(57)【要約】  内側嗅皮質および海馬皮質を含む皮質脂質を含むｔｒｋＢ受容体中のニューロン細胞の成長と活性を刺激するための成長因子の使用プロトコール。本方法はＢＤＮＦ，ＮＴ−４／５およびＮＴ−３のような外因性成長因子をＥＣに導入する。本方法は哺乳動物の脳中の、欠陥，疾患または障害のあるニューロンの治療、特にアルツハイマー病または正常な加齢の神経変性状態の治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療用の神経系成長因子を標的のｔｒｋＢ受容体を含む皮質組織中の欠陥、疾患または障害のあるニューロンに送達する方法であって、神経系成長因子組成物を被験者の標的皮質組織内の１つまたはそれ以上の送達部位に送達することを含み、該神経系成長因子との接触が、内側嗅皮質（ＥＣ）中の欠陥、疾患又は障害を含む、被験者の皮質細胞中の欠陥、疾患又は障害を改善する方法。
【請求項２】
欠陥、疾患又は障害の改善が治療された被験者の認識機能の改善をもたらす請求項１記載の方法。
【請求項３】
成長因子が脳由来の神経栄養性因子（ＢＤＮＦ）である請求項２記載の方法。
【請求項４】
成長因子がＮＴ−４／５である請求項１記載の方法。
【請求項５】
成長因子がＮＴ−３である請求項１記載の方法。
【請求項６】
成長因子が、組換え発現ベクターからの成長因子のインサイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）発現によって送達された組換え蛋白である請求項１記載の方法。
【請求項７】
組換え発現ベクターがレンチウイルスベクターである請求項６記載の方法。
【請求項８】
レンチウイルスベクターがＨＩＶ−１である請求項７記載の方法。
【請求項９】
成長因子組成物が注入によってＥＣに送達される請求項１記載の方法。
【請求項１０】
該注入がマイクロポンプを介して長期間に亘って行われる請求項９記載の方法。
【請求項１１】
被験者がヒトである請求項１記載の方法。
【請求項１２】
ヒトがアルツハイマー疾患を患っており、その疾患がＥＣ中のニューロンの刺激によって改善する請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
該疾患が、アルツハイマー疾患に関連した認識機能の欠失の逆転によって改善する請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
欠陥、疾患または障害のある標的のニューロンが海馬皮質中のそれらを含む請求項１記載の方法。
【請求項１５】
欠陥、疾患または障害のある標的のニューロンが、前頭葉皮質、側頭葉皮質または視覚皮質中のそれらを含む請求項１記載の方法。
【請求項１６】
該ニューロン中の欠陥または疾患または障害が加齢の結果である請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経変性疾患および加齢の治療法並びに哺乳動物の脳に治療用の成長因子を送達する方法に関する。具体的には、本発明は、内側嗅皮質（ＥＣ）中のニューロン活動を刺激するために、（脳由来の神経栄養因子（ＢＤＮＦ）および神経系成長因子−４／５（ＮＴ−４／５）を含む）ｔｒｋＢ神経系成長因子受容体を活性化する成長因子の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病の神経変性は海馬と内側嗅皮質内で始まる。臨床上の中等度の痴呆の患者においてさえ、ＥＣ層ＩＩのニューロンの３０％の損失が観察される。重度のＡＤの発症では、損失は９０％に上昇する。特にＥＣにおける神経変性の治療を目的とした、ＡＤおよび他の神経変性状態の治療法はまだない。
【０００３】
ＢＤＮＦおよびＮＴ−４／５は、グルタミン酸塩が介在する脳皮質ニューロンと皮質星状細胞間の情報伝達の刺激（Ｐａｓｃｕａｌ，ｅｔ  ａｌ，Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ，１２：２６７３−２６７７，２００１）、およびドパミンの形成（Ｔｈｅｏｆｉｌｏｐｏｕｌｏｕｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ，１２７：１１１−１２２，２００１）の誘導を含む、多様な機構によって脳の機能に重要な役割を果たす神経系成長因子である。これらの神経系成長因子は、認識に関係する脳の領域間のニューロン連結の制御において、ＮＴ−３のような他の成長因子と機能を共有する。
【０００４】
