(57)【要約】１．以下（ａ）〜（ｄ）：（ａ）SK-3カルシウム依存性カリウムチャネル・ポリペプチド；（ｂ）SK-3カルシウム依存性カリウムチャネル・ポリペプチドを活性化する化合物；（ｃ）SK-3カルシウム依存性カリウムチャネル・ポリペプチドを阻害する化合物；または（ｄ）SK-3カルシウム依存性カリウムチャネル・ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；から選択される化合物の、（i）男性もしくは女性の生殖器の機能不全；または（ii）狭心症、卒中および高血圧などの血管障害；を治療するための医薬の製造における使用。２．前記医薬が性的機能不全および血管障害の治療に使用される、上記１の使用。３．前記医薬がSK-3カルシウム依存性カリウムチャネル・ポリペプチドを特異的に活性化または阻害する化合物を含む、上記１の使用。４．男性もしくは女性の生殖器の機能不全または狭心症、卒中および高血圧などの血管障害を治療するための医薬の製造において使用するための、SK-3カルシウム依存性カリウムチャネル・ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストとして働く化合物をスクリーニングする方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）SK-3カルシウム依存性カリウムチャネル・ポリペプチド；
（ｂ）SK-3カルシウム依存性カリウムチャネル・ポリペプチドを活性化する化合物；
（ｃ）SK-3カルシウム依存性カリウムチャネル・ポリペプチドを阻害する化合物；
または
（ｄ）SK-3カルシウム依存性カリウムチャネル・ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
から選択される化合物の、
（i）男性もしくは女性の生殖器の機能不全；
または
（ii）狭心症、卒中および高血圧などの血管障害；
を治療するための医薬の製造における使用。
【請求項２】
前記医薬が性的機能不全および血管障害の治療に使用されるものである、請求項１記載の使用。
【請求項３】
前記医薬がSK-3カルシウム依存性カリウムチャネル・ポリペプチドを特異的に活性化または阻害する化合物を含む、請求項１記載の使用。
【請求項４】
男性もしくは女性の生殖器の機能不全または狭心症、卒中および高血圧などの血管障害を治療するための医薬の製造において使用するための、SK-3カルシウム依存性カリウムチャネル・ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストとして働く化合物をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、SK-3カルシウム依存性カリウムチャネル・ポリヌクレオチドおよびそれによりコードされるポリペプチドの新規用途、男性および女性の性的機能不全および血管障害の治療ならびに治療に有用な化合物の同定におけるそれらの使用、に関する。
【背景技術】
【０００２】
様々な細胞タイプにおいて、細胞内Ca2+の上昇はカルシウム依存性K＋チャネルによる膜の過分極と関連している。単一のコンダクタンスと薬理学的特性を基準とし、さらについ最近の関連遺伝子の同定によれば、３タイプのカルシウム依存性カリウム（KCa）チャネルが知られている。これらはBK（大コンダクタンス）、IK（中コンダクタンス）およびSK（小コンダクタンス）である。BKである孔形成性βサブユニットは、ある1つの遺伝子、すなわちhSloによりコードされている。このhSloタンパク質は、SKやIKとの配列類似性が殆ど無い。種々の組織におけるその活性は、少なくとも4種のβサブユニットにより調節されている(Meera et al., 2000; Brenner et al. 2000)。IKチャネルはSKと同じ遺伝子ファミリーに属しており、これらは互いに約40％の配列同一性を有する。SKチャネルは3種のメンバー、すなわちSK-1、SK-2およびSK-3からなり、これらは互いに60〜70％の配列同一性を有する。これらのチャネルは各々、6個の膜貫通ドメイン、孔形成領域、ならびに細胞内N末端およびC末端を有する(Kohler et al. 1996)。カルモジュリンはこのC末端に近接した部分に構成的に結合し、Ca２＋センサーとして働く(Xia et al., 1998)。SKチャネルはハチ毒であるアパミンで阻害することができるが、IKチャネルとBKチャネルは阻害されない。まさにこれが、SKチャネルの決定的な特徴である。何故なら、アパミンは非常に特異的かつ選択的であり、試験では他の全てのチャネルタイプに対して不活性であることが証明されているからである。SK-1、SK-2およびSK-3チャネルをコードする遺伝子のクローニングについては、Terstappen et. al. Neuropharmacology 40:772-783(2001)に記載されている。
【０００３】
アパミン感受性K＋チャネルは、陰茎海綿体を含む多くのタイプの平滑筋に存在する(Prieto et al. 1998; Ayajiki et al. 2001)。SKチャネルが開くと膜の過分極が生じ、それに伴って電位依存性カルシウムチャネルを介したカルシウムの流入が減少することにより平滑筋が弛緩する。SK-3サブタイプは結腸の平滑筋、特にカハール介在細胞(Fujita et al. 2001; Ro et al. 2001)で発現されるが、これまで血管平滑筋で観察されたことは無い。アパミン、および別のSKチャネル・アンタゴニストであるシラトキシン（scyllatoxin）は、一酸化窒素非依存性の作用機序を介してイヌ陰茎海綿体平滑筋におけるアセチルコリン誘導性の平滑筋弛緩を抑制する。このことは、SKチャネルがこの組織において重要な役割を担っていることを示唆している。また、アパミンはウマ陰茎海綿体小動脈のアセチルコリン誘導性弛緩も弱める。非選択的SK／IKチャネルオープナーであるEBIOは、血管平滑筋の過分極と弛緩を誘導する。
【０００４】
これらの報告にもかかわらず、いかなるSKチャネルのサブタイプが男性および女性の生殖組織および血管平滑筋に存在するかということは未だ知られていない。
【発明の開示】
【０００５】
発明の概要
１態様では、本発明は、Terstappen et. al. Neuropharmacology 40:772-783(2001)に開示されたSK-3カルシウム依存性カリウムチャネル・ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの新規用途に関する。かかる用途には、特に、以後本明細書中で「疾患」と称する勃起機能不全や血管障害の治療が含まれる。さらに別の態様では、本発明は、本発明により提供される材料を用いてモジュレート化合物（アゴニストおよびアンタゴニスト）を同定する方法、およびその同定した化合物を用いてSK-3カルシウム依存性カリウムチャネルに関連する病的状態を治療する方法に関する。
【０００６】
配列の簡単な説明
配列番号１は、SK-3カルシウム依存性カリウムチャネル・ポリヌクレオチドのコード配列である［EMBLアクセッション番号AJ251016 (Terstappen et al., 2001)］。
【０００７】
配列番号２は、SK-3カルシウム依存性カリウムチャネルのアミノ酸配列である。
【０００８】
発明の説明
第１の態様では、本発明は、以下（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）SK-3カルシウム依存性カリウムチャネル・ポリペプチド；
（ｂ）SK-3カルシウム依存性カリウムチャネル・ポリペプチドを活性化する化合物；
（ｃ）SK-3カルシウム依存性カリウムチャネル・ポリペプチドを阻害する化合物；
または
（ｄ）SK-3カルシウム依存性カリウムチャネル・ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
から選択される化合物の、
（i）男性もしくは女性の生殖器の機能不全；
または
（ii）狭心症、卒中および高血圧などの血管障害；
を治療するための医薬の製造における使用に関する。
【０００９】
