(57)【要約】本発明は、良性および悪性の腫瘍のような、患者に有害なまたは望ましくない細胞の除去または破壊を必要とする状態を処置する方法であって、神経糸タンパク質のアミノ酸配列の一部分を含むペプチドを含有する、またはそれに基づく化合物を使用する方法に関する。
2005507647.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドであって、
（ａ）配列番号１０（Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ）のアミノ酸配列によって表されるペプチド；
（ｂ）配列番号１１（Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ）のアミノ酸配列によって表されるペプチド；
（ｃ）配列番号１２（Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ）のアミノ酸配列によって表されるペプチド；
（ｄ）配列番号１３（Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ）のアミノ酸配列によって表されるペプチド；
（ｅ）配列番号１４（Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ）のアミノ酸配列によって表されるペプチド；
（ｆ）配列番号１５（Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ）のアミノ酸配列によって表されるペプチド；
（ｇ）配列番号１６（Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ）のアミノ酸配列によって表されるペプチド；
（ｈ）配列番号１７（Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ）のアミノ酸配列によって表されるペプチド；
（ｉ）配列番号１８（Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ）のアミノ酸配列によって表されるペプチド；
（ｊ）配列番号１９（Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ）のアミノ酸配列によって表されるペプチド；
（ｋ）配列番号２０（Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ）のアミノ酸配列によって表されるペプチド；
（ｌ）配列番号２１（Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ）のアミノ酸配列によって表されるペプチド；
（ｍ）配列番号２２（Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ）のアミノ酸配列によって表されるペプチド；
（ｎ）配列番号２３（Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ）のアミノ酸配列によって表されるペプチド；
（ｏ）配列番号２４（Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ）のアミノ酸配列によって表されるペプチド；
（ｐ）配列番号２５（Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ）のアミノ酸配列によって表されるペプチド；
（ｑ）配列番号２６（Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ）のアミノ酸配列によって表されるペプチド；
（ｒ）配列番号２７（Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ）のアミノ酸配列によって表されるペプチド；
（ｓ）配列番号２８（Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ）のアミノ酸配列によって表されるペプチド；
から成る群より選択される少なくとも一つのペプチドを含むペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載の一つまたはそれを超えるペプチドおよびそのための担体を含む組成物。
【請求項３】
請求項１に記載のペプチドのホモログ、誘導体、フラグメントまたは変異体を含むペプチド。
【請求項４】
請求項１に記載のペプチドのアミノ酸配列に基づく逆Ｄ順序のアミノ酸を含むペプチド。
【請求項５】
ペプチドの３’末端かまたは５’末端に隣接する１〜２５個の追加のアミノ酸によって修飾された請求項１に記載のペプチドを含むペプチド。
【請求項６】
少なくとも二つの請求項１に記載のペプチドを含むペプチド。
【請求項７】
請求項１に記載のペプチドの少なくとも二つの反復を含むペプチド。
【請求項８】
請求項１に記載のペプチドの模擬体。
【請求項９】
抗体、抗体のフラグメントまたは抗体様分子に融合した請求項１に記載のペプチドを含むペプチド。
【請求項１０】
請求項１に記載のペプチドおよびそのホモログ、フラグメントおよび変異体に対応するアミノ酸配列をコードしている核酸。
【請求項１１】
一つまたはそれを超える請求項１０に記載の核酸およびそのための薬学的に許容しうる担体を含む組成物。
【請求項１２】
細胞の除去または破壊を必要とする患者の状態を処置する方法であって、要求がある哺乳動物に、治療的有効量の請求項１に記載のペプチドを投与することを含む方法。
【請求項１３】
投与することが、経口、皮下、皮内、鼻腔内、静脈内、筋肉内、脊髄内、鼻腔内、腫瘍内、局所および経皮から成る群より選択される方法を含んで成る請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
処置を、外科的切除、移植（transplantation）、移植片移植（grafting）、化学療法、免疫療法、ワクチン接種、熱または電気剥離、寒冷療法、レーザー療法、光線療法、遺伝子治療および放射線から成る処置の群より選択される処置で患者を処置する前に、際にまたは後に、患者に投与する請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
状態が、肺、乳房、胃、膵臓、前立腺、膀胱、骨、卵巣、皮膚、腎、洞、結腸、腸管、胃、直腸、食道、心臓，脾臓、唾液腺、血液、脳およびその被膜、脊髄およびその被膜、筋肉、結合組織、副腎、副甲状腺、甲状腺、子宮、精巣、下垂体、生殖器、肝、胆嚢、眼、耳、鼻、咽頭、扁桃、口、リンパ節およびリンパ組織から成る群より選択される組織の良性および悪性の腫瘍である請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
状態が、肺、乳房、胃、膵臓、前立腺、膀胱、骨、卵巣、皮膚、腎、洞、結腸、腸管、胃、直腸、食道、心臓，脾臓、唾液腺、血液、脳およびその被膜、脊髄およびその被膜、筋肉、結合組織、副腎、副甲状腺、甲状腺、子宮、精巣、下垂体、生殖器、肝、胆嚢、眼、耳、鼻、咽頭、扁桃、口、リンパ節およびリンパ組織から成る群より選択される組織の過形成、肥大または過成長である請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
状態が、肺、乳房、胃、膵臓、前立腺、膀胱、骨、卵巣、皮膚、腎、洞、結腸、腸管、胃、直腸、食道、心臓，脾臓、唾液腺、血液、脳およびその被膜、脊髄およびその被膜、筋肉、結合組織、副腎、副甲状腺、甲状腺、子宮、精巣、下垂体、生殖器、肝、胆嚢、眼、耳、鼻、咽頭、扁桃、口、リンパ節およびリンパ組織から成る群より選択される、ウイルス、細菌または寄生生物によって変化した組織である請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
状態が、肺、乳房、胃、膵臓、前立腺、膀胱、骨、卵巣、皮膚、腎、洞、結腸、腸管、胃、直腸、食道、心臓，脾臓、唾液腺、血液、脳およびその被膜、脊髄およびその被膜、筋肉、結合組織、副腎、副甲状腺、甲状腺、子宮、精巣、下垂体、生殖器、肝、胆嚢、眼、耳、鼻、咽頭、扁桃、口、リンパ節およびリンパ組織から成る群より選択される組織の奇形である請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
組織がリンパ組織である請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
状態が扁桃肥大である請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
状態が前立腺過形成である請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
状態が乾癬である請求項１２に記載の方法。
【請求項２３】
状態が湿疹である請求項１２に記載の方法。
【請求項２４】
状態が皮膚病である請求項１２に記載の方法。
【請求項２５】
状態が、組織への美容修正である請求項１２に記載の方法。
【請求項２６】
組織が、皮膚、眼、耳、鼻、咽頭、口、筋肉、結合組織、毛および乳房である請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
状態が血管疾患である請求項１２に記載の方法。
【請求項２８】
状態が痔核である請求項１２に記載の方法。
【請求項２９】
状態が拡張蛇行静脈である請求項１２に記載の方法。
【請求項３０】
血管疾患が、アテローム性動脈硬化症または動脈硬化症である請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
状態が、炎症性疾患、自己免疫疾患、代謝性疾患、遺伝性／遺伝学的疾患、外傷性疾患または身体的外傷、栄養欠乏性疾患、感染性疾患、アミロイド症、線維症、蓄積症、先天性奇形、酵素欠乏性疾患、被毒（poisoning）、中毒（intoxication）、環境性疾患、放射線疾患、内分泌性疾患、変性疾患および機械的疾患の内の一つである請求項１２に記載の方法。
【請求項３２】
前記ペプチドが、膵臓糸タンパク質のアミノ酸配列に由来している請求項１２に記載の方法。
【請求項３３】
ペプチドが、抗体、抗体フラグメントおよび抗体様結合分子から成る群より選択される分子であって、腫瘍または他の標的への結合について、他の細胞への結合より高い親和性を有する分子に抱合されている、連結しているまたは結合している請求項１２に記載の方法。
【請求項３４】
ペプチドが、抗体、抗体フラグメントおよび抗体様結合分子から成る群より選択される分子であって、腫瘍または他の標的への結合について、他の細胞への結合より高い親和性を有する分子とペプチドとから成る単一の新しいクローン化リコンビナント分子の一部分である請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、本明細書中に各々の開示がそのまま援用される、２００１年７月１９日出願の「Proteins and peptides effective in the treatment of tumors and other conditions requiring the removal or destruction of cells」という表題の予備出願第６０／３０６，１６１号、２００１年７月１９日出願の「Peptides effective in the treatment of tumors and other conditions requiring the removal or destruction of cells」という表題の予備特許出願第６０／３０６，１５０号および２００１年１１月１６日出願の「Peptides effective in the treatment of tumors and other conditions requiring the removal or destruction of cells」という表題の予備特許出願第６０／３３１，４７７号に優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ヒトの良性または悪性の腫瘍のような細胞要素の除去または破壊を必要とする状態を処置する方法であって、神経糸タンパク質のアミノ酸配列の一部分に対応する、類似したまたは相同のアミノ酸配列を含むペプチドに基づく化合物を使用する方法に関する。この方法には、これら化合物を単独でかまたは担体に抱合させて、筋肉内、経口、静脈内、脊髄内、腫瘍内、鼻腔内、局所、経皮等で投与することが含まれるが、これに制限されるわけではない。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
多くの医学的処置および手順の本質は、有害なまたは望ましくない組織の除去または破壊を必要とする。このような重要な処置の例には、癌成長の外科的除去、化学療法による転移性腫瘍の破壊、および腺（例えば、前立腺）過形成の減少が含まれる。他の例には、望ましくない顔面毛、いぼ、皮下組織、リンパ組織または脂肪組織の除去が含まれる。
【０００４】
有害なまたは望ましくない細胞および組織を破壊し、したがって、その除去を容易にするかまたは更なる成長を阻止するであろうが、主に限局作用を有し且つ全身毒性がないまたは最小限しかないであろう有効な薬剤が要求されている。神経糸タンパク質およびそれらの関連分子は、本明細書中にその開示がそのまま援用される２００２年３月８日出願の Methods of Treating Tumors and Related Conditions Using Neural Thread Proteins という表題の係属米国特許出願第１０／０９２，９３４号に開示されているこのような薬剤の一つのクラスである。神経糸タンパク質ＡＤ７ｃ−ＮＴＰのアミノ酸配列の一部分に対応するアミノ酸配列を含有するペプチドも、このような薬剤である。これらペプチドは、本明細書中にその開示がそのまま援用される２００２年５月２４日出願の Peptides Effective in the Treatment of Tumors and Other Conditions Requiring the Removal or Destruction of Cells という表題の係属米国特許出願第１０／１５３，３３４号に開示されている。
【０００５】
本明細書中に開示されているのは、細胞の除去または破壊を必要とする腫瘍および他の状態を処置する場合にも有用である神経糸タンパク質の若干の他のフラグメントである。
癌は、細胞の未制御の成長および再生を引き起こす細胞の内部調節機構の異常である。正常な細胞は、組織を構成しているが、これら細胞が、特殊化した、制御されたおよび協調した単位として挙動するそれらの能力を失った場合（脱分化）、その欠損は、細胞集団の中に混乱をもたらす。これが起こると、腫瘍が形成される。
【０００６】
組織の良性過成長は、ある器官から細胞を除去することが望まれる異常である。良性腫瘍は、身体のいたるところに転移することはないが、しかしながら、疾患症状を引き起こす細胞増殖である。このような腫瘍は、脳のような近づき難い器官内部位に位置する場合、致命的でありうる。肺、脳、皮膚、下垂体、甲状腺、副腎皮質および髄質、卵巣、子宮、精巣、結合組織、筋肉、腸管、耳、鼻、咽頭、扁桃、口、肝、胆嚢、膵臓、前立腺、心臓および他の器官を含めた器官の良性腫瘍が存在する。
【０００７】
外科手術は、しばしば、癌の処置の第一段階である。外科手術の目的は様々である。時々、それは、できるだけ多くの顕性腫瘍を除去するのに、またはそれを少なくとも縮小する（debulk）（他の手段によって処置する必要がほとんどないように腫瘍の一つまたは複数の大部分を除去する）のに用いられる。癌のタイプおよび場所に依って、拡大している脳腫瘍の大部分を外科医が除去することができるならば、頭蓋内圧は減少し、患者の症状の改善をもたらすであろう。
【０００８】
すべての腫瘍が外科手術を行いやすいわけではない。あるものは、完全に除去することを不可能にする身体部分に位置することがありうる。これらの例は、脳幹（呼吸を制御している脳部分）の腫瘍または主要血管中および周囲で成長した腫瘍であると考えられる。これらの場合、外科手術の役割は、腫瘍除去に関連した高い危険性のために限定される。
【０００９】
ある場合には、腫瘍を縮小するのに、外科手術は必要がないので用いられない。一例は、化学療法および放射線療法の組合せにきわめて充分に応答するリンパ節の癌であるホジキンリンパ腫である。ホジキンリンパ腫の場合、外科手術は、治癒に達するのに希に必要とされるが、診断を決定するのにはほとんど常に用いられる。
【００１０】
化学療法は、身体のいたるところで急速に分裂している細胞（腫瘍中で見出されるものなど）を特異的に攻撃する薬剤（通常は、口でまたは注射によって与えられる）の使用を伴う癌処置の一般的な形態である。これは、既に転移した癌、更には、血液およびリンパ系によって広がる高い可能性があるが、一次腫瘍を越える顕性ではない腫瘍を処置する場合に化学療法を有用にする。化学療法は、限局した腫瘍の外科手術および放射線療法への応答を増大させるのに用いることもできる。これは、例えば、頭部および頸部の若干の癌の場合である。
【００１１】
残念ながら、通常でも急速に分裂しているヒト体内の他の細胞（胃の内壁および毛など）も、化学療法によって影響される。この理由で、多数の化学療法薬は、悪心、嘔吐、貧血、失毛または他の症状などの望ましくない副作用を引き起こす。これら副作用は一時的であり、これら副作用の多くを軽減するのに役立ちうる薬剤が存在する。本発明者の知識が増え続けるにつれて、研究者は、癌細胞を死滅させるのにより良いだけでなく、患者への副作用もより少ない、より新しい化学療法薬を考案している。
【００１２】
化学療法は、いろいろな方法で患者に投与される。あるものは丸剤であり、そしてあるものは、静脈内注射または他の注射によって投与される。注射可能な化学療法については、患者は、処置のために診療室または病院に行く。他の化学療法薬は、血流中への連続注入を１日２４時間必要とする。これらタイプの化学療法については、患者が着用する小ポンプを植込むために、僅かな外科的方法を行うことがありうる。次に、このポンプは、薬剤を徐々に投与する。多くの場合、永久口を患者の静脈に入れて、繰り返し針を刺す必要をなくする。
【００１３】
放射線療法は、癌に対する戦いで一般的に用いられるもう一つの武器である。放射線は、腫瘍細胞内のＤＮＡを損傷することによって癌を死滅させる。放射線は、いろいろな方法で供給される。最も一般的なものは、腫瘍に集中するきわめて正確な方法で放射線ビームを患者に向けることを伴う。これを行うには、患者は台の上に横になり、その患者の周囲をビームが移動する。この手順は、何分か続けるが、処方される具体的な全線量に達しさせるために、（腫瘍のタイプに依って）毎日数週間行われてよい。
【００１４】
時々用いられる、近接照射療法と称されるもう一つの放射線法は、放射性ペレット（シード）またはワイヤを得且つそれらを体内の腫瘍部位に植込むことを伴う。永久インプラントについては、シード中の放射線が何日間かまたは何週間かにわたって崩壊するので、患者は放射性にはならない。一時的インプラントについては、通常は、放射線の全線量が数日で供給されるので、患者は、その期間中入院していなければならない。近接照射療法のどちらのタイプについても、概して、放射線はまさに標的の部位に供給されて、（化学療法のように全身を処置することに対立するものとして）癌への限局制御を得る。
【００１５】
若干の高度に選択された患者は、骨髄移植に委ねられることがありうる。この方法は、通常は、患者が、特に攻撃性である癌を有するからかまたは、彼らが、慣用的な療法で処置された後に再発した癌を有するから行われる。骨髄移植は、複雑な方法である。多数のタイプがあるが、それらは、副作用と治癒を引き起こす可能性が様々である。大部分の移植は、専門施設で行われるが、多くの場合、それらの使用は研究用と考えられる。
【００１６】
多数の他の療法が存在するが、それらの大部分は、臨床試験でなお調べられていて、まだ標準的なケアになっていない。例には、免疫療法、単クローン性抗体、抗血管新生因子および遺伝子治療の使用が含まれる。
【００１７】
免疫療法：放射線または化学療法とは全く別個に、患者自身の免疫系が癌と戦うのを助けるように設計されたいろいろな技術がある。しばしば、この目的を達成するために、研究者は、特別な由来のワクチンを患者に注射する。
【００１８】
単クローン性抗体：これらは、癌細胞と非癌細胞との間の抗原性および／または他の特性の違いを利用することによって癌細胞（および非正常細胞）に付着するように設計された抗体である。これら抗体は、その抗体が癌細胞を優先的に標的とするように、患者に単独でまたは種々の細胞毒性化合物に抱合されてまたは放射性の形で投与されることによって、所望の細胞にその毒性薬または放射能を供給することができる。
