(57)【要約】本発明は、免疫調節物質に関する。とりわけ本発明は、宿主免疫応答を増強または抑制する目的のために標的抗原提示細胞に適合させたスーパー抗原ＳＭＥＺ−２に基づく、そして更にとりわけ、スーパー抗原ＳＭＥＺ−２の突然変異体に基づく特異的免疫調節物質に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫調節性抗原に連関された抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化分子を含む免疫調節物質であって、上記ＡＰＣ標的化分子は、スーパー抗原ＳＭＥＺ−２を擬似するが、完全に機能的なＴ細胞レセプター結合部位を含まない、免疫調節物質。
【請求項２】
免疫調節性抗原に連関された抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化分子を含む免疫調節物質であって、上記ＡＰＣ標的化分子は、分子がＴ細胞を活性化する能力をほとんどまたは全く有さないように破壊されたＴ細胞レセプター結合部位を除き、構造的にＳＭＥＺ−２スーパー抗原である、免疫調節物質。
【請求項３】
免疫調節性抗原に連関された、配列番号１のアミノ酸配列の位置１８、４２、７５および１８２で１つ以上の突然変異を有するＳＭＥＺ−２を含む、免疫調節物質。
【請求項４】
ＳＭＥＺ−２が、
Ｙ１８Ａ、
Ｗ７５Ｌ、
Ｋ１８２Ｑおよび
Ｄ４２Ｃ、
からなる群より選択される１つ以上の突然変異を有する、請求項３記載の免疫調節物質。
【請求項５】
免疫調節性抗原に連関された、突然変異Ｙ１８Ａ、Ｗ７５Ｌ、Ｋ１８２ＱおよびＤ４２Ｃを有するＳＭＥＺ−２を含む、免疫調節物質。
【請求項６】
免疫調節性抗原に連関された、突然変異Ｗ７５Ｌ、Ｋ１８２ＱおよびＤ４２Ｃを有するＳＭＥＺ−２を含む、免疫調節物質。
【請求項７】
卵白アルブミンに連関されたＴｃＲ結合性欠損ＳＭＥＺ−２を含む、免疫調節物質。
【請求項８】
破傷風トキソイド（ＴＴ）またはそのペプチドに連関されたＴｃＲ結合性欠損ＳＭＥＺ−２を含む、免疫調節物質。
【請求項９】
ＬＣＭＶペプチドに連関されたＴｃＲ結合性欠損ＳＭＥＺ−２を含む、免疫調節物質。
【請求項１０】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化分子と免疫調節性抗原との間の連関が可逆性である、請求項１〜９のいずれか一項記載の免疫調節物質。
【請求項１１】
免疫調節性抗原が、タンパク質またはペプチドである、請求項１〜１０のいずれか一項記載の免疫調節物質。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項記載の免疫調節物質、および１つ以上の薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤および／または溶媒を含む、医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか一項記載の免疫調節物質を含む、ワクチン。
【請求項１４】
免疫系の誘導または刺激を必要とする障害の治療的または予防的処置の方法であって、請求項１〜１３のいずれか一項記載の免疫調節物質または医薬組成物をこのような処置を必要とする対象に投与することを含む方法。
【請求項１５】
障害が、細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生虫感染、自己免疫、アレルギー、および／または前腫瘍性もしくは腫瘍性形質転換からなる群から選択される、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
免疫系の誘導または刺激を必要とする障害の治療的または予防的処置のための医薬品の調製における、請求項１〜１３のいずれか一項記載の免疫調節物質の使用。
【請求項１７】
ａ．構造的にＳＭＥＺ−２スーパー抗原である抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化分子のＴ細胞結合部位に修飾および／または欠失を導入する工程と、
ｂ．それに免疫調節性抗原を連関させる工程、
を含む、請求項１〜１３のいずれか一項記載の免疫調節物質を調製する方法。
【請求項１８】
請求項１７記載の方法にしたがって調製された免疫調節物質。
【請求項１９】
位置１８、４２、７５、および１８２に存在する１つ以上の突然変異を除き、配列番号１を有するスーパー抗原。
【請求項２０】
突然変異が、
Ｙ１８Ａ、
Ｗ７５Ｌ、
Ｋ１８２Ｑおよび
Ｄ４２Ｃ、
からなる群より選択される、請求項１９記載のスーパー抗原。
【請求項２１】
配列番号２のアミノ酸配列を有するスーパー抗原ＳＭＥＺ−２。
【請求項２２】
配列番号３のアミノ酸配列を有するスーパー抗原ＳＭＥＺ−２。
【請求項２３】
請求項１８〜２２記載のスーパー抗原のいずれかをコードする核酸。
【請求項２４】
少なくとも請求項１８〜２２記載のスーパー抗原のいずれかをコードする核酸を含む核酸構築物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫調節物質およびその使用に関するものである。とりわけこれは、宿主免疫応答を増強または抑制する目的で、抗原提示細胞を標的とするように適合させた、スーパー抗原ＳＭＥＺ−２に基づく、および特にスーパー抗原ＳＭＥＺ−２の突然変異体に基づく特異的免疫調節物質に関するものである。本発明はまた、上記構築物を用いる化合物の抗原性を増強する方法および新規ＳＭＥＺ−２突然変異体にも関するものである。
【背景技術】
【０００２】
プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、非免疫、未処置動物における１次免疫応答を開始するのに必須である。最も重要なＡＰＣは、樹状細胞（ＤＣ）であり、身体のすべての領域で、これは環境との接触部分（すなわち皮膚および粘膜表面、例えば肺、気道、鼻腔等）でかみあい細胞として見出されている。ＤＣにより提示される抗原は、極めて免疫原性である。ＤＣの１つの重要な表現型マーカーは、非常に高レベルの表面ＭＨＣクラスＩＩ発現である。活性化されたＤＣは２次リンパ節まで移動し、抗原活性化エフェクター細胞として進行するＣＤ４およびＣＤ８双方のＴ細胞を「初回刺激」し、増殖し、サイトカインを生成し、そしてＢリンパ球の体液性応答を制御する。したがって、ＤＣによる抗原提示はいずれかの適合免疫応答における義務付けられた最初の工程であると思われる。その他のＡＰＣ、例えば、マクロファージおよびＢ細胞は、後の２次応答で重要であると思われ、そして単独では応答の最初の初回刺激において有効ではない。したがって、概して、ＤＣは、免疫応答の増強のため、標的化するために最も重要な細胞と見なされる。
【０００３】
しかしながら、抗原のＤＣへの標的化には問題がある可能性がある。例えば、多くのペプチドは、インビボでＡＰＣに効率的に分配されないので、単独では抗原性および免疫原性が乏しい。同様にペプチドは、ＡＰＣによりあまり効率的に利用されないので、有効な抗原提示に必要な２次シグナルを引き出さない。
【０００４】
スーパー抗原は、樹状細胞を含むＡＰＣで発現されるＴリンパ球およびＭＨＣクラスＩＩ分子のＶβドメインを介してＴ細胞レセプター（ＴｃＲ）に同時に結合することにより免疫系を標的化する半保存的細菌タンパク質のファミリーである。
【０００５】
スーパー抗原（ＳＡｇ）は、公知の最も強力な免疫マイトジェンであり、そしてフェムト−アトモル濃度（１０−１５〜１０−１８Ｍ）で多くのＴ細胞を活性化する。これはＴ細胞による大規模な全身性のサイトカイン放出のために有意な毒性を引き起こす。現在ブドウ球菌および連鎖球菌のスーパー抗原ファミリーの１９のメンバーがある。
【０００６】
Ｔｅｒｍａｎ（国際公開公報第９８／２６７４７号）１は、スーパー抗原を用いる治療用組成物を開示している。これは、スーパー抗原を１つ以上の更なる免疫治療用抗原と併せて使用して、標的に対して志向する治療用免疫応答を誘起するか、または疾患を引き起こす免疫応答を阻止するかのいずれかを行うことができることを示唆している。Ｔｅｒｍａｎは更に、免疫治療用抗原−スーパー抗原重合体の形成について記載している。このような重合体には、スーパー抗原成分が第２級アミン連関によりペプチド抗原に連関されているものが含まれる。しかしながら、スーパー抗原成分が、ＴｃＲ結合機能が全体的に、または部分的に削除されているものであることは、Ｔｅｒｍａｎにより、教示または示唆されていない。実際に、ＴｃＲ結合がＡＰＣの活性化、および重合体の抗原成分に対する免疫応答の刺激に必須ではないという認識はない。
