(57)【要約】本発明は、組織工学の分野、特に関節における病的な組織（主として、骨及び軟骨）の置換、及び関節における変形性関節症状態の治療と予防に関する。この目的のために、本発明は、細胞組成物の製造方法であって、間葉細胞及び滑液を用意する段階、並びに細胞組成物を得るために、これらを混合する段階を含む方法を開示する。変形性関節症及び関節疾患又は関節欠陥の治療に用いられる細胞組成物を提供する。さらに、該細胞組成物は移植片の製造に用いられる。最後に、本発明は、関節欠陥の治療方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記段階：（ａ）間葉細胞を用意する段階；（ｂ）滑液を用意する段階；（ｃ）細胞組成物を得るために、間葉細胞と滑液とを混合する段階を包含する、細胞組成物の製造方法。
【請求項２】
段階（ａ）で用意する間葉細胞を骨髄、脂肪組織、血液、海綿骨、軟骨又は他の間葉組織から単離する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
段階（ａ）で用意する間葉細胞が間葉前駆細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
段階（ａ）で用意する間葉細胞が自己由来である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
段階（ａ）で用意する間葉細胞が異種である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
段階（ａ）で用意する間葉細胞を、細胞培養で培養する、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
滑液を関節から得る、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
滑液が自己由来である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
段階（ｂ）で用意する滑液を合成的に製造する、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
段階（ｂ）で用意する滑液を化学的、物理的又は生物学的に修飾する、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
間葉前駆細胞が両能性又は多能性である、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
段階（ａ）で用意する間葉前駆細胞を、増殖因子及び／又は分化因子、サイトカイン、細胞外マトリックス成分又は走化性因子で処理する、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
段階（ａ）で用意する間葉前駆細胞を遺伝子工学によって修飾する、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかに記載の方法によって得られる細胞組成物。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれかに記載の方法によって得られる細胞組成物の、ヒト及び動物の関節欠陥の治療のための使用。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれかに記載の方法によって得られる細胞組成物の、関節窩中への注入のための使用。
【請求項１７】
請求項１〜１３のいずれかに記載の方法によって得られる細胞組成物の、関節欠陥中への注入のための使用。
【請求項１８】
請求項１〜１３のいずれかに記載の方法によって得られる細胞組成物の、関節欠陥の手術間治療のための使用。
【請求項１９】
請求項１〜１３のいずれかに記載の方法によって得られる細胞組成物の、間葉組織移植片のインビトロ培養のための使用。
【請求項２０】
間葉細胞及び滑液を包含する細胞組成物。
【請求項２１】
間葉細胞を骨髄、脂肪組織、血液、海綿骨、軟骨又は他の間葉組織から単離する、請求項２０記載の細胞組成物。
【請求項２２】
間葉細胞が間葉前駆細胞である、請求項２０又は２１に記載の細胞組成物。
【請求項２３】
間葉細胞が自己由来である、請求項２０〜２２のいずれかに記載の細胞組成物。
【請求項２４】
間葉細胞が異種である、請求項２０〜２３のいずれかに記載の細胞組成物。
【請求項２５】
間葉細胞を細胞培養で培養する、請求項２０〜２４のいずれかに記載の細胞組成物。
【請求項２６】
滑液が関節から得られる、請求項２０〜２５のいずれかに記載の細胞組成物。
【請求項２７】
滑液が自己由来である、請求項２０〜２６のいずれかに記載の細胞組成物。
【請求項２８】
滑液が合成的に製造される、請求項２０〜２７のいずれかに記載の細胞組成物。
【請求項２９】
滑液が化学的、物理的又は生物学的に修飾される、請求項２０〜２８のいずれかに記載の細胞組成物。
【請求項３０】
間葉細胞が両能性又は多能性である、請求項２０〜２９のいずれかに記載の細胞組成物。
【請求項３１】
間葉細胞が、増殖因子及び／又は分化因子、サイトカイン、細胞外マトリックス成分又は走化性因子で処理される、請求項２０〜３０のいずれかに記載の細胞組成物。
【請求項３２】
間葉細胞が、遺伝子工学的に修飾される、請求項２０〜３１のいずれかに記載の細胞組成物。
【請求項３３】
請求項１〜１３のいずれかに記載の方法によって得られる細胞組成物をキャリヤー物質上で培養することによって得られる移植片。
【請求項３４】
