(57)【要約】本発明は抗ＨＩＶ組成物及びその製造方法に関する。本発明に係る組成物は多価アニオン及びウイルスタンパク質ｇｐ１２０のＣＤ４ｉエピトープの暴露を誘導可能な分子を含有する。多価アニオンは例えばヘパリン、ヘパラン硫酸、及びヘパリン又はヘパラン硫酸に等価な多価アニオンからなる群から選択される。ウイルスタンパク質ｇｐ１２０のＣＤ４ｉエピトープの暴露を誘導可能な分子はＣＤ４ペプチド又はその誘導体である。本発明はまたエイズの治療のための医薬のような、医薬の製造のための上記組成物の使用にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多価アニオン及びＣＤ４ペプチド又は該ペプチドの誘導体、あるいはｇｐ１２０ウイルスタンパク質に結合し、ＣＤ４ペプチドに等価な形で上記ｇｐ１２０タンパク質を活性化可能なモノクローナル抗体から選択されるｇｐ１２０ウイルスタンパク質のＣＤ４ｉエピトープの暴露を誘導可能な分子を含有することを特徴とする組成物。
【請求項２】
多価アニオンがヘパリン、ヘパラン硫酸、及びヘパリン又はヘパラン硫酸に等価な多価アニオンからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ヘパリン、ヘパラン硫酸、又はヘパリンもしくはヘパラン硫酸に等価な多価アニオンが、１０から２４の重合度ｄｐを有している、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
ヘパリン、ヘパラン硫酸、又はヘパリンもしくはヘパラン硫酸に等価な多価アニオンが、１２から２０の重合度ｄｐを有している、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
ヘパリン、ヘパラン硫酸、又はヘパリンもしくはヘパラン硫酸に等価な多価アニオンが、１５から１７の重合度ｄｐを有している、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
ＣＤ４ペプチドが以下の配列（Ｉ）：
Ｃｙｓ又はＴＰＡ−Ｐ１−Ｃｙｓ−Ｐ２−Ｃｙｓ−Ｐ３−Ｃｙｓ−Ａｌａ又はＧｌｎ−Ｇｌｙ又は(Ｄ)Ａｓｐ又はＳｅｒ−Ｓｅｒ又はＨｉｓ又はＡｓｎ−ＸａａＪ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ又はＡｌａ−Ｃｙｓ−Ｘａａｋ−ＮＨ２（ここで、ＴＰＡはチオプロピオン酸を表し、ＸａａＪはβ−ナフチルアラニン、フェニルアラニン又はビフェニルアラニンを表し、ＸａａｋはＧｌｙ、Ｖａｌ又はＩｌｅｕを表し、Ｐ１は３から６のアミノ酸を表し、Ｐ２は２から４のアミノ酸を表し、Ｐ３は６から１０のアミノ酸を表し、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３のアミノ酸は天然でも非天然でも、同一でも異なっていてもよく、またＰ１、Ｐ２、Ｐ３は共通の配列を持っていてもよい）を有しており、かつ該ペプチドが、βターンがその配列（Ａ）のアミノ酸残基Ａｌａ又はＧｌｎ−Ｇｌｙ又はＤＡｓｐ又はＳｅｒ−Ｓｅｒ又はＨｉｓ又はＡｓｎ−ＸａａＪから構成されるβヘアピン高次構造を有している、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
ＣＤ４ペプチドがアペンディクスに添付した配列表の配列番号１から配列番号１８の配列から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
多価アニオン及びｇｐ１２０ウイルスタンパク質のＣＤ４ｉエピトープの暴露を誘導可能な分子が該組成物中で混合されている、請求項１ないし７の何れか１項に記載の組成物。
【請求項９】
多価アニオン及びｇｐ１２０ウイルスタンパク質のＣＤ４ｉエピトープの暴露を誘導可能な分子が、ｇｐ１２０ウイルスタンパク質のＣＤ４ｉエピトープの暴露を誘導可能な分子０．５から１．５モル当たり１から１０モルの多価アニオンの割合で該組成物中で混合されている、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
多価アニオン及びｇｐ１２０ウイルスタンパク質のＣＤ４ｉエピトープの暴露を誘導可能な分子が、ｇｐ１２０ウイルスタンパク質のＣＤ４ｉエピトープの暴露を誘導可能な分子当たり５モルの多価アニオンの割合で該組成物中で混合されている、請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
多価アニオン及びｇｐ１２０ウイルスタンパク質のＣＤ４ｉエピトープの暴露を誘導可能な分子が、該組成物中で互いに結合している、請求項１ないし７の何れか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
多価アニオン及びｇｐ１２０ウイルスタンパク質のＣＤ４ｉエピトープの暴露を誘導可能な分子が、多価アニオンの末端の一方において互いに結合している、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
多価アニオン及びｇｐ１２０ウイルスタンパク質のＣＤ４ｉエピトープの暴露を誘導可能な分子が、ポリエチレングリコールタイプのスペーサーアームによって互いに結合している、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
請求項８に記載の組成物の製造方法であって、
−  多価アニオンを調製し、
−  ｇｐ１２０ウイルスタンパク質のＣＤ４ｉエピトープの暴露を誘導可能な分子を調製し、
−  多価アニオンとｇｐ１２０ウイルスタンパク質のＣＤ４ｉエピトープの暴露を誘導可能な分子を混合して、上記組成物を得る、工程を具備してなる方法。
【請求項１５】
請求項１１に記載の組成物の製造方法であって、
−  多価アニオンを調製し、
−  ｇｐ１２０ウイルスタンパク質のＣＤ４ｉエピトープの暴露を誘導可能な分子を調製し、
−  多価アニオンとｇｐ１２０ウイルスタンパク質のＣＤ４ｉエピトープの暴露を誘導可能な分子を結合させて、上記組成物を得る、工程を具備してなる方法。
【請求項１６】
多価アニオンが酵素的又は化学的方法によってヘパリン又はヘパラン硫酸を部分脱重合させることによって調製される、請求項１４又は１５に記載の製造方法。
【請求項１７】
ｇｐ１２０ウイルスタンパク質のＣＤ４ｉエピトープの暴露を誘導可能な分子はペプチドであるので、固相化学合成又は遺伝子組換えによって調製される、請求項１４又は１５に記載の製造方法。
【請求項１８】
医薬品を調製するための、請求項１ないし７の何れか１項に記載の組成物の使用。
【請求項１９】
エイズの治療のための医薬品を調製するための、請求項１ないし７の何れか１項に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗ＨＩＶ組成物及びその製造方法に関する。本発明はまた抗ＨＩＶ医薬品を製造するための上記組成物の使用に関する。
