(57)【要約】豚繁殖呼吸器障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）  は豚において深刻な経済的損失を引き起こしている。本願発明は、ＰＲＲＳウイルス感染に対して感受性のない細胞系（ＢＨＫ−２１）に該細胞系列に感受性を与えるＣＤ１５１  をトランスフェクトさせることにより、ＣＤ１５１  がＰＲＲＳウイルス感染に対する感受性ファクターであることを決定する事にある。ＣＤ１５１  は、血液血小板および生殖細胞質を含む細胞物質から採取できるため、本願発明は、ＰＲＲＳウイルスに対する感受性に関して種々の異種の豚をスクリーニングする非侵襲法を提供し、よって育種プランを改良することにある。価値のある動物の場合には、そうしたスクリーニングから得られる結果は、その動物の子孫どれもがＰＲＲＳウイルスに対する感受性を示し得る。加えて、ウイルスＲＮＡ  とＣＤ１５１  の相互作用は高い親和性を持ち、コンビナトリアル・ケミストリーを用いることにより更に改良され得る抗ウイルス化合物を検出する１つの道具として用いられ得る。したがって、ウイルスＲＮＡ  とＣＤ１５１  との相互作用をブロックすることができる抗ウイルス化合物が開発され得る。有利なことには、ＣＤ１５１  をトランスフェクされた非サルウイルス細胞系列は、ＰＲＲＳウイルスに対する感受性を獲得することができる。そして、豚からの異種移植（ｘｅｎｏｐｌａｎｔｅｄ）  を受けた器官においては霊長類ウイルスの起源となり得るため避けられるサルウイルス細胞系列に対して、これら非サルの組替型細胞系列は、生物学的製剤（ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）  を製造するために使用され得る。最後に、本願発明はウイルスＲＮＡ  が標的細胞の中に入る基本的メカニズムを記述する。この新規クラスの蛋白質は、ウイルスＲＮＡ  エントリー蛋白質と命名されている。そして、抗ＲＮＡ  エントリー蛋白質と命名された新規な種類の化合物はウイルスＲＮＡ  の侵入をブロックするために使うことができ、それによってウイルス感染を防ぐのである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一匹の動物におけるＰＲＲＳウイルス感染への感受性を確かめる（ａｓｃｅｒｔａｉｎｉｎｇ）方法であって、
該動物から既知の起源を有する細胞物質（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｅｒｉａｌ）  サンプルを得るステップ、
該サンプル上でＣＤ１５１  アッセイを実施するステップ、および
該アッセイの結果を使って、該動物の感受性を測定するステップ、
の各ステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
細胞物質が、精液、血液、生殖細胞質（ｇｅｒｍｐｌａｓｍ）  、卵子および精子細胞から成るグループから選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
アッセイステップが該サンプルからＲＮＡ  を抽出するステップを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
抽出されたＲＮＡ  についてＲＴ−ＰＣＲを実施するステップを更に含む事を特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
アッセイステップが、検出されたＣＤ１５１  の量を定量するステップを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
ＣＤ１５１  の定量された量を、該細胞物質サンプルに対する既知の標準（ｓｔａｎｄａｒｄ）と比較するステップを更に含む事を特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
既知の標準が，  動物の平均感受性（ｔｈｅ  ａｖｅｒａｇｅ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）を表すことを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
既知の標準が、サンプルとしての同一起源を有する細胞物質サンプル由来のＣＤ１５１  につき数多くの定量されたＣＤ１５１  量の平均をとることにより決定されるものであることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項９】
一匹の動物のＰＲＲＳウイルス感染に対する感受性を  ＰＲＲＳ  ウイルス感染に対する感受性の既知の標準と比較する方法であって、
該既知の標準は、既知の起源を有する細胞物質のＣＤ  １５１量と相互に関連をもち、かつ、
該動物由来の既知の起源を有する細胞物質のサンプルを得るステップ、
該動物におけるＣＤ１５１  量を決定するための該サンプルを解析する（ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ｓａｉｄ  ｓａｍｐｌｅ）  ステップ、および
該サンプル由来の該決定されたＣＤ１５１  量を該既知の標準と同じＣＤ１５１  量    と比較するステップ、
の各ステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
既知の標準がサンプルとして同一の起源由来であることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
解析ステップが、サンプル由来のＲＮＡ  を抽出するステップを含むことを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１２】
抽出ＲＮＡ  につきＲＴ−ＰＣＲ（  逆転写酵素−ＰＣＲ）  を実施するステップを更に含むことを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
解析ステップが、既知の標準が決定されたＣＤ１５１  の量を定量するステップを含むことを特徴とする、請求項９記載の方法。
【請求項１４】
サンプルが、精液、卵子、血液、生殖細胞質（ｇｅｒｍｐｌａｓｍ）  、および精子細胞から成るグループから選択される細胞物質サンプルを含むことを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１５】
一匹の動物がＰＲＲＳウイルス感染に対して抵抗性があるかどうかを決定する方法であって、
該動物由来の細胞物質のサンプルを得るステップ、
該サンプルにおけるＣＤ１５１  の存在を確認するためのアッセイを実施するためのステップ、および、
該動物が、該サンプルにおいてＣＤ１５１  が存在する場合もしくは存在しない場合に、ＰＲＲＳウイルス感染にたいして抵抗性があるかどうかを決定するステップ、
の各ステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
サンプルが、既知の起源を有することを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
サンプルが、精液、卵子、血液、生殖細胞質、および精子細胞から成るグループから選択されることを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
一匹の動物におけるＰＲＲＳウイルス感染に対する抵抗性を分類する（ｃｌａｓｓｉｆｙ）方法であって、
該動物由来の既知の起源を有する細胞物質のサンプルを得るステップ、
該サンプルにおけるＣＤ１５１  の量を知るために該サンプルにつきアッセイを実施するステップ、
該サンプルの該ＣＤ１５１  量をＣＤ１５１  の既知のスケール（ｓｃａｌｅ）  と比較するステップであって、
該既知のスケールがＰＲＲＳウイルス感染に対する抵抗性の一定の程度（ｄｅｇｒｅｅ）に対応することを特徴とするステップ、および、
該スケールとの該比較に基づいて該動物のＰＲＲＳウイルス感染に対する抵抗性を分類するステップ、
の各ステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１９】
分類の結果として、動物のＰＲＲＳウイルス感染に対する抵抗性を、百分率でランク付けすることを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
サンプルが、血液、精液、卵子、生殖細胞質、および精子細胞から成るグループから選択されることを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
既知のスケールが、サンプルとしての同一起源を有する細胞物質に対する１つのスケールであることを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
既知のスケールが、サンプルの起源に依存して異なることを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２３】
アッセイステップがサンプルからＲＮＡ  を抽出するステップを含むことを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２４】
抽出されたＲＮＡ  につき、ＲＴ−ＰＣＲを実施するステップを更に含むことを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
細胞物質のサンプル中にＣＤ１５１  を検出する方法であって、
該動物からＲＮＡ  を抽出するステップ、
該抽出されたＲＮＡ  につき逆転写酵素ＰＣＲ  を実施するステップ、および、
ＣＤ１５１  が存在するかどうかについての該逆転写酵素ＰＣＲ  の結果を解析するステップ、
の各ステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項２６】
ＣＤ１５１  の量を定量するステップを更に含むことを特徴とする請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
サンプルが既知の起源を有することを特徴とする請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
サンプルが、精液、卵子、血液、生殖細胞質および精子細胞から成るグループから選択されることを特徴とする請求項２５記載の方法。
【請求項２９】
ＰＲＲＳウイルスのワクチン材料（ｓｔｏｃｋ）  を製造する方法であって、
該細胞系列をＣＤ１５１  によって形質転換するステップ、
該細胞系列にＰＲＲＳウイルスを感染させるステップ、および、
該細胞系列に、該ワクチンストック中で使用されるＰＲＲＳウイルスの子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）  を生成させるステップ、
の各ステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項３０】
細胞系列が、非サルウイルス起源を有することを特徴とする請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
細胞系列が、ＣＤ１５１  による形質転換に先立ってＰＲＲＳウイルス感染に対して非感受性であることを特徴とする請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
形質転換ステップが、ＣＤ１５１  のＤＮＡ  塩基配列を含むプラスミドによる安定なトランスフェクションを含むことを特徴とする請求項２９記載の方法。
【請求項３３】
ＣＤ１５１  塩基配列が  ＳＥＱ  ＩＤ    Ｎｏ．１  （塩基配列リストの配列番号１の配列）  と少なくとも約９１％の配列相同性を有することを特徴とする請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
ＣＤ１５１  塩基配列が  ＳＥＱ  ＩＤ    Ｎｏ．１  と少なくとも約９５％の配列相同性を有することを特徴とする請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
ＣＤ１５１  塩基配列がＳＥＱ  ＩＤ    Ｎｏ．１と少なくとも約９８％の配列相同性を有することを特徴とする請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
ＣＤ１５１  塩基配列が非サルウイルス起源を有することを特徴とする請求項２９記載の方法。
【請求項３７】
ＣＤ１５１  塩基配列が豚起源を有することを特徴とする請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
ＣＤ１５１  塩基配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４  と少なくとも８４％の配列相同性を有することを特徴とする請求項３２記載の方法。
【請求項３９】
ＣＤ１５１  塩基配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４  と少なくとも９０％の配列相同性を有することを特徴とする請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
ＣＤ１５１  塩基配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４  と少なくとも９５％の配列相同性を有することを特徴とする請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
ＣＤ１５１  塩基配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４  と少なくとも９８％の配列相同性を有することを特徴とする請求項３４記載の方法。
【請求項４２】
形質転換された細胞系列のワクチン材料（ｖａｃｃｉｎｅ  ｓｔｏｃｋ）  が、形質転換する前に前もって得ることができる力価（ｔｉｔｅｒ）  よりも、高い力価を有することを特徴とする請求項２９記載の方法。
【請求項４３】
形質転換された細胞系列（ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）  の力価が、形質転換する前に可能であった力価の少なくとも約１００倍高率であることを特徴とする請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
細胞系列が、形質転換前にＣＤ１５１  をコードしたＤＮＡ  を含まないことを特徴とするＣＤ１５１  をコードするＤＮＡ  を含む、形質転換された細胞系列。
【請求項４５】
細胞系列が、非サルウイルス起源を有することを特徴とする請求項４４記載の形質転換された細胞系列。
【請求項４６】
ＣＤ１５１  をコードするＤＮＡ  が、非サルウイルス起源を有することを特徴とする請求項４４記載の形質転換された細胞系列。
【請求項４７】
ＣＤ１５１  をコードするＤＮＡ  が、豚起源を有することを特徴とする請求項４６記載の形質転換された細胞系列。
【請求項４８】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１と少なくとも約９１％の配列相同性を有する単離された（ｉｓｌａｔｅｄ）  ＤＮＡ  塩基配列。
【請求項４９】
塩基配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１と少なくとも約９５％の配列相同性を有することを特徴とする請求項４８記載のＤＮＡ  塩基配列。
【請求項５０】
塩基配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１と少なくとも約９８％の配列相同性を有することを特徴とする請求項４９記載のＤＮＡ  塩基配列。
【請求項５１】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１と少なくとも約９１％の配列相同性を有するＤＮＡ  塩基配列を含むプラスミド。
【請求項５２】
プラスミドが、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１と少なくとも約９５％の配列相同性を有するＤＮＡ  塩基配列を含むことを特徴とする請求項５１記載のプラスミド。
【請求項５３】
プラスミドが、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１と少なくとも約９８％の配列相同性を有するＤＮＡ  塩基配列を含むことを特徴とする請求項５２記載のプラスミド。
【請求項５４】
Ｇｅｎｂａｎｋ  の受託番号（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ）ＡＦ２７５６６６を有するプラスミド。
【請求項５５】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４  と少なくとも８４％の配列相同性を有するＤＮＡ  塩基配列を含むプラスミド。
【請求項５６】
プラスミドが、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４  と少なくとも９０％の配列相同性を有するＤＮＡ  塩基配列を含むことを特徴とする請求項５５記載のプラスミド。
【請求項５７】
プラスミドが、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４  と少なくとも９５％の配列相同性を有するＤＮＡ  塩基配列を含むことを特徴とする請求項５６記載のプラスミド。
【請求項５８】
プラスミドが、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４  と少なくとも９８％の配列相同性を有するＤＮＡ  塩基配列を含むことを特徴とする請求項５７記載のプラスミド。
【請求項５９】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１と少なくとも約９１％の配列相同性を有するＤＮＡ  塩基配列を含むベクター。
【請求項６０】
ベクターが、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１と少なくとも約９５％の配列相同性を有するＤＮＡ  塩基配列を含むことを特徴とする請求項５９記載のベクター。
【請求項６１】
ベクターが、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１と少なくとも約９８％の配列相同性を有するＤＮＡ  塩基配列を含むことを特徴とする請求項６０記載のベクター。
【請求項６２】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４  と少なくとも８４％の配列相同性を有するＤＮＡ  塩基配列を含むベクター。
【請求項６３】
ベクターが、ＳＥＱ    ＩＤ    Ｎｏ．１４  と少なくとも９０％の配列相同性を有するＤＮＡ  塩基配列を含むことを特徴とする請求項６２記載のベクター。
【請求項６４】
ベクターが、ＳＥＱ    ＩＤ    Ｎｏ．１４  と少なくとも９５％の配列相同性を有するＤＮＡ  塩基配列を含むことを特徴とする請求項６３記載のベクター。
【請求項６５】
ベクターが、ＳＥＱ    ＩＤ    Ｎｏ．１４  と少なくとも９８％の配列相同性を有するＤＮＡ  塩基配列を含むことを特徴とする請求項６４記載のベクター。
【請求項６６】
ＣＤ１５１  をコードする塩基配列を含むプラスミドを用いて、細胞系列を形質転換するステップを含む、ＰＲＲＳウイルス感染に対する感受性を細胞系列に与える方法。
【請求項６７】
細胞系列が、形質転換ステップの前にＰＲＲＳウイルス感染に対して非感受性である（感染しづらい）ことを特徴とする請求項６６記載の方法。
【請求項６８】
細胞系列が非サルウイルス起源であることを特徴とする請求項６６記載の方法。
【請求項６９】
細胞系列が豚起源であることを特徴とする請求項６８記載の方法。
【請求項７０】
プラスミドが、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１と少なくとも約９１％の配列相同性を有するＤＮＡ  塩基配列を含むことを特徴とする請求項６６記載の方法。
【請求項７１】
プラスミドが、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１と少なくとも約９５％の配列相同性を有するＤＮＡ  塩基配列を含むことを特徴とする請求項７０記載の方法。
【請求項７２】
プラスミドが、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１と少なくとも約９５％の配列相同性を有するＤＮＡ  塩基配列を含むことを特徴とする請求項７１記載の方法。
【請求項７３】
プラスミドが、Ｇｅｎｂａｎｋ  アクセッション番号  ＡＦ２７５６６６  を有するＤＮＡ  塩基配列を含むことを特徴とする請求項６６記載の方法。
【請求項７４】
プラスミドが、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４  と少なくとも８４％の配列相同性を有するＤＮＡ  塩基配列を含むことを特徴とする請求項６６記載の方法。
【請求項７５】
プラスミドが、ＳＥＱ    ＩＤ    Ｎｏ．１４  と少なくとも９０％の配列相同性を有するＤＮＡ  塩基配列を含むことを特徴とする請求項７４記載の方法。
【請求項７６】
プラスミドが、ＳＥＱ    ＩＤ    Ｎｏ．１４  と少なくとも９５％の配列相同性を有するＤＮＡ  塩基配列を含むことを特徴とする請求項７５記載の方法。
【請求項７７】
プラスミドが、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４  と少なくとも９８％の配列相同性を有するＤＮＡ  塩基配列を含むことを特徴とする請求項７６記載の方法。
【請求項７８】
育種用動物を選択する方法であって、
ＣＤ１５１  の量（ｌｅｖｅｌ）  を得るために、ＣＤ１５１  が存在するかしないかに関して、該  動物の細胞物質サンプルをスクリーニングするステップ、
該ＣＤ１５１  の量を、ＣＤ１５１  量に関する既知の標準（ｓｔａｎｄａｒｄ）と比較するステップ、および
該既知の標準より少ないＣＤ１５１  量を有する、育種用動物を選択するステップ、
の各ステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項７９】
サンプルが、既知の起源を有することを特徴とする請求項７８記載の方法。
【請求項８０】
サンプルが、既知の標準と同一の起源を有することを特徴とする請求項７８記載の方法。
【請求項８１】
ＣＤ１５１  の量が、既知の標準より少なくとも約２０％少ないことを特徴とする請求項７８記載の方法。
【請求項８２】
ＣＤ１５１  の量が、既知の標準より少なくとも約３５％少ないことを特徴とする請求項８１記載の方法。
【請求項８３】
ＣＤ１５１  の量が、既知の標準より少なくとも約５０％少ないことを特徴とする請求項８２記載の方法。
【請求項８４】
サンプルが、血液、精液、卵子、生殖細胞質、および精子細胞を含むグループから選択されることを特徴とする請求項７８記載の方法。
【請求項８５】
ＰＲＲＳウイルス感染に対して感受性である（ウイルス感染を受けやすい）細胞中におけるＰＲＲＳウイルス生産を改変する（ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ）  方法であって、
細胞をＣＤ１５１  により形質転換するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項８６】
改変が、細胞においてＰＲＲＳウイルスの生産増加をもたらすことを特徴とする請求項８５記載の方法。
【請求項８７】
改変が、１  ｍｌのワクチンウイルスストックあたりのＰＲＲＳウイルスの生産増加をもたらすことを特徴とする請求項８５記載の方法。
【請求項８８】
ＣＤ１５１  が、豚以外に起源を有することを特徴とする請求項８５記載の方法。
【請求項８９】
ＣＤ１５１  が、豚に起源を有することを特徴とする請求項８８記載の方法。
【請求項９０】
ＰＲＲＳウイルスの細胞内への侵入（ｅｎｔｒｙ）  をブロックする方法であって、
ＰＲＲＳウイルスのＲＮＡ  がＣＤ１５１  と相互作用することをブロックするステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項９１】
ブロックするステップが、細胞を抗ウイルス化合物（ａｎｔｉ−ｖｉｒａｌ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ）に接触させることを含むことを特徴とする請求項９０記載の方法。
【請求項９２】
抗ウイルス化合物が、抗ＲＮＡ  エントリー化合物（ａｎｔｉ−ＲＮＡ  Ｅｎｔｒｙ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ）  を含むグループから選択されることを特徴とする請求項９１記載の方法。
【請求項９３】
抗ウイルス化合物が、ＣＤ１５１  上の結合サイトを占有することを特徴とする請求項９２記載の方法。
【請求項９４】
抗ウイルス化合物が、ＰＲＲＳウイルスＲＮＡ  以上に、結合サイトに対するより大きな親和性（  アフィニティー）  を有することを特徴とする請求項９３記載の方法。
【請求項９５】
抗ウイルス化合物が、ＰＲＲＳウイルスＲＮＡ  以上に、結合サイトに対するより大きな結合力（  アビディティー  ）を有することを特徴とする請求項９３記載の方法。
【請求項９６】
抗ウイルス化合物がハイスループット処理（ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｍａｎｎｅｒ）によりスクリーニングされることを特徴とする請求項９３記載の方法。
【請求項９７】
豚の群（ａ  ｓｗｉｎｅ  ｈｅｒｄ）におけるＰＲＲＳウイルス感染を診断する方法であって、
該群の個別の豚から、細胞物質サンプルを得るステップ、
