(57)【要約】本発明は、組換えヒトBACEポリペプチドに関するものである。特に、本発明はBACE配列の位置33に修飾アミノ酸配列を有する組換えヒトBACEポリペプチド、並びに修飾組換えヒトBACEポリペプチドの生産のためのポリヌクレオチド、発現ベクター、宿主細胞、及び方法に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾Pro33Lysを有するヒトBACEからなる単離ポリペプチド。
【請求項２】
少なくとも膜貫通ドメインの部分からなる請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項３】
少なくともC-末端テイルの部分からなる請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項４】
少なくともシグナルペプチドの部分からなる請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項５】
修飾Pro33Lysを有するBACEのプロ-酵素配列からなる活性ヒトBACEからなる組成物。
【請求項６】
BACEが少なくとも膜貫通ドメインの部分からなる請求項5に記載の組成物。
【請求項７】
BACEが少なくともC-末端テイルの部分からなる請求項5記載の組成物。
【請求項８】
BACEが少なくともシグナルペプチドの部分からなる請求項5に記載の組成物。
【請求項９】
SEQ ID NO: 2からなる単離ポリペプチド。
【請求項１０】
SEQ ID NO: 2からなる単離ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項1のポリペプチドをコードする配列からなる単離ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
SEQ ID NO: 2に記述されたアミノ酸配列をコードする配列からなる単離ポリヌクレオチド。
【請求項１３】
SEQ ID NO: 8のヌクレオチド70-1365からなる単離ヌクレオチド。
【請求項１４】
SEQ ID NO: 8のヌクレオチド70-1365からなる単離ヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項11のポリヌクレオチドからなる発現ベクター。
【請求項１６】
該発現ベクターが適合する宿主細胞中に存在しそして宿主細胞が生産に適した条件の下に培養されたときに該発現ベクターがPro33Lys-BACEを生産することができる、Pro33Lys-BACEポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる発現ベクター。
【請求項１７】
生産されたPro33Lys-BACEポリペプチドがSEQ ID NO: 2のポリペプチド配列からなる請求項16に記載の発現ベクター。
【請求項１８】
請求項15に記載の発現ベクターからなる組換え宿主細胞。
【請求項１９】
a) 該ポリペプチドを生産することができる条件下で請求項18の組換え宿主細胞を培養し；そしてb) 培養からポリペプチドを回収する：の段階からなるPro33Lys-BACEポリペプチドを生産する方法。
【請求項２０】
宿主細胞がE. coliである請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
請求項19の培養宿主細胞からPro33Lys-BACEを回収し、そしてポリペプチドを約1℃から15℃の温度の水で20-50倍に希釈することからなる活性Pro33Lys-BACEを生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は米国仮特許出願番号60/358,651、出願日2002年2月21日の優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は組換えヒトBACEに関するものである。特に、本発明はアミノ酸位置33に修飾のある活性ヒトBACEに関するものである。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
アルツハイマー病（AD）は主として加齢に伴う脳の進行性変性疾患である。ADの臨床的症状は、記憶力、認識力、推理力、判断力及び方向感覚の喪失が特徴である。病気が進行すると運動、感覚、及び言語能力も障害され、そしてついには複数の認知機能の総合的障害を生じる。これらの認知機能消失は徐々に生じるが、典型的に4年から12年の範囲内で重篤な障害を生じそして最終的に死に至る。
【０００４】
アルツハイマー病は脳内の二つの主要な病理所見が特徴である：主としてAベータとして知られているペプチドフラグメントの凝集からなる神経原繊維凝集及びベータアミロイド（または神経炎）斑。ADの患者は、脳（ベータアミロイド斑）及び脳血管（ベータアミロイド血管疾患）にベータアミロイド沈着並びに神経原繊維凝集を示すのが特徴である。神経原繊維凝集はアルツハイマー病のみならず、他の痴呆誘発疾患においても生じる。剖検により、このような病変は記憶及び認知に関係するヒトの脳の領域に一般的に多数認められている。
【０００５】
より限定された解剖学的部分におけるこれらの病変は、臨床的にADの症状を示さない大抵の高齢者の脳に少数認められている。アミロイド原性斑及び血管性アミロイド血管疾患はトリソミー21を持つ患者（ダウン症候群）、オランダ型遺伝性アミロイド性脳出血（HCHWA-D）、及びその他の神経変性疾患の患者の脳の特徴でもある。ベータアミロイドはADを特定する特徴でもあり、またこの病気を発症する原因前駆体または因子と現在考えられている。認知活動をつかさどる脳の領域におけるAベータの沈着はAD発症の主要な要因である。ベータアミロイド斑は主としてアミロイドベータペプチド（Aベータ、時にはベータA4とも言われる）により構成される。Aベータペプチドはアミロイド前駆タンパク（APP）のタンパク分解により生成し、39−42アミノ酸からなる。セクレターゼと呼ばれるいくつかのタンパク分解酵素がAPPのプロセッシングに関係している。
【０００６】
ベータ-セクレターゼによるAベータペプチドのN-末端におけるAPP切断及び1またはそれ以上のガンマ-セクレターゼによるC-末端における切断はベータ-アミロイド形成経路を構成する、すなわち、その経路によりAベータが形成される。アルファ-セクレターゼによるAPP切断はアルファ-sAPP、ベータアミロイド斑を形成しないAPPの分泌型、を生成する。この別経路はAベータペプチドの形成を不可能にする。APPのタンパク分解性プロッセシングフラグメントの記述は、例えば、米国特許番号5,441,870；5,721,130；及び5,942,400に認められる。
【０００７】
アスパラギン酸タンパク分解酵素がベータ-セクレターゼ切断部位においてAPPのプロセッシングを行う酵素として同定された。ベータ-セクレターゼ酵素は、BACE，Asp，及びメマプシンを含めて種々の名称を使用して開示されてきた。例えば、Sinha et al., 1999, Nature 402: 537-554(p501)及び公開PCT出願WO 00/17369を参照。
【０００８】
進行性のベータ-アミロイドペプチド（Aベータ）の脳内蓄積がADの病因において発展的な役割を演じており、数年から数十年認知症状より先行する。例えば、Selkoe, 1991, Neuron 6: 487参照。培養増殖中の神経細胞からのAベータの放出及び正常ヒト及びAD患者の脳脊髄液（CSF）中のAベータの存在が示されている。例えば、Seubert et al., 1992, Nature 359: 325-327参照。
【０００９】
