(57)【要約】  本発明は、異種蛋白質を発現する甲殻類のバイオマスを含有する食品の製造に関する。前記食品は、受動免疫により治療用蛋白質を送達する手段として投与できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
甲殻類の遺伝物質が改変されていない、組換え感染性ウィルスを含む甲殻類。
【請求項２】
前記甲殻類がホウネンエビである請求項１に記載の甲殻類。
【請求項３】
前記甲殻類がザリガニである請求項１に記載の甲殻類。
【請求項４】
前記甲殻類がロブスターである請求項１に記載の甲殻類。
【請求項５】
前記甲殻類がカニである請求項１に記載の甲殻類。
【請求項６】
前記甲殻類が小エビである請求項１に記載の甲殻類。
【請求項７】
前記ウィルスが、甲殻類に対して外来の蛋白質またはペプチドをコードするバキュロウィルスを含む、請求項１に記載の甲殻類。
【請求項８】
前記ウィルスが、甲殻類に対して外来の蛋白質またはペプチドをコードする白斑ウィルスを含む、請求項１に記載の甲殻類。
【請求項９】
前記ウィルスが、甲殻類に対して外来の蛋白質またはペプチドをコードするタウラウィルスを含む、請求項１に記載の甲殻類。
【請求項１０】
前記ウィルスが、抗菌性化合物をコードする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の甲殻類。
【請求項１１】
前記抗菌性化合物が、セクロピン類、ペネアジン類、バクテネシン類、カリネクチン類、ミチシン類、タキプレシン類、クラバニン類、ミスグリン類、プレウロシジン類、パラシン類、ヒストン類、酸性蛋白質類およびリゾチーム類から選択される、請求項１０に記載の甲殻類。
【請求項１２】
前記ウィルスが抗体または抗体断片をコードする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の甲殻類。
【請求項１３】
前記ウィルスがウィルス様粒子をコードする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の甲殻類。
【請求項１４】
前記ウィルスがホルモンをコードする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の甲殻類。
【請求項１５】
前記ホルモンがインスリンである、請求項１４に記載の甲殻類。
【請求項１６】
前記ウィルスがワクチンをコードする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の甲殻類。
【請求項１７】
前記蛋白質またはペプチドが、ヒトまたは非ヒト動物の欠乏を補給する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の甲殻類。
【請求項１８】
前記蛋白質またはペプチドが、疾病の感染性病原体と接触する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の甲殻類。
【請求項１９】
前記蛋白質またはペプチドが、細菌の増殖または複製を阻害する、請求項１８に記載の甲殻類。
【請求項２０】
前記細菌がビブリオ種である、請求項１９に記載の甲殻類。
【請求項２１】
前記治療用蛋白質が病原ウィルスを阻害する、請求項１８に記載の甲殻類。
【請求項２２】
前記ウィルスがタウラウィルスを含む、請求項２１に記載の甲殻類。
【請求項２３】
前記ウィルスが白斑ウィルスを含む、請求項２１に記載の甲殻類。
【請求項２４】
前記組換え感染性ウィルスが、２種以上の蛋白質またはペプチドをコードする、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の甲殻類。
【請求項２５】
ワムシの遺伝物質が改変されていない、組換え感染性ウィルスを含むワムシ。
【請求項２６】
前記ウィルスが、ワムシに対して外来の蛋白質またはペプチドをコードするバキュロウィルスルスを含む、請求項２５に記載のワムシ。
【請求項２７】
前記ウィルスが、ワムシに対する外来の蛋白質またはペプチドをコードする白斑ウィルスを含む、請求項２５に記載のワムシ。
【請求項２８】
前記ウィルスが、ワムシに対する外来の蛋白質またはペプチドをコードするタウラウィルスを含む、請求項２５に記載のワムシ。
【請求項２９】
前記ウィルスが、抗菌性化合物をコードする、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載のワムシ。
【請求項３０】
前記抗菌性化合物が、セクロピン類、ペネアジン類、バクテネシン類、カリネクチン類、ミチシン類、タキプレシン類、クラバニン類、ミスグリン類、プレウロシジン類、パラシン類、ヒストン類、酸性蛋白質類およびリゾチーム類から選択される、請求項２９に記載のワムシ。
【請求項３１】
前記ウィルスが抗体または抗体断片をコードする、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載のワムシ。
【請求項３２】
前記ウィルスがウィルス様粒子をコードする、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載のワムシ。
【請求項３３】
