(57)【要約】本発明は、リーダー配列に付着したＴＲＡＦ−６（ＴＮＦ受容体結合因子−６）結合ドメインからなるＲＡＮＫ（ＮＦ−κＢ活性化受容体）インヒビターを提供する。ペプチドインヒビターはＲＡＮＫＬ（ＲＡＮＫリガンド）媒介破骨細胞分化を阻害し、よって、ＲＡＮＫおよびＴＲＡＦ６間の相互作用の標的化分断は、代謝性骨障害、白血病、多発性骨髄腫、関節炎、および骨の転移性がんに対する治療に有効である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＮＦ受容体結合因子６（ＴＲＡＦ６）媒介シグナリングを阻害するポリペプチドであって、ＴＲＡＦ６結合ドメインおよびリーダーシグナル配列を含むポリペプチド。
【請求項２】
前記リーダーシグナル配列が、カポシ繊維芽細胞成長因子シグナル配列、ＨＩＶ−１  Ｔａｔ（４８−６０）、Ｄアミノ酸置換ＨＩＶ−１  Ｔａｔ（４８−６０）、アルギニン置換ＨＩＶ−１  Ｔａｔ（４８−６０）、ショウジョウバエ・アンテナペディア（４３−５８）、７個以上のアルギニンを含むウイルスＲＮＡ結合ペプチド、７個以上のアルギニンを含むＤＮＡ結合ペプチド、および６〜８個のアルギニンを含むポリアルギニンポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含む請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ウイルスＲＮＡ結合ペプチドが、ＨＩＶ−１  Ｒｅｖ（３４−５０）、ＨＴＬＶ−ＩＩ  Ｒｅｖ（４−１６）、ブロモモザイクウイルスＧａｇ（７−２５）、およびフロックハウスウイルスコートタンパク質（３５−４９）からなる群から選択される請求項２記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ＤＮＡ結合ペプチドが、ヒトｃ−Ｆｏｓ（１３９−１６４）、ヒトｃ−Ｊｕｎ（２５２−２７９）、および酵母転写因子ＧＣＮ４（２３１−２５２）からなる群から選択される請求項２記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記ＴＲＡＦ６結合ドメインが、ＣＤ４０、ＮＦ−κＢ活性化受容体、ＩＬ−１受容体結合キナーゼ１（ＩＲＡＫ１）、ＩＬ−１受容体結合キナーゼ２（ＩＲＡＫ２）、ＩＲＡＫ−Ｍ、およびＲＩＰ２からなる群から選択されるタンパク質からのＴＲＡＦ６結合ドメインである請求項１記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記ＴＲＡＦ６結合ドメインが、配列番号１〜１８からなる群から選択される配列を含む請求項５記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記ポリプチドが配列番号１９および２０からなる群から選択される配列を含む請求項１記載のポリペプチド。
【請求項８】
請求項１記載のポリプチドを細胞に与える工程を含むＮＦ−κＢ活性化受容体リガンド（ＲＡＮＫＬ）誘導破骨細胞分化を阻害する方法であって、前記ポリペプチドによるＮＦ−κＢ活性化受容体およびＴＲＡＦ６の相互作用の阻害の結果、ＮＦ−κＢ活性化受容体リガンド誘導破骨細胞分化が阻害される方法。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、リポソーム、ウイルス、および遺伝子伝達ベクターからなる群から選択された手段により前記細胞に伝達される請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記破骨細胞分化が乳がん細胞によって誘導される請求項８記載の方法。
【請求項１１】
請求項１記載のポリペプチドを個人に対して与える工程を含む、このような治療が必要な個人における破骨細胞分化を阻害する方法であって、前記ポリペプチドによるＮＦ−κＢ活性化受容体およびＴＲＡＦ６の相互作用の阻害の結果、破骨細胞分化が阻害される方法。
【請求項１２】
前記個人が、代謝性骨障害、白血病、多発性骨髄腫、関節炎、または骨の転移性がんからなる群から選択される疾患を有するものである請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
請求項１記載のポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む製薬組成物。
【請求項１４】
ＴＮＦ受容体結合因子６（ＴＲＡＦ６）結合ドメインおよびリーダーシグナル配列を含むポリペプチドの機能を模倣する非ペプチドアナローグであって、前記ポリペプチドがＴＲＡＦ６によって媒介されるシグナリングを阻害するものである、非ペプチドアナローグ。
【請求項１５】
前記リーダーシグナル配列が、カポシ繊維芽細胞成長因子シグナル配列、ＨＩＶ−１  Ｔａｔ（４８−６０）、Ｄアミノ酸置換ＨＩＶ−１  Ｔａｔ（４８−６０）、アルギニン置換ＨＩＶ−１  Ｔａｔ（４８−６０）、ショウジョウバエ・アンテナペディア（４３−５８）、７個以上のアルギニンを含むウイルスＲＮＡ結合ペプチド、７個以上のアルギニンを含むＤＮＡ結合ペプチド、および６〜８個のアルギニンを含むポリアルギニンポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含む請求項１４記載の非ペプチドアナローグ。
【請求項１６】
前記ウイルスＲＮＡ結合ペプチドが、ＨＩＶ−１  Ｒｅｖ（３４−５０）、ＨＴＬＶ−ＩＩ  Ｒｅｖ（４−１６）、ブロモモザイクウイルスＧａｇ（７−２５）、およびフロックハウスウイルスコートタンパク質（３５−４９）からなる群から選択される請求項１５記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記ＤＮＡ結合ペプチドが、ヒトｃ−Ｆｏｓ（１３９−１６４）、ヒトｃ−Ｊｕｎ（２５２−２７９）、および酵母転写因子ＧＣＮ４（２３１−２５２）からなる群から選択される請求項１５記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記ＴＲＡＦ６結合ドメインが、ＣＤ４０、ＮＦ−κＢ活性化受容体、ＩＬ−１受容体結合キナーゼ１（ＩＲＡＫ１）、ＩＬ−１受容体結合キナーゼ２（ＩＲＡＫ２）、ＩＲＡＫ−Ｍ、およびＲＩＰ２からなる群から選択されるタンパク質からのＴＲＡＦ６結合ドメインである請求項１４記載の非ペプチドアナローグ。
【請求項１９】
前記ＴＲＡＦ６結合ドメインが、配列番号１〜１８からなる群から選択される配列を含む請求項１８記載の非ペプチドアナローグ。
【請求項２０】
前記ポリプチドが配列番号１９および２０からなる群から選択される配列を含む請求項１４記載の非ペプチドアナローグ。
【請求項２１】
請求項１４記載の非ペプチドアナローグを細胞に与える工程を含むＮＦ−κＢ活性化受容体リガンド誘導破骨細胞分化を阻害する方法であって、前記ポリペプチドによるＮＦ−κＢ活性化受容体およびＴＲＡＦ６の相互作用の阻害の結果、ＮＦ−κＢ活性化受容体リガンド誘導破骨細胞分化が阻害される方法。
【請求項２２】
前記破骨細胞分化が乳がん細胞によって誘導される請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
請求項１４記載の非ペプチドアナローグを個人に対して与える工程を含む、このような治療が必要な個人における破骨細胞分化を阻害する方法であって、前記ポリペプチドによるＮＦ−κＢ活性化受容体およびＴＲＡＦ６の相互作用の阻害の結果、破骨細胞分化が阻害される方法。
