(57)【要約】モノクローナル抗体に由来する親和性成熟抗体またはその一部を使用した、炭疽菌に感染した宿主または炭疽菌に感染した危険性のある宿主を治療するための組成物および方法について開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質毒素に対して結合特異性を有する精製された親和性成熟組換え抗体またはその一部。
【請求項２】
抗原ハイブリドーマからクローニングされた、請求項1記載の抗体。
【請求項４】
一部が、scFvフラグメント、Fabフラグメント、およびIgGフラグメントからなる群より選択される、請求項1記載の抗体。
【請求項５】
任意の抗体クラスを含む、請求項1記載の抗体。
【請求項７】
バクテリオファージに感染した細菌において発現された、請求項1記載の抗体。
【請求項８】
バクテリオファージが、防御性抗原に対して野生型抗体より少なくとも3倍高い親和性および増大した安定性を示す1つまたは複数のクローンについてスクリーニングされる、請求項7記載の抗体。
【請求項９】
ホモ二量体抗体を生じるように1つまたは複数のクローンが野生型抗体と融合している、請求項8記載の抗体。
【請求項１０】
タンパク質毒素から宿主を防御する、請求項1記載の抗体。
【請求項１１】
宿主がヒトである、請求項10記載の抗体。
【請求項１２】
宿主が哺乳動物である、請求項10記載の抗体。
【請求項１３】
約1対1の化学量論でタンパク質抗原に結合する、請求項1記載の抗体。
【請求項１４】
タンパク質毒素が、ボツリヌス毒素、ウェルシュ菌毒素、コノトキシン、リシン、サキトキシン、志賀毒素、黄色ブドウ球菌毒素、テトロドトキシン、ベロ毒素、マイクロシスチン(シアンギノシン)、アブリン、コレラ毒素、破傷風毒素、トリコテセンマイコトキシン、および動物の毒液に由来する毒素からなる群より選択される、請求項1記載の抗体。
【請求項１５】
炭疽菌防御性抗原に対して結合特異性を有する精製された親和性成熟組換え抗体またはその一部。
【請求項１６】
抗防御性抗原ハイブリドーマからクローニングされた、請求項15記載の抗体。
【請求項１７】
抗防御性抗原ハイブリドーマ14B7からクローニングされた、請求項15記載の抗体。
【請求項１８】
一部がscFvフラグメントを含む、請求項15記載の抗体。
【請求項１９】
任意の抗体クラスを含む、請求項15記載の抗体。
【請求項２０】
一部がscFvフラグメントを含み、少なくとも40kDaの一価抗体部分を生じるように抗体定常領域をさらに含む、請求項15記載の抗体。
【請求項２１】
バクテリオファージに感染した細菌において発現された、請求項15記載の抗体。
【請求項２２】
バクテリオファージが、防御性抗原に対して野生型14B7より少なくとも3倍高い親和性および増大した安定性を示す1つまたは複数のクローンについてスクリーニングされる、請求項21記載の抗体。
【請求項２３】
二価ホモ二量体抗体を生じるように1つまたは複数のクローンが14B7野生型と融合している、請求項22記載の抗体。
【請求項２４】
炭疽菌毒素から宿主を防御する、請求項15記載の抗体。
【請求項２５】
宿主がヒトである、請求項24記載の抗体。
【請求項２６】
宿主が哺乳動物である、請求項24記載の抗体。
【請求項２７】
約1対1の化学量論で炭疽菌防御性抗原に結合する、請求項15記載の抗体。
【請求項２８】
炭疽菌感染の症状を緩和する、請求項15記載の抗体。
【請求項２９】
炭疽菌防御性抗原を中和する、請求項15記載の抗体。
【請求項３０】
炭疽菌毒素中毒から宿主を防御する、請求項15記載の抗体。
【請求項３１】
少なくとも約63nMの平衡解離定数を示す、炭疽菌防御性抗原に対する精製抗体。
【請求項３２】
抗PAハイブリドーマからクローニングされた抗体配列から親和性成熟された、請求項31記載の抗体。
【請求項３３】
抗PAハイブリドーマ14B7からクローニングされた抗体配列から親和性成熟された、請求項31記載の抗体。
【請求項３４】
一部がscFvフラグメントを含む、請求項31記載の抗体。
【請求項３５】
任意の抗体クラスを含む、請求項31記載の抗体。
【請求項３６】
一部がscFvフラグメントを含み、少なくとも40kDaの一価抗体部分を生じるように抗体定常領域をさらに含む、請求項31記載の抗体。
【請求項３７】
細菌において発現された、請求項31記載の抗体。
【請求項３８】
防御性抗原に対して野生型14B7より少なくとも3倍高い親和性および増大した安定性を示す、請求項31記載の抗体。
【請求項３９】
親和性成熟抗体を発現する遺伝子が、二価ホモ二量体抗体を生じるように14B7野生型遺伝子と融合している、請求項31記載の抗体。
【請求項４０】
炭疽菌毒素から宿主を防御する、請求項31記載の抗体。
【請求項４１】
宿主がヒトである、請求項40記載の抗体。
【請求項４２】
宿主が哺乳動物である、請求項40記載の抗体。
【請求項４３】
約1対1の化学量論で炭疽菌防御性抗原に結合する、請求項31記載の抗体。
【請求項４４】
炭疽菌感染の症状を緩和する、請求項31記載の抗体。
【請求項４５】
炭疽菌毒素を中和する、請求項31記載の抗体。
【請求項４６】
炭疽菌毒素中毒から宿主を防御する、請求項31記載の抗体。
【請求項４７】
細菌感染の症状から防御する免疫応答を生じる、および/または細菌感染の症状を緩和する、細菌毒素に対する抗体を生成する方法であって、以下の段階を含む方法:
細菌毒素またはその断片を発現する微生物を、微生物内で発現されるバクテリオファージ中で培養する段階;
親和性成熟抗体またはその一部を発現するバクテリオファージライブラリーを構築する段階;
バクテリオファージライブラリーと微生物を接触させる段階;および
細菌毒素に対して少なくとも3倍高い親和性を有するバクテリオファージを選択する段階。
【請求項４８】
親和性成熟抗体が、細菌毒素に特異的な抗体に由来する遺伝子配列を含む、請求項47記載の方法。
【請求項４９】
親和性成熟抗体が、炭疽菌防御性抗原に特異的な抗体に由来する遺伝子配列を含む、請求項47記載の方法。
【請求項５０】
親和性成熟抗体が14B7抗体の一部を含む、請求項47記載の方法。
【請求項５１】
親和性成熟抗体が14B7抗体のscFv遺伝子断片を含む、請求項47記載の方法。
【請求項５２】
親和性成熟抗体に由来する遺伝子配列とヒト定常ドメインの融合後に、より大きな分子量の一価抗体が作成される、請求項49記載の方法。
【請求項５３】
二価ホモ二量体抗体が作成される、請求項47記載の方法。
【請求項５４】
抗体またはその一部が二価である、請求項51記載の方法。
【請求項５５】
親和性成熟抗体またはその一部を精製する段階をさらに含む、請求項47記載の方法。
【請求項５６】
抗体が炭疽菌毒素から宿主を防御する、請求項47記載の方法。
【請求項５７】
宿主がヒトである、請求項56記載の方法。
【請求項５８】
抗体が炭疽菌感染の症状を緩和する、請求項56記載の方法。
【請求項５９】
抗体が炭疽菌毒素を中和する、請求項56記載の方法。
【請求項６０】
炭疽菌に感染した宿主または炭疽菌に感染した危険性のある宿主を治療する方法であって、以下の段階を含む方法:
モノクローナル抗体から得られた、タンパク質毒素に対する親和性成熟抗体またはその一部を含む組成物を宿主に投与する段階。
【請求項６１】
宿主がヒトである、請求項60記載の方法。
【請求項６２】
宿主が哺乳動物である、請求項60記載の方法。
【請求項６３】
症状が発症した後に親和性成熟抗体が投与される、請求項60記載の方法。
【請求項６４】
親和性成熟抗体またはその一部が予防的に投与される、請求項60記載の方法。
【請求項６５】
親和性成熟抗体またはその一部がscFvフラグメントを含む、請求項60記載の方法。
【請求項６６】
親和性成熟抗体またはその一部が少なくとも63nMの解離定数を示す、請求項60記載の方法。
【請求項６７】
薬学的に許容される担体中に毒素に対する親和性成熟抗体またはその一部を含む、病原体感染を治療するための薬学的組成物。
【請求項６８】
毒素が細菌毒素である、請求項67記載の薬学的組成物。
【請求項６９】
毒素が炭疽菌毒素である、請求項67記載の薬学的組成物。
【請求項７０】
炭疽菌を治療する方法であって、以下の段階を含む方法:
薬学的に許容される担体中の、炭疽菌防御性抗原に対して結合特異性を有する治療有効量の精製された親和性成熟抗体またはその一部を、炭疽菌の治療を必要とする個体に投与する段階。
【請求項７１】
タンパク質毒素に対して結合特異性を有する固定化され精製された親和性成熟組換え抗体またはその一部を含む診断装置。
【請求項７２】