下記段階：（ｉ）関節から滑液を抽出する、又は合成滑液を製造する段階、（ｉｉ）滑液と間葉細胞とを混合する段階、（ｉｉｉ）関節中へ（ｉｉ）からの混合物を注入する段階を包含する、ヒト及び動物の関節欠陥の治療方法。
【請求項３５】
段階（ｉ）が合成滑液の製造である、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
段階（ｉ）と（ｉｉ）の間で段階（ｉ）からの滑液を化学的、物理的又は生物学的に修飾することを特徴とする、請求項３４又は３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
間葉細胞を骨髄、脂肪組織、血液、海綿骨、軟骨又は他の間葉組織から単離する、請求項３４〜３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
間葉細胞が間葉前駆細胞である、請求項３４〜３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
間葉細胞が自己由来である、請求項３４〜３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
間葉細胞が異種である、請求項３４〜３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
間葉細胞を細胞培養で培養する、請求項３４〜４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
滑液が自己由来である、請求項３４〜４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
間葉細胞が両能性又は多能性である、請求項３４〜４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
間葉細胞を増殖因子及び／又は分化因子、サイトカイン、細胞外マトリックス成分又は走化性因子で処理する、請求項３４〜４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
間葉細胞を遺伝子工学的に修飾する、請求項３４〜４４のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織工学(tissue engineering)の分野に関し、特に、関節における病的な組織（主に、骨及び軟骨）の置換、並びに関節における変形性関節症状態の治療及び予防二間する。このために、本発明は、間葉細胞及び滑液の用意、並びに細胞組成物を得るためのそれらの混合を包含する、細胞組成物の製造方法を開示する。変形性関節症及び関節疾患又は関節欠陥の治療に用いられる細胞組成物を提供する。その上、該細胞組成物は、移植片の製造に用いられる。最後に、本発明は、関節欠陥の治療方法に関する。
【０００２】
変形性関節症は、世界中で最も頻繁に生じる関節疾患であり、６５才を超える年齢の全ての人々の大半がこれに罹患している。このことから、必然的に、非常に高い臨床的、健康政策的及び経済的関与を生じている。主として、変形性の、加齢に伴う前記関節疾患の経過では、関節表面の段階的な限局性破壊と、隣接及び軟骨下骨構造（骨棘）の反応性で、調節されない局所的成長が生じる。この結果は、疼痛と、罹患関節の機能及び運動性の制限である。変形性関節症の発生に影響を及ぼす全身的要素は、年齢、性別、体重、急性骨粗しょう症、家族性前負荷(familial preload)及び機械的過負荷である。局所的要素は、特定の関節形状、位置異常、外傷、並びに関節に影響を与えるバイオメカニック要素(bio-mechanic factors)である。本来の変形性発生にも拘わらず、変形性関節症では、炎症性変化も滑膜炎（内関節皮膚(inner joint skin)の炎症）と同様に生じるばかりでなく、例えばサイトカイン及び増殖因子の炎症促進性生物学的メッセンジャーの産生も生じる(Rubin,J.Am.Osteopath.Assoc.,101,2001,p.2-5;van der Kraan and van den Berg,Curr.Opin.Nut.Metab.Care,3,2000,p.205-211)。
【０００３】
進行性変化は、重度に負荷した軟骨構造及び骨構造の領域における組織ホメオスタシスの調節不良(defective regulation)である、即ち、変形方法と修復方法との間にバランス異常が存在する。そのために、この疾患は、骨、筋系及び関節神経の弱体化を含めた関節全体の領域における機能不全の結果であり、これは、最終的には、罹患関節の機械的過負荷及び生化学的な意味を含む破壊(biochemically imported destruction)を招来する。
【０００４】
さらに、該疾患の変形性関節症の治癒が生じないことが重要である。物理療法的方法及び鎮痛性抗炎症性薬（例えば、非ステロイド系抗リウマチ薬）は、大抵の場合に、不充分な対症療法に過ぎない。デブリドマン、関節シェービング、ミクロフラクチャー及びドリリングのような、既知（慣用的）整形外科的方法も、不充分な効果を示すに過ぎない（Fitzgibbons,T.C., AAOS Instructional Course Letters,Vol.48,1999,p.246-248を参照のこと）。明確な変形性変化の場合にのみ、しばしば最終的方法として、内部人工関節置換による再構成手術(operative-reconstructive surgery)のみが残されており、そのため、この最後に挙げた方法は、確かに、非常に英断的方法であるが、この方法はなるべく回避しなければならない。
