(57)【要約】哺乳類患者における、内皮機能障害に起因する又はそれを伴う医学的疾患の治療及び／又は予防におけるアポトーシス小体及び／又はアポトーシス細胞の使用、及び哺乳類患者における、内皮機能障害に起因する又はそれを伴う医学的疾患の治療及び／又は予防のための医薬の調製における、アポトーシス小体及び／又はアポトーシス細胞の使用である。前記医薬は、生存細胞と共に前記アポトーシス小体及び／又はアポトーシス細胞の懸濁液である。疾患は、アテローム性動脈硬化症、末梢血管疾患、うっ血性心不全、発作、心筋梗塞、アンギナ、高血圧症、レーノー病、心臓の症候群Ｘ、片頭痛、虚血性損傷、炎症性腸疾患及び対宿主性移植片疾患を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類患者における、内皮機能障害に起因する又はそれを伴う医学的疾患の治療及び／又は予防におけるアポトーシス小体及び／又はアポトーシス細胞の使用。
【請求項２】
哺乳類患者における、内皮機能障害に起因する又はそれを伴う医学的疾患の治療及び／又は予防のための医薬の調製における、アポトーシス小体及び／又はアポトーシス細胞の使用。
【請求項３】
前記医薬が、前記アポトーシス小体及び／又はアポトーシス細胞並びに生存細胞の懸濁液である、請求項２記載の使用。
【請求項４】
前記アポトーシス小体及び／又はアポトーシス細胞が、懸濁液の細胞部分の１０乃至９０％を占める、請求項３記載の使用。
【請求項５】
前記アポトーシス小体及び／又はアポトーシス細胞が、懸濁液の細胞部分の３０乃至７０％を占める、請求項４記載の使用。
【請求項６】
前記アポトーシス小体及び／又は細胞が、前記哺乳類患者の血液細胞に適合する血液細胞の体外治療から由来するものである、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記アポトーシス小体及び／又は細胞が確立された培養細胞系由来のものである、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
前記血液細胞が、前記哺乳類のものと適合する血液の白血球である、請求項６記載の使用。
【請求項９】
前記血液細胞が患者自身の白血球である、請求項８記載の使用。
【請求項１０】
前記血液細胞が患者自身のＴリンパ球である、請求項９記載の使用。
【請求項１１】
前記疾患が、アテローム性動脈硬化症、末梢血管疾患、うっ血性心不全、発作、心筋梗塞、アンギナ、高血圧症、レーノー病、心臓の症候群Ｘ、片頭痛、虚血性損傷、炎症性腸疾患及び対宿主性移植片疾患からなる群より選択されるものである、請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
ヒトの患者への投与のための医薬の単位用量の調製における請求項２乃至１１のいずれか一項に記載の使用であって、前記用量は、患者の体重１ｋｇ当たり、１０，０００乃至１０，０００，０００のアポトーシス小体及び／又はアポトーシス細胞を含むものである、使用。
【請求項１３】
前記用量は、患者の体重１ｋｇ当たり、５００，０００乃至５，０００，０００のアポトーシス小体及び／又はアポトーシス細胞を含むものである、請求項１２記載の使用。
【請求項１４】
前記用量は、患者の体重１ｋｇ当たり、１，５００，０００乃至４，０００，０００のアポトーシス小体及び／又はアポトーシス細胞を含むものである、請求項１２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５】
アポトーシス小体及び／又はアポトーシス細胞の有効量を、患者に投与することを含む、哺乳類患者における内皮機能障害に起因する又はそれを伴う医学的疾患に対する治療または予防の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、哺乳類患者の内皮機能障害関連の医学的疾患（血管の管壁の機能不全）の治療及び／又は予防における生化学及び生物学組成物、及びその使用に関する。より詳しくは、哺乳類の細胞性物質とその断片を含む組成物を投与することによる、内皮機能障害に関連する医学的疾患の治療及び予防に関し、哺乳類細胞性物質と断片を含む組成物自体に関し、そのような組成物を調製する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
