(57)【要約】本発明は、抗ウイルス剤として有用な6-(4- 置換-アニリノ)ピリミジン誘導体に関するもので、より詳しくはC型肝炎ウイルス(Hepatitis C virus; HCV)の増殖抑制効果に優れた下記化学式(I)で表示される新規の6-(4-置換-アニリノ)ピリミジン誘導体及びその薬学的に許容される塩、その製造方法、そして前記化合物を有効成分として含む抗ウイルス用薬学的組成物に関する。本発明による6-(4-置換-アニリノ)ピリミジン誘導体は、C型肝炎ウイルス(HCV)の増殖抑制効果が優秀なのでC型肝炎の予防と治療に有用である。ここで、下記化学式(I)中、Rは、C1-C4の直鎖若しくは分岐のアルコキシカルボニル基、ヘテロサイクリックカルボニル基、又はカルボキシアルキル基を示す。【化１】2005521744.tif 000009
2005521744.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式(I)で表示される6-(4-置換-アニリノ)ピリミジン誘導体又は薬学的に許容されるその塩：
【化１】
2005521744.tif 000007
前記化学式(I)中、Rは、C1-C4の直鎖若しくは分岐のアルコキシカルボニル基、ヘテロサイクリックカルボニル基、又はカルボキシアルキル基を示す。
【請求項２】
Rは、イソプロポキシカルボニル基、(3-ピリジル)カルボニル基、(4-ピリジル)カルボニル基、及びカルボキシメチル基から選択されるいずれか１である請求項１の6-(4-置換-アニリノ)ピリミジン誘導体又は薬学的に許容されるその塩。
【請求項３】
下記反応式で示される、
化学式IIの4、6−ジクロロ-2-(メチルチオ)ピリミジンと、化学式IIIの4-(4-モルフォリノ)アニリンを反応させ、化学式IVの2-(メチルチオ)-6-[4-(4-モルフォリノ)アニリノ]-4-クロロピリミジン中間体を製造する段階(段階i)；
化学式IV中間体を化学式Vのピペラジンと反応させて、化学式VIの2-(メチルチオ)-6-[4-(4-モルフォリノ)アニリノ]-4-(ピペラジン-1-イル)ピリミジン中間体を製造する段階(段階ii)；
化学式VI中間体を適切なハロゲン化合物と反応させて、6-(4-置換-アニリノ)ピリミジン誘導体を製造する段階(段階iii)；
を含む、6-(4-置換-アニリノ)ピリミジン誘導体の製造方法:
【化２】
2005521744.tif 000008
前記反応式中、Rは、C1-C4の直鎖若しくは分岐のアルコキシカルボニル基、ヘテロサイクリックカルボニル基、又はカルボキシアルキル基を示す。
【請求項４】
請求項１の6-(4-置換-アニリノ)ピリミジン誘導体又は薬学的に許容されるその塩を有効成分として含有するＣ型肝炎の予防又は治療用薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗ウイルス剤として有用な6-(4-置換-アニリノ)ピリミジン誘導体に関するもので、より詳しくはC型肝炎ウイルス(Hepatitis C virus; HCV)の増殖抑制効果に優れた下記化学式(I)で表示される新規の6-(4-置換-アニリノ)ピリミジン誘導体及びその薬学的に許容される塩、その製造方法、並びに前記化合物を有効成分とする抗ウイルス用薬学的組成物に関する。
【化１】
2005521744.tif 000003
【０００２】
前記化学式(I)中、Rは、C1-C4の直鎖若しくは分岐のアルコキシカルボニル基、ヘテロサイクリックカルボニル基、又はカルボキシアルキル基を示す。
【背景技術】
【０００３】
C型肝炎ウイルス(Hepatitis C virus, HCV; 以下"HCV")は非Ａ型、非Ｂ型肝炎(non-A, non-B viral hepatitis)の主要因子で、主に輸血および地域特異的感染によって発生される。HCVに感染されると、その兆候が現れる場合約80%は慢性感染に進行し、約20%程は、結果的に肝臓癌に転移する肝硬化を引き起こす急性感染に進行する。最近の報告によると、全世界的に約２億万人以上がHCVに感染されており、アメリカ内でも４百５０万人以上で推定され(最大一千五百万人が推定される)、ヨーロッパでも５百万人以上がHCV患者であると知られている。
【０００４】
HCVは、フラビウィルス(Flavivirus)科に属する膜を持つウィルスである。膜内に約9.5kbサイズの(+)-RNA(single stranded positive-sense RNA)ゲノムで持ち、RNAゲノムは5'末端と3'末端の非翻訳部分と一つの長いopen reading frame(ORF)で構成されている。このORFは、宿主細胞の酵素により3,010乃至3,040個のアミノ酸からなるポリプロテイン(polyprotein)で発現し、宿主細胞とウィルス自身の酵素(protease)により３個の構造蛋白質(structural protein)と６個の非構造蛋白質(nonstructural protein)に分けられる。ゲノムの5'末端と3'末端には各々同一に保存された部分(conserved region)が存在し、この部分が、ウィルスの蛋白質形成とRNA複製に重要な役割を果たすと思われる。