かかるSK-3カルシウム依存性カリウムチャネル・ポリペプチドには、配列番号２の全長にわたり、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の同一性、好ましくは少なくとも97〜99％の同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドが含まれる。かかるポリペプチドには、配列番号２のアミノ酸を含むポリペプチドが含まれる。
【００１０】
さらなるポリペプチドには、該ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号２の全長にわたり、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の同一性、好ましくは少なくとも97〜99％の同一性を有する単離されたポリペプチドが含まれる。かかるポリペプチドには、配列番号２のポリペプチドが含まれる。また、配列番号１に含有される配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドも含まれる。
【００１１】
本発明で使用するためのポリペプチドは、「成熟」タンパク質形態であっても、または前駆体や融合タンパク質といったより大きなタンパク質の一部であってもよい。分泌配列やリーダー配列、プロ配列、複数のヒスチジン残基などの精製時に役立つ配列、または組換え体作製時の安定性を付与する追加配列を含有する付加的アミノ酸配列を含んでいると、都合が良いことが多い。
【００１２】
本発明で使用するためのポリペプチドは、任意の適切な手法で調製することができる。かかるポリペプチドには、単離された天然のポリペプチド、組換えにより作製されたポリペプチド、合成により作製されたポリペプチド、またはこれらの方法を組み合わせることにより作製されたポリペプチドが含まれる。かかるポリペプチドを調製するための手段は、当分野で十分に理解されている。
【００１３】
さらに別の態様では、本発明はSK-3カルシウム依存性カリウムチャネル・ポリヌクレオチドの使用に関する。かかるポリヌクレオチドには、配列番号２の全長にわたり、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドが含まれる。この点では、少なくとも97％の同一性を有するポリペプチドが非常に好ましいが、少なくとも98〜99％の同一性を有するものがより好ましく、また少なくとも99％の同一性を有するものが最も好ましい。かかるポリヌクレオチドには、配列番号２のポリペプチドをコードする、配列番号１に含有されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが含まれる。
【００１４】
本発明で使用するためのさらなるポリヌクレオチドには、配列番号２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して、その全長コード領域にわたり少なくとも95％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドが含まれる。この点では、少なくとも97％の同一性を有するポリヌクレオチドが非常に好ましいが、少なくとも98〜99％の同一性を有するものがより好ましく、また少なくとも99％の同一性を有するものが最も好ましい。
【００１５】
本発明で使用するためのさらなるポリヌクレオチドには、配列番号１の全長にわたり、配列番号１に対して少なくとも95％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドが含まれる。この点では、少なくとも97％の同一性を有するポリヌクレオチドが非常に好ましいが、少なくとも98〜99％の同一性を有するものがより好ましく、また少なくとも99％の同一性を有するものが最も好ましい。かかるポリヌクレオチドには、配列番号１のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、ならびに配列番号１のポリヌクレオチドが含まれる。
【００１６】
配列番号１のヌクレオチド配列は、ヒトSK-3カルシウム依存性カリウムチャネルをコードするcDNA配列である(Chandy et. al., Mol. Psychiatry 3:32-37(1998); Terstappen et. al. Neuropharmacology 40:772-783(2001))。配列番号１のヌクレオチド配列は736個のアミノ酸からなるポリペプチド、すなわち配列番号２のSK-3カルシウム依存性カリウムチャネル・ポリペプチドをコードするポリペプチドコード配列（ヌクレオチド334〜2544）を含む。配列番号２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１に含有されるポリペプチドコード配列と同一であってもよいし、あるいは遺伝暗号の重複（縮重）の結果としてやはり配列番号２のポリペプチドをコードするが、配列番号１に含有される配列とは異なる配列であってもよい。配列番号２のポリペプチドはヒトSK-3カルシウム依存性カリウムチャネルタンパク質である(Chandy et. al., Mol. Psychiatry 3:32-37(1998); Terstappen et. al. Neuropharmacology 40:772-783(2001))。
【００１７】
本発明で使用するための好適なポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、特にその相同ポリペプチドおよびポリヌクレオチドと同様の生物学的機能／特性を有すると予想されるものである。さらに、本発明の好適なポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、少なくとも１種のSK-3カルシウム依存性カリウムチャネル活性を有する。
【００１８】
本発明で使用するためのポリヌクレオチドは、標準的なクローニング技術およびスクリーニング技術を用いて、哺乳動物起源の細胞または組織中のmRNAから得られたcDNAライブラリーから取得してもよい(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.  (1989))。また、本発明で使用するためのポリヌクレオチドは、ゲノムDNAライブラリーなどの天然の供給源から取得することもできるし、周知技術および商業的に利用可能な技術を利用して合成することもできる。
【００１９】
上記ポリヌクレオチドを、本発明で使用するためのSK-3カルシウム依存性カリウムチャネル・ポリペプチドを組換え生産するために使用してもよい。該ポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチドのコード配列を単独で含んでもよいし、あるいは該成熟ポリペプチドのコード配列を、リーダー配列もしくは分泌配列、プレ-、プロ-もしくはプレプロ-タンパク質配列、または他の融合ペプチド部分をコードする配列などの他のコード配列と共にリーディングフレーム中に含んでいてもよい。例えば、融合ポリペプチドの精製を容易にするマーカー配列をコードしていてもよい。本発明のこの態様における特定の好適な実施形態では、該マーカー配列は、pQEベクター(Qiagen, Inc.)内に提供されかつGentz et al., Proc Natl Acad Sci USA (1989) 86:821-824に記載されているヘキサヒスチジンペプチド、またはHAタグである。また該ポリヌクレオチドは、転写されるが翻訳はされない配列などの非コード5’および3’配列、スプライシングシグナルおよびポリアデニル化シグナル、リボソーム結合部位ならびにｍRNA安定化配列を含有していてもよい。
【００２０】
本発明で使用するための組換えポリペプチドは、当分野で周知の方法により、遺伝子操作した発現ベクター含有宿主細胞から調製してもよい。無細胞翻訳系を使用し、本発明のDNA構築物に由来するRNAを用いることにより、かかるタンパク質を製造してもよい。
【００２１】
