(57)【要約】本発明はアテローム性動脈硬化性疾患の重要な病原因子としての脂質酸化抗体の同定に関する。このような抗体の存在はこのような疾患の診断および予後診断のための重要なマーカーであり、本明細書ではアテローム性動脈硬化性病状の評価のための方法および手段が提供される。
2005501258.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体から得られたサンプルに由来する抗体の、脂質を酸化する能力を試験することを含む、アテローム性動脈硬化性疾患に関して個体を評価する方法。
【請求項２】
前記抗体の、クラミジア細胞抗原と結合する能力を試験することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
個体から得たサンプルに由来する抗体分子のクラミジア細胞抗原に対する結合を判定する工程、および該抗体分子の脂質酸化活性を決定する工程を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記サンプルをクラミジア細胞抗原と接触させること、および脂質の酸化を判定すること、を含んでなる、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
その脂質抗原がクラミジア細胞に含まれている、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
脂質の酸化が脂質酸化生成物の産生を判定することにより判定される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
脂質酸化生成物がマロンジアルデヒド(MDA)である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
脂質の酸化が赤血球溶血を判定することにより判定される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
脂質の酸化が微小容器からのリポーター物質の放出を判定することにより判定される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
サンプル中の前記抗体分子の量を測定することを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
アテローム性動脈硬化性疾患がアテローム性動脈硬化症である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
クラミジア細胞がクラミジア・プシタッシ（Chlamydia psittaci）群に属する種に由来する細胞である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
クラミジア細胞がヒツジクラミジア・プシタッシ（Chlamydia psittaci）細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
アテローム性動脈硬化性疾患に関して個体を評価する方法における、単離されたクラミジア細胞の使用。
【請求項１５】
アテローム性動脈硬化性疾患に関して個体を評価する方法における、単離されたクラミジア抗原の使用。
【請求項１６】
個体から得たアテローム性動脈硬化性病変部サンプルから抗体集団を単離すること、および該集団からクラミジア細胞との反応性を有する1以上の抗体を単離すること、を含む、脂質酸化抗体を単離する方法。
【請求項１７】
1以上の抗体の脂質酸化活性を決定することを含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項１８】
請求項６１または請求項６２に記載の方法によって得られる脂質酸化抗体。
【請求項１９】
脂質酸化活性を有し、かつクラミジア細胞と結合する、抗体分子。
【請求項２０】
ヒト血清リポタンパク質と結合する、請求項６４に記載の抗体分子。
【請求項２１】
アテローム性動脈硬化性疾患に関して個体を評価する方法において使用するための、単離されたクラミジア細胞と酸化判定試薬とを含むキット。
【請求項２２】
アテローム性動脈硬化性疾患に関して個体を評価する方法において使用するための、単離されたクラミジア抗原と酸化判定試薬とを含むキット。
【請求項２３】
アテローム性動脈硬化性疾患に関して個体を評価する方法において使用するための、単離されたクラミジア抗原、微小容器およびリポーター物質を含むキット。
【請求項２４】
アテローム性動脈硬化性疾患に関して個体を評価する方法において使用するための、単離されたクラミジア抗原とフリーラジカル伝播促進剤（propagator）とを含むキット。
【請求項２５】
請求項１の方法を用いてアテローム性動脈硬化性疾患を有すると評価された個体を治療する方法であって、該個体において前記抗体の脂質酸化活性を低下させる処置を該個体に施すことを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は個体におけるアテローム性動脈硬化症および関連病状の評価法ならびに治療法に関する。本発明の方法はアテローム性動脈硬化症および関連病状の臨床診断、予後診断、予防および治療に有用である。
【背景技術】
【０００２】
コレステロール[Swartz G.M., Jr.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988), 85, 1902-1906,  Alving C.R.およびSwartz G.M., Jr. Critical Reviews in Immunology (1991), 10, 441-453.]、リン脂質[Alving C.R. Biochem. Soc. Trans. (1984), 12, 342-344.]および低密度リポタンパク質(LDL)のような脂質に対する自己抗体がヒト血漿中に見られ[Kabakov A.E.ら, Clin. Immun. Immunopath. (1992), 63, 214-220, Mironova Mら,同書 (1997), 85, 73-82.]、それがアテローム性動脈硬化症の発症に関与している[Lopes-Virella M.F.およびVirella G. Clin. Immun. Immunopath. (1994), 73, 155-167, Kiener P.A.ら, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. (1995), 15, 990-999.]。
【０００３】
また一方で、抗体もLDLも病原因子ではないが、その2つからなる免疫複合体だけは病原因子である[Tertov V.Vら, Atherosclerosis (1990), 81, 183-189, Orekhov A.N.ら, Biochem. Biophys. Res. Comm. (1989), 162, 206-211.]。
【０００４】
未修飾の血漿リポタンパク質を含む免疫複合体はアテローム原性(atherogenicity)は低いことが知られている。しかし、リポタンパク質が修飾を受けると、特に酸化されると、これらの免疫複合体は高いアテローム原性を示すようになる[Orekhov A.N.ら, Biobhem. Biophys. Res. Comm. (1989), 162, 206-211, Orekhov A.N.ら, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. (1991), 11, 316-326.]。過酸化の形態をとる血漿脂質の酸化は、一般にアテローム性動脈硬化症の発症の原因と考えられ、それは、病院において一貫して見られ、かつ報告がなされているこの疾病の特徴である[Goto Y. In: Lipid Peroxides in Biology and Medicine, Yagi K.編, Academic Press, New York, London, Tokyo (1982), 295-303, Halliwell B.およびJ.M.C. Gutteridge, Free Radicals in Biology and Medicine, Clarendon Press, Oxford, 1989, Schultz Dら, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. (2000), 20, 1412-1413.]。しかし、本発明の開示までは血漿におけるこの過酸化の原因は明らかではなかった。
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、自己抗体のあるサブグループが、脂質およびリポタンパク質と結合し、かつこれらを酸化することができるという発見に関連する。これらの触媒抗体は低密度リポタンパク質と反応してこれを酸化し、アテローム原性因子を大量に生成する。これらは最初に報告された抗脂質アブザイムの例である。
【０００６】
本明細書に記載の触媒抗体は、例えば個体においてアテローム性動脈硬化性疾患を評価、判定または検出する方法において、アテローム性動脈硬化性疾患に関連する種々の用途を有する。このような方法は個体においてアテローム性動脈硬化性疾患の存在または重篤度を判定するため、あるいは個体が将来的にアテローム性動脈硬化性疾患に罹患するリスクを判定するために使用できる。本明細書に記載の触媒抗体はまた、アテローム性動脈硬化性疾患の治療に関連した方法および手段においても有用である。
【０００７】
種々の態様では、本発明はアテローム性動脈硬化性疾患に関して個体を評価する方法を提供する。
【０００８】
アテローム性動脈硬化性疾患に関して個体を評価する方法は、個体から得られたサンプルに由来する抗体の、脂質を酸化する能力を試験することを含む。
【０００９】
サンプル中に脂質を酸化する抗体が存在することは、その個体がアテローム性動脈硬化性疾患を有するかまたはそれに罹患している、あるいはその個体が将来的にそのような疾患に罹患するリスクがあることを示す。このような抗体の量、レベルまたは活性はこの疾患の重篤度の指標である。すなわち、抗体の量および／または活性が増大していることは疾患の重篤度が増していることを示す。従って、これらの方法は個体におけるアテローム性動脈硬化性疾患の存在および／または重篤度を判定するために適している。
【００１０】
このような方法は、例えば固定化した抗イディオタイプ抗体を用いて血清サンプルから抗体を捕捉し、捕捉した抗体の脂質酸化活性を決定することを含んでなる。
【００１１】
脂質酸化抗体は、結合活性および触媒活性の双方に関連する、免疫グロブリンスーパーファミリー(例えば、IgG、IgMまたはIgEなどの免疫グロブリン)のメンバーである分子である。例えばプロテインGを用いて精製した後、脂質酸化抗体は抗原との結合および触媒活性(すなわち、脂質の酸化)の双方を示す。
【００１２】
結合活性および触媒活性はいずれも脂質酸化抗体に本来的に備わったものでありうる。あるいは、脂質酸化活性は、該抗体と強固に結合してそれとともに複合体として(例えば、プロテインG／プロテインAまたはプロテインLカラムを用いて)同時精製される触媒分子によるものでありうる。この触媒分子は免疫グロブリン、または酵素もしくは金属イオンなどの非免疫グロブリンでありうる。精製後、この複合体は抗体に由来する結合活性と触媒分子に由来する触媒活性を示す。あるいは、脂質酸化抗体は別のメカニズムにより、例えば脂質抗原の環境を変化させる(例えば、単球の活性化による)ことにより、または脂質もしくはリポタンパク質を変化させて脂質の酸化を促進することにより、脂質の酸化を誘導しうる。
【００１３】
触媒抗体は、様々な抗原が保持する特定のエピトープに特異的であってそのために同じエピトープを有する異なる抗原と結合するものでもよい。この抗体は他のエピトープとは有意な結合を示さないと考えられる。従ってこの抗体はそのエピトープと、またはそのエピトープを含む抗原と、「特異的に結合する」と言える。この抗体によって認識されるエピトープは、宿主分子と、感染因子（例えば細菌、真菌、ウイルスまたは原生動物）由来の抗原とが共有するものであってよい。すなわち、例えば病原体感染の際に、外来抗原に応答して宿主が産生する脂質酸化抗体は宿主の脂質もしくはリポタンパク質、または他の抗原と交差反応しうる。
【００１４】
このように、脂質酸化抗体は宿主分子とも外来抗原とも結合でき、これらの分子の一方または双方の酸化を触媒することができる。
【００１５】
抗原は、ある範囲の感染性因子(例えば、2種以上のグラム陰性菌)で見られる高い配列同一性を共有する分子のファミリー(例えば、ホモログ)のメンバーであってもよいし、あるいは抗原は特定の感染性因子に特異的(すなわち、他種においてそのホモログが存在しない)なものであってもよい。また、同じエピトープが、高いレベルの配列同一性をそれ以外の部分では共有しない異なる感染性因子(すなわち、ホモログ)に由来する抗原に存在する場合もある。ある範囲の感染性因子に共通する抗原の例としては、アポリポタンパク質B、OmpA、リポ多糖(LPS)、hsp60 MQMP、(P)OMP、p54およびリピドAが挙げられる。
【００１６】
本発明の方法の被験体となりうる個体としては、ヒト、ならびにイヌ、ネコ、ウマおよびオウムなどの飼育動物、ヒツジおよびウシなどの家畜、およびゾウおよびトラなどの希少動物または外国産動物をはじめとする非ヒト動物が挙げられる。本明細書での「ヒト」についての言及は、特に他に断りのない限り、「非ヒト動物」も包含するものと理解すべきである。
【００１７】
本明細書に記載の方法における抗体はサンプルから単離、精製および／または抽出されていてもよく、あるいはまた個体から得られた血清、血漿、血液またはその他の生体サンプル中に含まれているものでもよい。抗体は血液、血清または血漿サンプルに含まれていることが好ましく、例えばIgG分子であってもよい。
【００１８】
脂質の酸化を触媒する抗体分子を、本明細書では触媒抗体分子、抗脂質アブザイム、アブザイムまたは脂質酸化抗体と呼ぶ。上記のように、このような触媒抗体は、内在的なもしくは本来的に備わっている脂質オキシダーゼ活性、または脂質酸化をもたらすその他の活性を有するか、あるいは脂質オキシダーゼ活性を有する分子と天然に会合している(すなわち、それらの天然状態でその本体内で非共有結合的に結合または付着している)ものであってよい。
