(57)【要約】末梢動脈閉塞疾患におけるヒトPAOD1遺伝子の役割が開示される。 PAOD1遺伝子における多型により引き起こされる末梢動脈閉塞疾患の診断、臨床過程の予測および治療方法【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子、またはその断片もしくはバリアントを含有してなり、該遺伝子が、エキソン４（配列番号：５）または５（配列番号：６）またはエキソン４およびエキソン５の両方を含む単離された核酸分子。
【請求項２】
プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子が配列番号：１のヌクレオチド配列を有してなる請求項１記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
配列番号：16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、および36からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし、かつエキソン４（配列番号：５）または５（配列番号：６）の全てまたは一部を含有してなる核酸。
【請求項４】
配列番号：１および配列番号：１の相補体からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を含有してなる単離された核酸分子。
【請求項５】
配列番号：１および配列番号：１の相補体からなる群より選ばれるヌクレオチド配列に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする単離された核酸分子。
【請求項６】
配列番号：16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、および36からなる群より選ばれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイスし、エキソン４（配列番号：５）またはエキソン５（配列番号：６）の全てまたは一部を含有してなる単離された核酸分子。
【請求項７】
サンプルと、配列番号：１および配列番号：１の相補体からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を含有する第２の核酸とを高ストリンジェンシー条件下で接触させる工程を含む、サンプル中の第１の核酸配列の存在をアッセイする方法。
【請求項８】
調節配列に任意に連結された、配列番号：１、配列番号１の相補体、配列番号：16をコードする核酸、配列番号：18をコードする核酸、配列番号：20をコードする核酸、配列番号：22をコードする核酸、配列番号：24をコードする核酸、配列番号：26をコードする核酸、配列番号：28をコードする核酸、配列番号：30をコードする核酸、配列番号：32をコードする核酸、配列番号：34をコードする核酸、配列番号：36をコードする核酸からなる群より選ばれる単離された核酸分子を含有してなるベクター。
【請求項９】
請求項８記載のベクターを含有してなる組換え宿主細胞。
【請求項１０】
単離された核酸分子の発現に適切な条件下で請求項９記載の組換え宿主細胞を培養する工程を含む、該核酸分子によりコードされるポリペプチドの製造方法。
【請求項１１】
請求項１記載の単離された核酸によりコードされる単離されたポリペプチド。
【請求項１２】
ポリペプチドが配列番号：18および配列番号：20からなる群より選ばれる配列を含有してなる請求項１１記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号：18および配列番号：20からなる群より選ばれるアミノ酸配列に約90％以上同一であるアミノ酸配列を含有してなる単離されたポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１１記載の単離されたポリペプチドを含有してなる融合タンパク質。
【請求項１５】
請求項１１記載のポリペプチドに選択的に結合する抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１６】
サンプルと、コードされるポリペプチドに特異的に結合する抗体とを接触させる工程を含む、サンプル中において請求項１記載の単離された核酸分子によりコードされるポリペプチドの存在をアッセイする方法。
【請求項１７】
プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子中の多型を検出する工程を含み、該遺伝子中の多型の存在が、末梢動脈閉塞疾患に対する感受性を示す、個体における末梢動脈閉塞疾患に対する感受性の診断方法。
【請求項１８】
対照サンプル中のプロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子によりコードされるポリペプチドの発現または組成と比較して、試験サンプル中のプロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子によりコードされるポリペプチドの発現または組成における変化を検出する工程を含み、試験サンプル中のポリペプチドの発現または組成における変化の存在が末梢動脈閉塞疾患に対する感受性を示す、末梢動脈閉塞疾患に対する感受性の診断方法。
【請求項１９】
プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子によりコードされるポリペプチドの発現または組成における変化が、対照サンプル中で発現されるイソ型とは異なる試験サンプル中のイソ型の発現を含む請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
請求項１１記載のポリペプチドの活性を変化させる薬剤の同定方法であって、
ａ）該ポリペプチドまたはその誘導体もしくは断片と試験対象の薬剤とを接触させる工程；
ｂ）該ポリペプチドまたはその誘導体もしくは断片の活性のレベルを評価する工程；および
ｃ）該活性のレベルと該薬剤の非存在下でのポリペプチドまたはその活性な誘導体もしくは断片の活性のレベルとを比較する工程、
を含み、薬剤の存在下でのポリペプチドまたはその誘導体もしくは断片の活性のレベルが、薬剤の非存在下でのレベルとは統計学的に有意な量で異なる場合、薬剤は、ポリペプチドの活性を変化させる薬剤である、方法。
【請求項２１】
請求項２１記載の方法により同定可能である、プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子によりコードされるポリペプチドの活性を変化させる薬剤。
【請求項２２】
プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子レセプター；プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子結合剤；ペプチド模倣物；融合タンパク質；プロドラッグ；抗体；およびリボザイムからなる群より選ばれる、プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子によりコードされるポリペプチドの活性を変化させる薬剤。
【請求項２３】
プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子によりコードされるポリペプチドと請求項２２記載の薬剤とを接触させる工程を含む、プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子によりコードされるポリペプチドの活性を変化させる方法。
【請求項２４】
請求項１１記載のポリペプチドとプロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子結合剤との相互作用を変化させる薬剤の同定方法であって、
ａ）該ポリペプチドまたはその誘導体もしくは断片、結合剤および試験対象の薬剤を接触させる工程；
ｂ）ポリペプチドまたはその誘導体もしくは断片と結合剤との相互作用を評価する工程；および
ｃ）該相互作用のレベルと、薬剤の非存在下でのポリペプチドまたはその誘導体もしくは断片と結合剤との相互作用のレベルとを比較する工程、
を含み、薬剤の存在下でのポリペプチドまたはその誘導体もしくは断片の相互作用のレベルが、薬剤の非存在下での相互作用のレベルとは統計学的に有意な量で異なる場合、薬剤がポリペプチドと結合剤との相互作用を変化させる薬剤である、方法。
【請求項２５】
請求項２４記載の方法により同定可能である、プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子ポリペプチドとプロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子結合剤との相互作用を変化させる薬剤。
【請求項２６】
プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子ポリペプチドと、プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子レセプター；プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子結合剤；ペプチド模倣物；融合タンパク質；プロドラッグ；抗体；およびリボザイムからなる群より選ばれる第１のプロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子結合剤との相互作用を変化させる薬剤。
【請求項２７】
プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子ポリペプチドおよび／またはプロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子結合剤と請求項２６記載の薬剤とを接触させる工程を含む、プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子ポリペプチドとプロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子結合剤との相互作用を変化させる方法。
【請求項２８】
ａ）請求項１記載の核酸またはその誘導体もしくは断片を含有する溶液と試験対象の薬剤とを接触させる工程；
ｂ）核酸、誘導体もしくは断片の発現のレベルを評価する工程；および
ｃ）発現のレベルと、薬剤の非存在下での核酸、誘導体または断片の発現レベルとを比較する工程、
を含み、薬剤の存在下でのヌクレオチド、誘導体または断片の発現のレベルが、薬剤の非存在下での発現とは、統計学的に有意な量で異なる場合、薬剤はプロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子の発現を変化させる薬剤である、プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子の発現を変化させる薬剤の同定方法。
【請求項２９】
請求項２８記載の方法により同定可能である、プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子の発現を変化させる方法。
【請求項３０】
ａ）レポーター遺伝子に作動可能に連結されたプロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子のプロモーター領域を含む核酸を含有する溶液と試験対象の薬剤とを接触させる工程；
ｂ）レポーター遺伝子の発現のレベルを評価する工程；および
ｃ）該発現のレベルと、薬剤の非存在下でのレポーター遺伝子の発現のレベルとを比較する工程、
を含み、薬剤の存在下でのレポーター遺伝子の発現のレベルが、薬剤の非存在下での発現のレベルとは有意な量で異なる場合、薬剤はプロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子の発現を変化させる薬剤である、プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子の発現を変化させる薬剤の同定方法。
【請求項３１】
請求項３２記載の方法により同定可能である、プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子の発現を変化させる薬剤。
【請求項３２】
ａ）請求項１記載の核酸またはその誘導体もしくは断片を含有する溶液と試験対象の薬剤とを接触させる工程；
ｂ）核酸、誘導体または断片の発現を評価する工程；および
ｃ）発現と、薬剤の非存在下での核酸、誘導体または断片の発現とを比較する工程、
を含み、薬剤の存在下でヌクレオチド、誘導体または断片の発現が、薬剤の非存在下での発現とは、統計学的に有意な量で異なる場合、薬剤はプロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子の発現を変化させる薬剤である、プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子の発現を変化させる薬剤の同定方法。
【請求項３３】
薬剤の存在下でのヌクレオチド、誘導体または断片の発現が、薬剤の非存在下での１つ以上のスプライシングバリアントの発現とは、種類または量が異なる請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
請求項３２記載の方法により同定可能である、プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子の発現を変化させる薬剤。
【請求項３５】
プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子のアンチセンス核酸；プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子ポリペプチド；プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子レセプター；プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子結合剤；ペプチド模倣物；融合タンパク質；そのプロドラッグ；抗体；およびリボザイムからなる群より選ばれるプロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子の発現を変化させる薬剤。
【請求項３６】
プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子を含有する細胞と請求項３５記載の薬剤とを接触させる工程を含む、プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子の発現を変化させる方法。
【請求項３７】
DNA結合ドメインおよびプロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子ポリペプチド、スプライシングバリアント、またはその断片もしくは誘導体をコードする核酸を含有する第１のベクター、および転写活性化ドメインをコードする核酸および試験ポリペプチドをコードする核酸を含有する第２のベクターを用いて、酵母ツーハイブリッド系を使用する工程を含み、転写活性化が、酵母ツーハイブリッド系で起こる場合、試験ポリペプチドはプロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子ポリペプチドと相互作用するポリペプチドである、プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子ポリペプチドと相互作用するポリペプチドの同定方法。
【請求項３８】
プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子またはその断片もしくは誘導体；プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子によりコードされるポリペプチド：プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子レセプター；プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子結合剤；ペプチド模倣物；融合タンパク質；プロドラッグ；抗体；プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子発現を変化させる薬剤；プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子によりコードされるポリペプチドの活性を変化させる薬剤；プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子によりコードされるポリペプチドの転写後プロセシングを変化させる薬剤；プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子とプロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子結合剤との相互作用を変化させる薬剤；プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子によりコードされるスプライシングバリアントの転写を変化させる薬剤；およびリボザイムからなる群より選ばれるプロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子治療剤。
【請求項３９】
請求項３８記載のプロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子治療剤を含有してなる医薬組成物。
【請求項４０】
プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子治療剤がプロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子またはその断片もしくは誘導体を含有する単離された核酸である請求項３９記載の医薬組成物。
【請求項４１】
プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子治療剤がプロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子によりコードされるポリペプチドである請求項３９記載の医薬組成物。
【請求項４２】
治療有効量のプロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子治療剤を個体に投与することを含む個体における末梢動脈閉塞疾患の処置方法。
【請求項４３】
プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子治療剤が、プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子アゴニストである請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子治療剤が、プロスタグランジンEレセプターサブタイプEP3遺伝子アンタゴニストである請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
外因性プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子およびプロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子ポリペプチドをコードする核酸からなる群より選ばれる核酸を含有してなるトランスジェニック動物。
【請求項４６】
ａ）ハイブリダイゼーションに適切な条件下で、サンプルと、プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子核酸の配列の一部に少なくとも部分的に相補的である隣接したヌクレオチド配列を含む核酸とを接触させる工程、
ｂ）プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子核酸と、該プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子核酸の配列の一部に少なくとも部分的に相補的である隣接したヌクレオチド配列を含む該核酸との間にハイブリダイゼーションが生じたか否かを評価する工程
を含む、プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子核酸の存在についてサンプルをアッセイする方法。
【請求項４７】
隣接したヌクレオチド配列を含む前記核酸が前記プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子核酸の配列の一部に完全に相補的である請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
前記プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子核酸の少なくとも一部の増幅を含む請求項４６記載の方法。
【請求項４９】
前記隣接したヌクレオチド配列が100以下のヌクレオチド長であり、ａ）配列番号：１のヌクレオチドの隣接した配列に少なくとも80％同一であるか；ｂ）配列番号：１のヌクレオチドの隣接した配列の相補体に少なくとも80％同一であるか；またはｃ）前記プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子核酸に選択的にハイブリダイズしうるかのいずれかである請求項４７記載の方法。
【請求項５０】
プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子核酸のヌクレオチド配列の一部に少なくとも部分的に相補的である隣接したヌクレオチド配列を含む核酸を含有してなる、プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子核酸の存在についてサンプルをアッセイするための試薬。
【請求項５１】
前記核酸が、前記プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子核酸のヌクレオチド配列の一部に完全に相補的である隣接したヌクレオチド配列を含有してなる請求項５０記載の試薬。
【請求項５２】
ａ）プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子核酸のヌクレオチド配列の一部に少なくとも部分的に相補的である隣接したヌクレオチド配列を含有する１つ以上の標識核酸；および
ｂ）該標識の検出のための試薬
を別々の容器に含有してなる、プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子核酸の存在についてサンプルをアッセイするための試薬キット。
【請求項５３】
標識核酸が前記プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子核酸のヌクレオチド配列の一部に完全に相補的である浅裂したヌクレオチド配列を含有してなる請求項５２記載の試薬キット。
【請求項５４】
プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子核酸のヌクレオチド配列の一部に少なくとも部分的に相補的であり、かつプライマー伸長のたの条件下で維持された場合、該プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子核酸のプライマーとして作用可能である隣接したヌクレオチド配列を含有する１つ以上の核酸を含有してなる、プロスタグランジンＥレセプターサブタイプEP3遺伝子核酸の存在についてサンプルをアッセイするための試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本出願は、2002年１月30日に出願された米国出願第10/060,902号（仮出願60/ に変更された）の優先権を請求する一部継続出願である。上記出願の全体の教示が、参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
発明の背景
アテローム性動脈硬化症は、心筋梗塞および末梢動脈閉塞疾患等の人類の最も致命的な疾患のいくつかの根底にある症状である。PAODは、他のアテローム硬化型疾患、特に喫煙、糖尿病、高血圧および高脂血症の危険因子を共有する（Dormandy, J.ら、Semin.Vasc.Surg., 12:123(1999); Hooi, J.D.ら、Br.J.Gen.Pract. 49:49 (1999)）。PAODは、肢、特に下肢の大きい動脈および中程度の動脈のアテローム性動脈硬化症を表し、大動脈および腸骨動脈を含む。これは、しばしば、冠状動脈疾患および脳血管疾患と共存する。臨床的に有意な病変は、徐々に末梢動脈を狭くし、休息により通常軽減される歩行時の疼痛（跛行）、虚血性潰瘍、壊疽、および時には肢切断を導きうる。医学的治療は一般に効果がないが、バイパス手術または人工移植片または静脈移植片での病変の置換手術は、少なくともそれらが再狭窄するまでは遠位の血流を改善する（Haustein, K.O., Int.J.Clin.Pharmacol, Ther., 35:266(1997)）。
【０００３】
発明の要旨
本明細書中に記載されるように、プロスタグランジンＥレセプター３（サブタイプEP3）（PTGER3またはEPとして知られているが、本明細書中ではPAOD1タンパク質またはポリペプチドとも呼ばれる）をコードする遺伝子（本明細書中以下では「PAOD」と呼ばれる）が、ヒト連鎖研究により末梢動脈閉塞疾患、特に肢および下肢のアテローム性動脈硬化症に関連していることが発見された。本発明は、PAOD1核酸を含有してなる単離された核酸分子に関する。ある態様では、単離された核酸分子は、表１に示される少なくとも１つの多型を任意に含みうる配列番号：１からなる群より選ばれるヌクレオチド配列およびその相補体を含む。本発明はさらに、表１に示される少なくとも１つの多型およびその相補体を任意に含みうる配列番号：１からなる群より選ばれるヌクレオチド配列に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子およびその相補体を含む。本発明はさらに、PAOD1ポリペプチドをコードする単離された核酸分子（例えば、DNA分子）（例えば、配列番号：16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36に示されるイソ型、または多型部位および／またはエキソン４もしくは５を含むPAOD1ポリペプチドの別のスプライシングバリアントをコードする）をコードする単離された核酸分子（例えば、cDNA分子）に関する。２つの新規なエキソンが同定され（エキソン４および５）、図３および図5A〜5Bに示される。新規エキソンを含む２つの新しいスプライシングバリアント（イソ型）が記載され、本明細書中ではEP3gおよびEP3h（図３および6A〜6F参照）と呼ばれる。