指標をさらに含む、請求項71記載の診断装置。
【請求項７３】
指標が色の変化をさらに含む、請求項72記載の診断装置。
【請求項７４】
親和性成熟組換え抗体またはその一部に対して結合親和性を有する固定化されたタンパク質毒素を含む診断装置。
【請求項７５】
指標をさらに含む、請求項74記載の診断装置。
【請求項７６】
指標が色の変化をさらに含む、請求項75記載の診断装置。
【請求項７７】
タンパク質毒素に対する暴露を診断する方法であって、以下の段階を含む方法:
タンパク質抗原に対して結合特異性を有する固定化され精製された親和性成熟組換え抗体またはその一部を含む診断装置と液体を接触させる段階、および
タンパク質抗原と抗体の反応が表れたかどうか診断装置を分析する段階。
【請求項７８】
液体が血液、尿、唾液、または他の体液である、請求項77記載の方法。
【請求項７９】
分析が検出器を含む、請求項77記載の方法。
【請求項８０】
検出器が、色、放射能、光ルミネセンス、化学ルミネセンス、蛍光、表面プラズモン共鳴などを検出する、請求項79記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、一般的に、抗体工学の分野、特に、治療の初期段階および進んだ段階で治療上有用な中和抗体構築物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
本願は変更書式であり、2001年11月5日に出願された米国特許仮出願第60/332,849号の優先権を主張する。
【０００３】
米国政府は、米国陸軍、テキサス大学会計番号26-0454-85、および国防総省助成金番号DAA21-93C-0101により本発明において一定の権利を有し得る。
【０００４】
本発明の範囲を限定することなく、真っ先に開発される生物戦病原体の1つである炭疽菌(Bacillus anthracis)の感染の治療に関連して、本発明の背景が説明される。現在、炭疽菌は、一例として米国において大きな脅威と認識されている。
【０００５】
今までこの分野での炭疽菌を形成する胞子に関する研究は、炭疽菌がヒトにまれにしか発生しないために限られてきた。一般的に炭疽病(anthrax)と呼ばれる炭疽菌による感染は、ひづめのある哺乳動物において最もよく発生する。ヒトでの予防処置計画は、一般的に、ペニシリン、ドキシサイクリン、およびフルロキノロンを含むいくつかの抗生物質を使用することに限られている。(Morbidity and Mortality Weekly Report.2001.最新情報:生物テロに関連する炭疽菌の研究および炭疽菌を保菌している可能性のある人間を臨床評価するための中間ガイドライン(Investigation of bioterrorism-related anthrax and interim guidelines for clinical evaluation of persons with possible anthrax.)50:941-8)。炭疽菌ワクチンでも感染を予防することができるが、米疾病管理予防センター(CDC)は一般の人々に広範囲の予防接種を薦めていない。(CDC Health Alerts,Advisories, and Updates.2001.郵便物を手で触るか、または処理をする職場での炭疽菌への暴露から就業者を保護するためのCDC中間勧告(CDC Interim Recommendations for protecting workers from exposure to Bacillus anthracis in work site where mail is handled or processed.)2000年10月31日 www.cdc.gov/DocumentsApp/Anthrax/10312001/han51.asp)。実際に、一般の人々へのワクチン接種は行われていない。
【０００６】
ヒト炭疽病の重篤な形として、吸入型炭疽病、皮膚型炭疽病、および腸型炭疽病が挙げられる。吸入型炭疽病は、通常、致死性である。腸型炭疽病は、汚染された食品を食べた後に起こることがあり、腸管の急性炎症により特徴付けられる。仮に発生しても、炭疽病が直接人間を介して広がる可能性は極めて低い。従って、CDCは、炭疽病にかかった人に接触した人(例えば、家庭で接触した人、友人、または同僚)が同じ感染源に暴露されていない限り、接触した人に予防接種または治療する必要はないと説明している。
【０００７】
炭疽菌に感染した人に対する治療の成功は、抗生物質耐性の発生率の増加および生存の機会を小さくする治療の遅れなどのいくつかの要因によって限定される。抗生物質を用いた炭疽病の早期治療は死亡率を低下させるのに必須であり、治療の遅れは生存率を著しく低下させることが知られている。しかしながら、例えば、細菌胞子を吸入した場合、今までに吸入型炭疽病として知られている感染の初期症状は風邪の症状と似ている場合があるので、早期治療は難しい。さらに、どのように細菌に接触したかによって、炭疽菌感染の症状が現れるのに7日から60日かかることがある。
【０００８】
炭疽菌の病原性は、2つの点、すなわち浮腫の出現により明らかになる毒性作用と、感染者の死亡につながることがある、いわゆる致死性の毒性作用で現れる。これらの作用は、炭疽菌に存在する3種類のタンパク質因子の組み合わせによって生じる毒素の存在に起因している。ヒトおよび哺乳動物において、毒素は、宿主に症状がないように見える感染初期段階でも体内で増加する。このことは、治療の遅れが死につながり得る理由を説明している。従って、より優れた炭疽病介入治療が絶対に必要とされるだけでなく、感染初期に炭疽菌の存在を確かめるためのポイントオブケアの迅速でかつ極めて感度の高い診断検査が絶対に必要とされる。
【０００９】
様々な細菌感染に対する治療介入として、毒素を抗体(通常、ポリクローナル抗体)で中和する受動免疫が用いられてきた(Keller M A,Stiehm E R,感染症の予防および治療における受動免疫(Passive Immunity in Prevention and Treatment of Infectious Diseases.)Clin.Microbiol.Reviews 13:602-614)。患者にポリクローナル抗血清を使用する大きな制約は、異なる種に由来するタンパク質に対する患者の免疫応答による「血清病」の可能性である。さらに、高親和性の抗体が毒素中和に有効であるが、ポリクローナル血清の親和性を故意に高める一般的な方法はなく、ハイブリドーマに由来するモノクローナル抗体でさえ親和性を意図して高める一般的な方法はない。
【００１０】
高親和性の操作された抗体または抗体構築物を用いて毒素を中和する一般的な治療法を、炭疽病、ジフテリア(diptheria)、百日咳、破傷風を生じる天然の細菌株、および志賀毒素を生成する大腸菌株を含む様々な細菌感染に適用することができる。ウシ流産菌(Brucella abortus)、マルタ熱菌(Brucella melitensis)、ブルセラ・スジス(Brucella suds)、オウム病クラミジア(Chlamydia psittaci)、ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)、野兎病菌(Francisella tularensis)、シュードモナス・マレト (Pseudomonas mallet)、偽鼻疽菌(Pseudomonas pseudomallei)、チフス菌(Salmonella typhi)、志賀赤痢菌(Shigella dysenteriae)、コレラ菌(Vibrio cholera)、ペスト菌(Yersinia pestis)などのオーストラリアグループの病原性細菌も抗体介入の対象に入れることができる。さらに、ボツリヌス毒素、ウェルシュ菌(Clostridium perfringens)毒素、コノトキシン、リシン、サキトキシン、志賀毒素、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)毒素、テトロドトキシン、ベロ毒素、マイクロシスチン(シアンギノシン(Cyanginosin))、アブリン、コレラ毒素、破傷風毒素、トリコテセンマイコトキシン、または動物の毒液に由来する毒素などの導入毒素を含む生物戦病原体として使用することを目的とした遺伝子操作された病原体を、同じように中和することができる。これにより、ワクチンが入手できない感染症でさえ生存率が著しく増加する。
【発明の開示】
【００１１】
発明の概要
