(57)【要約】本発明は、エネルギー恒常性および中性脂肪の代謝、および本発明において開示したタンパク質を同定およびをコード化するポリヌクレオチドの調節を行なう、3 つの新規タンパク質を開示する。本発明はまた、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを産生するための、ベクター、宿主細胞、抗体、および組換え方法に関連するものである。本発明はまた、体重調節、例えば、限定するものではないが、肥満症のような代謝疾患のほかに、肥満症、摂食障害、消耗症候群(悪質液)、膵臓の機能障害(真性糖尿病など)、高血圧症、膵臓の機能障害、動脈硬化症、冠動脈動脈疾病(CAD)、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、癌、例えば、生殖器官の癌、睡眠時無呼吸、などのような関連障害にもまた関連する、診断、研究、予防、および疾患と障害の治療におけるこれらの配列の使用に関連するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質ジスルフィド異性化酵素(DevG20)または ABC 輸送体(DevG4、DevG22)遺伝子系の核酸分子またはそれによってコード化されたポリペプチドまたは断片または当該核酸分子の変異型または当該ポリペプチドまたは抗体、タンパク質ジスルフィド異性化酵素の核酸分子を認識するアプタマーまたは別の受容体または ABC 輸送体の遺伝子系または、医薬用に許容できるキャリア、希釈液および(または)アジュバントと合わせた、それによってコード化されたポリペプチドを含む医薬品成分。
【請求項２】
核酸分子が脊椎動物または昆虫のタンパク質ジスルフィド異性化酵素または ABC 輸送体核酸、特にヒトタンパク質ジスルフィド異性化酵素核酸(DevG20)(Genbank アクセッション番号 NM-030810、配列認識番号 1)または ABC 輸送体核酸、例えば、ヒト MRP4 核酸(DevG4)(Genbank アクセッション番号 NM-005845;配列認識番号 3)または ヒト白色核酸(DevG22)(Genbank アクセッション番号 XM-009777; 配列認識番号 5)またはその断片またはその変異型および(または)その相補的核酸分子、であるような請求項 1 の成分。
【請求項３】
当該核酸分子が下記である、請求項 1 または 2 の成分。
(a) 0.2 x SSC および 0.1% のSDS を含む溶液中で SEQ ID NO: 1、3 および(または) 5 のアミノ酸配列をコード化する核酸分子またはその相補鎖に対して50EC にてハイブリダイズする核酸分子。
(b) 核酸分子(a)に対して縮重された核酸分子。
(c) 少なくとも85%、望ましくは 少なくとも90%、より望ましくは 少なくとも95%、より望ましくは 少なくとも98% および 99.6% までに SEQ ID NO:2、4 または 6 に同一であるポリペプチドをコード化する核酸分子。または
(d) (a)〜(g)の核酸分子と異なり、当該突然変異体がコード化されたポリペプチドにおいて改変、削除、複製または早期停止を生じるような突然変異による核酸分子。
【請求項４】
核酸分子が DNA 分子、特に cDNA またはゲノム DNA である請求項 1〜3 の任意の 1 項の成分。
【請求項５】
当該核酸がポリペプチドををコードし、エネルギー恒常性および中性脂肪の代謝の調節に寄与する、請求項 1〜4 の任意の 1 項の成分。
【請求項６】
当該核酸分子が修飾核酸分子である、請求項 1〜5 の任意の 1 項の成分。
【請求項７】
組換え核酸分子がベクター、特に発現ベクターである請求項 1〜6 の任意の 1 項の成分。
【請求項８】
ポリペプチドが組換えポリペプチドである請求項 1〜5 の任意の 1 項の成分。
【請求項９】
当該修飾ポリペプチドが融合ポリペプチドである請求項 8 の成分。
【請求項１０】
当該核酸分子が ハイブリダイゼーション プローブ、プライマーおよびアンチセンス オリゴヌクレオチドから選択される請求項 1〜7 の任意の 1 項の成分。
【請求項１１】
診断用成分である、請求項 1〜10 の任意の 1 項の成分。
【請求項１２】
医療用成分である、請求項 1〜10 の任意の 1 項の成分。
【請求項１３】
検出および(または)検証用の薬剤の製造、肥満症のような障害のほかに、脂肪過多症、摂食障害、消耗症候群(悪質液)、膵臓の機能障害(真性糖尿病など)、高血圧症、膵臓の機能障害、動脈硬化症、冠動脈動脈疾病(CAD)、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、癌、例えば、生殖器官の癌、睡眠時無呼吸、障害に関連する ROS 産生、および神経神経変性疾患、細胞、細胞塊、器官および(または)被験者における他の疾患のような関連障害も含めた治療、軽減および(または)予防のための請求項 1〜12 の任意の 1 項の成分。
【請求項１４】
DevG20、DevG4、および(または)DevG22 遺伝子系またはそのコードされたポリペプチドまたは断片または当該核酸分子の変異型または当該ポリペプチドまたは抗体、当該核酸分子を認識するアプタマーまたは別の受容体またはDev620、Dev64および(または)Dev622 ポリペプチドによって影響および(または)修飾される遺伝子および(または)遺伝子産物の機能を制御するためのコードされたそのポリペプチドの核酸分子の使用法。
【請求項１５】
DevG20、DevG4、および(または)DevG22 遺伝子系またはそのコードされたポリペプチドまたは断片または当該核酸分子の変異型または当該ポリペプチドまたは抗体、当該核酸分子を認識するアプタマーまたは別の受容体またはDevG20、DevG4、および(または)DevG22 ポリペプチドと相互作用する能力のある物質を同定するためのコードされたそのポリペプチドの核酸分子の使用法。
【請求項１６】
DevG20、DevG4、および(または)DevG22 ポリペプチドの修飾発現を示す非ヒト遺伝子組換え動物。
【請求項１７】
DevG20、DevG4、および(または)DevG22 ポリペプチドの発現が増大または減少した請求項 16 の動物。
【請求項１８】
DevG20、DevG4、および(または)DevG22 ポリペプチドの修飾発現を示す組換え宿主細胞。
【請求項１９】
ヒト細胞である請求項 18 の細胞。
【請求項２０】
哺乳動物におけるエネルギー恒常性および(または)中性脂肪の代謝に関与するポリペプチドを同定する方法のステップは下記の通りである。
(a) DevG20、DevG4、および(または)DevG22 ポリペプチドまたはその断片を用い、当該(ポリ)ペプチドの結合を可能にする条件下(ポリ)ペプチドの回収に接触するステップ。
(b)  結合しない(ポリ)ペプチドを除去するステップ。
(c) 当該 DevG20、DevG4、および(または)DevG22 ポリペプチドまたはその断片に結合する(ポリ)ペプチドを同定するステップ。
【請求項２１】
DevG20、DevG4、および(または)DevG22 ポリペプチド ポリペプチドの結合標的および薬剤との相互作用を調整する薬剤をスクリーニングする方法は下記のステップから成る。
(a)   下記から成る混合物をインキュベートするステップ。
(aa)  DevG20、DevG4、および(または)DevG22 ポリペプチド、またはその断片;
(ab)  当該DevG20、DevG4、および(または)DevG22 ポリペプチドまたはその断片の結合標的および薬剤; および
(ac)  候補薬剤
下記参照の親和性にて当該DevG20、DevG4、および/またはDevG22 ポリペプチドまたはその断片が特異的に当該結合標的と薬剤に結合する条件下;
(b) (候補)薬剤偏向親和性を決定するため、当該結合標的に対する当該 DevG20、DevG4、および(または)DevG22 ポリペプチドまたはその断片の結合親和性を検出する; および
(c)  (候補)薬剤偏向親和性とリファレンス親和性間の差異を確定するステップ。
【請求項２２】
医薬用に許容できるキャリア、希釈剤および(または)アジュバントを有する、請求項 20 の方法によって識別された(ポリ)ペプチド、または請求項 21 の方法によって識別された薬剤を含む組成物を産出する方法。
【請求項２３】
当該成分が、肥満症のほかに脂肪過多症、摂食障害、消耗症候群(悪質液)、膵臓の機能障害(真性糖尿病など)、高血圧症、動脈硬化症、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、癌、例えば、生殖器官の癌、睡眠時無呼吸、などののような関連障害もまた含めた患および障害を防止、軽減または治療するための医薬品成分である、請求項 22 の方法。
【請求項２４】
肥満症のほかに、脂肪過多症、摂食障害、消耗症候群(悪質液)、膵臓の機能障害(真性糖尿病など)、高血圧症、動脈硬化症、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、癌、例えば、生殖器官の癌、睡眠時無呼吸のような関連障害も含めた疾病の治療、軽減および(または)予防に対する医薬品成分の調製(調合)のための、請求項 20 の方法によって同定されたポリペプチド、 または請求項 21 の方法によって同定された薬剤の使用法。
【請求項２５】
DevG20、DevG4、および(または)DevG22遺伝子産物を過剰発現または低発現する非ヒト動物の準備(preparation)のための DevG20、DevG4、および(または)DevG22 ファミリーまたはその断片の核酸分子の使用法。
【請求項２６】
下記の最低 1 つを含むキット。
(aa)  DevG20、DevG4、および(または)DevG22 核酸分子、またはその断片;
(b)  (a) の核酸を含むベクター;
(c)  (a) の核酸または (b) のベクターを含む宿主細胞;
(d)  (a) の核酸によってコードされたポリペプチド;
(e)  (a) の核酸によってコードされた融合ポリペプチド;
(f)  (a) の核酸または (d) または (e) のポリペプチド に対する抗体、アプタマーまたは別の受容体;および
(g)  (a) の核酸の抗センス オリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質ジスルフィド異性化酵素および ABC 輸送体相同性タンパク質の、核酸およびアミノ酸配列の使用、および診断、研究、予防、および疾患および障害の治療に関連する体重調節、例えば、限定するものではないが、肥満症〜のような代謝疾患のほかに、肥満症、摂食障害、消耗症候群(悪質液)、膵臓の機能障害(真性糖尿病など)、高血圧症、動脈硬化症、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、癌、例えば生殖器官の癌、睡眠時無呼吸、などのような関連障害におけるこれらの配列の使用にもまた関連するものである。
【０００２】
肥満症は、世界で最も一般的な代謝障害の 1 つである。それは、依然としてほとんど理解されていないヒトの疾病であり、ますます西側諸国に関連性のある問題となっている。肥満症は、体脂肪の過剰として特定され、しばしば深刻な健康欠陥を結果としてもたらす。糖尿病、高血圧症および心臓病のような病気の重度の危険に加えて、肥満症に苦しむ個人は多くの場合、社会的に孤立している。ヒトの肥満症は、環境的要因および遺伝的要因によって強く影響され、そのために環境的な影響が多くの場合に(ヒト)肥満症の遺伝子同定の障害物となる。肥満症は、遺伝的要因、代謝要因、生化学的要因、心理学的要因、および行動的要因によって影響される。従って、肥満症は、持続的かつ肯定的な臨床成果を達成するために、いくつかの分野で取り組まなくてはならない複合体障害である。肥満した個人は以下を含んだ病気にかかる傾向がある: 真性糖尿病、高血圧症、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、癌、例えば、生殖器官の癌、および睡眠時無呼吸。
【０００３】
肥満症は、単一障害と考慮されず、(潜在的)複数原因をともなう異成分からなる条件群として考慮される。肥満症はまた、空腹時血漿インシュリンの上昇および経口グルコース摂取 (Koltermann、J. Clin. Invest 65、1980、1272〜1284)に対する過度なインシュリン反応を特徴とし、2型真性糖尿病における肥満症の明らかな介入を確認されている(Kopelman、Nature 404、2000、635〜643)。
【０００４】
たとえ、レプチン、VCPI、VCPL、またはペルオキシソーム増殖因子〜活性化受容体ガンマ活性化補助因子のような体重/重量を調節する、恒常性(維持)システムを影響するはずの、いくつかの候補遺伝子が記述されているとしても、肥満症または体重調節に影響する、固有の分子機構および(または)分子は知られていない。
以上の点から、本発明の根底にある技術的問題は、体重調節および(または)エネルギー恒常性(維持)回路を影響する、(病理学的な)代謝条件の調節のための手段と方法を提供することであった。当該技術的問題に対する解決は、請求項において特徴づけられた実施例を提供することによって達成することができる。
【０００５】
従って、本発明は、体重調節における新規機能をともなう遺伝子、エネルギー恒常性、代謝、および肥満症に関連するものである。本発明は、エネルギー恒常性、代謝、および肥満症に関与する、特定の遺伝子体重の調節を開示し、無秩序に、摂食障害、悪質液、真性糖尿病、高血圧症、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、癌、例えば、生殖器官の癌、および睡眠時無呼吸などに関連する。本発明では、上述した条件に関与するものとして、ヒトタンパク質ジスルフィド異性化酵素、MRP4、および ABC8(白色)遺伝子を記述する。
【０００６】
タンパク質ジスルフィド異性化酵素(PDI)は、タンパク質ジスルフィドの折りたたみ(構造)を触媒する、タンパク質チオール オキシドレダクターゼである。PDI は、 受容機能の調節、細胞間の相互作用、遺伝子発現、およびアクチンフィラメント重合に関与することが実証されている。PDI は、シャペロンおよびプロリル 4-ヒドロキシラーゼのサブユニットおよびミクロソームの中性脂肪伝達タンパク質(MTP)としての役割を有する。MTP は中性脂肪、コレステリル エステル、およびリン脂質の細胞膜間輸送(Berriot-Varoqueaux らの 2000、Annu Rev Nutr. 20、663-697)を促進している。MTP における突然変異体は、無β・リポタンパク血(症)、限定されたキロミクロンの産生をともなう遺伝性の疾病および腸および肝臓における非常に低密度のリポタンパク(質)(VLDL)(Rehberg らの 1996、J Biol Chem. 271(47)、29945-52)の原因となる。細胞内のVLDL は、PDIおよびグルコース調節されたタンパク質94 (GRP94、エンドプラスミン)を含んだ、シャペロンに関連し、アポリポタンパク質 B とともに組み立てられる(前出の Berriot-Varoqueaux ら)。これらのシャペロンは、スフィンゴシン依存型キナーゼ (SDKs)の内在性基質であり、およびシグナル 伝達経路によって調節される(例えば、Megidish らの 1999、Biochemistry. 38(11)、3369-78 を参照)。
【０００７】
シャペロンは、アポリポタンパク質B のようなリポタンパク(質)の脂質化が起こり得る、小胞体において見出される(Hussain らの 1997、Biochemistry. 36(42)、13060-7.; Wu らの 1996、J Biol Chem. 271(17)、10227-81)。加えて、アポリポタンパク質B の分泌は、PDI に依存する(Wang らの 1997、J. Biol. Chem. 272(44)、27644-51)。
【０００８】
追加タンパク質の形成または組立は、シャペロンの特定群の活性に強く依存する。PDI は、その先駆(原料)物質からの天然のインシュリンの形成およびインシュリン 劣化を調節している(Tang らの 1988、Biochem J. 255(2)、451-5; Duckworth らの 1998、Endocr Rev. 19(5)、608-24)。インシュリンのシグナル伝達は、血糖レベルおよび脂質代謝の適切な調節にとって、極めて重要である。
【０００９】
食事性エネルギー組織特異性は、マウスの肝臓における小胞体シャペロン遺伝子発現、特にグルコース調節タンパク質を調節する(Dhahbi らの 1997、J Nutr. 127(9)、1758-64)。加えて、PDI mRNA は、脂肪組織において強く発現され(Klaus らの 1990、Mol Cell Endocrinol. 73(2-3)、105-10)、代謝経路におけるそれらの重要な役割を強調する。
【００１０】
シャペロンはまた、酸化ストレス、熱ショックストレスまたは低血糖性ストレスのような、その異なる形態におけるストレスに対する細胞保護にとって必須であり(Barnes & Smoak、2000、Anat Embryol. 202(1)、67-74、Lee、1992. Curr Opin Biol. 4(2)、267-73)、細胞がアポトーシスを経験することを防止する。
【００１１】
さらには、シャペロンは、アルツハイマー病(Yoo らの 2001、Biochem Biophys Res Commun. 280(1)、249-58)、パーキンソン病(Duan & Mattson、1999、J Neurosci Res. 59(13)、195-206)、関節リウマチ(Corrigall らの 2001、J Immunol. 166(3)、1492-98)または患者を自殺につながる神経心理学的疾病(Bown らの 2000、Neuropsychopharmacology. 22(3)、327-32)のような異なる疾患に関与する。
【００１２】
ATP 結合カセット (ABC) 遺伝子は、いくつかのヒト遺伝的な疾患に関与することが知られている、輸送タンパク質のファミリーをコード化する。例えば、ショウジョウバエ 白色遺伝子のヒト相同体の遺伝子多型は、気分障害およびパニック障害(Nakamura らの 1999 Mol Psychiatry. 4(2):155-62)に関連する。小管の多選択性有機アニオン輸送体(cMOAT)遺伝子における突然変異体は、2 型高ビリルビン血(症)につながるデュービン・ジョンソン症候群の理由であり得る(Wada らの 1998、Hum Mol Genet. 7(2):203-7)。ロッド型光受容体特異的 ABC 輸送体(ABCR)は、スタルガルト病の原因である(Allikmets らの 1997、Nat Genet. 15(3):236-46)。ATP 結合カセット輸送体1 (ABC1)をコード化する遺伝子は、血漿高密度リポタンパク質(HDL)の不在、および細網内皮系におけるコレステリルエステルの巨脾症との被着、および扁桃腺およびリンパ腺の肥大につながる、タンジール病において変異される。(Brooks-Wilson らの 1999 Nat Genet. 22(4):336-45、Bodzioch らの 1999 Nat Genet. 22(4):347-51、Rust らの 1999、Nat Genet. 22(4):352-5)。さらには、ABC 輸送体のサブグループは、例えば、抗癌治療またはHIV 治療を打ち消す多剤耐性を引き起こす、細胞の解毒作用に関与する(Schuetz らの 1999 Nat Med. 1999 (9):1048-51)。
【００１３】
ABC 輸送体は、分子のいくつかのクラスを輸送する。ABC1 (ABCA1)、タンジール病において変異した遺伝子は、細胞からのコレステロールおよびリン脂質の apoAI 関連搬出を仲介し、コレステロールの排出によって調節される((Brooks-Wilson らの 1999 Nat Genet. 22(4):336-45、Bodzioch らの 1999 Nat Genet. 22(4):347-51、Rust らの 1999、Nat Genet. 22(4):352-5Brooks-Wilson らの 1999、Bodzioch ら 1999、Rust ら 1999)。ABC1 は、血漿膜およびゴルジ複合体上に発現され、脂質搬出プロセスは、タンジール病において阻害される、ゴルジと血漿膜との間の小胞発芽を必要とする。LDL および HDL３ は、マクロファージにおける ABC1 の発現を調節する(Orsoらの 2000 Nat Genet. 24:192-6)。
【００１４】
ショウジョウバエ 白色遺伝子(ABC8またはABCG1)のヒト相同体の発現は、LDL によって仲介されたコレステロール流入中に単球由来のマクロファージにおいて誘導され、コレステロール受容体 HDL３によって仲介された脂質排出を通して下方制御される。ABC8 は、コレステロールを含んだマクロファージの細胞表面および細胞内コンパートメント上に発現され、その発現もまた、オキシステロール核受容体を通して作用するオキシステロール、肝臓 X 受容体(LXRs)によって、およびレチノイド X 受容体結合基によって調節される。以上の点から、マクロファージにおける ABC8 活性は、コレステロール代謝および ABC1 に類似する動脈硬化症の発生にとって極めて重要であり得る。LXR 発現は、脂質生成にとって必須である、PPARg ガンマ シグナル伝達を通して調節され、以上の点から PPARg ガンマ シグナル伝達は、少なくともマクロファージにおける ABC1 および ABC8 輸送体の発現を調節し得る。(Klucken らの 2000 Proc Natl Acad Sci USA. 97(2):817-22.、Venkateswaran らの 2000 J Biol Chem. 275(19):14700-7)。