【０００５】
一つの長いORFは、ポリプロテインとして発現し、翻訳段階または翻訳後段階(post-translational processing)を通じて、構造蛋白質であるコア抗原蛋白質(core)、表面抗原蛋白質(E1, E2)、そして非構造蛋白質であるNS2(蛋白質分解酵素、protease)、NS3(セリン系蛋白質分解酵素 serine protease、ヘリカーゼ helicase) NS4A(補助因子 serine protease cofactor) NS4B(protease cofactor, resistance関連) NS5A, NS5B(RNA重合酵素 RdRp, RNA dependent RNA polymerase)などに分けられて各々ウィルスの増殖に作用する。構造蛋白質の場合、宿主細胞の信号ペプチド分解酵素(signal peptidase)によりcore、E1、E2の部分に分けられ、非構造蛋白質の場合、ウィルス自身のセリン蛋白質分解酵素(serine protease, NS3)と補助因子(cofactor, NS2, NS4A, NS4B)により分離される。構造蛋白質のコア抗原蛋白質は表面抗原蛋白質と共にウィルスのキャプシド(capsid)を構成し、NS3とNS5Bなど非構造蛋白質は、ウィルスRNAの複製(replication)に重要な役割を果たすことになる(参考：非特許文献１)。
【０００６】
ウィルスRNAの5'と3'末端部位には、他のフラビウィルスのように同一に保存された非翻訳部分(untranslational region, UTR)が存在し、この部分はウィルスの増殖に極めて重要な役割を果たすと知られている。5'末端には、341個のヌクレオチドからなる5'-UTRが存在し、この部分は4個のstem及びloop(I, II, III, IV)構造になっており、このため蛋白質発現のための翻訳(translation)過程に必要なリボソーム作用開始部位(internal ribosome entry site, IRES)として作用する。特に、もっとも大きく安定した構造を持ち、保存された塩基配列(conserved sequence)が存在するstem IIIが、リボソーム付着に最も必須的な部分であると報告されている。そして、stem IVの単一RNA部分に存在するAUGから翻訳が開始され、ウィルスの蛋白質が発現すると知られている(参考: 非特許文献２)。
【０００７】
また、3'末端には318個のヌクレオチドからなる3'-UTRが存在し、RNA複製に必須的な酵素であるNS5Bの付着(binding)が始まるのに重要な役割をすると知られている。この部分は塩基配列と３次元的構造により３個の部分に分けられる。即ち、5'末端から98個のヌクレオチド(98nt.)からなる-X-tail-5'部分、連続的にUTPが存在する-poly(U)-部分、そして3'-UTR-部分に分けられる。 X-tail-5'は非常に保存された塩基配列を持つ98個のヌクレオチドからなっており、3個のstem及びloop構造になっており、それゆえに安定的な３次元的構造を持つので、NS5B付着に必須的部分であると思われている。また、-poly(U)-部分はピリミジン系列を誘導(pyrimidine track)して、RNA重合酵素の作用を促進すると報告された。そして、3'-UTR部分はloopの３次元構造を持つのでNS5Bの付着に重要な役割を果たすけど、その構造は安定的ではない。結局HCV  RNAの3'末端部位は、RNAの複製が始まる時に、NS5B付着に必須的な構造を成すと知られている(参考：非特許文献３)。
【０００８】
HCVの多様な酵素中、NS5BはRNA複製に直接作用するので非常に重要である。NS5Bは、591個のアミノ酸からなる約分子量68kDaの酵素である。NS5B酵素中には反応に必要なRNAの付着に必須的なRBD(RNA-binding domain)1,2の二つの部分が存在する。RBD1はアミノ酸83乃至194番に存在し、RBD2はアミノ酸196乃至298番に存在する。RNA付着と活性に必須的に存在する(essential motif)アミノ酸は、220番asp、283番gly、317番gly、318番 asp、319番asp、346番lysである。また、この酵素は、ウィルス自身のRNAテンプレート(template)が存在する時、他のプライマー(primer)がなくても重合反応を進行できる(参考：非特許文献４)。
