(57)【要約】本発明の主題は、同時に２〜４個の遺伝子からの発現が可能であり、そして別々に調節されるバイシストロン性転写単位を特徴とする、マルチシストロン性真核生物プラスミド発現ベクターの構築である。これらのベクターの独特な特徴は、単一プロモーターの制御下で２種のタンパク質を翻訳するＩＲＥＳ（内部リボソームエントリー部位）配列の能力に基づくＣＡＰ−非依存性翻訳開始機構の存在である。このマルチシストロン性ベクターのファミリーは、２種以上の遺伝子の同時発現が必要である種々の生物工学的応用、例えば、遺伝子導入プロトコール、ＤＮＡ免疫において、または同じ細胞における異なる分子の発現のために有利に使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
読み取り段階において、プロモーター／エンハンサー配列、イントロン配列、クローニング部位、ウイルスＩＲＥＳ配列、クローニング部位およびチェーンターミネーターを含んでなる少なくと１個の真核生物発現カセットを含有する、少なくとも２種の同じか異なる関心のあるタンパク質の発現のために使用できるマルチシストロン性組み換えプラスミドベクター。
【請求項２】
チェーンターミネーターの下流に配置された転写減衰部位（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｐａｕｓｅ  ｓｉｔｅ）を含有する、請求項１に記載のプラスミドベクター。
【請求項３】
ＩＲＥＳ配列が脳心筋炎ウイルスまたはＣ型肝炎ウイルスに由来することを特徴とする、請求項１に記載のプラスミドベクター。
【請求項４】
プロモーター／エンハンサー配列がｐ／ｅＣＭＶまたはｐＲＳＶであることを特徴とする、請求項１に記載のプラスミドベクター。
【請求項５】
イントロン配列がＣＭＶ−イントロンＡまたはウサギβ−グロビンイントロンであることを特徴とする、請求項１に記載のプラスミドベクター。
【請求項６】
プロモーター／エンハンサー配列およびイントロン配列が互いに融合されていることを特徴とする、請求項１に記載のプラスミドベクター。
【請求項７】
チェーンターミネーターがポリＡ−ＳＶ４０、ＢＧＨおよびｍＲＧＢから選ばれることを特徴とする、請求項１に記載のプラスミドベクター。
【請求項８】
減衰部位がヒトα２グロビン遺伝子であることを特徴とする、請求項２に記載のプラスミドベクター。
【請求項９】
２個の発現カセットが存在することを特徴とする、請求項１〜６に記載のプラスミドベクター。
【請求項１０】
２種のＩＲＥＳ配列が異なるウイルス起源のものであることを特徴とする、請求項７に記載のプラスミドベクター。
【請求項１１】
１個のカセットが異なるウイルスゲノムに由来する２種のＩＲＥＳ配列を含有することを特徴とする、請求項８に記載のプラスミドベクター。
【請求項１２】
１つのカセットが脳心筋炎ウイルスに由来するＩＲＥＳ配列を含有し、そして他のカセットがＣ型肝炎ウイルスに由来するＩＲＥＳ配列を含有することを特徴とする、請求項９に記載のプラスミドベクター。
【請求項１３】
１つのカセットがプロモーター／エンハンサー配列ｐ／ｅＣＭＶを含有し、そして他のカセットがプロモーター／エンハンサー配列ｐＲＳＶを含有することを特徴とする、請求項７に記載のプラスミドベクター。
【請求項１４】
１つのカセットがイントロン配列ＣＭＶ−イントロンＡを含有し、そして他のカセットがウサギβ−グロビンイントロンを含有することを特徴とする、請求項７に記載のプラスミドベクター。
【請求項１５】
１つのカセットがイントロン配列ｈＣＭＶ−イントロンＡに融合したプロモーター／エンハンサー配列ｐＣＭＶおよび脳心筋炎ウイルスに由来するＩＲＥＳ配列を含有し、そして他のカセットがプロモーター／エンハンサー配列ｐＲＳＶ、ウサギβ−グロビンイントロンおよびＣ型肝炎ウイルスに由来するＩＲＥＳ配列を含有することを特徴とする、請求項７〜１２に記載のプラスミドベクター。
【請求項１６】
１つのカセットがターミネーターポリＡ−ＳＶ４０の配列を含有し、そして他のカセットがターミネーターＢＧＨまたはｍＲＧＢを含有することを特徴とする、請求項７〜１２に記載のプラスミドベクター。
【請求項１７】
クローニング部位がＳａｌＩ、ＸｈｏＩ、ＢｓｉＷＩ、ＮｏｔＩ、ＢｓｔＢＩ、ＥｃｏＲＶ、ＰａｃＩおよびＳｔｕＩから選ばれることを特徴とする、請求項１に記載のプラスミドベクター。
【請求項１８】
配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：４を有する、請求項１に記載のプラスミドベクター。
【請求項１９】
タンパク質の少なくとも１つが、レポーター遺伝子、選択可能なマーカー、抗原、または免疫調節もしくは免疫刺激活性を有するいずれかの分子であることを特徴とする、請求項１に記載のプラスミドベクター。
【請求項２０】
別個のクローニング部位において、少なくとも２種の関心のあるタンパク質をコードしている遺伝子配列を含有する、請求項１に記載のプラスミドベクター。
【請求項２１】
請求項１８に記載の少なくとも１種のプラスミドベクターを含有することを特徴とする、真核宿主細胞。
【請求項２２】
請求項１９にしたがって形質転換された宿主細胞の培養、および場合によってはタンパク質の回収を含んでなる、少なくとも２種の真核生物タンパク質の発現のための方法。
【請求項２３】
遺伝子導入、遺伝子治療およびＤＮＡ免疫における請求項１〜１８に記載のプラスミドベクターの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の主題は、同時に２〜４個の遺伝子の発現が可能であり、そして別々に調節されるバイシストロン性転写単位を特徴とする、マルチシストロン性真核生物プラスミド発現ベクターの構築である。これらのベクターの独特な特徴は、単一プロモーターの制御下で２種のタンパク質を翻訳するＩＲＥＳ（内部リボソームエントリー部位）配列の能力に基づくＣＡＰ−非依存性翻訳開始機構の存在である。このマルチシストロン性ベクターのファミリーは、２種以上の遺伝子の同時発現が必要である種々の生物工学的応用、例えば、遺伝子導入プロトコール、ＤＮＡ免疫において、または同じ細胞における異なる分子の発現のために有利に使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
同じウイルス、レトロウイルスまたはＤＮＡプラスミドベクター中の１種以上の遺伝子の同時発現を達成するための、種々の異なるアプローチが文献において存在している。
【０００３】
文献に記述される各戦略は、数種のタンパク質の発現のために１種のベクターにおける数種のプロモーターの使用に伴う問題、例えば、転移もしくは欠失の可能性、異なるプロモーターの競合的干渉、またはプロモーターのサプレッションを防ぐという目的を有する。事実、同じベクター内の数種のプロモーターの存在は、関心のある遺伝子の発現に失敗する可能性とともに、しばしば、転写の干渉、または異なる遺伝子の分離した発現をもたらす。
【０００４】
記述されたその他のアプローチは融合タンパク質の使用にある、すなわち、２種の遺伝子がキメラタンパク質を得るために「インフレーム」に融合される。しかしながら、このメカニズムは、２種の融合タンパク質が常に同じ活性を保持するとは限らないので、多くの場合にそれを応用不可能にさせる多数の問題を特徴とする；さらに、２種の開始タンパク質の細胞位置は異なるであろうし、そして関心のある個々のタンパク質の発現と機能を問題のあるものとするであろう。
【０００５】
