(57)【要約】本発明は、ビタミン-マイトマイシン結合体、病原性細胞を有する宿主動物において、その病原性細胞集団を選択的に除去するための該結合体の使用法、および、該結合体の調製方法に関する。この結合体は一般式Ｂ-Ｌ-Ｘで表される。ここで、Ｂ基は、病原性細胞集団によって単一で発現するか、過剰に発現するか、または、選択的に発現する表在性ビタミンレセプターに結合するビタミン、または、そのアナログもしくはその誘導体であり、L基は開裂可能なリンカーを含み、Ｘ基は、マイトマイシン化合物、または、そのアナログもしくはその誘導体を含む。例えば、化学療法剤のような追加の治療薬剤を、この結合体と組み合わせて投与し得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般式
Ｂ−Ｌ−Ｘ
の結合体であって、
該Ｂ基は、病原性細胞集団において単一で発現するか、過剰に発現するか、または、選択的に発現する表在性ビタミンレセプターに結合するビタミン、または、そのアナログもしくはその誘導体であり、
該Ｌ基は、開裂可能なリンカーを含み、かつ、
該Ｘ基は、マイトマイシン化合物、または、そのアナログもしくはその誘導体を含む、
ことを特徴とする結合体。
【請求項２】
前記ビタミンが、葉酸塩、リボフラビン、チアミン、ビオチン、ビタミンＢ12およびそれらのアナログもしくはそれらの誘導体からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の結合体。
【請求項３】
前記リンカーが、還元化状態において開裂されることを特徴とする、請求項１に記載の結合体。
【請求項４】
前記リンカーが、ジスルフィド基であることを特徴とする、請求項３に記載の結合体。
【請求項５】
前記マイトマイシンが、マイトマイシンＡ、マイトマイシンＢ、マイトマイシンＣ、マイトマイシンＤ、マイトマイシンＥ、マイトマイシンＦ、および、ポルフィロマイシンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の結合体。
【請求項６】
病原性細胞集団の細胞がビタミンに対する表在性結合部位を有する、該病原性細胞集団を有する宿主動物において、該病原性細胞集団を選択的に除去する方法であって、
以下の一般式
Ｂ−Ｌ−Ｘ
の結合体を該宿主に投与する工程と、
該病原性細胞集団を選択的に除去する工程を包含し、
該Ｂ基は、該病原性細胞集団において単一で発現するか、過剰に発現するか、または、選択的に発現する表在性ビタミンレセプターに結合するビタミン、または、そのアナログもしくはその誘導体であり、
該Ｌ基は、開裂可能なリンカーを含み、かつ
該Ｘ基は、マイトマイシン化合物、または、そのアナログもしくはその誘導体を含む、
ことを特徴とする方法。
【請求項７】
前記ビタミンが、葉酸塩、リボフラビン、チアミン、ビオチン、ビタミンＢ12、および、それらのアナログもしくはそれらの誘導体からなる群から選択されることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記リンカーが、還元化状態において開裂されることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記リンカーが、ジスルフィド基であることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記マイトマイシンが、マイトマイシンＡ、マイトマイシンＢ、マイトマイシンＣ、マイトマイシンＤ、マイトマイシンＥ、マイトマイシンＦ、および、ポルフィロマイシンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記病原性細胞集団が、癌細胞集団であることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
細胞傷害剤、腫瘍侵入促進剤、化学療法剤、細胞傷害性免疫細胞、および、内因性免疫応答を刺激し得る化合物からなる群から選択される治療因子を、前記宿主に投与する工程をさらに包含することを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
前記治療因子が、化学療法剤であることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記化学療法剤が、パクリタキセルであることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
以下の一般式
Ｂ−Ｌ−Ｘ
の結合体、および、その結合体に対して薬学的に受容可能なキャリアを含有する薬学組成物であって、
該Ｂ基は、病原性細胞集団において単一で発現するか、過剰に発現するか、または、選択的に発現する表在性ビタミンレセプターに結合するビタミン、または、そのアナログもしくはその誘導体であり、
該Ｌ基は、開裂可能なリンカーを含み、
該Ｘ基は、マイトマイシン化合物、または、そのアナログもしくはその誘導体を含む、
ことを特徴とする薬学組成物。
【請求項１６】
前記ビタミンが、葉酸塩、リボフラビン、チアミン、ビオチン、ビタミンＢ12、および、それらのアナログもしくはそれらの誘導体からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記リンカーが、還元化状態において開裂されることを特徴とする、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
前記リンカーが、ジスルフィド基であることを特徴とする、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記マイトマイシンが、マイトマイシンＡ、マイトマイシンＢ、マイトマイシンＣ、マイトマイシンＤ、マイトマイシンＥ、マイトマイシンＦ、および、ポルフィロマイシンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２０】
細胞傷害剤、腫瘍侵入促進剤、化学療法剤、および、内因性免疫応答を刺激し得る化合物からなる群から選択される治療因子をさらに含有することを特徴とする、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２１】
前記治療因子が、化学療法剤であることを特徴とする、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記化学療法剤が、パクリタキセルであることを特徴とする、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
下式
Ｂ−Ｌ−Ｘ
（式中、Ｂは、ビタミン、または、ビタミンレセプターに結合するそのアナログもしくはその誘導体であり、
Ｘは、マイトマイシン化合物、または、そのアナログもしくはその誘導体を含み、
Ｌは、ジスルフィド結合を含む2価のリンカーである。）
で表される生物活性結合体を調製する方法であって、
式Ｂ−（Ｌ’’）ｎＳＳＯ２Ｒのチオスルフォン酸塩中間体、または、式Ｘ−（Ｌ’）ｎＳＳＯ２Ｒの中間体を形成する工程と、
該チオスルフォン酸塩中間体を、それぞれ、式Ｘ−（Ｌ’）ｎ’−ＳＨまたはＢ−（Ｌ’’）ｎ’−ＳＨの化合物と反応させる工程を包含し、
Ｌ’およびＬ’’は、独立して、該チオール基ＳＨが、それぞれＢおよびＸに共有結合する2価のリンカーであり、
ｎおよびｎ’は1または0であり、かつ、
Ｒはアルキル、アルキル置換体、アリール、ヘテロアリール、または、アリール置換体またはヘテロアリール置換体である、
ことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜本発明の範囲＞
本発明は、病原性細胞集団の増殖が特徴的な病態を治療するために使用される組成物および方法に関する。特に、本発明は、ビタミン-マイトマイシン結合体、宿主動物において病原性細胞集団を選択的に除去するよう前記結合体を使用する方法、および、前記結合体の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
＜本発明の背景＞
哺乳動物の免疫系は、腫瘍細胞、他の病原細胞、および、侵入する外来病原体の認識および除去のための手段を提供する。この免疫系は、正常時には強固な防御を与えるが、腫瘍細胞、他の病原細胞または感染性因子が、宿主の免疫応答を回避して、宿主の病原性を伴って増殖する例、または宿主の病原性を持続させる例も数多く見受けられる。複製する新生物を除去するために、従来から化学療法剤および放射線療法が開発されている。しかし、現在利用可能な化学療法剤および放射線療法の、全部とは言わないまでもその多くが、癌細胞を破壊するように作用するだけではなく、正常な宿主細胞（例えば、造血系細胞）にも影響を及ぼし、副作用をもたらしている。現在使用可能な抗癌剤によるこのような副作用のために、病原性細胞集団に対して特異的であり、かつ、宿主に対して毒性の低い新規治療法の開発についての必要性を明らかにする。
【０００３】
