(57)【要約】酸化的条件下での化学固定因子への組織の曝露によって、組織を化学固定するための方法。この方法に有用である化学固定因子としては、アルデヒド（例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ジアルデヒドデンプン）、イソシアネート（例えば、ヘキサメチレンイソシアネート）および特定のポリエポキシ化合物（例えば、ＤＥＮＡＣＯＬ）が挙げられる。酸化的条件は、大気または酸素の存在下での架橋剤を含む化学固定溶液の加熱によって提供され得る。あるいは、酸化的条件は、化学固定溶液への１つ以上の酸化化学物質（例えば、過酸化水素または他の過酸化物、過ヨウ素酸ナトリウムまたは他の過ヨウ素酸塩、ジイソシアネート、ハロゲン、ｎ−ブロモスクシンイミドまたは他のハロゲン化化合物、過マンガン酸塩、オゾン、クロム酸、塩化スルフリル、スルホキシド、セレノキシド等）の添加によって提供され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的組織を化学的に処理するための方法であって、以下の工程：
（ａ）結合組織タンパク質を含む多量の生物学的組織を提供する工程；および
（ｂ）該生物学的組織内の結合組織タンパク質を固定するための従来の手段と比較して増加した安定性を与えるのに十分な時間にわたり、酸化条件下で、該生物学的組織を溶液と接触させる工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記酸化条件が、工程（ｂ）において、酸素の存在下で前記溶液を加熱することにより提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酸素の存在が、前記溶液中にある周囲の酸素により提供される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記酸素の存在の少なくとも幾分かが、前記溶液を、大気、酸素または酸素を含有する気体の溶液と接触させることによって提供される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記酸素の存在の少なくとも幾分かが、前記溶液を通して酸素または酸素を含有する気体の混合物をバブリングすることにより提供される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記酸化条件が、工程（ｂ）において、酸素の存在下で酸化剤を前記溶液と合わせることによって提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記酸化剤が、過酸化物、過酸化物を含む化合物、過酸化水素、過ヨウ素酸塩、過ヨウ素酸塩を含む化合物、過ヨウ素酸ナトリウム、ジイソシアネート化合物、ハロゲン、ハロゲンを含む化合物、ｎ−ブロモスクシンイミド、過マンガン酸塩、過マンガン酸塩を含む化合物、オゾン、オゾンを含む化合物、クロム酸、塩化スルフリル、スルホキシド、セレノキシド、およびこれらの組み合わせからなる酸化剤の群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記酸素の存在が、前記溶液中にある周囲の酸素により提供される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記酸素の存在の少なくとも幾分かが、前記溶液−酸化剤の混合物を、大気、酸素または酸素を含有する気体の混合物と接触させることによって提供される、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記酸素の存在の少なくとも幾分かが、前記溶液を通して酸素または酸素を含有する気体の混合物をバブリングすることにより提供される、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記酸化条件が、工程（ｂ）において、酸素の存在下で前記溶液に照射することによって提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記溶液が、α電離放射線、β電離放射線、紫外放射線、電子ビーム放射線、γ線およびこれらの組み合わせの群より選択される型の放射エネルギーにより照射される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記酸素の存在が、前記溶液中にある周囲の酸素により提供される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記酸素の存在の少なくとも幾分かが、前記溶液を、大気、酸素または酸素を含有する気体の混合物と接触させることによって提供される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記酸素の存在の少なくとも幾分かが、前記溶液を通して酸素または酸素を含有する気体の混合物をバブリングすることにより提供される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記溶液が流動している、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、前記溶液の流動は、該溶液および前記組織をコンテナ内に入れることによってもたらされ、ここで、該溶液が、加熱され、そして該コンテナを通って循環している、方法。
