(57)【要約】【課題】  多孔質高分子ベースマトリックスに枝分れ親水性ポリヒドロキシ官能性ポリマーが共有結合した表面改質ベースマトリックス。  【解決手段】  多孔質高分子ベースマトリックスに共有結合させるポリヒドロキシ官能性ポリマーとして、約０．２以上の枝分れ度（ＤＢ）を示す超枝分れポリマーを用い、各ポリマーは２以上の点でベースマトリックスに係留されている。本マトリックスは、例えばアガロースのような架橋炭水化物が可能で、超枝分れ親水性ポリマーは例えばエピクロルヒドリンと糖質のコポリマーが可能である。本発明は、多孔性ベースマトリックスの官能性水酸基を活性化し、活性化マトリックスを親水性超枝分れヒドロキシ官能性ポリマーと接触させる、表面改質方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔性高分子ベースマトリックスに枝分れ親水性ポリヒドロキシ官能性ポリマーが共有結合してなる表面改質ベースマトリックスであって、ポリヒドロキシ官能性ポリマーが０．２以上の枝分れ度（ＤＢ）を示す超枝分れポリマーであり、かつ各ポリマーが２以上の点でベースマトリックスに係留されていることを特徴とする表面改質ベースマトリックス。
【請求項２】
高分子ベースマトリックスが親水性ポリヒドロキシ官能性細孔表面を呈する請求項１記載のマトリックス。
【請求項３】
高分子ベースマトリックスが架橋炭水化物を含む請求項１又は請求項２記載のマトリックス。
【請求項４】
高分子ベースマトリックスが１以上の合成ポリマーを含む請求項１又は請求項２記載のマトリックス。
【請求項５】
ポリヒドロキシ官能性ポリマーの枝分れ度が約０．４以上、好ましくは０．６以上である請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載のマトリックス。
【請求項６】
超枝分れ親水性ポリマーが、エポキシドと架橋したポリヒドロキシ官能性モノマーを含むコポリマーである請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載のマトリックス。
【請求項７】
エポキシドがエピクロルヒドリンである請求項６記載のマトリックス。
【請求項８】
ポリヒドロキシ官能性モノマーが多価アルコールである請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載のマトリックス。
【請求項９】
多価アルコールが糖質又は糖質アルコールである請求項８記載のマトリックス。
【請求項１０】
ポリヒドロキシ官能性モノマーがスクロース、グルコース、ソルビトール、マンニトール及びキシリトールからなる群から選択される請求項９記載のマトリックス。
【請求項１１】
ポリヒドロキシ官能性モノマーがスクロースである請求項１０記載のマトリックス。
【請求項１２】
ポリマーの１以上の水酸基に官能基を結合することによってクロマトグラフのマトリックスに誘導体化されている請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載のマトリックス。
【請求項１３】
イオン交換体であり、かつ官能基が、反対の電荷の物質と結合することができる荷電基である請求項１２記載のマトリックス。
【請求項１４】
ポリマーの１以上の水酸基にスルホプロピル基を結合することによって陽イオン交換体に誘導体化されている請求項１３記載のマトリックス。
【請求項１５】
ポリマーの１以上の水酸基に４級アミノ基を結合することによって陰イオン交換体に誘導体化されている請求項１３記載のマトリックス。
【請求項１６】
官能基が親和性基、疎水性基及び金属キレート基からなる群から選択される請求項１２記載のマトリックス。
【請求項１７】
枝分れ度（ＤＢ）が約０．２以上、好ましくは約０．４以上、最も好ましくは約０．６以上の超枝分れポリマーであるポリヒドロキシ官能性ポリマーを、枝分れ親水性ポリヒドロキシ官能性ポリマーの表面改質に使用する方法。
【請求項１８】
（ａ）官能性水酸基を含む多孔性高分子ベースマトリックスを準備する段階、
（ｂ）求核置換反応によりベースマトリックス上の官能性水酸基を活性化する段階、
（ｃ）親水性の枝分れヒドロキシ官能性ポリマーを準備する段階、及び
（ｄ）親水性ポリマーがベースマトリックスへ共有結合カップリングすることを可能にする条件下で活性化ベースマトリックスにポリマーを接触させる段階、を含み
ポリヒドロキシ官能性ポリマーが約０．２以上の枝分れ度（ＤＢ）を示す超枝分れポリマーである、多孔性ベースマトリックスの表面改質方法。
【請求項１９】
段階（ａ）で準備する多孔性ベースマトリックスがアガロースのような架橋炭水化物である請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
段階（ａ）で準備するベースマトリックスの空隙率が約９０％以上、例えば約９４％以上である請求項１８又は１９記載の方法。
【請求項２１】
段階（ｂ）においてエポキシド試薬を添加する請求項１８乃至請求項２０のいずれか１項記載の方法。
【請求項２２】
親水性超枝分れヒドロキシ官能性ポリマーをポリヒドロキシ官能性モノマーとエピクロルヒドリンの重合により準備する請求項１８乃至請求項２１のいずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
ポリヒドロキシ官能性モノマーが糖質又は糖質アルコールのような多価アルコールである請求項１８乃至請求項２２のいずれか１項記載の方法。
【請求項２４】
ポリヒドロキシ官能性モノマーがスクロース、グルコース、ソルビトール、マンニトール及びキシリトールからなる群から選択され、好ましくはスクロースである請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
段階（ｄ）をアルカリ性条件下で実施する請求項１８乃至請求項２４のいずれか１項記載の方法。
【請求項２６】
超枝分れ親水性ポリマーの枝分れ度が約０．４以上、好ましくは約０．６以上である請求項１８乃至請求項２５のいずれか１項記載の方法。
【請求項２７】
イオン交換マトリックスの製造方法であって、多孔性高分子ベースマトリックスの表面を請求項１８乃至請求項２６のいずれか１項記載の方法で改質し、改質表面に在る１以上の水酸基に官能基を誘導するさらなる段階を含む方法。
【請求項２８】
官能基がイオン交換基、親和性基、疎水性基及び金属キレート基からなる群から選択される請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
請求項１乃至請求項１６のいずれか１項記載のマトリックスのクロマトグラフィーにおける使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分離の分野に関し、更に詳しくは、クロマトグラフ分離法において有用な、表面改質ベースマトリックスに関する。本発明は、イオン交換方法において有用な、新規な、表面改質ベースマトリックスも包含する。更に、本発明は、多孔性ベースマトリックスの表面改質方法のみならず、このような表面改質ベースマトリックスに由来するイオン交換体の製造方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
イオン交換は、イオン性の又はイオン化できる基を有する化合物の単離にしばしば使用される、クロマトグラフ法である。異なる化合物は、それらの正味の電荷に基づいて相互に分離できる。全てのクロマトグラフ法におけると同様に、２つの、相互に不混和性の相が接触せしめられ、このとき、一方は固定相であり、他方は可動相である。このように、１以上の標的化合物を含む試料が可動相に導入され、それは、可動相によって系を搬送されるときに、固定相と可動相の間で一連の相互作用をうける。脱着或いは溶出段階の間に、分離された化合物は、固定相との相互作用が増大する順序で出現する。保持が最小の成分は最初に溶出し、最も強固に保持される材料は最後に溶出する。試料がカラムから溶出するときに、一つの成分が、隣接する溶質の帯域と重なり合わないように十分に遅れれば、分離がなされる。
【０００３】
イオン交換体の固定相は、通常２つの成分、すなわち高分子マトリックスとその上につながれた官能基を含む。このような官能基は、一般にリガンドと呼ばれている。リガンドは、永久的に結合されたイオン性基であり、反対電荷の対イオンを持っている。これらの対イオンは、可動相中にある、符号が同じで等しい数の他のイオンと交換できる。このように、陽イオン交換法においては、リガンドは負電荷を持ち、一方、陰イオン交換法においては、リガンドは正電荷を持つ。標準的には、タンパク質は、低ｐＨ値では正に帯電し、高ｐＨでは負に帯電している。このため、タンパク質の分離においては、陽イオン交換及び陰イオン交換の両方の技術を使用できる。負に帯電したＤＮＡが重要な混入物質である場合、例えば細胞ホモジェネートの処理においては、タンパク質成分を特異的に吸着するために、陽イオン交換工程が好ましい。
【０００４】
イオン交換のために適切なマトリックスを選択する場合の重要な要因は、なかんずく、得られる吸着容量、及びリガンドの選択性及び特異性である。実際的な理由から、例えば多種類のタンパク質の分離に使用できる、汎用的なマトリックスも必要とされている。
【０００５】