【請求項２４】
前記個人が、代謝性骨障害、白血病、多発性骨髄腫、関節炎、または骨の転移性がんからなる群から選択される疾患を有するものである請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
請求項１４記載の非ペプチドアナローグおよび薬学的に許容される担体を含む製薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的には、サイトカイン生物学および骨疾患の分野に関するものである。より詳しくは、本発明は、骨再吸収関連疾患のような障害の治療に用いられるＮＦ−κＢ活性化受容体（ＲＡＮＫ）のインヒビターを提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＴＮＦおよびＴＮＦ受容体スーパーファミリーの構成員は、免疫応答の阻害および調節に関して重要な役割を果たしている（１−３）。これらのファミリーの構成員は生物学的機能は多くが重なり合っているが、遺伝子ノックアウトの研究によりこれの構成員は独特な特徴を有していることが明らかになった。このような受容体／リガンド対の一つであるＮＦ−κＢ活性化受容体（ＲＡＮＫ）およびそのリガンド（ＲＡＮＫＬ／ＴＲＡＮＣＥ／ＯＤＦ／ＯＰＧＬ）は、骨再生および骨形成に重要な関わりを有している（４）。ノックアウト遺伝子の研究により、ＲＡＮＫＬはまたリンパ節組織形成およびリンパ球発生に機能していることが示された（５）。さらにＮＦ−κＢ活性化受容体およびＲＡＮＫＬは、免疫応答の期間中、Ｔ細胞および樹状細胞の間の相互関係に関わりを示す（６）。
【０００３】
その名前から示されるように、ＮＦ−κＢ活性化受容体は核因子−κＢ（ＮＦ−κＢ）（７−１２）、免疫において必須の役割を果たす非常に多くの遺伝子の発現を調節する転写因子、および炎症反応（１３）の活性を刺激する。ここ数年で明らかになったように、ＴＮＦ受容体ファミリーのいくつかの構成員は、転写因子ＮＦ−κＢおよびｃ−ＪｕｎのＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）の活性化に係るＴＲＡＦｓ（ＴＮＦ受容体結合因子類）として知られるアダプタータンパク質のファミリーと相互作用する（１４）。
【０００４】
ＴＮＦ受容体結合因子ファミリーは６つの区別されるタンパク質からなり、それぞれ、自己会合に重要で、受容体の相互作用に要求されるＣ末端相同ドメインを有している。ＴＲＡＦ１およびＴＲＡＦ４を除く、すべてのＴＮＦ受容体結合因子はＮ末端に、他の信号タンパク質との相互作用に利用されるものと思われる環および亜鉛フィンガーモチーフを含んでいる。ＴＮＦファミリーのリガンドおよび受容体の三量体構造と同様に、ＴＮＦ受容体１およびＣＤ４０に由来するペプチドとのＴＲＡＦ２の相互作用に関して報告されたように、ＴＲＡＦ２のＣ末端も三量体構造を作る（１５，１６）。ＴＮＦ受容体結合因子の分子の三量体構造は、それらを下流にあるアダプタータンパク質と結合させる事を可能にするようである。
【０００５】
ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ５、およびＴＲＡＦ６はＮＦ−κＢ活性化受容体（ＲＡＮＫ）と相互作用し、また、ＮＦ−κＢ活性化受容体はＮＦ−κＢおよびＪＮＫ経路の両方を活性化できることが示されてきた（７）。引き続いて、ＮＦ−κＢ活性化受容体に対するこれらのＴＮＦ受容体結合因子の相互作用のより詳細な分析が報告された（８）。ＴＲＡＦ２−およびＴＲＡＦ５−結合ドメインとは区別される新規なＴＲＡＦ６−結合モチーフがＲＡＮＫにおいて同定された。ＣＤ４０における相同ＴＲＡＦ６結合モチーフが、コンビナトリアルペプチドライブラリー的手法を用いて報告された（１７）。ＲＡＮＫにおけるＴＲＡＦ６結合ドメインはＮＦ−κＢの活性化に十分なものであり、ＴＲＡＦ２およびＴＲＡＦ５はＮＦ−κＢ活性化に必要ないことが示唆される。しかしながら、ＴＲＡＦ６−結合ドメインはＪＮＫも活性化することができるが、ＴＲＡＦ２−結合モチーフも、その程度は小さいもののＪＮＫを活性化させるのに十分なものである。さらに、ＮＩＫ（ＮＦ−κＢ誘導キナーゼ）は、ＮＦ−κＢ活性化受容体によるＮＦ−κＢの活性化に必要とされることも発見された。ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ５、およびＴＲＡＦ６に加え、ＴＲＡＦ１およびＴＲＡＦ３もまたＮＦ−κＢ活性化受容体のカルボキシ末端に会合することが示されてきた（９−１２）。
【０００６】
ＲＡＮＫシグナル導入におけるそれぞれのＴＲＡＦ分子が果たす役割は定義されないままである。ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ５、およびＴＲＡＦ６の優性ネガティブ突然変異体はＲＡＮＫによるＮＦ−κＢ活性化における役割を評価することに用いられてきた。すべての優性ネガティブＴＲＡＦｓは２９３細胞におけるＲＡＮＫの過剰発現により誘導されたＮＦ−κＢの活性化を異なったやり方で阻害することが明らかにされた（９，１２）。しかしながら、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ５、およびＴＲＡＦ６の優性ネガティブ突然変異体のすべての含有物は、２９３細胞におけるＲＡＮＫにより誘導されたＮＦ−κＢの活性化を完全には排除しない（１２）。ＲＡＮＫの刺激はまた、細胞生存に潜在的に関連する分子である、タンパク質キナーゼＢ／ＡＫＴおよびホスホイノシトール−３−キナーゼの活性化の原因であると思われるｃ−Ｓｒｃの補充および活性化することになる、ＴＲＡＦ６の補充の原因となった（１８）。
【０００７】
ＲＡＮＫＬ、ＲＡＮＫ、およびオステオプロテゲリンのノックアウトマウスモデルにおいて、これらの分子が破骨細胞形成に必須の役割を果たすことが示されてきた。これらの分子の生物学的重要性はオステオプロテゲリンの標的分裂による重い骨粗しょう症の誘導およびＲＡＮＫＬの標的分裂またはオステオプロテゲリンの過剰発現による大理石骨症の誘導により確認されてきた（５，１９，２０）。それにより、破骨細胞形成は骨髄の微小環境におけるオステオプロテゲリンに対するＲＡＮＫＬの相対比率がその原因となり、そのバランスの変化が多くの代謝性骨疾患の主要な要因と思われる。
【０００８】
ＲＡＮＫＬ−／−マウスと同様に、ＮＦ−κＢ活性化受容体の標的分裂もまた、大理石骨症表現型を誘導する（２１，２２）。ＲＡＮＫ−／−およびＲＡＮＫＬ−／−マウスは破骨細胞が無く、破骨細胞形成において、これらの分子が本質的に要求されることが示される。さらに、ＴＲＡＦ６（２３−２５）、ｃ−Ｓｒｃ（２６）、ｃ−Ｆｏｓ（２７）、またはＮＦ−κＢサブユニットｐ５０／ｐ５２（２８，２９）を欠くマウスもまた大理石骨症表現型を示す。これらの突然変異マウスは破骨細胞を有しているが、これらの細胞は明らかに骨再吸収を欠くものである。従って、ＲＡＮＫＬおよびＮＦ−κＢ活性化受容体は細胞質シグナリング分子と同様に破骨細胞形成に要求される。
【０００９】
ＮＦ−κＢ活性化受容体に結合するＴＲＡＦ分子のうち、ＴＲＡＦ６だけは、ＴＲＡＦ６欠損マウスにおいて示されたように、破骨細胞分化において必須であると思われる。従って、ＮＦ−κＢ活性化受容体およびＴＲＡＦ６の相互作用は、治療における干渉に対する独特な標的であるかもしれず、競合する細胞浸透ペプチドによるこの相互作用を分断する能力は、依然調査すべきものとして残されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