第２の選択肢は、翻訳再開始（ｒｅ−ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ）機構を助けるために、互いに密接に接近した多数のエンコーディング配列からなるポリシストロン性単位の構築である。このアプローチの限界は、第１の遺伝子に続く遺伝子の翻訳効率が、しばしば極端に低下されることである。
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、同じベクター内の数種のタンパク質の同時発現に関連するすべての問題を解決することができる、ウイルスのＩＲＥＳ配列の使用に基づく新規なアプローチを記述する。これらの配列は、ＣＡＰ−依存様式での第１の遺伝子の翻訳に存する操作のメカニズムによって各ペプチドの翻訳の独立した開始を可能にし、それに対して、第２の遺伝子は、ＩＲＥＳ−依存様式において翻訳される。このメカニズムは、第１のシストロンの発現機構に対するいかなる種類の干渉もなしに、第２のシストロンの効率的な転写と翻訳をもたらすことが示された。
【０００７】
特に、本発明において記述されるテトラシストロン性ベクターは、異なる起源の２種のＩＲＥＳ配列の存在を特徴とし、この配置がベクターの安定性を増大し、そしてクローン化したタンパク質の発現に関与する転写と翻訳因子の間の競合を防ぐことができる。
【０００８】
２種の異なる、完全な、そして区別して調節されるバイシストロン性転写単位を特徴とするマルチシストロン性真核生物発現ベクターの新規ファミリーが発見され、そしてここに記述される。これらのベクターは、２種の異なるプロモーター／エンハンサー配列、すなわち、サイトメガロウイルス（ｐ／ｅＣＭＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ｐＲＳＶ）の存在を特徴とし、この配列が、独立に、組み換えｃＤＮＡの転写を導く。本発明によるバイシストロン性ベクターの独特な特徴は、単一プロモーターの制御下で２種のタンパク質を翻訳するために、ＩＲＥＳ配列（内部リボソームエントリー部位）の能力に基づく、もう一方のＣＡＰ−非依存性翻訳−開始機構の存在と結び付けられる。上記バイシストロン性ベクターから直接誘導され、そしてコードされているタンパク質の１つが他の効果を調節できる可能性によって異なるタンパク質を発現することができる共通の性質を有する、トリシストロン性もしくはテトラシストロン性ベクターの開発がまた記述される。
【０００９】
これらのベクターの発現の効率は、ＣＯＳ細胞トランスフェクションにより、レポーター遺伝子の発現を解析することによって、種々の遺伝子導入プロトコールにおいてイン・ビトロで例証された。
【００１０】
これらのマルチシストロン性ベクターは、同時に２種以上の遺伝子を発現することが必要であるすべての生物工学的応用、例えば、遺伝子導入、予防および治療の両目的のためのプラスミドＤＮＡの投与による免疫化において、ならびに互いの効果を調節する異なる分子の発現のために使用することができる。
【００１１】
ＲＮＡ翻訳の内部開始を促進するＩＲＥＳ要素の能力は、真核細胞においてポリシストロン性転写単位による２種以上のタンパク質の発現を容易にした。遺伝子を同時発現するために使用される発現ベクターは、しばしば転写干渉および／または別々の遺伝子発現をもたらし、一部の細胞は関心のある遺伝子の１つのみを発現するよう選択される。１つがレポーター遺伝子、選択可能なマーカー、抗原、または免疫調節もしくは免疫刺激活性を有するいずれかの分子である２種のタンパク質の同時発現は、しばしば生物工学的応用の必要条件である；特に、遺伝子治療における多くの応用は、１種以上のタンパク質の整合した放出を必要とする。
【００１２】
近年、異なるｍＲＮＡ転写物の安定性に関わる問題を防ぐために、ＩＲＥＳ要素を含有するバイシストロン性ベクターが開発され、そして細胞培養からトランスジェニック動物までの種々の実験局面に応用されてきた。本発明の主題は、遺伝子治療のため、およびタンパク質の発現のための新規な一連のプラスミドの構築であって、それらは、ウイルス起源または真核生物遺伝子由来のレギュレーター要素を含有することを特徴とする。これらの配列は、８０００ｂｐ未満のこじんまりした、比較的小さいプラスミド中に含有されている；小サイズのベクターは、転写効率を損なうことなく可成のサイズの遺伝子の導入を可能にするか、またはＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株からの大規模のプラスミド生産を可能にする。
【００１３】
本発明のプラスミドは、１または２個の独立した転写単位を特徴とし、これらの各々は、強力なウイルスプロモーター／エンハンサー（ｐ／ｅＣＭＶまたはｐＲＳＶ）、イントロン配列（ＣＭＶ−イントロンＡまたはウサギβ−グロビンイントロン）からなり、このように得られた転写物、ウイルスＩＲＥＳおよび効率的な転写終結要素（ＳＶ−４０のポリアデニル化部位または成長ホルモンＢＧＨのターミネーターであるが、またそれはウサギβ−グロビン遺伝子ｍＲＧＢ由来のターミネーターであってもよい）の安定性を増大する。両転写単位は組み換えｃＤＮＡが容易にクローン化できる特異的な希有制限部位を含有する。
【００１４】
これらの新規ベクターでは、転写干渉は異なる起源のプロモーターとポリアデニル化シグナルの使用によって、ならびに転写を効果的に終結するために第１の翻訳カセットの末端に減衰部位を導入することによって防止される。
【００１５】
本発明のベクターの独特な特徴は、各転写単位が、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）またはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に由来し、そして第１のシストロンが慣例のＣＡＰ−依存機構において翻訳され、続くシストロンがＣＡＰ−非依存性翻訳開始に基づく人為的な真核生物オペロンを組み立てるために使用できる異なるＩＲＥＳ配列を含有することである。実際に予期せぬことに、異なるＩＲＥＳ配列がベクターの安定性を増大し、そして配列においてトランスに作用する因子に対する競合を防ぐことが見い出された。これらのＩＲＥＳ要素は、最も強力な翻訳インデューサーのうちに入り、そしてほとんど組織屈性を示さないことが知られている（Ｂｏｒｍａｎ  Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．”Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒａｌ  ＩＲＥＳ−ｄｒｉｖｅｎ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｏｒｉｇｉｎｓ”  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｃｈ．２５（５）：９２５−９３２，１９９７）。
【００１６】
本発明によるベクターは、細菌における増幅と維持のために、カナマイシン耐性についての遺伝子およびｐＵＣ１９に基づく複製起点（ｏｒｉ）を有する、原核生物ベクターｐＵＣ１９に基づいて構築される。
【００１７】
最後に、４個の異なる希有の制限部位によるクローニングの可能性が、いかなるｃＤＮＡをもこれらのプラスミドに挿入されることを可能にし、そして多くの異なる生物工学的および治療的応用のためにそれらが使用されることを可能にする。
【００１８】
