(57)【要約】  本発明は、修飾トリデジンである、配列番号１由来のポリペプチドであって、修飾が、システイン残基、および／または以下のアミノ酸−Ｌｙｓ２、Ｌｙｓ７、Ｈｉｓ１０、Ｇｌｙ１２、Ｌｅｕ２４、Ｔｙｒ３１、Ｐｈｅ３４、Ａｒｇ３９、Ｉｌｅ４５、Ｍｅｔ４８、Ａｓｐ５０、Ｐｒｏ５５、Ｐｈｅ５８、Ａｓｎ６０、Ｐｒｏ６５、Ａｒｇ６６−の１つと別のアミノ酸との交換、および／または残ったポリペプチドが、少なくともアミノ酸配列ＤＤＩＹＱＲＸＶＸＦＰＸＬＰＬ（配列番号８９）を含んでなる、Ｎ末端またはＣ末端の欠失、および／またはポリエチレングリコールへの共有結合である、前記ポリペプチドに関する。前記ポリペプチドは、トランスグルタミナーゼ、特に、血液凝固カスケードの最終酵素であるＸＩＩＩａ因子の新規阻害剤である。本発明は、さらに、前記阻害剤の産生法およびトランスグルタミナーゼ阻害剤としてのその使用に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示すようなポリペプチドであって、少なくとも１つのシステインと別のアミノ酸との交換、および／または以下のアミノ酸−Ｌｙｓ２、Ｌｙｓ７、Ｈｉｓ１０、Ｇｌｙ１２、Ｌｅｕ２４、Ｔｙｒ３１、Ｐｈｅ３４、Ａｒｇ３９、Ｉｌｅ４５、Ｍｅｔ４８、Ａｓｐ５０、Ｐｒｏ５５、Ｐｈｅ５８、Ａｓｎ６０、Ｐｒｏ６５−の少なくとも１つと別のアミノ酸との交換、および／または残ったポリペプチドが、少なくともアミノ酸配列ＤＤＩＹＱＲＸＶＸＦＰＸＬＰＬ（配列番号８９）を含有する、Ｎ末端およびＣ末端の欠失、および／またはポリエチレングリコールへの共有結合から選択される、少なくとも１つの修飾を含有することで特徴付けられる、前記ポリペプチド。
【請求項２】
請求項１記載のポリペプチドを少なくとも１つ含有する化合物。
【請求項３】
融合タンパク質である、請求項２記載の化合物。
【請求項４】
融合タンパク質が、融合タンパク質を精製するために使用するタグを含有する、請求項３記載の化合物。
【請求項５】
タグが少なくとも５つの連続ヒスチジンを含有する、請求項４記載の化合物。
【請求項６】
請求項１〜５の少なくとも１つに記載のポリペプチドを調製する方法であって、組換え法またはペプチド化学反応法であることで特徴付けられる、前記方法。
【請求項７】
トランスグルタミナーゼ阻害剤としての、請求項１〜５の少なくとも１つに記載のポリペプチドの使用。
【請求項８】
血栓症を防止し、そして治療するための、請求項１〜５の少なくとも１つに記載のポリペプチドの使用。
【請求項９】
請求項１〜５の少なくとも１つに記載のポリペプチドおよび少なくとも１つのガレン（ｇａｌｅｎｉｃ）アジュバントを含んでなる、薬剤。
【請求項１０】
請求項１〜５の少なくとも１つに記載のポリペプチドおよび少なくとも１つのさらなる薬学的活性化合物を含んでなる、併用製剤。
【請求項１１】
さらなる活性化合物が抗凝血剤、好ましくはトロンビンおよびＸａ因子の阻害剤および／または血小板凝集阻害剤であることで特徴付けられる、請求項１０に記載の併用製剤。
【請求項１２】
アセチルサリチル酸、ヘパリン、低分子量ヘパリン、ヘパリノイド、ヒルジン、ビバリルジン（ｂｉｖａｌｉｒｕｄｉｎ）、メラガトラン（ｍｅｌａｇａｔｒａｎ）、アブシキシマブ、エプチフィバビド（ｅｐｔｉｆｉｂａｂｉｄｅ）、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、ストレプトキナーゼ、スタフィロキナーゼ、ウロキナーゼ、エミナーゼ（ｅｍｉｎａｓｅ）、ヘメンチン（ｈｅｍｅｎｔｉｎ）および／またはプラスミンと任意に併用する、請求項１〜５の少なくとも１つに記載のポリペプチド、および適切な場合、さらなる薬学的活性化合物を含んでなる、併用製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、修飾トリデジンである、配列番号１由来のポリペプチドであって、修飾が、少なくとも１つのシステイン残基、および／または以下のアミノ酸−Ｌｙｓ２、Ｌｙｓ７、Ｈｉｓ１０、Ｇｌｙ１２、Ｌｅｕ２４、Ｔｙｒ３１、Ｐｈｅ３４、Ａｒｇ３９、Ｉｌｅ４５、Ｍｅｔ４８、Ａｓｐ５０、Ｐｒｏ５５、Ｐｈｅ５８、Ａｓｎ６０、Ｐｒｏ６５およびＡｒｇ６６−の１つと別のアミノ酸との交換、および／または残ったポリペプチドが、少なくともアミノ酸配列ＤＤＩＹＱＲＸＶＸＦＰＸＬＰＬ（配列番号８９）を含有する、Ｎ末端およびＣ末端の欠失、および／またはポリエチレングリコールとの共有結合からなる、前記ポリペプチドに関する。本発明記載のポリペプチドは、トランスグルタミナーゼ、特に血液凝固カスケードの最終酵素であるＸＩＩＩａ因子の新規阻害剤である。本発明はまた、これらの阻害剤を調製する方法、およびトランスグルタミナーゼ阻害剤としての後者の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
トランスグルタミナーゼ（ＥＣ  ２．３．２．１３）は、以下の反応スキームにしたがって、ポリペプチド鎖内または異なるポリペプチド鎖間のアミド結合の形成を触媒する：
【０００３】
【化１】
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【０００４】
該酵素は、２つのポリペプチド鎖間にγ−グルタミル−ε−リジン結合を形成することによって、結果的に、タンパク質の架橋を触媒し、そしてそれによって、多くのタンパク質凝集体を安定化するのに寄与する。
【０００５】
ＸＩＩＩａ因子は、臨床的に非常に重要なトランスグルタミナーゼである。ＸＩＩＩａ因子は、血液凝集カスケードの最終酵素であり、そしてトランスグルタミン化によって、「柔らかい」血栓中のフィブリンポリマーを共有架橋する。さらに、ＸＩＩＩａ因子は、トランスグルタミン化による、フィブリンネットワークへのα２−アンチプラスミンの共有結合に関与する。架橋され、そして修飾された、こうした血栓は、「硬い」血栓と称され、そしてまったく共有架橋されていないフィブリンポリマーで構成される「柔らかい」血栓が、線維素溶解酵素によって分解されるほど迅速には、該酵素によって分解されない。その結果、ＸＩＩＩａ因子は、血栓を安定化させるのに重要な寄与を果たす。
【０００６】
ＸＩＩＩａ因子の阻害剤は、フィブリンネットワークの異なる鎖間の架橋反応を防止し、そしてまた、α２−アンチプラスミンの共有結合も防止し、そしてそれによって、血栓事象の予防的治療とともに、血栓溶解治療を促進する。
【０００７】
トランスグルタミナーゼのいくつかの阻害剤は、すでに先行技術に記載されてきている（セレクションを表１に示す）。これらの阻害剤は
・トランスグルタミナーゼに結合する免疫グロブリン、
・システインと反応する低分子量化学的化合物、
・天然基質と競合する低分子量アミン、および
・ヘメンテリア・ギリアニー（Ｈａｅｍｅｎｔｅｒｉａ  ｇｈｉｌｉａｎｉｉ）種に属するヒル（ｌｅｅｃｈ）から単離した活性分画
である。
【０００８】
表１：ＸＩＩＩａ因子の公開され、そして特許された阻害剤のセレクション
【０００９】
【表１】
2005513141.tif 000004
【００１０】
ＸＩＩＩ因子に対して向けられる免疫グロブリンが、例えばＵＳ５，４７０，９５７に開示されている。この刊行物では、ＸＩＩＩａ因子のサブユニットに対してモノクローナル抗体が調製され、そしてこれらの抗体が、トロンビンによるＸＩＩＩ因子の活性化を阻害することが観察された。しかし、これらの抗体を療法的に使用しようとするならば、通常、ヒトキメラの調製など、大規模な修飾が必要である。
【００１１】
別の種類の阻害剤は、ＸＩＩＩａ因子活性中心、すなわちシステイン残基に不可逆的に結合する、低分子量反応性化学的化合物からなる。しかし、ＷＯ９２／１３５３０に開示されるような化合物は、非常に反応性であり、そしてｉｎ  ｖｉｖｏで比較的不安定である点が不都合である。これらはまた、他のタンパク質のシステイン残基とも反応し、そしてその結果、ＸＩＩＩａ因子に特異的でない。その結果、これらは薬学的活性化合物として用いられない。
【００１２】
さらなるトランスグルタミナーゼ阻害剤は、トランスグルタミナーゼ反応の競合的基質として作用する、ＷＯ９１／１０４２７に開示されるような低分子量アミンである。しかし、これらはトランスグルタミン化反応によって消費され、そして、トランスグルタミナーゼ反応の結果、該アミンがカップリングするタンパク質の官能性を、予測不能な方式で改変する。さらに、これらは、比較的高濃度の約２００μＭで使用しなければならず、それによって療法的価値は制限される。
【００１３】
高い度合いの親和性および特異性でＸＩＩＩａ因子を阻害する分画が、ヘメンテリア・ギリアニー種に属するヒルの唾液腺から単離されてきている（ＵＳ６，０２５，３３０に開示）。精製された活性分画には、少なくとも２つの異なるタンパク質が存在し、１つのタンパク質は、およそ７〜８ｋＤａの大きさを有し、これが活性分画の主なタンパク質構成要素を構成する。タンパク質生化学の方法を用いて、長さ６６アミノ酸である、このポリペプチドの一次配列がほぼ決定された。このポリペプチドはトリデジン（ｔｒｉｄｅｇｉｎ）と名付られ、そして該タンパク質は、一般的にトランスグルタミナーゼを、そして特にＸＩＩＩａ因子を阻害すると仮定されている。
【００１４】
しかし、活性分画になお存在する他のタンパク質からトリデジンを分離する試みはなされず、これは、ＸＩＩＩａ因子を阻害するのがこれらのタンパク質であるという可能性が排除されていないことを意味する（特に、Ｆｉｎｎｅｙら（Ｆｉｎｎｅｙら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ３２４，７９７−８０５（１９９７）、図２、レーン３）を参照されたい）。ＸＩＩＩａ因子阻害活性が実際にペプチドであるかどうかさえ、確かめられていなかった。その結果、活性分画に存在する他のバイオポリマーが、例えば複合糖質もしくは脂質または糖脂質であって、ＳＤＳゲル上での解析中に明瞭でない場合、これらがＸＩＩＩａ因子の真の阻害活性を構成する可能性がある。その結果、これらの刊行物は、トリデジンがＸＩＩＩａ因子を阻害することを立証しない。