組換え体製造のために、宿主細胞を遺伝子操作してSK-3カルシウム依存性カリウムチャネル・ポリヌクレオチドの発現ベクターまたはその一部を組み込むことができる。ポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は、Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986)およびSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載された方法により達成することができる。かかる方法の好適なものとしては、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション法、電気穿孔法、または感染がある。
【００２２】
適切な宿主の代表例としては、細菌細胞、酵母細胞；ショウジョウバエS2やスポドプテラ(Spodoptera)Sf9細胞などの昆虫細胞；または好ましくはCHO、COS、HeLaもしくはHEK293などの動物細胞がある。
【００２３】
多種多様な発現ベクターを使用することが可能であり、かかるベクターとしては、例えば染色体、エピソームおよびウイルス由来の系、例えば細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入因子、酵母染色体エレメント、およびウイルス（バキュロウイルス、SV40などのパポーバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスやレトロウイルスなど）に由来するベクター、ならびに前出のものの組み合わせに由来するベクター（例えばプラスミドとバクテリオファージの遺伝要素（コスミドとファージミドなど）に由来するベクター）がある。該発現系は、発現を調節したり引き起こしたりする制御領域を含有していてもよい。一般に、ポリヌクレオチドを維持、伝達もしくは発現させて宿主細胞内にポリペプチドを産生させることのできる系またはベクターはいずれも使用することができる。例えばSambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual（上掲）に記載されているような周知でかつ慣例的に使用される様々な技術のいずれかを利用することにより、適切なヌクレオチド配列を発現系に挿入することができる。適切な分泌シグナルを所望のポリペプチドに組み込むことにより、翻訳されたタンパク質を小胞体内腔、細胞周辺腔、または細胞外環境内に分泌させてもよい。これらのシグナルは該ポリペプチドにとって内在性のものであっても、または異種性のシグナルであってもよい。
【００２４】
本発明のポリペプチドは、硫安もしくはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法により、組換え細胞培養物から回収ならびに精製することができる。最も好ましくは、精製時に高速液体クロマトグラフィーを使用する。ポリペプチドが単離および／または精製中に変性する場合には、タンパク質をリフォールディングするための周知技術を用いてその活性型高次構造を再生してもよい。
【００２５】
SK-3カルシウム依存性カリウムチャネル・ポリペプチドは、男性もしくは女性の生殖器の機能不全などの疾患状態、または狭心症、卒中および高血圧などの血管障害と直接または間接的に関わっていると考えられている。例えば、かかる疾患状態においては、SK-3カルシウム依存性カリウムチャネル・ポリペプチドは過小発現されているか、不適切に刺激されているか、または過剰発現されている可能性がある。このため、SK-3カルシウム依存性カリウムチャネル・ポリペプチドを活性化または阻害しうる化合物を同定するためのスクリーニング方法を考案することが望まれている。従って、さらに別の態様では、本発明は、SK-3カルシウム依存性カリウムチャネル・ポリペプチドをモジュレートする、すなわち活性化（アゴニスト）または阻害（アンタゴニスト）する化合物を同定するための、化合物のスクリーニング方法を提供する。SK-3カルシウム依存性カリウムチャネルモジュレーターは、SK-3カルシウム依存性カリウムチャネル・アゴニストであるかまたはSK-3カルシウム依存性カリウムチャネル・アンタゴニストである。
【００２６】
一般に、アゴニストおよびアンタゴニストの両方を含むモジュレーターを、治療および予防目的で上記のような疾患に用いることができる。
【００２７】
SK-3チャネル・アゴニストは、直接または間接的な作用機序を介してSK-3カルシウム依存性カリウムチャネルを活性化する化合物である。SK-3カルシウム依存性カリウムチャネルは、該チャネルが開いてカリウムイオンが該チャネルを通って流入可能な場合に活性化される。SK-3カルシウム依存性カリウムチャネル・アゴニストは、SK-3チャネルだけでなくIK、SK-1および／またはSK-2チャネルも活性化しうる。好ましくは、SK-3カルシウム依存性カリウムチャネル・アゴニストはSKチャネルを選択的に活性化する。SKチャネルを選択的に活性化する化合物は、SKチャネルを活性化するが、IKチャネルは活性化しないか、またはより弱く活性化する。より好ましくは、SK-3カルシウム依存性カリウムチャネル・アゴニストはSK-3チャネルを選択的に活性化する。SK-3チャネルを選択的に活性化する化合物は、SK-3チャネルを活性化するが、SK-1およびSK-2チャネルは活性化しないか、またはより低い程度でしか活性化しない。好ましくは、SK-3カルシウム依存性カリウムチャネル・アゴニストは活動依存性である。該アゴニストはSK-3カルシウム依存性カリウムチャネルに対するカルシウムイオンの親和性を高めるか、または該チャネルをその開口状態にて安定させる（チャネルの閉口を妨げる）。SK-3カルシウム依存性カリウムチャネル・アゴニストは膜電位の低下を引き起こし、平滑筋細胞内へのカルシウムの流入を減らす。また、カルシウム依存性カリウムSK-3アゴニストは、恐らくはこれらの作用機序を介して、血管と陰茎海綿体の平滑筋の弛緩を引き起こす。
【００２８】
SK-3カルシウム依存性カリウムチャネル・アンタゴニストは、直接または間接的な作用機序を介してSK-3チャネルを阻害する化合物である。SK-3カルシウム依存性カリウムチャネルは、該チャネルを介したカリウムイオンの流れが妨げられた場合に阻害される。SK-3カルシウム依存性カリウムチャネル・アンタゴニストは、SK-3チャネルだけでなくIK、SK-1および／またはSK-2チャネルも阻害する可能性がある。好ましくは、SK-3カルシウム依存性カリウムチャネル・アンタゴニストはSKチャネルを選択的に阻害する。SKチャネルを選択的に阻害する化合物は、SKチャネルを阻害するが、IKチャネルは阻害しないか、またはより弱く阻害する。より好ましくは、SK-3カルシウム依存性カリウムチャネル・アンタゴニストはSK-3カルシウム依存性カリウムチャネルを選択的に阻害する。SK-3カルシウム依存性カリウムチャネルを選択的に阻害する化合物は、SK-3カルシウム依存性カリウムチャネルを阻害するが、SK-1およびSK-2チャネルは阻害しないか、またはより弱い程度でのみ活性化する。SK-3カルシウム依存性カリウムチャネル・アンタゴニストは平滑筋細胞内へのカルシウムの流入を間接的に高め、血管と陰茎海綿体の平滑筋の収縮を引き起こす。
【００２９】
モジュレート化合物は、様々な供給源、例えば細胞、無細胞調製物、化学ライブラリー、および天然物の混合物から同定してもよい。そのようにして同定されるモジュレーターは、場合によって、前記ポリペプチドの天然のもしくは改変された基質、リガンド、受容体、酵素などであっても、またはその構造的もしくは機能的ミメティックであってもよい(Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1(2):Chapter 5 (1991)を参照されたい)。
【００３０】