したがって、本発明の主題は、読み取り段階において、プロモーター／エンハンサー配列、イントロン配列、クローニング部位、ウイルスＩＲＥＳ配列、クローニング部位およびチェーンターミネーターを含んでなる少なくと１個の真核生物発現カセットを含有する、少なくとも２種の同じか異なる関心のあるタンパク質の発現のためのマルチシストロン性組み換えプラスミドベクターによって表される。
【００１９】
好ましくは、ＩＲＥＳ配列は脳心筋炎ウイルスまたはＣ型肝炎ウイルスに由来し、プロモーター／エンハンサー配列はｐ／ｅＣＭＶまたはｐＲＳＶであり、イントロン配列はＣＭＶ−イントロンＡまたはウサギβ−グロビンイントロンであり、そしてターミネーターはポリＡ−ＳＶ４０およびＢＧＨターミネーター（ウシ成長ホルモンターミネーターであるが、またそれはウサギβ−グロビン遺伝子ｍＲＧＢ由来のターミネーターであってもよい）である。
【００２０】
本発明の好適な態様の１つによれば、プロモーター／エンハンサー配列およびイントロン配列は互いに融合されてもよい；特に、プロモーター／エンハンサー配列ｐ／ｅＣＭＶは、好ましくは、イントロン配列ＣＭＶ−イントロンＡに融合される。
【００２１】
ベクターが２種の別の翻訳カセットを含有する場合、２種のＩＲＥＳ配列は、好ましくは、異なるウイルス起源のものである；通常は、１つのカセットは脳心筋炎ウイルスに由来するＩＲＥＳ配列を含有し、そして他のカセットはＣ型肝炎ウイルスに由来するＩＲＥＳ配列を含有する。同様に、好ましくは、１つのカセットはプロモーター／エンハンサー配列ｐ／ｅＣＭＶを、他のカセットは配列ｐＲＳＶを含有し、そして１つのカセットはイントロン配列ＣＭＶ−イントロンＡを、他のカセットはウサギβ−グロビンイントロンを含有する。同様に、１つのカセットはポリＡ−ＳＶ４０ターミネーターを、他のカセットはウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ターミネーターを含有するが、またそれはウサギβ−グロビン遺伝子（ｍＲＧＢ）由来のターミネーターであってもよい。好適なクローニング部位は：ＳａｌＩ、ＸｈｏＩ、ＢｓｉＷＩ、ＮｏｔＩ、ＢｓｔＢＩ、ＥｃｏＲＶｍ、ＰａｃＩおよびＳｔｕＩである。
【００２２】
特に、配列：ＰＬ１９０に対応する配列番号：１、ＰＬ１７８に対応する配列番号：２、ＰＬ２４９に対応する配列番号：３、およびＰＬ２５０に対応する配列番号：４を有するプラスミドベクターは、本発明の好適な態様を構成する。本発明のさらなる主題は、先に定義されたような少なくとも１種のプラスミドベクターを含有する真核宿主細胞、宿主細胞の培養を含んでなる少なくとも２種の真核生物タンパク質の発現（および場合によっては、タンパク質の回収）のための方法、ならびに遺伝子導入、遺伝子治療およびＤＮＡ免疫における本発明によるプラスミドベクターの使用によって表される。
【００２３】
本発明のさらなる態様は、次に示す試験の部より明らかになるが、これは、本発明を限定するものと考えるべきではない。
【実施例】
【００２４】
原核生物のマーカーを用いる選択系
遺伝子ＡｍｐＲが、ＡｌｗＮＩおよびＳｓｐＩによる消化によってベクターｐＵＣ１９（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ，Ｂｉｏｌａｂｓ）から除去され、そして残りのプラスミドが、Ａｓｐ７００およびＡｌｗＮＩによってベクターｐＥＴ３９（Ｎｏｖａｇｅｎ）から予め回収されたカナマイシン耐性についての遺伝子に連結されて、Ｐｌ−６２（２５８３ｂｐ）が生成された。
【００２５】
プラスミドの精製
形質転換ＤＨ５−α  Ｅ．コリ株（ＳＵＰＥ４４，ΔｌａｃＵ１６９（φ８０  ｌａｃＺΔＭ１５），ｈｓｄＲ１７，ｒｅｃＡＩ，ｅｎｄＡＩ，ｇｙｒＡ９６，ｔｈｉ−１，ｒｅｌＡＩ）中に含有されるＤＮＡが、カナマイシン３０μｇ／ｍｌを補足したＬＢ培地において増殖され、そしてプラスミドＤＮＡが、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐプラスミドキットにより精製された。ＤＮＡはＵＶ分光測定によって定量され、そしてその純度は２６０ｎｍと２８０ｎｍにおける吸光度の比を計算することによってチェックされた。
【００２６】
クローニング技術
すべてのクローニング技術は、既述の慣用の方法にしたがって実施された（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）。制限および修飾酵素は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ，Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．から得られ、そして販売者により推奨されるように使用された。
【００２７】
レポーター遺伝子のクローニング
レポーター遺伝子をコードしているＤＮＡが、２種のベクターのクローニング部位における遺伝子の組み込みに都合がよいように特異的制限部位を含有するプライマーの使用によりＰＣＲによって増幅された。ＥＧＦＰ−１（７３５ｂｐ）をコードしている遺伝子は、プライマーＥＧＦＰ−１（ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣｇｃｃａｃｃａｔｔｇｇｔｇａｇｃａａｇ；下線ＳａｌＩ部位、小文字＝対合）およびＥＧＦＰ−２（ＣＣＴＣＣＴＣＧＡＧｔｔａｃｔｔｇｔａｃａｇｃｔｃｇｔｃ；下線ＸｈｏＩ部位、小文字＝対合）を用いてベクターｐＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から増幅され、ＳａｌＩおよびＸｈｏＩ制限酵素により消化され、そしてＰｌ−１６３のＳａｌＩおよびＸｈｏＩ部位（ＭＣＳ１）に連結されて、ベクターＰｌ−１７４（５９６１ｂｐ）が生成され、また、プライマーＧＦＰ−１７８−Ａ（ＡＧＣＴＧＡＴＡＴＣｇｃｃａｃｃａｔｇｇｔｇａｇｃａａ；下線ＥｃｏＲＶ部位、小文字＝対合）およびＧＦＰ−１７８−Ｂ（ＡＣＣＧＴＴＣＧＡＡｔｔａｃｔｔｇｔａｃａｇｃｔｃｇｔｃ；下線ＢｓｔＢＩ部位、小文字＝対合）を用いてベクターｐＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から増幅され、ＥｃｏＲＶおよびＢｓｔＢＩ制限酵素により消化され、そしてＰｌ−１７８のＥｃｏＲＶ，ＢｓｔＢＩ（ＭＣＳ３）部位に連結されて、プラスミドＰｌ−１８９（５２００ｂｐ）が生成された。ルシフェラーゼ（１６３０ｂｐ）をコードしている遺伝子は、プライマーＬｕｃ−１（ＧＴＡＴＣＧＴＡＣＧｔｇｇｔｃｔａｇａａｔｔａｃａｃｇｇｃｇ；下線ＢｓＩＷＩ部位、小文字＝対合）およびＬｕｃ−２（ＴＡＣＴＣＧＴＡＣＧｔｔｔｃｃａｔｇｇａａｇａｃｇｃｃａａ；下線ＢｓＩＷＩ部位、小文字＝対合）を用いてプラスミドｐ１８７（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からＰＣＲによって増幅され、予めＢｓＩＷＩ（ＭＣＳ２）で消化されたプラスミドＰｌ−１７４に連結されて、プラスミドＰｌ−１７７（７６３６ｂｐ）が生成され、また、プライマーＬｕｃｉｆ−１（ＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣｃａｔｇｇａａｇａｃｇｃｃａａａ；下線ＮｏｔＩ部位、小文字＝対合）およびＬｕｃｉｆ−２（ＡＴＡＧＣＣＡＴＴＣＡＧＧＣａｔｔａｃａｃｇｇｃｇａｔｃｔｔｔｃ；下線ＢｇｌＩ部位、小文字＝対合）を用いてプラスミドｐ１８７（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から増幅され、ＮｏｔＩおよびＢｇｌＩにより消化され、そしてＰｌ−１８９のＮｏｔＩおよびＢｇｌＩ部位（ＭＣＳ４）に連結されて、プラスミドベクターＰｌ−１９３（５２００ｂｐ）が生成された。得られたプラスミドのすべては、制限および配列解析によってチェックされた。