【００１５】
ABC 輸送体の別のサブグループは、細胞解毒作用を仲介し、以上の点から、多剤耐性関連タンパク質(MRPs)または 小管の多選択性有機アニオン輸送体(cMOATs)と命名される。MRP1 は、グルタチオン (GSH)、グルクロニドまたは硫酸塩および輸送スフィンゴ脂質、エイコサノイド、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミン類似体に抱合された化合物に対して高活性を有するが、その主要な機能は細胞解毒作用である。MRP4 (MOAT-B)過剰発現は、ヌクレオシド類似体 9-(2-ホスホニルメトキシエチル)アデニンおよびアジドチミジン モノリン酸塩に対する高レベルの抵抗性に関連し、その両方ともが抗ヒト免疫不全ウイルス (HIV)薬剤として使用されている(Schuetz らの 1999 Nat Med. 5(9):1048-51)。脂質輸送におけるMRP4 機能は、LDL および HDL３ がマクロファージにおけるその発現を調節するという事実にもかかわらず、未知である。
【００１６】
これまでは、タンパク質ジスルフィド異性化酵素または ABC 輸送体および相同性ヒトタンパク質が、エネルギー恒常性の調節および体重調節および関連障害に関与することは記載されていないので、上に列記したような代謝疾患および他の疾患における機能は検討されていない。本発明において、タンパク質ジスルフィド異性化酵素の正しい遺伝子投与量および(または) 2 つの ABC 輸送体遺伝子の正しい遺伝子投与量がエネルギー恒常性の維持にとって必須であることを実証する。タンパク質ジスルフィド異性化酵素遺伝子、MRP4遺伝子、および(または)白色(ABC8)遺伝子が、中性脂肪含有率、主要なエネルギー保管物質の著しい増加によって反映されたキイロショウジョウバエにおいて肥満症の原因となることを同定するために、遺伝子学的スクリーニングを使用した。
【００１７】
タンパク質ジスルフィド異性化酵素または ABC 輸送体に対して相同性を有するタンパク質をコード化するポリヌクレオチドは、肥満症のような代謝疾患および障害のほかに、上記に記載した関連障害もまた含んだ、疾患および障害を調査研究する機会を提供する。タンパク質ジスルフィド異性化酵素および ABC 輸送体に関連する分子は、上記に記載した代謝疾患および障害を含んだ、診断、治療、および疾患および障害の予後において有用である新規成分を提供することによって、当分野における要求を満たす。
【００１８】
本タンパク質、ヌクレオチド配列、および方法について以下に説明するが、説明した特定の装置、プロトコル、細胞株、ベクターおよび試薬に本発明が限定されるものではなく、改変し得ることは当然のことながら共通認識とする。また、本詳細書で使用する専門用語は特定の実施例を説明する目的で用いたものに過ぎず、特許請求の範囲にのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことも当然のことながら共通認識とする。本明細書中で用いる全ての専門用語および科学用語は、特に定義されている場合を除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載する方法および材料に類似または 等価な方法および材料は、本発明の実践または検査で用いることができるが、好適な方法、装置、および材料をここに記載した。本明細書で言及する全ての刊行物は、本発明に関連し得る刊行物中で報告されている細胞株、ベクターおよび方法論について説明および開示する目的で、ここに引用することをもって本明細書の一部となす。本明細書のいかなる開示内容も、本発明がこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【００１９】
本発明は、エネルギー恒常性および脂肪代謝、特に中性脂肪の代謝および保管、およびポリヌクレオチド、中性脂肪のポリヌクレオチド、および本発明において開示したタンパク質を同定およびコード化する、ポリヌクレオチドを調節する、新規タンパク質ジスルフィド異性化酵素相同性タンパク質および 2 つの新規 ABC 輸送体相同性タンパク質を開示する。本発明はまた、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを産生するための、ベクター、宿主細胞、抗体、および組換え方法に関連するものである。本発明はまた、体重調節、例えば、限定するものではないが、肥満症のような代謝疾患のほかに、肥満症、摂食障害、消耗症候群(悪質液)、膵臓の機能障害(真性糖尿病など)、高血圧症、動脈硬化症、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、癌、例えば、生殖器官の癌、睡眠時無呼吸、などのような関連障害にもまた関連する、診断、研究、予防、および疾患と障害の治療におけるこれらの配列の使用に関連するものである。
【００２０】
タンパク質ジスルフィド異性化酵素および ABC 輸送体相同性タンパク質および核酸分子コーディングは、昆虫または脊椎動物各種、例えば、哺乳動物または鳥から入手可能である。特に好適なのは、ヒトタンパク質ジスルフィド異性化酵素および ABC 輸送体相同性核酸、特にヒトタンパク質ジスルフィド異性化酵素相同性タンパク質をコード化する核酸である(MGC3178; mRNA に対する Genbank アクセッション番号 NM-030810 (Genbank アクセッション番号 BC001199 と同一); NP-110437.1 (タンパク質に対する Genbank アクセッション番号 AAH01199 と同一))、ヒト ATP 結合カセット、亜族 C (CFTR/MRP)、メンバー 4 (ABCC4; MRP4; mRNA に対する Genbank アクセッション番号 NM-005845 ; タンパク質に対する NP-005836.1)、およびヒト ATP 結合カセット、亜族 G (白色)、メンバー 1 (ABCG1; 白色; mRNA に対する Genbank アクセッション番号 XM-009777; タンパク質に対する XP-009777.3)。また、特に好適なのは、ショウジョウバエ のタンパク質ジスルフィド異性化酵素相同性および ABC 輸送体相同性核酸およびそれによってコードされたポリペプチドである。よって、好適な実施例における本発明はまた、タンパク質おび核酸分子コーディングのいわゆる「ABC-tran」ドメインも備えている。
【００２１】
本発明は特に、エネルギー恒常性および中性脂肪の代謝の調節に寄与する、ポリペプチドをコード化する核酸分子に関連するものであり、当該核酸分子は下記を備えている。
(a)  ヌクレオチド配列に示した配列認識番号 1、配列認識番号 3、または配列認識番号 5、
(b)  66EC にて 0.2 x SSC および0.1% SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)を含んでいる溶液において、配列認識番号 2、配列認識番号 4、または配列認識番号 6 のアミノ酸配列をコード化する核酸分子の相補鎖に対してハイブリタイズするヌクレオチド配列、
(c)  遺伝暗号の変性内における(a)または(b)の配列に対応する配列、
(d)  少なくとも 85%、望ましくは 少なくとも 90%、より望ましくは 少なくとも 95%、より望ましくは少なくとも 98% および99,6% まで配列認識番号 2、配列認識番号 4、または配列認識番号 6 に同一の、ポリペプチドをコード化する配列、
(e)  突然変異によって(a)〜(d)の核酸分子と異なる配列であり、当該突然変異体が、コードされたポリペプチドにおいて改変、削除、複製または早期停止を引き起こす配列、または
(f)  少なくとも 15 塩基、望ましくは少なくとも 20 塩基、より望ましくは少なくとも 25 塩基および最も望ましくは少なくとも50 塩基の長さを有する(a)〜(e)のヌクレオチド配列の任意の部分的配列。
【００２２】
本発明は、タンパク質ジスルフィド異性化酵素相同性タンパク質(特にPDI 様; DevG20 と呼ばれる)および ABC 輸送体相同性タンパク質(特に MRP4 および白色; 本明細書ではそれぞれ DevG4 および DevG22 と呼ぶ)およびこれらをコード化するポリヌクレオチドは、中性脂肪保管および以上の点からエネルギー恒常性の調節に関与するという発見に基づく。本発明では、肥満症のような代謝疾患を含んだその細胞のほかに、肥満症、摂食障害、消耗症候群(悪質液)、膵臓の機能障害(真性糖尿病など)、高血圧症、動脈硬化症、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、癌、例えば、生殖器官の癌、睡眠時無呼吸、などのような関連障害にもまた関連する、診断、研究、予防、または疾患と障害の治療に対するこれらの成分の使用を説明する。
【００２３】
エネルギー恒常性、代謝、および肥満症において新規機能をともなう遺伝子を発見するため、モデル生物体キイロショウジョウバエ (Meigen)を用いて機能的な遺伝子学的スクリーニングを実施した。スクリーニングのための 1 つのリソースは、専売のキイロショウジョウバエ EP ラインの在庫コレクションであった。このコレクションのPベクターは、UAS 部位への Gal4 の結合時に、近傍するゲノムショウジョウバエ配列に転写できる基底プロモーターに融合したGal4-UAS 結合部位を有する。これは、EP ライン コレクションが内在性側面遺伝子配列の過剰発現を行うことを可能にする。加えて、UAS 部位の活性化なしの、EP 因子の遺伝子への統合は、遺伝子活性の低下の原因となる可能性があり、機能喪失の表現型を検討することによって、その機能の決定を可能にする。
【００２４】
中性脂肪は細胞において最も効果的なエネルギー保管場所である。エネルギー恒常性において機能をともなう遺伝子を単離するするために、数千の専売 EP ラインの中性脂肪含有率を長期にわたる食餌期間後にテストした(詳細は実施例を参照)。さらなる分析のための肯定的な候補として、中性脂肪含有率が顕著に変化したラインを選択した。
【００２５】
肥満した人々は、主に中性脂肪含有率の著しい増加を示す。本発明において、6 日間の給餌後の同一遺伝子型を有するハエのプールの中性脂肪含有率を、例えば、中性脂肪測定法のような方法を使用して分析したが、これは本発明の範囲を限定するものではなく、その結果を以下に実施例の項において記載した。
【００２６】
本発明には、DevG20、DevG4、DevG22、および相同性タンパク質をコード化するポリヌクレオチドが包含される。従って、DevG20、DevG4、または DevG22 のアミノ酸配列をコード化する任意の核酸配を、DevG20、DevG4、または DevG22 を発現する組換え分子を生成するために使用することが可能である。特定の実施例によれば、本発明には、図 4A に示した1693 塩基対 (DevG20 配列認識番号 1 と呼ぶ PDI)、図 9A に示した 4487 塩基対の核酸配列(DevG4、配列認識番号 3 と呼ぶ MRP4)、および図 15A に示した 2459 塩基対の核酸配列(DevG22配列認識番号 5 と呼ぶ ABC8、または白色)の核酸配列が包含される。当業者にとっては当然のことながら、遺伝暗号の縮重の結果、DevG20、DevG4、または DevG22 をコード化する多数のヌクレオチド配列(一部は既知および天然の遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する)を産生することが可能である。したがって本発明では、可能コドン選択に基づく組み合わせの選択によって作製し得るような、ありとあらゆる可能性のあるヌクレオチド配列変異体が考慮されている。これらの組み合わせは、天然のDevG20、DevG4、またはDevG22 のヌクレオチド配列に適用される標準的なトリプレット遺伝暗号に従って作製され、全ての変異が明確に開示されていると考慮する。 DevG20、DevG4、または DevG22およびその変異体をコード化するヌクレオチド配列が、適切に選択された ストリンジェントな条件下で天然のDevG20、DevG4、または DevG22のヌクレオチド配列に対してハイブリダイズすることが可能なことが望ましいが、DevG20、DevG4、または DevG22 または実質上異なるコドン用法を有するその誘導体をコード化するヌクレオチド配列を産生することが有益であり得る。 宿主が特定のコドンを利用する頻度に基づいて、特定の真核または原核宿主に発生するペプチドの発現率を高めるようにコドンを選択することが可能である。コードされたアミノ酸配列を変えることなく、DevG20、DevG4、または DevG22 およびその誘導体をコード化するヌクレオチド配列を実質上変更するその他の理由には、より好ましい性質、例えば、天然の配列から産生される転写物より長い半減期などを有する、RNA 転写物の産生が含まれる。本発明にはまた、DevG20、DevG4、または DevG22 およびその誘導体をコード化する DNA 配列またはその一部分の、全てが合成化学によって行なわれる産生も包含される。その産生後には、本発明の出願時に当分野で周知の試薬を用いて、この合成配列を任意の入手可能な多数の発現ベクターおよび細胞系中に挿入することが可能である。その上に、合成化学を用いて、突然変異体を DevG20、DevG4、または DevG22 またはその任意の一部をコード化する配列の中に導入することも可能である。
【００２７】
また、本発明に包含されるのは、種々のストリンジェントな条件下で、請求項に記載のヌクレオチド配列、具体的には、配列認識番号 1、配列認識番号 3、およびin配列認識番号 5 に示した配列にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列である。ハイブリダイゼーション条件は、Wahl, G. M. and S. L. Berger (1987: Methods Enzymol. 152:399-407) and Kimmel, A. R. (1987; Methods Enzymol. 152:507-511)で教示されたように、核酸結合複合体またはプローブの溶解温度(Tm)に基づいており、特定のストリンジェントでの使用が可能である。望ましくは、ストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーションとは、1 時間 1 x SSC および0.1% SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)を用いて50EC にて、望ましくは55EC にて、より望ましくは62EC にて、および最も望ましくは 68EC にて、特に1 時間 0.2 x SSC および0.1% SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)中で 50EC にて、望ましくは 55EC にて、より望ましくは 62EC にて、および最も望ましくは 68EC にて洗浄後、正のハイブリダイゼーションシグナルが認められることを意味する。本発明に包含される DevG20、DevG4、または DevG22 をコード化する変異核酸配列には、欠損、挿入、または異なるヌクレオチドの置換が含まれており、同一または機能的に等価なタンパク質をコード化するポリヌクレオチドを結果としてもたらす。
【００２８】
コードされたタンパク質には、サイレント変化を産生し、機能的に等価なタンパク質を結果としてもたらす、アミノ酸残基の欠損、挿入、または置換も含まれ得る。計画的アミノ酸置換は、DevG20、DevG4、または DevG22 の生物学的活性が保持される限りにおいて、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および(または)両親媒性特性の類似性を基に行い得る。例えば、負に帯電したアミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ; 正に帯電したアミノ酸にはリジンおよびアルギニンが含まれ; および類似の親水性値を持つ非荷電極性ヘッドグループを有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、およびバリン; グリシンおよびアラニン; アスバラギンおよびグルタミン; セリンおよびトレオニン; フェニルアラニンおよびチロシンが含まれ得る。
【００２９】
また、本発明の範囲内に含まれているものには、DevG20、DevG4、または DevG22 をコード化する遺伝子の対立遺伝子もある。本明細書で使用されているように、「対立遺伝子」または「対立遺伝子配列」は、核酸配列において少なくとも 1 つの 突然変異から生じ得る、遺伝子の代替形態である。対立遺伝子は、構造または機能が変異し得るかどうかわからない変異 mRNAsまたはポリペプチドを結果としてもたらし得る。任意の遺伝子は、無、 単一、または多くの対立遺伝子形態を持つことが可能である。対立遺伝子を誘発する一般の突然変異性変化は通常、ヌクレオチドの自然欠損、付加、または置換に帰する。これらの各変化は、単独、またはその他の変化と共に、所定の配列内で 1 回以上生じ得る。当分野で公知であり、一般に入手可能な DNA シーケンシングのための方法を用いて、本発明の任意の実施例を実行することが可能である。その方法では、例えば、DNA ポリメラーゼ I のクレノウ断片、SEQUENASE DNA ポリメラーゼ (オハイオ州クリーブランド市の US Biochemical 社)、Taq ポリメラーゼ (Perkin Elmer 社)、熱安定性 T7 ポリメラーゼ (イリノイ州シカゴ市の Amersham 社)、または ELONGASE 増幅システム(メリーランド州ゲーサーズバーグの GIBCO/BRL 社)のような組換えポリメラーゼおよび校正エキソヌクレアーゼの組み合わせなどの、酵素を用い得る。望ましくは、そのプロセスを、Hamilton MICROLAB 2200 (ネバダ州リノ市の Hamilton 社)、Peltier thermal cycler (PTC200; マサチューセッツ州ウォータタウンの MJ Research 社)および ABI 377 DNA 配列rs (Perkin Elmer 社)などの機械を用いて自動化する。 DevG20、DevG4、または DevG22 をコード化する核酸配列を、部分的ヌクレオチド配列を利用し、且つ当分野で周知の種々の方法を用いて伸長させ、プロモーターおよび調節要素などの上流配列を検出することが可能である。例えば、用い得る方法の 1 つである「制限部位」PCR 法は、ユニバーサル プライマーを用いて既知の遺伝子座に対して近傍する未知の配列を読み出す(Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic. 2:318-322)。具体的には、ゲノム DNA を、先ず最初にプライマー存在下でリンカー配列および既知の領域に対する特異プライマーに対して増幅する。増幅した配列を、その時点で同リンカー プライマーおよび最初の領域に内在する別の特異プライマーを伴なう PCR 法の第二ラウンドの対象とする。PCR 法の各ラウンドの産生物は、適切な RNA ポリメラーゼで転写し、逆転写酵素を使用して配列せしめる。逆 PCR 法も、既知の領域に基づいた分岐プライマーを用いて配列を増幅または伸長するために使用することが可能である。(Triglia、T. らの Nucleic Acids Res. 16:8186)。プライマーは、オリゴ 4.06 プライマー分析ソフトウェア(ミネソタ州プリモス市の National Biosciences Inc.)、または別の適切なプログラムを用いて、長さが22〜30 ヌクレオチド、GC 含有率が50% 以上、およびto 温度約 68〜72EC の標的配列にアニールするようにデザインすることが可能である。その方法では、好適な断片を生成するために、いくつかの制限酵素が使用される。その断片は、その時点で分子内の連結反応によって環状化せしめ、PCR 鋳型として使用する。
【００３０】
使用可能な別の方法としては、キャプチャ PCR 法があり、これにはヒトおよび酵母菌人工染色体 DNA における既知の配列に近傍する DNA 断片の PCR 増幅が含まれる(Lagerstrom、M. らの PCR Methods Applic. 1:111〜119)。この方法では、PCR 法を実施する前に、複数の制限酵素の消化および連結反応をも用いて、組換え二本鎖配列を未知の DNA 分子の一部に配置する。
【００３１】
未知の配列を読み出すために使用可能な別の方法としては、Parker、J. D. らの方法が挙げられる(1991; Nucleic Acids Res. 19:3055-3060)。加えて、PCR 法、ネステッドプライマー、およびPROMOTERFINDER ライブラリを用いて、ゲノム DNA の中に入ることが可能である。(カリフォルニア州の Clontech、Palo Alto)。このプロセスは、ライブラリをスクリーニングすることを回避し、イントロン接合部およびエキソン接合部を見つけるのに有用である。