しかしながら、炭疽菌に暴露された患者を予防的に処置するための現在の組成物および方法は、抗生物質による治療が感染症に完全に効くように、細菌の防御性抗原(protective antigen)または毒素を標的としないことが分かっている。現行の治療レジメの重大な問題は、抗体が、広く使用されるのに必要な親和性およびアビディティを有さないことである。
【００１２】
必要とされるのは、炭疽菌防御性抗原に対して結合特異性を有する精製された親和性成熟組換え抗体またはその一部である。1つの態様において、抗体は、抗防御性抗原ハイブリドーマ(例えば、マウスハイブリドーマ14B7)からクローニングされる。抗体の一部は、抗体の任意の一部またはフラグメント(例えば、scFvフラグメント)でよい。抗体は任意の抗体クラスの抗体でよい。例えば、抗体はscFvフラグメントから得られてもよく、例えば、少なくとも40kDaの一価抗体部分を生じるように抗体定常領域をさらに含む。
【００１３】
抗体は、不完全PCR増幅後に、ハイブリドーマからクローニングされた野生型抗体配列より高い親和性を有するクローン(例えば、エラープローン発現ライブラリー)を選択することによって親和性成熟されてもよい。1つの態様において、防御性抗原に対して野生型より少なくとも3倍高い親和性および増大した安定性を示すクローンが選択される。
【００１４】
親和性成熟抗体またはその一部は、二価ホモ二量体抗体を生じるように、例えば、14B7野生型と融合されてもよい。抗体またはその一部は、一般的に、炭疽菌毒素から宿主を防御する。宿主は、例えば、ヒトでもよく、一例では、約1対1の化学量論を示す。炭疽菌防御性抗原に対する精製抗体は、一般的に、少なくとも約63nMの平衡解離定数を示す。
【００１５】
本発明はまた、細菌感染の症状から防御する免疫応答を生じる、細菌毒素に対する親和性成熟抗体を生成する方法に関する。前記方法は、細菌毒素またはその断片を発現する微生物を、微生物内で発現されるバクテリオファージ中で培養する段階を含む。次いで、バクテリオファージライブラリーが親和性成熟抗体またはその一部を発現する。バクテリオファージライブラリーおよび微生物を接触させ、細菌毒素に対して少なくとも3倍高い親和性を有するバクテリオファージが選択される。本発明を用いて、炭疽菌防御性抗原に特異的な親和性成熟抗体が作成された。
【００１６】
本発明は、炭疽菌に感染した宿主または炭疽菌に感染した危険性のある宿主を治療する方法をさらに含み、前記方法は、モノクローナル抗体から得られた親和性成熟抗体またはその一部を含む組成物を宿主に投与する段階を含む。親和性成熟抗体は症状が始まった後に投与されてもよく、予防的に投与されてもよい。1つの態様において、親和性成熟抗体またはその一部は、例えば、少なくとも約63nMの解離定数を有するscFvフラグメントでもよい。
【００１７】
本発明はまた、薬学的に許容される担体中に毒素に対する親和性成熟抗体またはその一部を含む、病原体感染を治療するための薬学的組成物を含む。毒素は細菌毒素(例えば、炭疽菌毒素)でもよい。例えば、炭疽菌感染の治療は、薬学的に許容される担体中の、炭疽菌防御性抗原に対して結合特異性を有する治療有効量の精製された親和性成熟抗体またはその一部を、炭疽菌の治療を必要とする個体に投与する段階を含んでもよい。
【００１８】
本発明はまた、タンパク質毒素に対して親和性を有する親和性成熟抗体を組み込み、固定化した診断装置を含む。逆の配置、すなわち、親和性成熟抗体の存在を診断するためにタンパク質毒素が固定化および使用される配置も含まれる。
【００１９】
本発明はまた、タンパク質毒素に対する暴露を検出するための診断方法を含み、前記方法は、タンパク質毒素に対して親和性を有する親和性成熟抗体を含み、組み込み、固定化した診断装置と液体(例えば、血液または尿)を接触させる段階、および診断装置を分析する段階からなる。
【００２０】
本発明の特徴および利点をさらに完全に理解できるようにするために、発明の詳細な説明と添付の図面が参照される。異なる図面中の同じ数字は同じ部分を指している。
【００２１】
発明の詳細な説明
本発明の様々な態様の作成および使用が以下で詳細に議論されるが、本発明は、様々な特定の場面で具体化し得る多くの適用可能な発明概念を提供することが理解されるべきである。本明細書で議論される特定の態様は、本発明を作成および使用する特定の方法の単なる例示であり、本発明の範囲を定めない。
【００２２】
炭疽菌は、世界の多くの土地で見られる、動物からヒトに感染する土壌生物である。グラム陽性細菌である炭疽菌の耐熱性胞子を吸入して感染すると、治療せずに放置しておくと、80％の死亡率まで達する(Shafazand.CHEST 116:1369-76)。現実に、炭疽菌は真っ先に開発される生物戦病原体の1つであった。炭疽菌は大きな脅威と認識され続けている。ワクチン株が開発されているが、広範囲の使用はできず、CDCによる推奨もされていない。
【００２３】
吸入後、炭疽菌胞子は肺胞マクロファージ内で発芽し、リンパ節に移動する。リンパ節で胞子は増殖し、血流に入り、急速に血液1ミリリットルにつき107〜108個の生物に達する(Dixon T,Meselson M,Guillemin J,Hanna P.1999.炭疽菌(Anthrax)New England Journal of Medicine 341:815-26)。増殖期の細菌は、疾患の原因である3つの成分からなるエキソトキシンを放出する。この毒素は83kDaポリペプチドの防御性抗原(PA)であり、最近特定されたマクロファージ表面受容体に結合し(Bradley AB,Mogridge J,Mourez M,Collier RJ,Young JAT.2001.炭疽菌毒素の細胞受容体の特定(Identification of the Cellular Receotpr for Antthrax Toxin.)Nature 414)、フリン様プロテアーゼにより切断され、七量体環にオリゴマー化した後、2つの触媒成分、致死因子(lethal factor)(LF)または浮腫因子(edema factor)(EF)の移動を促進する(図1)。LFは、MEK1、2、3を切断する亜鉛メタロプロテアーゼであり、サイトカインTNFαおよびIL-1βを放出させ、宿主おいてショックを誘導する。EFは、局所浮腫を引き起こし、好中球機能を損なうカルモジュリン依存性アデニル酸シクラーゼである(Leppla.Handb Exp Pharmacol.2000.145:445-72)。
【００２４】
炭疽菌毒素機構および14B7中和ステップを図1Aに示す。ステップ2において、PAは、未同定の細胞受容体と結合する。ステップ2において、PAはフリン様細胞表面プロテアーゼにより切断されて、20kDaのN末端断片20PAを放出する。63Paは結合したままである。ステップ4において、受容体に結合しているPAは七量体化し、その後、ステップ5において、EFおよびLFが化学量論的に七量体化PAに競合結合する。ステップ6において、複合体は受容体を介したエンドサイトーシスによって内部移行し、その後、小胞が酸性化する。次いで、PAはコンフォメーションを変えてエンドリソソーム膜に孔を作り、ステップ7に示されるように、この孔を通ってEF/LFは拡散する。抗体14B7は、ステップ1においてPA結合部位で細胞受容体と競合することによって、この方法を妨害する。図1Bは抗体構築物を示す:Fab(インタクトな抗体のタンパク質分解消化から作成される);一価scFv;C末端二量体化ヘリックスにより二量体化されたscFv;およびscAb(scFvとヒトκ定常ドメインのC末端融合により作成される)。
【００２５】
