(57)【要約】本発明は、ロックド核酸オリゴヌクレオチドを介して1つ以上の機能性成分に結合されたDNAを含む組成物に関する。とくに、本発明は、対象タンパク質をコードする遺伝子を含有するプラスミドをLNA-機能性成分に複合体化させて含む組成物を提供する。該プラスミドは、組織または細胞に導入して該遺伝子を発現させることが可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1個のロックド核酸塩基を含むオリゴヌクレオチドと機能性成分とを含んでなる、ロックド核酸コンジュゲート。
【請求項２】
前記機能性成分が、蛍光標識、核局在化ペプチド、真核細胞の原形質膜を横切る能力を有するペプチド(「細胞透過性ペプチド」)、エンドソーム脱出ペプチド、細胞標的性および結合性のペプチドまたはタンパク質、転写活性化ドメインを有するペプチドまたはタンパク質、およびアジュバント活性または免疫刺激活性を有する分子からなる群より選択される、請求項１に記載のロックド核酸コンジュゲート。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドが7〜25塩基の長さである、請求項１または２に記載のロックド核酸コンジュゲート。
【請求項４】
塩基の少なくとも50％がロックド核酸塩基である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のロックド核酸コンジュゲート。
【請求項５】
ロックド核酸モノマーが、O(オキシ)、S(チオ)、NH2(アミノ)架橋されたロックド核酸の群から選択される、請求項１〜４のいずれかに記載のロックド核酸コンジュゲート。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドが自己相補的塩基対合を含まない、請求項１〜５のいずれかに記載のロックド核酸コンジュゲート。
【請求項７】
患者への投与後に選択的に開裂しうる開裂性結合を、前記機能性成分と前記LNAオリゴヌクレオチドとの間に含む、請求項１〜６のいずれか1項に記載のロックド核酸コンジュゲート。
【請求項８】
前記機能性成分が、少なくとも1つの非メチル化CGジヌクレオチドモチーフを含有する免疫刺激性オリゴヌクレオチドである、請求項１〜７のいずれか1項に記載のロックド核酸コンジュゲート。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載のロックド核酸コンジュゲートと、前記オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有しかつプロモーターの制御下で遺伝子をコードするDNA配列と、を含んでなる複合体。
【請求項１０】
少なくとも1つのさらなるLNAコンジュゲートが存在し、該コンジュゲートが前記DNA配列に結合されたLNA複合体内の相補的配列に結合されている、請求項９に記載の複合体。
【請求項１１】
LNAオリゴヌクレオチド間のLNA:LNAハイブリダイゼーションにより形成された、前記DNA内の単一LNA相補的部位に結合されたLNAコンジュゲートのアレイを含む、請求項１０に記載の複合体。
【請求項１２】
前記遺伝子が治療用タンパク質または抗原をコードする、請求項９〜１１のいずれか1項に記載の複合体。
【請求項１３】
複数のLNA複合体が前記DNA配列内の複数の相補的配列にコンジュゲートされている、請求項９または１０に記載の複合体。
【請求項１４】
前記抗原が病原体または腫瘍に対する免疫応答を惹起することができる、請求項１２または１３のいずれかに記載の複合体。
【請求項１５】
前記DNAが開環状プラスミドまたはスーパーコイルプラスミドの形態である、請求項９〜１４のいずれか1項に記載の複合体。
【請求項１６】
請求項９〜１５のいずれか1項に記載の複合体と、製薬上許容される担体または希釈剤と、を含有する医薬組成物。
【請求項１７】
前記複合体がマイクロプロジェクタイル上にコーティングされている、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記マイクロプロジェクタイルが金ビーズである、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１６〜１８のいずれか1項に記載の医薬組成物が組み込まれている、デバイス。
【請求項２０】
医療に使用するための、請求項１〜８のいずれか1項に記載のLNAコンジュゲート。
【請求項２１】
医療に使用するための、請求項９〜１５のいずれか1項に記載の複合体。
【請求項２２】
感染症または癌を治療または予防するための医薬の製造におけるLNAコンジュゲートの使用。
【請求項２３】
感染症または癌を治療または予防するための医薬の製造における、請求項９〜１５のいずれか1項に記載の複合体の使用。
【請求項２４】
請求項１〜７のいずれか1項に記載のLNAコンジュゲートを、抗原または治療用タンパク質をコードする遺伝子を発現させることのできるプラスミドとハイブリダイズさせ、得られた複合体を製薬上許容される担体と共に製剤化するステップを含んでなる、請求項１６〜１８のいずれか1項に記載の医薬組成物の調製方法。
【請求項２５】
少なくとも1つのLNAを有するオリゴヌクレオチド配列を含む第1の領域と、少なくとも1つの非メチル化CGジヌクレオチドモチーフを含有する免疫刺激性オリゴヌクレオチド領域を含む第2の領域と、を含んでなるオリゴヌクレオチド。
【請求項２６】
前記第1のLNA含有領域と前記第2の免疫刺激性オリゴヌクレオチド領域とがホスホルアミデート領域により分離されていること、さらに前記第2の免疫刺激性オリゴヌクレオチド領域がホスホロチオエート骨格を含んでいることを特徴とする、請求項２５に記載のオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ロックド核酸オリゴヌクレオチドを介して1つ以上の機能性成分に結合されたDNAを含む組成物に関する。とくに、本発明は、対象タンパク質をコードする遺伝子を含有するプラスミドをLNA-機能性成分に複合体化させて含む組成物を提供する。該プラスミドは、組織または細胞に導入して該遺伝子を発現させることが可能である。
【背景技術】
【０００２】
とくに免疫化または遺伝子治療を目的として、プラスミドをベースとする遺伝子送達を行うことは、公知である。たとえば、裸のDNAを注射によりマウスの筋肉に投与することについては、国際特許出願WO90/11092にVicalにより概要が示されている。
【０００３】
JohnstonらのWO 91/07487には、対象遺伝子をコードするポリヌクレオチドでコーティングされたマイクロプロジェクタイル（微量発射物）を用いて、微粒子が標的細胞に進入できるように微粒子を加速することにより、遺伝子を脊椎動物細胞に導入する方法が記載されている。
【０００４】
DNAワクチンは、通常、強力なウイルスプロモーターと、抗原ペプチドをコードする対象遺伝子と、ポリアデニル化/転写終止配列と、が挿入された細菌プラスミドベクターからなる。対象遺伝子は、病原体、腫瘍、または防御すべき他の因子に関連する全タンパク質をコードするものであってもよいし、関連する抗原ペプチド配列を単にコードするものであってもよい。プラスミドは、たとえばE.coliのような細菌中で増殖させてから、意図した投与経路に応じて適切な培地で単離および調製を行った後、宿主に投与することができる。投与後、プラスミドは宿主の細胞により取り込まれ、コードされたペプチドが該細胞中で産生される。プラスミドベクターは、好ましくは、哺乳動物宿主におけるプラスミド複製および対象動物の染色体DNA内への組込みを防止すべく、真核細胞で機能する複製起点を用いずに、作製されるであろう。
【０００５】
DNAワクチン接種には、伝統的なワクチン接種法よりも優れた利点がいくつか存在する。第1に、DNA配列によりコードされるタンパク質は宿主中で合成されるので、タンパク質の構造またはコンフォメーションは疾患症状に関連する天然タンパク質のものと類似しているであろうと予測される。また、DNAワクチン接種は、エピトープを保存タンパク質と区別して認識する細胞傷害性Tリンパ球応答を引き起こすことにより、さまざまなウイルス株に対する防御を提供するであろうと思われる。さらに、プラスミドは宿主細胞により取り込まれ、該細胞中で抗原タンパク質を産生することができるので、長期持続性免疫応答が惹起されるであろう。また、この技術を用いれば、さまざまな免疫原を組み合わせて単一の調製物にすることにより、いくつかの疾患症状に対して同時に免疫化を行える可能性がある。
【０００６】
DNAワクチン接種に関する役立つ背景情報が、Donnelly et al "DNA vaccines" Ann. Rev Immunol. 1997 15: 617-648に提供されている。その開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【０００７】
DNAワクチン接種は伝統的なワクチン接種療法よりも優れた多くの利点を備えているにもかかわらず、動物に投与されるプラスミドDNAによりコードされたタンパク質により誘発される免疫応答を増大させるのに役立つ改良を加えたいという要求が依然として存在する。本発明は、こうした問題に対処するものである。
【０００８】
ロックド核酸(locked nucleic acid: LNA)は、RNAまたはDNAの類似体である。LNAという用語は、2'-酸素と4'-炭素の間のメチレン結合によりリボース環が拘束されたヌクレオチドモノマーを記述するために使用されるほかに、ロックド核酸のモノマーを1つ以上含有するオリゴヌクレオチドを記述するためにも使用される。メチレン架橋結合は、酸素(オキシ-LNA)、硫黄(チオ-LNA)、およびアミン(アミノ-LNA)を介するものであってもよい。コンフォメーションを拘束すると、相補的配列への結合親和性が増大する(Dwaine A. Braasch and David R. Corey, Chemistry and Biology 8 (2001) 1-7)。DNAまたはRNAオリゴヌクレオチドにLNAモノマーを導入すると、相補的DNAまたはRNA配列への親和性、すなわち、二本鎖の熱安定性として測定される親和性が増大し、たとえば、実際の塩基に依存して、融解温度(Tm)は、オリゴヌクレオチド中に存在するLNAモノマー1個あたり3〜8℃の範囲で増加する(Dwaine A. Braasch and David R. Corey, Chemistry and Biology 8 (2001) 1-7)。LNAの合成については、国際特許出願WO99/14226号に記載されている。
【０００９】
LNAオリゴヌクレオチドと短い二本鎖DNAオリゴヌクレオチドとの三本鎖形成についての記載はあるが(74, 75)、大きいスーパーコイルプラスミドDNA分子と組み合わせたときの鎖置換剤としてのLNAオリゴヌクレオチドの性質については、いまだに報告がなされておらず、このことが本発明の内容の一部分を構成する。実のところ、LNAオリゴヌクレオチドは、荷電バックボーンがあると、非荷電PNAオリゴヌクレオチドよりも効率の悪い鎖置換剤になる可能性のあることが最近示唆されている(Dwaine A. Braasch and David R. Corey, Chemistry and Biology 8 (2001) 1-7)。本発明者らは、スーパーコイルプラスミドDNAの鎖置換剤としてLNAオリゴヌクレオチドがPNAから誘導されるその対応物と少なくとも同程度に効率的であるという明らかな証拠を本明細書中に提示する。また、プラスミドDNAに結合させた後、LNAオリゴヌクレオチドは、PNAオリゴヌクレオチドよりも安定にプラスミドDNAに結合され、過酷な条件に暴露されたときに結合状態を保持することができるが、PNAオリゴヌクレオチドでは結合状態が保持されないという強力な証拠を我々は提示する。このことは、そのようなDNA/LNA複合体を医薬品として投与すべく製剤化することを考えた場合、有利である。
【００１０】
ペプチド核酸オリゴヌクレオチドにより、ペプチドおよび他の物質(たとえば、ローダミンのような蛍光標識)をDNAプラスミドに結合させることは、公知である(US 6165720)。これはまた、細胞をトランスフェクトするためも使用されてきた。PNA/DNA/PNA三本鎖がきわめて過酷な条件に耐えるという報告がなされているが(50)、そのような研究は、短いDNAオリゴヌクレオチドについて行われたにすぎず、大きいスーパーコイルプラスミドDNAについては行われていない。後者の場合、一連の外部条件に対する結合されたPNAの安定性についての報告はなされていない。さらに、そのような複合体は、医薬製剤またはワクチン製剤とくに(粒子媒介免疫療法剤送達)PMID用のワクチン製剤として投与したとき、PNAに結合された発蛍光団またはペプチドがプラスミドDNAに結合された状態を保持しうる程度に十分に安定ではないことを本発明者らは見いだした。さらに、本発明者らは、プラスミドDNAをPNAオリゴヌクレオチドで標識化すると、効率にばらつきを生じ、再現性が悪く、しかも最適なPNA標識化のために低塩または無塩かつ低pH(<6)が必要とされるという点で反応条件が制約を受けることを見いだした。
【発明の開示】
【００１１】
本発明は、LNAコンジュゲートと、遺伝子をin vivoで発現させることができるようにプロモーターの制御下に遺伝子を含有するプラスミドDNAへの該コンジュゲートの結合と、を提供する。LNAコンジュゲートは、安定であり、プラスミドDNAと共にin vivoで投与して、遺伝子を発現させる能力を保持したまま細胞内にプラスミドと機能性成分とを共局在させることが可能である。有利なことに、LNAオリゴヌクレオチドは、細胞内DNアーゼ酵素による分解を受けない(Dwaine A. Braasch and David R. Corey, Chemistry and Biology 8 (2001) 1-7)。
【００１２】
LNAコンジュゲートは、7〜25、好ましくは10〜20、より好ましくは11〜15塩基のオリゴヌクレオチドを含み、そのうちの少なくとも1つはロックド核酸であり、好ましくは少なくとも半分、より好ましくは全部のオリゴヌクレオチドが、LNA塩基で構成されている。典型的には、プラスミドDNAに結合させたときに最適な安定性が得られるように、少なくとも13個のLNA残基からなる配列が好ましい。本発明のいずれかの態様で使用するのに好ましいLNA分子を表１および３に列挙する。とくに好ましいLNAオリゴヌクレオチドをLNA4として表１に示す。LNAオリゴヌクレオチドは、DNAへの最適な結合が得られるように、自己相補的塩基対合配列を含んでいてはならない。LNAオリゴヌクレオチド同士のLNA:LNAハイブリダイゼーションにより形成されるLNAオリゴヌクレオチドのアレイをDNA内の単一LNA相補的部位に結合させることができるように、さらなるLNAオリゴヌクレオチドに相補的な配列が初期の結合LNAオリゴヌクレオチド中に存在する別の実施形態を考えることもできる。
【００１３】
本発明では、LNAを機能性成分にコンジュゲートする。その結果、LNAが対象遺伝子をコードするDNAプラスミドに会合して宿主に投与されると、DNAプラスミドが遺伝子を発現させて、結合された成分の機能を発揮させることができるようになる。好ましくは、機能性成分は、発現エンハンサーまたはワクチンアジュバントのような生物学的応答調節剤である。
【００１４】
好ましくは、機能性成分は、有機分子、タンパク質、ペプチドまたは炭水化物または脂質の成分からなる群より選択される。とくに、核局在化ペプチド、真核細胞の原形質膜を横切る能力を有するペプチド(「細胞透過性ペプチド」)、エンドソーム脱出ペプチド、細胞標的性および結合性のペプチドまたはタンパク質。また、転写活性化ドメインを含有するタンパク質またはペプチドを、このプロセスで、LNAオリゴヌクレオチドにコンジュゲートすることも可能である。同様に、アジュバント活性または免疫刺激活性を有する分子を結合させることも可能である。
【００１５】
一連の機能活性タンパク質およびペプチドを、LNAオリゴヌクレオチドを介してDNAに結合させて多種多様な用途に供することが可能である。これらは、核局在化、細胞透過、およびエンドソーム放出をはじめとする細胞内輸送特性を示すペプチドのような機能性ペプチドのグループと、アジュバント活性を呈する小分子およびタンパク質のグループと、に分けることができる。より詳細には、ペプチドをベースとする核局在化シグナル(NLS)は、核に局在化されるタンパク質内に保有されたアミノ酸の短いストレッチである。これらは、古典的クラス(塩基電荷をもつストレッチ)、二部構成クラス(10〜20アミノ酸介在スペーサーにより分離された塩基電荷をもつ2つのストレッチ)、および非古典的クラス(高塩基電荷をもたない)として知られる3つのクラスに任意に分類されてきた。NLSペプチドがどのように作用してタンパク質の核内取込みへと細胞質を高めるかに関する知識の現在の発達状態が、最近レビューされた(3,4)。プラスミドDNAに結合されたNLSペプチドの存在は、細胞分裂を必要とすることなくかつまた非分裂細胞中において、トランスフェクト細胞の核膜を横切る核内取込みを高めるようにデザインされている。その結果として、遺伝子発現が高まって、より迅速に行われる。また、DNAが送達され、DNAがうまく核に達し、そしてコードされた遺伝子が発現される細胞の割合が増加する。LNAオリゴヌクレオチドへのコンジュゲーションにより、この系で使用できると考えられるそのような核局在化ペプチドの例としては、SV40 T Ag NLSおよび他のペプチドとのキメラ組合せ体、たとえば、MPG(5、6、7、21)、アデノウイルス繊維状ペプチド(8)、hnRNP A1のM9配列(9)、ポリオーマウイルスおよびSV40主要キャプシドタンパク質VP1(10、23)、HIV-1 tatタンパク質(11)、アンテナペディアペプチドおよび他のトロージャン(trojan)ペプチドまたは核内増殖因子由来のドメインを含む透過型ペプチドドメイン(12、13、14、15)、ステロイドホルモンレセプターおよび核輸送に必要とされるその補因子に由来するペプチドおよびタンパク質、たとえば、ARNT由来のペプチド(16)、ヌクレオプラスミンペプチド(17)、Vir D2ペプチド(18)、c-mycペプチド(19)、ポリリシン(20)、ヒトCMVのpp65(UL83)外皮タンパク質(22)、デルタ肝炎抗原(23)、ならびに核タンパク質のインポルチンβ結合ドメイン、ロイシンジッパー領域、およびMADSボックス領域をベースとするペプチド(25)が挙げられるが、これにより、他のそのようなペプチドの使用を除外するものではない。
【００１６】
比較的エネルギーに依存せずに真核細胞の原形質膜を横切る能力を有するペプチドは、細胞透過性ペプチドとして記述されてきた(26)。これは、細胞外プラスミドDNAの取込みを促進するのに有用であり、プラスミドにコードされた遺伝子を発現させる細胞の割合を増大させる。いくつかのそのようなペプチドはまた、NLS特性をも有し、先に列挙したものに包含されうるが、考慮すべきでそのようなNLS活性をもたない他のペプチドも存在し、たとえば、HSV-1由来のVP22および同種ヘルペスウイルスタンパク質由来の類似ペプチド(27)、HPV-1タイプ16キャプシドタンパク質L2および同種パピローマウイルスのウイルスタンパク質由来の類似ペプチド(28)、PEA、すなわち、Pseudomonas aeruginosa由来のエキソトキシンA遺伝子(29)、B型肝炎ウイルス表面抗原のpreS2-ドメイン(30)、シグナル配列または膜トランスロケーション配列(MTS)ペプチドおよびガルパランまたはトランスポータンのような合成ペプチド(26)が挙げられる。ただし、そのようなリストは必ずしもすべてを網羅するものではない。
【００１７】
エンドソーム溶解活性を有するペプチドがいくつか記載されている。これは、合成遺伝子送達系に組み込んでエンドソームからプラスミドDNAを脱出させることにより遺伝子発現を可能にする重要な機能であると考えられる。本発明で使用できると考えられるそのようなペプチドとしては、インフルエンザヘマグルチニンHA-2ペプチド(31)、水疱性口内炎ウイルスGタンパク質、アルツハイマーβアミロイドペプチド(32)、GALA(33)、αヘリックスペプチド(34)、KALA(35)、EALA(36)、メリチン由来ペプチド(37)、ならびにクロロキンおよびPEIのようにエンドソーム放出を促進すると考えられる他の化学物質およびポリマー(40)が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１８】
同様に、プラスミドDNAにアニーリングさせたときに細胞標的性および結合性を増強するペプチドまたは他の成分をLNAオリゴヌクレオチドに結合させれば、DNA発現の細胞特異的取込みおよび標的化が改良されうると考えられる。本発明に使用できると考えられるペプチドおよび他の細胞標的化成分としては、細胞表面レセプターに対するモノクロナール抗体、たとえば、CD4(38)、細胞表面レセプターに対するペプチドまたはタンパク質リガンド、たとえば、塩基性繊維芽細胞増殖因子(39)、トランスフェリン(40)、Flt-3リガンド(44)、インテグリン結合性ペプチド、たとえば、RGDモチーフを含有するペプチド(45)、細胞表面レセプターに対するリガンドとして作用する糖、たとえば、マンノース(41)、またはラクトシル化もしくはグルコノイル化ポリリシン(42)、またはガラクトース(43)、ならびにホレートおよび(46、47)内に記載の他のそのような細胞特異的リガンドを挙げることができるが、これ以外のものをなんら除外するものではない。
【００１９】
同様に本発明の対象となるのは、LNAオリゴヌクレオチドを介してプラスミドに結合させたとき、核局在化、エンドソーム脱出、および細胞標的化の機能活性を兼ね備え、遺伝子発現を増強するキメラペプチド、たとえば、(48)に記載のキメラペプチドである。
【００２０】
転写活性化ドメインを含有するペプチドおよびタンパク質の使用は、本発明に係る実施形態である。コンジュゲート化LNAオリゴヌクレオチドは、酵素の進行を妨害することなく、プラスミドからの遺伝子発現に必要とされるプロモーター内で、RNAポリメラーゼの結合部位に近接したプラスミド内の部位に結合させるように、デザインすることができる。RNAポリメラーゼとその補因子との結合を強化することにより、遺伝子発現が増強されることが期待される。記載されてきた主要な転写活性化ドメインには、3つのクラスがあり、これらは、酸性ドメイン、グルタミンリッチドメイン、およびプロリンリッチドメインである(69、70、71、72)。本発明に包含されうるそのようなドメインの例としては、VP16(アミノ酸337〜347)、Oct-2(アミノ酸143〜160)、およびSp1(アミノ酸340〜385)が挙げられる。ただし、このリストにないものをなんら除外するものではない。
【００２１】
本発明のさらに他の実施形態は、LNAオリゴヌクレオチドを介して、タンパク質、ペプチド、脂質、または小分子化学物質のいずれかの形(ただし、必ずしも他の形の調製物を除外するものではない)の免疫調節剤とくに免疫刺激剤を、プラスミドDNAに結合させることである。これは、送達系に利点をもたらす。その場合、免疫アジュバントとDNAを1つの調製物中に加えて、同一の細胞にさえも、共送達することが可能になる。本発明を用いれば、より少ない用量、より特定的には標的化用量のアジュバントをDNAと一緒に共送達して、大量の全身的用量の免疫調節剤を用いることにより生じる問題点のいくつかを削減することができる。これは、PMIDにとくに有利であろう。有望な免疫刺激剤としては、合成イミダゾキノリン、たとえば、イミキモド[S-26308、R-837](58)およびレシキモド[S-28463、R-848](59)、抗原提示細胞およびＴ細胞の表面上で構成的に発現されるカルボニルとアミンとのシッフ塩基、たとえば、ツカレソール(tucaresol)(60)、サイトカイン、ケモカイン、およびタンパク質またはペプチドのいずれかの形の共刺激性分子、これには次のような炎症促進性サイトカインが含まれる:GM-CSF、IL-1α、IL-1β、TGF-α、およびTGF-β、Th1インデューサー、たとえば、インターフェロンγ、IL-2、IL-12、IL-15、およびIL-18、Th2インデューサー、たとえば、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、およびIL-13、ならびに他のケモカインおよび共刺激性遺伝子、たとえば、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、TCA-3、CD80、CD86、およびCD40L(63)、他の免疫刺激性標的性リガンド、たとえば、CTLA-4およびL-セレクチン(63)、アポトーシス刺激性タンパク質およびペプチド、たとえば、Fas(49)、合成脂質系アジュバント、たとえば、バキスフェクチン(vaxfectin)(64)、スクアレン、αトコフェロール、ポリソルベート80、DOPC、およびコレステロール、エンドトキシン、[LPS](67)、ならびにTh1誘導性サイトカインを産生するようにTollレセプターを作動させる他の有望なリガンド、たとえば、合成ミコバクテリアリポタンパク質、ミコバクテリアタンパク質p19、ペプチドグリカン、テイコ酸、およびリピドA(68)が挙げられる。ただし、このリストはなんら網羅的なものではなく他の作用剤を除外するものではない。
