(57)【要約】本発明は新たに同定したポリペプチドおよび呼吸器ケモカイン・レセプター・ポリペプチドとポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、それらの診断における使用および治療に有用な可能性のあるアゴニストおよびアンタゴニストとなり得る化合物の同定における使用、ならびにＧタンパク質−共役レセプターの分類に属するかかるポリペプチドおよびポリヌクレオチドの製造に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記ポリペプチド群のいずれか一つから選択される単離ポリペプチド：
（ａ）配列番号１または配列番号５の配列を含んでなるポリヌクレオチドがコードする単離ポリペプチド；
（ｂ）配列番号２または配列番号６のポリペプチド配列に少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド配列を含んでなる単離ポリペプチド；
（ｃ）配列番号２または配列番号６のポリペプチド配列に少なくとも９５％の同一性を有する単離ポリペプチド；および
（ｄ）配列番号２または配列番号６のポリペプチド配列；および
（ｅ）（ａ）ないし（ｄ）に記載のポリペプチドのフラグメントおよび変異体。
【請求項２】
配列番号２または配列番号６のポリペプチド配列を含んでなる請求項１記載の単離ポリペプチド。
【請求項３】
下記ポリヌクレオチド群のいずれか一つから選択される単離ポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１または配列番号５のポリヌクレオチド配列に少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含んでなる単離ポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１または配列番号５のポリヌクレオチドに少なくとも９５％の同一性を有する単離ポリヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号２または配列番号６のポリペプチド配列に少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる単離ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２または配列番号６のポリペプチド配列に少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を有する単離ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１または配列番号５の配列またはその少なくとも１５ヌクレオチドからなるフラグメントの配列を有する標識化プローブによりストリンジェントハイブリダイゼーション条件下にライブラリーをスクリーニングすることにより得た少なくとも１００ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）ないし（ｅ）に記載のポリヌクレオチドのＲＮＡ等価物であるポリヌクレオチド；または、その全長にわたって、上記ポリヌクレオチドの変異体およびフラグメントである当該単離ポリヌクレオチド(複数も可)に相補的なポリヌクレオチド配列、または上記ポリヌクレオチドに相補性である当該単離ポリヌクレオチド(複数も可)に相補性であるポリヌクレオチド配列。
【請求項４】
以下のポリヌクレオチドからなる群より選択される請求項３記載の単離ポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１または配列番号５のポリヌクレオチドを含んでなる単離ポリヌクレオチド：
（ｂ）配列番号１または配列番号５の単離ポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２または配列番号６のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる単離ポリヌクレオチド；および
（ｄ）配列番号２または配列番号６のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項５】
発現ベクターが適合宿主細胞に存在する、請求項１記載のポリペプチドを産生することの可能なポリヌクレオチドを含んでなる発現システム。
【請求項６】
請求項５記載の発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞または請求項１記載のポリペプチドを発現するその膜。
【請求項７】
請求項１記載のポリペプチドの製造方法であって、当該ポリペプチドの産生に十分な条件下で、請求項６に定義した宿主細胞を培養し、培地から該ポリペプチドを回収する工程を含んでなることを特徴とする製造法。
【請求項８】
免疫グロブリンＦｃ領域および請求項１記載のいずれか１つのポリペプチドからなる融合タンパク質。
【請求項９】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載のポリペプチドに対する免疫特異的抗体。
【請求項１０】
請求項１記載のポリペプチドの機能またはレベルを促進または阻害する化合物を同定するスクリーニング方法であって、
（ａ）該ポリペプチド（または該ポリペプチドを発現する細胞または膜）またはその融合タンパク質に対する候補化合物の結合を、該候補化合物と直接的または間接的に会合した標識により、定量的または定性的に測定または検出すること；
（ｂ）標識競合体の存在下に、該ポリペプチド（または該ポリペプチドを発現する細胞または膜）またはその融合タンパク質に対する候補化合物の結合の競合を測定すること；
（ｃ）該ポリペプチドを発現する細胞または細胞膜に適切な検出システムを用いて、候補化合物が該ポリペプチドの活性化または阻害によりシグナルを生じるか否かをテストすること；
（ｄ）請求項１記載のポリペプチドを含有する溶液と候補化合物とを混合して混合物を形成し、その混合物中のポリペプチド活性を測定し、該混合物の活性を、候補化合物を含有しない対照混合物と比較すること；または
（ｅ）当該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの産生または細胞中当該ポリペプチドの産生に対する候補化合物の影響を、例えば、ＥＬＩＳＡ検定法により検出すること；および
（ｆ）当該化合物を生物工学的または化学的標準技法にしたがって生産すること；
からなる群より選択される方法を含んでなるスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新たに同定したポリペプチドおよびかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、診断におけるそれらの使用および治療に有用な可能性のあるアゴニスト、アンタゴニストとなり得る化合物の同定におけるそれらの使用、ならびにＧタンパク質−共役レセプターの分類に属するかかるポリペプチドおよびポリヌクレオチドの製造に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品の発見過程は、“ファンクショナル・ゲノミクス”、すなわち、高処理能力ゲノムまたは遺伝子に基づく生物学を取り入れるようになって、現在、基本的な大変革を受けつつある。治療標的として遺伝子および遺伝子産物を同定する手段としてのこの方法は、“ポジショナルクローニング”に基づく初期の方法に急速に取り替わりつつある。表現型、すなわち生物機能または遺伝子疾患が同定されるようになり、それが遺伝子マップの位置に基づき原因となる遺伝子の究明につながるようになっている。
【０００３】
ファンクショナル・ゲノミクスは、高処理能力ＤＮＡ配列決定技術、および現在利用可能な多くの分子生物学データベースからの潜在的に興味をそそる遺伝子配列を同定するための様々なバイオインフォマティクス手段に大きく依存している。医薬品発見のための標的として、さらに遺伝子およびその関連ポリペプチド／タンパク質を同定し、特性化する必要性が引き続き存在している。
【０００４】
発明の要約
本発明は、特に、呼吸器ケモカイン・レセプター・ポリペプチドおよびポリヌクレオチド、組換え物質、およびそれらの製造方法に関する。かかるポリペプチドおよびポリヌクレオチドは特定の疾患、例えば、これらに限定されるものではないが、喘息、慢性閉塞性肺疾患、気腫、慢性気管支炎、急性呼吸窮迫症候群、咳、および急性気管支炎などの処置方法に関連して興味深いものであり、以下これらの疾患を本明細書では“本発明の疾患”という。さらなる局面において、本発明は本発明が提供する材料によりアゴニストおよびアンタゴニスト（例えば、インヒビター）の同定方法、および単球／マクロファージの移動／活性化、気道再造形、気道線維形成、上皮分化の制御、粘液過剰分泌の制御、ムコ繊毛クリアランスの制御、炎症の制御、好中球の変調、Ｔ細胞と好酸球の移動および／または活性化、および上皮細胞の制御または肥満細胞の活性化と関連する症状を、同定した化合物により処置する方法に関する。なおさらなる局面において、本発明は単球／マクロファージの移動／活性化、気道再造形、気道線維形成、上皮分化の制御、粘液過剰分泌の制御、ムコ繊毛クリアランスの制御、炎症の制御、好中球の変調、Ｔ細胞と好酸球の移動および／または活性化、および上皮細胞の制御または肥満細胞の活性化における不適切な活性／レベルと関連する疾患を検出する診断アッセイ方法に関する。
【０００５】
発明の記載
第一の局面において、本発明は呼吸器ケモカイン・レセプター・ポリペプチドに関する。かかるポリペプチドは以下の（ａ）〜（ｇ）を包含する：
（ａ）配列番号１または配列番号５の配列を含んでなるポリヌクレオチドがコードする単離ポリペプチド；
（ｂ）配列番号２または配列番号６のポリペプチド配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するポリペプチド配列を含んでなる単離ポリペプチド；
（ｃ）配列番号２または配列番号６のポリペプチド配列を含んでなる単離ポリペプチド。
（ｄ）配列番号２または配列番号６のポリペプチド配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する単離ポリペプチド；
（ｅ）配列番号２または配列番号６のポリペプチド配列；および
（ｆ）配列番号２または配列番号６のポリペプチド配列に比較して、０.９５、０.９６、０.９７、０.９８、または０.９９の同一性指標を有するポリペプチド配列を有するか、または含んでなる単離ポリペプチド；
（ｇ）（ａ）ないし（ｆ）に記載のかかるポリペプチドのフラグメントおよび変異体。
【０００６】
本発明のポリペプチドはＧタンパク質共役レセプター系統群ポリペプチドのメンバーであると信じられる。呼吸器ケモカイン・レセプターの生物学的性質は、本明細書において“呼吸器ケモカイン・レセプターの生物学的活性”または“呼吸器ケモカイン・レセプター活性”といい、単球／マクロファージの移動／活性化、気道再造形、気道線維形成、上皮分化の制御、粘液過剰分泌の制御、ムコ繊毛クリアランスの制御、炎症の制御、好中球の変調、Ｔ細胞と好酸球の移動および／または活性化、および上皮細胞の制御または肥満細胞の活性化などを包含する。
【０００７】
本発明のポリペプチドは、また、上記ポリペプチドの変異体を包含し、すべての対立形質型およびスプライス変異体を含む。かかるポリペプチドは、保存的または非保存的であってもよい挿入、欠失、および置換、またはその組合わせにより、対照標準ポリペプチドとは異なる。特に好適な変異体は、そのアミノ酸が数個、例えば、５０ないし３０個、３０ないし２０個、２０ないし１０個、１０ないし５個、５ないし３個、３ないし２個、２ないし１個、または１個、いずれかの組合せで、挿入、置換、または欠失しているものである。
【０００８】
