(57)【要約】本発明は、式（Ｉ）のステロール誘導体に関する。本発明はまた、これらの化合物の生成のための方法に関する。本発明はまた、これらの化合物のうちの１種を使用する医薬に関する。本発明はまた、これらの医薬を含む薬学的組成物に関する。本発明は、新規なステロール誘導体に関し、これらの化合物を得るための新規なプロセスに関し、そして腫瘍細胞における分泌小胞（ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｖａｃｕｏｌｅ）の生成のため、特に、癌腫瘍の後退のため、樹状突起生成（ｄｅｎｄｒｉｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）を増加するため、および神経変性疾患と闘うため、および免疫系の活性化のために、上記化合物を使用することに関する。
2005529882.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステロールベースの化合物であって、該化合物は、式（Ｉ）
【化１】
2005529882.tif 000011
に対応し、該式において、コレステロール骨格の４位にある炭素は、部分Ｔ１およびＴ２を保有し、該部分Ｔ１およびＴ２は、独立してＨまたはＣＨ３であり得、ＣＨ３は、α位および／またはβ位にあり、２４位にある炭素は、部分Ｔ４を保有し、該部分Ｔ４は、Ｈ、ＣＨ３、またはＣ２Ｈ５を示し、１４位にある炭素は、部分Ｔ３を保有し、該部分Ｔ３は、ＨまたはβＣＨ３であり得、炭素５と炭素６との間の結合、および炭素７と炭素８との間の結合のうちの一方は二重結合であり得、他方は、単結合であり、
Ｚは、５位または８位において、ＨまたはＯＨのいずれかを示し、ＯＨは、二重結合を保有しない炭素によってのみ保有され；そして
Ｒは、６位または７位において、二重結合を保有しない炭素上において、式−Ｑ０−Ｑ１の置換基を示し、
該置換基の式において、
−Ｑ０−は、式（ＩＩ）：
−Ｘ−（ＣＨ２）ｎ０[Ｙ１−（ＣＨ２）ｎ１]ｐ１[Ｙ２−（ＣＨ２）ｎ２]ｐ２[Ｙ３−（ＣＨ２）ｎ３]ｐ３[Ｙ４−（ＣＨ２）ｎ４]ｐ４[Ｙ５−（ＣＨ２）ｎ５]ｐ５−                        （ＩＩ）
のラジカルを示し、
該式（ＩＩ）において、
ｐ１、ｐ２、ｐ３、ｐ４およびｐ５は、独立して０または１に等しい整数であり、
ｎ０、ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４およびｎ５は、
１≦ｎ０≦４
０≦ｎ１，ｎ２，ｎ３，ｎ４，ｎ５≦４
であるような独立した整数であり、
−Ｘ−は、−Ｓ−、−Ｏ−、−ＣＨ２−または−ＮＲ３−あるいはヘテロ環
【化２】
2005529882.tif 000012
を示し、Ｒ３は、ＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキルラジカルであり、
−Ｙ１−、−Ｙ２−、−Ｙ３−、−Ｙ４−および−Ｙ５−は、互いに独立して、−Ｓ−、−Ｏ−、−Ｃ−、または−ＮＲ３−を示し、Ｒ３は、上記で与えられる意味を有し、
Ｑ１は、窒素原子を介して結合したインドール核、モルホリン核またはチオモルホリン核、ヘテロ環
【化３】
2005529882.tif 000013
であって該ヘテロ環においてＲ１はＨ、ＣＯＣＨ３、Ｃ１〜Ｃ４アルキルラジカルまたは
【化４】
2005529882.tif 000014
を示し、Ｒ１は、上記で与えられる意味を有し、Ｒ２は、ＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキルラジカルを示し、Ｒ１およびＲ２は一緒になって、必要に応じて、Ｃ１〜Ｃ４ラジカルで置換されたピペリジン環、ピリジン環またはピペラジン環、あるいは窒素原子と４つの炭素原子とを含むピロールヘテロ環またはピロリジンヘテロ環を構成し得、但し、
−Ｘ−＝−ＮＨ−でありかつ
【化５】
2005529882.tif 000015
である場合、構成要素ｐ１、ｐ２、ｐ３、ｐ４およびｐ５のうちの少なくとも１つは、０以外であり、
−Ｘ−＝−ＣＨ２−であり、ｎ０＝１であり、かつ構成要素ｐ１、ｐ２、ｐ３、ｐ４およびｐ５が０である場合、Ｑ１は、−ＮＨ２以外であることを特徴とする、化合物。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物であって、該化合物は、式（Ｉ）に対応し、該式（Ｉ）において、炭素Ｃ７と炭素Ｃ８との間の結合は、二重結合であり、Ｒ＝ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ−（ＣＨ２）４−ＮＨ２であり、そしてＴ１＝Ｔ２＝Ｔ３＝Ｈであることを特徴とする、化合物。
【請求項３】
請求項１に記載の化合物であって、該化合物は、式（Ｉ）に対応し、該式（Ｉ）において、炭素Ｃ７と炭素Ｃ８との間の結合は、二重結合であり、Ｔ１＝Ｔ２＝Ｔ３＝Ｈであり、Ｒ＝−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ−（ＣＨ２）４−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ２であることを特徴とする、化合物。
【請求項４】
請求項１に記載の化合物であって、該化合物は、式（Ｉ）に対応し、該式（Ｉ）において、炭素Ｃ７と炭素Ｃ８との間の結合は、二重結合であり、Ｔ１＝Ｔ２＝Ｔ３＝Ｈであり、
【化６】
2005529882.tif 000016
であることを特徴とする、化合物。
【請求項５】
請求項１に記載の化合物であって、該化合物は、式（Ｉ）に対応し、該式（Ｉ）において、炭素Ｃ７と炭素Ｃ８との間の結合は、二重結合であり、Ｔ１＝Ｔ２＝Ｔ３＝Ｈであり、Ｒ＝−ＮＨ−（ＣＨ２）４−ＮＨ２であることを特徴とする、化合物。
【請求項６】
請求項１に記載の化合物であって、該化合物は、式（Ｉ）に対応し、該式（Ｉ）において、結合Ｃ７−Ｃ８は、二重結合であり、Ｔ１＝Ｔ２＝Ｔ３＝Ｈであり、Ｒ＝−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ２であることを特徴とする、化合物。
【請求項７】
請求項１に記載の化合物であって、該化合物は、式（Ｉ）に対応し、該式（Ｉ）において、２つの結合Ｃ５−Ｃ６およびＣ７−Ｃ８は、単結合であり、Ｚは、５位におけるＯＨを示し、そしてＴ１＝Ｔ２＝Ｔ３＝Ｈであり、Ｒは、６位にありかつ請求項３においてと同じ意味を有することを特徴とする、化合物。
【請求項８】
請求項１に記載の化合物であって、該化合物は、式（Ｉ）に対応し、該式（Ｉ）において、２つの結合Ｃ５−Ｃ６およびＣ７−Ｃ８は、単結合であり、Ｚは、５位におけるＯＨを示し、そしてＴ１＝Ｔ２＝Ｔ３＝Ｈであり、Ｒは、６位にありかつ請求項４においてと同じ意味を有することを特徴とする、化合物。
【請求項９】
請求項１に記載の化合物であって、該化合物は、式（Ｉ）に対応し、該式（Ｉ）において、２つの結合Ｃ５−Ｃ６およびＣ７−Ｃ８は、単結合であり、Ｚは、５位におけるＯＨを示し、そしてＴ１＝Ｔ２＝Ｔ３＝Ｈであり、Ｒは、６位にありかつ意味
【化７】
2005529882.tif 000017
を有することを特徴とする、化合物。
【請求項１０】
請求項１に記載の化合物であって、該化合物は、式（Ｉ）に対応し、該式（Ｉ）において、２つの結合Ｃ５−Ｃ６およびＣ７−Ｃ８は、単結合であり、Ｚは、５位におけるＯＨを示し、そしてＴ１＝Ｔ２＝Ｔ３＝Ｈであり、Ｒは、６位にありかつ意味
【化８】
2005529882.tif 000018
を有することを特徴とする、化合物。
【請求項１１】
請求項１に記載の化合物であって、該化合物は、式（Ｉ）に対応し、該式（Ｉ）において、２つの結合Ｃ５−Ｃ６およびＣ７−Ｃ８は、単結合であり、Ｚは、５位におけるＯＨを示し、そしてＴ１＝Ｔ２＝Ｔ３＝Ｈであり、Ｒは、６位にありかつ請求項２においてと同じ意味を有することを特徴とする、化合物。
【請求項１２】
請求項１に記載の化合物を調製するためのプロセスであって、
第１工程において、溶媒Ａ中に溶解しているメタ−クロロペルオキシ安息香酸を、式（ＩＩＩ）
【化９】
2005529882.tif 000019
に対応する化合物と反応させることであって、該式（ＩＩＩ）において、コレステロール骨格の４位にある炭素は、部分Ｔ１およびＴ２を保有し、該部分Ｔ１およびＴ２は、独立してＨまたはＣＨ３であり得、ＣＨ３は、α位および／またはβ位にあり、２４位にある炭素は、部分Ｔ４を保有し、該部分Ｔ４は、Ｈ、ＣＨ３、またはＣ２Ｈ５を示し、１４位にある炭素は、部分Ｔ３を保有し、該部分Ｔ３は、ＨまたはβＣＨ３であり得、炭素５と炭素６との間の結合、および炭素７と炭素８との間の結合のうちの一方は二重結合であり得、他方は、単結合であり、式ＩＩＩの化合物は、溶媒Ａと混和性である溶媒Ｂ中に溶解している、こと、
第２工程において、アクチベーターＤの存在下で溶媒Ｃ中に溶解している第１工程において得られるエポキシ化合物を、該溶媒Ｃと混和性である溶媒Ｅ中に溶解している式Ｑ０Ｑ１のアミンと反応させることであって、Ｑ０およびＱ１は、請求項１において与えられる意味を有すること、
を特徴とする、プロセス。
【請求項１３】
請求項１２に記載のプロセスであって、前記第１工程において得られる生成物を、前記第２工程のために該生成物を使用する前に精製することを特徴とする、プロセス。
【請求項１４】
請求項１２および１３のうちのいずれかに記載のプロセスであって、過塩素酸リチウムをアクチベーターＤとして使用することを特徴とする、プロセス。
【請求項１５】
請求項１２〜１４のうちの１項に記載のプロセスであって、塩化メチレンを溶媒Ａとして使用することを特徴とする、プロセス。
【請求項１６】
５位にある炭素上にＯＨを保有しかつ炭素７と炭素８との間に二重結合を含む、式（Ｉ）の化合物の調製のための請求項１５に記載のプロセスであって、塩化メチレンとＮａ２ＣＯ３水溶液との混合物を、溶媒Ｂとして使用することを特徴とする、プロセス。
【請求項１７】
５位にある炭素上にＯＨを保有しかつ炭素７と炭素８との間に単結合を含む、式（Ｉ）の化合物の調製のための請求項１５に記載のプロセスであって、塩化メチレンを、溶媒Ｂとして使用することを特徴とする、プロセス。
【請求項１８】
請求項１６および１７のいずれかに記載のプロセスであって、無水エタノールまたはピリジンを溶媒Ｃとして使用し、前記第２工程の反応を、大気圧にて還流して実施することを特徴とする、プロセス。
【請求項１９】
医薬であって、該医薬は、薬学的に受容可能なビヒクル中に、請求項１に記載の少なくとも１種の化合物を含むことを特徴とする、医薬。
【請求項２０】
請求項１９に記載の医薬であって、該医薬は、生きている哺乳動物細胞の樹状突起生成を増加するために使用されることを特徴とする、医薬。
【請求項２１】
請求項２０に記載の医薬であって、該医薬は、神経細胞またはその前駆体における軸索生成を誘発するために使用させることを特徴とする、医薬。
【請求項２２】
請求項２１に記載の医薬であって、該医薬は、ヒト神経変性疾患と闘うため、特に、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、およびパーキンソン病と闘うために、使用されることを特徴とする、医薬。
【請求項２３】
請求項１９に記載の医薬であって、該医薬は、生きている生物の免疫系を活性化するために使用されることを特徴とする、医薬。
【請求項２４】
請求項１９に記載の医薬であって、単独で服用されるかまたは請求項２３と組み合わせて服用され、該医薬は、生きている生物の腫瘍細胞における分泌小胞の生成のために使用されることを特徴とする、医薬。
