(57)【要約】本発明は、ネコＩＧＦ−１、このタンパクをコードするヌクレオチド配列、および、特にネコレトロウイルスＦＩＶおよびＦｅＬＶに対する、ネコのワクチン接種用のアジュバントとしてのＩＧＦ−１の使用に関する。ＩＧＦ−１はタンパクの状態で使用、または適当な例えばウイルスまたはプラスミド、発現ベクターにより生体内で発現することができる。本発明は、全ての型のワクチン、すなわち、不活化、弱化、サブユニットおよび組換えワクチンに関する。ＩＧＦ−１を生体内で発現するベクターは、免疫刺激組成物中で用いることもできる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列またはその相補鎖を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号２または３に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）ＴがＵに置換されていることによりその配列が（ａ）の配列と異なるポリヌクレオチド、
（ｄ）遺伝コードの縮重によりその配列が（ａ）または（ｂ）の配列と異なるポリヌクレオチド、および
（ｅ）配列番号２と９８．５％以上、好ましくは９９％以上の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を含む群から選択される、ネコＩＧＦ−１の機能を有するポリペプチドまたはタンパクをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
単離されたネコＩＧＦ−１タンパク。
【請求項３】
ｉ．配列番号２または配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｉｉ．配列番号１に示されるヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、および
ｉｉｉ．配列番号２に示されるアミノ酸配列と９８．５％以上、好ましくは９９％以上の同一性を有するポリペプチド
から選択される、ＩＧＦ−１の機能を有するポリペプチド。
【請求項４】
請求項１に記載のポリヌクレオチドおよび、そのポリヌクレオチドを試験管内または生体内発現させる調節要素を含んでなる発現ベクター。
【請求項５】
ネコ免疫原または生体内でネコ免疫原を発現する組換えベクター、および
ｉ．配列番号２または配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｉｉ．配列番号１に示されるヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、
ｉｉｉ．配列番号２上のアミノ酸４９〜１１８を含むポリペプチド、および
ｉｖ．ポリペプチドｉ、ｉｉまたはｉｉｉと７０％以上の同一性を有するポリペプチド
から選択されるＩＧＦ−１活性を有するポリペプチド、および獣医学的に許容できるビヒクルまたは賦形剤
を含んでなる、ネコ疾患に対する免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項６】
ネコ免疫原または生体内でネコ免疫原を発現する組換えベクター、および
（ｉ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列またはその相補鎖を含むポリヌクレオチド、
（ｉｉ）配列番号２または３に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）ＴがＵに置換されていることにより配列番号１の配列と異なる配列を含むポリヌクレオチド、
（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸４９〜１１８をコードするポリヌクレオチド、および
（ｖ）ポリペプチド（ｉｉ）または（ｉｖ）と７０％以上の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
から選択される、ＩＧＦ−１活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む生体内発現ベクター、および獣医学的に許容できるビヒクルまたは賦形剤
を含んでなる、ネコ疾患に対する免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項７】
ポリヌクレオチドを含む発現ベクターがプラスミドであることを特徴とする請求項６記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項８】
ポリヌクレオチドを含む発現ベクターがウイルス性ベクター、例えば、ポックスウイルス、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスであることを特徴とする請求項６記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項９】
免疫原を発現する発現ベクターがプラスミドまたはウイルス性ベクター、例えば、ポックスウイルス、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスであることを特徴とする請求項５〜８のいずれか記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１０】
免疫原が不活化免疫原、生弱化免疫原およびサブユニットからなる群より選択されることを特徴とする請求項５〜８のいずれか記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１１】
免疫原がＦＩＶ免疫原を含むことを特徴とする請求項５〜１０のいずれか記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１２】
免疫原がＦｅＬＶ免疫原を含むことを特徴とする請求項５〜１０のいずれか記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１３】
免疫原がＦＩＶおよびＦｅＩＶ免疫原を含むことを特徴とする請求項５〜１０のいずれか記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１４】
免疫原が、ネコ病原ＦＰＶ、ＦＩＰＶ、ＦＨＶ、ＦＣＶ、狂犬病ウイルス、クラミジアの免疫原からなる群より選択されるネコ免疫原を含むことを特徴とする請求項５〜１３のいずれか記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１５】
獣医学的に許容できるビヒクルまたは賦形剤、および
（ｉ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列またはその相補鎖を含むポリヌクレオチド、
（ｉｉ）配列番号２または３に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）ＴがＵに置換されていることにより配列番号１の配列と異なる配列を含むポリヌクレオチド、
（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸４９〜１１８をコードするポリヌクレオチド、および
（ｖ）ポリペプチド（ｉｉ）または（ｉｖ）と７０％以上の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
から選択される、ＩＧＦ−１活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む生体内発現ベクター
を含んでなる、ネコの免疫を刺激するための組成物。
【請求項１６】
ベクターがプラスミドまたはウイルス性ベクター、例えば、ポックスウイルス、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスであることを特徴とする請求項１５記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ネコ成長因子ＩＧＦ−１、このＩＧＦ−１をコードするポリヌクレオチド、およびこれを含む発現ベクターに関する。本発明は、また、ネコ種用の、特にネコレトロウイルスに対するワクチン用のワクチンアジュバントとしてのＩＧＦ−１の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ＩＧＦ−１は、内分泌成長媒介物質である。これは、成長ホルモンの主効果物質である。免疫、サイトカインの側の炎症、およびホルモン（特に、成長ホルモンのコルチゾール）の調整の複合系においても役割を果たす。
【０００３】
米国特許５，２０２，１１９は、ヒト、特に免疫不全個体における免疫刺激剤としてヒトＩＧＦ−１を治療的に用いることを記載している。特別の用途は、この免疫原に対する抗体の生成を刺激するための、ヒトＩＧＦ−１と免疫原との組み合わせである。この特許は、用途を哺乳動物一般および鳥類種に拡張することを意図しているが、動物のＩＧＦ−１配列を記載せず、動物への実験の結果を提供していない。
【０００４】
出願人は、一般的に、ＩＧＦ−１が特に細胞反応を刺激することを発見した。この反応プロフィールは、ネコレトロウイルスの場合に、特に良く適合されると判明した。これは、粘膜免疫も刺激する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
さらに、本発明までは、ネコＩＧＦ−１をコードする遺伝子は利用できなかった。
【０００６】
出願人は、ネコ末梢血単核細胞（ＢＰＭＣ）由来のＩＧＦ−１遺伝子の単離および配列決定に成功した。この遺伝子は、実施例に記載のオリゴヌクレオチドを用いるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の後に単離された。
【０００７】