【００２８】
トランスフェクション試験
ベクターｐ１−１７７およびｐ１−１９３に挿入され、そして前記ルシフェラーゼおよびＥＧＦＰ−１についてのｃＤＮＡを含有する転写単位の活性を例証し、続いて、２種のｃＤＮＡ間に配置されたＩＲＥＳの正確な活性を確認するために、得られたベクターは、サルの腎細胞の真核細胞系（ＣＯＳ）にトランスフェクションされた。
【００２９】
ＣＯＳ細胞は、１０％ウシ胎児血清の存在下の非選択性ＤＭＥＭ培地において単層状態で増殖され、そして１０％ＣＯ２条件下の湿潤環境において３７℃で維持された。濃度１ｘ１０５〜３ｘ１０６の培養物において維持されたＣＯＳ細胞が、最終濃度１０〜２０μｇ／ｍｌにおける両組み換えプラスミドｐ１−１７７および対照ベクターｐ１−１６３を用いて、リン酸カルシウム［（Ｃａ３（ＰＯ４）２］法によるＤＮＡ沈殿によってトランスフェクションされた。トランスフェクションのために使用された細胞は、１０ｃｍプレート当たり０．５〜１ｘ１０６の密度において２４時間前に接種された。培地はトランスフェクション４〜８時間前および８〜１０時間後に更新された。
【００３０】
同じ方法がベクターｐ１−１９３によっても追随された。
【００３１】
検討
本発明では、種々の生物工学的および治療的応用のために使用できるマルチシストロン性ベクターの新規ファミリーの構築戦略が記述される。ベクターのファミリーは、高レベルの発現および転写物収量の高い安定性と相関した、ウイルス起源の構成的プロモーターおよび異なる転写要素を含有する２種の基礎的バイシストロン性ベクターの構築によって得られた。
【００３２】
構築されたプラスミドのすべては、細菌細胞当たり多数のプラスミドコピーの生産のために複製起点ＣｏｌＥ１を含有し、そして細菌系（例えば、Ｅ．コリ）における適当な選択のために使用されるアンピシリン耐性の内因性遺伝子をカナマイシン耐性の遺伝子により置換することによって改変されたベクターｐＵＣ１９の骨格に基づいている。
【００３３】
アンピシリンはβ−ラクタム系抗生物質に対する耐性を与えることができ、それがプラスミドＤＮＡの混入物として痕跡に存在した場合、感受性の個人においてアナフィラキシーショックを誘起するので、アンピシリン耐性を使用する選択系に基づいている文献に通常記載されるベクターは、ヒトの遺伝子治療における使用について、国際的規制当局（ＦＤＡおよびＷＨＯ）によっては実際には受け入れられないであろう。
【００３４】
それ故、本発明のベクターは、カナマイシン耐性をコードする遺伝子の存在、および構築物の発現レベルにおいて可能性のある悪影響を防ぐために除去された細菌起源の他の配列の不在を特徴とする。
【００３５】
第１のバイシストロン性プラスミドＰｌ−１９０を構築するために、ＰＣＲによる増幅によって得られた種々の転写要素が、基礎ベクターｐＵＣ１９の配列中に存在するクローニング部位において連結され（図１）、一方、バイシストロン性ベクターＰｌ−１７８の転写要素のすべては、ベクターｐＵＣ１９のクローニング領域（ポリリンカー）の下流約２００ヌクレオチドに位置するｐＵＣ１９の制限部位ＦｓｐＩにおいてクローン化された（図２）。これは２つの理由：第１に、プラスミドＰｌ−１９０中に直接Ｐｌ−１７８の完全な転写カセットをクローン化してＰｌ−２５０と呼ばれるテトラシストロン性ベクターを生成できるため（図３）、そして第２に、ＲＮＡポリメラーゼＩＩが、第１の転写単位に存在する終結シグナルの後で確実に停止するよう２つの単位間に約２００ヌクレオチドの距離を作成するために実施された。
【００３６】
トリシストロン性ベクターＰｌ−２４９は、制限酵素による消化によってベクターＰｌ−２５０からＨＣＶ−ＩＲＥＳ配列を除去し、そしてＰａｃＩおよびＳｔｕＩ制限部位を付加することによって得られた。
【００３７】
また、減衰部位（ｐａｕｓｅ  ｓｉｔｅ）が、２つの転写単位間の干渉の可能性を除去するために第１の転写単位の下流にクローン化された。減衰部位が強力なポリアデニル化シグナルの直接下流に置かれる場合、有意なレベルの転写終結が達成されるということが実際に示されていた（Ｌｅｖｉｔｔ  Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．”Ａ  ｐａｕｓｅ  ｓｉｔｅ  ｆｏｒ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩＩ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ”，ＥＭＢＯ．Ｊ．１０，７，１８３３−１８４２）。ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写の終結における機能的減衰部位の必要条件は数種の遺伝子：ヒトα２グロビン、後期アデノウイルスメジャー（ｍａｊｏｒ）および後期ポリオーマウイルスにおいて示された（Ａｄａｍｉ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ，ＥＭＢＯ  Ｊ．１９９８，７，２１０７−２１１６  ”Ｔｈｅ  ｓｌｏｗｉｎｇ  ｄｏｗｎ  ｏｒ  ｐａｕｓｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｂｅｙｏｎｄ  ｔｈｅ  ３’ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｉｓ  ａ  ｋｅｙ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ”；Ｅｇｇｅｒｍｏｎｔ  Ｊ．，Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ  Ｎ，Ｊ．，”Ｐｏｌｙ（Ａ）  ｓｉｇｎａｌｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｐａｕｓｅ  ｓｉｔｅｓ  ｃｏｍｂｉｎｅ  ｔｏ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩＩ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ”．１９９３  ＥＭＢＯ  Ｊ．１２（６）：２５３９−２５４８）。
【００３８】
前述の構築物では、ヒトα２グロビン遺伝子の減衰部位が使用された；これはＡに非常に富む９２ｂｐの領域であると報告されており、そしてほとんど完全な反復配列（ＣＡ４）６を特徴とし、これは強力な下流プロセッシングシグナルがＲＮＡポリメラーゼによって達せられる速度を低下させるために方向依存様式において作用する。減衰部位の３’側半分はタンパク質に対する明瞭な結合部位をもたず、またそれは有意に安定なＲＮＡ構造中にたたみ込まれることもない（Ｍｏｒｅｉｒａ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，”Ｕｐｓｔｒｅａｍ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｐｏｌｙ（Ａ）  ｓｉｔｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃ２  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ａｒｅ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ”，ＥＭＢＯ．Ｊ．１９９５．１４（１５）：３８０９−３８１９）。