毒素または胞子による攻撃後の死亡を妨げる治療ストラテジーとして、毒素の働きを阻止することが積極的に推し進められてきた。毒素の阻止は、以下の3つの方法の1つによりPAの機能を破壊することによって最も良く達成される:抗体またはペプチドを用いた触媒サブユニット結合の阻害(Mourez M,Kane RS,Mogridge J,Metallo S,Deschatelets Pら、2001.炭疽菌毒素の多価阻害剤のデザイン(Designing a polyvalent inhibitor of anthrax toxin.)Nature Biotechnology 19:958-61;Little SF,Novak JM,Lowe JR,Leppla SH,Singh Yら、1996.モノクローナル抗体を用いた炭疽菌防御性抗原の致死因子結合ドメインおよび細胞受容体結合ドメイン(Characterization of lethal factor binding and cell receptor binding domains of protective antigen of Bacillus anthracis using monoclonal antibodies.)Microbiology 142:707-15)、ネガティブドミナント変異体を用いたPAオリゴマー化の妨害(Sellman B,Mourez M,Collier R.2001.毒素サブユニットのドミナントネガティブ変異体:炭疽菌治療へのアプローチ(Dominant-Negative Mutants of a Toxin Subunit:An Approach to Therapy of Anthrax)Science 292:695-7;Singh Y,Khanna H,Chopra A,Mehra V.2001.炭疽菌防御性抗原のドミナントネガティブ変異体はインビボで炭疽菌毒素を阻害する(A dominant negative mutant of Bacillus anthracis protective antigen inhibits anthrax toxin in vivo.)Journal of Biological Chemistry 276:22090-4)、または抗体による毒素とその受容体の結合の阻止。最後のストラテジーは広範囲にわたって調べられており、エアロゾル化炭疽菌胞子で攻撃された実験動物において試験されている唯一のものである(Little S,Ivins B,Fellows P,Friedlander A.1997.モルモットにおける炭疽菌感染に対するポリクローナル抗体による受動防御(Passive protection by polyclonal antibodies against Bacillus anthracis infection in guinea pigs.)Infection and Immunity 65:5171-5)。PAに対するポリクローナル抗体の惹起は防御と相関している(Pitt M,Little S,Ivins B,Fellows P,Barth Jら、2001.吸入型炭疽病ウサギモデルにおける免疫のインビトロでの相関関係(In vitro correlate of immunity in a rabbit model of inhalational anthrax.)Vaccine 19:4768-73)、実際に、FDAより認可されたワクチンの主な免疫原成分を構成する。攻撃、特に、非常に毒性の強い炭疽菌株に対するモノクローナル抗体の防御能力は依然として問題となっている(Little S,Ivins B,Fellows P,Friedlander A.1997.モルモットにおける炭疽菌感染に対するポリクローナル抗体による受動防御、Infection and Immunity 65:5171-5)。
【００２６】
効果的な毒素中和への手掛かりは、遅いキネティックオフレイト(kinetic off-rate)に基づく高い親和性である。抗体のオフレイトがヒト血清中での抗体-毒素複合体のクリアランス時間より遅ければ、抗体は化学量論的に毒素を効果的に除去することができる。たとえクリアランス速度が抗体のオフレイトより遅くても、高親和性の抗体が少量の毒素をより良く中和することができるというのは理にかなっている。従って、高親和性の抗体を非常に低い用量で使用することができるので、治療用抗体試薬に対する不要な免疫反応などの副作用の可能性が少なくなる。強力な毒素を中和するのに、約70nMまたはそれ以下の解離定数(KD)を有する抗体が必要とされる。残念なことに、ポリクローナル免疫血清に由来する抗体の親和性を高める方法はなく、ハイブリドーマに由来するモノクローナル抗体についてもない。動物免疫化後に、単に「手にしたものを選択(take what one gets)」しなければならない。他方で、抗体工学は、合理的かつ進化的な方法により抗体の親和性および特異性の改善を可能にするだけではない。遺伝子工学的技法を用いて、親和性および特異性が増大した抗体を様々な形(例えば、ヒト化された全IgG、Fab、scAb、およびscFv)で作成することができる。これらの様々な形には全て特有の治療上の利点がある。
【００２７】
前述の理由の全てから、炭疽菌の症状を緩和し、感染後の抗生物質治療のウィンドウオブタイム(window of time)を延長することが必要とされる。本発明の組成物および方法は、医療の専門家および研究者に、感染したヒトまたは哺乳動物(従来、宿主として知られている)の防御を増大させ、感染の進んだ段階の患者を初めて治療する独特の治療法を提供する。
【００２８】
一般的に、以下の単語または句は、説明、実施例、および特許請求の範囲で用いられた時、指示された定義を有する。
【００２９】
用語「Fv」は、定常ドメインを含まない共有結合または非共有結合した重鎖および軽鎖のヘテロ二量体であると定義される。用語「scFv」は単鎖へテロ二量体を意味する。
【００３０】
用語「Fab'」は、抗体重鎖の可変ドメインおよび第1の定常ドメインと、抗体軽鎖の可変ドメインおよび定常ドメインと、重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端にある少なくとも1個の付加アミノ酸残基(1つまたは複数のシステイン残基を含む)からなるヘテロ二量体を含むポリペプチドと本明細書で定義される。F(ab')2抗体フラグメントは、1つまたは複数の共有結合により結合したFab'抗体フラグメント対である。Fab'重鎖はヒンジ領域を含んでもよい。これは、任意の望ましいヒンジアミノ酸配列でよい。または、ヒンジは、1個のシステイン残基、または好ましくは短い(約1〜10残基)システイン含有ポリペプチドに有利なように完全に除かれてもよい。特定の用途において、一般的な天然に生じる抗体ヒンジ配列(システインの後に、2個のプロリン、次いで、もう1つのシステイン)が用いられる。この配列はヒトIgG1分子のヒンジに見られる(Kabat EAら、1987.免疫学的に関心のあるタンパク質の配列(Sequence of Proteins of Immunological Interest)第3版.National Institutes of Health,Bethesda,MD)。他の態様において、ヒンジ領域は、別の望ましい抗体クラスまたはアイソタイプから選択される。本発明の特定の好ましい態様において、Fab'のCH1のC末端は配列Cys X Xと融合される。Xは、好ましくはAlaであるが、Arg、Asp、またはProなどの任意の他の残基でもよい。一方または両方のXアミノ酸残基が欠失されてもよい。
【００３１】
「ヒンジ領域」は、ネイティブな免疫グロブリンまたはその任意の配列バリアントのCH1とCH2の間に位置するアミノ酸配列である。以下で述べるヒト化4D5抗体の場合、ヒンジ領域は、残基224(...Cys Asp Lys...のasp)と233(...Cys Pro AlaのPro)の間に位置する。他の免疫グロブリンの類似領域が用いられるが、ヒンジ領域のサイズおよび配列は大幅に変わってもよいことが理解されるだろう。例えば、ヒトIgG1のヒンジ領域はわずか約10残基であるが、ヒトIgG3のヒンジ領域は約60残基である。
【００３２】
用語「Fv-SH」または「Fab'-SH」は、システイン遊離チオールを有するFvまたはFab'ポリペプチドと本明細書で定義される。好ましくは、遊離チオールはヒンジ領域にあり、通常、鎖内結合に関与している軽鎖および重鎖システイン残基はネイティブな形で存在している。本発明の最も好ましい態様において、Fab'-SHポリペプチド組成物は異なる成分のタンパク質分解フラグメントを含まず、実質的に(約90モルパーセントを超えて)Fab'フラグメントを含まず、ここで、重鎖および軽鎖は還元されているか、例えば、異常なジスルフィドまたはスルフヒドリル付加産物の形成によってネイティブな状態で存在しないように誘導体化されている。
【００３３】
本明細書での目的のヒト化抗体は、予め決められた抗原に結合することができ、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するFR領域および非ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列または予め選択された抗原に結合するように操作された配列を実質的に有するCDRを含む、免疫グロブリンアミノ酸配列バリアントまたはそのフラグメントである。
【００３４】