本発明ポリペプチドの好適なフラグメントは、配列番号２または配列番号６のアミノ酸配列から少なくとも３０、５０または１００個の隣接アミノ酸を有するアミノ酸配列を含んでなる単離ポリペプチド、または配列番号２または配列番号６のアミノ酸配列から末端切除したかまたは欠失した少なくとも３０、５０または１００個の隣接アミノ酸を有するアミノ酸配列を含んでなる単離ポリペプチドである。好適なフラグメントは単球／マクロファージの移動／活性化、気道再造形、気道線維形成、上皮分化の制御、粘液過剰分泌の制御、ムコ繊毛クリアランスの制御、炎症の制御、好中球の変調、Ｔ細胞と好酸球の移動および／または活性化、および上皮細胞の制御または肥満細胞の活性化などの生物活性を仲介する生物学的に活性なフラグメントであり、同様の活性または改善された活性を有するフラグメント、または不所望活性の低下したフラグメントを包含する。好適なフラグメントは動物において、とりわけヒトにおいて抗原性または免疫原性のフラグメントである。
【０００９】
本発明ポリペプチドのフラグメントはペプチド合成により対応する全長ポリペプチドの製造に採用し得る；したがって、これらの変異体は本発明の全長ポリペプチドを製造するための中間体として採用し得る。本発明のポリペプチドは“成熟”タンパク質の形状のものでもよいし、または前駆体または融合タンパク質などのより大型のタンパク質の一部であってもよい。多くの場合に有利なのは、分泌もしくはリーダー配列を有する追加のアミノ酸配列、プロ配列、精製目的の配列、例えば、複数のヒスチジン残基、または組換え生産に際しての安定化のための追加の配列などを含むことである。
【００１０】
本発明のポリペプチドは適切な方法、例えば、天然資源から、遺伝子工学により作製した発現システムを含んでなる宿主細胞（下記参照）から単離することにより、または、例えば、自動化ペプチド合成機による化学合成により、またはかかる方法の組合わせにより調製することができる。かかるポリペプチドを調製するための手段は技術上よく理解されている。
【００１１】
さらなる局面において、本発明は呼吸器ケモカイン・レセプター・ポリヌクレオチドに関する。かかるポリヌクレオチドは以下のポリヌクレオチドを包含する：
下記ポリヌクレオチド群のいずれか一つから選択される単離ポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１または配列番号５のポリヌクレオチド配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含んでなる単離ポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１または配列番号５のポリヌクレオチドを含んでなる単離ポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１または配列番号５のポリヌクレオチドに少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する単離ポリヌクレオチド配列；
（ｄ）配列番号１または配列番号５の単離ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２または配列番号６のポリペプチド配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる単離ポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号２または配列番号６のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる単離ポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号２または配列番号６のポリペプチド配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を有する単離ポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号２または配列番号６のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号２または配列番号６のポリヌクレオチド配列に比較して、０.９５、０.９６、０.９７、０.９８、または０.９９の同一性指標を有するポリヌクレオチド配列を有するかまたは含んでなる単離ポリヌクレオチド；配列番号２または配列番号６のポリペプチド配列に比較して、０.９５、０.９６、０.９７、０.９８、または０.９９の同一性指標を有するポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を有するかまたは含んでなる単離ポリヌクレオチド；および上記ポリヌクレオチドのフラグメントおよび変異体であるポリヌクレオチドまたはその全長にわたって上記ポリヌクレオチドに相補性であるポリヌクレオチド。
【００１２】
本発明の好適なポリヌクレオチドフラグメントは、配列番号１または配列番号５の配列からの少なくとも１５、３０、５０または１００個の隣接ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を含んでなる単離ポリヌクレオチド、または配列番号１または配列番号５の配列から末端切除したかまたは欠失した少なくとも３０、５０または１００個の隣接ヌクレオチドを有する配列を含んでなる単離ポリヌクレオチドである。
【００１３】
本発明の好適なポリヌクレオチド変異体は、スプライス変異体、対立形質変異体、および多形性であり、１つ以上の単一ヌクレオチド多形性（ＳＮＰ）を有するポリヌクレオチドを包含する。
【００１４】
また、本発明のポリヌクレオチドは配列番号２または配列番号６のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド変異体をコードするポリヌクレオチドであり、例えば、そのアミノ酸残基が数個、例えば、５０ないし３０個、３０ないし２０個、２０ないし１０個、１０ないし５個、５ないし３個、３ないし２個、２ないし１個、または１個、いずれかの組合せで、置換、欠失または付加しているものである。
【００１５】
さらなる局面において、本発明は本発明ＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物であるポリヌクレオチドを提供する。したがって、以下のＲＮＡポリヌクレオチドが提供される：
（ａ）配列番号２または配列番号６のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物を含んでなるＲＮＡポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２または配列番号６のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物であるＲＮＡポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１または配列番号５のＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物を含んでなるＲＮＡポリヌクレオチド；または
（ｄ）配列番号１または配列番号５のＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物であるＲＮＡポリヌクレオチド；およびこれらに相補性のＲＮＡポリヌクレオチド。
【００１６】
配列番号１のポリヌクレオチド配列は、配列番号２のポリペプチドをコードするｃＤＮＡ配列である。配列番号５のポリヌクレオチド配列は、配列番号６のポリペプチドをコードするｃＤＮＡ配列である。配列番号２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１のポリペプチドエンコード配列に一致し得るか、あるいは配列番号１以外の配列であってもよく、その場合、遺伝子コードの縮退（縮重）の結果として、配列番号２のポリペプチドをもコードする。配列番号６のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号５のポリペプチドエンコード配列に一致し得るか、あるいは配列番号５以外の配列であってもよくその場合、遺伝子コードの縮退（縮重）の結果として、配列番号６のポリペプチドをもコードする。配列番号２または配列番号６のポリペプチドは、ＧＰＣＲ−ＬＹＭＳＴと相同性および／または構造類似性を有するＧタンパク質−共役レセプターの他のタンパク質に関連がある（Jensen, C.P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:4816-4820, 1994）。
【００１７】
本発明の好適なポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、特に、その同族のポリペプチドおよびポリヌクレオチドに類似の生物学的機能／性質を有すると期待される。さらに、本発明の好適なポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、単球／マクロファージの移動／活性化、気道再造形、気道線維形成、上皮分化の制御、粘液過剰分泌の制御、ムコ繊毛クリアランスの制御、炎症の制御、好中球の変調、Ｔ細胞と好酸球の移動および／または活性化、および上皮細胞の制御または肥満細胞の活性化などの少なくとも１つの活性を有する。
【００１８】
本発明のポリヌクレオチドは、ヒト成人または胎児組織の細胞において、ｍＲＮＡから誘導されるｃＤＮＡライブラリーから、標準的なクローニングおよびスクリーニング技法により入手し得る（参照例：Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)）。本発明のポリヌクレオチドはまたゲノムＤＮＡライブラリーなどの天然起源から入手するか、または周知の商業的に利用し得る技法により合成することができる。
【００１９】
本発明のポリヌクレオチドを本発明ポリペプチドの組換え生産に使用する場合、該ポリヌクレオチドはそれ自体で成熟ポリペプチドのコーディング配列であるか、あるいは読取り枠に他のコーディング配列、例えば、リーダーもしくは分泌配列、プレ−、プロ−もしくはプレプロ−タンパク質、または他の融合タンパク質をコードする配列をもつ、成熟ポリペプチド用コーディング配列である。例えば、融合タンパク質の精製を容易にするマーカー配列をエンコードしていてもよい。本発明のこの局面におけるある好適な態様において、該マーカー配列は、ｐＱＥベクター（キアゲン（Qiagen, Inc.））（記載文献：Gentz et al., Proc Natl Acad Sci USA (1989) 86:821-824）に備えられたヘキサ−ヒスチジンペプチドであるか、またはＨＡタグである。該ポリヌクレオチドは非コーディング５'および３'配列、例えば、転写された非翻訳配列、スプライシングとポリアデニル化シグナル、リボソーム結合部位およびｍＲＮＡ安定化配列を含んでいてもよい。
【００２０】
配列番号１または配列番号５のポリヌクレオチド配列に一致するか、または十分な同一性を有するポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ用のハイブリダイゼーションプローブとして、または核酸増幅反応用プライマー（例えば、ＰＣＲ）として使用し得る。かかるプローブおよびプライマーは本発明のポリペプチドをコードする全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するために、また配列番号１または配列番号５に高い類似性、一般に少なくとも９５％の同一性を有する他の遺伝子（ヒト起源のパラログおよびヒト以外の種からのオルソログとパラログをコードする遺伝子を含む）のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するために使用することができる。好適なプローブおよびプライマーは一般に少なくとも１５個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも３０個のヌクレオチドを含んでなり、また少なくとも５０個、最少とは言わないまでも１００個のヌクレオチドを含んでいてもよい。とりわけ好適なプローブは３０ないし５０個のヌクレオチドを有する。特に好適なプライマーは２０ないし２５個のヌクレオチドを有する。
