(57)【要約】哺乳動物における骨粗鬆症検出法が本明細書において開示される。この方法は、ａ）骨関連組織または骨関連細胞のサンプルを入手する工程；およびｂ）細菌、細菌が産生した因子、およびＨＳＰからなる群より選択される少なくとも１つのマーカーの濃度を測定する工程、を包含する。この方法は、一定時間にわたるかまたは標準濃度に対して、同じ個体に由来する、第一のアッセイの濃度と、第二またはそれよりあとのアッセイの濃度とを比較する工程をさらに包含し得る。このマーカーは、細菌、シャペロン分子または産生される細菌であり得る。この方法は、たとえば、少なくとも約１２時間の期間にわたり第一のアッセイおよび第二のアッセイを包含する。ＨＳＰの濃度は、イムノアッセイを用いて測定され得る。このアッセイでは、ＨＳＰをコードするヌクレオチド分子を用いる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物において骨粗鬆症を検出する方法であって、
ａ）骨関連組織または骨関連細胞のサンプルを入手する工程；および
ｂ）感染性因子、感染性因子が産生した因子、および熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）からなる群より選択される少なくとも１つのマーカーの濃度を測定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
一定時間にわたるかまたは標準濃度に対して、同じ個体に由来する、第一のアッセイの濃度と、第二またはそれよりあとのアッセイの濃度とを比較する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記骨関連組織または骨関連細胞は、前記哺乳動物被検体におけるＨＳＰ応答を誘導しない条件下で得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＨＳＰは、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ９０、ｇｐ９６、ｃｐｎ１０、ｃｐｎ２０、ユビキチンおよびｃｐｎ３０からなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第一のアッセイと第二のアッセイとの間の期間は、少なくとも約１２時間である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプルは、骨細胞または体液を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＨＳＰはＨＳＰ６０である、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記ＨＳＰはＨＳＰ７０である、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記ＨＳＰはユビキチンである、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＨＳＰの濃度は、イムノアッセイを用いて測定される、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＨＳＰの濃度は、ＨＳＰをコードするヌクレオチド分子についてのアッセイを用いて測定される、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
前記病原体は、細菌、ウイルス、原生動物、寄生生物および真菌からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記病原体は、細菌が産生する因子、ウイルスが産生する因子、原生動物が産生する因子、寄生生物が産生する因子、および真菌が産生する因子からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記細菌は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｌｉｓ、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ  ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｕｓ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｒｅｃｔｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｂ．  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、およびＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍからなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記病原体は、内毒素、ＬＰＳ、ガプスタチンおよび皮膚壊死性毒素（ＤＮＴ）からなる群より選択される、細菌が産生する因子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記因子は、ガプスタチンおよび皮膚壊死性毒素からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記因子は、ガプスタチンである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記因子は、皮膚壊死性毒素である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記細菌は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、およびＦｕｓｏｂａｃｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍからなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
感染性因子、感染性因子が産生する因子、または骨疾患によって生じる骨粗鬆症を処置または予防する方法であって、哺乳動物被検体に対して、治療有効量の処方物を投与する工程であって、該処方物は、ＨＳＰ抗原性処方物および感染性因子抗原性処方物からなる群より選択される、工程を包含する、方法。
【請求項２１】
前記骨疾患は、ウイルス、細菌、真菌、原生動物および寄生生物からなる群より選択される骨感染性因子によって誘導される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＨＳＰは、抗原性材料と複合体化されているか、またはアジュバントと組み合わせて処方されている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗原性材料は、ペプチドまたはタンパク質であって、該ペプチドまたは該タンパク質は、骨疾患を誘導する、ウイルス、細菌、真菌、原生動物または寄生生物の抗原決定基を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗原性材料は、免疫不全ウイルスＩ型（ＨＩＶ−Ｉ）、ヒト免疫不全ウイルスＩＩ型（ＨＩＶ−ＩＩ）、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、Ｖａｒｉｃｅｌｌａ、アデノウイルス、Ｉ型単純ヘルペス（ＨＳＶ−Ｉ）、ＩＩ型単純ヘルペス（ＨＳＶ−ＩＩ）、牛疫、ライノウイルス、エコウイルス、ロタウイルス、ＲＳウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス、アルボウイルス、フンタウイルス、コクサッキーウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルスおよびポリオウイルスからなる群より選択されるウイルスの抗原決定基を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＨＳＰは、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、ｇｐ９６、ｃｐｎ１０、ｃｐｎ２０、ユビキチン、ｃｐｎ３０およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記骨粗鬆症は、オステオペニアである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記骨粗鬆症は、細菌または細菌が産生する因子によって生じる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１〜１９に記載の方法において使用するためのキット。
【請求項２９】
請求項２０〜２７に記載の方法において使用するための患者に投与するための薬学的に受容可能な組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本願発明は、概して、骨の喪失の診断方法に関する。より具体的には、本願発明は、細菌または哺乳動物分子シャペロンに基づく、骨の喪失の体液性マーカーの同定に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
骨粗鬆症は、骨のぜい弱性、ならびに股関節部、棘、および手首の骨折の罹患率の上昇をもたらす、骨重量の減少および骨組織の微小構築の変質によって特徴付けられる全身性の疾患である。オステオペニアは、Ｘ線撮影における減少した骨ミネラル含量という現象として規定されているが、オステオペニアという語は、より適切には、減少した骨重量から骨折および虚弱質への連続における段階をいう。Ｘ線撮影によってオステオペニアの診断がなされるまでに、顕著かつ不可逆的な骨の喪失が、すでに生じている。オステオペニアの最も一般的な原因は、骨粗鬆症であり、他の原因としては、骨軟化症、および上皮小体機能亢進症の骨減少が挙げられる。
【０００３】
合衆国において、５０歳を超える年齢の女性のおよそ４人に１人が、骨粗鬆症を有する。骨粗鬆症骨折の全体としての有病率は、閉経期の女性において劇的に上昇する。骨の喪失は、閉経期の開始後の最初の１０年の間、より急激であり、その後は、より緩やかな減少となる（Ｎｏｒｄｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  「Ｈｏｗ  ｃａｎ  ｗｅ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ？」  ｉｎ  Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ，  Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （ｅｄｓ）．  Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，  Ｎｏｒｈａｖｅｎ  Ａ／Ｓ，  １２０４−１２１０  （１９８７））。高齢になるに従って、骨折の発生が増加する。股関節部の骨折の頻度は、年齢に従って、特に７０歳より高齢の場合、指数関数的に増加する。このことは、白人女性において、より一般的に見られる。８０歳まで生存した女性の約３２％が、股関節部の骨折を有する（Ｇａｌｌａｇｈｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｏｒｔｈｏｐ．  １５０：１６３−１７１  （１９８０）；  Ｍｅｌｔｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．  １２９：１０００−１０１１  （１９８９））。股関節部骨折についての女性のリスクは、胸部癌、子宮癌、および卵巣癌のリスクの合計と同じであり、股関節部骨折で死亡するリスクは、胸部癌の死亡率と同じである（Ｅｌｆｆｏｒｓ，  Ａｇｉｎｇ  （Ｍｉｌａｎｏ）  １０：１９１−２０４  （１９９８））。椎骨の骨折の有病率は、高齢の女性および／または減少した骨重量を有する女性において、４２％である（Ｍｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９）。女性において、閉経の開始と最初に関連する椎骨の骨折の迅速な増加の後に、年齢に関連した骨の喪失に起因する手首および股関節部の骨折の頻度が増加する。
【０００４】
男性の場合、骨粗鬆症の発生頻度は女性よりも低い。なぜならば、男性の場合、骨の喪失は、より遅く開始し、そしてより緩やかに進行するからであり、また、迅速なホルモン変化および付随して生じる迅速な骨の喪失の時期がないからである。骨の形態およびリモデリングにおける差異もまた、男性における低い骨折の割合に寄与する。しかし、過去数年、特に、合衆国国立骨粗鬆症基金（ＵＳ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）によると、７０歳を超える男性の数が、１９９３年と２０５０年の間で２倍になるという推定を考慮して、男性の骨粗鬆症の問題が重要な公衆衛生の問題として認識されてきている。
【０００５】
５０歳を超える男性のおよそ８人のうち１人が、骨粗鬆症を有する。現在、合衆国内において、２００万人を超える男性が、骨粗鬆症に罹患し、別の３００万人が、この疾患のリスクを有する。毎年、男性の股関節部骨折は、股関節部骨折全体の３分の１であり、そして、男性の股関節部骨折患者の３分の１が１年以内に死亡する。股関節部骨折の頻度は、年齢に従って、特に７０歳を超えると、指数関数的に増加し、８０歳まで生存した男性の１７％が、股関節部の骨折を有する（Ｇａｌｌａｇｈｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８０）；  Ｍｅｌｔｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９））。股関節部骨折に加え、男性はまた、骨粗鬆症に起因する、棘、手首、および他の骨の、疼痛性骨折および消耗性骨折を有する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
骨粗鬆症によって生じる損傷は、重篤であり、時として致死性であるが、骨粗鬆症の場合、血液または尿についての厳密な臨床化学試験で異常なものはない。現在使用されている技術は、一般的には、生化学的マーカー、Ｘ線撮像、および骨ミネラル密度（ＢＭＤ）の測定である。これらの技術の使用は、費用、または正確性の理由のいずれかにより、限定されている。
【０００７】
本発明の目的は、骨格系における、環境ストレスおよび骨感染ストレスの評価のための効果的な手段を提供することにある。
【０００８】
さらに、本発明の目的は、骨格系における負の影響を有する感染性疾患を、処置および／または予防する手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
