(57)【要約】本発明は、ヒトリンパ腫に関連し、本明細書において外套組織球レトロウイルス（MHRV）と称される外套細胞リンパ腫から最初に単離された、単離されたおよび無傷のウイルスを特徴とする。本発明はさらに、MHRVを検出するための組成物および方法、ならびにインビトロにおけるMHRVの増殖、抗MHRV薬剤のスクリーニング、および弱毒化MHRV株の作製のためのを方法および組成物を特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された外套組織球レトロウイルス（MHRV）粒子。
【請求項２】
配列番号：8のアミノ酸残基1〜22のアミノ酸配列を含むGAGポリペプチドをコードするRNAゲノムを含む、請求項1記載の単離されたMHRV粒子。
【請求項３】
配列番号：2を含む第1のプライマーおよび配列番号：3を含む第2のプライマーを使用するPCR増幅により、約304bpの増幅産物を産生することで特徴づけられるRNAゲノムを含む、請求項1記載の単離されたMHRV粒子。
【請求項４】
304bp増幅産物が配列番号：1の配列を含む、請求項3記載の単離されたMHRV粒子。
【請求項５】
粒子が、感染およびウイルスの逆転写酵素の活性に続いて、高いストリンジェンシーの条件下で配列番号：1の核酸配列にハイブリダイズするcDNAを生成するRNAゲノムを含む、請求項1記載の単離されたMHRV粒子。
【請求項６】
配列番号：1に対応する配列を含むRNA分子を含む、請求項1記載の単離されたMHRV粒子。
【請求項７】
ヒトリンパ腫から単離できること；
約90nmから110nmの粒径を有すること；
膜脂質二重層を有すること；
電子顕微鏡法によって円錐形の偏心性ヌクレオイドとして見えるRNAゲノムを有すること；および
配列番号：8のアミノ酸配列のアミノ酸残基1〜22を含むGAGエンベロープポリペプチドを有すること、
によって特徴づけられる単離されたMHRV粒子。
【請求項８】
ヒトリンパ腫から単離できること；
約90nmから110nmの粒径を有すること；
膜脂質二重層を有すること；および
電子顕微鏡法によって円錐形の偏心性ヌクレオイドとして見えるRNAゲノムを有すること；および
RNAゲノムが配列番号：7のヌクレオチド残基1〜66に対応する核酸配列を含むこと、
によって特徴づけられる単離されたMHRV粒子。
【請求項９】
請求項1記載のウイルスに感染した、単離された哺乳類細胞。
【請求項１０】
細胞がマクロファージである、請求項9記載の単離された哺乳類細胞。
【請求項１１】
請求項8記載のウイルスに感染した、単離された哺乳類細胞。
【請求項１２】
細胞がマクロファージである、請求項11記載の単離された哺乳類細胞。
【請求項１３】
マクロファージがMHRV粒子を産生する、請求項10または12記載の単離された哺乳類マクロファージ。
【請求項１４】
配列番号：8のアミノ酸残基1〜22の少なくとも4つの隣接するアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１５】
ポリヌクレオチドが、配列番号：8のアミノ酸残基1〜22の少なくとも10個の隣接するアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列を含む、請求項14記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１６】
配列番号：7の核酸残基1〜66の少なくとも12個の隣接する残基の配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１７】
ポリヌクレオチドが、配列番号：7の核酸残基1〜66の少なくとも33個の隣接する残基の配列を含む、請求項16記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１８】
ポリヌクレオチドが、配列番号：7の核酸残基1〜66の少なくとも50個の隣接する残基の配列を含む、請求項17記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１９】
ポリヌクレオチドの長さが約1kb未満である、請求項14〜18のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２０】
ポリヌクレオチドが、異種性プロモーターエレメントに機能的に連結された、請求項14〜18のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２１】
高ストリンジェンシーの条件下で、少なくとも配列番号：7のヌクレオチド1〜66のポリヌクレオチド配列の一部分とハイブリダイズする配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２２】
配列番号：7の核酸残基1〜66の少なくとも12個の隣接するヌクレオチドに、少なくとも65%の同一性を有する配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２３】
請求項14〜22のいずれか一項記載のポリヌクレオチドを含む、単離された組換え宿主細胞。
【請求項２４】
請求項14〜22のいずれか一項記載のポリヌクレオチドを含む、単離されたベクター。
【請求項２５】
単離されたMHRV GAGポリペプチド。
【請求項２６】
請求項14〜22のいずれか一項記載のポリヌクレオチドによってコードされる、単離されたポリペプチド。
【請求項２７】
請求項25の単離されたMHRV GAGポリペプチドに特異的に結合する、単離された抗体。
【請求項２８】
請求項14〜22のいずれか一項記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに特異的に結合する、単離された抗体。
【請求項２９】
試料における外套組織球レトロウイルス（MHRV）を検出するための方法であって、本方法は
MHRVを含むことが疑われる生物学的試料を、MHRV特異的なプローブと接触させる工程であり、該接触は、MHRV特異的なプローブが試料に結合して、プローブとプローブ標的との間の複合体を形成するために十分な時間である工程；および
試料におけるMHRV特異的なプローブとプローブ標的の複合体の有無を検出する工程；を含み、
ここで試料における複合体の検出は、MHRVが試料に存在することを示す方法。
【請求項３０】
請求項29記載の方法であって、MHRV特異的なプローブおよびプローブ標的は核酸であり、ならびにMHRV特異的なプローブは配列番号：1の少なくとも8つの隣接するヌクレオチド残基を含む方法。
【請求項３１】
請求項29記載の方法であって、MHRV特異的なプローブおよびプローブ標的は核酸であり、ならびにMHRV特異的なプローブは配列番号：7の残基1〜66の少なくとも8つの隣接するヌクレオチド残基を含む方法。
【請求項３２】
請求項29記載の方法であって、MHRV特異的なプローブはMHRV特異的な抗体であり、およびプローブ標的はMHRV GAGポリペプチドである方法。
【請求項３３】
請求項29記載の方法であって、プローブ標的は抗MHRV抗体であり、およびMHRV特異的なプローブは配列番号：8のアミノ酸残基1〜22を含むポリペプチドである方法。
【請求項３４】
生物学的試料が血液、血液由来産物、血漿、および血清からなる群より選択される、請求項29記載の方法。
【請求項３５】
生物学的試料がマクロファージまたはマクロファージから派生した腫瘍細胞を含む組織を含む、請求項29記載の方法。
【請求項３６】
試料における外套組織球レトロウイルス（MHRV）を検出するための方法であって、本方法は
MHRVを含むことが疑われる生物学的試料を、第1のMHRV特異的な核酸プローブおよび第2のMHRV特異的な核酸プローブと接触させる工程であり、ここで第1のプローブおよび第2のプローブは、それぞれ配列番号：7の核酸配列またはその相補体の少なくとも15個の隣接するヌクレオチドを含み、該接触は、増幅されたDNA産物を産生するために有効な条件下であり；および
増幅されたDNA産物の有無を検出する工程；
を含み、
ここで、配列番号：7を含む核酸配列から予想される増幅されたDNA産物に対応する増幅されたDNA産物の検出は、試料にMHRVが存在することを示す方法。
【請求項３７】
第1のプローブがHERV-9およびHERV-10からなる群より選択される配列を含む、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
第2のプローブがHERV-8、HERV-11、およびHERV-12からなる群より選択される配列を含む、請求項36記載の方法。
【請求項３９】
第1のプローブがHERV-8であり、第2のプローブがHERV-9である、請求項36記載の方法であって、約304bpの増幅産物の検出は、MHRVが試料に存在することを示す方法。
【請求項４０】
第1のプローブがHERV-9であり、第2のプローブがHERV-12である、請求項36記載の方法であって、約1321bpの増幅産物の検出は、MHRVが試料に存在することを示す方法。
【請求項４１】
第1のプローブがHERV-10であり、第2のプローブがHERV-11である、請求項36記載の方法であって、約1966bpの増幅産物の検出は、MHRVが試料に存在することを示す方法。
【請求項４２】
外套組織球レトロウイルス（MHRV）の検出のためのキットであって、キットにはMHRV特異的なプローブを含み、ここでプローブは、
MHRV GAGポリペプチドをコードする配列に特異的にハイブリダイズするMHRV特異的な核酸プローブ；
MHRV特異的なGAG抗体；および
抗MHRV GAGポリペプチドに特異的に結合するMHRVポリペプチド：
からなる群より選択されるキット。
【請求項４３】
抗MHRV抗ウイルス剤をスクリーニングするための方法であって、本方法は
候補薬剤を、MHRVに感染した哺乳類細胞であって、ウイルス粒子を産生する細胞を含む培養液と接触させる工程；および
培養上清中のMHRVウイルス粒子を検出する工程；を含み、
ここで、上清中のMHRVウイルス粒子の減少は、候補薬剤が抗MHRV抗ウイルス剤と同様の活性があることを示す方法。
【請求項４４】
MHRVに関連した疾患を検出するための方法であって、本方法は
生物学的試料をMHRV特異的なプローブと接触させる工程、ここで、生物学的試料は、MHRVに関連した疾患を有することが疑われる被検者から得られ、該接触する工程は、MHRV特異的なプローブが試料に結合して、試料中のプローブとプローブ標的との間の複合体が形成されるために十分な時間行われる；および
試料中のMHRV特異的なプローブとプローブ標的の複合体を検出する工程；を含み、
ここで、試料中の複合体の検出は、MHRVが試料に存在することを示し、これは、被検者がMHRVに関連した疾患を有する可能性があることを示す方法。
【請求項４５】
MHRVに関連した疾患がMHRVに関連したリンパ腫である、請求項44記載の方法。
【請求項４６】
MHRVに関連した疾患が奇形癌腫、多発性硬化症、自己免疫性リウマチ疾患、および精神分裂症からなる群より選択される、請求項44記載の方法。
【請求項４７】
請求項25記載のMHRV GAGポリペプチドを作製する方法であって、以下の工程を含む方法：
a）ポリペプチドの発現に適した条件下で、組換えMHRV GAGポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え宿主細胞を培養する工程；および
b）宿主細胞培養からポリペプチドを回収する工程。
【請求項４８】
免疫原性のポリペプチドが、外套組織球レトロウイルス（MHRV）のGAGポリペプチドのアミノ酸残基1〜22のアミノ酸配列を含む免疫原性のポリペプチドを含む、免疫原性の組成物。
【請求項４９】
免疫原性のポリペプチドをコードする配列を有する核酸分子を含む免疫原性の組成物であって、免疫原性のポリペプチドは、外套組織球レトロウイルス（MHRV）のGAGポリペプチドのアミノ酸残基1〜22のアミノ酸配列を含み、核酸配列は、哺乳類細胞において発現させるために適応している免疫原性の組成物。
【請求項５０】
単離された組換えMHRVベクターであって、
請求項14〜22のいずれか一項記載のMHRVポリヌクレオチド；
異種性核酸の挿入のために適した少なくとも1つの制限部位；および
MHRVポリヌクレオチドに対して異種性の配列を含む関心対象の核酸
を含むベクター。
【請求項５１】
制限部位がMHRVゲノムにおいて天然に存在しない、請求項50記載の単離された組換えMHRVベクター。
【請求項５２】
請求項14〜22のいずれか一項記載のMHRVポリヌクレオチドを含み、異種性核酸の挿入に適した少なくとも1つの制限部位をさらに含む組換えMHRVゲノムを含む、単離された組換えMHRV粒子。
【請求項５３】
請求項52記載の単離された組換えMHRV粒子であって、組換えMHRVゲノムはMHRVポリヌクレオチドに対して異種性の配列を含む核酸をさらに含み、核酸は、宿主細胞へのMHRVベクターの導入において、宿主における発現のために機能的に挿入されている、組換えMHRV粒子。
【請求項５４】
MHRV粒子が複製欠損である、請求項52記載の単離された組換えMHRV粒子。
【請求項５５】
MHRV粒子が複製適格性である、請求項52記載の単離された組換えMHRV粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦によって後援された調査に関する陳述
本発明は、国立衛生研究所によって与えられた助成金番号U01：CA66529の下に政府支援を伴ってなされた。政府は、本発明に対して一定の権利を有し得る。
【０００２】
発明の技術分野
本発明は、ヒトレトロウイルス、特に、ヒトの、非ホジキンリンパ腫、特に外套細胞リンパ腫から単離されたヒトレトロウイルスに関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ヒトは年をとるにつれて、様々な慢性疾患を発症し始めるが、その病因は現時点では依然として不明である。これらの慢性疾患は、実質的に体の全ての器官系統に影響を及ぼす。慢性疾患のいくつかの動物モデルは、ウイルス感染、特にレトロウイルスの感染を含む。たとえば、マウス白血病ウイルスは、リンパ腫、自己免疫疾患、および免疫不全疾患を引き起こすことに関係している。これらのタイプの動物モデルの研究では、レトロウイルスがこれらの疾病状態に有意な役割を演ずることが示唆された。しかし、動物モデルにおける所見のヒトへの外挿では、HTLV（リンパ腫で）、HIV（AIDSで）、およびHuLAV（ヒトB細胞、非ホジキンリンパ腫で（米国特許第5,108,920号））以外の慢性免疫学疾患に関連した十分に感染性のレトロウイルスの同定がうまく成功したことは証明されていない。
【０００４】
その他の慢性疾患に関連した潜在的な薬剤の探索において、ヒト内在性のレトロウイルスエレメントの膨大なアレイが発見され特徴づけられた（Lowerら、Proc Natl Acad Sci 93: 5177-5184 （1996）； Tonjesら、J Virol 73 （11）: 9187-9195 （1999）； Sverdlov Bioessays 22 （2）： 161-171 （2000）。マウス疾患モデルにおける慢性疾患と関連ものであることがヒトにおいて同定された内在性のレトロウイルスエレメントの最新の分類は、ヒト内在性レトロウイルス（HERV）である（Wilierら、Virus Genes 15 （2）： 123-133 （1997））。HERV関連遺伝子の発現またはHERVエレメントに対する抗体についての証拠は、奇形癌腫（Bollerら、J Virol 71: 4581-4588 （1997）； Bollerら、Virology 196： 349-353 （1993））、リンパ腫（上記Lowerら、（1996））、多発性硬化症（Clericiら、J Neuroimmunol 99 （2）： 173-182 （1999）； Trabattoniら、J Neurovirol 6 （Suppl 2）： S38-41 （2000））、自己免疫性リウマチ疾患（Nelsonら、Immunol Invest 28 （4）: 277-289 （1999））、および最も最近の精神分裂症（Yolkenら、Brain Res Rev 31 （2-3）: 193-199 （2000））などの様々な慢性疾患において同定されている。しかし、ヒト内在性レトロウイルスエレメントは、ヒトゲノムのほぼ1%を構成し、これらのエレメントのそれぞれは、その他の内在性エレメントに非常に関連しているので、疾患の発症におけるこれらの役割を評価することは困難であった。
【０００５】
レトロウイルスおよび疾患に関連したその他の薬剤の同定における進歩にもかかわらず、多くの疾患の原因となる薬剤または関連した薬剤の同定は達成しにくいままである。あるタイプの悪性リンパ系は、このような疾患の1つである。形態および細胞の系統に基づいて3つの主なカテゴリーの悪性リンパ球：B細胞腫瘍、T細胞／ナチュラルキラー（NK）細胞腫、およびホジキンリンパ腫が、認識されている。B細胞およびT細胞／NK腫瘍は、非ホジキンリンパ腫と称することが多い。多くのリンパ系の腫瘍が固体段階および循環段階で存在しているので、リンパ腫およびリンパ性白血病は、これらの分類法の範囲内に含まれる。BおよびT細胞カテゴリー内にんは、2つの細別：分化の最も初期の段階に対応する前駆体腫瘍、およびより成熟した分化した腫瘍が認識されている。活動的なリンパ腫は、主にこれらが初めは無症候であるという性質のために、初期段階で診断することが特に困難である。したがって、活動的な非ホジキンリンパ腫の診断は、通常、疾患期間の遅い段階であり、予後は通常芳しくない。
【０００６】
外套細胞リンパ腫は、活動的な非ホジキンリンパ腫の例である。外套細胞リンパ腫は、リンパ節、脾臓、骨髄、血液、および時に胃腸系（リンパ腫のポリポーシス）において見出される。外套細胞リンパ腫は、CD5陽性の濾胞性外套B細胞、染色体11および14の転座、ならびにサイクリンD1タンパク質の過剰発現によって一般に特徴づけられる。軽度のリンパ腫と同様、外套細胞リンパ腫は、アンスラサイクリンに基づく化学療法では不治であると思われ、老齢の患者では、一般に無症候の進行期疾患を生じる。しかし、平均生存期間は、その他のリンパ腫のもよりも有意に短く（3〜5年）、それゆえにこの組織は現在活動的なリンパ腫であると考えられている。散在性パターンおよび芽球様細胞の変異体では、生存が短い活動的な経過を有するが、外套帯型では、より無痛性の経過を有する。どの化学療法アプローチがこの臨床病理学的な実体において最も長期生存をもたらすかは不明であり、化学療法に対する不応性は通常の特徴である。多くの調査者が、幹細胞／骨髄を補助する高投与量治療法またはCHOP（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニソン）化学療法後の、インターフェロンもしくは抗CD20抗体の使用を探索している。
【０００７】
癌などの慢性疾患の薬剤の同定は、発症した患者の診断および抗癌剤の開発のためだけでなく、原因因子が、たとえば輸血、感染組織の移植、針の共有または再使用、性的接触などを介して伝染される慢性疾患の蔓延を防止するためにも重要である。ドナーからレシピエントへのリンパ腫の伝染は、ウイルスに直接感染することにより生じ得る。
【０００８】
当技術分野において、未知の病因の癌に関連する（およびしたがって、マーカーとして機能することができる）か、または引き起こす因子を同定する必要がある。さらに、癌などの慢性疾患に関連する因子の同定により、使用前に関連する因子について生物物質をスクリーニングすることができる（たとえば、血液、血液製剤、組織などをスクリーニングする）。本発明はこの要求に取り組む。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
本発明は、ヒトリンパ腫と関連した、単離された無傷のウイルス、およびもともと外套細胞リンパ腫から単離されたウイルス（本明細書において外套組織球レトロウイルス（MHRV）と称される）を特徴とする。また、本発明は、MHRVを検出するための組成物および方法、ならびにインビトロにおいてMHRVを増殖するため、抗MHRV薬剤をスクリーニングするため、および弱毒化したMHRV株の作製するための方法および組成物を特徴とする。
【００１０】
1つの側面において、本発明は、単離された外套組織球レトロウイルス（MHRV）粒子を特徴とする。特定の態様において、MHRV粒子は、配列番号：8のアミノ酸残基1〜22のアミノ酸配列を含むGAGポリペプチドをコードするRNAゲノムを含む。その他の特定の態様において、MHRV粒子は、配列番号：2を含む第1のプライマーおよび配列番号：3を含む第2のプライマーを使用するPCR増幅により、約304bpの増幅産物を産生することで特徴づけられるRNAゲノムを含む。なおさらなる特定の態様において、MHRV粒子は、粒子が、感染およびウイルスの逆転写酵素の活性化に続いて、高いストリンジェンシーの条件下で配列番号：1の核酸配列にハイブリダイズするcDNAを生成するRNAゲノムを含む。もう一つの態様において、MHRVウイルス粒子は、配列番号：1に対応する配列を含むRNA分子を含む。さらに別の態様において、MHRV粒子は、ヒトリンパ腫から単離できること；約90nmから110nmの粒径を有すること；膜脂質二重層を有すること；電子顕微鏡法によって円錐形の偏心性ヌクレオイドとして見えるRNAゲノムを有すること；および配列番号：8のアミノ酸配列のアミノ酸残基1〜22を含むGAGエンベロープポリペプチドを有すること、または代わりに、もしくは加えて、配列番号：7のヌクレオチド残基1〜66に対応する核酸配列を含むRNAゲノムを有することによって特徴づけられる。
【００１１】
関連した側面において、本発明は、MHRVウイルス粒子に感染した単離された哺乳類細胞（たとえばマクロファージ）を特徴とする。選択的に、感染細胞は、MHRV粒子を産生する。
【００１２】
もう1つの側面において、本発明は配列番号：8のアミノ酸残基1〜22の少なくとも4つの隣接するアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列を含む、単離されたポリヌクレオチド（本明細書においてMHRVポリヌクレオチドと称するが、限定されない）を特徴とする。関連した側面において、本発明は、配列番号：7の核酸残基1〜66の少なくとも12個の隣接する残基の配列を含む単離されたMHRVポリヌクレオチド；高ストリンジェンシーの条件下で、少なくとも配列番号：7のヌクレオチド1〜66のポリヌクレオチド配列の一部分とハイブリダイズする配列を含む、単離されたポリヌクレオチド；配列番号：7の核酸残基1〜66の少なくとも12個の隣接するヌクレオチドに、少なくとも65%の同一性を有する配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを特徴とする。
【００１３】
関連した側面において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む単離された組換え宿主細胞および単離されたベクターを特徴とする。
【００１４】
もう1つの側面において、本発明は、単離されたMHRV GAGポリペプチドを特徴とする。関連した側面において、単離されたポリペプチドは、上記記載のようなMHRV GAGポリヌクレオチドによってコードされる。さらに関連した側面において、本発明は、単離されたMHRV GAGポリペプチドを特異的に結合する単離された抗体を特徴とする。
【００１５】