用語「調節配列」は、特定の宿主生物における機能的に連結されたコード配列の発現に必要なDNA配列を意味する。例えば、原核生物に適した調節配列として、プロモーター、選択的に、オペレーター配列、リボソーム結合部位、および転写ターミネーターが挙げられる。培養細胞が増殖および成熟している間に(例えば、対数増殖期)、Fab'ポリペプチド合成を増殖阻害量未満の濃度に抑制する、高度に調節される誘導性プロモーターが特に好ましい。
【００３５】
核酸は、別の核酸配列と機能的に関連するように配置された時に「機能的に連結」されている。例えば、プレ配列または分泌リーダーのDNAが、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されれば、ポリペプチドDNAに機能的に連結されている。プロモーターまたはエンハンサーがコード配列を転写すればコード配列に機能的に連結されている。または、リボソーム結合部位が、翻訳を促進するように配置されていればコード配列に機能的に連結されている。一般的に、「機能的に連結された」は、連結されているDNA配列が隣接しており、分泌リーダーの場合、隣接し、同じ読み枠にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは隣接している必要はない。連結は、便利な制限部位での連結により達成される。このような部位が存在しない場合、従来のやり方に合わせて合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが用いられる。
【００３６】
「外因性」エレメントは、細胞にとって外来の核酸配列、または細胞にあるものと相同であるが、そのエレメントが通常見られない宿主細胞核酸内に位置する核酸配列を意味すると本明細書で定義される。
【００３７】
本明細書で使用する表現「細胞」および「培養細胞」は同義で用いられ、このような全ての名称が子孫を含む。従って、単語「形質転換体」および「形質転換細胞」は、初代被験細胞および継代数に関係なく、それに由来する培養物を含む。全ての子孫は、人為的な変異または偶然の変異のためにDNA含有物が厳密に同一でなくてもよいことも理解される。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされたのと同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫が含まれる。様々な名称が前後関係から明らかになるであろう。
【００３８】
「プラスミド」は、小文字pの前および/または後の大文字および/または数字により示される。本明細書における出発プラスミドは市販されているか、制約なく公的に入手可能であるか、または公表されている手順に従って、このような入手可能なプラスミドから構築することができる。さらに、他の等価なプラスミドが当技術分野において周知であり、当業者に明らかであろう。
【００３９】
制限消化物からの、ある特定のDNA断片の「回収」または「単離」は、ポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲルでの電気泳動による消化物の分離、関心対象の断片の移動度と既知分子量のマーカーDNA断片の移動度の比較による関心対象の断片の同定、所望の断片を含むゲル部分の切除、およびゲルとDNAの分離を意味する。この手順は一般に知られている。例えば、Lawnら,1981.Nucleic Acids Res.,9:6103-6114およびGoeddelら,1980.Nucleic Acids Res.8:4057を参照のこと。
【００４０】
細胞からのDNAの「調製」は、宿主培養細胞からのプラスミドDNAの単離を意味する。一般的に用いられるDNA調製法は、Sambrookら(分子クローニング(Molecular Cloning): 1989.A Laboratory Manual New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press)のセクション1.25-1.33に記載されているラージスケールおよびスモールスケールのプラスミド調製である。DNA調製物は、当技術分野において周知の方法によって精製される(Sambrookら,前記のセクション1.40を参照のこと)。
【００４１】
「バクテリオファージ」は、天然宿主が細菌細胞である1つまたは多数のウイルスである。
【００４２】
本明細書で使用するモノクローナル抗体は、抗体産生細胞と骨髄腫細胞の融合物であるハイブリドーマ細胞により産生される。モノクローナル抗体は特異的であり、ほぼ全ての関心対象の抗原を対象とすることができ、大量に生成することができる。
【００４３】
本発明の一形態は、63nM〜0.25nMの範囲の平衡解離定数(KD)(表面プラズモン共鳴により測定される)を示す抗PA scFv抗体パネルを含む。操作されたscFv抗体は、インビボでのscFvの生体内分布に影響を及ぼすパラメータである、血清中でのインキュベーションならびに尿素変性および熱変性に対する非常に優れた安定性を示す。インビトロ細胞培養アッセイならびにラットモデルにおける炭疽菌毒素攻撃に対する防御が親和性と強く相関し、最も高い親和性の抗体(1H, KD =0.25nM)が最高に防御した。防御に及ぼすアビディティの影響を評価するために、scFvのホモ二量体二価バリアントも調製した。高いアビディティの抗体は細胞培養アッセイにおいて毒素を中和するのに非常に有効であるが、ラットモデルでは有効でない(恐らく、抗体の安定性が低いためである)。最後に、腎臓によるクリアランスキネティクスの遅れの影響を評価するために、ヒトκ定常ドメインと融合したscFv(scAb)を使用した(scFvでは28kDaに対してscAbでは45kDa)。
【００４４】
本発明により、百日咳毒素、ボツリヌス毒素、ウェルシュ菌毒素、コノトキシン、リシン、サキトキシン、志賀毒素、黄色ブドウ球菌毒素、テトロドトキシン、ベロ毒素、マイクロシスチン(シアンギノシン)、アブリン、コレラ毒素、破傷風毒素、トリコテセンマイコトキシン、または動物の毒液に由来する毒素などの他の細菌毒素も、前述の毒素に対する抗体を作成する段階的な遺伝子工学ステップを用いて中和される。
【００４５】
様々な抗体構築物が治療目的に使用されている。これらの抗体構築物として、全IgG抗体、Fab、scFv、および様々な二量体構築物(例えば、scAb)が挙げられる。大きな構築物、特に全IgG抗体には血清滞留時間が長いという大きな利点がある。二量体構築物にはアビディティという利点があり、小さな構築物には組織浸透性が高いという利点がある。
【００４６】
細菌毒素に加えて、高親和性の操作抗体は、昆虫、軟体動物、および爬虫類に遭遇した後の、これらの動物の毒液の中和に特に重要であり得る。高親和性scFvまたはscAbなどの小さな構築物は、全IgGと比較して血清病にかかる機会が少ないので速いクリアランス速度が利点である場合に特に有効であり得る。scFvなどの小さな構築物は、大きなタイプの抗体構築物より効果的に組織に浸透することができる。
【００４７】
親和性を高めた抗体はまた、診断試薬としてより大きな感度をもたらす。診断試薬として、このように感度が増大すると、血流中の少量の炭疽菌毒素の同定による合成炭疽菌の早期診断が可能になるかもしれない。特に、ポイントオブケアの時間内での早期診断により、首尾よい早期治療介入の可能性が高くなる。
【００４８】
当業者が炭疽菌PA毒素に対する他の抗体(例えば、PAの他の領域に結合する1G3)を使用できることも注目に値する。PAなどの毒素の標的をいくつかの異なるエピトープにすることには、ある特定の治療上または診断上の利点(例えば、診断試験の場合、いわゆる「サンドイッチ」アッセイ形式が可能になること、または治療用途の場合、協力作用的な非競合試薬が得られること)がある場合がある。
【００４９】
実施例
ハイブリドーマからのクローニング  重鎖および軽鎖の可変領域を、RT-PCRにより抗PAハイブリドーマ14B7からクローニングする(Krebber A,Bornhauser S,Burmester J,Honegger A,Willuda Jら、1997.改良ファージディスプレイシステムを用いたハイブリドーマおよび脾臓細胞レパートリーからの機能的抗体可変ドメインの信頼性の高いクローニング(Reliable cloning of functional antibody variable domains from hybridomas and spleen cell repertoires employing a reengineered phage display system.)J Immunol Methods 201:35-55)。VH遺伝子およびVL遺伝子をオーバーラップPCRにより連結し、5'側および3'側のSfiI部位を用いてpAK100ファージディスプレイベクターにクローニングする。大腸菌株中のシングルコロニーを96ウェルプレートにおいて増殖させ、ファージディスプレイscFvを産生させ、PA反応性クローンを同定するためにELISAによりスクリーニングする。