【００１９】
本明細書に記載の方法は個体がアテローム性動脈硬化性病状を有するかどうかを判定する上で、また、適切な治療方針を決定する上で有用でありうる。例えば、1つの方法は、個体から得られたサンプルに由来する抗体の、脂質を酸化する能力を試験し、必要であれば後述のように個体の血管系において抗体により媒介される脂質酸化活性を低下させることを含むものでありうる。
【００２０】
本願における実験データは、クラミジア感染に応答して誘導される抗体のサブグループが、宿主抗原と交差反応し、かつ、血漿の脂質過酸化の原因となる自己抗体であることをさらに示す。触媒性抗クラミジア抗体は、ヒトアテローム性動脈硬化性病変部とアテローム性動脈硬化症の臨床合併症を示す患者の血清とから抽出された抗リポタンパク質IgG画分には存在するが、健康人の血清から抽出されたIgGには存在しないことが示されている。よって、本明細書に記載のような脂質と結合してこれを酸化する触媒抗体は、クラミジア細胞との反応性を有し、すなわちそれと結合しうるものである。
【００２１】
アテローム性動脈硬化症は、以前には、細菌クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)が動脈壁に存在することと関連付けられていた[Roivainen M.ら, Circulation (2000), 101, 252-257, Siscovick D.S.ら,. J. Infect. Dis. (2000), 181, Suppl. 3, S417-420および米国特許第6,281,199号]が、患者の血漿または血清中の特異的な抗クラミジア抗体を検出するための血清学的試験[Mendall M.ら, (1995) J. Infect. 30 121-128, Wang S-Pら, (1970) 70 367-374]を用いてアテローム性動脈硬化症患者を同定または識別することはできない。その集団のうちかなりの割合がクラミジア感染歴を持ち、その結果、アテローム性動脈硬化症の臨床徴候がなくても、血清中に特異的抗クラミジア抗体を有する[Davidson M.ら, Circulation (1998), 98, 628-633m, Song Y.G.ら, Yonsei Med. J.(2000), 41, 319-327.]。よって、血漿または血清中に抗クラミジア抗体が存在すること自体はアテローム性動脈硬化症の指標とはならない。
【００２２】
しかし、本明細書では、ヒト抗原と交差反応し、血漿リポタンパク質の酸化を触媒する触媒性抗クラミジア抗体が、アテローム性動脈硬化性疾患のマーカーとしても、そのような疾患の治療標的としても有用であることを示す。
【００２３】
このことから、アテローム性動脈硬化性疾患に関して個体を評価するアッセイ法は、個体から得られたサンプルに由来する抗体について、クラミジア細胞抗原と結合し、かつ、脂質を酸化する能力を試験することを含みうる。
【００２４】
いくつかの実施形態において、1つの方法は、個体から得られたサンプルに由来する抗体分子の脂質酸化活性を決定することを含み、その場合、該抗体分子はクラミジア抗原と結合するものである。
【００２５】
別の実施形態において、1つの方法は、個体から得られたサンプルに由来する抗体分子のクラミジア抗原との結合を判定することを含み、その場合、該抗体分子は脂質酸化活性を有する(すなわち、脂質を酸化する)ものである。
【００２６】
なおさらなる実施形態において、1つの方法は、個体から得られたサンプルに由来する抗体分子のクラミジア抗原との結合を判定すること、および該抗体分子の脂質酸化活性を決定すること、を含みうる。
【００２７】
クラミジア抗原との反応性を有し(すなわち、それと結合し)、かつ、脂質を酸化する生物活性を有する抗体分子がサンプル中に存在することは、その個体がアテローム性動脈硬化性疾患に罹患しているか、該疾患に罹りやすいか、またはその疾患のリスクがあることの指標である。すなわち、1つの方法では、このような個体がアテローム性動脈硬化性疾患を有するかどうかを該活性および結合から推断することをさらに含みうる。
【００２８】
サンプル中に存在する脂質酸化抗体の量またはレベルはその病状の重篤度の指標となる。このような抗体分子は血漿リポタンパク質、特に低密度リポタンパク質、例えば以下のようなApo-Bの、脂質部分を酸化、特に過酸化することができる。
【００２９】
脂質酸化抗体分子は抗クラミジアアブザイムであっても抗体分子であってもよく、すなわち、それらはクラミジア細胞抗原と結合するか、またはそれとの反応性を有する。
【００３０】
本明細書に記載のようなクラミジア抗原はクラミジア細胞の任意の免疫原または免疫原性成分であってよく、すなわち、哺乳類においてクラミジア細胞に対して免疫応答を惹起するか、または惹起できるクラミジア由来の分子、例えばHsp60であってもよい(Huittinenら, (2001) Eur Resp. J. 17(6) 1078-1082, Kinnunen A.ら, (2001) Scand. J. Immunol. 54(1-2) 76-81)。好ましくはこの抗原はタンパク質抗原または脂質抗原であり、すなわち、それは脂質基または脂質部分を含むか、またはそれから構成される。脂質抗原は、例えば抗クラミジア抗体と結合する、脂質、リポタンパク質または他の脂質結合細胞成分であってもよく、「脂質抗原」とはこれらの成分のいずれもを指す。好適な脂質抗原の例としてはリポ多糖(LPS)がある。抗原は精製および／または単離されていてもよいし、あるいはクラミジア細胞内、特にクラミジア細胞の表面上に含まれていてもよい。このようなリポタンパク質を精製および／または単離する好適な方法は当技術分野で周知であり、例えばHPLCがある。
【００３１】
ヒトアポリポタンパク質Bに対する抗体はクラミジア細胞との反応性を有することが示されている(実施例７参照)。いくつかの実施形態では、このように、本明細書に記載のような脂質酸化抗体は例えばヒトアポリポタンパク質Bとの反応性を有しうる。このような抗体はまた、クラミジアリポ多糖(LPS)との反応性を有しうる。
【００３２】
クラミジア細胞はクラミジア・プシタッシ(Chlamydia psittaci)群に属する種に由来する細胞であってもよい。クラミジア・プシタッシ群には、クラミジア・プシタッシ(Chlamydia psittaci)およびクラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)が含まれる。いくつかの好ましい実施形態では、クラミジア細胞はヒツジ・クラミジア・プシタッシ細胞である。凍結乾燥形態のヒツジ・クラミジア・プシタッシ生菌の適当な調製物が市販されている(Intervet)。
【００３３】
上記のように、脂質の酸化(過酸化など)は、循環中のリポタンパク質を高度にアテローム原性である因子へ変換することをもたらす主要なプロセスの1つであり[Goto Y. (1982) 上記, Halliwell B., およびJ.M.C. Gutteridge, (1989) 上記, Schultz D., およびHarrison D.G. (2000) 上記]、そのため、触媒酵素、例えばクラミジア感染に応答して誘導される触媒抗体は、アテローム性動脈硬化症の発症の原因となる重要な病原因子である。さらに、このような役割のために、これらの触媒抗体はアテローム性動脈硬化症に関連する病状における治療的介入の重要な標的となる。
【００３４】
本明細書に記載のようなアテローム性動脈硬化性疾患の評価方法は、ある個体に対する最適な治療処置を決定する上で有用である。例えば、アテローム性動脈硬化性病状の指標である抗脂質アブザイムを有する個体に、病状またはその症状を緩和するための治療処置を施せばよい。この抗脂質アブザイムのレベルまたは量は病状の重篤度の指標となり、そのため特定の治療方針が適切であるか否かを決定するために使用できる。
【００３５】
アテローム性動脈硬化性疾患に罹りやすいか、または罹患するリスクが高いことが分かっている個体が、該疾患を発症するリスクを減少させるため、または発症を遅延させるかもしくは予防するために、あるいは該疾患の重篤度を軽減するために、例えば後述のように抗酸化剤または抗生物質による治療を受けることもありうる。
【００３６】
よって本発明は、後述のように、前記個体において、特に該個体の血管系において、抗体により媒介される脂質酸化活性を低下させる工程をさらに含んでなる方法を包含する。
【００３７】
抗クラミジア抗体に関する現行の血清学的試験がそれらのレベルを希釈率または力価で測定するようデザインされており半定量的であるのに対し、本明細書に記載の方法では、これらの抗体の触媒画分によって生ずる脂質の過酸化の程度を測定することが可能となる。酸化反応の発生の程度は、サンプル中に存在する触媒性抗クラミジア抗体の濃度の線形関数となる(図２参照)。よって、本発明の方法はサンプル中の触媒性抗クラミジア抗体のレベルの測定を提供する定量的アッセイを提供する。
【００３８】
本明細書に記載のようなアテローム性動脈硬化性病状を評価する方法はサンプル中の抗体分子の量を定量、測定または決定することを含む。この量は、任意の都合の良い方法により、例えば脂質酸化または脂質酸化活性の量、レベルまたは程度を決定し、それを存在する抗体の量と相関させることにより、決定することができる。
【００３９】
個体からのサンプル中の触媒性抗クラミジア抗体の量の定量は、アテローム性動脈硬化性疾患に対するその個体のリスクまたは罹りやすさの程度を定量化するために使用することができる。
【００４０】
また、サンプル中の触媒性抗クラミジア抗体の量は前記疾患の重篤度の指標でもある。よって、本明細書に記載の方法は、個体におけるアテローム性動脈硬化性病状の診断および予後診断に有用である。
【００４１】
脂質過酸化活性をはじめとする脂質酸化活性は、宿主脂質(例えば、サンプル由来の脂質)、クラミジア細胞などの外来抗原由来の脂質、またはアッセイ法の一部として添加されうる別の供給源由来の脂質の酸化を(例えば測定または検出することにより)判定することにより、判定されうる。
【００４２】
脂質酸化は、生成物、または共酸化される共役リポーター分子などの副生成物の蓄積、あるいは非修飾脂質などの基質もしくは酸素などの補基質の消失または消費を測定することにより判定してもよい。
【００４３】
当技術分野では脂質の過酸化を判定する多くの方法が知られており、これらは本発明に従って用いるのに適している。脂質酸化を判定する様式そのものは本発明の特徴ではなく、当業者ならばその好みや一般知識に従って適切な様式を選択することができる。
【００４４】
好適な方法は例えば、CRC Handbook of Methods for Oxygen Radical Research, CRC Press, Boca Raton, Florida (1985), Oxygen Radicals in Biological Systems. Methods in Enzymology, v. 186, Academic Press, London (1990); Oxygen Radicals in Biological Systems. Methods in Enzymology, v. 234, Academic Press, San Diego, New York, Boston, London (1994); and Free Radicals. A practical approach. IRL Press, Oxford, New York, Tokyo (1996)に記載されている。
【００４５】
好ましい実施形態では、酸化は脂質酸化生成物の産生(すなわち、その存在または量)を判定することにより判定する。
【００４６】
酸化が引き起こされた脂質の酸化生成物および／または中間体を測定してもよいし、あるいは酸化が伝播される脂質の酸化生成物および／または中間体を測定してもよい。
【００４７】
好適な脂質酸化生成物としては、マロンジアルデヒド(MDA)などのアルデヒド、(脂質)過酸化物、ジエンコンジュゲートまたは炭化水素ガスが挙げられる。脂質酸化生成物は好適な任意の方法によって測定すればよい。例えば、脂質過酸化生成物はHPLC(Brown, R.K.,およびKelly, F.J In: Free Radicals. A practical approach. IRL Press, Oxford, New York, Tokyo (1996), 119-131)、UV分光法(Kinter, M. Quantitative analysis of 4-hydroxy-2-nonenal.同書,133-145)、またはガスクロマトグラフィー-質量分析(Morrow, J.D.,およびRoberts, L.J. F2-Isoprostanes: prostaglandin-like products of lipid peroxidation.同書, 147-157)を用いて測定することができる。
【００４８】
脂質の過酸化はタンパク質、炭水化物、核酸およびその他の分子種の酸化をもたらしうる。このような酸化の生成物はまた、アブザイムの活性の間接的測定のために用いることができる。さらに、過酸化は、伝播する脂質酸化に伴ってリポーター分子の特性の変化を引き起こしうる。後述のように、リポーター分子がこれらの脂質中に、例えばリポソームとして封入されていて、リポソームからのリポーター分子の放出を酸化の指標としてもよい。
【００４９】
好適なリポーター物質および分子としては、発光細菌そのもの、ルミノール、ルシゲニン、フォラシンおよびルシフェリンが挙げられる。このような物質は、例えばペルオキシダーゼ、エステラーゼ、オキシダーゼ、ルシフェラーゼ、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、ペリレン、NAD+およびアクリジニウムエステルビス(トリクロロフェニル)オキサレートなどの分子を利用してH2O2/O2・−/O2-と共役させてもよい(Campbell A.K. Chemiluminescence. VCH, Ellis Horwood Ltd., England, 1988)。
【００５０】