哺乳動物において骨粗鬆症を検出する方法が、開発された。この方法は、以下の工程を包含する、ａ）骨関連組織または細胞のサンプルを得る工程；および、ｂ）細菌、細菌の産生した因子、または熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）の１つである少なくとも１つのマーカーの濃度を測定する工程。この方法はさらに、同一の個体から、ある時間にわたってか、または標準濃度に対して、第１のアッセイの濃度を第２またはそれより多いアッセイの濃度と比較する工程を、包含する。マーカーは、ＨＳＰ例えば、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ９０、ｇｐ９６、ｃｐｎ１０、ｃｐｎ２０、ユビキチンまたはｃｐｎ３０であり得る。マーカーはまた、細菌、例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｌｉｓ、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ  ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｕｓ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｒｅｃｔｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、またはＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍであり得る。マーカーは、細菌の産生した因子、例えば、内毒素−ＬＰＳ、ガプスタチン（ｇａｐｓｔａｔｉｎ）、および皮膚壊死性毒素（ＤＮＴ）であり得る。アッセイ間の時間を、例えば、少なくとも約１２時間の期間に延長し得る。１つの実施形態において、ＨＳＰの濃度は、イムノアッセイを用いて測定する。別の実施形態において、ＨＳＰの濃度は、ＨＳＰをコードするヌクレオチド分子についてのアッセイを使用して測定される。
【００１０】
骨粗鬆症を処置または予防する方法が、開発された。ＨＳＰ抗原性処方物または細菌抗原性処方物のいずれかである、治療的に有効な処方物の量。１つの実施形態において、骨粗鬆症は、骨の感染性因子、例えば、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、または寄生虫によって誘導される骨疾患によって生じる。ＨＳＰは、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、ｇｐ９６、ｃｐｎ１０、ｃｐｎ２０、ユビキチンまたはｃｐｎ３０、あるいはこれらの組み合わせであり得る。ＨＳＰはさらに、抗原性物質との複合体とされ得るか、またはアジュバントと組み合わせて処方され得る。抗原性物質は、骨疾患を誘導する、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、または寄生虫の抗原決定基を有するペプチドまたはタンパク質であり得る。
【００１１】
本明細書に開示される方法は、本明細書に開示される方法に従って形成されたキットを使用して実施され得る。
【００１２】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
用語、分子シャペロンは、タンパク質のアセンブリおよびリアセンブリ、ならびにタンパク質の膜貫通輸送（例えば、細胞質からミトコンドリアへ）に関与する、多数の関連性のないタンパク質を記載する。これらタンパク質のいくつかを、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）、またはストレスタンパク質という。代表的なＨＳＰとしては、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ７０、ｇｐ９６、およびＨＳＰ１００が挙げられる。これらＨＳＰは、異なる種類のシャペロン機能をなしとげる。例えば、細胞の細胞質、核、ミトコンドリア、または小胞体に局在するＨＳＰ７０は（Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２２：６３１−６７７）、免疫系の細胞に対する抗原の提示に関与し、そしてまた、正常細胞内でのタンパク質の輸送、フォールディング、およびアセンブリに関与する。サイトゾルに局在するＨＳＰ７０は、同様の活性に関与する。小胞体に存在するＧＰ９６もまた、抗原提示に関与する（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，  Ｐ．  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｉｍｍｕｎ．  １６７：１０９−１２３）。
【００１３】
ＨＳＰは、原核生物細胞および真核生物細胞の両方にとって、細胞内におけるタンパク質のフォールディング（アンフォールディング）、アセンブリ、および輸送の間のシャペロン機能のために必須である。定義によると、ＨＳＰ発現は、ストレス（例えば、損傷組織または炎症組織におけるストレス）を受ける細胞において、増大する。温度の上昇、低酸素、照射、感染、および毒性化合物に対する曝露のように多様な状態は全て、増加したＨＳＰ発現を生じ得る。
【００１４】
ストレッサーに対する曝露に際して、３つの異なる事象は、細胞内の代謝活性の迅速な変化を生じる：（１）ＨＳＰ  ｍＲＮＡの転写の増加が生じ、次に、ｍＲＮＡは細胞質へ優先的に輸送される、（２）ほとんどの他のｍＲＮＡの転写が抑制される、そして（３）リボゾームの正常な翻訳活性が破壊され、その結果ＨＳＰが優先的に翻訳される。これらの事象の全体としての結果は、細胞が迅速にＨＳＰ合成を開始し、そして他のペプチドの合成を抑圧するということである。新たなペプチドもＲＮＡ合成も、熱ショックペプチド遺伝子の翻訳の活性化には必要ない。このことは、予め存在する因子（例えば、ウイルス因子、または細菌因子）が関与し得ることを示す。細胞の型、細胞分化の状態、ストレッサーの型、およびストレスの持続および強度は、特定の型のＨＳＰの量および質に影響し得る。
【００１５】
ＨＳＰファミリー内において、個々のメンバーは、独特の配列相同性の程度を有する。ＨＳＰ６０について、ヒトタンパク質は、マイコバクテリアホモログと５０％の配列同一性を有し、さらに２０％の保存的置換を有する。このことのために、ヒト分子内のいくつかの領域が、細菌タンパク質と完全に同一である。その高い保存性の程度にも関わらず、ＨＳＰは、非常に免疫原性である。ＨＳＰが自己免疫を誘導する可能性が、広範に研究された。しかし、自己免疫の誘導は、ほとんどの実験系において報告されなかった。むしろ、多くの実験的な自己免疫疾患のモデルにおいて、疾患のその後の誘導に対する耐性の発生が、共通の特徴である。
【００１６】
近年、ＨＳＰは、構成的な分子であることが明らかになっている。多数のＨＳＰは、周知のタンパク質であり、ユビキチン、免疫抑制剤結合プロテインおよびＰ−糖タンパク質が挙げられる。ＨＳＰは、それらの炎症への関与に一致する、細胞および組織の挙動を誘導すると報告されている。ＨＰＳ７０およびＥ．ｃｏｌｉ  ｇｒｏＥＬは、膜における細孔を誘導し、従って、細菌によって産生される広範な種々のリジンおよび溶血素と類似の作用を有し得る。現在、種々の細菌由来のＨＳＰが、ヒトおよびマウスの細胞の、ある種の炎症誘発性サイトカインの放出を誘導し得るという、多数の報告が存在する。
【００１７】
努力は、ＨＳＰを利用する方法を開発することに向けられている。例えば、ＨＳＰ濃度を測定することによって、致死量以下のレベルの汚染物質への哺乳動物の長期間の曝露を評価する方法が、報告されている。例えば、米国特許第５，７８０，２４６号；米国特許第５，２３２，８６６号（どちらもＳａｎｄｅｒｓら）を参照のこと。癌のような疾患を予防するための、ＨＳＰを用いるワクチン接種の組成物および方法が、開発されている。例えば、米国特許第５，８３０，４６４号；同第５，９４８，６４６号；および同第６，０３０，６１８号（全てＳｒｉｖａｓｔａｖａ）を参照のこと。
【００１８】
「抗原性分子」とは、本明細書中で使用される場合、ＨＳＰがインビボで（例えば、感染した細胞中で）内因的に会合されるペプチド、ならびに外因性抗原／免疫原（すなわち、インビボではＨＳＰが複合体形成しない）または抗原フラグメント／免疫原フラグメント、およびこれらの誘導体をいう。
【００１９】
「特異的にハイブリダイズする」とは、本明細書中で使用される場合、選択された数の塩基対ミスマッチがハイブリダイゼーションを生じないストリンジェンシーな条件で、ＨＳＰについて遺伝子から転写されたｍＲＮＡとハイブリダイズするヌクレオチド分子をいう。当業者は、種々のハイブリダイゼーションアッセイ方式に対するストリンジェンシーな条件を、温度、イオン濃度およびｐＨの集合に依存して、理解する。一般に、最適なＲＮＡ：ＲＮＡハイブリダイゼーションについては、温度は塩濃度に逆比例し；ｐＨは約６．９から約７．４（例えば、１５ヌクレオチド配列（１５マー）について）の範囲内に維持されるべきである。ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションについては、類似のアッセイ条件が適用されるが、一般に、ＲＮＡ：ＲＮＡハイブリダイゼーションより低い温度（より高い塩濃度に付随する）が使用される。
【００２０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、タンパク質分析のための通常の手段である。ドデシル硫酸ナトリウムは、電場においてタンパク質が、いずれの分離マトリックスも存在せずに、同じ速度で移動するように、タンパク質を一定の電荷対質量の比で負の電荷でコーティングする、界面活性剤である。しかし、荷電したタンパク質が多孔性のポリアクリルアミドゲル上にロードされ、そして電場が印加される場合、より小さなタンパク質は、大きなタンパク質（これは、ゲルを通って移動する際に、より大きい抵抗を受ける）より速く、このゲルを通ってアノード（＋）へと移動し得る。ゲルを現像するために使用され得る、異なる型の染料（例えば、クーマシーブルーおよび銀染料）が存在する。多くの場合において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥは定性的な手段であり、サンプル中のタンパク質の大まかな量および大きさは、問題のバンドを、分子量ラダーのバンドと直接比較することによって、判断され得る。
【００２１】
Ａｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒＴＭは、ガラス、石英、またはプラスチックのチップ上に作製されたマイクロチャネルネットワークを有する小型の化学チップを使用する、微量全分析システム（ｐ−ＴＡＳ）である。代表的なチャネルは、およそ５０ミクロンの幅および１０ミクロンの深さである。Ａｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒＴＭ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ２００  Ａｓｓａｙは、大きさおよびサンプル中の濃度によって、タンパク質をより効率的に特徴付けるために開発された。この微小流体システムは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥといくらか類似して機能するが、大規模な分析方法より優れた多くの利点を与える。ＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒＴＭについてのＰｒｏｔｅｉｎ  ２００  Ａｓｓａｙのいくつかの利点としては、小さなサンプル容量、データ／サンプルのより高いスループット、減少した資源消費および廃棄物生成、ならびに多段階プロセスの自動化が挙げられる。
【００２２】
Ｐｒｏｔｅｉｎ  ２００  Ａｓｓａｙにおいて、タンパク質は、Ｂ−メルカプトエタノールで変性され、そして蛍光標識される。さらに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいてと同様に、これらのタンパク質は、一定の電荷対質量の比で、ＳＤＳでコーティングされる。戦略的に配置された電極は、流体を移動させ、そして異なる大きさのタンパク質を分離し得る、界面動電力を発生させる。分子は、タンパク質上の電荷の量によって分離される。より大きい、より負に荷電したタンパク質は、カソードに向かって移動する。標識されたタンパク質分子がチャネルにおける特定の点を通過して移動するにつれて、これらの蛍光が、レーザービームによって検出される。Ｐｒｏｔｅｉｎ  ２００  Ａｓｓａｙの感度は、サンプル緩衝液における塩濃度によって影響を受けることが既知である。なぜなら、より高い濃度において、より少量のタンパク質が、分離チャネルに注入されるからである。
【００２３】
（ＩＩ．骨粗鬆症のための診断技術）
血液または尿に対する正確な臨床化学試験はいずれも、骨粗鬆においては異常ではないが、生化学的マーカー、Ｘ線撮影法、および骨鉱物の密度（ＢＭＤ）の測定は、骨粗鬆症を診断する際に役立つ。骨の質量密度試験は、骨粗鬆症を診察するために使用され、そしてｘ線フィルムは、他の骨または関節炎の状態を除外するために使用される。細い骨は、ｘ線フィルム上で検出され得るが、骨密度試験は、より正確である。
【００２４】
（Ａ．骨デンシトメトリー）
骨格の骨質量を評価するための方法の開発におけるかなりの進歩により、現在、骨粗鬆症を非侵襲的に容易に検出することが可能である。一般に、骨粗鬆症は、最小の外傷を伴って起こる骨折の後に、ｘ線フィルム上での付随的な知見として、または骨デンシトメトリー（これはまた、骨密度走査として公知である）によるＢＭＤの測定によって、検出され得る。骨密度走査は、骨の状態の即時の断片であると、多くの人に考えられている。これらの走査（集合的にＢＭＤ試験として公知）は、脊椎、股関節部、手根、手、踵、または全身において、骨質量の量を検出し、そしてその密度を評価する。いくつかの研究は、任意の解剖学的部位における骨鉱物含有量に関する情報が、一般には、骨折の危険性を予測するために等しく価値があることを示したが（Ｂｌａｃｋら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ．７：６３３−６３８（１９９２）；Ｍｅｌｔｏｎら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ、８、１２２７−１２３３（１９９３））、他の研究は、目的の特定の部位において得られた測定値が、その部位における骨折の予測のための最も重要な情報を提供し得ることを示唆した（Ｃｕｍｍｉｎｇｓら、Ｌａｎｃｅｔ  ３４１：７２−７５（１９９３））。骨の鉱物密度試験は、最も感受性であり、そして骨粗鬆症に対する特定の試験は、骨折の危険性を予測する際に必須である。
【００２５】
ＢＭＤを非侵襲的に測定するための、いくつかの技術が利用可能である。今日のｘ線に基づく測定システムの全ては、正確であり、そして極端に低い有効放射線量を送達する。放射線核種システムより優れたｘ線システムの主な利点は、安全な、短縮された試験時間、より大きな正確さ、および高分解能に限定された精密さ、ならびに供給源の崩壊の補正に起因する誤差の除去である。今日広範に使用されている種々の骨走査技術としては、単一ｘ線吸光光度法、二重エネルギーｘ線吸光光度法（ＤＥＸＡ）、定量的コンピュータ連動断層撮影、末梢定量的コンピュータ連動断層撮影、放射線吸光光度法、定量的超音波、単純な光子吸光光度法、および二重光子吸光光度法が挙げられる。これらの開発は、この目的での平面のｘ線撮影法の固有の欠点を克服する必要性によって、推進された。単一および二重の光子吸光光度法は、依然として利用可能であるが、これらのより古い技術は、これらの最新の対応物である単一ｘ線吸光光度法およびＤＥＸＡによって、急速に取って代わられている。
【００２６】
