヌクレオチドと配列番号１、３、５もしくは７のコード配列との相互作用に対して、典型的には少なくとも10倍、好ましくは少なくとも100倍高い強度である。相互作用の強度は、例えば、プローブの放射性標識（例えば、32P）により、測定することができる。選択的ハイブリダイゼーションは、典型的には、中程度から高度のストリンジェンシー条件を用いて、達成することができる。しかし、このようなハイブリダイゼーションは、当業者には公知のどのような好適な条件下でも実施することができる（Sambrookら、1989）。例えば、高度ストリンジェンシーが要求される場合には、好適な条件は60℃〜65℃での0.1〜0.2 x SSCを含む。これより低いストリンジェンシーが要求される場合には、好適な条件は60℃での2 x SSCを含む。
【００４０】
配列番号１、３、５もしくは７のコード配列は、ヌクレオチド置換、例えば、１、２または３個から10、15、25、50もしくは100個までの置換によって改変することができる。これとは別に、またはこれに加えて、配列番号１、３、５もしくは７のポリヌクレオチドは、１以上の挿入および／または欠失および／または一端もしくは両端での伸長により、改変することも可能である。ポリヌクレオチドは１以上のイントロンを含んでいてよい。例えば、一実施形態では、ポリヌクレオチドはゲノムDNAを含む。また、細胞膜へのポリペプチドの挿入を助けるシグナル配列のような追加配列を含ませてもよい。改変したポリヌクレオチドは、一般に、選択したPXRと同じ活性を有するポリペプチドをコードする。あるいは、ポリヌクレオチドは、選択したPXRの活性を阻害するポリペプチドまたはそのリガンド結合部分をコードする。縮重置換を行ってもよいし、かつ／または、例えば、前記表１または表２に示すように、改変された配列が翻訳されるとき保存的アミノ酸置換が起こるような置換を行ってもよい。
【００４１】
配列番号１、３、５もしくは７のDNAコード配列の相補体と選択的にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列は、一般的に、配列番号１、３、５もしくは７の少なくとも20個、好ましくは少なくとも30個、例えば少なくとも40個、少なくとも60個、より好ましくは少なくとも100個連続したヌクレオチドの領域にわたって、最も好ましくはその全長にわたって、配列番号１、３、５もしくは７のコード配列に対して少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または少なくとも99％の配列同一性を有する。
【００４２】
例えば、UWGCGパッケージはBESTFITプログラムを提供するが、これは相同性を算出するために使用される（例えば、そのデフォルト設定で用いる）（Devereuxら（1984）Nucleic Acids Res. 12: 387-395）。PILEUPおよびBLASTアルゴリズムは、例えば、Altschul（1993）J. Mol. Evol. 36: 290-300；Altschulら（1990）J. Mol. Biol. 215: 403-410に記載されるように、（典型的には、そのデフォルト設定で）相同性を算出するため、または配列を整列させるために使用される。
【００４３】
BLAST分析を実施するためのソフトウエアは、国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)を通じて一般に入手可能である。このアルゴリズムは、最初に、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメントしたとき、ある正の値の閾値スコアＴに一致するか、またはこのスコアを満たす問合せ配列中の長さＷの短いワードを同定することにより、高いスコアを与える断片対（HSP）を同定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値（neighborhood word score threshold）と称される（Altschulら、1990）。これらの初期隣接ワードヒットは、それらを含むHSPを見つけ出す検索を開始するためのシード（seed）として働く。累積アラインメントスコアを増加することができる限り、ワードヒットを各配列に沿って両方向に延長させる。両方向でのワードヒットの延長は、下記の時点で停止させる。すなわち、累積アラインメントスコアがその最高達成値から量Ｘだけ下降したとき；１以上の負のスコアを与える残基アラインメントの蓄積のために、累積スコアがゼロ以下になったとき；あるいは、いずれか一方の配列の末端に達したとき。BLASTアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸはアラインメントの正確さと速度を決定する。BLASTプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）11、BLOSUM62スコアリングマトリックス（HenikoffおよびHenikoff（1992）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919）アラインメント（Ｂ）50、期待値（Ｅ）10、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両鎖の比較を用いる。
