(57)【要約】  本発明は、細胞を培養するためのモジュラーチャンバを特徴とし、ここでチャンバの容量は、チャンバのシールや無菌性を損なわずに調整することができる。本発明は、圧縮可能ガスケットと実質的に非圧縮性の栓を挟む２つの板の間に形成されるチャンバの容量が、流体漏れしないシールを板間で形成するガスケットを複数の圧縮レベルで使用して調整され得るという原理に基づく。本発明は、相対的に多くの容量を使用して細胞を接種し、ここでは、実質的に平行で堅い板の間での細胞の培養が可能で、このシステムを開けるか又は他のやり方で解体してその液漏れしないことや無菌性を損なわずに、灌流のために滞留量を低下させることができる。このように、この新規の閉じた、モジュラーでスケール調整可能な細胞培養チャンバは、臓器（例、肝臓）補助システムにおいて、細胞の産生のために、タンパク質やウイルスのような細胞由来産物の産生のために、又は生物学的液体を処理してアンモニアのような毒素を除去する、細胞合成産物を加える、又はその両方をするシステムのために、高いレベルの細胞機能がある細胞（例、肝細胞）を灌流して使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を培養するための可変容量閉鎖型チャンバを有する装置であって：
ガスケットにより分離される上板と下板の間に形成される区画室；
細胞を培養するための下板上の内部表面；
ガスケットが液漏れしない無菌のシールを維持しながら上板と下板の間の距離を変えることによって区画室の容量を変える手段
を含んでなる、前記装置。
【請求項２】
上板と下板の間の距離を変えることによって区画室の容量を変える手段が、非圧縮性スペーサ、バネ付勢されたボルト、留め留め具、１／４回転留め具、及びねじ込みボルトからなる群より選択される、請求項１の装置。
【請求項３】
板が平坦で堅い、請求項１の装置。
【請求項４】
肝臓補助デバイスである、請求項１の装置。
【請求項５】
肝臓補助デバイスへ組み込まれる、請求項１の装置。
【請求項６】
可変容量閉鎖型チャンバにおいて細胞を培養する方法であって：
ガスケットにより分離される上板と下板の間に形成される区画室を提供すること；
下板の内部表面上で細胞を培養すること；
生物学的液体に細胞を接触させること；並びに
ガスケットが液漏れしない無菌のシールを維持しながら上板と下板の間の隙間を変えることによって区画室の容量を変えること
を含んでなる、前記方法。
【請求項７】
非圧縮性スペーサにより設定される上板と下板の間の距離を変えることによって区画室の容量を変える、請求項６の方法。
【請求項８】
板が平坦で堅い、請求項６の方法。
【請求項９】
区画室への灌流により細胞を区画室へ導入する、請求項６の方法。
【請求項１０】
請求項１の装置を使用して細胞を培養する方法。
【請求項１１】
請求項１の装置を使用して患者を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養及び組織工学用と臓器補助デバイス用のチャンバにおいて細胞を培養するシステム及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞を培養するためのデバイス、チャンバ、及び装置は、細胞や細胞由来化合物を産生するためのシステムとして、並びに療法的治療及び遺伝子治療のシステムとして組織工学産物において細胞を使用するためのシステムとして、バイオテクノロジー産業において大きな注目の的である。先の世紀では細胞培養用の多種多様なデバイスが考案、開発、及び応用されてきたが、一部は既存デバイスの未解決の限界のために、そして一部は既存デバイスでは期待されない要求を伴う新たな応用のために、新規の改善されたシステムへのニーズが依然として存在する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
細胞培養用の現行デバイスにある未解決の限界には：（１）有利な細胞機能、増殖、及び細胞由来産物の濃度のために細胞あたりの培地量を減らす一方で、細胞接種（例えば、付着依存細胞の付着及び広がり）を支えるのに必要な細胞数に対して相対的に高い比率の培地量でデバイスにおいて細胞を接種して分配することができないこと、（２）デバイスのサイズの増加に伴って細胞培養物の機能をスケール調整することが本来的に不十分であること、及び（３）経済的に実施可能な製造スケールでは規制上の懸念の遵守を保証することができないことが含まれる。これらの問題は、物質移動の制限を減らすこと、細胞培養物を使用する生体内治療の間の血液希釈を制限するために灌流デバイスの滞留量（ホールドアップ）を最小化すること、そして厄介な細胞培養物（例えば、望まれない系統へ速やかに分化する幹細胞）の機能を最大化することへの要求によって複雑化される。
【０００４】
細胞培養用の既存デバイス、特に脆弱な付着依存性の哺乳動物細胞の培養に適したデバイスについて考察すると、取組むことを正当化する限界や不足が明らかになる。例えば、これまでに開示された細胞培養用のほとんどどのデバイスも、チャンバそのものの壁を含んでなる部品を変えること、及び／又はチャンバと支えられる細胞培養物の無菌性を損なうことなしに細胞を収容するチャンバ内に含まれる容量を制御する能力を欠いている。さらに、これまでに記載された、培養物の無菌性を損なわずに細胞培養の間に可変量を提供する２つの種類のデバイスは、その応用を妨げる重大な制限を提示する。
【０００５】
概念的には可変量の培養を可能にする、バッグに基づいた細胞培養用チャンバのいくつかの形態が以前に記載された（例えば、米国特許第５，６８６，３０４号と米国特許第５，７１４，３８４号）が、これらや他のバッグに存在する柔軟な壁は、容量の厳密な制御を提供せず、付着細胞の培養のために堅い表面を提供しないし、十分に規定された灌流のための十分に規定された形態のあるチャンバを提示しない（例えば、多くの付着細胞には、均一の水力学的せん断応力が必要とされる）。チャンバの壁の変形性は、概して（例えば、米国特許第６，１５２，１６３号に実践されるように）これらの本来的な限界をもたらす。あるいは、米国特許第５，７０７，８６８号は、細胞培養用の可変量チャンバとしてピストンベースの設計の使用を記載する。この種の設計は、米国特許第５，１４３，８４７号、米国特許第６，００７，４７２号、及び米国特許第６，２９０，９１０号に記載されるバイオテクノロジー応用のための他のピストンベースの設計に概念において類似していて、機械的に扱いにくく、付着単層の大きな平面培養にあまり適していない。
【０００６】
細胞培養用デバイスのこれまでの設計を再検討すると、実質的に平行な、堅い平坦板の間でスケール調整可能な細胞培養用の装置を創出することの必要が支持され、ここでは、相対的に多い量を使用して細胞を接種し、チャンバそのものの内側の滞留量を灌流のために減らして、開放するか又は他のやり方でシステムを解体してその液漏れしないことや無菌性を損なわないことが可能になる。そうしたデバイスはまた、接種とその後の灌流との間に、接種ウェルの除去によるような、デバイスの広汎な取扱いや解体を必要としてはならず、そして無菌処理を促進する一方で、通常は労働集約的な細胞培養の方法を改善すべきである。これらの必要条件に適合するのは、細胞が外気へ直に曝露されずにチャンバ中へ直接ポンプ注入され、定着して付着することを可能にし、接種培地を除去し、規定の培地若しくは血漿の灌流が最少の解体若しくは曝露で確立される、完全な閉鎖系であろう。さらに、これらの所望される特徴は、汚染のリスクがデバイスの大きさに伴って増加し、信頼し得る細胞の搬入がより難しくなるために、より大きなデバイスでさらにより重要になる。
【０００７】
細胞の高密度での培養を可能にするデバイスの開発及び応用は、病んでいるか又は他の点で衰弱している臓器を有する患者の体外療法に特に重要である。こうしたデバイスには、島の不全（例えば、糖尿病における）、腎不全、内分泌臓器（例、副腎）の不全、及び造血障害（例えば、骨髄の癌における）を有する他の患者の療法として応用可能性がある。
【０００８】
肝機能障害を罹患している人々の治療に新たな形態の細胞培養デバイスを応用することは、特に差し迫ったニーズである。４３，０００人を超すアメリカ人が毎年肝疾患で死亡し、それはアメリカにおける疾病関連死因の第１０位となっている。肝疾患は肝不全へ進行し、適合するドナー臓器が見つからなければ、その死亡率は８０％である。他の臓器と同じように、ドナー肝臓は決定的に不足している。現在１２，０００人を超す患者が移植候補者としてリストされているが、毎年提供されるドナー肝臓の数はその半分未満である。肝臓補助デバイス（ＬＡＤ）での治療は、患者が移植に適した候補者となるように患者を安定化することによって、好適なドナー肝臓が提供されるまで彼らを支援することによって、及び／又は肝移植が不可欠になる時点までの悪化を防ぐことによって、肝不全に関連した死亡を減少させるだろう。これらの患者の手術前の健康を改善することはまた、移植の成功を高め、それにより再移植の頻度を減らし、ドナー臓器への需要を緩和するだろう。
【０００９】
ウイルス感染や毒性の結果としてしばしば起こる、突然の又は肝臓の不全の場合、ＬＡＤでの治療は、これらの人々を彼ら自身の肝臓が再生するまで支援することによって移植の必要性を減らすだろう。肝移植は、現在最も高価な臓器移植法である。ＬＡＤの開発が成功すれば、必然的に、死亡数及び医療コストの低下において、米国へ多大な恩恵をもたらすことになる。
【００１０】
一時的な肝臓支援の体外デバイスは１９６０年代から検討された。肝臓補助デバイスの開発には２つの戦略が探究された：（１）吸着剤を用いた血液灌流、選択透過膜を通す血液透析、及び血漿交換に基づいた非生物学的デバイス（Malchesky,「非生物学的肝臓支援：史的概説（Non-biological liver support: historic overview）」, Artif. Organs 18: 342-347, 1994）；及び（２）細胞又は細胞成分を取り込む生物学的デバイス（Yarmush et al.,「人工肝臓支援技術の評価（Assessment of artificial liver support technology）」, Cell Trans. 1: 323-341, 1992）。
【００１１】
非生物学的デバイスは限られた効力しか示さず、合成材料は、肝臓が正常に遂行する複雑な代謝機能の範囲及び水準に置き換わり得ないことが確かめられた。一方、肝細胞を中空糸の外面に接種され、血液又は血漿がこれらの線維の内腔に循環する生物学的ＬＡＤがほぼ２５年前にＷｏｌｆと共同研究者によって提唱された（Wolf et al.,「培養細胞と合成毛細管より構成される人工肝臓によるビリルビン抱合（Bilirubin conjugation by an artificial liver composed of cultured cells and synthetic capillaries）」, Trans. Amer. Soc. Artif. Int. Organs 21: 16-23, 1975）。そうしたＬＡＤにおいては、タンパク異化産物（例えば、赤血球の代謝回転からのヘモグロビン）のクリアランス、生体異物（生物にとって外来の化合物）の解毒、糖新生、脂質、無機質、ビタミン、及び補因子のホメオスタシス、及び血液組成の調節（例えば、アルブミンのような担体タンパク質や凝固因子の分泌による）を含む、健常な肝臓において肝細胞が提供している広範囲の機能を提供することが望まれている。
【００１２】
現行の生物学的ＬＡＤの設計は、この今日までの概念の逆を使用する。最新の設計は、高密度の肝細胞懸濁液を中空糸に保持し、血液又は血漿をこの繊維の外で循環させることによって最も重要な肝機能を提供することに基づくことが多い。この設計においては、患者が肝再生を通して回復するまで、又は移植が利用可能になるまで、間欠的な体外肝機能を提供することができり。しかしながら、中空糸に基づいた設計にはいくつかの要因により限界がある：ａ）不十分な物質移動、ｂ）サイジングのためのスケール調整能（scalability）の不足、ｃ）設計及び組立てにおける柔軟性のモジュール方式の不足、ｄ）特に搬入の間の、細胞の分布に対する不十分な制御、ｅ）支援培地の容量における限界を含む、接種の間の肝細胞の不十分な支援、ｆ）無菌処理操作との不適合性、ｇ）デバイスの灌流回路に関するボイド量の制限、及びｈ）デバイスと患者間の相互接続の設計における制限による、デバイス内容物と患者の血漿との間の混合におけるダイナミクス。例えば、相対的に多数の細胞、健常成人中のほぼ２〜５ｘ１０11個の肝細胞の１０％以上までを高密度で（治療の間の血漿に対する希釈効果を最小化するために）、そして重要な分化機能を有したままで、体外で灌流することが望まれる。
【００１３】
中空糸は、肝細胞機能を支援する証明された能力ではなく、容易に利用可能であることに基づいてＬＡＤに選択されてきた。高密度肝細胞培養物の中空糸における灌流は、他の理由にまして、高密度培養物の支援を損なう輸送の限界により、納得させる利益に乏しいことが示された。こうした限界は、基本の代謝機能だけでなく、解毒の初期工程においても必須とされる酸素で特に深刻である。中空糸のネットワークを通して、又はその周りで酸素添加した血漿又は培地を灌流させることでこの問題に対処し得ないのは、これら水性の液体が酸素の不良な担体であり、輸送に関連する距離が相対的に大きいためである。コア中空糸の設計への修飾（例えば、米国特許第５，５１６，６９１号に開示されるような、一体化した酸素発生を提供する３つの独立した毛細管のセットの織込み式ネットワークの使用）は、製作を著しく複雑化し、根底にある輸送の限界に不完全に対処する。それらはまた、肝細胞をより臓器特有の層状配置に方向づける能力も欠いている。
【００１４】
最近、中空糸ベースのＬＡＤの性能を制限する８つの重要因子のサブセットに取り組む肝細胞培養用のデバイスについていくつかの設計が記載された。米国特許第５，６５８，７９７号は、プレート様の気体透過性のスライド上で培養する肝細胞を処置するデバイスを記載する。しかしながら、このデバイスは、複雑な放射状の形態を有し、コラーゲンゲル間の複雑で他の点でも束縛的なサンドイッチの内部でこれらの細胞を培養することを必要とする。米国特許第６，２２８，６０７号は、フローについてデカルト幾何学へ変更することによって米国特許第５，６５８，７９７号で導入された概念への改善を記載するが、培養の配置における制限と灌流液と細胞との間に介在する液体透過膜の必要性により、その適用を複雑にする。国際公開第ＷＯ００／７８９３２は、気体透過性、液体不透過性のフィルム上で灌流液と直接接触して肝細胞を培養するモジュラーデバイスを記載することによって上記の制約に取り組む。しかしながら、この後者の適用には、閉鎖系として灌流により細胞をロードするための手段も、無菌性を損なわずに細胞培養のためにチャンバの容量を変えるための手段も開示されていない。また、上記の開示は、いずれも、肝不全の患者や治療の必要な患者と体外ＬＡＤを相互接続させるためのシステムの配置に完全には取り組んでいない。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、細胞を培養するためのモジュラーチャンバを特徴とし、ここでチャンバの容量は、チャンバのシールや無菌性を損なわずに調整することができる。本発明は、２つの実質的に堅い板（ここで、板間の分離は、実質的に非圧縮性の栓により設定される）の間に形成されるチャンバの容量を、板間で流体緊密性シールを形成するガスケットを複数の圧縮レベルで使用して調整することができるという原理に基づく。本発明は、細胞を接種するために相対的に多くの容量を有するが、灌流のために相対的に少ない滞留量を有する、区画室のあるチャンバにおける細胞の培養を可能にし、この容量の低下は、チャンバを開けるか又は他のやり方で解体してその液漏れしないことや無菌性を損なわずになされる。
【００１６】
このように、臓器（例えば、肝臓）補助システムにおいて高いレベルの細胞機能を保ったままに、細胞又は細胞由来産物（例、タンパク質又はウイルス）の産生のために、又は生物学的液体を処理して毒素（例、アンモニア）を除去する、細胞合成産物を加える、又はその両方をするシステムのために、この新規の閉じた、モジュール方式のスケール調整可能な細胞培養チャンバを灌流して細胞（例、肝細胞）を培養するために使用することができる。１つ又は複数のチャンバに適切な細胞を接種してデバイスへ取り込む場合、該デバイスを使用して、機能上の補助の必要な臓器（例、肝臓）を有する患者を治療することができる。
【００１７】
本発明は、細胞を培養する方法を特徴とし、ここでチャンバは２つ以上の異なる配置の間で変換され、ここでそれぞれの配置は形成される区画室中の独自の容量に対応する上板と下板との間の独自の距離によって識別され、板間のガスケットにより形成される液漏れしない無菌のシールを損なわない。
【００１８】
本発明は、ガスケットを通過するチャネリングを許容せず、シーリングに必要な付勢荷重（applied load）の下では機械的に弱まらないシールを形成する間に、２以上の異なるレベルの圧縮まで圧縮することができるガスケットの付いたチャンバを特徴とする。ガスケットは、区画室の上壁、下壁、又は両方の壁にある溝の中に保持されて配列される。溝は、ガスケットの厚さ未満の深さとガスケットの厚さより大きい幅を有するが、ガスケットが溝の内部で傾くほど大きくはない。
【００１９】
１つの態様において、ガスケットは、閉鎖フォーム（closed-foam）シリコーンスポンジよりつくられる。
１つの態様において、ガスケットは、内圧は維持されるが内側の気体の量は変動して区画室の容量を変化させる、膨張可能なチューブである。
【００２０】
１つの態様において、ガスケットの表面は、ガスケットが湿るか、又は区画室の１つ以上の壁へよりよく付着するように処理される。
本発明は、シーリングのためにガスケットへ付勢荷重を供給する留め具の付いたチャンバを特徴とする。１つの態様において、これらの留め具は、標準の機械ネジより速やかに締め付けて緩めることを可能にする、留め留め具又は四半分ターン留め具である。必要とされる留め具の数は、ガスケットとチャンバの壁の機械特性に相関する。
【００２１】
本発明は、可変容量チャンバを特徴とし、ここでは１以上の実質的に非圧縮性の栓のセットが上壁と下壁の間の間隔と、それにより各配置の区画室の容量を設定する。