フリーラジカル連鎖反応を受けやすいその他の物質も、脂質酸化を判定するために用いることができる。例えば、連鎖プロセスとしての脂質の過酸化は、アクリルアミドの重合を誘導および促進する。従って、脂質酸化は14C-アクリルアミドの共重合を判定することにより判定されうる(Kozlov Yu P. (1968) Role of Free Radicals in normal and pathological processes. Doctorate thesis - MGU Moscow 1968)。
【００５１】
脂質およびリポタンパク質の過酸化はフリーラジカルによって媒介されるプロセスであることから、脂質酸化アブザイムはこれらのラジカルを検出することにより測定されうる。ラジカルは内因性低レベル化学発光(増感剤を用いるか、もしくは用いない)(Vladimirov, Y.A.,およびArchakov, A.I. Lipid Peroxidation in Biological Membranes. Nauka, Moscow (1972); Vladimirov, Y.A. Intrinsic low-level chemiluminescence. In: Free Radicals. A practical approach. IRL Press, Oxford, New York, Tokyo (1996), 65-82)、電子スピン共鳴(スピントラッピングを用いる(Mason, R.P. In vitro and in vivo detection of free radical metabolites with electron spin resonance. In: Free Radicals. A practical approach. IRL Press, Oxford, New York, Tokyo (1996), 11-24)か、もしくはスピントラッピングを用いない(Petyaev, M.M. Biophysical approaches in the diagnosis of cancer. Medicina, Moscow (1972))、または当技術分野で周知の他の技術を利用して、検出または測定すればよい。脂質酸化はまた、この反応の脂肪酸またはその他の物質の消費を判定することにより判定されうる。
【００５２】
いくつかの好ましい実施形態では、2-チオバルビツール酸(便宜には1mM)と反応させた後に、525nmなどの適当な波長での吸光度を測定することにより、マロンジアルデヒド(MDA)の産生を判定する。
【００５３】
抗クラミジアアブザイムによって酸化される脂質としては、リポタンパク質、脂肪酸、リン脂質、コレステロール、コレステロールエステルまたはトリグリセリドの脂質部分が挙げられる。上記のように、アブザイムの脂質酸化活性もまた、タンパク質、炭水化物および／または核酸、例えばリポタンパク質のタンパク質部分および／または炭水化物部分の酸化をもたらしうる。
【００５４】
いくつかの好ましい実施形態では、例えば抗クラミジアアブザイムの有無を判定するために使用できる好都合な一段階アッセイを提供することから、クラミジア脂質の酸化が判定される。クラミジア脂質の酸化は、脂質を含むクラミジア抗原と結合してそれを酸化するクラミジア特異的抗体が存在する場合に起こる。
【００５５】
これらの好ましい実施形態に従う方法では、抗原はクラミジア細胞抗原でありうる。
【００５６】
例えば、個体においてアテローム性動脈硬化性病状を評価する方法は、
i)個体により提供されるサンプルをクラミジア細胞抗原と接触させること、および
ii)該サンプルにおける脂質の酸化を判定すること、
を含みうる。
【００５７】
脂質の酸化の判定は、クラミジア抗原との接触の結果としてもたらされる酸化の量、レベルまたは程度を決定する（例えば、測定するかまたは検出する）ことを含みうる。好ましくはこのクラミジア細胞抗原は脂質抗原であり、クラミジア細胞脂質抗原の酸化が判定される。
【００５８】
抗原は精製および／または単離されていてもよく、より好ましくは完全に細胞膜内に含まれていてもよい。好ましい実施形態では、抗原はクラミジア細胞に(例えばその表面上に)含まれていてもよい。
【００５９】
例えば、個体においてアテローム性動脈硬化性病状を評価する好ましい方法としては、
i)個体により提供されるサンプルをクラミジア細胞と接触させること、および
ii)該細胞の脂質の酸化を判定すること、
を含みうる。
【００６０】
例えばサンプルにおける、クラミジア細胞または抗原の存在下での脂質の酸化を、クラミジア細胞または抗原の不在下での脂質の酸化と比較してもよい。脂質酸化の増大が抗脂質アブザイムが存在することを示す。
【００６１】
脂質／リポタンパク質の過酸化はフリーラジカル連鎖反応であり、ある分子から別の分子へ、または脂質含有ミセルへ、または(受容体または非特異的吸収によってその膜へ付着した後)細胞全体へと、自己伝播することができる(Chemical and Biochemical Aspects of Superoxide and Superoxide Dismutase. Elsevier/North-Holland, New York, Amsterdam (1980); Lipid Peroxides in Biology and Medicine. Academic Press, Orlando, San Diego, San Francisco, New York, London (1982); Halliwell, B.,およびGutteridge, J.M.C. Free Radicals in Biology and Medicine. Clarendon Press. Oxford (1996); Oxidants, Antioxidants, and Free Radicals. Taylor and Francis, Washington (1997))。
【００６２】
本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、過酸化の伝播を利用して脂質酸化アブザイムの検出を容易にする。
【００６３】
例えば、フリーラジカル分解を受けやすい材料から構成される膜(例えば、リン脂質膜)を有するリポソーム、小胞またはマイクロカプセルなどの微小容器に色素、蛍光色素、またはその他のリポーター物質もしくは検出物質、例えば、エオシン、フルオレサミン、ローダミンBまたはマラカイトグリーンを充填し、脂質酸化アブザイムの検出に用いてもよい。こうして、本明細書に記載の方法における脂質酸化は封入されたリポーター物質の放出を判定することにより判定してもよい。
【００６４】
充填した微小容器を血漿または血清サンプルと混合すればよい。次に、便宜にはクラミジア細胞中に、またはその一部に含まれるクラミジア抗原を、その混合物に加える。次に、サンプル中に脂質酸化アブザイムがあればそれが抗原と結合し、過酸化が引き起こされる。
【００６５】
クラミジア抗原とアブザイムとの相互作用による脂質／リポタンパク質酸化が引き起こされると、自己伝播し、微小容器のコーティングへと広がる。これがコーティングに損傷を与え、リポーター物質が周囲の溶液中に放出される。次に、この放出を検出する。
【００６６】
1つの方法では、
i)脂質酸化を受けやすく、かつ、リポーター物質を含有する微小容器の存在下で個体により提供されるサンプルをクラミジア細胞抗原と接触させること、および
ii)微小容器からの該リポーター物質の放出を判定すること、
を含みうる。
【００６７】
リポーター物質の放出は、該抗体と、リポーター物質を含有する微小容器、またはリポーター物質を含有する微小容器を含んでなる組成物との接触の結果として起こる。
【００６８】
リポーターの放出によって生じたシグナルの強度が、記録可能な、すなわち検出可能なシグナルを生じるには十分でない場合、反応混合物中に、フリーラジカル伝播促進剤(propagator)または増感剤、例えば遊離イオンおよびFe2+/Co2+錯体または過渡的原子価のその他の金属を含めることができる。
【００６９】
これらの、およびその他の増感剤はある系におけるフリーラジカルの量を増加させるのに役立つ。
【００７０】
微小容器からの含有されている物質の放出は、視覚的に(または他の便宜な手段によって)示されうる、反応混合物の物理／化学特性の変化をもたらす。あるいは、損傷した／断片化した／溶解した微小容器は、能動的遠心分離または受動的沈降法のいずれかにより、改質されていないものから分離することができる。
【００７１】
リポソームまたはその他の微小容器(リポーター物質を充填したもの)の代わりに、血液サンプル自体からの赤血球を、抗脂質アブザイムによって生ずる伝播性の脂質／リポタンパク質の過酸化の標的として用いてもよい。クラミジア菌またはクラミジア抗原は、場合により過酸化反応の伝播を確保するための増感剤の存在下で、血液サンプルに導入するかまたは血液サンプルと接触させればよい。脂質酸化は血液サンプルにおいて赤血球の溶血を判定することにより判定すればよい。
【００７２】
そのサンプルにおいてクラミジア抗原とアブザイムとの相互作用により脂質／リポタンパク質の酸化がわずかでも開始されれば、自己伝播し、赤血球細胞膜へと広がり、それによって損傷が生じ、そしてついには細胞溶解が起こる。従って、クラミジア菌／抗原の添加に応答して全血サンプルにおいて溶血が現れることは、脂質酸化アブザイムの存在を示す。溶血は任意の好適な方法によって判定することができる。
【００７３】
ある方法では、
i)個体により提供される、赤血球を含むサンプルを、クラミジア細胞抗原と接触させること、および
ii)該赤血球の溶血を判定すること、
を含みうる。
【００７４】
溶血は、前記抗体を赤血球または赤血球を含む組成物と接触させた結果として起こる。
【００７５】
これらの実施形態は、それらの分析の前にサンプルについて赤血球から血漿／血清を分離する必要がないので、ある状況においては好ましいものでありうる。リポソームまたはその他の微小容器には例えばヘモグロビンの赤色とは異なる色を発色しうる材料を充填してもよい。あるいは、供試サンプルのスピン、または受動的沈降でも、損傷を受けた微小容器／赤血球は分離できる。リポーター色素の放出または溶血は、分析材料中に脂質酸化抗体が存在することを示す。シグナルの強度はそれらの活性／濃度と相関する。
【００７６】
全血は上記の方法を用いて分析でき、遠心分離の工程は必要ないので、これらの方法は実験室以外の条件または家庭条件でも使用できる。アテローム性動脈硬化症の存在または重篤度は、例えば観察されたリポーターシグナルまたは溶血を、アテローム性動脈硬化症患者および正常個体の既知の値と比較することにより判定しうる。このような比較はアテローム性動脈硬化症の特定のステージまたは重篤度におけるリポーターシグナルまたは溶血の量またはレベルを示すチャート、スケール、グラフまたはキャリブレーションを用いて行えばよい。
【００７７】
脂質の過酸化はまた、共役した酸化還元系を用いて測定することができる酸化還元プロセスである。好適な酸化還元系には、物理系および化学系が含まれる。例えば、センサーチップを用いてそれと共役した脂質酸化反応の酸化還元能の変化を検出してもよい。酸化還元酵素または酸化還元メディエーターのいずれかに基づくある範囲のセンサーチップが当業者に公知である。これらの種のセンサーはいずれも、フリーラジカル分子またはそれと共役する酸化還元分子の検出のために適合させ／使用することができる(Hall E.A.H. Biosensors. Redwood Press Ltd., Great Britain, 1990)。
【００７８】
脂質の過酸化によって生ずるH2O2の蓄積は、例えば、過酸化水素を用いてそれとは別の補基質を酸化し発色生成物を生じるであろう、共役したペルオキシダーゼに基づく反応を加えることにより、測定できる。脂質の過酸化によって生じたO2・−の蓄積は、チトクロームCまたはリボフラビンなどのO2・−感受性分子を用いることにより判定することができる。
【００７９】
あるいは、脂質の過酸化は酸素分子を消費することから、何らかのO2依存性化学反応または物理的プロセスを、例えば酸素電極またはポーラログラフィーにおいて用いることができる(Polarography. Kolthoff I.M.編, Lingane J.J. Interscience Publishers, New York, London, 19520)。
【００８０】
本発明のいくつかの態様に従う方法は、個体から血液、血清または血漿サンプルを得ることを含みうる。血清または血漿の試験サンプルは例えば個体から血液を抽出し、抽出した血液から血清または血漿を単離することにより得られる。好適な抽出法としては、細胞材料から血清および血漿を単離するための遠心分離を含む。
【００８１】
本発明のアッセイ方法を用いる上で、当業者ならば適当な対照実験を用いる必要があることは十分承知しているであろう。
【００８２】
本明細書に記載のアテローム性動脈硬化性疾患またはその病状としては、アテローム性動脈硬化症、虚血性(冠状動脈性)心疾患、心筋虚血(狭心症)、心筋梗塞、動脈瘤疾患、アテローム性末梢血管疾患、大動脈回腸動脈疾患、慢性重症下肢虚血、内臓虚血、腎動脈疾患、脳血管疾患、卒中、アテローム性動脈硬化性網膜症、血栓症および異常血液凝固、ならびに高血圧症が挙げられる。このような病状は医学的または獣医学的病状でありうる。
【００８３】
上記の病状は密接に関連しており、このような病状の1つについての傾向がそのような病状の他のものについての傾向の指標となりうる。
【００８４】
本明細書に記載の方法は、個体においてアテローム性動脈硬化性疾患の存在および／または重篤度を判定または評価するのに用いることができる。さらに、このような方法は、アテローム性動脈硬化症の症状がない個体が将来的にアテローム性動脈硬化症に罹りやすいかどうかを判定するために用いることができる。このような疾患に罹りやすい個体は、該疾患に対して、その個体が生涯のうちにこの疾病に罹るリスクが集団全体よりも高い状況に置かれている傾向を示すことがありうる。罹患しやすい個体が実際にはその疾患に罹らない場合もありうる。
【００８５】
アブザイム、特に抗クラミジアアブザイムは、アポリポタンパク質Eε4など、集団内のリポタンパク質の特定のイソ型と優先的に結合して、これを酸化する場合がある。
【００８６】
本発明のある態様は、アテローム性動脈硬化症への個体の罹りやすさを判定する方法であって、個体から得られた、集団内に2以上のイソ型を有するリポタンパク質を含むサンプルにおいて、他のイソ型と比べて優先的に脂質酸化抗体に結合するリポタンパク質イソ型がその個体から得られた該サンプル中に存在するかどうかを判定することを含む前記方法を提供する。