【００４４】
BLASTアルゴリズムは２つの配列間の類似性の統計的分析を実行する。例えば、KarlinおよびAltschul（1993）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787を参照されたい。BLASTアルゴリズムにより提供される類似性の指標の１つは最小総和確率（P(N)）であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致（マッチ）が偶然に起こる確率を示している。例えば、第１配列と第２配列を比較した際の最小総和確率が約１より低い、好ましくは約0.1より低い、より好ましくは約0.01より低い、最も好ましくは約0.001より低い場合には、両配列は互いに類似しているとみなされる。
【００４５】
配列同一性の上記程度と最小サイズのどのような組合せも、本発明のポリヌクレオチドを定義するために使用することができ、その際、よりストリンジェントな組合せ（すなわち、より長い鎖長にわたるより高い配列同一性）ほど好ましい。従って、例えば、25、好ましくは、30ヌクレオチドにわたって少なくとも90％の配列同一性を有するポリヌクレオチドは本発明の一実施形態を構成し、また、40ヌクレオチドにわたって少なくとも95％の配列同一性を有するポリヌクレオチドも本発明の一実施形態を構成する。
【００４６】
本発明のヌクレオチドは、本発明に従うポリペプチドの生産に有用である。生産は、in vitro、in vivoまたはex vivoのいずれでも行なうことができる。ヌクレオチドは、組換えタンパク質合成に関与したり、それ本来の特質で治療薬として用いたり、遺伝子治療法に用いたり、かつ／または非ヒトトランスジェニック動物の作製に用いたりすることができる。また、PXRをコードするヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、つまりアンチセンス配列も治療に用いることができる。
【００４７】
本発明のポリヌクレオチドは、プライマー、例えば、PCRプライマーまたは選択的増幅反応用プライマーとして、あるいは、プローブ、例えば、放射性もしくは非放射性標識を用いた通常の手段により検出可能に標識されたポリヌクレオチドとして、用いることができる。加えて、ポリヌクレオチドは、ベクターにクローニングすることができる。
【００４８】
好ましくは、このようなプライマー、プローブおよびその他の断片は、長さが少なくとも10、好ましくは少なくとも15または少なくとも20、例えば、少なくとも25、少なくとも30または少なくとも40ヌクレオチドである。これらは、典型的には、長さが40、50、60、70、100または150ヌクレオチド以下である。プローブおよび断片は、長さが150ヌクレオチドより長く、例えば、最長200、300、400、500、600、700ヌクレオチドでもよいし、あるいは、配列番号１、３、５または７のコード配列を除いて、５または10ヌクレオチドのように数ヌクレオチドであってもよい。
【００４９】
本発明のポリヌクレオチドは、イヌ、霊長類、ブタまたは魚PXRのDNA結合ドメインもしくはリガンド結合ドメインを含むPXR成分と非PXR由来配列とを有するキメラ受容体または融合タンパク質の生産にも有用である。キメラ受容体が果たす目的に適するように、非PXR由来配列を選択することができる。このような配列の例として、限定するものではないが、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、酵母転写因子GAL4のDNA結合ドメイン、および、エストロゲンまたはグルココルチコイド受容体のDNA結合ドメインのようなその他のDNA結合ドメイン、ならびに、ウイルスVP16転写活性化ドメインが挙げられる。本発明のキメラ受容体はさらに、放射性または蛍光標識のような検出可能な標識を含んでいてもよい。このキメラ受容体はまた、ガラスもしくはプラスチック粒子またはプレートもしくはフィルターのような固相支持体に結合させてもよい。
【００５０】
本発明はまた、本発明のポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターも包含する。このような発現ベクターは分子生物学の分野でルーチンに構築されており、例えば、プラスミドDNAや好適なイニシエーター、プロモーター、エンハンサーおよびその他のエレメント（例えば、タンパク質を発現させるのに必要であり、正しい方向に位置づけられるポリアデニル化シグナルなど）を使用する。他の好適なベクターは、本明細書に記載した教示内容および当技術分野で公知のことに基づいて、当業者には明らかであろう。これに関する更なる例として、ここではSambrookら（1989）を引用する。