【０００４】
本発明は、選択的ハイブリダイゼーションに適切な条件下で、サンプルと、PAOD1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有する第２の核酸分子（例えば、表１に示される少なくとも１つの多型を任意に含みうる配列番号：１または配列番号：１の相補体；表１に示される少なくとも１つの多型を任意に含みうる配列番号：16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36いずれか１つからなる群より選ばれたもの等のイソ型またはスプライシングバリアント、または多型部位および／またはエキソン４または５を含むPAOD1ポリペプチドの別のスプライシングバリアントをコードするヌクレオチド配列）、またはその断片または誘導体とを接触させる工程を含む、サンプル中の全てまたは一部のPAOD1を含む核酸分子の存在についてサンプルをアッセイする方法をさらに提供する。本発明は、PAOD1ポリペプチド、その断片または誘導体の発現のレベルを検出（直接的または間接的）する工程を含むPAOD1ポリペプチド、またはその断片もしくは誘導体の発現のレベルについてサンプルをアッセイする方法をさらに提供する。
【０００５】
本発明はまた、調節配列に作動可能に連結された本発明の単離された核酸分子を含有するベクター、および上記ベクターを含有する組換え宿主細胞に関する。本発明はまた、上記核酸分子の発現に適切な条件下で本発明の組換え宿主細胞を培養する工程を含む、本明細書中に記載される単離された核酸分子によりコードされるポリペプチド（PAOD1ポリペプチド）の調製方法を提供する。
【０００６】
本発明は、本発明の単離された核酸分子によりコードされる単離されたポリペプチド（例えば、PAOD1ポリペプチド）、およびその断片または誘導体をさらに提供する。特定の態様では、上記ポリペプチドは、配列番号：16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36のいずれか１つのアミノ酸配列を含有し、本明細書中に記載される少なくとも１つの多型を含む。別の態様では、ポリペプチドは、PAOD1ポリペプチドの別のスプライシングバリアント、特にエキソン４および／またはエキソン５の全てまたは一部を含むスプライシングバリアントである。本発明はまた、配列番号：16、18、20、24、26、28、30、32、34、36のいずれか１つのアミノ酸配列に約90％よりも多く同一、好ましくは約95％同一、より好ましくは約98％同一なアミノ酸配列を含有し、本明細書中に記載される少なくとも１つの多型を含む、ポリペプチドに関する。
【０００７】
本発明はまた、本発明のポリペプチドに選択的に結合する抗体、またはその抗原結合断片、およびサンプルと、コードされるポリペプチドに特異的に結合する抗体とを接触させる工程を含む、サンプル中の本発明の単離された核酸分子によりコードされるポリペプチドの存在をアッセイするための方法に関する。
【０００８】
本発明はさらに、末梢動脈閉塞疾患に対する素因を診断する方法に関する。個体の末梢動脈閉塞疾患に対する素因を診断する方法は、PAOD1の変化の存在を検出する工程、およびPAOD1ポリペプチドの異なるスプライシングバリアントの存在等のPAOD1ポリペプチドの発現における変化を検出する工程を含む。発現における変化は、定量的、定性的、または定量的および定性的の両方でありうる。本発明の方法は、疾患のオンセットの際または前の末梢動脈閉塞疾患の正確な診断を可能にし、従って、末梢動脈閉塞疾患の消耗性影響を低減または最小化する。
【０００９】
本発明は、１つ以上のPAOD1ポリペプチドの活性または発現を変化（例えば、増強または阻害）する薬剤を同定するためのアッセイにさらに関する。例えば、細胞、細胞画分、あるいはPAOD1ポリペプチドまたはその断片もしくは誘導体を含む溶液は、試験対象の薬剤と接触され得、PAOD1ポリペプチド発現のレベルまたは活性が評価されうる。１つより多くのPAOD1ポリペプチドの活性または発現が同時に評価され得る（例えば、細胞、細胞画分、または溶液は、異なるスプライシングバリアント等のPAOD1ポリペプチドの１つのタイプよりも多くを含み、種々のポリペプチドまたはスプライシングバリアントのレベルが評価されうる）。
【００１０】
別の態様では、本発明は、１つ以上のPAOD1ポリペプチドと相互作用するポリペプチドを同定するためのアッセイに関する。酵母ツーハイブリッド系では、例えば、DNA結合ドメインおよびさらにPAOD1ポリペプチド、スプライシングバリアントまたはその断片もしくは誘導体をもコードする核酸を含む第１のベクターが使用され、転写活性化ドメインをコードする核酸およびさらにPAOD1ポリペプチド、スプライシングバリアントまたはその断片もしくは誘導体と潜在的に相互作用しうるポリペプチド（例えば、PAOD1ポリペプチド結合剤またはレセプター）をコードする核酸を含む第２のベクターが使用される。適切な条件下での第１のベクターおよび第２のベクターの両方を含む酵母のインキュベーションにより、PAOD1ポリペプチドまたはその断片もしくは誘導体と相互作用するポリペプチドの同定が可能になり、従って、PAOD1ポリペプチドの発現の活性を変化させる薬剤でありうる。
【００１１】
PAOD1ポリペプチド発現もしくは活性を増強または阻害する薬剤が本発明に含まれ、また、PAOD1および／またはポリペプチドを含有する細胞と、PAOD1もしくはポリペプチドの発現または活性を増強または阻害する薬剤とを接触させることにより、あるいはPAOD1ポリペプチドと、PAOD1もしくはポリペプチドの発現または活性を増強または阻害する薬剤とを接触させることにより、PAO1ポリペプチド発現または活性を変化（増強または阻害）させる方法が本発明に含まれる。
【００１２】
さらに、本発明は、本発明の核酸、本発明のポリペプチド、および／またはPAOD1ポリペプチドの活性を変化させる薬剤を含有する医薬組成物に関する。本発明は、さらに、本発明の核酸、本発明のポリペプチド、PAOD1ポリペプチドの活性を変化させる薬剤、または前記核酸、ポリペプチド、および／またはPAOD1ポリペプチドの活性を変化させる薬剤を含有する組成物等のPAOD1治療剤を投与することによる末梢動脈閉塞疾患の処置方法に関する。
【００１３】
本発明の上述および他の目的、特徴および利点は、付随する図面に説明されるように、以下の本発明の好ましい態様のより詳細な記載から明らかである。
【００１４】
発明の詳細な説明
患者の集団ベースリストを伴う集団に関する広範な系統学的情報は、通常の末梢動脈閉塞疾患における第１の主要な遺伝子座をマッピングする強力なゲノム共有方法と組み合わされている。６減数分裂事象内に関する、患者におけるゲノム広範スキャンは末梢動脈閉塞疾患を診断し、彼らの未発症の親類を完了した。染色体1p31上の遺伝子座PAOD11は、連鎖研究を通じて末梢動脈閉塞疾患に関連することが同定された。この遺伝子座は、末梢動脈閉塞疾患またはその危険因子（糖尿病、高脂血症および高血圧）の既知の感受性遺伝子座には相当せず、一般的な末梢動脈閉塞疾患の遺伝子の最初のマッピングを表す。現在まで、ヒトの末梢動脈閉塞疾患の既知の連鎖研究は存在せず、染色体のこの領域との何らかの関連性が示されている。行われた連鎖研究に基づいて、出願人は、PAOD1遺伝子と末梢動脈閉塞疾患との間の直接的な関係を発見した。正常な個体からのPAOD1遺伝子（すなわち、ゲノム配列ではなくcDNA）は公知であるが、PAOD1および末梢動脈閉塞疾患を直接調査する研究はない。さらに、末梢動脈閉塞疾患に会合するバリアント形態は報告されていない。PAOD1遺伝子およびスプライシングバリアントの完全配列は図面および配列番号：１に示される。さらなる単一ヌクレオチド多型は配列番号：１には示され得ないが、表１に報告される。本発明により包含される核酸およびその遺伝子産物は、配列番号：１に示されるヌクレオチド配列を含み、さらに表１に示される少なくとも１つの多型をさらに含有しうる。
【００１５】
本発明の核酸
核酸、一部およびバリアント
従って、本発明は、少なくとも１つのヌクレオチド変化を有し、末梢動脈閉塞疾患の発症に関連する単離された核酸分子に関する。本明細書中で使用される用語「PAOD1またはバリアントPAOD1」は、多数の末梢動脈閉塞疾患表現型に対する感受性に関連する染色体1p31上の単離された核酸分子、さらにPAOD1ポリペプチド（例えば、図面に示される配列番号：16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36のいずれかを有し、表１に示される少なくとも１つのSNPを任意に有するポリペプチド、またはPAOD1ポリペプチドの他のスプライシングバリアント）をコードする単離された核酸分子（例えば、cDNAまたは遺伝子）の一部または断片にも関する。好ましい態様では、単離された核酸分子は、配列番号：１（図４に示される）またはその相補体を含む。別の態様では、単離された核酸分子は、表１に示される１つ以上の単一ヌクレオチド多型が存在することを除いて、配列番号：１の配列または配列番号：１の相補体を含有する。別の態様では、単離された核酸分子は、エキソン４もしくは５、またはエキソン４および５の両方を含む。
【００１６】
本発明の単離された核酸分子は、RNA、例えば、mRNA、またはcDNAおよびゲノムDNA等のDNAでありうる。DNA分子は、二本鎖または一本鎖であり；一本鎖RNAまたはDNAは、コード鎖もしくはセンス鎖、または非コード鎖もしくはアンチセンス鎖のいずれかでありうる。核酸分子は、遺伝子のコード配列の全てまたは一部を含み、イントロンおよび非コード3'および5'配列（例えば、調節配列を含む）等のさらなる非コード配列をさらに含みうる。さらに、核酸分子は、マーカー配列、例えば、ポリペプチドの単離または精製において補助するポリペプチドをコードする配列に融合されうる。かかる配列としては、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）融合タンパク質をコードするもの、およびインフルエンザ由来の赤血球凝集素Ａ（HA）ポリペプチドマーカーをコードするものが挙げられるがこれらに限定されない。
【００１７】
本明細書中で使用される「単離された」核酸分子は、通常その遺伝子またはヌクレオチド配列（ゲノム配列中のように）に隣接する核酸から分離されたもの、および／または他の転写配列（例えば、RNAライブラリー中のように）から完全にまたは部分的に精製されたものである。例えば、本発明の単離された核酸は、それが天然に存在する複雑な細胞環境、または組換え技術により産生された場合には培養培地、または化学合成された場合には化学的前駆体または他の化合物に関して実質的に単離されうる。ある場合には、単離された材料は、組成物（例えば、他の物質を含む粗抽出液）、緩衝液系または試薬混合物の一部を形成する。他の環境において、材料は、例えば、PAGEまたはHPLC等のカラムクロマトグラフィーにより測定されるように本質的に均一に精製されうる。好ましくは、単離された核酸分子は、存在する全ての巨大分子種の少なくとも約50、80または90％（モル基準）を含有する。ゲノムDNAに関して、用語「単離された」はまた、ゲノムDNAが天然に会合する染色体から分離される核酸分子をいいうる。例えば、単離された核酸分子は、核酸分子が由来する細胞のゲノムDNA中の核酸分子に隣接する約５kb、４kb、３kb、２kb、１kb、0.5kbまたは0.1kb未満のヌクレオチドを含みうる。
【００１８】
核酸分子は、他のコードまたは調節配列に融合され得、なおも単離されていると考えられる。従って、ベクターに含まれる組換えDNAは、本明細書中で使用される「単離された」の定義に含まれる。また、単離された核酸分子は、異種宿主細胞中の組換えDNA分子、および溶液中の部分的にまたは実質的に精製されたDNA分子を含む。「単離された」核酸分子はまた、本発明のDNA分子のインビボおよびインビトロRNA転写物を含みうる。単離された核酸分子またはヌクレオチド配列は、化学合成されたか、または組換え手段により合成された核酸分子またはヌクレオチド配列を含みうる。それゆえ、ベクター中に含まれる組換えDNAは、本明細書中で使用される「単離された」の定義に含まれる。また、単離されたヌクレオチド配列は、相同な生物中の組換えDNA分子、および溶液中の部分的にまたは実質的に精製されたDNA分子を含む。本発明のDNA分子のインビボおよびインビトロRNA転写物もまた、「単離された」ヌクレオチド配列により包含される。かかる単離されたヌクレオチド配列は、コードされるポリペプチドの製造において、相同配列（例えば、他の哺乳動物種）を単離するためのプローブとして、遺伝子マッピング（例えば、染色体とのインサイチュハイブリダイゼーションによる）のために、またはノザンブロット解析等の組織（例えば、ヒト組織）中の遺伝子の発現を検出するために有用である。
【００１９】
本発明はまた、天然には必ずしも見出されないが、PAOD1ポリペプチド（例えば、配列番号：16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドあるいはPAOD1ポリペプチドの別のイソ型もしくはスプライシングバリアントまたはその多型バリアント）をコードするバリアント核酸分子に関する。従って、例えば、遺伝コードの縮重のために天然に存在するヌクレオチド配列とは異なる配列を含むが、本発明のPAOD1ポリペプチドをコードするDNA分子もまた本発明の目的である。本発明はまた、PAOD1ポリペプチドの一部をコードするか（断片）、アナログまたは誘導体などのバリアントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。かかるバリアントは、対立遺伝子変異または単一ヌクレオチド多型の場合には天然に存在し、種々の変異原または変異誘発プロセスにより誘導されたもの等は天然に存在しない。意図される変異としては、付加および欠失を含む保存的または非保存的アミノ酸変化を生じうる１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失および置換が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、ヌクレオチド（および／または生じるアミノ酸）変化はサイレントまたは保存的であり；すなわち、それらは、PAOD1ポリペプチドの特徴または活性を変化させない。ある態様では、ヌクレオチド配列は、１つ以上のポリマーミクロサテライトマーカーを含有する断片である。別の好ましい態様では、ヌクレオチド配列は、PAOD1遺伝子中に１つ以上の単一ヌクレオチド多型を含む断片である。
【００２０】
本発明の核酸分子の他の変化としては、例えば、標識、メチル化、非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメート）、荷電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート）、下垂成分（例えば、ポリペプチド）、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレン）、キレーター、アルキレーター、および改変結合（例えば、αアノマー核酸）等のヌクレオチド間修飾を含みうる。また、水素結合および他の化学的相互作用により設計された配列に結合する能力において核酸分子を模倣する合成分子が含まれる。
【００２１】
本発明はまた、選択的ハイブリダイゼーションのため等の高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で本明細書中に記載されるヌクレオチド配列（例えば、本明細書中に記載され、任意にポリペプチドの活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする核酸分子）にハイブリダイズする核酸分子に関する。ある態様では、本発明は、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件（例えば、選択的ハイブリダイゼーションのための）下で、任意に表１に示される少なくとも１つの多型を含みうる配列番号：１から選択されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列またはその相補体にハイブリダイズする本明細書中に記載されるバリアントを含む。別の態様では、本発明は、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件（例えば、選択的ハイブリダイゼーションのための）下で、配列番号：16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36またはその他の多型バリアントのいずれかから選ばれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列にハイブリダイズする本明細書中に記載されるバリアントを含む。好ましい態様では、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション下でハイブリダイズするバリアントは、PAOD1の活性を有する。
【００２２】
かかる核酸分子は、特異的なハイブリダイゼーションにより（例えば、高ストリンジェンシー条件下）検出および／または単離されうる。本明細書中で使用される「特異的ハイブリダイゼーション」は、第１の核酸が第２の核酸以外のいかなる核酸分子にもハイブリダイズしない（例えば、第１の核酸が、ハイブリダイゼーションが行われるサンプル中の任意の他の核酸よりも第２の核酸に高い類似性を有する場合）様式で第２の核酸にハイブリダイズする第１の核酸の能力をいう。ハイブリダイゼーションに関する「ストリンジェントな条件」は、第２の核酸への特定の核酸のハイブリダイゼーションを可能にするインキュベーションおよび洗浄条件、例えば、温度および緩衝液濃度の条件をいう用語であり；第１の核酸は、第２の核酸に完全に（すなわち、100％）相補的であるか、第１および第２の核酸は、完全よりも低いいくらかの相補性（例えば、70％、75％、85％、90％、95％、98％）を共有しうる。例えば、完全な相補性核酸と低相補性核酸とを識別する所定の高ストリンジェンシー条件が使用されうる。核酸ハイブリダイゼーションに関する、「高ストリンジェンシー条件」、「中程度のストリンジェンシー条件」および「低ストリンジェンシー条件」は、Current Protocols in Molecular Biology（Ausubel, F.M.ら、「Current Protocols in Molecular Biology」, John Wiley & Sons, (1998), その全体の教示は参考により本明細書中に援用される」）の2.10.1〜2.10.16頁および6.3.1〜6.3.1頁に説明されている。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する正確な条件は、イオン強度（例えば、0.2XSSC、0.1XSSC）、温度（例えば、室温、42℃、68℃）、およびホルムアミド等の不安定化剤またはSDS等の変性剤の濃度だけでなく、核酸配列の長さ、塩基組成、ハイブリダイズする配列間のミスマッチパーセントおよび他の非同一配列内のその配列のサブセットの出現の頻度にも依存する。従って、等価な条件は、類似した程度の２つの核酸分子間の相同性または類似性を維持しながら、これらのパラメーターの１つ以上を変化させることにより決定されうる。典型的には、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％または少なくとも約95％以上が互いに同一な配列が、互いにハイブリダイズしたままであるような条件が使用される。ハイブリダイゼーションが起こらないストリンジェンシーのレベルからハイブリダイゼーションが最初に観察されるレベルまでハイブリダイゼーション条件を変化させることにより、所定の配列をサンプル中の最も類似する配列と（例えば選択的）ハイブリダイズさせる条件が決定されうる。
【００２３】
例示的条件は、Krause, M.H.およびS.A. Aaronson, Mehods in Enzymology, 200: 546-556 (1991)に記載されている。また、Ausubelら、「Current Protocols in Molecular Biology」、John Wiley & Sons, (1998)は、中程度または低ストリンジェンシー条件のための洗浄条件の決定を記載している。洗浄は、条件が通常、ハイブリッドの相補性の最低レベルを決定するように設定される工程である。一般に、相同性ハイブリダイゼーションのみが起こる最も低い温度から始めて、最終洗浄温度が一度ずつ低下され（SSC濃度を一定に保ちながら）、ハイブリダイズする配列間のミスマッチの最大の程度の１％まで上昇させる。一般に、SSCの濃度を倍にすると、約17℃のTmの上昇を生じる。これらのガイドラインを使用して、洗浄温度は、求められるミスマッチのレベルに応じて、高、中程度、または低ストリンジェンシーについて経験的に決定されうる。
【００２４】
例えば、低ストリンジェンシー洗浄は、0.2XSSC/0.1％SDSを含む溶液中での室温で10分間の洗浄を含みうる；中程度のストリンジェンシー洗浄は、0.2XSSC/0.1％SDSを含む予め温めた（42℃）溶液中での42℃で15分間の洗浄を含みうる；高ストリンジェンシー洗浄は、0.1XSSC/0.1％SDSを含む予め温められた（68℃）中での68℃で15分間の洗浄を含みうる。さらに、洗浄は、当該分野で公知の所望の結果を得るために繰り返しまたは連続的に行われうる。等価な条件は、標的核酸分子と使用されるプライマーまたはプローブとの間の類似した程度の同一性または類似性を維持しながら、当該分野で公知であるような、例として挙げられた１つ以上のパラメーターを変化させることにより決定されうる。
【００２５】
２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の相同性または同一性のパーセントは、最適な比較目的のために配列を整列させることにより決定されうる（例えば、ギャップは、最適な整列のために第１の配列の配列にギャップが導入されうる）。次いで、対応する位置のヌクレオチドまたはアミノ酸が比較され、２つの配列間の同一性パーセントは、配列により共有される同一な位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一な位置の数／位置の総数x100）。ある配列の位置が他の配列の対応する位置と同じヌクレオチドまたはアミノ酸残基で占められている場合、分子はその位置において相同である。本明細書中で使用されるように、核酸またはアミノ酸「相同性」は、核酸またはアミノ酸「同一性」と等価である。所定の態様では、比較目的のために整列される配列の長さは、参照配列の少なくとも30％、例えば、少なくとも40％であり、所定の態様では、少なくとも60％であり、および別の態様では、少なくとも70％、80％、90％または95％である。２つの配列の実際の比較は、周知の方法、例えば、数学的アルゴリズムを使用することにより達成されうる。かかる数学的アルゴリズムの好ましい非制限的な例は、Karlinら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:5873-5877(1993)に記載されている。かかるアルゴリズムは、Altschulら、Nucleic Acids Res. 25:389-3402(1997)に記載されるようなNBLASTおよびXBLASTプログラム(バージョン2.0)に取り込まれる。BLASTおよびGapped BLASTプログラムを使用する場合、それぞれのプログラム（例えば、NBLAST）のデフォルトのパラメータが使用されうる。ある態様では、配列比較のパラメータは、スコア=100、ワード長=12で設定されうるか、または変化しうる（例えば、W=5またはW=20）。
【００２６】
配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの別の好ましい、非限定的な例は、MyersおよびMiller、CABIOS(1989)である。かかるアルゴリズムは、GCG-sequence alignment software package(Accelrys, Cambridge, UK)の一部であるALIGNプログラム（バージョン2.0）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを使用する場合、PAM120ウェイト残基テーブル、12のギャップ長ペナルティおよび４のギャップペナルティが使用されうる。配列分析のためのさらなるアルゴリズムは当該分野に公知であり、TorellisおよびRobotti (1994) Comput.Appl.Biosci., 10:3-5に記載されるようなADVANCEおよびADAM；ならびにPearsonおよびLipman(1988) PNAS, 85:2444-8に記載されるFASTAを含む。
【００２７】
別の態様では、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Blossom63マトリックスまたはPAM250マトリックスのいずれか、および12、10、８、６、または４のギャップウェイトおよび２、３、または４の長さウェイトを用いて、GCG-software package中のGAPプログラムを用いて達成されうる。さらに別の態様では、２つの核酸配列間の同一性パーセントは、50のギャップウェイトおよび３の長さウェイトを用いて、GCG-sofutware packageのGAPプログラムを用いて達成されうる。
【００２８】