【０００２】
ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）の細胞中への侵入はウイルス感染サイクルにおける本質的な段階である。このプロセスは、宿主の特異的レセプターのレベルの細胞表面でのウイルスの相互作用と、標的細胞中へのウイルスの遺伝子物質の侵入に対応する二つの段階に分けられる。
【０００３】
過去１０年にわたって、細胞表面へのＨＩＶの付着メカニズムはかなり明らかにされてきた。関与する分子対は、アペンディクスに添付した文献リストの文献［１，２］に開示されているように、現在は十分明確になっている。
【０００４】
ウイルスについては、エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０及びｇｐ４１がウイルス／細胞相互作用複合体から「円蓋への鍵」を構成している。最初は、ｇ−１２０は宿主細胞の膜タンパク質ＣＤ４に付随している。この相互作用はｇｐ１２０に高次構造の変化をもたらし、これが「ＣＤ４誘導」エピトープ（ＣＤ４ｉ）と呼ばれる特定のエピトープを暴露する。ＣＤ４ｉはケモカインレセプターファミリーのある種のメンバー（主としてＣＸＣＲ４及びＣＣＲ５）に対する結合部位を構成し、これが細胞表面においてｇｐ１２０コレセプターの役割を担う。この第二の相互作用、ｇｐ１２０／ＣＣＲ５又はｇｐ１２０／ＣＸＣＲ４はついでｇｐ１２０／ｇｐ４１タンパク質複合体の再構築をもたらす。この再構築がｇｐ４１を暴露し、それがついで細胞及びウイルス膜の融合、並びに細胞中へのウイルス遺伝子物質の侵入を開始させる。
【０００５】
これらの研究により、ＣＤ４及びＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４とのｇｐ１２０の相互作用の阻害、並びに融合の阻害の二つの新規な治療標的を定めることができる［３］。
【背景技術】
【０００６】
括弧内の文献はアペンディクスに添付された文献リストを意味する。
ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）感染の分野において、ヌクレオシドインヒビター、非ヌクレオシドインヒビター及び／又は抗プロテアーゼを利用する多剤併用療法（「高活性抗レトロウイルス剤療法」を略して「ＨＡＡＲＴ」）はウイルスの複製と成熟を標的とする。
【０００７】
これらの治療法により、ウイルス量を大幅に低減させることが可能になるが、ウイルスを身体から完全に根絶することはできない。実際、医薬品の投与を停止すると、数年の治療後でさえ、血漿中のウイルス量を再び急速に増大させる結果となる。この不具合の他に、これらの治療剤はかなり毒性があり、多くの副作用を有する。
【０００８】
エイズの新しい治療法の探索において、宿主細胞へのウイルスの吸着プロセスが、特にこの段階が細胞外で生じることから特に魅力的な治療標的を構成する。
ｇｐ４１に結合し、その融合活性を阻害するペプチドが開発されている［４，５］。現在進められている臨床試験は肯定的な結果をもたらし、融合を阻害し、よってウイルスの侵入を阻害することが有利な治療上の標的に効果的に対応する。
【０００９】
ウイルスの付着に関しては、様々な研究で、ＨＩＶの標的である細胞の表面に発現されるＣＤ４とウイルスの相互作用を阻害するための可溶型ＣＤ４の利用が探求されている。この解決手法は、ウイルスへの結合の際に、可溶型ＣＤ４がＣＤ４ｉエピトープを暴露し、ＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４コレセプターとウイルスの相互作用を実際に促進し、これが場合によっては感染を増大させるため、効果的ではないことが分かった［６］。
【００１０】
ＣＤ４に加えて、コレセプターはまた細胞へのウイルスの付着部位である。これらコレセプターに対する天然のリガンドはケミカイン、特にＲＡＮＴＥＳ及びＣＣＲ５のＭＩＰ、並びにＣＸＣＲ４のＳＤＦである。インビトロで又は培養細胞において、これらのケモカインは細胞とのウイルスの相互作用を阻害するが［７，８］、治療上の観点から使用することを困難にするある数の細胞応答をまた誘導する。ＡＭＤ３０１のようなある数の化合物又はコレセプターに結合するペプチドはまた抗ウイルス効果を有している［９，１０］。しかしながら、ＨＩＶコレセプターを標的にする際、これらの様々な分子はこれらのコレセプターの使用に関連した本来の細胞の機能をまたブロックする。
【００１１】
これらの細胞レセプターの他に、ＨＩＶは、それが感染する細胞上に存在する他の分子、例えばＤＣ−ＳＩＧＮ、スフィンゴ脂質又はヘパラン硫酸に結合しうる［１１］。
【００１２】
ヘパラン硫酸はグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）ファミリーに属する複合体多糖類である。それらは細胞表面、特に間質マトリックスに豊富に存在し、そこでそれらは特定の糖タンパク質ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧｓ）の細胞外ドメインに結合して見いだされる。ヘパラン硫酸（ＨＳｓ）は、ヘパリン（非常に類似した性質を有する他のタイプのＧＡＧ）の調製から半世紀前に発見されたものであるが、その構造とそれらが果たす機能の多様性のために他の生物学的巨大分子とは異なっている。それらは特にＨＩＶｇｐ１２０に結合することができ、ウイルスは標的細胞の表面に吸着するためにこの性質を利用する。ｇｐ１２０上のヘパラン硫酸の相互作用の部位はＶ３ループと呼ばれる可変構造上に位置している［１２］。しかしながら、ＨＩＶ感染中のこれら多糖類の正確な役割は比較的不明確なままである。研究から、細胞表面に発現したヘパラン硫酸を除去するとウイルス感染を許容し難くすることに寄与すること［１１］が分かっており、ウイルスの付着と侵入に対するこの分子の重要性が立証されている。
【００１３】
これらの知見を基に、細胞とのウイルスの相互作用を阻害するために、ヘパリンタイプの様々な多価アニオン性分子が開発されている。しかしながら、最初の臨床実験ではこれらの分子の活性はほんの僅かであるか又はないことが示されており、毒性作用が観察された場合もあった［１３，１４］。
【００１４】
従って、制約が少ない上に、副作用が生じることが少なく、治療逃れ、つまり治療にもはや応答しない耐性のあるウイルスの出現を回避することが可能になる、エイズに対する新しい治療法を開発することが必要であると思われる。新しい標的を対象とする他の抗ＨＩＶ治療法を見いだすことがまた必要である。
かかる事情の下に、本発明者等は本発明を完成した。
【発明の開示】
【００１５】
