(57)【要約】骨形成、腱の形成、または軟骨形成の治療に適した一つ以上の成長因子を含む組成物であって、前記成長因子が、培養された軟骨細胞から得られる組成物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨形成、腱の形成、軟骨形成およびそれらの組み合わせからなる群より選択される治療に適する、少なくとも一つの抽出された成長因子を含有する組成物であって、前記成長因子が培養された軟骨細胞から得られ、約７０ｋＤａと１０ｋＤａの間の大きさであり、そして成長因子の濃度が約５ｎｇ／ｍｌと１５ｎｇ／ｍｌとの間にある、組成物。
【請求項２】
成長因子が、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ、ＰＴＨｒＰ、ＲＡＮＫＬ、ＩｇＦ１、およびＯＰＧからなる成長因子の群より選択される一つ以上の成長因子である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
成長因子が軟骨細胞の単層培養から得られる、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
成長因子が治療上有効な濃度で存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
骨セメント、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、ハイドロキシアパタイト、およびその他の自己由来成長因子からなる群より選択される一つ以上の材料をさらに含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
軟骨細胞の単層培養を提供する工程；および
軟骨細胞の単層培養から、少なくとも一つの成長因子を抽出する工程
を含む、成長因子組成物を作製する方法。
【請求項７】
成長因子を濃縮する工程をさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
成長因子が、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ、ＰＴＨｒｈ、ＲＡＮＫＬ、ＩｇＦ１、およびＯＰＧからなる成長因子の群より選択される一つ以上の成長因子である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
軟骨細胞を培養する工程が、自己由来の軟骨細胞を単層で培養することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
成長因子が治療上有効な濃度に濃縮されている、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
濃縮成長因子を、骨セメント、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、ハイドロキシアパタイト、およびその他の自己由来成長因子からなる群より選択される一つ以上の材料と組み合わせる工程をさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
骨、腱、または軟骨の欠損を少なくとも一つの成長因子と接触させる工程を含む、骨、腱または軟骨の欠損を治療する方法であって、前記成長因子が培養された軟骨細胞から得られる、方法。
【請求項１３】
成長因子が、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ、ＰＴＨｒｈ、ＲＡＮＫＬ、ＩｇＦ１、およびＯＰＧからなる成長因子の群より選択される一つ以上の成長因子である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
成長因子が、骨セメント、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、ハイドロキシアパタイト、およびその他の自己由来成長因子からなる群より選択される一つ以上の材料と組み合わせられる、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ほとんどの細胞と同じく、軟骨細胞は、成熟段階と分化段階とを含むライフサイクルを有する。軟骨細胞は、増殖中に前軟骨芽細胞となる、間葉系幹細胞として生まれうる。これらの前軟骨芽細胞は、分化／マトリックス形成の間に軟骨芽細胞となる。次いで、軟骨芽細胞は肥大または成熟して、軟骨細胞となることができる。
【０００２】
発明の概要
本発明は、骨形成、腱の形成、および／または軟骨形成の治療に適した、少なくとも一つの成長因子を含むが、これに限定されない、組成物を対象とする。ここで、前記成長因子は、培養された軟骨細胞から得られる。
【０００３】
本発明はまた、被験者からの軟骨細胞を培養する工程と、軟骨細胞の培養物から少なくとも一つの成長因子を濃縮する工程とを含む、成長因子組成物を作製する方法を対象とする。
【０００４】
さらに、本発明は、組織または欠損を少なくとも一つの成長因子と接触させる工程を含む、骨、腱もしくは軟骨またはそれらの欠損を治療する方法を対象とする。ここで、前記成長因子は、培養された軟骨細胞から得られる。
【０００５】
詳細な説明
本明細書で用いられるように、「約」という用語は、指定された値の±１０％の範囲の値を意味する。たとえば、「約２０」には、２０の±１０％、すなわち１８から２２が包括的に含まれる。
【０００６】
本明細書で用いられるように、「実質的な」または「実質的に」という用語は、大部分または大きい程度に近似していることを意味する。
【０００７】
軟骨細胞は、多数の技術を用いて培養されてきた。軟骨細胞のための単層培養、軟骨細胞のためのコラーゲンゲル培養、軟骨細胞のためのアルギン酸塩ゲル培養、および、軟骨細胞のためのアガロースゲル培養が、それぞれ記載されてきた。これらの細胞は、アガロースゲル内で培養されている間に、細胞外タンパク質を生産することが分かった。
【０００８】
本発明の一つの実施形態において、７５ｃｍ２あたり約１００万個の細胞の培養密度での培養が可能である。軟骨細胞は、アスコルビン酸を含む１０％から２０％の自己由来の溶液中で成長することができる。一つの実施形態において、本発明と共に用いるための軟骨細胞にとっての適切な成長条件は、ＷＯ００/０９１７９および５、９８９、２６９に述べられており、これらの内容の全体は、引用することによって本明細書に取り込まれる。実施例６から１０までを参照のこと（そこには本発明において用いるための典型的な細胞培養の方法が示されている）。
【０００９】
どのようなタイプの細胞外タンパク質または成長因子を、もしあるとすれば、軟骨細胞が、これらの培養系内において細胞の形態的な外観から生産するかを、測定することは困難である。したがって、軟骨細胞が細胞外マトリックスタンパク質および成長因子を生産することを促進するための技術および方法を開発する必要がある。さらに、軟骨形成、腱の形成および骨形成の誘導に関連する細胞集団によって生産される成長因子の特徴を特定する必要がある。
【００１０】
多数の生体化合物が、軟骨細胞の発達をコントロールする。これらの化合物は、軟骨細胞から、特に軟骨細胞の単層培養から抽出および／または濃縮することができ、成長因子組成物、いわゆる成長因子の「カクテル」が形成される。これは、軟骨、腱、および／または骨の組織および欠損の治療の際に、治療的に用いることができる。たとえば、一つの実施形態において、本発明には、整形外科において、本発明の組成物から得られる、抽出および／または濃縮された成長因子を用いることが含まれる。
【００１１】
さらに、本発明の成長因子組成物には、脊椎、股関節部、膝、肩、手首、くるぶしおよび指ならびに骨折の固定に用いるための方法および装置、ならびに偽関節の骨折の治療に用いるための方法および装置を含む、再建方法ならびに装置における治療上の価値、ならびに、骨セメント、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、ハイドロキシアパタイト、およびそれらの組み合わせを含むがこれらには限定されないセメント、ならびに、その他の自己由来成長因子などの、その他の生成物における治療上の価値があり得る。本発明の組成物および使用方法を、以下に記載する。
【００１２】
１．成長因子
軟骨細胞、特に単層培養された軟骨細胞には、形質転換成長因子（ＴＧＦ−β３）、骨形成タンパク質(ＢＭＰ−２)、ＰＴＨｒＰ、オステオプロテゲリン(ＯＰＧ)、インディアンヘッジホッグ、ＲＡＮＫＬ、およびインスリン様成長因子(ＩｇＦ１)を含むがこれらには限定されない、多数の成長因子を生産する能力があることが分かってきている。
【００１３】
一つの実施形態において、本発明による成長因子組成物は、その他のものと同じく、軟骨細胞の単層培養から抽出することができ、そして、下記のように、治療目的に用いることができる本発明の組成物が形成される。さらに、別の実施形態において、本発明による成長因子組成物は、適切な成長因子を含む組成物から抽出することができ、治療目的に用いることができる、一つ以上の実質的に濃厚にされた、および／または濃縮された成長因子を含有する組成物が形成される。以下に、より詳細に記載されている。
