(57)【要約】本発明は、ＮＴＢ−Ａと称される新規なタンパク質、それをコードしている核酸分子、およびその使用に関するものである。本発明は、ナチュラルキラー細胞の活性を、ＮＴＢ−Ａの活性をインビトロ、エキソビボまたはインビボで調節することによって調節する方法にも関するものである。本発明は、活性化合物を、ＮＴＢ−Ａもしくはそのフラグメント、またはそれをコードしている核酸、または該ポリペプチドを発現する組換え宿主細胞を用いてスクリーニングする方法も含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）アミノ酸配列番号２を含むポリペプチドをコードしている核酸、
（ｂ）核酸（ａ）とか、または核酸（ａ）の連続する少なくとも３０個のヌクレオチドを含むその部分とハイブリダイズする核酸、
（ｃ）核酸分子（ａ）または（ｂ）の相補鎖、および
（ｄ）核酸分子（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の連続する少なくとも９個のヌクレオチドを含むフラグメント
から選ばれる核酸分子。
【請求項２】
アミノ酸配列番号２を含むポリペプチド、または配列番号２の連続する少なくとも５個のアミノ酸残基を含むポリペプチドをコードしている配列を含む、請求項１記載の核酸分子。
【請求項３】
ヒトＮＴＢ−Ａタンパク質をコードしている、請求項１または２記載の核酸分子。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸分子に相補的であり、それと特異的にハイブリダイズする、核酸プローブ。
【請求項５】
少なくともその一方のプライマーが、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸分子に相補的であり、それと特異的にハイブリダイズする、一対の核酸プライマー。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項７】
請求項６記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸分子がコードしているアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項９】
アミノ酸配列番号２を含むポリペプチド、または配列番号２の連続する少なくとも５個のアミノ酸残基を含むそのフラグメント。
【請求項１０】
請求項６記載のベクターを含み、かつ、請求項８または９記載のポリペプチドを発現する宿主細胞。
【請求項１１】
ポリペプチドを発現する細胞を調製する方法であって、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸分子、または請求項６記載のベクターをインビトロで細胞に導入する工程と、該ポリペプチドを発現する細胞またはその子孫を選択する工程とを含む方法。
【請求項１２】
請求項８または９記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項１３】
抗体を調製する方法であって、請求項８または９記載のポリペプチドをヒトではない哺乳動物に注入する工程と、該哺乳動物の血清または抗体産生細胞を回収する工程とを含む方法。
【請求項１４】
化合物を選択、スクリーニングまたは特徴付ける方法であって、試験化合物を請求項８または９記載のポリペプチドに接触させる工程と、該試験化合物が該ポリペプチドに結合することができる能力を決定する工程とを含む方法。
【請求項１５】
化合物を選択、スクリーニングまたは特徴付ける方法であって、試験化合物を請求項１０記載の宿主細胞に接触させる工程と、該試験化合物が該ポリペプチドに結合することができる能力を決定する工程とを含む方法。
【請求項１６】
化合物を選択、スクリーニングまたは特徴付ける方法であって、試験化合物を、ＮＴＢ−Ａに特異的な抗体の存在下でＮＫ細胞に接触させる工程と、該ＮＫ細胞の細胞溶解活性を測定することによって該試験化合物の活性を決定する工程とを含む方法。
【請求項１７】
化合物を選択、スクリーニングまたは特徴付ける方法であって、試験化合物を、ＮＴＢ−Ａポリペプチドの結合パートナーの存在下で該ポリペプチドに接触させる工程と、該試験化合物が該ＮＴＢ−Ａポリペプチドと該結合パートナーとの相互作用を調整できる受容能力を評価する工程とを含む方法。
【請求項１８】
化合物を選択、スクリーニングまたは特徴付ける方法であって、（ｉ）試験化合物がＮＴＢ−Ａポリペプチドに結合できる能力を決定する工程と、（ii）工程（ｉ）で選ばれた試験化合物が、ＮＫ細胞が介在する標的細胞の溶解を調節（たとえば遮断、緩和または刺激）できる能力を決定する工程とを含む方法。
【請求項１９】
対象者における免疫機能を調節する医薬の製造におけるＮＴＢ−Ａポリペプチドの活性を調節する化合物の使用。
【請求項２０】
対象者におけるＮＫ細胞の活性を調節する医薬の製造におけるＮＴＢ−Ａポリペプチドの活性を調節する化合物の使用。
【請求項２１】
ＮＴＢ−Ａの活性を調節する化合物と、薬学的に許容され得るビヒクルまたは担体とを含む医薬組成物。
【請求項２２】
ＮＴＢ−Ａポリペプチドを調節する化合物と、２Ｂ４受容体を調節する化合物とを、併用、逐次使用または分離使用のために含む製剤組成物。
【請求項２３】
ＮＴＢ−Ａ活性を阻害または低減する化合物、好ましくは抗体と、２Ｂ４活性を阻害または軽減する化合物、好ましくは抗体とを含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
対象者における機能不全（またはそれを発症する危険性）を検出する方法であって、該対象者に由来するサンプル中のＮＴＢ−Ａ遺伝子もしくはＲＮＡの突然変異もしくは変化の存在を決定する工程、またはＮＴＢ−Ａポリペプチドの存在もしくは量を決定する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＴＢ−Ａと称される新規なタンパク質、それをコードしている核酸分子、およびその使用に関するものである。本発明は、対象者における免疫応答を、ＮＴＢ−Ａの活性をインビトロ、エキソビボまたはインビボで調節することによって調節する方法にも関するものである。本発明は、免疫細胞、特にナチュラルキラー細胞、Ｔリンパ球および／またはＢリンパ球の活性を、ＮＴＢ−Ａの活性をインビトロ、エキソビボまたはインビボで調節することによって調節する方法にも関するものである。本発明は、活性化合物を、ＮＴＢ−Ａもしくはそのフラグメント、またはそれをコードしている核酸、または該ポリペプチドを発現する組換え宿主細胞を用いてスクリーニングする方法も含む。
【背景技術】
【０００２】
宿主防衛におけるヒトＮＫ細胞の役割を我々が理解するのに、最近、重要な前進が遂げられた。進歩は、主として、ＮＫ細胞表面で発現され、ＮＫ細胞の機能を調節している、一連の受容体の発見の結果として生じている。これらの受容体のいくつかは、正常細胞表面のＭＨＣクラスＩ分子の発現を監視することによって、ＮＫ細胞を阻害する［１〜３］。その他の受容体は、ＮＫ細胞の活性化の原因となっている［４］。これは、ＮＫ細胞が、ウイルス感染または腫瘍形質転換の結果として、ＭＨＣクラスＩ分子を発現しないか、または不適切な量のそれを発現する細胞と作用し合うときに生じる［５］。ヒトでは、異なるトリガリング（triggering）受容体が特定されている。ＮＫｐ４６［６］、ＮＫｐ３０［８］およびＮＫｐ４４［９、１０］は、集合的に「自然細胞傷害性受容体」（ＮＣＲ）と呼ばれ［１１］、ＮＫ細胞によって選択的に発現され、自然細胞傷害性の誘導の際に互いに協力する。ＮＣＲは、結合表面発現を特徴とし、それらの表面密度と、ＮＫ細胞が様々な腫瘍を死滅させることができる能力との間に、直接の相関関係が存在する［１２］。ＮＣＲは、すべて、Ｉｇスーパーファミリー（ＩＧ−ＳＦ）の成員であり、低い程度の類似性を互いに示し、ＤＣ３ζ、ＦｃεＲＩγおよびＫＡＲＡＰ／ＤＡＰ１２を包含する、異なるシグナル変換アダプタータンパク質と結合する［８〜１０］。
【０００３】
ＮＫ細胞によって発現されるもう一つの触発受容体は、ＮＫＧ２Ｄで表され、ヒト第１２染色体上の「ＮＫ遺伝子複合体」内でコードされるＣ型レクチン表面分子である［１３］。ストレス誘導性のＭＩＣＡ／Ｂ分子［１４］が標的細胞で認識されると、ＮＫＧ２Ｄは、ＮＫが介在する細胞傷害性を強く増強する［１４、１５］。ＮＣＲとは異なり、ＮＫＧ２Ｄは、実質的にすべてのＴＣＲ−γ／δ＋ばかりでなく、ＣＤ８ＴＣＲ−α／β＋細胞によっても発現される。その機能は、ＤＡＰ１０［１６］またはＫＡＰ１０［１７］と呼ばれる、新たに特定されたシグナリングサブユニットとの会合を必要とする。最近示されたとおり、ＮＫＧ２Ｄは、腫瘍細胞溶解におけるＮＣＲの役割を補完するが、その相対的関与は、分析された標的および／またはエフェクター細胞の種類にもっぱら依存する［１５］。
【０００４】
注目すべきことに、ＮＫ細胞の最適の触発は、２Ｂ４と呼ばれるもう一つの分子（ＣＤ２４４：参考文献１８〜２０）の機能を必要とし得る。この分子は、ＮＫ細胞ばかりでなく、単球、およびＣＤ８Ｔ細胞のサブユニットによっても発現される。ＮＫ細胞では、２Ｂ４のｍＡｂ介在架橋結合またはＣＤ４８（すなわち２Ｂ４のリガンド）によるその結合が、細胞溶解活性の増強を招く［１８〜２２］。クローンレベルでの分析は、この効果が、高いＮＣＲ表面密度を発現するＮＫ細胞（ＮＣＲ高輝度）に限定されることを明確に示した。その上、ＮＣＲのｍＡｂ介在調整は、ＮＫ細胞の２Ｂ４結合不応答を招くが、その表面発現は、影響されない。したがって、２Ｂ４がＮＫ細胞活性化を誘導できる能力は、ＮＫｐ４６を包含する主な触発受容体の同時結合に依存するように思われる。これは、２Ｂ４が、真の受容体としてよりも共受容体として機能し得るという意見［２３］を裏付ける。２Ｂ４は、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ８４、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭとも呼ばれる）およびＣＤ２９９（Ｌｙ９）も包含する、Ｉｇ−ＳＦのＣＤ２サブファミリーの一員である［２４］。２Ｂ４は、その細胞外部分の、膜遠位ＩｇＶドメインおよび膜近位ＩｇＣ２ドメインを特徴とする。この貫膜領域は、免疫のチロシンに基づく活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を担持するシグナル変換ポリペプチドとの会合に関与する、荷電アミノ酸を欠く［２１、２２、２５〜２７］。興味深いことに、細胞質尾部は、４個のチロシン基盤モチーフ（ＴｘＹｘｘＩ／Ｖ）を含み、これが、過バナジン酸ナトリウム処理の際にリン酸化［２７、２８］、または抗２Ｂ４ｍＡｂによる細胞触発［２９］を生じる。異なるポリペプチドが、２Ｂ４と会合し、２Ｂ４介在シグナル変換経路に参加することが示されている。このように、チロシンリン酸化の際は、２Ｂ４は、Ｓｒｃ相同性２ドメイン含有タンパク質（ＳＨ２Ｄ１Ａ；参考文献２７および２８）と呼ばれ、ＳＬＡＭ関連タンパク質（ＳＡＰ［３０］）とも称される、小さい細胞質ポリペプチドと会合する。いずれのＳＨ２含有ホスファターゼ（ＳＨＰ）が２Ｂ４に結合するのかについては、なおも論議が存在する。２Ｂ４／ＳＨＰ−２会合は、細胞トランスフェクション体で記載されているが［２７］、正常なＮＫ細胞では、２Ｂ４／ＳＨＰ−１会合のみが検出できたにすぎない［２８］。最近、正常ＮＫ細胞で、２Ｂ４は、Ｔ細胞活性化用リンカー（ＬＡＴ［２９］）と構成的に会合することが示されている。２Ｂ４のｍＡｂ介在架橋結合は、ＬＡＴのチロシンリン酸化、ならびにＰＬＣγおよびＧｒｂ２細胞質内シグナリング分子の動員を招く［２９］。