【０００５】
組織工学は、必要に応じて成形生体材料を補助する、機能的に活性な自己由来細胞の移植の可能性によって、有望な新規なテクノロジーを提供する。このようなテクノロジーを用いて、新しい組織が活性に形成されることができる、又は増殖することができる(Sittinger,M.et al.,Biomaterials,1994,p.451-456;Redlich,A.et al.,J.Mat.Sci.10,1999,p.767-772を参照のこと)。
【０００６】
そこで、もはや移植片に対する拒絶反応が生じないように、又は該反応が弱められるように、例えば、遺伝子工学によって、又は適当な基質と、免疫抑制性を有する因子との使用（例えば、DE-A 19632404）によって、新たに形成された組織を提供することができる。
【０００７】
ＤＥ−Ｃ４４３１５９８は、細胞培養からのインプラントの製造方法を記載する、この方法は、三次元担体構造への細胞の塗布と、その後の、細胞間マトリックスが少なくとも部分的に形成されるまでの培養培地による灌流を包含する。その後に、前記構造を患者に移植する。
【０００８】
同様に、ＤＥ−Ｃ４３０６６６１は、被覆された寸法安定性担体構造を記載しており、この構造は、その後、移植される。
最後に、ＤＥ−Ａ１９９５７３８８は、軟骨治癒及び軟骨保護のための基質を記載し、この基質は、局所細胞の活性化を可能にし、それ故、治癒方法の促進、又は細胞による罹患領域の過成長を生じる可能性がある。この場合、用いる基質を好ましくはペースト状で罹患関節表面に、骨の穿孔後に、即ち、関節腔と骨髄腔との間にダクトを形成した後に塗布する。
【０００９】
したがって、関節欠陥の治癒に関する先行技術(the state  of the art)の方法、すなわち組成物及び移植片の欠点は、該方法、すなわち組成物及び移植片がしばしば、関節の開孔、又は関節における又は関節内での大規模な機械的操作を必要にすることである。特に、このことは、担体構造に粘着する（その上、三次元である）移植片を関節中に注入しなければならない場合に該当する。したがって、感染の危険性が増大し、罹患関節の治癒は困難になるか、又は不可能になる。その上、移植片の灌流中に存在する状態は、関節内に存在する生理的状態とは異なる。
【００１０】
したがって、変形性関節症性の関節欠陥を治療するために、できるだけ控え目な(sparing)代替手段を開発するという強い必要性が先行技術に存在する。さらに、罹患した関節又は関節領域の再生を可能にし、できるかぎりインビボ状態に近似し、効果的である、変形性関節症及び関連病理の治療のための組成物を提供する必要性が存在する。その上、インビボ状態に近似した状態下で培養されたものであって、高度な生体適合性を有する移植片を提供する必要性が存在する。最後に、好ましくは最低侵襲性の手法による関節欠陥の治療を可能にする組成物を提供する必要性も、先行技術に存在する。
【００１１】
その結果、変形性関節疾患、特に変形性関節症の控え目で、インビボ状態に近似した、効果的な治療を可能にする組成物を提供することが、本発明の目的である。本発明の他の目的は、本発明による組成物の製造方法を提供すること、並びに本発明による組成物の使用によって製造される移植片を提供することである。最後に、本発明の１つの目的は、変形性関節症及び同様な変形性関節疾患の治療方法を提供することである。
【００１２】
上記及び他の目的は、本発明による方法及び細胞組成物によって達成される。
それ故、本発明は、下記段階：（ａ）間葉細胞を用意する段階；（ｂ）滑液を用意する段階；（ｃ）細胞組成物を得るために、間葉細胞と滑液とを混合する段階を包含する、細胞組成物の製造方法に関する。
【００１３】
段階（ａ）に記載する間葉細胞の用意は、好ましい実施態様では、例えば、骨髄、軟骨又は血液から新たに単離された細胞の使用を包含する。例えば、軟骨バイオプシーを用いて、最初に、関節の無負荷領域(unloaded region)から組織として又は軟骨として細胞を採取することができる。その後、前記軟骨バイオプシーから、個々の軟骨細胞を酵素消化(enzymatic digest)によって単離する。本発明の好ましい実施態様では、細胞を用意する前に、細胞を細胞培養で培養して、増殖させる。この場合に、後の混合物、特に、インビトロでの間葉細胞と滑液との好ましい混合物（段階（ｃ）参照）を問題なく、かつ機械的方法を用いずに得ることができるように、懸濁培養で細胞を培養することが特に好ましい。本発明の好ましい実施態様では、滑液の用意（段階（ｂ））は凍結滑液の使用に関し、この凍結滑液を使用前に解凍した。好ましい実施態様では、滑液を、間葉細胞との混合（段階（ｃ））前に、関節から抽出するが、この場合に、間葉細胞との混合直前に、滑液を抽出することが特に好ましい。間葉細胞と滑液との混合は、任意の順序で行なうことができる。混合後に存在する、容量単位当りの細胞数（細胞密度）に関して、１細胞／ｍｌから４０００万細胞／ｍｌ（最終細胞密度）までの密度が有利であり、２００万〜３０００万細胞／ｍｌ流体の細胞密度が好ましく、５００万〜１５００万細胞／ｍｌ流体（最終細胞密度）の細胞密度が特に好ましい。
【００１４】
好ましい実施態様では、本発明はさらに、段階（ａ）で用意する間葉細胞が、骨髄、脂肪組織、血液、海綿骨、軟骨又は他の間葉組織から単離される方法に関する。この場合に、原則として、間葉細胞を含有する、全ての組織を用いることができる。前記細胞の単離方法は、当業者に知られている。
(Haynesworth,S.E.,Goshima,J.,Goldberg,V.M.,Caplan,A.I.,Bone 13(1)(1992),p.81-88;