ＣＤ１５１  によって形質転換された細胞系列を供給する（ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ）  ステップ、
該サンプルおよび形質転換された該細胞系列を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断テストを実施するステップ、および、
ＰＲＲＳウイルス感染を診断するため該診断テストの結果を用いるステップ、
の各ステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項９８】
細胞物質が、血液、精液、卵子、生殖細胞質、および精子細胞から成るグループから選択されることを特徴とする請求項９７記載の方法。
【請求項９９】
診断テストがウイルス単離アッセイ（ｖｉｒｕｓ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙｓ）および免疫診断アッセイ（ｉｍｍｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｓｓａｙｓ）から成るグループから選択されることを特徴とする請求項９７記載の方法。
【請求項１００】
免疫診断アッセイが、エライザ（ＥＬＩＳＡ）  、間接蛍光抗体テスト（ｉｎｄｉｒｅｃｔ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｅｓｔｓ）  、および間接免疫ペルオキシダーゼテスト（ｉｎｄｉｒｅｃｔ  ｉｍｍｕｎｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｔｅｓｔｓ）  から成るグループから選択されることを特徴とする請求項９９記載の方法。
【請求項１０１】
形質転換された細胞系列が、形質転換前の該細胞系列以上に活発なウイルスの複製を可能にすることを特徴とする請求項９７記載の方法。
【請求項１０２】
細胞系列が、非サル起源（ｎｏｎ−ｓｉｍｉａｎ  ｏｒｉｇｉｎ）  を有することを特徴とする請求項９７記載の方法。
【請求項１０３】
形質転換された細胞系列が、非サル起源を有するＣＤ１５１  塩基配列を含むことを特徴とする請求項９７記載の方法。
【請求項１０４】
ＣＤ１５１  をコードする塩基配列（ＣＤ１５１  ｃｏｒｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を染色体へ直接組み込む方法であって、
ＣＤ１５１  をコードする塩基配列を内部に有するベクターを供給するステップ、
染色体を該ベクターと接触させるステップ、および
該ＣＤ１５１  をコードする塩基配列を染色体中に組み込んで１つにするステップ、
の各ステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１０５】
該ベクターがレトロウイルスベクターであることを特徴とする請求項１０４記載の方法。
【請求項１０６】
ＣＤ１５１  をコードする塩基配列の発現を引き起こすステップを更に含むことを特徴とする請求項１０４記載の方法。
【請求項１０７】
ＣＤ１５１  をコードする塩基配列が、サルＣＤ１５１  および豚ＣＤ１５１  から成るグループから選択されることを特徴とする請求項１０４記載の方法。
【請求項１０８】
ＣＤ１５１  をコードする塩基配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１と少なくとも約９１％の相同性を有することを特徴とする請求項１０４記載の方法。
【請求項１０９】
ＣＤ１５１  をコードする塩基配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１と少なくとも約９５％の相同性を有することを特徴とする請求項１０８記載の方法。
【請求項１１０】
ＣＤ１５１  をコードする塩基配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４  と少なくとも８４％の相同性を有することを特徴とする請求項１０４記載の方法。
【請求項１１１】
ＣＤ１５１  をコードする塩基配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４  と少なくとも９０％の相同性を有することを特徴とする請求項１１０記載の方法。
【請求項１１２】
ＣＤ１５１  をコードする塩基配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４  と少なくとも９５％の相同性を有することを特徴とする請求項１１１記載の方法。
【請求項１１３】
ＣＤ１５１  をコードする塩基配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４  と少なくとも９８％の相同性を有することを特徴とする請求項１１２記載の方法。
【請求項１１４】
改変前のゲノムと比較して、変化した（ａｌｔｅｒｅｄ）  量のＣＤ１５１  を発現する改変されたゲノムであって、該改変が該ゲノム中にあるＣＤ１５１  をコードする塩基配列（ＣＤ１５１  ｃｏｒｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の個数（ｔｈｅ  ｎｕｍｂｅｒ  、コピー数）  を変化させることを特徴とする改変されたゲノム。
【請求項１１５】
請求項１１４記載の、改変されたゲノムを有する動物。
【請求項１１６】
ｍＲＮＡ塩基配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３８  と少なくとも８４％の相同性を有するＤＮＡ  塩基配列に対応していることを特徴とする単離されたｍＲＮＡ塩基配列。
【請求項１１７】
ＤＮＡ  塩基配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３８  と少なくとも９０％の相同性を有することを特徴とする請求項１１６記載のｍＲＮＡ塩基配列。
【請求項１１８】
ＤＮＡ  塩基配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３８  と少なくとも９５％の相同性を有することを特徴とする請求項１１７記載のｍＲＮＡ塩基配列。
【請求項１１９】
ＤＮＡ  塩基配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３８  と少なくとも９８％の相同性を有することを特徴とする請求項１１８記載のｍＲＮＡ塩基配列。
【請求項１２０】
ＤＮＡ  塩基配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４  と少なくとも８４％の相同性を有することを特徴とするＣＤ１５１  をコードする単離されたＤＮＡ  塩基配列。
【請求項１２１】
ＤＮＡ  塩基配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４  と少なくとも９０％の相同性を有することを特徴とする請求項１２０記載の単離されたＤＮＡ  塩基配列。
【請求項１２２】
ＤＮＡ  塩基配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４  と少なくとも９５％の相同性を有することを特徴とする請求項１２１記載の単離されたＤＮＡ  塩基配列。
【請求項１２３】
ＤＮＡ  塩基配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４  と少なくとも９８％の相同性を有することを特徴とする請求項１２２記載の単離されたＤＮＡ  塩基配列。
【請求項１２４】
塩基配列が、豚ＣＤ１５１  に由来することを特徴とするＣＤ１５１  をコードする単離されたＤＮＡ  塩基配列。
【請求項１２５】
塩基配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５−２９から成るグループから選択された塩基配列を含むことを特徴とする請求項１２４記載の単離されたＤＮＡ  塩基配列。
【請求項１２６】
塩基配列が、ＣＤ１５１  をコードするイントロンおよびエキソンの両者を含むことを特徴とする請求項１２５記載の単離されたＤＮＡ  塩基配列。
【請求項１２７】
少なくともイントロンの１つが、ＳＥＱ    ＩＤ    Ｎｏ．１６，１８，２１，２３，２５，２７  および  ２９から成るグループから選択された塩基配列と少なくとも８４％の相同性を有することを特徴とする請求項１２６記載の単離されたＤＮＡ  塩基配列。
【請求項１２８】
少なくともエキソンの１つが、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５，１７，１９，２０，２２，２４，２６，および  ２８  から成るグループから選択された塩基配列と少なくとも８４％の相同性を有することを特徴とする請求項１２６記載の単離されたＤＮＡ  塩基配列。
【請求項１２９】
ワクチンが、非サルＣＤ１５１  により形質転換された非サル細胞系列において生成されるウイルスの子孫を含むことを特徴とする、ＰＲＲＳウイルスに対して有効な免疫を誘発するためのワクチン。
【請求項１３０】
ＣＤ１５１  が豚に起源を持つことを特徴とする請求項１２９記載のワクチン。
【請求項１３１】
ＣＤ１５１  が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４と少なくとも８４％の相同性を有することを特徴とする請求項１２９記載のワクチン。
【請求項１３２】
ＰＲＲＳウイルスに対する感受性に一塩基変異多形が与える影響を決定する方法であって、
少なくとも２つのＣＤ１５１  ゲノム塩基配列を得るステップ、
塩基配列間の一塩基多形（ＳＮＰｓ，  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）  を比較するステップ、および
一塩基多形をＰＲＲＳウイルス感受性と相互に関係づけるステップ、
の各ステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１３３】
細胞のＣＤ１５１  総量（ａｍｏｕｎｔ）を変化させるステップを含むことを特徴とする細胞中へのウイルスＲＮＡ  の侵入を調節する（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ）方法。
【請求項１３４】
ＲＮＡ  の侵入が、エンドサイトーシスに由来することを特徴とする請求項１３３記載の方法。
【請求項１３５】
ウイルスＲＮＡ  が、ＰＲＲＳウイルスＲＮＡ  であることを特徴とする請求項１３３記載の方法。
【請求項１３６】
ＰＲＲＳウイルス感受性ファクター（ＰＲＲＳＶ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｆａｃｔｏｒｓ）を、個々の豚の間で比較する方法であって、該方法は、
少なくとも２匹の豚の遺伝子配列を得るステップ、
ＣＤ１５１  遺伝子をコードする塩基配列（ＣＤ１５１  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）の量（ａｍｏｕｎｔ）を解析するステップ、および
ＣＤ１５１  遺伝子をコードする塩基配列の量を比較するステップ、
の各ステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１３７】
豚のＣＤ１５１  の塩基配列を決定する方法であって、
一匹の豚からバイオプシー（生物学材料）  を採取するステップであって、
該バイオプシーを耳ノッチ（ｅａｒ  ｎｏｔｃｈ、耳の刻み目）  もしくは尻尾スニップ（ｔａｉｌ  ｓｎｉｐ、尻尾の切れはし）から採取するステップ、および、
ＣＤ１５１  塩基配列を決定するために該バイオプシーについてＰＣＲ  を実施するステップ、
の各ステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１３８】
塩基配列決定されたＣＤ１５１  の配列を用いるステップ、および
発現量（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｌｅｖｅｌｓ）  をＰＲＲＳウイルスに対する感受性と相互に関連づけするステップ、
の両ステップを含むことを特徴とする請求項１３７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
塩基配列リスト
本願には、タイプ打ちした塩基配列リストを載せており、またフロッピーディスクおよび  ＣＤＲＯＭ    に、コンピューターで読み取り可能な  ＡＳＣＩＩファイルの形式で保存したこの塩基配列リストと同一内容のものも提出した。
【０００２】
発明の背景
発明の属する技術分野
本発明は、ＣＤ１５１  および／または豚ＣＤ１５１  を用いた  ＤＮＡ  ＰＣＲに対して定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）による、異なる豚育種系統のスクリーニングに関する。ＣＤ１５１  を遺伝的に僅かに含むか、もしくは含まない豚系統の選択は、豚繁殖呼吸器障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）  の感染に対して感受性の低いまたは感受性の全くない子孫を生ずる。本願発明はまた、ＰＲＲＳウイルスに対する感受性に関して、生きた豚および豚の生殖細胞質をスクリーニングするための非侵襲性の方法にも関する。加えて、本願は非サル（ｎｏｎ−ｓｉｍｉａｎ）細胞系列におけるウイルスの不活化ワクチンおよび生ワクチンを作るための高力価ストック（ｈｉｇｈ  ｔｉｔｅｒ  ｓｔｏｃｋ）を増殖させるための細胞系列の開発について記載する。更に、本願発明はワクチンに用いられる力価ストックをつくるために、以前は感受性のなかった細胞系列を、感受性のある細胞系列に形質転換する際に有用な新規なプラスミドを記載する。本願は、またＣＤ１５１  とＰＲＲＳウイルスの  ３’−非翻訳領域  ＲＮＡとの間の相互作用をブロックする新規クラスの抗ウイルス化合物を発見するための１つの道具を提供することにも関する。この新規クラスの化合物は抗ＲＮＡ  エントリー蛋白質（ａｎｔｉ−ＲＮＡ  Ｅｎｔｒｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  ａｎｔｉ−ＲＥＰｓ）と命名されている。
【０００３】
従来の技術
豚繁殖呼吸器障害症候群（ＰＲＲＳ）は豚の重要なウイルス病として１９８０年代後半に発生したＲＮＡ  ウイルスである。ＰＲＲＳはアメリカ合衆国においてまた全世界において、最も重要な経済的に意味のある病気である。ＰＲＲＳの起源と進化については分かっていない。それゆえ、ＰＲＲＳは豚の新規に出現した（ｅｍｅｒｇｉｎｇ）ウイルスである。以前から「神秘的な豚の病（ｍｙｓｔｅｒｙ  ｓｗｉｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）  」、「豚不妊呼吸器障害症候群（ｓｗｉｎｅ  ｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）」、あるいは「青耳病（ｂｌｕｅ  ｅａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）」として呼ばれてきたこの病気は、アメリカ合衆国およびカナダの育種中の群れに、多大な損害を生じた。同様な病気はヨーロッパの多くの地域でも現われ、ＰＲＲＳウイルスは世界中で検出されてきた。この病気は、２つの形態で明らかにされている。１つは、妊娠中の雌豚における深刻な生殖機能不全、死産児数の増加、ひからびた（ｍｕｍｍｉｆｉｅｄ）  あるいは虚弱な状態での豚出生児、分娩率の減少および次の発情期への回復遅延（ｄｅｌａｙｅｄ  ｒｅｔｕｒｎ  ｔｏ  ｅｓｔｒｕｓ）を引き起こし、他の形態は、感染した豚の肺中に現われる傷害によって明示づけられるように、豚に呼吸困難を生ずる。
【０００４】
ＰＲＲＳ病の生殖器系の形態は、Ｋｅｆｆａｂｅｒ，Ｋ．Ｋ．，”Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  Ｆａｉｌｕｒｅ  ｏｆ  Ｕｎｋｎｏｗｎ  Ｅｔｉｏｌｏｇｙ”，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｗｉｎｅ  Ｐｒａｃｔｉｔｉｏｎｅｒｓ  Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ，１：１０９（１９８９）  に記載されている。ＰＲＲＳ病の生殖器系の形態の最も顕著な臨床症状は、自発型後期堕胎、未熟児の出産（  全出産の２０−３０％の高比率にもなり得る）、およびひからびた胎児の分娩、死産児、病弱な豚仔である、そのような臨床症状は、豚の群において、典型的には、４週間から１６週間あるいはそれ以上の期間観察される。皮膚の黄褐色の退色と死後自己溶解によって証拠づけられるように、ＰＲＲＳ病の影響を受けた一腹の子豚の内の死産児はしばしばミイラ化（ｍｕｍｍｉｆｉｃａｔｉｏｎ）  の初期段階に見られる。ドーム形をした、胎児の頭部の奇形はまたしばしば見られる。雌豚の感染は気づかないうちに進行し、あるいは、傷害を受けた一般症状が数日間続くことにより明らかになるだろう。例えば、雌豚は食事を取らなくなり、正常体温以上または以下の体温を経験する。分娩段階において、雌豚は機能低下、無気力、発熱、およびときどき嘔吐を発現する。病気の影響を受けた群の中には、７５％までの豚仔が死亡することもある。ＰＲＲＳ病の経済的な結果は、したがって、大損害を及ぼすことになる。
【０００５】
ＰＲＲＳ病の呼吸器の形態は、年齢３−８週の豚仔においてもっとも著しい臨床徴候を発現するが、感染した群における全ての年齢の豚に起こることが報告されている。ＰＲＲＳ病に罹った豚仔は成長が遅く、毛皮はざらざらで、呼吸困難（動悸）を起こし、死亡率（離乳前の約８０％にまで及ぶ死亡率）  が増加している。ＰＲＲＳウイルスによる感染と関連した問題と闘うため、最新のＰＲＲＳ株に対する免疫を与える試みの中でワクチンが開発されてきた。現在のワクチンは、単にごくわずかに効果的であり、豚全個体群の中に、霊長類ウイルスが連続的に取り込まれる危険性を有するサル起源の細胞系列において全て生産されている。このＰＲＲＳ病の呼吸器系形態の影響を受けた、豚仔の巨視的および微視的損傷の予備的な試験における所見は、微視的な肺の損傷が、このＰＲＲＳ病の１つの重要な臨床的特徴であることを示唆している。
【０００６】
ＰＲＲＳウイルスは、Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ  属のＮｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ  目に属している。この属の他のメンバーとしては、馬動脈炎ウイルス（ｅｑｕｉｎｅ  ａｒｔｅｒｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、乳酸デヒドロゲナーゼウイルス（ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｅｌｅｖａｔｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ）  、および猿出血熱ウイルス（ｓｉｍｉａｎ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）が含まれます。一般に、ヒトのアルテリウイルス（ａｒｔｅｒｉｖｉｒｕｓ）  は知られていない。ＰＲＲＳウイルスゲノムは、長さ約１５．１  Ｋｂ  の＋鎖ＲＮＡ  である。５’末端の１５６−２２０  番目ヌクレオチドおよび３’末端の５９−１１７番目ヌクレオチドの非翻訳領域（ＵＴＲ’ｓ）  が、ウイルスゲノムに接している。ウイルスゲノムは、機能蛋白質および構造蛋白質をコードした８つのオーバーラッピングするオ―プンリーディングフレーム領域を有している。ＰＲＲＳウイルスは、感染した豚のマクロファージ中で、主として成長する。細胞培養中では、ＰＲＲＳウイルスは、ＣＬ  ２６２１，  ＭＡ−１０４，  ＭＡＲＣ  の各細胞系列の中で生育し、また豚の肺胞マクロファージ（ａｌｖｅｏｌａｒ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ）の初代培養においても生育することが知られている。これら連続した細胞系列の全てがサルに起源を有し、霊長類ウイルス（ｐｒｉｍａｔｅ  ｖｉｒｕｓ）  が豚個体群へ入り込む危険性を生ずる。ウイルスの侵入は、受容体を介したエンドサイトーシス（内向きの膜動輸送）によって起こり、そして受容体はヘパリン様分子として特徴づけられてきた。しかしながら、どのようにウイルスＲＮＡ  がエンドサイトーシスのあと、細胞質へ入るかのメカニズムは分かっていない。
【０００７】
アルテリウイルスの複製は、コロナウイルス（ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｅｓ）  の複製と同様である。ゲノムおよびサブゲノムの−鎖ｍＲＮＡ（（−）  ｓｅｎｓｅｍＲＮＡ）  は、感染された細胞において、＋鎖ｍＲＮＡに沿って作られる。サブゲノム−鎖ｍＲＮＡは、コロナウイルスにおいてｍＲＮＡ合成の主要な鋳型として、機能していることが示されてきた。不連続な転写はアルテリウイルスの中で起こり、ｍＲＮＡは機能的にモノシストロニック（単一遺伝子様）であり、転写末端は３’末端が共通であって、かつｍＲＮＡの積み重ねセット（ｎｅｓｔｅｄ  ｓｅｔ）の形態をもっている。遺伝子間の共通配列が、連結配列（ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）  ＵＣＡＡＣＣを通して、共通のリーダーをコーディング領域（ｔｈｅ  ｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）  に連結している。マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）  およびコロナウイルスにおいて、リーダー、遺伝子間配列およびＲＮＡ  本体の三者間の相互作用には、ｃｉｓ  およびｔｒａｎｓ  に作用する要素（ｅｌｅｍｅｎｔ）  が関わっている。上記ＭＨＶ、コクサッキーウイルス（ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ）、ライノウイルス（ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）およびポリオウイルス（ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ）のそれぞれ３’非翻訳領域（ＵＴＲｓ）は、ゲノムの転写のために必須であることが示された。３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）  と上流の調節配列の間には、これら二者間の相互作用のための配列相補性がほとんどなく、そのため３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）  と上流の調節配列の間の相互作用は、ウイルス蛋白質と細胞蛋白質の両方に関わるＲＮＡ−蛋白質−  ＲＮＡ  三者間相互作用を通して媒介される。
【０００８】
ウイルス蛋白質および細胞内蛋白質と、ウイルスの５  ’および３  ’非翻訳領域との間の相互作用に関しては、数多くの研究がある。シンドビスウイルス（Ｓｉｎｄｂｉｓ  ｖｉｒｕｓ）  、ブロムモザイクウイルス  （ｂｒｏｍｅ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）  、Ｑ  βファージ（Ｑβ  ｐｈａｇｅ）  およびポリオウイルス（ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ）は、転写を進めるために、或る宿主細胞蛋白質とウイルスの非翻訳領域とが相互作用することを必要とする。数多くの蛋白質が、これらの調節領域と結合していることが示されてきたが、そのうちほんの幾つかの蛋白質についてのみ特徴が述べられてきた。Ｌａ蛋白質、ポリリボＣ結合蛋白質２（ｐｏｌｙ（ｒＣ）  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２）およびポリピリミジントラクト結合蛋白質（ｐｏｌｙｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ  ｔｒａｃｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が、ポリオウイルスの非翻訳領域に結合することが示されてきた。ポリピリミジントラクト結合蛋白質および異種生物由来の細胞核のリボヌクレオプロテイン（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）は、ＭＨＶ（マウス肝炎ウイルス、ｍｏｕｓｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）のリーダー配列に結合することが示されている。これらの蛋白質は、ｍＲＮＡのスプライシングと輸送において１つの役割を演じていると予想されている。細胞骨格蛋白質およびシャペロン蛋白質の中には、アクチン、チューブリンおよび熱ショック蛋白質のように、ＲＮＡ  結合活性を持つことが示されているものがある。これらの蛋白質は、ウイルスＲＮＡ  合成を行う際に、もしくはＲＮＡ  複製複合体（ＲＮＡ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）  を複製の場所へ方向づけして輸送する際に、構造的な役割を演じているかも知れない。
【０００９】
ウイルスＲＮＡ  と相互作用する宿主細胞蛋白質の研究は、いまだ揺籃期の段階であり、この相互作用に関しては重要な情報、とりわけ宿主感受性ファクターに関連した情報が欠けている。ＰＲＲＳウイルスと同様、アルテリウイルスにおいてさえ宿主感受性ファクターは研究されてこなかった。それゆえ、豚育種に際して、ＰＲＲＳウイルスに対する宿主感受性の増加を示すマーカーは、分かっていない。しかしながら、実験的感染を行ったのち、感染した豚を屠殺し、豚肺中の間質性肺炎およびＰＲＲＳウイルス抗原の存在を調べるための組織病理学（ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ）および免疫組織化学（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）についての更なる検査を行い、これらの結果に基づいて育種の異なる豚は、ＰＲＲＳ感受性ウイルスに対する感受性が異なることが知られている。