【００３２】
完全長 cDNA をスクリーニングする際には、より大きな cDNA を含むようにサイズ選択されたライブラリを使用することが望ましい。また、遺伝子の 5' 領域を含んだ、より多くの配列を含むランダム プライム ライブラリも望ましい。ランダム プライム ライブラリの使用は、オリゴ d(T)ライブラリが完全長 cDNA を産しない状況において特に望ましい。ゲノムライブラリは、5' および 3' 非転写調節領域への配列の伸長に対して有用であり得る。市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、シーケンシング産生物または PCR 産生物のサイズを分析すること、またはそのヌクレオチド配列を確認することが可能である。具体的には、キャピラリー シーケンシングは、電気泳動分離のための流動性ポリマー、レーザー駆動の 4 つの異なる蛍光色素(各ヌクレオチドあたり 1 個)、および電荷結合素子(CCD)カメラによる発光波長の検出を用いることが可能である。出力および光の強度は、適切なソフトウェア(例えば Perkin Elmer 社の GENOTYPER および SEQUENCE NAVIGATOR)を使用して電気信号に変換することができ、試料の取り込みからコンピュータ分析までの全プロセス、および電子データ表示は、コンピュータ制御が可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定の試料に限られた量が存在する可能性のある DNA 小片のシーケンシング(配列決定)に特に望ましい。
【００３３】
本発明の別の実施例によれば、DevG20、DevG4、または DevG22またはその断片、または融合タンパク質またはその機能的等価物をコード化するポリヌクレオチド配列を組換え DNA 分子において用い、適切な宿主細胞中に DevG20、DevG4、または DevG22 の発現を誘導することが可能である。遺伝暗号の固有縮重により、実質上同一あるいは機能的に等価なアミノ酸配列をコード化する、他のDNA配列を産生することができ、これらの配列を用いて、DevG20、DevG4、または DevG22 をクローニングおよび発現することが可能である。当業者にとっては当然のことながら、非天然コドンをを有する DevG20 コード化、DevG4 コード化、およびDevG22 コード化のヌクレオチド配列を産生することは有益であり得る。例えば、特定の真核宿主または原核宿主によって好適とされるコドンは、タンパク質の発現率を高めるため、または、例えば天然配列から生成された転写物の半減期よりも長い半減期などの好ましい特性を有する組換え RNA 転写を産生するために、選択することが可能である。本発明のヌクレオチド配列は、種々の理由から DevG20、DevG4、または DevG22 のコード化する配列を変えるために、当分野で公知の方法を使用して遺伝子操作することができ、この理由には、遺伝子産物のクローニング、処理、および(または)発現を修飾する変化が含まれるが、これらに限定されるものではない。遺伝子断片および合成オリゴヌクレオチドのランダムなフラグメンテーションおよび PCR 再アセンブリによる DNA シャフリングを用い、ヌクレオチド配列を遺伝子操作することが可能である。例えば、部位特異的変異誘導を用いて、新規制限部位を挿入、グリコシル化のパターンを改変、コドン優先の変更、スプライス変異体の産生、または突然変異の導入、等々を行い得る。
【００３４】
本発明の他の実施例によれば、天然の核酸配列、修飾核酸配列または DevG20、DevG4、または DevG22  をコード化する組換え核酸配列を異種配列に連結反応させ、融合タンパク質をコード化することが可能である。例えば、DevG20、DevG4、または DevG22 活性の阻害剤に対してペプチドライブラリをスクリーニングするためには、市販の抗体によって識別可能なキメラタンパク質を産生することが有用であり得る。また、DevG20、DevG4、または DevG22 が異種部分から切断され、離れて精製され得るようにするため、融合タンパク質が、DevG20、DevG4、または DevG22 のコード化する配列と異種タンパク質配列との間に位置する切断部位を含むように遺伝子操作することも可能である。別の実施例によれば、当分野で周知の化学的方法を用いて、DevG20, DevG4, or DevG22 をコード化する配列の全部または一部を合成することが可能である(Caruthers, M.H.らの(1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 7:215-223, Horn, T.らの(1980)Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 7:225-232 を参照)。あるいは、タンパク質自体を、アミノ酸配列またはその一部の合成による化学的方法を使用して産生することが可能である。例えば、種々の固相技術を使用してペプチド合成を行うことができ(Roberge, J. Y.らの(1995)Science 269:202-204)、例えば ABI 431A ペプチド シンセサイザ(Perkin Elmer 社)を使用して自動合成を達成することが可能である。新規に合成したペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィー (例えば、Creighton, T. (1983) Proteins, Structures and Molecular Principles, WH Freeman and Co., New York, N.Y.)によって実質上精製することが可能である。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析またはシーケンシングによって確認することが可能である(例えば、the Edman degradation procedure; 前出のCreighton)。加えて、アミノ酸配列またはその任意の一部は、直接合成中に変異させることができ、および(または)変異型ポリペプチドを産生するために、化学的方法を使用して、他のタンパク質またはその任意の一部から得た配列と結合させることが可能である。
【００３５】
生物学的に活性な DevG20, DevG4, or DevG22 を発現するために、ヌクレオチド配列コーディングまたは機能的な等価物を好適な発現ベクター、例えば挿入されたコーディング配列の転写および翻訳に必要な要素を含むベクターに挿入することが可能である。当業者によく知られている方法を用いて、発現ベクターおよび好適な転写および翻訳調節要素を構築することが可能である。これらの方法には、生体外の組換え DNA 技術、合成技術、および生体内の遺伝的な組換えが含まれる。その技術は、Sambrook, J. らの(1989) Molecular Cloning、A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.、および Ausubel, F. M. らの(1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y. に記載されている。
【００３６】
種々の発現ベクターおよび宿主系を利用して、DevG20、DevG4、または DevG22 をコード化する配列を保持および発現することが可能である。 これらには、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミド DNA 発現ベクターで形質転換させた細菌や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌や、ウイルス発現ベクター(例えばバキュロウイルス)に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター(例えばカリフラワー モザイク ウイルス CaMV またはタバコ モザイク ウイルス TMV)または細菌発現ベクター(例えば Ti または pBR322 プラスミド)で形質転換させた植物細胞系、または動物細胞系などの微生物等が含まれているが、これらに限定されるものではない。「調節要素」または「調節配列」とは、ベクター・エンハンサーの非翻訳領域、プロモーター、転写および翻訳を行なうために宿主細胞タンパク質と相互作用する 5' および 3' の非翻訳領域である。このような要素の強度および特異性は様々である。利用されるベクター システムおよび宿主にもよるが、構成型プロモーターおよび誘導型プロモーターを含んだ任意数の適切な転写要素および翻訳要素を利用することが可能である。例えば、細菌系においてクローニングを行なう場合、BLUESCRIPT ファージミドのハイブリッド lacZ プロモーターような誘導型プロモーター(カリフォルニア州ラ・ホヤの Stratagene)または PSPORT1 プラスミド (Gibco BRL)などを使用することが可能である。バキュロウイルス ポリヘドリン プロモーターは昆虫細胞において使用することが可能である。植物細胞のゲノム(例えば、熱ショックである RUBISCO; および保管タンパク質遺伝子など)または植物ウィルス(例えば、ウィルス プロモーターおよびリーダー配列)に由来するプロモーターおよびエンハンサーは、ベクターにクローニングすることが可能である。哺乳動物の細胞系では、哺乳動物の遺伝子または哺乳動物のウィルスからのプロモーターが望ましいとされる。必要な複数のコピーの配列を含む細胞株を生成する必要がある場合には、SV40 または EBV に基づいたベクターを適切な選択可能マーカーと共に使用することが可能である。
【００３７】
細菌系では、タンパク質の使用目的に応じていくつかの発現ベクターを選択することが可能である。例えば、多量のタンパク質が抗体の誘発のために必要な場合は、容易に精製される、融合タンパク質の高レベル発現を誘導するベクターを使用することが可能である。そのようなベクターには、ハイブリッドタンパク質が産生されるように、DevG20、DevG4、または DevG22 をコード化する配列をアミノ末端 Met およびその結果生じた 7 つの β-ガラクトシターゼ残基に対する配列を有するフレーム中のベクターに結合することが可能である、BLUESCRIPT ファージミド(Stratagene)のような多機能大腸菌クローニングおよび発現ベクター、例えば pIN ベクター(Van Heeke、G. および S. M. Schuster (1989)J. Biol. Chem. 264:5503-5509)などが含まれるが、それらに限定されるものではない。PGEX ベクター (ウィスコンシン州マディソン市のPromega)を用いて、外来ポリペプチドをグルタチオン S-トランスフェラーゼ(GST)を有する融合タンパク質として発現することが可能である。一般に、そのような融合タンパク質は可溶であり、グルタチオン アガロース ビーズに対する吸着、それに続く遊離グルタチオンの存在下における溶出によって産生した溶解細胞から容易に精製することが可能である。そのようなシステムで作られたタンパク質は、所定のクローン ポリペプチドが GST 部分から意のままに開放することができるように、ヘパリン、トロンビン、または XA 因子プロテアーゼ切断部位を含むようにデザインすることが可能である。酵母菌、サッカロミセス セレビジエにおいて、 α因子、アルコール オキシダーゼ、および PGH などの構成型プロモーターまたは誘導型プロモーターを含むいくつかのベクターを使用することが可能である。論評に関しては、前出の Ausubel ら、および Grant らの(1987) Methods Enzymol. 153:516-544 を参照。
【００３８】
植物発現ベクターを使用する事例においては、DevG20、DevG4、または DevG22 をコード化する配列の発現を、いくつかのプロモーターの任意の 1 つによって駆動することが可能である。例えば、CaMV の 35S および 19S プロモーターのようなウィルス プロモーターを単独または TMV からのオメガ リーダー配列(Takamatsu, N. (1987) EMBO J. 6:307-311)と共に使用することが可能である。あるいは、RUBISCO の小サブユニットのような植物プロモーターまたは熱ショック プロモーターを使用することが可能である(Coruzzi, G.らの(1984) EMBO J. 3:1671-1680、Broglie, R.らの(1984) Science 224:838-843、および Winter, J. らの(1991) Results Probl. Cell Differ. 17:85-105)。これらの構成物は、直接 DNA 形質転換または病原体媒介性の形質移入によって、植物細胞内に導入することが可能である。そのような技術は、一般に入手できるいくつかの論評に記載されている(例えば、『マグローヒル科学技術年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology)(1992) McGraw Hill New York NY のHobbs, S. または Murry, L. E. を参照、ページ番号191-196)。
【００３９】
昆虫系を用いても、DevG20、DevG4、または DevG22 を発現することが可能である。例えば、そのような昆虫系の 1 つにおいては、ハスモンヨウ近似種(Spodoptera frugiperda)細胞またはウワバ（Trichoplusia)の幼虫において外来遺伝子を発現するため、オートグラファ カリフォルニア細胞核の多面性ウイルス(AcNPV)がベクターとして使用される。その配列を、ポリヘドリン遺伝子のようなウイルスの非必須領域にクローニングし、ポリヘドリン プロモーターの制御下に置くことが可能である。首尾良く行なわれた挿入は、ポリヘドリン遺伝子を不活性にし、外殻タンパク質に欠ける組換えウイルスを産生する。その時点で、その組換えウィルスを用いて、例えば、DevG20、DevG4、または DevG22 を発現し得る、ウワバ(Trichoplusia)幼虫のハスモンヨウ近似種(S. frugiperda)細胞を感染することが可能である(Engelhard、E. K. らの (1994) Proc. Nat. Acad. Sci. 91:3224-3227)。
【００４０】
哺乳動物の宿主細胞においては、いくつかのウィルスベースの発現系を利用することが可能である。アデノウイルスを発現ベクターとして使用する事例においては、DevG20、DevG4、または DevG22 をコード化する配列を、後発プロモーターおよび3 連 リーダー配列から成るアデノウイルス転写・翻訳複合体に結合することが可能である。ウィルス ゲノムの非必須 E1 または E3 領域における挿入を用いて、感染した宿主細胞において発現する能力のある生ウィルスを得ることが可能である(Logan、J. および Shenk、T. (1984)Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659)。加えて、ラウス肉腫ウイルス(RSV)エンハンサーのような転写エンハンサーを用いて、哺乳動物の宿主細胞における発現を高めることが可能である。
【００４１】
特定の開始シグナルを用いても、より効果的な翻訳をを達成することが可能である。そのようなシグナルには、ATG 開始コドンおよび近傍する配列が含まれる。 DevG20、DevG4、または DevG22、開始コドン、および上流配列をコード化する配列が適切な発現ベクターに挿入される事例においては、追加転写または翻訳調節シグナルが必要とされない可能性がある。但し、コーディング配列のみ、またはその一部のみが挿入される事例においては、ATG 開始コドンを含んだ外来性翻訳調節シグナルが提供される必要がある。さらに、その開始コドンは、全挿入の翻訳を確実にするため、正しい読み取りフレーム中に存在する必要がある。外来性の翻訳要素および開始コドンは、天然および合成の両方を含めた様々な起源の産物であり得る。発現の効率は、文献 (Scharf、D. らの(1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125-162)に記載されたように、使用される特定の細胞系に対して適切なエンハンサーを包括することによって高めることが可能である。
【００４２】
加えて、宿主細胞株は、挿入した配列の発現を調節する能力、または発現したタンパク質を所望の形態で処理する能力に対して選択することが可能である。このようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、およびアシル化が含まれるが、それらに限定されるものではない。タンパク質の「プレプロ」形態を切断する翻訳後の処理を用いても、正しい挿入、折りたたみ、および(または)機能を促進することが可能である。CHO、HeLa、MDCK、HEK293、および WI38 などの翻訳後の活性のための固有の細胞装置および特徴のある機構を有する種々の宿主細胞は、外来タンパク質の正しい修飾および処理を確実にするように選択することが可能である。
【００４３】
長期にわたる、組換えタンパク質の高歩留産生のためには、安定した発現が望ましい。例えば、安定して DevG20、DevG4、または DevG22 を発現する細胞株は、複製発現因子および(または)内在性発現因子のウィルス起源を含み、選択可能マーカー遺伝子を同一ベクター上または別個のベクター上に含み得る発現ベクターを使用して、形質転換することが可能である。 ベクターの導入後、細胞は、選択培地に移行せしめる前に強化培地において 1〜2 日間増殖せしめることが可能である。選択可能マーカーの目的は、選択への抵抗性を与えることであり、その存在によって、導入された配列を首尾良く発現する細胞の成長および回収が可能となる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖することが可能である。任意数の選択系を用いて、形質転換細胞株を回収することが可能である。この選択系には、単純ヘルペス ウイルス チミジン キナーゼ(Wigler, M. らの(1980) Cell 22:817-23)、および tk-細胞または aprt-細胞にそれぞれ用いることができるアデニン ホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowy, I. らの(1980) Cell 22:817-23)遺伝子が含まれるが、これらに限定されるものではない。また、代謝拮抗物質、抗生物質または除草剤の耐性は、その選択基準として用いることができ、例としてはメトトレキセートに耐性を与える dhfr (Wigler, M. らの(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-70)、アミノグリコシッド ネオマイシンおよび G-418 に耐性を与える npt (Colbere-Garapin, F.らの(1981) J. Mol. Biol. 150:1-14)、およびクロルスルフロン(chlorsulfuron)とホスフィノトリシン アセチルトランスフェラーゼ(phosphinotricin acetyltransferase)にそれぞれ耐性を与える als または pat (前出の Murry)などが挙げられる。追加の選択可能遺伝子、例えば、細胞がトリプトファンの代替としてインドールを利用することを可能にする trpB、または細胞がヒスチジンの代替としてヒスチノルを利用することを可能にする hisD などは(Hartman、S. C.およびR. C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:8047-51)に記載されている。最近、可視マーカーは好評を博しており、アントシアニン、β-グルクロニダーゼおよびその基質GUS、ルシフェラーゼおよびその基質ルシフェリンなどのマーカーは、形質転換体を同定するためだけではなく、特定のベクター系に依存する一過性または安定したタンパク質発現を定量化するために広範に使用されている(Rhodes、C. A. らの (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131)。
【００４４】
マーカー遺伝子発現の有無は、所定の遺伝子の有無も示唆するが、その存在および発現は確認する必要がある。例えば、DevG20、DevG4、または DevG22 をコード化する配列をマーカー遺伝子配列中に挿入する場合、DevG20、DevG4、または DevG22 をコード化する配列を含む組換え細胞は、マーカー遺伝子機能の不在によって同定することができる。あるいは、マーカー遺伝子は、単一プロモーターの制御下で、DevG20、DevG4、または DevG22 をコード化する配列に対してタンデムに配置することができる。マーカー遺伝子の発現は通常、誘発または選択に応答してタンデム遺伝子の発現も示す。あるいは、DevG20、DevG4、または DevG22 をコード化する核酸配列を保持および発現する宿主細胞は、当業者に既知の種々の手順によって同定することが可能である。これらの手順には、DNA-DNA、または DNA-RNA ハイブリダイゼーション、および核酸またはタンパク質の検出および(または)定量化のための膜系、溶液ベース、またはチップベースのテクノロジを含むタンパク質の生物学的試験法または免疫学的測定法が含まれるが、それらに限定されるものではない。