Haynesworth,S.E.,Baber,M.A.,Caplan,A.I.,Bone,13(1992),p.69- 80;Pittenger,M.F.,Mackay,A.M.,Beck,S.C.,Jaiswal,R.K.,Douglas,R.,Mosca,J.D.,Moorman,M.A.,Simonetti,D.W.,Craig,S.,Marshak,D.R.,Science,284(1999),p.43-147; Burmester,G.R.,Menche,D.,Merryman,P.,Klein,M.,Winchester,R.,Arthritis Rheum.26(1983),p.1187-1195;Sittinger,M.,Bujia,J.,Minuth,W.W.,Hammer,C.,Burmester,G.R.,Biomaterials15(1994),p.451-456; Sittinger,M.,Reitzel,D.,Dauner,M.,Hierlemann,H.,Hammer,C.,Kastenbauer,E.,Planck,H.,Burmester,G.R.,Bujia,J., J.Biomed.Mat.Res.33(1996),p.57-63;並びに米国特許５，４８６，３５９を参照のこと）。
【００１５】
本発明はまた、段階（ａ）で用意する間葉細胞が、間葉前駆細胞又は間葉祖先細胞である方法にも関する。先行技術に記載されているヒト胚祖先細胞(embryonic ancestral cells)の単離及び培養は、原則的には、適当な培養条件及び発達条件下で、前記全能細胞(omnipotent cells)から、例えば、軟骨細胞、骨細胞、皮膚細胞、筋肉細胞、肝臓細胞、腎臓細胞及び神経細胞のような、非常に異なる細胞集団の任意の身体固有の細胞形を作製する可能性を開くものである。しかし、前記組織特異性細胞の発達に関係する関連制御サイクルの非常な複雑さ、倫理的理由並びに前記細胞の限られた入手可能性が、重大な問題を惹起する可能性がある。骨欠陥及び軟骨欠陥を治療するための本発明による間葉前駆細胞の使用は、該細胞が既にそれらの発達において進んでおり、間葉細胞型に関するそれらの発達可能性について判明しているので、有利である。
【００１６】
本発明の意味(meaning)における間葉前駆細胞は、間葉祖先細胞をも包含する。間葉前駆細胞並びに間葉祖先細胞は、高度な再生能力を有し（Caplan,A.I., Clin.Plast.Surg.21,1994,p.429-435)、適当な培養条件下で、又は例えば遺伝的変化を用いた(by means of genetic change)適当な操作後に、軟骨、骨、筋肉、脂肪組織及び結合組織への発達を意味する、間葉組織の細胞に直接発達することができる。これらは、成人供与者(adult donator)の血液、骨髄及び脂肪組織から得ることができる(Pittenger,M.F.et al., Science,1999,p.143-147)ので、胎芽、全能胚細胞又は胚組織の、倫理的に論争される使用を本発明に関しては回避することができる。このことは、本発明による細胞組成物の医学的／製薬的適用可能性及び生産可能性を保証する。さらに、先行技術から知られる組織工学の既知方法は、通常、自己由来細胞の再生に基づいており、これを、その後に、例えば完全に発達した移植片として患者に再移植する。残念ながら、該細胞の増殖可能性は限定されており、多くの細胞系列を用いたインビトロ再生は、細胞の機能性(functional quality)を本質的に弱めて、このことが、次には、これらの細胞を移植にあまり適さないものにする。それ故、上記制限を受けない、本発明による間葉前駆細胞の使用は、有利である。
【００１７】
さらに、本発明は、特に好ましい実施態様で、段階（ａ）で用意する間葉細胞が自己由来である方法に関する。本発明の意味における“自己由来”は、移植する前に移植患者自体から採取された細胞を用いることを意味する。このことは、大手術前の自己供血と同様に−移植又は注入のために、遺伝的及び免疫学的に受容者(acceptor)に合わせて（ＭＨＣ組織適合性に関して）完全に調節された細胞又は細胞組成物を用いるという、かなりの利点を提供する。
【００１８】
好ましい実施態様では、本発明はさらに、段階（ａ）で用意する間葉細胞が異種である方法を提供する。自己由来細胞が移植のために利用できない場合には、本発明に関連して異種細胞又は細胞組成物を適用することもできる。“異種”とは、これに関連して、受容者とは異なる個体からの間葉細胞を、該細胞組成物の製造のために用いることができることを意味する。
【００１９】
さらに、好ましい実施態様では、本発明は、段階（ａ）で用意する間葉細胞が、細胞培養で培養される方法に関する。それによると、細胞を用意する前に、当業者に知られた細胞培養方法を用いて、間葉細胞の培養を行なう、この場合に、５〜５０日間の培養期間が有利であり、１０〜４０日間が好ましく、２０〜２５日間の期間が特に好ましい。
【００２０】
本発明は、好ましい実施態様において、滑液が関節から得られる方法に関する。好ましくは、滅菌した針又は注射器による穿刺によって関節から直接、滑液を得る。それによると、該関節は、生存哺乳動物（ヒトを含める）の一部であることができる。しかし、滑液を死亡した哺乳動物又は供与者(donator)から得ることも可能である。
【００２１】
