(57)【要約】標的分子を検出するための、または標的分子間の相互作用をモニターするための方法およびキット。とりわけ本発明は触媒性標識および基質標識を含む「二成分抱合体」系の使用に基づく方法に関する。
2005528103.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の標的分子を検出する方法であって、
（ａ）触媒性標識で標識された第１の結合物質および基質標識で標識された第２の別個の結合物質を含む、標的分子に特異的な２つ以上の結合物質とサンプルを接触させるステップにおいて、触媒性標識が基質標識に直接作用して基質標識において検出可能な変化を生じることができることを特徴とするステップと、
（ｂ）結合物質が標的分子に結合するのを可能にする条件下でインキュベートし、従って触媒性および基質標識が近位に接近させるステップと、
（ｃ）近位に接近して結合した場合に触媒性標識が基質標識に直接作用することを可能にし、それにより基質標識において検出可能な変化を生じさせるステップと、
（ｄ）基質標識における変化を検出するステップと、
を含む方法。
【請求項２】
２つ以上の相互作用物質間の相互作用を検出する方法であって、
（ａ）相互作用分子が相互作用でき、それにより相互作用分子の１つに付着した触媒性標識および別個の相互作用分子に付着した基質標識を近位に接近させることができるように、相互作用分子をインキュベートするステップにおいて、触媒性標識が基質標識に直接作用して基質標識において検出可能な変化を生じることができることを特徴とするステップと、
（ｂ）近位に接近して結合した場合に触媒性標識が基質標識に直接作用することを可能にし、それにより基質標識において検出可能な変化を生じさせるステップと、
（ｃ）基質標識における変化を検出するステップと、
を含む方法。
【請求項３】
検出可能な変化が基質標識の構造および／または活性における変化である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
検出可能な変化が非可逆的である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
触媒性標識および基質標識が結合物質または相互作用分子に直接付着している、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
基質標識が２つ以上の成分部分から形成され、少なくともその１つが触媒性標識に対して別個の結合物質／相互作用分子に付着している、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
触媒性標識および基質標識の成分部分が各々別個の結合物質／相互作用分子に付着している、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
基質標識の成分部分が全て単一の結合物質／相互作用分子に付着しており、そして触媒性標識が別個の結合物質／相互作用分子に付着している、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
基質標識の成分部分を自由溶液に加える、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
触媒性標識が２つ以上の成分部分から形成され、少なくともその１つが基質標識に対して別個の結合物質／相互作用分子に付着している、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
基質標識および触媒性標識の成分部分が各々別個の結合物質／相互作用分子に付着している、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
触媒性標識の成分部分が全て単一の結合物質／相互作用分子に付着しており、そして基質標識が別個の結合物質／相互作用分子に付着している、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
基質標識および触媒性標識が各々２つ以上の成分部分から形成され、基質標識および触媒性標識の各々の成分部分が別個の結合物質／相互作用分子に付着している、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
触媒性標識またはその成分部分が酵素である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
基質標識に対する触媒性標識の作用がフルオロフォアを生じる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
基質標識に対する触媒性標識の作用がフルオロフォアを消光する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
基質標識に対する触媒性標識の作用が続いて検出することができる電気化学的に活性な基を作製する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
基質標識が、触媒性標識の作用により活性化される不活性分子である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
基質標識が酵素前駆体、プロ酵素またはチモーゲンである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
触媒性標識またはその成分部分がプロテアーゼである、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
基質標識またはその成分部分が核酸であり、そして触媒性標識が核酸における検出可能な変化を触媒することができる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
触媒性標識またはその成分部分がリコンビナーゼ、リガーゼ、トランスポザーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、またはＲＮＡポリメラーゼである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
触媒性標識またはその成分部分がキナーゼであり、そして基質標識またはその成分部分がそのキナーゼによりリン酸化される分子である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
触媒性標識またはその成分部分がホスファターゼであり、そして基質標識またはその成分部分がそのホスファターゼにより脱リン酸化される分子である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
触媒性標識が最初に不活性状態で存在し、そして続いて活性化される、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
触媒性標識および基質標識を近位に接近させた後に触媒性標識が活性化される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
触媒性標識がアクチベーター物質の添加により活性化される、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
触媒性標識がｐＨの変化により活性化される、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２９】
触媒性標識が温度の変化により活性化される、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項３０】
触媒性標識が基質標識に作用できない条件下でステップ（ｂ）を実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
触媒性標識が基質標識に作用できない条件下でステップ（ａ）を実施する、請求項２に記載の方法。
【請求項３２】
触媒性標識が基質標識に直接作用して基質標識において検出可能な変化を生じることを特徴とする、触媒性標識で標識された第１結合物質および基質標識で標識された第２結合物質を含む試薬キット。
【請求項３３】
触媒性標識が基質標識に直接作用して基質標識において検出可能な変化を生じることを特徴とする、触媒性標識で標識された第１相互作用分子および基質標識で標識された第２相互作用分子を含む試薬キット。
【請求項３４】
触媒性標識が基質標識に直接作用して基質標識において検出可能な変化を生じることを特徴とする触媒性標識および基質標識、並びに触媒性標識および基質標識を相互作用分子または結合物質に付着させるための手段を含む試薬標識キット。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は標的分子または標的分子間の相互作用を検出すための方法およびキットに関する。とりわけ本発明は触媒性標識および基質標識を含む「二成分抱合体」系の使用に基づく方法に関する。