体内の細胞死の２つのメカニズム、ネクロシスとアポトーシスが知られている。アポトーシスは、プログラムされた細胞死のプロセスであり、Kerrら、1992[Kerr JFR,Wyliie AH,Currie AR (1992)"アポトーシス：組織キネティクスで広範囲の意味を有する基本的な生物学的現象（"Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics）" ”British Journal of Cnacer 26:239-257”]により記載されており、それにより、連続的な細胞分裂と分化が起こるように、体内の種々の器官システムと組織の安定状態のレベルが保持されている。アポトーシスを受ける細胞は、しばしば、細胞容量の著しい減少、細胞骨格の変化などの、特有の形態変化を示し、顕著な膜泡状突起、クロマチンの濃縮、ＤＮＡのオリゴヌクレオゾーム断片への分解をもたらす。これらの形態変化の後に、アポトーシス細胞は、破れて、アポトーシス小体として知られる、数多くの小さな断片となり、これは本質的に、インタクトなオルガネラ、クロマチンなどを含む膜結合体からなる。アポトーシス小体は、通常迅速に、マクロファージ、樹状突起細胞及び他の抗原提示細胞の食作用により体から除去され、その後、それらを溶解し、それらの潜在的な前炎症性細胞内容物を放出させることができる。
【０００３】
単純化すると、アポトーシスは以下のように進行すると考えられている。プログラムされた細胞死のアポトーシスのメカニズムにおいて、３つの期を同定することができる。
誘導期；
エフェクター期、及び
分解期。
【０００４】
誘導期は、部分的には、細胞表面膜の死誘導シグナルの特異的な相互作用に依存している。１つの共通シグナルは、細胞膜に存在するＴＮＦレセプターファミリーのレセプターへ特異的リガンドが結合することにより開始される。１つの重要なそのレセプターは、Ｆａｓ（ＡＰＯ−１、ＣＤ９５）であり、Ｆａｓ−リガンドと相互作用を及ぼし、アポトーシスを開始する。
【０００５】
エフェクター期は、誘導期のレセプターとリガンドの結合により活性化され、カスパーゼ、シスチニル−アスパルターゼ要求性プロテイナーゼ（タンパク質分解酵素）（カスパーゼ１及び８を含む）の活性化をもたらす。この活性化は、ミトコンドリアの透過性における変化と関連している可能性があり、これはシトクロームＣを放出させ、これがカスパーゼの活性化に関与している。活性化されたカスパーゼは、致死的なタンパク質分解イベントの連鎖を開始し、アポトーシスでみられるクロマチンと細胞骨格成分の変化で終わる。
【０００６】
アポトーシスを受ける多くの細胞が、ＤＮＡが開裂して一連の断片となることによって生じる、アファロースゲル電気泳動でみられるＤＮＡの特徴的な「ラダリング」により同定されることができる。これらの変化は、生体染色を排除する細胞能力で定義されるように、細胞の死の数時間前でおこる。細胞からのＤＮＡの抽出の後の、アガロースゲル電気泳動上のＤＮＡラダリングの出現は、細胞のアポトーシス同定の１つの認識された方法である [Loo, D. T. and Rillema, J. R. (1998) "細胞死の測定（Measurement of Cell Death）," Methods in Cell Biology 57: 251-264]が、常にアポトーシスが検出できるほど十分に感受性が高いわけではない。例えば、市販されている末端ｄＵＴＰニックエンドラベリング（ＴＵＮＥＬ）アッセイを用いた、核ＤＮＡ断片のin situラベリングは、アポトーシス細胞とアポトーシスを受けている細胞での断片化ＤＮＡの決定のための代替的でより再現可能な測定である[Gavrieli Y, Sherman Y, Ben-Sasson S A (1992)"核ＤＮＡ断片化の特異的ラベルを介したin situでのプログラム細胞死同定（Identification of programmed cell death in situ via specific labelling of nuclear DNA fragmentation）". Journal of Cell Biology 119: 493-501] 。
【０００７】
アポトーシスの間、ホスファチジルセリンが、細胞膜上で外部に露出し[Fadok V A, Voelker D R, Campbell P A, Cohen J J, Bratton D L, Henson P M (1992), "アポトーシスのリンパ球の表面上でホスファチジルセリンが露出することがマクロファージによる特異的認識と除去の引きがねである（Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages）". Journal of Immunology 148: 2207-2216]、この露出したホスファチジルセリンが、特異的なレセプターに結合して、哺乳類におけるアポトーシス細胞の取りこみとクリアランスを媒介する[Fadok V A, Bratton D L, Rose D M, Pearson A, Ezekewitz R A B, Henson P M (2000), "アポトーシス細胞のホスファチジルセリン特異的クリアランスのためのレセプター（A receptor for phosphatidylserine-specific clearance of apoptotic cells）", Nature 405: 85-90]。細胞でのホスファチジルセリンの表面発現は、アポトーシス細胞の同定の別の認識された方法である。
