(57)【要約】治療上の効果をもたらすために骨格筋へＧＤＮＦをデリバリーするための組成物及び方法が開示される。上記組成物及び方法は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づく遺伝子デリバリー系を用いる。上記方法は、運動ニューロンの疾患、例えば、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療するために有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
運動ニューロン疾患の哺乳類対象の筋肉細胞又は筋肉組織にデリバリーするための医薬の製造における組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ビリオンの使用であって、但し、組換えＡＡＶビリオンは、膠細胞系由来の神経親和性因子（ＧＤＮＦ）をＧＤＮＦの生体内転写及び翻訳を指示できる調節要素に作動可能に連結して含む、上記使用。
【請求項２】
筋肉細胞又は筋肉組織が骨格筋由来である、請求項１記載の使用。
【請求項３】
組換えＡＡＶビリオンが生体内で筋肉細胞に導入される、請求項１又は２記載の使用。
【請求項４】
組換えＡＡＶビリオンが筋肉内注射により導入される、請求項３記載の使用。
【請求項５】
組換えＡＡＶビリオンがインビトロにて筋肉細胞に導入される、請求項１乃至４の何れか１項記載の使用。
【請求項６】
組換えＡＡＶビリオンが生体内で筋肉細胞に導入される、請求項１乃至４の何れか１項記載の使用。
【請求項７】
運動ニューロン疾患が筋委縮性側索硬化症である、請求項１乃至６の何れか１項記載の使用。
【請求項８】
運動ニューロン疾患の哺乳類対象の筋肉細胞又は筋肉組織にデリバリーするための医薬の製造における組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ビリオンの使用であって、但し、組換えＡＡＶビリオンは、膠細胞系由来の神経親和性因子（ＧＤＮＦ）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ＧＤＮＦの生体内転写及び翻訳を指示できる発現調節要素に作動可能に連結して含むことにより治療効果を提供する、上記使用。
【請求項９】
対象がヒトであり、そしてポリヌクレオチドがヒトＧＤＮＦをコードする、請求項８記載の使用。
【請求項１０】
ポリヌクレオチドがヒトプレプロＧＤＮＦをコードする、請求項９記載の使用。
【請求項１１】
調節要素がウイルスプロモーターを含む、請求項８乃至１１の何れ１項記載の使用。
【請求項１２】
プロモーターがＭＬＰ，ＣＭＶ，又はＲＳＶのＬＴＲプロモーターである、請求項１１記載の使用。
【請求項１３】
筋肉細胞が生体内で形質導入される、請求項８乃至１２の何れか１項記載の使用。
【請求項１４】
組換えＡＡＶビリオンが対象の骨格筋に投与される、請求項１３記載の使用。
【請求項１５】
運動ニューロン疾患が筋委縮性側索硬化症である、請求項１乃至１４の何れか１項記載の使用。
【請求項１６】
運動ニューロン疾患の哺乳類対象の筋肉細胞又は筋肉組織に組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ビリオンをデリバリーする方法であって、
（ａ）膠細胞系由来の神経親和性因子（ＧＤＮＦ）をコードするポリヌクレオチドを、ＧＤＮＦの生体内転写及び翻訳を指示できる発現調節要素に作動可能に連結して含む，組換えＡＡＶビリオンを用意し；そして
（ｂ）当該組換えＡＡＶビリオンを、直接対象の筋肉細胞又は筋肉組織にデリバリーすることにより哺乳類対象において治療効果を提供するレベルにてＧＤＮＦが発現されること
を含む、上記方法。
【請求項１７】
筋委縮性側索硬化症のヒト対象の骨格筋に組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ビリオンをデリバリーする方法であって、
（ａ）膠細胞系由来の神経親和性因子（ＧＤＮＦ）をコードするポリヌクレオチドを、ＧＤＮＦの生体内転写及び翻訳を指示できる発現調節要素に作動可能に連結して含む、組換えＡＡＶビリオンを用意し；そして
（ｂ）当該組換えＡＡＶビリオンを、直接、生体内で対象の骨格筋にデリバリーすることにより、ヒト対象において治療効果を提供するレベルにてＧＤＮＦが発現されること
を含む、上記方法。
【請求項１８】
運動ニューロン疾患の哺乳類対象を治療する方法であって、対象の筋肉内へ、膠細胞系由来の神経親和性因子（ＧＤＮＦ）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ＧＤＮＦの生体内転写及び翻訳を指示できる発現調節要素に作動可能に連結して含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ビリオンを投与することにより、治療効果を提供することを含む、上記方法。
【請求項１９】
筋委縮性側索硬化症の哺乳類対象を治療する方法であって、対象の骨格筋へ、膠細胞系由来の神経親和性因子（ＧＤＮＦ）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ＧＤＮＦの生体内転写及び翻訳を指示できる発現調節要素に作動可能に連結して含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ビリオンを含む組成物を投与することにより、治療効果を提供することを含む、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
技術分野