【００２１】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ヒト以外の種からの同族体を含み、以下の工程からなる方法により得ることができる；ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で配列番号１または配列番号５の配列を有する標識プローブまたはそのフラグメント、好ましくは少なくとも１５個のヌクレオチドのプローブによりライブラリーをスクリーニングする工程；および当該ポリヌクレオチド配列を含む全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離する工程。かかるハイブリダイゼーション技法は当業者周知である。好適なストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７.６）、５ｘデンハート溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌ変性せん断サケ精子からなる溶液中、４２０℃で一夜インキュベーションし、次いでフィルターを０.１×ＳＳＣ中、約６５０℃で洗浄することからなる。このように、本発明はストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で配列番号１または配列番号５の配列を有する標識プローブまたはそのフラグメント、好ましくは少なくとも１５個のヌクレオチドのプローブによりライブラリーをスクリーニングすることによって得られる、好ましくは少なくとも１００個のヌクレオチド配列をもつ単離ポリヌクレオチドをも包含する。
【００２２】
当業者は多くの場合に単離したｃＤＮＡ配列が、ポリペプチドをコードする領域が５'末端に至るまで完全に伸張していないという意味で不完全であるということを認識する。このことは、逆転写酵素が第一鎖ｃＤＮＡ合成に際し、ｍＲＮＡ鋳型のＤＮＡコピーを完成し得ない本来低漸進性（重合反応に際して該酵素が鋳型に付着したままでいられる能力の尺度）の酵素である結果である。
【００２３】
全長鎖ｃＤＮＡを得るための、あるいは短鎖ｃＤＮＡを伸張するための、当業者周知かつ利用可能な幾つかの方法がある；例えば、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅法（ＲＡＣＥ）に基づく方法である（参照例：Frohman et al., Proc Nat Acad Sci USA 85, 8998-9002, 1988）。最近の改良技法は、例えば、マラソン（Marathon）（商標）工学技術（クロンテック・ラボ）（Clontech Laboratories Inc.）により例示されるが、より長鎖のｃＤＮＡ検索を有意に簡素化している。マラソン（Marathon）（商標）工学技術では、選択した組織から抽出したｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製し、‘アダプター'配列を各末端に結合させる。次いで、核酸増幅（ＰＣＲ）を実施し、遺伝子特異およびアダプター特異オリゴヌクレオチドプライマーの組合わせを用いて、ｃＤＮＡの“欠損”５'末端を増幅する。次いで、‘ネスト'プライマー、すなわち、増幅した産物内でアニールするように設計したプライマー（代表的にはアダプター配列においてさらに３'にアニールするアダプター特異プライマー、および既知遺伝子配列においてさらに５'にアニールする遺伝子特異プライマー）を用いてＰＣＲ反応を繰り返す。本反応の産物は次いでＤＮＡ配列決定により解析することが可能であり、全長ｃＤＮＡは既存のｃＤＮＡに直接該産物を結合させて完全配列とするか、または５'プライマー設計のための新たな配列情報を用いて別個の全長ＰＣＲを実施することにより構築する。
【００２４】
本発明の組換えポリペプチドは技術上周知の方法により、発現システムを含んでなる遺伝子工学的に作製した宿主細胞から調製することができる。したがって、さらなる局面において、本発明は、本発明の１つまたは複数のポリヌクレオチドを含んでなる発現システム、かかる発現システムにより遺伝子工学的に作製した宿主細胞、および組換え技法による本発明のポリペプチドの製造に関る。無細胞翻訳システムも、本発明のＤＮＡ構築物から誘導したＲＮＡを用い、かかるタンパク質の産生に使用することができる。
【００２５】
組換え製造のために、宿主細胞は遺伝子工学的に作製し、本発明ポリヌクレオチドのための発現システムまたはその部分を取り込むことができる。ポリヌクレオチドは多くの標準的実験室マニュアル（Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986) and Sambrook et al. (ibid)）に記載された方法により、宿主細胞に導入し得る。
【００２６】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する好適な方法は、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、マイクロインジェクション、カチオン性脂質介在トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレイプ・ローディング、弾道導入または感染などである。
【００２７】
適切な宿主の代表例は細菌細胞、例えば、連鎖球菌、ブドウ球菌、大腸菌、放線菌および枯草菌細胞；真菌類細胞、例えば、酵母細胞、アスペルギルス細胞など；昆虫細胞、例えば、ショウジョウバエＳ２およびハスモンヨトウＳｆ９細胞；動物細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３およびボウズ（Bowes）メラノーマ細胞など；および植物細胞である。
【００２８】
多様な発現システム、例えば、染色体、エピソームおよびウイルス由来システムなどを使用することが可能であり、これらのシステムとしては、例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入要素、酵母染色体要素、ウイルス（バキュロウイルス；ＳＶ４０などのパポーバウイルス；ワクシニアウイルス；アデノウイルス、鶏痘ウイルス；仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス）など由来のベクター、およびそれらの組合わせ由来のベクター、例えば、プラスミドとバクテリオファージから誘導したもの、例えば、コスミドおよびファジミドなどである。該発現システムは発現を制御し、発生させるコントロール領域を含んでいてもよい。一般に、ポリヌクレオチドを維持し、繁殖させ、または発現させ、宿主中にポリペプチドを産生させることの可能なシステムまたはベクターはいずれも使用することができる。適切なポリヌクレオチド配列は様々な周知の常套的技法、例えば、サムブルーク（Sambrook）ら記載の技法（上記参照）などにより発現システムに挿入し得る。適切な分泌シグナルを所望のポリペプチドに取り込ませ、翻訳タンパク質を、粗面小胞体の内腔、ぺリプラスム間隙または細胞外環境に分泌させることができる。これらのシグナルはポリペプチド内在性でもよいし、あるいは異種シグナルでもよい。
【００２９】
本発明のポリペプチドをスクリーニングアッセイに使用するために発現させる場合、一般には、該ポリペプチドを細胞表面に産生させるのが好ましい。この事象において、該細胞はスクリーニングアッセイに使用する前に収穫するのがよい。該ポリペプチドを培地中に分泌させる場合には、ポリペプチドの回収・精製のために培地を回収することができる。細胞内に産生される場合、細胞は、ポリペプチドを回収する前に、まず溶解させなければならない。
【００３０】
本発明のポリペプチドは組換え細胞培養物から周知の方法、例えば、硫酸アンモニウムもしくはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンもしくはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティ・クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト・クロマトグラフィー、およびレクチン・クロマトグラフィーなどにより回収精製することができる。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィーを精製に使用することである。該ポリペプチドが細胞内合成、単離および／または精製に際して変性している場合には、タンパク質を再生させる周知技法を採用して、活性なコンホメーションを再生させることができる。
【００３１】
本発明のポリヌクレオチドは会合した遺伝子の突然変異の検出を介して、診断試薬として使用することができる。ｃＤＮＡまたはゲノム配列において配列番号１または配列番号５のポリヌクレオチドにより特徴づけられる遺伝子であって、機能障害と関連する遺伝子の変異の形状を検出することは、遺伝子の低発現、過剰発現または空間的または時間的発現の変化から生じる疾患の診断、または疾患に対する罹病性診断に加わるか、またはそれらを規定することの可能な診断手段を提供する。遺伝子に突然変異をもつ個体は様々な技術上周知の技法によりＤＮＡレベルで検出することが可能である。
【００３２】
診断用の核酸は被験者の細胞から、血液、尿、唾液、組織生検または剖検材料として入手し得る。ゲノムＤＮＡは検出のために直接使用するか、または分析に先立ち、ＰＣＲ、好ましくはＲＴ−ＰＣＲ、または他の増幅技法を用いて酵素的に増殖してもよい。ＲＮＡまたはｃＤＮＡも同様の方式で使用し得る。欠失および挿入は増幅産物の規模の変化を正常な遺伝子型と比較して検出可能である。点突然変異は増幅したＤＮＡを標識したヌクレオチド配列にハイブリッド形成することにより同定し得る。完全に対合した配列はＲＮアーゼ消化により、または融点の差異により誤対合二重鎖と識別することができる。
【００３３】
また、ＤＮＡ配列の相違はＤＮＡフラグメントのゲル電気泳動における移動度の変化により、または直接のＤＮＡ配列決定により検出し得る（参照例：Myers et al., Science (1985) 230: 1242）。特定位置での配列変化はヌクレアーゼ防御アッセイ、例えば、ＲＮアーゼおよびＳ１防御により、または化学的切断法により解明し得る（参照：Cotton et al., Proc Natl Acad Sci USA (1985) 85: 4397-4401）。
【００３４】
呼吸器ケモカイン・レセプター・ポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含んでなるオリゴヌクレオチドを配列構築して、例えば、遺伝子突然変異の効率的なスクリーニングを実施することができる。かかる配列は、好ましくは高密度配列またはグリッドである。配列技法は周知であり、一般的な応用性をもち、分子遺伝学における様々な問題、例えば、遺伝子発現、遺伝子結合、および遺伝的変異性などの処理に使用し得る（参照例：M. Chee et al., Science, 274, 610-613 (1996) および本文献に引用された他の文献）。
【００３５】
