(57)【要約】  ヒトＨ３ヒスタミン受容体の新規スプライス変異体を開示する。前記スプライス変異体は野生型Ｈ３受容体のＮ末端の部分の欠失を有する。前記スプライス変異体はＨ３受容体でのヒスタミン作用のアゴニスト、インバースアゴニストもしくはアンタゴニストの同定方法において有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２及び配列番号２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド、または前記ポリヌクレオチドの相補体。
【請求項２】
Ｈ３受容体変異体ポリペプチドの抗原断片をコードする単離ポリヌクレオチドであって、前記Ｈ３受容体変異体ポリペプチドは配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２及び配列番号２４からなる群から選択される配列を有し、前記断片はＨ３受容体変異体ポリペプチドの少なくとも８連続アミノ酸を含み、前記断片はＨ３受容体変異体ポリペプチドの６位にプロリン残基及び７位にロイシン残基を含む前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記断片がＨ３受容体変異体ポリペプチドの少なくとも１０連続アミノ酸を含む請求項２に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記断片がＨ３受容体変異体ポリペプチドの少なくとも１５連続アミノ酸を含む請求項２に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１及び配列番号２３からなる群から選択される配列を有する請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１または請求項２に記載のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項８】
Ｈ３受容体変異体を含むポリペプチドの作成方法であって、請求項７に記載の宿主細胞をポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、前記宿主細胞培養物から前記ポリペプチドを回収することを含む前記方法。
【請求項９】
配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２及び配列番号２４からなる群から選択される配列の少なくとも８連続アミノ酸を含む単離ポリペプチドであって、前記ポリペプチドは６位にプロリン残基及び７位にロイシン残基を含む前記ポリペプチド。
【請求項１０】
請求項９に記載のポリペプチドを特異的に認識する抗体。
【請求項１１】
哺乳動物ヒスタミンＨ３受容体のアゴニスト、アンタゴニストもしくはインバースアゴニストの同定方法であって、
１）ある量のヒスタミンまたはヒスタミン代用薬の存在下で請求項９に記載のポリペプチドをヒスタミンアゴニスト、アンタゴニストもしくはインバースアゴニストの存在について試験しようとするサンプルと接触させ、
２）前記ポリペプチドに特異的に結合するヒスタミンまたはヒスタミン代用薬の量を測定し、
３）前記サンプルの存在下及び前記サンプルの非存在下で前記ポリペプチドに結合したヒスタミンまたはヒスタミン代用薬の量を比較する
ことを含み、前記サンプルの存在下で結合したヒスタミンの量の実質的減少がヒスタミンアゴニスト、アンタゴニストもしくはインバースアゴニストの存在を示す前記方法。
【請求項１２】
哺乳動物ヒスタミンＨ３受容体のアゴニスト、アンタゴニストもしくはインバースアゴニストの同定方法であって、
１）ある量のヒスタミンまたはヒスタミン代用薬の存在下で請求項９に記載のポリペプチドをヒスタミンアゴニスト、アンタゴニストもしくはインバースアゴニストの存在について試験しようとするサンプルと接触させ、
２）前記ポリペプチドにより変調される少なくとも１つの細胞機能を測定し、
３）前記サンプルの存在下及び前記サンプルの非存在下で前記ポリペプチドにより変調される少なくとも１つの細胞機能を比較する
ことを含み、前記サンプルの存在下での少なくとも１つの細胞機能の実質的変化がヒスタミンアゴニスト、アンタゴニストもしくはインバースアゴニストの存在を示す前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒトヒスタミン受容体に関し、特にＨ３受容体の変異体形態に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒスタミンは、炎症、喘息、アレルギー、アトピー性皮膚炎、卒中、心筋梗塞、片頭痛、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、関節リウマチ、多発性硬化症、炎症性腸疾患及び乾癬を含めた諸病状に関与している。ヒスタミンは免疫応答の強度及び期間を調節し、細胞間伝達に関与している。ヒスタミンは白血球遊走及び気管支血管収縮にも関与している。ラジオリガンド結合、生理学的アッセイ及び分子クローニングで立証されているように、各種のヒスタミン受容体タイプが存在する。更に、サブタイプ選択性を有する薬物が個別の病状を標的するように使用され得るように特定のヒスタミン受容体サブタイプは特定の病状に関与している。
【０００３】
現在、４つのヒトヒスタミン受容体Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３及びＨ４が公知であり、これらはすべてＧタンパク質結合分子である。ヒスタミン受容体の存在は何十年にもわたり薬理学的に確認されているが、Ｈ１及びＨ２受容体は１９９１年に初めてクローン化された（Ｙａｍａｓｈｉｔａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１１５１５（１９９１）；Ｇａｎｔｚら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：４２９（１９９１））。Ｈ３及びＨ４はつい最近までクローン化されなかった（Ｌｏｖｅｎｂｅｒｇら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５５：１１０１（１９９９）；米国特許第６，１３６，５５９号明細書；国際特許出願公開第００／２００１１号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ９８／２１０９０）；Ｏｄａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：３６７８１（２０００）；Ｚｈｕら，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５９：４３４（２００１）；Ｌｉｕら，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５９：４２０（２００１）；Ｍｏｒｓｅら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２９６：１０５８（２００１）；米国特許第６，２０４，０１７号明細書；国際特許出願公開第０１／２５４３２号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ００／２７４８１）；国際特許出願公開第０１／４６４１４号パンフレット（ＰＣＴ／ＪＰ００／０９０３８）；及びＮｇｕｙｅｎら，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５９：４２７（２００１））。
【０００４】
Ｈ３受容体サブタイプは、ヒスタミン及び数種の神経伝達物質の放出をコントロールするシナプス前受容体として中枢神経系及び末梢神経系で見つけられた。Ｈ３アンタゴニストは、そのＣＮＳ効果により肥満、てんかん、うつ病、睡眠／覚醒障害及び加齢性記憶障害（例えば、アルツハイマー病及び注意欠陥過活動性障害）の治療のための候補物質となり得る。知覚Ｃ繊維に対する負のフィードバック機構及び生じたＨ３受容体アゴニストの消炎効果から、前記化合物を片頭痛、喘息、心疾患及び神経因性気道炎症の治療に使用し得ることが示唆される。Ｈ３ヒスタミン受容体の各種アンタゴニスト及び前記アンタゴニストのアルツハイマー病、ナルコレプシー及び卒中，薬物またはアルコールに起因する昏睡を含めたＣＮＳ障害を治療するため、肥満治療における食欲を抑制するため、及びアレルギー、炎症、心及び脳血管疾患、胃腸障害、精神障害、睡眠障害及び視床下部機能不全を治療するための使用方法は米国特許第５，３８０，８５８号明細書、同第５，４８６，５２６号明細書、同第５，６３３，３８２号明細書、同第５，６３９，７７５号明細書、同第５，６５２，２５８号明細書、同第５，９９０，３１７号明細書、同第６，００８，２４０号明細書、同第６，０７２，０５７号明細書、同第６，１６６，０６０号明細書に記載されている。また、米国特許第６，１３６，５９９号明細書及び国際特許出願公開第００／２００１１号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ９８／２１０９０）も参照されたい。
【０００５】
最近の分子研究から、Ｈ３遺伝子の１つの形態からラット（Ｄｒｕｔｅｌら，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５９：１（２００１））及びモルモット（Ｔａｒｄｉｖａｌ−Ｌａｃｏｍｂｅら，Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ，１１：７５５（２０００））において多数のｍＲＮＡイソ型が生じ得ることが判明した。ヒトでは、Ｈ３受容体の６個のスプライス変異体が最近視床において報告された（Ｃｏｇｅら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３５５：２７９（２００１））。これらの変異体はヒト脳で同時発現されることが知見されたが、その相対分布は領域特異的に異なっていた。前記変異体は推定上第２膜貫通ドメインまたは第３細胞内ループのいずれかで欠失を示した。
【０００６】
ヒスタミンが多くの生理学的プロセス及び病状において発揮する重要な役割にてらして、特定タイプのヒスタミン受容体に対して選択的なアゴニスト、インバースアゴニスト及びアンタゴニストを同定するために有用な新規ヒスタミン受容体を含めた材料及び方法が要望されている。
【発明の開示】
【０００７】
本発明はＨ３ヒスタミン受容体の新規変異体を提供する。１つの態様で、本発明は新規受容体変異体（その断片及びアナログを含む）を含むポリペプチドを提供する。別の態様で、本発明は新規Ｈ３受容体変異体（その断片及びアナログを含む）をコードするポリヌクレオチド、アンチセンス核酸、前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクター及び前記ベクターを含む宿主細胞を提供する。前記ポリペプチドを発現するための条件下で宿主細胞を培養することによる本発明のポリペプチドの作成方法も提供する。更なる態様で、本発明は本発明の新規ポリペプチド（Ｈ３受容体の変異体イソ型を含む）に特異的なモノクローナル抗体を含めた抗体を提供する。Ｈ３受容体変異体（その断片及びアナログを含む）を含むポリペプチドへのヒスタミン結合の阻害剤を同定する方法及び前記ポリペプチドのアゴニスト、アンタゴニストもしくはインバースアゴニストのようなモジュレーターを同定する方法も提供する。本明細書に開示されているアッセイで同定される前記モジュレーターは例えば治療薬及び診断薬として有用である。前記治療薬の適応症には中枢神経系疾患、例えばうつ病、不安症、精神病（例えば、精神分裂病）、遅発性ジスキネジー、パーキンソン病、肥満、高血圧症、ツレット症候群、性機能不全、胃腸障害、精神障害、睡眠／覚醒障害、視床下部機能不全、薬物中毒、薬物乱用、認識障害、アルツハイマー病、老人痴呆、ナルコレプシー、卒中，薬物またはアルコールに起因する昏睡、強迫行動、パニック発作、疼痛、社会恐怖、摂食障害及び食欲不振、肥満治療のための食欲抑制、心血管性及び脳血管性障害、非インスリン依存性糖尿病、高血糖、便秘、不整脈、神経内分泌系障害、ストレス、痙縮、酸セクレチン、潰瘍、気道狭窄、喘息、アレルギー、炎症及び前立腺機能不全が含まれるが、これらに限定されない。
【０００８】
本発明の別の態様は本明細書の記載から明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明はヒトＨ３ヒスタミン受容体の新規スプライス変異体を提供する。ヒトＨ３ヒスタミン受容体の新規スプライス変異体が単離され、Ｈ３野生型受容体の残基７〜４２のＮ末端細胞外部分の領域の欠失を含むことが判明した。Ｈ３ｇ変異体（配列番号１３及び１４）及びＨ３ｈ変異体（配列番号１７及び１８）はヒト脳ｍＲＮＡから作成したｃＤＮＡのＰＣＲ増幅により同定された。Ｈ３ｇ変異体は、野生型Ｈ３受容体の配列（野生型Ｈ３受容体は本明細書中Ｈ３ａと称される。アミノ酸配列は配列番号２、ポリヌクレオチド配列は配列番号１である）に比してＮ末端をコードする領域に１０８塩基欠失を含む。Ｈ３ｇ変異体ｃＤＮＡの欠失により、膜貫通領域１（ＴＭ１）の前の細胞外Ｎ末端部分の３６アミノ酸残基（野生型配列の残基７〜４２）が失われる。Ｈ３ｈ変異体はＮ末端コード領域に同じ１０８塩基欠失及び更にｉ３細胞内ループをコードする領域に２４０塩基欠失を含む。同様の２４０塩基欠失を含むスプライス変異体は最近Ｃｏｇｅら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３５５：２７９（２００１））にＨ３（Δｉ３，３６５ａａ）として記載されていた。Ｎ末端コード領域の１０８塩基欠失と更なる欠失を含む他の新規なＨ３受容体変異体はＨ３ｉ（配列番号１５及び１６）、Ｈ３ｊ（配列番号１９及び２０）、Ｈ３ｋ（配列番号２１及び２２）及びＨ３ｌ（配列番号２３及び２４）として提供されている。これらの変異体の各々は、本明細書に記載の１０８塩基Ｎ末端欠失に加えて、受容体のカルボキシ末端部分をコードする領域に上記した欠失（上掲したＣｏｇｅら，２００１）を含む。１０８塩基，３６残基Ｎ末端欠失に加えて、Ｈ３ｉは膜貫通領域２（ＴＭ２）に４２塩基，１４残基欠失を含み、Ｈ３ｊは細胞内ループ３（ｉ３）に９０塩基，３０残基欠失を含み、Ｈ３ｋは細胞内ループ３（ｉ３）に３４８塩基，１１６残基欠失を含み、Ｈ３ｌは細胞内ループ３（ｉ３）に３５７塩基，１１９残基欠失を含む。上記したカルボキシ末端欠失変異体の配列は配列番号４、６、８、１０及び１２として示され、対応の核酸配列は配列番号３、５、７、９及び１１である。
【００１０】