ネコＩＧＦ−１遺伝子は、４６２ヌクレオチド（配列番号１）のサイズを有し、１５３アミノ酸を含むタンパク（配列番号２）をコードする。配列番号２に定義されるタンパクのＮ−末端において、タンパクの分泌に役立つ４８アミノ酸（配列番号２の配列における１から４８）からなるシグナルペプチド配列があり、このシグナルペプチドは二次的に開裂される。１０５アミノ酸の成熟タンパク（配列番号３）は、配列番号２のアミノ酸４９〜１５３に相当する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ネコＩＧＦ−１をコードするＤＮＡ配列およびその相補的ストランドをコードするＤＮＡ配列並びに対応するＲＮＡ配列、および遺伝コードの縮重により得られる相当する配列に関する。
【０００９】
従って、本発明の第１の目的は、配列番号１のヌクレオチド配列またはＴがＵに置換されＲＮＡ配列になっている同じ配列を含む単離されたポリヌクレオチド（定義として、ＤＮＡ、特にｃＤＮＡまたはＲＮＡ）である。さらなる対象は、この配列を有する単離されたポリヌクレオチドである。本発明は、また、配列番号２または３のアミノ酸配列をコードする単離されたポリヌクレオチドにも関する。
【００１０】
定義としては、本発明によるＩＧＦ−１の概念は、ネコ起源のＩＧＦ−１および、配列番号２と９８．５％以上、好ましくは９９％以上の同一性を有するタンパクを含む。ネコ起源のこれらのタンパクまたはこのように定義される相同体をコードするポリヌクレオチドが、本発明の一部をなす。
【００１１】
すなわち、本発明は、
（ａ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列またはその相補的ストランドを含むまたは本質的になるポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号２または３に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および
（ｃ）ＴがＵに置換されていることによりその配列が（ａ）の配列と異なるポリヌクレオチド、
を含む群から選択される、ネコＩＧＦ−１の機能を有するポリペプチドまたはタンパクをコードするポリヌクレオチドに関する。
【００１２】
同等の例として、これは、
（ｄ）遺伝コードの縮重によりその配列が（ａ）または（ｂ）の配列と異なるポリヌクレオチド、および
（ｅ）配列番号２との９８．５％以上、好ましくは９９％以上の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
のような、ネコＩＧＦ−１の機能を有するポリペプチドまたはタンパクをコードするポリヌクレオチドを含む。
【００１３】
同一性の百分率は、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５巻：４０３頁、１９９０年）を用いて決められ、このプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ、メリーランド州Ｂｅｔｈｅｓｄａ在）およびインターネットを含む複数の供給源から利用できる。デフォルト・パラメーター（ギャップ・イグジステンス・コスト１１、および残基当たりギャップ・コスト１）に設定されたブラストｐデフォルトＢＬＯＳＵＭ６２を用いるＮＣＢＩ  Ｂｌａｓｔ２配列を用いて、本開示に与えられたアミノ酸配列を有する全長アラインメントに渡って配列間の比較を行う。
【００１４】
本発明のポリヌクレオチドは、化学的合成により、または適当な発現ベクターを用いる発現により得ることができる。
【００１５】
本発明は、また、成熟状態で単離または生成されるネコＩＧＦ−１タンパクまたはポリペプチド、またはそれらの前駆体にも関する。従って、本発明は、特に、
（ｆ）配列番号２または配列番号３を含むまたは本質的になるポリペプチド、および
（ｇ）配列番号１もしくは、前記ポリヌクレオチド（ａ）〜（ｃ）のいずれかによりコードされるポリペプチド
に関する。
【００１６】
同等物として、これは、ポリペプチドが配列番号２と９８．５％以上、好ましくは９９％以上の同一性を有する、ＩＧＦ−１の機能を有するタンパクまたはポリペプチドを含む。前駆状態での発現および単離することも可能である。
【００１７】
ＩＧＦ−１タンパクまたはポリペプチドは、その分泌および５’におけるシグナルペプチドの開裂を引き起こす細胞系において成熟状態で発現および単離することができる。
【００１８】
本発明は、また、挿入物としての先に定義のポリヌクレオチドおよび、そのポリヌクレオチドを発現させる要素を含む発現ベクターにも関する。
【００１９】
ヌクレオチド配列は、特にバキュロウイルスのようなウイルス起源またはプラスミド起源の、従来の試験管内発現ベクター中に挿入することができる。次に、これらのベクターは、昆虫細胞、原核細胞起源（例えば、大腸菌）または真核細胞起源の細胞、特に、酵母、特にサッカロミセス・セレビシエ、哺乳動物細胞、特にハムスター細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）およびネコ細胞（例えば、ＣＲＦＫ細胞）のような適当な細胞系を感染または形質移入するために用いられる。バキュロウイルス（米国特許４，７４５，０５１；Ｖｉａｌａｒｄ  Ｊ．ら著、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９０年、第６４（１）巻、３７〜５０頁；Ｖｅｒｎｅ  Ａ．著、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９８８年、第１６７巻、５６〜７１頁）、例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａカリフォルニア核多角体病ウイルスＡｃＮＰＶを、昆虫細胞、特に、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  Ｓｆ９の細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７１１寄託）においてＩＧＦ−１を発現するためのベクターとして用いることが好ましい。当業者は、選択系に適合されたタンパクを生成する方法に詳しくそれを用いることができ、このように、ＩＧＦ−１が得られ単離される。従って、本発明は、本発明のポリヌクレオチドおよびそれを宿主細胞中で発現させる要素を含むこれら試験管内発現ベクター、このように生成されたネコＩＧＦ−１タンパク、およびその、ワクチンアジュバントおよび非特異的免疫刺激剤としての使用も含む。
【００２０】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドを、機能的ポリペプチドまたはネコＩＧＦ−１タンパクを宿主中で発現させる条件下に、成体内発現ベクター中に導入する。これら発現ベクターは、プラスミド、ポックスウイルスのようなウイルスベクター、例えば、ワクシニアウイルスの弱化突然変異体、アビポックスウイルス（特に、カナリア痘ウイルス、禽痘ウイルス）、豚痘ウイルス、アライグマ痘ウイルス、アデノウイルス（特に、ＣＡＶ−２）および、ネコヘルペスウイルスＦＨＶのようなヘルペスウイルスであり得る。ウイルスベクターのうち、カナリア痘ウイルスおよびＦＨＶが好ましい。これらのベクターは、宿主中でポリヌクレオチドを発現させる要素を含む。
【００２１】
ポックスウイルスに関しては、当業者は、ＷＯ−Ａ−９０／１２８８２を参照することができ、特に、ワクシニアウイルスに関しては米国特許４，７６９，３３０；米国特許４，７２２，８４８；米国特許４，６０３，１１２；米国特許５，１１０，５８７；米国特許５，４９４，８０７；米国特許５，７６２，９３８を参照することができ、禽痘ウイルスに関しては米国特許５，１７４，９９３；米国特許５，５０５，９４１；米国特許５，７６６，５９９を参照することができ、カナリア痘ウイルスに関しては米国特許５，７５６，１０３を参照することができる。
【００２２】
ワクシニアウイルスの弱化突然変異体としては、ＭＶＡ（アンカラ菌株）（Ｓｔｉｃｋｉ  Ｈ．およびＨｏｃｈｓｔｅｉｎ−Ｍｉｎｔｚｅｌ  Ｖ．著、Ｍｕｎｃｈ，Ｍｅｄ．Ｗｓｃｈｒ．，１９７１年，第１１３巻、１１４９〜１１５３頁；Ｓｕｔｔｅｒ  Ｇ．ら著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１９９２年、第８９巻、１０８４７〜１０８５１頁；市販菌株ＡＴＣＣ  ＶＲ−１５０８；ＭＶＡは、ニワトリ胚線維芽細胞上をアンカラワクシニアウイルスを５７０回継代させることにより得られる）またはＮＹＶＡＣ（その構造は米国特許５，４９４，８０７、特に実施例１〜６に記載されている；この特許は、この組換え体の挿入部位に非相同遺伝子を挿入することおよび、適当なプロモーターの使用も記載している；ＷＯ−Ａ−９６／４０２４１も参照されたい）を挙げることができる。
【００２３】
本発明の好ましい態様の一つによれば、ポックスウイルス発現ベクターは任意に弱化されるカナリア痘ウイルス、例えば、特にニワトリ胚線維芽（ＣＥＦ）細胞上での２００回を超える継代により弱化されたＡＬＶＡＣまたはカナリア痘ウイルス（例えば、Ｒｅｎｔｓｃｈｌｅｒ菌株のもの）である。ＡＬＶＡＣ菌株カナリア痘ウイルスは、１９９６年１１月１４日に受け入れ番号ＶＲ−２５４７でＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に登録された。カナリア痘ウイルスは、ＡＴＣＣにおいて照会番号ＶＲ−１１１で市販されている。弱化カナリア痘ウイルスは、米国特許５，７５６，１０３およびＷＯ−Ａ−０１／０５９３４に記載されている。
【００２４】
他の弱化ポックスウイルス、特に弱化禽痘ウイルス（例えば、ＴＲＯＶＡＣ）を用いることができる。ＴＲＯＶＡＣポックスウイルスに関しては、当業者は特許ＷＯ−Ａ−９６／４０２４１を参照することができる。多くの禽痘ワクチン菌株、例えば、Ｍｅｒｉａｌにより販売されているワクチンＤＩＦＴＯＳＥＣ  ＣＴ（登録商標）およびＩｎｔｅｒｖｅｔにより販売されているワクチンＮＯＢＩＬＩＳ（登録商標）が利用できる。
【００２５】