本発明の目的は、正確には、抗ＨＩＶ剤として使用することができる新規な組成物を提供することによって、上述の不具合を解消することにある。この組成物はエイズウイルスのその宿主細胞中への侵入をブロックすることができる。この点で、これは、医薬品、特にエイズの治療のための医薬品を調製するために使用することができる。
【００１６】
本発明の組成物は、多価アニオンと、ｇｐ１２０ウイルスタンパク質のＣＤ４ｉエピトープの暴露を誘導可能な分子とを含有することを特徴とする。
しかして、本発明において、本発明者等は、単一の組成物中に、第一に多価アニオン、例えばヘパリン又はヘパラン硫酸タイプのアニオンと、第二にｇｐ１２０ウイルスタンパク質のＣＤ４ｉエピトープの暴露を誘導可能な分子、例えば可溶型ＣＤ４ペプチドを組み合わせた。本発明者等は、この組成物により、予期しないことに、Ｖ３ループをブロックすることによってウイルス−細胞膜ヘパラン硫酸相互作用を、またＣＤ４ｉ部位をブロックすることによってウイルス−コレセプター相互作用を、両方とも阻害することが可能であることを示した。事実、本発明者等は、ｇｐ１２０上にヘパリン−又はヘパラン硫酸−多価アニオンの二つのドメイン又は部位が実際に存在していることを示した。第一のものはＶ３ループであり、第二のものはＣＤ４ｉドメインである。本発明者等は、ＣＤ４ペプチドの存在下で、ヘパリン又は十分なサイズのヘパリン断片がｇｐ１２０ウイルスタンパク質のＣＤ４ｉドメインと相互作用し、この組み合わせがｇｐ１２０／４８ｄ又は１７ｂ抗体相互作用を大きく阻害することを示した（以下の実施例を参照）。４８ｄ又は１７ｂはコレセプターの模倣体として使用される。
【００１７】
本発明の組成物でのＨＩＶのこの阻害は、当業者は、ＣＤ４分子を単独で使用すると所望の作用とは逆の作用を持ち得、コレセプターとの相互作用にドメインを暴露し、よってウイルス感染力を増大させうることを知っていることから、なおさら意外である。
【００１８】
よって、本発明の組成物は、ＣＤ４ペプチドの存在下でのヘパリン又は他の多価アニオンによる、つまりＨＩＶのそのコレセプターとの相互作用を阻害することによる、新規な治療標的を対象としている。この解決策は、ウイルス自体を標的とし細胞を標的としていないので、ウイルスへの細胞の付着を阻害するので治療的観点から非常に有利である。従って、第一に、標的とされるのがコレセプターである先行技術の製品の場合に観察される細胞性効果がそれには伴わない。また、生物に対する本発明の組成物の毒性は、その構成成分の性質のために、先行技術の殆どの化学的化合物より少ない。
【００１９】
本発明において、多価アニオンはヘパリン、ヘパラン硫酸、及びヘパリン又はヘパラン硫酸に等価な多価アニオンからなる群から好適に選択されうる。例えばデキストラン硫酸（商品名、ウエノ・ファインケム）、カードラン硫酸（商品名、味の素）、２−ナフタレンスルホネートポリマー（商品名、プロセプト）、ペントサン(Pentosan)ポリサルフェート（商品名、ベイカー・ノートン・ファーム；ヘキスト）、又はレゾベン(Resobene)（商品名）である。
【００２０】
本発明に係るヘパリン及びヘパラン硫酸の構成二糖類（基本要素）の構造は以下の式（Ｉ）の通りである：
【化１】
2005528405.tif 000002
【００２１】
多価アニオンは、本発明では望まれない抗凝固活性を持ち得、様々なタンパク質、特にトロンビン又はアンチトロンビンＩＩＩとの非特異的結合を形成しうるので、あまり長くならないことが好ましい。その長さは以下に定める重合度を有するヘパリン鎖と同様であるのが好ましい。多価アニオンは好ましくは二糖類当たり少なくとも二つのアニオン基を有する。本発明によれば、多価アニオンがヘパリン又はヘパラン硫酸である場合、それは１０から２４、有利には１２から２４、好ましくは１６から２２の重合度ｄｐを有している。本発明によれば、ヘパリン、ヘパラン硫酸、又はヘパリンもしくはヘパラン硫酸に等価な多価アニオンは、１２から２０、例えば１５から１７の重合度ｄｐを有しうる。
【００２２】
本発明によれば、多価アニオンは、酵素的方法、例えばヘパリナーゼによって、又は化学的方法、例えば亜硝酸によって、ヘパリン又はヘパラン硫酸を部分脱重合させることによって調製されうる。それらが化学的に得られる場合、ヘパランは、Ｎ硫酸化又はＮアセチル化グルコサミン、又はサルフェート基が可変割合であるウロン酸（グルクロン酸又はイズロン酸）に結合したＮ位が非置換のグルコサミンが存在することで定義されうる。これらのオリゴ糖の構造的な模倣体は化学合成法によって得ることができる。
【００２３】
本発明によれば、ｇｐ１２０ウイルスタンパク質のＣＤ４ｉエピトープの暴露を誘導可能な分子は、ＣＤ４ペプチド又は該ペプチドの誘導体、あるいはｇｐ１２０ウイルスタンパク質に結合し、ＣＤ４ペプチドに等価な形で上記ｇｐ１２０タンパク質を活性化可能なモノクローナル抗体から選択することができる。
【００２４】
それがＣＤ４ペプチドである場合、液体媒体中でのｇｐ１２０ウイルスタンパク質とのその相互作用の容易化、及びその標的へのその接近の容易化という明らかな理由から好ましくは可溶型である。
【００２５】
本発明によれば、ＣＤ４ペプチドは有利には以下の配列（Ｉ）：
Ｃｙｓ又はＴＰＡ−Ｐ１−Ｃｙｓ−Ｐ２−Ｃｙｓ−Ｐ３−Ｃｙｓ−Ａｌａ又はＧｌｎ−Ｇｌｙ又は(Ｄ)Ａｓｐ又はＳｅｒ−Ｓｅｒ又はＨｉｓ又はＡｓｎ−ＸａａＪ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ又はＡｌａ−Ｃｙｓ−Ｘａａｋ−ＮＨ２
（ここで、ＴＰＡはチオプロピオン酸を表し、ＸａａＪはβ−ナフチルアラニン、フェニルアラニン又はビフェニルアラニンを表し、ＸａａｋはＧｌｙ、Ｖａｌ又はＩｌｅｕを表し、Ｐ１は３から６のアミノ酸を表し、Ｐ２は２から４のアミノ酸を表し、Ｐ３は６から１０のアミノ酸を表し、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３のアミノ酸は天然でも非天然でも、同一でも異なっていてもよく、またＰ１、Ｐ２、Ｐ３は共通の配列を持っていてもよい）を有しており、かつ該ペプチドが、βターンがその配列（Ａ）のアミノ酸残基Ａｌａ又はＧｌｎ−Ｇｌｙ又はＤＡｓｐ又はＳｅｒ−Ｓｅｒ又はＨｉｓ又はＡｓｎ−ＸａａＪから構成されるβヘアピン高次構造を有している。実際、これらのペプチドはｇｐ１２０ウイルスタンパク質に対して非常に大なる親和性を示す。
【００２６】
本発明において使用することができるかかるペプチドの例は、アペンディクスに添付した配列表の配列番号１から配列番号１８の配列のペプチド、又は等価なペプチドである。
これらのペプチドは固相化学合成又は遺伝子組換えの常套的な方法によって調製できる。
【００２７】