【００４５】
DevG20、DevG4、または DevG22 をコード化するポリヌクレオチド配列の存在は、DevG20、DevG4、または DevG22 に特異的なポリヌクレオチドのプローブまたは一部または断片を使用して、DNA-DNAまたはDNA-RNA ハイブリダイゼーションまたは増幅によって検出することができる。核酸増幅ベースの測定法には、DevG20、DevG4、または DevG22 をコード化する DNA または RNA を含む形質転換体を検出するために、DevG20、DevG4、または DevG22 に特異的な配列に基づいたオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーの使用が含まれる。本明細書で使用された「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」 は、プローブまたはアンプリマーとして使用することができる、少なくとも約 10 ヌクレオチド、および 約 60 ほどのヌクレオチド、望ましくは約 15〜30 ヌクレオチド、およびより望ましくは約 20〜25 ヌクレオチドの核酸配列を参照する。
【００４６】
タンパク質に固有のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを使用して、DevG20、DevG4、または DevG22 の発現を検出および測定するための種々のプロトコルは、当分野で周知である。実施例には、酵素免疫測定(吸着)法(ELISA)、放射免疫測定(RIA)、および蛍光細胞分析分離装置(FACS)が含まれる。タンパク質上の 2 つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を利用する、2 部位モノクローナルベースの免疫学的測定法は好適ではあるが、競合結合アッセイを用いることが可能である。これらを含めた他の測定法は、Hampton、R. らの(ミネソタ州セントポール市、1990; Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press)および Maddox、D. E. らの(1983; J. Exp. Med. 158:1211-1216)の諸所に記載されている。
【００４７】
多岐にわたる標識技術および抱合技術が当業者に知られており、種々の核酸およびアミノ酸測定法において使用することが可能である。標識ハイブリダイゼーションを産生するための手段、または DevG20、DevG4、または DevG22 をコード化するポリヌクレオチドに関連する配列検出するための PCR プローブには、標識ヌクレオチドを使用する、オリゴ標識、ダコン翻訳、末端標識または PCR 増幅が含まれる。
【００４８】
あるいは、DevG20、DevG4、または DevG22 をコード化する配列、または その任意の一部分を mRNA プローブの産生のためのベクターにクローニングすることも可能である。このようなベクターは、当分野で周知であり、市販もされており、T7、T3、または SP6 および標識ヌクレオチドのような適切な RNA ポリメラーゼを追加することによって、生体外 RNA プローブの合成に使用することが可能である。このような手順は、市販されている種々のキット(ミシガン州カラマズーの Pharmacia & Upjohn 社)、Promega (ウィスコンシン州マディソン)、および U.S. Biochemical Corp.(オハイオ州クリーブランド)を用いて実行することが可能である。
【００４９】
使用可能な好適レポーター分子または標識には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、または発色剤のほかに、基質、補助因子、阻害剤、磁力粒子などもまた含まれる。
【００５０】
DevG20、DevG4、または DevG22 をコード化するヌクレオチド配列で形質転換した宿主細胞は、細胞培養からのタンパク質の発現および回収に好適な条件下で培養することが可能である。組換え細胞によって産生されたタンパク質は、使用される配列および(または)ベクターによるが、分泌または細胞内に含有せしめることが可能である。当業者によっては当然のことながら、発現ベクターは、 真核または原核細胞膜を透過するタンパク質の分泌を誘導するシグナル配列を含むようにデザインすることが可能である。その他の組換え構造を用いて、DevG20、DevG4、または DevG22 をコード化する配列を、水溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチド ドメインをコード化するヌクレオチド配列に対して結合することが可能である。そのような精製促進ドメインには、固定化金属上の精製を可能にするヒスチダイン トライトファン分子のような金属キレートペプチド、固定化免疫グロブリン上の精製を可能にするタンパク質 A ドメインおよびフラグ伸長・親和性精製システム(ワシントン州シアトル市の Immunex Corp.)において利用されるドメインが含まれるが、これらに限定されるものではない。精製 ドメインと所望のタンパク質との間にある XA 因子またはエンテロキナーゼ(腸活素)(カリフォルニア州のサンディエゴ市の Invitrogen 社)に対して特異的であるような切断可能リンカー配列の包括を用いて、精製を促進することが可能である。そのような発現ベクターの 1 つは、チオレドキシンまたはエンテロキナーゼ(腸活素)切断部位に先行するDevG20、DevG4、または DevG22 および 6 ヒスチジン残基をコード化する核酸を含む融合タンパク質の発現を提供する。エンテロキナーゼ(腸活素)切断部位は、融合タンパク質から DevG20、DevG4、または DevG22 を精製する手段を提供する一方、ヒスチジン残基は、IMIAC (Porath、J. らの(1992、Prot. Exp. Purif. 3: 263-281)に記載された固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー)上での精製を促進する。融合タンパク質を含むベクターの論考は、Kroll, D. J. らの(1993; DNA Cell Biol. 12:441-453)に提供されている。組換え産生に加えて、DevG20、DevG4、または DevG22の断片は、固相技術 (Merrifield J. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154)を用いた、直接ペプチド合成によって産生することが可能である。タンパク質合成は、手動または自動の何れの技術によっても実行することが可能である。自動合成は、例えば Applied Biosystems 431A ペプチド シンセサイザ(Perkin Elmer 社)を用いて達成することが可能である。DevG20、DevG4、または DevG22 の種々の断片は、完全長分子を産生するために、化学的方法を使用して、個別に化学的な合成および結合を行なうことが可能です。
【００５１】
診断および治療
本発明に開示したデータは、本発明の核酸およびタンパク質が、関連する診断および治療適用例、例えば、これらに限定されるものではないが、肥満症のような代謝障害のほかに、肥満症、摂食障害、消耗症候群(悪質液)、膵臓の機能障害(真性糖尿病など)、高血圧症、膵臓の機能障害、動脈硬化症、冠動脈動脈疾病(CAD)、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、癌、例えば、生殖器官の癌、睡眠時無呼吸などの疾患および障害のような関連障害においてもまた有用であることを示す。従って、本発明の DevG20、DevG4、または DevG22 タンパク質の診断用途および治療用途は、例えば、これらに限定されるものではないが、次の通りである: (i)タンパク質治療、(ii)小分子薬剤標的、(iii)抗体標的 (治療、診断、薬剤標的・細胞毒性抗体)、(iv)診断および(または)予後マーカー、(v)遺伝子療法(遺伝子送達と遺伝子除去)、(vi)研究ツール、および(vii)生体外および生体内 における組織再生(これらの組織に由来する組織型および細胞型を構成する全ての組織型および細胞型の再生)。
【００５２】
本発明の核酸およびタンパク質は、以下に記載した種々の疾患および障害および(または)その他の病理学および障害において関与するとされる診断および治療適用例において有用である。例えば、限定するものではないが、遺伝子療法、および本発明の DevG20、DevG4、または DevG22 タンパク質および特にそのヒト相同体において有用であり得る、本発明のタンパク質をコード化する cDNAs および特にそのヒト相同体は、それを必要とする被験体に投与された場合、有用であり得る。例証として、本発明の成分は、例えば、限定するものではないが、肥満症のような代謝障害のほかに、肥満症、摂食障害、消耗症候群(悪質液)、膵臓の機能障害(真性糖尿病など)、高血圧症、動脈硬化症、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、癌、例えば、生殖器官の癌、睡眠時無呼吸のような関連障害、およびその他の疾患および障害にも苦しむ患者の治療に有効性を有する。
【００５３】
本発明の DevG20、DevG4、または DevG22 タンパク質をコード化する核酸、またはその断片は、核酸またはタンパク質の存在または量が算定されるべき診断適用例においてもさらに有用であり得る。これらの材料はさらに、治療法または診断法における使用のため、本発明の新物質に対して免疫特異的に結合する抗体の生成において有用である。
【００５４】
例えば、一実施態様においては、DevG20、DevG4、または DevG22 に特異的な抗体を拮抗薬として直接的に、またはDevG20、DevG4、または DevG22 を発現する細胞または組織に薬剤を結合するための標的機構または送達機構として間接的に使用することが可能である。その抗体は、当分野で周知の方法を用いて生成することが可能である。このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖、Fab 断片、および Fab 発現ライブラリによって産生された断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。中和抗体(すなわち、二量体の形成を阻害する抗体)は特に治療用に望ましい。
【００５５】
抗体を産生するため、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒトなどを含む種々の宿主は、DevG20、DevG4、または DevG22 または免疫抗原性の特性を有する任意の断片またはそのオリゴペプチドを注入することによって、免疫化することが可能である。 宿主の種によるが、種々のアジュバントを用いて、免疫応答を高めることが可能である。そのようなアジュバントには、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、およびリゾレシチン、プルオニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳濁液、キーホールリンペットヘモシニアン、およびジニトロフェノールのような表面活性物質などが含まれるが、それらに限定されるものではない。ヒトに使用されるアジュバントの中では、BCG (カルメット‐ゲラン杆菌)およびコリネバクテリウム パルヴムが特に望ましい。抗体を誘引するために使用するペプチド、断片、または オリゴペプチドが、少なくとも 5 つのアミノ酸、およびより望ましくは少なくとも10 つのアミノ酸から成るアミノ酸配列を有することが望ましい。これらが、天然タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であること、および小さな天然分子の全アミノ酸配列を含み得ることが望ましい。アミノ酸の短い伸長部は、免疫抗原性を促進するために、キーホールリンペットヘモシニアンのような別のタンパク質の伸長部と融合することが可能である。
【００５６】
DevG20、DevG4 または DevG22 に対するモノクローナル抗体は、抗体分子の産生を提供する任意の技術を使用して、培養中の連続した細胞株によって調製することが可能である。これらには、ハイブリドーマ技術、ヒト B 細胞ハイブリドーマ技術、および EBV ハイブリドーマ技術(Koeler,Gらの (1975) Nature 256:495-497; Kozbor、D. らの (1985)J. Immunol. Methods 81:31-42; Cote、R. J. らの Proc. Natl. Acad. Sci. 80:2026-2030; Cole、S. P. らの (1984)Mol. Cell Biol. 62:109-120)が含まれるが、それらに限定されるものではない。
【００５７】
加えて、適切な抗原特異性および生物学的活性を有する分子を得るため、「キメラ 抗体」の産生のために開発された技術、マウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子への挿入を使用することができる(Morrison、S. L. らの(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855; Neuberger、M. S. らの(1984) Nature 312:604-608; Takeda、S. ら (1985) Nature 314:452-454)。あるいは、当分野で周知の方法を使用し、一本鎖抗体の産生のために記載された技術を適用して、一本鎖抗体を産生することができる。関連特異性を有するが、固有イディオタイプ成分の一部でもある抗体は、ランダムな組み合わせの免疫グロブリンライブラリからのチェーンシャフリングによって生成することが可能である(Burton、D. R. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88:11120-3)。抗体はまた、リンパ球集団における生体内産生の誘導によって産生することが可能であり、または組換え免疫グロブリン ライブラリまたは文献に開示したされているような高特異結合試薬パネルのスクリーニングによっても産生することが可能である(Orlandi、R. らの(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86:3833-3837; Winter、G. らの(1991) Nature 349:293-299)。
【００５８】
DevG20、DevG4、または DevG22 に対する特異結合部位を含む抗体断片もまた、生成することが可能である。例えば、そのような断片には、抗体分子のペプシン消化によって産生できる F(ab')２ 断片、および F(ab')２ のスルフィド架橋を還元することによって生成できる Fab 断片が含まれるが、それらに限定されるものではない。あるいは、Fab 発現ライブラリを作製して、所望の特異性を有するモノクローナル Fab 断片の迅速かつ容易な同定を可能にすることができる(Huse、W. D. らの (1989)Science 254:1275-1281)。
【００５９】
種々の免疫学的測定法をスクリーニングに対して使用し、所望の特異性を有する抗体を同定することが可能である。既存の特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを使用する、競合結合および免疫放射定量測定法のための幾多のプロトコルは、当分野で周知である。通常このような免疫学的測定法には、タンパク質とその特異性抗体との間の複合体形成の計測が関与する。2 つの非干渉性エピトープに反応するモノクローナル抗体を利用する 2 部位モノクローナルベースの免疫学的測定法が望ましいが、競合結合アッセイを用いることも可能である(前出のMaddox)。
【００６０】
本発明の別の実施例によれば、DevG20、DevG4、または DevG22、またはその断片、または アンチセンス分子をコード化するポリヌクレオチドは、治療目的に使用することが可能である。一実施態様において、アンチセンス分子は、mRNA の転写を阻止することが望ましい状況において使用することが可能である。具体的には、細胞は、DevG20、DevG4、または DevG22 をコード化するポリヌクレオチドに相補的な配列を用いて形質転換することができる。このように、アンチセンス分子を用いて、タンパク質活性を調節すること、または遺伝子機能を調節することができる。そのような技術は今、当分野で周知であり、センスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマー、またはより大きな断片を、DevG20、DevG4、または DevG22 をコード化する配列のコーディングまたは制御領域に沿った種々の位置からデザインすることができる。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスまたはワクチニア ウィルス、または種々の細菌プラスミドに由来する発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的器官、組織または細胞集団に送達することが可能である。当業者であれば周知の方法を用いて、DevG20、DevG4、または DevG22 をコード化する遺伝子のポリヌクレオチドに相補的なアンチセンス分子を発現する組換えベクターを作製することが可能である。これらの技術は、Sambrook ら(前出)および Ausubel ら(前出)の両方の文献に記載されている。 DevG20、DevG4、または DevG22 をコード化する遺伝子は、高レベルのポリヌクレオチドを発現する発現ベクター、または DevG20、DevG4、または DevG22 をコード化するその断片を用いて、細胞または組織を形質転換することによって、オフにすることができる。そのような構成物をを用いて、翻訳不可能なセンス配列またはアンチセンス配列を細胞に導入することが可能である。DNA への組み込みが不在の場合でさえ、そのようなベクターは、RNA 分子が内在性ヌクレアーゼ(核酸分解酵素)によって使用不可能になるまで、継続して RNA 分子を転写することが可能である。一過性の発現は、非複製ベクターによって 1 ヶ月以上持続することが可能であり、さらに適切な複製要素がそのベクター系の一部である場合には、より長く持続することが可能である。
【００６１】
上述したとおり、遺伝子発現の修飾は、アンチセンス分子、例えば、DNA、RNA、または PNA 分子を、DevG20、DevG4、または DevG22、すなわち、プロモーター、エンハンサー、およびイントロンをコード化する遺伝子の制御領域に対してデザインすることによって得ることができる。転写開始部位(例えば始動部位から -10 と +10 の間)由来のオリゴヌクレオチドが望ましい。同様に、阻害は、「三重らせん」塩基対合法を使用して達成することができる。三重らせん対合が有用であるのは、三重らせん対合は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合に対して二重らせんが充分に開くような能力を阻害するためである。三重らせん DNA を用いる最近の治療の進歩は文献に記載されている(Gee, J. E. らの (1994) In; Huber, B. E. and B. I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, N. Y.)。アンチセンスもまた、転写物のリボソームに対する結合を防止することによって、mRNA の翻訳を阻止する目的でデザインすることが可能である。
【００６２】
酵素性 RNA 分子であるリボソームを用いても、RNA の特異的切断を触媒することが可能である。リボザイム作用の機構は、内ヌクレオチド結合分解性の切断に先立つ、相補的標的 RNA へのリボザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションに関与する。使用可能な実施例には、DevG20、DevG4、または DevG22 をコード化する配列の内ヌクレオチド結合分解性切断を特異的かつ効果的に触媒する組換え型のハンマーヘッド型モチーフ リボザイム分子が含まれる。任意の潜在的 RNA 標的内の特異性リボザイム切断部位は、GUA、GUU、およびGUC 配列を含めたリボザイム切断部位に対する標的分子をスキャンすることによって、初めに同定する。ひとたび同定すると、標的遺伝子の領域に対応し、切断部位を含む 15〜20 リボヌクレオチド間の短い RNA配列は、オリゴヌクレオチドを機能不全にするような二次構造機能に対して評価することが可能となる。候補標的の適合性もまた、リボヌクレアーゼ保護測定法を使用して、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのアクセス容易性をテストすることによって、評価することが可能である。
【００６３】