他の好ましい実施態様では、本発明は、細胞組成物の製造方法であって、滑液が自己由来である方法に関する。本発明の意味における“自己由来”とは、移植前に、移植患者自体から採取した滑液を用いることを意味する。このことは、−間葉細胞に関して既に上述したように−、遺伝的及び免疫学的に受容者に合わせて完全に調節された、細胞又は細胞組成物を移植又は注入のために用いることができるという、かなりの利点を有する。このことは、受容者の拒絶反応の危険性を最少にするか、又は該反応を大規模に除去する。
【００２２】
さらに、本発明は、段階（ｂ）で用意する滑液が合成的に製造される方法に関する。滑液の合成的製造は、本発明に関連して、天然滑液と同様であるように再操作された(re-engineered)溶液を製造することを意味する、この場合に、好ましい実施態様では、前記溶液は細胞を含まない。他の好ましい実施態様では、合成滑液はタンパク質を含まない、この場合、細胞を含まず、タンパク質を含まない合成滑液が特に好ましい。最後に挙げた合成滑液は、本質的に免疫原を含まないために、多くの供与者に適合するので、広範に適用可能である滑液である。
【００２３】
さらに、本発明は、段階（ｂ）で用意する滑液が、化学的、物理的又は生物学的に修飾される方法に関する。本発明に関連した“化学的修飾”とは、滑液を主として化学的方法で処理することである。化学的修飾のために典型的であるのは、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティ・クロマトグラフィー、塩析、振り出し(shaking out)、分別沈殿、化学物質による処理若しくは化学物質の供給、酸若しくは塩基によるｐＨ値の調節、滑液の透析及び化学物質との反応である。本発明に関連した“物理的修飾”とは、主として物理的方法を用いた滑液の処理を意味する。物理的修飾のために典型的であるのは、この場合に、遠心分離、加熱／冷却処理、沸騰、冷却(cooling down)等である。本発明に関連した“生物学的修飾”とは、主として生物学的方法を用いた滑液の処理を意味する。生物学的修飾のために典型的であるのは、この場合に、遺伝子工学による細胞の修飾、該滑液からの細胞の供給／抽出、及び細菌、ウイルス、真菌又は微生物或いはこれらの代謝産物による該滑液の処理である。生物学的に活性な物質又は分子の供給も、本発明に関連した生物学的修飾である。本発明に関連して、特に好ましいのは、段階（ｃ）において間葉細胞を“クリアになった(cleared)”（殆ど、細胞を含まず及び／又はタンパク質を含まないことを意味する）滑液と混合することができるように、抽出後に存在するタンパク質が（例えば、沈殿とその後の遠心分離によって）及び／又は抽出後に存在する細胞又は細胞部分が（例えば、遠心分離によって）除去されている滑液である。
【００２４】
他の好ましい実施態様では、本発明は、用いる間葉細胞が両能性又は多能性である方法に関する。上述した、高度に胚性(embryonic character)を有し、いずれの所望の組織にも分化可能である全能(omnipotent)細胞又は細胞系（同意語：全能(totipotent)細胞又は細胞系）とは対照的に、本発明に関連して好ましく用いられる両能性又は多能性である細胞は、ある一定の−たとえ、低いとしても−分化度を既に有しており、成人供与者から得ることができる。このことは、このような細胞の良好な入手可能性と、問題のない抽出をもたらす。本発明の意味における“両能性”とは、用いる間葉（前駆）細胞が２つの異なる細胞種類に分化可能であることを意味し、これに対して“多能性(pluripotent)”とは、分化によって２種類を超える細胞が発生しうることを意味する。治療方法又は薬物の製造における胚組織の使用（それにも拘わらず、胚組織の利用可能性は制限される）又は胚細胞の使用に関して現在考察される倫理的問題は、両能性又は多能性細胞を用いる場合には、後退する。この理由から、本発明は、組織再生のために、本発明の意味では両能性又は多能性の間葉祖先細胞を包含する（上記参照）両能性又は多能性の間葉前駆細胞を使用することに基づく。増殖及び分化に関するこれらの細胞の可能性は、基本的には同様に、殆ど限定されず、そのために、前記細胞種類は、軟骨及び骨の組織工学のために特に重要である。
【００２５】
さらに、好ましい実施態様では、本発明は、段階（ａ）で用意する間葉細胞が増殖因子及び／又は分化因子、サイトカイン、細胞外マトリックス成分又は走化性因子で処理される方法に関する。間葉前駆細胞の分化挙動は、定義された(defined)培養条件で影響される可能性があるか、又はインビボでも、例えばＥＧＦ、ＤＣＧＦ、ＩＧＦ若しくはＦＧＦのような、種々な増殖因子及び分化因子の影響によって、又はＴＧＦ−βスーパーファミリーから得られる因子によって影響される可能性がある。本発明の範囲内で用いられるサイトカインは、インターロイキン、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ並びにＴＧＦ−ファミリーを含む。細胞外マトリックス成分としては、コラーゲンが典型的である。本発明に関連して、例えば、ＶＥＧＦ、ＳＤＦ−１、ＭＤＣ、ＭＩＰ、“スチール因子(steel factor)”、ＧＭ−ＣＳＦ及びインターロイキンを、間葉前駆細胞の処理に用いることができる。この場合に、“処理する(treating)”又は“処理(treatment)”なる用語は、間葉細胞が上記物質若しくは因子に暴露される、又はこれらの存在下で、ある一定期間インキュベートされる、又は前記因子と混合されるという意味で理解しなければならない。
【００２６】