【請求項１８】
請求項１に記載の方法であって、ここで、工程（ｂ）が以下の工程：
前記組織を、０．２〜２．０％のグルタルアルデヒドを含む溶液中に入れる工程；
該グルタルアルデヒド溶液を、０．５日間〜６０日間の期間にわたって２５℃〜７０℃で維持する工程；および
該グルタルアルデヒド溶液から該組織を取り出す工程、
を包含する、方法。
【請求項１９】
前記溶液が、約０．６２５％のグルタルアルデヒド濃度を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記０．６２５％のグルタルアルデヒド溶液が、約７日間〜約１４日間の間の期間にわたって約４５℃〜約５５℃で維持される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記溶液が、固定剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
固定剤が、グルタルアルデヒドである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
固定剤が、Ｄｅｎａｃｏｌである請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記溶液が過酸化物である請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
組織を含む生体補綴物であって、該補綴物は、以下の工程：
（ａ）結合組織タンパク質を含む多量の生物学的組織を提供する工程；および
（ｂ）該生物学的組織内の結合組織タンパク質の架橋を生じさせるのに十分な時間にわたり、酸化条件下で、該生物学的組織を溶液と接触させる工程、
を包含する方法により調製された、生体補綴物。
【請求項２６】
前記酸化条件が、工程（ｂ）において、酸素の存在下で前記溶液を加熱することにより提供される、請求項２５に記載の生体補綴物。
【請求項２７】
前記工程（ｂ）における酸素の存在が、前記溶液中にある周囲の酸素により提供される、請求項２５に記載の生体補綴物。
【請求項２８】
前記酸素の存在の少なくとも幾分かが、前記溶液を、大気、酸素または酸素を含有する気体の溶液と接触させることによって提供される、請求項２５に記載の生体補綴物。
【請求項２９】
前記酸素の存在の少なくとも幾分かが、工程（ｂ）において、前記溶液を通して酸素または酸素を含有する気体の混合物をバブリングすることにより提供される、請求項２５に記載の生体補綴物。
【請求項３０】
前記酸化条件が、工程（ｂ）において、酸素の存在下で酸化剤を前記溶液と合わせることによって提供される、請求項２５に記載の生体補綴物。
【請求項３１】
前記酸化剤が、過酸化物、過酸化物を含む化合物、過酸化水素、過ヨウ素酸塩、過ヨウ素酸塩を含む化合物、過ヨウ素酸ナトリウム、ジイソシアネート化合物、ハロゲン、ハロゲンを含む化合物、ｎ−ブロモスクシンイミド、過マンガン酸塩、過マンガン酸塩を含む化合物、オゾン、オゾンを含む化合物、クロム酸、塩化スルフリル、スルホキシド、セレノキシド、およびこれらの組み合わせからなる酸化剤の群より選択される、請求項３０に記載の生体補綴物。
【請求項３２】
前記酸素の存在が、前記溶液−酸化剤の混合物中にある周囲の酸素により提供される、請求項３０に記載の生体補綴物。
【請求項３３】
前記酸素の存在の少なくとも幾分かが、前記溶液−酸化剤の混合物を、大気、酸素または酸素を含有する気体の混合物と接触させることによって提供される、請求項３０に記載の生体補綴物。
【請求項３４】
前記酸素の存在の少なくとも幾分かが、前記溶液を通して酸素または酸素を含有する気体の混合物をバブリングすることにより提供される、請求項３０に記載の生体補綴物。
【請求項３５】
前記酸化条件が、工程（ｂ）において、酸素の存在下で前記溶液に照射することによって提供される、請求項２５に記載の生体補綴物。
【請求項３６】
前記溶液が、α電離放射線、β電離放射線、紫外放射線、電子ビーム放射線、γ線およびこれらの組み合わせからなる群より選択される型の放射エネルギーにより照射される、請求項３５に記載の生体補綴物。