【００８７】
集団内のリポタンパク質の他のイソ型と比べて、本明細書に記載のような脂質酸化抗体と優先的に結合するかまたは脂質酸化抗体により優先的に酸化されるリポタンパク質イソ型を有する個体は、その集団の他の構成員よりもアテローム性動脈硬化性病状に対する罹りやすさが増大している。疾患状態と関連するリポタンパク質イソ型の例としてはアポリポタンパク質Eε4が挙げられる。
【００８８】
上記のように、アテローム性動脈硬化性疾患に罹患している個体、またはそれに罹患しやすいと同定された個体において、本明細書に記載の方法を用いる場合には、その個体、特にその個体の血管系における抗体により媒介される脂質酸化活性を、減少または低下させるさらなる工程を含みうる。これは例えばその個体に抗酸化剤および／または抗生物質を投与することによって達成されうる。
【００８９】
本明細書に記載のような方法はまた、ある集団内のアテローム性動脈硬化性疾患の罹患率を予測または検出するため、そして、このような疾患の重篤度を見積もるためにも使用できる。
【００９０】
このような方法としては、集団から得られた1以上のサンプルに由来する抗体の、脂質を酸化する能力を試験することを含みうる。
【００９１】
好ましい実施形態では、抗体の、外来抗原、例えばクラミジアなどの病原体由来の抗原と結合する能力を試験する。
【００９２】
集団から得られた、抗脂質アブザイム、例えば触媒性抗クラミジア抗体を含むサンプルの割合を、その集団内のアテローム性動脈硬化性疾患の罹患率および／または重篤度を判定するために用いてもよい。
【００９３】
本発明のその他の態様は、アテローム性動脈硬化性疾患に関して個体を評価する方法における、脂質酸化抗体を誘導する1以上の外来(すなわち、非ヒト)抗原の使用、特に、このような方法における、単離クラミジア細胞または単離クラミジア抗原の使用を提供する。好適なクラミジア抗原としては、Hsp60、OmpA、ApoBおよびリポ多糖が挙げられる(Kalayoglu M.ら, (2000) J. Infect. Dis. 181 Suppl 3: S483-9)。
【００９４】
単離クラミジア細胞または抗原など、本明細書に記載のような方法において使用するための試薬は、キットの一部として、例えば内容物が外部環境から保護されているバイアルなどの好適な容器中に入れて提供してもよい。細胞は凍結乾燥形態で提供してもよい。キットには例えばサンプルにおいて抗クラミジアアブザイムの有無を判定する方法におけるそれら細胞の使用についての説明書を含めてもよい。キットにはまた、サンプルおよび細胞希釈液、外因性脂質またはリポタンパク質、および／または増感剤およびリポーターなどの脂質酸化を判定するための試薬といった、本方法に必要な1以上の他の試薬を含めてもよい。本明細書に記載のような病状に対して抗クラミジアアブザイムの有無、そしてすなわち個体におけるアテローム性動脈硬化症の存在および重篤度を判定する上で使用するためのキットに、試験サンプルを得ること自体を目的とした手段、例えば血液サンプルを採取するためのシリンジ(このような構成部品は一般に滅菌されている)および試験を行うためのチューブやキュベットなどの容器など、本方法の実施のための1以上の物品および／または試薬を含んでもよい。
【００９５】
本発明の別の態様では、個体においてアテローム性動脈硬化性疾患を判定する方法において用いる、単離クラミジア細胞と酸化判定試薬、または単離クラミジア抗原と脂質酸化判定試薬を含んでなるキットを提供する。
【００９６】
キットにはさらにアテローム性動脈硬化性疾患に関して個体を評価するための説明書および／またはアテローム性動脈硬化性疾患に関して個体を評価するためのバッファーもしくは試薬を含んでもよい。
【００９７】
脂質酸化判定試薬は変性剤を含んでもよい。変性剤はアッセイにおいて脂質およびタンパク質を変性させるほか、生化学反応を停止させたり、付随する分子からMDAを抽出したり、抽出されたMDAの検出のために最適なpHとするものでありうる。好適な変性剤としては、トリクロロ酢酸、H2SO4およびリンタングステン酸が挙げられる。
【００９８】
トリクロロ酢酸は5%〜75%、より好ましくは25%〜55%、例えば30%、40%または50%の濃度で使用すればよい。H2SO4は0.5〜10M、より好ましくは2M〜5M、例えば3Mまたは4M H2SO4で使用すればよい。リンタングステン酸は1%〜30%、より好ましくは5%〜15%、例えば10%(w/v)リンタングステン酸で使用すればよい。
【００９９】
脂質酸化判定試薬にはまた、MDAなどの酸化された脂質生成物と反応してシグナルを生じる検出試薬を含んでもよい。好適な検出試薬としては2-チオバルビツール酸(TBA)があり、これは1mMが好都合である。これはMDAと反応して525nmにて検出可能な色の変化をもたらす。この脂質酸化は525nmでの吸光度の変化を判定することにより判定することができる。
【０１００】
その他の好適な検出試薬としては、例えばMDAが本来有する蛍光の測定を含む蛍光アッセイにおいて用いるのに好適なn-ブタノールが挙げられる[Brown, R.K.,およびKelly, F.J. Peroxide and other products. In: Free Radicals. A practical approach. IRL Press, Oxford, New York, Tokyo (1996), 119-131]。
【０１０１】
抗原は粗製形態(すなわち、全細胞の懸濁液)、単離形態もしくは精製形態、合成もしくは組換え形態、またはエピトープを模倣する抗イディオタイプ抗体またはそれのフラグメントの形態で、提供しうる。
【０１０２】
本発明のこの態様に従うキットの一例は、ヒツジクラミジア生菌(凍結乾燥形態)、PBS(細菌を溶解させるため)、0.05M酢酸バッファーpH4.0、40%トリクロロ酢酸および1mMの2-チオバルビツール酸を含む。
【０１０３】
本発明の別の態様に従う方法を実施する上で用いるキットとしては、
i)微小容器、
ii)リポーター物質、
iii)クラミジア抗原
を含みうる。
【０１０４】
微小容器としては、酸化によって分解または損傷を受けて透過性となるような、すなわちその内容物が放出可能となるような膜からなるリポソーム、小胞またはマイクロカプセルでありうる。このような膜はクラミジア菌または抗原からのアブザイム触媒性の過酸化の伝播を受けやすい。
【０１０５】
リポーター物質は上記のように、色素、蛍光色素またはその他の検出物質もしくは標識でありうる。キット中のリポーター物質は微小容器内に封入されていてもよいし、あるいは使用前に使用者が微小容器に封入する別個の試薬として供給されるものでもよい。
【０１０６】
クラミジア抗原はクラミジア感染の際に免疫応答を惹起する抗原、特に自己触媒抗体を誘導する抗原である。その抗原は複合体またはクラミジア細胞に含まれているものでもよい。好適な抗原としてはクラミジアHsp60およびApoB抗原が挙げられる。
【０１０７】
キットにはさらにアテローム性動脈硬化性疾患に関して個体を評価するための説明書および／またはアテローム性動脈硬化性疾患に関して個体を評価するためのバッファーもしくは試薬を含んでもよい。
【０１０８】
本発明の別の態様に従うキットとしては、
i)脂質過酸化の伝播を可能とする、またはそれを促進する増感剤、
ii)クラミジア抗原
を含みうる。
【０１０９】
増感剤は、クラミジア抗原から、赤血球膜などの他の反応性種へ脂質過酸化反応を伝播する物質または薬剤である。
【０１１０】
キットにはさらにアテローム性動脈硬化性疾患に関して個体を評価するための説明書および／またはアテローム性動脈硬化性疾患に関して個体を評価するためのバッファーもしくは試薬を含んでもよい。
【０１１１】
本発明のキットはさらに2つの容器、例えばチューブ、キュベット、ボトル、ウェルまたはジャーを含んでもよい。このような容器の1つは対照血液サンプルに用い(すなわち、対照容器)、もう1つはクラミジア抗原の添加用に用いられる(すなわち、試験容器)。このような容器は抗凝固剤でコーティングしてもよい。好適な抗凝固剤は当業者に周知である。
【０１１２】
これらの容器を抗凝固剤でコーティングしない場合には、キットに個別に抗凝固剤を含めてもよい。
【０１１３】
上記のように、キットには本明細書に記載の方法に従った使用のための説明書も含めてよい。キットにはさらに、キットによって生じたシグナル(すなわち、溶血またはリポーター物質の放出)の強度を患者におけるアテローム性動脈硬化症またはその他のアテローム性動脈硬化性疾患の重篤度と対応させるチャート、スケール、グラフまたは曲線図表を含めてもよい。これにより、アテローム性動脈硬化性疾患の存在およびその重篤度の双方がサンプルから判定可能となる。チャートおよび／または説明書は紙の形態であってもよいし、あるいは、コンピューターハードドライブ、CD-ROM、フロッピーディスクでありうるデータ記録手段に保存されたコンピュータープログラム製品の形態であってもよい。
【０１１４】
以下、後述の添付図面および実施例を参照して本発明の態様を説明するが、これらは例示であって限定するものではない。当業者にはさらなる態様や実施形態は明らかであろう。
【０１１５】
本明細書にて言及した文献は全て、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１１６】
表１は、クラミジア菌の脂質過酸化に対するヒトアテローム性動脈硬化性病変部から抽出したIgG画分の影響を示すデータを含む。pH5.7。測定は全て3回行った。
【０１１７】
表２は、ヒト血清リポタンパク質とクラミジア・プシタッシのヒツジ株との間の病変部IgGに対する交差反応を示すデータを含む。
【０１１８】
表３は、ヒト血清における脂質過酸化に対するネコクラミジアの影響を示すデータを含む。測定は全て3回行った。
【０１１９】
表４は、ヒト血漿における、ヒツジクラミジアによる脂質過酸化の誘導におけるIgGの役割を示すデータを含む。測定は全て3回行った。
【０１２０】
表５は、対照血清およびアテローム性動脈硬化症の臨床合併症を有する患者の血清へのヒツジクラミジアの添加の影響を示すデータを含む。
【０１２１】
表６は、抗酸化阻害剤による、アテローム性動脈硬化性病変部のIgGの脂質酸化活性の阻害を示す。
【０１２２】
表７は、本発明に従って使用されうる金属キレート剤の例を示す。
【０１２３】
表８は、本発明に従って使用されうる抗菌薬の例を示す。
【０１２４】
表９は、本発明に従って使用されうる抗酸化剤の例を示す。
【０１２５】
表１０は、健康および感染ヒツジにおける脂質酸化性抗クラミジア抗体のレベルを示す(括弧の中の数字は、対照に対する増加率／低下率%を表す)。
【０１２６】
表１１は、金属キレート剤を用いたアブザイムの阻害を示す。
【０１２７】
表１２は、金属キレート剤を用いたin vitroアブザイム活性の阻害を示す。
【０１２８】
表１３は、冠状動脈性心臓病患者における抗クラミジアアブザイムの活性に対するアスピリンの影響を示す。
【０１２９】
表１４は、無症候性心筋虚血患者における抗クラミジアアブザイムの活性に対するアスピリンの影響を示す。
【０１３０】
表１５は、抗菌薬で処置した患者におけるアブザイム活性を示す。
【０１３１】
表１６は、抗菌薬＋アスピリンで毎日処置した患者におけるアブザイム活性を示す。
【０１３２】
表１７は、抗菌薬のみで処置した患者の臨床状態を示す。
【０１３３】
表１８は、アテローム性動脈硬化症関連病状に罹患している個体群の平均アブザイムレベルを示す。
【０１３４】
表１９は、アスピリンを投与された、または投与されなかった、狭心症に罹患している患者における個々のアブザイムレベルを示す。
【０１３５】
表２０は、クラミジアを接種したウサギにおけるアブザイムの誘導を示す。
【０１３６】
表２１は、アブザイムが誘導されたウサギにおけるホルマリンで処理したクラミジアの効果を示す。
【０１３７】
表２２は、毎日500mgのアジスロマイシンで処置した患者における抗クラミジアアブザイム活性を示す(治療群A)。
【０１３８】
表２３は、毎日500mgのアジスロマイシン＋250mgのアスピリンで処置した患者における抗クラミジアアブザイム活性を示す(治療群B)。
【０１３９】
表２４は、毎日500mgのアジスロマイシン＋抗酸化剤で処置した患者における抗クラミジアアブザイム活性を示す(治療群C)。
【０１４０】
表２５は、毎日250mgのアスピリンで処置した治療群Dの患者における抗クラミジアアブザイム活性を示す(治療群D)。
【０１４１】
表２６は、対照群の患者における抗クラミジアアブザイム活性を示す。
【０１４２】
表２７は、抗アブザイム処置の結果のまとめを示す。
【０１４３】
表２８は、改変型Rose-Blackburn質問表による処置前後の狭心症の重篤度の評価を示す。
【０１４４】
表２９は、抗クラミジアIgGについて陰性と判定されたIHD患者に関する処置前後のアブザイムおよびRose-Blackburnテストスコアを示す。
【０１４５】
表３０は、アブザイムに対するアジスロマイシンの阻害特性を示す。
【０１４６】
表３１は、抗クラミジアアブザイム活性に対する種々の薬剤の影響を示す。
【０１４７】
表３２は、血液凝固および血栓に対する抗アブザイム処置の効果を示す。
【実施例】
【０１４８】
材料および方法
サンプル
第一臨床病院の心血管外科センター(Rostov-na-Donu, Russia)に冠状動脈および腹部大動脈のバイパス手術のために入院した、アテローム性動脈硬化症の臨床合併症を患う22人の患者由来の血清3サンプルずつを使用した。
【０１４９】
これらの患者のうち20人は男性、2人は女性であり、年齢は47歳から66歳の間であった。これらの患者のうち1人(番号6/6a)が試験の際に急性心筋梗塞を起こしたため、いくつかの最終計算にはこの患者のデータは含まれなかった。対照群は臨床的に健康なボランティアからなり、5人は男性、5人は女性で年齢は40歳から55歳の間であった。
【０１５０】
これらの患者のうち7人の腹部大動脈から得たアテローム片を使用して、以下に記載するようにプロテインA吸着剤によりIgG画分を抽出した。
【０１５１】
アテローム性動脈硬化性病変部からのIgGの抽出