【００１５】
その結果、組換え的に調製した、例えば、原核生物である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）で発現させたトリデジンがＸＩＩＩａ因子の阻害剤として機能可能であるかどうかに関しては、完全に不確実である。ＵＳ６，０２５，３３０（４、１２〜１８）および対応する科学論文（Ｆｉｎｎｅｙら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ３２４，７９７−８０５（１９９７））の両方において、ヘメンテリア・ギリアニー種に属するヒルから精製されたトリデジンが、翻訳後修飾されることが観察された（Ｆｉｎｎｅｙら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊｏｕｒｎａｌ（１９９７）３２４，８００、右側の欄、最後の文）。これがまさに分泌タンパク質であり、トリデジンもその１つである分泌タンパク質が機能するには、しばしばこうした修飾が必要であることが知られているが（例えばＫｅｍｂａｌｌ−Ｃｏｏｋら，Ｇｅｎｅ，１３９（２）：２７５−２７９（１９９４）またはＰａｎｇら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４０（１１）：５１０２−５１１１（１９９９））、これらの２つの刊行物は、トリデジンの仮定される機能には、どの程度の翻訳後修飾が必要であるかには取り組んでいない。しかし、こうした修飾は、大腸菌で組換え的に調製されたタンパク質には欠けている。このため、該タンパク質はまさに、通常は細胞外に局在し、異種系で発現された場合、しばしば不活性であるタンパク質である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
ＷＯ４９０３９は、融合タンパク質を精製する新規技術を記載し、そしてこれに関連して、トリデジンをコードする合成ＤＮＡ配列を開示する。さらに、融合タンパク質として、トリデジンとグルコースデヒドロゲナーゼをともに発現させ、そして精製した；しかし、ＸＩＩＩａ因子の阻害剤としての融合タンパク質の活性を試験しなかった。
したがって、本発明の目的は、適切な量および純粋な形で、組換え的に、または合成的に、トランスグルタミナーゼの新規ポリペプチド阻害剤を調製することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
驚くべきことに、異種系、例えば大腸菌において発現させ、そして精製したトリデジンポリペプチドは、トランスグルタミナーゼの有効な阻害剤、特にＸＩＩＩａ因子、特にヒトＸＩＩＩａ因子の阻害剤であることが見出された。これによって、初めて、トリデジンポリペプチドが、実際にトランスグルタミナーゼ阻害剤、特にＸＩＩＩａ因子、特にヒトＸＩＩＩａ因子の阻害剤であることが立証された。驚くべきことに、１以上の修飾を所持するトリデジンポリペプチドもまた、トランスグルタミナーゼ阻害剤、特にＸＩＩＩａ因子、特にヒトＸＩＩＩａ因子の阻害剤としての活性を示した。驚くべきことに、酵母ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）で発現させた組換えトリデジンポリペプチドは、先に言及した、大腸菌から調製した組換えトリデジンポリペプチドよりもさらにより有効なトランスグルタミナーゼ阻害剤であることが見出された。
【００１８】
したがって、本発明は、配列番号１に由来し、そして１以上の修飾を所持する、修飾トリデジンポリペプチドに関する。
本発明の意味において、ポリペプチドは、１５アミノ酸（ＡＡ）より多く、そして２０００アミノ酸未満を有するペプチド、好ましくは１５ＡＡより多く、そして５００ＡＡ未満を有するペプチド、特に１６、１７、１８、１９または２０ＡＡより多く、そして４００、３００、２００、１００、８０、６０、５０、４０または３０ＡＡ未満を有するペプチドを示すと理解される。
【００１９】
本発明の意味において、修飾は、少なくとも１つのシステイン残基と別のアミノ酸との交換、および／または以下のアミノ酸−Ｌｙｓ２、Ｌｙｓ７、Ｈｉｓ１０、Ｇｌｙ１２、Ｌｅｕ２４、Ｔｙｒ３１、Ｐｈｅ３４、Ａｒｇ３９、Ｉｌｅ４５、Ｍｅｔ４８、Ａｓｐ５０、Ｐｒｏ５５、Ｐｈｅ５８、Ａｓｎ６０、Ｐｒｏ６５、Ａｒｇ６６−の少なくとも１つと別のアミノ酸との交換、および／またはＮ末端およびＣ末端の欠失、および／またはポリエチレングリコールへの共有結合によってもたらされる野生型トリデジンポリペプチド中の変化を示すと理解される。
【００２０】
本発明の意味において、交換は、ポリペプチドのアミノ酸配列における、特定の部位でのアミノ酸と別のアミノ酸、好ましくは他の１９の天然アミノ酸の１つとの交換を示すと理解される。
【００２１】
本発明の意味において、欠失は、トリデジンポリペプチドのアミノ酸配列のＮ末端および／またはＣ末端領域の除去、例えば、残ったポリペプチドが、少なくともアミノ酸配列ＤＤＩＹＧＲＰＶＥＦＰＮＬＰＬ（配列番号９２）またはＤＤＩＹＧＲＰＶＥＦＰＮＬＰＬＫ（配列番号４７）をなお含有する、合計で、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０アミノ酸（これによってＮ末端およびＣ末端で除去されるアミノ酸の合計を意味する）さえも超えるアミノ酸の除去を示すと理解される。
【００２２】
驚くべきことに、修飾トリデジンポリペプチドは、大腸菌で発現させた野生型トリデジンポリペプチドと比較した際、以下の好適な特性を示した。
大腸菌から得た組換え野生型トリデジンポリペプチドは、高分子量凝集体もまた形成するが、少なくとも１つのシステイン残基、好ましくは１〜４のシステイン残基、特に好ましくは３または４のシステイン残基が、別のアミノ酸、好ましくはバリン、アラニン、グリシンまたはセリンなどの小さいアミノ酸、特に好ましくはアラニンまたはセリン、特にアラニンと交換されている修飾トリデジンポリペプチドは、凝集体形成の減少を示した。これは、比較解析ゲルろ過実験で確証された。ゲルろ過実験の実験条件を実施例４に示しており、読者はこちらを参照されたい。
【００２３】
さらに、前記修飾トリデジンポリペプチドは、４℃での保存中、野生型トリデジンが示すよりも、より遅い、高分子量凝集体の形成を示す。これは、比較解析ゲルろ過実験で確証される。ゲルろ過実験の実験条件を実施例４に示しており、読者はこちらを参照されたい。
【００２４】
ピキア・パストリスで発現させた野生型トリデジンポリペプチドは、ごくＣ末端で１以上のプロテアーゼによって切断されるが、驚くべきことに、変異体Ａｒｇ６６Ｌｅｕは完全に発現され、そして精製可能であった。阻害活性はピキア・パストリスで発現させた野生型トリデジンポリペプチドに比較すると本質的に変化がないが、大腸菌で発現させた野生型トリデジンポリペプチドのものより優れていることが観察された。
【００２５】
宿主によって分泌されたトリデジンポリペプチドは、例えばピキア・パストリスから得たトリデジンを用いて本明細書で立証するように、細胞内で産生させたトリデジンポリペプチドより高い比活性を所持する可能性があり、そしてその結果、特に好適である可能性がある。このため、宿主から分泌によって得ることが可能な組換えトリデジンポリペプチドは、特に、宿主から分泌によって得られた際に、本発明の主題の一部である。同様に、分泌工程中、宿主から、細胞外部に、特に培地に遊離したトリデジンポリペプチドを用いて、トリデジンポリペプチドを調製する方法は、本発明の主題の一部である。これは、トリデジンポリペプチドを分泌する工程を含んでなる、トリデジンポリペプチドを調製するすべての組換え法に適用可能である。こうした分泌工程は、トリデジンポリペプチドが宿主において、細胞膜を横断するならば、存在することが可能である。分泌工程は、トリデジンポリペプチド合成中に、またはポリペプチドがすでに細胞に存在するようになってから後に、起こることが可能である。
【００２６】
組換え的に操作可能な宿主において発現させる、本発明の組換えポリペプチドの分泌は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．”第３版（２００１）ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓに記載されるような、適切な分子生物学的方法を用いて、対応する宿主における発現に適したプロモーターの調節下にある核酸を含んでなり、そして好ましくはそのＮ末端に、シグナルペプチドと称するものを含んでなるポリペプチドをコードする、ＤＮＡ発現ベクターを産生することによって達成可能である。シグナルペプチドは、細胞の分泌機構に認識されることが可能であり、そして細胞膜を通じたタンパク質の転位置を仲介することが可能である。転位置プロセスは、一般的に、転位置機構によって仲介され、該機構は、脂質膜を通じて、特定のタンパク質用のある種のチャネルを形成する。すべての場合ではないが、一般的に、分泌されるタンパク質のシグナルペプチドは、このチャネルを通じた転位置の間に切り離される。転位置機構の機能様式および構成要素は、Ｒａｐｏｐｏｒｔ  Ｔ．Ａ．ら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９６）６５：２７１−３０３に論じられ、真核生物および原核生物の転位置機構の共通の特徴および相異に関しても、該論文に論じられる。本発明のポリペプチドを発現させ、そして分泌させる宿主は、いかなる微生物宿主であることも可能であるが、宿主が、組換え法を用いて操作可能であり、そして組換えタンパク質を分泌可能である限り、宿主はまた、培養中のより高次の真核細胞、例えばヒト細胞（例えばＨｅＬａ細胞）または昆虫細胞（例えば異所タンパク質発現を達成するために、バキュロウイルスで感染可能な昆虫細胞）であることも可能である。