(57)【要約】本発明は、アルツハイマー病および他のアミロイド関連疾患を予防および／または治療するための立体化学に基づいた「非自己」抗原ワクチンに関する。本発明は、天然型ペプチド、タンパク質、または免疫原を用いることに関連する欠点を克服する、アルツハイマー病および他のアミロイド関連疾患を予防および治療するためのワクチンを提供する。2005508863.tif 000012
2005508863.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原量の全-Dアミロイドβペプチドを被験体に投与する段階を含む、被験体のアミロイド関連疾患を予防および／または治療する方法であって、該全-Dアミロイドβペプチドが、該アミロイド-βペプチドに対する該被験体による免疫応答を誘導し、該全D-アミロイドβペプチドが、配列番号：1〜70からなる群より選択される配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有する方法。
【請求項２】
全-Dペプチドがアミロイドタンパク質の少なくとも1つの領域と相互作用し、該領域が、N-またはC-末端領域、βシート領域、GAG-結合部位領域、マクロファージ接着領域、それらの免疫原性断片、それらのタンパク質結合物、それらの免疫原性誘導体ペプチド、それらの免疫原性ペプチド、およびそれらの免疫原性ペプチド様物質からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
全-Dペプチドが、さらに、
(a)水素、
炭素原子数1〜8の非環式または環式からなる低級アルキル基、
芳香族基、
複素環基、および
アシル基
からなる群より選択されるN-末端置換基、ならびに
(b)ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、置換されていてもよいアミノ基からなる群より選択されるC-末端置換基
を含む、請求項2記載の方法。
【請求項４】
アルキルまたは芳香族基が、ハロゲン化物基、ヒドロキシル基、アルコキシル基、アリールオキシル基、ヒドロキシカルボニル基、アルコキシルカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、カルバミル基、非置換アミノ基、置換アミノ基、スルホ基、アルキルオキシスルホニル基、ホスホノ基およびアルコキシホスホニル基からなる群より選択される基でさらに置換されている、請求項3記載の方法。
【請求項５】
全-Dペプチドが、酸性官能基または薬学的に許容されるその塩もしくはエステル形態をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項６】
全-Dペプチドが、塩基性官能基または薬学的に許容されるその塩の形態をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項７】
全-Dペプチドが可溶性アミロイド-βの除去を誘導し、それによってアミロイド誘導性細胞毒性、神経変性を予防もしくは減少させるか、または斑の形成を低下もしくは阻害する、請求項1記載の方法。
【請求項８】
以下の段階を含む、それを必要としている第1の哺乳類のアミロイド関連疾患を予防および／または治療する方法：抗原量の全-Dアミロイドβペプチドを第2の哺乳類に投与し、該全-Dアミロイドβペプチドが、該第2の哺乳類においてアミロイド-βペプチドに対する免疫応答を誘導する段階と、該第2の哺乳類から抗体または免疫細胞を回収する段階と、該第1の哺乳類に治療的または予防的に有効な用量の抗体または免疫細胞を提供する段階。
【請求項９】
全-Dアミロイドβペプチドが、配列番号：1〜70からなる群より選択される配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
全-Dペプチドがアミロイドタンパク質の少なくとも1つの領域と相互作用し、該領域が、C-末端領域、βシート領域、GAG-結合部位領域、マクロファージ接着領域、それらの免疫原性断片、それらのタンパク質結合物、それらの免疫原性誘導体ペプチド、それらの免疫原性ペプチド、およびそれらの免疫原性ペプチド様物質からなる群より選択される、請求項8記載の方法。
【請求項１１】
全-Dペプチドが、さらに、
(a)水素、
炭素原子数1〜8の非環式または環式からなる低級アルキル基、
芳香族基、
複素環基、および
アシル基
からなる群より選択されるN-末端置換基、ならびに
(b)ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、置換されていてもよいアミノ基からなる群より選択されるC-末端置換基
を含む、請求項8記載の方法。
【請求項１２】
アルキルまたは芳香族基が、ハロゲン化物基、ヒドロキシル基、アルコキシル基、アリールオキシル基、ヒドロキシカルボニル基、アルコキシルカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、カルバミル基、非置換アミノ基、置換アミノ基、スルホ基、アルキルオキシスルホニル基、ホスホノ基、およびアルコキシホスホニル基からなる群より選択される基でさらに置換されている、請求項8記載の方法。
【請求項１３】
全-Dペプチドが、酸性官能基または薬学的に許容されるその塩もしくはエステル形態をさらに含む、請求項8記載の方法。
【請求項１４】
全-Dペプチドが、塩基性官能基または薬学的に許容されるその塩の形態をさらに含む、請求項8記載の方法。
【請求項１５】
全-Dペプチドが可溶性アミロイド-βの除去を誘導し、それによってアミロイド誘導性細胞毒性、神経変性を予防もしくは減少させるか、または斑の形成を低下もしくは阻害する、請求項8記載の方法。
【請求項１６】
抗原量の全-Dアミロイドβペプチドを被験体に投与する段階を含む、哺乳類の血清アミロイド-βレベルを変更する方法であって、該全-Dアミロイドβペプチドが、該アミロイド-βペプチドに対する該被験体による免疫応答を誘導し、該全D-アミロイドβペプチドが、配列番号：1〜70からなる群より選択される配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有する方法。
【請求項１７】
哺乳類の血清アミロイド-βレベルの変更により、哺乳類からの可溶性アミロイド-βまたは原線維アミロイド-βの除去が促進される、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
哺乳類からの可溶性アミロイド-βまたは原線維アミロイド-βの除去により、該哺乳類の脳内での斑の形成が低下または阻害される、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
全-Dペプチドが、さらに、
(a)水素、
炭素原子数1〜8の非環式または環式からなる低級アルキル基、
芳香族基、
複素環基、および
アシル基
からなる群より選択されるN-末端置換基、ならびに
(b)ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、置換されていてもよいアミノ基からなる群より選択されるC-末端置換基
を含む、請求項16記載の方法。
【請求項２０】
アルキルまたは芳香族基が、ハロゲン化物基、ヒドロキシル基、アルコキシル基、アリールオキシル基、ヒドロキシカルボニル基、アルコキシルカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、カルバミル基、非置換アミノ基、置換アミノ基、スルホ基、アルキルオキシスルホニル基、ホスホノ基、およびアルコキシホスホニル基からなる群より選択される基でさらに置換されている、請求項16記載の方法。
【請求項２１】
全-Dペプチドが、酸性官能基または薬学的に許容されるその塩もしくはエステル形態をさらに含む、請求項16記載の方法。
【請求項２２】
全-Dペプチドが、塩基性官能基または薬学的に許容されるその塩の形態をさらに含む、請求項16記載の方法。
【請求項２３】
全-Dペプチドが可溶性アミロイド-βの除去を誘導し、それによってアミロイド誘導性細胞毒性もしくは神経変性を予防または減少させる、請求項16記載の方法。
【請求項２４】
アミロイド関連疾患が、過剰のアミロイド-βペプチドを含む疾患であって、アミロイド-βペプチドに対する被験体による免疫応答を誘導し、それによって該アミロイド-βペプチドの過剰なレベルを低下させ、それによって該アミロイド関連疾患を治療または予防する、請求項1記載の方法。
【請求項２５】
アミロイド関連疾患がアルツハイマー病である、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
アミロイド関連疾患が脳アミロイド血管障害である、請求項24記載の方法。
【請求項２７】
アミロイド関連疾患が、過剰のアミロイド-βペプチドを含む疾患であって、アミロイド-βペプチドに対する被験体による免疫応答を誘導し、それによって該アミロイド-βペプチドの過剰なレベルを低下させ、それによって該アミロイド関連疾患を治療または予防する、請求項8記載の方法。
【請求項２８】
アミロイド関連疾患がアルツハイマー病である、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
アミロイド関連疾患が脳アミロイド血管障害である、請求項27記載の方法。
【請求項３０】
アミロイド関連疾患が、過剰のアミロイド-βペプチドを含む疾患であって、アミロイド-βペプチドに対する被験体による免疫応答を誘導し、それによって該アミロイド-βペプチドの過剰なレベルを低下させ、それによって該アミロイド関連疾患を治療または予防する、請求項16記載の方法。
【請求項３１】
アミロイド関連疾患がアルツハイマー病である、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
アミロイド関連疾患が脳アミロイド血管障害である、請求項30記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
本発明は、アルツハイマー病および他のアミロイド関連疾患を予防および／または治療するための、立体化学に基づいた新規「非自己」抗原ワクチンに関する。
【０００２】
アミロイド症とは、アミロイド線維の存在によって特徴付けられる病的な状態をいう。アミロイドは、数多くの異なる疾病に見られる、多様であるが特定のタンパク質の沈着物群(細胞内および／または細胞外)をさす、総称的な用語である。アミロイド沈着物は全て、発生は多様であるが、共通の形態的特性を有し、特定の染料(例えば、コンゴーレッド)で染まり、染色後の偏光下において特徴的な赤-緑複屈折外観を有する。それらはまた、共通の超微細構造的な特徴を共有し、共通のx線回折および赤外線スペクトルも共有する。
【０００３】
アミロイド関連疾患は1つの臓器に限定されても、またはいくつかの臓器に及んでもよい。第1の例は「局所性アミロイド症」と言われ、2番目は「全身性アミロイド症」と言われる。
【０００４】
アミロイド性疾患には特発性のものもあるが、これらの疾患のほとんどは以前から存在する疾患の合併症として出現する。例えば、原発性アミロイド症は任意の他の症状を伴わないで出現したり、または形質細胞異形成もしくは多発性骨髄腫に後に生じることがある。二次的なアミロイド症は、通常、慢性感染症(結核など)または慢性炎症(慢性関節リウマチなど)に関連して見られる。家族型の二次的アミロイド症も家族性地中海熱(FMF)に見られる。この家族型のアミロイド症は、他の型の家族性アミロイド症の1つと同様に、遺伝的に受け継がれ、特定の集団群に見出される。これら2つの型のアミロイド症では、沈着物はいくつかの臓器において見られ、全身性アミロイド疾患と考えられる。別の型の全身性アミロイド症は長期血液透析患者において見られる。これらの症例の各々では、異なるアミロイド形成タンパク質がアミロイド沈着に関与している。
【０００５】
「局所性アミロイド症」は、1つの臓器系に関与する傾向のあるものである。異なるアミロイドはまた、沈着物中に存在するタンパク質の種類によって特徴付けられる。例えば、スクレイピー、ウシ海綿状脳炎、クロイツフェルト-ヤコブ病などのような神経変性疾患は、中枢神経系にプロテアーゼ-耐性型のプリオンタンパク質(AScrまたはPrP-27と言われる)が出現し、蓄積することによって特徴付けられる。同様に、別の神経変性疾患であるアルツハイマー病は、老人斑および神経原線維変化によって特徴付けられる。この場合には、原線維Aβアミロイドタンパク質の沈着によって斑および血管アミロイドが形成される。成人発症糖尿病(II型糖尿病)などの他の疾患は、膵臓へのアミロイドの局所的な蓄積によって特徴付けられる。
【０００６】
これらのアミロイドは一旦形成されると、インサイチューで沈着物の大部分を溶解する広く認められている既知の療法または治療法はない。
【０００７】
アミロイド形成タンパク質は各々、β-シートを形成して、細胞外または細胞内に沈着する不溶性の原線維を形成する能力を有する。アミロイド形成タンパク質は各々、アミノ酸配列が異なるが、原線維を形成し、プロテオグリカン、アミロイドPおよび補体成分などの他の要素に結合する同じ特性を有する。さらに、アミロイド形成タンパク質は各々、異なるが、プロテオグリカンのグリコサミノグリカン(GAG)部分に結合する能力を有する領域(GAG結合部位と言われる)およびβ-シート形成を促進する他の領域などの類似性を示すアミノ酸配列を有する。
【０００８】
具体的な症例では、アミロイド性原線維は、一旦沈着すると、周囲の細胞に毒性となることがある。一例として、老人斑として形成されるAβ原線維は、アルツハイマー病患者において神経細胞の死および小神経膠細胞症に関連することが示されている。インビトロにおいて試験したとき、Aβペプチドは、小神経膠細胞(脳マクロファージ)の活性化過程を誘導できることが示され、アルツハイマー病患者の脳に見出される小神経膠細胞症および脳の炎症の存在を説明すると思われる。
【０００９】
II型糖尿病患者に見られる別の型のアミロイド症では、アミロイド形成タンパク質IAPPは、インビトロにおいてβ-島細胞毒性を誘導することが示されている。このように、II型糖尿病患者の膵臓にIAPP原線維が出現は、β島細胞(ランゲルハンス)の損失および臓器の機能不全に寄与しうる。
【００１０】
アルツハイマー病に罹患している人は、以下の3つの大きな脳の構造的な変化を伴う、成人期の進行性痴呆を発症する：脳の多数の箇所におけるニューロンの散在性損失；神経原線維変化と呼ばれる細胞内タンパク質沈着物の蓄積；および奇形の神経終末(ジストロフィー性神経突起(dystrophic neurite))が取り巻くアミロイドまたは老人斑と呼ばれる細胞外タンパク質沈着物の蓄積。これらのアミロイド斑の主な構成成分は、β-アミロイド前駆体タンパク質(APP)の切断によって産生される40〜42アミノ酸タンパク質である、アミロイド-βペプチド(Aβ)である。アルツハイマー病の対症療法は存在するが、この疾患は現在では予防も治癒もできない。
【００１１】
アルツハイマー病を治療するためにワクチンを使うことは、原理的には可能である(Schenk, D.ら、(1999) Nature 400, 173-177)。Schenkらは、(アルツハイマー病において見られるような)脳アミロイド症の遺伝子組換えマウスモデルにおいて、Aβペプチドによる免疫化によって、アミロイド斑および関連するジストロフィー性神経突起の形成が抑制されることを示す。その検討において、凝集したヒトの全-Lペプチドを免疫原として使用するワクチンは、ワクチン投与した遺伝子組換えマウスにおいて、β-アミロイド斑の形成、星状膠細胞症、および神経突起ジストロフィーを防いだ。
【００１２】
しかし、内因性タンパク質（すなわち、ワクチン投与する動物に天然に存在するタンパク質）をワクチンとして使用するには数多くの欠点があることは明らかである。これらの欠点として、以下のものが挙げられる：
・「自己」タンパク質に対する抗体の形成による自己免疫疾患発症の可能性。
・宿主の免疫系が免疫寛容を破綻させられないことによる免疫応答誘導の困難。
・小神経膠細胞による抗体媒介性食作用による脳内の急性炎症応答発生の可能性。
・抗イディオタイプ抗体の形成。
【発明の開示】
【００１３】
発明の概要
本発明は、アルツハイマー病および他のアミロイド関連疾患を予防および／または治療するための、立体化学に基づいた「非自己」抗原ワクチンに関する。本発明の１つの目的は、原線維タンパク質（例えば、ベータアミロイド）などの、天然型ペプチド、タンパク質または免疫原を使用することに関連する欠点を克服する、アルツハイマー病および他のアミロイド関連疾患を予防および治療するためのワクチンを提供することである。
【００１４】
本明細書において使用する「原線維および／またはアミロイドペプチド」という用語は、本明細書において考察するモノマー、オリゴマーおよび可溶性β-アミロイドまたは任意の原線維タンパク質、ならびに天然に存在しうる、合成により構築されるまたは既知の原線維タンパク質に対応する任意の他の構造変種を含む。具体的には、原線維および／またはアミロイドペプチドは、アミロイドまたはその任意の構造変種などの、原線維ペプチド由来の少なくとも3つのアミノ酸からなる。「対応する」という用語は、ポリヌクレオチド配列が基準ポリヌクレオチド配列の全てもしくは一部と相同（すなわち、同一であり、進化的に厳密に関連するものではない）であること、またはポリペプチド配列が基準ポリペプチド配列と同一であることを意味するために本明細書において使用される。対照的に、「相補的である」という用語は、相補的な配列が基準ポリヌクレオチド配列の全てまたは一部と相同であることを意味するために本明細書において使用される。例えば、ヌクレオチド配列「TATAC」は基準配列「TATAC」に対応し、基準配列「GTATA」と相補的である。
【００１５】
「アミロイド関連疾患」という用語は、1つの臓器に限定されても（「局所性アミロイド症」）またはいくつかの臓器に広がってもよい（「全身性アミロイド症」）、可溶性または不溶性（斑）形態のアミロイドの蓄積に関連する疾患を含む。二次的なアミロイド症は、家族性地中海熱(FMF)にも見られる家族型の二次的なアミロイド症を含む、慢性感染症（結核など）または慢性炎症（慢性関節リウマチなど）に関連する場合もある。別の型の全身性アミロイド症は長期血液透析患者において見られる。局所型のアミロイド症には、II型糖尿病およびその任意の関連疾患、スクレイピー、ウシ海綿状脳炎、クロイツフェルト-ヤコブ病、アルツハイマー病、脳アミロイド血管症およびプリオンタンパク質関連疾患などの神経変性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１６】