このように、従来の技術は、ＲＡＮＫＬシグナリングおよびＲＡＮＫＬによって誘導された破骨細胞分化を阻害するために、ＮＦ−κＢ活性化受容体およびＴＲＡＦ６の相互関係を分断する方法を欠いていた。このようなインヒビターは骨障害および骨再吸収の増加に関連したがんの治療に有効なものであろう。本発明は、この技術分野における長年の要求および需要を満たすものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の要約
ＴＲＡＦ６（ＴＮＦ受容体結合因子６）はＮＦ−κＢ活性化受容体（ＲＡＮＫ）シグナリングに対する重要なアダプタータンパク質である。本発明は、細胞膜を横切ることを可能にするペプチドリーダー配列を有する、または、有していない新規なＴＲＡＦ６おとり（ｄｅｃｏｙ）ペプチド（Ｔ６ＤＰ）を開示する。ここにおいて、ＴＲＡＦ６おとりペプチドは、リーダー配列が付着したときのみに、ＲＡＮＫＬシグナリングおよびＲＡＮＫＬ媒介破骨細胞分化に関連する初期の出来事を阻害することを示している証拠が開示されている。このデータは、ＮＦ−κＢ活性化受容体およびＴＲＡＦ６の間の相互作用の標的化分断が、代謝性骨障害、白血病、関節炎、および骨の転移性がんの治療に有効であることを示している。
【００１２】
本発明は、ＴＮＦ受容体結合因子６（ＴＲＡＦ６）が仲介するシグナリンングを阻害するポリペプチドであって、ＴＲＡＦ６結合ドメインおよびリーダーシグナル配列を含むポリペプチドを提供する。本発明はさらに、ここで開示されたポリペプチドを用いた、ＮＦ−κＢ活性化受容体リガンド（ＲＡＮＫＬ）誘導破骨細胞分化の阻害方法を提供するものである。
【００１３】
本発明の別の態様では、ここにおいて開示されたポリペプチドの機能を模倣する非ペプチドアナローグであって、ＴＲＡＦ６媒介シグナリングを阻害する非ペプチドアナローグが提供される。本発明はさらに、ここで開示されたポリペプチドの機能を模倣する非ペプチドアナローグを用いた、ＮＦ−κＢ活性化受容体リガンド（ＲＡＮＫＬ）誘導破骨細胞分化の阻害方法を示すものである。
【００１４】
本発明の別の、そしてさらなる態様、特徴および利点は、以下の、本発明の現在における好ましい実施態様の記載により明らかにされるであろう。これらの実施態様は開示の目的で与えられたものである。
【発明の効果】
【００１５】
ＮＦ−κＢ活性化受容体およびＴＲＡＦ６の間の相互作用の標的化分断が、代謝性骨障害、白血病、関節炎、および骨の転移性がんの治療に有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
ＮＦ−κＢ活性化受容体（ＲＡＮＫ）は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの最近発見された一員であり、主として、樹状細胞、破骨細胞前駆体、活性化ＢおよびＴ細胞、および破骨細胞で発現される。自身のリガンド（ＲＡＮＫＬ）に対して結合することにより、ＮＦ−κＢ活性化受容体は、シグナリング過程の活性化を担うアダプター分子の継続的漸増の原因となる。これらの経路は、活性化タンパク質キナーゼの活性化を導き、それは次に、細胞の機能を変化させ、遺伝子発現における変化を導く、転写因子を活性化することになる。
【００１７】
ＲＡＮＫＬ、ＲＡＮＫおよびＲＡＮＫＬに結合する分泌可溶性受容体であるオステオプロテゲリン（ＯＰＧ）のノックアウトマウスモデルで、これらの分子が破骨細胞形成（すなわち、骨リモデリング）に必須の役割を果たすことが示された。これらの分子の生物学的受容性は、これらの分子の生物学的重要性はオステオプロテゲリンの標的分裂による重い骨粗しょう症の誘導およびＲＡＮＫＬ、ＮＦ−κＢ活性化受容体の標的分裂またはオステオプロテゲリンのトランスジェニック発現による大理石骨症の誘導により確認された。これらの結果は、破骨細胞形成は骨髄の微小環境におけるオステオプロテゲリンに対するＮＦ−κＢ活性化受容体リガンドの相対比率のせいであり、そのバランスの変化が多くの代謝性骨疾患の主要な要因と思われる。それゆえ、ＲＡＮＫ／ＲＡＮＫＬ／オステオプロテゲリンは、破骨細胞の活性の増加による骨疾患およびがん誘導骨破壊における主要な役割を果たす。
【００１８】
骨粗しょう症に加え、最近の報告では、これらの分子の、間接リューマチ、骨の巨大細胞腫瘍、パゲット病（Paget's disease）および（ＮＦ−κＢ活性化受容体のエクソン１における突然変異による）遺伝性骨溶解における、潜在的役割を示唆している。Ｔ細胞リンパ増殖障害は、悪性Ｔ細胞クローンの製造に貢献するＮＦ−κＢ活性化受容体およびＲＡＮＫＬの制御不良によって確認されてきた。
【００１９】
乳がんおよび前立腺がんは、転移して、骨において、骨溶解疾患の原因となる、侵入および成長する能力を有していると認識されてきた。腫瘍が破骨細胞形成および骨破壊の原因となる、転移性腫瘍マウスモデルにおいて、体系的なオステオプロテゲリンの投与により、腫瘍媒介骨破壊を減少させ、骨がんに関連した苦痛を減少させた。従って、ＮＦ−κＢ活性化受容体のシグナリングの標的化された分断を行う薬剤の開発により、代謝性骨障害およびがんを治療する可能性を有する。
【００２０】
ＮＦ−κＢ活性化受容体の細胞質ドメインは、ＴＲＡＦファミリーの構成員、特に、ＴＲＡＦ１、２、３、５および６と相互作用する。ＮＦ−κＢ活性化受容体を刺激すると、転写因子ＡＰ１およびＮＦ−κＢの活性化を導く、ＩＫＫｓおよびＭＡＰＫファミリー（すなわち、ＪＮＫ、ｐ３８、ＥＲＫ）の構成員を活性化する。ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ５、およびＴＲＡＦ６と、ＮＦ−κＢ活性化受容体との間の相互作用が報告されてきており、そこでは、ＮＦ−κＢ活性化受容体がＮＦ−κＢおよびＪＮＫ経路の両方を活性化できることが示されている。続いて、ＮＦ−κＢ活性化受容体において、ＴＲＡＦ２およびＴＲＡＦ５結合ドメインとは区別される、新規なＴＲＡＦ６結合モチーフが同定された。
【００２１】
ＮＦ−κＢ活性化受容体におけるＴＲＡＦ６結合ドメインはＮＦ−κＢの活性化に十分なものであり、ＴＲＡＦ２およびＴＲＡＦ５はＮＦ−κＢ活性化に必要ないことが示唆される。ＴＲＡＦ６欠損マウスでは、破骨細胞形成が欠如するために大理石骨症が発生し、ＴＲＡＦ２またはＴＲＡＦ５欠損マウスでは大理石骨症が見られないことは、この発見を支持するものである。
【００２２】
ＴＲＡＦ６はＮＦ−κＢ活性化受容体シグナリングに対して重要なアダプタータンパク質と思われるので、本発明では、細胞膜を横切ることを可能にするペプチドリーダー配列を有する、または、有していない新規なＴＲＡＦ６おとりペプチド（Ｔ６ＤＰ）を開発した。ここにおいて、ＴＲＡＦ６おとりペプチドは、リーダー配列が付着したときのみに、ＲＡＮＫＬシグナリングおよびＲＡＮＫＬ媒介破骨細胞分化に関連する初期の出来事を阻害することを示している証拠が開示されている。このデータは、ＮＦ−κＢ活性化受容体およびＴＲＡＦ６の間の相互作用の標的化分断が、代謝性骨障害、白血病、関節炎、および骨の転移性がんの治療に有効であることを示す。
【００２３】