もう一つの側面において、本発明は、MHRVを検出するための方法であって、MHRVを含むことが疑われる生物学的試料をMHRV特異的なプローブと、MHRV特異的なプローブが試料に結合してプローブとプローブの標的との間の複合体が形成されるために十分な時間接触させる工程；および試料におけるMHRV特異的なプローブとプローブ標的との複合体の有無を検出する工程を含む方法を特徴とする。試料における複合体の検出は、MHRVが試料に存在することを示す。
【００１６】
上記のMHRV検出方法の特定の態様において、プローブ標的は核酸であり、MHRV特異的なプローブは核酸であり、配列番号：1の少なくとも8つの隣接するヌクレオチド残基；または配列番号：7の残基1〜66の少なくとも8つの隣接するヌクレオチド残基を含む。その他の態様において、MHRV特異的なプローブはMHRV特異的な抗体であり、およびプローブ標的はMHRV GAGポリペプチドである。さらにその他の態様において、プローブ標的は抗MHRV抗体であり、およびMHRV特異的なプローブは配列番号：8のアミノ酸残基1〜22を含むポリペプチドである。関連した態様において、生物学的試料は、血液、血液由来産物、血漿、血清、またはマクロファージもしくはマクロファージから派生した腫瘍細胞を含む組織である。
【００１７】
もう1つの側面において、本発明は試料におけるMHRVを検出するための方法であって、本方法は、MHRVを含むことが疑われる生物学的試料を、第1のMHRV特異的な核酸プローブおよび第2のMHRV特異的な核酸プローブと接触させる工程であり、ここで第1のプローブおよび第2のプローブは、それぞれ配列番号：7の核酸配列またはその相補配列の少なくとも15個の隣接するヌクレオチドを含み、この接触は、増幅されたDNA産物を産生するために有効な条件下である工程；ならびに増幅されたDNA産物の有無を検出する工程を含む方法を特徴とする。配列番号：7を含む核酸配列から予想される増幅されたDNA産物に対応する増幅されたDNA産物の検出は、試料にMHRVが存在することを示す。
【００１８】
本発明のMHRV検出方法の特異的な態様において、第1のプローブは、HERV-9およびHERV-10からなる群より選択される配列を含む。その他の特異的な態様において、第2のプローブはHERV-8、HERV-11、およびHERV-12からなる群より選択される配列を含む。さらにその他の態様において、第1のプローブがHERV-8であり、第2のプローブがHERV-9であって、約304bpの増幅産物の検出は、MHRVが試料に存在することを示す；第1のプローブがHERV-9であり、第2のプローブがHERV-12であって、約1321bpの増幅産物の検出は、MHRVが試料に存在することを示す；または第1のプローブがHERV-10であり、第2のプローブがHERV-11であって、約1966bpの増幅産物の検出は、MHRVが試料に存在することを示す。
【００１９】
もう一つの側面において、本発明は、外套組織球レトロウイルス（MHRV）の検出のためのキットであって、キットにはMHRV特異的なプローブを含み、プローブは、MHRV GAGポリペプチドをコードする配列に特異的にハイブリダイズするMHRV特異的な核酸プローブ；MHRV特異的なGAG抗体；または抗MHRV GAGポリペプチドに特異的に結合するMHRVポリペプチドであるキットを特徴とする。
【００２０】
もう1つの側面において、本発明は抗MHRV抗ウイルス剤をスクリーニングするための方法であって、本方法は、候補薬剤をMHRVに感染した哺乳類細胞であってウイルス粒子を産生する細胞を含む培養液と接触させる工程；および培養上清中のMHRVウイルス粒子を検出する工程を含む方法を特徴とする。上清中のMHRVウイルス粒子の減少は、候補薬剤が抗MHRV抗ウイルス剤と同様の活性があることを示す。
【００２１】
さらにもう1つの側面において、本発明はMHRVに関連した疾患を検出するための方法であって、本方法は、生物学的試料をMHRV特異的なプローブと接触させる工程であり、ここで、この生物学的試料はMHRVに関連した疾患を有することが疑われる被検者から得られ、この接触は、MHRV特異的なプローブを試料に結合してプローブとプローブ標的との間の複合体が形成されるのに十分な時間行われる工程；および試料中のMHRV特異的なプローブとプローブ標的の複合体を検出する工程を含む方法を特徴とする。試料中の複合体の検出はMHRVが試料に存在することを示し、これは、被検者がMHRVに関連した疾患を有する可能性があることを示す。関連した態様において、MHRVに関連した疾患は、MHRVに関連したリンパ腫、奇形癌腫、多発性硬化症、自己免疫性リウマチ疾患、または精神分裂症である。
【００２２】
もう一つの側面において、本発明は、MHRV GAGポリペプチドを作製する方法を特徴とし、この方法は、ポリペプチドの発現に適した条件下で、組換えMHRV GAGポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え宿主細胞を培養する工程；および宿主細胞培養からポリペプチドを回収する工程を含む。
【００２３】
もう一つの側面において、本発明は、免疫原性のポリペプチドが、外套組織球レトロウイルス（MHRV）のGAGポリペプチドのアミノ酸残基1〜22のアミノ酸配列を含む免疫原性のポリペプチドを含む、免疫原性の組成物を特徴とする。
【００２４】
もう一つの側面において、本発明は、免疫原性のポリペプチドをコードする配列を有する核酸分子を含む免疫原性の組成物であって、免疫原性のポリペプチドは、外套組織球レトロウイルス（MHRV）のGAGポリペプチドのアミノ酸残基1〜22のアミノ酸配列を含み、核酸配列は、哺乳類細胞において発現するために適応している免疫原性の組成物を特徴とする。
【００２５】
もう1つの側面において、本発明は、MHRVポリヌクレオチドを含むウイルスゲノム（たとえば、配列番号：8の1〜22の少なくとも4つの隣接するアミノ酸残基をコードするポリヌクレオチド）、異種性核酸の挿入のために適した少なくとも1つの制限部位、およびMHRVポリヌクレオチドに異種性配列を含む関心対象の核酸を含む単離された組換えMHRVベクターであって、核酸は、宿主細胞にMHRVベクターを導入することにより、宿主における発現のために機能的に挿入されているベクターを特徴とする。特定の態様において、制限部位は、MHRVゲノムにおいて天然に存在しない。
【００２６】
もう1つの側面において、本発明は、MHRVポリヌクレオチドを含む組換えMHRVゲノム（たとえば、配列番号：8の1〜22の少なくとも4つの隣接するアミノ酸残基をコードするポリヌクレオチド）、および異種性核酸の挿入のために適した少なくとも1つの制限部位を含む単離された組換えMHRV粒子を特徴とする。特定の態様において、組換えMHRV粒子は、MHRVポリヌクレオチドに対して異種性の配列を有する核酸をさらに含み、かつ核酸は、宿主細胞にMHRVベクターを導入することにより、宿主における発現のために機能的に挿入されている。その他の特定の態様において、MHRV粒子は、複製欠損であるか、または複製適格性である。
【００２７】
発明の詳細な記載
本発明および本発明の特定の例示的な態様を記載する前に、本発明が記載された特定の態様に限定されず、従って当然ながら変更してもよいことは理解されるべきである。また、本明細書において使用される専門用語が特定の態様のみを記載するために存在し、限定されることは企図されないことが、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲のみに限定されると考えられという理由から理解されるはずである。
【００２８】
値の範囲が提供される場合、、文脈から明らかに他に指示していない限り、下限ユニットの10分の1までの、その範囲の上限と下限の間のそれぞれの介在値、および任意の他に指定した値または範囲を指定した介在値も本発明の範囲に包含される。よりせまい範囲に独立して含まれ得るこれらのよりせまい範囲の上限および下限は、指定した範囲で特に除外した限界に従って本発明の範囲内に包含される。指定した範囲が限界の一方または両方を含む場合、これらの含まれる限界の両者のいずれかを除外した範囲も、本発明に含まれる。
【００２９】
他に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、通常は、本発明が属する技術分野の当業者によって理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと同様または等価ないずれの方法および物質も本発明の実施または試験において使用することができ、好ましい方法および物質は本明細書に記載してある。本明細書において言及した全ての刊行物は、刊行物が引用している方法および／または物質を開示および記載するために、本明細書に組み入れられる。
【００３０】
本明細書および添付の特許請求の範囲に使用される、単数の形態「a」、および「the」は、文脈から明らかに他に指示していない限り、複数の参照を含む。したがって、たとえば「ウイルス粒子」に関しては、複数のこのようなウイルス粒子を含み、「細胞」に関しては、1つまたは複数の細胞および当業者に既知のその等価物などに関するものを含む。
【００３１】
本明細書において議論される刊行物は、単に本出願の出願日の前のこれらの開示に関して提供される。また、本明細書においては、従来の発明によって本発明がこのような刊行物に先だって権利が与えられていないと認めるものとは解釈されない。さらに、刊行物が提供された日は、実際の日付とは異なっている可能性があり、それぞれ確認することが必要であると考えられる。
【００３２】
定義
本明細書において使用される「外套組織球レトロウイルス」（MHRV）という用語は、本明細書に記載されたヒトレトロウイルスをいい、これは、一般に以下のいずれか1つまたは複数によって特徴づけることができる：1）ヒト外套細胞リンパ腫から単離できること（本明細書に記載されたとおりに）;2）電子顕微鏡法によって観察される直径約90nm〜110nmのビリオン粒子；3）膜脂質二重層を有すること；4）RNAゲノムを含む偏心性の円錐形のヌクレオイド。タンパク質レベルでは、MHRVは、ウイルス粒子が配列番号：8のアミノ酸配列のアミノ酸残基1〜22を含むGAGコアポリペプチドを有することで特徴づけられる。核酸配列レベルでは、MHRVは、RNAゲノムが、MHRVに特有のGAGをコードする配列の一部である配列番号：7のヌクレオチド残基1〜66に対応する核酸配列を含むという点で特徴づけられる。「ヌクレオチド残基に対応する」とは、これに関して、RNAが、デオキシリボヌクレオチドチミン（T）がリボヌクレオチドウラシル（U）と置換されることを除いて、提供されたDNA配列の配列を有することを意味する。MHRVがヒト外套細胞リンパ腫から単離されることの言及では、この供与源から単離されたMHRVのみに限定することは企図されず、むしろ本発明のウイルスを単離して記載する手段だけであることに留意されたい。
【００３３】
「単離されたウイルス核酸」または「単離されたウイルスポリペプチド」という用語は、本発明によって提供されたMHRVウイルスタンパク質またはペプチドが、天然に存在し、天然に結合しているタンパク質および有機の分子を少なくとも60重量%含まないことを意味する。好ましくは、調製物は、MHRVポリペプチドの少なくとも7重量5%、より好ましくは少なくとも90重量%、および最も好ましくは少なくとも99重量%である。単離されたウイルスタンパク質またはペプチドは、たとえばヒト外套細胞リンパ腫のマクロファージから得ることができるMHRVウイルス粒子から抽出することによって；MHRVウイルスタンパク質もしくはペプチドをコードする組換え核酸の発現によって；または、タンパク質もしくはペプチドを化学的に合成することによって得てもよい。純度は、任意の適切な方法によって、たとえばカラムクロマトグラフィ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはHPLC解析によって測定することができる。
【００３４】
「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、任意の長さの、リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドのいずれかのヌクレオチドの重合体形態をいう。したがって、これらの用語は、1本鎖、2本鎖、もしくは多重鎖のDNAもしくはRNA、ゲノムDNA、cDNA、DNA‐RNAハイブリッド、またはプリンおよびピリミジン塩基もしくはその他の天然の、化学的にもしくは生化学的に修飾された、非天然の、または誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを含むが、これらに限定されない。これらは、イントロン配列およびエキソン配列を含む（たとえばNiwaら、（1999） Cell 99 （7）: 691-702を参照されたい）。
【００３５】
ポリヌクレオチドのバックボーンは、糖およびリン酸基（RNAまたはDNAにおいて典型的に見出されるであろうもの）、または修飾もしくは置換された糖もしくはリン酸基を含むことができる。または、ポリヌクレオチドのバックボーンは、ホスホラミダイトなどの合成サブユニットのポリマーを含むことができ、したがって、アミド亜リン酸オリゴデオキシヌクレオシドまたは混合されたアミド亜リン酸エステル-リン酸ジエステルオリゴマーであることもできる。Peyrottesら、（1996） Nucl. Acids Res. 24: 1841-1848； Chaturvediら、（1996） Nucl. Acids Res. 24: 2318-2323。ポリヌクレオチドは、メチル化されたヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの修飾されたヌクレオチド、ウラシル、糖、ならびにフルオロリボースおよびチオアートなどのその他の結鎖基、ならびにヌクレオチド分岐物を含んでいてもよい。ヌクレオチド配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されていてもよい。ポリヌクレオチドは、ラベリング成分と結合することなどによって、重合後にさらに修飾されていてもよい。この定義に含まれるその他の改変のタイプは、cap、1つまたは複数の天然に存在するヌクレオチドの類似体による置換、ポリヌクレオチドをタンパク質、金属イオン、標識成分、その他のポリヌクレオチド、または支持体（たとえば、固体または半固体支持体、アレイとして使用するための支持体などに）に取り付けるための手段の導入を含む。ポリヌクレオチドは、様々な形態で、たとえばアレイに結合して提供することができ、またはポリヌクレオチドのライブラリー（たとえば、関心対象のポリヌクレオチドを含むベクターのライブラリー、このようなベクターを含む組換え宿主細胞のライブラリーなど）の一部として提供することができる。
【００３６】
RNAウイルスMHRV、およびその他のRNAウイルスにおいてのDNAに関してはゲノムRNAから産生されうるDNA配列を意味し、DNA配列を作製する方法に関して限定されないことが理解される。同様に、MHRV配列およびその他のRNAウイルスのDNA配列は、ウラシル（U）がチミン（T）で置換された対応するRNAを包含し、さらに相補鎖およびその対応するRNA配列を包含する。
【００３７】
「ポリペプチド」および「タンパク質」のという用語は、本明細書において交換可能に使用され、任意の長さのアミノ酸の重合形態をいい、コードおよび非コードアミノ酸、化学的もしくは生化学的に修飾（たとえば、グリコシル化などの翻訳後修飾）または誘導体化されたアミノ酸、重合性ポリペプチド、および修飾されたペプチドバックボーンを有するポリペプチドを含むことができる。本用語は、融合タンパク質を含む異種性アミノ酸配列との融合タンパク質、N末端メチオニン残基を有するもしくは有さない異種性および同種のリーダー配列を有する融合体；免疫学的にタグを付けられたタンパク質；などを含むが、これらに限定されない。また、ポリペプチドは、支持体への（たとえば、固体または半固体支持体への、アレイとして使用するための支持体などへの）付着を容易にするために修飾することもできる。
【００３８】
本明細書において使用される、指定された配列に「由来する」ポリヌクレオチドは、指定されたヌクレオチド配列の領域に対応するおよそ少なくとも約6つの隣接するヌクレオチド、少なくとも約8つのヌクレオチド、少なくとも約10〜12個の隣接するヌクレオチド、および少なくとも約15〜20個の隣接するヌクレオチドから構成されるポリヌクレオチド配列をいう。「対応する」は、指定された配列に相同的または相補的なことを意味する。好ましくは、ポリヌクレオチドが由来する領域の配列は、MHRVゲノムに特有の配列に相同的または相補的である。
【００３９】
配列がMHRVに特有であるか否かにかかわらず、当業者に既知の技術によってゲノムを決定することができる。たとえば、配列は、データバンク、たとえばGenBankの配列と比較して、感染していない宿主またはその他の生物に存在するかどうかを決定することができる。また、配列は、その他のレトロウイルス、特にヒト内在性レトロウイルスを含むその他の既知のウイルス性因子の配列をレトロウイルス科のメンバーと比較することができる。また、その他の配列に対して誘導された配列が対応するか、または対応しないかは、適切なストリンジェンシーの条件下におけるハイブリダイゼーションによって決定することができる。核酸配列の相補性を決定するためのハイブリダイゼーション技術は、当業者に既知であり、以下に議論してある。また、たとえばManiatisら（1982）を参照されたい。さらにハイブリダイゼーションによって形成される二体鎖ポリヌクレオチドのミスマッチは、たとえば、特異的に二体鎖ポリヌクレオチドの一本鎖領域を消化するS1などのヌクレアーゼによる消化を含む既知の技術によって決定することができる。典型的なDNAに「由来する」であろう領域は、たとえば、特異的なエピトープをコードする領域、ならびに非転写領域および／または非翻訳領域を含むが、これらに限定されない。
【００４０】
由来するポリヌクレオチドは、示されたヌクレオチド配列から必ずしも物理的に由来するというわけではなく、たとえば、化学合成、DNA複製、逆転写、または転写を含むいかなる方法で生成されてもよい。さらに、指定された配列のものに対応する領域の組み合わせは、当技術分野において既知の方法で修飾して、企図される使用で処方されてもよい。
【００４１】
同様に、指定した核酸配列に「由来する」ポリペプチドまたはアミノ酸配列は、配列においてコードされるポリペプチド、またはその一部分と一致するアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、この部分は、少なくとも3〜5つの隣接するアミノ酸、およびより好ましくは少なくとも8〜10個の隣接するアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも11〜15個の隣接するアミノ酸からなるか、またはこの配列でコードされるポリペプチドと免疫学的に同定可能なポリペプチドをいう。また、この専門用語は、指定された核酸配列から発現されるポリペプチドを含む。
【００４２】
組換えポリペプチドまたは由来するポリペプチドは、必ずしも指定された核酸配列、たとえば、配列番号：7に記載したようなMHRV GAGポリペプチドをコードする配列から、またはMHRVゲノムから翻訳されるというわけではなく；たとえば、化学合成、組換え発現系における発現、または変異MHRVを含むMHRVからの単離を含むいかなる方法で作製されてもよい。組換えポリペプチドまたは由来するポリペプチドは、その配列に1つもしくは複数のアミノ酸の類似体または非天然アミノ酸を含んでいてもよい。配列にアミノ酸の類似体を挿入する方法は、当業者に既知である。また、これは、1つまたは複数の標識を含んでいてもよく、これは当業者に既知である。
【００４３】
本明細書において使用される、「組換えポリヌクレオチド」という用語は、その起源または操作によって、：（1）天然において結合するポリヌクレオチドの全てまたは一部には結合しないもの、（2）天然において連結するもの以外のポリペプチドに連結するもの、または（3）天然には存在しないが、ゲノム、cDNA、半合成の、または合成起源のポリヌクレオチドを企図する。
【００４４】
「機能的に連結された」は、このように記載された成分が、その成分の企図された方法でそれらを機能させる関係で近位であることをいう。コード配列に「機能的に連結された」対照配列は、コード配列の発現が対照配列に適合した条件下で達成されるような方法でライゲーションされる。
【００４５】
「オープン・リーディング・フレーム」（ORF）は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の領域であり、この領域は、一部のコード配列または全コード配列を表してもよい。
【００４６】
「コード配列」は、適切な調節配列の制御下で配置されたときに、mRNAに転写される、および／またはポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列である。コード配列の境界は、5'末端の翻訳開始コドンおよび3'末端の翻訳停止コドンによって決定される。コード配列は、mRNA、cDNA、および組換えポリヌクレオチド配列を含むが、これらに限定されない。
【００４７】
たとえば、「MHRV GAGポリペプチドに対して異種性のプロモーターエレメント」という用語において使用される、「異種性の」という用語は、結合した2つのエレメントが天然において共に結合していることが見出されていないこと、たとえば、異なった供与源である（たとえば、プロモーターエレメントは、天然に見出されるMHRV GAGポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに結合されていない）ことを意味する。
【００４８】
本明細書において使用される、「形質転換」という用語は、挿入のために使用される方法、たとえば、直接取込み、トランスダクション、f-交接、またはエレクトロポレーションであるかにかかわらず、宿主細胞に外因性のポリヌクレオチドを挿入することをいう。外因性のポリヌクレオチドは、組込まれていないベクター、たとえば、プラスミドとして維持されていてもよく、または代わりに宿主ゲノムに組み込まれていてもよい。
【００４９】
MHRVポリヌクレオチド（たとえば、核酸プローブ）またはポリペプチド（たとえば、特異的にポリペプチドを結合する抗体を使用して検出されるもの）に関して使用される、「特異的に結合する」という用語は、MHRVポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、MHRVを非MHRVポリヌクレオチドまたは非MHRVポリペプチドから区別するために検出されるようなMHRVのマーカーとして使用することができることを意味する。たとえば、特異的なMHRVポリヌクレオチドは、非MHRV核酸からMHRV核酸を区別するために、MHRV核酸を特異的に検出するのに（たとえば、核酸増幅に基づいたアッセイ法またはハイブリダイゼーションに基づいたアッセイ法において）使用することができるものである。同様に、特異的なMHRVポリペプチドは、試料におけるMHRVを特異的に検出して、非MHRVポリペプチドからMHRVポリペプチドを区別するために検出することができる（たとえば、抗体に基づくアッセイ法によって）ポリペプチドである。同様に、MHRV特異的な抗体は、試料におけるMHRVを特異的に検出して非MHRVポリペプチドからMHRVポリペプチドを区別するために、MHRV特異的なポリペプチドまたはMHRV特異的なエピトープの検出に使用することができる抗体である。
【００５０】
本明細書において使用される「MHRVマーカー」は、試料において検出することができ、MHRVに対する試料の供与源に存在すること、または前に存在すること（たとえば、暴露の前に）を示す生物学的分子をいう。MHRVマーカーの例は、MHRVウイルス粒子、MHRVに特異的なMHRV核酸、MHRVに特異的なMHRVポリペプチド、および抗MHRV抗体を含む。