本発明のワクチンは、アミロイド関連疾患を予防および／または治療する際に使用しても、アミロイド関連疾患を予防および／または治療するための医薬品を製造する際に使用してもよい。原線維ペプチドまたはタンパク質は、本明細書において記載するように、ある種の形態のアミロイド疾患に関連することが既知の原線維前駆体タンパク質から誘導することができる。このような前駆体タンパク質には、血清アミロイドAタンパク質(ApoSAA)、免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、ApoAl、トランスチレチン、リゾチーム、フィブリノーゲンα鎖、ゲルソリン、シスタチンC、アミロイドβタンパク質前駆体(β-APP)、β2ミクログロブリン、プリオン前駆体タンパク質(PrP)、心房性ナトリウム利尿因子、ケラチン、島アミロイドポリペプチド、ペプチドホルモンおよびシヌクレインが挙げられるが、これらに限定されない。このような前駆体には、このような前駆体の突然変異タンパク質、タンパク質断片およびタンパク質分解ペプチドも含まれる。好ましい態様において、ペプチドは、原線維前駆体タンパク質に関して、アミロイド形成タンパク質またはペプチドによって形成されるエピトープに対して向けられる免疫応答を誘導するのに効果的である。すなわち、本明細書にさらに詳細に記載するように、多数の原線維形成ペプチドまたはタンパク質は、上記に掲載したものなどのこのような前駆体タンパク質の断片である。タンパク質分解切断などによってこのような断片が形成されると、前駆体には存在せず、従って断片が前駆体タンパク質の一部であるときには免疫系に免疫学的に利用できないエピトープが露出されることがある。
【００１７】
別の態様において、ペプチドは、アミロイド形成タンパク質またはペプチドによって形成されるエピトープに対して向けられる免疫応答を誘導するのに効果的である。アミロイド形成タンパク質またはペプチドは、アミロイドペプチドまたはタンパク質と同義であり、原線維、斑またはアミロイド沈着物を形成することができるタンパク質またはペプチドを含む。用語「Aβ」、「Aβペプチド」、「β-アミロイドペプチド」および「アミロイドβ」ペプチドは同義であり、本明細書に記載するベータアミロイド前駆体タンパク質(β-APP)から誘導される約38〜43のアミノ酸の1つ以上のペプチド組成物をいう。分離型Aβは、Aβの可溶性モノマーおよびオリゴマーペプチド単位を意味する。モノマーAβを作製する方法の1つは、凍結乾燥したペプチドを超音波で純粋なDMSOに溶解することである。得られた溶液を遠心分離して、任意の不溶性粒子を除去する。凝集したAβは、モノマー単位が非共有結合によって保持されているオリゴマーの混合物である。さらに、APP695、APP751およびAPP770は、それぞれ、ヒトAPP遺伝子によってコードされる鎖長695、751および770のアミノ酸残基長のポリペプチドをいう。Kangら、Nature 325, 773 (1987)、Ponteら、Nature 331, 525 (1988)およびKitaguchiら、Nature 331, 530 (1988)を参照されたい。ヒトアミロイド前駆体タンパク質(APP)内のアミノ酸は、APP77Oアイソフォームの配列による数が割り付けられる。Aβ39、Aβ40、Aβ41、Aβ42およびAβ43などの用語は、それぞれ、アミノ酸残基1〜39、1〜40、1〜41、1〜42および1〜43を含有するAβペプチドをいう。好ましくは、Aβペプチドはアミノ酸残基10〜21を含有する。さらに好ましくは、Aβペプチドはアミノ酸残基13〜21を含有する。
【００１８】
このように、本発明の一態様において、「自己」タンパク質を使用する欠点を回避するために、非天然型D-型アミノ酸から合成される「非自己」ペプチドまたはタンパク質を使用して作製されるワクチンが提供される。従来のワクチンとは異なり、本ペプチドは機能的または免疫原性にするために凝集させる必要はない。このように、「免疫原性ペプチド」または「免疫原」または「抗原」は、アジュバントと併用して、またはアジュバントなしで、患者に投与する結果、それに対する免疫学的応答を誘導することができる分子である。このような分子には、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、C3d、多糖、ウシ血清アルブミン(BSA)、破傷風トキソイド、熱ショックタンパク質(HSP)、卵白アルブミンまたはコレラ毒素などの担体タンパク質に結合されたアミロイド形成ペプチドまたはそれらの断片が挙げられる。
【００１９】
用語「免疫学的」または「免疫」または「免疫原性」応答は、脊椎動物個体において抗原に対して向けられる液性(抗体媒介性)および／または細胞性(抗原特異的T細胞またはそれらの分泌産物によって媒介される)応答の発生をいう。このような応答は、免疫原の投与によって誘導される能動的な応答であっても、または、抗原提示細胞として作用することができる抗原刺激を受けたT-細胞、B細胞、マクロファージNKもしくはNKT細胞または抗原刺激を受けた樹状細胞などの免疫細胞または抗体の投与によって誘導される受動的な応答であってもよい。細胞性免疫応答は、クラスIまたはクラスII MHC分子に関連するポリペプチドエピトープを提示して、抗原特異的なCD4+Tヘルパー細胞および／またはCD8+細胞障害性T細胞を活性化することによって誘導される。応答は、単球、マクロファージ、NK細胞、好塩基球、樹状細胞、星状細胞、ミクログリア細胞、好酸球または自然免疫の他の成分などの免疫細胞の活性化に関係することもある。細胞媒介性の免疫学的応答の存在は、当技術上既知の標準的な増殖アッセイ(CD4+T細胞)またはCTL(細胞障害性Tリンパ球)アッセイによって判定することができる。免疫原の予防的または治療的効果に対する液性および細胞性応答の相対的な寄与は、免疫した最初の哺乳類から免疫グロブリン(IgG)およびT-細胞分画を別個に単離し、第2の被験体における予防的または治療的効果を測定することによって識別することができる。
【００２０】
本明細書において交換可能に使用される「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、典型的なポリヌクレオチドに水素結合することができる塩基を支持する骨格を有するポリマー分子であり、ポリマー骨格が、ポリマー分子と典型的なポリヌクレオチド(例えば、1本鎖DNA)との間に配列特異的な様式でこのような水素結合を可能にするような塩基を提供するポリマー分子をいう。このような塩基は、典型的には、イノシン、アデノシン、グアノシン、シトシン、ウラシルおよびチミジンである。ポリマー分子には、2本鎖および1本鎖RNAおよびDNA、ならびに例えば、メチルホスホネート結合のようなそれらの骨格修飾物が挙げられる。本明細書において使用する「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合によって結合される1本鎖のアミノ酸残基から作られている化合物をいう。「タンパク質」という用語は、「ポリペプチド」という用語と同義であっても、または2つ以上のポリペプチドの複合体をさしてもよい。「ペプチド」という用語は、ペプチド結合によって結合されたアミノ酸残基を含む化合物もいう。一般に、ペプチドは100以下のアミノ酸を含むが、ポリペプチドまたはタンパク質は100より多いアミノ酸を有する。本明細書において使用する「タンパク質断片」という用語は、ペプチドを意味すると読むこともできる。
【００２１】
本明細書において特に規定されている場合を除いて、アミノ酸および保護基を命名するために本明細書において使用する略語は、生化学命名法に関するIUPAC-IUB委員会(IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature)(Biochemistry, 1972, 11: 1726-1732)の推奨に基づいている。
【００２２】
別の態様において、全-Dペプチドに対する抗体の産生を誘発し、被験体による免疫応答を誘発して、原線維形成、関連する細胞毒性および神経変性を予防する、抗原量の全-Dペプチドを被験体に投与することを特徴とし、抗体が、アミロイドタンパク質、原線維タンパク質またはアミロイド症を誘発する別の非アミロイドタンパク質の少なくとも1つの領域と相互作用する、被験体のアミロイド関連疾患を予防および／または治療する方法が提供される。「原線維ペプチド」または「原線維タンパク質」は、アミロイド斑に存在する原線維を形成するモノマーまたはオリゴマーまたは凝集型のタンパク質またはペプチドをいう。このようなペプチドおよびタンパク質の例は本明細書に提供されている。「非アミロイドタンパク質」を含有する製剤には、遺伝性全身性アミロイド症を治療するためのゲルソリン断片に対して免疫応答を生ずる組成物、遺伝性神経障害を治療するための突然変異リゾチームタンパク質(Alys)に対して免疫応答を生ずる組成物、腎臓疾患としての非神経障害型のアミロイド症発症のためのフィブリノーゲンの突然変異α鎖(AfibA) に対して免疫応答を生ずる組成物、およびアイスランドで報告された形態の遺伝性脳血管障害を治療するための突然変異シスタチンC(Acys) に対して免疫応答を生ずる組成物が挙げられるが、これらに限定されない。また、ある種の遺伝性のプリオン病(例えば、クロイツフェルト-ヤコブ病(CJD)、ゲルストマン-シュトロイスラー-シャインカー症候群(GSS)および致死性家族性不眠症(FFI)）は、プリオンタンパク質の突然変異アイソフォーム、PrPScによって特徴づけられる。このタンパク質は、本発明により、PrP斑の沈着を治療および予防するための治療的組成物に使用することができる。これらのワクチンは、アミロイド関連疾患を予防および／または治療する際、ならびにアミロイド関連疾患を予防および／または治療するための医薬品を製造する際に使用することができる。
【００２３】
本発明のさらなる態様において、被験体のアミロイド関連疾患を予防および／または治療するためのワクチンは、アミロイドタンパク質と相互作用して原線維形成を防ぐ少なくとも1つの抗体またはその断片であって、例えば、βシート領域、GAG-結合部位領域、Aβ(1〜42、全-D)およびマクロファージ接着領域Aβ(10〜16)、それらの免疫原性断片、それらのタンパク質結合物、それらの免疫原性誘導体ペプチド、それらの免疫原性ペプチド、ならびにそれらの免疫原性ペプチド様物質、または上記ペプチドのいずれかと実質的な同一性を有するペプチドのような、抗原量のこのようなタンパク質の全-Dペプチドに対して形成される抗体を含む。
【００２４】
以下の用語は、2つ以上のポリヌクレオチド間の配列の関係を記載するために使用する：「実質的な同一性」、「比較ウィンドウ」、「配列の同一性」「配列の同一性の割合」および「基準配列」。「基準配列」は、配列比較の基準として使用される規定された配列である。基準配列は、例えば、配列リストに提供されている全長のcDNAもしくは遺伝子配列のセグメントのような大きい配列のサブセットであっても、または完全なcDNAもしくは遺伝子配列を含んでもよい。一般に、基準配列は鎖長が少なくとも20ヌクレオチドであり、多くは鎖長が少なくとも25ヌクレオチドであり、しばしば鎖長が少なくとも50ヌクレオチドである。2つのポリヌクレオチドは、各々(1)2つのポリヌクレオチド間で類似している配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部）を含み、(2)2つのポリヌクレオチド間で異なる配列をさらに含んでもよいので、2つ(または2つ以上)のポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的には、配列の類似性の局所的な領域を同定し、比較するために、「比較ウィンドウ」上の2つのポリヌクレオチドの配列を比較することによって実施される。本明細書において使用する「比較ウィンドウ」は、ポリヌクレオチド配列を、少なくとも20の連続するヌクレオチドの基準配列と比較することができ、比較ウィンドウのポリヌクレオチド配列部分が、2つの配列を最適に整列させるために、基準配列（付加または欠失を含まない）と比較して20パーセント以下の付加または欠失（すなわちギャップ）を含んでもよい、少なくとも20の連続するヌクレオチド位置の概念的なセグメントをいう。比較ウィンドウを整列させるための配列の最適な整列は、SmithおよびWaterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482のローカル・ホモロジー・アルゴリズム、NeedlemanおよびWunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443のホモロジー・アラインメント・アルゴリズム、PearsonおよびLipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85: 2444の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実施(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0のGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA、Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.)、または検査によって実施することができ、種々の方法によって作製される最もよい整列(すなわち、比較ウィンドウ上で最も高い割合の相同性を生ずる）を選択する。
【００２５】
「配列の同一性」という用語は、2つのポリヌクレオチド配列が比較ウィンドウ上で同一である（すなわち、ヌクレオチド-対-ヌクレオチドに基づいて）ことを意味する。用語「配列の同一性の割合」は、比較ウィンドウ上に最適に整列された2つの配列を比較し、同一の核酸塩基（例えば、A、T、C、G、UまたはI)が両方の配列に存在して一致する位置数を生じる位置の数を求め、一致した位置の数を比較ウィンドウの合計位置数(すなわちウィンドウサイズ)で割り、結果に100を掛けて、配列の同一性の割合を出すことによって算出される。本明細書において使用する「実質的な同一性」という用語は、ポリヌクレオチドが、少なくとも20のヌクレオチド位置の比較ウィンドウ、多くの場合は少なくとも25〜50ヌクレオチドのウィンドウにわたって基準配列と比較したとき、少なくとも85パーセントの配列の同一性、好ましくは少なくとも90〜95パーセントの配列の同一性、さらに通常は少なくとも99パーセントの配列の同一性を有する配列を含み、配列の同一性の割合が、比較ウィンドウの基準配列の合計20パーセント以下の欠失または付加を含んでもよいポリヌクレオチド配列に基準配列を比較することによって算出される、ポリヌクレオチド配列の特徴を示す。
【００２６】
ポリペプチドに適用すると、「実質的な同一性」という用語は、デフォルトギャップウエイト(default gap weights)を使用したプログラムGAPまたはBESTFITなどによって最適に整列されたとき、2つのペプチド配列が少なくとも80パーセントの配列の同一性、好ましくは少なくとも90パーセントの配列の同一性、さらに好ましくは少なくとも95パーセント以上の配列の同一性(例えば、99パーセントの配列の同一性)を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基の位置は保存的アミノ酸置換によって異なっている。保存的アミノ酸置換とは、類似の側鎖を有する残基の互換性をいう。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸群はグリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンであり、脂肪族-ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸群はセリンおよびトレオニンであり、アミドを含有する側鎖を有するアミノ酸群はアスパラギンおよびグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸群はフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸群はリジン、アルギニンおよびヒスチジンであり、硫黄を含有する側鎖を有するアミノ酸群はシステインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換群は以下のとおり：バリン-ロイシン-イソロイシン、フェニルアラニン-チロシン、リジン-アルギニン、アラニン-バリン、およびアスパラギン-グルタミン。
【００２７】
「抗体」または「免疫グロブリン」という用語は、抗体全体またはそれらの断片を含んで使用される。抗体はモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であってもよく、組換え技法によって作製されても、血清もしくは腹水またはハイブリドーマ起源から採取されてもよい。典型的には、断片は、抗原断片への特異的な結合に対し、断片が由来する完全な抗体と競合する。断片は、組換えDNA技法、または完全な抗体を酵素的にもしくは化学的に切断することによって作製される。抗原結合断片には、Fab、Fab'、F(ab')2、Fvおよび1本鎖抗体が挙げられ、分けられた重鎖または軽鎖もさらに挙げられる。抗体断片は、組換えDNA技法、または免疫グロブリン全体を酵素的にもしくは化学的に分離することによって作製される。「抗体」という用語は、他のタンパク質との融合タンパク質に化学的に結合されるまたは他のタンパク質との融合タンパク質として発現される、1つ以上の免疫グロブリン鎖を含む。用語「抗体」はまた、二重特異性抗体も含む。二重特異性または二機能性抗体は、2つの異なる重鎖／軽鎖対および2つの異なる結合部位を有する人工的なハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはFab'断片の結合を含む種々の方法によって作製することができる。例えば、Songsivilai & Lachmann、Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990)、Kostelnyら、J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992)を参照されたい。