いくつかの利用可能な技術のうちの、ＤＥＸＡは、ＢＭＤを測定するために最も広範に使用される技術になっている。これは、その低い放射線、利用可能性、複数の部位を評価する能力、および使用の容易さに起因する（Ｇｅｎａｎｔら、Ａｍ  Ｊ．Ｍｅｄ．９１（補遺５Ｂ）；４９Ｓ−５３Ｓ（１９９１））。二重エネルギーｘ線吸光光度法は、軟部組織の組成（赤身および脂肪の質量）および腰椎、股関節、および前腕の骨質量または骨密度、ならびに全身のＢＭＤを、二重光子吸光光度法より大きな精度で、より速い走査時間で測定し得る（Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｅｎｔｅｒ：「Ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ」Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ．９０：１０７−１０１（１９９１））。スクリーニング手順と同様に、ＤＥＸＡは、その比較的高い取り付け費用によって制限される。この技術の正確さは、全ての骨格部位の測定について完全には証明されていない。
【００２７】
標準的な骨鉱物の報告は、目的の領域における骨鉱物含有量（ヒドロキシアパタイトのグラム量）として表され、そして面積密度（１平方センチメートルあたりのグラム数）に変換された、測定値からなる。さらに、正常値は、性別および人種に従って提供され、そして年齢に従ってプロットされる。人口統計学的データ（臨床的指標ならびに患者の年齢、性別、人種、体重および身長を含む）もまた、考慮される。標準的な骨鉱物の報告を解釈するためには、目的の領域が選択されなければならない。個体を比較するためには、測定の部位が一定であるべきである。なぜなら、骨鉱物含有量は、異なる骨の間で、そして同じ骨の異なる領域の間で変動するからである。これらの結果は、標準的な値と比較され、そして標準的な値の標準曲線が、両方の性およびいくつかの人種の個体に対して提供される。正常な若い個体または対応年齢の個体についての平均値との、測定値の比較は、骨折の危険性の評価を可能にする。
【００２８】
世界保健機関は、最近、明白な定義、および骨デンシトメトリーの結果の解釈の際に臨床医を補助することを試みた。その報告によれば、骨鉱物含有量についての標準値は、同じ年齢および性別のヤングアダルトについての平均値の、１の標準偏差（ＳＤ）以内（すなわち、ｔスコアが−１を超える）である。骨粗鬆症は、骨鉱物含有量の値が１ＳＤを超えるが、ヤングアダルトについての平均の２．５ＳＤＳ以下（すなわち、ｔスコアが−１未満でありかつ−２．５より大きい）場合に、存在するとみなされる。骨粗鬆症は、その値が、ヤングアダルトについての平均骨鉱物含有量の２．５ＳＤＳより低い値（すなわち、ｔスコアが−２．５未満）の場合に存在するとみなされる（Ｋａｎｉｓら、１９９４）。重篤な骨粗鬆症は、骨鉱物含有量についての値がヤングアダルトについての平均の２．５ＳＤＳより低く、そしていわゆる脆弱性骨折（わずかな外傷の結果として起こるので、骨粗鬆症に関連すると仮定される）が少なくとも１つ存在する場合に存在するとみなされる。一般に、ｔスコアは、低い骨質量または骨粗鬆症の診断のために、使用される。
【００２９】
医師は、患者の骨粗鬆症についての危険因子の存在または不在に基づいて患者の骨折の危険性を減少させるために治療を開始する。治療は、危険因子のない場合、−２未満の骨鉱物密度ｔスコアを有する女性において、および他の危険因子が存在する場合、−１．５未満のｔスコアを有する女性において、骨折の危険性を減少させるために開始される。
【００３０】
Ｂ．骨ターンオーバーの生化学マーカー
骨ターンオーバーのマーカーの組み合わせは、骨粗鬆症の臨床試験において種々の方法で使用され得る。増大する証拠は、閉経後の骨損失の割合が生化学マーカーにより決定され得、これにより閉経直後の１つの生化学的評価が、骨量測定と組み合わせて、高い骨ターンオーバーを有し、従って高い割合の骨損失を受けると思われる女性を同定するために使用され得ることを示唆する。骨粗鬆症患者において、マーカーは、低い骨ターンオーバーを有する患者において使用されるのとは異なる治療上の戦略の恩恵を受け得る、高い骨ターンオーバーを有する患者のサブグループを同定するために使用され得る。最終的に、マーカーは、それらの効果および作用機構をモニターするために、新規な治療剤の臨床試験において使用され得る（Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｅｎｔｅｒ  １９９１）。
【００３１】
オステオカルシンは、骨芽細胞（これは、骨形成細胞である）により分泌される骨特異的タンパク質であり、そしてその血清レベルは、骨形成の割合の感度の高いマーカーである。骨形成の他のマーカーとしては、全体のおよび骨特異的なアルカリホスファターゼおよび血清１型コラーゲンプロペプチドの血清レベルが挙げられる。ピリジノリンおよびデオキシピリジノリンは、破骨細胞の骨吸収の過程における１型コラーゲンの分解の間に血液中および尿中に放出されるコラーゲン架橋物である（Ｄｅｌｍｅｓ  「Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｉｎ  ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ」、Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎら（編）、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｏｓｔｅｏｐｒｅｓｓ、４５０〜４５８頁、１９９０）。ピリジノリン（例えば、ヒドロキシリジルピリジノリンおよびリジルピリジノリン）の尿分泌は、尿中ヒドロキシプロリンのような従来のマーカーよりも、骨吸収のより感度の高く、かつ特異的なマーカーであることが示されている（Ｕｅｂｅｌｈａｒｔら、Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒａｌ、８、８７−９６（１９９０）。血漿中酒石酸耐性酸性ホスファターゼは、骨吸収の別のマーカーである（Ｄｅｌｍｅｓ、（１９９０））。
【００３２】
Ｃ．Ｘ線写真所見
骨中カルシウム含有量の減少は、従来のＸ線写真において確実に観察される３０％を超える。長骨または椎骨体の皮質においてＸ線写真で明らかな薄層化が、留意され得る。普通のＸ線写真は、骨密度の実証は、Ｘ線写真技術に強く依存するので、骨粗鬆症の診断において大体不正確である。
【００３３】
ＩＩＩ．骨粗鬆症に対する細菌またはウイルスマーカーの同定
Ａ．骨粗鬆症に対する細菌マーカー
細菌感染および骨病理
骨病理に関与する範囲の細菌が存在する。これらの疾患に取り組むための鍵となる問いは、いかにして細菌が病理を刺激するかということ、およびいかにしてそれらが凍結した場所において骨に入り込むかということである。四肢および身体中心部の骨格の感染においては、回答は、骨マトリックス成分に対する細菌発現レセプター中にあり得る。例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓは、おそらく骨において血液運搬生物を捕捉する役割を有する、フィブロネクチン（Ｒａｊａら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５８２５９３−２５９８（１９９０）；ラミニン（Ｍｏｔａら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５６，１５８０−１５８４（１９８８））、コラーゲン（Ｐａｔｔｉら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６２：１５２−１６１（１９９４））、および骨シアロ糖タンパク質（Ｒｙｄｅｎら、Ｅｕｒ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８４：３３  １−３３６（１９８９））に対するレセプターを含有する。細菌は、歯周組織に侵入しないので、受け入れられたパラダイムは、局所病理が、可溶性細菌ビルレンス因子の放出に起因すること（Ｗｉｌｓｏｎ、Ｓｃｉ．Ｐｒｏｇ．７８：１９−３４（１９９５））およびこれが、全ての骨感染における一般的な機構であり得るということである。
【００３４】
【表１】
2005503533.tif 000002
いかにして細菌が病理的骨損失を引き起こすかということに関して、３つの可能性が存在する：（ａ）細菌が、遊離の酸およびプロテアーゼによって骨の非細胞成分を直接破壊する、（ｂ）細菌が、骨の分解を刺激する細胞プロセスを促進する、または（ｃ）細菌が骨マトリックスの合成を阻害する。（ｂ）および（ｃ）の機構は、細菌により放出された成分の直接の効果、または宿主因子（例えば、次いで骨細胞に作用するサイトカインまたはプロスタグランジン）の誘導の結果のいずれかであり得る。虫歯の病理に関係する機構は、骨格骨病理においては主要でない機構でしかないと思われる。
【００３５】
骨形成を阻害する細菌およびそれらの産物の能力
インビトロでの骨吸収の刺激に加えて、内毒素−ＬＰＳもまた、骨中コラーゲンおよび非コラーゲン（ｎｏｎｃｏｌｉａｇｅｎｏｕｓ）タンパク質の合成を阻害することが報告されている（Ｍｉｌｌａｒら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５７，３０２−３０６（１９８６））。多数の報告は、歯苔または培養中の歯周症性細菌（ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｐａｔｈｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ）の抽出物が骨マトリックス合成を阻害し得ることを示唆している（Ｈｏｐｐｓら、Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ：ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ａｎｄ  ｈｏｓｔ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｈａｍａｄａら編、（Ｑｕｉｎｔｅｓｓｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ）３０７−３２０頁（１９９１）；Ｍｕｌｔａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．１：７２９−７３９（１９８５））。口腔細菌由来の表面関連タンパク質もまた、骨マトリックス合成を阻害し得る（Ｍｅｇｈｊｉら、Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．６３：７３６−７４２（１９９２））。
【００３６】
特定の歯周症性細菌は、一般的な抗増殖活性を有する因子を生産する（ＨｅｌｇｅｌａｎｄおよびＮｏｒｄｂｙ，１９９３；Ｋａｍｅｎ  １９８１；Ｋａｔａｏｋａら、１９９３；Ｌａｒｊａｖａら、１９８７；Ｍｅｇｈｊｉ，ら、Ａｒｃｈ．Ｏｒａｌ  Ｂｉｏｌ．，３７：６３７−６４４（１９９２）；Ｓａｉｔｏら、１９９３；Ｓｈｅｎｋｅｒら、１９９１）。これらは、おそらく、骨芽細胞増殖を阻害する際に役割を果たし得、従って、骨再形成を損ない得る。これらの種々の生物学的活性はまだ精製されておらず、特徴付けられてもいない。ヒト骨芽細胞様細胞株に対して最も活性であるＡ．ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ由来の抗増殖タンパク質は、骨に対するいくらかの特異性を示唆する。この８ｋＤａタンパク質（Ｗｈｉｔｅら、１９９５）「ガプスタチン（ｇａｐｓｔａｔｉｎ）と称される」は、直接的にＤＮＡ合成を阻害しないが、細胞周期のＧ２期で細胞をブロックすることにより、細胞周期進行を阻害する。同期化された細胞集団の速度論研究は、ガプスタチンがＳ期で細胞にのみ作用することを示している。この分子は、サイクリンＢＩ（細胞がＧ２から有糸分裂への移行を行うために必要とされたタンパク質）の合成を阻害することにより作用し得る。骨再形成およびマトリックス合成は、骨芽細胞および破骨細胞の継続した生産を必要とするので、ガプスタチンの作用は、新規な骨マトリックス形成を阻害し得る。このような影響は、骨破壊を刺激する分子（例えば、ｃｐｎ６０）と共同で起こる場合、特に有害である。ガプスタチンは、破骨細胞の形成を阻害し得る可能性がある。
【００３７】
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａは、ブタ萎縮性鼻炎における鼻甲介萎縮の原因となる１４５ｋＤａ皮膚壊死性毒素ＤＮＴ）を生産する（Ａｃｋｅｒｍａｎら、１９９１；Ｄｕｎａｎら、１９６６）。組織学的には、Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａにより誘導される病変は、損なわれた骨芽細胞機能を示唆する（Ｓｉｌｖｅｉｒａら、１９８２）。培養骨に対するＤＮＴの影響の１つの報告が存在するが、その影響は、特に著しいわけではなかった（Ｋｉｍａｎら、１９８７）。しかし、マウス骨芽細胞細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１に添加された場合、それは、細胞構造に変化を引き起こし、アルカリホスファターゼおよびコラーゲンの両方を生産する骨芽細胞の能力（これは、インビボで複製される場合に骨再造形に重大に影響し得る作用である）を強く阻害した（５０％阻害濃度、１００ｐｇ／ｍｌ）（Ｈｏｒｉｇｕｃｈｉら、１９９１）。ＤＮＴがＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞へのトリチウム化チミジン取り込みの強力な刺激因子であり、５０％有効用量が約１ｎｇ／ｍｌであることが近年報告されている。この標識の取り込みにも関わらず、培養物中のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の数は増加しなかった。ＤＮＴへの曝露の主な結果は、多核骨芽細胞の出現であった。別の細胞周期阻害タンパク質は、歯周症性細菌Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅｕｔｕｍから近年単離されてきた。このタンパク質は、細胞周期の中期Ｇ期（ｍｉｄ−Ｇ）でヒトＴリンパ球をブロックする（ＳｈｅｎｋｅおよびＤａｔａｒ，１９９５）。それは、骨吸収を刺激すると期待される。
【００３８】
細菌が哺乳動物細胞周期に干渉し得る範囲のタンパク質を生産することが、現在明らかになってきているところである。これらのタンパク質の活性が新規な細菌ビルレンス機構を表すことが示唆され得る。骨再造形における骨細胞系譜の増殖および成熟の重要性は、おそらく、これまでに発見された細菌細胞周期調節タンパク質が骨病理を誘導するか、または骨マトリックス損失を包含する疾患に関与する細菌に主に由来し得る理由である。
【００３９】
Ｂ．骨粗鬆症に対する分子シャペロンマーカー
熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）としてもまた公知の分子シャペロンは、タンパク質の細胞内フォールディング（アンフォールディング）、アセンブリ、および転位の間にそれらのシャペロン機能を通じて原核細胞生物および真核細胞生物に必須である。構造的に関連したｈｓｐの４つの主要なファミリーが、それらの分子量に基づいて区別される：Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ６０、および低分子Ｈｓｐ。定義により、Ｈｓｐ発現は、ストレスを受ける細胞（例えば、損傷組織または炎症組織中の細胞）において上昇される。温度の上昇、低酸素、照射、感染、および毒性化学物質への曝露と同様に多様な条件が全て、増大されたＨｓｐ発現を生じ得る。Ｈｓｐファミリーの中で、個々のメンバーが、独特の配列相同性の程度を有する。Ｈｓｐ６０については、ヒトタンパク質は、ミコバクテリウムホモログと５０％の配列同一性を有し、さらなる２０％の保存的置換を有し、これにより、ヒト分子中のいくつかの領域が細菌タンパク質に完全に同一であるようになる。