【００５１】
特にMHRVの検出に関して使用される、「生物学的試料」という用語は、被検者、一般にヒト被験者から得られる任意の生物学的物質をいう。このような物質は、血液、血液由来産物、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、皮膚、呼吸管、腸管、および尿生殖器管の外部切片、涙、唾液、乳汁、血液細胞、細胞（たとえば、マクロファージ、骨髄、リンパ腫の癌細胞、腫瘍細胞、前癌の細胞（たとえば、形成異常細胞）など）、腫瘍、器官を含む(しかし、これらに限定されない)個体から単離された組織または液の試料、ならびにインビトロにおける細胞培養成分（ウイルスに感染した細胞、組換え細胞、および細胞成分の細胞培地において、細胞の増殖によって生じる培養上清を含むが、これらに限定されない）を含むが、これらに限定される必要はない。
【００５２】
本明細書において使用される、「被験者」または「患者」という用語は、本発明の方法、たとえば、診断方法を適用できる任意の被検者または患者を包含することを意図する。哺乳類の被検者および患者、特にヒトの被験者または患者は、特に関心対象である。
【００５３】
本明細書において使用される、「マクロファージ」および「単球」という用語は、交換可能に使用され、当技術分野において、「単球」という用語はCD14細胞表面マーカーを発現する循環単核細胞を記載するために使用されることが多く、および組織においては、この細胞はマクロファージとして分類されることも多いことが理解される。
【００５４】
当技術分野において、および本明細書において使用される「増殖するマクロファージ」という用語は、分裂しているマクロファージを示すと理解される用語である。通常、マクロファージは、さらに分裂することができない最終分化細胞である。本発明の目的では、「増殖するマクロファージ」は、さらに分裂することができるか、または末期もしくは最終段階であるとみなされない細胞周期の一部である。増殖は、クローン、すなわち単一の細胞に由来してもよい。
【００５５】
本明細書において使用される、「増殖するマクロファージの存在」を検出することは、増殖するマクロファージのレベルを検出することを一般に意味する。絶対的または相対的レベルでさえも決定される必要はないことは理解され、検出可能な増殖するマクロファージの観測で十分である。
【００５６】
「マイクロアレイ」および「アレイ」は、本明細書において交換可能に使用され、生化学的試料（標的）（これは、未決定の特徴を有することが多い）のための推定結合部位（たとえば、ハイブリダイゼーションによる）のアレイ、好ましくは規則正しいアレイを有する表面を含む。好ましい態様において、マイクロアレイは、基質の定義された部位に固定された異なったポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドプローブの構築をいう。アレイは、紙、ガラス、プラスチック（たとえば、ポリプロピレン、ナイロン）、ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、シリコン、光ファイバー、またはその他の任意の適切な固体もしくは半固体支持体などの物質で製造され、平面（たとえば、ガラス板、シリコンチップ）、または3次元（たとえば、ピン、繊維、ビーズ、粒子、マイクロタイターウェル、キャピラリー）の配置に配置された基質に形成される。
【００５７】
アレイを形成するプローブは、（i）フォトリソグラフィー技術を使用するインサイチューにおける合成（たとえば、高密度オリゴヌクレオチドアレイ）（Fodorら、Science （1991）, 251: 767-773；Peaseら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. （1994）, 91: 5022-5026；Lockhartら、Nature Biotechnology （1996）, 14: 1675；米国特許第5,578,832号；第5,556,752号；および第5,510,270号を参照されたい）；（ii）中程度から低い密度（たとえば、cDNAプローブ）でのガラス、ナイロン、またはニトロセルロースに対するスポッティング／印刷（Schenaら、Science （1995）, 270: 467-470、DeRisiら、Nature Genetics （1996）, 14: 457-460；Shalonら、Genome Res. （1996）, 6: 639-645；およびSchenaら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. （1995）, 93: 10539-11286）；（iii）マスキングにより（Maskos および Southern, Nuc. Acids. Res. （1992）, 20: 1679-1684）、および（iv）ナイロンまたはニトロセルロースハイブリダイゼーション膜に対するドットブロッティングにより（たとえばSambrookら、Eds., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory （Cold Spring Harbor, N.Y.）を参照されたい）を含む任意の数の方法によって、基質に取り付けられてもよい。また、プローブは、マグネチックビーズによって、またはマイクロタイターウェルもしくはキャピラリー中などの液相において、アンカーにハイブリダイゼーションすることによって基質に非共有結合で固定してもよい。プローブ分子は、一般にDNA、RNA、PNA、およびcDNAなどの核酸であるが、タンパク質、ポリペプチド、オリゴ糖、細胞、組織、および特異的に標的分子を結合することができるこれらのいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。
【００５８】
本明細書において使用される、「治療」という用語は、予防法および／または治療法をいう。
【００５９】
本明細書において使用される、「精製されたMHRV」という用語は、MHRVが濃縮された調製物、または単離されたMHRVを有する調製物をいい、この調製物は、ウイルスが正常に結合する細胞の成分、および感染した組織に存在するであろうその他のタイプのウイルスから得られた。ウイルスを単離するための技術は当業者に既知であり、たとえば、遠心、アフィニティークロマトグラフィなどを含む。
【００６０】
本明細書において使用される「MHRV粒子」という用語は、完全なビリオンならびにビリオン形成の中間体であろう粒子を含む。MHRV粒子は、一般にMHRV核酸に関連した1つまたは複数のMHRVポリペプチドを有する。
【００６１】
本明細書において使用される、「プローブ」という用語は、MHRVの特異的な検出に有用な分子をいう。従って、「プローブ」は、プローブの少なくとも1つの配列が標的領域の配列と相補的であるために、標的領域のMHRVポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。特に言及しない限り、プローブは、プライマー（たとえば、標的領域に隣接した領域のPCRに基づいた増幅に使用されるプライマー）を包含する。また、「プローブ」は、MHRVポリペプチドを特異的に結合する抗体、ならびに抗MHRV抗体を特異的に結合するMHRVポリペプチドを含む。プローブの意味は、本用語の使用の状況から当業者には容易に明らかであろう。
【００６２】
「MHRV特異的なプローブ」は、MHRV特異的なプローブ標的に特異的に結合する分子（たとえば、核酸、抗体、ポリペプチド）である。MHRV特異的なプローブの例は、MHRVの独特な配列に特異的にハイブリダイズする核酸、MHRV特異的な核酸配列の増幅を容易にする核酸プライマー対；MHRVのGAGを特異的に結合する抗MHRV GAGポリペプチド、および抗MHRV GAG抗体を特異的に結合するMHRV GAGポリペプチドを含む。
【００６３】
本明細書において使用される、核酸プローブに関して使用される「標的領域」という用語は、増幅され、および／または検出される核酸の領域をいう。抗体-ポリペプチド（抗体-抗原）複合体形成に関して使用される、「標的領域」という用語は、抗体が特異的に結合するエピトープを形成するポリペプチドの領域をいう。
【００６４】
本明細書において使用される、「プローブ標的」という用語は、MHRV特異的なプローブが特異的に結合する分子をいう。プローブ標的は、核酸（RNAもしくはDNA）、抗体、またはポリペプチドであることができる。本明細書に記載されたプローブおよびプローブ標的の組み合わせは、当業者であれば、本明細書を読むと直ちに明らかとなるであろう。
【００６５】
本明細書において使用される、MHRV核酸を含む「ウイルス核酸」という用語は、ウイルスゲノム由来の核酸、その断片、その転写産物、およびこれらに由来する突然変異体配列をいう。ウイルスの核酸は、たとえば、細胞、合成産生技術、組換え発現技術などの、任意の供与源に由来することもできる。
【００６６】
「MHRVに関連した疾患」は、ゲノムに統合されたMHRV核酸を有する細胞に関連した疾患を意味する。MHRVに関連したリンパ腫は、このようなMHRVに関連した疾患の例である。
【００６７】
「MHRVに関連したリンパ腫」は、MHRV核酸がゲノムに統合された細胞を有するリンパ腫を意味する。リンパ腫は、その主要な原因因子としてMHRVを有するもの、または一般にMHRVが見出されるかもしくは関連するものを有するが、主にMHRVによって引き起こされないものであってもよい。
【００６８】
「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞株」、「細胞培養」、およびその他の単細胞の実体として培養される微生物または高等真核細胞を示すような用語は、組換えベクターまたはその他の導入DNAのためのレシピエントとして使用することができ、または使用されている細胞をいい、トランスフェクトしたオリジナルの細胞の子孫を含む。単一の親細胞の子孫は、天然の、偶発の、またはゆっくりとした変異のために、もとの親株と形態において、ゲノムにおいて、または全DNA相補において、必ずしも完全に同一でなくてもよいことが理解される。
【００６９】
概要
本発明は、本明細書において外套組織球レトロウイルス（MHRV）と称される新規レトロウイルスの発見に基づく。MHRVは、ヒトリンパ腫と関連しており、ヒト内在性レトロウイルス（HERV）、特にHERV-K109と共有する有意なエレメントを有する、最初の複製適格性ヒトレトロウイルスである。本発明のウイルスは最初に外套細胞リンパ腫のマクロファージから単離され、したがって、これを反映してMHRVという名前をつけられた。しかし、本発明者らは、AIDSの大細胞リンパ腫および非AIDS濾胞性リンパ腫を含むその他のリンパ腫においても、MHRVを検出した。したがって、MHRVの名は、これらの所見がリンパ腫などのヒト癌と関連することを示すことから、MHRVが外套細胞リンパ腫を含むことに限定されることを企図しない。
【００７０】
動物モデルにおいてMHRVが単離された細胞がリンパ腫を生じる能力によって示されるとおりMHRVは伝播性であり、レシピエントにおいてリンパ腫を引き起こすことができる。このような観点からみて、本発明は、生物学的試料におけるMHRVを検出するための方法および組成物も提供し、これは、診断ならびに予防（たとえば、レシピエントに導入する前に血液、血液製剤、および組織をスクリーニングする際に）に関して使用することができる。
【００７１】
本発明の種々の態様を、これからさらに詳細に記載する。
【００７２】
外套組織球レトロウイルス（MHRV）
外套組織球レトロウイルス（本明細書においてMHRVと略記される）は、元々ヒト外套細胞リンパ腫から単離された。MHRV粒子は、電子顕微鏡法によって直径約90nm〜110nmとして観察され、およびRNAゲノムを含む円錐形の偏心性のヌクレオイドをカプセル化する膜脂質二重層を有する。観察されたレトロウイルスの形態は、B/D-タイプのものであった。5'LTR（末端反復配列）、pro、poly、env、および3'LTR領域に対応するMHRVゲノム領域は、HERV-K109と命名されたヒト内在性レトロウイルス（HERV）と約98〜100%の相同性を占めた（図1を参照されたい）。対照的に、MHRVのgag領域は、HERV-K109のgagに対して93%のみ相同性である。この観測は、MHRVがHERV-K109および別の外因性のウイルスとの組換事象の結果として生じたことを示唆する。その結果、ヌクレオチド残基約1246〜ヌクレオチド残基約3445におよぶMHRVゲノム領域、GAGコード配列に対応する領域、ならびにGAGポリペプチド自体は、MHRVのマーカーとして役立つ。
【００７３】
本発明はさらに、MHRVなどのマクロファージ向性ウイルスを同定するための方法を包含する。一般に、これらの方法は、MHRVを同定する方法に基づき、これは、以下の実施例の節において詳述する。たとえば、最初に、病原性の、増殖性のマクロファージ（たとえば、CD68およびPCNAの発現によって定義される）を有する組織を、組織学的な目視検査によって同定する。次いで、これらの組織または病原性のマクロファージを、適切な培地中で初代マクロファージと共に約1ヵ月間共培養する。次いで、細胞の電子顕微鏡法によって、ウイルスの存在について培養を検討することができる。さらに、または代わりに、培養細胞からの核酸は、本明細書に記載されたMHRV特異的なプライマーを使用して、スクリーニングまたは増幅（たとえば、PCRによって）することができる。MHRVの単離およびクローニングのために本明細書に記載されたものと同様の方法を使用して、ウイルス核酸をクローニングすることができる。
【００７４】
単離されたMHRVおよびMHRVの同定に基づいた本発明の種々の側面は、以下にさらに詳細に議論される。
【００７５】
MHRV核酸、ポリペプチド、およびポリペプチド特異的抗体
本発明は、MHRVの核酸、ならびにMHRVポリペプチドおよびこのようなポリペプチドを特異的に結合する抗体を特徴とする。以下、本発明のこれらのそれぞれの側面を詳細に説明する。
【００７６】
MHRV核酸
一つの側面において、本発明は、MHRVのポリヌクレオチドを特徴とする。本明細書に使用される、「MHRVポリヌクレオチド」という用語は、一般に、特定の関心対象であるMHRVを特異的に同定するために使用することができるポリヌクレオチドをいう（たとえば、ハイブリダイゼーションによる検出における核酸プローブ、または配列解析におけるもの）。このようなポリヌクレオチドの例は、MHRVのGAG遺伝子の配列の少なくとも一部を有するものであり、この配列は、MHRV核酸（たとえば、生物学的試料中のもの）の特異的な検出に有用である。本発明によって包含されるMHRV GAGポリヌクレオチド配列例は、配列番号：1および7を含むが、必ずしも限定されない。したがって、本発明のポリヌクレオチドの例は、また、隣接する配列として、MHRV GAGコード配列の5'隣接配列（たとえば、GAGオープン・リーディング・フレーム（ORF））を有するものを包含し、MHRV GAGコード領域の5'部分内の配列も、本発明によって想定される。同様に、本発明のポリヌクレオチドの例は、隣接する配列として、MHRV GAGコード領域の3'部分内の配列およびMHRV GAGコード領域の3'隣接配列を有するポリヌクレオチドを含む。
【００７７】
本発明によって想定されるその他の特定のMHRVポリヌクレオチドの例は、MHRV GAGポリペプチド（長さ約112アミノ酸）、たとえば、配列番号：8のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにこのようなポリヌクレオチド分子またはその部分に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドである。特定の関心対象のMHRVポリヌクレオチドは、MHRV GAGポリペプチドの5'部分のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列を含むもの、たとえば、配列番号：8の隣接するアミノ酸残基1〜22のアミノ酸配列の少なくともN末端領域を有するポリペプチド、たとえば、配列番号：8のアミノ酸残基1〜22由来の少なくとも約1〜4個の隣接するアミノ酸残基、配列番号：8のアミノ酸残基1〜22由来の少なくとも約2〜5個の隣接するアミノ酸残基、配列番号：8のアミノ酸残基1〜22由来の少なくとも約4〜10個の隣接するアミノ酸残基、配列番号：8のアミノ酸残基1〜22由来の少なくとも約8〜15個の隣接するアミノ酸残基、配列番号：8のアミノ酸残基1〜22由来の少なくとも約12〜20個の隣接するアミノ酸残基、配列番号：8のアミノ酸残基1〜22由来の22個までの隣接するアミノ酸残基を有するものである。さらにMHRVポリヌクレオチドの特定の例は、配列番号：7の少なくとも約10個の、少なくとも約15個の、少なくとも約20個の、少なくとも約50個の隣接するヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを含む。
【００７８】
本発明はさらに、本明細書に記載されたポリヌクレオチドの配列に配列相補性を有するポリヌクレオチド；本明細書に記載されたDNA配列に対応する配列を有するRNA；提供されたポリヌクレオチドに対応するウイルス遺伝子；本明細書に記載された生物学的物質またはその他の生物学的供与源（特にヒト供与源）から（たとえば、ストリンジェントな条件、特に高いストリンジェンシーの条件下のハイブリダイゼーションによって）得られたポリヌクレオチド；提供されたポリヌクレオチドおよびこれらに対応する遺伝子の変異体、特にこれらの遺伝コードの縮重のために存在する変異体（本明細書において「縮重変異体」という）および本発明のMHRVに特異的であるか、または本明細書において特異的に記載されたポリヌクレオチドによってコードされる遺伝子産物の生物学的活性を保持するその他の変異体（たとえば、GAGポリペプチドの生物学的活性、たとえばMHRV GAG特異的な抗体のその反応性を保持する）を包含する。本発明によって、および本発明の範囲内において想定されるその他の核酸組成物は、本明細書の開示と共に提供された場合は当業者には直ちに明らかであると考えられる。
【００７９】
本発明のポリヌクレオチドは、実質的な純度で、一般に完全な染色体または無処理のウイルス粒子以外として単離し、得ることができる。通常、DNAまたはRNAのいずれかとしてのポリヌクレオチドは、実質的に、その他の天然に存在する核酸配列がなく、一般に少なくとも約50%、通常少なくとも約90%純粋であり、天然に存在する染色体では通常結合してない1つまたは複数のヌクレオチドの側面に位置した「組換え」であることもできる。
【００８０】
本発明のポリヌクレオチドは、線状分子として、または環状分子内に提供することもでき、自律的に複製する分子（ベクター）内に、または複製配列のない分子内に提供することができる。ポリヌクレオチドの発現は、当業者に既知のそれら自体の、またはその他の調節配列によって調節することができる。本発明のポリヌクレオチドは、トランスフェリンポリカチオンを媒介したDNA導入による感染、裸のまたは被包性の核酸によるトランスフェクション、リポソームを媒介したDNA導入、DNA被覆ラテックスビーズの細胞内輸送、プロトプラスト融合、ウイルス感染、エレクトロポレーション、遺伝子銃、リン酸カルシウムを媒介したトランスフェクションなどの、当技術分野において利用できる様々な技術を使用して適切な宿主細胞に導入することができる。
【００８１】
組換え宿主細胞の産生のために適した宿主細胞は、たとえば、MHRV核酸を含むベクターの維持および／または複製に適しているか、またはMHRVウイルス粒子の複製および産生に適した任意の原核細胞または真核細胞であることができる。宿主細胞の例は、細菌、酵母、および哺乳類の宿主細胞を含むが、必ずしも限定されない。MHRV核酸を含む単離された組換え宿主細胞は、また、本発明において想定される。MHRV核酸を含む単離された組換えベクターまたは構築物も、同様に本発明において想定される。このようなベクターは、MHRV核酸（たとえば、プロモーターエレメント、転写終結エレメント、エンハンサーなど）によってコードされるポリペプチドの発現のためのその他の成分、ならびに宿主細胞における構築物の維持、複製、または（選択的に）ゲノム組込みのためのエレメント（たとえば、複製開始点など）を含むこともできる。
【００８２】
本発明の単離されたMHRVポリヌクレオチドは、5'、3'、または5'および3'の両方のフランキング配列と共に提供することができる。適切なフランキング配列は、プロモーター配列、エンハンサー配列、転写開始部位および／または停止部位、構築物またはベクターの配列（たとえば、構築物またはベクターの複製および維持のための配列、選択のために提供する遺伝子産物をコードする配列（たとえば、抗生物質の抵抗性または感受性、補充物を含むかまたは含まない培地中における増殖に影響を与える因子など）を含む（しかし必ずしもこれらに限定されない）直鎖状または環状の分子（たとえば、プラスミド）内のポリヌクレオチドの操作のために提供する配列）、ポリヌクレオチドおよび異種性ポリペプチドとの融合タンパク質の産生を提供する配列（すなわち、これが機能的に連結されたポリヌクレオチド以外の供与源に由来するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド）などを含むが、必ずしもこれらに限定されない。
【００８３】
本発明のポリヌクレオチドは、配列類似性または配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。配列類似を有する核酸は、低いストリンジェンシー、たとえば50℃および10×SSC（0.9Mの塩類溶液／0.09Mのクエン酸ナトリウム）の条件下のハイブリダイゼーションによって検出され、55℃において1×SSCで洗浄に供した場合に、結合したままである。配列同一性は、ストリンジェントな条件下、たとえば50℃またはそれ以上において、0.1×SSC（9mMの塩類溶液／0.9mMのクエン酸ナトリウム）でのハイブリダイゼーションによって決定することができる。
【００８４】
このような配列のハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で実行されていてもよい。「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、プローブがその標的配列に、他の配列よりも検出可能に強い程度でハイブリダイズすると考えられる条件が企図される（たとえば、背景よりも少なくとも2倍以上）。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、異なる状況においては異なる。ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄のストリンジェンシーを制御することによって、プローブに対して100%の相補的である標的配列を同定することができる（相同的プロービング）。または、ストリンジェントな条件は、類似性の程度の低いものが検出されるように、配列にいくつかのミスマッチが可能なように調整することもできる（非相同的プロービング）。通常、プローブは、長さが約1000未満のヌクレオチド、好ましくは長さが500未満のヌクレオチドである。
【００８５】