【０００８】
ミトコンドリア完全性の変化は、アポトーシスに密接に関連しており、ミトコンドリアの膜の透過性とミトコンドリアから細胞のサイトプラスムへのシトクロームｃの放出の変化をもたらす [Susin, S. A., Lorenzo, H. K., Zamzami, N., Marzo, I, Brenner, C., Larochette, N., Prevost, M. C., Alzari, P. M. and Kroemer, G. (1999) "アポトーシスプロセスの間の、ミトコンドリアの、カスパーゼ−２と−９の放出（Mitochondrial Release of Caspase-2 and -9 during the Apoptotic Process）", Journal of Experimental Medicine, 189: 381-394]。ミトコンドリア膜電位の変化の測定は、ミトコンドリア膜の透過性の変化を反映するものであり、アポトーシス細胞の同定の他の認識された方法である。
【０００９】
アポトーシスを受けている細胞及びアポトーシス細胞の同定の数多くの他の方法は、多くが、アポトーシス細胞に特異的マーカーに対するモノクローナル抗体を用いるものであり、科学文献に記載されている。
【００１０】
細胞性組成物中でアポトーシス細胞及びアプトーシス小体を定量する方法は、知られており、当業者により容易に実施することができる。技術は、フルオレセイン結合アネキシンＶなどの適当な、選択性の染料での処理された細胞集団の染色と、その後のインキュベーション及びフローサイトメトリーでの分析を含む。
【００１１】
ネクロシスは、これと対照的に、病理性の細胞死であり、外傷、細菌毒素の作用、炎症メディエーター、などから生じるものであり、膜の破損、周囲組織への細胞内容物の放出を含み、しばしば有害な炎症結果を有する。したがって、ネクロシス細胞を検出及び特徴づけできる方法の１つは、妥協した細胞膜の検出、例えば、プロピジウムイオジドで染色して、フローサイトメトリーまたは顕微鏡で検出する方法によるものである。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題及び課題を解決するための手段】
本発明は、前もってex vivoで調製したアポトーシス細胞及び／又はアポトーシス小体の哺乳類への投与を、内皮細胞、血管の細胞性管壁の機能障害が存在する医学的疾患の予防及び／又は治療に用いる。
【００１３】
その方法の態様の一つでは、アポトーシス小体及び／又はアポトーシス細胞の有効量を投与することを含む、哺乳類患者における、内皮機能障害に対する治療又は予防の方法に関する。
【００１４】
これらの方法は、好ましくはここに記載された製薬組成物を患者に投与することにより達成される。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明は、アポトーシス細胞及び／又は小体を投与することによる、内皮機能障害疾患の予防及び／又は治療に関するものである。
【００１６】
内皮は、哺乳類の血管の管壁である細胞の層である。血液とその下の組織との間の高度分化した界面であり、多くの機能を有し、例えば、血小板凝集を阻害することによるホメオスタシスの制御（抗トロンビン及び凝集とフィブロリノリティックシステムの制御）；血管のトーンと、血流の制御、血管平滑筋成長の制御及び細胞とタンパク質への選択的透過性を含む。
【００１７】
通常、内皮は、機能の適合性の変化により、生理的な刺激、例えば血流の変化、酸素テンションなどに反応することにより血管のホメオスタシスを保持している。機能障害の内皮は、そのような生理的刺激に対する反応が悪化しており、最後には医学的疾患をもたらす。多くのサブセットの内皮機能障害が知られており、内皮活性化、及び内皮媒介血管拡張機能障害を含む[De Caterina (2000). "内皮機能障害：血管の疾患の一般的基準（Endothelial dysfunctions: common denominators in vascular disease）". Current Opinions in Lipidology 11:9-23参照] 。
【００１８】
内皮活性化は、アテローム性動脈硬化症の開始をもたらす可能性があり、それにより内皮細胞での細胞吸引と細胞接着分子の不適当な上方制御と発現をおこすプロセスである。
【００１９】