本発明は、ＴＮＦ受容体結合因子６（ＴＲＡＦ６）が仲介するシグナリンングを阻害するポリペプチドを提供する。これらのペプチドは、ＴＲＡＦ６結合ドメインおよびリーダーシグナル配列を含む。当業者は、ＴＲＡＦ６阻害を探索するために、数多くの手法を用いることができる。例えば、ＲＡＮＫまたはＴＲＡＦ６細胞質ドメイン由来のペプチドライブラリーのスクリーニング、あるいは、オーバーラッピングペプチドの合成の二つの手法が挙げられる。本発明の一実施態様では、ポリペプチドは、配列番号１９および２０からなる群から選択された配列を含む。ＴＲＡＦ６は、また、ＩＬ−１、ＬＰＳ、ＩＬ−１８およびＣＤ４０Ｌのような多くの分子によって誘発されたシグナリングを媒介するので、ここにおいて請求されたポリペプチドは、これらの他の分子によって誘発されたシグナリングと同様に、ＲＡＮＫＬ媒介シグナリングを阻害するであろう。
【００２４】
ここにおいて開示されたポリペプチドはＣＤ４０、ＮＦ−κＢ活性化受容体、ＩＬ−１受容体結合キナーゼ１（ＩＲＡＫ１）、ＩＬ−１受容体結合キナーゼ２（ＩＲＡＫ２）、由来のＴＲＡＦ６結合ドメイン、ＩＲＡＫ−ＭまたはＲＩＰ２に由来するＴＲＡＦ６結合ドメインを有することができる。好ましくは、ＴＲＡＦ６結合ドメインは配列番号１〜１８からなる群から選択された配列を含むものである。
【００２５】
ここにおいて開示されたポリペプチドのＴＲＡＦ６結合ドメインに付着したリーダーシグナル配列は、多くの異なるタンパク質由来のものであるかもしれない。代表的なリーダーシグナルポリペプチドには、カポシ繊維芽細胞成長因子シグナル配列、ＨＩＶ−１  Ｔａｔ（４８−６０）、Ｄアミノ酸置換ＨＩＶ−１  Ｔａｔ（４８−６０）、アルギニン置換ＨＩＶ−１  Ｔａｔ（４８−６０）、ショウジョウバエ・アンテナパエディア（Drosophila Antennapaedia）（４３−５８）、７個以上のアルギニンを含むウイルスＲＮＡ結合ペプチド、７個以上のアルギニンを含むＤＮＡ結合ペプチド、および６〜８個のアルギニンを含むポリアルギニンポリペプチドが含まれる。これらアルギニンリッチな配列が外因性タンパク質の細胞内への伝達に使用できることは、当該技術分野でよく知られている（３９）。例えば、フタキら（Futaki et al.）（３９）は、ＨＩＶ−１  Ｔａｔ（４８−６０）のトランスロケーション活性と非常に似た活性を有する、多くのアルギニンリッチペプチドを報告している。これらのアルギニンリッチなペプチドには、ＨＩＶ−１  Ｒｅｖ（３４−５０）、ＨＴＬＶ−ＩＩ  Ｒｅｖ（４−１６）、ブロモ（ｂｒｏｍｅ）モザイクウイルスＧａｇ（７−２５）、フロックハウス（ｆｌｏｃｋ  ｈｏｕｓｅ）ウイルスコートタンパク質（３５−４９）、ヒトｃ−Ｆｏｓ（１３９−１６４）、ヒトｃ−Ｊｕｎ（２５２−２７９）および酵母転写因子ＧＣＮ４（２３１−２５２）が含まれる。
【００２６】
本発明はさらに、ここで開示されたポリペプチドを用いた、ＮＦ−κＢ活性化受容体リガンド（ＲＡＮＫＬ）誘導破骨細胞分化の阻害方法であって、これらポリペプチドをによるＮＦ−κＢ活性化受容体およびＴＲＡＦ６の相互作用の阻害によりＲＡＮＫＬ誘導破骨細胞分化を阻害する阻害方法を提供するものである。この方法は、乳がん細胞によって誘導された破骨細胞分化の阻害に利用することができる。ポリペプチドを、リポソーム、ウイルスまたは他の遺伝子伝達ベクターのような、当該技術分野でよく知られた多くの方法により、細胞に与えることができる。例えば、プロベクチン（ＰｒｏＶｅｃｔｉｎＴＭ））タンパク質伝達試薬は、ここで開示されたポリペプチドまたは生物活性分子を非常に多くの種類の型の細胞に伝達することを可能にする、独特な脂質を基本とした製剤である。
【００２７】
本発明の別の態様では、ここで開示されたポリペプチドを用いた、個人における破骨細胞分化の阻害方法が提供される。通常、前記個人は代謝性骨障害、白血病、関節炎、多発性骨髄腫、または骨の転移性がんを含む疾病を有している。
【００２８】
本発明は、また、薬学的に許容される担体と、ここで開示されたポリペプチドインヒビターを含む製薬組成物を提供する。「薬学的に許容される担体」の用語は、対象者に投与されたとき、アレルギーまたは同様の不適当な反応を起こすことが無い、分子本体および組成物を意味する。活性成分としてタンパク質を含む水性組成物の調製方法は、当該技術分野において公知である。
【００２９】
当業者は、過度の実験を行うことなしに、本発明の活性成分の適切な投与量および投与経路を容易に決定することができるであろう。インビボでの治療に使用する場合、本発明の活性組成物は、患者または動物に、治療上有効な量、すなわち、RANKL媒介破骨細胞分化を阻害する量を投与する。レミントン製薬科学（Remington's Pharmaceutical Science）１７版(1990) マーク出版社（Mark Publishing Co.）, イーストン（Easton）, ペン（Penn.）;並びに、グットマンおよびギルマン（Goodman and Gilman）著: 治療の製薬学的基礎（The Pharmacological Basis of Therapeutics）、８版(1990) ペルガモン出版（Pergamon Press.）参照。
【００３０】
本発明は、さらに、ここにおいて開示されたポリペプチドの機能を模倣する非ペプチドアナローグであって、ＴＲＡＦ６媒介シグナリングを阻害する非ペプチドアナローグを提供する。ここにおいて開示された阻害ポリペプチドを模倣する低分子量で、非ペプチド分子は、自己の本来要求される治療剤としての働きと同様に、生理学的および病理学的経路のモデルにおけるＴＲＡＦ６媒介シグナリングの役割を確定するための強力な手段として働くことができる。多くの文献に、高性能分析および高速修飾を受け入れる低分子量で、非ペプチド分子を設計するための理論と戦略が記載されている（４０−４２）。本発明はさらに、これらの非ペプチドアナローグを用いた、ＮＦ−κＢ活性化受容体リガンド（ＲＡＮＫＬ）誘導破骨細胞分化の阻害方法であって、前記非ペプチドアナローグによりＮＦ−κＢ活性化受容体およびＴＲＡＦ６の相互関係を阻害することで、ＲＡＮＫＬ誘導破骨細胞分化の阻害をする方法を提供するものである。この方法は、乳がん細胞により誘導された誘導破骨細胞分化の阻害に使用することができる。
【００３１】
以下の実施例は本発明の様々な態様を示すために与えられたもので、いかなるやり方においても本発明を制限することを意味するものではない。
【実施例１】
【００３２】
試薬、細胞系および抗体
ヒト胎児腎臓２９３細胞系およびマウスマクロファージ細胞系ＲＡＷ２６４．７はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Rockville, MD）から入手した。２９３細胞は１０％ウシ胎仔血清および抗生物質で補強したＭＥＭで培養した。ＲＡＷ２６４．７細胞は１０％ウシ胎仔血清および抗生物質で補強したＤＭＥＭ−Ｆ１２において培養した。リン酸ＥＲＫ、ｐ３８、およびＪＮＫに対するモノクローナル抗体はNew England Biolabsから購入した。西洋ワサビパーオキシターゼ複合ヤギ抗ウサギＩｇＧはBioRad Laboratories (Hercules, CA) から購入した。抗ＪＮＫ１および抗ＩκＢはSanta Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) から購入した。西洋ワサビパーオキシダーゼ複合ヤギ抗マウスＩｇＧはTransduction Laboratories (Lexington, KY) から購入した。タンパク質Ａ／ＧセファローズビーズはPierce (Rockford, IL)から購入し、抗ＦＬＡＧはSigma (St. Louis, MO)から購入した。酒石酸塩抵抗酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）陽性破骨細胞の染色は、実質的に（３０）に記載されたやり方、またはシグマから入手した酸性ホスファターゼキットを使用することにより行った。