微生物宿主は、古細菌、真正細菌またはより低次の真核生物、例えば真菌（例えば細胞性粘菌（ａｃｒａｓｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）、変形菌（ｍｙｘｏｍｙｃｅｔｅｓ）、藻菌（ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）、子嚢菌（ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）、担子菌（ｂａｓｉｄｏｍｙｃｅｔｅｓ）または不完全真菌、特にピキア・パストリスまたはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母）、または原生生物（例えば鞭毛虫（ｆｌａｇｅｌｌａｔｅｓ）、根足上綱（ｒｈｉｚｏｐｏｄａ）、胞子虫（ｓｐｏｒｏｚｏａ）または繊毛虫（ｃｉｌｉａｔｅｓ）、特にキイロタマホコリカビ（Ｄｉｃｔｏｓｔｅｌｉｕｍ  ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）などの粘菌（ｓｌｉｍｅ  ｍｏｕｌｄ）も）であることが可能である。適切なベクターでトランスフェクションした結果、哺乳動物細胞株などのより高次の真核生物の細胞もまた、細胞質においてタンパク質を発現可能である（例えばｐｃＤＮＡ３．１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．）か、または分泌するように発現可能である（例えばｐＳｅｃＴａｇ２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．）（例えば“Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，”Ｍ．Ｂｕｔｌｅｒ（監修），ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，オックスフォード−ニューヨーク−東京，９ページ，２３行：実施例６および７を参照されたい）。この目的に適した宿主細胞にはＣＨＯ細胞およびＨＥＫ２９３細胞が含まれる。特に、宿主は、大腸菌またはセラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）などのグラム陰性細菌であることが可能である。これらの細菌において、分泌された組換えタンパク質は、周辺質に放出されることが可能であり、そしてこれらの分泌されたタンパク質は、宿主細胞自体を破壊することなく単離可能である。グラム陰性細菌、例えば大腸菌で使用するのに適したシグナルペプチドが、Ｐｉｎｅｓ  Ｏ．およびＩｎｏｕｙｅ  Ｍ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９９）１２：２５−３４に記載されている。
【００２７】
特に、宿主は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、およびＢ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）またはＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）などの関連バチルス属種などのグラム陽性細菌であることが可能であり、これは、これらの細菌が、同様に、培地にタンパク質を放出可能なためである。グラム陽性細菌、例えば枯草菌で使用するのに適したシグナルペプチドが、Ｔｊａｌｓｍａ  Ｈ．ら，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，（２０００）６４：５１５−５４７に記載されている。
【００２８】
宿主として、より低次の真核生物を用いるのもまた好ましく、これは、これらの低次の真核生物に分泌される組換えタンパク質が、培地に放出されることが可能であり、そしてその結果、常には宿主細胞を破壊する必要がないためである。真核生物で使用するのに適したシグナルペプチドが、Ｒａｐｏｐｏｒｔ  Ｔ．Ａ．ら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９６）６５：２７１−３０３に記載されている。さらに、実施例６で使用するアルファ因子シグナルペプチド、並びにＫｊｅｌｄｓｅｎ  Ｔ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０００）５４（３）：２７７−８６およびＢｒａｋｅ  Ａ．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８９）１３：２６９−８０を参照されたい。特定の理論に束縛されることなく、細菌および真核生物の間で、進化上、部分的に保存されている転位置機構を、分泌トリデジンポリペプチドが通過すると、該ポリペプチドに、何らかの好都合な点を持つ折り畳みが提供されるようである。さらに、分泌と関連して活性である品質管理機構が、分泌トリデジンポリペプチドが不正確に折り畳まれたトリデジンポリペプチドを本質的に含まず、それによって分泌トリデジンポリペプチドが高い特異性の阻害活性を有することを可能にする可能性がある。さらに、分泌工程の結果、トリデジンポリペプチドが、細胞質の還元環境から酸化細胞区画に通過し、それによって、ジスルフィド架橋の形成が促進される。
【００２９】
少なくとも１つ、好ましくは１〜１０、特に好ましくは１〜６、特に１〜３、しかし特に１つのみの以下のアミノ酸−Ｌｙｓ２、Ｌｙｓ７、Ｈｉｓ１０、Ｇｌｙ１２、Ｌｅｕ２４、Ｔｙｒ３１、Ｐｈｅ３４、Ａｒｇ３９、Ｉｌｅ４５、Ｍｅｔ４８、Ａｓｐ５０、Ｐｒｏ５５、Ｐｈｅ５８、Ａｓｎ６０、Ｐｒｏ６５、Ａｒｇ６６−が、別のアミノ酸、好ましくはバリン、アラニン、グリシンまたはセリンなどの小さいアミノ酸、特に好ましくはアラニンおよびグリシン、特にアラニンと交換されている修飾トリデジンポリペプチドは、驚くべきことに、野生型トリデジンより低い抗原性を示し、これは驚くべきことに、ヒトＸＩＩＩａ因子に対する阻害活性と連動しており、次に驚くべきことに、該阻害活性は野生型トリデジンポリペプチドのものと匹敵する。
【００３０】
野生型トリデジンポリペプチド由来であり、そしてＸＩＩＩａ因子を阻害する最少アミノ酸配列に関して検索すると、驚くべきことに、少なくともアミノ酸配列ＤＤＩＹＱＲＸＶＸＦＰＸＬＰＬ、特にアミノ酸配列ＤＤＩＹＱＲＰＶＥＦＰＮＬＰＬまたはＤＤＩＹＧＲＰＶＥＦＰＮＬＰＬＫを含有するポリペプチドが、ヒトＸＩＩＩａ因子に対する阻害効果を示すことが見出された。したがって、上述のアミノ酸配列を含有する、わずか長さ１６アミノ酸のポリペプチドであっても、ヒトＸＩＩＩａ因子を阻害した。阻害活性を所持し、そしていずれの場合も、アミノ酸が１つずつアラニンと交換されている、野生型トリデジンポリペプチド由来ポリペプチドの変異体によって、これらの結果を確認した。さらに、これらの実験によって、阻害効果に必須な残基を推定することが可能となる。
【００３１】
元来のポリペプチド、配列番号２５におけるアラニン置換の結果（配列中の置換残基をＸで示す）は、以下のように要約可能である：
出発配列（配列番号２５）：ＰＭＤＤＩＹＱＲＰＶＥＦＰＮＬＰＬＫＰＲ
以下のＸアミノ酸の場合の、活性にはまったく減少がなかった置換：
ＸＸＤＤＩＹＱＲＸＶＸＦＰＸＬＰＬＫＸＸ
以下のＸアミノ酸の場合の、活性にわずかな減少があった置換：
ＰＭＸＸＩＹＸＸＰＸＥＸＸＮＸＸＬＸＰＲ
以下のＸアミノ酸の場合の、活性により多くの減少があった置換：
ＰＭＤＤＸＸＱＲＰＶＥＦＰＮＬＰＸＫＰＲ。
【００３２】
これらの結果から、最少ＦＸＩＩＩａ阻害ポリペプチドは、以下の配列：ＤＤＩＹＱＲＸＶＸＦＰＸＬＰＬ（配列番号８９）を有することがわかり、ここで、Ｘで示すアミノ酸は、互いに独立に、好ましくは天然アミノ酸から選択される、アミノ酸いずれか、特にバリン、アラニン、グリシンまたはセリンなどの小さいアミノ酸、特に好ましくはアラニンおよびグリシン、しかし特にアラニンであることが可能である。上記配列番号８９配列中のＸで示すアミノ酸の１つ、２つまたは３つはまた、対応する部位の野生型アミノ酸であることも可能である。
【００３３】
４０未満、好ましくは３０未満、特に好ましくは２５未満のアミノ酸を含有し、そして少なくともアミノ酸配列ＤＤＩＹＱＲＸＶＸＦＰＸＬＰＬ（配列番号８９）［脱落］短いポリペプチドであって、Ｘで示すアミノ酸が、互いに独立に、好ましくは天然アミノ酸から選択される、アミノ酸いずれか、特にバリン、アラニン、グリシンまたはセリンなどの小さいアミノ酸、特に好ましくはアラニンおよびグリシン、しかし特にアラニンであることが可能であり、そして上記配列番号８９配列中のＸで示すアミノ酸の１つ、２つまたは３つがまた、対応する部位の野生型アミノ酸、特にアミノ酸配列ＤＤＩＹＱＲＰＶＥＦＰＮＬＰＬまたはＤＤＩＹＱＲＰＶＥＦＰＮＬＰＬＫが含有するものであることも可能である、前記ポリペプチドは、凝集する傾向がより低いという、さらなる利点を所持し、多量に化学的に合成可能であり、そして野生型トリデジンポリペプチドより低い抗原性を示す。
【００３４】
さらなる好適な修飾トリデジンポリペプチドは、ポリエチレングリコールに共有結合したトリデジンポリペプチドである。ＰＧＥでの修飾の反応条件は、例えばＣｏｈｅｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３５７（３）：７９５−８０２（２００１）に記載される。修飾反応に用いるポリエチレングリコールは、５００Ｄａ〜２００００Ｄａ、好ましくは１０００Ｄａ〜１００００Ｄａの間、特に好ましくは２０００Ｄａ〜５０００Ｄａの間の分子量を有するべきである。ポリエチレングリコールは、０．５：１〜１０：１の間、好ましくは０．８：１〜４：１の間、特に好ましくは１：１〜２：１の間のポリエチレングルコール：本発明記載のポリペプチドのモル比であるべきである。これらの修飾ポリペプチドは、哺乳動物の血流への注射後、非修飾ポリペプチドより遅く分解されるという利点を有する。
【００３５】
本発明はさらに、上述のポリペプチドを含有する化合物に関する。