研究者達は、このような細胞に細胞傷害性化合物を標的化することによって、癌細胞を破壊する治療プロトコールを開発した。これらのプロトコールの多くは、毒素を用いるものであるが、正常細胞に対するその毒素の送達を最小限にするための試みとして、癌細胞に特有の抗原、または、癌細胞において過剰に発現する抗原に結合する抗体に結合させた毒素を利用する。この方法を用いて、いくつかの免疫毒素が開発されているが、それらの免疫毒素は、病原細胞上の特異的抗原に指向される抗体からなり、この抗体は、リシン、シュードモナス外毒素、ジフテリア毒素、および、腫瘍壊死因子のような毒素と結合している。これらの免疫毒素は、その抗体によって認識される特異的抗原を有する腫瘍細胞を標的にする（例えば、非特許文献1、非特許文献2および特許文献１参照）。免疫毒素は、病原細胞上の特異的抗原に指向されるものであるが、これらの化合物の毒成分は、正常な宿主細胞に対しても毒性を表し得る。細胞に化学療法剤を送達するためのビタミンの使用方法もまた記述されている（例えば、特許文献2参照）。
【０００４】
【特許文献１】ベター・エムディー（Better, M. D.）PCT公開番号WO91/07418、1991年5月30日発行
【特許文献２】米国特許第5,416,016号
【非特許文献１】オルスネス・エス（Olsnes, S.）, Immunol. Today, 10, pp. 291-295, 1989
【非特許文献２】メルビー・イーエル(Melby, E.L.), Cancer Res., 53(8), pp. 1755-1760, 1993
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
独立して宿主毒性を表し得る化合物の投与の必要性を回避するために、宿主における癌細胞の集団、または、外来性の病原体集団を標的化するための別の方法は、その病原細胞に対する宿主の免疫応答を増強することである。免疫療法について報告されている戦略の一つは、抗体（例えば、遺伝子組み換えの多量体の抗体）を腫瘍細胞表面に結合させて、細胞表面上の抗体の定常領域を発現させ、それによって、種々の免疫系が媒介するプロセスを通じて腫瘍細胞の傷害を誘発することである（ドゥビタ・ブィティー（DeVita, V.T.）、「癌の生物学的な治療（”Biologic Therapy of Cancer”）」、第2版、フィラデルフィア、Lippincott, 1995、スイヨー・ジェイピー(Soulillou, J.P.)、米国特許第5,672,486号）。しかし、この方法は、腫瘍に特異的な抗原を定義することが困難であるため、複雑なものとなっている。従って、罹患した宿主における病原性細胞集団の存在によって特徴付けられる疾患状態の治療に対して、指向される宿主毒性を最小限に留める効果的な治療法について、大きな需要がある。
【０００６】
マイトマイシンは、抗腫瘍活性を示すことが知られている天然の産物である。マイトマイシンは、Streptomyces caespitosusの醗酵によって産生され得、代表的な既知のマイトマイシンとしては、マイトマイシンＡ、マイトマイシンＢ、マイトマイシンＣ、マイトマイシンＤ、マイトマイシンＥ、マイトマイシンＦ、および、ポルフィロマイシンが挙げられる。これらの化合物の構造は以下の一般式によって表され、その置換体を表1に示す。
【０００７】
2005531564.tif 000002
【０００８】
2005531564.tif 000003
【０００９】
マイトマイシンは、キノン含有アルキル化剤として知られる細胞傷害剤の1種である。キノン機能基を還元すると、ＤＮＡを含む種々の細胞性成分と共有結合を形成し得る、2機能性のアルキル化分子種が形成される。ＤＮＡとの相互作用によりＤＮＡ架橋が形成され、これがアポトーシスおよび細胞死を誘導する。また、この相互作用は、マイトマイシン化合物の抗腫瘍活性にとって、最も重要な誘因と考えられている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
＜本発明の要旨＞
本発明は、開裂可能なリンカーを介して、マイトマイシン化合物に結合されるビタミン機能基を含む結合体、病原細胞集団の増殖によって特徴付けられる病態の治療におけるそれら結合体の使用、および、その結合体の調製方法に関する。本発明によるビタミン-マイトマイシン結合体は、罹患した宿主において、病原細胞集団を選択的に除去するのに使用し得る。この病原細胞集団の選択的除去は、ビタミン-マイトマイシン結合体のビタミン機能基が、標的ビタミンに特異的に結合し、かつ、病原性細胞において、単一で発現するか、過剰に発現するか、または、選択的に発現する、ビタミンレセプター、輸送体、または、他の表面に発現するタンパク質に結合することを通じて行われる。このビタミン-マイトマイシン結合体は、ビタミン機能基を、上記のレセプター、輸送体、または、表面に発現するタンパク質に結合させることによって標的細胞の内部に取り込ませることが可能で、かつ、ビタミン機能基をマイトマイシン化合物に結合させるのに、開裂可能なリンカーを使用した場合、ビタミン機能基とマイトマイシン化合物を細胞内で解離させることが可能となる。この解離されたマイトマイシン化合物は、その後、（例えば、ＤＮＡと架橋を形成することによって）ＤＮＡと相互作用を持ち、その病原細胞の殺傷または増殖の抑制をもたらす。
【００１１】
表面に発現するビタミンレセプター（例えば、親和性の高い葉酸レセプター）は、例えば、癌細胞上に過剰に発現する。卵巣、乳腺、結腸、肺、鼻、咽喉、および、脳の上皮癌は全て、葉酸レセプターの発現レベルが高いことが報告されている。事実、全てのヒト卵巣腫瘍の90％以上において、このレセプターを大量に発現することが知られている。従って、本発明は、種々の腫瘍細胞タイプ、および、ビタミンレセプターを過剰に発現する他の病原細胞タイプを殺傷またはその増殖を抑制するのに使用し得る。
【００１２】
マイトマイシンは、優れた抗腫瘍活性を示すことが知られているが、マイトマイシンはまた、これらの化合物で治療される宿主動物の白血球に対しても細胞傷害性を示す。マイトマイシンの抗腫瘍活性を高めるため、および／または、これらの化合物の望ましくない毒性を低減させるために、アミノミトサン骨格のC-7アミノ基において、各種の改変を施したマイトマイシン誘導体が調製されている。毒性を低減させた既知のマイトマイシン誘導体の中に、式ＲＳＳ（ＣＨ２）２ＮＨ−で表されるC-7置換体を含む、非対称性ジアルキルジスルフィドがある。この式において、i)Ｒはアルキル基であり（欧州特許出願第0116208A1号、および、日本国特許出願第175493/84号を参照のこと）、ii)Ｒは芳香環を含み（欧州特許出願第0116208A1号および同第0163550A2号、日本国特許出願第255789/85号、および、米国特許第4,866,180号を参照のこと）、ならびに、iii)Ｒは、アミノ酸またはペプチド断片に対して構造的に関連する（欧州特許出願第0163550A2号、日本国特許出願255789/85号、および、米国特許第4,691,024号を参照のこと）。
【００１３】
このような非対称性ジアルキルジスルフィド体の調製のための既知の方法は全て、非対称性ヘテロアリールアルキルジスルフィドをアルキルチオールでチオール転換することに基づく。注目すべきことは、最も一般的なヘテロアリールチオ脱離基は、2-チオピリジル（WO88/01622および欧州出願公報第0116208A1号を参照のこと）、および、3-ニトロ-2-チオピリジン（米国特許第4,691,024号を参照のこと）であることである。この開裂反応の駆動力は、ヘテロアリールチオ機能基の優れた脱離基の特性である。この反応を以下に示す。
2005531564.tif 000004
【００１４】
本発明によるビタミン-マイトマイシン結合体は、上記のチオール転換法を用いるか、または、チオスルフォン酸塩試薬のチオール嗜好性に基づく非対称性ジアルキルスルフィドの新規調製工程によって調製し得る。この調製工程において使用されるチオスルフォン酸塩試薬またはマイトマイシンＡの調製、および、ビタミン誘導体（例えば、システイン末端葉酸塩）の合成に用いられる合成スキームを、以下のスキーム1（Fmoc =9-フルオレニルメチルオキシカルボニル、Boc = tert-ブチルオキシカルボニル、Dap =ジアミノプロピオン酸、DMF =ジメチルフォルムアミド、DIPEA =ジイソプロピルエチルアミン、DMSO =ジメチルスルフォキシド、TFAA =トリフルオロ酢酸、PyBOP =ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス-（ピロリジノフォスフォニウムヘキサフルオロフォスフェート）に示す。
【００１５】
2005531564.tif 000005
【００１６】