【０００５】
最近、Ｘ染色体関連リンパ球増殖性疾患（ＸＬＰ［２８、３１、３２］）に罹患した個体で、２Ｂ４の劇的に変化した機能が検出された。ＸＬＰは、遺伝性の重篤な免疫不全であって、ＥＢＶ感染が劇症伝染性単核症またはリンパ腫を生じるのを制御できないことを特徴とする［３３、３４］。ＸＬＰの遺伝学的基盤、すなわちＳＨ２Ｄ１Ａコーディング遺伝子の致死的な突然変異［３０、３５、３６］が特定されている。これらの突然変異のため、ＸＬＰ−ＮＫ細胞では、２Ｂ４は、ＳＨ２Ｄ１Ａとは会合できないが、ＳＨＰ−１とは会合し、（活性化ではなく）阻害性シグナルを仲介する［２８］。したがって、ＥＢＶ感染細胞で高密度に発現されるＣＤ４８との２Ｂ４の結合は、ＮＫ介在細胞傷害性の急激な阻害を招く。
【０００６】
本発明は、ＮＴＢ−Ａと呼ばれる新規なＮＫ細胞表面分子の特定、クローニングおよび機能特性記述から生じた。
【０００７】
ＮＴＢ−Ａは、６０kDの糖タンパク質であって、ヒトＮＫ、ＴおよびＢリンパ球によって発現される。ＮＴＢ−Ａのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を介しての架橋結合は、ＮＫ介在細胞傷害性の誘導を招く。ＮＫ細胞活性化の際に共受容体として機能する２Ｂ４（ＣＤ２４４）に似て、ＮＴＢ−Ａも、高表面密度の自然細胞傷害性受容体を発現するＮＫ細胞でのみ細胞溶解活性を触発するにすぎない。これは、ＮＴＢ−ＡがＮＫ細胞活性化の過程で共受容体として機能し得ることを示している。ＮＴＢ−Ａ分子をコードしているｃＤＮＡの分子クローニングは、ＣＤ２サブファミリーに属する免疫グロブリンスーパーファミリーの新規な一員を明らかにした。ＮＴＢ−Ａは、その細胞外部分の、遠位のＶ型ドメインおよび近位のＣ２型ドメイン、ならびに３個のチロシン基盤モチーフを含む細胞質部分を特徴とする。ＮＴＢ−Ａは、チロシンリン酸化を受け、Ｓｒｃ相同性２ドメイン含有タンパク質（ＳＨ２Ｄ１Ａ）はもとより、ＳＨ２ドメイン含有ホスファターゼ（ＳＨＰ）とも会合する。重要なことに、Ｘ染色体関連リンパ球増殖性疾患（ＸＬＰ）の患者に由来するＮＫ細胞の分析は、ＳＨ２Ｄ１Ａタンパク質の欠如が、２Ｂ４ばかりでなくＮＴＢ−Ａの機能にも多大に影響していることを示した。したがって、ＸＬＰ−ＮＫ細胞では、ＮＴＢ−Ａは、活性化シグナルよりも阻害性シグナルを仲介する。これらの阻害性シグナルは、ＮＴＢ−Ａと、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）に感染した標的細胞で発現される、依然として定義されていないリガンドとの相互作用によって誘導される。その上、ｍＡｂを介してのＮＴＢ−Ａの遮蔽は、部分的には、この阻害効果を逆転するが、標的細胞の溶解の最大回復は、２Ｂ４とＮＴＢ−Ａとの双方を同時に遮蔽したときに達成することができる。したがって、ＮＴＢ−Ａの変化した機能は、ＸＬＰ−ＮＫ細胞がＥＢＶ感染標的細胞を死滅させないことに重要な役割を果たしているらしい。
【発明の開示】
【０００８】
本発明の目的は、ＮＴＢ−Ａというポリペプチドをコードしている核酸分子にある。
【０００９】
本発明のさらに一つの態様は、単離されたＮＴＢ−Ａポリペプチドにある。
【００１０】
本発明のさらに一つの態様は、ＮＴＢ−Ａポリペプチドに結合する抗体である。
【００１１】
本発明のさらにもう一つの態様は、対象者における免疫応答を調節する方法であって、ＮＴＢ−Ａの活性を調節する化合物を対象者に投与する工程を含む方法である。
【００１２】
本発明は、試験化合物がＮＴＢ−Ａの活性を調節できることを決定する工程を含む、化合物をスクリーニングする方法にも関するものである。
【００１３】
本発明は、ＮＴＢ−Ａの活性を調節する化合物と、薬学的に許容され得る賦形剤または担体とを含む製剤組成物にも関するものである。
【００１４】
本発明は、対象者における機能不全を診断する方法であって、ＮＴＢ−Ａの遺伝子またはＲＮＡにおける突然変異または変化の存在を決定する工程、またはＮＴＢ−Ａポリペプチドの存在もしくは量を決定する工程を含む方法にも関するものである。
【００１５】
本発明は、免疫細胞、特にＮＫ細胞、Ｔ細胞および／またはＢ細胞の活性が関与する病理学を処置もしくは診断するのに特に適している。本発明は、ＮＫ細胞の活性が関与する病理学、たとえばウイルス感染、腫瘍その他の増殖性疾患、自己免疫疾患等々を処置または診断するのに特に適している。本発明は、例として、Ｘ染色体関連リンパ球増殖性疾患の患者を治療するのに用いることができる。
【００１６】
核酸分子
本発明の特定の態様は、
（ａ）アミノ酸配列番号２を含むポリペプチドをコードしている核酸、
（ｂ）核酸（ａ）とか、または核酸（ａ）の連続する少なくとも３０個のヌクレオチドを含むその部分とハイブリダイズする核酸、
（ｃ）核酸分子（ａ）または（ｂ）の相補鎖、および
（ｄ）核酸分子（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の連続する少なくとも９個のヌクレオチドを含むフラグメント
から選ばれる核酸分子である。
【００１７】
特定の実施態様では、本発明は、アミノ酸配列番号２を含むポリペプチド、または配列番号２の連続する少なくとも５個のアミノ酸残基を含むポリペプチドをコードしている配列を含む、核酸分子に関するものである。
【００１８】
本発明は、上記に定義されたとおりのヒトＮＴＢ−Ａタンパク質またはポリペプチドをコードしている、いかなる核酸分子も包含する。
【００１９】
該核酸分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子であることができる。ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡまたは合成もしくは半合成ＤＮＡ、たとえば、イントロンのような付加配列、偏らせたコドン等々を含むものであることもできる。該核酸は、慣用のいかなる手法、たとえば人為的な合成、クローニングまたはそれらの組合せによって調製してもよい。
【００２０】
好適である具体的な実施態様は、配列番号１を含む核酸もしくはその連続する少なくとも９個のヌクレオチドを含む一部分、またはそれらの相補鎖である。
【００２１】
示したとおり、本発明は、アミノ酸配列番号２を含むポリペプチドをコードしている核酸、または核酸の連続する少なくとも３０個のヌクレオチドを含むその一部分とハイブリダイズする、核酸分子を包含する。ハイブリダイゼーションは、緊縮または非緊縮条件のいずれか、好ましくは緊縮条件下で実施することができる。代表的には、包含される核酸は、下記の条件下で上記の配列とハイブリダイズするものである：５０％ホルムアミド中４２℃での温置、５ｘＳＳＰＥ、５ｘデンハート溶液、０．１％ＳＤＳ（１ｘＳＳＰＥは、０．１５MＮａＣｌ、１０mMＮａＨ2ＰＯ4、１．３mMＥＤＴＡで構成される、pH７．４）。緊縮条件は、参考文献３７にも記載されている。該核酸は、コーディング配列全体とか、または示したとおり、３０個の連続ヌクレオチドを含む、その少なくとも一部分にハイブリダイズしなければならない。そのような長さは、ハイブリダイゼーションの高い特異性を確保すると考えられる。ハイブリダイズする核酸は、好ましくは、受容体機能を有するポリペプチドまたはその一部をコードしている。
【００２２】
上記核酸分子の好適なフラグメント（ｄ）は、連続する少なくとも１５個のヌクレオチド、はるかに好ましくは少なくとも２１個のヌクレオチドを含む。
【００２３】
上記核酸分子は、ＮＴＢ−Ａポリペプチドをインビトロ、エキソビボまたはインビボで製造して、適切ないかなる細胞内でも、たとえばプローブまたはプライマーとして、核酸を増幅するのに用いてよい。これらの核酸は、アンチセンス分子として（またはアンチセンス分子を設計するために）用いて、細胞内でか、インビトロ、エキソビボまたはインビボでのＮＴＢ−Ａの発現を調節してもよい。
【００２４】
因みに、本発明の目的は、上記に定義されたとおりの核酸分子に相補的であり、かつ特異的にハイブリダイズする核酸プローブにある。該プローブは、好ましくは、一本鎖分子であって、好ましくは９〜約３００個のヌクレオチドを含む。該プローブは、ＮＴＢ−Ａポリペプチドをコードしている完全な核酸配列を含み得る。該プローブは、変異体、突然変異体または欠失体に特異的であり、サンプル中のそのような種を特異的に検出することができる。該プローブは、放射性、酵素性、蛍光性、発光性、化学的等々のような、慣用のいかなる手段によって標識化してもよい。該プローブは、サンプル中のＮＴＢ−Ａの遺伝子またはＲＮＡの存在、特にサンプル中のＮＴＢ−Ａ遺伝子またはＲＮＡにおける突然変異もしくは変化の存在を検出するのに用いることができる。
【００２５】
本発明は、一対の核酸プライマーであって、該対の一方のプライマーが、上記に定義されたとおりの核酸分子に相補的であり、それと特異的にハイブリダイズする、一対の核酸プライマーも包含する。そのような一対のプライマーは、サンプル中で、ＮＴＢ−Ａをコードしている遺伝子またはＲＮＡの全部もしくは一部を増幅するのに用いることができる。増幅は、実施例に記載されたとおり、ＰＣＲによってか、またはその他公知のいかなる手法によっても実施することができる。該プライマーは、好ましくは、長さが約５０ヌクレオチド未満、代表的には長さが１０〜５０ヌクレオチドの一本鎖核酸分子である。
【００２６】
アンチセンス分子は、ＮＴＢ−Ａの遺伝子またはＲＮＡに特異的にハイブリダイズし、その転写または翻訳を阻害もしくは低減する、いかなる核酸でもある。該アンチセンスは、一本鎖または二本鎖の、ＤＮＡもしくはＲＮＡであってよく、好ましくは、上記のとおりの核酸配列の一部、代表的にはその少なくとも３０ヌクレオチドを含んでよい。
【００２７】
ベクター
本発明は、上記に定義されたとおりの核酸分子を含むいかなるベクターにも関するものである。該ベクターは、いかなるプラスミド、ファージ、エピソーム、人工染色体、ウイルス等々であってもよい。代表的な例は、プラスミドベクター、たとえば、商業的に入手できるプラスミド（ｐＵＣ、ｐＢＲ３２２、ｐｃＤＮＡ等々）に由来するものを包含する。その他の好適なベクターは、ウイルス、特に組換え（複製欠陥のある）ウイルス、たとえば、レトロウイルス、バクロウイルス、レンチウイルス、ＡＡＶ、アデノウイルス、ヘルペスウイルス等々に由来するそれである。該ベクターは、慣用の手法によって、たとえば、ＮＴＢ−Ａの核酸分子をベクターの適切なクローニング部位に結合することによって調製することができる。さらに、該ベクターは、調節配列、たとえばプロモーター、ターミネーター、エンハンサー、サイレンサー等々、複製起点、マーカー遺伝子等々を含んでもよい。プロモーターの代表的な例は、構成的であるか、または調節されたか、もしくは組織選択的である発現を許すプロモーター、細胞、ウイルスまたは合成起源の弱いか、もしくは強いプロモーター、たとえばＲＶＳ−ＬＴＲ、ＳＶ４０−ＩＥ、ＣＭＶ−ＩＥプロモーター、ドメスティック遺伝子（ＰＧＫ等々）のプロモーター、細菌またはファージ（Ｔ７、Ｌａｃ、Ｔｒｐ等々）のプロモーター等々を包含する。