クロマトグラフのベースマトリックスを種々のポリマーで被覆することが開示されている。すなわち、米国特許第５０３０３５２号（Ｐｕｒｄｕｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）は、硬質の疎水性ポリマー表面を、クロマトグラフの媒体として有用な親水性にする技術を開示している。更に具体的には、ポリスチレンジビニルベンゼン高分子材料のような疎水性表面を、親水性領域を表面から延びたままで残して疎水性領域を介して吸着する溶質に暴露させる。この延伸領域は、引き続いて、疎水性表面を部分的に、又は完全に遮蔽するのに十分な親水性の被覆を適切な位置に作り出すように、架橋される。溶質は、短い、相互に分散した、親水性及び疎水性の領域を持つことで定義され、そして、２つのモノマー、エピクロルヒドリン及びグリシドールで例証されている。重合は陽イオン重合の条件下で実施されるので、エピクロルヒドリンは、重合の間、疎水性塩素官能性共モノマーとして作用し、架橋剤としては作用しないであろう。被覆ポリマーは抗腐食性で、タンパク質水溶液と相性がよく、ほとんどのｐＨ値で化学的に安定であると説明されている。望むなら、被覆は、イオン交換体のような、クロマトグラフィー材料を生産するため更に誘導することができる基を含むことができる。しかしながら、この被覆は疎水性／親水性相互作用を介して吸着されているので、これは細孔表面上に比較的に平らで密な層を形成すると思われる。最も満足できる被覆はグリシドール／エピクロルヒドリンの比が３未満で得られたが、一方、比が５〜１０では有利性がもっと低いと述べられている。このように、支持体に共有結合ではなくて結合している架橋ポリマーの表面を含む、得られた平らな被覆は、被覆の目的がタンパク質と疎水性細孔表面の間の相互作用を防止することである、この場合には有利である。しかし、平らで密な表面は、高い拡散速度と高い容量が望まれる用途には有利性がもっと低いと思われる。
【０００６】
上記と同様に、米国特許第５５０３９３３号（Ｐｕｒｄｕｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）は、疎水性表面に共有結合で結合した親水性被覆物、及びその製造方法を開示している。被覆表面を形成するために、親水性領域に共有結合で、かつ柔軟に結合した疎水性領域を含み、その疎水性領域が不飽和基を含む化合物が提供されている。この化合物は疎水性表面に吸着し、その疎水性領域中の不飽和基は、ついで、フリーラジカル反応により、表面の不飽和基と共有結合で架橋する。この方法は、上記米国特許第５０３０３５２号と同じ目的に役立ち、かつ同様に平坦な、密の、かつ架橋層も得られる。上記の通り、この種の層は拡散の観点からは最も有利というわけではない。
【０００７】
多孔性ベースマトリックスをポリマーで処理して細孔にポリマーを詰め、クロマトグラフのマトリックスを提供することも示唆されている。米国特許第５９０６７４７号（Ｂｉｏｓｅｐｒａ  Ｉｎｃ）は、高い静的及び動的吸着容量を特徴とするクロマトグラフの媒体を開示しており、これは、アルカリ及び塩基性条件において化学的安定性が改良され、また非特異的なタンパク質の吸着をもたらす傾向が減少していると言われている。これは、１以上の極性置換基を含むビニルモノマー、疎水性領域、例えば長鎖の飽和炭化水素、オレフィン性炭化水素基、又は芳香族基を含む不動態化モノマー、及び架橋剤を含む、主モノマーの不動態化混合物で多孔性マトリックスを処理することにより達成される。好ましいマトリックスは、多孔性の無機酸化物粒子である。米国特許第５９０６７４７号に開示された方法は、高分子ゲル網状組織がマトリックスの細孔の内部に閉じこめられた複合材料をもたらす。高分子ゲル網状組織を閉じこめると、利用可能な結合部位の数を「希釈」し、それにより結合容量を減らすので望ましくないと述べられている、ゲルのいかなる実質的な膨潤も、防げると思われる。それでもなお、開示された複合マトリックスは、溶質が全体の高分子網状組織内で、その上に在る１以上の基と静電的に相互作用しながら、自由に動くことを許容している。しかしながら、多くのタンパク質型は、このヒドロゲル構造体の内部に望ましい程度までは浸透しないので、この種の製品の用途は限定されている。
【０００８】
国際公開第９９／６４１４９号は、吸着を目的とするもう一つのヒドロゲルを開示している。更に具体的には、タンパク質又はアガロースのような支持体マトリックスに、２層以上のポリエチレンアミンのようなポリアルキレンアミンを塗布する。次いで、その芯を、酵素的に又は加水分解で、分解除去する。この発明は、望ましくない金属イオンを浸出物から除去する状況の中で例示されている。
【０００９】
クロマトグラフのマトリックスを細孔に充填するもう一つの技術が、米国特許第５１１４５７７号（三菱化成）に記載されている。更に具体的には、有機多孔性高分子基質を含み、その細孔には、巨大網目構造を示す親水性ポリマーが堆積している、複合分離材が開示されている。この有機高分子基質は、スチレンのような単不飽和モノマーと、ジビニルベンゼンのような複不飽和モノマーの合成コポリマーから作られている。親水性ポリマーの例は、例えばエピクロルヒドリンと架橋した、架橋前の分子量Ｍｗが約５０００００であるデキストランである。この際、デキストランは多孔性基質中に拡散することができ、次いで、エピクロルヒドリンの添加により細孔系の中で架橋する。生じる複合分離材は優れた液体浸透性を示し、それ故、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）での使用が意図されている。そのための十分な機械的強度を備えるには、基質の架橋度が４〜１００％でなければならない。得られる複合分離材は、支持体マトリックスの細孔が架橋多糖類のヒドロゲルで完全に充填されている、上記米国特許第５９０６７４７号に類似している巨大網目構造を示す。米国特許第５１１４５７７号が意図しているＧＰＣ用途では、ヒドロゲルは、もっと大きな分子が支持体のマクロ細孔に入るのを妨げると思われる。もしこのヒドロゲルが取り込まれてイオン交換体を形成しても、このヒドロゲルに都合良く潜り込む粒子状のタンパク質だけに作用すると期待される。
【００１０】
さらに、結合容量が高められたクロマトグラフ用分離マトリックスを提供するために、一緒になってもっとふわふわした層を提供する増量材を含む別の塗布物が示唆されている。例えば、国際公開第９８／３３５７２号（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ）は、このようなマトリックスを含む流動層又は撹拌された懸濁液において、液体からある物質を吸着する方法を開示している。
【００１１】
このような、増量材を含む多孔性の又はふわふわした層の例は、国際公開第００／７５１９５号（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ）に例示されている。そこには、多孔性ベースマトリックスの親水化又は表面領域の拡張方法が開示されている。もっと具体的には、複数の−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＨ（ポリエチレングリコール）基を持つポリヒドロキシポリマーが、エチレンオキサイドのグラフト化又はエトキシ化ポリビニルアルコールのようなエトキシ化ポリマーのカップリングによって、多孔性ベースマトリックスに付けられている。ポリエチレングリコールはそれ自身直鎖性が高い分子であり、一方、エトキシ化ポリビニルアルコールは、櫛状のポリマー、すなわち直鎖の芯がポリエチレングリコールの短い側鎖を持つ構造に特徴がある。
【００１２】
もう一つの増量材が国際公開第９５／１３８６１号に開示されている。ここでは、ポリビニルエーテルを含む原理的に直鎖の増量材が示唆されている。
【００１３】
ふわふわの層を塗布物として用いてクロマトグラフ用マトリックスの結合容量を改変し高める技術は、市販品にも利用されている。例えば、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＸＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ（スウェーデン、ウプサラ））は、デキストランの層が接合されたアガロースマトリックスを含む製品で、それにカップリングしたイオン交換リガンドの利用性を増大している。リューコノストック・メセンテロイド（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）のＢ５１２−Ｆ株由来のデキストランは、約４０ｋＤ程度の、中分子量であり、中程度に枝分れしている、すなわちグルコース残基の約５％が枝分れ点であり、ＤＢが０．１である。
【００１４】
Ｒｏｙａｐｐａ：Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｏｌｙｍ  Ｓｃｉ  ６５、１８９７（１９９７）は、温度や水分のような種々の実験変数の影響を参照しながら、三フッ化硼素を触媒とするエピクロルヒドリンとグリシドールの陽イオン共重合の試験を報告している。モノマーの消費傾向は、幾ばくかの枝分かれと小さな環状種の生成を伴う、ブロック又はグラフトコポリマーの形成を示している。このように、上記米国特許第５０３０３５２号に似て、得られるポリマーは疎水性−親水性ポリマーと思われ、そこにはエピクロルヒドリン由来の塩素がなおも残存している。製造されたコポリマーは、クロマトグラフィーに使用する、顕微鏡レベルの多孔性の架橋ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）ビーズ上に塗布できることも述べられている。このような架橋ビーズは、下塗りされた形状では極端に疎水性だが、このポリマーを塗布すると、ビーズは親水化され水濡れ性になる。この塗布は、グリシドール由来の水酸基のような有用な活性基をビーズ表面に提供し、これは更に誘導体化されて、種類が異なるクロマトグラフ用媒体を創ることができる。しかしながら、アフィニティークロマトグラフィーやイオン交換において、ポリマーの疎水性部分は、なお非特異的吸着を惹起すると予想され、通常これは望ましくない。
【００１５】