本発明はまた、段階（ａ）で用意する間葉細胞が遺伝子工学によって修飾される方法に関する。好ましい実施態様では、間葉細胞の遺伝子工学による修飾が、例えば、培養中の場合と同様に、細胞中への所望の酵素又は構造タンパク質の発現を可能にするプラスミドの挿入によって行なわれる。しかし、染色体が例えば化学作用剤又は組み込み型ベクターによって修飾された細胞を用いることも可能である。このようにして、間葉細胞組成物の細胞に有利な性質を加えることができ、これらが後の治療の場（好ましくは罹患関節内を意味する）で有利な作用を生じる。例えば、このような作用は細胞外マトリックスタンパク質（コラーゲン）の過度発現であることができ、これらのタンパク質は、罹患した又は外科的に前処理された関節領域へのさらなる細胞及び細胞組織の定着を増加及び促進させる。
【００２７】
本発明はまた、上記方法のいずれかによって得られる細胞組成物にも関する。
本発明はまた、上記方法のいずれかによって得られる細胞組成物の、ヒト及び動物の関節欠陥の治療のための使用にも関する。本発明の意味での関節欠陥は、炎症性又は非炎症性発生方法によって惹起される、関節の病的変化である。
【００２８】
本発明はまた、上記方法のいずれかによって得られる細胞組成物の、関節窩中への注入のための使用にも関する。好ましい実施態様では、それによる出発物質は自己由来間葉細胞であり、これらの間葉細胞は、“天然滑液”としての自己由来滑液中で、罹患関節に挿入される。関節窩中又は直接、欠陥中への間葉細胞の適用は、細胞の定着を可能にし、細胞は、新たな軟骨又はさらに骨の形成及び再生のために、生理的条件下の欠陥領域中で分裂し、成熟することができる。
【００２９】
さらに、本発明は、上記方法のいずれかによって得られる細胞組成物の、関節欠陥中への注入のための使用に関する。関節窩中への注入（上記参照）の他に、状況に応じて、本発明に関連してトポロジー的理由から、欠陥自体中に細胞組成物を注入することが有利である可能性がある。
【００３０】
本発明はまた、上記方法のいずれかによって得られる細胞組成物の、関節欠陥の手術間治療(inter-operative treatment)のための使用にも関する。本発明に関連して、“手術間治療”なる用語は、本発明による組成物を、2回の関節手術の間の期間を利用して、関節欠陥の治療のために用いることを意味する。
【００３１】
最後に、本発明は、上記方法のいずれかによって得られる細胞組成物の、間葉組織移植片のインビトロ培養のための使用に関する。段階（ａ）〜（ｃ）で得られる細胞組成物は−関節欠陥中への注入及びそれに基づく前記欠陥のインビボ治療のための直接使用の他に−好ましい実施態様では、インビトロ培養のために、即ち、間葉細胞を包含する移植片の製造のために用いられる。特に好ましい実施態様では、三次元担体構造を用いることによって、このような移植片を培養する。それによると、担体構造として役立ち、間葉細胞によって定着される又は浸透される、例えば、ポリマー・フリース（例えば、ポリグリコール又はポリラクチドを包含する）、プラスチック・キャリヤー又はセラミック若しくは無機物質（例えば、ヒドロキシアパタイト）のような、生体適合性物質から出発する。この培養は、本発明による細胞組成物及び担体構造を含有するチャンバーで、担体構造が溶液によって包囲され、該細胞が前記構造に付着することができるように行なわれる。特に好ましい実施態様では、前記担体構造が吸収性であるので、間葉細胞が前記構造に付着し、関節欠陥中に移植された後に、該担体構造は上首尾に吸収される。移植片自体は、関節から得られたか又は合成された若しくは修飾されたものである（上記参照）滑液を包含する間葉細胞組成物を、担体構造の存在下で培養することによって得られる。それによると、担体構造は、好ましい実施態様では、完成移植片が示すべきである形状を既に有する。細胞と担体構造又はキャリヤー構造とからの前記移植片の製造方法は、当業者に知られており、特に、ＷＯ９４／２０１５１に記載されている。滑液（又は、修飾された若しくは合成された滑液）を包含する、本発明による細胞組成物の使用は、移植片を、関節内の状況に非常に類似した溶液中で培養するので、インビボ状態に近似する培養が可能であるという利点を有する。この培養は、受容者に対する高度の適合性を有する安定な移植片を結果として生じる。
【００３２】
前記方法又は使用に関連して用いられる用語の定義は、下記に挙げる細胞組成物及び治療方法にも、本発明に関連して、適用される。
さらに、本発明は、間葉細胞及び滑液を包含する細胞組成物、並びに該間葉細胞が、骨髄、脂肪組織、血液、海綿骨、軟骨又は他の間葉組織から単離されたものである細胞組成物に関する。
【００３３】
さらに、本発明は、好ましい実施態様において、該間葉細胞が間葉前駆細胞である細胞組成物に関する。本発明に関連して、“間葉前駆細胞”は間葉祖先細胞（上記参照）をも包含する。
【００３４】
本発明はまた、間葉細胞が自己由来である細胞組成物、間葉細胞が異種である細胞組成物、間葉前駆細胞が細胞培養で培養されたものである細胞組成物、滑液が関節から得られたものである細胞組成物、滑液が自己由来である細胞組成物、並びに滑液が合成的に製造されたものである細胞組成物に関する。
【００３５】
さらに、本発明は、滑液が化学的、物理的若しくは生物学的に修飾されたものである細胞組成物、間葉細胞が多能性である細胞組成物、間葉細胞が、増殖因子及び／又は分化因子、サイトカイン、細胞外マトリックス成分又は走化性因子で処理されたものである細胞組成物、並びに間葉前駆細胞が遺伝子工学によって修飾されたものである細胞組成物に関する。
【００３６】
最後に、本発明は、キャリヤー物質上で、上記方法のいずれかによって得られる細胞組成物を培養することによって得られる移植片に関する。キャリヤー構造又は担体構造（両用語は本発明に関連して同意語である）を形成する、好ましいキャリヤー物質は既に上述した。移植片は、既述したように、本発明による細胞組成物をキャリヤー構造の存在下（溶液中又は灌流下でも）で培養することによって製造される。