【００２２】
主にTh1型応答を惹起するのに好ましい特定のアジュバントとしては、たとえば、モノホスホリルリピドAまたは好ましくは3-デ-O-アシル化モノホスホリルリピドAのようなリピドA誘導体が挙げられる。MPL(登録商標)アジュバントは、Corixa Corporation (Seattle, WA;たとえば、米国特許第4,436,727号、同第4,877,611号、同第4,866,034号、および同第4,912,094号を参照されたい)から入手可能である。CpG含有オリゴヌクレオチド(含まれるCpGジヌクレオチドは非メチル化体である)もまた、主にTh1応答を誘発する。そのようなオリゴヌクレオチドは周知であり、たとえば、WO 96/02555、WO 99/33488、ならびに米国特許第6,008,200号および同第5,856,462号に記載されている。また、免疫刺激性DNA配列が、たとえば、Sato et al., Science 273:352, 1996に記載されている。他の好ましいアジュバントとしては、サポニン、たとえば、Quil A、またはその誘導体、たとえば、QS21およびQS7(Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA);エスシン;ジギトニン;またはGypsophilaもしくはChenopodium quinoaサポニンが挙げられる。
【００２３】
LNAを介してDNAプラスミドに結合するのにとくに好ましいアジュバントは、CpGオリゴ-およびジ-ヌクレオチド(65、66)である。したがって、少なくとも1つのLNAを含有するオリゴヌクレオチド配列を有する第1の領域と、少なくとも1つのCG非メチル化ジヌクレオチドモチーフを含有する免疫刺激性オリゴヌクレオチド領域を有する第2の領域と、を含む新規なオリゴヌクレオチド組成物が提供される。免疫刺激性配列は、多くの場合、プリン, プリン, C, G, ピリミジン, ピリミジンであり、ここで、ジヌクレオチドCGモチーフはメチル化されない。本発明のアジュバントまたはワクチンに使用するのに好ましいオリゴヌクレオチドは、好ましくは少なくとも3ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも6ヌクレオチド以上離れた2つ以上のジヌクレオチドCpGモチーフを含有する。本発明のオリゴヌクレオチドは、典型的には、デオキシヌクレオチドである。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチド間は、ホスホロジチオエート結合またはより好ましくはホスホロチオエート結合であるが、ホスホジエステル結合および他のヌクレオチド間結合も本発明の範囲内である。たとえば、混合ヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドは、本発明の範囲内である。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドまたはホスホロジチオエートオリゴヌクレオチドを生成する方法は、US5,666,153、US5,278,302、およびWO95/26204に記載されている。好ましいオリゴヌクレオチドの例は、以下の配列を有する。これらの配列は、好ましくは、ホスホロチオエート修飾ヌクレオチド間結合を含有する。
【００２４】
オリゴ1 (配列番号1): TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826)
オリゴ2 (配列番号2): TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758)
オリゴ3 (配列番号3): ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG
オリゴ4 (配列番号4): TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006)
オリゴ5 (配列番号5): TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668)
【００２５】
他のCpGオリゴヌクレオチドは、わずかな欠失または付加を行った形で上記の好ましい配列を含んでいてもよい。本発明で利用されるCpGオリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知の任意の方法により合成することが可能である(たとえば、EP 468520)。便宜上、そのようなオリゴヌクレオチドは、自動合成機を利用して合成してもよい。
【００２６】
本発明で利用されるオリゴヌクレオチドは、典型的には、デオキシヌクレオチドである。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチド間結合は、ホスホロジチオエート結合またはより好ましくはホスホロチオエート結合であるが、ホスホジエステルも本発明の範囲内である。異なるヌクレオチド間結合を含むオリゴヌクレオチド、たとえば、混合ホスホロチオエートホスホジエステルも、利用可能であると考えられる。オリゴヌクレオチドを安定化させる他のヌクレオチド間結合を使用することも可能である。
【００２７】
蛍光標識化されたLNAオリゴヌクレオチドを用いて、本発明について具体的に説明する。このLNAオリゴヌクレオチドは、供給業者Proligo LLC (Boulder, Colorado, USA)から入手可能である。LNAオリゴヌクレオチドの他の修飾は、たとえば、水性ディールス・アルダーバイオコンジュゲーション反応により、たとえば、ビオチン、PEGコンジュゲート、およびマレイミドにより修飾されたLNAオリゴヌクレオチドを生成させるように行うことができる。標準的方法を用いて、第一級アミノ基、スルフヒドリル基、およびトリチル保護スルフヒドリル基のような反応性基および保護された反応性基をLNAオリゴヌクレオチドに結合させることもできる。市販の試薬および標識化キットを用いて、いくつかの標準的方法により、そのような化学修飾LNAオリゴヌクレオチドに蛍光標識および他の小分子を結合させることができる。たとえば、蛍光標識化されたストレプトアビジン(Perbio Science AB: Pierce Chemical Co. Rockford, Illinois, USA)を用いれば、簡単にかつ特異的にビオチン化LNAオリゴヌクレオチドに結合させることが可能であり、またはAlexa Fluor標識化キット(Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, USA)を用いれば、第一級アミンで修飾されたLNAオリゴヌクレオチドまたは第一級アミン基を含有するペプチドとのLNAオリゴヌクレオチドコンジュゲートに簡単に反応させることができる。
【００２８】
タンパク質中に天然に存在するかまたは簡単に市販の合成ペプチドに組み込むことのできる反応性化学基への結合を可能にする一連の市販の架橋試薬を用いて、ペプチドおよびタンパク質を修飾LNAオリゴヌクレオチドに結合させることが可能である。LNAオリゴヌクレオチドに対する一連の有望なペプチド結合を、以下に例示する。
【００２９】
i) C末端スルフヒドリル基を有する合成ペプチドは、ストレプトアビジンまたはニュートラビジン、たとえば、市販のEZ-link Maleimide Activated Neutravidin Biotin Binding Protein (Perbio Science AB: Pierce Chemical Co. Rockford, Illinois, USA)に簡単に結合させてから簡単にビオチン化LNAオリゴヌクレオチドに結合させることができる。
【００３０】
ii) C末端スルフヒドリル基を有する合成ペプチドは、修飾マレイミド標識化LNAオリゴヌクレオチドに直接結合させることができる。
【００３１】
iii) C末端スルフヒドリル基を有する合成ペプチドは、市販品として入手可能なヘテロ二官能性架橋剤SPDP (N-スクシンイミジル3-[2-ピリジルジチオ]プロピオネート) (Perbio Science AB: Pierce Chemical Co. Rockford, Illinois, USA)に結合させることが可能であり、さらに、これを、第一級アミン基を含有するように修飾されたLNAオリゴヌクレオチドに結合させることができる(1)。
【００３２】
上述した例は、なんら網羅的なものではく、ペプチドまたはタンパク質に見いだされるアミノ、アリール、カルボキシル、およびヒドロキシル基を利用する他の有望な結合方法も考案されており、広範にレビューされている(2)。他のヘテロ二官能性架橋試薬は、そのような反応性基を結合させるために利用可能であり、たとえば、カルボキシル基をアミンに結合させるカルボジイミド架橋剤、具体例としては1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩、スルフヒドリル基に結合する他の架橋試薬(たとえば、ハロアセチルまたはピリジルジスルフィド)、またはアミノ基に結合する他の架橋試薬、たとえば、イミドエステルまたはN-ヒドロスクシンイミド-エステル、具体例としてはスクシミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(SMCC)およびスクシミジル-4-(p-マレイミドフェニル)-ブチレート(SMPB)が挙げられる。
【００３３】
本発明の好ましい一実施形態は、細胞に送達された後でLNAオリゴヌクレオチドおよび結合されたプラスミドから(おそらく生物学的応答を発揮させるべく)選択的に開裂させることができるように、LNAオリゴヌクレオチドへの機能性成分の結合をデザインすることである。この一例を実施例９に記載する。実施例９では、単一のDNAホスホルアミデート残基により、CpGアジュバントをホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの形でLNAオリゴヌクレオチドに結合させる。これにより、細胞のエンドソーム区画に送達されたときに細胞のホスホジエステル酵素により開裂されうる「ハイブリッド」オリゴヌクレオチドが得られる。次に、開裂が起これば、遊離ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドとしてCpGアジュバントが放出され、その生物学的効果が発揮されうる。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態では、遺伝子をコードしかつLNAオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するDNA分子にLNA-コンジュゲートを会合させる。DNAは、好ましくはプラスミドの形態であり、好ましくは抗原または治療用タンパク質をコードする。
【００３５】
プラスミドは、投与の対象となる宿主におけるプラスミド複製を防止するために、好ましくは機能性複製起点をもたない。プロモーターは、好ましくは、CMVプロモーターなどの強力なウイルスプロモーターである。
【００３６】
プラスミドは複数のLNA相補的結合配列を備えていて、複数のLNA/コンジュゲートを結合させることが可能である。コンジュゲートは明確に異なる機能性成分を有していてもよい。かくして、本発明の一態様では、プラスミドを、核局在化ペプチドに結合させたLNAおよび小分子アジュバントに結合させたLNAと結合させることができる。典型的には、プラスミドは4以上の相補的LNA結合配列（好ましくは10〜20の配列）を有するが、最大100の配列が可能である。したがって、本発明の一態様では、1つのプラスミドに4つ以上のLNAコンジュゲートが結合されているプラスミドLNAコンジュゲート複合体が提供される。
【００３７】
好ましい実施形態では、抗原は、ヒト病原体に対して免疫応答を惹起することができる。この抗原または抗原性組成物としては、HIV-1に由来するのもの(たとえば、tat、nef、gp120またはgp160、gp40、p24、gag、env、vif、vpr、vpu、rev)、ヒトヘルペスウイルスに由来するのもの(たとえば、gH、gL、gM、gB、gC、gK、gE、もしくはgD、またはそれらの誘導体、または前初期タンパク質、たとえば、HSV1もしくはHSV2に由来するICP27、ICP47、ICP4、ICP36)、サイトメガロウイルス、とくにヒトサイトメガロウイルスに由来するのもの(たとえば、gBまたはその誘導体)、エプスタイン・バーウイルスに由来するのもの(たとえば、gp350またはその誘導体)、水痘帯状疱疹ウイルスに由来するのもの(たとえば、gpI、II、III、およびIE63)、あるいは肝炎ウイルスに由来するのもの、たとえば、B型肝炎ウイルスに由来するのもの(たとえば、B型肝炎表面抗原または肝炎コア抗原またはpol)、C型肝炎ウイルス抗原、およびE型肝炎ウイルス抗原、あるいは他のウイルス病原体に由来するのもの、たとえば、パラミクソウイルス科の呼吸器合胞体ウイルスに由来するのもの(たとえば、FおよびGタンパク質またはそれらの誘導体)、またはパラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルスに由来する抗原、ヒトパピローマウイルスに由来する抗原(たとえば、HPV6、11、16、18のL1、L2、E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7など)、フラビウイルス(たとえば、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス)に由来する抗原、またはインフルエンザウイルス細胞に由来する抗原(たとえば、HA、NP、NA、もしくはMタンパク質、またはそれらの組合せ)、あるいは細菌病原体に由来する抗原、たとえば、Neisseria sppに由来する抗原、たとえば、N. gonorrheaおよびN. meningitidisに由来する抗原(たとえば、トランスフェリン結合性タンパク質、ラクトフェリン結合性タンパク質、PilC、付着因子); S. pyogenesに由来する抗原(たとえば、Mタンパク質もしくはその断片、C5Aプロテアーゼ); S. agalactia e、S. mutansに由来する抗原; H. ducreyiに由来する抗原; Moraxella sppに由来する抗原、たとえば、Branhamella catarrhalisとしても知られるM catarrhalisに由来する抗原(たとえば、高および低分子量の付着因子およびインベーシン); Bordetella sppに由来する抗原、たとえば、B. pertussisに由来する抗原(たとえば、ペルタクチン、百日咳毒素またはその誘導体、繊維状ヘマグルチニン、アデニル酸シクラーゼ、フィムブリエ)、B. parapertussisおよびB. bronchisepticaに由来する抗原、Mycobacterium sppに由来する抗原、たとえば、M. tuberculosisに由来する抗原(たとえば、ESAT6、抗原85A、-B、または-C、MPT44、MPT59、MPT45、HSP10、HSP65、HSP70、HSP75、HSP90、PPD 19kDa[Rv3763]、PPD 38kDa[Rv0934])、M. bovis、M. leprae、M. avium、M. paratuberculosis、M. smegmatisに由来する抗原; Legionella spp、たとえば、L. pneumophilaに由来する抗原; Escherichia sppに由来する抗原、たとえば、腸内毒性E. coliに由来する抗原(たとえば、定着因子、易熱性毒素またはその誘導体、耐熱性毒素またはその誘導体)、腸管出血性E. coliに由来する抗原、腸病原性E. coliに由来する抗原(たとえば、志賀毒素様毒素またはその誘導体); Vibrio spp、たとえば、V. choleraに由来する抗原(たとえば、コレラ毒素またはその誘導体); Shigella spp、たとえば、S. sonnei、S. dysenteriae、S. flexneriiに由来する抗原; Yersinia sppに由来する抗原、たとえば、Y. enterocoliticaに由来する抗原(たとえば、Yopタンパク質)、Y. pestis、Y. pseudotuberculosisに由来する抗原; Campylobacter sppに由来する抗原、たとえば、C. jejuniに由来する抗原(たとえば、毒素、付着因子、およびインベーシン)およびC. coliに由来する抗原; Salmonella spp.、たとえば、S. typhi、 S. paratyphi、S. choleraesuis、S. enteritidisに由来する抗原; Listeria spp.、たとえば、L. monocytogenesに由来する抗原; Helicobacter spp、たとえば、H. pyloriに由来する抗原(たとえば、ウレアーゼ、カタラーゼ、空胞形成毒素); Pseudomonas spp、たとえば、P. aeruginosaに由来する抗原; Staphylococcus spp.、たとえば、S. aureus、S. epidermidisに由来する抗原; Enterococcus spp.、たとえば、E. faecalis、E. faeciumに由来する抗原; Clostridium spp.に由来する抗原、たとえば、C. tetaniに由来する抗原(たとえば、破傷風毒素およびその誘導体)、C. botulinumに由来する抗原(たとえば、ボツリヌス毒素およびその誘導体)、C. difficileに由来する抗原(たとえば、クロストリジウム毒素AまたはBおよびその誘導体); Bacillus spp.、たとえば、B. anthracisに由来する抗原(たとえば、ボツリヌス毒素およびその誘導体); Corynebacterium spp.、たとえば、C. diphtheriaeに由来する抗原(たとえば、ジフテリア毒素およびその誘導体); Borrelia spp.に由来する抗原、たとえば、B. burgdorferiに由来する抗原(たとえば、OspA、OspC、DbpA、DbpB)、B. gariniiに由来する抗原(たとえば、OspA、OspC、DbpA、DbpB)、B. afzeliiに由来する抗原(たとえば、OspA、OspC、DbpA、DbpB)、B. andersoniiに由来する抗原(たとえば、OspA、OspC、DbpA、DbpB)、B. hermsiiに由来する抗原; Ehrlichia spp.、たとえば、E. equiに由来する抗原およびヒト顆粒球性エールリヒア症の因子; Rickettsia spp、たとえば、R. rickettsiiに由来する抗原; Chlamydia spp.、たとえば、C. trachomatisに由来する抗原(たとえば、MOMP、ヘパリン結合性タンパク質)、C. pneumoniaeに由来する抗原(たとえば、MOMP、ヘパリン結合性タンパク質)、C. psittaciに由来する抗原; Leptospira spp.、たとえば、L. interrogansに由来する抗原; Treponema spp.に由来する抗原、たとえば、T. pallidumに由来する抗原(たとえば、微量外膜タンパク質)、T. denticola、T. hyodysenteriaeに由来する抗原; あるいは寄生生物に由来するもの、たとえば、Plasmodium spp.、たとえば、P. falciparumに由来するもの; Toxoplasma spp.、たとえば、T. gondiiに由来するもの(たとえば、SAG2、SAG3、Tg34); Entamoeba spp.、たとえば、E. histolyticaに由来するもの; Babesia spp.、たとえば、B. microtiに由来するもの; Trypanosoma spp.、たとえば、T. cruziに由来するもの; Giardia spp.、たとえば、G. lambliaに由来するもの; Leshmania spp.、たとえば、L. majorに由来するもの; Pneumocystis spp.、たとえば、P. cariniiに由来するもの; Trichomonas spp.、たとえば、T. vaginalisに由来するもの; Schisostoma spp.、たとえば、S. mansoniに由来するもの、あるいは酵母に由来するもの、たとえば、Candida spp.、たとえば、C. albicansに由来するもの; Cryptococcus spp.、たとえば、C. neoformansに由来するものがある。
【００３８】
M. tuberculosisに対する他の好ましい特異的抗原は、たとえば、Rv2557、Rv2558、RPF: Rv0837c、Rv1884c、Rv2389c、Rv2450、Rv1009、aceA(Rv0467)、PstS1、(Rv0932)、SodA(Rv3846)、Rv2031c 16kDal、Tb Ra12、Tb H9、Tb Ra35、Tb38-1、Erd 14、DPV、MTI、MSL、mTTC2、およびhTCC1である(WO 99/51748)。M. tuberculosisに対するタンパク質にはまた、融合タンパク質およびその変異体が包含される。その場合、M. tuberculosis由来の少なくとも2つ、好ましくは3つのポリペプチドが融合されて、より大きいタンパク質が形成されている。好ましい融合体としては、Ra12-TbH9-Ra35、Erd14-DPV-MTI、DPV-MTI-MSL、Erd14-DPV-MTI-MSL-mTCC2、Erd14-DPV-MTI-MSL、DPV-MTI-MSL-mTCC2、TbH9-DPV-MTIが挙げられる(WO 99/51748)。
【００３９】
クラミジアに対する最も好ましい抗原としては、たとえば、高分子量タンパク質(HWMP)(WO 99/17741)、ORF3(EP 366 412)、および推定上の膜タンパク質(Pmps)が挙げられる。ワクチン製剤の他のクラミジア抗原は、WO 99/28475に記載されている群から選択することができる。
【００４０】
好ましい細菌ワクチンとしては、Streptococcus spp、たとえば、S. pneumoniaeに由来する抗原(PsaA、PspA、ストレプトリシン、コリン結合性タンパク質)およびタンパク質抗原ニューモリシン(Biochem Biophys Acta, 1989, 67, 1007; Rubins et al., Microbial Pathogenesis, 25, 337-342)ならびにそれらの突然変異無毒化誘導体(WO 90/06951; WO 99/03884)が挙げられる。他の好ましい細菌ワクチンとしては、Haemophilus spp.に由来する抗原、たとえば、H. influenzaeタイプBに由来する抗原(たとえば、PRPおよびそのコンジュゲート)、分類不能型H. influenzaeに由来する抗原、たとえば、OMP26、高分子量付着因子、P5、P6、プロテインD、およびリポプロテインD、ならびにフィンブリンおよびフィンブリンから誘導されるペプチド(US 5,843,464)、またはそれらの多重コピー変異体もしくは融合タンパク質が挙げられる。
【００４１】