Aベータペプチドはベータ-セクレターゼによるAPPプロセッシングの結果として蓄積するので、この酵素活性の阻害がADの治療に望ましいことが提唱されてきた。ベータ-セクレターゼ切断部位におけるAPPのインビボプロセッシングがAベータ生産の律速段階と考えられているので、AD治療の治療標的となっている。例えば、Sabbagh, M., et al., 1997, Alz. Dis. Rev. 3, 1-19参照。
【００１０】
公開国際特許出願WO 00/47618, WO 01/23533及びWO 00/17369はベータ-セクレターゼ酵素及びその種々な使用方法を明らかにしている。β-セクレターゼの作用機構をよりよく理解するために、そしてアルツハイマー病のための薬物を開発する新しい戦略を理解する助けとして、そのチモーゲンの3次元構造を明瞭にすることが重要になってきた。3次元構造から、標的分子に対する酵素活性を阻害すると共に潜在的な活性部位を明らかにすることになるBACEの可能な突然変異を解明することが可能になった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
発明の要約
本発明は、Pro33Lys修飾を持つヒトBACEからなる単離ポリペプチド配列に関するものである。このポリペプチドは少なくとも膜貫通ドメインの部分、少なくともC-末端テイルの部分、及び/または少なくともシグナルペプチドの一部を含むことができる。
【００１２】
本発明は、Pro33Lys修飾を持つBACEのプロ酵素配列からなる活性ヒトBACE酵素からなる組成物にも関するものである。このポリペプチドは少なくとも膜貫通ドメインの部分、少なくともC-末端テイルの部分、及び/または少なくともシグナルペプチドの一部を含むことができる。
【００１３】
さらに、本発明はSEQ ID NO: 2の単離ポリペプチドに関するものである。
【００１４】
本発明は、遺伝子コードの縮重によって、P33K-BACEをコードするポリヌクレオチド配列からなる単離ポリヌクレオチドに関するものである。P33K-BACEはSEQ ID NO: 2の配列を持つことができる。単離ポリヌクレオチドはSEQ ID NO: 8のヌクレオチド70−1365のヌクレオチド配列を含むことができる。
【００１５】
本発明は、P33K-BACEをコードするポリヌクレオチドからなる発現ベクターにも関係している。この発現ベクターは、該発現ベクターが適合する宿主細胞中に存在する場合にP33K-BACEポリペプチドを生産する。この発現ベクターはSEQ ID NO: 2 のポリペプチド配列を含むことができる。
【００１６】
P33K-BACEをコードするポリヌクレオチド配列を有する発現ベクターからなる組換え宿主細胞。
【００１７】
P33K-BACEをコードする発現ベクターを有する組換え宿主細胞を該ポリペプチドを十分に生産する条件下に培養しそして培養からポリペプチドを回収することからなるP33K-BACEポリペプチドを生産する方法。この宿主細胞はE. Coliであり得る。
【００１８】
上記宿主細胞の培養からP33K-BACEポリペプチドを回収しそして約1から15℃の水で20−50倍に希釈することからなる活性P33K-BACEの製造方法。
【００１９】
図の簡単な説明
図1はヒトBACE  [SEQ ID NO: 1]のアミノ酸配列を示す。
【００２０】
図2はP33K-BACEポリペプチド [SEQ ID NO: 2]の一態様のアミノ酸配列を示す。
【００２１】
図3は、β-セクレターゼチモーゲン（pbsz）[SEQ ID NO: 3], β-セクレターゼ（1fkn）[SEQ ID NO:4], プロガストリクシン(1htr) [SEQ ID NO: 5]及びペプシノーゲン（3psg） [SEQ ID NO: 6]の配列整列を示す。線は1fknに認められるジスルフィド結合の形成に関与する残基対を示す。アスパラギン酸タンパク分解酵素ファミリーの活性部位の保存残基を示すコードは、pbszについては残基93−95及び残基289-291、3psgについては残基91−93及び残基274-276、及び1htr については残基91−93及び残基276-278である。シグナルペプチド部分（pbszについて残基1−21、1htrについて残基1−16、及び3psgについて残基1−15）は、分泌過程の間にシグナルペプチターゼにより切り離されてしまうので、整列操作に含めなかった。
【００２２】
図4A及び4Bは、pET11a-P33K-BACE構築から発現された修飾組換えBACEのDNA及び推定アミノ酸配列である：アミノ酸配列 [SEQ ID NO: 7]; DNA配列[SEQ ID NO: 8]。
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明はアミノ酸33位置（もしリーダー配列を数えるならば、54位置）に突然変異を有するヒトBACEポリペプチドを提供する。「BACE」（ベータ部位APP切断酵素）、はAPPのベータ部位において切断を仲介する酵素のことである。この酵素は、ベータ-セクレターゼ、Asp2及びメマプシン2としても知られている。BACEは、例えば、その全体をここに引用して取り入れたWO 00/17369, WO 00/47618及びWO 01/23533に記述されている。BACEはアスパラギン酸タンパク分解酵素からなり、古典的アスパラギン酸タンパク分解酵素活性部位共通モチーフ（DTG/DSG）を含んでいる。
【００２４】
図1に示したヒトBACEポリペプチドの図は、イタリック体で示された21アミノ酸リーダー（シグナルまたはプレ-）配列、及び太字で示された24アミノ酸プロ-配列を含む。T1はプロ-配列の開始を示している。27アミノ酸膜貫通ドメインには下線をつけてあり、細胞質C-末端テイルが続いている。ジスルフィド架橋はシステイン（Cys195-Cys399, Cys257-Cys422;及び Cys309-Cys359）によって形成されている。本発明の目的のために、BACEは、（1）N-末端のシグナル配列の全てまたは部分、（2）膜貫通ドメインの全てまたは部分、及び/または（3）C-末端テイルの全てまたは部分を持つ完全な膜貫通ドメイン、を任意に含むことができる。「部分」とは種々の配列のいずれかの数のアミノ酸のことである。
【００２５】
「Pro33Lys-BACE」または「P33K-BACE」とは、図2に示すように位置33にプロリンからリシン突然変異を有する組換えヒトBACEのポリペプチド配列を含む酵素のことである。従って、適切に再生された場合には、組換えP33K-BACEはP33K突然変異を持つBACEの少なくともアミノ酸1-432のペプチド配列を含む活性BACE酵素である。Pro33Lys-BACE及びP33K-BACEとは、（1）N-末端のシグナル配列の全てまたは部分、（2）膜貫通ドメインの全てまたは部分、及び/または（3）C-末端テイルの全てまたは部分を持つ完全な膜貫通ドメイン、を任意に含むことができるポリペプチドのことである。「部分」とは種々の配列のいずれかの数のアミノ酸のことである。
【００２６】
「ベータセクレターゼチモーゲン」または「BACEチモーゲン」とは、24アミノ酸プロ-配列を含むBACEのことである。一般的に、酵素はそのプロ-ペプチドの存在により不活化されているであろう。しかし、多くのほかのチモーゲンと異なり、プロ-ペプチドの存在はBACEの活性には大きな影響を及ぼさないようである。BACEの中のプロ-配列の効果を理解するために、BACEの3次元構造が解明された。この3次元構造から、酵素活性を阻害することができるBACE中の突然変異を明らかにすることができた。
【００２７】