【００１０】
更に、サル（ｓｉｍｉａｎ）細胞系列は、最近のＰＲＲＳウイルスワクチンの細胞培養を提供するが、これは危険な作業である。これらの細胞培養のためにサル細胞系列を使用することが、異種移植（ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）を目的とした、豚の種にかなりの霊長類のウイルスを偶然に取り込むことになるかも知れない。豚は、ヒトの器官移植の不足に対応するために異種移植（ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）される器官の起源（ｓｏｕｒｃｅ）として現在ますます研究されつつあるために、霊長類の細胞系列を豚個体群を取り込むことは、最終的には、異種移植を受けた器官を有するヒトへのリスクを与える。それゆえ、豚ワクチンの製造の際にサル（ｓｉｍｉａｎ）細胞種の使用を避けることは賢明である。
【００１１】
したがって、当該技術において必要とされることは、ＰＲＲＳウイルス感染への感受性に関して豚をスクリーニングする方法である。好ましくは、このスクリーニングテストは、ＤＮＡ  を基礎（ＤＮＡ−ｂａｓｅｄ）  としたものであり、感受性遺伝子の重要なモチーフ  （ｍｏｔｉｆ）またはドメインにおける塩基配列の多様性と、ＰＲＲＳに対する低度、中度、高度の感受性とを相互に関連づけることができる。より好ましくは、このスクリーニングは非侵襲性であり、豚の生殖細胞質（ｇｅｒｍｐｌａｓｍ）  および全血を含む多くの異なる動物の体液および細胞物質について実施され得る。より好ましくは、このスクリーニングはＰＲＲＳに対する低度の感受性を持った豚を検出するために耳ノッチ（ｅａｒ  ｎｏｔｃｈ、耳の刻み目）  から採取するバイオプシー（生物材料）について実施される。加えて、必要とされることは、これらのスクリーニング結果を、豚の子孫のＰＲＲＳウイルス感染に対する感受性が少なくなるように設計された育種プログラム（ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ｐｒｏｇｒａｍ）に用いる１つの方法である。当該技術において他に必要とされることは、ＰＲＲＳウイルス感染に対する抵抗性（ウイルスに対する感染しづらさ）に有害な影響を与え、かつこの抵抗性と相互に関連するＤＮＡ  の一塩基多形（ＳＮＰｓ）を確認することである。更に必要とされることは、ＰＲＲＳウイルス感受性に有害な影響を与える遺伝子と、調節要素および／またＰＲＲＳウイルス感受性に関連して遺伝子の発現と調節に影響を与える他の遺伝子（ｃｉｓ−  およびｔｒａｎｓ−に作用するファクター）  との間の相互作用を理解することにある。更にまだ必要とされることは、染色体の構成および遺伝子の位置を理解することである。更に必要とされるものは、霊長類ウイルスが豚個体群に交差することを避けるために、高力価ＰＲＲＳウイルスワクチンストックを増殖させるための非サル細胞系列である。そのような細胞系列は、異種移植を受けた豚で用いられるワクチンにとりわけ適している。最後に、必要とされるものはウイルスＲＮＡ  が細胞に侵入することをブロックすることができるクラス（ｃｌａｓｓ）  の化合物である。
【００１２】
発明の概要
本願発明は、上記従来技術の問題を解決し、技術状態に明確な進歩を与えるものである。とりわけ、本願発明を通して、ＰＲＲＳウイルス感受性に対する非侵襲性遺伝学テスト、更なる育種のための豚の選択、非サル細胞系列における高力価ワクチンの開発、ＰＲＲＳウイルス処置に用いられ得る化合物の開発、およびＰＲＲＳゲノムの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）  ＲＮＡ  とウイルス感染に対して感受性を有する細胞系列との間の相互作用を検出しかつ特徴づけることができる方法が提供され、これらの方法によって、抗ＲＮＡ  エントリー化合物（ａｎｔｉ−ＲＮＡ  Ｅｎｔｒｙ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）と呼ばれる新規な抗ウイルス化合物の開発につながる。加えて、本願発明は、豚ＣＤ１５１  のゲノム塩基配列およびゲノム構成を規定し、豚ＣＤ１５１  のＲＮＡ  結合活性を明示し、異なる組織中のＣＤ１５１  のアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）  を確認し、およびトランスフェクトされた豚ＣＤ１５１  遺伝子を持つ非サル細胞系列を作り出す。最後に、本願発明は、豚ＣＤ１５１  の分子全体としての活性を説明し、ＲＮＡ  結合活性を与えかつ非サル細胞系列である  ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ−１２  （ＢＨＫ−２１）へ感受性を与えるＣＤ１５１  ドメインを同定する。
【００１３】
したがって、本願発明の１つの特徴は、比較的非侵襲性である方法を用いて、豚をスクリーニングする方法を提供することである。例えば、豚から血液サンプルを採取し、血小板中にＣＤ１５１  が存在することが、定量的ＲＴ−ＰＣＲおよび／またＤＮＡ  ＰＣＲｓを用いて検出され得る。また、ＤＮＡ  ＰＣＲｓは豚仔から採取した耳ノッチ（ｅａｒ  ｎｏｔｃｈ）  バイオプシーまたは尻尾スニップ（ｔａｉｌ  ｓｎｉｐ、尻尾の切れはし）  バイオプシーについて実施され得る。ＣＤ１５１  量が少ないか、もしくはＣＤ１５１  が全く検出されない豚さえも選択して、更に育種を続けることができるので、この種のスクリーニングから得られた知識は豚の育種プランを大いに改善し得る。本願発明の強み（ａｄｖａｎｔａｇｅ）  を用いた豚育種プログラムの１つの例は、個々の豚のＣＤ１５１  量をＣＤ１５１  の既知の標準（ｓｔａｎｄａｒｄ）と比較することである。この既知の標準は、豚からの細胞物質（例えば、体液または組織）  の数多くのサンプルからのＣＤ１５１  量を比較することによって一般に得られ、全サンプル中に検出されるＣＤ１５１  量の平均を表す。同一動物由来の異なる細胞物質は異なるＣＤ１５１  量を有するので、既知の起源（血液、血小板、精子細胞、生殖細胞質、精子、卵子等）の細胞物質由来のＣＤ１５１  量をその特定の細胞物質に対応する既知の標準と比較することが好ましい。その上、既知の標準は、豚のＣＤ１５１  量の平均を表すので、個々の豚の検出されたＣＤ１５１  量をその平均値と比較することによって、１個体の豚が更なる育種のために選択される。一般に、ＰＲＲＳ感染に対して抵抗性が増加した子孫を作り出すことを意図しているので、平均より低いＣＤ１５１  量を有する豚を選択することが好ましい。豚をスクリーニングする他の方法は、ＰＲＲＳの減少した感受性と相互関連性をもった望ましい一塩基多形（ＳＮＰｓ，ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）  を同定することを含む。このように、豚をしてＣＤ１５１  量に関して特定の望まれる百分率にランクづけさせる一定量のＣＤ１５１  を有する豚であって、他の望ましい育種特性を持つ豚が、更に育種を続けるために選択される。好ましくは、これらの豚は、ＣＤ１５１  量に関して下位５０％にランク付けされる。より好ましくは、これらの豚はＣＤ１５１  量に関して下位８０％にランク付けされる。更により好ましくは、これらの豚はＣＤ１５１  量に関して下位９０％にランク付けされる。そして最も好ましくは、これらの豚はＣＤ１５１  量に関して下位９５％にランク付けされる。言い換えれば、この最も好ましいグループ分けでは、全ての豚の９５％が、テストされる一匹の特定の豚よりも多いＣＤ１５１  量を有することになる。もちろん、ＣＤ１５１  を欠いた豚は更に育種を続けて、ＰＲＲＳウイルス感染に対して抵抗性のある（ウイルス感染を受けづらい）豚のノックアウト系統（”ｋｎｏｃｋｏｕｔ”  ｌｉｎｅ）  を作り出すことができる。
【００１４】
本願発明に関連した態様においては、精子細胞のような生殖細胞質の形の細胞物質、もしくは希釈した豚の精子は、豚を育種施設に仕分ける前にＣＤ１５１  が存在するかしないにつきスクリーニングされ得る。また、上記した同じ一般的手順を用いて、そのようなスクリーニングから得られた知識は、将来豚の育種プランを立て、生殖細胞質を大量に使用するために非常に貴重である。豚の、射精量は約５００ｍｌ  であり、射精された精子は更に希釈されるので、射精した豚がもはや農場にいず、死亡し、あるいは売却されたとしても、価値ある雄豚由来の生殖細胞質（ｇｅｒｍｐｌａｓｍ）  は、長年多くの雌豚のために使用され、将来数世代に渡って、望ましい遺伝子型または遺伝的性質を持った豚仔を提供し得る。そのような凍結した生殖細胞質は、人工授精の前にもＣＤ１５１  量およびＰＲＲＳウイルス感受性に関しても、またスクリーニングされ得る。ＣＤ１５１  量が多いことは、細胞によるウイルス生産および放出が多いことと相互に関連しているので、このスクリーニングは、また豚もしくはその子孫のＰＲＲＳウイルスによる感染に対する感受性をも示す。それゆえ、これらのテストは、ＰＲＲＳウイルスに対する感受性に関して、農場に生存する動物をスクリーニングするためにもまた応用され得る。生殖細胞質（ｇｅｒｍｐｌａｓｍ）  中に検出されるＣＤ１５１  量に基づき、更に育種を行うための豚の選択は次の様に行われる。生殖細胞質のサンプルが取り出され、そのサンプル中のＣＤ１５１  の量またはレベルがＲＴ−ＰＣＲによって決定される。異なるタイプの生殖細胞質が異なる量のＣＤ１５１  を一般的には含むので、この結果（ＣＤ１５１  の量）  はそのサンプルに対する既知の標準と比較される。その既知の標準は、そのようなサンプルの数多くのサンプルを定量した結果を平均することによって決められるだろう。標準と比較して減少したレベルのＣＤ１５１  を発現（し、またこれによってＰＲＲＳウイルスの感染に対して減少した感受性を有）し、更にまた他の価値ある育種の特徴を所有する豚は、更なる育種のために選択されるだろう（ｗｏｕｌｄ  ｂｅ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ）  。好ましくは、これらの豚は、テストされた全ての豚の内の約５０％未満のＣＤ１５１  量を有する。より好ましくは、これらのレベルは少なくても約８０％以下となる。更により好ましくは、少なくとも約９０％、そしてより更により好ましくは、ＣＤ  １５１量はテストされた全ての豚のうち少なくとも全ての豚の内の約９５％のものより少ない。他の言葉でいえば、これらの豚由来のサンプルにおけるＣＤ  １５１量はテストされた全ての豚の下位約２０％、約１０％、約５％にランク付けされるだろう。もちろん、細胞物質のサンプル中のＣＤ１５１  の量が定量され、定量された量のＣＤ１５１  が育種戦略に影響を与えるとすれば、本願発明の方法を用いて、この育種プランに幅広い多様性が生まれ、よってこれらの多様性は十分に説明がつくものと考えられる。
【００１５】
本願発明は、また動物におけるＰＲＲＳウイルス感染に対する感受性を確かめるための方法を提供する。そのような方法は、細胞物質のサンプルを得るステップ、このサンプルについてＣＤ１５１  アッセイを実施するステップおよびこのアッセイの結果を使って、ＰＲＲＳウイルスに対する動物の感受性を測定するステップを含むだろう。アッセイのために選ばれた細胞物質は、検出できるレベルのＣＤ１５１  を含むいかなる体液、組織、半精製した、あるいは精製した細胞標品（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）を含むいかなる細胞物質であっても良い。例えば、血液、血小板、生殖細胞質、精子細胞、卵子、および精液は全て検出できるレベルのＣＤ１５１  を含む。１つの好ましいアッセイは、サンプルからＲＮＡ  を抽出するステップ、そして抽出したＲＮＡ  上でＲＴ−ＰＣＲを実施するステップを含む。好ましくは、結果から検出されたＣＤ１５１  を定量した結果として、ＣＤ１５１  量が与えられる。この定量された量（ａｍｏｕｎｔ  ｏｒ  ｌｅｖｅｌ）  は、そこでＣＤ  １５１量に関して既知の標準と比較することができ、こうして、その定量化された量はその動物に関してＰＲＲＳ感染に対する感受性を示す。更により好ましくは、細胞物質サンプルは、既知の起源に由来しており、既知の標準はその同一の起源を持つ細胞物質に対する既知の標準を表す。
【００１６】
本願発明は、一匹の動物が、細胞物質においてＣＤ１５１  が存在するかするかしないかに基づいて、ＰＲＲＳウイルス感染に対して抵抗性を有するかどうかを決定するための方法を更に提供する。もしＣＤ１５１  が存在しなければ、動物は一般にＰＲＲＳウイルス感染を受けつけない。もしＣＤ１５１  が存在すれば、実際のＣＤ  １５１量に基づき、様々な程度で典型的に（ｔｙｐｉｃａｌｌｙ）ＰＲＲＳ  ウイルス感染を受けやすい。こういうふうに、細胞物質のいかなるサンプルにおいても、動物におけるＰＲＲＳウイルス感染に対する抵抗性は、検出されるレベルのＣＤ１５１  に基づいて分類される。そのような方法は、テストされた動物から細胞物質のサンプルを得るステップ、そのサンプルのＣＤ  １５１量を見いだすためにサンプル上でアッセイを実施するステップ、テストされた動物のＣＤ  １５１量を既知のスケール（ｓｃａｌｅ）  のＣＤ  １５１量と比較する（ここで既知のスケールがＰＲＲＳウイルス感染に対する抵抗性の一定程度に対応している）ステップ、そして最後に、既知のスケールとの比較に基づいてテストされた動物のＰＲＲＳウイルス感染を分類するステップを含む。好ましくは、細胞物質のサンプルが既知の起源のものであり、ＣＤ１５１  のスケールが他の動物における同一の起源由来の細胞物質のスケールを表すことである。そのような分類としては、その動物におけるＰＲＲＳウイルス感染に対する抵抗性を、百分率でランク付けすることもできる。
【００１７】
本願発明の他の態様は、野生種（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）  の検出のための試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での診断テストがＰＲＲＳウイルスに対する抗体と同様に開発されたことである。そのようなテストは、一般に一匹の動物から細胞物質のサンプルを得るステップ、組替型細胞系列におけるウイルスに対する抗体もしくはウイルスそれ自体を検出するよう設計された診断テストを実施するステップ、個々の豚あるいは豚の群がＰＲＲＳ病に罹っているのかどうかの診断が正しいことを確認するために行う実験（ｔｅｓｔｉｎｇ）  の結果を用いるステップを含む。より好ましい診断テストは、ウイルス単離アッセイ（ｖｉｒｕｓ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）  、エライザ（酵素免疫測定法、ＥＬＩＳＡ）のような免疫診断アッセイ、間接蛍光抗体テスト（ｉｎｄｉｒｅｃｔ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｅｓｔ）、および間接免疫ペルオキシダーゼテスト（ｉｎｄｉｒｅｃｔ  ｉｍｍｕｎｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｔｅｓｔｓ）  を含む。好ましくは、用いられる組替え細胞系列はウイルスのより活発な複製（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）  を可能とし、そのテストをＰＲＲＳウイルス感染あるいは抗体の存在に対して、より感受性の高いものとすることである。
【００１８】
本願発明のもう１つの態様は、豚群の免疫を助けるためにＣＤ１５１  によって形質転換された細胞系列において、より高い力価（ｈｉｇｈｅｒ  ｔｉｔｅｒ）を持つＰＲＲＳウイルスワクチンが開発され得ることだ。本願発明に関連する態様として、他の非サル細胞系列がＣＤ１５１  によって形質転換され、高力価のＰＲＲＳウイルスワクチンストックを増殖させるのに用いられ得る。異種移植（ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）（とりわけ豚において）が開発されればされるほど、このことはますます問題となってきた。サル細胞中で作られるワクチンを使用することは、サルのウイルスを豚に伝達することとなり、それゆえ異種移植に用いられる器官もまたこれら霊長類ウイルスのうちいくつかのものに対する感受性を持っている。それゆえ、ＰＲＲＳワクチンのために霊長類あるいはサルの腎臓細胞系列を用いることを避け、それによって、ヒトの移植レシピエント個体群へあとになって霊長類ウイルスが取り込まれるリスクを除去することが、より安全である。ＰＲＲＳ感染に既に感受性を持った細胞系列にとっての、ＣＤ１５１  の更に高い生産を結果する形質転換が、本願発明の方法を用いて成される。
【００１９】
本願発明の他の態様は、形質転換された細胞系列を生産するために、非サル（ｎｏｎ−ｓｉｍｉａｎ）細胞系列が非サルＣＤ１５１  によってトランスフェクトされる。この点において、霊長類ウイルスがヒト移植受容者個体群（ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）  へ取り込まれることを完全に避けるために、非サル細胞を非サルＣＤ１５１  によって形質転換することが好ましい。とりわけ好ましい、非サルＣＤ１５１  塩基配列は、豚ＣＤ１５１  の最初の完全ゲノム塩基配列を表す  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４  として与えられる。好ましくは、この塩基配列（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４）と少なくとも８４％の塩基配列相同性を有する塩基配列は、本願発明の目的のために細胞を形質転換するのに用いられる。より好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４との相同性は少なくとも９０％であり、更により好ましくは少なくとも９５％である。最も好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４との相同性は少なくとも９８％である。
【００２０】
本願発明の他の関連する態様は、非サル細胞系列において増殖する高力価ワクチンは、ＰＲＲＳに対する抗体を検出するための診断テストの開発やＥＬＩＳＡ  アッセイのような他の応用のために用いられ得る。
【００２１】
本願発明の他の関連する態様は、細胞系列を形質転換し、それら形質転換された細胞系列のＰＲＲＳウイルス感染に対する感受性を強めることができるプラスミドまたはベクターの開発および使用である。この点について、とりわけ好ましいプラスミドには、ｐＫＳＵ（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＡＦ  ２７５６６６）という名称が与えられており、本願ではＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１  として与えられ、図１にも記載されている塩基配列を含む。好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１  と少なくとも約９１％の相同性を有するかまたは９３％の塩基配列同一性を有する塩基配列は、その塩基配列がプラスミドにおいてまたは他の適切なベクターにおいて単離された塩基配列として出てくるかどうかに関わらず、本願発明に含まれる。より好ましくは、そうした塩基配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１  と少なくとも約９５％の塩基配列相同性を有するか９７％の塩基配列同一性を有し、更により好ましくは  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１と少なくとも約９８％の塩基配列相同性を有するか約９９％の塩基配列同一性を有する。この塩基配列が、単離されたサルＣＤ１５１  の塩基配列の最初の報告であると考えられる。もちろん、この塩基配列または類似の塩基配列に対応するアミノ酸配列も、アミノ酸配列の決定が当該技術分野における、お決まりの技術（ｒｏｕｔｉｎｅ  ｓｋｉｌｌ）  以上のものを要求しないため、本願発明に含まれると考えられる。細胞系列を形質転換する中で使用するためのベクターまたはプラスミドの開発に非サルＣＤ１５１  を使用することが望まれる場合には、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４と少なくとも８４％の相同性を有する塩基配列が、好ましくはプラスミドまたはベクターに含まれるように選択される。より好ましくは、選択された配列は、少なくとも９０％の塩基配列相同性を有するか更により好ましくは少なくとも９５％のホモロジーを有する。最も好ましくは、相同性はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４と比較して、少なくとも９８％になる。
【００２２】
同様に、本願発明は、一匹の動物のゲノムにＣＤ１５１  コーディング配列を直接に組み込む方法を提供する。この方法は一般に、そのような挿入のため意図されたベクターを用いて、染色体中へ関心のある塩基配列（  例えば、ＣＤ１５１）を組み込むステップを含む。換言すれば、関心のある塩基配列はレトロウイルスのベクターに組み込まれ、このレトロウイルスベクターは、その塩基配列をゲノム中の一個の染色体中に直接組み込むのに用いられる。
【００２３】
したがって、ＰＲＲＳウイルスワクチンストックを調製する方法は、本願発明によって与えられる。一般に、ＰＲＲＳウイルスワクチンストックを調製するために、１つの細胞系列が与えられそしてＣＤ１５１  によって形質転換される。この細胞系列は、形質転換前においては、ＰＲＲＳウイルス感染に対しては抵抗性であり得るか、もしくはＰＲＲＳ感染に対して感受性で有り得る。結果として生じた、形質転換された細胞系列は、そこでＰＲＲＳウイルスに感染させ、ワクチンストックに使用されるためにＰＲＲＳウイルスの子孫を作り出さしめる。上記記載のように、細胞系列は好ましくは、非サルの起源を持つ。このように、以前はＰＲＲＳ感染に対して感受性でなかった細胞系列は、ＣＤ１５１  によって形質転換したあとを感受性が与えられ、以前にＰＲＲＳ感染に対して感受性であった細胞系列は、より多くの数の子孫ウイルスを作り出す。好ましくは、形質転換のステップは、ＣＤ１５１  ＤＮＡ  塩基配列を含むプラスミドを使った安定なトランスフェクションを含む。ＣＤ１５１  塩基配列は、ＣＤ１５１  を含むいかなる動物由来のものであってもよい。好ましくは、ＣＤ１５１  塩基配列は豚またはサルＣＤ１５１  である。ＣＤ１５１  塩基配列が、豚起源であるかまたは豚起源であると望まれるときは、その塩基配列はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４と少なくとも８４％の塩基配列の相同性を有するべきである。より好ましくは、この塩基配列相同性は、少なくとも９０％そしてより好ましくは少なくとも９５％であるべきだ。最も好ましくは、ＣＤ１５１  ＤＮＡ  が豚起源のものかそれと望まれるときはＣＤ１５１  は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４と少なくとも９８％の塩基配列相同性を有するべきである。ＣＤ１５１  ＤＮＡ  が、サル起源であるかそれと望まれるときは、ＣＤ１５１  ＤＮＡ  塩基配列はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１  と少なくとも約９１％の塩基配列相同性を有する。更により好ましくは、ＣＤ１５１  ＤＮＡ  塩基配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１  と少なくとも約９５％の塩基配列相同性、そして更により好ましくは少なくとも約９８％の塩基配列相同性を有する。結果として生じた、ワクチンストックは、形質転換以前に予め得られていたよりも高い力価を有する。このワクチンストックの力価が以前可能であった力価より約１００倍高くなる場合もある。
【００２４】
本願発明の他の態様として、ＣＤ１５１  塩基配列の多形（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）を検出し、ＲＴ−ＰＣＲを用いて同定し、続いて塩基配列決定および特別にデザインされたテストを行う。これらの異なる多形はそこでＰＲＲＳウイルス感受性におけるこれら多形の効果を決定するために解析される。この点について、一塩基多形の使用は、非常に助けとなり、そうした方法は、病気に対する感受性を決め育種中の豚を評価、選択する方法として広く受け入れられてきた。その上、ＣＤ１５１  のレベルは、遺伝子のプロモーターのような調節配列によって影響を受けるかも知れない。調節配列はそこで、組織特異的な差異および豚仔個体間での差異を知るために解析される。加えて、染色体上の位置決めおよび遺伝子の位置決めから得られる情報は、ＰＲＲＳ病に対する抵抗性に関して豚の系統を選択するために用いられ得る。もちろん、病気に対する抵抗特性に関する選択をすることによって生ずる正の効果と負の効果の間のバランスを得るために、重要な生産特性に及ぼす付帯的効果がモニターされるべきである。
【００２５】