本発明に使用しうる抗原には、マラリアを引き起こす寄生生物に由来する抗原がさらに包含されうる。たとえば、Plasmodia falciparumに由来する好ましい抗原としては、RTS,SおよびTRAPが挙げられる。RTSは、B型肝炎表面抗原のpreS2部分の4つのアミノ酸を介して、P.falciparumのスポロゾイト周囲(CS)タンパク質のC末端部分を実質的にすべて、B型肝炎ウイルスの表面(S)抗原に連結させて含有するハイブリッドタンパク質である。その全構造は、英国特許出願第9124390.7号の優先権を主張してWO 93/10152号として公開された国際特許出願PCT/EP92/02591号に開示されている。酵母中で発現させた場合、RTSがリポタンパク質粒子として産生され、HBV由来のS抗原と共発現させた場合、RTS,Sとして知られる混合粒子が産生される。TRAP抗原については、WO 90/01496として公開された国際特許出願PCT/GB89/00895号に記載されている。本発明の好ましい実施形態は、抗原性調製物がRTS,S抗原とTRAP抗原との組合せを含むことを特徴とするマラリアワクチンである。マルチステージマラリアワクチンの成分の候補物質になると思われる他のマラリア原虫抗原は、P. faciparum MSP1、AMA1、MSP3、EBA、GLURP、RAP1、RAP2、Sequestrin、PfEMP1、Pf332、LSA1、LSA3、STARP、SALSA、PfEXP1、Pfs25、Pfs28、PFS27/25、Pfs16、Pfs48/45、Pfs230、およびPlasmodium sppにおけるそれらの類似体である。
【００４２】
本発明は、抗腫瘍抗原の使用を意図しており、癌の免疫療法処置に有用である。たとえば、前立腺癌、乳癌、大腸癌、肺癌、膵臓癌、腎臓癌、または黒色腫癌の腫瘍拒絶抗原など。代表的な抗原としては、MAGE 1、3、およびMAGE 4、またはWO99/40188に開示されているような他のMAGE抗原、PRAME、BAGE、Lage(NY Eos 1としても知られる)、SAGE、およびHAGE(WO 99/53061)またはGAGE(Robbins and Kawakami, 1996, Current Opinions in Immunology 8, pps 628-636; Van den Eynde et al., International Journal of Clinical & Laboratory Research (submitted 1997); Correale et al. (1997), Journal of the National Cancer Institute 89, p293)が挙げられる。実際には、これらの抗原は、黒色腫、肺癌、肉腫、および膀胱癌のような広範にわたる腫瘍タイプで発現される。
【００４３】
本発明に使用するためのMAGE抗原は、発現エンハンサーまたは免疫学的融合パートナーとの融合タンパク質として発現させることが可能である。とくに、Mageタンパク質はHeamophilus influenzae B由来のプロテインDに融合させることが可能である。とくに、融合パートナーは、プロテインDの最初の1/3を含有しうる。そのような構築物は、WO99/40188に開示されている。癌特異的エピトープを含有しうる融合タンパク質の他の例としては、bcr/abl融合タンパク質が挙げられる。
【００４４】
好ましい実施形態では、前立腺抗原、たとえば、前立腺特異的抗原(PSA)、PAP、PSCA (PNAS 95(4)1735 -1740 1998)、PSMA、またはプロスターゼとして知られる抗原が利用される。
【００４５】
プロスターゼは、保存されたセリンプロテアーゼ触媒性三つ組H-D-Sとアミノ末端プレプロペプチド配列（分泌機能の可能性が示唆される）とを有する254アミノ酸長の前立腺特異的セリンプロテアーゼ(トリプシン様)である (P. Nelson, Lu Gan, C. Ferguson, P. Moss, R. Gelinas, L. Hood & K. Wand, "アンドロゲンにより調節され前立腺で限定発現されるセリンプロテアーゼであるプロスターゼの分子クローニングおよび特性決定(Molecular cloning and characterisation of prostase, an androgen-regulated serine protease with prostate restricted expression), In Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96, 3114-3119)。推定上のグリコシル化部位についての記載がなされている。予測された構造は、他の公知のセリンプロテアーゼのものと非常に類似しており、その成熟ポリペプチドは単一ドメインにフォールディングされていることが明らかにされている。成熟タンパク質は、224アミノ酸の長さであり、1つのA2エピトープが、天然でプロセシングされることが明らかにされている。
【００４６】
プロスターゼヌクレオチド配列および推定ポリペプチド配列および相同体は、Fergusonら (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96, 3114-3119)ならびに国際特許出願WO 98/12302号(さらには対応付与特許US 5,955,306)、WO 98/20117号(さらには対応付与特許US 5,840,871およびUS 5,786,148)(前立腺特異的カリクレイン)、およびWO 00/04149号(P703P)に開示される。
【００４７】
本発明は、プロスターゼタンパク質ならびにその断片および相同体(「誘導体」)をベースとするプロスターゼタンパク質融合体を含む抗原を提供する。そのような誘導体は、前立腺腫瘍を処置するのに好適な治療用ワクチン製剤に使用するのに好適である。典型的には、断片は、先に参照した特許および特許出願に開示されているように、少なくとも20個、好ましくは50個、より好ましくは100個連続したアミノ酸を含有するであろう。
【００４８】
さらなる好ましい前立腺抗原は、WO98/37814に記載の配列番号113のP501Sとして知られている。その遺伝子によりコードされた免疫原性断片および部分としては、先に参照した特許出願に開示されているように、少なくとも20個、好ましくは50個、より好ましくは100個連続したアミノ酸を含有するものが利用可能であると考えられる。特定の断片は、PS108(WO 98/50567)である。
【００４９】
他の前立腺特異的抗原は、WO98/37418およびWO/004149から公知である。このほかには、STEAP PNAS 96 14523 14528 7-12 1999がある。
【００５０】
本発明に関連して有用な他の腫瘍関連抗原としては、Plu-1 (J Biol. Chem 274 (22) 15633-15645 1999)、HASH-1、HasH-2、Cripto (Salomon et al Bioessays 199, 21 61-70、米国特許第5654140号)、Criptin (米国特許第5 981 215号)が挙げられる。このほか、癌の治療においてワクチンにとくに適合した抗原として、さらに、チロシナーゼおよびサービビンが挙げられる。
【００５１】
本発明はまた、Muc-1、Muc-2、EpCAM、her 2/ Neu、マンマグロビン(米国特許第5668267号)のような乳癌抗原、またはWO/00 52165、WO99/33869、WO99/19479、WO 98/45328に開示されている抗原と組み合わせるのに有用である。Her 2 neu抗原は、とくに、米国特許第5,801,005号に開示されている。好ましくは、Her 2 neuは、全細胞外ドメイン(ほぼアミノ酸1-645を含む)またはその断片と、全細胞内ドメイン(C末端の約580アミノ酸)の少なくとも免疫原性部分と、を含む。とくに、細胞内部分は、リン酸化ドメインまたはその断片を含んでいなければならない。そのような構築物は、WO00/44899に開示されている。とくに好ましい構築物は、ECD PDとして知られ、第2の構築物は、ECD □PDとして知られる(WO/00/44899を参照されたい)。
【００５２】
本発明で使用されるher 2 neuは、ラット、マウス、またはヒトに由来しうる。
【００５３】
プラスミドは、腫瘍維持機構(たとえば、血管形成、腫瘍浸潤)に関連する抗原、たとえば、tie 2、VEGFをコードしうる。
【００５４】
本発明のワクチンはまた、アレルギー、癌、または感染性疾患のほかに、慢性障害の予防または治療に使用することも可能である。そのような慢性障害は、喘息、アテローム性動脈硬化症、およびアルツハイマー病のような疾患ならびに他の自己免疫障害である。避妊薬として使用するためのワクチンもまた、対象になりうる。
【００５５】
アルツハイマー性神経変性疾患に罹患しやすいまたは罹患している患者の予防および治療に適合する抗原は、とくに、N末端の39-43アミノ酸断片(アミロイド前駆体タンパク質およびより小さい断片)である。この抗原は、国際特許出願WO 99/27944-(Athena Neurosciences)に開示されている。
【００５６】
自己免疫障害用のワクチンまたは避妊ワクチンに含まれうる有望な自己抗原としては、サイトカイン、ホルモン、増殖因子、または細胞外タンパク質、より好ましくは4-ヘリカルサイトカイン、最も好ましくはIL13が挙げられる。サイトカインとしては、たとえば、IL1、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL11、IL12、IL13、IL14、IL15、IL16、IL17、IL18、IL20、IL21、TNF、TGF、GMCSF、MCSF、およびOSMが挙げられる。4重螺旋サイトカインとしては、IL2、IL3、IL4、IL5、IL13、GMCSF、およびMCSFが挙げられる。ホルモンとしては、たとえば、黄体形成ホルモン(LH)、濾胞刺激ホルモン(FSH)、絨毛性ゴナドトロピン(CG)、VGF、GHrelin、アグーチ(agouti)、アグーチ関連タンパク質、およびニューロペプチドYが挙げられる。増殖因子としては、たとえば、VEGFが挙げられる。
【００５７】
本発明のワクチンは、慢性症状および癌のような疾患の免疫療法処置だけでなく、持続性感染症の治療にも、とくに適している。したがって、本発明のワクチンは、結核症(TB)、AIDS、およびB型肝炎(HepB)ウイルス感染症のような感染性疾患の免疫治療にとくに好適である。
【００５８】
したがって、TB、AIDS、およびHepBのような感染性疾患の免疫治療のための本発明を含むワクチンと、TB、AIDS、およびHepBのような感染性疾患の免疫治療のための医薬の製造におけるその使用と、が提供される。TBに関連して、本発明のワクチンを個体に投与することにより、その個体の細菌負荷量を低減させることを含む、TB感染症に罹患している個体の治療方法が提供される。肺痰中に見いだされるTB量の低減に相当する細菌負荷量の低減は、TB疾患の改善または治癒をもたらす。
【００５９】
また、AIDSに関連して、AIDSに罹患しやすいまたは罹患している個体の処置方法が提供される。この方法には、本発明のワクチンを個体に投与することにより、後続のHIV感染により誘発されるCD4+ T細胞減少の量を低減させることまたはすでにHIVに感染している個体においてCD4+ T細胞減少を遅らせるかもしくは停止させることが含まれる。
【００６０】
さらに、持続性B型肝炎感染症に関連して、HepB感染症に罹患しやすいまたは罹患している個体の処置方法が提供される。したがって、本発明のワクチンを個体に投与することにより、血清中のHepB負荷のレベルを減少させること(DNAクリアランスにより測定される)、さらには肝損傷の量を減少させること(酵素アラニントランスフェラーゼ(ALT)の血清レベルの減少または安定化により検出される)を含む方法が提供される。
【００６１】
したがって、LNAコンジュゲート/DNA複合体は、医薬用または免疫原性の組成物またはワクチンとして製剤化することが可能である。本発明に係る実施形態では、たとえば、Ulmer et al., Science 259:1745-1749, 1993に記載されているように、またCohen, Science 259:1691-1692, 1993にレビューされているように、ポリヌクレオチドを「裸」のDNAとして投与/送達する。その際、DNAは、緩衝塩類溶液中に製剤化されるか、組織に直接注射される。裸のDNAの取込みは、細胞中に効率的に輸送される生分解性ビーズ上にDNAをコーティングすることにより、または他の周知のトランスフェクション促進剤を用いることにより、増大させることが可能である。LNAコンジュゲート/DNAは、たとえばリポソームのような担体と組み合わせて、投与することが可能である。典型的には、そのようなリポソームは、カチオン性であり、たとえば、イミダゾリウム誘導体(WO95/14380)、グアニジン誘導体(WO95/14381)、ホスファチジルコリン誘導体(WO95/35301)、ピペラジン誘導体(WO95/14651)、およびビグアニド誘導体である。LNAコンジュゲート/DNA複合体は、プロモーター配列に機能的に連結されたCTFRまたはエリトロポイエチン遺伝子のような対象遺伝子を送達しうる。したがって、病因が遺伝的異常(たとえば、嚢胞性繊維症)により特性づけられる疾患または障害を是正または補償する方法が提供される。その方法には、臨床処置の必要な哺乳動物患者に、治療上有効な量の構築物、好ましくは担体に組み込まれた構築物を投与するステップが含まれる。
【００６２】
さらに他の実施形態では、粒子ボンバードメント法により、本発明の組成物を送達することができる。その方法の多くは記載されている(WO 91/07487)。一具体例では、Powderject Pharmaceuticals PLC (Oxford, UK)およびPowderject Vaccines Inc. (Madison, WI)により製造されるようなデバイスを用いて、ガス駆動式粒子加速を達成することができる。そのようなデバイスのいくつかの例が、米国特許第5,846,796号、同第6,010,478号、同第5,865,796号、同第5,584,807号、およびEP特許第0500 799号に記載されている。この方法を用いれば、手持ち式デバイスにより発生させたヘリウムガスジェット内でポリヌクレオチドのような微細粒子の乾燥粉末製剤を加速して、対象標的組織(典型的には皮膚)の中に粒子を押し込む無針送達法が可能になる。粒子は、好ましくは0.4〜4.0μm、より好ましくは0.6〜2.0μmの直径を有する金ビーズであり、該ビーズにDNAコンジュゲートをコーティングし、次に、カートリッジに収容して「遺伝子銃」中に配置する。
【００６３】
したがって、対象遺伝子をコードするDNAプラスミドでコーティングされた緻密マイクロビーズを含むDNA送達デバイスが提供される。ただし、該プラスミドは、機能性成分に連結された1つ以上のLNAと会合している。好ましくは、機能性成分-LNA-プラスミドが金マイクロビーズに吸着されているワクチンまたは免疫原性組成物が提供される。
【００６４】
関連する実施形態では、本発明の組成物のガス駆動式無針注射を行うのに有用と思われる他のデバイスおよび方法には、Bioject, Inc. (Portland, OR)により提供されるものが包含される。そのいくつかの例は、米国特許第4,790,824号、同第5,064,413号、同第5,312,335号、同第5,383,851号、同第5,399,163号、同第5,520,639号、および同第5,993,412号に記載されている。
【００６５】
以下の実施例により、本発明について具体的に説明するが、これらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００６６】
スーパーコイルプラスミドDNAへのLNAおよびPNAオリゴヌクレオチドの比較結合
プラスミド
この試験で使用したプラスミドはすべて、図1に記載されている。Qiagen MaxiPrep手順(Qiagen GmbH, Hilden, Germany)を用いて標準的アルカリ溶解法によりプラスミドDNAを調製し、TE(10mM TrisHCl, 1mM EDTA), pH8.0中に1μg/μlで再懸濁させた。アガロースゲル電気泳動により分析したところ、プラスミドは>95%スーパーコイル状態であることがわかった(51)。
【００６７】
LNAオリゴヌクレオチド
この試験で使用したLNAオリゴヌクレオチド(表1)は、5'末端にローダミンを結合させた形で合成されたものである(Proligo LLC, Colorado, USA)。LNA 5は、100% LNAまたは100% DNAオリゴヌクレオチドと比較して中間的ハイブリダイゼーション特性が得られるように、50% LNAおよび50% DNAモノマー残基を用いて調製した。
【表１】
2005503780.tif 000002
【００６８】
LNA残基は、太字の大文字で示され、DNA残基は、太字の小文字で示され、PNAおよびアミノ酸残基は、イタリック体で示されている。
O = 8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸リンカー、J = プソイドイソシトシン、gly = グリシン、lys = リシン。
結合部位の数は、gWizプラスミドに存在する理論上のオリゴヌクレオチド結合部位の最大数をさす。
【００６９】
PNAオリゴヌクレオチド
この試験で使用したPNAオリゴヌクレオチド(表1)は、2つの供給元から入手した。GTS PNAは、市販のプラスミド標識化システムにより5'ローダミン標識化されたPNAクランプとしてGTS Inc., (San Diego, California, USA)から購入した。OsPNA2は、5'/N末端グリシン残基および3'/C末端リシン残基で修飾された5'ローダミン標識化「ビス」PNAまたはPNAクランプ(52,54)として、Oswel DNA Service (Southampton, UK)から購入した。これにより、DNAに結合させたときに「ビス」PNAの安定性が改良されると考えられる(53)。両方のPNAのデザイン構造の背後にある原理は、標準的ワトソン・クリック型塩基対合とフーグスティーン型塩基対合の両方によりDNAに結合させて、二本鎖DNAの一方の鎖上で三本鎖塩基対構造を形成できることである(50,52)。「O」残基(表1)は、PNAを2つの領域に分離し、「O」残基の3'すなわちC末端領域は、DNAとフーグスティーン型塩基対を形成することが可能であり、これは、J(プソイドシトシン)残基を含有する「ビス」PNAまたはPNAが高pH>5〜6で塩基対を形成するのに最適である。一方、C(シトシン)残基は、低pH<6でもフーグスティーン型塩基対合を呈することができる(52)。
【００７０】
LNAおよびPNAオリゴヌクレオチドは、いずれも、gWizプラスミド中に存在する複数のホモプリンAG結合部位に特異的に結合するはずである(表1, 図1, 50)。
【００７１】
図1は、この試験で使用したプラスミドを示している。
(A)gWizは、ルシフェラーゼ発現ベクター((Gene Therapy Systems [GTS], Inc., San Diego, California, USA))であり、これは、プラスミドのbGHpyA領域のDNA配列内に複数のAGモチーフを含有する(GTS Catalogue, 1999)。
Luc = ルシフェラーゼ、bGHpyA = ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域。
(B)pGGGFPは、GFP発現ベクター((Gene Therapy Systems [GTS], Inc., San Diego, California, USA))であり、これは、プラスミドのbGHpyA領域のDNA配列内に複数のAGモチーフを含有する(50)。
(C)pGL3CMVは、pGL3 Basicをベースとするルシフェラーゼ発現ベクター(Promega Corporation., Madison, Wisconsin, USA)であり、CMV前初期プロモーターがルシフェラーゼ発現を駆動する(I. Catchpole, 未発表)。
【００７２】
スーパーコイルプラスミドDNAとのLNAおよびPNAオリゴヌクレオチドのインキュベーション
PNAオリゴヌクレオチドのアニーリング/標識化条件は、文献(55)に記載の条件に従った。スーパーコイルプラスミドDNAへのPNA結合の効率を最大にするために、塩を含有しない低pH<6のバッファー(10mMリン酸塩バッファー, 1mM EDTA, pH5.8)中、37℃で16時間かけて標識化を行った。低pHでは、シトシン残基は、プソイドシトシン残基と同じような効率でフーグスティーン型塩基対を形成するはずである。最初に、10μgのプラスミドDNAを全体積20μlで標識化した(52)。そのとき、PNAオリゴヌクレオチドは、プラスミドDNA中に存在する有望な結合部位の最大数10部位の20倍モル過剰で存在させた(表1, 50参照)。OsPNA2については、95℃で10分間、続いて室温(20℃)で10分間、その後、37℃で16時間加熱することにより、標識化を行った(7)。
【００７３】
LNAオリゴヌクレオチドによるプラスミドの標識化は、最初に、PNA標識化の条件と同等の条件下で、すなわち、プラスミド中のPNA/LNA結合部位の最大数(10個)の20倍モル過剰のオリゴヌクレオチドを使用し全体積20μl中に10μgのプラスミドDNAを存在させて、行った。ただし、pH7.0(すなわち、10mMリン酸塩バッファー, 1mM EDTA, pH7.0, 16時間, 37℃)で行った。
【００７４】
2.5μgのプラスミドDNAを含有する標識化反応液の一部分を、臭化エチジウム(EtBr)の不在下で2%アガロース/TAEゲル(Sigma, 51)を用いて電気泳動させた後、分析した。ローダミン標識化(LNA/PNA結合)プラスミドDNAの存在は、UV光下の蛍光により可視化させた(図2A)。ローダミンの効率つまりPNA/LNA標識化の比較ができるように、EtBrゲル染色(0.5μg/ml, 10分間)により全プラスミドの局在位置を特定し、UV光下で可視化させた(図2 B)。
【００７５】
図2は、ローダミン標識化LNAまたはPNAオリゴヌクレオチドと共にインキュベートしたスーパーコイルプラスミドDNAを分析すべく臭化エチジウム(EtBr)の不在下で2%アガロースゲル電気泳動を行った結果を示している。
(A) EtBr染色前のGel Doc 1000システム(Bio-Rad Laboratories, California, USA)を用いたMulti Analystパッケージによるゲル分析。
(B) EtBr染色後の(A)。
1) 1μgの1kb DNAラダー(Life Technologies Ltd, Paisley, UK)。
2) GTS PNAにより商業的に標識化された2.5μgのpGGGFPプラスミド。
3) GTS PNAローダミン標識化キットにより標識化された2.5μgのgWizプラスミド。
4) 37℃でローダミンOsPNA2により標識化された2.5μgのgWizプラスミド。
5) 95℃/室温でローダミンOsPNA2により標識化された2.5μgのgWizプラスミド。
6) 37℃でローダミンLNA2により標識化された2.5μgのgWizプラスミド。
7) 37℃でローダミンLNA4により標識化された2.5μgのgWizプラスミド。
8) 37℃でローダミンLNA5により標識化された2.5μgのgWizプラスミド。
【００７６】
図2に示されるデータから明らかなように、この試験で使用した3つのLNAオリゴヌクレオチド(LNA 2、4、および5)すべてについて、PNAオリゴヌクレオチドで示された効率と同じような効率で、記載の条件下で、プラスミドDNAへの鎖置換および結合を行うことが可能であった。
【００７７】
スーパーコイルプラスミドDNAとのLNAおよびPNAオリゴヌクレオチドのより大きいスケールでのアニーリング
90〜110μgのプラスミドDNAのサンプルについて、先に記載のものと同じような標識化条件下で、200〜500μlの体積で、プラスミド標識化反応を繰り返した。この実験では、LNAオリゴヌクレオチドとプラスミドDNAとの比を、プラスミド1分子あたり理論上の10結合部位の2倍モル過剰まで減少させた。ただし、OsPNA2のモル過剰率は、100倍まで増大させた。
【００７８】
上述したように、2.5μgのプラスミドDNAを含有する標識化反応液のアリコートを、2%アガロース/TAEゲルを用いて電気泳動させた後、分析した(図3)。
【００７９】
図3は、ローダミン標識化LNAまたはPNAオリゴヌクレオチドと共にインキュベートしたスーパーコイルプラスミドDNAを分析すべく臭化エチジウム(EtBr)の不在下で2%アガロースゲル電気泳動を行った結果を示している。
(A) EtBr染色前のGel Doc 1000システム(Bio-Rad Laboratories, California, USA)を用いたMulti Analystパッケージによるゲル分析。
(B) EtBr染色後の(A)。