【０００７】
したがって、それ自体がＴｃＲへの結合により大規模な無差別のＴ細胞応答を引き出すことから、野生型ＳＡｇまたはＴｃＲに結合する能力を保持している修飾されたＳＡｇは、ほとんど使用されていない。このＴｃＲ架橋はその毒性の主要な原因であると思われる２。
【０００８】
したがって、通常非免疫原性であるか、または免疫原性が低く、しかし有効であり、そして毒性が低い抗原、例えばペプチドのＴ細胞認識を与え、そして増強するためにＳＡｇのＤＣ標的化および活性化の独特な特徴を利用する改善された免疫調節物質の必要性が存在する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
先行技術の少なくともいくつかの不都合を打破または改善するか、または有用な代替物を提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の第１の態様にしたがうと、免疫調節性抗原に連関された抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化分子を含む免疫調節物質を提供し、上記ＡＰＣ標的化分子はスーパー抗原ＳＭＥＺ−２を擬似するが、完全な機能的Ｔ細胞結合部位を含まない。
【００１１】
本発明の第２の態様にしたがうと、免疫調節性抗原に連関された抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化分子を含む免疫調節物質を提供し、上記ＡＰＣ標的化分子は、分子がＴ細胞レセプターを活性化する能力をほとんどまたは全く有さないように破壊されたＴ細胞レセプター結合部位以外は、構造的にはＳＭＥＺ−２スーパー抗原である分子である。
【００１２】
好ましくは、ＳＭＥＺ−２抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化分子と免疫調節性抗原との連関は可逆的である。
【００１３】
好ましくは、免疫調節性抗原はタンパク質またはペプチドである。
【００１４】
免疫調節性抗原は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化分子に連関されていない場合、完全に非免疫原性でよいが、本発明の免疫調節物質は、その効率を改善するために、免疫原性である抗原を組み込むこともできる。したがって、本発明は、既に公知であり、そして使用されているが、本発明の免疫調節物質により改善することができるワクチンのように、例えば新たなワクチンに同様に適用可能である。
【００１５】
別の態様では、本発明は、免疫調節性抗原に連関されたそのアミノ酸配列の位置１８、４２、７５および１８２で１つ以上の突然変異を有するＳＭＥＺ−２を含む免疫調節物質を提供する。好ましくは、突然変異を、
Ｙ１８Ａ、
Ｗ７５Ｌ、
Ｋ１８２Ｑ、および
Ｄ４２Ｃ、
からなる群より選択する。
【００１６】
別の態様では、本発明は、免疫調節性抗原に連関された、突然変異Ｙ１８Ａ、Ｗ７５Ｌ、Ｋ１８２Ｑ、およびＤ４２Ｃを有するＳＭＥＺ−２を含む免疫調節物質を提供する。
【００１７】
別の態様では、本発明は、免疫調節性抗原に連関された、突然変異Ｗ７５Ｌ、Ｋ１８２Ｑ、およびＤ４２Ｃを有するＳＭＥＺ−２を含む免疫調節物質を提供する。
【００１８】
更に別の態様では、本発明は、卵白アルブミンまたは破傷風トキソイド（ＴＴ）に連関されたＴｃＲ結合性欠損ＳＭＥＺ−２を含む免疫調節物質を提供する。
【００１９】
別の態様にしたがって、本発明による免疫調節物質および１つ以上の薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤、および／または溶媒を含む薬学的組成物が提供される。
【００２０】
更に別の態様にしたがって、本発明による免疫調節物質を含むワクチンが提供される。
【００２１】
第５の態様にしたがって、免疫系の誘導または刺激を必要とする障害の治療的または予防的処置の方法であって、このような処置を必要とする対象に本発明による免疫調節物質または薬学的組成物を投与することを含む方法が提供される。
【００２２】
好ましくは、障害は、細菌、ウイルス、真菌、または寄生虫感染、自己免疫、アレルギーおよび／または前腫瘍性もしくは腫瘍性転化からなる群より選択される。
【００２３】
別の態様にしたがって、免疫系の誘導または刺激を必要とする障害の治療的または予防的処置のための医薬品の調製のための本発明による免疫調節物質の使用が提供される。
【００２４】
好ましい障害は、細菌、ウイルス、真菌、または寄生虫感染、自己免疫、アレルギー、および／または前腫瘍性もしくは腫瘍性転化からなる群より選択される。
【００２５】
別の態様にしたがって、
ａ  構造的にＳＭＥＺ−２スーパー抗原である抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化分子のＴ細胞結合部位に修飾および／または欠失を導入する工程と、
ｂ  それを免疫調節性抗原に連関させる工程と、
を含む免疫調節物質を調製する方法が提供される。
【００２６】
しかしながら、１つ以上の抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化分子を用いることができ、そして免疫調節物質の組み合わせをいずれかの処置で使用することができることは理解される。
【００２７】
別の態様では、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列の１８、４２、７５、および１８２位置で１つ以上の突然変異を有するＳＭＥＺ−２を提供する。好ましくは、突然変異を、
Ｙ１８Ａ、
Ｗ７５Ｌ、
Ｋ１８２Ｑ、および
Ｄ４２Ｃ、
からなる群から選択する。
【００２８】
別の態様では、本発明は、突然変異Ｙ１８Ａ、Ｗ７５Ｌ、Ｋ１８２Ｑ、およびＤ４２Ｃを有するスーパー抗原ＳＭＥＺ−２を提供する。
【００２９】
別の態様では、本発明は、突然変異Ｗ７５Ｌ、Ｋ１８２Ｑ、およびＤ４２Ｃを有するスーパー抗原ＳＭＥＺ−２を提供する。
【００３０】
関連する態様では、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列の１８、４２、７５、および１８２位置で１つ以上の突然変異を有するＳＭＥＺ−２をコードする核酸を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明は、少なくとも部分的に、スーパー抗原に擬似するが、完全に機能的なＴｃＲ結合部位を欠いている分子は、免疫調節性抗原に連関された場合、ＡＰＣに結合して、そして以前に知られていなかったか、または疑われた程度までＡＰＣを活性化することができるという観察に基づいている。
【００３２】
この結果は、国際公開公報第０２／４５７３９号に本発明者らにより開示された。本出願は、スーパー抗原ＳＭＥＺ−２を擬似する特異的分子の免疫調節物質における使用に志向されている。国際公開公報第０２／４５７３９号にて論じられているように、本発明の免疫調節物質は、高い分配能力、およびＴｃＲを削除されたスーパー抗原のＡＰＣ活性化能力、および連関された抗原の特異性を保持している。しかしながら、本発明者らは、ＳＭＥＺ−２（特に本明細書に後記するこれらのＳＭＥＺ−２突然変異体）に基づく免疫調節物質を用いて、予測されるものを超える特に非常に効果的で、そして強力であることを実証した。これらの構築物は、予測されるＭＨＣ応答よりも良好に展示することに留意される。
【００３３】
本発明の免疫調節物質を本明細書にて「免疫調節性構築物」または単に「構築物」と称することもできる。
【００３４】
ＡＰＣ標的化分子として多様なＴｃＲ結合性欠損スーパー抗原またはその擬似物質が、選択的に試験されている。これらは具体的には、本明細書で後記で詳記するようなＳＭＥＺ−２の突然変異体を含む。ＳＭＥＺ−２は、ＳＭＥＺのアレルバリアントである。
【００３５】
ＴｃＲ結合部位の標的化された突然変異誘発を完成させてＴ細胞分裂誘発性の＞１０５倍低下した突然変異体を作製した。図１は、１つのＳＭＥＺ−２分子に４つまでの特異的点突然変異を含む特異的ＳＭＥＺ−２突然変異体に関するＴ細胞分裂誘発性の＞１０５倍低下を説明している。
【００３６】