β-セクレターゼチモーゲンの3次元構造解明の第一段階として、Vassar et al., 1999, Science 286: 735-741に開示されているβ-セクレターゼチモーゲン (pbszと略記) [SEQ ID NO:3]、β-セクレターゼ（1fkn）[SEQ ID NO:4]、プロガストリクシン（1htr）[SEQ ID NO:5]、及びペプシノーゲン（3psg）[SEQ ID NO:6]について配列整列をGCGパッケージ（Genetic Computer Group, Madison, Wisconsin）のPILEUPプログラムを使用しておこなった。ペプシノーゲン及びプロガストリクシンはβ-セクレターゼを含むアスパラギン酸タンパク分解酵素のファミリーの中のプロ-酵素である。整列の結果を図3に示すが、プロ-ペプチドには下線がついている。pbszの場合には、シグナルペプチドは残基1-21（示さず）を含み、プロ-ペプチドは残基22-45を含み（Bennett, et al, 2000, Journal of Biological Chemistry 275: 37712-37717）、そして主鎖は残基46-446（活性部位アスパラギン酸は93及び289）を含む。残基446に続く膜貫通及び細胞内ドメインはこの研究の範囲外である。
【００２８】
図3の配列pbszのアミノ酸のナンバリングと、図1及び2の対応アミノ酸のナンバリングが異なっているが、その理由は、図3のナンバリングは図1においてイタリック体で示した21アミノ酸シグナル配列を含んでいるからである。従って、図3におけるpbszの位置54は、図1及び2における位置33と同一である。従って、P33Kは図1に示すようにBACEの位置33におけるプロリンからリシンへの突然変異のことであるが、図3のpbszに関してはその同じ突然変異をP54Kと言うことができることを理解すべきである。
【００２９】
図3に示した整列を使用して、β-セクレターゼチモーゲン（pbsz）の3次元モデルが、（i）最近Hong et al., 2000, Science 290: 150-153によって測定されたβ-セクレターゼ（1fkn.pdb）のタンパク分解酵素ドメインのX線座標、及び (ii)Hartsuck et al, 1992, PROTEINS: Structure, Function and Genetics 13: 1-25によって測定されたペプシノーゲン（3psg.pdb）のX線座標、から構築された。ペプシノーゲン構造のプロ-部分は、β-セクレターゼプロ-部分の類似モデルの基礎となり、それを下記方法を使用してβ-セクレターゼタンパク分解酵素ドメインに移植した。
【００３０】
このモデルのプロ-ペプチド部分及びタンパク分解酵素ドメインは二つの異なる鋳型に由来するので、二つの構造の適当な部位におけるなめらかな接続のための操作が必要である。これを次のように行った。鋳型構造3psg.pdbを、市販ソフトウエアパッケージ、MOE（Chemical Computing Ltd.）を使用して、鋳型構造1fkn.pdbに重ね合わせた。重ね合わせ操作の間、3psgの全体構造の移動及び回転運動を行い、3psgの座標を変化させ、一方1fknの座標は変えずにおいた。両構造の重ね合わせから、Gly-74から始まりC-末端方向へ続いて（残基番号は図2に示されたpbszの配列に基づいて数える）、1fknの骨格鎖は、二葉性構造のN-末端葉のほとんどについて、3psgの骨格鎖の曲線とほとんど同じであった。しかし、β-セクレターゼのGly-74からN-末端方向に移動すると、構造は著しく異なっていた。従って、β-セクレターゼ構造の残基74はペプシノーゲンのプロ-部分上の（実際のβ-セレクターゼプロ-部分配列の形へ）移植する結合点になった。3psgの残基16-72及び1fknの残基74-446のなめらかな結合（図2）は構造的な問題なく実現した。次いでこのようにして得られた構造は、部分マッチングモデル方法によりβ-セレクターゼチモーゲン（pbsz）の最終的3次元モデルを開発するための結合鋳型として使用した。Levitt, M., 1992, J. Mol. Biol. 226: 507-533．
【００３１】
（MOEソフトウエア中の）部分マッチング法は、アミノ酸配列の整列に基づいて未知標的構造を構築するために、既知タンパク構造のデータベースを使用する。この場合には、標的構造はβ-セクレターゼチモーゲン、すなわち、プロ-部分プラスβ-セクレターゼのタンパク分解酵素ドメイン、であった。標的構造は最初短い部分のセットに分解された。標的構造に類似しそして適合するアミノ酸配列に基づくマッチング部分についてデータベースを探索した。この操作を10回繰り返し、平均的モデルを発生させ、次いで最終モデルを創るためにプロ-酵素全体についてエネルギー極小化を行った。このようにして得られた構造は、残基22-45、pbszのプロ-部分、のみならず1fkn.pdbの結晶構造では分からなかった（Hong et al., 2000）主鎖の残基46-55の部分の原子座標も一義的に決定した。さらに、pbszのタンパク分解酵素ドメイン（残基75-446）の大部分は1fkn中の相当する配列とほとんど同一であっが、タンパク分解酵素ドメインの小さな移行-結合部分（残基56-74）はプロ-部分の存在のために影響を受けた。この方法は元来、モデル化構造の全原子の根平方和偏差（RMSD）が0.93オングストローム及び1.73オングストロームの間にある場合には、46から323残基の大きさの範囲の8個の試験タンパクについて高度に正確であることが示めされた（Levitt, M,. 1992, J. Mol. Biol. 226: 507-533）。この方法はカスパーゼ-3のX線座標が発表される前に、カスパーゼ-8のタンパク分解酵素ドメインの構造をモデル化するために既に使用されていた（13）。その特別な研究において、カスパーゼ-3の触媒ドメインの原子座標はカスパーゼ-1のX線構造に基づいて推定され、そしてこうして得られたカスパーゼ-3は次いでカスパーゼ-8のタンパク分解酵素ドメインのモデル化のための鋳型として役立った。カスパーゼ-3タンパク分解ドメインのX線座標が最終的に発表され、そしてカスパーゼ-8タンパク分解酵素ドメインのX線構造が決定した（Watt, et al, 1999，Structure 7: 1135-1143）後に、カスパーゼ-3タンパク分解酵素ドメインの骨格原子のX線と推定構造の間のRMSDは2.7オングストロームであったが、一方カスパーゼ-8の対応するRMSDは3.1オングストロームであり、そのコア構造についてはわずか1.2オングストロームであることが、明らかとなった。このことはカスパーゼ-3及び-8のコンピューター構造は対応するX線構造に極めて近似することを示している。
【００３２】
このモデルのタンパク分解酵素ドメインの起源は結晶解析座標に由来するので、そのドメインの最終的エネルギー極小化モデルは、全てではないにしても、実験的性質の大部分を維持していることが期待される、そして事実そうである。特に、そのモデルは3対のジスルフィド結合、すなわち、Cys216-Cys420, Cys278-Cys443;及び Cys330-Cys380、を維持している。このことは、プロ-ペプチド部分はジスルフィド結合を破壊せずに、むしろ活性タンパク分解酵素ドメインに観察されるように3対のジスルフィド結合を形成するために適した折りたたみを促進していることを、示している、Haniu, M. et al, 2000, Journal of Biological Chemistry 275: 21099-21106。プロ-部分の接合点からN-末端の方向に進むと、骨格は活性部位の裂け目の一端から延びて中心に向かい、次いでHong et al., 2000 に記述されているように活性部位の「覆い」の上を覆っている。それはさらに活性部位の逆側へ続き、そして折り返し、二つのへリックスにより出発点の近くに戻っている。その全体構造はそれが由来したペプシノーゲンプロ-部分にいくらか類似しているが、下記のような重要な違いがある。β-セクレターゼ結晶構造とプロ-酵素モデルを重ね合わせてみると、プロ-部分の存在に誘発された側鎖の位置の違いが認められ、そしてエネルギー極小化によると思われる遠位の位置のわずかな違いが認められる。