更に、Ｒｏｙａｐｐａ  ｅｔ  ａｌ  （Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ．８２、２２９０−２２９９（２００１）：Ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ  Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｉｄｏｌ  ｗｉｔｈ  Ｎｏｎｐｏｌａｒ  Ｅｐｏｘｉｄｅ  Ｃｏｍｏｎｏｍｅｒｓ）は、陽イオン開環重合で合成した、グリシドールと、エピクロルヒドリンのような種々の共モノマーとのコポリマーに関する考察を報告している。共モノマー製品は超枝分れポリグリシドールの芯から成り、低分子量である。これらの製品は、それ以上の精製をなんら必要とせずに、ＨＩＣ塗布物として有用である。ボットＮＭＲ及びＦＴＩＲデータは、水酸基及び共モノマー由来の側基で充満した、高度に枝分れポリエーテル鎖とつじつまが合うと要約されている。しかしながら、スペクトルデータからは、共モノマー中のいずれの側基も、多少なりとも反応に参画しているとは見えず、これはある種の用途において難点となる可能性がある。
【００１６】
国際公開第９６／３１５４９号は、樹枝状グラフトポリマーの段階的製造方法を開示している。更に具体的には、この発明は、水酸基を含有する担体に基づく樹枝状グラフトポリマーを開示しており、そのポリマー表面には、担体に対する末端位モノマーユニットが共有結合している。これから、各構造体は一点で担体に係留されていると思われる。
【００１７】
最後に、Ｃｈｅｒｅｓｔｅｓ  ａｎｄ  Ｅｎｇｅｌ  （ＰＯＬＹＭＥＲ  Ｖｏｌｕｍｅ  ３５、Ｎｕｍｂｅｒ  １５、１９９４：３３４３−３３４４）は、樹枝状イオン交換材料を記述している。更に具体的には、高分子骨格に樹枝状の「風船」又は「紐」が付けられているイオン交換材料が開示されている。この「風船」は、芯に結合した非枝分れユニットを持ち、芯位置から幾つかの方向に念入りに構成されたデンドリマーである。すなわち、カスケード分子としても知られている、このようなデンドリマーは、繰返し対称性の要素を包含する種である。開示されたデンドリマーは、単一の構造ユニットに共有結合で組み入れられた複数の陽イオン性部位を含有する。この材料は、三級アミン試薬で処理した、スチレン／ジビニルベンゼンコポリマーから製造される。
【００１８】
要約すると、クロマトグラフィーの分野では、望ましいリガンドを誘導した後に、もっと幅広い、種々のタンパク質の効率的な単離に有用な効率的なイオン交換体を提供できる、別のベースマトリックスの必要性がなお存在する。
【特許文献１】米国特許第５０３０３５２号明細書
【特許文献２】米国特許第５５０３９３３号明細書
【特許文献３】米国特許第５９０６７４７号明細書
【特許文献４】国際公開第９９／６４１４９号パンフレット
【特許文献５】米国特許第５１１４５７７号明細書
【特許文献６】国際公開第９８／３３５７２号パンフレット
【特許文献７】国際公開第００／７５１９５号パンフレット
【特許文献８】国際公開第９５／１３８６１号パンフレット
【非特許文献１】Ｒｏｙａｐｐａ，  Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｏｌｙｍ  Ｓｃｉ  ６５，１８９７（１９９７）
【非特許文献２】Ｒｏｙａｐｐａ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ．８２、２２９０−２２９９（２００１）
【非特許文献３】Ｃｈｅｒｅｓｔｅｓ  ａｎｄ  Ｅｎｇｅｌ，  ＰＯＬＹＭＥＲ  Ｖｏｌｕｍｅ  ３５、Ｎｕｍｂｅｒ  １５、１９９４：３３４３−３３４４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明の一つの目的は、イオン交換体に誘導体化されたときに、従来技術と比べてより高い容量、特にタンパク質容量を示すクロマトグラフ用マトリックスを提供することである。これは、超枝分れ親水性ポリヒドロキシ官能性のポリマーが共有結合で表面に付着している多孔性高分子ベースマトリックスを含む、表面改質ベースマトリックスを提供することにより達成できる。
【００２０】
本発明のもう一つの目的は、化学的安定性及び堅牢性に関しても十分な特性を示す、上記マトリックスを提供することである。
【００２１】
本発明の更なる目的は、イオン交換体に誘導体化されたときに、従来技術のマトリックスに比べてより広い適用性を示すマトリックスを提供することである。
【００２２】
本発明の更にもう一つの目的は、幾つかのクラスのタンパク質に対して良好なクロマトグラフィー性能を示す、上で論じたマトリックスを提供することである。
【００２３】
本発明の更なる実施形態及び利点は、以下の詳細な説明及び実施例から明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
図１は、ポリマー改質試作品に関し、試験タンパク質であるリゾチームの動的結合容量に対して描いた試験タンパク質であるＢＳＡの動的結合容量を示す。
【００２５】
図２は、ＢＳＡを試験タンパク質とし、ポリマー改質試作品について描いた動的結合容量を示す。
【００２６】
定義
本明細書において、「超枝分れ」化合物なる語は、樹状構造を示すことを意味する（すなわち、枝が更に下位の枝に分かれ、これが順に枝分れし、等々）。枝分れ度（ＤＢ）は、ＤＢ＝ｎＤ／（ｎＤ＋Ｌ）で定義できる。ここで、Ｄは枝分れ点モノマーユニットの数、ｎは各枝分れ点から延びている枝分れの平均数、そしてＬは直鎖の（枝分れしていない）モノマーユニットの数である。
【００２７】
「親水性」なる語は、本明細書において、タンパク質と疎水性相互作用をしない、水溶性又は水膨潤性の材料を意味する。多孔性非荷電媒体の親水性の試験は、高濃度の硫酸アンモニウムを含有する緩衝液中のモデルタンパク質（例えばフェリチン）を吸着させ、次いで硫酸アンモニウム濃度が減少する勾配でそれを溶出させることで可能である。媒体の親水性が高いほど、タンパク質がより早く溶出するであろう。
【００２８】
「ポリヒドロキシ官能性」化合物なる語は、本明細書において、化学反応に利用できる２個以上のＯＨ基を提示する化合物を意味する。
【００２９】
「ベースマトリックス」なる語は、本明細書において、従来よりクロマトグラフ法で使用されている担体を意味する。従って、この語は、球形粒子のような粒子、板状体、及び膜を含む。
【００３０】
本明細書で用いる多孔性ベースマトリックスの「表面」は、マトリックスの外表面及び細孔表面の両者を含むと理解される。
【００３１】
「共有結合で付着した」なる語は、電気陰性度の差がほんの少しである原子間の電子の共有により結合が形成されていることを意味する。電気陰性度の減少順に並べた以下の原子は、相互に共有結合を形成することが知られている：Ｆ＞Ｏ＞Ｎ＞Ｃｌ＞Ｂｒ＞Ｃ＞Ｓ＞Ｉ＞Ｈ。この状況において重要なのは、共有結合は強固であり簡単には解離しないということである。結合の解離エネルギーは、一般的に１５０〜１０００ｋＪ／ｍｏｌｅの範囲である。
【００３２】
表面に「接合された」なる語は、本明細書において、ポリマー分子が共有結合を介して表面に付着していることを意味する。
【００３３】
発明の詳細な説明
本発明の一つの形態は、多孔性高分子ベースマトリックスに枝分れ親水性ポリヒドロキシ官能性ポリマーが共有結合した表面改質ベースマトリックスである。このポリヒドロキシ官能性ポリマーは、約０．２以上の枝分れ度（ＤＢ）を示す超枝分れポリマーであり、かつ各ポリマーが２以上の点でベースマトリックスに係留されている点に特徴がある。これらのポリマーはマトリックスの外表面のみではなく、細孔表面にも付着している。更に、定義通り、ポリヒドロキシ官能性ポリマーの本質は全体的に親水性であり、従って、上記米国特許第５０３０３５２号に説明されている平らな塗布物とは異なる。
【００３４】
表面上の２以上の接触点における、ポリマーの本発明に従う係留は、この種のポリマーにおいてこれまで示唆或いは使用されていない特徴である。これから、本発明により、従来の塗布物よりもっと枝分れしているためもっと広がっている、新らしい種類の綿毛状塗布物が提供される。
【００３５】
その上、上に定義した超枝分れポリマーを用い、本発明に従って表面改質したベースマトリックスを従来の様に誘導して作製したイオン交換体は、クロマトグラフィーで使用されたときに、思いがけず高い結合容量をもたらすことが、本発明者等によって示されている。これは下記実験の部において示す。
【００３６】
上述の高い結合容量は、もし「遊離」の又は非拘束の塗布物を多孔性支持マトリックスに適用した場合、膨潤及び結合部位の希釈により結果的に結合容量が減少するであろうと推測されている、上記した米国特許第５９０６７４７号を参照しても予期できなかった。
【００３７】
本発明に係る表面改質イオン交換マトリックスのもう一つの利点は、例えば塗布物が単に疎水性表面に吸着されている上述の米国特許第５０３０３５２号と比べ、超枝分れ親水性ポリマーが表面に連結されたとき、本質的に不活性なことである。更に具体的には、塗布物をマトリックス表面に引きつける、或いは望ましい範囲を超えて平坦にする相互作用が、殆ど又は全く無いであろうということを意味する。
【００３８】
一実施形態において、高分子ベースマトリックスは、アガロース、寒天、セルロース、デキストラン、キトサン、蒟蒻、カラギーナン、ゲラン、アルギネート等の架橋性炭水化物を含む。具体的実施形態において、ベースマトリックスは、市販の粒状Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ（スウェーデン、ウプサラ））のような、流動層吸着（ＥＢＡ）に適するように改質された架橋多糖類を含む。
【００３９】
本発明に従い表面改質ベースマトリックスは、逆懸濁ゲル化（Ｓ  Ｈｊｅｒｔｅｎ：Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ７９（２）、３９３−３９８（１９６４））のような標準方法により、容易に調製できる。或いは、ベースマトリックスは、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ（スウェーデン、ウプサラ））のような、市販品である。