発現ベクターがワクシニアウイルスの弱化突然変異体である場合、発現すべきポリヌクレオチドの挿入部位は、特に、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、ヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子および、Ａ型封入体（ＡＴＩ）の領域である。ＭＶＡウイルス中への遺伝子の挿入が、複数の公報、例えば、Ｍ．Ｗ．Ｃａｒｒｏｌｌら著、Ｖａｃｃｉｎｅ  １９９７年，第１５（４）巻，３８７〜３９４頁；Ｋ．Ｊ．Ｓｔｉｔｔｅｌａａｒら著，Ｊ．Ｖｏｒｏｌ．２０００年，第７４（９）巻，４２３６〜４２４３頁；Ｇ．Ｓｕｔｔｅｒら著，Ｖａｃｃｉｎｅ  １９９４年，第１２（１１）巻，１０３２〜１０４０頁にも記載されており、当業者が参照することができる。ＭＶＡの完全ゲノムが、Ｇ．Ａｎｔｏｉｎｅ著，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９８年，第２４４巻，３６５〜３９６頁に記載されており、これにより他の挿入部位および他のプロモーターを見つけることができる。
【００２６】
カナリア痘ウイルスの場合、挿入部位は、特に、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）Ｃ３、Ｃ５およびＣ６に配置またはそれらにより形成される。禽痘ウイルスの場合、挿入部位は、特に、ＯＲＦ  Ｆ７およびＦ８に配置またはそれらにより形成される。
【００２７】
好ましくは、発現ベクターがポックスウイルスの場合、発現すべきポリヌクレオチドは、ポックスウイルス特異的プロモーター、特にワクシニア７．５ｋＤａプロモーター（Ｃｏｃｈｒａｎら著、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９８５年，第５４巻，３０〜３５頁）、ワクシニア１３Ｌプロモーター（Ｒｉｖｉｅｒｅら著、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９２年，第６６巻，３４２４〜３４３４頁）、ワクシニアＨＡプロモーター（Ｓｈｉｄａ著，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９８６年，第１５０巻，４５１〜４５７頁）、牛痘ウイルスＡＴＩプロモーター（Ｆｕｎａｈａｓｈｉら著，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．１９８８年，第６９巻，３５〜４７頁）またはワクシニアウイルスＨ６プロモーター（Ｔａｙｌｏｒ  Ｊ．ら著，Ｖａｃｃｉｎｅ，１９８８年，第６巻，５０４〜５０８頁；Ｇｕｏ  Ｐ．ら著，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９８９年，第６３巻，４１８９〜４１９８頁；Ｐｅｒｋｕｓ  Ｍ．ら著，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９８９年，第６３巻，３８２９〜３８３６頁）の制御下に挿入される。
【００２８】
発現ベクターがＦＨＶである場合、発現すべきポリヌクレオチドの挿入部位は、特に、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）ＯＲＦ２およびＯＲＦ５である（米国特許６，０７４，６４９）。
【００２９】
好ましくは、発現ベクターがヘルペスウイルスの場合、発現すべきポリヌクレオチドは、転写を調節する信号、特に、好ましくは挿入により提供されるプロモーター、例えば、サイトメガロウイルスまたはＣＭＶ−ＩＥ（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  Ｅａｒｌｙ）の初期プロモーター、特に、ヒト起源のもの（ｈＣＭＶ−ＩＥ）、ラット、モルモットまたは好ましくはネズミ起源のもの（ｍＣＭＶ  ＩＥ）、ウイルスＳＶ４０（Ｓｉｍｉａｎ  Ｖｉｒｕｓ  ４０）の初期および晩期プロモーター、糖タンパクの晩期プロモーター、特に、ｇＢ、ｇＣおよびｇＤのもの、αヘルペスウイルスのもの、特にネコヘルペスウイルス（ＦＨＶ）のもの、に依存して挿入される。
【００３０】
定義として、プラスミドは、意図するポリヌクレオチド、例えばＩＧＦ−１をコードするものを含む少なくとも一つの転写単位、およびその生体内発現に必要な要素を含む。環状、スーパーコイルまたはその他のプラスミド形状が好ましい。線状形状も、本発明の範囲に入る。
【００３１】
各プラスミドは、宿主細胞中での、その制御下に挿入されたポリヌクレオチドの発現を確保することができるプロモーターを含む。これは、通常、強真核生物プロモーターである。ヒトまたはネズミ起源の、または任意に、ラットまたはモルモットのようないかなる他の起源のサイトメガロウイルス極初期（ＣＭＶ−ＩＥ）プロモーターも、好ましい強真核生物プロモーターである。ＣＭＶ−ＩＥプロモーターは、エンハンサー成分と連結または連結しなくてよい実際のプロモーター成分を含むことができる。欧州特許２６０  １４８、欧州特許３２３  ５９７、米国特許５  １６８  ０６２、米国特許５  ３８５  ８３９、米国特許４  ９６８  ６１５およびＷＯ−Ａ−８７／０３９０５を参照することができる。ヒト（Ｂｏｓｈａｒｔ  Ｍ．ら著，Ｃｅｌｌ．，１９８５年，第４１巻，５２１〜５３０頁）またはネズミＣＭＶ−ＩＥが好ましい。
【００３２】
より一般的には、プロモーターは、ウイルス起源または細胞起源である。ＣＭＶ−ＩＥ以外の強ウイルスプロモーターとして、ウイルスＳＶ４０の初期プロモーターまたは晩期プロモーター、またはラウス肉腫ウイルスのＬＴＲプロモーターを挙げることができる。強細胞プロモーターとして、デスミンプロモーター（Ｋｗｉｓｓａ  Ｍ．ら著，Ｖａｃｃｉｎｅ，２０００年，第１８（２２）巻，２３３７〜２３４４頁）のような細胞骨格遺伝子プロモーターまたは、アクチンプロモーター（Ｍｉｙａｚａｋｉ  Ｊ．ら著，Ｇｅｎｅ，１９８９年，第７９（２）巻，２６９〜２７７頁）が挙げられる。
【００３３】
同じプラスミド中に複数の遺伝子が存在する場合、これらは、同じ転写単位中にまたは幾つかの異なる単位中に存在してよい。
【００３４】
同様に、適度のプロモーター活性を維持しているこれらのプロモーターのサブフラグメント：例えば、ＷＯ−Ａ−９８／００１６６による切形ＣＭＶ−ＩＥプロモーターも本発明に含まれる。従って、本発明のプロモーターの概念は、適度のプロモーター活性、好ましくは、それらが誘導される適当なプロモーターに本質的に類似の活性を維持している誘導体およびサブフラグメントを含む。ＣＭＶ−ＩＥに関しては、この概念は、適当なプロモーター部分および／またはエンハンサー部分および、誘導体およびサブフラグメントを含む。
【００３５】
発現ベクターは、イントロン型、例えば、ウサギβグロビン遺伝子のイントロンＩＩ（ｖａｎ  Ｏｏｙｅｎら著，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９７９年，第２０６巻，３３７〜３４４頁）の安定化配列、および／または、例えばヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター遺伝子（ｔＰＡ；Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙら著，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９７年，第４３巻；２８５〜２９２頁）の信号配列、および／または、例えばウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）（米国特許５，１２２，４５８）の遺伝子のまたはウサギβグロビン遺伝子のあるいはＳＶ４０ウイルスの遺伝子のポリアデニル化信号（ｐｏｌｙＡ）のような、他の転写調節要素も含むことができる。例えば、ＩＧＦ−１の信号配列は、もう一つの起源の信号配列により置き換えることができる。
【００３６】
本発明によれば、一または二以上のネコ免疫原、特にネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）およびネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）からの免疫原のようなネコレトロウイルス免疫原に対して導かれる細胞および／または粘膜免疫反応を特に高めるために、ネコＩＧＦ−１をワクチンアジュバントとして用いることができる。他の種からのＩＧＦ−１もこの目的で用いることができるが、ネコＩＧＦ−１が好ましい。
【００３７】
従って、本発明は、ネコ種の一員、特にネコにおけるネコ病因に対する免疫反応を誘発することを意図した組成物に関する。本発明の免疫原またはワクチン組成物は、ＩＧＦ−１タンパクまたはポリペプチド、好ましくは本発明によるネコＩＧＦ−１または、このタンパクまたはポリペプチドを生体内で発現する組換えベクター、少なくとも一つのネコ免疫原または、そのような免疫原を生体内で発現する組換えベクター、特に、少なくとも一つのＦＩＶおよび／またはＦｅＬＶ免疫原または、この免疫原を生体内で発現する組換えベクター、および獣医学的使用に許容される賦形剤またはビヒクルを含む。免疫原組成物の概念は、考えられる病因に対して導かれる免疫反応を誘発することができる任意の製剤を含み、一旦、ネコ種、特にネコに投与されると、この反応は、ＩＧＦ−１タンパクの存在により増加する。これは、好ましくは、この病因に対する効果的保護またはある程度の保護を誘発することができるワクチン組成物であり、この保護の程度は、ＩＧＦ−１タンパクまたはポリペプチド、特にネコＩＧＦ−１の生体内存在により増加する。
【００３８】
本発明で目標にされる免疫原およびワクチン組成物は、全ての既知のタイプ、すなわち、不活化組成物、弱化生組成物、サブユニットおよび組換えベクターを含む。すなわち、ここで特記しない限り、免疫原という用語は、不活化微生物、生弱化微生物、一または二以上の微生物サブユニット、またはこれらの組み合わせを含む。ベクターにより発現される免疫原という用語は、特に、宿主において病原物質に対する免疫反応を誘発することができるペプチド、ポリペプチドまたはタンパクを意味し、これは全タンパクまたは糖タンパクあるいは、それらの免疫学的に活性なフラグメントであり得る。
【００３９】
