(57)【要約】本発明は、細胞、好ましくは有機生成物の生成増加を可能とする細胞と非相同の遺伝子をコードする発現ベクターを含むクラブトリー陰性表現型である生体触媒に関する。より詳しくは、本発明は、遺伝学的に修飾したクリュイベロミセス属（Kluyveromyces）細胞、前記クリュイベロミセス属（Kluyveromyces）細胞を製造するための方法、および有機製品、特に、Ｄ−乳酸の製造におけるそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
自然にはピルビン酸塩を蓄積しない組み換え酵母細胞であって、そのゲノム内に組み込まれた少なくとも一つの外因性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含み、前記Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が、機能的プロモーター配列およびターミネーター配列と動作可能のように結合している組み換え酵母細胞。
【請求項２】
カンジダ属（Candida）またはクリュイベロミセス属（Kluyveromyces）である請求項１記載の組み換え酵母細胞。
【請求項３】
前記細胞が、カンジダ・ソノレンシス（C. sonorensis）またはクリュイベロミセス・マルシアヌス（K. marxianus）である請求項２記載の組み換え酵母細胞。
【請求項４】
前記プロモーター配列が、酵母種の野生型であるプロモーター配列と少なくとも９０％以上の相同性を有する請求項１記載の組み換え酵母細胞。
【請求項５】
前記ターミネーター配列が、酵母種の野生型であるターミネーター配列と少なくとも９０％以上の相同性を有する請求項４記載の組み換え酵母細胞。
【請求項６】
前記酵母種が、野生型のＰＤＣプロモーターを有する野生型のＰＤＣ遺伝子を含み、前記プロモーター配列が、前記野生型のＰＤＣプロモーター配列と少なくとも９０％以上の相同性を有する請求項４記載の組み換え酵母細胞。
【請求項７】
前記野生型のＰＤＣ遺伝子が、野生型のＰＤＣターミネーターを有し、前記ターミネーター配列が、前記野生型のＰＤＣターミネーター配列と少なくとも９０％以上の相同性を有する請求項６記載の組み換え酵母細胞。
【請求項８】
前記野生型のＰＤＣ遺伝子が、欠失している請求項７記載の組み換え酵母細胞。
【請求項９】
前記酵母種が、野生型のＰＤＣ遺伝子を含み、前記野生型のＰＤＣ遺伝子が、欠失している請求項１記載の組み換え酵母細胞。
【請求項１０】
前記ヌクレオチド配列が、ラクトバチルス・ヘルヴェティクス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）、ラクトバチルス・ブルガリクス（Lactobacillus bulgaricus）、ラクトバチルス・デルブリュッキイ（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバチルス・プランタルム（lactobacillus plantarum）およびラクトバチルス・ペントスス（Lactobacillus pentosus）由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼタンパク質をコードする請求項１記載の組み換え酵母細胞。
【請求項１１】
前記プロモーターが、クリュイベロミセス属（Kluyveromyces）またはサッカロミケス属（Saccharomyces）由来の酵母種由来である請求項１０記載の組み換え酵母細胞。
【請求項１２】
前記プロモーターが、クリュイベロミセス・マルシアヌス（Kluyveromyces marxianus）由来である請求項１１記載の組み換え酵母細胞。
【請求項１３】
前記プロモーターが、サッカロミケス・セレヴィシアエ（Saccharomyces cerevisiae）由来である請求項１１記載の組み換え酵母細胞。
【請求項１４】
ＰＤＣ活性の低下を示す請求項１記載の組み換え酵母細胞。
【請求項１５】
前記Ｄ−ＬＤＨ遺伝子が、欠失したＰＤＣ遺伝子の遺伝子座に組み込まれている請求項８記載の組み換え酵母細胞。
【請求項１６】
炭水化物を乳酸に発酵させるための方法であって、請求項１記載の細胞を、前記細胞によって発酵可能な炭水化物を含む培地内で、発酵条件下で培養することを含む方法。
【請求項１７】
炭水化物を乳酸に発酵させるための方法であって、請求項８記載の細胞を、前記細胞によって発酵可能な炭水化物を含む培地内で、発酵条件下で培養することを含む方法。
【請求項１８】
炭水化物を乳酸に発酵させるための方法であって、請求項９記載の細胞を、前記細胞によって発酵可能な炭水化物を含む培地内で、発酵条件下で培養することを含む方法。
【請求項１９】
炭水化物を乳酸に発酵させるための方法であって、請求項１４記載の細胞を、前記細胞によって発酵可能な炭水化物を含む培地内で、発酵条件下で培養することを含む方法。
【請求項２０】
さらに、少なくとも乳酸の一部をラクチドに変換する工程を含む請求項１６、１７、１８または１９記載の方法。
【請求項２１】
さらに、前記ラクチドを重合して、ポリラクチドポリマーまたはポリラクチドコポリマーを形成する工程を含む請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
乳酸を製造するための方法であって、請求項1記載の細胞を、前記細胞によって発酵可能な糖質を含む培地内で、発酵条件下で培養することを含む方法。
【請求項２３】
乳酸を製造するための方法であって、請求項８記載の細胞を、前記細胞によって発酵可能な糖質を含む培地内で、発酵条件下で培養することを含む方法。
【請求項２４】
乳酸を製造するための方法であって、請求項９記載の細胞を、前記細胞によって発酵可能な糖質を含む培地内で、発酵条件下で培養することを含む方法。
【請求項２５】
乳酸を製造するための方法であって、請求項1４記載の細胞を、前記細胞によって発酵可能な糖質を含む培地内で、発酵条件下で培養することを含む方法。
【請求項２６】
さらに、少なくとも前記乳酸の一部をラクチドに変換する工程を含む、請求項２２、２３、２４または２５記載の方法。
【請求項２７】
さらに、前記ラクチドを重合して、ポリラクチドポリマーまたはポリラクチドコポリマーを形成する請求項２６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母におけるＤ−乳酸の生産方法およびその材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願は、２００２年５月３０日に出願された米国仮出願Ｎｏ．６０／３８４３３３に基づく優先権を主張する。
【０００３】
本発明は、エネルギー省により付与された契約番号DE-FC36-00GO10598に基づき、政府支援のもとで行われた。この発明において、米国政府が、一定の権利を有する。
【０００４】
乳酸は、化学合成または、微生物（生合成）における発酵処理により産生できる有機分子である。生合成による手法は有機製品を製造するための化学合成による手法以上の利点を有し、その利点としては、効率的な収率、より早い製造、異性体が混入することないことおよび低コストがあげられる。
【０００５】
Ｄ−（またはＲ−）乳酸は、除草剤および医薬品を含む生物学的に活性な原料の製造における成分である。そのため、Ｄ−乳酸のコストを削減する新しい処理方法によって、プラスチックを含むより大きな化学市場の獲得および普及を可能にする。Ｄ−乳酸を、多くの潜在的用途（例えば、フィルム、繊維およびそのほかのポリマー用途の製造があげられる）を有するＤ−ラクチド、Ｄ−乳酸の周期的な縮合物に変換することができる。Ｄ−ラクチドを重合して、ポリ（Ｄ−ラクチド）（Ｄ−ＰＬＡ）、ポリ（Ｌ−ラクチド）（Ｌ−ＰＬＡ）と同様の特性を有し、様々なポリマー用途として使用されているポリマーとすることができる。現在、カーギル・ダウ社（Cargill Dow）により製造されているような結晶性の高いＰＬＡは、Ｌ−立体異性体を多く含む。この高Ｌ−異性体樹脂は、ＰＬＡ繊維市場において最も一般的に使用されている。なぜならば、強い圧力をかけることで、繊維の引っ張り強度を増加し、収縮を抑制し、かつ、使用可能な温度をＬ−ＰＬＡガラス転移温度以上に増加できるためである。Ｄ−異性体が同程度多く含まれるポリマーは、同様の特性を有するものと考えられる。さらに、高Ｄ−異性体ポリマーは、高Ｌ−異性体ポリマーと混合して、極めて高い融解温度（約２３０℃以下）を有する立体錯体を形成することができる。このように、融解温度が高くなることにより、ＰＬＡを、熱耐性が必要とされるような用途に使用できる。このような用途の例としては、ある衣類の使用があげられ、融解温度を高くすることが必要とされる、例えば、アイロンがけの可能な布地の製造する場合である。
【０００６】
また、Ｄ−乳酸は、除草剤および医薬品に使用できる有用な工業化学薬品中間体である。例えば、Ｄ−乳酸は、フェノキシプロピオン酸系の除草剤およびアリールオキシフェノキシプロピオン酸系の除草剤の製造における中間体である。
【０００７】
既知の乳酸の生合成処理方法は、ある一定の限定がある。例えば、乳酸桿菌属（Lactobacilli）等の乳酸産生微生物は、発酵条件下で、大量のＬ−乳酸を産生することができる。しかしながら、これらの微生物は、効率的に産生するために、複合発酵培地を必要とする。発酵培地が複雑化することにより、原材料費を増やし、培地から乳酸を分離することをより一層困難かつ高価にする。さらに、これらの微生物を用いた発酵製法は、その他の乳酸を産生しない種を混入する傾向がある。不要な種族を選択的に除去するための経済的な方法はない。
【０００８】
これらの微生物を使用した場合、バクテリア自身および、前記バクテリアの増殖を抑制できるかまたは細胞死を起こすことができるブロスの双方を、低pHの環境とするように、発酵ブロス中のpHを保持する必要がある。これは、発酵ブロスに、例えば、炭酸カルシウム等の中和剤を加えて、乳酸カルシウムを形成することにより達成できる。乳酸を正常な状態に戻すためには、乳酸カルシウムを、例えば、硫酸等の強酸で処理し、乳酸とすることが必要となる。前記硫酸は、乳酸カルシウムと反応して乳酸と石膏（硫酸カルシウム）を形成する。それゆえ、これらの微生物が、低ｐＨにおいて機能できなくなることで、原材料と不要な副生成物（石膏）の除去にさらなる費用がかかる。
【０００９】
Ｄ−乳酸を産生する遺伝子組み換え酵母が開示されている（例えば、特許文献１）。前記酵母宿主は、ピルビン酸塩を“蓄積する”特別な種、すなわち、さらに代謝できない程度に極めて大量のピルビン酸塩を産生できる特別な種である。
【特許文献１】特開２００２−１３６２９３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
すなわち、微生物によりＤ−乳酸を産生する生合成方法であって、１）Ｄ−乳酸を、よい収率かつ生産性で生産でき、２）好ましくは、簡易な発酵培地のみを必要とし、そして３）好ましくは、不要な微生物種による汚染を除くことができる低ｐＨおよび／または高温の発酵培地が可能となる生合成方法が、技術的に必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
第１の態様として、本発明は、自然にはピルビン酸塩を蓄積しない種の組み換え酵母細胞であって、そのゲノム内に組み込まれた少なくとも一つの外因性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含み、前記Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が、機能的プロモーター配列およびターミネーター配列と動作可能のように結合している組み換え酵母細胞を提供する。
【００１２】
また、本発明は、機能的プロモーター配列およびターミネーター配列と動作可能のように結合しているＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子をコードする組み換え核酸を提供する。本発明の組み換え核酸は、前記組み換え酵母細胞におけるＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を可能にする。
【００１３】
別の態様において、本発明は、前記本発明の細胞を、Ｄ−乳酸の生合成を可能にさせる条件下で発酵させることを含むＤ−乳酸の生産方法を提供する。
【００１４】
前記形質転換酵母細胞は、商業的に重要な収率で、Ｄ−乳酸を製造することができる。前記細胞は、十分なＤ−乳酸の存在を許容でき、かつ、前記発酵ブロスが、高濃度のＤ−乳酸を含む場合、効率的な製造を続けることができる。Ｌ−乳酸およびＤ−乳酸の双方が、特定の微生物の生育および生存を阻害する傾向があることから、この効果は、予想外の効果である（例えば、Lett. Appl. Microbiol. 2002;35(3):176-80; Susceptibility of Escherichia coli O157 and non-O157 isolates to lactate. McWilliam Leitch EC, Stewart CS.  Appl. Environ. Microbiol. 2002 Sep;68(9):4676-8参照）。ある場合には、真核細胞およびバクテリア細胞が、Ｌ−乳酸に比べて、Ｄ−乳酸に対して異なる反応を示すことが示されている（例えば、Uribarri J, Oh MS, Carroll HJ, Medicine (Baltimore) 1998 Mar;77(2):73-82, "D-lactic acidosis: a review of clinical presentation, biochemical features, and pathophysiologic mechanisms;" cf. Leitch et al, 同上）。
【００１５】
本発明の具体的な好ましい実施形態は、後に続く、特定の好ましい実施形態のより詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の酵母細胞は、前述の通り、組み換える前は、ピルビン酸塩を蓄積しない種由来の細胞である。ピルビン酸塩を“蓄積しないこと”は、日本の特開２０００−７８９９６号公報の実施形態５に示す方法に基づき培養した場合、10g/L以上のピルビン酸を生産しないことを示す。ピルビン酸塩を、例えば、エタノール、アセトンまたはバイオマス等の種々の代謝産物に代謝する活性代謝経路を含む場合、一般的には、酵母細胞は、ピルビン酸塩を蓄積しない。このような酵母細胞は、ピルビン酸塩を速やかに代謝し、常に、前記細胞内には、ピルビン酸塩はほとんどなく、少量のピルビン酸塩が、前記細胞により分泌される程度である。好ましい酵母細胞は、ピルビン酸デカルボキシラーゼタンパク質を生成する１以上の活性ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）遺伝子を生来有し、ピルビン酸塩をエタノールに変換するピルビン酸デカルボキシラーゼタンパク質を産生する。より好ましい酵母細胞は、クラブトリー陰性表現型を示すものであって、前記クラブトリー陰性表現型は、高濃度のグルコース存在下であっても、細胞の好気的な代謝経路（呼吸およびＴＣＡサイクル）を阻害しない。適当な酵母細胞の例は、カンジダ属（Candida）、サッカロミセス属（Saccharomyces）、クリュイベロミセス属（Kluyveromyces）、ピチア属（Pichia）、ハンゼヌラ属（Hansenula）である。カンジダ属（Candida）およびクリュイベロミセス属（Kluyveromyces）由来の細胞が、特に好ましい。特に好ましい細胞は、カンジダ・ソノレンシス（C. sonorensis）、クリュイベロミセス・ラクチス（K. lactis）、クリュイベロミセス・サーモトレランス（K. theromotolerans）およびクリュイベロミセス・マルシアヌス（K. marxianus）である。最も好ましい細胞は、C. sonorensisおよびクリュイベロミセス・マルシアヌス（K. marxianus）である。
【００１７】
本発明の組み換え酵母細胞は、そのゲノムに組み込まれた少なくとも１つの外因性D-LDH遺伝子を含む。ラクトバチルス・ヘルヴェティクス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）、ラクトバチルス・ブルガリクス（Lactobacillus bulgaricus）、ラクトバチルス・デルブリュッキイ（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバチルス・プランタルム（lactobacillus plantarum）およびラクトバチルス・ペントスス（Lactobacillus pentosus）は、相応するＤ−乳酸デヒドロゲナーゼを有する種であって、特に、本願で用いる組み換え遺伝子技術によって得ることができる。好ましいＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、L. helveticusのＤ−乳酸デヒドロゲナーゼである。この細胞は、多様な外因性LDH遺伝子、例えば、このような遺伝子を少なくとも２つ含み、好ましくは、このような遺伝子を約２〜１０つ含み、より好ましくは、このような遺伝子を２〜５含む。組み込まれたLDH遺伝子は、全て、同一の遺伝子であってもよいし、２以上の異なる種類のLDH遺伝子を含んでいてもよい。
【００１８】
遺伝子、プロモーターまたはターミネーターは、本発明において、（１）修飾されていない細胞のゲノム内に見出されない場合、（２）修飾されていない細胞のゲノムに存在する遺伝物質と相同性がない場合、“外因性”であるとみなす。本願明細書において、遺伝子、ターミネーターまたはプロモーターが、その酵母種の修飾されていない細胞のゲノム内に見出されている場合（変異の効果がない同一個体間の（individual-to-individual）変異は除く）、酵母種の野生型である。
【００１９】
前記外因性D-LDH遺伝子は、機能的プロモーターおよびターミネーター配列に動作可能のように結合している。本願明細書において、“動作可能のように結合”とは、プロモーターまたはターミネーターとが、場合に応じて、前記酵母ゲノムへの組み込みの後、前記Ｄ−LDH遺伝子の転写の開始と終了とのそれぞれを制御するように働くことを意味する。
