(57)【要約】  レポーター構造体は、哺乳類のＩＮＧＡＰ５’−制御領域又はその断片、哺乳類のＩＮＧＡＰ又は異種プロモーターから得られる最小プロモーターエレメント、並びにレポーター遺伝子を含有する。レポーター構造体を使用して、単独又は組み合わせでレポーター遺伝子の発現を増加又は減少させる作用因子についてスクリーニングすることができる。あるいは、レポーター構造体を使用して、ハムスターＩＮＧＡＰ５’制御領域又はその断片に結合する作用因子についてスクリーニングすることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２の単離核酸塩基配列。
【請求項２】
レポーター構造体であって、
ａ．検出可能な産物を符号化するヌクレオチド配列と、
ｂ．検出可能な産物を符号化するヌクレオチド配列の５’末端部に連結された制御領域ヌクレオチド塩基配列と
を含み、前記制御領域ヌクレオチド塩基配列が、配列番号：２のヌクレオチド１〜３１３７から選択される１つ以上の領域で構成されるレポーター構造体。
【請求項３】
レポーター構造体であって、さらに、
ａ．前記制御領域ヌクレオチド配列と、検出可能な産物を符号化するヌクレオチド配列との間に存在する、プロモーターエレメントを含むことを特徴とする請求項３に記載のレポーター構造体。
【請求項４】
前記制御領域ヌクレオチド塩基配列が、配列番号：１、２、２３、３２、３５、３７、２８、２４、２５、２６、２７、２９、３０、３１、３３、３４、３８、及び３６からなる群から選択されることを特徴とする請求項３又は４に記載のレポーター構造体。
【請求項５】
前記プロモーターエレメントが、配列番号：２から選択されることを特徴とする請求項４に記載のレポーター構造体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のレポーター構造体を含むことを特徴とする宿主細胞。
【請求項７】
ＩＮＧＡＰの発現を調節する作用因子の同定法であって、
ａ．請求項７に記載の宿主細胞を試験作用因子と接触させることと、
ｂ．細胞内の検出可能なタンパク質又は核酸産物の発現を判定することと、
ｃ．前記試験作用因子が細胞内で検出可能な産物の発現を調節する場合に、前記試験作用因子をＩＮＧＡＰ発現のモジュレーターとして同定することと
を含む方法。
【請求項８】
ＩＮＧＡＰの発現を調節する作用因子の生体外同定法であって、
ａ．前記ヌクレオチド配列の転写及び翻訳に十分な条件下で、請求項３又は４に記載のレポーター構造体を試験物質と接触させることと、
ｂ．検出可能なタンパク質又は核酸産物の発現を判定することと、
ｃ．前記試験物質が検出可能な産物の発現を調節する場合に、前記試験物質をＩＮＧＡＰ発現のモジュレーターとして同定することと
を含む方法。
【請求項９】
ＩＮＧＡＰの発現を調節する作用因子の生体外同定法であって、
ａ．請求項２に記載の核酸又はその断片を試験作用因子と接触させることと、
ｂ．核酸への前記試験作用因子の結合を判定することと、
ｃ．前記試験作用因子が核酸に結合する場合に、前記試験作用因子をＩＮＧＡＰ発現の潜在的モジュレーターとして同定することと
を含む工程。
【請求項１０】
ＩＮＧＡＰの発現を必要とする哺乳類においてその発現を調節する方法であって、前記哺乳類においてＩＮＧＡＰの発現を刺激する有効量の因子を、哺乳類に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子の発現を調節する因子の検出アッセイの分野に関する。より詳細には、本発明は、レポーター構造体及びＩＮＧＡＰ遺伝子の発現を調節する作用因子を同定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
膵島新生遺伝子関連タンパク質（ＩＮＧＡＰタンパク質）は、通常の胚形成時の膵島の発達を繰り返すような方式で、膵臓内に存在する前駆細胞からの膵島細胞新生を誘発することができる、膵臓の腺房細胞タンパク質として確認されている。ＩＮＧＡＰは、膵臓に関係した前駆体細胞からランゲルハンス島の成長及び分化を刺激することが可能な点において独特である。これらの膵島は、生理的に血糖の乱れ（perturbation）に応答可能な成熟インスリン分泌特性を発達させる。この潜在的な抗糖尿病療法は、いくつかの生物種にわたる類似性を示し、生物学的反応を与えることが示されている。
【０００３】
進行性自己免疫反応がインスリン産生β細胞の選択的破壊をもたらす１型真性糖尿病では、膵島細胞の質量が失われている。２型真性糖尿病は、いわゆる成人発症性の疾病であるが、若い肥満の人々にも増えている症状であり、β細胞の質量が正常時の６０％程度減少している場合がある。膵臓内で機能するβ細胞の数は、糖尿病の進行、過程、及び結末にきわめて重要である。Ｉ型糖尿病では、β細胞の質量が正常時の２％未満に減少する。ＩＩ型糖尿病で発生するような重度のインスリン抵抗性に直面した場合でも、糖尿病が進行するのは、β細胞の質量の代償性増加が不十分な場合に限られる。したがって、主形態のいずれの糖尿病の進行も、適応β細胞成長の欠如及びその後のインスリン分泌の不足とみなすことができる。前駆体細胞からの膵島及びβ細胞の成長を刺激することは、膵島新生として知られ、糖尿病を改善させる興味深い手法である。β当該技術分野では、動物であるか培養細胞であるかを問わず、ＩＮＧＡＰの発現を調節できる作用因子を同定する方法が必要とされている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、哺乳類のＩＮＧＡＰ遺伝子から得られる５’−制御領域を含有するレポーター構造体を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、ＩＮＧＡＰの発現を調節する作用因子を同定する方法を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、ＩＮＧＡＰ５’−制御領域の核酸又は断片を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、ＩＮＧＡＰの発現を増加させる方法を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、ＩＮＧＡＰの発現を調節するキットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明のこれら及び他の目的を、後述する１つ以上の実施形態によって提供する。
【０００６】