本発明は、遺伝子デリバリーの組成物及び方法に関する。特定すれば、本発明は、運動ニューロン疾患、例えば、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療するための、膠細胞系由来の神経親和性因子（ＧＤＮＦ）の骨格筋へのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づく遺伝子デリバリー系に関する。
発明の背景
運動ニューロンの神経変性疾患は主要な公的な健康問題を差し出す。例えば、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、運動ニューロンの選択的な絶滅を含む残忍な進行性の致死性疾患である。家族性ＡＬＳの約２０％がＣｕ／Ｚｎスーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ１）遺伝子の変異にリンクしている（Ｊｕｌｉｅｎ，Ｊ．Ｐ．，Ｃｅｌｌ（２００１）１０４：５８１−５９１）。この変異遺伝子を過剰発現するトランスジェニックマウス（ｍＳＯＤ１Ｇ９３Ａ）は、家族性ＡＬＳの臨床上及び病理学上の特性の多くを有する、主に遺伝性の成人において開始する麻酔性障害を発症する（Ｇｕｒｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４）２６４：１７７２−１７７５）。しかしながら、現在まで、ＡＬＳの運動ニューロンの変性を導く分子機構及びほとんどの運動ニューロン疾患は、現在のところほとんど理解されていない。ＡＬＳの運動ニューロンの変性を導く機構が知られていないため、ＡＬＳを予防及び治癒させるために利用可能な治療法は現在のところ存在しない。
【０００２】
膠細胞系由来の神経親和性因子（ＧＤＮＦ）は、脊髄の運動ニューロンの増殖、分化、及び生存のためのもっとも有力な神経親和性因子であることが示された。ＧＤＮＦ及びＧＤＮＦのｍＲＮＡレベルは、ＡＬＳ，多発性筋炎（ＰＭ）及び筋ジストロフィー（ＭＤ）のように神経を除去した筋肉においてか又は末梢神経損傷等の後では、アップ制御されることが報告された（Ｔｒｕｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（１９９５）１３０：１３７−１４８；Ｌｉｅ  ａｎｄ  Ｗｅｉｓ，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．（１９９８）２５０：８７−９０；Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．（１９９９）２４：７８５−７９０）。ＧＤＮＦは運動ニューロン疾患を治療するための治療剤として提案された（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４）２６６：１０６２−１０６４；Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９５）３７３：３４４−３４６；Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９５）３７３：３４１−３４４；Ｓａｇｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（１９９６）１６：２３３５−２３４１；Ｂｏｈｎ，Ｍ．Ｃ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９９９）５７：１３５−１４２；Ｍｏｈａｊｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（１９９９）１０：１８５３−１８６６）。ＧＤＮＦのような神経親和性因子は、運動ニューロンの変性を遅延させ、そしてまだ生ている非機能性運動ニューロンの機能を回復させることが示された（Ｔｒｕｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（１９９５）１３０：１３７−１４８；Ｓａｇｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（１９９８）１８：１１３２−１１４１；Ｌｉｅ  ａｎｄ  Ｗｅｉｓ，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．（１９９８）２５０：８７−９０；Ｂａｕｍａｇａｒｔｎｅｒ  ａｎｄ  Ｓｈｉｎｅ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．（１９９８）５４：７６６−７７７；Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．（１９９９）２４：７８５−７９０；Ｂｉｅｓｃｈ  ａｎｄ  Ｔｕｓｚｙｎｓｋｉ，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．（２００１）４３６：３９９−４１０；Ｋｅｌｌｅｒ−Ｐｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００１）２１：６１３６−６１４６）。
【０００３】