【請求項３７】
前記酸素の存在が、前記溶液中にある周囲の酸素により提供される、請求項３５に記載の生体補綴物。
【請求項３８】
前記酸素の存在の少なくとも幾分かが、前記溶液を、大気、酸素または酸素を含有する気体の混合物と接触させることによって提供される、請求項３５に記載の生体補綴物。
【請求項３９】
前記酸素の存在の少なくとも幾分かが、前記溶液を通して酸素または酸素を含有する気体の混合物をバブリングすることにより提供される、請求項３５に記載の生体補綴物。
【請求項４０】
前記溶液が流動している、請求項２５に記載の生体補綴物。
【請求項４１】
請求項４０に記載の生体補綴物であって、前記溶液の流動は、該溶液および前記組織を固定コンテナ内に入れることによってもたらされ、ここで、該溶液が、加熱され、そして該コンテナを通って循環している、生体補綴物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般的に、医療用のデバイスおよび方法に関し、より詳細には、移植可能な生体補綴物質（ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ  ｍａｔｅｒｉａｌ）およびそれらの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
（Ｉ．生体補綴デバイスの調製および使用）
移植可能な生体補綴デバイスが、凍結（すなわち低温保存）によってか、または化学固定（すなわち、なめし）によって保存されたヒトまたは動物の組織から全体的にまたは部分的に形成される。生体補綴物として用いられる生物学的組織の型としては、心臓の弁、血管、皮膚、硬膜、心膜、靱帯および腱が挙げられる。これらの生物学的組織は、代表的に、組織の支持的骨格として作用する結合組織タンパク質（すなわち、コラーゲンおよびエラスチン）を含む。各々の生物学的組織の柔軟性（ｐｌｉａｂｉｌｉｔｙ）または剛性は、組織内に存在するコラーゲンおよびエラスチンの相対量によってか、および／またはその結合組織骨格の物理的構造およびコンフォメーションにより大部分が決定される。コラーゲンは、ほとんどの組織に存在する最も豊富な結合組織タンパク質である。各々のコラーゲン分子は、コイル状で螺旋状の構成に編み合わされた３つのポリペプチド鎖からなる。
【０００３】
生物学的組織の化学固定のために用いられる技術は、代表的に、所定のコラーゲン分子内のポリペプチド鎖の間の架橋（すなわち、分子内架橋）または隣接するコラーゲン分子の間のポリペプチド鎖の間の架橋（すなわち、分子間架橋）を形成する１つ以上の化学固定剤（すなわち、なめし剤）への、生物学的組織の曝露を含む。
【０００４】
コラーゲン性の生物学的組織を架橋するために以前から使用されてきた化学固定剤の例としては、以下；ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ジアルデヒドデンプン、ヘキサメチレンジイソシアネート、および特定のポリエポキシ化合物、が挙げられる。利用可能な種々の化学固定剤の内、グルタルアルデヒドが、最も広範に用いられている。
【０００５】
グルタルアルデヒドは、多くの市販の生体補綴製品（例えば、ブタ生体補綴心臓弁（例えば、Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ−Ｅｄｗａｒｄｓ（登録商標）Ｓｔｅｎｔｅｄ  Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｓｉｓ）、ウシ心膜心臓弁補綴物（例えば、Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ−Ｅｄｗａｒｄｓ（登録商標）ＰＥＲＩＭＯＵＮＴ（登録商標）Ｐｅｒｉｃａｒｄｉａｌ  Ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｓｉｓ）およびステントレスのブタ大動脈補綴物（例えば、Ｅｄｗａｒｄｓ  ＰＲＩＭＡ  ＰｌｕｓＴＭ  Ｓｔｅｎｔｌｅｓｓ  Ａｏｒｔｉｃ  Ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｓｉｓ）（全て、Ｅｄｗａｒｄｓ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ  ９２６１４から入手可能である））についての固定剤として用いられる。
【０００６】