【発明の背景】
【０００２】
サンプル中の標的生物学的分子の検出は特異的認識事象と、そうでなければ擬陽性の結果に至る非特異的認識事象との間の区別を可能にする感受性のある技術を必要とする。
【０００３】
タンパク質、核酸、ウイルス、細菌および炭水化物などの多くの異なる型の生物学的分子を検出するための技術は当分野で公知である。高度に特異的な検出は、検出される標的分子に結合する複数の結合物質を用いることによりしばしば達成される。
【０００４】
核酸を検出するための公知の技術には、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などがある。この技術では、２つの短い核酸プライマーが標的核酸を認識する。標的核酸の検出は、双方のプライマーが同一の標的分子に結合し、そしてそれによって連結される場合にのみ達成される。非特異的相互作用により双方のプライマーが結合し、そして連結されることがなければ、プライマーとその他の分子とのこの非特異的相互作用は検出されない。反応条件は後者の可能性が極めて低いような条件である。当分野で公知であるその他の分子増幅方法には核酸配列に基づいた増幅（ＮＡＳＢＡ）（Ｃｏｍｐｔｏｎ（１９９１））および３ＳＲ（Ｆａｈｙら（１９９１））などがある。
【０００５】
タンパク質は、ウェスタン・ブロッティングなどの公知の技術により検出することができる。この技術は非常に有用であるが、増幅工程の欠如、および標的に結合する物質が単一であるという事実のために、感受性および特異性において限定される。
【０００６】
しかしながら、国際公開公報第９９／６３３４８号に開示されるように、デュアルファージアプローチにより非常に感受性が高く、そして特異的な様式で標的分子を検出することができる。デュアルファージアッセイでは、シグナルを生成するために２つのファージが必要であり、そして２つのファージを一緒にするか、または標的分子を介して連結しなければならない。ファージを標的分子に特異的である抗体などのリガンドに連結することにより、これは最も容易に達成される。この方法では、核酸、タンパク質および単純または複合分子などの広範な標的分子を検出することが可能である。
【０００７】
米国特許第５，６３５，６０２号および米国特許第５，６６５，５３９号に記載される別のアプローチでは、２つの標的特異的抗体は共に同一の核酸片に連結され、そして核酸はブリッジを形成するようになる。標的への結合の後に、この核酸ブリッジは特異的に切断され、そして次に再会合する。核酸ブリッジは２つのＰＣＲプライマー結合部位を含有するので、ＰＣＲおよび再形成された核酸を認識する２つのプライマーを使用することにより、無傷の核酸ブリッジ（すなわち切断され、そして再会合した）の存在が示される。双方の抗体分子が標的に結合し、そして従って、空間的に近位に接近している場合、核酸は切断後に再形成される可能性が更に高いので、このアプローチによりアッセイの特異性が増強される。１つの抗体のみが意図した標的以外の分子に非特異的に結合する場合、核酸ブリッジが再形成される可能性は低い。このアプローチの欠点は、全ての核酸ブリッジ分子が標的抗原の非存在下で切断されることを確実にする問題である。さらに、その方法は複雑であり、そしてＤＮＡ制限酵素、ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡライゲーション酵素を含み得る多くのステップに関係している。
【０００８】
国際公開公報第０１／６１０３７号はいわゆる近接プローブを用いて溶液中の分析物を検出するためのアッセイに関する。当該近接プローブは結合部分および核酸から構成される。近接プローブの分析物への結合時に、核酸を近位に接近させ、そして従って、ライゲートし、そして次に通常増幅により検出することができる。この技術は、ライゲーションが不十分な反応である可能性があり、そして近接プローブの有効なライゲーションを可能にするのに十分高い濃度で、リガーゼを反応物に添加しなければならないことである。
【０００９】
高感度な方法はまた分子相互作用をモニターするのに使用するためにも必要である。創薬およびプロテオミクスはちょうどこのような相互作用に頼る技術の２つの分野である。当分野で公知である、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）（ＢｏｓｗｏｒｔｈおよびＴｏｗｅｒｓ（１９８９））および種々の酵母ハイブリッド法（ＭａおよびＰｔａｓｈｎｅ（１９８８）；ＦｉｅｌｄｓおよびＳｔｅｒｎｇｌａｎｚ（１９９４））などの種々の方法が現在用いられている。
【００１０】
デュアルファージ法を分子相互作用のモニターに適用することもできる。この場合、その相互作用が研究される分子の各々が、直接的または間接的のいずれかで１つのファージ型に結合できるリガンド結合部位を有している。従って、２つのファージ型の連結により分子の相互作用をモニターすることができる。分子が相互作用する場合、２つのファージ型が一緒になるが、それらが相互作用しない場合、２つのファージ型は分離したままである。このアプローチをプロテオミクスおよび創薬に適用することができる。
【００１１】
生物学的分子間の相互作用を検出するのに用いられる別のアプローチには、あるフルオロフォアの発光が別の励起に繋がる距離依存性励起状態相互作用である蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）などがある。ＦＲＥＴはエネルギーの量子、または励起子を蛍光受容体に転移させる蛍光供与体に頼り、従って、供与体の光励起電子は基底状態に戻り、受容体の電子は高エネルギー状態に上昇する。供与体フルオロフォアおよび受容体フルオロフォア間の共鳴相互作用は原子間よりも大きな距離にわたって生じる。ＦＲＥＴの成功のためには、供与体の蛍光発光スペクトルは受容体の吸収スペクトルと重複しなければならず、そして供与体および受容体の遷移双極子の配向はほぼ平行でなければならない。エネルギー転移が生じる可能性はフルオロフォア間距離の６乗に依存する。
【００１２】
供与体および受容体が異なる場合、受容体の蛍光の発現により、または供与体の蛍光の消光によりＦＲＥＴを検出することができる。供与体および受容体が同一である場合、その結果生じる蛍光脱分極によりＦＲＥＴを検出することができる。供与体フルオロフォアの波長で励起された場合、フルオロフォア受容体からの発光を測定することによりエネルギー転移を検出することができる。ＦＲＥＴが生じなければ、この波長は受容体からの発光を生じない。あるいは、その励起波長で供与体発光に及ぼす受容体が有する消光効果を測定することによりＦＲＥＴを検出することができる。
【００１３】
米国特許第３９９６３４５号、米国特許第４２６１９６８号および米国特許第１９９５５９号は蛍光クエンチャー発色団ペアを用いるイムノアッセイについて記載している。ここで、発色団ペアの１つまたは双方は抗体に結合している。目的の特定のリガンドに依存して、種々の試薬の組み合わせを用いることができ、その場合消光の量はアッセイ媒体に存在するリガンドの量に直接関係する。
【００１４】
米国特許第６，２５１，５８１号は分析物の含有が疑われる媒体において分析物を測定するための方法を開示している。１つの方法は、分析物が存在するとすれば、分析物が光増感剤および化学発光化合物を近位に接近させるような条件下で、分析物の含有が疑われる溶媒を処置することを含む。光増感剤は一重項酸素を生じ、そして近位に接近している場合、化学発光化合物を活性化する。活性化された化学発光化合物は続いて光を生じる。生じた光の量は媒体中の分析物の量に関係する。
【発明の説明】
【００１５】
本発明は標的分子を検出し、そして分子相互作用をモニターする改善された方法を提供することを希求する。
【００１６】
本明細書で以後「標的検出方法」と称する、本発明の第１の態様に従って、サンプル中の標的分子を検出する方法であって、
（ａ）触媒性標識で標識された第１の結合物質および基質標識で標識された第２の別個の結合物質を含む、標的分子に特異的な２つ以上の結合物質とサンプルを接触させるステップにおいて、触媒性標識が直接基質標識に作用して基質標識において検出可能な変化を生じることができることを特徴とするステップと、
（ｂ）結合物質が標的分子に結合するのを可能にする条件下でインキュベートし、従って触媒性および基質標識が近位に接近させるステップと、
（ｃ）近位に接近して結合した場合に触媒性標識が基質標識に直接作用することを可能にし、それにより基質標識において検出可能な変化を生じさせるステップと、
（ｄ）基質標識における変化を検出するステップと、
を含む方法を提供する。