【００１４】
Ａ）成長因子の誘導
一つの実施形態において、本発明の成長因子組成物は、自己由来の軟骨細胞を含むがこれには限定されない、細胞から得られる。このように、自己由来の軟骨細胞から得られる成長因子の特徴は、被験者の成長因子の本来の特徴と実質的に一致することがある。
【００１５】
別の実施形態において、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ/ＩＢ０２/０２７５２号（この内容の全体は、引用することによって本明細書に取り込まれる）に記載された技術を用いて、特に、そのＰＣＴ出願の実施例１、２および３に記載され、本明細書にて実施例２、３および４として繰り返されている技術を用いて、被験者の成長因子の組成物について最初に特徴を調べた。その他の適切な技術としては、被験者の成長因子の特徴についてのウェスタンブロット分析、および免疫蛍光による特徴解析が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００１６】
被験者の成長因子の特徴が一旦適切に特徴解析されると、その特徴は、その他の検査用の特徴と比較することができ、処理する細胞または組織についての被験者の成長因子の特徴と実質的に一致する特徴を有する、適切な成長因子組成物を見出すことができる。一つの実施形態において、検査用の特徴は、ａ）非自己由来の細胞、ｂ）被験者から異なる時点で取り出された自己由来の細胞、および／またはｃ）被験者の軟骨細胞とは異なる形態の自己由来の細胞、からの成長因子の特徴解析から、得ることができる。あるいは、この特徴は、組換えＤＮＡ技術を用いて、すなわち、微生物を用いて成長因子タンパク質を生産させ、次いでタンパク質を混合して、処理される細胞または組織についての被験者の成長因子の特徴と実質的に一致する特徴を有するタンパク質の混合物を得ることにより、発生させることができる。
【００１７】
さらに別の実施形態において、成長因子組成物は、一つ以上の成長因子タンパク質を付加または除去することによって修飾され、オーダーメイドの特徴を有する組成物、または、被験者の特徴もしくは別の所望の特徴と実質的に一致することができる特徴を有する組成物が、作製される。
【００１８】
Ｂ）成長因子の機能
上記の成長因子は軟骨、腱、および骨の再生に重要である。最初に、培養された軟骨細胞が増殖している間、ＴＧＦ−β３、ＢＭＰ−２、ＰＴＨｒＰ、インディアンヘッジホッグ、ＯＰＧ、ＲＡＮＫＬならびにＩｇＦ１が存在する。これらの因子ならびにその他の因子は、軟骨細胞、腱細胞および骨芽細胞の増殖および分化の程度をコントロールすることができ、それによって、軟骨形成、腱の形成および骨形成のプログラムに影響が及ぶ、と考えられている。したがって、本明細書に記載されている成長因子を負傷した被験者に適切に投与することにより、軟骨細胞、腱細胞、および骨芽細胞の関与を必要とする、あらゆる治癒を促進することができ、その結果、負傷または病気からの回復が促進される。
【００１９】
マトリックス形成の間に、ＩＩ型コラーゲン、および／またはアグレカンおよびその他のマトリックスの材料は、マトリックス形成の程度をコントロールすることができる。このようなコントロールは、細胞性のフィードバックによって維持することができる、と考えられている。特に、成長因子およびサイトカインは転写因子を制御し、次にはこれが、ＩＩ型コラーゲン、ＩＸ型コラーゲンおよびＸＩ型コラーゲン、アグレカン、ＣＥＰ−６８ならびにＧＰ３９などの細胞外マトリックスタンパク質の形成を制御し、次にはこれが、たとえば、成長因子およびサイトカインの細胞外の濃度を低下させることによって、成長因子およびサイトカインの存在を制御することができる。
【００２０】
図１は、軟骨細胞の系統の特徴解析と、自己由来の軟骨細胞移植後における軟骨修復の分子コントロールを示す。インビトロでの増殖段階において、軟骨細胞は、ＴＧＦ−β３、ＢＭＰ−２、ＰＴＨｒＰ、インディアンヘッジホッグ、ＯＰＧ、ＲＡＮＫＬを含むがこれらに限定されない、成長因子およびサイトカインを生産する。被験者に移植した後では、軟骨細胞はマトリックス形成より先行する。ＳＯＸ−９、ＩＩ型コラーゲン、アグレカンおよびその他の細胞外マトリックスタンパク質もまた、生産される。マトリックスが形成された後、ビタミンＤ３を含む多数の因子が、軟骨細胞のマトリックスの成熟または修飾を制御しうる。
【００２１】
図２は、単層培養された軟骨細胞からの成長因子および転写因子の発現を示す。図２で示されるように、成長因子ＴＧＦ−β３およびＢＭＰ−２は軟骨細胞内で発現する。また、転写因子ＳＯＸ−９が発現する。
【００２２】
図３は、ＳＯＸ−９が発現している時、マトリックスタンパク質ＣＥＰ−６８もまた発現することを示す。このことは、調査されている軟骨細胞にはマトリックスと成長因子とを形成する能力があることを示唆する。
【００２３】
図４は、成長因子ＴＧＦ−β３が発現している時、マトリックスタンパク質のアグレカンおよびＩＩ型コラーゲンもまた、軟骨細胞によって発現することを示す。
【００２４】
逆転写酵素のＰＣＲを利用することによって、３０サイクルの遺伝子増幅の時点で、図５は、ＲＡＮＫＬの発現が検出されないことを示す。しかしながら、３４サイクルの時点では、ＲＡＮＫＬのｍＲＮＡを見出すことができ、それによって、ＲＡＮＫＬの発現が生じているであろうことが示唆される。さらに、図５は、ＲＡＮＫＬの細胞のレセプター、すなわちＧＡＤＰＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）、およびＯＰＧもまた、軟骨細胞において発現することを示す。これらのデータは、ＲＡＮＫＬが軟骨細胞の成長に重要であろうことを示唆する。
【００２５】
図６は、ステロイドホルモンのレセプターである、ＧＡＤＰＨ、ＧＲα、ＧＲβ、およびＶＤＲが、軟骨細胞において発現することを示す。これらのデータは、一つ以上のステロイドホルモンに対する軟骨細胞の応答が、軟骨細胞における成長因子の生成を制御する経路を提供しうることを示唆する。考えられる適切なステロイドホルモンには、ビタミンＤ３およびグルココルチコイドが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
したがって、一つの実施形態において、単層培養における軟骨細胞は、形質転換成長因子、骨形成タンパク質、ＰＴＨｒＰ、オステオプロテゲリン、ＲＡＮＫＬ、およびインディアンヘッジホッグを含むがこれらに限定されない、多数の成長因子を生産することができる。これらの因子は、本発明の方法によって抽出することができ、そしてその後に被験者に送達される、成長因子の「カクテル」を形成する。本明細書で記載されるように、これらの成長因子は、被験者自身の自己由来の軟骨細胞から得ることが可能であり、そして、骨、腱および軟骨の欠損を含むがこれらに限定されない、組織の治療に用いられる。
【００２７】
たとえば、軟骨の欠損を治療するために自己由来の軟骨細胞を移植する技術を利用することによって、軟骨細胞がインビトロで増殖し、成長因子を生産する。被験者に移植した後では、マトリックス形成段階の間に、軟骨細胞は細胞外マトリックスタンパク質を生産し始めることが可能である。軟骨細胞による軟骨形成プロセスは、転写因子ＳＯＸ−９の存在によって、特徴づけられうる。
【００２８】
したがって、上記の情報から、成長因子の発現および／または存在と、骨、腱および軟骨の組織および欠損の再生および／または治癒に適したマトリックスタンパク質の発現および生産を導く、転写因子の発現との間には、因果関係が存在することが分かった。
【００２９】
２．軟骨細胞からの成長因子の分離
本発明において、本明細書に記載された一つ以上の成長因子は、その他のものと同じく、培養された軟骨細胞の培地から抽出および／または精製することができ、そして治療目的に用いることができる本発明の組成物が形成される。さらに、別の実施形態において、上記の成長因子は、培養された軟骨細胞の培地から濃縮することができ、そしてまた治療目的に用いることができる本発明の組成物が形成される。
【００３０】
一つの実施形態において、本発明による成長因子の抽出による精製および／または濃縮は、濾過透析によって達成することができ、この濾過透析を用いて、低分子量の分子を血清およびその他の生体の体液から除去することができる。本発明において、濾過透析、またはより一般的には「限外濾過」は、濃度勾配の代わりに静水圧を用いて使用され、軟骨細胞の培養液、好ましくはヒトの軟骨細胞の培養液の上清から、上記の成長因子を抽出、濃縮および／または精製する。一つの実施形態において、成長因子を含有する上清は、ミリポア／アミコン(Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ/Ａｍｉｃｏｎ)社により製造されたＣｅｎｔｒｉｐｌｕｓ（登録商標）遠心濾過装置などの遠心濾過装置に、細胞培養液を最初に充填し、細胞の培養材料を複数の相に、典型的には液相と固相とに分離させることによって、得られる。
【００３１】