【００５１】
また、本発明のポリヌクレオチドをアンチセンス配向で前記ベクターに挿入することにより、アンチセンスRNAの生産を達成することができる。アンチセンスRNAまたはその他のアンチセンスポリヌクレオチドは合成手段によっても生産することができる。このようなアンチセンスポリヌクレオチドは、本発明のアッセイでの試験化合物として用いることができ、また、治療においても有用である。
【００５２】
好ましくは、ベクター中で用いられる本発明のポリヌクレオチドは、宿主細胞によるコード配列の発現をもたらす制御配列と機能的に連結させる。すなわち、上記ベクターは発現ベクターである。「機能的に連結させる」とは、記載された成分がそれらの意図した様式で機能する関係にある並置を意味する。例えば、コード配列と「機能的に連結された」調節配列（例えば、プロモーターなど）は、コード配列の発現が調節配列と適合する条件下で達成されるように位置づけられている。
【００５３】
ベクターは、例えば、複製起点、任意にポリヌクレオチド発現用のプロモーター、および任意に該プロモーターの調節物質を有するプラスミド、ウイルスまたはファージベクターでありうる。これらのベクターは、１以上の選択マーカー遺伝子、例えば、細菌プラスミドの場合にはアンピシリン耐性遺伝子または真菌ベクター用の耐性遺伝子を含んでいてもよい。ベクターは、例えば、DNAもしくはRNAの生産のためにin vitroで使用したり、宿主細胞、例えば、哺乳動物宿主細胞をトランスフェクションもしくは形質転換するために使用することができる。上記ベクターはまた、in vivoで用いるために、例えば、遺伝子治療法や非ヒトトランスジェニック動物（好ましくは、マウス）の作製に用いるために改変してもよい。当分野で公知の更なるベクター成分は本発明のベクターにおいても使用するのに適しており、このような成分として、例えば、ポリアデニル化シグナルのようなプロセッシング部位、リボソーム結合部位、RNAスプライス部位、および転写終結配列などが挙げられる。
【００５４】
プロモーターおよびその他の発現調節シグナルは、発現について設計される宿主細胞と適合するように選択することができる。本発明で用いることができる酵母プロモーターの例として、S. cerevisiae GAL4およびADHプロモーター、ならびに、S. pombe NMT1およびADHプロモーターが挙げられる。ウイルスプロモーターを用いることもできる。ウイルスプロモーターの例として、限定するものではないが、モロニーマウス白血病ウイルスの長末端反復（MMLV LTR）、ラウス肉腫ウイルス（RSV）LTRプロモーター、SV40プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）IEプロモーター、アデノウイルス、HSVプロモーター（HSV IEプロモーターなど）、またはHPVプロモーター、特にHPV上流調節領域（URR）が挙げられる。本発明で有用な哺乳動物プロモーターは、カドミウムのような重金属に応答して誘導しうるメタロチオネインプロモーターおよびβ−アクチンプロモーターである。組織特異的プロモーターが特に好ましい。これらすべてのプロモーター、ならびに、本発明において有用なその他のプロモーターは、当分野で容易に入手可能である。
【００５５】
上記ベクターはさらに、真核生物ゲノム配列（好ましくは、哺乳動物ゲノム配列またはウイルスゲノム配列）と相同な配列を含むポリヌクレオチドをもたらす該ポリヌクレオチドに隣接する配列を含んでもよい。これは、相同的組換えによる真核細胞またはウイルスのゲノムへの本発明のポリヌクレオチドの導入を可能にする。特に、ウイルス配列により挟まれた発現カセットを含むプラスミドベクターは、本発明のポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に送達するのに適したウイルスベクターを調製するために用いることができる。好適なウイルスベクターの他の例として、単純ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびHPVウイルスを挙げることができる。これらのウイルスを用いた遺伝子導入法は当業者には公知である。例えば、レトロウイルスベクターを用いて、宿主ゲノムにポリヌクレオチドを安定して組み込むことができる。これに対して、複製欠損アデノウイルスベクターはエピソームのままであるため、一過性発現を可能にする。
【００５６】
本発明はまた、PXRポリペプチドまたはその変異体を発現するように改変された細胞を含む。このような細胞には、哺乳動物細胞や昆虫細胞などの一過性の（好ましくは安定した）高等真核細胞系、酵母のような下等真核細胞、または細菌細胞のような原核細胞が含まれる。本発明のポリペプチドをコードするベクターの挿入により改変され得る細胞の例として、限定するものではないが、哺乳動物HEK293T、CHO、HeLaおよびCOS細胞を挙げることができる。
【００５７】