【００２８】
該ベクターは、本発明の核酸をインビトロ、エキソビボまたはインビボで発現するのに用いることができる。特に、該ベクターは、遺伝子治療プログラムにおいて、細胞内、インビトロまたはエキソビボはもとより、インビボで直接、ＮＴＢ−Ａポリペプチドを調製するのに用いることができる。
【００２９】
ポリペプチド
本発明のもう一つの目的は、ＮＴＢ−Ａポリペプチドである。本発明の前後関係においては、ＮＴＢ−Ａポリペプチドは、配列番号２を含むいかなるポリペプチドはもとより、そのいかなる変異型、誘導体または相同体も含んで、それらの天然に産するいかなる誘導体、または様々な哺乳動物種（齧歯類、ウマ、ブタ等々を包含）から単離された相同体も包含する。変異型は、より一般的には、配列番号２と比較して、一つまたはいくつかのアミノ酸の、単独でか、もしくは様々な組合せによる、突然変異、欠失、挿入および／もしくは置換を包含する、修飾を有するいかなるポリペプチドも包含する。より好ましくは、ＮＴＢ−Ａポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列またはそのフラグメントと７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の同一性を有するポリペプチドである。同一性は、公知の方法、および商業的なコンピュータプログラム、たとえばＣＬＵＳＴＡＬまたはＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩ）を用いて決定することができる。様々な検索また整列パラメーターを用いてもよい。好適実施態様では、アミノ酸（または核酸）の同一性の百分率は、ＣＬＵＳＴＡＬ−Ｗというプログラム（Compugen）を用いて決定する。
【００３０】
具体的な実施態様では、本発明は、アミノ酸配列番号２を含むポリペプチド、または配列番号２の連続する少なくとも５個のアミノ酸残基を含むそのフラグメントに関するものである。
【００３１】
もう一つの具体的な実施態様では、本発明は、第２６６位に余分なアラニン残基を有するアミノ酸配列番号２を含むポリペプチド、または連続する少なくとも５個のアミノ酸残基を含むそのフラグメントに関するものである。本発明者らは、実際に、配列番号２の第２６６位にアラニン残基をコードしている余分なコドン（ＣＡＧ）を含む、ＮＴＢ−Ａの対立遺伝子イソ型を特定した。そのため、得られるＮＴＢ−Ａポリペプチドは、３３２個のアミノ酸を含む。
【００３２】
ポリペプチドフラグメントは、エピトープ、特にＢまたはＴ細胞エピトープ、ポリペプチドの、細胞内の他のタンパク質または分子との相互作用に関与する部分を包含する、ヒトＮＴＢ−Ａの機能性ドメインもしくは部分、リン酸化ドメイン等々を含んでよい。本発明のポリペプチドフラグメントは、一般的には、３００未満のアミノ酸、はるかに好ましくは２５０未満のアミノ酸を含む。
【００３３】
本発明の特定のポリペプチドは、配列番号２の第２２〜第３３１アミノ酸残基を含むポリペプチド、または第２６６位に余分なアラニン残基を有するその変異型である。第２２〜第３３１残基は、成熟ＮＴＢ−Ａポリペプチドに相当する。
【００３４】
本発明のもう一つのポリペプチドは、ＮＴＢ−Ａの単一ペプチド領域、特に配列番号２の第１〜第２１アミノ酸残基を含むポリペプチドである。
【００３５】
本発明のもう一つのポリペプチドは、ＮＴＢ−Ａの細胞外領域、特に配列番号２の第２２〜第２２６アミノ酸残基を含むポリペプチド、または連続する少なくとも５個のアミノ酸を含むそのフラグメントである。より好適なフラグメントは、代表的には、連続する５〜５０個、はるかに好ましくは６〜４０個のアミノ酸を含む。この領域は、ＮＴＢ−Ａと、標的細胞上の推定されるリガンドとの相互作用の原因であり、ＮＴＢ−Ａの活性を調節すること、またはＮＴＢ−Ａ活性のリガンド（内在性リガンドを包含する）もしくはモジュレーターについてスクリーニングすることに特に役立つ。そのサブフラグメントも、同様に用いることができる。
【００３６】
本発明のもう一つのポリペプチドは、ＮＴＢ−Ａの貫膜領域、特に配列番号２の第２２７〜第２４８アミノ酸残基を含むポリペプチド、または連続する少なくとも５個のアミノ酸を含むそのフラグメントである。より好適なフラグメントは、代表的には、連続する５〜２０個、はるかに好ましくは６〜１５個のアミノ酸を含む。
【００３７】
本発明のもう一つのポリペプチドは、ＮＴＢ−Ａの細胞質内領域、特に配列番号２の第２４９〜第３３１アミノ酸残基を含むポリペプチド、または第２６６位に余分なアラニン残基を有するその変異型、または連続する少なくとも５個のアミノ酸を含むそのフラグメントである。より好適なフラグメントは、代表的には、連続する５〜５０個、はるかに好ましくは６〜４０個のアミノ酸を含む。この領域は、ＮＴＢ−Ａと、ＮＫ、ＢまたはＴ細胞による推定されるシグナリング分子もしくは受容体との相互作用の原因であり、ＮＴＢ−Ａの活性を調節すること、またはＮＴＢ−Ａ活性の結合パートナーもしくはモジュレーターについてスクリーニングすることに役立つ。そのサブフラグメントも、同様に用いることができる。因みに、本発明のさらに一つのポリペプチドは、ＮＴＢ−Ａの機能性部分を含むポリペプチド、たとえば、ＳＨ２Ｄ１Ａ結合ドメインまたはチロシン残基、特に配列番号２の第２７１〜第２７６（ＬＥＹＶＳＶ）、第２８２〜第２８７（ＴＶＹＡＳＶ）または第３０６〜第３１１（ＴＩＹＳＴＩ）アミノ酸残基、またはＮＴＢ−Ａの該残基を含む、より大きいポリペプチドフラグメントである。
【００３８】
本発明は、一般的には、上記に定義されたとおりの核酸分子がコードしているアミノ酸配列を含むいかなるポリペプチドにも関するものである。
【００３９】
本発明は、可溶性ＮＴＢ−Ａポリペプチドも包含する。
【００４０】
本発明のポリペプチドは、いかなる異種配列または部分、たとえば安定剤、マーカー、タグ、標的化部分、薬物、サイトカイン、毒素等々に結合してもよい。それらは固体の支持体、たとえばカラム、ビーズ等々に結合または固定化してもよい。本発明のポリペプチドは、好ましくは、単離または精製された形態（すなわちその天然の環境にない）をなすか、または組換え宿主細胞から発現される。それらは、その他の活性分子またはアジュバントもしくは溶媒と組み合わせてもよい。該ポリペプチドは、抗体を生成し、免疫応答を調整し、ＮＴＢ−Ａの活性をインビトロ、エキソビボまたはインビボで調節し、ＮＴＢ−Ａ活性等々を調整する化合物についてスクリーニングするのに用いることができる。
【００４１】
宿主細胞
本発明は、上記に定義されたとおりの核酸分子またはベクターを含む宿主細胞にも関するものである。好適実施態様では、該宿主細胞は、上記に定義されたとおりの核酸分子またはベクターを含み、上記に定義されたとおりのポリペプチドを発現する。該ポリペプチドは、好ましくは、該細胞の表面で発現される。該ポリペプチドは、細胞の細胞質内で発現されてよいか、またはいかなる手段によって細胞から放出されてもよい。該ポリペプチドは、特に、それの部分（たとえばＴＭおよび／または細胞質ドメイン）を除去することによって可溶性であるか、または分泌される分子として発現されてよい。
【００４２】
該組換え細胞は、培養できるいかなる細胞、たとえば、細菌、酵母、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物細胞等々を包含する、原核または真核細胞であることもできる。該細胞は、細胞系または初代細胞であってよい。代表的な例は、大腸菌、サッカロミセス属、クライベロミセス属Kluyveromyces、昆虫細胞、哺乳動物繊維芽細胞または胚性細胞、ＨＥＫ、ＣＨＯ、ＣＯＳ、３Ｔ３、２９３等々を包含する。本発明は、特定のいかなる種類の宿主細胞にも限定されることはないと理解すべきである。
【００４３】
好適実施態様では、該宿主細胞は、ヒトＮＴＢ−Ａポリペプチドを自発的には発現しない細胞である。そのような宿主細胞は、好都合には、増大させた選択性を有するスクリーニングアッセイに用いることができる。
【００４４】
本発明のもう一つの目的は、ＮＴＢ−Ａポリペプチドを発現する細胞を調製する方法であって、上記に定義されたとおりの核酸分子またはベクターをインビトロで細胞に導入する工程と、該ペプチドを発現する細胞またはその子孫を選択する工程とを含む方法である。該核酸分子またはベクターの導入は、公知の様々な方法、たとえばＤＮＡ直接転移、脂質介在トランスフェクション、リン酸カルシウム沈澱、電気穿孔等々によって達成し得る。該細胞は、適切ないかなる培地で培養し、慣用のいかなる方法で貯蔵してもよい。
【００４５】
抗体
本発明は、上記に定義されたとおりのポリペプチドに結合する抗体にも関するものである。該抗体は、好ましくは、動物を上記に定義されたとおりのポリペプチド、または上記に定義されたとおりの宿主細胞で感作することによって得られる。因みに、本発明の目的は、抗体を調製する方法であって、上記に定義されたとおりのポリペプチドをヒトではない哺乳動物に注入する工程と、該哺乳動物の血清または抗体産生細胞を回収する工程とを含む方法も包含する。
【００４６】
該抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体はもとより、そのフラグメントおよび誘導体、特に、実質的に同じ抗原特異性を有する該抗体のフラグメントおよび誘導体であってよい。これらは、抗体フラグメント（たとえばＦａｂ、Ｆａｂ’２、ＣＤＲ等々）、ヒト化抗体、多機能抗体、一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）等々を包含する。これらは、動物の感作、および血清（ポリクローナル）または脾臓細胞（適切な細胞系との融合によってハイブリドーマを調製するため）の回収を包含する、慣用の方法に従って調製してよい。
【００４７】
マウス、齧歯類、霊長類、ウマ、ブタ、ウサギ、家禽等々を包含する、様々な種からモノクローナル抗体を調製する方法は、たとえば、Harlowら［Antibodies: A laboratory Manual, CSH Press, 1988］またはKohlerら［Nature 256 (1975) 495］に見出し得る。略述すると、これらの方法は、動物を抗原で感作した後、脾臓細胞を回収し、次いで、これを不死化した細胞、たとえば骨髄腫細胞と融合することを含む。得られるハイブリドーマは、モノクローナル抗体を産生し、限定希釈によって選択して、個々のクローンを単離することができる。
【００４８】
抗体は、たとえばWardら［Nature, 341 (1989) 544］に開示されたとおり、免疫グロブリンの組合せライブラリーの選択によって調製してもよい。
【００４９】
上記に列挙されたとおりの様々な種からポリクローナル抗体を産生する方法は、たとえば、Vaitukaitisら、1971、1971に見出し得る。略述すると、抗原をアジュバント（たとえばフロイントアジュバント）と組み合せ、代表的には皮下注射によって、動物に投与する。血液サンプルを回収し、免疫グロブリンまたは血清を分離する。
【００５０】
Ｆａｂまたは（Ｆａｂ’）２のフラグメントは、プロテアーゼ消化によって、慣用の手法に従って調製してよい。ヒト化抗体は、以前に記載されたとおりに［Jones, 1986］調製することができる.
