(57)【要約】成体骨髄において血管芽細胞は新しい血管の形成に関与している。血管芽細胞の血管細胞への分化の調節によって、特定組織における血管新生を増加させる又は減少させることができる。ＳＤＦ−１活性を妨げる抗体の硝子体注射は、血管芽細胞を介した誘発された網膜新血管新生を阻害する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体の対象組織における血管新生を調節するための方法であって、被験体において血管芽細胞の血管細胞への分化のレベルを調節する非自発的な段階を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
被験体において血管芽細胞の血管細胞への分化のレベルを調節する段階は、被験体において血管芽細胞の数を増加又は減少させる段階を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
被験体において血管芽細胞の血管細胞への分化のレベルを調節する段階は、被験体において血管芽細胞の数を増加させる段階を含むことを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
被験体において血管芽細胞の数を増加させる段階は、被験体への血管芽細胞の投与によって行われることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
被験体へ投与される血管芽細胞は、被験体から取り出された細胞から得たものであることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
被験体から取り出された細胞は、被験体への投与前に試験管内で増殖させたものであることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
被験体へ投与される血管芽細胞は、被験体以外のドナーからの細胞から得たものであることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項８】
ドナーからの細胞は、被験体への投与前に試験管内で増殖させたものであることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項９】
被験体において血管芽細胞の血管細胞への分化のレベルを調節する段階は、被験体において血管芽細胞の数を減少させる段階を含むことを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項１０】
被験体において血管芽細胞の数を減少させる段階は、血管芽細胞を消耗させる物質を被験体へ投与する段階を含むことを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記物質は、血管芽細胞の表面にある分子へ特異的に結合する抗体であることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
被験体において血管芽細胞の血管細胞への分化のレベルを調  節する段階は、骨髄から非骨髄区画への血管芽細胞の補充を増加又は減少させ  る段階を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１３】
被験体において血管芽細胞の血管細胞への分化のレベルを調節する段階は、骨髄から非骨髄区画への血管芽細胞の補充を増加させる段階を含むことを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
被験体において血管芽細胞の血管細胞への分化のレベルを調節する段階は、骨髄から非骨髄区画への血管芽細胞の補充を減少させる段階を含むことを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
被験体において血管形成を減少させる方法であって、ＳＤＦ−１の活性を妨げる物質を被験体へ投与する段階を含む方法。
【請求項１６】
前記物質はＳＤＦ−１に特異的に結合する抗体であることを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記物質は被験体の眼に投与されることを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
前記物質は被験体の眼に投与されることを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
成体骨髄から単離されたことを特徴とする血管芽細胞。
【請求項２０】
前記成体骨髄は哺乳動物の骨髄であることを特徴とする請求項１９記載の血管芽細胞。
【請求項２１】
成体動物の骨髄からの血管芽細胞を単離するための方法であって、
（ａ）少なくとも一つの血管芽細胞と少なくとも一つの非血管芽細胞を含んでいる骨髄を動物から単離する段階と、
（ｂ）少なくとも一つの血管芽細胞と少なくとも一つの非血管芽細胞を分離する段階と、
（ｃ）少なくとも一つの血管芽細胞を収集する段階と
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２２】
少なくとも一つの血管芽細胞と少なくとも一つの非血管芽細胞を分離する前記段階（ｂ）は、骨髄を少なくとも一つの血管芽細胞に特異的に結合するが少なくとも一つの非血管芽細胞に結合しない物質と相互作用させる段階を含むことを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも一つの血管芽細胞と少なくとも一つの非血管芽細胞を分離する前記段階（ｂ）は、骨髄を少なくとも一つの非血管芽細胞に特異的に結合するが少なくとも一つの血管芽細胞に結合しない物質と相互作用させる段階を含むことを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
前記物質が抗体であることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
前記物質が抗体であることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の属する分野）
本発明は、薬学、血管新生、幹細胞生物学の分野に関する。さらに詳しくは、血管新生を調節するための組成物と方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
成体の骨髄（ＢＭ）由来である造血幹細胞（ＨＳＣ）は、個々の生体の血液とリンパ球の細胞が機能的に再増殖する間に、自己を再生する能力で特徴付けられる。Muller-Sieburg, C. (ed.) Hematopoietic stem cells: animal models and human transplantation (Spring-Verlag, New York, 1992)を参照。これらの能力のため、造血幹細胞は、血液悪性白血病やリンパ腫を含む多様な骨髄欠乏状態のための治療法である骨髄移植において、臨床上有益である。造血幹細胞は、既知の方法で高い濃度に濃縮し定量することができる。例えばHarrison et al. Exp Hematol 21, 206-19 (1993)を参照。他の組織由来の幹細胞と同様、造血幹細胞は、再生前駆体が損傷や圧迫を受けた無血管組織に潜在的な貢献を与える可塑性に関する高い能力を保持すると考えられる（Goodell et al., Ann N Y Acad Sci. 938, 208-18; discussion 218-20 (2001)及びKrause et al., Cell 105, 369-77 (2001)）。
【０００３】
実際、致死的に放射線を当てられたネズミを単一の骨髄由来造血幹細胞で十分に恒久的に再構成した後、脳、心臓、骨格筋、肝臓、内皮細胞のような多岐に渡った組織で、ドナー細胞が同定された。上記のKrause et. al。その研究の実験計画法によればドナーの非造血組織への寄与が低いレベル（５％未満）であったが、造血幹細胞由来の前駆体が多岐な組織の機能的な再生をできることをこの結果は示唆している。他の移植モデルでは、造血前駆体は、その肝臓中の肝細胞を再増殖させ、化学的に誘発された損傷を与えられた肝臓の機能を回復させることが示されており（Petersen et al., Science 284, 1168-70. (1999)及び Lagasse et al., Nat Med 6, 1229-34 (2000)）、心筋を再生させて梗塞後の心臓の機能を改善することが示されている(Orlic et al., Nature 410, 701-5 (2001))。