この大動脈片(湿重量で約200〜400mg)をおよそ10mgの切片になるよう切断し、1%非イオン性界面活性剤Igepal CA-630を含むPBS 5.0ml中に入れ、機械式ホモジナイザー(Ultra-Turrax)により、15mmプローブを用いて全出力でそれぞれ3秒間、冷却用の間隔20秒間をはさんで3回繰り返してホモジナイズした。ホモジナイズの後、5000g、10分間の遠心分離により不溶性成分を分離し、上清を分析に用いた。
【０１５２】
この上清を、架橋した4％ビーズ状アガロースに結合させたプロテインAで37℃にて30分間処理した。次に、ビーズに結合した免疫グロブリン画分を5000gで10分間の遠心分離により沈降させ、上清をデカントした。沈降させた免疫グロブリンに結合したリポタンパク質を除去するために、このサンプルを10% Igepal CA-630に再懸濁した。次に、それらを5000gで10分間遠心分離し、上清をデカントした。
【０１５３】
界面活性剤を除去するために、過剰量のリン酸バッファー中で同じ設定での遠心分離により、その後3回洗浄した。免疫グロブリン画分からのリポタンパク質の除去は、この画分にコレステロールが存在しないことによって確認した。
【０１５４】
抗クラミジア抗体の測定
一晩絶食した翌朝に肘前静脈から血液を採取し、血清を分離して試験を行うまで-20℃で凍結しておいた。
【０１５５】
抗クラミジア抗体の存在は、ヒツジクラミジア細胞との凝集反応およびELISA(組換え抗原に基づく)アッセイにより測定した。
【０１５６】
凝集反応では、供試血清の段階希釈液を、106個のヒツジクラミジア生菌とともに37℃で24時間インキュベートした。凝集塊の出現を700nmにて検出し、測定した。ELISAアッセイは製造業者の説明書(Medac)に従って行った。
【０１５７】
1：64以上の力価を血清反応陽性とみなした。
【０１５８】
脂質の過酸化の判定
脂質の過酸化は、分光光度法により測定されたMDA濃度のレベルとして評価した[Draper, H.H.ら,  Free Radic. Biol. Med. (1993) 15, 353]。この方法は、マロンジアルデヒドがチオバルビツール酸と反応する際の発色生成物の形成に基づく。
【０１５９】
血清リポタンパク質とクラミジアとの間の交差反応性
抗クラミジアアブザイムを含むIgG画分は、上記のようにヒトアテローム性動脈硬化性病変部から抽出した。この画分の100μl(1ml当たり1μg含有)を、健康なドナー由来の890μlの全血清または脱脂血清とともに37℃、pH5.7で1時間プレインキュベートした。
【０１６０】
リポタンパク質(および結合物質)を、既報の方法[Havel R.Jら, J. Clin. Invest. (1955) 34, 1345-1353.22]に従ってKBr溶液中での分取超遠心分離により血清から除去した。
【０１６１】
次に、10μl体積中の105個のクラミジア・プシタッシ細胞(Intervet)を血清に加えた。次いでクラミジア細胞との接触により誘発された酸化の量を上記の方法を用いて測定した。
【０１６２】
抗クラミジアアブザイムと血漿リポタンパク質との結合が存在する場合には、抗クラミジアアブザイムは超遠心分離により除去されるため、クラミジア細胞との接触時にさらなる酸化は認められない。
【０１６３】
抗クラミジアアブザイムと血漿リポタンパク質との結合が存在しない場合には、抗クラミジアアブザイムがサンプル中にまだ存在しているため、血漿とクラミジア細胞との接触時に酸化が認められる。
【０１６４】
抗クラミジアアブザイムのアッセイ
抗クラミジアアブザイムのアッセイに使用される試薬を以下に示す：
1. ヒツジクラミジア生菌(凍結乾燥形態)
2. PBS(細菌溶解用)
3. 0.05M 酢酸バッファー pH4.0
4. 40%トリクロロ酢酸
5. 1mM 2-チオバルビツール酸。
【０１６５】
サンプル中の触媒性抗クラミジア抗体の存在または量は以下のように検出した。
1. 被験血清のサンプルを0.05Mの酢酸バッファー(pH4.0)で1：1に希釈し、これらのサンプルの最終pHを5.6〜5.8の間にする。
2. 990μlの希釈血清を10μlの市販ヒツジクラミジア生ワクチンと混合する。
3. 次にサンプルを37℃で一晩(12〜16時間)インキュベートする。
4. 各サンプルに250μlの40%トリクロロ酢酸および250μlの1mM 2-チオバルビツール酸を加える。
5. 全てのサンプルを水浴中に入れて、30分間煮沸する。
6. サンプルを冷まし、3,000gで10分間遠心分離する。
7. 上清を回収してそれらの吸光度をλ525nmで測定して、脂質過酸化の生成物であるマロンジアルデヒド(MDA)の濃度を決定する。
【０１６６】
結果
実施例１
上記の方法を用いて患者のアテローム性動脈硬化性病変部からIgGを抽出した。このIgG画分には抗クラミジア抗体が存在することが認められた(図１)。
【０１６７】
抽出されたIgG画分の脂質酸化能を決定した。このIgG画分はヒツジおよびネコ両方のクラミジア・プシタッシ菌株において脂質の過酸化を引き起こすことが示された(表１)。この過酸化反応の反応速度分析から、この反応は酵素的特徴を持つことが示された(図２、３)。そのため、クラミジア細菌は、ヒトアテローム性動脈硬化性病変部から抽出されたそれらの抗体に対する基質と考えることができた。
【０１６８】
さらに非イオン性界面活性剤を用いて、抗クラミジアアブザイムに対するエピトープを検討した。クラミジアをTriton X-100またはIgepal CA-630で処理することにより、抽出されたアブザイムによる細菌中の脂質の酸化は失われた。ヒト血清低密度リポタンパク質を処理する場合についても同様の結果が得られた。
【０１６９】
このことは、触媒抗体に対するいずれのエピトープも高次構造性のものであり、かつ／またはその抗原の完全性がリポタンパク質およびクラミジア双方における脂質の酸化を誘導するために重要であることを示唆する。
【０１７０】
次に、抗クラミジアアブザイムの、血漿リポタンパク質と交差反応する能力を決定した。アテローム性動脈硬化性病変部から抽出したIgGを患者由来の血清とともにプレインキュベートし、抽出物中の抗リポタンパク質抗体を非修飾リポタンパク質と相互作用させた。次に、このリポタンパク質とそれに結合している抗体を超遠心分離により除去した。
【０１７１】
触媒性抗クラミジア抗体は、リポタンパク質とともに除去されたことが分かった(表２)。このことは、この触媒性抗クラミジア抗体が血清リポタンパク質およびヒツジクラミジア細菌株の両方と交差反応することを示す。
【０１７２】
次に、アテローム性動脈硬化症患者の血清中の抗クラミジア抗体の存在について検討した。ヒツジクラミジアを患者の血清に添加したところ、サンプル中で脂質過酸化の増大が起こった。同様の効果がネコクラミジア株を用いた場合にも観察された(表３)。
【０１７３】
観察されたこの効果は、患者血清中のIgG画分に脂質酸化性抗クラミジア抗体が存在することによるものである(表４)。従ってアテローム性動脈硬化症患者の血清由来の触媒抗体はリポタンパク質およびヒツジクラミジア双方と交差反応することが観察された。
【０１７４】
ヒト血清中の抗クラミジア抗体および抗リポタンパク質抗体の濃度の相関性分析から、これらのパラメーターは両方とも高い相関係数0.82を示す統計学的に有意な正の関連性を有することが分かった。このことはさらに、同じ抗体が両方の結合活性を有していることを示すものである。
【０１７５】
研究において、アテローム性動脈硬化症患者について上記のアッセイ法を用いたところ、アテローム性動脈硬化症の臨床合併症を患う患者の81%に触媒性抗クラミジア抗体が認められたのに対し、対照群では10%に認められただけであった(図４、表５)。このことは、これらの抗体がこの疾患の病因性マーカーであることを示す。
【０１７６】
この研究では、生体系における抗脂質／リポタンパク質アブザイムの存在が初めて示された。それらがアテローム性動脈硬化症においては出現するが、健康な個体では出現しないことは、これらのアブザイムがこの疾患およびその合併症の病因において重要な役割を果たしていることを示す。そのことはまた、このような生化学的／免疫学的疾患の主たるものを、脂質過酸化、抗リポタンパク質抗体の出現およびクラミジア感染(これらは全てアテローム性動脈硬化症の発症に関与している)の活性化の点で、相互に関連付ける可能性がある。
【０１７７】
ある個体の血漿中の脂質酸化性抗クラミジア抗体の存在は、この疾患に特有の病理学的変化が既に始まっていることを示す。これらのアブザイムは脂質／リポタンパク質の酸化を担い、またこのプロセスは通常、アテローム性動脈硬化症の全身拡大の程度／強度と相関しており、抗脂質アブザイムのレベル／活性はこの疾病の重篤度を反映する。
【０１７８】
血漿／血清中のリポタンパク質プロフィールの変化および全コレステロールの増加はアテローム性動脈硬化症に関して確立された唯一の特有の危険因子である。しかし、これらの変化はこの疾患の臨床合併症を患う全ての患者のうちのわずか10〜15%についてしか検出できない。脂質酸化性抗クラミジア抗体の検出はアテローム性動脈硬化症の２番目の特異的マーカーであり、しかしながら上記の脂質パラメーターの測定よりもずっと高い診断的価値を有する。
【０１７９】
従って本明細書に記載の方法は、アテローム性動脈硬化症および関連病状の診断および予防に幅広く適用できる。
【０１８０】
実施例２
脂質過酸化の阻害
ヒト検体
第一臨床病院の心血管外科センター(Rostov-na-Donu, Russia)において腹部大動脈狭窄のバイパス手術の際に、年齢範囲53〜64歳の4人の男性患者から取り出したヒト大動脈の、進行したアテローム性動脈硬化性病変部から抗体を抽出した。これらのサンプルは回収後直ちに30% w/vのNaCl溶液中に入れて試験まで0〜4℃で1〜2週間保存した。
【０１８１】
対照実験では、この期間中、トリプシン、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、グルタチオンパーオキシダーゼ、クレアチンキナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼなどの酵素の活性が、免疫グロブリン(IgG)の断片化レベルおよび脂質過酸化の程度(マロンジアルデヒドの濃度)とともに、有意に変化しなかったことを示した。
【０１８２】
大動脈片(湿重量で約200〜400mg)をおよそ10mgの切片になるよう切断し、1%非イオン性界面活性剤Igepal CA-630を含むPBS 5.0ml中に入れ、機械式ホモジナイザー(Ultra-Turrax)により、15mmプローブを用いて全出力でそれぞれ3秒間、冷却用の間隔20秒間をはさんで3回繰り返してホモジナイズした。ホモジナイズの後、5000g、10分間の遠心分離により不溶性成分を分離し、上清を分析に用いた。
【０１８３】
抗体の抽出
4人の異なる患者から得た4片の腹部大動脈の病変部から抗体を抽出し、別々に分析した。
【０１８４】
第1の工程では、この上清を、架橋した4%ビーズ状アガロースに結合させたプロテインAで37℃にて30分間処理した。次に、ビーズに結合した免疫グロブリン画分を5000gで10分間の遠心分離により沈降させ、上清をデカントした。沈降した免疫グロブリンに結合したリポタンパク質を除去するために、このサンプルを10% Igepal CA-630に再懸濁した。次に、それらを5000gで10分間遠心分離し、上清をデカントした。界面活性剤を除去するために過剰量のリン酸緩衝液中で同じ設定での遠心分離により、その後3回洗浄した。免疫グロブリン画分からのリポタンパク質の除去は、この画分にコレステロールが存在しないことによって確認した。
【０１８５】
リポタンパク質
従前に記載された方法[Havel R.J.ら, J. Clin. Invest. (1955) 34, 1345-1353]に従ってKBr溶液中の連続分取超遠心分離により、健康なドナーの血漿から低密度リポタンパク質(d=1.030〜1.050)を得た。この調製物中でLDLはすでに血漿免疫グロブリンと結合している可能性がある[Bauer B.J. et al Atherosclerosis (1982), 44, 153-160]。
【０１８６】
これらの免疫グロブリンは、LDLと、プロテインAに結合したそれら抗体との反応を妨げたり、または後者のタンパク質そのものに結合したりする可能性がある。これらの人工事象の可能性を避けるために、アフィニティー試験において病変部の抗体を用いるリポタンパク質の滴定の前に、飽和量のプロテインAアガロースビーズを用いて抗体が結合したLDLを除去することが重要であった。
【０１８７】
LDLレベルを(コレステロール濃度として)測定するために、リポタンパク質の新しいバッチごとに、また新しい実験ごとに、キャリブレーション曲線を作製した。
【０１８８】
病変部のIgGによるLDLの過酸化
供試抗酸化剤を加えた、または加えない(対照)、LDLサンプルを、病変部のIgGとともに37℃、pH5.6で16時間インキュベートした。マロンジアルデヒド(MDA)濃度としての脂質過酸化のレベルを、以下に示す方法で測定した。各サンプル1.0mlに250μlの40%トリクロロ酢酸および250μlの1mM 2-チオバルビツール酸を加えた。サンプルを水浴中で30分間煮沸した後、それらを冷まし、3,000gで10分間遠心分離した。上清を回収してその吸光度をλ525nmで測定した。
この実験の結果を表６に示す。
【０１８９】
抗酸化活性を有する各種阻害剤は、アテローム性動脈硬化性プラークから単離された抗体の脂質酸化活性を本アッセイの検出限界以下に減少させることが認められた。よってこれらの化合物は全て脂質酸化抗体の活性を阻害する。
【０１９０】
単離されたアブザイムを以下に示すクラスの種々の抗酸化阻害剤存在下で、本明細書に記載の触媒活性に関してin vitroでアッセイした。
鉄(Fe2+)キレート剤−テトラサイクリン
銅(Cu2+)キレート剤−DDC、アスピリンおよびペニシラミン
一般金属キレート剤−CN-、N3、DTPA(遊離イオンのみキレートする)、およびピコリン酸
結果は表１１に示す。
【０１９１】
これらの結果は、アブザイム阻害が鉄原子のキレート化ではなく銅原子のキレート化を介して起こることを示す。3種の別個の銅キレート剤が活性を阻害することが示され、これらの結果はアブザイムが触媒中心としての結合銅イオンと接触することを示唆する。
【０１９２】
実施例３
脂質酸化性抗クラミジア抗体活性の低下の臨床例