【００１９】
抗血管新生因子：癌細胞が急速に分裂し、腫瘍が成長するにつれて、それらの血液供給はすぐに増加することがありうる。これを埋め合わせるために、若干の腫瘍は、それらの周辺の血管を成長させるのに役立つと考えられる物質を分泌し、したがって、癌細胞に血管栄養源を与える。実験的療法は、腫瘍への血管の成長を阻止するように設計されている。
【００２０】
遺伝子治療：癌は、癌細胞の生産およびその過剰の増殖を最終的にもたらす一連の突然変異の産物である。癌は、癌の増殖を抑えるかまたは止めるように作用する、細胞を破壊する細胞のプログラム化された細胞機作を作動させる、細胞の免疫認識を促す、または毒性代謝産物に変換するプロドラッグまたは腫瘍成長を阻害するサイトカインを発現するであろう遺伝子を癌細胞に導入することによって処置することができる。
【００２１】
良性腫瘍および奇形は、外科手術、放射線療法、薬物療法、熱または電気剥離、寒冷療法およびその他を含めたいろいろな方法によって処置することもできる。良性腫瘍は、転移することはないが、それらは大きく成長することがありうるし、再発することがありうる。良性腫瘍の外科的摘出は、いずれも、概して外科手術が難しく且つ副作用があるが、下垂体腺腫、脳の髄膜腫、前立腺過形成およびその他のような若干の良性腫瘍については、しばしば繰り返し行われなければならない。
【００２２】
選択的細胞除去が望まれる望ましくない細胞要素を伴う他の状態がなお存在する。例えば、心疾患および発作は、一般的には、アテローム性動脈硬化症によって引き起こされるが、これは、血管壁を歪め、管腔を狭くし、血流を圧迫し、病巣血餅の素因を与え、そして最終的には、遮断および梗塞をもたらす線維脂肪要素および改変された平滑筋要素の増殖性病変である。アテローム性動脈硬化症のためのいろいろな処置には、バイパス移植片；人工移植片；再疎通、掻爬、放射線、レーザーまたは他の除去での血管形成；脂質減少によってアテローム性動脈硬化症を阻止する薬物療法；抗凝血療法；および食事、運動およびライフスタイルの一般的な測定が含まれる。外科的方法の危険および副作用を伴うことなくアテローム性動脈硬化症病変を除去する方法が要求されている。
【００２３】
選択的細胞除去が望まれる望ましくない細胞要素の他の例には、いぼのような、ウイルスに誘導される成長が含まれる。もう一つの例は、炎症状態で見出される肥大性炎症性塊、および肥大性瘢痕またはケロイドである。なお他の例は、望ましくない毛、例えば、顔毛の除去のような美容の場合に、または顔の皮膚および結合組織または手足の皮膚および結合組織などにおける美容目的のための望ましくない組織部位の縮小について見出される。
【００２４】
なお他の例は、本明細書中の開示を読むことで、当業者に明らかになるであろう。これら例のすべてまたは大部分において、慣用的な療法の危険および副作用を伴うことなく、望ましくない細胞要素を除去するまたは破壊することができる処置、または望ましくない細胞要素をより正確に除去する処置が要求される。
【００２５】
神経糸タンパク質（ＮＴＰ）は、最近特性決定された脳タンパク質のファミリーである。このファミリーの一つのメンバーであるＡＤ７ｃ−ＮＴＰは、神経突起萌芽に関連した機能を有する約４１ｋＤ膜関連リンタンパク質である（de la Monte et al., J.Clin.Invest., 100:3093-3104(1997); de la Monte et al., Alz..Rep., 2:327-332(1999); de la Monte SM and Wands JR, Journal of Alzheimer's Disease, 3:345-353(2001)）。ＡＤ７ｃ−ＮＴＰおよび予想されるＡＤ７ｃ−ＮＴＰのタンパク質配列をコードしている遺伝子は、識別され且つ記載されている（de la Monte et al., J.Clin.Invest., 100:3093-3104(1997)）。約４１ｋＤの種類に加えて、神経糸タンパク質の他の種類（約２６ｋＤ、約２１ｋＤ、約１７ｋＤおよび約１５ｋＤ）が識別されていて、神経外胚葉腫瘍、星状膠細胞腫および神経膠芽細胞腫に、および低酸素症、スキーマ（schema）または脳梗塞による傷害に関連している（Xu et al., Cancer Research, 53:3823-3829(1993); de la Monte et al., J.Neuropathol.Exp.Neurol., 55(10):1038-50(1996), de la Monte et al., J.Neurol.Sci., 138(1-2):26-35(1996); de la Monte et al., J.Neurol.Sci., 135(2):118-25(1996); de la Monte et al., J.Clin.Invest., 100:3093-3104(1997); and de la Monte et al., Alz..Rep., 2:327-332(1999)）。
【００２６】
神経糸タンパク質の種類は、いずれも「Neural Thread Protein Gene Expression and Detection of Alzheimer's Disease」についての米国特許第５，９４８，６３４号；第５，９４８，８８８号；および第５，８３０，６７０号に、および「Method of Detecting Neurological Disease or Dysfunction」についての米国特許第６，０７１，７０５号に記載され且つ請求の範囲に記載されている。これら特許の開示は、本明細書中にそのまま具体的に援用される。それらに記載されているように、ＮＴＰは、細胞死の際にアップレギュレーションされ且つ生産される。例えば、死滅したおよび死滅する神経細胞は、ＮＴＰを過剰生産すると記載され、したがって、その存在は、神経細胞の死およびアルツハイマー病（ＡＤ）の始まりを示している。
【００２７】
神経糸タンパク質の他の種類は、ＡＤ７ｃ−ＮＴＰ遺伝子の他の産物（例えば、ＮＣＢＩ Entrez-Protein データベース Accession ＃ＸＰ ０３２３０７  ＰＩＤ  ｇ１５９２８９７１に記載の１１２アミノ酸タンパク質）としてまたは神経糸タンパク質に類似している（例えば、ＮＣＢＩ Entrez-Protein データベース Accession ＃ＡＡＨ１４９５１  ＰＩＤ  ｇ１５９２８９７１に記載の１０６アミノ酸タンパク質、ＮＣＢＩ Entrez-Protein データベース Accession ＃ＸＰ ０３９１０２  ＰＩＤ  ｇ１８５９９３３９に記載のもう一つの１０６アミノ酸タンパク質、およびＮＣＢＩ Entrez-Protein データベース Accession ＃ＡＡＨ０２５３４  ＰＩＤ  ｇ１２８０３４２１に記載の６１アミノ酸タンパク質）として識別されている。
【００２８】
神経糸タンパク質は、ＡＤに関連していて、ＮＴＰは、ＡＤにおける細胞死に関連してアップレギュレーションされる。ＡＤ７ｃ−ＮＴＰｍＲＮＡは、対照と比較して、ＡＤ脳中でアップレギュレーションされ；脳およびＣＳＦ中のＡＤ７ｃ−ＮＴＰタンパク質レベルは、対照よりもＡＤにおいて高く；そしてＡＤ７ｃ−ＮＴＰ免疫反応性は、老人斑において、神経原線維変化（ＮＦＴ）において、変性ニューロン、神経網糸、およびＡＤおよびダウン症候群の脳でのジストロフィー性神経症萌芽において見出される（Ozturk et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 86:419-423(1989); de la Monte et al., J.Clin.Invest., 86(3):1004-13(1990); de la Monte et al., J.Neurol.Sci., 113(2):152-64(1992); de la Monte et al., Ann.Neurol., 32(6):733-42(1992); de la Monte et al., J.Neuropathol.Exp.Neurol., 55(10):1038-50(1996), de la Monte et al., J.Neurol.Sci., 138(1-2):26-35(1996); de la Monte et al., J.Neurol.Sci., 135(2):118-25(1996); de la Monte et al., J.Clin.Invest., 100:3093-3104(1997); and de la Monte et al., Alz..Rep., 2:327-332(1999)）。ＮＴＰは、細胞内、神経網内の微細な突起中に局在している、またはＡＤおよびダウン症候群双方の脳の細胞外にある。de la Monte et al., Ann.Neurol., 32(6):733-42(1992)。
【００２９】
上昇したレベルのＡＤ７ｃ−ＮＴＰタンパク質は、ＡＤ患者のＣＳＦおよび尿の双方で見出されている（de la Monte and Wands, Front Biosci 7:989-96(2002); de la Monte and Wands, Journal of Alzheimer's Disease 3:345-353(2001); Munzar et al, Alzheimer's Reports 4:61-65(2001); Kahle et al, Neurology 54:1498-1504(2000); Munzar et al, Alzheimer Reports 3:155-159(2000); de la Monte et al, Alzheimer's Reports 2:327-332(1999); and de la Monte et al., J.Clin.Invest., 100:3093-3104(1997)）。
【００３０】
ＮＴＰの過発現は、アルツハイマー病での細胞死の過程にも関連している（de la Monte and Wands, J.Neuropathol.Exp.Neurol., 60:195-207(2001); de la Monte and Wands, Cell Mol Life Sci 58:844-49(2001)）。ＡＤ７ｃ−ＮＴＰは、ダウン症候群脳組織においても識別されている（Wands et al., 国際特許公開ＷＯ９０／０６９９３号；de la Monte et al, J Neurol Sci 135:118-25(1996); de la Monte et al., Alz..Rep., 2:327-332(1999)）。ＮＴＰの過発現が正常眼圧緑内障に関連することもありうるという若干の証拠が存在する（Golubnitschaja-Labudova et al, Curr Eye Res 21:867-76(2000)）。
【００３１】
ＮＴＰは、in vitro の神経膠腫および神経芽細胞腫の細胞培養物においても、in vivo の正常齧歯類動物の筋組織、皮下結合組織および皮膚、および乳癌、皮膚癌および乳頭腫、結腸癌、脳神経膠腫、および齧歯類動物モデルにおけるその他を含めた種々の異なったヒトおよび非ヒト由来腫瘍においても、細胞死を引き起こすのに有効な物質であると証明されている。２００２年３月８日出願の係属米国特許出願第１０／０９２，９３４号、Methods of Treating Tumors and Related Conditions Using Neural Thread Proteins を参照されたい。
【００３２】
ＡＤ７ｃ−ＮＴＰの若干のペプチド配列（「ＡＤ７ｃ−ＮＴＰペプチド」）も、in vitro の神経膠腫および神経芽細胞腫の細胞培養物および／または in vivo の正常齧歯類動物の筋組織、皮下結合組織、皮膚および他の組織の双方において細胞死を引き起こすのに有効な物質であると証明されている。２００２年５月２４日出願の、Peptides Effective in the Treatment of Tumors and Other Conditions Requiring the Removal or Destruction of Cells という表題の米国特許出願第１０／１５３，３３４号を参照されたい。
【００３３】
関連出願の前述の説明を含めた本明細書を通して、いずれかのおよびすべての米国特許を含めた本明細書中に記載のいずれかのおよびすべての公的に入手可能な論文は、本明細書中にそのまま具体的に援用される。関連出願の前述の説明は、いずれにせよ、係属米国特許出願を含めたそれらに記載されるいずれかの論文が、本発明の先行技術であると承認するものではない。
【００３４】
当該技術分野において、望ましくない細胞要素を処置するための新しい、毒性がより少ない処置が依然として要求されている。本発明は、これら要求を満たしている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００３５】
発明の要旨
本発明は、良性および悪性の腫瘍、腺（例えば、前立腺）過形成、望ましくない顔毛、いぼ、および望ましくない脂肪組織などの、望ましくない細胞増殖を処置するペプチド、組成物および方法に関する。このような方法は、要求がある哺乳動物に、細胞死を引き起こすのに有効な薬剤であると知られているＮＴＰペプチドの治療的有効量を投与することを含む。ＮＴＰペプチドという表現は、下に定義される。
【００３６】
本発明のペプチドは、ある種の神経糸タンパク質のアミノ酸配列の一部分に対応する少なくとも一つのアミノ酸配列を有する。本発明の組成物には、ペプチドおよび薬学的に許容しうる担体、または担体もしくは類似のものに抱合されたペプチド、またはポリマーマトリックス内に封入されたペプチド等が含まれる。
【００３７】
本発明は、本発明者らが発見したＡＤ７ｃ−ＮＴＰに含有されるペプチド配列が、有害なまたは望ましくない細胞の破壊または除去に有効な薬剤である、および、それらの変異体およびホモログが、ヒトおよび他の哺乳動物を含めた他の生物の他のタンパク質中でも見出されるという発見を一部分包含する。これらペプチド配列がいったん発見されると、これらタンパク質は、National Center Biotechnology Information's Protein データベースなどの広く利用可能な公的および商業的タンパク質データベースおよびＢＬＡＳＴ（登録商標）（Basic Local Alignment Search Tool）などの検索プログラムの使用によって当業者が発見することができる。Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaeffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 を参照されたい。
【００３８】
次に、当業者は、本明細書中に記載の検定法を用いることによってこれらタンパク質をスクリーニングして、望ましくないまたは有害な細胞の破壊または除去のための薬剤としてのそれらの有効性を決定することができる。次に、一つまたはそれを超えるこのような有効な薬剤を発見した当業者は、それら薬剤のどの部分が、本明細書中に記載の、または２００２年５月２４日出願の、Peptides Effective in the Treatment of Tumors and Other Conditions Requiring the Removal or Destruction of Cells という表題の係属中の米国特許出願第１０／１５３，３３４号に記載のＡＤ７ｃ−ＮＴＰペプチド配列に相同のまたは類似した配列を含有するのかを決定し、それら薬剤の部分を当業者に知られている方法を用いて合成し、そしてそれら合成された薬剤を、望ましくないまたは有害な細胞の破壊または除去のための薬剤としての有効性について調べることができる。更に、当業者は、いずれかのこのような発見されたタンパク質のアミノ酸配列を用いて、本明細書中に記載の、または２００２年５月２４日出願の、Peptides Effective in the Treatment of Tumors and Other Conditions Requiring the Removal or Destruction of Cells という表題の係属米国特許出願第１０／１５３，３３４号に記載のＡＤ７ｃ−ＮＴＰペプチド配列に類似していないまたは相同でない他のペプチド配列を決定もしうると考えられる。次に、これら新しい合成された配列は、望ましくないまたは有害な細胞の破壊または除去のための薬剤としての有効性について調べることができる。
【００３９】
本発明のペプチドまたはタンパク質（「細胞死ペプチド」）は、単独で、または担体または抗体に抱合されて投与することができる。この細胞死ペプチドは、筋肉内、経口、静脈内、腹腔内、大脳内（実質内）、脳室内、腫瘍内、病巣内、皮内、脊髄内、鼻腔内、眼内、動脈内、局所、経皮、エアゾル剤、注入、ボーラス注射、植込装置、徐放性システム等によって、単独でかまたは担体に抱合されて投与することができる。或いは、細胞死ペプチドは、このペプチドを発現する遺伝子を投与することによって、このような生産を引き起こすワクチンを投与することによって、またはこのペプチドを遺伝子修飾のためかまたはそれ以外で in vivo 発現する細胞、細菌またはウイルスを導入することによって、in vivo で発現することができる。
【００４０】
更に、細胞死ペプチドは、良性および悪性の腫瘍、および他の望ましくないまたは有害な細胞増殖を処置するための他の療法と共に用いることができる。前述の一般的な説明および次の詳細な説明は両方とも、代表するものおよび説明するためのものであり、請求の範囲に記載の発明について追加の説明を与えるためのものである。他の目的、利点および新規な特徴は、次の発明の詳細な説明から、当業者に容易に理解されるであろう。
【００４１】
好ましい態様の詳細な説明
本明細書中で用いられる用語および句は、特に断らない限り、下記のように定義される。
【００４２】
「ＡＤ７ｃ−ＮＴＰ」という表現は、de la Monte et al., J.Clin.Invest., 100:3093-104(1997) に、米国特許第５，９４８，６３４号、第５，９４８，８８８号および第５，８３０，６７０号の配列１２０および１２１に、および GenBank ＃ＡＦ０１０１４４に記載の約４１ｋＤタンパク質、およびそれをコードする遺伝子および核酸配列を意味し、それについての核酸配列およびアミノ酸配列は、図１に示されている。「ＡＤ７ｃ−ＮＴＰ」という用語は、ＡＤ７ｃ−ＮＴＰの生物学的に活性なフラグメント、変異体、誘導体、ホモログおよび模擬体も包含する。
【００４３】
「ＮＴＰ」または「神経糸タンパク質」という用語は、神経糸タンパク質および関連分子（膵臓糸タンパク質を含めた）、およびそれらタンパク質をコードする核酸配列を意味し、次のタンパク質およびこれらタンパク質のアミノ酸配列をコードしている核酸配列が含まれる（が、これに制限されるわけではない）。
【００４４】
（ａ）ＡＤ７ｃ−ＮＴＰ；
（ｂ）約４２ｋＤ、約２６ｋＤ、約２１ｋＤ、約１７ｋＤ、約１４ｋＤおよび約８ｋＤの種類の、米国特許第５，９４８，６３４号、第５，９４８，８８８号、第５，８３０，６７０号および第６，０７１，７０５号に、および de la Monte et al., J.Neuropathol.Exp.Neurol., 55(10):1038-50(1996)、de la Monte et al., J.Neurol.Sci., 138(1-2):26-35(1996); de la Monte et al., J.Neurol.Sci., 135(2):118-25(1996)、de la Monte et al., J.Clin.Invest., 100:3093-3104(1997) および de la Monte et al., Alz..Rep., 2:327-332(1999) に記載の神経糸タンパク質；
（ｃ）American Type Culture Collection, Manassas, Va. に受託番号ＨＢ−１２５４６として寄託されている単クローン性抗体＃２または American Type Culture Collection, Manassas, Va. に受託番号ＨＢ−１２５４５として寄託されている単クローン性抗体＃５によって特異的に認識されるタンパク質；
（ｄ）ＡＤ７ｃ−ＮＴＰ遺伝子によってコードされるタンパク質；
（ｅ）１２２アミノ酸神経糸タンパク質であって、米国特許第５，８３０，６７０号、第５，９４８，６３４号および第５，９４８，８８８号による配列４０に記載され且つＮＣＢＩ Entrez-Protein Accession ＃ＡＡＥ２５４４７，ＰＩＤ  ｇ１００４８５４０に挙げられた、アミノ酸配列が図２に示されているもの；