これらの化合物には、特に、トリデジンポリペプチド由来でなく、例えば５〜５００、好ましくは５〜４００、５〜３００、５〜２００、５〜１００、５〜５０、特に５〜２０アミノ酸の別のタンパク質由来であるアミノ酸配列の内容を有する融合タンパク質（ＬａＶａｌｌｉｅおよびＭｃＣｏｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６（５）：５０１−５０６（１９９５））とともに、トリデジンポリペプチド由来でなく、例えば５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０または５０アミノ酸より多く、そして５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、７５、５０または４０アミノ酸未満の別のタンパク質由来のアミノ酸配列の内容を有する融合ポリペプチド、並びにその単離型のすべての並べ替えが含まれる。これに関連して、トリデジンポリペプチド由来のアミノ酸配列の内容は、好ましくは、５０、４５、４０、３５、３０、２５または２０アミノ酸未満である。
【００３６】
外来（ｆｏｒｅｉｇｎ）タンパク質由来のこうしたアミノ酸配列の例は、例えば大腸菌ガラクトシダーゼ由来であることが可能な、原核生物ペプチドおよびポリペプチド配列である。さらにまた、この方式で、当業者に知られるファージディスプレー法（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８（６３０１）：５５２−５５４（１９９０））用の融合タンパク質を生成するため、例えばバクテリオファージＮ１３由来の、ウイルスペプチドおよびポリペプチド配列を使用することも可能であろう。さらに、この方式で、ｉｎ  ｖｉｖｏで検出可能な蛍光融合タンパク質を生成するため、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、Ｐｒａｓｈｅｒら，Ｇｅｎｅ  １１１（２）：２２９−２３３（１９９２）に記載される）由来の真核生物ポリペプチド配列を使用することも可能である。ＧＦＰの変異体（Ｔｓｉｅｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：５０９−５４４（１９９８））とともに赤色蛍光タンパク質もまた、使用可能である。さらに、グルコースデヒドロゲナーゼおよびそのポリペプチド断片が、融合パートナーとして排除可能である。
【００３７】
融合タンパク質用のペプチドおよびポリペプチド配列の他の好ましい例は、上述の融合タンパク質の精製を促進するペプチド、すなわち、タグと呼ばれ、そして結果として本発明記載のポリペプチドを精製するのに使用可能なペプチドである（Ｎｉｌｓｓｏｎら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１１（１）：１−１６（１９９７）を参照されたい）。本発明記載のポリペプチドにタグを付けると、例えば、ポリペプチドが高い親和性でマトリックス上に吸収され、そして融合タンパク質およびマトリックス間の複合体が溶出されることなく、有意な度合いいずれかまで、適切な緩衝液でストリンジェントに洗浄され、そして続いて、マトリックスに結合した融合タンパク質が、選択的に溶出されることが可能になる。こうしたタグの例は、精製用のタグとして、５つの連続ヒスチジンを使用することがすでに可能であった（Ｈｉｓ）６タグ、Ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、キチン結合タグ、ポリペプチド・グルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、およびポリペプチド・マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）である。当業者は、同等の機能を有する他のタグに精通している。
【００３８】
融合タンパク質用のペプチドおよびポリペプチド配列の他の好ましい例は、宿主から上述のポリペプチドが分泌されるのを仲介するペプチドおよびポリペプチドである。こうしたペプチドおよびポリペプチド配列の例は、Ｐｉｎｅｓ  Ｏ．およびＩｎｏｕｙｅ  Ｍ．、上記；Ｒａｐｏｐｏｒｔ  Ｔ．Ａ．ら、上記、およびＴｊａｌｓｍａ  Ｈ．ら、上記に見出すことが可能である。
【００３９】
本発明はさらに、上述のポリペプチドを調製する方法に関する。したがって、本発明記載のポリペプチドは、組換え法またはペプチド化学反応法を用いて、調製可能である。
前記ポリペプチドの１つを調製する組換え法は、例えば、記載するポリペプチドの１つをコードする核酸を、適切な方式（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ”第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ”第３版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１））で、原核または真核発現ベクターにクローニングすることからなる。こうした発現ベクターは、少なくとも１つのプロモーター、少なくとも１つの翻訳開始シグナル、本発明記載のポリペプチドの１つをコードする、少なくとも１つの核酸配列、および原核発現ベクターの場合、翻訳終結シグナル、そしてさらに、転写終結シグナル、およびまた真核発現ベクターの場合、ポリアデニル化シグナルを含んでなる。本発明記載のポリペプチドの１つをコードする核酸は、例えば、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＢＡＣまたはＹＡＣなどのベクターの一部、特に原核または真核発現ベクターの一部であることが可能である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”第３版，“Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ”（２００１）；プラスミドは１．３−１．２９に記載され、ファージミドは３．４２−３．５２に記載され、コスミドは４．１−４．１０に記載され、そして真核発現ベクターは１７．８３−１７．１１１に記載される）。
【００４０】
原核発現ベクターのさらなる例は、例えば、大腸菌での発現に適した、ＵＳ４，９５２，４９６に記載されるような、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼに認識されるプロモーターに基づく発現ベクター、例えば枯草菌での発現に適した、Ｌｅ  Ｇｒｉｃｅ  Ｓ．Ｆ．Ｊ．によってＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９９０）ｖｏｌ．１８５，２０１−２１４ページに記載される発現ベクター、または枯草菌での分泌に適した、Ｎａｇａｒａｊａｎ  Ｖ．によって、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９９０）ｖｏｌ．１８５，２１４−２２３ページに記載される発現ベクターであり、一方、真核発現ベクターの例は、例えばベクターｐ４２６Ｍｅｔ２５またはｐ５２６ＧＡＬ１（Ｍｕｍｍｂｅｒｇら（１９９４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２２，５７６７−５７６８）、あるいはサッカロミセス・セレビシエでの発現に適した、Ｍｙｌｉｎ  Ｌ．Ｍ．ら（２９７−３０８）、Ｐｒｉｃｅ  Ｖ．Ｌ．ら（３０８−３１９）およびＥｔｃｈｅｖｅｒｒｙ  Ｔ．（３１９−３２９）によってＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９９０）ｖｏｌ．１８５，２９７−３２９ページに記載されるベクター、あるいはＳ．セレビシエでの分泌に適した、Ｂｒａｋｅ  Ａ．Ｊ．（４０８−４２１）およびＨｉｔｚｅｍａｎ  Ｒ．Ａ．ら（４２１−４４０）によってＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９９０）ｖｏｌ．１８５，４０８−４４０ページに記載されるベクター、ピキア・パストリスでの発現に適した、例えばＣｒｅｇｇ  Ｊ．Ｍ．ら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０００）１６（１）：２３−５２または“Ｐｉｃｈｉａ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”Ｄ．Ｒ．ＨｉｇｇｉｎｓおよびＪ．Ｍ．Ｃｒｅｇｇ（監修）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ニュージャージー州トトワに記載されるベクター、他の酵母、例えばハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）での発現に適した、Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ  Ｇ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０００）５４（６）：７４１−５０に記載されるベクター、昆虫細胞での発現に適した、ＥＰ−Ｂ１−０  １２７  ８３９またはＥＰ−Ｂ１−０  ５４９  ７２１に開示されるような、例えばバキュロウイルスベクター、および例えばベクターＲｃ／ＣＭＶおよびＲｃ／ＲＳＶ、またはＳＶ４０ベクター、あるいは哺乳動物細胞での発現に適した、Ｋａｕｆｍａｎ  Ｒ．Ｊ．によってＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９９０）ｖｏｌ．１８５，４８７−５１２ページに記載されるベクターであり、これらのベクターはすべて、一般的に入手可能である（さらなる適切な発現系に関しては、Ａｎｄｅｒｓｅｎ  Ｄ．Ｃ．およびＫｒｕｍｍｅｎ  Ｌ．，Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００２）１３（２）：１１７−２３もまた参照されたい）。
