(57)【要約】【課題】グルコサミニルの６−Ｏ硫酸化方法及び６−Ｏ硫酸化された多糖製剤を提供する。【解決手段】多糖製剤内のグルコサミニルであるＮアセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を６−Ｏ硫酸化する方法、不活性な抗凝血性のヘパラン硫酸を、活性な抗凝血性のヘパラン硫酸に変換する方法、及びそれらの方法により生成される概ね純粋な多糖類調整体が開示されている。また、抗凝血性が活性であるヘパラン硫酸を高生産する突然変異ＣＨＯ細胞が開示されている。また、生合成経路における酵素の活性の配列を解明する方法が提供されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多糖製剤におけるＮアセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）糖残基の６−Ｏ位置に、硫酸基を転移させる方法であって、
（ａ）ＧｌｃＮＡｃ糖残基を有する多糖製剤を供給するステップと、
（ｂ）硫酸基ドナーの存在下で、６−ＯＳＴタンパク質が前記ＧｌｃＮＡｃ糖残基の前記６−Ｏ位置に硫酸基を付加することが可能な状態で、前記多糖製剤を６−ＯＳＴタンパク質と接触させるステップとを含むことを特徴とする硫酸基転移方法。
【請求項２】
前記多糖製剤は、ヘパランを含むことを特徴とする請求項１に記載の硫酸基転移方法。
【請求項３】
前記多糖製剤は、グルクロン酸（ＧｌｃＵＡ）残基を含むことを特徴とする請求項１に記載の硫酸基転移方法。
【請求項４】
前記多糖製剤は、ＧｌｃＵＡ−ＧｌｃＮＡｃ糖残基を含むことを特徴とする請求項１に記載の硫酸基転移方法。
【請求項５】
前記多糖製剤は、ＧｌｃＵＡ／ＩｄｏＵＡ−ＧｌｃＮＳ、ＩｄｏＵＡ２Ｓ−ＧｌｃＮＳ及びＧｌｃＵＡ−ＧｌｃＮＳ３Ｓから成る群から選択された二糖を含むことを特徴とする請求項１に記載の硫酸基転移方法。
【請求項６】
前記多糖製剤は、ＧｌｃＮＡｃ／ＮＳ６Ｓ−ＧｌｃＵＡ−ＧｌｃＮＳ３Ｓ±６Ｓ−ＩｄｏＵＡ２Ｓ−ＧｌｃＮＳ６Ｓを含むことを特徴とする請求項１に記載の硫酸基転移方法。
【請求項７】
前記多糖製剤は、ＧｌｃＮＡｃ／ＮＳ−ＧｌｃＵＡ−ＧｌｃＮＳ３Ｓ±６Ｓ−ＩｄｏＵＡ２Ｓ−ＧｌｃＮＳ６Ｓを含むことを特徴とする請求項１に記載の硫酸基の転移方法。
【請求項８】
前記多糖製剤は、ＧｌｃＮＡｃ／ＮＳ６Ｓ−ＧｌｃＵＡ−ＧｌｃＮＳ３Ｓ±−ＩｄｏＵＡ２Ｓ−ＧｌｃＮＳ６Ｓを含むことを特徴とする請求項１に記載の硫酸基転移方法。
【請求項９】
前記多糖製剤は、ＧｌｃＮＡｃ／ＮＳ６Ｓ−ＧｌｃＵＡ−ＧｌｃＮＳ３Ｓ±６Ｓ−ＩｄｏＵＡ２Ｓ−ＧｌｃＮＳを含むことを特徴とする請求項１に記載の硫酸基転移方法。
【請求項１０】
前記６−ＯＳＴタンパク質は、組換型タンパク質であることを特徴とする請求項１に記載の硫酸基転移方法。
【請求項１１】
前記６−ＯＳＴタンパク質は、ヒト組換型タンパク質であることを特徴とする請求項１０に記載の硫酸基転移方法。
【請求項１２】
前記組換型タンパク質は、バキュロウイルス細胞、酵母細胞、細菌細胞、及び哺乳動物細胞から成る群から選択された発現系内で生成されることを特徴とする請求項１０に記載の硫酸基転移方法。
【請求項１３】
前記硫酸基ドナーは、ＰＡＰＳであることを特徴とする請求項１に記載の硫酸基転移方法。
【請求項１４】
前記６−Ｏ硫酸化は、ｐＨが６．５〜７．５である塩化物を少なくとも１つ含む反応混合物内で行われることを特徴とする請求項１に記載の硫酸基転移方法。
【請求項１５】
前記多糖製剤は、硫酸基ドナーの存在下で、６−ＯＳＴタンパク質を含む多糖製剤と少なくとも２０分間接触することを特徴とする請求項１に記載の硫酸基転移方法。
【請求項１６】
多糖製剤内に存在するＨＳａｃｔの一部をエンリッチ化させる方法であって、
（ａ）３−Ｏ硫酸化された多糖製剤を供給するステップと、
（ｂ）硫酸基ドナーの存在下で、６−ＯＳＴタンパク質が前記ＧｌｃＮＡｃ糖残基の前記６−Ｏ位置に硫酸基を付加することが可能な状態で、前記多糖製剤を６−ＯＳＴタンパク質と接触させるステップとを含み、
前記ステップ（ｂ）は、前記ステップ（ａ）と同時に、又は前記ステップ（ａ）の後に行われることを特徴とするＨＳａｃｔのエンリッチ化方法。
【請求項１７】
前記３−Ｏ硫酸化された多糖製剤は、３−ＯＳＴタンパク質を発現する細胞から得られることを特徴とする請求項１６に記載のＨＳａｃｔのエンリッチ化方法。
【請求項１８】
前記３−Ｏ硫酸化された多糖製剤は、ＨＳｉｎａｃｔを３−ＯＳＴ−１タンパク質と接触させることにより調製されることを特徴とする請求項１７に記載のＨＳａｃｔのエンリッチ化方法。
【請求項１９】
前記３−Ｏ硫酸化された多糖製剤は、ヘパランから得られることを特徴とする請求項１６に記載のＨＳａｃｔのＨＳａｃｔのエンリッチ化方法。
【請求項２０】
前記ステップ（ｂ）において、前記多糖製剤全体に対する前記ＨＳａｃｔの割合は７０％以上であることを特徴とする請求項１６に記載のＨＳａｃｔのエンリッチ化方法。
【請求項２１】
前記ステップ（ｂ）において、前記多糖製剤全体に対する前記ＨＳａｃｔの割合は５０％以上であることを特徴とする請求項１６に記載のＨＳａｃｔのエンリッチ化方法。
【請求項２２】
前記多糖製剤は、Ｎアセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基及びグルクロン酸（ＧｌｃＵＡ）残基を含むことを特徴とする請求項１６に記載のＨＳａｃｔのエンリッチ化方法。
【請求項２３】
前記多糖製剤は、ＧｌｃＵＡ／ＩｄｏＵＡ−ＧｌｃＮＳ、ＧｌｃＵＡ−ＧｌｃＮＡｃ、ＩｄｏＵＡ２Ｓ−ＧｌｃＮＳ及びＧｌｃＵＡ−ＧｌｃＮＳ３Ｓから成る群から選択された糖残基を含むことを特徴とする請求項１６に記載のＨＳａｃｔのエンリッチ化方法。
【請求項２４】
前記硫酸基ドナーは、ＰＡＰＳであることを特徴とする請求項１６に記載のＨＳａｃｔのエンリッチ化方法。
【請求項２５】
前記６−Ｏ硫酸化は、ｐＨが６．５〜７．５である塩化物を少なくとも１つ含む反応混合物内で行われることを特徴とする請求項１６に記載のＨＳａｃｔのエンリッチ化方法。
【請求項２６】
前記６−ＯＳＴタンパク質は、
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３、
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４、
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５、
（ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６、
（ｅ）前記（ａ）〜（ｄ）の突然変異体、及び
（ｆ）前記（ａ）〜（ｄ）の機能的断片
から成る群から選択されたポリペプチドを含むことを特徴とする請求項１から請求項２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
請求項１から請求項２５のいずれかに記載の方法により調製された概ね純粋な製剤。
【請求項２８】
ＨＳｔｏｔａｌに対して２８％以上のＨＳａｃｔを生成する突然変異ＣＨＯ細胞。
【請求項２９】
ＨＳｔｏｔａｌに対して２８〜５０％のＨＳａｃｔを生成する突然変異ＣＨＯ細胞。
【請求項３０】
請求項２８に記載の突然変異ＣＨＯ細胞であって、
（ａ）ＣＨＯ細胞を、３−ＯＳＴ−１の多重コピーを用いて変換するステップと、
（ｂ）前記ステップ（ａ）で得られた細胞に、突然変異を起こさせるステップと、
（ｃ）前記ステップ（ｂ）で得られたＨＳａｃｔを生成することのできない突然変異細胞を単離するステップと、
（ｄ）前記ステップ（ｃ）で得られた細胞を、６−ＯＳＴを用いて変換するステップとを含む生成方法により生成されることを特徴とする突然変異ＣＨＯ細胞。
【請求項３１】
生合成経路内の成分を特定する方法であって、
（ａ）前記生合成経路における上流の成分で発現する標的細胞を供給するステップと、
（ｂ）前記標的細胞を、単離化された前記生合成経路における下流の遺伝子の多重コピーを用いて変換するステップと、
（ｃ）変換された標的細胞に突然変異を起こさせるステップと、
（ｄ）変換され突然変異が起きた、前記生合成経路における表現型特性を発現することのできない標的細胞を特定するステップとを含むことを特徴とする生合成経路内の成分特定方法。
【請求項３２】
前記ステップ（ｄ）で得られた細胞を、前記ステップ（ａ）の細胞の野生型の表現型を発現する細胞となるように補正するステップ（ｅ）をさらに含むことを特徴とする請求項３１に記載の生合成経路内の成分特定方法。
【請求項３３】
前記補正ステップは、前記上流の遺伝子をコード化する核酸を用いて、前記細胞を変換するステップを含むことを特徴とする請求項３２に記載の生合成経路内の成分特定方法。
【請求項３４】
前記上流の遺伝子は、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡであることを特徴とする請求項３３に記載の生合成経路内の成分特定方法。
【請求項３５】
前記ステップ（ｄ）の細胞は、予め選択された前記生合成経路の成分のためのｃＤＮＡのプールを用いて変換されることを特徴とする請求項３１に記載の生合成経路内の成分特定方法。
【請求項３６】
前記ステップ（ｄ）の細胞は、野生型の表現型を発現する細胞から得られるｃＤＮＡライブラリを用いて変換されることを特徴とする請求項３１に記載の生合成経路内の成分特定方法。
【請求項３７】
前記補正ステップは、前記ステップ（ｄ）の細胞を前記上流の遺伝子の遺伝子産物と接触させるステップを含むことを特徴とする請求項３２に記載の生合成経路内の成分特定方法。
【請求項３８】
前記ステップ（ｄ）で得られた細胞を単離するステップをさらに含むことを特徴とする請求項３１に記載の生合成経路内の成分特定方法。
【請求項３９】
前記ステップ（ｄ）で得られた細胞を分析するステップをさらに含むことを特徴とする請求項３１に記載の生合成経路内の成分特定方法。
【請求項４０】
前記上流の遺伝子を単離するステップをさらに含むことを特徴とする請求項３４に記載の生合成経路内の成分特定方法。
【請求項４１】
前記突然変異生成ステップは、化学的突然変異生成、イオン放射及び紫外線放射から成る群から選択された突然変異生成技術により突然変異生成を行うことを特徴とする請求項３１に記載の生合成経路内の成分特定方法。
【請求項４２】
前記ｃＤＮＡ遺伝子を特定するステップは、相補性分析を含むことを特徴とする請求項３１に記載の生合成経路内の成分特定方法。
【請求項４３】
前記特定ステップは、ノーザンブロット分析、サザンブロット分析及びウエスタンブロット分析から成る群から選択された技術により前記遺伝子を特定することを特徴とする請求項３１に記載の生合成経路内の成分特定方法。
【請求項４４】
前記特定ステップは、ＰＣＲを用いて前記遺伝子を単離するステップをさらに含むことを特徴とする請求項３１に記載の生合成経路内の成分特定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概ね、グルコサミノグリカン（glucosaminoglycan）の生合成に関し、特に、多糖の６−Ｏ硫酸化（６−０−ｓｕｌｆａｔｉｎｇ）に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘパリン／ヘパラン硫酸（ＨＳ）は、プロテオグリカン（proteoglycan）のタンパク質のコアと共有結合的に付着する線状重合体である。プロテオグリカンは、ほとんど全ての動物細胞において、豊富にかつ偏在的に発現する。ＨＳは、次の一連の反応を触媒する、多数のファミリーの酵素の働きにより生成される。連鎖重合へのＮアセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及びグルクロン酸（ＧｌｃＵＡ）の残基の交互の付加。ＧｌｃＮＡｃのＮ脱アセチル化及びＮ硫酸化。グルクロン酸のＬイズロン酸（ＩｄｏＵＡ）へのエピマー化。ウロン酸の残基の２−Ｏ硫酸化。そして、グルコサミニル残基の３−Ｏ硫酸化及び６−Ｏ硫酸化。
【０００３】