（ｆ）１１２アミノ酸神経糸タンパク質であって、ＮＣＢＩ Entrez-Protein Accession ＃ＸＰ ０３２３０７，ＰＩＤｇ  １４７２５１３２に挙げられた、アミノ酸配列が図３に示されているもの；
（ｇ）１０６アミノ酸神経糸タンパク質様タンパク質であって、ＮＣＢＩ Entrez-Protein Accession ＃ＡＡＨ１４９５１  ＰＩＤ  ｇ１５９２８９７１に挙げられた、アミノ酸配列が図４に示されているもの；
（ｈ）１０６アミノ酸神経糸タンパク質様タンパク質であって、ＮＣＢＩ Entrez-Protein Accession ＃ＸＰ ０３９１０２，ＰＩＤ  ｇ１８５９９３３９に挙げられた、アミノ酸配列が図５に示されているもの；
（ｉ）９８アミノ酸神経糸タンパク質であって、米国特許第５，８３０，６７０号、第５，９４８，６３４号および第５，９４８，８８８号による配列３０に記載され且つＮＣＢＩ Entrez-Protein Accession ＃ＡＡＥ２５４４５，ＰＩＤ  ｇ１００４８５３８に挙げられた、アミノ酸配列が図６に示されているもの；
（ｊ）７５アミノ酸神経糸タンパク質であって、米国特許第５，８３０，６７０号、第５，９４８，６３４号および第５，９４８，８８８号による配列４８に記載され且つＮＣＢＩ Entrez-Protein Accession ＃ＡＡＥ２５４４８，ＰＩＤ  ｇ１００４８５４１に挙げられた、アミノ酸配列が図７に示されているもの；
（ｋ）６８アミノ酸神経糸タンパク質であって、米国特許第５，８３０，６７０号、第５，９４８，６３４号および第５，９４８，８８８号による配列３６に記載され且つＮＣＢＩ Entrez-Protein Accession ＃ＡＡＥ２５４４６，ＰＩＤ  ｇ１００４８５３９に挙げられた、アミノ酸配列が図８に示されているもの；
（ｌ）６１アミノ酸神経糸タンパク質様タンパク質であって、ＮＣＢＩ Entrez-Protein Accession ＃ＡＡＨ０２５３４，ＰＩＤ  ｇ１２８０３４２１に挙げられた、アミノ酸配列が図９に示されているもの；
（ｍ）膵臓糸タンパク質；
（ｎ）米国特許第６，０７１，７０５号に記載の神経膵臓糸タンパク質（ｎＰＴＰ）；および
（ｏ）American Type Culture Collection に寄託されたＨＢ９９３４、ＨＢ９９３５およびＨＢ９９３６から成る群によるハイブリドーマによって生産される抗体によって特異的に認識されるタンパク質。
【００４５】
「ＮＴＰペプチド」という表現は、ＮＴＰのアミノ酸配列の少なくとも一部分またはＮＴＰのフラグメントに対応するアミノ酸配列を含むペプチドを意味し、特に断らない限り、このようなペプチドのホモログ、誘導体、変異体、融合タンパク質およびペプチド模擬体が含まれる。「ＮＴＰペプチド」という表現には、米国特許出願第１０／０９２，９３４号および第１０／１５３３３４号に具体的に挙げられたペプチドも含まれる（が、それに制限されるわけではない）。「ＮＴＰペプチド」という表現には、好ましくは、ＮＴＰの次のアミノ酸配列：
（ａ）ＮＴＰペプチド＃１［配列番号１０］、ＡＤ７ｃ−ＮＴＰ  ｐ２２７−２４５に類似し、ｐ２２８の後に追加のフェニルアラニン残基の挿入を有する。
【００４６】
ＰＧＦＦＫＬＦＳＣＰＳＬＬＳＳＷＤＹＲＲ
Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ
対応する核酸配列［配列番号１０Ａ］
ＣＣＣＧＧＧＴＴＣＴＴＣＡＡＧＴＴＡＴＴＣＴＣＣＴＧＣＣＣＣＡＧＣＣＴＣＣＴＧＡＧＴＡＧＣＴＧＧＧＡＣＴＡＣＡＧＧＣＧＣ
（ｂ）ＮＴＰペプチド＃２［配列番号１１］、ＡＤ７ｃ−ＮＴＰ  ｐ１１４−１３２
ＰＥＬＫＱＳＴＣＬＳＬＰＫＣＷＤＹＲＲ
Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ
対応する核酸配列［配列番号１１Ａ］
ＣＣＴＧＡＧＣＴＣＡＡＧＣＡＧＴＣＣＡＣＣＴＧＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＣＡＡＡＧＴＧＣＴＧＧＧＡＴＴＡＣＡＧＧＣＧＴ
（ｃ）ＮＴＰペプチド＃３［配列番号１２］、ＡＤ７ｃ−ＮＴＰ  ｐ３２６−３４４
ＰＰＧＬＫＲＦＳＣＬＳＬＰＳＳＷＤＹＧ
Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ
対応する核酸配列［配列番号１２Ａ］
ＣＣＴＣＣＣＧＧＧＣＴＣＡＡＧＣＧＡＴＴＣＴＣＣＴＧＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＣＡＡＧＣＡＧＣＴＧＧＧＡＴＴＡＣＧＧＧ
（ｄ）ＮＴＰペプチド＃４［配列番号１３］、ＡＤ７ｃ−ＮＴＰ  ｐ３３２−３４５
ＦＳＣＬＳＬＰＳＳＷＤＹＧＨ
Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ
対応する核酸配列［配列番号１３Ａ］
ＴＴＣＴＣＣＴＧＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＣＡＡＧＣＡＧＣＴＧＧＧＡＴＴＡＣＧＧＧＣＡＣ
（ｅ）ＮＴＰペプチド＃５［配列番号１４］、ＡＤ７ｃ−ＮＴＰ  ｐ１１９−１３２
ＳＴＣＬＳＬＰＫＣＷＤＹＲＲ
Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ
対応する核酸配列［配列番号１４Ａ］
ＴＣＣＡＣＣＴＧＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＣＡＡＡＧＴＧＣＴＧＧＧＡＴＴＡＣＡＧＧＣＧＴ
（ｆ）ＮＴＰペプチド＃６［配列番号１５］、ＡＤ７ｃ−ＮＴＰ  ｐ２３２−２４５
ＦＳＣＰＳＬＬＳＳＷＤＹＲＲ
Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ
対応する核酸配列［配列番号１５Ａ］
ＴＴＣＴＣＣＴＧＣＣＣＣＡＧＣＣＴＣＣＴＧＡＧＴＡＧＣＴＧＧＧＡＣＴＡＣＡＧＧＣＧＣ
（ｇ）ＮＴＰペプチド＃７［配列番号１６］、ＡＤ７ｃ−ＮＴＰ  ｐ３３５−３４３
ＬＳＬＰＳＳＷＤＹ
Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ
対応する核酸配列［配列番号１６Ａ］
ＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＣＡＡＧＣＡＧＣＴＧＧＧＡＴＴＡＣ
（ｈ）ＮＴＰペプチド＃８［配列番号１７］、ＡＤ７ｃ−ＮＴＰ  ｐ１２２−１３２
ＬＳＬＰＫＣＷＤＹＲＲ
Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ
対応する核酸配列［配列番号１７Ａ］
ＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＣＡＡＡＧＴＧＣＴＧＧＧＡＴＴＡＣＡＧＧＣＧＴ
（ｉ）ＮＴＰペプチド＃９［配列番号１８］、ＡＤ７ｃ−ＮＴＰ  ｐ２３６−２４５
ＳＬＬＳＳＷＤＹＲＲ
Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ
対応する核酸配列［配列番号１８Ａ］
ＡＧＣＣＴＣＣＴＧＡＧＴＡＧＣＴＧＧＧＡＣＴＡＣＡＧＧＣＧＣ
（ｊ）ＮＴＰペプチド＃１０［配列番号１９］、Ｎ末端にロイシン残基およびプロリン残基の追加を有する、ＡＤ７ｃ−ＮＴＰ  ｐ２３９−２４５。
【００４７】
ＬＰＳＳＷＤＹＲＲ
Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ
対応する核酸配列［配列番号１９Ａ］
ＣＴＣＣＣＡＧＡＧＴＡＧＣＴＧＧＧＡＣＴＡＣＡＧＧＣＧＣ
（ｋ）ＮＴＰペプチド＃１１［配列番号２０］、ＡＤ７ｃ−ＮＴＰ  ｐ２３９−２４５
ＳＳＷＤＹＲＲ
Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ
対応する核酸配列［配列番号２０Ａ］
ＧＡＧＴＡＧＣＴＧＧＧＡＣＴＡＣＡＧＧＣＧＣ
（ｌ）ＮＴＰペプチド＃１２［配列番号２１］、ＡＤ７ｃ−ＮＴＰ  ｐ２３９−２４３，ｐ３３９−３４３
ＳＳＷＤＹ
Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ
対応する核酸配列［配列番号２１Ａ］
ＡＧＣＡＧＣＴＧＧＧＡＴＴＡＣ
（ｍ）ＮＴＰペプチド＃１３［配列番号２２］、ＡＤ７ｃ−ＮＴＰ  ｐ２３９−２４５  ＋  ＡＤ７ｃ−ＮＴＰ  ｐ１３９−１４４
ＳＳＷＤＹＲＲＦＩＬＦＦＬ
Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ
対応する核酸配列［配列番号２２Ａ］
ＧＡＧＴＡＧＣＴＧＧＧＡＣＴＡＣＡＧＧＣＧＣＴＴＴＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＴＴＡ
（ｎ）ＮＴＰペプチド＃１４［配列番号２３］、ＡＤ７ｃ−ＮＴＰ  ｐ２４１−２４５  ＋  ＡＤ７ｃ−ＮＴＰ  ｐ１９７−２０２
ＷＤＹＲＲＦＩＦＮＦＬ
Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ
対応する核酸配列［配列番号２３Ａ］
ＴＧＧＧＡＣＴＡＣＡＧＧＣＧＣＴＴＴＡＴＴＴＴＴＡＡＴＴＴＴＴＴＧ
（ｏ）ＮＴＰペプチド＃１５［配列番号２４］、ＡＤ７ｃ−ＮＴＰ  ｐ２９７−３０２
ＦＮＦＣＬＦ
Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ
対応する核酸配列［配列番号２４Ａ］
ＴＴＴＡＡＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴ
（ｐ）ＮＴＰペプチド＃１６［配列番号２５］、ＡＤ７ｃ−ＮＴＰ  ｐ１９７−２０２
ＦＩＦＮＦＬ
Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ
対応する核酸配列［配列番号２５Ａ］
ＴＴＴＡＴＴＴＴＴＡＡＴＴＴＴＴＴＧ
（ｑ）ＮＴＰペプチド＃１７［配列番号２６］、ＡＤ７ｃ−ＮＴＰ  ｐ３１−４３
ＰＡＳＡＳＰＶＡＧＩＴＧＭ
Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ
対応する核酸配列［配列番号２６Ａ］
ＣＣＴＧＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＣＣＡＧＴＡＧＣＴＧＧＧＡＴＴＡＣＡＧＧＣＡＴＧ
（ｒ）ＮＴＰペプチド＃１８［配列番号２７］、ＡＤ７ｃ−ＮＴＰ  ｐ１７５−１８７
ＰＡＳＡＳＱＶＡＧＴＫＤＭ
Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ
対応する核酸配列［配列番号２７Ａ］
ＣＣＴＧＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＣＡＡＧＴＡＧＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＡＧＡＣＡＴＧ
（ｓ）ＮＴＰペプチド＃１９［配列番号２８］、ＡＤ７ｃ−ＮＴＰ  ｐ２７７−２８９
ＰＡＳＡＳＱＳＡＧＩＴＧＶ
Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ
対応する核酸配列［配列番号２８Ａ］
ＣＣＴＧＣＣＴＣＧＧＣＣＴＣＣＣＡＡＡＧＴＧＣＴＧＧＧＡＴＴＡＣＡＧＧＣＧＴＧ
も含まれ（が、これに制限されるわけではない）、および、これら具体的に挙げられたＮＴＰペプチドおよびそれらの対応する核酸配列のホモログ、誘導体、変異体、フラグメント、融合タンパク質およびペプチド模擬体も含まれる。
【００４８】
「フラグメント」という用語は、ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドのアミノ酸配列の連続部分配列から成るタンパク質またはポリペプチドを意味し、スプライス変異体のような天然に存在するフラグメントおよび天然に存在する in vivo プロテアーゼ活性によって得られるフラグメントが含まれる。このようなフラグメントは、アミノ末端、カルボキシ末端および／または内部で（自然スプライシングによるように）切り取られていてよい。このようなフラグメントは、アミノ末端メチオニンを含んでまたは含むことなく調製することができる。「フラグメント」という用語には、同一であろうと異なっていようと、同じＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドからのものであり、直接的にかまたはリンカーを介して互いに連結された、共通したまたはしない連続アミノ酸配列を含むフラグメントが含まれる。
【００４９】
「変異体」という用語は、ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドのアミノ酸配列と比較したところ、一つまたはそれを超えるアミノ酸の置換、欠失および／または挿入が存在するタンパク質またはポリペプチドを意味し、ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドの天然に存在する対立遺伝子変異体または別のスプライス変異体を包含する。「変異体」という用語は、一つまたは複数の類似のもしくは相同のアミノ酸、または一つまたは複数の類似していないアミノ酸での、ペプチド配列中の一つまたはそれを超えるアミノ酸の置換を包含する。アミノ酸を、類似しているまたは相同であると格付けしうる多数の尺度が存在する。（Gunnar von Heijne, Sequence Analysis in Molecular Biology, p.123-39 (Academic Press, New York, NY 1987。）好ましい変異体は、一つまたはそれを超えるアミノ酸位置におけるアラニン置換を包含する。他の好ましい置換には、そのタンパク質の全体の正味電荷、極性または疎水性にほとんどまたは全く作用しない保存的置換が含まれる。保存的置換は、下の表２に示される。
【００５０】
【表１】
2005507647.tif 000003
【００５１】
表３は、アミノ酸置換のもう一つのスキームを示す。
【００５２】
【表２】
2005507647.tif 000004
【００５３】
他の変異体は、（ａ）置換部位におけるポリペプチド主鎖の、例えば、シートまたはヘリックスコンホメーションとしての構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩、を維持することへの作用が一層有意に異なる残基を選択することなどの、あまり保存的でないアミノ酸置換から成ることがありうる。概して、機能に一層有意に作用すると考えられる置換は、（ａ）グリシンおよび／またはプロリンが、別のアミノ酸で置換されている、または欠失しているまたは挿入されている；（ｂ）親水性残基、例えば、セリルまたはトレオニルが、疎水性残基、例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニルの代わりに（またはによって）置換されている；（ｃ）システイン残基が、いずれか他の残基の代わりに（またはによって）置換されている；（ｄ）陽電性側鎖を有する残基、例えば、リシル、アルギニルまたはヒスチジルが、陰電荷を有する残基、例えば、グルタミルまたはアスパルチルの代わりに（またはによって）置換されている；または（ｅ）嵩高い側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンが、このような側鎖を有していないもの、例えば、グリシンの代わりに（またはによって）置換されている置換である。他の変異体には、一つまたは複数の新規なグリコシル化および／またはリン酸化部位を生じるように設計されたものかまたは、一つまたは複数の既存のグリコシル化および／またはリン酸化部位を欠失するように設計されたものが含まれる。変異体は、グリコシル化部位、タンパク質分解切断部位および／またはシステイン残基に少なくとも一つのアミノ酸置換を包含する。変異体には、リンカーペプチド上のＮＴＰまたはＮＴＰペプチドアミノ酸配列の前または後に追加のアミノ酸残基を含むＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドも含まれる。例えば、システイン残基は、ジスルフィド結合の形成によって環化させるために、アミノ末端とカルボキシ末端の両方に加えることができる。「変異体」という用語は、ＮＴＰペプチドの３’末端かまたは５’末端に隣接する少なくとも１個〜２５個またはそれを超える追加のアミノ酸を含むＮＴＰペプチドのアミノ酸配列を有するポリペプチドも包含する。
【００５４】
「誘導体」という用語は、プロセシングおよび他の翻訳後修飾のような自然過程によって、また、例えば、一つまたはそれを超えるポリエチレングリコール分子、糖、リン酸および／または他のこのような分子であって、この一つまたは複数の分子は野生型ＮＴＰタンパク質またはペプチドに本来結合していない分子、の付加のような化学修飾技術のいずれによっても化学修飾されている化学修飾タンパク質またはポリペプチドを意味する。誘導体には塩が含まれる。このような化学修飾は、基本的教本におよびより詳細なモノグラフに、更には、多くの研究文献に充分に記載されており、当業者に周知である。同じタイプの修飾が、ある与えられたタンパク質またはポリペプチドのいくつかの部位に同じまたはいろいろな程度で存在してよいということは理解されるであろう。更に、ある与えられたタンパク質またはポリペプチドは、多数のタイプの修飾を含有してよい。修飾は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含めた、タンパク質またはポリペプチド中のどこにでも起こりうる。修飾には、例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合性付着、ヘム部分の共有結合性付着、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合性付着、脂質または脂質誘導体の共有結合性付着、ホスホチジルイノシトールの共有結合性付着、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、フェニル化、ラセミ化、グリコシル化、脂質付着、硫酸化、グルタミン酸残基のγカルボキシル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰ−リボシル化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のような転移ＲＮＡに媒介されるアミノ酸のタンパク質への付加、ならびにユビキチン化が含まれる。例えば、Proteins--Structure And Molecular Properties, 2nd Ed., T.E.Creighton, W.H.Freeman and Company, New York (1993) and Wold,F., "Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects," pgs.1-12 in Posttranslational Covalent Modification Of Proteins, B.C.Johnson, Ed., Academic Press, New York (1983); Seifter et al., Meth.Enzymol. 182:626-646(1990) and Rattan et al., "Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging," Ann.N.Y.Acad.Sci. 663:48-62(1992) を参照されたい。「誘導体」という用語は、分岐状になる、または分岐を含んでまたは含むことなく環状になるタンパク質またはポリペプチドを生じる化学修飾を包含する。環状、分岐状および分岐環状のタンパク質またはポリペプチドは、翻訳後自然過程によって生じてよいし、完全な合成法によって製造されてもよい。
【００５５】
「ホモログ」という用語は、場合により、二つのポリペプチドのアミノ酸の位置の類似性を比較するのに一般的に用いられる標準法によって決定したところ、ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドのアミノ酸配列が少なくとも６０％一致しているタンパク質を意味する。二つのタンパク質間の類似性または同一性の程度は、Computational Molecular Biology, Lesk,A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith,D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin,A.M., and Griffin,H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje,G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov,M. and Devereux,J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; and Carillo H. and Lipman,D., SIAM, J.Applied Math., 48:1073(1988) に記載のものが含まれるがこれに制限されるわけではない既知の方法によって容易に計算することができる。同一性を決定する好ましい方法は、調べられる配列間に最大の対合を与えるように設計されている。同一性および類似性を決定する方法は、公的に入手可能な計算機プログラムで体系化される。