本発明はまた、高ストリンジェントな条件下で、表１に示される少なくとも１つの多型を任意に含みうる配列番号：１から選ばれるヌクレオチド配列およびその相補体を含有するヌクレオチド配列にハイブリダイズする断片または一部を含む単離された核酸分子を提供し、また、高ストリンジェントな条件下で、配列番号：16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36のいずれかから選ばれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列またはその多型バリアントにハイブリダイズする断片または一部を含む単離された核酸分子を提供する。本発明の核酸断片は、少なくとも約15、好ましくは少なくとも約18、20、23または25ヌクレオチドであり、30、40、50、100、200以上のヌクレオチド長でありうる。より長い断片、例えば、30以上のヌクレオチド長（本明細書中に記載される抗原性ポリペプチドをコードする）は、本明細書中下記のような抗体の産生のため等に特に有用である。
【００２９】
プローブおよびプライマー
関連した局面では、本発明の核酸断片は、本明細書中に記載されるもの等のアッセイにおいてプローブまたはプライマーとして使用される。「プローブ」または「プライマー」は、核酸分子の相補鎖に塩基特異的様式でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。かかるプローブおよびプライマーとしては、Nielsenら、Science, 254, 1497-1500 (1991)に記載されるポリペプチド核酸が挙げられる。
【００３０】
プローブまたはプライマーは、隣接したヌクレオチド配列またはその多型バリアントを含む核酸分子の少なくとも約15、例えば、約20〜25、および所定の態様では、約40、50または75の連続ヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。他の態様では、プローブまたはプライマーは、100以下のヌクレオチドを含み、所定の態様では、６〜50ヌクレオチド、例えば、12〜30ヌクレオチドを含む。他の態様では、プローブまたはプライマーは、隣接したヌクレオチド配列または隣接したヌクレオチド配列の相補体に少なくとも70％同一であり、例えば少なくとも80％同一であり、所定の態様では少なくとも90％同一であり、他の態様では少なくとも95％同一であり、さらに隣接したヌクレオチド配列または隣接したヌクレオチド配列の相補体に選択的にハイブリダイズしうる。しばしば、プローブまたはプライマーは、標識、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、酵素または酵素コファクターをさらに含む。
【００３１】
上記に記載されるもの等の本発明の核酸分子は、標準的な分子生物学技術および本明細書中に提供される配列情報を用いて同定され、単離されうる。例えば、核酸分子は、表１に示される少なくとも１つの多型を任意に含みうる配列番号：１に提供される１つ以上の配列および／またはその相補体に基づいて設計されるか、または本明細書中に提供される１つ以上のアミノ酸配列をコードする配列に基づくヌクレオチドに基づいて設計される合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応により増幅され単離されうる。一般的にはPCR Technology: Principles and Appliations for DNA Amplification（H.A. Erlich, Freeman Press, NY, NY. 1992);PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innisら編、Academic Press, San Diego, CA, 1990); Mattilaら、Nucleic Acids Res., 19:4967 (1991); Eckertら編、PCR Methods and Applications, 1:17(1991); PCR(McPhersonら、IRL Press, Oxford)；および米国特許第4,683,202号を参照。核酸分子は、cDNA、mRNAまたはゲノムDNAをテンプレートとして用いて増幅され、適切なベクターにクローニングされ、DNA配列解析により特徴づけられうる。
【００３２】
他の適切な増幅方法としては、リガーゼ連鎖反応 (LCR) (WuおよびWallace, Genomics, 4:560 (1989), Landegrenら, Science, 241:1077 (1988)を参照のこと)、転写増幅 (Kwohら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:1173 (1989))、および自立した配列複製 (Guatelliら, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87:1874 (1990)) および核酸ベースの配列増幅 (NASBA) が挙げられる。後半２つの増幅方法は、増幅産物として一本鎖RNA (ssRNA) および二本鎖DNA (dsDNA) の両方をそれぞれ約30または100対1の割合で産生する等温転写に基づいた等温反応を伴う。
【００３３】
増幅したDNAは標識、例えば放射性標識され、ヒト細胞由来cDNAライブラリー、zap発現におけるmRNA、ZIPLOXまたは他の適切なベクターのスクリーニングのためのプローブとして使用され得る。対応するクローンは単離され得、インビボエキサイションに続きDNAが得られ得、クローン化されたインサートは適切な分子量のポリペプチドをコードする正しいリーディングフレームを同定するため当該分野で認識された方法によりいずれか方向のまたは両方向から配列決定され得る。例えば、本発明の核酸分子のヌクレオチド配列の直接的な分析は市販されている周知の方法を使用して達成され得る。例えば、Sambrookら, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd Ed., CSHP, New York 1989); Zyskindら, Recombinant DNA Laboratory Manual, (Acad. Press, 1988) を参照のこと。これらの方法または類似の方法を使用し、ポリペプチドおよびポリペプチドをコードするDNAは単離され、配列決定され、さらに特性付けされ得る。
【００３４】
本発明のアンチセンス核酸分子は、配列番号: 1および/または配列番号: 1の相補体、および/または配列番号: 1もしくは配列番号: 1の相補体の部分および/または該アミノ酸配列、あるいは配列番号: 16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36のいずれか１つをコードする配列、または配列番号: 16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36のいずれか１つの部分をコードする配列 (ここで、これらのいずれか１つは、表１に示されるような少なくとも１つの多型を任意に含み得る) を使用して設計され、当該分野で公知の手順を用いた化学合成および酵素ライゲーション反応を使用して構築され得る。例えばアンチセンス核酸分子 (例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド) は、天然に存在するヌクレオチドまたは分子の生物学的安定性を高めるためもしくはアンチセンス核酸とセンス核酸の間に形成された二本鎖の物理的安定性を高めるために設計された様々に修飾されたヌクレオチドを使用して化学合成され得、例えばホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが使用され得る。あるいはアンチセンス核酸分子は、核酸分子がアンチセンス方向にサブクローニングされている発現ベクターを使用して生物学的に産生され得る (すなわち、挿入された核酸分子から転写されたRNAは、目的の標的核酸に対してアンチセンス方向になる)。
【００３５】
一般に、本発明の単離された核酸配列は、サザンゲルの分子量マーカーとして、および関連遺伝子位置をマッピングするために標識される染色体マーカーとして使用され得る。該核酸配列はまた、遺伝的障害 (例えば末梢動脈閉塞疾患に対しての素因性または感受性) を同定するために患者の内因性DNA配列と比較するために使用され、また関連DNA配列をハイブリダイズし発見するためまたは試料から既知配列を除くためなどのプローブとしても使用され得る。該核酸配列はさらに、遺伝的フィンガープリンティングのためのプライマーを得るため、DNA免疫技術を使用して抗ポリペプチド抗体を惹起するため、および抗DNA抗体を惹起するまたは免疫応答を誘発する抗原として使用され得る。本明細書中で同定されたヌクレオチド配列の部分または断片 (および対応する完全な遺伝子配列) は、ポリヌクレオチド試薬として多数の方法において使用され得る。例えば、これらの配列は (i) 染色体上に各遺伝子をマッピングするため; および次いで遺伝的疾患に関連する遺伝子領域を位置付けるため; (ii) 微少な生物学的試料から個体を同定する (ティッシュータイピング) ため; および (iii) 生物学的試料の法医学的な同定における手助けをするために使用され得る。更に、本発明のヌクレオチド配列は、分析、特性付けまたは治療使用のための組換えポリペプチドを同定および発現させるために、あるいは対応するポリペプチドが組織分化の間または疾患状態のいずれかにおいて構成的に発現する組織のマーカーとして使用され得る。該核酸配列は更に、本明細書中に記載されたスクリーニングおよび/または診断アッセイにおける試薬として使用され得、また、本明細書中に記載されたスクリーニングおよび/または診断用アッセイに用いるキット (例えば試薬キット) の成分として含まれ得る。
【００３６】
ベクター
本発明の別の局面は、表１に示された少なくとも１つの多型を任意に含み得る配列番号: 1からなる群から選択された核酸分子およびその相補体 (またはその部分) を含む核酸構築物に関する。本発明の更に別の局面は、配列番号: 16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36のいずれか１つのアミノ酸配列をコードする核酸分子またはその多型バリアントを含む核酸構築物に関する。該構築物は、本発明の配列がセンスまたはアンチセンスの方向に挿入されているベクター (例えば発現ベクター) を含む。本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」とは、連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子をいう。ベクターの１つの型は「プラスミド」であり、付加DNAセグメントが連結され得る環状二本鎖DNAループをいう。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、付加ベクターDNAセグメントはウイルスゲノムに連結され得る。特定のベクターは、それらが導入された宿主細胞での自己複製が可能である (例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム性哺乳類ベクター) 。他のベクター (例えば、非エピソーム性哺乳類ベクター) は、宿主細胞へ導入されると宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより宿主ゲノムに沿って複製される。さらに特定のベクター、発現ベクターは作動可能に連結された遺伝子の発現を導くことができる。一般に、組換えDNA技術において有用な発現ベクターはしばしばプラスミドの形態である。しかしながら本発明は、等しい機能を供給するウイルスベクター (例えば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルス) などのかかる他形態の発現ベクターも含むことが意図される。
【００３７】
本発明の好ましい組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸分子の発現に適した形態の本発明の核酸分子を含む。これは組換え発現ベクターが、発現する核酸配列に対して作動可能に連結される、発現に使用される宿主細胞をに基づいて選択された１以上の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクターについて、「作動可能にまたは動作可能なように連結」とは、ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で (例えば、インビトロ転写/翻訳系において、またはベクターが宿主細胞へ導入される場合は宿主細胞において)、目的のヌクレオチド配列が調節配列に対して連結されることを意味すると意図される。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御因子 (例えばポリアデニル化シグナル) を含むと意図される。かかる調節配列は、例えばGoeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) に記載されている。調節配列は、多くの型の宿主細胞におけるヌクレオチド配列の構成性の発現を導くもの、および特定の宿主細胞のみにおけるヌクレオチド配列の発現を導くもの (例えば、組織特異的調節配列) を含む。発現ベクターの設計は、形質転換のための宿主細胞の選択および望ましいポリペプチドの発現レベルなどの要因に依存し得ると当業者に認められる。本発明の発現ベクターは宿主細胞に導入され得、それにより本明細書中に記載されたような核酸分子にコードされたポリペプチド (融合ポリペプチドを含む) を産生する。
【００３８】
本発明の組換え発現ベクターは、原核生物または真核生物の細胞 (例えば、E.coliなどの細菌細胞、昆虫細胞 (バキュロウイルス発現ベクターを使用する)、酵母細胞または哺乳動物細胞) における本発明のポリペプチドの発現のために設計され得る。適切な宿主細胞は、Goeddel, 前出 で更に論じられている。または、組換え発現ベクターは例えばT7プロモーター調節配列およびT7ポリメラーゼを使用してインビトロで転写および翻訳され得る。
【００３９】
本発明の別の局面は、本発明の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書中で交換可能に使用される。かかる用語は、特定の対象細胞だけでなくかかる細胞の後代または潜在的な後代のことを言うことが理解される。変異または環境的影響のいずれかにより次世代ではいくらかの改変が生じ得るため、かかる後代は実際には親細胞と同一ではないが、それでも本明細書中で使用される場合はこの用語の範囲内に含まれる。
【００４０】
宿主細胞は任意の原核生物または真核生物の細胞であり得る。例えば、本発明の核酸分子は細菌細胞 (例えばE.Coli)、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞 (チャイニーズハムスター卵巣細胞 (CHO) またはCOS細胞など) において発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
【００４１】
ベクターDNAは、従来の形質転換またはトランスフェクション技術によって原核生物または真核生物の細胞に導入され得る。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換」および「トランスフェクション」は外来の核酸分子 (例えばDNA) を宿主細胞に導入するための、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈澱、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションを含む当該分野で認識された様々な技術をいう。形質転換またはトランスフェクト宿主細胞のための適切な方法はSambrookら (前出)、および他の実験マニュアルにおいて見出され得る。
【００４２】
哺乳動物細胞の安定したトランスフェクションに関して、使用した発現ベクターおよびトランスフェクション技術に依存して、細胞の小画分のみが外来DNAをそのゲノムに組み込み得ることが公知である。これらの要素を同定および選択するために、選択的マーカー (例えば抗生物質耐性に対する) をコードする遺伝子が目的の遺伝子と共に宿主細胞に一般的に導入される。好ましい選択可能マーカーとしては、G418、ハイグロマイシンおよびメトトレキセートなどの薬剤に耐性を与えるものが挙げられる。選択的マーカーをコードする核酸分子は宿主細胞に、本発明の核酸分子と同じベクター上に導入され得るか、または異なるベクター上に導入され得る。導入された核酸分子で安定してトランスフェクトされた細胞は、薬剤選択により同定される (例えば、選択的マーカーが組み込まれた細胞は生存するが、他の細胞は死ぬ)。
【００４３】
培養状態の原核生物または真核生物宿主細胞などの本発明の宿主細胞は、本発明のポリペプチドを産生する (すなわち発現する) ために使用され得る。従って、本発明は更に本発明の宿主細胞を使用してポリペプチドを産生する方法を提供する。１つの態様において、該方法はポリペプチドが産生されるような適切な培地で本発明の宿主細胞 (本発明のポリペプチドをコードする組換え発現ベクターが導入されている) を培養する工程を含む。別の態様において、該方法は更に培地または宿主細胞からポリペプチドを単離する工程を含む。
【００４４】
本発明の宿主細胞はまた、非ヒトトランスジェニック動物を産生するために使用され得る。例えば１つの態様において、本発明の宿主細胞は本発明の核酸分子が導入されている (例えば、外来性のPAOD1遺伝子またはPAOD1ポリペプチドをコードする外来性核酸) 受精した卵母細胞または胚性幹細胞である。かかる宿主細胞は次いで外来性ヌクレオチド配列がゲノムに導入されている非ヒトトランスジェニック動物または外来性核酸配列が改変されている相同組換え動物を作製するために使用され得る。かかる動物は、核酸配列およびその配列にコードされたポリペプチドの機能および/または活性を研究するため、ならびにそれらの活性のモジュレーターを同定および/または評価するために有用である。本明細書中で使用される場合、「トランスジェニック動物」は、その動物の１つ以上の細胞が導入遺伝子を含む非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはラットまたはマウスなどのげっ歯類である。トランスジェニック動物の他の例としては、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、および両生類が挙げられる。導入遺伝子は、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれ、成熟した動物のゲノムに残存し、それによってトランスジェニック動物の１以上の細胞型または組織でコードされた遺伝子産物の発現を導く外来性DNAである。本明細書中で使用される場合、「相同組換え動物」は、内因性の遺伝子と、動物の細胞 (例えば動物の発生前の動物の胚性細胞) に導入された外来性DNA分子との間の相同組換えによって内因性遺伝子が改変されている非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウスである。
【００４５】
胚操作およびマイクロインジェクションによるトランスジェニック動物の作出方法は、特にマウスなどの動物において当該分野で慣習的になっており、例えば米国特許第4,736,866号および第4,870,009号、米国特許第4,873,191号ならびにHogan, Manipulating the Mouse Embryo (Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986) に記載されている。相同組換えベクターおよび相同組換え動物の構築方法は更にBradley (1991) Current Opinion in Bio/Technology, 2:823-829およびPCT 公開公報 WO90/11354, WO91/01140, WO92/0968およびWO93/04169において記載されている。本明細書中に記載される非ヒトトランスジェニック動物のクローンもまた、Wilmutら (1997) Nature, 385:810-813ならびにPCT公開公報 WO97/07668およびWO97/07669 に記載された方法にしたがって作出され得る。
【００４６】
本発明のポリペプチド
本発明はまた、PAOD1 (「PAOD1ポリペプチド」) にコードされた単離ポリペプチドおよびその断片とそのバリアント、ならびに本明細書中に記載されたヌクレオチド配列によりコードされたポリペプチド (例えば、他のスプライシングバリアント) に関する。用語「ポリペプチド」はアミノ酸のポリマーを言い、特別な長さを言わない; 従って、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質はポリペプチドの定義内に含まれる。本明細書中で使用されるにあたり、ポリペプチドは、組換えおよび非組換え細胞から単離された場合は細胞性物質から実質的に離れているとき、または化学合成された場合は化学的前駆体もしくは他の化学物質から実質的に離れているときに、「単離された」または「精製された」と言われる。しかしながらポリペプチドは、細胞において通常結合しない別のポリペプチドに結合し得 (例えば「融合タンパク質」において)、それでもなお「単離された」または「精製された」状態である。
【００４７】
本発明のポリペプチドは均質になるまで精製され得る。しかしながら、ポリペプチドが均質に精製されていない調製物は有用であると理解される。重要な特性は、かなりの量の他の物質の存在下であっても、この調製物はポリペプチドの所望の機能を可能にすることである。従って、本発明は様々な程度の純度を包含する。１つの態様において、「実質的に細胞性物質から離れた」という文言は、約30％ (乾燥重量で) より少ない他のタンパク質 (コンタミしたタンパク質)、約20％より少ない他のタンパク質、約10％より少ない他のタンパク質、約5％より少ない他のタンパク質を有するポリペプチドの調製物を含む。
【００４８】
ポリペプチドが組換え的に産生される場合、それはまた実質的に培養液から離れ得る、すなわち、培養液はポリペプチド調製物の量の約20％より少なく、約10％より少なく、または約5％よりも少なくなる。「実質的に化学的前駆体または他の化学物質から離れる」という文言は、ポリペプチドの合成に関連する化学的前駆体または他の化学物質から分離されたポリペプチドの調製物を含む。１つの態様において、「実質的に化学的前駆体または他の化学物質から離れる」という文言は、約30％ (乾燥重量で) 未満の化学的前駆体または他の化学物質、約20％未満の化学的前駆体または他の化学物質、約10％未満の化学的前駆体または他の化学物質、または約5％未満の化学的前駆体または他の化学物質を有するポリペプチドの調製物を含む。
【００４９】
１つの態様において、本発明のポリペプチドは、表１に示された少なくとも１つの多型を含み得る配列番号: 1ならびにその相補体およびその部分からなる群より選ばれたヌクレオチド配列を含む核酸分子にコードされるアミノ酸配列 (例えば、配列番号: 16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、またはその部分もしくはその多型バリアントのいずれかひとつ) を含む。しかしながら、本発明のポリペプチドはまた、断片および配列バリアントを包含する。バリアントは生物において同じ遺伝子座でコードされる実質的な相同ポリペプチド (すなわち、対立遺伝子性バリアント、ならびに他のスプライシングバリアント) を含む。バリアントはまた、生物における他の遺伝子座由来であるが、表１に示された少なくとも１つの多型を任意に含み得る配列番号: 1ならびにその相補鎖およびその部分からなる群より選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子にコードされるポリペプチドと実質的な相同性を有するか、あるいは配列番号: 16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36のいずれか１つにコードされるヌクレオチド配列またはその多型バリアントからなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされるポリペプチドに対して実質的に相同性を有する、ポリペプチドも包含する。バリアントはまた化学合成により産生されるこれらのポリペプチドと実質的に相同または同一なポリペプチドを含む。バリアントはまた、組換え方法により産生されるこれらのポリペプチドと実質的に相同または同一なポリペプチドを含む。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、２つのポリペプチド (またはポリペプチドの領域) は、アミノ酸配列が少なくとも約45％〜55％、特定の態様においては少なくとも約70〜75％、他の態様においては少なくとも約80〜85％、および他の態様においては約90％以上の相同性または同一性の場合、実質的に相同または同一である。本発明の実質的に相同なアミノ酸配列は、表１に示された少なくとも１つの多型を任意に含み得る配列番号: １またはその部分に対して上記により詳細に記載したストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によりコードされ、または配列番号: 16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36のいずれか１つをコードする核酸配列、その部分またはその多型バリアントに対して上記により詳細に記載したストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によりコードされる。
【００５１】
本発明はまた、同一性の度合いは低いが、本発明の核酸分子によりコードされたポリペプチドにより実行される１以上の同じ機能を果たすためには充分な類似性を有するポリペプチドを包含する。類似性は保存的アミノ酸置換により決定される。かかる置換はポリペプチドにおいて、所定のアミノ酸を同様の特性の別のアミノ酸で置換する。保存的置換は表現形的にはサイレントとなりやすい。典型的に保存的置換で見られるものは、脂肪族アミノ酸Ala, Val, LeuおよびIleの間での１つのものから別のものへの置換、ヒドロキシル残基SerおよびThrの相互変換、酸性残基 AspおよびGlnの交換、アミド残基 AsnとGlnとの間の置換、塩基性残基LysおよびArgの交換および芳香族残基 PheおよびTyrの間の置換である。アミノ酸変化が表現型的にサイレントになりやすいことに関するガイダンスは、Bowieら, Science 247:1306-1310 (1990) に見出される。
【００５２】