ＨＳと様々なタンパク質との相互作用は、ＨＳの高度に硫酸化された領域において起こる。さらに、ＨＳ−タンパク質の相互作用の特異性は、どれもＨＳ鎖における硫酸基の配列により概ね決定される。例えば、五糖連鎖である、ＧｌｃＮＡｃ／ＮＳ６Ｓ−ＧｌｃＵＡ−ＧｌｃＮＳ３Ｓ±６Ｓ−ＩｄｏＵＡ２Ｓ−ＧｌｃＮＳ６Ｓは、アンチトロンビン（ＡＴ）を結合するために必用な最小限の配列であるが、３Ｓ（３‐Ｏ硫酸基）及び６Ｓ（６‐Ｏ硫酸基）の集団は、結合に関しての最も重要な要素となる（１２−１６）。
【０００４】
ＡＴ−ＨＳ合成物は、強力な血液凝固防止性（抗凝血性）を有する。抗凝血性を有するヘパラン硫酸（ＨＳａｃｔ）の生合成に関係するいくつかの酵素は、精製及びクローン化されている。例えば、グルコサミニル３−Ｏスルホトランスフェラーゼ（３−ＯＳＴ）及びグルコサミニル６−Ｏスルホトランスフェラーゼ（６−ＯＳＴ）タンパク質は、精製及びクローン化されている（１７、１８）。６−ＯＳＴ及び３−ＯＳＴタンパク質の多数のイソ型は、単離されており、組織特異的発現パターン及び異なった基質特異性を有することが示されている。
【０００５】
ＨＳには、ＮＳ領域、ＮＡｃ／ＮＳ領域と呼ばれる２つの異なる硫酸化された領域が存在している（４０、４１）。ＮＳ領域は、連続的なイズロノシルＮ−スルホグルコサミン（iduronosyl N-sulfoglucosamine）の一群から成り、ＮＡｃ／ＮＳ領域は、交互にＮアセチル化及びＮ硫酸化された二糖部分から成る。基質として、Ｎ硫酸化されたヘパロソン（heparosan）及び脱硫化された脱Ｎ硫酸化ヘパリン（re-N-sulfated heparin）を用いた、６−ＯＳＴ−１、６−ＯＳＴ−２、及び６−ＯＳＴ−３の受容特異性は、６−ＯＳＴ−１、２Ａ、２Ｂ、及び３により触媒作用が及ばされたＮＳ領域内におけるＮスルホグルコサミン残基の６位の硫酸化と、６−ＯＳＴ−２及び６−ＯＳＴ−３により触媒作用が及ばされたＮＡｃ／ＮＳ領域内におけるＮスルホグルコサミン残基の６位の硫酸化を示す（２）。
【０００６】
組織特異性、及びＨＳの生合成酵素及び酵素のイソ型における発達的に調整された発現は、特定の配列のＨＳ鎖を形成する（１−３）。この微小不均一性は、ＨＳがタンパク質リガンドの広範囲の配列と相互作用することを可能にする。なお、タンパク質リガンドは、発達、分化、恒常性、及び細菌／ウイルス進入などの幅広い生物学的機能を調整する（４−１１）。前記した特定の配列を形成する多糖の合成は、前記した生物学的機能を調整するために行われている。
【０００７】
ヘパリン製剤（特に、ＨＳａｃｔを含む製剤）は、血栓の疾患の予防及び治療のための抗凝血療法として臨床的に使用されていた。また、ＨＳ製剤は、例えば透析装置やステントなどの体外の又は身体上の医療機器において、血液の流動性を保つために使用されている。
【発明の開示】
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、多糖製剤におけるＮアセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）糖残基の６−Ｏ位置に、硫酸基を転移させる方法であって、（ａ）ＧｌｃＮＡｃ糖残基を有する多糖製剤を供給するステップと、（ｂ）硫酸基ドナーの存在下で、６−ＯＳＴタンパク質が前記ＧｌｃＮＡｃ糖残基の６−Ｏ位置に硫酸基を付加することが可能な状態で、前記多糖製剤を６−ＯＳＴタンパク質に接触させるステップとを含むことを特徴とする。なお、好ましい実施形態では、前記硫酸基ドナーは、ＰＡＰＳである。
【０００９】
ある実施形態では、前記多糖製剤は、グルクロン酸（ＧｌｃＵＡ）残基、ＧｌｃＵＡ−ＧｌｃＮＡｃ糖残基、又はＧｌｃＵＡ／ＩｄｏＵＡ−ＧｌｃＮＳ、ＩｄｏＵＡ２Ｓ−ＧｌｃＮＳ及びＧｌｃＵＡ−ＧｌｃＮＳ３Ｓから成る群から選択された二糖を含んでいる。
【００１０】
ある好ましい実施形態では、前記多糖製剤は、アンチトロンビンとの結合モチ−フである五糖連鎖、即ちＧｌｃＮＡｃ／ＮＳ６Ｓ−ＧｌｃＵＡ−ＧｌｃＮＳ３Ｓ±６Ｓ−ＩｄｏＵＡ２Ｓ−ＧｌｃＮＳ６Ｓを含んでいる。
【００１１】
ある実施形態では、前記多糖製剤は、アンチトロンビンとの結合モチ−フである前駆体糖である、ＧｌｃＮＡｃ／ＮＳ−ＧｌｃＵＡ−ＧｌｃＮＳ３Ｓ±６Ｓ−ＩｄｏＵＡ２Ｓ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ、ＧｌｃＮＡｃ／ＮＳ６Ｓ−ＧｌｃＵＡ−ＧｌｃＮＳ３Ｓ±−ＩｄｏＵＡ２Ｓ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ、又はＧｌｃＮＡｃ／ＮＳ６Ｓ−ＧｌｃＵＡ−ＧｌｃＮＳ３Ｓ±６Ｓ−ＩｄｏＵＡ２Ｓ−ＧｌｃＮＳを含んでいる。特に好ましい前駆体は、ＩｄｏＡ／ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＡｃ６Ｓ、ＩｄｏＡ／ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮ６Ｓ、及びＩｄｏＡ２Ｓ−ＧｌｃＮＳ６Ｓを含んでいる。
【００１２】
また、ある実施形態では、前記６−ＯＳＴタンパク質は、バキュロウイルス細胞、細菌細胞、哺乳動物細、又は胞酵母細胞の発現系内で生成された組換型タンパク質である。好ましい実施形態では、前記６−ＯＳＴタンパク質は、ヒト組換型タンパク質である。なお、他の哺乳類の組換型タンパク質を用いてもよい。特に好ましい実施形態では、前記６−ＯＳＴタンパク質は、（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３、（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４、（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５、（ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６、（ｅ）前記（ａ）〜（ｄ）の突然変異体、及び（ｆ）前記（ａ）〜（ｄ）の機能的断片から成る群から選択されたポリペプチドを含んでいる。
【００１３】
ある実施形態では、硫酸化された反応混合物は、少なくとも１つの塩化物を含んでおり、ｐＨが６．５〜７．５である。好ましい実施形態では、前記６−ＯＳＴは、硫酸基ドナーの存在下で、多糖製剤タンパク質と少なくとも２０分間接触する。他の実施形態では、反応は朝まで続けられる。
【００１４】
また、本発明は、多糖製剤内に存在するＨＳａｃｔの一部をエンリッチ化させる方法であって、（ａ）３−Ｏ硫酸化された多糖製剤を供給するステップと、（ｂ）硫酸基ドナーの存在下で、６−ＯＳＴタンパク質が前記ＧｌｃＮＡｃ糖残基の６−Ｏ位置に硫酸基を付加することが可能な状態で、前記多糖製剤を６−ＯＳＴタンパク質に接触させるステップとを含み、前記ステップ（ｂ）は、前記ステップ（ａ）と同時に、又は前記ステップ（ａ）の後に行われることを特徴とする。好ましい実施形態では、前記硫酸基ドナーは、ＰＡＰＳである。ある実施形態では、前記多糖製剤はヘパランに由来する。また、前記多糖は、公知の他の多糖のソースに由来してもよい。
【００１５】
ある実施形態では、前記３−Ｏ硫酸化された多糖製剤は、３−ＯＳＴタンパク質を発現する細胞に由来する。他の実施形態では、前記３−Ｏ硫酸化された多糖製剤は、ＨＳｉｎａｃｔを３−ＯＳＴ−１タンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ２）、対立遺伝子の又は種の変異体、又は３−ＯＳＴ機能的断片に接触させることにより調製される。
【００１６】
好ましい実施形態では、前記ステップ（ｂ）において、前記多糖製剤全体に対する前記ＨＳａｃｔの割合は５０％以上である。特に好ましい実施形態では、前記ステップ（ｂ）において、前記多糖製剤全体に対する前記ＨＳａｃｔの割合は７０％以上である。
【００１７】
本発明の方法に用いられる好ましい多糖製剤は、Ｎアセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基及びグルクロン酸（ＧｌｃＵＡ）残基を含んでいる。特に好ましい多糖製剤は、ＧｌｃＵＡ／ＩｄｏＵＡ−ＧｌｃＮＳ、ＧｌｃＵＡ−ＧｌｃＮＡｃ、ＩｄｏＵＡ２Ｓ−ＧｌｃＮＳ及びＧｌｃＵＡ−ＧｌｃＮＳ３Ｓを含んでいる。
【００１８】
また、本発明は、ＨＳｔｏｔａｌに対して２８〜５０％のＨＳａｃｔを生成する突然変異ＣＨＯ細胞である。好ましい実施形態では、突然変異ＣＨＯ細胞は、ＨＳｔｏｔａｌに対して５０％以上のＨＳａｃｔを生成する。前記突然変異ＣＨＯ細胞は、（ａ）ＣＨＯ細胞を、３−ＯＳＴ−１の多重コピーを用いて変換するステップと、（ｂ）前記ステップ（ａ）で得られた細胞に、突然変異を起こさせるステップと、（ｃ）前記ステップ（ｂ）で得られたＨＳａｃｔを生成することのできない突然変異細胞を単離するステップと、（ｄ）前記ステップ（ｃ）で得られた細胞を、６−ＯＳＴを用いて変換するステップとを含む生成方法により生成することができる。特に好ましい実施形態では、前記６−ＯＳＴタンパク質は、（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３、（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４、（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５、（ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６、（ｅ）前記（ａ）〜（ｄ）の突然変異体、及び（ｆ）前記（ａ）〜（ｄ）の機能的断片から成る群から選択されたポリペプチドを含んでいる。
【００１９】
また、本発明は、生合成経路内の成分を特定する方法であって、（ａ）前記生合成経路における上流の成分で発現する標的細胞を供給するステップと、（ｂ）前記標的細胞を、単離化された前記生合成経路における下流の遺伝子の多重コピーを用いて変換するステップと、（ｃ）変換された標的細胞に突然変異を起こさせるステップと、（ｄ）変換され突然変異が起きた、前記生合成経路における表現型特性を発現することのできない標的細胞を特定するステップとを含むことを特徴とする。ある実施形態では、前記ステップ（ｄ）で得られた細胞を補正するステップ（ｅ）をさらに含んでいる。そのような実施形態では、前記補正ステップは、前記ステップ（ｄ）で得られた細胞に、上流の遺伝子を挿入するステップを含んでいる。前記上流の遺伝子は、ｃＤＮＡゲノムＤＮＡ、又はそれらの機能的断片である。好ましい実施形態では、前記ステップ（ｄ）の細胞は、予め選択された前記生合成経路の成分のためのｃＤＮＡのプールを用いて変換される。例えば、前記ステップ（ｄ）の細胞は、野生型の表現型を発現する細胞に由来するｃＤＮＡライブラリを用いて変換される。
【００２０】
ある実施形態では、前記補正ステップは、前記ステップ（ｄ）の細胞を前記上流の遺伝子の遺伝子産物に接触させるステップを含んでいる。他の実施形態では、前記補正ステップは、前記ステップ（ｄ）の細胞を、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はそれらの機能的断片（上流の遺伝子のための）と接触させるステップを含んでいる。
【００２１】
他の実施形態では、前記ステップ（ｄ）で得られた細胞を単離するステップ、前記ステップ（ｄ）で得られた細胞を分析するステップ、及び／又は流の遺伝子を単離するステップをさらに含んでいる。
【００２２】
ある実施形態では、前記突然変異生成ステップは、化学的突然変異生成、イオン放射及び紫外線放射から成る群から選択された突然変異生成技術により突然変異生成を行う。前記ｃＤＮＡ遺伝子を特定するステップは、相補性分析、ノーザンブロット分析、サザンブロット分析、及び／又はウエスタンブロット分析により前記遺伝子を特定する。好ましい実施形態では、前記上流の遺伝子は、ＰＣＲ又は他の公知の技術を用いて単離される。
【００２３】
また、本発明は、医療機器におけるトロンビン活量を減少させる方法であって、医療機器を、概ね純粋な製剤及び／又は本明細書で開示されたエンリッチ化されたＨＳａｃｔで覆うステップを含んでいる。好ましい実施形態では、前記医療機器は、血液と接触する体外の又は身体上の機器である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