本発明の１つの態様では、レポーター構造体が提供される。レポーター構造体は、制御領域ヌクレオチド配列と、検出可能な産物を符号化するヌクレオチド配列とを含む。本発明の１つの態様では、レポーター構造体は、ベクター内で提供される。制御領域ヌクレオチド配列は、検出可能な産物を符号化するヌクレオチド配列に連結している。制御領域ヌクレオチド配列には、配列番号：２３であるＩＮＧＡＰゲノム配列の５’制御領域の１つ以上の断片を含めてもよいし、又は５’制御領域の全長を含めてもよい。レポーター構造体の１つの実施形態では、プロモーターエレメントは、制御領域ヌクレオチド配列と、検出可能な産物を符号化するヌクレオチド配列との間に存在する。プロモーターエレメントは、ＩＮＧＡＰ制御配列内に存在するプロモーターエレメント群から選択してよい。あるいは、レポーター構造体を含むベクター内に存在するプロモーターエレメントを使用してもよい。検出可能な産物を符号化する前記ヌクレオチド配列によって符号化される検出可能な産物は、核酸又はタンパク質のいずれかであり得る。検出可能な産物が、必ずしもＩＮＧＡＰ遺伝子核酸又はタンパク質である必要はない。
【０００７】
本発明のもう１つの実施形態では、ＩＮＧＡＰの発現を調節する作用因子を同定する方法が提供される。この方法は、細胞を試験作用因子と接触させることを含んでおり、この細胞が本発明のレポーター構造体を含む。細胞内における検出可能な核酸又はタンパク質産物の発現が判定される。試験作用因子が細胞内で検出可能な産物の発現を調節する場合、その試験作用因子がＩＮＧＡＰ発現のモジュレーターとして同定される。
【０００８】
本発明のもう１つの実施形態では、ハムスターのＩＮＧＡＰ遺伝子（配列番号：２）のゲノム配列を含む単離核酸又はその断片が提供される。
【０００９】
本発明のもう１つの実施形態によれば、ＩＮＧＡＰの発現を調節する作用因子の生体外同定法が提供される。この方法は、ヌクレオチド配列の転写及び翻訳が可能な無細胞システムにおいて、試験作用因子を本発明のレポーター構造体と接触させることを含む。検出可能な産物の発現が判定される。試験物質が検出可能な産物の発現を調節する場合、その物質がＩＮＧＡＰ発現のモジュレーターとして同定される。
【００１０】
本発明のもう１つの実施形態によれば、ＩＮＧＡＰの発現を調節する作用因子の生体外同定法が提供される。この方法は、試験作用因子を本発明の核酸と接触させる工程を含む。試験作用因子が核酸に結合するかどうか判定される。試験作用因子が核酸に結合する場合、その試験作用因子がＩＮＧＡＰ発現のモジュレーターとして同定される。
【００１１】
本発明のもう１つの実施形態によれば、ＩＮＧＡＰの発現を増加させる方法が提供される。ＩＮＧＡＰの発現を直接的又は間接的に刺激する因子、例えば、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、又は薬剤の有効量が、ＩＮＧＡＰの発現を増加させる必要のある哺乳類に投与される。
【００１２】
本発明のもう１つの実施形態によれば、ＩＮＧＡＰの発現を調節するキットが提供される。このキットは、ＩＮＧＡＰ発現のモジュレーターと、ＩＮＧＡＰの発現を調節するためのＩＮＧＡＰ発現モジュレーターの使用説明書とを含む。
【００１３】
本発明のもう１つの実施形態によれば、膵島細胞機能の低下に関連した疾病状態を処置するために、哺乳類においてＩＮＧＡＰの発現を調節する方法が提供される。この方法は、有効量のＩＮＧＡＰ発現モジュレーターを哺乳類に投与し、それによって哺乳類におけるＩＮＧＡＰの発現の程度を変化させる工程を含む。
【００１４】
引用されるすべての文献は、その関連部分において本明細書に引用して援用するが、いずれの文献の引用も、それが本発明に関連する先行技術であるとの容認として解釈されるべきではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
（定義）
本明細書及び添付の請求項で使用する時、文脈で特に明確に指定しない限り、単数表現には複数のものを指す場合が含まれることに留意しなければならない。
【００１６】
用語「プロモーター」は、転写の開始及び速度が制御される遺伝子領域を定義するために使用される。それには、ＲＮＡポリメラーゼが結合する部位と、さらに、制御タンパク質、例えば、転写因子、リプレッサーなどが結合する部位とが含有される。転写開始部位と転写速度を調節する他の部位とを区別するために、プロモーター領域は、一般に「最小プロモーターエレメント」と「制御領域」とに細分される。したがって、用語「最小プロモーターエレメント」又は単に「プロモーター」と呼ばれることもある用語には、ＴＡＴＡボックス、ＧＣリッチ配列、及びＣＡＡＴボックスを含めてよく、「制御領域」は、普通、転写因子及び他の因子が結合するヌクレオチド配列の長い伸張部である。ほとんどの真核細胞遺伝子は、多くの異なる転写因子が結合する長い制御領域を有する。所与の種類の細胞、組織、器官、又は生命体における所与の遺伝子の発現又は発現の欠如は、その制御領域で起こる相互作用に支配される。
【００１７】
用語「転写因子」は、遺伝子の制御領域においてＤＮＡの短い伸張部に結合するタンパク質を記述するために使用される。転写因子は、転写因子同士と同様に、ＲＮＡポリメラーゼと相互作用することがある。したがって、転写因子は、ホルモン又はセカンドメッセンジャー、ＤＮＡ、ＲＮＡ、他の転写因子、又は他のタンパク質に結合することがある。それらは、所与の遺伝子の転写を活性化又は抑制することがある。また転写因子は、時に「エンハンサー」又は「リプレッサー」とも呼ばれる。転写因子結合部位を使用して、遺伝子の５’−制御領域に結合し、遺伝子の発現を調節する作用因子を同定することができる。
【００１８】
用語「レポーター」は、異種プロモーター又はエンハンサーエレメントに付着した符号化配列を記述するために使用され、その産物は、核酸にせよタンパク質にせよ、容易に検出され、定量化可能である。一般的なレポーター遺伝子をいくつか挙げれば、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が挙げられる。
【００１９】
「レポーター構造体」は、核酸の小片であり、これには好適なベクタープラスミドＤＮＡ内に含有されるプロモーターエレメント及びレポーター遺伝子が含まれる。制御領域ヌクレオチド配列は、それらが転写因子結合部位を含有するかどうか判定するために、プロモーターエレメントの５’クローンであってもよい。レポーター構造体含有ベクターは、多くの転写因子を含有する細胞に導入される。転写因子によるレポーター遺伝子の活性化を、レポーター遺伝子の産物の検出及び定量化によって観察してもよい。
【００２０】
用語「作用因子」は、本明細書では、ＩＮＧＡＰの発現を調節するあらゆる手段を本質的に記述するために使用される。作用因子は、化学的化合物、生物学的作用因子、又は物理的な力、機械的な仕掛け、又はこれらのいずれかの組み合わせであってよい。
【００２１】
（ＩＮＧＡＰプロモーター及び制御領域）
本発明者らは、ＩＮＧＡＰ遺伝子が、ＰＭＡ及びＬＩＦを含めた多くの既知の転写因子による調節の影響を受けやすい５’−制御領域によって制御されることを発見した。
【００２２】