典型的には、ストリンジェントな条件は、pH7.0〜8.3において塩濃度が約1.5M未満のNaイオン、典型的には約0.01〜1.0MのNaイオン濃度（または、その他の塩）であり、温度は、短いプローブ（たとえば10〜50ヌクレオチド）については少なくとも約30℃、および長いプローブ（たとえば50を超えるヌクレオチド）については少なくとも約60℃であるものと考えられる。また、ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成してもよい。低いストリンジェンシー条件の例は、37℃において30〜35%のホルムアミド、1MのNaCl、1%のSDS（ドデシル硫酸ナトリウム）緩衝液中でのハイブリダイゼーション、および50〜55℃において1×〜2×SSCでの洗浄を含む（20.×SSC=3.0MのNaCl/0.3Mのクエン酸三ナトリウム）。中程度のストリンジェンシーの条件の例は、37℃において、40〜45%のホルムアミド、1.0MのNaCl、1%のSDSにおけるハイブリダイゼーション、および55〜60℃における0.5×〜1×SSCにおける洗浄を含む。高ストリンジェンシーの条件の例は、37℃における50%のホルムアミド、1MのNaCl、1%のSDSにおけるハイブリダイゼーション、および60〜65℃における0.1×SSCでの洗浄を含む。
【００８６】
特異性は、典型的にはハイブリダイゼーション後の洗浄における機能であり、最終的な洗浄溶液のイオン強度および温度が重要な因子である。DNA-DNAハイブリッドについては、Tmは、MeinkothおよびWahl (1984) Anal. Biochem. 138: 267-284： Tm=81.5℃. +16.6 (log M) +0.41 (% GC) -0.61 (%ホルム) -500/L；の方程式から概算することができ、式中Mは、一価カチオンの容量モル濃度であり、%GCは、DNA中のグアノシンおよびシトシンヌクレオチドの割合であり、%ホルムは、ハイブリダイゼーション溶液におけるホルムアミドの割合であり、%は、塩基対におけるハイブリッドの長さである。Tmは、相補的な標的配列の50%が完全にマッチしたプローブにハイブリダイズする温度（イオン強度およびpHで定義されている）である。Tmは、それぞれ1%のミスマッチについて約1℃減少させ、したがって、Tm、ハイブリダイゼーション、および／または洗浄条件は、所望の同一性の配列にハイブリダイズするように調整することができる。
【００８７】
たとえば、約90%までの、および約90%を含む同一性を有する配列を探索する場合、Tmは、10℃減少することができる。一般に、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度およびpHにおいて、特異的な配列およびその相補体の温熱融点（Tm）よりも約5℃低く選択される。しかし、過酷にストリンジェントな条件は、温熱融点（Tm）よりも1、2、3、または4℃低くして、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができ；中程度にストリンジェントな条件は、温熱融点（Tm）よりも6、7、8、9、または10℃低くして、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができる；低いストリンジェントな条件は、温熱融点（Tm）よりも11、12、13、14、15、または20℃低くして、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができる。
【００８８】
方程式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成物、ならびに所望のTmを使用して、当業者であれば、ハイブリダイゼーションおよび洗浄工程の長さのバリエーション（たとえば、分（たとえば、15分〜30分）〜時間（たとえば、1〜2時間から一晩））としてのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄溶液のストリンジェンシーのバリエーションは、本開示の範囲内であることを理解すると考えられる。所望のミスマッチの程度が、45℃（水溶液）または32℃（ホルムアミド溶液）よりも低いTmとなる場合、高い温度を使用することができるようにSSC濃度を増大させることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションについての広範なガイドは、Tijssen （1993） Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biolog -- Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 （Elsevier, New York）；および Ausubelら編、 （1995） Current Protocols in  Molecular Biology, Chapter 2 （Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York）に見られる。Sambrookら、（1989） Molecular Cloning: A Laboratory Manual （2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York）を参照されたい。
【００８９】
特に関心対象となる核酸は、実質的に提供されたポリヌクレオチド配列と同一のものである（たとえば、遺伝子の遺伝的に改変したバージョンなど）。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において提供されたポリヌクレオチド配列にハイブリダイズする核酸（配列番号：1または7）も、特に関心対象のものである。核酸プローブ、特にDNA配列の標識されたプローブは、相同的なまたは関連したMHRVポリヌクレオチドを単離するために使用することができる。相同的な核酸の供与源は、任意の種、たとえば霊長類種、特にヒト；ラットおよびマウスなどの齧歯類；イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ、酵母、ネマトーダなどであり得る。
【００９０】
一般に、核酸ハイブリッド形成は、本明細書において提供されるポリヌクレオチドの少なくとも15個の隣接するヌクレオチド（nt）を使用して行われる。少なくとも15個の隣接するntの核酸プローブは、相補的な配列を含む核酸と優先してハイブリダイズし、選択されたプローブに唯一ハイブリダイズする核酸の検出、同定、および回収を可能にする。15ntよりも長いプローブ、たとえば長さが約18nt〜約100ntのプローブを使用することができるが、15ntは、唯一の同定のために十分な配列を表す。
【００９１】
また、配列類似性および配列同一性は、配列解析によって決定することができる。一般に、配列同一性は、参照配列に基づいて算出され、これは、保存されたモチーフ、コード領域、フランキング領域、その他同種のものなどの、より大きい配列のサブセットであってもよい。参照配列は、通常少なくとも約18個の隣接するntの長さ、より通常には少なくとも約30ntの長さであると考えられ、比較される配列の全体に及んでもよい。配列解析のためのアルゴリズムは、たとえばAltschulら、Nucleic Acids Res. （1997） 25: 3389-3402に記載されるギャップドBLASTなど、当業者に既知である。配列解析は、MPSRCHプログラム（Oxford Molecular）において実行されるスミス-ウォーターマン相同性サーチアルゴリズムを使用して行うことができる。本発明の目的のためには、同一性の割合（％）を算出する好ましい方法は、以下の検索パラメータのアフィン・ギャプ・検索を使用するMPSRCHプログラム（Oxford Molecular）において実行されるスミス-ウォーターマン相同性サーチアルゴリズムによって決定される：ギャップ・オープン・ペナルティ、12；およびギャップ・エクステンション・ペナルティ、１。
【００９２】
本発明のもう一つの態様は、本明細書に記載されたとおりの本発明のポリヌクレオチドと少なくとも85%、少なくとも88%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも94%、少なくとも96%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有する単離されたポリヌクレオチドを提供する。一つの態様では、表1に示した配列と、少なくとも85%、少なくとも88%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも94%、少なくとも96%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有する単離されたポリヌクレオチドを提供する。その他の態様において、単離されたポリヌクレオチドは、加えて、配列番号：7の配列と85%、83%、80%、75%、70%未満の配列同一性を有する。
【００９３】
本発明の核酸は、cDNA、またはゲノムDNAの成分として単離されたもの（たとえば、患者単離体）、ならびにその断片、特に本明細書に開示された方法において有用である断片（たとえば、診断において、MHRV核酸のユニークな識別子などとして）であることもできる。本明細書において使用される「cDNA」という用語は、スプライスバリアントを含む、天然の成熟mRNA種に見出すことができる配列エレメントの配置を共有する全ての核酸を含むことを企図する。
【００９４】
本発明の核酸組成物は、MHRVポリペプチド、たとえばMHRV GAGポリペプチドの全てもしくは一部をコードすることができ、またはMHRVポリペプチドをコードする領域のフランキング配列であることもできる。二重鎖または単一鎖の断片は、従来法に従ってオリゴヌクレオチドを化学的に合成することによって、限定酵素消化によって、PCR増幅によってなどにより、DNA配列から得ることができる。本発明の単離されたポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド断片は、配列番号：7で示すポリヌクレオチド配列から選択される少なくとも約10、約15、約20、約35、約50、約100、約150〜約200、約250〜約300、または約350の隣接するntを含む。一般に、断片は、少なくとも15nt、通常は少なくとも18ntまたは25ntであり、少なくとも約50の隣接するntの長さ以上であると考えられる。特定の関心対象の核酸断片は、約304の隣接するntであり、MHRV GAG遺伝子のPCR産物に対応するポリヌクレオチドを含む（たとえば、配列番号：1を参照されたい）。
【００９５】
本核酸組成物は、MHRV mRNA、または生物学的試料に存在するであろうものから（たとえばヒト細胞抽出物）得られるmRNAなどから作製されるcDNAの検出のための1本鎖もしくは2本鎖のプローブまたはプライマーとして使用することができる。また、本発明のMHRVポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのさらなるコピーを作製するために、アンチセンスオリゴヌクレオチドを作製するために、および3本鎖形成オリゴヌクレオチドとして使用することができる。これらのおよびその他の使用を、以下にさらに詳細に記載する。
【００９６】
MHRVに特異的な核酸プローブは、本明細書に開示されたポリヌクレオチド配列を使用して作製することができる。プローブは、好ましくは配列番号：7の隣接する配列の少なくとも約12、15、16、18、20、22、24、または25ntの断片、またはMHRV GAGポリペプチドをコードするその他のポリヌクレオチド配列である。核酸プローブは、約200bp、150bp、100bp、75bp、50bp、60bp、40bp、30bp、25bp、2kb、1.5kb、1kb、0.5kb、0.25kb、0.1kb、または0.05kb未満の長さであることができる。プローブは、たとえば、化学合成、PCR増幅、限定酵素を使用するより長いポリヌクレオチドからの作製、または当該技術において周知のその他の方法によって作製することができる。
【００９７】
本発明のポリヌクレオチドは、特に診断アッセイ法においてプローブとして使用される場合、検出可能に標識することができる。検出可能標識の例は、放射標識、蛍光色素（たとえば、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、ローダミン、Texas Red、フィコエリトリン、アロフィコシアニン、6-カルボキシフルオレセイン（6-FAM）、2',7’-ジメトキシ-4',5’-ジクロロ-6-カルボキシフルオレセイン、6-カルボキシ-X-ローダミン（ROX）、6-カルボキシ-2',4',7',4,7-ヘキサクロロフルオレセイン（HEX）、5-カルボキシフルオレセイン（5-FAM）、またはN,N,N',N'-テトラメチル-6-カルボキシローダミン（TAMRA））、放射性標識（たとえば、32P、35S、および3H）などを含むが、これらに限定されない。検出可能な標識は、2段階の系（たとえば、ビオチン-アビジン、ハプテン-抗ハプテン抗体など）を含み得る。
【００９８】
また、本発明は、本明細書に記載されたポリヌクレオチドのいずれかを具備するアレイなどの固体基質を含む。ポリヌクレオチドは、当業者に既知の方法を使用してアレイに固定される。アレイは、1つまたは複数の異なるポリヌクレオチドを有していてもよい。
【００９９】
MHRVポリペプチド
本発明のポリペプチドは、開示されたMHRVポリヌクレオチド、ならびに遺伝コードの縮重によって開示されたポリヌクレオチドと同一ではないが、同じポリペプチドをコードする核酸によってコードされるものを含む。特に関心対象のものは、配列番号：8に提供されるようなMHRV GAGポリペプチド、およびたとえば配列番号：8の配列を有するが、保存的アミノ酸置換を有するポリペプチドのような、ポリペプチドの変異体である。
【０１００】
「MHRVポリペプチド」は、一般にMHRVウイルス粒子、特にMHRVウイルスの特異的な検出のための基礎となり得るポリペプチドから得ることができるポリペプチドを意味する。MHRVに特異的な特定の関心対象のMHRVポリペプチドの例は、MHRV GAGポリペプチド（長さが約112アミノ酸）、たとえば配列番号：8のポリペプチドおよびその断片である。特定の関心対象のMHRVポリペプチドは、MHRV GAGポリペプチドの5'部分のアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、たとえば、配列番号：8の隣接するアミノ酸残基1〜22のアミノ酸配列の少なくともN末端領域を有するポリペプチド、たとえば、配列番号：8のアミノ酸残基1〜22由来の少なくとも約2〜4個の隣接するアミノ酸残基、配列番号：8のアミノ酸残基1〜22由来の少なくとも約2〜5個の隣接するアミノ酸残基、配列番号：8のアミノ酸残基1〜22由来の少なくとも約4〜10個の隣接するアミノ酸残基、配列番号：8のアミノ酸残基1〜22由来の少なくとも約8〜15個の隣接するアミノ酸残基、配列番号：8のアミノ酸残基1〜22由来の少なくとも約12〜20個の隣接するアミノ酸残基、配列番号：8のアミノ酸残基1〜22由来の22個までの隣接するアミノ酸残基、ならびにこのような領域を含むポリペプチドである。
【０１０１】
一般に、本発明のMHRVポリペプチドは、これらの天然に存在する環境から分離される。ある態様において、本タンパク質は、対照と比較してタンパク質が富んだ組成物に存在する。このように、精製されたポリペプチドが提供され、この場合、「精製された」とは、一般にタンパク質が非特異的に発現したポリペプチドを実質的に含まない組成物に存在することを意味し、ここで、実質的に含まないとは、組成物の90%未満、通常は60%未満、およびより通常には50%未満が、非特異的に発現されたポリペプチドからなることを意味する。
【０１０２】
本発明のMHRVポリペプチドは、天然に存在するMHRVタンパク質の変異体を含み、このような変異体は、相同的または実質的に天然に存在するタンパク質と同じであり、本明細書に記載されたMHRVと同じかまたは異なる種の起源であることもできる（たとえば、詳述したポリペプチドを天然に発現するヒト、ネズミ、またはその他の一部の種、通常は哺乳類種）。一般に、上記パラメータを使用してBLAST2.0によって測定されるものとして、変異体ポリペプチドは、本発明の特異的に発現されたポリペプチドと、少なくとも約80%、通常は少なくとも約90%、およびより通常には少なくとも約98%の配列同一性を有する配列を有する。変異体ポリペプチドは、天然にまたは非天然にグリコシル化することができる、すなわち、ポリペプチドは、対応する天然に存在するタンパク質において見出されたグリコシル化パターンとは異なるグリコシル化パターンを有する。または、ポリペプチドは、配列番号：8の隣接する以下の数のいずれかのアミノ酸を含んでいてもよい：4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、および22のアミノ酸。
【０１０３】
本発明のMHRVポリペプチドはさらに、MHRVポリペプチドのアミノ酸配列またはその断片を有する断片および融合タンパク質を含む。特定の関心対象のMHRVポリペプチド断片は、MHRVに特異的なものである。特定の関心対象のポリペプチド断片は、MHRV GAGポリペプチドの5'部分のアミノ酸配列を有するポリペプチド、たとえば配列番号：8の隣接するアミノ酸残基1〜22のアミノ酸配列の少なくともN末端領域を有するポリペプチド、たとえば配列番号：8のアミノ酸残基1〜22由来の少なくとも約1〜4個の隣接するアミノ酸残基、配列番号：8のアミノ酸残基1〜22由来の少なくとも約2〜5個の隣接するアミノ酸残基、配列番号：8のアミノ酸残基1〜22由来の少なくとも約4〜10個の隣接するアミノ酸残基、配列番号：8のアミノ酸残基1〜22由来の少なくとも約8〜15個の隣接するアミノ酸残基、配列番号：8のアミノ酸残基1〜22由来の少なくとも約12〜20個の隣接するアミノ酸残基、配列番号：8のアミノ酸残基1〜22由来の22個までの隣接するアミノ酸残基を有するポリペプチドである。
【０１０４】
突然変異体、断片、および融合物を含むポリペプチドの変異体のような変異体も、本発明の範囲内である。突然変異体は、アミノ酸の置換、付加、または欠失を含むことができる。アミノ酸の置換は、保存的アミノ酸置換またはグリコシル化部位、リン酸化部位、もしくはアセチル化部位の変化、または機能的に必要ではない1つまたは複数のシステイン残基の置換もしくは欠失によって誤った折り畳みを最小にするためなどの、非必須アミノ酸を除去するための置換を含むことができる。保存的アミノ酸置換は、総電荷、疎水性／親水性、および／または置換したアミノ酸の立体的な大きさを保存するものである。
【０１０５】
また、MHRVポリペプチド断片、特に抗原性に有効なポリペプチド断片、ならびにMHRVポリペプチドに特異的な抗体が結合し得るエピトープを定義する断片は、本発明に包含される。ポリペプチドは、単独またはキャリアータンパク質と組み合わせて、ポリペプチドを特異的に結合する抗体の産生を誘発するために有効である場合、「抗原性に有効な」ポリペプチドである。本明細書において使用される、「エピトープ」という用語は、ポリペプチドの抗原決定基をいう。エピトープは、エピトープに特有な空間コンホメーションの約3つ以上のアミノ酸を含み得る。通常、エピトープは、少なくとも5つのこのようなアミノ酸をからなり、より通常には、少なくとも8〜10個のこのようなアミノ酸からなる。アミノ酸の空間コンホメーションを決定する方法は、当技術分野において既知であり、たとえばX線結晶学および2次元核磁気共鳴分析法を含む。
【０１０６】
「ポリペプチド」は、ポリペプチド内に含まれる特異的エピトープの抗体認識により、ポリペプチドが抗体に結合する場合、抗体との「抗原反応性」がある。抗原反応性は、抗体結合によって、より詳細には抗体結合速度によって、および／またはエピトープに対する抗体のそのエピトープを含む既知のポリペプチドを競合物として使用する競合結合によって決定されていてもよい。ポリペプチドが抗体と抗原反応性かどうかを決定するための技術は、当技術分野において既知である。
【０１０７】
関心対象のポリペプチド断片は、典型的には、少なくとも約10aa、少なくとも約15aa、通常は、少なくとも約20aa〜22aa、または少なくとも約50aaの長さであると考えられ、長さが100aa以上であることもできる。
【０１０８】
特定の関心対象のポリペプチド断片は、少なくともMHRV GAGポリペプチドのN末端部分を有するものであり、たとえばポリペプチドは、少なくともMHRV GAGポリペプチドのアミノ酸残基1〜22によって定義されるポリペプチドの一部分を有する（たとえば、配列番号：8のアミノ酸残基1〜22）。以下の実施例においてさらに詳細に議論したとおり、MHRV GAGポリペプチドのこのN末端部分は、その他のレトロウイルスと比較してMHRVに特有であり、したがって、試料におけるMHRVの存在の特異的なマーカーとして役立ち得る。
【０１０９】
抗MHRV抗体
さらにもう一つの態様において、本発明は、MHRVポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供し、このポリペプチドは、MHRVウイルス粒子と結合しているか、またはこれから分離されていてもよい。抗体は、単離された無処理のMHRVウイルス粒子、ウイルスの抗原性部分、単離されたMHRVポリペプチド、または単離されたMHRVポリペプチドの抗原性部分を使用して作製することができる。このような抗体は、本明細書において一般に抗MHRV抗体と称される。
【０１１０】
本明細書において使用される、「抗体」という用語は、ポリペプチドまたは少なくとも1つの抗体結合部位を含むポリペプチドの群をいう。「抗体結合部位」または「結合ドメイン」は、抗体分子の可変ドメインの折りたたみによって形成され、抗原のエピトープの特徴に補足的な内部表面空間および電荷分布を有する三次元結合空間を形成して、これが抗原との免疫反応を可能にする。抗体結合部位は、抗原結合に寄与する高頻度可変性のループを形成する重鎖および／または軽鎖ドメイン（それぞれVHおよびVL）から形成されていてもよい。「抗体」という用語は、たとえば、脊椎動物抗体、ハイブリッド抗体、キメラ抗体、変質された抗体、一価抗体、Fabタンパク質、および単一ドメイン抗体を含む。
【０１１１】
タンパク質の免疫原性の測定およびウイルスまたはタンパク質に対する抗体の作製は、当技術分野において周知の技術である（たとえば、上記HarlowおよびLane、1988を参照されたい）。「免疫原性部分」または「免疫原性に有効な部分」は、動物に注射されたときに、免疫応答を引き起こして、免疫原性部分に結合する抗体を生成するのに十分な大きさおよび／またはコンホメーションのウイルスまたはウイルスのポリペプチドの部分を意味する。
【０１１２】
選択した抗原を特異的に結合する抗体を産生するための方法は、当技術分野において周知である。抗体を産生するための免疫原は、MHRVポリペプチドをアジュバントと混合することによって、および／またはより大きな免疫原性タンパク質との融合タンパク質を作製することによって調製することができる。また、MHRVポリペプチドを、キーホールリンペットヘモシニアンなどの、その他のより大きな免疫原性のタンパク質に共有結合させることもできる。抗体を作製するために、免疫原は、典型的にはウサギ、ヒツジ、およびマウスなどの実験動物に対して、皮内に、皮下に、または筋肉内に投与される。モノクローナル抗体は、脾臓細胞および融合骨髄腫細胞を単離してハイブリドーマを形成することによって作製することができる。
【０１１３】
