(57)【要約】(a)抗原提示細胞(ＡＰＣ)に抗原をパルス投与するステップと、(b)そのＡＰＣをＣｐＧオリゴヌクレオチドで処理するステップとを含む抗感染処理のために免疫刺激特性を有する抗原担体としてＡＰＣ、好ましくは骨髄由来樹状細胞(ＢＭＤＣ)または末梢血由来樹状細胞を生成させる方法を述べる。前記ＡＰＣはＡＩＤＳ、結核、マラリアまたはリーシュマニア症のような疾病に対する免疫予防剤または免疫治療剤として有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体において特異的抗原提示特性を有し、特異的疾病関連抗原とＣｐＧ分子とを含み、ＣＤ34+骨髄前駆細胞または末梢血単球調製物に由来する非天然樹状細胞(ＤＣ)。
【請求項２】
前記ＣｐＧオリゴヌクレオチドが核酸配列
５’−ＴＴＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ−３’
を含む請求項１に記載のＤＣ。
【請求項３】
前記ＤＣがＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦのｉｎ  ｖｉｔｒｏの長期曝露によって入手された請求項１から２に記載のＤＣ。
【請求項４】
前記抗原が微生物抗原または癌抗原である請求項１から３に記載のＤＣ。
【請求項５】
前記微生物抗原が寄生生物に由来する請求項４に記載のＤＣ。
【請求項６】
前記寄生生物がリーシュマニアである請求項５に記載のＤＣ。
【請求項７】
前記の特異的抗原提示特性がＴｈ１型免疫刺激応答を含む請求項４に記載のＤＣ。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかに記載のＤＣと、場合により薬剤として許容される担体、希釈剤および賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項９】
サイトカインを含む請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１から７に記載のＤＣと付加的なアジュバントとを含むワクチン。
【請求項１１】
感染症および癌疾患の予防的処理または治療的処理のための薬剤を調製するための請求項１から７に記載のＤＣの使用法。
【請求項１２】
以下のステップ：
（ａ）請求項１から７のいずれかに規定する分離されたＤＣに特異的抗原を曝露すること、および
（ｂ）１つまたは複数のＣｐＧオリゴヌクレオチドで前記ＤＣを処理すること
を含むＤＣの製造法。
【請求項１３】
前記ＤＣが動員された幹細胞に由来して、末梢血から分離され、前記前駆細胞が機能的ＤＣを生成させる条件で培養された請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ａ）および（ｂ）が同時に実施される請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
第１包装がＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦ中でＣＤ３４+骨髄前駆細胞調製物または末梢血単球調製物を培養することによって前記細胞から入手されるＤＣを包含し、第２包装がＣｐＧ分子を有し、第３包装が疾病関連抗原を有するいくつかの包装を備える医薬用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(発明の分野)
本発明は、(ａ)抗原提示細胞(ＡＰＣ)を抗原に曝露するステップと、(ｂ)そのＡＰＣをＣｐＧオリゴヌクレオチドで処理するステップとを含む抗感染処理および癌ワクチン接種のために免疫刺激特性を有する抗原担体としてＡＰＣ、好ましくは骨髄由来樹状細胞(ＢＭＤＣ)または末梢血由来樹状細胞(ＤＣ)を生成させる方法に関する。前記ＡＰＣは種々の癌性疾患および感染症のための免疫予防剤または免疫治療剤として有用である。
【０００２】
(発明の背景)
前世紀には、ワクチン接種と化学療法での主要な進歩が原因となって多様な感染症の予防と防除が著しく成功した。しかし、21世紀の初頭に感染症は開発途上国の罹病率と死亡率の第１原因のままであり、先進国における公衆衛生問題のかなりの割合を依然として占めている。例えば、世界保険機関(ＷＨＯ)はＡＩＤＳ、結核、マラリアおよびリーシュマニア症によって全世界で500万人を超える死者が出ているため、それらの疾病が将来目標とすべきヒトの主要な疾病群であり続けると1998年に報告した。
【０００３】
興味深いことに、これらの４つの疾病は癌と起源は異なるが、調査されたワクチン接種戦略との比較となると共通の性質を有する。一般に、癌ワクチン接種では陽性の臨床結果が欠如しており、様々なワクチン接種戦略は個々の患者に転移性病巣の退縮を生じる一般的に広く応用できる治療様式をもたらしていない。癌と感染に対するワクチン接種の目標とは関係なく、いくつかの特徴が共通なことに注目すべきである：１.信頼性のある有効なワクチンが入手できない、２.化学療法が限られる、３.原因因子が形質転換細胞型または細胞内病原体である、および４.罹患／感染した細胞の一部に対しては抗体が有益な場合もあろうが防御の媒介の中心となるのは細胞性免疫応答である。よって、細胞性免疫応答は過去10年間における熱心な研究の焦点であり、現在も依然としてそうである。そして、誘導と維持のメカニズムの一部が明らかにされた。細胞性免疫はＡＰＣによってプロセシングを受けた後のタンパク質を認識するＣＤ４+Ｔ細胞およびＣＤ８+Ｔ細胞によって媒介される。それらの機能は表現型の特徴とサイトカインのプロフィールに基づいている。Ｔ細胞の活性化にはＢ細胞や樹状細胞のようなＡＰＣの存在が必要である。ＣＤ８+Ｔ細胞はＭＨＣクラスI分子に関連して提示される抗原を認識し、ＣＤ８+Ｔ細胞の活性はＩＦＮ−γやＴＮＦ−αのようなサイトカインの産生、ならびに直接的な細胞溶解メカニズムによって媒介される。他方で、ＣＤ４+Ｔ細胞はＭＨＣクラスII分子と結合した抗原を認識後に活性化して、Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞と呼ばれる機能的サブセットに分化する。Ｔｈ１細胞は、マクロファージ活性化と細胞内微生物の死滅のための最も重要なメディエイタであるＩＦＮ−γを概して産生する。ＩＦＮ−γ産生性ＣＤ４+Ｔ細胞の誘導は、免疫応答の開始時に病原体に曝露された後のＡＰＣによるＩＬ−12の産生に依存することが示されている。したがって、多くの細胞内感染または癌細胞に関係した他の病理学的細胞内変化に応答してＩＬ−12はインデューササイトカインであり、ＩＦＮ−γはエフェクターサイトカインである。Ｔｈ２細胞は抗体の産生を刺激しマクロファージによる細胞内死滅の強力な阻害剤であるＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−10を概して産生する。
【０００４】
近年、多くの報告によると、与えられたＤＣサブセットが様々な微生物に応答する能力に顕著な柔軟性を有することを示しているため［２〜５］、このことは、ＤＣの受ける刺激の種類がＤＣ介在性のＴｈ細胞応答の分極化を生じる決定的な因子であることを示唆している。
【０００５】