１つの態様において、栓は、実質的に非圧縮性の金属若しくはプラスチックの小片である。上板及び下板の両端の外側に伸びるタブを含めて、異なる容量の異なる配置間で変換するシムの除去及び交換を可能にすることができる。
【００２２】
１つの態様において、栓は、実質的に非圧縮性のボルトである。ボルトは、留め具と同一線形で位置し、上板及び下板を一緒に固定することができる。
１つの態様において、上板及び下板の曲がりは、付勢荷重を供給するために使用する留め具と同じ中心線に沿って栓を配置することによって最小化される。
【００２３】
１つの態様において、上板及び下板の曲がりは、ガスケットの内側と外側にそれぞれ位置する２以上の栓を使用することによって最小化される。
１つの態様において、バネを留め具とともに使用して、チャンバの使用と異なる容量の配置間の変換の間、ガスケットに最小の付勢荷重を維持する。
【００２４】
１つの態様において、細胞の付着及び培養のためのチャンバ中の表面は気体透過性、液体不透過性のフィルムである。気体透過性、液体不透過性のフィルムは、例えば、ポリスチレンから作ることができて、また、例えばコロナ放電により処理することができる。
【００２５】
１つの態様において、フィルムは、細胞を接種することに先立ってコラーゲンでコートすることによって細胞培養の側面で処理される。
チャンバへ供給する酸素の濃度は、細胞の機能を制御するように変化させてよい。酸素添加は、細胞培養の表面より、培地より、又は両方の方法によりなし得る。
【００２６】
本発明はまた、フィルムを裏当て上で引っ張る方法を特徴とする。裏当ては、実質的に堅い、硬くて有孔であるか、又は穿孔した板であり得る。裏当て上で引っ張られたフィルムは、本発明のチャンバにおける細胞培養の表面として使用することができる。
【００２７】
１つの態様において、フィルムと裏当ての複合材が細胞培養のチャンバ中で使用される温度より高い温度でフィルムと裏当てを一緒に付着させることによって、フィルムを裏当て上で引っ張る（ここでフィルムと裏当ては、異なる熱膨張係数を有する）。
【００２８】
１つの態様において、温められるとフィルムと裏当ての間にその薄い接着剤のコーティングを形成することが可能になる接着剤を使用して、フィルムを裏当て上で引っ張る。
本発明は、２つの開口部を有する可変容量チャンバを特徴とし、ここで１つの開口部は、生物学的液体をチャンバ中へ導入するために使用し、別の開口部は、その液体の導入の間にチャンバの気体内容物を排気するために使用する。
【００２９】
１つの態様において、チャンバは、１対の開口部の２セットを有し、ここで１つのセットは、チャンバの大容量配置においてチャンバに接種するために使用し、他のセットは、チャンバの小容量配置においてチャンバを灌流するために使用する。
【００３０】
１つの態様において、細胞をチャンバへ接種するためのポートは、細胞培養のために細胞を表面に均一に分配するように分布する。
１つの態様において、複数のポートは、チャンバの区画室を通過する灌流用の生物学的液体を均一に分配するように分布して多岐配置（manifolded）される。
【００３１】
１つの態様において、生物学的液体を導入して除去するためのマニホルド間のスリットは、チャンバの区画室を通過して灌流する生物学的液体を均一に配置する。
本発明はまた、気体透過性、液体不透過性のフィルムと液体透過性の膜により形成される液体入口及び液体出口を含んでなる細胞区画室と、不透過性の壁と液体透過性の膜により形成される液体入口及び液体出口を含んでなる液体区画室のあるハウジングを含む、細胞培養用の可変容量チャンバを特徴とし、そしてここで、液体入口と液体出口は、液体入口に入る液体が液体入口へ流れ、液体灌流区画室を通過し、液体出口より液体灌流区画室を出て、液体出口よりハウジングを出るように配置される。
【００３２】
チャンバには細胞を接種することができて、それには付着依存性の細胞と哺乳動物起源の細胞が含まれる。これらの細胞は、ヒト、ブタ、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ラット、又はマウスのドナーからでも、また、１以上のこれらドナー由来の培養細胞株や細胞系からであってもよい。さらに、チャンバには肝細胞を接種することができる。細胞は、細胞の付着及び培養のために表面上に接種する。
【００３３】
本発明はまた、閉鎖系としてのチャンバ中へ細胞を接種する方法を特徴とし、ここでは生物学的液体中に懸濁した細胞を排気容器からチャンバへ管系（tubing）により灌流し、チャンバの気体内容物はチャンバから排気する。細胞は、チャンバ中で静的に培養しても、生物学的液体との灌流下に培養してもよい。
【００３４】
１つの態様において、閉鎖系としてのチャンバ中へ細胞を接種する方法を使用して、細胞を接種する前に細胞培養の表面をコラーゲンでコートする。
本発明は、可変容量チャンバを使用して細胞を培養する方法を特徴とし、ここでは、多量の生物学的液体を受容するように配置されたチャンバ中へ細胞を接種し、細胞を接種されたチャンバを少量の配置へ変換し、細胞を灌流する。
【００３５】
１つの態様において、細胞を接種するための閉鎖系は、無菌の配管溶接機を使用して作製し、無菌の接合部とする。
１つの態様において、複数のチャンバは、灌流のために平行、連続、又はそれらの組合せで一緒に多岐配置される。個々のチャンバは、同一量又は異なる容量の配置であってよく、１又は２つのいずれの区画室を有してよい。さらに、チャンバは、１つのチャンバを別のチャンバの上に積み重ねることを可能にするように配置してもよい。
【００３６】
１つの態様において、細胞を保存する。保存は、低温保存、低熱保存、又は凍結乾燥によりなし得る。
１つの態様において、栄養素を含有する培養基を灌流する。
【００３７】
本発明にはまた、（１）１以上の可変容量チャンバを含んでなり、それぞれに肝細胞を接種し、その入口では共通入口のマニホルドへ、その出口では共通の出口マニホルドへ多岐配置される、フロースルーデバイス；（２）患者からの血漿を入口マニホルドへ導くための第一導管；（３）処置した血漿をフロースルーデバイスから患者へ導くための第二導管；及び（４）血漿を導管及びフロースルーデバイスを通して動かすための１以上のポンプを含む、肝臓補助システムが含まれる。さらにこのシステムには、血球を全血から除去してフロースルーデバイスを通過する血漿を提供するための血漿分離器を含めてよい。
【００３８】
１つの態様において、本発明の肝臓補助システムには、患者、血漿分離器、及びフロースルーデバイスの間で血漿を混合して交換する血漿交換器が含まれる。血漿交換器は、単一の区画室のある容器であっても、液体透過膜により分離された複数の区画室を有してもよい。液体透過膜は、５０，０００〜１００，０００より大きい分子量を有する分子の輸送を妨げる孔を有する。
【００３９】
本発明の肝臓補助システムについての１つの態様において、血漿交換器は、免疫単離デバイスである。
本発明の肝臓補助システムについての１つの態様において、第一導管は、血漿を血漿分離器からチャンバへの入口マニホルドへ導き、第二導管は、血漿をチャンバの出口マニホルドから患者へ導く。
【００４０】
１つの態様において、２−区画室チャンバにおいて細胞及び液体の区画室を分離する液体透過膜は、５０，０００〜１００，０００より大きい分子量を有する分子の輸送を妨げる孔を有する。
【００４１】
本発明にはまた、本発明の細胞培養用フロースルーデバイスに肝細胞を接種すること、デバイスの液体入口へ血漿を導入すること、並びに、血漿がデバイスを通って流れて液体出口から出ることを可能にすることを含む、血漿を処置する方法が含まれる。
【００４２】
本発明にはまた、肝臓補助の必要な患者を治療する方法が含まれる。本方法には、本発明の肝臓補助システムを患者の血流へ結びつけることと患者を治療することが含まれる。
他に定義しなければ、本明細書に使用するすべての技術及び科学の用語は、本発明が属する技術分野の当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書の記載に類似しているか又は同等である方法及び材料を本発明の実施又は試験に使用することができるが、好適な方法及び材料は、以下に記載される。本明細書に言及されるすべての出版物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、そのまま参照により本明細書に組み込まれる。抵触の場合、調停するのは、定義を含む、本明細書である。さらに、本明細書の材料、方法、及び実施例は例示にすぎず、限定することを企図していない。
【００４３】
本装置の新規性は、実質的に平行な堅い平坦板の間でスケール調整可能に細胞を培養することであり、ここでは、システムを開くか又は他のやり方で解体してその液漏れしないことと無菌性を損なわずに、相対的に多量を使用して細胞を接種し、灌流のために滞留量を減らすことができる。
【００４４】
本発明が有用であるのは、相対的に低い細胞密度であっても可能な限り多くの細胞を接種して、細胞支援に十分な培地を提供すること、そしてチャンバの滞留量を最少化して処置の間の血液希釈を最小化するが効果に十分な細胞を提供することが望まれるためである。さらに、無菌の配管溶接機で無菌の接合部を形成する一方で、広汎な取扱いや無菌性を損なうことをせずに、接種用の配置から灌流用の配置へ変化させる能力により、取扱時間が低下し、無菌操作用の高額な機器（例えば、生物学的に安全なキャビネット、又は層流フード）への必要性が低下し、臨床施設での無菌操作の機会が提供される。
【００４５】
この新たな細胞培養のフロースルーデバイスはまた、高いレベルの培地のフローに通常関連する有害なせん断応力を潜在的に低下させる一方で、酸素と他の栄養素、老廃物、及び有益な産物の所望される物質移動のレベルで様々な細胞が培養されることを可能にする。結果として、肝細胞のような、相対的にせん断感受性が高い細胞でも、高レベルの機能を有するままに、相対的に低い培地の流速で、延長された時間の間培養することができる。結果として、酸素添加と灌流を独立して制御することができる。さらに、上記のデバイスは、細胞の付着及び機能の促進のために表面を直接処理すること、並びに、肝臓の生体内アーキテクチャーを模倣する層状培養の形態でデバイス内部に細胞がより均一に分布することを可能にする。上記の特徴は、この新たな細胞培養用のフロースルーデバイスを臓器（例、肝臓）補助システムに使用することを可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明と特許請求の範囲から明らかになるであろう。
細胞培養用の本新規チャンバは、相対的に多数で高密度の付着細胞（例えば、肝細胞）をチャンバ中の実質的に堅い表面で培養することを可能にし、ここでチャンバの容量は、装置のシール又は無菌性を損なわずに調整することができて、チャンバの形態は、チャンバの容量と細胞が受ける水力学的なせん断応力を正確に設定するように制御することができる。従って、本発明は：（１）チャンバに細胞を接種すること、そして、これらの細胞を相対的に多量の培地において培養すること、そして次いで、（２）細胞を同じチャンバにおいて灌流するが、チャンバの滞留量は減らすことを可能にする。本チャンバは、閉鎖系としての灌流による細胞の搬入(loading)を可能にし、ネジの付いた留め具の簡単な調整と実質的に非圧縮性の栓の交換により容量が変わるので、取扱い及び操作が容易である。本チャンバはまた、スケール調整可能でモジュール方式であり、灌流培地のフローを（栄養素と可溶性の毒素及び／又は誘導物質の供給と、老廃物及び代謝副産物の除去のために）酸素添加から分離することによって輸送限界が低下された、簡素で、気体透過性、液体不透過性の支持体上での細胞の培養を提供し、肝不全の患者の治療のためにフロー回路へ取り込むことを促進する。
【００４７】
図１ａ及び１ｂは、新規チャンバ（１０）の１つの態様を示し、これには、上壁（３０）と下壁（３３０）により、この上壁と下壁の間に液漏れしないシールを創出して区画室を外部環境より隔離する圧縮可能ガスケット（５０）により形成される側壁とともに規定される区画室（２０）が含まれる。ガスケットにより形成されるシールは、対応するレセプタクル（８０）の付いた留め具（７０）のセットにより適所に保持されるので、区画室の内側に保持される液体は、区画室から漏出することができず、外部環境の汚染物質（例、細菌やマイコプラズマ）は、このシールを通って区画室中へ浸透することができない。区画室の内容物は細胞（１３０）であり、下壁の上で、区画室を完全に満たして細胞への水分支援を供給する、細胞培養用の培地、血液、血漿、又は平衡化塩溶液のような生物学的液体（１５）と接触して実質的に培養される。
【００４８】
上壁（３０）は、典型的には、陽極酸化アルミニウム、ステンレススチール、他の金属合金、又は実質的に非圧縮性のプラスチック（例、ポリカーボネート、ポリスチレン、及びテフロン（登録商標））、及びそれらの複合材のような、細胞適合性、液体不透過性の材料から構成される。これらの材料は、取付部品及びマニホルドを含む、他のデバイス部品に使用することができる。下壁は、実質的に堅くて平面の材料、又は複合材から構成され、表面（３２０）は、細胞（１３０）の付着及び培養を促進し、支援し、又は他のやり方で干渉しない、区画室（２０）の内部に面する。典型的には、チャンバの全体重量を減らしてその取扱いを容易にするために、これらの部品の製作、組み立てられるチャンバの堅さ、及びチャンバの細胞培養についての機能可能性を他のやり方で妨げることがなければ、上壁及び下壁の厚さを可能な限り小さくすることが望ましい。これらの理由から、その強度の割には重量が相対的に軽いこと、その機械化の容易さ、そして細胞培養への生体適合性の故に、陽極酸化アルミニウムが構築の材料として有用である。
【００４９】
１つの態様において、チャンバ（１０）は、２以上の配置のうちの１つで存在し、それぞれの配置（構成）は、上壁（３０）と下壁（３３０）の間の高さにより確定されるチャンバの区画室の独自の容量により識別される。図１ａは、その相対的に高い容量の配置（以下、接種配置と呼ぶ）にあり、細胞を保持する相対的に大きい区画室（２０）を有する、１つの区画室チャンバを図示する。図１ｂは、その相対的に低い容量の配置（以下、灌流配置と呼ぶ）にあり、細胞を保持するより小さい区画室を有するチャンバを図示する。異なる容量の追加の配置も許容される。上壁及び下壁の間の実質的に平行の配列は、接種配置と灌流配置の間で（並びにどの追加の配置でも）同一のままであり、区画室の形態は、上壁及び下壁の間の距離によってのみ配置間で変化する。
【００５０】
チャンバは、ガスケット（５０）に対する付勢荷重及び圧縮を変化させることによって、異なる容量配置の間で変換する。図１ａのより高い容量の接種配置は、ガスケットが、相対的に低いレベルの付勢荷重及び圧縮で区画室（２０）と外部環境との間に液漏れしない無菌のシールを形成することを必要とし；図１ｂのより低い容量の灌流配置は、ガスケットが、より高いレベルの付勢荷重及び圧縮で区画室（２０）と外部環境との間にやはり液漏れしない無菌のシールを形成することを必要とする。付勢荷重は、典型的には、σ（応力）として測定及び表示され、単位面積あたりの力を単位とする。圧縮は、典型的には、ε（ひずみ）として測定及び表示され、無次元の単位である。
【００５１】
ガスケット（５０）は、支持すべき付勢荷重と各配置の容量との機械適合性を有する１以上の材料から構成される。各配置の付勢荷重は、ガスケットが圧縮してその配置での区画室（２０）の内部で生物学的液体（１５）が及ぼす圧力に耐えるシールを形成するほどに大きくなければならない。静的な配置では、この圧力は、区画室内の生物学的液体により生じる重力ヘッドにより与えられる。灌流配置又は灌流を伴う配置では、この圧力は、重力ヘッドと生物学的液体のフローに関連した圧力降下の組合せにより与えられる。最小及び最大の付勢荷重は、それぞれ、最大量と最小量の配置についての付勢荷重に対応する。各配置の容量は、上壁（３０）及び下壁（３３０）により区画室へ曝露される平面の面積とそのそれぞれの配置における区画室の高さとの積である。
【００５２】
図２は、新規チャンバ（２０）のガスケット（５０）に所望される機械的特性の設計曲線を図示する。どのシール形成材料とも同じように、ガスケットは、圧縮可能でなければならず、シールの片側から別の側への流体のチャネリングを許容する通路を含有してはならない。特に、この材料は、チャンバの配置に対応するそれぞれのレベルの圧縮に必要な付勢荷重を支えなければならない。この必要条件は、配置間で変換するのに必要な付勢荷重における変化の比率とこれらの配置間での圧縮のレベルにおける変化が相対的に小さくなるように、ガスケットが相対的に可撓性（compliant）であるべきことが望ましいことを意味する。この比率が小さいほど、チャンバの区画室（２０）に収容し得る容量の範囲が大きくなる。
【００５３】
ガスケット（５０）はまた、「機械的に不全化する」ことなく広範囲の付勢荷重及び圧縮に対して抵抗しなければならない。機械的な不全とは、ガスケットの材料が破損するか又はほかのやり方でその構造上の完全性を失い、それがもはや付勢荷重を支えることもできず、もはや液漏れしない無菌のシールを形成することもできないことを意味する。機械的な不全は、典型的には、圧縮のレベルが図２に示される圧縮の高いレベルを有意に超えて増加するにつれて必要とされる、付勢荷重の相対的に大きくて無制限の増加に伴なって発生する。ガスケットには、低い付勢荷重及び圧縮の状態と高い付勢荷重及び圧縮の状態の間で繰り返し切替えすることができる形態での可逆性が望まれるが、必須というわけではない。
【００５４】
複合材ではない材料は、新規チャンバ（１０）のガスケット（５０）としての使用に適している可能性がある。しかしながら、新規チャンバのガスケット（５０）としての使用に適した材料は、より典型的には、一方の成分が相対的に堅くて、他方の成分が相対的に可撓性である２以上の材料の複合材である。上記に概説したガスケットの機械的な必要条件を満たす特定の材料には、シリコーン、ネオプレン、強化シリコーンのような閉鎖フォームスポンジと、グリーン・ラバー・カンパニー（Greene Rubber Company）社（ウォバーン、マサチューセッツ州）より流通されるフルオロシリコーンゴム材料、閉鎖孔ポリウレタンフォーム、及び可逆的に「エネルギー付与される(energized)」ガスケットが含まれる。
【００５５】