選択されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに特異的なポリクローナルおよびモノクローナル抗体の調製は、当技術分野において既知の標準的な方法を使用してなされる。典型的には、エピトープを形成するために、少なくとも6、8、10、または12個の隣接するアミノ酸を必要とする。隣接しないアミノ酸を含むエピトープは、より長いポリペプチド、たとえば少なくとも15、25、または50個のアミノ酸を必要とすると考えられる。MHRVポリペプチドに特異的に結合する抗体は、一般には、ウエスタンブロットまたはその他の免疫化学的なアッセイ法において使用されるときに、非MHRVタンパク質で提供される検出シグナルよりも、少なくとも5、10、または20倍高い検出シグナルを提供するものである。好ましくは、本発明のポリペプチドを特異的に結合する抗体は、免疫化学的なアッセイ法において検出可能なレベルでその他のタンパク質に結合せず、特定のポリペプチドを溶液から免疫沈降させることができる。
【０１１４】
上述したとおり、「抗体」は、天然に存在する抗体、単一ドメイン抗体、ハイブリッド抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、抗原結合特異性を保持する抗体断片、ヒト抗体、ヒト化された抗体などを含む（しかし、必ずしもこれらに限定されない）種々の抗体を包含する。MHRVポリペプチドに、特にMHRV GAGポリペプチドに特異的な天然に存在する抗体は、当技術分野において周知の方法に従って得ることができる。たとえば、ヒト個体群における本発明のポリペプチドに対する血清抗体を、当技術分野において周知の方法によって、たとえばMHRVウイルス粒子、または対応する選択したポリペプチドもしくは融合タンパク質が結合されたカラム上に抗血清を通すことによって精製することができる。次いで、結合した抗体は、たとえば高塩濃度の緩衝液を使用してカラムから溶出させることができる。
【０１１５】
また、本発明は、単一ドメイン抗体、ハイブリッド抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、および抗原結合特異性を保持する抗体断片を包含する。本明細書において使用される、「単一ドメイン抗体」（dAb）という用語は、指定された抗原と免疫学的に反応するVHドメインを含む抗体である。dAbは、VLドメインを含まないが、抗体に存在することが知られているその他の抗原結合ドメイン、たとえばカッパドメインおよびラムダドメインを含んでいてもよい。dAbsを調製するための方法は、当業者に既知である。たとえばWardら（1989）を参照されたい。また、抗体は、VHおよびVLドメイン、ならびにその他の既知の抗原結合ドメインを含んでいてもよい。これらのタイプの抗体およびこれらを調製するための方法の例は、当技術分野において既知であり（たとえば、米国特許第4,816,467号を参照されたい、これは、参照として本明細書に組み入れられる）、以下を含む。
【０１１６】
「脊椎動物抗体」は、通常「Y」配位において凝集された軽鎖および重鎖であって、鎖間の共有結合性結合を有してもよく、または有していなくてもよい、四量体またはその凝集体である抗体をいう。脊椎動物抗体において、特定の抗体の全ての鎖のアミノ酸配列は、インサイチューで、またはインビトロで（たとえば、ハイブリドーマにおいて）その抗体を産生するリンパ球によって産生される1つの抗体に見出される鎖と相同である。脊椎動物抗体は、典型的には、天然の抗体、たとえば精製したポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含む。これらの抗体を調製するための方法の例は、以下に記載してある。
【０１１７】
「ハイブリッド抗体」は、重鎖および軽鎖の一方の対は第1の抗体のものと相同であるが、重鎖および軽鎖の他方の対は異なる第2の抗体のものと相同である抗体である。典型的には、これらの2対のそれぞれは、特に、異なる抗原上の異なるエピトープに結合する。この結果、「2価」の性質、すなわち、2つの抗原に同時に結合する能力を生じる。また、このようなハイブリッドは、後述のようにキメラ鎖を使用して形成されていてもよい。
【０１１８】
「キメラ抗体」は、重鎖および／または軽鎖が融合されたタンパク質である抗体である。典型的には、鎖の不変領域は、1つの特定の種および／または網に由来し、可変ドメインは、異なる種および／または網に由来する。また、重鎖もしくは軽鎖のいずれかまたは両方が異なる供与源の抗体の配列を模倣する配列の組み合わせからなるあらゆる抗体が含まれ、これらの供与源は、起源の異なる綱かまたは異なる種であり、融合点は、可変／定常の境界であるか否かのいずれかである。したがって、抗体は、定常領域または可変領域のいずれの既知の抗体配列も模倣せずに産生することができ、したがって、特定の抗原に対してより高い特異的な親和性を有する可変領域を有するか、または補体固定の増強を誘発することができる定常領域を有するか、または特定の定常領域が備えている性質にその他の改良をなされた抗体を提供する。
【０１１９】
また、本発明は、「変質された抗体」を包含し、これは脊椎動物抗体の天然に存在するアミノ酸配列が変化された抗体をいう。組換えDNA技術を利用して、抗体を再設計して所望の特徴を得ることができる。起こりうるバリエーションは、多くの、1つまたは複数のアミノ酸の変化から、領域、たとえば定常領域の完全な再設計の範囲に及ぶ。一般に、所望の細胞プロセスの特徴を達成するための定常領域の変化、たとえば、補体結合、膜との相互作用、およびその他のエフェクター機能における変化である。可変領域における変化は、抗原結合の特徴を変更するためになされていてもよい。また、抗体は、特異的な細胞または組織部位に、分子または物質の特異的なデリバリーを援助するように設計されていてもよい。所望の変化は、分子生物学における既知の技術、たとえば、組換え技術、部位特異的突然変異誘発、およびその他の技術によってなされていてもよい。
【０１２０】
さらに抗体の例は、「一価の抗体」含み、これは、第2の重鎖のFc（すなわち、定常）領域に結合した重鎖／軽鎖二量体で構成される凝集物である。この種の抗体は、抗原修飾を逃れる。たとえば、Glennieら（1982）を参照されたい。
【０１２１】
また、抗体の「Fab」断片も抗体の定義の範囲内に含まれる。「Fab」領域は、重鎖および軽鎖の分岐部分を含む配列とおおよそ同等か、または類似する重鎖および軽鎖の部分を指し、これは、特定の抗原に対し免疫学的に結合するが、エフェクターFc部を欠いていることが示されている。「Fab」は、1つの重鎖および1つの軽鎖（一般にFab'として知られている）、ならびに2H鎖および2L鎖を含む四量体の凝集物を含み（F（ab）.sub.2ともいう）、指定された抗原または抗原ファミリーと選択的に反応することができる。「Fab」抗体は、上記したもの、すなわち「脊椎動物Fab」、「ハイブリッドFab」、「キメラFab」、および「変質したFab」に類似したサブセットに分けてもよい。抗体の「Fab」断片を調製する方法は、当技術分野において既知であり、たとえば、タンパク質分解、組換え技術による合成を含む。
【０１２２】
試料中のMHRVを検出するためのアッセイ法
また、本発明は、MHRV配列を含むことが疑われる生物学的試料をスクリーニングする方法を想定する。このようなスクリーニング法は、一般にMHRV核酸の検出、MHRVポリペプチドの検出、または抗MHRV抗体の検出に基づくアッセイ法を含む。
【０１２３】
本明細書に記載されたアッセイ法が、インビトロまたはインビボにおけるアッセイ法として行うこと、または修飾することができることは、本明細書を読むことにより容易に理解できる考えられ、細胞を含まないもの（たとえば、生物学的試料の核酸から単離され、もしくは産生されたポリヌクレオチドを使用するインビトロ結合アッセイ法）または細胞に基づいたもの（たとえば、MHRVに感染したことが疑われる全細胞のスクリーニング）のいずれであってもよい。一般に、全てのアッセイ法は、たとえば背景以上の検出可能レベルでMHRVプローブ標的の検出を提供するために、MHRV特異的なプローブ（たとえば、核酸プローブ、抗体プローブ、ポリペプチドプローブ）をMHRVプローブ標的に特異的に結合させるために十分な条件下、および期間で行われる。アッセイ法は、種々の陽性対象および／または陰性対照を含むことができ、その性質は、本明細書を読むことにより、当業者には容易に理解できると考えられる。
【０１２４】
検出のためのアッセイ法の種々の側面は、以下により詳細に記載してある。
【０１２５】
検出アッセイ法のための生物学的試料
任意の適切な試料は、MHRVウイルス粒子、MHRVに感染した細胞、MHRV核酸、MHRVポリペプチド、抗MHRV抗体などを含むことが疑われる。スクリーニングのための関心対象の試料の例は、血液、血液派生物、血清、血漿、血小板、哺乳類細胞（関心対象のヒト細胞である、特に哺乳類リンパ球、より詳細には哺乳類マクロファージ）、組織（たとえば、もう１人の被検者に対する移植またはその他の移動の前のもの）、などの生物学的試料を含むが、必ずしもこれらに限定されない。スクリーニングのための関心対象のその他の試料の例は、非生物学的試料、特に医療機器上のまたはそれらから得られる試料を含み、たとえば手術器具は、血液およびその他の組織とこれらが接触するために、ウイルスをうまく死滅または除去せずに再利用した場合、容易にウイルスを伝播し得る。
【０１２６】
当業者であれば容易に認識すると考えられるが、選択される特異的なアッセイ法は、検出される試料および実体の供与源（たとえば、ウイルス粒子、核酸、ポリペプチド、抗体）によって変化すると考えられる。種々のタイプのアッセイ法の例は、以下で提供される。特別な手段または検出機器を必要とせずに、診療所において、または現場において容易に行うことができるアッセイ法は、特に関心対象のものである。
【０１２７】
生物学的試料中のMHRVマーカーの検出は、試料を得た被検者がMHRVにさらされたことを示し、したがって、MHRV感染を有し得る。また、被検者におけるMHRVの検出は、被検者が、MHRVに関連したリンパ増殖性疾患、たとえばリンパ腫などのMHRVに関連した疾患を有するか、または発症の危険性があることを示し得る。
【０１２８】
MHRVのためのスクリーニングに適していると考えられ、かつMHRVに関連していると考えられるリンパ増殖性疾患の例は以下のものを含むが、必ずしもこれらに限定されない：1）プラズマ細胞障害（たとえば、MGUS、プラズマ細胞腫（骨および延髄外のプラズマ細胞腫を含む）、多発性骨髄腫、およびアミロイドーシス）；2）ホジキン病；3）無痛性のリンパ腫／白血病（濾胞中心細胞リンパ腫および濾胞性（濾胞性リンパ腫）を含む）（たとえば、グレードI濾胞性小非正円形細胞；グレードII濾胞性混合；および散在性小非正円形細胞のリンパ腫）、散在性小リンパ性／慢性リンパ性白血病；リンパ球プラズマ細胞腫／ワルデンストーム（Waldenstrom’s）、周縁帯リンパ腫（たとえば、MALT（結節外）、単球様B細胞リンパ腫（結節）、および絨毛リンパ球での脾臓リンパ腫）、有毛細胞白血病、および菌状息肉腫／セザリー症候群；4）活動的（aggressive）リンパ腫／白血病（散在性大細胞リンパ腫（散在性混合細胞、散在性大細胞、免疫芽細胞を含む）を含む）、バーキットリンパ腫／散在性小正円形細胞リンパ腫、リンパ芽球リンパ腫、CNSリンパ腫、成人T細胞白血病／リンパ腫、外套細胞リンパ腫、移植後リンパ球増殖障害、AIDSに関連したリンパ腫（たとえば、真性組織球リンパ腫、原発性浸出液リンパ腫）。リンパ球増殖の分類法は、国立癌研究所によって提供されるREAL分類法のPDQの改変に基づいている。
【０１２９】
被検者におけるMHRVの検出はさらに、被検者がMHRVに関連した疾患、特にMHRVに関連した慢性疾患を有するか、または発症の危険性があることを示し得る。このような疾患の例は、奇形癌腫、多発性硬化症、自己免疫性リウマチ病、および精神分裂症を含み得るが、必ずしもこれらに限定されない。
【０１３０】
生物学的試料におけるMHRVの検出はさらに、生物学的試料を得た生物学的物質を別の被検者へ移動する目的では、このような移動はレシピエントの感染を生じてしまうため、使用されるべきではないことを示す。
【０１３１】
本発明に従った核酸およびポリペプチドMHRVマーカーの検出のための方法の例について、以下に記載する。
【０１３２】
MHRV核酸を検出するための方法
特定のMHRV核酸（たとえば、RNAまたはDNA）を検出するための当技術分野において既知のいずれの適切な定性的または定量的な方法を使用することができる。MHRV核酸は、たとえば、組織切片におけるインサイチューハイブリダイゼーションで、ハイブリダイズする核酸間の単一塩基対相違を検出する方法（たとえば、米国特許第5,846,717号に記載されたInvader（登録商標）技術を使用する）を使用して、逆転写酵素PCRによって、またはポリA+ mRNAを含むノーザンブロットにおいて、および当技術分野において周知のその他の方法で検出することができる。血液または血液由来の試料におけるMHRVポリヌクレオチドの検出のためには、単一塩基対のミスマッチを検出することができる方法を使用することが好ましい。
【０１３３】
MHRV核酸を、特定の関心対象であるMHRV GAGポリペプチドをコードする核酸と共に、基礎として使用して、組換えポリヌクレオチドからの切除によって、または合成的に、核酸プローブ（たとえば、少なくとも約8ヌクレオチド以上のオリゴマーを含む）を調製することができ、このプローブは、MHRV核酸とハイブリダイズし、したがって、試料中のMHRVウイルスの検出、および感染個体の同定、ならびにウイルスゲノムのさらなる特徴付けにおいて有用である。MHRVポリヌクレオチド（天然のまたは由来するもの）のためのプローブは、ハイブリダイゼーションによって特有のウイルス配列の検出が可能な長さまたは配列を有する。たとえば、約6〜8ヌクレオチドが有用であるが、より長い配列、たとえば約10〜12ヌクレオチド、または約20ヌクレオチド以上の配列も好ましいと考えられる。好ましくは、これらの配列は、MHRVウイルス単離体間で異種性のない領域に由来する。
【０１３４】
核酸プローブは、自動化オリゴヌクレオチド合成法を含むルーチン方法を使用して調製することができる。たとえば試料に存在する可能性のあるその他のウイルスからMHRVを識別することができるMHRVゲノムの部分（たとえば、HERV-K109などの内在性のレトロウイルスからMHRVウイルスを識別するため）のような、MHRVゲノムの任意の特有な部分の相補物が満足のできるものである。プローブとしての用途のためには完全な相補性が望ましいが、断片の長さが増加するにつれてそれは不要である。
【０１３５】
診断としてこのようなプローブを使用するためには、必要に応じて血液または血清などの解析される生物学的試料を処理し、これに含まれる核酸を抽出してもよい。試料から生じる核酸は、ゲル電気泳動またはその他のサイズ分離技術に供されていてもよく；または、核酸試料は、サイズ分離をせずにドットブロットされてもよい。プローブは、通常、検出可能な標識で標識する。プローブを標識するための適切な標識および方法は当技術分野において既知であり、たとえばニックトランスレーションまたはキナーゼ処理（kinasing）することによって組み入れられる放射性標識、ビオチン、蛍光プローブ、および化学発光プローブを含む。次いで、適切なストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下において、試料から抽出した核酸を標識されたプローブで処理する。
【０１３６】
プローブは、MHRVゲノムまたはその一部分に（たとえば、MHRV GAGポリペプチドをコードする全てまたは一部の配列に）完全に相補的に作製することができる。したがって、偽陽性を予防または少なくとも最小にするために、通常、高ストリンジェンシーの条件が望ましい。しかし、高ストリンジェンシーの条件は、プローブがMHRVウイルス単離体間で異種性がないウイルスゲノムの領域に相補的な場合にのみ使用するべきである。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーションの間、および洗浄手順の間の温度、イオン強度、時間の長さ、およびホルムアミドの濃度を含む多くの因子によって決定される。これらの因子は、たとえば、Sambrookら、（1989）, 「Molecular Cloning; A Laboratory Manual」, Second  Edition （Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.）に概説されている。
【０１３７】
通常、MHRV配列は感染個体から得られた生物学的試料（たとえば、血液、細胞、および同様のもの）に比較的低いレベルで、たとえば106細胞につき約102〜104 MHRV配列で存在するであろうことが予想される。このレベルは、ハイブリダイゼーションアッセイ法において使用される増幅技術を必要としうる。このような技術は、当技術分野において既知である。
【０１３８】
たとえば、Enzo Biochemical Corporationの「Bio-Bridge」系では、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼを使用して、修飾されていない3'-ポリ-dT尾部をDNAプローブに付加する。ポリdT-尾部を付加されたプローブを標的ヌクレオチド配列に、次いでビオチン修飾されたポリAにハイブリダイズさせる。PCT国際公開公報第84／03520号および欧州特許出願第124221号では、DNAハイブリダイゼーションアッセイ法が記載されており、そこでは：（1）検体は、酵素標識したオリゴヌクレオチドに相補的な一本鎖DNAプローブにアニールされ；および（2）生じる尾部の付加された二体鎖は、酵素標識したオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる。欧州特許出願第204510号では、DNAハイブリダイゼーションアッセイ法が記載されており、そこでは検体DNAはポリ-dT尾部などの尾部、ポリA配列などのプローブの尾部にハイブリダイズする配列を有する増幅因子鎖を有し、複数の標識された鎖に結合することができるプローブと接触される。
【０１３９】
MHRV配列を検出するために、非PCRに基づいた配列特異的なDNA増幅技術を本発明に使用することもできる。このような技術の例は、Invaderアッセイ法を含むが、必ずしもこれらに限定されず、たとえばKwiatkowskiら、Mol Diagn. 1999 Dec; 4 （4）: 353-64.を参照されたい。また、米国特許第5,846,717号を参照されたい。
【０１４０】
特に望ましい技術は、最初に血清中の標的MHRV配列の約10,000倍、たとえば約10配列/mLに増幅することを含んでもよい。これは、たとえばSaikiら、（1986）によって、Mullis、米国特許第4,683,195号によって、およびMullisら米国特許第4,683,202号によって記載されたポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）技術によって達成されうる。その他の増幅方法は、当技術分野において周知である。
【０１４１】
プローブ、あるいは試料からの核酸は、このようなアッセイ法のための溶液中に提供されていてもよく、または支持体（たとえば、固体もしくは半固体支持体）に付着されていてもよい。使用することができる支持体の例は、ニトロセルロース（たとえば、膜またはマイクロタイターウェル形態において）、ポリ塩化ビニル（たとえば、シートまたはマイクロタイターウェルにおいて）、ポリスチレンラテックス（たとえば、ビーズまたはマイクロタイタープレートにおいて）、ポリフッ化ビニリデン、ジアゾ化された紙、ナイロン膜、活性ビーズ、およびProteinAビーズである。
【０１４２】
一つの態様において、プローブ（または試料核酸）は、検出のためのアレイ上に提供される。アレイは、たとえば、二次元のマトリックスまたはアレイにおいて基質（たとえば、ガラス、ニトロセルロースなど）上へポリヌクレオチドプローブをスポッティングすることによって作製することができる。プローブは、共有結合によって、または疎水的相互作用などの非特異的相互作用によって、のいずれかで基質に結合することができる。ポリヌクレオチド試料は、検出可能に標識し（たとえば、放射性または蛍光性の標識を使用して）、次いで、プローブにハイブリダイズさせることができる。二重鎖ポリヌクレオチドは、プローブポリヌクレオチドに結合された標識試料ポリヌクレオチドを含み、一旦試料の未結合部分を洗い流して検出することができる。アレイを構築するための技術およびこれらのアレイを使用する方法は、欧州特許第799897号；国際公開公報第97/29212号；国際公開公報第97/27317号；欧州特許第785280号；国際公開公報第97/02357号；米国特許第5,593,839号；米国特許第5,578,832号；欧州特許第728520号；米国特許第5,599,695号；欧州特許第721016号；米国特許第5,556,752号；国際公開公報第95/22058号；および米国特許第5,631,734号に記載されている。アレイは、たとえば単一の試料で2つ以上の核酸標的領域の存在を解析する場合に、それぞれの標的領域に対するプローブ、ならびに対照（陽性および陰性の両方）を単一のアレイにおいて提供することができるので、特に有用である。したがって、アレイにより、迅速かつ便利な解析が容易になる。
【０１４３】
MHRVポリペプチドを検出する方法
一つの態様において、本発明は、試料におけるMHRVポリペプチドの検出を行い、これが試料におけるMHRV粒子の存在を示し得ることによって、試料におけるMHRVを検出するための方法を特徴とする。試料は、生物学的試料、またはたとえば医療機器から得た試料であることもできる。生物学的試料は、特定の関心対象のものである。配列番号：8によって例示されるようなMHRV GAGポリペプチドの検出は、特に関心対象のものである。MHRVのポリペプチドに基づく検出は、受容体（リガンド-結合受容体断片を含む）または標的MHRVポリペプチドに特異的に結合する抗体（たとえば、抗MHRV GAGポリペプチド抗体）（抗原-結合抗体断片を含む）を使用して達成することができる。
【０１４４】
MHRVのポリペプチドに基づいた検出は、様々な生物学的試料、たとえば血液または血液派生物（たとえば、血清、血漿など）、細胞、組織などを使用して達成することができる。抗MHRV抗体は、感染した宿主細胞の表面、MHRVウイルス粒子の表面、または（たとえば、ウイルス粒子もしくは感染した宿主細胞の溶解によって試料中に存在するような、宿主細胞またはウイルス粒子のいずれとも結合していない）遊離型のポリペプチドとしてのMHRVポリペプチドを検出するように作製することができる。
【０１４５】
一つの態様において、本発明は、生物学的試料、たとえば細胞または体液試料におけるMHRVポリペプチド（ウイルス粒子に存在するMHRVポリペプチドを含む）の存在を決定するための免疫アッセイ法であって、抗体（通常、モノクローナル抗体であるが、必ずしもこれに限定されない）と試料を接触させる工程；試料における抗体とMHRVウイルス粒子および／またはMHRVポリペプチドとの間の免疫複合体の形成を可能にする時間および条件下で、試料および抗体を反応させる工程；および免疫複合体を検出することとによる免疫アッセイ法を特徴とする。免疫複合体の存在は、試料におけるMHRVポリペプチドの存在を示す。
【０１４６】
免疫アッセイ法の設計は、多くのバリエーションを受けやすく、多くの形式が当業者に既知である。免疫アッセイ法は、MHRVに由来する少なくとも1つのウイルスのエピトープを利用する。一つの態様において、免疫アッセイ法は、MHRVに由来するウイルスのエピトープの組み合わせを使用する。これらのエピトープは、同じウイルスのポリペプチドから、または異なるウイルスのポリペプチドから由来してもよく、組換えまたは天然のポリペプチドを別々に、または同じ組換えポリペプチド中に一緒であってもよい。免疫アッセイ法は、たとえばウイルスのエピトープに向けられたモノクローナル抗体、1つのウイルス抗原のエピトープに向けられたモノクローナル抗体の組み合わせ、異なるウイルスの抗原のエピトープに向けられたモノクローナル抗体、同じウイルスの抗原に向けられたポリクローナル抗体、または異なるウイルスの抗原に向けられたポリクローナル抗体を使用してもよい。