ｇｐ１２０ウイルスタンパク質のＣＤ４ｉエピトープの暴露を誘導可能な分子が抗体である場合、それは例えば文献Sullivan N, Sun Y, Binley J, Lee J, Barbas CF 3rd, Parren PW, Burton DR, Sodroski J, Determinants of human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein activation by soluble CD4 and monoclonal antibodies. J Virol 1998; 72(8): pp.6332-6338に記載されているものから選択できる。
【００２８】
本発明の第一の実施態様によれば、多価アニオン及びｇｐ１２０ウイルスタンパク質のＣＤ４ｉエピトープの暴露を誘導可能な分子は上記組成物中で混合される。本発明に係るこの組成物により、コレセプターとの相互作用の部位（ＣＤ４ｉ部位）を暴露し、同時に多価アニオンからなるオリゴ糖部分によってこの部位をブロックすることが可能になる。
【００２９】
この第一の実施態様によれば、多価アニオン及びｇｐ１２０ウイルスタンパク質のＣＤ４ｉエピトープの暴露を誘導可能な分子は、ｇｐ１２０ウイルスタンパク質のＣＤ４ｉエピトープの暴露を誘導可能な分子０．５から１．５モル当たり１から１０モルの多価アニオン、好ましくはｇｐ１２０ウイルスタンパク質のＣＤ４ｉエピトープの暴露を誘導可能な分子１モル当たり５モルの多価アニオンの割合で該組成物中で好適に混合される。
【００３０】
本発明はまた次の工程：
−  多価アニオンを調製する工程、
−  ｇｐ１２０ウイルスタンパク質のＣＤ４ｉエピトープの暴露を誘導可能な分子を調製する工程、
−  多価アニオンとｇｐ１２０ウイルスタンパク質のＣＤ４ｉエピトープの暴露を誘導可能な分子を混合して、上記組成物を得る工程
を具備してなる、本発明のこの第一の実施態様に係る組成物を製造する方法にも関する。
【００３１】
混合物は、投与可能な医薬品を製造するために使用できるように、好ましくは生物学的バッファー中で調製される。ｐＨは好ましくは約７であり、溶液は例えば１５ｇ／ｌのＮａＣｌを含む。
【００３２】
本発明の第二の実施態様によれば、多価アニオン及びｇｐ１２０ウイルスタンパク質のＣＤ４ｉエピトープの暴露を誘導可能な分子は、上記組成物中で互いに結合している。それらは多価アニオン／ｇｐ１２０ウイルスタンパク質のＣＤ４ｉエピトープの暴露を誘導可能な分子のハイブリッド体を形成する。
例えば、本発明によれば、多価アニオンとｇｐ１２０ウイルスタンパク質のＣＤ４ｉエピトープの暴露を誘導可能な分子は、多価アニオンの末端の一方において互いに結合している。
【００３３】
使用される多価アニオンが、例えば１０から１２の重合度ｄｐと、短い場合、形成されるハイブリッド体がｇｐ１２０ウイルスタンパク質上の全てのその標的に結合するようにするために、多価アニオンとｇｐ１２０ウイルスタンパク質のＣＤ４ｉエピトープの暴露を誘導可能な分子をスペーサーアームによって互いに結合することが必要であろう。これはまた、ｇｐ１２０ウイルスタンパク質のＣＤ４ｉエピトープの暴露を誘導可能な分子が短すぎる場合も同様である。スペーサーアームは適切な長さの如何なるポリマーであってもよいが、好ましくは水性バッファー中に可溶性である。例えば、ポリオシド又はポリグリコールを挙げることができる。例えばポリエチレングリコール：(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｎである。本発明において使用することができるこの種のスペーサーアームの調製は先行技術に広く記載され、例えば文献［１８］及び［１９］に記載されている（添付の文献リストを参照）。
【００３４】
本発明はまた次の工程：
−  多価アニオンを調製する工程、
−  ｇｐ１２０ウイルスタンパク質のＣＤ４ｉエピトープの暴露を誘導可能な分子を調製する工程、
−  多価アニオンとｇｐ１２０ウイルスタンパク質のＣＤ４ｉエピトープの暴露を誘導可能な分子を結合させて、上記組成物を得る工程
を具備してなる、本発明の第二の実施態様に係る組成物を製造する方法にも関する。
【００３５】
多価アニオンとＣＤ４ｉエピトープの暴露を誘導可能な分子との結合は、例えば多価アニオンとペプチドを結合するために、当業者に知られている任意の方法によって形成することができる。例えば、ポリペプチドにオリゴ糖をカップリングさせるための文献［１５］、［１６］及び［１７］（添付の文献リストを参照）に記載された様々な方法を本発明において使用することができる。
【００３６】
本発明においては、上述の理由のために、任意のタイプの架橋剤、又は第一にオリゴ糖の一末端に結合し第二にその機能に本質的ではないＣＤ４部分に結合するスペーサーアームを使用することがまたできる。スペーサーアームは上述のものの一つでありうる。それは文献［１８］及び［１９］に記載されたようにして調製することができる。
【００３７】
本発明のハイブリッド分子は３つの利点を有している：アペンディクスに添付した図７に模式的に示されるように、それはｇｐ１２０ウイルスタンパク質のＣＤ４相互作用部位上、ｇｐ１２０分子がコレセプターとしてＣＸＣＲ４を使用してウイルスから誘導される場合はＶ３ループ上、そしてコレセプターとの相互作用のドメイン（ＣＤ４ｉドメイン）上に結合する。従って、その細胞レセプター及びコレセプターと相互作用するためにｇｐ１２０が利用する全てのドメインを同時にブロックすることが可能になる。
【００３８】
その他の特徴及び利点は、添付された図面と配列を参照しながら非限定的な例示のために記載される以下の実施例に照らせば、当業者には明らかであろう。
【実施例】
【００３９】
次の実施例において、ｇｐ１２０−ヘパリン相互作用の分析を表面プラズモン共鳴（BIAcoreシステム(商標)）によって実施した。この方法は、リアルタイムの相互作用の測定を実施可能にし、センサーチップに固定されたヘパリンが細胞表面のような二次元界面を構成する生理学的な真実に近いモデルを提供するという利点をまた有している。
【００４０】
実施例１：本発明の組成物を製造するために使用できるＣＤ４ペプチドの合成
アペンディクスに添付された配列表のペプチドを、アミノ酸のα-アミノ官能基の一時的な保護のためにフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基を使用するＦｍｏｃ化学によって、アプライド・バイオシステムズの自動ペプチド合成機ｍｏｄ．４３３Ａを用いた固相化学合成法によって合成する。このＦｍｏｃ法においてアミノ酸側鎖の副反応を防止するために使用される保護基はＳｅｒ、Ｔｈｒ及びＴｙｒ残基に対してはtert-ブチルエーテル（ｔＢｕ）；Ａｓｐ、Ｇｌｕに対してはtert-ブチルエステル（ＯｔＢｕ）；Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓに対してはトリチル（Ｔｒｔ）；Ｌｙｓに対してはtert-ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）及びＡｒｇに対しては２,２,５,７,８-ペンタメチルクロマン-６-スルホニル（Ｐｍｃ）とした。