細胞内感染および癌ワクチン接種の実験的マウスモデル、ならびにヒトの対応疾患の観察から、Ｔｈ１免疫応答は防御性であり、特に感染症ではＴｈ２が疾病促進性であることが広く受け入れられている。これは感受性BALB/cマウスに対する抵抗性C57BL/６マウスにおけるリーシュマニア(Leishmania major)感染で最初に実証されたが、他の細菌(Mycobacteria、Salmonella、Listeria)、菌類(Candida、Cryptococcus、Aspergillus、Paracoccidiodes)およびいくつかのウイルス(ＨＩＶ)感染にも当てはまることが後に確認された。この理由から、効果的なＴｈ１免疫応答の誘導は、癌や寄生生物感染のような起源が多様な疾病に対する免疫予防剤または免疫治療剤の開発にとって決定的に必要であると考えられる。
【０００６】
上記の研究結果にしたがって、細胞内感染および癌に対するワクチンおよび治療法を開発するための必要条件は細胞性免疫応答のＴｈ１部門の選好的誘導である。ＣＤ４+Ｔ細胞の分極化に影響する目下の既知の因子には：１.局所サイトカイン環境、２.抗原投与の用量と経路、３.Ｔ細胞を刺激するＡＰＣの種類、４.シグナルの「強度」すなわちＭＨＣと抗原との複合体に対するＴ細胞レセプターの親和性とレセプターの連結のタイミングと密度、および最後に５.免疫的に活性な増殖因子の存在がある。これらの因子の中で新たに活性化したＴ細胞周辺のサイトカイン環境が最も重要であると考えられる。
【０００７】
昨年、複数の研究室が最も強力なＡＰＣである樹状細胞(ＤＣ)を「天然」アジュバントおよびＴｈ１免疫応答の強力なインデューサとして使用することに特に興味を示していた。この目的のためにリーシュマニア症のマウスモデルが使用された。リーシュマニア(Leishmania major)の皮膚感染後にＤＣだけが遊走して皮膚からリンパ節に抗原を輸送することができ、特異的なＴ細胞の一次応答を開始するためのシグナルを与える点で無類であると示すことができよう。さらに、ＭＨＣクラスIIとペプチドとの複合体の安定性が増大するためにＤＣは免疫原性の寄生生物抗原を長期間保持する。よってリーシュマニア症に対する防御免疫を保有する寄生生物特異的Ｔ細胞を持続的に刺激するのかもしれない。これらの観察から、科学者は感染症に対して免疫するための天然アジュバントとしてＤＣを使用する可能性を調査することを促された。これらの研究は、ＤＣファミリーのメンバーである上皮ランゲルハンス細胞にリーシュマニア(L.major)の溶解物をex vivoでパルス投与後に、本来は感受性であるBALB/Cマウスがその後の毒性寄生生物の感染に対して持続性の防御を誘導できることを実証した。典型的なＴｈ２免疫応答を観察した対照動物に対比して、この防御はＴｈ１様パターンへの顕著な移行と平行していた。したがって、ＤＣは感染症に対するワクチン接種のための効果的な抗原送達系として役立ち、治療への可能な利用法の実現性を切り開くと期待できる。この概念は、細菌、寄生生物、真菌およびウイルス感染の他のモデルで得られた同様の結果によって支持されている。
【０００８】
治療のアプローチに必要な十分な数と、患者の臨床治療を援助するための質を備えたＤＣの入手性は、ＤＣの本質的な治療の潜在能力を使用できるか否かを長い目で見れば決定するであろう。この問題が解決されないのであれば、ＤＣは強力な研究手段であるという目下の位置に留まることを実質的に意味するであろう。
【０００９】
ＤＣはマクロファージとは表現型の異なる希少であるが不均一な集団を構成している(ＤＣはＣＤ14-)。ＤＣはＡＰＣとしての効力で規定され、他のよく知られているが効力が比較的低いＢ細胞およびマクロファージのようなＡＰＣとは異なる。ＤＣは多数の系列から得られ、局所炎症環境に応答して表現型を動的に移行させることが示されている。目下のところ知られており、ワクチン接種アプローチで使用に望ましい最も強力なＤＣは、ときに「ランゲルハンス細胞」(ＬＣ)と呼ばれる皮膚由来ＤＣである。しかし、ＬＣは上皮細胞のわずか１〜３％しか構成せず、皮膚からＬＣを分離することは面倒である。血液ＤＣは循環血液中の白血球集団全体の0.3％未満に寄与するように同様の小集団である。ＤＣに適切な培養法が欠如していることが付加的な制限となっている。したがってヒトでは多数の天然ＬＣ／ＤＣは入手できない。
【００１０】
他の研究室はＤＣの起源が血液単球調製物に由来するＣＤ34+前駆細胞または分化の方向付けが終わっていない骨髄由来ＣＤ34+細胞のような分化度の低い細胞であると報告した。しかし、これらの細胞はＤＣ表現型を獲得するためにまずex vivoで分化しなければならない。
【００１１】
ヒト単球由来ＤＣは目下のところ最も簡単に入手できるＤＣ源を表している。血液から入手できる単球の数は妥当で、必要となる操作はドナーにとってあまり不快とならない。一般に、ワクチンのプロトコルに使用されたＤＣは、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦで刺激された単球調製物または単球由来の前駆細胞(ＣＤ34+細胞)から生成したものである。ヒトでは、ＩＬ−４非存在下で培養した単球由来細胞は活性化マクロファージになる。マウス系ではＩＬ−４の使用はＤＣの生成に必要ではない。調製の第１ステップで、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)を密度遠心分離で分離する。この方法によってすべての赤血球と顆粒球は１つの分離ステップで欠失する。次にＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４存在下でＰＢＭＣを６日間培養する。第６日に細胞はＣＤ14(単球系列のマーカー)を欠失しＣＤ１ａを獲得している。リポ多糖(ＬＰＳ)のような古典的刺激は(未熟)ＤＣを刺激してＩＬ−６、ＩＬ−８およびＩＬ−12(ｐ40およびｐ70)のような因子を産生させることができる。
【００１２】
皮膚ＤＣが入手できないことによって引き起こされた制限にもかかわらず、皮膚ＤＣが最もよく研究された種類のＤＣである。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔリンパ球が重要な役割を演じ活性化する必要がある状況に大きく注目された。皮膚ＤＣはクラスI分子に関連して腫よう抗原および感染性因子の抗原を提示する。さらに、ＬＣはクラスI分子に負荷した外来抗原を提示することができる。この機能はＬＣ／ＤＣに独特でクロスプライミングとして知られている。したがってＤＣはＴ細胞とＢ細胞を刺激することができる。ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方が防御性癌免疫に必要で、クラスIで提示された抗原を介して活性化する必要があることから、この発見は極めて重要である。独特の抗原提示機能に加えて、皮膚ＤＣは並はずれた付帯機能を備えている。総合すると、これらの精妙な特徴によってＤＣは一次および二次免疫応答を誘導することができる。この理由からＤＣはしばしば「自然のアジュバント」と呼ばれ、このことが癌および感染症の治療に魅力的な選択肢を許している。
【００１３】
癌の免疫治療では、癌に特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞が抗原特異的な治療のための免疫応答を生成する役割は明白であり、その役割はワクチン接種の成功を予見し癌の予防と防除に焦点を当てた概念にとっての必要条件である。それにもかかわらず、免疫原性腫よう抗原の欠如、補助シグナルの不在および／または活性な免疫抑制が原因で、自然の、またはワクチン接種が誘導する免疫応答はしばしば欠如し癌との戦いを助けない。数か所の研究室から生まれた実験作業は皮膚ＤＣがクラスＩ分子に関連して腫よう抗原を提示することを示している。そのことはＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の両方が活性化して防御性癌免疫を実施するための必要条件である。