【００１７】
本明細書で「相互作用方法」と称する、本発明の第２の態様に従って、２つ以上の相互作用分子間の相互作用を検出する方法であって、
（ａ）相互作用分子が相互作用でき、それにより相互作用分子の１つに付着した触媒性標識および別個の相互作用分子に付着した基質標識を近位に接近させることができるように、相互作用分子をインキュベートするステップにおいて、触媒性標識が基質標識に直接作用して基質標識において検出可能な変化を生じることができることを特徴とするステップと、
（ｂ）近位に接近して結合した場合に触媒性標識が基質標識に直接作用することを可能にし、それにより基質標識において検出可能な変化を生じさせるステップと、
（ｃ）基質標識における変化を検出するステップと、
を含む方法を提供する。
【００１８】
「触媒性標識」および「基質標識」を近位に接近させるために、両方法は特異的な結合相互作用に頼る。触媒性標識は基質標識に直接作用して基質標識に検出可能な変化を生じることができる。ここで「検出可能な変化」とは、触媒性標識により引き起こされる基質標識の構造および／または活性における変化を意味し、構造および／または活性における変化を直接的または間接的に検出することができる。基質標識における「検出可能な変化」は変化を検出するために用いる条件下で非可逆的であるのが好ましい。
【００１９】
最も好ましい実施形態では、「検出可能な変化」は基質標識に対する触媒性標識の直接作用により引き起こされ、これは構造および／または活性における変化が、触媒性標識および基質標識間の直接的接触または物理学的相互作用によりもたらされることを意味している。「直接作用」なる用語は、触媒性標識および基質標識間の直接的接触または物理学的相互作用に関して何ら要件もなく、単に拡散可能な中間物質の作用によりもたらされる基質標識の構造および／または活性における変化を排除する。
【００２０】
触媒性標識および基質標識は「別個の」結合物質／相互作用分子に付着し、これは基質標識の部分と同一の結合物質／相互作用分子に付着する触媒性標識の部分はないことを意味している。結合物質の標的分子への特異的結合により（標的検出方法において）、または相互作用分子の特異的結合により（相互作用方法において）、触媒性標識および基質標識を近位に接近させ、従って基質標識に対する触媒性標識の直接作用を促す。特異的結合事象の結果である触媒性標識および基質標識の接近した並置が、結果的に自由溶液中の非結合触媒性標識および基質標識の間の無作為の相互作用によるバックグラウンドを超えてシグナル対ノイズ比の改善を提供する比率の上昇を招く。
【００２１】
本発明の標的検出および相互作用方法は、生物学的結合アッセイの型であり、これらの型のアッセイに関して当分野で公知の標準的な原理に従って実施することができる。例えば、添付の実施例で説明するように、過剰の／非結合性試薬を除去するために添加の間に中間物質洗浄工程を含むのが一般的である。
【００２２】
触媒性標識および基質標識の好ましい特徴
基質標識に対する触媒性標識の作用は結果的に基質標識の構造および／または活性の検出可能な変化を招く。
【００２３】
基質標識の構造の変化は、例えば標識の物理学的切断を含むことができる。
【００２４】
基質標識の活性の変化は、例えば蛍光、発光等のごとき検出可能な特性における変化、または酵素活性、電気化学的活性または酸化還元特性における変化を含むことができる。活性の変化は基質標識の構造の変化に随伴されるか、またはそれに引き起こされ得る。
【００２５】
基質標識の活性の「変化」は、基質標識に対する触媒性標識の別個の作用（例えば基質標識の切断である）の結果として、「不活性」状態から「活性」状態への（またはその逆）基質標識の別個のスイッチの結果である活性の変化でよい。しかしながら、別の実施形態では、活性の「変化」は、基質標識に対する触媒性標識の連続作用を必要とする活性の発現でよい。このような「変化」の実例は、ＲＮＡポリメラーゼ触媒性標識と、ＲＮＡポリメラーゼに特異的なプロモーターを担持する核酸基質標識との間の相互作用の結果である転写活性の上昇である。
【００２６】
好ましい触媒性標識には、酵素などがあるが、これに限定されない。
【００２７】
本発明の一実施形態では、基質標識に対する触媒性標識の作用はフルオロフォアを生成することができ、続いてこれを検出することができる。例えば基質標識は、触媒性標識の作用により切断される連結を介することにより蛍光部分の蛍光を消光するクエンチャー部分に連結された蛍光部分から形成され得る。連結の切断によりクエンチャー部分が放出され、従って蛍光部分からの蛍光が増加する。この蛍光の増加を適当な測定装置を用いて検出することができる。この実施形態では、触媒性標識は酵素でよく、そして「連結」は酵素の作用により切断される分子構造でよい。例えば、酵素はプロテアーゼでよく、そして連結は当該酵素の作用により切断されるペプチドでよい。「連結された」場合に、クエンチャー部分が蛍光部分からの蛍光を消光するように蛍光およびクエンチャー部分が相互作用することを可能にしなければならない場合を除いて、連結の正確な特性は重要ではない。
【００２８】
別の実施形態では、基質標識に対する触媒性標識の作用によりフルオロフォアを消光できる。
【００２９】
更に別の実施形態では、基質標識に対する触媒性標識の作用により、続いて検出することができる電気化学的に活性な種または基を生成できる。例えば、触媒性標識はアルカリホスファターゼ酵素でよく、そして基質標識は結合部分に直接連結されたフェノールリン酸部分でよい。この場合、この酵素は、基質の近位に接近したときに、リン酸基の除去を触媒し、電極表面での酸化還元反応により検出できる電気化学的に活性な基が生じる。
【００３０】
更に別の実施形態では、基質標識は、触媒性標識の作用により活性化される不活性分子でよい。このような標識の実例には、例えば酵素前駆体、チモーゲンまたはプロ酵素などがある。
【００３１】
多くの酵素は不活性前駆体、いわゆるチモーゲンまたはプロ酵素として合成され、これは続いて１つまたはいくつかの特異的ペプチド結合の切断により活性化される。このタンパク質分解性活性化は非可逆的過程である。例えばトリプシノーゲン、キモトリプシノーゲン、プロエラスターゼおよびプロカルボキシペプチダーゼは、各々消化酵素トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼおよびカルボキシペプチダーゼの、全て不活性前駆体である。これらのプロ酵素は全てトリプシンの作用により活性化され、これはプロ酵素のペプチド結合を加水分解する。従って、本発明の好ましい実施形態では、触媒性標識はトリプシン、またはタンパク質分解活性が同等であるが特異性が異なるプロテアーゼでよく、そして基質標識はトリプシノーゲン、キモトリプシノーゲン、プロエラスターゼおよびプロカルボキシペプチダーゼでよい。これらの実例は単に説明のためのものであって、本発明を限定することを意図するものではない。
【００３２】
酵素触媒性標識および酵素前駆体基質標識のその他の好ましい組み合わせには、エンテロペプチダーゼ／トリプシノーゲン（切断されてトリプシンを生じる）、スロンビン／フィブリノーゲン（切断されてフィブリンを生じる）などがある。
【００３３】
触媒性標識が酵素前駆体基質標識を切断して活性な酵素を生じるこのような系では、基質標識に対する触媒性標識の作用によりもたらされる「変化」（すなわち酵素活性化）を、基質標識の切断により生じる酵素活性に特異的な適当なアッセイにより検出できるのが便利である。このアッセイが、基質標識の切断の結果として生じる酵素活性と触媒性標識の酵素活性とを区別できることが重要である。
【００３４】
本発明に従って用いることができる触媒性標識のその他の好ましい実例には、ホスファターゼおよびキナーゼなどがある。このような触媒性標識は適当な基質標識を各々脱リン酸化またはリン酸化する。基質標識の脱リン酸化またはリン酸化が、今度は基質標識の構造および／または活性における検出可能な変化を導く。
【００３５】
特定の実施形態では、キナーゼ／ホスファターゼによりリン酸化／脱リン酸化される基質標識はタンパク質でよいが、本発明はタンパク質のみに限定されない。このようなリン酸化または脱リン酸化が構造および／または活性における検出可能な変化に随伴される、リン酸化または脱リン酸化できるいずれかの適当な基質標識を本発明の範囲内で使用することができる。
【００３６】
本発明の更に別の実施形態では、基質標識は核酸でよく、そして触媒性標識は核酸の構造および／または活性における検出可能な変化を触媒できる種、典型的には酵素でよい。適当な触媒性標識の実例には、例えばリコンビナーゼ、リガーゼ、トランスポザーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素またはＲＮＡポリメラーゼなどがある。
【００３７】