図３は、膨張可能な閉鎖管（１７０）としてのエネルギー付与ガスケットの１つの態様を例示する。図３ａは、その接種配置にあるチャンバを示し、ここではガスケット管（１７０）の内部の気体が圧縮されてこの管を膨張させ、ガスケット管は相対的に気体で充満し、堅くなり、上壁（３０）と下壁（３３０）の間に液漏れしない無菌のシールを形成する。管の内部の気体の容量及び加圧は、レギュレータで制御する。気体の管内の容量を変化させながら気体の管内の加圧を維持するようにこのレギュレータを調整することによって、シールを維持しながら、上壁及び下壁の間の距離を変化させることができる。例えば、このやり方で気体の管内の容量を減らすことによって、図３ａに図示する接種配置のチャンバを、図３ｂに図示するような、より小さな容量の区画室（２０）を有する、灌流配置のチャンバへ変換することができる。
【００５６】
区画室（２０）と外部環境との間でガスケットにより形成される液漏れしない無菌のシールを損なわずに異なるレベルの圧縮でガスケットを保持するための、並びに組立てと適切な操作のためにガスケットを配列するための溝を提供することは有用である。図１は、ガスケット（５０）が、そして図３は、ガスケット（１７０）が上壁（３０）中に形成される溝（３１０）に設置されることを示す。また、ガスケット用の溝は、下壁（３３０）に、又は上壁と下壁の両方に形成することも可能である。溝の深さは、ガスケットの非圧縮状態にある高さほど深くないように、そして２以上の圧縮のレベル、即ち、容量の配置を支えるのに対応する付勢荷重で所望の圧縮レベルを提供するように選択しなければならない。溝の幅は、ガスケットの幅以上であり、ガスケットの最大レベルの圧縮時にガスケットへ十分な容量を提供しなければならず、ここでこの容量の十分性は、ガスケットに対するポアソン比の関数である。特に、溝は、溝の内部でのガスケットの不整配列を可能にするほどに、また、ガスケットが溝の内部で傾き、異なる容量配置に所望される圧縮のレベルに確実に到達することができなくなるほど広くてはならない。
【００５７】
別の態様において、ガスケットの表面は、ガスケットがより湿るか、又は溝（３１０）、上壁（３０）、下壁（３３０）、又はこれらの組合せへよりよく付着するように処理される。この処理は、化学的、物理的、又は化学的と物理的の組合せでよい。この処理により、シールの強さが増すとともに、保持及び配列も促進される。
【００５８】
区画室（２０）の容量には固有の上限がないので、上壁（３０）若しくは下壁（３３０）の厚さとガスケット（５０）の厚さ及び種類の様々な組合せを選択することによって、所望される最小の付勢荷重について想定可能なあらゆる最小レベルの圧縮を達成することができる。異なる容量配置についての異なるレベルの圧縮は、上壁及び下壁の間の距離によって決定され、１以上の実質的に非圧縮性の栓のセットにより維持される。
【００５９】
図１に図示する１つの態様では、１以上の実質的に非圧縮性のシム（６０）及び（１６０）が栓として作用し、それぞれの異なる容量配置の圧縮、付勢荷重、及び容量のレベルを設定する。この態様において、異なる厚さのシムを、留め具（７０）の周縁部から外す、留め具の周縁部付近で挿入する、又は他のシムと交換して、相対的に高い容量の配置から相対的に低い容量の配置へ、そしてその逆へ変換する。シムの厚さにより、圧縮のレベルとチャンバの区画室の高さが決定される。特に、図１ａは、相対的に厚いシム（６０）（外部接種シムと呼ぶ）を有する接種配置が、区画室（２０）の上壁（３０）及び下壁（３３０）の間の間隔を設定するために使用されることを図示する。図１ｂは、相対的に薄いシム（１６０）（外部灌流シムと呼ぶ）を有する灌流配置が、区画室の上壁及び下壁の間の間隔を設定するために使用されることを図示する。
【００６０】
好ましくは、各配置の上壁及び下壁の間の間隔は、それぞれ同一の厚さで留め具の外部に存在する、４以上のシムのセットにより少なくとも部分的には決定され、シムは、捻ることや他のやり方で個々のシムを傷つけることなく、チャンバの側面から取り付けて、外したり交換したりすることができる。さらに、シムは、好ましくは、上壁（３０）及び下壁（３３０）の縁の外へ伸びるチャンバの面に広がりを有するので、チャンバからシムをつかんだり引いたりして配置の変換時にシムの除去を容易にすることを可能にするタブをそれぞれのシムが有する。あるいは、１つ以上の配置では、上壁及び下壁間の間隔が、シムとして作用する実質的に非圧縮性の材料の単一切片により決定され、ここでこのシムは、（１）組立ての間に取り付け、チャンバの使用の終了と洗浄のとき以外の操作の間は外さないか、又は（２）第一の配置から異なる容量を有する第二の配置へ変換するプロセスにおいて取り外し又は交換する間に不可逆的に変更する（例えば、切断するか、又は他のやり方で複数の部品へ分解する）ように企図される。
【００６１】
図４に図示する別の態様では、一定の長さの実質的に非圧縮性のボルト（２２０）が栓として作用し、特定の容量配置の圧縮、付勢荷重、及び容量のレベルを設定する。この態様において、これらのボルトは、図４ａの接種配置では区画室（２０）の高さを設定するためにきつく締め、図４ｂの灌流配置では緩め、この後者の配置では、これらのボルトが下壁（３３０）に触れず、上壁（３０）と下壁との間隔が、区画室（２０）の内側に存在してガスケット（５０）に境を接する、シム（１８０）（「内部シム」と呼ぶ）により設定される。この内部シムは、接種配置に存在するが、シムの対面上の点で上壁と下壁に同時には接触しないので、接種配置では、上壁及び下壁の間の間隔を設定しない。また、実質的に非圧縮性のボルトが下壁を通って伸びて、接種区画室（２０）内部の上壁の面に接触することも可能であり、これらのボルトは、ゆるむ時に、下壁の外面から突き出る。上壁を通過するボルトと下壁を通過するボルトの組合せも予期される。
【００６２】
実質的に非圧縮性の外部及び内部シムに適した特定の材料には、熱プラスチック（例、ポリカーボネート）、金属（例、アルミニウムとステンレススチール）、及び堅い材料の複合材が含まれる。シムの厚さには下限がないが、実践としては、約０．０２５４ｍｍ（０．００１インチ）より大きい厚さが望まれる。同様に、実質的に非圧縮性のボルト（２２０）に適した特定の材料には、熱プラスチック、金属、及び堅い材料の複合材が含まれる。ボルトの長さは、その製造により決定される。
【００６３】
新規チャンバ（１０）の設計においては、留め具（７０）を締めたときに、上壁（３０）及び下壁（３３０）の曲がりを最小化することが望ましい。曲がりが生じ得るのは、シーリングのために留め具により供給される付勢荷重の支点として作用するガスケット（５０）によりこれらの壁の片方又は両方に正味トルクがかかる場合である。留め具がガスケットの外側に位置しているので、このトルクにより典型的には区画室（２０）の容量を増加させるモーメントが生じる。一般に、曲がりが望ましくないのは、再現可能的に設定することが難しく、壁の間の間隔、そしてそれにより、このチャンバ内部の区画室の上壁及び下壁の間の間隔に変動をもたらし、同一に構築される異なるチャンバ間のある一定の配置について滞留量に変動をもたらすからである。
【００６４】
曲がりは、付勢荷重を供給する留め具と上壁及び下壁の間にスペースを設定する実質的に非圧縮性の栓を同一線形に位置づけることによって減らすことができる。例えば、１つの態様では、留め具の間で絡み合う指状部材の付いた実質的に非圧縮性のシムを使用することによって、曲がりを最小化する。上記の指状部材は、ガスケット（５０）の外側に留め具を有することによって生じるトルクを釣り合わせるように作用する。あるいは、図４ａに図示する態様に例示されるように、実質的に非圧縮性の栓（２２０）を留め具（７０）と同じ中心線上に位置付けることによって、曲がりを減らすことができる。これら２つの態様の組合せも可能である。
【００６５】
図４に示す態様では、バネ（２００）を使用して、異なる容量配置間の変換を含むすべての操作の間でガスケット（５０）に対する一定の最小付勢荷重を維持する。この態様において、留め具（７０）はレセプタクル（８０）により保持されて、それぞれのバネは、各留め具の周囲の一対のワッシャー（１９０）により保持される。図４ａ及び４ｂは、バネが上壁（３０）の上に存在することを示すが、あるいは、バネは下壁（３３０）の下に存在してもよい。本態様には、ゼロではない付勢荷重を連続付勢すると、液漏れしないシールの保存性と、それによる区画室（２０）の無菌性が保証されるという利点がある。
【００６６】
バネ（２００）には、それぞれの圧縮のレベルで、バネがその容量配置に十分であるか又は十分より大きい付勢荷重を提供するような機械特性がある。例えば、図４ａに表示する接種配置において、バネは、この配置に必要とされる最小の付勢荷重よりおそらくは大きい、相対的に高い付勢荷重を供給する。しかしながら、図４ｂに図示する灌流配置において、バネは、それでもなおこの配置に必要とされる付勢荷重以上である、相対的に低い付勢荷重を供給する。
【００６７】
バネ（２００）は、異なる容量配置と対応する圧縮のレベルに必要とされる付勢荷重の範囲にわたり塑性変形を受けない材料から作ることができる。このバネに適している材料には、ステンレススチールと他の金属が含まれる。バネにとって最も重要な特性は、その弾性率又はフック定数であり、それは留め具（７０）の付勢荷重及び長さに関して選択しなければならない。
【００６８】
最小の付勢荷重を供給するバネを含有しない態様では、付勢荷重と圧縮のレベルを変えて配置間で変換することが、図１及び３の留め具（７０）を緩めて圧縮のレベルを下げてチャンバの区画室の容量を増やすことか、又はこれらの留め具をさらに締めて圧縮のレベルを高めてその容量を減らすことのいずれかにより達成される。あるいは、図４のバネのある態様では、図４ａの締めた配置から図４ｂのさほど締められていない配置へボルト（２２０）を緩めることにより、相対的に高い容量の接種配置から相対的に低い容量の灌流配置へのチャンバ（１０）の変換をもたらす。この後者の態様では、留め具を使用してバネへの初期圧縮を設定し、その後は調整しない。
【００６９】
必要とされる留め具（７０）の数は、ガスケット（５０）の幅及び厚さ、上壁（３０）及び下壁（３３０）の機械特性、及び上壁及び下壁に曲がりを誘導せずにこのガスケットをシールするのに必要とされる付勢荷重により決定される。取扱い及び操作を容易にするには、これらの留め具がレセプタクル（８０）中にあり、それぞれの留め具を締めたり緩めたりするのに標準の機械ネジより少ないターンが必要とされるようにすることが望ましい。特別な容量配置に所望される付勢荷重により、特定の配置のために留め具を締めたり緩めたりすべき程度が決定される。新規チャンバ（１０）の留め具は、相対的に非貫入性で、非常に操作しやすく、不全化しにくく、そして入手して操作するのに廉価である。
【００７０】
図１に図示する新規チャンバ（１０）の留め具（７０）及びレセプタクル（８０）に特定の態様には、サウスコ（登録商標）（コンコードヴィル、ペンシルヴェニア州）、Ｒｅｘｎｏｒｄ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｆａｓｔｅｎｅｒ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（ハスブロウク・ハイツ、ニュージャージー州）、及びＤｚｕｓ  Ｆａｓｔｅｎｅｒ株式会社（ウェスト・イスリップ、ニューヨーク州）からの留め及び四半分回転留め具と、部品間の迅速な圧縮の適用及び解除を可能にする他の形態のラッチが含まれる。上壁（３０）又は下壁（３３０）に絶対必要である、陽極酸化アルミニウムやステンレススチールのような材料からなる、配列用のピンを使用することで、チャンバの組立ての間にこれらの壁を留め具及びレセプタクルとともに配列することを促進することができる。
【００７１】
新規チャンバ（１０）中の細胞（１３０）は、区画室（２０）の内側にあるどの表面に付着してもよいが、細胞塊は、区画室に面する下壁（３３０）の表面（３２０）上で実質的に培養されること、そしてこの表面が細胞培養の支持体として役立つことが好ましい。以下の特徴を有する材料が新規チャンバにおける使用に適した表面を提供する：少なくとも区画室に面する側で細胞に対して相対的に非細胞傷害性であること（細胞の付着及び機能がその材料によって制約されないように、又は、その材料をこの側で表面処理して、細胞の付着及び機能がその材料のこの表面処理した側によって制約されないように）、そして生物学的液体（１５）の存在下で相対的に非分解性であること。これらの特徴を有する材料は、容易に、市販品より入手するか又は標準の技術を使用して製造することができる。その開示が参照により本明細書に援用される、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ００／７８９３２に記載されるように、細胞の付着と所望の細胞機能を促進するための表面処理は、コラーゲン及び／又は他の分子での非特異的なコーティングによる、及び／又は細胞培養に有利である特定分子の共有付加によるような化学的処理、酸素担持気体（例、空気）の存在下でのコロナ放電のような物理的処理、又はこれらのあらゆる組合せであってよい。
【００７２】
細胞培養における多くの応用では、細胞とその補助培地の酸素添加の制御が細胞機能を調節するのに有益である。ある種類の細胞の培養において、酸素添加は、細胞培養の培地による。しかしながら、肝細胞のような他の種類の細胞には、特徴的に高い酸素への要求がある。生存能のある肝細胞の機能も、細胞へ提示される酸素の圧力に依存する場合がある。例えば、酸素の濃度を周囲（１９％）から４０％の濃度へ高めると、尿素産生がほぼ５０％増加する。細胞培養又は臓器補助デバイスにおける酸素添加の必要性を強める別の考察は、生物学的液体の容量を制限する一方で、相対的に多数で高密度の細胞をデバイスへ取り込む必要性である。
【００７３】
１つの態様において、細胞（１３０）を気体透過性、液体不透過性の平面支持体（３２０）上で培養し、それを通して細胞は、酸素のような気体をチャンバの外側にある酸素添加環境（例えば、１９％の酸素である、空気）と交換する。ＰＣＴ国際公開第ＷＯ００／７８９３２に開示されるように、この態様は、ＬＡＤに使用の肝細胞を含め、多くの種類の細胞に有用で望ましい。こうした細胞培養支持体は、操作時に遭遇する圧力の下で液体に対して不透過でなければならないが、約０．１ｍＬ／ｍ2／日〜約１０００Ｌ／Ｍ2／日の範囲では酸素に対して透過性でなければならない。
【００７４】
下壁（３３０）に必要な機械的剛性を保持するために、並びに、気体の透過性を許容し、滅菌を可能にし、空気漏れ、ほころび、及びしわ寄りに抵抗し、チャンバの製造の間に取扱うことが可能であるために、この下壁は、より厚い、有孔又は穿孔した堅い支持体又はフレーム（４０）に支持される薄い、気体透過性、及び液体不透過性のフィルム（３２０）の複合材であることが好ましい。特に、このフレームは、このフィルムを機械的に支持するが、十分に透過性で有孔であるか又は空間的に配置され、フレームは、特に酸素についての気体輸送に対して追加の有意な制限を提示せず、そしてまたフレームが他の点ではフィルムの有効な透過性に影響を及ぼさないように、必要な機械特性も有する。例えば、フィルムを支持するように相対的に広く間隔の開いた不透過性のポスト（示さず）の使用は、上記の要件を満たす。しかしながら、異なる容量配置の容量を正確に制御するには、使用において遭遇する圧力の下でフィルムが緊縮してたるまないことも必要とされる。
【００７５】
１つの態様において、下壁は、気体透過性、液体不透過性のフィルムを穿孔した金属フレーム上に引っ張ることによって形成されるフィルム−フレーム組立体である。引っ張りは、フィルムとフレーム間の熱膨張係数の差異を利用することによって、そしてフィルムとフレームを結合するのに使用する接着剤の粘度低下と広がる能力の増加により達成される。熱膨張係数は、摂氏温度あたりの単位長さにつき材料の長さが変化する比率である。フィルムがフレームより大きい熱膨張係数を有する場合、フィルムは、温度の低下時にフレームより大きく収縮する。従って、フィルムとフレームの間に接着剤を塗布して高い温度まで温めて、接着剤をこの高い温度に保っておくと、フィルムは、より低い温度へ戻したときにフレームより大きく収縮し、フィルムが緊縮することを生じる。この緊縮性の度合いは、フィルム及びフレーム間の熱膨張係数における相対的な差異と周囲温度及び高い温度の差異に依存する。本方法はまた、フィルムとフレームの両方と高い温度に適合する接着剤の使用を必要とする。
【００７６】
ほとんどの材料の粘度は温度が高まるにつれて減少することがよく知られている。図５は、接着剤がフィルムとフレームを緊密に結合することによってフィルム（３２０）をフレーム（４０）へ固定し、熱膨張係数の差異によりもたらされる緊縮性が冷却時に維持されることを示す。さらに、接着剤がフィルムとフレームを結合する接合部における出っ張り（bumps）を防ぐには、接着剤の薄くて均一の線若しくは層が必要であるが、上記の出っ張りは、ガスケット（５０）とフィルム−フレーム組立体（３３０）の間で形成されるシールを損なうだけでなく、上壁（３０）とフィルム−フレーム組立体の間の間隔に不均一性をもたらす場合がある。こうした不均一性は、図１ｂ、３ｂ、及び４ｂに図示する灌流配置のチャンバにおいて不均一なフローをもたらす場合がある。従って、接着剤は、好ましくは、先細りチップ（３０９）付きシリンジによるか、又はフレームとフィルムの間の間隔を最小化する薄いコーティングとして接着剤を搬送する他のそのようなデバイスにより塗布される。さらに、接着剤は、フレームにおいて利用可能な熱が接着剤を加熱し、薄いコーティングとして広がる接着剤の能力を高めるように、温められたフレームへ塗布される。接着剤を塗布する代わりの方法も可能であり、（１）フィルム、穿孔フレーム、又はその両方に接着剤を噴霧すること、及び（２）接着テープを使用して、部品へ塗布することが含まれる。
【００７７】
図５は、フィルム（３２０）をフレーム（４０）へ引っ張り、緊縮したフィルムのあるフィルム−フレーム組立体（３３０）を形成する方法を図示する。はじめに、典型的には１８〜２２℃の周囲室温より高く、そしてフィルムがチャンバ中の細胞培養の支持体として使用される３７℃の温度より高い温度までフレームを温め、先細りチップ（３０９）付きシリンジよりフレームの表面に付与することによって塗布する接着剤（３２５）の細い線をフィルムに接触させ、フィルムは、チャンバの区画室中の細胞（１３０）から離れて面するフィルムの側が接着剤及びフレームと接触するようにフレーム上に置かれ、そして新規のフィルム−フレーム組立体は、接着剤をセットするのに十分な時間の間、細胞培養に使用する温度より高い温度でオーブン又はインキュベーター（２９０）へ戻される。フレーム上で接着したフィルムの処理のための高い温度は、接着剤の塗布に先立ってフレームを加熱するのに使用する温度と同じであるか、好ましくは、接着剤のよりよい広がり、接着剤のフィルム及びフレームへのより速やかな結合、及び／又はフレームに関する異なる熱膨張係数によるフィルムの伸びの増加を促進するためのより高い温度と同じであってよい。次いで、このフィルム−フレーム組立体をオーブン又はインキュベーターより取ると、フィルムは収縮して緊縮性になる。