【００１４】
単球由来の樹状細胞(ＤＣ)は目下の実験的免疫治療プロトコルでは少数の機関でしか使用されていない。研究結果の比較が困難であるのは、一般に受け入れられている基準にしたがって関係するＤＣを生成させず、それらの表現型が異なるからである。腫よう関連タンパク質またはペプチドを負荷したＤＣを投与すると、様々な種類の悪性細胞に対する免疫応答の誘導が生じた。疾病の安定と腫ようの退縮のような臨床応答が一部の患者、特に黒色腫、骨髄腫、ろ胞性非ホジキンリンパ腫および前立腺癌の患者で報告された。
【００１５】
ＤＣ性ワクチンの臨床試験では、制限を与える多数の重大な問題が顕在化した。これらの問題にはＤＣの最適な供給源およびＤＣの表現型、抗原の種類および抗原をＤＣに負荷する方法、ＤＣの分化／成熟を誘導するかどうか、免疫の経路とタイミング、ならびに適切な臨床シナリオがある。
【００１６】
癌免疫治療に目下のところ使用されている単球由来ＤＣは一般的な標準計画にしたがって生成させたものではない。したがって、ＤＣに基づくアプローチをさらに調査するためには、ＬＣについて報告された性質と類似する強力な免疫刺激特性(ＭＨＣクラスI介在性抗原提示、付帯機能、Ｔヘルパー応答の誘導能)を有するＤＣを十分な量で生成させるためのプロトコルを樹立することが非常に重要である。骨髄前駆細胞の使用は多数のＤＣを生成させるための代替法と考えられる。しかし同じ疑問が生じる：それらを分化させて理想的な抗原担体にするためにはどのような刺激／培養条件が必要か。
【００１７】
免疫応答の移行とモジュレーションに関して細菌およびぜん虫のある産物がＡＰＣと同様にＤＣを刺激してそれぞれＴｈ１またはＴｈ２細胞を選好的にプライミングして活性化する。好ましい細菌産物にはＢ細胞、ＮＫ細胞、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)および血液樹状細胞の免疫刺激物質であることが示されたオリゴヌクレオチドがある(US6429199、US6207646参照)。種々の研究でKriegらは非メチル化シトシングアニン(ＣｐＧ)ジヌクレオチドモチーフが免疫刺激特性の中心であり、一般式：５'Ｘ1ＣＧＸ2３'で表されることを示した。ここで、Ｘ1はＡ、ＧおよびＴからなる群から選択され、Ｘ2はＣまたはＴである。ＣｐＧ含有ヌクレオチドは８から40塩基対の範囲であることが報告された。しかし、十分な免疫刺激モチーフが存在するならば、いかなるサイズの核酸も免疫刺激性である。著者ら(kriegら)はＣｐＧはＰＢＭＣを活性化すること、そして単球調製物中に存在する多様な種類の細胞の中でＣｐＧのＤＮＡがマクロファージを直接活性化し、マクロファージは多様なサイトカイン(ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−α)を放出して応答することを実証した。Ｂ細胞とＮＫ細胞の両方がODN1668によって特異的に活性化されることが示された。Kriegらは単球由来樹状細胞とは対照的に、ＣｐＧによる刺激に感受性であるのは血液中の少数(0.2％)の天然樹状細胞だけであることをさらに実証した。Kriegらは「単球由来樹状細胞」についてUS6429199に書いている：「多数のＤＣを得ることができる(略)が、ＩＬ−４を除去するとそれらの細胞はＤＣの性質を失い、(略)ＩＬ−４は最適ではないかもしれないＴｈ２免疫応答である特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導する；(略)単球由来樹状細胞はＬＰＳに感受性であるが、驚くべきことにＣｐＧモチーフによって活性化されないことを我々は発見した。単球由来ＤＣがＣｐＧに応答できないのは、非生理的方法でこれらの細胞を調製することが原因であるかもしれないと信じられている。」Kriegらは彼らの研究を通してＣｐＧを作用させる最も重要なターゲットとして末梢血の天然ＤＣのプロフィールを作成した。しかし以前に指摘されていたように、これらの生理的ＤＣは数に限りがあるためほ乳動物に治療用細胞を大規模に使用するとなると細胞の種類としては好ましくない。
【００１８】
したがって、本発明の基礎となる技術上の問題は、抗癌および抗感染処理のための抗原担体または天然アジュバントとして役立つことのできるＡＰＣ、好ましくはＤＣを大規模に提供することである。
【００１９】
(発明の概要)
上記の技術上の問題は、特許請求の範囲に特徴付けられる実施例を提供することによって次のような解決に達した：特にＤＣ、すなわちＢＭＤＣまたは単球由来ＤＣを特異的成熟刺激、すなわちＣｐＧオリゴヌクレオチドを与えてin vitroで取扱うことによって、Ｔ細胞免疫応答の顕著な誘導能を表して細胞内病原体による本来は致死性の感染および癌からほ乳動物を防御するような活性化ＢＭＤＣが生成できることを実証できよう。
【００２０】
Lutzらが記述したように骨髄前駆細胞からＤＣを生成し、得られた細胞集団は骨髄ＤＣ表現型(ＭＨＣクラスII＋、ＣＤ80＋、ＣＤ86＋、ＣＤ40＋、ＩＣＡＭ−１＋、ＣＤ11ｃ＋)を有する典型的なＤＣ形態と、同種ＭＬＲおよびリーシュマニア特異的Ｔハイブリドーマ細胞を用いた増殖アッセイで強力なＭＨＣクラスI依存性抗原提示機能とを有していた。ＢＭＤＣを10日間培養後、接着していない細胞を集め、ＧＭ−ＣＳＦを含有する培地で再び懸濁し、抗原をパルス投与した。
【００２１】
モデル系としてリーシュマニア(Leishmania major)による実験的リーシュマニア症を使用した。例えば、in vitroでリーシュマニア抗原をパルス投与し、成熟させるためにＣｐＧオリゴヌクレオチドで処理したＤＣ(ＤＣ/ＣｐＧ/リーシュマニア抗原)をマウスに単回ワクチン接種することによって、その後のリーシュマニア寄生生物による感染に対する完全な防御が媒介される。リーシュマニア抗原またはＣｐＧオリゴヌクレオチドの一方のみを得た対照マウスは防御されなかった。基礎となる免疫メカニズムの分析から、ＤＣ/ＣｐＧ/リーシュマニア抗原のワクチン接種は防御型の細胞介在性免疫応答、すなわちＣＤ４＋１型ヘルパー細胞(Ｔｈ１)が介在する免疫応答を誘導することがはっきりした。防御効果は安定かつ長期、すなわち20週間を超えて持続した。２回目の感染後にマウスは疾病のいかなる兆候も現さなかった。感染または癌に対するワクチン接種にこのアプローチを用いて、ヒトまたは他の動物から生成したＤＣに処理された個体で防御免疫応答が誘導されることが期待できる。
【００２２】
(図面の簡単な説明)
図１：ＢＭＤＣ調製物をワクチン接種し１週間後にリーシュマニア(L.major)寄生生物を感染させたBALB/cマウスにおける病巣の発達
「材料と方法」に記述するようにＢＭＤＣを産生し様々な処理を施して培養する。ＡとＢは独立した２実験を表し、各群について足蹠の腫脹の平均＋/−標準誤差を示す(ｎ＝５)。
【００２３】
図２：ＣｐＧで成熟させ溶解物をパルス投与したＢＭＤＣによって誘導されるマウス皮膚リーシュマニア症の臨床治癒は寄生生物の負荷量の有意な減少を伴う。
【００２４】