本発明では、さらに、ＩＮＧＡＰ遺伝子の５’−制御領域ヌクレオチド配列を、ＩＮＧＡＰ遺伝子の発現を調節可能な作用因子を同定するスクリーニングアッセイにおいて使用できることが発見された。これらの調節作用因子には、１型及び２型の両方の真性糖尿病、内分泌腺及び非内分泌腺の低形成、肥大、腺腫、腫瘍形成、及び膵島細胞症が挙げられるが、これらに限定されない病的状態を処置する治療薬としての可能性がある。
【００２３】
ほとんどの遺伝子と同様に、哺乳類のＩＮＧＡＰは、イントロン及びエクソンが後続する５’−制御領域を有する。哺乳類（ハムスター種）のＩＮＧＡＰ遺伝子の配列は、配列番号：２として与えられる。図１は、ハムスターのＩＮＧＡＰ遺伝子の５’−制御領域、イントロン、及びエクソンの相対的位置関係の詳細を示す。イントロン１〜５の境界、並びにＴＡＴＡボックス及びポリＡシグナルの場所を、表１に記載する。
【００２４】
【表１】
2005514930.tif 000002
哺乳類のＩＮＧＡＰのプロモーターエレメントを含めた５’−制御領域のヌクレオチド配列は、配列番号：１に部分的に示され、配列番号：２及び２３に完全に示される（配列番号：２のヌクレオチド１〜３１３７）。配列番号：１のヌクレオチド１〜３１２０は、配列番号：２及び配列番号：２３のヌクレオチド１〜３１２０と同一である。５’−制御領域の概観が図２に示されている。図２には、代表的な転写エンハンサー／リプレッサー結合部位も示されている。５’−制御領域のヌクレオチド１〜３１２３について予測される転写エンハンサー／リプレッサー結合部位が、図３に示されている。本明細書末尾の表３は、これらの転写因子及びそれらの結合部位、並びに制御領域におけるそれらの場所を詳細に示す。潜在的転写因子の結合解析は、マットインスペクター・プロフェッショナル（MatInspectorprofessional）（商標）を用いて実施された。これは、転写因子結合部位に関するマトリックス記述のライブラリーを用いて、長さ無制限の配列における一致部分の場所を特定する、生物情報学ソフトウェアである（クヴァント．Ｋ．（Quandt,K.）、フレシュ．Ｋ．（Frech,K.）、カラス．Ｈ．（Karas,H.）、ウィンゲンダー．Ｅ．（Wingender,E.）、ウェルナー．Ｔ．（Werner,T.）（１９９５）、核酸研究（Nucleic Acids Res.）２３、４８７８〜４８８４）。
【００２５】
表３は、機能による類似マトリックスファミリーへの分類（「ファミリー／マトリックス」）に基づいて、予測される結合タンパク質（「詳細」）を記載している。表には、タンパク質に結合すると予測されるＤＮＡ配列（「配列」）、センスＤＮＡであるかアンチセンスＤＮＡであるか（「Ｓｔｒ」）、及び配列番号：２における配列の場所（「位置」）が記載されている。さらに、マトリックスの連続最高保存ヌクレオチドとの類似性（「コア類似性」）及びそのマトリックス中の全ヌクレオチドとの類似性（「マトリックス類似性」）、並びに非制御試験配列において最小数の一致が見られるように規定された最適値（「最適値」）も、表に記載されている。マットインスペクター・プロフェッショナル（MatInspectorprofessional）（商標）で使用されるアルゴリズムの詳細について言及する。
【００２６】
最適値：このマトリックス類似性は、非制御試験配列において最小数の一致が見られるように規定された最適値である（すなわち、このマトリックス類似性によって、偽陽性一致の数が最小限に抑えられる）。このマトリックス類似性は、ユーザーがマットインスペクター・プロフェッショナル（MatInspectorprofessional）（商標）のマトリックス類似性閾値として「最適化」をチェックする時に使用される。
【００２７】
ファミリー：各マトリックスは、いわゆるマトリックスファミリーに属しており、この場合、機能的に類似のマトリックスが同じグループに分類されるので、マットインスペクター・プロフェッショナル（MatInspectorprofessional）（商標）プロフェッショナルによる重複一致がなくなる（ファミリーオプションが選択された場合）。例えば、マトリックスファミリーＶ＄ＮＦＫＢには、ＮＦκＢについて５つの類似マトリックス（Ｖ＄ＮＦκＢ．０１、Ｖ＄ＮＦκＢ．０２、Ｖ＄ＮＦκＢ．０３、Ｖ＄ＮＦκＢ５０．０１、Ｖ＄ＮＦκＢ６５．０１）と同様に、ＮＦκＢ関連因子ｃ−Ｒｅｌについて１つのマトリックス（Ｖ＄ＣＲＥＬ．０１）が含まれる。
【００２８】
マトリックス：マットインスペクター・プロフェッショナル（MatInspectorprofessional）（商標）のマトリックスは、次の７つの群のうちの１つを示す識別名を有しており：脊椎動物（Ｖ＄）、昆虫（Ｉ＄）、植物（Ｐ＄）、菌類（Ｆ＄）、線虫（Ｎ＄）、バクテリア（Ｂ＄）、及びその他の機能的エレメント（Ｏ＄）；その後に、マトリックスが指す因子についての頭文字と、同一因子の異なるマトリックスを区別する続き番号とが続く。したがって、Ｖ＄ＯＣＴ１．０２は、脊椎動物のＯｃｔ−１因子に関する第２マトリックスを示す。
【００２９】
コア類似性：マトリックスの「コア配列」は、マトリックスの連続最高保存位置（普通は４つ）として定義される。コア類似性は、本明細書に記載の通りに計算される。最大のコア類似性である１．０は、マトリックスの最高保存塩基が配列に正確に一致した時にだけ得られる。コア類似性よりも重要であるのがマトリックス類似性であり、これは、マトリックスの全長にわたる全ての塩基を考慮する。
【００３０】
マトリックス類似性：マトリックス類似性は、本明細書に記載の通りに計算される。マトリックスに完全に一致している場合、１．００のスコアが与えられ（各配列位置がマトリックス中のその位置での最高保存ヌクレオチドに相当する）、マトリックスとの「良好な」一致とは、普通、＞０．８０の類似性を有する場合である。マトリックスの高保存位置における不一致は、低保存領域における不一致よりもマトリックス類似性を低下させる。
【００３１】
本発明のもう１つの態様は、レポーター構造体を提供する。レポーター構造体は、配列番号：２３の５’制御領域ヌクレオチド配列断片（例えば、エンハンサー及び／又はリプレッサー結合部位含有領域）と、プロモーターエレメント（配列番号：２３のＩＮＧＡＰ制御領域ヌクレオチド配列から得られるものであってもなくてもよい）と、レポーター遺伝子とを含有する。５’−制御領域ヌクレオチド配列は、レポーター遺伝子の上流に位置する。５’制御領域ヌクレオチド配列に結合する様々な転写因子の同一性を判定し、ＩＮＧＡＰ遺伝子の５’制御ヌクレオチド配列内の結合場所を解明するには、欠失解析を使用してその領域をマッピングしてもよい。制御領域ヌクレオチド配列の１つ以上の断片を、初めに、様々な転写因子活性化因子に対するそれらの応答性について解析してもよい。関心領域が判定された後、制御領域内の異なる場所から得られるＤＮＡを組み合わせて強固で反応性のあるレポーター構造体を製造できる場合、さらに細かいマッピングを実施してもよい。ＩＮＧＡＰ５’−制御領域ＤＮＡ又はその断片のようなＤＮＡ配列は、当該技術分野において周知の方法によって操作することができる。そのような技術の例には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、制限酵素エンドヌクレアーゼによる消化、ライゲーション、及び遺伝子歩行が挙げられるが、これらに限定されない。５’−制御領域のようなＤＮＡ断片のクローニングは、当該技術分野において周知である。