これは特に、マクロファージケモアトラクタントプロテイン１（ＭＣＰ−１）、リンパ球のケモアトラクタント（ＩＰ−１０、ＭＩＧ、Ｉ−ＴＡＧ）と、血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）（ここに単球とリンパ球が接着する）を含む。いちど接着すると、白血球は動脈壁に入る。アテローム硬化症の初期の段階では、単球とリンパ球は、活性化された内皮のこれらの細胞の吸引と細胞接着分子によりにより血管の最内部（内皮の下の層）に引きぬかれる (Libby, P. (2000) "アテローム発生の変化する概念（Changing concepts of atherogenesis）," Journal of Internal Medicine 247:349-358参照) 。
【００２０】
内皮媒介血管拡張機能障害は、内皮依存性血管拡張の減少又は損失により特徴付けられ、「酸化窒素の生体利用性の減少」（生産の減少、破壊の増加及び／又は酸化窒素の感受性の減少）を含む[De Caterina (2000),上述] 。酸化窒素は、血管壁の平滑筋細胞を弛緩させることにより血管拡張を誘導する。内皮媒介血管拡張機能障害は、アセチルコリンに反応する血管拡張の減少として、又は、例えば血圧計のカフを用いた動脈血流の閉塞（反応性充血）の後の、血管拡張反応の減少として測定することができる。血管拡張の減少をもたらすと同様に、内皮の酸化窒素の生体利用性の減少も、血管収縮と高血圧の生産の増加をもたらす可能性がある。血小板凝集は、酸化窒素により阻害され、こうして酸化窒素の生体利用性の減少は、血小板凝集とそれによる血栓症の増加をもたらす可能性がある。これらは、いかに、内皮媒介血管拡張機能障害から起因する酸化窒素生体利用性が病理的な結果を有しえるかの単なるいくつかの例である。
【００２１】
内皮機能障害から起因し、こうして本発明により治療し得る医学的疾患は、アテローム性動脈硬化症、末梢血管疾患、うっ血性心不全、発作、心筋梗塞、アンギナ、高血圧症などの心臓血管障害であり得る。レーノー病、心臓の症候群Ｘ、片頭痛などの血管痙攣障害でもあり得る。虚血性に起因する損傷（虚血性障害又は虚血−再灌流障害）でもあり得る。要するに、実質的に不適当な機能の内皮に起因するあらゆる障害であり得る。
【００２２】
ここで用いられる用語としての「アポトーシス細胞」及び「アポトーシス小体」は、以下のアポトーシスに特徴的な一以上の特徴を示す細胞及び細胞小体を意味する。Annexin V染色などの標準的に認められている検出方法により検出されるような、ホスファチジルセリンが表面に露出すること；標準的に認められている検出方法(例えば、Salvioli, S., Ardizzoni, A., Franceschi, C. Cossarizza, A. (1997) " DiOC6(3)又は Rhodamine 123でなく、JC-1は、インタクトな細胞内でDelta Psi変化を評価するための信頼できる蛍光プローブである：アポトーシスの間のミトコンドリアの機能研究への関連（JC-1, but not DiOC6(3) or Rhodamine 123, is a Reliable Fluorescent Probe to assess Delta Psi Changes in Intact Cells: Implications for Studies on Mitochondrial Functionality during Apoptosis," FEBS Letters 411: 77-82]; によりミトコンドリア膜透過性の変化；細胞からのＤＮＡ抽出後のアガロースゲル電気泳動でのＤＮＡラダリングの出現などのＤＮＡ断片化の証拠 [Teiger, E., Dam, T. V., Richard, L., Wisnewsky, C., Tea, B. S., Gaboury, L., Tremblay, J., Schwartz, K. and Hamet, P. (1996) "ラットにおいて過剰な圧力で誘導された心臓肥厚でのアポトーシス（Apoptosis in Pressure Overload-induced Heart Hypertrophy in the Rat,）" Journal of Clinical Investigation 97; 2891-2897]または in situ ラベリング (上述のGavrieli et al., 1992参照)によるもの。
【００２３】
本発明に用いられるためのアポトーシス細胞及び／又はアポトーシス小体の組成物は、アポトーシス細胞／小体とネクロシス細胞／小体の合計重量に対して、好ましくは、ネクロシス細胞及び／又はネクロシス小体が約３５重量％以下であり、より好ましくは約２０重量％以下であり、さらに好ましくは約１０重量％以下である。これらのレベルでは、そのようなネクロシス細胞及び／又は小体の存在は、in vivoのプロセスに顕著な影響を与えないと考えられる。最も好ましい態様では、アポトーシス細胞／小体は、実質的にネクロシス細胞及び又は小体を含まない（すなわちネクロシス細胞／小体が約２重量％未満である）。