図１Ｂに示す実験のワクチン接種されていない対照マウスと防御されたマウスを屠殺し、生存している寄生生物の量を限界希釈法(Ａ)で測定した。足蹠懸濁液から得た献体を塗抹し、ギームザ染色し光学顕微鏡で観察した(Ｂ)。表示した写真は各群の代表である。
【００２５】
図３：防御されたマウス由来のリンパ節細胞によるサイトカインの発現パターンはＴｈ１様免疫応答への移行を示す
プールしたリンパ節細胞懸濁液を図１Ｂに示すいくつかの関連性のある群から調製し、リーシュマニア抗原の非存在下(白)または存在下(黒)で72時間培養した。上清をELISA法でアッセイしてＩＬ−２(Ａ)、ＩＦＮ−γ(Ｂ)およびＩＬ−４(Ｃ)の産生を調べた。
【００２６】
図４：防御されたマウスにおけるリーシュマニア特異的ＩｇＧ抗体の産生はＴｈ１免疫応答と相関する
図３に示す実験群に属する個々のマウスの血清をELISAで分析して総ＩｇＧ(Ａ)、ＩｇＧ１(Ｂ)およびＩｇＧ２ａ(Ｃ)の抗リーシュマニア抗体の存在を調べた。結果を吸光度(Ｏ.Ｄ.)で示し、平均値を横棒で表示する。各マウスについてＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１の比を計算し、Ｄに示す。
【００２７】
図５：ＣｐＧで成熟させ溶解物をパルス投与したＢＭＤＣによるマウス皮膚リーシュマニア症からの防御は抵抗性C57BL/6マウスにおいても示すことができる
「材料と方法」に述べるようにＢＭＤＣを処理し、寄生生物の感染の１週間前にマウスに静脈内注射した。足蹠の腫脹を毎週記録し(Ａ)、感染６週間後にプールした足蹠における寄生生物の負荷を定性した(Ｂ)。
【００２８】
図６：(Ａ)ＣｐＧで成熟させ溶解物をパルス投与したＢＭＤＣによる処理は再感染に対する強力な防御を媒介する
図１Ａに示す実験で治癒したマウスに５×１０5個の感染性寄生生物を再び感染させ、病巣の発達を毎週追跡した。
【００２９】
(Ｂ)ＣｐＧで成熟させ溶解物をパルス投与したＢＭＤＣによる治療の可能性の評価
マウスを感染させ、ＣｐＧで成熟させ溶解物をパルス投与したＢＭＤＣを図の上部に示す時点で静脈内注射し、足蹠の腫脹を監視した。
【００３０】
図７：ワクチン接種に使用されるＢＭＤＣによるＩＬ−12の発現
ＢＭＤＣを生成させ、表示されたように36時間処理し、遠心分離によって上清と細胞を分離した。「材料と方法」に記述するようにＲＴ−ＰＣＲによってＩＬ−12ｐ40およびＩＬ−12Ｐ35サブユニットのｍＲＮＡを増幅するために細胞を使用した(Ａ)。上清をELISAでアッセイしてＩＬ−12p70の発現を調べた。
【００３１】
(発明の詳細な説明)
本発明は１つの側面では、以下のステップ：(a)(例えばＡＰＣに抗原をパルス投与することによって)そのＡＰＣを抗原に曝露すること；および(b)そのＡＰＣをＣｐＧオリゴヌクレオチドで処理すること
を含む抗感染および抗癌処理のための免疫刺激特性を有する抗原担体としてＡＰＣを生成させる方法に関する。
【００３２】
本発明の方法に適したＡＰＣはＤＣファミリーの様々なサブセットを含み、ＢＭＤＣまたは末梢血由来ＤＣが好ましい。ＤＣの生成法と非ＡＰＣからの前記細胞の分離法は当業者に既知であり、例えばLutzら、J.Immunol.Meth. 223：77〜92(1999)；Romaniら、J.Immunol.Meth. 196：137〜151(1999)；Thurnerら、J.Immunol.Meth. 223：1〜15(1999)に記述されている。ＡＰＣ一般または特異的ＤＣに抗原をパルス投与する方法も当業者に既知であり、例えばFloheら、Eur.J.Immunol. 28：3800〜3811(1998)および下記の実施例１(Ｄ)に記述されている。
【００３３】
当業者はＣｐＧオリゴヌクレオチドでＡＰＣの処理を行う方法を、例えば下記の実施例１(Ｄ)に挙げる説明通りに行うことによって知っている。ステップ(a)および(b)を別々にまたは同時に実施することができる。
【００３４】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドの調製は従来法にしたがって行うことができる(Sambrookら、1989、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、ニューヨーク州、USA参照)。
【００３５】
「免疫刺激特性を有する」という用語は、成熟したＡＰＣが防御免疫応答を与える能力を含む。
【００３６】
本発明の感染症関連抗原はミコバクテリア(mycobacteria)、クラミジア(chlamydia)、インフルエンザウイルス、HPV、HBV、HCV、EBV起源から得られる全細胞溶解物および抗原混合物、ならびにリーシュマニア由来のLelF、伸長因子４(elongation factor ４)およびLACK、リステリアモノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)由来のリステリオリシン、ならびに例えばSAG１およびSAG２のようなトキソプラズマゴンディ(Toxoplasma gondii)抗原のような分子構造の明らかな抗原である。
【００３７】
ＣＤ８＋ｔ細胞によって認識されるヒト癌抗原は癌精巣抗原(例えばMAGE-３、BAGE、GAGE、NY-ESO-１)、メラニン細胞分化抗原(例えばMelan-A/Mart-１、チロシナーゼ、gp100)、過剰発現された抗原(例えばHer２/neu、erbB１、ｐ53、MUC-１)および点突然変異抗原(例えばβ−カテニン、MUM-１、CDK-４、p53、ras)の群から選択される。
【００３８】
本発明の好ましい実施例では、ほ乳動物において特異的抗原提示特性を有し、特異的疾病関連抗原とＣｐＧ分子とを含む非天然樹状細胞(ＤＣ)を生成させて使用する。前記ＤＣはＣＤ34＋骨髄細胞前駆細胞または末梢血単球に由来し、抗感染治療法および癌治療法のための免疫刺激性を有する抗原担体としてＡＰＣはＢＭＤＣまたは末梢血単球由来ＤＣであり、その方法は以下のステップ：
(a)大腿骨および／または脛骨から骨髄細胞を得るか末梢血単球調製物からＤＣ前駆細胞を分離すること；(b)その細胞をＤＣを生成できる条件で培養すること；(c)その分離されたＤＣに抗原をパルス投与すること；および(d)そのＤＣをＣｐＧオリゴヌクレオチドで処理することを含む。
【００３９】
ステップ(a)および(b)の方法は一般に知られているうえに、下記の実施例１(D)に記述されている。好ましくはステップ(c)および(d)を同時に行う。もしも連続的に行うならば、ステップ(d)をステップ(c)の前に行う。
【００４０】
本発明の方法のさらに好ましい実施例では、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは５'−ＴＴＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ−３'の核酸配列を含む。しかし、一般式(５'Ｘ１ＣＧＸ２ ３')で表される核酸を使用してもよい。ここでＸ１はＡ、ＧおよびＴからなる群から選択され、同様にＸ２はＣまたはＴである。ＣｐＧ含有ヌクレオチドの妥当な長さは８から40塩基対の範囲であると報告されている。
【００４１】
本発明に使用される抗原の免疫原性はアジュバントを含有させることによって実質的に増加するかもしれない。したがって、本発明に基づくワクチンの好ましい実施例はＱＳ21、フロイントの不完全アジュバント、ＩＬ−２、ＩＬ−12、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＰＬまたはＲＣ−529のようなＡＧＰを含む。