【００３２】
遺伝子の発現レベルを定量化するもう１つの手法は、遺伝子の転写を測定することである。ビオチンもしくはジゴキシゲニンで標識されたプライマー、オリゴヌクレオチドプローブ（オリゴプローブ）を使用して、又は転写物にジゴキシゲニンを取り込ませた直後に転写物を固相上に捕捉するのに、ＰＣＲ−ＥＬＩＳＡを使用してもよい（ワツィンガー．Ｆ．（Watzinger,F.）及びリオン．Ｔ．（Lion,T.）（２００１）核酸研究（Nucleic Acids Res.）、２９、ｅ５２）。捕捉した後に、転写物を、酵素標識アビジン又は標準ＥＬＩＳＡフォーマットに類似の抗ジゴキシゲニンレポーター分子を使用して検出することができる。もう１つの手法は、リアルタイムＰＣＲを用いてレポーター遺伝子の転写を検出することである（マッケイ．Ｉ．Ｍ．（Mackay,I.M.）及びニッチェ．Ａ．（Nitsche,A.）、核酸研究（Nucleic Acids Res.）２００２年３月１５日；３０（６）、１２９２〜３０５）。リアルタイムＰＣＲでは、蛍光発生ヌクレオチドが使用され、ポリメラーゼがレポーター遺伝子を転写する時に転写の進行がリアルタイムで監視される。
【００３３】
レポーター構造体中のプロモーターエレメントは、５’−制御領域と同一の遺伝子から得られるものであってもなくてもよい。一例として、ＩＮＧＡＰ５’−制御領域から得られるエンハンサー／リプレッサー領域、又はＩＮＧＡＰ５’−制御領域から得られるエンハンサー／リプレッサー領域の断片を、異種の最小プロモーターエレメント、例えば、最小ＣＭＶプロモーター（ボシャート（Boshart）他、１９８５）、並びにＴＫ（ノルディーン（Nordeen、１９８８）、ＩＬ−２、及びＭＭＴＶのプロモーターなどの上流にクローニングしてもよい。
【００３４】
遺伝子の転写は、最小プロモーターの周囲から始まる。図４は、哺乳類のＩＮＧＡＰ遺伝子（配列番号：２）について予測される転写開始部位を示す。配列番号：２は、ＴＡＴＡボックス、ＧＣボックス、ＣＡＡＴボックス、及び転写開始部位のような真核細胞のプロモーター認識エレメントを同定する、マーティン・リース（Martin Reese）によって設計された「神経回路網プロモーター予測（Neural Network Promoter Prediction）」プログラムを使用して解析された。これらのプロモーターエレメントは、配列中に様々な距離で隔てられた様々な組み合わせで存在する。このプログラムは、インターネット上で入手可能であり、http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.htmlにある。
【００３５】
レポーター構造体を使用して、ＩＮＧＡＰの発現を単独又は組み合わせで調節する作用因子を同定することができる。このような作用因子には、制御領域に直接結合することによってＩＮＧＡＰの発現を調節するものもある一方、ＩＮＧＡＰ制御領域に結合する転写因子の発現を調節するものもある。
【００３６】
レポーター構造体を、一時的又は安定的に、生体外で、又は膵管を通じて生体内で、宿主細胞にトランスフェクションすることができ、さらにアッセイシステムに導入された試験作用因子にトランスフェクションすることができる。試験作用因子の例には、有機及び無機化学剤、炭水化物、タンパク質、オリゴヌクレオチド、コレシストキニン、機械的に誘発された圧力、並びに膵管閉塞を引き起こす作用因子が挙げられるが、これらに限定されない。レポーター遺伝子産物の発現は、使用されるレポーター遺伝子に適したアッセイによって判定することができる。そのようなアッセイの例には、β−ガラクトシダーゼ又はルシフェラーゼについての発光アッセイ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼについての酵素アッセイ、及び蛍光タンパク質についての蛍光検出が挙げられるが、これらに限定されない。このようなアッセイは、当該技術分野において周知であり、当業者は、選択されたレポーターに適したアッセイを選択することができる。試験作用因子がレポーター遺伝子産物の発現を調節する場合、その試験作用因子がＩＮＧＡＰ発現のモジュレーターとして同定される。好ましくは、増加又は減少レベルは、少なくとも５０％、１００％、２００％、５００％、又は１０００％であるが、統計的に有意ないずれかの変化を調節作用の指標にすることもできる。また当業者は、未処理細胞において、並びにプロモーターのないレポーター遺伝子だけでトランスフェクションされた処理細胞及び未処理細胞において、レポーター遺伝子産物の発現を判定してもよい。このような判定を使用して、発現のバックグラウンドレベルを決定することができる。
【００３７】
また、試験作用因子は、膵臓分泌液の分画によって得ることもできる。膵臓分泌液の代表的な採取方法として、膵管閉塞法を使用することができる。膵臓分泌液は、当該技術分野において周知の方法によって分画することができる。例としては、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用カラム法、及び密度勾配遠心分離法が挙げられる。個々の分画は、本明細書に記載の方法を使用して、レポーター遺伝子の発現を調節する作用因子について検査することができる。個々の分画は、レポーター遺伝子の発現を調節する作用因子を同定するためにさらに分画することができる。同定された試験作用因子を使用して、ＩＮＧＡＰの発現を調節することができる。
【００３８】
宿主細胞は、好適なアッセイシステムにおけるトランスフェクション及びメンテナンスに適したあらゆる細胞であり得る。好適な細胞の例には、哺乳類細胞、ヒト細胞、マウス細胞、ラット細胞、サル細胞、イヌ細胞、ウシ細胞、及びブタ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、使用される細胞はヒト細胞である。細胞は、形質転換細胞株であっても初代細胞であってもよい。また、多くの異なる種類の細胞にわたって制御を監視する場合、全器官エクスプラントを使用してもよい。当該技術分野には、細胞にレポーター構造体のＤＮＡをトランスフェクション又はインフェクションする多くの方法が存在する。そのような方法には、リポフェクション、電気穿孔法、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥデキストラン、遺伝子銃、及び変性ウイルス法（例えば、組換えアデノウイルス又は組換えレトロウイルス）が挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、所与の種類の細胞及びアッセイシステムと併せて使用するのに適した方法を容易に選択することができる。