【００３３】
そのプロ-ペプチドによる酵素の不活化は一般的に、触媒部位の物理的阻害により基質の接近を妨げるためと考えられている。アスパラギン酸タンパク分解酵素の場合には、プロ-部分は2個のアスパラギン酸の間にある触媒に必要な水分子を破壊することができる。ペプシノーゲン、プロ-ガストリクシン、及びβ-セクレターゼプロ-酵素モデルの3次元構造の比較により、この3酵素全てのプロ-部分は触媒部位上を覆い、そのため基質の接近を阻害することが示された。しかしながら、タンパク分子運動の動態により、プロ-部分の周期的変性が基質のプロセッシングを可能にする触媒裂溝を露出させうる。しかし、β-セクレターゼプロ-酵素のみが基質プロセッシングを生じることが知られているので、このプロ-部分の位置に関して何か独特なものがある。
【００３４】
既に述べたように、アスパラギン酸タンパク分解酵素による基質アミド結合の加水分解は水分子の関与を必要とする（Silverman, R.B., 2000, The Organic Chemistry of Enzyme-Catalyzed Reactions, Chapter 2, Academic Press, San Diego）。触媒反応は、(i) 活性部位の二個のAsp残基（すなわち、β-セクレターゼの場合にAsp-93及びAsp-289）のβ-カルボキシル基は水素結合を形成して水分子を活性化するためにきわめて接近させられる；(ii)切れ易いペプチド結合のカルボニル炭素原子への活性化された水分子の求核攻撃により四面体中間体を形成する；(iii)四面体中間体の分解により切断ペプチド及び活性酵素の生成物を生じる、を含む。従って、アスパラギン酸タンパク分解酵素によりペプチド結合が切断される以前に、活性部位にある2個のAsp残基は最初に水分子と4個の水素結合を形成することにより水分子を活性化しなければならない。
【００３５】
しかし、ペプシノーゲン（3psg）の場合には、2個の活性部位Asp,すなわち、Asp-91及びAsp-274（図2）、は既に2個の塩橋によりプロ-ペプチドのLys-51と結合を形成している：Hartsuck  et al.により測定されたX線構造に明らかに示されているように、一つはAsp-91のOδ1及びLys-51のNζの間、及びもう一つはAsp-274のOδ2及びLys-51のNζの間。よく知られているように、塩橋は水素結合より強い。これが水分子を活性化する2個の活性化部位Aspを乱しているのであろう、そしてそのためにプロ-ペプチド部分の存在のためにペプチド結合を切断するペプシノーゲンの活性が阻害される。類似の状態はプロガストリクシン（1htr）の場合にも生じ、その場合には2個の活性部位Asp残基、すなわちAsp-91及びAsp-276、はプロ-ペプチドのLys-53と2個の塩橋を形成している：Ivanov et al, 1990, Biochim. Biophys. Acta, 1040: 308-310により測定されたX線構造により示されているように、一つはAsp-91のOδ1及びLys-53のNζの間、及びもう一つはAsp-276のOδ2及びLys-53のNζの間。従って、アスパラギン酸との塩橋はプロ-部分の位置を保って、触媒用の水分子が適切な位置に存在することを妨げる「固定」機構と見ることもできる。
【００３６】
β-セクレターゼチモーゲンモデルにおいて微細環境はさらに異なっており、そこではプロ-部分と2個の活性部位Asp残基、すなわちAsp-93及びAsp-289（図2）との間の塩橋は認められない。モデルによると、配列整列（図2）及び3次元構造の両者において他の2個のプロ-酵素構造におけるLys位置に対応するのはPro-54 である。図2におけるBACE（pbsz）のナンバリングは21アミノ酸シグナル配列を含んでいるので、図2のPro-54は図1のPro-33と同じ残基である。しかし、プロリン側鎖は塩橋を形成することができない。従って、β-セクレターゼチモーゲンの場合には、「固定」機構がなく、触媒用水分子の位置にプロ-部分の側鎖は存在しない。
【００３７】
従って、このモデルによると、プロ-ペプチド部分の存在によりβ-セクレターゼ活性を完全に減少させることはできない。このような構造上の観察は、次の独立した2グループの最近の実験的観察により支持されている。Shi et al., 2001, J. Biol. Chem. 276: 10366-10373，は、ポリペプチド基質を使用して検定した場合に、プロ-部分が完全なβ-セクレターゼのk(cat)/K(m)はβ-セクレターゼよりわずか2.3倍低下するのみであることを、観察した。彼らは、β-セクレターゼのプロ-ドメインは「厳密なチモーゲンのように活性を抑制せず、活性タンパク分解酵素ドメインの適切な折りたたみを促進するようにさえ見える」、と結論した。Benjannet et al., (2001  J. Biol. Chem. 276: 10879-10887)は、「プロ-BACEはスエーデン型突然変異βAPPSWβ-セクレターゼ産物C99を相当量生産することができる」ので、プロ-ドメインはBACE活性部位にはほとんど影響しない、ことを観察した。
【００３８】
プロ-BACEモデルにおいて「固定機構」が欠如していることはプロ-酵素の異常な活性の説明を可能にはするが、この仮説を検証するための実験計画は、プロ-BACEモデルにおけるPro54（図3）、またはPro33（図1）、はその残基の領域において、2個の比較対照構造（3psg及び1htr）において認められるものに比較して、かなり異なる骨格曲線を与えるという事実のために複雑である。この観察結果はプロリン残基の環状構造の立体的制約によることが予想されるであろう。同様に、プロ-BACEにおけるプロリンからリシンへの突然変異も、その領域における骨格の性質を変化させることが期待されるであろう。
【００３９】
下記実験に示されるように、P33K-BACEは本質的にBACEと同じ活性を有している。このことは、BACEプロ-部分の実験的修飾による仮説の確証のためにPro33Lys突然変異のみならず、近傍プロ-部分骨格を比較対照プロ-酵素により近似させるような1またはそれ以上の追加の残基を含める必要があるであろう。
【００４０】
組換えP33K-BACEを含め、組換えBACEを、例えば、E. coliまたはその他の適当な宿主細胞中に、P33K-BACEをコードするcDNAの少なくとも一部を含む、例えば、少なくとも図2に示したアミノ酸配列の部分をコードする構築を発現することにより、生産することができる。この構築は、必要に応じて、例えば、この組換えポリペプチドの精製または発現を支援するその他のヌクレオチド配列も含むことができる。
【００４１】
P33K-BACEを発現するためのポリヌクレオチド構築は、シグナルペプチド、膜貫通ドメイン及び/またはC-末端テイルまたはそれらの部分をコードするヌクレオチドを含むことができる。その構築は定法を使用して当業者により組み立てることができる。BACEの完全なヌクレオチド配列は、例えば、Vassar et al, Science 286: 7353-741 (1999)及びここに引用して取り入れた公開PCTの中に見出すことができる。さらに、GenBank登録番号No. NM 012104は多数のBACE配列の既知対立遺伝子を記述している。さらに、目的の生物体において配列の発現をよくするために、または他の理由により、「沈黙」ヌクレオチド置換をBACE構築配列に導入することができる。従って、遺伝子コードの縮重のために、BACEのポリペプチド配列は非常に多数のポリヌクレオチド配列から発現することができる。本発明はP33K-BACEをコードするいずれのポリヌクレオチド配列にも及ぶ。