初めに、用語について説明する。
〔抗凝血性のヘパラン硫酸（ＨＳａｃｔ）〕
「抗凝血性のヘパラン硫酸」又はその略語である「ＨＳａｃｔ」は、アンチトロンビン（ＡＴ）との結合部である五糖、即ちＧｌｃＮＡｃ／ＮＳ６Ｓ−ＧｌｃＵＡ−ＧｌｃＮＳ３Ｓ±６Ｓ−ＩｄｏＵＡ２Ｓ−ＧｌｃＮＳ６Ｓを含んでいる硫酸化されたＨＳを意味する。ＨＳａｃｔは、例えばＡＴ−アフィニティー・クロマトグラフィーなどの公知の手法を用いて、多糖のプールから精製することができる。サンプルの抗凝血性活量は、本明細書中に開示される方法、又は、例えばCoatestヘパリン定量装置（イタリア、ミランのChromogenix社製）などの公知の方法により計ることができる。
〔抗凝血作用が不活性なヘパラン硫酸（ＨＳｉｎａｃｔ）〕
「抗凝血作用が不活性なヘパラン硫酸」又はその略語である「ＨＳｉｎａｃｔ」は、アンチトロンビンとの結合部である五糖、即ちＧｌｃＮＡｃ／ＮＳ６Ｓ−ＧｌｃＵＡ−ＧｌｃＮＳ３Ｓ±６Ｓ−ＩｄｏＵＡ２Ｓ−ＧｌｃＮＳ６Ｓが不足している硫酸化されたＨＳを意味する。ＨＳｉｎａｃｔは、本明細書中に開示される方法、又は、例えばCoatestヘパリン定量装置（イタリア、ミランのChromogenix社製）などの公知の方法により特定し、計ることができる。
〔エンリッチ化された（Ｅｎｒｉｃｈｅｄ）〕
多糖製剤内に存在する特定の多糖構造体に関しては、「エンリッチ化された」は、多糖製剤における多糖構造体の割合が、天然の未処理の多糖製剤における多糖構造体の割合よりも統計的に有為な程度に多いことを意味する。本発明に係る多糖製剤は、６−ＯＳＴ−１硫酸化多糖又はＨＳａｃｔに対して、約１０−１００倍エンリッチ化されている。例えば、典型的な非エンリッチ化製剤における６−ＯＳＴ硫酸化多糖の割合は０〜３％であるのに対して、本発明に係るエンリッチ化製剤における６−ＯＳＴ硫酸化多糖の割合は約５〜９％である。同様に、典型的な非エンリッチ化製剤であるインビトロで作り出された培養細胞におけるＨＳａｃｔの割合は約０〜１％であるのに対して、本発明に係るエンリッチ化された多糖製剤（本発明に係る高生産性突然変異ＣＨＯ細胞から得られる）におけるＨＳａｃｔの割合は約２８〜５０％である。
〔ヘパラン硫酸〕
「ヘパラン硫酸」又はその略語である「ＨＳ」は、繰り返し二糖部分であるＤグルクロン酸（又は、Ｎ−アセチル又はＮ硫酸化されたＤグルコサミンと結合するＬイズロン酸）から構成されている多糖を意味する。多糖は、ＧｌｃＡとＩｄｏＡ残基の２−Ｏ位置、及びＧｌｃＮ残基の６−Ｏ位置と３−Ｏ位置の硫酸化と、ＧｌｃＮ残基の窒素のアセチル化又は脱アセチル化により、様々にモディファイ化される。したがって、この定義は、ヘパラン、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ヘパリチン、ヘパリチン硫酸、ヘパラノイド（heparanoid）、ヘパロソン（heparosan）などの全てのグルコサミノグリカン化合物を含む。ヘパラン分子は、純粋なグルコサミノグリカンであってもよいし、他の分子（例えば、タンパク質、及び脂質、又は小分子などの他のポリマーを含む）と結合しているグルコサミノグリカンであってもよいし、
〔３−Ｏスルホトランスフェラーゼ（３−ＯＳＴ）〕
「３−Ｏスルホトランスフェラーゼ」は、ＨＳ内のグルコサミンの３−ＯＨ位置に硫酸基を付加する役割を果たすタンパク質のファミリーのことである。これらの酵素は、様々な組織や細胞において異なる段階の異なる遺伝子から発現したいくつかのイソ型として存在する。これらの３−ＯＳＴは、生合成の後期においてＨＳをモディファイ化し（reviewed by Lindalil et al., 1998）、各イソ型はＨＳ鎖の領域におけるグルコサミン残基を基質として認識する。前記領域は、近隣の他の位置に対して、予め、特定のしかし互いに異なるモディファイ化（エピマー化及び硫酸化を含む）がなされている（Liu et al., 1999）。このようにして、互いに異なる複数の３−ＯＳＴは、ＨＳにおいてそれぞれ異なる潜在的なタンパク質結合部をもたらす。
〔３−ＯＳＴ−１〕
「３−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ−１」又はその略語である「３−ＯＳＴ−１」は、「１」として示される６−Ｏスルホトランスフェラーゼのファミリーにおける特定のイソ型のことである。３−ＯＳＴ−１については、ＷＯ  ９９／２２００５に詳細に記載されている（これは言及することをもって本明細書の一部とする）。「３−ＯＳＴ−１」は、３−ＯＳＴ−１遺伝子（ＳＥＱ．  ＩＤ  ＮＯ．  １）又はタンパク質（ＳＥＱ．  ＩＤ  ＮＯ．  ２）を含む核酸を指す。この用語が核酸又はポリペプチドに適用された場合でも適用されない場合でも、３−ＯＳＴの機能的断片を記号化した最小限の配列を含んでいることを意味する。一般に、機能的断片は、ＨＳの３−０位置に硫酸基を転移するのに必要な最小限のセグメントを含んでいる。したがって、機能的断片は省略することもでき、例えば、３−ＯＳＴ−１の全長には、リーダー配列が存在している。ＷＯ  ９９／２２００５は、３−ＯＳＴ−１の全長の核酸及びポリペプチドのどのセグメントが機能的断片を含んでいるかということに関してさらに詳しく説明している。
〔６−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ〕
６−ＯＳＴのファミリーの一員である「６−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ」は、ＨＳ内のグルコサミンの６−ＯＨ位置に硫酸基を付加する役割を果たす。これらの酵素は、様々な組織や細胞において異なる段階の異なる遺伝子から発現するいくつかのイソ型として存在する。前記した３−ＯＳＴと同様に、６−ＯＳＴは、生合成の後期においてＨＳをモディファイ化し（reviewed by Lindalil et al., 1998）、各イソ型はＨＳ鎖の領域におけるグルコサミン残基を基質として認識する。前記領域は、近隣の他の位置に対して、予め、特定のしかし互いに異なるモディファイ化（エピマー化及び硫酸化を含む）がなされている（Liu et al., 1999）。６−ＯＳＴは、核酸又はポリペプチド（ヒト６−ＯＳＴ−１、−２Ａ、−２Ｂ及び−３を含む）を指す。この用語が核酸又はポリペプチドに適用された場合でも適用されない場合でも、６−ＯＳＴの機能的断片を記号化した最小限の配列と同様に、対立遺伝子及び種の変異体を意味する。一般に、機能的断片は、ＨＳ製剤及び特にＨＳのＧｌｃＮＡｃ残基における６−０位置に硫酸基を転移するのに必要な最小限のセグメントを含んでいる。したがって、機能的断片は省略することもでき、例えば、タンパク質の全長には、膜貫通型の及び／又はリーダー配列が存在している。
〔概ね純粋〕
多糖製剤に関しては、「概ね純粋」という表現は、所定の多糖を少なくとも６０％（乾燥重量で）含んでいる製剤のことを意味する（他の意図的に含まれた化合物の重量は除く）。なお、前記製剤は、所定の多糖を、好ましくは少なくとも７５％含んでおり、より好ましくは少なくとも９０％含んでおり、最も好ましくは少なくとも９９％含んでいる（他の意図的に含まれた化合物の重量は除く。また、数値は乾燥重量を示す）。純度は、例えばカラム・クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、アミノ酸合成的分析、又はＵＰＬＣ分析などの適切な方法により計ることができる。もし、製剤が本発明に係る多糖を意図的に２つ以上含んでいる場合は、「概ね純粋な製剤」とは、本発明に係る多糖の総重量（乾燥重量）が全乾燥重量の少なくとも６０％であるという意味である（他の意図的に含まれた化合物の重量は除く）。なお、製剤が本発明に係る多糖を意図的に２つ以上含んでいる場合は、全乾燥重量における本発明に係る多糖の総重量は、好ましくは少なくとも７５％であり、より好ましくは少なくとも９０％であり、最も好ましくは少なくとも９９％である（他の意図的に含まれた化合物の重量は除く）。したがって、本発明に係る多糖が、投与、安定性、貯蔵などを目的として、他の１つ以上の化合物（例えば、希釈剤、浄化剤（detergent）、賦形剤、食塩、砂糖、脂質）と混合された場合は、それらの化合物は、製剤の純度を計算する際は無視される。さらに、前記多糖がプロテオグリカンである場合は、プロテオグリカンのタンパク質成分は、純度の計算からは除かれる。
〔転移〕
「トランスフォーメーション」とは、外生の核酸を細胞に導入する方法のことを意味しており、トランスフォーメーション、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロ・インジェクション、裸核酸のダイレクトンジェクション、粒子仲介供与（particle-mediated delivery）、ウイルス仲介形質導入（viral-mediated transduction）、又は他の核酸を宿主細胞に供与する方法を含んでいる（しかしそれらに限定されるものではない）。これらの方法は、結果として、核酸の一時的又は安定的な発現、又は核酸の宿主細胞（又はその子孫）のゲノムへの統合をもたらす。
〔変異体〕
「ＤＮＡ分子変異体」は、本来の６−ＯＳＴ配列の細部の変更を含むＤＮＡ分子のことである。なお、本来の６−ＯＳＴ配列は、例えば、好ましくは６−ＯＳＴ生合成活動が十分に保たれている間に、本来の６−ＯＳＴ配列のヌクレオチドの１つ以上が削除、付加する、及び／又は置換することにより変更される。「ＤＮＡ分子変異体」は、例えば、通常のＤＮＡ突然変異生成技術、又はＤＮＡ分子（又はその一部）の化学的合成により作成することができる。そのような変異体は、核酸のタンパク質コード化領域のリーディング・フレームを変化させないことが好ましい。また、６−ＯＳＴ生合成機能が単なる微細な削減又は増加しただけの、変化していないタンパク質をエンコードすることが好ましい。アミノ酸置換は、単独のアミノ酸残基の置換が好ましい。ＤＮＤ挿入は、約１〜１０の連続しているヌクレオチドが好ましく、除去は、約１〜３０の連続しているヌクレオチドが好ましい。挿入及び除去は、タンパク質コーディングまたはノンコーディング配列の端部より行うことが好ましい。また、隣接する塩基対に行うことが好ましい。置換、除去、挿入、又はそれらの組み合わせは、最終構成物に到達するために組み合わせることができる。本発明に係る核酸変異体は、「静かな」又は「地味な」変異体であることが好ましい。「静かな」変異体は、１つ以上の塩基対の置換が行われた、しかし前記配列によりコード化されたポリペプチドのアミノ酸配列は無変化である、本来の６−ＯＳＴ配列の変異体又はその同族体である。「地味な」変異体は、遺伝子のタンパク質コーディング領域の少なくとも１つのコドンが変化した本来の６−ＯＳＴ配列又はその同属であり、結果として、核酸配列によりコード化されたポリペプチドのアミノ酸残基の１つ以上が地味に変化する。全ての場合に、上述したような天然の６−ＯＳＴの変異体は、以下に示すようにして生物活性を検査する必要がある。特に、彼らは、ＨＳの糖残基の６−ＯＨ位置に硫酸基を付加する能力を持たなければならない。
【００２５】
本発明は、（１）３−ＯＳＴ−１が制限的でない場合、６−ＯＳＴが生合成経路のＨＳａｃｔの制限的な酵素である、（２）６−ＯＳＴは、アンチトロンビンとの結合モチ−フである６−Ｏ硫酸基を含むＧｌｃＮＡｃ残基に、６−Ｏ硫酸基を付加することができる、（３）３−Ｏ又は６−Ｏ硫酸化は、ＨＳａｃｔの生合成の最終段階である、という発見に一部分依存している。以上のように、本発明は、ＧｌｃＮＡｃ６Ｓを含むオリゴ糖を合成する方法、ＨＳａｃｔに対してエンリッチ化された製剤、及び６−ＯＳＴを用いてそのような製剤を調製する方法を提供する。
《多糖の６−Ｏ硫酸化》