従って、本発明は新規ヒスタミンＨ３受容体変異体、前記受容体変異体をコードする単離ポリヌクレオチド、並びに前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクター及び宿主細胞を提供する。Ｈ３受容体変異体に対するアンチセンス核酸も提供される。前記ヒスタミン受容体変異体は、活性なリガンド結合及びリガンド活性時にポジティブまたはネガティブな細胞内シグナル伝達を示す哺乳動物細胞において積極的に発現され得る。前記した新規受容体変異体はヒスタミンに対して測定可能なアフィニティーを有する。本発明は更に、中枢神経系疾患例えばうつ病、不安症、精神病（例えば、精神分裂病）、遅発性ジスキネジー、パーキンソン病、肥満、高血圧症、ツレット症候群、性機能不全、胃腸障害、精神障害、睡眠障害、視床下部機能不全、薬物中毒、薬物乱用、認識障害、アルツハイマー病、老人痴呆、ナルコレプシー、卒中，薬物またはアルコールに起因する昏睡、強迫行動、パニック発作、疼痛、社会恐怖、摂食障害及び食欲不振、肥満治療のための食欲抑制、心血管性及び脳血管性障害、非インスリン依存性糖尿病、高血糖、便秘、不整脈、神経内分泌系障害、ストレス、痙縮、酸セクレチン、潰瘍、気道狭窄、喘息、アレルギー、炎症及び前立腺機能不全を含めた各種疾患の治療及び管理において有用であり得るＨ３受容体または受容体変異体の選択的アゴニスト、アンタゴニストもしくはインバースアゴニストの発見方法を提供する。更に、本発明は、ヒスタミンに起因するかまたはヒスタミンが媒介する病状を患っている哺乳動物に対して例えば配列番号１４、１８、１６、２０、２２または２４、またはそのサブ配列により定義されるアミノ酸配列を有するＨ３ｇ、Ｈ３ｈ、Ｈ３ｉ、Ｈ３ｊ、Ｈ３ｋまたはＨ３ｌ受容体に結合するヒスタミン受容体のアゴニスト、インバースアゴニストもしくはアンタゴニスト、及び前記アゴニスト、インバースアゴニストもしくはアンタゴニストの１つ以上及び医薬的に許容され得る担体を含む医薬組成物を有効量投与することを含むヒスタミン媒介病状の治療方法も提供する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００１１】
「ポリペプチド」は、一般的なペプチド結合により連結されているアミノ酸のポリマーを指し、この中にはグリコシル化、非グリコシル化、ペグ化及び非ペグ化されている任意の大きさを有するタンパク質及びペプチド、並びに非修飾形態と同じ一次アミノ酸配列を保持している全ての他の修飾形態が含まれる。
【００１２】
「リガンド」は、本発明のＨ３受容体に結合し得る分子を指す。よって、受容体に対する特異的結合についてヒスタミンと競合し得るアゴニスト、インバースアゴニスト及びアンタゴニストのようにヒスタミンそれ自体がリガンドである、。
【００１３】
「ヒスタミン代用薬」は、ヒスタミン受容体に対するリガンドとして作用し、天然リガンドヒスタミンと同様にヒスタミン受容体の活性を変調する化合物を指す。ヒスタミン代用薬の例にはアミトリプチリン、クロルプロマジン、ドキセピン、シンナリジン、プロメタジン、シプロヘプタジン、クレミゾール、ミアンセリン、クロザピン、クロルフェニラミン、イメティット、フェニラミン、ジマプリット、α−メチルヒスタミンまたはシメチジンが含まれる。
【００１４】
「アゴニスト」は、Ｈ３受容体またはその変異体を含めたヒスタミン受容体が媒介する活性の強度または期間を増加させる化合物を指す。
【００１５】
「アンタゴニスト」は、Ｈ３受容体またはその変異体を含めたヒスタミン受容体が媒介する活性の強度または期間を減少させる化合物を指す。
【００１６】
「インバースアゴニスト」は、ヒスタミン受容体のアゴニスト誘導活性化を阻止し、ヒスタミン受容体のようなＧタンパク質結合受容体の不活性コンホメーションに優先的に結合することにより構成的または天然受容体活性をブロックする化合物を指す。
【００１７】
「抗体」は、モノクローナル及びポリクローナル抗体の両方を含み、この中には単鎖または多重鎖抗体（例えば、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂのような抗体断片）、二重特異性抗体、ｓｃＦｖ、ヒト化、キメラ及びヒト抗体（ヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニック動物由来のヒト抗体を含む）が含まれる。
【００１８】
「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡ及びＲＮＡの任意の長さを有する一本鎖または二本鎖核酸ポリマー及び混合ポリマーを含む。
【００１９】
「アンチセンス核酸」は、Ｈ３受容体変異体のコード領域のコード鎖（センス鎖）に相補的な任意の長さを有する核酸配列を指す。
【００２０】
「Ｈ３受容体変異体」または「受容体変異体」は、本明細書に記載したＨ３ｇ、Ｈ３ｈ、Ｈ３ｉ、Ｈ３ｊ、Ｈ３ｋまたはＨ３ｌポリペプチド（例えば、配列番号１４、１６、１８、２０、２２または２４）を指す。
【００２１】
「Ｈ３野生型受容体」は、米国特許第６，１３６，５５９号明細書に記載されているＨ３受容体タンパク質を指す。Ｌｏｖｅｎｂｅｒｇら，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５５：１１０１（１９９９）及び国際特許出願公開第００／２００１１号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ９８／２１０９０）も参照されたい。そのアミノ酸配列を配列番号２として示す。
【００２２】
ポリペプチド
本発明は、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２または配列番号２４を含む単離ポリペプチド、または前記配列番号のいずれかの少なくとも８連続アミノ酸残基を含むポリペプチドを提供し、そのポリペプチドは少なくとも前記配列番号のいずれか中で残基６に存在するプロリン（Ｐｒｏ６）及び残基７に存在するロイシン（Ｌｅｕ７）を含む。前記ポリペプチドは、好ましくは配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２または配列番号２４の配列の少なくとも１０連続アミノ酸残基、より好ましくは少なくとも１２連続アミノ酸残基、最も好ましくは少なくとも１５、２０または３０連続アミノ酸残基を含む。
【００２３】
本発明のポリペプチドには、その断片、アナログ及び変異体を含めた配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２または配列番号２４のＨ３受容体ポリペプチドの各種修飾形態が含まれる。ポリペプチドで起こる修飾はしばしば該ポリペプチドの作成方法に相関する。例えばポリペプチドを宿主においてクローン化遺伝子を発現させることにより作成した場合には、修飾の種類及び程度は大きく宿主細胞の翻訳後修飾能力及びポリペプチドのアミノ酸配列中に存在する修飾シグナルにより決定されるであろう。例えば、公知のように、グリコシル化は多くの場合大腸菌のような細菌宿主では起こらない。従って、グリコシル化を所望するときにはポリペプチドをグリコシル化宿主、通常真核細胞において発現させなければならない。昆虫細胞はしばしば哺乳動物細胞と同じように翻訳後グリコシル化を実施するので、昆虫細胞発現系は特にグリコシル化の天然パターンを有する哺乳動物タンパク質を効率的に発現させるべく開発された。ポリペプチドはインビトロでグリコシル化され得る。グリコシル化修飾を生じるための特に好ましい方法は、哺乳動物ヒスタミン受容体を通常前記プロセシングを実施する細胞由来のグリコシル化酵素、例えば哺乳動物グリコシル化酵素に接触させることを含む。或いは、真核発現系における産生中に結合した炭水化物を除去するために脱グリコシル化酵素が使用され得る。同様の考えは他の修飾にも適用する。
【００２４】
所与のポリペプチドの幾つかの部位に同一タイプの修飾が同じまたは異なる程度存在することもあり得ると考えられる。また、所与ポリペプチドは複数のタイプの修飾を含み得る。アミノ酸残基の修飾にはカルボキシ末端またはカルボキシ側鎖含有残基の脂肪族エステルまたはアミド、ヒドロキシ基含有残基のＯ−アシル誘導体、及びアミノ末端アミノ酸またはアミノ基含有残基（例えば、リシンまたはアルギニン）のＮ−アシル誘導体が含まれるが、これらに限定されない。前記修飾にもグリコシル化、ペグ化、ホルミル化及びビオチニル化が含まれるが、これらに限定されない。
【００２５】
本発明のポリペプチドはＨ３受容体変異体のいずれかの完全配列のサブ配列（断片を含む）を含み得る。断片を含めたサブ配列はＮ末端欠失部位に隣接するアミノ酸を含み、よって前記断片は本発明のＨ３受容体変異体に対してユニークである。前記断片は無傷Ｈ３受容体変異体のタンパク質分解開裂により産生され得、化学合成または組換えＤＮＡ技術を適用することにより作成され得、タンパク質分解開裂部位により描写されるポリペプチドに限定されない。ポリペプチドは、単独でもまたはより免疫原性とすべく担体分子に架橋またはコンジュゲートさせても抗体産生を誘発するための抗原として有用である。前記抗体は、例えば無傷Ｈ３受容体変異体のイムノアッセイ、イムノアフィニティー精製等で使用され得る。また、前記ポリペプチドは抗体ライブラリーをスクリーニングするため、Ｈ３受容体及び受容体変異体のアゴニスト、アンタゴニストもしくはインバースアゴニストを同定するための本発明の方法においても有用である。
【００２６】
また、本発明のポリペプチドはＨ３受容体変異体のアナログをも含む。用語「アナログ」は、アナログが野生型Ｈ３受容体を含まない条件で、Ｈ３受容体変異体中の１つ以上のアミノ酸残基の欠失、付加、修飾または置換により修飾されてなる本発明のＨ３受容体変異体を意味する。加えて、用語「アナログ」はアレリック及び多型変異体を包含し、哺乳動物ヒスタミンＨ３受容体変異体の全部または大部分を例えば側鎖基または末端残基を介して別のタンパク質、ポリペプチドまたは部分（融合パートナー）に共有結合して含んでいる変異タンパク質及び融合タンパク質も包含する。前記アナログがＨ３受容体変異体に対して１つ以上のアミノ酸置換を含んでいる場合その置換は好ましくは保存的置換である。「保存的置換」は、天然アミノ酸残基を物理的または化学的に類似の残基で置換すること、例えばタンパク質化学分野で公知のＧｌｙ／Ａｌａ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ／Ｌｅｕ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｎ／Ｇｌｎ及びＰｈｅ／Ｔｒｐ／Ｔｙｒを意図する。保存的置換を有するアナログは通常実質的にヒスタミン結合活性を保持している。Ａｓｎ／Ｇｌｕ、Ｖａｌ／Ｔｙｒ及びＨｉｓ／Ｇｌｕのような非保存的置換を有する他のアナログは前記活性を実質的に欠いている場合もある。しかしながら、前記アナログは免疫学的にコンピテントな宿主において抗体の産生を誘発するための抗原として使用され得るかまたは抗体ライブラリーをスクリーニングするために使用され得るので、該アナログも有用である。前記アナログは該アナログの誘導元である天然受容体変異体のエピトープ（抗原決定基）を多く保持しているので、前記エピトープに対して産生される多くの抗体は天然受容体の活性コンフォメーションまたは不活性（例えば、変性）形態に結合し得る。従って、前記抗体も、例えば天然受容体及び受容体変異体の免疫精製またはイムノアッセイのためにも使用され得る。他のアナログには、非天然もしくは非遺伝的コード化アミノ酸残基またはリン酸化アミノ酸残基（例えば、ホスホチロシン、ホスホセリンまたはホスホスレオニン残基）の導入（置換または挿入）を有するペプチドが含まれる。生物学的または免疫学的活性を改変または無効にすることなく置換、挿入または欠失され得るヌクレオチドまたはアミノ酸の決定についてのガイダンスは当業界で公知のコンピュータープログラム、例えばＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアを用いて見つけられ得る。上記したヒスタミン受容体変異体のアナログによるリガンド結合活性の“実質的保持”とは、対応のＨ３受容体変異体のヒスタミン結合活性及び／または特異性の少なくとも約５０％を維持していることを意味する。好ましくは、アナログは対応のＨ３受容体変異体のヒスタミン結合活性及び／または特異性の少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０％を保持している。
【００２７】
好ましいアナログ実施態様には更に、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２または配列番号２４のポリペプチド基準配列に対して少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９７または９９％の同一性を有するポリペプチドからなるものが含まれ、前記ポリペプチドは上記配列番号のいずれか中で残基６にプロリン及び残基７にロイシンを有する。当業界で公知のように「同一性」は配列の比較により明らかとされる２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列間の相関関係である。当業界において、「同一性」は、場合に応じて配列の線間の整合により決定されるようにポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列相関性の程度も意味する。２つのポリペプチド間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存アミノ酸置換を第２ポリペプチドの配列と比較することにより調べられる。「同一性」及び「類似性」は公知の方法により容易に計算され得る。前記方法には「コンピューター分子生物学(Computational Molecular Biology)」，Ａ．Ｍ．Ｌｅｓｋ編，ニューヨークに所在のオックスフォード大学出版（１９８８年）出版；「バイオコンピューティング：情報科学及びゲノムプロジェクト(Biocomputing: Informatics and Genome Projects)」，Ｄ．Ｗ．Ｓｍｉｔｈ編，ニューヨークに所在のＡｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３年）発行；「配列データのコンピューター分析(Computer Analysis of Sequence Data)」，第１部，Ａ．Ｍ．Ｇｒｉｆｆｉｎ及びＨ．Ｇ．Ｇｒｉｆｆｉｎ編，ニュージャージーに所在のＨｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４年）発行；「分子生物学における配列分析(Sequence Analysis in Molecular Biology)」，Ｇ．ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７年）発行；「配列分析プライマー(Sequence Analysis Primer)」，Ｍ．Ｇｒｉｂｓｋｏｖ及びＪ．