細胞残渣（ｃｅｌｌ  ｄｅｂｒｉｓ）（通常は固相）を取り除いた後、一以上の低吸着性の親水性ＹＭＴ膜（ミリポア／アミコン社から入手できる）、または分子ふるいを介して、培養液の上清を再度遠心分離にかけることができる。ここで、分子ふるいとしては、好ましくは約５から７０ｋＤａの間の孔径を持つものがよく、より好ましくは約１０から３０ｋＤａの孔径を持つものがよい。上清は、最初に、より大きい濾過器（通常約７０から３０ｋＤａのもの）を通過することができる。したがって、より大きい濾過器からの濾液は、より小さい濾過器（通常約５から１０ｋＤａのもの）を通過することができる。本発明の成長因子は通常、より大きい濾過器（７０から３０ｋＤａ）を通過し、そして通常、より小さい濾過器（５から１０ｋＤａ）で保持される。それ故に、本発明の組成物には、約７０から３０ｋＤａと約５から１０ｋＤａの間の大きさを持つ分子、好ましくは約３０ｋＤａから約１０ｋＤａの間の大きさを持つ分子が含まれる。
【００３２】
本発明のいくつかの成長因子が互いに結合することがあり、その結果、より大きい分子が形成されることに注意すべきである。したがって、より大きい濾過器の濾液とそれに続くより小さい濾過器の被保持物から得られる、本発明の組成物には、より大きい濾過器の孔径よりも大きい分子が含まれる可能性がある。特に、本発明の一つ以上の成長因子を含有する上清を上記の濾過器を通して濾過した後では、本発明の組成物は、約５０ｋＤａと５ｋＤａとの間の大きさの分子を含むことがあり、いくつかの実施形態においては、約７０ｋＤａと５ｋＤａとの間の大きさの分子を含むことがある。
【００３３】
より小さい孔径の濾過器によって保持された溶質を回収して、本発明の成長因子を含む、濃縮タンパク質としてさらに用いることができる。この方法によって、コントロール（非濃縮上清）と比較した場合、図７のウェスタンブロットの結果によって示されるように、たとえば１２ｋＤａの大きさであるＴＧＦ−β３などの、成長因子の濃度が高くなる。図７において、上清を濾過するのに用いた二種の濾過器は、孔径が１０ｋＤａ(ＹＫ１０)および３０ｋＤａ(ＹＫ３０)であった。
【００３４】
通常、抽出および／または濃縮のために行う遠心分離は、約２から８時間、好ましくは約４時間、約１５℃未満で、好ましくは約４℃で、そして遠心分離の速度は約２、０００×ｇよりも速く、好ましくは約３、０００×ｇで、行われうる。
【００３５】
代替的な実施形態において、市販のバイオリアクターを用いて、培地の回収、成長因子の抽出および／または濃縮を行うことができ、その結果、本発明の組成物が得られる。このようなバイオリアクターは、２００２年８月２７日に出願された、出願番号が６０/４０６２２４号で、「細胞培養のための、表面領域の拡張が可能なバイオリアクター(Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ  ｗｉｔｈ  Ｅｘｐａｎｄａｂｌｅ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ａｒｅａ  ｆｏｒ  Ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ  Ｃｅｌｌｓ)」という名称の仮特許出願に記載されており、この内容は、引用することによって本明細書に取り込まれる。一つの実施形態において、バイオリアクターは容器、その容器内にある担体、流入部、排出部、および撹拌機構を具備する。担体には、細胞がその上で培養される、拡張可能な表面領域を含めることができる。
【００３６】
バイオリアクターの一つの実施形態において、担体の表面領域は可逆的に拡張可能である。すなわち、この表面領域は拡張され、次いでもとの表面領域に縮小される。
【００３７】
バイオリアクターの一つの側面において、可逆的に拡張可能である担体は、取り外しが可能な多数の境界を備える組織培養プレートである。ここで、境界は、随意に、細胞の増殖によって表面領域が最適以下となるのにしたがって、境界を取り除くことにより組織培養プレートの表面領域が増加するような、同中心の境界である。境界の形状は、任意の規則的な形状または不規則な形状でよく、たとえば、正方形、長方形、三角形、円形、直線状または非直線状がある。
【００３８】
上記のやり方で、または別の適切なやり方によって、一旦抽出および／または濃縮すれば、組成物は次の一つ以上の成長因子：ＴＧＦ−β３、ＢＭＰ−２、ＰＴＨｒＰ、ＯＰＧ、インディアンヘッジホッグ、ＩｇＦ１、およびＲＡＮＫＬを含むことができるが、これらに限定されるわけではない。成長因子は、濃縮して、治療上有効な任意の濃度にすることができる。本明細書で用いられるように、「治療上有効」とは、所望の組織の成長に有効な量、組織における欠損の修復に有効な量、および／または特定の組織または欠損に関連性のある、本明細書に記載された疾患および病態の症状を軽減、解消、治療、予防またはコントロールするのに有効な量という意味である。
【００３９】
一つの実施形態において、一つ以上の成長因子（たとえばＴＧＦ−β３）は、濃縮された上清において、約５ｎｇ／ｍｌより多い量で、より好ましくは約１５ｎｇ／ｍｌより多い量で、存在することができる。いくつかの実施形態において、成長因子は、約１ｎｇ／ｍｌと１５ｎｇ／ｍｌとの間の量で、より好ましくは約５ｎｇ／ｍｌと１５ｎｇ／ｍｌとの間の量で、存在することができる。比較目的のために、濃縮前の上清中の成長因子の濃度は、図８に示されるように約１ｎｇ／ｍｌ以下とすることが可能である。
【００４０】
３．治療上の適用
一つの実施形態において、本発明の成長因子組成物の使用には、本発明の成長因子組成物を、負傷した身体の器官、組織または構造と接触させること、特に本発明の組成物を、骨、腱または軟骨を含むがこれらには限定されない、組織と接触させることが含まれる。
【００４１】
別の実施形態において、成長因子による治療には、本発明の組成物を、骨、腱または軟骨を含むがこれらには限定されない、組織における欠損と接触させることが含まれる。この欠損は、負傷またはその他の損傷ならびに老化による変性に起因するものでありうる。本発明の適用を介して、欠損部位における軟骨形成、腱の形成および／または骨形成の速度の増加を誘導することによって、欠損の治癒の速度を大きくすることができる。さらに、成長因子を濃縮した「カクテル」をヒトの軟骨細胞の培養液にインビトロで適用することによって、図９に示されるように、軟骨細胞の増殖が高まることが示された。特に、ＹＫ１０およびＹＫ３０の両方の濾過器の保持物に関して、１:５０に保持物を希釈することによって、約４８時間後に特に効果的であることが分かった。
【００４２】
本発明の成長因子組成物は、再建用装置、代用骨、骨折の固定、ならびに種々の整形外科上の状態における骨、腱および軟骨の再生を誘導することと一緒に用いることができる。さらに、本発明の成長因子組成物には、脊椎、股関節部、膝、肩、手首、くるぶしおよび指、骨折の固定、ならびに、偽関節の骨折、およびその他の骨、腱および軟骨の欠損の治療に用いるための、再建用装置ならびに方法における治療上の価値がある。
【００４３】
一箇所以上の骨軟骨欠損を治療するために、本発明の自己由来成長因子の「カクテル」は、部分的にまたは完全に、「骨の支持体」材料、リン酸カルシウムの足場、ハイドロキシアパタイト、硫酸カルシウムまたはコラーゲン複合体を含むがこれらには限定されない、足場となる担体と混ぜ合わせることができる。ドイツのレバークーゼンにあるフェリゲン・トランスプランテイション・サービシーズ・インターナショナル(Ｖｅｒｉｇｅｎ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ)社から入手できるマトリックス誘導性自己由来軟骨細胞移植術（ＭＡＣＩ（商標））などの、軟骨下骨の上の軟骨の欠損を回復させることができる、その他の従来の治療法と比較すると、成長因子の「カクテル」は、軟骨下の区画内で骨の形成を誘導することができる。
【００４４】
骨の欠損を治療するために、成長因子の「カクテル」は、上記の足場に充填し、そして、脊椎に接してかまたは脊椎の近傍に欠損が位置する場合、バルーン技術を含むがこれには限定されない、技術を利用して、欠損部位に移植することができる。
【００４５】
さらに、関節軟骨の修復または回旋筋腱板の腱の修復を含むがこれらには限定されない、軟骨、骨または腱の修復のためのコラーゲンの足場と一緒に、本発明を用いることができる。
【００４６】
一つの実施形態において、本発明の成長因子組成物は、その内容の全体が引用することによって本明細書に取り込まれる、（２００２年４月１２日に出願された）米国特許出願第１０/１２１、４４９号に記載されているように、Ｃｈｏｎｄｒｏ−Ｇｉｄｅ（ガイストリッヒ(Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ)社、スイス）、Ｓｍａｌｌ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  Ｓｕｂｍｕｃｏｓａ(ＳＩＳ)  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（デピュー・オルソピーディクス(ＤｅＰｕｙ  Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ)社）などの、生体材料の足場と一緒に用いることができる。
【００４７】