前述のように、ＩＧＦ−１タンパクまたはポリペプチドを、獣医学的使用に許容される賦形剤またはビヒクルの存在下に、そのまま、免疫原に添加して、直ぐに投与できる組成物を形成することができる。ＩＧＦ−１タンパクは、タンパクを少しずつ放出することを意図した遅放出系と組み合わせてもよい。免疫原組成物またはワクチンにおいて、ＩＧＦ−１タンパクまたはポリペプチドは、
ｉ．（ｆ）または（ｇ）で定義するポリペプチド、
ｉｉ．配列番号２上のアミノ酸４９〜１１８を含むまたは本質的になるポリペプチド、
ｉｉｉ．ポリペプチドｉまたはｉｉと７０％以上、特に７５、８０、８５、９０または９５％以上、さらには９８．５％以上、好ましくは９９％以上の同一性を有するポリペプチドであり得る。
【００４０】
ポリペプチドという用語は、同等物の例として、ＩＧＦ−１、例えば、成熟ネコＩＧＦ−１（本出願においてアミノ酸配列４９〜１５３またはそのフラグメント４９〜１１８として例示）のアジュバント力を実質的に維持するそのフラグメントを含む。
【００４１】
本発明の特別の特徴によれば、前述のような生体内発現ベクターまたは組換えベクターを用いて、ＩＧＦ−１タンパクを生体内で発現することができる。この場合、ＩＧＦ−１タンパクを発現しているものと同じまたは異なる型の組換えベクターにより発現されるネコ免疫原を有することも好ましい。少なくとも一つの免疫原およびＩＧＦ−１タンパクを含み発現している同じ生体内発現ベクターも用いることができる。この生体内発現ベクターは、
１  （ａ）〜（ｃ）に定義されるポリヌクレオチドおよびその同等物、
２  配列番号２と７０％以上、特に７５、８０、８５、９０または９５％以上、さらには９８．５％以上、好ましくは９９％以上の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
３  配列番号２上のアミノ酸４９〜１１８を含むまたは本質的になるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を含むことができる。
【００４２】
従って、本発明は、好ましくは、以下のものを含む免疫原組成物またはワクチンに関する：
ネコ類、特にネコにおいて機能的ＩＧＦ−１タンパクを発現させる条件下に好ましくはネコＩＧＦ−１をコードするポリヌクレオチドを含む生体内発現ベクター、
ＦＩＶおよび／またはＦｅＬＶ免疫原をコードする少なくとも一つのポリヌクレオチドを含む少なくとも一つの生体内発現ベクターであり、ＩＧＦ−１を発現するものであってもよい生体内発現ベクター、および
獣医学的使用に許容されるビヒクルまたは賦形剤。
【００４３】
サブユニットワクチンおよび組換えワクチンのためには、免疫原は好ましくは、ＦｅＬＶウイルスに関しては、エンベロープ（ｅｎｖ）糖タンパクまたはｇａｇ／ｐｏｌタンパクあるいはこれらのＦｅＬＶ免疫原の組み合わせであり、ＦＩＶに関しては、ｅｎｖ、ｇａｇ／ｐｒｏ、ｒｅｖまたはｔａｔタンパクあるいはこれらの組み合わせであり、好ましくは、任意にｒｅｖおよび／またはｔａｔと組み合わされるｅｎｖおよびｇａｇである。組換えワクチンに関しては、前記免疫原をコードするヌクレオチド配列が、その生体内発現のために必要な信号に依存して発現ベクター中に挿入される。
【００４４】
ワクチン接種のためにＩＧＦ−１を用いる利点は、特に、細胞および粘膜反応の増加、および用いられる免疫原または組換えベクター投与量の低下である。さらに、従来のワクチンの投与後に反応しない特定の動物において、従来のワクチンと組み合わせてＩＧＦ−１を用いることは、免疫反応を刺激し、保護水準まで上昇させる。
【００４５】
本発明の有利な特徴は、ＩＧＦ−１の作用期間を増加させる、ＩＧＦ−１の生体内発現のためのベクターの使用である。免疫原の形状が何であっても、ＩＧＦ−１用の生体内発現ベクターを用いることが好ましい。
【００４６】
特別の特徴によれば、本発明は、好ましくはネコＩＧＦ−１または本発明のポリペプチドをコードおよび発現するプラスミド、および少なくとも一つのネコ免疫原をコードおよび発現する少なくとも一つのさらなるプラスミドを含む組成物を包含する。
【００４７】
本発明で有用なネコ免疫原を含むプラスミド構造体の例がＷＯ−Ａ−９８／０３６６０に記載されている。態様として、本発明は、ＷＯ−Ａ−９８／０３６６０に開示のようなプラスミド、特にＷＯ−Ａ−９８／０３６６０の実施例７〜９（ＦｅＬＶ免疫原ｅｎｖ、ｇａｇ／ｐｏｌを発現）および１７〜１８（ＦＩＶ免疫原ｅｎｖ、ｇａｇ／ｐｒｏを発現）に記載のプラスミドの使用を提供する。例えば、本発明は、好ましくはネコＩＧＦ−１またはポリペプチドを発現するプラスミドとＷＯ−Ａ−９８／０３６６０に開示のような一種または二種以上のプラスミドとの組み合わせを提供する。本発明は、好ましくは本発明のネコＩＧＦ−１またはポリペプチドを同時にコードおよび発現するプラスミドと、少なくとも一種のＦｅＬＶまたはＦＩＶ免疫原とを含む組成物も包含する。すなわち、本発明は、本発明のポリヌクレオチドがさらに挿入されている、ＷＯ−Ａ−９８／０３６６０のこれらの実施例に開示のようなプラスミドを用いることができる。
【００４８】
本発明は、ＦＩＶおよびＦｅＬＶ以外のネコ病因に対する免疫にも適用される。他の病因として、特に、ネコ汎白血球減少症ウイルス（ＦＰＶ）、ネコ感染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）、ネコヘルペスウイルス（ＦＨＶ）、ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）、狂犬病ウイルスおよびクラミジアを挙げることができる。前述のように、ワクチンは弱化ワクチン、不活化ワクチン、サブユニットワクチンまたは組換えワクチンであってよい。サブユニットワクチンおよび組換えワクチンの場合、ネコ免疫原は、好ましくは、ＦＰＶ用のカプシドタンパクＶＰ２、ＦＩＰＶ用の糖タンパクＳ、Ｍ、Ｎおよびそれらの組み合わせ、ＦＨＶ用の糖タンパクｇＢ、ｇＣ、ｇＤおよびそれらの組み合わせ、ＦＣＶ用のカプシドタンパク  C、および狂犬病ウイルス用の糖タンパク  Gから選択される。
【００４９】
例えば、ＷＯ−Ａ−９８／０３６６０に記載のプラスミド（実施例１０のＦＰＶ  ＶＰ２遺伝子、実施例１１〜１３のＦＩＰＶ  Ｓ、Ｍ、Ｎ、実施例１４〜１５のＦＨＶ  ｇＢ、ｇＤ遺伝子、実施例１６のＦＣＶ  Ｃ遺伝子、実施例１９の狂犬病Ｇ遺伝子）およびＷＯ−Ａ−００／７７０４３に記載のプラスミド（実施例５のＦＨＶ  ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ遺伝子）を用いることができる。すなわち、本発明は、そのようなプラスミドと、好ましくはネコＩＧＦ−１タンパクまたはポリペプチドをコードするプラスミドとを組み合わせる組成物を包含する。本発明は、また、好ましくは本発明のネコＩＧＦ−１タンパクまたはポリペプチドを同時にコードし発現するプラスミドと、少なくとも一種のネコ免疫原とを含む組成物も包含する。すなわち、本発明は、本発明のポリヌクレオチドがさらに挿入されている、ＷＯ−Ａ−９８／０３６６０およびＷＯ−Ａ−００／７７０４３のこれら実施例に開示のようなプラスミドを用いることができる。プラスミドおよびウイルスベクター、例えば、ポックスウイルスの前記記載が、これら他のネコ病因にも適用される。
【００５０】
本発明の他の態様として、ＷＯ−Ａ−９８／０３６６０およびＷＯ−Ａ−００／７７０４３に例示のプラスミドを、タンパク状態で本発明のＩＧＦ−１またはポリペプチドと組み合わせることもできる。
【００５１】
本発明は、免疫原またはワクチン製剤が、これらの病因の二種またはそれ以上からの免疫原、特に、これらの病因の一種またはそれ以上からの免疫原、およびＦＩＶおよび／またはＦｅＬＶからの免疫原を含む、組成物も包含する。
【００５２】
本発明の組成物は、考えられるワクチン用のネコワクチンにおいて従来用いられているものから特に選択される一種または二種以上のさらなる免疫アジュバントも含むことができる。すなわち、従来の組成物（不活化ワクチン、弱化生ワクチン、サブユニットワクチン）は、従来のアジュバントとして、カルボマー型の化合物、水酸化アルミニウムを含む、または水中油または水中油中水エマルジョンとして調製することができる。ウイルス発現ベクターに基づく組成物の場合、カルボマー型の化合物および水中油または水中油中水エマルジョンを挙げることができる。
【００５３】
プラスミド組成物は、四級アンモニウム塩を含むカチオン性脂質を用いて有利に調製することができる。これらの脂質は、好ましくは、以下の式に相当するものである：
【化１】
2005516587.tif 000002
【００５４】
（式中、Ｒ1は１２〜１８個の炭素原子を含む飽和または不飽和線状脂肪族基であり、Ｒ2は２または３個の炭素原子を含むさらなる脂肪族基であり、Ｘはヒドロキシまたはアミノ基である。）
好ましいカチオン性脂質は、ＤＭＲＩＥ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（テトラデシロキシ）−１−プロパンアンモニウム；ＷＯ−Ａ−９６／３４１０９）を含み、好ましくは中性脂質、好ましくはＤＯＰＥ（ジオレオイル−ホスファチジル−エタノールアミン；Ｂｅｈｒ  Ｊ．Ｐ．著，１９９４年，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第５巻，３８２〜３８９頁）と組み合わされてＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥを形成するものを含む。
【００５５】
好ましくは、プラスミドとこのアジュバントとの混合物は即時に形成され、このように形成される混合物に、その投与前に、複合体を得る時間、例えば、１０〜６０分間、特に約３０分間を与えることが好ましい。
【００５６】
ＤＯＰＥが存在する場合、ＤＭＲＩＥ：ＤＯＰＥのモル比は好ましくは９５：５〜５：９５、特に１：１である。
【００５７】
プラスミド：アジュバントＤＭＲＩＥまたはＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥの重量比は、特に５０：１〜１：１０、特に１０：１〜１：５、好ましくは１：１〜１：２の範囲で変化し得る。