チオスルフォン酸塩を用いた非対称性ジアルキルジスルフィドとして、本発明のビタミン-マイトマイシン結合体の合成についての典型的な合成スキームを、スキーム2およびスキーム3として以下に表す。このジスルフィド結合の結合体において、アルキル機能基のうちの一つは、ミトサン骨格のC-7アミノ基に付着し、もう一方は、ビタミン分子、または、ビタミンレセプターに結合するそのアナログもしくはその誘導体に、2価のリンカーを介して共有結合するか、または、直接共有結合する。
2005531564.tif 000006
2005531564.tif 000007
【００１７】
スキーム2およびスキーム3の両方において、まず初めに、ミトサン誘導体2のキノン機能基のC-7におけるビニール様メチルエステルとチオールスルフォン酸塩基を含む市販のアミン1を反応させた。第二に、チオール類（例えば、全て葉酸誘導体である、プテロイル-グルタミル-システイン4、Pte-Glu-Asp-Arg-Asp-Cys-OH 6、Pte-Glu-Arg-Cys-Ala-Gly-OH 8）に認められるチオールのスルフォン化のために、得られたチオールスルフォン酸塩試薬3を使用する。即座のジスルフィド形成により、ビタミン-マイトマイシン結合体（例えば、プテロイル-Glu-Cys-S-マイトマイシンＣ結合体5、Pte-Glu-Asp-Arg-Asp-Cys-S-マイトマイシンＣ-OH結合体7、または、Pte-Glu-Arg-Cys-S-マイトマイシンＣ-Ala-Gly-O結合体9）をほとんど定量的収率で産生する。
【００１８】
本発明の実施形態において、ジスルフィド結合は、非対称性ジアルキルジスルフィド（例えば、前述の手段で調製される非対称性ジアルキルジスルフィド）であるが、その実施形態において、ビタミン-マイトマイシン結合体は病原細胞を選択的に除去し、正常細胞に対する毒性を低減させた。ビタミン機能基が、上記のジスルフィド結合によってマイトマイシン化合物に結合した実施形態において、そのビタミン機能基およびマイトマイシン化合物は、細胞内に存在する還元化状態で解離し得る。
【００１９】
一つの実施形態において、以下の一般式
Ｂ−Ｌ−Ｘ
の結合体であって、
該Ｂ基は、病原性細胞集団において、単一で発現するか、過剰に発現するか、または、選択的に発現する表在性ビタミンレセプターに結合するビタミン、または、そのアナログもしくはその誘導体であり、該Ｌ基は、開裂可能なリンカーを含み、該Ｘ基は、マイトマイシン化合物、または、そのアナログもしくはその誘導体である、ことを特徴とする結合体を提供する。
【００２０】
別の実施形態において、病原性細胞集団を有する宿主動物において、病原細胞集団を選択的に除去する方法であって、その細胞集団の細胞がビタミンに対して表在性結合部位を有する、ことを特徴とする方法を提供する。その方法は、以下の一般式
Ｂ−Ｌ−Ｘ
の結合体を宿主に投与する工程であって、該Ｂ基は、病原性細胞集団において、単一で発現するか、過剰に発現するか、または、選択的に発現する表在性ビタミンレセプターに結合するビタミン、または、そのアナログもしくはその誘導体であり、該Ｌ基は、開裂可能なリンカーを含み、該Ｘ基は、マイトマイシン化合物、または、そのアナログもしくはその誘導体を含む、ことを特徴とする結合体を前記宿主に投与する工程と、前記病原性細胞集団を選択的に除去する工程を包含する。
【００２１】
代替的な実施形態において、前記方法は、宿主動物に対してパクリタキセルのような化学療法剤を投与する工程をさらに包含し得る。
【００２２】
さらに別の実施形態において、以下の一般式
Ｂ−Ｌ−Ｘ
の結合体、およびその結合体に対して薬学的に受容可能なキャリアを含有する薬学組成物であって、該Ｂ基は、病原性細胞集団において、単一で発現するか、過剰に発現するか、または、選択的に発現する表在性ビタミンレセプターに結合するビタミン、または、そのアナログもしくはその誘導体であり、該Ｌ基は、開裂可能なリンカーを含み、該Ｘ基は、マイトマイシン化合物、または、そのアナログもしくはその誘導体を含む、ことを特徴とする、薬学組成物を提供する。
【００２３】
別の実施形態において、この薬学組成物は、パクリタキセルのような化学療法剤をさらに含有し得る。
【００２４】
さらに別の実施形態において、下式
Ｂ−Ｌ−Ｘ
（式中、Ｂは、ビタミン、または、ビタミンレセプターに結合するそのアナログもしくはその誘導体であり、
Ｘは、マイトマイシン化合物、または、そのアナログもしくはその誘導体を含み、
Ｌは、ジスルフィド結合を含む2価のリンカーである。）
で表される生物活性結合体を調製する方法であって、
式Ｂ−（Ｌ’）ｎＳＳＯ２Ｒのチオスルフォン酸塩中間体、または、式Ｘ−（Ｌ’）ｎＳＳＯ２Ｒの中間体を形成する工程と、
前記チオスルフォン酸塩中間体を、Ｘ−（Ｌ’）ｎ’−ＳＨ、または、Ｂ−（Ｌ’’）ｎ’−ＳＨ各々と反応させる工程を包含し、
Ｌ’およびＬ’’は、独立して、そのチオール基ＳＨが、ＢおよびＸ各々と共有結合する2価のリンカーであり、
ｎおよびｎ’は1または0であり、かつ、
Ｒはアルキル、アルキル置換体、アリール、ヘテロアリール、または、アリール置換体またはヘテロアリール置換体である、ことを特徴とする方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
＜本発明の詳細な説明＞
本発明は、開裂可能なリンカーによってマイトマイシン化合物に結合されるビタミン機能基を含有する結合体に関する。本発明によるビタミン-マイトマイシン結合体は、罹患した宿主における病原細胞集団の選択的な除去のために使用し得る。この病原細胞の選択的な除去は、ビタミン類またはビタミンのアナログに特異的に結合し、かつ、病原性細胞において単一で発現するか、過剰に発現するか、または、選択的に発現するビタミンレセプター、輸送体、または、他の表在性タンパク質に対して、このビタミン-マイトマイシン結合体のビタミン機能基を結合させることによって媒介される。病原性細胞において単一で発現するか、過剰に発現するか、または、選択的に発現する表在性タンパク質は、病原細胞の選択的な除去を実現するために、非病原性細胞には存在しないレセプターであるか、または、低濃度でしか存在しないレセプターであることが好ましい。
【００２６】
ビタミン-マイトマイシン結合体は、ビタミン機能基が上記レセプター、輸送体、または、表在性タンパク質に結合する際に内部に取り込まれ、ビタミン機能基をマイトマイシン化合物に対して共有結合するのに使用された開裂可能なリンカーの開裂により、ビタミン機能基およびマイトマイシン化合物は細胞内で解離し得る。この開裂可能なリンカーは、例えば、ジスルフィド結合であってもよいが、この結合は、正常細胞に対するビタミン-マイトマイシン結合体の毒性を低減させる。ビタミン機能基が、ジスルフィド結合によってマイトマイシン化合物に結合される実施形態において、ビタミン機能基およびマイトマイシン化合物は、細胞内に存在する還元化状態で解離し得る。ビタミン機能基から解離されると、マイトマイシン化合物は、（例えば、ＤＮＡと架橋を形成することにより）ＤＮＡと相互作用し得るが、これは、病原細胞の殺傷、または、増殖の抑制をもたらす。
【００２７】
代替的な実施形態において、結合体のビタミン機能基は、マイトマイシン化合物を細胞表面に近接させながら病原細胞に結合することが可能である。次いで、この薬剤は、例えば、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼによってジスルフィド結合を開裂することによって放出し得る。このマイトマイシン化合物は、ビタミン-マイトマイシン結合体が結合する病原細胞によって取り込まれ得るか、あるいは、その病原細胞に近接する別の病原細胞によって取り込まれ、細胞のＤＮＡと相互作用するか、または、その病原細胞を殺傷するか、もしくは、その増殖を抑制する可能性がある。あるいは、この薬剤は、放出可能なリンカーがジスルフィド基であるそのような細胞内において、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼによって放出され得る。
【００２８】
別の実施形態において、または、上述の実施形態の組み合わせにおいて、ビタミン-マイトマイシン結合体は、細胞性ビタミンレセプターとは独立したメカニズムを通じて作用し得る。例えば、この結合体は、血清中に存在する可溶性のビタミンレセプター、または、アルブミンのような血清タンパク質に結合することで、結合していないマイトマイシンに対する結合体の長期に渡たる循環を生じ、かつ、病原細胞集団に対する活性において、結合していないマイトマイシンに対する結合体の活性を高めることが可能である。
【００２９】