さらに、本発明のポリペプチドはトランスジェニックな非ヒト動物（好ましくは、マウス）の細胞に発現させることもできる。従って、本発明のPXRポリペプチドを発現するトランスジェニック非ヒト動物も本発明の範囲に含まれる。例えば、内在性マウスPXR遺伝子だけでなく本発明の選択したPXRを発現するトランスジェニックマウスを作製することができる。内在性マウスPXR遺伝子がノックアウトされていて、本発明の選択したPXRポリヌクレオチドで置き換えられているマウスも作出可能である。また、選択したPXRのアイソフォームおよび本発明のPXRの突然変異対立遺伝子を発現するトランスジェニック動物を作製することもできる。これらの方法により開発されたトランスジェニック動物は、薬物の相互作用および毒性について化合物をスクリーニングし、また、P450 3A4の調節をin vivoで研究するために使用することができる。
【００５８】
別の態様によれば、本発明は、本発明のポリペプチドに特異的な抗体に関する。このような抗体は、例えば、免疫沈降法を含む精製、単離またはスクリーニング方法に有用であり、また実際に、その本来の特質によって治療薬として有用である。
【００５９】
本発明に従うポリペプチドの特定のエピトープに対して抗体を誘導することができる。このような抗体を用いて、受容体へのリガンドの結合を阻止しうる。抗体またはその他の化合物は、その特異的タンパク質またはポリペプチドと優先的にまたは高度の親和性でもって結合するが、その他のタンパク質とは実質的に結合しないか、低い親和性でしか結合しないとき、そのタンパク質と「特異的に結合する」。抗体の特異的結合能を調べる競合的結合またはラジオメトリックアッセイは、当分野でよく知られている（例えば、Maddoxら、（1993）J. Exp. Med. 158: 1211-1226を参照されたい）。このようなイムノアッセイは、典型的には、特定のタンパク質とその抗体との複合体の形成および複合体形成の測定を含んでなる。
【００６０】
本発明の抗体は、イヌ、霊長類、ブタもしくは魚ポリペプチドに対する抗体またはそのフラグメントでありうる。本発明において「抗体」という用語は、それとは反対の記載がない限り、本発明のポリペプチドと結合するフラグメントを含む。このようなフラグメントとして、Fv、F(ab')およびF(ab')2フラグメント、ならびに、一本鎖抗体が挙げられる。さらには、抗体およびそのフラグメントはキメラ抗体、CDRグラフト抗体またはヒト化抗体であってもよい。
【００６１】
抗体は生物学的サンプル中の本発明のポリペプチドを検出する方法に用いることができる。これらの方法では、まず、本発明の抗体を用意する。次に、生物学的サンプルと上記抗体とを、該抗体とポリペプチドまたは抗原との複合体を形成させる条件下で、一緒にインキュベートした後、形成された抗体−ポリペプチド複合体の量を定量する。抗体−抗原複合体の形成を定量する様々な方法が当業者にはよく知られている。
【００６２】
本発明において「生物学的サンプル」とは、限定するものではないが、組織抽出物、血液、血清、唾液、尿、脳脊髄液、および胆汁を包含することを意味する。
【００６３】
本発明の抗体は、固相支持体に結合させ、かつ／または適当な試薬、対照、説明書などと一緒に好適な容器に入れてキットとしてパッケージングすることができる。抗体は検出可能な標識に結合させることができ、従って、in vivo PXRイメージング法で用いるのに適している。
【００６４】
本発明の抗体はどのような好適な方法によって生産してもよい。抗体を調製して特徴づけるための手段は当分野ではよく知られており、例えば、HarlowおよびLane（1988）"Antibodies: A Laboratory Manual"、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYを参照されたい。例えば、抗体を生産するには、完全なポリペプチドまたはその断片、例えば、その抗原エピトープ（以後「免疫原」と呼ぶ）に対して宿主動物の体内で抗体を誘導する。
【００６５】
ポリクローナル抗体を生産する方法は、免疫原で適当な宿主動物（例えば、実験動物）を免疫した後、該動物の血清から免疫グロブリンを単離することを含んでなる。この方法では、動物に免疫原を接種する。次に、動物から血液を採取し、IgG画分を精製する。
【００６６】
モノクローナル抗体を生産する方法は、所望の抗体を生産する細胞を不死化することを含んでなる。接種済の実験動物由来の脾細胞を腫瘍細胞と融合することにより、ハイブリドーマ細胞を作製することができる（KohlerおよびMilstein （1975） Nature 256: 495-497）。所望の抗体を生産する不死化細胞は通常の方法で選択しうる。次に、ハイブリドーマ細胞は培養下で増殖させるか、あるいは、腹水を生成させるために腹腔内に注入するか、または同種宿主もしくは免疫無防備状態の宿主の血流中に注射する。
【００６７】
モノクローナル抗体とポリクローナル抗体の両方の生産に適した実験動物は、ヤギ、ウサギ、ラットまたはマウスである。所望により、免疫原をコンジュゲート（免疫原を、例えばアミノ酸残基の１つの側鎖を介して、好適な担体に結合させたもの）として投与してもよい。担体分子は、典型的には、生理学的に許容される担体である。得られる抗体を単離し、所望により精製する。