コラーゲン架橋剤としての使用が以前から知られているポリエポキシ化合物は、米国特許第４，８０６，９５９号（Ｎｏｉｓｈｉｋｉら）および同第５，０８０，６７０号（Ｉｍａｍｕｒａら）に記載されている。以前より知られているこれらのポリエポキシ固定剤の少なくともいくつかは、Ｎａｇａｓｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｌｔｄ．（大阪、日本）からＤＥＮＡＣＯＬの商標の元で市販されている。特に、コラーゲン架橋剤としての使用が開示されている１つの二官能性エポキシ化合物は、日本国大阪のＮａｇａｓｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｌｔｄ．から、ＤＥＮＡＣＯＬとの名称の元で市販されているエチレングリコールジグリシジルエーテルベースの化合物である。
【０００７】
（ｉｉ  組織工学のための移植可能な足場の使用）
組織工学は、生物学の原理を使用する新たに出てきた技術であり、そしてヒトの器官または組織の保存、置換、補修または改善のための生きた「操作される組織」を開発するための技術である。ほとんどの用途において、この操作される組織は、患者内に恒久的に組み込まれ、これにより、欠損性の疾患または変形に対して強力で恒久的な治癒をもたらす。
【０００８】
多くの年月にわたり細胞がインビボで培養されてきたが、組織工学の分野における進歩により、器官または解剖学的構造の修復または再構築のために必要とされる特定の三次元構造で細胞を増殖し得るようになったのはごく最近のことである。組織工学のための３つの一般的なアプローチが明らかにされている：
１．後の外科的移植のための、身体の外側の人組織の設計および増殖。この最も一般的な例は、火傷の処置のために使用される皮膚移植片である。いくつかの例において、予備形成「足場（ｓｃａｆｆｏｌｄｉｎｇ）」デバイス（すなわち、具体的に構成されたマトリクス）を提供して、培養細胞を所望の形状または構成に増殖させることが、所望される。構造マトリクス上での、口腔組織および歯組織のエキソビボ培養のための１つのこのような方法は、米国特許第５，８８５，８２９号（Ｍｏｏｎｅｙら）、表題「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｏｒａｌ  Ｔｉｓｓｕｅｓ」に記載される。
【０００９】
２．身体内の組織の再生を誘導する、細胞を含有する足場デバイスまたは細胞を含まない足場デバイス（すなわちマトリクス）の移植。特定の生物学的因子または「シグナル」分子（例えば、増殖因子）が、足場誘導組織再生を援助するために投与され得る。今日まで、ポリマーマトリクスが、細胞が付着して組織を再構成するように増殖する足場デバイスを形成するために使用されている。このアプローチの一例は、歯周病（すなわち、慢性し肉疾患）に罹患している患者において骨の再生を促進するための生体材料足場の移植である。
【００１０】
３．疾患内部組織の機能を交換するための、機能的組織を含む内部デバイスまたは外部デバイスの移植または取付け。このアプローチは、患者の身体から細胞を単離する工程、この細胞を足場デバイス（すなわち、構造マトリクス）の上または中に配置する工程、および細胞に含浸した足場デバイスを身体の内側に移植する工程、またはこの細胞に含浸した足場デバイスを身体に取り付ける工程を包含する。このアプローチの例としては、患者自身の内皮細胞で裏打ちまたはシードされた血管移植片の移植および人工肝臓の移植が挙げられる。
【００１１】
組織操作の領域における進行中の研究は、皮膚、軟骨、骨中枢神経系組織、筋肉、肝臓および膵島（インスリン産生）細胞を操作する試みである。組織操作技術は、いつの日か、患者自身の身体由来の操作された組織または期間を試用して行われるべき臓器移植を可能にし、それにより、移植拒絶の可能性および抗拒絶治療の必要性（例えば、免疫抑制薬の長期の投与）を排除するかもしれない。
【００１２】
今日まで、組織操作において使用される足場またはマトリクスのほとんどは、合成ポリマーマトリクスから作製されていた。天然の組織を足場として使用することが望ましいが、従来技術の組織固定技術により固定されるほとんどの天然の組織は、このような足場形成用途において使用するのに必要な耐久性を示していない。
【００１３】
最近、生物学的組織を固定（すなわち、なめし）し、組織操作における種々の用途（足場形成用途を含む）において使用するのに十分生物学的に適合性でありかつ耐久性の生体補綴組織を提供するための新規の方法を開発する必要性が当該分野において残っている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（発明の要旨）