1) 1μgの1kb DNAラダー(Life Technologies Ltd, Paisley, UK)。
2) ブランク。
3) 37℃でローダミンLNA2により標識化された2.5μgのgWizプラスミド。
4) 37℃でローダミンLNA4により標識化された2.5μgのgWizプラスミド。
5) 37℃でローダミンLNA5により標識化された2.5μgのgWizプラスミド。
6) GTS PNAローダミン標識化キットにより標識化された2.5μgのgWizプラスミド。
7) 37℃でローダミンOsPNA2により標識化された2.5μgのgWizプラスミド。
8) ブランク。
【００８０】
LNAオリゴヌクレオチドのモル過剰率がOsPNA2のときと比較して大きく異なっていたにもかかわらず、3つのLNAオリゴヌクレオチド(LNA 2、4、および5)はすべて、UV光下のローダミン蛍光により判定した場合、OsPNA2よりも効率的にプラスミドDNAを標識化するように思われた(図3)。
【００８１】
プラスミドDNA内のコグネイト結合部位へのオリゴヌクレオチドの結合の確証
この試験に記載されているオリゴヌクレオチドLNAおよびPNAの両方がプラスミドDNA内の期待される相補的配列に結合したかを調べるために、図2に記載の標識化実験で用いたプラスミドDNAのサンプル2.5μgを制限酵素分析にかけた。簡潔に述べると、サンプルをBsa IおよびSphIで消化した(37℃で8時間、続いて55℃で8時間、それぞれ標準的条件(1×反応バッファー4, NEB, Beverly, MA, USA)下で消化した)。次に、上述したように、EtBrを用いずに2%アガロース/TAEゲルにより電気泳動させた後、サンプルを分析した。EtBr染色を行わないときの分析結果を図4Aに示し、EtBr染色後の分析結果を図4Bに示す。gWizプラスミド(6.73kb, 図1A)のBsa I/Sph I消化により、次のサイズ: 3.66kb、1.49kb、1.25kb、および300bpの線状DNA断片が生成される(データは示されていない, 図4B)。ここで、300bpのBsa I/Sph I断片は、プラスミドgWIZのbGHpyA領域内のすべてのPNAおよびLNAオリゴヌクレオチド結合部位(複数のAGモチーフ)を含有する(図1A, 50)。
【００８２】
3つのLNA(LNA 2、4、および5)がすべて、GTS PNA対照で観測されたように、期待される300bp断片への特異的結合を呈することに注目されたい(図4)。
【００８３】
図4は、ローダミン標識化LNAまたはPNAオリゴヌクレオチドと共にインキュベートしたスーパーコイルプラスミドDNAを分析すべく、制限酵素Bsa IおよびSph I(New England Biolabs Inc., Beverly, MA., USA)により37℃で一晩かけて消化した後、臭化エチジウム(EtBr)の不在下で2%アガロースゲル電気泳動を行った結果を示している。
(A) EtBr染色前のGel Doc 1000システム(Bio-Rad Laboratories, California, USA)を用いたMulti Analystパッケージによるゲル分析。
(B) EtBr染色後の(A)。
1) 1μgの1kb DNAラダー(Life Technologies Ltd, Paisley, UK)。
2) 37℃でローダミンLNA2により標識化された2.5μgのgWizプラスミド。
3) 37℃でローダミンLNA4により標識化された2.5μgのgWizプラスミド。
4) 37℃でローダミンLNA5により標識化された2.5μgのgWizプラスミド。
5) GTS PNAローダミン標識化キットにより標識化された2.5μgのgWizプラスミド。
6) 37℃でローダミンOsPNA2により標識化された2.5μgのgWizプラスミド。
7) 95℃/室温でローダミンOsPNA2により標識化された2.5μgのgWizプラスミド。
8) ブランク。
【００８４】
300bp断片に結合されるLNAオリゴヌクレオチドが異なれば、2%アガロースゲル中においてこの断片の電気泳動移動が遅延される度合も異なるように見える(図4)。興味深いことに、このことは300bp断片に結合されるLNAオリゴヌクレオチドの数または複数の結合部位の占有度に関連付けることが可能であると思われる。すなわち、最も遅延された種は最も多く結合されたLNAオリゴヌクレオチドを有するものに相当すると考えられる。OsPNA 2オリゴヌクレオチドの結合により引き起こされる300bp断片の遅延は、グリシンおよびリシンアミノ酸残基をも含有するこのPNAが正に荷電されていることが原因であると考えられる。いくつかのレーンでローダミン蛍光を示す弱い約3.66kbのバンド(図4A)は、部分的な制限酵素消化(すなわち、Bsa Iは完全には切断しない(図1A))により生成されるgWIzの約3.96kbのSphI断片である可能性が大きく、したがって、300bp Bsa I/Sph I断片中に存在すると期待されるオリゴヌクレオチド結合部位をすべて含有していると予想される。
【００８５】
スーパーコイル二本鎖プラスミドDNAへのPNAオリゴヌクレオチドの結合のときと同じように、LNAオリゴヌクレオチドとの結合は、おそらく、期待される相補的塩基対合規則に依存し、検出可能な配列非特異的結合を示さないと思われる。
【実施例２】
【００８６】
PMIDまたは「遺伝子銃」向けのカートリッジ作製手順におけるスーパーコイルプラスミドDNAに結合されたLNAおよびPNAオリゴヌクレオチドの挙動
「遺伝子銃」を用いるPMID向けに調製されたプラスミドDNA(Accell XR1, Powderject, Wisconsin, MA, USA)と組み合わせて、市販のローダミン-PNAクランププラスミド標識化システム(GTS Inc., San Diego, California, USA)を使用するこれまでの試みは、満足すべきものではなかった。「PNAクランプ」は、プラスミド/「金スラリー」コーティング手順において、完全に除去された(I. Catchpole, 未発表, 以下参照)。
【００８７】
上述した大きいスケールでのLNAおよびPNAオリゴヌクレオチド標識化プラスミド(図3)を、エタノール沈澱させ(51)、TE PH8.0(10mM Tris HCl pH8.0)中に1μg/μlで再懸濁させ、70〜100μgスケールでの「金スラリー」コーティング手順に付した(以下を参照されたい)。標識化されていないpGL3CMVプラスミドと、化学的方法(ローダミンコンジュゲートをプラスミドDNA中のほとんどのG残基に直接化学結合させる方法, Mirus Label IT kit, Panvera, Madison, Wisconsin, USA)によりローダミンで標識化されたpGL3CMVとを、対照としてカートリッジ作製手順に供した。
【００８８】
「遺伝子銃」DNAカートリッジ用のプラスミドコーティング「金スラリー」の調製
プラスミドDNA(約1μg/μl)、たとえば100μg、および2μmの金粒子、たとえば50mg(PowderJect)を、0.05Mスペルミジン、たとえば100μl(Sigma)中に懸濁させた。1M CaCl2、たとえば100μl(American Pharmaceutical Partners, Inc., USA)の添加により、DNAを金粒子上に沈澱させた。DNA/金複合体を室温で10分間インキュベートし、無水エタノール、たとえば3×1ml(あらかじめモレキュラーシーブ3A(BDH)で脱水しておく)で3回洗浄した。0.05mg/mlのポリビニルピロリドン(PVP、Sigma)を含有する無水エタノール中にサンプルを再懸濁させ、3つの等分アリコートに分けて1.5ml微量遠心チューブ(Eppendorf)に入れた。アリコートは、(a)「金スラリー」の分析、(b) (a)から溶出させた溶出液-プラスミドの分析、および(c)「遺伝子銃」用の金/プラスミドコーティングTefzelカートリッジの作製(下記の実施例3を参照されたい)に供した。サンプル(a)および(b)を調製するために、プラスミドDNA/「金スラリー」のエタノール/PVP液の入ったチューブをEppendorf 5418微量遠心機により最高速度で2分間回転させ、上清を除去し、「金スラリー」を室温で10分間乾燥させた。約50％コーティングを想定して、0.5〜1.0μg/μlのプラスミドDNAのTE pH8.0液にサンプル(a)を再懸濁させた。溶出を調べるために、0.5〜1.0μg/μlのプラスミドDNAのTE pH8.0液にサンプル(b)を再懸濁させ、37℃で30分間インキュベートし、激しく振盪し、次に、Eppendorf 5418微量遠心機により最高速度で2分間回転させ、上清(溶出液)を除去し、-20℃で保存した。溶出された正確なDNA濃度は、Genequant II(Pharmacia Biotech)を用いて分光測光定量法により決定した。
【００８９】
「金スラリー」調製後のLNAおよびPNAコンジュゲート化オリゴヌクレオチド/プラスミド複合体の分析
次に、「金スラリー」2.5μgから溶出させたプラスミドサンプルを、記載のごとく、EtBrを用いずに2%アガロース/TAEゲルにより電気泳動させた後、分析した(図5)。
【００９０】
図5は、ローダミン標識化LNAまたはPNAオリゴヌクレオチドと共にインキュベートし、「金スラリー」調製手順(「遺伝子銃」で送達するためのPMIDカートリッジ作製のため)に付し、次に、TE PH8.0で「金スラリー」から溶出させたスーパーコイルプラスミドDNAを分析すべく、臭化エチジウム(EtBr)の不在下で2%アガロースゲル電気泳動を行った結果を示している。
(A) EtBr染色前のGel Doc 1000システム(Bio-Rad Laboratories, California, USA)を用いたMulti Analystパッケージによるゲル分析。
(B) EtBr染色後の(A)。
1) 1μgの1kb DNAラダー(Life Technologies Ltd, Paisley, UK)。
2) 37℃でローダミンLNA2により標識化された2.5μgのgWizプラスミド。
3) 37℃でローダミンLNA4により標識化された2.5μgのgWizプラスミド。
4) 37℃でローダミンLNA5により標識化された2.5μgのgWizプラスミド。
5) GTS PNAローダミン標識化キットにより標識化された2.5μgのgWizプラスミド。
6) 37℃でローダミンOsPNA2により標識化された2.5μgのgWizプラスミド - 金スラリー調製後。
7) 37℃でローダミンOsPNA2により標識化された2.5μgのgWizプラスミド - 金スラリー調製前。
8) Mirus Label ITローダミン標識化キットにより標識化された0.8μgのpGL3CMVプラスミド。
【００９１】
図5Aおよび5Bの比較分析を行うことにより、ローダミン標識化オリゴヌクレオチドのどれが「金スラリー」調製後にプラスミドDNAに結合された状態を保持するかを調べた。ローダミン蛍光により判断した場合、LNA 4の結合は手順の影響を受けないように見えるが、LNA 2および5は依然としてプラスミドDNAへの結合の大きな減少を示した(図5)、しかしながら、ローダミン標識化PNAでは、「金スラリー」調製後、いずれのサンプルにおいてもプラスミドDNAへの結合を観測することができない。したがって、先に示したように、結合されたPNAオリゴヌクレオチドはこの手順により除去される。「金スラリー」調製物の直接分析(データは示されていない)を行った場合にも、同じような結果が見られた。したがって、この結果は溶出手順に左右されない。
【００９２】
LNAオリゴヌクレオチドは、プラスミドDNAに結合させた場合、PMID/「遺伝子銃」媒介送達に必要とされる条件に耐えるという点で、PNAオリゴヌクレオチドよりも優れているように見える。プラスミドDNAを濃縮し、それを金粒子上にコーティングするために使用した賦形剤(すなわち、スペルミジン、CaCl2、およびPVP)のうちの１種またはそれらの組合せは、PNA:DNAハイブリダイゼーションを阻害し、PNAクランプや「ビス」PNAのような精巧なPNAオリゴヌクレオチドでさえも除去する可能性がある。したがって、LNA:DNAハイブリダイゼーション特性はPNA:DNAよりも頑健であるように見える。また、十分な数のLNA:DNA残基が水素結合されているかぎり、PMID調製物の安定性を得るうえで、13 LNA/DNA対の領域のいずれかがわずかに必要とされるにすぎないように思われる。
【実施例３】
【００９３】
スーパーコイルプラスミドDNAから誘発される遺伝子発現に及ぼす、結合されたLNAおよびPNAオリゴヌクレオチドの影響
LNAオリゴヌクレオチドを用いてプラスミドDNAに機能性成分を結合させる場合、LNA結合それ自体は、プラスミドから誘発される遺伝子発現を阻害しないことが好ましいであろう。この性質はPNAクランプについては確証されており、プラスミドgWIZ上に存在するオリゴヌクレオチド結合部位は、それが存在してもRNAポリメラーゼ酵素およびその補因子の進行が妨害されないプラスミドの領域中に存在する(50)。この研究ですでに記載したデータから、LNAオリゴヌクレオチドはgWIZ中の同一のコグネイトPNA結合部位にのみ結合することが示唆されるが、これがプラスミド送達および遺伝子発現に及ぼす影響については、明らかにされていない。
【００９４】
MC57細胞への「遺伝子銃」送達後の、LNAおよびPNAオリゴヌクレオチドの結合されたプラスミドのルシフェラーゼ活性の比較
細胞培養
10%ウシ胎仔血清(FCS)、100単位/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、および2mMグルタミン(Life Technologies)を補充したダルベッコ変法イーグル培地(DMEM, Life Technologies)中で、37℃/5% CO2で、HeLaヒト子宮頚癌細胞系(C.Kitson, GSKからの贈呈物)およびMC57マウス繊維肉腫細胞系(P.Gilboy, GSK, 56からの贈呈物)の両方を増殖させた。
【００９５】
「遺伝子銃」DNAカートリッジ用のプラスミドコーティング「金スラリー」の調製
エタノール/PVP下で保存されたプラスミドDNAコーティング「金スラリー」のアリコート(実施例2)を再懸濁させ、そして効率的なTefzelチューブコーティングを行うのに、さらにまた2μg DNA/mg金のDNAローディング率(DLR)を得るのに十分な体積のエタノール/PVPの入ったシンチレーションバイアルに緩やかに移した。あらかじめN2で乾燥させておいたTefzelチューブ(Powderject)をチューブターナー(Powderject)の内部に配置し、そしてDNAコーティング金を遠心力によりチューブの内表面に適用した。Tefzelチューブカッター(BioRad)を用いて12.5mmの長さにチューブをカットし、4℃で乾燥剤と共に保存した。典型的には、約17mgのコーティング「金スラリー」の調製物から、20〜22カセットを得た。
【００９６】
PMIDによるin vitroトランスフェクション
MC57細胞へのPMIDは、プレート法(57)を用いて行った。Accell XR1遺伝子銃(PowderJect)を用いてPMIDにより細胞にトランスフェクトした。250ポンド/インチ2(psi)のヘリウムガス圧力を用いてカートリッジから細胞中にDNAコーティング金を送り込んだ。20±5μlの濃厚細胞懸濁液を6ウェルプレートの中央に一様に広げ、細胞の真上に遺伝子銃のノズルを保持した状態でトランスフェクトした。トランスフェクトした後、1mlの培地を細胞に添加し、37℃および5% CO2で24時間インキュベートした。細胞をPBSで1回洗浄し、1mlの受動溶解バッファー(Promega)の添加により溶解させた。6つの個別の6ウェルサンプルをプールし、40μlのプールされた溶解物を(二重反復試験方式で)200μlのルシフェラーゼアッセイ試薬(Promega)と共に黒色の96ウェルプレート(Nunc)に入れてアッセイした。ルシフェラーゼ活性(RLU)は、TopCountNXT HTSシンチレーションおよびルミネセンスカウンター(Packard)を用いて1秒あたりのカウント数として測定した。全タンパク質濃度は、製造業者のプロトコールを用いてCoomassie Plusタンパク質アッセイ試薬キット(Pierce)により計算した。簡潔に述べると、5μlの細胞溶解物を145μlの水(Sigma)および150μlのクーマシーブルー試薬と共に96ウェル平底プレート(Costar)に入れてアッセイした。吸光度は、Molecular Devices Spectra Max 340を用いて595nmで測定した。結果は、三重反復試験サンプル(μg/ml)の平均として表した。ルシフェラーゼ活性は、全タンパク質の相対光単位(RLU)/mgとして表した。
【００９７】
図6は、MC57細胞におけるLNAおよびPNA標識化ルシフェラーゼ発現プラスミドのPMIDから得られたルシフェラーゼ発現データ(トランスフェクションの24時間後)の比較を示している。
【００９８】
図6は、遺伝子銃によりMC57細胞に一過性にトランスフェクトされたプラスミドのルシフェラーゼ活性(トランスフェクションの24時間後)の比較を示している。MirusサンプルはMirus標識化pGL3CMVプラスミドであり、LNA4およびGTS PNAと記されたサンプルはそれぞれLNAおよびPNA標識化gWizプラスミドであることに留意されたい。値は、6つのプールされた個別の「遺伝子銃」トランスフェクションの平均である。
【００９９】
このことから、LNA 4オリゴヌクレオチドが結合されたgWizプラスミドは、GTS PNAで標識化された類似のプラスミドDNAと少なくとも同程度の転写活性をもつことが示される。ただし、後者のサンプルは、「金スラリー」調製手順において除去されたので(実施例2)、非標識化gWizプラスミドに相当する。これは、非標識化pGL3CMVプラスミドをMirus標識化pGL3CMVプラスミドと比較して示した発現データと対比することができる。後者の化学修飾プラスミドは、遺伝子発現の劇的な低下を示す。
【０１００】
DMRIE-Cを用いるリポフェクションによるin vitroトランスフェクション
DMRIE-C(Life Technologies)を用いてHeLa細胞にリポフェクションを行うことにより、MC57細胞におけるin vitro PMIDで示された結果と同じような結果を得た。
【０１０１】
簡潔に述べると、小さいスケールおよび大きいスケールの両方でLNAおよびPNAオリゴヌクレオチド標識化により得られたプラスミド(それぞれ、実施例1, 図2および3)を、6ウェルプレートの単一ウェルで、半集密的HeLa細胞に二重反復試験方式でトランスフェクトした。製造業者の説明書に従って、1ウェルあたり0.8μgプラスミドDNA:0.8μl DMRIE-Cの混合物を調製し、これらを、HeLa細胞を含む1mlのOptimem上に配置し、そして一晩放置した(Life Technologies)。トランスフェクションの24時間後に細胞を採取し、先にMC57に対して記載したように、ルシフェラーゼおよび全タンパク質に関してアッセイを行った。ルシフェラーゼ発現データの比較を図7に示す。
【０１０２】
図7は、DMRIE-C(Life Technologies)を用いてリポフェクションによりHeLa細胞に一過性にトランスフェクトされたプラスミドのルシフェラーゼ活性(トランスフェクションの24時間後)の比較を示している。LNAおよびPNA標識化サンプルはすべて、gWizプラスミドをベースにしたものである。値は、4つの独立したトランスフェクションの平均であり、標準偏差が併記されている。
【０１０３】
同様に、LNAまたはPNAヌクレオチドが結合されたgWizプラスミドは、結合されていないgWizプラスミドDNAと比較して、遺伝子発現の点で有意差を示さなかった。
【０１０４】
同様のトランスフェクションを行って8ウェルガラススライド(Nunc)に入れ、トランスフェクションの24時間後、細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定した。蛍光顕微鏡(ローダミンフィルターを備えたDiaphot 300 倒立型蛍光顕微鏡, Nikon Corporation, Tokyo, Japan)下でスライドを観察したところ、プラスミドに結合されたローダミン標識化LNAおよびPNAオリゴヌクレオチドは、この試験で使用したLNAおよびPNAオリゴヌクレオチドのいずれから得られたサンプルについても、核および細胞質の両方の区画ではっきり見ることができた(データは示されていない, 50)。
【実施例４】
【０１０５】
スーパーコイルプラスミドDNAに結合させて哺乳動物細胞にトランスフェクトしたときのNLSペプチド:PNAオリゴヌクレオチドコンジュゲートの挙動
プラスミドおよびPNAオリゴヌクレオチド
この試験で使用したプラスミドおよびPNAオリゴヌクレオチドについてはすべて記載済みである(実施例1)。
【０１０６】
ペプチドおよびAlexa Fluor 568標識化
この試験で使用したペプチドをすべて表2に列挙する。
【表２】
2005503780.tif 000003
【０１０７】
Sv40nls(7)、AdF(8)、およびM9ペプチド(9)については、すでに記載されており、0.25mmol Fastmoc MonPrvPk法を用いてABI 433ペプチド合成機により社内で合成したもの(Sv40nlsおよびAdF)またはResearch Genetics / Invitrogen BV(現在名Invitrogen Life Technologies, Paisley, UK)製のもの(M9)を用いた。ペプチドは、Alexa Fluor 568タンパク質標識化キット(Molecular Probes, Leiden, Netherlands)を用いて標識化した。通常は、100mMリン酸ナトリウムpH7.2中の2mg/mlのペプチド500μlを、Alexa Fluor 564染料で標識化した。
【０１０８】
ペプチドとマレイミド-PNAオリゴヌクレオチドとのコンジュゲーションおよびプラスミドDNAへの結合
マレイミド-PNA(mal-PNA, GTS Inc., San Diego, USA)とのペプチドコンジュゲートの形成方法は、1mgのAlexa Fluor 568標識化ペプチドを、100mM HEPES(N-[2-ヒドロキシエチル]ピペラジン-N'-[2-エタンスルホン酸], Sigma Aldrich,Company, Poole, UK), pH7.0〜7.2中の14μlの0.5M TCEP(トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩, Pierce現在ではPerbio, Rockford, Illinois, USA)で、振盪しながら室温で2時間処理することにより、遊離スルフヒドリル基を生成させ、マレイミドを活性化させるものであった。mal-PNAについては、50μlサンプル全部を同様にTCEP処理するか、または最初に、37℃において一晩かけて10mMリン酸ナトリウムバッファー, 1mM EDTA, pH5.8中でmal-PNAストック全部を134μgのgWiz(図1A)プラスミドDNAに結合させ、次に、プラスミド結合mal-PNAを上述したようにTCEPで処理した。次に、振盪しながら4℃でペプチドとmal-PNA(未結合型またはプラスミド結合型)とを20倍モル過剰のペプチド条件で一晩混合して結合させた。次に、Gene Clean Spinフィルターチューブ(Bio101, Carlsbad, California, USA)中で室温でSulfolink Couplingゲル(Perbio, Rockford, Illinois, USA)と共に1時間振盪させて遊離スルフヒドリル基で遊離未結合ペプチドを除去することによりサンプルをさらに精製し、そして微量遠心機を用いて3000rpmで2分間回転させることによりサンプルを回収した。プラスミドDNAにまだ結合されていないペプチド結合mal-PNAサンプルについては、次に、上述したように、プラスミドgWizへの結合を行った。最後に、マイクロスピンS400HRカラム(Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK)を用いてゲル排除クロマトグラフィーにより、ペプチド-malPNAコンジュゲートが結合されたすべてのプラスミドサンプルから、遊離未結合mal PNAおよびペプチドを分離した。次に、Gene Quant RNA DNA Calculator (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK)にかけて分析することにより、回収されたプラスミドの量を決定した。次に、2.5μgのプラスミドDNAのサンプルをアガロースゲル電気泳動にかけた。一例を図8に示す。この例では、プラスミドDNAに結合させた後でペプチドをmal-PNAに結合させたが、プラスミドに結合させる前にペプチドをmal-PNAにコンジュゲートさせた場合にも同じようなデータが得られた。データからわかるように、ペプチド結合PNAに対応する蛍光物質がアガロースゲル電気泳動で回収されるが、SV40nlsの場合だけ、この物質はプラスミドDNAに結合された状態で保持されている(図8A)。