【００４０】
最も研究されている分子シャペロンは、ｃｐｎ１０およびｃｐｎ６０（それらのサブユニットの分子量に由来する）として公知の２つの相互作用するオリゴマータンパク質からなる、シャペロニン（ｃｐｎｓ）である。ｃｐｎｓは、タンパク質折り畳みがｃｐｎ６０オリゴマーのキャビティー内に存在し、プロセスがヘプタマーｃｐｎ１０を必要として、ヘプタマー構造を形成する。対照的に、分子シャペロンのＨｓｐ７０ファミリーは、モノマーとして作用する。Ｈｓｐ９０ファミリーは、ストレスの無い真核生物細胞における最も豊富なタンパク質のうちの１つであり、そしてこの２量体タンパク質は、多数の細胞内タンパク質（最も顕著には、ステロイドレセプター）と相互作用する。多数の低分子量分子シャペロンもまた存在する（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ．Ｒｅｓ．２０：４８４−４９１（１９８５））。多数の他のあまり十分には特徴付けられていない分子シャペロンが公知である。Ｈｓｐ４７は、コラーゲン分子シャペロンであるとして公知である（Ｌａｅｍｍｌｉ、１９７０）。特定の分子シャペロンｃｐｎ６０、Ｈｓｐ７０およびＨｓｐ１０４は、アデノシン三リン酸に結合し、そしてアデノシン三リン酸を加水分解する。
【００４１】
哺乳動物被験体のＨＳＰを単離し、さらに分析するために、組織または細胞は、一般的に、ＨＳＰレベルを上昇させない条件下でサンプリングされる。組織または細胞のサンプリング、ＨＳＰ単離および測定、ならびにＨＳＰ複合体の形成の方法は、Ｓａｎｄｅｒｓに対する、米国特許第５，２３２，８３３号および同第５，７８０，２４６号（これらは、本明細書中において参考として援用される）によって記載される。
【００４２】
（代表的年齢のグループ由来のヒト骨サンプルの収集および骨密度測定に関するサンプルプールの特徴付け）
代表的な骨サンプルを、許可を受けた骨バンクから入手し得る。次いで、サンプルプールを、骨密度の測定に基づくデータベースを作製するために特徴付ける。多くの骨密度技術が、骨折の危険性を評価するために臨床的有用性を示している。現在、骨密度の測定について利用可能な２０より多くの異なるデバイスが存在する。いくつかのデバイスは、汎用性（すなわち、測定され得る骨格部位の数）、応答をモニターする能力、費用、有用性、および使用の容易さの点で利点を提供する（表２）。現在、これらの臨床的要件の全てに理想的に取り組む単一のデバイスは、存在しない。
【００４３】
【表２】
2005503533.tif 000003
ａＳＸＡ、シングルＸ線吸光光度計；ＤＸＡ、デュアルＸ線吸光光度計；ｐＤＸＡ、ペリフェラル（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ）デュアルＸ線吸光光度計；ＱＣＴ、定量コンピューター断層撮影；ｐＱＣＴ、ペリフェラル定量コンピューター断層撮影；ＱＵＳ、定量超音波診断法。
【００４４】
（Ｃ．ＷＨＯに従う、骨粗鬆症の確認）
臨床的に有用な骨塩密度（ＢＭＤ）測定について、これらは、確立された規範的なデータと比較して表現される必要がある。すべてのＢＭＤ生産業者は、この目的のために規範的なデータベースを提供する。これらのデータベースは、異なる年齢および人種の多くのグループの男性および女性の両方の骨密度測定から導かれる。比較は、同じ年齢、性別、および人種の健康な個体についての年齢の一致した正常値および若い正常値からの割合またはこのような正常値からの標準偏差の数として表現される。
【００４５】
割合のスコアは、年齢の一致した正常なＢＭＤ（ＡＭＮ）または若く正常なＢＭＤ（ＹＮ）のいずれかに関して、以下の等式を使用して、決定される：
年齢一致についての割合＝
［１＋（ＢＭＤ−ＡＭＮ／ＡＭＮ）］×１００％（Ｈａｒｒｉｓら、Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．１７：８７−９５（１９９２））
若く正常についての割合＝
［１＋（ＢＭＤ−ＹＮ／ＹＮ）］×１００％（Ｆａｕｌｋｎｅｒら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ．１１（補遺）：Ｓ９６（１９９６））。
【００４６】
代表的に、デンシトメトリー分析ソフトウェアは、これらの割合の値を計算し得る。標準偏差（ＳＤ）スコアはまた、通常、デンシトメトリーソフトウェアによって提供される。年齢一致のＳＤスコアは、通常、「Ｚスコア」と呼ばれ、一方、若く正常の標準偏差スコアは、「Ｔスコア」と標識されている。しかし、異なるデンシトメトリーシステムは、これらのパラメーターについて異なる名称を有し得る。
【００４７】
年齢一致またはＺスコアは、同じ年齢、性別および人種（ＡＭＮ）の差についての患者のＢＭＤと正常なＢＭＤとの間の差を、正常な集団のＳＤによって割ったものとして計算される。これは、以下の式を使用して、デンシトメトリーシステムによって計算される：
Ｚ＝（ＢＭＤ−ＡＭＤ）／ＳＤ
若く正常またはＴスコアは、ＢＭＤの差が、ＹＮ骨密度で表現されることを除いて、類似の様式で規定される：
Ｔ＝（ＢＭＤ−ＹＮ）／ＳＤ
骨粗鬆症の診断について、ＷＨＯは、任意の骨格部におけるＢＭＤ測定に基づいて、骨粗鬆症の評価についての以下の基準を規定している。
【００４８】
１．正常：ＢＭＤが、ＹＮよりも１ＳＤ以下で、下である（Ｔスコア≦−１）。
【００４９】
２．低い骨質量（オステオペニア）：ＢＭＤが、ＹＮよりも１〜２．５ＳＤだけ下である（Ｔスコア＜−１および＞−２．５）。
【００５０】
３．骨粗鬆症：ＢＭＤが、ＹＮよりも２．５ＳＤ以上で、下である（Ｔスコア≦−２．５）。
【００５１】
４．重症の骨粗鬆症：ＢＭＤが、若く正常よりも２．５ＳＤ以上で、下であり（Ｔ≦−２．５）、１箇所以上の脆弱性の骨折の存在がある。
【００５２】
（骨サンプルにおける、種々の細菌シャペロンおよび哺乳動物シャペロンの存在を同定するためのサンプル分析）
（骨サンプルからのシャペロン分子の抽出）
全ての骨サンプル（ＢＳ）は、滅菌生理食塩水において収集され得、遠心分離され得、手短に生理食塩水において洗浄され得、そして凍結乾燥され得る。シャペロン分子は、例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、（１９８５）によって記載されるような穏やかな生理食塩水抽出によって、種々の細菌から取り出される。簡単に述べると、骨サンプルは、滅菌生理食塩水において懸濁され、４℃で１時間穏やかに攪拌する。次いで、細片を遠心分離のような手段によって取り除き、そして可溶性の成分を蒸留水に対して広範囲に透析し、そして凍結乾燥する。ＢＳのタンパク質含有量は、Ｌｏｗｒｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９３：２６５−２７５（１９５１）によって記載されるような方法によって決定され得、炭水化物含有量は、Ｄｕｂｏｉｓら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２８：３５０−３５６（１９５６）に記載されるような方法によって決定され得、そして核酸含有量は、２６０／２８０における吸収によって実行する。ＬＰＳ含有量は、製造業者の指示に従って、Ｐｙｒｏｇｅｎｔ、Ｂｙｋ−Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ、Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫによって市販されるような、市販の色素原性Ｌｉｍｕｌｕｓアメーバ様細胞溶解物アッセイを使用して測定され得る。
【００５３】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
ＢＳの成分は、例えば、Ｌａｅｍｍｌｉら、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄ．）２２７：６８０−６８５（１９７０）によって記載されるような方法に従って、１２％ゲルを使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析され得る。当業者は、他の適切な方法を認識する。サンプルは、サンプル緩衝液を用いて、１：１のような適切な程度まで希釈され得、そして充填の前に、５分間のような期間、煮沸され得る。ゲルは、例えば、ＭｉｎｉＰｒｏｔｅａｎ  ＩＩシステム（Ｂｉｏ  Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して実行され得、そして例えば、クマシーブリリアントブルー（Ｓｉｇｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いて染色され得る。分子量マーカーは、Ｄａｌｔｏｎ標準（Ｓｉｇｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）または当業者が認識し得る任意の他の標準に基づき得る。ゲルはまた、タンパク質の存在および炭水化物の存在の両方を検出するために、市販のキット（例えば、Ｇｅｌｃｏｄｅ（Ｃ）マーク銀染色キット；Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）によって市販されるようなキット）を使用して、銀染色され得る。
【００５４】
（２次元ＰＡＧＥ）
２次元ＰＡＧＥゲルを、Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５０：４００７−４０２１（１９７５）によって記載されるような方法を使用して実行し得る。ゲルは、例えば、ＭｉｎｉＰｒｏｔｅａｎＴＭ  ＩＩシステムを使用して実行され得、そして例えば、上記のような類似の分子量マーカーと共に、例えば、クーマシーブルーを用いて染色され得る。第１次元（等電点電気泳動）は、１〜１４、好ましくは、３〜１０のｐＨ範囲にわたり得る。第２次元の分離は、例えば、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを使用する、分子量分離によって実行され得る。
【００５５】
（免疫ブロット法）
１次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたは２次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離されたサンプルを、一晩、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡによって市販されるヒンモビロン（ｈｎｍｏｂｉｌｏｎ）Ｐ  ポリビニルジフルオリド膜のような膜上にエレクトロブロット（ｅｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔ）され得る（Ｌａｅｍｍｌｉ、１９７０）。膜を、例えば、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（ＰＢＳ−Ｔ）を含むＰＢＳを用いて洗浄し得、そして２％ＦＣＳ（ブロッキング緩衝液）（ＳｅｒａＬａｂ）を含むＰＢＳ−Ｔを用いてブロックし得る。次いで、ブロックされた膜を、１時間のような期間、試験抗体（ブロッキング緩衝液中）を伴ってインキュベートし得、そして緩衝液（例えば、ＰＢＳ−Ｔ）を用いて洗浄し得る。結合した試験抗体（抗マウス）ＩｇＧを、例えば、ＰＢＳ−Ｔ２％  ＦＣＳ中で、１：１，０００において、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（γ−鎖特異的）（Ｓｉｇｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用して、検出し得る。最終の洗浄の後に、ブロットを、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ＢＤＩ−Ｉ）および０．０５％過酸化水素（Ｓｉｇｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含む、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（Ｓｉｇｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（ｐＨ７．６）中で、１ｍｇ／ｍｌの３，３プライム（ｐｒｉｍｅ）−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド（Ｓｉｇｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｃａｌｓ）のような溶液を用いて発色させ得る。各反応を、蒸留水を用いて広範囲にリンスすることによって終了させ得る。
【００５６】
（タンパク質精製）
粗製のＢＳは、カラムクロマトグラフィーを用いて分画され得る（例えば、Ｑ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭアニオン交換カラム（５０ｃｍ×１．６ｃｍ）で４℃での分画）。このカラムは、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）（緩衝液Ａ）のような溶液中で平衡化され得る。このＢＳ（一般に１００〜４００ｍｇ）は、同じ緩衝液中でロードされ得る。このカラムは、溶液（例えば、５００ｍｌの緩衝液Ａ）を用いて洗浄され得、次いで、例えば、１，０００ｍｌの緩衝液Ａ中で０〜２Ｍの直線勾配のＮａＣｌを用いて溶出され得る。画分は、収集され得、その吸光度が、２８０ｎｍで観察され得る。溶骨性シャペロンタンパク質の位置が、活性アッセイ（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびウェスタンブロット分析）の組合せによって測定され得る。溶骨性活性を含む画分を、例えば、脱イオン水に対して透析して、塩を除去し、そして凍結乾燥し得る。最も高い特異的活性およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の最も少ない数のタンパク質のバンドを有する画分が、さらに第２のカラム（例えば、アニオン交換カラム）で室温で分画され得る。
【００５７】
画分の純度が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってか、または当業者によって認識され得る別の手段を用いて、可視的に再度評価され得、そして１００ｐｇの最も純粋な画分が、１０ｍＭのＫＣｌおよび１０ｍＭのＭｇＣｌ２を含む５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．６）（緩衝液Ｃ）に対して透析され得る。このサンプルは、例えば、５ｍｌのＡＴＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ（Ｓｉｇｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）カラムで流され得る。このカラムは、緩衝液Ｃを用いて洗浄され得、そして結合したタンパク質はまた、緩衝液Ｃ中の５ｍＭのＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で溶出され得る。タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって位置づけられ得、銀染色キット（Ｓｉｇｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いて可視化され得る。ゲルろ過は、ＡＴＰ−アフィニティークロマトグラフィーのような方法によって単離される溶骨性シャペロンタンパク質の分子量範囲を測定するために用いられ得る。これは、精製されたタンパク質を、緩衝液（例えば、０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．７））中でカラム（例えば、Ｂｉｏ−Ｓｉｌ  ＴＳＫ２５０（Ｂｉｏ  Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）カラム）に流し、そして２０５ｎｍと２８０ｎｍとの間の範囲における波長で、収集された画分の吸光度を測定することによって、成し遂げられ得る。