【００２０】
本願明細書において、“プロモーター”という用語は、上流（すなわち、５’）に位置している非転写配列であって、構造遺伝子の翻訳開始コドン（一般的には、約１〜１０００bpであり、好ましくは１〜５００bpであり、特に１〜１００bp）を意味し、構造遺伝子の転写開始を制御する。前記プロモーターは、宿主細胞由来であっても外因性であってもよい。前記プロモーターは、遺伝子の発現を制御するものであればよく、主要な炭素代謝、例えば、解糖作用を有するプロモーターまたはＴＣＡサイクル遺伝子プロモーターを含むものであってもよい。適当なプロモーターとしては、特に制限されないが、例えば、酵母遺伝子由来のホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（TDH）、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（PDC1）、トリオースリン酸イソメラーゼ（TPI）、トランスクリプションエンハンサーファクター−１（TEF-１）、プリン−シトシンパーミアーゼ（PCPL３）、およびアルコールデヒドロゲナーゼ（ADH）があげられる。本発明の好ましいプロモーターとしては、TEF-1(S. cerevisiae)、PGK(S. cerevisiae)およびPDC1(S. cerevisiae、K. marxianus)のプロモーターがあげられる。
【００２１】
実施形態において、前記酵母細胞のゲノムの標的遺伝子座に前記D-LDH遺伝子を組み込む場合、前記プロモーター配列は、挿入の標的とする前記遺伝子のプロモーター配列と相同性を有する。前記標的遺伝子としては、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（PDC）が好ましい。さらに有利な標的遺伝子としては、アルコールデヒドロゲナーゼ（ADH）、オルチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ(ura3)および３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ(leu2)があげられる。
【００２２】
同様に、前記“ターミネーター”という用語は、下流（すなわち、３’）に位置している非転写配列であって、構造遺伝子の翻訳開始コドン（一般的には、約１〜１０００bpであり、好ましくは１〜５００bpであり、特に１〜１００bp）を意味し、構造遺伝子の転写終了を制御する。前記ターミネーターは、外因性であってもよいし、前記酵母種由来であってもよい。適当な外因性ターミネーターとしては、S. cerevisiaeまたはその他の酵母種由来のGAL10およびCYC-1ターミネーターがあげられる。
【００２３】
前記プロモーターと同様に、ある実施形態において、前記ターミネーター配列は、標的遺伝子のターミネーター配列と相同性を有する。
【００２４】
遺伝子、プロモーター、ターミネーターまたはその他の遺伝物質は、同一である場合、“相同性を有する”とみなす。同一であるとは、すなわち、その他の遺伝子物質とヌクレオチド配列とが、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または約９９％同一である場合か、もし同一でなくても、その機能を保持している程度に十分に類似している場合である。それゆえ、遺伝物質は、例えば、塩基対の点変異、欠失または付加による相違を含んでいたとしても、これらの変異、欠失または付加が、遺伝物質の機能に影響を及ぼすものでなければ、“相同性を有する”とみなす。側面配列（flanking sequences）については、前記配列が、野生型の遺伝子の側面配列と十分に類似し、側面配列が、野生型の遺伝子の側面配列と、唯一のクロスオーバーで互いに交わることができる場合、相同性が認められる。
【００２５】
前記“同一性”は、当該技術分野で知られているように、２以上のポリペプチド分子の配列、若しくは、２以上の核酸分子の配列間の関係を、それらの配列を比較することによって決定されるものである。当該技術分野において、“同一性”は、核酸分子またはポリペプチド間の、配列の相関性の割合を示し、場合に応じて、２以上のヌクレオチドまたは２以上のアミノ酸配列の文字列間の適合によって決定される。“同一性”は、特定の数学的モデルまたはコンピュータプログラム（例えば、“アルゴリズム”）によって導き出された、ギャップアライメント（もしあれば）を有する２以上の配列のより小さな配列間の同一性適合の割合を示すものである。
【００２６】
“類似性”という用語は、当該技術分野において、関連した概念に対して使用するものであって、“同一”とは著しく異なり、“類似性”は、同一適合と同類置換適合との双方を含む相関性の指標をいう。２つのポリペプチド配列が、例えば、同一のアミノ酸を10/20有する場合、残りは、全て非同類置換であり、同一性および類似性の割合は、双方50％となる。同様の例において、同類置換である5以上の箇所がある場合同一性の割合は、50％のままであるが、類似性の割合は、75％(15/20)となる。さらに、この場合、同類置換があれば、２つのポリペプチド間の類似性の割合は、それら2つのポリペプチド間の割合よりも高くなる。
【００２７】
関連した核酸およびポリペプチドの同一性および類似性は、既知の方法により容易に算出できる。このような方法としては、特に制限されないが、下記の文献に記載されているものがあげられる。COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY、(Lesk, A.M., ed.), 1988, Oxford University Press, New York; BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, (Smith, D.W., ed.), 1993, Academic Press, New York; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, Part 1, (Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds.), 1994, Humana Press, New Jersey; von Heinje, G., SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1987, Academic Press; SEQUENCE ANALYSIS PRIMER, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.), 1991, M. Stockton Press, New York; Carillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math., 48:1073; and Durbin et al., 1998, BIOLOGICAL SEQUENCE ANALYSIS, Cambridge University Press。
【００２８】
同一性を決定する好ましい方法は、試験配列間で最も適合するように設計することである。同一性を決定する方法は、公的に使用可能であるコンピュータプログラムに記載されている。2つの配列間の同一性を決定するための好ましいコンピュータプログラム方法としては、特に限定されないが、下記のものがあげられる。GAP(Devereux et al., 1984, Nucl. Acid. Res., 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI)、BLASTP、BLASTNおよびFASTA(Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 215:403-410)を含むGCGプログラムパッケージである。前記BLASTXプログラムは、National Center for Biotechnology Information (NCBI)および別のソース(BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul et al., 1990、同上)。また、周知のスミス・ウォーターマンアルゴリズムも、同一性の決定に利用できる。
【００２９】
２つのアミノ酸またはポリヌクレオチド配列をそろえるためのアライメントスキームは、結果として、２つの配列の短い領域だけを適合させるものがある。２つの全長配列間に、顕著な関連性がないにも関わらず、この短い領域は、非常に高い配列同一性を有する。したがって、ある態様では、選り抜きのアライメント方法（ＧＡＰプログラム）は、目的とするポリペプチドの少なくとも５０の連続したアミノ酸をスパンとするアライメントとなるようにする。いくつかの実施形態では、前記アライメントは、前記目的とするポリペプチドの少なくとも６０、７０、８０、９０、１００、１１０または１２０のアミノ酸を含むことができる。ポリヌクレオチドを、ＧＡＰを用いてアライメントする場合、前記アライメントは、少なくとも約１００、１５０または２００の連続したヌクレオチドをスパンとすることができる。
【００３０】
例えば、コンピュータアルゴリズムＧＡＰ(Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI)を用いると、配列の同一性の割合を決定しようとする２つのポリペプチドは、それら個々のアミノ酸の最適な適合（アルゴリズムによって決定される“適合スパン”）としてアライメントされる。ある実施形態では、ギャップオープニングペナルティー（３回の平均ディアゴナルとして計算され、前記“平均ディアゴナル”は、用いた比較マトリックスのディアゴナルの平均であり、前記“ディアゴナル”は、特定の比較マトリックスによって、各完全なアミノ酸適合となるように配置されたスコアまたは個数である）と、ギャップエクステンションペナルティー（通常、前記ギャップオープニングペナルティーの１０分の１である）とを、例えば、PAM250またはBLOSUM62のような比較マトリックスと同様に、前記アルゴリズムと共に用いる。ある実施形態では、標準の比較マトリックス(Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure, 5:345-352 for the PAM 250 comparison matrix; Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89:10915-10919 for the BLOSUM 62 comparison matrixを参照)を、前記アルゴリズムに用いた。
【００３１】
ある実施形態において、ポリペプチド配列比較のためのパラメータは、以下のものを含む。
アルゴリズム：Needleman et al., 1970, J. Mol. Biol., 48:443-453；
比較マトリックス：BLOSUM 62 from Henikoff et al., 1992、同上；
ギャップペナルティー：12；
ギャップ長ペナルティー：4；
相同性の閾値：０
前記GAPプログラムには、上記パラメータが有用である。ヌクレオチド配列では、パラメータは、ギャップペナルティー５０と、前記各ギャップにおけるシンボルごとにペナルティー３となるギャップ長ペナルティー３とを含んでいてもよい。ある実施形態では、前記パラメータは、GAPアルゴリズムを用いたポリペプチド比較（末端ギャップのためのペナルティーは含まない）のための通常のパラメータである。
【００３２】
前記酵母細胞は、その生来のゲノムに対して、種々のその他の変異株を有することができる。例えば、前記酵母細胞は、後述するように、関連したプロモーターおよび/またはターミネーター配列に併せて種々の選択マーカー遺伝子を含むことができる。前記酵母細胞は、さらに、欠失したPDC遺伝子またはPDC遺伝子における破壊を有していてもよい。PDC遺伝子の遺伝座へのD-LDH遺伝子の挿入に併せて前記PDCを欠失する方法は、以下に、より詳細に記載する。PDC活性を欠失または破壊するその他の方法は、以下の文献に記載されている。Porro, "Development of metabolically engineered Saccharomyces cerevisiae cells for the production of lactic acid", Biotechnol. Prog. 1995 May-Jun; 11(3): 294-8; Porro et al., "Replacement of a metabolic pathway for large-scale production of lactic acid from engineered yeasts", App. Environ. Microbiol. 1999 Sep:65(9):4211-5; Bianchi et al., "Efficient homolactic fementation by Kluyveromyces lactis strains defective in pytuvate utilization and transformed with the heterologous LDH gene", App. Environ. Microbiol. 2001 Dec; 67(12)5621-5; and WO 99/14335。
【００３３】
本発明の組み換え酵母細胞は、プロモーター配列に動作可能のように結合したD-LDH遺伝子を含む核酸断片を挿入することによって調製できる。前記断片は、一般的には、組み換え核酸の一部を形成し、同様にその他の要素を含んでいてもよく、含むことが好ましい。前記要素としては、（ａ）ターミネーター配列；（ｂ）１以上の選択マーカー遺伝子（対応するプロモーターおよびターミネーターを含む）；（ｃ）宿主細胞のゲノムの特定遺伝子座に、前記断片を挿入するための１以上の側面配列；（ｄ）前記酵母細胞のゲノムに挿入するための、前記LDH遺伝子、そのプロモーター及び側面配列、マーカー遺伝子および対応するプロモーターおよびターミネーター等を含む直線断片を形成するための１以上の制限酵素認識部位；および／または（ｅ）バックボーン部位があげられる。前記“組み換え核酸”という用語は、本願明細書中では、宿主細胞にタンパク質情報を転移するために用いる分子（例えば、核酸、プラスミドまたはウィルス）に言及するために用いる。細胞を形質転換する方法は、当該技術分野において周知であり、特に制限されないが、例えば、エレクトロポレーション、塩化カルシウムまたは酢酸リチウムによる方法等があげられる。前記形質転換に用いるＤＮＡは、特定の制限酵素で切断されていてもよいし、切断されていなくてもよい。
【００３４】
本願明細書において使用する“選択マーカー遺伝子”という用語は、選択培地において生育する宿主の生存および／または生育のために必要なタンパク質をコードする遺伝物質を示す。一般的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）抗生物質またはその他の毒に対する耐性を与えるタンパク質をコードする遺伝子、例えば、ゼオシン（zeocin）(Streptoalloteichus hindustanus由来のsh ble遺伝子)、Ｇ４１８(Tn903のカナマイシン耐性遺伝子)、ハイグロマイシン(E. coli由来のアミノグリコシド耐性遺伝子)、宿主由来のアンピシリン、テトラサイクリン、またはカナマイシン等;（ｂ）前記細胞の栄養素欠乏を補完するタンパク質および／または例えば、アミノ酸ロイシンが欠乏した単純な培地から得られない重要な栄養を供給するタンパク質をコードする遺伝子、例えば、K. marxianusのLeu2遺伝子；または、オルチジン−５'−リン酸デカルボキシラーゼ陰性遺伝子にウラシルを与えるK. marxianusのura3遺伝子である。好ましい選択マーカーは、特に制限されないが、例えば、ゼオシン耐性遺伝子、Ｇ４１８耐性遺伝子およびハイグロマイシン耐性遺伝子等があげられる。
【００３５】
バックボーン部位は、市販の酵母ベクターを入手することが好ましい。
【００３６】
外因性LDH遺伝子を挿入するために酵母細胞を形質転換する適当な方法は、WO 00/71738A1およびWO 02/42471A1に記載されている。前記方法には、前記文献に記載のL-LDH遺伝子をD-LDH遺伝子に変えて、本発明の組み換え酵母細胞を作ることができるように記載されている。
【００３７】
本願明細書で使用している“形質転換する”および“形質転換”という用語は、細胞の遺伝的特性を変化させることを示し、細胞が、新たな核酸を含むように改変されると、形質転換される。すなわち、細胞は、その野生型から遺伝的に改変されると、形質転換される。例えば、以下のトランスフェクション、形質転換したDNAを、前記細胞の染色体に物理的に挿入することによって、細胞のゲノムDNAで再結合することが好ましい。あるいは、少なくとも一時的にせよ（すなわち、４８から９６時間以内の細胞の形質転換）、前記核酸が、複製されることなくエピゾームの要素として一時的に保持されることができるか、または、プラスミドとして独立して複製されてもよい。前記DNAが、染色体に統合され、前記細胞の部分として複製された場合、細胞は、安定して形質転換されたとみなされる。
【００３８】
“トランスフェクション”という用語は、細胞によって異質のDNAまたは外因性のDNAが取り込まれることを示し、前記外因性DNAが、細胞膜内に導入されると、細胞が“トランスフェクト”されたことになる。多数のトランスフェクションの方法が、当該技術分野において周知である。例えば、以下の文献が参照できる。Graham et al., 1973, Virology 52:456; Sambrook et al., 2001, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratories; Davis et al., 1986, BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Elsevier; and Chu et al., 1981, Gene 13:197。これらの技法は、適当な宿主細胞に、１以上の外因性DNAを導入するために用いることができる。