【請求項２５】
請求項２４に記載の医薬であって、該医薬は、哺乳動物癌腫瘍を後退させるために使用されることを特徴とする、医薬。
【請求項２６】
請求項１９〜２５のうちの１項に記載の医薬であって、該医薬は、注入によって投与されることを特徴とする、医薬。
【請求項２７】
同時に服用される請求項２５および２６に記載の医薬であって、該医薬は、処置されるべき腫瘍領域中に注入されることを特徴とする、医薬。
【請求項２８】
請求項１９〜２７に記載の医薬であって、該医薬は、生きている生物１ｇ当たり、８．５ｎｇ〜１．７μｇの範囲の用量で投与されることを特徴とする、医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なステロール誘導体に関し、これらの化合物を得るための新規なプロセスに関し、そして腫瘍細胞における分泌小胞（ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｖａｃｕｏｌｅ）の生成のため、特に、癌腫瘍の後退のため、樹状突起生成（ｄｅｎｄｒｉｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）を増加するため、および神経変性疾患と闘うため、および免疫系の活性化のために、上記化合物を使用することに関する。
【背景技術】
【０００２】
樹状突起生成（ｄｅｎｄｒｉｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）は、特に神経系および免疫系において生じる、細胞の形態変化である。免疫系において、樹状突起生成は、単球からの樹状細胞の生成をもたらす。これらの生理学的に重要な現象は、現時点では十分には理解されていないが、これらの現象は、細胞の分泌活性の増加に関係している（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ａｃｒａ  Ｓ．ら，２００１，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２１（１１），３８３０〜３８およびＤｅｎｚｅｒ  Ｋら，２００１，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１１３，第１９部，３３６５〜７４）。これらの現象は、増殖因子およびサイトカインによって誘導される。単球から樹状細胞（ＣＤ）への分化は、単球をインターロイキン４（ＩＬ４／ＧＭ−ＣＳＦ）で処理することによって誘導され、このＣＤの活性化は、ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子α）での処理もまた必要とする。
【０００３】
腫瘍細胞は、抗原性であり、かつリンパ球によって特異的に認識されるその表面で抗原を発現することが、公知である。これらの抗原は、クラスＩ  ＣＭＨ分子上に負荷されたペプチドである：特定のＣＤ８−  Ｔリンパ球は、このＣＭＨ−ペプチド複合体を認識する。腫瘍抗原を示すようにエキソビボ改変されたＣＤは、マウスにおいて確立された腫瘍を予防および／または根絶する特異的免疫を誘導したことが、示されている（Ｓｃｈｕｌｅｒ  Ｐ．，Ｓｔｅｉｎｍａｎ  ＲＭ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９７，８，１１８３〜７およびＡｎｇｅｖｉｎ，Ａｎｄｒｅ，Ｚｉｔｖｏｇｅｌ，Ｂｕｌｌ  Ｃａｎｃｅｒ，２０００，８７（１），１０７〜１５）。従って、ＣＤは、治療免疫応答を誘導するための強力なアジュバントであると、考えられている。
【０００４】
現時点で、従って細胞治療は、臨床使用のためのヒトＣＤのエキソビボ生成のための方法に関する。
【０００５】
特に乳癌の場合、患者から単球を取り出し、そしてその単球を、サイトカインと提示されるべき抗原との組み合わせの存在下で培養することが、既に提唱されている。樹状突起生成によって得られる樹状細胞は、その抗原に特異的な細胞毒性Ｔリンパ球を発生するために患者中に再注入された（Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ＦｏｎｇおよびＥｄｇａｒ  Ｇ．Ｅｎｇｌｅｍａｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０００，１８，２４５〜２７３）。
【０００６】
ちょうど記載されている先行技術は、これらの方法において固有の欠点を示す。具体的には、樹状細胞の感作は、腫瘍抗原に由来するペプチドを使用する。しかし、腫瘍の大部分については、その特異的抗原は、同定されていない。さらに、樹状細胞を感作するために、その腫瘍に特異的な細胞毒性Ｔリンパ球クローンによってその腫瘍細胞において同定されたペプチドの使用が、一般的になされる。しかし、腫瘍細胞によって提示されるエピトープおよび抗原提示樹状細胞によって提示されるエピトープは、おそらく、同じではない。その上、上記の種々のエキソビボ処置に供された樹状細胞が使用される場合、表現型変化が生じ得、治療用途のために適切ではない不均質細胞集団をもたらす。従って、免疫療法の開発を可能にするために、感作された樹状細胞を得るための方法を改善することが、非常に望ましい。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、全く驚くべきことに、単球から樹状細胞への分化が、ある種類の新規なステロールベースの化合物によってインビボで誘導され得ることが見出されたという、事実に基づく。これまで、非ペプチド化合物の使用は、軸索生成（ｎｅｕｒｉｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）を増強するためにのみ想定された（Ｐｒａｄｉｎｅｓおよび共同研究者，１９９５，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６４，１９５４〜６４）。非ペプチド分子が、単球から樹状細胞への分化を誘導可能であることを当業者に対して示唆するものは、存在しなかった。本発明に従って、そして全く驚くべきことに、あるステロールカテゴリーが、低用量で、樹状突起生成増殖因子効果およびサイトカイン効果を模倣することが、見出された。
【０００８】
本発明の第１の主題は、結果として、上記の効果を提供可能な新規なステロール誘導体である。これらの誘導体は、式（Ｉ）
【０００９】
【化１０】
2005529882.tif 000003
【００１０】
の化合物であり、上記式において、コレステロール骨格の４位にある炭素は、部分Ｔ１およびＴ２を保有し、上記部分Ｔ１およびＴ２は、独立してＨまたはＣＨ３であり得、ＣＨ３は、α位および／またはβ位にあり、２４位にある炭素は、部分Ｔ４を保有し、上記部分Ｔ４は、Ｈ、ＣＨ３、またはＣ２Ｈ５を示し、１４位にある炭素は、部分Ｔ３を保有し、上記部分Ｔ３は、ＨまたはβＣＨ３であり得、炭素５と炭素６との間の結合、および炭素７と炭素８との間の結合のうちの一方は二重結合であり得、他方は、単結合であり、
Ｚは、５位または８位において、ＨまたはＯＨのいずれかを示し、ＯＨは、二重結合を保有しない炭素によってのみ保有され；そして
Ｒは、６位または７位において、二重結合を保有しない炭素上において、式−Ｑ０−Ｑ１の置換基を示し、
上記置換基の式において、
−Ｑ０−は、式（ＩＩ）：
−Ｘ−（ＣＨ２）ｎ０[Ｙ１−（ＣＨ２）ｎ１]ｐ１[Ｙ２−（ＣＨ２）ｎ２]ｐ２[Ｙ３−（ＣＨ２）ｎ３]ｐ３[Ｙ４−（ＣＨ２）ｎ４]ｐ４[Ｙ５−（ＣＨ２）ｎ５]ｐ５−                        （ＩＩ）
のラジカルを示し、
上記式（ＩＩ）において、
ｐ１、ｐ２、ｐ３、ｐ４およびｐ５は、独立して０または１に等しい整数であり、
ｎ０、ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４およびｎ５は、
１≦ｎ０≦４
０≦ｎ１，ｎ２，ｎ３，ｎ４，ｎ５≦４
であるような独立した整数であり、
−Ｘ−は、−Ｓ−、−Ｏ−、−ＣＨ２−または−ＮＲ３−あるいはヘテロ環
【００１１】
【化１１】
2005529882.tif 000004
【００１２】
を示し、Ｒ３は、ＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキルラジカルであり、
−Ｙ１−、−Ｙ２−、−Ｙ３−、−Ｙ４−および−Ｙ５−は、互いに独立して、−Ｓ−、−Ｏ−、−Ｃ−、または−ＮＲ３−を示し、Ｒ３は、上記で与えられる意味を有し、
Ｑ１は、窒素原子を介して結合したインドール核、モルホリン核またはチオモルホリン核、ヘテロ環
【００１３】
【化１２】
2005529882.tif 000005
【００１４】
であって上記ヘテロ環においてＲ１はＨ、ＣＯＣＨ３、Ｃ１〜Ｃ４アルキルラジカルまたは
【００１５】
【化１３】
2005529882.tif 000006
【００１６】
を示し、Ｒ１は、上記で与えられる意味を有し、Ｒ２は、ＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキルラジカルを示し、Ｒ１およびＲ２は一緒になって、必要に応じて、Ｃ１〜Ｃ４ラジカルで置換されたピペリジン環、ピリジン環またはピペラジン環、あるいは窒素原子と４つの炭素原子とを含むピロールヘテロ環またはピロリジンヘテロ環を構成し得、但し、
−Ｘ−＝−ＮＨ−でありかつ
【００１７】
【化１４】
2005529882.tif 000007
【００１８】
である場合、構成要素ｐ１、ｐ２、ｐ３、ｐ４およびｐ５のうちの少なくとも１つは、０以外であり、
−Ｘ−＝−ＣＨ２−であり、ｎ０＝１であり、かつ構成要素ｐ１、ｐ２、ｐ３、ｐ４およびｐ５が０である場合、Ｑ１は、−ＮＨ２以外である。
【００１９】
本発明の主題はまた、式（Ｉ）の化合物を得るためのプロセスであり、このプロセスにおいて、
第１工程において、溶媒Ａ中に溶解しているメタ−クロロペルオキシ安息香酸を、式（ＩＩＩ）
【００２０】
【化１５】
2005529882.tif 000008
【００２１】
に対応する化合物と反応させることであって、上記式（ＩＩＩ）において、コレステロール骨格の４位にある炭素は、部分Ｔ１およびＴ２を保有し、上記部分Ｔ１およびＴ２は、独立してＨまたはＣＨ３であり得、ＣＨ３は、α位および／またはβ位にあり、２４位にある炭素は、部分Ｔ４を保有し、上記部分Ｔ４は、Ｈ、ＣＨ３、またはＣ２Ｈ５を示し、１４位にある炭素は、部分Ｔ３を保有し、上記部分Ｔ３は、ＨまたはβＣＨ３であり得、炭素５と炭素６との間の結合、および炭素７と炭素８との間の結合のうちの一方は二重結合であり得、他方は、単結合であり、式ＩＩＩの化合物は、溶媒Ａと混和性である溶媒Ｂ中に溶解している、こと、
第２工程において、アクチベーターＤの存在下で溶媒Ｃ中に溶解している第１工程において得られるエポキシ化合物を、上記溶媒Ｃと混和性である溶媒Ｅ中に溶解している式Ｑ０Ｑ１のアミンと反応させることであって、Ｑ０およびＱ１は、請求項１において与えられる意味を有すること、
を包含する。
【００２２】
式（Ｉ）の好ましい化合物のうちで、
コレスタン−３β，５α−ジオール−６β−Ｎ−[１−Ｎ１−（３−アミノプロピル）ブタン−１，４−ジアミン]；
コレスタン−３β，５α−ジオール−６β−Ｎ−[Ｎ，Ｎ’−ビス（３−アミノプロピル）ブタン−１，４−ジアミン]；
コレスト−７−エン−３β，５α−ジオール−６β−Ｎ−[１−Ｎ１−（３−アミノプロピル）ブタン−１，４−ジアミン]；
コレスト−７−エン−３β，５α−ジオール−６β−Ｎ−[Ｎ，Ｎ’−ビス（３−アミノプロピル）ブタン−１，４−ジアミン]；