前記ウィルスがホルモンをコードする、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載のワムシ。
【請求項３４】
前記ホルモンがインスリンである、請求項３３に記載のワムシ。
【請求項３５】
前記ウィルスがワクチンをコードする、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載のワムシ。
【請求項３６】
前記蛋白質またはペプチドが、ヒトまたは非ヒト動物の欠乏を補給する、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載のワムシ。
【請求項３７】
前記蛋白質またはペプチドが、疾病の感染性病原体と接触する、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載のワムシ。
【請求項３８】
前記蛋白質またはペプチドが、細菌の増殖または複製を阻害する、請求項３７に記載のワムシ。
【請求項３９】
前記細菌がビブリオ種である、請求項３８に記載のワムシ。
【請求項４０】
前記治療用蛋白質が病原ウィルスを阻害する、請求項３７に記載のワムシ。
【請求項４１】
前記ウィルスがタウラウィルスを含む、請求項４０に記載のワムシ。
【請求項４２】
前記ウィルスが白斑ウィルスを含む、請求項４０に記載のワムシ。
【請求項４３】
前記組換え感染性ウィルスが２種以上の蛋白質またはペプチドをコードする、請求項２５〜４２のいずれか一項に記載のワムシ。
【請求項４４】
請求項１〜２４のいずれか一項に記載の甲殻類をヒトまたは非ヒト動物に給餌する方法。
【請求項４５】
請求項２５〜４３のいずれか一項に記載のワムシをヒトまたは非ヒト動物に給餌する方法。
【請求項４６】
前記非ヒト動物が陸生畜産にて生産される、請求項４４または４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記動物がブタである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記動物がニワトリである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記動物がウシを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
前記動物が水産養殖にて生産される、請求項４４または４５に記載の方法。
【請求項５１】
前記動物が魚類である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記動物が魚（ｆｉｎｆｉｓｈ）である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記動物がナマズである請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記動物がサケである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記動物が貝類である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５６】
前記動物が小エビである請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記動物が幼生である請求項５０に記載の方法。
【請求項５８】
前記動物が幼若体である請求項４６または５０に記載の方法。
【請求項５９】
前記動物が成体である請求項４６または５０に記載の方法。
【請求項６０】
治療用蛋白質またはペプチドを生産する方法であって、
該蛋白質またはペプチドが組換え感染性ウィルスによりコードされ、甲殻類中で生産される、方法。
【請求項６１】
前記甲殻類が、ホウネンエビ、ザリガニ、ロブスター、カニ、および小エビから選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
治療用蛋白質またはペプチドを生産する方法であって、
該蛋白質またはペプチドが組換え感染性ウィルスによりコードされ、ワムシ中で生産される、方法。
【請求項６３】
（ａ）ｃＤＮＡクローンを調製すること；
（ｂ）前記クローンをウィルス変換ベクターに結合させること；
（ｃ）前記組換えウィルスを用いて甲殻類またはワムシに感染させること、
をさらに含む、請求項６０〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記組換え感染性ウィルスが、バキュロウイルス、白斑ウイルスおよびタウラウイルスから選択される、請求項６０〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記甲殻類またはワムシの全体が、ヒトまたは非ヒト動物により消費される、請求項６０〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記蛋白質またはペプチドが、甲殻類またはワムシから抽出される、請求項６０〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記蛋白質またはペプチドがさらに加工される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