【００３９】
多様なD-LDH遺伝子を、多様な形質転換によって組み込むことができる。どのような多様なD-LDHを含む組み換え核酸をコンストラクションすることができ、すなわち、多様なLDH遺伝子を単一の工程で挿入することができる。
【００４０】
特定の目的（interest）の形質転換する方法は、自然に発生する標的遺伝子の遺伝子座に、D-LDH遺伝子の挿入を標的とすることである。標的遺伝子は、前記LDH遺伝子に置換されることが望ましい遺伝子である。好ましい標的遺伝子は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子であり、この遺伝子を置換することで、エタノールを産生する競合経路を破壊することができる。加えて、前記ピルビン酸遺伝子は、酵母種で活性である傾向があるため、前記PDCプロモーターおよびターミネーターの制御下における、前記ゲノムへの前記LDH遺伝子の挿入は、LDHを発現する変異株を十分に産生する傾向がある。さらに好ましい標的遺伝子は、ADH、Leu2およびUra3である。
【００４１】
好ましくは、本発明の酵母細胞が、本発明の組み換え核酸で形質転換され、組み換え核酸における選択マーカーが、形質転換株の優先的に生育を可能にした選択培地で生育されることによって選択されることである。前記形質転換細胞は、選択後、非選択培地下で生育させることが好ましい。このような条件下で、前記酵母染色体の標的遺伝子の遺伝子座に組み込まれた組み換え核酸を含む外因性D−LDH遺伝子を有する組み換え酵母細胞が、得られる。本発明の方法によって得られた場合、これらの細胞は、標的遺伝子を欠失し、外因性D-LDH遺伝子が、前記標的遺伝子座に挿入され、発現制御配列（例えば、前記プロモーターおよびターミネーター配列）の転写調節下で、動作可能なように結合している状態で、組み込まれている。前記標的遺伝子がPDC遺伝子である場合、前記PDC欠失が起こる細胞は、嫌気条件下で十分に生育できない。すなわち、個別の細胞および選択された細胞のコロニーを嫌気条件下に曝露することにより、これらのコロニーを選択することができる。生育できないコロニーは、PDC欠失が起こっているものと同定する。同様に、他の標的遺伝子を標的とした組み込みは、前記標的遺伝子の各々の欠失に関係する表現型によって同定することができる。
【００４２】
得られた酵母細胞は、標的遺伝子がなく、前記酵母細胞ゲノムの前記標的遺伝子の遺伝子座に組み込まれた外因性D-LDH遺伝子を有する。前記LDH遺伝子は、前記標的遺伝子のプロモーター配列およびターミネーター配列と相同であるプロモーター配列およびターミネーター配列の転写調節下にある。
【００４３】
前記D-LDHプロモーターおよびターミネーター配列は、前記細胞を形質転換するために使用した組み換え核酸に含まれる側面配列に存在していてもよいし、または、組み込まれた部位で、細胞のゲノムに元々存在するものであってもよい。また、前記標的遺伝子ターミネーターは、前記組込み型ベクターに存在するターミネーター配列の欠失を有していてもよい。
【００４４】
前記側面配列は、前記D-LDH遺伝子に直接隣接していてもよいし、または、中間配列の塩基対によって分離されていてもよく、前記配列としては、例えば、１〜１０００の塩基対であり、好ましくは１〜１００の塩基対である。本発明の組み換え核酸に用いる前記側面配列は、前記標的遺伝子の対応する側面配列と相同であることが好ましい。典型的な側面配列の長さは、約５０〜約４０００塩基対であり、好ましくは約１００〜約２０００塩基対であり、特に上限としては、約１２００塩基対である。前記側面配列は、プロモーター（下流側面配列の場合、ターミネーター）配列を含んでおり、各々が、前記標的遺伝子と相同であることが好ましい。好ましい実施形態として、前記側面配列は、それぞれが野生型酵母由来のプロモーターおよびターミネーター配列と相同であり、それらを含む。最も好ましくは、前記酵母ゲノムの染色体DNAにおける標的遺伝子座での組み換え核酸の組み込みが、結果として、外因性D-LDH遺伝子をコードし、それによって、前記側面配列を含む野生型の遺伝子発現調節配列の転写制御に該当することである。
【００４５】
適当な側面配列は、前記酵母細胞ゲノムを組み込むための目的部位を同定すること、前記部位の側面に位置する配列をクローニングすること（慣用的な方法を用いて）ならびに、前記組み換え核酸における所望の部位の配列を付着させることによって得られる。
【００４６】
前記組み換え核酸は、１以上の選択マーカー遺伝子を含むことがさらに好ましく、それらが、それ自身のプロモーターおよびターミネーター配列の転写調節下にあることがより好ましい。この実施形態において、マーカー遺伝子のプロモーターおよびターミネーター配列は、前記標的遺伝子のプロモーターおよびターミネーター配列でないことが好ましい。前記選択マーカー遺伝子およびそれらのプロモーターおよびターミネーターは、前記組み換え核酸の上流側面配列−LDH遺伝子−下流側面配列の配列を中断させることは好ましくない。前記選択配列遺伝子および各々のプロモーターおよびターミネーターは、優先的に、前記組み換え核酸上流（５'）から前記上流側面配列に配置される。
【００４７】
前記標的遺伝子は、前記LDH遺伝子と置換されることが望ましい遺伝子である。好ましい標的遺伝子は、ピルビン酸デカルビキシラーゼ遺伝子であり、この遺伝子を置換することで、エタノールを産生する競合経路を破壊するためである。加えて、前記ピルビン酸遺伝子は、酵母種で活性である傾向があるため、前記PDCプロモーターおよびターミネーターの制御下において、前記ゲノムへの前記LDH遺伝子の挿入は、LDHを発現する変異株を十分に産生する傾向がある。さらに好ましい標的遺伝子は、アルコールデヒドロゲナーゼ（ADH）、オルチジン-5'-リン酸デカルボキシラーゼ(ura3)、および3-isopropylmalate dehydrogenase(leu2)があげられる。
【００４８】
前記得られる酵母細胞は、標的遺伝子がなく、前記酵母細胞のゲノムの前記標的遺伝子の遺伝子座に組み込まれた外因性D-LDH遺伝子を含む。前記D-LDH遺伝子は、前記標的遺伝子のプロモーターおよびターミネーター配列のそれぞれと相同であるプロモーター配列およびターミネーター配列の転写調節下にある。
【００４９】
この実施形態において、前記LDHプロモーターおよびターミネーター配列は、前記細胞を形質転換するために使用した組み換え核酸に存在しているものであってもよいし、組み込まれた部位の前記細胞のゲノムに元来存在していたものであってもよい。第１のクロスオーバーの後、前記挿入したD-LDH遺伝子を、組込み型ベクターに存在するプロモーターおよびターミネーター配列に動作可能のように結合させる。第２のクロスオーバーの後、それらのプロモーターおよびターミネーター配列のいずれかまたは双方を、野生型のPDCプロモーターおよび／またはターミネーターと置換してもよい。例えば、前記野生型のPDCプロモーターを、前記プロモーター配列の欠失を有する状態にしておき、前記組込み型ベクターで代用してもよい。また、野生型のPDCターミネーターを、組込み型ベクターに存在するターミネーター配列の欠失を有する状態にしてもよい。
【００５０】
本発明の形質転換酵母細胞は、発酵製法における糖質からD-乳酸を産生するのに有用である。前記細胞は、機能しないL-LDH遺伝子を含むか、または、機能するL-LDH遺伝子を含んでいたとしても、その活性が、例えば、D-異性体である前記細胞によって産生される乳酸の活性の少なくとも９０％であり、好ましくは少なくとも９５％であり、より好ましくは少なくとも９９．０％であり、さらにより好ましくは少なくとも９９．５％である。
【００５１】
前記発酵は、適当な発酵方法を用いて行うことができる。典型的なものとしては、前記細胞に、ピルビン酸塩に代謝できる炭水化物を与え、発酵が起こるような条件下にさらす。また、前記発酵培地は、前記細胞の生存能を促進させる栄養素（例えば、窒素、リン、イオウ、微量金属等）を含む。
【００５２】
使用できる特定の炭水化物は、特定の宿主、および前記宿主細胞が、特定の炭水化物をピルビン酸塩に代謝するように遺伝子組み換えされたか否かで依存する。グルコースおよびフルクトース等のヘキソース糖類、マルトース、イソマルトース、マルトリオーススターチおよびスクロール等のグルコースのオリゴマー、マルトデキストリンおよびキシロース（ペントース等）が、好ましい。少し好ましい糖類は、ガラクトース、マンノールおよびアラビノースがあげられる。
【００５３】
発酵中の温度は、約室温以上であればよく、好ましくは約３０℃以上であり、より好ましくは約３５℃〜約５５℃であり、より好ましくは約５０℃以下であり、さらにより好ましくは４５℃以下である。最高温度は、特定の宿主細胞に依存する場合もある。前記宿主細胞は、K. marxianusであり、好ましくは、前記組み換え細胞が、比較的高温（例えば、約４０℃以上５０℃まで）に耐えることができることである。別の好ましい宿主種は、C. sonorensisであり、約４０℃までの温度に耐えることができる。この高温耐性は、生産性を著しく損なうことなく、このような高い温度（冷却費用を削減するために）で発酵処理できるかを規定するものである。十分な高温耐性によって得られるその他の利点は、前記発酵が、好ましくない微生物で汚染されていた場合、多くの場合、４０℃以上、特に４５℃以上に発酵培地を加熱することによって、本発明の好ましい細胞を著しく損傷させることなく、好ましくない微生物を選択的に滅ぼすことができる。
【００５４】
発酵の間、発酵培地の細胞の濃度は、典型的には、発酵培地中、約１〜１５０g乾燥細胞／Ｌの範囲であり、好ましくは３〜１０g乾燥細胞／Ｌの範囲であり、さらにより好ましくは約３〜６g乾燥細胞／Ｌの範囲である。
【００５５】
発酵の産生段階の間、ある場合、厳格に嫌気的にするよりも微好気的にするほうが好ましい。酸素摂取速度（OUR）と、それに対応する収率、基質消費割合および所望の発酵産物を産生する割合を測定することによって、最適な通気条件を、各微生物によって設定することができる。多くの場合、収率及び速度は、OURで特定した範囲内に最適化される。PDC破壊を有する酵母の場合、最適なOUR値は、約０．８〜約３．５mmolO2/乾燥重量細胞/hrの範囲内である傾向がある。OURは、発酵の間の細胞によって消費される酸素の割合を示し、単位時間あたりの乾燥重量あたりの酸素量（mmoleまたはグラム）、すなわち、molO2/乾燥重量細胞/hrで表される。酸素消費は、発酵に取り込まれた酸素と、発酵から放出された酸素とを測定することによって、容易に決定できる。OUR測定は、基本的には、発酵の産生段階の間、特定の有機体に最適な範囲内にOURを維持するために、通気条件（顕著な導入ガスの速度、アジテーション、酸素供給ガス中の酸素の比率、）を制御するために使用できる。前記ブロス中に溶解させる酸素の濃度は、１％以下の飽和度、特に１０μmolO2/L以下に同時に保持する。特に好ましい工程としては、発酵の生育段階において、前記産生段階の開始前（すなわち、前記生育段階における嫌気的な条件から、産生段階の微好気的な条件に切り換える）、ある一定の期間、例えば、約１５〜９０分、前記ブロス中に溶解させる酸素飽和度１％以内、特に、１０μmolO2/L以内にまで下げた状態で実施することである。
【００５６】
D-乳酸が産生されると、前記酸が形成するため、前記酸の全部または一部を中和するために塩を添加しない限り、前記発酵培地のpHは、下がる傾向がある。前記発酵製法の1つの実施形態において、例えば、炭酸カルシウム、水酸化カルシウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、アンモニア、水酸化アンモニウム等の中和剤を、前記発酵ブロスに添加して、所望の範囲内、典型的には、約５．０〜約８．０、特に、約５．５〜約７．５の範囲内にｐＨが保持されるようにする。このような塩基を添加した場合、対応する乳酸塩が形成される。それゆえ、乳酸の再生は、遊離乳酸を再生することを含む。典型的には、前記細胞を分離し、前記発酵ブロスを、例えば、硫酸等の強酸で酸性することによって行う。副産物塩を形成し、前記乳酸から分離する。（カルシウム塩が、中和剤であり、硫酸塩が、酸化剤である場合、石膏）。ついで、前記乳酸は、例えば、液体−液体抽出、蒸留、吸収等の技法によって回収される。前記技法は、例えば、下記の文献に記載されている。T.B. Vickroy, Vol. 3, Chapter 38 of Comprehensive Biotechnology, (ed. M. Moo-Young), Pergamon, Oxford, 1985; R. Datta, et al., FEMS Microbiol. Rev., 1995; 16:221-231; U.S. Patent Nos. 4,275,234, 4,771,001, 5,132,456, 5,420,304, 5,510,526, 5,641,406, and 5,831,122, and International Patent Application No: WO 93/00440。
【００５７】
あるいは、前記発酵のpHを、前記細胞によって産生される乳酸によって、下げることもできる。すなわち、前記発酵ブロスのpHは、乳酸の産生によって、約１．５〜約５．０の範囲内であり、好ましくは約１．５〜約４．２の範囲内であり、より好ましくは約１．５〜約３．８６（乳酸のｐＫａ）の範囲内であり、特には、約２．０から３．８６未満となってもよい。許容される生産性および収率を達成すれば、このような方法で前記発酵を行うことによって、いくつかの利点が得られる。中和剤の費用を削減することや、削除することである。前記発酵ｐＨ（前記発酵終了時点での）が、乳酸のｐＫａ以下であれば、前記乳酸は、その酸の形態でほとんど存在している。これによって、酸化工程を削減でき、さらなる処理工程、酸化費用および副産物塩の処分費用を節約できる。すなわち、特に好ましい工程は、発酵ブロスのｐＨが、３．８６未満になるまで前記発酵を続けることを含むことである。乳酸は、例えば、ＷＯ９９／１９２９０に開示されているような方法を用いて、得られた発酵ブロスから分離できる。
【００５８】
低pH環境に耐えることができる前記細胞の能力は、不要な微生物の汚染を減らすことによって、その他のメカニズムを提供する。本発明の細胞を含む培地を、pH条件を、例えば、約１．５〜４．２、好ましくは約２．０〜３．８６という程度に低くし、酸耐性を有さない汚染した微生物を撲滅するために十分な時間さらすこともできる
商業的に有用性としては、本発明の組み換え酵母は、種々の特性を示すことができる。前記酵母は、顕著な割合で、炭水化物を乳酸に変換できる（すなわち、高収率の産物を産生する）。高特定生産性を示し、すなわち、時間、細胞の重量あたり、大量の乳酸を産生できる。発酵ｐＨ、約５．０未満、好ましくは約１．５〜４．２、特に２．０〜３．８６以下に耐性があり、それらの条件下で十分な収率および生産性を提供することが好ましい。また、前記細胞は、ｐＨ５．０〜８．０で、高濃度のＤ−乳酸および／またはＤ−乳酸塩耐性を有することが好ましく、より好ましくは１．５〜５．０のｐＨ値であることが好ましく、１．５〜４．２であることが好ましく、特には２．０〜３．８６である。この最後の特性は高濃度の出発炭水化物を用いた発酵製法を可能にする。
【００５９】
一般に、本発明の組み換え細胞を用いる発酵製法は、以下の特性のいくつかまたは全てを提供することが望ましい：
Ａ．炭水化物１gあたり乳酸（ｇ）の収率が、少なくとも３０g/g、好ましくは少なくとも４０ｇ、より好ましくは少なくとも６０g/g、さらにより好ましくは少なくとも７５g/gである。理論上の望ましい収率は、１００％であるが、実質的な収量の限界は、約９８％（g/g）である。
Ｂ．１時間、細胞１gあたりのＤ−乳酸（ｇ）の特定生産性が、少なくとも０．１g/g、好ましくは少なくとも０．３g/g、より好ましくは約０．４g/g、特には０．５g/gである。特定生産性は、できる限り高いことが望ましい。
Ｃ．発酵培地１Ｌあたりの力価（Ｄ−乳酸の最大濃度）が、少なくとも１５g／Ｌ、好ましくは少なくとも２０ｇ／Ｌ、より好ましくは４０ｇ／Ｌ、さらに好ましくは少なくとも８０ｇ／Ｌ、また１５０ｇ／Ｌ以下、好ましくは約１２０ｇ／Ｌ以下である。発酵培地の温度は、簡単に達成できる力価の高い目標に幾分影響を及ぼす。高濃度の乳酸溶液（すなわち、約１５０ｇ／Ｌ以上）は、約３５℃未満の温度で非常に粘性を有する状態またはゲル化状態になる傾向があるためである。より高い発酵温度、例えば、約３５〜５０℃を用いることは、ゲル化または不必要な粘性が生じることなく、より高い力価を可能にする。
【００６０】
本発明の組み換え細胞は、中性（pH５．０〜８．０）発酵で、グルコースを用いた場合、９２〜９８％程度の高い収率、体積生産性１．５〜２．２g／L／hr、および力価８１〜９０g／Lを供給することが分かった。PHを約３．０にまで低下させたような低pH発酵で、本発明の細胞は、８０％以上の収率、１．２〜３．３g／Lの力価を供給することが分かった。全ての場合において、発酵条件を最適化することなくこのような結果が得られた。
【００６１】
加えて、本発明の発酵製法は、高体積生産性を達成することが好ましい。体積生産性は、時間単位あたり、発酵培地の体積単位あたりに産生された産物の量として表したものであり、一般的には、gram（産物）／liter（培地）／hr（時間）で表される。少なくとも１．５g／L／hrの体積生産性が望ましく、好ましくは少なくとも２．０g／L／hrであり、より好ましくは少なくとも２．５g／L／hrである。発酵培地中に、３〜６ｇ細胞/Ｌ以下の好ましい細胞密度で、最大生産性が、約５.０g／L／hr以下である傾向があり、より典型的には、約４.０g／L／hrである傾向がある。前記発酵を実施するために極めて好ましくは、前記培地pH、温度またはブロスが、前記段落に記載の範囲内である場合、これらの体積生産性が、達成されることである。
【００６２】
本発明によって産生された乳酸は、ラクチド、２つの乳酸分子の環状無水物を産生するのに有用である。前記乳酸の立体異性体に応じて、前記ラクチドは、D−ラクチド（２つのD-乳酸分子から作られる）、Ｌ−ラクチド（２つのL−乳酸分子から作られる）またはD−L−ラクチド（L-乳酸およびＤ−乳酸分子それぞれ１つから作られる）であることができる。乳酸からラクチドを産生する慣用的な方法は、USP5,142,023（Gruberら）に記載の重合／脱重合方法を介した方法である。