【００４１】
当業者は、これらの発現ベクターを調製する分子生物学的方法とともに、宿主細胞に発現ベクターを導入する方法、そしてまた形質転換宿主細胞を培養する条件、そして最後に、宿主細胞において、本発明記載の望ましいポリペプチドの発現を誘導する条件に精通している（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記もまた参照されたい）。本発明記載のポリペプチドの組換え調製の例を実施例１、２および４に示す。
【００４２】
しかし、上述のポリペプチドはまた、ペプチド化学反応を伴う方法、すなわち例えばＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅ．Ｓｏｃ．８５：２１４９（１９６２）に記載されるような周知の固相合成を用いる方法によって、実施例３におけるように調製可能である。ペプチドを合成し、そして精製する技術は、例えば、ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ，“Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｆｒｅｅｍａｎ，サンフランシスコ，１９６９）の２７−６２ページに、それとともにＵＳ４，２６９，８２７にもまた記載される。
【００４３】
本発明はまた、トランスグルタミナーゼ、特にＸＩＩＩａ因子、特にヒトＸＩＩＩａ因子の阻害剤としての、上述のポリペプチドの１つの使用にも関する。上述のポリペプチドは、例えばＢｅｈｒｉｃｈｒｏｍ（登録商標）アッセイ（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ  ＧｍｂＨ、マールブルグ）におけるように、ＸＩＩＩａ因子が触媒する反応中、グリシンエチルエステルを用いて特定のペプチド基質から放出されるアンモニウムイオンの、ＸＩＩＩａ因子が触媒する放出を、阻害する特性を有する。上述のポリペプチドの阻害効果は、例えば、実施例１〜４に記載されるように、Ｂｅｈｒｉｃｈｒｏｍ（登録商標）アッセイにおいて、検出可能である。
【００４４】
さらに、本発明記載のポリペプチドは、ヒトＸＩＩＩａ因子に相同な哺乳動物タンパク質、例えばヒトＸＩＩＩ因子に相同であり、そして７３２アミノ酸のうち６１７アミノ酸が同一（８４％）であり、そして７３２アミノ酸のうち６８９アミノ酸が関連している（９３％）、ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）タンパク質を阻害可能である。
【００４５】
ＸＩＩＩａ因子に対するその阻害効果に加えて、上述のポリペプチドはまた、他のトランスグルタミナーゼ、例えば角化細胞で発現されるトランスグルタミナーゼ１、表皮形成に関与するトランスグルタミナーゼ３、輸精管において、タンパク質の架橋およびポリアミンのコンジュゲート化に関与するトランスグルタミナーゼ４とともに、角化細胞の角化に関与するトランスグルタミナーゼ５、およびその結果、これまでに記載した、ヒトプロテオームトランスグルタミナーゼの６つすべても阻害する。
【００４６】
本発明の別の態様は、血栓症を防止し、そして治療するための、本発明記載のポリペプチドの使用にある。本発明記載のポリペプチドは、ＸＩＩＩａ因子を阻害するため、これらはまた、フィブリンポリマー架橋の形成も阻害する。それによって、これは、線維素溶解酵素による分解に抵抗性である「硬い」血栓の形成を阻害する。
【００４７】
例えば、本発明記載のポリペプチドは、実施例５に記載するように、ヒト血栓がより迅速に溶解されるのを可能にし、そしてまた、血液凝集の開始を阻害した。該タンパク質は、その結果、血栓症を防止し、そして治療するのに適している。
【００４８】
本発明はさらに、本発明記載のポリペプチドおよび少なくとも１つのガレン（ｇａｌｅｎｉｃ）アジュバントを含んでなる、薬剤に関する。本発明記載のポリペプチドは、強力なトランスグルタミナーゼ阻害剤であるが、これらはわずかな度合いの毒性しか示さず、そしてしたがって、薬剤を産生するのに特に容易に使用可能である。
【００４９】
本発明にしたがって、用語「ガレンアジュバント」は、本発明記載のポリペプチドまたは患者と、許容し得ない不都合な方式で反応しない限り、いかなる、不活性、非毒性の固形または液体増量剤（ｆｉｌｌｅｒ）、希釈剤またはパッケージング材料も示す。液体ガレンアジュバントの例は、無菌水、生理学的塩化ナトリウム溶液、糖溶液、エタノールおよび／または油である。錠剤およびカプセルを製造するためのガレンアジュバントは、例えば、結合剤および増量剤を含んでなることが可能である。
【００５０】
本発明はまた、本発明記載のポリペプチドとともに、少なくとも１つの薬学的活性化合物を含んでなる併用製剤にも関する。
本発明の好ましい態様は、少なくとも１つの本発明記載のペプチドとともに、抗凝血剤の形のさらなる活性化合物を含んでなる併用製剤からなる。抗凝血剤は、血栓の溶解を促進するか、または血栓の形成を阻害するかいずれかである。例えば、活性トロンビンまたはプロトロンビンの分解を促進する活性化合物である血栓溶解活性化合物、ポリマー性フィブリンの分解を促進する活性化合物である線維素溶解活性化合物、またはフィブリノーゲンの分解を促進する活性化合物であるフィブリノーゲン溶解（ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎｏｌｙｔｉｃ）活性化合物がある。プラスミンまたはプラスミノーゲンのアクチベーター、あるいはトロンビンおよびＸａ因子の阻害剤、あるいは血小板凝集の阻害剤である抗凝血剤が好ましい。
【００５１】
併用製剤において、本発明記載のペプチドと組み合わせて使用可能な、特に好ましい抗凝血剤は、アセチルサリチル酸、ヘパリン、低分子量ヘパリン、ヘパリノイド、ヒルジン、ビバリルジン（ｂｉｖａｌｉｒｕｄｉｎ）、メラガトラン（ｍｅｌａｇａｔｒａｎ）、アブシキシマブ、エプチフィバビド（ｅｐｔｉｆｉｂａｂｉｄｅ）、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、ストレプトキナーゼ、スタフィロキナーゼ、ウロキナーゼ、エミナーゼ（ｅｍｉｎａｓｅ）、ヘメンチン（ｈｅｍｅｎｔｉｎ）および／またはプラスミンである。
【００５２】
アセチルサリチル酸は、とりわけ、血小板凝集阻害剤として作用する。ヘパリンは、分子量６０００Ｄａ〜３００００Ｄａの分子量を有する、内因性ポリアニオン性多糖であり、そして内因性アンチトロンビンＩＩＩの活性を増加させる。ヘパリンの限定分解によって、低分子量ヘパリンが得られ、そして低分子量ヘパリンは、４０００Ｄａ〜６０００Ｄａの分子量を有する。ヒルジンは、例えばＥＰ  ０３４７３７６およびＥＰ  ０５０１８２１に記載される。「ヒルジン」は、ヒル由来であり、そしてトロンビンおよび血液凝固を阻害する、相同ポリペプチドのファミリーを示すよう用いられる。ビバリルジンは、トロンビン阻害ペプチドである（Ｋｅｌｌｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８９，６０４０−６０４４（１９９２））。メラガトランはトロンビン阻害ペプチド擬似体（ｍｉｍｅｔｉｃ）である（Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ７９（１）：１１０−１１８（１９９８））。アブシキシマブは抗体であり、そしてエプチフィバビドはペプチドであり；どちらもＧＰ  ＩＩｂ／ＩＩＩｂ、すなわち血小板糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩｂに結合し、そして血小板凝集を阻害する。ヘメンチンは、例えばＷＯ９１／１５５７６に記載され、多様なヒルに見られ、そしてフィブリノーゲンを分解し、そしてそれによって血液凝固を防止する。同じ方式で、プラスミンまたはエミナーゼはフィブリンの分解を導き、一方、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、スタフィロキナーゼおよび組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）はプラスミノーゲンを活性化し、そして活性プラスミンを生成することによって、フィブリン分解を導く。
【００５３】
本発明記載のポリペプチドを抗凝血剤と、そして適切な場合、さらなる薬学的活性化合物と組み合わせる、特別の利点は、１つの活性化合物自体によるよりも、活性化合物の組み合わせによる協同作用で、血栓がより迅速に分解することである。特に、ウロキナーゼおよび組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）などの線維素溶解剤との併用は、実施例５に詳細に記載するように、血栓の安定性の減少、およびより迅速な分解をもたらした。
【００５４】
本発明はここで、本発明を制限することなく、図および実施例を活用して、以下にさらに明確にされるであろう。
【実施例】
【００５５】
【化２】
2005513141.tif 000005
【００５６】
配列番号１：
【００５７】
【化３】
2005513141.tif 000006
【００５８】
配列番号１は、野生型トリデジンポリペプチドを示す。
配列番号２〜配列番号２６は、いずれの場合も、配列番号１由来の長さ２０アミノ酸のペプチドを示す。
配列番号２７〜配列番号４６は、トリデジンポリペプチドに突然変異を誘発するのに用いるオリゴヌクレオチドを示す。
配列番号４７は、配列番号１由来の長さ１６アミノ酸のペプチドを示し、一方、配列番号９２は、配列番号１由来の長さ１５アミノ酸のペプチドを示す。
配列番号４８〜配列番号８８は、一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ペプチドおよびペプチド変異体を示す。
配列番号８９は、長さ１５アミノ酸のペプチドを示す。
配列番号９０および配列番号９１は、ピキア・パストリスにおける発現に用いるコードＤＮＡ配列を示す。