コレスト−７−エン−３β，５α−ジオール−６β−Ｎ−[２−エチルアミノ（３Ｈ−イミダゾール−４−イル）]；
コレスタン−３β，５α−ジオール−６β−Ｎ−［２−エチルアミノ（３Ｈ−イミダゾール−４−イル）］；
コレスト−７−エン−３β，５α−ジオール−６β−Ｎ−（４−アミノブチルアミン）；
コレスト−７−エン−３β，５α−ジオール−６β−Ｎ−｛２−［２−（２−アミノエトキシ）−エトキシ］エチルアミン｝；
コレスタン−３β，５α−ジオール−６β−Ｎ−［４−（２−アミノエチル）イミダゾール−１−イル］；
コレスタン−３β，５α−ジオール−６β−Ｎ−（｛１Ｈ−イミダゾール−４−イル｝エチル）−アセトアミド
の言及が、なされるべきである。
【００２３】
ナノモル濃度での式（Ｉ）の化合物は、先行技術によると一般的に樹状突起生成に関係している種々の腫瘍細胞株において、および不死化細胞株（例えば、ＮＩＨ−３Ｔ３またはＣＯＳ−７）において、分泌小胞の生成を誘導することが、特に見出された。
【００２４】
従って、本発明の主題はまた、医薬であり、この医薬は、薬学的に受容可能なビヒクル中に、式（Ｉ）の少なくとも１種の化合物を含むことを特徴とする。
【００２５】
第１の変化形において、上記で規定される医薬は、生きている哺乳動物細胞の樹状突起生成を増加するために使用される。この医薬は、神経細胞またはその前駆体における軸索生成を誘発するため、およびヒト神経変性疾患と闘うために、使用され得る。
【００２６】
別の変化形において、上記で規定される医薬は、生きている生物の免疫系を活性化するために使用される。
【００２７】
第３の変化形において、上記で規定される医薬は、生きている生物の腫瘍細胞における分泌小胞の生成のため、特に哺乳動物における癌腫瘍の後退のために、使用される。
【００２８】
本発明に従う医薬は、注入によって有利に投与され得る。そのような場合、その医薬は、処置される生きている生物１ｇ当たり８．５ｎｇ〜処置される生きている生物１ｇ当たり１．７μｇの範囲の用量で使用され得る。腫瘍の処置の場合、その注入は、好ましくは、処置されるべき腫瘍の近くで実施される。
【００２９】
本発明の驚くべき性質は、式（Ｉ）により規定される化合物と同様の式を有する化合物が、以前に記載されており、本発明に従う式（Ｉ）の化合物について見出される活性とは全く異なる活性を記述するに過ぎなかったという事実から特に生じる。フランス国特許第２  ０４７  ８８０号において、記載される化合物は、低コレステロール血症活性を有することが示される。文献「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９７）、２７（１１），１９５１〜１９６２」において、記載される化合物は、抗生物質活性を有することが示される。文献「Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ−Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ（１９９５），４５（２），１９０〜４」および文献「Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９９）、１９（２Ａ），１２２９〜１２３４」において、記載される化合物は、細胞傷害活性を有することが示される。結果として、式（Ｉ）の化合物は、種々の腫瘍細胞株において樹状突起生成、軸索生成および／または分泌小胞の生成を誘導し得ることを、当業者は、先行技術から全く予測できなかった。
【００３０】
小胞生成の誘導は、種々の腫瘍細胞株において、特に、Ａ５４９細胞、Ｕ９３７細胞、ＭＣＦ−７細胞、ＨＴ２９細胞、ＰＣ１２細胞、およびＢ１６細胞において、観察された。樹状突起生成および軸索生成は、Ｕ９３７腫瘍細胞およびＰ１９腫瘍細胞において観察され、そしてまた、Ｂ１６細胞およびＰＣ１２細胞において観察された。
【００３１】
本発明に従う化合物の調製のいくつかの例は、本明細書下記に与えられる。例として与えられる種々の化合物の調製のために使用される一般的プロセスに関する詳細が、まず、提供される。このプロセスは、２つの工程で実施される。第１工程は、エポキシ−ステロールを得ることからなり、第２工程は、そのエポキシ−ステロールをアミノステロールへと変換することからなる。実施例１および２は、各々、異なる２つの５，６−α−エポキシ−ステロールシリーズを得るための第１工程を記載する。実施例３は、実施例１および２の中間体生成物を使用して、それらの中間体をアミンと反応させる第２工程を記載する。実施例４〜２７は、種々のアミンを用いて実施例３に従って得られる生成物を記載する。実施例２８および２９は、各々、２つの異なる別の５，６−α−エポキシステロールシリーズを得るための第１工程を記載する。実施例３０〜４７は、実施例２８〜２９の中間体生成物を使用して、それらの中間体をアミンと反応させる第２工程を記載する。
【実施例】
【００３２】
（実施例１：５，６−α−エポキシコレスタン−３β−オールの調製）
メタ−クロロペルオキシ安息香酸（０．７３ｇ、４．２５ｍｍｏｌ、純度７０〜７５重量％）を、塩化メチレン（１０ｍｌ）中に溶解し、塩化メチレン（２５ｍｌ）中に溶解したコレステロール混合物（１ｇ、２．５ｍｍｏｌ）の混合物に、滴下する。一晩攪拌し続ける。その反応混合物を、亜硫酸ナトリウム水溶液（１０重量％）および炭酸水素ナトリウム（５重量％）、ならびに塩化ナトリウムと塩化カリウムとの混合物の飽和溶液で洗浄する。その有機相を、無水硫酸マグネシウムで乾燥する。その有機溶媒を真空下でエバポレーションすると、０．７ｇの白色針状晶（６９．５％収量）を生じる。このエポキシドのα異性体およびβ異性体の生成は、２００ＭＨｚでのプロトンＮＭＲによって決定された：７８％  αエポキシドおよび２２％  βエポキシドが、見出された（プロトン１Ｈ  ＮＭＲ：δ  ２．８９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．３７Ｈｚ，Ｈ−６）；３．０４（ｄ，Ｊ＝２．４３Ｈｚ，Ｈ−６）；３．９１（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３）；ＭＳ  ＤＣＩ／ＮＨ３  ＭＨ’４０３。このα異性体およびβ異性体を、シリカゲル上での液体クロマトグラフィー（８５／１５  トルエン／エチルエーテル）によって分離した。このα異性体は、融点ｍ．ｐ．＝１４１〜１４２℃を有する。このβ異性体は、融点ｍ．ｐ．＝１３１〜１３２℃を有する。この特徴付けを完了するために、薄層クロマトグラフィーを実施した（酢酸エチル）；以下が得られた：Ｒｆ＝０．６９（硫酸／メタノール混合物を用いた展開後に褐色）。
【００３３】
（実施例２：５，６−α−エポキシコレスト−７−エン−３β−オールの調製）
７−デヒドロコレステロール（Ａｃｒｏｓ，１ｇ，２．６ｍｍｏｌ）および炭酸ナトリウム（０．５５ｇ，５．２ｍｍｏｌ）を、塩化メチレン（２５ｍｌ）と水（２５ｍｌ）との混合物中に溶解する。メタ−クロロペルオキシ安息香酸（０．７３ｇ，４．２５ｍｍｏｌ，純度７０〜７５重量％）を、塩化メチレン（１０ｍｌ）中に溶解し、この混合物に滴下し、激しい攪拌を維持した。１０分間攪拌した後、その相を回収し、その後、亜硫酸ナトリウム水溶液（１０重量％）、炭酸ナトリウム水溶液（５重量％）、および塩化ナトリウムと塩化カリウムとの混合物の飽和水溶液からなる水溶液で、洗浄する。その有機相を、無水硫酸マグネシウムで乾燥する。その溶媒のエバポレーションおよびアセトンからのその生成物の再結晶化によって、０．７ｇの白色針状晶（７０％収量）を得る。その構造を、プロトンＮＭＲによって確認した：δ  ０．５２（ｓ，３Ｈ，Ｈ−１９）；２．９８６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１Ｈｚ，Ｈ−６）；３．９１（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３）；ＭＳ  ＤＣＩ／ＮＨ３  ＭＨ＋  ４０１。その融点を決定した：ｍ．ｐ．＝１４４〜１４６℃。
【００３４】
（実施例３：上記エポキシ−ステロールからのアミノステロールの合成）
過塩素酸リチウム（０．７５ｍｍｏｌ）および塩基性形態のアミン（１ｍｍｏｌ）を、無水エタノール（１ｍｌ）中に溶解し、実施例１および２のいずれかに従って得られるエポキシ−ステロール（１００ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）のエタノール性溶液（３ｍｌ）に、アルゴン流下で添加する。その反応混合物を、実施例１の場合は還流下での攪拌を６日間維持し、実施例２の場合には、光の非存在下かつ室温にて３日間維持する。その反応の進行を、種々のアミンに適合された条件下で、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によってモニターする。その溶媒をエバポレーションによって除去し、その残渣を、エチルエーテル（５×３ｍｌ）およびヘキサン（５×２０ｍｌ）で洗浄する。その残渣を、水中に溶解し、そして２Ｍ  ＨＣｌ（２ｍｌ）で酸性化する。その溶液を、グラフト化シリカカートリッジ（ｓｅｐ−ｐａｋカートリッジＲＰ  Ｃ１８，５００ｍｇ，Ｗａｔｅｒｓ）にて予備精製し、過剰のポリアミンを、そのカートリッジに水（５ｍｌ）を押し通すことによって除去する。その生成物を、１／１  ＣＨ２ＣＮ／Ｈ２Ｏ混合物（５ｍｌ）で溶出させる。その生成物を、出発混合物Ｈ２Ｏ  ９５／ＣＨ３ＣＮ  ５／ＴＦＡ  ０．１％から６０分間（流量＝１ｍｌ／分；λ＝２１０ｎｍ）で混合物ＣＨ３ＣＮ  ９５／Ｈ２Ｏ  ５／ＴＦＡ  ０．１までに達する直線勾配によって、逆相ＨＰＬＣによって精製する。目的の画分を、混合物（ＣＨ３ＣＮ  ９５／Ｈ２Ｏ  ５／ＴＦＡ  ０．１）４４％／（Ｈ２Ｏ  ９５／ＣＨ３ＣＮ  ５／ＴＦＡ  ０．１％）５６％（流量＝１ｍｌ／分；λ＝２１０ｎｍ）から構成される移動相を使用して、イソクラティック（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）条件下で再精製した。
【００３５】
（実施例４：コレスタン−３β，５α−ジオール−６β−Ｎ−［１−Ｎ１−（３−アミノプロピル）ブタン−１，４−ジアミン］の調製）
実施例３において、Ｎ１−（３−アミノプロピル）ブタン−１，４−ジアミンを、アミンとして使用する。
【００３６】
得られる生成物を、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）（６／３／１  イソプロピルアルコール／２８％水性アンモニア／Ｈ２Ｏ）によって具体的に特徴付ける：Ｒｆ＝０．６２。
【００３７】
質量分析法もまた、実施した（エレクトロスプレー）：ＭＨ＋：５４８。
【００３８】
（実施例５：コレスタン−３β，５α−ジオール−６β−Ｎ−［Ｎ，Ｎ’−ビス（３−アミノプロピル）ブタン−１，４−ジアミン］の調製）
実施例３において、Ｎ，Ｎ’−ビス（３−アミノプロピル）ブタン−１，４−ジアミンを、アミンとして使用する。
【００３９】
得られる生成物を、ＴＬＣ（６／３／１  イソプロピルアルコール／２８％水性アンモニア／Ｈ２Ｏ）によって具体的に特徴付ける：Ｒｆ＝０．３７。
【００４０】
質量分析法もまた、実施した（エレクトロスプレー）：ＭＨ＋：６０５．５。
【００４１】
（実施例６：コレスト−７−エン−３β，５α−ジオール−６β−Ｎ−［１−Ｎ１−（３−アミノプロピル）ブタン−１，４−ジアミン］の調製）