しかし、Ｃｒｏｌｌら（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，９３：１４９１−１５０６，１９９９）が最近、ＢＤＮＦの過剰発現が認識機能を悪化し、正常な脳の機能に干渉し、脳のＥＣおよび海馬（ＨＣ）ＣＡ３領域における興奮性を生じること見出したことは注目すべきである。他の研究者も同様に、ＢＤＮＦの使用による好ましくない結果を報告している。例えば、Ｂｌａｈａら（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，  ９９：４８３−４９３，２０００）は、ＢＤＮＦを「高」用量（１日１２マイクログラム）および「低」用量（１日１．２マイクログラム）で（この試験のためにラットの損傷した）前頭骨皮質に注入した。注入の前後で、研究者は海馬，鋸歯状門，皮質および視床中央顔面神経節核におけるニューロン集団の損失を測定した。動物はＭｏｒｒｉｓの水迷路（Ｗａｔｅｒ  Ｍａｚｅ）（本試験で用いられるのと同じ試験）の成績も評価された。
【０００５】
ＢＤＮＦのニューロン生存促進の役割にもかかわらず、再びＢｌａｈａらは、「［Ｉ］われわれの軸索切断，虚血および興奮毒性の以前の試験と対照的に、このデータは［ＢＤＮＦ］は、これらの試験で検討された外傷後の遅延注入プロトコールを用いた実験的な脳外傷障害によって生じる挙動または組織学的欠失を保護しないことを示している」（要約から）と結論している。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ＢＤＮＦおよびＮＴ−４／５のような神経系成長因子を脳の内側嗅皮質（ＥＣ）中へ送達することによる、霊長類の認識機能改善のための臨床的に有用なプロトコールを提供する。以前に、他の研究者によって達成された結果と著しく対照的に、本発明の使用はニューロンの成長および代謝を促進するだけでなく、認識機能の顕著な改善をもたらす。
【０００７】
本発明によれば、神経系成長因子が、ＥＣ内の正常、変性または傷害組織に送達される。ＥＣ内の組織内で得られる反応に加えて、本発明の使用はＨＣに影響を及ぼし、前頭葉皮質，前頭骨皮質，側頭葉皮質および視覚皮質のようなｔｒｋＢ受容体を含む他の皮質組織に影響を及ぼすと思われる。
【０００８】
送達は標的の皮質組織の中への、神経系成長因子蛋白の直接注入によるか、または神経系成長因をコードしている発現可能なトランスジーンの導入による。本発明の特別な態様では、加齢のため空間学習能力と記憶が障害されている動物のＥＣに、神経系成長因子が送達される。Ｍｏｒｒｉｓの水迷路を含め、認識機能の測定に基づいて、本発明の神経系成長因子による治療によって、空間学習能力と記憶は顕著に改善される。
【０００９】
この態様の変形では、神経系成長因子は、１回の注入でＥＣ内の１つまたはそれ以上の部位を含む皮質組織に送達されるＢＤＮＦである。
【００１０】
この態様の他の変形では、神経系成長因子は、長期の注入でＥＣ内の１つまたはそれ以上の部位を含む皮質組織に送達されるＢＤＮＦである。
【００１１】
この態様の他の変形では、治療された動物の測定された認識機能は、傷害のない動物の機能と同等なレベルに改善する。
【００１２】
（発明の詳細な説明）
Ｉ．ＥＣへの神経系成長因子の送達法
本発明の実施によって、ＥＣ内の神経変性のために失われた認識機能を改善できる。本発明の方法の効果は、例えばＨＣのようなＥＣ以外のｔｒｋＢ受容体を含む組織および前頭葉，頭頂骨および視覚皮質に広げることができ、それによって疾患（例えばアルツハイマー病）または加齢に伴う神経変性の作用を本質的に逆転する機会を提供する。
【００１３】
この点で、生来のまたは組換えＢＤＮＦ，ＮＴ−４／５または同等な活性を有する他の神経系成長因子の、ＥＣを含む標的の皮質組織への直接の移入は、蛋白、まはたはその活性断片の特定位置において、組織への注入によってなされる。組換え神経系成長因子は、組換え発現ベクターに（ウイルス、  非ウイルスまたは線維芽細胞のような宿主細胞を介して）担持された発現トランスジーンを介して送達することもできる。
【００１４】
脳への神経系成長因子組成物の外科的送達は、マイクロポンプを利用した直接注入または長期注入を含む当業者に馴染みの方法で達成できる（例えばＤＵＲＥＣＴ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ［１０２４０  Ｂｕｂｂ  Ｒｏａｄ，Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ  ９５０１５−０５３０］から商業的に入手できるＡｌｚｅｔ  Ｏｓｍｏｔｉｃ  ｐｕｍｐ参照）、外科的切開によるマイクロインジェクション（例えば、Ｃａｐｅｃｃｈｉ、Ｃｅｌｌ，２２：４７９−４８８（１９８０）；電気穿孔法（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ及びＥｖａｎｓｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６：６５０−６６０（１９８８）参照）、注入、標的分子または共沈殿剤（例えば、リポソーム、カルシウム）との化学錯化、および発現可能なトランスジーンについては、標的組織の微粒子ボンバードメント（Ｔａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５６：１５２−１５４（１９９２））