バリアントポリペプチドは、１以上の置換、欠失、挿入、逆位、融合、および切断またはこれらの任意の組み合わせにより、アミノ酸配列において変化し得る。さらに、バリアントポリペプチドは完全に機能的であり得るか、１つ以上の活性において機能を失い得る。完全な機能的バリアントは典型的に保存的変異または非必須残基もしくは非必須領域における変異のみを含む。機能的バリアントはまた、機能における変化を生じないまたは明らかな変化を生じない類似アミノ酸の置換を含み得る。あるいは、かかる置換はポジティブにまたはネガティブにある程度機能に影響し得る。非機能的バリアントは典型的に１つ以上の非保存的アミノ酸置換、欠失、挿入、逆位、または切断あるいは重要残基または重要領域における置換、挿入、逆位または欠失を含む。
【００５３】
機能に必須のアミノ酸は、部位特異的突然変異またはアラニン‐スキャニング突然変異 (Cunninghamら, Science, 244:1081-1085 (1989)) などの当該分野で公知の方法により同定され得る。後者の手順は分子内の各残基で単一アラニン変異を誘導する。生じた変異体分子は次いでインビトロでの生物学的活性またはインビトロ増殖活性を試験される。ポリペプチド活性に重要な部位はまた、結晶化、核磁気共鳴またはフォトアフィニティーラベリング (Smithら, J. Mol. Biol., 224:899-904 (1992); de Vos et al., Science, 255:306-312 (1992)) などの構造分析により決定され得る。
【００５４】
本発明はまた、本発明のポリペプチドのポリペプチド断片を含む。断片は表１に示された少なくとも１つの多型を任意に含み得る配列番号: 1またはその部分およびその相補鎖 (例えば、配列番号: 16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、または他のスプライシングバリアントのいずれか１つ) を含む核酸分子によりコードされるポリペプチド由来であり得る。しかしながら、本発明はまた、本明細書中に記載されたポリペプチドのバリアントの断片を包含する。本明細書中で使用される場合、断片は少なくとも6個の連続したアミノ酸を含む。有用な断片は、ポリペプチドの１つ以上の生物学的活性を保持するもの、ならびにポリペプチド特異的抗体を生成するための免疫源として使用され得る断片を含む。
【００５５】
生物学的活性断片 (例えば、6、9、12、15、16、20、30、35、36、37、38、39、40、50、100以上のアミノ酸長であるペプチド) は、周知の方法を使用したポリペプチドシーケンスの分析により同定されているドメイン、セグメント、またはモチーフ (例えばシグナルペプチド、細胞外ドメイン、１つ以上のトランスメンブレンセグメントまたはループ、リガンド結合領域、ジンクフィンガードメイン、DNA結合ドメイン、アセチル化部位、グリコシル化部位、またはリン酸化部位) を含む。
【００５６】
断片は不連続であるか (他のアミノ酸またはポリペプチドに融合していない) またはより大きいポリペプチド内にあり得る。さらに、いくつかの断片は単一のより大きいポリペプチド内に含まれ得る。１つの態様において、宿主における発現のために設計された断片は、ポリペプチド断片のアミノ末端に融合した異種のプレポリペプチドおよびプロポリペプチド領域および該断片のカルボキシ末端に融合した付加領域を有し得る。
【００５７】
本発明は従って、キメラ化ポリペプチドまたは融合ポリペプチドを提供する。これらは実質的に該ポリペプチドと相同でないアミノ酸配列を有する異種タンパク質またはポリペプチドに作動可能に連結した本発明のポリペプチドを含む。「作動可能に連結した」とは、ポリペプチドと異種タンパク質がフレーム内で融合されることを示す。異種タンパク質はポリペプチドのN末端またはC末端に融合され得る。１つの態様において、融合ポリペプチドはポリペプチド自体の機能に影響を与えない。例えば融合ポリペプチドは、該ポリペプチド配列がGST配列のC末端に融合されるGST融合ポリペプチドであり得る。他の型の融合ポリペプチドとしては、例えばβ-ガラクトシダーゼ融合、酵母two-ハイブリッドGAL融合、ポリ-His融合およびIg融合といった酵素融合ポリペプチドが挙げられるが、これに限定されない。かかる融合ポリペプチド、特にポリ-His融合は、組換えポリペプチドの精製を容易にする。特定の宿主細胞 (例えば哺乳動物宿主細胞) において、ポリペプチドの発現および/または分泌は異種のシグナル配列を用いることにより増加され得る。従って別の態様において、融合ポリペプチドはそのN末端において異種のシグナル配列を含む。
【００５８】
EP-A-O 464 533 は、免疫グロブリン定常領域の様々な部分を含んでいる融合タンパク質を開示する。Fcは治療および診断に有用であり、例えば薬物動態性質の改良を生じる (EP-A 0232 262)。薬剤発見において、例えば、ヒトタンパク質はアンタゴニストを同定するためのハイスループットスクリーニングアッセイの目的でFc部分と融合されている。Bennettら, Journal of Molecular Recognition, 8:52-58 (1995) および Johansonら, The Journal of Biological Chemistry, 270, 16:9459-9471 (1995)。従って本発明はまた、本発明のポリペプチドおよび様々なサブクラス (IgG、IgM、IgA、IgE) の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常部位の様々な部分を含む可溶性融合ポリペプチドを包含する。
【００５９】
キメラ化ポリペプチドまたは融合ポリペプチドは標準の組換えDNA技術により産生され得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードしているDNA断片は従来技術に従ってフレーム内に共に結合される。別の態様において、融合遺伝子は自動DNA合成機を含む従来技術により合成され得る。あるいは、核酸断片のPCR増幅が、続いてキメラ核酸配列を精製するためアニールおよび再増幅され得る２つの連続した核酸断片間で相補的なオーバーハングを生じるアンカープライマーを用いて行われ得る (Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology, 1992)。さらに、多くの発現ベクターはすでに融合部分 (例えば、GSTタンパク質) をコードした状態で市販されている。本発明のポリペプチドをコードしている核酸分子は、融合部分がフレ？ム内でポリペプチドに連結されるようにかかる発現ベクターにクローン化され得る。
【００６０】
単離されたポリペプチドは、天然にそれを発現する細胞から精製され、それを発現するように改変された細胞 (組換え) から精製され、または公知のタンパク質合成方法を用いて合成され得る。１つの態様において、ポリペプチドは組換えDNA技術により産生される。例えば、ポリペプチドをコードしている核酸分子は発現ベクターにクローン化され、この発現ベクターは宿主細胞に導入され、ポリペプチドが宿主細胞において発現される。ポリペプチドは次いで、標準のタンパク質精製技術を用いて適切な精製スキームにより細胞から単離され得る。
【００６１】
一般に、本発明のポリペプチドは当該分野で認識された方法を用いたSDS-PAGEゲルまたは分子ふるいゲル濾過カラムにおける分子量マーカーとして使用され得る。本発明のポリペプチドは抗体の惹起のためにまたは免疫応答を誘発するために使用され得る。該ポリペプチドはまた、生物の体液中でそれが結合するポリペプチドまたは分子 (例えばレセプターまたはリガンド) のレベルを量的に決定するためのアッセイにおける試薬、例えば標識試薬としても使用され得る。該ポリペプチドはまた、対応するポリペプチドが優先的に組織分化の間に構成的に、または疾患状態のいずれかで発現される、細胞または組織のためのマーカーとしても使用され得る。該ポリペプチドは例えば、相互作用トラップアッセイなどで対応する結合剤 (例えばレセプターまたはリガンド) を単離するために、また結合相互作用のペプチドまたは低分子アンタゴニストまたはアゴニストをスクリーニングするために使用され得る。
【００６２】
本発明の抗体
遺伝子産物の１つの型を特異的に結合するが他の遺伝子産物の型は結合しないポリクローナルおよび/またはモノクローナル抗体もまた提供される。１つの多型部位または複数の多型部位を含むバリアントまたは参照遺伝子産物のいずれかの部分を結合する抗体もまた提供される。本発明は、例えば配列番号: 16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、のいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列またはその部分を有する、または表１に示された多型の少なくとも１つを任意に含み得る配列番号: 1の全てまたは部分を含む核酸分子 (例えば、配列番号: 16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36または別のアイソフォームまたはスプライシングバリアントもしくはその部分のいずれか１つ) によりコードされたアミノ酸配列を有する、本発明のポリペプチドおよびポリペプチド断片に対する抗体を提供する。本明細書中で使用される用語「抗体」とは、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫的に活性な部分、すなわち、抗原を特異的に結合する抗原結合部位を含む分子のことを言う。本発明のポリペプチドに特異的に結合する分子は、そのポリペプチドまたはその断片に結合する分子であるが、実質的に試料 (例えば天然にポリペプチドを含む生物学的試料) 中の他の分子は結合しない。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性のある部分の例としては、ペプシンなどの酵素で抗体を処理することにより生成され得るF(ab)およびF(ab')2断片が挙げられる。本発明は、本発明のポリペプチドに結合するポリクローナルおよびモノクローナル抗体を提供する。用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、本明細書中で使用する場合、本発明のポリペプチドの特定のエピトープとの免疫反応が可能である免疫源結合部位の１つの種のみを含む抗体分子の集合を言う。モノクローナル抗体組成物は従って典型的に、それと免疫反応する本発明の特定のポリペプチドに対する単一結合アフィニティーを表す。
【００６３】
ポリクローナル抗体は上記の通り、適切な被験体を望ましい免疫源、例えば、本発明のポリペプチドまたはその断片で免疫することにより調製され得る。免疫された被験体における抗体価は、固定されたポリペプチドを用いた酵素免疫測定法 (ELISA) などの標準技術を用いて経時的にモニターされ得る。所望の場合は、ポリペプチドに対して方向付けられた抗体分子は哺乳動物から (例えば、血液から) 単離され、さらにIgG画分を得るためプロテインAクロマトグラフィーなどの周知技術によって精製され得る。免疫後の適切な時間において、例えば抗体価が一番高い時に、抗体産生細胞は被験体から得られ、初めにKohlerおよびMilstein (1975) Nature, 256:495-497に記載されたハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術 (Kozborら (1983) Immunol. Today, 4:72)、EBV-ハイブリドーマ技術 (Coleら (1985), Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96) またはトリオマ (trioma) 技術などの標準技術によりモノクローナル抗体を調製するために使用され得る。ハイブリドーマを産生するための技術は周知である (一般的に、Current Protocols in Immunology (1994) Coliganら (eds.) John Wiley＆Sons, Inc., New York, NY)。端的に言えば、不死化細胞系 (典型的にはミエローマ) は、上記の免疫源で免疫された哺乳動物由来のリンパ球 (典型的には脾臓細胞) に融合され、生じたハイブリドーマ細胞の培養上清は本発明のポリペプチドを結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定するためにスクリーニングされる。
【００６４】
リンパ球と不死化細胞系の融合のための多くの周知プロトコルのうち任意のものを、本発明のポリペプチドに対する抗体を精製する目的のために適用し得る (例えば、Current Protocols in Immunology, 前出; Galfreら (1977) Nature, 266:55052; R.H. Kenneth, in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980); および Lerner (1981) Yale J. Biol. Med., 54:387-402を参照のこと)。さらに当業者は、それもまた有用であるかかる方法の多くのバリエーションがあることを認識する。
【００６５】
モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマの調製に代わり、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、それによりポリペプチドを結合する免疫グロブリンライブラリメンバーを単離するためのポリペプチドを用いて組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリ (例えば、抗体ファージディスプレイライブラリ) をスクリーニングすることにより同定および単離され得る。ファージディスプレイライブラリを生成しスクリーニングするためのキットは市販されている (例えば、Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, カタログ番号. 27-9400-01; およびStratagene  SurfZAPTM  Phage  Display Kit、カタログ番号. 240612)。更に、抗体ディスプレイライブラリの生成およびスクリーニングにおける使用のために特に反応性のよい方法および試薬の例は、例えば、米国特許第5,223,409号; PCT公開公報 WO92/18619; PCT公開公報 WO91/17271; PCT公開公報 WO92/20791; PCT公開公報 WO92/15679; PCT公開公報 WO93/01288; PCT公開公報 WO92/01047; PCT公開公報 WO92/09690 ; PCT公開公報; 90/02809; Fuchsら(1991) Bio/Technology, 9:1370-1372; Hayら (1992) Hum. Antibod. Hybridomas, 3:81-85; Huseら (1989) Science, 246:1275-1281; Griffithsら (1993) EMBO J., 12:725-734に見出され得る。
【００６６】
更に、標準組換えDNA技術を使用して作製され得るヒト部分および非ヒト部分の両方を含むキメラ化およびヒト化モノクローナル抗体などの組換え抗体は本発明の範囲内である。かかるキメラ化およびヒト化モノクローナル抗体は当該分野で公知である組換えDNA技術により産生され得る。
【００６７】
本発明はまた、ヒト抗体をカバーすると意図される。産生、単離、精製および使用のためのこれらの方法は、標準方法を使用する当業者に公知である。
【００６８】
一般に、本発明の抗体 (例えばモノクローナル抗体) はアフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降などの標準技術により本発明のポリペプチドを単離するために使用され得る。ポリペプチド特異的抗体は、細胞由来の天然ポリペプチドおよび宿主細胞において発現した組換え的産生ポリペプチドの精製を容易にし得る。更に、本発明のポリペプチドに特異的な抗体は、ポリペプチドの存在量および発現パターンを評価する目的でポリペプチド (例えば、細胞溶解物、細胞上清、または組織試料における) を検出するために使用され得る。抗体は臨床試験手順の一部として、組織におけるタンパク質レベルをモニターするため、例えば与えられた処置養生法 の効力を決定するために、診断的に使用され得る。検出可能な基質に抗体を結合させることによって、検出は容易になり得る。検出可能な基質の例としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる 適切なプロステリック群複合体の例としてはストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチンが挙げられ; 適切な蛍光物質の例としてはウンベリフェロン、フルオルセイン、フルオルセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオルセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが挙げられ; 発光物質の例としてはルミノールが挙げられ; 生物発光物質の例としてはルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびアクオリンが挙げられ; ならびに適した放射性物質の例としては125I, 131I, 35Sまたは3Hが挙げられる。
【００６９】
本発明の診断アッセイおよびスクリーニングアッセイ
本発明はまた、個体におけるPAOD1遺伝子または遺伝子産物の存在に関連した末梢動脈閉塞疾患の診断における診断方法または補助方法に関する。診断アッセイはPAOD1遺伝子発現を評価するためにまたは本発明のPAOD1ポリペプチドの活性を評価するために設計され得る。１つの態様において、本文脈における生物学的試料 (例えば、血液、血清、細胞、組織)のアッセイは、それにより個体が末梢動脈閉塞疾患に冒されているかどうか、または末梢動脈閉塞疾患を発症する危険性がある (素因または感受性がある) かどうかを決定するために使用される。本発明はまた、個体が末梢動脈閉塞疾患の発症に対して感受性があるかどうかを決定するための予後 (予測) アッセイを提供する。例えば、核酸における改変は生物学的試料においてアッセイされ得る。かかるアッセイは、それにより末梢動脈閉塞疾患に関連した症状の開始に先立って予防的に個体を処置するために、予後または予測目的に使用され得る。本発明の別の局面は、本発明の核酸発現またはポリペプチドの活性における薬剤 (例えば、薬物、化合物または他の薬剤) の影響をモニターするためのアッセイ、ならびにPAOD1ポリペプチドに結合する薬剤の同定のためのアッセイに関する。これらのアッセイおよび他のアッセイならびに薬剤を更に詳細に以下のセクションに記載する。
【００７０】
診断アッセイ
本明細書中に記載された核酸、プローブ、プライマー、ポリペプチドおよび抗体は、末梢動脈閉塞疾患に対する感受性の診断方法において、また末梢動脈閉塞疾患に対する感受性の診断のための有用なキットにおいて使用され得る。
【００７１】
１つの態様において、PAOD1核酸に関連する末梢動脈閉塞状態またはPAOD1核酸に関連する末梢動脈閉塞状態に対する感受性の診断に有用なキットは、表１において同定された１つ以上のSNPを含むプライマーを包含する。
【００７２】
本発明の１つの態様において、末梢動脈閉塞疾患に対する感受性の診断は、本明細書中に記載された通りPAOD1における多型を検出することにより行われる。多型はPAOD1における、フレームシフト変異を生じる単一ヌクレオチドまたは１より多いヌクレオチドの挿入または欠失;コードされたアミノ酸における変化を生じる少なくとも１つのヌクレオチドの変化;早期停止コドンの生成を生じる少なくとも１つのヌクレオチドの変化;ヌクレオチドによりコードされた１以上のアミノ酸の欠失を生じるいくつかのヌクレオチドの欠失;遺伝子のコーディング配列の妨害を生じる、不均等な組換えまたは遺伝子転換などの1つまたはいくつかのヌクレオチドの挿入; 全てのまたは一部の核酸の重複; 全てのまたは一部の遺伝子の転位; あるいは、全てのまたは一部の遺伝子の再配列などの変化であり得る。１より多いかかる変化が単一遺伝子に存在し得る。かかる配列変化はPAOD1核酸によりコードされたポリペプチドにおける差異を引き起こす。例えば差異がフレームシフト変化である場合、フレームシフトはコードされたアミノ酸における変化を生じ得、および/または切断されたポリペプチド生成を引き起こす早期停止コドンの生成を生じ得る。
【００７３】
あるいは、末梢動脈閉塞疾患に対する感受性に関連した多型は１つ以上のヌクレオチドにおける同義変化 (すなわち、PAOD1核酸によりコードされるポリペプチドに変化を生じない変化) であり得る。かかる多型はスブライシング部位を改変させ得、mRNAの安定性または輸送に影響を与え、あるいは一方で、遺伝子の転写または翻訳に影響を与える。上記の任意の改変を有するPAOD1核酸は、本明細書中で「改変核酸」と呼ばれる。
【００７４】
末梢動脈閉塞疾患に対する感受性を診断する第一の方法において、サザン分析、ノーザン分析、またはインサイチュハイブリダイゼーションなどのハイブリダイゼーション方法が使用され得る (Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.ら, eds., John Wiley & Sons (1999年中の全ての補完物を含む)を参照のこと)。例えば、ゲノムDNA、RNA、またはcDNAの試験被験体 (「試験試料」) 由来の生物学的試料は、末梢動脈閉塞疾患を有する疑いのある、末梢動脈閉塞疾患に対して感受性がある、または末梢動脈閉塞疾患の素因性を有する、あるいは末梢動脈閉塞疾患に対して欠陥を保有する個体 (「試験個体」) から得られる。個体は成体、子供、または胎児であり得る。試験試料はゲノムDNAを含む血液試料、羊水の試料、脳脊髄液の試料、あるいは皮膚、筋肉、口内または結膜の粘膜、胎盤、胃腸管または他の組織由来の組織サンプルなどの任意の供給源由来であり得る。胎児細胞または組織由来のDNAの試験試料は、羊水穿刺または絨毛生検などの適切な方法により得られ得る。DNA、RNAまたはcDNA試料は次いでPAOD1において多型が存在するかどうかを決定するため、および/またはPAOD1にコードされたどのスプライシングバリアントが存在しているかを決定するために試験される。多型またはスプライシングバリアントの存在は、核酸プローブに対するゲノムDNA、RNA、またはcDNAにおける遺伝子のハイプリダイゼーションにより示され得る。本明細書中で使用される「核酸プローブ」は、DNAプローブまたはRNAプローブであり得; 核酸プローブはPAOD1における少なくとも１つの多型を含み得るか、PAOD1の特定のスプライシングバリアントをコードする核酸を含み得る。プローブは上記の任意の核酸分子 (例えば遺伝子または核酸、断片、遺伝子を含むベクター、プローブまたはプライマーなど) であり得る。
【００７５】
末梢動脈閉塞疾患に対する感受性を診断するために、ハイブリダイゼーション試料を、少なくとも１つの核酸プローブと共にPAOD1を含む試験試料に接触させることにより形成した。mRNAまたはゲノムDNAを検出するための好ましいプローブは、本明細書中に記載されたmRNAまたはゲノムDNA配列にハイブリダイズすることができる標識核酸プローブである。核酸プローブは、例えば、少なくとも15、30、50、100、250または500ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドおよびストリンジェントな条件下で適切なmRNAまたはゲノムDNAに対して特異的にハイブリダイズするのに充分なオリゴヌクレオチドなどの、完全長核酸分子またはその部分であり得る。例えば、核酸プローブは表１に示される少なくとも１つの多型を任意に含み得る配列番号: １の全てまたは部分、またはその相補体もしくはその部分であり得; あるいは配列番号: 16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36の任意の１つの部分をコードする核酸であり得る。本発明の診断アッセイに使用するための他の適切なプローブは、上に記載されている (例えば「本発明の核酸」の見出しの下に記載されているプローブおよびプライマーを参照のこと)。
【００７６】
ハイブリダイゼーション試料は核酸プローブのPAOD1への特異的なハイブリダイゼーションを許容するのに充分な条件下で維持される。本明細書中で使用される「特異的なハイブリダイゼーション」は正確なハイブリダイゼーションを示す (例えばミスマッチのない)。特異的なハイブリダイゼーションは、例えば上記のような高いストリンジェンシー条件下または中程度のストリンジェンシー条件下で実行され得る。特に好ましい態様において、特異的なハイブリダイゼーションのためのハイブリダイゼーション条件は高いストリンジェンシーである。
【００７７】
特異的なハイブリダイゼーションが存在する場合は、次いで標準的方法を用いて検出される。特異的なハイブリダイゼーションが核酸プローブと試験試料におけるPAOD1との間に生じた場合、PAOD1は核酸プローブに存在する多型を有するか、またはスプライシングバリアントである。１より多い核酸プローブは本方法において同時に使用され得る。任意の１つの核酸プローブの特異的なハイブリダイゼーションは、PAOD1における多型またはPAOD1をコードする特定のスプライシングバリアントの存在を示し、従って末梢動脈閉塞疾患に対する感受性の診断を示す。
【００７８】
ノーザン分析 (Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, Fら, eds., John Wiley & Sons, 前出) において、上記のハイブリダイゼーション方法は末梢動脈閉塞疾患に対する感受性に関連した多型または特定のスプライシングバリアントの存在を同定するために使用される。ノーザン分析のために、RNAの試験試料は適切な手段により個体から得られる。上記のような核酸プローブの個体由来のRNAに対する特異的なハイブリダイゼーションは、PAOD1における多型、またはPAOD1によりコードされた特定のスプライシングバリアントの存在を示し、従って末梢動脈閉塞疾患に対する感受性の診断を示す。
【００７９】
核酸プローブの使用の代表的な例としては、例えば、米国特許第5,288,611号および第4,851,330号を参照のこと。
【００８０】