【００５８】
本発明は、特にネコレトロウイルスＦＩＶおよびＦｅＬＶに対して、ネコ種、特にネコを免疫するおよびワクチン接種する方法にも関する。
【００５９】
これらの方法は、本発明の免疫組成物またはワクチンの有効量を投与することを含む。この投与は、特に非経口的に、例えば、皮下、皮内または筋肉内投与により、または口腔および／または鼻腔経路で行うことができる。
【００６０】
これらの方法は、特に、関連免疫原、特にＦＩＶおよび／またはＦｅＬＶへの細胞および／または粘膜免疫反応を増加させることを意図することができる。
【００６１】
本発明は、非特異的免疫刺激組成物、換言すれば、一般的免疫刺激剤として用いられる本発明のＩＧＦ−１タンパクまたはポリペプチドに基づく組成物にも関する。本発明は、また、この組成物を投与することを含んでなる免疫を刺激する方法にも関する。これらの組成物は、特にネコ種、好ましくはネコの免疫を補強するために、一般的にはワクチンと独立して、前記病因の存在または不存在下に投与される。これらの組成物は、好ましくは、生体内で本発明のＩＧＦ−１タンパクまたはポリペプチドを発現するウイルスまたはプラスミド組換えベクター、および獣医学的使用に許容される賦形剤またはビヒクルを含み、これらの組成物は、生体内でＩＧＦ−１２を長期間生成させる。ベクター、ポリペプチドおよびポリペプチドの特徴は前述の通りである。これらの組成物は、前述のような一種または二種以上のアジュバントも含むことができる。
【００６２】
種々の組成物およびワクチンは、無針液体ジェットインジェクターを用いて射出することができる。
【００６３】
本発明の免疫原組成物およびワクチンは、有効量のプラスミドまたはウイルスベクターを含み、当業者は、これらの量を決めることができる。出願人は以下のことを薦める：
プラスミドに基づく免疫原組成物またはワクチンの場合、投与量は約１μｇ〜約２０００μｇ、特に約５０μｇ〜約１０００μｇである。投与体積は０．１〜２ｍｌ、好ましくは０．２〜１ｍｌであり、
ウイルスベクター、例えば、ポックスウイルスに基づく免疫原組成物またはワクチンの場合、投与量は約１０3ｐｆｕ〜約１０9ｐｆｕである。ベクターがカナリア痘ウイルスの場合、投与量は特に約１０5ｐｆｕ〜約１０9ｐｆｕ、好ましくは約１０6ｐｆｕ〜約１０8ｐｆｕである。ベクターがネコヘルペスウイルスの場合、投与量は特に約１０2ＣＣＩＤ50〜約１０7ＣＣＩＤ50である。ウイルスベクターに基づく免疫原組成物およびネコワクチンの投与体積は、通常、０．１〜２．０ｍｌ、好ましくは０．２〜１．０ｍｌである。
【００６４】
ＩＧＦ−１タンパクまたはポリペプチドをタンパク状態にする場合、投与量は２０〜２０００μｇ、好ましくは１００〜５００μｇであり得る。
【００６５】
本発明は、さらに、以下の説明的であり非限定的例により説明する。
（実施例）
全てのプラスミド構造体は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．らにより記載（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，ニューヨークＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ在、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ刊，１９８９年）された標準的分子生物学的技術（制限酵素による消化、一本鎖相補的ＤＮＡの合成、ポリメラーゼ連鎖反応、ポリメラーゼＤＮＡによるオリゴヌクレオチドの延長、等）を用いて生成された。本発明に用いられる全ての制限フラグメントおよび種々のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）フラグメントを、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ（登録商標）キット（カリフォルニア州ラ・ホーヤ在、ＢＩＯ１０１  Ｉｎｃ．製）を用いて単離および精製した。
（実施例１：ネコリンパ球からの全ＲＮＡの調製）
頸静脈から採血することによりヘパリン添加試験管に少量のネコ血液を収集した。刺激不存在下で、フィコール比重遠心法により単核細胞を収集した。懸濁液１００ｍｌに含まれているこれらの細胞の全ＲＮＡを、高純度ＲＮＡ単離キット（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｃａｔ＃  １  ８２８  ６６５）を用いて、抽出段階用の供給者の指示に従って、抽出した。抽出の最後に得られたＲＮＡ沈殿を、ＲＮａｓｅを用いることなく、滅菌蒸留水１〜２ｍｌで再懸濁させた。
（実施例２：ネコＩＧＦ−１をコードする遺伝子の単離）
Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｃａｔ＃  Ｎ  ８０８  ００１７，米国コネチカット州０６８５９ノーウォーク在、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を用いて供給者に提供された条件下に、ネコＩＧＦ−１の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成した。
【００６６】
ネコＲＮＡ懸濁液（実施例１）５０μｌ、ポリメラーゼＰｆｕ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製、Ｃａｔ＃  ６００１５４）および以下のオリゴヌクレオチドを用いて逆転写反応およびそれに続くポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行う。
【００６７】
ＥＬ４９０（３９量体）（配列番号４）
2005516587.tif 000003
【００６８】
およびＦＣ１２４（４２量体）（配列番号５）
2005516587.tif 000004
【００６９】
このオリゴヌクレオチド対により、Ｓａｌｌ制限部位、ＢａｍＨＩ制限部位、挿入部の５’におけるＡＴＧ開始コドン、および挿入部の３’における停止コドンを取り込むことができる。
【００７０】
第１のｃＤＮＡストランドの合成は、ＲＮＡマトリクスとハイブリッドした後にキットの六量体を延長することにより行われた。
【００７１】
第１のｃＤＮＡストランドの合成条件は、４２℃の温度で２０分間、次に、９９℃で５分間、および最後に４℃で５分間である。オリゴヌクレオチド対ＥＬ４９０およびＦＣ１２４の存在下におけるＰＣＲ反応の条件は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（米国オハイオ州クリーブランド在、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ製、Ｃａｔ＃  １８０３８−２６）の存在下に９５℃で２分間、次に４０サイクル（９５℃で３０秒、次に５５℃で４５秒、および７２℃で１分間）および、最後に７２℃で１０分間であり、これにより４８１塩基対（ｂｐ）のフラグメントが生成される。
【００７２】
次に、このフラグメントをプラスミドｐＣＲ２（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ製Ｔｏｐｏ  ＴＡクローニングキット，Ｃａｔ＃  Ｋ４５５０−４０）に挿入する。このように得られたプラスミドは寸法が４４３２ｂｐであり、ｐＢＰ４７６と表される。
【００７３】
全てのこれらの操作を２回以上繰り返して、プラスミドｐＢＰ４７６の３つの「集団」を得る。次に、これらのプラスミドの挿入部分を配列する。プラスミドｐＢＰ４７６のこれらの３つの「集団」に基づいて達成されたコンセンサス配列（配列番号１）は寸法が４６２ｂｐであり、１５３アミノ酸のタンパク（配列番号２）をコードする。このタンパクはネコＩＧＦ−１因子（ネコＩＧＦ−１）である。
（実施例３：プラスミドｐＢＰ４７７の構築）
プラスミドｐＢＰ４７６（実施例２）をＢａｍＨＩおよびＳａｌｌにより消化し、このように得られた４６８ｂｐのＢａｍＨＩ−Ｓａｌｌフラグメントを、ＢａｍＨＩおよびＳａｌｌにより予め消化していたプラスミドｐＶＲ１０１２（ＷＯ−Ａ−９８／０３１９９の図１および実施例７；Ｈａｒｔｉｋｋａ  Ｊ．ら著，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１９９６年，第７巻，１２０５〜１２１７頁）と接合して、プラスミドｐＢＰ４７７（５３３４ｂｐ）を得た。このプラスミドは、ヒトサイトメガロウイルスの初期プロモーターすなわちｈＣＭＶ−ＩＥ（ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  Ｅａｒｌｙ）の制御下に、ネコＩＧＦ−１をコードする挿入部を含む。
（実施例４：ネコＩＧＦ−１遺伝子の生成物の試験管内生物学的活性）
ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ハムスター卵巣細胞、受け入れ番号ＣＣＬ−６１でＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから得られる）を、直径６０ｍｍのペトリ皿中の最少必須培地またはＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）中で培養し、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ  ＰＬＵＳ（登録商標）（Ｃａｔ＃  １０９６４−０１３，米国オハイオ州クリーブランド在、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ製）１０μｌと予め複合されたプラスミドｐＢＰ４７７（実施例３）５μｇを形質移入する。複合体ＤＮＡ／ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ（登録商標）の形成および細胞の形質移入の条件は、供給者（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）により薦められる条件である。形質移入の４８時間後、培地の上澄みを集め凍結する。