本発明によるビタミン-マイトマイシン結合体は、病原細胞集団を有する宿主動物において、病原細胞集団を選択的に除去するために利用される。本発明は、癌を含む種々の病変、活性化マクロファージによって媒介される疾病、および、ビタミンレセプター、または、ビタミンアナログまたはビタミン誘導体に結合するレセプターを過剰に発現する任意の他のタイプの病原細胞によって媒介される疾病の原因となる、病原細胞集団に対して適用が可能である。従って、病原細胞集団は、良性腫瘍および悪性腫瘍を含めた腫瘍性の癌細胞集団であってもよいし、または、腫瘍性でなくてもよい。癌細胞集団は、自発的に生じてもよいし、宿主動物の系統に存在する突然変異のような過程を通じて生じてもよいし、体細胞における突然変異によって生じてもよいし、化学性、ウイルス性もしくは放射線誘発性に生じてもよい。本発明は、癌腫、肉腫、リンパ腫、ホジキン病、メラノーマ、中皮腫、バーキットリンパ腫、鼻咽頭癌腫、白血病、および、骨髄腫のような癌の治療に利用し得る。癌細胞集団は、口腔癌、甲状腺癌、内分泌腺癌、皮膚癌、胃癌、食道癌、咽頭癌、膵臓癌、結腸癌、膀胱癌、骨癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮癌、乳癌、睾丸癌、前立腺癌、直腸癌、腎臓癌、肝臓癌、および、肺癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
病原細胞集団が癌細胞集団である場合の実施形態において、結合体の投与の効果は、腫瘍塊の減少もしくは除去、腫瘍塊の維持、または、腫瘍細胞増殖の抑制によって測られる治療応答である。腫瘍の場合、この除去は、原発性の腫瘍細胞の除去であってもよいし、あるいは、転移した細胞の除去、または、原始腫瘍から解離しつつある細胞の除去であってもよい。外科的切除、放射線療法、化学療法、または、生物学療法を含む任意の治療法による腫瘍の除去の後に、腫瘍の再発を予防するために、このビタミン-マイトマイシン結合体による予防的治療を実施することもまた本発明に一致するものと考えられる。この予防処置は、ビタミン-マイトマイシン結合体による初回治療（例えば、毎日複数回の投与による治療）であっても、および／または、初回治療（単数または複数）数日後または数ヶ月後に行われる1回の追加治療または一連の治療であってもよい。従って、病原細胞集団の除去は、細胞の除去、病原細胞の増殖抑制、腫瘍塊の維持、または、病原細胞の復活を阻止する予防的な治療を含む。
【００３１】
本発明の方法は、ヒトの臨床医学にも獣医学的応用にも使用し得る。従って、病原細胞集団を有する宿主動物、および、ビタミン-マイトマイシン結合体によって治療される宿主動物は、ヒトであってもよいし、あるいは、獣医学的応用の場合は、実験室であっても、農業用であっても、飼育の動物であっても、または、野生の動物であってもよい。本発明は、以下の宿主動物に対して適用し得るが、これらに限定されない。その宿主動物としては、ヒト、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター等）、ウサギ、サル、チンパンジー等の実験動物、イヌ、ネコおよびウサギ等の飼育動物、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤマヒツジのような農業動物、クマ、パンダ、ライオン、トラ、ヒョウ、ゾウ、シマウマ、キリン、ゴリラ、イルカ、および、クジラのような飼育下の野生動物が挙げられる。
【００３２】
本発明のビタミン-マイトマイシン結合体は、広範な種類のビタミン類またはレセプターに結合するビタミンアナログ／誘導体、および、マイトマイシンから形成され得る。このビタミン-マイトマイシン結合体は、病原細胞では、ビタミンに対するレセプターが好んで形成され、ビタミン結合に利用が可能であるために、宿主動物における病原細胞集団を選択的に標的化し得る。受容可能なビタミン機能基としては、ナイアシン、パントテン酸、葉酸、リボフラビン、チアミン、ビオチン、ビタミンＢ１２、および、脂溶性ビタミンＡ、脂溶性ビタミンＤ、脂溶性ビタミンＥおよび脂溶性ビタミンＫが挙げられる。これらのビタミン類および、そのレセプターに結合するアナログおよび誘導体は、開裂可能なリンカーによってマイトマイシンと結合し得る、標的を定めた実体を構成し、本発明に従って使用されるビタミン-マイトマイシン結合体を形成する。好ましいビタミン機能基としては、葉酸、ビオチン、リボフラビン、チアミン、ビタミンＢ１２、および、これらビタミン分子のレセプターに結合するアナログおよび誘導体、ならびに、他に関連するビタミンレセプター結合性分子が挙げられる（米国特許第5,688,488号を参照のこと、援用することにより、本明細書中に組み込むものとする）。ビタミンアナログの例としては、Ｄ型のグルタミン酸残基（葉酸は通常プテロイン酸に結合するL型のグルタミン酸1個を含む）を含む葉酸アナログである。マイトマイシン化合物は、表1に示す任意のマイトマイシン類またはマイトマイシン関連化合物であり得、マイトマイシンＡ、マイトマイシンＢ、マイトマイシンＣ、マイトマイシンＤ、マイトマイシンＥ、マイトマイシンＦ、マイトマイシンＪ、および、ポルフィロマイシン、または、それらのアナログもしくはそれらの誘導体が挙げられる。
【００３３】
ビタミンに対する結合部位は、レセプターに特異的に結合が可能な任意のビタミン分子、または、その誘導体もしくはそのアナログに対するレセプターを含み得、このレセプターまたは他のタンパク質は、病原細胞集団において単一で発現するか、過剰に発現するか、または、選択的に発現するレセプターである。病原細胞において単一で発現するか、過剰に発現するか、または、選択的に発現する表在性タンパク質とは、代表的には、非病原性細胞においては存在しないか、または、低濃度でしか存在しないレセプターであって、これによって、病原細胞の選択的除去の手段を提供する。一つの実施形態において、本発明の結合体に使用し得るリガンドとしては、活性化マクロファージ上に特異的に発現するレセプター（例えば、葉酸塩、または、そのアナログもしくはその誘導体を結合する葉酸レセプター）が挙げられる。
【００３４】
本発明のビタミン-マイトマイシン結合体は、癌細胞または他の病原細胞上のレセプターに対して高い親和性を持って結合することが可能である。この高い親和性の結合は、ビタミン機能基に内在するものであってもよいし、あるいは、この結合親和性は、化学的改変されたビタミン（すなわち、アナログまたは誘導体）の使用によって、または、その結合体に存在するビタミンとマイトマイシン化合物との間の特定の化学結合によって増強されてもよい。
【００３５】
このリンカーは、生物適合性であれば、任意の開裂性のリンカーであってもよく、例えば、細胞中に存在する還元化状態で開裂され易いリンカーや、酸感受性リンカーや、または、酵素感受性リンカーであってもよい。代表的には、リンカーは、約1〜30個の炭素原子を、さらに代表的には約2〜約20個の炭素原子を含有する。代表的には、低分子量（すなわち、約30〜約300の分子量を有するもの）リンカーの方を使用する。
【００３６】
一般に、リンカーとビタミン、または、ビタミンレセプターに結合する誘導体もしくはアナログとの間の複合体、ならびに、リンカーとマイトマイシンとの間の複合体を形成する任意の方法が、本発明において利用可能である。この複合体は、例えば、水素結合、イオン結合、または、共有結合を通じて、ビタミンおよびマイトマイシンと開裂性リンカーを直接結合することによって形成し得る。ビタミン、または、ビタミンレセプターに結合する誘導体もしくはアナログ、および、マイトマイシンをリンカーに対して共有結合させるのは、例えば、酸基、アルデヒド基、ヒドロキシ基、アミノ基、スルフヒドリル基、または、ヒドラゾ基の間に、アミド結合、エステル結合、ジスルフィド結合、または、イミノ結合を形成することによって生じ得る。さらに、本発明においては、リンカーは、ビタミンをマイトマイシンに間接的に連関させる手段、例えば、スペーサーアームまたは架橋分子のような介在リンカーによる結合を含むことも可能である。連関のための直接的な手段および間接的な手段のいずれも、本発明方法の動作のために、細胞膜上のビタミンレセプターに対する、ビタミン、または、ビタミンレセプターに結合する誘導体もしくはアナログの結合を妨げるものであってはならない。
【００３７】
本発明はまた、下式
Ｂ−Ｌ−Ｘ
（式中、Ｂは、ビタミン、または、ビタミンレセプターに結合するそのアナログもしくはその誘導体であり、
Ｘは、マイトマイシン化合物、または、そのアナログもしくはその誘導体を含み、
Ｌは、ジスルフィド結合を含む2価のリンカーである。）
で表される生物活性結合体を調製する方法であって、
式Ｂ−（Ｌ’）ｎＳＳＯ２Ｒのチオスルフォン酸塩中間体、または、式Ｘ−（Ｌ’）ｎＳＳＯ２Ｒの中間体を形成する工程と、
前記チオスルフォン酸塩中間体を、それぞれ、Ｘ−（Ｌ’）ｎ’−ＳＨ、または、Ｂ−（Ｌ’’）ｎ’−ＳＨと反応させる工程を包含し、
Ｌ’およびＬ’’は、独立して、そのチオール基ＳＨが、それぞれＢおよびＸに共有結合する2価のリンカーであり、
ｎとｎ’は1か0であり、かつ、
Ｒはアルキル、アルキル置換体、アリール、ヘテロアリール、または、アリール置換体もしくはヘテロアリール置換体である、
ことを特徴とする方法を提供する。
【００３８】