【００２８】
本明細書において使用する、「1本鎖Fv」または「sFv」抗体断片は、抗体のVHおよびVLドメインが1本鎖ポリペプチド鎖に存在している、これらのドメインを含む。好ましくは、Fvポリペプチドは、抗原に結合するためにsFvに望ましい構造を形成させることができるポリペプチドリンカーをVHドメインとVLドメインの間にさらに含む。sFvの総説は、Pluckthun、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies、113巻、RosenburgおよびMoore編、Springer-Verlag, New York, 269-315ページ(1994)を参照されたい。
【００２９】
2つの物体の間の特異的な結合とは、少なくとも106 M-1、107 M-1、108 M-1、109 M-1または1010 M-1の親和性を意味する。108 M-1より大きい親和性が好ましい。本明細書において考察するように、抗体または免疫グロブリン分子のアミノ酸配列におけるわずかなバリエーションは、アミノ酸配列において、少なくとも75%、さらに好ましくは、少なくとも80%、90%、95%、最も好ましくは99%を維持している限り、本発明に含まれると考えられる。特に、保存的アミノ酸置換が考慮される。保存的置換は、側鎖において関連するアミノ酸ファミリー内で生じるものである。遺伝的にコードされるアミノ酸は、一般に、ファミリーに分類される：(1)酸性=アスパラギン酸、グルタミン酸、(2)塩基性=リジン、アルギニン、ヒスチジン、(3)非極性=アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンおよび(4)無電荷極性=グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。さらに好ましいファミリーは以下のとおり：脂肪族-ヒドロキシファミリーであるセリンおよびトレオニン；アミドを含有するファミリーであるアスパラギンおよびグルタミン；脂肪族ファミリーであるアラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン；ならびに芳香族ファミリーであるフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン。例えば、特に置換がフレームワーク部位内のアミノ酸に関与しない場合は、ロイシンのイソロイシンもしくはバリンでの単独の置換、アスパラギン酸のグルタミン酸での単独の置換、トレオニンのセリンでの単独の置換、またはアミノ酸の、構造的に関連するアミノ酸での同様の置換が、結果として生じる分子の結合または特性に大きな影響を与えないと考えるのは妥当である。アミノ酸の変化が機能的なペプチドを生じるかどうかは、ポリペプチド誘導体の特定の活性をアッセイすることによって容易に判定することができる。アッセイは本明細書に詳細に記載されている。断片または類似体の好ましいアミノ-およびカルボキシ-末端は機能的ドメインの境界付近に存在する。構造的および機能的ドメインは、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列データを公共または私有の配列データベースと比較することによって同定することができる。好ましくは、コンピュータによる比較方法を使用して、既知の構造および／または機能の他のタンパク質に生じる配列モチーフまたは予測されるタンパク質の高次構造ドメインを同定する。既知の三次元構造に折りたたまれるタンパク質の配列を同定する方法は既知である。Bowieら、Science 253: 164 (1991)。このように、上述の例は、本発明により構造的および機能的ドメインを規定するために使用することができる配列モチーフおよび構造的配座を当業者が認識することができることを示す。好ましいアミノ酸置換は、(1)タンパク質分解の受けやすさを低下するもの、(2)酸化の受けやすさを低下するもの、(3)タンパク質複合体を形成する結合親和性を変更するもの、(4)結合親和性を変更するもの、および(4)このような類似体の他の物理化学的または機能的特性を与えるまたは改変するものである。類似体は、天然型ペプチド配列ではない配列の種々の突然変異タンパク質を含んでもよい。例えば、1つまたは多数のアミノ酸置���（好ましくは、保存的アミノ酸置換）を天然型配列に加えてもよい(好ましくは、分子間接触を形成するドメインの外側のポリペプチド部分に）。保存的アミノ酸置換は、親配列の構造的特徴を実質的に変化させるものであってはならない(例えば、置換アミノ酸は、親配列にあるらせん構造を破壊したり、親配列を特徴づけている他の種類の二次構造を破壊する傾向にあってはいけない）。技術上認識されているポリペプチドの二次および三次構造の例は、それぞれ参照として本明細書に組み入れられる、Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton編、W. H. Freeman and Company, New York (1984))；Introduction to Protein Structure (C. BrandenおよびJ. Tooze編、Garland Publishing, New York, N.Y. (1991))；およびThorntonら、Nature 354: 105 (1991)に記載されている。
【００３０】
本明細書に使用する「ヒト化」形態の非ヒト(例えば、げっ歯類)抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそれらの断片(Fv、Fab、Fab'、F(ab')2または抗体の他の抗原結合物など)。ほとんどの部分は、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)の超可変領域の残基が、望ましい特異性、親和性およびキャパシティーを有するマウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種(ドナー抗体)の超可変領域の残基で置換されているものである。ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(FR)の残基が、対応する非ヒト残基で置換される場合もある。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、ドナー抗体にも見出されない残基を含む場合もある。これらの改変は、抗体の性能をさらに精密にし、最大にするために加えられる。一般に、ヒト化抗体は、超可変ループの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのそれらに対応し、FRの全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、選択的に、免疫グロブリンの定常部(Fc)の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものも含む。更に詳しくは、Jonesら、Nature, 3221:5222 525 (1986)；Reichmarmら、Nature, 332: 323-329(1988)；およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992)を参照されたい。
【００３１】
「結合する」または「結合される」は、一体として接続される、連結される、接着される、および／または融合されることを言うことを意図する。「タンパク質結合物」または「結合型タンパク質」は、一般に、タンパク質と非タンパク質の化合物を言うことを意図している。「結合型タンパク質」は、アミノ酸以外に、永久的に結合した化学的成分を含有する。結合型タンパク質の非アミノ酸部分は、一般に、その補欠分子族と言われる。結合型タンパク質は、それらの補欠分子族の化学的性質に基づいて分類される(参照として本明細書に組み入れられる、Lehninger Principles of Biochemistry、第3版  Worth Publishers 2000)。結合物ワクチンでは、抗原性分子が「担体」タンパク質またはポリペプチドに共有結合されている。結合は、結合された分子の抗原性を増加させる働きをする。抗原性分子および「担体」タンパク質またはポリペプチドから結合物ワクチンを形成する方法は、当技術上既知である(全て参照として本明細書に組み入れられる、Jacob, C. Oら、Eur. J. Immunol. 16: 1057-1062 (1986)；Parker J. M. R.ら、Modem Approaches to Vaccines, Chanock, R. M.ら編、133-138ページ、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1983)；Zurawski V. Rら、J. Immunol. 121: 122-129 (1978)；Klipstein, F. A,ら、Infect. Immun. 37: 550-557 (1982)；Bessler, W. G, Immunobiol. 170: 239-244 (1985)；Posnett, D. Nら、J. Biol. Chem. 263: 1719-1725 (1988)；Ghose, A. Cら、Molec. Immunol. 25: 223-230 (1988))。タンパク質および多糖の結合は、他の有利な結果を提供することができる。例えば、タンパク質-多糖結合物は、多糖成分だけでなくタンパク質成分に対する抗体応答も増加させることが見出されている。この効果は、例えば、共に参照として本明細書に組み入れられる、MondおよびLees、米国特許第5,955,079号および同第5,585,100号の二重結合物の特許出願に記載されている。この効果はまた、A. Leesら、Enhanced Immunogenicity of Protein-Dextran Conjugates: I. Rapid Stimulation of Enhanced Antibody Responses to Poorly Immunogenic Molecules、Vaccine、12巻、13号(1994)、1160-1166ページにも記載されている。これは全体の内容が参照として本明細書に組み入れられる。担体タンパク質の例には、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、C3d、多糖、ウシ血清アルブミン(BSA)、破傷風トキソイド、熱ショックタンパク質(HSP)、卵白アルブミンまたはコレラ毒素が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
別の態様において、原線維タンパク質および／または非アミロイドタンパク質の2つ以上の部分に結合する少なくとも2つの抗体またはそれらの断片の組み合わせを含む薬学的組成物を投与する段階を含む、被験体のアミロイド関連疾患を予防および／または治療する方法が提供される。別の態様において、薬学的組成物は、さらに、免疫細胞、さらに好ましくは抗原刺激されたリンパ球を含む。
【００３３】
「薬学的組成物」は、哺乳類個体、好ましくはヒトに投与するのに好適な化学的または生物学的組成物をいう。このような組成物は、経口、非経口、静脈内、動脈内、皮下、鼻腔内、舌下、脊髄内、脳室内、経皮等を含むが、これらに限定されない、数多くの経路の1つ以上により投与するために特に製剤化することができる。「薬学的賦形剤」または「薬学的に許容される賦形剤」は、活性な治療用ペプチドが製剤化される担体、通常液体である。賦形剤は、一般に、製剤に任意の薬理学的作用を提供しないが、化学的および／または生物学的安定性、放出特性等を提供することができる。例示的な製剤は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、第19版、Grennaro, A.編、1995に見出すことができる。
【００３４】
さらに別の態様において、例えば、βシート領域、GAG-結合部位領域、Aβ(1〜42)およびマクロファージ接着領域Aβ(10〜16)、それらの免疫原性断片、それらのタンパク質結合物、それらの免疫原性誘導体ペプチド、それらの免疫原性ペプチドおよびそれらの免疫原性ペプチド様物質のようなアミロイドタンパク質の少なくとも1つの領域とさらに相互作用することができ、化合物が被験体による免疫応答を誘発して原線維形成を予防する、抗原量の全-Dペプチドを被験体に投与する段階を含む、被験体のアミロイド関連疾患を予防および／または治療する方法が提供される。
【００３５】
別の関連する局面によると、本発明は、哺乳類被験体におけるアミロイド沈着によって特徴付けられる疾患を予防または治療する方法を含む。本発明のこの局面によると、被験体に、被験体が罹患しているアミロイド疾患に特徴的なアミロイドペプチドに対する免疫応答を生じるのに有効な量のペプチドを投与する。本質的には、本方法は、上記したものなどの、疾患に特異的な免疫原性アミロイドペプチドを含有する薬学的組成物を投与する段階を含む。このような方法は、被験体の免疫原性応答を誘導する際の有効性によってさらに特徴付けられる。好ましい態様によると、本方法は、免疫原性ペプチドが向けられるアミロイドペプチドに対して少なくとも1:1000の血清力価によって特徴付けられる免疫学的応答を生ずる上で有効である。さらに別の好ましい態様によると、血清力価は、アミロイド成分に対して少なくとも1:5000である。関連する態様において、免疫応答は、前処理対照血清試料において測定した免疫反応の血清レベルより約4倍を超えるものに相当する血清の免疫反応量によって特徴付けられる。この後者の特徴は、血清免疫反応がELISA技法によって測定される場合に特に適当であるが、血清免疫反応の任意の相対的または絶対的測定に適用することができる。好ましい態様によると、免疫反応は、抗体力価を求めるために約1:100〜1:10,000の血清希釈で測定される。
【００３６】
さらに別の関連する局面によると、本発明は、アミロイド疾患の治療を受ける患者の予後を判定する方法を含む。ここで、選択した疾患を特徴づけるアミロイドペプチドに対する患者の血清免疫反応量を測定し、患者の血清免疫反応量が血清免疫反応のベースライン対照レベルの少なくとも4倍であると、特定のアミロイド疾患に関し予後が良好な状態であることが示される。好ましい態様によると、患者血清中に存在する選択したアミロイドペプチドに対する免疫反応量は、そのアミロイドペプチドについて少なくとも約1:1000または少なくとも1:5000の血清力価によって特徴付けられる。
【００３７】
本明細書において使用する「受動免疫」は、免疫を与えるために、個体に抗体、それらの断片または免疫細胞、すなわち、T-細胞、B-細胞、NK細胞、NKT細胞、樹状細胞、マクロファージ、好塩基球、単球または補体経路の成分を投与することをいう。補体経路の成分は、能動免疫または受動免疫と合わせて自然免疫応答を増強するために、タンパク質に結合することができる。ヒトの血液から得られる免疫グロブリン(Ig)は、調製時に使用されるヒト血漿プールに応じて種々の因子に対する抗体を含有することがある。特定の免疫グロブリンは、特定の抗原に対する高いレベルの抗体を有するドナーまたはこのような応答を生ずるように免疫されたドナーの血漿から得られる(Immunization、Cecil Textbook of Medicine、第19版、1巻、W.B. Saunders Company 1992；Harrison's Principles of Internal Medicine、第14版、McGraw Hill, 1998)。脳および脳血管系内へのアミロイド-βペプチドの蓄積を予防するために、血漿、脳および脳脊髄液内のアミロイドβ-ペプチドを隔絶するためのヒト化モノクローナル抗体は、参照として本明細書に組み入れられる国際公開公報第01/62801号に記載されている。欧州特許第0613007号は、主にβ-シート配座であるβ-アミロイドペプチドに対する特異性を有する抗体について記載している。このような抗体は、本明細書に記載されている本発明に有用である。
【００３８】
本発明の一態様によると、アミロイド疾患を予防または治療するために、哺乳類を受動免疫化する方法および組成物が提供される。本発明のこの局面によると、患者は、アミロイドペプチドの選択した領域、好ましくはβ-シート形成を担当するペプチドの中心コア領域に近接した領域またはその内部の領域に特異的に結合する抗体またはその断片の有効量が投与されるか、または免疫細胞、好ましくは抗原刺激された免疫細胞もしくは抗原提示細胞が投与される。一般に、このような抗体は、このセクションの先のパラグラフに記載した薬学的組成物および方法に関して記載した、種々のタンパク質、ペプチドおよび成分に特異的に結合する能力について選択される。関連する態様によると、このような方法および組成物は、少なくとも2つのアミロイド成分に結合する抗体の組み合わせを含んでもよい。一般に、薬学的組成物は、対照血清試料において測定した成分に対する血清免疫反応レベルより少なくとも約4倍高い、標的アミロイドペプチドに対する血清免疫反応量を提供するように投与される。本明細書に記載するように、抗体は担体と共に投与されてもよい。一般に、本発明のこの局面によると、このような抗体は、腹腔内、経口、鼻腔内、皮下、筋肉内、経皮、局所または静脈内に投与(または投与するために製剤化)されるが、任意の薬学的に有効な(すなわち、上記および本明細書に記載するように、示した治療レベルを生じるのに有効な)経路によって投与されても、または投与するために製剤化されてもよい。
【００３９】