本発明は、多糖製剤内の多糖残基（多糖はＧｌｃＮＡｃ糖残基を含んでいる）を６−Ｏ硫酸化する方法を提供する。この方法は、硫酸基ドナーの存在下で、前記６−ＯＳＴがＧｌｃＮＡｃ糖残基をＧｌｃＮＡｃ６Ｓに変換することが可能な状態で、多糖製剤を６−ＯＳＴタンパク質に接触させるステップを含んでいる。好ましい実施形態では、前記６−ＯＳＴタンパク質は、（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３、（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４、（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５、（ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６、（ｅ）前記（ａ）〜（ｄ）の突然変異体、及び（ｆ）前記（ａ）〜（ｄ）の機能的断片から成る群から選択されたポリペプチドを含んでいる。好ましい実施形態では、前記硫酸基ドナーは、アデノシン３’‐リン酸５’‐ホスホ硫酸（ＰＡＰＳ）である。
【００２６】
また、本発明は、３−Ｏ硫酸化された多糖製剤を６−ＯＳＴタンパク質に接触させることにより、ＨＳａｃｔを生成する方法である。これらの方法は、ＨＳａｃｔ生合成において、６−Ｏ硫酸化は３−Ｏ硫酸化の後に行うことができるという発見に基づいている。特別な実施形態では、ＨＳａｃｔの前駆体配列の一部を含むＧｌｃＮＡｃ糖残基は、６−Ｏ硫酸化されている。ある実施形態では、標的多糖は、例えばＩｄｏＡ／ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＡｃ６Ｓ、ＩｄｏＡ／ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ、及びＩｄｏＡ２Ｓ−ＧｌｃＮＳ６Ｓの、ＨＳａｃｔの前駆体配列の一部を含んでいる。ある好ましい実施形態では、標的多糖は、３−Ｏ硫酸化された前駆体である。
【００２７】
また、本発明は、硫酸基ドナーの存在下で、６−ＯＳＴタンパク質がＨＳｉｎａｃｔをＨＳａｃｔに変換することが可能な状態で、多糖製剤を６−ＯＳＴタンパク質に接触させることにより、ＨＳプール（ＨＳａｃｔの一部を含んでいる）におけるＡＴ−結合部をエンリッチ化させる方法である。好ましい実施形態では、前記硫酸基ドナーは、アデノシン３’‐リン酸５’‐ホスホ硫酸（ＰＡＰＳ）である。このＨＳａｃｔ前駆体プールをＨＳａｃｔに変換する発明は、特に、抗凝血性を有するヘパラン硫酸（これは血栓の疾患の予防及び治療のための抗凝血療法として臨床的に使用される）を生成するのに有用である。抗凝血性ヘパラン硫酸生成物は、例えば透析装置などの医療機器において、血液の流動性を保つために使用される。一般に、ＨＳａｃｔがエンリッチ化された製剤は、抗凝血性ヘパラン硫酸を必要とするどの応用例にも使用される。
【００２８】
また、本発明は、ラベルが強調されたＨＳａｃｔの発現する組換型細胞株を生産する。インビトロで作り出された培養細胞は、０〜１％のＨＳａｃｔを生成する。また一方、ＣＨＯ細胞を、３−ＯＳＴ−１の多重コピーを用いて変換することにより生産され、その後、６−ＯＳＴを用いて突然変異させることにより補正された変異体（「補正物」又は「高生産物」）は、２８〜５０％のＨＳａｃｔを生成することが示されている。これは、ＨＳａｃｔの割合の大幅な向上を意味する。
【００２９】
６−０硫酸化された製剤及びＨＳａｃｔは、例えば血栓の疾患などの、抗凝血性を管理することにより好転させることのできる病気の予防及び治療のための治療薬として有用である。これらの合成物は、血液凝固を減少させるために、体外又は内内の医療機器の表面を覆うのに用いられる。
【００３０】
本発明は、下記の実施例によりさらに詳しく理解されるであろう。なお、これらの実施例は、本発明を限定するものではない。
（実施例１：インビトロでのＨＳの６−Ｏ硫酸化）
インビトロでのグルコサミノグリカンの６−Ｏ硫酸化は、公知のどの方法によっても達成することができる。６−Ｏ硫酸化には、６−ＯＳＴタンパク質又はそれの機能的断片、標的多糖、硫酸基ドナー（好ましくはＰＡＰＳ）、及び６．５〜７．５（好ましくは７．０）のｐＨ範囲が必用である。従って、好ましい方法では、反応混合物は、５０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ７．０）、１％（ｗ／ｖ）  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５ｍＭのＭｎＣｌ２、５ｍＭのＭｇＣｌ２、２．５ｍＭのＣａＣｌ２、０．０７５ｍｇ／ｍｌの塩化プロタミン、１．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、代謝的標識［３５Ｓ］ＨＳ又は非放射性ＨＳ鎖、冷やしたＰＡＰＳ（０．５ｍＭ）又は［３５Ｓ］ＰＡＰＳ（２５μＭ、２×１０７ｃｐｍ）、及び７０ｎｇの精製したヒト６−ＯＳＴ−１に発現したバキュロ・ウイルス（最終重量は５０μｌ）を含んでいる。前記混合物は、摂氏３７度で２０時間又は朝まで培養され、２００μｇのコンドロイチン硫酸が添加される。ＨＳ鎖は、フェノール／クロロホルム抽出、及び、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌの０．２５コラムに１ｍｌのシリンジに詰め込まれ、陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製される。エタノール沈殿の後、ペレットは７５％のエタノールで洗われ、真空中で簡単に乾燥させられ、後の分析のため、水中に溶解させられる。
（実施例２：インビトロでの６−ＯＳＴによるＨＳａｃｔの生成）
６−ＯＳＴ−１は、バクテリアとバキュロ・ウイルス内で発現し、精製される。精製されたタンパク質は、前駆型突然変異体及び野生型ＣＨＯ細胞に由来するＨＳ３５Ｓを硫酸化するのに用いられる。特に、前駆型突然変異体ＨＳ鎖は、冷たいＲＡＰＳ内で、発現したバキュロ・ウイルス、３−ＯＳＴ−１タンパク質、６−ＯＳＴ−１タンパク質、又は量タンパク質により処理される。ＨＳａｃｔは、ＡＴ親和性精製により単離され、ＨＳａｃｔの割合は計測される。結果は下記の表１に示される。表１に示されるように、ＨＳａｃｔの産出の割合（５１％）は、ＣＨＯ野生型のそれ（６４％）と同様である。
【００３１】
表１
2005507640.tif 000002
（実施例３：６−ＯＳＴ−１の硫酸化は３種類の６−０を含む二糖を生成する）
【００３２】
ＨＳ鎖における６−ＯＳＴ−１が６Ｓ残基を付加する部位を限定するために、同等の量の野生型及び前駆型突然変異体を発現している３−ＯＳＴ−ｌ由来のＨＳがインビトロで、精製されたバキュロ・ウイルスが発現した６−ＯＳＴ−１が、［３５Ｓ］ＰＡＰＳの存在下で、２０分間又は夜通しラベル化される。３−ＯＳＴ−ｌ由来のＨＳには、前駆型突然変異体由来のＨＳと区別するために、１〜１／３の放射能が含まれる。［３５Ｓ］は、単離され、ヘパリチネーゼの混合体と共に消化される。結果としての二糖（９４％の［３５Ｓ］が計測される）は、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ２カラム上に単離され、適した内部の標準と共に、ＩＰＲＰ−ＨＰＬＣにより分解される（図２）。
【００３３】
下記の表２に示すように、ＡＵＡ−ＧｌｃＮＡｃ６３５Ｓ及びＡＵＡ−ＧｌｃＮＳ６３５Ｓの二糖は、２０分よりも夜通しの方に多く観察される。６−Ｏ硫酸結合は、バキュロ・ウイルス発現６−ＯＳＴ−１の方が、バクテリア発現６−ＯＳＴ−１よりも１０倍高い。また一方、バクテリアの６−ＯＳＴ−１を用いた夜通しのラベル化は３つの６−０硫酸化された二糖を、次の割合で生成する。ＡＵＡ−ＧｌｃＮＡｃ６３５Ｓ（２５％）、ＡＵＡ−ＧｌｃＮＳ６３５Ｓ（２０％）、及びＡＵＡ２Ｓ−ＧｌｃＮＳ６３５Ｓ（５５％）。この６−Ｏ硫酸化された二糖の割合は、夜通しラベル化された二糖のバキュロ・ウイルスの６−ＯＳＴ−１と同程度である（図２Ｂ）。
【００３４】
表２
2005507640.tif 000003
（実施例４：ＨＳａｃｔオリゴ糖産出の６−ＯＳＴの寄与）
【００３５】
ＡＴ結合ＨＳａｃｔオリゴ糖への６−０−硫酸基の付加の位置決めするためには、冷たい突然変異体ＨＳ鎖は精製された夜通しラベル化された［３５Ｓ］ＰＡＰＳのバキュロ・ウイルスの６−ＯＳＴ−１で処理される。ヘパリチネーゼＩが消化された後、ＨＳａｃｔオリゴ糖は精製される。ＨＳａｃｔオリゴ糖は、その後、低ｐＨ亜硝酸により処理される。処理された又は処理されていないＨＳａｃｔオリゴ糖は、Ｂｉｏ  Ｇｅｌ  Ｐ６カラムに導入される（図３）。二又は四糖は、酵素により集められる。四糖は、ヘパリチネーゼＩ、ＩＩの結合に抵抗する。そして、ヘパリチネーゼの消化は、四糖を含む３−Ｏ硫酸に相当する（２０、３３）。このことは、３−０−含有四糖は、ＵＡ±２Ｓ−ＧｌｃＮＡｃ６３５Ｓ−ＧｌｃＵＡ−ＧｌｃＮＳ３Ｓ±６３５構造体を含んでいることを示唆している。このことを証明するために、酵素の消化により集められた四糖（図４Ａ）は（図３Ｃ）、ＨＩＰペプチドの存在下で、ヘパリチネーゼＩにより、さらに二糖に消化される（図４Ｂ）。
【００３６】
表３
2005507640.tif 000004
【００３７】
ＨＳａｃｔオリゴ糖には、６−ＯＳＴは６−０硫酸基を、ＧｌｃＵＡ／ＩｄｏＵＡ−ＧｌｃＮＳ、ＧｌｃＵＡ−ＧｌｃＮＡｃ、及びＩｄｏＵＡ２Ｓ−ＧｌｃＮＳだけでなく、ＧｌｃＵＡ−ＧｌｃＮＳ３Ｓが添加される。これらの結果は、６−ＯＳＴが、ＨＳａｃｔオリゴ糖の６−０硫酸基の決定グループだけでなく、ＨＳａｃｔオリゴ糖の他の６−ＯＳＴ硫酸基の重要なグループも同様に添加する酵素であることを示している。そのため、３−ＯＳＴ−１及び６−ＯＳＴは、ＨＳａｃｔの重要な酵素である。
【００３８】
３−ＯＳＴ−１は、通常、ＨＳａｃｔを生産するためのＨＳａｃｔ前駆体の活動では、限定された数が存在している。３−ＯＳＴ−１がもはや限定されていないとき、ＨＳａｃｔの生産のための能力は、ＨＳａｃｔ前駆体の発生量により決定される（２０）。インビトロで３−０硫酸基がＨＳｉｎａｃｔをＨＳａｃｔに変換することができるが、これは３−０硫酸基がＨＳａｃｔの生合成の最終調製段階であることが明らかに信じられる。驚くべきことに、インビトロでは、６−Ｏ硫酸基は、ＨＳｉｎａｃｔを含んでいる３−０硫酸基をＨＳａｃｔに変換する。
（実施例５：６−ＯＳＴ−１補正された突然変異体が５０％ＨＳａｃｔのＨＳを生産する）
【００３９】
減少した６−０ＳＴが前駆型突然変異体内における６−０ＳＴが活量を決定するために、前駆型突然変異体は６−ＯＳＴ−１ｃＤＮＡにより変換される。６−ＯＳＴ−１ｃＤＮＡを生産するためには、ＣＨＯ６−ＯＳＴ−ｌが増殖され、ＣＵＧ−Ｋ１の配列がＰＣＲによりｃＤＮＡライブラリをクイッククローンする。
【００４０】
部分的な６−ＯＳＴ−ｌがＣＨＯ細胞由来の配列をコーディングしているが、完全なＣＨＯ６−ＯＳＴ−ｌ配列があるGenbank（accession number: ABOO6l 80）。
【００４１】
特に、細胞は、ＡＴフルオレセイン及びＡｌｅｘａ５９４−ＦＧＦ−２によりラベル化され、二色のＦＡＣＳの対象となる。補正された細胞のＦＡＣＳ分析は、図５Ｇ、Ｈに示されている。補正された細胞は、単細胞クローンされる。補正された細胞に由来する［３５Ｓ］はＡＴ親和性クロマトグラフィーにより単離され、分析される。補正された細胞は、ＨＳ及びＨＳａｃｔを生産する。驚くべきことに、補正された細胞により生産されたＨＳの約２８〜５９％は、ＨＳａｃｔである。単に培養された細胞は、約０〜１のＨＳａｃｔを生産する。
（実施例６：補正された細胞は、インビボで、３−ＯＳＴ−１を発現する野生型ＣＨＯ又は前駆型突然変異細胞よりも多いＧｌｃＮＡｃ６Ｓ及びＧｌｃＮＳ６Ｓ残基を生産する）
【００４２】
補正された細胞由来のＨＳの組成の二糖は、下記のＣＨＯ細胞又は突然変異細胞よりも多くの割合のＧｌｃＮＡｃ６Ｓ及びＧｌｃＮＳ６Ｓ残基を含んでいる。３−ＯＳＴ−ｌ発現ＣＨＯ細胞由来のＨＳ［３５Ｓ］、前駆型突然変異体細胞、及び補正細胞は、ヘパリチナーゼの混合物と共に、単離され消化される。結果としての二糖は、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ２カラムにおいて、個々に分離され、ＩＰＲＰ−ＨＰＬＣにより溶解される（図６）。両者の割合は下記の表４に示される。