【００５０】
抗体親和性成熟  14B7 scFv遺伝子のエラープローンライブラリーを、マンガンおよび偏りのあるヌクレオチド比を用いて構築する(Daugherty P,Chen G,Iverson B,Georgiou G.2000.抗体の親和性成熟に及ぼす変異頻度の影響の定量分析(Quantitative analysis of the effect of the mutation frequency on the affinity maturation of antibodies.)Proc Natl Acad Sci USA、印刷中)。DNAシャッフリングを記載のように行う(Stemmer WPC.1994.DNAシャッフリングによるインビトロでのタンパク質の急速な進化(Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling.)Nature 370:389-91)。ライブラリー構築およびスクリーニング計画および親和性が改良されたクローンの系統を図2に示す。図2ではエラープローンPCRおよびDNAシャッフリングが行われる。例えば、パンニングは、イムノチューブ(immunotube)(ヌンク(Nunc))または高結合性ELISAウェル (コスター(Costar))に漸減濃度のPA(0.05μg/ml〜0.0003μg/ml)を一晩コーティングし、5％乳-PBSでブロッキングし、1011〜1012pfuファージを1時間添加し、その後に、低親和性ファージに結合するように可溶性PA(60nM)を2時間添加することによって行う。洗浄後(0.1％Tween-20を含むPBSで20回、その後にPBSで20回)、ファージを0.1Mエタノールアミン1mlで10分間溶出させ、新しいチューブに移し、1M Tris-HCl(pH7.5)500μlで中和する。溶出されたファージを力価測定し、次回パンニング用に、指数増殖しているTG1細胞に感染させるのに使用する。親和性成熟バリアントをスクリーニングする前に、各ライブラリーを5回パンニングする。
【００５１】
抗体発現  scFvを、SfiI-SfiIを介してファージディスプレイベクターpAK100から、以下の3つのうちの1つの発現ベクターにサブクローニングし((a)scFv発現用pAK300;(b)C末端二量体化ペプチドと融合したscFvからなる二価抗体作成用のpAK500(Krebber A,Bornhauser S,Burmester J,Honegger A,Willuda Jら、1997.改良ファージディスプレイシステムを用いたハイブリドーマおよび脾臓細胞レパートリーからの機能的抗体可変ドメインの信頼性の高いクローニング、J Immunol Methods 201:35-55);または(c)scAb発現用pAK400誘導体であるpMOPAC16(C末端ヒトκ定常ドメインが融合したscFv))、ペリプラズムシャペロンskpを同時発現させる。タンパク質は大腸菌BL21株のペリプラズム内に産生され、浸透圧衝撃および固定化金属アフィニティクロマトグラフィー(アマシャムファルマシア(Amersham Pharmacia))により精製される(Hayhurst A,Harris WJ.1999.大腸菌skpシャペロンの同時発現により単鎖抗体フラグメントの可溶性およびファージディスプレイが改善する(Escherichia coli skp chaperone coexpression improves solubility and phage display of single-chain antibody fragments.)Protein Expr Purif 15:336-43)。単量体および二量体scFvおよびscAbタンパク質を、溶離液としてPBSを用いてサイズ排除クロマトグラフィー(スーパデックス75(Superdex75),アマシャムファルマシア)により様々なオリゴマー化状態の形態から分離した(図3)。例えば、図3では、ニッケル親和性樹脂からの溶離液をスーパデックス75カラム(アマシャムファルマシア)にロードし、PBSで溶出する。scFvは主に単量体として溶出し、約20％が二量体および高分子量凝集物として溶出した。同じ条件下での再クロマトグラフィー後、単量体は単一ピークとして溶出される。二価Fv構築物は、溶出プロフィールに基づいて、およびネイティブPAGE分析により均一なように見える。精製収量は約200ng/OD600であり、これは全てのscFvバリアントについて1μg/mlに相当する。汚染エンドトキシン濃度をLALエンドトキシン試験により測定し、全ての調製物について＜10ng/Lであることが分かった。タンパク質濃度を、微生物学の分野において明らかなマイクロBCAアッセイにより測定する。
【００５２】
モノクローナル抗体およびFabフラグメントの調製  腹水をマウスIgG1 14B7ハイブリドーマから調製する。IgGを硫安沈殿させ、プロテインGクロマトグラフィーにより精製する。溶出後、IgG画分を、セントリコン-30(Centricon-30)カラムを用いて10mg/mlに濃縮し、脱塩する。Fabフラグメントを、パパイン(PBS-1mM EDTA-20mMシステインに溶解した10μgパパイン/mg免疫グロブリン)を用いて37℃で一晩消化することにより調製する。消化試料をプロテインA結合緩衝液(1.5Mグリシン,3M NaCl,pH8.9)で10倍に希釈し、組換えプロテインAカラム(シグマ(Sigma))に加える。Fabフラグメントを含むフロースルーを集め、セントリコン-10カラムで2mg/mlに濃縮し、溶離液としてPBSを用いてサイズ排除カラム(スーパーデックス200,アマシャムファルマシア)に加える。ELISAおよびSDS-PAGEによりFab画分に汚染FcおよびインタクトなIgGが無いことを確認する。
【００５３】
抗体:抗原結合性および安定性の分析。表面プラズモン共鳴により抗原結合キネティクスの分析を行う[Chenら、2001]。簡単に述べると、抗原(PAまたはBSA対照)を約1000RUのレベルでCM5チップ(ファルマシア)に固定化する。再結合効果を減らすために、試料を、HBS緩衝液(10mM HEPES,3.4mM EDTA,150mM NaCl,0.005％P20界面活性剤,pH7.4)中で速い流速(60μl/分)で走らせる。オンレイトは、少なくとも5種類の濃度(25nM〜300nM)の抗体を用いて測定した。
【００５４】
37℃、70℃、および対照として4℃での抗体安定性を、4つの試料(PBSに溶解した16μg/mlタンパク質)を各温度でインキュベートし、残った活性抗体の量をELISAでモニターすることによって測定する。尿素変性曲線を、0〜8.7Mの尿素濃度の存在下でタンパク質をPBSで最終濃度16μg/mlまで希釈することによって得る。折り畳まれたタンパク質および折り畳まれていないタンパク質を室温で3時間平衡状態に保った後、蛍光発光スペクトルを、フォトンテクノロジーインターナショナルスペクトロフルオリメーター(Photon Technology International spectrofluorimeter)を用いて得る。蛍光最大は、変性剤0の330nmから変性剤8.7Mの350nmにシフトし、これは蛍光強度の42％増加と同時に生じる。データは少なくとも3回の測定値の平均を示し、これを分析する(Pace CN.1990.タンパク質安定性の測定および増加(Measuring and increasing protein stability.)Trends in Biotechnology 8:93-8;Pace C,Shirley B,Thomson J.1989.タンパク質のコンフォメーション安定性の測定(In Measuring the Conformational Stability of a Protein)T.Creighton編,311-30頁.New York:IRL)。尿素変性の可逆性を評価し、完全に可逆性の変化を示したタンパク質についてのみデータを報告する。
【００５５】