【００７４】
少量のＣＲＦＫ細胞を、０．１％のＢＳＡおよび１％の胎児ウシ血清を加えたＭＥＭ培地中、ウエル当たり１０００００細胞の割合で９６のウエルを含むプレートにおいて培養し、２４時間後、培養培地を除去し、次に、プラスミドｐＢＰ４７７を形質移入したＣＨＯ−Ｋ１細胞の希釈または非希釈培養上澄みを、培地に加えた。各希釈度の上澄み（１／１、１／５、１／１０および１／１００）をＭＥＭ培地中で３回試験した。陰性対照は、ＣＨＯ−Ｋ１培養上澄みからなり血清を含まず、ｐＢＰ４７７が形質移入されていない。培養２４時間後、培養の最後の８時間はトリチウム化チミジンの存在下に３７℃でインキュベートする（最終的トリチウム化チミジン濃度：２．５μＣｉ／ｍｌ）。培養プレートを、−２０℃で貯蔵する。ＭｉｃｒｏＢｅｔａ  ｔｒｉｌｕｘカウンター（Ｗａｌｌａｃ）を用いて読み取ることにより放射能を測定する。
【００７５】
プラスミドｐＢＰ４７７を形質移入したＣＨＯ−Ｋ１細胞の上澄みは、以下の結果を与えた。
【００７６】
【表１】
2005516587.tif 000005
各四件の結果を、百分率で表されるサンプルと陰性対照との平均放射能値の比に相当する増殖指数により示す。
【００７７】
これらの結果は、プラスミドｐＢＰ４７７により発現されるネコＩＧＦ−１遺伝子の生成物が、試験管内細胞に生物学的活性を有することを示している。
【実施例１】
【００７８】
ＦＩＶウイルスの培養
Ｖｉｌｌｅｆｒａｎｃｈｅ  ＩＦＦＡ  １／８８菌株（Ｓｔｅｆｆａｎ  Ａ．Ｍ．ら著，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏ．，１９９４年，第７５巻，３６４７〜３６５３頁）またはＰｅｔａｌｕｍａ菌株のネコ免疫不全ウイルスを、補助ネコＴリンパ細胞（例えばＱ２０１；Ｗｉｌｌｅｔ  Ｂら著，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９７年，第７８巻，６１１〜６１８頁）上で、その増幅のために培養する。
【００７９】
グルタミン２ｍM、子ウシ血清１０％、ペニシリン１００Ｕｌ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌおよび組換えヒト２−インターロイキン１００Ｕｌ／ｍｌが加えられた、１ｍｌ当たり約１０００００個の細胞を含むイーグル−ＭＥＭ培地を有するＦａｌｃｏｎ  ２５ｃｍ2においてＱ２０１細胞を培養する。細胞を＋３７℃で培養する。
【００８０】
３日後、細胞層は集密的である。次に、培養培地を置換し、５ｐｆｕ／細胞の割合でＦＩＶウイルスを添加する。
【００８１】
細胞変性効果（ＣＰＥ）が完了（培養開始後、約４８〜７２時間）すると、ウイルス懸濁液を集め、次に、遠心分離により清澄化し、−８０℃で凍結する。ウイルスバッチの生成に、通常、３〜４連続継代が必要である。ウイルスバッチを−８０℃で貯蔵する。
（実施例６：ＦＩＶからのウイルスＲＮＡの抽出）
ＦＩＶ  Ｖｉｌｌｅｆｒａｎｃｈｅ菌株のウイルス懸濁液１００ｍｌ中に含まれるウイルスＲＮＡを、抽出段階についての供給者の指示に従って、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ（商標）  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ（Ｃａｔ＃  ８５８８８２、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ製）からの溶液で融解後に、抽出した。抽出の最後に得られたＲＮＡ沈殿を、ＲＮａｓｅを用いることなく、滅菌蒸留水１〜２ｍｌで再懸濁する。
（実施例７：プラスミドｐＢＰ３７１の構築）
ＦＩＶの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｃａｔ＃  Ｎ  ８０８  ００１７、米国コネチカット州０６８５９ノーウォーク在、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を用いて、供給者に提供された条件下に合成する。
【００８２】
ＦＩＶのウイルスＲＮＡ懸濁液（実施例６）５０μｌおよび以下のオリゴヌクレオチドを用いて逆転写反応およびそれに続くポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行う。
【００８３】
ＦＣ１１６（３６量体）（配列番号６）
2005516587.tif 000006
【００８４】
およびＦＣ１１７（３６量体）（配列番号７）
2005516587.tif 000007
【００８５】
このオリゴヌクレオチド対により、Ｐｓｔｌ制限部位、Ｘｈｏｌ制限部位、および挿入部の５’におけるＡＴＧ開始コドンを取り込むことができる。
【００８６】
第１のｃＤＮＡストランドの合成は、ＲＮＡマトリクスとハイブリッドした後にオリゴヌクレオチドＦＣ１１７を延長することにより行われた。
【００８７】
第１のｃＤＮＡストランドの合成条件は、４２℃の温度で１５分間、次に、９９℃で５分間、および最後に４℃で５分間である。オリゴヌクレオチド対ＦＣ１１６およびＦＣ１１７の存在下におけるＰＣＲ反応の条件は、９５℃で２分間、次に４０サイクル（９５℃で３０秒、次に５０℃で４５秒、および７２℃で３分間）および、最後に７２℃で７分間であり、これにより１４７６ｂｐのフラグメントが生成される。
【００８８】
このフラグメントを、アガロースゲル中で電気泳動後に、Ｐｓｔｌ制限酵素で、次に、Ｘｈｏｌ制限酵素で消化して、約１４５０ｂｐのＰｓｔｌ−Ｘｈｏｌフラグメントを単離する。このフラグメントをフラグメントＡと呼ぶ。
【００８９】
ＦＩＶのウイルスＲＮＡ懸濁液（実施例６）５０μｌおよび以下のオリゴヌクレオチドを用いて第２の逆転写反応およびそれに続くポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行う。
【００９０】
ＦＣ１１８（３６量体）（配列番号８）
2005516587.tif 000008
【００９１】
およびＦＣ１１９（５４量体）（配列番号９
2005516587.tif 000009
【００９２】
このオリゴヌクレオチド対により、Ｘｈｏｌ制限部位、ＢａｍＨｌ制限部位、および挿入部の３’における停止コドンを取り込むことができる。
【００９３】
第１のｃＤＮＡストランドの合成は、ＲＮＡマトリクスとハイブリッドした後にオリゴヌクレオチドＦＣ１１８を延長することにより行われた。
【００９４】
第１のｃＤＮＡストランドの合成条件は、４２℃の温度で１５分間、次に、９９℃で５分間、および最後に４℃で５分間である。オリゴヌクレオチド対ＦＣ１１８およびＦＣ１１９の存在下におけるＰＣＲ反応の条件は、９５℃で２分間、次に４０サイクル（９５℃で１３０秒、次に５０℃で４５秒、および７２℃で３分間）および、最後に７２℃で７分間であり、これにより１１９３ｂｐのフラグメントが生成される。
【００９５】
このフラグメントを、アガロースゲル中で電気泳動後に、Ｘｈｏｌ制限酵素で、次に、ＢａｍＨｌ制限酵素で消化して、約１１７０ｂｐのＸｈｏｌ−ＢａｍＨｌフラグメントを単離する。このフラグメントをフラグメントＢと呼ぶ。
【００９６】
フラグメントＡおよびＢを、ＸｂａｌおよびＥｃｏＲｌで予め消化した真核生物発現プラスミドｐＶＲ１０１２と接合して、プラスミドｐＢＰ３７１（７４６７ｂｐ）を得る。このプラスミドは、ヒトサイトメガロウイルスの初期プロモーターすなわちｈＣＭＶ−ＩＥ（ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  Ｅａｒｌｙ）の制御下に、ＦＩＶのｅｎｖタンパクをコードする挿入部を含む。
（実施例８：プラスミドｐＢＰ３７４の構築）
ＦＩＶの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｃａｔ＃  Ｎ  ８０８  ００１７、米国コネチカット州０６８５９ノーウォーク在、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を用いて、供給者に提供された条件下に合成する。
【００９７】
ＦＩＶのウイルスＲＮＡ懸濁液（実施例６）５０μｌおよび以下のオリゴヌクレオチドを用いて逆転写反応およびそれに続くポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行う。
【００９８】
ＢＰ６７０（３７量体）（配列番号１０）
2005516587.tif 000010
【００９９】
およびＢＰ６７４（４０量体）（配列番号１１）
2005516587.tif 000011
【０１００】
このオリゴヌクレオチド対により、Ｓａｌｌ制限部位、Ｎｏｔｌ制限部位、挿入部の５’におけるＡＴＧ開始コドンおよび３’における停止コドンを取り込むことができる。
【０１０１】
第１のｃＤＮＡストランドの合成は、ＲＮＡマトリクスとハイブリッドした後にオリゴヌクレオチドＢＰ６７４を延長することにより行われた。
【０１０２】
第１のｃＤＮＡストランドの合成条件は、４２℃の温度で１５分間、次に、９９℃で５分間、および最後に４℃で５分間である。オリゴヌクレオチド対ＢＰ６７０およびＢＰ６７４の存在下におけるＰＣＲ反応の条件は、９５℃で２分間、次に４０サイクル（９５℃で３０秒、次に５０℃で４５秒、および７２℃で３分間）および、最後に７２℃で７分間であり、これにより１７５８ｂｐのフラグメントが生成される。
【０１０３】
このフラグメントを、アガロースゲル中で電気泳動後に、Ｓａｌｌ制限酵素で、次に、Ｎｏｔｌ制限酵素で消化して、約１７５０ｂｐのＳａｌｌ−Ｎｏｔｌフラグメントを単離する。このフラグメントを、ＳａｌｌおよびＮｏｔｌで予め消化した発現プラスミドｐＶＲ１０１２と接合してプラスミドｐＢＰ３７４（６６３３ｂｐ）を得る。このプラスミドは、初期プロモーターｈＣＭＶ−ＩＥの制御下に、ＦＩＶのｇａｇ／ｐｒｏタンパクをコードする挿入部を含む。
（実施例９：プラスミドｐＢＰ３７５の構築）