「エピトープ」または「抗原決定因子」という用語は、抗体もしくは抗体結合断片が特異的に結合する、またはBおよび／もしくはT細胞が応答する、抗原上の部位をいう。B-細胞エピトープは、連続するアミノ酸から、またはタンパク質の三次的な折りたたみによって並置される非連続アミノ酸から、形成されうる。連続するアミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒に暴露しても維持されるが、三次的な折りたたみによって形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒で処理すると失われる。エピトープは、典型的には、独自の空間的配座中の、少なくとも3つ、さらに通常は少なくとも5または8〜10のアミノ酸を含む。エピトープの空間的配座を決定する方法には、例えば、x線結晶解析および2次元核磁気共鳴が挙げられる。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology、66巻、Glenn E. Morris編(1996)を参照されたい。同一エピトープを認識する抗体は、一方の抗体が、標的抗原に対する他方の抗体の結合を遮断する能力を示す簡単なイムノアッセイで同定することができる。L-細胞は、CD8細胞に対しては約9のアミノ酸またはCD4細胞に対しては約13〜15のアミノ酸の連続エピトープを認識する。エピトープを認識するT細胞は、エピトープに応答する抗原刺激されたT細胞による3H-チミジン取り込みによって(Burkeら、J. Inf Dis. 170, 1110-19 (1994))、抗原依存的死滅(細胞障害性Tリンパ球アッセイ、Tiggesら、J. Immunol. 156, 3901-3910)によって、またはサイトカイン分泌によって測定されるように、抗原依存的増殖を測定するインビトロアッセイによって同定することができる。
【００４０】
本明細書において使用する「化合物」という用語は、本発明のペプチド、または本発明のペプチドを含有する薬学的に許容される組成物をいう。本発明の好ましい態様において、化合物は式Iの化合物である:
R'-(P)-R''  (I)
式中、
Pは、アミロイドタンパク質の全-Dペプチド、例えば、βシート領域、GAG-結合部位領域、Aβ(1〜42、全-D)およびマクロファージ接着領域(10〜16、全-D)、それらの免疫原性断片、それらの免疫原性誘導体、それらのタンパク質結合物、それらの免疫原性ペプチド、およびそれらの免疫原性ペプチド様物質であり、
R'はN-末端置換基、例えば、
・水素、
・低級アルキル基、例えば、官能基を有してもよい炭素原子数1〜8の非環式または環式のもの、例えば、カルボキシレート、スルホネートおよびホスホネート、
・芳香族基、
・複素環基、ならびに
・アシル基、例えば、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基、スルホニル基、およびホスホニル基であり、
R''はC-末端置換基、例えば、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、置換されていてもよいアミノ基である。
【００４１】
一態様において、R'およびR''は同じまたは異なり、R'およびR''のアルキル基またはアリール基は、ハライド基(例えば、F、Cl、BrおよびI)、ヒドロキシル基、アルコキシル基、アリールオキシル基、ヒドロキシカルボニル基、アルコキシルカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、カルバミル基、置換されていてもよいアミノ基、スルホ基またはアルキルオキシスルホニル基、ホスホノ基またはアルコキシホスホニル基などの官能基でさらに置換される。
【００４２】
化合物が酸性官能基を有する場合には、薬学的に許容される塩またはエステルの形態であってもよい。化合物が塩基性官能基を有する場合には、薬学的に許容される塩の形態であってもよい。
【００４３】
一態様において、Pは、アミロイドタンパク質の少なくとも1つの領域と相互作用することができるペプチドである。
【００４４】
本発明の好ましい態様において、被験体はヒトである。
【００４５】
本発明のさらに別の態様において、アミロイド関連疾患はアルツハイマー病であってもよい。
【００４６】
本発明のさらに別の態様において、アミロイド関連疾患は脳アミロイド血管障害(CAA)であってもよい。
【００４７】
本発明の別の態様において、被験体に抗原量の式I:
R'-(P)-R''  (I)
(式中、
Pは、アミロイドタンパク質の全-Dペプチド、例えば、βシート領域、GAG-結合部位領域、Aβ(1〜42、全-D)およびマクロファージ接着領域(10〜16、全-D)、それらの免疫原性断片、それらの免疫原性誘導体、それらのタンパク質結合物、それらの免疫原性ペプチドおよびそれらの免疫原性ペプチド様物質であり、
R'は、以下からなる群より選択されるN-末端置換基であり：
・水素、
・低級アルキル基、例えば、官能基を有してもよい炭素原子数1〜8の非環式または環式のもの、例えば、カルボキシレート、スルホネートおよびホスホネート、
・芳香族基、
・複素環基、ならびに
・アシル基、例えば、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基、スルホニル基およびホスホニル基であり、
R''はC-末端置換基、例えば、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、置換されていてもよいアミノ基である)の化合物を投与する段階を含む、被験体のアミロイド関連疾患を予防および／または治療する方法が提供される。
【００４８】
この方法によると、化合物は被験体による免疫応答を誘発し、原線維形成、神経変性または細胞毒性を予防する。
【００４９】
本発明の好ましい態様によると、アミロイドタンパク質の少なくとも1つの領域、例えば、βシート領域(16〜21)、GAG-結合部位領域(13〜16)およびマクロファージ接着領域(10〜16、全-D)、それらの免疫原性断片、それらのタンパク質結合物、それらの免疫原性誘導体ペプチド、それらの免疫原性ペプチドおよびそれらの免疫原性ペプチド様物質とさらに相互作用することができる抗原量の全-Dペプチドを含む、被験体のアミロイド関連疾患を予防および／または治療するワクチンであって、化合物が被験体による免疫応答を誘発するまたは原線維形成を予防するまたは原線維形成の前にアミロイドタンパク質の除去を促進するワクチンが提供される。一局面において、本ワクチンは哺乳類の血漿中の可溶性Aβレベルを変更し、それによって哺乳類の脳内の可溶性Aβレベルを低下させ、それによって原線維斑の形成を予防する。
【００５０】
別の態様において、可溶性Aβまたは原線維Aβに対する受動免疫を必要とする方法もある。一局面において、本発明は、以下の段階を含む、それを必要とする第1の哺乳類のアミロイド関連疾患を予防および／または治療する方法を提供する：抗原量の全-Dアミロイド-βペプチドを第2の哺乳類に投与し、該全-Dアミロイド-βペプチドが、第2の哺乳類においてアミロイド-βペプチドに対する免疫応答を誘導する段階、第2の哺乳類から抗体または免疫細胞を回収する段階、第1の哺乳類に治療的または予防的に有効な用量の抗体または免疫細胞を提供する段階。この態様において、全-Dアミロイド-βペプチドは、配列番号：1〜70からなる群より選択される配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有する。本発明による抗体または免疫細胞を作製するのに有用なAβの他の反応性エピトープには、Aβの残基1〜42内のエピトープ、Aβの残基16〜21内のエピトープ、Aβの残基13〜21内のエピトープ、Aβの残基10〜21内のエピトープ、Aβの残基10〜16内のエピトープ、Aβの残基25〜35内のエピトープ、およびAβの遊離N-またはC-末端残基を含むエピトープが挙げられる。一局面において、Aβに対する受動免疫は、免疫細胞、すなわち、記載するようにAβに対して能動的に免疫化した第2の哺乳類由来のBまたはT細胞などの抗原刺激したリンパ球を第1の哺乳類に移すことによって達成され、それによって第1の哺乳類のAβ関連疾患を軽減または予防する。別の局面において、Aβに対する受動免疫は、Aβに特異的に結合することができる抗体またはその断片を移すことによって達成される。さらに別の局面において、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体を第1の哺乳類に投与し、それによってAβ関連疾患を軽減または予防する。
【００５１】
一態様において、本発明は、抗原量の全-Dアミロイドβペプチドを被験体に投与する段階であって、該全-Dアミロイドβペプチドが、該アミロイド-βペプチドに対する該被験体による免疫応答を誘導し、該全-Dアミロイドβペプチドが、配列番号：1〜70からなる群より選択される配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有する段階、またはAβの残基1〜42内のエピトープ、Aβの残基16〜21内のエピトープ、Aβの残基13〜21内のエピトープ、Aβの残基10〜21内のエピトープ、Aβの残基10〜16内のエピトープ、Aβの残基25〜35内のエピトープ、およびAβの遊離N-またはC-末端残基を含むエピトープに特異的に結合する少なくとも1つの抗体または断片を被験体に投与する段階を含む、被験体のアミロイド関連疾患を予防および／または治療する方法に関する。
【００５２】
一態様において、本発明は、Aβの残基1〜42内のエピトープ、Aβの残基16〜21内のエピトープ、Aβの残基13〜21内のエピトープ、Aβの残基10〜21内のエピトープ、Aβの残基10〜16内のエピトープ、Aβの残基25〜35内のエピトープ、およびAβの遊離N-またはC-末端残基を含むエピトープに特異的に結合する少なくとも1つの抗体または断片の治療的または予防的な量を投与することによって、それを必要としている哺乳類、例えば、ヒトの血清Aβレベルを変更することに関する。一局面において、哺乳類の血清Aβレベルを変更すると、哺乳類の可溶性Aβまたは原線維Aβのレベルが変更される。さらに別の局面において、哺乳類の血清Aβレベルを変更すると、哺乳類の脳内の可溶性または原線維Aβレベルが変更される。別の局面において、哺乳類の血清Aβレベルを変更すると、哺乳類の脳内のAβレベルの除去が促進される。
【００５３】
本方法は無症候性患者および現時点で疾患の症状を示している患者に使用することができる。このような方法で投与される抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、もしくは非ヒト抗体、またはその断片であってもよく、モノクローナル起源もしくはポリクローナル起源由来であっても、哺乳類から得られても、または組換え技法によって作製されてもよい。抗体が、Aβペプチドで免疫したヒトから作製される方法もあれば、ヒト化抗体が投与される方法もある。
【００５４】
抗体が薬学的組成物として薬学的担体と共に投与される方法もある。抗体が0.0001〜100mg/kg、好ましくは少なくとも1mg/kg体重の抗体用量で投与される方法もある。抗体が、長期間、例えば、少なくとも6ヶ月にわたって多数回投与で投与される方法もある。抗体が徐放性組成物として投与される方法もある。抗体は、例えば、腹腔内、経口、皮下、脳内、筋肉内、局所、鼻腔内、経皮または静脈内に投与することができる。
【００５５】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲により明らかであろう。
【００５６】
発明の詳細な説明
アミロイド疾患またはアミロイド症は、多種多様の外見上の症状を有する数多くの疾患状態を含む。これらの疾患には、共通して、通常直径が約10〜100nmで、特定の臓器または組織領域に局在する「アミロイド沈着物」または「アミロイド斑」として知られているタンパク質原線維の異常な細胞外沈着物が存在する。このような斑は、凝集して不溶性の原線維沈着物を形成する天然型可溶性タンパク質またはペプチドを主に含む。これらの不溶性沈着物は、直径約10〜15 nmの原線維の概ね側方の凝集物を含む。アミロイド原線維は、コンゴーレッド染料で染色すると、偏光下において特徴的なアップルグリーンの複屈折を生じる。
【００５７】
斑沈着物を形成するペプチドまたはタンパク質は、大きい前駆体タンパク質から作られることが多い。さらに具体的には、アミロイド原線維沈着物の原因は、一般に、「異常な」前駆体タンパク質の断片へのタンパク質分解による切断に関係する。これらの断片は、一般に、凝集して逆平行のβ-プリーツシートを形成するが、ある種の未分解型の前駆体タンパク質は、凝集して、家族性アミロイド多発性神経障害(異型トランスチレチン原線維)および透析関連アミロイド症(β2ミクログロブリン原線維)の原線維を形成することが報告されている(Tan, S. Y.およびPepys, M. B. Amyloidosis. Histopathology 25: 403-414 (1994))。具体的には、Aβ(16〜21)部位は、有害なAβペプチドアミロイド形成過程を開始する際に重要な役割を担うことが知られている。これらのペプチドがD-アミノ酸から作られる場合には、それらは天然の全-L相同配列と相互作用する能力を保持しており、それによってアミロイド形成を防ぐことも知られている。本発明に使用することができる他のアミロイドタンパク質には、IAPPのベータシート領域(例えば、24〜29、全-D)、β2-ミクログロブリン、アミロイドAタンパク質およびプリオン関連タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５８】
疾患は、従来、以下に考察するように、斑沈着物を形成する主要な原線維成分に基づいて分類される。しかし、理論に制限されるわけではないが、Aβは脳と血液の間を行き来することができること(Ghersi-Egea, Jら、J. Neurochem., 67: 880-883 (1996))および斑のAβ(不溶性または原線維Aβ)は可溶性Aβと平衡状態であること(Kawarabayashi, T.,ら、J. Neurosci. 21:372-381 (2001)を支持する証拠がある。両文献は全体の内容が参照として本明細書に組み入れられる。従って、主要な原線維成分に基づいた疾患の同定は簡便さのために提供されており、疾患の軽減は、原線維Aβまたは可溶性Aβを標的とすることによって、本明細書に記載されている組成物および方法により達成することができる。原線維Aβまたは可溶性Aβの標的化は、本明細書、ならびに各々全体の内容が参照として組み入れられる、PCT公報国際公開公報第01/62801号、国際公開公報第01/90182号、国際公開公報第01/18169号、国際公開公報第00/77178号、国際公開公報第00/72880号、国際公開公報第00/72876号、国際公開公報第99/60024号および国際公開公報第99/27944号に記載されている能動免疫または受動免疫によって実施することができる。標的化したAβのレベル、具体的には可溶性Aβのレベルは、当技術上既知の方法および本明細書に開示されている方法によって求めることができる(各々全体の内容が参照として組み入れられる、米国特許第5,766,846号、同第5,837,672号および同第5,593,846号を参照されたい)。これらのレベルは、予防的治療または治療的治療の経過中にモニターすることができる。疾患状態が低下したら、治療のエンドポイントに達する。
【００５９】
アミロイド疾患
本発明は、種々の疾患特異的なアミロイド沈着物の1つまたは複数の成分に対する免疫応答を刺激する働きをするペプチドを投与することによってアミロイド疾患を治療することができるという発見に基づいている。以下のセクションは、主要な型のアミロイド症を例示するために供されるもので、本発明を限定する意図のものではない。
【００６０】
AA(反応性)アミロイド症
一般に、AAアミロイド症は、持続性の急性期応答を誘発する数多くの疾患の症状発現である。このような疾患には、慢性炎症性疾患、慢性局所性または全身性細菌感染症および悪性腫瘍が挙げられる。
【００６１】
AA原線維は、一般に、HDL複合体中に存在し、IL-1、IL-6およびTNFのようなサイトカインに応答して肝細胞で合成される、循環アポリポタンパク質である血清アミロイドAタンパク質(ApoSAA)のタンパク質分解切断によって形成される8000ダルトンの断片(AAペプチドまたはタンパク質)を含む。沈着は生体内に広範に及ぶことがあり、実質性臓器が優先される。脾臓が、通常、沈着部位であり、腎臓も影響されることがある。沈着は、心臓および消化管にも見られる。
【００６２】
AAアミロイド疾患には、慢性関節リウマチ、若年性慢性関節炎、強直性脊椎炎、乾癬、乾癬性関節症、ライター症候群、成人スティル病、ベーチェット症候群およびクローン病などの炎症性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。AA沈着物はまた、らい病、結核、気管支拡張症、褥瘡性潰瘍、慢性腎盂腎炎、骨髄炎およびホイップル病などの慢性細菌感染症の結果として生ずる。ある種の悪性腫瘍がAA原線維沈着物を生じることもある。これらには、ホジキンリンパ腫、腎癌、腸、肺および尿生殖路の癌、基底細胞癌、ならびに有毛細胞白血病のような状態が挙げられる。
【００６３】
ALアミロイド症
ALアミロイド沈着は、一般に、形質細胞の悪性疾患(多発性骨髄腫)から良性の単クローン性免疫グロブリン血症に至る、Bリンパ球系統のほとんどどの悪液質にも関連する。アミロイド沈着物の存在が、内在する悪液質の主要な指標になるときもある。
【００６４】
ALアミロイド沈着物の原線維は、単クローン性免疫グロブリンの軽鎖またはそれらの断片を含む。さらに詳細には、断片は、軽鎖のN-末端領域(κまたはλ)に由来し、その可変(VL)ドメインの全てまたは一部を含有する。沈着物は、一般に、間葉組織に生じ、末梢および自律神経障害、手根管症候群、巨舌症、拘束性心筋症、大きい関節の関節症、免疫性悪液質、骨髄腫、ならびに潜在性悪液質を生じる。しかし、ほとんどどの組織も、特に心臓などの内臓器官が関与することに注目すべきである。
【００６５】
遺伝性全身性アミロイド症
多数の型の遺伝性全身性アミロイド症がある。それらは比較的稀有な状態であるが、症状の成人発症およびそれらの遺伝パターン(通常、常染色体優性)により、一般集団にこのような疾患が持続して存在する。一般に、本症候群は、前駆体タンパク質の点変異が原因であり、変異体のアミロイド形成(asnyloidogenic)ペプチドまたはタンパク質が産生される。表1は、これらの疾患の例示的な型の原線維組成を要約する。
【００６６】
【表１】
2005508863.tif 000003
2005508863.tif 000004