【０００４】
糖尿病性網膜症と未熟児網膜症は全世界における視界損失の主要な原因の一つである。既存脈管構造の変化と、病気であるにも関わらず補填される新たな毛細血管の成長とをもたらす低酸素症に反応して、網膜の血管形成は起こると考えられている（Grant et al., Diabetes 35, 416-20 (1986)及びLimb et al., Br J Ophthalmol 80, 168-73 (1996)）。出生後の新しい血管形成は、血管新生とされていて、あらかじめ存在している血管から新しい毛細血管が発生するのを特徴とする過程である（Folkman and Shing, J Biol Chem 267, 10931-4 (1992)）。  いくつかの研究により、試験管内での毛細血管形成に寄与できる内皮前駆細胞（ＥＰＣ）が、骨髄細胞より得られることが明らかになった（Asahara et al. , Science 275,964-7 (1997)、Gehling et al., Blood 95,3106-12 (2000)、Bhattacharya et al. , Blood 95,581-5 (2000)及びLin et al. , J Clin Invest 105,71-7 (2000)）。 血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）（例えばAsahara et al. , Embo J 18,3964-72 (1999)及びKalka et al. , Circ. Res. 86,1198-202 (2000)）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（例えばTakahashi et al. , Nat Med 5,434-8 (1999)）のような前血管新生の増殖因子は成体のＥＰＣの循環のレベルを増加させ、新しい血管形成を促す。最近、ヒドロキシメチルグルタリル（ＨＭＧ）−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤は、血管新生に関するプロテインキナーゼＡｋｔが関わるメカニズムによって、潜在的にＥＰＣの分化を増進することが証明された（Dimmeler, et al., J Clin Invest 108, 391-7 (2001)）。また、ある研究は、成体（Asahara et al., Embo J 18, 3964-72 (1999)、上記のKalka et al.,、Crosby et al., Circ Res 87, 728-30 (2000)及びMurohara et al., J Clin Invest 105, 1527-36 (2000)）や虚血症後の心臓の再灌流（Kocher et al., Nat Med 7, 430-6 (2001)及びKawamoto et al., Circulation 103, 634-7 (2001))における血管形成へのＥＰＣの寄与を支持する。しかし、これらの研究は、短期間の移植と急性損傷のモデルに基づいているので、ＥＰＣを生産する細胞が、長期間に渡って再増殖する造血幹細胞又は間葉幹細胞のような他の前駆体かどうかは明らかになっていない。
【発明の開示】
【０００５】
発生中の胚では、血液と血管の形成に寄与できる多能性の前駆体が生産されており、この過程は、血管芽新生（hemangiogenesis）と呼ばれる（Choi, K. , Biochem Cell Biol 76,947-56 (1998); Takakura, et al., Cell 102, 199-209 (2000)）。これらの多能性幹細胞は、血管芽細胞と呼ばれる。また、血管芽細胞は、血管内皮増殖因子に反応した試験管内での分化の間、胚幹細胞から得ることができる（上記のChoi）。しかし、従来、成体の骨髄に血管芽細胞が存在しているという明確な証拠、とりわけ新しい血管形成において骨髄由来の細胞が機能的な役割を果たすという明確な証拠は欠けていた。
【０００６】
（要約）
本発明は、血管芽細胞を成体の骨髄から単離することができるという発見に関する。単離された血管芽細胞は、成体網膜に血管を再形成する血液と血管細胞同様に、すべての造血細胞系統にクローンとして分化することができる。新しい血管形成を促す能力によって、成体血管芽細胞は、糖尿病性網膜症と未熟児網膜症のような虚血誘導性網膜血管疾患に寄与する。このため、この細胞は、血管新生に関連した疾患の治療における新しい治療のターゲットを提示する。例えば、本発明の組成物と方法は、血液の供給を制限することにより癌性腫瘍の治療と成長の阻止に有用である可能性がある。さらに新しい血管成長を促すことができるので、血管芽細胞の治療に関する能力は、血管内皮細胞が欠損し、又は損傷しているあらゆる疾患（例えば、心虚血のような虚血）に応用することができる。
【０００７】
また、本発明は、血管芽細胞による新しい血管形成を、例えば抗ＳＤＦ−１抗体を使ってＳＤＦ−１（例えばＳＤＦ−１α）の活性を妨げることにより阻害できるという発見に関する。例として、無毒化されている抗ＳＤＦ−１抗体の硝子体注射は、虚血性網膜の血管芽細胞由来の新しい血管形成を完全に妨げた。このため、ＳＤＦ−１の活性の調節は、糖尿病性網膜症、又は異常な血管形成に関する他の疾患の治療又は予防に用いられる可能性がある。
【０００８】
つまり、本発明は、被験体の対象組織において血管新生を調節する方法を特徴とする。この方法は、被験体での血管芽細胞の血管細胞への分化のレベルを調節する、非自発的な段階を含む。ある変形例において、被験体での血管芽細胞の血管細胞への分化のレベルを調節する段階は、被験体で血管芽細胞の数を増加又は減少させることを含む。被験体での血管芽細胞の数を増加させるためには、血管芽細胞の被験体への投与が行なわれる。被験体に投与された血管芽細胞は、被験体から取り出された細胞から得てもよい。ある変形例では、被験体から取り出された細胞は、被験体へ投与前に試験管内で増殖させることができる。また、別の変形例では、被験体に投与された血管芽細胞は、被験体以外からのドナーの細胞から得られてもよい。ドナーの細胞は、被験体へ投与前に試験管内で増殖させてもよい。
【０００９】
また被験体での血管芽細胞の血管細胞への分化のレベルを調節する段階は、被験体での血管芽細胞の数を減少させることを含む。被験体での血管芽細胞の数を減少させるためには、血管芽細胞を消耗させるための組成物が被験体に投与されてもよい。この発明の一変形例では、その物質は、血管芽細胞の表面にある分子に特異的に結合する抗体である。
【００１０】
別の実施形態では、被験体での血管芽細胞の血管細胞への分化のレベルを調節する段階は、骨髄から非骨髄画分への血管芽細胞の補充を増加又は減少させることを含む。
【００１１】
別の側面では、本発明は、被験体での血管形成を減少させるための方法を特徴とする。ある場合、この方法はＳＤＦ−１の活性を妨げる物質を被験体へ投与することを含む。その物質は、ＳＤＦ−１に特異的に結合する抗体であり得る。この方法の一変形例では、物質は被験体の眼に投与される。
【００１２】
また本発明は、成体の骨髄から単離された血管芽細胞を特徴とする。成体の骨髄は、哺乳動物の骨髄であってもよい。
【００１３】
さらに他の観点では、本発明は、成体動物の骨髄から血管芽細胞を単離する方法を特徴とする。この方法は動物から骨髄を単離することを含み、前記骨髄は血管芽細胞と非血管芽細胞を含み、血管芽細胞と非血管芽細胞を分離し、血管芽細胞を集めることを特徴とする方法である。血管芽細胞と少なくとも一つの非血管芽細胞を分離する段階は、骨髄と、血管芽細胞に特異的に結合するが非血管芽細胞には結合しない物質を相互作用させることを含んでもよい。この発明の別の変形例では、血管芽細胞と非血管芽細胞を分離する段階は、骨髄と、非血管芽細胞に特異的に結合するが少なくとも一つの血管芽細胞と結合しない物質を相互作用させる過程を含んでもよい。そのような物質として抗体があり得る。
【００１４】
他に定義されていない場合は、ここで用いられているすべての技術用語は、この発明の属する技術分野における通常の技術を有する人に普通に理解されている意味と同じ意味である。
【００１５】
「血管芽細胞」（hemangioblast）とは、長期間に渡って自己再生をし、クローン血管の形成に寄与できる多能性の幹／前駆細胞を指す。
【００１６】
「血管新生」(angiogenesis)とは、新しい血管を発達させることを含んだ組織の脈管形成の過程を意味する。
【００１７】
「新血管新生」(neovascularization)とは、新しい血管の形成を意味する。
【００１８】