【０００９】
HCVは、1989年にクローニング(molecular cloning)でRNAゲノム(genome)が分離された (非特許文献５)。それ以降、HCVに対する分子生物学的研究が進行されてきたが、効果的なcell culture systemとanimal modelの不足から制約があった。しかし、最近安定的にHCVのreplicationができるhepatoma cell lineが開発され、このような問題点をいくぶん解決できるようになった (参考：非特許文献６)。
【００１０】
現在まで、HCVに対する優秀なワクチンや効果的な治療剤は存在しない。従って、世界中の多くの製薬会社や研究所でHCV治療剤を開発している。HCVは、HBVに比べて全世界的に均等な分布を示し、肝硬化と肝臓癌に転移する比率がHBVより非常に高い。そして慢性肝炎に進行する比率が高いが、このような感染メカニズムに対する研究は未だに進行中である。また、C型肝炎は輸血のみならず、静脈注射による薬物使用や文身によっても感染されるが、主に直接的なblood contactによって感染される。しかし、まだ40−50%の場合、その感染経路は正確にはわかっていない。従って、緊急に効果的なワクチンと治療剤の開発が望まれる。HCVは、strainによりその遺伝型(genotype)が多様で、突然変異(mutation)が発生することが多く、HCVによる慢性感染の場合、遺伝的変異型(genetic variants)によって再感染(reinfection)、同時感染(coinfection)などが起きる事もある。この為、HCVに効果的なワクチンの開発は難しかった。治療方法の一つとして、アルファ−インターフェロン(α-interferon)が用いられているが、HCVの遺伝子型によってその効果は異なり、投与を中断すると殆ど再発するので、HCVが複製できないようにHCVの特定蛋白質にのみ結合する阻害剤(inhibitor)の開発が治療方法として望まれる。このような研究でもっとも良い標的は、HCVのNS3蛋白質分解酵素、ヘリカーゼとNS5B RNA重合酵素である。このような酵素は自身の増殖には必須的なものであるが、宿主細胞には不必要なので、抗HCV剤の開発に有用に用いられている。従って、HCVのNS5B(RNA dependent RNA polymerase(replicase))は、増殖に必須的なHCVの酵素なので、HCVの増殖を抑制するための治療に良い標的(target)になれると考えられる。
【００１１】
現在までの研究では、ワクチンを用いる治療は難しく、アルファ−インターフェロン(α-interferon)やリバビリン(Ribavirin)を用いる新しい治療法が施行されているが、治療率は低く、副作用があるので、その効果は微弱である。インターフェロン療法の場合、全く反応がない症例が約25%で、一時的に反応するが再発する症例が約25%ぐらいである。残りの約50%の患者は、治療終了後にもALT値が正常に維持され、HCV RNAが陰性になるが、その中約50%ぐらいは治療終了後3-6ヶ月以内に再発するので、結局25%だけが6ヶ月以上治療効果が維持される持続的反応(sustained response)を示すことになる。また、世界中にはC型肝炎ウィルスの遺伝子型(subtype)が存在し、1a,1b型は2,3型に比べてインターフェロン療法にあまり良い反応を示していない。その為、インターフェロンとリバビリン併用療法を用いることになり、この場合治療効果が2倍ぐらい高くなるが、リバビリンを単独で使用する場合は効果が殆どなく、赤血球が破壊され貧血などの副作用があるので、主にインターフェロン療法に反応がない症例や再発された症例に処方することが知られている。従って、今までHCVに特異的に作用し、その増殖を抑制することでＣ型肝炎を治療する抗ウイルス剤は開発されていなかった。
【００１２】
従って、本発明は組み替え(recombinant)HCV RNA重合酵素(NS5B, RNA polymerase)の活性を阻害する可能性ある物質を探索することで、HCVに優秀な抗ウイルス活性を示し、毒性や副作用が少ない非核酸系(nonnucleoside)化合物を開発することが目的である。
【００１３】
それゆえに本発明者らは、副作用と毒性が少ない新規なＣ型肝炎治療剤の開発を目標に、HCVに優秀な抗ウイルス活性を示す化合物の開発に努力した結果、前記化学式(I)で表示される新規の6-(4-置換-アニリノ)ピリミジン誘導体を合成し、この物質がHCVの増殖抑制効果に優れたことを確認し、本発明を完成するに至った。
【非特許文献１】Bartenschager, R., 1997, Molecular targets in inhibition of hepatitis C virus replication, Antivir. Chem. Chemother. 8: 281-301