【００４０】
もう一つの実施形態において、ベースマトリックスは、スチレン又はスチレン誘導体、ジビニルベンゼン、アクリルアミド、アクリレートエステル、メタリレートエステル、ビニルエステル、ビニルアミド等々の架橋性合成ポリマーを含む。このようなポリマーは、標準方法により容易に製造される。例えば、“Ｓｔｙｒｅｎｅ  ｂａｓｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｓｕｐｐｏｒｔｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ｂｙ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ（懸濁重合で開発されたスチレン系高分子支持体）”（Ｒ  Ａｒｓｈａｄｙ：Ｃｈｉｍｉｃａ  ｅ  Ｌ’Ｉｎｄｕｓｔｒｉａ  ７０（９）、７０−７５（１９８８））を参照。
【００４１】
或いは、Ｓｏｕｒｃｅ（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ（スウェーデン、ウプサラ））のような市販品を、本発明に従って表面改質できる。
【００４２】
このように、要約すると、多孔性ベースマトリックスとしては、おおむね、上述したような超枝分れ親水性ポリヒドロキシ官能性ポリマー又はセラミッスク等と共有結合ができる、任意の材料が可能である。
【００４３】
一の実施形態において、多孔性ベースマトリックスは親水性細孔表面を持つ。これは、あらゆる非特異的なタンパク質相互作用を避ける、又は少なくとも減少させるために有利である。これは、細孔表面が、超枝分れ親水性ポリマーの接合に利用できる水酸基を高密度で持っている場合も有利である。もし多孔性ベースマトリックスが望ましくない表面特性を持っているなら、ポリマーの接合の前に親水性ポリヒドロキシ官能性材料で被覆することが可能である。
【００４４】
一つの実施形態において、ベースマトリックスの空隙率、すなわち細孔体積を多孔性材料の全体積で割った値は、約６５％以上、好ましくは約７５％以上、更に好ましくは約８０％以上、最も好ましくは約９０％以上、例えば約９４〜９６％である。
【００４５】
本マトリックスの一実施形態において、超枝分れ親水性ポリマーの枝分れ度（ＤＢ）は、約０．２以上、好ましくは約０．４以上、更に好ましくは約０．６以上、最も好ましくは約０．７以上である。枝分れ度は、高分子化学の分野で周知の語であり、Ｆｒｅｙ等が作り上げた下記方程式を適用して決定することができる。
【００４６】
ＤＢ＝ｎＤ／（ｎＤ＋Ｌ）
ここで、
Ｄ＝樹枝状ユニット（枝分れ点モノマーユニット）の割合
Ｌ＝直鎖ユニットの割合、及び
ｎ＝各枝分れ点から延びている枝の平均の数である。
【００４７】
或いは、枝分れ構造はポリマー分子の大きさから評価できる。枝分れパラメーターｇは、ｇ＝（Ｒ２）ｂ／（Ｒ２）Ｌで定義されることが多い。ここで、Ｒは枝分れポリマー（ｂ）及び同じ分子量の線形ポリマー（Ｌ）の回転半径である。回転半径は、光散乱、例えばＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ技法を使って決定できる。枝分れは回転半径を小さくするので、高度に枝分れポリマーではｇ＜１となる。
【００４８】
一実施形態において、超枝分れ親水性ポリマーの分子量は１０〜２０００、好ましくは２０〜１０００、更に好ましくは３０〜５００、最も好ましくは４０〜４００の範囲であり、例えば約７０ｋＤである。
【００４９】
本発明に係るマトリックスの一実施形態において、超枝分れ親水性ポリマーは、エピクロルヒドリンのようなエポキシド又はジエポキシドと架橋したポリヒドロキシ官能性モノマーを含むコポリマーである。しかしながら、当業者が気付くように、所望のポリマーを得るのに十分な量使用される多価アルコールと重合できさえすれば、事実上、任意の周知のジ−又はポリ−官能性親電子試薬を使用できる。この種のコポリマーは、例えば米国特許３３００４７４（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の開示に従って調製できる。手短には、本発明に係るコポリマーの製造方法は、アルカリ水性の環境で、８個の水酸基を持つ二糖類であるスクロースをエピクロルヒドリンと反応させることを包含する。スクロースは、全ての水酸基が反応すれば６個までの側枝が伸びている、枝分れモノマーとして作用する。エピクロルヒドリンは、スクロース由来の水酸基、又は他のエピクロルヒドリン分子から形成される水酸基と反応できる。広範な枝分れと共に、形成されたポリマー分子内において内部架橋が形成される可能性も高い。可溶性のポリマーのみが形成され、巨大な架橋製品は形成されないように、重合条件を選定しなければならない。
【００５０】
この際、ポリヒドロキシ官能性とは、化合物が、十分な範囲まで吊り下がって反応性の水酸基を１以上含むことを意味する。従って、ポリヒドロキシ官能性モノマーの重合は、複数の官能性水酸基を示し、それ故ポリヒドロキシ官能性と呼ばれる超枝分れ親水性ポリマーをもたらす。
【００５１】
多くの水酸基を含む化合物群の一つは、糖質アルコールのような糖質及び糖質誘導体である。従って、ポリヒドロキシ官能性モノマーは、単糖類、二糖類及び多糖類、及び２以上の水酸基を含有するこれらの任意の誘導体からなる群から選択できる。このように、一実施形態において、ポリヒドロキシ官能性モノマーは糖質又は糖質アルコールのような多価アルコールである。具体的な実施形態において、ポリヒドロキシ官能性モノマーは、スクロース、グルコース、ソルビトール、マンニトール及びキシリトールからなる群から選択される。例示的な実施形態では、ポリヒドロキシ官能性モノマーはスクロースである。下の実験の部において、コポリマーがエピクロルヒドリンで架橋したスクロースを含む例を示す。このようなコポリマーは市販され、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ（スウェーデン、ウプサラ））として知られている。この具体的なコポリマーは高度に枝分れし、かつ内部架橋を含有し、密な球形の分子である。水溶液中における分子の直径は、対応する分子量のリューコノストック・メセンテロイドＢ５１２−Ｆ（Ｄｅｘｔｒａｎ（商標）Ｔ画分としてＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手できる）から誘導されたデキストラン分子の直径のおよそ半分である。
【００５２】
ポリエポキシドは、文献に従い、エポキシドの陰イオン及び陽イオン開環重合の両方により製造できる。その際、殆どのエポキシドはオキシランのような他の名前によっても知られていることに言及しておく。
【００５３】
超枝分れポリマーは、グリシドール、エピクロルヒドリン等の、エポキシドモノマーの別の群から製造できる。例示しているグリシドールモノマーは、成長末端とオキシラン環に吊り下がった水酸基の間に、水素交換のための部位を備える。交換反応は枝分れを開始し、ある実験条件下では超枝分れポリマーが得られるであろう。枝分れを促進する反応条件は、例えばモノマーのゆっくりした添加、低い反応温度等である。
【００５４】
下の実験の部において、親水性超枝分れポリマーがポリグリシドールである実施例を示す。
【００５５】
異なるエポキシドモノマーの共重合は、形成されるポリマーの化学的及び物理的特性を調節するための手段として使用できる。コポリマーは、ランダムコポリマー又はブロックコポリマーとして調製でき、線形、枝分れ又は超枝分れ構造体が得られる。
【００５６】
アリルグリシジルエーテルは、追加の官能性ユニット、アリル基を持っている線形共モノマーの代表である。グリシドールとアリルグリシジルエーテルの間におけるコポリマーの製造により、アリル基で機能化された親水性超枝分れ構造体が得られる。グリシドールモノマーは枝分れユニットとして作用し、一方、共モノマーであるアリルグリシジルエーテルは、イオン性基又は親和性リガンドのような官能基を付与するための基を提供する。形成されるポリマーはポリヒドロキシ官能性巨大分子である。下の実験の部において、親水性超枝分れコポリマーがポリ（アリルグリシジルエーテル−コ−グリシドール）である実施例を示す。
【００５７】
本発明に係るベースマトリックスは、任意のクロマトグラフ法において有用な機能化マトリックスに容易に誘導体化される。従って、本マトリックスは、任意の種類の標的物質、例えばタンパク質のような生体分子、例えばプラスミドの形のＤＮＡやＲＮＡのような核酸、ウイルス、治療薬のような小さい有機分子、炭水化物等を単離するために使用できる。このように、一実施形態において、本マトリックスは、ポリマーの１以上の水酸基に官能基を付与することにより、クロマトグラフ用マトリックスに誘導体化されている。この際、「機能的」というのは、クロマトグラフ法において、基が、標的物質と、好ましくはこれらの吸着により反応可能であることを意味すると理解されるべきである。
【００５８】
かくして、一実施形態において、本発明に係るマトリックスは、ポリマーの１以上の水酸基に、反対電荷の物質と結合できる電荷を持つ基を付与することにより、イオン交換体に誘導体化されている。イオン交換体の調製方法は、クロマトグラフィーの分野で周知であり、当業者は、表面改質マトリックス上にこのようなイオン交換リガンドを備えるための適切な条件及び／又は材料を容易に選択できる。
【００５９】
一実施形態において、本マトリックスは、ポリマーの１以上の水酸基に、ＳＰ基として既知のスルホプロピル基を付与することにより、陽イオン交換体に誘導体化されている。しかしながら、スルホネート、スルフェート、カルボキシレート、ホスホネート又はホスフェート基のような、他の負に帯電している基をこの代わりに、又は追加して付与することができる。