実施例３において、Ｎ１−（３−アミノプロピル）ブタン−１，４−ジアミンを、アミンとして使用する。
【００４２】
得られる生成物を、ＴＬＣ（６／３／１  イソプロピルアルコール／２８％水性アンモニア／Ｈ２Ｏ）によって具体的に特徴付ける：Ｒｆ＝０．６２。
【００４３】
質量分析法もまた、実施した（エレクトロスプレー）：ＭＨ＋：５４６。
【００４４】
（実施例７：コレスト−７−エン−３β，５α−ジオール−６β−Ｎ−［Ｎ，Ｎ’−ビス（３−アミノプロピル）ブタン−１，４−ジアミン］の調製）
実施例３において、Ｎ，Ｎ’−ビス（３−アミノプロピル）ブタン−１，４−ジアミンを、アミンとして使用する。
【００４５】
得られる生成物を、ＴＬＣ（６／３／１  イソプロピルアルコール／２８％水性アンモニア／Ｈ２Ｏ）によって具体的に特徴付ける：Ｒｆ＝０．３７。
【００４６】
質量分析法もまた、実施した（エレクトロスプレー）：ＭＨ＋：６０３．５。
【００４７】
（実施例８：コレスト−７−エン−３β，５α−ジオール−６β−Ｎ−［２−エチルアミノ（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）］の調製）
実施例３において、２−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）エチルアミンを、アミンとして使用する。
【００４８】
得られる生成物を、ＴＬＣ（ＭｅＯＨ）によって具体的に特徴付ける：Ｒｆ＝０．３８。
【００４９】
質量分析法もまた、実施した（エレクトロスプレー）：ＭＨ＋：５１２．５；ｍ／ｚ：３６５．３。
【００５０】
（実施例９：コレスタン−３β，５α−ジオール−６β−Ｎ−［２−エチルアミノ（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）］の調製）
実施例３において、２−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）エチルアミンを、アミンとして使用する。
【００５１】
得られる生成物を、ＴＬＣ（ＭｅＯＨ）によって具体的に特徴付ける：Ｒｆ＝０．３８。
【００５２】
「Ｂｉｓｈｏｆｆ」社により製造された、「Ｕｌｔｒａｓｅｐ  ＥＳ１００ＲＰ１８」カラム（６μｍ粒子、長さ２５０ｍｍ、直径８ｍｍ）を装備したＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ２００  装置を使用して、高速クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）もまた実施した。
【００５３】
ＨＰＬＣプロフィール：４４％Ｂ  λ＝２２０ｎｍ  室温  ＝  ４４〜５０分
最後に、質量分析法を実施した（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ：５１４．５（ＭＨ＋）。
【００５４】
（実施例１０：コレスト−７−エン−３β，５α−ジオール−６β−Ｎ−（４−アミノブチルアミン）の調製）
実施例３において、４−アミノブチルアミンを、アミンとして使用する。
【００５５】
得られる生成物を、ＴＬＣ（８／２  ＭｅＯＨ／２８％水性アンモニア）によって具体的に特徴付ける：Ｒｆ＝０．５５。
【００５６】
質量分析法もまた、実施した（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ：４８９（ＭＨ＋）。
【００５７】
（実施例１１：コレスト−７−エン−３β，５α−ジオール−６β−Ｎ−｛２−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］エチルアミン｝の調製）
実施例３において、２−｛２−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］エトキシ｝−エチルアミンを、アミンとして使用する。
【００５８】
得られる生成物を、ＴＬＣ（８／２  ＭｅＯＨ／２８％水性アンモニア）によって具体的に特徴付ける：Ｒｆ＝０．８。
【００５９】
質量分析法もまた、実施した（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ：５４９（ＭＨ＋）。
【００６０】
（実施例１２：コレスタン−３β，５α−ジオール−６β−Ｎ−［４−（２−アミノエチル）イミダゾール−１−イル］の調製）
実施例３において、２−（３Ｈ−イミダゾール−４−イル）エチルアミンを、アミンとして使用する。
【００６１】
得られる生成物を、ＴＬＣ（８／２  ＭｅＯＨ／２８％水性アンモニア）によって具体的に特徴付ける：Ｒｆ＝０．７２。
【００６２】
「Ｂｉｓｈｏｆｆ」社により製造された、「Ｕｌｔｒａｓｅｐ  ＥＳ１００ＲＰ１８」カラム（６μｍ粒子、長さ２５０ｍｍ、直径８ｍｍ）を装備したＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ２００  装置を使用して、ＨＰＬＣもまた実施した。
【００６３】
ＨＰＬＣプロフィール：４４％Ｂ  λ＝２２０ｎｍ  室温  ＝  ４４〜５０分
最後に、質量分析法を実施した（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ：５１４．５（ＭＨ＋）。
【００６４】
（実施例１３：コレスタン−３β，５α−ジオール−６β−Ｎ−（｛１Ｈ−イミダゾール−４−イル｝エチル）アセトアミドの調製）
実施例３において、Ｎ−［２−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）エチル］アセトアミドを、アミンとして使用する。
【００６５】
得られる生成物を、ＴＬＣ（１／１  ＭｅＯＨ／酢酸エチル）によって具体的に特徴付ける：Ｒｆ＝０．５。
【００６６】
「Ｂｉｓｈｏｆｆ」社により製造された、「Ｕｌｔｒａｓｅｐ  ＥＳ１００ＲＰ１８」カラム（６μｍ粒子、長さ２５０ｍｍ、直径８ｍｍ）を装備したＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ２００  装置を使用して、ＨＰＬＣもまた実施した。
【００６７】
ＨＰＬＣプロフィール：４４％Ｂ  λ＝２２０ｎｍ  室温  ＝  ４４〜５０分
最後に、質量分析法を実施した（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ：５５７（ＭＨ＋）。
【００６８】
（実施例１４：コレスタン−３β，５α−ジオール−６β−（３−アミノプロピルアミン）の調製）
実施例３において、１，３−ジアミノプロパンを、アミンとして使用する。
【００６９】
得られる生成物を、ＴＬＣ（８／２  ＭｅＯＨ／２８％水性アンモニア）によって具体的に特徴付ける：Ｒｆ＝０．５０。
【００７０】
質量分析法もまた、実施した（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ：４４７（ＭＨ＋）。
【００７１】
（実施例１５：コレスタン−３β，５α−ジオール−６β−（３−アミノプロピルアセトアミド）の調製）
実施例３において、Ｎ−（３−アミノプロピル）アセトアミンを、アミンとして使用する。
【００７２】
得られる生成物を、ＴＬＣ（８／２  ＭｅＯＨ／酢酸エチル）によって具体的に特徴付ける：Ｒｆ＝０．５４。
【００７３】
質量分析法もまた、実施した（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ：５１９（ＭＨ＋）。
【００７４】
（実施例１６：コレスタン−３β，５α−ジオール−６β−（４−アミノブチルアミン）の調製）
実施例３において、１，４−ジアミノブタンを、アミンとして使用する。
【００７５】
得られる生成物を、ＴＬＣ（８／２  ＭｅＯＨ／２８％水性アンモニア）によって具体的に特徴付ける：Ｒｆ＝０．５１。
【００７６】
質量分析法もまた、実施した（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ：４９１（ＭＨ＋）。
【００７７】
（実施例１７：コレスタン−３β，５α−ジオール−６β−（４−アミノブチルイル−１−アセトアミド）の調製）
実施例３において、Ｎ−（４−アミノブチル）アセトアミドを、アミンとして使用する。
【００７８】
得られる生成物を、ＴＬＣ（８／２  ＭｅＯＨ／酢酸エチル）によって具体的に特徴付ける：Ｒｆ＝０．５６。
【００７９】
質量分析法もまた、実施した（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ：５３３（ＭＨ＋）。
【００８０】
（実施例１８：コレスタン−３β，５α−ジオール−６β−（６−アミノヘキシルアミン）の調製）
実施例３において、１，６−ジアミノヘキサンを、アミンとして使用する。
【００８１】
得られる生成物を、ＴＬＣ（８／２  ＭｅＯＨ／２８％水性アンモニア）によって具体的に特徴付ける：Ｒｆ＝０．５２。
【００８２】
質量分析法もまた、実施した（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ：５１９（ＭＨ＋）。
【００８３】
（実施例１９：コレスタン−３β，５α−ジオール−６β−（６−アミノヘキシルアセトアミド）の調製）
実施例３において、Ｎ−（６−アミノヘキシル）アセトアミドを、アミンとして使用する。
【００８４】
得られる生成物を、ＴＬＣ（８／２  ＭｅＯＨ／酢酸エチル：２８％）によって具体的に特徴付ける：Ｒｆ＝０．５７。
【００８５】
質量分析法もまた、実施した（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ：５６１（ＭＨ＋）。
【００８６】
（実施例２０：コレステン−７−３β，５α−ジオール−６β−（３−アミノプロピルアミン）の調製）
実施例３において、１，３−ジアミノプロパンを、アミンとして使用する。
【００８７】
得られる生成物を、ＴＬＣ（８／２  ＭｅＯＨ／２８％水性アンモニア）によって具体的に特徴付ける：Ｒｆ＝０．５０。
【００８８】
質量分析法もまた、実施した（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ：４７５（ＭＨ＋）。
【００８９】
（実施例２１：コレステン−７−３β，５α−ジオール−６β−（３−アミノプロピルアセトアミド）の調製）
実施例３において、Ｎ−（３−アミノプロピル）アセトアミドを、アミンとして使用する。
【００９０】
得られる生成物を、ＴＬＣ（８／２  ＭｅＯＨ／酢酸エチル：２８％）によって具体的に特徴付ける：Ｒｆ＝０．５４。
【００９１】
質量分析法もまた、実施した（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ：５１７（ＭＨ＋）。
【００９２】
（実施例２２：コレスト−７−エン−３β，５α−ジオール−６β−（４−アミノブチルイル−１−アセトアミド）の調製）
実施例３において、Ｎ−（４−アミノブチル）アセトアミドを、アミンとして使用する。
【００９３】
得られる生成物を、ＴＬＣ（８／２  ＭｅＯＨ／酢酸エチルより特徴付ける：Ｒｆ＝０．５６。
【００９４】
質量分析法もまた、実施した（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ：５３１（ＭＨ＋）。
【００９５】
（実施例２３：コレステン−７−３β，５α−ジオール−６β−（６−アミノヘキシルアミン）の調製）
実施例３において、１，６−ジアミノヘキサンを、アミンとして使用する。
【００９６】