【００４１】
カップリング反応は樹脂（０．１ｍｍｏｌ）に対して過剰の１０当量のアミノ酸（１ｍｍｏｌ）で生じる。保護されたアミノ酸は１ｍｌのＮ-メチルピロリドン（ＮＭＰ）及びＮＭＰ溶媒中１-Ｎ-ヒドロキシ-７-アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）の１Ｍ溶液１ｍｌに溶解される。ついで、Ｎ,Ｎ'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）の１Ｍ溶液１ｍｌを添加する。４０から５０分の活性化後、生成した活性なエステルを、樹脂を含む反応器中に移す。この移送と次のカップリング工程の後に、ＮＭＰ中のピペリジン２０％溶液でそのＦｍｏｃ基を除去することにより、樹脂を脱保護する。およそ５から１０分後にＮＭＰで洗浄することによって過剰のピペリジンを除去する。
【００４２】
ペプチドの合成後、ＤＭＦ中のヒドラジン２％溶液でペプチド-樹脂を５回処理する。リンカーアームのカップリングは、ジイソプロピル-エチルアミンの存在下でＨＢＴＵ試薬を使用して１０当量のＦｍｏｃ-８-アミノ-３,６-ジオキサオクタン酸でＤＭＦ中で室温で１時間実施する。ついで、Ｆｍｏｃ基をＤＭＦ中２０％のピペリジンで脱保護する。
ペプチド-樹脂はＤＩＥＡの存在下で１０当量のトラウト(Traut)試薬（２-イミノチオラン塩酸塩(シグマ)）で直ぐに処理する。ペプチドは最終的には切り離され以下に記載のようにして脱保護される。
【００４３】
樹脂の切断と側鎖上に存在する保護基の切断は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で樹脂に結合したペプチドを同時に処理することによって実施した。切断を実施する前に、ジクロロメタン（ＤＣＭ）で樹脂を数回洗浄し、最後に乾燥させた。切断中に使用される試薬は、８１．５％のＴＦＡ及びフェノールスカベンジャー（５％）、チオアニソール（５％）、水（５％）、エタンジオール（２．５％）及びトリイソプロピルシラン（１％）を含む酸混合物である。樹脂１グラム当たり１００ｍｌの溶液の割合で、室温で攪拌しながら３時間この混合物で樹脂を処理した。溶液中の遊離ペプチドを濾過によって回収した。ついで、ペプチドを沈殿させ、ジイソプロピルエーテルで冷条件下で洗浄した後、２０％酢酸中に溶解し、凍結乾燥させた。
【００４４】
凍結乾燥後に回収したペプチド、つまり合成粗生成物は還元形態にあり、つまり鎖間ジスルフィド架橋は形成されていない。これらの共有結合の形成はシスタミン／システアミンレドックス対を使用して実施した。合成粗生成物を、溶解を容易にするために０．１％（ｖ／ｖ）のＴＦＡ及び６Ｍの塩化グアニジニウムを２．０ｍｇ・ｍｌ−１の割合で添加した水中に取り上げた。ついで、この溶液を、１００ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．８、及び５ｍＭのシステアミンから構成された還元バッファーに滴下して加え、０．２ｍｇ・ｍｌ−１まで希釈した。０．５ｍＭの最終濃度のシスタミン（酸化剤）を室温での４５分の反応後に添加した。その媒質を３０分後にｐＨ３．０にした。
【００４５】
システアミンによりペプチド上に存在するチオール基を還元することが可能になる。外気中で、それは酸化し、システインの酸化、従って鎖間ジスルフィド架橋の形成によるペプチドの折り畳みを可能にする。操作の終わりに添加されるシスタミンにより、折り畳みを完了させることができる。酸化の正しい進行は、粗生成物と酸化生成物の滞留時間を比較することにより、分析用クロマトグラフィーによって証明され、ここで滞留時間は粗生成物の方が大である。
【００４６】
ペプチドはＶｙｄａｃ Ｃ１８（１．０ｘ２５．０ｃｍ）分取カラムでの逆相高速液体クロマトグラフィーによって精製した。９０分にわたる、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液中０−６０％アセトニトリルの線形勾配を使用した。主ピークの画分を分析用ＨＰＬＣによって分析した；丁度一つのピークを示す画分を混合して凍結乾燥した。
このようにして得られた生成物を質量分析法によって分析した。これらはアペンディクスに添付した配列表のペプチドであった。
【００４７】
実施例２：本発明の組成物に使用できるヘパリン又はヘパラン硫酸タイプの多価アニオンの合成
Ａ）酵素的合成法
定まった重合度ｄｐを有するヘパリン又はヘパラン硫酸の分子を合成する。
６ｇのヘパリンを、５ｍＭのトリス、２ｍＭのＣａＣｌ２、５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍｇ／ｍｌのアルブミンを含むバッファーに溶解させた。ｐＨは酢酸で７．５に調整される。この溶液をおよそ５０ｈの間、ヘパリナーゼＩ（８ｍＵ／ｍｌ）と共に２５℃でインキュベートする（酵素反応は２３２ｎｍで測定される光学密度の増加によってモニターする）。
【００４８】
ついで、混合物をゲル濾過クロマトグラフィーによって精製する。固相は、０．２５ＭのＮａＣｌを用いて１ｍｌ／分で溶出させられる４．４ｃｍ直径の１．５０ｍカラムに含まれるバイオゲル(Biogel)Ｐ１０である。
図１１は２から１０の範囲の重合度ｄｐに対して得られた１５ｍｌの様々な画分の２３０ｎｍでの吸光度を表す。
様々なオリゴ糖（ｄｐ２、ｄｐ４等々）を水に対して透析した後、凍結乾燥する。
【００４９】
Ｂ）天然産物からの化学的脱重合による合成
出発材料がヘパリンである場合、次の手順が実施される：１ｇのヘパリンを２．１ｍｇ／ｍｌで２０ｍｌの亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ２）に溶解させる。その溶液を硫酸でｐＨ１．５に調整し、ついで３ｈの間、４℃にてインキュベートする。反応を停止させ、上記の段落Ａ）に記載したようにしてオリゴ糖を精製する。
【００５０】
出発材料がヘパラン硫酸である場合、次の手順が実施される：８ｇのヘパラン硫酸を５ｍＭのトリス、２ｍＭのＣａＣｌ２、５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍｇ／ｍｌのアルブミンを含む４０ｍｌに溶解させる。ｐＨを酢酸で７．５に調整する。この溶液をおよそ７２ｈの間、３０℃にてヘパリナーゼＩＩＩ（２５ｍＵ／ｍｌ）と共にインキュベートする。４８ｈの間、ヘパリナーゼＩＩＩを再び加えた後、生成物を、上記の段落Ａ）に記載したようにして精製する。
【００５１】
実施例３：本発明の組成物の合成：多価アニオンとのＣＤ４ペプチドの混合物
この実施例では、実施例１のＣＤ４ペプチドを、実施例２で調製したヘパラン硫酸と混合する。