【００３９】
９２ｂｐの領域が有効なポリアデニル化部位の３‘に配置された場合、転写における減衰のみならずまた減衰部位後の有意なレベルの終結も起こさないことが可能である。この領域は転写終結を容易にするためにポリアデニル化部位と相互作用するようである。
【００４０】
２つの転写単位を構築するためには、種々の転写要素、例えば強力なウイルスプロモーター（ｐ／ｅＣＭＶおよびｐＲＳＶ）、イントロン配列（ＣＭＶ−イントロンＡおよびｒ−β−グロビンイントロン）、ポリアデニル化部位およびＩＲＥＳ要素が使用された。使用したプロモーターおよび終結シグナルは、いかなる転写干渉の可能性をも除去するために異なる起源のものであった。
【００４１】
哺乳動物における発現のための市販ベクターのほとんどは、病原性ウイルスに由来するプロモーターを担持している。これらの要素はウイルスに由来するけれども、多数の哺乳動物組織において転写を開始するそれらの良好な能力のために、それらは遺伝子治療プロトコールにおける使用および遺伝的免疫化のための非常に有用な要素になった。サイトメガロウイルス（ｐ／ｅＣＭＶ）のプロモーター／エンハンサーおよびラウス肉腫ウイルス（ｐＲＳＶ）のプロモーターは２種の非常に強力なウイルスプロモーターであり、そしてそれらは種々の細胞種で強力な構成的発現を誘導するので、もっとも普通に使用されるプロモーターである。２種のプロモーターは類似の強さを示し、そして同じベクター中で使用される場合、２種以上の遺伝子の同時発現を可能にし、発現における差異を防ぐ。
【００４２】
タンパク質の発現のためにイントロン配列の使用によって達成される有利な効果に関して、それらがイン・ビトロでの異種遺伝子の発現を増進することが示されている（Ｃｈａｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｉｎｔｒｏｎ  Ａ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（Ｔｏｗｎｅ）  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ  ｇｅｎｅ  ｏｎ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ”，１９９１．ＮＡＲ  １９（１４）：３９７９−３９８６）。転写発現におけるそれらの効果は、基本的に、ＲＮＡのポリアデニル化の速度の増加およびＲＮＡのスプライシングに関わる核移送に関連している。さらにまた、イントロン配列は抗原発現にも重要な影響を有し、そして種々のトランスフェクション系において遺伝子発現を増進することが示されている。イントロンＡおよびウサギβ−グロビンイントロンのタンパク質発現に及ぼすポジティブ効果は、プロモーター／エンハンサー活性による上流要素の調節、または安定なｍＲＮＡのプロセッシングへの寄与によるものであろう（Ｈｕａｎｇ  Ｍ．Ｔ．ａｎｄ  Ｇｏｒｍａｎ  Ｃ．Ｍ．”Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ＲＮＡ  ３’ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ＲＮＡ”．１９９０．ＮＡＲ．１８：９３７−９４６）。正確な、そして有効な転写終結に必要であるその他の重要な要素は、ポリアデニル化部位によって構成される。ポリアデニル化は、安定なｍＲＮＡの生産のため、ならびに使用される種々のターミネーターにより変えることができるｍＲＮＡ翻訳効率を増強するために必須のプロセスである。さらにまた、転写開始割合が強力なプロモーター／エンハンサー要素の使用により増大される場合には、転写終結プロセスが転写効率の制限因子になるかもしれない（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｒ．Ｊ．ａｎｄ  Ｓｔａｎｄａｒｔ．”Ｄｏ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙ（Ａ）  ｔａｉｌ  ａｎｄ  ３’  ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｍＲＮＡ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ？”．Ｃｅｌｌ．１９９０；６２：１５−２４）。ＳＶ４０の後期ポリアデニル化シグナルは非常に効率的であり、そしてＲＮＡの安定性およびレベルを初期ポリＡＳＶ４０シグナルよりも約５倍以上増大する（Ｃａｒｅｗｅｌｌ  Ｓ．ａｎｄ  Ａｌｗｉｎｅ  Ｊ．Ｃ．”Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｕｔｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｉｍｉａｎ  ｖｉｒｕｓ  ４０  ｌａｔｅ  ｐｏｌｙａｄｅｎｉｌａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ：ｅｆｆｃｔｓ  ｏｆ  ｕｐｓｔｒｅａｍ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”．１９８９．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．９：４２４８−４２５８）。既述のプラスミドにおいて、このポリアデニル化シグナルは、クローニング部位の丁度下流に置かれたので有効なポリアデニル化シグナルを有しないクローン化遺伝子の効率的なプロセッシングを可能にした。
【００４３】
本発明のベクターにおいて使用される他のポリアデニル化部位は、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）由来のターミネーターであり、これは必須のポリアデニル化シグナルおよび下流の終結要素を含有するが、それはまたウサギβ−グロビン遺伝子（ｍＲＧＢ）由来のターミネーターであってもよい（Ｌｅｖｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｏｌｙ（Ａ）  ｓｉｔｅ”．１９８９，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．３：１０１９−１０２５）。これらの最適化した転写ターミネーターの存在は、他のターミネーターに比較してタンパク質発現を増大することが示された（Ｈａｒｔｉｋｋａ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．”Ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｄｉｒｅｃｔ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ”  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １９９６／７：１２０５−１２１７）。
【００４４】
本発明にしたがって構築されたプラスミドベクターのファミリーの独特な特徴は、２種の異なるＩＲＥＳウイルス配列、ＥＭＣＶ−ＩＲＥＳおよびＨＣＶ−ＩＲＥＳの存在であり、これらはバイシストロン性ｍＲＮＡにおける第２のシストロンの翻訳を引き起こすために使用される。
【００４５】