この実施形態では、核酸標識の「構造」の変化を、例えば適当な配列特異的プローブおよび／または核酸増幅技術を使用して、検出可能な配列の変化を含むように取る。特異的核酸配列を検出および区別するために用いることができる、当業者に公知の多くの適当な技術がある。
【００３８】
先に論じたように、核酸標識の「活性」の変化は、例えば触媒性標識がＲＮＡポリメラーゼであり、そして基質標識が前記ポリメラーゼに特異的なプロモーターを含有する場合に生じ得る転写活性の変化を含むことができる。本発明のこの実施形態に用いるのに好ましいＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター系には、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ、とりわけＴ７、Ｔ３およびＳＰ６ポリメラーゼおよびその同種のプロモーターなどがあるが、これらに限定されない。これらのポリメラーゼは当分野で公知であり、そして通常インビトロ転写に用いられる。適当なプロモーターを含有する基質標識に対するＲＮＡポリメラーゼ触媒性標識の作用によりもたらされる転写活性の増加を、得られた転写物を直接的または間接的に検出することにより検出することができる。好ましい実施形態では、基質標識は、レポーター遺伝子の発現を駆動する適当なプロモーターを含むレポーター遺伝子発現構築物でよい。次いでレポーター遺伝子の発現を検出することにより転写活性の増加をモニターすることができる。
【００３９】
本発明の実施形態では、基質標識は２つ以上の成分部分から形成され得るが、その少なくとも１つは触媒性標識に対して別個の結合物質／相互作用分子に付着している。これを達成できる種々の方法がある。例えば、基質標識の成分部分が全て単一の結合物質／相互作用分子に付着でき、そして触媒性標識は別個の結合物質／相互作用分子に付着できる。
【００４０】
別の配置では、触媒性標識および基質標識の成分部分は各々別個の結合物質／相互作用分子に付着できる。触媒性標識と基質標識との間で相互作用を生じるために３つの種が近位に接近しなければならないような系が有利である。従って、触媒性標識および基質標識の成分が各々別個の結合物質に付着している「標的検出方法」では、触媒性標識と基質標識との間の相互作用を可能にするために、共通の標的に対する結合物質の少なくとも３つの別個の結合事象が生じなければならない。少なくとも３つの別個の相互作用分子が各々触媒性標識および基質標識の成分で標識されている「相互作用方法」では、次に触媒性標識と基質標識との間の相互作用を可能にするために、少なくとも３つの別個の種の相互作用分子が一緒にならなければならない。
【００４１】
更に別の実施形態では、触媒性標識および基質標識の少なくとも１つの成分部分が各々別個の結合物質／相互作用分子に付着でき、そして基質標識の別の成分部分が自由溶液中に、好ましくは過剰の量で存在できる。この系では、標識された結合物質のその標的への結合または標識された相互作用分子の相互作用により、これらの２つの標識は近位になるだけであるので、結合物質／相互作用分子に付着している触媒性標識と基質標識の成分との間に「近位効果」が依然存在する。
【００４２】
二つの構成成分部分から形成される基質標識の実例は、適当な触媒性標識の存在下で相互作用して新規配列を有する少なくとも１つの核酸タグを生成することができる２つの別個の核酸タグから形成される基質標識である。この型の標識は、１つの核酸タグが結合物質／相互作用分子に付着、そして別の核酸タグが自由溶液中に過剰に存在するアッセイ系においてとりわけ有用である。
【００４３】
基質標識が２つの別個の核酸タグから形成される系の最も好ましい実施形態では、タグは組換えを介して相互作用し、少なくとも１つの新規配列のタグを生成することができる。この実施形態では、触媒性標識は核酸タグ間の組換えを触媒する酵素を含む。
【００４４】
本明細書において「組換え」は、検出が可能な少なくとも１つの新規配列を生成するために、核酸配列のいずれかの交換または核酸タグ間の配列の欠失もしくは挿入を含むように定義される。実例には、部位特異的組換え事象（例えば特異的なリコンビナーゼを必要とする）および転位事象（例えば特異的なトランスポザーゼを必要とする）などがある。
【００４５】
一般に核酸タグ間で広範な相同性を要求しない限り、部位特異的組換え事象は非相同組換え事象である。大抵の場合、部位特異的組換えは短い組換え部位配列（一般に数十個の塩基対）の存在を必要とする。多くの部位特異的組換え系は同一の組換え部位配列の存在を必要とする。しかしながら、各々バクテリオファージλおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体から誘導された組換え部位ａｔｔＰおよびａｔｔＢと同様に、別の系では組換え部位はほとんど、または全く配列相同性を共有しなくてもよい。
【００４６】
好ましい実施形態では、「基質標識」は２つの核酸タグから構成されており、各々が特定の部位特異的リコンビナーゼ酵素により認識される部位特異的組換え配列を含有し、そして「触媒性標識」は適当な部位特異的リコンビナーゼ酵素である。
【００４７】
用いることができる適当な部位特異的組換え系には、基質標識を構成する核酸タグがｌｏｘＰ部位を含有し、そして触媒性標識がＣｒｅリコンビナーゼであるＣｒｅ／ｌｏｘＰ系などがある。別の適当な系は、核酸タグがａｔｔＰおよびａｔｔＢ認識配列またはａｔｔＬおよびａｔｔＲ配列を含有し、これらの部位を認識する酵素標識により触媒される組換えを可能にする、バクテリオファージλ組換え系である。ａｔｔＢ部位とａｔｔＰ部位との間、またはａｔｔＬ配列とａｔｔＲ配列との間の組換えはλファージ酵素インテグラーゼにより触媒され、そして宿主アクセサリー因子ＩＨＦを必要とする。λファージ組換え系は当分野で公知であり、そして組換えに必要とされる酵素は市販されている（例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより供給されるＧａｔｅｗａｙ（商標）クローニング系の成分として）。これらの特定の組換え系は例示のためのみに列挙し、そして本発明をこれらの特定の系の使用に限定することを意図するものではない。当分野で公知のその他の部位特異的組換え系、例えばＦｌｐ／ＦＲＴ系を使用することもできる。
【００４８】
「リコンビナーゼ」系の特定の実施形態では、リコンビナーゼ酵素は実際には基質標識を構成する核酸タグの１つに付着していてよい。例えば、リコンビナーゼ基質を構成する２つの核酸タグは別個の結合物質／相互作用分子に付着していてよく、そしてリコンビナーゼ酵素は核酸タグの１つに付着していてよい。結合物質のその標的／相互作用分子間の相互作用への結合時に２つの核酸タグ＋リコンビナーゼは近位に接近するようになり、従って組換え反応を生じることが可能になる。しかしながら、大部分の適用では、リコンビナーゼおよび別個の成分に付着した核酸タグを有することが好ましい。
【００４９】
更に別の実施形態では、組換えは転位事象に依存し、そして触媒性標識としてトランスポザーゼの使用に頼ることができる。このような系の適当な実例はモザイク末端認識配列を認識するＴｎ５トランスポザーゼに依存する。しかしながら、本発明はこの特異的な系に限定されることを意図するものではなく、そして当分野で公知のその他の転位系を使用することができる。
【００５０】
基質標識を構成する２つの核酸タグ間の核酸配列の転位により「検出可能な変化」を生成するために、触媒性標識としてトランスポザーゼの使用に頼る系は、転位を生じさせるために、双方の核酸タグにおける特異的配列の存在を必要としてもしなくてもよい。いずれかの特定のトランスポザーゼ酵素／転位可能なエレメントを用いて転位を成功させるための要件は、一般に当業者に理解されよう。
【００５１】
基質標識が２つの核酸タグから構成される系の更に好ましい実施形態は触媒性標識としてのリガーゼの使用に基づく。リガーゼは２つの別個の核酸タグを一緒にライゲートすることができ、一緒に基質標識を構成して新規配列を有する検出可能なライゲーション産物を形成する。この系では核酸の１つを結合物質／相互作用分子に付着させ、そして自由溶液中に過剰量の第２のタグを加えることが可能である。
【００５２】
この実施形態で用いることができる核酸タグは２本鎖ＲＮＡから形成されることができ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによるライゲーションを可能にする。タグは相補的な「粘着」末端または平滑末端を有することができる。別の実施形態では、タグは１本鎖ＲＮＡから形成されることができ、これをＴ４  ＲＮＡリガーゼにより結合することができる。
【００５３】
「基質」核酸タグに対するリコンビナーゼ、トランスポザーゼまたはリガーゼの作用により生成することができるような、新規配列を有する核酸タグを当分野で公知のいずれかの適当な技術を用いて検出することができる。