【００６８】
本発明のさらに別の態様は、様々な種におけるP450 3A4レベルに対する化合物（特に有望な新薬）の効果をプロファイリングするために用いることができるin vitro（無細胞）およびin vivo（細胞に基づく）アッセイに関する。これらのアッセイは多様な形態のいずれを採用してもよい。PXR機能を活性化する化合物はP450 3A4遺伝子発現の誘導物質であることから、本発明の選択したPXRを用いた結合および活性化アッセイは、選択した生物種においてP450 3A4を活性化することが予想される化合物を同定するための効率のよい手段を提供する。
【００６９】
本発明の結合アッセイは無細胞アッセイを包含し、このアッセイでは、選択したPXRまたは選択したPXRのリガンド結合ドメイン（単独、または融合タンパク質として存在）を、有利には検出可能な標識（例：放射性または蛍光標識）を担持する試験化合物とインキュベートする。その後、様々な技法（例えば、ゲル濾過クロマトグラフィー（例：Sephadex G50スピンカラムによる）またはヒドロキシアパタイト樹脂での捕獲）のいずれかを用いて、選択したPXRまたはそのリガンド結合ドメイン（遊離または試験化合物と結合したもの）を遊離の試験化合物から分離する。次に、選択したPXRまたはそのリガンド結合ドメインと結合した試験化合物の量を標識の検出により測定する。
【００７０】
選択したPXRまたはそのリガンド結合ドメインと結合した放射性標識試験化合物を検出する別の手法として、シンチレーション近接アッセイ（SPA）がある。このアッセイでは、ビーズ（またはその他の粒子）にシンチラント（scintillant）を含浸させ、選択したPXRまたはそのリガンド結合ドメインを捕獲することができる分子でコーティングする（例えば、ストレプトアビジンでコーティングしたビーズを用いて、ビオチン化PXRリガンド結合ドメインを捕獲することができる）。放射能カウントが検出されるのは、放射性標識試験化合物と選択したPXRまたはそのリガンド結合ドメインとの複合体がSPAビーズの表面に捕獲され、放射性標識がシンチラントに十分接近してシグナルを発したときだけである。この手法は、結合した試験化合物から遊離の試験化合物を分離する必要がないという利点がある（Nicholsら、Anal. Biochem. 257:112-119（1998））。
【００７１】
また、試験化合物が選択したPXRのリガンド結合ドメインと相互作用するか否かを判定するアッセイは、競合結合アッセイにより実施することもできる。このアッセイでは、選択したPXRまたはそのリガンド結合ドメインを、選択したPXRと相互作用することが知られている化合物とインキュベートするが、この化合物は検出可能な標識（例：放射性または蛍光標識）を担持しているのが有利である。この反応に試験化合物を添加して、この化合物が選択したPXRまたはそのリガンド結合ドメインとの結合について標識化合物と競合する能力を調べる。遊離の既知（標識）化合物を結合化合物から分離するステップを用いる標準的なアッセイフォーマット、すなわちSPAフォーマットは、試験化合物の競合能を評価するために使用することができる。
【００７２】
試験化合物が選択したPXRを活性化し、従って、P450 3A4発現を誘導するか否かを判定するために、選択したPXRのリガンド結合ドメインを融合タンパク質（例えば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）、ヒスチジンタグまたはマルトース結合タンパク質との融合タンパク質）として調製する。融合タンパク質およびコアクチベーター（いずれか一方または両方を検出可能な標識、例えば、放射性標識または蛍光タグで標識することが有利である）を試験化合物の存在下および非存在下でインキュベートした後、コアクチベーターと融合タンパク質との結合の程度を測定する。試験化合物の存在下で相互作用が誘導されれば、その試験化合物は選択したPXRの活性化剤であることを示している。
【００７３】
本発明に従うPXR活性化アッセイは、全長PXRと、PXR結合ドメインにより認識されるDNA結合部位を１コピー以上含むリポーター系とを用いて、実施することができる。しかし、さらに好ましくは、確立されたキメラ受容体系を用いて活性化アッセイを実施する。例えば、選択したPXRのリガンド結合ドメインを、例えば酵母転写因子GAL4のDNA結合ドメインまたはエストロゲンもしくはグルココルチコイド受容体のDNA結合ドメインと融合させることができる。このキメラ（例：GAL4-PXRキメラ）の発現ベクターを、リポーター構築物と一緒に宿主細胞（例：CV-1、HuH7、HepG2またはCaco2細胞）にトランスフェクションすることができる。リポーター構築物は、リポーター遺伝子（例：CAT、SPATまたはルシフェラーゼ）の発現を駆動するキメラ中に存在する結合ドメイン（例：GAL4 DNA結合部位）により認識されるDNA結合部位を１コピー以上（例えば、５コピー）含んでいてもよい。次に、構築物を含む細胞をビヒクル単独または試験化合物を含むビヒクルのいずれかで処理し、リポーター遺伝子の発現レベルを測定する。このアッセイによれば、試験化合物の存在下でリポーター遺伝子の発現が増強されれば、該試験化合物は選択したPXRを活性化し、従って、その生物種においてCYP3A4遺伝子発現の誘導物質として機能しうることを示す。