【００３９】
レポーター構造体は、生体内で膵臓の細胞に直接導入することもできる。レポーター構造体を生体内で膵臓の細胞に導入する方法の例には、逆行性膵管潅流法及び生体内電気穿孔法（ミール（Mir）、２００１）が挙げられる。レポーター構造体は、レポーター遺伝子産物を符号化し、これが生体内で容易に測定される。試験作用因子は、全身投与又は局所投与することができ、生体内でのレポーター遺伝子の発現は、使用される特定のレポーターに適したアッセイによって判定することができる。そのような例には、緑色蛍光タンパク質についての蛍光アッセイが挙げられる。
【００４０】
ＩＮＧＡＰの発現を調節する作用因子の同定方法は、生体外でも遂行することができる。レポーター遺伝子の転写及び／又は翻訳に十分な条件下で、レポーター構造体を生体外で試験作用因子と接触させることができる。そのような方法には、ウサギの網状赤血球溶解産物又はコムギ胚芽抽出物のような構成成分を利用することができる。その後、前述したように、所与のレポーター遺伝子に適したアッセイを用いてレポーター遺伝子の発現レベルを決定することができる。試験作用因子がレポーター遺伝子の発現を調節する場合、その試験作用因子がＩＮＧＡＰ発現のモジュレーターとして同定される。変化の閾値レベルは、前述したように作業者が設定することができる。
【００４１】
代替的に、試験作用因子を、単離して精製されたＩＮＧＡＰ５’−制御ＤＮＡ分子と接触させることもでき、その試験作用因子がＤＮＡ分子に結合するかどうか判定することができる。試験作用因子は、化学剤、タンパク質、又は核酸にすることができる。適切なＩＮＧＡＰ５’−制御ＤＮＡ分子には、配列番号：２のヌクレオチド１〜６５８６、５’−制御領域ＤＮＡ（配列番号：１もしくは配列番号：２３）、又は５’−制御領域のいずれかの断片、好ましくは１つ以上のエンハンサー／リプレッサー結合部位を含有する断片が含まれる。試験作用因子がＤＮＡ断片に結合するかどうか判定する方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）がある。例えば、サンブルック（Sambrook）ら、分子クローニング：実験マニュアル（ＭOLECULAR ＣLONING：Ａ ＬABORATORY ＭANUAL）、第２版、１９８９年、９．５０〜９．５１ページを参照のこと。５’−制御領域の断片は、開示されている塩基配列（配列番号：２）を使用して当該技術分野において周知の方法によって得ることができる。そのような方法の例には、ＰＣＲ、制限酵素による消化、及び化学合成が挙げられる。５’−制御領域（配列番号：１又は２３）内のいずれのＤＮＡ断片も使用することができる。作用因子が結合する正確な場所は、例えば、より小さな断片を利用して試験作用因子に関する結合部位を精密にマッピングすることによって、決定することができる。アッセイにおいて結合する試験作用因子は、調節活性を必要とする他のアッセイにおいてさらに検査することができる。
【００４２】
レポーター遺伝子の発現を増加又は減少させる作用因子は、ＩＮＧＡＰ発現のモジュレーターとして使用することができる。モジュレーターは、そのような調節の必要のある哺乳類に投与することができる。ＩＮＧＡＰ発現の調節が必要な可能性のある哺乳類の例は、膵臓機能が低下している、特に膵島細胞の機能が低下している哺乳類である。そのような哺乳類には、真性糖尿病、耐糖能異常、空腹時血糖異常、高血糖症、肥満症、及び膵機能不全の哺乳類が挙げられる。
【００４３】
ＩＮＧＡＰ発現のモジュレーターとして同定される作用因子は、膵島細胞機能の低下に付随した疾病を処置するためのキットにおいて供給することができる。このキットは、単一又は分割容器内で、単一又は分割用量のＩＮＧＡＰ発現モジュレーターを含む。ＩＮＧＡＰ発現モジュレーターの使用説明書を含めてもよい。この説明書は、単に、読み手にウェブサイト又は他の情報源のような別の場所を参照させるものでもよい。
【００４４】
レポーター遺伝子の発現を増加させる作用因子を使用して、ＩＮＧＡＰの発現を増加させ、膵島細胞機能の低下に関連した疾病状態を処置することができる。レポーター遺伝子の発現を減少させる作用因子を使用して、ＩＮＧＡＰの発現を減少させ、膵島細胞の異常活性に関連した疾病状態又はＩＮＧＡＰ発現の抑制が望まれる疾病を処置することができる。そのような作用因子の例には、ＰＭＡ、ＬＩＦ、インターロイキン−６、オンコスタチンＭ、及び毛様体神経性因子が挙げられるが、これらに限定されない。作用因子には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、鞘内、心室内（intraventricular）、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、非経口、局所、舌下、直腸、又は逆行性膵管潅流法が挙げられるが、これらに限定されない、任意の数の経路で投与することができる。経口投与用の作用因子は、当該技術分野において周知の製薬上許容可能なキャリアを使用して、経口投与に適した用量で配合することができる。このようなキャリアによって、医薬組成物を、哺乳類が摂取する、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル錠、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などに配合できるようになる。静脈内、筋肉内、動脈内、経皮、及び皮下注射用の作用因子は、当該技術分野において周知の製薬上許容可能なキャリアを用いて、哺乳類への注射に適した用量で配合することができる。鼻腔内、局所、及び直腸投与用の作用因子は、当該技術分野において周知の製薬上許容可能なキャリアを用いて、哺乳類への表面投与に適した用量で配合することができる。ＩＮＧＡＰの発現を増加させる必要のある哺乳類には、例えば、真性糖尿病、耐糖能異常、空腹時血糖異常、高血糖症、肥満症、及び膵機能不全の哺乳類が挙げられる。ＩＮＧＡＰの発現を減少させる必要のある哺乳類には、例えば、低血糖症の哺乳類が挙げられる。
【００４５】
以下の実施例は、説明の目的で提示されるものであって、本明細書に開示される発明を制限するものではない。
【実施例】
【００４６】
（実施例１）
（ハムスターＩＮＧＡＰゲノム配列及び構造）