これらの２分子を、所望の最終濃度の２倍である濃度で溶解させる。これらの可溶化は生理学的バッファー；例えばＰＢＳ、ＴＢＳ（５０ｍＭトリス、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）又はＨＢＳ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中で実施する。
ついで、二つの調製物を等しい容量（１／１）で混合する。
【００５２】
実施例４：本発明の組成物の合成：多価アニオンとのＣＤ４ペプチドのカップリング
この実施例では、実施例１のＣＤ４ペプチドを、実施例２で調製したヘパラン硫酸とカップリングさせる。
ヘパラン硫酸をモル過剰のヒドラジン又はカルボジヒドラジドと共にインキュベートする。この工程の役割は、酵素的脱重合によって調製される場合にはオリゴ糖の還元性末端に、あるいは亜硝酸での化学的脱重合によって調製される場合にはオリゴ糖のアルデヒドに、ヒドラジン基を配することにある。
【００５３】
可溶型ＣＤ４ペプチドの糖鎖は過ヨウ素酸ナトリウムでの処理によって酸化され、このようにして作り出されたアルデヒド官能基はヒドラジン含有オリゴ糖のカップリングに使用される。
一般にＰＢＳバッファー（リン酸ナトリウム生理食塩水）中に１ｍＭの溶液のオリゴ糖を、モル過剰（例えば１００倍まで）のヒドラジン又はカルボジヒドラジドと共に、またＰＢＳ溶液中で同時インキュベートする。反応混合物を室温でインキュベートした後、脱塩(desalification)又は蒸留水に対しての透析によって精製し、最後に真空蒸発によって乾燥させ、又は凍結乾燥させる。
【００５４】
グリコシル化（哺乳動物細胞又は昆虫細胞中で産生）可溶型ＣＤ４分子（ｓＣＤ４）を２０ｍＭのリン酸塩バッファー、ｐＨ６．２に取り上げた後、過ヨウ素酸ナトリウム（１０ｍＭ）を用いて４℃で暗室にて２０分間処理した。過ヨウ素酸ナトリウムを除去するために、反応混合物をゲル濾過によって又はリン酸塩バッファーに対する透析によって脱塩する。
ｓＣＤ４は、そのグリカンがこのようにして酸化され、４℃にてモル過剰のヒドラジン含有オリゴ糖と共に同時インキュベートされ、２分子間の複合体が生成される。
【００５５】
ＣＤ４がグリコシル化されない場合は、手順はNajjam等の文献［１７］によって記載された形で実施される。
第一にオリゴ糖の一末端に結合し、第二にその機能に本質的ではないＣＤ４ペプチドの部分に結合する任意のタイプの架橋剤をまた使用することができる。当業者であればこの方法又は等価な方法を実施するのに困難な点はないであろう。
【００５６】
実施例５：ＣＤ４によるヘパリンに対するｇｐ１２０の親和性の増大の証明
３０レゾナンスユニット（ＲＵ）のビオチン化ヘパリンをバイオチップ（Biacore社によって製造された「センサーチップ」Ｂ１）の表面に固定化する。
５０ｎＭのｇｐ１２０（ｈｘｂｃ２）を、可溶型ＣＤ４の濃度を０、５０、１００、２５０又は５００ｎＭと増加させて１時間３０分インキュベートした後、１０μｌ／分でヘパリン表面に注入した。
【００５７】
表面プラズモン共鳴によるｇｐ１２０−ヘパリン相互作用の分析を時間の関数として実施した。
図１の曲線は５０ｎＭのｇｐ１２０及びそれぞれ０、５０、１００、２５０又は５００ｎＭ（この図中、下から上の各曲線に対して）のＣＤ４の注入に対応する。
図２はＣＤ４の濃度の関数としてヘパリンに結合したｇｐ１２０／ＣＤ４の量を示す。
【００５８】
およそ５：１のＣＤ４：ｇｐ１２０モル比が最大の応答を生じるようである。
これらの結果は、ｇｐ１２０のＣＤ４ｉドメインの暴露がヘパリンとのｇｐ１２０の相互作用を大きく増大させることを示している。従って、ＣＤ４ｉはヘパリンとの相互作用の新たな部位を表す。
【００５９】
実施例６：ＣＤ４依存性ｇｐ１２０／４８Ｄ相互作用
ＣＤ４ｉエピトープに特異的な１２５０ＲＵの抗体４８ｄを、上の実施例１におけるようにバイオチップ（「センサーチップ」Ｂ１）の表面に固定する。
５０ｎＭのｇｐ１２０ウイルスタンパク質（ｈｘｂｃ２）を、０、５０、１００、２４０又は５００ｎＭの増大する濃度の可溶型ＣＤ４と共に１時間２０分の間インキュベートした後、１０μｌ／分で４８ｄ表面上に注入する。
表面プラズモン共鳴によるｇｐ１２０−ヘパリン相互作用の分析を時間の関数として実施した。
【００６０】
図３の曲線は５０ｍＭのｇｐ１２０とそれぞれ０、５０、１００、２５０又は５００ｎＭのＣＤ４（この図で下から上の各曲線に対して）の注入に対応する。
この実施例は、ｇｐ１２０／４８ｄ相互作用がＣＤ４依存性であり、４８ｄがコレセプター認識ドメインＣＤ４ｉと相互作用することを示している。従って、この抗体を、コレセプターとのｇｐ１２０の相互作用に対するモデルとして使用することができる。
【００６１】
実施例７：ヘパリンによるｇｐ１２０タンパク質−４８ｄ相互作用の阻害
ｇｐ１２０タンパク質をＣＤ４と共に４０分間、同時インキュベートする。ついで、混合物を５つのアリコートに分け、それにヘパリン（１５ｋＤａ）を様々な濃度で添加する。
アリコート中の最終濃度は：ｇｐ１２０：５０ｎＭ；ＣＤ４：２５０ｎＭ及び図４の上から下に向けてヘパリン：０、３、６、１２又は３０μｇ／ｍｌである。一番上の曲線では、ヘパリンがなく、ｇｐ１２０／ＣＤ４相互作用が可視化される；他の曲線は全てヘパリンの存在下のものである（図４の上から下に向けて３から３０μｇ／ｍｌ）。
【００６２】
４０分のインキュベーション後に、様々な混合物を４８ｄ表面上に注入する。
表面プラズモン共鳴によるｇｐ１２０−ヘパリン相互作用の分析を時間の関数として実施した。
得られた結果を図４に示す。それらは、ヘパリンが、４８ｄ抗体表面上へのｇｐ１２０／ＣＤ４複合体の吸着を阻害することを示している。更に、ヘパリンは、阻害が試験濃度の最小値（３μｇ／ｍｌ）から視覚的に完全であるので、効果的なインヒビターであることが見いだされた。
これは、ヘパリンが４８ｄと競合し、よってＣＤ４ｉに結合することを示している。
【００６３】
この実施例は、上に定義したオリゴ糖（ヘパリン）の阻害活性がＣＤ４の存在下で得られることを示している。
この結果により、ＣＤ４と共有的に結合したヘパリンタイプのオリゴ糖からなるハイブリッド分子、又はこれら二つの分子の混合物の使用を提案することが可能になる。
多価アニオンとのＣＤ４ｉドメインの直接の相互作用は先行技術には決して記載されていないし、多価アニオンによるｇｐ１２０−抗体４８ｄ相互作用の阻害も記載されていない。ヘパリンタイプの分子によってｇｐ１２０のコレセプターとの可能な阻害を示す研究はなされていなかった。
【００６４】
実施例８：明確なサイズのオリゴ糖断片とのｇｐ１２０−４８ｄの相互作用の阻害
明確なサイズのオリゴ糖断片を酵素的脱重合によって得る。