【００２４】
本発明に用いられるためのアポトーシス細胞及び／又はアポトーシス小体は、哺乳類患者のそれと適合する哺乳類細胞からex vivoで調製される。それらは、実質的に、培養されたセルラインを含むあらゆるタイプの哺乳類細胞から調製することができる。好ましくは、それらは、哺乳類患者自身の体から、あるいは確立されたセルラインから由来するセルタイプから調製することができる。より好ましくは、それらは哺乳類患者のそれに適合する白血球から、より好ましくは患者自身の白血球から、さらに好ましくは患者自身のＴリンパ球から調製される。さらに好ましくは、それらは、確立されたセルラインから調製される。アポトーシス細胞及び／又はアポトーシス小体は、患者の投与の前に体外で、調製される。こうして、一の実施態様では、患者の血液のアリコートを、例えば静脈穿刺により抜いて、少なくともその白血球の一部を、体外のアポトーシス誘導条件下に供することができる。
【００２５】
アポトーシス細胞やアポトーシス小体を作製するような哺乳類細胞でのアポトーシスを誘導する種々の方法は、当業者にはよく知られているものであり、実質的には、本発明に用いるためのアポトーシス小体を調製するためにはこれらのうちのあらゆる方法を適用することができる。そのような方法の一つは、細胞にイオン化放射（ｙ線、ｘ線など）及び／又は紫外線を含む非イオン化電磁放射を行なうことである。アポトーシスは、細胞を超音波に供することでも誘導することができる。
【００２６】
他の方法は、スタウロスポリン(Bombeli, Karsan, Tait and Hirlan, (1997) "アポトーシスの血管内皮細胞はプロコアギュラントになる（Apoptotic Vascular Endothelial Cells Become Procoagulant）", Blood, Vol. 89:2429-2442参照)などの非特異的タンパク質キナーゼインヒビターなどの薬剤で細胞を処理することである。また、悪性腫瘍の治療に用いられるある種の化学療法剤、例えばアドリアマイシンも、スタチン剤（３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡレダクターゼインヒビター） [Guijarro C, Blanco-Colio L M, Ortego M, Alonso C, Ortiz A, Plaza J J, Diaz C, Hernandez G, Edigo J (1998), "３−ヒドロキシ−３メチルグルタリルコエンザイムＡレダクターゼとイソプレニル化インヒビターは培養中の血管平滑筋のアポトーシスを誘導する（3-hydroxy-3methylglutaryl coenzyme A reductase and isoprenylation inhibitors induce apoptosis of vascular smooth muscle in culture）," Circulation Research 83: 490-500]及びコルシシン（colcicine） [Suzuki Y (1998)", "コルシシン処理の後の、マウスの嗅上皮及び鋤鼻器における、細胞死、食作用及び神経発生（Cell death, phagocytosis and neurogenesis in mouse olfactory epithelium and vomeronasal organ after colcicine treatment）, "Annals of the New York Academy of Sciences 855: 252-254]と同様に、アポトーシスを誘導する。細胞上の死レセプターのリガンド、例えばＦａｓ−リガンドの使用がアポトーシスを誘導することは、上記アポトーシスの議論より明白であろう。
【００２７】
他の方法は、体外での、細胞への酸化的ストレスの適用である(例えば、Buttke and Sandstrom (1994) "アポトーシスのメディエーターとしての酸化的ストレス（Oxidative Stress as a Mediator of Apoptosis）," Immunology Today, Vol. 15:7-10参照)。これは、化学的な酸化剤、例えば過酸化水素、他の過酸化物及びヒドロペルオキシド、オゾン、過マンガン酸塩、過ヨウ素酸塩などを含む懸濁液中で、細胞を処理することにより達成することができる。そのように形成されたアポトーシス細胞とアポトーシス小体の残存及び汚染に関連する潜在的な問題を減少させるために、生物学的に許容されるそのような酸化剤は好ましく用いられる。