本発明のＳＭＥＺ−２基盤の構築物において使用するためのＴｃＲ結合性欠損ＳＭＥＺ−２は、好ましくは、本明細書で詳記するようなＳＭＥＺ−２のアミノ酸配列（配列番号１）の位置１８、４２、７５、１８２で１つ以上の突然変異を有するＳＭＥＺ−２から選択される。更に好ましくは、ＴｃＲ結合性欠損ＳＭＥＺ−２突然変異体は、１つ以上の以下の突然変異：Ｙ１８Ａ、Ｗ７５Ｌ、Ｋ１８２Ｑ、およびＤ４２Ｃを含む。本発明で有用なとりわけ好ましいＳＭＥＺ−２突然変異体を以下の表１に記載する。
【００３７】
【表１】
2005528100.tif 000002
【００３８】
図２は分子の結晶構造から発展させたＭ１の３−Ｄ構造図を説明する。Ｍ１突然変異体の構造図は、ＴｃＲ結合部位突然変異体（青色）および活性ＭＨＣ付着部位（赤色）を示す。ＭＨＣ結合部位の位置は、ＴｃＲ結合部位から少し離れていることが当業者に理解される。更にＴｃＲ結合および認識に関与する残基はＭＨＣ結合には関与しないと思われる。これはＭＨＣ結合親和性を実質的に低下させずに、ＳＭＥＺ−２のＴｃＲ結合特性を突然変異により破壊することが可能であることを意味している。
【００３９】
野生型ＳＭＥＺ、とりわけＳＭＥＺ−２において当技術分野で公知のいずれかの手段により突然変異を作り出すことができる。好ましい方法には、重複ＰＣＲの使用が包含される。当業者には理解されるように、概して、この技術は、特異的突然変異が導入されることになっている細菌プラスミドに含まれる野生型遺伝子鋳型の特異的配列にハイブリダイズする２つの相補的重複合成プライマーの使用を包含する。プライマーは、重複領域内に突然変異を含有する。プライマーの伸長により、特異的突然変異を含有する新たな核酸鎖の合成が可能になる。次いで突然変異した核酸プライマーを細菌に導入して組換え突然変異体タンパク質を生成する。本発明に有用なＳＭＥＺ−２突然変異体に到達するために用いることができる技術の具体例を本明細書後記の「実施例」見出しの下で提供する。
【００４０】
本発明のＡＰＣ標的化分子に連関することができる種々の抗原は、当業者には理解される。このような抗原を本明細書にて「免疫調節性抗原」と称することができる。これらは未変性のまたは組換えポリペプチド、タンパク質、完全および／または無能ウイルス、核酸、そして炭水化物抗原もまた含むことができる。本発明に有用な核酸およびポリペプチドを合成により生成できることは理解される。本発明で使用するための適当な抗原を入手または作製する手段は、当業者には容易に理解される。
【００４１】
免疫原性である必要があってもなくてもよいものを含む、前記した一連の抗原に関して本発明の免疫調節性構築物を調製することができる。これは抗原の免疫原性を提供もしくは改善すること、または免疫応答を誘導するのに必要な抗原量を低下させることの利点を有している。
例えば特定の病原体に関する保護免疫を生じることが解っているタンパク質を、最初にタンパク質をＴｃＲ結合性欠損ＳＭＥＺ−２分子に抱合させることにより更に免疫原性にすることができる。ペプチドタンパク質は、宿主免疫系に対して複数の限定ペプチドエピトープを提示するために最初にＡＰＣにより分解される。ＡＰＣ、例えば樹状細胞に対してウイルスを選択的に標的化する分子を付け足すことにより、抗ウイルス免疫を強化することができる。
【００４２】
ペプチドの１次配列に依存して耐性を誘導するために刺激性（すなわちアゴニスト応答を生じる）かまたは免疫抑制性（すなわちアンタゴニスト応答を生じる）のいずれかであるように抗原を設計することができる。これは病原体、例えばウイルス、細菌、およびその他の微生物に対するワクチン接種のため、または腫瘍特異的ペプチドを用いて特異的抗腫瘍免疫を作製するためかのいずれかのために免疫を促進するのに有用である。
【００４３】
アンタゴニスト応答は抗原に対するＴ細胞耐性を誘起し、そして疾患、例えば多発性硬化症、糖尿病、またはリウマチ性関節炎の場合、自己抗原、例えばタンパク質、および／または核酸に対する望ましくない自己免疫反応を抑制するのに有用であろう。
【００４４】
多くの自己免疫疾患では自己抗原に対する自己反応性Ｔ細胞応答が基礎になっている。疾患、例えばリウマチ性関節炎、多発性硬化症、および真性糖尿病はこのような実例である。
【００４５】
卵白アルブミン抗原（図５）および破傷風トキソイドのペプチドを用いて本発明のＳＭＥＺ−２基盤の免疫調節物質の効果を実証した。これらの抗原を含有する免疫調節物質をどのように用いることができ、そして抗原のスーパー抗原への付着が特異的免疫応答にどのような影響を及ぼすかは、本発明が関連する当業者には容易に理解される。しかしながら、実例として、破傷風トキソイドまたはそのペプチドを基盤とする免疫調節物質が、テタヌス抗原に対する応答性を増強し、そして必要な抗原量を減少させるためのテタヌスワクチン接種プロトコールにおいて有用であることを見出すことができる。
【００４６】
別の実例として、本発明の免疫調節物質は、免疫調節性抗原としてＬＣＭＶ（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス）ペプチドを含むことができ、これはアミノ酸配列ＣＫＡＶＹＮＦＡＴＭを有するのが好ましい。本明細書に後記で詳記するように、本発明者らの研究は、このペプチドを含有する構築物を用いて腫瘍成長を阻止するのを助け、そしてしたがって、癌の処置または緩解に有用であることを見出すことができることを示している。
【００４７】
当技術分野で標準的ないくつかの技術を用いて、ＡＰＣ標的化分子の、更に具体的にはＴｃＲが破壊されたＳＭＥＺ−２分子の抗原への連関を達成することができる。「連関する」（coupling）なる用語は、ＡＰＣ標的化分子が１つ以上の免疫調節性抗原に随伴され得るいずれかの手段を含むことを意図し、そして融合、化学的結合等を含むことを理解すべきである。例えば、スーパー抗原のＣ末端またはＮ末端のいずれかの遺伝子伸長として形成された抗原との融合タンパク質の形態で、構築物を組換えにより生成することができる。抗原がＭＨＣクラスＩＩ結合と干渉しないことを確実にするために特に考慮することが好ましい。あるいは、本明細書で「実施例」の小見出しの下で後記する技術にしたがって、または国際公開公報第０２／４５７３９号に記載するように、抗原およびＡＰＣ標的化分子を連関させることができる。
【００４８】
一般的な方法により、サクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオプロピオナート（ＳＡＴＰ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いてＡＰＣ標的化分子を抗原に連関させることができる。第１の工程では、抗原をＳＡＴＰを用いる抗原をチオール化過程に供する。抗原を最初にＮａＰＯ４に溶解し、一方ＳＡＴＰをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解する。ＳＡＴＰ溶液をモル比１：１でタンパク質に加え、そして室温で２時間インキュベートする。１００００ｒｐｍで約５分間ＶＩＶＡＳＰＩＮ濃縮器（５ｋＤａサイズ排除）を通過させることにより、非結合ＳＡＴＰを除去する。ＮａＰＯ４を加え、そして５回繰り返す［３］。あるいは、抗原にセファデックスＧ２５脱塩カラムのカラムを通過させる。遊離のＳＡＴＰを除去した直後に、脱アセチル化過程により、抗原ＳＡＴＰのスルフヒドリル基を脱保護する。ＮａＰＯ４、ＥＤＴＡ、およびヒドロキシルアミン−ＨＣｌを含む脱アセチル化溶液を用いてこれを達成することができる。次いでＳＭＥＺ−２のタンパク質−ＳＡＴＰに対するモル比１：１０でＴｃＲ結合性欠損ＳＭＥＺ−２を溶液に加える。当技術分野で容易に理解されるように、連関バッファーを加えることもできる。次いでＴｃＲ結合性欠損ＳＭＥＺ−２およびタンパク質−ＳＡＴＰを室温で約２時間インキュベートする。
【００４９】
抗原が、自然発生的システイン残基を有する場合、反応性スルフヒドリル基を導入する必要なく、ＳＭＥＺ−２への連関を直接達成することができる。この場合、連関は、前記で概要を示した、確立された手順に従う。
【００５０】
抗原が、自然発生的システインを有していない場合、多くの標準的な方法を用いて反応性スルフヒドリル基を導入することができる。実例としては、システイン残基を遺伝的に組換えペプチドに導入することができ、ポリペプチドは、ヘテロ発現系（原核細胞性または真核細胞性）から発現される。反応性スルフヒドリル基を導入する部位は分子表面で暴露されるのが好ましいことは、当業者には容易に理解される。当業者は実際の、または推定３Ｄタンパク質構造に基づいてこのような残基を容易に同定することができよう。
【００５１】