前記スクリーニング方法により、前記ポリペプチドへの、または前記ポリペプチドを担持する細胞もしくは膜への、またはその融合タンパク質への候補化合物の結合を、該候補化合物に直接もしくは間接的に結合させた標識を用いて簡単に測定してもよい。あるいは、前記スクリーニング方法は、標識された競合物質との競合を含んでいてもよい。このスクリーニング方法は、ビス-オキソノールDiBAC4またはDiSBACnなどの膜電位感受性色素をクマリン・タグ付きリン脂質と共に使用することを含んでいてもよい。これらの方法により、SK-3 Ca２＋依存性カリウムチャネルで生じた膜電位変化を蛍光または蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）の変化として記録する。さらに別の代替スクリーニング方法は、パッチクランプ電気生理学を用いてチャネル開口により生じるイオン電流を検出することを含んでいていもよい。使用しうる別の方法は、放射性または非放射性Rb＋の測定を利用してチャネル開口をモニターするというものである。さらに、これらのスクリーニング方法により、前記ポリペプチドを担持する細胞に適した検出系を利用して、前記候補化合物が、前記ポリペプチドの活性化もしくは阻害により生成するシグナルをもたらすかどうかを試験してもよい。さらに該スクリーニング方法は、候補化合物を本発明のポリペプチドを含有する溶液と混合して混合物を作製すること、該混合物中のSK-3カルシウム依存性カリウムチャネル活性を測定すること、および該混合物のSK-3カルシウム依存性カリウムチャネル活性を基準と比較すること、からなる工程を単に含んでいてもよい。既に記載したように、Fc部分とSK-3カルシウム依存性カリウムチャネル・ポリペプチドとから作製されるような融合タンパク質をハイスループットスクリーニングアッセイに使用して、本発明のポリペプチドのアンタゴニストを同定することもできる (D. Bennett et al., J Mol Recognition, 8:52-58 (1995); およびK. Johanson et al., J Biol Chem, 270(16):9459-9471 (1995)を参照されたい)。
【００３１】
また、SK-3カルシウム依存性カリウムチャネル・ポリヌクレオチド、ポリペプチド、およびSK-3カルシウム依存性カリウムチャネル・ポリペプチドに対する抗体を使用して、添加した化合物が細胞内におけるmRNAとポリペプチドの産生に及ぼす影響を検出するためのスクリーニング方法を設定してもよい。例えば、分泌されたかまたは細胞に随伴したポリペプチドの濃度を測定するために、当分野で公知の標準法によりモノクローナルおよびポリクローナル抗体を使用してELISAアッセイを構築してもよい。これを利用すれば、適切に操作された細胞または組織からのSK-3カルシウム依存性カリウムチャネル・ポリペプチドの産生を増強しうる物質を発見することができる。
【００３２】
従って、別の態様では、本発明は本発明のSK-3カルシウム依存性カリウムチャネル・ポリペプチドに対するアゴニストもしくはアンタゴニスト、またはかかるポリペプチドの産生を増強もしくは阻害する化合物を同定するためのスクリーニングキットに関し、該キットは以下（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）SK-3カルシウム依存性カリウムチャネル・ポリペプチド；
（ｂ）SK-3カルシウム依存性カリウムチャネル・ポリペプチドを発現する組換え細胞；
（ｃ）SK-3カルシウム依存性カリウムチャネル・ポリペプチドを発現する細胞膜；
または
（ｄ）SK-3カルシウム依存性カリウムチャネル・ポリペプチドに対する抗体；
を含む。ここで、SK-3カルシウム依存性カリウムチャネル・ポリペプチドは好ましくは配列番号２のポリペプチドである。
【００３３】
かかるキットにおいて、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）が実質的な成分を含みうることは理解されよう。
【００３４】
また当業者であれば、本発明のポリペプチドを、以下（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）まず第一に、ポリペプチドの３次元構造を決定すること；
（ｂ）前記３次元構造から、アゴニストもしくはアンタゴニストが反応または結合しそうな部位を推定すること；
（ｃ）推定された結合部位または反応部位と結合または反応すると予想される候補化合物を合成すること；
および
（ｄ）前記候補化合物が本当にアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを試験すること；
により、アゴニストまたはアンタゴニストを構造に基づいて設計するための方法にも使用しうることは容易に理解されよう。
【００３５】
さらに、これが通常は反復工程であることも理解されよう。
【００３６】
さらに別の態様では、本発明は、例えば男性もしくは女性の生殖器の機能不全、または狭心症、卒中および高血圧などの血管障害といった、SK-3カルシウム依存性カリウムチャネル・ポリペプチド活性に関連する異常状態を治療する方法を提供する。また、かかる異常状態を治療する際には、幾つかのアプローチを利用することもできる。あるアプローチは、本発明のポリペプチドを活性化または阻害する治療上有効な量の化合物（すなわち上記アゴニストまたはアンタゴニスト）を製薬上許容される担体と共に患者に投与し、それにより前記異常状態を緩和することを含む。あるいは、遺伝子治療を利用することにより、患者体内の当該細胞によるSK-3カルシウム依存性カリウムチャネルまたは他のカルシウム依存性カリウムチャネルの内因性の産生を促してもよい。例えば、上記で検討したように、本発明のポリヌクレオチドを発現のために操作して複製欠損性レトロウイルスベクターとしてもよい。その後、このレトロウイルス発現構築物を単離し、これを本発明のポリペプチドをコードするRNAを含有するレトロウイルスプラスミドベクターを用いて形質導入したパッケージング細胞内に導入することにより、該パッケージング細胞において目的の遺伝子を含有する感染性ウイルス粒子を産生させる。in vivoで細胞を操作したりin vivoで前記ポリペプチドの発現を操作したりするために、これらの産生細胞を患者に投与してもよい。遺伝子治療の概観については、Chapter 20, Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches, (および本書で引用されている参考文献) in Human Molecular Genetics, T Strachan and A P Read, BIOS Scientific Publishers Ltd (1996)を参照されたい。別のアプローチは、治療量の本発明のポリペプチドを適切な製薬用担体と共に投与するというものである。
【００３７】
さらに別の態様では、本発明は、治療上有効な量のアゴニストもしくはアンタゴニストのペプチドまたは小分子化合物を製薬上許容される担体または賦形剤と共に含む医薬組成物を提供する。かかる担体には、限定するものではないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが含まれる。本発明はさらに、前述の本発明の組成物の成分を１つ以上充填した１個以上の容器を含む医薬パックおよびキットに関する。本発明のポリペプチドおよび他の化合物を単独で、または治療用化合物などの他の化合物と共に使用してもよい。
【００３８】
前記組成物を投与経路、例えば全身または経口経路に適合させてもよい。全身投与の好適な形態には、注射、典型的には静脈注射によるものが含まれる。皮下、筋肉内、または腹腔内などの他の注射経路も利用できる。全身投与の代替手段としては、胆汁塩やフシジン酸、または他の界面活性剤などの浸透剤を用いる経粘膜および経皮投与がある。さらに、本発明のポリペプチドまたは他の化合物を腸溶剤またはカプセル化製剤として製剤化することができれば、経口投与も可能である。これらの化合物の投与を、軟膏、ペースト、ゲルなどの形態で局所的および／または限局的に行ってもよい。
【００３９】
必要とされる投与量範囲は、本発明のペプチドまたは他の化合物の選択、投与経路、製剤の性質、患者の病状の性質、および主治医の判断によって決まる。しかし、適切な投与量は患者の体重１kgあたり0.1〜100μgの範囲内とされる。しかし、利用可能な化合物の多様性や種々の投与経路の効率の差異を考慮すると、必要とされる投与量は幅広く変化すると思われる。例えば経口投与では、静脈内注射による投与よりも多く投与する必要があると考えられる。これらの投与量レベルの変動は、当分野で十分に理解されている標準的かつ経験的な最適化方法を用いて調整することができる。