【００５８】
（臨床的結果の計量値に対するデータ分析および相関関係）
実験的な知見および臨床的な骨密度測定値およびＱ−ＣＴ測定値が、例えば、数値のコードシステムを用いる標準的な関係型コンピュータデータベースを用いて実証され得る。１つの実施形態において、コンピュータプログラムＳＰＳＳ／ＰＣ＋９．０（ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．，４４Ｎ．Ｍｉｃｈｉｇａｎ  Ａｖｅ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ  ６０６１１）が、編集されたデータの統計学的分析に使用される。未加工データの記述統計学が、度数分布表を用いて実行され得る。正規分布が、正規性にあてはめること、および正規確率プロットを得ることによって測定され得、ここで、階数化された観測残差（平均からの偏差）は、ｙ軸上の正規分布の標準化された値に対してｘ軸上にプロットされる。次いで、観測残差が直線上に位置する場合、正規分布が示され得る。平均値間の有意差は、従属サンプルおよび独立サンプルについてのＴ−検定ならびに一元ＡＮＯＶＡ分散分析を用いて評価され得る。多変量変数を用いたＡＮＯＶＡからの統計学的に有意なＦ−検定の場合、寄与平均値が、不均等なサンプルサイズについてのＴｕｋｅｙ  ＨＳＤ検定を用いるポストホック（ｐｏｓｔ−ｈｏｃ）比較によって区別され得る。後者の２つの検定は、種々のシャペロン分子の出現率、ならびに患者の年齢および性別、および他の付随する病状に従う骨減少性骨サンプルの存在を測定し得る。従って、オステオペニアと相関する主なシャペロン分子が同定され得る。
【００５９】
オステオペニア、年齢、性別、他の寄与因子、およびシャペロン分子の存在の間の関係が、例えば、多元度数分布表を作成することによってクロス集計法を用いて確立され得る。これらの変数のそれぞれの可能な組合せについて、これらの表は、区画度数（すなわち、この特定の組合せを有する患者集団における場合の数）を作成する。さらに、このようなクロス集計法は、これらの関係のテストの信頼性を評価することを可能にする。故に、オステオペニアの存在、年齢、性別、他の寄与因子（例えば、病状）は、分類的な変数である。多元度数分布表の変数間の多数の連立関係および相互関係は、対数線形方程式に基づいて試験され得、これは、含まれる変数が無関係である場合、期待される区画分布の算出を可能にする。これは、例えば、反復比例適合方法を用いて実行され得る。従って、期待度数からの観測値の有意な偏差は、特異的シャペロン分子とオステオペニアとの間の統計学的に有意な関係を反映し得る。期待度数からの観測値の偏差の有意検定が、Ｐｅａｒｓｏｎ  χ２検定を介して実行され得る。残差度数は、観測度数から期待度数を引き算することによって計算され得る。何の関係も存在しない場合、全ての残差度数が、類似の大きさの正の数および負の数からなり、そして度数分布表の区画にわたって一様に分布されることが期待される。それ故、残差のプロッティングは、シャペロン分子の存在とオステオペニアとの間の相関関係を評価する別の手段として使用される。この研究において実行される全ての統計学的試験において、危険率（例えば、ｐ＜０．０５の１つ）が、選択され得る。当業者は、適切な危険率を選択し得る。
【００６０】
（ＩＶ．細菌および／または分子シャペロンマーカーを用いた骨粗鬆症の診断）
本明細書中で開示される骨粗鬆症を診断する方法は、一般に以下を含む：１）哺乳動物の被験体の組織または細胞をサンプリングする工程、２）マーカーのレベルを測定する工程、および３）マーカーのレベルが、コントロール群のメンバーにおけるマーカーの標準レベルよりも高い場合、骨粗鬆症を有するとして哺乳動物の被験体を診断する工程。この方法は、必要に応じて、マーカーを単離する工程を含み得る。コントロール群は、因子（例えば、地理的位置、性別および／または年齢）に従って選択される。あるいは、同じ哺乳動物の被験体における２回以上のマーカーの測定がなされ、そして数時間（例えば６時間）、数日（例えば１０日間）から数ヶ月または数年までの範囲の過程の間で比較される。後の測定またはアッセイのマーカーのレベルが、先の測定またはアッセイにおけるマーカーのレベルよりも高い場合、その哺乳動物の被験体は、骨粗鬆症を有すると指摘される。所望される場合、時々、骨粗鬆症を診断する２つの方法が、組合せで用いられ得る。
【００６１】
好ましくは、哺乳動物の被験体は、ヒトである。最も好ましくは、哺乳動物の被験体は、閉経後の女性である。
【００６２】
マーカーは、細菌、細菌の生成した因子、またはシャペロン分子のいずれかであり得る。１つの実施形態において、マーカーは細菌である。代表的な細菌マーカーは、以下である：Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｌｉｓ、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ  ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｉｎｔｅｒ−ｍｅｄｉａ、Ｃａｍｐｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｒｅｃｔｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ。
【００６３】
別の実施形態において、マーカーは、シャペロン分子であり得る。代表的なシャペロン分子マーカーは：ＨＳＰ７０、ＨＳＰ７０、ｇｐ９６、ｃｐｎ１０およびｃｐｎ２０単独または組合せである。好ましくは、マーカーはヒトＨＳＰである。
【００６４】
なお別の実施形態において、マーカーは、細菌が生成した因子（例えば、内毒素−ＬＰＳ、ガプスタチン（ｇａｐｓｔａｔｉｎ）、または皮膚壊死性毒素（ＤＮＴ））であり得る。
【００６５】
（Ｖ．骨粗鬆症を処置または予防する方法）
（Ａ．ＨＳＰ試薬の調製および精製）
ＨＳＰタンパク質およびそれぞれのペプチド複合体の調製および精製は、当該分野における知識内である。この複合体は、選択された組換え宿主細胞由来のＨＳＰ、および病気の骨細胞および組織細胞のｃＤＮＡから発現される抗原性ペプチドを有する細胞内で生成される複合体であり得；従って、この複合体の抗原性ペプチドは、このような骨細胞において見出される抗原性ペプチドの代表である。一般に、ＨＳＰ複合体を調製する方法は、１つ以上の個体から病気の骨細胞または他の組織細胞を得る工程（例えば、単離する工程）、細胞からＲＮＡを調製する工程、ＲＮＡからｃＤＮＡを作製する工程、ｃＤＮＡを宿主細胞中に導入する工程、病気の骨細胞由来ｃＤＮＡが発現されるように宿主細胞を培養する工程、および宿主細胞からＨＳＰ−ペプチド複合体を精製する工程を含む。
【００６６】
本明細書中で「病気の骨ｃＤＮＡ」といわれる病気の骨細胞ＲＮＡまたは組織細胞ＲＮＡから調製されるｃＤＮＡは、発現のための宿主細胞中に導入される前に、必要に応じて増幅される。このｃＤＮＡは、発現の前に複製の目的のためのクローニングベクター中に、必要に応じて挿入される。ｃＤＮＡは、発現ベクター中に挿入されるか、または染色体内に統合され、インビトロで適切な宿主細胞においてコードされるタンパク質を発現する目的のための調節エレメント（例えば、プロモーター）に作動可能に連結される。このｃＤＮＡは、宿主細胞中に導入され、ここでｃＤＮＡは宿主細胞によって発現され、これによって、細胞内でＨＳＰおよびペプチドの非共有結合の複合体を生成する。組換え宿主細胞は、大量の免疫原性複合体の生成のために大量に培養され得る。病気の骨ｃＤＮＡライブラリーは、将来の使用のために（例えば、凍結乾燥または凍結によって）保存され得るか、または免疫原性複合体に対する需要の増加に対処するために適切な宿主細胞中でのクローニングベクターにおける複製によって拡大され得る。
【００６７】
病変した骨組織のｃＤＮＡを発現する宿主細胞から調製される免疫原性組成物は、ペプチド（特に、ＲＮＡが本来誘導される病変した骨細胞由来のペプチド）に非共有結合される宿主細胞のＨＳＰの複合体を含む。このような複合体は、患者中の病変した骨細胞に対する、治療的または予防的に有効な免疫応答を誘導し得る。好ましくは、患者は、ｃＤＮＡを作製するために使用される病変した骨細胞が得られた被験体である。あるいは、病変した骨細胞は、患者とは異なるが病変した同一の組織型の骨組織を有する１以上の被験体由来であり得る。
【００６８】
必要に応じて、病変した骨組織のｃＤＮＡを発現するための宿主細胞はまた、１つ以上のＨＳＰ遺伝子を組換え的に共発現するように遺伝子操作され得、その結果、増加量のＨＳＰに非共有結合された免疫原性ペプチドを含む複合体が生成され得る。
【００６９】
ＨＳＰタンパク質、それらの各々のペプチド複合体の調製および精製、ならびに抗原性成分／免疫原性成分の単離は、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａに対する米国特許第５，８３０，４６４号；同第５，９４８，６４６号および同第６，０３０，６１８号（「ｔｈｅ  Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ特許」）において開示される。Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ特許はまた、ＨＳＰ−抗原性分子複合体のインビトロ生成、およびＨＳＰ−ペプチド複合体の免疫原性の決定のための適切な手順を記載した。Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ特許は、本明細書中に参考として援用される。
【００７０】
好ましい実施形態において、ＨＳＰ−抗原性分子複合体は、個人に対して自系である；すなわち、この複合体は、その個人自身の感染細胞のいずれかから単離される（例えば、好ましくは、患者の感染組織から調製される）。あるいは、この複合体はインビトロで生成される（例えば、ここでは、外因性抗原性分子との複合体が所望される）。あるいは、ＨＳＰおよび／または抗原性分子は、個人からもしくは他人から単離され得るか、または、クローニングしたＨＳＰ（本来は個人または他人由来）を使用する組換え生成法によって作製され得る。ＨＳＰとの複合体化において使用するための外因性抗原、ならびにそのフラグメントおよび誘導体（ペプチドおよび非ペプチドの両方）は、当該分野で公知の外因性抗原、ならびに、抗体もしくは主要組織適合分子（ＭＨＣ分子）に結合する能力（抗原性）、または免疫応答を生じる能力（免疫原性）による当該分野で公知の標準的イムノアッセイによって容易に同定される外因性抗原から選択され得る。ＨＳＰと抗原性分子との複合体は、患者の感染組織から単離され得るか、またはインビトロで生成され得る（このインビトロでの生成は、外因性抗原が抗原性分子として使用される実施形態において必要である）。患者に投与されるＨＳＰ−抗原性分子複合体は、患者に投与されるＡＰＣに感作するために使用されるＨＳＰ−抗原性分子複合体と同一であり得るか、または異なり得る。特定の実施形態（ここで、ＡＰＣおよび複合体は同時に投与される）において、ＡＰＣおよび精製したＨＳＰ−抗原性分子複合体は、投与のために、単一の組成物中または異なる組成物中に存在し得る。
【００７１】
使用され得るＨＳＰとしては以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＨＳＰ７０、ＨＳＰ７０、ｇｐ９６、ｃｐｎ１０およびｃｐｎ２０（単独または組合せで）。好ましくは、ＨＳＰはヒトＨＳＰである。ＨＳＰは患者に対して同種異系であり得るが、好ましい実施形態において、ＨＳＰは、このＨＳＰが投与される患者に対して自系（この患者由来）である。ＨＳＰおよび／または抗原性分子は、天然の供給源から精製され得るか、化学的に合成され得るか、または組換え的に生成され得る。
【００７２】
本明細書中で開示される免疫原性ＨＳＰ−ペプチド複合体としては、哺乳動物において免疫応答を誘導し得るＨＳＰおよびペプチドを含む、任意の複合体が挙げられ得る。このペプチドは、好ましくは、ＨＳＰに非共有結合される。好ましい複合体としては、以下が挙げられ得るがこれらに限定されない：ＨＳＰ６０−ペプチド複合体、ＨＳＰ７０−ペプチド複合体およびＨＳＰ−７０ペプチド複合体。例えば、真核生物細胞の小胞体中に存在し、そして細胞質ＨＳＰ７０に関連するｇｐ９６と呼ばれるＨＳＰは、ｇｐ９６−ペプチド複合体を含む有効なワクチンを生成するために、使用され得る。
【００７３】
抗原性分子に非共有結合されたＨＳＰを含む組成物は、複合体化された抗原性分子に対する（ＨＳＰに対してではない）効果的な特異的免疫応答を誘導するために投与され得る。ＨＳＰ−抗原性分子複合体は、好ましくは、全タンパク質（ｍｇ）の少なくとも７０％、８０％または９０％まで精製される。別の実施形態において、ＨＳＰ−抗原性分子複合体は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によってアッセイした場合に見掛け上均質となるまで、精製される。
【００７４】
ＨＳＰまたはＭＨＣ抗原と内因的に複合体化された免疫原性ペプチドまたは抗原性ペプチドは、骨疾患を処置および／または予防するための抗原性分子として使用され得る。例えば、以下が挙げられるがこれらに限定されない、異なるウイルスタンパク質に対する細胞障害Ｔ細胞応答を刺激するこのようなペプチドが、調製され得る：免疫不全ウイルスＩ型（ＨＩＶ−Ｉ）のタンパク質、ヒト免疫不全ウイルスＩＩ型（ＨＩＶ−ＩＩ）のタンパク質、Ａ型肝炎のタンパク質、Ｂ型肝炎のタンパク質、Ｃ型肝炎のタンパク質、インフルエンザのタンパク質、水痘のタンパク質、アデノウイルスのタンパク質、単純ヘルペスＩ型（ＨＳＶ−Ｉ）のタンパク質、単純ヘルペスＩＩ型（ＨＳＶ−ＩＩ）のタンパク質、牛疫のタンパク質、ライノウイルスのタンパク質、エコーウイルスのタンパク質、ロタウイルスのタンパク質、ＲＳウイルスのタンパク質、パピローマウイルスのタンパク質、パポバウイルスのタンパク質、サイトメガロウイルスのタンパク質、エキノウイルスのタンパク質、アルボウイルスのタンパク質、ハンタウイルス（ｈｕｎｔａｖｉｒｕｓ）のタンパク質、コクサッキーウイルスのタンパク質、ムンプスウイルスのタンパク質、麻疹ウイルスのタンパク質、風疹ウイルスのタンパク質およびポリオウイルスのタンパク質。
【００７５】
別の実施形態において、使用されるＨＳＰ−抗原性分子複合体は、細胞中でインビボで生成される複合体である。あるいは、インビトロで抗原性分子をＨＳＰに複合体化することによって、この抗原性分子を使用することを所望するような実施形態において、ＨＳＰは、このように使用するために、ＡＴＰの存在下または低ｐＨ下で、内因性ＨＳＰ−ペプチド複合体から精製され得る（または、化学合成され得るか、もしくは組換え的に生成され得る）。ＨＳＰおよびそれらの各々の複合体の精製のための手順は、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ特許中に記載される。本明細書中に記載されるプロトコルは、任意の真核生物細胞（例えば、組織、単離された細胞、または、予め選択した細胞内病原体で感染させた不死化真核生物細胞株）からＨＳＰ−ペプチド複合体、または単独のＨＳＰを単離するために使用され得る。