【００５９】
（実施例１）
大腸菌からの組換えトリデジンポリペプチド（配列番号１）の発現および精製
組換えトリデジンポリペプチドをコードする配列を含有する発現プラスミドｐＥＴ２２ｂ−１４を図１に示す。現在の方法を用いて、大腸菌発現株Ｏｒｉｇａｍｉ（登録商標）Ｂ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ、注文番号７０８３７）に該プラスミドを移入し、その後、この株を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、カナマイシンおよびテトラサイクリン（いずれの場合も、５μｇ／ｍｌ）を含有する液体ＬＢ培地中で培養した。発現株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）も同様の結果を生じ、そしてまた修飾トリデジンポリペプチドを発現するのに使用可能である。メインの培養を、０．７のＯＤ６００に到達するまで、３７℃および２２０ｒｐｍで震蘯した。０．７〜０．９  ＯＤ６００／ｍｌの細胞密度で、遺伝子発現を誘導するため、培養を２ｍＭ  ＩＰＴＧ／ｍｌで処理し、そしてその後、３７℃および２００〜２４０ｒｐｍでさらに４時間震蘯した。続いて、遠心分離（１５分間、５８２５ｘｇ）によって細胞を採取した。非常に純粋な水で１：１０に希釈しておいた１０ｘＢｕｇＢｕｓｔｅｒタンパク質抽出試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ）に、細胞沈降物を再懸濁し、そして破壊する目的で、ベンゾナーゼ（ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）（Ｎｏｖａｇｅｎ）およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨのＥＤＴＡ不含Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（登録商標））とともに、震蘯しながら４℃で１０〜２０分間インキュベーションした。続いて、１６０００ｘｇおよび４℃で２０分間遠心分離することによって、上清を得て、そしてその後、上清を等体積の溶解緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール）で処理した。生じたタンパク質懸濁物を４℃で一晩保存した。精製するため、３ｍｌのニッケルＮＴＡアガロース（Ｑｕｉａｇｅｎ）を空のカラムに充填し、そして５カラム体積の溶解緩衝液で平衡化した。タンパク質懸濁物をカラム上に装填し（ポンピングなしで、引力の結果、流れる）、そしてその後、洗浄緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール）で洗浄した（１０カラム体積）。溶出緩衝液（２〜３カラム体積）（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８）でカラムから溶出させた。分画を収集し、そしてトランスグルタミナーゼ阻害剤の存在に関して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって調べた（図２を参照されたい）。収量は、発現培養物１リットルあたり、組換えトリデジンポリペプチド２０ｍｇであり、純度は＞９０％であった。組換えトリデジンポリペプチドを含有する分画を合わせ、そして５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌに対して、徹底的に透析した（２ｌに対して２回）。その後、ＸＩＩＩａ因子に対する精製タンパク質の阻害活性を試験した。Ｂｅｒｉｃｈｒｏｍ（登録商標）アッセイ（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）を試験法として用いた。
【００６０】
Ｂｅｈｒｉｃｈｒｏｍ（登録商標）アッセイの実行：
該アッセイは、ＸＩＩＩ因子が、試薬中に存在するトロンビンによってＸＩＩＩａ因子を形成するように活性化されることに基づく。ＸＩＩＩａ因子は、特定のペプチド基質をグリシンエチルエステルに連結し、このとき、アンモニウムイオンが放出される。後者を、平行して進行する酵素反応で測定する。３４０ｎｍでの消光を用いて、ＮＡＤＨの減少を測定した。測定のため、ペプチドをストック濃度５ｍＭで５０％アセトニトリルに入れた。製造者によって供給されるＮＡＤＨおよび検出試薬を３ｍｌの水に溶解し、続いて、アクチベーター試薬を３ｍｌのＮＡＤＨ試薬に溶解した。使用のため、アクチベーター試薬および検出試薬を１：１の比で混合した。マイクロタイタープレート形式で測定を実行するため、１００μｌの試料（阻害剤または対照緩衝液）、２５μｌのＸＩＩＩ因子（１０Ｕ／ｍｌ）および１５０μｌの実験試薬を混合した。マイクロタイタープレート光度計中、３４０ｎｍおよび３７℃で２０分間連続して測定を行った。評価するため、１６分後および２０分後に測定した値の相異を比較した。
測定によって、精製トランスグルタミナーゼ阻害剤に関して、２〜４μＭのＩＣ５０が得られた（図３を参照されたい）。
【００６１】
（実施例２）
大腸菌からの修飾トリデジンの発現および精製
野生型トリデジンポリペプチドをコードする発現プラスミドの部位特異的突然変異誘発によって、修飾トリデジンを産生した。製造者の指示にしたがって、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ試薬（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いたＰＣＲによって、突然変異誘発を行った。オリゴヌクレオチド、配列番号２７〜配列番号４０およびそれぞれの逆相補配列を突然変異誘発に用いた。
【００６２】
生じた突然変異体のＤＮＡ配列を、配列決定によってチェックした。現在の方法を用いて、すでに上に記載したように、大腸菌発現株Ｏｒｉｇａｍｉ（登録商標）Ｂ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に、プラスミドｐＥＴ２２ｂ中の各コード配列を移入し、その後、この株を、アンピシリン、カナマイシンおよびテトラサイクリンを含有する液体ＬＢ培地中で培養した。さらに、発見された、自発的に生じる二重突然変異体もまた、発現させ、そして精製した。実施例１に記載するように、発現、精製および活性測定を行った。個々の修飾トリデジンに関して、以下の表２に示す活性を測定した。ＸｎＹ式にしたがって、修飾トリデジンに名前を付けた。
【００６３】
この式では、Ｘは、突然変異誘発によって変化したアミノ酸を示し、一方、ｎはポリペプチド鎖中のこのアミノ酸の位置を定義し、そしてＹは、突然変異誘発後に存在するアミノ酸を示す。
【００６４】
表２：Ｂｅｒｉｃｈｒｏｍ（登録商標）アッセイにおける、ＸＩＩＩａ因子に対する修飾トリデジンの阻害効果
【００６５】
【表２】
2005513141.tif 000007
【００６６】
以下のオリゴヌクレオチドを用いて、上述の変異体を産生した：
【００６７】
【表３】
2005513141.tif 000008
【００６８】
５．４５μＭの最終変異体濃度で、相対阻害効果（％）を測定した。組換えトリデジンポリペプチドの阻害効果を１００％に規準化した（５．４５μＭのもの）。
【００６９】
（実施例３）
トリデジンポリペプチド断片の阻害効果
ペプチド合成の現在の方法（Ｐｅｐｓｃａｎ、Ｌｅｌｙｓｔａｄ、ＮＬ）を用いて、組換えトリデジンポリペプチドに基づいて、長さ２０アミノ酸の２５のペプチドを化学的に合成した。該ペプチドはＮ末端にアセチル基を持ち、そして対応して、Ｃ末端にアミド基を持つ。配列は、
ａ）配列１全体を含み、そして
ｂ）いずれの場合も、１８アミノ酸残基が重複する（表３、配列２〜２６を参照されたい）
ように選択された。
【００７０】
上述のＢｅｒｉｃｈｒｏｍ（登録商標）アッセイを用いて、７．２７μＭのペプチド最終濃度で、相対阻害効果（％）を測定した。最終濃度７．２７μＭの組換えトリデジンポリペプチドの阻害効果を１００％に規準化した。
【００７１】
表３：Ｂｅｒｉｃｈｒｏｍ（登録商標）アッセイにおける、ＸＩＩＩａ因子に対する組換えトリデジンペプチドの阻害効果
【００７２】
【表４】
2005513141.tif 000009
【００７３】
再び、Ｂｅｒｉｃｈｒｏｍ（登録商標）アッセイを用いて、ＨＰＬＣによってペプチドを精製した後、ＸＩＩＩａ因子に対する、３つのＣ末端ペプチド（配列番号２４、２６および２６）の阻害効果を別個に測定した。以下のＩＣ５０値を測定した：
・配列番号２４：ＩＣ５０：７μＭ
・配列番号２５：ＩＣ５０：４μＭ
・配列番号２６：ＩＣ５０：５μＭ
最少の長さを決定するため、現在の方法を用いて、いずれの場合も、Ｃ末端から、またはＮ末端から、１アミノ酸ずつ一部切除した２０のペプチド（アセチル化またはアミド化）を合成した。
【００７４】
【化４】
2005513141.tif 000010
【００７５】
最も重要な残基を同定するため、いずれの場合も、１アミノ酸がアラニンと交換されている、さらに２０のペプチドを合成した。
【００７６】
【化５】
2005513141.tif 000011
【００７７】
上述のＢｅｒｉｃｈｒｏｍアッセイにおいて、これらの未精製ペプチド（アッセイ中の最終濃度〜７．２７μＭ）の阻害活性を調べた。図７に示す測定値を得た。
結果をさらにチェックするため、２つの配列ＭＤＤＩＹＱＲＰＶＥＦＰＮＬＰＬ（配列番号８７）（１６量体）およびＤＤＩＹＱＲＰＶＥＦＰＮＬＰ（配列番号８８）（１４量体）を合成し、そして精製した。精製ペプチドを用いて、出発配列（配列番号２５）の値を比較のために測定した。これによって、その後、上述のＢｅｒｉｃｈｒｏｍ（登録商標）試験において、阻害活性（ＩＣ５０）を決定することが可能になった：
−（配列番号８７）ＩＣ５０＝１９μＭ
−（配列番号８８）ＩＣ５０＝〜２８０μＭ
【００７８】
（実施例４）
システイン残基の交換によって修飾されているトリデジンの大腸菌からの発現および精製