患者−A.M.P.。白人。男性。43歳。息切れとともに一過性の非刺激性胸痛を訴える狭心症の初期ステージに似た臨床症状。しかしながら、ECGでは心臓に病理学的変化は認められなかった。
【０１９３】
2000年12月27日の血液検査の結果では、全コレステロールおよびLDLコレステロールレベルは正常であった。抗クラミジアIgGおよびIgA抗体の力価は両方とも1:64であった(ELISA, Medac)。しかし、脂質酸化性抗クラミジアアブザイムが検出され、その活性は血清1mlあたり32μM MDAであった(3回測定の平均値)。
【０１９４】
以下に示すような3ヶ月間にわたる毎日の処置が推奨された：塩酸テトラサイクリン500mgと抗酸化剤カクテル(ビタミンE 20mg、ビタミンA 1.5mg、ビタミンB6 3.2mg、アスコルビン酸180mg、グルコン酸亜鉛 30mg、L-セレノメチオニン100μg)との併用。
【０１９５】
この治療法の開始後3ヶ月で、胸部痛および息切れの訴えはなくなった。処置終了時点であり処置開始からほぼちょうど3ヶ月に当たる3月末に、患者血清を分析したところ、抗クラミジアIgGおよびIgA抗体力価に変化は認められなかった(1:64 (ELISA, Medac))。一方で、抗クラミジアアブザイムの存在は検出されなかった。
2週間後に重ねて行った試験の結果も同様であった。
【０１９６】
実施例４
ヒツジ血清の脂質過酸化に対するヒツジクラミジアの影響
標準法を用いてヒツジにクラミジア細胞をワクチン接種し、アブザイム活性について試験した。結果を表１０に示す。
【０１９７】
ワクチン接種前のヒツジは無病で健康であり、クラミジアを投与する場合としない場合とでアッセイレベルに有意な変化は認められなかった。
【０１９８】
ワクチン接種後、ヒツジは非常に高い抗クラミジア抗体レベルを示したが、アブザイムのレベルは有意でないか全く示されなかった。
【０１９９】
流産後(野生型)とは、子宮の血管系の閉塞により流産してしまったクラミジア症のヒツジを意味する。これらのヒツジにおいてクラミジア投与により確認されるアブザイム活性レベルは、クラミジアを投与しない場合よりも有意に高かった。
【０２００】
これらの結果は、クラミジアワクチンの投与が脂質酸化抗体の産生を減少させるか、または妨げる可能性を示す。
【０２０１】
実施例５
アブザイム活性と動脈狭窄との関連性
2つの異なる臨床群において、脂質酸化性抗クラミジア抗体の活性および動脈狭窄の程度を調べた。第1の群は虚血性心疾患(IHD)の患者からなり、第2の群は虚血性脳血管疾患(ICD)の患者からなる。
【０２０２】
冠状動脈狭窄
この試験の予備的な結果から、IHD患者の抗クラミジアアブザイムの活性と冠状動脈狭窄の重篤度との間には有意な正の相関関係がみられる(図５)。
【０２０３】
冠状動脈狭窄の程度と、トリグリセリド、全コレステロールおよび低密度リポタンパク質のコレステロール、LDL-コレステロールのような血清脂質との間に関連性は認められなかった(図６、７、８)。
【０２０４】
大脳動脈狭窄
ICD患者群において、アブザイムレベルと動脈狭窄との間に有意な正の相関関係が認められた(図９)。
【０２０５】
IHD患者群と同様に、この群においても動脈狭窄の程度と血清トリグリセリド、全コレステロールおよびLDLコレステロールとの間に関連性はなかった(図１０、１１、１２)。
【０２０６】
これらの実験は、抗クラミジアアブザイム活性と心臓および脳の両方の動脈の狭窄の程度との間の正の関連性を明らかにし、これらの抗体がアテローム性動脈硬化症の発症および進行の両方に関与していることを示す。
【０２０７】
実施例６
アセチルサリチル酸(アスピリン)を用いるアブザイムの阻害
表１３および１４に示したデータは、アセチルサリチル酸(アスピリン)をヒトに投与した場合、アセチルサリチル酸(アスピリン)が抗クラミジア脂質酸化アブザイムの活性を阻害することができることを示している。
【０２０８】
血液中のこれらのアブザイムのアブザイム活性が著しく高い冠状動脈性心臓病(CHD)の患者を、250mgの日用量のアスピリンを用いて処置した。
【０２０９】
1週間後、これらの患者の血液検査で、アブザイム活性の大幅な阻害が示された。1人の患者においては5分の1、他の2人においては検出できないほど低いレベルであった(表１３)。
【０２１０】
上記の実験でのアスピリンの投与が、患者の体からのアブザイムの自然な排泄に一致する可能性を排除するため、またin vivoにおけるアスピリンの抗クラミジア脂質酸化アブザイムに対する効果を検討するために、以下に示す実験を行った。
【０２１１】
アスピリンを毎日定期的に250mg服用していた、無症候性心筋虚血の患者Fを特定した。患者Fの血液中のアブザイムレベルを測定したところ、ほとんど検出できなかった。
【０２１２】
患者Fが1週間の間アスピリン服用を停止したところ、血液中のアブザイムレベルが同様に測定された。患者Fの血清中に有意なレベルの脂質酸化アブザイムが認められた。
【０２１３】
患者Fは従前のアスピリン250mg/日を投与する療法を再開し、7日後にアブザイムレベルを測定した。これらのアブザイムレベルは、患者がアスピリンを服用していなかった時のレベルに比べて有意に減少した(表１４)。
【０２１４】
これらの実験経過の間に、患者に呼吸器疾患またはその他の病的状態の徴候は見られなかった。このことは、報告されたアブザイム活性の変動がこの患者のアスピリン摂取に関連していたことを示す。
【０２１５】
結論として、本発明のデータは、アセチルサリチル酸がin vivoで、特にアテローム性動脈硬化症の臨床合併症を患う患者において、脂質酸化性抗クラミジア抗体を阻害することを示している。
【０２１６】
実施例７
クラミジア細胞と交差反応する抗体
ヒトApo-Bに特異的な抗体の市販品を、ヒツジクラミジア・プシタッシ(Intervet)と交差反応する能力について試験した。
【０２１７】
抗Apo-B抗体調製品は、ヒツジクラミジアにも結合する画分を含有することが認められた(図１３）。
【０２１８】
よってApo-Bは、クラミジア膜に存在するエピトープと同一のエピトープを有する。このエピトープに結合する抗体は、クラミジア細胞およびヒトApo-Bと交差反応する。
【０２１９】
実施例８
in vivoにおけるアブザイム活性に対する抗クラミジア薬の作用
年齢45〜62歳の安定狭心症の患者に、アジスロマイシン500mgを1日1回、15日間および30日間投与するか、またはアジスロマイシン500mgとアスピリン250mgを毎日15日間投与するかのいずれかによって処置した。
処置前および処置後のアブザイム活性を、第1群は表１５、第2群は表１６に示す。
【０２２０】
15日後、両群の患者のアブザイム活性は有意に減少し、アジスロマイシンとアスピリンを投与した群においてその減少は特に大きかった。LDLレベルの減少も認められた、いずれの患者においても副作用の報告はなかった。
【０２２１】
処置期間中、患者の臨床病状にも改善がみられた(表１７)。
抗クラミジア薬であるアジスロマイシンを、特にアスピリンと併用して2週間にわたり投与したところ、狭心症を患う患者のアブザイム活性が減少し、臨床病状が改善された。
【０２２２】
実施例９
in vivoにおけるアブザイム活性
本明細書に記載した方法を用いて、5組の被験者のアブザイムレベルを測定した。対照群は現行の手法により健康であると判定された。無症候性虚血群は、ECG運動負荷テストで虚血性であることが分かったが健康障害の自覚はない個体であった。安定または不安定狭心症を患う個体群、および心筋梗塞を患った個体群も試験した。
【０２２３】
各群のアブザイムレベルの平均を表１８に示した(表中、ｎは各群の個体数を表す)。本明細書に記載の方法を用い、クラミジア細胞を投与した際に脂質酸化の15%の増加が観察されれば、その個体はアブザイム陽性であるとみなした。各群のアブザイム陽性率も表１８に示した。この表の値はいずれもアスピリンを服用している個体についての調整は行っていない。
【０２２４】
アブザイム活性レベルおよびアブザイム陽性と判定された個体の割合が、その個体の病状の重篤度と相関することが示された。アブザイム活性は心臓発作後に激減することが認められた(不安定狭心症と急性期心筋梗塞の値を比較)。心臓発作後生き長らえた患者において、その後のアブザイム活性は徐々に増加する。
【０２２５】
このことはアブザイムが心筋梗塞の誘発に積極的な役割を果たすことを示唆している。アブザイムは、血管をふさいで梗塞を引き起こす血栓溶解性凝血塊の凝集メカニズムの一部を担っている可能性がある。この凝血塊中への凝集により、血管系中の検出可能なアブザイム活性は減少する。梗塞後、凝血塊が溶解するにつれて検出可能なアブザイム活性は増加する。
【０２２６】
実施例１０
in vivoにおけるアブザイム活性に対するアスピリンの影響
安定狭心症または不安定狭心症のクラスI、クラスIIおよびクラスIIIに当たる個体の群において、本明細書に記載の方法を用いてアブザイム活性を測定した。個体にはアスピリン服用の有無を問診した。アスピリン服用の報告の有無により個体をさらにサブグループに分けて、結果を表１９に示した。これらの結果は、アスピリンを服用しているが報告しなかった個体についての調整はされていない。
【０２２７】
表１９に示した数字は、各群の個体のアブザイム活性の値である(すなわち、クラスIアスピリン服用者およびアスピリン非服用者など)。
【０２２８】
これらの結果はアブザイムレベルが疾患の重篤度と一致することを示す。一般にアスピリン服用者は、同じ臨床病状のアスピリン非服用者よりもアブザイム活性が低い。
【０２２９】
実施例１１
アテローム性動脈硬化性疾患の動物モデル
ウサギに、1×107.5個のクラミジア細胞を含有するニワトリ胚の10%懸濁液1.5mlを気管内投与することにより、クラミジア・プシタッシ(Lori株)に感染させた。このウサギの血清を、標準的な血液採取経路により心臓から、0日目(感染前)に、そしてその後14日ごとに採取した。
【０２３０】
次にこの血清を標準ELISAアッセイに用いて、抗クラミジアIgG力価を測定した。同じ血清サンプルを用いて、クラミジアアブザイムレベルの量を上記の標準アッセイにより測定した。アブザイムの出現は、抗クラミジアIgG抗体の発現と相関していた。
4個体のウサギについての結果(感染3個体、対照1個体)を表２０に示す。
【０２３１】
これらの結果は、クラミジアに感染させることによりアブザイムレベルの高い動物モデルを作製できることを示す。このモデルはアブザイムにより引き起こされる疾患の進行の追跡、およびクリアランス速度のような種々のパラメーターの測定に有用である。また、このモデルはアブザイムレベルを減少させ、同時に症状を改善させるための薬物候補としての化合物を試験する上で有用である。
【０２３２】
実施例１２
ウサギにおける抗クラミジアアブザイム
クラミジア・プシタッシの気管内感染により、上記のように作製されたウサギモデルを用いて、脂質酸化性抗クラミジア抗体の産生を証明した。
【０２３３】
結果を表２１に示す。ウサギを、1×107.5細胞のクラミジア・プシタッシ(Lori株)を含有するニワトリ胚の10%懸濁液1.5mlを用いて気管内感染させた後、ウサギの心臓から血液を採取した。ワクチン、ホルマリン処理された1×107.5個のクラミジア・プシタッシ(Lori株) (表２１の§)を皮下注射した後7日目のアブザイムレベルを示す。
【０２３４】
アブザイムの出現は、ELISAにより検出された抗クラミジアIgGの蓄積と一致していた。感染14日目に同じ細菌ではあるがホルマリン処理した調製物を注射した場合(ウサギ3)、この接種後の7日目にELISAによる抗クラミジアIgG力価の増加がもたらされた。一方、このウサギの血清中のアブザイム活性は131から64μM MDA/mlへと2分の1に減少した。
【０２３５】
この接種を受けなかった他の2匹のウサギにおいてはこのようなアブザイム活性の減少はみられなかった。
【０２３６】
このように、クラミジア抗原のワクチン調製物の接種により抗クラミジアアブザイムの存在／活性の減少が認められた。
【０２３７】
実施例１３
虚血性心疾患における抗アブザイム治療
虚血性心疾患(IHD)患者30人の群を、血清中の抗クラミジアアブザイム活性を減少／排除する実験的治療のために選択し(治療群)、「同等の」患者20人の群は処置しなかった(非処置患者対照群)。この試験はサラトフ心臓病学センター(ロシア連邦)において2002年6月から8月まで行われた。
【０２３８】
この治療群は23人の男性患者および7人の女性患者からなり、平均年齢は55±1.1歳であった。アブザイムレベルをモニターするための患者対照群は20人のIHD患者からなり、そのうち15人は男性患者、5人は女性患者であり、平均年齢は53±1.2歳であった。各患者には試験への参加に関して書面による承諾をとった。
【０２３９】
全ての患者はカナダ心臓病学協会の分類によるクラスII〜IIIの狭心症であった。治療群の15人の患者および患者対照群の10人の患者は過去に心筋梗塞の病歴があった。第1群の他の15人および患者対照群の10人についてのIHD診断は冠状動脈造影法により確認し、70%以上の動脈狭窄が検出された。
【０２４０】
アテローム性動脈硬化症の全身拡大の程度または重篤度以外は、全ての群は年齢、性別および危険因子のみならず薬物療法、硝酸塩剤、β-遮断薬、アンギオテンシン変換酵素阻害剤などについても一致していた。
【０２４１】
患者の臨床病状の進行は、トレッドミル運動負荷／ストレスECGテストのための改変型Bruceプロトコール、Rose-Blackburn質問表(Cardiovascular Survey Methods. WHO, Geneva, 1968)を用いてモニターした。
【０２４２】
試験のための患者の選択に用いる主要なパラメーターは、15μMマロンジアルデヒド(MDA)/ml血清を超える抗クラミジアアブザイム活性レベルである。この治療群を4つの治療上のサブグループに分けた。
1.)  治療群A−抗クラミジアアブザイムの非特異的阻害剤であり、抗菌特性も有するアジスロマイシンが500mg/日の用量で処方された。
2.)  治療群B−同用量のアジスロマイシンとアセチルサリチル酸(アスピリン)の併用投与が処方された。後者はその活性中心の銅イオンをキレート化することにより特異的にアブザイムを阻害する明らかな能力を有する。アスピリンの用量は250mg/日であった。