*Tan & Pepys, 1994（上記）のデータ。
【００６７】
表1に提供するデータは例示的なものであり、本発明の範囲を限定することは意図しない。例えば、トランスチレチン遺伝子の40を越える別個の点変異が記載されており、その全てが臨床的に同様の型の家族性アミロイド多発性神経障害を生じる。
【００６８】
トランスチレチン(TTR)は、プレアルブミンとも呼ばれる14キロダルトンのタンパク質である。それは肝臓および脈絡叢によって産生され、甲状腺ホルモンおよびビタミンAを輸送する際に機能する。各々1つのアミノ酸の変更によって特徴付けられる少なくとも50の変異型のタンパク質が、種々の型の家族性アミロイド多発性神経障害の原因となっている。例えば、位置55のロイシンをプロリンに置換すると、特に進行性型の神経障害を生じ、位置111のロイシンをメチオニンに置換すると、デンマーク人患者において重度の心臓障害を生じた。全身性アミロイド症患者の心臓組織から単離されたアミロイド沈着物について、沈着物は、集合的にATTRと呼ばれ、その全長の配列が特徴付けられている、TTRとその断片の不均一な混合物を含むことが明らかとなった。ATTR原線維成分はこのような斑から抽出することができ、それらの構造および配列は、当技術上既知の方法により求めることができる(例えば、Gustavsson, A.ら、Laboratory Invest. 73: 703-708, 1995；Kametani, F.ら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 125: 622-628, 1984；Pras, M.ら、PNAS 80: 539-42, 1983)。
【００６９】
アポリポタンパク質AI分子に点変異(例えば、Gly→Arg26、Trp4→Arg50、Leu→4 Arg60)を有する人々は、アポリポタンパク質AIタンパク質またはその断片(AApoAI)の沈着物によって特徴付けられる型のアミロイド症(「Ostertag型」)を示す。これらの患者は、高密度リポタンパク質(HDL)のレベルが低く、末梢神経障害または腎不全を呈する。
【００７０】
酵素リゾチームのα鎖の突然変異(例えば、Ile→Thr56またはAsp→His57)は、英国の家族において報告されている別の型のOstertag型の非神経障害性遺伝性アミロイドの基礎である。ここでは、突然変異リゾチームタンパク質(Alys)の原線維が沈着し、患者は一般に腎機能不全を示す。このタンパク質は、本明細書に記載する原線維形成タンパク質のほとんどとは異なり、通常完全な(未切断)の形態で存在する(Benson, M. D.ら、 CIBA Fdn. Symp. 199: 104-131, 1996)。
【００７１】
β-アミロイドペプチド(Aβ)は、βアミロイド前駆体タンパク質(βAPP)として知られている大きいタンパク質のタンパク質分解によって誘導される39〜43アミノ酸のペプチドである。βAPPの突然変異は、以下にさらに詳細に記載されている、Aβ原線維および他の成分を含む斑の脳沈着によって特徴付けられる、家族型のアルツハイマー病、ダウン症候群、および／または老人性痴呆を生じる。アルツハイマー病に関連するAPPの既知の突然変異は、βもしくはγ-セクレターゼの切断部位の近位またはAβ内に生じる。例えば、位置717は、APPのAβへのプロセシングの際のγ-セクレターゼ切断部位の近位であり、位置670／671は、β-セクレターゼ切断部位の近位である。これらの残基のいずれかにおける突然変異は、おそらくAPPから形成されるAβの42／43アミノ酸型の量の増加を生じることによって、アルツハイマー病を生じうる。種々の鎖長のAβペプチドの構造および配列は当技術上既知である。このようなペプチドは当技術上既知の方法により作製することができる(例えば、GlennerおよびWong、Biochem Biophys. Res. Comm. 129: 885-890, 1984；GlennerおよびWong, Biochem Biophys. Res. Comm. 122: 1131-1135, 1984)。また、種々の形態のペプチドが市販されている。
【００７２】
シヌクレインは、アポリポタンパク質に類似しており、神経細胞質ゾルおよびシナプス前終末において豊富であるシナプス関連タンパク質である。NACと名づけられた、α-シヌクレインに由来するペプチド断片も、アルツハイマー病のアミロイド斑の成分である。(Claytonら、1998)。この成分も、以下に詳細に記載するように、本発明の免疫学に基づいた治療の標的として働く。
【００７３】
ゲルソリンは、断片およびアクチンフィラメントに結合するカルシウム結合タンパク質である。本タンパク質の位置187の突然変異(例えば、Asp→Asn、Asp→Tyr)は、フィンランドの患者およびオランダまたは日本起源の人々に通常見られる型の遺伝性全身性アミロイド症を生じる。罹患個体において、ゲルソリン断片(Agel)から形成される原線維は、通常、アミノ酸173〜243(68 kDaのカルボキシ末端断片)からなり、血管および基底膜に沈着して、末梢神経障害、ジストロフィー性皮膚変化および他の臓器への沈着に進行する、角膜ジストロフィーおよび脳神経障害を生じる(Kangas, H.ら、Human Mol. Genet. 5(9): 1237-1243, 1996)。
【００７４】
フィブリノーゲンの突然変異α鎖(AfibA)および突然変異シスタチンC(Acys)などの他の突然変異タンパク質も原線維を形成し、特徴的な遺伝性疾患を生ずる。AfibA原線維は、腎疾患を伴う非神経変性遺伝性アミロイドに特徴的な沈着物を形成し、Acys沈着物は、アイスランドで報告された遺伝性脳アミロイド血管障害に特徴的である(Isselbacher, Ct at., Harrison's Principles of Internal Medicine、McGraw-Hill、San Francisco、1995；Bensonら、上記)。少なくともいくつかの例において、脳アミロイド血管障害(CAA)患者は、βタンパク質と合わせて、非突然変異型のシスタチンCを含有するアミロイド原線維を有することが示されている(Nagai, A.ら、Molec. Chem. Neuropathol. 33: 63-78, 1998)。
【００７５】
以前は本質的に主に感染性であると考えられていたある種の型のプリオン病は、今では遺伝性であると考えられており、症例の15%以下を占める(Baldwinら、Research Advances in Alzheimer's Disease and Related Disorders, John Wiley and Sons, New York, 1995)。このようなプリオン疾患では、患者は、正常なプリオンタンパク質の異常なアイソフォーム(PrPSc)を含む斑を形成する。AScrと言われることもある、主な突然変異アイソフォームであるPrPScは、プロテアーゼ分解に対する抵抗性、界面活性剤抽出後の不溶性、二次的なリソソームへの沈着、翻訳後合成、およびβ-プリーツシートの高い含有量において、通常の細胞タンパク質と異なる。遺伝的な連鎖は、クロイツフェルト-ヤコブ病(CJD)、ゲルストマン-シュトロイスラー-シャインカー症候群(GSS)、および致死性家族性不眠症(FFI)を生じる少なくとも5つの突然変異について確立されている。スクレイピー原線維から原線維ペプチドを抽出し、配列を決定し、このようなペプチドを作製する(Baldwin)方法は当技術上既知である。(例えば、Beekes, Mら、J. Gen. Virol. 76: 2567-76, 1995)。
【００７６】
例えば、ある型のGSSはコドン102のPrP突然変異に連鎖しているが、終脳GSSはコドン117の突然変異とともに分離する。コドン198および217の突然変異は、アルツハイマー病に特徴的な老人斑がAβペプチドの代わりにPrPを含有する、ある型のGSSを生じる。ある種の型の家族性CJDは、コドン200および210の突然変異に関連しており、コドン129および178の突然変異は家族性CJDおよびFFIの両方において見出されている(Baldwin、上記)。
【００７７】
老人性全身性アミロイド症
全身性または局所性のアミロイド沈着は加齢と共に増加する。例えば、野生型トランスチレチン(TTR)の原線維は、通常、年長個体の心臓組織に見られる。これらは無症候性であったり、臨床的にサイレントであったり、心不全を生じることがある。無症候性の局所性の原線維沈着物は、脳(Aβ)、前立腺のアミロイド小体(β2ミクログロブリン)、関節、および精嚢に生じることもある。
【００７８】
脳アミロイド症
アミロイドの局所性の沈着は、特に年長個体の脳に多く見られる。脳で最もよく見られる型のアミロイドは、主に、Aβペプチド原線維を含み、痴呆または散発性(非遺伝性)のアルツハイマー病を生じる。実際、散発性アルツハイマー病の発現頻度は、遺伝性であることが示されているものをはるかに上回る。これらの斑を形成する原線維ペプチドは遺伝型のアルツハイマー病(AD)を参照して上記したものと非常に類似している。
【００７９】
透析関連アミロイド症
β2ミクログロブリン(β2M)原線維を含む斑は、通常、長期血液透析または腹膜透析を受けている患者に生じる。β2ミクログロブリンは11.8キロダルトンのポリペプチドであり、全ての有核細胞上に存在するクラスI MHC抗原の軽鎖である。通常の環境では、それは細胞膜から連続的に放出され、通常腎臓によってろ過される。腎機能障害の例などでは、除去されないことにより、腎臓および他の部位(主に関節のコラーゲンに富む組織)に沈着が起こる。他の原線維タンパク質とは異なり、β2M分子は、一般に原線維内で未切断形態で存在する(Benson、上記)。
【００８０】
ホルモン由来のアミロイド症
内分泌器官は、特に加齢個体においてアミロイド沈着物を保有することがある。ホルモン分泌性腫瘍もホルモン由来アミロイド斑を含有することがあり、その原線維は、カルシトニン(甲状腺の髄様癌)、島アミロイドポリペプチド(アミリン、ほとんどのII型糖尿病患者に生じる)および心房性ナトリウム利尿ペプチド(孤立性心房性アミロイド症)などのポリペプチドホルモンから作られている。これらタンパク質の配列および構造は、当技術分野においてよく知られている。
【００８１】
その他のアミロイド症
通常、アミロイドの局所性沈着物としての症状発現である種々の他の型のアミロイド疾患がある。一般に、これらの疾患は、おそらく、特定の原線維前駆体の局所的な産生および／もしくは異化作用の欠損、または原線維沈着に関する特定の組織(関節など)の素因の結果である。このような特発性沈着の例には、結節性ALアミロイド、皮膚アミロイド、内分泌アミロイドおよび腫瘍関連アミロイドが挙げられる。
【００８２】
薬学的組成物
本発明の薬学的組成物は、右旋型(D-異性体)のアミノ酸残基を少なくとも50%有する原線維ペプチドから製造されるワクチンに関する。好ましくは、ワクチンは、全D-Aβ(10〜21)、D-Aβ(13〜21)、D-Aβ(25〜35)、D-Aβ(16〜21)、D-Aβ(10〜16)、D-Aβ(1〜40)、D-Aβ(1〜42)、D-Aβ(10〜22)、D-Aβ(13〜22)もしくはD-Aβ(16〜22)またはD-Aβ(1〜42)のN-もしくはC-末端領域から製造される。ワクチンは、宿主の免疫応答を誘発するまたは天然型標的を認識する抗体を産生すると考えられている。本明細書において使用する「全-D」は、D-配置アミノ酸を少なくとも50%有するペプチドを含む。好ましくは、「全-D」はまた、D-配置アミノ酸を50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%以上または100%有するペプチドを含む。
【００８３】
本発明によるワクチンは、以下の2つの可能なシナリオにより脳アミロイド症の発症を予防することができる：1)アミロイド沈着部位における抗Aβ抗体の作用、および2) 循環液中の抗Aβレベルが高いことによる、血漿Aβ濃度に対する全身的な作用。
【００８４】
具体的には、血漿中の高い抗Aβ抗体レベルは、正常なAβ血漿レベルを低下させ、それによって正常なAβレベルの全身的不均衡を形成することによって、全身的に作用することができる。脳と血漿のAβレベルの間の正常な均衡を再度確立するために、このような不均衡により、Aβを脳から除去し、末梢に導入する機序が活性化されると思われる。
【００８５】
従って、能動免疫または受動免疫が血漿および脳のAβ40レベルに対して与える影響を、このような免疫後の異なる経過時点において判定することによって、この可能性を利用することができる。Aβ-免疫化はまた、脳アミロイド症の発症に対する全身的な予防効果を発揮することもできる。血漿および脳のAβレベルの比は免疫した遺伝子組換え動物では一定に維持されるはずであるが、対照の動物では低下するはずである。また、免疫した遺伝子組換え動物から未処理の遺伝子組換え動物にB-細胞または骨髄細胞を移入することは、抗Aβ抗体を使用した受動免疫と同じ影響を有するはずである。
【００８６】
さらに、本発明のワクチンには、「自己」タンパク質を使用するという欠点がなく、免疫応答を誘導するために凝集させる必要がない。例えば、全-D-Aβ(16〜21)ペプチドに対して形成される抗体は、全-L-Aβ(16〜21)ペプチド配列を認識すると期待することができる。本発明の薬学的組成物は、免疫原性ペプチド以外に、有効量のアジュバントおよび／または賦形剤を含んでもよい。薬学的に有効で有用なアジュバントおよび賦形剤は当技術上既知であり、以下にさらに詳細に記載されている。
【００８７】
本発明によると、アミロイド斑のある種の成分に向かう免疫応答を誘発または提供することができる組成物は、アミロイド疾患を治療またはアミロイド疾患の発症を予防するのに有効である。特に、本明細書に提供されている本発明によると、免疫刺激用量の抗アミロイドペプチドまたは対応する抗アミロイド免疫ペプチドを患者に投与して、罹患個体のアミロイド沈着の進行を防ぎ、症状を軽減し、および／またはアミロイド沈着プロセスを減少させることができる。このセクションは、アミロイドタンパク質に対する能動免疫応答および受動免疫応答を生ずる例示的な抗アミロイドペプチドを記載し、このような組成物を使用する治療がアミロイドの脳内濃度に対して与える影響を示す例示的なデータを提供する。
【００８８】
抗アミロイドペプチド：アミロイドタンパク質の抗体、類似体、および断片
一般に、本発明の抗アミロイドペプチドは、通常、特徴的なタンパク質、ペプチドまたはその断片である、特定の斑成分、好ましくはアミロイドまたはアミロイド形成成分を含む。ヒト型のAβは、Aβ39、Aβ4O、Aβ41、Aβ42およびAβ43と言われる。これらのペプチドの配列およびAPP前駆体に対する関係は、Hardy ら、 TINS 20, 155-158 (1997)の図1によって図示されている。例えば、Aβ42は、以下の配列を有する：
2005508863.tif 000005
【００８９】
Aβ41、Aβ40およびAβ39は、c-末端から、それぞれ、Ala、Ala-IleおよびAla-Ile-Valが脱落している点でAβ42と異なる。Aβ43は、c-末端にトレオニン残基が存在することがAβ42と異なる。
【００９０】
Aβの免疫原性断片は、いくつかの理由により本発明の方法では完全な分子より有利である。第一に、Aβ内のある種のエピトープだけが、アルツハイマー病を治療するために有用な免疫原性応答を誘導するので、このようなエピトープを含有する断片の質量の等しい投与量は、完全なAβの投与量より多くのモル濃度の有用な免疫原性エピトープを提供する。第二に、Aβのある種の免疫原性断片は、Aβが由来するAPPタンパク質に対する大きな免疫原性応答を生ずることなく、アミロイドタンパク質に対する免疫原性応答を生ずる。第三に、Aβの断片は、サイズが短いので、完全なAβより製造が簡単である。第四に、Aβの断片は、完全なAβと同一の方法では凝集せず、薬学的組成物の製造およびその投与を簡単にする。第五に、全長のAβは細胞に毒性であるが、断片は毒性ではなく、Aβ凝集物は斑の沈着を促進する種として働くと思われるが、非凝集断片はそのように作用しない。第六に、Aβは、典型的および代理の補体カスケードを調整して、活性化することができるという珍しい特性を有する。特に、それはClqに結合し、最終的にはC3biに結合する。この結合は、マクロファージへの結合を促進し、B細胞を活性化させる。また、C3biはさらに分解して、T細胞依存的方法でB細胞上のCR2に結合し、これらの細胞の活性を10,000倍増加させる。この機序により、Aβは他の抗原を超える免疫応答を生ずる(Bradtら、Complement-dependent Proinflammatory Properties of the Alzheimer's Disease β-Peptide, J. Exp. Med. 188巻、431〜438ページ(1998)；Thorntonら、Clin. Exp. Immunol. 104巻、531〜7ページ(1996)；Jacquier-Sarlinら、Immunology 84巻、164〜70(1995)。
【００９１】