【０１４７】
プロトコルは、たとえば競合、または直接反応、またはサンドイッチ型アッセイ法に基づいてもよい。また、プロトコルは、たとえば固体支持体を使用してもよく、または免疫沈降によるものであってもよい。大部分のアッセイ法は、標識された抗体またはポリペプチドの使用を含み；標識は、たとえば、酵素、蛍光性、化学発光、放射性、または染色分子であってもよい。プローブからのシグナルを増幅するアッセイ法も、既知であり、これらの例は、ビオチンおよびアビジンを利用するアッセイ法、ならびにELISAアッセイ法などの酵素結合および媒介免疫アッセイ法である。
【０１４８】
免疫アッセイは、異種または同種の形式であってもよく、標準的もしくは競争的タイプであっても良いが、これに限定されない。異種性の形式では、インキュベーション後におけるMHRVポリペプチドからの試料の分離を容易にするために、典型的には抗MHRV抗体を固体支持体に結合させる。これを含む固体支持体は、典型的には、結合した抗体の検出前に、抗体-抗原複合体形成を可能にするために十分な時間（たとえば、約10分）の反応後に洗浄する。標準的および競争的な形式はいずれも、当技術分野において既知である。
【０１４９】
同種の形式では、溶液中で抗MHRV抗体と試験試料をインキュベートする。たとえば、形成されたあらゆる抗原-抗体複合体を沈殿させると考えられる条件下でなされる。これらのアッセイ法のための標準的および競争的な形式は、当技術分野において既知である。
【０１５０】
標準的な形式では、MHRVポリペプチド抗体複合体のレベルを直接モニターする。これは、たとえば抗MHRV抗体のエピトープを認識する、標識された抗異種性固体（たとえば、抗ヒト）抗体が複合体形成によって結合するかどうかを決定することによって達成されてもよい。競合的形式において、試料中のMHRVポリペプチドの量は、複合体中の標識されたMHRVポリペプチド（またはその他の競合するリガンド）の既知の量の結合に対する競争的効果をモニターすることによって推測される。結合または複合体形成の量は、定性的にまたは定量的に決定することができる。
【０１５１】
MHRVポリペプチドおよび抗MHRV抗体を含む形成された複合体は、形式に依存して、既知の多くの技術のいずれかによって検出される。たとえば、複合体中の標識のないMHRV抗体は、標識（たとえば、酵素標識）と複合体を形成した抗異種性固体Igの複合物を使用して検出されてもよい。
【０１５２】
MHRVポリペプチドを検出するための免疫アッセイ法における抗体は、支持体（たとえば、固体または半固体）上で提供されていてもよく；または、試料中のポリペプチドを支持体上に固定することもできる。使用することができる支持体の例は、ニトロセルロース（たとえば、膜またはマイクロタイターウェル形態において）、ポリ塩化ビニル（たとえば、シートまたはマイクロタイターウェルにおいて）、ポリスチレンラテックス（たとえば、ビーズまたはマイクロタイタープレートにおいて）、ポリフッ化ビニリデン、ジアゾ化された紙、ナイロン膜、活性ビーズ、およびProteinAビーズである。ビーズに基づく支持体は、一般にアッセイ法における抗体の固定化に有用である。
【０１５３】
一つの態様において、生物学的試料は、細胞（たとえば、総細胞）を含み、検出は、試料を、標識された抗体と反応させることによって、従来法に従って行われる。一般に、本発明のMHRVポリペプチドに特異的に結合する抗体を試料に添加して、エピトープに結合させるために十分な期間（通常、少なくとも約10分）インキュベートする。抗体は、直接検出のために検出可能に標識することができ（たとえば、放射性同位元素、酵素、蛍光剤、化学発光などを使用して）、または2段階抗体もしくは結合を検出するための試薬と組み合わせて（たとえば、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合アビジンとビオチン、蛍光性化合物、たとえばフルオレセイン、ローダミン、テキサスレッドなどに結合した二次抗体）使用することができる。抗体結合の不存在または存在は、解離細胞のフローサイトメトリー、顕微鏡観察、放射線写真法、およびシンチレーション計数を含む種々の方法によって決定することができるが、これらに限定されない。特異に発現されたポリペプチドのレベルまたは量の定性的もしくは定量的検出は、任意の適切な代替方法、たとえばELISA法、ウエスタンブロット法、免疫沈降法、放射線免疫アッセイ法などを使用することもできる。
【０１５４】
このアッセイ法のもう一つの態様において、免疫複合体は、抗MHRV抗体を、試料および抗体が特異的に結合することが既知である競合抗原、たとえば検出可能に標識されたMHRV抗原、または単離されたウイルスタンパク質などの固定された競合抗原と反応させることによる競合的免疫アッセイ法によって検出することができる。競合抗原は、標識または固定することができる。
【０１５５】
または、免疫アッセイ法は、たとえばMHRVウイルス粒子または1次モノクローナル抗体のいずれかにも結合し、2つの抗体のうちの1つは固定されており、他方は標準的な技術を使用して標識されている、モノクローナル抗体などの二次抗体を使用するサンドイッチ免疫アッセイ法である。サンドイッチ免疫アッセイ法の手順において、MHRVウイルス粒子を結合する抗体は、不溶解性の物質に付着された捕獲抗体であることができ、および第2のMHRVウイルス粒子を結合する抗体は、検出器または標識抗体であり得る。
【０１５６】
抗MHRV抗体を検出する方法
もう一つの側面において、宿主におけるMHRVの存在は、抗MHRV抗体について、宿主由来の適切な生物学的試料をアッセイすることによって検出可能であってもよい。特に関心が持たれるのは、抗MHRV GAGポリペプチド抗体の検出の場合である。生物学的試料における抗MHRV抗体の検出のための種々の方法は、当技術分野において周知である。
【０１５７】
抗MHRV抗体は、たとえば、MHRV感染を有するかまたは疑われ（たとえば、MHRV関連リンパ腫を有することが疑われる）、この生物学的試料がMHRVに特異的に結合する抗体を含むことが疑われる患者からの生物学的試料を得ることによって検出することができる。患者の生物学的試料を、単離されたMHRV粒子と、またはMHRV GAGポリペプチドもしくはその抗原性の断片と接触させる。抗体-ウイルス粒子または抗体-ポリペプチド複合体の形成を標準的な技術によってモニターする（たとえば、Harlow および Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照されたい）。
【０１５８】
典型的には、抗MHRV抗体に対する免疫アッセイ法は、生物学的試料などの、抗体を含むことが疑われる試験試料を選択して調製し、次いでこれを抗原-抗体複合体の形成を可能にする条件下で、抗原性の（たとえば、エピトープ含有）MHRVポリペプチドとインキュベートし、このような複合体の形成を検出する工程を含む。適切なインキュベーション条件は、当技術分野において周知である。
【０１５９】
非MHRV粒子または非MHRVポリペプチドと交差反応する試験試料中の抗体は、望ましい場合は、標準的な対照スクリーニング工程を使用して試験試料から減少させることができる。抗MHRV抗体を検出する方法における変更は、MHRVウイルス粒子および／またはMHRVポリペプチドの検出のために上記したものと同様の、ならびに本明細書を読むことにより当業者には直ちに分かると考えられるその他の変更である。
【０１６０】
抗MHRVポリペプチド抗体の検出のための免疫アッセイ法は、支持体（たとえば、固体または半固体）上のMHRVポリペプチドを使用して行うことができ；または、試料中の抗体は、MHRVポリペプチドと接触させるための支持体に固定することもできる。使用することができる支持体の例は、ニトロセルロース（たとえば、膜またはマイクロタイターウェル形態において）、ポリ塩化ビニル（たとえば、シートまたはマイクロタイターウェルにおいて）、ポリスチレンラテックス（たとえば、ビーズまたはマイクロタイタープレートにおいて）、ポリフッ化ビニリデン、ジアゾ化された紙、ナイロン膜、活性ビーズ、およびProteinAビーズである。ビーズに基づく支持体は、本発明のこの態様におけるMHRVポリペプチドの固定化にさらに有用である。
【０１６１】
例示的な態様において、試料中の抗MHRV抗体のスクリーニングは、単離されたMHRVポリペプチドと生物学的試料を接触させることによって達成される。試料中の抗体とMHRVタンパク質との間の相互作用は、標準的な技術によってモニターされる（たとえば、上記Harlow および Lane, 1988を参照されたい）。抗体-MHRVポリペプチド複合体の検出は、試料が抗MHRV抗体を含むこと、および患者がMHRVに対する液性の反応を生じたことを示し、その結果として患者がMHRVに感染しているか、または少なくともMHRVにさらされたことを示す。
【０１６２】
薬学的組成物
本発明は、MHRVポリペプチドまたはMHRVポリヌクレオチドのうちの少なくとも1つを含む薬学的組成物をさらに想定し、これは薬学的に許容される賦形剤中に提供される。種々の薬学的に許容される賦形剤は、当技術分野において周知である。本明細書において使用される、「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、組成物の活性成分と組み合わせた場合に、成分の生物学的活性度を保持することができ、被験者の免疫系と分裂的な反応を引き起こさないあらゆる物質を含む。
【０１６３】
例示的な薬学的キャリアは、非水溶液、懸濁液、およびエマルジョンの無菌溶液を含む。例として、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、および様々なタイプの湿潤剤などの、標準的な薬学的賦形剤を含むが、これらに限定されない。非水系溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性のキャリアは、水、アルコール性／水性の溶液、エマルジョンまたは懸濁液を含み、塩類および緩衝化された媒体を含む。非経口的な媒体は、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル油または不揮発性油を含む。経静脈媒体は、液体および栄養素補液、電解質補充薬（リンゲルのデキストロースに基づくものなど）などを含む。また、MHRVポリペプチドまたはMHVEポリヌクレオチドの組成物は、本発明に従ってその後の再構成および使用のために、当技術分野において周知の手段を使用して凍結乾燥されていてもよい。また、リポソームによるデリバリーのための製剤、およびマイクロカプセル化されたMHRVポリペプチドまたはMHRVポリヌクレオチドを含む製剤も重要である。このような賦形剤を含む組成物は、周知の従来の方法によって処方される（たとえば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Chapter 43, 14th Ed., Mack Publishing Col, Easton PA 18042, USAを参照されたい）。
【０１６４】
一般に、薬学的組成物は、顆粒、タブレット、ピル、坐薬、カプセル（たとえば、経口デリバリーのために適合されたもの）、ミクロビーズ、ミクロスフィア、リポソーム、懸濁液、軟膏、ローションその他同種のものなどの種々の形態で調製することができる。薬学的等級の有機もしくは無機のキャリアおよび／または経口および局所の使用のために適した希釈液は、治療的に活性な化合物を含む組成物を作製するために使用することができる。当技術分野において既知の希釈液は、水性媒体、野菜および動物の油脂、安定化剤、湿潤剤、および乳化剤、浸透圧を変化させるための塩、または適切なpH値を固定するための緩衝液を含む。
【０１６５】
キット
MHRVポリヌクレオチド、MHRVウイルス粒子、MHRVポリペプチド、および／または抗MHRV抗体に特異的な試薬は、生物学的試料中のMHRVポリヌクレオチド、またはMHRVの発現産物の有無を検出するためのキットに供給することができる。このような試薬は、たとえば、試料中のMHRV核酸の検出のためのヌクレオチドプローブまたはプライマー、MHRVウイルス粒子および／またはポリペプチドの検出のための抗MHRV抗体、ならびに抗MHRV抗体の検出のためのMHRVポリペプチドを含み得る。試薬は、標識されたバイアルに提供することができる。また、キットは、緩衝液または標識成分、ならびに生物学的試料における標的核酸、ポリペプチド、または抗体を（定性的にまたは定量的に）検出するための試薬を使用するための説明書を含むこともできる。キットは、適切な陽性対照、陰性対照、または両方をさらに含むこともできる。
【０１６６】
たとえば、核酸プローブは、診断キットにパックすることができる。診断キットは、1つまたは複数のポリヌクレオチドプローブ（たとえば、DNAまたはRNA）を含むことができ（これは標識されていてもよい）；または、ポリヌクレオチドプローブは、標識されていなくてもよく、標識するための成分は、キットにおいて別々の容器内に含まれていてもよい。また、キットは、特定のハイブリダイゼーションプロトコル、たとえば、標準的なものに必要なその他の適切にパックされた試薬および物質、ならびに試験を行うための説明書を含んでいてもよい。
【０１６７】
免疫診断に適したキットおよび含有する適切な標識された試薬は、適切な容器にMHRVエピトープを含む本発明のポリペプチドまたはMHRVエピトープに対する抗体を含む適切な材料を、アッセイ法を行うために必要な残りの試薬および物質とともに、ならびにアッセイ法説明書の適切なセットとともに、パッケージングすることによって作製される。キットを使用するアッセイ法は、インビトロおよび無細胞で行われてもよく（たとえば、インビトロ結合実験）、または細胞に基づいたものであってもよい。
【０１６８】
MHRV複製のための細胞培養系および動物モデル系
MHRVは、ヒト内在性レトロウイルスに対する類似性を有するという所見により、MHRVを伝播するための方法についての情報がもたらされる。MHRVは、以下で詳細を記載したように、配列解析に基づいてHERVと類似していると考えられる。通常、MHRVを培養するための適切な細胞または細胞系は、特定の関心対象であるマクロファージと同系統の細胞および細胞株と共に、レトロウイルスの複製を助けることが知られているものを含んでいてもよい。MHRV増殖のために有用な細胞または細胞株は、ヒト細胞および細胞株、ならびに非ヒト細胞および細胞株を含み得る（たとえば、ブタ、ラットなど）。この点に関して有用な細胞の例は、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、ミクログリア細胞などのマクロファージ誘導細胞群、ならびにこれらの初代細胞群のいずれかに由来する細胞株を含むが、必ずしもこれらに限定されない。また、腫瘍株様のマクロファージ（たとえば、THP-1細胞）MHRVの培養に有用であろう。
【０１６９】
また、MHRVは、培養をMHRVで感染させることができるマクロファージの初代培養において増殖してもよい。または、マクロファージ培養は、感染した個体に由来することもできる。後者の場合は、インビボで感染して、インビトロで継代される細胞の例である。さらに、マクロファージ培養に由来する細胞株を得るために、種々の不死化方法を使用することができる。たとえば、初代マクロファージ培養（所望の個体群の栄養強化の前後で）は、安定性を維持するために、様々な細胞に融合させてもよい。または、培養は、永久的もしくは半永久的な細胞株を作製するために、形質転換ウイルスで感染してもよく、または形質転換遺伝子をトランスフェクトしてもよい。MHRVは、リンパ腫の発生と関連しているので、MHRVは、単独で細胞を形質転換させて、培養における安定細胞系を産生する可能性があることに留意されたい。
【０１７０】
上述したように、MHRVはレトロウイルスである。したがって、細胞系のMHRV感染が、その他のレトロウイルスで細胞を感染させるための分野において既知の技術によって達成される可能性がありうる。これらは、たとえばウイルスが細胞に侵入することを可能にする条件下で、ウイルスの調製物と細胞をインキュベートすることを含む。さらに、単離されたウイルスのポリヌクレオチドを細胞にトランスフェクションさせることにより、ウイルスの産生を得てもよい。ウイルスのゲノム核酸、またはこのようなウイルスのゲノム核酸に由来するcDNAを培養細胞にトランスフェクションさせるための方法は、当技術分野において既知であり、たとえば、エレクトロポレーション、およびDEAEデキストランまたはリン酸カルシウムでの沈降を使用する技術を含む。MHRV RNAの豊富な供与源は、完全なゲノムに対応するMHRV cDNAのインビトロ転写を行うことによって得ることができる。この材料での、またはクローニングされたMHRV cDNAのトランスフェクションは、ウイルスにおけるウイルス複製およびインビトロにおける増殖を生じるはずである。
【０１７１】
培養細胞に加えて、動物モデル系をウイルスの複製のために使用してもよく、動物系におけるレトロウイルスは、当業者に既知である。scidマウスは、動物モデルの例である。さらにモデルの例には、霊長類（たとえば、サル、チンパンジー、オランウータン、その他同種のもの）を含むが、必ずしもこれらに限定されない。
【０１７２】
抗MHRV薬剤の同定
本発明はさらに、MHRVのための抗ウイルス剤を同定する方法を指向する。MHRV抗ウイルス因子の例は、ウイルスを不活性化するもの（たとえば、使用前に機器または生物学的材料（たとえば、血液）を処理することによる）、宿主細胞へのMHRV侵入機構を阻害するもの、MHRV複製を阻害するもの、または他のMHRV病原を混乱もしくは干渉するものを含む。関心対象である細胞が死亡に至るまでおよびの死亡を含む感染細胞の増殖の阻害を容易にする薬剤と共に、ウイルスの複製を阻害する一方感染細胞の成長および増殖を可能にする薬剤は特に関心対象のものである。MHRVはリンパ腫と関連しているので、これらがMHRVに与える影響によって抗癌剤として作用する薬剤は、また重要である。
【０１７３】
本明細書において使用される「薬剤」という用語は、任意の分子、たとえば、抗MHRV活性のスクリーニングに順応するタンパク質または医薬品（たとえば、複製、感染、またはMHRV感染および伝播のその他の側面を阻害する活性）を表す。通常、アッセイ混合液の多くは、種々の濃度に特異な反応を検出するために異なる薬剤濃度で並列に行われる。典型的には、これらの濃度のうちの1つは陰性対照として働き、すなわちゼロ濃度または検出レベル以下である。
【０１７４】
候補薬剤は、典型的にはこれらが有機の分子であるにもかかわらず、多くの化学的分類を包含し、一般に50より大きく約2,500ダルトン未満の分子量を有する小さな有機化合物である。候補薬剤は、タンパク質との構造上の相互作用、特に水素結合のために必要な官能基を含み、典型的には、少なくともアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基、またはカルボキシル基、好ましくは官能基のうちの少なくとも2つを含む。候補薬剤は、上記の官能基の一つまたは複数で置換された環状の炭素構造もしくは複素環式構造および／または芳香族もしくはポリ芳香族構造を含むことが多い。また、候補薬剤は、以下のものを含む生体分子中で見出されるが、これらに限定されない：ペプチド、サッカライド、脂肪酸、ステロイド、フェロモン、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体、またはこれらの組み合わせ。
【０１７５】
候補薬剤は、合成または天然の化合物のライブラリーを含む多種多様な供与源から得られる。たとえば、多くの手段は、ランダム化されたオリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を含む、多種多様な有機化合物および生体分子のランダム合成および定方向合成に利用できる。または、細菌、真菌、植物、および動物の抽出物の形態の天然の化合物のライブラリーも、利用でき、または容易に産生される。その上、天然のまたは合成的に作製されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的、および生化学的手段を介して容易に修飾され、コンビナトリアル・ライブラリーを作製するために使用してもよい。既知の薬理学的薬剤は、アシル化、アルキル化、エステル化、アミジン化、構造類似体を産生するその他のものなどの、定方向またはランダムな化学修飾に供されてもよい。
【０１７６】
本発明に有用な種々のスクリーニング法は、当業者には既知である。通常、抗ウイルス剤は、ウイルスの複製を補助する細胞培養系において、ウイルスの複製の阻止に対するこれらの効果について様々な濃度で試験され、次いで動物モデル系において、感染性またはウイルスの病原性の阻害（および低レベルでの毒性）について、試験される。方法の例には、ウイルスのID50によるか、または細胞プラーク形成の誘導に対するウイルスの能力による薬剤の効果を決定するためのアッセイ法を含むが、必ずしもこれらに限定されない。
【０１７７】
本明細書において提供されるMHRVポリペプチドおよびMHRVポリヌクレオチドを検出するための方法および組成物は、これらが細胞プラークアッセイ法またはID50アッセイ法以外の別の感受性のあるウイルス複製に対する薬剤の効果を検出するための手段を提供するという点で、抗ウイルス剤のスクリーニングのために有用である。
【０１７８】
たとえば、本明細書に記載されたMHRV-ポリヌクレオチドプローブは、細胞培養において産生されるウイルス核酸の量を定量するために使用してもよい。これは、たとえば、標識されたMHRVポリヌクレオチドプローブと感染細胞の核酸のハイブリダイゼーションまたは競合ハイブリダイゼーションによって達成することができる。たとえば、また、抗MHRV抗体は、本明細書に記載された免疫アッセイ法を利用して、細胞培養におけるMHRV抗原の同定および定量のために使用してもよい。さらに、競合アッセイ法によって感染細胞培養中のMHRV抗原を定量することが望ましので、本明細書に記載されたMHRV cDNA内にコードされるポリペプチドは、これらの競合アッセイ法において有用である。通常、MHRV cDNAに由来する組換えMHRVポリペプチドは標識されていると考えられ、MHRVポリペプチドに対するこの標識ルされたポリペプチドの結合の阻害は、細胞培養系において産生される抗原によりモニターされると考えられる。さらに、これらの技術は、MHRVが細胞死を引き起こさずに細胞株において複製することができると考えられる場合に、特に有用である。
【０１７９】
これらの方法による有効性について試験されると考えられる抗ウイルス剤は、当技術分野において既知であり、たとえば、ウイルスの結合および／または複製に必要なビリオン成分および／または細胞成分と相互作用するものを含む。典型的な抗ウイルス剤は、たとえば、ビリオンポリメラーゼ阻害剤および／または前駆体ポリペプチドの切断に必要なプロテアーゼを含んでいてもよい。その他の抗ウイルス剤は、核酸と作用してウイルスの複製を阻止するもの、たとえばアンチセンスポリヌクレオチなどを含んでいてもよい。
【０１８０】