別の実例としては、標準的な方法にしたがって、遺伝子構築物の５〜１０個のグリシン残基の可動性リンカーを作製することによりＳＭＥＺ−２のＣ末端を伸長することにより、組換えＳＭＥＺ−２：抗原構築物を構築することができる。更に、マルチクローニング部位を含む核酸構築物を提供して、選択された抗原またはペプチド遺伝子配列を添加すること可能にできる。次いで全構築物を発現させて組換え融合構築物タンパク質を作製することができる。
【００５２】
別の実例としては、代替の連関方法は、ＳＭＥＺ−２に連関されたストレプトアビジンの使用を含むことができる。ストレプトアビジンは、４分子のビオチンと強固に結合する。これにより、ビオチン化タンパク質およびペプチドの多価性の付着を可能にするＳＭＥＺ−２ストレプトアビジン融合構築物が作製される。標準的な方法にしたがって、抗原をビオチン化し、次いでＳＭＥＺ−２ストレプトアビジン融合構築物に添加して、最終的なコンジュゲートを形成する。当技術分野で容易に理解されている技術にしたがって、このような連関を企図することができる。
【００５３】
本発明の好ましい実施態様では、ＡＰＣ標的化分子と抗原との間の連関は可逆的である。とりわけ好ましいのは、ＡＰＣ標的化分子は、免疫調節性抗原を放出することができ、そのためにＡＰＣにより正確に提示されることである。構築物からの抗原の放出は細胞内またはリソゾーム内の酵素切断により達成され得ることは、本発明が関係する当業者により認識されよう。適当なタンパク質溶解部位を構築物の連関領域に導入することにより、この方法を補助することができる。ジスルフィドおよび遊離のスルフヒドリル基が関与する酸化／還元反応を含む化学的手段により、該放出を達成することもできる。連関領域に特定のアミノ酸残基、例えばシステインを導入することにより、この方法を補助することもできる。このような切断または放出部位を構築物に組み込むことができる技術は、当業者には容易に理解される。しかしながら、実例としては、適当な部位を含むペプチドもしくはそれをコードする核酸の部位特異的突然変異誘発、組換えクローニングおよび／または発現、化学的合成などがある。
【００５４】
連関が、個々のペプチドに限定される必要はない。ペプチドに対する免疫応答は、宿主のＭＨＣ多型性により厳しく制限されているので、ある状況では、多様な免疫調節物質を作製するためにペプチドのセットで免疫することが適当であろう。構築物の多様性を高めるために、前記した手順または、当業者に明らかであるそれを修飾した手順により、大きな抗原、例えばウイルス、細菌、またはその他のタンパク質抗原の種々の成分に相当する複数のペプチドを連関して、混合抗原：ＳＭＥＺ基盤の構築物抗原応答を提供することができる。更に、ペプチドの比率を容易に制御して免疫応答を更に望ましい結果に微調整することができる。
【００５５】
加えて、大きな構造、例えばウイルスを、最初に反応性スルフヒドリル基を導入する化学物質でウイルスを処置することにより、ＴｃＲ欠損スーパー抗原、とりわけＳＭＥＺ基盤の、更にとりわけＳＭＥＺ−２基盤のスーパー抗原で「被覆」することができる。
【００５６】
いずれかの適当な手段によりＳＭＥＺ−２：抗原構築物の精製を実施することができる。構築物の特性およびそれを作製することができる方法に関連する適当な技術は、本発明が関係する当業者には容易に理解される。しかしながら実例としては、ＨＰＬＣにより、および／またはＳｕｐｅｒｏｓｅ  １２カラムを用いるＨＰＬＣのサイズ排除クロマトグラフィーもしくは、当技術分野で公知であるサイズに基づいてタンパク質を分離することができるいずれかその他の適当なクロマトグラフィー手段により本発明の構築物を精製することができる。
【００５７】
個々の免疫調節性構築物に加えて、本発明はまた、１つ以上の薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤および／または溶媒と一緒にそれらを含有する薬学的組成物をも提供する。
【００５８】
「薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤、および／または溶媒」なる語句は、製剤を調製するのに有用であり、本発明の免疫調節性構築物と同時投与できるが、その意図された機能を実施することを可能にし、そして概して、安全で、無毒で、そして生物学的にもそうでなくても望ましい物質を含むことを意図する。許容される薬学的担体、アジュバント、賦形剤、および／または溶媒には、獣医学的使用およびヒト使用に適したものが含まれる。許容される薬学的希釈剤、担体、および／または賦形剤の実例には、溶液、溶媒、分散液、培地、遅延化剤、エマルジョン、充填剤等が含まれる。
【００５９】
種々の許容される薬学的担体、アジュバント、賦形剤、および／または溶媒を本発明の組成物の調製に用いることができることは、当業者には容易に理解される。理解されるように、許容される薬学的担体、アジュバント、賦形剤、および／または溶媒の選択は、ある程度、意図される組成物の投与形態および組成物の投与様式により決定され得る。
【００６０】
適当な担体、賦形剤、および溶媒の実例には、ミョウバンおよびＴｉｔｒｅＭａｘが含まれる。
【００６１】
本発明が関係する当業者に理解されるように、アジュバントの選択は、多くの変動因子に依存して異なり得る。実例としては、アジュバントの化学的特性、および特定の対象におけるその作用様式、必要とされるアジュバント効果のレベル、特定のアジュバントの観察される副作用、用いる抗原の特性、特定の対象のアジュバントに対する耐性、対象が属する動物の種、並びに対象の年齢および／または一般健康状態などがある。適当なアジュバントの実例には、油基盤のアジュバント（例えばフロイント完全または不完全、鉱物油、乳化落花生油（アジュバント６５）、パラフィン、および植物油）、リポソーム、ミネラル化合物、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム、エンドトキシン、コレステロール、脂肪酸、脂肪族アミン、モノホスホリル脂質Ａ、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）（例えばＱｕｉｌ−Ａを伴うＩＳＣＯＭ）、およびスレオニル誘導体またはムラミルジペプチドを含有するＳｙｎｔｅｘアジュバント製剤（ＳＡＦ）などがある。
【００６２】
担体、アジュバント、賦形剤、および／または溶媒に加えて、本発明の組成物を更なる構築物と共に、または例えばその完全性の保護を補助するような様式で処方することができる。例えば、組成物は、タンパク質溶解性分解に対して保護を提供する構築物を更に含むことができる。
【００６３】
当業者は、本発明の組成物に含めることができる更なる成分を理解することができる。
【００６４】
当技術分野で標準的な多くの技術により、個々の成分を１つ以上の溶媒、担体、アジュバントおよび／または賦形剤と混合することにより本発明の組成物を生成することができる。
【００６５】
本発明の構築物または組成物を用いて種々の異なる疾患および疾病を処置および／または予防することができることは予想される。例えば本発明は、ウイルスおよび細菌の感染または疾患に適用される。
【００６６】
本明細書で用いる「処置」なる用語またはその変形は、その最も広義の局面で考慮される。該用語は、動物が完全に回復するまで処置されることを意味する必要はない。したがって、「処置」は、特定の症状の徴候もしくは重篤度の改善、または特定の症状の進行の予防もしくはそうでなければその危険性の低減を含む。
【００６７】
実例としては、例えばＨＩＶ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、およびコロナ（突発性急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）を含む）ウイルスでの感染に対して長期間の保護を促すことが望ましい場合、感染構築物は、多くのウイルス感染に関して有用であることを見出すことができる。これらのウイルスは集団の間で一般的な、そして／または悪性であり、そして代替治療が望ましい感染に相当する。例えばＨＩＶ基盤の構築物を種々のＨＩＶ非多型性表面またはコア抗原から形成することができる。
【００６８】
本発明はまた、結核、シュードモナス抗原、インフルエンザ菌、髄膜炎菌を含む感染に対して長期間の保護を促すことが望ましい場合、本発明は、細菌感染に関して有用であることを見出すことができる。これもまた、本発明が適用を有する可能性があり、そして現在付随されるかなりの医学的関連性がある細菌感染の１つの選択を単に提示したものである。細胞表面および細菌から分泌された抗原またはペプチドに基づいて抗原またはペプチドを調製することができる。