【実施例２】
【００３３】
発現プラスミド
マウスＦＬＡＧ付着ＴＲＡＦ５およびＴＲＡＦ６をコードする発現プラスミド（３１）はナカノ（H. Nakano）(順天堂大学、東京、日本)から提供され、ＦＬＡＧ付着ＴＲＡＦ２をコードする発現プラスミドはニ（J. Ni）(Human Genome Sciences, Inc.)から提供された。発現ベクター、並びに、ＧＳＴ、ＧＳＴ−ＮＦ−κＢ活性化受容体の細胞質ドメイン、およびＧＳＴ−Ｊｕｎ（１−７９）に対するＧＳＴ融合タンパク質の精製については、以前記載してきた（７，８）。完全長マウスＲＡＮＫＬ（また、ＴＮＦ関連活性化誘導サイトカイン（ＴＲＡＮＣＥ）としても知られている）の発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１−ＴＲＡＮＣＥ）はチョイ（Y. Choi）(Rockefeller University, New York, NY)から提供された。
【００３４】
ＲＡＮＫＬのためのバクテリア発現ベクターを生成するために、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩ部位をそれぞれ有する特異的５´および３´プライマーを、ｐｃＤＮＡ３−ＴＲＡＮＣＥ鋳型からＲＡＮＫＬの残基１５７−３１６をコードするＤＮＡを増幅するために用いた。ＰＣＲ産物はＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩで消化され、フレームに連結されＨＡタグ（Ｎ末端）およびヒスチジンタグ（Ｃ末端）、発現ベクターｐＨＢ６(Boerhinger Mannheim)に挿入された。可溶性ＲＡＮＫＬが発現し、Ｎｉアガロースを用いて精製した。
【実施例３】
【００３５】
一過性トランスフェクションおよびウエスタンブロット法
２９３細胞は、６ウェルプレートに０．６  ｘ  １０６細胞／ウェルで入れられ、次の日に、（８）に記載されたようにトランスフェクトされた。プラスミドＤＮＡの全量は、空のｐＣＭＶＦＬＡＧＩベクターを加えることにより、一定に保たれた。細胞および調節された上清は、トランスフェクションの２４〜３６時間後に収穫された。溶解物は（８）の記載に従って調製した。ウエスタンブロット分析のために、全細胞溶解物（１５〜３０μｇ）またはＧＳＴ親和性沈降により得られたタンパク質を８．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜に電気泳動的転写を行い、示された抗体とインキュベートした。膜はその後、促進化学発光（ＥＣＬ）システム(Amersham, Chicago, IL)を使用して現像した。
【実施例４】
【００３６】
インビトロ破骨細胞分化
一次骨髄単球（ＢＭ）またはＲＡＷ２６４．７細胞は、４８ウェル皿において、１  ｘ  １０５細胞／ウェルまたは２  ｘ  １０３細胞／ウェルの密度で培養した。それから、培養の開始時に示された要素により処理され、３日目に培地を交換した。１ウェルに存在する多核（＞３核）で、ＴＲＡＰ陽性細胞の総数を、７〜１０日目の間（ＢＭ）、または、５日目（ＲＡＷ２６４．７）に計測することで、破骨細胞形成を評価した（３０）。
【実施例５】
【００３７】
ＧＳＴ−ＲＡＮＫ融合タンパク質親和性結合アッセイ
２０μｌのグルタチオンアガロースビーズに接着された、等量のＧＳＴまたはＧＳＴ−ＲＡＮＫ細胞質ドメイン（ＧＳＴ−ＲＡＮＫｃｄ）融合タンパク質は、結合バッファー（２０ｍＭ  ＴＲＩＳ、ｐＨ８、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．１％  ＮＰ−４０）中で、エピトープ付着ＴＲＡＦタンパク質が発現するようにプログラムされた２９３細胞の溶解物（５０μｇ）および示されたペプチドと混合され、４℃で１時間、回転させられた。ビーズは遠心分離により収集され、結合バッファーで３回洗浄し、その後、低塩バファー（２０ｍＭ  ＴＲＩＳ、ｐＨ８、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および１ｍＭ  ＤＴＴ）で１回洗浄した。結合タンパク質はＳＤＳ添加サンプルバッファーにより溶出し、煮沸した。溶出タンパク質は、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥされ、抗ＦＬＡＧ抗体によるウエスタンブロット分析が行われた。
【実施例６】
【００３８】
免疫複合体キナーゼアッセイ
ＲＡＮＫＬで刺激されたＲＡＷ細胞から溶解物が、図面に示された説明に従って調製された。約３０μｇを、その後、示された抗体およびタンパク質Ａ／Ｇセファローズビーズとともに、１時間の免疫沈降のために用いた。ビーズは遠心分離により収集され、溶解バッファーで３回洗浄し、その後、低塩バファーで１回洗浄した。ＪＮＫ活性は、先の記載（８）に従って、基質として外因性ＧＳＴ−Ｊｕｎ（１−７９）を用いて分析された。キナーゼ活性は、ホスホイメージャー（PhosphoImager）およびイメージクアントソフトウエア（Imagequant Software）(Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)を用いて定量された。
【実施例７】
【００３９】
電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）
（３４）の記載に本質的に従って、トランスフェクト細胞から核抽出物を調製した。等量の核タンパク質を、（３４）の記載に従い、ＨＩＶ−ＬＴＲ由来の３２Ｐ標識ＮＦ−κＢオリゴヌクレオチドとのＥＭＳＡ反応に用いた。ＮＦ−κＢ活性はホスホイメージャーおよびイメージクアントソフトウエアを用いて定量された。
【実施例８】
【００４０】
ＴＲＡＦ６結合ドメイン
ＴＲＡＦ６のみに結合し、ＴＲＡＦ２またはＴＲＡＦ５には結合しない、ＲＡＮＫにおける新規なＴＲＡＦ６結合ドメインは以前に確認されていた（８）。２９３細胞でトランスフェクトされた場合、ＮＦ−κＢ活性化受容体のこの領域は、ＮＦ−κＢを活性化するには十分なものであった（８）。ヒトおよびマウスのＣＤ４０およびＲＡＮＫにおけるＴＲＡＦ６結合部位の構造を基礎として配列を整列させることにより、ＴＲＡＦ６結合モチーフＰｘＥｘｘ（Ａｒ／Ａｃ）（Ａｒは芳香族残基およびＡｃは酸性残基を示す）（図１Ａ）が明らかになった。ＲＡＮＫ配列の注意深い調査の結果、３つの潜在的ＴＲＡＦ６結合部位が存在することが示された（図１Ａ）。
【００４１】