Ｄｅｖｅｒｅｕｘ編，ニューヨークに所在のＭ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１年）発行；及びＨ．Ｇａｒｉｌｌｏ及びＤ．Ｌｉｐｍａｎ，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に記載されている方法が含まれるが、これらに限定されない。同一性を調べるための好ましい方法は試験する配列間で最大整合を与えるように設計される。同一性及び類似性を調べる方法は公に入手可能なコンピュータープログラムで体系化されている。２つの配列間の同一性及び類似性を調べるための好ましいコンピュータープログラム方法には、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｊ．Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２（１）：３８７（１９８４））、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＩＮ及びＦＡＳＴＡ（Ｓ．Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０））が含まれるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴ  ＸブログラムはＮＣＢＩ及び他のソース（「ＢＬＡＳＴマニュアル(BLAST Manual)」，Ｓ．Ａｌｔｓｃｈｕｌら，メリーランド州２０８９４べセズダに所在のＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ；Ｓ．Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０））から公に入手可能である。同一性を測定するために公知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも使用し得る。ポリペプチド配列比較のための好ましいパラメーターには、１）アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５３（１９７０）比較マトリックス、２）ギャップペナルティー１２及びギャップ長ペナルティー４を用いるＨｅｎｔｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｔｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）のＢＬＯＳＳＵＭ６２、３）マニュアル比較が含まれる。
【００２８】
アナログポリペプチド配列は、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２または配列番号２４の配列に比して少なくとも１個〜ある整数のアミノ酸改変を含み、前記改変は少なくとも１つのアミノ酸欠失、保存的及び非保存的置換を含めた置換または挿入からなる群から選択され、前記置換または挿入されるアミノ酸は天然または非天然アミノ酸であり得、前記改変は基準ポリペプチド配列内のアミノ酸中に個々にまたは基準ポリペプチド配列内の１つ以上の連続基中に分散している基準ポリペプチド配列のアミノ−またはカルボキシ末端位でまたは末端位間の任意の場所で起こり得、アミノ酸改変の数は基準配列中のアミノ酸の総数に同一％を１００で割った整数をかけ、その後その積を基準配列中のアミノ酸の総数から差し引くことにより求められる。すなわち、
ｎａ＝ｘａ−（ｘａ・ｙ）
上記式中、ｎａはアミノ酸改変の数であり、ｘａは基準配列中のアミノ酸の総数であり、ｙは５０％に対して０．５０、６０％に対して０．６０、７０％に対して０．７０、８０％に対して０．８０、８５％に対して０．８５、９０％に対して０．９０、９５％に対して０．９５、９７％に対して０．９７、または９９％に対して０．９９であり、乗法演算子の記号である。ただし、ｘａとｙの積が整数でないときには最も近い整数に切り捨てた後ｘａから差し引く。欠失部位（すなわち、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２または配列番号２４中のＰｒｏ６及びＬｅｕ７）に隣接するアミノ酸はアナログにおいて改変されないことが好ましい。
【００２９】
哺乳動物ヒスタミン受容体変異体のアナログは化学合成により製造され得るか、または受容体変異体をコードする核酸を修飾するためにＤａｕｇｈｅｒｔｙら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９：２４７１（１９９１））に例示されているように部位特異的突然変異（Ｇｉｌｌｍａｎら，Ｇｅｎｅ，８：８１（１９７９）；Ｒｏｂｅｒｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２８：７３１（１９８７）；Ｉｎｎｉｓ編，「ＰＣＲプロトコル：方法及び応用のガイド(PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications)」，ニューヨーク州ニューヨークに所在のＡｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０年）発行）またはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）（Ｓａｉｋｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：４８７（１９８８））を用いる組換え法により作成され得る。組換えまたは合成産物を精製または検出するためにエピトープタグを付加することも考えられる。
【００３０】
ポリヌクレオチド
本発明は、ヒスタミンＨ３受容体変異体のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、ヒスタミンＨ３受容体変異体のサブ配列（断片を含む）をコードする、または上記した遺伝的コード化アナログをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドは配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２または配列番号２４のアミノ酸配列を有するポリペプチドの少なくとも８連続アミノ酸をコードする。コードされる少なくとも８連続アミノ酸は通常Ｐｒｏ６残基及びＬｅｕ７残基を含む。本発明のポリヌクレオチドにはアンチセンス分子として有用なポリヌクレオチドを含めたコード鎖及び相補配列が含まれる。また、単離ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、特に発現ベクター及び前記ベクターを含む宿主細胞も提供される。本発明のポリヌクレオチドは特にＨ３受容体変異体の組換え産生のために、Ｈ３受容体変異体ＲＮＡまたは遺伝子の検出のためのプローブとして、制限消化分析、ＰＣＲまたは他の酵素増幅方法のためのプライマーとして有用である。
【００３１】
「単離ポリヌクレオチド」は、細胞中または組換えＤＮＡ発現系中に通常存在する他の成分から実質的に分離されてなる一本鎖もしくは二本鎖核酸、例えばＲＮＡまたはＤＮＡ分子、または混合ポリマーを指す。前記成分にはリボソーム、ポリメラーゼ、血清成分及び隣接ゲノム配列が含まれるが、これらに限定されない。よって、前記用語は天然環境から除去された核酸を包含し、その中には組換えまたはクローン化ＤＮＡ単離物、化学合成されたアナログまたは異種系により生物学的に合成されたアナログが含まれる。実質的に純粋な分子は単離形態の分子を含む。“ポリヌクレオチド”の用語によりポリマーのサイズまたはサイズ範囲を特に限定する意図はない。
【００３２】
単離ポリヌクレオチドは通常同一ヌクレオチド配列を有する分子の均質組成物であるが、幾つかの実施態様では僅かの配列異質性を含んでいてもよい。前記異質性は通常核酸コード配列の末端または所望の生物学的機能または活性にとって決定的でない領域で見られる。
【００３３】
「組換え核酸」はその産生方法または構造のいずれかにより規定される。よって、幾つかの組換え核酸はマニピュレーションまたは選択においてヒト介入を含む組換えＤＮＡ技術を用いて作成される。他の組換え核酸は本来相互に連続していない２つの断片を融合することにより作成される。単離ポリペプチドには組換え核酸が含まれる。遺伝子処理したベクター及び任意の合成オリゴヌクレオチド方法を用いて誘導される配列を含む核酸も包含される。
【００３４】
上記したように、本発明はヒスタミンＨ３受容体変異体をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２または配列番号２４のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは本発明のポリヌクレオチドの中に含まれる。配列番号１３はヒスタミンＨ３受容体変異体Ｈ３ｇをコードするｃＤＮＡの配列を表す。配列番号１５，配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１及び配列番号２３はそれぞれＨ３受容体変異体Ｈ３ｉ、Ｈ３ｈ、Ｈ３ｊ、Ｈ３ｋ及びＨ３ｌのコード配列を表す。当業者は理解し得るように、遺伝コードの縮重のために上記した特定配列番号の配列を有するもの以外にＨ３受容体変異体をコードし得る他のポリヌクレオチドは多数存在する。例えば、配列番号１３、配列番号１５，配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１または配列番号２３の配列のコード領域中に存在するコドンは同一アミノ酸残基をコードする縮重コドンで置換され得る。前記した縮重ポリヌクレオチドもすべて本発明のポリヌクレオチド中に含まれる。
【００３５】
本発明のポリヌクレオチドには、Ｈ３受容体変異体の断片をコードするポリヌクレオチド及びＨ３受容体変異体の遺伝的コード化アナログをコードするポリヌクレオチドも含まれる。「遺伝的コード化(genetically encoded)」アナログは、Ｈ３受容体変異体アナログを含むすべてのアミノ酸が２０個の遺伝的コード化アミノ酸から選択されているＨ３受容体変異体アナログであることを意図する。
【００３６】
例えば、野生型コドンは、核酸配列認識部位（例えば、制限部位）を導入または除去すると同時に保存的置換をコードするコドンで置換され得る。また、所望機能をコードする核酸セグメントは、本来一緒に存在しない機能の所望組合せをコードする単一遺伝子部分を生ずるように融合され得る。制限酵素認識部位はしばしば人工マニピュレーションの標的であるが、他の部位特異的標的、例えばプロモーター、ＤＮＡ複製部位、調節配列、コントロール配列または他の有用な要素を設計により導入し得る。上記した欠失または精製のためのエピトープタグをコードする配列も導入し得る。Ｈ３受容体変異体の断片をコードするポリヌクレオチドは通常配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１または配列番号２３の配列の少なくとも２４連続ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも３０連続ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも３６、最も好ましくは少なくとも４５、６０、または９０連続ヌクレオチド、またはその縮重バージョンである。「縮重バージョン」は同一ポリペプチド配列をコードする任意のポリヌクレオチド配列を意図する。
【００３７】
本発明は更に、本明細書に記載されているものに相同な配列を有する組換えＤＮＡ分子も包含する。本発明の核酸は転写、翻訳及びＤＮＡ複製をコントロールするＤＮＡセグメントに作動的に連結され得る。
【００３８】
好ましい相同ポリヌクレオチド実施態様には配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１または配列番号２３の基準配列に対して少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９７または９９％同一性を有し、アミノ酸残基６にプロリンのコドン及びアミノ酸７にロイシンのコドンを含むポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドが含まれる。“同一性”は上に定義した通りである。ポリヌクレオチド比較のための好ましいパラメーターには、比較マトリックス：マッチ＝＋１０，ミスマッチ＝０、ギャップペナルティー：５０及びギャップ長ペナルティー：３のアルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５３（１９７０）が含まれる。適当なプログニムは、ウィスコンシン州マディソンに所在のＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ＧｒｏｕｐからＧａｐプログラムとして入手可能である。相同ポリヌクレオチドは配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１または配列番号２３の配列に比較して少なくとも１個〜ある整数のヌクレオチド改変を含み、前記改変は少なくとも１つのヌクレオチド欠失、（トランジッション及びトランスバージョンを含めた）置換または挿入からなる群から選択され、前記改変は基準ヌクレオチド配列内のヌクレオチド中に個々にまたは基準ヌクレオチド配列内の１つ以上の連続基中に分散している基準ヌクレオチド配列の３’または５’末端位でまたは末端位間の任意の場所で起こり得、ヌクレオチド改変の数は配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１または配列番号２３中の総ヌクレオチド数に同一％を１００で割った整数をかけ、その後その積を配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１または配列番号２３中の総ヌクレオチド数から差し引くことにより求められる。すなわち、
ｎｎ＝ｘｎ−（ｘｎ・ｙ）
上記式中、ｎｎはヌクレオチド改変の数であり、ｘｎは基準配列中のヌクレオチドの数であり、ｙは５０％に対して０．５０、６０％に対して０．６０、７０％に対して０．７０、８０％に対して０．８０、８５％に対して０．８５、９０％に対して０．９０、９５％に対して０．９５、９７％に対して０．９７、または９９％に対して０．９９であり、乗法演算子の記号である。ただし、ｘｎとｙの積が整数でないときには最も近い整数に切り捨てた後ｘｎから差し引く。配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２または配列番号２４のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを改変すると、前記コード配列でナンセンス、ミスセンスまたはフレームシフト突然変異が生じ、それにより前記改変後ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドが改変され得る。