得られる生成物を、ＴＬＣ（８／２  ＭｅＯＨ／２８％水性アンモニア）によって具体的に特徴付ける：Ｒｆ＝０．５１。
【００９７】
質量分析法もまた、実施した（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ：５１７（ＭＨ＋）。
【００９８】
（実施例２４：コレステン−７−３β，５α−ジオール−６β−（６−アミノヘキシルアセトアミド）の調製）
実施例３において、Ｎ−（６−アミノヘキシル）アセトアミドを、アミンとして使用する。
【００９９】
得られる生成物を、ＴＬＣ（８／２  ＭｅＯＨ／酢酸エチル）によって具体的に特徴付ける：Ｒｆ＝０．５７。
【０１００】
質量分析法もまた、実施した（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ：５５９（ＭＨ＋）。
【０１０１】
（実施例２５：コレスタン−３β，５α−ジオール−６β−｛［２−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）エチル］メチルアミン｝の調製）
実施例３において、［２−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）エチル］メチルアミンを、アミンとして使用する。
【０１０２】
得られる生成物を、ＴＬＣ（８／２  ＭｅＯＨ／２８％水性アンモニア）によって具体的に特徴付ける：Ｒｆ＝０．５１。
【０１０３】
質量分析法もまた、実施した（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ：５２８（ＭＨ＋）。
【０１０４】
（実施例２６：コレスト−７−エン−３β，５α−ジオール−６β−｛［２−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）エチル］メチルアミン｝の調製）
実施例３において、［２−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）エチル］メチルアミンを、アミンとして使用する。
【０１０５】
得られる生成物を、ＴＬＣ（８／２  ＭｅＯＨ／２８％水性アンモニア）によって具体的に特徴付ける：Ｒｆ＝０．５１。
【０１０６】
質量分析法もまた、実施した（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ：５２６（ＭＨ＋）。
【０１０７】
（実施例２７：コレスト−７−エン−３β，５α−ジオール−６β−｛［２−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）エチル］メチルアミン｝の調製）
実施例３において、［２−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）エチル］メチルアミンを、アミンとして使用する。
【０１０８】
得られる生成物を、ＴＬＣ（８／２  ＭｅＯＨ／２８％水性アンモニア）によって具体的に特徴付ける：Ｒｆ＝０．５１。
【０１０９】
質量分析法もまた、実施した（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ：５２６（ＭＨ＋）。
【０１１０】
（実施例２８：５，６−α−エポキシ−β−シトスタン−３β−オールの調製）
実施例１において、β−シトステロールをステロールとして使用する。
【０１１１】
得られる生成物を、ＴＬＣ（酢酸エチル）によって具体的に特徴付ける：Ｒｆ＝０．６９。
【０１１２】
元素分析：理論値：Ｃ＝８０．８７；Ｈ＝１１．７０；Ｏ＝７．４３  実測値：Ｃ＝８０．８８；Ｈ＝１１．６９；Ｏ＝７．４２。
【０１１３】
質量分析：ＤＣＩ／ＮＨ３  ＭＨ＋  ４３２。
【０１１４】
（実施例２９：５，６−α−エポキシカンペスタン−３β−オールの調製）
実施例１において、カンペステロールをステロールとして使用する。
【０１１５】
得られる生成物を、ＴＬＣ（酢酸エチル）によって具体的に特徴付ける：Ｒｆ＝０．６９。
【０１１６】
元素分析：理論値：Ｃ＝８０．７１；Ｈ＝１１．６１；Ｏ＝７．６８  実測値：Ｃ＝８０．６６；Ｈ＝１１．６３；Ｏ＝７．７２。
【０１１７】
質量分析：ＤＣＩ／ＮＨ３  ＭＨ＋  ４１８。
【０１１８】
（実施例３０：シトスタン−３β，５α−ジオール−６β−（３−アミノプロピルアミン）の調製）
実施例３において、１，３−ジアミノプロパンをアミンとして、そして実施例２８のエポキシドをエポキシドとして使用する。
【０１１９】
得られる生成物を、ＴＬＣ（８／２  ＭｅＯＨ／２８％水性アンモニア）によって具体的に特徴付ける：Ｒｆ＝０．５０。
【０１２０】
質量分析法もまた、実施した（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ：５０５（ＭＨ＋）。
【０１２１】
（実施例３１：シトスタン−３β，５α−ジオール−６β−（３−アミノプロピルアセトアミド）の調製）
実施例３において、Ｎ−（３−アミノプロピル）−アセトアミドをアミンとして、そして実施例２８のエポキシドをエポキシドとして使用する。
【０１２２】
得られる生成物を、ＴＬＣ（８／２  ＭｅＯＨ／酢酸エチル）によって具体的に特徴付ける：Ｒｆ＝０．５４。
【０１２３】
質量分析法もまた、実施した（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ：５４７（ＭＨ＋）。
【０１２４】
（実施例３２：シトスタン−３β，５α−ジオール−６β−（４−アミノブチルアミン）の調製）
実施例３において、１，４−ジアミノブタンをアミンとして、そして実施例２８のエポキシドをエポキシドとして使用する。
【０１２５】
得られる生成物を、ＴＬＣ（８／２  ＭｅＯＨ／２８％水性アンモニア）によって具体的に特徴付ける：Ｒｆ＝０．５１。
【０１２６】
質量分析法もまた、実施した（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ：５１９（ＭＨ＋）。
【０１２７】
（実施例３３：コレスタン−３β，５α−ジオール−６β−（４−アミノブチル−１−アセトアミド）の調製）
実施例３において、Ｎ−（４−アミノブチル）アセトアミドをアミンとして、そして実施例２９のエポキシドをエポキシドとして使用する。
【０１２８】
得られる生成物を、ＴＬＣ（８／２  ＭｅＯＨ／酢酸エチル）によって具体的に特徴付ける：Ｒｆ＝０．５６。
【０１２９】
質量分析法もまた、実施した（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ：５６１（ＭＨ＋）。
【０１３０】
（実施例３４：カンペスタン−３β，５α−ジオール−６β−（３−アミノプロピルアミン）の調製）
実施例３において、１，３−ジアミノプロパンをアミンとして、そして実施例２９のエポキシドをエポキシドとして使用する。
【０１３１】
得られる生成物を、ＴＬＣ（８／２  ＭｅＯＨ／２８％水性アンモニア）によって具体的に特徴付ける：Ｒｆ＝０．５０。
【０１３２】
質量分析法もまた、実施した（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ：４９１（ＭＨ＋）。
【０１３３】
（実施例３５：カンペスタン−３β，５α−ジオール−６β−（３−アミノプロピルアセトアミド）の調製）
実施例３において、Ｎ−（３−アミノプロピル）アセトアミドをアミンとして、そして実施例２９のエポキシドをエポキシドとして使用する。
【０１３４】
得られる生成物を、ＴＬＣ（８／２  ＭｅＯＨ／酢酸エチル）によって具体的に特徴付ける：Ｒｆ＝０．５４。
【０１３５】
質量分析法もまた、実施した（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ：５３３（ＭＨ＋）。
【０１３６】
（実施例３６：カンペスタン−３β，５α−ジオール−６β−（４−アミノブチルアミン）の調製）
実施例３において、１，４−ジアミノブタンをアミンとして、そして実施例２９のエポキシドをエポキシドとして使用する。
【０１３７】
得られる生成物を、ＴＬＣ（８／２  ＭｅＯＨ／２８％水性アンモニア）によって具体的に特徴付ける：Ｒｆ＝０．５１。
【０１３８】
質量分析法もまた、実施した（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ：５０５（ＭＨ＋）。
【０１３９】
（実施例３７：カンペスタン−３β，５α−ジオール−６β−（４−アミノブチル−１−アセトアミド）の調製）
実施例３において、Ｎ−（４−アミノブチル）アセトアミドをアミンとして、そして実施例２９のエポキシドをエポキシドとして使用する。
【０１４０】
得られる生成物を、ＴＬＣ（８／２  ＭｅＯＨ／酢酸エチル）によって具体的に特徴付ける：Ｒｆ＝０．５６。
【０１４１】
質量分析法もまた、実施した（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ：５４７（ＭＨ＋）。
【０１４２】
（実施例３８：シトスタン−３β，５α−ジオール−６β−（６−アミノヘキシルアミン）の調製）
実施例３において、１，６−ジアミノヘキサンをアミンとして、そして実施例２８のエポキシドをエポキシドとして使用する。
【０１４３】
得られる生成物を、ＴＬＣ（８／２  ＭｅＯＨ／２８％水性アンモニア）によって具体的に特徴付ける：Ｒｆ＝０．５３。
【０１４４】
質量分析法もまた、実施した（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ：５４７（ＭＨ＋）。
【０１４５】
（実施例３９：シトスタン−３β，５α−ジオール−６β−（６−アミノヘキシルアセトアミド）の調製）
実施例３において、Ｎ−（６−アミノヘキシル）アセトアミドをアミンとして、そして実施例２８のエポキシドをエポキシドとして使用する。
【０１４６】
得られる生成物を、ＴＬＣ（８／２  ＭｅＯＨ／酢酸エチル）によって具体的に特徴付ける：Ｒｆ＝０．５８。
【０１４７】
質量分析法もまた、実施した（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ：５８９（ＭＨ＋）。
【０１４８】
（実施例４０：カンペスタン−３β，５α−ジオール−６β−（６−アミノヘキシルアミン）の調製）
実施例３において、１，６−ジアミノヘキサンをアミンとして、そして実施例２９のエポキシドをエポキシドとして使用する。
【０１４９】
得られる生成物を、ＴＬＣ（８／２  ＭｅＯＨ／２８％水性アンモニア）によって具体的に特徴付ける：Ｒｆ＝０．５２。
【０１５０】
質量分析法もまた、実施した（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ：５０５（ＭＨ＋）。
【０１５１】
（実施例４１：カンペスタン−３β，５α−ジオール−６β−（６−アミノヘキシルアセトアミド）の調製）
実施例３において、Ｎ−（６−アミノヘキシル）アセトアミドをアミンとして、そして実施例２９のエポキシドをエポキシドとして使用する。
【０１５２】
得られる生成物を、ＴＬＣ（８／２  ＭｅＯＨ／酢酸エチル）によって具体的に特徴付ける：Ｒｆ＝０．５７。
【０１５３】
質量分析法もまた、実施した（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ：５４７（ＭＨ＋）。
【０１５４】
（実施例４２：シトスタン−３β，５α−ジオール−６β−Ｎ−［Ｎ，Ｎ’−ビス（アミノプロピル）ブタン−１，４−ジアミン］の調製）