【００７８】
本方法に必要な特徴と上記の他の特徴との一致を有するフィルムの材料は、容易に、市販品を入手するか又は標準の技術を使用して製造することができる。１つの態様において、フィルムは、ポリフレックス（登録商標）のシート、プラスチック・サプライヤーズ社（コロンバス、オハイオ州）により製造される厚さ約０．０５０８ｍｍ（０．００２インチ）のポリスチレンフィルムの形態である、非孔性ポリスチレンである。陽極酸化アルミニウムからなるフレーム（４０）を用いるこの態様では、接着剤（３２５）が好ましくはエポキシであり、さらにより好ましくは、マスター・ボンド社（ハッケンサック、ニュージャージー州）からの医療用エポキシＥＰ２１ＬＶのような医療用エポキシであり、フレームを温める温度が４０℃であり、フィルム−フレーム組立体（３３０）の処理温度が４５℃である。
【００７９】
新規チャンバにおいて、チャンバの区画室中の生物学的液体は、細胞に細胞培養の基本栄養素を提供し、代謝物を運び去る。生物学的液体はまた、毒素、アミノ化分子、そして代謝されるべき他の生物学的老廃物を細胞に供給し、解毒化産物、分泌因子、及びタンパク質を運び去る。細胞の生体外培養(in vitro culture)のために、この生物学的液体は、好ましくは、細胞培養のために設計された培地である。この細胞による生体外処置(ex vivo treatment)のために、この生物学的液体は、好ましくは、血漿、血液、又はその成分である。
【００８０】
生物学的液体は、好ましくは、２つの開口部（一方は区画室に供給するための入口して役立ち、他の開口部は、区画室から放出又は排出するための出口として役立つ）を通って、新規チャンバ中の区画室へ供給されてそれから除去されるが、より好ましくは、図１、３、及び４に示すように、これらの開口部の対には２つのタイプがあり：第一のタイプの開口部（１１０）及び（１２０）は、図１ａ、３ａ、及び４ａに図示する相対的に高い容量の接種配置において懸濁液から細胞（１３０）を接種するために使用され、第二のタイプの開口部（９０）及び（１００）は、図１ｂ、３ｂ、及び４ｂに図示する相対的に低い容量の灌流配置において細胞を生物学的液体と灌流するために使用される。開口部は、ポート又はマニホルドにより区画室の内部及び外部の間で連通している。ポートは、他のチャンバの内腔と平行、連続、又はその両方で接続し、細胞の接種、生物学的液体の灌流、又は区画室の内容物の濯ぎ又は吸引のためのフロー回路又はループを創出する。他のポートを加えることは、充填の間に空気を置換するための通気孔として、又は他のポートを別のチャンバのそれへ取り付けるときに区画室から排出するための手段として役立つ場合がある。
【００８１】
生物学的液体の供給及び除去のための開口部は、好ましくは、新規チャンバに生物学的液体を均一に供給するように配置される。細胞は、生物学的液体中の細胞の懸濁液から、細胞がチャンバを通して均一に分布し、均一な培養物として培養支持体上に付着するように接種することが好ましい。本発明により許容される相対的に大きなチャンバでは、そのような均一の搬入は、好ましくは、細胞の懸濁液を導入するための１以上のポートをチャンバの１つの端若しくは側へ向かって位置づけること、そして、細胞の懸濁液の導入時に区画室から置換される空気を排出するための１以上のポートの別のセットを第一ポートのセットからチャンバの反対の端若しくは側に位置づけることによって促進される。空気の排出は、排出用のポートが懸濁液を導入するためのポートの水平面より上にあるように、チャンバを傾けることによって促進される。
【００８２】
灌流用の生物学的液体の供給及び排出のための開口部も、好ましくは、チャンバの区画室内で液体のフローが均一になるように配置される。均一性は、水平位置での水力学的せん断応力が実質的に一定であり、フローが区画室の本体のどの区画でも実質的により遅く、又はより速く動かないこととして定義される。肝細胞を用いた試験では、少なくとも２ｍＮ／ｍｍ2（２ダイン／ｃｍ2）までは尿素産生が水力学的せん断応力に無関係であることが証明されている。
【００８３】
灌流する生物学的液体（灌流液とも呼ぶ）の均一なフローを創出するには、複数の開口部を使用して灌流すべき生物学的液体をチャンバの灌流配置におけるチャンバの区画室へ導入すること、そして複数の開口部を使用して生物学的灌流液を区画室から除去することが好ましい。より好ましくは、灌流液を区画室へ導入するための開口部は、単一の共通入口から、マニホルドが区画室への均一分布のために個々のポートへ灌流液を均一に分布するように多岐配置される。同様に、灌流液を区画室から除去するための開口部も、別々のマニホルド（入口のマニホルドから区別される）が単一の共通出口を通してチャンバから除去するために第二セットの個別ポート（入口の第一ポートのセットから区別される）から灌流液を均一に回収するように多岐配置されることが好ましい。
【００８４】
チャンバの区画室内部で灌流液の均一なフローを達成するための別の方法は、入口マニホルドと区画室の間に薄いスリットを創出して、区画室と出口マニホルドの間に同様の薄いスリットを創出することである。スリットの長さは、好ましくは、区画室の長さであり、スリットの幅は、好ましくは、マニホルドの直径より実質的に小さい。
【００８５】
チャンバの内部で灌流する生物学的液体の均一なフローを創出することは、可視化することが可能であり、着色か又は他のやり方で検出可能な色素を灌流液へ導入して区画室内での色素の分布を観察することによって評価することができる。チャンバを通る灌流液のフローを評価する代わりの方法は、チャンバ全体の圧力降下（即ち、チャンバへの灌流の入口とチャンバへの灌流の出口の間の圧力の差異）を測定することに基づく。測定された圧力降下を、フローのパターンが理想的であるかどうか、又は上記のパターンがどのくらい理想から異なるかを明確化するための手段として、流体力学からのモデルにより予測される圧力降下と比較することができる（例えば、Denn, Process Fluid Mechanics, Prentice-Hall, Inc., Englewood Cliffs, NJ, 1980 に記載されるように）。特に、好ましくは、マニホルド及び区画室におけるフローは、フローが十分に特性決定されて、２０００未満のレイノルズ数を有するように、層状である。
【００８６】
こうした観察と流体力学からの基本概念に基づいて、ポート及びマニホルドの設計を指示するようにガイドラインを策定することができる。チャンバの灌流配置において入口マニホルドから複数の入口開口部へ、チャンバ内の区画室へ、そして区画室から複数の出口開口部を通って出口マニホルドへ灌流液を均一に分布するには、それぞれのマニホルドの断面積が、複数の対応する開口部の断面積の合計以上であることが好ましい。このように、このガイドラインに従って入口及び／又は出口開口部の数及び／又は直径、及び／又は対応するマニホルドの直径を変えることにより、灌流液の区画室からの均一な供給及び排出が促進される。あるいは、入口マニホルドの有効断面積は、２以上の入口開口部からチャンバへの入口マニホルドへ灌流液を供給することによって数的に換算することができる。
【００８７】
ある種の細胞は、流れる生物学的液体との直接接触により不都合に影響を受ける付着特性若しくは機能的特性を有し、せん断に感受性であるので、ある応用では、流れる生物学的液体と細胞の間に液体透過性の膜を配置して水力学的な相互作用を制限することが望ましい場合がある。この配置においては、追加の区画室、細胞区画室がチャンバへ組み込まれて、流れる生物学的液体のある区画室と相互作用する。
【００８８】
図６は、不透過性の上壁（３０）、細胞の付着及び培養を支持する下壁（１３０）、上壁と下壁との間に液漏れしないシールを創出する圧縮可能なガスケット（５０）、細胞（１３０）の区画室を灌流の区画室（２６０）より分離する少なくとも１つの液体透過膜（２４０）、及び区画室（２６０）の側壁（２５０）を有する細胞培養用の２−区画室チャンバの１つの態様を示す。細胞の区画室は、下壁、ガスケット、及び液体透過膜により画定される。灌流の区画室は、液体透過膜、側壁（２５０）、及び上壁により画定される。灌流の区画室の容量は、細胞の区画室と灌流の区画室の両方に接した液体透過膜の面積と側壁の高さの数学的な積である。灌流の区画室の容量を最小化するには、相対的に薄くて実質的に非圧縮性のシムより側壁が構成されることが好ましい。
【００８９】
図６は、灌流の区画室（２６０）が１以上の液体透過膜（２４０）の上にあるように分割された２区画チャンバを図示するが、チャンバは、細胞の区画室（２０）が液体透過膜と下壁（３３０）の間に介在する限りにおいて、どの方向に配置してもよい。図６は、組み立てられるチャンバを安定にしてガスケット（５０）に付勢荷重を供給する留め具（７０）と対になるレセプタクル（８０）の使用を図示する。しかしながら、上記の１つの態様に記載されるように、ワッシャーのついたバネも留め具及びレセプタクルとともに使用して、一定の最小付勢荷重を供給することができる。
【００９０】
１つの態様において、チャンバは、２以上の配置の１つで存在し、それぞれの配置は、液体透過膜（２４０）と下壁（３３０）の間の高さにより確定される細胞の区画室（２０）の独自の容量により識別される。図６ａは、相対的に高い容量の細胞区画室（２０）を有する、その接種配置にある２区画チャンバを図示する。図６ｂは、相対的に低い容量の細胞区画室を有する、その灌流配置にあるチャンバを図示する。上記の態様に記載される１区画チャンバと同様に、異なる容量を有する追加の配置も許容される。しかしながら、それぞれの配置で、灌流の区画室（２６０）の容量は、好ましくは一定のままである。但し、この後者の区画室の容量を変更することも差し支えない。上壁、液体透過膜、及び下壁の間の実質的な平面性は、接種配置と灌流配置の間で（並びに、どの追加の配置でも）同一のままであり、細胞の区画室の形態は、液体透過膜と下壁との間の距離のみによって配置間で変化する。
【００９１】
２区画チャンバは、ガスケット（５０）に対する付勢荷重及び圧縮を変えることによって異なる容量配置間で変換される。図６ａのより高い容量の接種配置では、相対的に低いレベルの付勢荷重及び圧縮で、ガスケットが細胞の区画室（２０）と外部環境との間に液漏れしない無菌のシールを形成することが求められ；図６ｂのより低い容量の灌流配置では、相対的に高いレベルの付勢荷重及び圧縮で、ガスケットが細胞の低下容量区画室と外部環境との間にやはり液漏れしない無菌のシールを形成することが求められる。細胞の区画室の容量は、実質的に非圧縮性の栓によりセットされるが、これは、図１、３、及び４に図示するように、上記の態様ですでに記載したようなシム、及び／又はボルトであり得る。配置間の変換は他の態様について上記に記載した通りであり、変換の方法は、栓としてどのシム若しくはボルトを使用するか、そして最小の付勢荷重をガスケットに供給するのにどのバネを使用するかに依存する。
【００９２】
灌流の区画室（２６０）は、細胞培養用の培地、平衡化塩溶液、血液、又は血漿のような第二の生物学的液体（１３２）を含有する。細胞の区画室（２０）は、下壁（３３０）上で実質的に培養される細胞（１３０）、並びに灌流の区画室中の第二の生物学的液体（１３２）と同じでも異なってもよい生物学的液体（１５）の両方を含有する。生物学的液体（１５）及び（１３２）は、介在する１以上の液体透過膜（２４０）を介して液体接触している。生物学的液体（１５）は、細胞培養の基本栄養素、毒素、アミノ化分子、及び代謝されるべき他の生物学的老廃物を細胞に供給し、細胞代謝物、解毒化産物、分泌因子、及びタンパク質を運び去る。これらの分子は液体透過膜を通して生物学的液体（１５）へ、そしてそれから輸送される。
【００９３】
細胞の区画室（２０）中の生物学的液体（１５）は、ごくゆっくりと流れるか、又は静的である。第一の生物学的液体（１５）のフローは、灌流の区画室（２６０）中の第二の生物学的液体（１３２）のフローに実質的に影響されない。第二の生物学的液体（１３２）は、選好的に、充填の間に細胞の区画室（２０）へはじめに供給され、液体透過膜（２４０）を通して生物学的液体（１５）と自由に交換する。細胞の懸濁液を接種する間、第一の生物学的液体（１５）は、好ましくは、２つの開口部より細胞の区画室へ供給されてそれから除去され、１つの開口部（１１０）は区画室に供給するための入口として役立ち、別の開口部（１２０）は、区画室から放出又は排出するための出口として役立つ。生物学的液体（１３２）は、好ましくは、第二の独立した２つの開口部のセットを通して灌流の区画室へ供給され、１つの開口部（９０）は灌流する生物学的液体を供給するための入口として役立ち、第二開口部（１００）は、灌流する生物学的液体の出口として役立つ。それぞれの開口部は、その対応する区画室の内部及び外部の間でポート又はマニホルドにより通じる。ポートは、他のチャンバの対応する区画室と平行、連続、又はその両方で接続し、細胞の懸濁液からの接種と第二の生物学的液体（１３２）の灌流、又は各区画室の内容物の濯ぎ又は吸引のための別々のフロー回路又はループを創出する。他のポートを加えることは、充填の間に空気を置換するための通気孔として、又は区画室に通じる他のポートを別のチャンバのそれへ取り付けるときに区画室から排出するための手段として役立つ場合がある。
【００９４】
図６に特徴づける態様において、生物学的液体（１５）及び（１３２）の供給及び除去のための開口部は、２区画チャンバの各区画室にその対応する生物学的液体を均一に供給するように配置される。細胞の区画室（２０）では、細胞（１３０）は、好ましくは、細胞がチャンバを通して均一に分布し、均一な培養物として培養支持体（３３０）上に付着するように懸濁液から接種される。本発明により許容される相対的に大きなチャンバでは、そのような均一の搬入は、好ましくは、細胞の懸濁液を導入するための１以上のポート（１１０）をチャンバの１つの端若しくは側へ向かって位置づけ、細胞の懸濁液の導入時に区画室（２０）から置換される空気を排出するための１以上のポート（１２０）の別のセットをポート（１１０）から反対のチャンバの端若しくは側に位置づけることによって促進される。空気の排出は、排出用のポートが懸濁液を導入するためのポートの水平面より上にあるように、チャンバを傾けることによって促進される。
【００９５】
１つの態様において、灌流液の供給及びドレナージのための開口部は、灌流の区画室内で液体のフローが均一になるように配置される。２−区画室チャンバでは、灌流の区画室において許容される流速と水力学的なせん断応力が、機械的なコンプライアンスと液体透過膜の強度により限定され、混合にはより高い流速とせん断応力が好ましい。灌流液の均一なフローを創出するには、好ましくは、複数の開口部を使用して、灌流すべき生物学的液体を灌流配置の灌流の区画室へ導入し、そして複数の開口部を使用して灌流液を区画室から除去する。より好ましくは、灌流液を灌流の区画室へ導入するための開口部は、単一の共通入口から、入口マニホルドが灌流の区画室への均一分布のために個々のポートへ灌流液を均一に分布するように多岐配置される。同様に、灌流液を灌流の区画室から除去するための開口部は、別々の異なる出口マニホルドが単一の共通出口を通してチャンバから除去するために灌流液を個別ポートから均一に回収するように多岐配置されることが好ましい。この態様のためのポート、開口部、及びマニホルドのサイズについてのガイドラインは、他の態様について上記に論じたガイドラインと同一である。
【００９６】
チャンバには機能的な細胞を接種する。好ましくは、その接種配置におけるその相対的に大きい容量にあるチャンバ（又は２区画チャンバの細胞の区画室）に、細胞の懸濁液から細胞を接種すると、下壁は細胞培養の支持体として作用する。さらに、臓器補助デバイスとしての使用のために、接種した細胞は、好ましくは、臓器中の細胞にあり得る機能の種類及びレベルを模倣するように一緒に機能する。細胞は、チャンバにおいて増殖しても、数において安定したままでも、増殖と数的安定のモード間をスイッチしてもよい。細胞はまた、そのかつての表現型を維持しても、チャンバ中の培養時に表現型を変化させてもよい。チャンバは、臓器補助の必要な患者を治療するために、生体外培養系として、及び／又は臓器補助デバイスとして使用することができる。
【００９７】
チャンバへの細胞の１つの供給源は、哺乳動物の臓器である。この臓器が肝臓である場合、ＬＡＤにおける使用のために培養される細胞は、適切な化学及び構造上の環境に置かれるときに肝臓に典型的に関連する機能上の必要条件を達成することが可能である肝臓の主要細胞である、肝細胞を含む。内皮細胞、Ｉｔｏ細胞、クッパー細胞（特殊化したマクロファージ様の細胞）、及び線維芽細胞のような、肝臓に存在する他の細胞も、ＬＡＤとして作用するチャンバに含めてよい。１以上の上記や他の種類の細胞と肝細胞の共存培養物がＬＡＤに望ましい場合がある。複数のチャンバを含んでなるデバイスでは、それぞれのチャンバに同数の細胞、及び／又は種々の細胞の組合せ、又は異なる数の細胞、及び／又は組合せを接種してよい。
【００９８】
ヒト細胞の相対的に限定された利用可能性を仮定すれば、本発明において非ヒト供給源の細胞を使用することができる。ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ヤギ、及びマウスの供給源が限定されずに含まれる、他の哺乳動物由来の細胞を使用してよい。細胞のドナーは、発達及び年齢、性別、種、体重、及び大きさにおいて変動し得る。細胞は、胚、新生児、又は成体を含む老齢の個体のドナー組織に由来してよい。実質若しくは間葉幹細胞のような胚性始原細胞を本発明に使用して、分化させて所望の組織へ発生するように誘導してよい。さらに、異なる細胞系統からの細胞の混合物、正常細胞と遺伝子修飾細胞の混合物、及び／又は２以上の種又は組織供給源由来の細胞の混合物を使用してよい。
【００９９】