ＦＩＶの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｃａｔ＃  Ｎ  ８０８  ００１７、米国コネチカット州０６８５９ノーウォーク在、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を用いて、供給者に提供された条件下に合成する。
【０１０４】
ＦＩＶのウイルスＲＮＡ懸濁液（実施例６）５０μｌおよび以下のオリゴヌクレオチドを用いて逆転写反応およびそれに続くポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行う。
【０１０５】
ＦＣ１１６（３６量体）（配列番号６）
2005516587.tif 000012
【０１０６】
およびＦＣ１２０（４８量体）（配列番号１２）
2005516587.tif 000013
【０１０７】
このオリゴヌクレオチド対により、Ｐｓｔｌ制限部位、ＢｓｐＭＩ制限部位、および挿入部の５’におけるＡＴＧ開始コドンを取り込むことができる。
【０１０８】
第１のｃＤＮＡストランドの合成は、ＲＮＡマトリクスとハイブリッドした後にオリゴヌクレオチドＦＣ１２０を延長することにより行われた。
【０１０９】
第１のｃＤＮＡストランドの合成条件は、４２℃の温度で１５分間、次に、９９℃で５分間、および最後に４℃で５分間である。オリゴヌクレオチド対ＦＣ１１６およびＦＣ１２０の存在下におけるＰＣＲ反応の条件は、９５℃で２分間、次に４０サイクル（９５℃で３０秒、次に５０℃で４５秒、および７２℃で３分間）および、最後に７２℃で７分間であり、これにより２６５ｂｐのフラグメントが生成される。
【０１１０】
このフラグメントを、アガロースゲル中で電気泳動後に、制限酵素Ｐｓｔｌで、次に、制限酵素ＢｓｐＭｌで消化して、約２４０ｂｐのＰｓｔｌ−ＢｓｐＭｌフラグメントを単離する。このフラグメントを、フラグメントＣと呼ぶ。
【０１１１】
ＦＩＶのウイルスＲＮＡ懸濁液（実施例６）５０μｌおよび以下のオリゴヌクレオチドを用いて第２の逆転写反応およびそれに続くポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行う。
【０１１２】
ＢＰ６７２（４８量体）（配列番号１３）
2005516587.tif 000014
【０１１３】
およびＢＰ６７３（３６量体）（配列番号１４）
2005516587.tif 000015
【０１１４】
このオリゴヌクレオチド対により、制限部位ＢｓｐＭｌ、制限部位Ｂｇｌｌｌ、および挿入部の３’における停止コドンを取り込むことができる。
【０１１５】
第１のｃＤＮＡストランドの合成は、ＲＮＡマトリクスとハイブリッドした後にオリゴヌクレオチドＢＰ６７３を延長することにより行われた。
【０１１６】
第１のｃＤＮＡストランドの合成条件は、４２℃の温度で１５分間、次に、９９℃で５分間、および最後に４℃で５分間である。オリゴヌクレオチド対ＢＰ６７２およびＢＰ６７３の存在下におけるＰＣＲ反応の条件は、９５℃で２分間、次に４０サイクル（９５℃で３０秒、次に５０℃で４５秒、および７２℃で３分間）および、最後に７２℃で７分間であり、これにより２４６ｂｐのフラグメントが生成される。
【０１１７】
このフラグメントを、アガロースゲル中で電気泳動後に、制限酵素ＢｓｐＭｌで、次に、制限酵素Ｂｇｌｌｌで消化して、約２３０ｂｐのＢｓｐＭｌ−Ｂｇｌｌｌフラグメントを単離する。このフラグメントをフラグメントＤと呼ぶ。
【０１１８】
フラグメントＣおよびＤを、制限酵素ＰｓｔｌおよびＢｇｌｌｌで予め消化した発現プラスミドｐＶＲ１０１２と接合して、プラスミドｐＢＰ３７５（５３１６ｂｐ）を得る。このプラスミドは、初期プロモーターｈＣＭＶ−ＩＥの制御下に、ＦＩＶのｒｅｖタンパクをコードする挿入部を含む。
（実施例１０：プラスミドｐＢＰ３８３の構築）
ＦＩＶの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｃａｔ＃  Ｎ  ８０８  ００１７、米国コネチカット州０６８５９ノーウォーク在、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を用いて、供給者に提供された条件下に合成する。
【０１１９】
ＦＩＶのウイルスＲＮＡ懸濁液（実施例６）５０μｌおよび以下のオリゴヌクレオチドを用いて逆転写反応およびそれに続くポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行う。
【０１２０】
ＢＰ６８０（２９量体）（配列番号１５）
2005516587.tif 000016
【０１２１】
およびＢＰ６８１（３２量体）（配列番号１６）
2005516587.tif 000017
【０１２２】
このオリゴヌクレオチド対により、Ｂｇｌｌｌ制限部位、Ｐｓｔｌ制限部位、および挿入部の５’におけるＡＴＧ開始コドンおよび３’における停止コドンを取り込むことができる。
【０１２３】
第１のｃＤＮＡストランドの合成は、ＲＮＡマトリクスとハイブリッドした後にオリゴヌクレオチドＢＰ６８１を延長することにより行われた。
【０１２４】
第１のｃＤＮＡストランドの合成条件は、４２℃の温度で１５分間、次に、９９℃で５分間、および最後に４℃で５分間である。オリゴヌクレオチド対ＢＰ６８０およびＢＰ６８１の存在下におけるＰＣＲ反応の条件は、９５℃で２分間、次に４０サイクル（９５℃で３０秒、次に５０℃で４５秒、および７２℃で１分間）および、最後に７２℃で７分間であり、これにより２５４ｂｐのフラグメントが生成される。
【０１２５】
このフラグメントを、アガロースゲル中で電気泳動後に、Ｐｓｔｌ制限酵素で、次に、Ｂｇｌｌｌ制限酵素で消化して、約２４０ｂｐのＰｓｔｌ−Ｂｇｌｌｌフラグメントを単離する。このフラグメントを、ＰｓｔｌおよびＢｇｌｌｌで予め消化した発現プラスミドｐＶＲ１０１２と接合して、プラスミドｐＢＰ３８３（５０８９ｂｐ）を得る。このプラスミドは、初期プロモーターｈＣＭＶ−ＩＥの制御下に、ＦＩＶのｔａｔタンパクをコードする挿入部を含む。
（実施例１１：ＦｅＬＶからのウイルスＲＮＡの抽出）
Ａ型ＦｅＬＶウイルス（Ｇｌａｓｇｏｗ−１菌株）（Ｓｔｅｗａｒｄ  Ｍ．ら著，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９８６年，第５８巻，８２５〜８３４頁）を、当業者に良く知られた技術により精製した。次に、各ウイルスのゲノムウイルスＲＮＡを、Ｐ．ＣｈｏｍｏｚｙｎｓｋｉおよびＮ．Ｓａｃｃｈｉにより記載されたチオシアン酸グアニジウム／フェノールクロロホルム抽出技術（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８７年，第１６２巻，１５６〜１５９頁）を用いて単離した。
（実施例１２：プラスミドｐＢＰ１７９の構築）
ＦｅＬＶの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｃａｔ＃  Ｎ  ８０８  ００１７、米国コネチカット州０６８５９ノーウォーク在、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を用いて、供給者に提供された条件下に合成する。
【０１２６】
ＦｅＬＶのウイルスＲＮＡ懸濁液（実施例１１）５０μｌおよび以下のオリゴヌクレオチドを用いて逆転写反応およびそれに続くポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行う。
【０１２７】
ＢＰ２４７（２９量体）（配列番号１７）
2005516587.tif 000018
【０１２８】
およびＢＰ２４９（２８量体）（配列番号１８）
2005516587.tif 000019
【０１２９】
このオリゴヌクレオチド対により、Ｓａｌｌ制限部位、ＢａｍＨｌ制限部位、および挿入部の５’におけるＡＴＧ開始コドンおよび３’における停止コドンを取り込むことができる。
【０１３０】
第１のｃＤＮＡストランドの合成は、ＲＮＡマトリクスとハイブリッドした後にオリゴヌクレオチドＢＰ２４９を延長することにより行われた。
【０１３１】
第１のｃＤＮＡストランドの合成条件は、４２℃の温度で１５分間、次に、９９℃で５分間、および最後に４℃で５分間である。オリゴヌクレオチド対ＢＰ２４７およびＢＰ２４９の存在下におけるＰＣＲ反応の条件は、９５℃で２分間、次に４０サイクル（９５℃で３０秒、次に５０℃で４５秒、および７２℃で１分間）および、最後に７２℃で７分間であり、これにより１９４７ｂｐのフラグメントが生成される。
【０１３２】
このフラグメントを、アガロースゲル中で電気泳動後に、Ｓａｌｌ制限酵素で、次に、ＢａｍＨｌ制限酵素で消化して、約１９３５ｂｐのＳａｌｌ−ＢａｍＨｌフラグメントを単離する。このフラグメントを、ＳａｌｌおよびＢａｍＨｌで予め消化した発現プラスミドｐＶＲ１０１２と接合して、プラスミドｐＢＰ１７９（６８０４ｂｐ）を得る。このプラスミドは、初期プロモーターｈＣＭＶ−ＩＥの制御下に、ＦｅＬＶ−Ａのｅｎｖタンパクをコードする挿入部を含む。
（実施例１３：プラスミドｐＢＰ１８１の構築）
ＦｅＬＶの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｃａｔ＃  Ｎ  ８０８  ００１７、米国コネチカット州０６８５９ノーウォーク在、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を用いて、供給者に提供された条件下に合成する。
【０１３３】
ＦｅＬＶのウイルスＲＮＡ懸濁液（実施例１１）５０μｌおよび以下のオリゴヌクレオチドを用いて逆転写反応およびそれに続くポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行う。
【０１３４】
ＢＰ２８３（３３量体）（配列番号１９）
2005516587.tif 000020
【０１３５】
およびＢＰ２８４（４０量体）（配列番号２０）
2005516587.tif 000021
【０１３６】
このオリゴヌクレオチド対により、Ｓａｌｌ制限部位、ＢａｍＨｌ制限部位、および挿入部の５’におけるＡＴＧ開始コドンおよび３’における停止コドンを取り込むことができる。