【００３９】
「相同核酸配列」または「相同ポリヌクレオチド」は、アラインし、比較したときに上記したように有意な同一％を示すものである。核酸のホモロジーに対する基準は、以下に詳記する配列比較により当業界で通常使用されているホモロジーに対する尺度であるかまたはハイブリダイゼーション条件に基づいている。実質的なホモロジーは、選択的なハイブリダイゼーション条件で１つの配列を別の配列にハイブリダイズするときにも存在する。典型的には、少なくとも約３０ヌクレオチドの範囲で少なくとも約５５％の同一性、好ましくは少なくとも約２５ヌクレオチドの範囲で少なくとも約６５％の同一性、より好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチドの範囲で少なくとも約７５％の同一性、最も好ましくは約９０％の同一性のときに選択的ハイブリダイゼーションが生ずる。例えば、Ｋａｎｅｈｉｓａ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２：２０３（１９８４）を参照されたい。
【００４０】
前記ホモロジー比較の長さはより長い範囲を含み得、ある実施態様では少なくとも約１７、好ましくは少なくとも約２５、より好ましくは少なくとも約５０、最も好ましくは少なくとも約７５ヌクレオチド残基をカバーし得る。
【００４１】
ホモロジーを確立するためのハイブリダイゼーションで使用される条件のストリンジェンシーは塩濃度、温度、有機溶媒の存在及び他のパラメーターのような諸因子に依存する。ストリンジエントな温度条件は通常約３０℃以上の温度、しばしば約３７℃以上の温度、典型的には約４５℃以上の温度、好ましくは約５５℃以上の温度、より好ましくは約６５℃以上の温度、最も好ましくは約７０℃以上の温度である。ストリンジエントな塩条件は一般的には約１０００ミリモル未満、通常約５００ミリモル未満、より一般的には約４００ミリモル未満、好ましくは約３００ミリモル未満、より好ましくは約２００ミリモル未満、最も好ましくは約１５０ミリモル未満である。例えば、１００、５０及び２０ミリモルの塩濃度を使用する。しかしながら、前記パラメーターの組合せは単一パラメーターの尺度よりも重要である。例えば、Ｗｅｔｍｕｒら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３１：３４９（１９６８）を参照されたい。
【００４２】
ポリペプチドをコードする２つの核酸配列が実質的に同一であるということは、第１核酸によりコードされるポリペプチドが第２核酸によりコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応することである。
【００４３】
その断片またはアナログを含めたＨ３受容体変異体をコードするポリペプチドは一般的方法により作成され得る。例えば、ＤＮＡは、例えばＭａｔｔｅｕｃｃｉら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０３：３１８５（１９８１））のホスホルアミデート固体支持体法、Ｙｏｏら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，７６４：１７０７８（１９８９））の方法、または他の公知方法を用いて化学的に合成され得る。これは、合成オリゴヌクレオチドの対を含む一連のオリゴヌクレオチドカセットを順次連結することにより実施され得る。或いは、ポリヌクレオチドは例えばＰＣＲ反応で酵素的に合成され得、またはＨ３受容体変異体コード領域、たとえば配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１または配列番号２３を含むベクターを増幅させることにより組換え産生され得る。特に、酵素的合成は完全長コード領域の断片であるポリヌクレオチドを作成するための便利な方法である。
【００４４】
更に、Ｈ３受容体変異体をコードする核酸はヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド挿入及びヌクレオチドストレッチの逆位により容易に修飾され得る。この修飾により、天然Ｈ３受容体変異体と共通する免疫原性または抗原性活性を有する抗原をコードする新規ＤＮＡ配列が生ずる。前記した修飾配列は、野生型または変異体受容体を産生するためまたは組換えＤＮＡ系における発現を増強するために使用され得る。
【００４５】
ヒスタミンＨ３受容体変異体をコードするポリヌクレオチドのベクターへの挿入は、受容体変異体ポリヌクレオチド及びベクターの両末端が適合性制限部位を含むときには容易に実施される。これができないときには、平滑末端を生成するように制限エンドヌクレアーゼ開裂により生じた一本鎖ＤＮＡ突出部を逆消化することによりポリヌクレオチド及び／またはベクターの末端を修飾するかまたは前記した一本鎖末端に適当なＤＮＡポリメラーゼを充填することにより同一結果を達成するために必要な場合がある。或いは、ヌクレオチド配列（リンカー）を末端にライゲートすること等により所望部位を作成し得る。前記リンカーは所望制限部位を規定する特定オリゴヌクレオチド配列を含み得る。制限部位はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いても作成され得る。例えば、Ｓａｉｋｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：４８７（１９８８）を参照されたい。開裂したベクター及びＤＮＡ断片を所要によりホモポリマー尾部接合により修飾することもできる。
【００４６】
本発明で使用される組換え発現ベクターは、典型的にはＨ３受容体変異体、またはその断片またはアナログの１つをコードするポリヌクレオチドを通常適合性宿主細胞における核酸の発現を調節し得る適当な遺伝制御要素に作動的に連結して含む、自己複製ＤＮＡ又はＲＮＡ構築物であるかまたは組込みプラスミドまたはレトロウイルスコード化ＤＮＡである。前記遺伝制御要素は原核プロモーター系または真核プロモーター発現制御系を含み得、典型的には転写プロモーター、転写の開始をコントロールするための任意オペレーター、ｍＲＮＡ発現レベルを高めるための転写エンハンサー、適当なリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び翻訳を終わらせる配列を含む。発現ベクターは、宿主細胞とは独立してベクターを複製させ得るか、組換えレトロウイルスベクターまたは組込みプラスミドベクターの場合にはベクターを宿主ゲノムで複製させ得る複製起源も含み得る。
【００４７】
本発明で使用され得るベクターには、微生物プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、組込み可能なＤＮＡ断片、及び宿主のゲノムへの核酸の組込みを容易とし得る他のベヒクルが含まれ得る。プラスミドが最も一般的に使用されているベクター形態であるが、均等の機能を発揮し且つ当業界で公知であるか公知となる他の形態の全てのベクターも本発明で使用するのに適している。例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら，「クローニングベクター：実験マニュアル(Cloning Vectors: A Laboratory Manual)」，１９８５及び補遺，ニューヨークに所在のＥｌｓｅｖｉｅｒ発行；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら編，「ベクター：分子クローニングベクター及びその使用の検討(Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses)」，マサチューセッツ州ボストンに所在のＢｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ（１９８８年）発行を参照されたい。
【００４８】
本発明のヒスタミン受容体、受容体変異体、及びその断片及びアナログをコードする核酸の発現は原核または真核細胞において一般的方法により実施され得る。原核系では大腸菌株が最も多く使用されているが、各種シュードモナス及びバチルス株のような他の多くの細菌は当業界で公知であり、同様に使用し得る。典型的に使用される原核発現コントロール配列にはプロモーター、例えばβ−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーターシステム（Ｃｈａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ，１９８：１０５６（１９７７））、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム（Ｇｏｅｄｄｅｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，８：４０５７（１９８０））、ラムダＰＬプロモーターシステム（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら，Ｎａｔｕｒｅ，２９２：１２８（１９８１））及びｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，２９２：１２８（１９８３））から誘導されるものが含まれる。コントロール配列を含む多数の発現ベクターは当業界で公知であり、市販されている。
【００４９】
Ｈ３受容体変異体、その断片またはアナログをコードする核酸を発現するのに適した宿主細胞には原核生物及び高等真核生物が含まれる。原核細胞にはグラム陰性及び陽性生物、例えば大腸菌及び枯草菌が含まれる。高等真核生物には非哺乳動物（例えば、昆虫細胞及び鳥）起源及び哺乳動物（例えば、ヒト、霊長類及びげっ歯類）起源の動物細胞由来の樹立組織培養細胞株が含まれる。
【００５０】
原核細胞宿主−ベクター系には多くの異なる種に対する各種ベクターが含まれる。本明細書中、大腸菌及びそのベクターは他の原核細胞において使用される同等のベクターを含むように包括的に使用される。ＤＮＡを増幅するための代表的ベクターはｐＢＲ３２２またはその多くの誘導体である。哺乳動物ヒスタミン受容体変異体を発現させるために使用され得るベクターにはｌａｃプロモーター（ｐＵＣ−ｓｅｒｉｅｓ）、ｔｒｐプロモーター（ｐＢＲ３２２−ｔｉｐ）、ＩＰＰプロモーター（ｐＩＮ−ｓｅｒｉｅｓ）、ラムダ−ｐＬまたはｐＲプロモーター（ｐＯＴＳ）、またはｐｔａｃ（ｐＤＲ５４０）のようなハイブリッドプロモーターを含むものが含まれるが、これらに限定されない。Ｂｒｏｓｉｕｓら，「ラムダ−、ｔｒｐ−、ｌａｃ−及びＩｐｐ誘導プロモーターを用いる発現ベクター(Expression Vectors Employing Lambda-, trp-, lac, and Ipp-derived Promoters)」，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ及びＤｅｎｈａｒｄｔ編，「ベクター：分子クローニングベクター及びその使用の検討(Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses)」，ｐｐ．２０５−２３６，ボストンに所在のＢｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ（１９８８年）発行を参照されたい。
【００５１】
Ｈ３受容体変異体、またはその断片またはアナログの組換え産生のための宿主として高等真核組織培養細胞が好ましい。昆虫バキュロウイルス発現系を含めた任意の高等真核組織培養細胞株を使用し得るが、哺乳動物細胞が好ましい。前記細胞の形質転換またはトランスフェクション及び増殖はルーチンな手順となっている。有用な細胞株の例には、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、仔ラット腎臓（ＢＲＫ）細胞株、昆虫細胞株、鳥細胞株及びサル（ＣＯＳ）細胞株が含まれる。
【００５２】
前記細胞株のための発現ベクターは通常複製起源、プロモーター、翻訳開始部位、ＲＮＡスプライス部位（ゲノムＤＮＡを使用する場合）、ポリアデニル化部位及び転写終止部位を含む。前記ベクターは通常選択遺伝子または増幅遺伝子をも含む。適当な発現ベクターは、例えばアデノウイルス、ＳＶ４０、パルボウイルス、ワクシニアウイルスまたはサイトメガロウイルスのようなソース由来のプロモーターを有するプラスミド、ウイルスまたはレトロウイルスであり得る。適当な発現ベクターの代表例には、ｐＣＲ．ＲＴＭ．３．１、ｐｃＤＮＡ１、ｐＣＤ（Ｏｋａｙａｍａら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，５：１１３６（１９８５））、ｐＭＣｌｎｅｏ  Ｐｏｌｙ−Ａ（Ｔｈｏｍａｓら，Ｃｅｌｌ，５１：５０３（１９８７））、ｐＵＣ１９、ｐＲＥＰ８、ｐＳＶＳＰＯＲＴ及びその誘導体、並びにｐＡＣ  ３７３またはｐＡＣ  ６１０のようなバキュロウイルスベクターが含まれる。特に有用なベクターは、エプスタインバーウイルスの複製ｏｒｉＰの起源を含むもの、例えばｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。
【００５３】
従って、本発明の１つの態様はヒスタミンＨ３受容体変異体、その断片またはそのアナログのアミノ酸配列を有するポリペプチドの作成方法を提供する。特に、本発明は配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２または配列番号２４のアミノ酸配列を含むポリペプチドの作成方法を提供し、その方法は配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１または配列番号２３を含むポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを含む宿主細胞を受容体ポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、発現したポリペプチドを宿主細胞培養物から回収することを含む。
【００５４】
ポリペプチドの精製