また、異常に減少または増加したレベルのポリペプチドまたはｍＲＮＡ発現の検出は、本発明疾患について被験者の罹病性を診断または判断するためにも使用し得る。発現の減少または増加は、ポリヌクレオチド定量のための周知方法、例えば、核酸増幅、例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼ防御、ノーザンブロッティングおよび他のハイブリダイゼーションのいずれかを用いてＲＮＡレベルで測定することが可能である。宿主から得たサンプル中、本発明ポリペプチドなどのタンパク質レベルを決定するために使用し得るアッセイ技法は当業者周知である。かかるアッセイ方法は、放射免疫アッセイ、競合結合アッセイ、ウエスターンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイなどである。
【００３６】
したがって、もう一つの局面において、本発明は以下の要素からなる診断キットに関する：
（ａ）本発明のポリヌクレオチド、好ましくは配列番号１または配列番号５のヌクレオチド配列またはそのフラグメントまたはＲＮＡ転写物；
（ｂ）（ａ）のヌクレオチドに相補性のヌクレオチド配列；
（ｃ）本発明のポリペプチド、好ましくは配列番号２または配列番号６のポリペプチドまたはそのフラグメント；または
（ｄ）本発明のポリペプチド、好ましくは配列番号２または配列番号６のポリペプチドに対する抗体。
【００３７】
かかるキットにおいては、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）が実質的な組成分となり得ることは認識されよう。かかるキットは疾患の診断または疾患に対する罹病性、とりわけ本発明の特定疾患の診断に使用し得る。
【００３８】
本発明のポリヌクレオチド配列は染色体存在部位の研究にとって価値がある。該配列は個々のヒト染色体上の特定位置を特異的に標的とし、ハイブリッド形成することができる。本発明により関連の配列を染色体にマッピングすることは、これらの配列と遺伝子関連疾患とを関係付ける上で重要な最初のステップである。一つの配列を正確な染色体の位置に地図化したならば、染色体上その配列の物理的位置を遺伝子地図データと相関させることができる。かかるデータは、例えば、マッククシック（V. McKusick）のヒトにおけるメンデル遺伝に見出される（ジョン・ホプキンス大学ウエルシュ医学図書館のオンライン利用可能）。
【００３９】
同じ染色体領域に地図化された遺伝子と疾患の関係は、連鎖解析を経て同定する（物理的に隣接する遺伝子の同時遺伝）。ゲノム配列（遺伝子フラグメントなど）についての正確なヒト染色体存在部位は放射線ハイブリッド（ＲＨ）マッピングにより決定することができる（Walter, M. Spillett, D., Thomas, P., Weissenbach, J., and Goodfellow, P., (1994); 全ゲノムの放射線ハイブリッドマップの構築方法；Nature Genetics 7, 22-28）。多数のＲＨパネルがリサーチ・ジェネティックス（ハンツビル（Huntsville）、ＡＬ、ＵＳＡ）；例えば、ジーン・ブリッジ４ＲＨパネル（Hum Moi Genet 1996 Mar; 5(3): 339-46; ヒトゲノムの放射線ハイブリッドマップ；Gyapay G, Schmitt K, Fizames C, Jones H, Vega-Czarny N, Spilleft D, Muselet D, Prud'Homme JF, Dib C, Auffray C, Morissette J, Weissenbach J, Goodfellow PN）から利用可能である。
【００４０】
このパネルを用いて遺伝子の染色体存在位置を決定するために、ＲＨ ＩＤＮＡに基づき対象の遺伝子から設計したプライマーを用いて９３回のＰＣＲを実施する。これらＤＮＡのそれぞれはハムスターバックグランドに維持したランダム・ヒトゲノムフラグメント（ヒト／ハムスター・ハイブリッド細胞株）を含む。これらのＰＣＲは対象遺伝子のＰＣＲ産物の有無を示す９３のスコアを与える。これらのスコアは既知存在位置のゲノム配列からのＰＣＲ産物を用いて作成したスコアと比較する。この比較はhftp://www.genome.wi.mit.edu/にて実施する。また、本発明のポリヌクレオチド配列は組織発現の研究に有用な手段でもある。かかる研究においては、それらをコードするｍＲＮＡの検出により、組織中エンコードされたポリペプチドの発現パターンに関して示唆し得る本発明ポリペプチドの発現パターンを決定し得る。
【００４１】
用いる技法は技術上既知であり、グリッド上に配列したクローンに対するハイブリダイゼーション技法、例えば、ｃＤＮＡマイクロアレイ・ハイブリダイゼーション（Schena et al, Science, 270, 467-470, 1995 and Shalon et al, Genome Res, 6, 639-645, 1996）およびＰＣＲなどの増幅技法である。好適な方法ではパーキンエルマー（Perkin Elmer）から入手し得るタックマン（TAQMAN）(商標）技法を使用する。これらの研究結果は生体中でのポリペプチドの正常機能を示唆し得る。さらに、ｍＲＮＡの正常発現パターンと同じ遺伝子の代替形状がコードするｍＲＮＡのパターン（例えば、ポリペプチドコーディングポテンシャルに変化をもつ遺伝子または調節突然変異をを有する遺伝子）または疾患における不適切なその発現パターンとの比較研究は、本発明ポリペプチドの役割に関して有用な洞察を与え得る。かかる不適切な発現は時間的、空間的または単に定量的な性質のものであり得る。
【００４２】
本発明のポリペプチドは、呼吸器組織、および単球／マクロファージの移動／活性化、気道再造形、気道線維形成、上皮分化の制御、粘液過剰分泌の制御、ムコ繊毛クリアランスの制御、炎症の制御、好中球の変調、Ｔ細胞と好酸球の移動および／または活性化、および上皮細胞の制御または肥満細胞の活性化に関係する組織において発現される。
【００４３】
本発明のさらなる局面は抗体に関する。本発明のポリペプチドまたはそのフラグメント、またはそれらを発現する細胞は、本発明のポリペプチドに免疫特異的な抗体を生成させるための免疫原として使用することができる。“免疫特異的”という術語は、該抗体が技術上関連する他のポリペプチドに対する親和性よりも、本発明のポリペプチドに対して実質的により大きな親和性を有することを意味する。本発明ポリペプチドに対して生成させる抗体は、該ポリぺプチドまたはエピトープ担持フラグメントまたは細胞を動物に、好ましくは非ヒト動物に、常套のプロトコールを用いて投与することにより得られる。モノクローナル抗体の調製には、連続的細胞系培養が産生する抗体を提供する技法を使用することができる。その例としては、ハイブリドーマ技法（Kohler, G. and Milstein, C., Nature (1975) 256: 495-497）、トリオーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Kozbor et al., Immunology Today (1983) 4:72）およびＥＢＶハイブリドーマ技法（Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, 77-96; Alan R. Liss, Inc., 1985）などである。
【００４４】
米国特許第４,９４６,７７８号に記載されたような一本鎖抗体の作製技法も、本発明ポリペプチドに対する一本鎖抗体の作製に適合する。また、トランスジェニックマウスまたは他の哺乳動物を含む他の生物体もヒト化抗体の発現に使用し得る。
【００４５】
上記の抗体は該ポリペプチドを発現するクローンを単離するために、または同定するために、またはアフィニティクロマトグラフィーにより該ポリペプチドを生成するために採用することができる。本発明のポリペプチドに対する抗体は、とりわけ本発明の疾患を処置するために採用することができる。
【００４６】
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドはワクチンとしても使用することができる。したがって、さらなる局面において、本発明は哺乳動物において免疫応答を誘導する方法に関し、該方法は該哺乳動物に本発明のポリペプチドを接種し、抗体および／またはＴ細胞免疫応答、例えば、サイトカイン産生Ｔ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞の免疫応答を適切に生じさせ、疾患が個体内にすでに確立されているか否かに拘わらず、当該動物を該疾患から防護することからなる。哺乳動物の免疫応答は、かかる免疫応答を誘導して本発明の疾患から当該動物を防護する抗体を生成させるために、インビボで該ポリヌクレオチドの発現を目的とした、本発明のポリぺプチドをコードするベクターを介して該ポリペプチドを送達する方法により誘発することもできる。
【００４７】
ベクター投与の一方法は微粒子上の被覆として、または他の手段で所望の細胞内へベクターを加速することによる。かかる核酸ベクターはＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾核酸、またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドからなる。ワクチンとして使用するためには、通常、ポリペプチドまたは核酸ベクターをワクチン製剤（組成物）として提供する。該製剤はさらに適切な担体を含んでいてもよい。ポリペプチドは胃内で分解し得るので、好ましくは非経口投与する（例えば、皮下、筋肉内、静脈内、または皮内注射）。非経口投与に適した製剤は、水性および非水性無菌注射溶液で、抗酸化剤、緩衝液、殺菌剤、および該製剤を受容者の血液と等張となるようにする溶質を含んでいてもよい；該製剤は懸濁化剤または粘稠化剤を含む水性および非水性無菌懸濁液でもよい。
【００４８】
該製剤は単位用量または多用量の容器、例えば、封入アンプルおよびバイアルに収容し、凍結乾燥条件下で保存し、使用直前に無菌液状担体を添加すればよいようにする。ワクチン製剤は製剤の免疫原性を高めるアジュバント系、例えば、水中油系および技術上既知の他の系としてもよい。投与量はワクチンの特異活性に依存するが、通常の実験により容易に決定し得る。
【００４９】
本発明のポリペプチドは１つ以上の病的状態、特に上記の本発明の疾患に関連のある１種以上の生物機能を有する。それ故、該ポリペプチドの機能またはレベルを促進または阻害する化合物を同定することこが有用である。したがって、さらなる局面において、本発明は該ポリペプチドの機能またはレベルを促進または阻害する化合物を同定するための化合物のスクリーニング方法を提供する。かかる方法によりアゴニストまたはアンタゴニストを同定し、それを上記の本発明疾患に対し治療および予防を目的として採用する。化合物については多様な起源、例えば、細胞、無細胞調製物、化学ライブラリー、化学物質のコレクション、および天然物の混合物などから同定し得る。このように同定されるかかるアゴニストまたはアンタゴニストは、天然または修飾した基質、リガンド、レセプター、酵素など、また場合により、ポリペプチドのもの；その構造的または機能的模倣物（参照：Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1(2): Chapter 5 (1991)）または小分子などである。
【００５０】
該スクリーニング方法では候補化合物とポリペプチドとの結合、または該ポリペプチドを担持する細胞または膜との、またはその融合タンパク質との結合を、該候補化合物と直接または間接に会合した標識により簡単に測定することができる。あるいは、該スクリーニング方法は、候補化合物と該ポリペプチドとの標識競合体（例えば、アゴニストまたはアンタゴニスト）に対する競合結合を（定性的または定量的に）測定または検出することからなる。さらに、これらのスクリーニング方法では該化合物が当該ポリペプチドの活性化または阻害によってシグナルを発生するようになるか否かを、ポリペプチド担持細胞に適切な検出システムによりテストすることができる。活性化の阻害剤は一般に既知アゴニストの存在下にアッセイし、活性化合物の存在下にアゴニストによる活性化への影響を観察する。さらに、該スクリーニング法は単に候補化合物と本発明ポリペプチド含有溶液とを混合して混合物とする工程、混合物中のＨＧＲＬ１０１活性を測定する工程、および該今後物のＨＧＲＬ１０１活性を候補化合物不含の対照混合物と比較する工程からなる。