本願発明の更に他の態様は、ノースウェスタン法（Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  ｓｔｒａｔｅｇｙ）  による抗ＲＮＡ  エントリー蛋白質（ａｎｔｉ−ＲＥＰｓ）  の開発と使用である。抗ＲＥＰｓは、出現してくるウイルスに対抗するための薬物群にさらに重要な追加事項となるであろう。新規に発生したウイルスは、全てＲＮＡ  であり、野生生物の生息地を人間が侵略することが原因となって、野生生物の個体群において発生するとするのが一番もっともらしいと考えられている。これらの抗ＲＮＡ  エントリー蛋白質（ａｎｔｉ−ＲＮＡ  Ｅｎｔｒｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  ａｎｔｉ−ＲＥＰｓ）は、（家畜および野生の）  動物および将来人間に発生するかもしれないウイルス病に対して使用され得る即座に手に入る方法を与えるがために極めて有用である。ＰＲＲＳウイルスに対するＣＤ１５１  のようなＲＮＡ  結合蛋白質の同定とメカニズムを理解することが重要であり、また抗ＲＮＡ  エントリー化合物（抗ＲＮＡ  エントリー蛋白質）  のカテゴリーに属する化合物の発見が重要である。細胞にＰＲＲＳウイルスが侵入することを防げる１つの潜在的な方法は、ＰＲＲＳウイルスＲＮＡ  がＣＤ１５１  と相互作用するのをブロックするステップを含んでいる。このブロック（妨害）  は、好ましくは、細胞が抗ウイルス化合物、好ましくは抗ＲＮＡ  エントリー化合物と接触することを伴う。これら抗ウイルス化合物は、ＣＤ１５１  の結合サイトを占めるようにデザインされており、これによってウイルスＲＮＡ  −ＣＤ１５１  間相互作用をブロックする。好ましくは、これら抗ウイルス化合物は、ＰＲＲＳウイルスＲＮＡ  よりも、これら結合サイトに対してより大きな結合力（アビディティー  ）とともにより大きな親和性（アフィニティー）を有する。
【００２６】
本願発明の他の態様は、ＣＤ１５１  のＲＮＡ  に結合する能力であり、そしてこれは、ＲＮＡ  結合活性を有するテトラスパン分子（ｔｅｔｒａｓｐａｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）についての最初の報告である。この発見は、ＰＲＲＳウイルスまたはウイルスＲＮＡ  がこのテトラスパンに結合し、そうすることによりエンドソーム（細胞のエンドサイトーシスによって形成された小胞構造）から細胞の細胞質へと放たれることを防ぐ、新規クラスの化合物を開発するために用いられる。コンビナトリアル・ケミストリ（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）  およびハイスループット・スクリーニングシステム（ａ  ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）によるスクリーニングとを用いることにより、ＰＲＲＳウイルスを処置するための母核となる化合物（ｌｅａｄ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）  を見つけることができ、また強力な抗ＲＥＰ  化合物が改変ノースウェスタンアッセイ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  ａｓｓａｙ）  により見出され得る。
【００２７】
豚ＣＤ１５１  に関連して、本願発明は豚ＣＤ１５１  のゲノム塩基配列を規定し、豚ＣＤ１５１  ｍＲＮＡがサル、マウス、ラットおよびヒト由来の既知のＣＤ１５１  と約８４％以下の塩基配列相同性を有することを結論づけた。しかしながら、豚ＣＤ１５１  のイントロン部分は他の既知のＣＤ１５１  イントロン塩基配列との相同性がほとんどないか全くないということが結論づけられた。豚ＣＤ１５１  の塩基配列は本願に、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４として与えられている。豚ＣＤ１５１  とＣＤ１５１  の他の既知の塩基配列の間で共有される部分はより低い相同性を持つことから、豚ＣＤ１５１  塩基配列と８４％以上の塩基配列相同性を有する塩基配列は、既知のＣＤ１５１  の中にはそのような高い程度の相同性を有するものがないため、本願発明に含まれると考えられる。好ましくは、本願発明を実施する際に用いられる塩基配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４と少なくとも９０％の塩基配列相同性を有し、あるいは更により好ましくは  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４  と少なくとも９５％の塩基配列相同性を有する。より好ましくは、選択された塩基配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４と少なくとも９８％の塩基配列相同性を有する。そのうえ、ＣＤ１５１  を構築する際に、ここに  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５−２９としてリストされた塩基配列と同様な相同性を有するエクソンおよびイントロンを用いることが望ましい。換言すれば、ＣＤ１５１  の全ての部分が  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏｓ  １５−２９  と一定程度の相同性を共有することが好ましい。ＣＤ１５１  のエクソンの場合に、相同性は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５，１７，１９，２０，２２，２４，２６，  および  ２８  のようにリストされた不連続の（ｄｉｓｃｒｅｔｅ）エクソンの各々に対して少なくとも８４％であることが好ましい。より好ましくは、相同性は、少なくとも９０％であることが好ましく、更により好ましくは少なくとも９５％であることが好ましい。もっとも好ましくは、各々のＣＤ１５１  塩基配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５，１７，１９，２０，２２，２４，２６，  および２８の各々と少なくとも９８％の塩基配列相同性を有する塩基配列を含むべきである。イントロンの場合には、豚ＣＤ１５１  イントロンが既知のいかなる塩基配列とも相同性を全く有していないため、相同性はそれほど高い必要はない。
【００２８】
豚ＣＤ１５１  は心臓、筋肉および内皮細胞において高レベルで発現することが結論づけられた。そのうえ、耳切り欠き生物材料（ｅａｒ  ｎｏｔｃｈ  ｂｉｏｐｓｉｅｓ）、あるいは精液および卵子の各サンプルについてのよりユーザーフレンドリーな（使いやすい）ＰＣＲにより豚における豚ＣＤ１５１  をスクリーニングすることを可能とする方法を提供する。
【００２９】
豚ＣＤ１５１  は、またＰＲＲＳウイルスの３’非翻訳領域とＲＮＡ  結合活性を有することが、ノースウェスタンアッセイ（ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  ａｓｓａｙ）によって示され、この活性はノースウェスタン  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｓｈｉｆｔ  ａｓｓａｙ  により、ＣＤ１５１  のエキソドメインである、エクソドメイン１および２（ｅｘｏｄｏｍａｉｎ  １  ａｎｄ  ｅｘｏｄｏｍａｉｎ  ２）  中に位置づけられることが示された。最後に、本願発明は豚ＣＤ１５１  の量とアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）  とが、組織のタイプ、豚の年齢および豚の交配に拠る、異なる豚の組織によって変化することを示す。
【００３０】
ＰＲＲＳウイルスは、豚における深刻な経済的損失を引き起こす＋鎖ＲＮＡ  ウイルスである。これまでの研究は、アンテリウイルスの３’非翻訳領域が細胞蛋白質との相互作用を通してウイルスの複製において重要な役割を演じているということを示してきた。ＭＡＲＣ細胞のｃＤＮＡライブラリーがλ  ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓベクター中に構築され、そのライブラリーは、［α−３２Ｐ］ＵＴＰで放射性標識したＰＲＲＳウイルスの＋鎖３’非翻訳領域  ＲＮＡでスクリーニングされた。１．４  ｋｂの挿入を持ったＲＮＡ  結合クローンが見出され、塩基配列決定の後、その１．４  ｋｂの挿入の塩基配列は、テトラスパンファミリーの蛋白質に属する膜透過蛋白質である、ＣＤ１５１  との相同性を示していた。ＭＡＲＫおよびＢＨＫ−２１細胞は、ＣＤ１５１  プラスミドによってトランスフェクトされ、その融合蛋白質は抗−Ｌａｃ  Ｚおよび抗ＣＤ１５１  抗体と免疫沈降した。ノースウェスタンブロッティング（Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）  において、その沈降した２９ｋＤの蛋白質が放射性標識した３’非翻訳領域と相互作用した。ＣＤ１５１  の正確な機能は分かっていないが、ＣＤ１５１  が細胞間接着（ｃｅｌｌ−ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ）、血管透過の調節（ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ）  および膜透過のシグナル伝達（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）  においてそれぞれ役割を演じていることが示された。ＢＨＫ−２１細胞系列は、ＣＤ１５１  を欠いており、ＰＲＲＳウイルス感染に対して感受性がない。しかし、ＢＨＫ−２１細胞系列がＣＤ１５１  プラスミドによってトランスフェクトされたときには、ＰＲＲＳウイルス感染に対して感受性となった。同様に、非サル細胞系列がＣＤ１５１  によって形質転換され、ＰＲＲＳウイルスを増殖させて高力価にするために用いられる。
【００３１】
ＰＲＲＳウイルス  ３’  非翻訳領域に結合する細胞蛋白質を同定するために、ＭＡＲＫ細胞発現ライブラリーのＲＮＡ  リガンドスクリーニング（ＲＮＡ  ｌｉｇａｎｄ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）が実施された。更に、この報告は、１つのテトラスパン分子であってＣＤ１５１  とも称される、Ｐｌａｔｅｌｅｔ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｔｅｔｒａｓｐａｎ  Ａｎｔｉｇｅｎ−３（ＰＥＴＡ−３）のＲＮＡ  結合特性およびＰＲＲＳウイルス感染におけるこのＰＥＴＡ−３の役割についての最初の報告である。ウイルスが受容体に結合し（  蛋白質−蛋白質相互作用）  、エンドソームにおいて細胞に入り込むということが知られている。低いｐＨ条件において、ウイルスは構造的な非組織化（ｄｉｓｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）  を行い、ウイルスＲＮＡ  をエンドソームに放出する。しかしながら、ウイルスＲＮＡ  がエンドソームにおいて細胞質へ侵入する方法は分かっていない。本願発明は、ＣＤ１５１  のようなＲＮＡ  結合蛋白質が、ウイルスの複製を活発にするため、ＰＲＲＳウイルスが細胞質へ入るのを助けることを明示する（図９）。
【００３２】
本願発明は、また、豚ＣＤ１５１  のｍＲＮＡ塩基配列につながるＤＮＡ  塩基配列をも決定するが、この配列は本願で  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３８  として与えられている。本願発明の目的のために、  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３８  と少なくとも８４％の塩基配列相同性を有するＤＮＡ  塩基配列に対応するｍＲＮＡ塩基配列を用いることが好ましい。そのＤＮＡ  塩基配列は  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３８  と少なくとも９０％の塩基配列相同性を持つことがより好ましく、少なくとも９５％の相同性を持つことが更により好ましく、少なくとも９８％の塩基配列相同性を有することが最も好ましい。
【００３３】
本願発明は、またＣＤ１５１  をコードするＤＮＡ  塩基配列をも与える。起源が非サルであるＣＤ１５１  をコードするＤＮＡ  塩基配列を用いる場合には、そのような塩基配列は豚ＣＤ１５１  由来のものであることが好ましく、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４と塩基配列相同性が少なくとも８４％であることが好ましい。より好ましくは、そのＤＮＡ  塩基配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４との塩基配列相同性として少なくとも９０％を有していること、より好ましくは少なくとも９５％、そして最も好ましくは少なくとも９８％の塩基配列相同性を有しているものであること。豚ＣＤ１５１  のゲノム塩基配列は、表２  に要約されたイントロンとエクソンの組み合わせである。上記述べたように、その豚ＣＤ１５１  のエクソンは、他の既知のＣＤ１５１  塩基配列と８４％以下の塩基配列相同性を共有し、豚ＣＤ１５１  のイントロンはいかなる既知の塩基配列とも相同性を共有していなかった。したがって、非サル起源のＣＤ１５１  塩基配列を構築し使用することが望まれるときには、そのイントロンを少なくとも１つ有するＤＮＡ  塩基配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６，１８，２１，２３，２５，２７  および２９からなるグループから選択される塩基配列と少なくとも８４％の相同性を有するイントロンを少なくとも１つを有していることが好ましい。同様に、そのＤＮＡ  塩基配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５，１７，１９，２０，２２，２４，２６および２８からなるグループから選択された塩基配列と少なくとも８４％の相同性を有するエクソンを少なくとも１つ有していることが好ましい。
【００３４】
本願の他の態様として、ＰＲＲＳウイルスに対する有効な免疫を誘発するワクチンが与えられる。ワクチンは非サルＣＤ１５１  により形質転換された非サル細胞系列において作り出されるウイルスの子孫を含む。好ましくは、ＣＤ１５１  は豚を起源とするものであること。さらにより好ましくは、ＣＤ１５１  は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４と少なくとも８４％の塩基配列相同性を有するものであること。
【００３５】
本願発明の他の態様として、一塩基多形（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）  がＰＲＲＳウイルスに対する感受性に及ぼす効果を決定する方法がある。その方法は一般に、少なくとも二つのＣＤ１５１  ゲノム塩基配列を得るステップ、その塩基配列間で一塩基多形を比較するステップおよび一塩基多形をＰＲＲＳウイルスに対する感受性と相互に関連づけするステップを含む。
【００３６】
最後に、本願発明は個々の豚の間でＰＲＲＳウイルス感受性ファクターを比較する方法を与える。その方法は、一般に、少なくとも二匹の豚の遺伝子塩基配列を得るステップ、ＣＤ１５１  遺伝子をコードする塩基配列の量を解析するステップおよびＣＤ１５１  遺伝子をコードする塩基配列の量を比較するステップを含む。豚の遺伝子塩基配列は、耳ノッチまたは尻尾スニップからのバイオプシーを採取し、ＣＤ１５１  塩基配列を決定するためそのバイオプシー上でＰＣＲ  を実施することにより得られる。そのような方法を用いて得られた情報は、発現量をＰＲＲＳウイルスに対する感受性と相互に関連づけるためにも、用いられ得る。
【００３７】
発明の実施の形態
次の実施例は、本願発明の好ましい形態を示す。しかしながら、これらの実施例は、例示の方法により示したが、それら実施例のいかなるものも本願発明の全範囲の内にいかなるに制限を加えるものと考えてはならない、と理解されるべきである。
【００３８】
ここに使用されるように、つぎの諸定義が適用される。「配列の同一性（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）  」とは、当該技術において知られているように、二つまたは三つ以上のポリペプチド配列の間の関係、あるいは二つまたは三つ以上のポリヌクレオチド配列の間の関係、すなわち参考配列（ａ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）とその参考配列と比較されるべき特定の配列（ａ  ｇｉｖｅｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）との関係を指している。配列の同一性は、比較される配列同士を、それら配列のひとつながり（ｓｔｒｉｎｇ）の間で対（ｍａｔｃｈ）  を作ることによって決定されるような、配列の程度が最大となるように最適に並べられたのち、特定の配列を参照配列と比較することによって決定される。そのように並べると、配列の同一性が、１つ１つの位置（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）ごとに、確かめられる。すなわち、特定の位置で両者の配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が同一であるならば、その配列はその特定位置で「同一」である。そのような位置同一性の総数は、そこで参考配列中のヌクレオチドあるいはアミノ酸残基の総数で割り、百分率にて配列同一性を得る。配列同一性は、以下の文献に記載されている公知の方法を含むがこれらに限定されない公知の方法によって即座に計算され得る。Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｎ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８），  Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，  Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，  Ｐａｒｔ  Ｉ，  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ａ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｎ  Ｈｅｉｇｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，  Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）；ａｎｄ  Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ  Ｊ．ＡｐｐｌｉｅｄＭａｔｈ．，４８：  １０７３（１９８８）  。これらの文献に開示されている内容は、参照として本明細書の内容とする。配列同一性を決定する好ましい方法は、テストされる配列間で最大の対（ｍａｔｃｈ）  を生ずるようにデザインすることだ。配列の同一性を決定する方法は、与えられた配列間の配列同一性を決定する公共に手に入るコンピュータープログラムにおいて、体系化されている。そのようなプログラムの例は、次のものを含むがこれらに限定されるものではない。ＧＣＧ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｐａｃｋａｇｅ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １２（１）：３８７（１９８４）），ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ  およびＦＡＳＴＡ  （Ａｌｔｓｃｈｕｌ��Ｓ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０）．  ＢＬＡＳＴＸ  プログラムはＮＣＢＩおよび他の出所から公けに入手できる。（ＢＬＡＳＴ    Ｍａｎｕａｌ，  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＮＣＶＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ  ２０８９４，  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．，  ２１５：４０３−４１０  （１９９０）  。これらの文献に開示されている内容は、本願で参考として取り込まれている。これらのプログラムは、特定の配列と参考配列の間の配列間同一性が最も高くなるように  ｄｅｆａｕｌｔ  ｇａｐ  ｗｅｉｇｈｔ  を用いて、配列を最適に並べる。１つの実例として、１つの参考ヌクレオチド配列に対して、例えば少なくとも９５％の「配列同一性」を有するヌクレオチド配列を有する１つのポリヌクレオチドとは、その特定のポリヌクレオチド配列がその参考ヌクレオチド配列の１００ヌクレオチド毎に最大で５個までの点突然変異を含むという事以外は、その特定のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列はその参考配列と同一となるということを意味している。換言すれば、その参考ヌクレオチド配列と比較して、少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにおいては、その参考配列におけるヌクレオチドの５％までが、削除されるかもしくは他のヌクレオチドで置き換えられるか、あるいはその参考配列における総ヌクレオチド数の５％までの数のヌクレオチドがその参考配列中に挿入されるということだ。その参考配列のこれらの突然変異は、その参考配列中のヌクレオチドに沿って突然変異が１つづつ個別に散在するか、もしくはその参考配列の内部で１箇所または２箇所以上隣接する位置に突然変異の群（ｇｒｏｕｐ）  を作って散在するかして、その参考配列の５’もしくは３’末端位置で起こることがあり、あるいはこれら両末端位置の間のどこかの場所で起こることもある。これに類似して、１つの参考アミノ酸配列に対して例えば少なくとも９５％の配列同一性を有する特定のアミノ酸配列を有する１つのポリペプチドとは、その特定のポリペプチド配列がその参考アミノ酸配列の各１００アミノ酸毎に最大５個までのアミノ酸の変化を含むことがあるという点を除いては、そのポリペプチドのその特定のアミノ酸配列はその参考配列と同一であることを意味している。換言すれば、１つの参考アミノ酸配列と、少なくとも９５％の配列同一性を有するある特定のポリペプチド配列を得るために、その参考配列におけるアミノ酸残基の５％までが、削除されることがあるか、もしくは他のアミノ酸で置き換えられることがある、あるいは、その参考配列における総アミノ酸残基数の５％までの数のアミノ酸がその参考配列中に挿入されることがあるということだ。参考配列のこれらの変化は、参考配列の残基中に個々に散在するか、もしくは、その参考配列内部の１つあるいはそれ以上の連続する群として散在して、その参考アミノ酸配列のアミノ末端位置もしくはカルボキシ末端位置、あるいはこれら両末端位置の間のどこかの位置で起こるだろう。同一でない残基の位置は、保存的なアミノ酸置換によって異なることが好まし���。しかしながら、保存的置換は、配列の同一性を決定するときに対（ｍａｔｃｈ）  として含まれるものではない。
【００３９】
同様に、「配列の相同性」は、本願で使用されているように、二つの配列の関連性を決定する方法をも指している。配列相同性を決定するために、二つもしくは三つ以上の配列が上記に述べたように最適に並べられ、必要ならばギャップが挿入される。しかしながら、「配列の同一性」に比較すると、保存的（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）アミノ酸置換が配列相同性を決定するときに対として数えられる。換言すれば、１つの参考配列と９５％の配列相同性を有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドを得るために、その参考配列における９５％のアミノ酸残基もしくはヌクレオチドは、他方の配列のアミノ酸またはヌクレオチドと対を作らなければならないか、あるいは他方の配列のアミノ酸またはヌクレオチドに対する対（ｍａｔｃｈ）  の保存的置換を含まなければならない。または、その参考配列における全アミノ酸残基あるいは全ヌクレオチド数の最大５％のアミノ酸数もしくはヌクレオチド数が、保存的置換の数を含まずに、その参考配列に挿入されることがある。
【００４０】
「保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｉｖｅ  ｓｕｂｓｔｉｕｔｉｏｎ）  」とは、あるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドが、サイズ、疎水性等を含む類似の特徴または性質を有する他のアミン酸残基もしくはヌクレオチドと、全般的な機能性が有意には変化しないような置換を指す。
【００４１】
「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」は、その自然の状態から「人の手によって」変化したという事を意味する。すなわち、もし「単離」が自然の中で起こるのであれば、もともとあった自然環境から変えられたもしくは持ち去られた、あるいはその両者であるということを意味している。例えば、生きている生物体中に自然に存在しているポリヌクレオチドもしくはポリペプチドは、「単離された」ものではない。しかしその自然の状態で共存している物質から分離された同一のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドは、「単離」と言う言葉が本願において使用されているように、「単離されて」いるのである。
【００４２】
「細胞物質」とは、細胞、組織、および細胞起源の物質を含む体液を指す。
【００４３】