【００４３】
表４
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《前駆型の突然変異体》
【００４４】
本発明は、（１）生合成の下流又は末端の酵素のための遺伝子が単離された、（２）下流の生成物の分析ができる場合の、生合成経路の成分の特定及び採取方法を提供する。この生合成経路を描写する方法は、多重発現物を生産するために、経路の下流の成分の遺伝子の多重コピー（例えば生合成経路の端末近くで活動する成分）を標的細胞株に配置するステップと、上流の成分で不足している突然変異体（下流の成分よりも経路の初期に、前駆型物質を生成する成分）を得るために、前記多重発現物に突然変異を起こさせるステップと、前記前駆型突然変異体を分析するステップとを含んでいる。ある実施形態では、この方法は、例えば、想定される前駆体タンパク質をコード化する遺伝子を用いて突然変異体を変換することにより、前記前駆型突然変異体を「補正」するステップをさらに含んでいる。この変換は、生合成経路における１つ以上の予め特定された成分、又は「ショットガン」ライブラリィ手法を用いて達成される。他の実施形態では、前記補正は、前記前駆型突然変異体を前記生合成経路の生成物である遺伝子に接触させ、野生型の表現型（例えばリガンド結合部）のためにスクリーニングする必要があるであろう。
【００４５】
末端又は下流の遺伝子生成物の多重コピー含む細胞株の長所は、下流の遺伝子生成物の活量が、続く突然変異生成で依然として損なわれないことである。その結果、上流の遺伝子生成物は、突然変異生成細胞の表現型により決定される。従って、本発明は、特に上流の遺伝子生成物にとって障害となる突然変異体の生成は方法を提供する。同様に、下流の成分の単離及び生合成経路の描写の方法を提供する。
（実施例７：前駆型突然変異体の創作）
【００４６】
ＨＳａｃｔ生合成を解明するために、ＨＳａｃｔの前駆体の生成の際に欠けている突然変異体が創作される。チャイニーズハムスター卵巣由来の樹立細胞株（ＣＨＯ）は、野生型ＣＨＯはＨＳｉｎａｃｔを生成するが、ＨＳａｃｔは生成しないため（おそらく、３−ＯＳＴ−１の発現が欠けているため）、標的細胞として選択される。さらに、一連のＨＳ生合成突然変異体は、ＣＨＯ細胞に成功裡に作成される（２３−２８）。
【００４７】
ＨＳａｃｔ生合成経路の末端酵素と推測される３−ＯＳＴ−１遺伝子は、レトロウイルス形質導により、ＣＨＯ細胞に導入される（２９）。３−ＯＳＴ−１発現は、ＣＨＯ細胞にＨＳａｃｔを生産する能力を誘発する。３−ＯＳＴ−１の３コピーを含むＣＨＯ細胞株（ここでは、「３−ＯＳＴ−１発現ＣＨＯ細胞」、「３−ＯＳＴ−１三重突然変異体」、又は「多重発現体」と呼ぶ）は、後の分析及び試験のために選択される。３−ＯＳＴ−１三重突然変異体は、化学的突然変異生成の対象となる。望ましい不活性型の表現型が陽性の、特にＨＳ発現が陽性でＨＳａｃｔ発現が陽性である細胞（ＦＧＦ−２結合により選択される）は、特定され、単離される（図５のＢとＦ）。この細胞株は、ここでは「６−ＯＳＴ−１不足突然変異体」、又は「前駆的突然変異体」と呼ぶ。
【００４８】
６−Ｏ硫酸化残基の量を減らす前駆的突然変異体は、６−ＯＳＴ活量の不足のため、ＡＴ結合（図５Ｅ）において欠ける。この突然変異体の短所は、インビボ（６−ＯＳＴ−１遺伝子の形質導入により）、及びインビトロ（ＨＳを６−ＯＳＴタンパク質に接触させることにより）の両方で、補正されている。
（実施例８：前駆型突然変異体の収集）
【００４９】
６−ＯＳＴ−１欠損突然変異体が欠けた６−ＯＳＴ−１硫酸基は、６−Ｏスルホトランスフェラーゼ−１遺伝子により収集される。結果として得られる細胞株（補正物）は、その５０％がＨＳａｃｔであるＨＳを生産する。これは、報告されているどの細胞株に対して最も高い割合である。したがって、本発明は、他の効果的なＨＳａｃｔの生産方法と同様に、細胞株にＨＳａｃｔの高生産を提供する。この細胞株（高生産物）は、ＨＳｔｏｔａｌに対して、約２８〜５０％ＨＳａｃｔが発現する。
（実施例９：前駆体欠損突然変異体由来のＧＡＧｓ及び野生型ＣＨＯ細胞は同様な電荷密度を有する）
【００５０】
ＣＨＯ細胞に発現した３−ＯＳＴ−１に由来するＧＡＧと、前駆型突然変異体細胞は単離され、［６−３Ｈ］ＧｌｃＮを使用した生合成ラベル検査により分析される。前駆型突然変異体由来の［３Ｈ］ＧＡＧ鎖のＨＰＬＣ陰イオン交換分析は、ＭＳ(0.31-0.50 M NaCl)からコンドロイチン硫酸(0.52-0.60 M NaCl)を決定する（図６）。３−ＯＳＴ−１発現ＣＨＯ細胞のＧＡＧ鎖は、前駆型突然変異体と似たプロファイルに決定される（図６）。この結果、前駆型突然変異体由来のＨＳと、３−ＯＳＴ−１発現ＣＨＯ細胞は同じ電荷密度を有する。そのため、ＡＴ結合活性の減少が、前駆型突然変異体内に観察される。
（実施例１０：前駆型突然変異体は、３−ＯＳＴ−１発現ＣＨＯ細胞よりも６−Ｏ硫酸基を少なく含む二糖を生産する）
【００５１】
前駆型突然変異体由来のＨＳは、３−ＯＳＴ−１発現ＣＨＯ細胞と同様の電荷密度を有しているので、前駆型突然変異体でのＡＴ結合の減少は、ＨＳ鎖の構造体の変化と相互に関連があることが期待される。３−ＯＳＴ−１発現ＣＨＯ細胞及び前駆型突然変異体から合成されるＧＡＧは、［３５Ｓ］硫酸基を使用した生合成ラベル検査により分析される。３−ＯＳＴ−１発現ＣＨＯ細胞、及び前駆型突然変異体は、同じ量の［３５Ｓ］ＨＳを生産する。そして、両方のサンプルは、〜７０％のＨＳと〜３０％のコンドロイチン硫酸を生産する。このＨＳのコンドロイチン硫酸に対する割合は、図６に示された結果と一致している。［３５Ｓ］硫酸基がラベル化された３−ＯＳＴ−１発現ＣＨＯ細胞由来のＨＳ鎖と、前駆型突然変異体は、ヘパリチネーゼの混合物と共に消化される。結果として得られる二糖は、Bio-Gel P2 カラム上で分離され、IPRP-HPLCにより決定される。表５に示すように、前駆型突然変異体細胞は、３−ＯＳＴ−１発現ＣＨＯ細胞よりも少ない量の６−０硫酸化二糖を生産する。
【００５２】
表５  二糖の組成
2005507640.tif 000006
（実施例１１：前駆型突然変異体及び３−ＯＳＴ−発現ＣＨＯ細胞は、６−ＯＳＴ−１ｍＲＮＡを生産する。ただし、６−ＯＳＴ−２ｍＲＮＡ又は６−ＯＳＴ−３ｍＲＮＡは生産しない）
【００５３】
前駆型突然変異体の二糖の６−ＯＳＴ硫酸基の減少割合を説明するために、３−ＯＳＴ−１発現の６−ＯＳＴ−１イソ型発現は、前駆型突然変異体の６−ＯＳＴ−１イソ型発現と比較される。ヒト６−ＯＳＴ−１、６−ＯＳＴ−２、及び６−ＯＳＴ−３ｃＤＮＡは、ノーザンブロット分析及びRT-PCR検査におけるプローブとして使用される。ノーザン分析は前駆型突然変異体と、３−ＯＳＴ−発現ＣＨＯ細胞が、同じ割合の６−ＯＳＴ−１ｍＲＮＡを有することを示す。しかしながら、３−ＯＳＴ−１発現ＣＨＯ細胞又は前駆型突然変異体細胞において、６−ＯＳＴ−２又は６−ＯＳＴ−３ｍＲＮＡは検出されないということは、ＣＨＯ細胞は、６−ＯＳＴ−１のみを発現することを示す。
【００５４】
ＣＨＯ細胞における６−ＯＳＴイソ型の発現パターンは、ＲＴ−ＰＣＲを用いた３−ＯＳＴ−１発現ＣＨＯ細胞及び前駆型突然変異体細胞の分析により確認される。６−ＯＳＴ−１のＰＣＲプライマの１セット、６−ＯＳＴ−２のＰＣＲプライマの３セット、及び６−ＯＳＴ−３のＰＣＲプライマの２セットは、６−ＯＳＴイソ型のｍＲＮＡの発現を判断するために用いられる。同じレベルの６−ＯＳＴＲＴ−ＰＣＲ生産物は、３−ＯＳＴ−発現ＣＨＯ細胞と前駆型突然変異体細胞の両細胞にて観察される。しかし、ＲＴ−ＰＣＲ生産物はどの細胞にも観察されない。ノーザン分析及びRT-PCR分析は、ＣＨＯ細胞は６−ＯＳＴ−１を発現し、６−ＯＳＴ−２又は６−ＯＳＴ−３を発現しないことを示す。
（実施例１２：点変異を含まない前駆型突然変異体における６−ＯＳＴ−１のコード化領域）
【００５５】
ノーザン分析及びＲＴ−ＰＣＲ分析は、前駆型突然変異体細胞及び３−ＯＳＴ−１発現ＣＨＯ細胞は、同レベルの６−ＯＳＴ−１ｍＲＮＡを発現する。しかし、詳細は後述するが、前駆型突然変異体細胞における６−ＯＳＴ−１活量のレベルは、３−ＯＳＴ−１発現ＣＨＯ細胞における６−ＯＳＴ−１活量のレベルよりも低い。観察により、前駆型突然変異体ＣＨＯ細胞は、６−ＯＳＴ−１遺伝子において、６−ＯＳＴスルホトランスフェラーゼ活量のレベルを減少させる１つ以上の点変異を有している。
【００５６】
突然変異体由来の６−ＯＳＴ−１、ＲＴ−ＰＣＲ生成物のコード化領域は、二本鎖切断配列であり、野生型６−ＯＳＴ−１と比べて、点変異は観察されない。したがって、観察された６−ＯＳＴ活量の減少レベルは、前駆型突然変異体における６−ＯＳＴ−１遺伝子の欠損のせいではない。
（実施例１３：前駆型突然変異体は、野生型ＣＨＯ細胞よりも減少した６−ＯＳＴスルホトランスフェラーゼ活量を有している）
【００５７】
ＦＡＣＳ分析は、前駆型突然変異体細胞はＡＴ結合が欠けていることを示す（図５Ｂ）。６−ＯＳＴ−１のコード配列は変化しない、そして、６−ＯＳＴ−１ｍＲＮＡの発現レベルは通常である。しかし、二糖の組成検査は、前駆型突然変異体細胞は、インビトロで、野生型ＣＨＯ細胞よりも少ない６−Ｏ硫酸化残基を生産する。前駆型突然変異体細胞の６−ＯＳＴスルホトランスフェラーゼ活量は、インビトロで評価される。野生型ＣＨＯ細胞及び前駆型突然変異体細胞に由来する天然の細胞ホモジェネートは、６−ＯＳＴ−１酵素のソースの役割を果たす。野生型ＣＨＯ細胞に由来するＨＳ細胞、Ｎ、Ｏ脱硫化、再Ｎ硫酸化ヘパリン（ＣＤＳＮＳヘパリン）、及び６−Ｏ脱硫酸化ヘパリンは、硫酸ドナーの存在下で、野生型ＣＨＯ細胞及び前駆型突然変異体細胞に由来する６−ＯＳＴ−１酵素と共に培養される。結果として得られる反応生成物は、ヘパリチネーゼの化合物によりに消化される、その後、Bio Gel P2クロマトグラフィーが行われる。集められた二糖は、その後、IPRP-HPLC分析の対象となる。２−Ｏ−［３５Ｓ］硫酸及び６−Ｏ−［３５Ｓ］硫酸ラベル化された、６−ＯＳＴ−１酵素の結果として得られる二糖は、計測される。基質としてＣＤＳＮＳヘパリンが用いられた場合は、２−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ活量は、前駆型突然変異体細胞（118±3 pmol/min/rng）、及び野生型ＣＨＯ細胞（122±2 pmol/min/rng）と同様である。しかし、３０〜３９％の残基の６−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ活量は、野生型ＣＨＯ細胞に対して前駆型突然変異体細胞に全ての３つの基質に観察される（表６）。
【００５８】
表６
2005507640.tif 000007
（実施例１４：質量分析と一体化されたサイズ除外クロマトグラフィーはオリゴ糖の組成分析に効果的である）
【００５９】
質量分析検出器は、従来のＵＶ又は蛍光性分析よりも、より多くの情報を生成し、単糖の組成の個々の成分を決定することが可能となる（３９）。安定同位体３４ＳをＨＳの３−０位置に導入することにより、質量分析と一体化された毛細血管のＩＰＲＰ−ＨＰＬＣにより、３−Ｏ硫酸を含んでいる二糖は同定される。この方法は、異なるＨＳ二糖の分離及び検出のためにＨＳ全体の０．５μｇを消費する。また、この方法は、放射性同位体によりラベル化されていない、通常の細胞は又組織からのＨＳサンプルのＨＳ二糖の分析を達成するための実践的な方法を提供する。さらに、生物学的に不活性のＨＳオリゴ糖は、他の純粋なスルホトランスフェラーゼ（スルホ基転移酵素）と共に、インビトロで処理される。異なる安定同位体は生物学的にタグ化され、順に、活性なオリゴ糖は毛細血管のＩＰＲＰ−ＨＰＬＣにより分離され、質量分析される。このように、生物学的に重要な領域を正確に示すこと、及び配列を決定することができる。
（質量分析と一体化された毛細血管のＩＰＲＰ−ＨＰＬＣ）
【００６０】