本発明のアンチセンスおよびリボザイムは、核酸分子合成のために当分野で知られている任意の方法を用いて調製することが可能である。これらの方法には、固相フォスフォアミダイト化合合成のようなオリゴヌクレオチドを化学的に合成する技術が含まれる。あるいは、DevG20、DevG4、または DevG22 をコード化する DNA 配列の生体外および生体内転写によって、RNA 分子生成することが可能である。このような DNA 配列は、T7 または SP6 のような好適な RNA ポリメラーゼ プロモーターを用いて、種々のベクターに組み込むことが可能である。あるいは、RNA を構成的または誘導的に合成するこれらの cDNA 構成物アンチセンスは、細胞株、細胞、または組織内に導入することができる。RNA 分子を修飾して、細胞内の安定性および半減期を向上することが可能である。可能な修飾には、分子の 5' 末端および(または) 3' 末端でのフランキング配列の追加、または ホスホロチオネートの使用、または分子の背骨連鎖内のホスホジエステラーゼ連鎖ではなく 2' O-メチルが含まれるが、それらに限定されるものではない。この概念は、PNA の産出に固有のものであり、例えばイノシン、クエオシン、ワイブトシンのほかに、アセチル系、メチル系、チオ系、および内在性エンドヌクレアーゼによって容易には認識されない、アデニン、シチジン、グアニン、チミン、およびウリジンに類似の修飾態様なども含めた非従来型塩基の抱合によって、これら全ての分子に適用することができる。
【００６４】
ベクターを細胞または組織に導入するための多数の方法を利用することが可能であり、それらの方法は生体内、生体外、および生体内外交通の使用に等しく適している。
【００６５】
生体内外交通 療法の場合、ベクターを患者から採取した幹細胞内に導入し、自家移植で同一患者に戻すためクローン増殖することが可能である。形質移入およびリポソーム注入による送達は、当分野で周知である方法用いて達成することが可能である。上記の治療方法はいずれも、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、および最も望ましくはヒトなどの哺乳動物を含めた、好適な被験体に適用することが可能である。
【００６６】
本発明の追加実施例は、上述した任意の治療効果対して、医薬用に許容できるキャリアと併せて、医薬品成分の投与に関するものである。そのような医薬品成分は、DevG20、DevG4、または DevG22、DevG20、DevG4、または DevG22 に対する抗体、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト、または DevG20、DevG4、または DevG22 の阻害剤で構成され得る。本成分は単独で投与することができるが、少なくとも 1 つの安定化化合物などの他剤と共に投与することもでき、その場合には、限定するものではないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロースおよび水などを含めた、任意の消毒した、生物学的に適合な医薬品キャリアを用いて投与することが可能である。本成分は単独で患者に投与することができるが、他剤、薬剤またはホルモンと共に投与することも可能である。本発明で利用した医薬品成分は、幾つもの経路によって投与することが可能であり、その経路には経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸などが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００６７】
その活性成分に加えて、これらの医薬品成分は、医薬用に使用することができる、活性化合物の製剤への処理を促進する、賦形剤および助剤を備えている好適な医薬用に許容できるキャリアを包含し得る。および投与に関する技術の詳細は、Remington's Pharmaceutical Sciences (ペンシルベニア州イーストンの Maack Publishing Co.)の最新版を参照。経口投与用の医薬品成分は、当分野で公知の医薬用に許容できるキャリアを使用して、経口投与に好適な投与量で製剤することができる。このようなキャリアを用いると、患者による摂取のために、医薬品成分を錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁液、その他に製剤することが可能となる。
【００６８】
経口用の医薬品の製剤は、活性化合物の固形賦形剤との組み合わせを介して得られるが、オプションとして、得られた混合物を粉砕し、好適な助剤を加えた後にその顆粒混合物の処理を行ない、所望であれば、錠剤または糖衣錠の核を得ることもできる。好適な賦形剤としては、ラクトース(乳糖）、サッカロース(蔗糖)、マニトール、またはソルビトールを含む糖類などのような炭水化物またはタンパク質の充填剤; トウモロコシ、小麦、米、ポテト、または他の植物からのでんぷん;  メチルセルロース、ハイドロキシプロピルメチル-セルロース、またはナトリウム・カルボキシメチルセルロースのようなセルロース; アラビアゴムおよびトラガカントゴムを含むゴム類;およびゼラチンおよびコラーゲンなどのタンパク質が挙げられる。所望であれば、崩壊剤または可溶化剤を加えることが可能であり、その例としては相互リンクされたポリビニール ピロリドン、寒天、アルギン酸、またはその塩であるアルギン酸ナトリウムなどが挙げられる。糖衣錠核は、濃縮砂糖水などのような好適なコーティングと共に使用することが可能であり、そのコーティングにはまた、アラビアゴム、タルク、ポリビニールピロリドン、carbopol ゲル、ポリエチレングリコール、および(または)二酸化チタン、漆液、および好適な有機溶剤または混合溶剤も含み得る。染料または顔料を、製品を識別するため、または活性化合物の量(投与量)を明確にするために、錠剤または糖衣錠コーティングに添加することが可能である。経口剤として使用できる医薬品製剤には、ゼラチン製の押しバメ式カプセルのほかに、ゼラチン製のソフトで密閉カプセル、およびグリセロームまたはソルビトールのようなコーティングもまた含まれる。押しバメ式のカプセルには、ラクトース(乳糖）またはでんぷん類、タルクまたはステアリン酸マグネシウムのような滑剤など、およびオプションとしては安定剤類などの充填剤または結着剤と混合された活性成分を含むことができる。ソフトカプセル中の活性化合物は、安定剤の有無に係わらず、脂肪油、液体、または液体ポリエチレングリコールのような好適な液剤に溶解または懸濁することが可能である。
【００６９】
非経口的投与に好適な医薬品は、水溶液中、望ましくは、ハンク溶液、リンゲル溶液、または緩衝生理食塩水のような、生理学的に適合性のある緩衝液中でで製剤することが可能である。水溶性の注射用懸濁液には、ナトリウム・カルボキシルメチル セルロース、ソルビトール、またはデキストランのような懸濁液の粘度を高める物質を含むことが可能である。加えて、活性化合物の懸濁液は、適切な油質の注射用懸濁液として調製することが可能である。好適な脂肪親和性溶剤または媒介物には、ごま油のような脂肪油、またはオレイン酸エチルまたはトリグリセリド(中性脂肪)のような合成脂肪酸エステル、またはリポソームなどが含まれる。オプションとして、懸濁液にはまた、高度に濃縮された溶液の調製を可能にするために、化合物の溶解度を高める好適な安定剤または試薬も含めることが可能である。
【００７０】
局所投与または鼻用投与用の場合には、浸透される特定の障壁に対して適切な浸透剤を製剤おいて使用する。そのような浸透剤は当分野で公知である。
【００７１】
本発明の医薬品成分は、当分野で周知の様式、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠製造、研和、乳化、カプセル化、取り込み、または凍結乾燥プロセスなどの手段によって製造することが可能である。医薬品成分は、塩として供給することが可能であり、多くの酸と共に形成することができ、例としては、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、琥珀酸などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。塩類は、対応する遊離塩基形態によりも、むしろ水溶液または他のプロトン溶剤に溶けやすい傾向がある。その他の事例における好適な調製は、下記のいずれかを含む凍結乾燥粉末であり得る: 1〜50 mM ヒスチダイン、0.1〜2% サッカロース(蔗糖)、および 2〜7% マニトール、pH 範囲 4.5〜5.5。尚、これらは使用前に緩衝液と結合させるものとする。医薬品成分を調製した後には、適切な容器に充填し、治療の対象となる適応症状を標識する。DevG20、DevG4、または DevG22 の投与のための標識には、投与の量、頻度、および方法を含まれるであろう。
【００７２】
本発明に好適な医薬品成分には、活性成分が所望の目的を達成するために有効な量で含有されているような成分が含まれる。有効投与量の決定は、当業者の能力の範囲内で行うものとする。任意の化合物の場合には、細胞培養アッセイ、例えば 前脂肪細胞の細胞株の細胞培養アッセイおいて、または通常マウス、ウサギ、イヌまたはブタなどの動物モデルにおいてのいずれかで、初めに治療に有効な投与量を推定することができる。動物モデルはまた、好適な濃度範囲および投与経路を決定するためにも使用することが可能である。次にはこのような情報を用いて、ヒトに対する有益な投与量および投与経路を決定することができる。治療に有効な投与量とは、特定の状態を治療するための活性成分の量、例えば、DevG20、DevG4、または DevG22 またはその断片、および DevG20、DevG4、または DevG22 の抗体を参照する。治療有効度および毒性は、細胞培養または実験用動物における標準的な調剤手順によって決定することが可能であり、その例としては、ED50(集団の 50% において治療に有効な量)および LD50(集団の 50% に対する致死量)などが挙げられる。治療効果と毒性効果の間の投与量の比は、治療指数であり、LD50/ED50 比率として表すことができる。高い治療指数を示す医薬品成分が望ましい。細胞培養アッセイおよび動物実験から得たデータは、ヒト用のさまざまな投与量の製剤に使用する。そのような成分に含まれる投与量は、毒性を殆ど持たない ED50 を含む循環濃度の範囲内にあることが望ましい。投与量は、投与量の採用元(dosage from employed)、患者の感受性、および投与の経路によって、この範囲内で変わる。正確な投与量は、治療を必要とする被験者に関する要因を考慮して、現場の医師が決定することになる。投与量および投与法は、十分なレベルの活性部を提供するため、または所望の効果を維持するように調節する。配慮される要因には、疾患の重症度、被験者の身体全体の健康状態、被験者の年齢、体重、および性別、食習慣、投与の時間と頻度、薬剤の組み合わせ、反応感受性、および治療に対する耐性と反応が含まれる。長時間効果のある医薬品成分は、特定の製剤の半減期およびクリアランス率にもよるが、3〜4 日毎、1 週間毎、または 2 週間毎に 1 回の間隔で投与することが可能である。通常の投与量は、投与経路にもよるが、約 0.1〜100,000 マイクログラムと異なり、合計投与量は約 1 グラムまでとする。特定の投与量および送達の方法に関する指針は文献に記載されており、当分野の実務者はそれを利用することができる。当業者は、タンパク質または阻害剤用の製剤とは異なったヌクレオチド用製剤を用いる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達も、特定の細胞、状態、位置などに対して特異的なものとなる。
【００７３】
別の実施例によれば、DevG20、DevG4、または DevG22 を特異的に結合する抗体を、DevG20、DevG4、または DevG22 の過剰発現または低発現を特徴とするまたはそれらの発現に関連する状態または疾患の診断のため、または測定法において用い、DevG20、DevG4、または DevG22、アゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤によって治療を受けている患者を監視することが可能である。診断目的に有用な抗体は、上記の治療で記載した方法と同様の様式で調製することが可能である。診断アッセイには、抗体および標識を利用してヒトの体液または細胞または組織の抽出物における DevG20、 DevG4、または DevG22 を検出する方法が含まれる。その抗体は、修飾の有無に拘わらず使用することが可能であり、共有結合または非共有結合のいずれかでレポーター分子と結合することによって標識化することが可能である。当分野で周知の種々のレポーター分子を使用することが可能であり、そのいくつかのレポーター分子を上記した。
【００７４】
ELISA、RIA、および DevG20、DevG4、または DevG22 を測定するための FACS を含む種々のプロトコルは、当分野では周知であり、改変または異常レベルの遺伝子発現を診断する基準を提供する。発現の正常値または標準値は、複合体の形成に適した条件下で、正常な哺乳動物である被験体、望ましくはヒトから採取した体液または細胞を DevG20、DevG4、または DevG22 に対する抗体と結合させることによって確定する。標準複合体の形成量は、種々の方法によって定量化することが可能であるが、測光的な手段を用いることが望ましい。生検組織から得た対照試料および疾患試料において発現した DevG20、DevG4、または DevG22 の量は、標準値と比較する。標準値と被験体の値の偏差は、疾患の診断のためのパラメータを確定する。
【００７５】
本発明の別の実施例によれば、DevG20、DevG4、または DevG22 に特異的なポリヌクレオチドは、診断目的に使用することが可能である。使用可能なポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、アンチセンス RNA および DNA 分子、および PNA が含まれる。ポリヌクレオチドを用いて、DevG20、DevG4、または DevG22 の発現が疾患と相関し得るような生検組織における遺伝子発現を検出および定量化することが可能である。診断アッセイを用いて、発現の不在、存在および過剰を区別すること、および治療介入中の遺伝子発現レベルの調節を監視することが可能である。
【００７６】
一実施形態において、ゲノム配列を含み、DevG20、DevG4、または DevG22 または密接に関連する分子をコード化するポリヌクレオチド配列を検出する能力のある PCR プローブとのハイブリダイゼーションを用いて、DevG20、DevG4、または DevG22 をコード化する核酸配列を同定することが可能である。プローブの特異性は、それが高度に特異的な領域、例えば 5' 調節領域における独特のヌクレオチド、またはあまり特異的ではない領域、例えば 特に 3' コーディング領域のいずれから作られたに拘わらず、またそのハイブリダイゼーションまたは増幅(最大、高、中、または低)のストリンジェントの度合に拘わらず、そのプローブが DevG20、DevG4、または DevG22 をコード化する天然の配列、対立遺伝子、または関連配列のみを同定するかどうかを決定する。プローブはまた、関連する配列の検出に用いることも可能であり、配列をコード化する任意の DevG20、DevG4、または DevG22 からのヌクレオチドの少なくとも 50% を含んでいることが望ましい。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、DNA または RNA であり得、 配列認識番号 1、配列認識番号 3 または配列認識番号 5 のヌクレオチド配列、または天然のDevG20、DevG4、または DevG22遺伝子のプロモーター、エンハンサー因子、およびイントロンを含むゲノム配列に由来し得る。 DevG20、DevG4、または DevG22 をコード化する DNA に対して特異的なハイブリダイゼーションプローブ産生の手段には、  of  DevG20、DevG4、または DevG22 またはその誘導体を mRNA プローブの産生のためのベクターにコード化する核酸配列のクローニングが含まれる。当業者に知られ、市販されている、このようなベクターを用いて、好適な RNA ポリメラーゼおよび好適な標識されたヌクレオチドを加えることによって、生体内で RNA プローブを合成することが可能である。ハイブリダイゼーションプローブは、種々のレポーター集団によって標識することが可能であり、その例としては、３２P または  ３５S のような放射性核種、またはアビジン結合系やビオチン結合系を介してプローブに結合されたアルカリホスファターゼのような酵素標識が挙げられる。
【００７７】
DevG20、DevG4、または DevG22 に特異的なポリヌクレオチド配列は、DevG20、DevG4、または DevG22 の発現に関連する状態または疾患の診断のために使用することが可能である。 そのような状態または疾患の実施例には、糖尿病を含む膵臓の疾患および障害が含まれるが、それらに限定されるものではない。 DevG20、DevG4、または DevG22 に特異的なポリヌクレオチド配列を用いて、糖尿病を含む膵臓の疾患および障害に対して治療を受けている患者の進歩状況を監視することが可能である。ポリヌクレオチド配列は、変異遺伝子の発現を検出するために患者の生検から採取した体液または組織を利用して、サザン法、ノーザン法、ドットブロット法またはその他の膜ベースの技術、および PCR 法、またはディップスティック法、ピン ELISA 法またはチップアッセイにおいて使用することが可能である。このような定量方法または定性方法は当分野で公知である。
【００７８】
特定の実施形態では、  DevG20、DevG4、または DevG22 をコード化するヌクレオチド配列は、肥満症のほかに、上記のような関連障害もまた含む種々の代謝疾患および障害の活性化または誘発を検出する測定法において有用であり得る。ヌクレオチド配列は、標準法で標識化されることが可能であり、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件下で、患者から採取した体液または組織の試料に添加することが可能である。好適なインキュベーション期間の後、その試料を洗浄して、そのシグナルを定量化し、標準値と比較する。生検試料または抽出試料におけるシグナル量が、類似試料がその試料中でヌクレオチド配列とハイブリダイゼーションを行なった結果のシグナル量と比べて著しく変化している場合は、その試料中のヌクレオチド配列の変異レベルの存在は、関連疾患の存在を示す。このような測定法を用いても、動物研究、臨床試験、または個々の患者の治療の監視において、特定の治療上の療法の有効性を評価することが可能である。
【００７９】
DevG20、DevG4、または DevG22 の発現に関連する疾患の診断に対する基準を提供するため、発現に対する正常概要または標準概要を確定する。これは、ハイブリダイゼーションまたは増幅に好適な条件下で、動物またはヒトのいずれかの正常な被験体から抽出した体液または細胞を、DevG20、DevG4、または DevG22 に特異的な配列と結合させることにより達成され得る。標準ハイブリダイゼーションの定量化は、正常な被験体から得た値を、既知量の実質的に精製されたポリヌクレオチドを使用する実験から得た値に対して比較することによって行なうことができる。正常試料から得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得た試料から得た値と比較することが可能である。標準値と被験体値との間の偏差を用いて疾患の存在を確定する。ひとたび疾患の存在を確定し、治療プロトコルを開始すると、ハイブリダイゼーションアッセイを定期的に繰り返し、患者の発現レベルが正常な患者に観察されるレベルに近づき始めたかどうかを評価することが可能である。連続アッセイから得られた結果を用いて、数日から数ヶ月の期間にわたる治療の効果を示すことが可能である。
【００８０】
肥満症のほかに、脂肪過多症、摂食障害、消耗症候群(悪質液)、膵臓の機能障害(真性糖尿病など)、高血圧症、動脈硬化症、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、癌、例えば、生殖器官の癌、睡眠時無呼吸のような関連障害もまたを含む代謝疾患および障害に関して、個別の被験体からの生検における比較的多量の転写物の存在は疾病発生の素因を示すか、または実際の臨床的症状の実証に先行する疾病の検出のための手段を提供することが可能である。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防手段または積極的な早期治療を施し、膵臓の疾病および障害の発達またはさらなる進行を防止することが可能となる。DevG20、DevG4、または DevG22 をコードする配列からデザインされたオリゴヌクレオチドの診断上の追加用途は、PCR 法の使用に関与し得る。このようなオリゴマーは、化学的に合成するか、酵素的に生成するか、または組換えソースから産出することが可能である。オリゴマーは望ましくは 2 つのヌクレオチド配列から成り、1 つはセンス方向(5'.fwdarw.3')を有し、別の 1 つアンチセンス方向(3'.rarw.5')を有し得、特定の遺伝子または条件を同定するために、最適化された条件下で用いられる。オリゴマーのネスト化したセット、または縮重オリゴマーの集積である、 2 つの同一のオリゴマーを、あまりストリンジェントでない条件下で用い、緊密に関連した DNA 配列または RNA 配列の検出あるいは(または)定量化を行なうことが可能である。