記治療用蛋白質またはペプチドが自然にヒトで発現される、請求項６０〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記蛋白質またはペプチドが抗菌性化合物である、請求項６０〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記抗菌性化合物が、セクロピン類、ペネアジン類、バクテネシン類、カリネクチン類、ミチシン類、タキプレシン類、クラバニン類、ミスグリン類、プレウロシジン類、パラシン類、ヒストン類、酸性蛋白質類およびリゾチーム類から選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記蛋白質またはペプチドが、抗体または抗体断片である、請求項６０〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記蛋白質またはペプチドが、ウィルス様粒子である、請求項６０〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記蛋白質またはペプチドが、ホルモンである、請求項６０〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記ホルモンがインスリンである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記インスリンが、経口、経鼻、経皮または注射経路により送達される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記蛋白質またはペプチドが、ワクチンである、請求項６０〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記ワクチンが経口ワクチンである請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記蛋白質またはペプチドが、ヒトまたは非ヒト動物の欠乏を補給する働きをする、請求項６０〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記蛋白質またはペプチドが、疾病の感染性病原体と接触する、請求項６０〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記蛋白質またはペプチドが、細菌の増殖または複製を阻害する、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記細菌がビブリオ種である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記蛋白質が病原ウィルスを阻害する、請求項７９に記載の方法。
【請求項８３】
前記ウィルスがタウラウィルスを含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記ウィルスが白斑ウィルスを含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８５】
前記組換え感染性ウィルスが、２種以上の蛋白質またはペプチドをコードする、請求項６０〜８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
前記組換え感染性ウィルスを甲殻類に感染させることを含む、治療用蛋白質またはペプチドを甲殻類に送達する方法。
【請求項８７】
組換え感染性ウィルスによりワムシを感染させることを含む、治療用蛋白質またはペプチドをワムシに送達する方法。
【請求項８８】
組換え感染性ウィルスを含む食用に適した材料を甲殻類またはワムシに給餌することをさらに含む、請求項８６または８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記ウィルス源が、前記ウィルスにより感染した培養細胞の上清である、請求項８６〜８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
前記ウィルス源が、前記ウィルスにより感染した甲殻類のバイオマスである、請求項８７または８８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
１．発明の分野
本発明は、甲殻類における蛋白質、核酸、ウィルスおよびウィルス様粒子の生産および使用に関する。このような生成物は、畜産または水産養殖の常法により生産され、ヒトならびに動物における重要な治療可能性を有するものとなり得る。これらの生成物は、甲殻類自体の消費により直接的に、あるいは甲殻類によって生産された有効物質の精製後に、ヒトまたは動物に与えることができる。甲殻類は、甲殻類における物質生産のための一または複数の遺伝子を含有するウィルスの感染の結果、該物質を生成する。この方法では、甲殻類自体の遺伝物質は変更されない。
【背景技術】
【０００２】
２．関連技術の説明
ある種のヒト治療用蛋白質は、現在、植物のゲノムを直接修飾することにより直接発現されており、その結果、植物が以前には全く生産したことのなかった蛋白質を生産する。このような植物は、遺伝子組換え作物（ＧＭＯ）類と称される。組み込まれた遺伝子から新規なアレルゲンが産生される可能性があるために、従来の食品におけるＧＭＯ類の利用についての懸念が高まってきている。それにもかかわらず、植物は、ある種のヒト治療用蛋白質を生産する、優れたかつ安価な態様を提供する。