【００１５】
ｒＢＤＮＦを雄フィッシャーラットのＥＣに導入するマイクロポンプを用いる外科的技術を下記の実施例１に記載する。ＥＣおよびＥＣ内の特別な移植部位の位置は、ＥＣニューロン減少および／またはＢＤＮＦ発現の減少および／またはＧＡＢＡ−ｂ受容体の発現のような、ＥＣ内でのＢＤＮＦ感受性遺伝子発現の減少がＥＣ領域内に集まるように選ばれる（実施例ＩＶ）。そのような領域は磁気共鳴（ＭＲＩ）および生検を含む周知の多くの技術を用いて臨床的に同定できる。ヒトでは、ＭＲＩのような非侵襲的なインビボ画像診断法が好ましい。
【００１６】
ＩＩ．本発明の実施に使用するための材料
Ａ．対象となる神経系成長因子
本発明の方法に有用な物質には、神経系成長因子蛋白（ＢＤＮＦ，ＮＴ−４／５，ＮＴ−３またはニューロン成長およびＥＣ内の活性に同等な作用のある成長因子）、活性蛋白断片、インビボ適合性組換え発現ベクター、パッケジング細胞系、ヘルパー細胞系、合成インビボ遺伝子治療ベクター、制御可能遺伝子発現系、カプセル化剤、医薬品として許容できる担体および対象となる成長因子をコーディングしているポリ核酸が含まれる。
【００１７】
周知の神経成長因子には、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経系成長因子−３（ＮＴ−３）、神経系成長因子−４／５（ＮＴ−４／５）、神経系成長因子−６（ＮＴ−６）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、線維芽細胞成長因子ファミリー（ＦＧＦの１−１５）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、インスリン様成長因子ファミリーの特定のメンバー（例えばＩＧＦ−１）、ニュートリン（ｎｅｕｒｔｕｒｉｎｓ）、パーセフィン（ｐｅｒｓｅｐｈｉｎ）、アルテミン、骨形成蛋白（ＢＮＭｓ）、イムノフィリン、成長因子のトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）ファミリー、ニューレグリン（ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎｓ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）およびその他が含まれる。ニューロン細胞のシナプス伝達およびＥＣニューロン細胞の柔軟性へのそれらの作用に関しては、ＢＤＮＦ，ＮＴ−４／５およびＮＴ−３、特にＢＤＮＦおよびＮＴ−４／５が本発明の使用に好適な選択である。
【００１８】
ＢＤＮＦは最初にヒトの脳から得られた２７ｋＤａのホモダイマーで、それはＮＧＦ，ＮＴ−３およびＮＴ−４／５の配列と高い相同性（およびいくつかの機能性）を共有し、ＣＮＳの多くのニューロン型に影響している。ＢＤＮＦは最初に脊椎感覚ニューロンの生成を促進することが示されたが、その後、感覚ニューロン、神経節ニューロン、ドパミン作動性ニューロン、コリン作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロンおよび運動ニューロンの生存と生成を助けることが示されている。ＢＤＮＦは感覚ニューロンに、多能性神経堤細胞の分化のシグナルを送ることができる。その作用は細胞選択的である。ＢＤＮＦはＮＧＦ感受性交感神経ニューロンに補助作用を示さない。
【００１９】
ＢＤＮＦは主として脳と脊髄でグリア細胞によって産生されるが、末梢運動ニューロンに関連したシュワン細胞によっても産生される。それはＴｒｋＢ受容体の２量化と自己燐酸化によって、シグナル導入を活性化する。ヒトを含む異なった種からの組換えＢＤＮＦ蛋白および天然のＢＤＮＦ蛋白およびＮＴ−４／５およびその免疫アッセイは、複数の業者から商業的に入手でき、ｒＮＴ−４／５はＰｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（２８００  Ｗｏｏｄｓ  Ｈａｌｌｏｗ  Ｒｏａｄ  Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１１−５３９９）から、ｒＢＤＮＦはＲｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  Ｉｎｃ（７７７  Ｏｌｄ  Ｓａｗ  Ｍｉｌｌ  Ｒｉｖｅｒ  Ｒｏａｄ，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、ＮＹ  １０５９１）から入手できる。