【００２８】
本発明は、アポトーシス細胞及びアポトーシス小体を作製する特定の方法に限定されず、ここで用いられるためには、あらゆる適当な周知の方法を用いることができる。
【００２９】
アポトーシスの検出及び定量の方法は、本発明において、患者に投与される調製物におけるアポトーシスの存在とレベルの決定に用いることができる。投与する前に、上述のイントロダクションで記載されたうちの少なくとも一の方法を用いて、達成されたアポトーシスのレベルを確認するべきである。それらは、分画遠心分離などの当業者には周知の方法により、使用前に適当に精製される。
【００３０】
アポトーシス細胞及び／又はアポトーシス小体を調製する際に、過剰なレベルの酸化的ストレス、放射、薬剤処理などをかけないように注意を払うべきである。そうでないと、処理において少なくとも細胞の一部がネクロシスをおこすリスクが高いからである。ネクロシスは細胞膜破壊と細胞内容物の放出をおこし、しばしば生物学的に有害な結果、特に炎症作用を伴うので、アポトーシス小体とともにネクロシス細胞とその成分が存在することは、避けるのがベストである。アポトーシス小体を作製するための細胞の処理の適当なレベルは、ある程度、選択した細胞と細胞成分の性質及びアポトーシスを誘導するために選択した処理のタイプに依存する。そのような適当なレベルは、上記論文を含む利用可能な文献を参照しながら当業者により容易に決定できる。
【００３１】
本発明の一つの好ましい方法は、患者からの細胞、または適合する哺乳類セルラインの培養を含む。培養された細胞は、ついで、アポトーシスを誘導し、アポトーシス細胞及び／又はアポトーシス小体をそこで形成するために処理することができる。患者の血漿または他の適当な懸濁媒体、例えば生理食塩水または調節哺乳類細胞培養媒体で懸濁された細胞は、ついで、下記の通り投与することができる。アポトーシス細胞及び／又は小体の数は、上述の参照論文を含む公表されている科学文献により決定することができる。必要な臨床的な効果を得るための、患者への投与に必要なそのようなアポトーシス細胞及び／又はアポトーシス小体の数は、細胞の起源、患者の病状、年齢、及び患者の体重及び他の関連する因子に応じて異なるであろうが、治療を行なう臨床医により容易に決定可能なものである。
【００３２】
こうして、本発明の好ましい方法の一例は、治療される患者から血液のアリコートを抽出すること、そこから白血球を分離すること、及びアポトーシスを起す条件下で白血球を処理して、その中の多くの数の白血球がアポトーシスをおこして、その中にかなりの数のアポトーシス細胞又は小体が生成している細胞成分を作製することを含む。ついで、処理された組成物は患者に投与される。より好ましくは、Ｔリンパ球は、周知の方法で血液から単離され、上述の如く懸濁されて、アポトーシス細胞及びアポトーシス小体源として用いることができる。
【００３３】
アポトーシス細胞及び／又はアポトーシス小体を作製するための処理に選択される生存細胞の数は、好適には、ヒト患者への各投与について、約４×１０9までであり、好ましくは約１，０００，０００乃至約１，０００，０００，０００であり、最も好ましくは約５０，０００，０００乃至約１５０，０００，０００である。投与のための細胞成分の約１０％ないし９０％、好ましくは約３０乃至７０％が、アポトーシス細胞及び／又はアポトーシス小体からなり、残りは生存細胞及びネクロシス細胞である。したがって、投与のためのアポトーシス細胞及び／又はアポトーシス小体の好ましい量は、これらの数の細胞をアポトーシス条件下におくことにより作製されたものである。アポトーシス誘導条件におかれる細胞源として、全血液を用いるとき、これらの数の白血球は、約４００ｍｌまでの、好ましくは１００ｍｌまでの容量の血液アリコートで得られる。より詳しくは、５０，０００，０００−１５０，０００，０００細胞は、容量１０−３０ｍｌの血液アリコートの白血球に匹敵する。
【００３４】
その中にアポトーシス細胞及び／又はアポトーシス小体を作製するための処理のために、患者から抜かれる血液のアリコートの容量は、約４００ｍｌまでが好適であり、好ましくは約０．１乃至約１００ｍｌであり、最も好ましくは約５乃至約１５ｍｌである。したがって、投与のためのアポトーシス細胞及び／又はアポトーシス小体の好ましい量は、アポトーシス誘導条件下におかれた後のそのような量の全血液に含まれる白血球、又は単離されたＴリンパ球由来の数に相当するものである。
【００３５】