【０１０９】
図8は、マレイミドGTS PNAオリゴヌクレオチド(表1, GTS)にコンジュゲートさせたAlexa Fluor 568標識化ペプチドと共にインキュベートしてからMicrospin S400HRカラム(Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK)を用いてゲル排除クロマトグラフィーにより遊離未結合PNAオリゴヌクレオチドから分離されたスーパーコイルプラスミドDNAを分析すべく臭化エチジウム(EtBr)の不在下で2%アガロースゲル電気泳動を行った結果を示している。ペプチド配列を表2に列挙する。
(A) EtBr染色前のGel Doc 1000システム(Bio-Rad Laboratories, California, USA)を用いたMulti Analystパッケージによるゲル分析。
(B) EtBr染色後の(A)。
1) 1μgの1kb DNAラダー(Life Technologies Ltd, Paisley, UK)。
2) マレイミドGTS PNAと共にインキュベートされた2.5μgのgWizプラスミド。
3) SV40nlsペプチド/マレイミドGTS PNAと共にインキュベートされた2.5μgのgWizプラスミド。
4) AdFペプチド/マレイミドGTS PNAと共にインキュベートされた2.5μgのgWizプラスミド。
5) M9ペプチド/マレイミドGTS PNAと共にインキュベートされた2.5μgのgWizプラスミド。
【０１１０】
Alexa Fluor 568 SV40nlsペプチド単独で行った類似の実験(データは示されていない)から、PNAの不在下でさえも、このペプチドはプラスミドDNAに結合できることが示される。したがって、AdFおよびM9ペプチド結合mal-PNAは、S400HRカラムを通過するのに十分な程度にプラスミドDNAに会合した状態で保持されるが、相互作用は不安定であり、アガロースゲル電気泳動の際、ペプチド-mal-PNAコンジュゲートとプラスミドとが分離されると結論づけることができる。
【０１１１】
エレクトロポレーションによるHeLa細胞のトランスフェクション
実施例3に記載されているようにHeLa細胞を増殖させた。ルシフェラーゼ遺伝子を発現する限定量のプラスミドDNAを用いた多数のHeLa細胞(1サンプルあたり約2×107)のエレクトロポレーションに基づくHeLa細胞トランスフェクションアッセイを考案した(データは示されていない)。その際、生成されるルシフェラーゼ発現のレベルがプラスミドDNA用量に直線的に比例するようにした。この系では、1〜10μgのプラスミドDNAを用いて少なくとも48時間かけたとき、gWizプラスミドDNA用量とルシフェラーゼ発現との直線的関係が実証された。そのようなプロトコールに従がって、上述した3つのNLSペプチド-mal PNAコンジュゲート、すなわち、SV40nls、AdF、またはM9ペプチドのいずれかを含有するmal PNAコンジュゲートに結合された1μg量のgWizプラスミドを、HeLa細胞にエレクトロポレートした。簡潔に述べると、HeLa細胞を採取し、細胞の入った集密的1×175cm2フラスコの内容物の半分をSorvall RT6000D卓上遠心機(DuPont, UK)により1400rpmで6分間遠心沈降させ、Optimem(Invitrogen Life Technologies, Paisley, UK)で洗浄し、そして最後に0.4cm Gene Pulserエレクトロポレーションキュベット(BioRad, Hemel Hempstead, UK)中で500μlのOptimemに再懸濁させ、次に、細胞とプラスミドDNAを混合した。次に、Gene Pulser IIエレクトロポレーターを用いて各キュベットに300V, 960μFの単一パルスを印加した。その後、細胞を5分間放置してから回収し、次に、10mlの全培地中に再懸濁させ、5 mlを1×25cm2フラスコに接種し(トランスフェクションの5時間後に採取する)、残りの細胞を1×75cm2フラスコに接種した(トランスフェクションの21時間後に採取する)。細胞をPBSで1回洗浄し、1mlの受動溶解バッファー(Promega)の添加により溶解させ、40μlのプールされた溶解物を(二重反復試験方式で)200μlのルシフェラーゼアッセイ試薬(Promega)と共に黒色の96ウェルプレート(Nunc)に入れてアッセイした。ルシフェラーゼ活性(RLU)は、TopCountNXT HTSシンチレーションおよびルミネセンスカウンター(Packard)を用いて1秒あたりのカウント数として測定した。全タンパク質濃度は、製造業者のプロトコールを用いてCoomassie Plusタンパク質アッセイ試薬キット(Perbio)により計算した。簡潔に述べると、5μlの細胞溶解物を145μlの水(Sigma)および150μlのクーマシーブルー試薬と共に96ウェル平底プレート(Costar)に入れてアッセイした。吸光度は、Molecular Devices Spectra Max 340を用いて595nmで測定した。結果は、三重反復試験サンプルの平均として表現した(μg/ml)。ルシフェラーゼ活性は、相対光単位(RLU)/mg全タンパク質として表現した。そのような実験で得られたデータを図9に示す。
【０１１２】
図9は、エレクトロポレーションによりHeLa細胞に一過性にトランスフェクトされたプラスミドのルシフェラーゼ活性(トランスフェクションの5および21時間後)の比較を示している。PNA標識化サンプルはすべて、gWizプラスミドをベースにしたものである。gWizmalおよびgWizmal2 = マレイミド結合PNA(GTS)で標識化された1μgのgWizプラスミド; MalSV40nls、MalAdF、およびMalM9 = マレイミド結合PNAで標識化された1μgのgWizプラスミドであり、それぞれ、ペプチドSV40nls、AdF、またはM9のうちの1つがプラスミド結合の前に結合されたもの; Mal+SV40nls、Mal+AdF、およびMal+M9 = マレイミド結合PNAで標識化された1μgのgWizプラスミドであり、それぞれ、ペプチドSV40nls、AdF、またはM9のうちの1つがプラスミド結合の後で結合されたもの。
【０１１３】
ここでは、mal-PNA(GTS)を介したコンジュゲートとしてのNLSペプチドをgWizプラスミドDNAに結合させたとき、gWizプラスミド単独またはmal-PNAに結合されたgWizプラスミドDNAと比較してルシフェラーゼ発現の有意な増加は観測されない。ペプチド-malPNAコンジュゲートをプラスミドDNAの結合前にあらかじめ形成しておいた場合、gWiz由来のルシフェラーゼ発現の明瞭な阻害はみられないが、試験した3つのペプチドのいずれについても、あらかじめプラスミドに結合されたmal-PNAにコンジュゲートさせたとき、gWiz由来のルシフェラーゼ発現は阻害される。再びmal-PNAを用いてまたはSPDP(N-スクシンイミジル3-[2-ピリジルジチオ]プロピオネート)-PNA(GTS, California, USA)を用いて同じような実験を行ったところ、同じようなデータが得られた。図8のデータと合わせれば、NLSペプチド-PNAオリゴヌクレオチドコンジュゲートの結合の安定性の低下は、遺伝子発現の増強ではなく減少に結びつく可能性がある。プラスミド由来の遺伝子発現に及ぼすコンジュゲート化NLSペプチドの影響を分析するためには、PNAオリゴヌクレオチドよりも安定なプラスミド結合系が必要とされる。
【実施例５】
【０１１４】
LNAオリゴヌクレオチド配列の要件およびスーパーコイルプラスミドDNAプラスミドへの結合条件の研究
プラスミド
この試験で使用したプラスミドは、図1および10に示されている。図10Aは、GFP発現ベクターであるプラスミドpGG2XGFP(Gene Therapy Systems [GTS], Inc., San Diego, California, USA)を示しており、これは、プラスミドのbGHpyA領域のDNA配列内に複数のAGモチーフを含有し、CMVプロモーターの5'側のDNA配列内に複数のAAGGモチーフを含有する(GTS Catalogue 2002, 50)。プラスミドpGG2XEMPTYは、GFP遺伝子の欠失によりpGG2XGFPから誘導された発現ベクターであるが、対象遺伝子を挿入してCMVプロモーターの制御下で発現させるためのポリリンカーを保持している。プラスミドpGG2XEMPTYをプラスミドpGG2XGFPから構築するために、後者を制限酵素Nhe IおよびBamH I(New England Biolabs, [NEB], Hitchin, Herts., UK)で消化させて、GFP遺伝子をコードする領域を欠失させ、残存する5.1kbプラスミド断片をゲル精製し、Klenow DNAポリメラーゼ(NEB)で処理し、T4 DNAリガーゼ(NEB)を用いて連結して、その後、E. coliに導入した(51)。プラスミドpGG2XEMPTYを含有する細菌細胞を標準的手順(51)により同定した。また、大きいスケールでのプラスミドDNA調製物は、実施例1に記載されているとおりであった。
【０１１５】
この試験で使用したLNAおよびPNAオリゴヌクレオチド
この試験で使用したLNAオリゴヌクレオチドのいくつかは、先に記載した(表1, 実施例1)。新規なLNAおよびPNAオリゴヌクレオチドを表3に列挙する。
【表３】
2005503780.tif 000004
【０１１６】
LNA残基は、太字の大文字で示され、DNA残基は、太字の小文字で示され、PTO残基はさらにイタリック体に変換され、PNAおよびアミノ酸残基は、イタリック体で示さている(通常のテキストは太字でなく、PNA塩基は大文字で示されている)。部位の数は、gWizまたはpGG2XGFP(図10a)プラスミドに存在する理論上のオリゴヌクレオチド結合部位の最大数を意味する。X =「PEGスペーサー」-9-O-ジメトキシトリチル-トリエチレングリコール, 1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-]ホスホルアミダイト, スペーサーホスホルアミデート9(Glen Research, USA); O = 8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸リンカー、g = グリシン、l = リシン、Fl = フルオレセイン、NH2 = 5'-アミノ-修飾剤C12ホスホルアミダイトスペーサー(Glen Research, USA)、PTO=ホスホロチオエート、S-S = チオール修飾剤, C6 S-Sホスホルアミデート(Glen Research, USA)。
【０１１７】
LNAオリゴヌクレオチドはすべて、Proligo LLC, Colorado, USAにより合成されたものである。大部分は、Alexa Fluor染料(Molecular Probes, Netherlands)で標識化できるように5'-アミノ-修飾剤C12ホスホルアミダイトスペーサー(Glen Research, USA)を用いて、またはマレイミドやSPDP(Perbio, USA)などのヘテロ二官能性リンカーを用いて、行った。大部分は、100% LNAモノマーであるが、LNA 5747(表3)は、50% LNAおよび50% DNAである。この「ビス」LNAオリゴヌクレオチドは、実施例1に記載されている「ビス」PNAクランプの類似体として作製され(50,52)、LNA残基とDNA残基との50:50混合物としてのみ効率的に合成することができた。表3に記載されているPNAはすべて、Oswel DNA Service, Southampton, UKから購入したものである。
【０１１８】
LNAオリゴヌクレオチドのAlexa Fluor染料による標識化
LNAオリゴヌクレオチドの5'末端の第一級アミン基NH2をAlexa Fluor染料:568、647、または350(Molecular Probes, Leiden, Netherlands)で標識化した。通常、25〜100μgのLNAオリゴヌクレオチドを標識化した。効率的な標識化が行えるように、オリゴヌクレオチドを等容量のクロロホルムで3回抽出し、次に、エタノール沈澱させ、そしてごく少ない容量のMillipore精製水(1〜4μl)中に再懸濁させた。標識化反応は、Alexa Fluor染料(DMSO, Sigma Aldrich Company, UK)のジメチルスルホキシド溶液を用いて、0.1M 四ホウ酸ナトリウムバッファー(pH8.5)に基づくものであり、振盪しながら室温で一晩インキュベートした。標識化後、エタノール沈殿によりAlexa Fluor標識化LNAオリゴヌクレオチドを精製して遊離の染料を除去し、20〜200ピコモル/μlの濃度でMillipore精製水中に再懸濁させ、Gene Quant(Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK)により検定した。
【０１１９】
LNAおよびPNAオリゴヌクレオチドをスーパーコイルプラスミドDNAに結合させるための条件の分析
LNAオリゴヌクレオチドによるプラスミド標識化は、通常、実施例1に記載されている条件下で、すなわち、10mMリン酸塩バッファー, 1mM EDTA, pH7.0、16時間、37℃、プラスミド中のPNA/LNA結合部位の最大数の20倍モル過剰のオリゴヌクレオチドの条件で行った。最初に、LNAオリゴヌクレオチドLNA2、LNA4、およびLNA5(表1)を用いて、プラスミドgWiz(図1A)に結合させることにより、7.0から5.8までのpHの減少、100mMまでの塩化ナトリウムの添加、3M TMAC(塩化テトラメチルアンモニウム、Sigma Aldrich, UK)の存在を含む一連の条件を評価した。37℃におけるインキュベーション時間もまた、3時間まで減少させた。上述した条件のいずれにおいても、3種のLNAはすべて、実施例1に記載されているアッセイにより、プラスミドに結合された状態で検出することができた(データは示されていない)。この分析から、最も効率的な結合は、LNA4(100% LNA 13mer)、10mMリン酸塩バッファー, 1mM EDTA, pH5.8、16時間、37℃のときであるように思われた。
【０１２０】
同様な試験により、表3に記載されているPNAオリゴヌクレオチドをも評価した。PNA223はLNAオリゴヌクレオチドの結合の分析に使用した条件と同様な条件下でスーパーコイルgWizプラスミドDNAに結合しないことがわかった。しかしながら、PNA234は10mMリン酸塩バッファー, 1mM EDTA, pH5.8のときのみ、37℃で16時間インキュベートした後、プラスミドに結合されていることがわかった(データは示されていない)。
【０１２１】
LNAオリゴヌクレオチド:LNA2、LNA4、およびLNA5(表1)を用いて、LNAオリゴヌクレオチドプラスミド結合条件のさらなる分析を行った。この分析では、「低用量」(5ピコモルのオリゴ/μgプラスミドDNA)および「高用量」(5ピコモルのオリゴ/μgプラスミドDNA)で、LNAオリゴヌクレオチドのインキュベーションを行った。アニーリングの温度および時間についても、この分析で評価した。その際、室温または37℃で1時間および4℃で16時間のインキュベーション時間の条件を用いた。これらの分析のいずれについても、バッファー条件は、10mMリン酸塩バッファー, 1mM EDTA, pH5.8であった。記載の条件のいずれにおいても、3種のLNAはすべて、実施例1に記載されているアッセイにより、プラスミドに結合された状態で検出することが可能であった(データは示されていない)。
【０１２２】
このほか、プラスミドDNAへのLNAオリゴヌクレオチドの結合はまた、100mMリン酸ナトリウム pH7.0においても、さらには1.25mM塩化コバルトおよび100mMカコジル酸カリウムの存在下でも検出された(データは示されていない)。さらに驚くべきことに、LNAオリゴヌクレオチドは、Mirus Label IT核酸標識化キット(Panvera, Madison, USA)で化学標識化されたスーパーコイルプラスミドDNAまたは結合されたインターカレート性TOTO-1ヨウ化物染料(Molecular Probes, Leiden, Netherlands)を含有するスーパーコイルプラスミドDNAにも結合することがわかった。詳細については、実施例8および図17を参照されたい。
【０１２３】
スーパーコイルプラスミドDNAへの結合に関する新規なLNAオリゴヌクレオチドの分析
LNAオリゴヌクレオチドのプラスミド結合特性が(CT)nのような特定の塩基配列(表1)に依存するか否か、またはこの特性がさまざまな塩基配列により広く適用可能であるか否かを試験するために、いくつかの異なるLNAオリゴヌクレオチドを合成した(表3)。これらはすべて、Gene Gripシリーズのプラスミド(GTS, San Diego, California, USA)中に見いだされるPNAのリピート結合部位に位置するDNA配列に基づくものであった。部位1は、gWizおよびpGGGFP(図1Aおよび1B)中に見いだされ、(CT)nリピートモチーフ(相補鎖[GA]n)に基づくものであり、そして(CCTT)n(相補鎖[GGAA]n)に基づく部位2は、pGG2XGFPおよびpGG2XEMPTY(図10Aおよび10B)中に見いだされ、後者の2つのプラスミドはいずれも、さらに部位1を含有する(GTS catalogue 2002)。
【０１２４】
図10は、この試験で使用したプラスミドを示している。
(A) pGG2XGFPは、GFP発現ベクター(Gene Therapy Systems [GTS], Inc., San Diego, California, USA)であり、これは、プラスミドのbGHpyA領域のDNA配列内に複数のAGモチーフを含有し、CMVプロモーターの5'側のDNA配列内に複数のAAGGモチーフを含有する(GTS Catalogue 2002, 50)。
(B) pGG2XEMPTYは、GFP遺伝子の欠失によりpGG2XGFPから誘導された発現ベクターであるが、対象遺伝子を挿入してCMVプロモーターの制御下で発現させるためのポリリンカーを保持している。
【０１２５】
(CT)nに基づく100% 13mer LNAであるLNA 5876(表3)は、ローダミン標識化型LNA4(表1)と同等である。「遺伝子銃」送達用の「金スラリー」の調製時に100% LNA 13merは安定であるが100% LNA 9merは安定でないと仮定して(実施例2)、中間の11mer (CT)nに基づくLNA、すなわち、5875またはローダミン標識化6563(表3)を合成することにした。部位1に相補的な鎖(すなわち5877, 表3)さらにまた部位2のそれぞれのDNA鎖に相補的な鎖(すなわち、5877および11701)を得るために、13〜14mer 100% LNAに基づくオリゴヌクレオチドを作製した。また、「ビス」型LNAクランプが、先に述べたPNAクランプのときと同じように、ワトソン・クリック型とフーグスティーン型の両方の塩基対合を可能にして、単純なオリゴヌクレオチドよりも安定であるとする考え方を試験するために、先に記載した「ビス」LNA(5747)を(CT)nモチーフに基づいて作製した。
【０１２６】
以上および表3に記載のローダミン標識化またはAlexa Fluor 568標識化LNAオリゴヌクレオチドはすべて、それらのコグネイト結合部位を含有するスーパーコイルプラスミドに結合することが判明した(データは示されていない)。
【０１２７】
プラスミドDNA内のコグネイト結合部位への新規なLNAオリゴヌクレオチドの結合の確証
上述したLNAオリゴヌクレオチドがプラスミドDNA内の期待される相補的配列に結合されたことを確定するために、上述した標識化実験で得られたプラスミドDNAの2.5μgのサンプルを制限酵素分析にかけた。ローダミン標識化またはAlexa Fluor 568標識化LNA: 5876、5827、5875、5747、および6563については、結合は、37℃で一晩かけてプラスミドgWizに対して行った。Bsa IおよびSphIを用いて、それぞれ標準的条件(1×反応バッファー4, NEB, Beverly, MA, USA)下にサンプルを消化した(37℃で8時間、続いて、55℃で8時間)。次に、実施例1に記載したように、EtBrを用いずに2%アガロース/TAEゲルで電気泳動させた後、サンプルを分析した。Alexa Fluor 568標識化LNA: 5877および11701については、結合は、37℃で一晩かけてプラスミドpGG2XGFPまたはpGG2XEMPTYに対して行った。標準的条件(1×反応バッファー4, NEB, Beverly, MA, USA)下で37℃で16時間かけてサンプルをNde Iで消化した。次に、実施例1に記載したように、EtBrを用いずに2%アガロース/TAEゲルで電気泳動させた後、サンプルを分析した。そのような分析の例を図11に示す。EtBr染色を行わないときのアガロースゲル電気泳動の結果は、図11Aに示され、EtBr染色後の結果は、図11Bに示されている。
【０１２８】
図11は、Alexa Fluor 568標識化LNAオリゴヌクレオチドと共にインキュベートしたスーパーコイルプラスミドDNAを分析すべく、制限酵素Bsa IおよびSph IまたはNdeI(New England Biolabs Inc., Beverly, MA., USA)を用いて37℃で一晩かけて消化させた後、臭化エチジウム(EtBr)の不在下で2%アガロースゲル電気泳動を行った結果を示している。
(A) EtBr染色前のGel Doc 1000システム(Bio-Rad Laboratories, California, USA)を用いたMulti Analystパッケージによるゲル分析。
(B) EtBr染色後の(A)。
1) 1μgの1kb DNAラダー(Life Technologies Ltd, Paisley, UK)。
2) 37℃でAlexa Fluor 5877により標識化された2.5μgのpGG2XGFPプラスミドをNde Iで切断。
3) 37℃でAlexa Fluor 5827により標識化された2.5μgのgWizプラスミドをBsa IおよびSph Iで切断。
【０１２９】
gWizプラスミド(6.73kbおよび図1A)のBsa I/Sph I消化により、次のサイズ: 3.66kb、1.49kb、1.25kb、および300bpの線状DNA断片が得られる(データは示されていない, 図11 B)。この300bp Bsa I/Sph I断片は、プラスミドgWIZ(図1A, 50)のbGHpyA領域内のすべてのLNAオリゴヌクレオチド結合部位(複数のCTnまたはGAnモチーフ)を含有する。5種のローダミン標識化またはAlexa Fluor標識化LNA: 5876、5827、5875、5747、および6563はすべて、期待される300bp断片への特異的結合を示したことに留意されたい。5827の例を図11に示す。pGG2XGFPプラスミド(5.80kb, 図10A)のNde I消化により、次のサイズ: 3.76kb、1.56、kbおよび491bpの線状DNA断片が得られる(データは示されていない, 図11 B)。この491bp Nde I断片は、プラスミドpGG2XGFP(図10A, GTS Catalogue 2002)のCMVプロモーターのすぐ5'側の領域内のすべてのLNAオリゴヌクレオチド結合部位(複数のCCTTnまたはGGAAnモチーフ)を含有する。Alexa Fluor標識化LNA: 5877および11701はいずれも、期待される491bpの断片への特異的結合を示したことに留意されたい。5877の例を図11に示す。
【０１３０】
コグネイト結合部位を含有しないスーパーコイルプラスミドと共にLNAオリゴヌクレオチドを同様にインキュベートしたとき、プラスミド結合は観測されないことも注目すべきである。たとえば、LNA 5877は、プラスミドpGG2XGFP(図10A)には結合するが、pGGGFP(図1 B)には結合しない(データは示されていない)。