【００２０】
インサイチュでの発現に関して、他の哺乳動物種の神経系成長因子に対するコーディング配列と同様、多数のヒト神経系成長因子に対するコーディングポリ核酸、前駆体およびプロモーターが知られている。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｍ６１１７６はＢＤＮＦ（ＸＭ ００６０２７も参照）のコーディング配列（ｍＲＮＡ）を設定する；ＢＤＮＦの前駆体はＢＦ４３９５８９に設定され；ＢＤＮＦ特異的プロモーターはＥ０５９３３に設定される。ＮＴ−３およびＮＴ−４／５を含む、他の神経系成長因子に対する類似した範囲のコーディング配列はＧｅｎＢａｎｋおよび他の公にアクセスできるヌクレオチド配列データベースから入手できる。
【００２１】
ヒト疾患の治療での使用には、同種成長因子に比べて比較的免疫原性が低いために、本発明のヒト成長因子が好適である。しかし、ここに記載した適切な種類の試験によって、本発明の使用に適した他の種（例えば非ヒト霊長類）の成長因子も知られている。
【００２２】
Ｂ．組換え発現ベクター
インビボで標的細胞にトランスジーンを移入するストラテジーには、次の基本的段階が含まれる。（１）適切なトランスジーンの選択；（２）遺伝子移入のための適切な、且つ効率的なベクターの選択と開発；（３）標的細胞のインビボでの導入とトランスジーンの発現が安定的、且つ効率的に起きることの証明；（４）インビボの遺伝子治療手順が重篤な有害作用を起こさないことの証明；および（５）宿主動物での所望の表現型の効果の証明
【００２３】
選択された発現ベクターは次の基準に合致しなければならない：１）ベクターは標的細胞を感染することができ、従って、適切な宿主範囲を有するウイルスベクターを選択しなければならない；２）移入された遺伝子は持続することができ、細胞中での安定な維持と発現のために長期間に亘って（細胞死を起こさずに）、細胞中で発現しなければならない；３）ベクターは標的細胞に殆ど障害を与えない。
【００２４】
成人哺乳動物の脳細胞は分裂しないので、選択された組換え発現ベクターは分裂していない細胞中で感染でき、発現できなければならない。現在、この能力を有することが知られているベクターには、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）およびＨＩＶに基づくレンチウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）およびウマ免疫不全ウイルス（ＥＩＶ）のようなＤＮＡウイルスが含まれる。この能力を有する他のベクターには、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）が含まれる。しかしこれらのウイルスの中には毒性および／または免疫原性を生じるものがある（例えば、ＡＡＶおよびＨＳＶ）。
【００２５】
最近、ＨＩＶに基づくレンチウイルスのベクター系が開発され、それは他のレトロウイルスと同様、宿主細胞の核にトランスジーンを挿入できる（発現の安定性を増強する）が、他のレトロウイルスと異なり、非分裂細胞の核に挿入できる。レンチウイルスベクターは、直接注入後、脳細胞を安定してトランスフェクトし、ウイルス蛋白からの検出可能な病因なしに、安定して外部のトランスジーンを発現することが示されている（参考文献として含めたＮａｌｄｉｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７２：２６３−２６７（１９９６）および実施例５参照）。初めてＨＩＶ−１レトロウイルスベクターを構築した研究者の教示に従って、当業者は、本発明の方法に用いるのに適したレンチウイルスのベクターを構築することができるであろう（レトロウイルス構築に関するより一般的な参考文献としては、例えば、Ｋｒｉｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ．（ＮＹ１９９０）  ａｎｄ  Ｍｕｒｒａｙ，ＥＪ，ｅｄ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（ＮＪ１９９１））．更に詳細な総説について当業者は、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（ＮＹ  １９８２）を参照されたい。