患者に投与されるための処理されたアポトーシス細胞及び／又は小体の懸濁液は、生物学的に許容される液体懸濁媒体、例えば患者の血清または血漿、生理食塩水または調節された哺乳類細胞培養媒体中で調製される。他の因子、例えばサイトカイン、ホルモン、ストレスがかかった細胞の産物または他の適当な生物学的に活性な物質の添加は、投与されたアポトーシス細胞物質の有利な効果を強めることができる。アリコートは、あらゆる適当な方法で、最も好ましくは筋肉内注射、または皮下注射、ミニ移植、腹膜内注射、動脈内注射、静脈内注射、経口投与により患者の体内に導入することができる。アポトーシス体は、あらゆる適当な周知の薬剤送達システムを用いて、特定の体の器官及び／又は部位へ送達することができる。
【００３６】
本発明の組成物は、任意に、製薬上許容される賦形剤を含むことができる。適当な賦形剤の例としては、滅菌水、滅菌生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などが含まれる。
【００３７】
投与されるとき、製薬組成物は、内皮機能障害の罹患のリスクがあるまたは罹患している患者中で適当な予防及び／又は治療反応を誘導するために有効な量のアポトーシス小体／細胞を含む。哺乳類患者に投与される組成物は、体重１ｋｇ当たり好ましくは１０，０００乃至１０，０００，０００、より好ましくは５００，０００乃至５，０００，０００、最も好ましくは約１，５００，０００乃至約４，０００，０００のアポトーシス細胞又は小体を含む。用いられる特定の容量は、もちろん、治療される患者における年齢、体重、疾患の重篤度によるものであり、これらのすべては治療を行なう臨床医の通常の技術範囲である。
【００３８】
内皮機能障害を含む哺乳類の疾患の最も有効な治療及び／又は予防のためには、患者に、本発明のアポトーシス細胞及び／又は小体での治療の一連のコースを与えることができる。治療の各コースは、患者へ、上述の懸濁細胞物質の１乃至６アリコートの投与することを含むことができる。そのようなアリコートは１日当たり１を越えて投与してはならず、２つの連続した投与の間の最大の休養期間は、約２１日を超えてはならない。下記のブースター治療は有利に用いることができる。所望の効果を保持するために、患者は、３乃至４ヶ月の間をおいて、上述の懸濁アポトーシス細胞及び／又はアポトーシス小体のアリコートをさらに投与するコースによって、ブースター治療を受けることができる。
【００３９】
上述のごとく、本発明は、広範囲の哺乳類の内皮機能障害を含む哺乳類の障害の治療及び予防に適用可能である。これらには、アテローム性動脈硬化症、末梢血管疾患、うっ血性心不全、発作、心筋梗塞、アンギナ、高血圧症などの心臓血管障害、レーノー病、心臓の症候群Ｘ、片頭痛などの血管痙攣障害、及び虚血性に起因する損傷（虚血性障害又は虚血−再灌流障害）が含まれるが、これらに限定されない。要するに、実質的にあらゆる不適当な機能の内皮から起因するあらゆる疾患でよい。
【００４０】
本発明を以下の実施例で説明するが、これは単に例示を目的とするものである。
【００４１】
【実施例】
実施例１
本発明を示すための実験は、そのような実験を行なうことが認可されている条件下で、実験室マウスで行なった。
【００４２】
本発明の好ましい実施態様にしたがった、接触過敏症（ＣＨＳ）（Ｔｈ−１−細胞炎症疾患の一例で、炎症性サイトカインにより媒介されることが知られている）に対する、治療の有効性は、認可された動物実験手法に従って、Kondo et. al., "抗原１結合リンパ球（ＬＦＡ−１）の機能はアレルギー性接触皮膚炎の最大誘引のために必要である（Lymphocyte function associated antigen-1 (LFA-1) is required for maximum elicitation of allergic contact dematitis）" Br. J. Dermatol. 131:354-359 (1994)に記載された方法を用いて、わずかな変形を加えて、実験室マウスで評価した。その開示は参照としてここに取りこまれる。簡単に述べると、ＣＨＳを誘導するために、各マウスの腹部の皮膚を剃り、感作化合物であるジニトロジフルオロベンゼンＤＮＦＢを、２５μｌの４：１アセトン：オリーブ油中の０．５％ＤＮＦＢ溶液を用いて、塗った。この感作は、２つの群のＢａｌｂ／ｃマウス、合計１０匹に適用した。
【００４３】
アポトーシス小体を、ネズミの繊維芽細胞から調製した。ネズミの繊維芽細胞は、ＲＰＭＩ培地中の５０ｍＭ酪酸ナトリウムで処理し、１日コンフルーエンシーを行ない、ついで酪酸ナトリウム培地を代えた。アポトーシス細胞及び小体の数を増やすためには、細胞はさらにＵＶ−光で照射することができる（例えば７５ｍｊ）。浮遊細胞を含む上清は、照射後２４時間で除去する。
【００４４】