【００６０】
もう一つの実施形態では、本マトリックスは、ポリマーの１以上の水酸基に、Ｑ基として既知の４級アミノ基を付与することにより、陰イオン交換体に誘導体化されている。しかしながら、アミン、スルホニウム又はホスホニウム基のような、他の正に帯電している基をこの代わりに、又は追加して付与することができる。
【００６１】
もう一つの実施形態では、上記の官能基は親和性基、すなわち標的物質、又は金属キレート基等と疎水性相互作用ができる基である。従って、本発明に係る表面改質マトリックス上に在る水酸基を、周知の方法に従って任意の所望の官能基を付与するためのハンドルとして使用できる。
【００６２】
従って、本発明の一形態は、枝分れ度が約０．２以上、好ましくは約０．４以上、更に好ましくは約０．６以上、最も好ましくは約０．７以上であるポリヒドロキシ官能性ポリマーがその上に共有結合で付けられている多孔性高分子ベースマトリックスを含む、表面改質クロマトグラフ用ベースマトリックスの、クロマトグラフ分離法における使用であり、前記マトリックスにおいて、各ポリマーはベースマトリックスに２以上の点で係留されている。マトリックス及び方法に関する詳細は、上で及び本明細書の他のどこかで説明した通りである。
【００６３】
クロマトグラフィーの分野において周知であるが、多くの要因が、得られる結合容量を左右する。このような要因は、例えば接合されたポリマーの量及びベースマトリックスの空隙率と細孔の寸法である。タンパク質に関しては、ある条件下で、クラスが異なるタンパク質がもっと有利に使用されることがしばしば観察される。この際、タンパク質は免疫グロブリン、酵素、高分子量タンパク質、低分子量タンパク質等のクラスに分けることができる。
【００６４】
本ベースマトリックスがイオン交換体に誘導体化されたときに重要であると判っている要因の一つは、イオン交換体のイオン容量である。かくして、一実施形態において、誘導体化された表面改質マトリックスのイオン容量は、滴定測定により、約１００〜２００、例えば１５０μｍｏｌｅ／ｍｌマトリックス（ゲルとして）である。イオン交換体のイオン容量も、下の実験の部で論じる。
【００６５】
しかしながら、当業者が気付くように、上記の他の要因と同じく、最適な超枝分れ親水性ポリマーは、各場合において、機械的な試験に基づいて選択できる。
【００６６】
本発明の第二の形態は、超枝分れヒドロキシ官能性親水性ポリマーであって、枝分れ度が約０．２以上、例えば約０．４以上、好ましくは約０．６以上であるポリマーの、クロマトグラフ用ベースマトリックスの表面改質のための使用である。他の実施形態において、本発明に従って使用される超枝分れ親水性ポリマーは上で論じた通りである。
【００６７】
本発明の第三の形態は、多孔性ベースマトリックスの表面改質方法であり、
（ａ）官能性水酸基を含む多孔性ベースマトリックスを準備する段階、
（ｂ）求核置換反応により前記ベースマトリックス上の官能性水酸基を活性化する段階、
（ｃ）親水性の超枝分れヒドロキシ官能性ポリマーを準備する段階、及び
（ｄ）親水性ポリマーがベースマトリックスへ共有結合カップリングすることを可能にする条件下で、活性化ベースマトリックスにポリマーを接触させる段階
を含み、ここで、ポリヒドロキシ官能性ポリマーは、枝分れ度（ＤＢ）が０．２以上の超枝分れポリマーである。具体的な実施形態において、枝分れ度は約０．４以上であり、好ましい実施形態では、約０．６以上、例えば約０．７以上である。当業者には自明であろうが、枝分れを促進する反応条件は、例えばモノマーのゆっくりした添加、低い反応温度等である。好ましい実施形態において、得られるベースマトリックスには２以上の接触点でマトリックス表面に係留されたポリマーが在るであろう。
【００６８】
一実施形態において、段階（ａ）で準備する多孔性ベースマトリックスは、アガロースのような架橋炭水化物である。具体的な実施形態において、段階（ａ）で準備するベースマトリックスの空隙率は、約９０％以上、例えば約９４％以上である。本方法において有用な多孔性ベースマトリックスは、本発明の第一の形態に関連して上述した通りに、得ることができる。
【００６９】
本方法の実施形態において、段階（ｂ）におけるエポキシド試薬の添加が有利である。別の実施形態では、周知の方法に従い、臭化アリル、臭化シアン、塩化シアヌル、ジビニルスルホン、塩化トシル、塩化トレシル等の親電子的活性試薬を添加して段階（ｂ）を実施する。
【００７０】
本方法の一実施形態において、ポリヒドロキシ官能性モノマーをエピクロルヒドリンと重合させて、親水性超枝分れヒドロキシ官能性ポリマーを準備する。一実施形態において、ポリヒドロキシ官能性モノマーは糖質又は糖質アルコールである。具体的な実施形態において、ポリヒドロキシ官能性モノマーはスクロース、グルコース及びソルビトールからなる群から選択され、好ましくはスクロースである。このように、本コポリマーは、周知の方法に従う化学合成により得られ、又は市販品として入手できる。このような市販品の一例は、上記Ｆｉｃｏｌｌである。
【００７１】
一実施形態において、本方法の（ｄ）はアルカリ性条件下で実施される。
【００７２】
本発明の更なる形態は、イオン交換マトリックスの製造方法である。この方法は、上記の通り多孔性ベースマトリックスの表面を改質すること、及び、改質表面に在る１以上の水酸基に、反対電荷の物質と結合できる帯電基を誘導する追加の段階を含む。ベースマトリックスからのイオン交換体の調製は、周知の方法に従って容易になされ、これも上で論じた。
【００７３】
本発明の最後の形態は、上記の通り表面改質したベースマトリックスであり、また上記の通り製造されるイオン交換体である。
【００７４】
図面の詳細な説明
図１は、ポリマー改質試作品に関し、試験タンパク質であるリゾチームの動的結合容量に対して描いた試験タンパク質であるＢＳＡの動的結合容量を示す。試作品は、表面改質の型に従って命名されている。ｉｃ＝イオン容量（実施例１〜６参照）。動的結合容量は、ＨＲ５／１０カラム中ｐＨ４．７５、流速３００ｃｍ／ｈで試験した。
符号：▲：ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ；●：ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ；◆：Ｆｉｃｏｌｌ７０；＊：Ｆｉｃｏｌｌ４００；□：ポリ（ＡＧＥ−コ−グリシドール）；＋：ポリグリシドール。
【００７５】
図２は、試験タンパク質としてＢＳＡを用い、ポリマー改質試作品とＬ．メセンテロイドＢ５１２−Ｆ由来デキストランで被覆した市販のＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬと比較して描いた動的結合容量を示す（実施例１〜６参照）。動的結合容量は、ＨＲ５／１０カラム中ｐＨ４．７５、流速３００ｃｍ／ｈで試験した。
【００７６】
図３は、ＨＲ１０／１０カラム中流速３００ｃｍ／ｈにおける、ウシ血清アルブミンの前端分析で評価したＱ−イオン交換体を示す。容量は１０％漏出（Ｑｂ１０％）及び平衡点（Ｑｅｑ）で測定している。高分子改質試作品を、対応する非改質試作品と比較している。Ｑ−ソルビトール−メタクリレート対Ｑ−Ｆｉｃｏｌｌ−メタクリレート、及びＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６ＦＦ対Ｑ−Ｆｉｃｏｌｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６ＦＦ（実施例８及び１０）。
【００７７】
図４は、サイズ排除特性に関する、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６ＦＦとＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ６ＦＦの比較を示している。選択性は、マトリックスをポリマーで改質すると変化している。サイズ排除クロマトグラフィーは３種のタンパク質によりＨＲ１０／１０カラムで実行した（実施例７）。
【００７８】
図５は、サイズ排除特性に関する、Ｆｉｃｏｌｌ−メタクリレートとメタクリレートの比較を示している。選択性は、マトリックスをポリマーで改質すると変化している。サイズ排除クロマトグラフィーは３種のタンパク質によりＨＲ１０／１０カラムで実行した（実施例９）。
【実施例】
【００７９】
以下に、本発明を実施例により説明するが、これらは添付の特許請求の範囲に規定された発明を制限することを全く意図していない。以下及び本明細書のどこかに在る引例は、引用により本明細書に取り込まれる。
【００８０】
実施例１
ポリグリシドールの合成
代表的な実施例において、磁気撹拌子を備えた反応容器とガラス瓶を１１０℃で、一方Ｈａｍｉｌｔｏｎ注射器を６５℃度で、終夜乾燥した。管、膜及び注射針を、シリカゲルを充填したデシケータ内で終夜乾燥した。熱い装置は、使用前にデシケータ内で冷却した。開始剤カリウム−ｔｅｒｔ−ブトキシド（Ａｌｄｒｉｃｈ）を秤量して反応容器に入れ（Ｍ／Ｉ＝１００）、直ぐに容器を膜で密封してアルゴンガスを吹き入れた。グリシドールモノマー（１４．０ｇ）（Ａｌｄｒｉｃｈ）をＨａｍｉｌｔｏｎ注射器で別のガラス瓶に入れた。モノマー混合物を入れてあるガラス瓶にアルゴンを吹き入れた。
【００８１】
反応容器を氷上で冷却した。ペリスタポンプＰ−１（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）（管内径１．０ｍｍ）使用して、モノマーをガラス瓶から反応容器に移した。添加３０分後、反応容器の温度を重合温度まで上げた。約４時間後、ガラス瓶中のモノマー混合物を完全に反応容器に移した。
【００８２】