【実施例６】
【０１３１】
PMIDまたは「遺伝子銃」向けのカートリッジ作製手順におけるスーパーコイルプラスミドDNAに結合された一連のLNAオリゴヌクレオチド配列およびPNAオリゴヌクレオチド配列の挙動
LNAおよびPNAオリゴヌクレオチド
この試験で使用したLNAおよびPNAオリゴヌクレオチドは、表1および表3に列挙されている。これらは、実施例5に記載されているように、5'末端にローダミンを結合させた形で合成されたものであるか、または5' Alexa Fluor 568標識化が行われたものであった。具体的には、この分析で比較されたLNAおよびPNAオリゴヌクレオチドは、ローダミン標識化された6563、LNA4、およびPNA234、ならびにAlexa Fluor 568標識化された5747、5827、および5877であった。
【０１３２】
「遺伝子銃」DNAカートリッジ用のプラスミドコーティング「金スラリー」の調製
基本的には、実施例2に記載の方法に従ったが、いくつかの変更を施した。25μgのプラスミドgWizまたはpGG2XGFPへの標識化LNAまたはPNAオリゴヌクレオチドの大きいスケールでのアニーリングを、37℃で一晩かけて行った。2.5μgのサンプルを「金スラリー調製前」の対照として取り出し、残りの22.5μgのプラスミドDNAは、0.05Mスペルミジンたとえば100μl(Sigma)中に懸濁させた2μm金粒子すなわち11.25mg(PowderJect)上にコーティングした。1M CaCl2たとえば100μl(American Pharmaceutical Partners, Inc., USA)の添加によりDNAを金粒子上に沈澱させたが、この手順は実施例2に従った。記載のごとく、20μl中で各サンプルから22.5μgのプラスミドをすべて溶出させようと試みたが、これはうまくいかなかったので、22.5μgのgWizプラスミドの残りの部分を含有する金スラリー調製物を、以下に記載されているようにアガロースゲル電気泳動によっても分析した。
【０１３３】
「金スラリー」調製後のLNAおよびPNAコンジュゲート化オリゴヌクレオチド/プラスミド複合体の分析
次に、「金スラリー」から溶出させようと試みたプラスミドサンプル、直接的「金スラリー」サンプル、および蛍光標識化PNAおよびLNAオリゴヌクレオチドが結合された2.5μgのプラスミドサンプル(「金スラリー調製前)を、記載のごとく、EtBrを用いずに2%アガロース/TAEゲルで電気泳動させた後、分析した(図12Aおよび12B)。図12A: IおよびIIならびに図12B: IおよびIIの比較分析を行うことにより、蛍光標識化オリゴヌクレオチドのうちのどれが「金スラリー」調製後にプラスミドDNAに結合された状態で保持されるかを決定した。これらの条件下ではスラリーからプラスミドが溶出しなかったので、「金スラリー」調製物の分析から直接結果が得られる。また、得られたデータを、実施例2に記載され図5に示されるデータと比較した。
【０１３４】
図12は、高用量(約40pmol/μgプラスミド)または低用量(5pmol/μgプラスミド)のローダミン標識化(6563、LNA4、PNA234)またはAlexa Fluor 568標識化(5747,5827,5877)LNAまたはPNAオリゴヌクレオチドと共に37℃でインキュベートし、「金スラリー」調製手順(「遺伝子銃」で送達するためのPMIDカートリッジ作製用)に付し、そしてゲルに直接充填したまたはTE pH8.0で金スラリーから溶出させたスーパーコイルプラスミドDNAを分析すべく、臭化エチジウム(EtBr)の不在下で1.5%アガロースゲル電気泳動を行った結果を示している。注: これらの条件下では、プラスミドは溶出せず、「金スラリー」上に保持された。
【０１３５】
(A) 6563、LNA4、およびPNA234のゲル分析
(I) EtBr染色前のUVP EpiChemi Darkroom Bio Imaging System, 302nm UV-臭化エチジウムフィルター(UVP, Cambridge, UK)を用いたLabworks 4.0パッケージによるゲル分析。
(II) EtBr染色後の(I)。
1) 1μgの100 bp DNAラダー(Life Technologies Ltd, Paisley, UK)
2) LNA4(40pmol/μgプラスミド)で標識化されたpGG2XGFPプラスミドの溶出液 - 金スラリー調製後
3) LNA4(40pmol/μgプラスミド)で標識化されたpGG2XGFPプラスミド - 金スラリー調製前
4) LNA4(40pmol/μgプラスミド)で標識化されたpGG2XGFPプラスミドの金スラリー調製物
5) LNA4(5pmol/μgプラスミド)で標識化されたpGG2XGFPプラスミドの溶出液 - 金スラリー調製後
6) LNA4(5pmol/μgプラスミド)で標識化されたpGG2XGFPプラスミド - 金スラリー調製前
7) LNA4(5pmol/μgプラスミド)で標識化されたpGG2XGFPプラスミドの金スラリー調製物
8) 6563(40pmol/μgプラスミド)で標識化されたpGG2XGFPプラスミドの溶出液 - 金スラリー調製後
9) 6563(40pmol/μgプラスミド)で標識化されたpGG2XGFPプラスミド - 金スラリー調製前
10) 6563(40pmol/μgプラスミド)で標識化されたpGG2XGFPプラスミドの金スラリー調製物
11) 6563(5pmol/μgプラスミド)で標識化されたpGG2XGFPプラスミドの溶出液 - 金スラリー調製後
12) 6563(5pmol/μgプラスミド)で標識化されたpGG2XGFPプラスミド - 金スラリー調製前
13) 6563(5pmol/μgプラスミド)で標識化されたpGG2XGFPプラスミドの金スラリー調製物
14) PNA234(40pmol/μgプラスミド)で標識化されたpGG2XGFPプラスミドの溶出液 - 金スラリー調製後
15) PNA234(40pmol/μgプラスミド)で標識化されたpGG2XGFPプラスミド - 金スラリー調製前
16) PNA234(40pmol/μgプラスミド)で標識化されたpGG2XGFPプラスミドの金スラリー調製物
【０１３６】
(B) PNA234、5747、5827、および5877のゲル分析
(I) EtBr染色前のUVP EpiChemi Darkroom Bio Imaging System(UVP, Cambridge, UK)を用いたLabworks 4.0パッケージによるゲル分析。
(II) EtBr染色後の(I)。
1) 1μgの100 bp DNAラダー(Life Technologies Ltd, Paisley, UK)
2) PNA234(5pmol/μgプラスミド)で標識化されたpGG2XGFPプラスミドの溶出液 - 金スラリー調製後
3) PNA234(5pmol/μgプラスミド)で標識化されたpGG2XGFPプラスミド - 金スラリー調製前
4) PNA234(5pmol/μgプラスミド)で標識化されたpGG2XGFPプラスミドの金スラリー調製物
5) 5747(36pmol/μgプラスミド)で標識化されたpGG2XGFPプラスミドの溶出液 - 金スラリー調製後
6) 5747(36pmol/μgプラスミド)で標識化されたpGG2XGFPプラスミド - 金スラリー調製前
7) 5747(36pmol/μgプラスミド)で標識化されたpGG2XGFPプラスミドの金スラリー調製物
8) 5827(40pmol/μgプラスミド)で標識化されたpGG2XGFPプラスミドの溶出液 - 金スラリー調製後
9) 5827(40pmol/μgプラスミド)で標識化されたpGG2XGFPプラスミド - 金スラリー調製前
10) 5827(40pmol/μgプラスミド)で標識化されたpGG2XGFPプラスミドの金スラリー調製物
11) 5877(15pmol/μgプラスミド)で標識化されたpGG2XGFPプラスミドの溶出液 - 金スラリー調製後
12) 5877(15pmol/μgプラスミド)で標識化されたpGG2XGFPプラスミド - 金スラリー調製前
13) 5877(15pmol/μgプラスミド)で標識化されたpGG2XGFPプラスミドの金スラリー調製物。
【０１３７】
6563, 11mer 100% LNAオリゴヌクレオチドを含めて、この分析で試験したLNAオリゴヌクレオチドはすべて、「金」スラリー調製時、プラスミド上に保持される。このことから、PMID調製において安定性を得るうえで、これは最小LNA配列の要件を11 LNA/DNA塩基対合まで低減させる。LNAオリゴヌクレオチドのうち、5827が最良の結合を示し、「金スラリー」調製手順による破壊が最も少ないと思われる。「ビス」9mer 50% LNA, 50% DNAオリゴヌクレオチド5747は、9mer LNA2(表1, 実施例2, 図5)とは対照的に、「金スラリー」調製手順においてプラスミドにより保持される。しかしながら、このLNAは、合成が困難であり(Proligo LLC, 私信)、他の13〜14 mer 100% LNAオリゴヌクレオチドよりも利点があるとは思われない。
【０１３８】
PNAオリゴヌクレオチド(PNA 234)は、先に記載のPNAオリゴヌクレオチド(表1, 実施例2, 図5)とは対照的に、「金スラリー」調製後、わずかな程度のプラスミド結合保持を示した。しかしながら、安定性を高める追加のアミノ酸を有する13mer「ビス」PNAでさえも、この分析で試験したすべての単純な100% LNAオリゴヌクレオチドよりも性能が劣っていた。
【０１３９】
このことから、LNAオリゴヌクレオチドは、プラスミドDNAに結合させたときにPMID/「遺伝子銃」媒介送達に必要とされる条件に耐えるという点で、PNAオリゴヌクレオチドよりも優れていることが確認される。
【実施例７】
【０１４０】
スーパーコイルプラスミドDNAへのLNAオリゴヌクレオチドの結合の機構
高または低オリゴヌクレオチド濃度でのプラスミドDNAへの(CT)n系LNAオリゴヌクレオチドの結合
最初に、実施例5に記載の結合条件の分析の一部分として、高オリゴヌクレオチド濃度(40ピコモル/μg DNA)および低オリゴヌクレオチド濃度(5ピコモル/μg DNA)におけるスーパーコイルプラスミドDNAへの蛍光標識化LNAオリゴヌクレオチドの結合の差異を調べようと試みた。gWizプラスミドDNAへの結合に関する(CT)n配列をベースとしたLNA: LNA2、LNA4、およびLNA5の分析結果を図13に示す。
【０１４１】
図13は、高用量(約40pmol/μgプラスミド)または低用量(5pmol/μgプラスミド)のローダミン標識化LNAオリゴヌクレオチドと共にインキュベートしたスーパーコイルプラスミドDNAを分析すべく、臭化エチジウム(EtBr)の不在下で2%アガロースゲル電気泳動を行った結果を示している。
(A) EtBr染色前のGel Doc 1000システム(Bio-Rad Laboratories, California, USA)を用いたMulti Analystパッケージによるゲル分析。
(B) EtBr染色後の(A)。
1) 1μgの1kb DNAラダー(Life Technologies Ltd, Paisley, UK)
2) 37℃でローダミンLNA2(5pmol/μgプラスミド)により標識化された2.5μgのgWizプラスミド
3) 37℃でローダミンLNA2(40pmol/μgプラスミド)により標識化された2.5μgのgWizプラスミド
4) 37℃でローダミンLNA4(5pmol/μgプラスミド)により標識化された2.5μgのgWizプラスミド
5) 37℃でローダミンLNA4(40pmol/μgプラスミド)により標識化された2.5μgのgWizプラスミド
6) 37℃でローダミンLNA5(5pmol/μgプラスミド)により標識化された2.5μgのgWizプラスミド
7) 37℃でローダミンLNA5(40pmol/μgプラスミド)により標識化された2.5μgのgWizプラスミド
8)ブランク。
【０１４２】
明らかに、3種のLNAオリゴヌクレオチドはすべて、低オリゴヌクレオチド濃度のときと比べて高オリゴヌクレオチド濃度のときにプラスミドDNAへの結合の著しい増大を示した(図13A)。オリゴヌクレオチドに対する理論上の結合部位の数は、より長いないしより短いオリゴヌクレオチドについて、4から8の範囲である。しかしながら、いずれの場合においても、より高い濃度で、プラスミド結合LNAオリゴヌクレオチドの強度が著しく増大したことから、LNAオリゴヌクレオチド結合には2つの機構が働いている可能性があり、おそらく、それが原因で、高オリゴヌクレオチド濃度のときにプラスミド結合LNAの数が低オリゴヌクレオチド濃度のときの2倍になることさえも起こると考えられる。これは、高LNAオリゴヌクレオチド濃度において、ワトソン・クリック型とフーグスティーン型の両方の塩基対合により達成され、「ビス」PNA(50,52)について記載されたのと同様に、LNA:DNA:LNAの三本鎖が形成される可能性がある。配列(CT)nをベースとしない他のLNAオリゴヌクレオチドでは、同様な挙動を実証できなかったことに注目されたい(データは示されていない)。したがって、これは、より容易にフーグスティーン塩基対を形成すると考えられるこの反復ポリピリミジン配列をベースとしたオリゴヌクレオチドの特徴であろう(50, 52)。
【０１４３】
LNAオリゴヌクレオチド結合時におけるスーパーコイルプラスミド中の鎖置換を実証するためのDNA配列決定アッセイ
プラスミドDNAへのLNAオリゴヌクレオチドの結合が未結合DNA鎖の鎖置換を引き起こすか否かを最終的に明確化するために、一本鎖DNA配列決定アッセイを確立した。これは、PNAオリゴヌクレオチドに基づく鎖侵入および鎖置換を実証するために記載されたものと同様な方法の改良に基づくものであった(53, 76)。改良法は、一本鎖DNAに対してのみ最適であるDNA配列決定法用の鋳型として二本鎖スーパーコイルプラスミドDNAを(結合LNAオリゴヌクレオチドの存在下もしくは不在下で)使用することであった。この分析のために選択されたプラスミドは、pGG2XGFP(図10A)であり、「鎖置換剤」として選択されたLNAは5877(表3)であった。最適なDNA配列決定プライマー(RevGG2B, 表3)をデザインし(5'Cy5標識がある場合とない場合の両方)、標準的な「big dye」PCRに基づく熱サイクル配列決定により、pGG2XGFP中の結合部位2(図14を参照)のリピート領域全体にわたり良品質の配列決定が行えることを確証した(図15Aを参照)。
【０１４４】
図14は、DNA配列決定プライマーCy5 RevGG2B(表3)を用いるLNA 5877の存在下でのプラスミドpGG2XGFP, (GGAA)n結合部位モチーフからの結合部位2におけるDNA配列決定ストラテジーを示している。
【０１４５】
先に記載したような大きいスケールでのLNA結合を行った。その際、LNA 5877(低濃度: 5ピコモル/μg)を25μgのプラスミドpGG2XGFPに結合させ、そしてマイクロスピンS400HRカラム(Amersham Pharmacia Biotech)を通過させて未結合LNAオリゴヌクレオチドを除去するようにした。次に、Cy5標識化RevGG2B DNAプライマーおよびT7 DNAポリメラーゼを用いて、AutoRead Sequencing Kit(Amersham Pharmacia Biotech)により、プラスミドpGG2XGFP(LNAが結合されているものと結合されてないもの)を改良一本鎖DNA配列決定プロトコールに付した。この分析のために、インプット鋳型プラスミドDNAの用量を1μg〜3μgに変更し、アニーリング温度を37℃または42℃まで低下させたが、アニーリングの時間は30分間に延長した。これは、プラスミドの二本鎖特性を破壊しない条件下で、いずれの置換された一本鎖DNA領域に対してもDNA配列決定プライマーの配列特異的結合を最大化させるためであった。次に、配列決定反応を行ってVisible Genetics DNA Sequencerにより分析した。データを図15に示す。
【０１４６】
図15は、LNA 5877の存在下もしくは不在下におけるプラスミドpGG2XGFPについて、Cy5RevGG2Bプライマーを用いてALF一本鎖DNA配列決定キット(Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK)により配列決定を行い、Visible Genetics DNA Sequencer(Visible Genetics, Cambridge, UK)により可視化したDNA配列データ(手作業でクロマトグラムを解読した)を示している。「big dye」PCRに基づく熱サイクル配列決定プロトコールによる二本鎖DNA配列決定に付して、ABI 3700 DNA Analyzer(ABI, Warrington, Cheshire, UK)により可視化したプラスミドpGG2XGFPの対照もまた、示されている。
(A) pGG2XGFP, (LNA結合なし, 二本鎖DNA) - 配列決定された二本鎖DNA
(B) pGG2XGFP+LNA 5877 - 配列決定された一本鎖DNA, 鋳型3μg アニーリング温度42℃
(C) pGG2XGFP+LNA 5877 - 配列決定された一本鎖DNA, 鋳型1μg アニーリング温度37℃
(D) pGG2XGFP, (LNA結合なし, 二本鎖DNA) - 配列決定された一本鎖DNA, 鋳型1μg アニーリング温度37℃。
【０１４７】
この領域の既知のDNA配列(図14)を用いることにより、LNAが結合されたプラスミドで得られた図15Bおよび15CのDNA配列を肉眼で解釈することができた。このDNA配列は、明らかに、そのコグネイト結合部位へのDNA配列決定プライマーの特異的結合に対応する正確なDNA配列である。LNAが結合されていないプラスミドでは(図15D)、ランダムで非特異的な解釈できないシグナルだけを見ることができる。低LNAオリゴヌクレオチド濃度(5ピコモル/μgのDNA)で、LNAは、おそらく鎖侵入およびワトソン・クリック型塩基対合により、正確な結合部位に結合して鎖置換を起こし、その結果、置換された鎖の一本鎖DNA配列決定が可能になることが、このデータから明確に示される。
【０１４８】
置換された鎖への蛍光標識化DNAオリゴヌクレオチドの結合によるスーパーコイルプラスミドDNAのLNAオリゴヌクレオチド駆動型鎖侵入の実証
プラスミドDNAへのLNAオリゴヌクレオチドの結合時の相補的DNA鎖の鎖置換を実証するためのより簡単なアッセイを提供するために、置換された鎖にDNAオリゴヌクレオチドを結合させるための記載された方法に改良を加えて利用した(78)。簡潔に述べると、記載のごとく、低濃度および高濃度でLNAオリゴヌクレオチドを25μgのプラスミドに結合させ、マイクロスピンS400HRカラムを用いて未結合LNAを除去した。次に、LNAに相補的な配列をもつ、したがって、置換されたDNA鎖に結合することができる、フルオレセイン標識化DNAオリゴヌクレオチドを、40ピコモル/μg DNAの濃度で、標準的LNAオリゴヌクレオチド結合バッファー(10mMリン酸ナトリウム, pH7.1, 1mM EDTA)中で、かつ37℃で、プラスミドと共に45分間インキュベートし、再び、マイクロスピンS400HRカラムを用いて遊離未結合オリゴヌクレオチドを除去した。LNA結合により置換されたプラスミドDNA鎖への蛍光標識化DNAオリゴヌクレオチドの結合は、アガロースゲル電気泳動により分析した。一例を図16に示す。この例は、プラスミドgWizのLNA 5867媒介型鎖置換をDNAオリゴヌクレオチドKH2(表3)で検出した結果を示している。
【０１４９】
図16は、高濃度(40pmol/μgプラスミド)および低濃度(5pmol/μgプラスミド)のLNAと共に37℃で一晩インキュベートし(未結合LNAは、S400HRスピンカラムゲル濾過, Amersham Pharmacia Biotechにより除去した)、続いてフルオレセイン標識化DNAプライマー(40pmol/μgプラスミド, MWG Biotech AG, Germany)と共にインキュベートしたスーパーコイルプラスミドDNAを分析すべく、臭化エチジウム(EtBr)の不在下で1.5%アガロースゲル電気泳動を行った結果を示している。
(A) EtBr染色前のUVP EpiChemi Darkroom Bio Imaging System, 302nm uv, EtBrフィルター(UVP, Cambridge, UK)を用いたLabworks 4.0パッケージによるゲル分析。
(B) EtBr染色後の(A)。
1) 高濃度のLNA 5876およびKH2と共にインキュベートされた2.5μgのgWizプラスミド
2) 低濃度のLNA 5876およびKH2と共にインキュベートされた2.5μgのgWizプラスミド
3) ブランク
4) KH2と共にインキュベートされた2.5μgのgWizプラスミド。
【０１５０】
鋳型としてのプラスミドpGG2XGFPと、結合部位2で結合してDNAを鎖置換するLNA 5877とを用いて（その結果、DNAオリゴヌクレオチドKH3(表3)は置換された鎖に結合できるようになる）、非常によく似たデータを得た(データは示されていない)。後者の実験は、いかにDNA配列決定ストラテジーを実施してDNA配列データを取得したかという点で類似したものであり、これにより両者の分析の妥当性が確認される(図15)。
【０１５１】
全体的にみて、置換された鎖に対するDNA配列データおよびDNAオリゴヌクレオチド結合データから、LNAオリゴヌクレオチドの結合の主要な機構は、低オリゴヌクレオチド濃度のときでさえも、鎖侵入および鎖置換を介したワトソン・クリック型塩基対合によるものであることが示唆される。
【実施例８】
【０１５２】
LNAオリゴヌクレオチドは、トランスフェクション後、哺乳動物細胞中でスーパーコイルプラスミドDNAに結合した状態を保持し、プラスミド由来の遺伝子発現を可能にする
CHO細胞の細胞培養およびトランスフェクション
10%ウシ胎仔血清(FCS)、100単位/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、2mMグルタミン、MEM非必須アミノ酸、およびHT補助剤(Life Technologies)で補足されたイスコフ改変ダルベッコ培地中にCHO K1細胞を保持した。8ウェルガラスチャンバースライド(Lab Tech, Nalge Nunc, Int.)中でCHO K1細胞を集密度80%まで増殖させ、1ウェルあたり400μlのOptimemを用いて2回洗浄し、そしてプラスミドDNA:カチオン性脂質複合体(1μg対6μlのDNA:TransfastTM[Promega]比で200〜500ngのプラスミドDNA)のOptimem溶液100μlでトランスフェクトした。トランスフェクションミックスを細胞に接触した状態で24時間放置し、そして細胞を洗浄し固定するか、またはより長い時間点のときは、トランスフェクションミックスを除去し、細胞をリン酸塩緩衝食塩水(PBS)で1回洗浄し、完全増殖培地と交換して、さらなるインキュベーションに供した。
【０１５３】
Mirus Label IT核酸標識化キットを用いるプラスミドDNAの標識化
実施例3でローダミン標識化キットの使用について説明したが、プラスミドDNAは、通常、Mirus Label IT(Panvera, Madison, USA)フルオレセイン標識化キットを用いて標識化した。通常は、製造業者の説明書に従って、100μgスケールで、125μlの全体積で、かつ37℃で、1時間かけてプラスミドを標識化し、標準的なエタノール沈殿(51)により遊離の染料を除去した。DNAを約1μg/μlで水中に再懸濁させ、LNA結合およびトランスフェクション実験に供した。
【０１５４】
TOTO-1核酸染料によるプラスミドDNAの標識化
通常は、100μgスケールで、Toto-1染料を含有する1×TAE(0.5μM Toto-1のTAE溶液600μl)中で、800μlの全体積で、かつ室温で、1時間かけてプラスミドを標識化し、標準的なエタノール沈殿(51)により遊離の染料を除去した。DNAを約1μg/μlで水中に再懸濁させ、LNA結合およびトランスフェクション実験に供した。
【０１５５】
細胞固定および共焦点蛍光顕微鏡分析