【００４２】
E. coli中に発現した場合に、組換えP33K-BACEは細胞内に不溶型で蓄積し、細胞質中にフェーズ・ブライト封入体を生じる（封入体）。封入体中のタンパクは、還元型及び酸化型の両者の、タンパクの単量体及び多量体の混合物でありうる。
【００４３】
不溶性細胞試料から生物学的に活性な、可溶性タンパクを回収することを目的とする操作は、（1）細胞分解、（2）封入体の単離、（3）封入体からタンパクの可溶化、（4）可溶化タンパクの再生、（5）活性タンパクの精製、の段階を一般的に含む。これらの段階のそれぞれは以下の発明に関連して記述される。
【００４４】
P33K-BACEを生産するために有用な構築は、P33K-BACEポリペプチドの分泌部分を発現するように設計される。P33K-BACEポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現構築中に適当な転写または翻訳調節配列に作動的に連結することができる。調節配列には、転写プロモーター、オペレーター、エンハンサー、mRNAリボソーム結合部位、及び転写または翻訳を調節するその他の配列、が含まれる。ヌクレオチド配列は、調節配列がP33K-BACEをコードするポリヌクレオチドと機能的に関係している場合に、「作動的に連結」している。従って、プロモーターヌクレオチド配列がP33K-BACE配列の転写を指令するならば、プロモーターヌクレオチド配列はP33K-BACEをコードするポリヌクレオチドに作動的に連結している。
【００４５】
ポリヌクレオチドはE. coli中に発現するための適当な発現ベクターの中にクローニングされる。一般的に、発現ベクターは選別マーカー及びE. coli中で増殖するための複製起点を含むであろう。発現ベクターは一般的に一つまたはそれ以上の表現型選別マーカー遺伝子を含む。そのような遺伝子は一般的に、例えば、抗生物質耐性を付与するか、または栄養要求性を与えるタンパクをコードしている。
【００４６】
ポリヌクレオチドは、原核性宿主における組換えポリペプチドの発現を促進するために、例えば、E. coliにおける発現のために、N-末端にメチオニンを有するP33K-BACEポリペプチドをコードすることができる。このN-末端メチオニンは発現したP33K-BACEポリペプチドから任意に切断することができる。ポリヌクレオチドは、E. coliにおける発現を促進するためにP33K-BACEポリペプチドに追加したその他のN-末端アミノ酸もコードすることができる。そのようなアミノ酸としては、限定はしないが、T7リーダー配列、T7-カスパーゼ8リーダー配列、及び抗体に結合することができるT7-タグMASMTGGQQMGR [SEQ ID NO: 9]、またはニッケルに結合することにより精製することができる6-ヒスチジンタグ (His)6 、のような精製用の既知タグが含まれる。その他の有用なペプチドタグとしては、チオレドキシンタグ、ヘマグルチニンタグ、及びGSTタグがある。これら及びその他のアミノ酸タグはP33K-BACEをコードするポリヌクレオチドのいずれかの末端に付け加えたポリヌクレオチドによりコードすることができる。
【００４７】
発現構築のポリヌクレオチドは、C-末端細胞質テイル、膜貫通ドメイン、膜に近い領域、の全てまたは部分またはそれらの組合せの除去により短縮されたP33K-BACEポリペプチドをコードすることができる。発現構築は、必要があれば、発現したタンパクの精製を改善するために、または酵素の発現を支援するために、選択した酵素の切断部位をコードすることもできる。
【００４８】
膜貫通ドメイン及び細胞質テイル領域が除かれている活性組換えBACEタンパクはS432で終わることができることが発見された。これが可溶性型のBACEであり、すなわち、膜に結合していない型である。従って、以下の例において、既知活性組換えBACEと活性を比較するP33K-BACEはS432で終わっている。
【００４９】
効率の良い発現のために、位置指定突然変異誘起のような技術を使用して、P33K-BACEをコードするポリヌクレオチド配列の一つまたはそれ以上のコドンを修飾して、組換えタンパクの効率の良いクローニングまたは発現を妨害することが知られている強い2次構造のGC-リッチ領域を除去することができる。例えば、公開されているコドン選択表に従って、E. coliにおける発現のためにコドンを最適化することができる。図4に示す下線付きヌクレオチドは望ましいコドン変換を示す。
【００５０】
P33K-BACEをコードするポリヌクレオチドを含む発現構築は、P33K-BACEタンパクを生産するために、細菌、例えば、E. coliを形質転換するために使用することができる。タンパクの生産は、ベクター中に使用した調節配列によって、誘導的にまたは構成的にすることができる。例えば、発現構築を細菌宿主、例えばE. coli BL21 codon plus (DE3)RP (Stratagene)に導入し、適当な培地、例えば100μg/mlアンピシリン及び34μg/mlクロラムフェニコールを添加したLuriaブロス中で増殖する。細胞が目的の濃度に増殖したときに、一般的には、550 nmにおける培養の吸光度が0.5と0.6の間になったときに、発現は誘導される。例えば、T7またはT5 lacプロモーターは、培地にIPTG（例えば、約1 mMの最終濃度まで）を加えることにより作動的に連結したP33JK-BACEポリヌクレオチドの発現を開始する。誘導の後、例えば、約3時間後、細胞ペレットを回収し、後の酵素精製用に、一般的には−70℃で保存することができる。
【００５１】
発現した組換え酵素は細胞内に、封入体として、不溶型で蓄積する。不溶性細胞試料から酵素を回収するために、細菌細胞を細菌細胞培養からペレットとし、分解し、そして封入体を分解細胞から単離する。次いで組換え酵素を単離した封入体から単離する。
【００５２】
一般的に、タンパク封入体を得るための細胞の分解は、機械的及び化学的技術を含む多数の既知方法を使用して実施することができる。超音波処理及び凍結融解技術は一般的に大量の細胞を破壊するには実用的でない。しかし、フレンチプレスまたはRannie装置のような、細胞を破壊するのに圧差を使用する市販装置は、処理容量がこれらの装置と同じかそれより大きいならば、使用できる。界面活性剤による可溶化は一般的に実用的な方法ではない、その理由は界面活性剤の除去が困難な問題を生じることがあり、そして続く再生操作に影響するであろう。界面活性剤は封入体から目的のタンパクの一部または全部と共に目的外タンパク及び核酸を可溶化することがあり、従って望ましい選択肢ではない。細胞を分解した後に、共存するまたは封入体に混入した目的外タンパクを除去するために封入体を洗うことができる。除去されない場合には、その混入不純物は酵素の再生を阻害または妨害するであろう。
【００５３】
例えば、封入体を得るために、細菌細胞を、塩化ナトリウムのような塩、EDTAのようなキレート剤、または両者を含む適当な緩衝液中に懸濁することができる。次いで懸濁細胞を、例えば、フレンチプレスまたはRannie装置を使用して分解する。得られた不溶性細胞試料を緩衝液で洗い、そして凍結して-20℃で終夜保存することができる。
【００５４】