【００６３】
ラクチドは、同様に、ポリラクチドポリマー（PLA）とコポリマーとの産生のためのモノマーとして、特に有用である。これらの調製方法についても、USP5,142,023（Gruberら）に記載されている。好ましいPLA産物は、USP5,338,822（Gruberら）に記載されているような溶融安定性のポリマーである。前記PLAは、半結晶であってもよいし、非晶性であってもよい。
【００６４】
以下の実施例は、本発明のある実施例を説明するものであって、本発明の範囲または意図を限定するものではない。
【実施例１】
【００６５】
（実施例１Ａ）
S. cerevisiaeのＰＧＫプロモーターをベースとした発現プラスミドpＮＣ２、およびS. cerevisiaeのＰＤＣ１プロモーターｐＮＣ４のコンストラクション
発現プラスミドpＮＣ２（図1）は、S. cerevisiaeのＰＧＫ１プロモーターと、前記S. cerevisiaeのＧＡＬ１０ターミネーターとを、pＧＥＭ５Ｚ(+)(Promega, Wisconsin) バックボーンベクター上で結合させることによって作った。前記酵母プロモーターとターミネーターとの間で発現させる遺伝子を挿入するために、ＰＧＫ１プロモーターと前記ＧＡＬ１０ターミネーターとを、特定の遺伝子を挿入するための制限酵素認識部位Xba1、EcoR1およびBamH1を有するポリリンカー領域によって分離した。
【００６６】
以下の配列を有するS. cerevisiaeのＰＧＫ１プロモーターを、使用した。
5'-GCGGCCGCGG   ATCGCTCTTC   CGCTATCGAT   TAATTTTTTT   TTCTTTCCTC TTTTTATTAA    CCTTAATTTT   TATTTTAGAT   TCCTGACTTC   AACTCAAGAC   GCACAGATAT   TATAACATCT   GCACAATAGG   CATTTGCAAG   AATTACTCGT   GAGTAAGGAA   AGAGTGAGGA   ACTATCGCAT   ACCTGCATTT   AAAGATGCCG   ATTTGGGCGC   GAATCCTTTA   TTTTGGCTTC   ACCCTCATAC   TATTATCAGG   GCCAGAAAAA   GGAAGTGTTT   CCCTCCTTCT   TGAATTGATG   TTACCCTCAT   AAAGCACGTG   GCCTCTTATC   GAGAAAGAAA   TTACCGTCGC   TCGTGATTTG   TTTGCAAAAA   GAACAAAACT   GAAAAAACCC   AGACACGCTC   GACTTCCTGT   CTTCCTATTG   ATTGCAGCTT   CCAATTTCGT   CACACAACAA   GGTCCTAGCG   ACGGCTCACA   GGTTTTGTAA   CAAGCAATCG   AAGGTTCTGG   AATGGCGGGA   AAGGGTTTAG   TACCACATGC   TATGATGCCC   ACTGTGATCT   CCAGAGCAAA   GTTCGTTCGA   TCGTACTGTT   ACTCTCTCTC   TTTCAAACAG   AATTGTCCGA   ATCGTGTGAC   AACAACAGCC   TGTTCTCACA   CACTCTTTTC   TTCTAACCAA   GGGGGTGGTT   TAGTTTAGTA   GAACCTCGTG   AAACTTACAT   TTACATATAT   ATAAACTTGC   ATAAATTGGT   CAATGCAAGA   AATACATATT   TGGTCTTTTC   TAATTCGTAG   TTTTTCAAGT   TCTTAGATGC   TTTCTTTTTC   TCTTTTTTAC   AGATCATCAA   GGAAGTAATT   ATCTACTTTT   TACAACAAAT   CTAGAATT-3'（配列番号1）
この配列は、制限断片として、プラスミドpＢＦＹ００４から得た。あるいは、鋳型としてのS. cerevisiaeの染色体DNAおよび前記配列に基づいて設計されたプライマーを用いたPCR増幅によって、得られる。
【００６７】
前記使用したS. cerevisiaeのＧＡＬ１０ターミネーターは、以下の配列を有する。
5'-GTAGATACAT   TGATGCTATC   AATCCAGAGA   ACTGGAAAGA   TTGTGTAGCC   TTGAAAAACG   GTGAAACTTA   CGGGTCCAAG   ATTGTCTACA   GATTTTCCTG   ATTTGCCAGC   TTACTATCCT   TCTTGAAAAT   ATGCACTCTA   TATCTTTTAG   TTCTTAATTG   CAACACATAG   ATTTGCTGTA   TAACGAATTT   TATGCTATTT   TTTAAATTTG   GAGTTCAGTG   ATAAAAGTGT   CACAGCGAAT   TTCCTCACAT   GTAGGGACCG   AATTGTTTAC   AAGTTCTCTG    TACCACCATG   GAGACATCAA   AAATTGAAAA   TCTATGGAAA   GATATGGACG   GTAGCAACAA   GAATATAGCA   CGAGCCGCGG   ATTTATTTCG   TTACGC-3'(配列番号２)
この配列は、制限断片として、プラスミドpＢＦＹ００４から得た。あるいは、鋳型としてのS. cerevisiaeの染色体DNAおよび前記配列に基づいて設計されたプライマーを用いたPCR増幅によって、得ることができる。
【００６８】
セレヴィシアエ（S. cerevisiae）のＰＤＣ１プロモーターとＧＡＬ１０ターミネーターとに基づく発現カセットを含む前記プラスミドpＮＣ４をコンストラクトし、一般的な発現ベクターとして使用した。前記マーカー遺伝子の多くは、このプロモーター下で発現する。前記pＮＣ４プラスミドを、図２に示す。
【００６９】
プラスミドpＮＣ４のバックボーンは、pＧＥＭ５Ｚ(+)(Promega Corporation; Madison, WI)である。前記S. cerevisiaeのＰＤＣ１プロモーターは、前記プライマーＰＳＰＤＣＳ１(5'-CCA TCG ATA ACA AGC TCA TGC AAA GAG-3'（配列番号３）)およびＰＳＰＤＣＡＳ２(5'-GCT CTA GAT TTG ACT GTG TTA TTT TGCG-3'（配列番号４））を用いて、鋳型としてのS. cerevisiaeのＧＹ５０９８の染色体DNAを用い、PCR増幅した。温度サイクルは、PfuTurbo DNA ポリメラーゼ(Stratagene)を用いて、９４℃で１分、５６℃で１分、７２℃で１分を３０サイクルし、続いて、最後に７２℃で７分のインキュベーションによって行った。
【００７０】
前記S. cerevisiaeのＧＡＬ１０ターミネーターは、前述のようにして得た。図３Ａの配列番号４１は、マルチクローニングサイトを有する前記ＰＧＫ１プロモーターおよびＧＡＬ１０ターミネーターを含む断片を示し、図３Ｂの配列番号４２は、マルチクローニングサイトを有する前記ＰＤＣ１プロモーターおよびＧＡＬ１０ターミネーターを示す。
【００７１】
（実施例１Ｂ）
S. cerevisiaeのＰＧＫ１プロモーターの調節下での、B. megateriumのL-LDHを含むpＶＲ２４のコンストラクション
前記Ｌ−ＬＤＨ遺伝子をコードするB. megateriumのDNAを、以下のようにして単離した。B. megateriumは、American Type Culture Collection (ATCC Accession #6458)から得て、標準的な条件下で生育した。ゲノムDNAは、Invitrogen社の"Easy-DNA"キットを用いて、メーカーの説明書に従って、これらの細胞から精製した。プライマーは、GenbankのB. megaterium由来のL-LDHとして入手できるものに基づいて設計した(Genbank accession #M22305)。PCR増幅反応は、Perkin Elmer buffer II(1.5 mM MgCl2)と、AmpliTaq Gold ポリメラーゼとを用いて行った。各反応液は、濃度の６ng/μL B. megateriumのゲノムDNA、濃度０．２mMの4 dNTPs、２つの増幅プライマーＢＭ１２７０およびＢＭ１７９をそれぞれ１μMの濃度で含む。なお、これらのプライマーは、以下の配列を有する。
ＢＭ１２７０:5'-CCT GAG TCC ACG TCA TTA TTC-3'（配列番号５）および
ＢＭ１７９:5'-TGA AGC TAT TTA TTC TTG TTAC-3'（配列番号６）。
【００７２】
反応は、以下の温度サイクル条件下に準じて行った：最初に９５℃で１０分インキュベーションし、続いて、９５℃で３０秒、５０℃で３０秒、および７２℃で６０秒を３５サイクルした。強力な産生断片（１１００bp）を、アガロースゲル電気泳動を用いて精製および単離し、クローニングし、配列を決定した。得られた配列は、既知のL-LDHをコードする遺伝子(例えば、Genbank accession #M22305)と優れた相同性を示すポリペプチドに翻訳することができる。
【００７３】
B. megateriumのＬＤＨをコードする遺伝子のためのコード配列を、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子由来のプロモーターおよび前記ＧＡＬ１０遺伝子由来の転写ターミネーターに動作可能のように結合させた。なお、前記プロモーターおよびターミネーターは、どちらも酵母S. cerevisiae由来である。2つのオリゴヌクレオチドプライマーBmeg5'およびBmeg3'は、前記遺伝子をコードする配列の末端に制限酵素認識部位を導入するように設計した。
Bmeg5':5'-GCT CTA GAT GAA AAC ACA ATT TAC ACC-3（配列番号７）および
Bmeg3':5'-ATGG ATC CTT ACA CAA AAG CTC TGT CGC-3'（配列番号８）。
【００７４】
この増幅反応は、前述の濃度のdNTPおよびプライマーを用い、メーカーの提供する緩衝液中のPfu Turbo ポリメラーゼ(Stratagene)を用いて行った。温度サイクルは、最初に９５℃で３分インキュベーションし、続いて、９５℃で３０秒、５０℃で３０秒および７２℃で６０秒を２０サイクルし、続いて、７２℃で９分の最後のインキュベーションによって行った。前記産物は、制限酵素XbaIおよびBamHIで制限酵素処理し、プラスミドpＮＣ２の前記XbaIおよびBamHI部位につないだ。このライゲーションによって、前記B. megateriumのLDHをコードする配列は、前記ＰＧＫプロモーターおよびＧＡＬ１０ターミネーターに動作可能のように結合している状態になる（図４）。
【００７５】
（実施例１Ｃ）
前記ＰＤＣ１プロモーターおよびＧＡＬ１０ターミネーター(S. cerevisiae)に動作可能のように結合したＧ４１８耐性カセットを有するpＶＲ２２のコンストラクション
前記Ｇ４１８耐性マーカーを、S. cerevisiaeのＰＤＣ１プロモーター下でクローニングし、このようにコンストラクションしたものを、pＶＲ２２とした（図５に示す）。前記S. cerevisiaeのＧＡＬ１０ターミネーターを、Ｇ４１８耐性遺伝子のためのターミネーターとしてこのプラスミドに用いた。前記Ｇ４１８耐性遺伝子を、プライマー5'-GCT CTA GAT GAG CCA TAT TCA ACG GGA AAC(5' G fragment（配列番号９）)および5'-ATG GAT CCT TAG AAA AAC TCA TCG AGC ATC(3' G fragment（配列番号１０）)と、前記鋳型としての前記プラスミドpPIC9K(Invitrogen, Carlsbad, CA),とともに、Pfu Turbo Polymerase (Stratagene)を用いて、PCRによって増幅した。温度サイクルは、最初に、反応混合物を９５℃で５分のインキュベートし、ついで、９５℃で３０秒、４９℃で３０秒、７２℃で２秒を３５サイクルし、続いて、最後に７２℃で１０分のインキュベーションを行った。前記PCR産物は、BamHIおよびXbaIで制限酵素処理し、８２１bpの断片を単離し、４３０３bpのpＮＣ２のBamHI-XbaI断片とつないだ。得られたプラスミドは、前記ＰＧＫプロモーターおよびＧＡＬ１０ターミネーターに動作可能なように結合した前記Ｇ４１８耐性遺伝子を有し、pＶＲ２２とした。このプラスミドを、図７に模式的に示す。
【００７６】
（実施例１Ｄ）
複製プラスミドpＫＤ１上のバシルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)のＬ−ＬＤＨ遺伝子の発現のためのプラスミドpＮＣ７のコンストラクション
プラスミドpＮＣ７（図６）は、以下のようにしてコンストラクションした。前記ＰＧＫプロモーターおよびＧＡＬ１０ターミネーター(S. cerevisiae)の転写調節下の、B. megateriumのＬＤＨ遺伝子を含む発現カセットを、pＶＲ２４からNotI断片として単離し、NotIで切断したプラスミドpＮＣ３につなぐことにより、pＮＣ７を得た。pＮＣ３は、プラスミドpＫＤ１全体をつなぐことによってコンストラクションした（Wesolowski-Louvel et al., Nonconventional Yeasts in Biotechnology; "Kluyveromyces lactis", pp. 139-201; K.Wolf ed.; Springer-Verlag, Berlin, 1996） linearized with Sph1 into the unique Sph1 site of pTEF1/Zeo (Invitrogen)を参照;pＮＣ３の構造は、図？？に示す。）
（実施例１Ｅ）
クリュイベロミセス・マルシアヌス（Kluyveromyces marxianus）株のＮＣ３９のコンストラクション
プラスミドpＮＣ７を、標準的な方法を用いて、野生型K. marxianus（ＣＤ２１株）に形質転換し、マルチコピープラスミドpＫＤ１上に前記B. megateriumのＬ−ＬＤＨ遺伝子を有する組み換えＮＣ３９株を得た。
【００７７】
（実施例１Ｆ）
PDC1破壊ベクタ-の破壊のためのプラスミドpＳＯ２８およびpＳＯ２９のコンストラクション
前記プラスミドpＳＯ２１を、前記プライマーSO-M2 5'-CTT CCA GTC CAG CAG GTC GAC CAG-3'（配列番号１１）およびSO-M1 5'-GTC CAG CAT GTC GAC CAG-3'（配列番号１２）を用いてコンストラクションした。鋳型としてのK. marxianus（ＣＤ２１株）由来のゲノムDNAを用い、前記プライマーを使用し、慣用的なPCR手順を用いて、５．５kbの断片を得た。前記断片は、そのプロモーター、ターミネーターおよび前記遺伝子の上流および下流の大きな領域に加えて、前記K. marxianusのＰＤＣ１遺伝子からなる。前記５．５kbの断片を、前記プラスミドpＣＲＩＩ(Invitrogen)にクローニングし、プラスミドpＳＯ２１（図７ａ）を得た。前記プラスミドpＳＯ２７（図７ｂ）は、プライマーSO-M4 5'-GAA CGA AAC GAA CTT CTC TC-3'（配列番号１３）およびSO-M5 5'-CTT GGA ACT TCT TGT CAG TG-3'（配列番号１４）を使用し、慣用的なPCR手順を用い、pＳＯ２１から、３．３kbのPDC1断片（PDC遺伝子、プロモーター）を、PCR増幅によって合成した。得られた断片を、ゲル電気泳動によって単離精製し、続いて、pＣＲＩＩ(Invitrogen)につないでpＳＯ２７を得た。
【００７８】
pＳＯ２８（図８）は、PDCIを有するpＳＯ２７を、BbsIで制限酵素処理し、PDC1をコードする領域から４１７bpを取り除くことによってコンストラクションした。得られたヌクレオチドの突出部を、Pfu DNA ポリメラーゼ(Stratagene)で埋めた。この断片（約２．９kb）を、pＶＲ２２（実施例１Ｃ）のPfu平滑末端のNotI断片につないだ。前記pＶＲ２２は、S. cerevisiaeのＰＧＫプロモーターおよび前記Ｇ４１８耐性遺伝子、さらにS. cerevisiaeのＧＡＬ１０ターミネーターを有する。
【００７９】
同様に、pＳＯ２９（図９）は、pＳＯ２７をBbsIで制限酵素処理して、前記PDCIをコードする領域から４１７bpを取り除くことによってコンストラクションした。前記ヌクレオチドの突出部を、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)で埋めた。この断片を、pTEF1/Zeo(Invitrogen)のPfu平滑XhoI/XbaI断片とつないだ。前記pTEF1/Zeoは、S. cerevisiaeのＴＥＦ１プロモーターおよび前記ゼオシン耐性遺伝子に続いてS. cerevisiaeのＣＹＣ１ターミネーターを有する。
【００８０】
これらのコンストラクションは、ｐｄｃ１ヌル遺伝子型を有するK. marxianus株を作り出すのに有用な様々な組み込みカセットを設計するために、作成した。前記形質転換体を、最初に、前記ＰＤＣ１遺伝子座の挿入を確認するためのスクリーニングし、ついで、エタノールを産生する能力がないことおよび嫌気的に生育できないことをスクリーニングした。好ましい組み換えは、前記ゲノム上のＰＤＣ１での複交雑である。また一方、単一組み換えまたは複組み換えが起こるか、もしくは、ＤＮＡ挿入突然変異誘発事象が起こることができる。
【００８１】
（実施例１Ｇ）
ｐｄｃ１ヌル遺伝子型のためのK. marxianusの形質転換およびPdc−表現型を用いた抽出：ＣＤ１８１、ＣＤ１８６、ＣＤ２１４、ＣＤ２１５、ＣＤ２１６、ＣＤ２１７、ＣＤ２１８、ＣＤ２１９、ＣＤ２２０およびＣＤ２２１株のコンストラクション