ＴＲＡＦ６は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーおよびインターロイキン１受容体（ＩＬ−ｌＲ）／Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）スーパーファミリーの両方の情報伝達に参加する唯一のＴＲＡＦファミリー構成員である。ＩＬ−１Ｒ／ＴＬＲスーパーファミリーに対する最も良く特徴付けられたＴＲＡＦ６シグナリング経路は、ＴＲＡＦ６の上流のアダプターキナーゼであるＩＲＡＫを含むものである。受容体を刺激すると、ＩＲＡＫは重合し、ＴＲＡＦ６と相互作用する（４３）。完全長ＩＲＡＫは、３箇所のＴＲＡＦ６結合部位を含んでいる（図１Ａ）。２つのＩＲＡＫ相同体である、ＩＲＡＫ−２およびＩＲＡＫ−Ｍは、それぞれ、２箇所および１箇所の潜在ＴＲＡＦ６結合部位を含んでいる（図１Ａ）。ここでは、ＩＬ−１シグナリングにおけるＩＲＡＫ−２およびＩＲＡＫ−Ｍにかかわる役割、ならびに、ＴＬＲ４のシグナリングにおけるＩＲＡＫ−２にかかわる役割は維持されている。さらに、ＮＦ−κＢを活性化し、細胞死を誘発することができるキナーゼＲＩＰ２は、また、推定ＴＲＡＦ６結合部位を含むことが発見された（図１Ａ）。これらの様々な分子にＴＲＡＦ６結合部位が存在することは、ＴＲＡＦ６が多重シグナリングカスケードを成立させる役割を果たしている可能性を示唆している。
【００４２】
ペプチドまたはタンパク質の細胞膜を横断する伝達は、膜を自由に通過できる分子にペプチドを共有結合させることで、達成することができる（３５）。例えば、カポシ繊維芽細胞成長因子シグナル配列の疎水性ドメインは、膜を交差し位置を変更できるように、ＮＦ−κＢのｐ５０サブユニットの核局在シグナルに付着させられる（３６）。本発明では、この疎水性配列は、マウスＲＡＮＫ由来のペプチド、すなわち、公知のＴＲＡＦ６結合ドメインを含むＬ−Ｔ６ＤＰ−１および同様のモチーフを含むＬ−Ｔ６ＤＰ−２に結合させられる（図１Ｂ）。さらに、リーダー配列を除いて合成されたこれらのペプチドは両方とも、細胞膜を横断することができなかった（図１Ｂ）。
【実施例９】
【００４３】
ＲＡＷ２６４．７細胞におけるＴＲＡＦ６おとりペプチドによるＲＡＮＫＬ媒介破骨細胞分化の阻害
マウスマクロファージ細胞系ＲＡＷ２６４．７は、細胞表面にＮＦ−κＢ活性化受容体を発現し、ＮＦ−κＢ活性化受容体リガンドで刺激した場合、４〜５日後に、多核の酒石酸塩抵抗リン酸（ＴＲＡＰ）陽性破骨細胞に分化する（図２Ａ）。Ｌ−Ｔ６ＤＰ−１がＲＡＮＫＬ媒介破骨細胞分化を阻害することができるかを決定するために、ＲＡＷ２６４．７細胞を、徐々に濃度を増加させたＬ−Ｔ６ＤＰ−１またはＴ６ＤＰ−１のいずれか、および、３０ｎｇ／ｍｌのＲＡＮＫＬと、４日間、共存培養した。
【００４４】
図２Ｂに示されるように、リーダー配列を欠いたＴＲＡＦ６おとりペプチドはＲＡＮＫＬ媒介破骨細胞分化を停止できなかった。しかしながら、Ｌ−Ｔ６ＤＰ−１による処理は破骨細胞分化の量依存性阻害の原因となった。一方、１００μＭのＬ−Ｔ６ＤＰ−１での処理の後、細胞はＴＲＡＰ陽性であったが、多核破骨細胞は観察されなかった（図２Ｂ）。さらに、Ｌ−Ｔ６ＤＰ−１またはＬ−Ｔ６ＤＰ−２のいずれかの存在下で、ＲＡＷ２６４．７細胞をＲＡＮＫで処理すると、ＴＲＡＰ陽性破骨細胞は量に依存して減少したが、Ｌ−Ｔ６ＤＰ−１による処理は、Ｌ−Ｔ６ＤＰ−２よる処理よりも非常に効果的であった（図２Ｃ）。
【実施例１０】
【００４５】
骨髄由来マウス単球におけるＴＲＡＦ６おとりペプチドによるＲＡＮＫＬ媒介破骨細胞分化の阻害
ＲＡＷ２６４．７細胞系で得られた結果をさらに補強するために、１次マウス由来単球におけるＲＡＮＫＬ媒介破骨細胞分化阻害に対するこれらのペプチドの能力を検査した。多核、ＴＲＡＰ陽性破骨細胞を染色することで、骨髄由来単球をＲＡＮＫＬおよびＭ−ＣＳＦで共刺激すると、７〜１０日後に破骨細胞分化が起こるものと決定された（３０）。ＲＡＷ２６４．７細胞での結果と同様に、Ｌ−Ｔ６ＤＰ−１およびＬ−Ｔ６ＤＰ−２の両方がＴＲＡＰ陽性破骨細胞の発生を、量依存的に阻害し、その効果は、Ｌ−Ｔ６ＤＰ−１のほうが高かった（図３）。リーダー配列を欠いたＴＲＡＦおとりペプチドは破骨細胞分化を阻害することができず（図３）、このペプチドは細胞に対して毒性がないことが示唆される。３０μＭのＬ−Ｔ６ＤＰ−１で処理された後、細胞はＴＲＡＰ陽性となるが、多核化破骨細胞は１００μＭのＬ−Ｔ６ＤＰ−１では観察されず、破骨細胞は観察されなかった（図３Ｂ）。これらの結果を合わせるとＴＲＡＦ６とＲＡＮＫの相互作用は、ＲＡＮＫＬ媒介破骨細胞分化に必須のものであることが示される。
【実施例１１】
【００４６】
ＲＡＷ２６４．７細胞におけるＴＲＡＦ６おとりペプチドによるＲＡＮＫＬ媒介ＮＦ−κＢ活性阻害
１個のＴＲＡＦ６結合ドメインを有するＮＦ−κＢ活性化受容体の突然変異体はＮＦ−κＢを活性化するのに十分であり（８）、優性ネガティブＴＲＡＦ６は、２９３細胞においてＲＡＮＫ媒介ＮＦ−κＢ活性化を阻害する（９）。ＲＡＮＫＬ誘導ＮＦ−κＢ活性化に対するＴＲＡＦ６結合ペプチドの効果を調査するために、ＲＡＮＫＬで刺激したときにＮＦ−κＢを活性化するＲＡＷ２６４．７細胞においてＮＦ−κＢ活性化を調査した（３７）。ＲＡＮＫＬ刺激ＲＡＷ２６４．７細胞は、ゲル移動度シフトアッセイで示されるように、ＮＦ−κＢを活性化する（図４Ａ）。ＮＦ−κＢ活性化は、Ｌ−Ｔ６ＤＰ−１による前処理のみで量依存的に抑制される（図４Ａ）。ＮＦ−κＢの活性化および抑制を同時に起こさせるＩκＢαの水準は、図４Ｂに示されるとおりである。これらのデータは、Ｌ−Ｔ６ＤＰ−１が、ＲＡＷ２６４．７細胞において特異的にＲＡＮＫＬ媒介ＮＦ−κＢ活性化を阻害することを示す。
【実施例１２】
【００４７】
ＲＡＮＫ細胞質ドメインへのＴＲＡＦ６結合を特異的に阻害するＴＲＡＦ６おとりペプチド
ＲＡＮＫの細胞質ドメインは、ＴＲＡＦ１、２、３、５および６を含む多くのＴＲＡＦ分子と相互作用する（７−９、１１、１２）。ＴＲＡＦ１、２、３および５はＮＦ−κＢ活性化受容体のＣ末端テールと相互作用するが、ＴＲＡＦ６はＮＦ−κＢ活性化受容体の細胞質ドメインの膜近位領域と相互作用する。ここで開示されたＴＲＡＦ６結合ペプチドが、ＴＲＡＦ６のＲＡＮＫとの相互作用を阻害することを確認するために、競合ＧＳＴプルダウンアッセイを行った。
【００４８】
ＦＬＡＧ結合ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ５またはＴＲＡＦ６を含む細胞抽出物を、Ｌ−Ｔ６ＤＰ−１またはＬ−Ｔ６ＤＰ−２のいずれかの存在下、および存在しない状態でＧＳＴ−ＲＡＮＫ細胞質ドメイン融合タンパク質と混合した。これらのペプチドがＴＲＡＦ分子と競合する場合は、ウエスタンブロットにおいてＦＬＡＧ結合タンパク質はほとんど観察されない。図４に示されるように、Ｌ−Ｔ６ＤＰ−１およびＬ−Ｔ６ＤＰ−２のいずれもが、ＴＲＡＦ２およびＴＲＡＦ５がＲＡＮＫの細胞質ドメインに結合することを阻害しない（図４Ｃ）。Ｌ−Ｔ６ＤＰ−１のみが、ＴＲＡＦ６とＲＡＮＫの細胞質ドメインの相互作用を阻害する（図４Ｃ）。これらのデータは、リーダー配列はＮＦ−κＢ活性化受容体とＴＲＡＦｓの相互関係に干渉せず、Ｌ−Ｔ６ＤＰ−１はＴＲＡＦ６とＲＡＮＫの相互関係を特異的に阻害することを示している。
【実施例１３】
【００４９】
ＲＡＷ２６４．７細胞におけるＲＡＮＫＬによるＪＮＫ、ＥＲＫおよびｐ３８キナーゼの活性化に対するＴＲＡＦ６おとりペプチドの特異的な阻害