【００２６】
Ｃ．医薬品として許容できる神経系成長因子組成物
選択された成長因子（蛋白または発現可能なトランスジーン）は医薬品として許容できる担体に送達されて成長因子組成物を形成する。本発明で使用する成長因子組成物は成長因子蛋白または成長因子をコードしているトランスジーン（例えば、ウイルスまたは非ウイルスベクター中で発現可能なものであるが、これに限定されない）を医薬品として許容できる懸濁液、溶液またはエマルジョンに入れて調製できる。適した媒体には食塩水およびリポソーム製剤が含まれる。
【００２７】
より具体的には、医薬品として許容できる担体には、滅菌した水性または非水性溶液、懸濁液およびエマルジョンが含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油およびオレイン酸エチルのような注入可能な有機酸エステルである。水性担体には、水、アルコール／水性溶液、食塩水および緩衝媒体を含むエマルジョンまたは懸濁液が含まれる。注射媒体には塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストローズ、デキストローズおよび塩化ナトリウム、乳酸化リンゲルまたは不揮発性油が含まれる。静脈内媒体には保液および栄養補給剤、電解質補給剤（リンゲルデキストローズをベースにしたもの等）および類似物が含まれる。
【００２８】
例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガスおよび類似物のような保存剤および他の添加剤を加えても良い。更に成長因子トランスジーンの組成物は、その後の再溶解および本発明による使用のために、当技術分野で周知の手段を用いて凍結乾燥してもよい。
【００２９】
ＩＶ．投与
本開示に用いられているように、「単位用量」は成長因子組成物ｍｌあたりの成長因子の濃度を示す。ウイルスベクターについては、成長因子の濃度は成長因子組成物ｍｌあたりのウイルス粒子数で定義される。
【００３０】
成長因子蛋白の送達のために、成長因子組成物の各ｍｌは、蛋白または活性ペプチド断片を１および２５ｎｇ／ｍｌ担体の濃度で含む。ウイルス発現ベクターを用いる成長因子の送達には、成長因子の各単位用量は２．５から２５μｌの成長因子組成物を含むのが最適で、その組成物は、ウイルス発現ベクターを医薬品として許容できる液体中に含み、成長因子組成物ｍｌあたり１０１０から１０１５までの成長因子発現ウイルス粒子を提供する。
【００３１】
霊長類で、手術可能な成長因子をコードしているトランスジーンを有するウイルスベクターは脳およびＣＮＳに送達後、１２ヶ月間ヒト成長因子を発現することが示されている（実施例Ｖ）。ヒト成長因子蛋白を用いて、外因性成長因子は、成長因子発現可能なトランスジーンを用いて達成されるよりも若干短い期間標的組織に留まることが予想される。いずれの例でも、本発明は脳内の長期間利用できる成長因子源を提供する。
【００３２】
Ｖ．動物モデルと臨床評価
非ヒト霊長類では、加齢の過程は、ＢＤＮＦ活性、ＥＣニューロン細胞集団の損失およびＢＤＮＦ感受性受容体（例えばＧＡＢＡ−ｂ）の損失を含む加齢ヒトで経験する神経学的変化を刺激する。加齢動物での本発明の方法の使用と有効性を証明するデータを実施例に示す。高い完全性でアルツハイマー病モデルになる非加齢動物モデルはラットと霊長類で、それらのモデルでは隔膜を繋いでいる頭蓋経路の海馬からの離断が実施されている。
【００３３】
治療の臨床評価およびモニタリングは実施例に記載したインビボ画像技術および処理した組織の生検および組織学的分析を用いて実施できる。後者の点では、例えば抗成長因子抗体（分泌成長因子の免疫アッセイ）（実施例ＩＩＩ）を用いて、または実施例ＩＶに示したように成長因子感受性遺伝子発現を追跡して、組織試料中のニューロン数を定量できる。勿論、認識機能の改善は、そのような機能が障害された加齢の疾患または傷害動物で、明らかに望ましい目標であり、この目標は本発明を用いて達成することが可能である（実施例ＩＩ）
【００３４】
本発明を完全に記載したので、その実施を説明する実施例を以下に示す。しかし、これらの実施例は、添付した請求項で定義される本発明の範囲を制限すると考えるべきではない。当業者は、実施例は本発明の１つの態様を説明するが、達成された結果は本明細書に教示した他の態様によって実施できることを評価するであろう。この実施例では、「ｍｉｎ」は「分」を示し、「ｈｒｓ」は「時間」を示し、測定単位（例えばｍｌ）は標準的な省略で示される。引用した印刷物は参考にすべて本明細書に組み入れる。
【実施例】
【００３５】
（実施例Ｉ）
ＢＤＮＦのＥＣへの送達による加齢動物の治療