「抗ＲＮＡ  エントリー蛋白質（Ａｎｔｉ  ＲＮＡ  Ｅｎｔｒｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）  」もしくは「抗ＲＥＰｓ  （Ａｎｔｉ    ＲＥＰｓ）  」とは、ウイルスＲＮＡ  が１つのＲＮＡ  蛋白質に結合することを防ぐ新規クラスの化学薬品（ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）  もしくは化学薬品類似物（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ）を指す。これらの抗ＲＥＰｓは哺乳動物細胞に対して毒性はないが、しかし細胞がＲＮＡ  ウイルスに感染することを防ぐことができる。
【００４４】
実施例１
この実施例は、あとの実験で用いられる、細胞、ウイルスおよびモノクローナル抗体を同定し、記述し、λ  Ｚａｐ発現ライブラリーを調製し、ＰＲＲＳウイルスゲノムの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）  のクローニングおよびプローブ調製を詳述し、ＣＤ１５１  を含む細胞のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを記載し、ＣＤ１５１  を含むプラスミドでの細胞によるトランスフェクションを記載し、そのトランスフェクションが成功し、ＣＤ１５１  がＰＲＲＳウイルスの３’非翻訳領域に結合すると言うことを証明する。
【００４５】
材料と方法：
ＭＡＲＫ、ＣＯＳ−７  、Ｖｅｒｏ、ＣＬ  ２６２１  、ＭＡ−１０４  （アフリカミドリザルの腎臓細胞に由来する）  およびＢＨＫ−２１（Ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ）  細胞系列が本研究で用いられた。ＭＡＲＫ細胞は、１０％牛胎児血清（ＦＣＳ；  Ｈｙｃｌｏｎｅ，  Ｌｏｇａｎ，  ユタ州）  を補充したイーグルの最小必須培地（ＭＥＭ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，メリーランド州）  で成育された。１０％牛胎児血清を補充したダルベッコの最小必須培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  メリーランド州）  は、ＢＨＫ−２１細胞を培養するのに用いられた。ＰＲＲＳウイルスのＡＴＣＣ  ＶＲ  ２３３２株が本研究で用いられた。他に記載されていない限りは、ウイルスは、ＭＡＲＫ細胞中で増殖した。抗ＣＤ−１５１モノクローナル抗体クローンである  １４Ａ２．Ｈ１は、カリフォルニア州  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ    にある  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  から購入した。抗βーガラクトシダーゼモノクローナル抗体クローンである  Ｄ１９−２Ｆ３−２  （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，インディアナ州）  および    抗ＰＲＲＳウイルスヌクレオプロテインモノクローナル抗体（ａｎｔｉ−ＰＲＲＳＶ  ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＭＡｂ）である  ＳＲ  ３０  （Ｒｕｒａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｂｒｏｏｋｉｎｇｓ，サウスダコタ州）  が本研究において使用された。
【００４６】
λ  Ｚａｐ発現ライブラリーを調製するために、ＺＡＰ  発現ｃＤＮＡ合成キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，カリフォルニア州）  を製造者の指示に従って用いて、ＭＡＲＫ細胞系列  ｃＤＮＡライブラリーを調製した。全細胞ＲＮＡ  は、酸フェノール−グアニジニウム  イソチオシアネート法（ｔｈｅ  ａｃｉｄ  ｐｈｅｎｏｌ−ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ  ｍｅｔｈｏｄ）  によって全細胞から抽出した。ｍＲＮＡは、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，カリフォルニア州）  を用いて全細胞ＲＮＡ  から単離し、そこで、５μｇ  のｍＲＮＡを  ｃＤＮＡ  に変換し、λ  ＺＡＰ発現ベクター中に直接クローンした。ｃＤＮＡライブラリーは、ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ｃＤＮＡ  Ｇｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩ  Ｇｏｌｄ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，カリフォルニア州）  を用いてパッケージされた。そのライブラリーの品質は、青色／白色の発色スクリーニングにより、また挿入部分のサイズを確認することにより検証された。
【００４７】
ＰＲＲＳウイルスゲノムの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）  をクローンし、かつプローブを調製するために、フォワードプライマー（ｔｈｅ  ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ）  ５’−ＣＣＣＣＡＴＴＴＴＣＣＴＣＴＡＧＣＧＡＣＴＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３１）  およびリバースプライマー（ｔｈｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ）５’−ＣＧＧＣＣＧＣＡＴＧＧＴＴＣＴＣＧＣＣＡＡＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３２）を用いた  ＴＡ  クローニングにより、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）  が、ＰＲＲＳウイルスＲＮＡ  の  ＲＴ−ＰＣＲ  による増幅によって  ｐＣＲＩＩベクター中にクローニングされた。［α−３２Ｐ］ＵＴＰ  ＲＮＡ  トランスクリプトは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により調製された。ｃＤＮＡはＢａｍＨＩ  で切断され線状とされ（ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ）、ＲｉｂｏｓｃｒｉｂｅＴＭ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ウィスコンシン州）  のＴ７  ＲＮＡ合成キットを用い、製造者の指示に従って  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  で転写された。ＤＮＡ  の鋳型は、１  ＭＢＵ  の  ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  で、３７℃で１５分間切断された。Ｑｕｉｃｋ  ＳｐｉｎＴＭカラム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  インディアナ州）  がフリーのヌクレオチドを除去するために使用された。プローブは、０．３  Ｍ  酢酸ナトリウムと  ２．５倍量の１００％エタノールで、−２０℃で３０分間沈澱させた。プローブの活性は、放射能カウンター（Ｂｉｏｓｃａｎｅ，  Ｉｎｃ．，ワシントン  Ｄ．Ｃ．）で測定した。
【００４８】
次に、ｃＤＮＡライブラリーがノースウェスタンブロッティングにより、前に記載された方法に多少の修正を加えて、スクリーニングされた。スクリーニングの全ての手順を一巡する中で、プラークを、１０ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて、最初のリフト（ｌｉｆｔ）中に  １．５時間誘導し、２度目のリフト中に２時間誘導した。プラークリフト（ｐｌａｑｕｅ  ｌｉｆｔｓ）から移し取ったニトロセルロース膜は、３０分間、６  Ｍの塩酸グアニジニウム中で変性し、１０分毎に、等量の  ＳＢ  緩衝液  （ｓｉｎｇｌｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  ：  １５  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ［ｐＨ  ７．９］；  ５０  ｍＭ  ＫＣｌ，  ０．０１％［Ｖ／Ｖ］  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０；  ０．１％  ［ｗ／ｖ］  Ｆｉｃｏｌｌ  ４００−ＤＬ；  ０．１％［ｗ／ｖ］  ＰＶＰ−４０；  ０．１  ｍＭ  ＭｎＣｌ２；０．１  ｍＭ  ＺｎＣｌ２；  ０．１  ｍＭ  ＥＤＴＡ；  ０．５  ｍＭ  ＤＴＴ）  を交換し徐々に再変性した。プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの間、２５０  μｌ  の一本鎖ＤＮＡ  と５μｌ  （１０  ｍｇ／ｍｌ）の酵母ｔＲＮＡ  が、非特異的結合をブロックするために５ｍｌの  ＳＢ  緩衝液に加えられた。ハイブリダイゼーションは、５００，０００  ｃｐｍ／ｍｌの比活性の３２Ｐ  で放射性標識した、ＰＲＲＳウイルスの３’非翻訳領域  ＲＮＡプローブで、一晩実施された。ＲＮＡ  結合活性はオートラジオグラフィーによって検出された。
【００４９】
対応する陽性プラークは、円筒形に抜き取り、４０μｌ  クロロホルムを加えた１ｍｌのＳＭ緩衝液で、抽出した。クローンの挿入部分は、Ｇｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩ  ｇｏｌｄ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ  を用いて切除した。今や  ｐＢＫ−ＣＭＶベクター中にある、その挿入部分は、Ｓｅｑｕｉｔｈｅｒｍ  ＥＸＣＥＬ  ＩＩ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ  （Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，ウィスコンシン州）  を使い、Ｔ７およびＴ３プライマーを用いて、手仕事で塩基配列を決定した。塩基配列決定は、また、アイオワ州  Ａｍｅｓ  にあるアイオワ州立大学  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（配列研究機関）で実施された。同様な蛋白質を確認するために  ＢＬＡＳＴ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｓｅａｒｃｈを実施した。
【００５０】
ＢＨＫ−２１および  ＭＡＲＫ  細胞系列をトランスフェクトするために、製造者の指示（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  メリーランド州）  に従ってリポフェクタミン試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ｒｅａｇｅｎｔ）  を用い、ＣＤ１５１  を含む  ｐＢＫ−ＣＭＶプラスミドを使用した。瞬間的なトランスフェクションに対して、細胞はトランスフェクションから２４時間後にハーベストされた。安定なトランスフェクションは、ＢＨＫ−２１細胞については１ｍｇ／ｍｌ  の細胞濃度、ＭＡＲＫ細胞については０．７  ｍｇ／ｍｌ  の細胞濃度の生育培地中で、Ｇ４１８（Ｏｍｅｇａ  Ｓｃｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｉｎｃ．，  Ｔａｒｚａｎａ，カリフォルニア州）  選択によってなされた。選択の後、細胞は、ＢＨＫ−２１細胞に対しては０．５  ｍｇ／ｍｌ  の細胞濃度のＧ４１８の存在下で、ＭＡＲＫ細胞に対しては  ０．３５  ｍｇ／ｍｌ  の細胞濃度Ｇ４１８の存在下で維持される。ＣＤ１５１  の発現を、免疫沈降によって測定した。
【００５１】
次に、ＣＤ１５１  がＰＲＲＳウイルスの３’非翻訳領域に結合することを証明するために、免疫沈降したＣＤ１５１  蛋白質のノースウェスタンブロットを実行した。２４穴プレート中でトランスフェクトされた細胞は、１００  μｌ  の  ｓｉｎｇｌｅ  ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ  ８］，  １５０  ｍＭ  ＮａＣｌ，  ＰＭＳＦ  １００μ／ｍｌ  ａｎｄ  １％  ［ｖ／ｖ］  ＮＰ−４０）  中で溶解した。５０μｌ  の細胞溶解物に対して、１μｌ  のモノクローナル抗体（抗ＣＤ１５１  および抗βガラクトシダーゼ抗体）  が加えられ、４℃で一晩振盪した。免疫複合体（ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｌｅｘ）  は、ホルマリン固定した４μｌ  の  Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  を加え、２時間氷上で沈殿させ、１  ０  分間  ４，０００×ｇ  にて遠心した。続いて行う洗浄は全て、１０分間  １２，０００  ×ｇ  にて遠心した。ペレットは冷やしたＴＳＡ（０．０５  Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ  ８．０］；  ０．１５  Ｍ  ＮａＣｌ；  ０．０２５％  ＮａＮ３）と１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  および１％  ＳＤＳで、１回洗った。２度目の洗いは、冷やした  ＴＳＡ中でのみで行い、続いて１ｍＭ  ＥＤＴＡ  を含む  １０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ  ７．５  ］中で２回洗った。ペレットは、２０μｌ  の  ２×ＳＤＳ  ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ中に懸濁させ、１０％ＳＤＳ  を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲル上で電気泳動を行った。蛋白質は、ニトロセルロース膜上にブロットされ、ノースウェスタンブロットが上記に記載されたように実行された。
【００５２】
ＰＲＲＳウイルスの３’非翻訳領域  ＲＮＡに結合する  ＭＡＲＫ  細胞蛋白質を同定するために、ＭＡＲＫ細胞のｃＤＮＡライブラリーが作成され、放射性標識された３’非翻訳領域を用いてノースウェスタンブロッティングによりスクリーニングされた。ＭＡＲＫ細胞のｃＤＮＡライブラリーは、平均挿入サイズが  １−４  ｋｂ  で、１０８  ｐｆｕ  の力価を有していた（データを示してはいない）。約６  ×１０６  のプラークがノースウェスタンブロッティングによりスクリーニングされた。５  回繰り返してプラークの精製と再スクリーニングを行うと、１つだけ反するクローンが得られた。スクリーニングの最後の一巡において、１つだけ単離されたプラークが円柱状に抜き取られ、摘出された。制限酵素による切断において、挿入サイズが１．５  ｋｂであることが分かった（データは示されていない）  。マニュアルに沿った塩基配列決定の後、ＢＬＡＳＴ  ｓｅａｒｃｈを行い、その挿入部分が、１つのテトラスパン分子（ａ  ｔｅｔｒａｓｐａｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）  であるＣＤ１５１／ＰＥＴＡ−３  と９８％の相同性を有することが示された。その挿入の完全長の塩基配列決定も、またアイオワ州  Ａｍｅｓ  にあるアイオワ州立大学  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ  （配列研究機関）  で実施された。その挿入は、開始コドンと終止コドンおよび更に  ｐｏｌｙ（Ａ）  ｔａｉｌ  を有する完全長  ｃＤＮＡ  であった。本願は、サルＣＤ１５１  の完全な塩基配列の最初の報告である。その塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ，  ＡＦ２７５６６６）は、推定上の（ｐｕｔａｔｉｖｅ）膜透過領域に下線を付けて、図１に示した。与えられた塩基配列はサルのものであるが、他の動物種（例えば、豚）  から単離されたＣＤ１５１  の塩基配列も、またこのサルＣＤ１５１  塩基配列との相同性が予想されるため使用され得る。肺胞マクロファージ中に豚ＣＤ１５１  が存在することは、ウェスタンブロットによって証明された（図５参照）  。
【００５３】
ＣＤ１５１  がＲＮＡ  結合活性を有すると言う見解を検証するために、免疫沈降に続いて、Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  を実行した。ＢＨＫ−２１細胞およびＭＡＲＫ細胞の両者は、ＣＤ１５１  の挿入を含む  ｐＢＫ−ＣＭＶプラスミドでトランスフェクトされた（ライブラリースクリーニングで得られた）。ＣＤ１５１  は、Ｌａｃ  Ｚ  融合蛋白質として発現されるので、トランスフェクトされた細胞の溶解物は、抗ＣＤ１５１  モノクローナル抗体および抗β−  ガラクトシダーゼ    モノクローナル抗体の両者により免疫沈降した。図２及び図３で示されるように、対照が陰性であるのに対して、３２Ｐ  で放射性標識したＰＲＲＳウイルスの３’非翻訳領域  ＲＮＡをプローブとして用いたとき、両モノクローナル抗体で免疫沈降した蛋白質は、ＲＮＡ  結合活性を発現した。このことは、発現蛋白質であるＣＤ１５１  は  ＰＲＲＳ  ウイルスＲＮＡ  を結合する活性を有し、ＰＲＲＳウイルスの３’非翻訳領域に結合すると言うことを証明した。図２において、レーン１は  ＭＡＲＫ  細胞溶解物（免疫沈降なし）  を含み、レーン２はトランスフェクトされた  ＭＡＲＫ  細胞を含み、レーン３は、トランスフェクトされた  ＢＨＫ−２１  細胞を含み、レーン４はトランスフェクションを受けていないＭＡＲＫ細胞を含み、レーン５はトランスフェクションを受けていないＢＨＫ−２１細胞を含む。図３  については、レーン１はトランスフェクトを受けていないＢＨＫ−２１細胞を含み、レーン２はトランスフェクトされたＢＨＫ−２１細胞を含み、レーン３は、トランスフェクトされたＭＡＲＫ細胞を含み、レーン４はトランスフェクトを受けていないＭＡＲＫ細胞を含み、図３  のレーン５はＭＡＲＫ細胞溶解物（免疫沈降なし）である。
【００５４】
実施例２
この実施例は、ＢＨＫ−２１細胞によるＣＤ１５１  の発現が、細胞にＰＲＲＳ感染に対する感受性を与えることを決定した。
【００５５】
材料と方法：
（安定なトランスフェクションによって得られた）ＣＤ１５１  を発現するＢＨＫ−２１細胞がＰＲＲＳウイルス感染に対して感受性となるかどうかを決定するために、免疫組織化学染色（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）を実施した。細胞を、２４穴プレート中に播き、ＰＲＲＳウイルスを感染多重度（ＭＯＩ；  ａ  ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）  ０．０１  で３７℃、１時間かけて感染させた。感染度は、感染から２４時間後に免疫組織化学（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）によって決定される。細胞は、アセトン−  ＰＢＳ（３：１，  ｖ／ｖ）  中で、４℃で１０分間固定され、５分間空気乾燥した。一次抗体および抗ＰＲＲＳウイルス核蛋白質（ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）  モノクローナル抗体（ＰＢＳ  で１０００倍に希釈）が加えられ、３７℃で１時間インキュベートした。細胞は、そこでＰＢＳ  中で１回１０分間洗浄し、そして室温で３０分間、ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧビオチン化抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，カリフォルニア州）  でインキュベートした。ＰＢＳ  中で１回１０分間洗浄した後、アビジン−  ビオチン酵素複合体  （Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）を加え、室温で３０分間インキューベートした。細胞を、そこでＰＢＳ  中で１回１０分間洗浄し、１回５分間蒸留水で洗浄し、そこでＤＡＢ  基質を加えて、１０分間暗室でインキュベートした。細胞を、５分間蒸留水中で洗浄し、３０秒間  Ｇｉｌｌ’ｓ−１  ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  で対比染色し、水道水で洗浄し、光学顕微鏡によって検査した。
【００５６】
結果：
この実施例の結果は、図７ａ  および図７ｂに示した。図７ａに描かれた親ＢＨＫ−２１細胞系列は、ＰＲＲＳウイルス感染に対して感受性ではないが、図７ｂに描かれたＣＤ１５１  によって形質転換された組替型ＢＨＫ−２１は、ＰＲＲＳウイルス抗原に対して陽性であり、これによりＰＲＲＳウイルス感染に対する感受性を示している。それゆえＣＤ１５１  を取り込むと、以前はＰＲＲＳウイルス感染に非感受性であったサル細胞系列がＰＲＲＳウイルス感染に対して感受性となった。図２に示されるように、トランスフェクションを受けていないＭＡＲＫ細胞はＣＤ１５１  を含むが、しかるにトランスフェクションを受けていないＢＨＫ−２１はＣＤ１５１  を含んでいない。興味深いことに、トランスフェクションを受けていないＭＡＲＫ細胞は、ＰＲＲＳウイルス感染に対して感受性があり、しかるにトランスフェクションを受けていないＢＨＫ−２１細胞はＰＲＲＳウイルス感染に対して感受性がない。
【００５７】
実施例３
この実施例は、ＣＤ１５１  を過剰に発現する、ＭＡＲＫ細胞の効果を評価するためウイルスバーストアッセイ（ｖｉｒｕｓ  ｂｕｒｓｔ  ａｓｓａｙ）を活用した。
【００５８】
材料と方法：
ＣＤ１５１（実施例１において記述されているような安定なトランスフェクションによって得られる）  を過剰に発現する、ＭＡＲＫ細胞の単層に、感染多重度０．１  で３７℃、１時間、ＰＲＲＳウイルスを感染させた。細胞は、ＭＥＭ  中で２回洗い、１％牛胎児血清（ＦＣＳ）  を補充した１ｍｌ  のＭＥＭ  で表面を覆った。１８時間インキュベートして、細胞は凍結融解（ｆｒｅｅｚｅ  ａｎｄ  ｔｈａｗ）  により溶解し、細胞破砕物（ｃｅｌｌ  ｄｅｂｒｉｓ）  は、５分間１２，０００×ｇ  の遠心によって取り除かれた。上清中のウイルスの量は、親ＭＡＲＫ細胞を用いたプラークアッセイによって滴定した。ＣＤ１５１  過剰発現がＰＲＲＳウイルス複製に与える効果が少しでもあるか無いかを決定するために、ＭＡＲＫ細胞が、感染量（ｌｅｖｅｌ）  に与える効果について調べられた。ＭＡＲＫ細胞（両親の細胞系列、およびＣＤ１５１  を過剰発現するトランスフェクションを受けた子孫細胞系列の両方）  は、プラークから精製した等しい量のＰＲＲＳウイルスを感染させ、１回の完全な複製周期の間（１８時間）  成長させた。ＰＲＲＳウイルスの量は親ＭＡＲＫ細胞を用いたプラークアッセイによって測定される。プラークアッセイにおいては、上清を１０回繰り返して連続希釈して得た１００  μｌ  の希釈液が上記に記載したように感染用に用いられた。感染後、単層がＰＢＳ  中で１回、ＭＥＭ  中で１回洗浄され、そして１％ＦＣＳ  および１％寒天を含む１ｍＭ  ＭＥＭ  でその単層の表面を覆った。プラークは、０．０１％  の  ｎｅｕｔｒａｌ  ｒｅｄで染色することにより、３７℃で１  日インキュベーションしたのちに可視化した。
【００５９】
結果：
親  ＭＡＲＫ  細胞に比較して、ＣＤ１５１  を過剰に発現するトランスフェクションを受けた  ＭＡＲＫ  細胞中で、ウイルスの量が約１００  倍に増加した。これらの結果は、図８に示した。これらの結果とが、ウイルスの侵入に関する以前の実験から得られる結果とを組み合わせて考慮すると、ＣＤ１５１  は、ウイルスＲＮＡ  もしくはウイルスの侵入を促進することにより、ＰＲＲＳウイルス感染の量を増加させたのかも知れないと考えられている。それゆえ、ＣＤ１５１  を取り込むことは、ＰＲＲＳウイルスのより高い力価材料（ｓｔｏｃｋ）  を作るために用いられ得る。同様に、一匹の特定の豚でＣＤ１５１  の発現量を決定することは、標準と比較して、ＰＲＲＳウイルス感染に対する感受性についての、１つの指標（ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）を与える。このようにして、その組織もしくは体液に対する平均もしくは標準を確立するために、異なる組織および体液由来の数多くのサンプルが、ＣＤ１５１  量についてアッセイされる。同一の組織もしくは体液から得られるＣＤ１５１  の個体ごとの量は、そこで、動物個体毎のＰＲＲＳウイルス感染に対する感受性を決定するために、この平均もしくは標準と比較され得る。
【００６０】
実施例４
この実施例は、ＭＡＲＫ細胞におけるＣＤ１５１  ｍＲＮＡを検出するために、ＲＴ−ＰＣＲを活用した。
【００６１】
材料と方法：