タンパク凝集（封入体）を可溶化し、ついで活性タンパクを得るために再生する。P33K-BACEを可溶化するために使用できる試薬は、一般的に6から8 Mの濃度の尿素、塩酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン、などである。ベータ-メルカプトエタノール（BME）、グルタチオン（ガンマ-Glu-Cys-Gly;またはGSH, Sigma Cat. No. G-6529）;またはDTT（ジチオトレイトール、Sigma Cat. No. D-0632）などのような還元剤も使用することができる。これらの還元剤は、還元型（ランダムコイル）で単離タンパクを提供するために、別々にまたは併用して使用することができる。これらの試薬は二量体及び高分子量多量体の存在を減少させ、そして、例えば、タンパク内のシステイン残基の還元の結果として不適当な折りたたみを減少させ、またはタンパクの凝集を減少させることができる。
【００５５】
封入体中に存在するP33K-BACEの可溶化は、高いpH（約pH 10-11）において、BMEのような還元剤の存在下に可溶化試薬と処理することにより行うことができる。例えば、不溶性細胞試料は8 M尿素, 1 mM EDTA, 1 mMグリシン, 100 mM Tris塩基 (pH 10.1-10.6),及び 100 mM BMEで可溶化することができる。検体の分割液を、例えば、10倍に希釈し、遠心分離し、280 nmにおける光学密度（OD）を測定する。検体を希釈してODを約5.0に調節し、pHを約10.1とする。次いで検体を還元剤を含まない8 M尿素緩衝液で希釈する。その後、還元剤、例えば、BMEを加えて、還元剤の合計モル濃度を約10 mMとする。ジチオトレイトール（DTT）、還元グルタチオン（GSH）及び酸化グルタチオン（GSSG）を溶液に加えて、10 mM DTT, 1 mM GSH, 及び0.1 mM GSSGの最終濃度とし、そして溶液のpHを10.3-10.5に調節する。この操作により還元型のP33K-BACEが得られる。
【００５６】
その他に、10 mM Tris 緩衝液(pH 8), 1 mM EDTA (TE)で洗うことにより、不溶性細胞試料は可溶化され、そして還元型で酵素が得られる。次いで封入体を8 M尿素, 100 mM AMPSO (pH 10.5-10.8), 1 mM グリシン, 1 mM EDTA,及び100 mM BMEで抽出する。AMPSOは3-[(1,1-ジメチル-2-ヒドロキシエチル)アミノ]-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸（Sigma Cat. No. A1911）である。遠心分離の後、緩衝液を加えて上清のタンパク濃度をA280において約5.0に調節することができる。次いでタンパクを8 M尿素, 100 mM AMPSO, 1 mM グリシン, 1 mM EDTA、及び濃度を10 mMに調節した BMEで希釈する。AMPSOを他の緩衝溶液、例えば、CAPSまたはTrisに置換することができる。CAPSは3-[シクロヘキシルアミノ]-1-プロパンスルホン酸（Sigma Cat. No. C-2632）である。
【００５７】
タンパクを可溶化した後、正しい立体構造に再生し、活性酵素を得ることができる。典型的に、発現した組換え酵素の再生は、例えば、透析または希釈により、可溶化試薬の除去及び水性緩衝液への置換により行うことができる。一般的に、ジスルフィド架橋のあるタンパクについては、還元タンパクの酸化は再生に先立ってまたは同時に生じる。
【００５８】
本発明に従うと、還元タンパクP33K-BACEは、冷却した水のような水性溶液中に酵素を、任意に溶液ml当り約10μgから30μgのP33K-BACEの最終濃度に、相当に希釈（20から50倍、一般的に20から30倍）することにより再生される。一般的に、4℃から15℃の温度の水が望ましい。
【００５９】
一般的に、組換えによって発現したP33K-BACEの再生は希釈した酵素溶液（約pH10-11）を、例えば、冷却室または冷蔵庫中約4℃-15℃に約3-5日置くことにより行われる。
【００６０】
例えば、下記例に示すように、可溶化した組換えP33K-BACEは、任意に水ml当り約10マイクログラムから30マイクログラムのP33K-BACEの最終濃度に、そして一般的にpH 約10.5-10.8に、水で希釈（20-25倍）することができる。この混合物を約4℃から15℃の温度で数日間（3-5日）維持し、そして定期的に酵素活性を検定する。活性検定は、希釈段階開始後約20から24時間後に開始し、この維持期間実施する。
【００６１】
再生した酵素は、標準的な液体クロマトグラフィー技術、例えば、カチオンまたはアニオン交換クロマトグラフィー（例えば、Amersham Pharmacia Biotechから入手可能）、疎水性相互作用（例えば、Toso Haasから入手可能）、色素相互作用（例えば、Sigmaから入手可能）、セラミックヒドロキシアパタイト（例えば、Bio-Radから入手可能）、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、活性酵素に結合する阻害物質を使用する）、またはサイズ排除クロマトグラフィー（例えば、Sephacryl-S100または S200カラム精製並びにBioRad, Toso Haas, Sigma, 及びAmersham Pharmacia Biotechの樹脂）を使用して精製することができる。これらの精製技術の一つまたは組合せを、本発明に従って精製、組換えP33K-BACEを得るために使用することができる。例えば、Q-セファロース、モノ-Q、またはResource  Qカラムを使用するアニオン交換クロマトグラフィーは有用な分離方法である。
【００６２】
再生、精製組換えP33K-BACEの活性は、基質の切断をすることができる適当な条件下に再生酵素と適当な基質をインキュベートすることにより測定することができる。基質は、切断反応を検出できるような検出マーカー、例えば、蛍光標識で標識することができる。
【００６３】
適する基質はP33K-BACE切断部位を含むペプチドである。例えば、合成ペプチド（SEISY-EVEFRWKK）（SEQ ID NO: 10）及び（GLTNIKTEEISEISY-EVEFRWKK）（SEQ ID NO: 11）は組換えP33K-BACEにより切断することができる（「-」により示した位置で）。その他のBACE切断に適した基質としては、非限定的例として、（SEVNL-DAEFRWKK）（SEQ ID NO: 12）及びAPPスエーデン型突然変異を含む（GLTNIKTEEISEVNL-DAEFRWKK）（SEQ ID NO: 13）が含まれる。
【００６４】
この基質は切断を可視化することができる適当な検出マーカーで標識することができる。組換えによって調製されたP33K-BACEの活性を検出する検定は検出マーカーの残存または遊離を測定することができる。適当な検出マーカーとしては、例えば、放射活性、酵素活性、化学発光、または蛍光標識がある。一部の態様において、基質の切断後に検出力が増大する内部消去標識を含むことができる。基質を修飾して、限定はしないが、7-アミノ-4-メチルクマリン及びジニトロフェノールを含めた蛍光基および消去基の対を導入することができ、そしてP33K-BACEによる基質の切断により、蛍光基と消去基の物理的分離の結果として、蛍光が増加する。その他の蛍光基および消去基の対としてはbodipy-テトラメチルローダミン及びQSY-5（Molecular Probes, Inc）がある。
【００６５】
この態様の変法において、ビオチンまたはその他の適当なタグをペプチドの一方の末端に結合して検定プレートの基質に固定することができる、そしてもう一方の末端に蛍光基をおくことができる。有用な蛍光基としてはここに列記したもの、並びにW8044（EG&G Wallac, Inc.）のようなユーロピウム標識がある。一つの代表的な標識はシステイン残基に結合することができるオレゴングリーンである。P33K-BACEによる基質の切断は蛍光基またはその他のタグをプレートから放出し、残留する蛍光の増加を検出することができる。