【００５４】
最も好ましくは、新規配列の検出は増幅反応、例えばＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、３ＳＲまたは当分野で公知のいずれかその他の増幅技術を含む。新規配列に特異的な増幅プライマーの使用により増幅を達成する。新規タグ配列に関する特異性を提供するために、完全に新規な配列の領域に相当するプライマー結合部位を選択できるか、あるいは元来のタグには存在しないプライマー結合部位の新規組み合わせを選択できる。
【００５５】
新規配列がまた、新規配列の検出に必要なプライマー結合部位以外の配列、例えばＲＮＡポリメラーゼ結合部位またはＮＡＳＢＡまたは３ＳＲなどの等温増幅技術に必要なプロモーター配列を含むこともできることは当業者には理解されよう。
【００５６】
好ましい実施形態では、新規配列の検出を増幅反応の生成物の「リアルタイム」検出を用いる増幅により実施する。増幅産物の形成の連続的なモニターを可能にするいずれかの増幅技術を用いることによりこれを達成することができる。
【００５７】
増幅反応の産物のリアルタイム検出のための多くの技術が当分野で公知である。これらの多くが連続的モニターできる蛍光読み取りを生じ、具体例は分子ビーコンおよび蛍光共鳴エネルギー転移プローブである。ＴａｑＭａｎ（登録商標）系（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＰＣＲ反応のリアルタイム定量を達成することができる。
【００５８】
最も好ましい実施形態では、方法をリアルタイムで実施し、これは結合物質の標的分子への結合（または相互作用分子の特異的結合）、核酸基質標識に対する触媒性標識の作用および相互作用の産物の検出が単一の反応工程で同時に実施されることを意味する。リアルタイム検出は、中間物質の洗浄工程を必要とせずに、結合工程、基質標識に対する触媒性標識の作用、および相互作用の生成物の検出を全て単一のセットの反応条件下で実施できることを要求する。この実施形態では、結合物質の標的分子への結合／相互作用分子間の相互作用に悪影響を及ぼし得る温度変化を避けるために、等温増幅反応、例えばＮＡＳＢＡまたは３ＳＲを用いて新規配列のリアルタイム検出を実施するのが好ましい。
【００５９】
基質標識が核酸タグから構成される実施形態では、「核酸タグ」なる用語は、触媒性標識が作用して、例えば組換えにより新規配列を生成することができるいずれかの天然の核酸および天然または合成アナログを含む。適当な核酸タグは２本鎖または１本鎖ＤＮＡ、２本鎖または１本鎖ＲＮＡから構成されるタグを含む。部分的に２本鎖であり、そして部分的に１本鎖であるタグもまた企図される。２本鎖タグと組み合わせて１本鎖タグを使用すること、すなわち１本鎖タグで標識された一方の成分および、１本鎖タグと相互作用できる２本鎖タグで標識されたもう一方の成分を使用することもまた企図される。触媒性標識が組換えを触媒する場合、次いで核酸タグは組換え反応に参加できるいずれかの核酸から構成されてよく、適当な実例には直鎖状または環状２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）もしくは２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）またはその混合物などがある。最も好ましくは、核酸タグはｄｓＤＮＡを含む。「核酸」なる用語は天然の核酸に類似の様式で触媒性標識の基質を形成する合成アナログ、例えば非天然すなわち誘導された塩基を組み込んだ核酸アナログ、または修飾されたバックボーンを有する核酸アナログを包含する。とりわけ、「２本鎖ＤＮＡ」または「ｄｓＤＮＡ」なる用語は非天然塩基を含有するｄｓＤＮＡを包含するように解釈される。
【００６０】
核酸タグに対する触媒性標識の「作用」を可能にするために特定の配列が必要とされ得る場合を除いて、核酸タグの正確な配列は本発明に重要ではない。例えば、部位特異的組換えを可能にするために特異的配列が必要とされる。「基質標識」を構成する２つの核酸タグは最も通常的には異なる配列のものであるので、核酸タグ間の相互作用事象により検出できる少なくとも１つの新規配列の生成が導かれる。しかしながら、タグが相互作用して新規配列を生成できれば、同一の配列のタグを使用することを排除するものではない。最も好ましくは、基質標識に対する触媒性標識の作用により、各々が新規配列を有している２つの別個の核酸タグの生成が導かれる。これは、新規配列の２つのタグが独立して検証可能な産物を形成するという利点を有している。
【００６１】
本発明の別の実施形態では、触媒性標識は２つ以上の成分部分から形成されるとができ、その少なくとも１つは基質標識に対して別個の結合物質／相互作用分子に付着する。このような触媒性標識の実例には、例えば酵素／補酵素、多サブユニット酵素等がある。
【００６２】
基質標識および触媒性標識の成分部分は各々別個の結合物質／相互作用分子に付着することができるか、または触媒性標識の成分部分は全て単一の結合物質／相互作用分子に付着することができ、そして基質標識は別個の結合物質／相互作用分子に付着することができる。
【００６３】
更に別の実施形態では、基質標識および触媒性標識は各々２つ以上の成分部分から形成されることができ、ここで基質標識および触媒性標識の成分部分は別個の結合物質／相互作用分子に付着している。この実施形態では、基質標識の全ての成分部分は単一の結合物質／相互作用分子に付着することができるか、または成分部分は多くの別個の結合物質／相互作用分子に付着することができる。同様に、触媒性標識の全ての成分部分は単一の結合物質／相互作用分子に付着することができるか、または成分部分は多くの別個の結合物質／相互作用分子に付着することができる。唯一の制限は基質標識および触媒性標識（の成分部分）は同一の結合物質／相互作用分子に付着してはならないということである。
【００６４】
不活性状態の触媒性標識で出発し、そして次に結合物質の標的分子への結合（または相互作用分子間の相互作用）を生じて、触媒性標識および基質標識を近位に接近するように位置付けた後にのみ、触媒性標識を活性化するのが一般に好ましい。触媒性標識の活性化は、例えば反応媒体の組成、ｐＨまたは温度を変化させることにより達成することができる。この「外的活性化」工程は、自由溶媒中の触媒性標識と基質標識との間の非特異的相互作用の結果であるバックグラウンドを最小にすることにより、方法の感受性を高める。これは、触媒性標識および基質標識を近位に接近させるために、結合物質のその標的分子への結合、または相互作用分子間の特異的相互作用の結果である「近位効果」がそれ自体バックグラウンドの非特異的相互作用を超える十分なシグナル対ノイズ比の増強を提供しない適用では重要であろう。
【００６５】
特定の実施形態では、標的検出方法のステップ（ｂ）および相互作用方法の等価なステップ（ａ）を、触媒性標識が基質標識に作用できない条件下で実施することができる。これらの「条件」は、例えば基質標識に対する触媒性標識の作用に必要な重要な成分の欠如でよい。基質標識が２つの成分部分から形成される場合、その１つを自由溶液に添加し、次いで「条件」はこの成分の欠如でよい。結合物質の標的分子への結合（または相互作用分子間の相互作用）を生じて、触媒性標識および基質標識を近位に接近するように位置付けた後、「条件」を変化させて触媒性標識が基質標識において作用することを可能にする。この変化は例えば、触媒性標識と基質標識の成分との間の続く反応を可能にする条件下での基質標識の欠落した成分の添加でよい。反応媒体における「変化」を中間物質洗浄工程の使用により、または欠落した反応成分の単純な添加により（その双方は生物学的結合アッセイの標準的な原理に従う）容易に達成することができる。
【００６６】
基質標識が、２つのタグ間でのハイブリダイゼーションを必要とする相互作用において一緒にされる２つ（またはそれ以上）の別個の核酸タグから形成される実施形態では、タグ間でハイブリダイゼーションができず、そして次に反応条件を変化させてハイブリダイゼーションを可能にする条件下で標的検出方法のステップ（ｂ）および、相互作用方法の等価のステップ（ａ）を実施するのが便利であろう。
【００６７】
好ましい実施形態では、触媒性標識および基質標識は結合物質または相互作用分子に直接付着している。共有結合による連結を介して直接連結を達成することができる。
【００６８】
タンパク質成分のその他のタンパク質への、または核酸もしくは炭水化物への、直接的な共有結合による連結のための技術は当分野で公知であり、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ；Ｍ．  ＡｓｌａｍおよびＡ．Ｄｅｎｔ編、Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．（１９９８）などのマニュアルに記載される技術を例えば参照されたい。