【００５１】
本発明の好適な抗体は、上記のとおりのＮＴＢ−Ａポリペプチド、好ましくは、配列番号２のポリペプチド、もしくは第２６６位に余分なアラニン残基を有する変異型、またはそのフラグメント、特にＮＴＢ−Ａの細胞外ドメインの全部または一部を含むフラグメントによる感作によって調製される。因みに、本発明の特に好適な抗体は、配列番号２の第２２〜第２２６アミノ酸残基に含まれるエピトープに特異的に結合する（モノクローナル）抗体である。
【００５２】
本発明の最も好適な抗体は、機能性抗体、すなわち、ＮＴＢ−Ａの活性を調節する抗体、より詳しくは、標的細胞とのＮＴＢ−Ａの相互作用を活性化または遮断できる抗体である。そのような抗体は、上記に開示された抗体をＮＫ細胞および標的細胞に接触させ、該抗体がＮＫ介在標的細胞溶解を遮断または活性化できる能力を決定することによって、さらに選択することができる。本発明は、そのような機能性（すなわち遮断性）抗体を調製かつ使用して、免疫細胞の活性を調節できることを示す。
【００５３】
該抗体は、異種部分、たとえば毒素、標識、薬物その他の治療剤に、直接にか、またはカップリング剤もしくはリンカーの使用によるかして、共有結合もしくは非共有結合でカップリングしてよい。標識は、放射性標識、酵素、蛍光標識、磁性粒子などを包含する。毒素は、ジフテリア毒、ボツリヌス毒等々を包含する。薬物または治療剤は、リンホカイン、抗体、アンチセンス、成長因子等々を包含する。
【００５４】
そのような異種部分を用いる方法は、たとえば米国特許第4,277,149号および第3,996,345号明細書に例示されている。
【００５５】
本発明の抗体は、治療および診断の用途を包含する、様々な適用を有し、たとえば、サンプル（たとえば血漿または血清サンプル）中のＮＴＢ−Ａポリペプチドの免疫精製または検出にも用いてよい。特に、以下に記載することになるとおりのスクリーニングアッセイにか、または対象者から回収されたサンプル、代表的には、哺乳動物、具体的にはヒトという対象者からの血液サンプル中のＮＴＢ−Ａポリペプチドの存在（または量）を検出または定量するのに、インビトロで用いることができる。
【００５６】
スクリーニング
本発明は、ＮＫ細胞、およびあり得ることにはＴおよびＢ細胞の活性、ならびに免疫系の調節に関与する新規な分子を提供する。この分子はもとより、対応する核酸、宿主細胞、プラスミドおよびその結合パートナーも、化合物、特に生物学的活性化合物、特に免疫調節およびＮＫ調節の分野のそれについてスクリーニングするのに用いることができる。
【００５７】
特に、本発明は、試験化合物がＮＴＢ−Ａの活性を調節できる能力を決定する工程を含む、化合物のスクリーニングの方法にも関する。本発明の文脈中で、用語「ＮＴＢ−Ａの活性」は、ＮＴＢ−Ａの発現はもとより、ＮＴＢ−Ａポリペプチドの生物学的活性も包含する。したがって、ＮＴＢ−Ａの活性を調節することは、ＮＴＢ−Ａ合成の調節（たとえば、転写、翻訳、転送、細胞膜への輸出、翻訳後修飾等々）はもとより、ＮＴＢ−Ａの生物学的活性の調節（たとえばリガンドとのその相互作用、ＮＴＢ−Ａの架橋結合または内部化、ＮＴＢ−Ａのリン酸化または転移、細胞におけるその他のパートナーとのＮＴＢ−Ａの会合等々）も包含する。
【００５８】
好適化合物は、ＮＴＢ−Ａの活性を選択的に調節する、すなわち、もう一つのＮＫ細胞受容体には基本的に直接干渉しないが、二次的効果が誘導され得るそれである。
【００５９】
特定の実施態様では、この方法は、試験化合物が、
−ＮＴＢ−Ａに結合するか、
−ＮＴＢ−Ａを活性化するか、
−ＮＴＢ−Ａを阻害するか、
−ＮＴＢ−Ａ合成を阻害するか、
−ＮＴＢ−Ａ合成を刺激するか、
−推定されるその内因性リガンドとのＮＴＢ−Ａの結合を調整するか、
−標的細胞とのＮＴＢ−Ａ（またはＮＫ細胞、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、組換え細胞等々のような、ＮＴＢ−Ａを発現する細胞）の相互作用を調整（たとえば遮断または活性化）するか、
−ＮＴＢ−Ａが介在する、ＮＫ細胞によって誘導される標的細胞の溶解を調整（たとえば遮断または活性化）するか、
−ＮＴＢ−ＡとＳＨ２Ｄ１Ａとの相互作用を調整するか、あるいは
−ＮＴＢ−ＡとＳＨＰとの相互作用を調整する
ことができる能力を決定する工程を含む。
【００６０】
特定の実施態様では、本発明は、化合物を選択、スクリーニングまたは特徴付ける方法であって、試験化合物を上記に定義されたとおりのポリペプチドに接触させる工程と、該試験化合物が該ポリペプチドに結合できる能力を決定する工程とを含む方法にある。該ポリペプチドは、細胞によって、特に該細胞の表面で単離されるか、または発現されてよい。
【００６１】
したがって、本発明は、化合物を選択、スクリーニングまたは特徴付ける方法であって、試験化合物を上記に定義されたとおりの宿主細胞（該宿主細胞は、ＮＴＢ−Ａポリペプチドを発現する）に接触させる工程と、該試験化合物が該ポリペプチドに結合できる能力を決定する工程とを含む方法にも関するものである。
【００６２】
試験化合物がＮＴＢ−Ａポリペプチドに結合できる能力は、当技術に公知の様々な手法によって決定してよい。インビトロでは、この結合は、電気泳動、ＳＰＡ、ＦＲＥＴ等々、またはＮＴＢ−Ａポリペプチドの標識化されたリガンドとの競合によって決定してよい。因みに、好適実施態様では、結合は、試験化合物が標識化されたリガンドの結合を調整できる能力を測定することによって決定される。標識化されたリガンドは、たとえば抗体であってよい。
【００６３】
本発明は、化合物を選択、スクリーニングまたは特徴付ける方法であって、試験化合物を上記に定義されたとおりの宿主細胞（該宿主細胞は、ＮＴＢ−Ａポリペプチドを発現する）に接触させる工程と、該試験化合物がＮＴＢ−Ａポリペプチドに特徴的な生物学的応答を誘導できる能力を決定する工程とを含む方法にも関する。該生物学的応答は、たとえば、結合パートナー、細胞溶解活性等々であってよい。
【００６４】
特定の実施態様では、本発明は、試験化合物を、ＮＴＢ−Ａに特異的な抗体の存在下でＮＫ細胞に接触させる工程と、該ＮＫ細胞の細胞溶解活性を測定することによって該試験化合物の活性を決定する工程とを含む。
【００６５】
さらに一つの実施態様では、本発明は、化合物を選択、スクリーニングまたは特徴付ける方法であって、試験化合物をＮＴＢ−Ａポリペプチドに、その結合パートナーの存在下で接触させる工程と、該試験化合物が該ＮＴＢ−Ａポリペプチドと該結合パートナーとの相互作用を調整できる受容能力を評価する工程とを含む方法に関する。該結合パートナーは、たとえば、ＳＨ２Ｄ１ＡまたはＳＨＰの全部もしくは一部である。本発明は、ＮＴＢ−Ａが細胞質内ドメイン内に、ＳＨ２Ｄ１ＡまたはＳＨＰのようなシグナリング分子との結合を許す領域を含むことを実際に示す。さらに、本発明は、そのような相互作用が、生理学的条件下で実際に生じることを示す。したがって、該相互作用に干渉できる能力を有する化合物のスクリーニングは、ＮＴＢ−Ａの活性を調節できる能力を有する分子を提供する。そのようなスクリーニングは、ＮＴＢ−Ａポリペプチド（またはその細胞質内ドメインの全部もしくは一部を含むその一部分）を試験化合物および結合パートナーに接触させることによって、インビトロで実施することができる。
【００６６】
もう一つの実施態様では、該結合パートナーは、ＮＴＢ−Ａのリガンド、特に標的細胞が発現するリガンドである。したがって、該相互作用に干渉できる能力を有する化合物のスクリーニングは、ＮＫ細胞が介在する標的細胞の溶解を遮断または刺激できる能力を有する分子を提供する。そのようなスクリーニングは、ＮＴＢ−Ａポリペプチド（またはその細胞質外ドメインの全部もしくは一部を含むその一部分）を試験化合物およびリガンド、または該リガンドを発現する標的細胞に接触させることによって、インビトロで実施することができる。
【００６７】
特定の実施態様では、スクリーニング方法は、（ｉ）試験化合物がＮＴＢ−Ａポリペプチドに結合できる能力を決定する工程と、（ii）工程（ｉ）で選ばれた試験化合物が、ＮＫ細胞が介在する標的細胞の溶解を調節（たとえば遮断、緩和または刺激）できる能力を決定する工程とを含む。
【００６８】
該試験化合物は、有機生成物、脂質、ペプチド、タンパク質、核酸（たとえばアンチセンス）等々を包含する、いかなる合成化合物であってもよい。該アッセイは、適切ないかなる装置、たとえばプレート、試験管、ディッシュ、フラスコ等々内で実施してもよい。代表的には、該アッセイは、多穴プレートで実施する。いくつかの試験化合物を平行して検定することができる。さらに、該試験化合物は、様々な起源、性質および組成のものであってよい。単離されているか、または他の物質との混合物中のいかなる有機もしくは無機物質であってもよい。該化合物は、たとえば、生成物の組合せライブラリーの全部または一部であってよい。
【００６９】
使用
本発明は、新規タンパク質および対応するスクリーニング方法を開示する。該タンパク質は、免疫機能の調節に関与し、そのため、その調整または調節は、インビボでの免疫機能の調節を生じることができる。特に、ＮＴＢ−Ａの活性を調節する化合物は、ＮＫ細胞、Ｂ細胞またはＴ細胞の活性を調節するのに、特にＮＫ細胞の活性、より具体的にはＮＫ細胞介在細胞溶解を刺激または阻害するのに用いてよい。したがって、そのような化合物は、ＮＫ細胞の活性が関与する病理学、たとえばウイルス感染、腫瘍その他の増殖性疾患、自己免疫疾患等々の治療、予防または診断に用いるのに適している。例示するならば、本発明は、Ｘ染色体関連リンパ球増殖性疾患の患者を治療するのに用いることができる。
【００７０】
したがって、本発明の目的は、対象者における免疫応答を調節する方法であって、ＮＫ細胞の活性を（選択的に）調節する化合物を該対象者に投与する工程を含む方法にある。本発明は、ＮＴＢ−Ａの活性を（選択的に）調節する化合物を、対象者における免疫応答を調節する医薬を製造するのに用いる使用にも関する。
【００７１】
本発明は、ＮＴＢ−Ａの活性を調節する化合物と、薬学的に許容され得る賦形剤または担体とを含む製剤組成物にも関する。特定の組成物は、ＮＴＢ−Ａの活性を刺激するか、またはＮＴＢ−Ａの活性を阻害する化合物を含む。
【００７２】
本発明の組成物は、もう一つのＮＫ細胞受容体、特に２Ｂ４受容体を調節する化合物をさらに含む。そのような組成物は、特にＸＬＰ疾患において、そのような患者のＮＫまたはＴ細胞活性を回復することによって、インビボでの有意な効果をもたらす。したがって、本発明の特定の目的は、ＮＴＢ−Ａ受容体を調節する化合物と、２Ｂ４受容体を調節する化合物とを、併用、逐次使用または分離使用のために含む組成物にある。該化合物は、好ましくは、ＮＴＢ−Ａ活性を阻害または低減する化合物、特に上記の方法によって選択されたか、または特定された抗体もしくは分子である。以下に与えられる実施例は、そのような組み合わされた処置が、ＸＬＰ疾患の患者においてＮＫ細胞の活性を回復する効力を例示する。
【００７３】
該化合物は、様々な経路に従って、たとえば静脈内、動脈内、筋内、皮内、腹腔内等々によって投与してよい。該化合物は、当業者が適合させることができる様々な投与量で用いてよい。
【００７４】
該化合物は、ヒトである対象者の免疫応答を刺激するのに、特にヒトである対象者のＮＫ細胞を刺激するのに特に適している。
【００７５】
本発明は、対象者における機能不全を診断する方法であって、ＮＴＢ−Ａ遺伝子またはＲＮＡの突然変異もしくは変更の存在を決定する工程、またはＮＴＢ−Ａポリペプチドの存在もしくは量を決定する工程を含む方法にも関するものである。これらの方法は、上記の抗体または核酸プライマーもしくはプローブを用いて実施してよい。該方法は、該対象者に由来するいかなるサンプル、たとえば血清、血液、血漿、その他の生物学的流体、組織サンプル等々で実施することもできる。