【００６６】
検出マーカーのその他の例は、基質に結合したレポータータンパクアミノ酸配列である。代表的なレポータータンパクとしては、蛍光タンパク（例えば、緑色蛍光タンパク、ルシフェラーゼ、など）または比色測定可能な切断産物を生産する基質の切断に使用される酵素がある。また通常定量的検定用の抗原決定基として使用されるタグ配列も包含される。望ましくは、検出マーカーはP33K-BACEと基質の結合、または続く基質の切断を妨害しない。例えば、検出マーカーはP33K-BACE活性を妨害しない適当な大きさで提供される。一部の態様において、スペーサーを使用して検出マーカーを基質に結合することができる。
【００６７】
例1：P33K-BACEのクローニング
E. coliにおいて組換えP33K-BACEタンパクを生産するための発現構築は、pET11a-BACEと呼ばれる既存構築から位置指定突然変異誘起により調製した。この構築は次の配列をコードするヌクレオチドを含んでいる：T7タグ(MASMTGGQQMGR)-GSM-BACE(A-8-S432)、これで発現するBACEフラグメントは図1に示す配列に比較してN-末端及びC-末端の両領域で短縮されている。挿入は膜貫通ドメイン及びリーダー配列の13 N-末端残基を欠失したタンパクをコードしている。メチオニンコドンは最初のBACEコドンに隣接して挿入されており、BamHIによるBACE挿入の除去及びT7タグのないBACE配列の発現のための潜在的再クローニングを促進している。しかし、このメチオニン残基は、T7 タグが含まれている場合には、必要ない。BACE cDNA配列はE. coliにおける発現のために望ましいコドンを含んでいる。これらのコドン変換は図4Aにおいて下線がついてる。
【００６８】
pET11a-BACEは当業者によく知られた技術により調製することができる。挿入は全長BACE cDNAからPCRにより得られる。PCRプライマーは、Ala-8 からSer432までのBACE配列を増幅し、pET11aベクター（Novagen, Madison, Wisconsin）に挿入するためのBamHI部位を含むように設計される。使用しうるPCRプライマーの例は：
2005531292.tif 000002
【００６９】
PCR産物をゲル精製し、制限酵素で消化し、そしてベクターpET11aの相当部位に連結する。このベクターはT7 lacプロモーターを含み、IPTGの添加により発現を誘導することができる。
【００７０】
コドン変換（図4Aの下線付き部分）は、オリゴヌクレオチドプライマー及びPCR及びP33Kの突然変異誘起に関する下記方法を使用する位置指定突然変異誘起により導入することができる。これらの変換はE. coliにおけるBACEの良好な発現には必要ではないが、稀なコドンの除去により再生可能なタンパクの収量を改善することができる。
【００７１】
本発明のこの態様において、pET11a-BACE構築は2個の既存クローンに由来する。一つのクローンは、pET11a-BACE-Jと呼ばれ、望ましいコドン変換を含んでいるが、2個のC-末端システインを欠失している。pQE80L-BACE（MRGS(H)6GSGSIGTD-BACE:T1-S432）と呼ばれているもう一つのクローンは必要なシステイン(6)を全て含んでいるが、Ala-8からGly-1を欠失している（pQE80L, Qiagen）。2個の重複するcDNAフラグメントをPCRにより発生させた。BACEをコードするポリヌクレオチド、図4A及び4Bに示す37から880、をpET11a-BACE-Jから増幅した、これはpQE80L-BACE（BACEのこの位置には存在しない終結コドンを含むヌクレオチド861-1368）から増幅した残りのBACE配列と20ヌクレオチド重複している。
【００７２】
pET11a-BACE-J のBACEをコードするポリヌクレオチド37から880の増幅用PCRプライマーは：
2005531292.tif 000003
プライマーPF3は図4Aに示したものに加えて望ましいコドン変換を含んでいる。
【００７３】
残りのC-末端アミノ酸を含むpQE80L-BACEの重複部分は下記プライマーを使用して別のPCR反応において増幅した：
2005531292.tif 000004
【００７４】
PCR条件は次の通りであった：変性の最初の1サイクルは95℃，30秒、30サイクルの95℃で30秒間の変性、60℃で30秒間のアニーリング、72℃で2分間のエクステンション、次いで72℃，5分間の1サイクル。反応組成は：1Xクローン化Pfuポリメラーゼ緩衝液（Stratagene）、100μMの各dNTP, 100 ngの各プライマー、10 ng鋳型DNA,及び2Tl（20単位）のクローン化Pfu DNAポリメラーゼ。
【００７５】
これら二つのPCR増幅から得られた産物を、外部プライマーPF3 [SEQ ID NO:16]及びPR5 [SEQ ID NO:18]を使用する第3のPCRにおいて一緒に連結した。この最終産物をゲル精製し、BamHIで消化し、ベクターpET11aの相当部位に連結した。
【００７６】
P33K-BACEを発現する構築は、下記のようなプライマーPF8及びPF9を使用するPCRによりpET11a-BACE中にP33K突然変異を導入することにより得た：
2005531292.tif 000005
アミノ酸位置33のプロリンをリシンに変換するためのコドンに下線をつけた。リシンはAAGによってもコードされる。従って、順及び逆コドンはそれぞれAAG及びCTTのこともある。
【００７７】
これら二つのPCR増幅から得られた産物を下記pET11aベクター用の外部プライマーを使用する第3のPCR増幅により一緒に連結した：
2005531292.tif 000006
この最終産物をゲル精製し、BamHIで消化し、ベクターpET11aの相当部位に連結した。pET11a-P33K-BACE構築の完全DNA及びアミノ酸配列を図4A及び4Bに示す。最初の15アミノ酸（下線付き）はベクターのT7 タグに相当し、BamHIクローニング部位並びに追加のメチオニンを含む。E. coliにおける発現に望ましいコドン変換を太字で示す。
【００７８】
例2．細胞培養及び封入体の回収
増殖及びDNA単離のために連結したDNAをE. coli DH5αに導入した。生成したDNAを両鎖について完全に配列解析し、次いで発現のためにE. coli BL21 CodonPlus (DE3) Rpに導入した。100μg/mlアンピシリン及び34μg/mlクロラムフェニコールを加えたLuriaブロス（LB）、pH 7.5,中で37℃及び200 rpm（2.5インチ振幅）で、細胞を増殖した。構築のグリセロール保存の1ループを培地に接種し、A550=0.5-0.6になるまでインキュベートした。細胞を遠心分離により採取し、新鮮培地に再懸濁し、1:100に希釈して2次培養の種として使用した。細胞密度がA550=0.5-0.6に達したときに、細胞を室温にける遠心分離によって回収し、次いで再びアンピシリン及びクロラムフェニコールを含む新鮮LBに同じ濃度に再懸濁した。
【００７９】
IPTGを最終濃度1 mMまで加えることによりP33K-BACEの発現を誘導した。組換えタンパクの発現は誘導後3時間継続した（A550=1.8-2.0）。細胞を遠心分離により回収し、-80℃で保存した。
【００８０】
組換えタンパクの発現レベル及び局在を調べるために、遠心分離によって回収した細胞（細胞ペースト）を元の培養濃度の1/10にTE（10 mM Tris HCl pH 8.0, 1 mM EDTA）に再懸濁し、超音波処理した。可溶性タンパクフラクションを細胞破片及び不溶性タンパク不溶性タンパクから、10,000ｘｇ15分間の遠心分離により分離した。各フラクションのタンパクをSDS-PAGEにより分析した。