【００７６】
（Ｂ．外因性抗原性分子）
外因性抗原または抗原性タンパク質は、ＨＳＰと複合体化するための抗原分子として使用するために、当該分野に公知の抗原分子から選択され得るか、または、抗体またはＭＨＣ分子と結合し得る（抗原性）か、もしくは免疫応答を生成し得る（免疫原性）イムノアッセイによって決定され得る。抗体への結合を検出することによって免疫原性または抗原性を決定するために、当該分野で公知の種々のイムノアッセイが使用され得、このイムノアッセイとしては以下の技術を使用する競合および非競合アッセイ系が挙げられるが、これらに限定されない：放射性イムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、ゲル内沈降反応、免疫拡散アッセイ、インビボイムノアッセイ（例えば、コロイド状の金標識、酵素標識または放射性同位体標識を使用する）、ウェスタンブロット、免疫沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、赤血球凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイおよび免疫電気泳動アッセイなど。１つの実施形態において、抗体結合は、一次抗体上の標識を検出することによって、検出される。別の実施形態において、この一次抗体は、二次抗体の一次抗体への結合、または試薬の一次抗体への結合を検出することによって、検出される。さらなる実施形態において、この二次抗体が標識される。イムノアッセイにおける結合を検出するための多くの手段が、当該分野で公知であり、そして、使用されることが想定される。免疫原性を検出するための１つの実施形態において、Ｔ細胞媒介応答は、標準的方法（例えば、インビトロ細胞障害（ｃｙｔｏｘｉｃｉｔｙ）アッセイ、またはインビボ遅延過敏症アッセイ）によって、アッセイされ得る。
【００７７】
抗原性分子として使用される潜在的に有効な抗原またはその誘導体はまた、例えば、以下のような種々の基準によって同定され得る：病原体の感染力の中和における抗原の関与（ここで、このような病原体による感染を処置することまたは予防することが所望される）（Ｎｏｒｒｂｙ，１９８５，Ｓｕｍｍａｒｙ，ｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ８５，Ｌｅｒｎｅｒら（編）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，３８８〜３８９頁）、型特異性もしくは群特異性、患者の抗血清または免疫細胞による認識、および／あるいは抗原に対して特異的な抗血清または免疫細胞の防御効果の立証。さらに、病原体によって生じる疾患を処置または予防することが所望される場合、抗原のコードされるエピトープは、好ましくは、時間が経っても、同一の病原体の異なる単離株の間でも、低度の抗原性の変異を示すか、または全く示さない。好ましくは、骨組織のウイルス感染によって生じる骨粗鬆症を処置または予防することが所望される場合、上記で議論されたように、既知のウイルスのエピトープを含む分子が使用される。好ましくは、骨組織の細菌感染によって生じる骨粗鬆症を処置または予防することが所望される場合、上記で議論したように、既知の細菌のエピトープを含む分子が使用される。骨組織の原生生物感染によって生じる骨粗鬆症を処置または予防することが所望される場合、既知の原生生物のエピトープを含む分子が使用される。例えば、このような抗原性エピトープは、以下が挙げられるがこれらに限定されない原生生物から調製され得る；リーシュマニア属、コクジディア（ｋｏｋｚｉｄｉｏａ）属、およびトリパノソーマ属。骨組織の寄生虫感染によって生じる骨粗鬆症を処置または予防することが所望される場合、公知の寄生虫のエピトープを含む分子が使用される。例えば、このような抗原性エピトープとしては、クラミジアおよびリッケチアが挙げられるがこれらに限定されない寄生虫由来であり得る。
【００７８】
（Ｃ．骨粗鬆症を処置する方法）
シャペロン分子マーカーを用いて診断され得る骨の感性性疾患により引き起こされる骨粗鬆症は、上記に記載されるように、ウイルス、細菌、真菌、原生動物および寄生生物を含むがこれらに限定されない骨感染性因子によって引き起こされ得る。本明細書中に開示される骨粗鬆症を処置する方法は、一般的に、骨粗鬆症を引き起こしている感染性因子を処置するために有効な薬物組成物を哺乳動物被験体に投与することを包含する。この薬物組成物は、一般的に、薬物、ならびに必要に応じて、薬物送達キャリアおよび／または１つ以上の生体適合性賦形剤を含有する。例示的な薬物送達キャリアは、リポソーム、天然もしくは生分解性合成ポリマー（例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリヒドロキシアルカノエート）から形成されたミクロ粒子またはナノ粒子、天然のかまたは化学的に改変されたデンプン、キトサンおよびタンパク質（例えば、ゼラチン）である。骨粗鬆症のためのマーカーが、ＨＳＰのようなシャペロン分子である場合、この薬物組成物は、別の分子と共にＨＳＰから形成される１つ以上の複合体を含み得る。
【００７９】
治療的試薬は、本質的に、ＧＭＰ標準に従って精製および調製される診断試薬と同一であり得る。投与の様式としては、皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内、皮内または粘膜が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８０】
本明細書中に開示される治療的レジメンおよび薬学的組成物は、免疫細胞に影響するサイトカインＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＴＮＦ、もしくは他のサイトカインを含むが、これらに限定されない、付加的な免疫応答増強薬または生物学的応答修飾因子と共に使用され得る。ＨＳＰおよび抗原性分子の複合体は、これらのサイトカインの１つ以上との共に組合わせ治療において投与される。
【００８１】
薬物溶解度および吸収位置は、治療的薬剤の投与の経路を選択する際に考慮されるべき因子である。１つの実施形態において、ＨＳＰ−抗原性分子複合体は、任意の所望される投与経路を用いて投与され得る。皮内投与または粘膜投与の利点としては、それぞれ低用量および迅速な吸収の使用が挙げられる。皮下投与または筋肉内投与の利点としては、それぞれいくつかの不溶性懸濁液および油状懸濁液に対する適合性が挙げられる。粘膜経路の投与は、経口、直腸および経鼻の投与を含むがこれらに限定されない。粘膜投与のための調製物は、以下に記載されるような種々の処方物において適切である。
【００８２】
この複合体が、水溶性である場合、この複合体は、適切な緩衝液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水または他の生理学的に適合性の溶液（好ましくは滅菌））中で処方され得る。代替的に、得られた複合体が、水性溶媒中に乏しい可溶性を有する場合、この複合体は、非イオン性界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、またはポリエチレングリコール）を用いて処方され得る。従って、化合物およびそれらの生理学的に受容可能な溶媒化合物は、吸入もしくはガス注入（いずれも口もしくは鼻を通じて）による投与、または経口、頬、非経口、もしくは直腸の投与に対して処方され得る。
【００８３】
経口投与について、薬学的調製物は、液体の形態（例えば、溶液、シロップもしくは懸濁液）であり得るか、または使用前に水もしくは他の適切なビヒクルを用いる再構成のための薬物製品として与えられ得る。このような液体調製物は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または硬化食用脂）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（例えば、扁桃油、油性エステル、または分別された植物油）；および防腐剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピルまたはソルビン酸）のような薬学的に受容可能な添加物と共に、慣用的な手段によって調製され得る。薬学的組成物は、結合剤（例えば、ゼラチン化前（ｐｒｅｇｅｌａｔｉｎｉｚｅ）のトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、滑石またはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）のような薬学的に受容可能な賦形剤と共に慣用的な手段によって調製される、例えば、錠剤またはカプセルの形態をとり得る。この錠剤は、当該分野において周知の方法によって被膜され得る。
【００８４】
経口投与のための調製物は、活性化合物の制御された放出を与えるように適切に処方され得る。
【００８５】
頬の投与について、組成物は、慣用的な様式で処方される錠剤または舐剤の形態をとり得る。
【００８６】
この化合物は、注射による（例えば、ボーラス注射または連続注入による）非経口の投与のために処方され得る。注射のための処方物は、添加される防腐剤と共に、単位投薬形態（例えば、アンプル中または多用量容器中）で与えられ得る。この組成物は、油性または水性のビヒクル中で懸濁液、溶液もしくは乳濁液のような形態をとり得、そして懸濁剤、安定剤および／または分散剤のような処方剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔ）を含有し得る。代替的に、活性成分は、使用前に、適切なビヒクル（例えば、無菌の発熱物質のない水）を用いる構成のための粉末形態であり得る。
【００８７】
この化合物はまた、例えば、カカオ脂または他のグリセリドのような慣用的な坐薬基剤（ｂａｓｅ）を含有する、坐剤または蓄積（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）浣腸のような直腸の組成物で処方され得る。
【００８８】
すでに記載される処方物に加えて、この化合物はまた、貯留（ｄｅｐｏｔ）調製物として処方され得る。このような長く作用する処方物は、移植（例えば、皮下または筋肉内）によってかまたは筋肉内注射によって投与され得る。従って、例えば、この化合物は、適切な高分子材料もしくは疎水性材料（例えば、受容可能な油中の乳濁液として）またはイオン交換樹脂と共に、あるいはやや可溶性の誘導体として（例えば、やや可溶性の塩として）処方され得る。リポソームおよび乳濁液は、親水性薬物についての送達ビヒクルまたはキャリアの周知の例である。
【００８９】
吸入による投与について、使用のための化合物は、慣用的に、適切な推進薬（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切な気体）の使用と共に、加圧されたパックまたは噴霧器からのエアロゾルスプレー呈示の形態で送達され得る。加圧されたエアロゾルの場合、投薬単位は、定量を送達するバルブを提供することで決定され得る。吸入器または注入器での使用のための、例えば、ゼラチンのカプセルおよび薬包は、化合物の粉末混合物および適切な粉末基剤（例えば、ラクトースまたはデンプン）を含有して処方され得る。
【００９０】
（Ｄ．細菌またはＨＳＰにより誘導される骨粗鬆症に対する耐性）
細菌性感染または骨疾患により引き起こされる骨粗鬆症は、免疫原性組成物を哺乳動物被験体に対して投与して免疫することによって処置され得る。１つの実施形態において、免疫原性組成物は、弱毒化されたかまたは改変された感染性因子を含有し得る。別の実施形態において、免疫原性組成物は、ＨＳＰを含有し得る。ＨＳＰによる骨疾患に対する免疫は、十分に実証される。例えば、ラットアジュバント関節炎（ＡＡ）において、耐性は、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）におけるマイコバクテリアのＨＳＰ６０を用いる免疫により誘導され得た。同様の所見が、マイコバクテリアならびにＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのＨＳＰ７０およびＨＳＰ１０で得られ、そしてマイコバクテリアのＨＳＰ６０を用いるＤＮＡワクチン接種もまた、防御性であった。Ｂａｒｄｗｅｌｌ，Ｊ．Ｃ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：８４８−８５２（１９８４）；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ｇ．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，５：１２３９−４５。マイコバクテリアまたはヒトのＨＳＰ６０のいずれかを発現する組換えワクシニアウイルスを用いる免疫は、疾患の誘導後に投与された場合であっても、ＡＡを抑制することが見出された。マイコバクテリアのＨＳＰ６０について、経口投与はまた、ラットＡＡを阻害することが示され；この場合、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｍｔ）由来のマイコバクテリア抗原を誘発する疾患に対する増殖性の応答を抑制したトランスホーミング増殖因子（ＴＧＦ−β）産生細胞の誘導についての証拠が存在し、従って疾患耐性の潜在的な機構を暗示する（Ｉｒｂｙ，Ｒ．Ｂ．ら）。
【００９１】
【表３】
2005503533.tif 000004
ＨＳＰ６０を用いる予備免疫は、連鎖球菌細胞壁誘導性関節炎−８、ならびに重要なことには、非微生物的に誘導されるモデル（例えば、アブリジン（ａｖｒｉｄｉｎｅ）−９（合成非免疫原性の類脂質性アミン）またはプリスタン誘導性関節炎、およびコラーゲン誘導性関節炎）のような、他の関節炎モデルにおいて自己免疫に対する耐性を誘導することが見出されている。同様に、ラットにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）および非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）マウスにおける糖尿病の発生は、ＨＳＰ６０を用いる事前免疫により阻害されることが見出されている。従って、ＨＳＰに対する免疫学的曝露は、種々の形態の誘導性または自発性の自己免疫に対する耐性をもたらし得る。
【００９２】
種々のモデルに基づく報告は、集合的に、ＨＳＰ６０により誘導される自己免疫に対する耐性は、実際の自己免疫疾患の要因に無関係に作用し、そして抑制効果は、ストレス（炎症）でアップレギュレーションされた自己ＨＳＰに対して応答する抗炎症性Ｔ細胞の誘導に起因することを示す。炎症した関節における自己ＨＳＰ６０のアップレギュレーションされた発現は、実験モデルおよびヒトの両方で示されている。ＨＳＰ６０媒介性の防御が、ＮＯＤ糖尿病で実証され、そして自己ＨＳＰのアップレギュレーションされた発現が、炎症した島で生じ、従って自己ＨＳＰに特異的な抗炎症性Ｔ細胞がまた、このモデルにおいて、同様の疾患抑制活性を生成し得るようである。明らかに、このような抑制活性は、ＣＤ４＋  Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）媒介性の慢性関節炎症およびインスリン産生Ｔ細胞の一次（ｐｒｉｍａｒｉｌｙ）ＣＤ８＋  Ｔ細胞媒介性の破壊と同様に多様な条件で有効である。従って、自己ＨＳＰ分子の認識は、自己寛容の樹立または維持に寄与する、重要な免疫学的ストラテジーであり得る。同じことは、感染により引き起こされる炎症の場合にあてはまり、ＨＳＰに対するＴ細胞応答が、それらの起源に無関係に、炎症性応答の制御およびダウンモジュレーション（ｄｏｗｎｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）に作用することを論理的に結論し得る。