ＮＣ３９株を、形質転換宿主として選択した。なぜならば、前記宿主に前記pＫＤ１バックボーン上に前記Ｌ−ＬＤＨを有する複製プラスミドとしてプラスミドpＮＣ７を含み、ＰＤＣ１での欠失の可能性を増加させることができるからである(Chen XJ, et al., Curr. Genet., 1989 Aug; 16(2):95-8参照)。
【００８２】
前記プラスミドpＮＣ７を維持するために、ＮＣ３９株を、100μg/mLのゼオシン(Invitrogen)選択性を有するYPDで一晩生育させ、下記の酵母化学的形質転換プロトコルにしたがって形質転換を起こした。細胞を、5mLのYPD培地中、30℃で、250rpmで撹拌しながら、一晩生育した。前記培地を、開始OD600が約0.2となるように、50mLのYPDで希釈した。ついで、前記培地を、前記OD600が約3.0となるまで、250rpm、30℃で生育した。ついで、前記細胞を、2500rpm、5分の遠心によって回収し、50mLの滅菌水に懸濁した。前記細胞を、2500rpm、5分での遠心によって回収した。懸濁および遠心を1度繰り返した。続いて、前記細胞ペレットを、1.0mLの10mM Tris（pH7.5）、1mM EDTA、20mM酢酸リチウム（pH7.5）に再懸濁した。微小チューブに、SacI/ApaIで切断した直線状のpＳＯ２８のDNA断片（前記Ｇ４１８選択マーカーおよび側面PDC1領域を有する）4.0μg、キャリアDNA(Colette - 10mg/mL sand solicited)25μL、および前述のようにして調製したＮＣ３９を500μL加え、ボルテックスで混合した。これに、3mLの40％PEG、10mM Tris（pH7.5）、1mM EDTA、20mM酢酸リチウム（pH7.5）を加え、ボルテックスで混合した。ついで、この混合物を、250rpmで、30℃で30分インキュベートした。このインキュベート後、DMSOを350μL加え、チューブの反転により混合した。ついで、前記細胞を、42℃で15分間熱ショックを与え、続いて、氷上で3分間急冷した。前記細胞を、14000rpmで10秒の回転によって沈殿させ、その上清を除去した。前記細胞を、YPD1mLで再懸濁した。前記細胞を、250rpmで撹拌しながら、30℃で4時間インキュベートすることによって回復させた。この時点で、前記細胞を、YPDの最終的な体積の約500μLがなるように再懸濁した。前記細胞懸濁液のアリコート（20μL）を、1つの選択プレートにプレーティングし、アリコート100μLを、6つのその他のプレートにプレーティングした。このプレーティングした細胞は、コロニー成長が観察されるまで、30℃でインキュベートした。
【００８３】
この形質転換に使用したプレートは、（Ｇ４１８）300μg/mLの選択剤を含む。このような第１のプレート上で生育した形質転換体を、ついで、同一の濃度の選択剤を含む第２のプレートにパッチプレーティングした。このような第２のプレート上に生育したコロニーを、挿入断片の下流および外側である３'プライマー(SO4549 5'-CCA TCC GAA GAA GTC GAT CTC-3'（配列番号１５）)と、前記Ｇ４１８抗体遺伝子内に存在する５'プライマー(SO285 5'-CTT GCC ATC CTA TGG AAC TGC-3'（配列番号１６）)を用いて、PCRによって、PDC1へ組み込みがおきたものをスクリーニングした。このPCR分析によって、２００のコロニーのうち１つだけが陽性だった。さらに慣用的なPCR方法と、pＳＯ２７の欠失BbsI断片を標的としたＰＤＣ１プライマー(-SO2740 5'-GAA GGC TGG GAA TTG AGT GA-3'（配列番号１７）および-SO2444 5'-GCT CCA TCT GAA ATC GAC AG- 3'（配列番号１８）)とを用いたPCR分析は、無傷の野生型PDC1を確認するために使用した。
【００８４】
唯一の陽性形質転換体を単一コロニーとして単離し、グリセロールストックを作製した。これをＣＤ１８１とした。ついで、前記株を、選択圧なしで培養することによって、プラスミドpＮＣ７をキュアし、続いて、Ｇ４１８（300μg／mL）を含むYPD寒天プレート上に、培養した細胞を撒いた。４つのコロニーを採取し、ゼオチン感受性と、L-乳酸産生の欠如を試験した。４つ全てコロニーで、ゼオシン感受性を示し、L-乳酸を産生する能力を欠如していた。単一コロニーを選択し、それを用いて、グリセロールストックを作製した。なお、これを、ＣＤ１８６とした。
【００８５】
PDC-表現型（エタノールを産生することなく、嫌気条件下で生育しない）を有するK. marxianus株を作るために、ＣＤ１８６をさらに形質転換する必要があった。ＣＤ１８６を、前記プロトコルに従い、NheI/NotIで切断し、前記ゼオシン選択マーカーおよびPDC1領域に欠失を含む直線状のpＳＯ２９のDNA断片６．８μgで、形質転換した。
【００８６】
得られた形質転換体を、300μg/mLゼオシンを含むYPD寒天プレート上にプレーティングした。このような第１のプレート上で生育した形質転換体を、300μg/mLのＧ４１８と、300μg/mLのゼオシンとを含む第２のプレート上にパッチプレーティングした。このような第２のプレートで生育したコロニーを、PDC1の遺伝子座に組み込むために、PCRによってスクリーニングし、pＳＯ２７から取り除いたBbsI断片に存在するプライマー（-SO2740 5'-GAA GGC TGG GAA TTG AGT GA-3'（配列番号１７）および-SO2444 5'-GCT CCA TCT GAA ATC GAC AG- 3'（配列番号１８））を用いて、野生型のPDC1の欠如を試験した。
【００８７】
８つのコロニーにおいて、ＰＤＣ１の欠失を有することが分かった。PCR分析による確認の結果、これは、野生型のＰＤＣ１から予想される欠失およびＰＤＣ表現型（エタノールを産生することなく、嫌気条件下で生育しない）を示されたものである。これら８つの形質転換体から、単一コロニーを単離し、Cargill Dow Culture collectionに入れた。これら８つのK. marxianusのｐｄｃ１ヌル株を、ＣＤ２１４、ＣＤ２１５、ＣＤ２１６、ＣＤ２１７、ＣＤ２１８、ＣＤ２１９、ＣＤ２２０およびＣＤ２２１とした。YPD培地50mLを含む250mLの振とうフラスコ中にコロニーを植菌することによって、ＣＤ２１５のエタノール産生の試験を行った。前記培養株は、70rpmで撹拌しながら30℃でインキュベートした。前記試料のHPLC分析では、エタノールを検出されなかった。
【００８８】
（実施例１Ｈ）
S. cerevisiaeのＰＤＣ１プロモーターおよびＧＡＬ１０ターミネーターに機能的にハイグロマイシン耐性遺伝子を結合したプラスミドpＰＳ１のコンストラクション
形質転換酵母細胞に、ハイグロマイシン耐性を与えるための組み換え核酸であって、有機製品の合成に有用なタンパク質をコードする組み換え核酸コンストラクトを含む酵母細胞形質転換体の選択を可能にする組み換え核酸を、以下のようにして調製した。前記ハイグロマイシン耐性マーカー(E. coli hph)を、サッカロミケス・セレヴィシアエ（Saccharomyces cerevisiae）のＰＤＣ１プロモーターの転写調節下でクローニングした。
【００８９】
ハイグロマイシンBに対する耐性を与えるE. coliのｈｐｈ遺伝子を、プライマー５’HYGXBA1 (5'-AAG CTC TAG ATG AAA AAG CCT GAA CTC AC-3'（配列番号１９）)および３'HYGBamH1(5'-CGC GGA TCC CTA TTC CTT TGC CCT CGG AC-3'（配列番号２０）)と、鋳型としての前記プラスミドpＲＬＭｅｘ３０（例えば、Mach et al. 1994, Curr. Genet. 25, 567-570; Rajgarhia et al., U.S. Patent Application No: 10/154,460, filed May 23, 2002を参照（参考のために、その全体を示す））とを用いてPCR増幅した。また、前記hph遺伝子は、鋳型としての役割を果たす、E. coli染色体DNAを有する同じプライマーを用いて得ることもできる。温度サイクルは、Pfu Turbo DNA ポリメラーゼ(Stratagene)を用いて、９４℃で１分、５６℃で１分、７２℃で３分を３０サイクルし、続いて、最後に７２℃で７分のインキュベーションを行った。PCR産物は、0．8％アガロースゲルで、電気泳動的に分離し、１０２６bpの産物を単離した。前記PCR産物を、XbaIとBamHIとで制限酵素処理し、XbaIとBamHIとで切断した部分をpＮＣ４につなぎ、プラスミドpＰＳ１を得た（図１０参照）。
【００９０】
（実施例１Ｉ）
L. helveticusのD-LDHを含むpＶＲ４３のコンストラクション
D-LDHを、以下のようにして、Lactobacillus helveticusから単離した。Lactobacillus helveticus細胞を、American Type Culture Collection (ATCC Accession #10797)から入手し、標準的な条件下で生育した。以下のプロトコルを用いて、ゲノムDNAをこれらの細胞から精製した。
【００９１】
１．単一コロニーまたは乳酸バクテリアのグリセロールストックから5μLを、を含む250mLの滅菌フラスコ中に植菌した。前記培養液を、37℃で48時間、170rpmでアジテーションしながら生育した。
【００９２】
２．前記培養液を、50mLの滅菌ブルーキャップチューブに移し、3000rpmで10分遠心した。前記細胞のペレットを、12.5％w/vしょ糖溶液50mLに懸濁し、3000rpmで10分遠心した。そのペレットを再懸濁して、50mLの滅菌プルーキャップチューブ（Falcon (Cat. No.29050)）で12.5％w/vしょ糖溶液5mLと合わせた、前記細胞懸濁液に、5mLのTES溶液(TESは、10mM Tris(pH 8.0)、50mM EDTA(pH8.0)、50mM NaClであり、滅菌濾過した)を加えた。別の25%w/vしょ糖溶液5mLを加え、ついで混合した。粉末リゾチーム（300mg）を前記懸濁液に加え、ボルテックスで混合した。いったん十分に混合し、25μLのmutanolysin溶液（原液濃度2.2mg/mL）を、前記混合液に加えた。この懸濁液を、37℃で一晩（約10〜12時間）培養した。
【００９３】
３．前記夜通しの培養に続いて、20％SDS溶液2.5mLと、プロティナーゼＫ溶液（原液濃度28mg/1.4mL）168μLを加えた。このチューブを、撹拌することなく、反転することによって混合した。前記チューブを50℃で1時間インキュベートした。この時点で、細胞膜が壊れはじめ、溶液が半透明になった。十分量のNaClを加え、前記溶液中の濃度が0.15Mとなるようにした。
【００９４】
４．その混合物を、50mLのOakridgeチューブ(Beckman Instruments Inc., Palo Alto, CA)または、２つのチューブに移し、同体積のフェノール：クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)溶液で処理した。前記混合物を激しく撹拌し、10000rpmで10分遠心した。
【００９５】
５．前記水性の上清を、無菌のOakridgeチューブに移し、同体積のクロロホルムを加えた。この溶液を振とう混合し、5000rpmで10分遠心した。
【００９６】
６．この上清を吸い上げ、新しいチューブに入れた。前記上清に、RNAse（原液濃度100mg/mL）25μLを加え、反転することによって混合した。前記チューブを37℃で15分培養した。DNAse free RNAseを過剰に加え、RNAを直ちに分解した。
【００９７】
７．最後に、2.5体積のエタノールを、前記チューブの側面に沿って注意深く注ぐことにより、前記混合物に加えた。前記液体の界面に形成したDNAを、ガラスのピペットを用いて巻取り、70％エタノールで洗浄した。前記DNAを、空気乾燥し、microfugeチューブで、10mM Tris-HCl（pH8.5）（多くのQiagenキットの溶出緩衝液）に懸濁した。前記DNAが溶液中に現れるまで、前記チューブを、50℃で培養した。
【００９８】
Genbankにおいて、L. helveticusのＤ−ＬＤＨとして入手できる配列(Genbank accession #U07604 or #X66723 (SEQ ID No. 43))に基づいてプライマーを設計した。Pfu Turbo ポリメラーゼ(Stratagene, WI, USA)を用いて、PCR増幅反応を行った。各反応液は、500ngの濃度でL. helveticusのゲノムDNAを、0．2mMの濃度で各々の4dNTPs、そして、1μMで各々の増幅プライマーＶＲ１５０（5'-GGT TGG ATT TAT GAC AAA GGT TTT GCTT-3'（配列番号２１））およびＶＲ１５３（5'-AAT TAA AAC TTG TTC TTG TTC AAA GCA ACT-3'（配列番号２２））を含む。反応は、以下のサイクル条件にしたがって行った。つまり、最初に９５℃で１０分インキュベーションし、続いて９５℃で３０秒、５１℃で３０秒、７２℃で６０秒を３５サイクル行った。１０２７bpの大きな産生断片を、慣用的な処理手順を用いてゲルで精製し、PCR-BluntII topoクローニングベクター(Invitrogen, Carlsbad, CA)にクローニングした。得られたプラスミドの配列を決定し、それをpＶＲ４３とした（図１１ａ参照）。得られた配列は、ポリペプチドを翻訳することができ、既知のL. helveticusのD-LDHをコードする遺伝子配列(GenbankにおいてAccession # U07604 or #X66723)と極めて相同性を示した。
【００９９】
（実施例１Ｊ）
S. cerevisiaeのＰＧＫ１プロモーターおよびＧＡＬ１０ターミネーターの調節下におけるL. helveticusのＤ−ＬＤＨを含むpＶＲ４７のコンストラクション
プライマーは、pＮＣ２にクローニングするために、Ｄ−ＬＤＨ遺伝子の5’末端および3’末端に、XbaIおよびBamHI部位を挿入するように設計した。PCR増幅反応は、Pfu Turbo ポリメラーゼ(Stratagene, Wisconsin, USA)を用いて行った。各反応液は、pＶＲ４３（L. helveticusのＤ−ＬＤＨをもつ）(5ng)、濃度0．2mMの各々の4dNTPs、および1μMの各々の増幅プライマーＶＲ１６５（5'-CGT CTA GAT TTA TGA CAA AGG TTT TGCT-3'（配列番号２３））およびＶＲ１６６（5'-GCG GAT CCT TAA AAC TTG TTC TTG TTC AA-3'（配列番号２４））を含む。反応は、以下のサイクル条件で行った。つまり、最初に、９５℃で１０分インキュベーションし、続いて９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で６０秒を３５サイクル行った。１０３５bpの大きな産生断片を、慣用的な手順を用いて慣用的な処理手順を用いてゲルで精製し、PCR-BluntII topoクローニングベクター(Invitrogen, Carlsbad, CA)にクローニングした。得られたプラスミドの配列を決定し、それをpＶＲ４４とした（図１１ｂ参照）。この配列は、ポリペプチドを翻訳することができ、既知のL. helveticusのD-LDHをコードする遺伝子配列(GenbankにおいてAccession # U07604 or #X66723)と極めて相同性を示し、Ｄ−ＬＤＨ遺伝子の5’および3’末端に、XbaIおよびBamHI部位を有した。
【０１００】
プラスミドpＮＣ２を、XbaIおよびBamHIで制限酵素処理した。直線状のpＮＣ２の5'-リン酸末端を、メーカーのプロトコルに従って、シュリンプ由来のアルカリフォスファターゼ(Roche Diagnostics, USA)を用いて脱燐した。pＶＲ４４もまた、XbaIおよびBamHIで制限酵素処理し、１０２７bpのL. helveticusのＤ−ＬＤＨ遺伝子を、ゲル電気泳動によって単離した（0．8％アガロースゲル）。前記２つの断片をつなぎ、得られたプラスミドを、pＶＲ４７（図４参照）と命名し、その配列を決定した。そのプラスミドpＶＲ４７は、図１２に示すように、S. cerevisiaeのＰＧＫプロモーターおよびＧＡＬ１０ターミネーターに動作可能なように結合した（すなわち、酵母細胞において転写活性がある）L. helveticusのＤ−ＬＤＨ遺伝子を有する（配列番号４３）。
【０１０１】
Ｄ−ＬＤＨ遺伝子の配列
5'-TGACAAAGGTTTTTGCTTACGCTATTCGAAAAGACGAAGAACCATTCTTGAATGAATGGAAGGAAGCTCACAAGGATATCGATGTTGATTACACTGATAAACTTTTGACTCCTGAAACTGCTAAGCTAGCTAAGGGTGCTGACGGTGTTGTTGTTTACCAACAATTAGACTACACTGCAGATACTCTTCAAGCTTTAGCAGACGCTGGCGTAACTAAGATGTCATTACGTAACGTTGGTGTTGACAACATTGATATGGACAAGGCTAAGGAATTAGGTTTCCAAATTACCAATGTTCCTGTTTACTCACCAAACGCTATTGCTGAACATGCTGCTATTCAGGCTGCACGTGTATTACGTCAAGACAAGCGCATGGACGAAAAGATGGCTAAACGTGACTTACGTTGGGCACCAACTATCGGCCGTGAAGTTCGTGACCAAGTTGTCGGTGTTGTTGGTACTGGTCACATTGGTCAAGTATTTATGCGTATTATGGAAGGTTTCGGTGCAAAGGTTATTGCTTACGATATCTTCAAGAACCCAGAACTTGAAAAGAAGGGTTACTACGTTGACTCACTTGACGACTTGTACAAGCAAGCTGATGTAATTTCACTTCACGTACCAGATGTTCCAGCTAACGTTCACATGATCAACGACAAGTCAATCGCTGAAATGAAAGACGGCGTTGTAATTGTAAACTGCTCACGTGGTCGACTTGTTGACACTGACGCTGTAATCCGTGGTTTGGACTCAGGCAAGATCTTCGGCTTCGTTATGGATACTTACGAAGACGAAGTTGGTGTATTTAACAAGGATTGGGAAGGTAAAGAATTCCCAGACAAGCGTTTGGCAGACTTAATTGATCGTCCAAACGTATTGGTAACTCCACACACCGCCTTCTACACTACTCACGCTGTACGTAACATGGTTGTTAAGGCATTCAACAACAACTTGAAGTTAATCAACGGCGAAAAGCCAGATTCTCCAGTTGCTTTGAACAAGAACAAGTTTTAA3'（配列番号４３）