【００６９】
更に、本発明の構築は、抗腫瘍処置において、および自己免疫疾患の処置のために適用を有する可能性がある。特異的抗腫瘍免疫応答を生じるために、連関された抗原またはペプチドを腫瘍、例えばメラノーマおよび充実性腫瘍から調製することができ、例えばを本発明の構築においてＬＣＭＶを抗原として使用することができる（後記にて詳記）。ＴｃＲ欠損ＳＭＥＺ−２に連関されたペプチドまたはタンパク質を用いて、多発性硬化症のごとき自己免疫疾患を有する患者における免疫応答を抑制することができる。
【００７０】
本発明の組成物および／または構築物を当技術分野で公知のいずれかの投与形態として投与することができることが理解される。好ましくは、注入可能な液体を使用する。しかしながら、経口投与用液体、錠剤、カプセル、丸剤、顆粒剤、懸濁液およびエマルジョン、並びにスプレー（アトマイザーまたはエアロゾル）のごとき投与形態を用いることができる。
【００７１】
本発明の組成物および／または構築物を好ましくは、静脈内または筋肉内注射により投与する。しかしながら、当業者には、例えば処置される症状および用いられる投与形態を考慮して代替の投与経路を容易に認識されよう。
【００７２】
理解されるように、対象間で、構築物に対する耐性、体重、代謝、選択される投与様式、徴候の重篤度、並びに対象の年齢および／または一般健康状態のごとき変動因子に依存して、投与される用量、投与の期間、および一般的な投与計画を変更することができる。
【００７３】
本発明の別の態様では、そして本明細書に記載する原理を適用して、以下を達成することもできる。
・ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ制限ペプチドを組み合わせて、改善されたヘルパーＣＤ４および細胞溶解性ＣＤ８エフェクター細胞を提供することができる。
・１つ以上のウイルス抗原からの免疫優性ペプチドを組み合わせて、選択的抗ウイルス免疫を促進することができる。
・通常保護免疫応答において優性でないが、その複製またはライフサイクルに必須であるウイルスの領域に相当し、そして自然に強く保存されているウイルス抗原の領域からのペプチドを使用することができる。これはレトロウイルス（例えばＨＩＶ）のごとき高度に突然変異したウイルスに対するワクチンの開発においてとりわけ重要である。
・ペプチドおよびその他の抗原を一緒に組み合わせて、そして免疫調節物質により分配して免疫応答を増強または変調することができる。
【００７４】
本発明の別の態様は、ＴｃＲ結合部位欠損を有するスーパー抗原ＳＭＥＺ−２に関する。好ましくは、ＳＭＥＺ−２は、配列番号１のアミノ酸配列の位置１８、４２、７５および１８２で１つ以上の突然変異を有する。更に好ましくは、突然変異をＹ１８Ａ；Ｗ７５Ｌ；Ｋ１８２Ｑ；およびＤ４２Ｃからなる群から選択する。とりわけ好ましい実施態様では、突然変異Ｙ１８Ａ、Ｗ７５Ｌ、Ｋ１８２Ｑ、およびＤ４２Ｃを有するＳＭＥＺ−２（Ｍ２；配列番号３）、および突然変異Ｗ７５Ｌ、Ｋ１８２Ｑ、およびＤ４２Ｃを有するＳＭＥＺ−２（Ｍ１；配列番号２）に関する。
【００７５】
本発明によるＴｃＲ結合性欠損を有するＳＭＥＺ−２スーパー抗原を作製する方法は、本発明が関係する当業者には容易に理解される。これらの方法には、天然供給源からの単離、組換え産生、化学的合成、および本明細書のいずれかで記載した技術が含まれる。
【００７６】
本発明はまた、本発明のＳＭＥＺ−２突然変異体をコードする核酸および同一物を含む構築物を提供する。本発明による核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡ、例えば２本鎖または１本鎖、センスまたはアンチセンスであってよく、そして本発明のＳＭＥＺ−２突然変異体をコードする核酸を含有する組換え構築物を含むことができる。
【００７７】
本発明が関係する当業者は、本発明に包含されるＳＭＥＺ−２突然変異体をコードする核酸を容易に同定することが可能であろう。本明細書にて提供されるアミノ酸配列、遺伝子コード、および解っているその縮重に基づいてこれを行うことができる。また本発明に包含されるＳＭＥＺ−２突然変異体をコードする核酸を、本明細書にて例示するＳＭＥＺ−２アミノ酸配列に基づく核酸プローブを用いるゲノムもしくはｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングにしたがって同定および単離するか、またはこのようなプローブを用いて天然供給源から単離することもできる。
【００７８】
本発明をここで、更にとりわけ非限定的な実施例を参照して例示する。具体例により処置方法において本発明の免疫調節性構築物の効率が改善された証拠が提供される。一例では、卵白アルブミン抗原に連関されたＭ１と称されるＳＭＥＺ−２突然変異体を含む構築物を開発した。卵白アルブミン単独ではマウスにおいて弱い免疫原であり、そして強力な抗体応答を生じない。しかしながら、ＴｃＲ削除されたＭ１に連関された卵白アルブミンは抗卵白アルブミン抗体に対して劇的に増加した力価（１０倍）を生じる。更にこの抗体はＩｇクラススイッチングが起こっていることを示すＩｇＧ１サブクラスの抗体であることが解った。これは、抗体を産生するＢ細胞が高力価の抗体の長期間産生を確実にする記憶細胞を発生させる可能性があるという兆候である。したがって、Ｍ１：卵白アルブミン構築物は非常に増強された免疫原性を説明し、そして長寿命の保護性体液性免疫応答に重要である高親和性ＩｇＧ１抗体を生じる。
【００７９】
ヒトにワクチン接種するために用いられる破傷風トキソイド（ＴＴ）タンパク質からの合成ペプチドを用いて別の構築物を調製した。これらのペプチドを用いて、ヒトにおける天然発生応答を試験し、そしてＴｃＲ結合性欠損ＳＭＥＺ−２に連関されたペプチドがペプチド単独よりも有効にヒト記憶Ｔ細胞を刺激することができるかどうかを決定した。この実験の１０年前にワクチン接種されたヒトから末梢血リンパ球を採取した。特異的ＳＭＥＺ−２基盤分子に抱合されたＴＴペプチドを含む構築物がＴＴペプチド単独よりも１０，０００，０００倍以上低い濃度で活性であったことがその結果により説明される。ＴＴペプチド１０μｇ／ｍｌに対して、１００ｆｇ／ｍｌのＴＴの構築物でより高い抗ＴＴ特異的応答が患者において認められ、これはＴＴペプチドがＴｃＲ削除されたスーパー抗原に連関された場合、ＴＴペプチドの免疫原性が実質的に非常に上昇することを示している。Ｍ１：ペプチド構築物により刺激された場合、抗ＴＴ  Ｔ細胞の前駆体頻度もまた大きくなるように思われる。これは、構築物が裸のＴＴペプチドにより刺激されなかった双方の低親和性Ｔ細胞クローンを刺激することを示唆している。
【００８０】
これらの結果は、ヒトにおいて少なくともＳＭＥＺ−２の突然変異体を基盤にする構築物の免疫原性の非常な上昇を示しており、そしてそれを用いてヒトおよび動物ワクチン、処置を実質的に改善し、そして生物学的アッセイを提供することができることを説明している。
【実施例】
【００８１】
本発明者らは、以前に国際公開公報第０２／４５７３９号において免疫調節性構築物を構築する方法および種々の免疫調節性構築物を開示した。国際公開公報第０２／４５７３９号は、スーパー抗原をクローニングする方法、スーパー抗原のＴｃＲ結合部位の削除、種々の合成および天然ペプチドおよび／または抗原からの種々の免疫調節性構築物の構築、並びに生物学的な系におけるその効果を開示した。本実施例は、特異的ＳＭＥＺ−２基盤の免疫調節性構築物に関する。ＳＭＥＺ−２構築物は、予測されるよりも良好にＭＨＣ応答および一般的な強度示す。
【００８２】
これらの研究の目的は、例えば野生型ＳＡＧの活性の約０．０００１％でＴ細胞を刺激する突然変異体を生成することであった。
【００８３】
ＳＭＥＺ−２は、ＳＭＥＺのアレルバリアントである。ＴｃＲ結合部位の標的化突然変異誘発により、本発明者らが、Ｔ細胞分裂促進性が＞１０５倍低下した突然変異体を作製することが可能になった。図１は、Ｔ細胞分裂促進性の＞１０５倍低下がＳＭＥＺ−２分子の３つの特異的残基の突然変異の結果であることを説明している。
【００８４】
ＳＭＥＺ−２遺伝子のクローニング、発現および突然変異
ａ）ＳＭＥＺ−２    Ｙ１８Ａ
ｂ）ＳＭＥＺ−２    Ｄ４２Ａ
ｃ）ＳＭＥＺ−２    Ｗ７５Ｌ
ｄ）ＳＭＥＺ−２    Ｒ１８２Ｑ
ｅ）ＳＭＥＺ−２    Ｄ４２Ｃ、Ｗ７５Ｌ、Ｋ１８２Ｑ（Ｍ１）