【００４２】
本発明の方法のよりいっそう好ましい実施例では、ＡＰＣ、好ましくはＢＭＤＣをＴヘルパー免疫応答を誘導する能力で特徴づける。この能力は標準アッセイ、例えば下記実施例５に記述するアッセイによってアッセイできる。
【００４３】
「抗原」という用語はここでは病原微生物、例えば寄生生物(調製には例えば下記の実施例１(D)を参照)の溶解物、もしくは病原生物の１つまたは複数の精製タンパク質を含む。好ましくはその抗原は微生物の分離されたタンパク質またはそのようなタンパク質の混合物であり、および／またはその微生物は細胞内病原体である。(1)細胞または抽出物、(2)分離された微生物抗原、(3)その抗原を表現し、分離された抗原を発現するためのプロモータと作動連結した分離された核酸またはその機能変異体、(4)分離されたポリペプチドまたはその機能変異体を発現する宿主細胞、からなる群からその微生物抗原を選択することが特に好ましい。
【００４４】
本発明の方法は多様な微生物、好ましくは例えばHIV、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、マラリア病原虫(Plasmodium)、リーシュマニア(Leishmania)、サルモネラ(Salmonella)、リステリア(Listeria)、トキソプラズマ(Toxoplasma)およびクラミジア(Chlamydia)のような細胞内病原体(寄生生物)に対する免疫防御を提供するために有用である。
【００４５】
本発明は、上記に説明し下記実施例に例示する本発明の方法で入手できる免疫刺激特性を有するＡＰＣ、好ましくはＢＭＤＣまたは末梢血由来ＤＣ、ならびに前記細胞を含み、好ましくは適当な製剤用の担体を組み合わせた医薬組成物にも関する。適当な製剤用の担体の例は業界で既知であり、緩衝性水溶液を含む。そのような担体を従来法で製剤化でき、適当な用量で対象に投与できる。その適当な組成物をワクチン接種のために投与することは様々な方法、例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内または皮内投与によって遂行してもよい。当然、投与経路は疾病の性質、例えば病原体または寄生生物の種類および医薬組成物に含まれるＡＰＣの種類に依存する。投薬プログラムは担当医師および他の臨床要因によって決定されよう。医学でよく知られているように、いかなる１人の患者に対する投薬も患者の体格、体表面面積、年齢、性別、投与される特定のＡＰＣ、投与の時間と経路、病原体の種類、全身の健康状態および同時投与される他の薬剤のような多くの要因に依存する。抗原をパルス投与し、本発明のＣｐＧおよび／または医薬組成物で処理したＤＣをワクチンとして使用してもよい。したがってさらなる一面において、本発明はほ乳動物に免疫応答を誘導する方法に関し、その方法は抗原をパルス投与し本発明のＣｐＧおよび／または医薬組成物で処理し、疾病がその個体内ですでに樹立しているか否かにかかわらず、前記動物をその疾病から防御するための抗体および／または例えばサイトカイン産生Ｔ細胞もしくは細胞傷害性Ｔ細胞を含むＴ細胞免疫応答の産生に十分なＤＣをそのほ乳動物に接種することを含む。ポリヌクレオチドの発現を指示し、in vivoでポリペプチドをコードするベクターを介して本発明の抗原を送達することを含む方法でほ乳動物に免疫応答を誘導してもよい。その方法は免疫応答の誘導して、その動物を本発明の疾病から防御するための細胞傷害性および記憶Ｔ細胞、または抗体を産生させることを目的としている。そのベクターを投与する一方法は、粒子のコーティングまたは別なものとして目的細胞への導入を促進することによる。そのような核酸ベクターにはＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾された核酸、またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドが含まれるかもしれない。ワクチンとして使用するには、抗原をパルス投与しＣｐＧで処理したＤＣを通常はワクチン製剤(組成物)として用意する。その製剤はさらに適当な担体を含んでもよい。好ましい投与経路は非経口(例えば皮下、筋肉内、静脈内または皮内注射)である。非経口投与に適した製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および製剤をレシピエントの血液と等張にする溶質を含有するかもしれない水性または非水性の滅菌注射液、ならびに懸濁化剤または粘稠化剤を含有するかもしれない水性および非水性の滅菌懸濁液がある。包装された製剤は単位量または多回量用の包装容器、例えば封入アンプルおよびバイアルに入れたものであるかもしれないし、使用直前に滅菌した液体担体を加えるだけでよい凍結乾燥状態で貯蔵されるかもしれない。水中油系や業界で既知である他の系のような、製剤の免疫原性を促進するためのアジュバント系をワクチン製剤に含有させてもよい。免疫を促進するための別の方法ではＩＬ−２、ＩＬ−４、���Ｌ−12、α−ＩＦＮ、ＧＭＣ−ＣＳＦのようなサイトカインおよび増殖因子を含有させる必要があるかもしれない。用量はワクチンの比活性とレシピエントの体重に依存するだろうし、慣例的な実験で容易に決定できる。
【００４６】
最後に、本発明は細胞内病原体によって引き起こされる疾病を治療するための医薬組成物、好ましくは免疫予防用組成物または免疫治療用組成物を調製するために上記のようなＡＰＣ、好ましくはＢＭＤＣまたは末梢血由来ＤＣを使用することに関する。好ましい疾病は、ＡＩＤＳ、結核、マラリア、サルモネラ症、リステリア症、トキソプラズマ症またはリーシュマニア症である。
【００４７】
以下の実施例で本発明をさらに詳細に説明する。
【００４８】
実施例１：一般的な方法
（Ａ）マウス
雌性BALB/cおよびC57BL/６マウスをCharles River Breeding Laboratories(スルツフェルド、ドイツ)から購入した。実験の開始時に動物は６から８週齢で、通常の条件で飼育した。
【００４９】
（Ｂ）寄生生物と抗原の調製
リーシュマニア(Leishmania major)分離株MHOM/IL/81/FE/BNI(Solbachら、Infect.Immun. 54：909(1986)をBALB/cマウスを使って継代することによって維持しin vitroで通常の血液寒天平板で増殖させた。リーシュマニア(L.major)の総溶解物を調製するために、定常期のプロマスチゴートを集め、３回洗浄しＰＢＳに１×１０9/ｍｌとなるように再懸濁し、凍結と融解を３サイクル行った。
【００５０】
（Ｃ）オリゴヌクレオチド
ＭＷＧ(エベルスベルグ、ドイツ)がオリゴヌクレオチド1668(ＣｐＧ ＯＤＮ、５'ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ３')と対照である富ＡＴオリゴヌクレオチド(非ＣｐＧ ＯＤＮ、５'ＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴ３')を合成し、ホスホロチオエート修飾は行わなかった。
【００５１】