別の細胞の供給源は、哺乳動物臓器よりこれまでに得られた細胞を培養するか、又はすでに培養されたことがあり、細胞系として存在するような細胞を培養することによる。本発明に使用の細胞は、正常なものでも、自発的な、化学品の、又はウイルスのトランスフェクションにより遺伝子工学処理されたものでもよい。組換え又は遺伝子工学処理細胞を、不死性、低下した同種異系性、又は分化した肝細胞機能のために創出することができる。細胞を遺伝子工学的に処理する手順は、当該技術分野で一般に知られていて、Sambrook et al.,「分子クローニング、実験マニュアル（Molecular Cloning, A Laboratory Manual）」、コールドスプリングハーバープレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州（１９８９年）に記載されている。
【０１００】
細胞は、新鮮で、処理された組織から、かつて 生体外培養された細胞から、低温保存した組織から融解して、又はこれらの組合せより接種する。接種に先立って、細胞を接種培地に懸濁し、細胞培養の表面を含有する下壁を、所望されるならば処理して、上記のように細胞の付着及び機能を促進する。この表面の処理は、チャンバの組立てに先立って行なっても、チャンバの組立てに続いて行ってもよい。表面処理をチャンバの組立てに続いて行なう場合、この処理は、それが流体の形態であれば、細胞を接種する入口及び出口を通して適用される。
【０１０１】
細胞の懸濁液を外部環境へ直に曝露せずにデバイスへ直接ポンプ注入することによって、その接種配置にあるチャンバ（又は液体透過膜のある２区画チャンバの細胞用チャンバ）へ細胞を接種する。細胞の懸濁液を搬送する流速は、搬送の回路内で細胞が沈殿することや他の不都合なことを妨げるほどに速いが、細胞への実質的な機械的損傷又は水力学的なせん断による凝集を妨げるほどに遅いものである。この流速は、管系のサイズに依存し、実践的には、搬送に最も重要な特性は、搬送の管系の壁に対する水力学的なせん断応力である。好ましくは、搬送システムの壁が曝露されるせん断応力は、０．１〜３．０ダイン／ｃｍ2の間である。細胞の懸濁液は、好ましくは、１以上のポートを介してチャンバの区画室へ搬送されるので、細胞の区画室へのより均一な分布に有利である一方で、搬送の時間とせん断応力はともに最小化される。
【０１０２】
チャンバへの搬送に続き、細胞の培養物を定着させるのに十分な期間、典型的には６時間以上２４時間以下の間、細胞を定着させて付着させる。この時点で、一対のポートを開き、真空下に生物学的液体を吸引するためにこれらポートの１つを、そしてチャンバを排気して空気が生物学的液体に置き換わることを可能にするために他のポートを使用することによって、細胞を接種するのに使用した生物学的液体を除去する。次いで、上記のように、接種配置のチャンバを灌流配置のチャンバへ変換し、灌流用の生物学的液体を満たして、チャンバの灌流を開始する。この手順のセットにより、相対的に多い量の生物学的液体中の細胞（典型的には、１ｍＬの基本培養基につき５ｘ１０6個の細胞）を接種することが可能になり（より高い密度の細胞も可能であるが、さほど好ましくない）、後続の灌流では、チャンバの滞留量が４倍低下し、分解や外部環境への曝露が最小になる。
【０１０３】
チャンバに細胞を接種する環境については２つの特定の態様が可能である。いずれの態様でも、部品はすべて滅菌し（例えば、蒸気オートクレーブ、γ線照射、又は過酸化水素への曝露のような化学処理）、その後で、無菌の（即ち、生物学的汚染物質がない）環境を提供する生物学的安全性キャビネット（ＢＳＣ）内でチャンバと周辺回路へ組み立てる。あるいは、非無菌の部品からチャンバを組み立ててから、組み立てたチャンバを、上記の方法の１つにより、ユニットとして滅菌してもよい。
【０１０４】
１つの態様において、完全にＢＳＣ内でチャンバを処理する。別の態様では、ＢＳＣをさらに使用せずに、その代わりに無菌の配管溶接機を使用してチャンバを処理し、相対的に非清浄の環境において、端を施栓したＰＶＣベースの管系の切片の間で（加熱ナイフ又はマイクロ波又はＵＶ放射により）無菌接続をして。汚染を防ぐ。好ましくは、テルモ・メディカル・コーポレーション（サマーセット、ニュージャージー州）からのＳＣＤ（登録商標）ＩＩＢ、ＳＣＤ（登録商標）３１２、又はＴＳＣＤ（登録商標）配管溶接機を使用して、信頼し得るほどに無菌接続を創出して解体する。実験により、ＢＳＣを使用するだけで取扱ったチャンバとＳＣＤ（登録商標）ＩＩｂ配管溶接機を使用して処理したチャンバの間には性能において差異がないことが示された。配管溶接機で無菌の接続を形成する間に、詳細に取扱うことも無菌性を損なうこともなく接種配置から灌流配置へチャンバを変化させる能力により、取扱い時間の低下が促進され、無菌処理のための高額機器（例えば、ＢＳＣや他の種類の層流フード）の必要性が低下し、臨床現場での無菌処理の機会が提供される（これにより低温保存の可能性が広がる）。
【０１０５】
新規チャンバの細胞培養についての一元性のために、本チャンバは、区画室へ表面積及び容量を加えることや複数のチャンバを加えることで、スケール調整可能である。追加のチャンバを取り込む場合、区画室がポートを介して連絡してそれらの間での生物学的液体の灌流を可能にすることが好ましい。この連絡のために、生物学的液体の入口（９０）を、生物学的液体のフローを複数の区画室のそれぞれへ均等に分配して細胞（又は、２区画チャンバの灌流用区画室）を生物学的液体に曝露する外部入口マニホルドへ接続する。平行している多数の区画室を通過した後で、生物学的液体を共通の外部出口マニホルドに採取する。
【０１０６】
細胞培養用の多区画室チャンバのマニホルドは、好ましくは、離脱可能コネクタによりその関連区画室へ接続する。これらのコネクタにより、簡単な取り付けと個々の接続のあり得る置換が可能になる。あるいは、外部入口及び出口マニホルドは、所望されるならば、それぞれの関連区画室へ永久的に接続してよい。
【０１０７】
複数の個別チャンバからなるデバイスでは、個々のチャンバに、集合状態にある他のチャンバと一緒に細胞を接種しても、外部入口及び出口マニホルドとで一緒に結束してはいない個別チャンバとして別々に細胞を接種してから、その後で完全なシステムへ一緒に多岐配置してもよい。この後者の態様において接種したチャンバを一緒に組み立てる時間は、接種の直後でも、培養をさらに確定させた後でもよい。
【０１０８】
チャンバに接種した細胞は、保存することが出来る。保存は、低温保存、微温保存、又は凍結乾燥であり得る。
接種した細胞が肝細胞、及び／又は肝臓由来の他の細胞である場合、灌流配置の新規チャンバをＬＡＤとして使用して肝臓補助の必要な個体を治療することができる。一般に、ＬＡＤは、１以上のチャンバ、患者より治療のために血液を入手する手段、並びに、その血液をチャンバの内容物と交換して細胞が血液又はその成分を処置することを可能にするための手段からなる。ＬＡＤは、肝不全のヒト又は他の動物を治療するために使用することができる。
【０１０９】
一般に、１以上のチャンバのセット、患者、血液を患者より入手する手段、及び患者の血液をチャンバと交換する手段を配置するには少なくとも２種類の態様が可能である：チャンバを通る流速が患者由来の血液又は分離血漿の流速から独立している回路と、チャンバを通る流速が患者由来の血液又は分離血漿の流速に適合している回路である。第一の配置を完全再循環式ＬＡＤと以下に呼び、第二の配置を単一通過式ＬＡＤと以下に呼ぶ。
【０１１０】
図７ａは、細胞培養用の新規チャンバ（１０）を完全再循環式ＬＡＤの一部として使用する体外肝臓支援システムの態様の概略図を示す。本システムには、灌流配置にある多数のチャンバ（図１ｂ、３ｂ、４ｂ、及び６ｂに図示するチャンバのような）とともにインキュベーター（２９０）が含まれる。インキュベーターの内側には、生物学的液体を各チャンバの灌流用入口（９０）へ分配する外部入口マニホルド（６１１）と、各チャンバの灌流用出口（１００）より生物学的液体を採取するための外部出口マニホルド（６１２）が収容される。生物学的液体はポンプ（２７６）により血漿交換器（３００）より外部入口マニホルドへ供給され、外部出口マニホルドより血漿交換器へ戻される。患者（９００）からの血液は、ポンプ（２７２）によりプラズマフェレーシスユニット（２８０）へ供給され、ここで血漿が細胞成分の濃い血液より分離される。次いで、分離した血漿は血漿交換器へ流入し、ここでチャンバにおいて培養された細胞により処理された生物学的液体と混合する。濃縮された血液は、患者へ直接戻される。血漿交換器の内容物のいくらかも第三ポンプ（２７４）により患者へ戻されて、処理された血漿が患者へ運ばれる。生物学的液体及び血漿のフローの内部には、ｐＨ、温度のモニターとフローセンサーもある（示さず）。
【０１１１】
図７ａに図示する体外肝臓支援システム（６００）を完全再循環式ＬＡＤと呼ぶのは、チャンバ（１０）の内容物がチャンバを毎回通過した後で患者（９００）へそのまま戻らないで、むしろ再循環されて、血漿交換器（３００）において患者からの血漿と混合するためである。チャンバは、好ましくは平行に多岐配置されるが、１以上のチャンバを連続して多岐配置することも可能である。チャンバの数は１００以上まで変動してよく、チャンバには、同一であるか又は異なる細胞をロードしても、同一であるか又は異なる数の細胞をロードしてもよい。さらに、チャンバは、区画室の数において同一であっても、あるチャンバが単一区画室しか有さずに、別のチャンバが１以上の介在する液体透過膜付き２区画室を有してもよい。
【０１１２】
完全再循環式ＬＡＤ（６００）中の血漿交換器（３００）は、患者よりプラズマフェレーシスユニット（２８０）により産生した血漿とチャンバ（１０）中で細胞により処理された生物学的液体のミキサーとして機能する。血漿交換器は、２つの態様の１つにおいて存在することができる。１つの態様において、血漿交換器は、プラズマフェレーシスユニット由来の血漿のチャンバからの生物学的液体とのフリー混合を、他の混合制限を伴って可能にする単純な容器である。この態様において血漿交換器中の液体の組成は、血漿交換器の容量と、プラズマフェレーシスユニットにより産生される血漿、多岐配置されたチャンバにより産生される処理済の生物学的液体、及び血漿交換器からチャンバと患者へポンプ注入される液体の流速に基づいて、２つの完全に混和する液体の混合の規則により単に決定される。この態様では、免疫単離膜としても機能する液体透過膜の付いた２つの区画室をチャンバがそれぞれ有さなければ、チャンバ中の細胞と患者の間には免疫単離が存在しない。
【０１１３】
血漿交換器（３００）は、プラズマフェレーシスユニットからの血漿とチャンバからの生物学的液体とのフリー混合を可能にする単純な容器ではなく、むしろ、免疫単離デバイスでもある場合があり、ここでは、患者からの新鮮血漿とチャンバ（１０）からの処理済み液体との混合が、免疫反応性分子の通過を妨げるように設計された膜を横断する通過により制御される。この免疫単離デバイスでは、患者より産生されて患者へ戻る血漿のプールが、チャンバにより処理されてチャンバへ供給される生物学的液体のプールより分離される。免疫単離デバイスを用いると、患者の血漿とチャンバ中の細胞により処理される生物学的液体との混合は、先の態様の単純なミキサーにおいて許容されるフリー混合に比べて低下する。しかしながら、免疫単離デバイスの膜空孔サイズのカットオフを選択すると、第一の態様の単純なミキサーでは可能でない免疫単離の利益をもたらす。これらの液体透過膜は、好ましくは、５０，０００〜１０００，０００より大きい分子量がある分子の輸送を妨げる空孔を有する。
【０１１４】
図７ｂは、細胞培養の新規チャンバを単一通過式ＬＡＤの一部として使用する体外肝臓支援システムの態様の概略図を示す。本システムには、灌流配置にある多数のチャンバ（１０）（図１ｂ、３ｂ、４ｂ、及び６ｂに図示するチャンバのような）とともにインキュベーター（２９０）が含まれる。インキュベーターの内側には、血漿を各チャンバの灌流用入口（９０）へ直接分配する外部入口マニホルド（６１１）と、各チャンバの灌流用出口（１００）より処理済の血漿を採取するための外部出口マニホルド（６１２）が収容される。患者からの血液は、ポンプ（２７２）によりプラズマフェレーシスユニット（２８０）へ供給される。次いで、分離した血漿は、ポンプ（２７８）によりプラズマフェレーシスユニット（２８０）から外部入口マニホルドへ供給され、処理済の血漿として外部出口マニホルドから患者（９００）へ直接戻される。濃縮された血液を再び患者へ直接戻す。
【０１１５】
図７ｂに図示する体外肝臓支援システム（６０５）を単一通過式ＬＡＤと呼ぶのは、チャンバ（１０）の内容物がチャンバを１回通過した後で再循環されずに患者へ直接戻されて、血漿交換器において患者からの血漿と混合されるためである。チャンバは、平行に、又は連続して多岐配置してよく、配置の選択は、所望の混合特性と毒素を処理する細胞の動態に依存する。チャンバの数は１００以上まで変動してよく、チャンバには、同一であるか又は異なる細胞をロードしても、同一であるか又は異なる数の細胞をロードしてもよい。さらに、チャンバは、区画室の数において同一であっても、あるチャンバが単一区画室しか有さずに、別のチャンバが１以上の介在する液体透過膜付き２区画室を有してもよい。単一通過式のＬＡＤ（６０５）は、患者より生じる血漿をチャンバにより処理される生物学的液体と混合するために血漿交換器を特徴としないので、単一通過式のＬＡＤは、免疫単離膜として機能する少なくとも１つの液体透過膜の付いた２つの区画室をそれぞれのチャンバが有さなければ、患者と細胞の間に免疫単離を提供することができない。
【０１１６】
実施例
本発明を以下の実施例においてさらに記載するが、これらは、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を制限するものではない。実施例１は、示差熱膨張に基づいて、薄いポリマーフィルムを穿孔した金属裏当て上で引っ張る手順を記載する。実施例２、３、及び４は、可変容量細胞培養閉鎖型チャンバの組立て、細胞の接種、及び灌流を記載し、ここでは、実質的に非圧縮性のプラスチックシムの交換により容量を調整する。実施例５は、複数の可変容量細胞接種閉鎖型チャンバを使用して臓器不全の患者を治療するシステムの１つの態様を記載する。実施例６は、肝細胞機能を測定して可変容量細胞培養閉鎖型チャンバの性能を評価するために使用するアッセイを記載する。図７及び８は、可変容量細胞培養閉鎖型チャンバの性能を記載する。実施例９は、可変容量細胞培養閉鎖型チャンバの組立て、細胞の接種、及び灌流を記載し、ここでは、バネを使用してチャンバのシール上に最小の荷重を維持する。
【０１１７】
実施例１：ポリスチレンフィルムを穿孔金属裏当て上へ引っ張ること
フィルムとフレーム間の熱膨張係数における差異に基づいて薄いポリマーフィルムを穿孔金属フレーム上へ付着して引っ張ることができることを、厚さ０．０５０８ｍｍ（０．００２インチ）のポリスチレンフィルム（Ｐｏｌｙｆｌｅｘ（登録商標）、プラスチクス・サプライヤーズ社、コロンバス、オハイオ州）とアルミニウムフレーム（４０）（図８に図示する）を使用して例証した。片側をコロナ処理したこのフィルムは、気体透過性、液体不透過性の表面を提供し、国際公開第ＷＯ００／７８９３２にすでに記載されるように、この上に肝細胞を接種して、付着させ、培養することができる。フレームは、厚さ約６．３５ｍｍ（１／４インチ）のアルミニウムジグ板（ＭｃＭａｓｔｅｒ−Ｃａｒｒ，ブリッジポート、ニュージャージー州）の約３０．４８ｘ４８．２６ｃｍ（１２インチｘ１９インチ）表面を中心とする蜂の巣様のパターンにおいて直径から直径が約０．６９ｃｍ（０．２７２インチ）の間隔で離れている、２２４０個の直径約０．６４ｃｍ（０．２５２インチ）の通り穴（３５０）の第一セットと５２個の直径約０．６４ｃｍ（０．２５２インチ）の通り穴（３４０）の第二セットをその周辺に沿って同じ表面へ機械加工することによって製造した。引き続き、このフレームを厚さ約０．１２７〜０．２０３ｍｍ（０．０００５〜０．０００８インチ）の硫酸電極酸化（ＩＩ型、Ｍｉｌ−Ａ−８６２５Ｃに従って認可）で処理し、溶媒による攻撃に対して保護した。この第一セットの穴（３５０）は、フィルムを通過するガスの自由な交換がなされるための穿孔を提供し；第二セットの穴（３４０）は、フィルムの付いたフレームが対板とともに細胞培養用のチャンバへ組み立てられることを可能にした。第二セットは、フレームの長軸に沿って、フレームの短軸に沿ってフレームの隣の端から約２．０９６ｃｍ（０．８２５インチ）に配置され、約２．３２７ｃｍ（０．９１６インチ）離れた中心が等間隔にある２群の２１個の通り穴と、フレームの短軸に沿って、フレームの長軸に沿ってフレームの隣の端から約０．８６４ｃｍ（０．３４０インチ）に配置され、約４．３８２ｃｍ（１．７２５インチ）離れた中心が等間隔にある２群の５個の通り穴からなった。
【０１１８】
フィルム−フレーム組立体を成形するために、穿孔フレーム（４０）をインキュベーターにおいてはじめに４０℃まで温めてから、少しの間動かして、薄い、厚さほぼ０．０７６ｍｍ（０．００３インチ）の線の医療用エポキシ（ＥＰ２１ＬＶ，マスター・ボンド社、ハッケンサック、ニュージャージー州）（部品Ａ及びＢを１：１の重量比で混合した）を、通り穴を含有するフレームの両面の１つに塗布した。このエポキシの線は、内径約０．６８６ｍｍ（０．０２７インチ）へ先端が先細りした１０ｍＬ量のシリンジ（スモール・部品社、マイアミレイクス、フロリダ州）より処理して塗布し、通り穴（３５０）及び（３４０）それぞれの内部及び外部セットの間に置いた。次いで、ポリフレックスの約２５．４ｘ４５．７２ｃｍ（１０インチｘ１８インチ）フィルムのフレームに対面していないフィルム面のコロナ側をフレームのエポキシ処理側上に置き、この組立体を４５℃で一晩インキュベートした。組立体をインキュベーターより外し、室温へ冷やし、エポキシの線に対して外側でフレームの端に向かうフィルムの部分を、ボックスカッターを使用して切り出し、そしてこの組立体をγ放射線により滅菌した。この手順は、付着細胞の付着及び培養の表面として適していて、実質的に平坦で、細胞培養用の灌流チャンバへ組み立てられるときに実質的にはたるまない穿孔金属裏当て上に固定される、引っ張られた気体透過性、液体不透過性のフィルムをもたらした。
【０１１９】
実施例２．可変容量閉鎖型チャンバ組立てと細胞の接種