本発明のＨ３受容体変異体ポリペプチド（その断片及びアナログを含む）は上記した宿主細胞培養物から、他の細胞または組織ソースから、または合成環境から一般的方法により精製され得る。前記方法には塩またはアルコール沈殿、分取ディスク−ゲル電気泳動、等電点電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣ、ゲル濾過、カチオン及びアニオン交換及び分配クロマトグラフィー、及び向流分配が含まれるが、これらに限定されない。これらの精製方法は当業界で公知であり、例えば「タンパク質精製ガイド，酵素学における方法(Guide to Protein Purification, Methods in Enzymology)」，第１８２巻，Ｍ．Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ編，ニューヨーク州ニューヨークに所在のＡｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０年）発行に開示されている。ヒスタミン受容体の精製に対して適用され得るより具体的な方法を以下に記載する。
【００５５】
精製ステップの後に、下記するリガンド結合活性のためのアッセイを実施し得る。特に受容体が細胞または組織ソースから単離された場合には、アッセイシステムに１つ以上のタンパク質分解酵素阻害剤、例えばフェニルメタンスルホニルフロリド（ＰＭＳＦ）を配合することが好ましい。
【００５６】
アンチセンスポリヌクレオチド
本発明は、特定遺伝子または特定ｍＲＮＡスプライス変異体の発現を部分的または完全に抑えるために使用され得るアンチセンスポリヌクレオチドを提供する。Ｈｅｌｅｎｅ及びＴｏｕｌｍｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１０４９：９９（１９９０）；Ｐｅｐｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３５５：７２５（１９９１）；Ｓｔｏｕｔ及びＣａｓｋｅｙ，Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１６：３６９（１９９０）；Ｍｕｎｉｒら，Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１６：３８３（１９９０）を参照されたい。
【００５７】
一般的に、本発明の目的のためのアンチセンスポリヌクレオチドはＨ３変異体のコード領域の配列の一部に相補的である。相補性アンチセンスポリヌクレオチドには、各ｍＲＮＡ種に特異的にハイブリダイズし得且つ前記ｍＲＮＡ種の転写及び／またはＲＮＡプロセシング及び／またはコード化ポリペプチドの翻訳を妨げるかまたは防ぐことができるアンチセンスＲＮＡが含まれる（Ｃｈｉｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：１０００６−１００１０（１９８９）；Ｂｒｏｄｅｒら，Ａｎｎ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．，１１３：６０４−６１８；Ｌｏｒｅａｕら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２７４：５３−５６（１９９０）；Ｈｏｌｃｅｎｂｅｒｇらの国際特許出願公開第９１／１１５３５号パンフレット；国際特許出願公開第９１／０９８６５号パンフレット；同第９１／０４７５３号パンフレット；同第９０／１３６４１号パンフレット；欧州特許出願公開第３８６５６３号明細書）。アンチセンス配列は、標的コード領域配列に対して実質的に相補的な少なくとも約１５連続ヌクレオチド長、典型的には少なくとも２０〜３０ヌクレオチド長、好ましくは約３０以上のヌクレオチド長を有するポリヌクレオチド配列である。最低でも、アンチセンスポリヌクレオチドは欠失部位のアミノ酸、すなわちＰｒｏ６及びＬｅｕ７をコードする配列に相補的な配列を含む。幾つかの実施態様では、アンチセンス配列は相補的標的配列に比較して置換、付加または欠失を有し得るが、特異的ハイブリダイゼーションが保持される限りポリヌクレオチドは通常遺伝子発現のアンチセンス阻害剤として機能する。
【００５８】
抗体
本発明はＨ３受容体変異体を特異的に認識する抗体を提供する。「特異的に認識」とは、抗体がＨ３ｇ、Ｈ３ｈ、Ｈ３ｉ、Ｈ３ｊ、Ｈ３ｋまたはＨ３ｌ変異体に優先的に、例えば野生型Ｈ３受容体よりも高いアフィニティーで結合することを意図する。通常、本発明の抗体は野生型Ｈ３受容体よりも上記Ｈ３変異体の１つに対して少なくとも２倍高いアフィニティーを有する。好ましくは、本発明の抗体は野生型Ｈ３受容体よりも上記Ｈ３変異体の１つに対して少なくとも５倍高いアフィニティーを有する。より好ましくは、本発明の抗体は野生型Ｈ３受容体よりも上記Ｈ３変異体の１つに対して少なくとも１０倍高いまたは少なくとも１００倍高いアフィニティーを有する。本発明のＨ３受容体変異体を特異的に認識する抗体は、Ｈ３野生型受容体上に存在しないエピトープ（例えば、変異体中の新しいスプライス接合部によりコードされる領域中に存在するエピトープ）またはＨ３野生型受容体に比してＨ３受容体変異体中のコンフォーメーション変化のために現れるエピトープを認識し得る。Ｈ３野生型受容体には、Ｌｏｖｅｎｂｅｒｇら（米国特許第６，１３６，５５９号明細書；国際特許出願公開第００／２００１１号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ９８／２１０９０））に記載されており、そのアミノ酸配列を配列番号２に記載したＨ３受容体が含まれる。
【００５９】
場合によりリガンド結合活性を有する本発明のＨ３受容体変異体の抗原性（すなわち、免疫原性）ポリペプチド（そのサブ配列及び断片を含む）を作成し得る。前記ポリペプチドはヒスタミンに結合するかに関係なく、これらのポリペプチドは完全受容体のように完全受容体変異体に結合し得る一般的な方法により抗体を作成するための抗原として有用である。受容体変異体（その断片を含む）に基づくまたは受容体変異体（その断片を含む）から誘導される短いサブ配列は鎖状体形成されても担体に結合されていてもよい。エピトープは通常少なくとも約５個、好ましくは少なくとも約８個のアミノ酸残基を含むことは当業界で公知であるので（Ｏｈｎｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：２９４５（１９８５））、抗体作成のために使用される断片は通常少なくともそのサイズを有する。好ましくは、前記断片は上記したようにより多くの残基を含む。所与のポリペプチドが免疫原性であるかはルーチンの実験により容易に調べることができる。
【００６０】
通常免疫学的にコンピテントな宿主において抗体産生を誘発するための抗原として完全長受容体変異体を使用するときには必要はないが、より短い抗原断片をまず架橋もしくは鎖状体形成により、または免疫原性担体分子（すなわち、宿主動物において独立して免疫応答を誘発する特性を有するマクロ分子）にカップリングさせることによって、より免疫原性とすることが好ましい。短いポリペプチド断片が時にはハプテン（抗体に特異的に結合し得るが抗体産生を誘発することができない分子、すなわち非免疫原性である）として作用するので担体分子への架橋またはコンジュゲーションが必要なことがある。前記断片の免疫原性担体分子へのコンジュゲーションにより、通常“担体効果”として公知の効果によりより免疫原性となる。
【００６１】
適当な担体分子の例には、タンパク質、天然及び合成ポリマー化合物（例えば、ポリペプチド、ポリサッカライド、リポポリサッカライド等）が含まれる。タンパク質担体分子が特に好ましく、この中にはキーホールリンペットヘモシアニン、哺乳動物血清タンパク質（例えば、ヒトまたはウシγ−グロブリン、ヒト，ウシまたは家兎血清アルブミン）、または前記タンパク質担体のメチル化または他の誘導体が含まれるが、これらに限定されない。他のタンパク質担体は当業者に自明である。タンパク質担体が断片に対する抗体を誘発させようとする宿主動物にとって異物であることが好ましいが、そうでなくてもよい。
【００６２】
担体分子に対する共有カップリングは当業界で公知の方法を用いて達成され得るが、方法の正確な選択は使用する担体分子の種類により規定される。免疫原性担体分子がタンパク質の場合には、本発明の断片は例えばジシクロヘキシルカルボジイミドのような水溶性カルボジイミドまたはグルタルアルデヒドを用いてカップリングされ得る。
【００６３】
上記したようなカップリング剤は、別の担体分子を使用せずに断片をそれ自体に架橋するためにも使用され得る。凝集物に前記架橋すると、免疫原性も向上し得る。免疫原性は公知アジュバンドを単独で使用することにより、またはカップリングまたは凝集と組み合わせることにより免疫原性も向上させ得る。
【００６４】
動物にワクチン接種するための好適なアジュバントには、Ａｄｊｕｖａｎｔ  ６５（落花生油、モノオレイン酸マンニド及びモノステアリン酸アルミニウム含有）、フロイント完全及び不完全アジュバント、無機ゲル（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム及び明ばん）、界面活性剤（例えば、ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、リソレシチン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシメチル）プロパンジアミン、メトキシヘキサデシルグリセロール及びプルーロニックポリオール）、ポリアニオン（例えば、ピラン、硫酸デキストラン、ポリＩＣ、ポリアクリル酸及びカルボポール）、ペプチド（例えば、ムラミルジペプチド、ジメチルグリシン及びタフトシン）及びオイルエマルションが含まれるが、これらに限定されない。ペプチドはリポソームまたは他のマイクロキャリアに配合後投与してもよい。
【００６５】
アジュバント及びイムノアッセイの各種態様に関する情報は、例えばＰ．Ｔｉｊｓｓｅｎ，「酵素イムノアッセイの実際及び理論(Practice and Theory of Enzyme Immunoassays)」，第３版，ニューヨークに所在のＥｌｓｅｖｉｅｒ（１９８７年）発行に記載されている。ポリクローナル抗血清を作成するための方法に関する他の有用な文献には、「微生物学(Microbiology)」，Ｈｏｅｂｅｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｈａｒｐｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｗ（１９６９）；Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒ，「血清反応の特異性(Specificity of Serological Reactions)」，ニューヨークに所在のＤｏｖｅｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９６２年）発行；及びＷｉｌｌｉａｍｓら，「免疫学及び免疫化学における方法(Methods in Immunology and Immunochemistry)」，第１巻，ニューヨークに所在のＡｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９６７年）発行が含まれる。
【００６６】
一般的方法を用いて免疫化した動物から産生される血清は直接使用され得、または抗体フラクションを前記血清から血漿搬出法またはＩｇＧ特異的吸着剤（例えば、固定化プロテインＧ）を用いる吸着クロマトグラフィーのような一般的方法を用いて分離することもできる。或いは、モノクローナル抗体を作成し得る。
【００６７】
本発明のＨ３受容体変異体、またはその抗原断片またはアナログに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは公知の方法により産生される。通常、前記方法は不死化細胞株を所望抗体を産生するＢ−リンパ球と融合することを含む。或いは、不死抗体産生細胞株を作成するための非融合方法、例えばウイルス誘導形質転換（Ｃａｓａｌｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３４：４７６（１９８６））を使用し得る。不死化細胞株は通常形質転換した哺乳動物細胞、特にげっ歯類、ウシまたはヒト起源のミエローマ細胞である。最も一般的には、ラットまたはマウスのミエローマ細胞株は便利さ及び利用可能性の点で使用され得る。
【００６８】
抗原を注射した哺乳動物、例えばヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニック動物から抗体産生リンパ球を得る方法は公知である。通常、ヒト起源の細胞を使用するときには末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を使用し、または非ヒト哺乳動物ソース由来の脾臓またはリンパ節細胞を使用する。宿主動物に精製抗原を繰り返し注射し（ヒト細胞をインビトロで感作させる）、その動物で所望の抗体産生細胞を産生させ、その後前記細胞を不死化細胞株と融合させるために収集する。融合方法は当業界で公知であり、通常細胞を融合剤、例えばポリエチレングリコールと混合することを含む。
【００６９】
ハイブリドーマは一般的方法、例えばＨＡＴ（ヒポキサンチン−アミノプテレン−チミジン）選択を用いて選択される。所望抗体を分泌するハイブリドーマを一般的なイムノアッセイ、例えばウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）等を用いて選択する。抗体を培地から一般的なタンパク質精製方法（Ｔｉｊｓｓｅｎ，「酵素イムノアッセイの実際及び理論(Practice and Theory of Enzyme Immunoassays)」，アムステルダムに所在のＥｌｓｅｖｉｅｒ（１９８５年）発行）を用いて回収する。
【００７０】
上記方法を適用する際のガイダンスを与えるために多くの文献を利用し得る（Ｋｏｈｌｅｒら，「ハイブリドーマ技術(Hybridoma Techniques)」，ニューヨーク所在のＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８０年）発行；Ｔｉｊｓｓｅｎ，「酵素イムノアッセイの実際及び理論(Practice and Theory of Enzyme Immunoassays)」，アムステルダムに所在のＥｌｓｅｖｉｅｒ（１９８５年）発行；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，「モノクローナル抗体方法(Momoclonal Antibody Technology)」，アムステルダムに所在のＥｌｓｅｖｉｅｒ（１９８４年）発行；Ｈｕｒｒｅｌｌ，「モノクローナルハイブリドーマ抗体：技術及び応用(Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications)」，フロリダ州ボカラトンに所在のＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９８２年）発行）。モノクローナル抗体は公知のファージライブラリーシステムを用いても表示、選択または産生され得る。例えば、Ｈｕｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５（１９８９）；Ｗａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ，３４１：５４４（１９８９）を参照されたい。