中間体の結合基Ｌ’とＬ’’の性質は、これらのリンカーが、好ましくは開裂可能であるということを除いては、重大なことではない。また、このビタミン結合体の調製においてもチオスルフォン酸塩のＲ基の性質は重大なことではない。この結合基の前駆物質は、代表的には、求核性の機能基または求電子性の機能基、あるいは、その両方を兼ね備えた機能基を、容易に開裂可能な保護基を有する保護形態を必要に応じて取るように（そのようにすると、その前駆物質を中間体分子種の合成に使用し易くなる）、選択される。この結合体の-Ｌ-で表される結合基は、式−（Ｌ’）ｎ−Ｓ−Ｓ−（Ｌ’’）ｎ’−によって表される中間体結合基Ｌ’とＬ’’の複合体として表すことが可能である。−Ｌ’−の場合、Ｘ−（Ｌ’）ｎ−ＳＨなる実体は、細胞傷害性活性を保持していなければならない。
【００３９】
本発明はまた、1以上の用量で投与した場合、宿主動物において病原細胞集団を除去するのに有効な量の、ビタミン-マイトマイシン結合体を含有する薬学組成物にも指向される。このビタミン-マイトマイシン結合体は、好ましくは宿主動物に、非経口的（例えば、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、または、硬膜下腔内）に投与される。あるいは、本結合体は、宿主動物に、医学的に有用な他の過程を通じて投与することが可能であるし、また、任意の有効投与量、および、持続放出剤形を含む任意の好適な治療剤形の使用が可能である。本発明の方法は、腫瘍の外科的切除、放射線療法、化学療法、または、生物学的療法（例えば、モノクロナール抗体療法、免疫修飾剤による治療、免疫エフェクター細胞の任意の輸送、造血系成長因子、サイトカイン、および、ワクチン療法による治療を含む他の免疫療法が挙げられるが、これらに限定されない）と組み合わせて使用し得る。
【００４０】
非経口の投与形態の例としては、活性剤の水溶液（等張生食液）、5％グルコース、または、他の周知の薬学的に受容可能な液体キャリア（例えば、液体アルコール類、グリコール類、エステル類、および、アミド類）が挙げられる。本発明による非経口の投与形態は、ビタミン-マイトマイシン結合体の用量を含有する、再構成可能な凍結乾燥製剤の形態を取ることも可能である。本実施形態の一つの好ましい態様において、例えば、米国特許第4,713,249号、同第5,266,333号、および、同第5,417,982号（これらの開示は、援用することにより本明細書中に組み込むものとする）に記述される生物分解性炭水化物基質のような、当該分野で公知のいくつかの徐放剤の形態でいずれも投与し得る。あるいは、別態様として、低速ポンプ（例えば、浸透圧ポンプ）も使用し得る。
【００４１】
このビタミン-マイトマイシンが媒介する病原細胞集団の除去を増強するために、治療因子を含有する少なくとも1つの追加の組成物を組み合わせて宿主に投与するか、または、前述の方法に対するアジュバントを宿主に投与することが可能である。あるいは、1つ以上の追加の治療因子を投与することが可能である。この治療因子（単数または複数）は、内因性の免疫応答を刺激し得る化合物、化学療法剤、または、投与したビタミン-マイトマイシン複合体の効能を補うことが可能な別の治療因子の中からから選択され得る。本発明の方法は、前述の結合体に加えて、内因性の免疫応答を刺激し得る化合物または組成物（例えば、インターロイキン1-18、幹細胞因子、塩基性ＦＧＦ、ＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＬＫ-2リガンド、ＨＩＬＤＡ、ＭＩＰ-1α、ＴＧＦα、ＴＧＦβ、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、可溶性ＣＤ23、ＬＩＦ、および、これらのサイトカインの組み合わせまたは免疫細胞成長因子が挙げられるが、これらに限定されない）を宿主に投与することによって実施され得る。
【００４２】
治療に有効なこれらの因子の組み合わせが使用され得る。例えば、一つの実施形態において、ＩＬ-2の治療有効量として、例えば、一日につき複数回投与処方において、約5000 IU／用量／日〜約500,000 IU／用量／日の範囲のものを、あるいは、例えば、一日につき複数回投与処方において、約7500 IU／用量／日〜約150,000 IU／用量／日の範囲のものを、病原細胞集団を有する宿主動物において病原細胞を除去するために、ビタミン-マイトマイシン結合体と一緒に使用し得る。あるいは、ＩＬ-2は、ＩＦＮ-αと組み合わせて使用することも可能である。その場合、ＩＬ-2は、例えば、一日につき複数回投与処方において約0.1 MIU／m2／用量／日〜約15 MIU／m2／用量／日の範囲のものを、そして、IFN-αは、例えば、一日につき複数回投与処方において約0.1 MIU／m2／用量／日〜約7.5 MIU／m2／用量／日の範囲のものを結合体と共に使用し、それによって病原細胞集団を有する宿主動物において、その病原細胞を除去するかまたは中和することが可能である（MIU＝百万国際単位、m2=平均的なヒトの体表面積近似値）。別の実施形態において、ＩＬ-12およびIFN-αが治療有効量で使用され、また別の実施形態において、ＩＬ-15およびIFN-αが治療有効量で使用される。代替的な実施形態において、ＩＬ-2、IFN-αまたはIFN-γ、および、GM-CSFが組み合わせで使用される。本発明はまた、他のインターロイキンおよびインターフェロンならびにコロニー刺激因子の組み合わせを含む、任意の他の有効なサイトカイン同士の組み合わせの使用も考慮の対象とされる。
【００４３】
それ自体が細胞傷害性である化学療法剤は、腫瘍の透過性を高めるように作用し得、腫瘍の成長もしくは腫瘍細胞の増殖等を抑制し得、またさらに、本発明の方法に従って、ビタミン-マイトマイシン結合体と組み合わせて使用するのに好適である。このような化学療法剤としては、アドレノコルチコイド、アルキル化剤、抗アンドロゲン剤、抗エストロゲン剤、アンドロゲン、エストロゲン、シトシンアラビノシドのような抗代謝剤、プリンアナログ、ピリミジンアナログおよびメトトレキサート、アクチノマイシンＤ、ゲムシタビン、ブスルファン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチンおよび他の白金化合物、トリメトプリム、ジクロキサシリン、ダウノルビシン、ドクソルビシン、エピルビシン、ミトキサントロン、トポテカン、エトポシド、タモキシフェン、タキソール（登録商標、すなわち、パクリタキセル）、シクロフォスファミド、シクロスポリン、植物アルカロイド、プレドニゾン、ヒドロキシ尿素、テニポシド、ブレオマイシン、ジゴキシン、ナイトロジェンマスタード、ニトロソ尿素、ビンクリスチン、ビンブラスチン、マイトマイシンＣ、刺激剤および刺激促進剤、ならびに、当該分野で認識されている任意の他の化学療法剤が挙げられる。
【００４４】
この追加の治療因子は、ビタミン-マイトマイシン結合体の投与前に、ビタミン-マイトマイシン結合体の投与後に、または、ビタミン-マイトマイシン結合体の投与と同時に、宿主動物に投与し得、かつ、この治療因子は、結合体を含む同じ組成物の一部として、または、ビタミン-マイトマイシン結合体とは別の組成物の一部として投与し得る。この治療有効用量において治療因子を含む任意のこのような治療組成物は、多数の治療因子を含有する組成物を含む本発明において使用し得る。
【００４５】
一つの実施形態において、追加の治療因子はタキソール（登録商標、すなわち、パクリタキセル；ブリストルマイヤーズスクイブ社（Bristol Myers Squibb Co.）からタキソールという商品名で、また、イバックス社（Ivax Co.）からオンキソールという商品名で販売されている）である。本発明に従って、タキソール（登録商標）、オンキソール（商標）、タキソールの任意の他のジェネリック形態、または、任意の関連化合物は、ビタミン-マイトマイシン結合体との組み合わせで使用し得る。タキソール（登録商標）、タキソール（登録商標）のジェネリック形態、または、関連化合物は、例えば、患者に対して、約10〜約500 mg/ｍ2、約50〜約400 mg/ｍ2、約100〜約300 mg/ｍ2、約100〜約200 mg/ｍ2の用量で投与し得るが、ビタミン-マイトマイシン結合体と組み合わせて任意の有効量を使用し得る。
【００４６】
さらに、タキソール（登録商標）、タキソール（登録商標）のジェネリック形態、または、関連化合物を投与するための任意の効果的な投与計画を使用し得る。例えば、タキソール（登録商標）またはジェネリックまたは関連化合物を、3週間毎に1回、合計18週、1回につき3時間投与し得るが、任意の他の効果的な投与計画が、本発明に従って考慮される。タキソール（登録商標）またはジェネリックまたは関連化合物は、経口、または、非経口（例えば、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、または、硬膜下腔内）の任意の有効な経路で投与し得る。
【００４７】