【００５６】
二つの配列間の同一性および類似性を決定するのに有用な好ましい計算機プログラム方法には、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux,J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387(1984)）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Atschul,S.F. et al., J.Molec.Biol., 215:403-410(1990)）が含まれるが、これに制限されるわけではない。ＢＬＡＳＴ  Ｘプログラムは、ＮＣＢＩおよび他の源から公的に入手可能である（ＢＬＡＳＴ Manual, Altschul,S., et al., ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ Bethesda, Md. 20894; Atschul,S., et al., J.Mol.Biol., 215:403-410(1990)）。例として、ＧＡＰ（Genetic Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.）のような計算機アルゴリズムを用いて、配列同一性％が決定される予定の二つのタンパク質またはポリペプチドを、それぞれのアミノ酸を最適に対合させるために整列させる（アルゴリズムによって決定される「対合スパン」）。
【００５７】
ギャップオープニングペナルティー（gap opening penalty）（３ｘ（倍）平均ダイアゴナルとして計算される；「平均ダイアゴナル」は、用いられている比較マトリックスのダイアゴナルの平均である；「ダイアゴナル」は、具体的な比較マトリックスによって各々の完全なアミノ酸に割り当てられるスコアまたは数である）およびギャップエクステンションペナルティー（gap extension penalty）（通常は、ギャップオープニングペナルティーの１／１０倍である）、更には、ＰＡＭ２５０またはＢＬＯＳＵＭ６２のような比較マトリックスを、このアルゴリズムと共に用いる。標準的な比較マトリックス（ＰＡＭ２５０比較マトリックスについては、Dayhoff et al. in: Atlas of Protein Sequence and Structure, vol.5, supp.3[1978] を参照されたい；ＢＬＯＳＵＭ６２比較マトリックスについては、Henikoff et al., Proc.Natl.Acad.Sci USA, 89:10915-10919[1992] を参照されたい）も、このアルゴリズムによって用いることができる。次に、同一性％を、このアルゴリズムによって計算する。典型的には、ホモログは、場合により、比較ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドと比較すると、一つまたはそれを超えるアミノ酸の置換、欠失および／または挿入を有するであろう。
【００５８】
「ペプチド模擬体」または「模擬体」という用語は、あるペプチドまたはタンパク質の生物学的活性を模擬しているが、化学的性質がもはやペプチドでない、すなわち、ペプチド結合（すなわち、アミノ酸間のアミド結合）をもはや全く含有していない生物学的に活性な化合物を意味する。ここで、ペプチド模擬体という用語は、より広い意味で、プソイドペプチド、半ペプチドおよびペプトイドのような、性質がもはや完全にペプチドではない分子を包含するのに用いられる。このより広い意味でのペプチド模擬体（ペプチドの一部分が、ペプチド結合を欠いた構造によって置き換えられている場合）の例を、下に記載する。完全に非ペプチドであれ部分的に非ペプチドであれ、本発明によるペプチド模擬体は、そのペプチド模擬体が基づいているＮＴＰペプチド中の活性基の三次元配置にきわめて似ている反応性化学部分の空間的配置を与える。この類似した活性部位幾何学的形の結果として、ペプチド模擬体は、ＮＴＰペプチドの生物学的活性に類似している生体系への作用を有する。
【００５９】
本発明のペプチド模擬体は、好ましくは、三次元形状も生物学的活性も、本明細書中に記載のＮＴＰペプチドに実質的に類似している。当該技術分野において知られているペプチドを構造的に修飾してペプチド模擬体を生じる方法の例には、タンパク質分解への増加した安定性を、特にＮ末端において、活性に悪影響を与えることなくもたらしうるＤアミノ酸残基構造をもたらす主鎖キラル中心の反転が含まれる。一例は、"Tritriated D-ala1-Peptide T Binding", Smith C.S. et al., Drug Development Res., 15,pp.371-379(1988) という論文に記載されている。二番目の方法は、Ｎ−Ｃ鎖間イミドおよびラクタムのような、安定性のために環状構造を変化させることである（Ede et al. in Smith and River (Eds.) "Peptides: Chemistry and Biology", Escom, Leiden (1991), pp.268-270）。これの例は、本明細書中にその開示がそのまま援用される米国特許第４，４５７，４８９号（１９８５年），Goldstein,G. et al. に開示されたものなどの、コンホメーションが制限されたチモペンチン（thymopentin）様化合物において与えられている。三番目の方法は、タンパク質分解に耐性を与えるプソイドペプチド結合によってＮＴＰペプチド中のペプチド結合を置換することである。
【００６０】
概して、ペプチドの構造および生物学的活性に影響を与えない多数のプソイドペプチド結合が記載されてきている。このアプローチの一つの例は、レトロインベルソ（retro-inverso）プソイドペプチド結合を代用することである（本明細書中に援用される、"Biologically active retroinverso analogues of thymopentin", Sisto A. et al in River,J.E. and Marshall,G.R.(eds) "Peptides, Chemistry, Structure and Biology", Escom, Leiden (1990), pp.722-773） and Dalpozzo, et al. (1993), Int.J.Peptide Protein Res., 41:561-566）。この修飾によれば、これらペプチドのアミノ酸配列は、一つまたはそれを超えるペプチド結合がレトロインベルソプソイドペプチド結合によって置き換えられていることを除いて、上記のＮＴＰペプチドの配列と一致しうる。好ましくは、最もＮ末端のペプチド結合が置換されるが、それは、このような置換が、Ｎ末端に作用するエキソペプチダーゼによるタンパク質分解に耐性を与えるからである。更に別の修飾も、アミノ酸の化学基を、類似した構造の他の化学基で置き換えることによって行うことができる。生物学的活性をほとんどまたは全く失うことなく酵素的切断への安定性を増加させることが知られているもう一つの適当なプソイドペプチド結合は、還元等配電子体（reduced isostere）プソイドペプチド結合である（本明細書中にそのまま援用される Couder, et al. (1993), Int.J.Peptide Protein Res., 41:181-184）。
【００６１】
したがって、これらペプチドのアミノ酸配列は、一つまたはそれを超えるペプチド結合が等配電子体プソイドペプチド結合によって置き換えられていることを除いて、ＮＴＰペプチドの配列と一致しうる。「（一つまたは複数の）アミノ酸配列」という表現は、好ましくは、少なくとも２個のアミノ酸、好ましくは、少なくとも４個のアミノ酸、より好ましくは、少なくとも５個アミノ酸の配列を示すのに用いられる。好ましくは、最もＮ末端のペプチド結合が置換されるが、それは、このような置換が、Ｎ末端に作用するエキソペプチダーゼによるタンパク質分解に耐性を与えると考えられるからである。一つまたはそれを超える還元等配電子体プソイドペプチド結合を含むペプチドの合成は、当該技術分野において知られている（上に引用される Couder, et al. (1993)）。他の例には、ペプチド結合を置き換えるためのケトメチレン結合またはメチルスルフィド結合の導入が含まれる。
【００６２】
ＮＴＰペプチドのペプトイド誘導体は、生物学的活性に重要な構造決定基を保持しているがなお、ペプチド結合が除かれていることによって、タンパク質分解への耐性を与えているペプチド模擬体のもう一つのクラスである（本明細書中にそのまま援用される Simon, et al., 1992, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 89:9367-9371）。ペプトイドは、Ｎ−置換グリシンのオリゴマーである。天然アミノ酸の側鎖に各々対応する多数のＮ−アルキル基が記載されてきている（上に引用される Simon, et al. (1992)）。ＮＴＰペプチドの若干のまたはすべてのアミノ酸を、置き換えられたアミノ酸に対応するＮ−置換グリシンで置き換えてもよい。
【００６３】
「ペプチド模擬体」または「模擬体」という表現には、下に定義される逆Ｄペプチドおよび鏡像異性体も含まれる。「逆Ｄペプチド」という句は、ＮＴＰペプチドのＬ−アミノ酸配列と比較して逆順序で配置されるＤ−アミノ酸から成る生物学的に活性なタンパク質またはペプチドを意味する。したがって、Ｌ−アミノ酸ＮＴＰペプチドのカルボキシ末端残基は、Ｄ−アミノ酸ペプチドのアミノ末端等になる。例えば、ＮＴＰペプチドＳＳＷＤＹは、ＹdＤdＷdＳdＳdになり、ここにおいて、Ｄd、Ｓd、ＷdおよびＹdは、Ｌ−アミノ酸Ｄ、Ｓ、ＷおよびＹにそれぞれ対応するＤ−アミノ酸である。
【００６４】
本明細書中で用いられる「鏡像異性体」は、ＮＴＰペプチドのアミノ酸配列中の一つまたはそれを超えるＬ−アミノ酸残基が、一つまたは複数の対応するＤ−アミノ酸残基で置き換えられている生物学的に活性なタンパク質またはペプチドを意味する。
【００６５】
本明細書中に記載のアミノ酸およびアミノ酸残基は、下の表に与えられる承認された一文字または三文字コードによって表すことができる。
【００６６】
【表３】
2005507647.tif 000005
【００６７】
本発明は、本発明中において上に定義のＮＴＰペプチドを含む組成物に関する。好ましいＮＴＰペプチドは、ＡＤ７ｃ−ＮＴＰに由来するＮＴＰペプチドに類似しているまたは相同である。しかしながら、ＮＴＰタンパク質の他の種類の一部分またはフラグメントに基づく他のＮＴＰペプチドの使用も、本発明によって包含される。例えば、ＡＤ７ｃ−ＮＴＰペプチド配列および類似の変異体およびホモログは、広範囲のヒトおよび非ヒトタンパク質（「関連タンパク質」）中でも見出される。具体的には、ＡＤ７ｃ−ＮＴＰ遺伝子は、ヒトおよび他の霊長類ゲノムの他の遺伝子中でも見出されるものにきわめて類似しているＡｌｕ型配列を含有する。
【００６８】
したがって、すべてではないとしても若干の関連タンパク質が、ＡＤ７ｃ−ＮＴＰペプチドに相同のまたはきわめて類似しているペプチド配列を含有するので（「関連ペプチド」）、それらも細胞死を引き起こすのに有効な薬剤であると証明されるであろうと考えるのは妥当である。同様に、当業者は、細胞死を引き起こすのに有効な薬剤であることが判明したいずれかの関連タンパク質のアミノ酸配列に基づく特定の関連ペプチドを合成し、そして細胞死を引き起こすための薬剤としての効力についてそれらを調べることができる。
【００６９】
細胞死を引き起こすのに有効な薬剤であることが判明した関連タンパク質に由来する他のペプチド配列も、細胞死を引き起こすのに有効な薬剤でありうる。当業者は、他の有効なペプチド配列を同定するために、過度の実験を伴うことなく、有効な関連タンパク質のフラグメントをそのタンパク質のアミノ酸配列全体にわたって合成することができる。
【００７０】
本発明の好ましいＮＴＰペプチドには、ＮＴＰペプチド配列に一致する、きわめて類似したまたは相同のアミノ酸配列を含有することが知られているタンパク質およびペプチドが含まれる。
【００７１】
本発明によって包含されるＮＴＰペプチドおよびそれらのフラグメント、変異体、誘導体、ホモログおよび模擬体は、組換えＤＮＡ技術、タンパク質合成、および天然に存在するＮＴＰペプチドおよびそれらのフラグメント、変異体、誘導体およびホモログの単離などの、当業者に知られている方法を用いて調製することができる。
【００７２】
ＮＴＰペプチドは、Sambrook et al.（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. [1989]）および／または Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishers Inc. and Wiley and Sons, N.Y. [1994] に記載された方法などの周知の組換えＤＮＡ技術方法を用いて調製することができる。
【００７３】
ＮＴＰペプチドをコードしている遺伝子またはｃＤＮＡは、例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって、またはＰＣＲ増幅によって得てもよい。このライブラリーをスクリーニングするのに有用なプローブまたはプライマーは、例えば、他のＮＴＰペプチドまたはＮＴＰタンパク質中で見出される保存モチーフなどの同じまたは関連した遺伝子ファミリーからの、他の既知の遺伝子または遺伝子フラグメントの配列情報に基づいて生じることができる。更に、ＮＴＰペプチドまたはＮＴＰタンパク質をコードしている遺伝子が一つの種から同定されている場合、その遺伝子の全部または一部分をプローブとして用いて、他の種から相同遺伝子を同定することができる。これらプローブまたはプライマーは、ＮＴＰペプチドまたはＮＴＰタンパク質遺伝子を発現すると考えられる種々の組織源からｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに用いることができる。典型的には、スクリーニングから得られる偽陽性の数を最小限にするようにスクリーニングするために、高ストリンジェンシー条件が用いられるであろう。
【００７４】
ＮＴＰペプチドまたはＮＴＰタンパク質をコードしている遺伝子を調製するもう一つの手段は、Engels et al. (Angew.Chem.Intl.Ed., 28:716-734[1989]) によって記載された方法のような当業者に周知の方法を用いた化学合成を用いることである。これら方法には、特に、核酸合成のためのホスホトリエステル法、ホスホロアミダイト法およびＨ−ホスホネート法が含まれる。このような化学合成に好ましい方法は、標準的なホスホロアミダイト化学を用いたポリマーに支持された合成である。典型的には、ＮＴＰペプチドまたはＮＴＰタンパク質をコードしているＤＮＡは、数百ヌクレオチド長さであろう。約１００ヌクレオチドより大の核酸は、これら方法を用いていくつかのフラグメントとして合成することができる。次に、それらフラグメントを互いに連結して、完全長ＮＴＰペプチドまたはＮＴＰタンパク質を形成することができる。通常は、タンパク質のアミノ末端をコードしているＤＮＡフラグメントは、メチオニン残基をコードしているＡＴＧを有するであろう。このメチオニンは、宿主細胞中で生産されるタンパク質が、その細胞から分泌されるように設計されているかどうかによって、ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドの成熟型上に存在してよいしまたはしなくてよい。
【００７５】
ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドをコードしている遺伝子、ｃＤＮＡまたはそのフラグメントは、標準的な連結技術を用いて適当な発現または増幅ベクター中に挿入することができる。このベクターは、典型的には、用いられる具体的な宿主細胞中で機能性であるように選択される（すなわち、ベクターは、遺伝子の増幅および／または遺伝子の発現が起こりうるような宿主細胞機構と適合性である）。ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドをコードしている遺伝子、ｃＤＮＡまたはそのフラグメントは、原核生物、酵母、昆虫（バキュロウイルス系）および／または真核生物の宿主細胞中で増幅／発現されてよい。宿主細胞の選択は、このＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドが、グリコシル化されるのかおよび／またはリン酸化されるのかどうかに一部分は依存するであろう。そのような場合、酵母、昆虫または哺乳動物の宿主細胞が好適である。
【００７６】
典型的には、いずれかの宿主細胞中で用いられるベクターは、５’フランキング配列（プロモーターとも称される）と、一つまたは複数のエンハンサー、複製起点要素、転写終結要素、ドナーおよびアクセプタースプライス部位を含有する完全なイントロン配列、シグナルペプチド配列、リボソーム結合部位要素、ポリアデニル化配列、発現されるポリペプチドをコードしている核酸を挿入するためのポリリンカー領域、および選択可能マーカー要素などの他の調節要素を含有するであろう。これら要素は各々、下で論じる。場合により、ベクターは、タグ配列、すなわち、ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドコーディング配列の５’末端または３’末端に位置するオリゴヌクレオチド分子を含有してよく；このオリゴヌクレオチド分子は、ポリＨｉｓ（ヘキサＨｉｓなど）、または商業的に入手可能な抗体が存在するＦＬＡＧ、ＨＡ（ヘマグルチニンインフルエンザウイルス）またはｍｙｃなどの他のタグをコードしている。このタグは、典型的には、ポリペプチドの発現時にポリペプチドに融合し、そして宿主細胞からのＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドのアフィニティー精製のための手段として役立ちうる。アフィニティー精製は、例えば、アフィニティーマトリックスとしてこのタグに対する抗体を用いたカラムクロマトグラフィーによって行うことができる。場合により、タグは、精製されたＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドから、ある種のペプチダーゼを用いるようないろいろな手段によってその後除去することができる。
【００７７】
ヒト免疫グロブリンのヒンジ領域およびＦｃ領域は、当業者によって、ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドのＮ末端かまたはＣ末端において融合しうる。その後のＦｃ融合タンパク質は、プロテインＡアフィニティーカラムの使用によって精製しうる。Ｆｃは、長い薬物動態学的 in vivo 半減期を示すことが知られており、Ｆｃに融合したタンパク質は、未融合の対応物よりも実質的に長い in vivo 半減期を示すことが判明している。更に、Ｆｃ領域への融合は、若干の分子の生物活性に有用でありうる分子の二量体化／多量体化を可能にする。
【００７８】
５’フランキング配列は、相同であってよいし（すなわち、宿主細胞と同じ種および／または系統による）、異種であってよいし（すなわち、宿主細胞の種または系統以外の種による）、ハイブリッド（すなわち、１より多くの源からの５’フランキング配列の組合せ）であってよいし、合成であってよいし、またはそれは、天然のＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチド遺伝子５’フランキング配列であってよい。そのようなものとして、５’フランキング配列源は、いずれの単細胞原核性生物または真核生物であってもよいし、いずれの脊椎動物または無脊椎動物であってもよいし、またはいずれの植物であってもよいが、但し、その５’フランキング配列は、宿主細胞機構中で機能性であり、しかも宿主細胞機構によって活性化されうるという条件付きである。