「分化」(differentiation)とは、特定の機能により特化するように細胞を発展させることにより単純な形態からより複雑な形態へ変化することをいう。
【００１９】
ここで使われている「成体骨髄」(adult bone marrow)とは、出生後の生物からの骨髄を意味する。
【００２０】
ここで述べられているのと同じ又は同様な方法と材料を本発明の実施や試験のために用いることができるが、適切な方法と材料を以下に述べる。ここで述べた全ての出版物、特許出願、特許又は他の参考文献は、全体として参考文献に含まれている。抵触の場合、定義を含む本明細書が規制する。以下の特定の実施例は、説明をするためだけのものであって、限定することを意図していない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
（詳細な説明）
本発明は、被験体における対象組織の血管新生を調節するための方法や組成物だけでなく、骨髄から単離された血管芽細胞も提供する。前記組成物は、成体骨髄から単離された血管芽細胞を含む。ある方法において、対象組織の血管新生は、被験体における血管芽細胞から血管細胞への分化のレベルを調節する非自発的な段階によって調節される。例えば虚血性組織（例えば心筋）での血管新生を促すために、被験体の血管芽細胞の数を増やすことにより、血管芽細胞から血管細胞への分化を増進することができる。他の例として、対象組織（例えば低酸素症後の網膜）の血管新生を減少させるために、被験体の血管芽細胞の数を減らすことにより、血管芽細胞から血管細胞への分化を減退させる又は妨げてもよい。例えば、以下に述べているように、抗ＳＤＦ−１抗体の硝子体注射は網膜での血管新生を阻害する。つまり、本発明の方法と組成物は、異常な血管形成と関連した多数の疾患を治療するために用いてもよい。
【００２２】
（生物学的方法）
慣用の分子生物学的手法を含んでいる方法がここで述べられている。そのような方法は技術的に一般に知られて、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed. , vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. , 2001及びCurrent Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al. , Greene Publishing and Wiley- Interscience, New York, 1992（定期的な最新版）.のような方法に関する専門書に詳しく述べられている。免疫学的方法（例えば抗原特異的な抗体の準備、免疫沈降、免疫ブロット法）は例えばCurrent Protocols in Immunology, ed. Coligan et al. , John Wiley & Sons, New York, 1991及びMethods of Immunological Analysis, ed. Masseyeff et al. , John Wiley & Sons, New York, 1992とに述べられている。また、慣用の遺伝子転移と遺伝子治療の方法を、本発明の実施のために適用することができる。参照：例えばGene Therapy: Principles and Applications, ed. T. Blackenstein, Springer Verlag, 1999、Gene Therapy Protocols (Methods in Molecular Medicine), ed. P. D. Robbins, Humana Press, 1997及びRetro-vectors for Human Gene Therapy, ed. C.P. Hodgson, Springer Verlag, 1996。幹細胞移植の方法はここで述べられている。そのような手法は技術的に一般に知られていて、Hematopoietic stem cell: animal models and human transplantations, ed. Muller-Sieburg, C., Springer Verlag, NY 1992に詳しく述べられている。
【００２３】
（骨髄から単離された血管芽細胞）
本発明は、成体骨髄から単離された血管芽細胞を提供する。本発明中の血管芽細胞は、より分化し発展上制限された、長期間に渡る自己再生能力を失った前駆体（例：末梢血で発見された循環している内皮前駆細胞）の源である造血幹細胞である。血管芽細胞が単離される骨髄の源を、あらゆる適当な動物（つまり、血管芽細胞を含む骨髄を有するあらゆる動物）から得てもよい。本発明のさまざまな方法の使用のために、骨髄の源を成体でない生物（例：胚）から得てもよい。あらゆる適当な方法を用いて、骨髄を動物から単離してもよい。例えば、骨髄は骨から直接、針吸引により単離してもよい。他の骨髄細胞と比べて血管芽細胞に区別をつけて発現するマーカーを利用して、血管芽細胞を骨髄から単離してもよい。例えば、ヒト骨髄では血管芽細胞は、ＣＤ３４マーカーに陽性であり、ＣＤ３８マーカーとＬｉｎマーカーに陰性である。加えて、ＡＣ１３３マーカー又は造血幹細胞の他のマーカーを使って、ヒト血管芽細胞を単離してもよい。マーカーの発現に基づいて細胞を単離する多くの異なる手法が知られている。例えば、イムノパン（ｉｍｍｕｎｏｐａｎ）、磁気ビーズ分離、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）のような抗体に基づいた方法が挙げられる。具体例として、齧歯動物ドナーから回収された骨髄を、単細胞浮遊液とし、ＩＭＤＭと２０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）から成る組織培養皿へ４時間置く。非吸着細胞が集め、適切な細胞分離システム（例：Ｍｉｌｔｙｎｉ  ＭＡＣＳ  ｓｙｓｔｅｍ）を使って、何回かの（例：３回）系統抗体消耗（Ｂ２２０、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、Ｇｒ−１、ＴＥＲ１１９）を行う。これは、フィコエリスリン（ＰＥ）標識系統抗体の混合物が結合している少量のものがＦＡＣＳによって約９５％より高い系統陰性であることを示すまで行なわれる。次に、Ｓｃａ−１陽性、Ｌｉｎ陰性が約９５％より高い純度を示すものが達成されるまで、Ｓｃａ−１陽性であるように確実に２，３回、Ｌｉｎ陰性細胞を選び出す。それから、造血由来のものであるかを確かめるために、Ｓｃａ−１陽性、Ｌｉｎ陰性細胞をＣＤ４５により染色する。同様の造血幹細胞の濃縮は、磁気ビーズ又はフローサイトメトリー分離法のどちらか一方を用いて、ＣＤ３４陽性、ＣＤ３８陰性、Ｌｉｎ陰性細胞を単離することによりヒトにおいて可能である。
【００２４】
本発明の方法で有用な血管芽細胞は、検出できるラベル（例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ））をコードしている核酸を含んでいてもよい。例えば、ＧＦＰをコードしている核酸を含んでいる血管芽細胞は、緑色蛍光で容易に視覚化でき、新しく形成された脈管の中で娘細胞と同様にその細胞も検出することを目的とする場面で特に有益である。特に、血管芽細胞は、ＧＦＰをコードする核酸配列に機能的に結び付けられている強いプロモーターとエンハンサー（例えばチキン・ベータアクチンプロモーターやＣＭＶ前初期エンハンサー）を持つ核酸を含ませてもよい。ここで述べた実験でドナー株として使われたｇｆｐ陽性トランスジェニックマウス株の記述は実施例１にある。
【００２５】
（対象組織の血管新生の調節）
また被験体において対象組織の血管新生を調節するための方法は本発明の範囲内に含まれる。その方法は、被験体において血管芽細胞から血液細胞への分化のレベルを調節する非自発的な段階を含む。対象組織は、血管新生を調節するのが望まれるどんな組織であってもよい（例えば眼、心臓、肢又は中枢神経系組織）。
【００２６】