Aβの免疫原性断片には、天然ペプチドの少なくとも2、3、5、6、10または20の連続するアミノ酸配列を有するものがある。Aβの10、9、8、7、5または3以下の連続する残基を有する免疫原性断片もある。好ましい免疫原性断片としては、Aβの残基1〜42が挙げられる。抗体がAβの残基16〜21内のエピトープに特異的に結合する方法もある。抗体がAβの残基13〜21内のエピトープに特異的に結合する方法もある。抗体がAβの残基10〜21内のエピトープに特異的に結合する方法もある。抗体がAβの残基10〜16内のエピトープに特異的に結合する方法もある。抗体がAβの残基25〜35内のエピトープに特異的に結合する方法もある。Aβ16〜21という呼び方は、例えば、断片がAβの残基16〜21を含み、Aβの他の残基を欠損していることを示す。他の好ましさが下がる断片には、Aβ1〜5、1〜6、1〜7、1〜10、3〜7、1〜3および1〜4が挙げられる。これらの断片は、使用前に、実施例に記載するように、アミロイド沈着物を除去または予防する際の活性についてスクリーニングする必要がある。天然型のAβに存在する少なくとも1つの、時には少なくとも5つまたは10の、N-またはC-末端アミノ酸を欠損する断片が使用される方法もある。例えば、Aβ43のC-末端から5つのアミノ酸を欠損する断片としては、AβのN-末端から最初の38のアミノ酸が挙げられる。特記しない限り、Aβの言及は、上記に示す天然型ヒトアミノ酸配列、ならびに対立遺伝子、種および誘導された変種を含む類似体を含む。類似体は、典型的には、しばしば保存的置換によって、1つ、2つまたは数箇所の位置が天然型ペプチドとは異なる。類似体は、典型的には、天然型ペプチドと少なくとも50%の配列の同一性を示し、好ましくは60%、70%、80%の配列の同一性を示し、最も好ましくは90%の配列の同一性を示す。NまたはC末端アミノ酸の、1つ、2つまたは数箇所の位置に非天然型アミノ酸または修飾を含む類似体もある。例えば、Aβの位置1および／または7の天然のアスパラギン酸残基をイソ-アスパラギン酸と交換することができる。非天然型アミノ酸の例は、D-アミノ酸、α,α-二置換アミノ酸、N-アルキルアミノ酸、乳酸、4-ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタメート、ε-N,N,N-トリメチルリジン、ε-N-アセチルリジン、O-ホスホセリン、N-アセチルセリン、N-ホルミルメチオニン、3-メチルヒスチジン、5-ヒドロキシリジン、ω-N-メチルアルギニンおよびイソアスパラギン酸である。断片および類似体は、以下に記載するように、未処理の対照またはプラシーボ対照と比較して、遺伝子組換え動物モデルにおいて予防または治療効果についてスクリーニングすることができる。
【００９２】
Aβ、その断片および類似体は、固相ペプチド合成もしくは組換え発現によって合成することも、または天然起源から得ることもできる。自動ペプチド合成装置は、カリフォルニア州フォスターシティーのApplied Biosystemsなどの数多くの供給元から市販されている。組換え発現は、大腸菌などの細菌、酵母、昆虫細胞または哺乳類細胞において行うことができる。組換え発現の手法は、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (C.S.H.P. Press, NY 第2版、1989)に記載されている。いくつかの型のAβペプチドは市販もされている(例えば、American Peptides Company, Inc.、カリフォルニア州サニーベール、およびCalifornia Peptide Research, Inc. 、カリフォルニア州ナパ)。
【００９３】
治療用ペプチドはまた、例えば、Aβペプチドの活性な断片を他のアミノ酸と共に含む長いポリペプチドも含む。他のアミノ酸は、アジュバント特性または免疫刺激特性を有するものおよびペプチドの安定性を増加させる働きをするものを含んでもよい。例えば、好ましいペプチドは、異種アミノ酸配列に対するヘルパーT-細胞応答を誘導し、それによってAβセグメントに対するB-細胞応答を誘導する、異種アミノ酸配列に融合したAβのセグメントを含む融合タンパク質を含む。このようなポリペプチドは、以下に記載するように、未処理の対照またはプラシーボ対照と比較して、動物モデルにおいて予防または治療効果についてスクリーニングすることができる。Aβペプチド、類似体、活性な断片または他のポリペプチドは、結合した形態もしくはマルチマー形態または解離した形態で投与することができる。治療用ペプチドはまた、モノマーおよびオリゴマー免疫原性ペプチドのマルチマーを含む。さらに一般的には、本発明に使用する治療用ペプチドは、アミロイドタンパク質に対して免疫応答を形成または誘導する。抗体は、シンク（sink）として作用して、Aβを脳から末梢に誘導し、Aβ平衡をCNSから末梢に調節するかまたは末梢でAβと安定な複合体を形成することによって、Aβの脳からの除去を促進するために、末梢において可溶性の形態に結合することも考えられる。従って、このようなペプチドには、成分自体およびその変種、成分に対する抗体を誘導および／もしくは交差反応する成分の類似体および模倣体、ならびにアミロイドペプチドと特異的に反応する抗体もしくはT-細胞が挙げられるが、これらに限定されない。免疫応答の誘導は、患者の成分と反応性の抗体もしくはT-細胞を誘導するために免疫原が投与される場合には能動的であっても、または、それ自身が患者のアミロイドペプチドに結合する抗体が投与される場合には受動的であってもよい。アミロイドタンパク質に対して免疫応答を誘導または形成するための例示的なペプチドは以下に記載されている。
【００９４】
一般的なクラスの好ましい抗アミロイドペプチドは、アミロイドタンパク質に由来するペプチドからなる。上記のように、アミロイド疾患の指標は、特徴的なアミロイドタンパク質またはペプチドを含む主に原線維からなるアミロイド斑の1つまたは複数の臓器への沈着である。本発明によると、このようなアミロイドタンパク質またはペプチド成分は、抗アミロイド免疫応答を誘導するのに有用なペプチドである。表1は、種々のアミロイド疾患に特徴的な例示的な原線維形成タンパク質を要約している。本発明のこの局面によると、その相同体または断片を含む適当なアミロイドタンパク質またはペプチドを含む免疫刺激組成物を罹患個体または罹患しやすい個体に投与することにより、アミロイド疾患に対する治療または予防が提供される。
【００９５】
上記に考察したように、遺伝型のアミロイド症を治療する他の製剤には、遺伝性全身性アミロイド症を治療するためにゲルソリン断片に対する免疫応答を形成する組成物、遺伝性神経障害を治療するために突然変異リゾチームタンパク質(Alys)に対する免疫応答を形成する組成物、非神経障害型のアミロイド症の腎疾患としての症状発現のためのフィブリノーゲンの突然変異α鎖(AfibA)に対する免疫応答を形成する組成物、およびアイスランドで報告された型の遺伝性脳血管障害を治療するために突然変異シスタチンC(Acys)に対する免疫応答を形成する組成物が挙げられる。また、ある種の遺伝型のプリオン病(例えば、クロイツフェルト-ヤコブ病(CJD)、ゲルストマン-シュトロイスラー-シャインカー症候群(GSS)および致死性家族性不眠症(FFI))は、突然変異アイソフォームのプリオンタンパク質、PrPScによって特徴付けられる。このタンパク質は、本発明により、PrP斑の沈着の治療および予防のための治療用組成物に使用することができる。
【００９６】
上記のように、アミロイド沈着は、全身性であっても、局所性であっても、加齢に関連している。このような加齢に関連する1つ以上のタンパク質からなる組成物を罹患しやすい個体に投与することによって、このような沈着を予防または治療することができるのは、本発明のさらなる局面である。このように、野生型TTRに由来するATTRを含む斑は、高齢者の心臓組織に見られることが多い。同様に、ある年長個体は、脳にAβの無症候性局所性原線維沈着を発症することがあり、本明細書において詳細に記載するAβペプチド治療はこのような個体において保証されると考えられる。限定するものではないさらに別の例として、本発明の治療方法の候補である数多くの他の非遺伝型のアミロイド疾患がある。β2ミクログロブリン原線維斑は、通常、長期血液透析または腹膜透析を受けている患者において発症する。このような患者は、本発明により、β2ミクログロブリンに対する治療用組成物、またはさらに好ましくは、その免疫原性エピトープで治療しうる。
【００９７】
ホルモン分泌腫瘍も、その組成が一般に罹患した特定の内分泌臓器を特徴づける、ホルモン由来のアミロイド斑を含有することがある。このように、このような原線維は、カルシトニン(甲状腺の髄様癌)、島アミロイドポリペプチド(ほとんどのII型糖尿病患者に生じる)および心房性ナトリウム利尿ペプチド(孤立性心房性アミロイド症)などのポリペプチドホルモンから作られうる。アテローム性動脈硬化症の大動脈内膜に形成されるアミロイド沈着物に対する組成物も本発明に考慮されている。例えば、Westermarkらは、このような斑を形成するアポリポタンパク質Aの69アミノ酸N-末端断片を記載しており(Westermarkら、Am. J. Path. 147: 1186-92, 1995)、本発明の治療用組成物には、このような断片に対する免疫学的ペプチドおよび断片自身が含まれる。
【００９８】
上記の考察は、種々の型のアミロイド疾患を治療または予防する際に治療用ペプチドとして使用しうるアミロイド原線維成分に焦点を絞っている。
【００９９】
治療用ペプチドは、ヒトに投与すると、同様の予防的または治療的免疫応答を誘導するエピトープを含有する天然型もしくは突然変異型原線維ペプチドまたはタンパク質の活性な断片あるいは類似体であってもよい。免疫原性断片は、典型的には、天然のペプチドの少なくとも3、5、6、10または20の連続するアミノ酸の配列を有する。例示的なAβペプチド免疫原性断片としては、Aβの残基16〜21、残基13〜21、残基10〜21、残基10〜16、残基25〜35、残基10〜22、残基13〜22、残基16〜22が挙げられる。抗体が、Aβの遊離N-またはC-末端残基を含むエピトープに結合する方法もある。
【０１００】
天然型原線維成分に存在する、少なくとも1つ、ときには少なくとも5または10の、N-またはC-末端アミノ酸を欠損する断片を使用する方法もある。例えば、Aβ43のC-末端から5つのアミノ酸を欠損する断片として、AβのN-末端から最初の38アミノ酸が挙げられる。いくつかの方法においては、AβのN-末端側の断片が好ましい。類似体には、対立遺伝子、種および誘導された変種が挙げられる。類似体は、典型的には、しばしば保存的置換によって、1箇所または数箇所が天然型ペプチドと異なる。類似体は、典型的には、天然のペプチドと少なくとも80%または90%の配列の同一性を示す。NまたはC末端のアミノ酸に非天然のアミノ酸または修飾を含む類似体もある。非天然のアミノ酸の例は、α,α-二置換アミノ酸、N-アルキルアミノ酸、乳酸、4-ヒドロキシプロリン、(-カルボキシグルタメート、(-N,N,N-トリメチルリジン、(-N-アセチルリジン、O-ホスホセリン、N-アセチルセリン、N-ホルミルメチオニン、3-メチルヒスチジン、5-ヒドロキシリジン、T-N-メチルアルギニンである。
【０１０１】
一般に、本発明のこの局面により設計される断片および類似体は、天然型原線維成分との交差反応性および／または以下に記載する遺伝子組換え動物モデルにおける予防的または治療的効果についてスクリーニングすることができることを当業者は認識する。このような断片または類似体は、それらの免疫反応性および動物モデルでの有効性が、アミロイド原線維成分について測定された対応するパラメーターとほぼ等しいかまたはそれを上回る場合には、本発明の治療用組成物に使用しうる。
【０１０２】
このようなペプチド、タンパク質または断片、類似体および他のアミロイド形成ペプチドは、当技術上既知の標準的な方法により固相ペプチド合成もしくは組換え発現によって合成することも、または天然起源から得ることもできる。例示的な原線維組成物、原線維を抽出する方法、原線維ペプチドまたはタンパク質成分の配列は、引用文献の多くおよび本明細書に提供されている特定の原線維成分に関する説明によって提供される。さらに、他の組成物、抽出方法および配列を決定する方法は、このような組成物を製造し、使用することを所望する人々が利用できる分野において既知である。自動ペプチド合成装置は、Applied Biosystems (Perkin Elmer、カリフォルニア州フォスターシティ)などの数多くの製造業者から市販されており、これを使用してこのような組成物を製造することができる。合成ペプチドを製造する手法は当技術上既知である。組換え発現は、組換え発現は、大腸菌などの細菌、酵母、昆虫細胞または哺乳類細胞において行うことができる。または、タンパク質は、当技術分野において既知の、細胞を含有しないインビトロ翻訳系を使用して製造することができる。組換え発現の手法は、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (C.S.H.P. Press, NY 第2版、1989)によって記載されている。ある種のペプチドおよびタンパク質は市販もされており、例えば、いくつかの型のAβペプチドは、American Peptides Company, Inc.、カリフォルニア州サニーベールおよびCalifornia Peptide Research, Inc. 、カリフォルニア州ナパなどの供給元から入手できる。
【０１０３】
治療用ペプチドは、例えば、活性ペプチドアミロイド断片または類似体を他のアミノ酸と共に含む長いポリペプチドを含んでもよい。例えば、Aβペプチドは、APPタンパク質全体またはそのセグメント、例えば、AβのN-末端から始まりAPPの末端まで続くC-100断片など、として存在することができる。このようなポリペプチドは、以下に記載する動物モデルにおいて予防的または治療的効果についてスクリーニングすることができる。Aβペプチド、類似体、活性な断片または他のポリペプチドは、結合型(すなわち、アミロイドペプチドとして)またはオリゴマー、モノマーもしくは可溶性型などの解離型で投与することができる。治療用ペプチドはまた、広い範囲の抗アミロイド斑活性を提供するために、モノマーおよびオリゴマー免疫原性ペプチドのマルチマーもしくは結合物または担体タンパク質を含んでも、ならびに／または上記のように、他の原線維成分に添加してもよい。
【０１０４】
さらに別の形態において、Aβの断片などの免疫原性ペプチドは、免疫原性組成物の一部としてウィルスまたは細菌によって提供されうる。免疫原性ペプチドをコードする核酸が、ウィルスまたは細菌のゲノムまたはエピソームに組み込まれる。選択的に、核酸は、ペプチドが提示されるように、免疫原性ペプチドが分泌タンパク質として、またはウィルスの外側表面タンパク質もしくは細菌の膜貫通タンパク質との融合タンパク質として発現される方法で組み込まれる。このような方法に使用されるウィルスまたは細菌は、非病原性または弱毒性でなければならない。好適なウィルスには、アデノウィルス、HSV、ベネズエラウマ脳炎ウィルスおよび他のαウィルス、水疱性口内炎ウィルスおよび他のラブドウィルス、ワクシニアならびに鶏痘が挙げられる。好適な細菌には、サルモネラおよびシゲラが挙げられる。HBVのHBsAgへの免疫原性ペプチドの融合は特に好適である。治療用ペプチドとして、Aβとアミノ酸配列の顕著な類似性を必ずしも持たないが、Aβの模倣体として働き、同様の免疫応答を誘導する、ペプチドおよび他の化合物も挙げられる。例えば、β-プリーツシートを形成する任意のペプチドおよびタンパク質を好適性についてスクリーニングすることができる。Aβまたは他のアミロイド形成ペプチドに対するモノクローナル抗体に対する抗イディオタイプ抗体も使用することができる。このような抗Id抗体は抗原を模倣し、それに対する免疫応答を形成する(Essential Immunology (Roit編、Blackwell Scientific Publications、パロアルト、第6版)、181ページを参照されたい)。Aβペプチド以外のペプチドは、上記に掲載したAβの好ましいセグメント(例えば、10〜16、10〜21、13〜21、16〜21および25〜35)の1つ以上に対する免疫原性応答を誘導しなくてはならない。好ましくは、このようなペプチドは、Aβの他のセグメントに向かうことなく、これらのセグメントの1つに特異的に向かう免疫原性応答を誘導する。
【０１０５】
ペプチドまたは他の化合物のランダムライブラリも好適性についてスクリーニングすることができる。ステップバイステップ様式で合成することができる多数の種類の化合物のコンビナトリアルライブラリを作製することができる。このような化合物には、ポリペプチド、β-ターン模倣体、多糖、リン脂質、ホルモン、プロスタグランジン、ステロイド、芳香族化合物、複素環化合物、ベンゾジアゼピン、オリゴマーN-置換グリシンおよびオリゴカルバメートが挙げられる。化合物の大規模コンビナトリアルライブラリは、Affymax、国際公開公報第95/12608号、Affymax、国際公開公報第93/06121号、コロンビア大学、国際公開公報第94/08051号, Pharmacopeia、国際公開公報第95/35503号およびScripps、国際公開公報第95/30642号(各々、全ての目的のために参照として組み入れられる)に記載されているコード化合成ライブラリ(encoded synthetic libraries(ESL))法によって構築することができる。ペプチドライブラリもファージディスプレイ法で作製することができる。例えば、Devlin、国際公開公報第91/18980号を参照されたい。
【０１０６】
コンビナトリアルライブラリおよび他の化合物は、まず、AβまたはATTRなどの他のアミロイド形成ペプチドに特異的であることが既知である抗体またはリンパ球(BまたはT)に結合する能力を判定することによって、好適性についてスクリーニングされる。例えば、最初のスクリーニングは、Aβまたは関心対象の任意の他のアミロイド形成ペプチドに対する任意のポリクローナル血清またはモノクローナル抗体を用いて実施することができる。このようなスクリーニングによって同定した化合物を、Aβまたは他のアミロイド形成ペプチドに対する抗体または反応性リンパ球を誘導する能力についてさらに分析する。例えば、アミロイドペプチドで事前コーティングしたマイクロタイタープレートで多重希釈血清を試験することができ、標準的なELISAを実施して、Aβに対する反応性抗体を試験することができる。次いで、実施例に記載するように、アミロイド形成疾患に罹患しやすいようにした遺伝子組換え動物において、予防的および治療的有効性について化合物を試験することができる。このような動物には、例えば、Gamesら（上記）によって記載されているAPPの717突然変異を有するマウス、ならびに、McConlogueら、米国特許第5,612,486号、およびHsiaoら、Science 274, 99 (1996)；Staufenbielら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 13287-13292 (1997)；Sturchler-Pierratら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 13287-13292 (1997)；Borcheltら、Neuron 19, 939-945 (1997))によって記載されているものなどのAPPの670/671スウェーデン突然変異を有するマウスが挙げられる。上記のように、Aβの断片、Aβの類似体、およびAβを含む長いペプチドなどの他の可能なペプチドについて同一のスクリーニング方法を使用することができる。