1種以上の薬剤送達結合体を使用し得る。共同投薬のプロトコールに従って、各種ビタミン（例えば、葉酸-マイトマイシン結合体およびＢ１２-マイトマイシン結合体）を含む結合体を用いて、宿主動物を治療し得る。他の実施形態において、種々のマイトマイシンに結合させた種々のビタミンを含有する結合体を用いて、宿主動物を治療し得る。例えば、葉酸-マイトマイシンＣ結合体および葉酸-マイトマイシンＡ結合体によって、または、葉酸-マイトマイシンＣ結合体およびビタミンＢ12-マイトマイシンＡ結合体を用いて、宿主動物を治療し得る。さらに、同じ薬剤送達結合体の一部として、多数のビタミンと多数のマイトマイシンを含有する同じビタミンもしくは異なるビタミン、および、同じマイトマイシンもしくは異なるマイトマイシンを有する薬剤送達結合体が使用し得る。
【００４８】
このビタミン-マイトマイシン結合体の1日あたりの単位用量は、宿主の状態、治療される疾病の状態、結合体の分子量、投与経路および組織分布、ならびに、放射線療法のような他の治療処置の併用の可能性に応じて、有意に変動し得る。患者に投与される有効量は、体表面積、患者の体重、および、医師による患者の状態の評価に基づく。有効用量は、約1 ng/kg〜約1 mg/kg、より好ましくは約1 μg/kg〜約500 μg/kg、最も好ましくは約1 μg/kg〜約100 μg/kgの範囲であり得る。
【００４９】
ビタミン-マイトマイシン結合体を投与するための任意の効果的な投与計画を使用し得る。例えば、ビタミン-マイトマイシン結合体を単一用量として投与してもよいし、1日あたり複数回用量の投与計画として投与してもよい。さらに、変動的な投与計画（例えば、1週につき1〜3日投与を、連日治療に代わる別法として用いることも可能であり、本発明を定義するに際し、このような日々の投与の断続的または変動的な投与計画は、連日投与と等価であり、本発明の範囲内にあると考慮される。本発明の一つの実施形態において、病原細胞集団を除去するために、ビタミン-マイトマイシン結合体を宿主に複数回注入することによって治療する。一つの実施形態において、ビタミン-マイトマイシン結合体を宿主に複数回（好ましくは約2回〜約50回）、例えば、12時間〜72時間間隔で、または、48時間〜72時間間隔で注入する。初回の注入（単数または複数）後、数日または数ヶ月の間隔を置いて、ビタミン-マイトマイシン結合体の追加注入を患者に投与し得、かつ、この追加注入は病原細胞に起因する疾病状態の再発を防止する。疾病の再発を防ぐために、初回注入後、化学療法剤（例えば、パクリタキセル）のような任意の追加の治療因子もまた投与し得る。
【００５０】
一つの実施形態において、本発明の結合体において使用し得るリガンドとして、活性化マクロファージの上に特異的に発現するレセプターに結合するもの（例えば、葉酸塩、または、そのアナログ、もしくは、その誘導体に結合する葉酸レセプター）が挙げられる。この葉酸-マイトマイシン結合体は、宿主に疾病状態を引き起こす活性化マクロファージを殺傷、または、その活性を抑制するのに使用し得る。このようなマクロファージを標的化する結合体は、活性化マクロファージが媒介する疾病の状態に悩まされる患者に投与する場合、結合したマイトマイシンを活性化マクロファージ集団に集中し、結びつけて、その活性化マクロファージを殺傷するか、または、マクロファージの機能を抑制する。活性化マクロファージ集団の除去、または、脱活性化は、治療の対象となる疾病状態に特徴的なマクロファージが媒介する病因を阻止するかまたは低減するように作用する。活性化マクロファージによって媒介されることが知られる疾患の例としては、リウマチ関節、潰瘍性大腸炎、クローン病、乾癬、骨髄炎、多発性硬化症、アテローム硬化症、肺線維症、サルコイドーシス、全身性硬化症、臓器移植拒絶反応（ＧＶＨＤ）、および、慢性炎症が挙げられる。結合体の投与は、代表的には、疾病状態の症状が軽減するかまたは除去されるまで続けられ、かつ、この結合体は、例えば、化学療法剤（例えば、パクリタキセル）のような任意の付加的な治療因子と組み合わせて投与し得る。
【００５１】
本発明の方法に従って投与される結合体は、好ましくは、疾病状態に罹患する動物または患者に対して、非経口（例えば、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、または、静脈内）的に、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて投与される。あるいは、この結合体は、医学的に有用なものであれば、どのような手順によってでも動物または患者に投与し得、また、標準剤形または徐放剤形として有効用量を投与し得る。本発明の治療法は、単独で用いてもよいし、または、マクロファージが媒介する疾病状態の治療のために認められている他の治療法と組み合わせて用いてもよい。
【実施例】
【００５２】
＜実施例１＞
＝＝＝化合物5、7および9の調製＝＝＝
化合物5、7および9（スキーム2およびスキーム3を参照のこと）を以下のように調製した。まず、アルゴンの下で攪拌しながら、化合物1および2（それぞれ45 μモル）を、1 mLの無水メタノールと混合した。20時間攪拌した後、TLC（シリカゲル；CHCl3/MeOH = 9/1）で定量した場合、両方の開始物質は消えていた。化合物5を調製するために、別のフラスコにおいて、42 μモルの化合物4に1.0 mLの脱イオン水を加え、この溶液をアルゴンで洗浄した。この溶液に0.1 N NaHCO3をpHが7に調整されるまで添加し、前述の最初の反応液（化合物1および2と混合して調製）とこの溶液を混合した。この結合反応は30分で完了した。メタノールを減圧蒸留し、調製HPLC（Prep Novapak HR C18 19 X 300 mMカラム、展開相（A）−1.0 mMリン酸バッファー、pH = 6、有機相(B)−アセトニトリル、条件−30分で99％Aおよび1％Bから50％Bおよび50％Aまでの勾配、流速＝15 mL／分）において結合体を精製した。第二溶液で、化合物4の代わりに、それぞれ化合物6および8を用いたことを除いては、化合物7と9も同じプロトコールを用いて調製した。1次元NMR（図5）および2次元NMR（図6）およびMS（ES）によって、化合物5、7および9を同定した。
【００５３】
＜実施例２＞
＝＝＝ＥＣ72およびマイトマイシンＣの細胞傷害性＝＝＝
この薬剤が葉酸レセプター陽性ＫＢ細胞の成長を抑制する能力を予測するin vitroの細胞傷害性アッセイを用いて、ＥＣ72と表示される化合物（スキーム1を参照のこと）を評価した。この化合物は、スキーム2に記載したプロコールに従って調製した、マイトマイシンＣに結合した葉酸アナログを含有する。表示の濃度のＥＣ72、遊離マイトマイシンＣ（薬剤#1）、または、ＥＣ72および少なくとも100倍過剰な葉酸に、37℃で15分間、ＫＢ細胞を暴露した。次いで、新鮮な培養液で細胞をリンスし、新鮮な培養液中において37℃で72時間インキュベートした。ブロモデオキシウリジンによるELISAアッセイによって、細胞の生存率を評価した。
【００５４】
直接比較した場合、ＥＣ72の細胞傷害性は、遊離マイトマイシンＣの細胞傷害性と等しかった（図1を参照のこと）。ＥＣ72の細胞傷害性は、過剰な遊離葉酸の存在下で阻止された。これは、葉酸レセプターへの結合を介して、観察した細胞の殺傷が起こることを示す。重要なことに、この結果はまた、葉酸レセプターをほとんど発現しないかまたは全く発現しない正常組織が、このＥＣ72結合体によって影響を受けないことを示している。
【００５５】
＜実施例３＞
＝＝＝ＥＣ72で治療された、腫瘍を含むマウスの生存率＝＝＝
M109腫瘍を含むBalb/cマウスを用いて、腫瘍を有するマウスの生存率を高めるために、ＥＣ72の効果をin vivoで評価した。本実験には二つの目的がある。すなわち、i)ＥＣ72による連日腹腔内治療が、葉酸レセプター陽性の腫瘍を有するマウスに対して、同一用量の投与計画の下で試験した場合、マイトマイシンＣが実現可能としたものを上回るかどうかを確定すること、および、ii)葉酸レセプター陽性組織である腎臓組織を含めた正常組織に対して、ＥＣ72による治療が病的作用を持つかどうかを調べることである。ほとんどの正常組織は極めて低いレベルでの葉酸レセプターを含むが、腎臓の近位尿細管は著明な数の葉酸レセプターを発現する。従って、ＥＣ72のin vivoでの評価はまた、葉酸-マイトマイシン結合体の全身性投与に起因する腎臓特異的な損傷の程度を評価し得る。
【００５６】
Balb/cマウス（1群あたり5匹）に1x106個のM109細胞を腹腔内注入した。次いで、このマウスに、1800ナノモル／kgのＥＣ72またはマイトマイシンＣを、腫瘍細胞接種後5日目に始めて1日につき1回腹腔内注入した（コントロールマウスにはＰＢＳを注入した）（ILS＝延命増加率（すなわち、生存中央値））。
【００５７】
図2に示したように、コントロールマウスは全て、腫瘍接種後22日目までに死んだ。改変していないマイトマイシンＣで治療した動物においては、延命（ILS）に39％の増加が認められたが、その一方、ＥＣ72で治療した動物は平均178％の延命増加率を示した。
【００５８】