あるいは、上記のハイブリダイゼーション方法において、核酸プローブのかわりにペプチド核酸 (PNA) プローブが使用され得る。PNAはメチレンカルボニルリンカーを介してグリシン窒素に結合した有機塩基 (A、G、C、TまたはU) と共に、N-(2-アミノエチル)グリシンユニットなどのペプチド様無機バックボーンを有するDNA模倣物である (例えば、Nielsen, P.E.ら, Bioconjugate Chemistry, 1994, 5, American Chemical Society, p.1 (1994) を参照のこと)。PNAプローブは末梢動脈閉塞疾患に対する感受性に関連した多型を有する遺伝子に特異的にハイブリダイズするように設計され得る。PNAプローブのPAOD1へのハイブリダイゼーションは、末梢動脈閉塞疾患に対する感受性の診断を示す。
【００８１】
本発明の別の方法において、遺伝子内の変異または多型が制限部位の創造または除去を生じる場合、制限消化による変異分析は変異遺伝子または多型を含む遺伝子を検出するために使用され得る。ゲノムDNAを含む試験試料は個体から得られる。ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) は、試験個体由来のゲノムDNAの試験試料において、PAOD1 (および必要であれば、フランキング配列) を増幅するために使用され得る。RFLP分析は記載の通りに行われる (Current Protocols in Molecular Biology, 前出を参照のこと)。関連性のあるDNA断片の消化パターンは、PAOD1における変異または多型の存在または非存在を示し、従って末梢動脈閉塞疾患に対する感受性の存在または非存在も示す。
【００８２】
配列分析はまた、PAOD1における特異的な多型を検出するために使用され得る。DNAまたはRNAの試験試料は、試験個体から得られる。PCRまたは他の適切な方法は、遺伝子、および/または所望の場合はそのフランキング配列を増幅するために使用され得る。PAOD1の配列もしくは該遺伝子の断片、またはcDNAもしくはcDNAの断片、またはmRNAもしくはmRNAの断片は標準手法を用いて決定される。遺伝子、遺伝子断片、cDNA、cDNA断片、mRNA、またはmRNA断片の配列は、該遺伝子、cDNA (例えば、表１に示される少なくとも１つの多型を任意に含み得る配列番号: 1、または配列番号: 16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36の任意の１つをコードする核酸配列もしくはその断片)、またはmRNAの公知核酸配列と適切に比較される。PAOD1における多型の存在は、個体が末梢動脈閉塞疾患に対して感受性を有することを示す。
【００８３】
アレル特異的オリゴヌクレオチドはまた、増幅されたオリゴヌクレオチドの対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド (ASO) プローブとのドットブロットハイブリダイゼーションの使用を介してPAOD1における多型の存在を検出するために使用され得る (例えば、Saiki, R.ら, (1986), Nature (London) 324:163-166 を参照のこと)。「対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド」 (本明細書中ではまた、「対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブ」といわれる) は、特異的にPAOD1にハイブリダイズし、末梢動脈閉塞疾患に対する感受性に関連した多型を含むおよそ10〜50塩基対、好ましくはおよそ15〜30塩基対のオリゴヌクレオチドである。PAOD1における特定の多型に対して特異的な対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブは、標準技術を用いて調製され得る (Current Protocols in Molecular Biology, 前出 を参照のこと)。末梢動脈閉塞疾患に対する感受性に関連した遺伝子における多型を同定するために、DNAの試験試料が個体から得られる。PCRはPAOD1の全てまたは断片、およびそのフランキング配列を増幅するために使用され得る。増幅されたPAOD1 (または該遺伝子の断片) を含むDNAは標準方法 (Current Protocols in Molecular Biology, 前出) を用いてドットブロットされ、そのブロットはオリゴヌクレオチドプローブと接触される。増幅されたPAOD1へのプローブの特異的ハイブリダイゼーションの存在が次いで検出される。対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブの個体由来のDNAへの特異的なハイブリダイゼーションは、PAOD1における多型を示し、従って末梢動脈閉塞疾患に対する感受性を示す。
【００８４】
本発明は、一塩基多型を含む遺伝子または核酸の参照または異なる対立遺伝子、あるいはそれの相補体にハイブリダイズする、対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドをさらに提供する。これらのオリゴヌクレオチドはプローブまたはプライマーになりえる。
【００８５】
対立遺伝子に特異的なプライマーは、多型をオーバーラップさせる標的DNA上の部位へハイブリダイズし、プライマーが完全な相補性を示す対立形質の増幅を単に促進する。 ギブス（Gibbs）, Nucleic Acid Res.17, 2427-2448 (1989)を参照。このプライマーは第２のプライマーと共に使用され、それは末端の部位でハイブリダイズする。増幅は2つのプライマーから生じ、検出できる産物が得られ、それは、特別の対立形質が存在することを示す。対照は、次の1対のプライマーで通常行なわれる。そのうちの1つは多型性の部位で1塩基のミスマッチを示し、他方は末端の部位に対して完全な相補性を示す。1塩基ミスマッチは増幅を防ぎ、また、検出できる産物は形成されない。ミスマッチが多型と提携した（aligned)オリゴヌクレオチドの3'-大部分の位置に含まれている場合、この位置がプライマーからの伸長を最も不安定にしているので、前記方法は最もうまく作用する(例えば、WO 93/22456参照)。
【００８６】
ロックされた核酸(LNA)のようなアナログの付加で、プライマーとプローブのサイズはわずか8つの塩基に減らすことができる。LNAは二環性のDNAアナログの新規なクラスであり、フラノース環中の2'位および4'位が、O-メチレン基(オキシ−LNA)、S−メチレン基(チオ-LNA)、またはアミノメチレン基(アミノ−LNA)部分によって連結される。これらのLNAバリアントのすべてに共通のことは、相補的な核酸への親和性(それはDNAアナログについて報告された中で最も高い)である。例えば、特にオキシ−LNAのノナマー（nonamer）はすべて、相補的DNAまたはRNAとの複合体の状態にある場合は、それぞれ64℃と74℃の融解温度を持つと示された（対応するDNA ノナマー（nonamer）についてのDNAおよびRNAの両方に対しての28℃とは対照的に）。LNAモノマーが、標準DNAまたはRNAモノマーと結合して使用される場合、Tmの実質的増加も得られる。プライマーとプローブについては、LNAモノマーがどこに含まれているか(例えば、3'末端、5'末端、あるいは中間で)によって、Tmは相当に増加されるかもしれない。
【００８７】
別の態様では、個体からの標的核酸配列セグメントに相補的な、オリゴヌクレオチド・プローブのアレイは、PAOD1の多型を同定するために使用することができる。例えば、1つの態様では、オリゴヌクレオチドアレイを使用することができる。オリゴヌクレオチドアレイは、典型的には異なる既知の位置の基質の表面に結合される複数の異なるオリゴヌクレオチド・プローブを含む。「Genechips.TM．」でも記載された、これらのオリゴヌクレオチドアレイは、当該分野において一般的に記載されている（たとえば、米国特許第5,143,854号およびPCT特許公開第WO 90/15070号および92/10092号）。これらのアレイは一般に機械的な合成方法または光指向合成方法を使用して生産することができ、これは、写真石版術の方法および固相オリゴヌクレオチド合成方法の組み合わせを組み込んでいる。フォーダー（Fodor）ら、Science、251:767-777(1991)、ピルング（Pirrung）ら、米国特許第5,143,854号(さらにPCT出願WO 90/15070号も参照)、およびフォーダー（Fodor）ら、PCT公開第WO 92/10092号および米国特許第5,424,186号を参照すること、それぞれの教示は参照により本明細書に援用される。機械的な合成方法を使用するこれらのアレイの合成用技術は、例えば米国特許第5,384,261号に記載される(その教示はすべて参照により本明細書中に援用される)。 別の例において、線状アレイが利用されうる。
【００８８】
一旦オリゴヌクレオチドアレイが調製されると、目的の核酸はアレイでハイブリダイズされ、多型についてスキャンされる。ハイブリダイゼーションとスキャンは、本明細書に記載の方法および、例えば、PCT出願第WO 92/10092号およびWO 95/11995号、並びに米国特許第5,424,186号に記載の方法により一般に行われ、それらの全ての教示は、参照によって本明細書中に組込まれる。1つ以上の以前に同定された多型性のマーカーを含んでいる標的核酸配列は、要するに周知の増幅技術(例えばPCR)によって増幅される。典型的には、これは、多型から上流および下流の両方の標的配列の二本鎖に相補的なプライマー配列の使用を含んでいる。非対称のPCR技術も使用されてもよい。次いで、一般にラベルを組込んでいる、増幅された標的は、適切な条件の下でアレイでハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーションの完了およびアレイの洗浄に際して、アレイは標的配列がハイブリダイズするアレイ上の位置を決定するためにスキャンされる。スキャンから得られたハイブリダイゼーションデータは、典型的に、アレイ上の位置の作用として蛍光強度の形をしている。
【００８９】
単一の検出ブロックによって(例えば単一の多型の検出について)主として記載されたが、アレイは多数の検出ブロックを含むことができ、したがって、多数の特定の多型を分析することができる。代わりの貼り合わせでは、検出ブロックが単一のアレイ内、あるいは、多数の個別のアレイにおいてグループ化されてもよいことは一般に理解されるだろう。その結果、変わる最適条件がアレイへの標的のハイブリダイゼーション中に使用されてもよい。例えば、ゲノムの配列のG-Cリッチな伸張内にあるこれらの多型の検出を、A-Tリッチなセグメントに生じるものとは別に提供することが多くの場合望ましいかもしれない。これは、各状況のハイブリダイゼーション条件の個別の最適化を可能にする。
【００９０】
多型の検出のためのオリゴヌクレオチドアレイの使用のさらなる記載は、米国特許第5,858,659号および第5,837,832号で、例えば見つけることができる。それらの全ての教示は、参照によって本明細書中に組込まれる。
【００９１】
核酸分析の他の方法は、PAOD1の多型、あるいはPAOD1によってコードされたスプライシングバリアントを発見するために使用することができる。代表的な方法は、以下のものを含んでいる:直接のマニュアル・シーケンシング(チャーチ（Church）およびギルバート（Gilbert）(1988)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1991-1995;サンガー（Sanger）、F.ら(1977)Proc. Natl. Acad. Sci.74:5463-5467;  ベービス（Beavis）ら、米国特許第5,288,644号);自動蛍光性シーケンシング; 一本鎖構成多型分析(SSCP);強制変性ゲル電気泳動法(CDGE); 変性勾配ゲル電気泳動(DGGE)(シェフィールド（Sheffield）, V.C. ら、 (19891) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:232-236)、可動性シフト分析(オリタ（Orita）、M.ら(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2766-2770)、制限酵素分析(フラベル（Flavell）ら(1978)Cell 15:25;  ゲーバー（Geever）ら(1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5081))(シェフィールド（Sheffield）、V.C.ら(19891) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5081);ヘテロデュプレックス分析; 化学的ミスマッチ開裂;(CMC)(コットンら(1985)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4397-4401);RNase保護アッセイ;(メイヤース（Myers）、R.M.ら(1985) Science230:1242); E. coli mutSタンパク質のようなヌクレオチド・ミスマッチを認識するポリペプチドの使用;例えば対立遺伝子に特有のPCR。
【００９２】
本発明の1つの態様において、PAOD1核酸に関連した疾患または病状(例えば末梢動脈閉塞疾患)の診断あるいはPAOD1核酸に関連した疾患または病状(例えば末梢動脈閉塞疾患)に対する感受性の診断も、定量的PCR(力学的熱サイクリング)による発現分析によってなすことができる。TaqMan（登録商標）を利用するこの技術は、多型の同定および患者が同型接合性か、ヘテロ接合性かの識別を可能にするために使用することができる。この技術は、PAOD1核酸によってコードされたポリペプチドまたは、PAOD1核酸によってコードされたスプライシングバリアントの発現または組成の変化の存在を評価することができる。さらに、物理的にあるいは機能的に異なるものとしてバリアントの発現を定量することができる。
【００９３】
本発明の別の態様においては、末梢動脈閉塞疾患への感受性の診断も酵素連結免疫吸着アッセイ(ELISA)、ウェスタンブロット、免疫沈降法と免疫蛍光法を含む様々な方法によって、PAOD1ポリペプチドの発現および／または組成の検討によりなすこともできる。個体由来の試験サンプルはPAOD1によってコードされたポリペプチドの発現の変化の存在、および/またはその組成の変化の存在、あるいはPAOD1によってコードされた特定のバリアントの存在について評価される。PAOD1によってコードされたポリペプチドの発現の変化は、例えば定量的ポリペプチド発現(すなわち、生産されたポリペプチドの量)の変化になりえる;PAOD1によってコードされたポリペプチドの組成の変化は、質的ポリペプチド発現(例えば突然変異体PAOD1ポリペプチド、または異なるスプライシングバリアントの発現)の変化である。好ましい態様では、末梢動脈閉塞疾患への感受性の診断は、PAOD1によってコードされた特定のスプライシングバリアント、あるいは特定のパターンのスプライシングバリアントを検出することによりなされる。
【００９４】
両方のそのような変化(定量的および質的)もまた存在することができる。ポリペプチド発現または組成の「変化」は、本明細書中で使用された場合、対照サンプル中のPAOD1によるポリペプチドの発現または組成と比較して、試験サンプル中の発現または組成の変化をいう。対照サンプルは、試験サンプルに相当し(例えば、同じタイプの細胞由来)、末梢動脈閉塞疾患に冒されていない個体由来のサンプルである。試験サンプル中のポリペプチドの発現または組成の変化は、対照サンプルと比較して、末梢動脈閉塞疾患への感受性を示す。同様に、対照サンプルと比較した場合、試験サンプル中の1つ以上の異なるスプライシングバリアントの存在、あるいは試験サンプル中の有意に異なる量の相違するスプライシングバリアントの存在は、末梢動脈閉塞疾患への感受性を示す。PAOD1によってコードされたポリペプチドの発現あるいは組成を試験する様々な手段は、分光学、比色定量、電気泳動、等電点電気泳動法、およびイムノブロッティング法(Current Protocols in Molecular Biology, 特に第10章を参照)のようなイムノアッセイ(例えばデビッド（David）ら、米国特許第4,376,110号)を含めて、使用することができる。例えば、1つの態様では、ポリペプチド(例えば上記されたような)に結合することができる抗体、好ましくは検出可能な標識を有する抗体が使用されうる。抗体はポリクローナル、あるいはより好ましくは、モノクローナルでありうる。完全な抗体、またはそれの断片(例えば、FabまたはF(ab')2)が使用されうる。用語「標識化」は、プローブまたは抗体に関してプローブまたは抗体に対して検出可能な物質を連結すること(つまり物理的に連結すること)による、プローブまたは抗体の直接的な標識化、ならびに直接的に標識化される別の試薬との反応によるプローブまたは抗体の間接的な標識化を、包含するように意図される。間接的標識化の例としては、蛍光的に標識化された二次抗体を使用する一次抗体の検出、および蛍光的に標識化されたストレプトアビジンで検出することができるようにビオチンを用いたDNAプローブの末端標識化を含んでいる。
【００９５】
上記のように変化PAOD1によってコードされたポリペプチドに特異的に結合する抗体、あるいは変化されていない核酸によってコードされたポリペプチドに特異的に結合する抗体、あるいはPAOD1によってコードされた特定のスプライシングバリアントに特異的に結合する抗体を使用するウェスタンブロット分析は、特定のスプライシングバリアント、あるいは多型性もしくは変化されたPAOD1によってコードされたポリペプチドの試験サンプル中の存在、あるいは特定のスプライシングバリアント、あるいは非多型性もしくは変化されていない酸によってコードされたポリペプチドの試験サンプル中の非存在を同定するために使用することができる。PAOD1核酸によってコードされた、特定のスプライシングバリアントが存在(あるいは非存在)する場合、多型性または変化された核酸によってコードされたポリペプチドの存在、または非多型性もしくは変化されていない核酸によってコードされたポリペプチドの非存在は、末梢動脈閉塞疾患への感受性についての診断である。
【００９６】
この方法の1つの態様では、試験サンプル中のPAOD1によってコードされたポリペプチドのレベルあるいは量は、対照サンプル中のPAOD1によってコードされたポリペプチドのレベルあるいは量と比較される。対照サンプル中のポリペプチドのレベルまたは量より高いまたはより低い、試験サンプル中のポリペプチドのレベルまたは量は（その違いが統計的に有意である）、PAOD1によってコードされたポリペプチドの発現の変化を示し、末梢動脈閉塞疾患への感受性についての診断である。あるいは、試験サンプル中のPAOD1によってコードされたポリペプチドの組成は、対照試中のPAOD1によってコードされたポリペプチドの組成量(例えば異なるスプライシングバリアントの存在)と比較される。試験サンプル中のポリペプチドの組成の違いは、対照サンプル中のポリペプチドの組成と比較した場合、末梢動脈閉塞疾患への感受性についての診断である。別の態様では、ポリペプチドのレベルまたは量、および組成の両方は、試験サンプル、および対照サンプル中で評価することができる。対照サンプルと比較された試験サンプル中のポリペプチドの量またはレベルの差;対照サンプルと比較された試験サンプル中の組成の差; あるいは、量またはレベルの差と組成の差との両方は、末梢動脈閉塞疾患への感受性の指標である。
【００９７】
本発明は、リスクのあるハプロタイプ(例えばPAOD1核酸を含むハプロタイプ)の同定により、個体における末梢動脈閉塞疾患への感受性の診断または同定のための方法にさらに関する。1つの態様では、リスクのあるハプロタイプは末梢動脈閉塞疾患の有意なリスクを与えるものである。1つの態様では、ハプロタイプに関連した有意性は、オッズ比によって測定される。さらなる態様では、有意性は百分率によって測定される。1つの態様では、有意なリスクは少なくとも2.2(約)のオッズ比として測定され、特に制限されていないが次のものを含む:1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8および1.9。さらなる態様では、少なくとも1.2のオッズ比は有意である。さらなる態様では、少なくとも約1.5のオッズ比は有意である。さらなる態様では、リスクの有意な増加は少なくとも約1.7であり、有意である。さらなる態様では、リスクの有意な増加は、少なくとも約20%であり、約25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%および98%を含むが、これらに限定されない。さらなる態様では、リスクの有意な増加は少なくとも約50%である。しかしながら、リスクが医学的に重要であるかどうかを同定することは、特異的疾患、ハプロタイプ、そしてしばしば、環境要因を含む様々な要因に依存してもよいことは理解される。
【００９８】
本発明は、個体における末梢動脈閉塞疾患あるいは末梢動脈閉塞疾患への感受性の診断方法にも関する。これは、健康な個体(対照)の中のその存在の頻度と比較して、末梢動脈閉塞疾患に感受性のある(冒された)個体中により頻繁に存在するPAOD1核酸中のリスクのあるハプロタイプ用スクリーニングを含み、そこではハプロタイプの存在は末梢動脈閉塞疾患あるいは末梢動脈閉塞疾患への感受性を示す。末梢動脈閉塞疾患に関係しているSNPおよび/またはマイクロサテライトマーカーの存在についての遺伝子型決定の標準的な技術を、蛍光性に基づいた技術(チェン（Chen）ら、Genome Res. 9、492(1999)、PCR、LCR、組み込み（Nested）PCRおよび核酸増幅用の他の技術のように使用することができる。好ましい態様では、前記方法は、末梢動脈閉塞疾患に関係しているPAOD1核酸中のSNPおよび/またはマイクロサテライトの存在または頻度を個体において評価することを含み、そこで、健康な対照個体と比較して過剰またはより高い頻度のSNPおよび/またはマイクロサテライトは、個体が末梢動脈閉塞疾患を有しているまたは末梢動脈閉塞疾患に感受性があることを示す。
【００９９】
診断の方法に有用なキット(例えば試薬キット)は、任意の本明細書に記載の方法に有用な成分を含み、例えば、本明細書中に記載した、ハイブリダイゼーション・プローブあるいはプライマー(例えば標識化されたプローブあるいはプライマー)、標識分子の検出用試薬、制限酵素(例えばRFLP分析用)、対立遺伝子特有オリゴヌクレオチド、変化された、あるいは変化されていない(天然の)PAOD1ポリペプチドに結合する抗体、PAOD1を含む核酸の増幅のための手段、あるいはPAOD1の核酸配列を分析するための、もしくはPAOD1ポリペプチドなどのアミノ酸配列を分析するための手段を含む。
【０１００】
スクリーニングアッセイおよびそれにより同定される試薬
本発明は、本発明の核酸にハイブリダイズするヌクレオチドの存在を同定するための方法、ならびに本発明の核酸によってコードされたポリペプチドの存在を同定するための方法(本明細書中では「スクリーニングアッセイ」とも呼ばれる)を提供する。1つの態様では、サンプル中における目的の核酸分子(例えば本発明の核酸と有意なホモロジーを有する核酸）の存在(あるいは非存在)は、サンプルを、本発明の核酸を含む核酸（たとえば、配列番号:１の配列を有する核酸、これは表1中で示される少なくとも1つの多型、またはその相補体を任意に含んでもよい、あるいは任意の配列番号:16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36を有するアミノ酸をコードする核酸、またはかかる核酸の断片もしくはバリアント）と上記のストリンジェントな条件下で接触させ、次いでハイブリダイゼーションの存在(あるいは非存在)のためのサンプルを評価することにより評価することができる。 好ましい態様では、高いストリンジェンシー条件は選択的なハイブリダイゼーションに適切な条件である。別の態様では、目的の核酸分子を含んでいるサンプルは、目的の核酸分子の一部に少なくとも、部分的に相補的な、隣接するヌクレオチド配列(例えば上記のプライマーまたはプローブ)を含んでいる核酸と接触され、接触したサンプルは、ハイブリダイゼーションの有無について評価される。 好ましい態様では、隣接するヌクレオチド配列を含んでいる核酸は、目的の核酸分子の一部に完全に相補的である。
【０１０１】
これらの任意の態様において、すべてまたは一部の目的の核酸は、ハイブリダイゼーションを行なう前に増幅に供することができる。
【０１０２】
別の態様では、サンプル中における、本発明のポリペプチドまたはその断片もしくはバリアントのような目的のポリペプチドの存在(あるいは非存在)は、サンプルと目的のポリペプチドに特異的にハイブリダイズする抗体（たとえば、上記のような抗体）とを接触させ、次いで、目的のポリペプチドへの抗体の結合の存在(あるいは非存在)についてサンプルを評価することにより評価することができる。
【０１０３】
別の態様では、本発明は、薬剤(例えば融合蛋白質、ポリペプチド、ペプチド模倣体、プロドラッグ、レセプター、結合剤、抗体、低分子、もしくは他の薬剤、または、本明細書中に記載したポリペプチドの活性を変更する(例えば増加または減少する)、もしくは他の場合には本明細書中のポリペプチドと相互作用するリボザイム)を同定する方法を提供する。例えば、そのような薬剤は本明細書中に記載されたポリペプチドに結合する薬剤(例えばPAOD1結合剤);例えば本発明のポリペプチドの活性に関して刺激的または阻害的作用を有する薬剤; あるいはPAOD1結合剤(例えばレセプターまたは他の結合剤)と相互作用する本発明のポリペプチドの能力を変える(例えば、増強する、あるいは阻害する)薬剤;あるいはPAOD1ポリペプチドの翻訳後プロセシングを変化させる薬剤(例えば細胞表面のような細胞の別の位置へそれが通常合成される場所からポリペプチドを導くために蛋白質分解を生ずるプロセシングを変化させる薬剤;より多くのポリペプチドが細胞から放出されるように蛋白質分解を生ずるプロセシングを変更する薬剤など)でありうる。
【０１０４】