【００７４】
本発明と共に用いるのに適した別のフォーマットは、酵母ツーハイブリッドアッセイである。これは、酵母において行われるタンパク質−タンパク質相互作用を検出するための確立された手法である。ベイト（餌：bait）に相当するタンパク質#1を、DNA結合ドメイン（例えば、GAL4）とのキメラとして酵母において発現させる。捕食体(predator)に相当するタンパク質#2を、強力な転写活性化ドメインとのキメラとして、同じ酵母細胞において発現させる。ベイト（餌）と捕食体の相互作用により、結果的にリポーター遺伝子（例：ルシフェラーゼまたはβ−ガラクトシダーゼ）の活性化または選択マーカー（例：LEU2遺伝子）の調節が起こる。この手法をスクリーニングとして用いて、例えば、選択したPXRと、コアクチベータータンパク質（例：SRCI、TIFI、TIF2、ACTR）のようなその他のタンパク質またはそれらの断片との間のリガンド依存性相互作用を検出することができる（Fieldsら、Nature 340: 245-2.46（1989））。
【００７５】
さらに別のフォーマットは、リガンド誘導型複合体形成（LIC）アッセイである。このアッセイでは、核受容体−DNA相互作用に対するリガンド媒介効果を検出する。選択したPXR（または、少なくともそのDNAおよび／またはリガンド結合ドメイン）を、確立されたPXR／RXR結合部位に相当するDNAの存在下で、そのヘテロ二量体パートナーRXRと一緒にインキュベートする。次に、試験化合物がPXR／RXRヘテロ二量体とDNAとの結合を増強または妨害する能力について、該試験化合物をアッセイすることができる（Formanら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4312-4317（1997））。
【００７６】
好ましい実施形態において、スクリーニングアッセイは、FRET（Fluorescence Resonance Emission Transfer: 蛍光共鳴発光転移）アッセイ（Nicholsら（1998）Anal. Biochem. 257: 112-119）の形をとる。このスクリーニングアッセイは、第１位置に存在するドナーと、第２位置に存在するアクセプターからなるサンプル部分を、ドナーにおいて第１電子移動を誘導することができる第１波長の光に曝露するステップを含んでなる。上記ドナーはランタニドキレートと該キレートに結合することができるランタニドとの複合体からなる。ドナー発光とアクセプター吸収のスペクトル重複は、アクセプター発光の検出可能な増加により測定して、ドナーからアクセプターへのエネルギー転移を可能にするのに十分なものである。好ましい実施形態では、SRC-1（LCD2、677-696）ランタニドキレートを用いる。好ましくは、ランタニド元素はユーロピウムからなり、シグナルキレートは本発明のPXRに結合したユーロピウムからなる。また、PXRに結合したユーロピウムと、SRC-1に結合したAPC(アロフィコシアニン)からなるシグナル対（例えば、Parksら（1999）Science 284：1365-1368）を用いてもよい。
【００７７】
前記アッセイでスクリーニングすることができる好適な試験化合物としては、コンビナトリアルライブラリー、規定された化学種および化合物、ペプチドおよびペプチドミメチック、オリゴヌクレオチド、ディスプレイライブラリー（例：ファージディスプレイライブラリー）のような天然物ライブラリー、ならびに、抗体物質が挙げられる。
【００７８】
典型的には、有機分子、好ましくは、分子量が50〜2,500ダルトンの小有機分子をスクリーニングする。候補試験化合物は生体分子、例えば、サッカリド、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体、およびそれらの組合せでありうる。このような試験化合物は合成および天然化合物のライブラリーを含めて非常に多様な供給源から得られる。さらに、既知の薬物を定方向のまたはランダムな化学的修飾（例えば、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化など）に付すことにより、構造的類似体を製造することも可能である。
【００７９】
試験化合物は、例えば、１回の反応につき10種の化合物の初期スクリーンに用いた後、阻害または活性化を示す上記バッチの化合物を個々に再スクリーニングすることができる。試験化合物は、１nM〜1000μM、好ましくは１μM〜100μM、さらに好ましくは１μM〜10μMの濃度でスクリーニングすることができる。好ましくは、試験化合物の活性を、既知活性化剤または阻害剤の活性と比較する。阻害剤として作用する試験化合物は、該受容体の活性の50％阻害をもたらすのが好ましい。あるいは、活性化剤として作用する試験化合物は、既知活性化剤を用いて得られる最大活性の50％をもたらすのが好ましい。