【００６９】
例えば、多くの化学的架橋化合物のいずれか１つを用いてアミン誘導核酸タグをタンパク質結合物質／相互作用分子に連結させることができる。
【００７０】
触媒性標識または基質標識を間接的に結合物質／相互作用分子に結合させることもまた本発明の範囲内である。例えば、「間接的」付着はリンカー分子を介して達成することができる。適当なリンカー分子には、高い親和性で結合する生物学的結合ペアの成分、例えばビオチン／ストレプトアビジンまたはビオチン／アビジンなどがある。
【００７１】
標的検出方法のほとんどの適用では、反応の出発時に、少なくとも結合物質の標的分子への結合の前に、触媒性標識および基質標識は結合物質／相互作用分子に付着している。最も好ましくは、結合物質は触媒性標識および基質標識で予め標識されて供給されるか、あるいは別個の試薬標識工程で標識を付着させる。しかしながら、検出反応自体の間の、すなわち結合物質の標的への結合の後の触媒性標識および／または基質標識の結合物質への付着の可能性は排除されない。
【００７２】
標的検出方法の好ましい特徴
「標的検出方法」を用いて、特異的標的検出方法を開発することが望ましい本質的にいかなる標的分子も検出することができる。
【００７３】
標的分子は単一の分子、多量体、凝集物または分子集合体または複合体を含むことができる。一般に多量体は共有結合または非共有結合性相互作用を介して一緒に連結された多くの単一分子の反復を含む。一般に複合体は共有結合または非共有結合性相互作用を介して相互作用する異なる分子から構成される。
【００７４】
本発明の局面では、「結合物質」は標的分子に特異的に結合できるいずれかの分子として定義される。結合物質には、例えば抗体、レクチン、レセプター、転写因子、コファクターおよび核酸、並びに標的特異的結合活性を保持するそのフラグメント（例えばＦａｂフラグメント）などがある。このリストは単なる説明のためのものであり、本発明に対する制限を意図するものではない。
【００７５】
結合物質は単一の標的分子の異なる領域に結合することができる。従って、結合物質が標的分子のその各々の領域に結合したときに、触媒性標識および基質標識が近位に接近するようになる。
【００７６】
標的分子が多量体または凝集物である場合、次いで結合物質は多量体の単量体成分または凝集物を構成する単位上の等価な結合部位に結合することができる。
【００７７】
要求される特異性の適当な「結合物質」を利用できる本発明の「標的検出方法」を本質的にいかなる「標的分子」をも検出するために適合させることができる。その方法を用いて試験される「サンプル」は、標的検出方法の操作に必須である特異的結合反応を可能にする本質的にいかなる物質でもよい。
【００７８】
「標的検出方法」は標的分子、とりわけタンパク質、核酸、炭水化物などの標的生物学的分子の特異的検出を提供するのが望ましい技術の全ての分野で有用である。標的検出方法の適用の１つの重要な分野は臨床診断の分野であるが、限定されることを意図するものではない。典型的には「サンプル」は、ヒト患者から採取した生物学的液体、例えば全血、血清、血漿、尿等である。その他の重要な適用は環境試験およびモニターの分野を含むことができる。
【００７９】
相互作用方法の好ましい特徴
分子間の相互作用、とりわけ生物学的分子間の相互作用をモニターするのが望ましい本質的にいかなる当分野でも「相互作用方法」を用いることができる。
【００８０】
好ましい実施形態では、分子相互作用を調査するために、相互作用方法をプロテオミクスにおいて用いることができる。例えば第１相互作用分子を触媒性標識または基質標識のいずれかで標識することができ、そして第１相互作用分子と相互作用する可能性のある分子のライブラリーを次いでその他の標識型で各々標識することができる。第１相互作用分子と分子のライブラリーからの成分との間で相互作用が生じる場合、これは触媒性標識および基質標識を近位に接近させ、従って相互作用が基質標識の構造および／または活性に変化を生じることが可能になり、相互作用パートナーを同定するために変化を検出することができる。
【００８１】
別の適用は創薬の分野である。例えば相互作用方法を用いて分子の特定の組み合わせの間の相互作用を研究することができ、また分子相互作用の可能性のあるインヒビターまたはエンハンサーを同定することができる。相互作用分子間の相互作用により近位に接近するようになった触媒性標識および基質標識の相互作用の後に検出されるシグナルを低減させる能力に関してスクリーニングすることにより、規定の相互作用の可能性のあるインヒビターを同定することができる。
【００８２】
「相互作用分子」は、試験するのが望ましい相互作用分子の本質的にいかなる組み合わせでもよい。これらは例えば、多サブユニット複合体のサブユニット、二量体を構成する単量体のペア、リガンドおよびレセプター、酵素および基質またはインヒビター等でよい。
【００８３】
「相互作用方法」は、標的分子に結合できる結合物質によりもむしろ、触媒性標識および基質標識が評価するのが望ましい相互作用分子に付着している点においてのみ標的検出方法と異なっている。従って相互作用方法は、当業者には明白であるように、標的検出方法に関連して上述した特徴に類似した特徴を組み込むことができる。
【００８４】
リアルタイムで相互作用方法を実施するのがとりわけ好ましい。リアルタイムで分子相互作用をモニターする能力はとりわけ創薬の分野において有意な利点を提供する。
【００８５】
試薬キットおよび試薬標識キット
本発明はまた、本発明の標的検出方法または相互作用方法の実施において使用するのに適している試薬キットにも関する。
【００８６】
「標的検出方法」の実施において使用するのに適している試薬キットは、触媒性標識で標識された第１結合物質および基質標識で標識された第２結合物質を含むことができ、触媒性標識は基質標識に直接作用して基質標識において検出可能な変化を生じさせることができることを特徴とする。
【００８７】
「相互作用方法」の実施において使用するのに適している試薬キットは、触媒性標識で標識された第１相互作用分子および基質標識で標識された第２相互作用分子を含むことができ、触媒性標識は基質標識に直接作用して基質標識において検出可能な変化を生じさせることができることを特徴とする。
【００８８】
試薬キットは標的検出方法および相互作用方法に関連して記載したいかなる好ましい特徴も組み込むことができる。触媒性標識および基質標識の好ましい組み合わせは、標的検出方法および相互作用方法の説明において上に列挙したとおりである。
【００８９】
試薬キットは更に、適当な反応バッファーの供給および、基質標識に対する触媒性標識の作用によりもたらされた「検出可能な変化」の検出に必要な試薬も含むことができる。例えば基質標識における活性の「変化」が酵素活性の変化である場合、キットはこの酵素活性を測定するのに使用するためのアッセイ試薬を含むことができる。「変化」が、核酸増幅により検出できるような新規配列の核酸タグの生成である場合、キットは増幅反応に必要な試薬、例えばプライマーセット、増幅酵素、増幅産物を検出するためのプローブ（蛍光またはその他の明らかにする標識で標識されたプローブを含む）、陽性対照増幅鋳型、反応バッファー等を含むこともできる。
【００９０】
本発明はなお更に、触媒性標識が基質標識に直接作用して基質標識において検出可能な変化を生じることができることを特徴とする触媒性標識および基質標識、並びに触媒性標識および基質標識を相互作用分子または結合物質に付着させるための手段を含む試薬標識キットを提供する。
【００９１】
一実施形態では、タグを相互作用分子または結合物質に付着させるための手段は触媒性標識および／または基質標識を結合物質または相互作用分子に架橋することができる化学的試薬でよい。
【００９２】
別の実施形態では、「タグを付着させるための手段」は間接的連結でよい。好ましい型の間接的連結は生物学的結合ペアの成分、例えばビオチン／アビジンまたはビオチン／ストレプトアビジンにより提供される。この実施形態では、触媒性標識および／または基質標識は生物学的結合ペアの片方に抱合され、生物学的結合ペアのもう片方に抱合された結合物質または相互作用分子に連結することが可能になる。キットは予め抱合された触媒性標識および基質標識の供給を含むことができるか、または未だ抱合されていないタグを、結合ペアの片方と触媒性標識または基質標識を抱合させるための手段と一緒に含むことができる。キットは更に、結合ペアの別の片方と予め抱合された結合物質または相互作用分子のいずれか、あるいは結合ペアの別の片方に選択された結合物質または相互作用分子を抱合されるための手段を含む。
【００９３】