1つの態様では、本発明は、アッセイによって同定可能な薬剤と同様に本明細書中に記載されたポリペプチド(またはその生物学的に活性な部分)に結合するまたはその活性を調整する候補または試験薬剤をスクリーニングするためのアッセイを提供する。試験薬剤は、次のものを含む当該分野において既知のコンビナトリアルライブラリー方法の中での多数のアプローチのいずれかを使用して得ることができる:生物学的ライブラリー; 立体的にアドレス可能な並列の固相または液相ライブラリー;デコンボリューションを要求する合成ライブラリー方法; 「1ビーズ1化合物」ライブラリー方法;およびアフィニティー・クロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー方法。他の4つのアプローチがポリペプチド、非ペプチド・オリゴマーまたは低分子ライブラリーの化合物に適用可能な一方で、生物学的ライブラリー・アプローチはポリペプチド・ライブラリーに制限されている(ラム（Lam）, K.S. (1997) Anticancer Drug Des., 12:145)。
【０１０５】
1つの態様において、PAOD1ポリペプチドの活性を変化させる薬剤を同定するために、PAOD1ポリペプチド(例えば配列番号16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36のうちの任意の1つ、またはPAOD1によってコードされた別のスプライシングバリアント)、あるいはその断片もしくはその誘導体(上に記載されたような)を含有または発現している細胞、細胞溶解物または溶液は、試験される薬剤と接触されうる; あるいはポリペプチドが、試験される薬剤と、直接接触されうる。PAOD1活性のレベル(量)は評価され(例えば、PAOD1活性のレベル(量)は、直接または間接的に測定される)、対照(すなわち、試験される薬剤の非存在下でのPAOD1ポリペプチドまたはその断片もしくは誘導体の活性レベル)での活性レベルと比較される。薬剤の非存在下での活性のレベルから、統計的に有意な量で薬剤の存在下での活性のレベルが異なる場合、薬剤はPAOD1ポリペプチドの活性を変化させる薬剤である。対照に関するPAOD1活性のレベルの増加は、薬剤がPAOD1活性を増強する(そのアゴニストである)薬剤であることを示す。同様に、対照に関するPAOD1活性のレベルの減少は、薬剤がPAOD1活性を抑制する(そのアンタゴニストである)薬剤であることを示す。別の態様において、試験される薬剤の存在下でのPAOD1ポリペプチドまたはその誘導体もしくはその断片の活性レベルは、以前に確立された対照レベルと比較される。統計的に有意な量で対照レベルと異なる薬剤の存在下での活性のレベルは、薬剤がPAOD1活性を変化させることを示す。
【０１０６】
本発明は、また、PAOD1遺伝子(例えばアンチセンス核酸、融合蛋白質、ポリペプチド、ペプチド模倣体、プロドラッグ、レセプター、結合剤、抗体、低分子または他の薬剤、あるいはリボザイム)の発現を変化させる薬剤の同定のためのアッセイに関し、それらは、遺伝子の発現(例えば転写または翻訳)を変化させる(例えば増加または減少する)、あるいはそれは他の場合には本明細書に記載の核酸、ならびにアッセイによって同定可能な薬剤と相互作用する。例えば、PAOD1ポリペプチドをコードしている核酸(例えばPAOD1遺伝子)を含んでいる溶液は、試験される薬剤と接触させることができる。前記溶液は、例えば、核酸を含んでいる細胞または核酸を含んでいる細胞溶解物を含むことができる;あるいは、前記溶液は、核酸の転写/翻訳に必要な要素を含む別の溶液になりえる。所望であれば、溶液中に懸濁されない細胞も使用することができる。PAOD1発現のレベルおよび/またはパターン(例えば、mRNAまたは発現されたタンパク質のレベルおよび/またはパターン、たとえば、異なるスプライシングバリアントのレベルおよび/またはパターン)は評価され、対照での発現のレベルおよび/またはパターン(すなわち、試験される薬剤の非存在下でのPAOD1発現のレベルおよび/またはパターン)と比較される。薬剤の存在下でのレベルおよび/またはパターンが、統計的に有意な量または方法で、薬剤の非存在下でのレベルおよび/またはパターンと異なる場合、この薬剤は、PAOD1の発現を変化させる薬剤である。PAOD1発現の増強は、薬剤がPAOD1活性のアゴニストであることを示す。同様に、PAOD1発現の阻害は、薬剤がPAOD1活性のアンタゴニストであることを示す。別の態様において、試験される薬剤の存在下におけるPAOD1ポリペプチド(例えば、異なるスプライシングバリアント)のレベルおよび/またはパターンは、以前に確立された対照のレベルおよび/またはパターンと比較される。統計的に有意な量または方法で対照のレベルおよび/またはパターンと異なる薬剤の存在下でのレベルおよび/またはパターンは、薬剤がPAOD1発現を変化させることを示す。
【０１０７】
本発明の別の態様においては、PAOD1遺伝子の発現を変化させるまたは他の場合には本明細書に記載の核酸と相互作用する薬剤は、レポーター遺伝子に作動可能に連結されたPAOD1遺伝子のプロモーター領域をコードする核酸を含んでいる細胞、細胞溶解物または溶液を使用して同定することができる。試験される薬剤との接触後、レポーター遺伝子の発現のレベル(例えばmRNAまたは発現されたタンパク質のレベル)は評価され、対照での発現のレベル(すなわち、試験される薬剤の非存在下でのレポーター遺伝子の発現レベル)と比較される。薬剤の存在下でのレベルが、薬剤の非存在下でのレベルと統計的に有意な量または方法で異なる場合、この薬剤は、PAOD1の発現を変化させる薬剤であり、PAOD1遺伝子プロモーターに作動可能に連結される遺伝子の発現を変化させるその能力によって示される。レポーターの発現の増強は、薬剤がPAOD1活性のアゴニストであることを示す。同様に、レポーターの発現の阻害は、薬剤がPAOD1活性のアンタゴニストであることを示す。別の態様において、試験される薬剤の存在下でのレポーターの発現のレベルは、以前に確立された対照レベルと比較される。統計的に有意な量または方法で対照レベルと異なる薬剤存在下でのレベルは、薬剤がPAOD1発現を変化させることを示す。
【０１０８】
PAOD1によってコードされた、異なるスプライシングバリアントの量を変化させる薬剤(例えば第１のスプライシングバリアントの活性を増強し、第２のスプライシングバリアントの活性を阻害する薬剤)、ならびに第１のスプライシングバリアントの活性のアゴニスト、および第２のスプライシングバリアントの活性のアンタゴニストである薬剤は、上記の方法を使用して、容易に同定することができる。
【０１０９】
本発明の他の態様では、アッセイはPAOD1結合剤に関するポリペプチド活性への試験薬剤の影響を評価するために使用することができる。例えば、PAOD1と相互作用する化合物(本明細書において、「PAOD1結合剤」と呼ばれ、レセプターなどの、PAOD1と相互作用するポリペプチドまたは他の分子でありえる)を発現する細胞は、PAOD1と試験薬剤の存在下で接触され、PAOD1とPAOD1結合剤の間の相互作用を変化させる試験薬剤の能力が決定される。かわりに、PAOD1結合剤を含んでいる細胞溶解物または溶液を使用することができる。PAOD1またはPAOD1結合剤に結合する薬剤は、PAOD1のPAOD1結合剤への結合、会合、または他の場合には相互作用する能力を干渉することまたは増強することにより相互作用を変化させることができる。試験薬剤がPAOD1またはPAOD1結合剤に結合する能力の決定は、例えば放射性同位体または酵素の標識と試験薬剤とを結合することにより遂行され得、ポリペプチドへの試験薬剤の結合は、125I、35S、14Cまたは3Hでの標識化の検出により直接または間接的に決定することができ、そして放射性同位体は、放射線放出（radioemmission）の直接のカウントまたはシンチレーションカウントによって検出される。あるいは、試験薬剤は、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼ、および適切な基質の産物への転換の決定によって検出される酵素の標識で酵素的に標識されることができる。それは、また任意の反応体の標識化のないポリペプチドと相互作用する試験薬剤の能力を決定する本発明の範囲内である。例えば、ミクロ物理メーター（microphysiometer）は、PAOD1、試験薬剤またはPAOD1結合剤いずれの標識化もなしに、試験薬剤の、PAOD1、またはPAOD1結合剤との相互作用を検出するために使用することができる。McConnell、H.M.ら(1992) Science、257:1906-1912。本明細書中に使用される場合、「ミクロ物理メーター」(例えばサイトセンサー（CytosensorTM)は、光アドレス可能電位差計センサー(LAPS)を使用して、細胞がその環境を酸性化する速度を測定する分析機器である。この酸性化速度の変化は、リガンドとポリペプチドの間の相互作用の指標として使用することができる。既知のPAOD1結合パートナーは、Gi/Go, Gs および Gpを含んでいる(ナンバ（Namba）ら, Nature, 365:166-170, 1993)。したがって、これらのレセプターは、末梢動脈閉塞疾患を処置するのに使用されるPAOD1レセプター・アゴニストまたは末梢動脈閉塞疾患を研究用のPAOD1レセプター・アンタゴニストである化合物についてスクリーニングするために使用することができる。本明細書中に提供される連関データは、初めて、末梢動脈閉塞疾患とのかかる関係を提供する。薬剤は、アデニレート（adynelate）シクラーゼ、MAPキナーゼ、 Rho(GTPアーゼ)ホスホリパーゼC、NFkBのように、下流遺伝子のシグナル経路および転写事象を制御するために順に使用することができるPAOD1レセプター活性化を制御するように設計することができる。
【０１１０】
本発明の別の態様では、アッセイは本明細書中に記載されるように、1つ以上のPAOD1ポリペプチドと相互作用するポリペプチドを同定するために使用することができる。例えば、フィールズ（Fields） およびソング（Song） (Fields, S. および Song, O., Nature 340:245-246 (1989))により記載されるような酵母ツーハイブリッド系は、1つ以上のPAOD1ポリペプチドと相互作用するポリペプチドを同定するために使用することができる。そのような酵母ツーハイブリッド系では、ベクターは、2つの機能的なドメイン(DNA結合ドメインおよび転写活性化ドメイン)を有する転写因子の順応性に基づいて構築される。2つのドメインが分離されるが互いと相互作用する2つの異なるタンパク質に融合される場合、転写活性化は達成することができ、特定のマーカー(例えば、His および Adeなどの栄養マーカー、またはlacZなどのカラーマーカー)の転写は、相互作用および転写活性化の存在を同定するために使用することができる。例えば、本発明の方法では、第１のベクター（それはDNA結合ドメインおよびまたPAOD1ポリペプチド、スプライシングバリアント、またはその断片もしくは誘導体をコードする核酸を含んでいる）が使用され、また、第２のベクター（転写活性化ドメインをコードする核酸、およびまたPAOD1ポリペプチド、スプライシングバリアント、またはその断片もしくは誘導体と潜在的に相互作用してもよいポリペプチドをコードする核酸を含んでいる）が使用される(例えばPAOD1ポリペプチド結合剤またはレセプター)。適切な条件(例えば、Clontech製のMatchmakerTMシステムなどで使用される交接条件）下で第１のベクターと第２のベクターを含有する酵母のインキュベーションは、目的のマーカーを発現するコロニーの識別を可能にする。これらのコロニーは、PAOD1ポリペプチドまたはその断片もしくは誘導体と相互作用するポリペプチドを同定するために検査することができる。上記のように、そのようなポリペプチドは、PAOD1ポリペプチドの発現の活性を変化させる薬剤として有用でありえる。
【０１１１】
本発明の上記のアッセイ方法の1つを越える態様において、非複合体化（uncomplexed）された形態の１つまたは両方のポリペプチドからの複合体化したもの（complexed）の分離を促進するため、ならびにアッセイの自動化を提供するために、PAOD1、PAOD1結合剤、またはアッセイの他の成分のいずれかを固体支持体上に固定することは望ましいかもしれない。試験薬剤の存在または非存在での試験薬剤のポリペプチドとの結合、またはポリペプチドの結合剤との相互作用は、反応物を含有するのに適当な任意の容器中で達成されうる。そのような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管およびマイクロ遠心分離管が含まれる。1つの態様では、融合蛋白質(例えばグルタチオン-S-トランスフェラーゼ融合蛋白質)が提供され、それはマトリックスまたは他の固体支持体へのPAOD1またはPAOD1結合剤の結合を可能にするドメインを付加する。
【０１１２】
別の態様では、本発明の核酸分子の発現のモジュレーターは、PAOD1をコードする核酸を含んでいる細胞、細胞溶解物または溶液が試験薬剤と接触され、細胞、細胞溶解物または溶液中における適切なmRNAまたはポリペプチド(例えばスプライシングバリアント)の発現が決定される方法において、同定される。試験薬剤の存在下での適切なmRNAまたはポリペプチドの発現のレベルは、試験薬剤の非存在下でのmRNAまたはポリペプチドの発現のレベルと比較される。次いで、試験薬剤は、この比較に基づいた発現のモジュレーターとして同定することができる。例えば、mRNAまたはポリペプチドの発現が試験薬剤の存在下においてその非存在下よりもより大きな(統計的に有意に大きな)場合、試験薬剤は、mRNAまたはポリペプチド発現の刺激物質またはエンハンサーであると同定される。代わりに、mRNAまたはポリペプチドの発現が試験薬剤の存在下においてその非存在下よりも少ない(統計的に有意に少ない)場合、試験薬剤はmRNAまたはポリペプチド発現のインヒビターとして同定される。細胞のmRNAまたはポリペプチドの発現レベルは、mRNAまたはポリペプチドの検出のために本明細書中に記載された方法によって決定することができる。
【０１１３】
本発明は、さらに上記スクリーニングアッセイによって同定された新規な薬剤に関する。従って、適切な動物モデルにおいて本明細書中に記載されるように同定された薬剤をさらに使用することは本発明の範囲内である。例えば、本明細書中に記載されるように同定された薬剤(例えば調整剤、アンチセンス核酸分子、特異的抗体またはポリペプチド結合剤である試験薬剤)は、そのような薬剤を用いる処理の効能、毒性または副作用を決定するために、動物モデルの中で使用することができる。あるいは、かかる薬剤の作用機構を決定するために、本明細書中に記載されるように同定された薬剤は、動物モデルの中で使用することができる。更に、本発明は、本明細書中に記載されるような処理用の上記スクリーニングアッセイによって同定された新規な薬剤の使用に関する。さらに、本明細書中に記載されるように同定された薬剤は、本明細書中に記載されるように同定された薬剤とポリペプチドまたは遺伝子とを接触する(あるいは、ポリペプチドまたは核酸を含む細胞とを接触する)ことにより、PAOD1によってコードされたポリペプチドの活性を変化させるため、またはPAOD1の発現を変化させるために使用することができる。
【０１１４】
医薬組成物
本発明は、また、本明細書中に記載された核酸、特に本明細書中に記載されたポリペプチドをコードするヌクレオチドを含む医薬組成物;本明細書中に記載されたポリペプチド(例えば、任意の配列番号:16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36)を含む医薬組成物; および/またはPAOD1によってコードされた、他のスプライシングバリアントを含む医薬組成物;および/または、本明細書中に記載されるようなPAOD1遺伝子発現またはPAOD1ポリペプチド活性を変化させる(例えば、増強するまたは阻害する)薬剤に関する。例えば、ポリペプチド、タンパク質(例えばPAOD1レセプター)、PAOD1遺伝子発現を変化させる薬剤、またはPAOD1結合剤または結合パートナー、断片、その融合蛋白質もしくはプロドラッグ、または本発明のヌクレオチドを含むヌクレオチドもしくは核酸構築物(ベクター)、またはPAOD1ポリペプチド活性を変化させる薬剤が、生理学的に許容される担体または賦形剤と配合されて、医薬組成物を調製することができる。担体と組成物は殺菌されうる。その配合は、投与様式に適するべきである。
【０１１５】
適切な薬学的に許容される担体は、限定はないが、水、食塩水(例えばNaCl)、生理食塩水、緩衝生理食塩水、アルコール、グリセロール、エタノール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロースまたはデンプンのような炭水化物、デキストロース、ステアリン酸マグネシウム、滑石、ケイ酸、粘着性のパラフィン、香油、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなど、ならびにそれの組み合わせが挙げられる。医薬品は、所望であれば、例えば活性剤と有害に反応しない、潤滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩類、バッファー、着色剤、風味剤および/または芳香剤などの、助剤と混合してもよい。
【０１１６】
前記組成物は、所望であれば、小さな量の湿潤剤または乳化剤、pH緩衝剤を含有することができる。前記組成物は、溶液、懸濁液、乳化物、タブレット、錠剤、カプセル、徐放性配合物または粉体になりえる。前記組成物は、従来のバインダー、およびトリグリセリドなどの担体と共に坐剤として配合することができる。経口配合は、医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような標準担体を含むことができる。
【０１１７】
これらの組成物の導入方法は、制限されないが、皮内、筋肉内、腹腔内、眼内、静脈内、皮下、局所的、口内および鼻腔内を含む。他の適切な導入方法は、また、遺伝子治療(下記のように)、再充電可能なデバイスまたは生物分解性デバイス、粒子加速デバイス(「遺伝子銃」)および遅放出重合体デバイスを含むことができる。本発明の医薬組成物は、他の薬剤を用いた組み合わせ治療の一部として投与することもできる。
【０１１８】
ヒトへの投与に適合した医薬組成物として、前記組成物は、日常的な手段に従って配合することができる。例えば、静脈内投与用組成物は、典型的には殺菌した等張の水性バッファー中の溶液である。必要なところで、前記組成物は、また注入の部位で苦痛を緩和するために可溶化剤と局所麻酔薬を含んでいてもよい。一般に、成分は、たとえば、活性剤の量を示すアンプルまたはサチェット（sachette）などの密封容器中の凍結乾燥された粉体または無水濃縮物として、単位用量の形で別々に、またはともに混合されるのいずれかで供給される。前記組成物が注入によって投与されることになっている場合、それは、殺菌した医薬等級の水、生理食塩水またはデキストロース/水を含んでいる注入ボトルで投薬することができる。前記組成物が注射によって投与される場合、成分が投与に先立って混合されるように、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。
【０１１９】
局所適用については、局所適用と適合する担体を含み、水より好ましくは大きな動粘性係数を有する半固形または固体形式に粘着性のスプレーできない（nonsprayable）形式は使用することができる。適切な配合物としては、限定はないが、溶液、懸濁液、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、粉剤、浣腸剤、ローション剤、ゾル、塗布薬、軟膏剤、エアゾール剤などが挙げられ、それは所望であれば、助剤（例えば、防腐剤、安定剤、湿潤剤、浸透圧に影響を及ぼすバッファーまたは塩類 ）で滅菌されまたはそれと混合される。薬剤は、化粧用の配合物に組み込まれてもよい。局所適用については、また、有効成分が好ましくは固体または液体の不活性キャリア物質と結合してスクイーズボトルに包装された、または気圧調節された揮発性の、通常ガス状の推進薬（propellant）(例えば加圧空気)と混ぜたスプレーすることができるエアゾール調製品である。
【０１２０】
中性のものまたは塩形態として、本明細書中に記載された薬剤を配合することができる。薬学的に許容される塩類としては、遊離アミノ基で形成されたもの（塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸など由来のものなど）、遊離カルボキシル基で形成されたもの（ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなど由来のものなど）が含まれる。
【０１２１】
薬剤は、治療上有効量で与えられる。特定の疾患または状態の処置に治療上有効であろう薬剤の量は、疾患または状態の性質に依存し、また、その薬剤は標準の臨床技術によって決定することができる。さらに、インビトロまたはインビボのアッセイは、最適の用量の範囲を同定するのを助けるために任意に使用されてもよい。配合物で使用される正確な用量は、また、投与経路、および末梢動脈閉塞疾患の徴候の重態に依存し、開業者および各患者の状況の判断に従って決定されるべきである。有効用量は、インビトロの実験系または動物モデルの実験系に由来した用量作用曲線から推定されてもよい。
【０１２２】
本発明は、また、本発明の医薬組成物の成分の1つ以上で満たされた1個以上の容器を含む製薬パックまたはキットを提供する。任意にそのような容器に付随するものは、調合薬または生物学的製剤(それらの掲示は機関による、ヒトの投与のための製造、使用または販売の許可を反映する)の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形式での掲示でありえる。パックまたはキットは、投与の様式、薬剤投与の順序(例えば別々に、連続してまたは同時に)などに関する情報で標識付けすることができる。パックまたはキットは、また治療を受けることを患者に思い出させるための手段を含んでいてもよい。パックまたはキットは、併用療法の一単位用量になりえる、あるいは、それは複数の単位用量でありえる。特に、薬剤は、分離され、単一のバイアルまたはタブレットの中に存在して、任意の組み合わせでともに混合することができる。ブリスターパックまたは他の分配手段に集められた薬剤が好まれる。本発明の目的について、単位用量は、各薬剤の個々の薬力学に依存し、FDAで認可された用量で標準時間コースにおいて投与される用量を意味することが意図される。
【０１２３】
治療方法
本発明は、またPAOD1治療薬を使用して、末梢動脈閉塞疾患または末梢動脈閉塞疾患への感受性についての処置(予防および/または治療)方法に関する。「PAOD1治療薬」は、本明細書中に記載のように、PAOD1ポリペプチド活性および/またはPAOD1遺伝子発現を変化させる(例えば、増強するまたは阻害する)薬剤である(例えば、PAOD1アゴニストまたはアンタゴニスト)。PAOD1治療薬は、様々な手段により、例えば、付加的なPAOD1ポリペプチドの提供によって、またはPAOD1遺伝子の転写または翻訳をアップレギュレートすることによって;PAOD1ポリペプチドの翻訳後プロセシングの変化によって; PAOD1スプライシングバリアントの転写の変化によって;あるいはPAOD1ポリペプチド活性(例えばPAOD1ポリペプチドに結合することによる)で干渉することによって、またはPAOD1遺伝子の転写または翻訳をダウンレギュレートすることによって、PAOD1ポリペプチド活性または遺伝子発現を変化させることができる。代表的なPAOD1治療薬は下記のものを含んでいる:本明細書中に記載の核酸またはその断片もしくは誘導体、特に本明細書中に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチドおよびそのような核酸(例えば遺伝子、cDNA、および/またはmRNA（PAOD1ポリペプチドをコードする核酸またはその活性断片もしくは誘導体、またはオリゴヌクレオチド；例えば、表1に示される少なくとも1つの多型を任意に含んでもよい配列番号:1またはイソ型またはその断片もしくは誘導体をコードする核酸)を含むベクター; 本明細書中に記載のポリペプチド(例えば、1つ以上の配列番号:16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、および/またはPAOD1によってコードされた、他のスプライシングバリアント、またはその断片もしくは誘導体);他のポリペプチド(例えば、PAOD1レセプター); PAOD1結合剤;ペプチド模倣物; その融合蛋白質またはプロドラッグ;抗体(例えば突然変異体PAOD1ポリペプチドに対する抗体、または突然変異でないPAOD1ポリペプチドに対する抗体、または上記のPAOD1によってコードされた特定のスプライシングバリアントに対する抗体); リボザイム;他の低分子; またPAOD1遺伝子発現またはポリペプチド活性を変化させる(例えば、増強するまたは阻害する)、あるいはPAOD1スプライシングバリアントの転写を調節する他の薬剤(例えば、発現されるスプライシングバリアントに影響する薬剤、または発現される各スプライシングバリアントの量に影響する薬剤)。1つを越えるPAOD1治療薬は、所望であれば、同時に使用することができる。
【０１２４】
核酸であるPAOD1治療剤は、末梢動脈閉塞性疾患の処置または末梢動脈閉塞疾患の罹病性の処置において使用される。本明細書で使用される用語「処置」は、疾患に関連する症状を緩和することだけでなく、該疾患の発症を予防または遅滞させること、および該疾患の症状の重篤度もしくは頻度を低下させることをいう。治療は、個体におけるPAOD1ポリペプチドの活性を改変(例えば、阻害または増強)、置換または補足するために計画される。例えば、PAOD1治療剤は、PAOD1遺伝子またはPAOD1の特定のスプライシングバリアントの発現もしくは利用可能性をアップレギュレートもしくは増加するため、または、逆にPAOD1遺伝子またはPAOD1の特定のスプライシングバリアントの発現もしくは利用可能性をダウンレギュレートもしくは低減するために投与され得る。天然PAOD1遺伝子または特定のスプライシングバリアントの発現または利用可能性のアップレギュレーションまたは増加は、欠陥遺伝子または別のスプライシングバリアントの発現または活性を妨害または補い得; 天然PAOD1遺伝子または特定のスプライシングバリアントの発現または利用可能性のダウンレギュレーションまたは低減は、欠陥遺伝子または該特定のスプライシングバリアントの発現または活性を最小限に抑制し得、それにより、欠陥遺伝子または該特定のスプライシングバリアントの影響を最小限にし得る。
【０１２５】