【００７６】
本発明のそれ以上の態様および利点は、下記の実施例に開示されることになるが、これらは、本願の対象範囲を例示するものと見なさなければならず、限定するものと見なしてはならない。引用された参考文献は、すべて、参照によってここに組み込まれる。
【００７７】
材料および方法
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）
５週齢のＢＡＬＢ／ｃ系マウスを、以前に記載されたとおり［６、８、９］、ＮＫクローンであるＫＫ４（表面表現型：ＣＤ３；ＣＤ１６；ＣＤ５６ＮＣＲ；ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ）で感作することによって、ＭＡ１２７のｍＡｂを得た。本発明者らの研究室で調製した下記のｍＡｂをこの研究に用いた：ＪＴ３Ａ（ＩｇＧ２ａ、抗ＣＤ３）、ＢＡＢ２８１およびＫＬ２４７（それぞれＩｇＧ１およびＩｇＭ、抗ＮＫｐ４６）、Ｚ２３１およびＫＳ３８（それぞれＩｇＧ１およびＩｇＭ、抗ＮＫｐ４４）、Ｚ２５およびＦ２５２（それぞれＩｇＧ１およびＩｇＭ、抗ＮＫｐ３０）、ＰＰ３５およびＳ３９（それぞれＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ、抗２Ｂ４）、ＫＤ１およびｃ１２７（それぞれＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ１、抗ＣＤ１６）、ｃ２１８およびＧＰＲ１６５（それぞれＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ、抗ＣＤ５６）、Ａ６−１３６（ＩｇＭ、抗ＨＬＡクラスＩ）、ＸＡ１８５（ＩｇＧ１、抗ＣＤ９４）、ならびにＺ１９９およびＺ２７０（それぞれＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ１、抗ＮＫＧ２Ａ）。Ｄ１．１２（ＩｇＧ２ａ、抗ＨＬＡ−ＤＲ）というｍＡｂは、R.S. Accolla博士（Pavia、イタリー国）が提供した。ＨＰ２．６（ＩｇＧ２ａ、抗ＣＤ４）というｍＡｂは、P. Sanchez-Madrid博士（Madrid、スペイン国）が提供した。ＷＴ３１（ＩｇＧ１、抗ＴＣＲ−／）は、Becton Dickinsonが購入した。
【００７８】
ポリクローナルまたはクローナルＮＫ細胞集団の精製
ＰＢＬを得るために、ＰＢＭＣをFicoll-Hipaque勾配上で単離し、プラスチック付着性細胞を枯渇させた［６］。ＰＢＬを抗ＣＤ３（ＪＴ３Ａ）、抗ＣＤ４（ＨＰ２．６）および抗ＨＬＡ−ＤＲ（Ｄ１．１２）ｍＡｂとともに（４℃で３０分）、次いでヤギ抗マウス被覆したDynabeads（Dynal）とともに（４℃で３０分）温置し、免疫磁気枯渇させることによって［６］、富裕化されたＮＫ細胞を単離した。ＣＤ３、ＣＤ４、ＤＲ細胞を、照射した支持細胞上で、１００U/mlのｒＩＬ−２（プロロイキン；Chiron Corp.）および１．５ng/mlのＰＨＡ（Gibco BRL）の存在下で培養して、ポリクローナルＮＫ細胞集団、または限定希釈後に［６、８］ＮＫ細胞クローンを得た。
【００７９】
ＸＬＰの患者
この研究で分析したＸＬＰ患者は、イソロイシンのアミノ酸変化への移行へと導く、翻訳開始コドンにおけるＧからＴへのヌクレオチド変化（ＡＴＧからＡＴＴへ）（患者Ａ）、および第５５コドンでの成熟前終結へと導く、第１６３位におけるＣからＴへのヌクレオチド変化（患者ＢおよびＣ）によって代表される、ＳＨ２Ｄ１Ａの座での突然変異に影響される。以前に記載した通り［２８］、これらの突然変異は、ＳＨ２Ｄ１Ａタンパク質の完全な不在を招く。
【００８０】
細胞溶解活性および流動細胞蛍光測定法による分析
ＮＫ細胞を、以前に記載されたとおりの［６、８、９、２８］、４時間の５１Ｃｒ放出アッセイで、（ＦｃＲ）Ｐ８１５というマウスマスト細胞腫細胞系、またはリンパ芽球腫細胞系（ＬＣＬ）７２１．２２１というＥＢＶ細胞系（ＨＬＡクラスＩ；ＣＤ４８；ＦｃＲ）に対する細胞溶解活性について、ＮＫ細胞を試験した。加えた様々なｍＡｂの濃度は、再指向致死については０．５g/ml、または遮蔽実験については１０g/mlであった。Ｅ／Ｔ比は、文脈中に示す。単色または二色細胞蛍光測定分析（ＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）；Becton Dickinson）のためには、細胞を、適切なｍＡｂ、次いで、ＰＥまたはＦＩＴＣ結合イソ型特異的ヤギ抗マウス第二試薬（Southern Biotechnology Associates, Inc.［６、８、９］）で染色した。
【００８１】
ＮＴＢ−Ａ分子の生化学的特性記述
２０  １０  ６細胞を、以前に記載された［２８］とおり、ビオチン（Pierce Chemical Co.）で標識化した。１％のＮＰ−４０細胞溶解物を、セファロース−ＰＡ（Amersham Pharmacia Biotech）結合ｍＡｂで免疫沈降させた。サンプルを、Ｎ−グリコシダーゼＦ（Boehringer；参考文献２８）で消化していないか、または消化した不連続ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、Immobilon P（Millipore）に移転した。Neutravidin（Pierce Chemical Co）で染色した後、Renaissance Chemiluminescence Kit（NEN Life Science Products）を用いて検出した。
【００８２】
ＮＴＢ−Ａシグナル形質導入経路の分析
ＮＫ細胞［１０、８］を、１００Mの過バナジン酸ナトリウムで刺激したか、またはしなかった［２８］。１％ＮＰ−４０または１％ジギトニン細胞溶解物を、セファロース−ＰＡ（Amersham Pharmacia Biotech）結合ｍＡｂで免疫沈降させた。サンプルを、不連続ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分析し、Immobilon P（Millipore）に移転し、（ａ）抗ホスホチロシンｍＡｂ（ＰＹ２０−ＨＲＰＯ；Transduction Laboratories）で；（ｂ）抗ＳＨＰ−２または抗ＳＨＰ−１ｍＡｂ（それぞれＰＴＰ１ＤおよびＰＴＰ１Ｄ；Transduction Laboratories）、次いでウサギ抗マウスＨＲＰＯ（Dako）で；（ｃ）抗ＳＨ２Ｄ１Ａウサギ抗血清（Eurogentec S.A.が製造；参考文献２８）、次いでロバ抗ウサギＨＲＰＯ（Amersham Pharmacia Biotech）で調べた。検出には、Renaissance Chemiluminescence Kit（NEN Life Science Products）を用いた。ＮＴＢ−Ａの既知のシグナル形質導入分子との推定される会合は、１％ジギトニン細胞溶解物から得られた抗ＦｃＲＩ（E. Vivier、Marseille、フランス国が提供）、抗ＤＡＰ１２（ＳＩ−２８；参考文献１０）および抗ＬＡＴ（ＵＢＩ；Upstate Biotechnology）抗血清でか、または抗ＣＤ３ｍＡｂ（ＴＩＡ／２；Immunotech）によるＮＴＢ−Ａ免疫沈降物を調べることによって分析した。
【００８３】
ＣＯＳ−７におけるｃＤＮＡ発現によるライブラリースクリーニング、およびＳｉｂ選択
以前に記載された［７］とおりに、ライブラリースクリーニングを実施した。略述すると、異なる１０のプールに分画したｃＤＮＡライブラリーを、非リポソームFuGene-6試薬（Roche）を用いて、製造者の指示に従って、ＣＯＳ−７細胞に一時的トランスフェクションした。陽性プールの選択は、特異的な抗ＮＴＢ−ＡｍＡｂのＭＡ１２７を用いた免疫細胞化学的染色、およびｓｉｂ選択によって実施した。
【００８４】
ＤＮＡ配列および逆転写ＰＣＲ分析
ｄ−ローダミンターミネーターサイクル配列決定キット、および３７７ＡＢＩの自動配列決定装置（PerkinElmer/Applied Biosystems）を用いて、ＤＮＡ配列決定を実施した。ＫＡＬＩｃＤＮＡがコードしている、推定されるタンパク質の解析を、GeneWorksの２．５．１Ｎおよびhttp://genome.cbs.dtu.dk/htbin/ nph-webfaceというサイトを用いて実施した。ＲＮＡｚｏｌ（Cinna/Biotecx）を用いて抽出したＲＮＡ、およびオリゴ（ｄＴ）で開始したｃＤＮＡを、標準的手法によってポリクローナルＮＫ細胞集団および胸腺細胞から製造した。プライマーのＫＡＬＩアップ（ＡＴＧの開始コドンを有する）：5 GCG GAA AGC ATG TTG TGG、およびＫＡＬＩダウン（３の非翻訳領域内に設定）：5' TCA TTC CCG AAT TCC TCT Gのセットを用いて、ＫＡＬＩ−ＯＲＦを増幅した。９５℃で１２分の予備活性化後に、３０サイクルのＰＣＲ（３０秒、９５℃；３０秒、６０℃；および３０秒、７２℃）を、ＴＡＱ−ＧＯＬＤ（PerkinElmer/Applied Biosystems）を用いて実施した。得られた増幅生成物を、真核ＴＯＰＯ−ＴＡクローニングキット（Invitrogen）を用いてｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５／Ｈｉｓ−ＴＯＰＯベクター内にクローニングした。
【００８５】
一時的トランスフェクション
ＣＯＳ−７細胞（５ｘ１０5／プレート）に、ＶＲ１０１２／ＫＡＬＩ構成体を、FuGene-6試薬（Roche；参考文献２３）を用いてトランスフェクションした。４８時間後、トランスフェクションした細胞を、ＭＡ１２７（抗ＮＴＢ−Ａ）およびＰＰ３５（抗２Ｂ４；負の対照として）のｍＡｂ、次いでＩｇＧ１のＰＥ結合ヤギ抗マウス第二試薬で染色し、ＦＡＣＳｏｒｔ（登録商標；Becton Dickinson）を用いたフローサイトメトリーによって分析した。
【００８６】
染色体の定位およびZoo-Blot分析
２０の多染色体ヒト／ハムスター体細胞ハイブリッドに加えて３種類の対照ゲノムＤＮＡ（ヒト、ハムスターおよびマウス）を有する、体細胞ハイブリッドブロッティング（BIOS Laboratories）を用いて、ＫＡＬＩ遺伝子を特定の染色体に割り当てた［１０］。ＫＡＬＩ遺伝子の読み取り枠をプローブとして用いて、高緊縮ハイブリダイゼーションを実施した［３７］。ＫＡＬＩ遺伝子の交差特異性保存の分析を、CLONTECH LaboratoriesからのZoo-Blotを用いて実施した。このサザンブロットは、ヒト、アカゲザル、Sprague-Dawley系ラット、ＢＡＬＢ／ｃ系マウス、イヌ、ウシ、ウサギ、ニワトリおよび酵母サッカロミセス・セレビシエからのゲノムＤＮＡを含んだ。洗浄は、低緊縮条件下で実施した［７］。
【００８７】
結果
ＮＴＢ−Ａ分子の特定および細胞内分布
マウスを、ヒトＮＫ細胞クローンのＫＫ４（表面表現型：ＣＤ３；ＣＤ１６；ＣＤ５６ＮＣＲ；ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ）で感作した。細胞融合の後、ＭＡ１２７（ＩｇＧ１）と呼ばれるｍＡｂを、ＦｃＲＰ８１５というマウス標的細胞に対する再指向致死アッセイにおいてポリクローナルまたはクローナルＮＫ細胞（感作中のＮＫ細胞クローンＫＫ４を包含）に細胞傷害性を誘導できるその能力に基づいて選択した（下記を参照されたい）。ＭＡ１２７反応性分子の細胞表面分布を、正常な供与者からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）における間接免疫蛍光および細胞蛍光測定分析によって分析した。表Ｉに示したとおり、ＭＡ１２７ｍＡｂは、ＮＫ、ＴおよびＢリンパ球を明るく染色した。一方、単球、顆粒球、および一群の非リンパ細胞系では、反応性が全く検出されなかった。ＮＫ細胞またはＴＣＲ−／細胞もしくは胸腺細胞のいずれのポリクローナル集団も、ビオチンで表面標識化され、ＭＡ１２７ｍＡｂによって細胞溶解物が免疫沈降した。すべての事例で、このｍＡｂは、還元性（図１）および非還元性（図示せず）の両条件下で、６０kDの表面分子を免疫沈降させた。Ｎ−グリコシダーゼによる処理後に残留したタンパク質骨格は、３７kDの分子量を示した。これらのデータは、ＭＡ１２７ｍＡｂが、ＮＫ細胞ばかりでなく、ＴおよびＢリンパ球によっても発現される、新規な触発性分子を認識し得ることを示唆しており；以後、この分子をＮＫ−Ｔ−Ｂ抗原（ＮＴＢ−Ａ）と呼んだ。