反応完了後、ポリマーを少量のメタノールに溶かし、ＨＣｌを加えて反応を停止させた。ポリグリシドールをアセトン中に析出させ精密に検査した。測定でＭｗは２０５００ｇ／ｍｏｌであり、計算でＤＢは５０％であった。
【００８３】
ポリグリシドールのＳｅｐｌｚａｒｏｓｅ  ６ＦＦへのカップリング
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６ＦＦゲル（４０ｇ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ（スウェーデン、ウプサラ））を秤量して丸底容器に入れ、蒸留水３０ｍｌを添加した。ＮａＯＨ（５ｇ）及びＮａＢＨ４（０．０７ｇ）を添加し、それから温度を３０℃に安定させて１時間放置した。その後、エピクロルヒドリン（９ｍｌ）（Ｓｈｅｌｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を添加し、３０℃で２時間反応を進行させた。酢酸を用いて中和し反応を停止させた。ガラスフィルター上で、多量の水を用いてゲルを洗浄した。滴定から、ゲル１ｍｌ中のエポキシドの数は２５μｍｏｌであった。
【００８４】
蒸留水（１６ｍｌ）にポリグリシドール（１２ｇ）を溶かし、直ぐにエポキシド機能化ゲル（３３ｇ）を添加した。混合物を３０℃で１時間撹拌した。ＮａＯＨ（５０％）（１．７ｍｌ）及びＮａＢＨ４（０．０２ｇ）を添加し、３０℃で終夜反応を進行させた。
【００８５】
酢酸を用いて反応混合物を中和し、ガラスフィルター上で、多量の脱イオン水を用いてゲルを洗浄した。ポリマーをカップリングさせる前後のゲル１ｍｌの乾燥重量を測定して、ポリグリシドールの含量を見積もった。カップリングしたポリマーの量はおよそ６ｍｇ／ｍｌゲルであった。
【００８６】
陽イオン交換性基（スルホプロピル基）の導入
反応容器中、ポリグリシドールがカップリングしたＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６ＦＦ（２０ｇ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ（スウェーデン、ウプサラ））に、蒸留水（ｌ０ｍｌ）を混合した。ゲルスラリーに、水酸化ナトリウム（６ｇ）、水素化ホウ素ナトリウム（０．０８ｇ）及び硫酸ナトリウム（３ｇ）を添加した。サーモスタット付きの水浴でフラスコを５０℃に加熱した。１時間後、塩が溶けたときに、アリルグリシジルエーテル（１２ｍｌ）（Ｉｎｓｐｅｃ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｂ．Ｖ．）を添加した。反応混合物を、終夜５０℃で撹拌した。濃酢酸で中和して反応を停止させ、先ずエタノールで、次いで蒸留水で洗浄した。この手順で、アリル含量２１７μｍｏｌ／ｍｌゲルを得た。
【００８７】
アリル官能性ゲル（１６ｇ）、蒸留水（２５ｍｌ）及びＮａ２Ｓ２Ｏ３（１４ｇ）を秤量して丸底容器中に入れた。ＮａＯＨ５０％を用いてｐＨをおよそ６．５に調整した。反応混合物中に一定流量の空気を分散させた。撹拌しながら、室温で終夜、そのまま反応させた。反応後、ガラスフィルター上で、多量の蒸留水を用いてゲルを洗浄した。滴定から、ゲル１ｍｌのイオン容量は２２８μｍｏｌ／ｍｌゲルであった。
【００８８】
実施例２
ポリ（アリルグリシジルエーテル−コ−グリシドール）の合成
代表的な実施例において、磁気撹拌子を備えた反応容器とガラス瓶を１１０℃で、一方Ｈａｍｉｌｔｏｎ注射器を６５℃で、終夜乾燥した。管、膜及び注射針を、シリカゲルを充填したデシケータ内で終夜乾燥した。熱い装置は、使用前にデシケータ内で冷却した。開始剤カリウム−ｔｅｒｔ−ブトキシド（Ａｌｄｒｉｃｈ）を秤量して反応容器に入れ（Ｍ／Ｉ＝１０５）、直ぐに容器を膜で密封してアルゴンガスを吹き入れた。モノマー、アリルグリシジルエーテル（１１．４ｇ）（Ｉｎｓｐｅｃ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｂ．Ｖ．）及びグリシドール（７．６ｇ）（Ａｌｄｒｉｃｈ）をＨａｍｉｌｔｏｎ注射器でガラス瓶に入れた。モノマー混合物を入れてあるガラス瓶にアルゴンを吹き入れた。
【００８９】
反応容器を３０℃に加熱した。Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ（スウェーデン、ウプサラ）製のペリスタポンプＰ−１（管内径１．０ｍｍ）を用いて、モノマー混合物をガラス瓶から反応容器に移した。添加３０分後、反応容器の温度を重合温度に上げた。約５時間後、ガラス瓶中のモノマー混合物を全て反応容器に移した。
【００９０】
反応完了後、ポリマーを少量のメタノール中に溶かし、ＨＣｌを添加して反応を停止させた。コポリマーを真空炉で乾燥し、それ以上精製しないで乾燥状態で使用した。ＳＥＣによりＭｗは１３６００ｇ／ｍｏｌ、ＮＭＲから計算してアリルグリシジルエーテル含量は３４％、及び計算によりＤＢは４１％であった。
【００９１】
ポリ（アリルグリシジルエーテル−コ−グリシドール）のＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）４ＦＦへのカップリング
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）４ＦＦ（２６６ｇ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ（スウェーデン、ウプサラ））を秤量して、ＮａＯＨ５０％（２１５ｍｌ）、ＮａＢＨ４（１．４ｇ）及びＮａ２ＳＯ４（３６ｇ）と共に、丸底容器に入れた。これらの塩を５０℃で１時間溶かした。アリルグリシジルエーテル（２６６ｍｌ）（Ｉｎｓｐｅｃ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｂ．Ｖ．）を添加し、５０℃で終夜、反応を進行させた。
【００９２】
混合物を濃酢酸で中和して反応を停止させた。ガラスフィルター上で、アリル−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）４ＦＦゲルを、多量の脱イオン水を用いて、次いでエタノールで、更にもう一度脱イオン水で洗浄した。
【００９３】
滴定により、ゲルのアリル含量は２６６μｍｏｌ／ｍｌゲルであった。
【００９４】
ガラスフィルター上で、アリル官能性Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ゲルを多量の蒸留水で洗浄した。ゲル（６５ｇ）及び酢酸ナトリウム三水和物（１５ｇ）を秤量して丸底容器に入れ、蒸留水６５ｍｌを混合した。室温で、機械的に撹拌しながら臭素（３ｍｌ）を導入し、１０分間反応させた。少量の水に溶かした蟻酸ナトリウムを添加して過剰の臭素を中和した。中和反応を室温で１時間進行させた。ガラスフィルター上で、ゲルを多量の蒸留水で洗浄した。
【００９５】
丸底ビーカー中の水に、ポリ（アリルグリシジルエーテル−コ−グリシドール）（１５ｇ）、ＮａＯＨ（８ｇ）及びＮａＢＨ４（０．１２ｇ）を溶かした。臭素機能化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ゲル（３０ｇ）を添加し、機械的撹拌下、５０℃で終夜カップリング反応を進行させた。酢酸を用いて反応混合物を中和し、ゲルを、大量のエタノールで、次いで蒸留水で洗浄した。
【００９６】
連結されたポリマー中のアリル基の数を滴定して、ゲル１ｍｌ中の連結されたポリマーの量を測定した。連結されたポリマーの量は、４２ｍｇ／ｍｌゲルであった。
【００９７】
陽イオン交換性基（スルホプロピル基）の導入
ポリ（アリルグリシジルエーテル−コ−グリシドール）が連結したＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）４ＦＦゲル（２５ｇ）、蒸留水（２５ｍｌ）及びＮａ２Ｓ２Ｏ３（１４ｇ）を秤量して丸底容器に入れた。ＮａＯＨ５０％を用いてｐＨをおよそ６．５に調整した。反応混合物中に、一定流量の空気を分散させた。撹拌しながら、室温で終夜、そのまま反応させた。反応後、ガラスフィルター上で、ゲルを大量の蒸留水で洗浄した。滴定により、イオン容量は１４８μｍｏｌ／ｍｌゲルであった。
【００９８】
実施例３
Ｆｉｃｏｌｌ（商標）７０のＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）４ＦＦへのカップリング
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）４ＦＦのビーズ（１００ｇ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｅｓｃｉｅｎｅｅｓ  ＡＢ（スウェーデン、ウプサラ））、蒸留水（５０ｍｌ）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）（１２ｇ）及び水素化ホウ素ナトリウム（０．２ｇ）を３０℃の反応容器中で混合した。その後、エピクロルヒドリン（２４ｍｌ）（Ｓｈｅｌｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を添加した。２時間後、反応混合物を中和するまで酢酸を添加した。得られたゲル（ｅｐｏｘＦＦ）を水洗した。この手順で、エポキシ含量は１６．１μｍｏｌ／ｍｌゲルであった。
【００９９】
Ｆｉｃｏｌｌ（商標）７０（５０ｇ）及び蒸留水（８０ｍｌ）をビーカー中で混合し、ポリマーが完全に溶けるまでゆっくり撹拌した。ｅｐｏｘＦＦゲル（１００ｇ）を秤量して丸底フラスコに入れ、ポリマー溶液を添加した。およそ３０分後、所望量の５０％−水酸化ナトリウム（５．２５ｍｌ）及び水素化ホウ素ナトリウム（０．０５ｇ）を添加した。スラリーを、５０℃で終夜撹拌した。濃酢酸で中和して反応を停止させ、ガラスフィルター上で、ゲルを蒸留水で洗浄した。