ＲＮＡ  は、酸フェノールグアニジニウムイソチオシアネート法を用いて、ＰＲＲＳウイルスが感染したＭＡＲＫ細胞から抽出された。ＲＮＡ  の品質は、アガロースゲル電気泳動により評価された。ＲＴ−ＰＣＲは、フォワードプライマー（ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ）  ５’−ＣＣＴＡＣＣＴＧＧＣＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ３３）  およびリバースプライマー（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ）  ５’−ＡＣＡＧＧＣＧＣＡＧＣＡＧＧＴＴＣＣＧＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ３４）  を有する  ＧｅｎｅＡｍｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  ｋｉｔ  （Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，カリフォルニア州）  を用いて実施された。逆転写反応は、４２℃で４５分間、９５℃で１０分間および５℃で５分間の条件で実施された。ＰＣＲ  は９４℃で２分間、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１５秒間の条件で行い、これを２５回繰り返した。それから、７２℃で３０分間の条件で反応させた。生成物は、エチジウムブロマイド（ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）で染色した２％アガロースゲル中で解析された。
【００６２】
結果：
１４９塩基対（ｂｐ）の増幅単位（ａｍｐｌｉｃｏｎ）の増幅を示す  ＲＴ−ＰＣＲ  の予想される結果を、図４に示す。この図中で、ＣＤ１５１  蛋白質のｉｎ  ｖｉｖｏ  結合活性が、感染を受けた  ＭＡＲＫ  細胞溶解物中の  ＣＤ１５１モノクローナル抗体と免疫沈降させた後、ＲＴ−ＰＣＲによって証明された。この図中で、レーンＭは１２３塩基対のラダーであり、レーン１はＰＣＲ  ベクター対照であり、レーン２は感染を受けていないが免疫沈降した  ＭＡＲＫ  細胞系列、レーン３は関連のないｗａｓｐ（Ｃｏｔｅｓｉａ  ｆｏｌｅｐｉｓ）  モノクローナル抗体である、レーン４は  ＵＶ−ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  （ＵＶ−  架橋）  を実施しなかった  ＣＬ２６２１  細胞系列とともに電気泳動した、ＣＤ１５１  モノクローナル抗体で免疫沈降した感染を受けた  ＭＡＲＫ  細胞であり、レーン５は  ＵＶ−ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇを１５分間実施したのち、ＣＤ１５１  モノクローナル抗体で免疫沈降した、感染を受けた  ＭＡＲＫ  細胞であり、レーン６は  ＵＶ−ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇを３０分間実施したのち、ＣＤ１５１  モノクローナル抗体で免疫沈降した、感染を受けた  ＭＡＲＫ  細胞であり、レーン７は  ＵＶ−ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇを４５分間実施したのち、ＣＤ１５１  モノクローナル抗体で免疫沈降した、感染を受けた  ＭＡＲＫ  細胞である。
【００６３】
実施例５
この実施例は、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  を活用することにより  ＣＤ１５１がｉｎ  ｖｉｖｏ  ＲＮＡ  結合活性を有するかどうかを決定した。
【００６４】
材料と方法：
２４穴プレート中の  ＭＡＲＫ  細胞単層は、ＰＲＲＳウイルスを、感染多重度    ０．１  、３７℃で１時間の条件で感染させた。単層は、ＰＢＳ  中で３回、ＭＥＭ  で２回洗い、そして１％胎児牛血清（ＦＣＳ）  を補充したＭＥＭ  に置き換えた。感染から１８時間経過後、細胞はＰＢＳ  中で２回洗い、そこで新しいＰＢＳ  中に表面を覆われ、そして  ＵＶ  ｃｒｏｓｓ  ｌｉｎｋｅｒ  （Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ペンシルベニア州）  に入れて氷上に保持し、３００λの光源から１０ｃｍの距離において、１５分間、３０分間、４５分間ＵＶ照射した。照射の後、ＰＢＳ  は取り除かれ、全細胞は５０μｌ  の  ｓｉｎｇｌｅ  ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒを加えて溶菌させ、そこで氷結および溶解させた。ホルマリン固定した  Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  細胞の替わりに  ＩｇＧが結合したセファロースビーズ（ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｂｅａｄｓ）  を用いた以外、上記記載のように、抗ＣＤ１５１  モノクローナル抗体を用いて免疫沈降を行った。蛋白質の性質を有する物質は、プロテイナーゼＫ（４μｇ／ｍｌ）  で、３７℃で１５分間切断し、そしてＲＮＡ  をフェノール−グアニジニウム法を用いて抽出した。フォワードプライマー（ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ）  ５’ＴＧＧＧＣＴＧＧＣＡＴＴＣＴＴＧＡＧＧＣ’３  （ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ３５）およびリバースプライマー（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ）  ５’ＴＴＣＧＧＧＣＣＧＣＡＴＧＧＴＴＣＴＣＧＣ’３  （ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ３６）  を用いて、ＰＲＲＳウイルスＲＮＡ  が存在するかどうかを決定するために、ＲＴ−ＰＣＲを実施した。
【００６５】
結果：
ＣＤ１５１  がｉｎ  ｖｉｖｏ  ＲＮＡ  結合活性を有するかどうかを決定するために、ＵＶ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇに続いて、ＲＴ−ＰＣＲを実施した。その原理は、ＣＤ１５１  蛋白質と、細胞中のＰＲＲＳウイルスの３’非翻訳領域  ＲＮＡの間に何らかの相互作用があるとすれば、その組成物（ＣＤ１５１蛋白質と、細胞中のＰＲＲＳウイルスの３’非翻訳領域  ＲＮＡ）  は、抗ＣＤ１５１  モノクローナル抗体を加えることによって免疫沈降を起こすはずだと言うものである。ＭＡＲＫ細胞を、ＰＲＲＳウイルスに感染させ、ＰＲＲＳウイルスの３’非翻訳領域  ＲＮＡとＣＤ１５１  の間の相互作用を強めるために、方法の項目中に記載したように  ＵＶ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  が実施された。免疫沈降した組成物は、蛋白質性物質を取り除くためにプロテイナーゼＫで処理された。ＰＲＲＳウイルスの３’  非翻訳領域  ＲＮＡが、図４に示す様に、ＲＴ−ＰＣＲ    による免疫沈降物中に検出された。ＣＤ１５１  蛋白質およびＰＲＲＳウイルスの３’非翻訳領域の間の相互作用は強く、ＵＶ誘導した１５分間のｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  は、ＲＮＡ  をＣＤ１５１  とともに免疫沈降させるのに十分であったが、しかるに非特異的モノクローナル抗体を有する対照は陰性であった。それゆえ、ＣＤ１５１  はｉｎ  ｖｉｖｏ  ＲＮＡ  結合活性を有している。
【００６６】
実施例６
この実施例は、ＭＡＲＫ    細胞蛋白質、ＢＨＫ−２１    細胞蛋白質および  Ｖｅｒｏ  細胞蛋白質においてＣＤ１５１  を検出するためにウェスタンブロッティングを活用した。
【００６７】
材料と方法：
ＭＡＲＫ、ＢＨＫ−２１およびＶＥＲＯ細胞蛋白質は、１０％  ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動ゲル中で電気泳動され、ニトロセルロース膜上にブロットされた。ＰＢＳ  中の５％ノンファットドライミルク（ｎｏｎ−ｆａｔ  ｄｒｉｅｄ  ｍｉｌｋ）中で一晩ブロッキングした後、その膜は室温で５時間、抗ＣＤ１５１  モノクローナル抗体（ＰＢＳ−Ｔ  中で、１：２，０００  の比率）中でインキュベートした。その膜は、２回、ＰＢＳ−Ｔ  中で１５分間洗浄し、抗マウスＨＲＰＯ複合抗体（１：１０，０００）中で室温で２時間インキュベートした。洗浄後全蛋白質は、製造業者の指示（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  メリーランド州）  に従い  ３’，３’，５’，５’−ｔｅｔｒａ−ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ，  ＴＭＢ  膜ペルオキシダーゼ基質によって検出された。
【００６８】
結果：
感受性細胞においてＣＤ１５１  が存在することを、抗ＣＤ１５１  モノクローナル抗体を用いて、ウェスタンブロッティングにより決定した。図５および図６に示すように、ウイルス感受性のＭＡＲＫ細胞はＣＤ１５１  蛋白質を有するが、しかるに非感受性のＢＨＫ−２１細胞はその蛋白質を欠いている。その上、トランスフェクションを受けたＢＨＫ−２１細胞（図５、レーン１３）  は、ＣＤ１５１  を有しており、ＰＲＲＳウイルス感染に対して感受性がある。ＣＯＳ−７  細胞のＰＲＲＳウイルスに対する感受性については何も報告されていないが、しかるに、Ｖｅｒｏ細胞においては、ＰＲＲＳウイルスが細胞に入るが、生産的なウイルス感染を結果するものではない。Ｖｅｒｏ細胞は、ＰＲＲＳ感染に要求される他の細胞ファクターを欠いているかも知れない。これらの結果は、ＣＤ１５１  が（ＣＤ１５１  以外に）付加的な細胞内ファクターが関与していた場合に、ＰＲＲＳウイルス感染に対する感受性を決定する上でのファクターの１つであるということを示す。
【００６９】
実施例７
この実施例は、ＣＤ１５１  蛋白質が存在することと、ＰＲＲＳウイルス感染に対する感受性との間の相互関連を決定する。
【００７０】
材料と方法：
ＣＤ１５１  蛋白質が存在することと、ＰＲＲＳウイルス感染への感受性との間で考えられる関係を決定するため、ＣＤ１５１  特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲが感受性のある細胞系列および感受性がない細胞系列をスクリーニングするため実施された。これらの細胞系列は、ＭＡ１０４  、ＭＡＲＫ，Ｖｅｒｏ、ＣＯＳ−７  を含むが、これら細胞のうちの３つは全てアフリカミドリザル（Ａｆｒｉｃａｎ  ｇｒｅｅｎ  ｍｏｎｋｅｙ  ｃｅｌｌｓ）の細胞であるＳＴ，ＢＨＫ−２１、ＭＤＢＫおよびＨＲＴ  （Ｈｕｍａｎ  ｒｅｃｔａｌ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ）に由来している。全ＲＮＡ  が、実施例４に記載されたように抽出され、ＣＤ１５１  の存在が実施例４に記載された手順とプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲによって検出された。
【００７１】
結果：
ＭＡ１０４，  ＭＡＲＫ１４５，  Ｖｅｒｏ，  ＣＯＳ−７  および  ＳＴ  細胞系列において、期待されるサイズである１０５  塩基対の増幅単位  （ａｍｐｌｉｃｏｎ）  が存在した。ＣＬ２６２１，  ＶｅｒｏおよびＣＯＳ−７  細胞系列においては、ＣＤ１５１  の代わりのスプライスされた形態によると考えられる、より高い位置の付加的なバンドがある。ＣＤ１５１  は、ＢＨＫ−２１，  ＭＤＢＫ（図５を参照）  および  ＨＲＴ細胞系列中には存在しない。興味あることに、ＭＡＲＫ１４５  、ＭＡ１０４  およびＣＬ２６２１は、ＰＲＲＳウイルス感染に対して感受性のある細胞系列であるが、しかるに、ＢＨＫ−２１細胞系列は、感受性がない。過去において、ＰＲＲＳウイルスに感受性の唯一の細胞は、サル細胞系列ＣＬ−２６２１  およびＭＡＲＫ−１４５豚肺胞マクロファージであると考えられていた。それゆえ、本願発明は、アクセサリーファクター（ａｃｃｅｓｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）  であるＣＤ１５１  によってトランスフェクトを受けた後も非サル細胞系列はＰＲＲＳウイルスに対して感受性を有するがゆえに、サル細胞系列のみがＰＲＲＳウイルス（Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，８４６，８０５  参照）  感染に対して感受性を有するとの以前の主張に異議を唱えるものである。ＢＨＫ−２１、ＭＡ１０４  、ＣＯＳ−７  、ＳＴ、ＭＤＢＫおよびＨＲＴ１８  細胞系列は、ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＡＴＣＣ），１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，メリーランド州  ２０８５２から入手できる。代表的な受託番号は、ＢＨＫ−２１が  ＡＴＣＣ＃  ＣＲＬ８５４４、ＭＡ１０４  がＡＴＣＣ＃  ＣＲＬ２３７８  、ＣＯＳ−７  が  ＡＴＣＣ＃  ＣＲＬ１６５１、ＳＴが  ＡＴＣＣ＃  ＣＲＬ１７４６、ＭＤＢＫが  ＡＴＣＣ＃  ＣＣＬ２２およびＨＲＴ１８  が  ＡＴＣＣ＃  ＣＣＬ２４４  である。ＭＡＲＫ１４５  細胞系列は、アイオワ州  Ａｍｅｓ  にある  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  （ＮＶＳＬ）から得られ、ＣＬ２６２１はアイオワ州  Ａｍｅｓ  にある上記同じ  ＮＶＳＬ  が専売している細胞系列である。Ｖｅｒｏ細胞系列は、ＡＴＣＣ＃  ＣＣＬ８１  と一致していた。それゆえ、この実施例はＣＤ１５１  がＰＲＲＳウイルス感染において重要な役割を演じているとの更なる証拠を与える。
【００７２】
実施例８
この実施例は、ＣＤ１５１  蛋白質とＰＲＲＳウイルス蛋白質の間に直接の蛋白質−  蛋白質相互作用が無いことを決定し、ＣＤ１５１  がアクセサリー蛋白質（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ）  であり、ＰＲＲＳウイルスの受容体ではないと言うことを証明した。
【００７３】
材料と方法：
ＣＤ１５１  がＰＲＲＳウイルス感染のために必須であるということを確立した後に、ＰＲＲＳウイルス蛋白質とＣＤ１５１  との間に、直接の相互作用があると言う可能性が共免疫沈降法  （ｃｏｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）により決定された。感染を受けたＭＡＲＫ細胞は、ＣＤ１５１  モノクローナル抗体と免疫沈降し、免疫沈降物におけるＰＲＲＳウイルス蛋白質の存在が、一次抗体としてのＰＲＲＳウイルスポリクローナル抗体および二次抗体としての抗豚  ＨＲＰＯ  によって検出され、ＥＣＬ  ウェスタンブロット検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ニュージャージ州）  によって検出された。共免疫沈降法は、最初に  ＰＲＲＳ  ウイルスポリクローナル抗体で免疫沈降させ、一次抗体としてのＣＤ１５１  モノクローナル抗体および二次抗体としての抗マウス  ＨＲＰＯ  により免疫沈降物中にＣＤ１５１  が存在するか否かをチェックすることによっても実施された。
【００７４】
結果：
ＣＤ１５１  とＰＲＲＳウイルス蛋白質との間に直接の相互作用はない。このことは、ＣＤ１５１  の受容体としての可能性を除去する。しかしながら、このことは、ＣＤ１５１  とＰＲＲＳウイルスとの間に間接的相互作用があると言う可能性を除くものではない。間接的な相互作用があるとすれば、ＣＤ１５１  と  ＰＲＲＳ  ウイルスの蛋白質の間に相互作用を備え、かつこれを完了することができる更にもう１つの別の蛋白質を確認することが必要になるだろう。それゆえ、ウイルスＲＮＡ−蛋白質相互作用が検証されてきた。しかし、ＣＤ１５１  とＰＲＲＳウイルス蛋白質の間には、直接的な蛋白質−  蛋白質間相互作用はない。したがって、ＣＤ１５１  は、ＰＲＲＳウイルス力価を上げ、そしてこれによってウイルスＲＮＡ  の侵入を増進しかつ媒介するがゆえに、アクセサリー蛋白質であって、受容体蛋白質ではない。
【００７５】
実施例９
この実施例は、ウイルスＲＮＡ  とＣＤ１５１  の間の相互作用を止めるために使われる化合物を発見するための方法を説明し、抗ＲＮＡ  エントリー蛋白質と呼ばれる新規クラスの抗ウイルス化合物を規定する。
【００７６】
材料と方法：
本願発明に基づくと、ウイルスＲＮＡ  の細胞への侵入が、ウイルスＲＮＡ  とＲＮＡ  結合蛋白質との間の相互作用によって媒介されているようである。このテストは  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  で簡単に実施され得る。ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｙｓｔｅｍ処理によって、ＣＤ１５１  もしくは完全長ＣＤ１５１  それぞれの中心部分（ｍｏｔｉｆ）  は、ニトロセルロース上に、もしくは何らかの固体を結合したマトリックス中に、自動化装置を使ってスポットされる。薬剤が存在しない陰性対照において、一本鎖ＤＮＡ  の形態のＲＮＡ  の結合  ａｐｔａｍｅｒ（低分子化合物）は、蛍光標識をしたのち、引き続いて電気泳動のウェル中に加えることができる。薬剤が存在しなければ、蛍光の最大レベル（１００％）もしくは結合活性が観察される。どんな種類の未知化合物をプレートに加えるてもよい。オリゴヌクレオチドとＲＮＡ  に結合する  ａｐｔａｍｅｒとの結合をブロックする化合物は、ＰＲＲＳウイルスＲＮＡ  が細胞中へ侵入することをブロックするために使用され得る、有効でかつ無毒性の化合物を見出すために、更に改変される。同様な原理が、非常に多用な動物ウイルスに対する処置法を発見するために用いられ得る。この新規なクラスの薬剤は、今まで文献中に記載されていなかったと考えられる。
【００７７】
その代わりに、酵母のハイブリッドシステム（ｙｅａｓｔ  ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ）  が発見されたため、ＰＲＲＳウイルスの３’非翻訳領域  ＲＮＡおよびＣＤ１５１  蛋白質は、これら二者間の相互作用をブロックする化合物を発見するために酵母トリハイブリッドシステム（ｙｅａｓｔ  ｔｒｉ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ）  に適用され得る。
【００７８】
実施例１０
本実施例は、ＣＤ１５１  ｍＲＮＡおよび生存する豚から生まれ得る子孫のＰＲＲＳウイルスに対する感受性の程度（ｌｅｖｅｌ）  に関して、その生存する豚および貯蔵された生殖細胞質をスクリーニングする中で、本願発明を活用するための非侵襲性方法を示す。加えて、本実施例は実施例４に類似しており、生きた雄豚の精液をスクリーニングする中で本願発明の応用を例示的に説明し、かつ本願発明の応用を、ＰＲＲＳウイルス感染に対する豚の抵抗性を改良するための豚育種プログラムの中で、未来世代の次のリッター（同腹子、ｌｉｔｔｅｒ）へと進展する。
【００７９】
材料と方法：
本願発明に基づくと、標的細胞のＰＲＲＳウイルスに対する感受性を決定する中でＣＤ１５１  の量が１つの重要なファクターであることは明らかである。豚の異なる育種系統が、肺胞マクロファージ、精液、生殖細胞、卵子および血小板のような細胞物質におけるＣＤ１５１  量に関して、定量的ＲＴ−ＰＣＲによってスクリーニングされる。標的器官において少ない量のＣＤ１５１  を有する豚の系統は、ＰＲＲＳウイルスに対してより感染しづらいと期待され、よってＰＲＲＳ感染による有害な効果の影響をより受けにくいと期待されている。現状は、感染後の屠殺に基づいて、豚を選択し交配を行っている。比較的少ない量のＣＤ１５１  を有していることが分かった動物を、ＰＲＲＳウイルスに感染しづらくなるよう選択的に交配する。このことが、豚をチェックする非侵襲方法を可能にする。ＣＤ１５１  ノックアウト実験の助けを借りることにより、ＰＲＲＳウイルスに全く感染しない豚系統を開発することが可能となる。
【００８０】
結果：
本実施例は、本願発明がＰＲＲＳウイルスで実験的に感染させた後に豚の感染しやすさを決定するためには豚の種々の系統を屠殺すると言う現在の限界を克服するものであると言うことを、説明する。末梢血液の血小板、貯蔵された生殖細胞質、もしくは希釈された豚生殖細胞質および希釈なしの豚生殖細胞質のような非侵襲性の診断方法を用いて、豚育種操作により、ＰＲＲＳウイルスに感染しづらくなった動物を選択することができるはずである。
【００８１】
実施例１１
本実施例は、異なる豚育種系統におけるＣＤ１５１  の定量を可能とする。
【００８２】
材料と方法：
本実施例は、プラスミド  ｐＫＳＵ  が定量的な目的で用いられるということを除き、実施例４に類似している。このプラスミドは、ＣＤ１５１  の完全長オープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅｓ）  を含む。既知の量（例えば、０．０５μｇ）のこのプラスミドが  ＰＣＲチューブに入れられ、異なる豚組織中に予想されるＣＤ  １５１量の範囲をカバーするように希釈された、所定のサンプルの希釈溶液が加えられ、これによってあらかじめ定量された既知の標準を与える。未知の豚サンプル中のＣＤ１５１  の量が、既知の標準曲線と比較することにより定量される。加えて、豚組織中のＣＤ１５１  の正確な量を見出すために、ＣＤ１５１  に対する定量的  ＴａｑＭａｎ  を実施することができる。これによって、生殖細胞質および末梢血血小板において、既知の豚組織の１ｍｌあたりもしくは１ｇ  あたり、生殖細胞質１ｍｌあたり、または１００万の豚血小板あたりもしくは１００万の豚精子（ｓｐｅｒｍａｔａｚｏａ）  あたりのピコグラムからナノグラムの量で、ＣＤ１５１  の正確な定量を得られる。
【００８３】
結果：
定量的ＣＤ１５１  ＲＴ−ＰＣＲにより、ＣＤ１５１  が少ない豚育種系統が、ＰＲＲＳウイルスに感染しづらくなる豚を育種するために選択される。
【００８４】
実施例１２
本実施例は、ＰＲＲＳウイルスを管理しもしくは防ぐためにより高い力価を持ちよりかつ安全なワクチンの生産を行うための非サル、組替型細胞系列の使用を例示的に説明する。
【００８５】
材料と方法：
本願発明に基づいて、ＣＤ１５１  によって形質転換された、非サル細胞系列は、ＰＲＲＳウイルスに感染し易いのみではなく、親細胞系列以上により高い力価になるようＰＲＲＳウイルスを増殖させる。最初に、本願発明の属する分野において公知の方法を用いて、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、豚パルボウイルス（ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、および  ＢＶＤウイルスのような混入に対してチェックされる。一旦その細胞系列について、これらの雑菌混入がないと分かれば、細胞系列はフラスコもしくはローラーボトル（ｒｏｌｌｅｒ  ｂｏｔｔｌｅ）  中で培養され、プラークから精製したＰＲＲＳウイルスを感染させた。米国産単離株である  Ｌｅｌｙｓｔａｄ  ｖｉｒｕｓ  もしくは他のいずれかの  ＰＲＲＳ  ウイルスの分離株が用いられた。細胞培養は６０時間の間、ウイルス感染を受け、−８０℃で凍結され、凍結溶解を３回繰り返した。細胞物質を取り除き、澄んだ上清を、滴定を行った後にワクチンとして用いる。１００  万  ＰＦＵｓ／ｍｌでワクチンを使用することが薦められ、そのワクチンの投与量は非経口アジュバント（ｔｈｅ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ）の存在の下で、筋肉注射用に１ｍｌである。このワクチンは高い力価を持つために、１バイアルあたりの特定の投与量を決めるために、更に希釈され得る。別法として、本願発明の技術分野において既知となっている多様な組み合わせが適用され得る。本願発明に含まれる全ての操作と改変は、動物ワクチンの生物学的製剤（ｂｉｌｏｇｉｃｓ）を調製する分野において、おきまりの手順（ｒｏｕｔｉｎｅ）  である。
【００８６】
結果：
前述の材料と方法で、非サル細胞系列におけるＰＲＲＳウイルスに対する、安全で高力価の不活化ワクチンもしくは改変生ワクチンが生成される。
【００８７】
実施例１３
本実施例は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断アッセイの開発を目的としてＰＲＲＳウイルスを増殖させるために非サル細胞系列を応用することを示す。
【００８８】
材料と方法：
有利なことに、鼻から綿棒で分泌物を採集したサンプル（ｎａｓａｌ  ｓｗａｂ）、肺もしくはリンパ節のような組織、またはＰＲＲＳウイルス感染、堕胎もしくは呼吸器系疾患が疑われる各症例を有する豚由来組織のプールのような臨床サンプル由来の野生型ウイルスを増殖させるために、非サル細胞系列がウイルス感染に対するより高い感受性を有すると言う理由によって、これら非サル細胞系列をＰＲＲＳウイルスを増殖させるために使用することができる。これらの細胞は、約７２時間経過して単層がコンフルエントになるまで培養され、サンプルが接種され、そして細胞系列が  ＳＤＯＷ  １７  ＦＩＴＣ  複合抗体（ＳＤＯＷ  １７  ＦＩＦＣ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を用いた蛍光抗体テストによりウイルスが存在するか否かがチェックされている。実施例１２で生産されたような、増殖したウイルスは、エライザプレート（ＥＬＩＳＡ，  ｅｎｚｙｍｅ‐ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）  をコートするために用いられ、ＰＲＲＳウイルス抗体の検出のための酵素免疫測定技術の開発のための標準手順が、Ｗｉｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ−Ｂａｓｅｄ  Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｖｉｒｕｓ，  ７  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ７００−７０２，  （２０００）  の手順を用いて記載されてきたが、これらの文献に開示されている内容は、引用して本明細書の内容とされる。最近、酵素免疫測定法が、豚ＰＲＲＳウイルスをモニターするための最高の標準（ｇｏｌｄ−ｓｔａｎｄａｒｄ）  であるとみなされている。