広範に記載される本発明は、酸化的条件下で組織を溶液に曝露することによって、組織の化学的処理を行うための方法を提供する。この溶液は、アルデヒド（例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ジアルデヒドデンプン）、イソシアネート（例えば、ヘキサメチレンジイソシアネート）および特定のポリエポキシ化合物（例えば、ＤＥＮＡＣＯＬ）を含む化学固定液であり得る。この酸化的条件は、室内の空気および酸素の存在下で、架橋剤を含む溶液を加熱することによって提供され得る。あるいは、この酸化的条件は、１つ以上の酸化化学物質（例えば、過酸化水素もしくは他の過酸化物、過ヨウ素酸ナトリウムもしくは他の過ヨウ素酸塩、ジイソシアネート、ハロゲン、ｎ−ブロモスクシンイミドまたは他のハロゲン化化合物、過マンガン化物、オゾン、クロム酸、塩化スルフリル、スルホキシド、セレノキシドなど）によって、またはこのような化学物質を化学固定溶液に添加することによって、提供され得る。あるいは、この酸化的条件は、室内の空気または酸素の存在下における、溶液の照射（例えば、α線、β線、紫外線、電子ビーム、γ線）によって、提供され得る。本発明に従う酸化的条件下で固定された組織は、酸加水分解に対して改善された抵抗性を示し、従って、酸化的条件の非存在下で固定された組織と比較した場合、改善された安定性を示す。
【００１５】
この溶液は、固定液（例えば、グルタルアルデヒドまたはＤｅｎａｃｏｌ）であり得るか、または過酸化物であり得る。本発明に従う例示的な方法は、０．２〜２．０％のグルタルアルデヒドを含む溶液中に組織を入れることによって、この組織を参加的条件に曝露する工程、このグルタルアルデヒド溶液を、０．５〜６０日間、２５℃〜７０℃に維持する工程、およびこのグルタルアルデヒド溶液から組織を取り出す工程を包含する。この溶液は、望ましくは、約０．６２５％のグルタルアルデヒド濃度を有し、そして約７〜１４日の間（好ましくは、７日間近く）、約４５〜５５℃で維持される。
【００１６】
さらに本発明によると、上で要約した本発明の方法により調製された組織から全体的にまたは部分的に形成された生体補綴デバイスまたは物品が提供される。本発明に従う生体補綴デバイスまたは物品を調製するために使用され得る特定の生物学的組織としては、以下が挙げられるが、これらに限定される必要はない：心臓弁；静脈弁；血管；尿管；腱；硬膜；皮膚；心膜；軟骨（例えば、半月）；靱帯；骨；腸（例えば、腸壁）；および骨膜。
【００１７】
さらに本発明によると、本発明の酸化的固定方法によって調製された生体補綴デバイスを移植することによる、哺乳動物患者の疾患および障害の処置のための方法が提供される。このような処置方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ａ）罹患した心臓弁を、本発明の固定方法により調製した生体補綴心臓弁で外科的に交換すること、ｂ）本発明の固定方法により調製した血管移植片を移植することによる、血管の修復およびバイパス形成、ｃ）本発明の固定方法により調製した生体補綴靱帯を移植することによって、断絶または不足した靱帯を外科的に交換または修復すること、およびｄ）本発明の固定方法（例えば、天然の組織足場を用いる組織操作）により調製した１つ以上の生体補綴組織足場を移植することによって、元の組織を、修復するか、再構築するか、再形成するか、促進するか、かさ高くするか、伸長させるか、再構成および再生成すること。
【００１８】
本発明のさらなる局面および目的は、以下に記載の「例示的な実施形態の詳細な説明」を読み理解すると、関連分野の当業者に明らかとなる。
【００１９】
本発明のさらなる実施形態および局面は、以下に記載の詳細な説明および特定の実施例を読み、理解すると、当業者に明らかになり得る。
【００２０】
（例示的な実施形態の詳細な説明）
以下の実施例は、本発明のいくつかの例示的な実施形態を記載および例示する目的のみで、示される。本発明の他の実施形態が、可能であるが、本明細書中では詳細に記載しない。従って、これらの実施例は、いずれの様式でも本発明の範囲を限定することを意図しない。
【実施例】
【００２１】
当業者は、酸素の存在下で固定溶液を単に加熱すること（例えば、室内の空気または酸素で覆われたまま、または固定溶液に室内の空気または酸素をバブリングしながら、この溶液を加熱すること）から、この固定溶液に酸化化学物質を添加すること（例えば、液体過酸化水素溶液を添加することまたは気体のオゾンをこの固定溶液にバブリングすること）までの範囲の種々の方法で、酸化的条件が生成され得ることを理解する。
【００２２】
（１．一般的方法論）
図１は、本発明に従う生体補綴材料を調製する一般的方法を記載する流れ図である。示されるように、この方法は、ａ）ヒトまたは動物ドナーから所望の生物学的組織を収集する工程、およびｂ）この組織を、酸化的条件下で、少なくとも１種の固定液に曝露する工程、を包含する。この固定液は、以下のような、結合組織タンパク質を架橋する任意の適切な化学物質であり得る：
アルデヒド（例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ジアルデヒドデンプン）；