8ウェルガラスチャンバースライド(Nalge、Nunc)上で増殖させた細胞を、PBSで2回洗浄し、次に、4%パラホルムアルデヒドと共にインキュベートすることにより10分間固定し、次に、PBSでもう1回洗浄した。プラスチックチャンバーおよびゴムシールを取り除き、細胞を乾燥させ、次に、UV光源(Vector Labs. , Burlington, CA, 9401U, USA.)下で細胞核を可視化するためにDAPIを含有する蛍光用Vectorshieldマウンティング媒体中にマウントし、そしてマニキュア液(white ice, No7, Boots PLC, Nottingham, England)を用いてNo.1厚さのガラスカバースリップ(Esco, Erie Scientific, Portsmouth, N.H., USA)の上側をシールした。
【０１５６】
固定した細胞は、光ファイバーにより共焦点スキャナーに連結されたアルゴン(UV, 351および364nm)、アルゴン(可視, 476nmおよび488nm)、クリプトン(可視, 568nm)およびヘリウム/ネオン(可視, 633nm)レーザーを利用して、Leica TCS NT共焦点顕微鏡を用いて、共焦点蛍光顕微鏡法により分析した。コンピュータにより制御されたLeitz DM IRBE倒立顕微鏡のサイドポートにスキャナーを結合し、倍率63倍の水浸レンズを用いてサンプルを観察した。TCS画像解析パッケージにより画像を解析した。
【０１５７】
プラスミドに結合した単一および複数のLNAオリゴヌクレオチドがトランスフェクション後にCHO細胞中でプラスミドDNAと共に局在することの実証
プラスミドDNAに結合させたとき、LNAオリゴヌクレオチドが哺乳動物細胞中へのトランスフェクション後にプラスミドに会合した状態を保持することを実証するために、Mirusフルオレセイン標識化キット(Panvera)または結合Toto-1(Molecular Probes)染料によりあらかじめ標識化されたプラスミドpGG2XEMPTY(図10B)を用いて、CHO細胞でトランスフェクション実験を行った。最初の実験で、Mirus標識化プラスミド(25μg)をローダミン標識化6563 LNAと結合させ(37℃で一晩, 10mMリン酸ナトリウム、1mM EDTA pH8.0、40ピコモル オリゴ/μg, 表3)、そしてS400HRスピンカラムに通して未結合LNAを分離除去した後、LNAが結合された標識化プラスミドをCHO細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクションの36時間後に固定されたそのようなCHO細胞の共焦点分析の例を図17に示す。この図から、プラスミド由来のフルオレセインシグナルと6563 LNA由来のローダミンシグナルとの100%相関すなわち共局在が存在することが明確に実証される。このことは、結合されたLNAがCHO細胞中への脂質ベースのトランスフェクション後にプラスミド上に保持されることを示唆するものである。
【０１５８】
図17は、プラスミドに結合されたLNAのCHO細胞中における共局在を共焦点顕微鏡(Leica TCS NT)下で可視化して示したものである(トランスフェクションの36時間後)。
(A) Mirus Label ITフルオレセイン標識化キットで標識化されたPGG2xEMPTYプラスミドをFITCチャネル(アルゴンレーザー, 488nm励起)上で可視化したものである。
(B) TRITCチャネル(クリプトンレーザー, 568nm励起)上で可視化したLNA 6563(ローダミンで標識化)
(C) UV光(アルゴンレーザー, 351+364nm励起)下で可視化したDAPI染色核
(D) 3つの異なるチャネル(A)+(B)+(C)のオーバーレイ。
【０１５９】
非常によく似た実験において、プラスミドpGG2XEMPTY内の2つの異なる部位に結合する異なる配列の3種のLNAオリゴヌクレオチドが、CHO細胞中へのトランスフェクション後、プラスミドDNAとの共局在を示すことが実証された(データは示されていない)。Mirusフルオレセイン標識化キット(Panvera)または結合Toto-1(Molecular Probes)染料によりあらかじめ標識化されたプラスミドpGG2XEMPTY(25μg, 図10B)を、37℃で、かつ10mMリン酸ナトリウム, 1mM EDTA pH8.0(40ピコモル オリゴ/μg)で、一晩かけて、LNA4(ローダミンで標識化, 表1)に結合させ、S400HRスピンカラムに通して分離した後、遊離未結合LNAを除去した。続いて、Alexa Fluor 647で標識化されたLNA 5877およびAlexa Fluor 350で標識化されたLNA 5827を順に結合させ、それぞれの段階で遊離オリゴヌクレオチドをS400HRスピンカラム分離により除去した。次に、プラスミドDNAをCHO細胞中にトランスフェクトし、トランスフェクションの48時間後に固定して共焦点顕微鏡下の分析に供した。次の四チャネル共焦点顕微鏡分析を行った。
(i) Toto-1(Molecular Probes, Leiden, Netherlands)で標識化されたPGG2xEMPTYプラスミドを、FITCチャネル上で可視化した(アルゴンレーザー, 488nm励起)
(ii) LNA4(ローダミンで標識化)を、TRITCチャネル上で可視化した(クリプトンレーザー, 568nm励起)
(iii) Alexa Fluor 647で標識化されたLNA 5877を、Far red/Cy5チャネル上で可視化した(ヘリウム-ネオンレーザー, 633nm励起)
(iv) Alexa Fluor 350で標識化されたLNA 5827を、UV光下で可視化した(アルゴンレーザー, 351+364nm励起)。
【０１６０】
CHO細胞において4色すべての共局在を明確に実証しうるので(データは示されていない)、3種のLNAオリゴヌクレオチドはすべてトランスフェクション後にプラスミドDNAに結合した状態を保持することが示唆される。LNA 4(表1)および5827(表2)は、プラスミドpGG2XEMPTY内の類似の部位に結合するが、それは相補的DNA鎖上であり、一方、5877(表2)は、無関係なDNA配列に結合することに注目されたい。これらの2種のLNAオリゴヌクレオチドがそれらのコグネイト結合部位でプラスミドDNAに同時にかつ特異的に結合しうることが、図4および11(それぞれ、LNA 4および5877)に示されるものと同じような制限切断マッピングデータによりすでに明らかにされていることにも注目されたい。
【０１６１】
蛍光性LNAオリゴヌクレオチドが結合されたGFP発現プラスミドはトランスフェクション後にCHO細胞中に共局在化されかつGFP発現を示すことの実証
LNAオリゴヌクレオチドをこの研究で記載したプラスミド(たとえば, pGG2XGFP, 図10A, GTS Catalogue, 2002, GTS, California, USA)内のそれらのコグネイト結合部位に結合させたとき、結合されたLNAを含有するプラスミドが、プラスミドにコードされた遺伝子の発現を呈しうることを実証するために、共焦点顕微鏡法実験を行った。プラスミドpGG2XGFP(25μg)をローダミン標識化6563 LNAに結合させ(37℃で一晩, 100mMリン酸ナトリウム, 1mM EDTA pH8.0, 40ピコモル オリゴ/μg，表3)、S400HRスピンカラムに通して未結合LNAを分離除去した後、結合されたLNAを有する標識化プラスミドを、8ウェルガラススライド上で増殖させたCHO細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクションの66時間後、先に述べたように細胞の固定および処理を行い、緑色蛍光タンパク質(GFP)の発現およびプラスミドに結合されたローダミン標識化LNAの検出を、共焦点顕微鏡法により検出した。図18参照。
【０１６２】
図18は、緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するプラスミドに結合されたLNAのCHO細胞中における共局在を、共焦点顕微鏡(Leica TCS NT)下で可視化して示したものである(トランスフェクションの66時間後)。
(A) GFPを発現するPGG2XGFPプラスミドをFITCチャネル上で可視化したもの(アルゴンレーザー，488nm励起)；
(B) LNA 6563(ローダミンで標識化)をTRITCチャネル(クリプトンレーザー，568nm励起)上で可視化したもの；
(C) UV光(アルゴンレーザー，351+364nm励起)下のDAPI染色核；
(D) 3つの異なるチャネル(A)+(B)+(C)のオーバーレイ。
【０１６３】
結合された6563 LNAに由来するローダミンシグナルをも含有するトランスフェクトされたpGG2XGFPプラスミドに由来するGFPを発現するCHO細胞は、容易に検出可能であった。これらの結果は、LNAオリゴヌクレオチドをこの研究で記載したプラスミドに結合させたとき遺伝子発現が起こりうること実証し、実施例3に記載の実験データに追加されるさらなる確証を分子レベルで提供する。
【実施例９】
【０１６４】
LNAオリゴヌクレオチドを有するスーパーコイルプラスミドDNAへのCpGベース免疫アジュバントの結合およびRAW264.7細胞におけるin vitro免疫アジュバント効果のアッセイ
LNAおよびPTO(ホスホロチオエート)、オリゴヌクレオチド、プラスミドDNA、ならびにエンドトキシン試験
LNAオリゴヌクレオチドPTOCpGおよびPTOGpCは、表3に記載されている。これらは、Proligo LLC, Colorado, USAにより合成されたものである。簡潔に述べると、これらのオリゴヌクレオチドは、両方とも、5'末端に20個のホスホロチオエート残基、続いて、投与後に酵素的開裂および遊離CpGの放出を容易にするための単一のDNAホスホルアミデート残基、続いて、3'末端に13個のLNA残基を含有するように、合成されたものである。LNA残基は、LNA 5827に対して記載したものと同じであるが(表3)、ただし、修飾アミノ基は含まれていなかった。これらのオリゴヌクレオチドのホスホロチオエート成分は、PTOCpGでは、記載のCpGアジュバントオリゴヌクレオチド1826(80,81)に基づき、GpCでは、CpGモチーフを突然変異させたその対照1745(81)に基づく。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドCPG1826(80, 81)およびCPG1745(81, 表3)は、それぞれ、単純にオリゴヌクレオチドPTOCpGおよびPTOGpCの100%ホスホロチオエート成分であり、MWG-Biotech AG, Ebersberg, Germanyにより合成されたものであった。
【０１６５】
プラスミドDNAであるgWiz(図1A)およびpGG2XGFP(図10B)は、製造業者の使用説明書に従ってQiagen Endofree Plasmid Maxiキット(Qiagen、GmbH、Germany)により調製した。
【０１６６】
Biowhittaker QCL-1000 LALキット(Biowhittaker Inc., Walkersville, USA)またはPyrochrome LALキット(Cape Cod Inc., Falmouth, MA, USAの関連会社)を用いてエンドトキシンレベルを測定することにより、この試験で使用したいずれのオリゴヌクレオチドおよびプラスミドにもエンドトキシンが存在しないことを確認した。アッセイは、製造業者の使用説明書に従って行った。エンドトキシンレベルは、この試験で使用したいずれのプラスミドおよびオリゴヌクレオチドにおいても、0.1 EU(エンドトキシン単位)/μg DNA未満であった。
【０１６７】
Ulysisキットによるオリゴヌクレオチドの化学標識化
Alexa Fluor 488蛍光染料を含有するUlysis核酸標識化キット(Molecular Probes, Leiden, Netherlands)を用いて、オリゴヌクレオチドを標識化した。簡潔に述べると、一般的には5μgスケールで、全体積105μlで、かつ80℃で、15分間かけて、オリゴヌクレオチドを標識化し、氷上で急冷することにより反応を停止させ、そして標準的なエタノール沈殿(51)により遊離の染料を除去した。次に、オリゴヌクレオチドを約20〜25ピコモル/μlで水中に再懸濁させ、プラスミド結合実験に供した。
【０１６８】
プラスミドDNAへの「ハイブリッド」PTO/LNAオリゴヌクレオチドの結合
プラスミドpGG2XEMPTYをPTOCpGまたはPTOGpCのいずれかに結合させた(37℃で一晩, 10mMリン酸ナトリウム, 1mM EDTA pH8.0, 表3)。簡潔に述べると、2.5μgのプラスミドDNAを約90ピコモルのUlysis Alexa Fluor 488標識化オリゴ/μg DNAに結合させ、得られた産物をアガロースゲルで分析した(図19参照)。
【０１６９】
図19は、Alexa Fluor 568を用いて5' NH2基が標識化されたかまたはUlysis Alexa Fluor 488標識化キットを用いてN7 G残基が化学標識化されたLNAオリゴヌクレオチドと共にインキュベートされたスーパーコイルプラスミドDNAを分析すべく、臭化エチジウム(EtBr)の不在下で2%アガロースゲル電気泳動を行った結果を示している(表3, Molecular Probes, Leiden, Netherlands)。
(A) EtBr染色前のUVP EpiChemi Darkroom Bio Imaging System, 302nm uv, SYBR金フィルター(UVP, Cambridge, UK)を用いたLabworks 4.0パッケージによるゲル分析。
(B) EtBr染色後の(A)。
1) 1μgの1kb DNAラダー(Promega, Southampton, UK)；
2) 37℃で5' Alexa Fluor 568標識化5827と共にインキュベートされた2.5μgのpGG2xEMPTYプラスミド；
3) 37℃でUlysis Alexa Fluor 488標識化5827と共にインキュベートされた2.5μgのpGG2xEMPTYプラスミド；
4) 37℃でUlysis Alexa Fluor 488標識化PTOCpGと共にインキュベートされた2.5μgのpGG2xEMPTYプラスミド；
5) 37℃でUlysis Alexa Fluor 488標識化PTOGpCと共にインキュベートされた2.5μgのpGG2xEMPTYプラスミド。
【０１７０】
いずれの場合においても、PTOCpGとPTOGpCの両方のLNA成分に基づく5827のような蛍光標識化対照LNAのときと同じようにプラスミドDNAに結合された形で蛍光標識化オリゴを検出しうる(図19)。このことから、ホスホロチオエート残基とDNA残基とからなる21残基による13mer 100% LNAオリゴヌクレオチドの5'伸長部は、プラスミドDNAに結合するLNAの能力を阻害しないということが明確に実証される。さらに、Ulysis標識化キットは優先的にグアニンのプリン環のN7原子に蛍光染料分子を付加させるだけでなくアデニン残基にも付加することは公知である。LNA成分はグアニン残基とアデニン残基だけからなるので、これらはまたUlysisキットにより5827 LNA上でも標識化されることは明らかである(図19)。プリン塩基のN7原子は、大きい蛍光標識の付加により阻害される可能性のあるフーグスティーン型塩基対合に関与すると思われるが(74)、ワトソン・クリック型塩基対合に必要とされる分子相互作用は、標識化による影響を受けないことが期待されよう。このことは、プラスミドDNAへのLNAオリゴヌクレオチド結合の主要機構がワトソン・クリック型塩基対合による鎖置換の機構であるということを裏づけるさらなる証拠である。
【０１７１】
上述した条件下におけるプラスミドDNAへのPTOCpGまたはPTOGpCオリゴヌクレオチドの結合では、プラスミドDNAに結合されないいくらかの遊離オリゴヌクレオチドが残存した(図19)。これらの実験の目的は、LNAオリゴヌクレオチドを介してプラスミドDNAに結合させることにより、免疫刺激性アジュバント(すなわち、CpGモチーフ(79)を有するオリゴヌクレオチド)を付加する効果を分析することであったので、アジュバント効果を呈する遊離オリゴヌクレオチドは、結合オリゴヌクレオチドを含有するプラスミド調製物から除去しなければならないことは明らかである。プラスミドと結合オリゴヌクレオチドとの調製物から未結合オリゴヌクレオチドを除去する標準的な方法、すなわち、S400HRスピンカラム(Amersham Pharmacia Biotech)に通して分離する方法を確認するために、さらなる実験を行った。Ulysis標識化キットによりAlexa Fluor 488で標識化されたオリゴヌクレオチドPTOCpGを、先に記載したように、プラスミドDNA pGG2XEMPTYに結合させた。ただし、プラスミド結合の前、オリゴヌクレオチドを80℃で10分間加熱し、次に、ただちに氷中で急冷させた。これは、プラスミド結合に影響を及ぼす可能性のあるオリゴヌクレオチド内のホスホロチオエート塩基間の自己相補的相互作用を完全に破壊するためであった。サンプルを二分し、その片方をS400HRスピンカラムに通して分離し、次に、両方のサンプルをアガロースゲル電気泳動により分析した(図20参照)。S400HRで処理しなかったサンプルのゲルの中間部および底部の近傍に存在する遊離オリゴヌクレオチドの大きい強い標識化バンドは、S400HRで処理したサンプルでは完全に除去されたことが図20からはっきりとわかる。
【０１７２】
図20は、Ulysis Alexa Fluor 488標識化キット(表3, Molecular Probes, Leiden, Netherlands)によりN7 G残基で化学標識化されたLNAオリゴヌクレオチドと共にインキュベートされたスーパーコイルプラスミドDNAを分析すべく、臭化エチジウム(EtBr)の不在下で2%アガロースゲル電気泳動を行った結果を示している。
(A) EtBr染色前のUVP EpiChemi Darkroom Bio Imaging System, 302nm uv, St Brフィルター(UVP, Cambridge, UK)を用いたLabworks 4.0パッケージによるゲル分析。
(B) EtBr染色後の(A)。
1) 1μgの1kb DNAラダー(Promega, Southampton, UK)；
2) 37℃でUlysis Alexa Fluor 488標識化PTOCpGと共にインキュベートされた2.5μgのpGG2xEMPTYプラスミド；
3) 37℃でUlysis Alexa Fluor 488標識化PTOCpGと共にインキュベートされ、S400HRスピンカラムに通して分離された2.5μgのpGG2xEMPTYプラスミド。
【０１７３】
上記のデータを考慮して、非標識化オリゴヌクレオチドPTOCpGまたはPTOGpCをそれぞれプラスミドgWiz(エンドトキシンを含まない)に結合させる同様な結合実験を行った。その際、記載のごとく、S400HRスピンカラムに通すことにより、両方のサンプルから遊離オリゴヌクレオチドを除去した。これらのプラスミドサンプルは、次に、マウス腫瘍壊死因子α(TNFα)誘導を調べるRAW264.7トランスフェクション実験で使用するのに好適であった(以下参照)。
【０１７４】
RAW264.7細胞培養、DNAトランスフェクション、およびオリゴヌクレオチドインキュベーション
10% FCS、100単位/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、2mMグルタミンを含むRPMI 1640培地(Life Technologies)中にマウスマクロファージ細胞系RAW264.7を維持した。96ウェルプレート(Lab tech, Nalge Nunc. Int.)中でRAW264.7細胞を集密的になるまで増殖させ、1ウェルあたり250μlのPBSで1回洗浄し、150μlのOptimem中、37℃で、2時間インキュベートした。0.01〜10μM CpGオリゴヌクレオチド+/-FuGENE6トランスフェクション試薬(Roche Molecular Biochemicals, それぞれ1μMオリゴヌクレオチド:0.5μl FuGENE6の比)、Optimemのトランスフェクション混合物を100μlの最終体積になるように添加し、混合物を室温で30分間インキュベートした。RAW264.7細胞を含有するOptimemにトランスフェクション混合物を添加し、37℃で14時間インキュベートした。対照として、FuGENE6トランスフェクション試薬単独と、トランスフェクション試薬を用いたときと用いないときの0.1〜5μg gWizプラスミド(プラスミドDNA 1μg：6μl FuGENE6トランスフェクション試薬の比)と、を用いて、同一の手順を行った。
【０１７５】
RAW264.7細胞由来の腫瘍壊死因子α(TNFα)に対するELISA
CpGモチーフ(84, 85, 86, 87)で刺激した後のマウスTNFαの産生に基づくELISAアッセイを行うために、先に記載したように、RAW264.7細胞を増殖させ、プラスミドおよびオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。
【０１７６】
先に述べたように14時間インキュベートした後、培養液上清を採取し、製造業者のプロトコールに従って、Duoset ELISA展開系キット(R&D systems, Minneapolis)を用いてマウスTNFαレベルを検出した。次に、新たな培地をRAW267.4細胞に添加し、トランスフェクションの24時間後に採取して溶解細胞でルシフェラーゼアッセイを行った。詳細については以下を参照されたい。上清サンプルを試薬希釈剤(1% BSAを含有するPBS)で希釈した後、96ウェルNunc Immuno ELISAプレート(Nalge Nunc)中でELISAを行い、Molecular Devices Spectra Max 190を用いて吸光度を450nmで測定し、Softmax Pro 3.1.2ソフトウェアにより4-PL曲線フィットを行ってマウスTNFα値を計算した。二重反復試験サンプルの平均として結果を表した(ng/ml)。
【０１７７】
CpG「ハイブリッド」PTO/LNAオリゴヌクレオチドによりプラスミドgWizに理論上結合されうるCpGオリゴヌクレオチドの用量当量の計算
RAW264.7細胞中にトランスフェクトされたプラスミドgWiz(μg)の用量を、gWizプラスミド中に結合部位を有するLNAオリゴヌクレオチドにCpGオリゴヌクレオチドが結合されているときに(すなわち、PTOCpGとして存在しているときに, 表3)gWizプラスミドに理論上結合しうるCpGオリゴヌクレオチドの等価用量(μM)に変換した。計算上、次のことを仮定する。すなわち、1μgの5kbプラスミドは約0.3ピコモルであり(GTS「PNAクランプ」, 製造業者の使用説明書)、プラスミドgWizは6.7kbであり、したがって、1μgは約0.23ピコモルであると仮定する。理論上、1μgのプラスミドは、結合部位1つあたり0.23pmolのPTOCpGオリゴヌクレオチドに結合することが可能であり、gWizプラスミド上には6つの結合部位が存在する(表3)。したがって、プラスミドgWiZ上の6つの結合部位がすべて占有された場合、すなわちLNAのワトソン・クリック型塩基対を形成することにより6つのPTOCpGオリゴヌクレオチドが結合した場合、6×0.23=1.2pmol CpGオリゴヌクレオチドが結合される。ELISAアッセイの全体積は250μlであるので、CpGの濃度は4.8μMである。結論として、1μgのプラスミドは4.8μMのCpGオリゴヌクレオチドに匹敵する。この比較を用いて、RAW264.7トランスフェクションにおけるgWizプラスミドと遊離CpGオリゴヌクレオチドとの間でマウスTNFαレベルを規格化した。
【０１７８】
gWizプラスミドと理論数の有望な結合CpGオリゴヌクレオチドとを用いてTNFαシグナルを誘導するRAW264.7トランスフェクションアッセイが、プラスミド結合アジュバントの存在と不在の識別に敏感であるかを予測する手段として、この一例を図22に示す。
【０１７９】
図22は、RAW264.7中へのgWizプラスミド結合PTOCpGの脂質ベースのトランスフェクションにより誘発されたアジュバント効果を、TNFレベルとして、gWizプラスミド単独、CPG1826オリゴヌクレオチド、ならびに陰性対照のCPG1745オリゴヌクレオチドおよびPTOGpC結合gWizのときと比較した、用量応答曲線を示している。
【０１８０】