ｇｐ１２０ウイルスタンパク質を、ＣＤ４ｉドメインを暴露するようにＣＤ４と共に６０分間同時インキュベートする。混合物を８のアリコートに分け、１から８の塩基二糖ユニット、つまり２から１６の重合度（ｄｐ）を有する増加サイズのヘパリン断片を、ｇｐ１２０が５０ｎＭ、ＣＤ４が２５０ｎＭ、ヘパリン断片が１２５ｎＭの最終濃度になるように添加する（二糖の分子量はおよそ６００Ｄａである）。
【００６５】
ついで混合物を、４８ｄ表面上に注入する（図５）。得られたデータにより、ヘパリン断片のサイズの関数として４８ｄに結合したｇｐ１２０／ＣＤ４複合体の量を表すことが可能になる（図６）。
これらの結果は、ｄｐ６（３つの二糖）以下のサイズのオリゴ糖は４８ｄとのｇｐ１２０／ＣＤ４複合体の相互作用をブロックする能力を有していないことを示している。
他方、相互作用は、試験濃度にて、そのサイズがｄｐ１０より大きく、更に好ましくはｄｐ１２より大きい断片によって完全に阻害される。
【００６６】
これらの結果は、例えば、２５０ｎＭのＣＤ４の存在下で１６の重合度（ｄｐ１６）、つまり０．６μｇ／ｍｌを持つ１２５ｎＭの濃度のヘパリンがｇｐ１２０（５０ｎＭ）との４８ｄ抗体の相互作用を９０から１００％阻害することを明らかにしており、直接の相互作用が存在することを確認できる。同様に、４０ｎＭのｄｐ１４からｄｐ１８のタイプのヘパリンのオリゴ糖は１７ｂ抗体とのｇｐ１２０（５ｎＭ）／ＣＤ４（１０ｎＭ）の相互作用を阻害する。
【００６７】
これらの結果は、ヘパラン硫酸に非常に類似した構造を有する分子であるヘパリンがまたｇｐ１２０上の第二結合部位と相互作用することを示している。ＣＤ４ｉと呼ばれるこの部位は、ｇｐ１２０がＣＤ４と相互作用する場合に唯一暴露されるエピトープであり、ＨＩＶコレセプター結合部位を構成する。これらの結果は、その効果がＣＤ４ｉ部位を暴露することにあるＣＤ４の存在がｇｐ１２０−ヘパリン又はｇｐ１２０−ヘパラン硫酸の相互作用を極めて大幅に増加させることを示している；これはどこにも記載されているものではなく、ＣＤ４ｉ部位を介してのｇｐ１２０とヘパリン又はヘパラン硫酸の可能な相互作用の初めての証明となる。
【００６８】
分子モデルの研究により、ｇｐ１２０のＣＤ４ｉ部位が塩基性アミノ酸からなることが分かった。これらの塩基性アミノ酸はタンパク質の表面上に配列され、ヘパリンとの相互作用の部位、又はヘパリン又はヘパラン硫酸から誘導されたオリゴ糖を効率的に構成する。
従って発明者等はこの新規な相互作用部位を標的とする多価アニオン化合物の治療的使用をここに提案する。本アプローチは、多価アニオンとＣＤ４ｉエピトープを暴露可能な分子の、同時投与又はハイブリッド分子の形態での併用使用からなる。この種の分子は宿主細胞とのｇｐ１２０の相互作用の全てのドメインを同時にブロックする。
【００６９】
実施例９：タンパク質とカップリングさせるためのオリゴ糖の活性化プロトコール
該プロトコールはアミン又はヒドラジド基を持つ（オリゴ糖上の）アルデヒド基のタンパク質への反応に基づく。
オリゴ糖が（亜硝酸での）ヘパリンの化学脱重合によって得られる場合、アルデヒド官能基が切断部位に作り出され、オリゴ糖がカップリングを受ける準備ができる。
【００７０】
オリゴ糖が酵素的脱重合によって得られる場合、次の手順を実施できる：
およそ１０ｍＭの濃度のオリゴ糖を炭酸水素アンモニウムの飽和溶液中で９６時間、インキュベートする。ついで、反応混合物を、１０ｍＭの炭酸水素アンモニウムで平衡させたゲル濾過カラムで精製した後、残留している炭酸水素アンモニウムを除去するために試料を数回凍結乾燥させる。この工程の目的はオリゴ糖の還元性末端にグリコシルアミンを作り出すことにある。
【００７１】
あるいは、オリゴ糖（１０ｍＭ）を、９６時間の間、ｐＨ５のシアノホウ化水素ナトリウム（ＮａＢＨ３ＣＮ、１Ｍ）の存在下で０．２５ｍＭのアジピン酸ジヒドラジドと共にインキュベートすることもできる。ついで、反応混合物を、蒸留水で平衡させたゲル濾過カラムで精製した後、凍結乾燥によって乾燥させる。この工程の目的はオリゴ糖の還元性末端にヒドラジド官能基を導入することにある。
【００７２】
上記の二つの方法に従って調製されたオリゴ糖をついでｐＨ５で０．５Ｍのジグルチルアルデヒドと共に４時間の間、ついで０．１ＭのＮａＢＨ３ＣＮと共に３０分、インキュベートする。ついで、反応混合物を、蒸留水で平衡させたゲル濾過カラムで精製した後、凍結乾燥によって乾燥させる。この工程の目的はオリゴ糖の還元性末端にアルデヒド基を配することにある。
【００７３】
実施例１０：ウイルスのコレセプター（ＣＸＣＲ４）とのｇｐ１２０の相互作用に対するオリゴ糖の阻害活性の証明
ＣＸＣＲ４遺伝子を形質移入したＣＨＯ細胞（グリコサミノグリカンの発現が欠損せしめられた変異体２２４１で、ヘパラン硫酸を生じない）を、ヘパリンを伴うか伴わないで、ｇｐ１２０（２０μｇ／ｍｌ）と共に、又はｇｐ１２０／ＣＤ４複合体（タンパク質のそれぞれが２０μｇ／ｍｌ）、あるいは６ｋＤａのヘパリン（１０μｇ／ｍｌ）又はヘパリンドデカサッカライド（１０μｇ／ｍｌ）と共に前もってインキュベートされたｇｐ１２０／ＣＤ４複合体と共に、プレインキュベートする。
細胞の表面に結合したｇｐ１２０を、ＦＩＴＣ標識二次抗体に結合した抗ｇｐ１２０抗体を使用して検出した後、ＦＡＣＳによって分析した。
【００７４】
アペンディクスに添付された図１２に表された結果はｇｐ１２０／ＣＸＣＲ４相互作用のパーセントを示している。ネガティブコントロール（０％）は細胞へのｇｐ１２０の非特異的結合に対応する（ｇｐ１２０単独又はヘパリンの存在下）（１）。ポジティブコントロール（１００％）はｇｐ１２０／ＣＤ４複合体に対して観察され（２）、ＣＤ４により誘導された、ＣＸＣＲ４コレセプターへのｇｐ１２０の結合に対応する。ヘパリン（３）とドデカサッカライド（４）は共に相互作用を大きく低減させる（それぞれ８．５及び４．１％、つまり９１．５及び９５．９阻害％）。
使用したヘパリンはｇｐ１２０のコレセプターとの相互作用を明確に阻害する。
【００７５】
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【００７６】
（配列表の簡単な説明）
アペンディクスに添付された配列表の配列番号１から配列番号１８は本発明の目的のためのｇｐ１２０ウイルスタンパク質のＣＤ４ｉエピトープの暴露を誘導可能な分子の非限定的な例である。これらの分子はヒトＣＤ４由来のペプチド（配列番号１）、又はサソリの毒のペプチドから由来するか取り出された人工的ペプチド（配列番号２から１８）である。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】様々なＣＤ４濃度（ｎＭ）に対する時間ｔ（秒）の関数としての、レゾナンスユニット（ＲＵ）で表したヘパリン結合ｇｐ１２０／ＣＤ４量を表すグラフである：下から上に向けて、０；５０；１００；２５０；５００ｎＭの曲線である。
【図２】ＣＤ４濃度（ｎＭ）の関数としての、レゾナンスユニット（ＲＵ）で表したヘパリン結合ｇｐ１２０／ＣＤ４量を表すグラフである。