被験体における血管芽細胞の血管細胞への分化のレベルは、多くの方法によって調節されてもよい。そのような一方法で、被験体の血管芽細胞の数を増加又は減少させる。ドナー動物から取り出された血管芽細胞の被験体への移植を含めたあらゆる適切な方法によって、被験体における対象組織の血管芽細胞の数を増加させてもよい。ドナーとして被験体自身又は他の動物がであってもよい。そのような方法の一例では、最初骨髄細胞はあるドナーから取り出される。それから骨髄細胞の集団から単離された血管芽細胞は、血管芽細胞の発展（例えば増殖）を可能とする条件下、試験管内で培養される。そのような条件は、一つ以上の増殖因子（例：ＶＥＧＦ，ＳＤＦ−１）を含む基本培地中における細胞の成長を一般的に含む。試験管内で幹細胞を発展させる方法はT. Asahara Science 275:964-967, 1997に述べられている。それから発展させた細胞は被験体へ投与される。カテーテルによる送達静脈注射、又は心臓、脳、眼への直接注射を含めた、さまざまな手法を血管芽細胞の被験体への再導入のために使ってもよい。ドナー幹細胞を単離し、単離された細胞を移植する手法は、技術的に知られている。本発明によれば同種細胞移植だけでなく自家細胞移植を行ってもよい。あるいは血管形成を促すために血管前駆細胞の循環のレベルを増加させるＶＥＧＦとＧＭ−ＣＳＦのような因子の投与によって、被験体における対象組織の血管芽細胞の数を増加させてもよい。血管芽細胞の自己再生を減少させ、それによって血管芽細胞の血管細胞への分化を増加させるために、ＴＮＦとＮＯ阻害剤のような分子を本発明のための組成物と方法として用いてもよい。
【００２７】
また血管芽細胞に特異的に結合する抗体の被験体へ投与を含めた、多くの手法によって、被験体における対象組織の血管芽細胞の数を減少させてもよい。加えて、骨髄から非骨髄区画（例えば対象組織）への血管芽細胞の補充を妨げる又は減少させることによって、被験体における対象組織中の血管芽細胞の数を減少させてもよい。ＳＤＦ−１が特異的に結合する抗体、ヘパリン誘導体(Presta et al., Curr. Pharm. Des. 9:553-566, 2003)、ＶＥＧＦとその受容体をターゲットとする阻害剤（例：抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体、Jain RK, Semin. Oncol. 29 (6 suppl. 16):3-9, 2002）、血管芽細胞又は白血球の移動に役割を果たす他のインテグリン、セレクチン、接着分子を含んでいる物質であって、骨髄からの血管芽細胞の補充を減少させる又は妨げる物質を被験体へ投与することによって、これを達成させてよい。
【００２８】
血管芽細胞の血管細胞への分化を調節する他の方法においては、骨髄から非骨髄区画（例：対象組織）への血管芽細胞の補充又は移動を増加又は減少させる。多くの物質が血管芽細胞の補充を増加又は減少させることが知られている。特定の適用により、これらのどれでも本発明に用いてよい。骨髄から非骨髄区画（例：対象組織）への血管芽細胞の補充を増加させるために、血管芽細胞の補充を促すことのできるあらゆる物質の投与が用いられてもよい。多くのそのような物質が知られている。参照：例えばそれらが国際出願 WO 00/50048に述べられている（ＳＤＦ−１α、ＳＤＦ−１α受容体、インテグリン（例：α４、α５）、接着分子のセレクチンファミリー、Ｇ−ＣＳＦのようなコロニー増殖因子）。加えて血管芽細胞の補充を増加させる内因子の調節は、骨髄から非骨髄区画（例：対象組織）への血管芽細胞の補充を促進させるために役立たせてもよい。例えば、ＳＤＦ−１αはＣＸＣＲ４のリガンドであり、内皮細胞の走化性を誘発し血管芽細胞を刺激することが示されている。このため、骨髄から非骨髄区画（例：対象組織）への血管芽細胞の補充を増加させるために、ＳＤＦ−１のレベル及び／又は活性を増加させてもよい。
【００２９】
逆に、骨髄から非骨髄区画（例：対象組織）への血管芽細胞の補充を減少させるための方法の中で、ＳＤＦ−１活性を減少させる又は妨げることが用いられてもよい。例えば、ＳＤＦ−１結合分子（例：ＳＤＦ−１受容体）へ結合できるＳＤＦ−１分子の数を減少させることによって被験体におけるＳＤＦ−１活性のレベルを調節してもよい。ＳＤＦ−１受容体へ結合できるＳＤＦ−１分子（例：ポリペプチド）の数を減少させ、骨髄から非骨髄区画（例：対象組織）への血管芽細胞の補充を妨げる又は減少させるために、ＳＤＦ−１ポリペプチドに特異的に結合する抗体を被験体へ投与してもよい。網膜血管新生を妨げる一つの例で、ＳＤＦ−１に特異的に結合する抗体を被験体の眼へ投与する。また上記のような骨髄からの血管芽細胞の移動を減少させる又は妨げる他の物質の被験体への投与によって、骨髄から非骨髄区画（例：対象組織）への血管芽細胞の補充の妨げを達成させてもよい。例えば、インテグリン（例：α４、α５）、接着分子のセレクチンファミリー又はＧ−ＣＳＦのようなコロニー増殖因子に対する抗体を用いてもよい。
【００３０】
血管芽細胞から血管細胞への分化を増加させる方法で、多くの手法を採用してもよい。例えば、単独で又は血管芽細胞移植に合わせて、血管芽細胞分化のための正の調節因子である物質（例：サイトカイン、増殖因子）を上方に制御するか、あるいは被験体へ投与してもよい。例えば、血管芽細胞の分化を促進するために、血管芽細胞の自己再生のための負の調節因子である、ＴＮＦのようなサイトカイン（参照：Dybedal et al. Blood 98: 1782-91 (2001)）を被験体へ投与してもよい。特に、ケモカイン（炎症サイトカインの大きなファミリー）は、血管新生の調節で重要な役割を果たすことが示された。ケモカインの血管新生活性又は抗血管新生活性を検定するために、多くの血管新生測定法が一般に利用される。これらは試験管内の内皮細胞活性化測定と、生体外又は生体内の新血管新生のモデルを含んでいる。精製された内皮細胞集団に対する試験管内測定又は生体内測定（Bernardini et al., J. Immunol. Methods 273:83-101, 2003）を実行することによって、ケモカインの内皮細胞に対する効果を測定できる。サイトカインによる血管新生の調節はNaldini et al., Cur. Pharm. Dis. 9:511-519, 2003において概説されている。
【００３１】
インターロイキン、インターフェロン、マトリックスメタロプロテイナーゼ及びアンジオポエチンタンパク質のような分子を、被験体において血管新生を調節する（例：増加させる）ための物質として用いてもよい。亜酸化窒素（ＮＯ）は血管芽細胞活性の主要な調節因子である。つまり、ＮＯのレベルに影響を与える又はＮＯを生成する遺伝子を阻害する薬剤（シルデナフィル、アミノグアニジン、Ｌ−ＮＡＭＥ、Ｌ−ＮＩＬ及びＡＭＴ等）は、補充を妨げる／促進させること、又は新しく形成された血管の大きさと分岐構造を変化させることのどちらか一方によって、血管芽細胞活性を調節することができる。
【００３２】
また線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＧＭ−ＣＳＦ、形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）及びＶＥＧＦのような増殖因子も、血管芽細胞の分化と血管新生を促進させるために有用である。そのような増殖因子は、新血管新生を促すために、内皮前駆細胞の循環レベルを増加させることによって作用する。微小血管内皮細胞の増殖中の増殖因子とその受容体についての概説は、Suhardja and Hoffman Microsc. Res. Tech. 60:70-75, 2003で見い出すことができる。エリスロポエチン（ｅｐｏ）と他の前血管由来の分子は、さまざまな増殖因子（ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３及びＩＧＦ−１）と相助的に作用し赤血球前駆細胞の成熟と増殖を引き起こすことが示されている(Fisher JW, Exp. Biol. Med. 228:1-14, 2003)。血管新生を増加させる好ましい実施形態においては、ＶＥＧＦが被験体へ投与され血管芽細胞の分化と血管新生を増加させる。増殖因子のＶＥＧＦファミリーは内皮細胞特異的な有糸分裂促進剤である糖タンパク質である。ＶＥＧＦは内皮細胞の増殖を刺激すること及び内皮細胞が再生する速度を加速することが示されている。血管新生におけるＶＥＧＦの役割は、Goodgell DS, Oncologist 7:569-570, 2002において概説されている。
【００３３】
ウィルスベクターを含んだ、多くの組み換えＤＮＡと遺伝子治療技術を用いて、血管新生を調節する分子（例：ＶＥＧＦ）の送達を行ってもよい。好ましいウィルスベクターは宿主に低毒性を示し、血管新生を調節する分子の治療量を生みだす。ウィルスベクターに関する方法とプロトコルはKay et al., Nature Medicine 7:33-40, 2001に概説されている。本発明に有用なウィルスベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）から得られたウィルスを含む。好ましいＡＡＶベクターは、血管新生を調節する分子をコードする核酸を操作できるように連結されている、発現を指示するプロモーターを含む、少なくとも一つのカセットを隣にした一対のＡＡＶ逆方向末端反復を含む。例えば、組み替えＡＡＶベクターの使用のための方法はTal, J., J.Biomed. Sci. 7:279-291, 2000とMonahan and Samulski, Gene Therapy 7:24-30, 2000に述べられている。