【００７９】
本発明のベクター中で有用な５’フランキング配列は、当該技術分野において周知のいくつかの方法のいずれによっても得ることができる。典型的には、ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチド遺伝子フランキング配列以外の本明細書中で有用な５’フランキング配列は、マッピングによっておよび／または制限エンドヌクレアーゼ消化によって予め同定されているので、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて適当な組織源から単離することができる。ある場合には、５’フランキング配列の完全なヌクレオチド配列を知ることができる。ここで、５’フランキング配列を、核酸の合成またはクローニングについて上に記載された方法を用いて合成することができる。
【００８０】
５’フランキング配列の全部または一部分だけが知られている場合、それは、ＰＣＲを用いて、および／または、同じ種または別の種から適当なオリゴヌクレオチドおよび／または５’フランキング配列フラグメントでゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。
【００８１】
５’フランキング配列が知られていない場合、５’フランキング配列を含有するＤＮＡのフラグメントは、例えば、コーディング配列または別の一つもしくは複数の遺伝子さえも含有しうるより大きいＤＮＡ片から単離することができる。単離は、制限エンドヌクレアーゼ消化により、適当なＤＮＡフラグメントを単離するために慎重に選択された一つまたはそれを超える酵素を用いて行うことができる。消化後、所望のフラグメントを、アガロースゲル精製、Qiagen（登録商標）カラムまたは当業者に知られている他の方法によって単離することができる。この目的を達成するのに適した酵素の選択は、当業者に容易に理解されるであろう。
【００８２】
複製起点要素は、典型的には、商業的に購入される原核生物発現ベクターの一部分であり、宿主細胞中でのベクターの増幅を助ける。一定のコピー数へのベクターの増幅は、ある場合には、ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドの最適発現に重要でありうる。選択されたベクターが複製起点部位を含有していない場合、既知の配列に基づいて化学合成し、そしてベクター中に連結してもよい。転写終結要素は、典型的には、ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドコーディング配列の３’末端に位置し、ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドの転写を終結するのに役立つ。通常は、原核細胞中の転写終結要素は、Ｇ−Ｃの多いフラグメント後にポリＴ配列がある。この要素は、ライブラリーからクローン化されてよいしまたはベクターの一部分として商業的に購入されてよいが、上に記載されたような核酸合成の方法を用いて容易に合成することもできる。
【００８３】
選択可能マーカー遺伝子要素は、選択培地中で増殖した宿主細胞の生存および増殖に必要なタンパク質をコードしている。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）原核生物宿主細胞に、抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、テトラサイクリンまたはカナマイシンへの耐性を与える、（ｂ）細胞の栄養要求性欠損を補足する；または（ｃ）複合培地から入手できない重大な栄養素を供給する、タンパク質をコードしている。好ましい選択可能マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子およびテトラサイクリン耐性遺伝子である。
【００８４】
Shine-Dalgarno 配列（原核生物）または Kozak 配列（真核生物）と一般的に称されるリボソーム結合要素は、通常は、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要である。この要素は、典型的には、合成されるＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドのプロモーターの３’およびコーディング配列の５’に位置している。この Shine-Dalgarno 配列は様々であるが、典型的には、ポリプリンである（すなわち、高いＡ−Ｇ含量を有する）。多数の Shine-Dalgarno 配列が同定されており、各々、上記の方法を用いて当業者が容易に合成することができるし、原核生物ベクター中で用いることができる。
【００８５】
ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドが宿主細胞から分泌されることが望まれる場合、シグナル配列は、ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドを、それが合成される宿主細胞の外へと指示するのに用いることができ、このタンパク質のカルボキシ末端部分は、膜固定を妨げるために欠失していてよい。典型的には、このシグナル配列は、ＮＴＰタンパク質／ＮＴＰペプチド遺伝子またはｃＤＮＡのコーディング領域中に、またはＮＴＰタンパク質／ＮＴＰペプチド遺伝子コーディング領域の５’末端に直接的に位置している。多数のシグナル配列が同定されており、選択された宿主細胞中で機能性であるそれらはいずれも、ＮＴＰタンパク質／ＮＴＰペプチド遺伝子またはｃＤＮＡと共に用いることができる。したがって、このシグナル配列は、ＮＴＰタンパク質／ＮＴＰペプチド遺伝子またはｃＤＮＡに相同であってよいしまたは異種であってよいし、ＮＴＰタンパク質／ＮＴＰペプチド遺伝子またはｃＤＮＡに相同であってよいしまたは異種であってよい。更に、このシグナル配列は、上記の方法を用いて化学合成してもよい。大部分の場合、シグナルペプチドの存在による宿主細胞からのポリペプチドの分泌は、ポリペプチドからのアミノ末端メチオニンの除去を引き起こすであろう。
【００８６】
多くの場合、ＮＴＰタンパク質／ＮＴＰペプチド遺伝子またはｃＤＮＡの転写は、ベクター中の一つまたはそれを超えるイントロンの存在によって増加するが；これは、特に、ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドが真核生物宿主細胞、特に、哺乳動物宿主細胞中で生産される場合に真実である。用いられるイントロンは、特に、用いられる遺伝子が完全長ゲノム配列またはそのフラグメントである場合、ＮＴＰタンパク質／ＮＴＰペプチド遺伝子内に天然に存在していてよい。このイントロンが（大部分のｃＤＮＡの場合のように）遺伝子内に天然に存在しない場合、一つまたは複数のイントロンは、別の源から得ることができる。フランキング配列およびＮＴＰタンパク質／ＮＴＰペプチド遺伝子に関するイントロンの位置は、このイントロンが有効であるように転写されるべきであるので、概して重要である。そのようなものとして、発現ベクター中に挿入されるＮＴＰタンパク質／ＮＴＰペプチド遺伝子がｃＤＮＡ分子である場合、イントロンの好ましい位置は、転写開始部位の３’およびポリＡ転写終結配列の５’である。ＮＴＰタンパク質／ＮＴＰペプチドｃＤＮＡについて、好ましくは、一つまたは複数のイントロンは、それがこのコーディング配列を分断しないように、ｃＤＮＡ一方の側またはもう一方（すなわち、５’または３’）に位置するであろう。いずれかのウイルス、原核生物および真核生物（植物または動物）を含めたいずれかの源からのいずれのイントロンも、本発明を実施するのに用いることができるが、但し、それは、それが挿入される一つまたは複数の宿主細胞と適合性であるという条件付きである。更に、本明細書中に含まれるのは、合成イントロンである。場合により、二つ以上のイントロンをベクター中に用いてよい。
【００８７】
上記の一つまたはそれを超える要素が、用いられるベクター中に既に存在しているのではない場合、それらは、個々に得ることができそしてベクター中に連結することができる。これら要素の各々を得るのに用いられる方法は、当業者に周知であり、上記の方法（すなわち、ＤＮＡの合成、ライブラリースクリーニング等）に匹敵する。
【００８８】
本発明を実施するのに用いられる最終ベクターは、典型的には、商業的に入手可能なベクターなどの出発用ベクターから構築される。このようなベクターは、完成したベクター中に含まれるべき若干の要素を含有してよいしまたは含有しなくてよい。出発用ベクター中に所望の要素が全く存在しない場合、ベクター中に連結される要素の末端およびベクターの末端が連結に適合性であるように、一つまたは複数の適切な制限エンドヌクレアーゼでベクターを切ることによって、各々の要素を個々にベクター中に連結することができる。ある場合には、満足のいく連結を得るために、互いに連結されるこれら末端をブラントにすることが必要でありうる。ブラントにすることは、クレノウＤＮＡポリメラーゼまたはＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを全４個のヌクレオチドの存在下で用いて、最初に「付着末端」を埋めることによって行われる。この手順は、当該技術分野において周知であり、例えば、Sambrook et al., 上記に記載されている。或いは、ベクター中に挿入される二つまたはそれを超える要素は、（それらが互いに隣接した位置にあるべきならば）最初に互いに連結した後、ベクター中に連結することができる。
【００８９】
ベクターを構築するさらなる方法は、いろいろな要素の連結をすべて一つの反応混合物中で同時に行うことである。ここでは、これら要素の不適当な連結または挿入のために、多数のナンセンスまたは非機能性ベクターが生じるであろう。しかしながら、機能性ベクターは、制限エンドヌクレアーゼ消化によって同定され且つ選択されてよい。
【００９０】
本発明を実施するのに好ましいベクターは、細菌、昆虫および哺乳動物の宿主細胞と適合性であるものである。このようなベクターには、特に、ｐＣＲＩＩ、ｐＣＲ３、およびｐｃＤＮＡ３．１（Invitrogen Company, San Diego, Calif.）、ｐＢＳＩＩ（Stratagene Company, La Jolla, Calif.）、ｐＥＴ１５ｂ（Novagen, Madison, Wis.）、ＰＧＥＸ（Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J.）、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２（Clontech, Palo Alto, Calif.）、ｐＥＴＬ（BlueBacII; Invitrogen）およびｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（Gibco／ＢＲＬ，Grand Island, N.Y.）が含まれる。
【００９１】
ベクターを構築し、そして完全長または一部切断されたＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドをコードしている核酸分子をベクターの適当な部位に挿入した後、完成したベクターを、増幅および／またはポリペプチド発現に適した宿主細胞中に挿入することができる。宿主細胞は、原核生物宿主細胞（大腸菌（Ｅ．coli）など）または真核生物宿主細胞（酵母細胞、昆虫細胞または脊椎動物細胞など）であってよい。この宿主細胞は、適切な条件下で培養された場合、ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドを合成することができ、続いて、それを（宿主細胞がそれを培地中に分泌する場合）培地から、または（それが分泌されない場合）それを生産する宿主細胞から直接的に、集めることができる。
【００９２】
採集後、このＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドは、モレキュラーシーブクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等のような方法を用いて精製することができる。ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドの生産のための宿主細胞の選択は、一部分は、そのＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドがグリコシル化されるのかまたはリン酸化されるのかどうかに（この場合、真核生物宿主細胞が好適である）、および宿主細胞がそのタンパク質を、生物学的に活性なタンパク質が生物学的活性を有するＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドによって調製されるようなその天然の三次構造（例えば、ジスルフィド橋の適当な配向等）にフォールディングすることができる方法に依存するであろう。このＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドは、合成後に下に論じるような適切な化学的条件を用いてフォールディングされてよい。本発明において有用な適当な細胞または細胞系には、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ヒト胚性腎（ＨＥＫ）２９３または２９３Ｔ細胞、または３Ｔ３細胞などの哺乳動物細胞が含まれる。適当な哺乳動物宿主細胞の選択、および形質転換、培養、増幅、スクリーニングおよび生成物の生産および精製の方法は、本明細書中に与えられる指針を用いて当業者が行うことができる。他の適当な哺乳動物細胞系には、サルＣＯＳ−１およびＣＯＳ−７細胞系、およびＣＶ−１細胞系が含まれる。更に例示的な哺乳動物宿主細胞には、形質転換された細胞系を含めた、霊長類細胞系および齧歯類細胞系が含まれる。正常二倍体細胞、一次組織の in vitro 培養に由来する細胞系統、更には、一次外植体も適している。候補細胞は、遺伝子型に関して選択遺伝子を欠損していてよいし、または優先的に作用する選択遺伝子を含有していてよい。他の適当な哺乳動物細胞系には、マウス神経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞、ＨｅＬａ、マウスＬ−９２９細胞、スイス由来３Ｔ３系、Ｂａｌｂ−ｃまたはＮＩＨマウス、ＢＨＫまたはＨａＫハムスター細胞系が含まれるが、これに制限されるわけではない。
【００９３】
本発明に適した宿主細胞として同様に有用であるのは、細菌細胞である。例えば、Ｅ．coli のいろいろな系統（例えば、ＨＢ１０１、ＤＨ５．α、ＤＨ１０およびＭＣ１０６１）は、バイオテクノロジーの分野において宿主細胞として周知である。枯草菌（Ｂ．subtilis）、シュードモナス属（Pseudomonas spp.）、他のバチルス属（Bacillus spp.）、ストレプトミセス属（Streptomyces spp.）等のいろいろな系統も、この方法で用いることができる。当業者に知られている酵母細胞の多数の系統も、本発明のポリペプチドの発現のための宿主細胞として利用可能である。
【００９４】
更に、望まれる場合、昆虫細胞システムを、本発明の方法で利用することができる。このようなシステムは、例えば、Kitts et al.（Biotechniques, 14:810-817[1993]）、Lucklow et al.（Curr.Opin.Biotechnol., 4:564-572[1993]）および Lucklow et al.（J.Virol., 67:4566-4579[1993]）に記載されている。好ましい昆虫細胞は、Ｓｆ−９およびＨｉ５（Invitrogen, Carlsbad, Calif.）である。
【００９５】
選択された宿主細胞中へのベクターの挿入（形質転換またはトランスフェクションとも称される）は、塩化カルシウム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクションまたはＤＥＡＥ−デキストラン法のような方法を用いて行うことができる。選択される方法は、一部分は、用いられる宿主細胞のタイプと相関関係にあるだろう。これら方法および他の適当な方法は、当業者に周知であり、例えば、Sambrook et al., 上記に記載されている。
【００９６】
ベクターを含有している（すなわち、形質転換されたまたはトランスフェクションされた）宿主細胞は、当業者に周知の標準的な培地を用いて培養することができる。この培地は、通常は、細胞の増殖および生存に必要なすべての栄養素を含有するであろう。Ｅ．coli 細胞を培養するのに適した培地は、例えば、Luria Broth（ＬＢ）および／または Terrific Broth（ＴＢ）である。真核細胞を培養するのに適した培地は、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＥＭ、ＤＭＥＭであり、これらはいずれも、培養されている具体的な細胞系によって必要とされる血清および／または増殖因子を補足されていてよい。昆虫培養物に適した培地は、必要とされるようにイーストレート（yeastolate）、ラクトアルブミン加水分解産物および／またはウシ胎児血清を補足された Grace's 培地である。典型的には、形質転換された細胞のみの選択的増殖に有用な抗生物質または他の化合物を、培地への補足物として加える。用いられる化合物は、宿主細胞を形質転換させたプラスミド上に存在する選択可能マーカー要素によって決められるであろう。例えば、選択可能マーカー要素がカナマイシン耐性である場合、培地に加えられる化合物はカナマイシンであろう。
【００９７】
宿主細胞中で生産されたＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドの量は、当該技術分野において知られている標準法を用いて評価することができる。このような方法には、制限されることなく、ウェスタンブロット分析、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、非変性ゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分離、質量分光分析、免疫沈降法、および／またはＤＮＡ結合ゲルシフト分析のような活性検定が含まれる。
【００９８】
ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドが宿主細胞から分泌されるように設計されていた場合、大部分のＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドは、細胞培地中で見出されうる。この方法で製造されるタンパク質は、細胞からの分泌の際に、アミノ末端メチオニンが除去されるので、典型的には、それを有していないであろう。しかしながら、ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドが宿主細胞から分泌されない場合、それは、細胞質および／または核中に（真核生物宿主細胞について）またはサイトゾル中に（グラム陰性細菌宿主細胞について）存在するであろうし、それはアミノ末端メチオニンを有することがありうる。
【００９９】
宿主細胞の細胞質および／または核中にあるＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドについては、典型的には、宿主細胞を、最初に機械的にまたは界面活性剤で破壊して、細胞内内容物を緩衝溶液中に放出させる。次に、ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドをこの溶液から単離することができる。
【０１００】
溶液からのＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドの精製は、いろいろな技法を用いて行うことができる。タンパク質が、そのカルボキシル末端かまたはアミノ末端に、ヘキサヒスチジン（ＮＴＰペプチド／ヘキサＨｉｓ）のようなタグ、またはＦＬＡＧ（Sigma-Aldritch, St.Louis, MI）またはカルモジュリン結合ペプチド（Stratagene, La Jolla, CA）のような他の低分子ペプチドを含有するように合成された場合、それは、本質的には、アフィニティーカラムを介して溶液を通過させることによって一段法で精製することができるが、その場合、カラムマトリックスは、このタグにまたは直接的にタンパク質に高親和性を有する（すなわち、ＮＴＰペプチドを特異的に認識する単クローン性抗体）。例えば、ポリヒスチジンは、ニッケル、亜鉛およびコバルトに高い親和性および特異性で結合し；したがって、ニッケル基剤アフィニティー樹脂（Qiagen's ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓシステムまたは Invitrogen's Xpress System で用いられる）またはコバルト基剤アフィニティー樹脂（ＢＤ Biosciences−ＣＬＯＮＴＥＣＨ’ｓ Talon システムで用いられる）を用いる固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーを、ＮＴＰペプチド／ポリＨｉｓの精製に用いることができる。（例えば、Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Section 10.11.8, John Wiley & Sons, New York [1993] を参照されたい）。