【非特許文献２】Stanley, M. Lemon and Masao Honda, 1997, Internal ribosome entry sites within the RNA genomes of hepatitis C virus and other Flaviviruses, seminars in Virology 8: 274-288
【非特許文献３】Yamada et al., 1996, Genetic organization and diversity of the hepatitis C virus genome, Virology 223: 255-281
【非特許文献４】Lohmann, V. et al., 1997, Biochemical properties of hepatitis C virus NS5B RNA dependent RNA polymerase and identification of amino acid sequence motifs essential for enzymatic activity, J. virol. 71: 8416-8428
【非特許文献５】Choo, Q-L, et al., 1989, Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science 244:359-362
【非特許文献６】Lohmann, V., F. Korner, J-O Koch, U. Herian, L. Theilmann, R. Bartenschlager, 1999, Replication of subgenomic hepatitis c virus RNAs in a hepatoma cell line. Science 285:110-113
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、6-(4-置換-アニリノ)ピリミジン誘導体、薬学的に許容されるその塩およびその製造方法を提供することである。
本発明のもう一つの目的は、前記化合物を有効成分とする、副作用が少なく経済的なＣ型肝炎の治療および予防用薬学的組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
前記目的を達成する為、本発明では下記化学式(I)で表示される新規の6-(4-置換-アニリノ)ピリミジン誘導体又は薬学的に許容されるその塩を提供する。
【化１】
2005521744.tif 000004
【００１６】
前記化学式(I)中、Rは、C1-C4の直鎖若しくは分岐のアルコキシカルボニル基、ヘテロサイクリックカルボニル基、又はカルボキシアルキル基を示す。
【００１７】
望ましくは、前記化学式(I)中、Rはイソプロポキシカルボニル基、(3−ピリジル)カルボニル基、(4−ピリジル)カルボニル基、カルボキシメチル基を示す。
【００１８】
前記した通りに、本発明の化学式(I)の化合物は薬学的に許容される塩の形態で用いることができ、塩としては薬学的に許容される遊離酸(free acid)により形成された酸付加塩が利用できる。 化学式(I)の化合物は、該当技術分野で通常的な方法により薬学的に許容される酸付加塩を形成できる。遊離酸としては、有機酸と無機酸が用いられ、無機酸では塩酸、ブロム酸、硫酸、りん酸などが用いられ、有機酸ではクエン酸(citric acid)、酢酸、乳酸、酒石酸(tartaric acid)、マレイン酸、フマル酸(fumaric acid)、ぎ酸、プロピオン酸(propionic acid)、シュウ酸、トリフルオロ酢酸、安息香酸、グルコン酸、 メタンスルホン酸、グリコール酸、コハク酸、4−トルエンスルホン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸などが用いられる。
【００１９】
また、本発明では下記図式で表示される6-(4-置換-アニリノ)ピリミジン誘導体の製造方法を提供する。
【化２】
2005521744.tif 000005
【００２０】
前記図式中の化学式(I)中、Rは、C1-C4の直鎖若しくは分岐のアルコキシカルボニル基、ヘテロサイクリックカルボニル基、又はカルボキシアルキル基を示す。
【００２１】
本発明の製造方法は、前記図式のように、
(i) 化学式IIの4、6−ジクロロ-2-(メチルチオ)ピリミジンと、化学式IIIの4-(4-モルフォリノ)アニリンを反応させ、化学式IVの2-(メチルチオ)-6-[4-(4-モルフォリノ)アニリノ]-4-クロロピリミジン中間体を製造する段階(段階i)；