（実施例１Ｋ）
L. helveticusのＤ−ＬＤＨ遺伝子とハイグロマイシン耐性マーカーとを含み、それらが互いに隣接しているpＶＲ４８のコンストラクション
pＰＳ１を、SphIで制限酵素処理し、S. cerevisiaeのＰＤＣ１プロモーターおよびＧＡＬ１０ターミネーターの調節下で発現するハイグロマイシン耐性遺伝子を含む２．２５９kbpの断片を、0．8％アガロースゲルを用いて電気泳動により単離した。pＶＲ４７を、SphIで制限酵素処理し、直線状のプラスミド５’リン酸末端を、メーカーのプロトコルに従って、シュリンプ由来のアルカリフォスファターゼ(Roche Diagnostics, USA)を用いて脱燐した。前記２つの断片をつなぎ、得られたプラスミドの配列を決定し、それをpＶＲ４８（図１３参照）とした。前記プラスミドは、L. helveticusのＤ−ＬＤＨ遺伝子と、ハイグロマイシン耐性マーカーカセットを含み、これらが互いに隣接している状態で含む。
【０１０２】
（実施例１Ｌ）
K. marxianusのゲノムへの、ランダムな組み込みを介した、L. helveticusのＬ−ＬＤＨ遺伝子をコードするDNAの挿入
L. helveticusのＤ−ＬＤＨ：ｈｐｈ耐性遺伝子カセットを含む４．５４kbpの断片を、pＶＲ４８をSstIおよびApaIで制限酵素処理することによって、pＶＲ４８から単離した。この断片を、0.8％アガロースゲルを用いたゲル電気泳動によって単離した。この断片を使用して、後述するエレクトロポレーションプロトコルを用いて、Kluyveromyces marxianus (ＣＤ２１５;実施例１Ｆ、１Ｇ参照)のpdc1ヌル変異体を形質転換した。
【０１０３】
K. marxianusの単一コロニーを用い、50mLのYPD（10g/L酵母抽出物、20g/Lペプトン、20g/Lグルコースおよび2％寒天を含む）を含む250mLのバッフル型振とうフラスコ中に、OD600が0.1となるように植菌した。その培養液を、最終OD600が10となるまで、150rpmで30℃、16時間生育した。培養液10mLの細胞を、遠心によって回収し、エレクトロポレーション緩衝液(EB;10mM Tris-Cl、270mM sucrose、1mM MgCl2、pH 7.5)で1度洗浄した。その細胞を、培養緩衝液(IB;YPD+25 mM DTT、20mM HEPES、pH 8.0)に懸濁し、30℃で、250rpm、30分インキュベーションした。ついで、その細胞を、遠心によって回収し、EBで1度洗浄した。その細胞を1mLのEBで懸濁し、これらの細胞400μLを、0.4cmのエレクトロポレーション用キュベット(BioRad; Hercules, CA)に移した。
【０１０４】
４．５４kbpのpＶＲ４８由来のSstI/ApaI断片2μgを、前記キュベットに加え、その細胞を、1.8kV、1000Ω、15μFでエレクトロポレーションした。この細胞を、YPDを1mL入れた50mLのスクリューキャップのファルコンチューブ中に移し、30℃、250rpmで4時間インキュベートし、その後、200μg/mLハイグロマイシンを含むYPDにプレーティングして、選択した。形質転換体を37℃で3日生育した。ハイグロマイシン耐性を有する形質転換体を、200μg/mLを含む新たな選択プレートに、ストリークした。
【０１０５】
PCR分析：
K. marxianusのＣＤ２１のゲノムへの前記断片の組み込みの確認は、下記の2組のPCRプライマーを用いて行った。
【０１０６】
１．１組目のプライマーは、L. helveticusのＤ−ＬＤＨ遺伝子と、ハイグロマイシン耐性遺伝子と相同であるリバースプライマーとが相同性を有するように設計した。前記プライマーＶＲ１６１（5'-AGT TGG TGT ATT TAA CAA GG-3'（配列番号２５））およびＶＲ１４２（5'-GTG ACA CCC TGT GCA CGG CGG GAG ATG-3'（配列番号２６））は、前記カセットを有する株において、L. helveticusのＤ−ＬＤＨ遺伝子と、ハイグロマイシン耐性遺伝子との間に１．７４８kb産物を増幅し、前記カセットを有さない株において、いかなる断片も増幅しないように設計した。温度サイクルは、TaqDNAポリメラーゼ(Qiagen, USA)を用いた形質転換コロニー上で、反応混合物を、最初に９４℃で２分のインキュベーションし、続いて、９４℃で３０秒、４３℃で３０秒、７２℃で３分を３５サイクル行い、続いて、最後に７２℃で７分のインキュベーションを行った。
【０１０７】
２．２組目のプライマーは、ＰＧＫプロモーター領域と、L. helveticusのＤ−ＬＤＨと相同であるリバースプライマーとが相同性を有するように設計した。前記プライマーＶＲ１７３（5'-GCG ACG GCT CAC AGG TTT TG-3'（配列番号２７））およびＶＲ１７０（5'-CTT GTC TTG ACG TAA TAC ACG TGC AGC-3'（配列番号２８））は、前記カセットを有する株において、ＰＧＫプロモーターとL. helveticusのＤ−ＬＤＨ遺伝子との間に０．７５kb産物を増幅し、前記カセットを有さない株においていかなる断片も増幅しないように設計した。温度サイクルは、TaqDNAポリメラーゼ(Qiagen, USA)を用いた形質転換コロニー上で、反応混合物を、最初に、９４℃で２分のインキュベーションし、続いて、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を３５サイクル行い、続いて、最後に７２℃で７分のインキュベーションを行った。分析した形質転換体のうち１９の形質転換体が、目的のＰＣＲ産物を産生した。
【０１０８】
D-乳酸の酵素およびGC検定
D-乳酸の光学純度は、Boehringer Mannheim(Roche Diagnostics, USA)のD-乳酸検出キットを用いて、前記形質転換体を測定することによって行った。メーカーのプロトコルに従い、１９の形質転換体のうち、６の形質転換体が、L-乳酸を０％産生することが示された。
【０１０９】
前記形質転換体の上清のガスクロマトグラフィー分析は、前記株が、99％以上のD-乳酸を産生することを示した。
【０１１０】
GC分析方法
乳酸の“D”および“L”鏡像体の分離および定量は、キラルガスクロマトグラフィー法を用いて行う。確立された方法には、メタノール中での触媒由来の加水分解を含み、続いて、硫酸で酸処理し、エステル化を触媒し、塩化メチレンでメチル乳酸鏡像体を抽出することを含む。ついで、有機層を、フレームイオン化検出器（FID）を用いて、ガスクロマトグラフィー（GC）によって分析した[Hewlett Packard 6890 with split/splittless injector set in split mode, auto injection, and a FID detector]。メチル乳酸鏡像体の分離は、キラルキャピラリーカラムを用いて行った[口径30meter×0.25mm β-Dex 325 capillary column(膜厚み0.25μm), Supelco.(#24308)]。“D”および“L”乳酸の標準的な相対的割合は、この方法で得られる。
【０１１１】
GC分析の試料は、20mLのガラス製バイアル瓶で、試料の重量(1.000g)を測定し、そこにメタノール4mLを加えることによって調製する。前記バイアル瓶に蓋をし、150μLの濃硫酸をゆっくり加えた。そのバイアル瓶を、Reati-therm heater/stirrer中で、65℃で10分放置した。ついで、脱イオン水を、前記バイアル瓶に加え（5mL）、続いて、塩化メチレンを10mL加えた。前記バイアル瓶に蓋をし、力強く振とうした。チューブピペットフィルターを備えた使い捨てのプラスチック製注射器を用い、底部の有機層の部分を除去し、前記ガスクロマトグラフィーに注入するために、残った底部の有機層を、2mLのガスクロマトグラフィー用バイアル瓶に移した。
【０１１２】
（実施例１Ｍ）
ゲノムに組み込まれたL. helveticusのＤ−ＬＤＨ遺伝子を有するK. marxianusによる、緩衝化条件下で、振とうフラスコ培養のYPD+グルコース培地中におけるD-乳酸の産生
光学的に純粋なD-乳酸を産生する前記6つの形質転換体を、ＣＤ５５４、ＣＤ５５５、ＣＤ５５６、ＣＤ５５７、ＣＤ５５８およびＣＤ５５９とした。これらの株を、100g/Lグルコースを補給した50mLのYPDを含む250mLのバッフル型振とうフラスコで培養し、YPD寒天プレートから植菌した。前記培地を、250rpmで撹拌しながら、30℃で、OD600が0.1になるまで16時間生育した。各フラスコに残った残余グルコースと、対数増殖期中である細胞を測定した後、4g/L細胞乾燥重量当量を、遠心分離によって回収し、約100g/Lグルコースと55g/L CaCO3とを補給した50mLのYPDを含む250mLのバッフル型振とうフラスコで懸濁した。この培養液を、70rpmで撹拌しながら30℃で放置した。種々の時間間隔で、試料を取り出し、その細胞を濾過により回収した。培養上清を、HPLC（後述する）によって分析した結果、グルコース、D-乳酸塩、ピルビン酸塩およびエタノールが得られた。
【０１１３】
HPLC分析方法
以下の実験で用いるHPLC方法は、水素の形態でスチレンジビニルベンゼン樹脂を各々含むBio-Rad Fast Acid Analysis Columnと、Rezex Fast Fruit Analysis Columnとを組み合わせて行う。有機組成物は、内部標準として、イソブチル酸を用いた250nmのUV検出器と組み合わせた屈折率検出器で定量した。試料は、既知量の試料を計り取り、内部標準の存在下で希釈することによって調製する。得られた溶液を、HPLCシステムに注入し、既知の標準試料を用いて定量した。
【０１１４】
このような培養条件下で、ＣＤ５５４、ＣＤ５５５、ＣＤ５５６、ＣＤ５５７、ＣＤ５５８、ＣＤ５５９株は、D-乳酸を９９％以上産生し、グルコースに対する収率が、９２〜９８％であった。D-乳酸の力価は、８２〜９０g/Lの範囲であり、体積生産性は、３０℃で、２．２g/L/hr以上であった。
【実施例２】
【０１１５】
（実施例２Ａ）
PDC1コード配列および１段階の置換方法を用いて、ＰＤＣ１遺伝子座に組み込まれたL. helveticusのＤ−ＬＤＨ遺伝子欠失を有する株のコンストラクション
プラスミドpＣＡ５０は、プラスミドpＶＲ４８（実施例１Ｋ）の４．７kbのNgoMIV/PsiI断片を、MscIとSgrAIとで切断したプラスミドpＢＨ５Ｃ（実施例３Ｂに記載、図１６ｃ）のバックボーンにつなぐことによってコンストラクションした。pＶＲ４８断片は、S. cerevisiaeのＰＧＫプロモーターによって駆動されるL. helveticusのＤ−ＬＤＨ遺伝子、続いて、S. cerevisiaeのGAL10転写終止配列を含む。この発現カセットは、S. cerevisiaeのＰＤＣ１プロモーターによって駆動されるハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｐｈ）、そして、ＧＡＬ１０ターミネーター(S. cerevisiae)と隣接する。pＶＲ４８断片を、pＢＨ５ｃバックボーンとつなぎ、これによって、プラスミドpＣＡ５０が作られる。Ｄ−ＬＤＨ：ｈｐｈコンストラクトは、K. marxianusのＰＤＣ１遺伝子座のすぐ上流および下流配列によって、はさまれている（図１４）。
【０１１６】
前記プラスミドpＣＡ５０を、SbfIおよびBseRIで制限酵素処理し、６２７２bpの断片を作った。この断片2.5μgを、ゲル電気泳動によって単離精製し、形質転換に使用した。実施例１Ｍに開示したエレクトロポレーションプロトコルを用いて、野生型K. marxianus(ＣＤ２１)を、この精製した断片で形質転換した。形質転換した細胞を、150μg/mLハイグロマイシンを含むYPD選択プレートにプレーティングし、そのゲノムへのpＣＡ５０断片のランダムな組み込み、または前記断片によって野生型のＰＤＣ１遺伝子座の相同的な置換を含む細胞の選択を行った。30℃で3日生育させた後、コロニーを単離し、150μg/mLハイグロマイシンを含む新たなYPDにストリークし、その表現型を確認した。
【０１１７】
そのコロニーを、PCRによって分析し、pＣＡ５０断片によって野生型のＰＤＣ１遺伝子座の相同的な置換を含むものを同定した。細胞を、PCR反応液で懸濁し、鋳型DNAを得た。５’プライマーoCA85 5'-GGA CCG ATG GCT GTG TAG AA-3'（配列番号２９）を、設計してｈｐｈ遺伝子の３’末端を増幅した。３’プライマーoCA80 5'-TCG CTT ACC TCG GTA CAG AA-3'（配列番号３０）を設計し、pＣＡ５０コンストラクトには含まれていないK. marxianusの遺伝子座の配列下流を増幅した。増幅分析は、プローブとしてTaqポリメラーゼ(Qiagen)を用いた標的配列、および以下のPCR反応条件を使用した。つまり、９５℃で１０分の初期の溶解工程を行い、続いて、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３分の増幅サイクルを４０サイクル、続いて、７２℃で１０分行った。
【０１１８】
相同的な置換を有する形質転換した細胞は、２．５kbのPCR産物を産生した。ランダムな組み込みを有する細胞は、ｏＣＡ８５およびｏＣＡ８０を有するＰＣＲ産物の産生が見られない。ＣＤ５９７からＣＤ６０１の株は、この２．５kbのPCR産物に陽性であった。
【０１１９】
（実施例２Ｂ）
１段階の置換方法を用いて、ＰＤＣ１遺伝子座に組み込まれたD-LDHの単一コピーを有するK. marxianusによる、振とうフラスコ培養の、微好気的複合CaCO3緩衝化培地中におけるD-乳酸の産生
２段階の置換の結果得られるｐｄｃ１Δ：：Ｌｈ−Ｄ−ＬＤＨ株ＣＤ５８７（実施例３Ｅ）を、１段階の置換（実施例２Ａ）によって作られたｐｄｃ１Δ：：Ｌｈ−Ｄ−ＬＤＨ株ＣＤ５９７、ＣＤ５９９およびＣＤ６００と比較し、これらの株が、産生方法に左右されることなく、同様の乳酸力価を産生するのかどうかを調べた。
【０１２０】
バイオマスを、100g/Lグルコースと50g/L CaCO3とを加えたYPD中で、37℃、225rpmで撹拌しながら一晩生育することによって産生した。産生用フラスコに、一晩バイオマスを撹拌したフラスコから、2g/L細胞乾燥重量を植菌した。産生条件は、100g/Lグルコースと50g/L CaCO3とを加えたYPD培地で、70rpmでアジテーションしながら、バッフル型振とうフラスコ、35℃とした。試料は、種々の時点で取り出した。バイオマスおよびCaCO3を、濾過によって除去し、濾過物をHPLC（実施例１Ｍ）で分析した結果、グルコース、乳酸塩、エタノールおよびピルビン酸塩が定量された。
【０１２１】
54時間後、ＣＤ５８７、ＣＤ５８９およびＣＤ５９０は、８５〜８８g/Lのグルコースを消費し、８１g/Lの乳酸塩および２．５g/Lのピルビン酸塩を産生した。乳酸力価は、グルコースに対する乳酸の収率９２〜９５％を示し、微好気的な間において、１．５g/L/hr以上の体積生産性を示した。この結果は、前記Ｄ−ＬＤＨ形質転換体が、D-乳酸を産生できることを示す。これらの株によって産生された乳酸の酵素的分析をしたところ、前記乳酸には、鏡像異性的純度が９９％以上で、D-乳酸が含まれていることを示した。これらの結果は、１段階の遺伝子置換方法を用いて産生した前記Ｄ−ＬＤＨ形質転換体（ＣＤ５９７、ＣＤ５９９およびＣＤ６００）は、２段階の株ＣＤ５８７と同様のD-乳酸を産生することができることを示すものである。
【実施例３】
【０１２２】
（実施例３Ａ）
S. cerevisiaeのＰＧＫプロモーターおよびＧＡＬ１０ターミネーターに動作可能なように結合したＧ４１８耐性遺伝子を有するpＶＲ２９プラスミドのコンストラクション(pＶＲ２９)
Ｇ４１８耐性マーカー（pＶＲ２２；実施例１Ｃ）を、pＮＣ２（実施例１Ａ）にクローニングし、前記コンストラクトである、pＶＲ２９を設計した（図１５）。Ｇ４１８耐性遺伝子を発現させるために、S. cerevisiaeのＰＧＫプロモーターと、S. cerevisiaeのＧＡＬ１０ターミネーターとを用いた。Ｇ４１８耐性遺伝子を、プライマー5'- GCT CTA GAT GAG CCA TAT TCA ACG GGA AAC(5'G断片（配列番号９）)および5'- ATG GAT CCT TAG AAA AAC TCA TCG AGC ATC(3'G断片（配列番号１０）)を有するPfu Polymerase(Stratagene, Madison, WI)と、鋳型としてのプラスミドpＶＲ２２（実施例１Ｃ）とを用いたPCRによって増幅した。温度サイクルは、はじめに、前記反応混合物を９５℃で５分インキュベーションし、続いて、９５℃で３０秒、４９℃で３０秒および７２℃で２分を３５サイクル行い、最後にＰＣＲインキュベーションとして７２℃で１０分のインキュベーションによって行った。PCR産物を、BamHIおよびXbaIで制限酵素処理し、８２１bp断片を単離し、４３０３bpのpＮＣ２のBamHI-XbaI断片とつないだ。得られたプラスミドpＶＲ２９（図１５）は、ＰＧＫプロモーターおよびＧＡＬ１０ターミネーターに動作可能なように結合したＧ４１８耐性遺伝子を含む。
【０１２３】
（実施例３Ｂ）
K. marxianusのＰＤＣ１遺伝子座を標的として、ＤＮＡを組み込むためのプラスミド
K. marxianusのＰＤＣ１遺伝子を側面に位置するＤＮＡ配列を、プラスミドpＶＲ２９（実施例３Ａ、図１５）に挿入し、ＰＤＣ１遺伝子座にＤＮＡを組み込むための組み換え核酸を作った。得られたコンストラクトが、pＢＨ５ａである(図１６ａ)。pＢＨ５ａは、SbfI制限酵素部位を含み、クローニングした遺伝子を、ＰＤＣ１プロモーターと動作可能のように結合可能できる。