【０１００】
陽イオン交換性基（スルホプロピル基）の導入
反応容器中で、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）７０が連結したＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）４ＦＦ（１００ｇ）及び蒸留水（５０ｍｌ）を混合した。水酸化ナトリウム（３０ｇ）、水素化ホウ素ナトリウム（０．４ｇ）及び硫酸ナトリウム（１４ｇ）を反応容器に添加した。サーモスタット付きの水浴で、フラスコを５０℃に加熱した。１時間後、塩が溶けたときに、アリルグリシジルエーテル（２０ｍｌ）（Ｉｎｓｐｅｃ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｂ．Ｖ．）を添加した。反応混合物を５０℃で終夜撹拌した。濃酢酸で中和して反応を停止させ、ガラスフィルター上で、先ずエタノール、次いで蒸留水で洗浄した。この手順で、アリル含量は１３４μｍｏｌ／ｍｌゲルであった。
【０１０１】
反応容器中で、形成されたアリル官能性製品に蒸留水（２６ｍｌ）及びメタ重亜硫酸ナトリウム（１５ｇ）を混合した。５０重量％水酸化ナトリウム溶液で、反応混合物のｐＨを６．５に調整した。ガラス管を通して過剰の空気を供給し、反応混合物中に発泡させた。混合物を、２３℃で、機械的攪拌機で終夜撹拌した。ガラスフィルター上で、形成品を水洗した。この手順で、イオン容量は１１０μｍｏｌ／ｍｌゲルであった。
【０１０２】
実施例４
Ｆｉｃｏｌｌ（商標）７０のＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）４ＦＦへのカップリング
Ｆｉｃｏｌｌ（商標）７０のＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）４ＦＦへのカップリングを、実施例３と同様に実施した。
【０１０３】
陽イオン交換性基（スルホプロピル基）の導入
Ｆｉｃｏｌｌ（商標）７０改質Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）４ＦＦのアリル機能化を、例Ｘに従い、ただし反応混合物へのアリルグリシジルエーテル（３０ｍｌ）（Ｉｎｓｐｅｃ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｂ．Ｖ．）添加量を増やして、実施した。この手順で、アリル含量は１８２μｍｏｌ／ｍｌゲルであった。
【０１０４】
アリル基のスルホプロピル基への誘導は、実施例３と同様に実施した。この手順で、イオン容量は１４９□ｍｏｌ／ｍｌゲルであった。
【０１０５】
実施例５
Ｆｉｃｏｌｌ（商標）７０のＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）４ＦＦへのカップリング
Ｆｉｃｏｌｌ（商標）７０のＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）４ＦＦへのカップリングを、実施例３と同様に実施した。
【０１０６】
陽イオン交換性基（スルホプロピル基）の導入
Ｆｉｃｏｌｌ（商標）７０−改質Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）４ＦＦのアリル機能化を、実施例３と同様に、ただし反応混合物へのアリルグリシジルエーテル（６０ｍｌ）（Ｉｎｓｐｅｃ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｂ．Ｖ．）添加量を増やして、実施した。この手順で、アリル含量は３１０μｍｏｌ／ｍｌゲルであった。
【０１０７】
アリル基のスルホプロピル基への誘導は、実施例３と同様に実施した。この手順で、イオン容量は２２０μｍｏｌ／ｍｌゲルであった。
【０１０８】
実施例６
Ｆｉｃｏｌｌ（商標）４００のＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）４ＦＦへのカップリング
Ｆｉｃｏｌｌ（商標）４００のＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）４ＦＦへのカップリングを、実施例３と同様に、ただしＦｉｃｏｌｌ（商標）７０の代わりにＦｉｃｏｌｌ（商標）４００を用いて、実施した。
【０１０９】
陽イオン交換性基（スルホプロピル基）の導入
Ｆｉｃｏｌｌ（商標）４００改質Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）４ＦＦのアリル機能化を、実施例３と同様に実施した。この手順で、アリル含量は１４５μｍｏｌ／ｍｌゲルであった。
【０１１０】
アリル基のスルホプロピル基への誘導は、実施例３と同様に実施した。この手順で、イオン容量は１３９μｍｏｌ／ｍｌゲルであった。
【０１１１】
実施例７
サイズ排除クロマトグラフィー用媒体の合成
Ｆｉｃｏｌｌ（商標）７０のＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６ＦＦへのカップリング
反応容器中で、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ａ．Ｂ（スウェーデン、ウプサラ））（２００ｇの水抜きゲル）に蒸留水（１２０ｍｌ）、ＮａＯＨ（２６ｇ）及びＮａＨＢ４（０．４ｇ）を添加した。温度を３０℃一定にした。エピクロルヒドリン（４８ｍｌ）を添加し、３０℃で２時間、混合物を激しく撹拌した。濃酢酸で中和して反応を停止させ、その後水洗した。これにより、エポキシ含量は約３５μｍｏｌ／ｍｌゲルであった。
【０１１２】
ビーカー中でＦｉｃｏｌｌ（商標）７０（１００ｇ）と蒸留水（１５０ｍｌ）を混合し、ポリマーが完全に溶けるまで、ゆっくり撹拌した。溶液を５０℃に加熱した。エポキシ機能化したＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６ＦＦゲル（２００ｇ）を秤量して丸底フラスコに入れ、ポリマー溶液を添加した。およそ３０分後、所望量の水酸化ナトリウム（３３ｇ）及び水素化ホウ素ナトリウム（１．０ｇ）を添加した。スラリーを、５０℃で終夜撹拌した。濃酢酸で中和して反応を停止させ、次いで、ガラスフィルター上で、ゲルを蒸留水で洗浄した（Ｆｉｃｏｌｌ（商標）７０−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６ＦＦ）。
【０１１３】
実施例８
陰イオン交換媒体の合成
Ｆｉｃｏｌｌ（商標）７０のＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６ＦＦへのカップリング
Ｆｉｃｏｌｌ（商標）７０のＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６ＦＦへのカップリングを、実施例７と同様に実施した（Ｆｉｃｏｌｌ７０−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６ＦＦ）。
【０１１４】
陰イオン交換性基（４級アミン）の導入
５００ｍｌの瓶中、３０℃、３０分間で、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）７０−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６ＦＦ（５０ｇ）にグリシジルトリメチルアンモニウムクロライド（ＧＭＡＣ）（２５０ｍｌ）を混合した。ＮａＯＨ（５０％）（７．５ｍｌ）を添加し、混合物を３０℃で６時間撹拌した。濃ＨＯＡｃで中和して反応を停止させ、次いで、ガラスフィルター上で水洗した（Ｑ−Ｆｉｃｏｌｌ７０−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６ＦＦ）。この手順で、イオン容量０．２６ｍｍｏｌ／ｍｌのゲルを得た。
【０１１５】
実施例９
サイズ排除クロマトグラフィー用媒体の合成
Ｆｉｃｏｌｌ（商標）７０のメタクリレートビーズへのカップリング
当分野で周知の標準方法に従い、グリシジルメタクリレートとグリセロール−ｌ，３−ジメタクリレートから多孔質ビーズを調製した。エポキシ含量は約３０〜４０μｍｏｌ／ｍｌである。
【０１１６】
ビーカー中で、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）７０（２０ｇ）及び蒸留水（３０ｍｌ）を混合し、ポリマーが完全に溶けるまで、ゆっくり撹拌した。溶液を５０℃に加熱した。メタクリレートゲル（４０ｇ）を秤量して丸底フラスコに入れ、ポリマー溶液を添加した。およそ３０分後、所望量の水酸化ナトリウム（６．６ｇ）及び水素化ホウ素ナトリウム（０．２ｇ）を添加した。スラリーを、５０℃で終夜撹拌した。濃酢酸で中和して反応を停止させ、次いで、ガラスフィルター上で、ゲルを蒸留水で洗浄した（Ｆｉｃｏｌｌ７０−メタクリレート）。
【０１１７】
実施例１０
陰イオン交換媒体の合成
Ｆｉｃｏｌｌ（商標）７０のメタクリレートビーズへのカップリング
Ｆｉｃｏｌｌ（商標）７０のメタクリレートビーズへのカップリングを、実施例９と同様に実施した（Ｆｉｃｏｌｌ７０−メタクリレート）。
【０１１８】
ソルビトールのメタクリレートビーズへのカップリング
当分野で周知の標準方法に従い、グリシジルメタクリレートとグリセロール−ｌ，３−ジメタクリレートから多孔質ビーズを調製した。エポキシ含量は約３０〜４０μｍｏｌ／ｍｌである。
【０１１９】
ビーカー中で、ソルビトール（３００ｇ）及び０．２Ｍ  ＮａＯＨ（３００ｍｌ）を混合し、ソルビトールが完全に溶解するまで、ゆっくり撹拌した。メタクリレートゲル（１５０ｇ）を秤量して丸底フラスコに入れ、ソルビトール／ＮａＯＨ溶液を添加した。温度を８０℃に上げ、スラリーを終夜、撹拌した。濃酢酸で中和して反応を停止させ、次いで、ガラスフィルター上で、ゲルを蒸留水で洗浄した（ソルビトール−メタクリレート）。