現在まで、しかしながら、組換えＧＤＮＦ、並びに他の神経親和性因子、例えば繊毛状の神経親和性因子（ＣＮＴＦ）、脳由来の神経親和性因子（ＢＤＮＦ）及びインスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）の繰り返しの投与を用いた臨床試験は限界を示すか又は裏付けがなく、及び／又は重度の副作用をもたらした（Ｙｕｅｎ，Ｅ．Ｃ．，Ｐｈｙｓ．Ｍｅｄ．Ｒｅｈａｂｉｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎ．Ａｍ．（２００１）１２：２９３−３０６）。特に、これらの蛋白質は短い生体内血漿半減期を有し、脊髄の運動ニューロンに対して乏しい接近性しか有さず、そして十分な用量における投与を妨害する炎症性の反応を引き起こす（Ｈａａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．（１９９７）３：４２９−４３６；Ａｌｉｓｋｙ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（２０００）１１：２３１５−２３２９）。これらの限界は、ほとんどの運動ニューロン変性性疾患の慢性的性質及び進行性の性質と共に、神経親和性因子の運動ニューロンへのより有効かつ長期間のデリバリーを提供する革新的な戦略を開発する必要性を強調する。上記の問題を克服する試みにおいて、実験者らは、ＡＬＳを治療するために遺伝子治療のアプローチを研究した（Ａｌｉｓｋｙ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（２０００）１１：２３１５−２３２９）。遺伝子を修飾された筋原細胞に基づくＧＤＮＦ遺伝子の筋肉内デリバリーは、脊髄の運動ニューロンの損失を阻止し、そしてトランスジェニックマウスの家族性ＡＬＳモデルにおいて上記疾患の開始を遅延させた（Ｍｏｈａｊｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（１９９９）１０：１８５３−１８６６）。しかしながら、処置した筋肉内のＧＤＮＦ蛋白質のレベルは検出不可能であった。
【０００４】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はヒトにおける臨床試験において遺伝子治療のために遺伝子をデリバリーする裏付けを示した（例えば、Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．（２０００）２４：２５７−２６１）。非病原性且つ複製欠損性のウイルスに基づいた単独のウイルスベクター系として、組換えＡＡＶビリオンを用いて、様々な組織において増殖性細胞及び末期分化細胞の両方の、有効且つ持続した遺伝子の運搬を確立するのに成功した（Ｂｕｅｌｅｒ，Ｈ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９９）３８０：６１３−６２２）。これらの成功にも拘わらず、運動ニューロン疾患、例えばＡＬＳを治療するためのＡＡＶ媒介性ＧＤＮＦ遺伝子治療は証明されていない。
【０００５】
ＡＡＶゲノムは約４６８１ヌクレオチドを含む直鎖の一本鎖ＤＮＡ分子である。ＡＡＶゲノムは一般的に、インバーテッドターミナルリピート（ＩＴＲｓ）を各末端の周囲に有する内部非反復ゲノムを含む。当該ＩＴＲｓは約１４５塩基対の長さである。当該ＩＴＲｓは複数の機能を有し、ＤＮＡ複製起点としての機能、及びウイルスゲノムのパッケージングシグナルとしての機能を含む。ゲノムの内部非反復部分は２つの大きなオープンリーディングフレームを含み、ＡＡＶ複製（ｒｅｐ）及びキャプシッド（ｃａｐ）遺伝子として知られる。ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子はウイルスが複製してビリオンへパッケージされることを許容するウイルス蛋白質をコードする。特に、少なくとも４つのウイルス蛋白質のファミリー、Ｒｅｐ７８，Ｒｅｐ６８，Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０がＡＡＶのｒｅｐ領域から発現され、それらの見かけ上の分子量に従い命名されている。ＡＡＶのｃａｐ領域は少なくとも３つの蛋白質、ＶＰ１，ＶＰ２及びＶＰ３をコードする。
【０００６】
ＡＡＶゲノムの内部の非反復部分を除去し（即ち、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子）、そしてＩＴＲｓ間の異種遺伝子を挿入することによりＡＡＶを工作して、目的の遺伝子をデリバリーさせた。異種遺伝子は、典型的には、適当な条件下で患者の標的細胞内で遺伝子発現を推進できる異種プロモーター（構成的、細胞特異性、又は誘導可能性）に、機能するように連結される。末端のシグナル、例えばポリアデニル化部位を含ませることもできる。
【０００７】
ＡＡＶはヘルパー依存性ウイルスである；それはＡＡＶビリオンを形成するのに、ヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス又はワクシニア）との同時感染を必要とする。ヘルパーウイルスとの同時感染が無いと、ＡＡＶはウイルスゲノムを宿主細胞染色体に挿入するが感染性ビリオンを生成しない潜伏状態に落ち着く。ヘルパーウイルスによるのちの感染が組込まれたゲノムを「救済し」、それが複製して感染性ＡＡＶビリオンにそのゲノムをパッケージすることを許容する。ＡＡＶは異なる種からの細胞に感染することができるが、ヘルパーウイルスは宿主細胞と同じ種のものでなければならない。即ち、例えば、ヒトＡＡＶは、イヌアデノウイルスを同時感染させたイヌ細胞中で複製することになる。
【０００８】
しかしながら、本発明以前に、運動ニューロン疾患、例えばＡＬＳの治療のためのＡＡＶ媒介性のＧＤＮＦのデリバリーは成功していなかった。
発明の概要