【０１２４】
ＰＤＣ１のすぐ上流の１２５４bpのDNA断片を、プライマー5'-CAA GAA GGT ACC CCT CTC TAA ACT TGA ACA-3'(5'-Flank 5'（配列番号３１）)および5'-GTA ATT CCT GCA GGT GCA ATT ATT TGG TTT GG-3'(5'-Flank 3'（配列番号３２）)と、鋳型としてのプラスミドpＳＯ２１（実施例７Ｂ、実施例１Ｆ）とを用いたPCRによって増幅した。温度サイクルは、反応混合液を、最初に９４℃で２分のインキュベーションし、ついで、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、および７２℃で１．５分を３５サイクルし、続いて、最後に７２℃で７分のインキュベーションによって行った。１２５４ｂｐのPCR産物を、0.8％アガロースゲルでの電気泳動によって分離し、単離した。前記PCR産物およびpＶＲ２９（図１５ａ）の双方を、KpnIおよびSbfIで制限酵素処理した。制限酵素処理したPCR産物を、５０６７bpのpＶＲ２９につなぎ、６３１５bpのpＢＨ５ａ（図１１Ａ参照）を得た。得られたプラスミドは、S. cerevisiaeのＰＧＫプロモーターおよびＧＡＬ１０ターミネーターに動作可能のように結合したＧ４１８耐性遺伝子、およびＰＤＣ１遺伝子のすぐ上流のDNAと相同的な１２４０bpのDNA断片を含む。
【０１２５】
ＰＤＣ１のすぐ下流の５３５bpのDNA断片を、プライマー5'-CCA AGC CCT GCA GGA GAG GGA GAG GAT AAA GA-3'(3'-Flank 5'（配列番号３３）)および5'-CTC GTA ACG CGT GTA CAA GTT GTG GAA CAA-3'(3'-Flank 3'（配列番号３４）)と、鋳型としてのプラスミドpＳＯ２１（図７Ａ）とを用いてPCR増幅した。温度サイクルは、前記反応混合液を、最初に９４℃で２分のインキュベーションし、ついで、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、そして７２℃で４５秒を３５サイクルし、続いて、最後に７２℃で４分のインキュベーションを行うことによって行った。PCR産物を、0.8％アガロースゲルを用いた電気泳動によって分離し、５３５bpの産物を単離した。このPCR産物を、SbfIおよびMluIで制限酵素処理した。５２９bpの断片を、pＢＨ５ａのSbfI-MluI断片とつなぎ、プラスミドpＢＨ５ｂを得た。pＢＨ５ｂは、ｐｄｃ１側面配列間に位置している独自のSbfI部位を備えたPDC1のすぐ上流の１．２kbのＤＮＡおよびすぐ下流の０．５kbのＤＮＡを含み、また、S. cerevisiaeのＰＤＣ１プロモーターおよびＧＡＬ１０ターミネーターに動作可能のように結合した選択的Ｇ４１８耐性マーカーを含む。pＢＨ５ｂを、図１６ｂに模式的に示す。
【０１２６】
また、PDC1(K. marxianus)遺伝子座の部分は、市販のプラスミドpＵＣ１９(Invitrogen)にサブクローニングし、pＢＨ５ｃを以下のようにして作った。プラスミドｐＳＯ２１を、NheIおよびNdeIで制限酵素処理し、PDC1のすぐ上流の４８６bpのDNA、PDC1の完全な配列、およびＰＤＣ１のすぐ上流の１１５７bpのDNA断片を含む３３３９bpのDNA断片を、0.8％アガロースゲルでの電気泳動で分離し、単離した。pＵＣ１９を、XbaIおよびNdeIで制限酵素処理し、２４５２bpのＤＮＡ断片を、0.8％アガロースゲルでの電気泳動で分離し、単離した。制限酵素処理したpＵＣ１９と、ＰＤＣ１遺伝子座とをつなぎ、５７９１bpのpＢＨ５ｃを得た。pＢＨ５ｃを、図１６ｃに模式的に示す。
【０１２７】
（実施例３Ｃ）
K. marxianusのＰＤＣ１遺伝子座を標的として、L. helveticusのＤ−ＬＤＨ遺伝子を組み込むためのプラスミド
pＶＲ４８（実施例１Ｋ）のＤ−ＬＤＨ遺伝子を、pＢＨ５ｂのSbfI部位にクローニングし、K. marxianusのＰＤＣ１遺伝子座にＤ−ＬＤＨを組み込み可能で、内因性のＰＤＣ１プロモーターおよびターミネーターの調節下で、Ｄ−ＬＤＨを発現可能な組み換え核酸を作った。
【０１２８】
Ｄ−ＬＤＨ遺伝子を、プライマー5'-TTT TTA CCT GCA GGC TAG ATT TAT GAC AAA GG-3' (Lh-D-LDH 5'（配列番号３５）)および5'-TCT ACC CCT GCA GGA AAA CTT GTT CTT GTT CA-3' (Lh-D-LDH 3'（配列番号３６）)と、鋳型としてのpＶＲ４７（実施例１Ｊ）とを用いて、PCR増幅した。温度サイクルは、Failsafe PCR System(Epicentre, Madison, WI)を用いて、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１．５分を３０サイクルし、続いて、最後に７２℃で４分のインキュベーションによって行った。PCR産物を、0.8％アガロースゲルでの電気泳動によって分離し、１０２８bpの産物を単離した。PCR産物を、SbfIで制限酵素処理し、６８４４bpのSbfI制限酵素処理したpＢＨ５ｂにつなぎ、７８７２bpのプラスミドpＢＨ６を得た。pＢＨ６は、S. cerevisiaeのＰＤＣ１プロモーターおよびＧＡＬ１０ターミネーターに動作可能なように結合したＧ４１８耐性マーカーとともに、ＰＤＣ１プロモーターおよびターミネーターに動作可能のように結合したＤ−ＬＤＨ遺伝子を含む。
【０１２９】
（実施例３Ｄ）
ＰＤＣ１遺伝子座へのpＢＨ６の組み込み、K. marxianus株ＣＤ５８８の作成
Ｄ−ＬＤＨを含む組み込みプラスミドpＢＨ６を、野生型K. marxianus（ＣＤ２１）に形質転換した。前記染色体上の、pＢＨ６のＤ−ＬＤＨ遺伝子のすぐ上流のＰＤＣ１側面DNAと、ＰＤＣ１遺伝子のすぐ下流のDNAとの間の初期の単一相同組み換えを介して、プラスミド全体を、ＰＤＣ１遺伝子座に組み込んだ。得られた株は、ＰＤＣ１の野生型コピーと、ＰＤＣ１遺伝子座に組み込まれたpＢＨ６の単一コピーとを含む。
【０１３０】
ＣＤ２１を使用して、100g/Lのグルコースを補充した50mLのYPDを含む250mLのバッフル型振とうフラスコ中で、OD600が0.1になるように植菌した。前記培養液を、250rpmで、30℃、OD600が12になるまで、16時間生育した。培養液10mLから、遠心分離によって回収し、１度、エレクトロポレーション緩衝液(EB;10mM Tris-Cl、270 mMしょ糖、1mM MgCl2、pH7.5)で洗浄した。前記細胞を、培養緩衝液(YPD+25mM DTT、20mM HEPES、pH8.0)に懸濁し、30℃、250rpmで30分培養した。その細胞を遠心により回収し、EBで１度洗浄した。その細胞を、1mLのEBで再懸濁し、この懸濁液400μLを、0.4cmのエレクトロポレーションキュベットに移した。12μgの非切断pＢＨ６（全体積50μL）を、前記キュベットに加え、その細胞を、1.8kV、1000Ω、25μFでエレクトロポレーションした。その細胞を、1mLのYPDを含む50mLのスクリューキャップのファルコンチューブに移し、250rpmで撹拌しながら、30℃で4時間培養し、300μg/mLのＧ４１８を含むYPD上にプレーティングし、選択した。形質転換体を、37℃で2日生育した。生育した形質転換体を、新たな選択プレートにストリークした。
【０１３１】
K. marxianusの染色体上の、pＢＨ６のＤ−ＬＤＨ遺伝子のすぐ上流のＰＤＣ１の側面ＤＮＡと、ＰＤＣ１遺伝子のすぐ下流のDNAとの間の単一相同組み換えを介して、ＰＤＣ１遺伝子座への、pＢＨ６の適切な組み込みの確認は、プライマー5'-AAG CAC CAA GGC CTT CAA CAG-3'(PDC1染色体 5'（配列番号３７）)および5'-CTT GTC TTG ACG TAA TAC ACG TGC AGC-3'（D-LDH 3'（配列番号３８））を用いて評価した。なお、このプライマーは、ＰＤＣ１遺伝子の上流の染色体DNAとpＢＨ６に相同的に組み込まれたDNAの外側との間の２．７kb産生物と、Ｄ−ＬＤＨ遺伝子とを増幅するように設計した。温度サイクルは、前記反応混合液を、最初に、９４℃で２分インキュベーションし、続いて９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、および７２℃で３分を３５サイクルし、続いて、最後に７２℃で７分のインキュベーションによって行った。分析した結果、１０分の７の形質転換体が、目的の２．７kbのPCR産物を産生した。2つの産物を、ＰＤＣ１遺伝子座5'-CGC AAA GAA AAG CTC CAC ACC-3'(PDC1 5'（配列番号３９）)および5'-CCC ATA CGC TTA TAA TCC CCC-3'(PDC1 3'（配列番号４０）)を増幅するように設計したプライマーを用いて、PCR分析したところ、ＰＤＣ１に相当する１．７kbのバンド、およびＤ−ＬＤＨに相当する１．０kbのバンドが得られた。温度サイクルは、前記反応混合物を、９４℃で２分インキュベーションし、続いて、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で２分の増幅サイクルを３５サイクルし、そして、最後に７２℃で５分のインキュベーションによって行った。Ｇ４１８耐性遺伝子を検出するように設計したプローブを用いたサザンブロッティング分析を使用して、単一コピーの組み込みのさらなる確認を行った。分析した形質転換体の７分の１が、pＢＨ６の単一コピーの組み込みを備えた目的のバンドパターンを示した。PCRおよびサザンブロッティング分析による確認により、ＰＤＣ１遺伝子座に位置するpＢＨ６の単一コピーを備えた株は、ＣＤ５８８とした。
【０１３２】
これらの結果は、野生型K. marxianusのＣＤ２１のＰＤＣ１遺伝子座を標的として、形質転換したpＢＨ６のDNAの組み込みが、ＰＤＣ１プロモーター配列間の単一の相同組み換えを通して行われることを示した。また、これらの結果は、pＢＨ６が、ＣＤ５８８株に単一コピーとして存在することを同定する。
【０１３３】
（実施例３Ｅ）
pＢＨ６プラスミドバックボーンおよびＣＤ５８８のＰＤＣ１遺伝子の欠失させることによる、K. marxianus株ＣＤ５８７、ＣＤ５８９およびＣＤ５９０の産生
ＣＤ５８８を、種々の生育段階のための非選択倍地上で培養し、組み込まれたpＢＨ６のＰＤＣ１ターミネーター配列と、野生型のＰＤＣ１ターミネーターとの間に第２の相同性組み換えを促進させた。前記ターミネーター配列での第２の相同性組み換えの結果、ＰＤＣ１遺伝子が、Ｄ−ＬＤＨ遺伝子によって置換された株が得られた。第２の組み換えの結果として、この株は、ＰＤＣ１遺伝子とともに、Ｇ４１８遺伝子を欠失しているためＧ４１８耐性マーカー遺伝子がない。得られた株は、ＰＤＣ１が、Ｄ−ＬＤＨによって置き換わっているため、嫌気的な生育の欠如とともに、Ｇ４１８感受性表現型を示す。
【０１３４】
ＣＤ５８８を、YPD寒天プレート上にプレーティングし、37℃で一晩生育した。コロニーのスワブを、新たなYPD寒天プレートに移した。これを、４回繰り返した。YPD寒天プレート上で非選択生育の15ラウンドの後、100g/Lグルコースおよび42g/LCaCO3を補充した50mLのYPDを含む６×50mLのバッフル型振とうフラスコに、OD600が0.1となるように、15ラウンド目の非選択培地から細胞を入れた。前記振とうフラスコを、30℃で、250rpm、16時間生育した。ついで、前記培養液を、希釈し、YPD寒天プレート上に単一コロニーとしてプレーティングした。加えて、15ラウンド目の非選択培地からのコロニーのスワブを、1mLのPBS(リン酸緩衝生理食塩水)に懸濁し、続いて希釈し、YPD寒天プレート上に単一コロニーとしてプレーティングした。このラウンドのプレーティングから得られた単一コロニーを、YPD寒天にプレーティングし、嫌気的なチャンバーに放置した。37℃で2日生育した後、嫌気的なチャンバーを開き、嫌気的に生育したコロニーに印をつけた。このプレートを、35℃でさらに1日培養した。嫌気的ではなく、好気的に生育したコロニーを移し、スクリーニングのためのプレートを３つ作成した。このスクリーニング条件に使用したプレートは、YPDプレート（好気）、YPDプレート（嫌気）およびＧ４１８を300μg/mL補充したYPDプレートである。3種類の形質転換体を、Ｇ４１８感受性および嫌気的生育の欠失を有する目的の表現型有するとして、同定した。これらの形質転換体を、ＣＤ５８７、ＣＤ５８９およびＣＤ５９０とした。
【０１３５】
Ｄ−ＬＤＨとＰＤＣ１との置換の確認は、ＰＤＣ１遺伝子座を増幅するように設計したプライマー5'-CGC AAA GAA AAG CTC CAC ACC-3'(PDC1 5'（配列番号３９）)および5'-CCC ATA CGC TTA TAA TCC CCC-3'(PDC1 3'（配列番号４０）)と、鋳型としてのＣＤ５８７、ＣＤ５８９およびＣＤ５９０の染色体DNAとを用いて行った。温度サイクルは、はじめに、前記反応混合液を、９４℃で２分インキュベーションし、続いて、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で２分を３５サイクルし、そして、最後に７２℃で５分のインキュベーションによって行った。３つの株すべての染色体DNAから、Ｄ−ＬＤＨに相当する単一の１．０kbのPCR産物が産出された。Ｇ４１８遺伝子とハイブリダイズするように設計したプローブを用いたサザンブロッティング分析は、Ｇ４１８遺伝子の欠失を示した。さらに、ＰＤＣ１をコードする領域のためのプローブを加えたサザンブロッティング分析は、いかなるバンドも検出しなかった。ＰＤＣ１のすぐ上流および下流の領域をハイブリダイズするように設計したプローブでは、Ｄ−ＬＤＨとＰＤＣ１との置換に一致する大きさのバンドが得られた。
【０１３６】
これらの結果は、S. cerevisiaeのＰＤＣ１プロモーターおよびＧＡＬ１０ターミネーターに動作可能のように結合したＧ４１８耐性マーカーを含むプラスミドpＢＨ６のバックボーンとともに、ＰＤＣ１遺伝子を、ＣＤ５８８染色体から、ＣＤ５８８のＰＤＣ１遺伝子座に存在する２つのｐｄｃ１ターミネーターの間に起こる第２の相同組み換えを介して欠失していることを示す。この第２の組み換えは、ＰＤＣ１遺伝子が、SbfI部位によってはさまれているＤ−ＬＤＨ遺伝子に正確に置換されている株を提供する。
【０１３７】
（実施例３Ｆ）
ＰＤＣ１遺伝子座に組み込まれたＤ−ＬＤＨの単一コピーを含むK. marxianusによる、振とうフラスコ培養の、微好気的複合CaCO3緩衝培地中におけるD-乳酸の産生
Ｐｄｃ＋  Ｌｈ−Ｄ−ＬＤＨ株ＣＤ５８８およびＰｄｃ−  Ｌｈ−Ｄ−ＬＤＨ株ＣＤ５８７、ＣＤ５８９およびＣＤ５９０を、YPD寒天プレートに、OD600が0.1となるように加え、100g/Lグルコースおよび50g/L CaCO3を補充したYPD 50mLを含む250mLのバッフル型振とうフラスコで、30℃、250rpm、16時間培養した。フラスコ内に残存グルコースが残っていること、及び、細胞が対数増殖期であることを確認した後、4g/L細胞乾燥重量当量を、遠心によって回収し、100g/Lグルコースおよび50g/L CaCO3を補充した50mLのYPDを含む250mLのバッフル型振とうフラスコに懸濁した。前記培養液を、70rpm、30℃で放置した。試料を、様々な時間間隔で回収し、その細胞を濾過により除去した。培養上清をHPLCによって分析した結果（上記実施例１Ｍに記載）、グルコース、乳酸塩、ピルビン酸塩およびエタノールが定量された。
【０１３８】
23時間後、Ｐｄｃ＋  Ｌｈ−Ｄ−ＬＤＨ株ＣＤ５８８は、１２７g/Lのグルコースを消費し、３３g/Lの乳酸塩、３７g/Lのエタノールおよび０．２g/Lのピルビン酸塩を産生した。Ｐｄｃ−  Ｌｈ−Ｄ−ＬＤＨ株ＣＤ５８７、ＣＤ５８９およびＣＤ５９０は、４０〜４３g/Lのグルコースを消費し、３６〜３９g/Lの乳酸塩、１．０〜１．３g/Lのピルビン酸塩を産生した。
【０１３９】
54時間後、ＣＤ５８７、ＣＤ５８９およびＣＤ５９０は、８５〜８８g/Lのグルコースを消費し、８１g/Lの乳酸塩および２．５g/Lのピルビン酸塩を産生した。この乳酸力価は、グルコースに対する乳酸の収率が、９２〜９５％であり、微好気的産生期間において、１．５g/L/hr以上の体積生産性を示す。54時間後、非溶解性乳酸カルシウムの沈殿が形成された（“ケーキ”）。これは、大量のD-乳酸塩が、培養液に生産されたためによる。したがって、さらなる分析を中止した。実施例１Ｌに基づく酵素的分析およびGC分析によると、産生された乳酸塩のうち99％以上が、D-乳酸塩であることが示された。ＣＤ５８７、ＣＤ５８９およびＣＤ５９０の培養液では、エタノールは検出されず、これは、LDHによるPDC1の置換に一致した。
【０１４０】
これらの結果は、前記Ｄ−ＬＤＨ形質転換体が、Ｄ−乳酸を産生できることを示す。機能的なＰＤＣ１を有する乳酸産物は、ほぼ当量の乳酸およびエタノールを産生した。これは、Ｄ−ＬＤＨが、ピルビン酸塩のための野生型のＰＤＣ１と競合することができることを示す。L. helveticus由来のＤ−ＬＤＨと、ＰＤＣ１とを置換することによって、乳酸力価は、２倍に増加し、理論上の最大値に到達する高力価および高収率が得られた。さらに、これらの株は、エタノールを産生しなかった。これは、Ｄ−ＬＤＨとＰＤＣ１との置換を実証する。これらの株によって産生された乳酸の酵素的分析は、前記乳酸中に、鏡像異性的純度が９９％以上でＤ−ＬＤＨを含むことを示した。
【０１４１】
（実施例３Ｇ）
K. marxianus株による、振とうフラスコ培養の、微好気的複合CaCO3緩衝化培地中における、高温でのD-乳酸の産生