【００８８】
抗ＮＴＢ−ＡｍＡｂ介在交差結合に対する応答におけるクローンの不均質性
ＮＫ細胞クローン間には、与えられたＨＬＡクラスＩ陰性の標的細胞を死滅できるその能力に不均質性が存在し、これは、ＮＣＲのディファレンシャル発現を反映することが示されている［１２］。そのため、強い細胞溶解活性を示すＮＫ細胞クローンは、高レベルのＮＣＲを発現する（ＮＣＲブライト）のに対し、低い細胞溶解活性を有するものは、少ない量のＮＣＲを発現する（ＮＣＲダル）。重要なことに、ＮＣＲの表面密度も、２Ｂ４の機能と相関することが見出された。したがって、２Ｂ４は、両種類のＮＫ細胞クローンで類似する表面密度を発現されるが、ＮＣＲブライトのものによってのみ、細胞傷害性を誘導する［２３］。ＮＣＲブライトまたはＮＣＲダルの表現型のいずれかを示す一群のＮＫ細胞クローンを、ＭＡ１２７ｍＡｂの存在下でのＰ８１５標的細胞に対する再指向致死アッセイで分析した。図２に示したとおり、ＮＫｐ４６ブライトクローンは、抗ＮＣＲおよび抗２Ｂ４または抗ＮＴＢ−ＡｍＡｂの双方に対して応答性を有したが、ＮＫｐ４６ダルクローンは、これらのｍＡｂのすべてに対して不充分に応答したにすぎない（抗ＣＤ１６ｍＡｂには充分に応答したが）。顕著なことに、分析したＮＫ細胞クローンは、すべて、ＮＴＢ−Ａの類似する表面密度を発現した（図示せず）。抗ＮＴＢ−ＡｍＡｂに対する応答性とＮＫｐ４６の表面密度との関連性をさらに探求するために、本発明者らは、ＮＫｐ４６分子の表面調整の効果を分析した。このために、ＮＫｐ４６ブライトクローンを、固定化された抗ＮＫｐ４６ｍＡｂ（ＫＬ２４７、ＩｇＭ）の存在下で終夜温置した。これは、細胞表面からのＮＫｐ４６分子の実質的に完全な消滅を招いた［２３；データ示さず］。この処理は、ＮＴＢ−Ａまたは他のＮＫ細胞表面分子の表面発現に影響しなかった。異なる表面分子に仕向けたｍＡｂに対するその応答性を分析するため、Ｐ８１５標的細胞に対する再指向致死アッセイにおけるエフェクターとして、ＮＫｐ４６で調整したクローンを用いた。ＮＫｐ４６が、マウスの標的の認識および溶解の際に主要なヒト受容体として機能することを示す、以前のデータ［７、１２、３８］に一致して、ＮＫｐ４６調整ＮＫ細胞は、Ｐ８１５細胞を（ｍＡｂの不在下で；図２ｂ；参考文献２３）自発的に溶解できる能力の明確な減退を示した。重要なことに、異なるｍＡｂの効果の分析は、不応性は、抗ＮＫｐ４６または抗２Ｂ４ｍＡｂ［２３］ばかりでなく、抗ＮＴＢ−ＡｍＡｂにも限られる。逆に、抗ＮＫｐ４４、抗ＮＫｐ３０または抗ＣＤ１６ｍＡｂに対する応答は、影響されなかった［２３］。これらのデータは、抗２Ｂ４ｍＡｂを用いた以前のデータ［２３］を思い出させ、ＮＴＢ−ＡもＮＫ細胞活性化の機序における共受容体として機能し得ることを示唆する。しかし、ＮＴＢ−Ａの細胞表面分布と分子量とは、ともに、２Ｂ４のそれとは明確に別個であることに注目されたい（表Ｉおよび図１を参照されたい）。
【００８９】
ＥＢＶ標的細胞のＮＫ介在致死におけるＮＴＢ−Ａの関与
２Ｂ４は、（ＨＬＡクラスＩ；ＣＤ４８；ＦｃＲ）のＬＣＬ７２１．２２１のようなＥＢＶ感染細胞の認識および致死の過程で、ＮＫｐ４６に協力することが示されている［２８］。逆に、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４およびＮＫＧ２Ｄを包含する、ＮＫ細胞が発現するその他の触発性受容体の、ＬＣＬ７２１．２２１のＮＫ介在溶解への寄与は、極めて僅かであるか、または不在である（データ示さず）。本発明者らは、ＮＴＢ−Ａも、これらの標的細胞の溶解に関与しているか否かを分析した。そのため、正常な供与者に由来するＮＫ細胞クローンを、ＬＣＬ７２１．２２１（図２ｃ）またはドーディバーキットリンパ腫（図示せず）の細胞系に対する細胞溶解活性について、ＮＴＢ−Ａ、２Ｂ４またはＮＫｐ４６に仕向けたｍＡｂの不在もしくは存在のいずれかの下で評価した。ｍＡｂが介在するＮＴＢ−Ａまたは２Ｂ４のいずれかの遮断は、これらの標的のＮＫ介在致死に有意には影響しなかった。しかし、ＮＴＢ−Ａおよび２Ｂ４に仕向けたｍＡｂの併用は、溶解の部分的阻害を招いた。重要なことに、ＮＫｐ４６のｍＡｂ介在遮蔽によって得られる阻害効果は、抗ＮＴＢ−Ａまたは抗２Ｂ４ｍＡｂのいずれかの存在下で有意に増強され、３分子がそれぞれのｍＡｂによって同時に遮断されたときに、最大の阻害が得られた。単独でか、または併せて用いられた、イソ型に合わされた抗ＣＤ５６ｍＡｂは、阻害効果が皆無であった（示さず）。これらのデータは、正常細胞では、ＮＴＢ−Ａは、２Ｂ４とともに、ＥＢＶ標的細胞に対するＮＫ介在細胞傷害性の誘導の際、ＮＫｐ４６に協力することを示唆する。その上、データは、ＮＴＢ−Ａが、２Ｂ４と同様に、ＥＢＶ標的細胞で発現された細胞表面リガンドを認識することを示唆する。しかし、正常なＮＫ細胞を用いて得られたデータは、ＥＢＶ標的細胞に対する細胞溶解活性には、異なる受容体（たとえばＮＫｐ４６）および共受容体（たとえばＮＴＢ−Ａおよび２Ｂ４）が関与するため、説明が困難であり得ることを強調しなければならない。一方、ＮＴＢ−Ａが、２Ｂ４と同様に［２８］、ＥＢＶ標的細胞を実際に認識できることは、ＮＫ９２という白血病ＮＫ細胞系をエフェクター細胞源として用いる実験によって確認された。この細胞系は、ＮＴＢ−Ａ２Ｂ４であるが、非常に小量のＮＫｐ４６を発現する（示さず）。したがって、ＮＫｐ４６のｍＡｂ介在交差結合は、再指向致死アッセイでは、Ｐ８１５に対するＮＫ９２介在細胞傷害性を誘導できなかった（図２ｄ）。しかし、重要なことに、このアッセイでは、ＮＫ９２細胞の細胞傷害性は、ＮＴＢ−Ａまたは２Ｂ４のいずれかのｍＡｂ介在交差結合によって強く増強されることができなかった。これらのデータは、（正常なＮＫ細胞と異なる）ＮＫ９２細胞の場合、ＮＴＢ−Ａおよび２Ｂ４介在活性化は、ほとんどＮＫｐ４６依存性であることを示唆する。そのため、ＮＫ９２細胞系は、ＥＢＶ標的細胞の認識および致死へのＮＴＢ−Ａの関与を解明するための有用な手段を提供する。実際、図２ｄに示したとおり、ＮＫ９２細胞は、ＬＣＬ７２１．２２１標的細胞に対しては強い細胞溶解性を有した。ＮＴＢ−Ａまたは２Ｂ４のいずれかのｍＡｂ介在遮蔽は、細胞傷害性の一貫した阻害を招いたのに対し、両ｍＡｂの併用は、ＬＣＬ７２１．２２１のＮＫ９２介在致死の実質的な排除を招いた。併せると、これらのデータは、ＮＴＢ−ＡがＥＢＶ標的の認識に関与するという意見を裏付ける。
【００９０】
ＮＴＢ−Ａ介在シグナル形質導入経路
ＮＴＢ−Ａ分子を、過バナジン酸ナトリウムで処理したか、または処理しなかったポリクローナルＮＫ細胞集団から免疫沈降させた。ＮＴＢ−Ａ分子のチロシンリン酸化は、過バナジン酸ナトリウム処理した細胞から得た免疫沈降物では一貫して検出できたが、未処理細胞からのでは検出できなかった（図３ａ）。逆に、ＮＴＢ−Ａは、ＣＤ３、ＦｃＲＩおよびＤＡＰ１２を包含する、シグナル形質導入ポリペプチドとは会合しなかった。これらのデータは、ＮＣＲとは異なるが、２Ｂ４とは同様に、ＮＴＢ−Ａ分子が、その細胞質内部分にチロシンに基づくモチーフを示し得ることを示唆する。これらのモチーフは、活性化シグナルの形質導入に関与する、細胞質内分子との会合に介在する可能性があった。この可能性を分析するため、上記のとおりに得たＮＴＢ−Ａ免疫沈降物を、抗ＳＨ２Ｄ１Ａ抗血清、またはＳＨＰ−１もしくはＳＨＰ−２に特異的なｍＡｂを用いて調べた。対照としては、同一の細胞溶解物を、２Ｂ４、または阻害性受容体タンパク質６０（ＩＲｐ６０）もしくはＮＫｐ４６に特異的なｍＡｂで免疫沈降させた。２Ｂ４は、ＳＨＰ−１と、また過バナジン酸ナトリウム処理またはｍＡｂ介在交差結合の際には、ＳＨ２Ｄ１Ａと会合することが示されている［２７〜２９］。一方、ＩＲｐ６０は、ＳＨＰ−１とＳＨＰ−２との双方と会合する、チロシンに基づく免疫阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を有する受容体である［３９］が、ＮＫｐ４６は、細胞質の尾部にチロシンに基づくモチーフを欠き、ＣＤ３およびＦｃＲＩのＩＴＡＭ含有貫膜アダプター分子との会合を介して、活性化シグナルを形質導入する［４］。この分析は、未処理および過バナジン酸ナトリウム処理細胞の双方から得られたＮＴＢ−Ａ免疫沈降物中の、ＳＨＰ−１の存在を明らかにした。対照的に、ＳＨＰ−２とのＮＴＢ−Ａの会合は、処理細胞にのみ検出できたにすぎない（図３ｃ）。注目すべきことに、過バナジン酸ナトリウムによる処理は、ＳＨ２Ｄ１Ａ分子とのＮＴＢ−Ａの会合にも導いた（図３ｃ）。併せると、これらのデータは、ＮＴＢ−Ａ分子が、ＰＢＭＣには明確な表面分布を示すものの、２Ｂ４と同様の機能的および分子的特徴性を示すとの理念を強化した。
【００９１】
ＮＴＢ−Ａは、ＸＬＰ−ＮＫ細胞では活性化シグナルではなく阻害シグナルを仲介する
２Ｂ４との類似性に注目して、本発明者らは、ＸＬＰに罹患した異なる患者からのポリクローナルおよびクローナルＮＫ細胞におけるＮＴＢ−Ａの機能を分析した（材料および方法を参照されたい）。ＮＴＢ−Ａおよび２Ｂ４を包含する様々な表面分子に特異的なｍＡｂの存在もしくは不在のいずれかの下での、Ｐ８１５マウス標的に対する、再指向致死アッセイで分析した。図４ａに示したとおり、かつ以前のデータ［２８］と一致して、代表的なＸＬＰ患者ＡからのＮＫ細胞では、２Ｂ４は、活性化ではなく阻害性の機能を示したが、ＣＤ１６（示さず）およびＮＣＲは、正常な触発能を示した。重要なことに、特異的ｍＡｂによるＮＴＢ−Ａの交差結合も、自発的な細胞傷害性の顕著な阻害をまねいた。はるかに大きい阻害効果は、ＮＴＢ−Ａおよび２Ｂ４ｍＡｂ双方の存在下で観察された（図４ａ）。その上、ＮＴＢ−Ａの交差結合は、抗ＣＤ１６（示さず）または抗ＮＣＲｍＡｂによって誘導される細胞溶解活性を阻害することができた。以前の結果に整合して［２８］、抗２Ｂ４ｍＡｂの存在下で、類似する阻害活性が観察された。示されてはいないが、ＸＬＰ−ＮＫ細胞内のＳＨ２Ｄ１Ａの不在は、細胞表面でのＮＴＢ−Ａの発現レベルに影響しなかった。ＮＴＢ−Ａが、２Ｂ４と同様に、ＥＢＶ標的細胞で発現された細胞表面リガンドを認識し得るとの観察に基づき（上記を参照されたい）、本発明者らは、ＸＬＰ−ＮＫ細胞では、この相互作用がＮＴＢ−Ａを介しての阻害シグナルの発生を誘導できるか否かを問うた。ＸＬＰ−ＮＫ細胞を、大量のＣＤ４８（すなわち２Ｂ４の天然のリガンド）を発現する、（ＨＬＡクラスＩ；ＣＤ４８；ＦｃＲ）ＬＣＬ７２１．２２１というＥＢＶ細胞系を溶解できるその能力について、さらに分析した。以前の報告［２８］に一致して、これらの標的細胞は、正常なＮＫ細胞によって充分に溶解されたが、ＸＬＰ−ＮＫ細胞による溶解には耐性であった（図４ｂ）。２Ｂ４［２８］またはＮＴＢ−Ａ分子のいずれかのｍＡｂ介在遮蔽は、ＬＣＬ７２１．２２１細胞の溶解の部分的回復を招き；この効果は、両分子の同時遮蔽によってさらに増強された（図４ｂ）。２Ｂ４とは異なり、ＮＴＢ−Ａ分子が、エフェクター（ＮＫ細胞）と標的（Ｂ細胞）との双方によって発現されることは、注目すべきである。しかし、溶解の回復は、標的細胞ではなくエフェクターの抗ＮＴＢ−ＡｍＡｂによる前処理の際にのみ検出できたにすぎない（示さず）。同様な結果は、患者Ｂ［２８］、および同じ突然変異を有する患者Ｃに由来するＸＬＰ−ＮＫ細胞で得られた（示さず）。