野生型トリデジンに存在するシステインの部位特異的突然変異誘発によって、これらの修飾トリデジンを産生した。この突然変異誘発の目的は、段階的な方式で、分子間ジスルフィド架橋を形成するのに適したシステイン残基を交換することであった。還元剤（例えばメルカプトエタノールおよびＤＴＴ）の存在下または非存在下で、元来のトランスグルタミナーゼ阻害剤（配列番号１）の適切なクロマトグラフィー解析を行うことによって、ジスルフィド架橋を形成する傾向、およびそれに付随する最終産物の凝集を検出した。したがって、１つのゲルろ過実験（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＨｉＰｒｅｐ２６／６０  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ２００  ＨＲカラム上；２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ；１ｍｌ／分）では、精製組換えトリデジンポリペプチドは、およそ８０％の含量で多量体高分子量凝集体を有した。組換えトリデジンを、１．５ｍＭ  ＤＴＴ、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ中の還元条件下、ゲルろ過実験で分離すると、凝集体の含量は、有意により低かった（＜２０％）。
【００７９】
製造者の指示にしたがって、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ試薬（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、突然変異誘発を行った。オリゴヌクレオチド、配列番号４１〜配列番号４６、およびそれぞれの逆相補配列を突然変異誘発に用いた。生じた突然変異体のＤＮＡ配列を、配列決定によってチェックした。
【００８０】
現在の方法を用いて、すでに上に記載したように、大腸菌発現株Ｏｒｉｇａｍｉ（登録商標）Ｂ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に、プラスミドｐＥＴ２２ｂ中の各コード配列を移入し、そしてその後、この株を、上述のように、液体ＬＢ培地中で培養した。実施例１に記載するように、発現、精製および活性測定を行った。個々の突然変異体に関して、測定した活性を以下の表４に示す。ＸｎＹ式にしたがって、突然変異体に名前を付けた。
【００８１】
この式では、Ｘは、突然変異誘発によって変化したアミノ酸を示し、一方、ｎはポリペプチド鎖中のこのアミノ酸の位置を定義し、そしてＹは、突然変異誘発後に存在するアミノ酸を示す。
【００８２】
表４：Ｂｅｒｉｃｈｒｏｍ（登録商標）アッセイにおける、ＸＩＩＩａ因子に対する、システイン残基の交換によって修飾しておいたトリデジンの阻害効果
【００８３】
【表５】
2005513141.tif 000012
【００８４】
５．４５μＭの最終変異体濃度で、相対阻害効果（％）を測定した。組換え野生型トリデジンポリペプチドの阻害効果（５．４５μＭのもの）を１００％に規準化した。上述の変異体を産生するのに用いたオリゴヌクレオチドはまた、表中にも明記される。
【００８５】
（実施例５）
組換えトリデジンまたはトリデジン断片の存在下、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）およびウロキナーゼの線維素溶解活性の改善
本発明記載のポリペプチドの療法的潜在能力を立証するため、大腸菌由来組換えトリデジンポリペプチド（配列番号１、図５）またはピキア・パストリス由来トリデジンポリペプチド（配列番号９１、図１１）またはトリデジン断片（配列番号２５、図１０）の存在下、全血において、血液凝固および線維素溶解を測定した。これを行うため、血栓弾性図（ｔｈｒｏｍｂｅｌａｓｔｏｇｒａｍ）と呼ばれるものをプロットした。血栓弾性検査（ｔｈｒｏｍｂｅｌａｓｔｏｇｒａｐｈｙ）は、凝血および線維素溶解を測定する、現在の方法である。該方法は、血液中に存在するプランジャーの回転に対する抵抗性の変化によって、血液の粘性の変化を測定する（Ｃａｌａｔｚｉｓら、２０００）。図４は、血栓弾性図における、典型的な凝血相および線維素溶解相を示す。血栓弾性図は、止血の重要なパラメーターを定量化する：
・凝血時間（凝血の開始および血液粘性における測定可能な変化の開始の間の時間、ＣＴ）
・血栓安定性（最大の幅（ａｍｐｌｉｔｕｄｅ）、最大の血餅の硬さ、ＭＣＦ）
・線維素溶解時間（血液粘性における測定可能な変化の開始および凝血前の出発値の達成の間の時間、溶解時間、ＬＴ）
Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ  ＧｍｂＨ、ミュンヘンから供給されるＲＯＴＥＧ（登録商標）装置を、示す測定に用いた。図５および６は、Ｃａ２＋（Ｓｔａｒｔｅｇ試薬、Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ  ＧｍｂＨ）およびトロンボプラスチン・リン脂質（Ｉｎｔｅｇ試薬、Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ  ＧｍｂＨ）を添加した後の、全クエン酸血液の血栓弾性図を示す。これらの試薬を用いて、凝血を誘導する。血栓療法に用いられる慣用的な線維素溶解剤、並びに組換えトリデジンポリペプチドおよび修飾トリデジンの協同効果を、本発明にしたがって立証する目的で、多様な実験を行った。血栓弾性図によって、例として選択した線維素溶解剤である組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）およびウロキナーゼによってもたらされる線維素溶解を、組換えトリデジンポリペプチド、および修飾トリデジンが、加速し、そして改善することが示される。これは
ａ）幅がより小さく（血栓の安定性がより低く）、そして
ｂ）線維素溶解速度が増加している
ことによって明らかとなる。
【００８６】
さらに、凝血時間（ＣＴ）が、トランスグルタミナーゼ阻害剤の非存在下での１９０秒間から、大腸菌由来組換え野生型トリデジンポリペプチド（配列番号１）または修飾トリデジンの存在下では３８０秒間に延長されたことから、組換えトリデジンポリペプチドおよび修飾トリデジンがまた、血液凝固も阻害することが示される（図５ＡおよびＢを参照されたい）。
【００８７】
（実施例６）
ピキア・パストリスからの組換えトリデジンポリペプチド（配列番号９０にコードされるもの）の発現および精製
組換えトリデジンをコードする配列を含有する、発現プラスミド、トリデジンｐＰＩＣＺαＡ（発現ベクターｐＰＩＣＺαＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎに基づく）を図８に示す。
【００８８】
配列番号９０：
【００８９】
【化６】
2005513141.tif 000013
【００９０】
アルファ因子シグナルペプチドに融合させることによって、トリデジンを培地に分泌させることが可能である。現在の方法を用いて、該プラスミドを、ピキア・パストリス株ＫＭ７１ＨおよびＳＭＤ１１６８に移入した。ゼオシン耐性クローンを選択して、そしてその後、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の慣用法を用いて、トリデジンＤＮＡ配列を検出することによって、安定に組み込まれたトリデジン配列を含有するクローンを選択した。
【００９１】
生じたクローンをおよそ１６〜２４時間、そして震蘯しながら、１００ｍｌのＢＭＧＨ（１％酵母エキス；２％ペプトン；１００ｍＭ  リン酸Ｋ、ｐＨ６；１．３４％酵母窒素基剤；４ｘ１０−５％ビオチン；１％グリセロール）中、単一コロニーとして培養した（３０℃）。細胞を遠心分離して落とし（３０００ｘｇ、５分間）、そして２０〜３０ｍｌのＢＭＭＨ（１％酵母エキス；２％ペプトン；１００ｍＭ  リン酸Ｋ、ｐＨ６；１．３４％酵母窒素基剤；４ｘ１０−５％ビオチン；０．５％メタノール）中に再懸濁し、そして再度、震蘯しながら３０℃でインキュベーションした。２４時間後、メタノール（最終濃度０．５％）を添加した。さらに２４時間インキュベーションし、上述のように細胞を遠心分離して落とした。培養上清を直接プロセシングするか、または−７０℃で保存した。
【００９２】
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動およびクーマシーブリリアントブルー染色によって、トリデジンポリペプチドを検出した。ポリペプチドをＮ末端配列決定（Ｅｄｍａｎ分解、Ｔｏｐｌａｂ  ＧｍｂＨ）に供することによって、シグナルペプチドが正しくプロセシングされたことを確認した。しかし、６つのＣ末端ヒスチジン残基を含有する、完全に発現されたトリデジンポリペプチドは、現在のウェスタンブロッティング法（５つの連続ヒスチジン残基に対する抗体、Ｑｕｉａｇｅｎ  ＡＧ）を用いると、少量しか検出されなかった。質量分析（ＭＡＬＤＩ、Ｔｏｐｌａｂ  ＧｍｂＨ）によって、Ｃ末端タンパク質配列ＧｌｕＧｌｕＳｅｒＬｅｕＧｌｕＨｉｓＨｉｓＨｉｓＨｉｓＨｉｓＨｉｓが失われていることが見出された。
【００９３】