【００７１】
こうして産生されたポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、例えば公知の方法により固体支持体に結合した固定化形態で、免疫アフィニティークロマトグラフィーにより受容体変異体を精製するために使用され得る。
【００７２】
抗原断片に対する抗体は、Ｈ３受容体及びＨ３受容体変異体のイムノアッセイのベースとして標識せずにまたは一般的方法により標識して使用され得る。使用される特定標識はイムノアッセイの種類に依存する。使用可能な標識の例には、３２Ｐ、１２５Ｉ、３Ｈ、１４Ｃのような放射能標識；フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル及びウンベリフェロンのような蛍光標識；ルシフェリン及び２，３−ジヒドロフタラジンジオンのような化学ルミネッセンサー；及びホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、リゾチーム及びグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼのような酵素が含まれるが、これらに限定されない。
【００７３】
抗体に対して公知の方法により前記標識が付けられ得る。例えば、抗体に蛍光、化学ルミネッセントまたは酵素標識を付けるためにアルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミド、イミデート、スクシンイミド、ビスジアゾ化ベンザジン等のカップリング剤を使用し得る。関係する一般的方法は当業界で公知であり、例えば「イムノアッセイ：実際的ガイド(Immunoassay: A Practical Guide)」，Ｃｈａｎ編，フロリダ州オーランドに所在のＡｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．（１９８７年）発行に記載されている。前記イムノアッセイは、例えば受容体変異体の精製中に得られた分画に対して実施され得る。
【００７４】
本発明の抗体は、発現クローニング系においてＨ３受容体変異体を発現する特定ｃＤＮＡクローンを同定するためにも使用され得る。
【００７５】
受容体のリガンド結合部位に対して特異的な中和抗体もヒスタミン結合を阻止するためのアンタゴニスト（阻害剤）として使用され得る。前記中和抗体はルーチンの実験により、例えば上記したラジオリガンド結合アッセイを用いることにより容易に同定され得る。ヒスタミン活性は完全抗体分子、単鎖または多重鎖抗体分子、または公知の抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆｃ、Ｆ（ａｂ）２及びＦｖ断片）を用いて拮抗され得る。
【００７６】
前記断片の定義は、例えばＫｌｅｉｎ，「免疫学(Immunology)」，ニューヨークに所在のＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ（１９８２年）発行；Ｐａｒｈａｍ，第１４章，Ｗｅｉｒ編，「免疫化学(Immunochemistry)」，第４版，オックスフォードに所在のＢｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８６年）発行に記載されている。抗体断片の使用及び作成は、例えばＦａｂ断片（Ｔｉｊｓｓｅｎ，「酵素イムノアッセイの実際及び理論(Practice and Theory of Enzyme Immunoassays)」，アムステルダムに所在のＥｌｓｅｖｉｅｒ（１９８５年）発行）、Ｆｖ断片（Ｈｏｃｈｍａｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１２：１１３０（１９７３）；Ｓｈａｒｏｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１５：１５９１（１９７６）；Ｅｈｒｌｉｃｈらの米国特許第４，３５５，０２３号明細書）、及び抗体半分子（Ａｕｄｉｔｏｒｅ−Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓの米国特許第４，４７０，９２５号明細書）にも記載されている。更に、公知の抗体重鎖及び軽鎖可変領域配列に基づく組換えＦｖ断片の作成方法は、例えばＭｏｏｒｅらの米国特許第４，６４２，３３４号明細書及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：５４５（１９９１）に記載されている。或いは、前記断片は一般的な方法で化学的に合成することもできる。
【００７７】
アゴニスト、インバースアゴニストもしくはアンタゴニストの同定方法
本発明により、各種疾患の治療及び管理に有用であり得る新規受容体変異体の選択的アゴニスト、インバースアゴニストもしくはアンタゴニストが発見できる。前記疾患には、中枢神経系疾患、例えばうつ病、不安症、精神病（例えば、精神分裂病）、遅発性ジスキネジー、パーキンソン病、肥満、高血圧症、ツレット症候群、性機能不全、胃腸障害、精神障害、睡眠障害、視床下部機能不全、薬物中毒、薬物乱用、認識障害、アルツハイマー病、老人痴呆、ナルコレプシー、卒中，薬物またはアルコールに起因する昏睡、強迫行動、パニック発作、疼痛、社会恐怖、摂食障害及び食欲不振、肥満治療のための食欲抑制、心血管性及び脳血管性障害、非インスリン依存性糖尿病、高血糖、便秘、不整脈、神経内分泌系障害、ストレス、痙縮、酸セクレチン、潰瘍、気道狭窄、喘息、アレルギー、炎症及び前立腺機能不全が含まれる。よって、本発明のＨ３受容体変異体はＨ３受容体またはＨ３受容体変異体のアゴニスト、アンタゴニストまたはインバースアゴニストを同定するためのスクリーニングシステムにおいて使用され得る。本質的に、前記システムには、Ｈ３受容体変異体、ヒスタミンそれ自体を含めた適当な公知リガンド、及びヒスタミンアゴニスト、アンタゴニストもしくはインバースアゴニストの存在について調べようとするサンプルを混合する方法が含まれる。
【００７８】
少なくとも２つの基本的タイプのスクリーニングシステム、すなわち標識リガンド結合アッセイ及び“機能”アッセイが使用され得る。結合アッセイにおいて使用される標識リガンドは、ヒスタミン、またはヒスタミンアゴニスト、インバースアゴニストもしくはアンタゴニスト（すなわち、ヒスタミン代用薬）を抗体の標識について上記した測定可能な基で標識することにより得ることができる。ヒスタミンの各種標識形態は市販されているかまたは一般的方法を用いて作成され得る。下記実施例では、３Ｈ−Ｎα−メチルヒスタミンをリガンドとして使用する。
【００７９】
典型的には、所与量の本発明のＨ３受容体変異体を漸増量の標識リガンド、例えばヒスタミンまたは３Ｈ−Ｎα−メチルヒスタミンと接触させ、非結合標識リガンドを洗浄により除去した後結合した標識リガンドの量を測定する。標識リガンドの量が多くなると、最後には全ての受容体変異体結合部位が占められるかまたは飽和される点に達する。非標識リガンドが大過剰になると標識リガンドは受容体変異体に特異的に結合しない。前記ヒスタミン結合アッセイは当業界で公知であり、例えばＴｅｄｆｏｒｄら，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２７５：５９８（１９９５）に記載されている。
【００８０】
好ましくは、標識リガンドの受容体への非特異的結合が最小であるアッセイシステムを使用する。非特異的結合は通常標識リガンドの総結合の５０％未満、好ましくは１５％未満、より好ましくは１０％未満である。
【００８１】
原則として、本発明の結合アッセイは本発明の可溶性受容体変異体を用いて実施され得る。例えば、大腸菌発現系から一般的方法により作成及びリフォールディングし、生じた受容体変異体−標識リガンド複合体を例えば受容体変異体に対する抗体を用いて沈降させ得る。次いで、沈降物を洗浄し、結合した標識リガンドの量を測定し得る。
【００８２】
しかしながら、前記方法で使用するＨ３受容体変異体は好ましくは膜結合受容体変異体である。この膜結合受容体変異体を作成するために、本発明のＨ３受容体変異体の１つをコードする核酸を適当な宿主細胞にトランスフェクトすると受容体変異体は細胞の膜に導入されるようになる。次いで、膜分画を細胞から単離し、アッセイのための受容体変異体のソースとして使用し得る。好ましくは、非トランスフェクト宿主細胞由来の膜分画に対する標識リガンドの特異的結合は無視し得る。
【００８３】
本発明の結合アッセイは、ヒスタミンアゴニスト、インバースアゴニストもしくはアンタゴニストが標識リガンドの受容体変異体への結合を妨害するので前記化合物を同定するために使用され得る。
【００８４】
基本的結合アッセイにおいて、ヒスタミンアゴニスト、アンタゴニストもしくはインバースアゴニストの同定方法は、
（ａ）ある量の標識リガンド（例えば、ヒスタミンまたはヒスタミン代用薬）の存在下で配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２または配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有する受容体変異体、その断片またはそのアナログを含むポリペプチドをヒスタミンアゴニスト、インバースアゴニストもしくはアンタゴニストの存在について調べようとするサンプルと接触させ、
（ｂ）受容体に結合した標識受容体リガンド（例えば、Ｎα−メチルヒスタミン）の量を測定し、
（ｃ）前記サンプルの存在下及び前記サンプルの非存在下でのポリペプチドに結合した標識リガンド受容体の量を比較して、ヒスタミンアゴニスト、インバースアゴニストもしくはアンタゴニストの非存在下で測定される量に比較してポリペプチドへの標識受容体リガンドの結合の実質的低下を測定することにより前記サンプル中の前記アゴニスト、インバースアゴニストもしくはアンタゴニストを同定すること
を含む。
【００８５】
“実質的低下”とは、サンプルの存在下でのヒスタミンの結合が該サンプルの非存在下でのヒスタミンの結合の８０％以下、好ましくは７０％以下、より好ましくは５０％以下、最も好ましくは４０％、３０％、２０％または１０％以下であることを意味する。好ましくは、ヒトへの治療用ヒスタミンアゴニスト、インバースアゴニストもしくはアンタゴニストを同定するために使用されるポリペプチドは配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２または配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有するかまたは前記配列のいずれかの断片である。
【００８６】
その後、標識リガンドの受容体変異体への結合を抑制する特定分子がアゴニスト、インバースアゴニストもしくはアンタゴニストであるかどうかを第２機能アッセイで調べる。結合アッセイで同定したヒスタミンアゴニスト、インバースアゴニストもしくはアンタゴニストの機能性を細胞及び動物モデルで調べることができる。
【００８７】
ヒスタミン受容体のアンタゴニスト／アゴニスト／インバースアゴニストに対する機能アッセイ
細胞モデルでは、アンタゴニスト及び／またはアゴニスト及び／またはインバースアゴニスト活性のためにヒスタミン受容体により媒介される細胞内活性に関するパラメーターがモニターされ得る。前記パラメーターには、公知方法を用いるＨ３ヒスタミン受容体により活性化される細胞内第２メッセンジャー経路、細胞増殖率の変化、ホルモンの分泌等が含まれるが、これらに限定されない。前記方法の例は、フォルスコリン刺激細胞内ｃＡＭＰ産生の受容体媒介抑制に対するリガンドの効果（Ｐａｒｋｅｒら，Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，３４：１７９−１８９（１９９５））、受容体刺激Ｃａ２＋可動化及び分裂促進効果（Ｓｅｔｈｉら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５１：１６７４−１６７９（１９９１））及びイノシトールホスフェート産生及びＭＡＰキナーゼ誘導（Ｗａｎｇら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７：６７１１−１７（１９９８））の測定である。米国特許第６，２０４，０１７号明細書に記載されているＦＬＩＰＲ方法も細胞内カルシウム放出を測定するのに適している。他の適当な機能アッセイはＬｏｖｅｎｂｅｒｇら，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５５：３３（１９９９）またはＣｏｇｅら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３５５：２７９（２００１）に記載されている。
【００８８】
また、ヒスタミン受容体のアゴニスト、インバースアゴニストもしくはアンタゴニストは機能アッセイを用いることにより直接同定され得る。アゴニスト、インバースアゴニストもしくはアンタゴニストはヒスタミン受容体に対するヒスタミン結合を直接抑制することもしないこともある。
【００８９】
上記した方法に加えて、アンタゴニストの活性は、改変細胞内ｃＡＭＰまたはカルシウムイオン濃度について細胞モデルで測定され得る。培養細胞を用いるヒスタミン誘導走化性も利用され得る。更に、アフリカツメガエルを用いるモデル、メラニン保有細胞における顔料分散／凝集、及び哺乳動物細胞におけるエクオリンアッセイもこの目的に適している。前記活性のために動物または動物組織を用いる方法も使用可能である。前記方法の例は、ヒスタミン刺激好中球走化性、強化した好中球−内皮相互作用、脱顆粒及びメディエーター、酵素及びスーパーオキシドの放出をもたらす好中球活性化、炎症性疼痛、及び高いサイトカイン産生及び転写である。
【００９０】
基本的機能アッセイでは、本発明の方法は哺乳動物ヒスタミン受容体のアゴニスト、インバースアゴニストもしくはアンタゴニストの同定方法を提供し、その方法は
１）ある量のリガンド（例えば、ヒスタミンまたはヒスタミン代用薬）の存在下で配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２または配列番号２４のアミノ酸配列を有するポリペプチド、その断片またはそのアナログをヒスタミンアゴニスト、インバースアゴニストもしくはアンタゴニストの存在について調べようとするサンプルと接触させ、
２）前記ポリペプチドにより変調される少なくとも１つの細胞機能を測定し、
３）前記サンプルの存在下及び前記サンプルの非存在下での前記ポリポプチドにより変調される少なくとも１つの細胞機能を比較すること