【００９２】
こうして、ＸＬＰ患者におけるＳＨ２Ｄ１Ａの欠如は、２Ｂ４ばかりでなく、新たに特定されたＮＴＢ−Ａ分子の著しい機能不全も招いた。したがって、両分子とも、ＸＬＰ−ＮＫ細胞がＥＢＶ標的細胞を死滅できる能力に寄与するように思われる。
【００９３】
ＮＴＢ−Ａ表面分子をコードしているｃＤＮＡの分子クローニングおよび特性記述
ＮＴＢ−Ａ分子をコードしているｃＤＮＡを、ＮＫ細胞由来ｃＤＮＡの発現ライブラリーから、ＭＡ１２７ｍＡｂを用いて単離した［７］。このｃＤＮＡ（ＫＡＬＩと称される）は、２，７４４ｂｐの長さを特徴とした。ＣＯＳ−７細胞内のＶＲ１０１２／ＫＡＬＩ構成体のトランスフェクションは、ＭＡ１２７ｍＡｂによって明るく染色される分子の表面発現を許した（図５）。その上、ＭＡ１２７ｍＡｂは、細胞トランスフェクション物から、あるタンパク質を特異的に免疫沈降させ、それは、Ｎ−グリコシダーゼＦによる処理後に、ポリクローナルＮＫ細胞に由来するＮＴＢ−Ａ分子のそれと同一のタンパク質骨格を示した（示さず）。予測されたアミノ酸配列は、Ｉｇ−ＳＦに属する３３１アミノ酸のＩ型貫膜タンパク質と一致する（図６）。ＮＴＢ−Ａ分子は、２０４残基の細胞外領域に先行する、２１アミノ酸のリーダーペプチドを特徴とする。タンパク質の配列分析は、細胞外部分が、Ｎ末端のＶ型ドメイン（古典的なジスルフィド結合を欠く）と、後続するＣ２型ドメイン（二つの可能なドメイン内ジスルフィド結合を特徴とする）とによって構成されることを示唆する。細胞外部分は、Ｎに結合した可能な糖鎖形成部位を含むが、推定されたＯ−糖鎖形成部位は含まれなかった。２３アミノ酸長の貫膜領域は、荷電したアミノ酸残基を欠くが、３個のチロシン残基を有する比較的長い（８３アミノ酸）細胞質内部分が先行する。二つのチロシン残基は、ＴｘＹｘｘＶ／Ｉという、２Ｂ４細胞質尾部で最近記載された［２５〜２８］モチーフの一部である。注目すべきことに、これらのモチーフは、ＳＨ２Ｄ１Ａとの会合のための共通配列を表すと考えられる。第三のチロシン残基は、２Ｂ４細胞質尾部に不在である、古典的なＩＴＩＭ（Ｌ／Ｖ／Ｌ／ＳｘＹｘｘＬ／Ｖ；参考文献３）に包含される。異なるＮＫ細胞クローンに由来するＲＮＡに対して、ＫＡＬＩのＯＲＦ特異性プライマーを用いて実施した逆転写（ＲＴ）ＰＣＲは、ＮＴＢ−Ａの推定される対立遺伝子イソ型をコードしている、第二のｃＤＮＡの存在を明らかにした。このｃＤＮＡは、成熟タンパク質の第２６６位のＡｌａ残基の挿入を招く、余分なコドン（ＣＡＧ）を特徴とする。GenBank／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪデータベース内のＮＴＢ−Ａのアミノ酸配列と、以前に特定されたその他のタンパク質との比較は、ＣＤ８４との相同性（２５％の同一性）を明らかにした［４０］。サザンブロット分析による染色体の定位は、ヒトの第一染色体上のＮＴＢ−Ａコーディング遺伝子の分離を明らかにした（示さず）。顕著なことに、ＣＤ２サブファミリーの様々な成員をコードしているすべての遺伝子についても、同じ染色体定位が確立している［２４］。この発見は、Ｉｇ様ドメインの詳しいコア構造（Ｎ末端の非ジスルフィド結合ＩｇＶドメイン、およびあり得る二つのドメイン内ジスルフィド結合を有する膜近位ＩｇＣ２ドメインを特徴とする）と相まって、ＮＴＢ−Ａが、ＣＤ２サブファミリーの新規な成員を表すことを示唆する。最後に、ＫＡＬＩＯＲＦプローブとZooBlotとのハイブリダイゼーションは、ヒトとサルとの間の交差種保存を示唆した（示さず）。
【００９４】
考察
この研究で、本発明者らは、ＮＴＢ−Ａを特定し、分子的に特性記述し、クローニングしたが、それは、ＣＤ２サブファミリーに属する新規な触発性表面分子であって、ＮＫ、ＴおよびＢリンパ球を包含する、休止および活性化リンパ系集団で発現される。２Ｂ４と同様に［２３］、ＮＴＢ−Ａを介しての正常ＮＫ細胞の触発は、ＮＫｐ４６の同時結合を必要とする。共受容体としてのＮＴＢ−Ａの役割は、ｍＡｂ介在遮蔽実験によってさらに文書化される。これらの実験では、正常なＮＫ細胞が介在する、ＥＢＶに感染したＢ細胞系の溶解を、ＮＴＢ−Ａ、ＮＫｐ４６および２Ｂ４の同時遮蔽によって阻害した。生化学的分析は、ＮＴＢ−Ａが、２Ｂ４と同様に［２７、２８］、ＳＨ２Ｄ１ＡおよびＳＨＰと会合することを明らかにした。ＳＨ２Ｄ１Ａは、小さい細胞質内アダプター分子であって、その発現は、高度に調節されているように思われる。実際、休止細胞では、非常に低レベルのＳＨ２Ｄ１Ａを検出することができるが、細胞を活性化すると、それらは劇的に増加する［４１］。ＳＨ２Ｄ１Ａが同時刺激に直接的な役割を果たし得るとは思われない。一方、ＳＨ２Ｄ１Ａは、ＮＴＢ−Ａ介在活性化シグナルの形質導入に、この活性化共受容体との結合について細胞質内ホスファターゼと競合することによって、単純に参加するように思われる。この流れに沿って、従来の報告は、ＳＨ２Ｄ１Ａが、２Ｂ４［２７、２８］およびＣＤ１５０［４２］を介しての活性化シグナルの形質導入に決定的重要であることを示した。その上、２Ｂ４のチロシンリン酸化、およびＳＨ２Ｄ１Ａとの会合が、過バナジン酸ナトリウム処理ばかりでなく、２Ｂ４ｍＡｂ介在交差結合の際にも検出された［２９］。ＮＴＢ−Ａが、チロシンリン酸化の際にＳＨ２Ｄ１Ａと会合するとの発見は、本発明者らに、ＸＬＰに罹患した個体におけるＮＴＢ−Ａの機能を調べさせることになった［３３、３４］。ＸＬＰは、ＳＨ２Ｄ１Ａコーディング遺伝子の死活的な突然変異を特徴とする［３０、３５、３６］。ＸＬＰ患者は、ＥＢＶ感染の制御不能を招く重篤な免疫不全に苦しむ。従来の研究は、ＳＨ２Ｄ１Ａと会合した分子が、細胞溶解性細胞がＥＢＶ感染標的細胞を死滅させるのに失敗することに重要な役割を果たし得ることを示唆した。この前後関係で、正常なＮＫ細胞で触発性共受容体として機能する［２３］、２Ｂ４分子は、ＸＬＰ−ＮＫ細胞の場合には、シグナリング経路の絶大な変化を示すことが示されている。したがって、ＳＨ２Ｄ１Ａ会合の不在のため、２Ｂ４は、反対の機能を示す、すなわち活性化シグナルではなく阻害シグナルを仲介する。特異的ｍＡｂ、またはＥＢＶ感染細胞で高密度に発現されるその天然リガンド（ＣＤ４８）のいずれかによる、２Ｂ４の結合は、ＸＬＰ−ＮＫ細胞が介在する細胞傷害性のダウンレギュレーションを招いた。これは、異なる活性化受容体（すなわちＮＫｐ４６；参考文献２８および本報告）を介して誘導された、自発的な細胞溶解活性とＮＫ細胞触発との双方に該当する。ポリクローナルＸＬＰ−ＮＫ細胞でＲＴ−ＰＣＲによって得られた、増幅されたｃＤＮＡの分析は、分析されたすべてのサンプルで、ＮＴＢ−Ａの配列が、健康な供与者から得られたそれと同一であることを明らかにした（示さず）。その上、ＸＬＰ−ＮＫ細胞の細胞蛍光測定分析は、ＳＨ２Ｄ１Ａ分子の不在が、ＮＴＢ−Ａの表面発現に影響しないことを示した。重要なことに、ＸＬＰ−ＮＫ細胞では、ＮＴＢ−Ａは、２Ｂ４と同様の役割を果たすように思われる［２８］。実際、ＳＨ２Ｄ１Ａの不在下では、ＮＴＢ−Ａは、阻害シグナルではなく、触発シグナルを形質導入しない。これは、再指向致死アッセイでは容易に認識することができて、ＮＴＢ−ＡのｍＡｂ介在交差結合が、ＸＬＰ−ＮＫ細胞の自発的およびＮＣＲ介在性の双方の細胞傷害性の阻害を招く。より重要なことに、同様の阻害シグナルが、ＸＬＰ−ＮＫ細胞がＥＢＶ標的細胞と作用し合ったときに発生した。２Ｂ４／ＣＤ４８相互作用［２８］に加え、ＮＴＢ−Ａと、ＥＢＶ細胞で発現される、依然として未知のリガンドとの相互作用によって、もう一つの阻害シグナルが発生した。したがって、ＮＴＢ−ＡのｍＡｂ介在遮断は、ＸＬＰ−ＮＫ細胞が介在するＥＢＶ標的の溶解を部分的に回復するが、黒色腫、肺癌、Ｔ細胞リンパ腫および子宮頸管癌を包含する、異なる腫瘍標的の溶解には、その効果が皆無であった（示さず）。このことは、ＣＤ４８と同様に、ＮＴＢ−Ａリガンドの発現が、一定の細胞型に限定され得ることを示唆する。これに代えて、いくつかの細胞のみが、ＮＴＢ−Ａによる結合の際のシグナリングを許すのに充分な表面密度のリガンドを発現するのにすぎない可能性もある。ＮＴＢ−Ａは、ＣＤ１５０と同様に［４２］、ホモフィリック相互作用を示すか、または（ＣＤ２／ＣＤ４８、ＣＤ２／ＣＤ５８および２Ｂ４／ＣＤ４８相互作用の場合のように）ＣＤ２サブファミリーの他の成員と作用し合うことも可能である［２１、２２、４３］。予備データは、ＮＴＢ−Ａに対するリガンドが、ＣＤ４８（すなわち２Ｂ４のリガンド）によっては説明されないことを示唆すると思われる。したがって、ＮＴＢ−Ａおよび２Ｂ４の双方を同時遮蔽すると、ＥＢＶ標的細胞のＸＬＰ−ＮＫ細胞介在溶解の回復に追加的な効果が生じる（上記を参照されたい）。その上、ＥＢＶ標的細胞上のＣＤ４８のｍＡｂ介在遮蔽の際は、ＮＫ介在細胞傷害性の部分的回復が生じたが、ＸＬＰ−ＮＫ細胞のＮＴＢ−Ａの同時遮蔽によって、溶解の強い増強を検出することができた（データは示さず）。この研究では、ＥＢＶ標的に対するＸＬＰ−ＮＫ細胞の細胞溶解活性の分析は、キラー阻害性受容体（ＫＩＲ）／ＨＬＡクラスＩ相互作用による干渉を避けるために、主として、ＨＬＡクラスＩのＥＢＶＬＣＬに対して評価がなされた。本発明者らは、以前に、ＸＬＰ患者で、自己ＨＬＡクラスＩＥＢＶＬＣＬ細胞に対するＮＫ介在細胞傷害性の復旧は、ＨＬＡ／ＫＩＲ相互作用のｍＡｂ介在破断の際に生じないことを示した。正常な供与者とは異なり、これらの患者では、ＨＬＡクラスＩおよび２Ｂ４の同時ｍＡｂ介在遮蔽のみが、細胞傷害性の再構成へと導くにすぎなかった［２８］。示してはいないが、同様の結果は、ＨＬＡクラスＩおよびＮＴＢ−Ａの同時遮蔽によっても得ることができた。したがって、正常な個体とは異なり、ＸＬＰ患者では、２Ｂ４、ＮＴＢ−Ａおよびそれらのリガンド間に活性化ではなく、阻害性の相互作用が生じるために、ＨＬＡ不全ＥＢＶ感染細胞の清掃が損なわれるものと思われる。この前後関係で、異なる研究が、ＥＢＶ感染の際には、ＨＬＡクラスＩ分子のダウンレギュレーションが生じることを報告した［４４〜４６］。しかし、この事象は、ＥＢＶ感染の与えられた段階でのみ、「インビボ」で生じ得るにすぎず、かつ／または一つもしくはいくつかのＨＬＡクラスＩ対立遺伝子に影響し得るにすぎない。実際、ほとんどのＥＢＶ感染細胞は、ＨＬＡクラスＩのフレームワーク決定域に仕向けたｍＡｂで分析したとき、ＨＬＡクラスＩを招き得ないが、この分析は、明らかに、単一の対立遺伝子損失を明らかにするには不適切である。単一の対立遺伝子のダウンレギュレーションは、標的細胞を、失われた対立遺伝子に特異的なＫＩＲを発現するＮＫ細胞の効果を受けやすくする［１］ことが強調されなければならない。他の報告では、ＸＬＰ−ＮＫ細胞では２Ｂ４の阻害機能が全く観察されていない。これらの研究は、２Ｂ４の「機能の欠如」を示唆した［３１、３２］。これ以上の研究は、互いに異なるこれらの結果を、特に、それらが患者の表現型の不均質性を反映するのか、それともその他のなおも未知の機序を反映するのかを解明しなければならない。本発明者らは、現在、患者Ａ、ＢおよびＣとは異なるＳＨ２Ｄ１Ａ遺伝子座に突然変異を有する、追加の３名のＸＬＰ患者を調査している。予備データは、これらの患者でも、２Ｂ４およびＮＴＢ−Ａが、ともに、阻害機能を示すことを示唆する（データは示さず）。したがって、異なる６名の患者で、本発明者らは、一貫した結果を得ることができた。これらの発見は、２Ｂ４またはＮＴＢ−Ａとそれらのリガンドとの相互作用の破断が、細胞溶解機能の回復へと導き得ることから、特に適切であり得る。