【０００３】
近代的な農業バイオテクノロジーは、植物自体のゲノムを直接修飾することなく、ある種のヒト治療用蛋白質の生産システムとして、植物を用いる様式も確立している。このような場合、植物（例えば、タバコ）は、ヒト治療用蛋白質の遺伝子を担持するウィルス（例えば、タバコモザイクウィルス；ＴＭＶ）による感染を受ける。このような場合、植物の発現は植物ＤＮＡを直接変更することなく修飾される。次に、ヒト治療用蛋白質は単離、精製されてヒト治療目的のために使用される。
【０００４】
細菌、酵母および菌類などの組換え微生物が、ヒト治療用蛋白質を生産するために利用されてきた。しかしながら、このような組換え微生物は、一般に翻訳後の修飾における変化により、哺乳類細胞に作られる蛋白質の正確なミミックを産生しない。さらに、このような組換え微生物は、生物体全体の摂取を前提とする農業目的には利用されていなかった。植物および微生物双方の場合において、組換え生物は単に工場として使用されており、次いで使用前に治療用蛋白質を単離、精製される。
【０００５】
ある種の組換え蛋白質は、昆虫ウィルス発現システム（バキュロウィルス）を用いて昆虫細胞中で産生される。このような蛋白質はまた、修飾バキュロウィルスによる感染後、無傷（ｉｎｔａｃｔ）の幼虫においても生産される。いずれの場合も、昆虫細胞または幼虫は、目的の蛋白質を生産する工場として使用され、次いで組換え蛋白質が製薬目的のために精製される。一般に、昆虫細胞により産生された蛋白質は、翻訳後の修飾がより近似しているため、哺乳類細胞において産生される蛋白質により近いミミックであり、その方法は一般に哺乳類細胞での生産よりもはるかに安価である。しかしながら、昆虫細胞または幼虫により製造された蛋白質は、治療に使用できるようになる前に、依然として多くの精製ステップを必要とする。
【０００６】
ある種の甲殻類（例えば、ブライン・シュリンプ）は、重要な第１幼虫段階への生餌の代表であるように、種々の水産養殖収穫物（例えば、魚類または小エビ）用飼料として用いられる。多くの場合において、ホウネンエビがある種のミクロ藻類が「装填」され、該ミクロ藻類はホウネンエビの消費により幼生動物に送達される。このようにして、ある種の有益な栄養物を、飼料を通して藻類から幼虫に提供できる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
発明の概要
本発明の目的は、治療用蛋白質またはペプチドを含む動物飼料または飼料成分である組成物、および生物活性ペプチドまたは生物活性蛋白質の治療的用量をこのような飼料を消費する動物へ送達する目的での、この飼料の使用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一実施形態において、本発明は、治療的価値のある蛋白質（例えば、抗体、または免疫学的応答または抗菌能力を有する蛋白質）を発現するための遺伝子を発現または担持する組換えウィルス（例えば、バキュロウィルス）により感染を受けた甲殻類（例えば、ホウネンエビ）を含む飼料を提供する。このような飼料により、消費する種のための経口的ワクチンが提供できると考えられる。
【０００９】
本発明の他の実施形態において、ホウネンエビは、目的とする治療用蛋白質の低コストで大規模な生産システムとして使用される。このような蛋白質は、ホウネンエビ全体のバイオマスの一部としてヒトまたは他の動物により消費されることが可能であり、あるいは、蛋白質を抽出、精製して、経口、注射、または経皮的または経鼻送達のいずれかによる従来の製薬製品としても提供できる。
【００１０】
海洋環境は魚類および／または貝類を攻撃し得る細菌およびウィルス類により満たされている。このような細菌またはウィルスによる感染は、極めて迅速に集約的海洋養殖場を荒廃させる恐れがある。ウィルスまたは細菌感染が農場の生産性を劇的に制限する恐れのある陸生環境にとっても同じことが当てはまる。今日、小エビ水産養殖における主要な疾病コントロール問題の１つは、ある種のウィルス（例えば、白斑、タウラなど）による感染である。抗生物質またはプロバイオティック戦略はいずれもこの状態で効力がなく、また小エビは、魚類に使用されるものと類似の方法ではワクチン接種できない。全ての甲殻類と同様、小エビは、未発達な免疫系しか持たないため、ウィルス攻撃による荒廃に特に感受性が強い。
【００１１】
本発明は、抗ウィルス抗体またはその断片を直接小エビに送達するためのベクターとして標的動物の飼料を用いる栄養コントロール法を提供することにより、この課題に対する解決策を提供する。これらの「デザイナー飼料」は、抗体の治療的用量を小エビの腸管に直接送達するものである。このアプローチは、抗体が宿主生物の外側に留まり、腸壁を通ってウィルスの侵入を防止するだけであることから、「受動免疫」として知られている。本発明は、トランスジェニック多細胞生物（植物、動物、昆虫など）の消費により標的動物の腸管に抗体を送達させるトランスジェニック多細胞生物の使用を企図している。あるいは、標的動物に与えることのできる多細胞生物内に目的の抗体またはその断片を産生するように設計された宿主特異的ウィルスにより、飼料源自体を感染させることができる。あるいは、飼料材料は、飼料を消費する小エビ、他の貝類または魚類または陸生動物を能動的に免疫するために、ウィルスの一部（例えば、コート蛋白質）またはその断片を送達してもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