ｆ）ＳＭＥＺ−２    Ｙ１８Ａ、Ｄ４２Ｃ、Ｗ７５Ｌ、Ｋ１８２Ｑ（Ｍ２）
【００８５】
すべての突然変異体を重複ＰＣＲにより作製した。これは必要とされる突然変異が双方のＤＮＡ鎖に別個に導入され、続いてアニーリングし、そして２つの鎖を増幅する２工程法である。
【００８６】
第１の工程では、すべてのＰＣＲ反応を０．５ｍｌ  ＰＣＲチューブ（ＳＳＩ、カリフォルニア州、米国）中で、ｐＧＥＸ−３ｃ：ＳＭＥＺ−２  ｗｔ  ＤＮＡ（鋳型）５００ｎｇ、０．２μＭ  各プライマー、１００μＭ  各ｄＮＴＰ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および１Ｕ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて実施した。各ＰＣＲを鉱物油または同様のもので重層してサイクリング中の反応混合物の蒸発を防いだ。Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｃｙｃｌｅｒを用いて以下の反応条件下でＰＣＲサイクリングを行った：９４℃の温度で３０秒間の変性、５３℃からの温度で４５秒間のアニーリング、および７２℃の温度で３０秒間の伸長。１５サイクル行った。
【００８７】
ＤＮＡフラグメントをＴｒｉｓアセタートバッファー中１％  アガロースゲルに流し、４０μｇ／ｍｌ臭化エチジウムの溶液で染色し、そして紫外光の下で切除した。ＵｌｔｒａＣｌｅａｎ（商標）１５  ＤＮＡ精製キット（ＭＯＢＩＯ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｓｏｌａｎａ  Ｂｅａｃｈ、カリフォルニア州、米国）を用いて製造者の指示書にしたがってアガロース片からＤＮＡフラグメントを抽出した。
【００８８】
第２工程では、ａ）第１工程からの２つの精製されたＰＣＲ産物各５０ｎｇを鋳型として使用した、ｂ）ｐＧＥＸ  ｕｐｐｅｒおよびｐＧＥＸ  ｌｏｗｅｒプライマーを使用した、ｃ）アニーリングは４８℃であった、並びにｄ）２０サイクルを行った以外は、前記したのと同一のＰＣＲプロトコールを用いて別のＰＣＲを実施した。
【００８９】
第１工程ＰＣＲに使用したプライマーの組み合わせ
ａ）ＳＭＥＺ−２  Ｙ１８Ａ：ＳＭＥＺ−２  Ｙ１８Ａ．ｆｗ／  ｐＧＥＸ−ｌｏｗｅｒおよびＳＭＥＺ−２  Ｙ１８Ａ．ｒｅｖ／  ｐＧＥＸ−  ｕｐｐｅｒ
ｂ）ＳＭＥＺ−２  Ｄ４２Ａ：  ＳＭＥＺ−２  Ｄ４２Ａ．ｆｗ／  ｐＧＥＸ−ｌｏｗｅｒおよびＳＭＥＺ−２  Ｄ４２Ａ．ｒｅｖ／  ｐＧＥＸ−  ｕｐｐｅｒ
ｃ）ＳＭＥＺ−２  Ｗ７５Ｌ：  ＳＭＥＺ−２  Ｗ７５Ｌ．ｆｗ／  ｐＧＥＸ−ｌｏｗｅｒおよびＳＭＥＺ−２  Ｗ７５Ｌ．  ｒｅｖ／  ｐＧＥＸ−  ｕｐｐｅｒ
ｄ）ＳＭＥＺ−２  Ｒ１８２Ｑ：  ＳＭＥＺ−２  Ｒ１８２Ｑ．ｆｗ／  ｐＧＥＸ−ｌｏｗｅｒおよびＳＭＥＺ−２  Ｒ１８２Ｑ．  ｒｅｖ／  ｐＧＥＸ−  ｕｐｐｅｒ
【００９０】
プライマー配列：
【００９１】
【表２】
2005528100.tif 000003
【００９２】
すべてのプライマーは、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬにより商業用に製造された。
【００９３】
４つの突然変異の連続的な導入により四重突然変異体を作製した。最初にｐＧＥＸ−３ｃ：ＳＭＥＺ−２  Ｋ１８２Ｑを鋳型として用いてＳＭＥＺ−２  Ｗ７５Ｌ、Ｋ１８２Ｑを作製した。この二重突然変異体をｐＧＥＸ−３ｃにクローン化し、そして次に鋳型として用いてＳＭＥＺ−２  Ｄ４２Ｃ、Ｗ７５Ｌ、Ｋ１８２Ｑ（Ｍ１）を作製した。最後にｐＧＥＸ−３ｃ：Ｍ１三重突然変異体を鋳型として提供してＭ２四重突然変異体ＳＭＥＺ−２  Ｙ１８Ａ、Ｄ４２Ｃ、Ｗ７５Ｌ、Ｋ１８２Ｑを作製した。
【００９４】
組換えＳＭＥＺ−２突然変異体の発現および精製
重複ＰＣＲフラグメントを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ）を用いて消化し、そしてｐＧＥＸ−３ｃ発現ベクターにクローン化した。このベクターは、挿入したＤＮＡの直ぐ上流のピコルナウイルス（Ｗａｌｋｅｒら（１９９４）３）から高度に特異的なプロテアーゼ３Ｃ切断部位を発現するｐＧＥＸ−２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃ）を修飾したものである。組換えＳＭＥＺ−２突然変異体は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５でグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質として発現された。培養物を３７℃で成長させて、そして０．２ｍＭ  イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加した後、３〜４時間誘導した。
【００９５】
ＧＳＴ融合タンパク質をグルタチオン（ＧＳＨ）アガロース上で精製し、そしてプロテアーゼ３Ｃ（Ｋｅｉｔｈ  Ｈｕｄｓｏｎ（Ｏｘｆｏｒｄ大学、Ｏｘｆｏｒｄ、英国）により提供された）を用いて室温で一晩、ＧＳＴから突然変異体タンパク質を切断した。カルボキシメチルセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて２ラウンドのカチオン交換クロマトグラフィーにより突然変異体タンパク質を更に精製した。
【００９６】
ゲル電気泳動
すべての精製した組換え毒素を１２．５％  ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で純度に関して試験した。
【００９７】
アミノ酸配列情報
野生型ＳＭＥＺ−２および前記の方法により作製された突然変異体に関する配列の詳細を以下に記載する。
ＳＭＥＺ２  野生型（配列番号１）
【００９８】
【表３】
2005528100.tif 000004
【００９９】
Ｍ１突然変異体（配列番号２）
【０１００】
【表４】
2005528100.tif 000005
【０１０１】
Ｍ２突然変異体（配列番号３）
【０１０２】
【表５】
2005528100.tif 000006
【０１０３】
組換え野生型および突然変異体タンパク質の精製
ＳＭＥＺ野生型（ｗｔ）および／または突然変異体タンパク質をカチオン交換クロマトグラフィーにより精製した。簡単には、ＧＳＴおよびＳＭＥＺ−２の双方を含有する切断された融合タンパク質を１０ｍＭ  ＰＯ４（ｐＨ６．０）１ｌ中で一晩透析し、同一バッファーで予め平衡にしたＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の１０ｍｌカラムに負荷した。これらの条件下ではＳＭＥＺ−２のみが結合し、そしてＧＳＴが溶出される。次いで精製されたＳＭＥＺ−２  野生型および／または突然変異体を５０ｍＭ  ＰＯ４（ｐＨ６．８）を用いてカラムから溶出した。ＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーによる精製を前記したように２回目も繰り返す。ＳＭＥＺ−２  野生型および／または突然変異体を滅菌濾過し、そして５０ｍＭ  リン酸塩バッファー中１ｍｇ／ｍｌで４℃で保存した。
【０１０４】
ＳＭＥＺのＴｃＲ結合性欠損したもののＴ細胞増殖アッセイ
部位特異的突然変異誘発を用いてＳＭＥＺ−２のＴｃＲ結合突然変異体を前記したように調製した。Ｔ細胞増殖に及ぼすＳＭＥＺ−２突然変異体の影響を標準的なチミジン取り込みアッセイを用いて研究した。健常ヒト提供者からのヒト末梢血リンパ球を平底９６ウェルプレート中５×１０５セル／ウェルで、種々の希釈の精製されたスーパー抗原突然変異体と共にインキュベートし、そして３７℃で３日間インキュベートした。３日後、３Ｈ  チミジン１０μＣｉを加え、そしてセル・ハーベスターを用いて４日に細胞を収集した。リンパ球増殖の測定として、ＤＮＡへの３Ｈ  チミジンの取り込みをシンチレーション・オートグラフィーにより測定した。
【０１０５】
Ｔ細胞増殖に関する突然変異体対野生型の比較データを表２に示す。
【０１０６】
【表６】
2005528100.tif 000007
【０１０７】
抗腫瘍免疫−インビボ腫瘍保護
多くの新規癌免疫治療は、直接樹状細胞に対して潜在的腫瘍特異的抗原（通常系統特異的または分化抗原）を標的化することにより宿主腫瘍耐性を破ることを試みている。
【０１０８】