3.)  治療群C−抗酸化特性を有するアブザイムの2種類の非特異的阻害剤である、前記の群と同用量の抗菌薬アジスロマイシン、およびビタミンE、A、C、の併用投与が処方された。ビタミンEは30mg/日、ビタミンAは1,500EU/日およびビタミンCは90mg/日の用量であった。
4.)  治療群D−この群の患者にはアスピリンのみを250mg/日の用量で投与した。
【０２４３】
3群全ての患者の血液を2週間ごとに試験した。抗クラミジアアブザイム活性の抑制／排除の効率に応じて治療を継続し、試験結果はプラシーボ／治療薬の投与後最大60日までを示す。
【０２４４】
治療群において、上記の方法を用いて抗クラミジア抗体の力価を測定した(表２６参照)。臨床症状の重篤度も判定した(表２８参照)。
【０２４５】
抗クラミジアアブザイム活性の抑制をモニターした結果を以下の表に示す(表２２〜２７)。
【０２４６】
最初に、治療を始めて2週間で、全ての群でアブザイム活性の著しい減少が認められた。最も顕著だったのは非特異的阻害剤であるアジスロマイシンと特異的阻害剤であるアスピリンを併用した治療群Bであった(表２３）。実際、この群の活性レベルは臨床的に健康な個体のレベルに達した(総括した表２８を参照)。重要な観察結果は、この群の患者TGB7のアブザイムレベルが45日目に(アスタリスク2個−表２３)大幅に増加したことであり(これは臨床症状の悪化と相関した)、次いでさらに15日投与した後、その患者は回復し始め、アブザイムは0にまで減少した。また、TGB7は、45日目のアブザイムレベルの増加と同時に、ApoBレベルの増加も示した(アスタリスク−表７参照)。
【０２４７】
最も効果の低かった治療法は、治療群A(アジスロマイシン単独−表２２)であり、患者の27%(11人中3人、アスタリスクで示す)においては15日後のアブザイム活性に変化は認められなかった。しかし、第1の群において継続的に減少していた大多数の患者のうち2人は試験30日目に結果が逆転した(TGA2およびTGA6、表１、2つのアスタリスクで示す)。この結果と、何人かの患者では減少してはいるが依然としてかなりのアブザイム活性レベルが残存している事実と併せて、投与をさらに30日延長した結果、全ての患者において有意な減少が認められた。治療群Aにおいて患者TGA2およびTGA6の臨床症状は15日間は改善し、アブザイムレベルの減少と相関していたが、試験の30日目ごろに臨床症状が悪化してアブザイムレベルも増加した(2つのアスタリスク−表２２)。
【０２４８】
治療群C(アジスロマイシンおよび抗酸化剤)においては、1人の患者(TGC1)はアブザイム活性が減少しなかった(アスタリスク−表２４)。
【０２４９】
アジスロマイシンは投与せず、処方された用量のアスピリン単独を使用した場合にもアブザイム活性の減少が引き起こされたが、併用投与でみられたものよりもその程度は低かった(治療群D−表２５)。
【０２５０】
適用した抗アブザイム治療法は、改変型Rose-Blackburn質問表により評価され、トレッドミル運動負荷／ストレスESGテストを使用して確認したところ、大多数の患者の臨床病状を有意に改善した(表２７)。一方、対照群においては積極的な臨床学的動態を示した患者は1人もいなかった。表２７において、PCGは患者対照群、§は免疫蛍光アッセイによって得られた結果、§§は免疫酵素的アッセイによって得られた結果、§§§は免疫比濁アッセイによって得られる結果を示す。*は統計学的有意差を示す。
【０２５１】
以下の凝集パラメーターについて統計学的に有意な変化は認められなかった：カオリン凝固時間、活性化部分トロンボプラスチン時間、プロトロンビン時間。血清クレアチニンおよび肝酵素アラニンアミノトランスフェラーゼおよびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼのレベルに変化は認められなかった。
【０２５２】
実験的治療群のどの患者も、この試験に選ばれる以前の数ヶ月／数年の間、臨床病状に好ましい変化がなかった。従って、好ましい動態が認められない状態を、著しい臨床学的改善が観察された患者についての「内在性」対照として用いることができる。
【０２５３】
抗菌特性を有するアブザイム阻害剤の本来の集中治療は、完全に抗クラミジアIgGの存在を排除した。
【０２５４】
抗クラミジアアブザイムを標的とすることにより、脂質濃度および血栓症における著しい改善がもたらされた(表２７)。従って、アテローム性動脈硬化症における脂質代謝および凝固系の異常の発生が、これらの脂質酸化性触媒抗体の出現に対して二次的なものであることが示唆されうる。
【０２５５】
試験のために選択された30人の患者中15人(50%)だけが、試験前にクラミジア感染について陽性と判定されていたため、観察されたアジスロマイシンの有益な効果を、その抗細菌特性により説明することはできなかった。他の8人の患者の血清中の抗クラミジアIgGレベルは有意ではなく免疫蛍光アッセイでは1:32を下回っていた。他の7人の患者は陰性と判定された。
【０２５６】
診断学的試験は、ある患者がアブザイムを保持しているかどうかは、その患者がクラミジアIgG抗体について陽性であることと必ずしも相関しないことを示している。よってこの治療法はクラミジアについて血清反応陽性であることに基づいて処方されるべきではない。このことは、この診断学的試験が、正しい治療とその後のこの治療を用いるアブザイムのクリアランスをモニターするための反復予後診断試験を行うことと関連付けられる場合には、本発明における有用性を示す。
【０２５７】
治療用診断(theranostic)試験では、特定のIHD患者の抗クラミジアIgG抗体は陰性であったがアブザイムは陽性と判定された。これらの患者の、投与前および投与後のアブザイムおよびRose-Blackburnテストスコアを表２９に示す。これらの患者は処置されて、アブザイム活性が減少し、その後臨床症状も改善された。
【０２５８】
これらの結果は、患者がアブザイムを保持しているかどうかはその患者がクラミジアIgG抗体について陽性であることとは必ずしも相関しないことを示している。アテローム性動脈硬化性病状は、クラミジアについて血清反応陽性であることに基づいて診断または治療処方することはできない。しかし、アブザイムはアテローム性動脈硬化性病状の診断マーカーとして有用であることが示されているので、それは適切な治療とその後のアブザイムのクリアランスをモニターするための反復予後診断試験を行うことと関連付けられる。
【０２５９】
実施例１４
アジスロマイシンの抗アブザイム／抗酸化特性
アテローム性動脈硬化性病変部から単離されたアブザイムに対するアジスロマイシンの阻害活性を上記のように測定した。その結果を表３０に示す。それぞれの数は、ヒツジクラミジアワクチン('Intervet')を0.5の免疫用量で投与する前および後の被験血清中のMDA蓄積レベル間の差として計算された2回測定／3回測定の平均値である。(**)で示された場合は、DMSOの影響を測定値から差し引いた。
【０２６０】
アジスロマイシンはアブザイム活性のin vitroでの強力な阻害剤であることが分かった。この活性は、アジスロマイシン投与後のアブザイム活性の急激な減少のような、アジスロマイシンにより認められるin vivoにおける生物学的作用を担っている可能性がある。
【０２６１】
実施例１５
クラミジアの膜の完全性とアブザイム活性
ホルマリン、硫酸アンモニウムまたはSDS処理されたクラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)またはクラミジア・プシタッシ(Chlamydia psittaci)のサンプルを用いて、上記のようにアブザイム活性を測定した。これらの反応において、試験系中で脂質酸化反応は認められなかった。
【０２６２】
非イオン性界面活性剤である1% Triton X-100およびIgepal CA-630、10%DMSO溶液を含むカオトロピック剤でクラミジア細菌を処理した場合、その系中の膜脂質の存在は維持されるが、細菌の膜の完全性は破壊されて、脂質酸化反応の発生は完全に失われた。
【０２６３】
これらの実験は、脂質がこの試験系中で生じている脂質過酸化反応の誘導および進行のために重要であることを示す。特に前記の処理で破壊されるリポ多糖の役割が示される。
【０２６４】
実施例１６
症例経過
症例番号1
64歳の男性患者は、狭心症の最初の症状がみられた3年前に虚血性心疾患であると診断された。この診断は冠状動脈造影法で確認され、2つの動脈の狭窄が明らかになった：右冠状動脈の75%、前心室内動脈の100%が閉塞。
【０２６５】
この患者は血清中にアブザイムが検出されたという理由で治療用診断(theranostic)試験のために選ばれた。2つのアブザイム阻害剤を、アジスロマイシンを500mg/日の用量で、そしてアスピリンを250mg/日の用量で、併用した。患者の抗クラミジアIgGレベルは高く、力価は1:256であった。
【０２６６】
改変型Rose-Blackburnプロトコールのスコアにより評価された投与前の臨床病状は、19であった。アブザイム活性は25μM MDA/ml、全コレステロールレベルは226 mg/dL、トリグリセリドは90 mg/dL、HDLコレステロールは56 mg/dL、LDLコレステロールは73 mg/dL、ApoAは139 mg/dL、ApoBは81 mg/dL、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)は25 U/L、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)は29 U/L、クレアチニンは0.71 mg/dLであった。
【０２６７】
投与期間中、顕著な副作用はみられなかった。治療開始後の最初の来院時に(15日目)、この患者はその疾患の徴候がある程度改善したことを報告した。この改善は治療30日目まで続いた。このことは、改変型Bruceプロトコールによるトレッドミル運動負荷ESGテストの耐容時間の増加により支持された。
【０２６８】
その時点ではアブザイム活性のみならず抗クラミジアIgGも患者血清中からは検出されなかった。脂質パラメーターのレベルも改善した。総コレステロールレベルは172 mg/dL、トリグリセリドは80 mg/dL、HDLコレステロールは52 mg/dL、LDLコレステロールは64 mg/dL、ApoAは110 mg/dL、ApoBは67 mg/dLに減少した。ALT、ASTおよびクレアチニンのレベルは、それぞれ25 U/ml、27 U/ml、および0.7 mg/dLと同程度に維持された。
【０２６９】
治療開始から45日目に至ったとき、患者は1週間前つまり開始から38日目に病状が悪化し始めたこと、つまり狭心症発作の頻度および強度が突然増加したことを報告した。このことは、80μM MDA/mlに達したアブザイム活性の上昇と一致していた。しかし、「従来の」抗クラミジアIgGが認められなかったことに注目することは重要である。
【０２７０】
それと同時に、脂質代謝のパラメーターも悪化した。総コレステロールは185 mg/dL、トリグリセリドは143 mg/dL、LDLコレステロールは74 mg/dL、ApoAは115 mg/dL、ApoBは87 mg/dLに増加した。HDLコレステロールレベルおよびApoAレベルは本質的には同程度に保持され、50 mg/dL および115 mg/dLであった。重要な観察結果は、肝酵素のレベルも変化したことであり、ALTが35 U/Lに、ASTが39 U/Lに増加し；クレアチニン濃度は0.8mg/dLであった。
【０２７１】
しかし、治療継続によりアブザイム活性は完全に抑制／排除されたように思われ、いくつかの脂質パラメーター濃度においても改善が認められた。総コレステロールは165mg/dLに、トリグリセリドは100mg/dLに減少した。HDLコレステロール濃度は47mg/dL、LDLコレステロールは72mg/dL、ApoAは112mg/dLであった。ALT、ASTおよびクレアチニンはそれぞれ24U/ml、25U/mlおよび0.7mg/dLとなった。
【０２７２】
一方、ApoBレベルは投与前のレベルである80mg/dLのままであった。最初に改善した臨床病状も治療開始前のレベルに戻り、Rose-Blackburnスコアは19であった。患者の臨床パラメーターを改善する試みとともに抑制されたアブザイムレベルで安定化するため、処方された抗アブザイム治療を続けることが推奨された。
【０２７３】
この患者においては、治療開始の15日目から抗クラミジアIgGは検出されず、アジスロマイシンの継続使用は、細菌感染それ自体ではなく、リポタンパク質に結合して酸化する交差反応性アブザイムを抑制されたレベルに制御することを目的とした。
【０２７４】
症例番号2
2002年2月21日に46歳の男性患者が急性心筋梗塞で入院し、IHDと診断された。その患者は、それ以前には心臓病の病歴はなかった。その後5月に冠状動脈造影を行い、冠状動脈に狭窄／狭小化は無いことが示された。
【０２７５】
この患者は血清中の抗クラミジアアブザイム活性がかなり高いという理由で治療用診断(theranostic)試験に選ばれた。その値は140μM MDA/mlであった。2つのアブザイム阻害剤の組み合わせである、アジスロマイシンを500mg/日の用量、およびビタミンE、A、Cの抗酸化剤カクテルが、処方された。ビタミンEは30mg/日、ビタミンAは1,500EU/日およびビタミンCは90mg/日の用量であった。
【０２７６】
投与前または投与期間中、この患者の血清中に検出可能なレベルの「従来の」抗クラミジアIgA、IgGまたはIgMは検出されなかった。改変型Rose-Blackburnプロトコールのスコアにより評価された投与前の臨床病状は17であった。総コレステロールレベルは205 mg/dL、トリグリセリドは129me/dL、HDLコレステロールは39mg/dL、LDLコレステロールは80mg/dL、ApoAは152mg/dL、ApoBは221mg/dLであった。
【０２７７】
投与中、顕著な副作用はみられなかった。患者は投与の最初の2週間経過後から疾患の徴候にある程度の改善を感じ始めた。この改善は60日間の治療期間全体を通して続いた。このことは、改変型Bruceプロトコールに従って行われたトレッドミル運動負荷ESGテストの耐容時間の有意な増加により支持された。
【０２７８】