実施例ＩＩに記載したように、試験動物は術前の水迷路トレーニングを受けた。このパイロット試験で提出されたデータは次の解析によって得た：１０匹のＢＤＮＦ注入加齢、８匹の加齢未処理、９匹の媒体注入加齢、９匹の中年齢および２０匹の若い無処理および２匹の媒体注入若年齢ラット。加齢（２４ヶ月齢）、中年齢（１１ヶ月齢）および１０匹の若年齢（５ヶ月齢）雄フィッシャー３４４ラットをＨａｒｌａｎ／ＮＩＡげっ歯類コロニーから得た。
【００３６】
ラットをケタミン（５０ｍｇ／ｋｇ）、アセプロマジン（０．５ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（２．６ｍｇ／ｋｇ）の混合物で麻酔した。皮膚刺激に対するすべての反射がないことを確認後、加齢動物（Ｂｒｅｇｍａの血族）の内側嗅皮質に対して次の位置で移植した：−９．３ｍｍ前／後、±５．６ｍｍ中央側方、頭蓋表面に対して腹面の６ｍｍカニューレ長。最初のパイロット実験で、若年（４ヶ月齢）動物（Ｂｒｅｇｍａの血族）に対する補正ＥＣの位置は次の通りであることが示された：−８．６ｍｍ前／後、±５．３ｍｍ中央側方、頭蓋表面に対して腹面の５ｍｍカニューレ長。Ａｌｚｅｔミニポンプ（モデル番号２００４）を４週間用いて、媒体溶液（ラット人工脳脊髄液および１ｍｇ／ｍｌラット血清アルブミン）または媒体溶液に溶解したヒト組換えＢＤＮＦ（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，Ｉｎｃ．提供）１０ｎｇ／ｍｌを送達した。
【００３７】
（実施例ＩＩ）
術前および術後水迷路試験
水迷路装置：水迷路試験の初回は水（１９−２１℃）を満たした黒い循環タンク（直径：１．４０ｍ、高さ：０．６０ｍ）中で行った。トレーニングと習得期間中、黒い非難プラットホームは水の表面から３ｃｍ下に水没させた。検体の試験中、非難プラットホームは取り除いた。明白な目に見える手掛りを提供するために、４つの木製のポストを手掛りトライアル中にプラットホームに取り付けた。黒いカーテンをタンクの周りに下げ、４つのユニークな壁手掛りを環境標識として役立つように下げた。データ解析のために、タンクを４つの部分に分けた：北、南、東、西。データの収集と解析はＳａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のコンピューター追跡システムを使用して実施した。
【００３８】
次の水迷路試験は毒性のない白いテンプラ塗料（１９−２１℃）の添加によって不透明にした水を満たした白い循環タンク（直径：１．８３ｍ、高さ：０．７０ｍ）中で行った。トレーニングと習得期間中、白い非難プラットホームは水の表面から５ｃｍ下に水没させた。検体のトライアルの前に、非難プラットホームを下げ、各検体トライアルの終わりに、タンクの外から上げた。明白な目に見える手掛りを提供するために、手掛り学習トライアル中、水のレベルの十分上に突き出た大きなポストを有する黒いプラットホームを使用した。白いカーテンをタンクの周りに下げ、４つのユニークな壁手掛りを環境標識として役立つように下げた。データの収集と解析はＳａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のコンピューター追跡システムを使用して実施した。
【００３９】
術前試験：各回の水迷路試験すべてで、作業は、６回のトライアル（１日３回）の４回のトレーニングブロックで実施した８日間のトレーニングで構成された。各トレーニングブロックは５回の習得トライアル（１回のトライアル最高９０秒；トライアル間隔１分）に続き１検体のトライアル（３０秒の自由水泳）を含んだ。検体を使わないすべてのトライアル中、水没させた非難プラットホームはプールの「ゴール」部分の中央に置いた。各トライアルを始めるために、ラットをプールの周りに均等に隔てられた４つの出発位置（北、南、東、西）の１つからの迷路壁に面して水中に置いた。出発位置はすべてのラットに対して各試験日の始めに無作為に選んだ。ラットはプラットホームに到るまで、または最高９０秒間水泳し、その後プラットホームに誘導した。各試験の終了時に、ラットはプラットホームに３０秒間留め、ついで実験者によって取り去られ、動物ケージに１分間置かれた。
【００４０】
非難プラットホームを見つけるための集積探索エラー（ＳＥ）、時間（潜在）および距離（経路長）をトレーニングトライアル中の学習の測定に用いた。６回目のトライアル毎に、プラットホームを取り去り（１回目）または下げて（その以降）プラットホーム位置への近さの平均と３０秒の自由水泳中の環の横断を記録してラットの学習を調べた。加齢動物からの学習測定のそれぞれを検討し、若年動物と比較した。
【００４１】