図１は、ＧＦＰを融合蛋白質として発現するように改変されたバキュロウィルス（ＡｃＮＰＶ−ｅＧＦＰ）を用いて、経口的に感染させられたパシフィック・ホワイト・シュリンプ（Ｐｅｎａｅｕｓ  ｖａｎｎａｍｅｉ）を示す。感染の７２時間後に観察すると、ＧＦＰで標識した組換えバキュロウウィルスは、肝膵領域および該シュリンプの頭胸部に局在していた。
実施形態の詳細な説明
本発明は、抗菌性化合物、抗体または治療用蛋白質の製造および送達の際、これらを甲殻類源内で製造しパッケージする点で、微生物源と比較して有利である。無菌発酵は、医薬品ＧＭＰの準拠にとって重要であるが、一方、それより純度の落ちる供給源でも食品または飼料利用のためには全く問題のないものとなる。甲殻類は、水生種または陸生種（水産養殖または農業を含む）のいずれの食物連鎖においても共通の要素である。ヒト蛋白質の細菌製造による主要な問題の１つは、微生物が生産した組換え蛋白質は、不正確な翻訳後修飾のために効果がないことである。真核性プロセス（例えば、甲殻類種による）は、細菌からの組換え生成物と比較して、より「天然」であり得る翻訳後修飾を提供する。
【００１３】
白斑ウィルスまたはタウラウィルスなどの所望の標的に対する抗体または抗体の断片は、通常の免疫、およびモノクローナル抗体−生産ハイブリドーマの選択、またはイムノグロブリン遺伝子および遺伝子断片のウィルスまたは細菌による発現ライブラリをスクリーニングすることにより調整できる。「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、コラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ）ら編集、ワイリー・インターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、１９９１年および定期的な増補を参照されたい。選択された抗体の結合部位をコードする核酸配列は、標準的方法（オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編集、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、ワイリー・インターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）１９８７年、および定期的な増補を参照）を用いてクローン化でき、抗体は、組換え植物、組換え動物または組換え昆虫から発現させることができ、または所望の飼料材料に感染するウィルスにクローン化できる。
【００１４】
微生物増殖を阻害する多数の周知の殺菌性および静菌性ペプチド類があり、限定はしないが、セクロピン類（ｃｅｃｒｏｐｉｎ）、ペネアジン類（ｐｅｎｅａｄｉｎ）、バクテネシン類（ｂａｃｔｅｎｅｃｉｎ）、カリネクチン類（ｃａｌｌｉｎｅｃｔｉｎ）、ミチシン（ｍｙｔｉｃｉｎ）、タキプレシン（ｔａｃｈｙｐｌｅｓｉｎ）類、クラバニン類（ｃｌａｖａｎｉｎ）、ミスグリン類（ｍｉｓｇｕｒｉｎ）、プレウロシジン類（ｐｌｅｕｒｏｃｉｄｉｎ）、パラシン類（ｐａｒａｓｉｎ）、ヒストン類（ｈｉｓｔｏｎｅ）、酸性蛋白質類およびリゾチーム類が挙げられる。本発明によれば、これらのペプチド類は、当業者に周知の組換え法を用いて甲殻類宿主内に作製され、場合によっては侵入に対する抵抗性または耐性を与える飼料成分として提供できる。甲殻類は、多くの水産養殖種の食料であり、本発明は、幼若魚類（例えば、半成育ナマズ）ならびに幼生魚類の天然また養殖場の食餌における治療用蛋白質の組換え生産が企図されている。このように、水産養殖における幼生、幼若および成体の給餌における食物連鎖の一部、ならびに陸生動物（例えば、ブタ、ニワトリおよびウシ）の飼料における同一の生命連鎖を構成している宿主生物が本発明の企図の範囲内にある。
【００１５】
可食材料は、摂取されるいずれの材料であってもよい。本発明の一実施形態は、甲殻類が外因性のペプチドおよび／または抗体または抗体断片を直接産生するように遺伝子的に修飾され、修飾された甲殻類が摂取される。
【００１６】
使用する材料の調製のために、ある種の収穫後加工が必要となり得る。本発明は、甲殻類材料を食餌用に変換するための標準的（公知の）加工を想定している。このような標準的加工としては、ホモジナイゼーション、次いで適用対象（例えば、幼生、幼若および成体）による種々のサイズのペレットへの押出し加工が挙げられる。他の調製様式としては、スプレー乾燥、流動性ベッド乾燥または液体懸濁液としての材料の提供も挙げられる。あるいは、治療用蛋白質を発現する甲殻類を増殖させ、収穫し、次いで甲殻類から治療用蛋白質を含有するフラクションを単離できる。場合によっては、当業者に公知である追加の加工ステップを、治療用蛋白質をさらに精製するために適用してもよい。
【実施例】
【００１７】