【００４０】
また治療に使用されるポリペプチドは、上記のように「遺伝子治療」と称されることの多い治療様式において、患者の体内で内生的に生成させることもできる。従って、例えば、患者から得た細胞をDNAやRNAなどのポリヌクレオチドで操作することにより（例えば、レトロウイルスプラスミドベクターを使用することにより）、ex vivoでポリペプチドをコードさせてもよい。その後、この細胞を患者に導入する。
【００４１】
本明細書中で頻繁に使用される特定の用語を理解しやすくするために、以下の定義を提供する。
【００４２】
「抗体」には、本明細書中で使用する場合、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、キメラ、１本鎖、およびヒト化抗体、ならびにFabまたは他の免疫グロブリンの発現ライブラリーの産物を含むFabフラグメントが含まれる。
【００４３】
「単離された」は、その天然の状態から「人の手により」変化させられていることを意味する。「単離された」組成物または物質が自然界に存在する場合、それはその元の環境から変更されているか、取り出されているか、またはその両方である。該用語を本明細書中で使用する場合、例えば動物生体内に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離された」ものではないが、その天然の状態で共存する種々の物質から分離されている同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離された」ものである。
【００４４】
「ポリヌクレオチド」は一般に、非修飾RNAもしくはDNAまたは修飾RNAもしくはDNAでありうる任意のポリリボヌクレオチドあるいはポリデオキシヌクレオチドを意味する。「ポリヌクレオチド」には、限定するものではないが、１本鎖および２本鎖DNA、１本鎖領域と２本鎖領域との混合体であるDNA、１本鎖および２本鎖RNA、１本鎖領域と２本鎖領域との混合体であるRNA、１本鎖、より典型的には２本鎖、または１本鎖領域と２本鎖領域との混合体でありうるDNAとRNAを含むハイブリッド分子が含まれる。さらに「ポリヌクレオチド」は、RNAまたはDNAまたはRNAとDNAの両方を含む３本鎖領域も意味する。また、該用語「ポリヌクレオチド」には、１つ以上の修飾塩基を含有するDNAまたはRNA、および安定性もしくは他の理由で修飾された骨格を有するDNAまたはRNAも含まれる。「修飾」塩基には、例えばトリチル化塩基およびイノシンなどの例外的な塩基が含まれる。DNAおよびRNAに様々な修飾を施してもよい。従って、「ポリヌクレオチド」には、通常は自然界で見出されるような化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態のポリヌクレオチド、ならびにウイルスおよび細胞に特徴的な化学形態のDNAおよびRNAが包含される。また「ポリヌクレオチド」には、オリゴヌクレオチドと称されることの多い、比較的短いポリヌクレオチドも包含される。
【００４５】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合により互いに連結された２つ以上のアミノ酸、すなわちペプチドアイソスターを含む任意のペプチドまたはタンパク質を意味する。「ポリペプチド」は、一般にペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴマーと称される短鎖、および通常はタンパク質と称される長鎖の両方を意味する。ポリペプチドは20種の遺伝子コードアミノ酸以外のアミノ酸を含有していてもよい。「ポリペプチド」には、翻訳後プロセシングなどの天然の工程により、または当分野で周知の化学修飾技術により修飾されたアミノ酸配列が含まれる。かかる修飾については基本教科書およびより詳細な研究論文、ならびに膨大な量の研究文献に詳しく記載されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシ末端を含むポリペプチド中のどの位置に存在していてもよい。同一タイプの修飾が所与のポリペプチド中の幾つかの位置に同程度または異なる程度で存在しうることは理解されよう。また、所与のポリペプチドは、多くのタイプの修飾を含んでいてもよい。ポリペプチドは、ユビキチン化の結果として分岐していても、分岐を伴うかまたは伴わない環状であってもよい。環状、分岐、および分岐環状ポリペプチドは、天然の翻訳後プロセスの結果生じるものであっても、または合成方法により作製されたものであってもよい。修飾には、アセチル化、アシル化、ADP-リボシル化、アミド化、ビオチン化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有結合性架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ-カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカーの形成、水酸化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質加水分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、転移RNA仲介型のアルギニン化などのタンパク質へのアミノ酸付加、およびユビキチン化が含まれる（例えば、Proteins - Structure and Molecular Properties, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York, 1993; Wold, F., Post-translational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, pgs.  1-12 in Post-translational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, 1983; Seifter et al., "Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors", Meth Enzymol (1990) 182:626-646およびRattan et al., "Protein Synthesis: Post-translational Modifications and Aging", Ann NY Acad Sci (1992) 663:48-62を参照されたい）。
【００４６】
「同一性」とは、当分野で知られている通り、２つ以上のポリペプチド配列同士または２つ以上のポリヌクレオチド配列同士を比較することにより決定される、これらの配列間の関係である。また当分野では、場合によって、「同一性」はポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の文字列間の一致により決定される、かかる配列間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」および「類似性」は、Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; およびSequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; およびCarillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)に記載されたものを含むがこれらに限定されない公知の方法により、容易に算出することができる。同一性を決定するための好適な方法を設計して、試験する配列間で最大の一致が得られるようにする。同一性および類似性を決定するための方法は、公的に入手可能なコンピュータープログラムにコード化されている。２つの配列間の同一性および類似性を決定するための好適なコンピュータープログラム法としては、限定するものではないが、GCGプログラムパッケージ(Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984))、BLASTP、BLASTN、およびFASTA (Atschul, S.F. et al., J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990))がある。BLAST XプログラムはNCBIおよび他のソースから公的に入手可能である(BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)。周知のSmith Watermanアルゴリズムを使用して同一性を決定してもよい。