（Ｄ）骨髄由来樹状細胞(ＢＭＤＣ)の調製と培養 Lutzら、J.Immunol.Meth. 223：77〜92(1999)のプロトコルを若干修正して骨髄前駆細胞から樹状細胞(ＤＣ)を生成させた。簡略には、シリンジからＰＢＳを流すことで大腿骨および脛骨から総骨髄細胞を得た。細胞懸濁液を洗浄し培地(熱不活性化ウシ胎仔血清(10％)、Ｌ−グルタミン(２ｍＭ)、Hepes緩衝液(10ｍＭ)、ペニシリン(60μｇ/ｍｌ)、ゲンタマイシン(20μｇ/ｍｌ)、ＮａＨＣＯ３(17ｍＮ)および２−メルカプトエタノール(0.05ｍＭ)を補充したClick RPMI 1640培地)に再懸濁した。第０日に細菌用ペトリ皿中で200Ｕ/ｍｌの組換えマウス顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ−ＣＳＦ；Peprotek/Tebu、フランクフルト、ドイツ)を含む総体積10ｍｌの培地に２×１０6個の細胞を接種した。200Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦを含む培地５ｍｌを第３および第６日にさらに添加した。10日間培養した後、接着していないＤＣを集め、200Ｕ/ｍｌのＧＭ−ＣＳＦを含む新鮮培地に１×１０6細胞/ｍｌとなるように再懸濁し、抗原をパルス投与するために培養液１ｍｌあたり寄生生物溶解物30μｌ(１細胞あたり寄生生物およそ30個に相当)を加えて一晩(約18時間)培養した。一部の実験群では、パルス投与時にＢＭＤＣの成熟を誘導すると認識されている物質(リポ多糖、ＬＰＳ：１μｇ/ｍｌ、Sigma、ハイデルベルグ、ドイツ；ＣｐＧ ＯＤＮおよび非ＣｐＧ ＯＤＮ：25μｇ/ｍｌ；抗ＣＤ40ｍＡｂ：５μｇ/ｍｌ、Pharmingen、ハンブルグ；および腫よう壊死因子α、ＴＮＦ−α：500Ｕ/ｍｌ、Peprotec/Tebu、フランクフルト、ドイツ)で同時処理も行った。ＣｐＧ ＯＤＮ、非ＣｐＧ ＯＤＮまたはＬＰＳだけを加えた対照群も組入れた。一晩培養後に、細胞を洗浄して可溶性の寄生生物抗原および成熟誘導物質を除き、さらに使用するためにＰＢＳに再懸濁した。
【００５２】
（Ｅ）マウスの処理
抗原パルス投与／成熟後に、ＢＭＤＣを洗浄し、ＰＢＳに再懸濁して、ナイーブマウスの尾静脈に５×１０5個の細胞を静脈内(i.v.)注射した。対照マウスにはＰＢＳを注射した。１週間後にマウスの右後足蹠にリーシュマニア(L.major)の定常期のプロマスチゴートを２×１０5個(BALB/cマウス)または２×１０6個(C57BL/６マウス)皮下(s.c.)注射した。未感染の対側の足蹠と比較して足蹠のサイズの増加を測定することで感染の経過を１週間ごとに監視した。再感染実験では一次感染の９週間後、すなわち一次感染が完全に治癒した３週間後に５×１０5個の寄生生物をマウスの左後足蹠に感染させた。治療免疫のために、マウスを最初に感染させ続いてi.v.注射により感染後第７、０＋７、７＋14または14＋21日に５×１０5個のＢＭＤＣで処理した。
【００５３】
（Ｆ）寄生生物の負荷の測定
感染部位で効果的な殺リーシュマニアメカニズムが起こっているかどうかを分析するために、足蹠に生存する寄生生物の量を限界希釈法で測定した。簡略には、感染後５〜６週間で右足を除去し、エタノールで洗浄し、ＰＢＳで３回すすいだ。滅菌したメスで切り目をいくつか入れ、その足を細胞ろ過器中で浸軟することで軟組織の調製を行った。細胞懸濁物に30Ｇの注射針を通過させて細胞内寄生生物の放出を確実にした。次に、懸濁物を100ｇで５分間遠心分離して組織の塊と破片を分離した。その上清を段階希釈して血液寒天の96穴マイクロ培養平板に100μｌ/穴となるように入れた。各希釈物について20穴を使用した。５％ＣＯ2の加湿雰囲気中で28℃で10日間培養後に、倒立顕微鏡を用いて培養物に寄生生物が存在するかどうかを評点した。陽性の穴を少なくとも１つ示す最終の希釈率の逆数と最初の希釈係数とを掛合わせることによって足蹠あたりの寄生生物数を推定した。一部の実験群では足蹠の細胞懸濁物10μｌをスライドガラスに塗抹し、ギームザ染色し通常の光学顕微鏡でリーシュマニア(L.major)の無べん毛体が存在するかを観察した。
【００５４】
（Ｇ）サイトカイン産生の測定
感染した足蹠の所属リンパ節を注射の５週間後に除去した。単一細胞懸濁物の調製後に１×１０6個の細胞を寄生生物溶解物10μｌの非存在下または存在下で体積１ｍｌ(24穴平板)として72時間培養した。その後、培養上清を回収して以前の文献のようにサンドイッチELISA法でサイトカインＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＦＮ−γを測定した(Floheら、Eur.J.Immunol. 28：3800〜3811(1998))。パルス投与／成熟の20時間後にＢＭＤＣ培養上清中のＩＬ−12p70もサンドイッチELISA法で測定した。
【００５５】
（Ｈ）リーシュマニア特異的ＩｇＧ抗体の測定
図１Ｂに示す実験のマウスを感染の５週間後に屠殺し、リーシュマニア特異的ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの血清中レベルをELISA法でアッセイした。総溶解物(５×１０5個の寄生生物／穴に相当)で平板をコートしマウス血清と共に一晩温置した(総ＩｇＧでは１：100希釈、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａでは１：50希釈)。総ＩｇＧでは第二抗体(抗マウスＩｇＧ−アルカリホスファターゼ複合体)を１時間温置し色素形成性のホスファターゼ基質を用いて発色させた。ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａでは、アイソタイプ特異性第二抗体(それぞれウサギ由来ビオチニル化抗マウスＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ)と共に１時間、ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼと共に１時間温置して、最終的に基質を発色させた。抗体の相対レベルを吸光度(O.D.)で表わす。
【００５６】
（Ｉ）ＲＴ−ＰＣＲ
様々なパルス投与／成熟処理の36時間後にＲＮｅａｓｙ総ＲＮＡ抽出キット(Qiagen、ヒルデン、ドイツ)を用いてＢＭＤＣ培養物から総ＲＮＡを分離し、ＲＮＡ２μｇを逆転写した(Qiagen、ヒルデン、ドイツ)。ＩＬ−12p35、ＩＬ−12p40およびβ−アクチンのためのプライマー(ＭＷＧ Biotech、エベルスベルグ、ドイツ)をＰＣＲ反応に使用して各々のｍＲＮＡの相対量を推定した。
【００５７】
実施例２：ＣｐＧで成熟させ／溶解物をパルス投与したＢＭＤＣは皮膚リーシュマニア症からBALB/cマウスを防御する