【０１０７】
他のアミロイド斑成分に対する免疫学的応答も、アミロイド疾患において、斑の沈着を予防、遅延、または減少させる際に有効となりうると考えられる。このような成分は、原線維の小さな成分であっても、または原線維に結合しても、もしくは斑内の原線維形成に関係してもよいが、生体内に偏在する、またはアミロイド沈着物に比較的非特異的な成分は、一般に治療標的として使用する上で適性が低い。
【０１０８】
従って、特定の斑成分に対する免疫応答を誘導するペプチドが、アミロイド疾患の進行を治療または予防する際に有用であることは、本発明のさらなる発見である。このセクションは、いくつかの例示的なアミロイド斑関連分子の背景を提供する。これらの分子を単独で、または上記の原線維成分に対するもしくは下記の他の非原線維形成成分のいずれかに対する免疫原性治療用組成物との併用によって、これらの分子に対する免疫応答を誘導することにより、本発明による他の抗アミロイド治療法が提供される。また、本発明の形成部分は、本明細書に記載するような、このような斑成分に基づいた受動免疫療法である。
【０１０９】
一例として、シヌクレインは、構造がアポリポタンパク質に類似しているが、特にシナプス前終末付近の神経細胞質ゾルに見出されるタンパク質である。α、βおよびγシヌクレインと名づけられた、少なくとも3つの型のタンパク質がある。最近、αおよびβシヌクレインはある種のアミロイド疾患、特にアルツハイマー病におけるアミロイド沈着物の核形成に関与することが示されている(Clayton, D. F.ら、TINS 21(6): 249-255, 1998)。さらに詳細には、αおよびβシヌクレインのNACドメインの断片(残基61〜95)がアルツハイマー病患者のアミロイド斑から単離されており、実際、この断片は、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)で可溶化しても不溶性のままである斑の約10%を構成する(George, J. M.ら、Neurosci. News 1: 12-17, 1995)。さらに、全長のαシヌクレインおよびそのNAC断片は、インビトロにおいてβ-アミロイドペプチドの不溶性のアミロイドへの凝集を促進することが報告されている(Clayton、上記)。
【０１１０】
アミロイド斑に関連する他の成分には、非ペプチド成分が挙げられる。例えば、パールカン（perlecan）およびパールカン由来グリコサミノグリカンは、糖尿病に関連するアミリン斑を含む、アルツハイマー病ならびに他のCNSおよび全身性アミロイド症のAβを含有するアミロイド斑に存在する大型の硫酸ヘパリンプロテオグリカンである。これらの化合物は、Aβ原線維形成を増強することが示されている。パールカンのコアタンパク質およびグリコサミノグリカン鎖はAβへの結合に関与することが示されている。他のグリコサミノグリカン、具体的には、デルマタン硫酸、コンドロイチン-4-硫酸およびペントサンポリ硫酸は様々な種類のアミロイド斑に共通に見られ、原線維形成を増強することも示されている。デキストラン硫酸もこの特性を有する。この増強作用は、分子が脱硫酸化されると、有意に低下する。特定のグリコサミノグリカン自体を含む硫酸型のグリコサミノグリカンに向けられる免疫原性治療剤は、一次または二次治療として、本発明の他の態様を形成する。このような分子の製造およびこのような分子を含有する適当な治療用組成物は、当業者の技術の範囲内である。
【０１１１】
免疫手法
本発明のワクチンを受けた宿主に存在する誘発された抗体は、Aβ(16〜21)エピトープまたはAβ(10〜21)、Aβ(13〜21)などの他のエピトープに結合する。AβのAB(10〜22)、AB(13〜22)、AB(16〜22)およびN-またはC-末端領域は、アミロイド形成を予防または回復させる能力を有する。本発明のワクチンは、ワクチン投与した宿主において効果的な抗アミロイド形成抗体を形成させる。
【０１１２】
提案する免疫手法は以下のとおり：
a)天然型βアミロイドペプチド、すなわちAβ(全-L)の配列と実質的に同一の配列を有する全-Dペプチドからワクチンを製造する。全-Dペプチドは、全長のAβ(1〜42、全-D)、Aβ(1〜42、全-D)の免疫原性断片に由来するペプチド、および関連するペプチド様物質を含む。
b)宿主をワクチンで免疫して、原線維形成、関連する細胞毒性、および神経変性を予防することができる結合部位を有する抗体を宿主内に形成させる。
【０１１３】
薬学的に許容される好適な担体には、リン酸緩衝生理食塩液(PBS)などの、経口、非経口、鼻、粘膜、経皮、血管内(IV)、動脈内(IA)、筋肉内(IM)および皮下(SC)投与経路に好適な任意の非免疫原性薬学的アジュバントが挙げられるが、これに限定されない。
【０１１４】
薬学的担体は、抗原を抗原提示細胞に搬送する媒体を含有してもよい。媒体の例は、リポソーム、免疫刺激複合体、微小流動化水中スクアレンエマルジョン(microfluidized squalene-in-water emulsion)、ポリ(乳酸／グリコール酸）(PLGA)を含んでもよいミクロスフェアである。規定された寸法の粒子(<5ミクロン)には、水中油滴型ミクロエマルジョン(MF59)およびポリマー微小粒子が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１５】
本発明の担体はまた、免疫応答を増大するためまたは免疫原の抗原性を増加するために化学的および遺伝的アジュバントまたは免疫刺激因子を含んでもよい。これらのアジュバントまたは免疫刺激因子は、リンパ系細胞動員、サイトカイン誘導およびDNAの細胞内への流入の促進などのいくつかの機序により免疫調節特性を発揮する。サイトカインアジュバントには、顆粒球-マクロファージコロニー-刺激因子、インターロイキン-12、GM-CSF、合成ムラミルジペプチド類似体またはモノホスホリルリピドAが挙げられるが、これらに限定されない。他の化学的アジュバントまたは免疫刺激因子には、乳酸菌、Al(OH)3、ムラミルジペプチドおよびサポニンが挙げられるが、これらに限定されない。細菌アジュバントの例には、CpGモチーフ、フロイント、ムラミルジペプチド、LPS誘導体、熱ショックタンパク質(HSP)、リピドA誘導体、多糖、コレラ毒素、百日咳菌死菌およびLT(リンホトキシン大腸菌)が挙げられるが、これらに限定されない。非細菌性アジュバントの例には、アルミニウム塩、ミョウバン、鉱物油、イスコーム(iscoms)、リポソーム、ビロゾーム、アーケオゾーム(archaeosomes)、トランスファーゾーム(transfersomes)、ニオゾーム(niosomes)、コクレート(cochleates)、プロテオソーム、リン酸カルシウム、DDA(ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド)、サイトカイン、ホルモンおよびC3dが挙げられるが、これらに限定されない。このようなアジュバントは当技術上十分に理解されている。
【０１１６】
ペプチドは、循環液中のペプチドの半減期を調節する担体に接続してもよい。これにより、保護期間をコントロールすることができる。ペプチド-担体はアジュバントに乳化させ、標準的な免疫経路によって投与してもよい。
【０１１７】
本発明の組成物および方法は、アミロイド-β原線維形成、凝集または沈着に関連する疾患を治療するために、治療的または予防的に投与することができる。本発明の組成物および方法はまた、例示する意図のものであって限定するものではない以下の機序のいずれかを使用して、アミロイド-β関連疾患の経過を軽減するようにも作用しうる：アミロイド-β原線維形成もしくは沈着速度を低下させる；アミロイド-β沈着の程度を低下させる；アミロイド-β原線維形成を阻害、予防もしくは低下させる；アミロイド-βによって誘導される神経変性もしくは細胞毒性を阻止する；アミロイド-β誘導性の炎症を阻止する；脳からのアミロイド-βの除去を増加する；または、脳もしくは血漿中のアミロイド-β40もしくはアミロイド-β42ペプチドのレベルを低下させる。
【０１１８】
好ましい態様において、本発明の方法は、アルツハイマー病(例えば、散発性または家族性AD)を治療するために使用される。本発明の方法は、ダウン症候群患者、および脳アミロイド血管障害患者、遺伝性脳アミロイド血管障害患者、遺伝性脳内出血患者、または出血発作患者におけるような、アミロイド-β沈着の他の臨床症状発現を治療するために、予防的または治療的にも使用することができる。
【０１１９】
また、筋肉繊維へのAPP(β-アミロイド前駆体タンパク質)およびアミロイド-βタンパク質の異常な蓄積は、散発性封入体筋炎(IBM)の病因に関係しているとされている(Askanas, V.ら、(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1314-1319、Askanas, V.ら、(1995) Current Opinion in Rheumatology 7: 486-496)。従って、本発明の化合物は、化合物を筋肉線維に送達することによって、IBMの治療などの、アミロイド-βタンパク質が非神経学的位置に異常に沈着する疾患の治療に、予防的または治療的に使用することができる。
【０１２０】
本発明のワクチンは、ほとんどの場合、血管内(IV)、動脈内(IA)、筋肉内(IM)、皮下(SC)、経皮などのように、非経口的に投与される。いくつかの例において、ワクチンの性質により血管系に移行することができる場合には、投与は、経口、経鼻、経直腸、経皮、またはエアロゾルであってもよい。通常、単回注射を使用するが、望ましい場合には、2回以上の注射を使用してもよい。典型的には、初回免疫に次いで、同一抗原または望ましい場合にはさらに改変した抗原を使用して、数週間の間隔で多数回の追加抗原投与を実施する。アジュバントまたは免疫刺激因子は、同一であってもよく、望ましい場合には異なってもよい。ワクチンは、シリンジ、外套針、カテーテル等を含む、任意の簡便な手段によって投与してよい。好ましくは、投与は血管内であり、導入部位が本発明にとって重大でない場合は、好ましくは血の流れが速い部位、例えば、末梢または中心静脈への静脈内である。投与に徐放技法または保護基質を組み合わせる場合には、他の経路にも用途が見出される。
【０１２１】
アルツハイマー病および他のアミロイド関連疾患を予防および／または治療する際の本発明のワクチンの用途は、対応する全-Dペプチドに対する抗体を形成し、それらが天然のアミロイドペプチド(全-L)の原線維形成を効果的に阻害または予防できるかどうかを調べるためにそれらを試験することによって証明することができる。
【０１２２】
本発明によるワクチンを製造するために使用する化合物は式Iの共通構造を有する：
R'-(P)-R''  (I)
式中、
Pは、原線維またはアミロイドタンパク質の全-Dペプチド、例えば、βシート領域、GAG-結合部位領域、Aβ(1〜42、全-D)およびマクロファージ接着領域(10〜16、全-D)、それらの免疫原性断片、それらの免疫原性誘導体、それらのタンパク質結合物、それらの免疫原性ペプチド、およびそれらの免疫原性ペプチド様物質であり、
R'は、以下のものからなる群より選択されるN-末端置換基であり：
・水素、
・低級アルキル基、例えば、官能基を有してもよい炭素原子数1〜8の非環式または環式のもの、例えば、カルボキシレート、スルホネートおよびホスホネート、
・芳香族基、
・複素環基、ならびに
・アシル基、例えば、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基、スルホニル基、およびホスホニル基であり、
R''はC-末端置換基、例えば、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、置換されていてもよいアミノ基である。
【０１２３】
R'およびR''は同じであっても、異なってもよく、R'およびR''のアルキル基またはアリール基は、ハロゲン化物基(F、Cl、BrおよびI)、ヒドロキシル基、アルコキシル基、アリールオキシル基、ヒドロキシカルボニル基、アルコキシルカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、カルバミル基、置換されていてもよいアミノ基、スルホ基またはアルキルオキシスルホニル基、ホスホノ基またはアルコキシホスホニル基などの群より選択される有機官能基でさらに置換されてもよい。
【０１２４】
「アルキル」という用語は、直鎖アルキル基(例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチルおよびオクチル)を含む飽和脂肪族基、分岐鎖アルキル基(例えば、イソプロピル、tert-ブチル、イソブチル)、シクロアルキル(例えば、脂環式)基(例えば、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル)、アルキル置換シクロアルキル基およびシクロアルキル置換アルキル基を含む。「アルキル」は、炭化水素骨格の1つ以上の炭素原子を置換した、酸素、窒素、硫黄またはリン原子を有するアルキル基をさらに含む。ある態様において、直鎖または分岐鎖アルキルは、骨格の炭素原子数が6以下であり(例えば、直鎖はC1〜C6、分岐鎖はC3〜C6)、さらに好ましくは4以下である。同様に、好ましいシクロアルキルは、環構造の炭素原子数が3〜8であり、さらに好ましくは、環構造の炭素数が5〜6である。「C1〜C6」は、炭素原子数1〜6のアルキル基を含む。
【０１２５】
「アルキル」という用語は、「非置換アルキル」および「置換アルキル」の両方をも含み、後者は、炭化水素骨格の1つ以上の炭素上の水素と置換した置換基を有するアルキル部分をいう。このような置換基として、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、シアノ、アミノ(アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノおよびアルキルアリールアミノを含む)、アシルアミノ(アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む)、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、サルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリールまたは芳香族もしくは芳香族複素環部分を挙げることができる。シクロアルキルは、例えば、上記の置換基でさらに置換されてもよい。「アルキルアリール」または「アラルキル」部分は、アリールで置換したアルキルである(例えば、フェニルメチル(ベンジル))。「アルキル」はまた、天然および非天然アミノ酸の側鎖を含む。
【０１２６】
本明細書において使用する「アシル基」は、アシルラジカル(CH3CO-)またはカルボニル基を含有する化合物および部分を含む。「置換アシル」は、水素原子の1つ以上が、例えば、アルキル基、アルキニル基、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、ホスホニル、シアノ、アミノ(アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノおよびアルキルアリールアミノを含む)、アシルアミノ(アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む)、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、サルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、スルホニル ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリールまたは芳香族もしくは芳香族複素環部分、すなわち、アリールカルボニル、によって置換されているアシル基を含む。
【０１２７】
「複素環基」という用語は、1つ以上のヘテロ原子を含む、閉じた環構造、例えば、3-〜10-または4-〜7-員環を含む。複素環基は飽和であっても不飽和であってもよく、ピロリジン、オキソラン、チオラン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、ラクトン、アゼチジノンおよびピロリジノンなどのラクタム、スルタム、スルトン等を含む。複素環は、1つ以上の位置が上記の置換基、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、シアノ、アミノ(アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノおよびアルキルアリールアミノを含む)、アシルアミノ(アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む)、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、サルフェート、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリルまたは芳香族もしくは芳香族複素環部分で置換されてもよい。
【０１２８】