従って、本発明は、運動ニューロンに影響する神経変性性疾患を治療するための有力且つ有効な方法を提供する。本明細書に示すとおり、骨格筋はＡＡＶ媒介性ＧＤＮＦデリバリーに特に有用である。骨格筋は形質導入可能性が高く、容易に接近可能であり、そして低い細胞代謝回転を示す（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０００）９７：１３７１４−１３７１９；Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９６）７０：８０９８−８１０８）。神経末端は様々な物質に対するバリアーが存在しない神経筋肉接合点（ＮＭＪｓ）において筋繊維とのみ接触し、中枢神経系にそれらを到達させるのを可能にする。神経栄養理論に従えば、神経突起はそれらの標的に接合することにより、ニューロンの生存のために標的由来の神経栄養性因子への接近を獲得する。標的由来の神経栄養因子として、骨格筋により製造される内因性のＧＤＮＦは、脊髄の中の標的筋肉組織から運動ニューロン細胞体への逆行性軸索輸送を通して機能する（Ｍｉｔｓｕｍｏｔｏ，Ｈ．，Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ（１９９９）２２：１０００−１０２１）。発明者らは、本発明において、筋肉内投与を通したＡＡＶ媒介性ＧＤＮＦ遺伝子デリバリーが多数の筋繊維の中でＧＤＮＦの実質上の持続性発現を推進することを発見した。さらに、発現されたＧＤＮＦは筋肉内の神経末端から脊髄の運動ニューロンへ逆行輸送される。重要なことに、発明者らは、本発明において、ＡＬＳ動物モデルにおける研究を通して、骨格筋によるＡＡＶ媒介性ＧＤＮＦデリバリーが疾患の発症を顕著に遅らせ、生存期間を延長させ、行動上の欠陥を軽減させ、そして運動ニューロンの生存を促進することを発見した。
【０００９】
従って、一つの態様において、発明は、組換えＡＡＶビリオンを運動ニューロン異常の哺乳類対象の筋肉細胞又は筋肉組織にデリバリーする方法に向けられる。当該方法は、
（ａ）ＧＤＮＦの生体内転写及び翻訳を指示することができる調節要素に作動可能に連結させたＧＤＮＦをコードするポリヌクレオチドを含む組換えＡＡＶビリオンを用意し；そして
（ｂ）対象の筋肉細胞又は筋肉組織に、直接、組換えＡＡＶビリオンをデリバリーし、それにより哺乳類対象において治療効果を提供するレベルにＧＤＮＦが発現されること
を含む。
【００１０】
特定の態様において、筋肉細胞又は組織は、骨格筋由来である。また別の態様において、組換えＡＡＶビリオンは生体内で筋肉細胞へ、例えば細胞内注射により、導入される。追加の態様において、組換えＡＡＶビリオンは、インビトロにて筋肉細胞に導入される。またさらなる態様において、運動ニューロンの異常は筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である。
【００１１】
別の態様において、発明は、ＡＬＳのヒト対象の骨格筋へ組換えＡＡＶビリオンをデリバリーさせる方法に向けられる。当該方法は、
（ａ）ＧＤＮＦの生体内転写及び翻訳を指示することができる調節要素に作動可能に連結させたＧＤＮＦをコードするポリヌクレオチドを含む組換えＡＡＶビリオンを用意し；そして
（ｂ）ヒト対象の筋肉細胞又は筋肉組織に、直接、組換えＡＡＶビリオンをデリバリーし、それによりヒト対象において治療効果を提供するレベルにＧＤＮＦが発現されること
を含む。
【００１２】
また別の態様において、発明は、治療効果を提供するためにＧＤＮＦの生体内転写及び翻訳を指示することができる調節要素に作動可能に連結させたＧＤＮＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ビリオンを、対象に筋肉内投与することを含む、運動ニューロン異常の哺乳類対象を治療する方法に向けられる。
【００１３】
特定の態様において、運動ニューロン異常はＡＬＳである。追加の態様において、対象はヒトであり、そしてポリヌクレオチドはヒトＧＤＮＦ、例えばヒトプレプロＧＤＮＦをコードする。さらに、調節要素は、ウイルスプロモーター、例えばＭＬＰ，ＣＭＶ，又はＲＳＶ  ＬＴＲプロモーターを含み得る。さらに追加の態様において、筋肉細胞は、例えば骨格筋への投与により、生体内で形質導入される。
【００１４】
別の態様において、発明は、ＡＬＳの哺乳類対象を治療する方法に向けられる。当該方法は、治療効果を提供するためにＧＤＮＦの生体内転写及び翻訳を指示することができる調節要素に作動可能に連結させたＧＤＮＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ビリオンを含む組成物を、対象の骨格筋に投与することを含む。
【００１５】
特定の態様において、対象はヒトであり、そしてポリヌクレオチドはヒトＧＤＮＦ、例えばヒトプレプロＧＤＮＦをコードする。さらに、調節要素は、ウイルスプロモーター、例えばＭＬＰ，ＣＭＶ，又はＲＳＶ  ＬＴＲプロモーターを含み得る。
【００１６】
対象の発明のこれら及び他の態様は、本明細書の開示により当業者の心に浮かぶことになる。
発明の詳細な説明
本発明の実施は、他に示さない限り、当業者の範囲内の、ウイルス学、微生物学、分子生物学及び組換えＤＮＡ技術の慣用の方法を用いることになる。そのような技術は、文献において完全に記載される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（最新版）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌ．Ｉ  ＆  ＩＩ（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編纂）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ，編纂、最新版）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，編纂、最新版）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，編纂、最新版）；ｃｒｃ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，ｖｏｌ．