アンチセンスのポリヌクレオチド分子は、これらがゲノムまたはRNAの指定された領域に特異的にハイブリダイズすることができる相補的なヌクレオチド配列から構成され、本発明のアッセイ法をスクリーニングを介して同定することができる関心対象の抗MHRVウイルス剤の例である。アンチセンスポリヌクレオチドは、たとえば結合することによってmRNAにタンパク質翻訳を遮断すると考えられる分子を含んでいてもよく、またはトランスクリプターゼによってウイルスRNAの複製を阻止する分子であってもよい。これらはまた、たとえばウイルスRNAの切断を引き起こすことにより、ウイルスのRNAを不活性にする薬剤を保有する（非共有結合による付着または共有結合）分子を含んでいてもよい。また、これらはウイルスの感染性、複製能力、または慢性を増強し、および／または必要とされる細胞のポリヌクレオチドに結合してもよい。MHRV誘導されたRNAにハイブリダイズするであろうアンチセンス分子は、本明細書に提供されるMHRV cDNAの配列情報に基づいて設計されていてもよい。MHRVのアンチセンスポリヌクレオチドに基づく抗ウイルス剤は、高い特異性で結合するように、溶解性が増大するように、安定するように、および低い毒性を有するように設計されてもよい。それゆえに、これらは特定化した系、たとえばリポソームにおいて、または遺伝子治療によって送達されていてもよい。さらにこれらは、類似体、付着したタンパク質、塩基間の結合が置換または変化されたものなどを含んでいてもよい。
【０１８１】
抗MHRV活性を有するその他のタイプの薬剤は、MHRVゲノムの重要な制御領域を「模倣」するポリヌクレオチドに基づいてもよく、これはウイルスの感染性または複製の原因となる系の鍵となる成分とこれらが相互作用することにより、治療的でありうる。
【０１８２】
MHRV薬剤の使用
本明細書に記載されたとおりに同定された抗MHRV薬剤、またはその他の抗MHRV薬剤は、被験者におけるMHRV感染を治療するために使用することができ、この場合「被験者」には、特定の関心対象の哺乳類、特にヒトでのMHRV感染に感受性の全ての宿主を包含する。MHRVは、逆転写酵素およびプロテアーゼ酵素を保有するため、これらの双方ともが抗HIV治療のための成功した標的であり、同様の方法で作用する薬剤は、MHRV感染の治療における特定の使用が見出され得る。さらに、MHRVに関連した外套細胞リンパ腫を有する患者から単離した血液マクロファージは異常であり（増殖と一致してPCNAを発現する）、インビトロにおいてポリアミン類似体によって死滅される。
【０１８３】
「ポリアミン」は、一般に生合成によりアミノ酸に由来する一群の脂肪族直鎖アミン化合物のいずれかをいう。ポリアミンはMartonら、（1995） Ann. Rev. Pharm. Toxicol. 35: 55-91において概説されている。ポリアミンは、たとえば天然に存在するポリアミンまたは真核細胞において天然に産生される天然のポリアミンであることができる。ポリアミンの例は、プトレッシン、スペルミジン、スペルミン、およびカダベリンを含む。「ポリアミン類似体」は、一般にスペルミンおよび／またはスペルミジン、ならびにこれらの前駆体のジアミンプトレッシンなどの天然に存在するポリアミンと構造的に同様であるが、同一ではない有機カチオンをいう。ポリアミン類似体は、分岐もしくは非分岐、または組み込まれた環状部分であることもできる。ポリアミン類似体の例としては、N1,N14-ジエチルホモ-スペルミン（DEHSPM）およびN1,N12-ジエチルスペルミン（DESPM）が挙げられるが、これに限定されない。たとえば、一級アミノ基を含むポリアミンを開示する国際公開公報第98/17624号および米国特許第5,541,230号、米国特許第5,037,846号、および第5,242,947号を参照されたい。ポリアミン類似体であって、ポリアミン類似体の全ての窒素原子が独立して二級、三級、または四級アミノ基であるものが特に好ましい。
【０１８４】
MHRVの治療において使用に適したポリアミン類似体、ならびに製剤、組成物、およびデリバリーの方法の考察については、たとえばPCT国際公開広報第99/21542号を参照されたい。いずれの適切なポリアミン類似体、またはその立体異性体、塩もしくは被保護誘導体（またはポリアミン類似体の有効な量を含む組成物、またはその立体異性体、塩もしくは被保護誘導体）も、一般に製造業者の／供給者の説明書に従って投与してもよい。通常、ポリアミン類似体は、皮下または静脈の注射によって投与される。また、これらは、経口的に投与されていてもよい。
【０１８５】
投与されるポリアミン類似体（またはその立体異性体、塩もしくは被保護誘導体）の量は、使用される特定の類似体（または立体異性体、塩もしくは保護薬誘導体）、投与の時間経過、固体の症状、所望の目的、疾患の程度、どの程度の用量が投与されるか、およびその他の物質が投与されているどうかなどのいくつかの変数に依存すると考えられる。通常、使用される量は、製造業者によって推奨されるもの、および／または経験的な研究に基づいたものであると考えられる。ポリアミン類似体（またはその立体異性体、塩、もしくは被保護誘導体）の場合、量は、一般に約1〜約300mg／m2／日、可能ならば約15〜約150mg／m2／日であると考えられる。投与は、一般に間欠性であり、類似体（またはその立体異性体、塩、もしくは被保護誘導体）が、少なくとも1〜2日の期間あたりに投与され、次いで少なくとも1〜2日の期間は投与されず、このサイクルが示されたとおりに繰り返される。一つの態様において、ポリアミン類似体（またはその立体異性体、塩、もしくは誘導体）は、3週ごとに6日間である。
【０１８６】
投与の経路は、一般に使用される特定のポリアミン類似体（または、立体異性体、塩もしくは被保護誘導体）の性質に依存すると考えられ、たとえば、経口または注射（皮下または静脈内）によってであってもよい。投与は、一般に静脈または皮下注射によってなされる。
【０１８７】
通常、ポリアミン類似体（または立体異性体、塩もしくは被保護誘導体）、またはポリアミン合成経路、ポリアミン代謝、および／またはスペルミンの細胞内濃度維持を妨げるその他の適切な薬剤は、適切な薬学的賦形剤を含む組成物において投与される。薬学的賦形剤は、当技術分野において既知であり、Remington's' Pharmaceutical Sciences, 18th edition, Mack Publishing （1990）に記載されている。また、ポリアミン類似体は、マクロファージに対する薬剤デリバリーを容易にするか、またはマクロファージに対する薬剤の特異性を増大する別の物質と結合されていてもよい。たとえば、薬剤は、リポソームに結合されていてもよい。リポソームは、当技術分野において既知である。そしてまた、リポソームは、IgGFc受容体などのターゲティング物質と結合されてもよい。ザイモサンまたはテトラクロロデカオキシジェン（TCDO）などのマクロファージ食作用および／またはMCSF、GMCSF、もしくはIL-3などの活性化を増大させる物質は、抗増殖剤の取込みを増大させるために使用してもよい。
【０１８８】
抗MHRV薬剤の投与と組み合わせて（投与の前、投与と共に、または投与後に）、その他の薬剤を投与することもできる。
【０１８９】
MHRVの弱毒化された株の調製
上記に加えて、組織培養系および／または動物モデル系を利用して、MHRVの弱毒化株を構築および／または単離することができる。これらの株は、ワクチンのために、またはウイルス抗原の単離のために適していると考えられる。
【０１９０】
弱毒化株は、細胞培養および／または動物モデルにおける多数の継代後に単離することができる。感染細胞または感染個体における弱毒化株の検出は、当技術分野において既知の技術によって達成することができ、たとえば、プローブとしてMHRVにおいてコードされる1つまたは複数のエピトープに対する抗体を使用すること、またはプローブとして少なくとも約8ヌクレオチドのMHRV配列を含むポリヌクレオチドを使用することを含みうる。
【０１９１】
または、もしくはさらに、弱毒化株は、本明細書に提供したMHRVのゲノム情報を利用して、および組換え技術を利用して構築されてもよい。通常、たとえば病原性に関連したポリペプチドをコードするゲノム領域を欠失させることによって、MHRVの欠失突然変異体が生成されると考えられるが、ワクチン注射した宿主にMHRV抗原に対する有効な免疫応答を生じさせるために、少なくともあるレベルのウイルス複製ができるようにする。さらに、ゲノム構築により、MHRVに対する中和抗体を引き起こすエピトープを発現することができると考えられる。次いで、変質されたゲノムを、細胞を形質転換させるために利用することができ、これによりMHRV複製が可能となり、ウイルス複製を可能にする条件下で細胞を培養した。
【０１９２】
ワクチンとしてのこれらの使用に加えて、弱毒化MHRV株は、ウイルス抗原の商業的に産生するための供与源として使用することもできる。ワクチン目的のための弱毒化ウイルスは、たとえば初代マクロファージに感染する形態で、MHRVに感染した、病気にかかった個体、対病気にかかっていない個体の研究によって定義された抗原性部位を含み得る。次いで、このような抗原構造を、ワクチンに使用するために、発現させて単離することができる。
【０１９３】
MHRVに基づくウイルスベクター
MHRVゲノムは、ウイルスベクター、たとえば関心対象の遺伝子産物をコードする組換え核酸の操作および移動のための組換えMHRVベクターを作製するために使用できるシャトルベクターのベースとして使用することができる。一つの態様において、本発明のMHRVベクターは、関心対象の核酸の挿入およびライゲーションを容易にするために、クローニングサイト、好ましくはマルチクローニングサイトを含むように修飾された全てまたは一部のMHRVゲノムを含み、これにより制限部位、好ましくは独特の制限部位が提供される。本明細書において使用される「制限部位」は、限定酵素によって認識および切断される核酸配列をいう。一つの態様において、関心対象の遺伝子産物をコードする核酸は、この核酸はMHRVゲノムとは異種性（すなわち、核酸は、MHRVゲノムにおいて通常見出されない）であり、天然に存在し、好ましくはMHRVゲノムに独特な制限部位に挿入される。好ましくは、関心対象の核酸は、宿主細胞にMHRVベクターを導入することにより、宿主細胞（インビトロまたはインビボ）においてコードする遺伝子産物の発現をもたらすために、ベクターに機能的に挿入される。
【０１９４】
一つの態様において、適切な宿主細胞における組換えMHRVベクターの発現により、複製適格性組換えMHRVウイルス粒子を提供し、これにより、関心対象の遺伝子産物をコードする配列を含むように修飾される。関心対象の核酸が導入されたクローニングサイトおよび／または組換え体は、任意の適切な部位でMHRVゲノムに挿入することができる。特定の態様において、クローンニングサイトおよび／または組換え核酸は、MHRVゲノムpol領域に隣接して挿入される。
【０１９５】
もう一つの態様において、MHRVベクターは、たとえば、欠失またはその他の修飾によってGagエンベロープタンパク質をコードする配列、ポリメラーゼ（pol）をコードする配列、または両方ともを機能させて複製欠損にされている。特定の態様において、クローニングサイトおよび／または組換え核酸は、ポリメラーゼをコードする配列を破壊するようにMHRVゲノムのpol領域に挿入される。次いで、遺伝子産物をコードする配列を含むように、複製欠損ベクターを修飾する。次いで、MHRVウイルス粒子の産生のために必要とされる必要なウイルス成分を発現（構成的に、または誘導性に）するように修飾されたパッケージング細胞（一般に哺乳類細胞）、たとえば、組換えMHRVベクターの修飾されたエレメントを補うために必要なものとしてMHRV gag、MHRV pol、または両方共を発現する細胞に、複製欠損MHRVベクターを導入することによって、組換えMHRV粒子をインビトロにおいて産生させる。この修飾された組換え宿主細胞におけるMHRVベクターの共発現により、ウイルス粒子の産生を生じ、次いでこれを単離して（たとえば、上清から）、標的細胞を感染させるために使用することができる。
【０１９６】
組換えMHRVベクターに挿入するための組換え核酸は、関心対象の任意の遺伝子産物をコードする関心対象の任意の核酸であり得る。MHRVベクターまたはMHRVウイルス粒子は、インビトロ（たとえば、エキソビボ治療法）またはインビボのいずれかにおいて宿主細胞を修飾するために使用することができる。たとえば、本発明の組換えMHRVウイルス粒子は、インビボにおいて、患者が欠損しているか、または患者が治療的な利益を得られるであろう任意の可溶性タンパク質を長期間分泌する目的で、宿主細胞における産生のための分泌されたポリペプチドを送達するために使用することができる。たとえば、自己血から調製したマクロファージに血液凝固（たとえば、第VIII因子）をコードする遺伝子を送達するために組換えMHRV粒子を使用することができ、この修飾されたマクロファージを第VIII因子の供与源を提供するために宿主へ注入して戻し、これにより血友病を軽減することができる。
【０１９７】
組換えMHRVベクターおよび組換えMHRVウイルス粒子は、現在遺伝子治療において使用されている大多数のレトロウイルスでは共有しない特徴である、非分裂細胞、たとえば非分裂マクロファージにMHRVが効率的に感染するという点で、特に遺伝子デリバリー媒体として魅力的である。したがって、組換えMHRVベクターおよび組換えMHRVウイルス粒子は、このような非分裂細胞、たとえばマクロファージ、幹細胞などに対する、または非分裂細胞を経た遺伝子産物のデリバリーにおける特定の使用が見出されると考えられる。
【０１９８】
寄託
以下のウイルスの生物学的に純粋な培養物の寄託は、本出願の出願日の期日もしくは期日以前にブタベスト条約の規定のもとに、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、10801 University Blvd., Manassa, VA 201110-2209でなされた。示したアクセッション番号が、生存率検定が成功した後に割り当てられ、必要な手数料を支払った。前記培養物へのアクセスは、特許出願の係属する間、このような37 C.F.R.§1.14および35 U.S.C.§122の下で、長官によって権利が与えられることが決定されたものに利用できる。公衆に対するこの培養の有効性における全ての制限は、本出願に基づいた特許の付与の際に、取り消しできないように除去される。さらに、指定された寄託は、寄託の日から30年間、もしくは寄託の最後の要請の後の5年間；または、米国特許の実施可能な期間のいずれか長い期間維持されるであろう。培養物は、成育不能になるか、もしくは不注意に破壊されるか、またはプラスミドを含有する株の場合、そのプラスミドを失われた場合、同じ分類学上の記載の生存可能な培養物と置換されるであろう。
【０１９９】
これらの寄託は単に当業者に対する便宜のみとして提供され、寄託が必要であることの承認ではない。寄託する物質を作製する、使用する、または販売するためにライセンスを必要としてもよく、このようなライセンスは、本明細書によっては付与されない。以下の寄託は、ATCCによって本出願の出願日の期日もしくは期日以前に受け取られた。
2005508154.tif 000002
【０２００】
実施例
以下の実施例は、本発明を製作し使用する方法の完全な開示および説明を、当業者に提供するために提示され、これらの発明に関して本発明の範囲を限定することは企図されず、または、これらは以下の実験が全てであること、もしくは行った実験のみであることを表すことは企図されない。使用した数（たとえば、量、温度、分子量）に関して、正確さを保証するための努力をしたが、一部の実験誤差および偏差は予期されるべきである。一方、示されない限り、部は、重量部であって、分子量は、重量平均分子量であり、温度は、摂氏度であり、圧力は大気圧または大気圧に近い圧力である。
【０２０１】
実施例1：循環する活性化されたマクロファージを有する、リンパ腫を有する患者
AIDS痴呆の患者の血液において、活性化されたマクロファージが以前に同定されている（Pulliamら、Lancet 349: 692-695 （1997））。予備研究において、リンパ腫の患者は、高側面分散（CD14発現細胞の流動細胞光散乱）およびCD69などの活性化マーカーによって「活性化された」ように見える異常な循環マクロファージを有することにも留意されたい。これらのマクロファージの研究では、これらが活性化かつ増殖していたことが示され、増殖マーカーPCNA、Ki-67で染色された。また、これらの細胞は増殖する細胞の特徴である、ブロモデオキシウリジンの取り込みをした。
【０２０２】
AIDSリンパ腫および非AIDSリンパ腫の患者に由来する末梢血CD14細胞のPCNA染色の割合（％）の概要を、実験室の研究者に由来する血液と比較して図2に示す。PCNA染色は、AIDSおよび非AIDSリンパ腫の患者から得られた全血形態、ならびに実験室の研究者対照によって達成した。末梢血単核細胞を試料から単離し、当技術分野において周知の方法にしたがって細胞を固定し、透過化処理し、抗PCNA抗体で染色した。細胞上のCD14の染色を対照として使用した。CD14の細胞の背景以上のPCNAの割合（％）を、算出してプロットした。対照（n=13）、HIV非ホジキンリンパ腫（NHL）（n=16）、非HIV-NHL（n=18）について得られる値をそれぞれ算出した。陽性値を与えるためのカットオフとして、30%のPCNA+値を使用した。図2に示したように、AIDSおよび非AIDSリンパ腫の患者は、これらの血液において、対照（年齢25〜45）実験室研究者よりも高頻度でPCNA+CD14細胞が上昇した（＞30%、それぞれp=0.03、0.006）。最も高いレベルのPCNA+CD14細胞の患者の研究では、彼らが無痛性の慢性リンパ腫（濾胞性リンパ腫、外套細胞リンパ腫、菌状息肉腫）を有することが明らかとなった。また、これらのPCNA+マクロファージは、AIDSリンパ腫組織検体においても観察された。
【０２０３】
マクロファージまたはマクロファージ様細胞が増殖の証拠を示したかどうかを決定するために、非AIDS濾胞性リンパ腫検体において研究を行った。
【０２０４】
図3は、有糸分裂を経ている低級濾胞性リンパ腫における濾胞樹状細胞を含む組織切片を示し、病原体の増殖に対するこの細胞群の能力を示唆している。さらに、有糸分裂の図は悪性の症候であると考えられる異常の三極である。これらのデータは、潜在的にマクロファージ様細胞は非AIDSリンパ腫において同定され得ることを示唆する。
【０２０５】
実施例2：新規ヒトレトロウイルスのMHRVの特徴づけ
AIDSリンパ腫において記載されたものと一致する特徴を有するマクロファージを含む非ホジキンリンパ腫のインデックスケースを、ウイルス単離の試みにおいて利用した。この外套細胞リンパ腫の組織学は図4に示す。ウイルスの単離および培養のためのプロトコルは、以下の通りであった。
【０２０６】
ヒトマクロファージにおけるMHRV培養
外套組織球レトロウイルス（MHRV）は、ヒトマクロファージにおいて培養し、解析のために培養細胞および培地から回収した。使用したプロトコルは、以下に記載する。
【０２０７】
1）オリジナルの材料：オリジナルの外套細胞リンパ腫物質は、Herndier博士によって同定され、彼は、HIVリンパ腫と関連したマクロファージと比較して、この組織において観察される超微細構造の類似に基づいて、候補組織の可能性があるものとしてMCL-1（患者LL）を同定した。患者は、HIV、HBV、およびHCVに対して陰性の51歳の老人であった。
【０２０８】
2）マクロファージ調製物：血液は、スタンフォード血液センターから得た。血液を抜き、調製して、室温で一晩貯蔵した。次いで、翌朝、マクロファージを次のように血液から得た。バッグを開けて、同体積のDPBS（30ml）を血液に添加した。希釈血液を50mlの遠心管に入れ、14mlのパーコール（1.087g／ml）を血液下にピペットで移した。次いで、これを1800 RPMで30分間遠心分離した。
【０２０９】
一番上の血漿層を捨て、中間の細胞層を除去して清潔な50mlの遠心管に配置した。DPBS（ダルベッコのリン酸緩衝食塩水）を50mlの総容積に添加して、調製物を1400 RPMで10分間室温において遠心分離した。上清を除去して、細胞ペレットを清潔なチューブに配置し、10%のウシ胎児血清を含む25mlのIMDM培地に再懸濁した。次いで、再懸濁した細胞をウシ胎児血清と1時間インキュベートして150mmのガラスペトリプレートに配置した。細胞は、ペトリプレート上で1.5〜2時間、加湿したCO2インキュベーター内で37℃においてインキュベートした。
【０２１０】
インキュベーション後、培地を吸引して、接着細胞をペトリ皿においてDPBSで3回洗浄した。次いで、接着細胞を10mlのDPBS中で掻爬して、清潔な50mlの遠心管へ移した。DPBSの体積を50mlに増加して、細胞を1200 RPMで10分間遠心分離した。遠心後、細胞ペレットを25mlの培地に再懸濁してT75フラスコへ移した。次いで、細胞を加湿したCO2インキュベーター内で37℃において培養した。それぞれ30mlの血液から、2つのT75フラスコにマクロファージをまいた。
【０２１１】
3）MHRV生殖：外套細胞リンパ腫（MCL-1）の患者のLL由来の凍結組織を3回凍結融解し、マクロファージをまいてから1〜2日後のT75フラスコに可溶化液（約107細胞）を添加した。可溶化液は、直接細胞上の培地に添加して、細胞と共に24時間インキュベートした。インキュベーション期間の後、細胞をDPBSで洗浄し、次いで15mlの培地を細胞上に入れた。培地は、毎週交換した。
【０２１２】
MHRV増殖のための物質を得るために、培地を細胞から吸引し、5mlの新しい培地を細胞上に添加して、細胞スクレーパーを使用してフラスコ表面の細胞を掻爬した。次いで、これらの細胞を解析のために、または新規なマクロファージ培養にMHRVを導入するために、凍結融解を3〜4回行った後に使用した。また、増殖性に感染した初代共培養からの細胞を含まない上清は、0.22ミクロンのフィルターを通した濾過の後にMHRV伝染のために効率よく使用された。
【０２１３】
4）試料調整および貯蔵：細胞培養上清は、毎週置換して、解析までは-80℃に貯蔵した。掻爬した細胞は、解析のために、または増殖のために使用するまで液体窒素中で貯蔵した。
【０２１４】
5）細胞増殖および維持：細胞は、（1）50%のMyelocult H5100（Stem Cell Technologies）、（2）10%のウシ胎児血清（Hyclone）、グルタミン（Biowhittaker）、およびPenstrep溶液（Biowhittaker）を補った25%のIMDM（Biowhittaker）、（3）コンフルエントな状態のヒトジプロイド繊維芽細胞を含むフラスコにおいてインキュベートされた25%のIMDM条件培地、で構成される培地中で培養した。培地は、M-CSF（1マイクログラム／ml、Sigma）、IL-3（1マイクログラム／ml、Sigma）、および抗生剤の抗真菌剤（Life Science Technologies）を補った。
【０２１５】
6）実験試料：マクロファージ培養の調製後、細胞をMHRVを含む可溶化液に24時間さらした。次いで、培地を約1週に一回細胞上から除去して、-80℃に保存した。6〜8週間の実験の終わりに、細胞単層をフラスコ中で掻爬して、液体N2において10%のDMSO／培地中で凍結させた。これらの細胞を電子顕微鏡法のために使用した。
【０２１６】
MHRV感染した初代マクロファージの電子顕微鏡法：上記の通りに、1ヵ月間MHRVに感染した細胞において、透過型電子顕微鏡法を行った。レトロウイルス粒子が観察された多くの場合において、これらは細胞内液胞に存在し、B/D型レトロウイルスの特徴的な形態を有した。このレトロウイルスにおいて再現的に観察される古典的な形態は図5に示す。同様の粒子は、並行して行った、同じ初代マクロファージドナーからの感染していないマクロファージ培養では観察されなかった。