【００９３】
（関節炎患者におけるＨＳＰに対する免疫応答）
ＨＳＰに関する免疫反応性は、広範囲にわたって研究されている。例えば、若年性関節リウマチ（ＪＲＡ）の小児におけるＨＳＰ６０に対するＴ細胞の増殖性応答をモニタリングする場合、応答は、疾患の進行性（多関節または全身性）の形態の患者ではなく、疾患の自発的に軽減する少関節（ｏｌｉｇｏａｒｔｉｃｕｌａｒ）の形態（ＯＡ−ＪＲＡ）の患者において排他的に存在することが見出された。このような応答は、これらが回復の進行（すなわち、疾患の抑制）と一致することを示唆する変動パターンを示した。これらの患者におけるＴ細胞の分析は、Ｔｈ２型応答を示す、ＨＳＰ６０を用いる活性化の際に、インターロイキン４（ＩＬ−４）およびＴＧＦ−βの産生ならびにＣＤ３０の過剰発現を示した。さらに、そのようなＨＳＰ６０感受性患者の滑膜におけるＩＬ−４およびＩＬ−１０についてのアップレギュレーションされたｍＲＮＡレベルが、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって観察された。
【００９４】
そのようなＨＳＰ６０反応性Ｔ細胞の大部分は、ミコバクテリアＨＳＰ６０分子に対してだけでなく、特に、ヒトＨＳＰ６０に対しても応答することが見出された。疾患の自己軽減形態におけるそのようなＴｈ２型細胞の存在によって、ヒトにおけるこれらのＴ細胞の保護性が示唆される。成人の慢性関節リウマチ（ＲＡ）患者でのＨＳＰに対する免疫反応性について種々の研究が報告されている。体液性応答およびＴ細胞媒介性応答の両方が観察されているが、ＨＳＰに対する免疫応答は、ＲＡにおいて一般的かつ優勢な特徴ではないようであり；確かに、その疾患の、進行した形態または進行性の形態では見いだされないようである。しかし、初期の報告において、自己ＨＳＰ６０交差反応性Ｔ細胞応答を示すＲＡ患者が、疾患の迅速な軽減過程を有することが明確に記録された。成人ＲＡ患者におけるＨＳＰに対するＴ細胞増殖性応答の最近の研究によって、ヒトＨＳＰ６０に対する応答は、インビトロでＩＬ−４を添加することで惹起されたことが明らかにされた。この応答が、ミコバクテリアＨＳＰ６０に対する応答に関して観察されなかったことから、ＯＡ−ＪＲＡにおける所見と一致して、ヒト（自己）分子の認識によって、調節性の表現型を有するＴ細胞が、優先的に刺激されるようである。ＲＡ患者由来のヒトＨＳＰ６０特異的Ｔ細胞株を、自己末梢血単核細胞に添加した同時培養実験によって、これらのＴ細胞の調節的性質が確認された。なぜならＲＡ患者由来の単核細胞において、腫瘍壊死因子α産出を阻害することが見出されたからである。
【００９５】
ＨＳＰは、調節性Ｔ細胞応答に対する標的である。ＨＳＰは、ＨＳＰを重篤な免疫状態にするようである独特の特徴（特に、そのストレス依存性差次的発現）を有する。ＨＳＰ６０の強い構成的発現が、胸腺髄質上皮中に示されたが、自己ＨＳＰに対する末梢Ｔ細胞応答は、豊富である。従って、自己ＨＳＰ特異的Ｔ細胞は、おそらく、ポジティブに選択され、その後ネガティブな選択から逃れるが、このことは、Ｔ細胞のレセプターが自己ＨＳＰ分子に対して低い親和性を有することを示唆する。末梢において、ＨＳＰ６０のような、ＨＳＰの構成的発現のレベルは低く、これらの自己抗原に対する末梢寛容は、他の、より豊富に入手可能な自己タンパク質に対する末梢寛容よりも厳重でないようである。炎症性ストレスの条件下において、ＨＳＰ合成は、大雑把にアップレギュレートされ、危険な、または潜在的に有害性の炎症性状態をモニターおよび制御する標的を免疫系に提供する。
【００９６】
ＨＳＰの特徴的な性質のいくつかは、重要である。第１に、進化上の保存のその独特の程度は、免疫細胞による微生物ＨＳＰおよび自己ＨＳＰの、立証された交差認識に関する分子的基礎を提供する。第２に、微生物ＨＳＰは、高度に免疫原性であり、そして健康な個体は、自己ＨＳＰ反応性Ｔ細胞を有する。第３に、任意の細胞型のＨＳＰは、体内のいたるところにおいて、即座のアップレギュレーションによって、ストレスに対して応答する。これらの特徴のいくつかは、天然にある他のタンパク質について個々に当てはまり得るが、この３つの特徴の組合せは、ＨＳＰに特有である。
【００９７】
（ＨＳＰ反応性Ｔ細胞による調節に導く機構）
多くの可能な機構は、炎症部位での、自己ＨＳＰ反応性Ｔ細胞の、調節性の表現型に寄与し得る。そのような機構は、免疫系における自己ＨＳＰ反応性Ｔ細胞の持続および安全な封じ込めを担う末梢寛容機構に、関連することが提唱される。第１に、末梢組織における、低いレベルの自己ＨＳＰ発現のせいで、自己ＨＳＰ特異的Ｔ細胞は、自己ＨＳＰ分子を単に無視するという可能性がある。感染の際または腸粘膜において、微生物ＨＳＰに対して曝された後にのみ、保存された微生物ＨＳＰエピトープに対して交差特異性を有するこれらのＴ細胞は、刺激および増幅される。これらの自己免疫炎症において、自己ＨＳＰ発現は、アップレギュレートされ、局所的に応答するＴ細胞は、自己ＨＳＰエピトープとの低い親和性で相互作用に携わる。このことは、これらの細胞におけるダウンレギュレーション性のＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β（Ｔｈ２）の表現型を導き、バイスタンダー（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ）調節を引き起こす。
【００９８】
第２に、末梢中の本職でない（ｎｏｎｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ）抗原提示細胞（ＡＰＣ）すなわち非活性化ＡＰＣによる自己ＨＳＰエピトープの低レベル発現、または「寛容化」腸環境中の、保存された微生物ＨＳＰのエピトープは、通常の条件下において、Ｔ細胞によって、連続的に認識されることが可能性がある。この認識は、そのようなＴ細胞を調節性表現型またはアネルギーの方に、向かわせ得る。本職のＡＰＣ上に過剰発現されたＨＳＰの認識の後に、炎症部位でのこれらの細胞の次の関与は、その細胞の調節活性を増進し得る。最近、本職の（ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ）ＡＰＣの非存在下で抗原を使用して生成されたアネルギー性Ｔ細胞が、アネルギー性細胞によって認識される抗原が、培養物中に存在する場合、ＡＰＣ存在下で他のＴ細胞の増殖応答に対するバイスタンダー抑制を発揮したことが実証された。ＨＳＰの場合、このことは、休止ＨＳＰ特異的Ｔ細胞が、その調節活性を、ＨＳＰが一時的に過剰発現される炎症部位へ集束することを意味し得る。感染の間、そのようなアネルギー性レギュレーターの活性は、保存されていない微生物ＨＳＰエピトープに対して、および末梢の他のところでは「サイレンシングされない」Ｔ細胞によって認識される、他の微生物のエピトープに対して（活発に）応答するＴ細胞の優勢な頻度によって、過剰に見積もられている。
【００９９】
第３の可能性は、自己ＨＳＰエピトープがＡＰＬとして、Ｔ細胞によって認識されるか、または「完全なアゴニスト」の微生物ＨＳＰエピトープの「部分的アゴニスト」の密接に関連する改変体であることである。ＡＰＬは、Ｔ細胞を完全に活性化しないが、調節性サイトカインの産生のような、特定のエフェクター機能を誘発する能力を有する。これは、ＨＳＰの場合に、有益な戦略であり得る。なぜなら、腸の中、または感染の間、完全なアゴニストの微生物ＨＳＰエピトープに対して曝すことは、自己ＨＳＰまたはＡＰＬ指向性（調節性）レパートリーを拡大するからである。自己免疫炎症の間、アップレギュレートされた自己ＨＳＰは、ＨＳＰ反応性細胞において、調節性の表現型を誘導するＡＰＬとして働く。ＡＰＬは、概して、予測できず、かつ多様な効果を有し得るが、このモデルにおいて、ＡＰＬ様自己ＨＳＰが、胸腺のポジティブな選択に関与し、ＡＰＬとの低親和性の相互作用のみを有するＴ細胞を生成すると仮定されている事実は、ＡＰＬのこの特定の型に対する（調節的な）方向性を与え得る。
【０１００】
（分子シャペロンによる骨再吸収の刺激）
細菌の分子シャペロンの１つのクラスであるシャペロニンは、骨再吸収の強力な誘導体であることが、最近発見された（Ｎａｉｒら、Ｃａｌｃｉｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ  ６４（３）：２１４−８（１９９９）。シャペロニンの骨溶解性活性が、このタンパク質のクラスに特有であるかどうか、またはこの活性が、一般的に分子シャペロンの共通の特徴であるかどうかという疑問に取り組むために、多くの細菌分子シャペロンおよび哺乳動物分子シャペロンが、マウス頭蓋冠骨再吸収アッセイで活性に対して試験された。全てのＥ．ｃｏｌｉの分子シャペロン（ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳ、およびｄｎａＫ）が、活性であることが見出されている。ｇｒｏＥＬの骨溶解性活性が、インドメタシンおよびインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）天然のアンタゴニストによって阻害されたが、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の中和または５−リポキシゲナーゼの阻害による影響を受けなかった。分子量２７ｋＤａ、４７ｋＤａ、７０ｋＤａ、および９０ｋＤａの哺乳動物分子シャペロンもまた試験され、４７ｋＤａタンパク質の例外を有するが、マウス頭蓋冠アッセイにおいて、全て活性を示した。従って、分子シャペロンは、骨外植片培養物において細胞のプロセスを調整し、石灰化したマトリクスの再吸収が生じる能力を有するようである。
【０１０１】
本明細書中に開示されるＨＳＰ複合体を使用する骨疾患の処置方法は、養子免疫療法を含む。ＨＳＰ複合体は、抗原提示細胞（「ＡＰＣ」）および／またはマクロファージ細胞の感作に使用され得る。マクロファージおよび／またはＡＰＣを感作するためにＨｓｐ複合体を使用する方法は、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａへの米国特許第５，９８５，２７０号によって記載されている。従って、本明細書中に開示される養子免疫療法は、参考として本明細書中で完全に援用される。ＡＰＣは、当該分野において公知のこれらの抗原提示細胞から選択され得る。この抗原提示細胞には、マクロファージ、樹状細胞、Ｂリンパ球およびそれらの組合せが挙げられる（がこれらに限定されず）、好ましくはマクロファージである。ＨＳＰ複合体感作ＡＰＣは、ＨＳＰ抗原分子複合体の投与と、同時または前もしくは後に投与され得る。本明細書中に開示される養子免疫療法は、ＨＳＰ抗原分子複合体と共に、インビトロでインキュベーションすることによって、抗原提示細胞の活性化を可能にする。好ましくは、インビボでの細胞の使用の前に、インビトロでの骨感染性因子に対する反応性の測定を行う。このインビトロでの上昇に続いて、クローン選択および／またはクローンの拡大を行い、そして患者の投与は、有用な治療的／予防的戦略を構成する。
【０１０２】
骨粗鬆症を処置および／または予防する方法は、骨粗鬆症の処置および／または予防が所望される個体において、有効量の抗細菌組成物またはＨＳＰ複合体を含む組成物をその哺乳動物の被験体に投与することによって、免疫応答を誘発することを含む。ＨＳＰ複合体は、本質的に、本明細書中に開示される養子免疫療法と組合わせた投与の任意の従来の様式を使用して、抗原分子に非共有結合的に結合するＨＳＰである。投与の様式としては、皮下様式、筋内様式、静脈内様式、腹腔内様式、心房内様式、粘膜様式が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０３】
（治療的投薬量）
薬物用量は、１平方メートルの体表面積あたりのミリグラム数で提供される。なぜなら、体重ではなくこの方法が、特定の代謝機能および排泄機能と良い相関を達成するからである（Ｓｈｉｒｋｅｙ，Ｈ．Ｃ．，１９６５，ＪＡＭＡ  １９３：４４３）。さらに、体表面積は、成人および小人においての、ならびに以下の表１に示される異なる動物種においての、薬物投薬量に対する共通の特徴として使用され得る（Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈ，Ｅ．Ｊ．ら、１９６６，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐ．Ｒｅｐ．５０：２１９−２４４）。
【０１０４】
【表４】
2005503533.tif 000005
例：ｍｇ当量／ｍ２用量として、任意の所定の種において、ｍｇ／ｋｇ用量を表すために、用量に適切なｋｍ因子を掛ける。成人のヒトにおいて、１００ｍｇ／ｋｇは、１００ｍｇ／ｋｇ×３７ｋｇ／ｍ２＝３７００ｍｇ／ｍ２と等価である１。Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈら、１９６６，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐ．Ｒｅｐ．５０：２１９−２４４。
【０１０５】
投与について使用されたＨＳＰおよび抗原分子の精製された複合体の投薬量は、好ましくは上記で記載した従来技術法により推定された投薬量よりさらに少ない。例えば、本明細書中で開示された方法の好ましい実施形態に従い、ＨＳＰ７０抗原性分子複合体および／またはｇｐ９６抗原性分子複合体の量は、皮下に投与され、この量は、ヒト患者に対して約１０μｇ〜約６００μｇの範囲内であり、さらに好ましいヒトの投薬量は、２５ｇのマウスにおいて使用されたもの（すなわち、１０〜１００μｇの範囲内）と同じである。本明細書中で開示された方法により提供されるヒト患者におけるＨＳＰ９０ペプチド複合体についての好ましい投薬量は、約５０〜５，０００μｇの範囲であり、さらに好ましい投薬量は１００μｇである。あるいは、特定の実施形態において、ＨＳＰ７０抗原性分子複合体およびｇｐ９６抗原性分子複合体の量は、ヒト患者に対して約０．１μｇ〜約６０μｇの範囲であり、皮内または粘膜に投与される。他の特定の実施形態において、ＨＳＰ７０抗原性分子複合体およびｇｐ９６抗原性分子複合体の治療的に有効な量は、１０μｇ未満であり（例えば、０．１〜９μｇの範囲内）；好ましいヒトの投薬量は、２５ｇのマウスにおいて使用された投薬量（例えば、０．５〜２．０μｇの範囲内）と実質的に等しいかまたはこの投薬量より少ない。ヒト患者に対する皮内投与または粘膜投与のためのＨＳＰ７０抗原性分子複合体についての好ましい投薬量は、約５〜５００μｇの範囲内である。特定の実施形態において、ＨＳＰ７０抗原性分子複合体の治療的に有効な量は、５０μｇ未満であり（例えば、５〜４９μｇの範囲内）；好ましい投薬量は、５〜４０μｇの範囲内である。
【０１０６】
ひとつの実施形態において、この投薬量は一日おきに合計５回の注射で投与される。好ましい実施形態において、上記の投薬量は、約４週〜６週の期間に、週１回投与され、そして投与の様式は、好ましくは各投与によって変更される。好ましい例において、投与の各部位は、順次変えられる。したがって、例示であって制限されない方法により、１回目の注射は左腕、２回目は右腕、３回目は左腹部、４回目は右腹部、５回目は左大腿、６回目は右大腿などで皮内に投与され得る。同じ部位には、１回以上の注射の間隔後に繰り返され得る。また、分割注射も与えられ得る。したがって、例えば、半分の用量を、１つの部位に、そして同日に別の半分を別の部位に投与し得る。