骨セメントを含むがこれには限定されない、セメントなどの、本発明の組成物を含むその他の生産物、およびその他の自己由来成長因子もまた、本発明の範囲内である。このような組成物は、骨形成、腱の形成、および軟骨形成を促進するために、特に用いられうる。
【００４８】
４．投与量
本発明による、成長因子組成物の治療に必要な量は、投与方法、標的部位、被験者の生理学的状態、およびその他の成長因子およびまたは投与される薬剤を含む、多数の異なる因子に左右されるだろう。したがって、安全性と効果とが最適化されるように、治療のための投与量を滴定すべきである。典型的には、インビトロで用いられる投与量によって、これらの薬剤をインシトゥで（ｉｎ  ｓｉｔｕ）投与するのに役立つ量についての有益な手引きが提供されるだろう。特定の疾患を治療するための有効量についての動物実験を行うことによって、ヒトの投与量の予測指標がさらに提供されるだろう。種々の検討事項が、たとえば、Ｇｉｌｍａｎら（編）、グッドマンとギルマンの：治療学の薬理学的基礎(Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ'ｓ:  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ)、第８版、Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０年）；レミントンの薬学(Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ)、第７版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、イーストン、ペンシルベニア州(１９８５年)に記載されている；それぞれの内容の全体は、引用することによって本明細書に取り込まれる。
【００４９】
本発明の成長因子組成物は、体重１ｋｇあたり一日に約０.００１ｍｇから約１０ｍｇの範囲の投与量で投与する場合、有用となる。あるいは、いくつかの例において、０.０００１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇを投与してもよい。使用される特定の投与量は、治療される特定の組織の状態、投与経路によって、および／または同様に、病態の重症度、年齢および被験者の全般的な病態などの因子いかんによる、臨床医の判断によって、調節される。
【００５０】
５．被験者と指標
本明細書で用いられるように、被験者としては、骨、軟骨、および／または腱の負傷または欠損を含むがこれらには限定されない、整形外科上の病態に苦しんでいる人であれば誰でもよい。
【００５１】
次の実施例を設けて、本発明を例証する。しかしながら、本発明が、これらの実施例にて記載された特定の条件または細部に制限されるわけではないことを理解すべきである。明細書全体を通して、米国特許を含むがそれに限定されるわけではない、ありとあらゆる公に利用できる文書への言及は、引用によって明確に取り込まれる。
【００５２】
実施例１  本発明の成長因子組成物と組み合わせた代用骨
本発明の有効量の濃縮成長因子は、その材料と成長因子とを被験者に投与する前に、その材料に相応しいタイプのミキサーで混合することによって、下記の材料と組み合わせることができる。
【００５３】
最初の代用骨の材料としては、Ｂｉｏｍｅｔ  Ｍｅｒｃｋ社（所在地はオランダ国、Ｆｒｕｉｔｅｎｉｅｒｓｓｔｒａａｔ  ２３、Ｐｏｓｔｂｕｓ  １１３８，３３３０  ＣＣ  Ｚｗｉｊｎｄｒｅｃｈｔ）によって製造されるＥｎｄｏｂｏｎ（登録商標）が含まれ、これは、移植用の代用骨として用いるのに特に適しているハイドロキシアパタイトセラミック（ＨＡセラミック）である。この材料は生体に由来し、骨伝導性である。移植すると、セラミックの相互に連絡している細孔システムにより、新しい骨が直接セラミック内に成長する。Ｅｎｄｏｂｏｎ（登録商標）を用いて、骨折、骨嚢胞、関節固定および骨腫瘍といった骨の欠損を封じることができる。
【００５４】
第二の代用材料としては、これもＢｉｏｍｅｔ  Ｍｅｒｃｋ社によって製造された、Ｂｉｏｂｏｎ（登録商標）が含まれ、これは、体温で吸熱を伴って硬化する再吸収性の合成微結晶性リン酸カルシウムセメントである。それは、骨の欠損の充填または再建のために用いることができる。リン酸カルシウム粉末および生理食塩水を適切に混合した後に、得られるペーストを被験者に用いることが可能であり、そしてＢｉｏｂｏｎ（登録商標）は骨の欠損の形で硬化することができる。硬化した後に、その化学組成および結晶構造が、自然の骨のリン酸カルシウム成分と本質的に一致すると思われる。
【００５５】
実施例２  ＲＴ−ＰＣＲを用いる軟骨細胞の特徴解析
軟骨細胞の分化に関するいくつかのマーカーについてＲＴ−ＰＣＲを実施した。そしてＰＣＲプライマーは、Ｉ型コラーゲン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ  ０１２６５１）、ＩＩ型コラーゲン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ  １０３４７）、アグレカン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ  ０８３９２１）、ＳＯＸ−９（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ  ０３９０９４）、ＢＭＰ−２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ  ００１２００）、ＴＧＦ−β−３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ  ００３２３９）、Ｃｂｆａ−１、ＰＴＨｒＰ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ  ５７２９３、Ｍ  ３２７４０）、アルカリホスファターゼ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ  ００１８２６）、およびインディアンヘッジホッグを含む、これらのマーカーのヌクレオチド配列を用いて、作製した。このプライマーおよびＰＣＲ条件を、それぞれ表１および表２に示す。
【００５６】
全ＲＮＡは、メーカー（Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．、オースチン、テキサス州）の取扱説明書にしたがって、ＲＮＡｚｏｌ溶液を用いて、軟骨細胞の培養液から単離された。ＲＴ−ＰＣＲのために、一本鎖ｃＤＮＡは、オリゴ−ｄＴプライマーと一緒に逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ社、シドニー、オーストラリア）を用いて、２μｇの全ＲＮＡから調製された。２μｌのそれぞれのｃＤＮＡについては、１×ＰＣＲ緩衝液中に０.４ｍｍｏｌ／ｌのプライマー、１２５μｍｏｌ／ｌのｄＮＴＰと一緒に、１.０ｕｎｉｔのＴａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、シドニー、オーストラリア）を用いて、そして水で総体積を２５μｌとして、ＰＣＲを３０サイクル行った（表２を参照のこと）。増幅は、ＤＮＡサーマルサイクラー（モデル２４００；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社）にて、実施した。
【００５７】
特定のプライマー配列は、ゲノムＤＮＡシグナルの汚染を避けるために、対象の遺伝子の別個のエクソンから、選択された。プライマーは、ｈｔｔｐ://ｇｅｎｚｉ.ｖｉｒｕｓ.ｋｙｏｔｏ−ｕ.ａｃ.ｊｐ/ｃｇｉ−ｂｉｎ/ｐｒｉｍｅｒ３.ｃｇｉに存在するソフトウェアプログラムを用いて設計され、そして、ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｇｅｎｓｅｔｏｌｉｇｏｓ.ｃｏｍ/ａｕｓｔｒａｌｉａに存在するＧｅｎｓｅｔ  Ｏｌｉｇｏｓ（オーストラリア）によって合成された（表１を参照のこと）。内部コントロールとして、一本鎖ｃＤＮＡについては、ハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ(ＧＡＰＤＨ)の特定のプライマーを用いて、２５サイクルのＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ産物は、１.５％のアガロースゲル上で電気泳動にかけ、エチジウムブロミドで染色した。
【表１】
2005521633.tif 000002
【表２】
2005521633.tif 000003
【００５８】
実施例３  ウェスタンブロット分析を用いる軟骨細胞の特徴解析
ＩＩ型コラーゲン、アグレカンおよびＳ−１００タンパク質ならびにその他のタンパク質を含む、軟骨細胞についてのいくつかのマーカーは、ウェスタンブロット分析を利用する、培養された軟骨細胞の特徴解析に用いることができる。このようなマーカーに対する抗体は、たとえば、Ｓｉｇｍａ社（セントルイス、ミズーリ州）、Ｄａｋｏ社（オーストラリア）およびＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社（ミネアポリス、ミネソタ州）から販売されている。