このことは、ＸＬＰ患者における、さもなければ致命的である急性ＥＢＶ感染の治療に対して、重要な意味を有し得る。再指向致死アッセイでのＴ細胞介在細胞溶解活性の分析が示唆するとおり、ＮＴＢ−Ａは、これらの細胞で細胞傷害性を触発することができなかい。また、この発見は、２Ｂ４分子に関する以前のデータを思い出させる［２８］。注目すべきことに、Ｔ細胞は、再指向致死アッセイに用いたＰ８１５標的細胞のような、マウス細胞に存在するリガンドに特異的なＮＫｐ４６受容体を発現しない。したがって、この実験の設定で、ＣＴＬは、２Ｂ４およびＮＴＢ−Ａに特異的なｍＡｂに不応性であり得るが、それは、単に、両分子とも、共受容体として作用し、その機能には、真の受容体（たとえばＮＫｐ４６）が与える同時刺激を必要とするためである。一方、Ｔ細胞では、他の触発性受容体が、２Ｂ４およびＮＴＢ−Ａシグナリングに必要とされるシグナルの提供に生理学的に関与し得ると考えることもできる。この流れに沿って、その後の研究は、ＥＢＶ特異的なＣＴＬが、共受容体として、２Ｂ４およびＮＴＢ−Ａを実際に用いているのか否か、およびこれらの分子が、ＸＬＰ患者では、ＥＢＶに対するＴ細胞が介在する応答を阻害し得るのか否かを解明しなければならない。Ｂリンパ球におけるＮＴＢ−Ａの機能に関しては、この論点を解明するための研究が進行中である。これまで、ＳＨ２Ｄ１Ａは、正常なＢ細胞はもとより、ほとんどのＢ細胞系で検出することができなかった［４１］ことは、注目すべきことである。したがって、Ｂ細胞にシグナルを形質導入するには、ＮＴＢ−Ａは、別個の細胞質内アダプター分子との会合を必要とし得るように思われる。この前後関係で、あり得る候補は、Ｂ細胞で発現され、ＳＨ２Ｄ１Ａとの高い同一性を示す、最近記載されたＥＡＴ−２分子によって説明される［４１］。分子クローニングは、ＮＴＢ−Ａが、ＣＤ２サブファミリーの新規な一員を表すことを明らかにした［２４］。これらの分子は、比較的限られたアミノ酸同一性を示すものの、ヒト第１染色体に密集し、Ｉｇ様ドメインの顕著に類似するコア構造を示す。ＮＴＢ−Ａは、ＤＡＰ１２、ＣＤ３およびＦｃＲＩシグナル形質導入ポリペプチドと会合しない。その上、２Ｂ４とは異なり、ＮＴＢ−Ａは、ＬＡＴとも会合しない（示さず）。この前後関係で、配列分析は、ＮＴＢ−Ａが、貫膜領域内の荷電アミノ酸残基と、貫膜／細胞質部分中のＣｘＣ／モチーフ（すなわち正に荷電した残基に囲まれたＣｘＣ配列）とをともに欠くことを明らかにした。これらのモチーフは、異なる受容体／アダプター相互作用に決定的な役割を果たすことが示唆されている［４、４７］。２Ｂ４と共通するその他の特徴［２８］は、ＳＨＰ−１に、およびチロシンリン酸化の際はＳＨ２Ｄ１Ａにも結合できる、ＮＴＢ−Ａの能力である。後者の会合と一致して、ＮＴＢ−Ａの細胞質尾部は、ＳＨ２Ｄ１Ａとの会合のための共通配列を表すと考えられる、二つのＴｘＹｘｘＶ／Ｉモチーフを含む［４］。その上、ＮＴＢ−Ａと会合するＳＨＰ−１の量は、過バナジン酸処理およびＳＨ２Ｄ１Ａ結合の際に、減少するように思われる（図３を参照されたい）。これらのデータは、２Ｂ４で得られたもの［２８］に類似し、ＳＨ２Ｄ１Ａが、ＮＴＢ−Ａの場合にも、ＳＨＰ−１との結合について競合し得ることを示唆する。２Ｂ４とは矛盾して、ＮＴＢ−Ａは、細胞質部分における古典的なＩＴＩＭモチーフを特徴都市、チロシンリン酸化に際してＳＨＰ−２と会合することができる。ＳＨＰ−２は、阻害および活性化受容体の双方と会合することが見出されていて［４８］、ＳＨＰ−２の動員の最終的な機能的結果が、異なるＳＨＰ−２特異的基質の機能的特性に依存し得ることを示唆する。したがって、これまで、ＮＴＢ−Ａ介在シグナリングにおけるこのリン酸エステルの実際の役割は、決定を待つままとなっている。
【００９５】
【表１】
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【００９６】
異なる組織型の正常細胞および腫瘍細胞系を、ＭＡ１２７およびＰＰ３５（抗２Ｂ４）ｍＡｂ、次いでＰＥ結合したヤギ抗マウスＩｇＧ１との反応性について、免疫蛍光およびＦＡＣＳ分析によって分析した。細胞は、別途指定されない限り、ヒトのそれである。
【００９７】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】ＮＴＢ−Ａ分子の生化学的特性記述を示す図である。ＮＫ細胞、ＴＣＲγ／δ細胞、および胸腺細胞（Ｔｈｙ）の集団を、ＥＢＶ標的細胞の再指向致死アッセイおよびＮＫ介在致死アッセイで、ＮＴＢ−Ａ分子について表面標識分析した。（ａ）代表的なＮＫｐ４６ブライト（ＭＸ３６７、ＣＣ１６）およびＮＫｐ４６ダル（ＨＥＲ１２、ＨＥＲ１３）のＮＫ細胞クローンを、（ＦｃＲ）Ｐ８１５マウス標的細胞に対する再指向致死アッセイで、図示された分子に特異的なｍＡｂの不在または存在のいずれかの下で分析した。ｍＡｂは、すべて、ＩｇＧ１サブクラスのものであった。（ｂ）抗ＮＫｐ４６（ＫＬ２４７、ＩｇＭ）ｍＡｂで未処理であるか、または調整されたかのいずれかの代表的なＮＫｐ４６ブライトクローン（ＭＯＡ１１０）を、細胞溶解活性について、マウスＰ８１５標的細胞に対する再指向致死アッセイにて、図示された分子に特異的なｍＡｂの不在または存在のいずれかの下で試験した。実験の双方で、用いたＥ／Ｔ比は８：１であった。（ｃ）二つの代表的なＮＫｐ４６ブライトのＮＫ細胞クローン（ＭＸ３６７およびＭＯＡ１１０）を、ＬＣＬ７２１．２２１ＥＢＶ細胞系（ＨＬＡクラスＩ、ＣＤ４８ＦｃＲ）に対する細胞溶解活性について、図示された分子に特異的なｍＡｂの不在または存在のいずれかの下で分析した。用いたＥ／Ｔ比は２：１であった。（ｄ）ＮＫ９２というＮＫ細胞系を、（ＦｃＲ）Ｐ８１５マウス標的細胞、またはＬＣＬ７２１．２２１というＥＢＶ細胞系に対する細胞溶解活性について、図示された分子に特異的なｍＡｂの不在または存在のいずれかの下で分析した。用いたＥ／Ｔ比は５：１であった。結果は、７通りの無関係な実験を表している。三重試行の平均の標準偏差は、４％であった。
【図２ａ】ＥＢＶ＋標的細胞の再指向致死アッセイおよびＮＫ介在致死における、ＮＴＢ−Ａ分子の機能分析を示すグラフである。（ａ）代表的なＮＫｐ４６ブライト（ＭＸ３６７、ＣＣ１６）およびＮＫｐ４６ダル（ＨＥＲ１２、ＨＥＲ３）のＮＫ細胞を、（ＦｃγＲ＋）Ｐ８１５マウス標的細胞に対する再指向致死アッセイにて、図示された分子の不在または存在双方の下で分析した。ｍＡｂは、すべて、ＩｇＧ１サブクラスのものであった。
【図２ｂ】ＥＢＶ＋標的細胞の再指向致死アッセイおよびＮＫ介在致死における、ＮＴＢ−Ａ分子の機能分析を示すグラフである。（ｂ）抗ＮＫｐ４６（ＫＬ２４７、ＩｇＭ）で未処理であるか、または調整したかのいずれかの代表的なＮＫｐ４６ブライトクローン（ＭＯＡ１１０）を、細胞溶解活性について、マウスＰ８１５標的細胞に対する再指向致死アッセイにて、図示された分子に特異的なｍＡｂの不在または存在のいずれかの下で分析した。実験の双方で、用いたＥ／Ｔ比は８：１であった。
【図２ｃ】ＥＢＶ＋標的細胞の再指向致死アッセイおよびＮＫ介在致死における、ＮＴＢ−Ａ分子の機能分析を示すグラフである。（ｃ）二つの代表的なＮＫｐ４６ブライトＮＫ細胞クローン（ＭＸ３６７およびＭＯＡ１１０）を、ＬＣＬ７２１．２２１のＥＢＶ細胞系（ＨＬＡクラスＩ−、ＣＤ４８＋、ＦｃγＲ-）に対する細胞溶解活性について、図示された分子に特異的なｍＡｂの不在または存在のいずれかの下で分析した。用いたＥ／Ｔ比は２：１であった。
【図２ｄ】ＥＢＶ＋標的細胞の再指向致死アッセイおよびＮＫ介在致死における、ＮＴＢ−Ａ分子の機能分析を示すグラフである。（ｄ）ＮＫ９２のＮＫ細胞系を、（ＦｃｇＲ+）Ｐ８１５マウス標的細胞、またはＬＣＬ７２１．２２１というＥＢＶ細胞系に対する細胞溶解活性について、図示された分子に特異的なｍＡｂの不在または存在のいずれかの下で分析した。用いたＥ／Ｔ比は５：１であった。結果は、７通りの無関係な実験を表している。三重試行の平均の標準偏差は、＜４％であった。
【図３ａ】ＮＴＢ−Ａ特異的シグナル形質導入経路の分析を示す図である。（ａ）過バナジン酸ナトリウム（１００M、１０分、３７℃）で未処理であるか（−）、または処理されたか（＋）のいずれかのポリクローナルＮＫ細胞集団に由来する細胞溶解物を、抗２Ｂ４および抗ＮＴＢ−ＡｍＡｂで、逐次、免疫沈降させた（ＩＰ）。サンプルは、８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中の還元性条件下で分析し、抗ホスホチロシンを用いて調べた。
【図３ｂ】ＮＴＢ−Ａ特異的シグナル形質導入経路の分析を示す図である。（ｂ）（ａ）のとおりに由来する細胞溶解物を、抗２Ｂ４、抗ＮＴＢ−Ａ、抗ＮＫｐ４６および抗ＩＲｐ６０で、逐次、免疫沈降させた。等量の各免疫沈降物を、８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中の還元性条件下で分析し、抗ＳＨＰ−１または抗ＳＨＰ−２ｍＡｂのいずれかを用いて調べた。
【図３ｃ】ＮＴＢ−Ａ特異的シグナル形質導入経路の分析を示す図である。（ｃ）（ａ）のとおりに由来する細胞溶解物を、抗２Ｂ４、抗ＮＴＢ−Ａおよび抗ＳＨ２Ｄ１Ａで、逐次、免疫沈降させた。サンプルは、１４％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中の還元性条件下で分析し、抗ＳＨ２Ｄ１Ａ抗血清を用いて調べた。各パネルに、分子量マーカー（kD）を示す。
【図４ａ】ＸＬＰ患者に由来するＮＫ細胞内のＮＴＢ−Ａの機能分析を示すグラフである。（ａ）ＸＬＰ患者Ａに由来するポリクローナルＮＫ細胞集団を、細胞溶解活性について、（ＦｃｇＲ＋）Ｐ８１５標的細胞系に対する再指向致死アッセイにて、図示された分子に特異的なｍＡｂの不在または存在のいずれかの下で分析した。用いたＥ／Ｔ比は８：１であった。この実験に用いたｍＡｂは、すべて、ＩｇＧ１イソ型のものであった。
【図４ｂ】ＸＬＰ患者に由来するＮＫ細胞内のＮＴＢ−Ａの機能分析を示すグラフである。（ｂ）ＸＬＰ患者Ａ、または健康な供与者に由来するポリクローナルＮＫ細胞集団を、ＬＣＬ７２１．２２１のＥＢＶ細胞系（ＨＬＡクラスＩ、ＣＤ４８、ＦｃｇＲ＋）に対する細胞溶解活性について、図示された分子に特異的なｍＡｂの不在または存在のいずれかの下で分析した。用いたＥ／Ｔ比は６：１であった。結果は、６通りの無関係な実験を表している。三重試行の平均の標準偏差は、５％であった。
【図５】ＶＲ１０１２／ＫＡＬＩ構成体をトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞におけるＮＴＢ−Ａの表面発現を示すグラフである。ＶＲ１０１２／ＫＡＬＩ構成体をトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞を、ＭＡ１２７（抗ＮＴＢ−Ａ）またはＰＰ３５（抗２Ｂ４）ｍＡｂ、次いでＰＥ結合したヤギ抗マウス第二試薬で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。白色の像は、第二試薬のみとともに温置した細胞を示す。
【図６ａ】ＮＴＢ−Ａ分子のアミノ酸配列（配列番号２）を示す図である。推定されるシグナルペプチドを、小文字で示し（第１〜第２１残基）、貫膜領域を、箱で囲んだ。細胞質尾部に存在するチロシンに基づくモチーフは、下線を施した。
【図６ｂ】ＮＴＢ−Ａ分子の核酸およびアミノ酸配列（配列番号１）を示す図である。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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