【０１０１】
ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドが、タグが取り付けられることなく製造され、しかも利用可能な抗体がない場合、他の周知の精製方法を用いることができる。このような方法には、制限されることなく、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、モレキュラーシーブクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、ゲル溶離と組み合わせた未変性ゲル電気泳動、および分取用等電点電気泳動（Isoprime machine/technique, Hoefer Scientific）が含まれる。ある場合には、これらの内二つまたはそれを超える技法を組み合わせて、増加した純度を得ることができる。
【０１０２】
ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドが主に細胞内で見出されるであろうと考えられる場合、細胞内物質（グラム陰性細菌については封入体を含めた）を、当業者に知られているいずれかの標準的な技法を用いて宿主細胞から抽出することができる。例えば、これら宿主細胞を、フレンチプレス、ホモジナイゼーションおよび／または超音波処理後の遠心分離により、溶解させてペリプラズム／細胞質の内容物を放出させることができる。ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドが、サイトゾル中で封入体を形成した場合、それら封入体は、しばしば、細胞の内膜および／または外膜に結合することがありうるので、主に、遠心分離後のペレット材料中で見出されるであろう。次に、このペレット材料を、ｐＨ両極において、または界面活性剤、グアニジン、グアニジン誘導体、尿素または尿素誘導体のようなカオトロピック剤で、アルカリ性ｐＨでのジチオトレイトールまたは酸性ｐＨでのトリスカルボキシエチルホスフィンのような還元剤の存在下において処理して、封入体を放出させ、破砕し、可溶化させることができる。次に、ここで可溶性の形のＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドは、ゲル電気泳動、免疫沈降法または類似のものを用いて分析することができる。ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドを単離することが望まれる場合、単離は、下におよび Marston et al.（Meth.Enz., 182:264-275[1990]）に記載のものなどの標準法を用いて行うことができる。
【０１０３】
ある場合には、ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドは、単離時に生物学的に活性でなくてよい。このポリペプチドをその三次構造にリフォールディングするまたは変換するおよびジスルフィド結合を生じるためのいろいろな方法を用いて、生物学的活性を回復することができる。このような方法には、可溶化したポリペプチドを、特定の濃度のカオトロープの存在下において、通常は７を超えるｐＨに暴露することが含まれる。カオトロープの選択は、封入体可溶化に用いられる選択肢に極めて類似しているが、通常は、より低い濃度であり、必ずしも可溶化に用いられるのと同じカオトロープではない。大部分の場合、リフォールディング／酸化溶液は、還元剤、または酸化型を特定の比率で加えた還元剤も含有して、タンパク質の一つまたは複数のシステイン橋の形成においてジスルフィドシャッフリングを引き起こすことを可能にする特定のレドックス電位を生じるであろう。一般的に用いられる若干のレドックス対には、システイン／シスタミン、グルタチオン（ＧＳＨ）／ジチオビスＧＳＨ、塩化第二銅、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）／ジチアンＤＴＴ、２−メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ジチオ−ｂ（ＭＥ）が含まれる。多くの場合、リフォールディングの効率を増加させるのに共溶媒（cosolvent）が必要であり、この目的に用いられるより一般的な試薬には、グリセロール、いろいろな分子量のポリエチレングリコール、およびアルギニンが含まれる。
【０１０４】
ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチド封入体が、宿主細胞中において有意の程度まで形成されない場合、ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドは、主に、細胞ホモジネートの遠心分離後の上澄み中で見出されることがありうるので、このＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドは、下に示されるような方法を用いて上澄みから単離することができる。
【０１０５】
ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドを部分的にまたは完全に単離することが好ましいそれら状況において、精製は、当業者に周知の標準法を用いて行うことができる。このような方法には、制限されることなく、電気泳動後の電気溶出、各種タイプのクロマトグラフィー（イムノアフィニティー、モレキュラーシーブおよび／またはイオン交換）および／または高速液体クロマトグラフィーが含まれる。ある場合には、完全な精製のために、これら方法の二つ以上を用いるのが好ましいことがありうる。
【０１０６】
組換えＤＮＡ技術を用いてＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドを製造し且つ精製することに加えて、ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドおよびそれらのフラグメント、変異体、ホモログおよび誘導体は、Merrifield et al.（J.Am.Chem.Soc., 85:2149[1963]）、Houghten et al.（Proc Natl Acad.Sci.USA, 82:5132[1985]）および Stewart and Young（Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.[1984]）によって記載されたものなどの当該技術分野において知られている技法を用いる、化学合成法（固相ペプチド合成など）によって調製してもよい。このようなポリペプチドは、アミノ末端上にメチオニンを含んでまたは含むことなく合成されてよい。化学合成されたＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドは、これら参考文献に記載の方法を用いて酸化されて、ジスルフィド橋を形成することができる。これらＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドは、組換えによって製造されたまたは天然源から精製されたＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドに匹敵する生物学的活性を有すると考えられるので、リコンビナントまたは天然のＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドと交換可能に用いることができる。
【０１０７】
ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドがポリマーに連結している化学修飾されたＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチド組成物は、本発明の範囲内に包含される。選択されるポリマーは、典型的には、水溶性であるので、それが結合しているタンパク質は、生理学的環境のような水性環境中で沈殿することはない。選択されるポリマーは、通常は、アシル化のための活性エステルまたはアルキル化のためのアルデヒドのような単一反応性基を有するように修飾されるので、重合度は、本方法で与えられるように調節することができる。このポリマーは、いずれの分子量を有してもよいし、分岐状であってよいしまたは未分岐であってよい。／／ＮＴＰペプチドポリマーの範囲内に含まれるのは、ポリマーの混合物である。
【０１０８】
ある場合には、天然に存在するＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドの核酸および／またはアミノ酸変異体を調製するのが望ましいことがありうる。核酸変異体は、位置指定突然変異誘発、ＰＣＲ増幅または他の適当な方法を用いて製造することができるが、この場合、一つまたは複数のプライマーは、所望の点突然変異を有する（突然変異誘発技術の説明については、Sambrook et al., 上記および Ausubel et al., 上記を参照されたい）。Engels et al., 上記によって記載の方法を用いた化学合成も、このような変異体を調製するのに用いることができる。当業者に知られている他の方法も用いることができる。
【０１０９】
好ましい核酸変異体は、ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドを製造するのに用いられる宿主細胞中におけるコドン選択（codon preference）が理由となるヌクレオチド置換を含有するものである。このようなコドン最適化は、University of Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group, Madison, Wis によって提供されるような高度に発現された細菌遺伝子のコドン選択のための Ecohigh.Cod のようなコドン出現頻度表を包含する計算機アルゴリサー（algorithers）によって決定することができる。他の有用なコドン出現頻度表には、Celegans_high.cod、Celegans_low.cod、Drosophila_high.cod、Human_high.cod、Maize_high.cod および Yeast_high.cod が含まれる。他の好ましい変異体は、野生型と比較される上記のような保存的アミノ酸変化をコードしている（例えば、天然に存在するアミノ酸側鎖の電荷または極性が、異なったアミノ酸での置換によって実質的に変化していない）もの、および／または、新規な一つまたは複数のグリコシル化および／またはリン酸化部位を生じるように設計されたものかあるいは既存の一つまたは複数のグリコシル化および／またはリン酸化部位を欠失するように設計されたものである。
【０１１０】
ＮＴＰタンパク質、ＮＴＰペプチドおよびそれらのフラグメント、ホモログ、変異体、誘導体および塩は、当業者に知られている慣用的なペプチド合成技術を用いて製造することができる。これら技術には、化学カップリング法（Wunsch,E: "Methoden der organischen Chemie", Volume 15, Band 1+2, Synthese von Peptiden, thime Verlag, Stuttgart (1974), および Barrany,G.; Marrifield,R.B.: "The Peptides", eds. E.Gross, J.Meienhofer, Volume 2, Chapter 1, pp.1-284, Academic Press (1980) を参照されたい）、酵素カップリング法（Widmer,F. Johansen,J.T., Carlsberg Res.Commun., Vol.44, pp.37-46(1979), および Kullmann,W.: "Enzymatic Peptide Synthesis", CRC Press Inc. Boca Raton, Fla. (1987), および Widmer,F., Johansen,J.T. in "Synthetic Peptides in Biology and Medicines:, eds. Alitalo,K., Partanen,P., Vatieri,A., pp.79-86, Elsevier, Amsterdam (1985) を参照されたい）、または工程設計および経済的にこれが好都合であるならば、化学的および酵素的方法の組合せが含まれる。本開示に与えられる内容を用いて、当業者は、ＮＴＰペプチドのペプチド配列を変化させて、元のまたは天然のＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドと同じまたは類似の生物学的活性（生物活性）を有するホモログを作ることができる。
【０１１１】
ある与えられたＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドの模擬体を用いることは、タンパク質自体よりもむしろ好都合でありうる。概して、ペプチド模擬体は、タンパク質およびペプチドよりも生物学的利用能があり、長い作用期間を有し、そして製造するのにより安価でありうる。
【０１１２】
したがって、上記のＮＴＰタンパク質およびＮＴＰペプチドは、類似の生物学的活性を有し、したがって類似の治療的有用性を有するこのような低分子化合物の開発に有用である。ＮＴＰタンパク質およびＮＴＰペプチドのペプチド模擬体は、組合せ化学技術および当該技術分野において知られている他の技術を用いて開発することができる（例えば、Proceedings of the 20th European Peptide Symposium, ed. G.Jung, E.Bayer, pp.289-336 およびその参考文献を参照されたい）。
【０１１３】
当該技術分野において知られているペプチドを構造的に修飾してペプチド模擬体を生じる方法の例には、タンパク質分解への増加した安定性を、特にＮ末端において、活性に悪影響を与えることなくもたらしうるＤ−アミノ酸残基構造をもたらす主鎖キラル中心の反転が含まれる。一例は、"Tritriated D-ala1-Peptide T Binding," Smith C.S. et al., Drug Development Res., 15,pp.371-379(1988) という論文に記載されている。
【０１１４】
第二の方法は、Ｎ−Ｃ鎖間イミドおよびラクタムのような、安定性のために環状構造を変化させることである（Ede et al. in Smith and River (Eds.) "Peptides: Chemistry and Biology", Escom, Leiden (1991), pp.268-270）。これの例は、本明細書中にその開示がそのまま援用される米国特許第４，４５７，４８９号（１９８５年），Goldstein,G. et al. に開示されたものなどの、コンホメーションが制限されたチモペンチン様化合物において与えられている。
【０１１５】
第三の方法は、ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチド中のペプチド結合を、タンパク質分解に耐性を与えるプソイドペプチド結合によって置換することである。概して、ペプチドの構造および生物学的活性に影響を与えない多数のプソイドペプチド結合が記載されてきている。このアプローチの一つの例は、レトロインベルソプソイドペプチド結合を代用することである（本明細書中に援用される、"Biologically active retroinverso analogues of thymopentin", Sisto A. et al in River,J.E. and Marshall,G.R.(eds) "Peptides, Chemistry, Structure and Biology", Escom, Leiden (1990), pp.722-773） and Dalpozzo, et al. (1993), Int.J.Peptide Protein Res., 41:561-566）。この修飾によれば、これらペプチドのアミノ酸配列は、一つまたはそれを超えるペプチド結合がレトロインベルソプソイドペプチド結合によって置き換えられていることを除いて、上記のＮＴＰタンパク質およびＮＴＰペプチドの配列と一致しうる。好ましくは、最もＮ末端のペプチド結合が置換されるが、それは、このような置換が、Ｎ末端に作用するエキソペプチダーゼによるタンパク質分解に耐性を与えるからである。
【０１１６】
一つまたはそれを超える還元レトロインベルソプソイドペプチド結合を含むペプチドの合成は、当該技術分野において知られている（上に引用される Sisto (1990) および Dalpozzo, et al. (1993)）。したがって、ペプチド結合は、ペプチド模擬体が元のペプチドに類似した構造をとり、したがって生物学的活性を示すことを可能にする非ペプチド結合によって置き換えることができる。更に別の修飾を、アミノ酸の化学基を類似した構造の他の化学基で置き換えることによって行うこともできる。生物学的活性をほとんどまたは全く失うことなく酵素的切断への安定性を増加させることが知られているもう一つの適当なプソイドペプチド結合は、還元等配電子体プソイドペプチド結合である（本明細書中にそのまま援用される Couder, et al. (1993), Int.J.Peptide Protein Res., 41:181-184）。したがって、これらペプチドのアミノ酸配列は、一つまたはそれを超えるペプチド結合が等配電子体プソイドペプチド結合によって置き換えられていることを除いて、ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドの配列と一致しうる。好ましくは、最もＮ末端のペプチド結合が置換されるが、それは、このような置換が、Ｎ末端に作用するエキソペプチダーゼによるタンパク質分解に耐性を与えると考えられるからである。一つまたはそれを超える還元等配電子体プソイドペプチド結合を含むペプチドの合成は、当該技術分野において知られている（上に引用される Couder, et al. (1993)）。他の例には、ペプチド結合を置き換えるためのケトメチレン結合またはメチルスルフィド結合の導入が含まれる。
【０１１７】
ＮＴＰタンパク質およびＮＴＰペプチドのペプトイド誘導体は、生物学的活性に重要な構造決定基を保持しているがなお、ペプチド結合が除かれていることによってタンパク質分解への耐性を与えているペプチド模擬体のもう一つのクラスである（本明細書中にそのまま援用される Simon, et al., 1992, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 89:9367-9371）。ペプトイドは、Ｎ−置換グリシンのオリゴマーである。天然アミノ酸の側鎖に各々対応する多数のＮ−アルキル基が記載されてきている（上に引用され且つ本明細書中にそのまま援用される Simon, et al. (1992)）。ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドの若干のまたはすべてのアミノ酸は、置き換えられたアミノ酸に対応するＮ−置換グリシンで置き換えられる。
【０１１８】
ペプチド模擬体の開発は、元のＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドの三次構造を、ＮＭＲ分光分析、結晶学および／または計算機支援分子モデリングによって決定することにより助けられうる。これら技術は、元のペプチドより高い力価および／または大きい生物学的利用能および／または大きい安定性を有する新規な組成物の開発を助ける（いずれも本明細書中にそのまま援用される、Dean (1994), BioEssays, 16:683-687; Cohen and Shatzmiller (1993), J.Mol.Graph., 11:166-173; Wiley and Rich (1993), Med.Res.Rev., 13:327-384; Moore (1994), Trends Pharmacol.Sci., 15:124-129; Hruby (1993), Biopolymers, 33:1073-1082; Bugg et al. (1993), Sci.Am., 269:92-98）。