(ii) 前記段階iで製造された化学式IV中間体を化学式Vのピペラジンと反応させて、化学式VIの2-(メチルチオ)-6-[4-(4-モルフォリノ)アニリノ]-4-(ピペラジン-1-イル)ピリミジン中間体を製造する段階(段階ii)；及び
(iii)前記段階iiで製造された化学式VI中間体を適切なハロゲン化合物と反応させて、本発明の6-(4-置換-アニリノ)ピリミジン誘導体を製造する段階(段階iii)、
を含む。
【００２２】
前記図式中の出発物質および反応物質として用いられる4、6−ジクロロ-2-(メチルチオ)ピリミジン、4-(4-モルフォリノ)アニリン、ピペラジンおよびハロゲン化合物などは商業的に市販されている物質である。前記段階(iii)のハロゲン化合物は、目的化合物に置換基を導入する為の試薬であって、導入する置換基の種類によって適切なものを選択できるし、これは当該技術分野に属する通常の知識を持つ者なら容易に選択して使用できる。
【００２３】
前記段階(i)と段階(ii)の製造方法をもっと詳しく説明すると、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ジクロロメタン、クロロフォルム、アセトニトリル、N,N-ジメチルホルムアミド、アセトンなど有機溶媒の中、トリエチルアミン、N,N-ジイソプロピルエチルアミン、N-メチルモルフォリン、1-メチルピペリジン、ピリジン、2,6-ルチジン、4-ジメチルアミノピリジン、N,N−ジメチルアニリンなど一般的な有機塩基の存在下、40℃-65℃の温度で、12時間-45時間進行する。
【００２４】
前記段階(iii)の製造方法をもっと詳しく説明すると、ジクロロメタン、クロロフォルム、アセトニトリル、N,N-ジメチルホルムアミドなど有機溶媒の中、トリエチルアミン、N,N-ジイソプロピルエチルアミン、N-メチルモルフォリン、1-メチルピペリジン、ピリジン、2,6-ルチジン、4-ジメチルアミノピリジン、N,N−ジメチルアニリンなど一般的な有機塩基の存在下、ハロゲン化合物の種類及び反応性により0℃-10℃の温度で１時間以内に完了するか又は40℃-80℃の温度で12時間以内に完了する。
【００２５】
また、本発明では、化学式(I)で表示される6-(4-置換-アニリノ)ピリミジン誘導体及び/又は薬学的に許容されるその塩を有効成分として含有するＣ型肝炎の治療剤又は予防剤用薬学的組成物を提供する。
【００２６】
Ｃ型肝炎の治療剤として化学式(I)の化合物は、臨床使用時、経口または非経口で投与可能で、一般的な医薬品の形態で使用できる。もし、固形製剤に調製することが必要な場合には、増量剤、ビルダー、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤、賦形剤を含む一般的に使用される希釈薬が利用できる。一方、経口投与用固形製剤は、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤を含む。このような固形製剤は、１以上の化学式(I)の化合物、１以上の賦形剤、例えば澱粉、炭酸カルシウム(Calcium carbonate)、スクロース(Sucrose)又はラクトース(Lactose)、ゼラチンなどを含んでいる。経口投与用液状製剤には懸濁剤、液剤、油剤、シロップ剤などが利用可能であるが、単なる希釈液、すなわち水、流動パラフィン又は賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤が利用可能である。非経口投与製剤としては、滅菌水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、油剤がある。好ましくは、使用される非水溶液及び懸濁液は、プロピレングリコール(Propylene glycol)、ポリエチルレングリコール(Polyethylene glycol)、オリーブオイルのような植物性オイル、オレイン酸エチルのような注射可能のエステルである。
【００２７】
化学式(I)の化合物の有効投与量は、患者の性別、年齢、状態によって適切に選択できるが、一般的には成人に10-1000mg/日、望ましくは20-500mg/日であり、１日1-3回分割して投与できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、実施例は本発明を例示するもので、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２９】
製造例１: 2-(メチルチオ)-6-[4-(4-モルフォリノ)アニリノ]-4-クロロピリミジンの製造
メタノール80mLに、4、6−ジクロロ-2-(メチルチオ)ピリミジン 5.85g、4-(4-モルフォリノ)アニリン 5.35g、そしてトリエチルアミン 5.1mLを順番に加え、加熱して55℃-60℃で18時間反応させた。反応混合物を、20℃に冷却して、２時間攪拌を続けた後、濾過し、メタノール25mLで洗浄して、結晶生成物を得た。その生成物を、30℃-40℃で真空乾燥して、8.79g(収率：87%)の目的化合物を得た。