ＴｃＲ欠損ＳＭＥＺ−２基盤の構築物は通常ＡＰＣに対する腫瘍特異的抗原を標的とし、そして抗原提示を増強する同時刺激シグナルを促すことが本発明者らにより実証されている。
【０１０９】
国際公開公報第０２／４５７３９号に記載されるペプチド連関方法にしたがって、三重（Ｍ１）および四重（Ｍ２）ＴｃＲ−／−ＳＭＥＺ−２をＬＣＭＶペプチド（ＣＫＡＶＹＮＦＡＴＭ配列を有する）に連関させ、そして等量のフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）と共に乳化した。ペプチド１μｇと等価のスーパー抗原−ＬＣＭＶを注射し、そしてＩＦＡと共に乳化したペプチド１００μｇをＣ５７ＢＬ６／Ｊマウス（ｎ＝５）の群の右脇腹に皮下注射したものと比較した。免疫の７日後、マウスを左脇腹に皮下注射した１×１０６ＬＬ−ＬＣＭＶ腫瘍細胞でマウスを誘発した。ＬＬ−ＬＣＭＶ細胞は、ＬＣＭＶ３３−４１ペプチドのミニ遺伝子でトランスフェクトしたルイス肺癌腫細胞（ＬＬＴＣ）であり、そしてＨ−２ｂバックグラウンドのマウスで、インビボで標的として認識され得る。一度、各群の１匹が直径１６ｍｍかまたは面積２００ｍｍ２に至る腫瘍を有すると、３〜４日毎にマウスをモニター観察し、そして剖検した。
【０１１０】
腫瘍サイズを２等分した腫瘍直系の積の算術平均として示す（図４ａは、この実験の結果を示す。図４ｂは、マウスを５倍以上の腫瘍細胞で誘発した類似の実験の結果を示す）。結果により、ＳＡｇ−ＬＣＭＶで免疫されたマウスは、ＬＬ−ＬＣＭＶで誘発された場合、腫瘍成長を阻止するようであるということが説明され、そしてペプチド単独よりもＳＭＥＺ−２突然変異体に抱合された場合、実質的に低いＬＣＭＶペプチドでの免疫によりＬＣＭＶ特異的免疫応答が作製されたことが示される。
【０１１１】
腫瘍および／または癌の処置のために薬学的に許容され得る形態でＳＡＧペプチド複合体を提供できることが予想される。
【０１１２】
ＳＭＥＺ−２に連関された抗原に対する抗体応答の増強
Ｍ１を卵白アルブミンタンパク質に連関させた。卵白アルブミンは、免疫応答を引き出す貯蔵タンパク質である。卵白アルブミンは、単独ではマウスにおいて弱い免疫原であり、そして強力な抗体応答生じない。抗原またはタンパク質に対する特異的高親和性抗体の産生により測定されるような免疫原性が、構築物として分配された場合に実質的に増強され得ることを説明するためにこの実験を行なった。
【０１１３】
以下に概要を示す手順によりＭ１を卵白アルブミンタンパク質に連関させた。
【０１１４】
卵白アルブミンにＭ１を連関するために用いられる方法
工程１：ＳＡＴＰによるタンパク質のチオール化
ａ．卵白アルブミンを５０ｍＭ  ＮａＰＯ４（ｐＨ７．５）に５〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。
ｂ．ＳＡＴＰをＤＭＳＯに１０ｍｇ／ｍｌ（４１マイクロモル／ｍｌ）の濃度で溶解した。
ｃ．次いでＳＡＴＰを卵白アルブミンに１：１のモル比で加えた。
ｄ．これを室温で２時間インキュベートした。
【０１１５】
工程２：遊離のＳＡＴＰの除去
ｅ．１０，０００ｒｐｍで５分間、０．５ｍｌ  ＶＩＶＡＳＰＩＮ（Ｖｉｖａ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＡＧ、Ｈａｎｎｏｖｅｒ）濃縮器（５ｋＤａ  サイズ排除）に通して非結合性ＳＡＴＰを除去した。
ｆ．５０ｍＭ  ＮａＰＯ４（ｐＨ７．５）０．５ｍｌを加え、次いで遠心を繰り返した。これを５回繰り返した。
ｇ．あるいは、ＳＡＴＰ−卵白アルブミンを１．５ｍｌ  セファデックスＧ３５脱塩カラムに通した。
ｈ．次いでＶＩＶＡＳＰＩＮ  カラムを用いてＳＡＴＰ−卵白アルブミンを５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。
【０１１６】
工程３：タンパク質−ＳＡＴＰとＳＭＥＺ−２  Ｍ１との連関
ｉ．遊離ＳＡＴＰの除去の直後に１０（容量／容量）％  脱アセチル化溶液（５０ｍＭ  ＮａＰＯ４、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５Ｍ  ヒドロキシルアミンＨＣｌ、ｐＨ７．５）を添加してＳＡＴＰ−卵白アルブミンの保護されたスルフヒドリル基を脱アセチル化した。
ｊ．次いでＳＭＥＺ−Ｍ１をＳＡＴＰ−卵白アルブミンに１：１０（ＳＭＥＺ−２  Ｍ１対タンパク質−ＳＡＴＰ）のモル比で加えた。
ｋ．次いで１０（容量／容量）連関バッファー（２Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）、２０μＭ  ＣｕＳＯ４）を加えた。
ｌ．次いでこれを室温で２時間インキュベートした。
【０１１７】
次いでＳｕｐｅｒｏｓｅ１２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムを用いてＨＰＬＣのサイズ排除クロマトグラフィーにより遊離の反応物質から構築物を分離した。
【０１１８】
１．Ｍ１
２．卵白アルブミン
３．ＳＭＥＺ  Ｍ１＋卵白アルブミン
４．ＳＭＥＺ  Ｍ１：卵白アルブミン構築物
１０ｇを用いて皮下で２匹４群（２週齢Ｂａｌｂ／ｃ）を免疫した。
【０１１９】
１〜４（前記）のＭ１、卵白アルブミン、Ｍ１＋卵白アルブミンおよびＭ１：卵白アルブミン構築物のサンプルを等容量のフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）で乳化した。
【０１２０】
最初の免疫後１１日に、更なる卵白アルブミン１０μｇでマウスをブーストした。最初の免疫後、０、１１、および２１日にマウスを出血させた。
【０１２１】
当技術分野で公知の標準的なＥＬＩＳＡ法を用いて卵白アルブミンに対する抗体を測定した。ＥＬＩＳＡプレートを５μｇ／ｍｌ卵白アルブミンで被覆した。
【０１２２】
最初の免疫後２１日に、Ｍ１と卵白アルブミンの混合物またはただの卵白アルブミン単独のいずれかで免疫したマウスと比較して、ＳＭＥＺ  Ｍ１：卵白アルブミン構築物で免疫したマウスにおける抗卵白アルブミン応答が実質的に増強されたことが示された。
【０１２３】
標準的な血清の希釈シリーズから各々のマウスの抗卵白アルブミン抗体の実際の力価を決定した（表３）。２２日の抗卵白アルブミンの力価は、卵白アルブミンおよびＭ１の双方の混合物で免疫したマウスの１：８０と比較して、構築物で免疫したマウスで１：１２８０であった。これはおよそ１６倍の増強を示している（図５参照）。
【０１２４】
記載したように、卵白アルブミン単独はマウスにおいて弱い免疫原であり、そして強力な抗体応答を生じない。しかしながらＭ１に連関された卵白アルブミンは抗卵白アルブミン抗体の力価を劇的に上昇させる（１６倍）ことが示された。
【０１２５】
更に、この抗体は、ＩｇＧ１サブクラスであり、これはＩｇクラススイッチングを生じていることを示している。したがって、ＳＭＥＺ−２：卵白アルブミン構築物は、非常に増強された免疫原性を説明し、そして長寿命の保護性体液性免疫応答に必須である高親和性ＩｇＧ１抗体を作製する。
【０１２６】
表３：免疫されたマウスにおける抗卵白アルブミン力価（データは、各群２匹の平均である）
【０１２７】
【表７】
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【０１２８】
自然発生ヒト記憶Ｔ細胞に対する破傷風トキソイドペプチドのＭ１提示
合成ペプチドｐ２およびｐ３０を用いて破傷風トキソイド（ＴＴ）タンパク質から構築物を調製した。これらのペプチドを用いてヒトにおける天然発生応答を試験し、そしてＴｃＲ削除されたＳＭＥＺ−２に連関されたペプチドがペプチド単独よりも、既存のヒト抗ＴＴ  Ｔ細胞の刺激において更に強力であるかどうかを決定した。これはヒトにおいて非常に一般的なワクチンであり、そして長時間持続性のＴおよびＢ細胞記憶応答を引き出すことが解っている。
【０１２９】
ペプチドｐ２およびｐ３０は、破傷風トキソイド（ＴＴ）抗原の「ユニバーサル」エピトープであると考えられる（Ｖａｌｍｏｒｉ，Ｄら（１９９２）４）。
【０１３０】
前記と同様にｐ２  ＴＴをＭ１に連関した。量的な連関が、双方の構築物で観察された。わずかに低い分子量で移動するＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により、抱合されなかった残りの遊離Ｍ１の量を決定することによりこれを測定した。前記で用いたように、量的とはすべてのＳＭＥＺ−２が、ＳＤＳ  ＰＡＧＥにおいて高分子量種として観察された事実を意味している。
【０１３１】