【０１３７】
第１のｃＤＮＡストランドの合成は、ＲＮＡマトリクスとハイブリッドした後にオリゴヌクレオチドＢＰ２８４を延長することにより行われた。
【０１３８】
第１のｃＤＮＡストランドの合成条件は、４２℃の温度で１５分間、次に、９９℃で５分間、および最後に４℃で５分間である。オリゴヌクレオチド対ＢＰ２８３およびＢＰ２８４の存在下におけるＰＣＲ反応の条件は、９５℃で２分間、次に４０サイクル（９５℃で３０秒、次に５０℃で４５秒、および７２℃で１分間）および、最後に７２℃で７分間であり、これにより３０４９ｂｐのフラグメントが生成される。
【０１３９】
このフラグメントを、アガロースゲル中で電気泳動後に、Ｓａｌｌ制限酵素で、次に、ＢａｍＨｌ制限酵素で消化して、約３０３９ｂｐのＳａｌｌ−ＢａｍＨｌフラグメントを単離する。このフラグメントを、ＳａｌｌおよびＢａｍＨｌで予め消化した発現プラスミドｐＶＲ１０１２と接合して、プラスミドｐＢＰ１８１（７９０８ｂｐ）を得る。このプラスミドは、初期プロモーターｈＣＭＶ−ＩＥの制御下に、ＦｅＬＶ−Ａのｇａｇ／ｐｒｏタンパクをコードする挿入部を含む。
（実施例１４：プラスミドの調製）
ネコのワクチン接種用のプラスミドを調製するために、精製プラスミドの懸濁液を得るためのいかなる方法も用いることができる。これらの方法は当業者に良く知られている。これらのプラスミドは、本発明のプラスミドにより形質転換された大腸菌Ｋ１２バクテリアの培養により生成する。これらは、特に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．らにより記載（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，ニューヨークＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ在、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ刊，１９８９年）のようなエチジウムブロミドの存在下における塩化物およびセシウムのグラジエントでの２つの連続的超遠心分離処理が続くアルカリ溶解の技術を含む。ワクチン接種に適したプラスミドを産業的規模で生成する方法を記載している特許出願ＷＯ−Ａ−９５／２１２５０およびＷＯ−Ａ−９６／０２６５８を参照することができる。ワクチン生成のために、貯蔵に耐える高濃厚溶液（＞２ｍｇ／ｍｌ）を提供するようにプラスミドを再懸濁する。この目的のために、プラスミドを、超純水またはＴＥ緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  １０ｍＭ；ＥＤＴＡ  １ｍＭ；ｐＨ８．０）のいずれかに再懸濁させる。
（実施例１５：ワクチンの生成および投与）
プラスミドｐＢＰ４７７の貯蔵物を、ＴＥ緩衝液、生理学的水またはＢＰＳ緩衝液中に希釈し、種々の免疫原を発現するワクチンプラスミド、特にｐＢＰ３７１（実施例７）および／またはｐＢＰ３７４（実施例８）および／またはｐＢＰ３７５（実施例９）および／またはｐＢＰ３８３（実施例１０）および／またはｐＢＰ１７９（実施例１２）および／またはｐＢＰ１８１（実施例１３）と混合する。これらのプラスミドは、例えば、ＷＯ−Ａ−９８／０３６６０およびＷＯ−Ａ−００／７７０４３の実施例に記載のものであってもよい。
【０１４０】
「免疫原性」プラスミドとこのように得られたプラスミドｐＢＰ４７７との種々の混合物を、各ネコに筋肉内に共投与する。この場合、ワクチンは体積１ｍｌで注射する。
（実施例１６：プラスミドの調製）
「免疫原性」プラスミドとプラスミドｐＢＰ４７７（実施例１５）との混合物をＴＥ緩衝液、生理学的水またはＢＰＳ緩衝液中に、１ｍｇ／ｍｌの濃度を得るように希釈した。０．７５ｍＭのＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥの溶液を、適当な体積の滅菌Ｈ2Ｏを含むＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥの凍結乾燥体を取り込むことにより調製する。
【０１４１】
プラスミドＤＮＡ−脂質複合体の形成は、ＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥ０．７５ｍＭの溶液を、１ｍｇ／ｍｌのＤＮＡの溶液に等しい割合で希釈することにより行う。ＤＮＡ溶液を、起泡を妨げるようにカチオン性脂質溶液を含むフラスコの壁に沿って折り曲げた針２６Ｇを用いて少しずつ導入する。２つの溶液を、混合後穏やかに攪拌する。最終的に、ＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥ０．３７５ｍＭおよび５００μｇ／ｍｌのＤＮＡを含む組成物を得る。
【０１４２】
用いられるすべての溶液が、全ての前記操作について周囲温度であることが望ましい。ＤＮＡ／ＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥの複合は、実施例１５に記載のように、動物を免疫する前に、周囲温度で３０分間行わせる。
（実施例１７：プラスミドｐＣＤ０１８の構築）
ＦＩＶの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｃａｔ＃  Ｎ  ８０８  ００１７、米国コネチカット州０６８５９ノーウォーク在、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を用いて、供給者に提供された条件下に合成する。
【０１４３】
ＦＩＶのウイルスＲＮＡ懸濁液（実施例６）５０μｌおよび以下のオリゴヌクレオチドを用いて逆転写反応およびそれに続くポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行う。
【０１４４】
ＦＣ１１８（３６量体）（配列番号８）および
ＦＣ１１９（５４量体）（配列番号９）
このオリゴヌクレオチド対により、Ｘｈｏｌ制限部位、ＥｃｏＲｌ制限部位、および挿入部の３’における停止コドンを取り込むことができる。
【０１４５】
第１のｃＤＮＡストランドの合成は、ＲＮＡマトリクスとハイブリッドした後にオリゴヌクレオチドＦＣ１１８を延長することにより行われた。
【０１４６】
第１のｃＤＮＡストランドの合成条件は、４２℃の温度で１５分間、次に、９９℃で５分間、および最後に４℃で５分間である。オリゴヌクレオチド対ＦＣ１１８およびＦＣ１１９の存在下におけるＰＣＲ反応の条件は、９５℃で２分間、次に４０サイクル（９５℃で１３０秒、次に５０℃で４５秒、および７２℃で３分間）および、最後に７２℃で７分間であり、これにより１１９３ｂｐのフラグメントが生成される。
【０１４７】
このフラグメントを、アガロースゲル中で電気泳動後に、Ｘｈｏｌ制限酵素で、次に、ＥｃｏＲｌ制限酵素で消化して、約１１５０ｂｐのＸｈｏｌ−ＥｃｏＲｌフラグメントを単離する。このフラグメントをフラグメントＥと呼ぶ。
【０１４８】
ｐＣＭＶβプラスミド（米国カリフォルニア州パロアルト在、ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．製、Ｃａｔ＃  ６１７７−１）を、アガロースゲル中で電気泳動後に、Ｎｏｔｌ制限酵素で、次に、ＥｃｏＲＶ制限酵素で消化して、約３６８９ｂｐのＮｏｔｌ−ＥｃｏＲＶフラグメントを単離する。このフラグメントをフラグメントＦと呼ぶ。
【０１４９】
フラグメントＡ（実施例７）、ＥおよびＦを一緒に接合し、プラスミドｐＣＤ０１８（６３５５ｂｐ）を得る。このプラスミドは、ヒトサイトメガロウイルスの初期プロモーターすなわちｈＣＭＶ−ＩＥ（ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  Ｅａｒｌｙ）の制御下に、ＦＩＶのｅｎｖタンパクをコードする挿入部を含む。
（実施例１８：ネコのワクチン接種）
約９〜１１週齢のＨｉｌｌ  Ｇｒｏｖｅ  ＳＰＦキャット（特異病原を含まない）の３つの群を実験で用いる。
【０１５０】
対照群では、６匹のネコに、ウマヘルペスウイルス１型（ＥＨＶ−１）糖タンパクＣ（ｇＣ）をコードする対照プラスミド０．４ｍｇを含む生理学的溶液（水中０．９％ＮａＣｌ）１．０ｍｌを、０日、２８日および５６日目に筋肉内（ＩＭ）経路で注射した。
【０１５１】
第２の群では、６匹のネコに、プラスミドｐＣＤ０１８（実施例１７）０．１ｍｇ、プラスミドｐＰＢ３７４（実施例８）０．１ｍｇ、プラスミドｐＰＢ３８３（実施例１０）０．１ｍｇおよび、ＥＨＶ−１ｇＣをコードするプラスミド０．１ｍｇ（同じ量の注射プラスミドとなるため）を含む生理学的溶液１．０ｍｌを、０日、２８日および５６日目に筋肉内経路で注射した。
【０１５２】
第３の群では、６匹のネコに、プラスミドｐＣＤ０１８（実施例１７）０．１ｍｇ、プラスミドｐＰＢ３７４（実施例８）０．１ｍｇ、プラスミドｐＰＢ３８３（実施例１０）０．１ｍｇおよびプラスミドｐＰＢ４７７（実施例３）０．１ｍｇを含む生理学的溶液１．０ｍｌを、０日、２８日および５６日目に筋肉内経路で注射した。
【０１５３】
次に、３つの群に、８４日目に、ＦＩＶ菌株Ｐｅｔａｌｕｍａ（Ｐｅｄｅｒｓｅｎら著，Ｖｅｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ  １９８９年，第２１（１）巻、１１１〜２９頁）の３．０ｌｏｇ１０  ＣＣＩＤ５０を含む１．０ｍｌを腰筋において筋肉内注射を試みた。
【０１５４】
ワクチン接種および攻撃後、ウイルス感染の発生を追跡する、特に、ＣＤ４およびＣＤ８リンパ球の集合、ＦＩＶプロウイルスの量（ＰＣＲによる）およびＦＩＶウイルスの量（ＲＴ−ＰＣＲによる）を追跡するために血液および組織サンプルを規則正しく採取する。
【０１５５】
添付の請求項に定義の発明は、前記特定の態様に限定されず、本発明の範囲または精神から外れない変更を含むと解すべきである。
【配列表】
2005516587000001.app
【国際調査報告】
2005516587.tif 000022
2005516587.tif 000023
2005516587.tif 000024
2005516587.tif 000025