【００５１】
本発明のポリペプチドは常套の低許容能スクリーニング法にも、高処理能力スクリーニング（ＨＴＳ）方式にも採用し得る。かかるＨＴＳ方式は定着した９６穴マイクロタイタープレートの使用、そしてより最近の３８４穴プレートの使用のみならず、シュレックら（Schullek et al., Anal Biochem., 246, 20-29 (1997)）が記載しているナノウエル法などの新たに出現する方法をも包含する。
【００５２】
融合タンパク質、例えば、Ｆｃ部分および呼吸器ケモカイン・レセプター・ポリペプチドから作製された融合タンパク質は、上記のように、本発明ポリペプチドに対するアンタゴニストを同定するための高処理能力スクリーニングアッセイにも使用し得る（参照：D. Bennett et al., J Mol Recognition, 8: 52-58 (1995); and K. Johanson et al., J Biol Chem, 270 (16): 9459-9471 (1995)）。
【００５３】
スクリーニング技法
本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび該ポリペプチドに対する抗体は、細胞中のｍＲＮＡおよびポリペプチド産生に対する添加化合物の影響を検出するスクリーニング方法を設定するために使用することもできる。例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ法はポリペプチドの分泌レベルまたは細胞会合レベルを、技術上既知の標準法によりモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を用いて測定するために構築し得る。この方法は適切に操作した細胞または組織からのポリペプチドの産生を阻害または上昇させ得る（それぞれアンタゴニストまたはアゴニストと呼称する）作用因子を見出すために使用することができる。
【００５４】
本発明のポリペプチドは、もし存在するなら、技術上既知の標準レセプター結合技法を介して、膜結合または可溶性レセプターを同定するために使用することができる。これらは、以下に制限されるものではないが、リガンド結合および架橋アッセイであり、そこではポリペプチドを放射活性同位体（例えば、１２５Ｉ）により標識し、化学的に修飾（例えば、ビオチニル化）するか、または検出または精製に適したペプチド配列に融合し、次いで推定レセプターの起源（細胞、細胞膜、細胞上清、組織抽出物、体液）とインキュベートする。他の方法は生物物理学的技法であり、例えば、表面プラズモン共鳴および分光法である。これらのスクリーニング法は、もし存在するなら、該ポリペプチドとそのレセプターとの結合と競合するポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストを同定するためにも使用し得る。かかるアッセイを実施するための標準法は、技術上よく理解されている。
【００５５】
本発明ポリペプチドのアンタゴニストの例は抗体であり、あるいはある場合には、リガンド、基質、レセプター、酵素などに密接に関係するオリゴヌクレオチドまたはタンパク質であり、場合によってはポリペプチドのもの、例えば、リガンド、基質、レセプター、酵素などのフラグメントである；または本発明のポリペプチドに結合はするが応答を引き出すものではないが、結果としてポリペプチドの活性を防止し得る小分子である。
【００５６】
また、スクリーニング方法ではトランスジェニック技法と呼吸器ケモカインレセプター遺伝子を使用してもよい。トランスジェニック動物の構築技術は確立したものとなっている。例えば、呼吸器ケモカインレセプター遺伝子は、マイクロインジェクションにより受精した卵母細胞のオス前核に、またはレトロウイルス伝達により移植前または移植後の胚に、またはエレクトロポレーションによるなどの遺伝子的に修飾した胚幹細胞を胚盤胞に注射することにより導入することができる。とりわけ有用なトランスジェニック動物は、いわゆる“ノックイン”動物であり、動物の遺伝子を当該動物のゲノム内でヒトの等価遺伝子と置換えた動物である。ノックイン・トランスジェニック動物は薬物の発見過程において標的確認のために有用であり、その場合に該化合物はヒトの標的に特異的である。他の有用なトランスジェニック動物は、いわゆる“ノックアウト”動物であり、この場合には本発明のポリペプチドであって、細胞中で内在性のＤＮＡ配列がコードするポリペプチドの動物オルソログの発現が部分的にまたは完全に無効とされる。遺伝子のノックアウトは特定の細胞または組織を標的とするものであり、技術的制約の結果として一部の細胞または組織にのみ起こるか、または動物のすべての細胞または実質的にすべての細胞に起こり得る。また、トランスジェニック動物技術は全動物発現−クローニング系を提供し、その場合には、導入された遺伝子が発現されて大量の本発明ポリペプチドを生じる。
【００５７】
上記の方法に使用するスクリーニングキットは本発明のさらなる局面を形成する。かかるスクリーニングキットは以下の要素を含んでなる：
（ａ）本発明ポリペプチド：
（ｂ）本発明ポリペプチドを発現する組換え細胞；
（ｃ）本発明ポリペプチドを発現する細胞膜；または
（ｄ）本発明ポリペプチドに対する抗体であって、そのポリペプチドが好ましくは配列番号２または配列番号６のポリペプチドであるもの。
かかるキットにおいて、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）は当然ながら実質的な組成分を含んでなる。
【００５８】
用語集
以下の定義は本明細書にてしばしば使用された特定術語の理解を容易にするために提供するものである。
【００５９】
“抗体”：本明細書にて使用する場合、抗体はポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、キメラ、一本鎖およびヒト化抗体、ならびにＦａｂフラグメントを含み、Ｆａｂまたは他の免疫グロブリン発現ライブラリーからの産物を含む。
【００６０】
“単離”：単離（された）とはその自然界での状態からヒトの手によて変えられたことを意味する、すなわちそれが自然界で起きる場合には、その元の環境から変化したか、または取り出されたこと、またはその両方を意味する。例えば、生きた生物体に自然のままに存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは“単離”されたものではないが、同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドがその自然状態の共存する物質から分離したものであれば“単離”されたものであり、術語として本明細書にて採用される。さらに、形質転換、遺伝子操作または他の組換え方法により生物体に導入したポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、それがなお当該生物体に存在し、その生物体が生きていても生きていなくても、“単離”されたものである。
【００６１】
“ポリヌクレオチド”：一般的にはポリリボヌクレオチド（ＲＮＡ）またはポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）をいい、修飾または非修飾のＲＮＡまたはＤＮＡでもよい。“ポリヌクレオチド”は制限なしに一本鎖および二本鎖のＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖のＲＮＡ、および一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡとを含んでなるハイブリッド分子であって一本鎖またはより典型的には二本鎖であるか、または一本鎖および二本鎖領域の混合物であるハイブリッド分子を包含する。さらに、“ポリヌクレオチド”はＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡを含んでなる三本鎖領域をいう。“ポリヌクレオチド”という術語はまた１個以上の修飾した塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡを、また安定化またはその他の理由で修飾したバックボーンをもつＤＮＡまたはＲＮＡをも包含する。
【００６２】
“修飾”：修飾（した）塩基とは、例えば、トリチル化塩基およびイノシンなどの通常と異なる塩基を含む。多様な修飾がＤＮＡおよびＲＮＡに対してなし得る；したがって、“ポリヌクレオチド”とは、一般に自然界に見出されるポリヌクレオチドの化学的、酵素的または代謝的に修飾した形状、ならびにウイルスおよび細胞に特有のＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形状を包含する。また、“ポリヌクレオチド”はしばしばオリゴヌクレオチドと言われる比較的短鎖のポリヌクレオチドをも包含する。
【００６３】
“ポリペプチド”：ポリペプチドとは互いにペプチド結合により、または修飾ペプチド結合（すなわち、ペプチド等配電子体）により連結した２個またはそれ以上のアミノ酸を含んでなるポリペプチドをいう。“ポリペプチド”は、通例、ペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴマーと言われる短鎖のもの、および一般にタンパク質と言われる長鎖のものをいう。ポリペプチドは２０種の遺伝子エンコードアミノ酸以外のアミノ酸を含んでいてもよい。“ポリペプチド”は翻訳後プロセシングなどの自然過程により、または技術上周知の化学的修飾技法により修飾されたアミノ酸配列を含む。かかる修飾については基礎の教科書に、またより詳細にはモノグラフに、また膨大な量の研究文献に記載されている。修飾はポリペプチドのいずれの箇所で起こってもよく、例えば、ペプチドバックボーン、アミノ酸側鎖、およびアミノ末端またはカルボキシル末端などである。所定のペプチドの幾つかの部位に、同じ程度または異なる程度で同一タイプの修飾が存在し得ることは理解されよう。また、所定のポリペプチドが多くのタイプの修飾を有し得る。ポリペプチドはユビキチン化の結果として分岐していてもよく、また環状であることもあり、その場合も分岐があり得る。環状、分岐および分岐環状ポリペプチドは翻訳後の自然過程で生じるか、または合成法で作製し得る。修飾はアセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、ビオチニル化、フラビンの共有結合付着、ヘム部分の共有結合付着、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合付着、脂質または脂質誘導体の共有結合付着、ホスホチジルイノシトールの共有結合付着、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチン形成、ピログルタメート形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化などのタンパク質への転移ＲＮＡ介在アミノ酸付加、およびユビキチン化などである（参照例：Proteins-Structure and Molecular Properties, 2nd Ed., T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York, 1993; Wold, F., Post-translation Protein Modifications: Perspectives and Prospects, 1-12, in Post-translational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, 1983; Seifter et al., “Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors”, Meth Enzymol, 182, 626-646, 1990, and Rattan et al., “Protein Synthesis: Post-translational Modifications and Aging”, Ann NY Acad Sci, 663, 48-62, 1992）。