【００８０】
比較薬理学は、ヒト以外のモデル動物を用いて、ヒトにおける化合物の効果を予測したり、またはヒトにおける化合物の効果に対する対照を提供したりするものである。従って、本発明のPXRを用いた前記のようなアッセイから得られた結果は、対象化合物が、類似したヒト受容体と同様に、あるいは、これとは異なって、該受容体をモジュレートするか否かに関して重要な情報を提供する。
【００８１】
さらに、ヒトPXRの活性化と、本発明の非ヒトPXRまたは前臨床試験でモデルとして用いられる他の非ヒト動物由来のPXRの活性化と、の比較は、ヒトにおけるP450 3A4に対する試験化合物の作用を予測できる前臨床モデル動物を選択する上で有用である。この方法では、試験化合物の存在下でのヒトPXRのin vitro活性化を、同じ試験化合物の存在下での様々な前臨床モデル動物由来のPXR（限定するものではないが、本発明のPXRを含む）のin vitro活性化と比較する。前臨床モデル動物由来のPXRが、試験化合物の存在下でヒトPXRと類似したin vitro活性化を示す場合には、ヒトにおけるP450 3A4に対する試験化合物の作用を予測できる前臨床モデル動物であることを示している。
【００８２】
本発明の非ヒトPXRの活性化を各種ステロイド、生体異物、および胆汁酸の存在下で試験した。本発明の非ヒトPXRの活性化に対する効果をスクリーニングされたステロイドおよび生体異物は、下記のものを含んでいた：プレグネノロン16a-カルボニトリル（PCN）；リファンピシン；３アミノエチルベンゾエート；TCPOBOP（1,4-ビス[2-(3,5-ジクロロピリジルオキシ)]ベンゼン）；エポキシコレステロール；RU 486；オメプラゾール；プリミドン；エトスクシミド；ニフェジピン；メチラポン；レセルピン；トランス−ナノクロル；アンドロスタノール；クロフィブレート；クロフィブリン酸；トログリタゾン；6,16-ジメチルプレグネノロン；プレグネノロン；17a-OHプレグネノロン；プロゲステロン；17a-OH-プロゲステロン5b-プレグナン3,20-ジオン；コルチコステロン；コルチゾン；DHEA（デヒドロエピアンドロステロン）；DHT（ジヒドロテストステロン）；スピロノラクトン；b-エストラジオール；タモキシフェン；デキサメタゾン；デキス-t-ブチルアセテート；ヒロドコルチゾン；d-アルドステロン；酢酸シプロテロン；ヒペルフォリン；フェノバルビタール；カルバマゼピン；フェニトイン；クロトリマゾール；SR12813；ロバスタチン；メバスタチン；スクアレスタチンおよびクロルプロマジン。本発明の非ヒトPXRの活性化に対する効果をスクリーニングされた胆汁酸は、下記のもの含んでいた：12-ケトリトコール酸；3,6-ジケトコラン酸；3,7-ジケトコラン酸；3a,7a-ジヒドロキシ-12-ケトコラン酸；6-ケトリトコール酸；7,12-ジケトリトコール酸；7-ケトデオキシコール酸；7-ケトリトコール酸；ケノデオキシコール酸；コール酸；デヒドロリトコール酸；デオキシコール酸；7-ケトデオキシコール酸メチルエステル；グリコケノデオキシコール酸；グリココール酸；グリコデヒドロコール酸；グリコデオキシコール酸；グリコヒオコール酸；グリコヒオデオキシコール酸；タウロデオキシコール酸；グリコリトコール酸；ヒオコール酸；ヒオデオキシコール酸；リトコール酸；ムロコール酸；タウロケノデオキシコール酸；タウロコラン酸；タウロコール酸；タウロデヒドロコール酸；タウロヒオコール酸；タウロデオキシコール酸；タウロリトコール酸；タウロ-b-ムリコール酸；ウルソコラン酸；ウルソデオキシコール酸；a-ムリコール酸；b-ムリコール酸；5b-コラン酸-7a,12a-ジオール-3-オン；および5b-コラン酸-3,7,12-トリオン。実施例２に記載した共トランス活性化(co-transactivation)アッセイを用いて、これらの化合物をスクリーニングした。活性化は、対照遺伝子のトランスフェクションレベルに対して基準化した分泌型の胎盤アルカリホスフェート（基準化SPAP）のレベルの測定により評価した。これらの実験から得られた結果を図１〜８に示す。生体異物およびステロイドは、特にグラフに示さない限り、10μMの濃度で評価した。胆汁酸は、特にグラフに示さない限り、100μMの濃度で評価した。
【００８３】
これらの実験からわかるように、様々な種由来のPXRは、同じ化合物の存在下で多様な活性化パターンを示した。これらと同様の活性化スクリーニングアッセイを他の試験化合物、最も好ましくは、開発中の新薬について実施することができる。これらアッセイから得られた結果は、PXR比較薬理学において有用であり、また、ヒトにおける効果を予測できる前臨床試験に適したモデル動物を選択する上で有用である。
【００８４】
以下に示す非限定的な実施例により、本発明をさらに詳しく説明する。
【実施例】
【００８５】