野生型K. marxianusのＣＤ２１、ＰＤＣ＋  Ｌｈ−Ｄ−ＬＤＨ株ＣＤ５８８およびＰＤＣ−  Ｌｈ−Ｄ−ＬＤＨ株ＣＤ５５８およびＣＤ５８７を、YPD寒天プレートから、OD600が0.1となるように、100g/Lグルコースおよび50g/L CaCO3を補充した50mLのYPDを含む250mLのバッフル型振とうフラスコ中に植菌し、33℃、250rpmで16時間生育した。フラスコ内に残存グルコースが残っていること、及び、細胞が対数増殖期であることを確認した後、4g/L細胞乾燥重量当量を、遠心により回収し、100g/Lグルコースおよび50g/L CaCO3を補充した50mLのYPDを含む250mLのバッフル型振とうフラスコ中に懸濁した。その培養液を、70rpmで、37℃、42℃または50℃で生育した。試料を様々な時間間隔で取り出し、その細胞を濾過により除去した。培養上清をHPLCで分析したところ（実施例１Ｍ）、グルコース、乳酸塩、ピルビン酸塩、アセテート、グリセロールおよびエタノールが定量された。
【０１４２】
23時間後、37℃で発酵させたＰＤＣ＋  Ｌｈ−Ｄ−ＬＤＨ株ＣＤ５８８は、１１５．５g/Lのグルコースを消費し、１６．２g/Lの乳酸塩、３７．６g/Lのエタノール、７．６g/Lのグリセロール、２．６g/Lのアセテートおよび０．２g/Lのピルビン酸塩を産生した。37℃で47時間後、ＰＤＣ−  Ｌｈ−Ｄ−ＬＤＨ株ＣＤ５５８およびＣＤ５８７は、９９〜１０５g/Lのグルコースを消費し、９０〜９９g/Lの乳酸塩、２．７〜３．５g/Lのピルビン酸塩および１．２〜１．４g/Lのアセテートを産生した。一方、野生型株ＣＤ２１は、１１５．５g/Lのグルコースを消費し、主としてエタノールを産生し（４３．５g/L）、少量の乳酸塩を産生した（１．７g/L）。
【０１４３】
23時間後、42℃で発酵させたＰＤＣ＋  Ｌｈ−Ｄ−ＬＤＨ株ＣＤ５８８は、１１５．５g/Lのグルコースを消費し、１２．８g/Lの乳酸塩、３４．７g/Lのエタノール、６．９g/Lのグリセロール、３．０g/Lのアセテートおよび０．３g/Lのピルビン酸塩を産生した。42℃で47時間後、ＰＤＣ−  Ｌｈ−Ｄ−ＬＤＨ株ＣＤ５５８およびＣＤ５８７は、８０g/Lのグルコースを消費し、７５g/Lの乳酸塩、２．５g/Lのエタノールおよび１．５g/Lのアセテートを産生した。一方、野生型株ＣＤ２１は、１１５．５g/Lのグルコースを消費し、主としてエタノールを産生し（３９．７g/L）、少量の乳酸塩を産生した（１．０g/L）。
【０１４４】
47時間後、50℃で発酵させたＰＤＣ＋  Ｌｈ−Ｄ−ＬＤＨ株ＣＤ５８８は、４９．６g/Lのグルコースを消費し、６．８g/Lの乳酸塩、９．５g/Lのエタノール、４．５g/Lのグリセロールおよび１．８g/Lのアセテートを産生した。50℃で47時間後、ＰＤＣ−  Ｌｈ−Ｄ−ＬＤＨ株ＣＤ５５８およびＣＤ５８７は、１５g/Lのグルコースを消費し、１０g/Lの乳酸塩、１．２〜１．４g/Lのピルビン酸塩および１．６〜１．７g/Lのアセテートを産生した。一方、野生型株ＣＤ２１は、７０．５g/Lのグルコースを消費し、主としてエタノールを産生し（１３．６g/L）、少量の乳酸塩を産生した（０．５g/L）。
【０１４５】
この結果は、Ｄ−Ｌｄｈ＋形質転換体が、50℃程度の高温で、D-乳酸を産生できることを示す。これらの株によって産生された乳酸は、酵素的分析によって測定した結果、鏡像異性的純度が９９％以上でD-乳酸を含む。全グルコース消費量および乳酸産生率が、温度増加とともに減少したものの、ＰＤＣ−  Ｌｈ−Ｄ−ＬＤＨ株ＣＤ５５８およびＣＤ５８７のグルコースからの乳酸の収率は、８８〜１００％の間にとどまっている。
【０１４６】
（実施例３Ｈ）
前記染色体に組み込まれたL. helveticus D-LDHの単一コピーを備えたK. marxianusによる、振とうフラスコ培養の、微好気的非緩衝化複合培地中における、D-乳酸の産生
野生型K. marxianus株ＣＤ２１、ＰＤＣ＋  Ｌｈ−Ｄ−ＬＤＨ株ＣＤ５８８およびＰＤＣ−  Ｌｈ−Ｄ−ＬＤＨ株ＣＤ５５８ならびにＣＤ５８７を、YPD寒天プレートから、100g/Lグルコースを補充した50mLのYPDを含む250mLのバッフル型振とうフラスコ中に、OD600が01.となるように植菌し、30℃、250rpmで16時間生育した。フラスコ内に残存グルコースが残っていること、及び、細胞が対数増殖期であることを確認した後、4g/L細胞乾燥重量当量を、遠心により回収し、40g/Lグルコースを添加した50mLのYPDを含む2種類の250mLのバッフル型振とうフラスコ中で懸濁した。その培養液を、70rpm、37℃で生育した。試料を様々な時間間隔で取り出し、その細胞を濾過により除去した。培養上清をHPLCで分析したところ（実施例１Ｍ）、グルコース、乳酸塩、ピルビン酸塩、アセテート、グリセロールおよびエタノールが定量された。
【０１４７】
23時間後、ＰＤＣ＋  Ｌｈ−Ｄ−ＬＤＨ株ＣＤ５８８は、５８．９g/Lのグルコースを消費し、０．９g/Lの乳酸、０．２g/Lのピルビン酸塩、２．６g/Lのグリセロールおよび０．６g/Lのアセテートを産生した。最終的な培地のpHを測定したところ、４．６であった、エタノールの産生は、２４〜２４．７g/Lで、この発酵の主産物であった。23時間後、ＰＤＣ−  Ｌｈ−Ｄ−ＬＤＨ株ＣＤ５５８およびＣＤ５８７は、４．１g/Lのグルコースを消費し、２．５g/Lの乳酸塩、１．０g/Lのピルビン酸塩、０．８g/Lのグリセロールおよび０．４g/Lのアセテートを産生した。ＣＤ５８７およびＣＤ５５８株の最終的な培地のpHは、３．３１〜３．６５の範囲であった。乳酸塩が、１．２〜３．３g/Lの範囲のレベルでこの発酵の主産物であった。野生型株ＣＤ２１は、最終のpHが４．６５で、23時間で、５８．９g/Lのグルコースを消費し、最もエタノールを産生し（１２．８〜２０．４g/L）、少量の乳酸塩を産生した（１．２〜１．３g/L）。
【０１４８】
これらの結果は、Ｄ−Ｌｄｈ＋形質転換体が、３．３１程度に低いpH値で、D-乳酸を産生することを示す。これらの株によって産生した乳酸の酵素的分析は、この乳酸中に、鏡像異性的純度が99％以上でD-乳酸を含むことを示した。
【０１４９】
（実施例３Ｉ）
株における、D-キシロースからD-乳酸の産生
３種類の人工K. marxianus株について、ＣＤ２１（野生型）と相対的なD-キシロースからD-乳酸の産生を分析した。前記株は、ＣＤ５５８(ＰＤＣ１を含まず、ランダムに組み込まれたL. helveticus Ｄ−ＬＤＨを含む)、ＣＤ５８７(ＰＤＣ１：：Ｌｈ−Ｄ−ＬＤＨ)およびＣＤ５８８（L. helveticusのＤ−ＬＤＨを含む）を含む。以下の結果は、人工株が、非グルコース基質からD-乳酸を産生できることを示す。
【０１５０】
ＣＤ２１、ＣＤ５５８、ＣＤ５８７およびＣＤ５８８株の細胞を、YPD+20g/LのD-キシロース寒天プレートで生育し、それを用いて、20g/L酵母抽出物、10g/Lペプトン、17g/L CaCO3,および50g/L D-キシロースを含む培地100mLを含むバッフル型振とうフラスコに植菌した。前記植菌した振とうフラスコを、250rpmで撹拌しながら、35℃で培養した。試料を前記フラスコから採取し、培地の生育および糖質の利用を観察するために、OD600nmを測定した。36時間後、前記細胞を遠心により回収し、各培地の細胞乾燥重量（CDW）を測定した。20g/L酵母抽出物、10g/Lペプトン、および50g/L D-キシロースを含む2種類のバッフル型振とうフラスコに、各株から3.0g/L CDWの細胞を加えた。前記フラスコを、70rpmで撹拌しながら35℃で培養した。HPLC分析および培地組成物の定量のために、試料を様々な時点で採取し、その試料には、キシロース、D-乳酸塩、キシリトールおよびエタノールが含まれていた。
【０１５１】
ＣＤ５５８およびＣＤ５８７株によって産生された主な有機組成物は、D-乳酸であり、平均最高力価は、１３．７g/kgに達した。これは、約３３％のD-キシロースからD-乳酸が得られたことを示す。ＣＤ２１株によって産生された主な有機組成物は、キシリトールであり、平均最高力価は、２５．０g/kgに達した。これは、約５０％のＤ−キシロールからキシリトールが得られたことを示す。ＣＤ５８８株によって産生された主な有機組成物は、キシリトールであり、平均最高力価は、１９．６g/kgに達した。これは、約４４％のD-キシロースから平均のキシリトールが得られたことを示す。いずれの株においても、HPLC分析によって、グリセロール、クエン酸塩、ピルビン酸塩、コハク酸塩またはアセテート産物は検出されなかった。
【実施例４】
【０１５２】
B. megateriumのＤ−Ｌｄｈを発現するため、および、ＰＤＣ１遺伝子座を標的とした、形質転換したDNAを組み込むためのプラスミド
ＰＤＣ１遺伝子座を標的として組み込むためのB. megateriumのＤ−ＬＤＨ遺伝子を含むプラスミドは、以下のようにして調製した。
【０１５３】
プラスミドpＭＩ２５７(Candida application)を、NcoIで直線状にし、５’突出部を、DNAポリメラーゼI、クレイノウ酵素、dATP、dCTPおよびdTTPの混合物で部分的に埋め、前記反応からｄGTPを取り除いた。マングビーンヌクレアーゼで処理することによって、単一ストランドの伸張部の除去した。ついで、DNAを、BamHIで制限酵素処理して、電気泳動での分離の後、０.８％アガロースゲルから、９２００bpの断片を単離した。B. megateriumのＤ−ＬＤＨを含むプラスミドpＶＲ４７（実施例１Ｊ）を、B. megateriumのゲノムDNAから作り、それを図１２に示す。B. megateriumのＬＤＨを含む１０２３bpの断片を、pＶＲ４７からXbaIによって切り出し、続いて、5’突出部を、DNAポリメラーゼI、クレイノウ酵素および各4dNTPSによって埋め、BamHIによって切断した。pＭＩ２５７からの９２００bpのNcoI(blunt)-BamHI断片と、pＶＲ４７からのXbaI(blunt)-BamHI断片とを、つなぎ、得られたプラスミドを、pＭＩＸＸＸとし、それを図１８に示す。PＭＩ１０００は、C. sonorensisのＰＤＣ１プロモーター、C. sonorensisのＰＧＫ１プロモーターに動作可能のように結合したS. cerevisiaeのMEL5遺伝子、C. sonorensisのＰＧＫ１プロモーターに動作可能のように結合したB. megateriumのＤ−ＬＤＨおよびC. sonorensisのＰＤＣ１ターミネーターを含む。pＭＩ１０００を、NotIで制限酵素処理して、PDC1 5'および3'領域によってはさまれたＭＥＬ５およびＬＤＨ発現カセットからなる７３００bpの断片を切り取った。この７５００bpの断片を用いてC. sonorensis (Candida filing)を形質転換し、その形質転換体を、X-α-galを40μg/mLの濃度で添加したYPDプレートでスクリーニングした。その形質転換体は、X-α-gal（40μg/mL）を添加したYPDプレートで生育した。
【０１５４】
上記の開示内容は、本発明を個別具体的に示すものであって、全ての修正または代替案は、添付の特許請求の範囲に示す発明の範囲および意図内にあると理解すべきである。本明細書に記載している文献は、そっくりそのまま参考のために示す。
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】図１は、双方S. cerevisiae由来のＰＧＫプロモーターおよびＧＡＬ１０ターミネーターを含むpＮＣ２のプラスミドマップである。
【図２】図２は、双方S. cerevisiae由来のＰＤＣ１プロモーターおよびＧＡＬ１０ターミネーターを含むpＮＣ４のプラスミドマップである。
【図３】図３ａは、PCRで増幅させたS. cerevisiae染色体DNA由来の1.235kb配列のNotI制限酵素切断断片地図であって、ＰＧＫプロモーターおよびＧＡＬ１０ターミネーター(S. cerevisiae)、前記プロモーターとターミネーターとの間にマルチプルクローニングサイトを含み、図３ｂは、PCRで増幅させたS. cerevisiae染色体DNA由来の1.235kb配列のNotI制限酵素切断断片地図であって、ＰＤＣ１プロモーターおよびＧＡＬ１０ターミネーター(S. cerevisiae)、前記プロモーターとターミネーターとの間にマルチプルクローニングサイトを含む。
【図４】図４は、S. cerevisiae由来のＰＧＫプロモーターおよびＧＡＬ１０ターミネーターと機能的に結合したB. megateriumのＬ−ＬＤＨを含むpＶＲ２４のプラスミドマップである。
【図５】図５は、S. cerevisiae由来のＰＧＫプロモーターおよびＧＡＬ１０ターミネーターと機能的に結合したＧ４１８耐性マーカーを含むpＶＲ２２のプラスミドマップである。
【図６】図６は、S. cerevisiae由来のＰＧＫプロモーターおよびＧＡＬ１０ターミネーターと機能的に結合したB. megaterium由来のＬＤＨ遺伝子を含むpＮＣ７のプラスミドマップである。
【図７】図７Ａは、K. marxianus由来のPDC1を含むpＳＯ２１プラスミドマップであり、図７Ｂは、PDC1の遺伝子座の５'上流領域を含むＰＤＣ１の3.3kbの断片（K. marxianus）を含むpＳＯ２１プラスミドマップである。
【図８】図８は、ｐSO21に含まれるＰＤＣ１をコードする領域の欠失と、S. cerevisiae由来のＰＧＫプロモーターおよびＧＡＬ１０ターミネーターと機能的に結合したＧ４１８耐性遺伝子とを含むpＳＯ２８のプラスミドマップである。
【図９】図９は、ｐSO21に含まれるコードする領域の欠失と、S. cerevisiae (pTEF1/Zeo;Invitrogen社製)由来のＴＥＦ１プロモーターおよびＴｃｙｃ１ターミネーターと機能的に結合したゼオシン耐性遺伝子とを含むｐＳＯ２９のプラスミドマップである。
【図１０】図１０は、S. cerevisiae由来のＰＤＣ１プロモーターおよびＧＡＬ１０と機能的に結合した大腸菌由来のハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｐｈ）を含むpＰＳ１のプラスミドマップである。
【図１１】図１１ａは、L. helveticus由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子を含むｐＶＲ４３のプラスミドマップであり、図１１ｂは、５’および３’末端それぞれに、XbaIおよびBamHIを備えたＤ−ＬＤＨ遺伝子（L. helveticus由来）を含むpＶＲ４４のプラスミドマップである。
【図１２】図１２は、S. cerevisiae由来のＰＧＫプロモーターおよびＧＡＬ１０ターミネーターと機能的に結合したL. helveticus由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子を含むpＶＲ４７のプラスミドマップである。
【図１３】図１３は、S. cerevisiae由来のＰＧＫプロモーターおよびＧＡＬ１０ターミネーターと機能的に結合したL. helveticus由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子と、S. cerevisiae由来のＰＤＣ１プロモーターおよびＧＡＬ１０ターミネーターと機能的に結合したhph耐性遺伝子とを含むpＶＲ４８のプラスミドマップである。
【図１４】図１４は、ＰＤＣ１遺伝子座の3'の上流域と5'の上流域との間に挿入された発現カセットを含み、S. cerevisiae由来のＰＧＫプロモーターおよびＧＡＬ１０ターミネーターと機能的に結合したL. helveticus由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子と、S. cerevisiae由来のＰＤＣ１プロモーターおよびＧＡＬ１０ターミネーターと機能的に結合したｈｐｈ耐性遺伝子を含むpＣＡ５０のプラスミドマップである。
【図１５】図１５は、S. cerevisiae由来のＰＧＫプロモーターおよびＧＡＬ１０ターミネーターと機能的に結合したＧ４１８耐性マーカーを含むpＶＲ２９のプラスミドマップである。
【図１６】図１６ａは、ＰＤＣ１遺伝子座の5'側面(K. marxianus)と、独立してS. cerevisiae由来のＰＧＫプロモーターおよびＧＡＬ１０ターミネーターと機能的に結合したＧ４１８耐性遺伝子とを含むpＢＨ５ａのプラスミドマップであり、図１６ｂは、ＰＤＣ１遺伝子座の5'および3'の側面領域(K. marxianus)と、独立して、S. cerevisiae由来のＰＧＫプロモーターおよびＧＡＬ１０ターミネーターと機能的に結合したＧ４１８耐性遺伝子とを含むpＢＨ５ｂのプラスミドマップであり、図１６Ｃは、K. marxianus由来のPDC1遺伝子座を含むpＢＨ５ｂプラスミドマップである。
【図１７】図１７は、ＰＤＣ１遺伝子座(K. marxianus)の5'側面領域と3'側面領域との間に配置したL. helveticus由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子と、独立して、S. cerevisiae由来のＰＤＣ１プロモーターおよびＧＡＬ１０ターミネーターと機能的に結合したＧ４１８耐性遺伝子とを含むｐＢＨ６のプラスミドマップである。
【図１】
2005528112.tif 000002
【図２】
2005528112.tif 000003
2005528112.tif 000004
2005528112.tif 000005
【図４】
2005528112.tif 000006
【図５】
2005528112.tif 000007
【図６】
2005528112.tif 000008
2005528112.tif 000009
2005528112.tif 000010
【図８】
2005528112.tif 000011
【図９】
2005528112.tif 000012
【図１０】
2005528112.tif 000013
【図１１】
2005528112.tif 000014
2005528112.tif 000015
【図１２】
2005528112.tif 000016
【図１３】
2005528112.tif 000017
【図１４】
2005528112.tif 000018
【図１５】
2005528112.tif 000019
2005528112.tif 000020
2005528112.tif 000021
【図１７】
2005528112.tif 000022
【配列表】
2005528112000001.app
【国際調査報告】
2005528112.tif 000023
2005528112.tif 000024