【００４７】
ポリペプチド配列を比較するための好適なパラメーターには、以下のものが含まれる：
（１）アルゴリズム：Needleman and Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970)
比較マトリックス：Hentikoff and Hentikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919 (1992)に記載のBLOSSUM62
ギャップペナルティ：12
ギャップ長ペナルティ：4
これらのパラメーターを有する有用なプログラムは、「gap」プログラムとしてGenetics Computer Group, Madison WIから公的に入手可能である。前述のパラメーターはペプチド比較用のデフォルトパラメーターである (末端ギャップに対するペナルティ無し)。
【００４８】
ポリヌクレオチド比較のための好適なパラメーターには、以下のものが含まれる：
（１）アルゴリズム：Needleman and Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970)
比較マトリックス：一致＝＋10、不一致＝0
ギャップペナルティ：50
ギャップ長ペナルティ：3
この「gap」プログラムは、Genetics Computer Group, Madison WIから公的に入手可能である。これらは核酸比較用のデフォルトパラメーターである。 
一例として、本発明のポリヌクレオチド配列は配列番号１の参照配列と同一であってよく、すなわちそれは100％同一であっても、または該参照配列と比較してある一定の整数個までのヌクレオチドの変更を含んでいてもよい。かかる変更は、少なくとも１個のヌクレオチドの欠失、トランジションおよびトランスバージョンを含む置換、または挿入からなる群より選択されるが、ここで該変更は、該参照ヌクレオチド配列の5’もしくは3’末端部位またはそれら末端部位の間の任意の位置に、該参照配列のヌクレオチドの中で個別にまたは該参照配列内に1個以上の連続したグループとして生じてもよい。ヌクレオチドの変更の数は、配列番号１のヌクレオチドの総数に各同一性％の数値割合（100で割ったもの）を掛けた後、その積を配列番号１のヌクレオチドの総数から引くことにより（すなわち以下の式を用いて）決定される：
ｎｎ ＜ ｘｎ − (ｘｎ・ｙ)
〔式中、ｎｎはヌクレオチドの変更の数であり、ｘｎは配列番号１のヌクレオチドの総数であり、またｙは、例えば70％の場合は0.70、80％の場合は0.80、85％の場合は0.85、90％の場合は0.90、95％の場合は0.95などである。またｘｎとｙとの非整数となる積については、その端数を切り捨てて最も近い整数とした後にそれをｘｎから引く。配列番号２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を変更して該コード配列中にナンセンス、ミスセンスまたはフレームシフト変異を生じさせることにより、かかる変更後の該ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを変更してもよい〕。
【００４９】
同様に、本発明のポリペプチド配列は配列番号２の参照配列と同一であってよく、すなわちそれが100％同一であっても、または該参照配列と比較してある一定の整数個までのアミノ酸の変更を含んでいるためにその同一性％が100％未満となっていてもよい。かかる変更は、少なくとも１個のアミノ酸の欠失、保存的および非保存的置換を含む置換、または挿入からなる群より選択されるが、ここで該変更は、参照ポリペプチド配列のアミノもしくはカルボキシ末端部位またはそれら末端部位の間の任意の位置に、該参照配列のアミノ酸の中で個別にまたは該参照配列内に1個以上の連続したグループとして生じてもよい。所与の同一性％に対するアミノ酸の変更の数は、配列番号２のアミノ酸の総数に各同一性％の数値割合（100で割ったもの）を掛けた後、その積を配列番号２のアミノ酸の総数から引くことにより（すなわち以下の式を用いて）決定される：
ｎａ ＜ ｘａ − (ｘａ・ｙ)
〔式中、ｎａはアミノ酸の変更の数であり、ｘａは配列番号２のアミノ酸の総数であり、またｙは、例えば70％の場合は0.70、80％の場合は0.80、85％の場合は0.85などである。またｘａとｙとの非整数となる積については、その端数を切り捨てて最も近い整数とした後にそれをｘａから引く〕。
【００５０】
「融合タンパク質」とは、２つの（多くは無関係の）融合された遺伝子またはその断片によりコードされるタンパク質を意味する。１例として、EP-A-0 464には、免疫グロブリン分子の定常領域の種々の部分を別のヒトタンパク質またはその一部と共に含む融合タンパク質が開示されている。多くの場合、免疫グロブリンFc領域を融合タンパク質の一部として利用することは、治療および診断で使用する際に都合が良く、またその結果として、例えば改善された薬物動態特性が得られる（例えば、EP-A 0232 262を参照されたい）。一方、幾つかの用途においては、融合タンパク質を発現させて検出および精製した後にそのFc部分を取り除くことができるのが望ましい。
【実施例１】
【００５１】
SK-3のヒト多組織における分布
SK-3 mRNAは様々な神経組織および非神経組織において広く発現される（図１）。脳領域内に最も豊富に存在するが、子宮筋、網、直腸、小腸および膀胱などの平滑筋に富む多くの組織中にも有意な濃度で存在する。SK-3 mRNAを発現する他の組織は、骨格筋、甲状腺、子宮、子宮頸部、扁桃腺、胸腺、肺、アデノイド、腎臓、食道、心臓、卵巣、精巣、気管、副腎、脾臓、唾液腺、耳下腺、乳腺および胃である。膵臓、脂肪、肝臓、胎児肝、胎盤および前立腺には、SK-3 mRNAは殆どまたは全く存在していなかった。
【実施例２】
【００５２】
陰茎海綿体および陰核におけるSK-3の局在
TaqMan解析により、SK-3が女性の陰核および男性の陰茎海綿体に存在するSK／IKファミリーのカルシウム依存性カリウムチャネルの中でも優勢なチャネルタイプであることが示された（図２）。陰核におけるSK-3の発現（図3A）は、他のタイプの平滑筋組織と類似したレベルで生じている。しかし、陰茎海綿体（B）におけるSK-3の発現は、明らかに脳および他のタイプの平滑筋組織と比べて30倍以上高い（図3A）。別の実験では（図3B）、SK-3は他のヒト男性の陰茎組織サンプルにおいても極めて高度に発現されることが見出されており、また、SK-3は10種の別個の組織のうち9種においてSK／IKファミリーのイオンチャネルの中でも飛びぬけて豊富に存在するチャネルである。
【実施例３】
【００５３】
抗hSK-3抗体M75の特異性
ウサギ抗hSK-3抗体M75をN末端hSK-1ペプチドに対して作製した。抗体M75の特異性を、hSK-1、hSK-2、hSK-3およびhIK-1を発現するHEK293安定細胞系ならびに非トランスフェクトHEK293細胞から得た細胞抽出物を用いた免疫ブロット法により解析した。抗体M75により、HEK-hSK-3安定細胞系由来の全細胞抽出物中の高分子量タンパク質複合体が認識されたが、HEK-hSK-1、HEK-hSK-2、HEK-hIK-1または非トランスフェクトHEK293細胞由来のものは認識しなかった（図4）。SK-3の免疫反応性は、対応する免疫ペプチドにより阻害された。
【実施例４】