PAOD1治療剤は、治療有効量(すなわち、疾患に関連する症状を緩和、疾患の発症を予防もしくは遅滞および／または該疾患の症状の重篤度もしくは頻度を低下させることなどにより、該疾患を処置するのに充分な量)で投与される。特定の個体の障害または症状の処置において治療上有効である量は、その疾患の症状および重篤度に依存し、標準的な臨床技術により決定され得る。また、最適用量範囲を確認するのを補助するために、インビトロまたはインビボアッセイが任意に使用され得る。また、製剤において使用される正確な投薬量は、投与経路および疾患または障害の深刻さに依存し、担当医師の判断および各患者の事情に応じて決定されるべきである。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から得た用量応答曲線から外挿され得る。
【０１２６】
一態様において、本発明の核酸(例えば、表1に示す少なくとも１つの多型を任意に含有し得る、配列番号:1などの、PAOD1ポリペプチドをコードする核酸;あるいは、配列番号:16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36のいずれか１つをコードする核酸などの、PAOD1ポリペプチドまたはそのスプライシングバリアント、誘導体もしくは断片をコードする核酸)を、単独または上記のような医薬組成物において使用し得る。例えば、PAOD1またはPAOD1ポリペプチドをコードするcDNAは、単独で、またはベクター内に含有されて、細胞が天然PAOD1ポリペプチドを産生するように、(インビトロまたはインビボのいずれかで)細胞内に導入され得る。必要であれば、該遺伝子もしくはcDNAまたは該遺伝子もしくはcDNAを含有するベクターで形質転換された細胞を、前記疾患に罹患した個体内に導入（または再導入）し得る。したがって、自然状態では、天然PAOD1の発現および活性を欠くか、または変異型PAOD1の発現および活性を有するか、または疾患関連PAOD1スプライシングバリアントの発現を有する細胞を操作して、PAOD1ポリペプチドまたはPAOD1ポリペプチドの活性断片(もしくはPAOD1ポリペプチドの異なるバリアント)を発現させ得る。好ましい態様において、PAOD1ポリペプチドまたはその活性断片もしくは誘導体をコードする核酸は、ウイルスベクターなどの発現ベクター内に導入され得、ベクターは、動物の適切な細胞内に導入され得る。ウイルス導入系および非ウイルス導入系を含む他の遺伝子導入系を使用し得る。あるいはまた、リン酸カルシウム共同沈降、機械的技術(例えば、マイクロインジェクション); リポソームによる膜融合媒介性導入;または直接DNA取込みなどの非ウイルス遺伝子導入方法もまた使用し得る。
【０１２７】
あるいはまた、本発明の別の態様では、本発明の核酸;本発明の核酸に相補的な核酸;またはかかる核酸の一部(例えば、以下に記載のようなオリゴヌクレオチド)は、PAOD1のmRNAおよび／またはゲノムDNAに特異的にハイブリダイズする核酸(例えば、オリゴヌクレオチド)がインサイチューで投与または作製される「アンチセンス」療法において使用され得る。該mRNA および／またはDNAに特異的にハイブリダイズするアンチセンス核酸は、例えば、翻訳および／または転写を阻害することによりPAOD1ポリペプチドの発現を阻害する。アンチセンス核酸の結合は、従来の塩基対相補性、または、例えば、DNA二重鎖への結合の場合は、二重らせんコイルの主溝における特異的相互作用によるものであり得る。
【０１２８】
本発明のアンチセンス構築物は、例えば、上述したような発現プラスミドとして送達され得る。このプラスミドが細胞内で転写されると、PAOD1ポリペプチドをコードするmRNAおよび／またはDNAの一部に相補的なRNAが作製される。あるいはまた、アンチセンス構築物は、エキソビボで作製され、細胞内に導入されるオリゴヌクレオチドプローブであり得る;次いで、これは、PAOD1のmRNAおよび／またはゲノムDNAにハイブリダイズすることにより発現を阻害する。一態様において、オリゴヌクレオチドプローブは、内因性ヌクレアーゼ、例えばエキソヌクレアーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼに耐性である改変オリゴヌクレオチドであり、それにより、それらはインビボで安定となる。アンチセンスオリゴヌクレオチドとしての使用のための例示的な核酸分子は、DNAのホスホルアミデート、ホスホチオエートおよびメチルホスホネートアナログ(米国特許第5,176,996;同第5,264,564号;および同第5,256,775号も参照のこと)。さらにまた、アンチセンス療法に有用なオリゴマーを構築する一般的なアプローチは、例えば、Van der Krolら((1988) Biotechniques 6:958-976);およびSteinら( (1988) Cancer Res 48:2659-2668)によっても記載されている。アンチセンスDNAに関しては、翻訳開始部位由来のオリゴデオキシリボヌクレオチド、例えば、PAOD1配列の-10〜+10領域が好ましい。
【０１２９】
アンチセンス療法を行なうため、PAOD1をコードするmRNAに相補的なオリゴヌクレオチド(mRNA、cDNAまたはDNA)を設計する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、PAOD1 mRNA転写物に結合し、翻訳を抑制する。完全な相補性は、好ましいが、必要ではない。本明細書で使用される、RNAの一部に「相補的な」配列は、RNAとハイブリダイズできるのに充分な相補性を有し、安定な二重鎖を形成する配列を示し;二本鎖アンチセンス核酸の場合は、したがって二重鎖DNAの一本の鎖を試験すればよく、または、三重鎖の形成をアッセイしてもよい。ハイブリダイズできる能力は、先に詳細に記載したように、アンチセンス核酸の相補性の度合および長さの両方に依存する。一般に、ハイブリダイズする核酸は、長いほどRNAとの塩基ミスマッチを多く含み得、安定な二重らせん(または、場合によっては三重らせん)をなお形成し得る。当業者は、標準的な手順の使用により、許容範囲の程度のミスマッチを確認し得る。
【０１３０】
アンチセンス療法において使用されるオリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のDNA、RNAまたはそのキメラ混合物もしくは誘導体もしくは修飾体であり得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションなどを改善するために、塩基部分、糖部分またはリン酸骨格で修飾し得る。オリゴヌクレオチドは、ペプチド(例えば、インビボでの宿主細レセプターの標的化のため)、または細胞膜(例えば、Letsingerら(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6553-6556; Lemaitreら、(1987), Proc. Natl. Acad Sci. USA 84:648-652; PCT国際公開公報第W088/09810参照)もしくは血液脳関門(例えば、PCT国際公開公報第W089/10134参照)を透過する輸送を容易にする薬剤、またはハイブリダイゼーション誘導切断剤(例えば、Krolら(1988) BioTechniques 6:958-976参照)もしくはインターカレート剤(例えば、Zon, (1988), Pharm. Res. 5:539-549参照)などの他の付加基(appended group)を含み得る。この目的のため、オリゴヌクレオチドを別の分子(例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘導架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘導切断剤)に結合し得る。
【０１３１】
アンチセンス分子は、インビボでPAOD1を発現する細胞に送達される。多くの方法が、アンチセンスDNAまたはRNAを細胞に送達するために使用され得る;例えば、アンチセンス分子は、組織部位内に直接注入され得るか、または、所望の細胞に標的化するために設計された修飾アンチセンス分子(例えば、標的細胞表面上に発現されたレセプターまたは抗原に特異的に結合するペプチドまたは抗体に連結されたアンチセンス)を全身投与し得る。あるいはまた、好ましい態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドが強力なプロモーター(例えば、pol IIIまたはpol II)の制御下に配置された組換えDNA構築物が利用される。患者の標的細胞をトランスフェクトするためのかかる構築物の使用は、内因性PAOD1転写物と相補的塩基対を形成する一本鎖RNAの充分量の転写をもたらし、それにより、PAOD1 mRNAの翻訳が抑制される。例えば、ベクターを、細胞により取り込まれ、アンチセンスRNAの転写が指示されるようにインビボで導入し得る。かかるベクターは、所望のアンチセンスRNAが作製されるように転写され得る限り、エピソーム性が維持されるか、または染色体に組込まれ得る。かかるベクターは、当該技術分野において標準的な組換えDNA技術方法および上述のような組換えDNA技術方法により構築され得る。組織部位に直接導入され得る組換えDNA構築物を調製するために、例えば、プラスミド、コスミド、YACまたはウイルスベクターを使用し得る。あるいはまた、所望の組織に選択的に感染するウイルスベクターを使用し得るが、この場合、投与は別の経路（例えば、全身）により達成され得る。
【０１３２】
また、内因性PAOD1発現は、標的化相同組換え(例えば、Smithiesら(1985) Nature 317:230-234; Thomas & Capecchi (1987) Cell 51:503-512; Thompsonら(1989) Cell 5:313-321参照)を用い、PAOD1またはそのプロモーターを不活化または「ノックアウト」することにより低減させ得る。インビボでPAOD1を発現する細胞をトランスフェクトするため、例えば、内因性PAOD1(PAOD1のコード領域または調節領域のいずれか)に相同なDNAに隣接する変異型非機能性PAOD1(または完全に無関係なDNA配列)を、選択可能マーカーおよび／または陰性選択可能マーカーとともに、またはなしで使用し得る。標的化相同組換えによるDNA構築物の挿入は、PAOD1の不活化をもたらす。組換えDNA構築物は、上述のように、必要な部位に、直接投与され得るか、または適切なベクターを用いてインビボで標的化され得る。あるいはまた、非変異型PAOD1の発現は、類似の方法を用いて増加させ得る:非変異型機能性PAOD1(例えば、表1に示す少なくとも１つの多型を任意に含有し得る配列番号:1を有する遺伝子)を含有するDNA構築物、またはその一部を、変異型PAOD1の代わりに該細胞内に上述のようにして挿入するために、標的化相同組換えを使用し得る。別の態様において、細胞内に存在するものとは異なるPAOD1ポリペプチドバリアントをコードする核酸を含有するDNA構築物を挿入するために標的化相同組換えを使用し得る。
【０１３３】
あるいはまた、PAOD1の調節領域(すなわち、PAOD1プロモーターおよび／またはエンハンサー)に相補的なデオキシリボヌクレオチド配列を標的化することにより、内因性PAOD1発現を低減し、体内の標的細胞においてPAOD1の転写を抑制する三重らせん構造を形成し得る(一般的に、Helene, C. (1991) Anticancer Drug Des., 6(6):569-84; Helene, C.,ら(1992) Ann, N.Y. Acad. Sci., 660:27-36;およびMaher, L. J. (1992) Bioassays 14(12):807-15を参照)。同様に、本明細書に記載のアンチセンス構築物は、PAOD1タンパク質の１つの正常な生物学的活性を拮抗することにより、組織の操作、例えば、インビボおよびエキソビボの両方の組織培養物における組織分化において使用され得る。さらにまた、アンチセンス技術(例えば、アンチセンス分子のマイクロインジェクション、または、その転写物がPAOD1 mRNAまたは遺伝子配列に関してアンチセンスであるプラスミドでのトランスフェクション)を使用して、発生事象におけるPAOD1の役割、および成体組織におけるPAOD1の正常な細胞機能を調査し得る。かかる技術は、細胞培養において使用され得るが、トランスジェニック動物の作製においても使用され得る。
【０１３４】
本発明のさらに別の態様では、本明細書に記載の他のPAOD1治療剤もまた、末梢動脈閉塞疾患の処置または予防に使用され得る。このような治療剤は、上述のような組成物にて、または単独で送達され得る。それらは、全身に投与され得るか、または特定の組織に標的化され得る。治療剤は、例えば化学合成;組換え産生;インビボ産生(例えば、トランスジェニック動物、Meadeらへの米国特許第4,873,316号など)を含む種々の手段により作製され得、本明細書に記載のものなどの標準的な手段を用いて単離され得る。
【０１３５】
上記の処置方法の任意の組み合わせ(例えば、変異型PAOD1 mRNAを標的化するアンチセンス療法と組み合わせた非変異型PAOD1ポリペプチドの投与;PAOD1によりコードされる第２スプライシングを標的化するアンチセンス療法と組み合わせたPAOD1によりコードされる第１スプライシングバリアントの投与)も使用され得る。
【０１３６】
本発明を、以下の非限定的実施例により以下にさらに記載する。すべての刊行物の教示は参照により本明細書にそのまま取りこまれる。
【実施例】
【０１３７】
実施例1  PAOD1遺伝子の同定
材料および方法
集団および家系学
本研究は、アイスランドデータ保護委員会(Data Protection Commission of Iceland)およびアイスランド国立生命倫理委員会(National Bioethics Committee of Iceland)により承認された。すべての患者およびその近縁者からインフォームドコンセントを得、彼らのDNA試料を連鎖調査に使用した。1980〜1995年までのPAOD1患者の原集団ベースリストをアイスランドの大手病院の２つから得た。すべての患者は、血管造影を受け、85%が血管形成術および／または血管外科手術を受けたことがあった。外傷のために血管処置を受けた者は除外した。
【０１３８】
家系図の患者をクラスター化(cluster)するために、deCODE genetics, Inc.にて確立された包括的家系学データベースを使用した(Gulcher, J.R.,およびStefansson, K., Clin. Chem. Lab. Med. 36:523 (1998))。コンピュータ処理された家系学データベースの各バージョンは、本研究所に到着する前にアイスランドデータ保護委員会により可逆的に暗号化される(Gulcher, J.R., ら、Eur. J. Hum. Genet. 8:739 (2000))。データベースは患者リストを使用するが、入力の際に個人の識別は暗号化され、さかのぼった既定の数の世代内で入力リスト上の任意の構成員と相関する、データベース内のすべての祖先を見出すために帰納的アルゴリズムを使用する。次いで、クラスター機能が、入力リストの任意の２人以上の構成員に共通する祖先を検索する。
【０１３９】
マイクロサテライトマーカーおよび遺伝子型判定
フレームワークマッピングセットのためのマーカーの配列順および位置を、第8染色体上の３-マーカー推定逆位を除いてMarshfield遺伝子地図から得た(Jonsdottir, G.M. ら、Am. J. Hum. Genet. 67:332 (2000); Yu, A. ら、Am. J. Hum. Genet. 67:10 (2000); Giglio ら、Am. J. Hum. Genet., 68:874-83 (2001))。
【０１４０】
DNA試料を、ほぼ1000の蛍光標識プライマーを用いて遺伝子型判定した。マイクロサテライトスクリーニングセットを、一部、ABI Linkage Marker (v2) スクリーニングセットおよびABI Linkage Marker (v2)インターカレーティングセットを基にし、500を超える特注マーカーを組み合わせて開発した。すべてのマーカーを頑健性、スコアリングの容易さおよび4X多重PCR反応における効率について徹底的に試験した。各マーカーについて、同様のプロトコルにより、Perkin Elmer/Applied Biosystems 877 Integrated Catalyst ThermocyclerにてPCR増幅をセットアップし、実施し、プールした。使用した反応容量は5μlとし、各PCR反応について、20 ngのゲノムDNAを、2 pmolの各プライマー、0.25 U AmpliTaq Gold、0.2 mM dNTPおよび2.5 mM MgCl2(バッファーは製造業者により供給)の存在下で増幅した。使用したPCR条件は、95℃で10分間、次いで、94℃で15秒、55℃で30秒および72℃で1分間を37サイクルとした。PCR産物に内部サイズ標準を添加し、プールした物質を分離し、GENESCAN v3.0 ピーク呼出しソフトウェア(calling software)を用いてApplied Biosystems モデル 377 Sequencer にて検出した。自動蛍光シークエンサーからのDNA断片データに基づいて自動対立遺伝子呼出しを行なうTrueAlleleプログラムにより対立遺伝子を自動的に呼出した。このソフトウェアは自動的にレーンを追跡し、呼出すあらゆる遺伝子型の品質(quality)を評価する。TrueAllele は、スタッターデコンボルーション(stutter deconvolution)を使用し、PCRスタッター(「シャドウバンド(shadow band)」)をデータから数学的に除去する。例えば、米国特許第5,541,067号、同第5,580,728号、同第5,876,933号および同第6,054,268号参照。また、対立遺伝子を、プログラムDecodeGT(deCODE genetics, Iceland)により自動的に呼出し、これを用いて量に応じて分画し、呼出した遺伝子型を編集した(Palsson, B. ら、Genome Res. 9:1002-12 (1999))。少なくとも180のアイスランド人対照を遺伝子型判定し、対立遺伝子頻度を導いた。
【０１４１】
Decode-GTは、対立遺伝子呼出しプログラムTrueAllele (Cybergenetics, Inc.)の下流で作動する編集プログラムである。これは、データの手動編集に必要とされる時間の大部分を削減する、対立遺伝子呼出し品質制御に対するパラメトリックアプローチである。Decode-GTは、Windows NTのもとで実行されるPCプログラムであり、３つの主な機能を有する。第１は、品質測度(measure)にしたがって対立遺伝子呼出しをソートし、これを基にした電気泳動図を表示し得ることである。第２は、ゲルが正しく較正されるのを確実にするために、CEPH対照試料の対立遺伝子呼出しをチェックすることである。第３は、家系図情報を用いて結果に関する遺伝チェックを行なうことである。Decode-GTは、TrueAllele由来の総合結果ファイルを読み、データを、不良対立遺伝子呼出し、良好対立遺伝子呼出しおよび不明瞭対立遺伝子呼出しの３つのカテゴリーにソートし、ソートは、TrueAllele品質測度、ピーク高さおよびピークシフトに基づいている。目的は、ユーザーによる検査を必要とするのは不明瞭カテゴリーの呼出しのみとすることであり、それにより手動編集への依存性が低減される。
【０１４２】
連鎖解析のための統計学的方法
本明細書に記載の解析では、マルチポイント罹患単独対立遺伝子共有(affected-only allele-sharing)方法を、連鎖の証拠を評価するために使用した。血管造影図またはPAOD1手術を有しなかったすべての近縁者は「未知」状態を有するとみなした。すべての結果は、プログラム ALLEGRO (Gudbjartsson, D.F. ら、Nat. Genet. 25:12-3 (2000))を用いて得た。Spairs スコアリング機能(Whittemore, A.S.およびHalpern, J., Biometrics 50:118-27 (1994); Kruglyak, L. ら、Am. J. Hum. Genet. 58:1347-63 (1996))および指数的対立遺伝子共有モデル(Kong, A.およびCox, N.J., Am. J. Hum. Genet. 61:1179-88 (1997))を用い、意義のある(relevant)一自由度統計学を作製した。全体のスコアを得るために家族スコアを組み合わせる場合、家族に等しく重みづけする(weight)代わりにGENEHUNTERのデフォルト(Kruglyak, L. ら、Am. J. Hum. Genet. 58:1347-63 (1996))を、または罹患ペア(Affected pairs)に等しく重みづけする代わりに、対数目盛り２つの中間である重みづけスキームを使用した;家族重みづけは、２つのスキームの重みづけの相乗平均である。同一ではないが、重みづけスキームは、兄弟姉妹群のために作られたHodgeの重みづけスキーム(Hodge, S.E., Genet. Epidemiol. 1:109-22 (1984))の拡張としてのWeeksおよびLangeによるもの(Week, D.E.およびLange, K., Am. J. Hum. Genet. 42:315-26 (1988))と比較すると、同様の結果を与える傾向にある。P値を２つの異なる方法で計算し、有意差の小さい方を報告した。第１P値は、大サンプル理論に基づいて計算した; Zlr = v(2 loge (10) lod)は、無連鎖のヌル仮説(Kong, A.およびCox, N.J., Am. J. Hum. Genet. 61:1179-88 (1997))のもとで、おおむね、標準的な正規確率変数として分布される。少数サンプル挙動の懸念のため、観察されたlodスコアを、そのヌル仮説(Gudbjartsson, D.F. ら、Nat. Genet. 25:12-3 (2000))のもとでの完全データサンプリング分布と比較することにより、第２P値を計算した。データセットが、今回の場合のように、一握りより多い家族から構成される場合、これらの２つのP値は、非常に類似する傾向にある。結果が、資料に含まれる情報の忠実な反映であることを確実にするため、および連鎖結果を有意とみなすためには、P値が2x10-5 よりも小さいことが必要であっただけでなく(Lander, E.およびKruglyak, L., Nat. Genet. 11:241-7 (1995))、該領域内の情報量が少なくとも85%である必要があった。本研究における家族では、85%の情報量は、センチモルガン毎におよそ１マーカーのマーカー密度に相当した。本明細書における情報測度は以前に明示されており(Nicolae, D.L., 1999, Allele sharing models in gene mapping: a likelihood approach. A dissertation submitted to the faculty of the division of the physical sciences in candidacy for the degree of doctor of philosophy, University of Chicago, Chicago)、ALLEGROにおいて実施されている。この測度は、情報の古典的な測度(Dempster, A.P. ら、J. Roy. Statist. Soc. B39:1-38 (1977))と密接に関連しており、マーカー遺伝子型が完全に情報価値のない場合の０と、遺伝子型が罹患近縁者間の家系で共有される対立遺伝子の正確な量を決定する場合の１の間であるという特性を有する。
【０１４３】
ALLEGROは、一般的な家族について多くのマーカーを伴う正確なマルチポイント連鎖計算を可能にし、プログラムGENEHUNTER (Kruglyak, L., Daly, M.J., Reeve-Daly, M.P., Lander, E.S. (1996) Am. J. Hum. Genet. 58:1347-1363.)およびその後の改良版GENEHUNTER-PLUSに基づくものである。GENEHUNTERと同様、ALLEGROは隠しMarkovモデルを使用するが、Genehunterよりもかなり速い(典型的には20〜100倍)。より大きな家系図(典型的には20〜30%大きい)を許容する以外に、速度向上はシミュレーション研究に意義がある。ALLEGROは、GENEHUNTERおよびGENEHUNTER-PLUSの機能の大部分を有する。具体的には、ALLEGROは、スコアリング機能SpairsおよびSall、ハプロタイプの再構築、マーカー(観察された地図)間の推定組換えカウントおよびエントロピー情報に基づいて、マルチポイントパラメトリックlodスコア、NPLスコアおよび対立遺伝子共有lodスコアを計算する。X染色体はすべての計算においてサポートされる。
【０１４４】
SpairsおよびSallならびにエントロピー測度に加えて、ALLEGROは、他のスコアリング機能および情報測度をサポートする。他の利点は、改良された入力および出力ならびに追加費用がほとんどなしで多数の解析(異なるパラメトリックモデル、スコアリング機能および家族-重みづけスキームを用いる)を同時に実施可能なことである。また、実行時間の10〜30%の消費で、ALLEGROは、必要であれば、必要メモリーをGENEHUNTERと比べて20〜60倍削減するために、再計算またはディスクスワッピング(disk-swapping)を使用する。ALLEGROは、無連鎖または連鎖下の多遺伝子座マーカーデータをシミュレートし得る。無連鎖下のシミュレーションは、P値を計算する種々の方法の較正を検討するために使用し得る。特定家族のゲノム的調整P値およびマーカー密度が決定され得る。罹病性遺伝子に対する連鎖下では、ALLEGROは、観察された疾患表現型および既定の遺伝様式を条件とするマーカーデータをシミュレートする。これらのシミュレーションは、一群の家族の検出力、またはマーカー密度および欠損データの効果を評価するために使用され得る。また、それらは、パラメトリックおよび非-パラメトリック方法、種々のスコアリング機能および重みづけスキームならびにSNP対マイクロサテライトを比較するために使用され得る。
【０１４５】