本明細書中に企図されている本発明を、以下の実施例に記載するが、その効用は提供された実施例に限定されるものではない。
実施例１．ホウネンエビにおけるウィルス抗原の産生。
【００１８】
伝染性膵臓壊死症ウィルス（ＩＰＮＶ）は、幼若マスおよび幼若サケにおいて高死亡率を引き起こし得るウィルスの一例である。これらの動物においては、できるだけ早期にワクチンを接種させることが最善である。したがって、早期の幼若段階で経口ワクチンを送達させることが有利となり得る。ＩＰＮＶゲノムは、２種のセグメントを含有し、大きい方のセグメントは、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４ウィルスコート蛋白質の遺伝子を含有する。１種以上のウィルスコート蛋白質遺伝子を含有する完全長ｃＤＮＡをおよびトランスフェクションマーカー（例えば、グリーン蛍光蛋白質−ＧＦＰ）を、従来の分子生物学的手法を用いて調製する。次にこの断片を、ｐＡｃＵＷ２１などのバキュロウィルス形質変換ベクター上の、Ｐ１０プロモーター領域の下流のクローニング部位に連結する。ウィルスコート蛋白質遺伝子およびＧＦＰ遺伝子の双方を含有する組換えバキュロウィルスが、ホウネンエビへのトランスフェクションに用いられる。目的生成物（例えば、ＶＰ２）の感染および発現は、ホウネンエビ内のグリーンの蛍光の出現によりモニターする。発現が満足のいくものであれば、ホウネンエビを収穫し、幼若魚類に給餌できる。幼若魚類によるＶＰ２発現ホウネンエビの摂取により、安価でかつ有効な経口ワクチン接種方法が提供されることとなる。
実施例２．ホウネンエビにおける白斑ウィルス（ＷＳＶ）に対する抗体の製造。
ＷＳＶは、３種の主要なウィルスコート蛋白質を含有し、３種の蛋白質全てが抗体断片（Ｆａｂｓ）の調製に使用することができ、これらのＦａｂｓの遺伝子は、組換えファージおよびＥ．Ｃｏｌｉにおける発現によって該抗体断片（Ｆａｂｓ）を調製するために使用できる。これらＦａｂｓの遺伝子は、当業者に公知の技術により、調製および単離できる。続いて該遺伝子を、バキュロウィルスベクター内へスプライシングし、ホウネンエビを感染させるために使用する。
【００１９】
１〜５ｍｇの抗原（それぞれ３種のウィルス蛋白質）を出発として、２匹のｂａｌｂ／ｃマウスを免疫し、脾臓を摘出し、脾細胞を単離する。メッセンジャーＲＮＡを脾細胞から抽出し、オリゴｄＴカラム上で精製する。ｃＤＮＡライブラリを作製し、ゲル分析前にＰＣＲにより増幅する。バンドをゲルから単離し、Ｖｈ鎖およびＶ鎖をエタノールで沈殿させる。アセンブリおよびフィル・イン反応後、第２の増幅が精製および精製ＳｃＦｖの単離前に必要となり得る。次いでこのＤＮＡをＳｆｉとＮｏｔ１とで消化し、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅなどのプラスミド内に連結する。次に大腸菌を形質変換し、組替えファージライブラリをレスキューし、抗原陽性の組換えファージ抗体を選択するために三回選別する。最高特異性のＦａｂをコードするＳｃＦｖ遺伝子を次にプラスミドから単離し、バキュロウィルス発現系内に結合させる。このようなウィルスは、グリーン蛍光蛋白質（ＧＦＰ）などのトランスフェクションのための発現マーカを含んでいてもよい。ホウネンエビを次にバキュロウィルスにより感染させることができ、感染の程度はグリーンカラーの強度により容易にモニターできる。このような場合において、感染を受けた小エビはまた、ＷＳＶに対する抗体を産生する。飼料添加物としてバイオマスを用い、抗体または抗体断片を動物に導入することによって受動的免疫が提供される。
実施例３．ホウネンエビにおける殺菌性または静菌性蛋白質の発現。
【００２０】
殺菌性または静菌性蛋白質は、具体的な適用に関して選択される。好適な例としては、小エビにおける病原性コントロールのためにペナエイジン（ｐｅｎａｅｉｄｉｎ）類の蛋白質が挙げられる。ペナエイジン類は、甲殻類（例えば、ペナウス（Ｐｅｎａｅｕｓ）小エビ）から単離された抗菌性ペプチド類ファミリーの一つである。抗菌性ペプチド類は、昆虫および鋏角類からも得ることができ、限定はしないが、セクロピン類、ペネアジン類、バクテネシン類、カリネクチン類、ミチシン類、タキプレシン類、クラバニン類、ミスグリン類、プレウロシジン類、パラシン類、ヒストン類、酸性蛋白質類およびリゾチーム類が挙げられる。選択された蛋白質またはペプチドの遺伝子は、元の起源、または増幅源のいずれかから単離され、または合成的に作製できる。前記遺伝子を、グリーン蛍光蛋白質（ＧＦＰ）遺伝子を含有することもできるバキュロウィルスベクター内にスプライシングする。次に前記ウィルスは、ホウネンエビをトランスフェクションするために用いられ、殺菌性または静菌性蛋白質の生産はＧＦＰの発現強度によりモニターされる。適当なレベルで目的物を生産するホウネンエビを単離したら、このホウネンエビを魚類または小エビの食餌に添加する。このようにして、静菌性または殺菌性蛋白質は、ホウネンエビ自体の形態で動物の腸管に直接送達される。ホウネンエビ全体が飼料または飼料成分として使用できる。あるいは、甲殻類をホモジネートし、飼料用に好適なペレットに押出し加工できる。バキュロウィルスベクターは、飼料としての使用前に高温により、または当業専門家によく知られている他の方法により不活化できる。