ハムスターのＩＮＧＡＰゲノム配列及び構造は、遺伝子歩行（クロンテック（Clontech））及びＤＮＡ配列決定法によって決定された。遺伝子歩行は、ゲノムＤＮＡにおいて、ｃＤＮＡのような既知の配列からプロモーターに向かって上流に、又は下流に歩行する方法である。この方法は、クローニングされていない、アダプターがライゲーションされた４つのゲノム断片ライブラリーを使用する。次の注目すべき事項を除いて、製造業者が推奨するプロトコルに従う：すなわち、クローニングされていない、アダプターがライゲーションされたゲノム断片ライブラリーの形成には、ハムスターのゲノムＤＮＡを使用した。
【００４７】
クローニングされていない、アダプターがライゲーションされたゲノム断片ライブラリーを形成するために、ハムスター細胞からゲノムＤＮＡを精製した。４つの別個のアリコートを、ＰｖｕＩＩ、ＳｔｕＩ、ＤｒａＩ、又はＥｃｏＲＶによって完全に消化した。消化、制限酵素の不活性化、及び脱ホスホリル化の後、ＤＮＡ断片の別個のプールそれぞれをアダプターにライゲーションさせた。図５を参照のこと。ライゲーション反応に必要なリン酸塩基をもたらすために、アダプターをリン酸化させた。また、短いアダプターの３−プライム側が、アダプターのコンカテマー形成を防ぐためにアミン基を含有することにも留意すべきである。
【００４８】
既知の塩基配列の各領域（すなわち、ＩＮＧＡＰ遺伝子のエクソン）について、２つの遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ１及びＧＳＰ２）を設計した。断片の場所、並びにＧＳＰ１及びＧＳＰ２の場所については、図６を参照のこと。遺伝子特異的プライマーは、断片１＿２及び１４＿５を除く全ての断片についてリバースＰＣＲプライマーとして設計された。断片１＿２及び１４＿５についての遺伝子特異的プライマーは、フォワードプライマーとして設計された。アダプタープライマー１（ＡＰ１）及びアダプタープライマー２（ＡＰ２）（図５）は、リバースＰＣＲプライマーである断片１＿２及び１４＿５を除き、全ての断片についてフォワードＰＣＲプライマーであった。ＰＣＲ反応において、外側の遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ１）をアダプタープライマー１とともに使用した。特異性を増大させるために、内側の遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ２）及びアダプタープライマー２を使用して、第２のネステッドＰＣＲを調製した。第１反応の小さなアリコートは、第２反応のテンプレートの働きをした。遺伝子歩行に用いた遺伝子特異的ＰＣＲプライマーを表２に記載し、ＩＮＧＡＰゲノム塩基配列の構築に使用した方策を図６及び図７に示す。図６の矢じりは、アダプタープライマー（ＡＰ１及びＡＰ２）を表し、丸は、遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ１及びＧＳＰ２）を表す。
【００４９】
【表２】
2005514930.tif 000003
ＰＣＲ断片の配列を決定して、ＩＮＧＡＰ５’−制御領域、イントロン、イントロン／エクソン接合部、及び３−プライムポリアデニル化領域のヌクレオチド配列を決定した。ハムスターＩＮＧＡＰゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列は、配列番号：２に示されている。
【００５０】
（実施例２）
（レポーター構造体へのハムスターＩＮＧＡＰ５’−制御領域断片のクローニング）
ＩＮＧＡＰ５’−制御領域を構築するために、個々のＰＣＲ断片を、２つの隣接断片内に位置するユニークな制限部位のところで一緒に接合した。図６及び図７は、ＩＮＧＡＰ５’−制御領域を１つにつなぎ合わせるのに使用された方策の詳細を示す。断片８＿３及び２＿３は、ユニークなＳｐｈＩ部位で接合され；１４＿３及び８＿３は、ユニークなＢｂｓＩ部位で接合され；１６＿３及び１４＿３は、ユニークなＰｓｔＩ部位で接合された。ハムスターＩＮＧＡＰ５’−制御領域ＤＮＡのヌクレオチド配列は、配列表の配列番号：１及び２３に示されている。
【００５１】
ハムスターＩＮＧＡＰ５’−制御領域又は５’−制御領域の断片は、レポータープラスミドであるｐβＧａｌ−塩基（Basic）（クロンテック（Clontech））にクローニングされた。５’−制御領域又は断片は、遺伝子歩行アダプタープライマーから得られるユニークなＸｍａＩ部位、及び制御領域の３−プライム部位に位置するユニークなＢｇｌＩＩ部位を利用してクローニングされた。図８は、ｐβＧａｌ−塩基にクローニングされた断片の詳細を示している。断片のサイズは、断片の右側に示され、断片のヌクレオチドの数として表されている。
【００５２】
（実施例３）
（ＩＮＧＡＰの発現を調節する因子をスクリーニングするためのアッセイシステム）
ＩＮＧＡＰのプロモーター解析で、共通転写因子結合部位を含めた潜在的プロモーター近位調節部位がいくつか確認された；すなわち、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）、ＡＰ−１、及びＳＴＡＴである。プロモーター断片レポーター遺伝子構造体を、２９３Ｔ細胞に一時的にトランスフェクションし、分泌アルカリホスファターゼの共トランスフェクションを使用して、トランスフェクション効率を標準化した。
【００５３】
ＩＮＧＡＰ５’−制御領域断片である、２＿３ｓＰ（配列番号：３７）、２＿３ｄＰ（配列番号：３８）、２＿３ｐＰ（配列番号：３６）、１４＿３Ｐ（配列番号：３４）、１６＿３Ｐ（配列番号：３１）、又は１９＿３Ｐ（配列番号：２３）を含有するレポーター構造体を、ヒト細胞にトランスフェクションした。また、ハムスターＩＮＧＡＰ  ＤＮＡをもたないｐβＧａｌ−塩基プラスミドも、内生レポーター活性のレベルを評価するためのコントロールとしてヒト細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションから２日後、細胞をＰＭＡで２４時間処理したか、又は処理しなかった。プロモーター活性レベルを決定するために、β−ガラクトシダーゼについての発光アッセイを用いてβ−ガラクトシダーゼ遺伝子産物の量を決定した。図９Ａは、構造体１４＿３Ｐが最も強くＩＮＧＡＰの発現を活性化し、次が２＿３ｐＰ及び１６＿３Ｐであったことを示している。
【００５４】
ＩＮＧＡＰ５’−制御領域ＤＮＡヌクレオチド２０３０〜３１２０を含有するレポーター構造体を、ヒト細胞にトランスフェクションした。また、ハムスターＩＮＧＡＰ  ＤＮＡをもたないｐβＧａｌ−塩基プラスミドも、内生レポーター活性のレベルを評価するためのコントロールとしてヒト細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションから２日後、細胞をＬＩＦで２４時間処理したか、又は処理しなかった。プロモーター活性レベルを決定するために、β−ガラクトシダーゼについての発光アッセイを用いてβ−ガラクトシダーゼ遺伝子産物の量を決定した。図９Ｂは、その結果を示している。ＬＩＦが、哺乳類ＩＮＧＡＰの５’−制御領域の活性を増加させることが判定された。フォルスコリン（ｃＡＭＰ／ＣＲＥＢ／ＣＲＥの活性化因子）は、遺伝子の発現を調節しなかった（データは示さず）。