有意な対立遺伝子共有lodスコアを得た後、この罹病性遺伝子座の寄与を理解するための試みにおいて、ある範囲のパラメトリックモデルをデータに当てはめた。パラメトリックモデルを当てはめる場合であっても、罹患単独解析は、個体が罹患しているか、または未知疾患状態を有するかのいずれかに分類される意味において行なった。その結果、浸透度の比のみ意義がある。ある範囲の単一遺伝子座優性、相加(additive)および同義性(multiplicative)モデル(Risch, N., Am. J. Hum. Genet. 46:229-41 (1990))を当てはめた。PAOD1のような複雑な疾患では、これらの単純モデルはいずれも厳密に正確ではない傾向にあり、遺伝子およびそのバリアントの効果は、リスク性バリアント（１つまたは複数）を同定した後にのみ、確実に測定され得る。しかしながら、対応する兄弟姉妹再現リスク率への寄与を計算することにより、当てはめたパラメトリックモデルは、どの程度多くの遺伝子が該疾患の家族クラスタリングに寄与しているかに関してある程度の大まかなアイデアを提供する。
【０１４６】
発作をも有するPAOD1患者35例を差し引いて得られたlodスコアの増加が偶然起こったのかどうかを評価するため、後に状態が解析において「未知」に変更された35例の患者の1000の無作為の組を選択した。使用したP値は、ピーク遺伝子座において、発作患者の罹患状態を「未知」に変更することにより観察された場合以上のlodスコア増加を生じた1000のシミュレーションの割合(fraction)である。MIも有するPAOD1患者38例を差し引いたことを評価するために、同じ方法を使用した。しかしながら、その場合、lodスコアの減少の有意差は、MI患者の罹患状態を「未知」に変更したことにより観察された場合以上のlodスコア減少を生じたシミュレーションの割合を調べることにより評価した。
【０１４７】
物理的および遺伝的マッピング
該遺伝子座領域について、高密度のSTSおよびFinger Printing Contig (FPC)データベースを用いたBAC膜の同時発生(coincident)ハイブリダイゼーションのデータの組み合わせを用い、Pieter deJong (Childrens's Hospital Oakland Research Institute)により提供されたRPCI -11ライブラリーからBACの大コンティグを構築した。BACコンティグは、同時発生ハイブリダイゼーション対RPCI-11 BACライブラリーをデータマイニングおよびFPCプログラムを組み合わせる方法により作製した。ハイブリダイゼーションは、Weizmann Institute Unified Databaseにおける位置にしたがって、目的の領域内のマーカーに由来するプライマーを用いて行なった。ギャップを埋めるため、新しいマーカーをBAC末端配列から作製した。
【０１４８】
高分離遺伝子マッピングを、物理的マッピングにより見出されたコンティグを位置決定し、正しく配列するため、および正しく配列されたマーカーの正確なマーカー間距離を得るため(使用したマーカー配列順および距離に関する表2を参照)の両方に使用した。112のアイスランド核家族(２〜７の兄弟姉妹を含む兄弟姉妹群とその両親)のデータを、PAOD1家系図内で得られ得る核家族とともに解析した。遺伝子マッピングの目的のため、112の核家族だけで588の減数分裂を提供し、マッピングに利用可能な減数分裂の合計数は1000を超えた。比較により、Marshfield遺伝子地図を、182の減数分裂をもとにして構築した。本研究の家族内における多数の減数分裂事象は、1.0 cMまたはそれより良好な分離でマーカーをマッピングする能力をもたらす。マーカー間の遺伝子距離を推定するため、ALLEGROプログラムの改良版を用いてEMアルゴリズム(Dempster, A.P. ら、J. Roy. Statist. Soc. B39:1-38 (1977))をデータに適用した。この情報を物理的地図と組み合わせると、ともに正確な連鎖解析に重要である、高度に信頼性のあるマーカー配列順、およびピーク領域内でのマーカー間距離のより良好な推定値がもたらされた(Halpern, J.およびWhittemore, A.S., Hum. Hered. 49:194-6 (1999); Daw, E.W. ら、Genet. Epidemiol. 19:366-80 (2000))。
【０１４９】
PAOD1遺伝子
PAOD1ヒトゲノム配列(配列番号:1)を図4に示す。これは、322,101 nts (Genbankアクセッション番号
>gi|4775605|emb|AL031429.11|HS333A15および
>gi|16972792|emb|AL158087.12|AL158087に一部記載;全教示は本明細書に取りこまれる)。この配列は、健常個体の代表である。ORFは、エキソン1のヌクレオチド58,162のATGから始まる。12のエキソンが示されており、エキソン4および5は新しい。この遺伝子は、選択的に発現されるプロスタグランジンEレセプター3(サブタイプ3)タンパク質であるGPCRをコードする。図3は、11のアイソフォームを示す; EP3gおよびEP3hは本明細書において新たに報告されたものである。エキソン1および2は、すべてのPTGER3アイソフォームに見られ、タンパク質の大部分すなわち、細胞外ドメインおよびすべての7つの膜貫通型スパニングヘリックスを構成する359個のアミノ酸をコードする。テイル-形成エキソンは、種々のPTGER3アイソフォームを構成する。
【０１５０】
単一ヌクレオチド多型(SNP)を表1に列挙する。既知のSNPについては、GenBankアクセッション番号を示す。ヌクレオチド番号付けは、配列番号:1に関するものである。４つのさらなるSNPが同定され、添え字「mut」で識別する。PAOD1患者対対照研究では、２つのSNPが以下のような良好なp-値を示した:
rs571705           p-0.0063
d15ptgSNP697624    p-0.00466
これに基づいて、これらのSNPの一方または組み合わせを用い、PAOD1またはその素因を診断し得る。
【０１５１】
プロスタグランジンEレセプター3タンパク質は、平滑筋細胞、血小板、内皮およびマクロファージを含む組織内に広範に分布している。それらは、Gi/Go、GsおよびGpを含むGタンパク質に結合することが知られている。Namba ら、Nature 365: 166-170 (1993)参照。
【０１５２】
結果
家系学データベースを、血管形成術および／またはPAOD1の手術を受けた1745例の患者の集団-ベースリストとともに使用し、PAOD1患者の家族を特定した。本明細書に記載の研究は、6減数分裂事象以内の他の患者(合計272患者および116家族内の612近縁者)と相関した患者に焦点をあてた。図1は、本解析において使用した大家族のうちの２つ、およびPAOD1患者が発作をも有する別のPAOD1患者と相関する家族の一例を示す。最も明白な連鎖が2.95のlodスコアで染色体1pにおいて見られたが、1.5を超える他のlodスコアも13qおよび18qにおいて生じる。さらなるマイクロサテライトマーカーを遺伝子型判定し、染色体1pピーク領域についてマッピングした。deCODEで注釈を付されたゲノム地図を用いると、マルチポイント解析では、第１染色体でのlodスコアが3.93に増加した(P=1.04・10-5) (図2)。ピークをマーカーD1S2895に集め、それぞれテロメア性およびセントロメア性のマーカーD1S411およびD1S2855は、ピークからのlodスコアの目盛り１つの低下を規定する。この遺伝子座PAOD11と命名した。連鎖に寄与する家族におけるPAOD1患者は、該遺伝子座に寄与しない家族よりも高率の糖尿病、高血圧または高脂血症を有さず、これは、この遺伝子座が、これらのリスクファクターの遺伝子座ではないかもしれないことを示す。
【０１５３】
ピーク領域における19のマーカーに関する本発明者らによる遺伝子地図を、公的に入手可能なMarshfield遺伝子地図とともに表2に示す。Marshfield地図は、多くのマーカーの配列順（Marshfieldは分離なし）、およびマーカー間の遺伝子距離の両方において、本発明者らによる地図と異なる。Marshfield地図を直接用いて本発明者らのデータを解析すると、ピークでのlodスコアは2.83である。Marshfield距離ではなく、マーカーの正しい配列順を用いた場合も、lodスコアは2.83である。UCSC原案の2000年12月据置き(freeze)の本発明者らの提出時では、ヒトDNA配列のアセンブリーは入手可能であった。本発明者らのマーカー配列順は、表2に示した２つのマーカーを除いて、公の配列と一致した。2001年４月の据置き(2001年６月公開)では、これらの２つのマーカーの配列順を訂正したが、２つの他の組(表2に示さず)の配列順を変更した。2001年８月据置きは、本発明者らによる配列順と一致する。
【０１５４】
完全な患者セットについて、いくつかの人口統計学的情報およびいくつかのリスクファクターを有する患者の割合を表3に示す。リスクファクターに関し、本発明者らは、１以上のNPLスコアを有する家族における患者の組に対する割合を示した(これらの家族の患者は、家系代々(descent over)同一遺伝物質の過剰共有を示し、そのことは単にその血縁関係により予想され得る)。これらの家族に由来する患者に関するリスクファクターのパターンにおいて、実質的な変化(shifting)はないようである。これは、このPAOD1遺伝子座がこれらのリスクファクターの遺伝子座ではないことを示す。
【０１５５】
PAOD1は、しばしば、脳血管疾患および冠動脈疾患などの他の形態のアテローム性動脈硬化と関連し、本研究での患者の多くはまた、発作および／または心筋梗塞の病歴を有した。発作の病歴をも有する35例のPAOD1患者(全体の13%)を、罹患の代わりに未知疾患状態と規定した後、データを再度解析すると、第１染色体でのlodスコアは4.93に増加した。発作患者を差し引くことによるこのlodスコアの増加は、統計学的に有意である(P = 0.019) (図2)。MIをも有する38例のPAOD1患者(14%; 彼らを「未知」と指定する)を差し引くと、lodスコアの2.95への減少がもたらされた。しかしながら、この減少は統計学的に有意ではなく(P = 0.577)、単にデータ(material)の減少を反映しているのかもしれない。
【０１５６】
種々のパラメトリックモデル、優性、相加および同義性を、この遺伝子座に当てはめた。これらのモデルの各々について、この遺伝子座で4.0を超えるlodスコアを達成することが可能であった。例えば、リスク性(at-risk)対立遺伝子が14%の頻度を有し、非保有者(non-carrier)の浸透度が０であると仮定する評価する優性モデルは、4.26のlodスコアを与える。優性モデルを当てはめると、116家族のうち47家族が正のlodスコアを与え;これらのうち38家族が0.1より大きいlodスコアを有し、３家族が0.4〜0.7のlodスコアを有する。図1に示すこの３家族、A、BおよびCは、このモデルについて、それぞれ0.68、0.62および-0.12のlodスコアを与えた。負のlodスコアを有する家族であっても、異なる給源から遺伝し得るため、一部またはすべての患者がリスク性対立遺伝子を有し得ることに注目されたい。リスク性対立遺伝子が20%の頻度を有し、保有されたリスク性対立遺伝子毎にリスクの7倍増加があると仮定する同義性モデルは、4.23のlodスコアを与える。これらの優性および同義性モデルは、2.37および2.54の兄弟姉妹再現リスク率に相当する。
【０１５７】
考察
PAOD1の本研究において、表現型は、外科的に補正されたPAOD1と規定され、および／または血管造影法により裏づけられ、多くの利点を有する。この主観性の減少は、PAOD1を患者の間欠性跛行歴に基づいて規定すると、ときどき遭遇する。これはまた、観測者によって変わり得る足首-上腕血圧比(Jeelani, N.U. ら、Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 20:25-8 (2000))への依存の必要性を削減した。PAOD1患者の約20〜25%のみが血管形成術および手術をなお継続しており、この群は、より重篤に該疾患に罹患している患者を示した。
【０１５８】
発作への連鎖研究に対するPAOD11への明白な連鎖の欠如は、発作を有する患者において、PAOD1遺伝子が、発作またはPAOD1に対するよりも、PAOD1に対して特異的な素因を付与することを示す。発作患者の排除に伴うこのlodスコアの増加は、PAOD1および発作の両方に寄与する他の強力な遺伝的および／または環境因子が存在し得ることを示唆する。
【０１５９】
本研究は、アテローム性動脈硬化の主要な症状、具体的にはPAOD1および発作の発現の遺伝的要因間に重複と独立の両方が存在することを示唆する。PAOD11は、単純に高血圧、糖尿病または高脂血症の遺伝子座ではないようであるため、これは、さらなる遺伝的要因が、アテローム性動脈硬化が起こる動脈壁において直接的に、または単核細胞、マクロファージ、血小板または凝固因子などの血中の媒介物質により間接的に、アテローム性動脈硬化の病因に影響し得ることを示唆する。
【０１６０】
【表１−１】
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【０１６１】
【表１−２】
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【０１６２】
【表２】
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【０１６３】
【表３】
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【０１６４】
【表４】
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【０１６５】
本発明は、その好ましい態様を参照して、詳細に示され、そして記載されているが、形態および詳細における種々の変化が、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲から逸脱せずに、その中でなされ得ることは、当業者によって理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１６６】
【図１】図1A〜1Cは、PAOD1の連鎖研究に使用した３つの家族を示す。２つの家族、ＡおよびＢは、染色体1p31座位に正のlodスコアを有し、一方、家族Ｃのいとこ夫婦は負に寄与した。性指標は、上の２つの世代においていくらかの個体について混合されており、発症してない患者の兄弟姉妹はプライバシー保護のために示されていない。暗い四角および丸は、それぞれPAOD1を発症した男性および女性を表す。編み目の影をつけたものは発作をも起こしたPAOD1患者を表す。斜線の記号は死亡した個体を表す。
【図２】図２は、PAOD11内の余分のミクロサテライトマーカーを有する染色体１の複数点対立遺伝子共有lodスコアを示す。実線は、全ての272 PAOD1患者の結果を表す。破線は、発作を有さないPAOD1のような限定発症者の結果を表す。
【図３】図３は、新規イソ型EP3gおよびEP3hを含むPAOD1の種々のイソ型を示す。既知のバリアントが報告されている。Schmid A, Thierauch KH, Schleuning WD, Dinter H. Splice variants of the human EP3 receptor for prostaglandin E2, Eur.J.Biochem., 15; 228 (1):23-30, 1995 Feb; Kotaniら、Genomics, 40: 425-434(1997)を参照。
【図４】図4.1〜4.83は、注釈をつけたPAOD1のゲノム核酸配列（配列番号：１）を示す。ORFは、nts58,162のATGで始まる。エキソンについて、オープンリーディングフレームはATGで始まり、GTで終わる。5'UTRは、ATGの上流である。エキソン２および３に関して、GTは、EP3c意外の全てのイソ型において使用される内部スプライス部位である。イソ型ｃの3'UTRの最初のnts.に下線を付した。エキソン４に関して、AGまたはAAのいずれかにスプライス部位を有しうる。エキソン６に関して、EPa1およびa2のa2イソ型で、エキソン６はGTで切断され、2,563ntsで始まる3'UTRにスプライスされる；両方の場合において3'UTRの最初のntsに下線を付する。エキソン９は、EP3vおよびEP3viと呼ばれる２つのイソ型の一部である（Kotani, M.ら、Genomics 40:425-434 (1997)）。表４参照。
【図５】図5A〜5Bは、エキソン１〜12の核酸（エキソン１および２）配列（配列番号：２〜14）を示す。
【図６】図6A〜6Fは、PTGER3イソ型の核酸およびアミノ酸配列（配列番号：15〜36）を示す。エキソン２は最初の下線により示される；両方は、全てのイソ型で見出され、タンパク質のほとんど、すなわち、細胞外ドメインおよび７つ全ての膜貫通スパンヘリックスを構成する359アミノ酸をコードする。尾部形成エキソン（太字で示される）は、異なるPTGER3イソ型を構成する。3''UTRの始まりは２番目の下線により示される。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図４−６】
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【図４−７】
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【図４−８】
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【図４−９】
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【図４−１０】
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【図４−１１】
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【図４−１２】
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【図４−１３】
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【図４−１４】
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【図４−１５】
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【図４−１６】
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【図４−１７】
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【図４−１８】
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【図４−１９】
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【図４−２０】
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【図４−２１】
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【図４−２５】
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【図４−２９】
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【図４−３０】
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【図４−３１】
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【図４−３５】
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【図４−３６】
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【図４−３７】
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【図４−３８】
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【図４−３９】
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【図４−４０】
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【図４−４１】
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【図４−４２】
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【図４−４３】
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【図４−４４】
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【図４−４５】
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【図４−４６】
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【図４−４７】
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【図４−４８】
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【図４−４９】
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【図４−５０】
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【図４−５１】
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【図４−５２】
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【図４−５３】
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【図４−５４】
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【図４−５５】
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【図４−５６】
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【図４−５７】
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【図４−５８】
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【図５−５９】
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【図４−６０】
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【図４−６１】
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【図４−６２】
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【図４−６３】
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【図４−６４】
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【図４−６５】
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【図４−６６】
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【図４−６７】
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【図４−６８】
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【図４−６９】
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【図４−７０】
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【図４−７１】
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【図４−７２】
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【図４−７３】
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【図４−７４】
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【図４−７５】
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【図４−７６】
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【図４−７７】
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【図４−７８】
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【図４−７９】
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【図４−８０】
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【図４−８１】
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【図４−８２】
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【図４−８３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【国際調査報告】
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