【００８９】
結果：
野生型ＰＲＲＳウイルスは、ウイルス単離により  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  で検出され得る。加えて、ＰＲＲＳ抗生物質の存在と品質が、これらの免疫診断アッセイを用いて検出され得る。野生型ＰＲＲＳウイルスと抗体を検出し豚の群中にＰＲＲＳ診断を検証するための  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  診断テストを与える他のアッセイは、間接的な蛍光抗体テストおよび間接的免疫ペルオキシダーゼテスト（ｉｎｄｉｒｅｃｔ  ｉｍｍｕｎｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｔｅｓｔｓ）  とを含む。そのようなテストは、本願発明が属する技術分野において公知であり、従来技術のみを用いて開発され得る。
【００９０】
実施例１４
本実施例は、血小板溶解物（ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｌｙｓａｔｅ）  、精子溶解物および豚肺胞マクロファージ溶解物を含む豚体液サンプルをモニターするために使用され得るＣＤ１５１  に、免疫診断用の道具（例えば、定量的エライザ）を応用することを示す。
【００９１】
材料と方法：
蛋白質は、Ｗｉｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００  の方法を用いて定量的に検出される。例えば、豚サンプルにおける  ＣＤ１５１の量は、これらの方法を用いて検出される。サンプルは、凍結融解される。蛋白質の量は、モニターされる。
【００９２】
結果：
本実施例は、定量的  ＣＤ１５１エライザを用いた豚サンプルの大量スクリーニングを可能にする。加えて、１ｍｌの豚サンプルあたりもしくは１ｇ  の組織あたりの量のＣＤ１５１  蛋白質が、これらの方法を用いて検出される。
【００９３】
実施例１５
本実施例は、サル起源以外の起源からのＣＤ１５１  を、以前はＰＲＲＳウイルス感染しなかった細胞系列にＰＲＲＳウイルス感染に対する感受性を与えるために使うことができると言うことを例示的に説明する。
【００９４】
材料と方法：
ＣＤ１５１  を含む細胞物質のサンプルは一匹の豚から得られる。ＲＮＡ  は、前に記載のようにこのサンプルから抽出され、そこで豚ＣＤ１５１  は  ＲＴ−ＰＣＲ  を用いて単離される。単離されたＣＤ１５１  はそこで、以前ＰＲＲＳウイルスに感染しなかった細胞系列にＰＲＲＳウイルスに対する感受性（感染し易さ）  を与えるために使用され得る適切な哺乳動物発現ベクトルの中に入れられる。加えて、そのベクターを予め感受性のあった細胞系列に入れることにより、これらの細胞系列はＣＤ１５１  を過剰発現するために用いられ得る。
【００９５】
結果：
予めＰＲＲＳウイルスに感染しなかった細胞系列は、豚ＣＤ１５１  を含むベクターをその細胞系列に入れた後、ＰＲＲＳウイルスの感染を受け易くなる。予めＰＲＲＳウイルス感受性を有していた細胞系列は、挿入されたＣＤ１５１  を過剰発現できる。それゆえ、いかなる起源由来のＣＤ１５１  であっても非サル細胞系列を含む細胞系列をＣＤ１５１  を発現するように形質転換するのに使われ得る。このことは、ＣＤ１５１（サル、豚等）の起源は本願発明の実施に関連せず、豚もしくは他の同様なＣＤ１５１  配列を用いて、サルＣＤ１５１  を用いた発明の全ての態様もまた成され得る、ということを証明する。
【００９６】
実施例１６
本実施例は、テトラスパンＣＤ１５１もしくは馬ＣＤ１５１のような他の生物種における関連したホモローグ  （ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ、相同物）  は、馬および他の生物種からのアルテリウイルスを増殖させるために使われ得ると言うことを証明する。
【００９７】
材料と方法：
異種生物由来の  （ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）  ＣＤ１５１  配列が、単離され、そして前に記述されたような組替型細胞系列を作成するために用いられる。この細胞系列は、そこで前に記載したようにそのウイルスを単離しかつ増殖させるために用いられる。
【００９８】
結果：
ＰＲＲＳウイルスと同様に、他のアルテリウイルスが単離され、非サル細胞系列を含む同種生物由来（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）のおよび異種生物由来の細胞系列の中で高力価に増殖され得る。それゆえ、他のアルテリウイルスは、アルテリウイルスによる感染に対して予め抵抗性のあった（感染しにくい）  細胞系列中に高力価ワクチンを生産し、およびアルテリウイルスに予め感受性のあった（感染し易い）細胞系列におけるウイルス産生を増加させることを確認する方法において、ＰＲＲＳウイルスと同一の方法で研究され得る。
【００９９】
実施例１７
本実施例は、ＣＤ１５１  のＤＮＡ  塩基配列とゲノム構成を決定する。
【０１００】
材料と方法：
豚ＣＤ１５１  の完全な塩基配列を決定するために、各々のイントロンの塩基配列を決定するために、各々のエクソンの終端から次のエクソンの開始までのプライマーが設計された。プライマーの対は、下の表１に示される。
【０１０１】
【表１】
2005507634.tif 000002
【０１０２】
ゲノムＤＮＡ  は、ゲノムＤＮＡ  抽出キットを使いかつ製造業者の指示（Ｄｎｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ  ｃａｔａｌｏｇ  ＃  ６９５０４，  Ｑｉａｇｅｎ，  Ｖａｌｅｎｃｉａ，  ＣＡ）  に従って、豚肺胞マクロファージ（ＰＡＭ  細胞）から抽出された。ＰＣＲ  は、次のように準備された。ゲノムＤＮＡ    ２００μｇ，１０×ＰＣＲ  緩衝液、２  ｍＭ    ＭｇＣｌ２  、ＤＭＳＯ  ２．５  μｌ  、ｄＮＴＰ    各１０ｎＭおよび各プライマー  ２０  ｐｍｏｌである。９５℃で５分間最初の変性を行った後、２．５  ユニットのＴａｑ  ポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  カリフォルニア州）  がＰＣＲ  反応液に加えられ、次にこれを９５℃で３０秒間、３５サイクル繰り返したのち、各々の遺伝子内領域に特異的なアニーリング温度で１５秒間、７２℃の伸長温度（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）  で１分間、７２℃で４５分間最終伸長の反応を行った。各々の遺伝子内領域に対するアニーリング温度は、次のようである。遺伝子内領域１に対しては５７℃、遺伝子内領域２に対しては５８℃、遺伝子内領域３に対しては５９℃、遺伝子内領域４に対しては５５℃、遺伝子内領域５に対しては５３℃、遺伝子内領域６および７に対しては５７℃である。ＰＣＲ  産物は、１％アガロースゲル電気泳動中で電気泳動され、ＰＣＲ  のバンドは切断され、ｐＧＥＭ−Ｔ    イージーベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，ウィスコンシン州）  にクローンされる。その塩基配列は、そこで、ＳｅｑｕｉＴｈｅｒｍ  ＥＸＣＥＬ  ＩＩ  塩基配列キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ｃａｔａｌｏｇ  ＃  ＳＥＭ７９１００，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ウィスコンシン州）  を用いおよび製造業者の指示に従って手作業により決定した。
【０１０３】
結果：
豚ＣＤ１５１  の塩基配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．  １４  で与えられる。イントロンの塩基配列は、ＣＤ１５１  のヒト、ラットおよびマウスのホモローグ（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）  の塩基配列解析で決定されたように、生物種間で変化することが知られており、この生物種間で変化することは、豚ＣＤ１５１  のイントロンとＣＤ１５１  を有する他の動物のイントロンの間に相同性がほとんどないかもしくは全くないと言うことを示した豚ＣＤ１５１  に対しても当てはまると言うことも今や分かった。
【０１０４】
豚ＣＤ１５１  のゲノム構成は、表２に表されている。イントロンとエクソンはまた、特定のＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  を有するものとして次のように与えられる。ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  １５はエクソン１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  １６はイントロン１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  １７はエクソン２  、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  １８はイントロン２  、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  １９はエクソン３  、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ２０はエクソン４  、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ２１はイントロン４  、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ２２はエクソン５  、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ２３はイントロン５  、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ２４はエクソン６  、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ２５はイントロン６  、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ２６はエクソン７  、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ２７はイントロン７  、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ２８はエクソン８  、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ２９はイントロン８  である。イントロン３を除く全てのイントロンが下記のように同定され、イントロン３の塩基配列は、残りのイントロン配列を得るために用いられる方法に類似した方法を用いて決定される。もちろん、イントロン３の配列がないという場合も有り得る。しかしながらもしイントロン３が存在すれば、豚ゲノムＤＮＡ  を用いてその塩基配列が得られる。
【０１０５】
【表２】
2005507634.tif 000003
【０１０６】
【表３】
2005507634.tif 000004
【０１０７】
発見された豚ＣＤ１５１  塩基配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ  に寄託された  ＥＳＴ塩基配列由来の部分的豚ＣＤ１５１  クローン（受託番号：クローン１−  ＢＥ２３３２６５、クローン２−  ＡＷ３１４２０９、クローン３−  ＡＷ７８６３７９）  とランダムに符号し、ヒトＣＤ１５１  の公表されたゲノム塩基配列と比較された。本願発明までは、これらの前に公表されたランダムなＣＤ１５１  塩基配列は、単に発現研究のためにのみ用いられてきた。そのため、完全長豚ＣＤ１５１  はこれまで決して塩基配列決定がなされなかった。更に、これらのランダム部分  ＥＳＴ配列は、いかなる既知の蛋白質、遺伝子、もしくは機能とも比較されなかった。寄託された  ＥＳＴ配列を使用しても、本質的にＣＤ１５１  の完全な配列ができるようにはならないと言うことに注意することもまた重要である。このことは、豚ＣＤ１５１  の全てのイントロン塩基配列で符合するものがなかったという事実を考慮すると、とりわけ正しい。それゆえ、本願は完全な豚ＣＤ１５１  のｍＲＮＡおよびゲノム塩基配列の最初の報告である。
【０１０８】
図１０は、豚ＣＤ１５１  塩基配列の、模式的な説明である。この図の上部の番号１−８は、ＣＤ１５１  エクソンの位置を表す。エクソンは、またこの図中の垂直方向の長方形で表され、この図で長方形内部に水平線が引いてある。イントロンは、各々のエクソンを結ぶ薄い線で表されている。対角線を持った長方形は、翻訳されない塩基配列を表す。開始コドンはＡＴＧで表され、終止コドンはＴＧＡで表されている。完全な配列は、ポリＡテイル（ｐｏｌｙ−Ａ  ｔａｉｌ）  で終わる。
【０１０９】
実施例１８
本実施例は、ＣＤ１５１  の一塩基多形（ＳＮＰｓ）を確認する。
【０１１０】
材料と方法：
各々のイントロンが、ＳＮＰｓにおける差異を決定し、これらの  ＳＮＰｓ  をＰＲＲＳウイルス感染に対する細胞の感受性と相互に関連づけるために、ＰＣＲ  クローニングにより解析される。ＰＡＭ  細胞由来の各々のイントロンからの塩基配列データは、実施例１７に記述されるようして得られ、プライマーはただ各々のイントロンを増幅するために設計され、そしてそこで様々な感受性のおよび非感受性の細胞系列における対応する各々のイントロンを増幅するのに用いられる。得られたデータは、そこで  ＧＣＧプログラム（ウィスコンシン大学、マヂソン、ウィスコンシン州）  を用いて解析される。
【０１１１】
結果：
いかなる遺伝子のイントロンおよびエクソンにおける一塩基多形（ＳＮＰｓ）であっても、遺伝子発現において重要な役割を演じているかも知れない。イントロンの塩基配列多様性の全体（ｓｕｍ）  も、細胞中の遺伝子の発現において重要な役割を演じるかも知れず、これによってＰＲＲＳウイルス感染に対する感受性の多様性につながるかも知れない。
【０１１２】
実施例１９
本実施例は、豚ＣＤ１５１  の染色体上の位置決め（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）を決定する。
【０１１３】
材料と方法：
染色体上の位置決めは、蛍光  Ｉｎ−Ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）により実施された。染色体のスプレッド（ｓｐｒｅａｄｓ）が標準的方法によって調製された。白血球がヘパリン処理された血液から採取され、赤血球（ＲＢＣｓ）が溶解されて、染色体がスライド上に広げられた。スライドは  ２×ＳＳＣ  、７０％ホルムアミド中で７０℃で変性された。スライドはそこで、ビオチン標識したプローブ（ｇｅｎｏｍｉｃ  ＣＤ１５１）  でインキュベートされた。ハイブリダイゼーション後の洗浄が標準方法により実施され、その結合は、  Ｒｏｌａｎｄ  Ｍ．  Ｎａｄｏｒｅ  ｉｎ  Ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎ−Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｗｈｏｌｅ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；  ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｌｏｒｅｔｔｅ  Ｊａｖｉｓ  （ｐａｇｅｓ  ３７１−３７７）によって記載されている様に、フルオレセイン標識したアビジンを用いた標準的方法によって検出されたが、これらの文献に開示されている内容は、引用して本明細書の内容とされる  （Ｎａｄｏｒｅ，  Ｒｏｌａｎｄ  Ｍ．  １９９９  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  （２ｎｄ  ｅｄ．），  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｐａｇｅｓ  ３７１−３７７）  。
【０１１４】
結果：
豚ＣＤ１５１  の染色体上の位置を確認することに加えて、本実施例はまた、この染色体と関連している他の病気の位置を特定するために助けとなる。このことは、ＣＤ１５１  遺伝子が他の病気に対して抵抗性の遺伝子、もしくは肉質特性（ｍｅａｔ  ｃａｒｃａｓｓ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｔｒａｉｔｓ）  のような育種状態に影響を与える生産特性と結びつくかも知れないと言う点で、従来技術を超える明確な進歩を与えるだろう。遺伝子の位置特定はＣＤ１５１  を選択すると言う付帯的効果を予想するのを助ける。一旦、この染色体に関連した他の病気が、ＣＤ１５１  と相互に関連しているならば、育種のための戦略を開発することができる。もちろん、ＰＲＲＳウイルス抵抗性を選択し、なおかつ肉質を維持することができることが最も望ましい。
【０１１５】
実施例２０
本実施例は、豚ＣＤ１５１  遺伝子の転写特性（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｆｉｌｅ）  を与える。
【０１１６】
材料と方法：
いろいろな感受性のおよび非感受性の組織が豚から採取され、その組織は、そのＲＮＡ  が  Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ  ａｎｄ  Ｓａｃｃｈｉ，  Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ａｃｉｄ  Ｑｕａｄｎｉｄｉｎｉｕｍ  ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−ｐｈｅｎｏｌ−ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ．６２  Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５６−１５９．（１９８７）によって記述されている酸グアニジニウムおよびフェノールクロロホルム法（ｔｈｅ  ａｃｉｄ  ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ  ａｎｄ  ｐｈｅｎｏｌ  ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ  ｍｅｔｈｏｄ）  を用いて抽出されるようにすりつぶされたが、これらの文献に開示されている内容は、引用して本明細書の内容とされる。総ＲＮＡ  は、１％ホルムアルデヒド  アガロースゲル電気泳動にかけ、ナイロン膜に移された。ＣＤ１５１  転写物はそこで、標準プロトコールに従い、放射性標識したＣＤ１５１  ｍＲＮＡプローブを用いた、ノザンブロッティング（Ｎｏｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）により検出された。等しい量のＲＮＡ  が各々のウェル（ｗｅｌｌ）に乗せられた。転写物のサイズは、既知の放射性標識されたＲＮＡ  マーカーを用いることによって比較された。その転写物の量は、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡプローブを対照として用いることにより定量された。ハイブリダイゼーション後に洗浄とオートラジオグラフィーを行ってから、結果を記録した。
【０１１７】
結果：
本実施例は、ＣＤ１５１  の二つの転写物を確認した。これらの転写物のサイズは特定されていない。しかしながら、最初の転写物はより大きく／上の方にあり、そして二番目の転写物はより低く／より下の方にある。最初の実験において、上の方にある転写物および下の方にある転写物は感受性のある組織（  脾臓、肺、腎臓および心臓）  に存在していた。しかしながら、感受性のない組織は（  筋肉および肝臓）  は上のほうにある転写物のみを有している。それゆえ、より小さな（  より下の方にある）  転写物のみがではＰＲＲＳウイルス感受性を示し、しかるに、より大きな（より上の方にある）転写物のみが非感受性組織に存在する。
【０１１８】
実施例２１
本実施例は、豚ＣＤ１５１  のＲＮＡ  結合活性を立証する。
【０１１９】
材料と方法：
豚組織（１００  ｍｇ）を液体窒素中に凍結し、３０秒間    マイクロディスメンブレイネイター（ｍｉｃｒｏｄｉｓｍｅｍｂｒａｎａｔｏｒ）  ですりつぶした。組織ペレットは、１００  μｌ  の０．０１Ｍ  燐酸緩衝液  （ＰＢＳ，  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）  と９００  μｌ  ＲＩＰＡ溶解緩衝液（１０  ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ  ｐＨ  ８．０，  ０．１４  Ｍ  ＮａＣｌ２），１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，  １％  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ，  ０．１％  ＳＤＳ，  および０．２／ｍＬのＡｐｒｏｔｉｎｉｎ  ）に再懸濁し、ボルテックスミキサーで撹拌し、３７℃で３０分間インキュベートした。組織サンプルは、そこで細胞破砕物を取り除くため、１０分間  ８，０００ｒｐｍ  で遠心分離を行った。上清が集められ、抗ＣＤ１５１  モノクローナル抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  カリフォルニア州、Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．  ５５６０５６）  と免疫沈降を行うため用いられ、続いて、上述したように、放射性標識したＰＲＲＳウイルス３’非翻訳領域  ＲＮＡを用いたノースウェスタンアッセイ（ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  ａｓｓａｙ）を行った。
【０１２０】
結果：
豚ＣＤ１５１  は図１１のノースウェスタンブロット（ｔｈｅ  ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ）  に示されたようにＲＮＡ  結合活性を有する。このブロットは筋肉由来であり、豚ＣＤ１５１  のＲＮＡ  結合活性を明らかに表示している。このことは、豚ＣＤ１５１  はサルＣＤ１５１  と同様に機能し、ＲＮＡ  の侵入の原因であり、それゆえ、ＰＲＲＳウイルスに対する感受性ファクターの原因であるということを証明している。
【０１２１】
各々の転写物の正確なサイズおよび量が解析され、各々の組織のＰＲＲＳウイルスに対する病気感受性と相互に関連づけられた。
【０１２２】
実施例２２
本実施例は、豚ＣＤ１５１  によってトランスフェクトされた非サル細胞系列における細胞病理学（ｃｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ）  とウイルス力価を決定する。
【０１２３】
材料と方法：
ＢＨＫ−２１細胞は、実施例１に記載したように、豚ＣＤ１５１  によって安定にトランスフェクトされた。本実験で用いられた豚ＣＤ１５１  の構成体は、オープンリーディングフレームの９アミノ酸を欠いている。このクローンは、そこでＰＲＲＳウイルス感受性に対してテストされた。ＰＲＲＳウイルス力価は、そこで力価実験によりテストされた。ＰＲＲＳウイルスは、１時間、３７℃で連続希釈（１０培希釈、そこで更にこの１０倍希釈を１０回繰り返す）する中で感染させた。単層はそこで、ＰＢＳ  中で洗浄され、１ｍｌ  のＭＥＭ  で置き換えられた。上清１００  μｌ  が、感染後の、０時間、２４時間、３６時間、４８時間、および７２時間の各時点で採取された。７２時間経過後は、全細胞は、ＳＤＯＷ−１７    核蛋白質モノクローナル抗体を用いた直接蛍光抗体テスト（ＦＡ）によってＰＲＲＳウイルスに対して染色された。異なる時間間隔で採取されたウイルスは、ＭＡＲＫ細胞中で力価測定された。
【０１２４】
結果：
期待されたように、細胞変性効果（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ）はＢＨＫ−２１細胞中に観察されなかった。しかしながら、ＭＡＲＫ細胞がＣＤ１５１  によって安定にトランスフェクションされても、ＰＲＲＳウイルスの生産が高められた。このことは、豚ＣＤ１５１  の機能は他のすでに確認されたＣＤ１５１  塩基配列と同様に機能すると言うことを更に証明する。しかしながら、最初の９アミノ酸を欠く構成体は全く同じようには機能しなかった。それゆえ、豚ＣＤ１５１  が非サル細胞系列においてＰＲＲＳウイルスを生産するために同様に用いられ得る。
【０１２５】
実施例２３
本実施例は、異なる生物種で発現するＣＤ１５１  の量を決定し比較した。
【０１２６】
材料と方法：