実質的に非圧縮性のシムの使用により容量が設定される、可変容量閉鎖型チャンバの、細胞を接種する能力についてチャンバを構築することによって評価した。図９ａ、９ｂ、及び９ｃに図示するようなチャンバ（１０）には、上板（３０）、フィルム−フレーム組立体（３３０）、圧縮可能ガスケット（５０）、実質的に非圧縮性の内部シム（１８０）、接種用及び灌流用の実質的に非圧縮性の外部シムのセット（６０）、関連した取付部品（４１０）、（４４０）、（４５０）、及び（４６０）、並びにフィルム−フレーム組立体を上板へ締め付けるための関連部品（７０）、（８０）、（４２０）、（４３０）、及び（４７０）が含まれた。
【０１２０】
上板（３０）は、６種の特徴のセットで機械加工し、厚さ約０．１２７〜０．２０３ｃｍ（０．０００５〜０．０００８インチ）の硫酸陽極酸化（ＩＩ型、Ｍｉｌ−Ａ−８６２５Ｃに従って認可）で仕上げた、一枚の厚さ約３０．４８ｃｍｘ４８．２６ｃｍｘ０．９５３ｃｍ（１２インチｘ１９インチｘ３／８インチ）のアルミニウムジグ板（ＭｃＭａｓｔｅｒ−Ｃａｒｒ）であった。３２個の直径約０．６５３ｃｍ（０．２５７インチ）−深さ約０．９５３ｃｍ（３／８インチ）の通り穴（３６０）のセットを、フィルムーフレーム組立体（３３０）のフレーム（４０）において３２個の通り穴（３４０）のセットに適合させ、留め具（７０）の通過を可能にした。これらの適合する通り穴のセットは、留め具からの荷重力をガスケットでの均一シーリングのために実質的に分配するように間隔をあけた。上板の１つの約３０．４８ｃｍｘ４８．２６ｃｍ（１２インチｘ１９インチ）面で、＃６−３２ステンレススチール丸ネジ（４７０）にネジ立てた２つの直径約０．２８５ｃｍ（０．１１２インチ）の通り穴（４００）を、穴（３６０）のサブセットに対して機械加工した。上板の対面上にあり、この面の中心にある、深さ約１．９８１ｍｍ（０．０７８インチ）、幅約９．５２５ｍｍ（０．３７５インチ）の約４５．５０ｃｍｘ２５．１９ｃｍ（１７．９１４インチｘ９．９１６インチ）の溝（３１０）は、厚さ約６．３５ｍｍ（１／４インチ）の中位品質シリコーンスポンジゴムガスケット（グリーンラバー、ウォバーン、マサチューセッツ州）を収容するためのスペースを提供した。プラスチックの＃１／４−２８オス型ネジ切りルアー（Ｌｕｅｒ）ロック取付部品（４６０）にネジ立てた、さらに４つの深さ約９．５２５ｍｍ（３／８インチ）の通り穴（１１１）（溝のない上板の面より時計回りに数える）を溝の隅に隣接する上板において機械加工した。これらの穴は、溝に対する面上に取り付け面径０．３４６インチであり、サイズ００９のＯリングを使用して取付部品（４６０）と上板の間でシールすることを可能にした。取付部品と穴の組合せにより、接種ポート（１１０）、接種／吸引ポート（１１６）、排気ポート（１２０）、及び余剰ポート（１２１）を生じた。これらの穴は、相対的に高い容量の接種配置における液体の導入及び除去に使用した。
【０１２１】
相対的に低い容量の灌流配置への液体の導入と、それからの液体の除去は、相対的に大きな口径の入口及び出口管のマニホルドとより小さい口径のクロス穴のセットにより実施した。隣接サイドから約４．６８１ｃｍ（１．８４３インチ）にあり、厚さ約９．５２５ｍｍ（３／８インチ）の面に集中する、２つの長さ約４８．２６ｃｍ（１９インチ）、直径約０．３９４７ｃｍ（０．１５５インチ）の通り穴（３７０）及び（３８０）を上板の長軸に沿って機械加工した。これらの穴のそれぞれの端は、取り付け面径約７．３６６ｍｍ（０．２９０インチ）ｘ深さ約１．２７０ｍｍ（０．０５０インチ）であり、深さ約０．５０８ｃｍ（０．２００インチ）にネジ立て、関連００６  Ｏリング（４３０）の付いたステンレススチール＃１０−３２取付部品（４４０）を受け入れて取付部品を上板へシールした。最後に、３０個の直径約０．６３５ｍｍ（０．０２５インチ）、深さ約２．７９４ｍｍ（０．１１０インチ）のクロス穴（３９０）を接続する溝の付いた上板の面へパンチして、長さ約４８．２６ｃｍ（１９インチ）の穴（３７０）及び（３８０）から長さ約４８．２６ｃｍ（１９インチ）の穴につき１５個の穴（３９０）がある上面への流体の通路を提供した。これらの穴は、均一に約２．８６８ｃｍ（１．１２９インチ）離れた間隔にあった。
【０１２２】
先ず、ネジ立て穴（４００）と２つの＃６−３２ステンレススチール丸ネジ（４７０）を使用して、溝（３１０）に対面する上板（３０）の面上へ２８個のＳｏｕｔｈｃｏ（登録商標）ステンレススチールレセプタクル（８０）（Ｄ．Ｂ．ロバーツ、ボストン、マサチューセッツ州）のセットを締め付けることによってチャンバ（１０）を一部組み立てた。これらレセプタクルは、細胞培養後のチャンバの解体及びクリーニングの間に上板より定常的に外すことを企図しなかった。次いで、Ｏリング（４３０）の付いた４つのルアーロック取付部品（４６０）を、対応するネジ立て穴（１１１）へ緩くねじ込み、対応するプラスチックのメス型ルアーロック栓（４５０）をこれらルアーロック取付部品のそれぞれの上へ締めた。次いで、上板を弾いて溝（３１０）のある面を曝露し、ガスケット（５０）を溝に配列し、厚さ約０．１２７ｍｍ（０．００５インチ）、幅約０．６３５ｃｍ（０．２５インチ）の約４３．５４ｃｍ（１７．１４インチ）ｘ約２３．２２ｃｍ（９．１４インチ）ポリカーボネートの内部シム（１８０）を上板上に置いて、ガスケットにより画定した。この部分的な上面組立体を蒸気オートクレーブにより滅菌した後で、さらに組み立てた。＃１０−３２ステンレススチール平ネジ（４１０）及び＃１０−３２オス型ネジ切りルアーロック取付部品（４４０）の対を（サイズ−００６のＯ−リング（４３０）も一緒に）蒸気により滅菌した。
【０１２３】
組立てにおける後続の工程は、いずれも生物学的安全性キャビネット（ＢＳＣ）において実施し、明記する以外は、滅菌した部品を伴った。ＢＳＣ内で無菌ピンセット又は無菌グラブのいずれかで材料を取扱うことによって無菌処理を確実にした。はじめに、フィルムーフレーム組立体（３３０）と部分的な上面組立体をそのオートクレーブバッグより開けて、緩い取付部品（４６０）を締めた。次いで、このフィルム−フレームと上面組立体を通し穴（３６０）及び（３４０）のセットに適合させることによって配列し、フィルム−フレーム組立体の担フィルムサイドと突出ガスケットのある上面組立体のサイドが対面するようにした。次いで、Ｓｏｕｔｈｃｏ（登録商標）ファストリードねじ込みステンレススチールネジ（７０）をフィルム−フレーム組立体の曝露面より穴（３６０）及び（３４０）を通して挿入し、レセプタクル（８０）に捕捉した。４つの厚さ約１．５８８ｃｍ（０．６２５インチ）のポリカーボネート外部シム（６０）のセットをネジの間に入れ、チャンバ（１０）の容量を接種配置において細胞を接種するための１６５ｍＬに設定した。これらの接種用の外部シムには面の広がりがあり、図９ｂ及び９ｃに図示するように、上板（３０）及びフィルム−フレーム組立体の縁により形成される周辺の外へ伸びることを可能にした。
【０１２４】
次いで、パワーネジ（Ｂｌａｃｋ  ＆  Ｄｅｃｋｅｒ，ハムステッド、メリーランド州）を最小のトルクで使用して、Ｓｏｕｔｈｃｏ（登録商標）ネジ（７０）を隅の内側から締めて、チャンバの実質的な曲がりを引き起こさずにガスケット（５０）を均一に圧縮することによってチャンバ（１０）をシールした。引き続き、ネジのトルク調節を３と１／２に設定して上記の手順を繰り返すことによって、Ｓｏｕｔｈｃｏ（登録商標）ネジ（７０）をさらに締めた。接種配置の閉鎖型チャンバの組立てにおける最終工程は、取付部品（４４０）及び（４１０）を１対の長さ約４８．２６ｃｍ（１９インチ）の穴（３７０）及び（３８０）の端に取り付けて締めることであり、それによりチャンバのそれぞれの側はこれら２つの取付部品の１種のみを含有した。無菌条件下にチャンバを維持し、使用まで開けなかった。この手順により、接種配置の閉じた無菌のチャンバが創出され、この中で、シールされた１６５ｍＬ量区画室内にある約４３．６０ｃｍ（１７．１６４インチ）ｘ約２３．２８ｃｍ（９．１６６インチ）の面積の気体透過性、液体不透過性のフィルム上に細胞を接種することができた。
【０１２５】
細胞培養デバイスとしての閉鎖型チャンバ（１０）の試験を、体重８±３ｋｇのヨークシア／ハンプシア交雑種のブタ（ＥＭ  Ｐａｒｓｏｎｓ，ハドリー、マサチューセッツ州、及びＡＢＩ，ボルチモア、メリーランド州）の肝臓より入手した、（１％  ウマ血清（ＨＳ）を含む基本培養基（４．５ｇ／Ｌ  グルコース、０．５Ｕ／ｍＬ  ウシインスリン、７ｎｇ／ｍＬ  グルカゴン、７．５μｇ／ｍＬ  ヒドロコーチゾン、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２０ｎｇ／ｍＬ  ＥＧＦ、２０ｍＭ  グルタミン、１０ＩＵ  ペニシリン、及び１０μｇ  ストレプトマイシンを補充したウィリアムＥ培地）中の一次肝細胞を使用して実施した。ヘパリン（Ｅｌｋｉｎｓ−Ｓｉｎｎ，チェリーヒル、ニュージャージー州）を０．５ｍｇ／ｋｇで静脈内投与し、Ｔｅｌａｚｏｌ（７〜１１ｍｇ／ｋｇ，フォートドッジ・ラボラトリーズ、フォートドッジ、ルイジアナ州）とＲｏｍｐｕｎ（５ｍｇ／ｋｇ，マイルズ社、ショーニー、ミッション、カンザス州）の混合物でドナーを麻酔した。イソフルランガスで麻酔の水準を維持した。すべての手順は、ＩＡＣＵＣガイドラインに則って実施した。
【０１２６】
Ｓｅｌｇｅｎ法（Selgen,「単離ラット肝細胞の調製（Preparation of isolated rat liver cells）」、「細胞生物学の方法（Methods in Cell Biology）」中、Prescott ら、監修、第１３巻、アカデミック・プレス、ニューヨーク、ニューヨーク州、１９７６年）の改良法を使用して細胞を単離した。簡潔に言えば、曝露した肝臓にカニューレを通し、切除前に２０ｍｌ／分の冷たい乳酸リンゲル液（バクスター、ディアフィールド、イリノイ州）で in situ 灌流した。この肝臓をすぐに温めて、０．２％  ＥＤＴＡとともに３７℃で灌流した後で、消化が完了したように見えるまで（典型的には１８〜２６分後）、３７℃で１ｍｇ／ｍＬ  コラゲナーゼ（ライフテクノロジーズ、グランドアイランド、ニューヨーク州）の灌流をした。１０％  ＨＳを補充した冷たいハンクス緩衝化生理食塩水溶液（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，ウォーカーヴィル、メリーランド州）を加えてさらなる消化を停止した。未消化組織と胆嚢を切除し、組織の残りを孔径２００μｍのステンレススチール篩い（フィッシャー・サイエンティフィック、ピッツバーグ、ペンシルヴェニア州）に連続的に通過させた。次いで、細胞の懸濁液を２回洗浄し、基本培養基に再懸濁した。
【０１２７】
次いで、図１０に図示する装置（４８０）を使用して、細胞をチャンバ（１０）へ接種した。概念的には、配管溶接機を使用して無菌的に接続部をつくれば、ＢＳＣは必要でないものの、無菌性を確実にするために他に述べることを除けば、すべての工程は、ＢＳＣの内部で無菌の部品を用いて無菌的に実施した。しかしながら、簡略性のために、上記の試験において配管溶接機は使用しなかった。
【０１２８】
ある試験では、気体透過性、液体不透過性のフィルムを、無菌の１６０ｍＬ量の、蒸留した脱イオン水中の４４μｇ／ｍＬ  Ｉ型コラーゲン溶液で３０〜６０分の間予めコートした。ＢＳＣを使用して、メス型ルアーロック栓をチャンバの上部の外面にある１対のルアーロックポートから外すこと、区画室のガス内容物を他のオープンしたポートよりＢＳＣへ排気しながら５０ｍＬ量のピペットでこの溶液をオープンしたポートへ処理すること、並びに、ルアーロック栓をそのそれぞれの取付部品上へ再設置することによって、この溶液をチャンバ（１０）へ導入した。引き続き、上記の対のルアーロック栓を再び外すこと、ルアーロック栓により空いたばかりのオープン取付部品に置かれた２ｍＬ量のパスツール・ピペットで区画室を吸引すること、この区画室を５０ｍＬの基本培養基でピペットにより濯ぐこと、並びにコラーゲンの溶液について記載したようにこのリンス液を吸引することによって、非付着コラーゲンの溶液を除去した。この結果、分子の厚さのコラーゲンがフィルム上にコートされる。
【０１２９】
ストッパー（５００）、フィルター（４９０）、及び、接種する間に排気するための関連部品（４４０）、（４５０）、（５５０）、及び（５７０）の付いた管状部（５２０）（フィッシャー・サイエンティフィック）のある１Ｌ量のＰｙｒｅｘ（登録商標）吸引ボトル（５１０）において５ｘ１０6細胞／ｍＬの濃度で調製した細胞（１３１）の懸濁液より、個々のチャンバ（１０）へ細胞を接種した。フラスコをシェーカー（５４０）上に置き、懸濁液をよく混合して接種の間に細胞が沈殿することを最少化した。チャンバの上部の外面にあるルアーロック取付部品より３つのルアーロック栓を外すことによって、チャンバを接種用に準備した。
【０１３０】
次いで、細胞（１３０）をチャンバ（１０）中へ分配するための装置（４８０）を、管状部（５２０）をタイゴン（登録商標）ＬＦＬ  ＵＳ（登録商標）１７  マスタフレックス（登録商標）内径約０．６３５ｃｍ（０．２５インチ）管系（５７０）（コール・パーマー・インスツルメント・カンパニー（Cole Parmer Instrument Company）、バーノンヒルズ、イリノイ州）の切片へ、有刺オス型ルアーロック取付部品（５５０）へ、四方向弁（５６０）へ、オス型ルアーロック有刺取付部品（５５０）及びメス型−メス型ルアーロック取付部品（５５１）へ、タイゴン（登録商標）ＬＦＬ  ＵＳ（登録商標）２５  マスタフレックス（登録商標）内径約０．４８３ｃｍ（０．１９インチ）管系（５８０）（コール・パーマー・インスツルメント・カンパニー）の２つの平行切片へ、チャンバ（１０）へ、そしてチャンバ（１０）からオス型ルアーロック有刺取付部品（５５０）へ接続し、タイゴン（登録商標）ＬＦＬ  ＵＳ（登録商標）１７  マスタフレックス（登録商標）管系（５７０）（コール・パーマー・インスツルメント・カンパニー）の切片へ、有刺オス型ルアーロック取付部品（８４０）へ、部品（４４０）、（５９０）、（５７０）、及び（４９０）の組立体により形成される廃棄物レシーバー（５３０）へ接続することによって組み立てた。このレシーバー（５３０）は、装置（４８０）の無菌排気が、細胞の接種の間にチャンバ及び管系より置換されるガス内容物を収容することを可能にした。
【０１３１】
装置（４８０）におけるフローは、Ｅａｓｙ−Ｌｏａｄ（登録商標）ポンプヘッドへの個別管系（５８０）の切片を、ステンレススチールのローター（２７０）（コール・パーマー・インスツルメント・カンパニー）のあるＬ／Ｓ（登録商標）可変速デジタルペリスタドライブ上に搭載したＰＳＦハウジング（２７１）（コール・パーマー・インスツルメント・カンパニー）にロードすることによって制御した。細胞の懸濁液（１３１）を導入するのに二元ポートを使用することにより、チャンバ（１０）へ細胞を均一に接種することが促進された。管系（５７０）及び（５８０）の切片は、切片（５７０）内のフローの断面積を切片（５８０）内のフローの断面積の合計と適合させるように選択した。これら管系の３つの切片に細胞の懸濁液（１３１）を満たした後で、チャンバへ細胞を導入した。
【０１３２】
細胞の懸濁液（１３１）をチャンバ（１０）へ実際に接種するには、チャンバをその短軸上で水平位置からほぼ４５°傾けて、管系（５８０）の二元切片より、１６５ｍＬの細胞の懸濁液（１３１）を５０ｍＬ／分でポンプ注入することによって満たした。この流速は、懸濁液の過剰なせん断を引き起こさずに細胞を接種するのに必要な時間を最小化するように選択した。引き続き、チャンバを傾けて水平位置へ戻し、管系をチャンバから外し、チャンバ上のすべてのオープンポートに栓をした。次いで、３７℃、１０％  ＣＯ2、及び相対湿度８５％で作動するインキュベーターへチャンバを移した。複数のチャンバに接種するには、この手順を繰り返してよい。
【０１３３】
実施例３．可変容量閉鎖型チャンバ容量の低減
１６５ｍＬの培地を含有する接種配置より３５ｍＬの培地を含有する灌流配置へ変換される細胞接種済みチャンバの能力を、図９に図示する実施例１０のチャンバ（１０）で例証した。ほぼ１８〜２４時間の静的な培養の後で、はじめにチャンバをインキュベーターから移し、それをＢＳＣに置くことによって、チャンバを再配置した。次いで、ポート（１１６）及び（１２０）の栓（４５０）を外し、オープンにしたポート（１１６）よりチャンバ中の培地を吸引し、５０ｍＬの基本培養基を分配してポート（１１６）より吸引することによって、区画室を濯いで非付着の残滓を除去し、栓（４５０）を交換した。次いで、灌流取付部品（４４０）の栓を外し、留め具（７０）を緩め、４つの厚さ０．０６２５インチの外部シム（６０）を外して４つの厚さ約０．１２７ｍｍ（０．００５インチ）のポリカーボネートシムのセットに交換し、実施例２に記載のように留め具（７０）を再び締めることによって、区画室の容量を低下させた。シムは、そのタブにより引き出すことによって外した。この手順により、チャンバの無菌性は損なわず、区画室の容量と関連するフロー通過量は４倍減少して３５ｍＬになり、接種した２ｘ１０7個の細胞につきほぼ１ｍＬとなった。
【０１３４】
灌流液は、上板（３０）へ機械加工した内部の入口及び出口マニホルドを使用して、チャンバの内部を通して分配した。灌流液は、入口灌流ポートの１つより入り、長さ約４８．２６ｃｍ（１９インチ）の関連穴を通って流れ、それから１５個の関連クロス穴（３９０）を通ってチャンバの区画室へ分配された。次いで、灌流液は、チャンバの区画室を通って流れ、１５のクロス穴（３９０）のセットを通して長さ約４８．２６ｃｍ（１９インチ）の関連穴へ出て、灌流出口ポート（１００）よりチャンバ（１０）を出た。灌流の流速は、上板（３０）の特徴とチャンバの区画室を通るフローが層状である（即ち、関連するレイノルズ数が２０００未満である）ように選択した。長さ約４８．２６ｃｍ（１９インチ）の穴（３７０）及び（３８０）の直径に比較してクロス穴（３９０）の小さな直径は、クロス穴（３９０）を通る灌流液の流れを、クロス穴のサブセットを通る灌流液の最小選好導流で均一に分配するように選択し、これは、チャンバの区画室を通る灌流液の選好導流をもたらす。
【０１３５】
実施例４．可変容量閉鎖型チャンバ単一カートリッジとしての灌流
灌流配置の細胞接種済みチャンバ（１０）が灌流され得る能力を、実施例３のチャンバと閉ループ回路で評価した。この検査はまた、培地又は血漿の灌流下での肝細胞の生体外の機能の試験、肝不全の動物を治療するために一緒に多岐配置された多数のこれらチャンバの使用、並びに、上記新規チャンバから国際公開第ＷＯ００／７８９３２にすでに記載のチャンバへの細胞あたりの機能のスケーリングの確認を可能にした。