生物学的結合ペアの片方を結合物質または相互作用分子に付着させるための手段は（結合ペアの特性に依存して）化学的架橋剤でよい。しかしながら、これは、結合ペアの別の片方との直接融合として、または結合ペアの別の片方の付着を可能にするポリペプチドタグとの融合としてのいずれかの融合タンパク質として、結合物質または相互作用タンパク質を発現するために用いることができる発現ベクターを含むことができる。実例としては、ビオチン化融合タンパク質の発現のためのベクターが当分野で公知であり、そして市販されている（例えばＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州、米国）のＰｉｎＰｏｉｎｔベクター系）。これらのベクターにより、ビオチンカルボキシラーゼ・キャリヤタンパク質のビオチン化ドメインとの融合としてのタンパク質の発現が可能になる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞において融合タンパク質をＡＴＰ依存的酵素反応でビオチン化することができる。従って、試薬標識キットはビオチン化結合物質／相互作用分子タンパク質の発現を可能にするこのようなベクター、加えてストレプトアビジン抱合された触媒性標識および／または基質標識の供給を含むことができる。
【００９４】
本発明は更に添付の図面と一緒に以下の非限定的な実験実施例を参照することにより更に理解されよう。
【実施例１】
【００９５】
ＤＮＡ基質で修飾された結合物質および酵素で修飾された結合物質の近位の接近による検出可能なＤＮＡ修飾の例示
この実験は、標的分子への結合により結合物質を近位に接近させる条件下で、１つの結合物質上のＤＮＡ基質を別の結合物質上のＤＮＡ特異的酵素により検出可能な様式で修飾できることを説明している（図１参照）。この実施例では、１本鎖突出を有するＤＮＡの２本鎖片をビオチン−ストレプトアビジンブリッジを介してポリクローナル抗Ｃ型肝炎コア抗体に連結する。そのコアに特異的な別の抗体をＴ４  ＤＮＡリガーゼで標識する。アッセイでは標的抗原であるＣ型肝炎ウイルスコアタンパク質を最初に固相表面に免疫捕捉させて、そして次に抗体結合を可能にするが、１つの抗体上の酵素が別の抗体上のＤＮＡを修飾することができない条件下で、標識された抗体と共にインキュベートする。抗体抱合体の結合および洗浄による過剰の抱合体の除去の後、抗体／ＤＮＡ抱合体の配列に相補的な１本鎖配列を有するＤＮＡオリゴマーを、ハイブリダイゼーションを可能にするバッファー条件で添加する。各々ＤＮＡおよびリガーゼで標識した２つの抗体が近位に接近している場合、次いでハイブリダイズされたＤＮＡ鎖をライゲートして安定した２本鎖ＤＮＡ分子を形成させ、次いでそれを核酸増幅方法、例えばＰＣＲにより検出できることができる。
【００９６】
ａ）ＤＮＡ抗Ｃ型肝炎コア抗体抱合体の合成
【００９７】
１．  ２つの重複するオリゴヌクレオチドを構築した：
３２２Ｓ１；5’ CGGGCCTCTT GCGGGATATC GTCCATTCCG ACAGCATCGC CAGTCACTAT GGCG 3’
３２２ＡＳ１；5’ ATAGTGACTG GCGATGCTGT CGGAATGGAC GATATCCCGC AAGAGGCCCG 3’
３２２Ｓ１を５’末端でビオチンを用いて合成してストレプトアビジンとの抱合を可能にし、一方３２２ＡＳ１を５’末端でリン酸を用いて合成して続くライゲーションを可能にした。
【００９８】
２．  ４塩基対の１本鎖のリン酸で終結した配列伸長を伴う２本鎖ＤＮＡを形成するために、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中５０ピコモル／μｌの濃度でオリゴを混合し、そして３７℃で１時間インキュベートした。
【００９９】
３．  ２本鎖ＤＮＡ産物をストレプトアビジンと複合化してストレプトアビジン／ＤＮＡ  １：１のモル比で抱合体を形成した。反応物を室温（２２℃）で１時間インキュベートして複合体を形成させた。
【０１００】
４．  この２本鎖ＤＮＡ−ストレプトアビジン複合体を更に、ビオチン化抗体（標準的なビオチン化プロトコールに従ってビオチン化した）をストレプトアビジン／抗体  １：１のモル比で添加することにより抗Ｃ型肝炎コア抗体と複合化した。反応物を室温（２２℃）で１時間インキュベートして最終的な抱合体を形成させた。この実施例では次いで、遊離のストレプトアビジンまたは抗体を何ら先行して除去することなく、抱合体をアッセイ手順で使用した。
【０１０１】
ｂ）リガーゼ−抗Ｃ型肝炎コア抗体抱合体の合成
【０１０２】
１．  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼをＳｉｇｍａ（Ｐｏｏｌｅ、英国）から入手し、そして供給者が推奨する標準的な化学的抱合手順に従って、ヘテロ二官能性試薬ＳＭＣＣ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏ）を用いて抗Ｃ型肝炎コア抗体に連結した。カップリング手順において抗体に対して２：１のモル比のリガーゼを使用した。この実施例では、遊離のリガーゼまたは抗体を何ら先行して除去することなく、抱合体をアッセイ手順で使用した。
【０１０３】
ｃ）以下の工程６で用いる２本鎖ＤＮＡの合成
【０１０４】
１．  ２つの重複するオリゴヌクレオチドを構築した：
ｉ．  ３２２Ｓ２；TGCTGCTAGC GCTATATGCG TTGATGCAAT TTCTATGCGC ACCCGTTCTC GGAGCA 3’
ｉｉ．  ３２２ＡＳ２；5’ TGCTCCGAGA ACGGGTGCGC ATAGAAATTG CATCAACGCA TATAGCGCTA GCAGCACGCC 3’
３２２Ｓ２を５’末端でリン酸を用いて合成して続くライゲーションを可能にした。
【０１０５】
２．  ４塩基対の１本鎖のリン酸で終結した配列伸長を伴う２本鎖ＤＮＡを形成するために、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中５０ピコモル／μｌの濃度でオリゴを混合し、そして３７℃で１時間インキュベートした。
【０１０６】
ｄ）ＨＣＶ組換えコア抗原の検出
【０１０７】
１．  ９６ウェルマイクロプレートのマイクロウェルを５０ｍＭ  炭酸バッファー（ｐＨ９．０）中１０μｇ／ｍｌ  抗Ｃ型肝炎コア抗体でコーティングした（図１のＡ参照）。
【０１０８】
２．  ０．１（ｖ／ｖ）％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＰＢＳバッファー中組換えコア抗原の連続希釈物を調製した。各希釈物１００μｌを抗体コーティングしたマイクロプレートウェル中６０分間インキュベートして捕捉させた（図１のＢ参照）。
【０１０９】
３．  ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．５）、０．１（容量／容量）％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、１ｍＭ  ＥＤＴＡでウェルを３回洗浄した。
【０１１０】
４．  １０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）１００μｌ中抗体抱合体１０ｎｇを加え、そして３０分間インキュベートして抱合体を捕捉された抗原に結合させた（図１のＣ参照）。
【０１１１】
５．  同一バッファーでウェルを３回、そして次にＥＤＴＡおよびＴｗｅｅｎ  ２０不含のバッファーで２回洗浄した。
【０１１２】
６．  次いで、抱合されたＤＮＡの配列に相補的な４塩基対の突出を伴う２本鎖ＤＮＡ１０ｎｇを含有する１０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＡＴＰ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２（ｐＨ７．５）１００μｌを加え、そして３７℃で６０分間インキュベートしてハイブリダイゼーションおよびライゲーションを生じさせた（図１のＤおよびＥ参照）。
【０１１３】
７．  ライゲーションの後、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒで標準的な条件を使用して、「ｈｏｔ−ｓｔａｒｔ」定量ＰＣＲを用いて、新たに共有結合により連結された２本鎖ＤＮＡの生成を調査した。２つのＤＮＡフラグメントがライゲートされている結合部分に渡って増幅するプライマー：３２２ＰＣＲＡＳ  5’ ACGGGTGCGC ATAGAAATTG CATC 3’および３２２ＰＣＲＳ  5’ GCGGGATATC GTCCATTCCG ACAG 3’を使用した。ＰＣＲで増幅されるＤＮＡの量およびＰＣＲが陽性になるときのＰＣＲの時間／サイクルは反応中に存在するライゲートされたＤＮＡフラグメントの数に関係し、これは、今度は、近位に接近させた抗体抱合体の数に関係し、従って捕捉されたＨＣＶコア抗原の数の測定である。