を含み、前記サンプルの存在下での少なくとも１つの細胞機能の実質的変化はヒスタミンアゴニスト、アンタゴニストもしくはインバースアゴニストの存在を示す。“実質的変化”は少なくとも１０％の変化（活性または期間の増加または低下）を意図する。実質的変化は、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、４０％、５０％または７５％である。上記機能アッセイが少なくとも１つの細胞機能を測定し得る環境、例えば全細胞または単離膜において本発明のポリペプチドを用いて実施されることは当業者に明らかである。
【００９１】
アゴニスト、インバースアゴニスト及びアンタゴニスト医薬組成物
本発明の方法により同定されたアゴニスト、インバースアゴニストもしくはアンタゴニスト、並びに同定されたアゴニスト、インバースアゴニストもしくはアンタゴニスト及び医薬的に許容され得る担体を含む医薬組成物も本発明に包含される。
【００９２】
１つの態様で、本発明は本明細書に開示されている方法により同定したアゴニスト、インバースアゴニストもしくはアンタゴニストのいずれかの化合物を提供し、前記化合物はＨ３ヒスタミン受容体に関連するかまたはＨ３ヒスタミン受容体により変調される疾患、障害及び状態の治療のために有用である。前記状態の幾つかには上記した疾患が含まれる。本明細書に開示されている方法に従って同定した化合物（アゴニスト、インバースアゴニストもしくはアンタゴニスト）は単独で、可能性ある毒性を最小限としながらヒトヒスタミンＨ３受容体変異体またはその活性を最適に変調（活性化または阻害）させるためにルーチンの試験により決定される適当な用量で使用され得る。加えて、他の薬剤を同時または逐次投与することが望ましいことがある。
【００９３】
本発明の目的は、ヒトＨ３受容体及びＨ３受容体変異体に関連する疾患及び障害の治療方法において使用される適当な局所、経口、全身及び非経口処方物を提供することである。ヒトヒスタミンＨ３受容体変異体を変調する際に使用する活性成分として本発明に従って同定した化合物を含む組成物は、投与のための慣用ビヒクル中の各種治療用剤形の形態で投与され得る。援用により本明細書に含まれるとする米国特許第５，３８０，８５８号明細書、同第５，４８６，５２６号明細書、同第５，６３３，３８２号明細書、同第５，６３９，７７５号明細書、同第５，６５２，２５８号明細書、同第５，９９０，３１７号明細書、同第６，００８，２４０号明細書、同第６，０７２，０５７号明細書及び同第６，１６６，０６０号明細書には、Ｈ３受容体アンタゴニストを含む医薬組成物の製造及びその投与が記載されている。前記方法は本発明の化合物に対しても適している。例えば、本発明化合物またはモジューレーターは錠剤やカプセル剤（いずれも徐放性及び持効性処方物を含む）、ピル剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、溶液、懸濁液、シロップ及び乳濁液のような経口剤形でまたは注射により投与され得る。また、本発明化合物は静脈内（ボーラス及び注入）、腹腔内、皮下、場合により密封を伴う局所、または筋肉内形態でも投与され得、これらの投与形態は製薬業界の当業者に公知である。非毒性有効量の所望化合物がヒトヒスタミンＨ３受容体変異体モジュレーター（すなわち、アゴニスト、アンタゴニストもしくはインバースアゴニスト）として使用され得る。
【００９４】
化合物の１日用量は０．０１〜１，０００ｍｇ／患者／日の広範囲で変更され得る。経口投与の場合、組成物を治療対象の患者の症状に合わせて用量を調節するために０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０及び５０．０ｍｇの活性成分を含む刻みつき(scored)または刻みなしの錠剤の形態で提供することが好ましい。薬物の有効用量は通常約０．０００１〜約１０００ｍｇ／ｋｇ体重／日の用量レベルである。より好ましくは、前記範囲は約０．００１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日である。併用したときにはヒトヒスタミンＨ３受容体変異体モジュレーターの用量は所望効果を達成するために調節される。一方、各種薬剤の用量は、単独で使用したときよりも病状を更に緩解する相乗的効果が達成されるように独立して最適化され、組み合わされる。
【００９５】
有利には、本発明の化合物を１日１回投与してもよく、または総１日用量を１日に２〜４回に分けて投与してもよい。更に、本発明の化合物またはモジュレーターは、適当な鼻内ビヒクルを局所適用して鼻腔内形態で、または当業者に公知の経皮パッチを用いて経皮ルートで投与され得る。勿論、経皮デリバリーシステムの形態で投与するためには投薬はそのレジメ中間断的よりはむしろ連続的である。２つ以上の活性物質を別々の投与処方物中に配合して用いる併用療法では、複数の活性物質を同時に投与してもよく、または各活性物質を時差を設けて別々に投与してもよい。
【００９６】
本発明の化合物を用いる投薬レジメは、患者の種類，種，年齢，体重，性別及び病状、治療しようする病状の重篤度、投与ルート、患者の腎及び肝機能、及び使用する特定化合物を含めた諸要因に従って選択される。担当医または獣医は病状の進行を防止、対抗または阻止するのに必要な薬物の有効量を容易に決定、処方し得る。毒性なしに効果を生ずる範囲内の薬物の濃度を最適精度で決定するには、標的部位に対する薬物アベイラビリティーの動態に基づくレジメが必要である。このためには薬物の分布、平衡及び消失を考慮する。
【００９７】
本発明の治療方法では、本明細書に詳記されている化合物が活性成分を形成し得、通常所期の投与形態、つまり経口錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、シロップ剤等に関して適当に選択され且つ慣用の製薬プラクティスに合致する適当な薬用希釈剤、賦形剤または担体（まとめて本明細書中“担体”材料と称する）と混合して投与される。
【００９８】
例えば、錠剤またはカプセル剤の形態で経口投与する場合、活性薬物成分は非毒性医薬的に許容され得る不活性の経口用担体、例えばエタノール、グリセロール、水等と併用され得る。更に、所望または所要により、適当な結合剤、滑沢剤、崩壊剤及び着色剤も混合物中に配合し得る。適当な結合剤にはスターチ、ゼラチン、天然糖（例えば、グルコースまたはβ−ラクトース）、コーン甘味料、天然及び合成ゴム（例えば、アカシア、トラガカントまたはアルギン酸ナトリウム）、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックス等が含まれるが、これらに限定されない。上記剤形中に使用される滑沢剤にはオレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム等が含まれるが、これらに限定されない。崩壊剤にはスターチ、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガム等が含まれるが、これらに限定されない。
【００９９】
液体剤形では、活性薬物成分は適当に着臭させた懸濁または分散剤、例えばトラガカント、アカシア、メチルセルロース等のような合成及び天然ゴムと併用され得る。使用し得る他の分散剤にはグリセリン等が含まれる。非経口投与のためには滅菌懸濁液及び溶液が望ましい。静注投与を所望するときには、通常適当な保存剤を含む等張性製剤を使用する。
【０１００】
活性薬物成分を含む局所製剤は当業界で公知の各種担体材料、例えばアルコール、アロエエキスゲル、アラントイン、グリセリン、ビタミンＡ及びＥオイル、鉱油、ＰＰＧ２ミリスチルプロピオネート等と混合して、例えばアルコール溶液、外用クレンザー、クレンジングクリーム、スキンジェル、スキンローション、クリームまたはゲル形態のシャンプーを形成し得る。
【０１０１】
本発明の化合物はリポソームデリバリーシステム、例えば小単ラメラ小胞、大単ラメラ小胞及び多重ラメラ小胞の形態でも投与され得る。リポソームは各種リン脂質（例えば、コレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリン）から形成され得る。
【０１０２】
本発明の化合物は、該化合物分子をカップリングさせた個々の担体としてモノクローナル抗体を使用することによってもデリバリーされ得る。本発明の化合物またはモジュレーターは標的可能な薬物担体としての可溶性ポリマーとカップリングさせてもよい。前記ポリマーにはポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミドフェノール、ポリヒドロキシ−エチルアスパルタミドフェノール、またはパルミトイル残基で置換したポリエチレンオキシドポリリシンが含まれる得る。更に、本発明の化合物またはモジュレーターは薬物を制御放出させるのに有用なクラスの生分解性ポリマー（例えば、ポリ乳酸、ポリ−ε−カプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロ−ピラン、ポリシアノアクレリート及びヒドロゲルの架橋または両親媒性ブロックコポリマー）にカップリングさせてもよい。
【０１０３】
経口投与の場合、化合物をカプセル剤、錠剤またはボーラスの形態で投与してよく、または動物飼料に混合してもよい。カプセル剤、錠剤またはボーラスは活性成分と適当な担体ビヒクル（例えば、スターチ、タルク、ステアリン酸マグネシウムまたはリン酸ジカルシウム）の組合せから構成される。前記単位剤形は、均質混合物が得られるように活性成分を適当な微粉末不活性成分、例えば希釈剤、充填剤、崩壊剤及び／または結合剤と均密に混合することにより製造される。不活性成分は、化合物またはモジュレーターと反応せず、治療対象の動物に対して非毒性のものである。適当な不活性成分にはスターチ、ラクトース、タルク、ステアリン酸マグネシウム、植物ガム及び油等が含まれる。上記処方物は、治療対象の動物種のサイズ及びタイプ、感染のタイプ及び重篤度のような諸要因に応じて異なる量の活性成分及び不活性成分を含み得る。活性成分は、化合物を飼料と単に混合するかまたは化合物を飼料の表面に適用することにより飼料に対する添加剤としても投与され得る。或いは、活性成分は不活性担体と混合され、生じた組成物は飼料と混合するかまたは動物に対して直接与えられ得る。適当な不活性担体にはコーンミール、シトラスミール、発酵残渣、大豆粗粒子、乾燥粒子等が含まれる。活性成分は、最終組成物が０．００１〜５重量％の活性成分を含むように粉砕、撹拌、ミリングまたはタンブリングにより不活性担体と均密に混合される。
【０１０４】
また、化合物は活性成分を不活性液体担体に溶解してなる処方物を注射することにより非経口的に投与され得る。筋肉内、管腔内、気管内または皮下に注射され得る。注射用処方物は活性成分と適当な不活性液体担体の混合物からなる。許容され得る液体担体には植物油（例えば、落花生油、綿実油、ゴマ油等）及び有機溶媒（例えば、ソルケタール、グリセロール、ホルマール等）が含まれる。或いは、水性非経口処方物も使用し得る。植物油が好ましい液体担体である。前記処方物は、最終処方物が０．００５〜１０重量％の活性成分を含むように液体担体中に活性成分を溶解または懸濁することにより調製される。
【０１０５】
本発明の化合物またはモジュレーターを含む液体飲薬またはシャンプーを用いることにより、当該化合物またはモジュレーターを水性溶液または懸濁液として局所投与することができる。前記処方物は通常ベントナイトのような懸濁剤を含み、通常消泡剤をも含む。０．００５〜１０重量％の活性成分を含む処方物が許容され得る。好ましい処方物は０．０１〜５重量％の本発明化合物を含むものである。
【０１０６】
下記実施例により本発明を説明する。ただし、この実施例は本発明を限定するものではない。
【実施例】
【０１０７】
Ｈ３ｇ及びＨ３ｈ受容体変異体のクローニング：
ｃＤＮＡの作成
ヒト脳由来のポリＡ＋ｍＲＮＡは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（米国カリフォルニア州９４３０３−４２３０パロアルト  イーストメドゥサークル１０２０に所在；カタログ番号６５４８−１）から入手した。このポリＡ＋ｍＲＮＡをＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号１８０６４０１４）、ランダムヘキサマープライマー（インディアナ州インディアナポリスに所在のＲｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；カタログ番号１０３４７３１）を用いて逆転写した。ポリＡ＋（５０ｎｇ）を鋳型として使用した。転写は、まず室温において５分間、その後５０℃において４５分間実施した。
【０１０８】
分子クローニング
Ｈ３ヒスタミン配列をヒト脳ＤＮＡからＰＣＲにより２つの断片にクローン化した。プライマー用配列を以下に示す。Ｎ末端に対してはプライマーＨＲ３５２及びＨ３ＮＨＥ３を用いた。プライマーＨ３ＮＨＥ３は受容体アセンブリのために使用され得る内部Ｎｈｅ−１制限部位を含んでいた。この部位を受容体のコード配列を破壊することなくＨ３配列に加工した。Ｈ３受容体のＣ末端をクローニングするためにプライマーＨ３ＮＨＥ５及びＨＲ３３を使用した。Ｈ３断片のＰＣＲ増幅はＤＮＡポリメラーゼのＥｘｐａｎｄ混合物（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；カタログ番号１７３２６５０）を用いて実施した。５０μｌ  ｃＤＮＡ反応物（５μｌ）を以下のＰＣＲ条件でのＰＣＲ増幅に用いた。９４℃×２分；９４℃×４０秒、６０℃×４０秒、７２℃×１分３０秒を１サイクルとして１０サイクル；９４℃×４０秒、６０℃×４０秒、７２℃×１分３０秒＋２０秒を１サイクルとして２５サイクル；７２℃×７分間；４℃で保持。ＰＣＲ増幅産物を１％アガロースゲルを用いて分析したところ、Ｈ３のＮ末端に既に公開されているＨ３配列よりも１０８塩基短い１つのバンドを示した。これにより、野生型Ｈ３よりも３６アミノ酸短いタンパク質が生じた。Ｃ末端のＰＣＲにより、長さが７９７及び５５７の２つの断片が生じた。短い方の断片は細胞内ループ３をコードする領域に２４０塩基対（８０残基）欠失を含んでいた。ＰＣＲ産物をベクターｐＡＭＰ−１（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号１８３８１０１２）にＵＤＧクローニングシステムを用いてクローン化した。工学処理したＮｈｅ  Ｉ部位を用いて、Ｎ末端断片及びＣ末端断片を連結することにより完全長構築物をアセンブリした。
【０１０９】