様々な感受性組織および非感受性組織が豚から採取され、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ  と  Ｓａｃｃｉにより記載された酸グアニジニウムおよびフェノールクロロフォルム法（ｔｈｅ  ａｃｉｄ  ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ  ａｎｄ  ｐｈｅｎｏｌ  ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ  ｍｅｔｈｏｄ）  を用いてＲＮＡ  が抽出され得るように、組織がすりつぶされた。総ＲＮＡがそこで、１％ホルムアルデヒドアガロースゲル上で電気泳動され、ナイロン膜へ移された。放射性標識したＣＤ１５１  ｍＲＮＡをプローブとして用い、かつ標準プロトコールに従ってＣＤ１５１  転写物が、ノザンブロッティング（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）により検出された。等しい量のＲＮＡが各々のウェル中へ乗せられ、そしてそこで既知の放射性標識したＲＮＡ  マーカーが転写物の大きさを比較するために用いられた。ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡプローブを対照として用いて、転写物の量が定量された。ハイブリダイゼーション後に洗浄とオートラジオグラフィーを行った後、結果を記録した。
【０１２７】
結果：
いかなる遺伝子のＣＤ１５１  ｍＲＮＡに対して豚組織のノザンブロットアッセイ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔ  ａｓｓａｙｓ）を行っても、その組織において発現された蛋白質の量を示した。正しいサイズおよび量を持った転写物が存在すると言うことはその組織中で蛋白質の発現を決定する上で非常に重要である。前に議論されたように２つの転写物が観察された。各々の組織がＣＤ１５１  に対して独自の転写特性を持っている。
【０１２８】
実施例２４
本実施例は、実施例２０によって示される細胞の転写特性を比較し、豚の異なる品種に対する結果を比較する。
【０１２９】
材料と方法：
転写特性は実施例２０に記載されたように与えられる。しかしながら、これら特性における差異は豚の多様な感受性および非感受性の品種と相互に関連性を持つ。
【０１３０】
結果：
豚の異なる品種由来の異なる組織における各々の転写物の量は、各々の品種の相対的ＰＲＲＳウイルス感受性との間で相互に関連を有する。非感受性の品種もしくはＰＲＲＳウイルスに対して感受性が減少した品種が、これら同一の組織由来であるが他の生物種起源由来のＣＤ１５１  の量と比較したときに、その組織中のＣＤ１５１  の量が減少していることを示していた。異なる品種の豚における個々の豚の転写特性は、改良された豚の品種に対する選択の判断基準を開発するために使われる。
【０１３１】
実施例２５
本実施例は、豚ＣＤ１５１  の組織分布を決定した。
【０１３２】
材料と方法：
異なる豚組織を採取し、その組織の１００ｍｇ  を液体窒素中に凍結し、３０秒間のパルスで  ｍｉｃｒｏｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒを用いてすりつぶした。すりつぶされた組織は、１ｍｌ  の  ＲＩＰＡ  緩衝液に再懸濁した。サンプルはそこで、シェーカー中、室温で３０分間インキュベートされた。蛋白質サンプルは、そこで５分間、６，０００ｒｐｍで遠心分離された。上清は、そこで１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動された。次に全蛋白質は、１０％馬血清中でブロックされたニトロセルロース膜に移され、ＣＤ１５１  抗体がブロッキング溶液（ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）  中で、１／５００  量加えられた。膜は、そこで二次抗体である抗マウス  ＨＲＰＯ  複合抗体  （Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，カリフォルニア州）  を１／１０，０００量加えてインキュベートする前に、１５分間で３回洗浄した。膜は、そこで膜ＴＭＢ  複合体（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ＴＭＢ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  メリーランド州）  中で展開された。
【０１３３】
豚ＣＤ１５１  のゲノム構成を決定するために、ヒトＣＤ１５１  に対して産生された抗ＣＤ１５１  モノクローナル抗体  １４Ａ２．Ｈ１  （Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，カリフォルニア州）  が使用された。ウェスタンブロットアッセイ（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ  ａｓｓａｙ）がそこで実施され、その結果がＣＤ１５１  発現量に対して解析された。豚ＣＤ１５１  の２つのアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）  が定量され、ＰＲＲＳウイルス感受性と相互に関連づけられた。これらのパラメータはまた、豚の品種選択の際に助けとなるために使用される。最終的には、その判断基準は、品種と選択のための異なる重さに割り当てられる。
【０１３４】
結果：
２つのバンドがウェスタンブロットアッセイを用いて確認されたので、豚の筋肉および心臓組織は大量のＣＤ１５１  を持つことが示された。１つのバンドは、約６０ｋＤであり、他のバンドは約３０ｋＤである。ＣＤ１５１  遺伝子の細胞内での発現は、その遺伝子のゲノム構成によって決定されるため、ＣＤ１５１  の大量もしくは少量の発現は、その構成に直接関係している。その構成は、また、豚のＰＲＲＳ病に対する異なる感受性につながる遺伝子発現のエンハンサーもしくはインヒビターのような他のファクターがあるかないかをも示している。
【０１３５】
実施例２６
本実施例は、ＰＲＲＳウイルスの生態におけるＣＤ１５１  のカルボキシ末端に存在する  ＹＲＳＬ  ドメインの本質的役割を示す。
【０１３６】
材料と方法：
ＰＲＲＳウイルスＲＮＡ  の侵入におけるＣＤ１５１  の細胞質側末端（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｔａｉｌ）の突然変異の効果を研究するために、これらの突然変異の効果が、ＰＲＲＳウイルス感染に対する突然変異の効果によってチェックされる。ウイルスの存在は、免疫蛍光アッセイ（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）によってチェックされる。端的に言えば、ＰＣＲ  に基づく突然変異は、ＰＲＲＳウイルス感染に与えるこれら突然変異の効果を研究するために、ＣＤ１５１（サルおよび豚）  の２つの構成について実施される。
【０１３７】
結果：
ＣＤ１５１  分子は、細胞質側末端において  ＹＲＳＬ  （ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ２９）配列を含む。この配列は  ＹＸＸＬ  （ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ３６）モチーフ（ｍｏｔｉｆ、中心的図形）  もしくはドメインの中にあると考えられている。このモチーフおよびとりわけ  ＹＲＳＬ  配列は、カルボキシ末端に位置している既知のＲＮＡ  結合ドメインである。そのようなドメイン中で、ＸＸ残基は、内面化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）  における何らかの変化なしで、突然変異を受けるかも知れない。Ｌ  （ｌｅｕｃｉｎｅ）  残基は、重要な疎水性の残基である。ＣＤ１５１  の細胞質側末端が、ＰＲＲＳウイルス侵入において重要な役割を演じているならば、突然変異したＣＤ１５１  はＢＨＫ−２１細胞系列におけるＰＲＲＳウイルス感染性を回復することができる。Ｙ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ）  もしくは  Ｌが突然変異を受けたのならばこの場合が当てはまると考えられている。しかしながら、Ｒ（ａｒｇｉｎｉｎｅ）  もしくは  Ｓ（ｓｅｒｉｎｅ）が突然変異を受けたのならば細胞質側末端のＲＮＡ  結合能に対して何ら影響を及ぼさないと考えられる。従って、そのような突然変異したＣＤ１５１  配列はＢＨＫ−２１細胞系列においてＰＲＲＳウイルス感染性を回復することができる。そのような状況では、ＹＲＳＬ配列がＣＤ１５１  のカルボキシ末端における１つのシグナルとして作用すると言うことが考えられている。このことは、カルボキシル末端にシグナルを有する、エンドサイトーシスのサイクルの末期に細胞内に入る他の既知物質と相互に関連を有するだろう。エンドサイトーシスは、細胞膜から細胞へと芽を出すクラスリン被覆小孔（ｃｌａｔｈｒｉｎ  ｃｏａｔｅｄ  ｐｉｔ）  を形成することを含む。ＰＲＲＳウイルス細胞はクラスリン被覆小孔を通って入る。ＣＤ１５１  が、内皮細胞のような標的器官のエンドソームの中に局在し、ＰＲＲＳウイルスのエンドソームを通って侵入することに参加しているかも知れないということが分かっている。ＰＲＲＳは多くの遺伝子型と７５以上の免疫型（ｉｍｍｕｎｏｔｙｐｅ）があるが、しかし、全ての分離株は共通の侵入通路（ｅｎｔｒｙ  ｐａｔｈｗａｙ）  を用いている。従って本実施例から明らかになった情報は、何らかの系統の豚がＣＤ１５１  のこの重要な配列において突然変異を有しているかどうかを見出すために用いられるだろう。
【０１３８】
議論
ウイルスは、複製のためには限定的な遺伝物質を有し必然的に（ｏｂｌｉｇａｔｏｒｙ）内部パラサイト（内部寄生物、ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｐａｒａｓｉｔｅ）である。ウイルスはしばしば、ＲＮＡ  結合蛋白質、転写因子、プロテアーゼ、および自己のＤＮＡ  複製のための膜因子の形で、宿主細胞のファクターを活用する。ＲＮＡ  結合蛋白質は、転写、翻訳、位置づけ（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）  、およびウイルスＲＮＡ  の輸送において役割を演じることができる。どのようにウイルスＲＮＡ  複製が進行するかを理解するために、これらの蛋白質を同定し特徴づけることが重要である。ＰＲＲＳウイルスの３’非翻訳領域に結合する宿主細胞蛋白質の同定についての報告はない。
【０１３９】
本願で、ＰＲＲＳウイルスの３’非翻訳領域に結合する新規２９ｋＤの糖蛋白質であるサルＣＤ１５１  の同定について報告する。ＣＤ１５１は、細胞蛋白質のテトラスパン  もしくは４回膜貫通蛋白質スーパーファミリーに属する膜透過糖蛋白質である。テトラスパンは脂質二重層および２つの細胞外領域をまたぐ４つの高度に保存された疎水性領域を有する。Ｎ末端とＣ末端が細胞質の中に見出される。サルＣＤ１５１  は、内皮細胞膜、血小板、巨核球、上皮、肺、筋肉、シュバン細胞、および糸球体（ｇｌｏｍｅｒｕｌｉ）  に主に見出される  ＰＥＴＡ−３  と９８％の相同性を共有する。この蛋白質は、Ｔ細胞白血病ウイルスＩ型によって形質転換されるヒトＴ細胞において、上向き調節を受ける（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅ）ことが示されてきており、ＳＦＡ−１  と命名されてきた。ＰＥＴＡ−３のかなりの量は、細胞内コンパートメント（区画）  中に存在しており、核周囲（ｐｅｒｉｎｕｃｌｅａｒ）  の顆粒に局在化し、内皮細胞に存在する  ＰＥＴＡ−３  蛋白質の総量の６６％を占める。テトラスパンであるＣＤ１５１  は、癌の転移における初期のステップで要求され、造血細胞系列におけるインテグリンとの相互作用、細胞−  細胞吸着（ｃｅｌｌ−ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎｓ）  の調節、および蛋白質−  蛋白質相互作用を通しての膜透過の信号伝達（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）  に関与する。
【０１４０】
ＣＤ１５１  がＰＲＲＳウイルスの３’非翻訳領域に結合することを証明した後に、ＣＤ１５１  の存在とＰＲＲＳウイルス感染に対する感受性との間の相互作用がテストされた。全て腎臓細胞由来である、ＭＡ１０４  、ＭＡＲＫ，ＣＯＳ−７  およびＶｅｒｏ細胞系列は、ＣＤ１５１  を有することが見出された。しかしながら、ＢＨＫ−２１およびＭＤＢＫ細胞もまた腎臓細胞由来であるが、しかしＣＤ１５１  細胞を欠いている。それゆえ、ＣＤ１５１  は、腎臓特異的蛋白質であるとはいえない。ＰＲＲＳウイルスは、ＢＨＫ−２１細胞に入らないが、しかし、これらの細胞をＰＲＲＳウイルスＲＮＡ  または感染性のｃＤＮＡクローンによってトランスフェクトすることは、近隣の細胞に広がることなしに豊富なウイルス感染をさせることができる。それゆえ、ＢＨＫ−２１細胞は、ＰＲＲＳウイルスＲＮＡ  の複製を支持するがウイルスもしくはウイルスＲＮＡ  の侵入のために要求される細胞ファクターを欠くと結論される。ＣＤ１５１  が膜透過蛋白質であることが見出されたので、ＰＲＲＳウイルスおよび／またウイルスＲＮＡ  の侵入に役割を有しているかも知れないと言うことは筋が通っている。もう１つのテトラスパンであるＣＤ９がＭＤＢＫを非感受性細胞系列に変え、イヌジステンパーウイルス感染に対して感受性を与え、１つのエントリー分子として機能すると言うことが先に報告されている。ＣＤ１５１  がＰＲＲＳウイルス感染の１つの感受性ファクターであると言うことを証明するために、ＣＤ１５１  を発現するＢＨＫ−２１細胞がＰＲＲＳウイルスによって感染を受けたが、しかるに、ＣＤ１５１  を欠く親細胞系列は感染を受けないと言うことが決定された。それゆえ、ＣＤ１５１  は膜透過分子であるので、ＢＨＫ−２１細胞へのウイルスの侵入もしくはＲＮＡ  の侵入においてＣＤ１５１  が１つの役割を演じているかも知れない。
【０１４１】
ウイルスの細胞への侵入は、ウイルス蛋白質と細胞膜上に存在する特定のウイルス受容体との相互作用によって起こる。これらの受容体は、ウイルス感染に対する感受性の非常に重要な抗原決定基（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ）である。以前の研究は、ＰＲＲＳウイルスがヘパリン様分子に結合し、そしてウイルスの侵入が受容体を媒介としたエンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）によって起こると言うことを証明してきた。これらの小胞中の低いｐＨは、豊富な感染のために必須（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ）である。共免疫沈降法が、ＰＲＲＳウイルス蛋白質とＣＤ１５１  の間に何らかの相互作用があるかどうかを決定するために実施された。しかしながら、両者の間の直接の蛋白質−  蛋白質相互作用の証拠は無かった。このことは、もう１つのテトラスパンであるＣＤ９がイヌジステンパーに対する感受性ファクター（ｆａｃｔｏｒ）であるが、しかし、ＣＤ９はそのウイルス蛋白質とは直接結合しないと言う従来の観察と一致するものだ。受容体である蛋白質ならば、そのウイルス蛋白質と相互作用するに違いない。それゆえ、ＣＤ１５１  は、その受容体としては機能しない。ＣＤ１５１  は小胞中にそしてまた膜中にも存在するので、ＲＮＡ  を輸送する分子（ＲＮＡ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）としての役割が二つの観察に基づいて予想されている。１つは、ＣＤ１５１  が非感受性の（ウイルス感染を受けない）  ＢＨＫ−２１細胞をウイルス感染に対する感受性を与える（ウイルスに感染し易くする）  、そして二番目に、（安定なトランスフェクションにより）ＣＤ１５１  を過剰発現するＭＡＲＫ細胞が自然のままの（ｎａｔｉｖｅ）細胞系列に比較してウイルス生産において１００倍増加した発現をする。ウイルスの複製におけるＣＤ１５１  のこの効果は、ＲＮＡ  輸送分子として機能するＣＤ１５１  を有するウイルスを侵入させる間に、ウイルスＲＮＡ  の細胞による取り込みが増加することによって説明される。このプロセスは図９に模式的に示される。ＲＮＡ  結合蛋白質が、ＲＮＡ  輸送分子として機能することが予想されると言う以前のデータがある。精巣および脳のＲＮＡ  結合蛋白質は、ｍＲＮＡの３‘非翻訳領域と相互作用し、ｍＲＮＡを、それが翻訳される細胞内の場所まで輸送する。この蛋白質はまた、細胞と細胞の間で全ｍＲＮＡを輸送するとも報告されている。タバコモザイクウイルス（ｔｏｂａｃｃｏ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）においては、３０ｋＤの移動蛋白質（ｍｏｖｅｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が細胞間連絡（  原形質連絡、ｐｌａｓｍｏｄｅｓｍａｔａ）経由で細胞から細胞へのウイルスＲＮＡ  の輸送に関わっている。ｂｅｅｔ  ｎｅｃｒｏｔｉｃ  ｙｅｌｌｏｗ  ｖｉｒｕｓ  においては、蛋白質ｐ４２、ｐ１４およびｐ１３がウイルスＲＮＡ  との相互作用により細胞間連絡を通してウイルスＲＮＡ  の運動に関わっている。動物ウイルスにおいては、ＲＮＡ  輸送分子の報告は何もない。ＰＲＲＳウイルス感染において、ＣＤ１５１  は、単独でもしくは他の蛋白質と結合して、ウイルスが小胞（ｖｅｓｉｃｌｅ）  中で殻を取った後、細胞質ヘ侵入するＲＮＡ  輸送分子（ＲＮＡ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）として活動する��ろう。それゆえ、本願発明は、ＣＤ１５１  が主としてウイルスＲＮＡ  エントリー蛋白質としてＰＲＲＳウイルスの複製に関わっていると言うことを証明する。
【０１４２】
ＣＤ１５１  膜透過蛋白質がウイルスおよびウイルスＲＮＡ  の細胞への侵入に１つの役割を演じているかどうかを決定するために、ＢＨＫ−２１細胞が、ＰＲＲＳウイルス感染に対して抵抗性がある（ウイルスに感染しづらい）  と言う理由から、実験のために選択された。しかしながら、ＢＨＫ−２１細胞がＰＲＲＳウイルスＲＮＡ  もしくはＰＲＲＳウイルスの感染性のｃＤＮＡクロ−ンのどちらかによってトランスフェクトされた場合には、ＢＨＫ−２１細胞がＰＲＲＳウイルスの複製を助ける。それゆえ、ＢＨＫ−２１細胞における抵抗因子（ａ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｆａｃｔｏｒ）は、そのエントリー分子（ｔｈｅ  ｅｎｔｒｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）と結びついているかも知れない。ＢＨＫ−２１がＣＤ１５１  を欠いていると言う事実は、ＣＤ１５１  に特異的なプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ（図５、レーン６）  によって明確に示された。ＣＤ１５１  を発現するＢＨＫ−２１細胞は、上記＜材料と方法＞中に記載されたように、安定なトランスフェクションによって得られた。これらのトランスフェクトされた細胞を、ＰＲＲＳウイルスに感染させ、免疫組織化学（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）的方法によってウイルス産生についてテストした。特に、ＣＤ１５１  でトランスフェクトされた細胞は、ＰＲＲＳウイルスに感染するようになったが、しかし、ＣＤ１５１（図６で証明されている）  を欠く親ＢＨＫ−２１細胞はウイルス感染するようにならなかった。
【０１４３】
本願発明の他の有利な形態は、これらの実験で用いられる  ｔｈｅ  ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ（ＢＨＫ）  細胞系列は、サル起源ではないということだ。それゆえ、ＢＨＫ  は、サル起源のＰＲＲＳウイルスを増幅するために用いられる全ての他の細胞系列とは異なる。非サル細胞系列を使用しても、霊長類ウイルスもしくはサルウイルスを豚、とりわけ、異種生物間移植された豚へ伝達することに何のリスクも引き起こさないため、このことは大きな強みを与える。ＰＲＲＳウイルスを増殖させるために非サル細胞系列を使うことにより、霊長類ウイルスおよび／またサルウイルスは豚個体群（ｓｗｉｎｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）に導入されず、それゆえ、ヒト個体群へのリスクを引き起こさない。また、ＣＤ１５１  を発現するこれらの細胞は、ＰＲＲＳウイルスのより高い力価を有するがゆえに、ワクチン生産目的でＰＲＲＳウイルスを増殖させるには、より便利でかつ経済的有用性もある。好都合にも、これらの細胞は、ＰＲＲＳウイルスの不活化ワクチンおよび生ワクチンを作るために使用することができ、かつ血清診断アッセイ（ｓｅｒｏｄｉａｇｎｓｔｉｃ  ａｓｓａｙｓ）に使用され得る。
【０１４４】
７Ｇ１０という名称のモノクロ−ナル抗体が開発された。この抗体は、細胞培養中のＰＲＲＳウイルス感染を完全にブロックする。この抗体は、ＭＡＲＫ細胞系列の宿主細胞蛋白質に対して作られ、そしてＰＲＲＳウイルスに対する高い中和活性を発現するＩｇＡ  アイソタイプ（ｉｓｏｔｙｐｅ）  である。ｖｉｒｕｓ  ｏｖｅｒｌａｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｌｏｔ  ａｓｓａｙ  （ＶＯＰＡ）  に基づけば、７Ｇ１０はＰＲＲＳウイルスの受容体を認識しており、それゆえＰＲＲＳウイルスを中和し得る。これらの特異的特徴があるので、７Ｇ１０はＰＲＲＳウイルスの伝達を防ぐために豚産業に応用され得るのである。
【０１４５】
最後に、本願発明は、豚ＣＤ１５１  のＤＮＡ  塩基配列とゲノム構成を決めた。そうした知識は、耳ノッチバイオプシー（ｅａｒ−ｎｏｔｃｈ  ｂｉｏｐｓｙ）について実施され得るＤＮＡ−ｂａｓｅｄ  ＰＣＲ  を開発するのを助ける。一匹の生存動物が入手できなければ、生殖細胞質、精子および成熟した卵子（ｆｌｕｓｈｅｄ  ｏｖａ）  を用いても実験（ｔｅｓｔｉｎｇ）  は実施できる。そうしたデザインにより、動物の死後数年或いは数世代経過したのちに、死亡動物由来の生殖細胞質を、群れ全体の改良を目的として使用することができる。更に、豚ＣＤ１５１  は豚組織中にＰＲＲＳウイルスＲＮＡ  結合活性を有し、かつ豚ＣＤ１５１  はヒト、サルおよびマウスに対応する既知のＣＤ１５１  配列とたった８４％の塩基配列相同性を有しているに過ぎないと言うことが分かった。加えて、本願発明は、豚ＣＤ１５１  ｍＲＮＡの塩基配列決定を可能にした。そのような配列は、Ｔａｂｌｅ  ２  のエクソンを配列順に連結し、かつこれら連結されたエクソンのＤＮＡ  塩基配列からＲＮＡ  への転写を考えることで決定され得る。ｍＲＮＡの塩基配列へつながり得る１つの塩基配列が本願で、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３８として与えられている。
【図面の簡単な説明】
本特許の出願は、カラーで作成された少なくとも一枚の図面を含む。カラー図面を付した本願特許のコピーは、請求により必要な費用の支払いを条件として米国特許商標庁から入手できる。
【図１】サルＣＤ１５１  のｃＤＮＡクローンのヌクレオチド塩基配列であり、推定上の膜透過領域（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎｓ）  に下線を付した、予想されるアミノ酸配列およびフレーム内終止コドンをアステリスク（ａｓｔｅｒｉｓｋ）によって表示した。
【図２】ノースウェスタンブロッティングアッセイ（Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ａｓｓａｙ）  においてＣＤ１５１  モノクローナル抗体との免疫沈降で検出されたＣＤ１５１  蛋白質のＲＮＡ  結合活性を示す写真である。
【図３】ノースウェスタンブロッティングアッセイ（Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ａｓｓａｙ）  においてベータガラクトシダーゼ（  β−ｇａｌａｃｔｏｃｉｄａｓｅ）  モノクローナル抗体との免疫沈降で検出されたＣＤ１５１  蛋白質のＲＮＡ  結合活性を示す写真である。
【図４】ＰＲＲＳウイルスが感染したＭＡＲＫ細胞溶解物（ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅｓ）を免疫沈降させたのち、ＲＴ−ＰＣＲによって明示されるようにＣＤ１５１  蛋白質の  ｉｎ  ｖｉｖｏ    ＲＮＡ  結合活性を示す写真である。
【図５】ＣＤ１５１  の１０５  塩基対（ｂｐ）の増幅単位の増幅を明示する  ＲＴ−ＰＣＲ  の写真である。
【図６】ＣＤ１５１  の存在を検出するウェスタンブロット実験（ａ  ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）  の結果を示す写真である。
【図７ａ】ＰＲＲＳウイルスの抗原が検出されないことを示す、野生型ＢＨＫ−２１におけるＰＲＲＳウイルスの存在を検出するための免疫組織化学染色の写真である。
【図７ｂ】ＣＤ１５１  によってトランスフェクトされたＢＨＫ−２１中にＰＲＲＳウイルスの存在を検出するための免疫組織化学染色の写真である。
【図８】ＣＤ１５１  によって安定なトランスフェクションを行ったのちの  ＭＡＲＫ  細胞による、増幅されたＰＲＲＳウイルス生産を明示するグラフである。
【図９】ＰＲＲＳウイルスＲＮＡ  が標的細胞に侵入するメカニズムおよびＣＤ１５１  のようなＲＮＡ  結合蛋白質の役割を模式的に表したものである。
【図１０】豚ＣＤ１５１  ＤＮＡ  の塩基配列を模式的に表したものである。
【図１１】豚ＣＤ１５１  のＲＮＡ  結合活性を明示するノースウェスタンブロット（ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ）  の写真である。
【図２】
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【図３】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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