実施例４．ホウネンエビにおけるヒトインスリンの発現。
【００２１】
ヒトインスリンは、甲殻類中で生産し得るヒト治療用蛋白質である。ヒトインスリン（または他のいずれかのヒト治療用蛋白質）の遺伝子は入手されるか、または合成的に生産され、バキュロウィルス発現ベクター内に結合される。バキュロウィルス発現ベクターはまた、グリーン（またはレッド）蛍光蛋白質（ＧＦＰまたはＲ−ＦＰ）などのトランスフェクションマーカーも含有し得る。次にバキュロウィルスは、ホウネンエビなどの甲殻類養殖物を感染させるために使用される。治療用蛋白質の発現レベルは、ＧＦＰまたはＲＦＰによって生じる蛍光の強さにより決定される。治療用蛋白質の最大生産時点で、前記甲殻類を収穫する。ブライン・シュリンプを直接湿潤ペーストとして使用でき、または生成物の完全性を保持する何らかの適切な方法（例えば、スプレー乾燥、押出し加工など）により乾燥できる。あるいは、ブライン・シュリンプを粉砕し、目的蛋白質を従来の生化学的方法論によって単離し精製できる。精製された蛋白質は、経口、経鼻、経皮または注射可能な送達形態で使用し得る。
実施例５．他の甲殻類およびワムシからの生産。
【００２２】
実施例１〜４のいずれかに記載の加工バキュロウィルスを、他の甲殻類（例えば、カニ、ザリガニ、ロブスターなど）に感染させることもできる。そのような感染は、ライフサイクルにおけるずっと後の段階で生じさせて、十分に成熟した甲殻類が、食物としてはるかに許容されやすい形態で、薬剤製品を送達するようにしてもよい。あるいは、他のある種の甲殻類（縦おば、カニ、ザリガニ）を、実施例１〜４の手順後に、治療用蛋白質送達のベクターとして使用してもよい。また、あるいは、ワムシを、実施例１〜４の手順後に、治療用蛋白質送達のベクターとして使用してもよい。
実施例６．バキュロウィルスへの治療用蛋白質遺伝子の組み込み、および飼料としての感染材料の使用
パシフィック・ホワイト・シュリンプ（Ｐｅｎａｅｕｓ  ｖａｎｎａｍｅｉ）を加工バキュロウィルス（ＡｃＮＰＶ−ｃＧＦＰ）を用いて、経口によりトランスフェクションし、融合蛋白質としてＧＦＰを発現させた。Ｂａｃｍｉｄ  Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（登録商標）バキュロウィルス発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をクローニングとトランスフェクションとに利用した。ＧＦＰを含有する７２０ｋｂ断片をｐｏｌｉｈｅｄｒｏｎ((ｐＰｏｌｈ）プロモーターに融合させＸｈｏＩ部位３’でｐＰｏｌｈに連結した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製品の文献に記載された方法を用いて、Ｓｆ９昆虫細胞が組換えバキュロウィルスによりトランスフェクションされた。７２時間後、プラーク形成が肉眼で観察され、７０ｍｌの培養液培地を４℃で５分間、１００ｇにペレット化した。生じた細胞ペレットは、続く経口トランスフェクションに使用するまで４℃に保持した。対応して生じる上清を２７％スクロース勾配、４℃、８０，０００ｇで２時間遠心分離し、精製ウィルスを得た。このスクロース精製されたウィルスペレットは、続く経口トランスフェクションに使用するまで４℃に保持した。
【００２３】
塩分の濃度を３０ｐｐｔとした脱塩素化水を満たした３クオートの容器からなる小エビ隔離チャンバに、酸素化用エアストーンをつけた。１グラムの小エビを３匹、各容器に入れ、一晩順化させた。
【００２４】
前記小エビへの給餌前３０分以内に以下の手順を実施した。先ず、ビーカ内の１０ｍｌの蒸留脱イオン水（ｄｄＨ２Ｏ）に、１００ｍｇのアルギン酸（Ｓｉｇｍａ社）を加え、攪拌しながら４０℃に加熱することにより、ペレットマトリックスを調製した。ゲル形成開始後、１５０ｍｇのデンプン（Ｓｉｇｍａ社）を加えた。前記溶液を１分間混合させた後に、５００ｍｇのオキアミ食を添加した。この溶液の攪拌を続けながら熱源を除去した。
【００２５】
ペレットマトリックスのアリコート（５００μｌ）を５μｌの感染細胞ペレット、または５μｌのスクロース精製ウィルスと合わせてヴォルテックスミキサーで静かに混合した。感染ペレットマトリックスをツベルクリン・シリンジ内へ吸引し、引き続いてこれに２１ゲージ針を付けた。形成用溶液は、５グラムの塩化カルシウム（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ社）および１グラムの塩化ナトリウム（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ社）を１００ｍｌのｄｄＨ２Ｏ内へ溶解することによって形成した。形成溶液をゆっくりと撹拌しながら、この溶液中に注射針を通してマトリックスをしぼり出し、管状のペレットを形成させた。押出されると直ちに溶液内にペレットが形成され、スパーテルを用いてペレット間の針をきれいにした。ペレットの容積は２５〜３０μｌと見られた。このペレットを１０％ＮａＣｌ内で洗浄し、小エビ隔離容器へ加えた。小エビは直ちにペレットを消費したが、飽食するまで与えた。各小エビがおおよそ１個のペレットを消費した。
【００２６】