【００５４】
結腸平滑筋および海綿体平滑筋ならびに血管におけるSK-3タンパク質の局在
5種のヒト結腸生検サンプルに対して免疫組織化学を実施した（表１）。「特異的な」染色とは、低い抗体濃度（1〜8μg mL-1）で得られる染色であって、その5倍濃度の対応ペプチドの存在により阻害されうるものと定義した。ウサギIgGを同濃度で用いた対照実験（図5）により、平滑筋における非常に低レベルのバックグラウンド染色を除いては、これらの切片に対する非特異的免疫反応性は存在しないことが明らかとなった。
【表１】
2005524615.tif 000002
【００５５】
5個中5個の結腸の血管平滑筋および内蔵平滑筋の両方においてSK-3染色（図6A）は強かった。5個中3個の結腸においては、ごく一部の単核細胞（単球またはマクロファージである可能性が高い）が強く染色された。腸筋神経叢および粘膜下神経叢のニューロンは弱く染色された。ヒト男性の陰茎海綿体を用いた別の実験でも、海綿体平滑筋および血管平滑筋ならびに血管内皮細胞のいずれにおいても、SK-3染色（図6B）は非常に強かった。
【実施例５】
【００５６】
蛍光-膜電位ベースのスクリーニング方法を利用したSK-3チャネル・インヒビターおよびアクチベーターの同定
細胞を用いた蛍光アッセイにおいて膜電位感受性色素DiBAC4を使用することにより、複数の化合物をそのhSK-3チャネル活性化作用および阻害作用について評価した。hSK-3チャネルを安定して発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞を384ウェルマイクロタイタープレート上に7.5K細胞／ウェルの密度で予め播いておき、これを4日間静置した。次いで、細胞にDiBAC4 (5μM)を30分間加えた後、それを蛍光画像プレートリーダー(FLIPR384, Molecular devices)に移した。試験化合物をオンライン式で添加し、蛍光変化を時間的に記録した。チャネル・アクチベーターは蛍光強度を下げるが、インヒビターはイオノマイシン（5μM）、すなわちCa２＋イオノフォアに対する応答を妨げる。図7は、２種の化合物の代表的な濃度-応答曲線をアクチベーターおよびインヒビター画面フォーマット（それぞれ上向きの三角印および丸印）にて示したものである。下向きの三角印は、細胞外インキュベーション溶液が高濃度のK＋（145mM）を含有している場合にはチャネル・オープナーの活性が見られないことを示唆している。これらの条件ではK＋の濃度勾配は存在しないため、特定のオープナーに対する膜電位変化は生じない筈である。
【００５７】
方法
リアルタイムPCR(TaqManアッセイ)
4種の遺伝子(hSK-1、hSK-2、hSK-3、hIK-1)各々の発現を、5個の異なる鋳型にて評価した。hSK-1、hSK-2、hSK-3、およびhIK-1プラスミドDNAを鋳型として用意した。各プラスミドDNA 1μg中に含有されるコピーの総数は、Copy Calculator (John Pfeifer, Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いて算出した。DNA 5μL当たり1e６コピーのプラスミドを含有する各サンプルのストック溶液を作製した。特異性をさらに測定するため、全4種のプラスミドからなる混合物も作製した。ここで、その各プラスミドは2e５コピーに相当する。PCR反応1回につき総量5μLのDNAを使用した。5’ヌクレアーゼアッセイ(TaqMan)とABI Prizm 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いてPCRの結果を出した。5’ヌクレアーゼアッセイでは、２つの従来型のPCRプライマーを蛍光発生プローブと共に使用する。該プローブは、その5’末端をFAM蛍光色素で、またその3’末端をTAMRA消光色素で標識された、伸長不可能なオリゴヌクレオチドである。Taq DNAポリメラーゼの5’ヌクレアーゼ活性により加水分解が生じ、蛍光FAM標識が遊離する。蛍光レベルをモニターし、PCRサイクル毎に記録した。蛍光の増加量は開始時の鋳型の量に比例する。
【００５８】
順方向および逆方向プライマーならびにプローブの配列は次の通りである：
HSK-1： 順方向プライマー ACGCTTACCGACCTAGCCAAG（配列番号3）、逆方向プライマー CTCCAGCTCCTCGTGCTGAG（配列番号4）、およびhSK-1プローブ FAM-
CAGACCGTCATGTACGACCTTGTATCGGA-TAMRA（配列番号5）。
【００５９】
HSK-2：順方向プライマー TTACCCTGGAAACAAAACTAGAGACTT （配列番号6）、逆方向プライマー TGCCTGATGGTCTGGCTTATG（配列番号7）、およびhSK-2プローブ FAM- CATCCACGCCCTCCCTGGGC-TAMRA（配列番号8）。 
HSK-3：順方向プライマー TCCAAGATGCAGAATGTCATGTATG（配列番号9）、逆方向プライマー GGTGAGATGCTCCAGCTTCG（配列番号10）、およびhSK-3プローブ FAM- TCCAGGTCTTCGCTCCGGTCATTG -TAMRA（配列番号11）。 
HIK-1：順方向プライマー CTCCAAGATGCACATGATCCTGTA（配列番号12）、逆方向プライマー GCAGTGCTAAGCAGCTCAGTCA（配列番号13）、およびhIK-1プローブ FAM- CAGCAGAATCTGAGCAGCTCACACCG -TAMRA（配列番号14）。
【００６０】
900nMの各順方向および逆方向プライマー、150nMプローブ、および1×PCRマスターミックス(Applied Biosystems, Foster City, CA)を含むマスターミックスを使用した。１反応当たりの総量は25μL（20μLのマスターミックスと5μLのcDNA）とした。全てのサンプルを二重にアッセイした。cDNAサンプル用のサイクル条件は、95℃で10分、ならびに95℃で15秒および60℃で1分を40サイクルとした。
【００６１】
正常な肺と罹患した肺、正常な脳と罹患した脳、CHO安定細胞系、正常な小脳と多発性硬化症を発症した小脳、正常な運動皮質と運動ニューロンが罹患した運動皮質、後根および下神経節、背側および腹側脊髄、結腸筋ならびに粘膜を含む種々の組織から取得したcDNAについて遺伝子発現を解析した。全RNAサンプルを総量を120μL（102μLのRNA＋H2Oサンプル、12μLの10×転写バッファ、および6μLの2U／μL DNアーゼ1）として、DNアーゼで処理した。このサンプルを37℃で1時間、続いて75℃で5分間インキュベートした。その後、該サンプルをRibogreenで定量した。ウェル当たり25ngの組織を用いて、全サンプルにおけるGAPDH+/-RTを解析した。必要な場合には、サンプルを低温で約15分間、Speed Vacを用いて遠心することにより濃縮した。残存体積の量を算定し、水を加えて総容量を56.5μLとした。次いで、ランダムヘキサマーを用いて該サンプルをcDNAに変換し、次いでこれを標準化した。18S rRNA発現の解析により、標準化について該サンプルを評価した。18Sが非常に豊富であるため、全サンプルを1:100に希釈した。40nMの順方向プライマー、20nM 逆方向プライマー、50nM プローブ、5.5mM MgCl2、1×Taqman Buffer A、300μM dNTPs、10U RNアーゼ阻害剤、12.5U MuLV逆転写酵素、および1.25U Amplitaq Goldを含むマスターミックスを使用した。１反応当たりの総量を25μL（20μLのマスターミックスと各5μLの希釈済みサンプル）とした。全サンプルを二重にアッセイした。サイクル条件は、48℃で30分、95℃で10分、95℃で15秒および60℃で1分を40サイクルとした。その後、この条件および上記プローブとプライマーのセットを用いてリアルタイムPCRを実施した。
【００６２】
免疫ブロット法