【００３０】
m.p.: 159-161℃
1H-NMR(CDCl3), ppm: δ2.51(s, 3H), 3.15(t, 4H), 3.86(t, 4H), 6.19(d, 1H), 6.76(s, 1H), 6.91(d, 2H), 7.16(d, 2H)
【００３１】
製造例２: 2-(メチルチオ)-6-[4-(4-モルフォリノ)アニリノ]-4-(ピペラジン-1-イル)ピリミジンの製造
メタノール80mLに、前記製造例１から製造された2-(メチルチオ)-6-[4-(4-モルフォリノ)アニリノ]-4-クロロピリミジン 5.6g、無水ピペラジン 14.3g、そしてトリエチルアミン 2.6mLを順番に加え、加熱して55℃-60℃で40時間反応させた。反応混合物を、20℃に冷却して、２時間攪拌を続けた後、濾過し、メタノール25mLで洗浄して、結晶生成物を得た。その生成物を、30℃-40℃で真空乾燥して、6.17g(収率：96%)の目的化合物を得た。
【００３２】
m.p.: 232-234℃
1H-NMR(DMSO-d6), ppm: δ2.39(d, 3H), 2.70(brs, 4H), 3.02(brs, 4H), 3.35(brs, 4H), 3.70(m, 4H), 5.53(s, 1H), 6.87(d, 2H), 7.34(d, 2H), 8.78(s, 1H)
実施例１
【００３３】
2-(メチルチオ)-6-[4-(4-モルフォリノ)アニリノ]-4-[4-(イソプロポキシカルボニル)ピペラジン-1-イル]ピリミジンの製造
ジクロロメタン 40mLに、2-(メチルチオ)-6-[4-(4-モルフォリノ)アニリノ]-4-(ピペラジン-1-イル)ピリミジン 1g、トリエチルアミン 0.4mLを順番に加え、10分間攪拌して完全に溶解し、O℃に冷却した。0℃-5℃でイソプロピルクロロフォーメート(1.0M-トルエン溶液) 2.85mLをゆっくり加えた後、0℃-5℃で20分間反応させた。さらに、水 40mLを加え、20℃で10分間攪拌した後、有機層を分離し、水40mLでさらに一回洗浄した。有機層を減圧濃縮し、残査をエチルエテル30mLで結晶化した後、室温で2時間攪拌し、濾過して生成物を得た。その生成物を、エチルエテル 5mLで洗浄し、そして30℃-40℃で真空乾燥して、1.05g(収率：86%)の目的化合物を得た。
【００３４】
m.p.: 155-157℃
1H-NMR(CDCl3), ppm: δ1.23(d, 6H), 2.48(s, 3H), 3.15(brs, 4H), 3.50(brs, 8H), 3.85(t, 4H), 4.93(m, 1H), 5.41(s, 1H), 6.42(s, 1H), 6.90(d, 2H), 7.15(d, 2H)
実施例２
【００３５】
2-(メチルチオ)-6-[4-(4-モルフォリノ)アニリノ]-4-[4-[(3-ピリジル)カルボニル]ピペラジン-1-イル]ピリミジンの製造
ジクロロメタン 40mLに、2-(メチルチオ)-6-[4-(4-モルフォリノ)アニリノ]-4-(ピペラジン-1-イル)ピリミジン 1g、トリエチルアミン 0.8mLを順番に加え、10分間攪拌して完全に溶解し、０℃に冷却した。0℃-5℃でニコチノイルクロリド塩酸塩 0.48gをゆっくり加えた後、0℃-5℃で30分間反応させた。さらに、水 40mLを加え、20℃で10分間攪拌した後、有機層を分離し、次に水40mLでさらに一回洗浄した。そして、有機層を減圧濃縮し、残査をジクロロメタン4mLとエチルエテル40mLの混合溶媒で結晶化した後、室温で2時間攪拌し、濾過して固体生成物を得た。その生成物を、エチルエテル 5mLで洗浄し、30℃-40℃で真空乾燥して、1.13g(収率：89%)の目的化合物を得た。
【００３６】
m.p.: 131-133℃
1H-NMR(CDCl3), ppm: δ2.47(d, 3H), 3.15(brs, 4H), 3.49(m, 6H), 3.86(m, 6H), 5.43(s, 1H), 6.89(d, 2H), 7.15(d, 2H), 7.35(t, 1H), 7.75(dd, 1H), 8.67(d, 2H)
実施例３
【００３７】
2-(メチルチオ)-6-[4-(4-モルフォリノ)アニリノ]-4-[4-[(4-ピリジル)カルボニル]ピペラジン-1-イル]ピリミジンの製造
ニコチノイルクロリド塩酸塩の代わりにイソニコチノイルクロリド塩酸塩を使用し、前記実施例２と同じ方法で目的化合物を製造した。
【００３８】
収率：93%
m.p.: 155-156℃