【０１１９】
可能性のあるペプチド模擬体化合物がいったん識別されると、それは、下の実施例に概説される方法を用いて合成し且つ検定して、その活性を評価することができる。ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドの生物学的活性および類似した三次元構造を有する、上の方法によって得られるペプチド模擬体化合物は、本発明によって包含される。ペプチド模擬体を、上記の一つまたはそれを超える修飾を有するいずれかのＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドから生じることができるということは、当業者に容易に明らかであろう。更に、本発明のペプチド模擬体を、治療的化合物としてのそれらの有用性に加えて、なお一層強力な非ペプチド化合物の開発に更に用いることができるということは明らかであろう。
【０１２０】
現在、本明細書中に記載の関連タンパク質、関連ペプチドおよびＮＴＰペプチドを合成することができる多数の組織が存在している。例えば、あるＮＴＰペプチドの配列が与えられると、その組織は、そのペプチドを合成し、そして合成されたペプチドを、そのペプチドの同一性の資料および証明書を添付して発送することができる。
【０１２１】
本発明は、更に、哺乳動物組織または体液試料中のＮＴＰペプチド、ＮＴＰペプチドＤＮＡまたは対応するＲＮＡの存在について、定性的にかまたは定量的に調べる検定のためのＮＴＰペプチドおよびそれらの該当する核酸分子の使用を包含する。ＮＴＰペプチドおよびそれらの対応する核酸分子は、ＮＴＰペプチドまたはコードされたＮＴＰペプチドが生物学的活性を示すにせよ示さないにせよ、このような検定における標品に用いることができる。ＮＴＰペプチド核酸配列は、哺乳動物組織または体液試料中のＮＴＰペプチドＤＮＡまたは対応するＲＮＡの存在について、定性的にかまたは定量的に調べるのに有用なハイブリダイゼーションプローブ源でありうる。
【０１２２】
それ自体は生物学的に活性でないＮＴＰペプチドは、ＮＴＰペプチドを認識するおよび／またはそれに結合する抗体を調製するのに有用でありうる。このような抗体は、標準法を用いて製造してもよい。したがって、ＮＴＰペプチドと反応する抗体、更には、このような抗体の短鎖抗体フラグメントおよび他の反応性フラグメントも、本発明の範囲内と考えられる。これら抗体は、多クローン性、単クローン性、リコンビナント、キメラ、一本鎖および／または二重特異性であってよい。典型的には、抗体またはそのフラグメントは、ヒト由来であるかまたは、ヒト化されている、すなわち、患者に投与された場合に、抗体への免疫反応を妨げるまたは最小限にするように調製されるであろう。好ましい抗体は、多クローン性かまたは単クローン性のヒト抗体である。抗体フラグメントは、Ｆab、Ｆab'等のような、本発明のＮＴＰペプチドと反応性であるいずれかのフラグメントであってよい。本発明によって更に提供されるのは、いずれかのＮＴＰペプチドを抗原として、ある選択された哺乳動物に提示後、その哺乳動物の細胞（例えば、脾臓細胞）とある種の癌細胞とを既知の技法によって融合して不死化細胞系を作ることによって生じるハイブリドーマである。ＮＴＰペプチドの全部または一部分に対して向けられるこのような細胞系および抗体を生じるのに用いられる方法も、本発明によって包含される。
【０１２３】
これら抗体は、更に、体液または細胞試料中のＮＴＰペプチドの存在を検出するための標識された形などで、in vivo および in vitro の診断または研究目的に用いてもよい。
本発明は、更に、哺乳動物組織または体液試料中のＮＴＰペプチド、ＮＴＰペプチドＤＮＡまたは対応するＲＮＡの存在について、定性的にかまたは定量的に調べる検定における検量線基準としての一つまたはそれを超えるＮＴＰペプチドの使用を包含する。
【０１２４】
本発明は、良性および悪性の腫瘍、腺（例えば、前立腺）過形成、望ましくない顔毛、いぼおよび望ましくない脂肪組織のような、細胞の除去を必要とする状態を処置する新規な方法に関する。このような方法は、要求がある哺乳動物に、治療的有効量のＮＴＰペプチドを投与することを含む。
【０１２５】
その状態は、例えば、肺、乳房、胃、膵臓、前立腺、膀胱、骨、卵巣、皮膚、腎、洞、結腸、腸管、胃、直腸、食道、血液、脳およびその被膜、脊髄およびその被膜、筋肉、結合組織、副腎、副甲状腺、甲状腺、子宮、精巣、下垂体、生殖器、肝、胆嚢、眼、耳、鼻、咽喉、扁桃、口、リンパ節およびリンパ系（リンパ組織）、および他の器官の腫瘍でありうる。
【０１２６】
本明細書中で用いられる「悪性腫瘍」という用語は、不十分に分化した、中程度に分化したおよび充分に分化した形で生じるすべての形のヒト癌、肉腫および黒色腫を包含する意味である。
【０１２７】
本発明は、外科手術の危険が少なく且つ望ましくない副作用もほとんどなく良性腫瘍を除去しうる処置への当該技術分野における要求を満たす。身体の深部（例えば、脳、心臓、肺およびその他）のような外科的に危険な部位の良性腫瘍を除去する方法は、特に要求される。
【０１２８】
細胞が除去されなくてはならない状態を処置する方法は、外科的切除、化学療法および放射線などの、このような状態を処置する慣用的な方法と共に用いることができる。ＮＴＰペプチドは、このような慣用的な処置の前に、際にまたは後に投与することができる。
【０１２９】
処置される状態は、肺、乳房、胃、膵臓、前立腺、膀胱、骨、卵巣、皮膚、腎、洞、結腸、腸管、胃、直腸、食道、血液、脳およびその被膜、脊髄およびその被膜、筋肉、結合組織、副腎、副甲状腺、甲状腺、子宮、精巣、下垂体、生殖器、肝、胆嚢、眼、耳、鼻、咽喉、扁桃、口、およびリンパ節およびリンパ系から成る群より選択される組織の過形成、肥大または過成長でもありうる。
【０１３０】
本発明の方法を用いて処置することができる他の状態には、肺、乳房、胃、膵臓、前立腺、膀胱、骨、卵巣、皮膚、腎、洞、結腸、腸管、胃、直腸、食道、血液、脳およびその被膜、脊髄およびその被膜、筋肉、結合組織、副腎、副甲状腺、甲状腺、子宮、精巣、下垂体、生殖器、肝、胆嚢、眼、耳、鼻、咽喉、扁桃、口、およびリンパ節およびリンパ系から成る群より選択される、ウイルス、細菌または寄生生物によって変化した組織が含まれるが、これに制限されるわけではない。
【０１３１】
処置される状態は、肺、乳房、胃、膵臓、前立腺、膀胱、骨、卵巣、皮膚、腎、洞、結腸、腸管、胃、直腸、食道、血液、脳およびその被膜、脊髄およびその被膜、筋肉、結合組織、副腎、副甲状腺、甲状腺、子宮、精巣、下垂体、生殖器、肝、胆嚢、眼、耳、鼻、咽喉、扁桃、口、およびリンパ節およびリンパ系から成る群より選択される組織の奇形または障害でもありうる。
【０１３２】
具体的には、処置される状態は、扁桃肥大、前立腺過形成、乾癬、湿疹、皮膚病または痔核でありうる。処置される状態は、アテローム性動脈硬化症または動脈硬化症などの血管疾患、または拡張蛇行静脈などの血管性疾患でありうる。処置される状態は、皮膚、眼、耳、鼻、咽喉、口、筋肉、結合組織、毛または乳房組織などの組織への美容修正でもありうる。
【０１３３】
ＮＴＰペプチドの治療的組成物は、本発明の範囲内である。このような組成物は、治療的有効量のＮＴＰペプチドを薬学的に許容しうる担体との混合物で含んでよい。この担体物質は、好ましくは、哺乳動物への投与用水剤に一般的な他の物質を補足された、注射用水であってよい。典型的には、治療的使用のためのＮＴＰペプチドは、一つまたはそれを超える生理学的に許容しうる担体、賦形剤または希釈剤と共に精製ＮＴＰペプチドを含む組成物の形で投与されるであろう。中性緩衝化生理食塩水または血清アルブミンと混合される生理食塩水は、代表的な適当な担体である。好ましくは、生成物は、適当な賦形剤（例えば、スクロース）を用いて凍結乾燥物として処方される。他の標準的な担体、希釈剤および賦形剤は、所望されるように含まれてよい。約７．０〜８．５のｐＨを有するトリス緩衝液または約４．０〜５．５のｐＨを有する酢酸緩衝液を含めた、適当な範囲のｐＨ値を有する当業者に知られている緩衝剤を含めた組成物は、ソルビトールまたはそれに代わる適当な代用品を更に包含してよい。
【０１３４】
望ましくない細胞要素に標的指向するための、抗体、抗体フラグメント、抗体様分子、または細胞レセプター、シグナルペプチドまたは過発現された酵素などの、特異的腫瘍マーカーに高親和性を有する分子に抱合されたまたは連結したまたは結合したＮＴＰペプチドの使用も、本発明の範囲内に包含される。この抗体、抗体フラグメント、抗体様分子、または特異的腫瘍マーカーに高親和性を有する分子は、特定の細胞または組織標的にＮＴＰペプチド抱合体を指向させるのに用いられる。例えば、特徴的な表面抗原または発現された抗原を有する腫瘍は、この抗体、抗体フラグメントまたは抗体様結合分子によって標的とされうるし、そして腫瘍細胞は、ＮＴＰペプチドによって死滅しうる。抗体ターゲッティングを用いたこのようなアプローチは、投薬量を減少させる、標的細胞に結合し且つそれに取り込まれる可能性を増加させる、および転移性腫瘍および微視的サイズの腫瘍に標的指向し且つそれを処置することへの増加した有用性という予想される利点を有する。
【０１３５】
本発明は、更に、腫瘍または他の望ましくない細胞の一つまたは複数の部位またはその付近における、腫瘍特異的または部位特異的酵素またはプロテアーゼによる、または腫瘍または他の望ましくない細胞を標的とする抗体抱合体による切断により、腫瘍または他の望ましくない細胞の一つまたは複数の部位またはその付近においてＮＴＰペプチドを放出する組成物を形成するための、タンパク質または他の分子に抱合されたまたは連結したまたは結合したＮＴＰペプチドの使用を包含する。
【０１３６】
本発明は、更に、処置される組織を、光線（レーザー治療または他の光力学的または光活性化治療の場合のような）；赤外線放射、紫外線放射、ｘ線またはγ線放射のような他の形の電磁放射；局所熱；αまたはβ線放射；超音波照射；または他の局所エネルギー源への暴露時に、ＮＴＰペプチドまたはＮＴＰペプチドの若干の生物学的に活性なフラグメントを放出する組成物を形成するための、タンパク質または他の分子に抱合されたまたは連結したまたは結合したＮＴＰペプチドの使用を包含する。
【０１３７】
これらＮＴＰペプチドは、処置されている適応症について適切に、単独で、互いに一緒に、またはサイトカイン、増殖因子、抗生物質、アポトーシス誘発剤、抗炎症薬および／または化学療法薬のような他の医薬組成物と組み合わせて用いることができる。
【０１３８】
本発明は、更に、デンドリマー、フラーレン、および他の合成分子、ポリマーおよび巨大分子を用いたＮＴＰペプチドの治療的組成物を包含するが、この場合、ＮＴＰペプチドおよび／またはその対応するＤＮＡ分子は、それだけでかまたは、腫瘍特異的マーカーのような他の種の分子と一緒に、その分子、ポリマーまたは巨大分子で抱合されている、それに付いているまたは中に封入されている。例えば、米国特許第５，７１４，１６６号、Bioactive and/or Targeted Dendimer Conjugates は、特に、一つまたは複数の標的指示物質を含む少なくとも一つのデンドリマーと、それに抱合された少なくとも一つの生物活性物質とを含んで成る樹状ポリマー抱合体を調製し且つ用いる方法を提供している。
【０１３９】
本発明は、更に、ＮＴＰペプチドおよび／または遺伝子と、脂質エマルジョン、ミセルポリマー、ポリマーミクロスフェア、電気活性ポリマー、ヒドロゲルおよびリポソームのようなドラッグデリバリービヒクルとの治療的組成物を包含する。
【０１４０】
望ましくない細胞に導入されるＮＴＰペプチドまたは関連遺伝子または遺伝子均等物の使用も、本発明の範囲に包含される。腫瘍内でのＮＴＰペプチドの過発現は、腫瘍中の細胞を死滅させ、それによって腫瘍細胞集団を減少させるのに用いることができる。望ましくない細胞要素を処置するためのＮＴＰペプチドの遺伝子または遺伝子均等物導入は、より少ない投薬量を必要とする、および標的とされる細胞要素が細胞子孫に継代され、それによって、より低い頻度の治療を必要とし、および治療の総計がより少ないという利点を有すると予想される。本発明は、更に、望ましくない細胞または隣接細胞への、ＮＴＰペプチドを含有する融合タンパク質をコードする遺伝子の導入を包含するが、この場合、遺伝子の発現および融合タンパク質の生産および／または分泌後、この融合タンパク質は、天然の酵素またはプロテアーゼによってかまたはプロドラッグによって切断されて、望ましくない細胞においてまたはその付近でＮＴＰペプチドを放出する。
【０１４１】
クローン化リコンビナントＮＴＰペプチド−抗体抱合体；クローン化リコンビナントＮＴＰペプチド−抗体フラグメント抱合体；およびクローン化リコンビナントＮＴＰペプチド−抗体様タンパク質抱合体の使用も、本発明の範囲に包含される。標的指向抱合体（抗体、抗体フラグメント、抗体様分子、または癌特異的レセプターまたは他の腫瘍マーカーに高親和性を有する分子）と組み合わされたクローン化ＮＴＰペプチドの利点は、このような分子が、クローン化抱合分子の製造および規格化生産の利点に加えて、上記の標的指向利点を兼備しているということである。
【０１４２】
経口投与用の固体剤形には、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤および顆粒剤が含まれるが、これに制限されるわけではない。このような固体剤形では、活性化合物は、好ましくは、次の、（ａ）クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムなどの一つまたはそれを超える不活性賦形剤（または担体）；（ｂ）デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよびケイ酸などの充填剤または増量剤；（ｃ）カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよびアラビアゴムなどの結合剤；（ｄ）グリセロールなどの保湿剤；（ｅ）寒天、炭酸カルシウム、バレイショまたはタピオカデンプン、アルギン酸、一定の錯ケイ酸塩および炭酸ナトリウムなどの崩壊剤；（ｆ）パラフィンなどの溶液抑制剤（solution retarders）；（ｇ）第四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤；（ｈ）アセチルアルコールおよびグリセリンモノステアラートなどの湿潤剤；（ｉ）カオリンおよびベントナイトなどの吸着剤；および（ｊ）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムまたはそれらの混合物などの滑沢剤、の内少なくとも一つと混合される。カプセル剤、錠剤および丸剤について、その剤形は、緩衝剤を含んでいてもよい。
【０１４３】
経口投与用の液状剤形には、薬学的に許容しうる乳剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤およびエリキシル剤が含まれる。活性化合物に加えて、これら液状剤形は、水または他の溶媒などの当該技術分野において一般的に用いられる不活性希釈剤、可溶化剤および乳化剤を含んでいてよい。代表的な乳化剤は、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、綿実油、ラッカセイ油（groundnut oil）、トウモロコシ胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油などの油剤、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ソルビタンの脂肪酸エステル、またはこれら物質の混合物等である。
【０１４４】
このような不活性希釈剤の他に、この組成物には、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味剤、着香剤および芳香剤のようなアジュバントも含まれうる。
本発明の組成物中の活性成分の実際投薬量レベルは、具体的な組成物および投与方法について望まれる治療的応答を得るのに有効である一定量のＮＴＰペプチドを得るように変更されてよい。したがって、選択される投薬量レベルは、所望の治療的作用、投与経路、所望の処置期間および他の因子に依存するであろう。
【０１４５】
ヒトを含めた哺乳動物について、体表面積を基準として有効量を投与することができる。いろいろなサイズ、種およびヒトの動物用投薬量の相互関係（ｍｇ／Ｍ2体表面に基づく）は、E.J.Freireich et al., Cancer Chemother.Rep., 50(4):219(1966) によって記載されている。体表面積は、個体の身長と体重からほぼ決定することができる（例えば、Scientific Tables, Geigy Pharmaceuticals, Ardsley, N.Y. pp.537-538(1970) を参照されたい）。
【０１４６】
宿主に投与されるＮＴＰペプチドの１日用量の総量は、単回または分割用量であってよい。投薬量単位組成物は、１日用量を調製するのに用いることができるような、その約数のような量を含有してよい。しかしながら、いずれかの具体的な患者に特定の用量レベルは、体重、全身の健康状態、性別、食事、投与時間および経路、投与される薬物の力価、吸収および排泄の速度、他の薬物との組合せ、および処置されている具体的な疾患の重症度を含めたいろいろな因子に依存するということは理解されるであろう。
【０１４７】
本発明によるＮＴＰペプチド組成物を投与する方法には、これら化合物を、筋肉内、経口、静脈内、腹腔内、大脳内（実質内）、脳室内、腫瘍内、病巣内、皮内、脊髄内、鼻腔内、眼内、動脈内、局所、経皮、エアゾル剤、注入、ボーラス注射、植込装置、徐放性システム等によって投与することが含まれるが、これに制限されるわけではない。
【０１４８】
本発明のＮＴＰペプチドを投与するもう一つの方法は、経皮または皮膚を通した経路による。このような態様の一つの例は、貼付剤の使用である。具体的には、貼付剤は、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中またはＤＭＳＯと綿実油の混合物中のＮＴＰペプチドの微細懸濁液で調製し、腫瘍を有する哺乳動物の皮膚ポケット（pouch）内部の腫瘍部位から離れた皮膚と接触させることができる。他の基剤またはそれらと他の溶媒および固体支持体との混合物も、均等に作用すると考えられる。この貼付剤は、ＮＴＰペプチド化合物を溶液または懸濁液の形で含有しうる。次に、貼付剤を患者の皮膚に、例えば、縫合、クリップまたは他の保持装置によって皮膚を合わせて折り重ね且つ保持することによって形成される患者の皮膚ポケット中にそれを挿入することによって適用することができる。このポケットは、皮膚との連続接触が、この哺乳動物に妨害されることなく確保されるような方法で用いられるべきである。皮膚ポケットを用いることの他に、皮膚と接触している貼付剤の確定した位置を確保するいずれの装置も用いることができる。例えば、接着ガーゼ包帯を用いて、皮膚上の適所に貼付剤を保持しうると考えられる。
【０１４９】
ＮＴＰペプチドは、徐放性処方物または調製物で投与してもよい。徐放性調製物の適当な例には、造形品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形の、半透過性ポリマーマトリックスが含まれる。徐放性マトリックスには、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（Ｕ．Ｓ．３，７７３，９１９号、ＥＰ５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Sidman et al, Biopolymers, 22:547-556[1983]）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Langer et al., J.Biomed.Mater.Res., 15:167-277[1981] および Langer, Chem.Tech., 12:98-105[1982]）、エチレン酢酸ビニル（Langer et al., 上記）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８号）が含まれる。徐放性組成物には、リポソームも含まれうるが、これは、当該技術分野において知られているいくつかの方法のいずれかによって製造することができる（例えば、Eppstein et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 82:3688-3692[1985]; ＥＰ３６，６７６号；ＥＰ８８，０４６号；およびＥＰ１４３，９４９号）。