【００５９】
軟骨細胞のウェスタンブロット分析を行うための材料および方法を、詳述する。
【００６０】
約１０３から１０４個の培養軟骨細胞を回収し、そしてそれらを遠心分離にかけてペレットにすることにより、細胞を溶解させた。上清を取り出し、そしてペレットを２５０μｌのＮＥＴ−ｇｅｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｑｕａｇｅｎ  ＧｍｂＨ、ドイツ）中に再懸濁させ、そして氷上で２０分間インキュベートした。ピペットを用いて、細胞残渣および溶解用緩衝液を１.５ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（商標）チューブに移し、そして４℃で、１２０００ｇにて２分間遠心分離にかけた。上清を取り出して新しいチューブに入れ、そして上清についてＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを行った。このゲルは、Ｍｉｎｉ  Ｔｒａｎｓ−ｂｌｏｔ電気泳動用トランスファー・セル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、カリフォルニア州、米国）を用いて、３０Ｖ（４０ｍＡ）にて一晩かけて、０.４５μｍのニトロセルロース膜のＨｙｂｏｎｄ（商標）−Ｃ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）に転写した。この転写は、２ｌの水の中に、７.５７ｇのグリシン、３６９ｇのトリスおよび４００ｍｌのメタノールを含有する、転写用緩衝液の存在下で、実施する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、分子クローニング：実験室マニュアル(Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ:Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ)に掲載、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ社、ニューヨーク）。ウェスタンブロットのための標準的なプロトコールは、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年、分子クローニング：実験室マニュアルに掲載、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ社、ニューヨーク）、およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９７年、分子生物学の最新プロトコール(Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ)に掲載、Ｇｒｅｅｎ＆Ｗｉｌｅｙ社、ニューヨーク）にあるものを利用でき、これらは、引用することによって本明細書に取り込まれる。
【００６１】
変性および再生工程
グアニジン−ＨＣｌ(Ｇ−ＨＣｌ)の濃度が６Ｍ、３Ｍ、１Ｍ、および０.１Ｍの４種の溶液を調製した。表３に、この工程で用いるＧ−ＨＣｌ溶液の調製の詳細を示す。
【００６２】
Ｇ−ＨＣｌ溶液を調製する場合、すべての成分は新しいものを用意すべきである。粉ミルクは、その他の成分に粉ミルクを添加する前に水に溶解し、Ｇ−ＨＣｌ溶液中の最終濃度が２％のミルクとなるように作製した。膜については、一回の洗浄に３０分間かけて４回洗浄し、それぞれの回について、室温にて６ＭのＧ−ＨＣｌ、３ＭのＧ−ＨＣｌ、１ＭのＧ−ＨＣｌ、および０.１ＭのＧ−ＨＣｌによって洗浄した。この膜は、次いで、アフィニティークロマトグラフィー(ＡＣ)用緩衝液に２％の粉ミルク溶液を加えたものを用い、４℃で一晩かけて洗浄した。
【００６３】
ＡＣ用緩衝液を次のように調製する：
５０ｍｌのグリセロール（最終的に１０％のグリセロール）
１０ｍｌの５Ｍ  ＮａＣｌ（最終的に１００ｍＭのＮａＣｌ）
１０ｍｌの１Ｍ  トリス、ｐＨ７.６（最終的に２０ｍＭのトリス）
１ｍｌの０.５Ｍ  ＥＤＴＡ（最終的に０.５ｍＭのＥＤＴＡ）
５ｍｌの１０％Ｔｗｅｅｎ−２０（最終的に０.１％のＴｗｅｅｎ−２０）
氷上に放置
【表３】
2005521633.tif 000004
【００６４】
洗浄およびブロッキング工程
次いで、膜を、５分間かけて、１×ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで２回洗浄し、その後、５分間かけて、ＡＣ用緩衝液で１回洗浄した。続けて、膜を、２％のスキムミルクおよび１×ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで調製されたブロッキング溶液で、室温にて１時間インキュベートし、次いで、１×ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで５分間の洗浄を２回行った。
【００６５】
対象タンパク質の探索
探索用の反応混合液（２０  １×ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中に２％のスキムミルク粉末を含み、５０μｌのタンパク質プローブおよび２０μｌの１Ｍ  ＤＴＴを有するもの）を膜に添加し、そして４℃で２時間インキュベートし、次いで、１回に５分間かけて１×ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで２回、４℃で洗浄した。タンパク質プローブは、対象タンパク質に対する抗体である。この場合において、タンパク質プローブはＴＧＦ−β−３に対する抗体であった。次いで、膜を、２％のスキムミルクを含む１０ｍｌの１×ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎを用い、４℃にて１５分間かけて再度洗浄し、その後、１×ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎを用い、４℃で２０分間かけて、２回目の洗浄を行った。
【００６６】
一次抗体の添加
振盪装置を用いて、膜を、１×ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ緩衝液にて、それぞれの洗浄に５分間かけて、もう２回洗浄した。
【００６７】
１×ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎおよび１％のスキムミルク（０.２ｇ）を含有する２０ｍｌのチューブを用意し、そして、一次抗体および二次抗体のために、２本の１０ｍｌのチューブに等分した。１μｌの抗Ｖ５抗体を、最終的な抗体の希釈度が１/１００００となるように、一次抗体のチューブ内にピペットで注入し、そして穏やかに混合した。一次抗体溶液を膜上に注ぎ、そして、室温で２時間、振盪装置上でインキュベートした。あるいは、抗体溶液を、４℃で一晩インキュベートしてもよい。
【００６８】
二次抗体の添加
インキュベートの後、１×ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回の洗浄を、１回の洗浄につき５分間行った。
【００６９】
５μｌの二次抗体（抗マウスＩｇＧ−Ｆａｂ）を、最終的な二次抗体の希釈度が１/２０００となるように、二次抗体溶液内にピペットで注入し、そして穏やかに混合した。二次抗体溶液を膜上に注ぎ、そして、室温で４５分間、振盪装置上でインキュベートした。
【００７０】
検出用溶液の添加
二次抗体溶液と共にインキュベートした後、１×ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎを用いて２回の洗浄を、１回の洗浄につき５分間、振盪装置上で行った。１×ＴＢＳだけを用いて、振盪装置上で、もう２回の洗浄を、１回の洗浄につき５分間行った。
【００７１】
検出用溶液は、２ｍｌのＬｕｍｉｇｅｎ検出用溶液Ａおよび５０μｌのＬｕｍｉｇｅｎ検出用溶液Ｂ(ＥＣＬ  ｐｌｕｓ社、シドニー、オーストラリア)を混合することにより調製し、そして膜に添加し、膜が確実に検出用溶液で均等に覆われるようにした。余分の検出用溶液を取り除き、そしてラップフィルムで膜を密閉して、ラップ内に確実にしわがないようにした。この膜を、フィルム枠内にある１枚のフィルムの上に置き、そして約３０分間露光し（露光時間は変化する）、次いで現像した。
【００７２】
上記の方法を用いて、その結果により、培養された軟骨細胞におけるＴＧＦ−β−３の検出が実証された。
【００７３】
実施例４  免疫組織化学分析および免疫蛍光分析
ウェスタンブロット分析と同様に、ＩＩ型コラーゲン、アグレカンおよびＳ−１００タンパク質を含む軟骨細胞についてのいくつかのマーカーを用いて、培養された軟骨細胞の、免疫組織化学および免疫蛍光を利用する特徴解析を行うことができる。これらの方法を、ＭＡＣＩ（登録商標）（マトリックス誘導性の自己由来の軟骨細胞の移植）による軟骨細胞上で直接用いることができる。
【００７４】
材料および方法を説明する。
【００７５】