加齢動物は、その成績が若年動物の成績の範囲外であった場合に、加齢障害と考えた。習得データは術前と術後の同一レベルの水迷路の成績を有する加齢ＢＤＮＦと加齢媒体動物の群を作るために使用した。
【００４２】
術後の試験：３週間遅れの後（この間ラットはＢＤＮＦまたは媒体のいずれかが与えられていた）、ラットを術前中に用いたのと同じ多回トライアル場所学習作業（８日、４ブロック）で再試験した。
【００４３】
手掛りトレーニング：術後試験終了後に視覚試験を行い、それは異なる出発場所からの６つの試験から構成された。目に見えるプラットホームを前に学習した水没プラットホームの場所と異なる場所に置いた。
【００４４】
挙動データの解析：データを編集し、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ（Ａｂａｃｉｓ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）のＳｔａｔ  Ｖｉｅｗ  ５．０で解析した。群間の比較は、トレーニングデータについてはＡＮＯＶＡの繰り返し測定を用いて行い、検体トライアルデータについては階乗ＡＮＯＶＡを用いた。挙動データは平均±平均の標準誤差として示してある。有意差の水準は９５％確率レベルに設定した。
【００４５】
水迷路試験結果によると、ＢＤＮＦ注入は術後試験の最終ブロックで、媒体注入および無傷加齢群と比べて、加齢動物の成績を有意に改善した（図３；階乗ＡＮＯＶＡ：Ｆ５，５５＝１８．７７；Ｐ＜０．０００１；ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  Ｆｉｓｈｅｒの検定：Ｐ＜０．００１，ＢＤＮＦ注入対媒体注入加齢、およびＰ＜０．０００１、ＢＤＮＦ注入対加齢障害比較）。ＡＮＯＶＡ解析はまた加齢ＢＤＮＦ注入動物が加齢無障害（ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  Ｆｉｓｈｅｒの検定：Ｐ＝０．９９）および中年令（ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  Ｆｉｓｈｅｒの検定：Ｐ＝０．２５）動物と同等レベルの成績であったことを示した。このように、本発明によるＢＤＮＦの送達が治療動物において認識機能を改善する結果を示した。
【００４６】
（実施例ＩＩＩ）
ＥＣ中のＢＤＮＦの局在
治療動物の注入部位での外因性ＢＤＮＦの貯留程度を測定するために、麻酔動物から視床下部，海馬，内側嗅皮質，前頭葉皮質および新皮質の残余を切り出し、切断し、液体窒素中で冷凍した。組織は−８０℃で貯蔵した。
【００４７】
ＢＤＮＦの免疫組織化学を１：６０００の濃度のウサギ抗ＢＤＮＦ抗体と治療動物から調製した切片を用いて実施した。抗体に対する特異性は一次抗体を除いた結果、細胞のラベル化が損失したことによって確認した。
【００４８】
ＢＤＮＦのレベルは標準的手順（Ｃｏｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，１７：２２９５，１９９７）によって開発した２部位酵素免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて測定した。このアッセイはＢＤＮＦに特異的で、それが用いられた（１−１００ｐｇ／試料）範囲に亘って比較的線型であった。ＢＤＮＦのために開発したアッセイでの、他の神経系の成長因子ファミリーメンバーとの検出できる交差反応性がないことは、これらの蛋白をアッセイ上限（２０００ｐｇ／試料）の２０倍過剰にアッセイに加えてもないことによって示された。
【００４９】
ＥＬＩＳＡプレート上の非特異的結合をブロック後、プレートを洗浄用緩衝液で２回洗浄した。精製したＢＤＮＦ（１−１００ｐｇ／ウェル）の既知量または組織抽出からの未知試料をウェルに加え（５０μｌ／ウェル）、プレートを一夜４℃で培養した。翌日、未結合物質を除去し、プレートを５回洗浄した。ついで、適切な検出（抗ＢＤＮＦ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｇ１６４１；１：２５００希釈））およびＨＰＲ結合（パーオキシダーゼ結合抗ニワトリＩｇＹ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｇ１３５１；１：１０００希釈））またはパーオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ（Ｄａｋｏ  ｐ−２６０；１：１０００希釈））抗体（それぞれ一夜４℃で培養）を加えて、結合した抗原を検出した。可溶性の比色定量性反応産物が生成し、４９０ｎｍの吸収による光学的濃度測定をマイクロプレートリーダー上で行った。すべて例において、ＩｇＧ被覆ウェル中で測定した値を抗神経系成長因子被覆ウェル中での値から差し引いて、非特異的相互作用に対して結果を補正した。