【００３７】
以下に挙げる治療方法で述べられる段階、物質及び組成物は、他に定義しない限り、上記で既に用いられた定義に従って解釈すべきである。
本発明はさらに、ヒト及び動物の関節欠陥の治療方法であって、下記段階：（ｉ）関節から滑液を抽出する又は合成滑液を製造する段階、（ｉｉ）滑液と間葉細胞とを混合する段階、（ｉｉｉ）関節中へ（ｉｉ）からの混合物を注入する段階を包含する方法に関する。
【００３８】
段階（ｉ）における関節からの滑液の抽出は、滅菌した針又は注射器を用いて、非破壊的方法で、好ましく行なわれる。本発明に関連して、滑液は生存する供与者又は死亡した哺乳動物（ヒトを包含する）のいずれに由来することもできる。抽出された滑液と間葉細胞との段階（ｉｉ）での混合は、任意の順序で行なうことができる。混合後に存在する容量単位当りの細胞数（細胞密度）に関して、１細胞／ｍｌ〜４０００万細胞／ｍｌ（最終細胞密度）の密度が有利であり、２００万〜３０００万細胞／ｍｌ流体の細胞密度が好ましく、５００万〜１５００万細胞／ｍｌ（最終細胞密度）の細胞密度が特に好ましい。受容者の関節中への混合物の注入（段階（ｉｉｉ））はできるだけ控え目にかつ無菌条件下で行なうべきである。本発明の範囲内で、全ての治療段階及び治療方法に関して最低侵襲性の方法の使用が好ましい。
【００３９】
本発明はまた、段階（ｉ）が合成滑液の製造である該方法に関する。
合成滑液の製造並びにその利点は、本発明に関連して、既に記載されている（上記参照）。
【００４０】
さらに、本発明は、段階（ｉ）と（ｉｉ）との間で段階（ｉ）からの滑液を化学的、物理的又は生物学的に修飾することを特徴とする方法に関する。
滑液の修飾の種々な可能性は、既に上述されており、これによって詳細に言及されている。
【００４１】
最後に、本発明は、ヒト及び動物の関節欠陥の治療方法であって、間葉細胞を骨髄、脂肪組織、血液、海綿骨、軟骨又は他の間葉組織から単離する方法、間葉細胞が自己由来である方法、間葉細胞が異種である方法、間葉細胞が細胞培養で培養される方法、間葉細胞が間葉前駆細胞である方法、並びに滑液が自己由来である方法に関する。
【００４２】
最後に、本発明は、間葉細胞が両能性又は多能性である方法、間葉細胞が増殖因子及び／又は分化因子、サイトカイン、細胞外マトリックス成分又は走化性因子によって処理される方法、及び間葉細胞が遺伝子工学によって修飾される方法に関する。
【００４３】
本発明をさらに下記実施態様を用いて説明する。これらの実施態様は、本発明を限定するものとは見なされず、本発明を例示するものである。
実施態様
実施例１
関節炎で変形している関節表面の治療用の細胞組成物を提供するために、最初に自己由来間葉前駆細胞を骨髄から単離する（Haynesworth,S.E., Goshima,J. Goldberg,V.M., Caplan,A.I., Bone 13(1)(1992),p.81-88; Haynesworth,S.E., Baber,M.A., Caplan,A.I., Bone 13(1992),p.69-80; Pittenger,M.F., Mackay,A.M., Beck,S.C., Jaiswal,R.K., Douglas,R., Mosca,J.D., Moorman,M.A., Simonetti,D.W., Craig,S., Marshak,D.R., Science 284(1999),p.43-147,並びに米国特許第５，４８６，３５９号を参照のこと）。該前駆細胞に細胞培養条件下でＤＭＥ培地（Biochrom KG,Berlin)を２４日間補充し、１０％自己由来血清(DME-autologS)と共に培養する。
【００４４】
吸引針を用いて、５〜１０ｍｌの滑液を病変関節から及び健全な関節から抽出して、次に、これに間葉前駆細胞を、５００万細胞／ｍｌの細胞濃度が得られるように、混合する。このために、前駆細胞を培養表面からトリプシンを用いて剥離して、２倍量のＤＭＥ−ａｕｔｏｌｏｇＳで処理して、カウントする。５００万細胞／ｍｌ滑液の細胞濃度を得るために、前駆細胞懸濁液の各量を遠心管（１５ｍｌ）に移して、室温において３００ｇで１０分間遠心分離する。上清を捨て、細胞ペレットを適当量の滑液中で血清学的ピペット（５ｍｌ）を用いて、上下にピペッティングすること(up-and down-pipetting)によって細心に混合する。このようにして得られる細胞組成物を注入毎に関節窩中に直接注入する。２〜３週間の間隔で細胞組成物を反復供給することによって、適用が行なわれる。
【００４５】
実施例２
関節表面の限局性欠陥の治療用の細胞組成物を得るために、最初に自己由来間葉前駆細胞を骨髄から単離する（Haynesworth,S.E., Goshima,J. Goldberg,V.M., Caplan,A.I., Bone 13(1)(1992),p.81-88; Haynesworth,S.E., Baber,M.A., Caplan,A.I., Bone 13(1992),p.69-80; Pittenger,M.F., Mackay,A.M., Beck,S.C., Jaiswal,R.K., Douglas,R., Mosca,J.D., Moorman,M.A., Simonetti,D.W., Craig,S., Marshak,D.R., Science 284(1999),p.43-147,並びに米国特許第５，４８６，３５９号を参照のこと）。該前駆細胞に細胞培養条件下でＤＭＥ培地（Biochrom KG,Berlin)を２４日間補充し、１０％自己由来血清(DME-autologS)と共に培養する。