【００５５】
ヒト細胞内に存在する時に、ハムスターＩＮＧＡＰ５’−制御領域はヒト転写因子によって転写促進されることに留意することが重要である。したがって、レポーター遺伝子に連結させると、ハムスターＩＮＧＡＰの５’−制御領域は、ＩＮＧＡＰの発現を調節する因子についてスクリーニングするための感度の高いアッセイシステムを形成する。
【００５６】
（実施例４）
（５’−制御領域におけるＰＭＡ及びＬＩＦを介した転写因子の結合のおよその場所の決定）
ＰＭＡ開始型又はＬＩＦ開始型の転写因子結合のおよその場所をマッピングするために、ハムスターＩＮＧＡＰ５’−制御領域の様々な断片を、ｐβＧａｌ−塩基にクローニングした。図８を参照のこと。レポーター構造体にクローニングされた断片は、２＿３ｓＰ（配列番号：３７）、２＿３ｄＰ（配列番号：３８）、２＿３ｐＰ（配列番号：３６）、１４＿３Ｐ（配列番号：３４）、１６＿３Ｐ（配列番号：３１）、又は１９＿３Ｐ（配列番号：２３）であった。レポーター構造体をヒト細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションから２日後、細胞を様々な濃度のＰＭＡ又はＬＩＦで２４時間処理した。使用されたＰＭＡの濃度は、６ｎｇ／ｍｌ、１７ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、又は３００ｎｇ／ｍｌであった。使用されたＬＩＦの濃度は、１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、又は３０ｎｇ／ｍｌであった。プロモーター活性レベルを決定するために、β−ガラクトシダーゼの発光アッセイを用いてβ−ガラクトシダーゼ遺伝子産物の量を決定した。図１０及び図１１は、それぞれＰＭＡ及びＬＩＦ処理に関する結果を示す。ＰＭＡ及びＬＩＦの両方が細胞のレポーター構造体を活性化した。ＤＮＡ接触部位の正確な場所は、より小さな断片のハムスターＩＮＧＡＰ５’−制御領域をクローニングすることによって、また、部位指定突然変異又は欠失によって、さらに狭めることができる。
【００５７】
（実施例５）
（ＩＮＧＡＰ遺伝子の発現増加（upregulation）のＲＮＡ解析）
ＩＮＧＡＰのＲＮＡレベルが、ＳＴＡＴを通じてシグナルを発生するサイトカインによって刺激された後で増加するかどうか判定するために、ラットのアンフォクライン（amphocrine）膵臓細胞であるＡＲ４２ＪをＩＬ−６（１０００Ｕ／ｍｌ）で２４時間処理した。当該技術分野において周知の技術、例えば、トライゾール（TRIzol）（登録商標）試薬を使用して、処理細胞及び未処理細胞から総ＲＮＡを抽出した。
【００５８】
同量の総ＲＮＡ（１０μｇ）を２．５％ホルムアルデヒドゲルに取り込ませ、循環ポンプを用いてバッファを一定して循環させながら７０Ｖで４時間電気泳動した。ゲルを写真撮影し、室温において水で２回洗浄し、２０倍のＳＳＣに浸した。標準的な手順に続いて、ゲルをナイロン膜（アマーシャム（Amersham））に移動し、２０倍のＳＳＣ中に一晩置いた。膜を２０倍のＳＳＣで洗浄して、膜に付着していた可能性のある寒天を除去し、８０℃で４時間焼いた。
【００５９】
ランダム・プライム標識キット（Random Prime Labeling kit）（ロシュ−ＢＭＢ（Roche-BMB））及びα−Ｐ32ｄＣＴＰ（ＩＣＮ）を使用して、１００ナノグラムのハムスターＩＮＧＡＰのｃＤＮＡを標識した。標準的な手順に続いて、約２０００万カウントを使用し、一晩４２℃において２０ｍｌハイブリダイゼーションバッファ中でハイブリダイゼーションを実施した。ブロットを次のように洗浄した：２倍のＳＳＣを用いて室温で２回、それぞれ１０分間洗浄；２倍のＳＳＣを用いて４２℃で２回、それぞれ１０分間洗浄；１倍のＳＳＣを用いて５５℃で２回、それぞれ１０分間洗浄。膜をフィルム（ＸＯＭＡＴ−コダック（Kodak））に露光させ、一晩−８０℃に維持してから現像した。
【００６０】
ＩＬ−６で処理したところ、ＩＮＧＡＰ遺伝子の発現が増加した（図１２）。これらのデータは、ＡＰ−１−結合転写因子及びＳＴＡＴ−結合転写因子を高める細胞外因子が、ＩＮＧＡＰ遺伝子の発現の制御に関与していることを実証している。これらの研究は、膵島新生を誘発させる手段として、ＩＮＧＡＰの発現の向上が適していることを示唆している。
【００６１】
本発明の特定の実施形態について説明し記載したが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく他の様々な変更及び修正が可能であることが、当業者には自明である。したがって、本発明の範囲内にあるそのような全ての変更及び修正を添付の特許請求の範囲で扱うものとする。
【００６２】
【表３−１】
2005514930.tif 000004
【００６３】
【表３−２】
2005514930.tif 000005
【００６４】
【表３−３】
2005514930.tif 000006
【００６５】
【表３−４】
2005514930.tif 000007
【００６６】
【表３−５】
2005514930.tif 000008
【００６７】
【表３−６】
2005514930.tif 000009
【００６８】
【表３−７】
2005514930.tif 000010
【００６９】
【表３−８】
2005514930.tif 000011
【００７０】
【表３−９】
2005514930.tif 000012
【００７１】
【表３−１０】
2005514930.tif 000013
【００７２】
【表３−１１】
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【００７３】
【表３−１２】
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【００７４】
【表３−１３】
2005514930.tif 000016
【００７５】
【表３−１４】
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【００７６】
【表３−１５】
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【００７７】
【表３−１６】
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【００７８】
【表３−１７】
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【００７９】