最近、リーシュマニア抗原をパルス投与されたランゲルハンス細胞はマウスリーシュマニア症に対する防御を付与することが報告された。異なるＤＣの細胞集団であるＢＭＤＣでこの防御効果を再現する最初の試みは成功しなかった。ＢＭＤＣの生成時期、マウスに注射するＢＭＤＣの量および様々な抗原パルス投与条件に関してプロトコルの色々な修正がなされた。しかし、感染防御は観察できなかった(図に示さず)。よって、ＢＭＤＣに付加的な成熟刺激が必要と考えられた。したがって、細胞に(抗原源として)寄生生物の溶解物をパルス投与するだけでなく、ＬＰＳ、抗ＣＤ40抗体、ＣｐＧ ＯＤＮおよびＴＮＦ−αを含むＢＭＤＣの成熟誘導物質で細胞を処理する一連の実験を行った。２つの独立した代表的な実験を図１に示す。繰り返すが抗原をパルス投与したＢＭＤＣはリーシュマニア症に対する防御を誘導できなかった(図１Ｂ)。成熟誘導物質であるＬＰＳ、抗ＣＤ40およびＴＮＦ−αで、またはそれらの刺激を組み合わせて、抗原をパルス投与したＢＭＤＣを処理しても、ＢＭＤＣはリーシュマニア症を防御できなかった(図１Ａおよび１Ｂ)。対照的に、ＣｐＧ ＯＤＮの存在下で培養した抗原をパルス投与したＢＭＤＣをマウスに免疫すると、本来は感受性のBALB/cマウスにその後のL.major感染に対する完全な防御を付与された(図１Ａおよび１Ｂ)。それらの細胞をワクチン接種されたマウスはすべて足蹠の腫脹が少なく(常に１ｍｍ未満、図１Ａおよび１Ｂ)、腫脹は感染３週間後にピークに達し、６週間後には完全に治癒した(図１Ａ)。この群のマウスは１匹も潰瘍形成の兆候を示さなかった。パルス投与せずにＣｐＧ処理したＢＭＤＣまたはパルス投与し非ＣｐＧモチーフである富ＡＴ性ＯＤＮで処理したＢＭＤＣを免疫した対照群における病巣の発達経過はＰＢＳ対照群と類似していた(図１Ｂ)。これらの結果から、抗原をパルス投与しＣｐＧで成熟させたＢＭＤＣの単回i.v.注射はマウスリーシュマニア症に対する完全な防御を媒介することを実証した。
【００５８】
実施例３：臨床上の治癒は寄生生物の負荷の有意な減少と相関する
ＣｐＧで成熟させ抗原をパルス投与したＢＭＤＣにより誘導される防御が感染部位での寄生生物の複製の効果的な制御と平行するかを分析した。図２Ａは防御群および対照群のマウスをそれぞれ分析したときの寄生生物の負荷を示す。ＣｐＧ／抗原−ＢＭＤＣをワクチン接種されたマウスは対照マウスよりも有意に低い寄生生物の負荷を有した。平均して、足蹠あたりの寄生生物数は１０4分の１を下回った(対照群と防御群ではそれぞれ7.3×１０11および1.2×１０7)。対照の足蹠からの塗抹物を顕微鏡で分析すると、数えられないほど多数の寄生生物を認め、図２Ｂに示すようにマクロファージには概して細胞内寄生生物が充満し、複製が活発であることを示した。対照的に、防御された足蹠から得た検体では、寄生生物をほとんど検出できず、細胞内無べん毛体が存在しないか存在してもごくわずかであることを概して観察した(図２Ｂ)。以上の結果は、ＣｐＧで成熟させ抗原をパルス投与したＢＭＤＣを感受性マウスに免疫することによって誘導される防御が、抗リーシュマニアエフェクターメカニズムを効果的に活性化する能力の獲得を原因とすることを示した。
【００５９】
実施例４：ＣｐＧで成熟させ／溶解物(Lys)をパルス投与したＢＭＤＣはサイトカインプロフィールの移行を誘導する
ＢＭＤＣによって誘導される防御がサイトカイン発現の異なるプロフィールを伴うかどうかを確定するために、リンパ節細胞によるＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の分泌を評価した。図１Ｂに示す最も関連性のある実験群のマウスを感染の５週間後に屠殺し、総リンパ節細胞を培養してELISAによるサイトカイン分析に供した。リーシュマニア抗原の非存在下でのＩＬ−２レベルは7.6〜20.7ｎｇ/ｍｌの範囲であり、ＢＭＤＣ−溶解物−ＣｐＧをワクチン接種された防御群が最大レベルを示した。しかし、リーシュマニア抗原を培養物に添加するとこの差は著しく増加した。対照群に比べ防御群ではこのサイトカインが13倍のレベルになり、その他の群よりも２〜４倍高くなることを観察した(図３Ａ)。ＩＦＮ−γを測定するといっそうさらに顕著な差を観察した。図３Ｂに示すように、防御群を対照群と比較すると抗原の非存在下で10倍の増加、他の群と比較すると２〜７倍の増加を観察した。リーシュマニア抗原が培養物に存在するとき、防御群を対照群およびその他の群と比較すると、それぞれ151および16〜60倍高いＩＦＮ−γレベルを観察した(図３Ｂ)。ＩＬ−２およびＩＦＮ−γと対照的に、防御されたＢＭＤＣ-溶解物-ＣｐＧ群に属するマウスのリンパ節細胞は、抗原の非存在下または存在下でそれぞれ検出不能または非常に低いレベルのＩＬ−４を分泌した(図３Ｃ)。非防御群の一部もＩＬ−４の低い産生を示した。したがって、ＣｐＧで成熟させ／溶解物をパルス投与したＢＭＤＣで処理したマウスでは、リンパ節細胞に誘導されるサイトカインプロフィールはＴｈ１様免疫応答に強く移行した。
【００６０】
実施例５：ＣｐＧで成熟させ／溶解物をパルス投与したＢＭＤＣをワクチン接種したマウスにおいてリーシュマニアに特異的なＩｇＧ抗体のパターンはＴｈ１免疫応答の誘導と相関する
それぞれ異なるＩｇＧサブクラスのプロフィールはＴｈ１またはＴｈ２免疫応答と相関することがよく知られている。高レベルのＩｇＧ１抗リーシュマニア抗体および低力価のＩｇＧ２ａ抗リーシュマニア抗体の存在はＴｈ２応答と、Ｔｈ１応答の逆の分布とを伴う。したがって、防御群ではＩｇＧサブクラスの産生パターンがＴｈ１型応答に移行しているかどうかを検討した。図１Ｂに示す最も関連性のある実験群のマウスを感染の５週間後に屠殺し、総ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体の相対レベルをELISA法で測定した。図４Ａに示すように、リーシュマニアに特異的な総ＩｇＧ抗体レベルは多様であるがすべての実験群で有意であった。ＩｇＧサブクラスの分布を測定すると、ＢＭＤＣ-溶解物-ＣｐＧで処理を受けた防御されたマウスの血清に低レベルのＩｇＧ１と高レベルのＩｇＧ２ａが産生する明らかな傾向を観察した(図４Ｂおよび４Ｃ)。低レベルのＩｇＧ１を示す群もあれば高レベルのＩｇＧ２ａを示す群もあったが、ＣｐＧで成熟させ／溶解物をパルス投与した防御されたＢＭＤＣだけが両方を組み合わせて誘導できた。Ｔｈ１様移行を認めるための簡単なパラメータはＩｇＧ１に対するＩｇＧ２ａの相対比で、その値が大きいとＴｈ１の誘導を示すと考えられる。図４Ｄに示すように、防御されたＢＭＤＣ-溶解物-ＣｐＧ群は最高のＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比の平均を示し、その値は対照群の４倍であった(それぞれ1.4992および0.3661)。他の群の一部もＩｇＧ２ａレベルが高いことが原因で対照群よりも高い比の値を示したが、防御された群と対照的に、それらの群は対照群よりも高レベルのＩｇＧ１も示した。総合すると、以上の結果はＣｐＧで成熟させ溶解物をパルス投与したＢＭＤＣをワクチン接種された防御群のマウスだけが毒性森林型熱帯リーシュマニア(L.major)を感染させた後に強力なＴｈ１免疫応答を誘導することと相関するパターンの抗リーシュマニア抗体を産生することを示した。
【００６１】
実施例６：抵抗性系統のC57BL/６マウスでもＣｐＧで成熟させ／溶解物をパルス投与したＢＭＤＣの防御効果が観察される