【００８１】
DevG20、DevG4、または DevG22 の発現を定量化するために使用し得る方法には、放射標識またはビオチン ヌクレオチド、調節核酸の相互増幅、および実験結果が補間された標準曲線等が含まれる(Melby, P.C. らの (1993) J. Immunol Methods, 159:235-244; Duplaa, C. らの (1993) Anal. Biochem. 212:229-236)。複数試料の定量化速度は、目的のオリゴマーが種々の希釈液中に存在し、そして分光光度法または非色応答が迅速な定量に関与するような状態にある、ELSA 形態のアッセイを実行することによって加速することが可能である。
【００８２】
本発明の別の実施例によれば、DevG20、DevG4、または DevG22 に特異的な核酸配列を用いても、天然のゲノム配列をマッピングするために有用であるハイブリダイゼーションプローブ生成することが可能である。その配列は、特定の染色体にマッピングするか、または公知の方法を使用して染色体の特定領域にマッピングすることが可能である。このような技術には、FISH、FACS、または酵母人工染色体、細菌人工染色体、細菌 P1 構築または単一染色体 cDNA ライブラリのような人工染色構造があり、Price, C. M. (1993) Blood Rev. 7:127-134, および Trask, B.J. (1991) Trends Genet. 7:149-154. FISH (Verma らによって記述されているとおり、(1988) Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York, N.Y.)などの文献で論評されているように、他の物理的な染色体のマッピング技術および遺伝地図データと相関することが可能である。遺伝地図データの例は、1994 Genome Issue of Science (265:1981f)に見出すことができる。物理的染色体地図上の DevG20、DevG4、または DevG22 をコードする遺伝子の位置、および特定の疾患または特定の疾患に対する素因との間にある相関性は、遺伝子の疾病に関連する DNA の領域を画定するのに役立ち得るものである。
【００８３】
本発明のヌクレオチド配列を用いて、健常者、保有者、または感染者の三者間における遺伝子配列の相違を検出することが可能である。確定した染色体マーカーを使用する、染色体標本および連鎖分析のような物理的マッピング技術の原位置ハイブリダイゼーションを用いて、遺伝地図を拡張することが可能である。マウスのような別の哺乳動物種の染色体上への遺伝子の配置は、多くの場合、特定のヒト染色体の数またはアームが未知の場合でさえも、関連するマーカーを明らかにすることが可能である。新配列は、物理的マッピングによって、染色体アーム、またはその部分に指定することができる。これは、位置クローニングまたはその他の遺伝子発見技術を用いて疾病遺伝子を探索する研究者にとって貴重な情報を提供する。ひとたび疾患または症候群を、例えば AT to 11q22-23 (Gatti, R.A. らの(1988) Nature 336:577-580)などの特定ゲノム領域への遺伝的連鎖によって大まかに位置決めを行なうと、その領域に対してマッピングする任意の配列が、さらなる調査のための関連遺伝子または調節遺伝子を表することが可能である。本発明のヌクレオチド配列を用いて、転座、反転などに起因する、健常者、保有者、感染者の三者間における染色体位置の相違を検出することが可能である。
【００８４】
本発明の別の実施例によれば、DevG20、DevG4、または DevG22、それらの触媒断片または免疫抗原断片またはそのオリゴペプチドは、例えば、ペプチドまたは低分子重量の有機分子などの化合物スクリーニング ライブラリのために、種々の薬剤スクリーニング技術において使用することができる。このようなスクリーニングで用いた断片は、溶液中に遊離していても、固体支持物に付着していても、細胞表面上にあっても、または細胞内にあっても構わない。タンパク質とテストされる薬剤との間の結合複合物の形成は、測定することが可能である。
【００８５】
使用可能な別の薬剤スクリーニング技術は、公開 PCT 出願番号 WO84/03564 に記載されているように、目的タンパク質に対して好適な結合親和性を有する化合物の高処理能力スクリーニングを提供する。この方法では、DevG20、DevG4、または DevG22 に対して適用したように、多数の異なる試験化合物、例えば小分子は、プラスチックのピンまたはその他の表面のような固形基質状で合成した。試験用化合物は、タンパク質またはその断片と反応させ、洗浄した。次に、結合したタンパク質を、当分野で周知の方法で検出した。精製したタンパク質は、前記した薬剤スクリーニング技術で使用するプレート上で直接被覆することもできる。あるいは、非中和抗体を用いて、ペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持物上に固定することもできる。別の実施例では、DevG20、DevG4、または DevG22 を結合するために、DevG20、DevG4、または DevG22 を完全に試験化合物と結合する能力のある中和抗体において、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることが可能である。この様式で、抗体を用いて、DevG20、DevG4、または DevG22 と 1 つ以上の抗原決定因子を共有する任意のペプチドの存在を検出することができる。別の実施例では、DevG20、DevG4、または DevG22 をコード化するヌクレオチド配列は、その新規技術が既知のヌクレオチド配列の特性、例えば、限定するものではないが、トリプレット遺伝暗号および特異的塩基対の相互作用などを含む特性に依存する限り、今後開発される任意の分子生物学技術においてでも使用することができる。
各図の示すところは以下の通りである。
【００８６】
図 1 は、エコトロピック発現による、HD-EP(X)10478 および HD-EP(X)31424 ハエ(キイロショウジョウバエ; 図中、10478 および 31424 と呼ばれる)の飢餓耐性の平均増加率を示す。「FB- or elav-Gal4 駆動するr」 (野生型のハエ (オレゴン R)に相対して; FB は脂肪体を意味する; elav-Gal4 は上昇 Gal4 を意味する)を使用。生存ハエ (「平均生存者」は毎時点パーセントで表示(水平線上に飢餓時間として表示; 8 時間〜72 時間)の平均値を示した。詳細は実施例を参照。
【００８７】
図 2 は、異所性発現による HD-EP(X)10478 および HD-EP(X)31424 ハエの中性脂肪含有率の増加を示す。「FB- or elav-Gal4 駆動するr」 (野生型のハエ (オレゴン R)に相対して)を使用。測定値の標準偏差は、細いバーとして示した。ハエ集団の中性脂肪含有率は、ハエ(縦)の湿潤重量 (wt)ug/mg で示した。
【００８８】
図 3 は、DevG20 遺伝子座の分子組織を示す。
【００８９】
図 4A は、ショウジョウバエ DevG20 タンパク質をコード化する核酸配列(配列認識番号 7)を示す。
図 4B は、図 4A に示した核酸配列によってコード化された、ショウジョウバエ DevG20 のタンパク質配列(配列認識番号 8)を示す。
図 4C は、Genbank アクセッション番号 NM-030810.1 (MGC3178)を有するホモサピエンス仮想タンパク質をコード化するヒト DevG20 相同体タンパク質の核酸配列(配列認識番号 1)を示す。
図 4D は、図 4C に示した核酸配列によってコードされたヒト DevG20 タンパク質配列 (配列認識番号 2)(GenBank アクセッション番号 NP-110437.1)を示す。
【００９０】
図 5 は、ショウジョウバエ DevG20 タンパク質(配列認識番号 8)および ヒト DevG20 タンパク質(配列認識番号 2; GenBank アクセッション番号 NP-110437.1)、図においてhG20 と呼ばれる、に対するBLASTP (対非重複合成データベース)同一性検索結果を示す。アライメントの中間配列は、同一アミノ酸を 1文字コードでを示し、+ として保存する。アライメントにおけるギャップは、- として表す。
【００９１】
図 6 は、哺乳動物の組織における DevG20 の発現を示す。
図 6A は、異なる野生型のマウス組織における DevG20 様発現のリアルタイム PCR 分析を示す。相対 RNA 発現は、左側に示し、テストした組織は水平線上に示した(例えば、膵臓('pancre')、白色脂肪組織('WA')、茶色脂肪組織 ('BA')、筋肉('muscl')、肝臓('liv')、罹病視床下部('hypothalam')、小脳('cerebell')、皮質('corte')、中脳('midbra'); 小腸('s. intestine')、心臓('hear')、肺('lun')、脾臓('splee')、腎臓('kidne')、および骨髄('b. marrow')。
図 6B は、異なるマウスモデルにおける DevG20 様 発現のリアルタイム PCR 分析を示す(野生型のマウス ('wt')「薄灰色シェーディングのバー; 断食マウス」濃灰色シェーディングのバー、肥満マウス('ob/ob')、白色のバー)。異なる組織においては(白色脂肪組織 ('WA')、茶色脂肪組織 ('BA')、筋肉('musc')、肝臓('liv')、膵臓('pancre')、罹病視床下部('hypothala')、小脳('cerebell')、皮質('corte')、中脳('midbra'); 小腸('s. intestine')、心臓('hea')、肺('lun')、脾臓('sple')、腎臓('kidn')、および骨髄('b. marrow')。
図 6C は、3T3-L1 細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のDevG20 様発現のリアルタイム PCR 分析を示す。相対 RNA 発現は左側に示し、日数差は水平線上に示した(d0 = 第 0 日目、実験の始動、至 d10 = 第 10 日目)。
【００９２】
図 7 は、Pベクター(野生型のハエ (EP-control)に相対)のホモ接合性の生存統合に起因する、EP(2)0646、EP(2)2188、およびEP(2)2517 ハエの中性脂肪含有率に相対して増加を示す。測定値の標準偏差は、細いバーとして示した。ハエ集団の中性脂肪含有率は、TG/タンパク質含有率比として示した。
【００９３】
図 8 は、DevG4 遺伝子の遺伝子座の分子組織を示す。
【００９４】
図 9A は、 ショウジョウバエ DevG4 タンパク質をコード化する核酸配列(配列認識番号 9)を示す。
図 9B は、図 9A に示した mRNA によってコードされたショウジョウバエ DevG4 タンパク質配列(配列認識番号 10) を示す。
図 9C は、 ヒト DevG4 相同体(ホモサピエンスATP 結合カセット、サブファミリ C (CFTR/MRP)、メンバー 4、また、ABCC4 および MPR4 と呼ばれる; GenBank アクセッション番号 NM-005845)をコード化する核酸配列(配列認識番号 3)を示す。
図 9D は、ヒト DevG4 相同体のタンパク質配列 (配列認識番号 4; GenBank アクセッション番号 NP-005836.1)を示す。
【００９５】
図 10 は、ヒト DevG4 タンパク質のタンパク質ドメイン(黒色ボックス)を示す。
【００９６】
図 11 は、 異なる種(ヒト 「hMRP4」、マウス(図 11D にのみ示した、mMRP4)、およびショウジョウバエ (DevG4))のDevG4 タンパク質ドメインの比較を示す。アライメントにおけるギャップは、- として表す。アライメントは、Clustal V ソフトウェア (Higgins,D.G. および Sharp,P.M. (1989). CABIOS, vol. 5, no. 2, 151-153.)の複数配列アライメントプログラムを使用して産生した。
(A) ABC 細胞膜 I ドメインのアライメント。ショウジョウバエ DevG4 およびヒト DevG4 (hMRP4)のアミノ酸の同一性は、41% であり、類似性は 63% である。
(B) ABC-tran I ドメインのアライメントショウジョウバエ DevG4およびヒト DevG4 (hMRP4)のアミノ酸の同一性は、56% であり、類似性は 75% である。
(C) ABC 細胞膜 II ドメインのアライメントショウジョウバエ DevG4 およびヒト DevG4 (hMRP4)のアミノ酸の同一性は、42% であり、類似性は 60% である。
(D) ABC-tran II ドメインのアライメントショウジョウバエ DevG4 およびヒト DevG4 (hMRP4)のアミノ酸の同一性は、69% であり、類似性は 86% である。ヒトおよびマウス ABC-tran II はほとんど同一である。
【００９７】
図 12 は、哺乳動物の組織における DevG4 の発現を示す。
図 12A は、異なる野生型のマウス組織における DevG4 (MRP4)発現のリアルタイム PCR 分析を示す (膵臓 ('pancre')、白色脂肪組織 ('WA')、茶色脂肪組織 ('BA')、筋肉 ('muscl')、肝臓 ('liv')、罹病視床下部('hypothalam')、小脳('cerebell')、皮質('corte')、中脳('midbra'); 小腸 ('s. intestine')、心臓 ('hear')、肺 ('lun')、脾臓 ('splee')、腎臓 ('kidne')、および骨髄('b. marrow')。相対 RNA 発現は左側示し、テストした組織は水平線上に示した。
図 12B は、異なるマウスモデルにおけるDevG4 (MRP4)発現のリアルタイム PCR 分析を示す(野生型のマウス ('wt')、断食マウス、肥満したマウス ('ob/ob'))異なる組織においては(白色脂肪組織 ('WA')、茶色脂肪組織 ('BA')、筋肉 ('muscl')、肝臓 ('liv')、膵臓 ('pancre')、罹病視床下部('hypothalam')、小脳('cerebell')、皮質('corte')、中脳('midbra'); 小腸 ('s. intestine')、心臓 ('hear')、肺 ('lun')、脾臓 ('splee')、腎臓 ('kidne')、および骨髄('b. marrow')。
図 12C は、3T3-L1 細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のDevG4 (MRP4)発現のリアルタイム PCR 分析を示す。相対 RNA 発現は左側に示し、日数差は水平線上に示した(d0 = 第 0 日目、実験の始動、至 d10 = 第 10 日目)。
【００９８】
図 13 は、Pベクター(野生型のハエ (EP-control)に相対)のホモ接合性の生存統合に起因する、HD-EP(2)20388 および EP(2)2482 ハエの中性脂肪含有率に相対して増加を示す。測定値の標準偏差は、細いバーとして示した。ハエ集団の中性脂肪含有率は、TG/タンパク質含有率比としてパーセントで示した。
【００９９】
図 14 は、DevG22 遺伝子の遺伝子座の分子組織を示す。
【０１００】
図 15A は、ショウジョウバエ DevG22 タンパク質をコード化する核酸配列 (配列認識番号 11)を示す。
図 15B は、ショウジョウバエ DevG22 タンパク質のタンパク質配列 (配列認識番号 12)を示す。
図 15C は、ヒト DevG22 相同体(ホモサピエンスATP 結合カセット、サブファミリ G 白色、メンバー 1 タンパク質; GenBank アクセッション番号 XM-009777)をコード化する核酸配列 (配列認識番号 5)を示す。
図 15D は、ヒト DevG22 相同体(ホモサピエンスATP 結合カセット、サブファミリ G 白色、メンバー 1 タンパク質; GenBank アクセッション番号 XP-009777.3)のタンパク質配列 (配列認識番号 6)を示す。
【０１０１】
図 16 は、DevG22 タンパク質のタンパク質ドメイン (黒色ボックス)を示す。
【０１０２】
図 17 は、ヒト、マウスおよびハエDevG22 タンパク質(白色様 ABC 輸送体)のアライメントを示す。白色様 ABC 輸送体は、単一 ABC-tran タンパク質ドメインのみを有する。ショウジョウバエ DevG22 は、ヒト DevG22 (hWhite; ABC8、ABCG1、GenBank アクセッション番号 XM-009777)に対して 36% 同一であり、52% 類似である。ショウジョウバエ DevG22 は、マウスDevG22 (mWhite; GenBank アクセッション番号 NP-033723)に対して 36% 同一であり、51% 類似である。ヒトおよびマウス DevG22 タンパク質は、 95% の同一性および 96% の類似性を示す。
【０１０３】
図 18 は、DevG22における哺乳動物の組織の発現を示す。
図 18A は、異なる野生型のマウス組織におけるDevG22 発現のリアルタイム PCR 分析を示す(膵臓 ('pancre')、白色脂肪組織 ('WA')、茶色脂肪組織 ('BA')、筋肉 ('muscl')、肝臓 ('liv')、罹病視床下部('hypothalam')、小脳('cerebell')、皮質('corte')、中脳('midbra'); 小腸 ('sm. testine')、心臓 ('hear')、肺 ('lun')、脾臓 ('splee')、腎臓 ('kidne')、および骨髄('b. marrow')。
図 18B は、異なるマウスモデルにおける DevG22 発現のリアルタイム PCR 分析を示す(野生型のマウス ('wt')、断食マウス、肥満したマウス ('ob/ob'))異なる組織においては(白色脂肪組織 ('WA')、茶色脂肪組織 ('BA')、筋肉 ('muscl')、肝臓 ('liv')、膵臓 ('pancre')、罹病視床下部('hypothalam')、小脳('cerebell')、皮質('corte')、中脳('midbra'); 小腸 ('s. intestine')、心臓 ('hear')、肺 ('lun')、脾臓 ('splee')、腎臓 ('kidne')、および骨髄('b. marrow')。
図 18C は、3T3-L1 細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のDevG22 様発現のリアルタイム PCR 分析を示す。
実施例
本発明のより良い理解およびその多くのメリットは、図示のみによって示された次の実施例から明らかであろう。
【０１０４】
実施例 1: 機能的遺伝子学的スクリーニングを使用して、エネルギー恒常性において新規機能を有する EP ラインの分離
エネルギー恒常性において機能を有する遺伝子を単離するために、組織特定の様式における Gal4 の発現を誘導する 2 つの「Gal4 ドライバ」ラインに対して、数千のEP ラインを交雑した。 2 つの異なる「ドライバ」ラインをスクリーニング: (i)主に fatbody (FB)における Gal4 の発現、(ii) 神経細胞(elav)における Gal4 の発現(図 1)、において使用した。「ドライバ」ラインを EPラインに対して交雑後、内在性遺伝子は、fatbody または神経細胞においてそれぞれ活性化することが可能である。エネルギー恒常性に影響する関連遺伝子の選択のため、6 日間の食餌後に、その交雑の子孫を飢餓状態に晒した。野生型のハエは一定の飢餓耐性を示す。飢餓耐性に顕著な変化を示した EP ラインを、肯定的なとして候補選択した。
【０１０５】
実施例 2: HD-EP(X)10478 および HD-EP(X)31424 ハエは、fatbody または神経細胞中に駆動されると、顕著な飢餓耐性を示した。
【０１０６】
EP ライン HD-EP(X)10478 および HD-EP(X)31424 の異所性発現は、染色体領域 10D4-10D6 において両方ともホモ接合性の生存統合であり、「FB ドライバ」および「elav ドライバ」の制御下で、野生型のハエ (オレゴン R、図 1 を参照)に相対して顕著な飢餓耐性を生じた。交雑またはラインによる数百のハエの子孫を、飢餓状態下で分析した。. 毎時点生存者は図 1 に示した。24 時間の飢餓後、HD-EP(X)10478 および 31424 ハエは両方の「ドライバ」と共に、野生型のオレゴン R より 80〜100% 多くの生存者を示した。48 時間の飢餓後、ほとんどの野生型のハエは死滅した。対照的に、48 時間の飢餓後、HD-EP(X)10478 および 31424 の集団の約 20% は、両方の「ドライバ」と共に依然として生存しており、これは顕著な増加である。HD-EP(X)10478 および 31424 の少数のハエは、両方の「ドライバ」と共に、72 時間の飢餓後、依然として生存するが、通常、野生型のハエは生存しない。以上の点から、キイロショウジョウバエ の fatbody および神経細胞におけるHD-EP(X)10478 および HD-EP(X)31424 を介する異所性発現は、顕著な飢餓耐性につながる。