【００６４】
“フラグメント”：ポリペプチド配列のフラグメントは対照標準配列よりも短いが、標準ポリペプチドと本質的に同じ生物機能または活性を保持するポリペプチド配列をいう。ポリヌクレオチド配列の“フラグメント”は配列番号１または配列番号５の対照標準配列よりも短いポリヌクレオチド配列をいう。
【００６５】
“変異体”：対照標準ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるが、本質的に同じその性質を保持するポリヌクレオチドまたはポリペプチドをいう。ポリヌクレオチドの代表的な変異体は対照標準ポリヌクレオチドとヌクレオチド配列が異なる。変異体のヌクレオチド配列の変化は対照標準ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドのアミノ酸配列を変えるものでも変えないものでもよい。ヌクレオチドの変化は以下に考察するように、対照標準配列がコードするポリペプチドにおいて、アミノ酸置換、付加、欠失、融合および末端切除に至らしめる可能性がある。ポリペプチドの代表的な変異体は対照標準ポリペプチドとアミノ酸配列が異なる。一般に、変更は対照標準ポリペプチドと変異体の配列が全体として密接に類似し、多くの領域で一致するように制限を受ける。変異体と対照標準ポリペプチドはアミノ酸配列が１個以上の置換、挿入、欠失、そのいずれかの組合せで異なり得る。置換または挿入アミノ酸残基は遺伝子コードによりエンコードされていてもいなくてもよい。代表的な保存置換は、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ−ＩＳｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅとＴｙｒである。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体は対立遺伝子のように天然産でもよいし、あるいは天然の存在未知の変異体でもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの非天然産変異体は変異誘発技法により、または直接の合成により作製し得る。また、変異体として包含されるものは、１つ以上の翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、リン酸化、メチル化、ＡＤＩＰリボシル化などを有するポリペプチドである。これらの態様には、Ｎ−末端アミノ酸のメチル化、セリンとトレオニンのリン酸化、およびＣ−末端グリシンの修飾を包含する。
【００６６】
“対立遺伝子”：ゲノムにおける所定の遺伝子座に存在する遺伝子の２つ以上の代替形状の１つをいう。
【００６７】
“多形性”：集団内のゲノムにおける所定位置でのヌクレオチド配列（そしてもし適切ならばエンコードされたポリペプチド配列）の変動をいう。
【００６８】
“単一ヌクレオチド多形”（ＳＮＰ）：集団内のゲノムにおける１個のヌクレオチド位置のヌクレオチド可変性の発生をいう。ＳＮＰは遺伝子内で、またはゲノムの遺伝子間領域内で起こり得る。ＳＮＰは対立遺伝子特異的増幅（ＡＳＡ）によりアッセイし得る。このプロセスには、少なくとも３種のプライマーが必要である。共通のプライマーは検定する多形性に対し逆補体として使用する。共通のプライマーは多形性塩基から５０ないし１５００ｂｐでよい。他の２つ（またはそれ以上）のプライマーは互いに一致するが、、終末３'塩基がゆらいで多形性を造る２つ（またはそれ以上）の対立遺伝子の１つと対合する場合は例外である。２回（またはそれ以上）のＰＣＲ反応をサンプルＤＮＡ上で実施するが、それぞれで共通プライマーと対立遺伝子特異プライマーの１つを使用する。
【００６９】
“スプライス変異体”：本明細書にて使用する場合、同じゲノムＤＮＡ配列から最初に転写されたＲＮＡ分子であるが別のＲＮＡスプライシングを受けたＲＮＡ分子から産生されるｃＤＮＡ分子をいう。別のＲＮＡスプライシングは、一次ＲＮＡ転写物が一般にはイントロンの除去のためにスプライシングを受け、１つ以上のｍＲＮＡ分子を産生するに至り、そのそれぞれが異なるアミノ酸配列をエンコードし得るものとなる。また、スプライス変異体という術語は上記のｃＤＮＡ分子がコードするタンパク質をいう。
【００７０】
“同一性”：同一性とは２つ以上のポリペプチド配列間、または２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係を反映するものであり、配列の比較により決定される。一般に、同一性とは、２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド配列の、それぞれ比較すべき配列の全長について、ヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸が厳密に対応することをいう。
【００７１】
“％同一性”：厳密な対応の無い場合の配列について、“％同一性”を決定し得る。一般に、比較すべき２つの配列を整列して配列間に最大の相関性を与える。この操作は整列度合いを高めるために一方または双方の配列に“ギャップ”を挿入することも含む。％同一性は比較すべき配列それぞれの全長にわたり（２３の比較（いわゆる、球状整列）は同一または非常に類似している長さの配列に特に適している）またはより短い一定の長さについて（いわゆる、局所整列は長さの異なる配列により適している）決定し得る。
【００７２】
“類似性”：類似性は２つのポリペプチド配列間の関係のさらに複雑な尺度である。一般に、“類似性”は２つのポリペプチド鎖のアミノ酸間の残基ごとの比較を意味するが、（同一性について）比較すべき配列のそれぞれから一対となる残基間の厳密な対応のみならず、厳密な対応のない場合には、進化に基づき、１つの残基が他のものに置換わる可能性があるかどうかを考慮する。この可能性は関連する“スコア”をもち、そこから２つの配列の“％類似性”を決定することができる。
【００７３】
２つ以上の配列の同一性および類似性を比較する方法は、技術上周知である。したがって、例えば、ウイスコンシン配列解析パッケージの９.１バージョン（Devereux J et al, Nucleic Acids Res, 12, 387-395, 1984; ジェネティックス・コンピューター・グループから入手可；Madison, Wisconsin, USA）にて利用し得るプログラム、例えば、ＢＥＳＴＦＩＴおよびＧＡＰを使用し、２つのポリヌクレオチド間の％同一性、および２つのポリペプチド間の％同一性と％類似性を決定することができる。ＢＥＳＴＦＩＴではスミスとウォータマン（Smith and Waterman）の“局部相同性”アルゴリズム（J MOL Biol, 147, 195-197, 1981, Advances in Applied Mathematics, 2, 482-489, 1981）を使用し、２つの配列間の最良の類似性単一領域を見出す。ＢＥＳＴＦＩＴは長さの異なる２つのポリペプチド配列を比較するのにより適当であり、そのプログラムは短鎖配列が長鎖の一部であることを確証する。対照的に、ＧＡＰでは２つの配列を整列させ、ネッドルマンとヴンシュ（Neddleman and Wunsch）のアルゴリズム（J Mol Biol, 48, 443-453, 1970）にしたがって“最大類似性”を見出す。ＧＡＰは略同じ長さの配列を比較するのにより適しており、全長について整列し得ると期待される。好ましくは、各プログラムに使用されるパラメータ“ギャップウエイト”および“長さウエイト”はポリヌクレオチド配列についてはそれぞれ５０および３、ポリペプチド配列については１２および４である。好ましくは、％同一性および類似性は、比較すべき２つの配列が最適配列された場合に決定される。
【００７４】
配列間の同一性および／または類似性を決定するその他のプログラムも技術上既知である；例えば、ＢＬＡＳＴファミリーのプログラム（Altschul S F et al, J Mol Biol, 215, 403-410, 1990, Altschul S F et al, Nucleic Acids Res., 25: 389-3402, 1997, 国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）（ベセスダ、メリーランド、ＵＳＡ）から入手可能；またＮＣＢＩのホームページ、www.ncbi.nlm.nih.gov、にもアクセス可能）およびＦＡＳＴＡ（Pearson W R, Methods in Enzymology, 183, 63-99, 1990; Pearson W R and Lipman D J, Proc Nat Acad Sci USA, 85, 2444-2448; ウイスコンシン配列解析パッケージの一部として利用可能）などである。
【００７５】
好ましくは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸置換マトリックス (Henikoff S and Henikoff J G, Proc Nat. Acad Sci. USA, 89, 10915-10919, 1992) を、どのヌクレオチド配列が比較前のアミノ酸配列に最初に翻訳されるかを含め、ポリペプチド配列比較に使用する。
【００７６】
好ましくは、プログラムＢＥＳＴＦＩＴを使用し、対照標準ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に関し、問題のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の％同一性を決定するが、問題の配列と対照標準配列は最適となるよう配列し、上記のようにプログラムのパラメータをデフォルト値にセットする。
【００７７】
“同一性指標”：候補配列（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）と対照標準配列との比較に使用し得る配列関連性の尺度である。したがって、例えば、対照標準ポリヌクレオチド配列に比較して、例えば、０.９５の同一性指標を有する候補ポリヌクレオチド配列は候補ポリヌクレオチド配列が平均して対照標準配列のヌクレオチド１００個につき５個までの相違を含み得るということを除き、対照標準配列に一致する。かかる相違は少なくとも１個のヌクレオチド欠失、置換（転移および転換を含む）、または挿入からなる群より選択される。これらの相違は対照標準ポリヌクレオチド配列の５'または３'末端位置で、またはこれらの末端位置間のいずれかの位置で起こり得るものであり、対照標準配列におけるヌクレオチド間で個々に散在するか、または対照標準配列内の１個以上の連続する群内に散在する。換言すると、対照標準ポリヌクレオチド配列に比較して、０.９５の同一性指標を有するポリヌクレオチド配列を得るためには、対照標準配列のヌクレオチド１００個ごとに平均５〜２５個が、上記のように、欠失、置換または挿入が行われるか、またはそのいずれかの組合わせが行われる。同様のことが同一性指標の他の値、例えば、０.９６、０．９７、０.９８および０.９９を準用して適用される。
【００７８】