実施例３において、Ｎ，Ｎ’−ビス（３−アミノプロピル）ブタン−１，４−ジアミンをアミンとして、そして実施例２８のエポキシドをエポキシドとして使用する。
【０１５５】
得られる生成物を、ＴＬＣ（６／３／１  イソプロピルアルコール／２８％水性アンモニア／Ｈ２Ｏ）によって具体的に特徴付ける：Ｒｆ＝０．３９。
【０１５６】
質量分析法もまた、実施した（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ：６３３．５（ＭＨ＋）。
【０１５７】
（実施例４３：カンペスタン−３β，５α−ジオール−６β−Ｎ−［Ｎ，Ｎ’−ビス（アミノプロピル）ブタン−１，４−ジアミン］の調製）
実施例３において、Ｎ，Ｎ’−ビス（３−アミノプロピル）ブタン−１，４−ジアミンをアミンとして、そして実施例２９のエポキシドをエポキシドとして使用する。
【０１５８】
得られる生成物を、ＴＬＣ（６／３／１  イソプロピルアルコール／２８％水性アンモニア／Ｈ２Ｏ）によって具体的に特徴付ける：Ｒｆ＝０．３８。
【０１５９】
質量分析法もまた、実施した（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ：６１９．５（ＭＨ＋）。
【０１６０】
（実施例４４：シトスタン−３β，５α−ジオール−６β−Ｎ−［１−Ｎ１−（３−アミノプロピル）ブタン−１，４−ジアミン］の調製）
実施例３において、Ｎ１−（３−アミノプロピル）ブタン−１，４−ジアミンをアミンとして、そして実施例２８のエポキシドをエポキシドとして使用する。
【０１６１】
得られる生成物を、ＴＬＣ（６／３／１  イソプロピルアルコール／２８％水性アンモニア／Ｈ２Ｏ）によって具体的に特徴付ける：Ｒｆ＝０．６２。
【０１６２】
質量分析法もまた、実施した（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ：５７６（ＭＨ＋）。
【０１６３】
（実施例４５：カンペスタン−３β，５α−ジオール−６β−Ｎ−［１−Ｎ１−（３−アミノプロピル）ブタン−１，４−ジアミン］の調製）
実施例３において、Ｎ１−（３−アミノプロピル）ブタン−１，４−ジアミンをアミンとして、そして実施例２９のエポキシドをエポキシドとして使用する。
【０１６４】
得られる生成物を、ＴＬＣ（６／３／１  イソプロピルアルコール／２８％水性アンモニア／Ｈ２Ｏ）によって具体的に特徴付ける：Ｒｆ＝０．６２。
【０１６５】
質量分析法もまた、実施した（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ：５６２（ＭＨ＋）。
【０１６６】
（実施例４６：シトスタン−３β，５α−ジオール−６β−Ｎ−｛［２−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）エチル］エチルアミン｝の調製）
実施例３において、［２−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）エチル］エチルアミンをアミンとして、そして実施例２８のエポキシドをエポキシドとして使用する。
【０１６７】
得られる生成物を、ＴＬＣ（ＭｅＯＨ）によって具体的に特徴付ける：Ｒｆ＝０．３９。
【０１６８】
質量分析法もまた、実施した（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ：５４２．５（ＭＨ＋）。
【０１６９】
（実施例４７：カンペスタン−３β，５α−ジオール−６β−Ｎ−｛［２−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）エチル］エチルアミン｝の調製）
実施例３において、［２−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）エチル］エチルアミンをアミンとして、そして実施例２９のエポキシドをエポキシドとして使用する。
【０１７０】
得られる生成物を、ＴＬＣ（ＭｅＯＨ）によって具体的に特徴付ける：Ｒｆ＝０．３９。
【０１７１】
質量分析法もまた、実施した（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ：５２８．５（ＭＨ＋）。
【０１７２】
実施例４８（以下参照）は、本発明に従う化合物の使用に関する。
【０１７３】
（実施例４８：樹状突起生成）
（１）Ｃ５７ＢＬ／６マウス脾臓単球において）
５週齢のマウスを、頸部脱臼によって屠殺する。その後、それらのマウスを、解剖する。その脾臓を、滅菌条件下で取り出し、その後、抗生物質（ストレプトマイシンおよびペニシリン）を補充した無血清培養培地を含む冷溶液（４℃）中に配置する。その脾臓を、滅菌ヒュームカップボード中で粉砕し、その後、１００μｍフィルターを通して濾過する。その溶出液を回収し、その後、４℃にて１０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。その細胞ペレットを、コラゲナーゼを含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）溶液中に再懸濁する。この目的は、赤血球を溶解することである。その懸濁物を、１０００ｒｐｍで遠心分離し、その後、その細胞を、ＰＢＳ中に再懸濁する。その洗浄操作を２回実施する。最終再懸濁を、全培養培地中で実施し、その細胞を、計数し、６ウェルディッシュ中に密度４０，０００細胞／ｍｌで分布させる。４時間後、接着細胞を、ＰＢＳで激しく洗浄して、その接着細胞にかまたは培養ディッシュに結合したままであり得る細胞を、除去する。
【０１７４】
図１は、上記に示されるようにして得られるマウス単球における主要な形態変化（樹状細胞を生じる変換）を示す。この転換は、用量１ｎＭにて得られ、その生成物の作用の開始３６時間後に写真を撮った。試験生成物は、実施例９の試験生成物である。細胞増殖物の外観を観察する。その外観は、活性化樹状細胞の主要な特徴のうちの１つである。
【０１７５】
その細胞の処理と同時に、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦは効果がないことが観察された。式（Ｉ）の試験化合物の合成のために使用した化合物（すなわち、コレステロール、エポキシ−コレステロール誘導体およびアミン）もまた、効果がないこともまた、観察された。
【０１７６】
同様の結果が、実施例８、１０、１１、４６および４７の化合物を用いて得られた。
【０１７７】
（２）Ｕ−９３７ヒト骨髄性白血病細胞において）
図３は、実施例９の化合物によるＵ−９３７細胞から樹状細胞への分化の誘導を示す。
【０１７８】
写真１は、１０ｎｇ／ｍｌのホルボールミリスチルアセテート（ＰＭＡ）を用いて細胞を培養ディッシュの底に接着させる処理をした後の、細胞を示す。写真２は、実施例９の化合物１ｎＭを用いて２日間処理した後に、樹状細胞（ＣＤ）の外観を観察することを可能にする。写真３は、５日間の処理後に、樹状突起の大きさの増加（１００μｍまで）およびもつれた（ｅｎｔａｎｇｌｅｄ）細胞の凝集物からなる多数のロゼット（ｒｏｓｅｔｔｅ）（Ｒ）の形成を示す。
【０１７９】
同じ観察が、実施例９の化合物を実施例４６または４７の化合物で置換した場合に、なされる。
【０１８０】
（実施例４９：軸索生成）
（１）ＰＣ１２細胞において）
ＰＣ１２細胞を、初期密度１．５×１０６細胞／ｍｌにて、１０％ウシ胎仔血清および５％ウマ血清を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地中で培養した。培養ディッシュの基部を、０．１重量％のポリリジンまたはコラーゲン溶液で処理して、その細胞の接着を引き起こす。上清細胞を１２時間後に取り出し、１０ｎｇ／ｍｌの神経成長因子（ＮＧＦ）を用いてかまたは用いずに、実施例６または実施例７の化合物を用いてかまたは用いずに、処理する。その細胞を、位相差顕微鏡によって観察する。
【０１８１】
「コントロール」ＰＣ１２細胞を、試験化合物のために使用した溶媒ビヒクル（すなわち、水＋０．１重量％エタノール）を用いて処理した。これらの「コントロール」細胞は、丸く見えるが、経時的に形態変化しない。
【０１８２】
実施例６の化合物で処理したＰＣ１２細胞を、用量１０ｎＭで処理した。その化合物の作用時間は、３６時間であった。
【０１８３】
実施例６の化合物で処理したＰＣ１２細胞は、形態が迅速に変化する。それらの細胞は、２〜４時間の処置後に、卵形になる。次いで、突出物の外観が観察される。これは、徐々に樹状突起の形成へと変化する（図２を参照のこと）。これらのＰＣ１２細胞は、二分極化することが、観察される。
【０１８４】
実施例６の化合物でＰＣ１２細胞を４時間処理した後、細胞接着点（ｆｏｃｕｓ）が、培養ディッシュ中で観察される。これらの点は、用量１０ｎｇ／ｍｌで使用したＮＧＦで処理した細胞の場合よりも４〜６倍多い。その試験化合物は、実施例６の化合物での処理について以前に示された条件と同様の条件下で、ＰＣ１２細胞における樹状突起の成長を引き起こす。同じ観察が、実施例６の化合物を実施例４、５、７、４２、４３、４４および４５のうちの１つの化合物で置換した場合に、なされる。
【０１８５】
（２）マウスＰ１９細胞において）
Ｐ１９細胞を、マウス胚性癌腫に由来する。それらの細胞は、多能性細胞であり、これは、レチノイン酸で処理することによって、ニューロンまたは神経膠細胞へと変化し得（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９８２  Ａｕｇｕｓｔ，９４（２）：ｐｐ．２５３〜２６２）、そしてジメチルスルホキシドの存在下で筋肉細胞へと分化し得る（Ｎａｔｕｒｅ  １９８２〜９  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，２９９（５８  ７９）：ｐｐ．１６５〜１６７）。
【０１８６】
ＰＣ１９細胞を、「Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ」社によって販売される「ＲＰＭＩ  １６４０」培養培地の存在下で培養する。この培地は、２ｍＭのグルタミンおよび４重量％のウシ胎仔血清を補充している。これらのＰ１９細胞を、低密度（６０ｍｍウェル当たり１０，０００細胞）で接種する。このＰ１９細胞を、実施例６の化合物で処理する。その後、これらのＰ１９細胞を、位相差顕微鏡によって観察する。これらの細胞を、用量１０ｎＭで処理した。その化合物の作用時間は、３６時間であった。
【０１８７】
実施例６の化合物で処理したＰ１９細胞は、１２時間の処理後に継代が変化する。細胞増殖物の外観を、観察する。その外観は、樹状突起の形成へと変化する（図１６を参照のこと。この図において、写真１は、ブランクコントロールに対応し、写真２は、試験化合物に対応する）。
【０１８８】
同じ観察が、実施例６の化合物を、実施例４、５、７、４２、４３、４４および４５のうちの１つの化合物で置換した場合に、なされる。
【０１８９】
（実施例５０：ＣＤの分化状態に特徴的である表面抗原の外観）
この研究は、Ｃ５７ＢＬ／６マウス脾臓由来のＣＤ、ヒトＰＢＭＣ由来のＣＤ、およびＵ９３７骨髄性白血病細胞由来のＣＤに対して実施した。Ｃ５７ＢＬ／６マウス脾臓細胞を、実施例４８．１に示されるように調製した。
【０１９０】