【０１０７】
実施例 3: HD-EP(X)10478 および HD-EP(X)31424 を介した異所性発現によって、fatbody および神経細胞における中性脂肪含有率を高めた
飢餓耐性は、その起源をエネルギー恒常性における変化に有する。例えば、エネルギー消費の低下および(または)中性脂肪のような物質の保管における増加が挙げられる。中性脂肪は細胞において最も効果的なエネルギー保管場所である。以上の点から、同一 遺伝子型を有するハエのプールの中性脂肪含有率を、中性脂肪測定法を使用して分析した。
【０１０８】
ハエの中性脂肪含有率の決定のため、HD-EP(X)10478 および HD-EP(X)31424, HD-EP(X)10478/FB-Gal4 および HD-EP(X)31424/FB-Gal4, HD-EP(X)10478/elav-Gal4 および HD-EP(X)31424/elav-Gal4 および オレゴン R の各回 10 匹のメスのいくつかのアリコットを分析した。ハエは、5 分間 90EC にて水溶性の緩衝液中において水浴を使用してインキュベートした後に、熱抽出を行なった。さらなる 5 分間 90EC にてインキュベーションし、マイルドな遠心分離を行なった後、Sigma 中性脂肪(INT 336-10 または-20)アッセイを使用し、製造者のプロトコルに従って光学的な濃度における変化を測定することによって、ハエの中性脂肪含有率抽出を決定した。参照として、抽出手順の前にハエ質量を測定した。
【０１０９】
中性脂肪含有率分析の結果を図 2 に示した。HD-EP(X)10478 および 31424 ハエの中性脂肪含有率の平均増加率は、 「FB ドライバおよびelav Gal4 ドライバ」ラインと共に、野生型のハエ(オレゴン R)および HD-EP(X)10478 および 31424 統合のみと比較して示した。測定値の標準偏差は、細いバーとして示した。ハエ集団の中性脂肪含有率は、Fg/mg ハエ湿潤重量 (wt.)で示した。各測定において、中性脂肪測定法において、その子孫を6日間食餌した後、交雑またはラインの子孫の 10 匹のメスを分析した。そのアッセイを何度か繰返した。野生型のハエは、30 to 45 Fg/mg ハエ湿潤重量という一定の中性脂肪レベルを示した。HD-EP(X)10478 および 31424 ハエは、野生型と類似または、わずかに低い中性脂肪含有率を示した。対照的に、HD-EP(X)10478 および 31424 ハエは、、野生型(オレゴン R)ハエおよび HD-EP(X)10478 および 31424 統合のみと比較して、両方の「ドライバ」 と共に 55 to 72 Fg/mg 湿潤重量の 1.8 倍までの平均増加率を示した。以上の点から、遺伝子座 10D4-6 における遺伝子活性の増加は、エネルギー保管中性脂肪の代謝における変化の原因となる。
【０１１０】
FB-Gal4 を使用するゲノム ショウジョウバエ配列の異所性発現は、野生型のハエ (オレゴン R)に相対して、平均1.8 倍の中性脂肪含有率の増加を引き起こした。「elav-Gal4 ドライバ」の制御下において、HD-EP(X)10478 および HD-EP(X)31424 は、中性脂肪含有率のより小さな増加を引き起こした。以上の点から、キイロショウジョウバエ の fatbody におけるHD-EP(X)10478 および HD-EP(X)31424 を介する異所性発現は、エネルギー保管中性脂肪の著しい増加につながり、以上の点から、肥満したハエモデルを表す。遺伝子機能の増加による中性脂肪含有率の増加は、中性脂肪としてエネルギー保管の量を制御する、投与量依存型および組織特定の様式において、エネルギー恒常性における遺伝子活性を示唆する。
【０１１１】
実施例 4: ホモ接合性ハエ(EP(2)0646、EP(2)2188、EP(2)2517、HD-EP(2)20388、EP(2)2482)の中性脂肪含有率の測定
中性脂肪は細胞において最も効果的なエネルギー保管場所である。エネルギー恒常性において機能をともなう遺伝子を単離するするために、数千の EP ラインの中性脂肪含有率を長期にわたる食餌期間後にテストした。さらなる分析のための肯定的な候補として、中性脂肪含有率が顕著に変化したラインを選択した。本発明において、同一 遺伝子型を有するハエのプールの中性脂肪含有率を、6 日間の食餌の後、中性脂肪測定法を使用して分析した。中性脂肪含有率の決定のため、その子孫を 6 日間食餌後、交雑またはラインの子孫の各回 10 匹のオスのいくつかのアリコットを分析した。
ハエ質量を参照として測定した。ハエは、メタノール/クロロホルム(1:1)において抽出し、真空下で、抽出のアリコットを蒸発せしめた。脂質は、可聴化の助けを借りて、水溶性の緩衝液において乳化せしめた。 Sigma INT 336-10 または -20 測定法を使用して、製造者のプロトコルに従って光学的な濃度における変化を測定することによって、中性脂肪含有率を決定した。
【０１１２】
ハエの中性脂肪含有率の決定の改良および簡素化を行ない、中性脂肪測定法で、その子孫に 6 日間食餌後、各アッセイにおける交雑またはラインの子孫の 10 匹のオスを分析した。そのアッセイを何回か繰返した。ハエは、5 分間 90EC にて水溶性の緩衝液中において水浴を使用してインキュベートした後に、熱抽出を行なった。さらなる 5 分間 90EC にてインキュベーションし、マイルドな遠心分離を行なった後、Sigma 中性脂肪(INT 336-10 または-20)アッセイを使用し、製造者のプロトコルに従って光学的な濃度における変化を測定することによって、ハエの中性脂肪含有率抽出を決定した。参照として、BIO-RAD DC タンパク質測定法 を使用し、製造者のプロトコルに従って、同一抽出のタンパク質含有率を測定した。
【０１１３】
野生型のハエは、常に中性脂肪レベル 11〜23 Fg/mg ハエ湿潤重量を示した。EP(2)0646、EP(2)2188、EP(2)2517、および HD-EP(2)20388、および EP(2)2482 ホモ接合性ハエは、常に野生型(図 7および図 13)より高い中性脂肪含有率を示した。対照的に、EP(2)0646、EP(2)2188、EP(2)2517、HD-EP(2)20388、およびEP(2)2482 ハエは、両方の「ドライバ」と共に、野生型(オレゴン R)(図示せず)に相対して、ときたまわずかな増加のみを示した(49 to 53 Fg/mg 湿潤重量の2.1〜2.3 倍)。以上の点から、EP(2)0646、EP(2)2188、EP(2)2517、HD-EP(2)20388、およびEP(2)2482 ハエの Pベクターが、ホモ接合性生存結合している、その座位における遺伝子活性の損失は、エネルギー保管中性脂肪代謝における変化の原因であり、以上の点から、両方の事例において、肥満したハエモデルを表した。遺伝子機能の損失による中性脂肪含有率の増加は、中性脂肪としてエネルギー保管の量を制御する、投与量依存型の様式において、エネルギー恒常性における潜在的遺伝子活性を示唆する。
【０１１４】
実施例 5: 遺伝子の同定
DevG20 (PDI)
本発明の DevG20 タンパク質をコード化をする核酸を、プラスミド救出技術を使用して同定した。単離された HD-EP(X)10478またはHD-EP(X)31424 統合を、約 1 kb のゲノム DNA 配列に対して直接的に 3' の位置決めをした。それら単離したゲノム配列を使用して、Berkeley ショウジョウバエ ゲノムプロジェクト(GadFly)のような公共データベースをスクリーニングし、それによって HD-EP(X)10478 および HD-EP(X)31424および近傍に局在する内在性遺伝子(図 3)の統合側を確認した。図 3 は、DevG20 遺伝子座の分子組織を示す。ゲノム DNA 配列を、組立 AE003487 によって、EP(X)1503、HD-EP(X)10478 および HD-EP(X)31424 の統合部位を含んだ、黒色 ラインとして表した。番号は、 AE003487 ゲノム DNA の座標、予測遺伝子および EP ベクター統合部位を表す。矢印は、内在性遺伝子の異所性発現の方向を表し、EP ベクターにおける Gal4 プロモーターによって制御する。遺伝子CG2446およびCG1837 の予測エキソンは灰色バーとして示した。プラスミド救出方法を使用して、約 1 kb ゲノム DNA 配列を直接に局在化した 3' の HD-EP(X)10478 および HD-EP(X)31424 統合部位を単離した。1 kb プラスミド救出 DNA を使用して、公共 DNA 配列データベースをスクリーニングし、それによってHD-EP(X)10478 および HD-EP(X)31424 の統合部位を同定した。
【０１１５】
HD-EP(X)10478 および HD-EP(X)31424 を予測遺伝子 CG2446 において統合した。この遺伝子は、EST 血栓 241-2-4 によって表されるが、その Gal4 プロモーターは、CG2446 発現の方向に対して逆の方向に、内在性遺伝子の異所性発現を誘導する。約 2 kb 3' の HD-EP(X)10478 および HD-EP(X)31424 の統合部位の予測遺伝子 CG1837 は局在化して、est 血栓 3553-14 に対応し、 「FB- and elav-Gal4-drivers」を使用して異所的に発現することができる。
fatbody またはより弱い神経細胞における CG1837 異所性発現は、ハエにおける中性脂肪含有率の増加につながる。
【０１１６】
HD-EP(X)10478 を、アンチセンス方向において EST 血栓 241-2-4 に対応する、CG2446 の第１予測エキソンに挿入した。HD-EP(X)10478 の Gal4 プロモーター領域は、CG2446 が発現された方向と逆の方向に発現を駆動し、以上の点から、別の内在性遺伝子の異所性発現を駆動することができる。HD-EP(X)31424 をCG2446 の第 1 予測エキソンに挿入し、その Gal4 プロモーターは、CG2446 発現に相対して逆の方向に発現を駆動する。EST 血栓 3553-14 に対応する異なる内在性遺伝子 CG1837 は、EP-統合の両方のセンス方向において、局在的な 2180 塩基対 3' である。CG1837 は、HD-EP(X)10478 および HD-EP(X)31424 を経由して、異所的に発現し、肥満症につながる。
【０１１７】
DevG4 (MRP4)
本発明の DevG4 タンパク質をコード化をする核酸を、プラスミド救出技術を使用して同定した。単離された約 0.8 kb のゲノム DNA配列を、EP(2)0646、EP(2)2517およびEP(2)2188 統合に対して直接的に 3' 局在化した。それら単離したゲノム配列を使用して、Berkeley ショウジョウバエ ゲノムプロジェクト(GadFly)のような公共データベースをスクリーニングし、それによって0646, EP(2)2517 and EP(2)2188 および近傍に局在する内在性遺伝子(図 8)の統合側を確認した。図 8 は、DevG4 遺伝子座の分子組織を示す。図 8 において、黒色点線として表示したゲノム DNA 配列には(17.5 kb、染色体 2L の位置 8256000 から始まる)、0646、EP(2)2517およびEP(2)2188 (矢印)の統合部位が含まれる。番号は、ゲノム DNA の座標を表す。矢印は、内在性遺伝子の異所性発現の方向を表し、EP ベクターにおける Gal4 プロモーターによって制御する。転写された DNA 配列 (EST および血栓)は、下部の 2 行にバーとして示した。遺伝子 CG7627(GadFly)の予測エキソンは、緑色のバーとしておよびイントロンは灰色のバー として示した。
【０１１８】
0646, EP(2)2517 および EP(2)2188 を 5' の EST 血栓 6022-1 に、アンチセンス方向で統合した。血栓 6022-1 は cDNA クローニング を表すが、その意味は、その DNA 配列がショウジョウバエ.において発現されることを示す。血栓 6022-1 配列は、予測遺伝子 CG7627 の配列と重複し、以上の点から、血栓 6022-1 には、DevG4遺伝子および EP(2)0646 および EP(2)2517 の 5' 末端が含まれ、DevG4 のプロモーターにおいてホモ接合性生存結合している。0.8 kb プラスミド救出 DNA を使用して、公共 DNA 配列データベースをスクリーニングし、それによってEP(2)0646 および EP(2)2517 の統合部位を同定した。EP(2)0646 および EP(2)2517 は、遺伝子のプロモーターにおいて GadFly アクセッション番号 CG7627 と統合さ、EST 血栓 6022-1 として表されることを発見した。Gal4 プロモーターは、内在性遺伝子の異所性発現を、CG7627 発現の方向対して逆の方向に誘導する。以上の点から、CG7627の発現は、EP(2)0646、EP(2)2517およびEP(2)2188 のホモ接合性生存統合によって影響され、エネルギー保管中性脂肪の増大つながる。
【０１１９】
DevG22
図 14 は、黒色点線として表示したゲノム DNA 配列を示し(15 kb、染色体 2L の位置 171400.5 から始まる)、EP(2)20388 の統合部位が含まれる(矢印)。番号は、ゲノム DNA 座標を表す。矢印は、内在性遺伝子の異所性発現の方向を表し、EP ベクターにおける Gal4 プロモーターによって制御する。転写された DNA 配列 (EST および血栓)は、別の行に緑色のバーとして示した。GadFly アクセッション番号 CG17646 を有する遺伝子の予測エキソンは、緑色のバーとしておよびイントロンは灰色のバー として示した。DevG22 は、CG17646 としてGadFly 配列分析プログラムによって予測された新規遺伝子に対してコード化することを発見した。プラスミド救出方法を使用して、約 0.6 kb ゲノム DNA 配列を直接に局在化した 3' の EP(2)20388 結合部位を単離した。0.6 kb プラスミド救出 DNA を使用して、公共 DNA 配列データベースをスクリーニングし、それによって、EP(2) 20388 の統合部位を同定する。EP(2)20388 を直接に 5' の EST SD03967 に、センス方向で統合した。SD03967 は、cDNA クローニングを表すが、その意味は、その DNA 配列がショウジョウバエ.において発現されるということである。SD03967 配列は、予測遺伝子 CG17646 の 5' 配列と重複し、以上の点から SD03967 には、5' および 3' 末端の DevG22遺伝子が含まれる。3' 末端の SD03967 は、CG17646 配列と重複せず、 以上の点から、DevG22 のcDNA は図 14 に示したよりも長い可能性がある。EP(2)20388 を遺伝子CG17646 のプロモーターにおいて統合し、EST SD03967 として表わし; その Gal4 プロモーターは、当然 CG17646 の異所性発現を誘導する。以上の点から、CG17646 の発現は、EP(2)20388 のホモ接合性生存統合によって影響され、エネルギー保管中性脂肪の増大につながる。
【０１２０】
実施例 6: DevG20 の分析
DevG20 は、GadFly 配列分析プログラムおよび単離された EST クローンによって予測される新規遺伝子をコード化する。表現型データまたは機能的データのいずれも、本発明において DevG20 と呼ばれる、従来の技術における新規遺伝子 CG1837 対して入手可能でない。本発明では、DevG20 の核酸配列 を、図 4A、配列認識番号 1 に示すように説明した。
【０１２１】
本発明では、配列認識番号 2 のアミノ酸配列を備えているポリペプチドを図 4B において説明するが、その符号は順番の 1 文字コードを使用した。DevG20 は長さが 416 のアミノ酸である。オープン リーディング フレームは、ヌクレオチド 37 の ATP 開始コドンを発端とし、ヌクレオチド 1284 の CAC 終止コドンで終了とした(図 4B)。
【０１２２】
予測アミノ酸配列は、公的に利用可能である GenBank データベースにて検索した。配列データベースの検索において、例えば、DevG20 は、ヒト hGRP58 タンパク質、すなわち324アミノ酸(GenBank アクセッション番号 NP-110437.1; 前アクセッション番号 AAH01199 および BC001199 と同一)(図 4C および 4D を参照; 配列認識番号 1 および 2)の潜在的 58 kDa グルコース調節タンパク質と、60% の相同性を持つことを発見した。具体的には、ショウジョウバエ DevG20 およびヒト hGRP58 タンパク質は 60% の相同性を共有し(図 5 を参照)、発端は DevG20 のアミノ酸 84〜407(および hGRP58 のアミノ酸 1〜316)である。 hGRP58 タンパク質は、翻訳済マウス EST クローンとタンパク質の配列比較を行なう tblastp を使用して、cDNA クローニング 601333564F1 NCI-CGAP-Mam6 によってコード化されたマウスタンパク質に対して相同性がある。
【０１２３】
InterPro タンパク質分析、用具を使用して、例えば、DevG20 タンパク質が、少なくとも 3 つのチオレドキシン タンパク質モチーフおよび小胞体標的配列を有することを発見した。これらのモチーフおよび標的シーケンシングはまた、グルコース調節タンパク質およびタンパク質ジスルフィド異性化酵素において見出される。グルコース調節されたタンパク質およびタンパク質ジスルフィド異性化酵素は、小胞体でのリポタンパク質組立のような、多くの異なるプロセスに関与するシャペロンである。
【０１２４】
DevG20 は、タンパク質ジスルフィド異性化酵素またはグルコース調節タンパク質のファミリーに対して相同性を持つ新規タンパク質をコード化する。相同性に基づいて、本発明の DevG20 タンパク質および各相同性タンパク質またはペプチドは少なくともある程度の活性を共有する。
【０１２５】
実施例 7: DevG4 の分析
上記に記載したように、DevG4 は、GadFly アクセッション番号 CG7627 によってコード化される。ショウジョウバエ DevG4 の核酸配列は図 9A、配列認識番号 9 示した。本発明では、配列認識番号 10 のアミノ酸配列を備えているポリペプチドを図 9B において説明するが、その符号は順番の 1 文字コードを使用した。ショウジョウバエ DevG4 タンパク質は、長さが1355 のアミノ酸である。オープン リーディング フレームは、ヌクレオチド 158 の ATP 開始コドンを発端とし、ヌクレオチド 4225 の終止コドンで終了とした。ショウジョウバエ DevG4 は、追加の 28 アミノ酸を N-末端で持ち、血栓 6022-1 および CG7627 cDNA 配列 を結合した後、フレームを変えること無しに予測 CG7627 タンパク質に相対する。
【０１２６】
予測アミノ酸配列は、公的に利用可能である、GenBank (NCBI)データベースにおいて検索した。検索は、ショウジョウバエ DevG4 が約 40% の同一性を、ヒト MRP4 (MOAT-B)タンパク質、1325アミノ酸(アクセッション番号: NP-005836;配列認識番号 10)の ATP 結合カセット(ABC)輸送体タンパク質(図 9C を参照)と有することが明らかにした。具体的には、ショウジョウバエ DevG4 およびヒト相同体 DevG4(hMRP4)タンパク質は約 80% の相同性を共有し(図 9D を参照)、発端は、DevG4 のアミノ酸 8〜1330(および hMRP4 のアミノ酸 7〜1277)が挙げられる。
【０１２７】
ABC スパーファミリのメンバーにおいて見出されるタンパク質ドメインは、高度に保存されており、ヒト相同体タンパク質およびマウス相同体タンパク質を有するショウジョウバエ DevG4 の 4 つのタンパク質ドメイン間の比較(Clustal X 1.8)を行なった(図 11を参照)。ヒトおよびマウス(配列の一部分のみが入手可能な)の MRP4が最もショウジョウバエ DevG4 タンパク質に近い相同性タンパク質であることを見出した。InterPro タンパク質分析ツールを使用して、その DevG4 タンパク質が少なくとも 4 つの 4 タンパク質モチーフ ドメインを持つことを発見した(図 10)。これらのモチーフおよび標的シーケンシングは、全 ABC 輸送体スーパーファミリを通して発見された。ABC 輸送体とは、多くの異なる輸送プロセスに関与するタンパク質におよぶ細胞膜のことである。図 11 A は、ABC 細胞膜 I  ドメインのアライメントを示す。ショウジョウバエ DevG4 およびヒト hMRP4 のアミノ酸の同一性は、41% であり、配列の類似性は 63% である。図 11 B は、ABC-tran I  ドメインのアライメントを示す。ショウジョウバエ DevG4およびヒト DevG4 のアミノ酸の同一性は、56% であり、類似性は 75% である。マウス配列は入手可能でない。. 図 11 C は、ABC 細胞膜 II  ドメインのアライメントを示す。ショウジョウバエ DevG4 およびヒト hMRP4 のアミノ酸の同一性は、42% であり、類似性は 60% である。マウス配列は入手可能でない。. 図 11 D は、ABC-tran II  ドメインのアライメントを示す。マウス配列は入手可能でない。. ショウジョウバエ DevG4およびヒト DevG4 のアミノ酸の同一性は、69% であり、類似性は 86% である。ヒトおよびマウス ABC-tran II ドメインはほとんど同一である。