【０１３６】
灌流用の閉ループ回路（即ち、完全な再循環を伴う灌流のための回路）を、その灌流配置にある細胞接種済みチャンバ（１０）、関連の栓及び取付部品がある無菌の５００ｍＬ量レシーバー、及び、チャンバ及びレシーバーを接続する関連有刺オス型ルアーロック取付部品の付いた、長さ約６０．９６ｃｍ（２フィート）のＬ／Ｓ（登録商標）１４  マスタフレックス（登録商標）内径約０．１５２ｃｍ（０．０６インチ）の管系（コール・パーマー・インスツルメント・カンパニー）の２つの切片で組み立てた。レシーバーに一定量の灌流液をロードしてから、接続した。管系は、ジアゼパムを含有しない培地又は血漿での試験ではＴｙｇｏｒｉ  ＬＦＬであった；ジアゼパムでチャレンジする培地での試験には、Ｖｉｔｏｒｉ管系を使用した。この管系の２つの切片は、チャンバの入口及び出口ポートをそれぞれレシーバーへ接続した。部品は、蒸気オートクレーブにより滅菌するか、又は組立てに先立って無菌にした。
【０１３７】
灌流用に組み立てた回路を、ＢＳＣより３７℃及び１０％  ＣＯ2で作動するインキュベーターへ移した。レシーバー及び入口ポートをチャンバへ接続する管系を、ステンレススチールのローター（コール・パーマー・インスツルメント・カンパニー）のあるＵＳ（登録商標）可変速デジタルペリスタドライブ上に搭載したＥａｓｙ−Ｌｏａｄ（登録商標）ポンプヘッド（コール・パーマー・インスツルメント・カンパニー）へロードした。次いで、レシーバー中の培地を、典型的には１０ｍＬ／分の流速で回路を通して（即ち、レシーバーから管系を通りチャンバへ、第二セットの管系を通りレシーバーへ戻る）再循環させた。スタートアップの時点で、チャンバ（１０）を、典型的にはその短軸上で水平位置から傾けて、チャンバの区画室からの気泡の除去を促進した。この回路におけるレシーバーは、気泡トラップとしても機能した。６、１８、又は２４時間の灌流の後で、再循環の灌流液をサンプリングし、実施例４に記載のように、肝細胞機能を反映する生化学特性を検査した。レシーバーを新鮮灌流液のある新しいレシーバーに交換することによって、多数の連続時間の灌流が可能であった。
【０１３８】
試験の完了時に、チャンバ（１０）をインキュベーターより動かし、解体し、洗浄した。生物学的危険物質についての適切な手順に従って、すべての管系とプラスチック取付部品を外して処理した。次いで、留め具（７０）と灌流用のステンレススチールメス型ルアーロック取付部品（４４０）を外し、音波処理により３０分間清浄化した。気体透過性、液体不透過性のフィルムをフィルム−フレーム組立体（３３０）よりはがし、フレーム（４０）を水中７０％エタノールに２４時間浸漬して残留エポキシを放ち、このエポキシと、結合したフィルム残滓をレーザーブレード又は外科用メスを使用してそぎ落とした。ガスケット（５０）と内部シム（１８０）を両方外した後で、上板（３０）をＢａｃｄｏｗｎ洗剤（Ｄｅｃｏｎ  Ｌａｂｓ，Ｂｒｙｎ  Ｍａｗｒ，ペンシルヴェニア州）でこすり洗うことによって清浄した。長さ約４８．２６ｃｍ（１９インチ）の通り穴（３７０）及び（３８０）を、パイプクリーナーの切片を使用して１％  Ｈ2Ｏ2をさっと通して、個別に清浄した。次いで、すべての部品を水で濯ぎ、以降の使用のために乾燥した。
【０１３９】
上記の灌流用回路は閉ループ配置を有していたが、我々は、流路が供給貯留部からポンプを通り、チャンバを通り、採取貯留部へ至る開ループ配置を有する、本実施例に記載の態様の形態を想定する。この開ループ回路の組立て及び操作は、閉ループ回路について上記に記載の一般手順に従う。
【０１４０】
実施例５．可変容量細胞培養閉鎖型チャンバを複数含むシステムで肝不全動物を治療するシステム
その灌流配置にある細胞接種済みチャンバ（１０）を体外ＬＡＤ回路（６００）の一部として使用して、肝不全状態にある３０〜５０ポンドのブタを治療した。図１１に図示するように、このシステムは、アフェレーシス用のＭＳＣ９０００＋マシーン（２８０）（ヘモネティクス社、ブレインツリー、マサチューセッツ州）、平行に多岐配置された１０個のチャンバ（１０）のセット、上記のチャンバに環境上の支援を提供するモデル＃３１１０単一チャンバインキュベーター（２９０）（サーモフォーマ、マリエッタ、オハイオ州）、水浴（７３０）、並びに、関連のポンプ、管系、及び他の流体取扱い関連品からなった。図１１は、簡明性のために３つのみのチャンバを示す。ＭＣＳ９０００＋は、血漿を他の血液成分より分離するための、ＦＤＡ承認された遠心分離に基づくデバイスである。ＭＣＳの操作は、オペレーター介入をほとんど必要としないが対象物の安全性は確保する、使いやすい電子ディスプレイによって制御される。例えば、ＭＣＳは、自動的に、血流を交互に「ドロー（引く）」及び「リターン（戻す）」するサイクルを制御して、体外血液量の限界に達すれば応答する。
【０１４１】
ＬＡＤ（６００）での対象物の処置には多数のフェーズを必要とした：その接種配置にある複数のチャンバ（１０）へ肝細胞を接種する（実施例２に記載のように）第一フェーズ、その接種配置にあるチャンバをその灌流配置へ変換する（実施例３に記載のように）第二フェーズ、その灌流配置にあるチャンバを平行に多岐配置して、基本培養基で灌流する（「プレ灌流」）第三フェーズ、肝不全のブタの血漿を対外ＬＡＤで処置する第四フェーズ、及び、その灌流配置にあるチャンバに基本培養基を再灌流する（「ポスト灌流」）第五フェーズである。プレ灌流により、肝機能が弱った対象物からの血漿への曝露に先立つＬＡＤの生体外の性能のベースラインを得たが、異なる生体外の肝細胞機能のプレ灌流に対するポスト灌流の比率は、ＬＡＤ中の細胞が病んだ血漿への曝露にもかかわらずどのくらいよく生存したかを評価する測定基準を提供した。
【０１４２】
複数のチャンバ（１０）がある体外ＬＡＤ（６００）は、「血漿貯留部」（３００）と表記されるユニットを介して相互接続する２つの回路、「デバイス回路」（６１０）と「血漿リターン回路」（６２０）より構成された。「血漿貯留部」は、国際公開第ＷＯ００／７８９３２に貯留部として記載された組立体に基づく、ポリカーボネートの組立体であり、対象物からの血漿の受入れ、培地灌流用のマニホルド（６１３）及び（６１４）を介した「デバイス回路」へとそれからの血漿のフロー、血漿を対象物へ戻すリターン、及び気圧の堆積を防ぐために血漿貯留部を排気することのための関連取付部品を有した。実施例１、２、３、又は４においてこれまで記載しなかった部品はすべてγ放射線か又は蒸気オートクレーブのいずれかにより滅菌した。以下に記載の管系のそれぞれの切片は、他に明記しなければ、有刺オス型ルアーロック取付部品（５５０）をそれぞれの端に有した。
【０１４３】
「デバイス回路」（６１０）は、２セットのデバイス入口及び出口マニホルド（６１１）及び（６１２）、チャンバへつながって出る関連の管系及び取付部品の付いた多岐配置チャンバ（１０）、関連の管系及び取付部品の付いた培地灌流用マニホルド（６１３）及び（６１４）、プレ及びポスト灌流用の培地の貯留部（８００）、病的血漿の処置の後で細胞を濯ぐための貯留部（８１０）、及び老廃物貯留部（８２０）を含んだ。平行に一緒に多岐配置した、その灌流配置にある５つの細胞接種済みチャンバの２つのセットを以下のように組み立てた。それぞれのチャンバの入口（９０）を、Ｗａｔｓｏｎ  Ｍａｒｌｏｗ  Ｔｕｂｉｎｇ（６５０）（ワトソン・マーロウ社、ウィルミントン）、ＤＥ（それぞれの端で関連取付部品（５５０）及び（８４０）とともに）、タイゴン（登録商標）ＬＦＬ  ＵＳ（登録商標）１４  マスタフレックス（登録商標）管系（６３０）の連続切片により、チャンバ（１セットの四方向弁（５６０）を連続して接続して形成した）の入口マニホルド（６１１）へ接続した。それぞれのチャンバの出口ポート（１００）を、第二セットのタイゴン（登録商標）ＬＦＬ  ＵＳ（登録商標）１４  マスタフレックス（登録商標）管系（６３０）の切片により、チャンバ（第二セットの四方向弁（５６０）を連続して接続して形成した）の出口マニホルド（６１２）へ接続した。
【０１４４】
デバイス回路（６１０）の残りを以下のように形成した。２セットのチャンバの入口及び出口マニホルド（６１１）及び（６１２）を、タイゴン（登録商標）Ｌ／Ｓ（登録商標）２５  マスタフレックス（登録商標）管系（５８０）の切片により培地灌流用の入口及び出口マニホルド（６１３）及び（６１４）へそれぞれ接続した。この後者のマニホルドは、それぞれ３方向弁（５６０）を含んだ。培地灌流用入口マニホルド（６１３）上の１つの弁（５６０）を、タイゴン（登録商標）ＬＦＬ  Ｌ／Ｓ（登録商標）２５  マスタフレックス（登録商標）管系（５８０）の切片により、「血漿貯留部」（３００）上の取付部品（３０１）へ接続し、培地灌流用入口マニホルド上の第二弁（５６０）を、タイゴン（登録商標）ＬＦＬ  Ｌ／Ｓ（登録商標）２５  マスタフレックス（登録商標）管系（５８０）の切片により、培地灌流用の貯留部入口（８１０）へ接続し、そして培地灌流用入口マニホルド上の第三弁（５６０）を、濯ぎ貯留部（８１０）入口とプライミング・貯留部（８３０）（関連の空気フィルター（４９０）の付いた使い捨て１２５ｍＬ量Ｎａｌｇｅｎｅボトル）入口へ接続した。培地灌流用出口マニホルド（６１３）上の１つの弁（５６０）を、タイゴン（登録商標）ＬＦＬ  ＵＳ（登録商標）２５  マスタフレックス（登録商標）管系（５８０）の切片により、「血漿貯留部」（３００）上の取付部品（３０２）へ接続し、培地灌流用出口マニホルド上の第二弁（５６０）を、タイゴン（登録商標）ＬＦＬ  ＵＳ（登録商標）２５  マスタフレックス（登録商標）管系（５８０）の切片により、培地灌流用の貯留部出口（８１０）へ接続し、そして培地灌流用出口マニホルド上の第三弁（５６０）を老廃物貯留部（８１０）出口へ接続した。「デバイス回路」（６１０）を、実施例４に記載のように１８時間プレ灌流した。次いで、「デバイス回路」を１Ｌの基本培養基で濯ぎ、その間に、チャンバの内容物を老廃物貯留部（８２０）へ流した。次いで、この組立体を、肝不全のブタを処置するための手術室へ移した。
【０１４５】
体外灌流回路（６００）により、対象物治療配置にあるデバイスをアフェレーシスユニット（２８０）へ接続した。アフェレーシスユニット(apheresis unit)の出口を、対象物への接続に先立って、「血漿貯留部」（３００）へ無菌的に接続した。実施のシステムは、１２５ｍＬ量の遠心分離ボウルの使用に基づいた。
【０１４６】
術後に血圧が安定したらすぐに、アフェレーシスを開始した。健全な血漿での血液希釈を最小化するために、「血漿貯留部」を培地で満たし、この培地の１００ｍＬを、アフェレーシスの開始に先立って対象物へ戻した。対象物の左大腿動脈に埋めたカニューレ(cannule)より「ドロー／リターン」ラインを通るアフェレーシスユニット（２８０）により全血を吸引し、血液を血漿と濃縮血（血球と残存量の血漿の混合物）へ分離させた。ドロー速度は、２０〜８０ｍｌ／分に調整可能であった。治療効果を最適にするには、対象物の生理学的状態によって制約されるこの速度を最大化することが望まれた。濃縮血は、「ドロー／リターン」ラインより２０〜６０ｍＬ／分で対象物へ戻した。この速度は、埋め込んだカニューレの口径により制約された。生理食塩水中４０Ｕ／ｍＬのヘパリンの溶液を、抗凝固薬として、アフェレーシスユニットにより１ｍＬ〜１５ｍＬの吸引血液の速度で投与した。血漿をアフェレーシスユニットにより「血漿貯留部」へポンプ注入し、アフェレーシスユニットからのラインにある弁より「血漿貯留部」へサンプリングした。
【０１４７】
「血漿貯留部」より、血漿は、デバイスを通って送られて、対象物へ戻った。血漿は、「血漿リターン回路」（６２０）を介して対象物へ戻った。この回路は、ポンプ（２７４）、ラドノチ（Ｒａｄｎｏｔｉ）水ジャケット気泡トラップ（６７０）へ接続した管系の切片、及び、対象物の左大腿静脈へ埋めたカニューレより構成された。この血漿に生理食塩水（７９０）と生理食塩水中の５％デキストロース溶液（７８０）を、単一チャネルデジタルポンプ（２５８）及び（２８６）によりそれぞれ供給して、補充した。これらのポンプの使用は、体外治療に必要な血管アクセスを利用しながら、生理食塩水及びデキストロースのＩＶ点滴による注入よりも大きな制御及び信頼性をもたらした。生理食塩水は２ｍＬ／分の速度で、デキストロースは０．３０ｍＬ／分−ｋｇ体重（肝不全前）と０．１ｍＬ／分−ｋｇ体重（肝不全時）の速度で注入した。
【０１４８】
アフェレーシスユニット（２８０）からの血漿が「血漿貯留部」（３００）に入り、対象物へのリターンから独立して、デバイスマニホルド（６１１）及び（６１２）を通して循環する、再循環ループの「デバイス回路」（６１０）において、チャンバ（１０）を通る灌流により血漿を処置した。「デバイス回路」は、「血漿貯留部」を介して「血漿リターン回路」（６２０）と相互接続した。この貯留部中の血漿は、空気中１０％  ＣＯ2の混合物を供給するインキュベーター（２９０）に収容する１以上のチャンバのセットを通して連続的に再循環させた。それぞれの個別チャンバを通る灌流の体積流量は、以下の実施例７に記載の生体外機能のスケーリングを最適化するために使用する流速に基づいて、１０ｍＬ／分とした。Ｗａｔｓｏｎ−Ｍａｒｌｏｗ  １６チャネルポンプを使用して個別の管系をそれぞれのチャンバへ１０ｍＬ／分でポンプ注入することによって、血漿を「血漿貯留部」から「デバイス回路」を通して連続的に再循環した。単一チャネルデジタルポンプを使用して血漿を可変速度で「血漿貯留部」よりポンプ注入し、対象物へ戻した。可変速度は、サイクルあたりの血漿収量と全体サイクル時間に基づいて決定した。この処置法により、それぞれのドローサイクルからの血漿が対象物へ戻る前に「デバイス回路」を通して多数の通路をとることを可能にした。
【０１４９】
このＬＡＤ（６００）は、血漿貯留部（３００）の前と後に位置するシリンジで半時間ごとに血漿試料を採取して連続的に運転した。アフェレーシスの開始から６時間の処置時間の後で、培地灌流用入口及び出口マニホルド（６１３）及び（６１４）中の４方向弁（５６０）をその「ｆ」ポジションへ回すことによって、「デバイス回路」（６１０）を「血漿リターン回路」（６２０）より外した。アフェレーシスをさらに２時間の間継続し、サンプリングを続けて、肝細胞接種デバイスカートリッジでの処置の効果を評価した。対象物を屠殺して、放血させた。培地灌流用入口及び出口マニホルド（６１３）及び（６１４）の弁（５６０）の位置を変えることによって「デバイス回路」に流し、１Ｌの濯ぎ培地が濯ぎ貯留部（８１０）よりデバイス回路を通って老廃物貯留部（８２０）へ灌流することを可能にした。血漿をチャンバ（１０）より流した後で、「デバイス回路」をポスト灌流培地で１８時間の間灌流した。１８時間の培地試料を取り、デバイスを解体して、実施例４に記載のように清浄した。
【０１５０】
実施例６．肝細胞機能の評価アッセイ
肝細胞は、同化（例、グルコース及びアルブミンの合成及び分泌）及び異化（例、アンモニア及びタンパク代謝産物を尿素へ代謝することと、相対的に非極性の化合物を相対的により極性の抱合化合物へ変換することによって生体異物を解毒すること）を含む、多種多様な代謝機能を有する。特に、異化により、より有毒ではない、腎臓系（即ち、腎臓と尿）により身体からより容易に清浄される化合物が産生される。我々は、尿素産生（尿素の合成及び分泌）の比率、アンモニアのクリアランス率、モデル生体異物であるジアゼパムの代謝率、ジアゼパムの代謝物の抱合の程度、及び、グルコースの培養基への分泌率として代謝の機能を評価した。これらの特性における増加は、細胞の増加した機能を反映する。乳酸産生（乳酸塩の合成及び分泌）の比率と、細胞質の酵素、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）（ピルビン酸塩の乳酸塩への変換を触媒する）とミトコンドリアの酵素、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）（アスパラギン酸のアミノ基をケトグルタル酸のケト基への変換を触媒する）の培養基における蓄積率によって培養状態を決定した。これらの比率を異なる種類のデバイス間で比較することによって、これらのデバイスにおいて培養される細胞の状態間の比較が可能になる。
【０１５１】
尿素産生は、基本培養基で１８時間灌流、又は１０ｍＭの外因性ＮＨ4Ｃｌを補充した基本培養基で２４時間灌流のいずれか一方のデバイスにおける肝細胞の培養物について測定した。それぞれのデバイスからの肝細胞処置培地の２０μＬ量の試料を、脱イオン蒸留水中の１１１ｇ／Ｌ  Ｈ3ＰＯ4，３．３３Ｎ  Ｈ2ＳＯ4，６６．７ｍｇ／Ｌ  ＦｅＣｌ3，１．６７ｇ／Ｌ  ジアセチルモノオキシム、及び１３．３ｍｇ／Ｌ  チオセミカルバゾンの０．５ｍｌと９６微小管クラスタープレート（シグマ、＃０７−２００−３１９）の個々の微小管において混合してから、１００℃で５分間インキュベートした。それぞれの微小管からの２００μＬ量（同一３検体）の吸光度を、９６ウェルプレートの個別ウェルにおいて、スペクトラマックス（登録商標）２５０マイクロプレートリーダー（モレキュラー・デバイス、サニーヴェイル、カリフォルニア州）で測定した。次いで、５４０及び６９０ｎｍでの吸光度における差と１〜１００μｇ／ｍＬでの標準曲線に基づいて、濃度を決定した。尿素産生率は、１日につき接種された灌流細胞につき産生された尿素の量に灌流液の容量濃度を掛け、接種した細胞の数で割ったものとして表した。このアッセイにおいて、高率の尿素生成は、臨床的に望まれる標的機能である、脱アミノ作用とアンモニアのクリアランスの予測される高レベルに対応する。尿素産生率が高いほど、予測される脱アミノ作用のレベルが大きい。
【０１５２】
ジアゼパムの代謝は、１０ｍｇ／ｍＬでＤＭＳＯに可溶化したこの薬物（Ｄ−８９９；シグマケミカル、セントルイス、ミズーリ州）の２５μｇ／ｍＬと１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補充した基本培養基で２４時間灌流した装置における肝細胞の培養物について測定した。ジアゼパムは、ベンゾジアゼピン、Ｖａｒｉｕｍの一般名である。相対的に非極性の分子として、ジアゼパムは、より極性の分子に至る２つの変換相の後で腎臓系によってより効果的に排出される。脱アルキル化とヒドロキシル化は、シトクロムＰ４５０混合機能モノオキシゲナーゼのファミリーのアイソザイムにより触媒される第Ｉ相プロセスであり；例えば、２Ｃ１９アイソザイムは、ジアゼパムをノルジアゼパムへ、又はテマゼラムをオキサデパムへ脱アルキル化し、３Ａ４アイソザイムは、ジアゼパムをテマゼパムへ、又はノルジアゼパムをオキサゼパムへヒドロキシル化する。抱合は、炭水化物又は硫酸塩の脂肪親和体への共有付加をもたらす別の酵素のセットにより仲介されるフェーズＩＩプロセスである。