1H-NMR(CDCl3), ppm: δ2.47(d, 3H), 3.15(brs, 4H), 3.41(brs, 2H), 3.57(brs, 4H), 3.85(m, 6H), 5.42(s, 1H), 6.50(s, 1H), 6.91(brs, 2H), 7.15(brs, 2H), 7.28(m, 2H), 8.70(d, 2H)
実施例４
【００３９】
2-(メチルチオ)-6-[4-(4-モルフォリノ)アニリノ]-4-[4-(カルボキシメチル)ピペラジン-1-イル]ピリミジンの製造
段階１: 2-(メチルチオ)-6-[4-(4-モルフォリノ)アニリノ]-4-[4-(エトキシカルボニルメチル)ピペラジン-1-イル]ピリミジンの製造。
アセトニトリル 50mLに前記製造例2から製造された2-(メチルチオ)-6-[4-(4-モルフォリノ)アニリノ]-4-(ピペラジン-1-イル)ピリミジン 3g、クロロ酢酸エチル 0.9mL、そしてトリエチルアミン 1.3mLを順番に加え、加熱して、70℃-80℃で７時間反応させた。  反応完了後、20℃までゆっくり冷却し、メタノール 30mLを加えて１時間攪拌した後、濾過して、固体生成物を得た。その生成物を、メタノール15mLで洗浄し、35℃-45℃で真空乾燥して、3.41g(収率：93%)の目的化合物を得た。
【００４０】
m.p.: 88-90℃
1H-NMR(DMSO-d6), ppm: δ1.16(m, 3H), 2.39(d, 3H), 3.02(brs, 4H), 3.15(m, 2H), 3.35(d, 4H), 3.44(brs, 4H), 3.70(d, 4H), 4.04(m, 2H),5.56(d, 1H), 6.87(m, 2H), 7.34(d, 1H), 7.37(d, 1H), 8.82(s, 1H)
【００４１】
段階2: 2-(メチルチオ)-6-[4-(4-モルフォリノ)アニリノ]-4-[4-(カルボキシメチル)ピペラジン-1-イル]ピリミジンの製造。
メタノール 30mLに前記段階１から製造された2-(メチルチオ)-6-[4-(4-モルフォリノ)アニリノ]-4-[4-(エトキシカルボニルメチル)ピペラジン-1-イル]ピリミジン 2.5g、水 25mLと3N-水溶性水酸化ナトリウム水溶液 5.3mLを順番に加えた後、加熱して50℃-60℃で1時間反応させた。反応完了後、ゆっくり冷却して、10℃-20℃で3N-塩酸をゆっくり加えてpH 6.0-7.0に調整した。混合物を、１時間攪拌して濾過し、固体生成物を得た。その生成物を、水20mLで洗浄し、40℃-50℃で真空乾燥して、2.24g(収率：95%)の目的化合物を得た。
【００４２】
m.p.: 156-158℃
1H-NMR(DMSO-d6), ppm: δ2.39(d, 3H), 2.62(brs, 4H), 3.02(brs, 4H), 3.20(s, 2H), 3.47(brs, 4H), 3.71(m, 4H), 5.57(s, 1H), 6.87(d, 2H), 7.34(d, 2H), 8.84(s, 1H)
実験例１
【００４３】
HCV RNA重合酵素(RNA依存型RNAポリメラーゼ、NS5B)に対する生体外(in vitro)阻害活性の測定
本発明の化合物のHCV RNA依存型RNAポリメラーゼに対する活性阻害効果を測定するために、以下のin vitro実験を行った。
【００４４】
組み替えHCV RNAポリメラーゼの製造
HCV RNAポリメラーゼは以下のように製造した。まず、HCV-1b型C型肝炎ウィルス患者の血液からHCVcDNAを得て、PCRを利用しNS5B(1773bps)部位を増幅して、続いてバキュロウイルス(baculovirus)転移ベクター(transfer vector)pVLHISに挿入して、組み替え転移ベクターを製造した。製造された転移ベクターを、Wild-type AcNPVベクターと共に昆虫細胞(Sf9 cell line)に感染(cotransfection)させ、ヒスチジン標識(histidine tag)組み替えベクターpVLHIS-NS5Bを持つ組み替えバキュロウイルスを製造した。このように製造された組み替えバキュロウイルスを、十分に培養された昆虫細胞に感染(infection)させ、10% FBSを含むGrace'mediumで3-4日培養した。培養ブロスの遠心分離により、感染された細胞だけを得た。得られた細胞を、PBSで３回洗浄し、バインディングバッファ[50mM Na-phosphate(pH 8.0), 30mM NaCl, 10mM imidazole, 1mM DTT, 10% glycerol, 1% NP-40]中に再懸濁し、超音波分解処理(sonication)し、透明溶解液（clearized  lysate）を得た。組み換えNS5Bを、NI-NTA His bind resin(Novagen社)を利用した親和性(affinity)カラムクロマトグラフィーの精製により、純粋なNS5B蛋白質を製造した。(His)6-tagged NS5Bは、Ni-NTA resinに結合されており、50mM イミダゾールを含むバインディングバッファで洗浄された。結合されたNS5Bは、イミダゾール(100-300mM)を含むバッファでステップーグラデイエント方法（100-300mM）で溶出された。NS5B蛋白質画分はバッファ[50mM Tris-HCl, 50mM NaCl, 1mM DTT, 5mg MgCl2, 10% glycerol]で透析した後、スモールアリコートで-70℃冷却した。