【００３４】
有用なプロモーターは誘導可能であるか恒常的に活性を持つことができ、限定されないが以下のプロモータを含む。ＳＶ４０早期プロモーター領域(Bernoist et al., Nature 290:304, 1981)、ラウス肉腫ウイルスの３' 末端の長い末端反復に含まれるプロモーター（Yamamoto et al., Cell 22:787-797, 1998）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441, 1981）及びメタロチオネイン遺伝子の調節塩基配列（Brinster et al., Nature 296:39, 1998）。
【００３５】
いくつかの非ウィルス性の方法であって、血管新生を調節する分子をコードする核酸を導入するための方法も本発明において有用である。血管新生を調整する分子（例：ＶＥＧＦ）をコードする核酸の導入のためにプラスミドＤＮＡを採用する方法は技術的に一般に知られていて、Y Curr. Opin. Mol. Ther. 1:116-120, 1999とWolff, JA. Neuromuscular Disord. 7:314-318, 1997のような文献に述べられている。血管新生を調節する分子の宿主細胞への導入のための物理的な手法を含む方法を本発明における使用に適用してもよい。そのような方法は微粒子銃や細胞電気的透過処理を含む。プラスミドＤＮＡと多細胞の会合体を形成する合成遺伝子転移分子も有用である。そのような分子はポリマーＤＮＡ結合陽イオン（Guy et al., Mol. Biotechnol. 3:237-248, 1995）、カチオン両親媒性物質（リポポリアミン、カチオン脂質、Felgner et al., Ann. NY Acad. Sci. 772:126-139, 1995）及びカチオンリポソーム（Fominaya et al., J. Gene Med. 2:455-464, 2000）を含む。
【００３６】
血管芽細胞分化の正の調節因子である物質を投与する好ましい方法の中で、ＡＡＶベクター内にＶＥＧＦポリペプチドをコードしている核酸が被験体へ投与される。ＡＡＶベクターはＡＡＶ粒子内に含まれてもよい。
【００３７】
血管芽細胞の血管細胞への分化のレベルを減少させるために、血管芽細胞分化の負の調節因子である物質を被験体へ投与してもよい。血管芽細胞の血管細胞への分化を減少させる又は妨げるあらゆる物質を使ってもよい。そのような物質は、サイトカイン、ＰＵ．１、ｈｏｘＢ４及びｗｎｔ−５Ａのような転写因子又はＶＥＧＦ受容体アゴニストを含む。分化を妨げるために、血管芽細胞に特異的に結合し殺す細胞傷害抗体の送達を用いてもよい。あるいは負に分化を調節するサイトカインを宿主に送達してもよい。例えば、特定の免疫グロブリン療法を、ＳＤＦ−１、ＣＸＣＲ−４（ＳＤＦ−１受容体）、α４とα５インテグリン又は接着分子のセレクチンファミリーのような分子を妨げるために用いてもよく、こうして血管芽細胞の網膜虚血性傷害の部位への補充を妨げる。加えて、血管芽細胞活性を変化させるために、Ｇ−ＣＳＦの投与のような血管芽細胞の補充による療法を用いてもよい。
【００３８】
血管新生を阻害する又は軽減する付加分子の例は、ドーパミンアゴニストとグルココルチコイド（Goth et al., Microsc. Res. Tech. 60:98-106, 2003）、エンドスタチン（Ramachandran et al., Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expression 12:175-191, 2002）、スルホンアミドとスルホン化（ｓｕｌｆｏｎｙｌａｔｅｄ）派生物（Casini et al., Curr. Cancer Drug Targets 2:55-75, 2002）、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子の活性部位阻害剤（Mazar AP, Anticancer Drugs 12:387-400, 2001）、ケモカイン（Bernardini et al., J. Immunol. Methods 273:83-101, 2003）、ソマトスタチンアナログ（Garcia de la Torre et al., Clin. Endocrinol. 57:425-441, 2002）及びトリアムシノロンのようなステロイドを含む。加えて、ＶＥＧＦとＶＥＧＦ受容体の発現及び／又は活性を阻害する物質は、被験体の血管新生を調節する（例：減少させる）のに有用である。（Sepp-Lorezino and Thomas, Expert Opin. Investig. Drugs 11:1447-1465, 2002）内皮細胞のレベルで血管新生を阻害する物質の概説は、Jekunen and Kairemo, Microsc. Res. Tech. 60:85-97, 2003で見い出すことができる。
【００３９】
血管新生を調節するための組成物と同様に、血管への送達を目標とする多くの手法のどれを使っても、血管新生を調節するための物質の送達と活性を増加させることができる。例えば、前記物質が脈管を狙いとするために、調節するための前記物質（ＶＥＧＦ又はＳＤＦ−１）をコードする核酸を内皮特異的な遺伝子に結び付けることができる。血管新生を促進する多くの薬剤が知られており、本発明に関する組成物の中で有用であるかもしれない。血管新生と血管を標的とすることに関する最近の進歩に関する概説のためには「Bikfalvi and Bicknell, Trends Pharmacol. Sci. 23:576-582, 2002」を参照。血管新生を促進することが示されている肥満細胞（Hiromatsu and Toda, Microse. Res. Tech. 60:64-69, 2003）の投与及び／又は補充は、被験体の血管新生を増加させる上で有用であるかもしれない。
【００４０】
（骨髄からの血管芽細胞の単離）
本発明は成体動物の骨髄から血管芽細胞を単離するための方法を提供する。この方法は動物から骨髄を単離する段階を含む。骨髄は少なくとも一つの血管芽細胞と少なくとも一つの非血管芽細胞を含む。そして少なくとも一つの血管芽細胞と少なくとも一つの非血管芽細胞を分離する。さらに少なくとも一つの血管芽細胞を集める。あらゆる適切な方法によって非血管芽細胞と血管芽細胞を分離することができる。そのような方法の一つの例では、血管芽細胞に特異的に結合するが非血管芽細胞に結合しない、固定された物質と骨髄を相互作用させる。あるいは非血管芽細胞に特異的に結合するが血管芽細胞に結合しない、固定された物質と骨髄を相互作用させてもよい。これらの方法の一変形例では、血管芽細胞又は非血管芽細胞へ特異的に結合する物質は抗体である。
【００４１】
（血管新生を調節するための使用法）
血管新生を調節するための方法と組成物が役に立つ多くの用途がある。被験体の血管新生を増加させる本発明の組成物と方法は、血管の不在が疾患の病状を起こす又は血管の不在が疾患の病状と関係する血管関連疾患を治療するために役立たつだろう。そのような疾患の例としては貧血、虚血（例：肢虚血、心虚血及び脳虚血）、冠動脈疾患及び糖尿病性循環不全が含まれる。
【００４２】
また本発明の組成物と方法によって与えられる血管新生から利益を受ける生理的状態の例としては、器官と組織の再生、創傷治癒及び骨治癒が含まれる。血管再生は創傷修復に重要である（Li et al., Microsc. Res. Tech. 60:107-114, 2003）。新しく形成された血管は仮肉芽組織の形成に関与し、成長組織に栄養と酸素を与える。さらに炎症細胞は損傷部位へ入るために内皮基底膜との相互作用と、内皮基底膜を通る遊出が必要である。ＶＥＧＦ、アンジオポエチン、ＦＧＦ及びＴＧＦ−βは、損傷での血管新生において最も強力な血管由来のサイトカインの一つである。従って本発明の血管芽細胞の投与と合わせてそのようなサイトカインの投与は損傷修復を促進する上で有用である。
【００４３】