【表３−１８】
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【００８０】
【表３−１９】
2005514930.tif 000022
【００８１】
【表３−２０】
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【００８２】
【表３−２１】
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【００８３】
【表３−２２】
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【００８４】
【表３−２３】
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【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】ハムスターＩＮＧＡＰ遺伝子構造の注釈。イントロン１〜５の境界は、表１に記載されている。
【図２】十分に特徴化された周知である多くの転写因子結合部位を示す、ハムスターＩＮＧＡＰ遺伝子の５’制御領域（配列番号：２のヌクレオチド１〜３１３７）の概観を示す図。最小プロモーターエレメントは、下線を記した領域（ＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、及びＧＣボックス）を含有する。
【図３】ハムスターＩＮＧＡＰ遺伝子の５’制御領域（配列番号：１）のヌクレオチド１〜３１２３に関する、十分に特徴化された周知である多くの転写因子結合部位の略図。表３は、これらの転写因子結合部位をさらに記載している。
【図４】ハムスターＩＮＧＡＰ遺伝子（配列番号：２）の５’制御領域（配列番号：１）内の予測される転写開始部位を示す図。予測される開始部位は、太字体のヌクレオチドによって示されている。プロモーター配列について、開始及び終止ヌクレオチド番号が示されている。これらの番号は、ハムスターＩＮＧＡＰ遺伝子（配列番号：２）のヌクレオチド番号を指す。
【図５】遺伝子歩行において使用されるアダプタープライマー構造及び配列を示す図。アダプタープライマー１（ＡＰ１）及びアダプタープライマー２（ＡＰ２）が示されている。
【図６】ハムスターＩＮＧＡＰ遺伝子を再構築するための方策を示す図。ハムスターＩＮＧＡＰ遺伝子は、遺伝子歩行技術を用いて再構築された。遺伝子歩行のためのＰＣＲ増幅において使用される、断片及び遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ１及びＧＳＰ２）が示されている。断片は、各断片内の特有の制限酵素部位を使用して１つに接合された。個々のプライマーのヌクレオチド配列は、表２に記載されている。
【図７】ハムスターＩＮＧＡＰ遺伝子を再構築するための方策を示す図。ハムスターＩＮＧＡＰ遺伝子は、遺伝子歩行技術を用いて再構築された。遺伝子歩行のためのＰＣＲ増幅において使用される、断片及び遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ１及びＧＳＰ２）が示されている。断片は、各断片内の特有の制限酵素部位を使用して１つに接合された。個々のプライマーのヌクレオチド配列は、表２に記載されている。
【図８】β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子のｐβＧａｌ−塩基の上流にクローニングされた、ＩＮＧＡＰ５’制御領域の断片を示す図。左側の標示は、ｐβＧａｌ−塩基の上流にクローニングされた、配列番号：２３のヌクレオチド断片を指す。
【図９Ａ】βガラクトシダーゼレポーター遺伝子（ｐβＧａｌ−塩基）の上流にクローニングされたハムスターＩＮＧＡＰ  ＤＮＡの５’制御領域（配列番号：２３）の様々な断片を含有するレポーター構造体によってトランスフェクションされたヒト胚腎臓細胞（２９３Ｔ）、又はＩＮＧＡＰ  ＤＮＡを含有しないレポーター構造体におけるレポーター活性を示す図。細胞は、ホルボールミリステートアセテートによって刺激される。プロモーター活性は、β−ガラクトシダーゼ発光アッセイを用いて細胞中に存在するβ−ガラクトシダーゼのレベルを決定することによって評価される。
【図９Ｂ】βガラクトシダーゼレポーター遺伝子の上流にクローニングされたハムスターＩＮＧＡＰの５’制御領域（配列番号：２３）のヌクレオチド２０３０〜３１３７を含有するレポーター構造体によってトランスフェクションされたヒト胚腎臓細胞（２９３Ｔ）、又はＩＮＧＡＰ  ＤＮＡを含有しないレポーター構造体におけるレポーター活性を示す図。細胞は、白血病阻害因子によって刺激される。プロモーター活性は、β−ガラクトシダーゼ発光アッセイを用いて細胞中に存在するβ−ガラクトシダーゼのレベルを決定することによって評価される。
【図１０】βガラクトシダーゼレポーター遺伝子の上流にクローニングされたハムスターＩＮＧＡＰの５’制御領域の様々な断片（図８参照）を含有するレポーター構造体によってトランスフェクションされた、ヒト胚腎臓細胞（２９３Ｔ）におけるレポーター活性を示す図。細胞は、ホルボールミリステートアセテートによって刺激される。使用されるＰＭＡの濃度は、６ｎｇ／ｍｌ、１７ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、又は３００ｎｇ／ｍｌである。プロモーター活性は、β−ガラクトシダーゼ発光アッセイを用いて細胞中に存在するβ−ガラクトシダーゼのレベルを決定することによって評価される。
【図１１】βガラクトシダーゼレポーター遺伝子の上流にクローニングされたハムスターＩＮＧＡＰの５’制御領域の様々な断片（図８参照）を含有するレポーター構造体によってトランスフェクションされた、ヒト胚腎臓細胞（２９３Ｔ）におけるレポーター活性を示す図。細胞は、ヒト白血病阻害因子（ｈＬＩＦ）によって刺激される。使用されるｈＬＩＦの濃度は、１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、又は３０ｎｇ／ｍｌである。プロモーター活性は、β−ガラクトシダーゼ発光アッセイを用いて細胞中に存在するβ−ガラクトシダーゼのレベルを決定することによって評価された。
【図１２】サイトカインＩＬ−６で処理された、又は未処理の、ラットのアンフィクライン（amphicrine）膵臓細胞であるＡＲ４２ＪにおけるＩＮＧＡＰ遺伝子の発現増加（upregulation）に関するＲＮＡ解析を示す。総ＲＮＡは、ＩＮＧＡＰ遺伝子についてのノーザン（Northern）解析によって調査される。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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