このことから、CPG1826オリゴヌクレオチドはCpGアジュバント効果を示すが、陰性対照CPG1745は示さないことが明確に実証される。プラスミド用量をCpG用量に変換することにより、次の点も強く示唆される。すなわち、期待される6つのCpGオリゴヌクレオチド(すなわち、PTOCpG, 表3)がgWizプラスミドDNAに結合すれば、TNFαシグナルがgWizプラスミドDNAのときの12〜30倍に増加することが期待される。gWizはこのプラスミドでトランスフェクトされたRAW264.7におけるベースラインTNFα産生の原因となりうる1つのマウス6mer「コア」CpG配列を含有することに留意されたい(83)。
【０１８１】
RAW264.7細胞におけるCpG「ハイブリッド」PTO/LNAオリゴヌクレオチドアジュバント効果の実証
プラスミドgWizに結合されたオリゴヌクレオチドPTOCpGを有することによるアジュバント効果を実証するデータを、RAW264.7細胞中へのトランスフェクション後のTNFα産生として図22に示す。図22ではまた、1μMのCPG1826およびCPG1745から逐次2倍希釈を行って0.078Mまでの用量範囲で、プラスミド用量とCpGオリゴヌクレオチド用量との比較も行われている。プラスミドgWiz(μg)からCpG(μM)への変換は、先に記載したように、また図21に示されるように行った。
【０１８２】
図21は、RAW264.7細胞と共にインキュベートしたときのCpGオリゴヌクレオチドのアジュバント効果の用量応答曲線を、プラスミドgWizのトランスフェクションにより誘導した基礎レベルと比較して示している。これは、ng/ml単位のTNF産生に対するμm単位のオリゴヌクレオチド濃度としてグラフ表示されている。対数曲線または直線は、点を結ぶトレンドラインを意味する。
【０１８３】
図22にプロットされたグラフを用いて、gWizプラスミド+/-結合PTOCpGにより誘導されるTNFαレベルと遊離オリゴヌクレオチドCPG1826により誘導されるTNFαレベルとの差を決定した。プラスミドgWizが結合PTOCpGオリゴヌクレオチドを有する場合、TNFαレベルはプラスミド単独で誘導されるレベルの7〜27倍である。これは、図21から予測される倍率(すなわち、12〜30倍)およびこの実験(図22)における遊離CPG1826g誘導TNFαレベルとgWizプラスミド誘導TNFαレベルとの差、すなわち5〜22倍の両方によく一致する。このデータから、免疫アジュバント、すなわちCpGオリゴヌクレオチドをLNAオリゴヌクレオチドが結合したプラスミドDNAに付加できることが明確に実証される。このアッセイは、CpGモチーフがTLR9レセプターと相互作用してTNFα産生(82,83)の誘発を引き起こすと考えられるRAW264.7細胞のエンドソームへのトランスフェクトプラスミドDNAまたは遊離オリゴヌクレオチドの取込みに基づくことが考えられる。FuGENE6を有するプラスミドをRAW264.7細胞中にトランスフェクトすると、プラスミドDNAのほとんどがエンドソーム中に取り込まれることはすでに明らかにされている(データは示されていない)。
【０１８４】
RAW264.7細胞からのルシフェラーゼアッセイ
トランスフェクション効率を測定するために、トランスフェクションの24時間後、細胞をPBSで1回洗浄し、1ウェルあたり100μlの低デタージェントMagnus溶解バッファー(10mM EDTA 0.25%, TritonX-100, 10mM DDT, 250mM Hepes pH7.5)の添加により溶解させた。96ウェルBlack & White Isoplate(Wallac, Perkin Elmer)中で、50μlの溶解物を200μlのルシフェラーゼアッセイ試薬(Promega)と一緒にしてアッセイした。ルシフェラーゼ活性(相対光単位, RLU)は、Victor2 1420多重標識HTSカウンターを用いてルミネセンスプログラム(Wallac, Perkin Elmer)により1分あたりのカウント数として測定した。製造業者のプロトコールに従って、Coomassie Plusタンパク質アッセイ試薬キット(Perbio)により、全タンパク質濃度を計算した。透明96ウェル平底プレート(Costar)中で、5μlの細胞溶解物、145μlの水(Sigma)、および150μlのクーマシーブルー試薬を混合し、Molecular Devices Spectra Max 190を用いて595nmで吸光度を測定した。二重反復試験サンプルの平均として結果を表した(μg/ml)。ルシフェラーゼ活性は、相対光単位(RLU)/mg全タンパク質として表した。
【０１８５】
この例を図23に示す。この図では、4つの異なる用量でgWiz単独(μg単位)またはPTOCpGが結合したものもしくはPTOGpC 1745が結合したものから誘導されるシフェラーゼ活性を比較する。
【０１８６】
図23は、結合オリゴヌクレオチドを含むときと含まないときのgWizプラスミドの脂質ベースのトランスフェクションにより誘導されたRAW264.7細胞中でのルシフェラーゼ発現を、タンパク質1mgあたりの相対ルミネセンス単位量(RLU)として示したものである。オリゴヌクレオチドと記されたサンプルは、単にRAW264.7細胞と共にオリゴヌクレオチドをインキュベートした陰性対照を表す。
【０１８７】
図22にプロットしたELISAの結果を得るために使用した細胞サンプルから直接、データを得る。このデータから、gWizプラスミドDNA上に結合CpGオリゴヌクレオチドが存在してもルシフェラーゼの発現は減少しないことがはっきりとわかる。結合CpGオリゴヌクレオチドのアジュバント効果をも考慮すると、LNAオリゴヌクレオチドを用いて、コードされた抗原を発現するプラスミドDNAに免疫アジュバントを結合させることにより、免疫アジュバント効果と高レベルの抗原発現の両方を達成できることが示される。
【実施例１０】
【０１８８】
プラスミドDNAに結合させるためのLNAオリゴヌクレオチドに機能性ペプチドをコンジュゲートとして結合させて遺伝子導入効率を改良する方法
修飾ペプチドをLNAオリゴヌクレオチドに結合するためのヘテロ二官能性架橋剤の使用
ペプチド-オリゴヌクレオチドコンジュゲートの結合および／または共合成を行うためのさまざまな技術の使用が、最近レビューされた(88)。ペプチド-オリゴヌクレオチドコンジュゲートの形成を行う方法の1つは、修飾基をもたせてそれぞれを合成することである。たとえば、遊離スルフヒドリル基を導入するためのC末端シスチン残基を有するペプチドおよび遊離第一級アミノ基を導入するための5'修飾を有するLNAオリゴヌクレオチドのようなオリゴヌクレオチドを合成する。そのような分子は、次に、市販品として入手可能である広範にわたるヘテロ二官能性リンカー(Perbio Catalogue 2002, Perbio)、たとえば、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP, Perbio, 89)、マレイミドベースのもの、たとえば、4-(マレイミドメチル)-1-シクロヘキサン-カルボン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(SMCC, Perbio, 90)、スルホ-MBS m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル(Sulfo-MBS, Perbio)、N-(6-マレイミドカプロイルオキシ)スルホスクシンイミド(Sulfo-EMCS, Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan)を用いて結合させることが可能である。LNAに結合させうる機能性ペプチドとしては、核局在化シグナル(nls)または膜輸送配列(MTS, 26)を含有するペプチド(表2参照, (19))およびこの研究で先に記載したような他の機能性ペプチドが挙げられる。この方法でペプチドに結合させうるLNAオリゴヌクレオチドは、表3に列挙したものと類似のものである。これらは、ペプチド:LNAオリゴヌクレオチドをプラスミドDNAに結合させる前に互いに結合させることが可能であり、またはPNAオリゴヌクレオチドに対して記載し方法(実施例4)と同じような方法でプラスミドDNAに結合させながら修飾LNAオリゴヌクレオチド上で結合コンジュゲーションを行うことも可能である。
【０１８９】
ペプチドとLNAオリゴヌクレオチドとのジスルフィド架橋の使用
機能性ペプチドとオリゴヌクレオチドとのコンジュゲーションを行うさらなる方法は、ジスルフィド結合の形成により結合を可能にする遊離スルフヒドリル基または開裂性ジスルフィド基をもたせて両方の分子を合成することである。先に述べたように、C末端シスチン残基をもつペプチドを合成した。例としては、表3に列挙されているペプチドが挙げられる。これらについては、すでに実施例4で説明したが、FGF(94)は、Genemed Synthesis Inc., California, USAにより合成されたものである。5' C6 S-S修飾が組み込まれた100% LNAオリゴヌクレオチドである5'SHGAは、Proligo LLC, Boulder, USAにより合成されたものである(表3)。先に実施例4で述べたように、ペプチドを1〜2mg/mlの量でPBS中に再懸濁させ、Alexa Fluor 568染料で標識化した。表2に列挙されている4種の蛍光標識化ペプチドのそれぞれを20倍モル過剰で、1000ピコモルの5'SHGA LNAオリゴヌクレオチド(これは、先に記載したように、gWizプラスミドDNAにすでに結合されているものである)と混合した。これを固定化TCEPジスルフィド還元ゲル(Perbio)と共に室温で1時間インキュベートして、ジスルフィド結合を切断した。次に、Eppendorf微量遠心機を用いて3000rpmで2分間遠心することにより、ゲルから混合物を取り出し、そして還元されたペプチド/オリゴヌクレオチド/プラスミド混合物を4℃で激しく振盪させながら16時間インキュベートし、ペプチド-オリゴヌクレオチドコンジュゲートを形成させた。次に、サンプルをS400HRスピンカラムに通して、遊離未結合ペプチドまたはオリゴヌクレオチドをプラスミドDNAから完全に除去した。次に、蛍光性ペプチドに結合された結合LNAオリゴヌクレオチドを有するプラスミドDNAのサンプル2.5μgをアガロースゲル上で可視化させた(図24)。
【０１９０】
図24は、5'SHGA LNAオリゴヌクレオチド(表3)にコンジュゲートされたAlexa Fluor 568標識化ペプチドと共にインキュベートし、次に、Microspin S400HRカラム(Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK)に通してゲル排除クロマトグラフィーにより、遊離未結合LNAオリゴヌクレオチドから分離されたスーパーコイルプラスミドDNAを分析すべく、臭化エチジウム(EtBr)の不在下で2%アガロースゲル電気泳動を行った結果を示している。ペプチド配列を表2に列挙する。
(A) EtBr染色前のUVP EpiChemi Darkroom Bio Imaging System, 302nm uv, Et Brフィルター(UVP, Cambridge, UK)を用いたLabworks 4.0パッケージによるゲル分析。
(B) EtBr染色後の(A)。
1) 1μgの1kb DNAラダー(Promega, Southampton, UK)；
2) 2.5μgのgWizプラスミド；
3) 37℃でSV40nlsペプチド/5'SHGA LNAオリゴヌクレオチドと共にインキュベートされた2.5μgのgWizプラスミド；
4) 37℃でAdFペプチド/5'SHGA LNAオリゴヌクレオチドと共にインキュベートされた2.5μgのgWizプラスミド；
5) 37℃でM9ペプチド/5'SHGA LNAオリゴヌクレオチドと共にインキュベートされた2.5μgのgWizプラスミド；
6) 37℃でFGFペプチド/5'SHGA LNAオリゴヌクレオチドと共にインキュベートされた2.5μgのgWizプラスミド；
7) ブランク；
8) ブランク。
【０１９１】
調べた4種のペプチドすべてについて、蛍光結合ペプチドLNAコンジュゲートを含むプラスミドバンドの検出および定量化が可能であったが(データは示されていない)、プラスミドgWiz単独では不可能であった(図24)。sv40 nlsペプチド(表2)は、プラスミドDNAに単独で結合することがすでに明らかにされているが(データは示されていない)、同様に処理されたペプチドと共にインキュベートされたプラスミドgWizは、アガロースゲル電気泳動で蛍光性バンドを示さなかった。ペプチド:LNAオリゴヌクレオチドはこのようにして形成することが可能であり、しかもプラスミドに結合してプラスミドDNAに機能を付与できることがこのデータから示唆される。たとえば、LNAを介して結合されたnlsペプチドを有するプラスミドを哺乳動物細胞にトランスフェクトすれば、実施例4に記載されているように、遺伝子発現の増大に及ぼすなんらかの効果をモニターすることが可能であろう。FGF(表2, 94)のような膜輸送配列ペプチドをLNAオリゴヌクレオチドに結合させ、さらにプラスミドに結合させれば、実施例8に記載したのと同じように共焦点顕微鏡法により、哺乳動物細胞中への蛍光標識化プラスミドDNAの取込みの増大に及ぼす影響を分析することが可能であろう。プラスミドDNA(95)に付与することのできる増強されたエンドソーム放出特性および核内取込み特性を示すメリチン(77, 95)のように二元機能を有するペプチドにコンジュゲートされたLNAオリゴヌクレオチドが結合されたプラスミドについても、同様なアッセイを行うことが可能であろう。
【０１９２】
ペプチドをLNAオリゴヌクレオチドにコンジュゲートさせるための「天然連結」(native ligation)の使用
プラスミドDNAに結合させるためのLNAオリゴヌクレオチドに機能性ペプチドを結合させるために使用しうるさらなる方法は、「天然連結」(91, 92)として記載されるものであり、Link Technologies, Strathclyde, Scotlandから市販品として入手可能である。この方法は、N末端チオエステル官能化ペプチドおよび5'システイニルLNAオリゴヌクレオチドの合成を必要とする。官能化されたペプチドおよびオリゴヌクレオチドを、合成直後、さらなる精製を行うことなく、TCEPの水溶液を用いてコンジュゲートさせることが可能である(91)。この方法および他の方法で形成されたペプチド-LNAオリゴヌクレオチドコンジュゲートを、プラスミドDNAへの結合前に、逆相HPLCにより精製することが可能である(88, 91)。
【０１９３】
LNAオリゴヌクレオチド:ペプチドコンジュゲートを形成するための固相共合成法の使用
機能性ペプチドと、プラスミドDNAに結合させるためのLNAオリゴヌクレオチドと、のコンジュゲートを生成するために使用しうる他のさらなる方法は、オリゴヌクレオチドの3'ペプチドコンジュゲートの共合成を可能にする固相法に基づく(93)。この方法は、標準的条件下でオリゴヌクレオチドとペプチドの両方のアセンブリーを可能にするホモセリン官能化固体担体系に基づく(93)。
【０１９４】
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【０１９５】
略号
LNA - ロックド核酸
NLS - 核局在化シグナル
HnRNP - ヘテロ核リボ核タンパク質
HIV-1 -ヒト免疫不全ウイルス-1
CMV - サイトメガロウイルス
HSV - 単純ヘルペスウイルス
HPV - ヒトパピローマウイルス
PEI - ポリエチレンイミン
TAMRA - カルボキシテトラメチルローダミン
ROX - カルボキシ-X-ローダミン
PNA - ペプチド核酸
GFP - 緑色蛍光タンパク質
PMID - 粒子媒介免疫療法剤送達
TAE - トリスアセテートEDTA, pH8.0
DMRIEC - 1,2-ジミリスチルオキシプロピル-3-ジメチル-ヒドロキシルエチルアンモニウムブロミドとコレステロールとの1:1(M/M)混合物
【図面の簡単な説明】
【０１９６】
【図１Ａ】ルシフェラーゼ発現ベクターgWizであり、これは、プラスミドのbGHpyA領域のDNA配列内に複数のAGモチーフを含有する。Luc = ルシフェラーゼ、bGHpyA = ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域。
【図１Ｂ】GFP発現ベクターpGGGFPであり、これは、プラスミドのbGHpyA領域のDNA配列内に複数のAGモチーフを含有する。
【図１Ｃ】pGL3 Basicをベースとするルシフェラーゼ発現ベクターpGL3CMVであり、CMV前初期プロモーターがルシフェラーゼ発現を駆動する。
【図２】ローダミン標識化LNAまたはPNAオリゴヌクレオチドと共にインキュベートしたスーパーコイルプラスミドDNAを分析すべく臭化エチジウム(EtBr)の不在下で2%アガロースゲル電気泳動を行った結果を示す。
【図３】ローダミン標識化LNAまたはPNAオリゴヌクレオチドと共にインキュベートしたスーパーコイルプラスミドDNAを分析すべく臭化エチジウム(EtBr)の不在下で2%アガロースゲル電気泳動を行った結果を示す。
【図４】ローダミン標識化LNAまたはPNAオリゴヌクレオチドと共にインキュベートしたスーパーコイルプラスミドDNAを分析すべく、制限酵素Bsa IおよびSph Iにより37℃で一晩かけて消化した後、臭化エチジウム(EtBr)の不在下で2%アガロースゲル電気泳動を行った結果を示す。
【図５】ローダミン標識化LNAまたはPNAオリゴヌクレオチドと共にインキュベートし、「金スラリー」調製手順に付し、次に、TE PH8.0で「金スラリー」から溶出させたスーパーコイルプラスミドDNAを分析すべく、臭化エチジウム(EtBr)の不在下で2%アガロースゲル電気泳動を行った結果を示す。
【図６】遺伝子銃によりMC57細胞に一過性にトランスフェクトされたプラスミドのルシフェラーゼ活性(トランスフェクションの24時間後)の比較を示す。
【図７】DMRIE-C(Life Technologies)を用いてリポフェクションによりHeLa細胞に一過性にトランスフェクトされたプラスミドのルシフェラーゼ活性(トランスフェクションの24時間後)の比較を示す。
【図８】マレイミドGTS PNAオリゴヌクレオチドにコンジュゲートさせたAlexa Fluor 568標識化ペプチドと共にインキュベートしてからMicrospin S400HRカラムを用いてゲル排除クロマトグラフィーにより遊離未結合PNAオリゴヌクレオチドから分離されたスーパーコイルプラスミドDNAを分析すべく臭化エチジウム(EtBr)の不在下で2%アガロースゲル電気泳動を行った結果を示す。
【図９】エレクトロポレーションによりHeLa細胞に一過性にトランスフェクトされたプラスミドのルシフェラーゼ活性(トランスフェクションの5および21時間後)の比較を示す。
【図１０Ａ】GFP発現ベクターpGG2XGFPの模式図であり、これは、プラスミドのbGHpyA領域のDNA配列内に複数のAGモチーフを含有し、CMVプロモーターの5'側のDNA配列内に複数のAAGGモチーフを含有する。
【図１０Ｂ】GFP遺伝子の欠失によりpGG2XGFPから誘導された発現ベクターpGG2XEMPTYであるが、対象遺伝子を挿入してCMVプロモーターの制御下で発現させるためのポリリンカーを保持している。
【図１１】Alexa Fluor 568標識化LNAオリゴヌクレオチドと共にインキュベートしたスーパーコイルプラスミドDNAを分析すべく、制限酵素Bsa IおよびSph IまたはNdeIを用いて37℃で一晩かけて消化させた後、臭化エチジウム(EtBr)の不在下で2%アガロースゲル電気泳動を行った結果を示す。
【図１２Ａ】高用量(約40pmol/μgプラスミド)または低用量(5pmol/μgプラスミド)のローダミン標識化またはAlexa Fluor 568標識化LNAまたはPNAオリゴヌクレオチドと共に37℃でインキュベートし、「金スラリー」調製手順に付し、ゲルに直接充填したまたはTE pH8.0で金スラリーから溶出させたスーパーコイルプラスミドDNAを分析すべく、臭化エチジウム(EtBr)の不在下で1.5%アガロースゲル電気泳動を行った結果を示す。
【図１２Ｂ】高用量(約40pmol/μgプラスミド)または低用量(5pmol/μgプラスミド)のローダミン標識化またはAlexa Fluor 568標識化LNAまたはPNAオリゴヌクレオチドと共に37℃でインキュベートし、「金スラリー」調製手順に付し、ゲルに直接充填したまたはTE pH8.0で金スラリーから溶出させたスーパーコイルプラスミドDNAを分析すべく、臭化エチジウム(EtBr)の不在下で1.5%アガロースゲル電気泳動を行った結果を示す。
【図１３】高用量(約40pmol/μgプラスミド)または低用量(5pmol/μgプラスミド)のローダミン標識化LNAオリゴヌクレオチドと共にインキュベートしたスーパーコイルプラスミドDNAを分析すべく、臭化エチジウム(EtBr)の不在下で2%アガロースゲル電気泳動を行った結果を示す。
【図１４】DNA配列決定プライマーCy5 RevGG2Bを用いるLNA 5877の存在下でのプラスミドpGG2XGFP, (GGAA)n結合部位モチーフからの結合部位2におけるDNA配列決定ストラテジーを示す。
【図１５】LNA 5877の存在下もしくは不在下におけるプラスミドpGG2XGFPについて、Cy5RevGG2Bプライマーを用いてALF一本鎖DNA配列決定キットにより配列決定を行い、Visible Genetics DNA Sequencerにより可視化したDNA配列データを示す。
【図１６】高濃度(40pmol/μgプラスミド)および低濃度(5pmol/μgプラスミド)のLNAと共に37℃で一晩インキュベートし、続いてフルオレセイン標識化DNAプライマーと共にインキュベートしたスーパーコイルプラスミドDNAを分析すべく、臭化エチジウム(EtBr)の不在下で1.5%アガロースゲル電気泳動を行った結果を示す。
【図１７】プラスミドに結合されたLNAのCHO細胞中における共局在を共焦点顕微鏡下で可視化して示したものである(トランスフェクションの36時間後)。
【図１８】緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するプラスミドに結合されたLNAのCHO細胞中における共局在を、共焦点顕微鏡下で可視化して示したものである(トランスフェクションの66時間後)。
【図１９】Alexa Fluor 568を用いて5' NH2基が標識化されたかまたはUlysis Alexa Fluor 488標識化キットを用いてN7 G残基が化学標識化されたLNAオリゴヌクレオチドと共にインキュベートされたスーパーコイルプラスミドDNAを分析すべく、臭化エチジウム(EtBr)の不在下で2%アガロースゲル電気泳動を行った結果を示す。
【図２０】Ulysis Alexa Fluor 488標識化キットによりN7 G残基で化学標識化されたLNAオリゴヌクレオチドと共にインキュベートされたスーパーコイルプラスミドDNAを分析すべく、臭化エチジウム(EtBr)の不在下で2%アガロースゲル電気泳動を行った結果を示す。
【図２１】RAW264.7細胞と共にインキュベートしたときのCpGオリゴヌクレオチドのアジュバント効果の用量応答曲線を、プラスミドgWizのトランスフェクションにより誘導した基礎レベルと比較して示す。
【図２２】RAW264.7中へのgWizプラスミド結合PTOCpGの脂質ベースのトランスフェクションにより誘発されたアジュバント効果を、TNFレベルとして、gWizプラスミド単独、CPG1826オリゴヌクレオチド、ならびに陰性対照のCPG1745オリゴヌクレオチドおよびPTOGpC結合gWizのときと比較した、用量応答曲線を示す。
【図２３】結合オリゴヌクレオチドを含むときと含まないときのgWizプラスミドの脂質ベースのトランスフェクションにより誘導されたRAW264.7細胞中でのルシフェラーゼ発現を、タンパク質1mgあたりの相対ルミネセンス単位量(RLU)として示したものである。
【図２４】5'SHGA LNAオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされたAlexa Fluor 568標識化ペプチドと共にインキュベートし、次に、Microspin S400HRカラムに通してゲル排除クロマトグラフィーにより、遊離未結合LNAオリゴヌクレオチドから分離されたスーパーコイルプラスミドDNAを分析すべく、臭化エチジウム(EtBr)の不在下で2%アガロースゲル電気泳動を行った結果を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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