内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）は、トランスに作用する細胞因子の助けによりｍＲＮＡ中に存在する内部開始コドンおいて小リボソームサブユニットを用いてシスに作用する要素である。この領域は、第１のシストロンの翻訳を調節するＣＡＰ−依存性翻訳機構に影響することなくリーディングコードの効率的翻訳のイニシエーターとして機能できる。また、２つのプロセスのメカニズムは異なる細胞因子の使用とは明らかに異なる。
【００４６】
ＩＲＥＳ要素は、リボソームの集合とそれらのスキャニングを触媒する特定の二次構造をとることができる。若干の哺乳動物遺伝子はＩＲＥＳ要素を含有して、正常な発生の特殊な段階において、または翻訳が感染の結果として抑圧される場合に翻訳を確保する（Ｂｉｒｎｓｔｉｅｌ  Ｍ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，”Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ３’ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ：ｔｈｅ  ｅｎｄ  ｉｓ  ｉｎ  ｓｉｔｅ．”１９８５  Ｃｅｌｌ．４：３４９−３５９）。病原性ウイルスはしばしば、宿主の細胞翻訳手段をウイルスの複製の方向に変えて、宿主のＣＡＰ−依存性翻訳機構を破壊し、そしてＩＲＥＳ−媒介様式においてそれらの転写を翻訳する。これらのウイルスのメッセンジャーのほとんどはモノシストロン性であるけれども、それらのＩＲＥＳ要素は人為的な真核生物オペロンを組み立てるために使用することができ、このオペロンでは慣例の第１のシストロンがＣＡＰ−依存性機構において翻訳され、そして続くシストロンがＣＡＰ−非依存性翻訳開始機構にしたがって翻訳される（Ｆｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．”ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｍｕｌｔｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”．Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９８．２８：１１１−１２５）。
【００４７】
ＲＮＡ翻訳の内部開始を促進するＩＲＥＳ要素の能力は、真核細胞におけるポリシストロン性転写単位による２種以上のタンパク質の発現を可能にした（Ｂｏｒｍａｎ  Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，”Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒａｌ  ＩＲＥＳ−ｄｒｉｖｅｎ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｏｒｉｇｉｎｓ”ＮＡＲ．１９９７．２５（５）：９２５−９３２）；ほとんどの場合には、第２の遺伝子の発現効率が増大される（Ｇａｌｌａｒｄｏ  Ｈ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．”Ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｅｎａｂｌｅｓ  ｒｅｌｉａｂｌｅ  ｃｏ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ”．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．１９９７．４：１１１５−１１１９）。
【００４８】
脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）では、一般分類にしたがってピコルナウイルスＩＩ型ＩＲＥＳに包含されているＩＲＥＳ領域は、５’における非翻訳領域の約４５０〜６００ヌクレオチドからなり、そして保存ＵＵＵＣモチーフからなる２５ヌクレオチドの要素、それに続くピリミジンに富むより可変性の部分とＧに乏しいスペーサー、および最後に、実際のリボソームエントリー部位であると考えられるＡＵＧトリプレットを含有する３’において終結する。この領域の存在は、それが単一のメッセンジャーによって２個のＯＲＦの翻訳を可能にするので、バイシストロン性ベクターの作成を容易にする（Ｊａｎｇ  Ｓ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，”Ａ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ５’ｎｏｎ−ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ＲＮＡ  ｄｉｒｅｃｔｓ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｅｎｔｒｙ  ｏｆ  ｒｉｂｏｓｏｍｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”．Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９８．６２（８）：２６３６−２６４３）。
【００４９】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のＩＲＥＳ配列は、内部翻訳開始を導くための最良の候補として記述されているＥＮＣＶおよびＦＭＤＶのＩＲＥＳのようなＩＩ型ＩＲＥＳと同様に挙動する。この領域は、非翻訳領域の大部分を伴う内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）を用いてＨＣＶのポリタンパク質の翻訳を開始できることが知られている。ＨＣＶのＩＲＥＳ配列は、このセグメントの一次配列とＲＮＡの二次および三次構造の複合体を形成するその能力の両者に大きく依存する；この領域には、主要なＨＣＶウイルス遺伝子型は、翻訳を開始するためには使用されない５ＡＵＧコドンを保持する。
【００５０】
種々の研究は、ＨＣＶのＩＲＥＳが霊長類に由来しない細胞系を含む試験された細胞系のすべてにおいて翻訳開始を導くことを示している。さらにまた、他のＩＩ型ＩＲＥＳにおいて示されるように、ＨＣＶのＩＲＥＳはイン・ビトロよりもイン・ビボにおいて一層効率的である。最小のＨＣＶ−ＩＲＥＳ配列はまだ議論の余地がある（Ｆｕｋｕｓｈｉ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，”Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ５’ｎｏｎ  ｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  ｉｓ  ｎｅｃｅｓｓａｒｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ＲＮＡ”  ＢＥＲＣ．１９９４．１９９（２）：４２５−４３２；Ｔｓｕｋｉｙａｍａ−Ｋｏｈａｒａ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．”Ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ  ｗｉｔｈｉｎ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ＲＮＡ”．Ｊ．  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１９９２．６６（３）：１４７６−１４８３）。種々の研究は、ＨＣＶゲノムのほぼヌクレオチド４４から３５４まで伸長するＩＲＥＳ配列を記述している。本発明者らは、それが最小の機能領域であることが示されたので、ヌクレオチド１０９〜３４１（ウイルス遺伝子型１ｂの２３０ｂｐ）を包含するヌクレオチド配列を使用することを選んだ（Ｃｏｌｌｉｅｒ  Ａ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．”Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ５’  ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｉｘ  ｍａｊｏｒ  ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ”．１９９８．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．７９：２３５９−２３６６）。