前記ウィルス感染マトリックス消費の７２時間後、小エビをペトリ皿に入れてダークリーダー（Ｄａｒｋ  Ｒｅａｄｅｒ（登録商標））トランスイルミネーター（Ｃｌａｉｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）上で観察した。ＧＦＰを発現している小エビは緑色がかった光を示した（図１）。非感染小エビは蛍光を示さなかった。７２時間目に観察されたＧＦＰ標識組換えバキュロウィルスは小エビの頭胸部の肝膵臓領域内に特異的に位置していた（図１）。
【００２７】
引用文献
本明細書は、以下の引用文献を参照すると最もよく理解され、それらの全体が本明細書中に組み込まれている。
【００２８】
オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編集、（１９８７年および定期的な増補）「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、ワイリー・インターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）。
【００２９】
「Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｍａｎｕａｌ」、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１０３５９〜０１６。
【００３０】
チャルフィー．Ｍ．ツウ．Ｙ．（Ｃｈａｌｆｉｅ、Ｍ．、Ｔｕ、Ｙ．）、エウスカーチェン（Ｅｕｓｋｉｒｃｈｅｎ）．Ｇ．、ワード（Ｗａｒｄ）．Ｗ．Ｗ．およびプラッシャー（Ｐｒａｓｈｅｒ）．Ｄ．Ｃ．（１９９４）「Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓ  ａ  Ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６３：８０２〜８０５頁。
【００３１】
コラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ）ら編集、（１９９１年および定期的な増補）「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、ワイリー・インターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）。
【００３２】
イノウエ（Ｉｎｏｕｅ）．Ｓ．、およびツジ（Ｔｓｕｊｉ）．Ｆ．Ｉ．（１９９４）「Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｇｒｅｅｎ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ」、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、３４１：２７７〜２８０頁。
【００３３】
ルイス、デービッド（Ｌｅｗｉｓ、Ｄａｖｉｄ）．Ｌ．、デ・カミリス、マーク（ＤｅＣａｍｉｌｌｉｓ、Ｍａｒｋ）．Ａ．、ブルネッティ、クレーグ（Ｂｒｕｎｅｔｔｉ、Ｃｒａｉｇ）．Ｒ．、ハルダー（Ｈａｌｄｅｒ）．Ｇ．、カスナー、ビクトリア（Ｋａｓｓｎｅｒ、Ｖｉｃｔｏｒｉａ）．Ａ．、セレグ（Ｓｅｌｅｇｕｅ）．Ｊ．Ｅ．、ヒッグス（Ｈｉｇｇｓ）．Ｓ．、およびキャロル（Ｃａｒｒｏｌｌ）．Ｓ．Ｂ．（１９９９）「Ｅｃｔｏｐｉｃ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｈｏｍｅｏｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｒｔｈｒｏｐｏｄｓ  ｕｓｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｓｉｎｄｂｉｓ  ｖｉｒｕｓｅｓ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ９：１２７９〜１２８７頁。
【００３４】
プラッシャー（Ｐｒａｓｈｅｒ）．Ｄ．Ｃ．、エッケンロード（Ｅｃｋｅｎｒｏｄｅ）．Ｖ．Ｋ．、ワード（Ｗａｒｄ）．Ｗ．Ｗ．、プレンダーガスト（Ｐｒｅｎｄｅｒｇａｓｔ）．Ｆ．Ｇ．およびコルミア（Ｃｏｒｍｉｅｒ）．Ｍ．Ｊ．（１９９２）、「Ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ  ｇｒｅｅｎ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ」、Ｇｅｎｅ、１１１：２２９〜２３３頁。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】融合蛋白質としてＧＦＰを発現するように設計されたバキュロウィルス（ＡｃＮＰＶ−ｅＧＦＰ）により、経口的にトランスフェクションされたパシフィック・ホワイト・シュリンプ（Ｐｅｎａｅｕｓ  ｖａｎｎａｍｅｌ）を表す。感染後７２時間目に観察されたＧＦＰ標識組換えバキュロウィルスは、小エビの頭胸部の肝膵臓領域内に特異的に位置している。
【図１】
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【国際調査報告】
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