ＮＦ−κＢ活性化受容体の刺激は、ＪＮＫ、ＥＲＫおよびｐ３８キナーゼを含むＭＡＰＫファミリーの構成員を活性化する。ペプチド結合ＴＲＡＦ６による、ＮＦ−κＢ活性化受容体リガンド誘導ＪＮＫ、ＥＲＫおよびｐ３８キナーゼの活性化に対する阻害能力をＲＡＷ２６４．７細胞において調査した。インビトロＪＮＫキナーゼアッセイの結果は、ＪＮＫはＲＡＮＫＬによって活性化され、Ｌ−Ｔ６ＤＰ−１ペプチドによる処理だけがＲＡＮＫＬ媒介ＪＮＫ活性化を阻害することができることを示した（図５Ａ）。ＪＮＫの結果と同様に、Ｌ−Ｔ６ＤＰ−１だけが、ＲＡＷ２６４．７細胞においてＮＦ−κＢ活性化受容体リガンドにより誘導されるＥＲＫ（図５Ｂ）およびｐ３８キナーゼ（図５Ｃ）の活性化を阻止することができた。前記の結果を考慮すると、本発明は、Ｌ−Ｔ６ＤＰ−１がＮＦ−κＢリガンド媒介破骨細胞分化、並びに、ＮＦ−κＢ、ＪＮＫ、ＥＲＫおよびｐ３８キナーゼ活性化を含むＮＦ−κＢ活性化受容体リガンド開始初期シグナリングを抑制できることを示している。
【実施例１４】
【００５０】
乳がん細胞による破骨細胞形成の誘導、および、ＴＲＡＦ６おとりペプチドによる阻害
乳がんは、アメリカ合衆国における女性の最も一般的な悪性腫瘍であり、女性のがん死亡の２番目に多い原因である。乳がんを患った女性は、骨転移の危険性を有する。乳がんを患った患者の５から１０％は、初期の骨の転移性疾患になる。転移性乳がん由来の骨溶解性骨疾患を有する患者は、病理学的骨折、骨の痛み、索状組織圧縮およびハイパーカルセミアの危険性が大きい。骨転移の現在の標準的な治療方法は、骨に起こる進行を遅らせるが、完全には防ぐことができないビスホスホネート治療である。さらに、全ての患者にこの治療の効果があるわけではない。より効果的な治療方法が望まれており、この病気のさらなる生物学的および分子的な詳細な分析が必要とされる。実際に、近年、乳がん細胞を注射されたヌードマウスモデルにおいて、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）が骨溶解を阻害し、腫瘍の負担を減少させることが示された。
【００５１】
乳がん細胞の破骨細胞形成を誘発する能力、および、乳がん細胞におけるＮＦ−κＢ活性化受容体／ＮＦ−κＢ活性化受容体リガンド／オステオプロテゲリンは十分に定義されていない。乳がん細胞系の破骨細胞分化および機能に対して影響を与える能力を示した報告はほとんどない。しかしながら、このプロセスにおけるＮＦ−κＢ活性化受容体リガンドの直接的関与を記載した証拠は無い。以下に示されるように、乳がん細胞が骨芽細胞／ストローマ細胞の不在の状態で、破骨細胞分化および機能を直接誘発するという仮説を支持する証拠が存在する。骨微小環境における乳がん細胞のＮＦ−κＢ活性化受容体リガンド、および、ここにおいて記載された破骨細胞形成の新規なインヒビターの生物学的および分子的役割を理解することによって、骨転移を伴う乳がん患者を治療することができる新規な治療的手法または複合治療を開発することができる。
【００５２】
本発明の実施例で、ＲＡＷ細胞と、ＮＦ−κＢ活性化受容体リガンドを発現し、破骨細胞分化の要因となることが示されている骨芽細胞様細胞（骨肉腫ＭＧ−６３）との共存培養アッセイシステムが開発された。多量のＭＧ−６３細胞が、ＲＡＷ細胞を破骨細胞に分化させた。これらの観察は、破骨細胞の形成に要求されるＭＧ−６３細胞に対する多量のＲＡＷ細胞の間の直接的逆位関係を示している。ＭＧ−６３（データは示さず）または乳がん細胞系（すなわち、Ｔ４７ＤおよびＭＤＡ−ＭＢ−４６８）とＲＡＷ細胞を共存培養した結果、ＲＡＷ細胞をＮＦ−κＢ活性化受容体リガンドで刺激した時と同様に、これらの乳がん細胞は実際に、ＲＡＷ細胞を４日後にＴＲＡＰ＋の多核化破骨細胞に形成できることが示された（図６Ａ）。さらに、組織培養において成長した乳がん細胞系を、膜によってＲＡＷ細胞から分離された箇所に挿入したときもなお、破骨細胞が形成され、このことから、破骨細胞の分化には直接的な細胞対細胞の接触は必要とされないことが示唆される（データは示さず）。合成骨スライド上で成長させた場合、共存培養アッセイ由来の破骨細胞は骨再吸収の原因となることができた（図６Ｂ）。
【００５３】
これらの共存培養アッセイにおいて、Ｌ−Ｔ６ＤＰ−１を添加した場合、乳がん細胞によるＲＡＷ細胞を破骨細胞に分化させる能力は無くなったが、一方、Ｔ６ＤＰ−１は何の影響も与えなかった（図６Ａ）。正常胸部上皮細胞ＭＣＦ−１０ＡはＲＡＷの破骨細胞分化を誘導できなかった。しかしながら、外因性のＮＦ−κＢ活性化受容体リガンドをこれら共存培養物に添加した場合には破骨細胞が形成された（図６Ｃ）。まとめると、これらのデータは、正常胸部上皮細胞ではなく、乳がん細胞が骨芽細胞／ストローマ細胞の不在の状態で、破骨細胞分化を直接誘発することができ、Ｌ−Ｔ６ＤＰ−１がこのプロセスを阻害することを示す。
【実施例１５】
【００５４】
ＲＡＮＫおよびＴＲＡＦ６の相互作用を阻害する非ペプチドアナローグ発見のための戦略
以前に記載された方法(J. Biol. Chem., 276: 12235-12240,2001)と同様のＥＬＩＳＡを基本とする方法がRANKおよびTRAF6の相互作用を阻害する小さな分子を発見するために用いることができる。簡単に説明すると、Ｔ６ＤＰを含むペプチドをビオチニル化し、ＴＲＩＳ緩衝塩溶液（５０ｍＭ  ＴＲＩＳ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣＩ）に溶解し、ニュウートリアビシン（NeutrAvidin）でコートした９６ウェルマイクロティッタープレートのウェルに入れた。プレートは４℃で一晩振とうさせ、ＴＢＳ−ＢＴ（ＴＢＳ含有０．１％ウシ胎仔血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．１％トゥーイン（Ｔｗｅｅｎ）２０）に続いてＴＢＳですすいだ。ライブラリーからの検査小分子を含む溶液が、その後ウェルに加えられた。６個のヒスチジン付着ＴＲＡＦ６（３０９−５２２）がその後各ウェルに加えられた。プレートを室温で１時間インキュベートし、その後ＴＢＳ−ＢＴで３回洗浄した。ＴＲＡＦ６のＣ末端に対する抗体がその後ウェルに加え、プレートを室温で１時間インキュベートし、その後ＴＢＳ−ＢＴで３回洗浄する。ヤギ抗マウスアルカリ性ホスファターゼからなる第二抗体をその後各ウェルに加えられ、プレートを室温で１時間インキュベートし、その後ＴＢＳ−ＢＴで３回洗浄した。プレートは以前記載されたように(Darnay et al., J. Biol. Chem. 274: 77247731, 1999)、蛍光プレートリーダーを使用し、アルカリ性ホスファターゼ活性を検査した。
【００５５】
本発明においては、以下の参考文献を引用した。
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【００５６】
本明細書に記載されているいかなる特許または文献も本発明が属する技術分野の通常の知識を有する技術者の水準を示すものである。さらに、これらの特許および文献は、個々の文献が特別にそして個別に参照文献として取り入れて示されるのと同様の程度で、ここに参照文献として取り入れられる。
【００５７】
当業者は本発明に本来備わっている対象、目的および利点だけでなく、本発明をその対象、目的および利点を実現するために、容易に十分応用することを認識できるであろう。ここで記載された方法、手順、処理、分子および特異的化合物とともに本発明の実施例は、好ましい実施態様の代表例を示し、例示するものであって、本発明の範囲を制限する意図のものではない。当業者に対して発生する、ここにおける変化および他の用途は、特許請求の範囲で定義される本発明の精神の範囲内に含まれる。
【００５８】