その表現型を、「ＦＡＣ  Ｓｃａｎ  Ｆｌｏｗ」機器（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｋｉｎｓｏｎ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｆｒａｎｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）において、ＦＩＴＣ結合体化抗体（ＨＬＡ−ＤＲ，ＣＤ−８０、ＬＡＭＰ−１１）およびフィコエリトリン結合体化抗体（抗ＣＤ−８３、ＣＤ−８６およびＣＤ−４０、すべて「ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ」起源である）を使用して、フローサイトメトリーによって分析する。
【０１９１】
実施例９の化合物について、結果を、以下の表に示す。
【０１９２】
（実施例９の化合物で刺激した樹状細胞の表現型）
【０１９３】
【表１−１】
2005529882.tif 000009
【０１９４】
【表１−２】
2005529882.tif 000010
【０１９５】
（実施例５１：樹状細胞によるＩＬ−１２ｐ７０およびＩＬ−１０の生成）
培養上清を、サイトカインの存在下について試験する時まで、温度−８０℃で凍結する。ＩＬ−１２ｐ７０およびＩＬ−１０の存在を、「Ｅｎｄｏｇｅｎ」（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）から得たＥＬＩＳＡキットを使用して測定する。
【０１９６】
図４は、実施例９の化合物で処理したＵ−９３７細胞によるサイトカインの生成を示す。この処理は、処理開始３６時間後から、ＩＬ−１２のｐ７０サブユニットの生成を刺激することが、観察される。この表現型は、２週間の処理の間継続する。この同じ処理は、２週間の期間にわたって続く処理のために、ＩＬ−１０の転写を刺激しない。この結果は、特に有利である。なぜなら、ＩＬ−１０は、樹状細胞の分化をブロックする免疫抑制特性を有すること、およびその組（ＩＬ−４＋ＧＭ−ＣＳＦ）は、ＩＬ−１０の生成を刺激することが、公知であるからである。
【０１９７】
同じ観察が、実施例９の化合物を実施例４６および４７の１つの化合物で置換した化合物で置換した場合に、なされた。
【０１９８】
（実施例５２：Ｔリンパ球の増殖）
Ｃ５７ＢＬ／６マウス単球を、実施例４８．１に示されるように収集した。樹状細胞を、実施例９に示されるように得た。試験化合物でＣＤを形質転換した後、その細胞を、抗有糸分裂剤（０．０００６ｍｇ／ｍｌのマイトマイシンＣ）で処理し、３７℃にて３０分間インキュベートして、そのＣＤにおけるＤＮＡ合成をブロックする。この処理の後、細胞を、１０％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地で２回洗浄する。
【０１９９】
ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓もまた、収集し、そしてＣ５７ＢＬ／６マウス単球の調製について記載されたように処理した。Ｔリンパ球を含む非接着細胞を、回収し、そしてＣ５７ＢＬ／６マウス樹状細胞に添加する。細胞を接触させて４日目に、トリチウム化チミジンを添加する。１８時間のインキュベーション後、その細胞を、無水アルコールで溶解する。沈殿物を、水中に懸濁し、その後、セルロースフィルターに通して濾過する。チミジンの取り込みを、シンチレーションカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｍｅｒｉｄｅｎ  ＣＴ，ＵＳＡ）によって測定する。
【０２００】
図５は、樹状細胞を用いるＴリンパ球の活性化が、実施例９の化合物の効果の下で生じたことを示す。実施例１４．１に従って得られるマウス脾臓から生じる接着単球を、可変用量にて上記の化合物で処理した。そのようにして得られた樹状細胞を、ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓から生じるＴリンパ球と接触させて配置した。リンパ球増殖を、ＤＮＡ中へのトリチウム化チミジンの組み込みを測定することによって、測定する。
【０２０１】
この試験化合物は、Ｔリンパ球増殖の刺激を５倍誘導することが、見出される。同じ細胞を上記の組（ＩＬ−４／ＧＭ−ＣＳＦ）で処理し、その後、ＴＮＦαで処理した後、その増殖効果が、より低いレベルまでのみ観察される。なぜなら、この効果は、１．４倍に対応するからである。
【０２０２】
同じ観察が、実施例９の化合物を、実施例４６および４７の１つの化合物で置換した場合に、なされた。
【０２０３】
（実施例５３：培養におけるマウス乳腺癌細胞（ＴＳ／Ａ（Ｈ−２ｄ））の増殖）
マウス腫瘍株ＴＳ／Ａ（Ｈ−２ｄ）は、ＢＡＬＢ／ｃマウスの同系マウスの自然発生乳腺癌細胞株である。これらを、エンドトキシンを含まない制御したウシ胎仔血清（Ｇｉｒｃｏ−Ｂｒｉｏ，２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、必須アミノ酸およびピルビン酸）を補充した、マイコプラズマを含まない制御したＲＰＭＩ  １６４０培地中で培養する。
【０２０４】
図６は、インビトロでのＴＳ／Ａに対する細胞毒性を示す。上記腫瘍細胞を、可変用量の実施例９の化合物で処理した。その細胞毒性は、用量５０μＭにて現れる。ＢＡＬＢ／ｃマウスに移植した腫瘍に対する試験を実施するために選択した用量は、用量５ｎＭおよび１μＭであった。これらの用量について、その細胞とのインキュベーション時間に関わらず、毒性は観察されない。
【０２０５】
（実施例５４：ＢＡＬＢ／ｃマウスに移植した腫瘍に対する増殖試験）
腫瘍を、以下の様式で移植する：１×１０６  ＴＳ／Ａ細胞を、５〜６週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｊａｎｖｉｅｒ育種ステーション、Ｌｅ  Ｇｅｎｅｓｔ  Ｓａｉｎｔ  Ｉｓｌｅ）の腹部右脇腹に皮内注射によって接種する。
【０２０６】
試験分子は、実施例９に対応する試験分子である。この試験分子を、３日目に、腫瘍の領域中に皮内注射する。結果を、図７に示す。
【０２０７】
化合物の非存在下で、腫瘍は、４日間以内に出現し、そして３０日間にわたって増殖する。コントロールマウスに比較して、減速効果が、マウス１ｇ当たり８．５ｎｇの用量の試験化合物について出現する。マウス１ｇ当たり用量１．７μｇにて、このマウスにおいて腫瘍は検出不能である。このことは、処理の極限効力を示す。解剖病理学的分析は、試験化合物注射領域において、壊死の痕跡が観察されないことを示す。試験化合物で処理したマウスについて、用量１．７μｇ／ｇで、腫瘍を移植していようが移植してなかろうが、末梢リンパ系の過形成が、観察される。このことは、免疫系の活性化を示す。
【０２０８】
上記の実験と同じ実験を、反復して、実施例９に対応する分子の注射領域を変化させる。その注射は、腫瘍移植後３日目に、同じ移植に対して対側性位置に皮内に実施する。この実験において、コントロールマウスと比較した腫瘍増殖の減速が、マウス１ｇ当たり１．７μｇの用量について観察される。このことは、腫瘍から離れた試験化合物の投与について、処理の効力を示す。得られる結果は、図１７における曲線によって示される。
【０２０９】
同じ観察が、実施例９の化合物を実施例４６および４７の１つの化合物で置換した場合に、なされた。
【０２１０】
（実施例５５：Ａ５４９腫瘍細胞株における小胞生成の誘導）
Ａ５４９細胞を、実施例９に従う化合物１００ｎＭで１２時間処理した。
【０２１１】
Ａ５４９細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から得た。そのＡ５４９細胞を、１２ウェルプレート中に密度１ウェル当たり５０，０００細胞で接種し、５％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ培地中で培養した。本発明に従う化合物での処理を実施するために、細胞を、上記化合物とともに（またはコントロール生成物とともに）４８時間インキュベートする。その後、その細胞を、小胞の形成をモニターするために、４時間ごとに位相差顕微鏡によって観察し、その後、０．４％パラホルムアルデヒドのｐＨ７．４のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）溶液を用いて固定する。
【０２１２】
その結果を、図８に示す（位相差顕微鏡法）。写真Ａは、処理前の細胞を示し、写真Ｂは、処理後の細胞を示す。写真Ｃにおいて、その細胞を、溶媒ビヒクルで処理し、写真Ｄにおいて、本発明に従う化合物での処理は、小胞の塊状の外観をもたらすことが、観察される。
【０２１３】
上記に示した写真Ｄを得るために、上記プロセスを、以下の通りに実施した：細胞を処理した後、培養培地を除去し、細胞を、ｐＨ７．４のＰＢＳで洗浄する。その細胞を、１μＭモノダンシルカダベリン（ＭＤＣ）溶液とともに１０分間インキュベートする。その後、その細胞を、４℃にてＰＢＳ溶液を用いて徹底的にリンスする。１滴の「Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ」溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＣＡ）を、顕微鏡スライドとカバースリップとの間に封入する前に添加する。その後、細胞を、顕微鏡下で素早く観察し、写真を撮影する。図８の写真Ｄは、その細胞中の多数の蛍光小胞を示す。
【０２１４】
試験化合物は、Ａ５４９ヒト腫瘍株において細胞質小胞の塊生成を誘導することが、そのようにして観察される。観察される効果は、用量依存性であり、処理後６時間で出現する。この効果は、処置後１２時間で最大に達する。
【０２１５】
同じ観察が、実施例９の化合物を実施例４６および４７の１つの化合物で置換した場合に、なされた。
【０２１６】
実施例８の化合物もまた同様の効果を示すことが、見出された。さらに、同様の現象が、Ａ５４９細胞について上記に示すようにして得られ処理された、Ｕ−９３７細胞、ＰＣ−１２細胞、ＭＣＦ−７細胞、ＨＥＬＡ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＨＴ−２９細胞、およびＣＨＯ細胞にて観察された。
【０２１７】
細胞処理を、増殖培地を新鮮な培地で置換することによって停止した場合、小胞が消失する。このことは、本発明に従う化合物の効果は、可逆的であることを示す。
【０２１８】
上記に示したように実施例９に従う化合物で処理したＡ５４９細胞をまた、電子顕微鏡によっても試験した。これらのＡ５４９細胞を電子顕微鏡により試験するために、それらのＡ５４９細胞を、３％グルタルアルデヒドを含むＰＢＳ溶液を使用して固定し、樹脂（ＥＰＯＮ）中に配置し、そして最後に、超ミクロトームを使用して切断して薄いスライスにする。その後、これらのスライスを、２００メッシュの銅格子上に配置し、電子顕微鏡によって試験する。その結果を、図１１に示す。図１１．１は、「コントロール」細胞を示す（倍率：６０００）；図１１．２は、実施例９の化合物で処理した細胞を示す（倍率：４０００）；図１１．３は、図１１．２において観察され得る小胞の拡大図を示す（倍率：７２０００）。この図１１において、使用した文字は、以下の意味を有する：Ｎ＝核；Ｃ＝細胞質；Ｍ＝ミトコンドリア；Ｖｉ＝細胞質内小胞；Ｖｅ＝細胞外小胞；ＭＬＢ＝多層体。
【０２１９】