【００４６】
吸引針を用いて、５〜１０ｍｌの滑液を病変関節から及び健全な関節から抽出して、次に、これに間葉前駆細胞を、５００万細胞／ｍｌの細胞濃度が得られるように、混合する。このために、前駆細胞を培養表面からトリプシンを用いて剥離して、２倍量のＤＭＥ−ａｕｔｏｌｏｇＳで処理して、カウントする。５００万細胞／ｍｌ滑液の細胞濃度を得るために、前駆細胞懸濁液の適当量を遠心管（１５ｍｌ）に移して、室温において３００ｇで１０分間遠心分離する。上清を捨て、細胞ペレットを適当量の滑液中で血清学的ピペット（５ｍｌ）を用いて、上下にピペッティングすることによって細心に混合する。このようにして得られる細胞組成物を欠陥中に直接注入する。
【００４７】
実施例３
関節における骨軟骨炎性欠陥の治療用の細胞組成物を得るために、最初に自己由来間葉前駆細胞を骨髄から単離する（Haynesworth,S.E., Goshima,J. Goldberg,V.M., Caplan,A.I., Bone 13(1)(1992),p.81-88; Haynesworth,S.E., Baber,M.A., Caplan,A.I., Bone 13(1992),p.69-80; Pittenger,M.F., Mackay,A.M., Beck,S.C., Jaiswal,R.K., Douglas,R., Mosca,J.D., Moorman,M.A., Simonetti,D.W., Craig,S., Marshak,D.R., Science 284(1999),p.43-147,並びに米国特許第５，４８６，３５９号を参照のこと）。該前駆細胞に細胞培養条件下でＤＭＥ培地（Biochrom KG,Berlin)を２４日間補充し、１０％自己由来血清(DME-autologS)と共に培養する。
【００４８】
吸引針を用いて、５〜１０ｍｌの滑液を病変関節から及び健全な関節から抽出して、次に、これに間葉前駆細胞を、１０００万細胞／ｍｌの細胞濃度が得られるように、混合する。このために、前駆細胞を培養表面からトリプシンを用いて剥離して、２倍量のＤＭＥ−ａｕｔｏｌｏｇＳで処理して、続いてカウントする。５００万細胞／ｍｌ滑液の細胞濃度を得るために、前駆細胞懸濁液の適当量を１５ｍｌ遠心管に移して、室温において３００ｇで１０分間遠心分離する。上清を捨て、細胞ペレットを適当量の滑液中で血清学的ピペット（５ｍｌ）を用いて、上下にピペッティングすることによって細心に混合する。このようにして得られる細胞組成物に、線維芽細胞増殖因子スーパーファミリーの骨誘導増殖因子又はトランスフォーミング増殖因子−β（１０ｎｇ／ｍｌ最終濃度）を混合して、これを骨欠陥中に直接注入する。該骨欠陥が硬化した後に、実施例１に記載したような、間葉前駆細胞を包含する細胞組成物を、軟骨欠陥の完全な治癒を達成するために、関節窩中に注入する。
【００４９】
実施例４
関節の軟骨欠陥を治療するために、関節の無負荷領域から軟骨バイオプシーを抽出する。酵素消化によって、軟骨細胞を軟骨バイオプシーから単離して(Burmester,G.R., Menche,D., Merryman,P., Klein,M., Winchester,R., Arthritis Rheum.26(1983),p.1187-1195; Sittinger,M., Bujia,H., Minuth,W.W., Hammer,C.,Burmester,G.R., Biomaterials 15(1994),p.451-456; Sittinger,M., Reitzel,D., Dauner,M.,Hierlemann,H., Hammer,C., Kastenbauer,E., Planck,H., Burmester,G.R., Bujia,J., J.Biomed.Mat.Res.33(1996),p.57-63を参照のこと）、ＲＰＭＩ培地(Biochrom KG,Berlin)を補充し、１０％自己由来血清（ＲＰＭＩ−ａｕｔｏｌｏｇＳ）を含む細胞培養で増殖させる。吸引針によって、５〜１０ｍｌの自己由来滑液を健全な関節から抽出し、これから、室温における３００ｇでの１０分間の遠心分離によって、細胞を除去する。上清に軟骨細胞を、１０００万細胞／ｍｌの細胞濃度が得られるように、混合する。このために、軟骨細胞を細胞表面からトリプシンによって剥離して、２倍量のＲＰＭＩ−ａｕｔｏｌｏｇＳで処理して、カウントする。１０００万細胞／ｍｌ滑液の細胞濃度を得るために、軟骨細胞懸濁液の適当量を１５ｍｌ遠心管に移して、室温において３００ｇで１０分間遠心分離する。過剰(excess)を捨て、細胞ペレットを適当量の滑液中で血清学的ピペット（５ｍｌ）を用いて、上下にピペッティングすることによって細心に混合する。このようにして得られる細胞組成物をＡＣＴ（自己由来軟骨細胞移植）を用いて欠陥中に注入して、該欠陥を自己由来骨皮膚(bone skin)で被覆縫合する(over-sewed)。
【国際公開パンフレット】
2005503146.tif 000002
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【国際調査報告】
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2005503146.tif 000032
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