ヘパリン相互作用タンパク質（ＨＩＰ）のヘパリン−結合ドメインを模倣する合成ペプチド（ＣＲＰＫＡＫＡＫＡＫＡＫＤＱＴＫ）に対して高い親和性を示すヘパリン分子は、また、ＡＴ（３７）にも極めて高い親和性を示す。ヘパリチナーゼ消化溶液中のこの小さなペプチドの混入によって、ＨＳでラベルされた３−Ｏ−［３５Ｓ］硫酸塩が四糖へと分解されることが防止されると考えられていた。理論上は、ＨＩＰペプチド保護された、ＡＴ結合ＨＳオリゴ糖が回収されうる。しかし、ＨＩＰペプチドの存在下では、糖でラベルされた３−Ｏ−［３５Ｓ］硫酸塩が、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ２の溶出位置、及びＩＰＲＰ−ＨＰＬＣ（ΔＵＡ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ  二糖標準物質の溶出前に完全に溶出した二糖を含む主要な３−０−［３５Ｓ］硫酸塩）上の独自の溶出位置で判断されるように、少オリゴ糖若しくは四糖ではなく、二糖へと分解された。ΔＵＡ−ＧｌｃＮＳ３Ｓ標準物質は報告されていないので、構造が検証された。安定同位体ＰＡＰ３４Ｓが作成された。ＰＡＰ３４Ｓ（ＥＳ−ＭＳで決定された９９％アイソトープ純度）は、ＡＴＰ及び安定したアイソトープＮａ２３４ＳＯ４（Isonics Corp.）を、ＡＴＰスルフリラーゼ（Sigma）、アデノシン５’−ホスホサルフェートキナーゼ（Dr. Irwin H. Segel提供のもの）、及び無機ピロホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ）  （３８）とともにインキュベートすることで調整された。野生型ＣＨＯ細胞よりのＨＳ鎖は、純粋な３−ＯＳＴ−１  ｐｌｕｓ  ＰＡＰ３４Ｓでラベルされた。ＨＳ二糖を分離するキャピラリＩＰＲＰ−ＨＰＬＣ  （LC Packings）方法が開発された。この方法は、イオン対試薬（Sigma）として５  ｍＭのジブチルアミンを用いることを除けば、従来方式のＩＰＲＰ−ＨＰＬＣ  （２９）に類似するものであり、また、ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（Marine Workstation, PerSeptive Biosystems, Inc.）に対して結合させ、溶出された各々の二糖量を検出する。生化学（seikagaku）よりの六つのＨＳ二糖標準物質は、キャピラリＨＰＬＣによって分離され、逆極性ＥＳＩ−ＭＳによって検知された。ＥＳ−ＭＳの正確性は、製品（Bis TBA、Heptadecaflurononanoic acid、Perfiurotetradecanoic acid）によって供給された分子標準セットを用いたキャリブレーションの後、±０．００１ｍ／ｚユニットである。３−Ｏ−３４Ｓ−ラベルされたＨＳは、０．５  ｍｇ／ｍｌのＨＩＰ  ペプチドの存在又は不在下における、１  ｍＵの各ヘパリチナーゼＩ、ヘパリチナーゼＩＩ、ヘパリチナーゼＩＶ、及びヘパリナーゼの組み合わせによって消化（温浸）された。０．５μｇの消化ＨＳが、質量分析と併せられたキャピラリＨＰＬＣへと注入された（図８）。ＵＶのピークＢは、ΔＵＡ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ標準物質と同一時刻で溶出され、一方で、ＵＶのピークＤは、ΔＵＡ２Ｓ−Ｇ１ｃＮＳ標準物質と同一時刻で溶出された（図８、パネルＡ）。ｍ／ｚ２４７．５、４９６．０、及び６２５．２を有する３つの主要なイオンが、双方のＵＶピーク内に於いて観察されており（図３パネルＢ及びＤ）、ここでは、２４７．５はｚ１（−１）チャージされており、４９６．０はｚ２（−２）チャージされており、また６２５．２は一つのジブチルアミン付加されたｚ−１（−１）のΔＵＡ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ又はΔＵＡ２Ｓ−ＧｌｃＮＳ二糖である���しかし、ピークＢ及びＤの双方からのｍ／ｚ領域４９４．０から５０１．０である場合、ｍ／ｚ  ４９８．０を有する天然ではない豊富なｚ１チャージされた分子イオンはＵＶのピークＢにおいて見られるが、ピークＤにおいては見られなかった。４９８．０  ｖｓ  ４９６．０の二糖イオンが、ΔＵＡ−ＧｌｃＮＳ３［３４Ｓ］Ｓ及びΔＵＡ−ＧｌｃＮＳ６Ｓの各々を示していても良い。ΔＵＡ−ＧｌｃＮＳ３［３４Ｓ］Ｓの量は、ＨＩＰペプチドが無ければかろうじて検出可能である。このことは、糖を含有する３−Ｏ−硫酸塩が、通常は四糖へと分解され、ヘパリチナーゼ  消化（２０、３３）によって二糖には分解されないという文献の記載と一致する。ＨＩＰペプチドは、３−Ｏ−硫酸塩が二糖には分解された場合、ヘパリチナーゼ消化に含まれた。
【００６１】
《前記した実施例における材料及び方法》
（細胞培養）
チャイニーズハムスター卵巣由来の樹立細胞株（ＣＨＯ−Ｋ１）は、American Type Culture Collection (CCL-61; ATCC, Rockville, MD)から得た。ＣＨＯ細胞は、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２補足培地内で、５％の二酸化炭素、摂氏３７度、相対湿度１００％で、１０％のウシ胎児の漿液（ＨｙＣｌｏｎｅ）、ペニシリンＧ（１００  ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）、硫酸ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）と共に培養される。これらの細胞は、０．１２５％の（ｗ／ｖ）のトリプシン及び１ｍＭのＥＤＴＡと共に、３〜４日、継代培養される。そして、１０〜１５サイクルの後、新鮮な細胞は、液体窒素の下で貯蔵されたストックにより回復される。低硫酸化された培地は、ペニシリンＧ（１００  ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）及びリン酸緩衝食塩水よりも２００倍透析されたウシ胎児の漿液が補足されたＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地から構成されている。低グルコースＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地は、ペニシリンＧ（１００  ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）、硫酸ストレプトマイシン、及びリン酸緩衝食塩水よりも２００倍透析されたウシ胎児の漿液が補足されたが補足された１ｍＭのグルコースを含んでいる。全ての組織培養媒体及び試薬は、他に示されない限り、Life Technologies (Gaithersburg, MD)から購入している。
（３−ＯＳＴ組換型レトロウイルス形質導入）
【００６２】
レトロウイルスプラスミドｐＭＳＣＶｐａｃは、Dr. Robert Hawley, University of Toronto（３１）から得た。ｐＣＭＶ３−ＯＳＴ−１は、野生型ネズミ３−ＯＳＴ−１ｃＤＮＡをリリースするために、ＢｇｌＩＩ及び  ＸｈｏＩによりダイジェストされる（１５）。ｃＤＮＡ断片（１，６２３ｂｐ）は、ｐＭＳＣＶｐａｃのＢｇｌＩＩ＋ＸｈｏＩ部位にクローニングされる。トランスフェクションに備える全てのプラスミドＤＮＡは、生産者の使用法により、Invitrogen SNAP-MIDI kitを用いて生産される。感染性ビリオンは、リン酸カルシウムトランスフェクション技術を用いて、組換型プロウイルスプラスミドを用いて、エコトロピックＰＨＯＥＮＩＸパッケージング細胞を変換することにより生産される。次の沈殿反応ステップは、前記細胞は、２ｍｌ／ｗｅｌｌの新鮮な（及び朝まで培養された）ＤＭＥＭによりｒｅ−ｆｅｄされる。ウイルスの上清は、液体窒素に瞬間冷凍した後摂氏８０度で保存する、又は低速遠心分離された後、補正される。
【００６３】
エコトロピック・レセプターを含んでいる野生型ＣＨＯ細胞は、トリプシンにより処理され、その後、６穴プレートに１５０，０００  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで平板培養される。１日後、標的細胞（＜７０％コンフルエント）は、５μｇ／ｍｌのポリブレン界面活性剤を含むウイルスの上清と共に、一晩培養される。１２時間後、ウイルスを含む媒体は、新鮮な成長媒体と交換される。野生型ＣＨＯ細胞は、組換型レトロウイルスに３回暴露され、選択され、７．５μｇ／ｍｌのピューロマイシン  （Ｓｉｇｍａ）に保存される。
（アンチトロンビン及びＦＧＦ−２ラベル化）
【００６４】
蛍光性ＡＴを調製するための標準的な反応混合物は、最終的な容量となる２８０μｌ中に、２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．０）、０．３ｍＭのＣａＣｌ２、ＡＴで透析された２５μｇのＰＢＳ（ＧｌｙｃｏＭｅｄ）、４ｍＵノイラミニダーゼ（Worthington Biochemical Corp.）、及び１２５μｇ／ｍｌのフルオレセインヒドラジド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ，  Ｃ−３  ５６）を含んでいる。前記混合物は、摂氏３７度で、１時間培養される。ＰＢＳ（１００μｌ）内のＰＢＳ（１ｍｌ）及び硫酸セファロースの５０％スラリーは、転倒型で２０ｍｍまで添加され混合される。遠心分離の後、硫酸セファロースビーズは、ＰＢＳ（１ｍｌ）により４回洗われる。ラベル化されたＡＴは、１０倍に濃縮されたＰＢＳの４つの０．２５ｍｌのアリコートにより溶離され、２つのＭｉｃｒｏｃｏｎ−１０カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、１４，０００ｒｐｍ、３５分で遠心分離することにより脱塩される。濃縮化されたＡＴは、２ｍＭのＥＤＴＡを含んでいるＰＢＳ内で５ｍｌの１０％ＦＢＳで希釈され、細胞のラベル化検査に直接使用される。蛍光性ＦＧＦ−２は、５０μｌの１Ｍ重炭酸ナトリウムを、２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ及び３μｇのＦＧＦ−２を含んでいる０．５ｍｌのＰＢＳに混合させることにより調製される。前記混合物は、その後、反応染料の水薬瓶（Alexa 594, Molecular Probes）に移し変えられ、室温で１時間攪拌される。ラベル化化されたＦＧＦ−２の単離は、前述したＡＴのラベル化の場合と同様に行う。
（細胞のソーティング）
【００６５】
３−ＯＳＴ−１変換されたＣＨＯＫ１の細胞の集密した単分子層は、１０％のＦＢＳを含んでいるＰＢＳに、１ｍＭのＥＤＴＡを１０ｍｌ添加し、遠心分離することにより分離される。前記細胞パレットは、氷上に位置され、フルオレセインＡＴ及びAlexa 594-FGF-2の各５０μｍが添加される。３０分後、細胞は一度洗われ、２ｍＭのＥＤＴＡを含んでいるＰＢＳ内の１０ｍｌのＦＢＳ内で再懸濁すされる。フローサイトメトリー及び細胞のソーティングは、２色の検査フイルタを用いて、ＦＡＣＳｃａｎ及びＦＡＣＳｔａｒ機器（Becton Dickinson）上で行われる。陽性細胞を結合するＡＴ及びＦＧＦ−２はソーティングされ、続いて、単細胞が９６穴プレートにクローニングされる。単細胞のクローンは、後の分析のために、拡大され、冷凍される。ＣＨＯＫ１クローンを変換した１２の３−ＯＳＴ−１は、上述したようにして得た。個々のクローンにおける３−ＯＳＴ−１のコピーの数は、後述するサザン分析により測定される。ゲノムＤＮＡ（１０μｇ）は、ＥｃｏＲＩの４０Ｕを用いて、摂氏３７度、０．７％（ｗ／ｖ）のアガロース・ゲル電気泳動により消化され、GeneScreen Plus (NEN)に転移され、３−ＯＳＴ−１ｃＤＮＡラベル化を用いて、Megaprime labeling kit (Amersham)により精査される。ブロットは、オートラジオグラフにより、３−ＯＳＴ−１  ｐｒｏｂｅ  （２  ｘ  １０６  ｃｐｍ／ｍｌ）を含んでいるExpressflyb Solution (Clontech)により交雑される。３−ＯＳＴ−１の３重コピーされた細胞クローンは、後の検査のために拡大され冷凍される。