【００５０】
データを編集し、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ（Ａｂａｃｉｓ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）のＳｔａｔ  Ｖｉｅｗ  ５．０で解析した。ＥＬＩＳＡのデータは階乗ＡＮＯＶＡを用いて解析した。有意差の水準は９５％確率レベルに設定した。
【００５１】
灌流と、選択したパイロット動物の区分け後、ＢＤＮＦの免疫ラベルで内側嗅皮質（図１）内のカニューレの正確な位置を確認した。ＢＤＮＦのＥＬＩＳＡでＢＤＮＦの注入が、脳内で見られる内因性のＢＤＮＦ濃度を有意に超す濃度に、内側嗅皮質内のＢＤＮＦ濃度を上昇したことが確認された（図２；階乗ＡＮＯＶＡ：Ｆ４，２７＝１１．４２；Ｐ＜０．０００１；ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  Ｆｉｓｈｅｒの検定：Ｐ＜０．０００１（ＢＤＮＦ注入対ＢＤＮＦ非注入群のすべての比較について））。
【００５２】
（実施例ＩＶ）
ＢＤＮＦ治療のＢＤＮＦ感受性受容体発現への影響
総ＲＮＡをＲＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて組織から単離し、総ＲＮＡ１−５μｇから二重鎖ＤＮＡを合成した。ビオチン標識ｃＲＮＡを精製し、断片化し、１００ｍＭ  Ｍｅｓ，ｐＨ７．４／１Ｍ  ＮａＣｌ／２０ｍＭ  ＥＤＴＡ／０．０１％Ｔｗｅｅｎ  ２０中でＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｒａｔ  ａｒｒａｙｓにハイブリッド形成した。そのアレー（ａｒｒａｙ）を洗浄し、ストレプトアビジン−フィコエリスリンで染色し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＡｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒでスキャンした。データはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｇｅｎｅｃｈｉｐ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（バージョン３．１）で解析した。
【００５３】
そのアレーを約１０，０００の既知の遺伝子とＥＳＴｓに対する検体セットを含むライブラリーを用いて解析した。数の要約と群間の変化の方向を下表１に示す。このうち、表２に示すように、ＲＴ−ＰＣＲで内側嗅皮質を確認するために１０が選ばれた。ＥＣとＨＣの両方について、ＢＤＮＦ注入加齢動物（ｎ＝２）と媒体注入動物（ｎ＝２）を比較した遺伝子変化（ＥＳＴｓを含まぬ）の完全なリストを表３と４に示す。
【００５４】
この解析で、ＢＤＮＦの注入が、ＥＣの注入部位内の殆どで、多数の遺伝子の発現を有意に変えたが、少数の遺伝子は、遠く離れた海馬で変った。例えば、ＧＡＶＡ−ｂ受容体の発現は、ＢＤＮＦの注入後、５０倍を超して増加した。ＧＡＶＡ−ｂ受容体の発現は、加齢障害動物のＥＣおよびＨＣ両方で低下した。そのような阻害ニューロンシグナリングに対する推定される反応性の変化は、ＢＤＮＦの注入の挙動作用を媒介する可能性がある。
【００５５】
【表１】
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【００５６】
【表２】
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【００５７】
【表３】
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【００５８】
【表４】
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【００５９】
（実施例ＶＩＩＩ）
治療動物中の長期ＧＤＮＦ発現
右尾状核と被殻および左黒質にレンチ神経系成長因子の注入を受けた若年齢成人ベンガルサルで、治療後１年間、堅固な神経系成長因子の発現があることが示された。長期の遺伝子発現の評価は、免疫組織化学と酵素免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって行った。
【国際調査報告】
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