同様に、ポリペプチドについては、例えば、対照標準ポリペプチド配列に比較して０.９５の同一性指標をもつ候補ポリペプチド配列は候補ポリペプチド配列が平均して対照標準配列のアミノ酸１００個につき５個までの相違を含み得るということを除き、対照標準配列に一致する。かかる相違は少なくとも１個のアミノ酸の欠失、置換（同類および非同類置換を含む）、または挿入からなる群より選択される。これらの相違は対照標準ポリペプチド配列のアミノ−またはカルボキシ−末端位置で、またはこれらの末端位置間のいずれかの位置で起こり得るものであり、対照標準配列におけるアミノ酸間で個々に散在するか、または対照標準配列内の１個以上の連続する群内に散在する。換言すると、対照標準ポリペプチド配列に比較して、０.９５の同一性指標を有するポリペプチド配列を得るためには、対照標準配列のアミノ酸１００個ごとに平均５個までのアミノ酸が、上記のように、欠失、置換または挿入が行われるか、またはそのいずれかの組合わせが行われる。同様のことが同一性指標の他の値、例えば、０.９６、０．９７、０.９８および０.９９を準用して適用される。
【００７９】
ヌクレオチド数またはアミノ酸数の相違と同一性指標との関係は以下の式で表し得る：
【数１】
2005503137.tif 000002
ただし、式中、
ｎａはヌクレオチド数またはアミノ酸数の相違である；
ｘａは配列番号１または配列番号５のヌクレオチド総数、または配列番号２または配列番号６のアミノ酸総数である；
Ｉは同一性指標である；
記号・は乗法演算子記号であり、ｘａとＩの積が非整数のとき、ｘａから引き算する前に端数を切り捨て最も近い整数とする。
【００８０】
“同族体”：対照標準配列に対して高度の配列関連性を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を示すために使用される一般的技術用語である。かかる関連性は本明細書に定義した２つの配列間の同一性および／または類似性の程度を決定することにより定量化することができる。この一般用語に入るのは、“オルソログ”および“パラログ”という用語である。“オルソログ”は他の種におけるポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能的等価物であるポリヌクレオチドまたはポリペプチドをいう。“パラログ”は同じ種内で機能的に類似しているポリヌクレオチドまたはポリペプチドをいう。
【００８１】
“融合タンパク質”：融合タンパク質は２つの無関係な融合遺伝子またはそのフラグメントによりエンコードされるタンパク質をいう。その例はＵＳ５５４１０８７および５７２６０４４に開示されている。Ｆｃ−ＰＧＰＣＲ−３の場合には、融合タンパク質の一部として免疫グロブリンＦｃ領域を使用することが、Ｆｃ−ＰＧＰＣＲ−３またはＰＧＰＣＲ−３のフラグメントの機能的発現を実施するために有利であり、治療に使用する場合のかかる融合タンパク質の薬物動態性を改善し、また二量体Ｆｃ−ＰＧＰＣＲ−３を生成する。Ｆｃ−ＰＧＰＣＲ−３のＤＮＡ構築物は５'から３'方向に、分泌カセット、すなわち哺乳動物細胞からの輸出の引き金を引くシグナル配列、融合パートナーとして免疫グロブリンＦｃ領域フラグメントをコードするＤＮＡ、およびＦｃ−ＰＧＰＣＲ−３またはそのフラグメントをコードするＤＮＡを含んでなる。一部の使用に際し、機能的Ｆｃサイドを変異させながら融合タンパク質の残りの部分には触れずにおくことによって本来の機能的性質（補体結合、Ｆｃ−レセプター結合）を変えるか、または発現後にＦｃ部分を完全に除去することを可能とすることが望ましい。
【００８２】
特許および特許出願に限定せず、本明細書に引用したすべての刊行物および文献は、参照によりそれらの全文を本明細書の一部とする。それぞれ個々の刊行物または文献は、具体的かつ個々に全文を明示したものとして参照により本明細書に取込まれたことを表示したものとする。本出願が優先権を主張する特許出願もまた、刊行物および文献について記載したと同様に、その全文を参照により本明細書の一部とする。
実施例
【実施例１】
【００８３】
哺乳動物細胞発現
本発明のレセプターはヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）または接着性ｄｈｆｒＣＨＯ細胞にて発現される。レセプターの発現を最大とするために、一般的には、ｐＣＤＮまたはｐＣＤＮＡ３ベクターに挿入する前に、レセプターｃＤＮＡから５'および３'非翻訳領域（ＵＴＲ）をすべて除去する。細胞は個々のレセプターｃＤＮＡでリポフェクチンにより形質移入し、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８の存在下に選択する。選択の３週間後に個々のクローンを取り出し、さらに解析するために拡張する。ベクターのみで形質移入したＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞は陰性対照とする。個々のレセプターを安定的に発現する細胞株を単離するために、約２４のクローンを代表的なものとして選択し、ノーザンブロット分析により分析する。レセプターｍＲＮＡは一般に分析したＧ４１８−抵抗性クローンの約５０％に検出し得る。
【実施例２】
【００８４】
結合および機能的アッセイ用リガンドバンク
１２００種を超える推定レセプターリガンドのバンクはスクリーニング用として集めてある。このバンクは以下のものからなる：ヒトの７種の膜貫通（７ＴＭ）レセプターを介して作用することの知られている伝達物質、ホルモンおよびケモカイン；ヒト７ＴＭレセプターに対する推定アゴニストであり得る天然化合物、非哺乳動物の生物学的に活性なペプチドであって、その哺乳動物の対応物が未だ同定されていないペプチド；および自然界には見出されていないが、未知天然リガンドとともに７ＴＭレセプターを活性化する化合物。このバンクは先ず機能的アッセイ（すなわち、カルシウム、ｃＡＭＰ、マイクロフィジオメーター、卵母細胞電気生理学など；下記参照）ならびに結合アッセイの両方を用いて、既知リガンドに対するレセプターを選抜するために使用する。
【実施例３】
【００８５】
リガンド結合アッセイ
リガンド結合アッセイはレセプターの薬理学を確認する直接法を提供し、高処理能力フォーマットに適合させ得る。レセプターに対する精製リガンドは結合研究用に高比活性（５０〜２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）に放射標識する。次いで、放射標識過程がそのレセプターに対するリガンド活性を減弱しないことを判断する。バッファー、イオン、ｐＨおよびヌクレオチドなどの他のモジュレーターについてのアッセイ条件を最適化し、膜と全細胞レセプター起源両方に対する作業シグナル対ノイズ比を確立する。これらのアッセイについて、特異的レセプター結合は、総会合放射活性マイナス過剰の非標識競合リガンドの存在下に測定した放射活性と定義する。可能であれば、１つを超える競合リガンドを用いて残余の非特異結合を確定する。
【実施例４】
【００８６】
アフリカツメガエル卵母細胞での機能アッセイ
標準的手法にしたがって、本発明レセプターｃＤＮＡをコードする線状化プラスミド鋳型からキャップＲＮＡ転写物をＲＮＡポリメラーゼによりインビトロで合成する。インビトロ転写物は最終濃度０.２ｍｇ／ｍｌとして水に懸濁する。卵巣葉を成熟メスヒキガエルから取り出し、第Ｖ期脱卵胞卵母細胞を得て、マイクロインジェクション装置によりＲＮＡ転写物（１０ｎｇ／卵母細胞）５０ｎｌボーラス注入する。２つの電極電圧クランプを用いて、アゴニストとの接触に応答した個々のアフリカツメガエル卵母細胞からの電流を測定する。Ｃａ２＋不含有バース（Barth）培地中、室温で記録を実施する。アフリカツメガエル系を使用し、既知リガンドとリガンド活性化用の組織／細胞抽出物を選抜する。
【実施例５】
【００８７】
マイクロフィジオメトリック・アッセイ
多様な二次メッセンジャーシステムを活性化すると細胞から少量の酸が放出される。形成された酸は大部分が代謝活性増加の結果として、細胞内シグナル伝達プロセスの燃料供給に必要とされる。細胞を取り巻く媒体のｐＨ変化は非常に小さいが、サイトセンサー・マイクロフィジオメーター（CYTOSENSOR microphysiometer）（モレキュラー・ディバイス（Molecular Devices Ltd., Menlo Park, CA））により検出可能である。サイトセンサーは、したがって、本発明のＧタンパク質共役レセプターなどのエネルギー利用細胞内シグナル伝達経路に共役するレセプターの活性化を検出することができる。
【実施例６】
【００８８】
抽出物／細胞上清スクリーニング
存在する大多数の哺乳動物レセプターについては未だにリガンドを活性化する同族体（アゴニスト）が存在しないままである。したがって、これらレセプターの活性リガンドはこれまでに同定されたリガンド・バンク内には含まれていない可能性がある。
したがって、本発明の７ＴＭレセプターは天然のリガンドを同定するための組織抽出物に対して（カルシウム、ｃＡＭＰ、マイクロフィジオメーター、卵母細胞電気生理学などの機能的選抜法を用いて）機能的に選抜する。
陽性の機能的応答を生じる抽出物は、活性化するリガンドが単離同定されるまで連続的に分画化することができる。
【実施例７】
【００８９】
カルシウムとｃＡＭＰ機能的アッセイにおいて、ＨＥＫ２９３細胞中で発現される７ＴＭレセプターはＰＬＣの活性化およびカルシウム動態化および／またはｃＡＭＰ促進もしくは阻害に機能的に結合していることが示されている。レセプター移入またはベクター制御細胞におけるＨＥＫ２９３細胞の基底カルシウムレベルは、正常で１００ｎＭないし２００ｎＭの範囲であることが観察された。組換えレセプターを発現するＨＥＫ２９３細胞にフラ２を負荷し、１日で、＞１５０の選択したリガンドまたは組織／細胞抽出物をアゴニスト誘発カルシウム動態化について評価する。同様に、組換えレセプターを発現するＨＥＫ２９３細胞について、標準ｃＡＭＰ定量アッセイ法を用いてｃＡＭＰ産生の促進または阻害を評価する。カルシウム一過性またはｃＡＭＰ変動を引き起こすアゴニストはベクター制御細胞内でテストし、その応答がレセプターを発現する形質移入細胞に特有のものかどうかを判断する。
【実施例８】
【００９０】
組織発現
プライマー設計
プライマーエクスプレス・プログラム（アップライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems））を使用するか、またはマニュアルどおりにオーファンＧＰＣＲ配列に対しプライマーを設計する。プライマーのアニール化温度および増幅条件はゲノムＤＮＡにより最適化する。各反応混合物は、０.２ｍＭ−ｄＮＴＰ、１.５ｍＭ−ＭｇＣｌ２含有１×ＰＣＲバッファー（ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ）、０.５単位ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ）、２２３ｎｇのゲノムＤＮＡ（プロメガ（Promega））、各５０ｐｍｏｌのプライマーおよび脱イオン水、総容量２５μｌを含む。サイクリングは０.２ｍｌチューブ中で、バイオメトラ（Biometra）Ｔ勾配ＰＣＲ機を用い、代表的には８回の反応をアニール化温度範囲４８℃〜７２.２℃として実施する。サイクリング条件は以下のとおりである：９４℃１分４５秒の変性を１サイクル、次いで９４℃１５秒間の変性、１５秒間のアニール化、７２℃３０秒間の進展を３５サイクル実施。反応物は１.５％アガロースゲル上で分析する。
【００９１】
細胞調製、ＲＮＡおよび第一鎖ｃＤＮＡ合成
ＲＮＡはＲＮイージー抽出キット（キアゲン（Qiagen））を用い、業者のプロトコールにしたがって、細胞から調製する。使用した細胞は一次ヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥＣ）、分化ＨＢＥＣ、一次ヒト肺線維芽細胞、一次ヒト気管支平滑筋細胞（ＳＭＣ）、ヒト末梢血Ｔ細胞、ヒト末梢血好中球、およびＧＭ−ＣＳＦで刺激した好中球である。一次ヒト細胞はバイオフィットテイカー（Biowhittaker）から購入するか、または明示している場合には標準手法にしたがってヒト末梢血から単離する。ヒト・マクロファージはインビトロで分化したヒト末梢血から標準プロトコールにしたがって調製する。第一鎖ｃＤＮＡは第一鎖ｃＤＮＡ合成キット（ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ）に備わった試薬とプロトコールを用いて、細胞から単離した全ＲＮＡから調製する。