（突然変異体のスクリーニング）
【００６６】
３−ＯＳＴ−１の３重コピーと一体の野生型ＣＨＯは、文献（３１）に記されたように、エチルメタンスルホン酸を用いて突然変異生成され、液体窒素の下で冷凍される。細胞の一部は解凍され、３日間増殖され、Ａｌｅｘａ  ５９４−ＦＧＦ−２及びｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ＡＴの両方によりラベル化される。ラベル化された細胞はソーティングされ、ＦＧＦ−２活性及びＡＴ不活性細胞は集められる。約１×１０４ソーティングされた細胞は、完全なＦ−１２  Ｈａｍ’ｓ  培地の１ｍｌに集められ、Ｔ−７５フラスコで培養される。ソーティングされた細胞の数は、１週間の間保たれる。そして、細胞は上述したように、再度、ラベル化及びソーティングがされる。５回目のソーティングの後、ＦＧＦ−２活性及びＡＴ不活性細胞は、９６穴プレートに単細胞ソーティングされる。単細胞クローンは、後の検査のために拡大され冷凍される。３−ＯＳＴ−１の３重コピー、前駆型突然変異体、及び突然変異体の６−ＯＳＴ−１補正物と一体の野生型ＣＨＯのソーティングプロファイルは、２色蛍光性フローサイトメトリーにより図５に示される。
（ＨＳ調製及び分析）
【００６７】
細胞の単層は、１００μＣｉ／ｍｌの無担体の硫酸ナトリウム（carrier free sodium [35S]sulfate (ICN) in sulfate deficient DMEM）内で、ペニシリンＧ（１００  Ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）及び１０％の透析されたＦＢＳと共に、夜通しラベル化される。プロテオグリカンの一部分は、０．５ＭのＮａＢＨ４、０．４ＭのＮａＯＨ、摂氏４０度、夜通しのＥＡＢ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーによりにより単離される。サンプルは、５Ｍの酢酸により中和される。遠心分離されたペレットは、７５％のエタノールで洗われ、水中で再懸濁される。ＧＡＧｓは、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ及び５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ８．０）を含む緩衝剤内で、２０ｍＵのコンドロイチン分解酵素ＡＢＣ（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ，Ｉｎｃ．）と共に消化される。コンドロイチン分解酵素ＡＢＣにより硫酸化されたコンドロイチン硫酸の完全な消化は、二糖（100μg = 1.14 absorbance units at 232 nm）へのキャリアの変換の範囲をモニタリングすることにより保証される。ＨＳは、フェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿により、コンドロイチン分解酵素により分解された生成物により精製される。パレットを０．５ｍｌの７５％エタノールで洗った後、ＨＳは、後の分析のために水に溶解される。
（ＣＨＯ６−ＯＳＴ−ｌのｃＤＮＡクローニング及び発現）
【００６８】
ＣＨＯ  ６−ＯＳＴ−１の配列コードは、CHO Kl/cDNA quick-clone library (Clontech)に詳述されている。反応混合物は、２ユニットのｐｆｕポリメラーゼ、１  ｎｇ  のｃＤＮＡ、１００  ｐｍｏｌのプライマを含んでいる。プライマは、Ｂｇｌ  ＩＩ  サイト  （５’  ＧＣＡＧＡＴＣＴＧＣＡＧＧＡＣＣＡＴＧＧＴＴＧＡＧＣＧ  ＣＧＣＣＡ  ＧＣＡＡＧＴＴＣ−３’）を有している。６−ＯＳＴ−１プライマ配列は、ヒト６−２５  ＯＳＴ−１  ｃＤＮＡ配列（残基は２４０〜２６４）、及びその文献（３２）のような相補体（残基は１１４７  〜１１７２）に由来する。３０の熱サイクル（1 min of denaturation at 940C, 2 min of annealing at 550C, 3 min of extension at 720C）の後、増幅産物は、１％のアガロース・ゲル内で分析され、エチジウムブロマイド染色により検出される。増幅産物は、ゲルから切除され、Gel Extraction kit (Qiagen)によりきれいにされる。ＰＣＲ産物は、Ｂｇｌ  ＩＩ  及びＸｂａ  Ｉにより処理され、ｐｌｎｄ／Ｈｙｇｒｏプラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）消化されたXba I and BamUl に結紮され、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５ａコンピテント細胞に変換される。
ＰＣＲ反応より２つづつ分離された４つのクローンは配列される（これらのクローンは同一である）。ｐｌｎｄ／Ｈｙｇｒｏ  ６−ＯＳＴ−１を含んでいるプラスミドは、ソーティングされ、その後、９６穴プレートに単細胞クローンされる。ＡＴ及び  ＦＧＦ−２結合細胞は、ソーティングされ、その後、９６穴プレートに単細胞クローンされる。単細胞クローンは、後の分析のために、拡大され、冷凍される。
（インビトロでのＨＳの６−０硫酸化）
【００６９】
標準的な反応混合物は、最終容量の５０μｌ内に、５０ｍＭＭＥＳ（ｐＨ７．０）、１％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５ｍＭのＭｎＣｌ２、５ｍＭのＭｇＣｌ２、２．５ｍＭのＣａＣｌ２，０．０７５ｍｇ／ｍｉのプロタミン塩化物、１．５ｍｇ／ｍｉのＢＳＡ、代謝的にラベル化された［３５Ｓ］ＨＳ又は非放射性ＨＳ鎖、冷凍ＰＡＰＳ（０．５ｍＭ）又は［３５Ｓ］ＰＡＰＳ（２５ｒｉＭ，２ｘ１０７ｃｐｍ）、及び７０  ｎｇの精製されたバキュロ・ウイルス発現ヒト６−ＯＳＴ−１を含んでいる。この反応混合物は、摂氏３７度で、２０分間又は夜通し培養される。そして、２００μｇのコンドロイチン硫酸Ｃが添加される。ＨＳ鎖は、フェノール／クロロホルム抽出及び陰イオン交換クロマトグラフィー（0.25-ml columns of DEAB-Sephacel packed in 1 ml syringes (20)）により精製される。エタノール沈殿後、パレットは、７５％エタノールで洗われ、真空で簡単に乾燥され、後の分析のために水に溶解される。
（ＡＴアフィニティー・クロマトグラフィーによるＵＳａｃｔ及びＵＳｉｎａｃｔの分離）
【００７０】
ＡＴ−ＨＳ混合物は、５００μｌのＨＢ緩衝剤（１５０ｍＭのＮａＣｌ，１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．４））中にて、２．５ｍＭのＡＴ、１００μｇのコンドロイチン硫酸、０．００２％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００、及び１ｍＭのＣａＣｌ２，ＭｇＣｌ２，ＭｎＣｌ２と共に、３−０硫酸化ＨＳを混合することにより生産される（１８）。ＵＢは、５０５スラリーのコンカナバリンＡ−セファロース４Ｂ（６０ｐ１）を含んでいる。ＡＴ混合物は、Ａｓｎ接合オリゴ糖によりコンカナバリンＡに結合される。
摂氏４０度での１時間の転倒型回転後、１０，０００  ｘｇの遠心分離によりビーズは沈殿する。
【００７１】
上澄は集められ、２５ｍｌのＨＢ含有０．０００４％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００により３回洗われる。上澄と洗うための溶液はＵＳｉｎａｃｔを含んでいる。ＵＳａｃｔは、１ＭのＮａＣｌ及び０．０００４％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００を含有している１００μｌＨＢによる３回の連続した洗浄により溶出される。キャリアとして、１００μｇのコンドロイチン硫酸をＵＳａｃｔに添加した後、サンプル同量のフェノール／クロロホルムにより抽出され、その後に、ＤＥＡＢ−セファロースのクロマトグラフィーとエタノール沈殿が行われる。パレットは７５％エタノールで洗われ、真空で簡単に乾燥され、水に溶解される。
（ＨＳの二糖分析）
【００７２】
ヘパリチネーゼＩ（ＥＣ．４．２．２．８）、ヘパリチネーゼＩＩ（no BC number）、及びヘパリチネーゼは、Seikagakから得られ、ヘパリチネーゼＩＶは、Dr.Yoshida, Seikagaku Corporation, Tokyoから得られる。ヘパリチネーゼＩは、Ｇ１ｃＮＡｃ／ＮＳ±６Ｓ（３Ｓ？）−↓ＧｌｃＵＡ−ＧｌｃＮＡｃ／ＮＳ±６Ｓ配列を認識する。前記矢印は、切断部位を示す。ヘパリチネーゼＩＩは、ＧｌｃＮＡｃ／ＮＳ±６Ｓ（３Ｓ？）−↓ＧｌｃＵＡ／ＩｄｏＵＡ±２Ｓ−ＧｌｃＮＡｃ／ＮＳ±６Ｓの広範囲な配列を認識する。ヘパリチネーゼ（ヘパリチネーゼＩＩＩ）及びヘパリチネーゼＩＶは、ＧｌｃＮＳ±３Ｓ±６Ｓ−↓ＩｄｏＵＡ２Ｓ／ＧｌｃＵＡ２Ｓ−ＧｌｃＮＳ±６Ｓ．配列を認識する。ＨＳの消化は、１００μｌの４０ｍＭ酢酸アンモニウム（3.3 mM CaCl2 with 1 mU of heparitinase I or 1 mU of each heparitinase I, heparitinase II, heparitinase IV, and heparinase (heparitinase III)を含む）により実行される。消化物は、摂氏３７度で培養される（他に示されない限り）。低ｐＨ亜硝酸の粉化のために、放射性同位体でラベル付けされたＨＳサンプルは、１０μｇのウシ腎臓のＨＳ（ＩＣＮ）と混合され、消化される（３５）。
【００７３】
二糖は、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ２  クロマトグラフィーにより精製され、適した標準的な二糖によるイオン対逆相ＨＰＬＣにより消散される（３６）。Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ２又はＰ６  カラム（０．７５  ｘ  ２００  ｃｍ）は、１００ｍＭの重炭酸アンモニウムにより釣り合わせられる。放射性同位体でラベル付けされたサンプル（２００μｌ）は、デキストラン・ブルー（５μｇ）及びフェノール・レッド（５μｇ）と混合され、カラムに取り込まれる。サンプルは、０，５ｍｌ分留の収集により、流速４ｍｌ／時において溶離する。望ましい分留は、真空下において乾燥され、重炭酸アンモニウムを除去するために、個々に又はプールされる。
（毛細血管ＩＰＲＰ−ＨＰＬＣ、質量分析）
【００７４】