【００５１】
短いＩＲＥＳセグメントの使用は、それが治療遺伝子の挿入のための空間の大きさを増加するので、バイシストロン性ベクターの構築のためには特に重要である。本発明のベクターの機能性は、ＣａＣｌ２法の使用によりＣＯＳ細胞をトランスフェクションし、そして両イン・ビトロとイン・ビボで容易に検出可能であるＥＧＦＰおよびルシフェラーゼレポーター遺伝子をクローニングすることによってイン・ビトロで試験された。
【００５２】
結論
本発明において記述した新規ベクターのファミリーは、新規な遺伝子組み合わせ物が単一ベクターにおいて作成されることを可能にする用途の広い道具を表す。単一ベクターにおいて２種以上の遺伝子を同時発現する機能は、２つの別々のベクターの使用よりも有意に効果的であり、そして有利である。ポリシストロン性ベクターのこのファミリーは、遺伝子治療、同時発現の研究、特定の細胞系における２種の遺伝子の相乗効果の解析および１種のタンパク質の２個以上のサブユニットの同時発現へのアプローチを含む分野において、多くの異なる応用を有するであろう。
【００５３】
単一ベクターの使用は同時トランスフェクションの研究を単純化し、そして劇的に増加させる。何故ならば、それは遺伝子の両方を発現するためにコ・トランスフェクション株を作成し、そして２種のタンパク質について類似レベルの発現を達成するために、１回の選択段階で安定なトランスフェクション株を作成する方法において時間を節約させるからである。
【００５４】
したがって、本発明で記述した新規ベクターは、種々の生物工学的応用において、特に遺伝子治療の応用、例えばがん遺伝子治療、免疫原性治療およびＤＮＡワクチン接種のために、２種以上の遺伝子を発現するために使用することができる。これらのすべての応用において、多遺伝子性アプローチは事実、一遺伝子性アプローチを超える効率を示した。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
図１  ベクターＰｌ−１９０の構築の図式説明
ａ）ｐ／ｅＣＭＶ−イントロンＡ（１６２２ｂｐ）は、プライマーＥＰ１Ａ−１（ＡＡＡＡＣＴＧＣＡＧｔｇｇｇｃｃａｔｔｇｃａｔａｃｇｔｔｇｔａ；下線ＰｓｔＩ部位、小文字＝対合）およびＥＰ１Ａ−２（ＣＡＡＡＣＴＧＣＡＧａａａａｇａｃｃｃａｔｇｇｇｇｇｇａａａｇ；下線ＰｓｔＩ部位、小文字＝対合）を用いてベクターＰｌ−１８７からＰＣＲによって増幅され、ＰｓｔＩ制限酵素により消化され、そしてＰｌ−６２のクローニング部位のＰｓｔＩ部位に連結されて、プラスミドＰｌ−９３（４２０５ｂｐ）が生成された。
【００５６】
プロモーターｐ／ｅＣＭＶはベクターｐＵＣ１９のプロモーターＬａｃＺとして同方向にクローン化された；同様のことがｐ／ｅＣＭＶプロモーターの下流の他のクローン化フラグメントのすべてについて実施された。
【００５７】
ｂ）ＥＣＭＶ−ＩＲＥＳ（６３１ｂｐ）は、プライマーｐＩＲＥＳ−１（ＡＧＣＧＧＡＴＣＣｔｃｇａｇｃａｔｔｃｔａｇｇｇｃｇｇａａｔｔ；下線ＢａｍＨＩ部位、小文字＝対合）およびｐＩＲＥＳ−２（ＧＣＧＧＡＴＣＣｔｔｔａａａｔｇｔｇｇｃａａｇｃｔｔａｔｔｃａｔｃｇｔ；下線ＢａｍＨＩ部位、小文字＝対合）を用いてｐＩＲＥＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から増幅され、ＢａｍＨＩ制限酵素により消化され、そしてＰｌ−９３のＢａｍＨＩ部位に連結されて、ベクターＰｌ−１３７（４８２９ｂｐ）が生成された。
【００５８】
ｃ）ポリＡ−ＳＶ４０フラグメント（４３０ｂｐ）は、プライマーポリ−２Ａ（ＴＣＣＧＴＡＣＧｃａｇａｃａｔｇａｔａａｇａｔａｃａｔｔｇ；下線ＢｓＩＷＩ部位、小文字＝対合）およびポリ−３Ａ（ＡＴＣＣＧＣＴＡＧＣａｃｃｇｇｔｃａｔｇｇｃｔｇｃｇｃ；下線ＮｈｅＩ部位、小文字＝対合）を用いてベクターｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からＰＣＲによって増幅され、予めＥｃｏＲＩで消化され、そしてクレノウ修飾酵素で処理されたＰｌ−１３７ベクターに連結された。このクローニングはベクターＰｌ−１６３（５２４２ｂｐ）をもたらした。ＢｓＩＷＩおよびＮｈｅＩ制限部位が、続いてのクローニング段階を容易にするためにプライマー中に導入された。
【００５９】
ｄ）減衰部位フラグメント（９８ｂｐ）は、プライマーＰＬＳ−１（ＣＴＡＧＣＴＡＧＣａａｃａｔａｃｇｃｔｃｔｃｃ；下線ＮｈｅＩ部位、小文字＝対合）およびＰＬＳ−２（ＴＣＡＧＣＴＡＧＣａｇａｇａａａｔｇｔｔｃｔｇｇｃａｃ；下線ＮｈｅＩ部位、小文字＝対合）を用いてベクターＰ−ＧＥＭ−Ｐ（Ｂａｓｅｃｌｅａｒ，ＢＨ  Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから合成で得られた）から増幅され、予めＮｈｅＩで消化されたベクターＰｌ−１６３に連結された。このクローニングはプラスミドＰｌ−１９０（５３４０ｂｐ）をもたらした。
【００６０】
得られたベクターのすべては、制限および配列解析によってチェックされた。
ＭＣＳ＝多重クローニング部位。ＭＣＳ１＝ＳａｌＩ、ＸｈｏＩ；ＭＣＳ２＝ＢｓＩＷＩ。
【００６１】
図２ａ／ｂ  ベクターＰｌ−１７８の構築の図式説明
ａ）プラスミドＰｌ−１７８の構築のために、すべてのフラグメントがＰＣＲによって増幅されて、ベクターＰｌ−６２中にフラグメントを組み込むための特異的制限部位が作成され、そしてまた、続くクローニング段階のための新しい独特のクローニング部位が作成された。
【００６２】
ウサギβ−グロビンイントロン（７００ｂｐ）は、プライマーイントロン−１（ＡＴＧＧＣＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣａｔｃｃｇｔｃｇａｇｇａａｔｔｃｔｔｔ；下線ＫａｓＩ部位、下線ＥｃｏＲＶ部位、小文字＝対合）およびイントロン−２（ＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＣＴＡＧＣｔｃｇａｔｃｇａｃｃｇａｔｃｃｔｇａｇａ；下線ＮｄｅＩ部位、下線ＮｈｅＩ部位、小文字＝対合）を用いてベクターＰｌ−７９から増幅され、そして予めＮｄｅＩおよびＫａｓＩ制限酵素により消化されたベクターＰｌ−６２に連結された。このクローニングはベクターＰｌ−１４０（３２３０ｂｐ）をもたらした。ＥｃｏＲＶおよびＮｈｅＩ制限部位は続くクローニング段階を容易にするために導入された。
【００６３】