毒素攻撃に対するマウスマクロファージの防御  毒素攻撃後、指定の時間で抗体を投与した後の(攻撃後中和;100ng/ml PA,50ng/ml LF)、RAW264.7マウスマクロファージ様細胞(ATCC番号TIB-71)の生存を、攻撃の0、5、10、または20分後に抗体を添加した以外は本質的にLittleら(Little SF,Leppla SH,Cora E.1988.炭疽菌毒素の防御性抗原成分に対するモノクローナル抗体の作成および特徴付け(Production and characterization of monoclonal antibodies to the protective antigen component of Bacillus anthracis toxin.)Infect Immun 56:1807-13)により述べられたように測定する。3時間後、生存率をMTTでモニターし、吸光度をA590で検出した。指定の抗体量で毒素攻撃から生き残った細胞のパーセントを報告する。
【００５６】
ラットモデルにおける毒素攻撃に対する防御  インビボ中和実験は、本質的にIvins B,Ristroph J,Nelson G.1989.炭疽菌致死毒素に対するフィッシャー344ラットの応答に及ぼす体重の影響(Influence of Body Weight on Response of Fischer 344 Rats to Anthrax Lethal Toxin.)Applied and Environmental Microbiology 55:2098-100に記載のように行う。80mg/kg体重のケタミンおよび10mg/kgキシラジンを腹腔内注射することによって、フィッシャー344ラット(各250〜275g;平均、標準偏差を加えること)に麻酔をかける。盲検試験で抗体(または滅菌PBS)を200μl体積で投与し、5分後に、両方とも陰茎静脈注射により、200μl体積で10×MLD致死量の炭疽菌毒素(40μg PA,8μg LF)(Ezzell JW,Ivins BE,Leppla SH.1984.炭疽菌毒素の防御性抗原および致死因子成分の免疫電気泳動分析、毒性、およびインビトロ生成キネティクス(Immunoelectrophoretic analysis, toxicity,and kinetics of in vitro production of the protective antigen and lethal factor components of Bacillus anthracis toxin.)Infect Immun 45:761-7)を投与する。5匹の動物を各試験条件に使用し、不快感および死亡対生存の時間についてモニターする。ラットを、不快感を最小限にするように麻酔した状態で5時間、または死亡するまで保つ。呼吸および心拍の停止により死亡をモニターする。生存しているラットを、過量のフェノバルビトールナトリウムの腹腔内注射によって安楽死させ、その後、適切に廃棄処分する。抗体調製物の防御能力は死亡までの時間の遅れとして測定し、p＜0.05水準で有意とみなされた(スチューデント片側t検定により測定した)。
【００５７】
異なる結合親和性を有する抗PA抗体の操作  14B7モノクローナル抗体のVHおよびVL遺伝子(Little SF,Leppla SH,Cora E.1988.炭疽菌毒素の防御性抗原成分に対するモノクローナル抗体の作成および特徴付け、Infect Immun 56:1807-13)をRT-PCRにより単離する。重鎖配列と軽鎖配列の間に (Gly4Ser)4リンカーをコードする配列が挿入された750bpのscFv遺伝子断片を作成するために、オーバーラップエクステンションPCRを使用する。scFv遺伝子は、繊維状バクテリオファージでのディスプレイのためにpIIIと融合している。5×105個の独立した形質転換体からなるライブラリーを構築するために、エラープローンPCRを使用する。このライブラリーをファージディスプレイでスクリーニングすることによって、クローンA2Eが単離された。対応するscFvタンパク質は、PAに対する3倍高い親和性および著しく増大した安定性を示す。DNA配列決定から、A2EはCDR L2に1個のL56Ser:Pro置換を含むことが明らかになった(表1)。
【００５８】
（表１）抗体親和性および安定性の概要
2005508395.tif 000002
＄  37℃の試験は90％FBS中で7日間行った。
＊  70℃のPBS中で2時間インキュベーションした後に残ったPA結合量
【００５９】
図4は、14B7 scFvおよび関連バリアントのアミノ酸配列アラインメントを示す。図4では、14B7 WT配列を一文字アミノ酸コードで記した。Kabat番号付けを横に示した。CDRを括弧でくくった。アミノ酸変化を赤字で示した。CDR L2の1個のL56Ser:Pro置換は、DNAシャッフリングにより親14B7 scFvと戻し交雑(backcross)した後でも後の全ての高親和性scFvに存在する(Stemmer WPC.1994.DNAシャッフリングによるインビトロでのタンパク質の急速な進化、Nature 370:389-91)。次いで、例えば、最初のライブラリーの5回目のファージパンニングから単離されたクローンのDNAシャッフリングは、DNAシャッフリングにより再結合される。結果として生じた遺伝子プールは増幅され、ランダム変異誘発にかけられ、5回のファージパンニングによりスクリーニングされる。方法全体(すなわち、シャッフリング、エラープローン変異誘発、およびパンニング)が繰り返され、比較に値する抗原親和性を示すクローン6Aおよび1Hが得られた。さらなる研究のために後者の抗体が選択された。DNA配列決定から、1HはL56Ser:Proに加えて、さらに2つの変異:CDR L2のL55Q:Leuおよび重鎖フレームワーク4に位置するH106ALys:Arg変異を含むことが明らかになった。
【００６０】
親和性成熟変異体に加えて、変異L97Leu:Alaを含む抗体も構築した。L97Leu:Ala置換は高い平衡解離定数をもたらし、14B7:PA境界の33残基のアラニンスキャニング変異誘発試験の一環として特定された。二価ホモ二量体scFv抗体を、14B7野生型ならびにA2E scFvおよび1H scFvとC末端二量体化ポリペプチドで融合させることによって構築した。(Krebber A,Bornhauser S,Burmester J,Honegger A,Willuda Jら、1997.改良ファージディスプレイシステムを用いたハイブリドーマおよび脾臓細胞レパートリーからの機能的抗体可変ドメインの信頼性の高いクローニング、J Immunol Methods 201:35-55)。最後に、さらに大きな分子量の一価scAb(45kDa)を、scFvとヒトκ定常ドメインとのC末端融合によって作成した(Hayhurst A,Harris WJ.1999.大腸菌skpシャペロンの同時発現により単鎖抗体フラグメントの可溶性およびファージディスプレイが改善する、Protein Expr Purif 15:336-43)。
【００６１】
特徴分析  全てのscFvおよびscAbが比較に値するレベルで大腸菌において発現した。少なくとも0.25〜0.5μgタンパク質/A600または1mg/L培養物の精製収量が得られ、これは十分に発現された他の治療用scFv抗体の収量に匹敵する。抗体は、金属アフィニティクロマトグラフィーの後、さらに高分子量の凝集物を除去するためにサイズ排除FPLCにより精製される。scFvは大部分が(＞80％)単量体であり、大腸菌での発現中にインビボで二量体化する傾向をほとんど示さない(図5)。クロマトグラフィー後、単離された単量体scFvタンパク質は、高分子量化学種が＞95％フリーである。新たに精製された抗体試料を、表面プラズモン共鳴による抗体結合キネティクスの決定および炭疽菌毒素の中和効力の評価に使用した。二量体scFvは、何週間も4℃でインキュベーションした後でさえ、どの汚染低分子量形態も高分子量形態も現れることなく均一なままであった。
【００６２】
14B7 FabおよびscFvは同じ抗原結合キネティクスを示し(表面プラズモン共鳴により測定した)、3.1±0.3×105 M-1 sec-1のkonおよび0.0035±2 sec-1のオフレイトから12nMの平衡解離定数が得られた(表1)。比較のために、二価IgGは2.3nMのKDを示した(二価結合を最小限にするためにチップ上で低カップリング密度のPAの条件下で測定した)。A2Eおよび1H変異体は、それぞれ、1/3および1/48の平衡解離定数を示した(表1)。対照的に、アラニン変異体L97は14B7より5倍以上高いKDを示す。scFvの二量体化により、対応する単量体と比較してほぼ10倍高い見かけの親和性が得られた。二価構築物の親和性増大は明らかにアビディティ効果によるものであり、これは以前の知見と一致している(Willuda J,Kubetzko S,Waibel R,Schubiger P,Zangemeister-Wittke Uら、2001.自己会合ペプチドにより多量体化された一価、二価、および三価の抗p185HER2ミニ抗体の腫瘍標的化(Tumor targeting of mono-, di-, and tetravalent anti-p185HER2 miniantibodies multimerized by self associating peptides.)Journal of Biological Chemistry 276:14385-92)。