本発明の組成物と方法を用いて血管新生を増加させることは、虚血状態を治癒するために有用である。側枝の血管を発達させる能力は、血管の閉塞性疾患（例：虚血）に対する重要な対応を示す。血管芽細胞と血管新生増殖因子を含む物質は、重大な心筋虚血と同様に肢虚血を有する被験体を治療するために有用であるかもしれない。冠動脈疾患（例：心筋虚血）の予防と治療が継続して発展しているにも関わらず、バルーン血管形成とステント術又は冠動脈バイパス移植術といった従来の血管再生法の候補者とならない患者の集団が依然として残っている。本発明の組成物と方法を使った虚血性心臓組織又は骨格筋の血管新生を、これらの患者と他の患者の治療上の血管新生を達成するために用いてもよい。最近の研究により、ＶＥＧＦとＦＧＦのような血管由来の増殖因子を使用し、肢や心筋の虚血を有する患者の血管新生を増加させることの実現可能性が示されてきている（Silverstre and Levy, Vale et al., J. Interv. Cardiol. 14:511-528, 2001）。
【００４４】
また本発明による血管新生を減少させる組成物と方法は、糖尿病性網膜症のような疾患のための効果的な治療法として役立たせてもよい。糖尿病性網膜症は主要な公衆の健康上の問題であり、依然として２０才から６５才の人々の失明の主要な原因である。他の失明にいたる病気のように、糖尿病性網膜症は異常な血管形成の反応に関係している（「Garnder et al., Surv. Ophthalmol. 47 (suppl. 2):S253-262, 2002」と「Spranger and Pfeiffer, Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes 109 (suppl. 2):S438-450, 2001」とに概説されている）。糖尿病性網膜症を治療するための方法の一例では、ＳＤＦ−１αに特異的な抗体を患者に投与すると血管新生が防止される。
【００４５】
加えて本発明の組成物と方法は、血液供給の制限によって癌腫瘍成長を治療し予防するために役立たせてもよい。制御されていない内皮細胞の増殖が腫瘍の新血管新生と血管増殖性の疾患において観察される。新しい血液供給が与えられないと、癌腫瘍は限られた大きさを超えて成長できない。そのため新血管新生の過程の調節は、悪性腫瘍の治療法を示す。本発明の組成物と方法を用いて治療されてもよい固形腫瘍癌は、神経膠腫、大腸癌、卵巣と前立腺の癌腫瘍を含んでいる。
【００４６】
（哺乳動物の被験体、対象組織、対象細胞及び幹細胞）
本発明は、血管芽細胞の血管細胞への分化を調節すること及び被験体（例：哺乳動物）の対象組織への血管芽細胞の補充を調節することによって、被験体における対象組織の血管新生を調節するための組成物と方法を与える。哺乳動物の被験体はヒト、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、サル、類人猿、ウサギ、ウシ等のようなあらゆる動物を含む。哺乳動物の被験体は、成体、幼若動物及び新生仔を含んだ発生のあらゆる段階であってもよい。また哺乳動物の被験体は、発生の胎児段階における被験体を含む。対象組織は、網膜、肝臓、腎臓、心臓、肺、胃腸菅の構成要素、膵臓、胆嚢、膀胱、脳を含む中枢神経系、皮膚、骨等の哺乳動物の被験体におけるあらゆる組織であってもよい。
【００４７】
（単離された血管芽細胞と骨髄の被験体への移植）
本発明の細胞、組成物及び方法は、細胞移植によって被験体（例：ヒト）における血管を再生させるのと同様に血管を発生させるために使われてもよい。被験体の血管を発生又は再生するために、細胞をあらゆる適切な送達方法によって被験体へ移植することができる。一方法では、細胞はドナー動物から単離される。血管芽細胞は骨髄細胞から単離されて被験体へ導入される。被験体へ血管芽細胞を導入するために、静脈注射によるカーテル媒介性の送達、又は対象組織（例：心臓、脳又は眼）への直接注入などの様々な方法を用いることができる。
【００４８】
従来の手法によって、骨髄から単離された血管芽細胞を被験体（例：血管損傷を患うヒト患者）へ投与してもよい。例えば、内部もしくは外部の対象部位（例：肢又は脳室）への注入（適当な、緩衝塩溶液のようなキャリアーや希釈液中の細胞の注入）もしくは内部か外部の対象部位（例：肢又は脳室）への外科的な送達によって、又は血管を通って到達できる部位へのカーテルによって、血管芽細胞は対象部位（例：肢、心筋、脳）へ直接投与されてもよい。正確に配置するために、定位的な注入手法によって正確に細胞を脳の部位へ送達してもよい。
【００４９】
効果がある量（つまり、治療される被験体に好ましい結果（例：被験体における血管新生を調節する）をもたらすことのできる効果的な量）で上記の細胞を被験体（例：哺乳動物）へ投与する方が好ましい。そのような治療上の効果のある量を実験的に決定することができる。範囲はかなり異なるかもしれないが、治療上の効果のある量は動物の体重１キログラム当たり５００から１０6の細胞数の範囲内であることが見込まれる。
【００５０】
（ＳＤＦ−１αに特異的な抗体）
本発明は、ＳＤＦ−１ポリペプチドに特異的に結合する抗体の被験体への投与によって、被験体におけるＳＤＦ−１活性のレベルを調節することに関する。本発明に有用な抗体を生産するために、既知の手法にしたがって、ＳＤＦ−１αタンパク質及び／又はＣＸＣＲ４のようなＳＤＦ−１αタンパク質受容体（又はその免疫原性フラグメントやアナログ）を用いてもよい。技術的に知られている組み換え技術によって、そのような蛋白質を生産してもよい。
【００５１】
被験体におけるＳＤＦ−１活性のレベルを調節することに加えて、本発明に有用な抗体はまた、例えば生物試料（例：網膜切片、網膜細胞）におけるＳＤＦ−１αタンパク質（又はＳＤＦ−1αタンパク質受容体）の検出にも用いてもよい。またＳＤＦ−１αタンパク質もしくはＳＤＦ−１αタンパク質受容体の発現又は局在に基づく候補化合物の効果を測定するためのスクリーニング測定の中で、抗体を使ってもよい。加えて、ＳＤＦ−１αタンパク質と、ＳＤＦ−１αタンパク質受容体のようなＳＤＦ−１αタンパク質に結合する他の分子との相互作用を妨げるために、そのような抗体を使ってもよい。
【００５２】
（組成物の投与）
上記の組成物は、齧歯動物とヒトを含む動物へあらゆる適当な処方で投与されてもよい。投与の方式と経路、標準的な薬学上の慣習に基づいて選択された方法で薬剤として許容性のあるキャリアー（例：生理食塩水）中の、又はそのままの本発明の組成物を被験体へ投与してもよい。血管新生を調節するための組成物は薬剤として許容性のある、生理食塩水や緩衝塩溶液のようなキャリアー中に又は希釈液中に製剤されてもよい。薬学上の製剤に加えて、典型的な薬剤として許容性のあるキャリアーと希釈液の概説は、この分野での標準的な教科書であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎの薬剤科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）とUSP/NFで見つけることができる。本組成物を安定化する及び／又は保存するために他の成分を本組成物へ加えてもよい。
【００５３】
（ウィルスベクターの被験体への投与）
被験体の血管新生を調整するための方法としてウィルスベクターを用いてもよい。この方法では、ＶＥＧＦをコードしている核酸を有するウィルスベクター（例：ＡＡＶ）を核酸が発現される方法で動物に投与する。動物への直接導入（例：静脈内の注入、腹腔内の注入、生体内原位置の対象組織への注入）によって、ウィルスベクター（例：ＡＡＶ）の動物への投与を達成してもよい。例として、ウィルスベクター粒子懸濁液を動物へ注入するために、慣用のシリンジと針を用いてもよい。投与の望まれる経路に応じて、注入は、生体内原位置への（つまり特定組織、組織の特定位置への）、筋肉内への、静脈内への、腹腔内への、又は他の非経口の経路による注入であってもよい。
【００５４】
注入によるベクター又はベクター粒子の非経口の投与は、例えば大量瞬時投与又は持続点滴によって実行されてもよい。注入のための製剤は、防腐剤を加えられた単位剤形（例えばアンプル又は数々の単位の包装）の中に入れて提供されてもよい。組成物は油性又は水性の媒体の中で懸濁液、溶液又は乳濁液のような形を取ってもよいし、懸濁化剤、安定化剤及び／又は分散剤のような剤形上の物質を含んでいてもよい。あるいは使用前に適切な媒体（例えば殺菌した発熱物なしの水）と構成するために、ベクター又はベクター粒子は粉末状態（例：凍結乾燥されている）であってもよい。
【００５５】
（効果のある投与量）
好ましくは効果がある量（つまり治療される被験体に好ましい結果（例：被験体において血管新生を調節する）をもたらすことのできる効果的な量）にして、上記組成物を哺乳動物（例：齧歯動物、ヒト）へ投与する方がよい。本発明の方法で使われる組成物の毒性と治療効力は標準的な薬学上の手順によって決定可能である。医学又は獣医学の技術でよく知られているように、あらゆる動物のための投与量は多くの因子（被験体の大きさ、体の表面面積、年齢、投与される特定の組成物、投与の時間と経路、全般的な健康状態、及び一緒に投与される他の薬を含む因子）によって決まる。