リーシュマニア(L.major)感染に抵抗性である異なる系統のマウスにもこのアプローチを適用できるかどうか検討した。周知のように(また図５Ａの対照群に示すように)、C57BL/６マウスは感染後に足蹠に限定した炎症を発し感染６〜８週後に結局治癒する。しかし、感染１週間前にこれらのマウスにＣｐＧで成熟させ／溶解物をパルス投与したＢＭＤＣをワクチン接種すると、足蹠の腫脹が有意に減少し、最大ピークが低下し治癒が早まる(図５Ａ)。これらのマウスにＢＭＤＣ単独をワクチン接種すると最初に非特異的効果が観察される。しかし、これらのマウスは感染４〜５週間後に対照と類似した足蹠の腫脹に達した(図５Ａ)。予想通り、ＣｐＧ単独で処理したＢＭＤＣをワクチン接種しても効果を示さなかった。BALB/cマウスと対照的に、ＣｐＧ処理せずに溶解物をパルス投与したＢＭＤＣをワクチン接種されたC57BL/６マウスはワクチン接種を受けていないマウスに比べ病巣の発達の減少を示したが、この効果は抗原をパルス投与しさらにＣｐＧ ＯＤＮ処理で成熟させたＢＭＤＣによって誘導される効果ほどは顕著でなかった(図５Ａ)。様々なワクチン接種群における寄生生物の負荷を分析すると、臨床結果との顕著な相関を観察した。非防御処理を受けたマウスの寄生生物数は対照マウスと同様であった(図５Ｂ)。溶解物をパルス投与したＢＭＤＣをワクチン接種されたマウスは寄生生物の負荷が10分の１に減少した。最も注目すべきことには、ＣｐＧで成熟させ溶解物をパルス投与したＢＭＤＣをワクチン接種されたマウスは足蹠におよそ100分の１の寄生生物しか有さなかった(図５Ｂ)。以上の結果は、BALB/cマウスおよびC57BL/６マウスの両方においてＣｐＧで成熟させ溶解物をパルス投与したＢＭＤＣをワクチン接種すると感染部位での寄生生物の負荷の減少を伴う有意な防御効果が誘導されることを実証した。
【００６２】
実施例７：ＣｐＧで成熟させ／溶解物をパルス投与したＢＭＤＣの免疫によって誘導される抵抗性は強力で再感染を防御する
ＣｐＧで成熟させ／溶解物をパルス投与したＢＭＤＣが防御の媒介に異例の有効性を発揮することから(マウスの総治癒率100％、図１)、一次感染が消散したマウスが寄生生物の２回目の感染に抵抗できるかを検討した。このために図１Ａに示す実験で完全に治癒したマウス10匹に対して最初の感染の10週間後に0.5×１０6個の発育終末寄生生物(一次感染での用量の2.5倍)を再感染させた。図６Ａの結果はこれらのＢＭＤＣの免疫によって強力な免疫が樹立したことを示す。それは二次感染後に生成した腫脹が一次感染後の腫脹よりもさらに小さいからである。再感染させたマウスの足蹠の腫脹はほとんど測定できず(0.5ｍｍ未満)、それらの大部分が二次感染の３週間後には完全に治癒した。この群のマウスを二次感染後20週間を超えて追跡したが疾病の兆候をまったく示さなかった。
【００６３】
実施例８：ＣｐＧで成熟させ／溶解物をパルス投与したＢＭＤＣの免疫治療効果はＢＭＤＣの投与時間に依存する
長期持続性Ｔｈ１防御免疫応答を誘導するうえでこれらの細胞が並はずれた効力をもつとすれば、次に取組むべき問題はすでに樹立したリーシュマニア感染を治癒することが可能かどうかであった。この目的のために、ナイーブマウスを感染させ次に様々な時点にＣｐＧで成熟させ／溶解物をパルス投与したＢＭＤＣで処理する一連の実験を計画した。図６Ｂに示す結果は我々の実験条件で注射後７日を超えない非常に限定された時間範囲で免疫応答を防御表現型に向け直すことがまだ可能であることを示している。マウスを第０日(感染後１時間)および感染１週間後に処理するとき、非常に明らかな治療効果を観察する。治療を感染１および２週間後に行うと、その効果は逆転する。それは治療効果が観察されないだけでなく、その処理で悪化するようにみえるからである。感染の１週間後に治療用用量を単回注射するときにも疾病の進行カーブが類似していることが観察される。これは、０＋７日p.i.(感染後)の治療計画で発揮される治療の有効性が二回目の投与よりも最初の投与の方に大きく依存し、少なくともこのモデルおよび我々の実験条件ではこのアプローチの使用を強く促すことを示している。最後に、14および21日p.i.に２回の治療用投与を行うことは対照群に類似した疾病の進行動態が証明するようにまったく効果を示さなかった(図６Ｂ)。したがって、マウスリーシュマニア症にＢＭＤＣを治療応用することは可能であるが、投与時期が有効性に重大であると考えられる。
【００６４】
実施例９：ＣｐＧで成熟させ／溶解物をパルス投与したＢＭＤＣはＩＬ−12を発現する
ＣｐＧで成熟させ／溶解物をパルス投与したＢＭＤＣをワクチン接種されたマウスで観察されるＴｈ１様防御免疫応答の活性化に関与するメカニズムを調査するために、ＩＬ−12の発現を分析した。このサイトカインはｐ40およびｐ35というサブユニットから形成されＴｈ１細胞の発達に主要な役割を演じることが知られている。この目的のために、実施例１に記述するようにＢＭＤＣを処理し、36時間後に総ＲＮＡを分離しＩＬ−12のｐ35ｍＲＮＡレベルおよびｐ40ｍＲＮＡレベルをＲＴ−ＰＣＲで測定した。同培養物の上清も集めて活性なｐ70型タンパク質をELISA法で測定した。図７Ａに示すように、ＢＭＤＣにおいてｐ40ｍＲＮＡおよびｐ35ｍＲＮＡはパルス投与刺激／成熟刺激によって分別調節されていた。ＬＰＳと同様にＣｐＧおよび非ＣｐＧ ＯＤＮはｐ35ｍＲＮＡの非常に強い上向き調節を誘導する一方で、寄生生物抗原のパルス投与は基礎発現と誘導された発現の両方を下向き調節する。パルス投与刺激および成熟刺激で処理された群の中では、ＢＭＤＣとＣｐＧとの組合せが最大のｐ35ｍＲＮＡレベルを示した。ｐ35とは対照的に、ｐ40ｍＲＮＡの基礎レベルはパルス投与だけでは一見変化しなかった。しかし、溶解物とＣｐＧとの組合せを除き、パルス投与は誘導性発現を下向き調節した(ＬＰＳおよびＣｐＧｃｏ単独に対してそれぞれＬＰＳ−ＬｙｓおよびＣｐＧｃｏ−Ｌｙｓを参照)。また、パルス投与刺激と成熟刺激で処理された群の中では、ＢＭＤＣとＣｐＧとの組合せが最大のｐ40ｍＲＮＡレベルを示した。図７Ｂに示すように上清における活性なｐ70タンパク質レベルもパルス投与／成熟処理に依存した。予想通りＢＭＤＣのＣｐＧ ＯＤＮ処理によって最大レベルのｐ70サブユニットが誘導された。無処理培養、パルス投与のみを行った培養およびＣＤ40またはＴＮＦ−αで成熟させパルス投与した培養でｐ70 ＩＬ−12は検出できなかった。しかし、さらにパルス投与がＬＰＳ誘導性およびＣｐＧ誘導性のｐ70産生を下向き調節するにもかかわらず、パルス投与し／成熟させた群の中で先の群が機能的に活性なＰ70 ＩＬ−12の最大レベル(少なくとも２倍量)を示す処理であった。以上の結果のすべてはリーシュマニア溶解物をパルス投与しＣｐＧ ＯＤＮで成熟させたＢＭＤＣを感受性マウスにワクチン接種すると観察される防御効果は強力なＴｈ１免疫応答の誘導が原因で、その免疫応答はこれらの細胞が活性なｐ70ＩＬ−12を分泌する能力と相関することを示唆している。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】ＢＭＤＣ調製物をワクチン接種し１週間後にリーシュマニア(L.major)寄生生物を感染させたBALB/cマウスにおける病巣の発達を示す。
【図２】ＣｐＧで成熟させ溶解物をパルス投与したＢＭＤＣによって誘導されるマウス皮膚リーシュマニア症の臨床治癒は寄生生物の負荷量の有意な減少を伴う。
【図３】防御されたマウス由来のリンパ節細胞によるサイトカインの発現パターンはＴｈ１様免疫応答への移行を示す。
【図４】防御されたマウスにおけるリーシュマニア特異的ＩｇＧ抗体の産生はＴｈ１免疫応答と相関する。
【図５】ＣｐＧで成熟させ溶解物をパルス投与したＢＭＤＣによるマウス皮膚リーシュマニア症からの防御は抵抗性C57BL/6マウスにおいても示すことができる。
【図６】(Ａ)ＣｐＧで成熟させ溶解物をパルス投与したＢＭＤＣによる処理は再感染に対する強力な防御を媒介する。(Ｂ)ＣｐＧで成熟させ溶解物をパルス投与したＢＭＤＣによる治療の可能性の評価を示す。
【図７】ワクチン接種に使用されるＢＭＤＣによるＩＬ−12の発現を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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