観察したＥＣ72が媒介する抗腫瘍活性を確かめるため、かつ、ＥＣ72の作用が、そのレセプターに結合する葉酸によって媒介されるか否かを確かめるために、（ＥＣ72またはマイトマイシンＣによる30日間連日注入を除いて）同じ実験を繰り返した。従って1つ群の動物には、ＥＣ72プラス10倍過剰の遊離葉酸を腹腔内に注入した。図3に示すように、ＥＣ72で治療した動物の群は、最大の延命増加率を示すが（すなわち、生存時間中央値は、ＰＢＳコントロール基よりも185％上回っていた）、その一方、マイトマイシンＣ群における動物は、わずか約25％の増加しか示さなかった。さらに、4匹のＥＣ72処置動物のうち1匹は、腫瘍細胞接種後70日目に腫瘍を完全に消失した。ＥＣ72結合体のこの抗腫瘍効果は、中等度の過剰濃度を持つ葉酸を同時投与することによって有意に減少し（生存時間中央値で112％の増加）、かつ、この群のマウスは全て最終的には腫瘍によって死亡した。
【００５９】
ＥＣ72およびマイトマイシンＣの両方を処置した動物において、（安楽死後）主要な臓器を収集し、これらを、検査のために独立した病理学者に送付した。以下の表2に記載されるように、マイトマイシンＣを処置した動物は、マイトマイシンＣ療法の特徴的な副作用である骨髄抑制を示した。事実、この群の動物は全て、明らかにマイトマイシンＣと関連した副作用が原因で死亡した。驚くべきことに、ＥＣ72で治療した動物は、骨髄抑制または腎障害の所見を示さなかった（すなわち、脾臓、大腿骨骨髄、および、腎臓は、検査をした熟練した病理学者には全て正常に見えた）。興味あることに、ＥＣ72で処置した動物から採取した血液を検査してみると、ＥＣ72による連続30日間の注入後にも、血中尿素窒素レベルおよびクレアチンレベルは正常であることが示された。上記から、葉酸-マイトマイシンＣ結合体は、葉酸レセプター陽性の腎臓を含めた正常組織に対して有害な損傷を招くことのない、効果的な化学療法剤であると思われる。
【００６０】
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【００６１】
＜実施例４＞
＝＝＝ＥＣ72を静脈内に投与した腫瘍を有するマウスの生存率＝＝＝
腫瘍を有する動物に静脈内に投与（i.v.）した場合のＥＣ72の抗腫瘍活性を、皮下にM109腫瘍を有するBalb/cマウスにおいて評価した。従って、化合物をi.v.で投与し（後述）、かつ、腫瘍が皮下にあることを除いては、実施例3で記述したものと同様のプロトコールに従った。腫瘍接種後4日目のマウスの右腋窩の皮下に、1800ナノモル／kgのＥＣ72を、連日5回、6週間静注した。腫瘍が少なくとも1500 mm3に成長するまで、各治療群において、腫瘍成長を2日間隔で定量した。尾静脈が過度に傷つけられ、12回の静注後には注入不能になったので、同じように連日5回の投与を追随しながら腹腔内投与を続けた。図4に示すように、ＥＣ72処置は、M109腫瘍の成長を遅らせるのに有効であった。興味あることに、腹腔内投与に切り替えて間もなくして、腫瘍の成長は増加し始めた。従って、ＥＣ72の腹腔内投与後には、ＥＣ72は、末梢の皮下腫瘍に効率的に到達することができなかったのかも知れない。これは、治療の初期段階においてＥＣ72を静脈内に投与した場合には見られなかった限定事項である。
【００６２】
＜実施例５＞
＝＝＝ＥＣ72で治療した充実性腫瘍を有するマウスの生存率＝＝＝
治療期間を通じてマウスに静脈内で投与したこと、および、4週間 ＥＣ72で治療したことを除いては、実施例4で記述したプロトコールに従った。Balb/cマウス（n=5）の右腋窩の皮下に1x10６個のM109細胞を皮下注射して、1800 nmol/kgのＥＣ72を、連日5回、4週間治療した。腫瘍細胞接種後（PTI、表3を参照のこと）指定の日に初めてＥＣ72を静脈内に投与した。動物の生存率を連日モニターしたが、完全反応を示したマウスは、PTI 60日目において、腫瘍を完全に消失した。
【００６３】
皮下腫瘍モデルでは、生存率は、ＥＣ72投与の遅延が長引くにつれて低下した。従って、表3にまとめられているように、ＥＣ72による治療をPTI 1日目で開始した場合において効果は最大であって、その場合、5匹のうち2匹が完全応答を示し、5匹のうち3匹が、延命において133％の増加を示した（ILS、すなわち、部分応答）。対照的に、ＥＣ72による治療をPTI 12日目まで遅らせると、わずか8％ILSしか得られず、完全応答はゼロであった。また、生存時間中央値（日）および％ILSは、ＥＣ72治療の開始の遅れが増すにつれて減少した。
【００６４】
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【００６５】
＜実施例６＞
＝＝＝ＥＣ72およびタキソール（登録商標）で治療した充実性腫瘍を有するマウスの生存率＝＝＝
動物に対して治療期間の開始時に静脈内に投与し、治療期間の後半では腹腔内注入を行ったことを除いては、実施例5に記述したプロコールにそのまま従った。ＥＣ72およびタキソール（登録商標）の組み合わせが、充実性腫瘍を有するマウスの生存を効果的に延長し得るか否かを調べるために、Balb/cマウス（各治療群毎にn=5）において、皮下にM109腫瘍を12日間に渡って形成した（すなわち、ＥＣ72単独治療の開始が無効であったPTI時間である（表3を参照のこと））。次いで、マウスを、タキソール（登録商標、すなわちパクリタキセル）をＥＣ72と併用するか、または、ＥＣ72と併用しないで投与して治療した。原発性腫瘍体積と動物の生存率の両方を測定した。
【００６６】
PTI 12日において、マウスを、タキソール（登録商標）（20 mg/kg静脈内、PTI 12、15、19、22および26日目）をＥＣ72と併用（1800 nmol/kg、連日5回、4週間、静脈内、PTI 12、15、19、22および26日目で、その後の日は全て腹腔内注入）するか、または、ＥＣ72と併用しないで投与して治療した。腫瘍体積は、式Ｖ＝ａｘｂ２／２を用いて計算した。この式で”a”は腫瘍の長さで、”b”は腫瘍の幅でいずれもミリメートルで表したものである。腫瘍は測径器を用いて測定した。
【００６７】
図7に示すように、未処置のコントロール動物の腫瘍は急速に成長し、PTI 50日までには安楽死を必要とするほどのサイズに達した。タキソール（登録商標）を処置した動物の腫瘍は、PTI 29日までは成長しなかったが、その後は成長を取り戻した。20 mg/kgのタキソール（登録商標）単独による治療では1.3対数細胞殺(LCK）をもたらしたが、タキソール（登録商標）単独で治療を受けた動物は病的で、体重減少を発現し、コホートにおける5匹のマウスのうち、長期の生存したものはいなかった。対照的に、タキソール（登録商標）およびＥＣ72の組み合わせで治療を受けたマウスの腫瘍は、投与期間中サイズが減少し、この投与計画により、この投与計画の5匹のマウスのうち3匹に1.8 LCKが得られ、かつ、5匹のマウスのうち2匹が、90日PTIで完全に腫瘍を消失した。さらに、タキソール（登録商標）およびＥＣ72の組み合わせで治療を受けたマウスは全て、投与期間中、体重を維持し、外見上健康であった。これらの結果から、ＥＣ72およびタキソール（登録商標）は相乗的に作用して腫瘍成長を阻止することが明らかになった。なぜなら、この皮下腫瘍モデルにおいて、ＥＣ72治療をPTI 12日に開始すると、ＥＣ72単独では抗腫瘍反応を引き起こすことができず（表3を参照のこと）、また、ＥＣ72およびタキソール（登録商標）の組み合わせの反応は、タキソール（登録商標）単独の場合よりもはるかに大きいためである。
【００６８】
＜実施例７＞
＝＝＝ＥＣ72およびタキソール（登録商標）で治療した充実性腫瘍を有するマウスの生存率＝＝＝
タキソール（登録商標）を15 mg/kgで投与し、6匹／コホートのマウスを試験したことを除いては、実施例6に記載した手順に従った。図8に示すように、未処置のコントロール動物の腫瘍は、指数関数的な速度で成長し、PTI 50日までには安楽死が必要となるほどのサイズに達した。対照的に、タキソール（登録商標）を処置したマウスの腫瘍は、PTI 21日までは成長しなかったが、その後は、明らかに通常の指数関数的な成長を取り戻した。タキソール（登録商標）療法は、0.6 LCKをもたらし、6匹のうち4匹の平均生存時間に135％の延長が見られ、かつ、6匹のうち2匹は完全に応答した（表4を参照のこと、この表において、CR=完全応答、PR=部分応答、および、NR=応答なし）。実施例6のように、ＥＣ72を用いて処置したタキソール（登録商標）で処置した動物において、目覚しいほど良好な成績が得られた。すなわち、タキソール（登録商標）およびＥＣ72の組み合わせにより、1.5 LCKが得られ、6匹のうち2匹の平均生存時間に185％の延長が見られ、かつ重要なことに、6匹のうち4匹は完全に応答した（図8および表4を参照のこと）。以上をまとめると、これらの結果、および、図7に示した結果は、タキソール（登録商標）およびＥＣ72は、腫瘍の成長を抑制するために、相乗的に作用することを示す。
【００６９】
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【００７０】