Ｈ３の野生型形態（Ｈ３ａ）を得るために、我々のＨ３  Ｎ末端中に欠失１０８塩基ヌクレオチド配列を再導入した。このためには、前記塩基を数回のＰＣＲ増幅により挿入した。以下のプライマー組を用いて数回のＰＣＲ増幅を実施した。第１回：Ｈ３ＥＸＴ１＋Ｈ３ＮＨＥ３、第２回：Ｈ３ＥＸＴ２＋Ｈ３ＮＨＥ３、第３回：Ｈ３ＥＸＴ３＋Ｈ３ＮＨＥ３、第４回：Ｈ３ＥＸＴ４＋Ｈ３ＮＨＥ３、第５回：Ｈ３ＥＸＴ５＋Ｈ３ＮＨＥ３、第６回：Ｈ３ＥＸＴ６＋Ｈ３ＮＨＥ３、第７回：ＨＲ３５２＋Ｈ３ＮＨＥ３。これらの配列を増幅させるために使用したＰＣＲ条件は次の通りであった：９４℃×２分；９４℃×４０秒、６０℃×４０秒、７２℃×１分３０秒を１サイクルとして３５サイクル；７２℃×７分間；４℃で保持。いずれの場合も、１回のＰＣＲからの増幅産物（１μｌ）を１／１０希釈した後次回の増幅のための鋳型として使用した。最終産物を上記したようにｐ−ＡＭＰ−１にサブクローン化した。工学処理したＮｈｅ−Ｉ部位を再び構築物のアセンブリために使用した。
【０１１０】
Ｈ３ｇ及びＨ３ｈ変異体のヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号１３及び１７に示す。対応のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１４及び１８に示す。野生型Ｈ３受容体（上記したＨ３ａ構築物）のヌクレオチド配列を配列番号１に示す。Ｈ３野生型受容体のタンパク質配列を配列番号２に示す。野生型Ｈ３受容体からＣ末端コード領域及びＮ末端領域が２４０塩基欠失されているＨ３変異体のヌクレオチド配列はＨ３ｂと称され、ヌクレオチド配列を配列番号３に示し、アミノ酸配列を配列番号４に示す。上掲のＣｏｇｅら（２００１）に記載されているＨ３受容体変異体のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を比較のために示す。配列番号５及び配列番号６はそれぞれＨ３（ΔＴＭ２，４３１ａａ）変異体のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。配列番号７及び配列番号８はそれぞれＨ３（Δｉ３，４１５ａａ）のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。配列番号９及び配列番号１０はそれぞれＨ３（Δｉ３，３２９ａａ）のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。配列番号１１及び配列番号１２はそれぞれＨ３（ΔＴＭ５＋Δｉ３，３６２ａａ）のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。
【０１１１】
ＣＯＳ−７細胞におけるＨ３ヒスタミン受容体変異体の一過性発現及びヒスタミン結合の測定
完全長野生型受容体（Ｈ３ａ）、受容体変異体Ｈ３ｇ及びＨ３ｈ、及び変異体Ｈ３ｂ（Ｎ末端１０８塩基，３６アミノ酸欠失ではなく細胞内ループ（ｉ３）に２４０塩基，８０アミノ酸欠失を含む）を、ＣＯＳ−７細胞での発現のためのｐＣＤＮＡ３．０真核細胞発現ベクターにクローン化した。培養チャンバーで増殖させたＣＯＳ−７細胞にＨ３受容体または受容体変異体の１つを含むプラスミドＤＮＡ（２μｇ）をＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）トランスフェクション試薬を用いてトランスフェクトした。
【０１１２】
ヒスタミンの受容体または受容体変異体に対する結合をＢＯＤＩＰＹ−Ｌ−ヒスタミンまたはフルオレセインヒスタミン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）により測定した。簡単に説明すると、トランスフェクトした細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中ＢＯＤＩＰＹ−Ｌ−ヒスタミンまたはフルオレセインヒスタミン（１μＭ）を細胞に添加し、３７℃において３０分間インキュベートした。非結合蛍光標識ヒスタミンを冷ＰＢＳで洗浄し、スライドを直ちに蛍光顕微鏡で検査した。Ｈ３ｇ、Ｈ３ｈ及びＨ３ｂ変異体をトランスフェクトした細胞はＨ３ａ野生型受容体をトランスフェクトした細胞に匹敵するヒスタミン結合を示した。
【０１１３】
Ｈ３ヒスタミン受容体をクローン化するために使用したプライマー
Ｎ末端に対して
【０１１４】
【化１】
2005508652.tif 000002
【０１１５】
Ｃ末端に対して
【０１１６】
【化２】
2005508652.tif 000003
【０１１７】
短縮Ｈ３  Ｎ末端を伸長させるためには、次のプライマーを使用した。
【０１１８】
【化３】
2005508652.tif 000004
【０１１９】
膜作成
Ｈ３受容体変異体プラスミドを単独でまたはＧタンパク質プラスミドと共にトランスフェクトした細胞を、５ｍＭ  ＥＤＴＡ／リン酸緩衝食塩液中でインキュベートした後繰り返しピペッティングすることにより収集する。前記細胞を１，０００ｇで５分間遠心する。ＥＤＴＡ／ＰＢＳをデカントし、等容量の氷冷５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を添加し、細胞をＰｏｌｙｔｒｏｎホモジナイザー（ＰＴ−１０チップ、設定５、３０秒間）を用いて破壊する。核及び非破壊細胞を１，０００ｇで１０分間沈降させた後、上清を５０，０００ｇで１０分間遠心する。上清をデカントし、ペレットをＰｏｌｙｔｒｏｎ均質化により再懸濁し、サンプルをＢＣＡタンパク質アッセイ（イリノイ州ロックフォードに所在のＰｉｅｒｃｅ）のために採取し、組織を再び５０，０００ｇで遠心する。ペレットは−２０℃で冷凍保存され得る。
【０１２０】
ラジオリガンド結合
飽和結合のために、漸増濃度の適当なリガンド（例えば、［３Ｈ］Ｎαメチルヒスタミン（７０〜９０Ｃｉ／ミリモル；ニュージャージー州ピスカタウェーに所在のＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））を２４℃において総容量２００μｌの５０ｍＭ  Ｎａ−ホスフェート（ｐＨ７．５）中場合により適当な濃度の適当な物質（例えば、１０−５Ｍのチオペラミド）の存在下で４０〜６０μｇの膜タンパク質と３回４０分間インキュベートする。０．１％  ポリエチレンイミン（Ｓｉｇｍａ）で予備処理したＵｎｉｆｉｌｔｅｒ−９６  ＧＦ／Ｂフィルター（コネティカット州メリデンに所在のＰａｃｋａｒｄ）を介して濾過することにより結合放射能を分離する。フィルターを氷冷５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）（４００μｌ）で８回洗浄し、フィルター上に残存する放射能をＴｏｐ−カウント（Ｐａｃｋａｒｄ）を用いる液体シンチレーション計数により３４％の効率で定量する。競合結合アッセイの場合には、５つの濃度の化合物を適当な濃度の適当なリガンド（例えば、１ｎＭの［３Ｈ］Ｎαメチルヒスタミン）及び７０μｇの膜タンパク質と上記した条件下で３回インキュベートする。サンプルを濾過し、放射能を上記したように定量する。結合データを、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（カリフォルニア州サンジェゴに所在のＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて適当なモデルへの非線形最小自乗曲線の当てはめにより分析し、Ｋｉ値をＣｈｅｎｇ及びＰｒｕｓｏｆｆ（１９７３）に従ってＩＣ５０値から計算し得る。
【０１２１】
細胞内カルシウム（［Ｃａ２＋］ｉ）可動化アッセイ
トランスフェクトから２４時間後細胞をトリプシンを使用せずに収集し、ポリ（Ｄ−リシン）処理９６ウェル透明ボトムブラックプレート（ニュージャージー州フランクリンレークスに所在のＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）において１０％  ウシ胎仔血清添加ＤＭＥＭに２．５×１０５細胞／ウェルで接種する。実験化合物をハンクス平衡塩類溶液、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２．５ｍＭ  プロべネシド、１％  ウシ血清アルブミン（洗浄緩衝液）で希釈する。トランスフェクトから４８時間後、細胞に１０％  ウシ胎仔血清添加ＤＭＥＭ中２μＭ  Ｆｌｕｏ  ３−ＡＭ（Ｆ−６１４２；Ｓｉｇｍａ）、２．５ｍＭ  プロべネシド及び２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを１．５時間充填する。細胞を洗浄緩衝液を用いて十分に洗浄して、過剰の染料を除去し、蛍光測定イメージングプレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）（カリフォルニア州サニーベールに所在のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いてリガンド誘導［Ｃａ２＋］ｉ放出を調べる。結果を初期測定値からの蛍光の相対変化として示し、化合物を添加後３分間にわたり調べる。
【０１２２】
ｃＡＭＰアッセイ
細胞を上記したようにトランスフェクトし、トランスフェクトしてから４８時間アッセイする。百日咳毒素で予備処理した細胞を一晩インキュベートした後、完全血清培地において百日咳毒素（１００ｎｇ／ｍｌ）を用いてアッセイする。アッセイ当日に、細胞を２ｍＭ  ＥＤＴＡ／ＰＢＳに収集し、冷（４℃）アデニル酸シクラーゼ緩衝液（ＡＣ緩衝液）（２５０ｍＭ  スクロース、７５ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．５ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４）中に５×１０６細胞／ｍｌの最終濃度まで再懸濁する。前記培地にはアスコルビン酸（１０ｍｇ／５０ｍｌ）及びジチオトレイトール（３１ｍｇ／５０ｍｌ）を毎日添加する。ホスホジエストラーゼ阻害剤Ｒｏ  ２０−１７２４（４−［（３−ブトキシ−４−メトキシフェニル）メチル］−２−イミダゾリジノン）を１００μＭの最終濃度で添加し、細胞を１５分間（室温）または３０分間（氷上）インキュベートする。薬物はＡＣ緩衝液±フォルスコリン（チャイニーズハムスター卵巣細胞に対しては１０μＭ、ＨＥＫ−２９３細胞に対しては１００ｎＭ）中２×最終濃度で調製する。アッセイのために、薬物溶液（５０μｌ）を１ｍｌ  Ｘ９６ウェルアッセイブロック中の細胞懸濁液（５０μｌ）に添加し、インキュベーター−シェーカーにおいて３７℃で１５分間インキュベートし、３分間煮沸した後氷で冷却する。次いで、細胞ライゼートをＮＥＮ環状ＡＭＰフラッシュプレートアッセイ（マサチューセッツ州ボストンに所在のＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．）を製造業者のプロトコルに従って用いて全環状ＡＭＰについてアッセイする。各条件で生じた全ｃＡＭＰを次のように測定する：各サンプルの％Ｂ／Ｂｏ＝（標準のサンプルの平均正味カウント数×１００）／ゼロ標準の平均正味カウント数。標準曲線は各標準の％Ｂ／Ｂｏをｌｏｇ［ｃＡＭＰのｐｍｏｌ］に対してプロットすることにより作成し得る。各サンプルについてのｃＡＭＰの濃度は標準曲線から内挿され得る。結果をｃＡＭＰのフェムトモル／ウェルとして表示する。
【０１２３】
ＭＡＰキナーゼアッセイ
細胞を上記したようにトランスフェクトする。トランスフェクトしてから２４時間後、細胞を収集し、６ウェル皿において１×１０６細胞／ウエルの密度で再接種する。接種してから５〜８時間後に完全血清培地を０．４％血清培地で一晩交換する。百日咳毒素で予備処理した細胞を一晩インキュベートしてから、０．５％  血清培地において１００ｎｇ／ｍｌの百日咳毒素を用いてアッセイする。薬物攻撃の１時間前に、細胞をバックグラウンドＭＡＰキナーゼ活性化を減ずるために血清なしの培地に入れる。次いで、薬物を適当な濃度で添加し、３７℃において５分間インキュベートする。次いで、細胞を冷ＰＢＳで１回洗浄し、５０ｍｌあたり１つの完全プロテアーゼ阻害剤カクテルテーブル（インディアナ州インディアナポリスに所在のＲｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含む冷溶解緩衝液［１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  トリス（ｐＨ８．０）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ９．８）、１０ｍＭ  ＮａＦ、１０ｍＭ  二塩基性ピロリン酸ナトリウム、１％（ｖ／ｖ）  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、０．５％（ｗ／ｖ）  デオキシコール酸ナトリウム（ＲＩＰＡ）］（１００μｌ）中に溶解させる。細胞ライゼートを遠心チューブに集め、４℃において１３，０００ｇで１５分間回転させて細胞破片をペレット化する。ライゼートのタンパク質濃度をＢＣＡタンパク質アッセイを用いて測定する。タンパク質（２０μｇ）を等量の２Ｘ  ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動サンプル緩衝液に添加し、５分間煮沸した後、１０％  トリス−グリシンポリアクリルアミドゲル（カリフォルニア州カールズバッドに所在のＮｏｖｅｘ）を用いて分離する。ゲル中のタンパク質を半乾燥転移装置（カリフォルニア州ヘルクレスに所在のＢｉｏ−Ｒａｄ）を用いて転移緩衝液（２５ｍＭ  トリス、１９２ｍＭ  グリシン、２０％  メタノール，ｐＨ８．３）中ニトロセルロース膜に移す。膜を室温において５％（ｗ／ｖ）  ミルクを含有するブロッキング溶液［５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％（ｖ／ｖ）  ツイーン２０（ＴＴＢＳ）］中で１時間以上インキュベートする。膜をＴＴＢＳで３回すすいだ後、ＰｈｏｓｐｈｏＰｌｕｓ  ｐ４４／４２  ＭＡＰキナーゼ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）抗体キット（マサチューセッツ州ビバリーに所在のＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）を製造業者の指示に従って用いて展開する。
【０１２４】
本明細書に挙げた刊行物及び特許文献はすべて、それぞれの刊行物または特許文献が個別に本明細書に援用されると特記されている場合と同程度に本明細書に援用されるものとする。
【０１２５】
本発明を詳細に説明してきたが、添付請求範囲の趣旨または範囲を逸脱することなく多くの変化及び修飾を加え得ることは当業者に明らかである。
【配列表】
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【国際調査報告】
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