ｂ）ｐＲＳＶ（６２３ｂｐ）は、プライマーｐＲＳＶ−１（ＣＡＴＧＣＴＡＧＣｔａｃｃｃａｇｃｔｔｇｇａｇｇｔｇｃａ；下線ＮｈｅＩ部位、小文字＝対合）およびｐＲＳＶ−２（ＡＴＴＣＡＴＡＴＧｔｔｇａｃａｇｃｔｔａｔｃａｔｃｇｃａｇ；下線ＮｄｅＩ部位、小文字＝対合）を用いてベクターｐＲＥＰ−４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から増幅され、ＮｄｅＩおよびＮｈｅＩで消化され、そしてＰｌ−１４０のＮｄｅＩおよびＮｈｅＩ部位に連結されて、ベクターＰｌ−１５４（３８５９ｂｐ）が作成された。
【００６４】
ｃ）プラスミドＰｌ−１６５の構築のために、ＨＣＶ−ＩＲＥＳ領域（２６０ｂｐ）（Ｂａｓｅｃｌｅａｒ，Ｂ．Ｈ．Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓにより合成で製造された）をコードしているフラグメントが、ベクターｐＧＥＭ＋ＨＣＶ−ＩＲＥＳから酵素ＢｇｌＩおよびＥｃｏＲＶを用いる制限消化によって切断され、そしてプラスミドＰｌ−１５４のＢｇｌＩおよびＥｃｏＲＶ部位に連結されて、ベクターＰｌ−１６５（４１１０ｂｐ）が生成された。
【００６５】
ｄ）ＢＧＨフラグメント（３９０ｂｐ）は、プライマーｍＲＧＢ−１（ＡＴＡＧＣＣＡＴＴＣＡＧＧＣｔｇｇａｔｃｃａｇａｔｃｔａｃｔｔｃ；下線ＢｇｌＩ部位、小文字＝対合）およびｍＲＧＢ−２（ＧＡＣＴＴＧＣＧＣＡｔｃｃｔａｔｇａａｔｔｔｃｔｃｔｃｃａｔｔａｃ；下線ＦｓｐＩ部位、小文字＝対合）を用いてベクターＰｌ−１８７から増幅され、ＢｇｌＩおよびＦｓｐＩで消化され、Ｐｌ−１６５のＢｇｌＩおよびＦｓｐＩ部位に連結されて、ベクターＰｌ−１７８（４５００ｂｐ）が生成された。
得られたベクターのすべては、制限および配列解析によってチェックされた。ＭＣＳ＝多重クローニング部位。ＭＣＳ３＝ＥｃｏＲＶ、ＢｓｔＢＩ；ＭＣＳ４＝ＮｏｔＩ、ＢｇｌＩ（ＢｇｌＩ制限部位はテトラシストロン性ベクター中のユニーク部位ではない）。
【００６６】
図３  マルチシストロン性ベクターの構築
４遺伝子を潜在的に発現することができるプラスミドＰｌ−１５０の構築では、ベクターＰｌ−１７８がＦｓｐＩおよびＮｄｅＩにより消化され、クレノウで処理され、そしてＰｌ−１９０のＦｓｐＩ部位にクローン化されて、最終プラスミドＰｌ−２５０が生成された。
【００６７】
３遺伝子を潜在的に発現することができるプラスミドＰｌ−２４９の構築では、ＨＣＶ−ＩＲＥＳ配列が酵素ＥｃｏＲＶ−ＮｏｔＩを用いる制限処理によってベクターＰｌ−２５０から除去され、そしてＰａｃＩおよびＳｔｕＩ制限部位が付加された。
【図１】
2005507248.tif 000002
【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年10月13日(2003.10.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
読み取り段階において、プロモーター／エンハンサー配列、イントロン配列、クローニング部位、ウイルスＩＲＥＳ配列、クローニング部位およびチェーンターミネーターを含んでなる少なくと１個の真核生物発現カセットを含有する、少なくとも２種の異なる関心のあるタンパク質の発現のために使用できるマルチシストロン性組み換えプラスミドベクターであって、ＤＮＡワクチン接種のために、（ａ）タンパク質の少なくとも１種が抗原であり、（ｂ）タンパク質の少なくとも１種が免疫調節もしくは免疫刺激活性を有する分子であり、そして（ｃ）該ベクターがカナマイシン耐性についての遺伝子および原核生物複製起点を含有することを特徴とする、プラスミドベクター。
【請求項２】
チェーンターミネーターの下流に配置された転写減衰部位（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｐａｕｓｅ  ｓｉｔｅ）を含有する、請求項１に記載のプラスミドベクター。
【請求項３】
ＩＲＥＳ配列が脳心筋炎ウイルスまたはＣ型肝炎ウイルスに由来することを特徴とする、請求項１に記載のプラスミドベクター。
【請求項４】
プロモーター／エンハンサー配列がｐ／ｅＣＭＶまたはｐＲＳＶであることを特徴とする、請求項１に記載のプラスミドベクター。
【請求項５】
イントロン配列がＣＭＶ−イントロンＡまたはウサギβ−グロビンイントロンであることを特徴とする、請求項１に記載のプラスミドベクター。
【請求項６】
プロモーター／エンハンサー配列およびイントロン配列が互いに融合されていることを特徴とする、請求項１に記載のプラスミドベクター。
【請求項７】
チェーンターミネーターがポリＡ−ＳＶ４０、ＢＧＨおよびｍＲＧＢから選ばれることを特徴とする、請求項１に記載のプラスミドベクター。
【請求項８】
減衰部位がヒトα２グロビン遺伝子であることを特徴とする、請求項２に記載のプラスミドベクター。
【請求項９】
２個の発現カセットが存在することを特徴とする、請求項１〜６に記載のプラスミドベクター。
【請求項１０】
２種のＩＲＥＳ配列が異なるウイルス起源のものであることを特徴とする、請求項７に記載のプラスミドベクター。
【請求項１１】
１個のカセットが異なるウイルスゲノムに由来する２種のＩＲＥＳ配列を含有することを特徴とする、請求項８に記載のプラスミドベクター。
【請求項１２】
１つのカセットが脳心筋炎ウイルスに由来するＩＲＥＳ配列を含有し、そして他のカセットがＣ型肝炎ウイルスに由来するＩＲＥＳ配列を含有することを特徴とする、請求項９に記載のプラスミドベクター。
【請求項１３】
１つのカセットがプロモーター／エンハンサー配列ｐ／ｅＣＭＶを含有し、そして他のカセットがプロモーター／エンハンサー配列ｐＲＳＶを含有することを特徴とする、請求項７に記載のプラスミドベクター。
【請求項１４】
１つのカセットがイントロン配列ＣＭＶ−イントロンＡを含有し、そして他のカセットがウサギβ−グロビンイントロンを含有することを特徴とする、請求項７に記載のプラスミドベクター。
【請求項１５】
１つのカセットがイントロン配列ｈＣＭＶ−イントロンＡに融合したプロモーター／エンハンサー配列ｐＣＭＶおよび脳心筋炎ウイルスに由来するＩＲＥＳ配列を含有し、そして他のカセットがプロモーター／エンハンサー配列ｐＲＳＶ、ウサギβ−グロビンイントロンおよびＣ型肝炎ウイルスに由来するＩＲＥＳ配列を含有することを特徴とする、請求項７〜１２に記載のプラスミドベクター。
【請求項１６】
１つのカセットがターミネーターポリＡ−ＳＶ４０の配列を含有し、そして他のカセットがターミネーターＢＧＨまたはｍＲＧＢを含有することを特徴とする、請求項７〜１２に記載のプラスミドベクター。
【請求項１７】
クローニング部位がＳａｌＩ、ＸｈｏＩ、ＢｓｉＷＩ、ＮｏｔＩ、ＢｓｔＢＩ、ＥｃｏＲＶ、ＰａｃＩおよびＳｔｕＩから選ばれることを特徴とする、請求項１に記載のプラスミドベクター。
【請求項１８】
配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：４を有する、請求項１に記載のプラスミドベクター。
【請求項１９】
別個のクローニング部位において、少なくとも２種の関心のあるタンパク質をコードしている遺伝子配列を含有する、請求項１に記載のプラスミドベクター。
【請求項２０】
該原核生物複製起点がｐＵＣ１９の複製起点であることを特徴とする、請求項１〜１９に記載のプラスミドベクター。
【請求項２１】
ＤＮＡワクチンの製造のための請求項１〜２０に記載のプラスミドベクターの使用。
【国際調査報告】
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