上記した本発明の特徴、利点及び対象、明らかになる他のものを含めた事項は、実施され、詳細に理解できるように、上記発明について、添付の図面に示されているある実施態様を参照することにより、より詳細に記載している。これらの図面は明細書の一部を形成する。しかしながら、添付の図面は本発明の好ましい実施態様を記載したものであり、したがって発明の範囲を制限するものでないことを特記する。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】ＲＡＮＫにおける新規なＴＲＡＦ６結合ドメインを示す図である。
図１ＡはＴＲＡＦ６結合ドメインのコンセンサス配列を示している。ＴＲＡＦ６と特異的に相互作用するＣＤ４０のアミノ酸配列内の領域（残基２３０〜２４５）（３８）をＲＡＮＫ、ＩＲＡＫ１、およびＩＲＡＫ２の配置決定のための鋳型として使用した。同一の残基は太字で示してある。コンセンサスモチーフが最後に記載されている。
図１Ｂは、本発明で使用したペプチドを示している。（下線を引いた）カポシ繊維芽細胞成長因子信号配列の疎水性ドメイン（３６）は、マウスＮＦ−κＢ活性化受容体由来の二つの潜在的ＴＲＡＦ６結合ドメインに付着させられた。さらに、リーダー配列を欠いた二つのペプチドが合成された。
【図２】図２は、ＲＡＷ２６４．７細胞において、Ｌ−Ｔ６Ｂｐ１がＲＡＮＫＬ媒介破骨細胞分化を阻害することを示す図である。
図２Ａは、ＲＡＮＫＬ誘導ＴＲＡＰ陽性媒介破骨細胞を示す。ＲＡＷ２６４．７細胞は１２ウェルプレートに入れられ、ＲＡＮＫＬ（３０ｎｇ／ｍｌ）で４日間刺激された。細胞は、本質的には上記したようにして、ＴＲＡＰに対して染色された。写真は１０倍の対物レンズを使用して撮影した。
図２Ｂは、Ｌ−Ｔ６ＤＰ−１が破骨細胞分化を阻害することを示す。ＲＡＷ細胞は図２Ａにおいて記載されたようにプレートに入れられ、１、３０、または１００μＭのペプチドの存在下で、ＲＡＮＫＬで処理された。４日目に、図２Ａと同様に染色し、評価を行った。
図２Ｃは、Ｌ−Ｔ６ＤＰ−１がＲＡＮＫＬにより誘導されたＴＲＡＰ陽性媒介破骨細胞の総数を抑制することを示す。ＲＡＷ２６４．７細胞は４８ウェルプレートに、３通りに入れられ、段階的に増加した量の示されたペプチドの存在下で、ＲＡＮＫＬで処理された。４〜５日後、以下に示すように、ＴＲＡＰに対して染色され、破骨細胞の総数が計測された。
【図３】リーダーＴＲＡＦ６結合ペプチドが、ＲＡＮＫＬおよびＭ−ＣＳＦによる正常マウス由来破骨細胞分化を阻害することを示す図である。
図３Ａは、マウス由来単球が４８ウェルプレートに、３通りに入れられ、示されたペプチドの不在（０）または存在下で、マウスＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＲＡＮＫＬ（３０ｎｇ／ｍｌ）で共刺激されたことを示す。６〜７日後、細胞は固定され、ＴＲＡＰに対して染色された。多核の、ＴＲＡＰ陽性破骨細胞の数を計測した。
図３Ｂは、ＬＴ６ＤＰ−１がマウス由来単球の破骨細胞分化を阻害することを示す図である。マウス由来単球は、４８ウェルプレートに入れられ、図３Ａと同様に示されたペプチドの不在（左側）または存在下で、マウスＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＲＡＮＫＬ（３０ｎｇ／ｍｌ）で共刺激された。６〜７日後、細胞は固定され、ＴＲＡＰに対して染色された。それぞれのウェルの代表的な視野が１０倍で撮影された。
【図４】Ｌ−Ｔ６ＤＰ−１が、ＲＡＮＫＬ誘導ＮＦ−κＢ活性化およびＴＲＡＦ６結合を特異的に阻害することを示す図である。
図４Ａは、Ｌ−Ｔ６Ｂｐ−１によるＲＡＮＫＬ媒介ＮＦ−κＢ活性化の阻害を示す。ＲＡＷ２６４．７細胞は、６ウェルプレートに入れられ、示されたペプチドで５時間処理され、その後、ＲＡＮＫＬ（１０ｎＭ）で１５分間処理された。核および細胞質抽出物が調製され、上記したようにして、８μｇの核抽出物を用いて、ゲル移動シフトアッセイを行った。
図４Ｂは、Ｌ−Ｔ６ＤＰ−１によるＩκＢ分解の阻害を示す図である。図４Ａからの細胞質抽出物（３０μｇ）は、以下に記載されたように抗ＩＫＢとイムノブロットされた。
図４Ｃは、Ｌ−Ｔ６ＤＰ−１が、ＴＲＡＦ６のＮＦ−κＢ活性化受容体細胞質ドメインに対する結合を阻害することを示す。ＦＬＡＧ−ＴＲＡＦ２、−ＴＲＡＦ５、または−ＴＲＡＦ６のいずれかでトランスフェクトされたヒト２９３細胞由来の細胞抽出物は、１００μＭの示されたペプチドの存在下、またはペプチドが存在しない状態で、ＧＳＴまたはＧＳＴ−ＲＡＮＫｃｄと混合された。上記したように、ＧＳＴプルダウンアッセイが行われた。結合したＴＲＡＦｓは抗ＦＬＡＧ抗体によるイムノブロッティングにより可視化された。
【図５】Ｌ−Ｔ６ＤＰ−１が、特異的にＲＡＮＫＬ誘導ＪＮＫ、ＥＲＫおよびｐ３８キナーゼの活性化を特異的に阻害することを示す図である。
図５Ａは、Ｌ−Ｔ６ＤＰ−１によるＲＡＮＫＬ媒介ＪＮＫ活性化を阻害することを示す。ＲＡＷ２６４．７細胞は、６ウェルプレートに入れられ、示されたペプチドで６時間処理され、その後、ＲＡＮＫＬ（１０ｎＭ）で１５分間処理された。全細胞質抽出物が調製され、３０μｇの細胞溶解物を抗ＪＮＫ１で免疫沈降させた。上述したようにして、基質としてＧＳＴ−Ｊｕｎ（１−７９）を用いたインビトロキナーゼアッセイを行った。
図５Ｂおよび図５Ｃは、Ｌ−Ｔ６ＤＰ−１による、ＲＡＮＫＬ媒介ＥＲＫおよびｐ３８キナーゼの活性化の阻害を示している。図５Ａからの全細胞抽出物（３０μｇ）は、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離され、ニトロセルロース膜にエレクトロブロットされた。膜は、前述されたようにして、リン酸特異的抗体で一次イムノブロットされ、その後、ストリッピングされ、示された抗体と再プローブされた。
【図６】Ｌ−Ｔ６ＤＰ−１が、乳がん細胞により誘導された破骨細胞分化を阻害することを示す図である。
図６Ａ：乳がん細胞（５００／ウェル）は、ＲＡＷ細胞（１００００／ウェル）の存在下または無い状態で、並びに、Ｌ−Ｔ６ＤＰ−１またはＴ６ＤＰ−１（１００μＭ）の存在下または無い状態で、２４ウェルプレートに入れられた。５日後、細胞は、固定化され、ＴＲＡＰに対して染色され、１０倍の対物レンズを用いて写真撮影された。
図６Ｂは、ＲＡＷ細胞が、それのみ、または示された細胞の存在下で、合成骨スライド（ＢＤ バイコート・オステオロジック・マルチテスト・スライド（ＢＤ BiCoat Osteologic MultiTest Slides））上で、培養された。６日後、スライドを漂白剤で５分間洗浄することで細胞を除去し、その後、蒸留水で完全に洗浄した。スライドは空気乾燥され、光学顕微鏡（１０倍の対物レンズ）を用いて写真撮影した。機能性破骨細胞が合成骨基質を破壊した所は、破骨細胞のゴースト（矢印）を見ることができる。
図６Ｃは、正常胸部上皮細胞（ＭＣＦ１ＯＡ、１０００／ウェル）をＲＡＷの存在下で成長させ、図６Ａで示したようにＴＲＡＰに対して染色したものを示している。右側のパネルには、共存培養物に対して添加されたＲＡＮＫＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）が含まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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