【０１０７】
４〜６週間後、さらなる注射は、好ましくは１ヶ月の期間にわたって、２週間間隔で投与される。その後の注射は、月１回投与され得る。その後の注射のペースは、患者の臨床的な進行および免疫療法に対する応答性に依存して変更され得る。あるいは、投与の様式は、順次変えられる（例えば、毎週の投与を、皮内または粘膜に順番に投与する）。
【０１０８】
ＨＳＰ−抗原性分子複合体の投与についての上記レジメンは、ＨＳＰ−抗原性分子複合体感作ＡＰＣの投与前、投与の間、投与後に生じ得る。例えば、治療の様式は、順次変えられ得る（例えば、ＨＳＰ−抗原性分子複合体は、一度に投与され得、そしてＨＳＰ−抗原性分子複合体感作ＡＰＣをこの次に投与しうる。あるいは、ＨＳＰ−抗原性分子複合体は、ＨＳＰ−抗原性分子複合体感作ＡＰＣと同時に投与され得る。好ましくは、ＡＰＣおよび複合体は、互いに１週間以内に患者に投与される。
【０１０９】
本明細書中で開示された組成物のキットは、抗原分子に非共有結合的に結合されたＨＳＰの複合体および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を第１の容器中に；ならびに抗原提示細胞を第２の容器中に含む。ＨＳＰ−抗原分子複合体は、上記で記載されるような投与のために薬学的調製物に処方され得る。組成物は、示された骨感染症疾患の処置のために調製され、パッケージされ、そして標識された適合性薬学的キャリアで処方された化合物を含みうる。あるいは、薬学的組成物は、適切な骨感染症疾患の処置のために処方され得る。
【０１１０】
この組成物は、必要に応じて、活性成分を含む１つ以上の単位投薬形態を含み得る１パックまたはディスペンサーデバイスで存在し得る。このパックは、例えば金属箔またはプラスチック箔（例えば、ブリスターパック）を含み得る。このパックまたはディスペンサーデバイスは、投与についての説明書が添付され得る。
【０１１１】
本明細書中で開示された治療レジメンを実行するためのキットもまた、提供される。このようなキットは、薬学的に受容可能な形態におけるＨＳＰ−抗原性分子複合体（好ましくは精製された）の治療的または予防的な有効量を第１のひとつ以上の容器中に；ならびに感作されたＡＰＣ（好ましくは精製された）を第２の容器中に含む。キットのバイアル中のＨＳＰ−抗原性分子複合体は、薬学的に受容可能な溶液（例えば、滅菌した生理食塩水、ブドウ糖溶液、または緩衝液の組み合わせ）、または他の薬学的に受容可能な滅菌した液体の形態であり得る。あるいは、複合体は、凍結乾燥されるかまたは乾燥され得る；この場合、キットは、必要に応じて、注射の目的のための溶液を形成する複合体を再構成するための、薬学的に受容可能な溶液（例えば、生理食塩水、ブドウ糖溶液など）（好ましくは滅菌した）の容器中にさらに含まれる。
【０１１２】
別の実施形態において、本明細書中で開示されたキットは、複合体を注射するための針またはシリンジ（好ましくは、滅菌した形態でパッケージされる）、および／またはパッケージされたアルコールパッドをさらに含む。必要に応じて、臨床医または患者による、ＨＳＰ−抗原性分子複合体の投与のために説明書が含まれ得る。
【０１１３】
方法および組成物およびこれらの使用は、以下の非限定な例によりよく理解され得る。
【実施例】
【０１１４】
（実施例１）
（実験）
健康な被験体および易感染性の被験体から得られたサンプルの両方を、秤量し、そして５０ｍｌファルコンチューブに移した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を、骨のサンプルに添加し、０．４＋０．２の重量（ｇ）：容積（ｍｌ）の比率を得た。サンプルを、攪拌し、そして「Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｅａｒｅｒ」を使用して回転設定１（４５００〜８０００ｒｐｍ）で１分間、およびさらに１分間回転設定３（１２，０００〜１７，０００ｒｐｍ）で部分的に粉砕する。抽出効率を増加するために、骨サンプルを、４℃で９日間ファルコンチューブ内に貯蔵した。１ｍｌの各サンプルをエッペンドルフチューブに移す時に、脂質および大きな細片を回避した。任意の細片を、１５，０００ｒｐｍで１０分間サンプルを遠心分離することにより一掃した。
【０１１５】
このサンプルを初めにＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いでＡｇｉｌｅｎｔ  ２  １００  ＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒによるＰｒｏｔｅｉｎ  ２００  Ａｓｓａｙを使用して分析した。良好な結果を生成しないいくつかのサンプル（上部のマーカーを欠失することによりしばしば示される）を、脱塩し、そしてＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒで再度分析した。サンプルを、ＹＭ−３  Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎチューブを使用して、４２００×ｇで約１．５時間回転することにより脱塩した。Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎフィルターを、反対にし、そして１０００×ｇで３分間、回転した。このサンプルを、２２ｍＭトリスを用いてこれらの元の容積に再構成した。
【０１１６】
（結果）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、コントロールの健康体の患者由来の骨抽出物について行った。公知のタンパク質のラダーに対するサンプルのスラブゲル電気泳動法は、良好な分離を示唆した。次いで、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ２００  Ａｓｓａｙを、一連の抽出物を用いて、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒと共に使用した。この結果は、易感染性の患者からえたサンプルについて、４５〜６５ｋＤａの範囲内でバンドのより強い存在を示す。塩の存在がアッセイを妨げることは公知であり、しかもこの研究で使用された抽出物は、リン酸緩衝生理食塩水溶液内で生産されていることに起因して、追加実験を、可能性のある塩問題を解消するように設計した。第一に、濾過工程を、サンプルから塩を取り除くために加えた。さらに、抽出を、ＰＢＳの代わりに脱イオン水を用いて行った。この変更により改良された分離を生じ、上部マーカーは、いくつかのサンプルにおいて見えるようになった。
【０１１７】
この研究は、骨抽出におけるタンパク質を同定するための２つの方法を提供した：従来のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動およびＰｒｏｔｅｉｎ  ２００  Ｃｈｉｐ  Ａｓｓａｙ。後者の技術は、前者よりもさらに感度が高く、そしてこれは低レベルで生産されたタンパク質を検出することにおいて利点があり得る。このデータは、易感染性の骨サンプルと４５〜６５ｋＤａ領域における電気泳動のバンドの間に関連があることを示す。
【０１１８】
（免疫ブロット法）
１次元または２次元のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離されたサンプルは、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｐ．ポリビニルジフルオライド膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ．）上に一晩電気ブロットされる（Ｌａｅｍｍｌｉ，１９７０）。膜を、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）を用いて洗浄し、そして２％ＦＣＳ（ＳｅｒａＬａｂ）を含むＰＢＳ−Ｔ（ブロッキング緩衝液）を用いてブロッキングする。次いで、ブロッキングした膜を、１時間、試験抗体（ブロッキング緩衝液中）と共にインキュベートし、そしてＰＢＳ−Ｔを用いて洗浄する。ＰＢＳ−Ｔ２％ＦＣＳ中で１：１，０００での試験抗体（抗マウス）ＩｇＧ（γ鎖特異的）（Ｓｉｇｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）が結合されている。最終洗浄後、ブロットを、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ＢＤＩ−Ｉ）および０．０５％過酸化水素（Ｓｉｇｍｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含む、ｐＨ７．６の５０ｍＭトリス（Ｓｉｇｍｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）中で、１ｍｇ／ｍｌの３，３プライム−ジアミノベンジジン  テトラヒドロクロライド（Ｓｉｇｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）溶液を用いて発色する。各反応は、蒸留水を用いて完全にリンスすることにより、終結される。
【０１１９】
（タンパク質精製）
粗製ＢＳを、Ｑ−セファロース陰イオン交換カラム（５０ｃｍ×１．６ｃｍ）により４℃で画分する。このカラムを、２０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．５（緩衝液Ａ）で平衡化し、そしてＢＳ（一般的に１００４００ｍｇ）を、同じ緩衝液でロードする。このカラムを、５００ｍｌの緩衝液Ａを用いて洗浄し、次いで緩衝液Ａ中で、０〜１Ｍ  ＮａＣｌの１，０００ｍｌ線形勾配を用いて溶出する。１０ｍｌの画分を、回収し、そして２８０ｎｍにおける吸光度を、モニタリングする。溶骨性シャペロンタンパク質の局在を、活性アッセイ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびウェスタンブロット分析の組み合わせにより決定する。溶骨性活性を含む画分を、脱イオン水に対して透析し、塩を取り除き、そして凍結乾燥する。次いで、最も高い比活性かつＳＤＳ−ＰＡＧＥによる最も少ない数のタンパク質バンドを有する画分を、第２の陰イオン交換カラムにより室温で、さらに画分する。
【０１２０】
画分の純度は、再び、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって視覚的に評価され、もっともきれいな画分１００ｐｇを、５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ７．６（１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む；緩衝液Ｃ）に対して透析した。このサンプルを、５ｍｌのＡＴＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（（Ｓｉｇｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）カラムに対して流す。このカラムを、１０カラム容量の緩衝液Ｃで洗い、そして結合したタンパク質を５カラム容量の緩衝液Ｃ中の５ｍＭのＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で溶出する。タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって位置決定され、そして銀染色キット（Ｓｉｇｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いて視覚化される。ゲルろ過を用いて、ＡＴＰアフィニティークロマトグラフィーによって単離された骨分解性シャペロンタンパク質の分子量範囲を決定する。このことは、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．７中でＢｉｏ−Ｓｉｌ  ＴＳＫ２５０（Ｂｉｏ  Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）カラムにおいて精製されたタンパク質を流し、そして２０５／２８０ｎｍで吸光度を測定することによって行う。
【０１２１】
（特定の目的＃３：データ分析および臨床結果変数との相関付け）
実験上の知見および臨床上の骨密度ならびにＱ−ＣＴ測定値を、数量コードシステムを用いて、コンピュータの標準化されたリレーショナルデータベースを用いて文書化する。コンピュータプログラムＳＰＳＳ／ＰＣ＋９．  ０  （ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．，  ４４  Ｎ．Ｍｉｃｈｉｇａｎ  Ａｖｅ．，  Ｃｈｉｃａｇｏ，  ＩＬ  ６０６１１）をコンパイルされたデータの統計学的分析のために用いる。生データの記述統計学を、頻度表の使用によって行う。正規分布を、正規性への適合および正規確率プロットを入手することによって決定する。ここで、ランク付けされた観察された残差（平均からの偏差）をｙ軸上の正規分布の標準化された値に対してｘ軸上にプロットする。正規分布は、観察された残差が直線上に載るかどうかを示す。平均同士の間の有意な差異を、従属および独立のサンプルについてのｔ検定ならびに分散の一方向ＡＮＯＶＡの使用によって評価した。他変数を用いたＡＮＯＶＡからの統計学的に有意なＦ検定の場合、寄与手段を、不均一なサンプルサイズについてのＴｕｋｅｙ  ＨＳＤ検定を用いた事後（ｐｏｓｔ−ｈｏｃ）比較によって差別化する。この後者の２つの検定の使用によって、患者の年齢および性別ならびに随伴する医学的状態に従って種々のシャペロン分子の生起およびオステオペニア骨サンプルの存在を決定することができる。本質的には、この検定によって、本発明者らはオステオペニアに相関付けられる優勢なシャペロン分子を同定することができる。
【０１２２】
クロスの表生成方法を用いて、オステオペニア、年齢、性別、他の寄与因子およびシャペロン分子の存在の間の関係を、多方向頻度表を精製することによって測定する。これらの変数の各々の可能な組み合わせについて、これらの表は、セル頻度（すなわち、この特定の組み合わせを有した患者集団における症例数）を生じる。さらに、クロスの表生成法によって、検定の信頼性（換言すれば、これらの関係の統計学的な有意性）を評価することができる。従って、オステオペニアの存在、年齢、性別、他の寄与因子（たとえば、医療状態）は、カテゴリーの変数である。多方向頻度表の変数の間の多数の同時の関係および相互作用を、対数線形方程式に基づいて試験する。これによって、関与する変数が無関係であった場合に予測されるセル頻度の計算が可能になる。これは、相互作用比例適合手順を用いて行う。従って、予測される頻度から観察される有意な偏差は、特定のシャペロン分子とオステオペニアとの間の統計学的に有意な関係を反映する。予測される頻度から観察される有意な偏差検定は、ピアソンχ二乗検定によって行う。残差頻度は、観察された頻度から予測された頻度を減じることによって算出する。関係が存在しない場合、すべての残差頻度は、類似する程度の正および負の値からなると予測され、そして頻度表のセルにわたり均一に分布していることが予測される。従って、残差のプロットは、シャペロン分子の存在とオステオペニアとの間の相関を評価する別の手段として使用される。この研究において用いたすべての統計学的検定において、ｐ＜０．０５の有意レベルを選択する。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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