【図３】様々なＣＤ４ペプチド濃度（ｎＭ）に対する時間ｔ（秒）の関数としての、ｇｐ１２０ウイルスタンパク質／抗体４８ｄ相互作用（反応ＲＵ）の発生を表すグラフである：下から上に向けて、０；５０；１００；２５０；５００ｎＭの曲線である。
【図４】様々なヘパリンＨ濃度（ｎＭ）に対する時間ｔ（秒）の関数としての、抗体４８ｄとのｇｐ１２０／ＣＤ４複合体の相互作用の阻害（反応ＲＵ）を表すグラフである：下から上に向けて、０；３；６；１２；３０μｇ／ｍｌの曲線である。
【図５】ｄｐ０からｄｐ１８の重合度でのヘパリン断片のサイズの関数としての、４８ｄと結合したｇｐ１２０／ＣＤ４複合体の量の阻害を表すグラフである（上から下に向けて、ｄｐ０；ｄｐ２；ｄｐ４；ｄｐ６；ｄｐ８；ｄｐ１０；ｄｐ１２；ｄｐ１４；ｄｐ１６；ｄｐ１８）。
【図６】図５に表されたデータに基づくヘパリン断片サイズの関数としての、４８ｄに結合したｇｐ１２０／ＣＤ４複合体の量を表すグラフである。
【図７】ｇｐ１２０ウイルスタンパク質、及びｇｐ１２０ウイルスタンパク質との本発明の第二実施態様に係る組成物の相互作用を模式的に示す図である。この図中、ｓＣＤ４ｂｓ（「ｓ」は可溶型、「ｂｓ」は結合部位を示す）＝ＣＤ４結合部位、Ｖ３＝Ｖ３ループ、ＣＤ４ｎｉ＝非誘導（「ｎｉ」）の（非到達性）コレセプター結合部位、ＣＦ４ｉ＝ｇｐ１２０へのＣＤ４の結合によって誘導されたコレセプター結合部位（「ｉ」は誘導を示す）、ＣＤ４／Ｈ＝本発明の第二実施態様に係るＣＤ４ペプチド／ヘパリン又はヘパラン硫酸のハイブリッド分子、及びＨ＝ヘパリン又はヘパラン硫酸である。
【図８】ａ）ないしｈ）は、様々なｇｐ１２０ウイルスタンパク質濃度：０ｎＭ（ａ）；０．６２ｎＭ（ｂ）；１．２５ｎＭ（ｃ）；２．５ｎＭ（ｄ）；５ｎＭ（ｅ）；１０ｎＭ（ｆ）；２０ｎＭ（ｇ）及び４０ｎＭ（ｈ）での、活性化センサーチップ上のｇｐ１２０ウイルスタンパク質及びｇｐ１２０／ＣＤ４の複合体のヘパリンとの相互作用をグラフの形で表したもので、８０ｎＭの可溶型ＣＤ４と共に行われるプレインキュベーションを伴うもの（連続線）又はプレインキュベーションを伴わないもの（不連続線）である。
【図９】ｍＡｂ１７ｂで活性化されたセンサーチップ上のヘパリン及びヘパリン（Ｈ）のオリゴ糖によるｇｐ１２０／ＣＤ４相互作用の阻害をグラフの形で表したものである。ｇｐ１２０ウイルスタンパク質（５ｎＭ）は、ｍＡｂ１７ｂ表面への注入前に、連続してＣＤ４ペプチド（１０ｎＭ）、そして０ｎＭ（曲線ａ）；２．１ｎＭ（ｂ）；４．２ｎＭ（ｃ）；８．３ｎＭ（ｄ）；及び１６．７ｎＭ（ｅ）の濃度のヘパリン（［Ｈ］）と共にプレインキュベートした。
【図１０】ｍＡｂ１７ｂで活性化されたセンサーチップ上のヘパリン及びヘパリン（Ｈ）のオリゴ糖によるｇｐ１２０／ＣＤ４相互作用の阻害をグラフの形で表したものである。ｇｐ１２０ウイルスタンパク質（５ｎＭ）は、ｍＡｂ１７ｂ表面への注入前に、ｄｐ０（曲線１）；ｄｐ２（曲線２）；ｄｐ４（曲線３）；ｄｐ６（曲線４）；ｄｐ８（曲線５）；ｄｐ１０（曲線６）；ｄｐ１２（曲線７）；ｄｐ１４（曲線８）；ｄｐ１６（曲線９）；ｄｐ１８（曲線１０）の様々な重合度にて、連続してＣＤ４ペプチド（１０ｎＭ）及び４０ｎＭの濃度のヘパリンと共にプレインキュベートした。
【図１１】２から１０の範囲の重合度でのヘパリンの酵素的合成の間に得られた１５ｍｌの様々なフラクション（Ｆ）の２３０ｎｍでの吸光度を表す（ｄｐは曲線上に示した図に対応する）。
【図１２】実施例１０の実験結果から作成したグラフである。このグラフはヘパリンの存在又は不存在下でのｇｐ１２０／ＣＸＣＲ４相互作用のパーセントを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年12月21日(2004.12.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
−  ヘパリン、ヘパラン硫酸、あるいはヘパリン又はヘパラン硫酸に等価な多価アニオンから選択される多価アニオンと、
−  以下の配列（Ｉ）：
Ｃｙｓ又はＴＰＡ−Ｐ１−Ｃｙｓ−Ｐ２−Ｃｙｓ−Ｐ３−Ｃｙｓ−Ａｌａ又はＧｌｎ−Ｇｌｙ又は(Ｄ)Ａｓｐ又はＳｅｒ−Ｓｅｒ又はＨｉｓ又はＡｓｎ−ＸａａＪ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ又はＡｌａ−Ｃｙｓ−Ｘａａｋ−ＮＨ２
（ここで、ＴＰＡはチオプロピオン酸を表し、ＸａａＪはβ−ナフチルアラニン、フェニルアラニン又はビフェニルアラニンを表し、ＸａａｋはＧｌｙ、Ｖａｌ又はＩｌｅｕを表し、Ｐ１は３から６のアミノ酸を表し、Ｐ２は２から４のアミノ酸を表し、Ｐ３は６から１０のアミノ酸を表し、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３のアミノ酸は天然でも非天然でも、同一でも異なっていてもよく、またＰ１、Ｐ２、Ｐ３は共通の配列を持っていてもよい）を有しているＣＤ４ペプチドであって、βターンがその配列（Ａ）のアミノ酸残基Ａｌａ又はＧｌｎ−Ｇｌｙ又はＤＡｓｐ又はＳｅｒ−Ｓｅｒ又はＨｉｓ又はＡｓｎ−ＸａａＪから構成されるβヘアピン高次構造を有しているペプチドと、
の混合物を含有することを特徴とする組成物。
【請求項２】
ヘパリン、ヘパラン硫酸、又はヘパリンもしくはヘパラン硫酸に等価な多価アニオンが、１２から２０の重合度ｄｐを有している、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ヘパリン、ヘパラン硫酸、又はヘパリンもしくはヘパラン硫酸に等価な多価アニオンが、１５から１７の重合度ｄｐを有している、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
配列（Ｉ）のＣＤ４ペプチドがアペンディクスに添付した配列表の配列番号１から配列番号１８の配列から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
多価アニオン及び配列（Ｉ）のＣＤ４ペプチドが、ｇｐ１２０ウイルスタンパク質のＣＤ４ｉエピトープの暴露を誘導可能な分子０．５から１．５モル当たり１から１０モルの多価アニオンの割合で該組成物中で混合されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
多価アニオン及び配列（Ｉ）のＣＤ４ペプチドが、ｇｐ１２０ウイルスタンパク質のＣＤ４ｉエピトープの暴露を誘導可能な分子当たり５モルの多価アニオンの割合で該組成物中で混合されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
請求項１に記載の組成物である抗ＨＩＶ組成物。
【国際調査報告】
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