アポトーシス小体は、上述したように、上清の遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）、上清の吸引、得られた細胞ペレットのＰＢＳでの洗浄、再度の遠心分離により定量した。アポトーシス小体を含むペレットを、ＰＢＳ中に再懸濁した。実験の持続のために、細胞をＰＢＳ中に４℃で保存した。定量のために染色される細胞は、１×結合バッファー中に、１×１０6細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。１００μｌの細胞を５ｍｌチューブに移し、１０μｌのフルオレセイン結合アネキシンＶと１０μｌのヨウ化プロピジウム試薬を添加した。細胞は、静かにボルテックスで攪拌し、細胞混合物は１５分間２５℃で暗中でインキュベートした。インキュベーションの後、４００μｌの１×結合バッファーを各チューブに添加する。試料は、１時間かけてフローサイトメーターで分析した。
【００４５】
感作されたマウスの２つの群のうち、第１の対照群Ａは処理を行なわなかった。第２の試験群Ｂは、５０μｌ容量の懸濁アポトーシス小体の接種で処理し、これは、上述の如く調製した、上述のストレッサーに供された血液で、１接種当たり少なくとも１５０，０００小体を含むものであった。処理は、各々、各液体の５０μｌの筋肉内注射を含むものであり、感作の日から開始し、毎日全６日間反復した。最後の処理の同じ日に、その投与の後、動物は、各動物の右耳に、１０μｌのアセトン・オリーブ油中０．２％ＤＮＦＢ溶液を塗布することにより、ＤＮＦＢの攻撃を行なった。各動物の左耳には、ＤＮＦＢを含まないアセトン／オリーブ油溶媒を塗布した。ＣＨＳのための炎症がそれ自体、右耳の腫脹で現れる。耳の厚みを、ピーコックバネ付勢ミクロメーターを用いて、攻撃後２４時間で測定した (Ozaki Co., 東京、日本)。攻撃して２４時間経った後の結果を、各動物の右耳と左耳の厚み及び差異として表した。
【００４６】
結果の統計的な有意性を確保するために、十分な回数で、さらに２つの動物群を用いて、実験を反復した。非処理の群に比べて、耳の厚み（炎症）の注目すべき有意な減少が、本発明のアポトーシス細胞及びアポトーシス小体懸濁液で処理された動物で観察され、炎症の有意な減少を示した。各群についての結果を、下記の表と、正味の耳腫脹（右耳と左耳の厚みの差異）の棒グラフとして、図面に示す。標準偏差は、各カラムの上の垂直ラインで示している。
【００４７】
【表１】
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【００４８】
【表２】
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【００４９】
試験群Ｂの動物へ投与されたアポトーシス細胞及び小体の懸濁液の分析は、その中に、約４０％のアポトーシス細胞及び小体、残りの生存細胞、及びわずかな量のネクロシス細胞（２０％以下）（この存在はin vivoプロセスで有意でないと考えられる）が存在することを示した。
【００５０】
実施例２
上記試験手法は、試験群に対して、約６０％のアポトーシス細胞及び小体、残りの生存細胞、及びわずかな量のネクロシス細胞（２０％以下）を含むアポトーシス細胞及び小体の懸濁液を用いた以外は、動物の同様の群、対照群、及び試験群で反復した。実質的に同様の結果を得た。
【００５１】
ＣＨＳによる炎症の予防及び軽減における本発明の方法と組成物の有効性は、上記アポトーシス細胞及び小体の投与が、ＩＬ−１０などの抗炎症Ｔｈ−２由来のサイトカインのin vivo生成を上方に制御(ＣＨＳに関与していることは知られている。Kondo, McKenzie and Sauder, "The Journal of Investigative Dermatology," Vol. 103, 1994, page 811-814参照) し、及び／又はＴＮＦγ、ＩＬ−６及びＩＬ−１２などのＴｈ−１炎症サイトカインを下方制御することを示す。これらの炎症性サイトカインは、アテローム性動脈硬化症、末梢血管疾患、うっ血性心不全、発作、心筋梗塞、アンギナ、高血圧症などの心臓血管障害、レーノー病、心臓の症候群Ｘ、片頭痛などの血管痙攣障害、及び虚血性に起因する損傷（虚血性障害又は虚血−再灌流障害）としてそれ自体現れる内皮機能障害に関与している。したがって、上記実施例で報告されたＣＨＳ治療の成功の発見は、Ｔｈ−１炎症サイトカインのその付随する下方制御で、上記の疾患を含む広範囲の内皮機能障害疾患の治療と予防における方法と組成物の使用の成功を示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の組成物で治療されたマウスと対照群との、正味の耳腫脹の比較を示すグラフである。
【図１】
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【国際調査報告】
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