【００８１】
封入体を得るために、培養細胞を遠心分離して細胞ペレットにした。細胞培養1.0リットルあたりの細胞ペレットの重量を測定した。細胞ペレットの湿重量は2.25 gであった。細胞ペレットを20 ml TEに再懸濁した。この再懸濁細胞ペレットを16,000 psiのフレンチプレスにかけた。得られた溶液を6000 rpm 30分間、次いでSorvall SS34ローター中2900 rpm 30分間遠心分離した。ペレットを保存のために−20℃に凍結し、後に4 mlの8 M尿素, 100 mM AMPSO, 1 mM グリシン, 1 mM EDTA,及び 100 mM BME, pH 10.5-10.8に懸濁した。Sorvall SS34ローター中12,900 rpm 40分間の遠心分離の後、上清のタンパク濃度を上記緩衝液（BMEを含まず）で50倍に希釈し、A280を約5.0-7.0にした。
【００８２】
再懸濁したタンパクを約1700 mlの冷却水で20-25倍に希釈し、数滴のHClを加えてpHを10.1に調節してP33K-BACEを再生した。精製の前に、この希釈液を約3週間4-15℃で保存した。
【００８３】
例3．再生P33K-BACE酵素の精製
最初の精製段階はQ-Sepharose（登録商標）FAST FLOWカラムを使用して、酵素検体を濃縮し、この段階で大量に存在する核酸を除去する。（BACEタンパク溶液のイオン強度とマッチさせるために）伝導度を0.9 mMhosにするために10 mM Tris (pH 8.2), 0.4 M尿素及びNaClで予め平衡した10 mlのQ-Sepharose(登録商標)  FAST FLOWカラムに、1700 mlの酵素検体を負荷した。カラムを平衡するのに使用したのと同じ緩衝液に0-1.0 M NaClの直線グラジエントを適用した。5.5 mlのフラクションを集めた。タンパクフラクションの溶出液は氷室に保存した。
【００８４】
第2の精製段階は親和性による精製である。アフィニティーカラムは、メーカー説明書に従って、1 mg/mgゲルの量でEconoカラム（BioRad）中SulfoLink（登録商標）カップリングゲル（Pierce, Cat. No. 204011）のml当り１mgの還元インヒビターI-1（下記に示す）をカップリングすることにより作成した。
2005531292.tif 000007
【００８５】
Q-Sepharose（登録商標）FAST FLOW精製から得られた36 mlのBACE溶液を9 mlの1 M酢酸ナトリウム緩衝液、pH 4.5、に加えた。眼に見える沈殿は認められなかった。次いで検体を200 mM酢酸ナトリウム緩衝液、pH 4.5、で予め平衡したアフィニティーカラムに負荷した。アフィニティーカラムからの溶出はpH 8.5において100 mMホウ酸ナトリウムで行った。溶出検体、30 ml、の活性を測定し、SDS-PAGEで分析した。
【００８６】
例4．CHO細胞におけるBACEの発現（対照）
E. coliにおいて発現し、そして例1-3に示すように調製されたP33K-BACEの活性検定の対照を提供するために、下記表1に示すアミノ酸配列をコードするBACE構築（Asp2-2L-TM-His6）をCHO細胞中に発現し、約75リットルの馴化培地から精製した。精製操作は、タンジェンシャルフロー濃縮、硫酸アンモニウム沈殿、ニッケルアフィニティーカラム、及びアフィニティークロマトグラフィー（I-1 アフィニティー）の連続段階から成り立っていた。しかし、この精製タンパクは、図1のナンバリングによるT1QHGIRL......及びE25TDEEPEEPG......で始まるイソフォームの50:50の混合物を含んでいる。この2個のイソフォームは未だ不明のタンパク分解酵素による翻訳後切断により発生する。P33K-BACEをBACEポリヌクレオチドの位置指定突然変異誘起によりCHO細胞内に発現できることは容易に予想される。
2005531292.tif 000008
【００８７】
例5．活性検定
上記例に従ってE. coli中に発現したP33K-BACEの活性を、上記のように調製されたP33K突然変異のないヒトBACEの活性、及びCHO細胞中に発現したヒトBACEと比較した。その結果を表2に示す。
【００８８】
BACE活性を検定するために、特記しない限り以下の活性検定条件を使用した:20μl  1M酢酸ナトリウム（NaOAc）, pH 5.0 ; 125μl  H2O；50μl  BACE検体、5-10 pmole タンパク含有；及び5μl 1 mM基質S-1（SEQ ID NO:10）。
【００８９】
200μl検定反応液を37℃で1-2時間インキュベートした。活性は、組換えBACEによる基質S-1の切断による蛍光（トリプトファン蛍光）産物の遊離により発生する蛍光ピーク面積として示した。反応は4％TFA水溶液100μlで停止した。切断産物を分離して組換えBACEの活性を測定するために、反応混合物の50μlを、88％試薬A(0.1％TFA水溶液)、12％試薬B（0.1％TFAアセトニトリル溶液）で予め平衡したAlltech Rocket（登録商標）カラム（内径7mm x 長さ53 mm , C18, 3 μm）を装着したHewlett Packard Model 1100 HPLCに注入した。このカラムの流速は毎分3 mlであった。
2005531292.tif 000009
【００９０】
上記の例は請求した発明のある態様を説明するものであり、範囲または精神について本発明を制限するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】図1はヒトBACE  [SEQ ID NO: 1]のアミノ酸配列を示す。
【図２】図2はP33K-BACEポリペプチド [SEQ ID NO: 2]の一態様のアミノ酸配列を示す。
【図３】図3は、β-セクレターゼチモーゲン（pbsz）[SEQ ID NO: 3], β-セクレターゼ（1fkn）[SEQ ID NO:4], プロガストリクシン(1htr) [SEQ ID NO: 5]及びペプシノーゲン（3psg） [SEQ ID NO: 6]の配列整列を示す。線は1fknに認められるジスルフィド結合の形成に関与する残基対を示す。アスパラギン酸タンパク分解酵素ファミリーの活性部位の保存残基を示すコードは、pbszについては残基93−95及び残基289-291、3psgについては残基91−93及び残基274-276、及び1htr については残基91−93及び残基276-278である。シグナルペプチド部分（pbszについて残基1−21、1htrについて残基1−16、及び3psgについて残基1−15）は、分泌過程の間にシグナルペプチターゼにより切り離されてしまうので、整列操作に含めなかった。
【図４Ａ】図4Aは、pET11a-P33K-BACE構築から発現された修飾組換えBACEのDNA及び推定アミノ酸配列である：アミノ酸配列 [SEQ ID NO: 7]; DNA配列[SEQ ID NO: 8]。
【図４Ｂ】図4Bは、pET11a-P33K-BACE構築から発現された修飾組換えBACEのDNA及び推定アミノ酸配列である：アミノ酸配列 [SEQ ID NO: 7]; DNA配列[SEQ ID NO: 8]。
【図１】
2005531292.tif 000010
【図２】
2005531292.tif 000011
【図３】
2005531292.tif 000012
【図４Ａ】
2005531292.tif 000013
【図４Ｂ】
2005531292.tif 000014