イソシアネート（例えば、ヘキサメチレンジイソシアネート）；および／または
ポリエポキシ化合物（例えば、ポリグリシジルエーテル）。
【００２３】
この酸化的条件は、室内の空気または酸素の存在下で、架橋剤を含む化学固定溶液を加熱することによって、提供され得る。あるいは、この酸化的条件は、１つ以上の酸化化学物質（例えば、過酸化水素もしくは他の過酸化物、過ヨウ素酸ナトリウムもしくは他の過ヨウ化物、ジイソシアネート、ハロゲン、ｎ−ブロモスクシンイミドもしくは他のハロゲン化化合物、過マンガン化物、オゾン、クロム酸、塩化スルフリル、スルホキシド、セレノキシドなど）を、この化学固定溶液に添加することによって、提供され得る。あるいは、この酸化的条件は、以下を含む化学的酸化を促進するための任意の適切な手段によって提供され得る：
酸素（例えば、周囲の酸素、室内の空気、または気体の酸素）の存在下で、生物学的組織の曝露の間に、固定液を加熱すること；
酸素（例えば、周囲の酸素、室内の空気、または気体の酸素）の存在下で、生物学的組織の曝露の間に、固定液を照射（例えば、α線、β線、紫外線、電子ビーム、γ線）すること；および／または生物学的組織の曝露の前またはその間に、固定液に、化学酸化剤（例えば、過酸化物、過ヨウ化物、化マンガン化物、オゾン、ｎ−ブロモスクシンイミド、ハロゲンなど）を添加すること。
【００２４】
図２は、熱が、生物学的組織の固定の間に、酸化的条件を提供するために使用される方法の例を示す。この方法の特定の工程は、以下のとおりである：
（２．酸化が固定液の加熱により達成される方法）
図２の流れ図は、組織の曝露の間、固定液（例えば、グルタルアルデヒド）を加熱することにより、酸化的条件が生成される、組織固定方法の例を示す。図２で示される方法の工程は、以下のとおりである：
工程１：生物学的組織の収集／調製
所望の生物学的組織を収集する（すなわち、その宿主動物から、外科的に取り出すかまたは切断する）。その後、この組織を、代表的には、切り取るかまたはある大きさに切断し、そして滅菌水、塩基性塩溶液、生理食塩水または他の適切な洗浄溶液で洗浄する。
【００２５】
工程２：室内の空気または酸素の存在下における加熱／流動固定溶液を用いる生物学的組織の固定
次いで、この生物学的組織を、米国特許第５，９３１，９６９（本明細書中で明確に参考として援用される）に記載されるタイプの循環固定カラムに入れる。この固定カラムを、適切なレベルまで、０．６２５重量％のグルタルアルデヒド溶液（リン酸緩衝液のような適切な緩衝液により約ｐＨ７．４まで緩衝化されている）で満たす。室内の空気で、このグルタルアルデヒド溶液を囲むかまたは覆う。浸漬可能なヒーターを、このグルタルアルデヒド溶液中に入れ、そしてこの溶液を、カラム型デバイスを通して循環させる。次いで、予め収集された、切り取られて洗浄された組織を、米国特許第５，９３１，９６９号に記載されるようなカラムデバイスに入れ、このグルタルアルデヒド溶液を、このデバイスを通して循環させ、そしてこのヒーターを使用して、グルタルアルデヒド溶液の温度を、約７〜１４日間の間、５０＋／−５℃に維持する。その後、この組織を、このカラムから取り出し、そしてリンスする。
【００２６】
上記のタイプの固定カラムデバイス中に組織を入れること以外は、この固定溶液を移動または流し得る任意の他の適切な手段が使用され得ることが理解される。例えば、この組織は、固定溶液に入れられ得、次いで、この溶液は振盪されるか、撹拌されるか、またはそうでなければ、当該分野で公知の多数のタイプの振盪器またはスターラーのいずれか（米国特許第５，９３１，９６９号に示される振盪器またはスターラーを含む）を使用して撹拌され得る。
【００２７】
この方法を使用して固定された組織が、１１０℃の６ＮのＨＣｌに５日間浸漬される場合、これらは、最小の変性を示す。逆に、従来のグルタルアルデヒド固定技術により固定された組織は、代表的に、１１０℃の６ＮのＨＣｌに２４時間未満曝露された後に、実質的な変性を示す。
【００２８】
上記は、本発明の好ましい実施形態を記載してきたが、種々の代替物、変更物および等価物が使用され得る。さらに、特定の他の変更が、添付の特許請求の範囲内で実施され得ることが、明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、本発明の酸化的処理方法の一般的な流れ図である。
【図２】図２は、本発明の酸化的処理方法の流れ図であり、ここで、酸化的条件は、酸素の存在下で、流動性の溶液を加熱することによって提供される。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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