図１１の写真の詳細な分析は、以下の観察を可能にする：図１１．１は、細胞質に囲まれた中央の大きな核を有する細胞を示す。その細胞の表面は、小さな拡張部であり、この拡張部は、絨毛である。写真１１．２は、本発明に従う化合物で処理された後の細胞を示す。この細胞は、紡錘形形態を採り、絨毛は、その細胞の一面（図１１．２の下右角）に集中しており、そこで、多数の小胞が、その表面上に出現する。多数の小胞およびミトコンドリアはまた、細胞質中にも観察される。写真１１．３は、多数のミトコンドリアおよび小胞を示し、これらは、黒い本体を含み、かつ骨格筋線維により囲まれている。この図において、２つの型の小胞（細胞質内小胞（Ｖｉ）および細胞質外小胞（Ｖｅ））が、観察され得る。図１１．４は、細胞質内小胞中に含まれる構造体の詳細を示す。この構造体は、界面活性剤Ｂ型のタンパク質を生成する肺細胞に特徴的な多層体である。
【０２２０】
（実施例５６：ＰＣ１２細胞の生存）
ＰＣ１２細胞を、実施例４９．１に示されるように処理した。本実施例の場合、そのＰＣ１２細胞を、１００ｎＭで使用した漸増用量の本発明に従う化合物で処理する。それらのＰＣ１２細胞を、培養ディッシュ中に３週間維持する。生存細胞の数を、２日ごとに測定する。試験化合物を、２日間ごとに処理の最初の６日間の間添加する。
【０２２１】
この試験を、実施例６の化合物および実施例７の化合物を用いて実施した。ＰＣ１２細胞を、試験化合物各々および１０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦとともに３７℃でインキュベートした。これらの物質を、その接種の間に培養培地に添加した。結果を、３つの独立した実験についてのＰＣ１２細胞の生存の平均パーセントとして表す。その結果を、図９に示す。
【０２２２】
同じ観察が、実施例６の化合物を実施例４、５、４２、４３、４４、および４５の１つの化合物で置換した場合に、なされる。
【０２２３】
そのように処理したＰＣ１２細胞を、樹状突起成長した後に、培養中で維持する。樹状突起の成長の存在は、実施例１５によって確立された。これらの細胞の生存は、ＮＧＦの使用と比較して、本発明に従う化合物を使用した場合に、かなり増加させることが、見出される。
【０２２４】
（実施例５７：運動ニューロンの生存）
マウスニューロンを抽出し、Ｄｕｏｎｇら、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１９９９，第２８巻、ｐｐ．１３８５〜１３９２により記載される方法に従って、培養中に維持した。培養中に維持した細胞を、使用した溶媒−ビヒクル（水＋０．０２％ジメチルスルホキシド）で、神経栄養因子（すなわち、ＢＤＮＦ、「脳由来神経栄養因子（Ｂｒａｉｎ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｆａｃｔｏｒ）」で、または本発明の化合物で、処理した。可変用量の化合物を使用して、正常運動ニューロンに対する本発明に従う化合物の特性を評価した。生存細胞を培養および計数するために使用した形態は、実施例５６に規定されるのと同じ細胞である。精製運動ニューロンを、３７℃にて、上記に示す溶媒−ビヒクルとともに、１０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦとともに、または濃度１００ｎＭの実施例６もしくは実施例７の化合物とともに、インキュベートした。結果を、図１０に示す。
【０２２５】
同じ観察が、実施例６の化合物を実施例４、５、４２、４３、４４、および４５の１つの化合物で置換した場合に、なされる。
【０２２６】
本発明の化合物またはＢＤＮＦでの処理が存在しない場合、細胞は、２〜３日以内に素早く消滅することが、見出される。試験した本発明の化合物のいずれかの効力は、ＢＤＮＦの効力より優れていることが、見出される。従って、本発明の化合物の添加は、樹状突起成長を生じる（実施例４９により確立されたように）のみならず、３週間の間に細胞の生存もまた生じる。
【０２２７】
実施例５６および５７において示される生存試験は、神経変性疾患（例えば、筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈ．Ｌａｔｅｒａｌ  Ｓｃｌｅｒ．Ｏｔｈｅｒ  Ｍｏｔｏｒ  Ｎｅｕｒｏｎ  Ｄｉｓｃｏｒｄ（２００１）２  Ｍａｒｃｈ；補遺１：Ｓ５５〜６８）またはアルツハイマー病およびパーキンソン病（Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｖｉｅｗ（２０００）第３巻，ｐｐ．１９９〜２２７））に対する上記分子の好ましい効果を示す。
【０２２８】
（実施例５８：処理したＡ５４９細胞におけるアクチン骨格）
Ａ５４９細胞を、実施例５５に詳細に記載したプロトコルに従って、実施例９の化合物を用いて処理した。そのＡ５４９細胞を、６ウェル培養ディッシュ（ＮＵＮＣ）の底に、１ウェル当たり５０，０００細胞の密度でガラススライド上に、１０％ウシ胎仔血清を補充した「ＲＰＭＩ  １６４０」型の栄養培地（「Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ」社から販売される）中に接種する。その後、その細胞を、３％パラホルムアルデヒド溶液を用いて固定し、そしてＰＢＳ中０．１％の「Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００」を含む界面活性剤溶液を用いて透過性にする。処理した細胞のアクチン骨格を、その細胞をファロイジン（ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ）−ＦＩＴＣで標識することによって、観察した。
【０２２９】
結果を、図１２に示す。図１２の写真１は、コントロールＡ５４９細胞を示す。そのアクチン細胞骨格は、細胞を規則的な様式に保持する。図１２の写真２は、屈折（ｒｅｆｒｉｎｇｅｎｔ）小胞の外観を示し、この小胞は、アクチンによって囲まれており、このような小胞はまた、細胞の外側に出現する。アクチンは、実施例５５に示されるエキソサイトーシス小胞の分泌の間に、モーターとして介入すると、考えられる。
【０２３０】
図１３は、蛍光顕微鏡によるＡ５４９細胞に関するチューブリン骨格の観察を示す。写真１は、未処理コントロール細胞を示し、写真２は、実施例２１に詳細に示されるプロセスに従って処理された細胞を示す。この場合、Ａ５４９細胞Ｊを、抗γ−チューブリン抗体で標識し、抗ＩｇＧ−ＦＩＴＣ抗体で発色させる。
【０２３１】
写真１は、規則的な繊維状ネットワークを示す。写真２は、細胞質内小胞の存在を示し、この細胞質内小胞は、γ−チューブリンに囲まれていない（多数の穴の外観が、これらの小胞の存在を区切る）。
【０２３２】
図１２および１３を合わせた観察は、処理したＡ５４９細胞において電子顕微鏡によって観察可能な細胞骨格線維は、アクチン線維を含むことを示す。
【０２３３】
同じ観察が、実施例９の化合物を実施例４６および４７の１つの化合物で置換した場合に、なされた。
【０２３４】
（実施例５９：Ｕ９３７腫瘍細胞株における小胞生成の誘導）
Ｕ９３７細胞を、１０ｎＭの実施例９に従う化合物で２４時間処理した。この処理方法は、実施例５５に詳細に記載される方法である。
【０２３５】
結果を、図１４に示す。この図面において、写真１は、「コントロール」細胞に対応する（倍率：６０００）。写真２は、実施例９の化合物で処理した細胞に対応する（倍率：４０００）。その細胞は、形状を変化させ、そして多数の細胞質内小胞が出現したことが、観察される（この写真における参照Ｖｉ）。図１４における参照文字の意味は、図１１について使用される意味と同じである。写真３（倍率：２５，０００）において、極度に発達した膜ネットワークの存在が、観察される。多数の細胞器官（ｏｒｇａｎｉｔｅ）が、識別される：（多数のミトコンドリア（これは、強い活性の証拠である））；多胞体ＭＶＢ）もまた、識別され、その詳細は、図１４の写真４に現れる。この写真は、細胞からの分泌の過程にあるＭＶＢを示す（倍率：７２，０００）。
【０２３６】
同じ観察が、実施例９の化合物が実施例４６および４７の１つの化合物で置換された場合に、なされた。
【０２３７】
（実施例６０：Ｕ９３７腫瘍細胞株における膜レセプターの過剰発現）
Ｕ９３７細胞を、「Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ」社により販売された「ＲＰＭＩ  １６４０」培地において培養した。プロテインＧ共役レセプターのスーパーファミリーに属してＨＡ標識を含む、ＲＣＰＧ−ＭＡ膜レセプターを生成する。このレセプターを発現するＵ９３７細胞を、「リポフェクタミン」試薬を製造業者の指示に従って使用するトランスフェクションによって、生成する。
【０２３８】
トランスフェクションの４８時間後、トランスフェクト細胞を、１０ｎＭの実施例９に従う化合物で１２時間処理した。
【０２３９】
図１５は、ＲＣＰＧ−ＨＡを発現し、実施例９の化合物での処理に供された、Ｕ９３７細胞の２つの免疫蛍光写真を示す。これらの細胞を、蛍光顕微鏡によって試験するために固定した。このレセプターの存在は、抗ＨＡ抗体の存在下でのインキュベーション、その後の抗ＩｇＧ−ＦＩＴＣ抗体とのインキュベーションによって、明らかになる。図１５の写真は、本発明に従う化合物で処理した細胞中のＲＣＰＧ型の膜レセプターの発現を示し、一方、処理の非存在下で、免疫検出は、達成するのが困難である。同じ観察が、実施例９の化合物を実施例１０、１１、１４、１６、４６、および４７のうちの１つの化合物で置換した場合に、なされる。
【０２４０】
この実験は、トランスフェクトされた細胞が、細胞質内小胞中で膜レセプターを大量に生成し得ることを、示す。
【０２４１】
本明細書中上記に記載されている実施例４８などは、上記実験に供された細胞型すべてが、本発明に従う化合物の１つで処理された場合に、小胞を生成することを示し、事例に依存して、それらの小胞は、多層小胞および／または多胞小胞であり得る。本発明に従う化合物での処理は、腫瘍細胞が正常表現型へと再分化する活性を処理細胞中で観察することを可能にすることが、見出される。
【図面の簡単な説明】
【０２４２】
【図１】図１は、上記に示されるようにして得られるマウス単球における主要な形態変化（樹状細胞を生じる変換）を示す。
【図２】図２は、実施例４９における樹状突起の形成を示す。
【図３】図３は、実施例９の化合物によるＵ−９３７細胞から樹状細胞への分化の誘導を示す。
【図４】図４は、実施例９の化合物で処理したＵ−９３７細胞によるサイトカインの生成を示す。
【図５】図５は、樹状細胞を用いるＴリンパ球の活性化が、実施例９の化合物の効果の下で生じたことを示す。
【図６】図６は、インビトロでのＴＳ／Ａに対する細胞毒性を示す。
【図７】実施例５４における、この試験分子を３日目に腫瘍の領域中に皮内注射した結果を示す。
【図８】実施例５５における位相差顕微鏡法の結果を示す。
【図９】実施例５６における３つの独立した実験についてのＰＣ１２細胞の生存の平均パーセントとして結果を示す。
【図１０】実施例５７における結果を示す。
【図１１】実施例５５における電子顕微鏡試験の結果を示す。
【図１２】実施例５８における観察の結果を示す。
【図１３】図１３は、蛍光顕微鏡によるＡ５４９細胞に関するチューブリン骨格の観察を示す。
【図１４】図１４は、実施例５９における処理結果を示す。
【図１５】図１５は、ＲＣＰＧ−ＨＡを発現し、実施例９の化合物での処理に供された、Ｕ９３７細胞の２つの免疫蛍光写真を示す。
【図１６】実施例４９における樹状突起形成を示す。
【図１７】実施例５４における腫瘍から離れた試験化合物の投与についての処理効力の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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