【００５６】
（実施例１  材料と方法）
ｇｆｐキメラマウスの作成：ドナー株として用いられるｇｆｐトランスジェニックマウス株は、ジャクソン研究所（Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME）から得られた。この株はチキンベータアクチンプロモーターとＣＭＶ前早期エンハンサーによって調整されるｇｆｐを有している。この動物内の全ての細胞種類はｇｆｐを発現する。受容体のＣ５７Ｂ６マウスを９５０ラドで照射し、その後ｇｆｐ陽性ドナーマウスからの全骨髄（１×１０6）又は精製された血管芽細胞（２×１０5）のいずれか一方を静脈内注入することによって、Ｃ５７Ｂ６．ｇｆｐ放射性キメラマウス（ｎ＝４６）を作成した。成体骨髄から以下のように血管芽細胞を精製した：得られた骨髄を、単細胞浮遊液とし、ＩＭＤＭ＋２０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）中で4時間処理されたプラスチックシャーレ上に置いた。非吸着細胞を集め、ＰＥ標識系統抗体のカクテルで標識されている少量のものがＦＡＣＳによって９５％を超える系統陰性であることを示すまで、Miltyni磁気活性化細胞分離（ＭＡＣＳ）システムを用いて３回の細胞系抗体消耗（Ｂ２２０，ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８，ＣＤ１１ｂ，Ｇｒ−１、ＴＥＲ１１９）を実行した。そして９５％より大きいＳｃａ−１陽性、Ｌｉｎ陰性の純度を示すものを達成するまで、Ｓｃａ−１であるようにＬｉｎ陰性細胞を２、３回、確実に選び出した。それからＳｃａ−１陽性、Ｌｉｎ陰性細胞をＣＤ４５により染色し造血由来であることが確かめた。一連の移植のために約１０００倍に精製された血管芽細胞を移植した。単一の血管芽細胞移植のために、Ｓｃａ−１陽性、ｃ−ｋｉｔ陽性、Ｌｉｎ陰性血管芽細胞をＦＡＣＳにより選別し、その後の蛍光顕微鏡による極微操作装置を用いた単一の血管芽細胞選別によって濃縮した。それから個々のＧｆｐ＋血管芽細胞を、２×１０5の非Ｇｆｐ＋骨髄細胞（放射線を照射されたホストに移植する前に、磁気ビーズによってＳｃａ−１＋を消耗した骨髄細胞）と混ぜた。
【００５７】
網膜新血管新生の誘発：恒久的な造血系の再構築を行った後、キメラマウスにＡＡＶ−ＶＥＧＦを眼内へ注入し、その後一ヶ月の１０％フルオロセインナトリウムを腹腔内に注入した。１５分間後、それらにレーザー処理を施した。網膜血管光凝固に７８ジオプトリーレンズを備えたアルゴングリーンレーザーシステム（HMG Corporation, Salt Lake City, Utah）を用いた。青緑色のアルゴンレーザー（波長４８８−５１４ｎｍ）が視神経隣りの選択された静脈部位に適用された。１秒の持続時間、５０μｍのスポットの大きさ及び５０から１００ｍＷの強度のレーザの条件を用いて静脈閉塞は達成された。
【００５８】
データ収集と分析：レーザー処理の３週間後、マウスを屠殺し眼を摘出した。技術的な制限のため、共焦点顕微鏡と免疫細胞化学の両方のために、平置した網膜が使用できなかった。網膜の厚さ（約２００マイクロン）は抗体の適切な浸透を妨げた。そのため、核をラベルし血管の内腔の輪郭を描くために、選択されたマウス（ｎ＝１０）をヘキスト染色を含んだ緩衝液で灌流した。処置された放射線キメラからの眼（ｎ＝２０）を切片としヘマトキシリンで染色した。切片は、内皮細胞を同定するために、ＰＥ結合抗ファクターVIII又は、ビオチン結合抗ＰＥＣＡＭ−１とビオチン結合抗ＭＥＣＡ−３２とその後のアビジンＰＥ（BD BioSciences, San Jose, Califonia）を用いて切片を対比染色した。１つの眼について最低３０の断片がｇｆｐ陽性、ＰＥ陽性細胞の存在のために調べられた。
【００５９】
この方法は、平置した全網膜の、共焦点顕微鏡によって検知できる無傷の毛細血管網の視覚化を妨げた。共焦点可視化のため、マウス（ｎ＝３６）に３〜５ｍｌのリン酸緩衝ホルムアルデヒド（ｐＨ  ７．４）中の５０ｍｇ／ｍＬのイソチオシアン酸テトラメチル・ローダミン（ＴＲＩＴＣ）複合デキストリン（平均１６０，０００の分子量、Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri）を左心室を通して投与して灌流した。その後すぐに、眼を取り除いて、網膜を解剖し、光漂白を阻害するためにヴェクタシールド（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ）マウント媒介物（Vector Laboratories, Burlingame, California）を用いて共焦点顕微鏡のために平坦に置いた。Bio-Radの共焦点１０２４ＥＳシステムに取り付けられたオリンパスIX−７０を逆位ステージで蛍光顕微鏡に用いた。波長５９８ｎｍと
５２２ｎｍの発光検出器を有するクリプトンーアルゴンレーザーを赤と緑色の蛍光を区別するために用いた。このシステムで用いたレンズは（オリンパス）１０Ｘ／０．４  Uplan Apo、２０Ｘ／０．４LC Plan Apo、４０Ｘ／０．８５Uplan Apo、６０Ｘ／１．４０ oil Plan Apo及び１００Ｘ／１．３５oil Uplan Apoであった。ソフトウェアはＯＳ／２ Laser Sharpであった。またドナーの寄与を分析するために、ＰＥに結合された系統特異抗体（BD BioSciences, San Jose, California）を用いたＦＡＣＳによって末梢血と骨髄を集めた。
【００６０】
（実施例２  機能的な血管芽細胞活性を示す移植された動物）
Ｃ５７ＢＬ６．ｇｆｐと呼ばれる放射性キメラを生産するために、普遍的なｇｆｐマウスドナーから全骨髄、高濃度に濃縮された血管芽細胞又は単一の血管芽細胞のいずれか一つを照射を受けたＣ５７ＢＬ６受容体に移植した。精製された血管芽細胞と多系列の再構成のＦＡＣＳ分析を行った。移植された細胞は、以下の結果として血管芽細胞が高濃度に濃縮されたと考えられた。（１）区別を示す吸着による選択（ＭＳＣは組織培養プラスチックに吸着するが血管芽細胞は吸着しない）、（２）フィコール遠心とその後のＳｃａ−１陽性、Ｌｉｎ陰性表現型への精製による非吸着細胞の更なる選別。  最初ＦＡＣＳによってＳｃａ−１陽性、ｃ−Ｋｉｔ陽性、Ｌｉｎ陰性集団として単一のｇｆｐ陽性血管芽細胞を精製した後、その移植前に蛍光顕微鏡を通した顕微操作での個々の選別をした。これらのキメラでは、骨髄又は血管芽細胞由来細胞のｇｆｐ発現は視覚的に緑色の細胞として同定された。これらのＣ５７ＢＬ６．ｇｆｐキメラの網膜新血管新生を引き出すために、部位特異である増殖因子過剰発現と虚血発作の組み合わせを用いた。研究の初期においては、レーザによる閉塞又はＶＥＧＦの局所的な発現のどちらか一方を用いることが試みられたが、どちらの処理も単独では一貫した新血管新生に結びつかなかった。それに対して、部位特異的なＶＥＧＦの発現とその後のレーザによる静脈閉塞の組み合わせは、前網膜血管と一貫した前網膜新血管新生の数の増加に導いた。
【００６１】
最初に、虚血誘発前の恒久的で多系列造血性の再構成に関して、第一の血管芽細胞移植受容体を調べた。血管芽細胞移植の６ヶ月後及び損傷の１ヶ月後、処理された放射キメラの眼を切片化しヘマトキシリンで染色した。核をラベルし血管の内腔の輪郭を描くためにヘキスト染色を含んだ緩衝液で動物を灌流した。ＶＥＧＦ遺伝子を含んだ組み換えＡＡＶを静脈内注入し、その後レーザーによる静脈閉塞を施したマウスの眼において前網膜新血管新生の誘発を観察した。ｇｆｐ陽性で血管芽細胞由来の緑色内皮細胞は血管の内腔に組み込まれた。緑色細胞の内皮の性質を確かめるために、ＰＥ結合抗ファクターVIII又はビオチン結合抗ＰＥＣＡＭ−１とビオチン結合抗ＭＥＣＡ―３２のいずれか一方と第二のＰＥ−アビジンを用いて切片を対比染色した。内腔（ヘキスト染色により輪郭が描かれている）を囲むｇｆｐ陽性細胞は赤い蛍光性のファクターVIII又はＰＥＣＡＭ−１抗体と反応し、結合したイメージとして黄色細胞を生産することが明瞭に観察された。従って、それらはドナー由来内皮細胞であることが確かめられた。一つの網膜につき最低３０の切片（両方の視神経よりサンプリングした）の調査により、内腔を囲んでいる各々のｇｆｐ陽性細胞は内皮細胞特異的な抗体と反応することが示された。赤色蛍光標識デキストランで灌流した、平置した網膜に、本モデルにおいて誘発される血管発達の傾向が容易に観察された。蛍光顕微鏡の写真において、ＡＡＶを静脈内注入し、その後レーザによる静脈閉塞を施したＣ５７Ｂ６．