免疫ブロット法では、HEK-hSK-1、HEK-hSK-2、HEK-hSK-3、HEK-hIK-1を含む一群のhSK／IK安定細胞系およびHEK293野生型細胞から得た全細胞抽出物を使用した。50mM Tris-HCl（pH 7.6）、2mM EDTA、150mM NaClおよび1% NP40を含有するバッファ中に細胞を溶解した。次に、サンプルを、0.25M Tris-HCl、10％グリセロール、5％SDS、0.05％ブロモフェノールブルー、および0.1M DTTを含有するサンプルバッファ中で5分間煮沸した。電気泳動は、全細胞タンパク質抽出物(10μg)を、各ウェル内の4〜20％勾配Tris-グリシンゲル（Novex）上に載せて行った。その後、分離したタンパク質をニトロセルロース膜上にエレクトロブロッティングした。残りのタンパク質結合部位をPBS＋5％脱脂粉乳で1時間以上かけてブロックし、1μg／mL免疫グロブリン含有ブロッキング溶液中で4℃にて一晩インキュベートした。PBS＋0.1％Tween20中で6×15分の洗浄工程の後、HRPコンジュゲート化ヤギ抗ウサギIgG（Dako）およびPierce SuperSignal試薬を用いて免疫反応性のバンドを特定した。
【００６３】
免疫組織化学
ヒト結腸を手術で取り出し、4％緩衝化中性ホルマリン中に24時間静置した。  固定後、組織を真空処理してパラフィンワックス片に移した。ワックス切片を3〜5μmに切断し、Vectabond被膜スライド上に載せた。免疫組織化学のため、切片を脱パラフィン化して水を加えた。該切片をpH6.0の抗原回収溶液（HD supplies Aylesbury, Buck）中で20分間レンジ加熱し、蒸留水で洗浄した後、PBS中に入れた。該切片を0.3％過酸化水素中で20分インキュベートすることにより、内因性のペルキシダーゼ活性を抑えた。その後、切片をPBS で3×5分すすぎ、これを5％乳タンパク質含有PBS中に30分置いて全ての非特異的な結合を阻害した。切片を、0.3％Triton X-100、3％正常ヤギ血清含有PBS中で１次抗血清（ウサギ）と共に室温にて１時間インキュベートした。陰性対照切片も使用したが、その場合、１次抗体をウサギIgG（Vector Inc,Burlingame. CA）と置き替えた。切片をPBS中で3×5分すすぎ、その後２次抗体としてのビオチン化ヤギ抗ウサギ（BioGenex, San Ramon, CA）のPBSによる1:20希釈物中で室温にて20分間インキュベートした。切片をPBS中で3×5分すすぎ、ストレプトアビジンペルオキシダーゼ溶液(BioGenex, San Ramon, CA)中で室温にて20分インキュベートした。切片をPBS中で3×5分すすいだ。該切片の色素原の発色は、3,3’-ジアミノベンジジン(DAB)溶液を用いて2〜5分とした。切片を蒸留水ですすぎ、マイヤーのヘマトキシリン(Pioneer Research Chemicals, Colchester, Essex)で2分間対比染色した後、水道水を流しながら5分間すすいだ。最後に、切片を一連の漸増濃度のエタノールで脱水（70％、90％、100％で各5分）し、キシレン中で脱脂（5分）した後、カバーガラスを載せた。
【００６４】
配列情報
配列番号１：EMBLアクセッション番号AJ251016 (Terstappen et al., 2001)
2005524615.tif 000003
【００６５】
配列番号２：配列番号１の334〜2544位の翻訳配列
2005524615.tif 000004
【００６６】
配列番号３：ACGCTTACCGACCTAGCCAAG 
配列番号４：CTCCAGCTCCTCGTGCTGAG 
配列番号５：CAGACCGTCATGTACGACCTTGTATCGGA  
配列番号６：TTACCCTGGAAACAAAACTAGAGACTT
配列番号７：TGCCTGATGGTCTGGCTTATG 
配列番号８：CATCCACGCCCTCCCTGGGC 
配列番号９：TCCAAGATGCAGAATGTCATGTATG
配列番号１０：GGTGAGATGCTCCAGCTTCG
配列番号１１：TCCAGGTCTTCGCTCCGGTCATTG 
配列番号１２：CTCCAAGATGCACATGATCCTGTA 
配列番号１３：GCAGTGCTAAGCAGCTCAGTCA
配列番号１４：CAGCAGAATCTGAGCAGCTCACACCG 
【００６７】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】リアルタイムPCRによる、ヒトSK-3の多組織分布。一群のRNAをhSK-3についてリアルタイムPCRにより解析した。＊で示すRNAはClontechより入手したものである。♯で示すRNAはGlaxoSmithKlineにて1人の患者から調製したものである。＄で示すRNAはGlaxoSmithKlineにて２人の患者から調製したものである。相対存在量は、240−ｎ（ｎ＝PCRサイクル数）として算出した。
【図２】リアルタイムPCRによる、ヒト生殖組織におけるhSK-3の分布。RNAサンプルはヒト男性の陰茎海綿体および女性の陰核から調製した。SK-1,2,3とIK-1についてリアルタイムPCR解析を実施した。相対存在量は、240−ｎ（ｎ＝PCRサイクル数）として算出した。
【図３−Ａ】ヒトSK-3の多組織分布の比較。生殖組織と他の組織の間でのhSK-3発現の違いを明らかにするため、図１および図２に示したhSK-3のリアルタイムPCR試験の結果をまとめてある。
【図３−Ｂ】リアルタイムPCRによる、ヒト陰茎海綿体におけるSK／IKイオンチャネルのmRNAの分布。RNAサンプルは10人のヒト男性の陰茎海綿体サンプルから調製した。SK-1,2,3とIK-1についてリアルタイムPCR試験を実施した。総RNA 50ng当たりのチャネルタイプmRNAについて算出したコピー数を示す（SK-4＝IK-1）。
【図４】免疫ブロット法による抗hSK-3抗体M75の検証。左の表示は分子量マーカーの位置を示す。HEK-hSK-3のレーンに見られるバンドラダーは、この抗体の特異性を証明するものである。
【図５】ヒト結腸に対するウサギIgGの免疫組織化学。ヒト結腸から得た切片を、ウサギ抗SK-3抗体MK75に対応する濃度の対照ウサギIgGで染色した。核をマイヤーのヘマトキシリンで対比染色した。全結腸切片の殆ど全ての細胞タイプで抗体の染色は見られず、このことは、非特異的なIgG免疫反応性が存在しないことを示している。１個の結腸から得られた典型的な結果を示す。
【図６−Ａ】ヒト結腸に対するhSK-3の免疫組織化学。ヒト結腸から得た切片を抗体MK75で染色した。核をマイヤーのヘマトキシリンで染色した。矢印はM75の免疫反応性を示す。全ての染色（上段パネル）は対応ペプチドにより阻害された（下段パネル）。１個の結腸から得られた典型的な結果を示す。
【図６−Ｂ】ヒト男性の陰茎海綿体に対するhSK-3の免疫組織化学。ヒト男性の陰茎海綿体から得た切片を抗体M75で染色した。核染色にはマイヤーのヘマトキシリンを用いた。矢印はM75の免疫反応性を示す。
【図７】蛍光−膜電位スクリーニング法を用いたSK-3チャネル・インヒビターおよびSK-3チャネル・アクチベーターの同定。CHO細胞内で安定して発現されるhSK-3チャネルを阻害または活性化する例示的化合物についての濃度応答曲線。膜電位変化は、DiBAC、すなわち電位感受性色素の蛍光強度変化を測定することにより決定した。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３−Ａ】
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【図３−Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６−Ａ】
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【図６−Ｂ】
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【図７】
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【国際調査報告】
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