ＭＡＣＩ（登録商標）膜上での軟骨細胞を、５％のパラホルムアルデヒド溶液で固定し、そして直接免疫蛍光に付した。あるいは、軟骨細胞を、固定後にパラフィン包埋してもよい。次いで、この軟骨細胞を、０.２Ｍトリス緩衝化生理食塩水(ＴＢＳ)中で洗浄し、そして、３５％の過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）内でインキュベートすることによって、内因性のペルオキシダーゼについてブロックした。次いで、細胞を２０％の通常のウマ血清でプレインキュベートし、そして一次抗体でインキュベートした。細胞をＴＢＳで洗浄し、そして二次抗体（結合しうる）でインキュベートした。ストレプトアビジンが結合したペルオキシダーゼを検出するための、３'３'−ジアミノベンジジンなどの呈色反応検出システムを用いて、軟骨細胞のマーカーを検出する。
【００７６】
上記の方法を用いて、免疫蛍光によって検出されるような、コラーゲン膜上で培養された軟骨細胞におけるＴＧＦ−β−３の発現を実証する。
【００７７】
実施例５
移植された自己由来の軟骨または軟骨細胞の中へ血管が発達することを防ぐためにＳｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）を本発明にしたがって用いることを目的として、Ｓｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）を、最初にグルタルアルデヒドなどの固定剤で処理した。簡単に言えば、Ｓｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）を、０.６％のグルタルアルデヒドで１分間処理し、次いで、数回洗浄して、取り除かなければ組織にとって有毒でありうる残余のグルタルアルデヒドを除去した。あるいは、Ｓｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）は、実施例２にて記載されているように、グルタルアルデヒドで処理する前に、Ｔｉｓｓｅｅｌ（登録商標）と呼ばれるフィブリン接着剤で処理した。たとえばグルタルアルデヒドなどの固定剤で固定され、滅菌生理食塩水（０.９％）で洗浄され、そして冷蔵庫内で保管された、Ｓｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）は、１から２ヶ月では分解しないことが分かった。一般的に、Ｓｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）は、７から１４日間の期間内に吸収される。移植された軟骨細胞が固化した軟骨の層内に成長する前に、骨の構造からの移植された軟骨の中への血管の発達、すなわち血管新生を防止するには、より長い期間を必要とすることから、この期間はあまりにも短い。換言すれば、血管新生の十分な阻害は、たとえば１ヶ月といった、より長い期間の間必要である。それゆえに、その期間の前に、その生産物は著しく吸収されるべきではない。他方では、最終的には吸収は必要である。したがって、阻害用の障壁として用いられる有機材料はこれらの能力を持つべきであり、そして、このようなやり方で処理されるＳｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）は、かかる機能を備えるものであることが分かっている。
【００７８】
実施例６
Ｓｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）はまた、有機接着剤で被覆した。本実施例において、用いられた接着剤はＴｉｓｓｅｅｌ（登録商標）であったが、その他のものを用いることもできる。この生産物は、Ｓｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）と共に、本発明の特別の目的について使用に適した障壁を形成する。その他の任意の止血剤または血管を抑制する障壁を用いることもできる。Ｔｉｓｓｅｅｌ（登録商標）を下記のようにして混合した。次いで、Ｓｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）の両側に、Ｔｉｓｓｅｅｌ（登録商標）が染み込むまで噴霧することによって、Ｓｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）をＴｉｓｓｅｅｌ（登録商標）で被覆した。次いで、Ｔｉｓｓｅｅｌ（登録商標）（フィブリン接着剤）を室温で凝固させた。続いて、凝固が完了する直前に、被覆されたＳｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）を０.６％のグルタルアルデヒド中に１分間置き、次いで滅菌生理食塩水（０.９％）で洗浄した。続いて、ｐＨが７.２から７.４にて安定的となるまで、ＰＢＳおよび／またはＮａＯＨでｐＨを調整した。その後、このように処理されたＳｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）を次に、１５ｍＭのヘペス緩衝液を含む最小必須培地／Ｆ１２などの組織培養培地中で洗浄した。
【００７９】
本実施例で説明したように、本発明者らは、フィブリン接着剤としてＴｉｓｓｅｅｌ（登録商標）を用いて、Ｓｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）の被覆を行ってきた。さらに、このフィブリン接着剤または糊はまた、Ｓｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）がその上で接着するところの、骨の方を向いている損傷部の底面に、直接塗布してもよい。インビボでの試験に代えて用いるインビトロシステムは、細胞の調査研究用のＮＵＮＣＬＯＮ（商標）デルタ６ウェル滅菌済み使い捨てプレート（ＮＵＮＣ、ＩｎｔｅｒＭｅｄ社、ロスキレ、デンマーク）から構成された。それぞれのウェルの直径は約４ｃｍである。
【００８０】
本発明において、フィブリン接着剤は、フィブリン成分と一緒になって、人体が許容できる接着剤を形成する、あらゆる接着剤であり得る（Ｉｈａｒａ、Ｎら、Ｂｕｒｎｓ  Ｉｎｃｌ.  Ｔｈｅｒｍ.  Ｉｎｊ.、１９８４、１０、３９６）。本発明ではまた、フィブリン接着剤に代えて用いることができる、その他の任意の接着剤成分が期待できる。本発明において、本発明者らは、Ｔｉｓｓｅｅｌ（登録商標）またはＴｉｓｓｕｃｏｌ（登録商標）（Ｉｍｍｕｎｏ  ＡＧ社、ウィーン、オーストリア）を用いた。Ｔｉｓｓｅｅｌ（登録商標）のキットは、次の成分から構成される：
Ｔｉｓｓｅｅｌ（登録商標）、凍結乾燥したウイルス不活性化シーラー、凝固性タンパク質：フィブリノゲン、血漿フィブロネクチン(ＣＩＧ)および第ＸＩＩＩ因子、ならびにプラスミノゲンを含む。
アプロチニン溶液（ウシ）
トロンビン４（ウシ）
トロンビン５００（ウシ）
塩化カルシウム溶液
Ｔｉｓｓｅｅｌ（登録商標）キットには、ＤＵＰＬＯＪＥＣＴ（登録商標）アプリケーション・システムが含まれる。フィブリン接着剤またはＴｉｓｓｅｅｌ（登録商標）キットを用いる二成分の封止剤は、Ｉｍｍｕｎｏ  ＡＧ社の製品の挿入シートにしたがって、次のやり方で組み合わせる：
【００８１】
実施例７
軟骨細胞は、３７℃のＣＯ２インキュベーター内で、ＨＡＭ  Ｆ１２および１５ｍＭのヘペス緩衝液ならびに５から７.５％の自己由来の血清を含有する最小必須培地中で培養され、そして、Ｖｅｒｉｇｅｎ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ａ/Ｓ社、Ｓｙｍｂｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐａｒｋ（コペンハーゲン、デンマーク）のクラス１００の実験室内で取り扱われた。軟骨細胞を培養するために、その他の組成の培養培地を用いてもよい。細胞は、トリプシン・ＥＤＴＡを用いて５から１０分間、トリプシン処理を行い、そして、Ｂｕｒｋｅｒ−Ｔｕｒｋ式計算板でトリパンブルー生死判別染色を利用して計数した。細胞の計測数は、１ｍｌあたり７.５×１０５細胞に調節した。クラス１００の実験室内では、一枚のＮＵＮＣＬＯＮ（商標）プレートのカバーを外しておいた。
【００８２】
Ｓｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）の止血用障壁は、ＮＵＮＣＬＯＮ（商標）組織培養トレイのウェルの底に適合する適切なサイズに切断した。この場合において、無菌条件下で直径が約４ｃｍの円を切断して（しかし任意の可能なサイズでよい）、そして、細胞の調査研究用のＮＵＮＣＬＯＮ（商標）デルタ６ウェル滅菌済み使い捨てプレート（ＮＵＮＣ、ＩｎｔｅｒＭｅｄ社、ロスキレ、デンマーク）のウェルの底面に置いた。ウェルの底面に置かれる止血用障壁を、実施例１に記載のように前処理した。この処理によって、Ｓｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）の吸収が顕著に遅延する。次いで、この止血用障壁を、反応しなかったグルタルアルデヒドが洗い流されるまで、蒸留水で数回洗浄した。血清を含有する少量の細胞培養培地を、それが止血用障壁内に吸収されるように適用して、ウェルの底部で止血用障壁が湿っている状態を維持した。