【００６３】
上皮腫瘍抗原糖タンパク質-2(glycocoprotein-2)を認識するscFv抗体の生体内分布および標的化効率は、タンパク質の熱安定性および変性剤安定性と相関する(例えば、Willuda J,Kubetzko S,Waibel R,Schubiger P,Zangemeister-Wittke Uら、2001.自己会合ペプチドにより多量体化された一価、二価、および三価の抗p185HER2ミニ抗体の腫瘍標的化、Journal of Biological Chemistry 276:14385-92)。従って、安定性に差があると、抗PA抗体の中和能力を評価する時に親和性効果がかき消される。ほとんどのscFvは37℃の血清中で急速に活性を失うが(Benhar I,Pastan I.1995.モノクローナル抗体B3の単鎖Fvを安定化する残基の同定(Identification of residues that stabilize the single-chain Fv of monoclonal antibodies B3.)J Biol Chem 270:23373-80;Helfrich W,Kroesen BJ,Roovers RC,Westers L,Molema Gら、1998.T細胞をヒト癌腫に再標的化するための二重特異性抗体の構築および特徴付け(Construction and characterization of a bispecific diabody for retargeting T cell to human carcinomas.)Int J Cancer 76:232-9)、試験された全ての組換え抗体は血清中での不活化に対して非常に安定であることが分かった。scFvおよびscAbは高温でも優れた安定性を示したが、二量体化scFvは高温で安定性を示さなかった(表1)。特に、A2E scFvは、70℃で2時間インキュベーションした後でさえ結合活性の約25％を保持した。scAbは、恐らく、Ckドメインによる好ましい相互作用が寄与するために、それぞれのscFvより高い熱安定性を示す。注目すべきことに、14B7 Fabはこれらの条件下で結合活性の消失を示さない(表1)。
【００６４】
尿素中での抗体の変性は、アンフォールディングの際に生じるタンパク質蛍光の変化をモニターすることによって評価した(Pace CN.1990.タンパク質安定性の測定および増大、Trends in Biotechnology 8:93-8;Worn A,Pluckthun A.2001.抗体単鎖Fvフラグメントの安定性操作(Stability Engineering of Antibody Single Chain Fv Fragments.)Journal of Molecular Biology 305:989-1010)。アンフォールディング曲線は完全に可逆性であることが示され、高い尿素濃度から希釈または透析した際のタンパク質蛍光は、同じ最終尿素濃度に直接希釈したタンパク質のタンパク質蛍光と同一であった。他のいくつかのscFv抗体と同様に、抗PA scFvは、単純な2段階モデルがアンフォールディング過程を説明するのに適さない場合があることを示す比較的広範囲のアンフォールディング転移を示し、これは以前の研究と一致している(Worn A,Pluckthun A.2001.抗体単鎖Fvフラグメントの安定性操作、Journal of Molecular Biology 305:989-1010)。特に、A2Eおよび1Hバリアント(両方ともSerからProへの置換を含む)は、ほぼ間違いなくプロリン残基が変性状態の不均一性を高めるために、14B7 scFvと比較して広範囲の転移領域を示す。全てのscFvについて、アンフォールディングは5Mを上回る尿素濃度でしか検出されない。50％アンフォールディングの尿素濃度値(m1/2値)は、14B7、A2E、および1H scFvそれぞれについて6.8、7.7、および6.5Mである(図6)。比較のために、代表的なscFvは2.5〜4.5M尿素のm1/2値を示す。
【００６５】
4℃または70℃で2時間インキュベーションした後のscFv単量体安定性のELISA測定値を図7に示す。最大シグナルの50％を生じる濃度を基準にして、WTは、高温でのインキュベーションにより以前の活性の3.5％まで低下するのに対して、バリアントA2Eは活性の25％を保持する。結果は4回行った実験の平均であり(エラーバーは標準誤差を示す)、片側t検定により有意(p＜0.005水準)である。バリアントおよびその高温安定性の完全なリストについては表1を参照のこと。
【００６６】
毒素中和  毒素攻撃後の様々な時間で投与された抗体によるマクロファージの防御を評価した。攻撃後の防御は親和性の増大と強く相関した(表2)。
【００６７】
（表２）  ラットモデルにおける毒素攻撃に対する防御
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＊  死亡までの時間は、5時間の試験期間に死亡した動物のみを計算した。全ての動物を5時間後に屠殺した。
∞  対照動物は、PBSで処理した動物が死亡した30分後に屠殺した。
【００６８】
興味深いことに、14B7 scFvは14B7モノクローナルと比較して極めて有効であり、低いIC50量をもたらす。例えば、毒素および3nMの抗体が同時(すなわち、t=0)に投与された時、高親和性抗体1HのIC50は、scFvおよびモノクローナルIgGで得られた値と比較して、それぞれ、1/6および1/9であった。1Hは攻撃の20分後でさえ著しく防御したのに対して、親scFvおよびモノクローナルは防御しなかった。全般的にみて、これらの結果から、小さいサイズのscFvは、毒素結合についてマクロファージ受容体と競合するのに有効でない可能性があることが分かる。
【００６９】
毒素中毒に対する防御はフィッシャー344ラットモデルにおいて試験した。ラットを10×MLD量のPAおよびLFで攻撃し(それぞれ、0.160mg/kgおよび0.064mg/kg)、生存を5時間モニターする。処理としてPBSのみを与えた対照ラットは91±7分後に死亡した。毒素攻撃の5分後に14B7 scFvを与えた動物は、死亡までの時間が短いが有意に延長した(110±17分,p＜0.05)。A2E scFvを投与すると、症状の始まりおよび死亡までの時間が両方とも著しく遅れる(平均TTD 237±63分、2匹が生存)。
【００７０】
本発明は例示的な態様を参照して説明されたが、この説明は限定的な意味で解釈されることを目的としていない。例示的な態様の様々な変更および組み合わせならびに本発明の他の態様は、説明を参照すれば当業者に明らかであろう。従って、添付の特許請求の範囲は、このような全ての変更または態様を含むことが意図される。
【００７１】
本明細書で述べた全ての刊行物および参考文献は、本発明が属する当業者の技術レベルを示す。全ての刊行物および特許出願は、それぞれ個々の刊行物または参考文献が参照として組み入れられるように詳細かつ個々に示されるのと同じ程度に参照として本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
（図１）炭疽菌毒素機構の概略を示す図である。
（図２）親和性成熟ストラテジーである。
（図３）抗体構築物のFPLC分析である。
（図４）14B7 scFvおよび関連バリアントのアミノ酸配列アラインメントである。
（図５）インビボでの攻撃後結果を示すグラフである。
（図６）14B7および親和性が改善された変異体の尿素変性曲線を示すグラフである。
（図７Ａ〜７Ｄ）scFv単量体安定性のELISA測定値である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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