ｇｆｐキメラマウスにおいて血管が発達する傾向を発見した。損傷した虚血性眼における全網膜の典型的な平置したものは、ドナーであるｇｆｐ陽性血管芽細胞を由来とする内皮細胞を有する、新しく再生された血管の領域を示した。同じ動物の損傷されていない眼は、血管の内皮細胞への見かけ上の寄与がない原型血管を通ってｇｆｐ陽性細胞が循環をしていることを示した。損傷した眼において、網膜血管内（新しい血管増殖を示す毛細血管網内を含む）で、ｇｆｐを発現する細胞を観察した。ｇｆｐを発現する新しく形成された毛細管の多くの領域は、以前存在していた血管の領域からの拡張された領域であることが観察された。ｇｆｐ陽性内皮細胞はローダミンで灌流できる内腔を生産するので、併合される緑色と赤色の媒介物は新しく形成された血管を黄色の管として視覚化した。重要なことは高い濃度で濃縮された血管芽細胞（〜９５％  Ｓｃａ−１陽性、Ｌｉｎ陰性）を移植した５つの全マウスは、ｇｆｐ陽性細胞から成る血管であって、多くの新しい血管を含んでいた。そして、それは網膜の至る所で容易に観察された。調べた全部分の中で、最低２つの新しい領域で新血管新生を観察した。このことは、ほとんどの損傷が、ある部分においてはドナー由来の細胞で修復されたことを示していた。それに対して、全骨髄を受け取ったマウス（ｎ＝１０）は新血管新生の領域においてｇｆｐ陽性細胞が減少した頻度であることを示した。これは、キメラを生産するために移植された血管芽細胞の数が多くなればなるほど、視覚で認識できるドナー由来の内皮細胞の数が多くなることを示している。しかし、血管芽細胞と共に増加する血液の再増殖と血管の再生によって定義されるよ��に、全ての移植された動物は、機能的な血管芽細胞の活性を示した。
【００６２】
ネズミモデルにおける造血幹細胞の機能のための古典的な確定測定方法は、放射線を照射されたホストの中での恒久的な長期間に渡る造血系の再構成である。第一の移植された動物から得られた、濃縮された骨髄血管芽細胞を、致死的に放射線を照射された第二のホストへ次なる移植をすることによって、造血幹細胞が発展し自己再生できることがわかった。従って、幹細胞の定義を満たす。骨髄幹細胞（ＭＳＣ）は連続的に移植できることを示す証拠はないので、連続的な移植は骨髄幹細胞の再構成への関与を妨げる傾向がある。新血管新生の間に観察される「緑色」内皮細胞の生産が、自己再生し長期間に渡り再増殖する造血幹細胞の性質であることを確かめるために、第一の受容体由来の高度に精製された造血幹細胞の第二の移植を行った。五体の動物が致死的に放射線を照射し、高度に濃縮されたｇｆｐ陽性の造血幹細胞を第一の受容体に移植した。恒久的で多系列の造血系再構成を確かめるために動物を１０ヶ月間観察した。それからｇｆｐ陽性造血幹細胞を第一の受容体から精製し、血管芽細胞活性を誘発するために五体の第二のホストへ移植した。３ヵ月後に第二の受容体における多系列の造血系再構成を確認した後、これらの動物にｇｆｐ陽性造血幹細胞から得られた血管芽細胞活性による点数をつけた。網膜虚血が誘導され、それに伴う新血管新生を第二の移植後５ヶ月間分析した。ローダミンで灌流されて、処理された網膜からの血管内腔は、ｇｆｐ陽性内皮細胞が誘発された毛細血管の再生に関与していることを示した。結合したイメージは、ドナー造血幹細胞由来の内皮細胞は第二の移植受容体における全ての血管房を再生することを示している。このため、連続した移植が可能であり、複数の造血系統を再構成する成体の造血幹細胞（つまり、血管芽細胞）は明瞭に血管芽細胞の特性を有しており、機能的な血管を再生できる。
【００６３】
単一の造血幹細胞クローンが血液と血管との両方を作ることができるかどうかを決定するために、単一の造血幹細胞で再構成された動物を用いたモデルを繰り返して使用した。ＦＡＣＳ選別の後、個々のＧｆｐ陽性、Ｓｃａ−１陽性、ｃ―ｋｉｔ陽性、Ｌｉｎ陰性造血幹細胞をマニュアルに従い単離し、２×１０5のＳｃａ−１が消耗した非ｇｆｐ骨髄とともに移植した。消耗された骨髄は短期間の造血前駆体の源としての役割を果たし、単一造血幹細胞の移植片生着を高めた。単一の造血幹細胞により、多系列の造血系再構成と新血管新生へのしっかりとした内皮細胞の寄与があった。この新しい血管形成は単一の造血幹細胞移植を施した三体の動物全てで観察され、単一の成体造血幹細胞は血管芽細胞として機能できるという明らかな証拠を与えている。
【００６４】
（実施例３  網膜新血管新生の阻害）
上記の実施例１と実施例２中に述べた血管芽細胞モデルを、網膜新血管新生に対する抗ＳＤＦ−１抗体の効果を試験するために用いられた。本実施例においては、特定の修正を特徴とする血管芽細胞モデルを用いた。特にマウスの眼にＳＤＦ−１活性を妨げる抗体を注入した。この実験はＳＤＦ−１活性を無効化する（例：抗ＳＤＦ−１抗体を硝子体注入する）ことによって網膜新血管新生が妨げられることを示した。眼の処理は虚血性網膜におけるｇｆｐ陽性血管芽細胞由来の新血管新生を完全に妨げた。蛍光共焦点顕微鏡写真は、抗ＳＤＦ−１抗体によって血管芽細胞による新血管新生が阻害されることを示した。齧歯動物の眼においてｇｆｐ血管芽細胞由来細胞が新血管へ普通に組み込まれていることが観察された。眼の中でＳＤＦ−１活性の阻害により、ｇｆｐ陽性血管芽細胞の血管への組み込みが妨げられた。虚血性網膜におけるｇｆｐ陽性血管芽細胞由来の新血管新生の阻害のためのプロトコルの例を以下に述べる。
【００６５】
最初にｇｆｐオスを全身麻酔の状態で頸部脱臼によって安楽死させ、そのオスから骨髄を回収した。ｃ−ｋｉｔＡＰＣとＳｃａ−１ＰＥに染色された細胞はＦＡＣＳにより選別がされた。細胞を選別している間、ＢＬ６メスが致死的に放射線を当てられた（８５０ラド）。次に、選別された細胞の放射線を当てられたＢＬ６マウスへの網膜眼窩洞（ＲＯＳ）注入によって骨髄移植を行った。ＲＯＳ注入の３週間後、尾部出血を行った。Ｓｃａ−１／ｃ−ｋｉｔ細胞の移植を調べるためにＦＡＣＳキャリバー（Ｃａｌｉｂｅｒ）を用いた。次に、確実に移植されたマウスの右眼に、組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）−ＶＥＧＦを、硝子体注入した。ＶＥＧＦ注入の４週間後、網膜レーザー光凝固を右眼で行った。レーザー処理のすぐ後、モノクローナル抗ＳＤＦ−１抗体（R&D System MAB310）を右眼に硝子体注入した。処理していない眼にＰＢＳを硝子体注入した。抗ＳＤＦ−１抗体の硝子体注射を、一週間に１回の頻度でその後４週間行った。そして動物を麻酔し、心臓（左心室）の穿刺によって３ｍｌの４％緩衝ホルムアルデヒド中のＴＲＩＴＣ−デキストランを灌流した。次に、処理した眼と処理していない眼の両方の網膜を解剖した。緩衝グリセリン中に網膜を平坦に置いて、共焦点顕微鏡によって撮像した。
【００６６】
別の動物の一団を用いて、上記の実験を繰り返した。ＳＤＦ−１抗体又は偽模擬処理されたＰＢＳのどちらか一方を硝子体注入により動物に処置し、その後動物において網膜虚血が誘発された。血管を観察するために赤色染料で動物を灌流し、共焦点顕微鏡によって撮像した。ＳＤＦ−１抗体注入はｇｆｐ血管芽細胞由来の緑色の血管形成を完全に阻害したのに対して、模擬注入された動物は、推測されたように網膜虚血に反応してｇｆｐ血管芽細胞由来の緑色の血管を形成した。ｇｆｐ陽性血管芽細胞を移植された複数のマウス又はＰＢＳを模擬注入された複数のマウスのどちらかの蛍光共焦点顕微鏡写真により、虚血の誘発後、血管が形成することがわかった。ｇｆｐ陽性血管芽細胞由来の緑色の血管は一般的な機能を示した。共焦点撮像により、抗ＳＤＦ−１抗体の硝子体注入をされた動物中の新しい血管形成は起こらないことがわかった。
【００６７】
（他の実施形態）
発明はその詳細な説明と合わせて述べられているのに対して、前述の説明は説明をすることを意図するものであって発明の範囲を限定することを意図しているものではなく、発明の範囲は添えられている特許請求の範囲によって規定されることが理解される。他の側面、利点及び変形例は、特許請求の範囲にある。
【００６８】
（関連特許）
この出願は、２００２年３月２１日に出願された米国仮特許出願番号第60/367,078号、２００２年１１月２７日に出願された米国仮特許出願番号第60/429,744号及び２００３年２月１９日に出願された米国仮特許出願番号第60/448,691号の優先権を主張する。
【００６９】
（連邦政府委託研究に関する声明）
本発明は、国立生命医学研究所により与えられた補助金交付番号ＨＬ７０７３８に基づくアメリカ合衆国政府の支援を受けた。アメリカ合衆国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【国際調査報告】
2005528362.tif 000002