【０１５３】
ジアゼパムとその非抱合及び抱合代謝物は、逆相ＨＰＬＣを使用して検出して、濃度を測定した。この測定には、ヴィトン（登録商標）より構成される灌流回路中の管系の使用を必要とし、これは、ＢＳＡと一緒に、ジアゼパムとその代謝物の非特異吸着を最少化し、実質的に１００％の回収を可能にした。はじめに、肝細胞処置培地の試料を、３７℃で３時間、１００μｇグルコニダーゼ／スルファターゼ（Ｓ−９７５１，シグマ）で処理した。この処理により、第ＩＩ相の解毒化の間にグルクロン酸化又は硫酸化した代謝物の検出が可能になった。次いで、４００μＬの肝細胞処置培地と４００μＬのグルクロニダーゼ処理、肝細胞処置培地を、１．５ｍＬ遠心分離管中の６００μＬのメタノールへ別々に加え、混合し、４℃で３０分間、７２００ｘｇで回転させた。次いで、遠心分離した試料をオートサンプラーのバイアルへ入れて、個々の試料をＣ１８カラム（μＢｏｎｄａｐａｋ，３．９ｘ３００ｍｍ；ウォーターズ社、ミルフォード、マサチューセッツ州）にロードした。６０％メタノール及び４０％  ０．０３Ｍリン酸カリウム（ｐＨ４．５）の移動相において１．５ｍＬ／分の流速でジアゼパムとその代謝物を溶出させることによって、逆相ＨＰＬＣを実施した。Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＢｅｃｋｍａｎのＨＰＬＣシステム（システムゴールド（登録商標）モデル５０８オートサンプラー、モデル１６８検出器、モデル１２６溶媒モジュール）で２４０ｎｍでの吸光度により溶出を測定した。試料は、システムゴールド（登録商標）３２  カラット（商標）  ソフトウェアで分析した。４０％培地及び６０％メタノールにおいて調製して、細胞処置培地の試料と同様に取扱った標準試料（シグマ）を使用して、ジアゼパムと各代謝物の標準曲線を作成した。標準曲線は、２〜７４μｇ／ｍＬに及び、定量の下方限界は４μｇ／ｍＬであった。メタノールを使用する抽出の回収は平均８２％で、変動係数は２０％未満であった。全体的に、この方法は、既存の方法に比較して優れた回収をもたらした。
【０１５４】
ジアゼパムの代謝率は、１日につき接種された灌流細胞につき産生された代謝物の全量に灌流液の容量濃度を掛け、接種した細胞の数で割ったものとして表した。抱合の程度は、代謝物の全体濃度に対する抱合化合物の全体濃度の比として表した。このアッセイにおいて、高率の代謝物の生成は、第Ｉ相アイソザイムの高い活性を反映し、高い程度の抱合は、第ＩＩ相酵素の高い活性を反映する。
【０１５５】
乳酸産生は、シグマキット＃７３５１０（セントルイス、ミズーリ州）を使用して、基本培養基とともに１８又は２４時間の間灌流したデバイス中の肝細胞の培養物について測定した。このキットは、乳酸塩をピルビン酸塩及びＨ2Ｏ2へ変換するオキシダーゼと過酸化物の存在下に発色産物の産生を触媒するペルオキシダーゼの両方がある試薬を含有する。各デバイスからの１０μＬ試料の同一３検体を９６ウェルマイクロプレートの個別ウェルにおいて１００μＬのキット試薬とともに１０分間インキュベートした。次いで、５４０ｎｍでの吸光度をスペクトラマックス（登録商標）２５０マイクロプレートリーダーで測定した。０．０５〜５ｍＭの標準曲線に基づいて濃度を決定した。乳酸産生率は、１日につき接種された灌流細胞につき産生された乳酸塩の量に灌流液の容量濃度を掛け、接種した細胞の数で割ったものとして表した。このアッセイにおいて、乳酸塩の同様の生成率は、同様の生理学的状態にある培養物に対応する。
【０１５６】
基本培養基で灌流したデバイスにおける肝細胞の培養物からの培地中のＬＤＨ及びＡＳＴの濃度とブタ血漿で灌流した培養物からのアンモニア及びグルコースの濃度を、Ｖｉｔｒｏｓｏ  ＤＴ６０ＩＩ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（オルト−クリニカル・ジアグノスティクス、ラリタン、ニュージャージー州）を使用して、１０μＬ試料より測定した。ＬＤＨ及びＡＳＴの蓄積率は、１日につき接種された灌流細胞につき放出されたＬＤＨ及びＡＳＴの量に灌流液の容量濃度を掛け、接種した細胞の数で割ったものとして表した。ＬＤＨ若しくはＡＳＴの培地における同様の蓄積率は、同様の細胞死の程度にある培養物に対応する。グルコースの分泌率は、１日につき接種された灌流細胞につき分泌されたグルコースの量に灌流液の容量濃度を掛け、接種した細胞の数で割ったものとして表した。肝細胞による処置の後での血漿におけるアンモニア濃度の減少と培地及び血漿におけるグルコース濃度の増加（「糖新生」と呼ばれる）は、これらの細胞の臨床的に意義のある機能性の増加を反映する。
【０１５７】
実施例７：既報の細胞培養チャンバと新規の可変容量細胞培養閉鎖型チャンバの間での性能の比較
実施例３の装置で灌流した肝細胞の機能を、国際公開第ＷＯ００／７８９３２に記載の２つのより小さなシステムにおいて培養した肝細胞の機能と比較した。以下、「小」、「中」、及び「大」デバイスと呼ぶ、これらのシステムのそれぞれにおいて、肝細胞を気体透過性、液体不透過性のポリスチレンフィルム（Ｐｏｌｙｆｌｅｘ）上に類似の密度でロードし、ロードした細胞につき等量の培地で静的に１日間培養し、ロードした細胞につき等量の培地で、そして等しいせん断応力（チャンバの高さ及び幅と灌流液の流速に基づいて算出した）の完全再循環において１日間灌流した。
【０１５８】
「小」及び「中」デバイスは、ピペット先端より培養面へ懸濁液を垂直に滴下することによって細胞を接種し、取り外し可能でゆるいカバーをかけて静的に培養し、細胞を接種する培地は、カバーを完全に外した後で吸引により除去し、引き続き、キャップと管系を設置して灌流用の閉鎖型チャンバを創出する、細胞培養チャンバであった。上記の操作は、静的培養を例外として、滅菌処理のための無菌環境を提供するＢＳＣの内部で実施した。比較すると、「大」デバイスは、可変容量閉鎖型チャンバという本発明の特性を特徴とし、特に、閉鎖型チャンバ中への灌流により接種し、チャンバの壁を損なわずに細胞を接種するための培地を吸引し、そして、無菌性を損なわずにチャンバの容量を減らすことによって灌流用の閉鎖型チャンバを創出した。上記の試験では、配管溶接機を使用せずに無菌の接続部をつくったが、吸引の操作と管系の閉鎖型チャンバへの接続だけは、ＢＳＣの使用を必要とした。
【０１５９】
単一培養チャンバからなる「小」、「中」、及び「大」デバイスのサイズと作動特性を表１に記載する。「小」及び「中」デバイスのシステムは、実施例３の装置のサイズのそれぞれ１／４０と１／８であるが、「小」及び「中」デバイスの灌流の間のチャンバそれ自体の容量は、実施例２の装置の容量のほぼ１／１６及び１／１２であり、灌流の体積流量は、異なるサイズ間で異なる。しかしながら、反応器設計の原理に基づいた細胞培養物の機能のスケーリングには、培養する細胞の密度、灌流する培地の細胞あたりの量、そして経験される機械的な力（即ち、水力学的せん断応力）を異なるサイズのシステム間で適合させることが必要とされ、チャンバの容量や流速そのものを適合させることは必要とされない。培養物の機能及び状態は、培養物中の細胞の密度と、培養物中の化合物の枯渇及び蓄積に依存し、これが培養物の機能及び状態に影響を及ぼし、細胞あたりに利用可能な培地の量に依存する。最後に、培養物の機能及び状態は、せん断応力により影響される場合がある。従って、尿素産生、ジアゼパムの代謝、糖新生、乳酸産生、並びにＬＤＨ及びＡＳＴの放出の細胞あたりの比率は、等しい密度で接種されて、細胞あたり等しい量の培地が供給される異なるサイズのデバイスで変動することはない。表２は、そのような適合が我々のシステムの間で達成されたことを示す。
【０１６０】
【表１】
2005514058.tif 000002
【０１６１】
【表２】
2005514058.tif 000003
【０１６２】
３つの異なるサイズのデバイス間のスケーリングに好ましい操作条件を確立した後で、我々は、これらのデバイスにおいて培養される肝細胞の代謝機能と培養状態を評価し、細胞あたりのベースで機能及び特性を比較した。尿素産生、ジアゼパムの代謝、糖新生、乳酸新生、並びにＬＤＨ及びＡＳＴの放出を実施例６に記載のように決定した。培養物を２４時間灌流した試験では、実施例４に記載のように、単一チャンバ（１０）からなる大きなデバイスを使用したが、培養物を１８時間灌流した試験では、実施例５に記載のように、平行に多岐配置した１０個の個別チャンバ（１０）からなる大きなデバイスを使用した。
【０１６３】
表３は、アンモニア及びジアゼパムをチャレンジした基本培養基で２４時間灌流したデバイスについて、尿素産生とジアゼパムの代謝という最も重要な肝細胞特異的な特性が３つの異なるサイズの間で細胞あたりのベースで同様であったことを示す。さらに、乳酸塩及びＬＤＨの培地における蓄積は、細胞あたりのベースで、より小さなデバイスよりも可変容量閉鎖型チャンバ（１０）においてより少なかった。生体外尿素産生は生体内尿素産生及び脱アミノ作用と相関し、減少したＬＤＨの放出は、より健全な肝細胞を反映すると期待される。減少した生体外乳酸産生は、肝不全の下でのアシドーシスの減少に相関するはずである。上記の結果は、接種から灌流の配置への変換に追加の操作を必要とする装置において培養される細胞に比較して、いくつかの肝細胞機能の支援における改善を伴う、本新規発明における生体外機能のスケーリングを支持する。
【０１６４】
【表３】
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【０１６５】
表４は、上記に参照される、非チャレンジの基本培養基で１８時間灌流した個別の小スケールデバイスと、一緒に平行に多岐配置された灌流配置において実施例５に記載のように灌流した１０個の閉鎖型チャンバ（１０）のセットとの間で、細胞あたりのベースで、尿素産生が同様であったことを示す。さらに、乳酸産生と酵素ＬＤＨ及びＡＳＴの灌流液への放出の細胞あたりの比率も、２つのスケールのシステム間で同様であった。上記の試験で、我々はまた、実施例２に記載のようにコラーゲンコーティングを使用することの、そのシステムの生じる性能に及ぼす影響を検査した。コラーゲンでコートしたチャンバとコートしなかったチャンバの間に大きな差は観察されなかった。さらに、上記の結果は、本システムにおけるチャンバの数のスケーリング、モジュラー性の概念を支持すること、及びフィルム（３２０）をコラーゲンでプレコートすることに細胞機能が影響を受けないことだけでなく、本新規発明における生体外機能のスケーリングを支持する。
【０１６６】
【表４】
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【０１６７】
実施例８：可変容量細胞培養閉鎖型チャンバでの血漿の処理
実施例４の装置を１００％  ＨＳで３時間灌流し、アンモニアのクリアランスと糖新生を実施例６に記載のように検査した。アンモニアの濃度が最初の５６４μＭから６時間にわたり４６８±２８μＭへ低下する一方、グルコースの濃度は５３ｍｇ／ｄＬから５６±０ｍｇ／ｄＬへ増加した。上記の結果は、可変容量閉鎖型チャンバにおいて培養される肝細胞（１３０）の、動物の血漿を処理する能力を例証する。
【０１６８】
実施例９：可変容量閉鎖型チャンバとガスケットに対する規定最小荷重の維持−組立て、細胞の接種、容量の低下、及び灌流
容量を低下させるプロセスの間の処理時間を減らし、この容量低下プロセスを通してガスケット圧縮に十分な力を連続的に提供するためのバネ付勢されたボルトを使用してチャンバの設計を改善するために、実施例２及び３に記載の装置の改良品を開発した。容量を接種配置に設定するには、長さ２０  ５／１６インチ〜１８  １／２インチの１８−８ステンレススチールの六角キャップネジ（２２０）（以下、「スタンドオフボルト」と呼ぶ）を一定の長さへ機械加工して、上板（３０）へ締め付け、実施例１に従って製造したフィルム−フレーム組立体（３３０）の底まで降下したときに深さ約０．１５２ｃｍ（０．０６０インチ）となる区画室（２０）を創出した。この板の長軸に沿ったそれぞれの端より約２．０９６ｃｍ（０．８２５インチ）にある直径約１５．８８ｃｍ（６．２５インチ）の穴（２２１）の２セットとこの板の短軸に沿った端より約０．８６４ｃｍ（０．３４インチ）にある直径約１０．８０ｃｍ（４．２５インチ）の穴（２２１）の２セットに５／１６インチの１８のネジ山を通して、スタンドオフボルト（２２０）の締め付けを可能にした。
【０１６９】
長さ約８１．９２ｃｍ（３２と１／４インチ）〜約７３．０３ｃｍ（２８と３／４インチ）の１８−８ステンレススチールの六角キャップネジ（２３０）を使用して、上板（３０）とフィルム−フレーム組立体（３３０）を組み立てた。このネジは、板を通過するとき、直径約０．６３５ｃｍ（１／４インチ）の２つの１８−８ステンレススチールワッシャー（１９０）の間に挟まり、ナット（２１０）で固定されたバネ（２００）（バネ定数：１１９．７ｌｂｆ／ｉｎ）がそれぞれロードされた。ガスケット（５０）を均一に圧縮して液漏れしないシールを確実にするのに必要とされる力の量は、バネ高さが約１．９０５ｃｍ（０．７５インチ）の自由な高さから約１．３８４ｃｍ（０．５４５インチ）の圧縮高さへ変化するようにナットを締めることによって供給された。あるいは、チャンバ（１０）を実施例３に記載のように組み立てて接種し、スタンドオフボルト（２２０）を外部シム（６０）で、そしてバネ付勢されたネジ（２７０）をＳｏｕｔｈｃｏ（登録商標）留め具で代用した。スタンドオフボルトとバネ付勢されたネジがパターンを交替することで、ガスケットを均一に圧縮するのに必要とされる力の量と、最小の板の曲がりを伴って区画室（２０）に均一な容量を創出するのに必要とされるスタンドオフボルトの数をもたらした。
【０１７０】
チャンバ（１０）をその灌流配置へ再配置するには、接種配置にあるバネ付勢されたボルトの付いた細胞接種チャンバを、実施例４に記載の灌流用回路へ接続した。六角ヘッドレンチを使用してスタンドオフボルト（２２０）を１／４回転緩め、その「スタンドオフ」特性を組立体から除去した。バネ（２００）がガスケット（５０）を圧縮し続けたとき、上板（３０）とフィルム−フレーム組立体（３３０）は、実施例２にすでに記載のように、実質的に非圧縮性の約０．１２７ｍｍ（０．００５インチ）内部シム（１８０）上にゆっくりと降下して、区画室の容量を低下させ、チャンバ内の流体を灌流入口及び出口マニホルドを通して外に出した。次いで、実施例４に記載のように、チャンバを灌流した。
【０１７１】
他の態様
本発明をその詳しい説明とともに記載したが、上記の記載は本発明を例示するものであって、付帯の特許請求の範囲により規定されるその範囲を制限することを企図しないことを理解されたい。他の側面、利点、及び修飾は、以下の特許請求項の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【０１７２】
【図１】図１ａ及び１ｂは、圧縮可能ガスケットでシールされ、実質的に非圧縮性のシムの交換により相対的に高い容量の配置（１ａ）から相対的に低い容量の配置（１ｂ）へ変換される、細胞培養及び臓器補助のための可変容量閉鎖型チャンバの概略図である。
【図２】図２は、ひずみに相関する応力のグラフの形態にある、本発明のガスケットに所望される機械特性の設計曲線である。
【図３】図３ａ及び３ｂは、可逆的に膨張可能なガスケットでシールされ、相対的に高い容量の配置（３ａ）から相対的に低い容量の配置（３ｂ）へ変換される、細胞培養閉鎖型チャンバの１つの態様の概略図である。
【図４】図４ａ及び４ｂは、バネを使用して最少の応力をシールへかける間の、固定した長さの分布した実質的に非圧縮性のボルトの除去により、相対的に高い容量の配置（４ａ）から相対的に低い容量の配置（４ｂ）へ変換される、細胞培養閉鎖型チャンバの概略図である。
【図５】図５は、フィルムと裏当ての間の熱膨張係数の差に基づいて、フィルムを裏当て上で引っ張る方法の概略である。
【図６】図６ａ及び６ｂは、相対的に高い容量の細胞区画室（６ａ）が相対的に低い容量の細胞区画室（６ｂ）へ変換される細胞区画室から灌流区画室を分離する液体透過膜を含む、細胞培養閉鎖型チャンバの１つの態様の概略図である。
【図７】図７ａ及び７ｂは、臓器不全の患者をチャンバ中の細胞で治療する臓器補助システムの一部として、複数の可変容量細胞接種閉鎖型チャンバを使用する２つの態様の概略図である。図７ａは、チャンバを通る流速が患者からか又は患者への血液若しくは血漿の流速から独立しているシステムの概略図である。図７ｂは、チャンバを通る流速が患者からか又は患者への血液若しくは血漿の流速に依存するシステムの概略図である。
【図８】図８は、気体透過性、液体不透過性のフィルムが細胞培養閉鎖型チャンバの内部に面する側へ付く、複数の穴のあるフレームの概略図である。
【図９】図９ａ、９ｂ、及び９ｃは、実質的に非圧縮性のシムの交換によって容量を調整する細胞培養閉鎖型チャンバの透視図の概略図である。図９ａは、その部品を示す、非組み立てチャンバの各部分の概略図である（上下逆に見る）。図９ｂは、組み立てられたチャンバの概略図であり（上下逆に見る）、図９ｃは、組み立てられたチャンバの概略図である（右側を上に見る）。
【図１０】図１０は、貯留部からの灌流により閉鎖型チャンバに細胞を接種するための閉鎖系の概略図である。
【図１１】図１１は、複数の可変容量細胞接種閉鎖型チャンバを臓器不全の患者と相互接続させるための体外システムの１つの態様の概略図である。
【図１２】図１２ａ、１２ｂ、及び１２ｃは、バネを使用して最少の応力をシールへかける間の、固定した長さの分布した実質的に非圧縮性のボルトの除去により容量を調整する、細胞培養閉鎖型チャンバの透視図の概略図である。図１２ａは、その部品を示す、非組み立てチャンバの各部分の概略図であり、図１２ｂは、細胞を接種するために拡大量を有する配置にある、組み立てられたチャンバの概略図であり、図１２ｃは、灌流のために低下した容量を有する配置にある、組み立てられたチャンバの概略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【国際調査報告】
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