末梢血リンパ球を９６ウェルプレートに５×１０５／ウェルで播種した。抗原を規定の濃度で添加した。３日目に３Ｈチミジン取り込みによりＴ細胞増殖を測定した。
【０１３２】
バックグラウンド±３標準偏差以上の３Ｈチミジン取り込みを有した場合、いずれのウェルも陽性として割り当てた。
【０１３３】
用いた患者は、１０年前にテタヌスに対して最後のワクチン接種を行った。
【０１３４】
【表８】
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【０１３５】
その結果、ＴＴの構築物は、ＴＴペプチド単独よりも１０，０００，０００倍以上低い濃度で活性であることを示した。１００μｇ／ｍｌ  ＴＴペプチドに対して、ＴＴの構築物１２０ｆｇ／ｍｌを用いた患者でより高い抗ＴＴ特異的応答が認められ、これはＴＴペプチドをＴｃＲ削除スーパー抗原に連関した場合、ＴＴペプチドの免疫原性を実質的に非常に上昇させることを示している。
【０１３６】
抗ＴＴ  Ｔ細胞の前駆体頻度は、Ｍ１：ペプチド構築物により刺激された場合に大きくなるようである。これは構築物が、裸のＴＴペプチドで刺激されなかった低親和性Ｔ細胞クローンの双方を刺激することを示唆している。
【０１３７】
この感受性の上昇は、２つの方法で明らかになった。
１．必要とされるＳａｇ：ペプチドの量は、ペプチド単独よりも１０，０００，０００倍少なかった。
２．抗ｐ２および抗ｐ３０前駆体頻度は連関されていないペプチドで観察された前駆体頻度を超えて増加した。ウェルあたり５×１０５ＰＢＬが播種され、そしてすべてのセルが陽性とは限らない場合、次いで遊離のペプチドを用いて測定した前駆体頻度は１０５中１未満でなければならない。抱合されたペプチドでの頻度は１０５中１より大きく、そしてより高くなる。
【０１３８】
これらの結果により、少なくとも本発明のＳＭＥＺ−２：抗原構築物のヒトにおける免疫原性における非常な上昇が示され、そしてこれを用いてヒトおよび動物ワクチン、処置およびアッセイを実質的に改善できることを説明している。
【０１３９】
ヘルパーＴ細胞ペプチドのスーパー抗原への連関は、自然発生ヒト記憶Ｔ細胞に対する抗原性を劇的に上昇させる。
【０１４０】
インビトロ細胞毒性アッセイ：ＪＡＭ試験
３１８匹のマウスのリンパ節細胞を２４ウェルプレート（２．５×１０６／ｍｌ）中連続希釈したスーパー抗原−ペプチド複合体（国際公開公報第０２／４５７３９号に記載のとおり構築した）またはｃｙｃＬＣＭＶペプチドの存在下、５日間培養することにより細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を作製した。３日に細胞にｒｈＩＬ−２およびＲＰＭＩを供給した。５日に、細胞を２回洗浄し、そしてＪＡＭ試験によりＣＴＬ活性に関して検定した（Ｍａｔｚｉｎｇｅｒ（１９９１）５）。簡単には、ＥＬ４細胞を５μＣｉ／ｍｌ  ［３Ｈ］チミジンと共に一晩インキュベートし、翌日ＬＣＭＶペプチドを１０ｎＭで３時間加えた。細胞を２回洗浄し、そして図６に記載するようにスーパー抗原−ＬＣＭＶ複合体で作製したＬＣＭＶ特異的ＣＴＬに関して標的細胞として使用した。ＣＴＬおよびＥＬ４細胞を種々エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比率で３時間一緒にインキュベートした。特異的溶解のパーセンテージを以下の等式を用いて算出した。
【０１４１】
【数１】
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【０１４２】
Ｓ＝キラー不在下で保持されたＤＮＡ（ＣＰＭ）、およびＥ＝キラー存在下で保持されたＤＮＡ（ＣＰＭ）。結果を図６に示す。
【０１４３】
前記した方法を用いて位置８で修飾された合成ＬＣＭＶペプチド（Ｍ８Ｃ）をＳＰＥＣ−Ｙ１５Ａ．Ｃ２７Ｓ．Ｎ７９Ｃ．Ｒ１８１Ｑに連関した。スーパー抗原：ＬＣＭＶを用いて３１８匹のマウスからのリンパ節細胞におけるインビトロ応答を決定した。ペプチドの最後の残基（位置番号８）をメチオニンからシステインに変化させて、ジスルフィドブリッジによりそれをスーパー抗原に連関できるようにした。
【０１４４】
本明細書に記載する本発明の利点はとりわけ前記の実施例を考慮して当業者に容易に理解される。しかしながら、本発明の例示的なＴｃＲ欠損免疫調節性構築物の利点および特徴のいくつかは、以下のとおりである。
ａ．スーパー抗原は、全ＴｃＲに対する結合において完全欠損性であり、そしてしたがって、インビボで無毒である。
ｂ．ペプチドの連関は単純で、有効で、そして可逆的でおよび広範に適用可能である。
ｃ．スーパー抗原：ペプチド構築物は、可溶性である。
ｄ．ＭＨＣクラスＩＩに結合するスーパー抗原は、免疫原性および非免疫原性部分のＡＰＣ活性化を増強する。
ｅ．本発明のＳＭＥＺ−２基盤の構築物は、非常に強力でそして予測されるＭＨＣ応答よりも良好である。
【０１４５】
前記の記載では、具体的な文献に付した整数、または等価であると解っている発明の整数に対して参照し、次いでこのような等価物を個々に示されたとして本明細書に組み込む。
【０１４６】
本発明を実施例により、およびその可能な態様に対する参照と共に記載してきたが、本発明の範囲または精神から逸脱することなく、そこに修飾または改良を行うことができることは理解される。
【０１４７】
本明細書の全体にわたって、それ以外の局面が必要とされない限り、「含む」、「含んでいる」等の語は、排他的な意味に対して、包含的な意味であると意図され、すなわち「非限定的であるが、含んでいる」の意味である。
【０１４８】
本明細書におけるいずれかの先行技術に対する参照は、先行技術が世界のいずれかの国の共通する一般的知識の一部を成すことの肯定またはいずれかの形態の示唆として考えるものではなく、そしてそのように考えるべきではない。
【０１４９】
【表９】
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【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】ＳＭＥＺ−２（Ｍ１）突然変異体の分裂促進性。Ｙ１８Ａ、Ｗ７５Ｌ、Ｋ１８２Ｑ、Ｄ４２Ｃで点突然変異を含有するＭ１突然変異体は、もはやヒトＴ細胞を刺激しない。種々濃度の突然変異体ＳＭＥＺ−２タンパク質を用いてヒト末梢Ｔ細胞を刺激し、そして４日間のインキュベーションの後にその増殖を測定した。
【図２】ＳＭＥＺ−２突然変異体。突然変異したＴｃＲ残基（青色）および付着部位（赤色）の位置を示すＭ１突然変異体の３次元構造。ＭＨＣクラスＩＩ結合部位の位置をも示す。
【図３】Ｍ１突然変異体は、培養物中のヒト末梢リンパ球に添加した場合実質的にインターロイキン２を生成せず、そして腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦａ）の量を低下させる。双方のサイトカインは、野生型スーパー抗原に対する毒性効果に寄与する。これは、少なくともＭ１突然変異体を用いて構築物を生成する利点を実証している。
【図４ａ】ＳＭＥＺ−ＬＣＭＶ複合体を用いる免疫による腫瘍成長の阻止。Ｍ１−ＬＣＭＶ構築物の単回投与で予め免疫したＣ５７Ｂｌ／６マウスにおける腫瘍成長の阻止を、ＬＣＭＶ  ペプチド１００μｇ単独と比較し、そして次にＬＣＭＶペプチドを発現するルイス肺癌腫細胞１×１０６で誘発した。
【図４ｂ】Ｍ１−ＬＣＭＶ構築物１μｇの単回投与、続いてＬＣＭＶペプチドを発現する腫瘍細胞５×１０６個の誘発による腫瘍成長の阻止。ＬＣＭＶペプチド１００μｇ単独で免疫した対照のマウスと比較して、Ｍ１−ＬＣＭＶ  １μｇで免疫したマウスは腫瘍成長を有意に遅延させるかまたは、腫瘍成長が全くない。
【図５】Ｍ１に連関された抗原に対する抗体応答に及ぼす影響。卵白アルブミン（卵アルブミン）は、マウスＢａｌｂｃ／ｃマウスにおいて抗体応答をわずかしか生じないタンパク質である。卵白アルブミンは、化学的にＭ１に抱合され、卵白アルブミンおよび非抱合Ｍ１で免疫したマウスと比較して１６倍高い力価の抗卵白アルブミンＩｇＧ１抗体を生成した。
【図６】ＣＴＬの抗原性に及ぼすＳＡＧ−ＬＣＭＶペプチドの影響。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年2月7日(2005.2.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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