【００８３】
１ｍｌの培養培地中にある約１０６細胞を、止血用障壁の先端部に直接置き、上記のようにして０.４％のグルタルアルデヒドで前処理された止血用障壁の表面上に分散させた。次いで、このプレートを、ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて６０分間インキュベートした。５から７.５％の血清を含有する２から５ｍｌの量の組織培養培地を、培地を排出する際にピペットのチップがウェルの側面に接するように保持することによって細胞が飛び散るのを避けて、細胞を含むウェルに慎重に添加した。培地のｐＨはあまりにも低すぎる（ｐＨは約６.８）ようであった。次いで、ｐＨを７.４から７.５に調整した。翌日、いくつかの軟骨細胞が、止血用障壁上で塊状に配列して成長し始めていた。細胞のうちのいくつかは、ｐＨの調整を行う前に、低いｐＨに曝されていたため、死滅していた。３日目に培地を変えて、このプレートを３から７日間インキュベートした。
【００８４】
インキュベートの期間の最後に、培地をデカントし、そして、０.１Ｍのジメチルアルシン酸ナトリウム（カコジル酸ナトリウムとも呼ばれており、ｐＨはＨＣｌで７.４に調整している）を含む、冷却した２.５％のグルタルアルデヒドを、電子顕微鏡検査用の細胞および支持体（止血用障壁）を調製するために、固定剤として添加した。
【００８５】
実施例８
軟骨細胞は、３７℃のＣＯ２インキュベーター内で、ＨＡＭ  Ｆ１２および１５ｍＭのヘペス緩衝液ならびに５から７.５％の自己由来の血清を含有する最小必須培地中で培養され、そして、Ｖｅｒｉｇｅｎ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ａ/Ｓ社、Ｓｙｍｂｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐａｒｋ（コペンハーゲン、デンマーク）のクラス１００の実験室内で取り扱われた。軟骨細胞を培養するために、その他の組成の培養培地を用いてもよい。細胞は、トリプシン・ＥＤＴＡを用いて５から１０分間、トリプシン処理を行い、そして、Ｂｕｒｋｅｒ−Ｔｕｒｋ式計算板でトリパンブルー生死判別染色を利用して計数した。細胞の計測数は、１ｍｌあたり７.５×１０５細胞に調節した。クラス１００の実験室内では、一枚のＮＵＮＣＬＯＮ（商標）プレートのカバーを外しておいた。
【００８６】
（止血用障壁として用いるための）Ｓｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）を、実施例１に記載されたようにして、０.６％のグルタルアルデヒドで１分間処理し、そして、０.９％の滅菌塩化ナトリウム溶液で、または、好ましくはＰＢＳ緩衝液などの緩衝液もしくはＭＥＭ/Ｆ１２などの培養培地で、洗浄した。というのは、グルタルアルデヒド処理後のｐＨは６.８であり、好ましくは７.０から７.５であるべきだからである。ＤＵＰＬＯＪＥＣＴ（登録商標）システムを用いて、Ｓｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）の両側の面にＴｉｓｓｅｅｌ（登録商標）を適用し、用いることを意図されるパッチである、Ｓｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）の両側を、このように、フィブリン接着剤で被覆した。少なくとも３から５分間、無菌条件下で接着剤を放置して乾燥させた。この「被覆」された止血用障壁を、細胞の調査研究用のＮＵＮＣＬＯＮ（商標）デルタ６ウェル滅菌済み使い捨てプレートのウェルの底面に置いた。血清を含有する少量の組織培養培地を、それが止血用障壁内に吸収されるように適用した。血清を含有する１ｍｌの組織培養培地中にある約１０６細胞を、止血剤の先端部に直接置き、止血用障壁の表面上に分散させた。次いで、このプレートを、ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて６０分間インキュベートした。５から７.５％の血清を含有する２から５ｍｌの量の組織培養培地を、培地を排出する際にピペットのチップがウェルの側面に接するように保持することによって細胞が飛び散るのを避けて、細胞を含むウェルに慎重に添加した。３から６日後に、顕微鏡検査から、細胞は満足できる態様で、Ｓｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）に接着しており、Ｓｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）内に成長していることが示され、このことは、Ｓｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）は軟骨細胞に対する毒性を示さないこと、および、軟骨細胞はＳｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）内に満足できる態様で成長することを示唆するに十分な態様であった。
【００８７】
３日目に培地を変えて、このプレートを３から７日間インキュベートした。インキュベートの期間の最後に、培地をデカントし、そして、０.１Ｍのジメチルアルシン酸ナトリウム（カコジル酸ナトリウムとも呼ばれており、ｐＨはＨＣｌで７.４に調整している）を含む、冷却した２.５％のグルタルアルデヒドを、電子顕微鏡検査用の細胞および支持体（止血用障壁）を調製するために、固定剤として添加した。
【００８８】
実施例９
軟骨細胞は、３７℃のＣＯ２インキュベーター内で、ＨＡＭ  Ｆ１２および１５ｍＭのヘペス緩衝液ならびに５から７.５％の自己由来の血清を含有する最小必須培地中で培養され、そして、Ｖｅｒｉｇｅｎ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ａ/Ｓ社、Ｓｙｍｂｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐａｒｋ（コペンハーゲン、デンマーク）のクラス１００の実験室内で取り扱われた。細胞は、トリプシン・ＥＤＴＡを用いて５から１０分間、トリプシン処理を行い、そして、Ｂｕｒｋｅｒ−Ｔｕｒｋ式計算板でトリパンブルー生死判別染色を利用して計数した。細胞の計測数は、１ｍｌあたり７.５×１０５から２×１０６細胞に調節した。クラス１００の実験室内では、一枚のＮＵＮＣＬＯＮ（商標）プレートのカバーを外しておいた。
【００８９】
Ｂｉｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）は、関節（ここで、止血用障壁と同様に、培養された軟骨細胞がこの関節内に移植される）の不具合のある領域を覆うためのパッチまたは包帯として用いられるであろう、吸収性の二層膜として用いることができることが分かった。Ｂｉｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）は、規格化され、コントロールされた製造プロセス（Ｅ.Ｄ.Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ  Ｓｏｈｎｅ  ＡＧ、ＣＨ−６１１０  Ｗｏｌｈｕｓｅｎによる）によって得られる，純粋なコラーゲンの膜である。コラーゲンは獣医によって保証されたブタから抽出され、そして，抗原性の反応を避けるために慎重に精製して、二重のブリスター包装内でガンマ線照射によって滅菌されている。二層膜は多孔性表面と緻密性表面とを有する。膜はＩ型コラーゲンとＩＩＩ型コラーゲンとから作製され、さらなる架橋または化学的処理は伴わない。このコラーゲンは２４週間以内に吸収される。この膜は、湿っている場合でさえ、完全にその構造を保持し、そして、縫合糸またはネイルで固定することもできる。また、この膜は、縫合糸の代わりに、または縫合糸と一緒に、Ｔｉｓｓｅｅｌ（登録商標）などのフィブリン接着剤を用いて、隣接する軟骨または組織に「接着」してもよい。
【００９０】
クラス１００の実験室内では、Ｂｉｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）のカバーを外しておいて、二層膜の多孔性表面を上にした状態か、または緻密性表面を上にした状態のいずれかで、無菌条件下にて細胞の調査研究用のＮＵＮＣＬＯＮ（商標）デルタ６ウェル滅菌済み使い捨てプレートのウェルの底面に置いた。血清を含有する１ｍｌの組織培養培地中にある約１０６の細胞を、Ｂｉｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）の先端部に直接置き、Ｂｉｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）の多孔性表面または緻密性表面のいずれかの上に分散させた。次いで、このプレートを、ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて６０分間インキュベートした。５から７.５％の血清を含有する２から５ｍｌの量の組織培養培地を、培地を排出する際にピペットのチップがウェルの側面に接するように保持することによって細胞が飛び散るのを避けて、細胞を含むウェルに慎重に添加した。
【００９１】
Ｂｉｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）を含有するウェル内に軟骨細胞を置いて２日後に、Ｎｉｋｏｎ社の倒立顕微鏡で細胞を検査した。いくつかの軟骨細胞がＢｉｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）の縁に付着していたことに気付いた。この顕微鏡を用いて、Ｂｉｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）そのものを十分に調べることは、当然のことながら不可能であった。
【００９２】
３日目に培地を変えて、このプレートを３から７日間インキュベートした。インキュベートの期間の最後に、培地をデカントし、そして、０.１Ｍのジメチルアルシン酸ナトリウム（カコジル酸ナトリウムとも呼ばれており、ｐＨはＨＣｌで７.４に調整している）を含む、冷却した２.５％のグルタルアルデヒドを、細胞と多孔性表面上または緻密性表面上のいずれかで培養された細胞を伴うＢｉｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）支持体とを調製するために、固定剤として添加した。次いで、電子顕微鏡検査のために、Ｂｉｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）のパッチはデンマークのヘルレブ病院(Ｈｅｒｌｅｖ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ)の病理学部門に送られた。
【００９３】
電子顕微鏡検査から、Ｂｉｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）の緻密性表面上で培養された軟骨細胞が、Ｂｉｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）のコラーゲン構造の内部へ成長することはないこと、それに対して多孔性表面上で培養された細胞は、コラーゲン構造の内部へ実際に成長していることが示され、さらに、プロテオグリカンの存在が示され、また、繊維芽細胞構造の徴候がないことが示された。この結果から、たとえばＢｉｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）のパッチのようなコラーゲンのパッチを、軟骨の欠損を覆うパッチとして縫い付ける場合、多孔性表面は、培養された軟骨細胞が注入される予定のその欠損の方に向けて表を下にするべきであることが、示される。次いで、これらがコラーゲンに浸透することが可能となり、無傷の表面と調和して滑らかな軟骨表面が形成され、そして、この領域内で、プロテオグリカンの平滑な層が構築されることになる。それに対して、コラーゲンの緻密性表面を欠損内へ下向きにすると、移植される軟骨細胞はコラーゲンと統合されることがなく、細胞は上記と同一の滑らかな表面を形成しないであろう。
【００９４】
実施例１０
軟骨細胞は、３７℃のＣＯ２インキュベーター内で、ＨＡＭ  Ｆ１２および１５ｍＭのヘペス緩衝液ならびに５から７.５％の自己由来の血清を含有する最小必須培地中で培養され、そして、Ｖｅｒｉｇｅｎ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ａ/Ｓ社、Ｓｙｍｂｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐａｒｋ（コペンハーゲン、デンマーク）のクラス１００の実験室内で取り扱われた。細胞は、トリプシン・ＥＤＴＡを用いて５から１０分間、トリプシン処理を行い、そして、Ｂｕｒｋｅｒ−Ｔｕｒｋ式計算板でトリパンブルー生死判別染色を利用して計数した。細胞の計測数は、１ｍｌあたり７.５×１０５から２×１０６細胞に調節した。クラス１００の実験室内では、一枚のＮＵＮＣＬＯＮ（商標）プレートのカバーを外しておいた。
【００９５】
吸収性の二層膜として用いられるＢｉｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）はまた、追加として、製品の挿入物に記載されているような、Ｔｉｓｓｅｅｌ（登録商標）で通常見られるよりも明らかにアプロチニンの含有量が高いＴｉｓｓｅｅｌ（登録商標）などの有機接着剤と一緒に用いてもよい。アプロチニンの含有量を約２５、０００ＫＩＵ／ｍｌにまで増やすことによって、その材料の吸収作用が、通常の期間である日単位に代えて週単位で遅延するだろう。
【００９６】
インビトロでこの特徴を試験するために、ＮＵＮＣＬＯＮ（商標）プレートのウェルの底部にＴｉｓｓｅｅｌ（登録商標）を適用し、そして、完全ではない程度に固化させる。次いで、Ｔｉｓｓｅｅｌ（登録商標）の上にＢｉｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）などのコラーゲンのパッチを適用し、そしてウェルの底部に接着する。Ｂｉｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）とＴｉｓｓｅｅｌ（登録商標）とのこの組み合わせは、血管による軟骨細胞の移植領域への発達または浸潤を阻害または防止するであろう止血用障壁となるように、設計される。今や、このハイブリッドコラーゲンのパッチは、損傷の底部での止血用障壁として（修復される表面に最も近い）、および、軟骨の形成の支持体としての両方に用いることができる。というのは、末端の表面をコラーゲンのパッチの多孔性表面側とすることができ、そしてそれゆえに、軟骨細胞および軟骨マトリックスの浸潤が促進されるからである。したがって、このハイブリッドコラーゲンのパッチはまた、移植された軟骨細胞の方に向けて下向きにしたコラーゲンの多孔性表面を伴う移植組織の先端部と、先端部を形成する障壁とを覆うのに用いることもできる。アプロチニン成分が多いハイブリッドコラーゲンのパッチはまた、Ｔｉｓｓｅｅｌ（登録商標）などの任意の有機接着剤なしで用い、欠損の内部に直接置いて自然の力で接着させてもよい。したがって、コラーゲンのパッチは、止血用障壁、および細胞を含まない修復／移植部位の被覆剤の両者として、移植された軟骨細胞／軟骨の方に向けられたパッチの多孔性表面と共に用いることができる。別の変形物では、ＩＩ型コラーゲン（すなわち、Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ  Ｓｏｈｎｅ  ＡＧ、ＣＨ−６１１０  Ｗｏｌｈｕｓｅｎからのもの）から成るコラーゲンのパッチが用いられるであろう。
【００９７】
したがって本発明は、ハイブリッドコラーゲンのパッチを提供する。ここで、パッチは、有機性のマトリックス接着剤に関連するものであって、高濃度のアプロチニン成分、好ましくは約２５、０００ＫＩＵ／ｍｌを含むコラーゲンマトリックスであり、コラーゲン成分はＢｉｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）の吸収性の二層材料かまたはＩＩ型コラーゲンと類似し、そして、有機接着剤はＴｉｓｓｅｅｌ（登録商標）の材料と類似する。別の実施形態において、ハイブリッドコラーゲンのパッチには、修復部位を接着するために、いずれの有機接着剤も用いない。
【００９８】
本発明の特定の実施形態だけについて上記に特に詳述したが、本発明の精神および意図する範囲を逸脱することなく、本発明の改良および変形が可能であることが、認識されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】図１は、自己由来の軟骨細胞移植を用いる軟骨修復の分子コントロールを表す図である。
【図２】図２は、軟骨細胞における成長因子および転写因子の遺伝子発現を表す図である。
【図３】図３は、軟骨細胞における成長因子、マトリックスタンパク質および転写因子の遺伝子発現を示す図である。
【図４】図４は、軟骨細胞における成長因子、マトリックスタンパク質および転写因子の遺伝子発現を示す図である。
【図５】図５は、軟骨細胞におけるＲＡＮＫＬおよびそのレセプターの遺伝子発現を示す図である。
【図６】図６は、軟骨細胞におけるステロイドホルモンのレセプターの遺伝子発現を示す図である。
【図７】図７は、非濃縮のコントロールサンプルと濃縮サンプルとの間の成長因子のウェスタンブロットの比較を示す図である。
【図８】図８は、非濃縮のコントロールサンプルと濃縮サンプルとの間の成長因子の濃度の比較を示す図である。
【図９】図９は、ヒトの軟骨細胞培養物に本発明の成長因子を適用した後の軟骨細胞の細胞培養を示す図である。
【図１】
2005521633.tif 000005
【図２】
2005521633.tif 000006
【図３】
2005521633.tif 000007
【図４】
2005521633.tif 000008
【図５】
2005521633.tif 000009
【図６】
2005521633.tif 000010
【図７】
2005521633.tif 000011
【図８】
2005521633.tif 000012
【図９】
2005521633.tif 000013
【国際調査報告】
2005521633.tif 000014
2005521633.tif 000015