60日後の観察期間終了時には、アブザイム活性のみならず抗クラミジアIgGの存在も患者血清中からは検出されなかった。
【０２７９】
アブザイム活性のこれらの変化は、患者の臨床病状における顕著な改善と一致していた。改変型Rose-Blackburnプロトコールのスコアは処置前の17から処置後は13に減少した。
【０２８０】
実施例１７
血栓症に対する抗アブザイム治療の効果
アテローム性動脈硬化性疾患の指標のうちの1つは、多くの場合、患者の血液が凝血塊を形成するのに要する時間に異常がみられることである(患者ではこれは通常増加している）。様々な経路により凝血塊形成が引き起こされ、そのため凝固時間に関しては国際的に認められた試験が4つある。1つは活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)と呼ばれており、トロンボプラスチンとカルシウムを添加し、内在性経路を測定することによって実施する。2つめはプロトロンビン時間(PT)と呼ばれ、外因性経路を単純に測定するものである。シリカ凝固時間(SCT)は、微細粒子(シリカ)により誘発された凝固を測定し、カオリン凝固時間(KCT)はより大きな粒子(カオリン)により誘発された凝固を測定する。これら全てについて、凝固時間が迅速であることは血栓症の危険度が高いことを示す。
【０２８１】
処置の前に、4つの全ての方法を用いて全治療群の全患者の凝固時間を測定し、平均と標準誤差を計算した。60日後に測定を繰り返した。対照は本研究での患者対照群(測定は1回行った。これらの患者についての値はその期間にわたって有意に変化しなかった)および臨床的に健康な対照群であった。処置の結果を表３２に示した。
【０２８２】
処置前の患者のAPTTテストについての平均値は22.4±0.89であり(患者対照群の対応する値は25.2±1.37)、臨床的に健康な群についての値49.1±7とは有意に異なっていた。処置後の患者は平均値46.9±6.45を示し、従ってこれは凝固時間の「正常範囲」内であり、すなわち、正常化された。
【０２８３】
処置前の患者のPTテストについての平均値は13.5±0.94であり(患者対照群の対応する値は17.3±4.05)、臨床的に健康な群についての値23.7±4.01よりも低かった。処置後の患者は平均値25.3±4.05を示し、従ってこれは凝固時間の「正常範囲」内であり、すなわち正常化された。
【０２８４】
処置前の患者のSCTテストについての平均値は151±15.0であり(患者対照群の対応する値は137±11.5)、臨床的に健康な群についての値248±10.0よりも有意に低かった。処置後の患者は平均値235±17.9を示し、従ってこれは凝固時間の[正常範囲」内であり、すなわち正常化された。
【０２８５】
処置前の患者のKCTテストの平均値は51.2±4.59であり(患者対照群の対応する値は50.3±2.16)、臨床的に健康な群についての平均値133±23.7とは有意に異なっていた。投与後の患者は平均値126±34.2を示し、従ってこれは凝固時間の「正常範囲」内であり、すなわち正常化された。
【０２８６】
これらの結果は、抗アブザイム治療法を凝固時間を正常化するために使用することができ(全て国際的に認められた凝固時間アッセイを用いて)、そして血栓症、およびそれによる心臓発作および卒中のリスクを低減し得ることを示している。
【表１】
2005501258.tif 000003
【０２８７】
【表２】
2005501258.tif 000004
【０２８８】
【表３】
2005501258.tif 000005
【０２８９】
【表４】
2005501258.tif 000006
【０２９０】
【表５】
2005501258.tif 000007
【０２９１】
【表６】
2005501258.tif 000008
【０２９２】
【表７】
2005501258.tif 000009
【０２９３】
【表８】
2005501258.tif 000010
【０２９４】
【表９】
2005501258.tif 000011
【０２９５】
【表１０】
2005501258.tif 000012
【０２９６】
【表１１】
2005501258.tif 000013
【０２９７】
【表１２】
2005501258.tif 000014
【０２９８】
【表１３】
2005501258.tif 000015
【０２９９】
【表１４】
2005501258.tif 000016
【０３００】
【表１５】
2005501258.tif 000017
【０３０１】
【表１６】
2005501258.tif 000018
【０３０２】
【表１７】
2005501258.tif 000019
【０３０３】
【表１８】
2005501258.tif 000020
【０３０４】
【表１９】
2005501258.tif 000021
【０３０５】
【表２０】
2005501258.tif 000022
【０３０６】
【表２１】
2005501258.tif 000023
【０３０７】
【表２２】
2005501258.tif 000024
【０３０８】
【表２３】
2005501258.tif 000025
【０３０９】
【表２４】
2005501258.tif 000026
【０３１０】
【表２５】
2005501258.tif 000027
【０３１１】
【表２６】
2005501258.tif 000028
【０３１２】
【表２７】
2005501258.tif 000029
【０３１３】
【表２８】
2005501258.tif 000030
【０３１４】
【表２９】
2005501258.tif 000031
【０３１５】
【表３０】
2005501258.tif 000032
【０３１６】
【表３１】
2005501258.tif 000033
【０３１７】
【表３２】
2005501258.tif 000034
【図面の簡単な説明】
【０３１８】
【図１】100μlのヒツジクラミジアと、ヒトアテローム性動脈硬化性病変部から抽出したIgGとの間の凝集反応の結果を示す。
【図２】ヒトアテローム性動脈硬化性病変部のIgGの濃度に対するヒツジクラミジアの過酸化の相関関係を示す。クラミジアの濃度は一定とし、pHは5.7とした。
【図３】1.8μgヒトアテローム性動脈硬化性病変部のIgGによるヒツジクラミジアにおける脂質過酸化のミカエリス-メンテン反応速度論を示す。クラミジア懸濁液の見かけのKM＝13.3−16.1μl。pH5.7。
【図４】ヒト血清における脂質過酸化に対するヒツジクラミジア懸濁液の添加の影響を示す。細菌懸濁液10μlを1:1希釈した血清990μlに加えた。pH5.7。混合したサンプルは全て37℃で18時間インキュベートした(血清番号は表５と同じ)。
【図５】IHD患者における冠状動脈狭窄の程度と脂質酸化性抗クラミジア抗体の活性との間の相関を示す。狭窄の重篤度は、血管造影法により見積もられた冠状動脈狭窄の積分パラメーターとして計算されたスコアで示す。
【図６】冠状動脈狭窄の程度とIHD患者血清中のトリグリセリド濃度との間の関係を示す。
【図７】冠状動脈狭窄の程度とIHD患者血清中の全コレステロール濃度との間の関係を示す。
【図８】冠状動脈狭窄の程度とIHD患者血清中のLDL-コレステロール濃度との間の関係を示す。
【図９】大脳動脈狭窄の程度とICD患者血清中の脂質酸化性抗クラミジア抗体の活性との間の相関を示す。狭窄の重篤度は、血管造影法により見積もられた大脳動脈狭窄の積分パラメーターとして計算されたスコアで示す。
【図１０】冠状動脈狭窄の程度とICD患者血清中のトリグリセリド濃度との間の関係を示す。
【図１１】冠状動脈狭窄の程度とICD患者血清中の全コレステロール濃度との間の関係を示す。
【図１２】冠状動脈狭窄の程度とICD患者血清中のLDL-コレステロール濃度との間の関係を示す。
【図１３】抗アポリポタンパク質B抗体とクラミジアとの交差反応を示す。
【図１】
2005501258.tif 000035
【図２】
2005501258.tif 000036
【図３】
2005501258.tif 000037
【図４】
2005501258.tif 000038
【図５】
2005501258.tif 000039
【図６】
2005501258.tif 000040
【図７】
2005501258.tif 000041
【図８】
2005501258.tif 000042
【図９】
2005501258.tif 000043
【図１０】
2005501258.tif 000044
【図１１】
2005501258.tif 000045
【図１２】
2005501258.tif 000046
【図１３】
2005501258.tif 000047
【国際公開パンフレット】
2005501258.tif 000048
2005501258.tif 000049
2005501258.tif 000050
2005501258.tif 000051
2005501258.tif 000052
2005501258.tif 000053
2005501258.tif 000054
2005501258.tif 000055
2005501258.tif 000056
2005501258.tif 000057
2005501258.tif 000058
2005501258.tif 000059
2005501258.tif 000060
2005501258.tif 000061
2005501258.tif 000062
2005501258.tif 000063
2005501258.tif 000064
2005501258.tif 000065
2005501258.tif 000066
2005501258.tif 000067
2005501258.tif 000068
2005501258.tif 000069
2005501258.tif 000070
2005501258.tif 000071
2005501258.tif 000072
2005501258.tif 000073
2005501258.tif 000074
2005501258.tif 000075
2005501258.tif 000076
2005501258.tif 000077
2005501258.tif 000078
2005501258.tif 000079
2005501258.tif 000080
2005501258.tif 000081
2005501258.tif 000082
2005501258.tif 000083
2005501258.tif 000084
2005501258.tif 000085
2005501258.tif 000086
2005501258.tif 000087
2005501258.tif 000088
2005501258.tif 000089
2005501258.tif 000090
2005501258.tif 000091
2005501258.tif 000092
2005501258.tif 000093
2005501258.tif 000094
2005501258.tif 000095
2005501258.tif 000096
2005501258.tif 000097
2005501258.tif 000098
2005501258.tif 000099
2005501258.tif 000100
2005501258.tif 000101
2005501258.tif 000102
2005501258.tif 000103
2005501258.tif 000104
2005501258.tif 000105
2005501258.tif 000106
2005501258.tif 000107
2005501258.tif 000108
2005501258.tif 000109
2005501258.tif 000110
2005501258.tif 000111
2005501258.tif 000112
2005501258.tif 000113
2005501258.tif 000114
2005501258.tif 000115
2005501258.tif 000116
2005501258.tif 000117
2005501258.tif 000118
2005501258.tif 000119
2005501258.tif 000120
2005501258.tif 000121
2005501258.tif 000122
2005501258.tif 000123
2005501258.tif 000124
2005501258.tif 000125
2005501258.tif 000126
2005501258.tif 000127
2005501258.tif 000128
2005501258.tif 000129
2005501258.tif 000130
2005501258.tif 000131
2005501258.tif 000132
2005501258.tif 000133
2005501258.tif 000134
2005501258.tif 000135
2005501258.tif 000136
2005501258.tif 000137
2005501258.tif 000138
2005501258.tif 000139
2005501258.tif 000140
2005501258.tif 000141
2005501258.tif 000142
2005501258.tif 000143
2005501258.tif 000144
2005501258.tif 000145
2005501258.tif 000146
2005501258.tif 000147
2005501258.tif 000148
2005501258.tif 000149
2005501258.tif 000150
2005501258.tif 000151
2005501258.tif 000152
2005501258.tif 000153
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005501258.tif 000154
2005501258.tif 000155
【国際調査報告】
2005501258.tif 000156
2005501258.tif 000157
2005501258.tif 000158
2005501258.tif 000159