【０１５０】
本発明のＮＴＰペプチドを投与するもう一つの方法は、処置される腫瘍または他の組織中へのＮＴＰペプチドの直接的または間接的注入による。このような態様の一つの例は、処置される腫瘍または他の組織中へのＮＴＰペプチドの直接的注射である。この処置は、処置される腫瘍または他の組織の退行または破壊を、バイオプシー、画像化、または組織増殖を監視する他の方法によって監視することを伴う、単回注射、一時に多数回の注射、または何時間か、何日間かまたは何ヶ月間かにわたる一連の注射から成ってよい。処置される腫瘍または他の組織中への注射は、鼻、口、耳、膣、直腸または尿道などの開口部中に挿入される装置によってよいし、または in vivo の腫瘍または組織に達するために切開によってよく、しかも１回または複数の注射に適当な部位を決定するために、超音波または光ファイバースコープなどの画像化または光学システムと共に行ってもよい。このような態様のもう一つの例は、組織へのＮＴＰペプチドの一定注入を経時的に行うことができる装置の使用である。
【０１５１】
本発明のＮＴＰペプチドを投与するもう一つの方法は、除去されるまたは破壊されることが必要なまたは望まれる腫瘍または他の組織または細胞要素を物理的に切除する、剥離する、またはそれ以外には死滅させるまたは破壊するのに用いられる外科的または類似の方法と連結しているが、この場合、本発明のＮＴＰペプチドは、この方法によって除去されないまたは破壊されないいずれかの腫瘍細胞または他の細胞要素を破壊するまたはその成長を遅らせるために、腫瘍または他の組織が除去された一つまたは複数の部位を取り囲む一つまたは複数の隣接部位に投与される。
【０１５２】
本発明のＮＴＰペプチドを投与するもう一つの方法は、処置される腫瘍または他の組織内への装置の植込による。このような態様の一つの例は、処置される腫瘍または他の組織中への、ＮＴＰペプチドを含有するウェファーの植込である。このウェファーは、治療的用量のＮＴＰペプチドを組織中に経時的に放出する。或いは、または更に、この組成物は、ＮＴＰペプチドが吸収された膜、スポンジまたは他の適当な材料の患部中への植込によって局所的に投与することができる。植込装置が用いられる場合、この装置は、いずれかの適当な組織または器官中に植込むことができ、そしてＮＴＰペプチドの供給は、この装置を介して直接的に、ボーラスによってよいし、または連続投与によってよいし、または連続注入を用いてカテーテルによってよい。
【０１５３】
代わりの投与方法は、ＮＴＰペプチド−エンコーディング遺伝子の一つまたはそれを超えるコピーを、標的にされている細胞に導入することであり、そして、必要ならば、その遺伝子の一つまたは複数のコピーに、ＮＴＰペプチドを細胞内生産することを開始させることである。遺伝子治療を適用することができる一つの方式は、構成性または誘導性プロモーターに機能的に連結されて遺伝子治療ＤＮＡコンストラクトを形成することができるＮＴＰペプチド−エンコーディング遺伝子（ＮＴＰペプチド（またはそのフラグメント、変異体、ホモログまたは誘導体）をコードしているゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび／または合成ＤＮＡ）を使用することである。このプロモーターは、内因性ＮＴＰペプチドエンコーディング遺伝子に相同であってよいしまたは異種であってよいが、但し、それは、このコンストラクトが挿入される細胞または組織タイプにおいて活性であるという条件付きである。この遺伝子治療ＤＮＡコンストラクトの他の成分には、必要に応じて、部位特異的組込み用に設計されるＤＮＡ分子（例えば、相同的組換えに有用な内因性フランキング配列）、組織特異的プロモーター、一つまたは複数のエンハンサーまたはサイレンサー、親細胞にまさる選択的利点を与えることができるＤＮＡ分子、形質転換された細胞を識別する標識として有用なＤＮＡ分子、負の選択システム、細胞特異的結合剤（例えば、細胞ターゲッティングの場合のような）、細胞特異的インターナリゼーション因子、およびベクターによる発現を促す転写因子並びにベクター製造を可能にする因子が含まれてもよい。
【０１５４】
細胞または組織への in vivo または ex vivo 遺伝子供給手段には、本明細書中にそれら開示がそのまま援用される米国特許第４，９７０，１５４号、ＷＯ９６／４０９５８号、米国特許第５，６７９，５５９号、米国特許第５，６７６，９５４号および米国特許第５，５９３，８７５号に開示されたような、裸のＤＮＡの直接的注射、弾道法（ballistic method）、リポソーム媒介導入、レセプター媒介導入（リガンド−ＤＮＡ複合体）、エレクトロポレーションおよびリン酸カルシウム沈降が含まれる（が、これに制限されるわけではない）。それらには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ポックスウイルス、レンチウイルス、パピローマウイルスまたは単純ヘルペスウイルスなどのウイルスベクターの使用、ＤＮＡ−タンパク質複合体の使用、およびリポソームの使用も含まれる。遺伝子治療ベクターの使用は、例えば、本明細書中にそれら開示がそのまま援用される米国特許第５，６７２，３４４号、米国特許第５，３９９，３４６号、米国特許第５，６３１，２３６号および米国特許第５，６３５，３９９号に記載されている。
【０１５５】
ＮＴＰペプチド−エンコーディング遺伝子は、ex vivo で遺伝子操作された若干の細胞を、本明細書中に記載されたような方法を用いて患者に植込むことによって供給されて、ＮＴＰペプチドまたはそのフラグメント、変異体、ホモログまたは誘導体を発現し且つ分泌することができる。このような細胞は、動物またはヒトの細胞であってよく、患者自身の組織に由来してよいしまたはヒトかまたは非ヒトの別の源に由来してよい。場合により、これら細胞は、不死化されていてよいしまたは幹細胞であってよい。しかしながら、免疫学的応答の機会を減少させるためには、これら細胞を、周囲組織の浸潤を免れるようにカプセル封入するのが好適である。カプセル封入材料は、典型的には、生体適合性の半透過性ポリマー囲いまたは膜であって、一つまたは複数のタンパク質産物を放出させるが、患者の免疫系によるまたは周囲組織からの他の有害な因子による細胞の破壊を妨げるものである。細胞の膜カプセル封入に用いられる方法は、当業者に公知であり、カプセル封入された細胞の調製および患者へのそれらの植込は、過度に実験することなく行うことができる。例えば、本明細書中にそれら開示がそのまま援用される米国特許第４，８９２，５３８号；同第５，０１１，４７２号；および同第５，１０６，６２７号を参照されたい。生きている細胞をカプセル封入するシステムは、ＰＣＴ  ＷＯ９１／１０４２５号に記載されている。リポソーム担体、生物侵食性（bio-erodible）粒子またはビーズのようないろいろな他の徐放または制御供給手段を製剤化する技術も、当業者に知られており、例えば、本明細書中にその開示がそのまま援用される米国特許第５，６５３，９７５号に記載されている。これら細胞は、カプセル封入されていようといまいと、患者の適当な体組織または器官中に植込むことができる。
【０１５６】
次の実施例は、本発明を詳しく説明するために与えられる。しかしながら、本発明が、これら実施例に記載の具体的な条件または詳細に制限されないということは理解されるはずである。本明細書を通して、米国特許を含めた公的に入手可能な論文へのいずれかのおよびすべての参考文献は、具体的に援用される。
【０１５７】
詳しくは、本発明は、特に、ＡＤ７ｃ−ＮＴＰタンパク質全体が、in vitro の神経膠腫および神経芽細胞腫の細胞培養物において、そして、in vivo の正常齧歯類動物の筋組織、皮下結合組織および皮膚、および乳癌、皮膚癌および乳頭腫、結腸癌、脳神経膠腫、および齧歯類動物モデルにおけるその他を含めた種々の異なったヒトおよび非ヒト由来腫瘍においても、細胞死を引き起こすのに有効な物質であるということを示している係属米国特許出願第１０／０９２，９３４号、Methods of Treating Tumors and Related Conditions Using Neural Thread Proteins に含まれる実施例を援用する。更に、本発明は、特に、ＮＴＰペプチドが、in vivo の正常齧歯類動物の筋組織、皮下結合組織、皮膚および他の組織において細胞死を引き起こすのに有効な物質であるということを示している米国特許出願第１０／１５３３３４号に含まれる実施例を援用する。
【実施例】
【０１５８】
実施例１
この実施例の目的は、注射部位における組織へのＮＴＰペプチド＃７の作用を決定することであった。
【０１５９】
４匹の正常ラットの、皮膚および皮下においては各４か所の異なった箇所、および四肢骨格筋においては各２か所の異なった箇所に、ステンレス鋼製２６ゲージ針によってプラスチックシリンジから供給される、１００〜４００ｍＬの量の食塩水中に０．１〜１ｍｇ／ｍＬの濃度のＮＴＰペプチド＃７を注射した。
【０１６０】
これら被験動物を２４時間観察し、そして２４時間目に無痛屠殺した。個々の浸潤箇所を切り取り、１０％ホルマリン中に固定し、パラフィン中に包埋し、そして標準的な組織病理学的方法によって染色し且つ調べた。
【０１６１】
対照には、生理食塩水だけを与えた。
結果：
ＮＴＰペプチド＃７の注射は、注射部位に組織壊死を生じた。この壊死は、ＮＴＰペプチド＃７が注射された部位の筋組織、皮下結合組織および皮膚において明白であった。この壊死は、注射面に相関し、注射部位より遠くへ広がっているようには見えなかった。
【０１６２】
軽症の炎症面は別として、対照は、壊死または細胞損失の形跡を示さなかった。これら対照は、筋変化を最小限にしかまたは全く示さなかった。対照注射では、注射部位における軽症〜最小限の急性炎症と、針による局所的な微量出血があった。
【０１６３】
実施例２
この実施例の目的は、注射部位における組織へのＮＴＰペプチド＃７の作用を決定することであった。
【０１６４】
４匹のラットをエーテルで麻酔し、そしてＮＴＰペプチド＃７を前立腺内注入によって与えた。これら注射は、ＰＢＳ  ｐＨ７．４中に１ｍｇ／ｍＬのＮＴＰペプチド＃７の３００μｌ（１．０ｍｇ／ｋｇ）から成った。対照には、ＰＢＳ単独の注射を与えたまたは注射しなかった。ラットを、７２時間後に無痛屠殺した。前立腺を切離し、１０％緩衝化ホルマリン中に２４時間固定し、パラフィン中に包埋し、切片にし、そしてＨ＆Ｅで染色した。各々の被験動物について、前立腺全体を包埋し、切片にした。染色された切片をすべて、組織学的に調べた。
【０１６５】
結果：
ＮＴＰペプチド＃７で処置されたラット前立腺は、注射部位において、腺上皮の損失、扁平化および萎縮を伴う組織壊死を示した。ＰＢＳ注射単独の対照と、無注射対照との間には、認められうる差がなかった。
【０１６６】
実施例３
この実施例の目的は、注射部位における組織へのＮＴＰペプチド＃１４の作用を決定することであった。
【０１６７】
ラットの皮膚および皮下に、ＮＴＰペプチド＃１４を注射したこと以外は上の実施例１の場合と同様に注射した。
これら被験動物を２４時間観察し、そして２４時間目に無痛屠殺した。組織を切り取り、１０％ホルマリン中に固定し、パラフィン中に包埋し、そして標準的な組織病理学的方法によって染色し且つ調べた。
【０１６８】
対照は、実施例１と同様であった。
結果：
ＮＴＰペプチド＃１４の注射は、注射部位において細胞死および組織壊死を生じた。上の実施例１と同様に、細胞死は、ＮＴＰペプチド＃１４が注射された部位の筋組織、皮下結合組織および皮膚に存在した。
【０１６９】
軽症の炎症面は別として、対照は、壊死または細胞損失の形跡を示さなかった。対照注射では、注射部位における軽症〜最小限の急性炎症と、時々、針による局所的な微量出血があった。
【０１７０】
実施例４
この実施例の目的は、注射部位における組織へのＮＴＰペプチド＃１７の作用を決定することであった。
【０１７１】
正常ラットの前立腺に、ＮＴＰペプチド＃１７を注射したこと以外は上の実施例２の場合と同様に注射した。ラットを７２時間後に無痛屠殺し、それらの前立腺を実施例２の場合と同様に調べた。
【０１７２】
結果：
上の実施例２の場合と同様に、ＮＴＰペプチド＃１７の注射は、７２時間目の前立腺に有意の細胞損失および萎縮を生じた。対照は、針による軽症の局所的な炎症から成る最小限の変化または変化不存在を示した。
【０１７３】
本発明は、特に好ましい態様および実施例に関して記載されている。当業者は、しかしながら、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、いろいろな修正を本発明に行うことができるということを理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１７４】
【図１】図１は、ＡＤ７ｃ−ＮＴＰ遺伝子およびその遺伝子のＡＤ７ｃ−ＮＴＰタンパク質産物（米国特許第５，８３０，６７０号、第５，９４８，６３４号および第５，９４８，８８８号による配列１２０および１２１；de la Monte et al., J.Clin.Invest., 100:3093-3104(1997)；ＮＣＢＩ Entrez-Protein Accession ＃ＡＡＣ０８７３７；ＰＩＤ  ｇ３００２５２７）の完全なアミノ酸配列および核酸配列を示す［配列番号１］。
【図２】図２は、１２２アミノ酸神経糸タンパク質（米国特許第５，８３０，６７０号、第５，９４８，６３４号および第５，９４８，８８８号による配列４０；ＮＣＢＩ Entrez-Protein Accession ＃ＡＡＥ２５４４７  ＰＩＤ  ｇ１００４８５４０）の完全なアミノ酸配列を示す［配列番号２］。
【図３】図３は、１１２アミノ酸神経糸タンパク質（ＮＣＢＩ Entrez-Protein Accession ＃ＸＰ ０３２３０７  ＰＩＤ  ｇ１５９２８９７１）の完全なアミノ酸配列を示す［配列番号３］。
【図４】図４は、１０６アミノ酸神経糸タンパク質様タンパク質（ＮＣＢＩ Entrez-Protein Accession ＃ＡＡＨ１４９５１  ＰＩＤ  ｇ１５９２８９７１）の完全なアミノ酸配列を示す［配列番号４］。
【図５】図５は、１０６アミノ酸神経糸タンパク質様タンパク質（ＮＣＢＩ Entrez-Protein Accession ＃ＸＰ ０３９１０２  ＰＩＤ  ｇ１８５９９３３９）の完全なアミノ酸配列を示す［配列番号５］。
【図６】図６は、９８アミノ酸神経糸タンパク質（米国特許第５，８３０，６７０号、第５，９４８，６３４号および第５，９４８，８８８号による配列３０；ＮＣＢＩ Entrez-Protein Accession ＃ＡＡＥ２５４４５，ＰＩＤ  ｇ１００４８５３８）の完全なアミノ酸配列を示す［配列番号６］。
【図７】図７は、７５アミノ酸神経糸タンパク質（米国特許第５，８３０，６７０号、第５，９４８，６３４号および第５，９４８，８８８号による配列４８；ＮＣＢＩ Entrez-Protein Accession ＃ＡＡＥ２５４４８，ＰＩＤ  ｇ１００４８５４１）の完全なアミノ酸配列を示す［配列番号７］。
【図８】図８は、６８アミノ酸神経糸タンパク質（米国特許第５，８３０，６７０号、第５，９４８，６３４号および第５，９４８，８８８号による配列３６；ＮＣＢＩ Entrez-Protein Accession ＃ＡＡＥ２５４４６，ＰＩＤ  ｇ１００４８５３９）の完全なアミノ酸配列を示す［配列番号８］。
【図９】図９は、６１アミノ酸神経糸タンパク質様タンパク質（ＮＣＢＩ Entrez-Protein Accession ＃ＡＡＨ０２５３４，ＰＩＤ  ｇ１２８０３４２１）の完全なアミノ酸配列を示す［配列番号９］。
【図１】
2005507647.tif 000006
【図２】
2005507647.tif 000007
【図３】
2005507647.tif 000008
【図４】
2005507647.tif 000009
【図５】
2005507647.tif 000010
【図６】
2005507647.tif 000011
【図７】
2005507647.tif 000012
【図８】
2005507647.tif 000013
【図９】
2005507647.tif 000014
【国際公開パンフレット】
2005507647.tif 000015
2005507647.tif 000016
2005507647.tif 000017
2005507647.tif 000018
2005507647.tif 000019
2005507647.tif 000020
2005507647.tif 000021
2005507647.tif 000022
2005507647.tif 000023
2005507647.tif 000024
2005507647.tif 000025
2005507647.tif 000026
2005507647.tif 000027
2005507647.tif 000028
2005507647.tif 000029
2005507647.tif 000030
2005507647.tif 000031
2005507647.tif 000032
2005507647.tif 000033
2005507647.tif 000034
2005507647.tif 000035
2005507647.tif 000036
2005507647.tif 000037
2005507647.tif 000038
2005507647.tif 000039
2005507647.tif 000040
2005507647.tif 000041
2005507647.tif 000042
2005507647.tif 000043
2005507647.tif 000044
2005507647.tif 000045
2005507647.tif 000046
2005507647.tif 000047
2005507647.tif 000048
2005507647.tif 000049
2005507647.tif 000050
2005507647.tif 000051
2005507647.tif 000052
2005507647.tif 000053
2005507647.tif 000054
2005507647.tif 000055
2005507647.tif 000056
2005507647.tif 000057
2005507647.tif 000058
2005507647.tif 000059
2005507647.tif 000060
2005507647.tif 000061
2005507647.tif 000062
2005507647.tif 000063
2005507647.tif 000064
2005507647.tif 000065
2005507647.tif 000066
2005507647.tif 000067
2005507647.tif 000068
2005507647.tif 000069
2005507647.tif 000070
2005507647.tif 000071
2005507647.tif 000072
2005507647.tif 000073
2005507647.tif 000074
2005507647.tif 000075
2005507647.tif 000076
2005507647.tif 000077
2005507647.tif 000078
2005507647.tif 000079
2005507647.tif 000080
2005507647.tif 000081
2005507647.tif 000082
2005507647.tif 000083
2005507647.tif 000084
2005507647.tif 000085
2005507647.tif 000086
2005507647.tif 000087
2005507647.tif 000088
2005507647.tif 000089
2005507647.tif 000090
2005507647.tif 000091
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005507647.tif 000092
2005507647.tif 000093
【国際調査報告】
2005507647.tif 000094
2005507647.tif 000095
2005507647.tif 000096
2005507647.tif 000097
2005507647.tif 000098
2005507647.tif 000099
2005507647.tif 000100
2005507647.tif 000101