ヘパリン分子は、合成ペプチドと高い親和性を示す（ＣＲＰＫＡＫＡＫＡＫＡＫＤＱＴＫ）。これは、ヘパリン結合タンパク質（heparin interacting protein:HIP）のヘパリン結合分野と良く似ている。そして、ＡＴと特に高い親和性を示す（３７）。ヘパリチネーゼ消化溶液内でのこの小さいペプチドの含有は、３−Ｏ［３５Ｓ］硫化ラベル化されたＨＳの、四糖への分解を防止することができるとの見込みである。理論上は、ＨＩＰペプチドは保護される。また、ＨＳオリゴ糖を結合するＡＴは再生する。しかしながら、ＨＩＰペプチドの存在は、全ての３−Ｏ［３５Ｓ］硫化ラベル化された糖は、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ２及びｏｎ  ＩＰＲＰ−ＨＰＬＣ上のそれらのユニークな遊離位置の判定により、オリゴ糖又は四糖の代わりに、二糖に分解される。その理由は、構造が確認された、ＡＵＡ−ＧｌｃＮＳ３Ｓの標準的な報告がないためである。安定同位体ＰＡＰ３４Ｓは生産される。ＰＡＰ３４Ｓ（９９％のアイソトープ純度、ＥＳ−ＭＳにより測定）は、ＡＴＰ及びＮａ２３４ＳＯ４の安定同位体（Ｉｓｏｎｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．）、ＡＴＰスルフリラーゼ（Ｓｉｇｍａ）、アデノシン５´ホスホ硫酸化キナーゼ、及び無機ピロリン酸の培養により用意される（３８）。野生型ＣＨＯ細胞由来のＨＳ鎖は、純粋な３−ＯＳＴ−１とＰＡＰ３４Ｓによりラベル化される。ＨＳ二糖の分離のための毛細血管ＩＰＲＰ−ＨＰＬＣ（ＬＣパッキング）方法は発達している。この方法は、イオン対試薬（Ｓｉｇｍａ）のように、５ｍＭのジブチルアミンを使用すること以外は、従来のＩＰＲＰ−ＨＰＬＣ（２９）と似ている。そして、溶融した各二糖を検出するために、それをＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（Mariner Workstation, PerSeptive Biosystems, Inc.）に結合させる。Ｓｅｉｋａｇａｋｕによる６つのＨＳ二糖標準は、毛細血管ＩＰＲＰにより分離され、否定極性ＥＳＩ−ＭＳにより検出される。分子標準セット（Bis TBA, Heptadecaflurononanoic acid, Perfiurotetradecanoic acid製）による標準試験後のＥＳ−ＭＳの精度は、±0.001 m/z unitである。３−Ｏ−３４Ｓラベル化されたＨＳは、５ｍｇ／ｍｌのＨＩＰペプチドの有無を問わず、１ｍＵのヘパリチネーゼＩ、ヘパリチネーゼＩＩ、ヘパリチネーゼＩＶ及びヘパリチネーゼと共に、消化される。０．５μｇの消化されたＨＳは、と共に、質量分析と一体となった毛細血管ＨＰＬＣに注入される（図８）。ＵＶピークＤは、ΔＵＡ２Ｓ−ＧｌｃＮＳ標準と同時に溶出するのに対して、ＵＶピークＢは、ΔＵＡ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ  標準と同時に溶出する（図８Ａ）。３つの主なイオンｍ／ｚ２４７．５、４９６．０、及び６２５．２は、両方のＵＶピークに観察される（図３Ｂ、Ｄ）。４９６．０はｚ１（−１）帯電しており、２４７．５はｚ２（−２）帯電しており、６２５．２はｚ１（−１）帯電しているΔＵＡ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ又はΔＵＡ２Ｓ−ＧｌｃＮＳ二糖が付加された１つのジブチルアミンである。
【００７５】
ピークＢ及ぶＤの両方からのｍ／ｚ範囲４９４．０〜５０１．０が拡大されたときは（Ｃ、Ｄ）、ｍ／ｚ  ４９８．０と共に、ｚ１帯電分子は、ＵＶピークＢに観察される。しかし、ＵＶピークＤでは観察されない。４９８．０対４９６．０の二糖イオンは、ΔＵＡ−ＧｌｃＮＳ３［３４Ｓ］Ｓ及びＡＵＡ−ＧｌｃＮＳ６Ｓの個々に相当する。ＡＵＡ−ＧｌｃＮＳ３［３４Ｓ］Ｓの質量は、ＨＩＰペプチドが不在のときは、ほとんど検出することができない（２０、３３）。３−Ｏ含有ＨＳが二糖に分解されている場合、ＨＩＰペプチドは、ヘパリチネーゼ消化に含まれている。
（ノーザン法ハイブリッド形成及びＲＴ−ＰＣＲ）
【００７６】
特別なノーザン法ハイブリッド形成調査を行うためには、ヒト６−ＯＳＴ−１、６−ＯＳＴ−２及び６−ＯＳＴ−３内のユニークな配列をひとまとめに扱うＰＣＲプライマが設計された。２４９ｂｐＰＣＲ生成物はイソ型を特定するプローブとし使用される。同様に、２９９ｂｐＰＣＲ生成物は、プローブとし使用される。ＰＣＲは、α［３２Ｐ］ｄＣＴＰ(NEN Life Science Products)と共に用いられる。そして、イソ型を特定する放射線ラベル化プローブは、G-25 Sephadex spin columns (Boehringer Mannheim)で精製される。ハイブリッド形成は、2x10 cpm probe per ml of BxpressHyb solution (CLONTECH)を用いて行われる。ハイブリッド形成の完結後、ブロットは、０．１％  ＳＤＳを含んでいる２Ｘ  ＳＳＣで２回洗浄され、０．１％  ＳＤＳを含んでいる０．ｌＸ  ＳＳＣで１回洗浄される（全て室温で）。それから、ブロットは、摂氏５０度で、０．１％  ＳＤＳを含んでいるＯ．１Ｘ  ＳＳＣで１回洗浄される。ブロットを６−ＯＳＴ  プローブとハイブリッド形成するために、最後の洗浄は摂氏６５度で２回行われる。細胞膜は、その後、BioMax imaging film (Kodak)及びBioMax MS intensifying screen (Kodak)により、オートラジオグラフィーの対象となる。
【００７７】
ＲＴ−ＰＣＲのために、精製されたポリＡは又はトータルＲＮＡ処理されたＤＮａｓｅ  Ｉが用いられる。プライマペアは、ヒト配列の６ＯＳＴ−２及び６ＯＳＴ−３の両方に設計される。６ＯＳＴ−１には、ハムスター配列のｎｔ５４（ＧＣＧ  ＴＧＣ  ＴＴＣ  ＡＴＧ  ＣＴＣ  ＡＴＣ  ＣＴ）  ｔｏ  ６２２  （ＧＴＧ  ＣＧＣ  ＣＣＡ  ＴＣＡ  ＣＡＣ  ＡＴＧ  Ｔ）に相当する５６９  ｂｐフラグメントが用いられる。６ＯＳＴ−２には、ＰＣＲ標的である、ｎｔ  ２３  （ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＧＣＴ  ＴＴＧ  ＧＴＧ  ＡＴ）  及び３４６  （ＧＣＡ  ＧＡＡ  ＧＡＡ  ＡＴＧ  ＣＡＣ  ＴＴＧ  ＣＣＡ）から始まり、ｎｔ  １４７１  （ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＡＴＣ  ＡＣＣ  ＴＴＧ  ＴＣＣ  ＣＴ）、１４９１  （ＴＣＡ  ＴＴＧ  ＧＴＧ  ＣＣＡ  ＴＴＧ  ＣＴＧ  Ｇ）及び１５３２  （ＴＧＡ  ＧＴＧ  ＣＣＡ  ＧＴＴ  ＡＧＣ  ＧＣＣ  Ａ）で終わる範囲が使用される。６ＯＳＴ−１には、ＰＣＲ標的である、ｎｔ  ５  （ＣＣＧ  ＧＴＧ  ＣＴＣ  ＡＣＴ  ＴＴＣ  ＣＴＣ  ＴＴＣ）  及び  ３５３  （ＴＴＣ  ＡＣＣ  ＣＴＣ  ＡＡＧ  ＧＡＣ  ＣＴＧ  ＡＣＣ）から始まり、ｎｔ  ９８８  （ＧＣＴ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＧＡＴ  ＧＧＴ  ＧＴ）  及び  １２１７  （ＧＣＴ  ＧＧＡ  ＡＧＡ  ＧＡＴ  ＣＣＴ  ＴＣＧ  ＣＡＴ  ＡＣ）で終わる範囲が使用される。全てのＲＩＮＡは、野生型及び前駆型突然変異体ＣＨＯ−Ｋ１細胞から、RINeasy total RNA kit(Qiagen)を用いて精製される。ＲＮＡは吸光度により計測される。
（バキュロ・ウイルスの発現、及び６−ＯＳＴ−１の精製）
【００７８】
ヒト６−ＯＳＴ−１組換型バキュロ・ウイルスは、ｐＦａｓｔＢａｓ  ＨＴドナープラスミドを用いて用意される。一日に、３つの変換対象のバキュロ・ウイルスが、１０％のＰＥＧ、０．５ＭのＮａＣｌ（１２，ＯＯＯｘｇ）の媒質により精製され、１４ｍｌのメディアで再懸濁され。１００−ｍｍ皿に１．５ｘ１０７  Ｓｆ９細胞シードされる。感染した細胞からの媒質は、摂氏２７度、９０時間の成長後、収穫される。そして、４００ｘｇで遠心分離され、Ｔｒｉｓで１０ｍＭ生産され、ｐＨ８．０に調製され、４０００ｘｇで遠心分離される。浄化された媒質は、同等の容量の冷たい１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．６ｍｌで３０分間攪拌されたＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｍのクロマトグラフィ媒介（ＴｏｓｏＨａａｓ）により希釈される。ヘパラン硫酸は、カラム（０．４×４．７５ｃｍ），に詰め込まれ、５ mlのTCG 50 (10 mM Tris-HCJ, pH 8.0, 2% glycerol, 0.6% CHAPS, 50 mMNaCl)で洗浄され、10 mMのイミダゾールを含み、0.25 mlに濃縮されたMicrocon YM-1 0 遠心分離フィルタ(Millipore Corp.）内に、１．２  ｍｌの TCG 1000 (as above, but 1 M inNaCi) で溶出される。６−ＯＳＴ−１組換型ヒスチジン標的は、ヘパリンセファロースから溶出した（９０分、摂氏４０度、ＮｉＮＴＡ磁性アガロース・ビーズ（Qiagen, Inc.）から生産された生成物を混合することにより精製される。ビーズは、２０ｍＭのイミダゾールを含む０．１２５ｍｌのＴＣＧ４００により２回洗浄され、２５０ｍＭのイミダゾールを含む０．０３ｍｌのＴＣＧ４００により２回溶出される。結合された溶離フラクションは、約２５％のスルホトランスフェラーゼを含む。
（細菌の発現、及び６−ＯＳＴ−１の精製）
【００７９】
ベクターｐＥＴ１５ｂ発現は、Novagen (Madison, WI)から購入される。E. co/IストレインBL2l and DH5cαは、ATCC (Manassas, VA)から購入される。限定部位酵素Ｉは、２１１−２１６ｂｐより取り込まれる。また、ＢａｍＨＩ限定部位は、ＰＣＲによりヒト６−ＯＳＴ−１−１の１３４４−１３４９ｂｐより取り込まれる（３２）。ヒト６−ＯＳＴ−１−１遺伝子は、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＪにくくられ、Ｅ．ｃｏ／ｉストレインＤＨ５ａに変換される。ＡＢＬ２１コロニーはｐＥＴｉＳｈに６−ＯＳＴ−１を含んでいる。培養物は、摂氏３７度、２５０ｒｐｍで、フラスコ内で攪拌される。６００ｎｍでの光学密度が１．２に達したとき、１ｍＭのＩＰＴＧが培養物に添加される。培養物は、その後、室温で夜通し２５０ｒｐｍで攪拌される。培養物は５０００ｒｐｍで１５分間ペレットされる。上清は破棄され、細胞パレットは、４０ｍＬの２０ｍＭＴｒｉｓ、５００ｍＭのＮａＣｌ、０．６％のＣＨＡＰＳ、１％のグリセロール、及び５ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．９（“binding buffer”）で再懸濁される。細胞は均質化され、ホモジェネートは１３，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離される。上清は、０．２μｍのろ過紙でろ過され、BioCAD HPLC system (PerSeptive Biosystems,Cambridge, MA)に取り込まれ、Ｎｉ２＋キレートクロマトグラフィーにより精製される。簡単に言えば、上清は、カラムに取り込まれ、非結合物質がカラムから洗い流されるまで、結合バッファにより洗浄される。そして、２０ｍＭのＴｒｉｓ、５００ｍＭのＮａＣｌ、０．６％ＣＨＡＰＳ、１％のグリセロール、５ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．９を用いて、低親和性物質がカラムから洗い流される。そして、２０ｍＭのＴｒｉｓ、５００ｍＭのＮａＣｉ、０．６％のＣＨＡＰＳ、１％のグリセロール、及び５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．９を用いてカラムから溶出される。組換型６−ＯＳＴ−ｌの純度は、銀染色タンパク質ゲルにより測定される。
下記の文献を参考のために示す。
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【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】［３５Ｓ］硫化代謝ラベル化されたＨＳ二糖のＩＰＲＰ−ＨＰＬＣを示す。
【図２】６−ＯＳＴ−１及び［３５Ｓ］ＰＡＰＳラベル化されたＨＳ二糖のＩＰＲＰ−ＨＰＬＣを示す。
【図３】消化されたＨＳのBio-Gel P6の分別を示す。
【図４】６−０−硫酸基がタグ化されたＨＳａｃｔの二又は四糖のＩＰＲＰ−ＨＰＬＣを示す。
【図５】ＡＴ（Ａ、Ｃ、Ｂ、Ｇ）及びＦＧＦ−２（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ）の２色の蛍光性フロー細胞数測定分析を示す。
【図６】ＧＡＧｓのＨＰＬＣ陰イオン交換クロマトグラフィーを示す。
【図７】ＨＳａｃｔ生合成経路の解明の一実施形態を示す図である。
【図８】質量分析と一体となった毛細血管ＩＰＲＰ−ＨＰＬＣにより測定されたΔＵＡ−ＧｌｃＮＳ３Ｓ二糖構造体を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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