各試験の投与計画の毒性についても、体重減少、血液化学、および、組織病理学を測定することによってモニターした。タキソール（登録商標）をＥＣ72と組み合わせて治療した動物は、外見上は健康であり、投与期間を通じて体重減少を発現しなかった。また、タキソール（登録商標）およびＥＣ72で処置したマウスから得られた組織病理学から、これらの動物の主要臓器には変性が無いことを確かめた（表5）。
【００７１】
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【００７２】
＜実施例８＞
＝＝＝相対的な親和性アッセイ＝＝＝
葉酸と関連した葉酸レセプター（ＦＲ）に対するＥＣ72の親和性を、前述した方法（Westerhof, G.R., J.H. Schornagel, et al., (1995) Mol. Pharm., 48:459-471）に若干の修正を加えて定量した。簡潔には、0.25％トリプシン含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）において、室温で3分間、ＦＲ陽性ＫＢ細胞を穏やかにトリプシン処理し、その後、熱で不活性化した10％ウシ胎児血清（ＨＩＦＣＳ）を含む葉酸欠如ＲＰＭＩ（ＦＦＲＰＭＩ）で希釈した。5分間800 x gで遠心し、ＰＢＳで1回洗浄した後、最終細胞ペレットをＦＦＲＰＭＩ 1640（無血清）に懸濁した。ＥＣ72もしくは葉酸がない条件下において、または、漸増させた濃度のＥＣ72もしくは葉酸との共存下において、氷上で15分間、細胞を100 nM 3H-葉酸とインキュベーションした。標本を5分間10,000 x gで遠心し、次いでこの細胞ペレットをバッファーに懸濁し、5 mLのシンチレーション試験混合液を含む個々の試験管に移し、その放射活性をカウントした。陰性コントロールの試験管は、ＦＦＲＰＭＩに溶解した3Ｈ-葉酸のみを含んでいた（競合物質無し）。陽性コントロールの試験管は、最終濃度1 mMの葉酸を含み、かつ、これらのサンプルにおいて測定されたCPM（標識の非特異的な結合を表す）を全てのサンプルから差し引いた。注意すべきことは、相対的な親和性は、ＫＢ細胞上のＦＲに結合する3Ｈ-葉酸の50％を置換するのに必要とされる化合物のモル比の逆数と定義され、かつ、ＦＲに対する葉酸の相対的な親和性を1に設定したことである。図9に示すように、ＥＣ72は0.59の相対的な親和性を有しており、これは、この結合体が、葉酸レセプターと結合する点において、葉酸（天然リガンド）と効果的に競合することが可能であることを示す。
【００７３】
＜実施例９＞
＝＝＝インビトロでの用量反応＝＝＝
ＫＢ細胞を12ウェルのファルコンプレートに播種し、一晩でほぼ集密的な単層を形成させた。1 mLの新鮮なＦＦＲＰＭＩ/ＨＩＦＣＳで1回リンスした後、0.1 mM葉酸（競合物質）の存在下において、または、非存在下において、各ウェルに濃度を漸増させたＥＣ72を含む0.5 mLのＦＦＲＰＭＩ/ＨＩＦＣＳを与えた。細胞を37℃で15分インキュベートし、0.5 mLのＦＦＲＰＭＩ/ＨＩＦＣＳで4回リンスした。次いで、0.5 mLの新鮮なＦＦＲＰＭＩ/ＨＩＦＣＳを各ウェルに加え、37℃で合計72時間、細胞を追跡した。インキュベーション終了2時間前に、各ウェルにおいて、培養液を5 μCiの3H-チミジンを含む0.5 mLのＦＦＲＰＭＩ/ＨＩＦＣＳと交換した。次いで、細胞単層を、0.5 mLのＰＢＳで3回洗浄し、冷却10％トリクロロ酢酸1 mLにて沈殿させた。トリクロロ酢酸溶液を収集して廃棄し、沈殿物質を室温で15分間、0.5 mLの0.25N NaOHおよび1％ドデシル硫酸ナトリウムの順序で溶解した。次いで、サンプルについて、パッカード（Packard）のガンマ・カウンターを用いて放射能をカウントした。最終的な表記入数値は、未処理の細胞サンプルに取り込まれた放射能のパーセントで表した。図10に示すように、ＥＣ72は、ＦＲ陽性ＫＢ細胞に対して、用量依存性の高い活性を示し（IC50 = 5 nM）、その活性は特異的である。なぜなら、遊離葉酸が過剰にあると、それは、任意のＤＮＡ合成抑制を効果的に阻止したからである。
【００７４】
＜実施例１０＞
＝＝＝in vivoにおける用量反応＝＝＝
ハーラン社(Harlan, Inc.)、インディアナポリス、インディアナ州から、6〜7週齢のマウス（Balb/C系統の雌）を入手した。本実験の開始前の合計3週間と実験中、ハーランの葉酸が欠如した飼料においてこれらのマウスを飼育した。葉酸レセプター陽性M109PＯ腫瘍細胞（1匹の動物あたり0.5x106個の細胞）を、投与開始4日前に上部腹腔に接種した。図11に示す図は、腫瘍接種後4日目から始めて連日30回、腹腔内に投与したものであり、動物の生存率を毎日モニターした。ＥＣ72は、M109腫瘍を有するマウスにおける用量依存性の活性を示したものである。1800 nmol/kgのＥＣ72レベル（in vivoにおける飽和可能な葉酸レセプター）では、寿命において240％の延長が認められ、4匹のうち1匹が完全な反応を示した。
【００７５】
＜実施例１１＞
＝＝＝葉酸レセプターが陰性の腫瘍におけるin vivoの活性＝＝＝
ハーラン社（Harlan, Inc.）、インディアナポリス、インディアナ州から、6〜7週齢のマウス（Balb/C系統の雌）を入手した。本実験の開始前の合計3週間と実験中、ハーランの葉酸が欠如した飼料においてこれらのマウスを飼育した。葉酸レセプターが陰性の4T-1腫瘍細胞（1匹の動物あたり1x106個の細胞）を右腋窩の皮下に接種した。図12に示す図は、腫瘍接種後4日目から始めて連日30回、腹腔内に投与したものであり、動物の生存率と共に、腫瘍体積を毎日モニターした。ＥＣ72は、皮下に形成された葉酸レセプターが陰性の4T-1腫瘍に対する活性を示さなかった。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】図1は、ＥＣ72（スキーム1を参照のこと；黒三角）の細胞毒性と、マイトマイシンＣ（黒四角）の細胞毒性との比較を示す。過剰な遊離葉酸存在下におけるＥＣ72の細胞毒性も示す（黒丸）。
【図２】図2は、ＰＢＳ（コントロール；黒四角）、マイトマイシンＣ（白丸）、または、ＥＣ72（黒丸）を注入した、M109腫瘍含有マウスの生存パーセントを示す。
【図３】図3は、ＰＢＳ（コントロール；黒三角）、マイトマイシンＣ（黒四角）、ＥＣ72（黒丸）、または、ＥＣ72プラス過剰な遊離葉酸（黒ひし形）を注入した、M109腫瘍を有するマウスの生存パーセントを示す。
【図４】図4は、皮下に腫瘍を形成させるためにM109細胞を移植し、ＰＢＳ（黒四角）、または、ＥＣ72（黒丸）で治療したマウスにおける腫瘍サイズを示す。
【図５】図5は、プテロイル-Glu-Cys-S-マイトマイシンＣ結合体（化合物5；スキーム2を参照のこと）、Pte-Glu-Asp-Arg-Asp-Cys-S-マイトマイシンＣ-OH結合体（化合物7；スキーム2を参照のこと）、および、Pte-Glu-Arg-Cys-S-マイトマイシンＣ-Ala-Gly-O結合体（化合物9；スキーム3を参照のこと）の1次元NMRを示す。
【図６】図6は、プテロイル-Glu-Cys-S-マイトマイシンＣ結合体（化合物5；スキーム2を参照のこと）、Pte-Glu-Asp-Arg-Asp-Cys-S-マイトマイシンＣ-OH結合体（化合物7；スキーム2を参照のこと）、および、Pte-Glu-Arg-Cys-S-マイトマイシンＣ-Ala-Gly-O結合体（化合物9；スキーム3を参照のこと）の2次元NMRを示す。
【図７】図7は、皮下に腫瘍を形成させるためにM109細胞を移植し、ＰＢＳ（黒四角）、タキソール（20 mg/kg；白丸）、または、タキソール＋ＥＣ72（黒丸）で治療したマウスにおける腫瘍サイズを示す。
【図８】図8は、皮下に腫瘍を形成させるためにM109細胞を移植し、ＰＢＳ（黒四角）、タキソール（15 mg/kg、白丸）、または、タキソール＋ＥＣ72（黒丸）で治療したマウスにおける腫瘍サイズを示す。
【図９】図9は、遊離葉酸（下の曲線）またはＥＣ72（上の曲線）の濃度を漸増させた場合の、ＫＢ細胞に対する３Ｈ-葉酸の結合度を示す。
【図１０】図10は、ＥＣ72の濃度を漸増させた場合（黒丸）の、または、0.1 mMの遊離葉酸存在下でＥＣ72濃度を漸増させた場合（白丸）の、ＫＢ細胞のＤＮＡ合成の抑制を示す。
【図１１】図11は、ＰＢＳ（コントロール；黒四角）、または、濃度を漸増させたＥＣ72を注入した、M109腫瘍を有するマウスの生存パーセントを示す。ＥＣ72注入の内訳（黒ひし形= 100 nmol/kg、黒三角= 400 nmol/kg、および、黒丸= 1800 nmol/kg）。
【図１２】図12は、皮下に腫瘍を形成させるために葉酸レセプター陰性4T-1細胞を移植し、ＰＢＳ（黒四角）、または、ＥＣ72（黒丸）で治療したマウスにおける腫瘍サイズを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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