【０１２０】
陰イオン交換性基（４級アミン）の導入
２５０ｍｌの瓶中、３０℃、３０分間で、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）７０−メタクリレート（４０ｇ）にグリシジルトリメチルアンモニウムクロライド（ＧＭＡＣ）（２００ｍｌ）を混合した。ＮａＯＨ（５０％）（６ｍｌ）を添加し、混合物を３０℃で６時間撹拌した。濃ＨＯＡｃで中和して反応を停止させ、次いで、ガラスフィルター上で水洗した（Ｑ−Ｆｉｃｏｌｌ７０−メタクリレート）。この手順で、イオン容量が０．３２ｍｍｏｌ／ｍｌのゲルを得た。
【０１２１】
５００ｍｌの瓶中、３０℃、３０分間で、ソルビトール−メタクリレート（５０ｇ）に蒸留水（５０ｍ１）及びグリシジルトリメチルアンモニウムクロライド（ＧＭＡＣ）（２５０ｍｌ）を混合した。ＮａＯＨ（５０％）（５．４ｇ）及びＮａＢＨ４（０．１ｇ）を添加し、混合物を３０℃で１８〜２０時間撹拌した。濃ＨＯＡｃで中和して反応を停止させ、次いで、ガラスフィルター上で水洗した（Ｑ−ソルビトール−メタクリレート）。この手順で、イオン容量０．１４ｍｍｏｌ／ｍｌのゲルを得た。
【０１２２】
実施例１１
陰イオン交換媒体の合成
ポリプロピレンイミンテトラミンのＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６ＦＦへのカップリング
反応容器中で、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ（スウェーデン、ウプサラ））（５０ｇの水抜きゲル）に蒸留水（３０ｍｌ）、ＮａＯＨ（６．５ｇ）及びＮａＨＢ４（０．１ｇ）を混合した。温度を３０℃一定にした。エピクロルヒドリン（１２ｍｌ）を添加し、３０℃で２時間、混合物を激しく撹拌した。濃酢酸で中和して反応を停止させ、その後水洗した。この手順で、エポキシ含量は約４４μｍｏｌ／ｍｌゲルであった。
【０１２３】
ビーカー中で、ポリプロピレンイミンテトラミンＤＡＢ（ＰＡ）４（Ａｌｄｒｉｃｈ  ４６、０６９−９）（１０ｇ）及び蒸留水（３０ｍｌ）を混合し、ポリマーが完全に溶けるまで、ゆっくり撹拌した。溶液を３０℃に加熱した。エポキシ機能化したＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６ＦＦゲル（４０ｇ）を秤量して丸底フラスコに入れ、ポリマー溶液を添加した。およそ３０分後、所望量の水酸化ナトリウム（６．６ｇ）及び水素化ホウ素ナトリウム（０．２ｇ）を添加した。スラリーを、３０℃で終夜撹拌した。濃酢酸で中和して反応を停止させ、次いで、ガラスフィルター上で、ゲルを蒸留水で洗浄した（ＤＡＢ（ＰＡ）４−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６ＦＦ）。
【０１２４】
この手順で、イオン容量が０．１５ｍｍｏｌ／ｍｌ、ウシ血清アルブミンの漏出点容量（Ｑｂ１０％）が６５ｍｇ／ｍｌのゲルを得た（実施例１４による方法）。
【０１２５】
実施例１２
ソルビトールとエピクロルヒドリンに基づく超枝分れポリマーの合成
ソルビトール（１０ｇ）を蒸留水（１０ｍｌ）に溶かし、４５％ＮａＯＨ（１ｍｌ）を添加した。撹拌下、混合物を５０℃に加熱し、エピクロルヒドリン（１０ｍｌ）（Ｓｈｅｌｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）及び４５％ＮａＯＨ（１０ｍｌ）を、少しづつ２時間かけて添加した。最後の添加後、５０℃で、更に１時間反応混合物を撹拌した。これをビーカーに注ぎ、撹拌下、エタノール（１５０ｍｌ）を添加して、形成したポリマーを析出させた。白色粘着性の析出物を分離し、少量の水を加えて再溶解した。次いで、エタノールでポリマーを再度析出させ、エタノールで洗浄し、真空乾燥した。乾燥物の回収量は８．８ｇであった。
【０１２６】
実施例１３
陽イオン交換クロマトグラフィー
３００ｃｍ／ｈ、充填層における、ＢＳＡに関する漏出点容量Ｑｂ
装置：
カラム：ＨＲ５／１０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ、Ｓｗｅｄｅｎ）
バッファーＡ：１００ｍＭ  酢酸ナトリウム、ｐＨ４．７５
バッファーＢ：３０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．３
タンパク質：ウシ血清アルブミン、ＢＳＡ、（Ｓｉｇｍａ）
流速：３００ｃｍ／ｈ
手順：
漏出点容量Ｑｂは、ＨＲ５／１０カラム上、３００ｃｍ／ｈの定速で測定した。タンパク質をバッファーＡに溶かし、濃度４ｍｇ／ｍｌのタンパク質溶液を調製した。
【０１２７】
カラムを、カラム容積（ＣＶ）の２倍の１００ｍＭ  酢酸ナトリウム、ｐＨ４．７５で平衡にした。Ａ２８０が溶液の最大吸光度の５０％に達するまで、タンパク質溶液の負荷を続けた。溶出は、溶出緩衝液で、吸光度が最大吸光度の２０％になるまで、行った。次いで、ＣＩＰで６０分間（３０ＣＶ）、カラムをきれいにした。最後に、電導度が５ｍＳ／ｃｍ未満になるまで、１００ｍＭ  酢酸ナトリウム、ｐＨ  ４．７５で再平衡化した。ＱＢ１０％値を決定するため、漏出点曲線の評価を行った。
【０１２８】
３００ｃｍ／ｈ、充填層における、リゾチームに関する漏出点容量Ｑｂ
装置：
カラム：ＨＲ５／１０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ、Ｓｗｅｄｅｎ）
バッファーＡ：１００ｍＭ  酢酸ナトリウム、ｐＨ４．７５
バッファーＢ：３０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．３
タンパク質：リゾチーム（ニワトリ卵白）（ＵＳＢ）
流速：３００ｃｍ／ｈ
手順：
ＢＳＡに関する手順に同じ。
【０１２９】
実施例１４
陰イオン交換クロマトグラフィー
ＡＫＴＡ（商標）システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ（スウェーデン、ウプサラ））上で実施した前端分析により、Ｑ−イオン交換体の特性を明らかにした。ウシ血清アルブミンを用い、流速３００ｃｍ／ｈで試作品を評価した。ゲルを、ＨＲ１０／１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ（スウェーデン、ウプサラ））に充填した。平衡容量（Ｑｅｑ）及び１０％漏出点容量（Ｑｂ１０％）を測定した。ポリマー改質ゲルを非改質マトリックスと比較した。
前端分析用タンパク質及びバッファー；ＢＳＡ
タンパク質：ＢＳＡ
ローディングバッファー：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０
溶出バッファー：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１Ｍ  ＮａＣｌ
ＣＩＰ−溶液：１．０Ｍ  ＮａＣｌ＋０．５Ｍ  ＮａＯＨ。
【０１３０】
実施例１５
サイズ排除クロマトグラフィー
改質が、どのように空隙率、それによりサイズ排除特性に影響を与えるかを見るため、ゲル濾過でポリマー改質化ベースマトリックスの特性を明らかにした。非改質化マトリックスと比較した。
【０１３１】
使用したシステムはＦＰＬＣ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ（スウェーデン、ウプサラ））、使用したカラムの型はＨＲ１０／１０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ（スウェーデン、ウプサラ））であった。およそ７ｇの水抜きゲルで、水でスラリーを作り、底のアダプタにストッパーがあるカラムに注入した。ゲルを自己堆積させ、最後に、１０ｍｌ／ｍｉｎの流速で充填した。
【０１３２】
サイズ排除クロマトグラフィーに関する方法：
流速：０．２ｍｌ／ｍｉｎ
印字装置速度：０．２ｃｍ／ｍｉｎ
バッファー：０．０５Ｍ  リン酸ナトリウム＋０．１５Ｍ  ＮａＣｌ；ｐＨ７．０
試料：フェリチン        １．２５ｍｇ／ｍｌ
ＢＳＡ            ５ｍｇ／ｍｌ
リボヌクレアーゼ  ５ｍｇ／ｍｌ
空隙：ブルーデキストラン
試料体積：５０μｌ
タンパク質についてＫａｖを計算し、分子量の対数に対してプロットした。
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１】試験タンパク質であるリゾチームの動的結合容量に対して描いた試験タンパク質であるＢＳＡの動的結合容量を示す。
【図２】試験タンパク質としてＢＳＡを用い、ポリマー改質試作品とＬ．メセンテロイドＢ５１２−Ｆ由来デキストランで被覆した市販のＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬと比較して描いた動的結合容量を示す。
【図３】ＨＲ１０／１０カラム中流速３００ｃｍ／ｈにおける、ウシ血清アルブミンの前端分析で評価したＱ−イオン交換体を示す。
【図４】サイズ排除特性に関する、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６ＦＦとＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ６ＦＦの比較を示している。
【図５】サイズ排除特性に関する、Ｆｉｃｏｌｌ−メタクリレートとメタクリレートの比較を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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2005531767.tif 000008
2005531767.tif 000009