【００４５】
HCV 3'末端(3'-UTR)を含むRNAテンプレート(RNA template)の製造
HCV 3'末端(-UTR)を含むRNAテンプレートは以下のような方法で製造した。HCVの3'UTR  CDNA(220bp)は、PCRによってC型肝炎患者の血液の1b  HCV  RNAから得た、そしてpcDNA3  vectorに導入した。3'-UTRを含む直線DNAフラグメントは、制限酵素 Eco RIを利用して調製し、そして3'-UTRを含むRNAフラグメントを調製するためのT7  RNA  ポリメラーゼを利用して試験管内転写(in vitro transcription)ための鋳型として利用した。
【００４６】
組み替えHCV本発明の化合物の生体外阻害活性測定
組み替えHCV RNAポリメラーゼに対する本発明の化合物の生体外阻害活性測定方法は以下の通りである。測定しようとする試料に合わせてストレプトアビジン(streptavidin)でコーティングされたウェル(well)を準備し、まず各ウェルに2Xアッセイ緩衝液 [50mM Tris-Cl(pH 7.5), 100mM NaCl, 10mM MgCl2, 20mM KCl, 1mM EDTA, 1mM DTT]を25μl、精製されたHCV RNAポリメラーゼ 200ngの10μl、3'-UTRテンプレートRNAを加えた。測定しようとするサンプルを最終濃度が各々10, 1, 0.1, 0.01μg/mLになるように5μlずつ添加した。HCV 3'-UTR RNAのRNAテンプレートと、ポリメラーゼ反応のためのヌクレオチドとしてDIG-(digoxigenin)-UTP, biotin-UTP, ATP, CTP, GTP, UTPを含んだ反応液10μlずつ各ウェルに加えた後、22℃で60分間反応させた。HCVポリメラーゼの活性により、新しく生じるビオチン及びDIG結合UTPを含むRNAsが複製され、そしてこれらの新しいRNAsは、UTP結合ビオチンによってウエル上にコートされたストレプトアビジンに結合できる。反応が終った後、反応しないで残ってる基質及び不純物を除去するため、各ウェルに200μlの洗浄緩衝液(washing buffer, pH 7.0, Roche社)で3回洗浄した。その後、2次抗体である抗-DIG-POD(peroxidase, Roche社)100μlずつ各ウェルに加え、37℃で1時間反応させた後、再び洗浄緩衝液で各ウェルを洗浄した。最後に、POD基質であるABTSR(Roche社)100μlを各々ウェルに加え、15-30分間反応させた後、ELISA  reader(Bio-Tek instrument社)を利用し405nmにて光学度(OD値)を測定した。この時、試料を添加しなかった対照群(positive control)との相対的な光学濃度差により、HCVポリメラーゼに対する活性抑制効果を計算した。その結果は以下の表１に示す。
【００４７】
【表１】
2005521744.tif 000006
【００４８】
上記表に示されるように、本発明の化合物は、HCVの複製に重要な役割をするHCV RNAポリメラーゼの活性を阻害する効果が優秀なので、それゆえにHCVの増殖を抑制できる。従って、本発明の化合物はC型肝炎の予防剤およ治療剤として有用に使用することができる。
実験例２
【００４９】
細胞毒性実験
化学式Iの化合物の細胞毒性(Cytotoxicity)を確認する為に、Hep G2細胞を利用し、一般的によく知られているMTT分析方法により試験管内(in vitro)実験を行った。その結果、実験に使用された化合物すべてCC50値が100μl/mL以上で、細胞に対する毒性が極めて少ないことが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
以上のように、本発明による前記化学式(I)で表示される新規の6-(4-置換-アニリノ)ピリミジン誘導体は、Ｃ型肝炎ウィルスの増殖を抑制する効果が優秀で、さらに毒性も少ないので、Ｃ型肝炎の予防剤および治療剤として有用に使用できる。
【国際調査報告】
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