本明細書において使用する「芳香族基」という用語は、「アリール」置換基を含むことを意図している。「アリール」は、0〜4つのヘテロ原子を含んでもよい5-および6-員環単環芳香族基、ならびに少なくとも1つの芳香族環を有する多環系を含む、芳香族性を有する基を含む。アリール基の例には、ベンゼン、フェニル、ピロール、フラン、チオフェン、チアゾール、イソチアゾール、イミダゾール、トリアゾール、テトラゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジンおよびピリミジン等が挙げられる。さらに、「アリール」という用語は、多環アリール基、例えば、ナフタレン、ベンゾキサゾール、ベンゾジオキサゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾイミダゾール、ベンゾチオフェン、メチレンジオキシフェニル、キノリン、イソキノリン、ナフスリジン（napthridine）、インドール、ベンゾフラン、プリン、ベンゾフラン、デアザプリンまたはインドリジンのような、例えば、三環、二環を含む。環構造にヘテロ原子を有するようなアリール基は、「アリール複素環」、「複素環」、「ヘテロアリール」または「芳香族複素環」といわれることもある。芳香環は、1つ以上の環上の位置が、上記の置換基、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アラルキルアミノカルボニル、アルケニルアミノカルボニル、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アラルキルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、シアノ、アミノ(アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノおよびアルキルアリールアミノを含む)、アシルアミノ(アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む)、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、サルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリールまたは芳香族もしくは芳香族複素環部分で置換されてもよい。アリール基は、多環系(例えば、テトラリン、メチレンジオキシフェニル)を形成するために、芳香族でない脂環式または複素環と縮合または架橋されてもよい。
【０１２９】
官能基が酸である場合には、その薬学的に許容される塩またはエステルは本発明の範囲内である。官能基が塩基である場合には、その薬学的に許容される塩は本発明の範囲内である。
【０１３０】
一態様において、Pは、アミロイドタンパク質または原線維の少なくとも1つの領域と相互作用することができるペプチドである。
【０１３１】
別の態様において、好ましい化合物は、全長のペプチド、Aβ(1〜42、全-D)、ならびに、Aβ(1〜40、全-D)、Aβ(1〜35、全-D)、Aβ(1〜28、全-D)およびAβ(10〜21、全-D)からなる、その低級相同体から選択される。
【０１３２】
別の態様において、好ましい化合物は、短いペプチド、例えば、Aβ(1〜7、全-D)、Aβ(10〜16、全-D)、Aβ(13〜21、全-D)、Aβ(16〜21、全-D)、Aβ(36〜42、全-D)、AB(10〜22、全-D)、AB(13〜22、全-D)またはAB(16〜22、全-D)の群から選択される。ペプチドは、どちらかの末端または両方の末端から1つ以上の残基を除去することによってさらに短くすることができる。
【０１３３】
好ましい化合物は、配列の1つ以上の残基を、アミノアルカンスルホン酸残基などの他のアミノ酸残基または非アミノ酸断片で置換することによって上記のペプチドから誘導された全-Dペプチドであってもよい。
【０１３４】
さらに別の態様において、好ましい化合物は、化合物の生体内分布、免疫原性特性および半減期を調節する担体に接続されてもよい。
【０１３５】
以下は、アルツハイマー病および他のアミロイド関連疾患を予防または治療するためのワクチンを製造する例示的な化合物である：
2005508863.tif 000006
2005508863.tif 000007
2005508863.tif 000008
2005508863.tif 000009
【０１３６】
上記に掲載した化合物は、1つ以上のアミノ酸残基を除去もしくは挿入することによって、または1つ以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸もしくは非アミノ酸部分もしくは断片で置換することによって改変することができる。
【０１３７】
以下は、1または2つのアミノ酸残基を他のアミノ酸で置換することによって、化合物18(全-D KLVFFA-NH2、配列番号：18)から誘導した例示的な化合物である。
2005508863.tif 000010
【０１３８】
上記化合物について、Thi、ChaおよびPglyという用語は、それぞれ、チエニルアラニン、シクロヘキシルアラニンおよびフェニルグリシンを意味することを意図している。
【０１３９】
ウサギを全-Dまたは全-L KLVFFAで免疫した。得られた抗体力価の結果を図7に示す。図7からわかるように、本発明のワクチンは抗体の産生を生じる。
【０１４０】
別の実験において、成体TgCRND8マウスを全-Dまたは全-L KLH-アミロイド-β断片([L]-アミロイド-β 13〜21および[D]-アミロイド-β13〜21)で免疫した。抗体力価の結果を表2に示す。
【０１４１】
【表２】
2005508863.tif 000011
【０１４２】
本発明は、例えば、ワクチン方法を使用したアミロイド療法のような、本発明のワクチンを使用して引き起こされる様々の種類の免疫応答を含む。
【０１４３】
本発明によると、使用する免疫の種類により、優先的なTH-2応答またはTH-1応答を誘発するワクチンも提供される。TH-2応答を誘導することによって、IL-4、IL-10およびTGF-βなどの抗炎症性サイトカイン産生、ならびにIgG1およびIgG2b抗体クラスの産生が促進される。AD患者の脳内では主要な炎症性応答が回避されると思われるので、このような種類の応答は好ましいと思われる。一方、好ましいTH-1応答の場合では、IL-1、IL-6、TNFおよびIFNγなどの炎症性サイトカインの産生による炎症誘発性応答が促進されると思われる。この種の応答は、マクロファージ集団の活性化を誘発する可能性が大きいと思われる。そして、これらのマクロファージは、補体活性化過程および抗体媒介過程により、(斑などの)任意の粒状沈着物を貪食すると思われる。この方法は、すでに形成されている老人斑を除去し、新たな原線維沈着物の形成を予防するのに有益であると思われる。しかし、この応答は、宿主に有害であると思われる炎症応答を伴うとも思われる。
【０１４４】
両方の方法(すなわち、TH-1およびTH-2)とも有用である。使用する抗原は、細胞接着を担当する領域、すなわち10〜16領域、GAG結合部位を担当する領域、すなわち13〜16、βシートを担当する領域、すなわち16〜21、またはC-末端に特異的な領域、すなわち40〜42、を含有するペプチドであってよい。これらのペプチドは、使用するアジュバントの種類に応じてまたはワクチンの投与経路に応じて、優先的なTH-1またはTH-2応答が得られる方法で提示されてもよい。例えば、経鼻投与経路はTH-2応答を促進することが知られているため、このような投与経路による粘膜免疫が考えられる。
【０１４５】
本発明は、本発明の範囲を限定するのではなく本発明を例示するための、以下の実施例を参照することによって、より容易に理解されよう。
【０１４６】
実施例I
原線維形成性アミロイドタンパク質から誘導される全-Dペプチドワクチンの有効性を試験するためのインビトロ確認手法をウサギまたはマウスにおいて実施して、抗体がAβ16〜21(全-D)に対して形成されうることを証明した(図7を参照されたい)。インビトロにおいて抗体が天然のAβ(1〜40、全-L)の原線維形成を効果的に防ぐことを証明するために、作製した抗体を試験した。原線維形成の標準的なアッセイを使用して、チオフラビンT、円偏光二色性、および溶解度に基づくものなどの活性を評価した。
【０１４７】
この方法を使用して、抗原線維形成ワクチンを製造するために全-Dペプチドの形態で使用するとき、Aβペプチドのどの領域が最も有効であるかも確立した。実験は以下のように実施した：
a)Aβ(1〜42)配列から作製される一連の重複する全-Dペプチド、例えば、Aβ(16〜21）、Aβ(10〜21)、Aβ(13〜21)等でウサギまたはマウスを免疫した。
b)免疫したウサギまたはマウスから抗血清を調製した。
c)上記の原線維形成の標準的なアッセイにおいて原線維形成を最も効果的に防ぐ抗血清をAβ配列のどの部分が作製するかを調べるために、これらの抗血清を試験した。
【０１４８】
実施例II
D-およびL-Aβ(16〜21)ペプチドワクチンに対する抗体が原線維形成に対して与える影響
D-およびL-Aβ(16〜21)ペプチドに対して形成される抗体の抗原線維形成活性を試験する確認手法を実施した。
【０１４９】
ウサギをD-およびL-Aβ(16〜21)ペプチドで免疫した。形成された抗体を、ThTアッセイおよび電子顕微鏡(EM)によって抗原線維形成作用について試験した。
【０１５０】
D-およびL-型のKLVFFAに対して形成される抗体は、チオフラビンTアッセイ(ThT)(図2および3)およびEM(図4A〜4C)いずれによってもわかるように、原線維形成過程を遮断することができた。ThTアッセイにおいて、原線維形成は、蛍光の経時的な増加によってモニターされる。図からわかるように、抗体は蛍光のこのような増加を阻害することができ、これらの抗体は原線維形成を阻害していることを証明した。
【０１５１】
これらの図(図2〜4)からわかるように、D-ペプチドに対して形成される抗体は、抗L抗体より抗-原線維形成作用が良好である。
【０１５２】
これらの結果はEM(図4A〜4C)によっても確認され、抗-Dおよび抗-L KLVFFAペプチドは両方とも、対照と比較したとき、原線維形成を阻害した（図4A）。さらに、繰り返しになるが、抗-Dペプチドは、抗-Lペプチド(図4C)より抗-原線維形成作用が大きい(図4B)。これはThTアッセイと共に実施し、抗-Dペプチド抗体の蛍光の低下は抗-Lペプチド抗体より大きかった。
【０１５３】
実施例III
抗体結合アッセイ
脳切片を、KLVFFAペプチド(DおよびL型)に対して形成された抗体で染色した。図5A〜5Dおよび6A〜6Dからわかるように、抗体は凝集した(チオS陽性)Aβに結合することができなかった。斑(チオSを使用)およびAβペプチド(形成された抗体を使用)について染色した一連の図から、抗体は細胞表面のAβを認識するが、斑に結合することができないことがわかる。これらの結果は、抗KLVFFAペプチド抗体は凝集したAβに結合しないことを示している。これらの結果は、抗体は非凝集形態だけを認識して、原線維形成を阻害することを明白に証明している。このような作用を有することによって、抗体は凝集したAβに結合することができないので、本発明のワクチンは、1)Aβに原線維を形成させるのを防ぎ、2)不溶性形態に結合するこのような抗体によって誘発される炎症応答を防ぐ。さらに、Aβを可溶性形態に維持することによって、このような抗体は、原線維形成前に脳からのAβの除去を促進しうる。このような抗体はまた、脳内と血漿中のAβの濃度の有益な平衡を維持すると思われる。
【０１５４】
実施例IV
D-およびL-Aβ(13〜21-KLH)ペプチドワクチンに対する抗体が脳および血漿中のアミロイド-β蓄積に対して与える影響
成体TgCRND8マウス(ヒトアミロイド前駆体タンパク質(hAPP)を発現する導入遺伝子を保有する)を、9週齢時およびその後は2週間ごとに、DまたはLペプチドで免疫した(合計5回注射)。最終追加免疫投与の10〜14日後に動物を犠牲にし、マウスの脳および血漿へのアミロイド-βの蓄積を測定した。脳は以下のようにホモジナイズした：
先ず、脳を凍結し、凍結した組織を秤量した。次いで、1×プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有する4容量の50mM Tris-HCl pH 8.0（Calbiochem #539131）中で、Wheaton Overheadスターラーを使用して、速度3.6で、組織をホモジナイズした。試料をボルテックスで混合し、4℃においてEppendorf遠心分離器で16,000×gで20分遠心分離した。150μLの上清を250μLの8Mグアニジウム／50mM Tris-HCl pH8.0に添加した。混合液をボルテックスで混合し、-80℃で保存した。ペレットを融解し、7容量の5Mグアニジウム／50 mM Tris pH8.0中でボルテックスで混合することによって再懸濁させて、-80℃で保存した。上清およびペレットを融解し、Elma Ultrasonic浴で80℃において15分間超音波処理し、15分間ドライアイス上で凍結させ、融解し、Elma Ultrasonic浴で80℃において10分間超音波処理した。次いで、試料を4℃において16,000×gで20分間遠心分離し、アミロイド-β定量のために上清を保存した。Biosource International製のヒトβアミロイドELISAキット(カタログ番号88-344)を使用して、アミロイド-β40およびアミロイド-β42を定量した。
【０１５５】
標準的なELISA手法を使用して、特異的な血漿抗体力価を測定した(上記表2に示す)。[D]13〜21ペプチドによる免疫は、免疫応答を誘導する際に[L]13〜21ペプチドによる免疫よりはるかに効果的であったことを表2のデータは示している。
【０１５６】
結果はまた、[D]13〜21-KLHによる免疫後のTgCRND8マウスの脳において、可溶性および原線維(不溶性)Aβ40レベルの低下(図8Aおよび8B)、可溶性および原線維Aβ42レベルの低下(図9)、ならびに総Aβレベルの低下(図10Aおよび10B)も示した。結果は、Dペプチドによる免疫は、Aβレベルの低下に有効であったことを示している。また、Dペプチドによる免疫だけがAβレベルを低下させ、Lペプチドによる免疫はAβレベルを低下させず、DペプチドはLペプチドよりはるかに強力であった。
【０１５７】
実施例V
アミロイド-βに対する受動免疫
動物を抗原量の全-Dアミロイドβ(10〜22)に暴露することによって、Xenomouse(登録商標)(Abgenix、カリフォルニア州フリーモント)などの遺伝子組換え動物からヒト化抗体を形成して得た。抗原量は、10ng〜10mgの全-Dアミロイドβペプチドである。記載したようなアジュバントを使用することによって免疫応答を増強することができ、それによって低濃度の免疫原を使用することができる。ELISAまたは免疫応答を測定する他の方法により血清抗体レベルをモニターする。抗体は動物の血清から直接回収しても、またはこのような抗体を発現するB-細胞を、ハイブリドーマ系統を作出するための免疫動物から回収してもよい。ヒト化抗体は、プロテインGクロマトグラフィーまたは同様の抗体精製方法によって、血清、腹水、または細胞培養培地から精製される。
【０１５８】
第2のもしくはドナー哺乳動物において直接形成された抗体またはドナー哺乳動物の免疫細胞から誘導されたハイブリドーマ系統の作出によって間接的に形成された抗体を使用して、アミロイド関連病もしくは疾患に罹患している第1のすなわち被験哺乳動物を免疫することができる、あるいは、アミロイド関連疾患もしくは疾患を予防することができる。第1の哺乳動物に、治療的または予防的に有効な用量の抗Aβ抗体を与える。抗体断片、または、B-細胞、T-細胞などの抗原刺激した免疫細胞、または、刺激された抗原提示細胞も、ドナー、好ましくはヒトドナー、さらに好ましくは同系のヒトドナーから入手することができる。治療的に有効な用量とは、記載した技法およびアッセイによって測定したとき、第1の哺乳動物の原線維斑の形成または質量を少なくとも5〜50%以上低下させるものとする。斑形成または質量の100%以上の低下を治療のエンドポイントと考える。医師または他の医療従事者は、治療効果またはエンドポイントに達成するために投与計画をモニターすることができる。
【０１５９】
本発明は具体的な態様に関連して記載されているが、さらなる改良を加えることができることが理解され、本願は、一般に、本発明の原理に従う本発明の任意の変更、用途または適合をカバーすることを意図しており、本発明が属する技術分野の既知または慣例の実施範囲内であり、本明細書に記載する本質的な特徴に適用することができ、ならびに、添付の特許請求の範囲内で追従する、本発明の開示内容からのこのような逸脱を含む。
【図面の簡単な説明】
【０１６０】
【図１】抗原性断片の標的部位を図示する。
【図２】DおよびL型のAβ(16〜21)に対して形成されたポリクローナル抗体1mg/mlが原線維形成に対して与える影響を図示する。
【図３】DおよびL型のAβ(16〜21)に対して形成されたポリクローナル抗体0.5mg/mlが原線維形成に対して与える影響を図示する。
【図４】図4A〜4Cは、抗-D KLVFFAペプチド抗体(図4B)および抗-L KLVFFAペプチド抗体(図4C)が対照(図4A)と比較して原線維形成に対して与える影響を示す電子顕微鏡写真を図示する。
【図５】図5A〜5Dは、脳の脳梁膨大後部皮質(図5A)および頭頂皮質(図5C)部分における凝集したAβペプチドに対する抗-D KLVFFAの免疫組織化学、ならびに脳の同じ脳梁膨大後部皮質(図5B)および頭頂皮質(図5D)部分における凝集したAβペプチドに対する抗-D KLVFFAの組織化学(チオフラビンSアッセイ)を図示する。
【図６】図6A〜6Dは、脳の頭頂皮質(図6A)および嗅内皮質(図6C)部分における凝集したAβペプチドに対する抗-L KLVFFA抗体の免疫組織化学、ならびに脳の同じ頭頂皮質(図6B)および嗅内皮質(図6D)部分における凝集したAβペプチドに対する抗-L KLVFFA抗体の組織化学(チオフラビンSアッセイ)を図示する。
【図７】KLHが結合した全-Lおよび全-D KLVFFAに対するウサギの応答を図示する。
【図８】図8Aおよび8Bは、D13-21-KLHで免疫したTgCRND8マウスの脳のAβ40レベル、可溶性および不溶性分画の減少を図示する。
【図９】D13-21-KLHで免疫したTgCRND8マウスの脳のAβ42レベル、可溶性分画の減少を図示する。
【図１０】図10Aおよび10Bは、D13-21-KLHで免疫したTgCRND8マウスの脳の総Aβレベル(Aβ40およびAβ42)の減少を図示する。
【図１】
2005508863.tif 000013
【図２】
2005508863.tif 000014
【図３】
2005508863.tif 000015
【図４】
2005508863.tif 000016
【図５】
2005508863.tif 000017
【図６】
2005508863.tif 000018
【図７】
2005508863.tif 000019
【図８】
2005508863.tif 000020
【図９】
2005508863.tif 000021
【図１０】
2005508863.tif 000022
【国際調査報告】
2005508863.tif 000023
2005508863.tif 000024
2005508863.tif 000025
2005508863.tif 000026