【０１２８】
相同性に基づいて、ショウジョウバエ DevG4 タンパク質および各相同性タンパク質またはペプチドは少なくともある程度の活性を共有する。DevG4 タンパク質は 2 つの特性を持つ。ABC 細胞膜 ドメイン、6 つの貫通膜ヘリカル領域 (標識済「 ABC-membrane」図 10 中、ABC 輸送体貫通膜領域)タンパク質を細胞膜にアンカーする。加えて、DevG4 は、数百のアミノ酸残基から成る 2 つの ABC-輸送体ドメインを持つ、(標識済 「ABC-tran」図 10 中、ABC 輸送体)、ATP 結合部位を含む。ABC ファミリーのタンパク質は、原核生物および真核生物の両方において、種々の固有の生物学的プロセス関連する、タンパク質におよぶ膜であり、例えば、輸送プロセスにおいて、細胞質膜を横断するような小さな親水性分子のアクティブな輸送のようなものである。 さらには、単一 MMR-HSR1 ドメイン (未知の機能の GTPase、図 4A における薄灰色正方形ボックス)を DevG4 において同定した。図 10 は、単一の 特徴を持つ DevG22 タンパク質の ABC-輸送体 ドメイン(「ABC trans」)を示す。
【０１２９】
実施例 8: DevG22 の分析
上述のように、ショウジョウバエ DevG22 タンパク質は、コードされた GadFly アクセッション番号 CG17646 である。本発明は、図 15A、配列認識番号 11 において示したように、DevG22  の核酸配列を説明している。本発明では、配列認識番号 2 のアミノ酸配列を備えているポリペプチドを図 15B において説明するが、その符号は順番の 1 文字コードを使用した。ショウジョウバエ DevG22 タンパク質は、長さが627 のアミノ酸である。オープン リーディング フレームは、ヌクレオチド 576 の ATP 開始コドンを発端とし、ヌクレオチド 2459 の終止コドンで終了とした。
【０１３０】
予測アミノ酸配列は、公的に利用可能である GenBank データベースにて検索した。配列データベースの検索において、例えば、DevG22 は、ヒト白色(ABC8、ABCG1)タンパク質、および674アミノ酸(GenBank アクセッション番号 XP-009777.3; 図 15C および 15D を参照; 配列認識番号 5 および 配列認識番号 6)のATP 結合カセット(ABC)輸送体タンパク質とほとんど40% の同一性を持つことを発見した。具体的には、ショウジョウバエ DevG22 および ヒト相同体タンパク質は約 70% の相同性を共有し(図 17 を参照)、その発端はショウジョウバエ DevG22 (および ヒト DevG22-h白色のアミノ酸 27〜507)のアミノ酸57〜622である。
【０１３１】
InterPro タンパク質分析ツールを使用して、その DevG22 タンパク質が少なくとも 1 つの 4 タンパク質モチーフを持つことを発見した(図 16)。ABC 輸送体の白色様サブファミリは、1 つの ABC-tran ドメインおよび総体的なアミノ酸配列であることを特徴とする。以上の点から、完全なコーディング配列およびドメインのみだけが比較されるものではない。図 17 は、ヒト、マウスおよびショウジョウバエ DevG22 タンパク質(白色様 ABC 輸送体)のアライメントを示す。ショウジョウバエ DevG22 は、ヒト DevG22 (hWhite; ABC8、ABCG1、GenBank アクセッション番号 XP-009777)に対して 36% 同一であり、52% 類似である。ショウジョウバエ DevG22 は、マウスDevG22 (mWhite; GenBank アクセッション番号 NP-033723)に対して 36% 同一であり、51% 類似である。以上の点から、 脊椎動物の白色輸送体は、ショウジョウバエ DevG22 に対して最も近い相同体である。ヒトおよびマウス白色タンパク質は、 95% の同一性および 96% の類似性を示す。相同性に基づいて、本発明の DevG22 タンパク質および各相同性タンパク質またはペプチドは少なくともある程度の活性を共有する。
実施例 9: 哺乳動物の組織におけるポリペプチドの発現
本発明において開示した哺乳動物の組織におけるポリペプチドの発現を分析するため、いくつかのマウス菌株 (望ましくは、標準モデル系における肥満症および糖尿病の研究である、マウス菌株 C57Bl/6J、C57Bl/6 ob/ob および C57Bl/KS db/db)は、Harlan Winkelmann (33178 Borchen、Germany)から購入し、一定の温度下に維持した(望ましくは 22EC)、湿度 40 パーセントおよび明/暗サイクルの望ましくは14/10 時間。 マウスには標準食を与えた(例えば、ssniff Spezialitaeten有限責任会社、製品番号 ssniff M-Z V1126-000)。動物は 6〜8 週間の年令で屠殺した。動物組織は、当業者であれば既知の標準手順に従って単離し、液体窒素で簡易冷凍し、必要となるまで -80℃ にて保管した。
【０１３２】
本発明において開示した、生体外分化におけるタンパク質の役割の分析のため、異なる哺乳動物細胞の培養細胞、前脂肪細胞の脂肪細胞への変換、哺乳動物の線維芽細胞(3T3-L1)細胞(例えば、Green & Kehinde、Cell 1: 113-116、1974)を American Tissue Culture Collection(米国バージニア州ハナサスの ATCC、; ATCC- CL 173)から入手した。3T3-L1 細胞は、線維芽細胞として維持し、従来の技術に記述されたように脂肪細胞へ分化した(例えば、Qiu. らの J. Biol. Chem. 276:11988-95、2001; Slieker らの BBRC 251: 225-9、1998)。分化手順の種々の時点で、発端として 第 0 日(密集日)および第 2 日目(ホルモン追加; 例えば、デキサメタゾンおよび 3-イソブチル-1-メチルキサンチン)、分化は 10 日を最大とする、好適な細胞のアリコットを 2 日毎に採取した。あるいは、哺乳動物の線維芽細胞 3T3-F442A 細胞(例えば、Green & Kehinde, Cell 7: 105-113, 1976)は Harvard Medical School, Department of Cell Biology (米国ボストン州マサチューセッツ)から取得した。3T3-F442A 細胞は、線維芽細胞として維持し、前述のように脂肪細胞へ分化した(Djian、P. らの、J. Cell. Physiol.、124:554-556、1985)。分化手順の種々の時点で、発端として 第 0 日(密集日およびホルモンの追加。例えば、インシュリン)、分化は 10 日を最大とする、好適な細胞のアリコットを 2 日毎に採取した。3T3-F442A 細胞は、既に密集段階の生体外でホルモン(インシュリン)追加後に分化する。
RNA は、Trizol 試薬 (例えば、ドイツ国 Invitrogen、Karlsruhe から)を使用して、マウス組織または細胞の培養細胞から単離した。およびさらに、RNeasy Kit (例えば、ドイツ国の Qiagen から)と共に、DNase-treatment を使用し、製造者の指示に従って、またおよび当業者であれば既知の方法で精製した。全 RNA を逆転写した(望ましくは Superscript II RNaseH− Reverse Transcriptase を利用する。Invitrogen、Karlsruhe、ドイツ国) また、全 RNA は Taqman 分析の対象となり、望ましくは Taqman 2xPCR Master Mix を使用して(Applied Biosystems、Weiterstadt、ドイツ国; このミックスには、製造者によれば、例えば、AmpliTaq ゴールド DNA ポリメラーゼ、AmpErase UNG、dUTP  を有する dNTP、 GeneAmp 5700配列検出システム上(Applied Biosystems より、Weiterstadt、ドイツ国)上の受動的な参照 Rox および最適化された緩衝液成分)などが含まれている。
【０１３３】
DevG20 の発現分析のために、taqman 分析を実施した。使用したのは次のプライマー/プローブ ペア (図 6 を参照)である: マウスDevG20 (PDI)フォーワード プライマー (配列認識番号 13): 5「-CAC GGG TGA CAA GGG CA-3」; マウスDevG20 (PDI)逆 プライマー (配列認識番号 14): 5「-CCC CTG TGC AAT AGT GTC CTC-3」; Taqman プローブ (配列認識番号 15): (5/6-FAM)TGC TGG CAC TCA CCG AGA AGA GCT T (5/6-TAMRA)。
【０１３４】
図 6A で示したように、DevG20 発現のリアルタイムの分析 PCR 法(Taqman)、哺乳動物の(マウス)におけるタンパク質組織は、DevG20 (PDI) はむしろ偏在的に種々のマウス組織において発現されることを明らかにした。但し、WATおよびBATにおける明らかな発現もまた、実証することができる。DevG20 (PDI)は、遺伝子学的に肥満したob/ob マウスの BAT、皮質および脾臓におけるその発現の上方制御を示す(図 6B)。加えて、断食マウスの腎臓および骨髄におけるその発現もまた、上方制御した。ob/ob マウスのWATにおけるDevG20 (PDI)発現の上方制御 を観察したが、生体外での 3T3-L1 細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中、その発現の上方制御が二倍であることを明らかに実証した。 (図 6C)。
【０１３５】
DevG4 の発現の分析のため、次のプライマー/プローブ ペアを使用して(図 12 を参照)、taqman 分析を実施した: マウスDevG4 (mrp4)フォーワード プライマー (配列認識番号 16): 5'-CAA GTA GCG CCC ACC CC-3'; マウスDevG4 (mrp4)逆 プライマー (配列認識番号 17): 5'-AGT TCA CAT TGT CGA AGA CGA TGA-3'; Taqman プローブ (配列認識番号 18): (5/6-FAM)AGG CTG GCC CCA CGA GGG A (5/6-TAMRA)。
【０１３６】
Taqman 分析は、DevG4 (mrp4)が、最も高いレベルの発現を腎臓において見出されるような種々のマウス組織において、偏在的に発現されることをを明らかにした。(図 12A)。DevG4 (mrp4)は、遺伝子学的に肥満したob/ob マウス肝臓におけるその発現非常に顕著な上方制御を示す(図 12B)。加えて、腎臓における有意な上方制御はまた、これらの条件下で観察することができる。空腹時状態下、DevG4 (mrp4) 発現は、その発現の全体的な下方制御を示すようであり、これは特に空腹時マウスのBAT組織において顕著である。DevG4 (mrp4)発現は、3T3-L1 細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への 生体外分化中、およそ 4 倍に増加する(図 12C)。
【０１３７】
DevG22 の発現分析のために、taqman 分析を実施した。使用したのは次のプライマー/プローブ ペアである: マウスDevG22 (白色) フォーワード プライマー (配列認識番号 18): 5'-TCG TAT ACT GGA TGA CGT CCC A-3'; マウスDevG22(白色) 逆 プライマー (配列認識番号 19): 5'-TGG TAC CCA GAG CAG CGA AC-3'; Taqman プローブ (配列認識番号 20): (5/6-FAM)CCG TCG GAC GCT GTG CGT TTT (5/6-TAMRA)。
【０１３８】
Taqman 分析は、DevG22(白色)の大部分は神経組織において発現されることを明らかにした。但し、その他の組織における明らかな発現、例えば WAT または BAT もまた観察された(図 18A および 18B)。BAT および WAT における DevG22(白色)の発現は代謝制御下にある: 断食マウスにおいて、発現は BAT において高まる。これに反して、遺伝的に肥満したob/ob マウスにおける発現は WAT および筋肉において高まる。 (図 18B)。ob/ob マウスにおけるこの上方制御は、  観察された 3T3-L1 細胞の生体外分化中の DevG22(白色) 発現の強力な上方制御と相関する(図 18C)。
【０１３９】
本明細書において開示した全ての刊行物および特許を言及することをもって本明細書の一部となす。
【０１４０】
本発明の方法およびシステムの種々の修正および改変は当業者に当然のことであり、本発明の範囲および精神から逸脱しない限り行い得るものとする。本発明について説明するにあたり特定の好適実施例に関連して説明を行ったが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことは当然のことである。実際に、分子生物学または関連分野の専門家には明らかな、本明細書に記載されている本発明の実施方法の様々な改変は、特許請求の範囲内にあるものとする。Aa
文献
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【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】図 1 は、エコトロピック発現による、HD-EP(X)10478 および HD-EP(X)31424 ハエ(キイロショウジョウバエ; 図中、10478 および 31424 と呼ばれる)の飢餓耐性の平均増加率を示す。
【図２】図 2 は、異所性発現による HD-EP(X)10478 および HD-EP(X)31424 ハエの中性脂肪含有率の増加を示す。
【図３】図 3 は、DevG20 遺伝子座の分子組織を示す。
【図４】図4A は、ショウジョウバエ DevG20 タンパク質をコード化する核酸配列(配列認識番号 7)を示す。
図4B は、図 4A に示した核酸配列によってコード化された、ショウジョウバエ DevG20 のタンパク質配列(配列認識番号 8)を示す。
図4C は、Genbank アクセッション番号 NM-030810.1 (MGC3178)を有するホモサピエンス仮想タンパク質をコード化するヒト DevG20 相同体タンパク質の核酸配列(配列認識番号 1)を示す。
図4D は、図 4C に示した核酸配列によってコードされたヒト DevG20 タンパク質配列 (配列認識番号 2)(GenBank アクセッション番号 NP-110437.1)を示す。
【図５】図 5 は、ショウジョウバエ DevG20 タンパク質(配列認識番号 8)および ヒト DevG20 タンパク質(配列認識番号 2; GenBank アクセッション番号 NP-110437.1)、図においてhG20 と呼ばれる、に対するBLASTP (対非重複合成データベース)同一性検索結果を示す。
【図６】図 6 は、哺乳動物の組織における DevG20 の発現を示す。
図6A は、異なる野生型のマウス組織における DevG20 様発現のリアルタイム PCR 分析を示す。
図6B は、異なるマウスモデルにおける DevG20 様 発現のリアルタイム PCR 分析を示す(野生型のマウス ('wt')「薄灰色シェーディングのバー; 断食マウス」濃灰色シェーディングのバー、肥満マウス('ob/ob')、白色のバー)。   図6C は、3T3-L1 細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のDevG20 様発現のリアルタイム PCR 分析を示す。相対 RNA 発現は左側に示し、日数差は水平線上に示した(d0 = 第 0 日目、実験の始動、至 d10 = 第 10 日目)。
【図７】図 7 は、Pベクター(野生型のハエ (EP-control)に相対)のホモ接合性の生存統合に起因する、EP(2)0646、EP(2)2188、およびEP(2)2517 ハエの中性脂肪含有率に相対して増加を示す。測定値の標準偏差は、細いバーとして示した。ハエ集団の中性脂肪含有率は、TG/タンパク質含有率比として示した。
【図８】図 8 は、DevG4 遺伝子の遺伝子座の分子組織を示す。
【図９】図 9A は、 ショウジョウバエ DevG4 タンパク質をコード化する核酸配列(配列認識番号 9)を示す。
図 9B は、図 9A に示した mRNA によってコードされたショウジョウバエ DevG4 タンパク質配列(配列認識番号 10) を示す。
図 9C は、 ヒト DevG4 相同体(ホモサピエンスATP 結合カセット、サブファミリ C (CFTR/MRP)、メンバー 4、また、ABCC4 および MPR4 と呼ばれる; GenBank アクセッション番号 NM-005845)をコード化する核酸配列(配列認識番号 3)を示す。
図 9D は、ヒト DevG4 相同体のタンパク質配列 (配列認識番号 4; GenBank アクセッション番号 NP-005836.1)を示す。
【図１０】図 10 は、ヒト DevG4 タンパク質のタンパク質ドメイン(黒色ボックス)を示す。
【図１１】図 11 は、 異なる種(ヒト 「hMRP4」、マウス(図 11D にのみ示した、mMRP4)、およびショウジョウバエ (DevG4))のDevG4 タンパク質ドメインの比較を示す。(A) ABC 細胞膜 I ドメインのアライメント。ショウジョウバエ DevG4 およびヒト DevG4 (hMRP4)のアミノ酸の同一性は、41% であり、類似性は 63% である。(B) ABC-tran I ドメインのアライメントショウジョウバエ DevG4およびヒト DevG4 (hMRP4)のアミノ酸の同一性は、56% であり、類似性は 75% である。(C) ABC 細胞膜 II ドメインのアライメントショウジョウバエ DevG4 およびヒト DevG4 (hMRP4)のアミノ酸の同一性は、42% であり、類似性は 60% である。(D) ABC-tran II ドメインのアライメントショウジョウバエ DevG4 およびヒト DevG4 (hMRP4)のアミノ酸の同一性は、69% であり、類似性は 86% である。ヒトおよびマウス ABC-tran II はほとんど同一である。
【図１２】図 12 は、哺乳動物の組織における DevG4 の発現を示す。
図 12A は、異なる野生型のマウス組織における DevG4 (MRP4)発現のリアルタイム PCR 分析を示す。
図 12B は、異なるマウスモデルにおけるDevG4 (MRP4)発現のリアルタイム PCR 分析を示す。
図 12C は、3T3-L1 細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のDevG4 (MRP4)発現のリアルタイム PCR 分析を示す。
【図１３】図 13 は、Pベクター(野生型のハエ (EP-control)に相対)のホモ接合性の生存統合に起因する、HD-EP(2)20388 および EP(2)2482 ハエの中性脂肪含有率に相対して増加を示す。
【図１４】図 14 は、DevG22 遺伝子の遺伝子座の分子組織を示す。
【図１５】図 15A は、ショウジョウバエ DevG22 タンパク質をコード化する核酸配列 (配列認識番号 11)を示す。
図 15B は、ショウジョウバエ DevG22 タンパク質のタンパク質配列 (配列認識番号 12)を示す。
図 15C は、ヒト DevG22 相同体(ホモサピエンスATP 結合カセット、サブファミリ G 白色、メンバー 1 タンパク質; GenBank アクセッション番号 XM-009777)をコード化する核酸配列 (配列認識番号 5)を示す。
図 15D は、ヒト DevG22 相同体(ホモサピエンスATP 結合カセット、サブファミリ G 白色、メンバー 1 タンパク質; GenBank アクセッション番号 XP-009777.3)のタンパク質配列 (配列認識番号 6)を示す。
【図１６】図 16 は、DevG22 タンパク質のタンパク質ドメイン (黒色ボックス)を示す。
【図１７】図 17 は、ヒト、マウスおよびハエDevG22 タンパク質(白色様 ABC 輸送体)のアライメントを示す
【図１８】図 18 は、DevG22における哺乳動物の組織の発現を示す。
図 18A は、異なる野生型のマウス組織におけるDevG22 発現のリアルタイム PCR 分析を示す。
図 18B は、異なるマウスモデルにおける DevG22 発現のリアルタイム PCR 分析を示す。
図 18C は、3T3-L1 細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のDevG22 様発現のリアルタイム PCR 分析を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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