実施例１：配列の特定決定
ブタ、イヌ、ゼブラフィッシュ、およびアカゲザル由来の４つのPXR LBD配列をクローニングした。各々ほぼ同じストラテジーを用いて、各配列の単離を達成した。別の種由来のPCRプライマーをクロスハイブリダイズさせるか、またはESTデータベース中のLBD配列の一部をみいだすかのいずれかにより、LBDの小さいストレッチを取得した。次に、該LBDの残部を単離するために、A）5’配列を単離する場合には、DBDの標準的なP-ボックスを示す縮重オリゴ、またはB）3’配列を単離する場合には、オリゴd(T)20-G、d(T)20-Cもしくはd(T)20-A、のいずれかと組み合わせた出発配列内からのプライマーを用いて、隣接配列のPCR増幅を行った。該配列をポリ(A)尾部まで誘導した後、コード配列と隣接するプライマーを用いて全長LBDを作製した。各全長LBDの少なくとも３回の独立した増幅試験により野生型配列を決定した。
【００８６】
ブタPXR LBDをクローニングするために、FastTrack 2.0 RNA調製キット（InVitrogen、サンディエゴ、CA）を用いて凍結ブタ肝臓（1g）から全mRNAを調製した。cDNAサイクルキット（InVitrogen、サンディエゴ、CA）を用いたRT-PCRにより、オリゴd(T)プライマーを用いたcDNA合成を実施した。相同マウスPXR LBDプライマーを用いて、このcDNAからブタPXR LBDの約250塩基対のストレッチを増幅した。
【００８７】
イヌPXR LBDをクローニングするために、ヒトPXR LBDプライマーを用いて、イヌ肝臓5'ストレッチλgt11 cDNAライブラリー（Clontech、Palo Alto、CA）から約450塩基対の断片を増幅した。
【００８８】
アカゲザルPXR LBDをクローニングするために、ヒトプライマーを用いて、アカゲザル肝臓cDNAライブラリーからアカゲザルPXR LBDの末端以外の全部を増幅した。プライマー配列5'-TGC CGT GTA TGT GGG GAC AAG GC-3'（配列番号９）および5'-GGC ATG AAG AA GAG ATG ATC ATG-3'（配列番号10）を用いて、CMVSport6ベクターに構築したアカゲザル肝臓ライブラリーから274塩基対の断片を増幅した。この断片を配列決定し、このアカゲザル配列に基づいて新しいプライマーを設計した。次に、これらのプライマーをベクターアームプライマーと一緒に用いて、配列決定された既知の断片の5'および3'側の領域を増幅した。
【００８９】
ゼブラフィッシュ（Danio rerio）PXR LBDをクローニングするために、PXR LBDの初期断片をEST配列（登録番号AI943313）として同定した。この配列を用いて、ゼブラフィッシュ胚（48時間）オリゴd(T)プライムドcDNAを用いて合成したcDNAから全LBDを増幅するためのプライマーを設計した。
【００９０】
実施例２：共トランスフェクションアッセイによる選択したPXRの特性決定
細胞に基づくアッセイでPXRを活性化する能力についてリガンドを評価するために、一過性のトランスフェクション法を用いた。PXRリガンド結合ドメインをGal4 DNA結合ドメインに融合させて、Gal4応答エレメント（酵母UASG由来）により調節されたリポーター遺伝子に対して試験した。以前に記載されたように（Jonesら、2000 Molecular Endocrinology, 第14巻、pp. 27-39）、リポフェクタミンに基づく一過性トランスフェクションアッセイを実施したが、ただし、(CYP3A1DR3)2-tk-CATリポーターベクターの代わりに、UAS-tk-SPAPリポーターベクターを用いた。胆汁酸を試験する場合は、細胞による胆汁酸の取込みを促進するために腸胆汁酸輸送体（IBAT）をコードする発現プラスミドを添加した。
【００９１】
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【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】各種ステロイドおよび生体異物の存在下での霊長類PXRの活性化を示す棒グラフである。
【図２】各種ステロイドおよび生体異物の存在下でのイヌPXRの活性化を示す棒グラフである。
【図３】各種ステロイドおよび生体異物の存在下でのブタPXRの活性化を示す棒グラフである。
【図４】各種ステロイドおよび生体異物の存在下での魚PXRの活性化を示す棒グラフである。
【図５】各種胆汁酸の存在下での霊長類PXRの活性化を示す棒グラフである。
【図６】各種胆汁酸の存在下でのイヌPXRの活性化を示す棒グラフである。
【図７】各種胆汁酸の存在下でのブタPXRの活性化を示す棒グラフである。
【図８】各種胆汁酸の存在下での魚PXRの活性化を示す棒グラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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