【０１１４】
ｅ）結果
ＰＣＲが陽性になったときの時間およびサイクル数はウェルに捕捉された抗原の量に関係した。この方法により０．１ｆｇほどの少量のＨＣＶコア抗原標的を検出することができた。
【０１１５】
ｆ）考察
この実験により、ＤＮＡ基質で標識された抗体抱合体および検出可能な様式でＤＮＡを修飾するＤＮＡ依存性酵素を用いて高感度な、そして特異的な様式で抗原を検出することができる。
【実施例２】
【０１１６】
２つのＤＮＡ基質で標識された結合物質および酵素で標識された結合物質の近位に接近した結合による検出可能なＤＮＡ修飾の２つの例示
この実験は、結合物質上の２つのＤＮＡ基質を、別の結合物質上のＤＮＡ特異的酵素により、標的分子への結合により近位に接近するようになるような条件下で、検出可能な様式で修飾することができることを説明している（図２参照）。この実施例では、１本鎖配列伸長を有する２つの２本鎖ＤＮＡオリゴマーがビオチン−ストレプトアビジンブリッジを介して標的特異的抗体（ポリクローナル抗Ｃ型肝炎コア抗体）に連結される。別の標的特異的抗体をＴ４  ＤＮＡリガーゼで標識する。このアッセイでは標的抗原は固相に免疫捕捉されており、そして次に抗体結合が可能であるが、１つの抗体上の酵素が別の抗体上のＤＮＡを修飾することはできない条件下で、標識された抗体と共にインキュベートする。抗体抱合体の結合および洗浄による過剰な抱合体の除去の後、次にバッファー条件を変化させてハイブリダイゼーションを可能にする。２つの抗体抱合体（２つのＤＮＡオリゴマーおよびリガーゼに各々抱合されている）が近位に接近している場合、２つのＤＮＡ鎖がライゲートして安定した２本鎖ＤＮＡ産物が生じ、次いでＰＣＲなどの核酸増幅法によりこれを検出できる。
【０１１７】
ａ）ＤＮＡ−抗Ｃ型肝炎コア抗体抱合体の形成
【０１１８】
１．  ２つの重複するオリゴヌクレオチドを構築した：
３２２Ｓ１；5’ CGGGCCTCTT GCGGGATATC GTCCATTCCG ACAGCATCGC CAGTCACTAT GGCG 3’
３２２ＡＳ１；5’ ATAGTGACTG GCGATGCTGT CGGAATGGAC GATATCCCGC AAGAGGCCCG 3’
３２２Ｓ１を５’末端でビオチンを用いて合成してストレプトアビジンとの抱合を可能にし、一方３２２ＡＳ１を５’末端でリン酸を用いて合成して続くライゲーションを可能にした。
【０１１９】
２．  ４塩基対の１本鎖のリン酸で終結した配列伸長を伴う２本鎖ＤＮＡを形成するために、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中５０ピコモル／μｌの濃度でオリゴを混合し、そして３７℃で１時間インキュベートした。
【０１２０】
３．  ２つの別の重複するオリゴヌクレオチドを構築した：
３２２Ｓ２；TGCTGCTAGC GCTATATGCG TTGATGCAAT TTCTATGCGC ACCCGTTCTC GGAGCA 3’
３２２ＡＳ２；5’ TGCTCCGAGA ACGGGTGCGC ATAGAAATTG CATCAACGCA TATAGCGCTA GCAGCACGCC 3’
３２２Ｓ２を５’末端でリン酸を用いて合成して続くライゲーションを可能にした。
【０１２１】
４．  ４塩基対の１本鎖のリン酸で終結した配列伸長を伴う２本鎖ＤＮＡを形成するために、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中５０ピコモル／μｌの濃度でオリゴを混合し、そして３７℃で１時間インキュベートした。
【０１２２】
５．  ２つのＤＮＡおよびストレプトアビジンを等モル濃度で混合することによりこれらの２本鎖ＤＮＡ生成物をストレプトアビジンに連結させた。反応物を室温で１時間インキュベートして複合体形成を生じさせた。
【０１２３】
６．  この２本鎖ＤＮＡ−ストレプトアビジン複合体を、ビオチン化抗体（標準的なビオチン化プロトコールに従ってビオチン化した）をストレプトアビジンに対して１：１のモル比で添加することにより抗Ｃ型肝炎コア抗体と複合化した。反応物を室温で１時間インキュベートして複合体形成を生じさせた。この実施例では、遊離のストレプトアビジンまたは抗体を何ら除去することなく、抱合体をアッセイにおいて使用した。
【０１２４】
ｂ）リガーゼ−抗Ｃ型肝炎コア抗体抱合体の形成
【０１２５】
１．  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼをＳｉｇｍａ（Ｐｏｏｌｅ、英国）から入手し、そして供給者が推奨する標準的な化学的抱合手順に従って、ヘテロ二官能性試薬ＳＭＣＣ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏ）を用いて抗Ｃ型肝炎コア抗体に連結した。カップリング手順において抗体に対して２：１のモル比のリガーゼを使用した。この実施例では、遊離のリガーゼまたは抗体を何ら先行して除去することなく、抱合体をアッセイ手順で使用した。
【０１２６】
ｃ）ＨＣＶ組換えコア抗原の検出
【０１２７】
１．  ９６ウェルマイクロプレートのマイクロウェルを５０ｍＭ  炭酸バッファー（ｐＨ９．０）中１０μｇ／ｍｌ  抗Ｃ型肝炎コア抗体でコーティングした（図２のＡ参照）。ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．２）、０．１（ｖ／ｖ）％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、１ｍＭ  ＥＤＴＡで組換えコア抗原の連続希釈物を調製し、各希釈物１００μｌをコーティングしたウェル中６０分間インキュベートして捕捉させた（図２のＢ参照）。
【０１２８】
２．  ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．２）、０．１（ｖ／ｖ）％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、１ｍＭ  ＥＤＴＡでウェルを３回洗浄した。
【０１２９】
３．  １０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）１００μｌ中各抗体抱合体１０ｎｇを加え、そして３０分間インキュベートして抗体抱合体を抗原に結合させた（図２のＣ参照）。
【０１３０】
４．  同一バッファーでウェルを３回、そして次にＥＤＴＡおよびＴｗｅｅｎ  ２０不含のバッファーで２回洗浄した。
【０１３１】
５．  次いで１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＡＴＰ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２（ｐＨ７．５）１００μｌを加え、そして３７℃で６０分間インキュベートしてハイブリダイゼーション、ライゲーションおよび共有結合で連結されたＤＮＡフラグメントの形成を生じさせた（図２のＤ参照）。
【０１３２】
６．  ライゲーションの後、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒで標準的な条件を使用して、「ｈｏｔ−ｓｔａｒｔ」定量ＰＣＲを用いて、共有結合により連結された２本鎖ＤＮＡの生成を調査した。２つのＤＮＡフラグメントが結合されている結合部分に渡って増幅するプライマー：３２２ＰＣＲＡＳ  5’ ACGGGTGCGC ATAGAAATTG CATC 3’および３２２ＰＣＲＳ  5’ GCGGGATATC GTCCATTCCG ACAG 3’を使用した。ＰＣＲで増幅されるＤＮＡの量および反応が陽性になるときのＰＣＲの時間／サイクルは反応中に存在するライゲートされたＤＮＡフラグメントの数に関係し、これは、今度は、近位に接近するようになった抗体抱合体の数に関係し、従って捕捉されたＨＣＶコア抗原分子の数の測定である。
【０１３３】
ｄ）結果
ＰＣＲが陽性になったときの時間およびサイクル数はウェルに捕捉された抗原の量に関係した。この方法により０．２ｆｇほどの少量の抗原標的を検出することができた。
【０１３４】
ｅ）考察
この実験により、検出可能な過程でＤＮＡを修飾する２つのＤＮＡ基質およびＤＮＡ依存性酵素により各々標識された抗体を用いて高感度な、そして特異的な様式で抗原を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】本発明による「標的検出」アッセイの概略図である。
【図２】本発明による別の「標的検出」アッセイの概略図である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2005528103.tif 000006
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