主な産物である、１１のＣ末端残基を含まないトリデジンポリペプチドを、以下の方法を用いて精製した。培養上清２５ｍｌあたり１０ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４の比で、培養上清を（ＮＨ４）２ＳＯ４で処理した。生じた沈降物を遠心分離して落とし、そして２０ｍＭ  ＣＨＥＳ、ｐＨ９に溶解した；その後、この溶液を２０ｍＭ  ＣＨＥＳ、ｐＨ９に対して透析した。その後、試料をＳｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｑ（２５ｍｌ）またはＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑ（１ｍｌ）イオン交換カラム（どちらもＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから得た）上に装填した（流速、１〜４ｍｌ／分）。２０ｍＭ  ＣＨＥＳ、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ９に対する２０ｍＭ  ＣＨＥＳ、ｐＨ９の勾配で、カラムから溶出させた。溶出中に収集した分画を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分画し、そしてクーマシーブリリアントブルーで染色した。この方式で、トリデジンポリペプチド含有分画を同定した。これらの分画を合わせて、そしてＰＢＳ（０．２ｇ  ＫＣｌ／ｌ、０．２ｇ  ＫＨ２ＰＯ４／ｌ、８ｇ  ＮａＣｌ／ｌ、１．１５ｇ  Ｎａ２ＨＰＯ４／ｌ、ｐＨ７．２）に対して透析し、そして限外ろ過（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  ＹＭ−３、Ａｍｉｃｏｎ）によって、濃縮した。図９は、ピキア・パストリスから単離したトリデジン試料を用いて得た、ＦＸＩＩＩａ阻害曲線を示す。活性を測定するため、上述のＢｅｒｉｃｈｒｏｍアッセイを用いた。
【００９４】
（実施例７）
ピキア・パストリスからの修飾組換えトリデジンポリペプチド（配列番号９１にコードされるもの）の発現および精製
実施例６で発現させ、そして精製したトリデジンポリペプチドは、６つのＣ末端ヒスチジンを欠く。これらのヒスチジンは、おそらく、プロテアーゼによって切断された。したがって、現在の部位特異的突然変異誘発法を用いて、コードされるトリデジンポリペプチドをプロテアーゼが消化するのを阻害するため、コードＤＮＡ配列を改変した。これに関連して、発現プラスミドｐＰＩＣＺアルファＡ−トリデジンＲ６６Ｌを生成した（トリデジン配列、配列番号９１）。該トリデジンポリペプチド配列において、Ｃ末端のアルギニン残基をロイシンと交換した。
【００９５】
配列番号９１：
【００９６】
【化７】
2005513141.tif 000014
【００９７】
実施例６に記載するようにトリデジンポリペプチドを発現するのに、発現プラスミドを用いた。これに関連して、上述のウェスタンブロッティング法を用いて、驚くべき高収率で、Ｃ末端ヒスチジンを含有する完全タンパク質配列を検出可能であることが発見された。
【００９８】
以下の方法を用いて、この産物を精製した。７．４のｐＨに達するまで、１Ｍ  リン酸Ｎａ、ｐＨ８を培養上清に添加した。その後、培養上清を、１：１で、緩衝液Ａ（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール）で希釈し、そして実施例１に記載するように、ニッケル−ＮＴＡカラム（Ｑｕｉａｇｅｎ）を通過させた。その後、溶出緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ８）を用いて溶出させた。分画を収集し、そしてトランスグルタミナーゼ阻害剤の存在に関して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検査した。トリデジンポリペプチドを含有する分画を合わせて、そしてＰＢＳ（０．２ｇ  ＫＣｌ／ｌ、０．２ｇ  ＫＨ２ＰＯ４／ｌ、８ｇ  ＮａＣｌ／ｌ、１．１５ｇ  Ｎａ２ＨＰＯ４／ｌ、ｐＨ７．２）に対して透析した。図９は、この方法で、ピキア・パストリスから単離した、これらのトリデジン試料を用いて得た、ＦＸＩＩＩａ阻害曲線を示す。活性を測定するのに、上述のＢｅｒｉｃｈｒｏｍ（登録商標）アッセイを用いた。
【００９９】
（実施例８）
血液凝固および線維素溶解に対するトリデジンポリペプチド由来ペプチドの影響もまた測定した（図１０）。ペプチド（配列番号２５および配列番号８８）をＰＢＳに溶解して、そして希釈した。全血（４℃で２４時間保存）を図１０に示す測定に用いた。
【０１００】
血液凝固および線維素溶解に対する、ピキア・パストリスから単離した組換え精製トリデジンポリペプチドの影響を図１１に示す。トリデジンポリペプチド（トリデジンＲ６６Ｌ、配列番号９１にコードされる）をこれらの測定に用いた。該ポリペプチドは、血栓弾性図の最大の幅（すなわち血餅の安定性、ＭＣＦ）を減少させ、そして、さらに、ｔＰＡまたはウロキナーゼの存在下で、線維素溶解時間（ＬＴ）を短縮する。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】発現プラスミドｐＥＴ２２ｂ−１４のマップ（Ａ）およびトリデジンポリペプチドコード配列の明細（Ｂ）。塩基はプラスミドマップにしたがって番号付けしている。
【図２】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ゲル）によって調べた、組換え野生型トリデジンポリペプチドの精製。  レーン１は、Ｎｉ−ＮＴＡカラム上に装填する前の総大腸菌溶解物である。  レーン２〜７は、イミダゾールでの溶出分画である。すべての試料をＳＤＳ試料緩衝液で処理し、そして９５℃で５分間インキュベーションした。
【図３】Ｂｅｒｉｃｈｏｍ（登録商標）アッセイにおける、ＸＩＩＩａ因子に対する組換え精製トリデジンポリペプチドの阻害効果。  対照物質としてセルレニン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を用いた。
【図４】血栓弾性図の図式的表示。  記載する実験に関係するパラメーターは、ＣＴ（凝血時間）、ＭＣＦ（血餅の最大の硬さ）およびＬＴ（溶解時間）である。
【図５】組換えトリデジンの非存在下（Ａ、ＣおよびＥ）および存在下（Ｂ、ＤおよびＦ）での全クエン酸血（ｃｉｔｒａｔｅ  ｂｌｏｏｄ）の血栓弾性図。  すべてのアッセイ試料は、全クエン酸血（３００μｌ）、Ｃａ２＋（Ｓｔａｒｔｅｇ試薬２０μｌ）およびトロンボプラスチン・リン脂質（Ｉｎｔｅｇ試薬１０μｌ）を含有する。  Ｂ：＋配列番号１を有するトランスグルタミナーゼ阻害剤（１０μＭ）  Ｃ：＋ウロキナーゼ（２５Ｕ）  Ｄ：＋配列番号１を有するトランスグルタミナーゼ阻害剤（１０μＭ）およびウロキナーゼ（２５Ｕ）  Ｅ：＋ｔＰＡ（４０．５ｎｇ）  Ｆ：＋配列番号１を有するトランスグルタミナーゼ阻害剤（１０μＭ）およびｔＰＡ（４０．５ｎｇ）
【図６】配列番号２５の非存在下（Ａ、ＣおよびＥ）および存在下（Ｂ、ＤおよびＦ）での全クエン酸血の血栓弾性図。  すべてのアッセイ試料は、全クエン酸血（３００μｌ）、Ｃａ２＋（Ｓｔａｒｔｅｇ試薬２０μｌ）およびトロンボプラスチン・リン脂質（Ｉｎｔｅｇ試薬１０μｌ）を含有する。  Ｂ：＋配列番号２５を有するトランスグルタミナーゼ阻害剤（２０μＭ）  Ｃ：＋ウロキナーゼ（２５Ｕ）＋不活性対照ペプチド（Ｂａｃｈｅｍのアセチル−アドヘシン（１０２５−１０４４）アミド）  Ｄ：＋配列番号２５を有するトランスグルタミナーゼ阻害剤（２０μＭ）およびウロキナーゼ（２５Ｕ）  Ｅ：＋ｔＰＡ（４０．５ｎｇ）＋不活性対照ペプチド（２０μＭ）  Ｆ：＋配列番号２５を有するトランスグルタミナーゼ阻害剤（２０μＭ）およびｔＰＡ（４０．５ｎｇ）
【図７】Ｂｅｒｃｈｒｏｍ（登録商標）アッセイにおける、ＸＩＩＩａ因子に対するトリデジン由来ペプチドおよびその変異体の阻害効果（Ａ〜Ｄ）。既定の濃度の組換え精製大腸菌トリデジン、およびペプチド２５（配列番号２５；アッセイ中の最終濃度〜７．２７μＭ）を対照として用いた。使用したペプチドの配列を列挙する（Ｅ）。エラーバーは標準誤差に関する（ｎ＝３）。
【図８】発現プラスミド、トリデジンｐＰＩＣＺαＡのマップ（Ａ）およびトリデジンポリペプチドコード配列の明細（Ｂ）。塩基はプラスミドマップにしたがって番号付けしている。
【図９】Ｂｅｒｉｃｈｒｏｍ（登録商標）アッセイにおける、ＸＩＩＩａ因子に対する組換え精製トリデジンポリペプチド（Ａ）、またはピキア・パストリス（ＫＭ７１Ｈ）由来変異体トリデジンＲ６６Ｌ（Ｂ）の阻害効果。
【図１０】配列番号８７または２５（どちらも２５μＭ）の非存在下（Ａ、ＤおよびＧ）および存在下（Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、ＨおよびＩ）での全クエン酸血の血栓弾性図。すべてのアッセイ試料は、全クエン酸血（３００μｌ）、Ｃａ２＋（Ｓｔａｒｔｅｇ試薬２０μｌ）およびトロンボプラスチン・リン脂質（Ｉｎｔｅｇ試薬１０μｌ）を含有する。  Ｂ：＋配列番号８７を有するトランスグルタミナーゼ阻害剤（ＴＩ）（２５μＭ）  Ｃ：＋配列番号２５を有するＴＩ（２５μＭ）  Ｄ：＋ウロキナーゼ（２５Ｕ）  Ｅ：＋配列番号８７を有するＴＩ（２５μＭ）＋ウロキナーゼ（２５Ｕ）  Ｆ：＋配列番号２５を有するＴＩ（２５μＭ）＋ウロキナーゼ（２５Ｕ）  Ｇ：＋ｔＰＡ（４０．５ｎｇ）  Ｈ：＋配列番号８７を有するＴＩ（２５μＭ）＋ｔＰＡ（４０．５ｎｇ）  Ｉ：＋配列番号２５を有するＴＩ（２５μＭ）＋ｔＰＡ（４０．５ｎｇ）
【図１１】組換え精製ピキア・パストリス由来トリデジンＲ６６Ｌ（配列番号９１にコードされるもの）の非存在下（Ａ、ＣおよびＥ）および存在下（Ｂ、ＤおよびＦ）での全クエン酸血の血栓弾性図。すべてのアッセイ試料は、全クエン酸血（３００μｌ）、Ｃａ２＋（Ｓｔａｒｔｅｇ試薬２０μｌ）およびトロンボプラスチン・リン脂質（Ｉｎｔｅｇ試薬１０μｌ）を含有する。  Ｂ：＋配列番号９１を有するトランスグルタミナーゼ阻害剤（ＴＩ）（５μＭ）  Ｃ：＋ウロキナーゼ（２５Ｕ）  Ｄ：＋配列番号９１を有するＴＩ（５μＭ）＋ウロキナーゼ（２５Ｕ）  Ｅ：＋ｔＰＡ（４０．５ｎｇ）  Ｆ：＋配列番号９１を有するＴＩ（５μＭ）＋ｔＰＡ（４０．５ｎｇ）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2005513141.tif 000021
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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