【０２１７】
実施例3：MHRVのクローニング
MHRVゲノムをクローニングするために使用したクローニングストラテジーは図6に提供される。当技術分野において周知の方法に従った初期polプロテアーゼ遺伝子断片のシーケンシングの後、相同検索を行い、プロテアーゼ（pro）およびポリメラーゼ（pol）遺伝子の両者は、ウイルスのヒト内在性レトロウィルス-Kサブファミリーについて以前に記載されたものと同様の無処理のタンパク質をコードする、完全なオープン・リーディング・フレームを有することが見出された。初期の最も近い相同性では、HERV-K109ウイルスに関連した。
【０２１８】
次のクローニングストラテジーでは、初期polプロテアーゼ遺伝子由来の5-プライムおよび3-プライムを伸長するMHRV特異的なプライマーを使用した。このストラテジーにより、ビリオンの全長をコードするDNAの配列を得た。BLAST解析では、MHRV配列が、HERV-K109ゲノムと最も高い相同性を有することを示した。事実上完全な相同性がpol遺伝子の5'末端で観察されたが、gag領域には異種性領域が存在した。
【０２１９】
MHRVゲノム配列においてORF発見手段（NCBI）を使用するオープン・リーディング・フレーム解析により、MHRV GAGタンパク質をコードするオープン・リーディング・フレームが示された。GAG遺伝子の5'末端のヌクレオチド配列（配列番号：7）および予測されたアミノ酸配列（配列番号：8）は、以下の通りである：
2005508154.tif 000003
【０２２０】
ヌクレオチド残基番号は、予備的なMHRVゲノム配列（1〜9182）内のヌクレオチドの位置に基づく。304bpのPCR産物の5'末端はこの配列内で見出され、上記番号付けを使用するとヌクレオチド残基1325で開始する。これらの配列は、本明細書において、MHRV 5”GAG核酸およびポリペプチド配列と称される。
【０２２１】
HERV-K109に関する相同性は図1に示す。MHRVゲノムのヌクレオチド残基3548の後方付近において、MHRVゲノムとHERV-K109ゲノムとの間で高い相同性が観察され、ちょうど5'からこの領域に有意な程度で非相同性が生じ、MHRVの全てのgag遺伝子を包含する。MHRV gag遺伝子の配列解析では、観察されたHERV-K109 gag遺伝子との93%の相同性よりも高い相同性は全く示されなかった。この領域に類似するその他のウイルスgagエレメントは、全て、HERVファミリーに該当するが、HERV-K109よりもより遠い関係であった。したがって、MHRVゲノム配列は、未知のgag含有外因性レトロウイルスエレメントとHERV-K109との間の組換え事象と、その後の感染性レトロウイルスの産生が起こり得ることを示唆する。大きなオープン・リーディング・フレームには、ウイルスの複製のために必要な全ての遺伝子（gag、pol、env）が存在していた。
【０２２２】
実施例4：MHRV DNAは、オリジナルの外套細胞リンパ腫DNAにおいて検出されるが、正常なドナーまたはHIV＋AIDSリンパ腫DNA検体のいずれかから単離されたDNAでは検出されない
MHRVがオリジナルの外套細胞リンパ腫に存在する候補の独特なウイルスであるかどうかを試験するために、独特のgag遺伝子配列に基づいてプライマーを構築し、オリジナルの外套細胞リンパ腫DNAまたはAIDS関連リンパ腫の患者からのDNAから調製したDNA検体を増幅するために利用した。使用したプライマーの配列（HERV-8、HERV-9、HERV-10、HERV-11、およびHERV-12）は、図1に提供される。HERV-10およびHERV-11プライマー対を使用する増幅（試料AおよびB、図7のレーン3）では、約1966bpのPCR産物を生じるはずであり；HERV-9およびHERV-12のプライマー対（試料AおよびB、図7のレーン2）を使用する増幅では、約1321bpのPCR産物を生じるはずであり；ならびに、HERV-8およびHERV-9のプライマー対（試料AおよびB、図7のレーン1）を使用する増幅では、約304bpのPCR産物を生じるはずである。PCR増幅は、オリジナルの外套細胞リンパ腫（MCL-1 DNA）から、およびAIDS非ホジキンのリンパ腫（AIDS-NHL DNA）から単離されたDNAを使用して行った。PCRは、当技術分野において周知の方法に従って、65℃のTmで行った。具体的には、21μl（約100ng DNA以下の範囲で）のDNA試料を、5μlの10×緩衝液中で、1μlの200μM dNTP、3μlの1.5mM MgCl2、1μlのそれぞれのプライマー（それぞれ400nM）、および0.3μlの1.5μM AmpliTaq DNA ポリメラーゼと、36.7μlの水と共にインキュベートした。PCRサイクルは、以下の通り、94℃で3分；94℃で30秒に続いて65℃で1分を40サイクル；68℃で2分；および68℃で10分であった。
【０２２３】
図7はこの解析の結果を示す。レーン1〜3（B、MCL-1 DNA）に示すように、gag-特異的なPCRプライマーの3つのセットの全てにおいて、最初のMHRVシーケンシング解析に基づいて予測されたとおりの分子量の特異的な遺伝子産物が生じた。これらのサイズは右軸に示す。同じセットのプライマーでは、HIV+ AIDSリンパ腫DNA（A、AIDS-NHL DNA）から単離されたDNA由来のいずれを増幅することもできなかった。HERV-8/-9のプライマー対では、HIV+ AIDSリンパ腫DNAからいずれの検出可能なPCR産物も増幅することができず；HERV-9/-12プライマー対を使用するとかすかなバンドが存在し、またHERV-10/-11プライマー対（A、1〜3）を使用すると、全長（1966bp）PCR産物が検出された。したがって、MHRV特異的なプライマーは、正常ヒトゲノム（Aレーン）に存在する配列を検出しなかった。これらのデータは、患者のオリジナルの腫瘍のDNA（Bレーン）からの特異的なMHRVの検出と一致する。
【０２２４】
リンパ腫が寛解傾向であった場合の、この患者からの血液検体における次の研究では、図7にて説明したように、同じ大きさのMHRV特異的なDNAを示した。これらのデータは、MHRVがオリジナルの腫瘍内に存在し、血液検体において観察されるためには、腫瘍細胞が存在することは必要とされないことを示す。
【０２２５】
実施例5：MHRV GAG配列の解析
実施例3に記載した上記MHRV全長GAGポリペプチド配列は、GenBankのBLAST解析における照会配列（配列番号：9）として使用した。GenBankアクセッション番号AF164609（配列番号：10）およびY08032（配列番号：11）は、以下に示す。
2005508154.tif 000004
【０２２６】
それぞれの例において、ポリペプチドは、照会MHRV GAGアミノ酸配列の最初の4アミノ酸にマッチしなかった。MHRV GAGポリペプチドの残基22までおよび残基22を含むN末端部分は、既知のgagポリペプチドに対してほとんど相同性を示さなかった。
【０２２７】
実施例6：MHRVに感染したマクロファージは、完全なウイルス粒子を産生する
インビトロにおける初代マクロファージのMHRVによる感染がウイルス粒子を生じるかどうかを試験するために、上記した方法に従って以下の実験を行った。初代マクロファージドナーをMHRVに感染させ、感染していないままにした同細胞を並行して培養した。方法は上記のとおりに行った。
【０２２８】
感染開始の6週間後に、感染した培養および感染していない培養物、細片ペレット、および25／45%のショ糖段階的勾配上の上清層から上清を得た。超遠心分離を90,000Gで2時間行い、勾配を4部分に分別した。上層の培地を含む部分（AおよびB、レーン1、図8）、25%のショ糖部分（AおよびB、レーン2、図8）、25／45%バンドの物質（AおよびB、レーン3、図8）、およびペレット（AおよびB、レーン4、図8）を全DNAse1で処理し、RNAを抽出した。同じ手順を、感染した細胞および感染していない細胞からの上清に対して行った。それぞれの勾配選択された検体に対する逆転写酵素PCR実験において、MHRV特異的なプライマー（HERV-K8およびHERV-K9）を利用した。
【０２２９】
図8に示すように、MHRV感染した培養の25／45%界面からの検体のみが、検出されるMHRV特異的なRNAを含んだ。感染した上清からのその他のいずれの画分においても、RNAに結合した検出可能なMHRV粒子はなく、また感染していない対照上清からも検出できる増幅可能な配列はなかった。これらのデータは、解析の6週前にMHRVの供与源に感染した初代マクロファージによって産生されたMHRV RNAに結合した粒子の検出と一致する。同様の実験を、8つの異なった初代マクロファージドナーにおいて行い、図5において示されるものと同様に細胞内にウイルス粒子が存在することを示す電子顕微鏡法によって感染を確認した。
【０２３０】
単離されたMHRVがインビトロにおいて細胞に感染する能力は、ウイルスが血液中で伝染する可能性があることを示唆し、したがって、MHRVについて血液供給（血漿および血清などの血液製剤を含むこと）をスクリーニングすることは、MHRV感染性核酸を含みうる組織およびその他の生物学的物質をスクリーニングするものであることが保証される。
【０２３１】
実施例7：MHRVのウエスタンブロット解析
オリジナルの外套細胞リンパ腫患者が、MHRV特異的なタンパク質に対して免疫学的反応を示すかどうかを試験するために、患者が完全寛解（骨髄移植後）した際にこの患者から血漿を得た。任意のMHRV特異的なタンパク質を観察することができるかどうかを決定するために、この血漿を、感染した細胞および感染していない細胞（上記の通りの）から得られた細胞可溶化液に対して試験するための抗体の供与源とした。当技術分野において周知の方法に従ってウエスタンブロットを行った。
【０２３２】
感染したおよび感染していない正常ドナー末梢血に由来するマクロファージの一定分量（2×106細胞）を、0.5mlの試料緩衝液（25%グリセロール、SDS、2%および0.01%ブロムフェノールブルーを含む62.5マイクロモル濃度のトリス-HCI、pH6.8）中で4分間沸騰した。30マイクロリットルの試料は、4〜15%ポリアクリルアミドゲル（BIO-RAD、Richmond、CA）に充填して、本質的に以前に記載される方法に従って処理した（Ngら、Jimmunol 143：2501-2507（1989））。簡潔に述べると、試料を、100vにおいて、25マイクロモル濃度のトリス、192マイクロモル濃度のグリシン、0.1%のSDS、pH8.3中で1時間泳動した。タンパク質を、90ボルトで1時間、25マイクロモル濃度のトリス、192マイクロモル濃度のグリシン、20%のメタノール転写緩衝液中でニトロセルロース（Scheicher and Schuell, Keene, NH）へ転写した。4℃で一晩、2%の乳汁／PBSでブロッキング後、膜を1/100希釈の患者血漿と30分間反応させ、次いでPBSで洗浄した。次いで、抗ヒトIgGアルカリホスファターゼのPBS溶液（Zymed,San Francisco, CA）を30分間添加して、ブロットをPBSで洗浄した。ビオチン-分子量マーカー（BIO-RAD）の検出は、アビジン-AP（Zymed）とインキュベーションすることによって達成した。タンパク質-抗体バンドの検出は、BCIP／NBT基質（Zymed）を添加することによって行った。
【０２３３】
図9は、感染していない初代マクロファージと比較して、感染したものに特異的に存在するバンドを示す予備的なウエスタンブロット結果を示す。試料は、左から右に次のような順番である：感染した細胞可溶化液プラス検出可能な標識された二次抗体の抗IgG-AP（C(対照のため)、MHRV感染したもの）；感染した細胞可溶化液、患者血漿、および抗IgG-AP（LL）；抗IgG-APおよび感染していない細胞（C、感染していないMHRV）；ならびに、感染していない細胞、患者血漿（LL）、および抗IgG-AP（LL、感染していないMHRV）。
【０２３４】
患者の血漿は、MHRV感染細胞とのみ反応した。観察されたタンパク質バンド（68kDおよび80kD）の大きさは、タンパク質のグリコシル化によるものであると考えられる。骨髄移植後数か月経過した患者における免疫応答は、一般に全てT細胞非依存的であるので、観察されるウエスタンブロットバンドは、MHRVタンパク質のグリコシル化された形態（すなわち、エンベロープ）の可能性がある。
【０２３５】
実施例8：ウイルス培養
MHRVは、上記したものと同様の方法で、凍結した組織および／または新しい組織から単離する。原発腫瘍物質／血液に由来するCD14+を1月間（細胞選別から）共培養した後、接着したマクロファージを組織培養フラスコから掻爬し、ペレットにして、電子顕微鏡分析のために調製する。これらの細胞からの上清を凍結して、25-45%のショ糖段階勾配のショ糖密度のバンドである、DNA-ase耐性RNAに結合した粒子の存在を評価する。MHRVを同定するためにプライマーを利用し、図1にて説明したような、粒子に結合したビリオンの存在を同定するために、代表する一般的なプロテアーゼおよびポリメラーゼ縮重プライマーセットを使用した。上清は、陽性の結果が得られるいずれかの共培養から単離して、上清を0.22のミクロンフィルターに通して濾過し、初代培養に再接種して、1ヵ月培養した。同様のEMおよびウイルスRNAの特徴を、潜在的な新規レトロウイルスエレメントのさらなる特徴づけ／クローニングの前に記録する。
【０２３６】
実施例9：MHRVに基づいた配列を使用する分子疫学
MHRV gag遺伝子はMHRVのみを認識する特異的なPCRプライマーセットの開発が可能な独特な配列を有するため、広範な慢性疾病状態の患者からの血液においてMHRV特異的な配列を同定するための分子疫学研究がなされている。発見されるその他の新規のレトロウイルス因子は、MHRVのために以下に定義したとおりの特徴づけ研究と同様の方法で、特徴づけられる。
【０２３７】
患者材料の供与源：患者に由来する検体において、MHRV特異的な配列および／または抗体反応性の存在を評価する。分子疫学研究の初期の焦点は、一連のリンパ腫患者組織ならびにMHRV特異的な配列の存在する患者に由来する血液細胞の評価である。MHRV特異的な配列がリンパ腫の患者のサブセット内にあると同定される場合は、MHRVの役割およびその伝播能についての広範な研究を行う。
【０２３８】
MHRV特異的な配列について評価したその他の検体における分類は、過去10年以上にわたる様々な刊行物において見出されるHERV特異的な配列に関連した疾患を含む。これらは、多発性硬化症、奇形癌腫、乳癌、および様々な自己免疫性疾患の患者からの検体を含む。これらの材料の分類の全てが現在利用でき、利用できる場合は組織、ならびにPBMCを、MHRV特異的な配列の存在について評価する。正常なドナーからの対照検体は血液バンクから得られる。この初期スクリーンの結果を解析した後、その他の疾病状態からのさらなる対照検体を評価する。また、これらの原発性病理組織は、潜在的なその他のMHRV関連配列の供与源として役立ち、種々の慢性疾患環境におけるMHRV異種性の程度を決定するために、これをクローニングして配列決定を行う。
【０２３９】
実施例10：インビトロにおけるMHRV増殖特徴の特徴づけ
MHRVは原発性外套細胞リンパ腫腫瘍組織から最初に単離された。もっぱら腫瘍関連マクロファージに関連していると思われる発現（電子顕微鏡法、示さず）は、初代マクロファージ培養においてインビトロで最初に単離された。上記のように、感染した培養のみが、粒子結合RNA単離体ショ糖結合アッセイ法において、MHRV特異的な配列を産生する証拠を示した。このアッセイ法は、典型的には完全なウイルス粒子にパックされていない内在性レトロウイルスRNAが混入することと比較して、実際にビリオンに結合したパックされたMHRV配列間を区別することができる。
【０２４０】
様々な細胞タイプにおけるMHRVの詳細な宿主範囲解析を行う。宿主範囲研究は、ヒト起源の様々な腫瘍株、正常細胞（リンパ球、繊維芽細胞、血管内皮細胞）、およびマウス、ラット、ウサギ、ウシを含む様々な動物細胞群、ならびに非ヒト細胞群のいずれかにおいてMHRV複製するはずであるその他の種々の動物種の細胞株に感染させる試みにおいて、陽性対照として初代培養マクロファージを使用することを含む。
【０２４１】
最終目的は、将来の研究のための疾患モデルを開発するために、MHRVが非ヒト細胞に感染させることができるかどうかを決定することである。MHRVウイルスの産生は、PCRによってウイルス特異的なgag配列をトラッキングすることよってモニターされる。インビトロにおける増殖目的のために、MHRVを初代ヒトマクロファージ中で培養し続け、全てのウイルス単離研究は、同じドナーからの感染させたマクロファージ 対 感染していないマクロファージにおいて、精製処理中にMHRV特異的なタンパク質を追跡するために並行して処理した調製物を用いて行われる。
【０２４２】
実施例11：MHRVタンパク質の特徴づけ
MHRVは、ヒト内在性レトロウイルスに非常に関連する。MHRV特異的なタンパク質の研究により、潜在的な複製適格性ヒト内在性レトロウイルス・タンパク質プロフィールがどのように見え得るかについての第1の見解が得られるものと考えられる。上記のように、HERV-K109関連のプロテアーゼ、ポリメラーゼ、およびエンベロープ遺伝子においてオープン・リーディング・フレームが観察された。
【０２４３】
慢性的に感染したマクロファージにおいて産生されるMHRVを放射性アミノ酸で標識して、これらの細胞によって産生されたレトロウイルスを、ショ糖勾配精製技術を介して単離した。MHRV特異的なタンパク質は、非特異的な対照として機能する同じドナーの非感染細胞由来の粒子に結合した放射性タンパク質を用いる、2次元ゲル電気泳動を利用して視覚化される。
【０２４４】
これは、MHRV由来の成熟したレトロウイルス・タンパク質産物の可視化を提供し、HIVもしくはHTLV-1などの様々なその他のレトロウイルスに感染した患者、または単に広く交差反応する能力のある抗体を有する患者（様々な自己免疫性疾患の患者など）と比較した、MHRVに感染した患者（MHRV特異的なプライマーを使用するDNA PCR増幅研究によって検出）における抗体反応性を研究するための地図として役立つと考えられる。また、このアプローチは、これらがパッケージ複製適格性形態で存在するので、これらの転写／翻訳後修飾を有する天然のレトロウイルス・タンパク質のための潜在的な精製スキームとして役立ち得る。
【０２４５】
実施例12：リンパ腫におけるMHRVの検出
304塩基対のプライマーを使用して、上記の通りに、患者から単離した一連の検体からDNAを増幅した。以下のものは陰性であった：
a）異なる正常な血液バンクドナー（Stanford）由来の6つの正常マクロファージ培養、全て感染してない；
b）2つのAIDSリンパ腫組織およびこれらの未関与の脾臓（4標本）；
c）4つの正常な末梢血DNA調製物、HIV陰性；および、
d）2つの非AIDS濾胞性リンパ腫。
【０２４６】
以下の5つの標本は、陽性であった：
1）MT：AIDS腹水大細胞リンパ腫；
2）S93-268102：非AIDS濾法性リンパ腫；
3）UV：オリジナルのMHRV RNA配列；
4）S92-4336：非AIDS濾胞性リンパ；および、
5）BR：AIDS大細胞リンパ腫。
【０２４７】
特に、ソートされたCD14細胞を使用し、マウスリンパ腫細胞をインビボにおいて拡大し、MT（MHRV+）リンパ腫マクロファージによって部分的に促進することにより、SCIDマウスにおいて高純度リンパ腫を確立するために、MTリンパ腫（前段落の1））を前もって使用した。
【０２４８】
上記のそれぞれの1〜5から増幅されたGAG配列を配列決定し、これらの配列をMHRV GAG（UV）の配列と比較した。LL組織のMHRV GAG配列は、MHRVが元々同定された外套細胞リンパ腫組織DNAを表す。配列のアラインメントを図10に提供する。
【０２４９】
LL組織、MTリンパ腫、およびS93-268102の304bpのPCR産物のDNA配列は、同一であった。UV、S92-4336、およびBR単離体の304bpのPCR産物のDNA配列は、それぞれ1ヌクレオチドがLL配列とは異なる（それぞれ、304のセグメントのヌクレオチド232（Aに対するG）；ヌクレオチド89（ヌクレオチド89、Aに対するG）；およびヌクレオチド168（Cに対するT））。
【０２５０】
これらのデータは、MHRVが、個々の腫瘍結合単離体間で保存された独特の遺伝的配列を含むヒトリンパ腫関連ウイルスであることを示す。
【０２５１】
本発明は、その特異的な態様に関して記載されているが、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく種々の変化がなされていてもよいこと、および等価物が置換されてもよいことは、当業者により理解されるはずである。さらに、特定の状況、物質、化合物、工程、工程段階、または段階に対し、本発明の目的、趣旨、および範囲に適応させるために多くの改変がなされていてもよい。全てのこのような改変は、本明細書に添付した請求項の範囲内であることが企図される。
【図面の簡単な説明】
【０２５２】
【図１】MHRVゲノム配置、ならびにHERV-K109に対して相同な領域、MHRV GAGをコードする領域を増幅するために使用したプライマーの相対的な位置、ならびにプライマーの配列およびHERV-8およびHERV-9プライマーを使用して作製された304bpのPCR増幅産物を示す概略図である。MHRVゲノム配置および相同領域を示す概略図に沿った数は、MHRVゲノムにおける対応するヌクレオチド残基部位を示す。
【図２】対照（Normals）、AIDSリンパ腫（HIV非ホジキンリンパ腫）、および非HIVリンパ腫の被検者から単離された末梢血単核細胞におけるPCNAレベルを示すグラフである。
【図３】非HIVリンパ腫を有する被検者の濾胞樹状細胞であると推定される細胞の非定型の有糸分裂の図と共に、濾胞性リンパ腫を示す写真である。
【図４】MHRVを単離した外套細胞リンパ腫の組織を示す写真である。
【図５】感染したマクロファージにおけるMHRVの透過型電子顕微鏡像の写真である。
【図６】MHRVゲノムをクローニングするために使用した方法を詳述する概略図である。
【図７】MHRV GAG特異的なプライマーおよびAIDS非ホジキンのリンパ腫（AIDS-NHL）および陽性対照としてのもとの外套細胞リンパ腫DNA（MCL-1）に由来する核酸を使用する、PCR増幅の結果を示す写真である。A=AIDS NHL DNA;B=MCL-1DNA。
【図８】単離されたMHRV粒子を感染した初代マクロファージ培養から単離したRNAに対する、MHRV GAG特異的なプライマーを使用したPCR増幅の結果を示す写真である。
【図９】MHRV感染患者からの血漿抗体を用いない（C=対照）および用いる（LL）、MHRV感染細胞およびMHRV非感染細胞のウエスタンブロットを示す。血漿抗体の結合を検出するために、抗IgG-AP抗体を使用した。
【図１０】304bp MHRV gagセグメント内の異なるリンパ腫から生じたPCR産物のDNA配列のアラインメント（配列番号:12〜14）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年1月31日(2003.1.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
連邦によって後援された調査に関する陳述
本発明は、国立衛生研究所によって与えられた助成金番号U01：CA66529およびCA67381の下に政府支援を伴ってなされた。政府は、本発明に対して一定の権利を有し得る。




【国際調査報告】
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