【００９２】
ＲＴ−ＰＣＲ
選択した配列について、組織由来のｃＤＮＡに、また上記の異なる細胞型に、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によりそのプロフィールを描く。ＲＴ−ＰＣＲプロフィール描写に使用する組織ｃＤＮＡはクロンテック（Clontech）から購入する。各反応混合物は、０.２ｍＭ−ｄＮＴＰ、１.５ｍＭ−ＭｇＣｌ２含有１×ＰＣＲバッファー、０.５単位ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、各５０ｐｍｏｌのプライマーおよび脱イオン水、総容量２５μｌを含む。使用する鋳型ｃＤＮＡはクロンテック・パネルＩおよびパネルIIからの組織サンプル由来市販のｃＤＮＡ（２.５μｌ）から、または前項記載の細胞型から調製したｃＤＮＡ（１μｌ）からのものである。サイクリングは０.２ｍｌチューブ中で、バイオメトラ・トリオＰＣＲ機を用い、最適化したアニール化温度で実施する。サイクリング条件は以下のとおりである：９４℃１分４５秒の変性を１サイクル、次いで９４℃１５秒間の変性、１５秒間のアニール化、７２℃３０秒間の進展を３５サイクル実施。反応物は１.５％アガロースゲル上で分析し、臭化エチジウムで染色する。対照のＲＴ−ＰＣＲ反応は自家保有の遺伝子ＧＡＰＤＨに特異的なプライマーにより実施する。
【００９３】
ポリヌクレオチド４１３に対するプライマー配列は配列番号３（前進用）および配列番号４（逆進用）に示し、ポリヌクレオチド８８.１に対しては配列番号７（前進用）および配列番号８（逆進用）に示す。組織分布を表１に示す。
【００９４】
ＰＣＲ産物の配列決定
ＰＣＲ産物をアガロースゲルから切り出し、キアクイック（QIAquick）スピンゲル抽出キット（キアゲン）を用い、業者の指示書にしたがって精製する。ＰＣＲ産物は３０μｌの無菌水で溶出する。典型的には、精製ＰＣＲ産物１０ｎｇを配列決定するに際し、増幅に使用したプライマーの１つを使用し、またビッグダイ（BigDye）ターミネーター・サイクル配列決定ミックス（アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems））を業者の指示書にしたがって使用する。配列決定反応はＡＢＩ３１０シーケンサー上で分析する。
【００９５】
ノーザンブロット分析
ノーザンブロット分析は１２レーン多重組織ノーザンブロット（クロンテック）を用い、業者の指示書にしたがって実施する。簡単に説明すると、ゲル精製ｃＤＮＡ（２５ｎｇ）を新鮮な［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰにより、レッディプライム（Rediprime）標識キット（アマーシャム（Amersham））を用いて、業者の指示書にしたがって標識した。標識したプローブは９５℃で５分間変性し、次いで使用直前に５分間氷上で冷却する。０.１ｍｇ／ｍｌ変性ニシン精子ＤＮＡ含有エクスプレスハイブ（ExpressHyb）溶液（クロンテック）５ｍｌ中、ハイベイド（Hygaid）オーブンにて６８℃３０分間プレハイブリダイゼーションを実施する。ニシン精子ＤＮＡ（０.１ｍｇ／ｍｌ）および変性プローブ含有の新たなエクスプレスハイブによりハイブリダイゼーションを実施する。ハイブリダイゼーションは６８℃で約２時間行う。ブロットは２×ＳＳＣ、０.０５％ＳＤＳで室温１０分間４回洗浄し、次いで０.１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで５０℃２０分間２回洗浄する。ブロットをプラスチックバッグに封入し、リン光画像スクリーン（モレキュラー・ダイナミックス（Molecular Dynamics））に一夜露光する。画像はストーム・ホスホイメイジャー機器（モレキュラー・ダイナミックス）を使用し、またイメージクワント（ImageQuant）５.０ソフトウエアにより加工処理する。ブロットを０.５％ＳＤＳ中１０分間沸騰してストリップし、β−アクチン（クロンテック）３２Ｐ−標識プローブで再ハイブリッド形成する。
【００９６】
【表１】
2005503137.tif 000003
【００９７】
組織発現
−：検出されず
＋：弱いシグナル
＋＋：良好なシグナル
＋＋＋：強いシグナル
【実施例９】
【００９８】
ＢＬＡＳＴ相同性検索
同定したまたは推定遺伝子に比較したヌクレオチドおよびアミノ酸レベルでのパーセント相同性：
【００９９】
【表２】
2005503137.tif 000004
【実施例１０】
【０１００】
ＣＨＯ−Ｋ１−ＣＲＥ細胞株にて安定に発現されるシングレット＿４１３レセプター
リガンドの釣り上げはオーファンレセプター・シングレット＿４１３を安定に形質移入したＣＨＯ−Ｋ１−ＣＲＥ細胞において一過性Ｃａ２＋を生じ得る化合物を探索することからなる。Ｆｌｉｐｒ３８４を用い、該化合物を細胞に注射し、そのシグナル（反応速度）を同時に記録する。実験の２４時間前に細胞を収穫し、計測し、３８４穴プレートにウエル当たり１００００細胞を播種し、３７℃／５％ＣＯ２に放置する。実験当日、該化合物を容れたインジェクションプレートを下記表に記載のように調製する。
【０１０１】
【表３】
2005503137.tif 000005
【０１０２】
ＨＢＳＳ／Ｈｅｐｅｓバッファー中、細胞に２μＭ−Ｆｌｕｏ−４を負荷する。３７℃／５％ＣＯ２で１時間インキュベーションした後、細胞を２.５ｍＭプロベネシド含有ＨＢＳＳ／Ｈｅｐｅｓで洗浄する（２回の洗浄サイクル＋容積調節を実施）。ＡＴＰで刺激するプレートは最終容量２０μｌに調整し、該化合物を直接入れるプレートは最終容量４０μｌに調整する。４枚のアッセイプレートに開始時２０μＭとして（最終濃度１０μＭ）２０μｌのＡＴＰを添加刺激し、室温で３０分間インキュベートする。最終濃度３倍のプレートの化合物を、フリップル（Ｆｌｉｐｒ）ピペッターにより、刺激および非刺激プレート両方に注入する。フリップルレーザーを０.６ワット、露光時間０.４秒に設定する。励起波長４８８ｎＭとする。化合物注入前に１０秒のベースラインを記録する。注入後、シグナルを１分間毎秒記録する。次いで、シグナルの減衰をさらに２０秒間測定する。２種の統計手段をエクスポートする：ＦｂａｓａｌおよびＦｍａｘ。各ウエルについて、ｄＦ／Ｆ値は以下の式で表す：（Ｆｍａｘ−Ｆｂａｓａｌ）／Ｆｂａｓａｌ；ただし、式中Ｆｂａｓａｌは化合物注入前の基底蛍光であり、Ｆｍａｘは反応速度ピーク値である。
【０１０３】
【表４】
2005503137.tif 000006
【０１０４】
初期刺激後、１５種の化合物がＣａ２＋一過性シグナルを示す。その内の１４種の化合物は脂質集団からのものである。これらの化合物につき、選択性をチェックするために野生型細胞および他の形質移入細胞を対象にテストする。５−ケトエイコサテトラエン酸はｄＦ／Ｆ＝１.４１を示し、非形質移入細胞上では不活性である。
【０１０５】
バリデーション
バリデーションはＥＣ５０を評価するために、容量反応方式で該化合物をテストすることにある。各化合物につき８濃度、４重測定でテストする。５−ケトエイコサテトラエン酸の保存濃度は０.１ｍＭである。テストした容量反応範囲は以下のとおりである：５００ｎＭ、１５８ｎＭ、５０ｎＭ、１５.８ｎＭ、５ｎＭ、１.５８ｎＭ、０.５ｎＭおよび０。
【０１０６】
細胞プレートの調製はリガンドの釣り上げと同様である（上記）。細胞はＡＴＰ１０μＭで刺激し、化合物注入前に３０分間インキュベートする。
【表５】
2005503137.tif 000007
５−ケトエイコサテトラエン酸のＥＣ５０は０.５ｎＭである。
【０１０７】
アデニリルサイクラーゼ活性測定のために、細胞を２４穴プレートに１ウエル当たり１０００００細胞の密度で播種し、２〜３日間培養維持する。アッセイ当日に細胞を洗浄し、［３Ｈ］アデニン（アマーシャム；２μＣｉ／ｍｌ）含有無血清培地中で４時間インキュベートし、細胞内ＡＴＰプールを標識する。要すれば、百日咳毒素（ＰＴＸ；シグマ、１００ｎｇ／ｍｌ）をこの標識化に際し含める。
【０１０８】
その後、プレートを洗浄し、細胞はイソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ；シグマ、１ｍＭ）補充ＨＢＳ（１３０ｍＭ−ＮａＣｌ、０.８ｍＭ−ＭｇＳＯ４、５.４ｍＭ−ＫＣｌ、０.９ｍＭ−ＮａＨ２ＰＯ４、１.８ｍＭ−ＣａＣｌ２、２５ｍＭグルコース、２０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ；ｐＨ７.４）５００μｌ中、３７℃でインキュベートする。次いで、細胞をジテルペン・フォルスコリン（ＦＳＫ；シグマ、３μＭ）で、また適切な濃度のレセプターアゴニストで刺激する。これらのアッセイ条件下で、ＡＣに陽性または陰性に共役したレセプターは、レセプターがそれぞれＦＳＫ−刺激シグナルを上昇または下降させたときに、検出することができる。
【０１０９】
１５分のインキュベーション後、バッファーを吸引することにより反応を停止させ、氷冷トリクロロ酢酸（５％）１ｍｌにより細胞を抽出する。［３Ｈ］ＡＴＰおよび［３Ｈ］ｃＡＭＰのプールはダウエックスおよびアルミナカラム上の連続クロマトグラフィーにより分離する。
【国際公開パンフレット】
2005503137.tif 000008
2005503137.tif 000009
2005503137.tif 000010
2005503137.tif 000011
2005503137.tif 000012
2005503137.tif 000013
2005503137.tif 000014
2005503137.tif 000015
2005503137.tif 000016
2005503137.tif 000017
2005503137.tif 000018
2005503137.tif 000019
2005503137.tif 000020
2005503137.tif 000021
2005503137.tif 000022
2005503137.tif 000023
2005503137.tif 000024
2005503137.tif 000025
2005503137.tif 000026
2005503137.tif 000027
2005503137.tif 000028
2005503137.tif 000029
2005503137.tif 000030
2005503137.tif 000031
2005503137.tif 000032
2005503137.tif 000033
2005503137.tif 000034
2005503137.tif 000035
2005503137.tif 000036
2005503137.tif 000037
2005503137.tif 000038
2005503137.tif 000039
2005503137.tif 000040
2005503137.tif 000041
2005503137.tif 000042
2005503137.tif 000043
2005503137.tif 000044
2005503137.tif 000045
2005503137.tif 000046
2005503137.tif 000047
2005503137.tif 000048
2005503137.tif 000049
2005503137.tif 000050
2005503137.tif 000051
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005503137.tif 000052
【国際調査報告】
2005503137.tif 000053
2005503137.tif 000054
2005503137.tif 000055
2005503137.tif 000056
2005503137.tif 000057
2005503137.tif 000058