Ｉ  ＆  ＩＩ（Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ，編纂）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第２版、ｖｏｌ．Ｉ  ＆  ＩＩ（Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，編纂）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ．Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（Ｗｏｌｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，第３版）；及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ）を参照されたい。
【００１７】
本明細書及び特許請求の範囲にて使用される、単数形「ａ」「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、他に明確に指図しない限り、複数形表示を含む。
Ａ．定義
本発明を記載するに際して、以下の用語を用い、以下に示すとおりに定義されることを意図する。
【００１８】
本明細書にて使用される、用語「膠細胞系由来の神経親和性因子ポリペプチド」又は「ＧＤＮＦポリペプチド」は、あらゆる起源の神経親和性因子を指し、あらゆる様々な公知のＧＤＮＦに実質上及び機能上均等である。３つの哺乳類種の代表的ＧＤＮＦを図７、８及び９に示す。ラット（図８、配列番号：４）とヒト（図７、配列番号：２）蛋白質の間の相同性の程度は約９３％であり、そして全ての哺乳類のＧＤＮＦは類似の高い度合いの相同性を有する。そのようなＧＤＮＦは、それらの生物活性形態において、モノマー、ダイマー又は他のマルチマーとして存在するかもしれない。即ち、本明細書にて使用される用語「ＧＤＮＦポリペプチド」は、活性なモノマーＧＤＮＦ、並びに活性マルチマーＧＤＮＦ、活性なグリコシル化された形態及び非グリコシル化形態のＧＤＮＦ及び当該分子の末端削除型を包含する。
【００１９】
本明細書にて使用される「機能上均等な」は、運動ニューロンに関しての生物学上の特性のいくつか又は全てを保持するが、必ずしも天然ＧＤＮＦ分子と同じ程度ではない、ＧＤＮＦポリペプチドを意味する。
【００２０】
「相同性」は、２つのポリヌクレオチド又は２つのポリペプチドの間の類似性パーセントを意味する。２つのポリヌクレオチド又は２つのポリペプチドの配列が少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％−８５％，好ましくは少なくとも約９０％、そしてもっとも好ましくは少なくとも約９５％−９９％又はそれ以上の配列類似性又は配列同一性を分子の規定された長さにわたり有する場合、それらは互いに「実質上相同」である。本明細書にて使用される、実質上相同は、特定されたポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列に対して完全同一性を示す配列をも意味する。
【００２１】
一般的に、「同一性（identity）」は、２つのポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列の正確なそれぞれヌクレオチド対ヌクレオチド又はアミノ酸対アミノ酸の対応を意味する。同一性パーセントは、配列を並べ（aligning）、２つの並べられた配列間の適合の正確な数をカウントし、短い方の配列の長さで割り、そして結果を１００倍することにより、２つの分子の間の配列情報の直接の比較により、決定することができる。
【００２２】
容易に利用可能なコンピュータープログラムは、類似性及び同一性の分析の補助のために使用することができ、例えば、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編纂、補遺５  ３：３５３−３５８、Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣの中のＡＬＩＧＮ，Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．であり、ペプチド分析のためにＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２−４８９，１９８１の局所相同性アルゴリズムを適応させる。ヌクレオチド配列の類似性及び同一性を決定するためのプログラムは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，バージョン８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、例えば、ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ及びＧＡＰにおいて利用可能であり、これらもＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムに依存する。これらのプログラムは製造者により勧められ、そして上記のＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅにおいて記載された欠点パラメーターを用いて容易に利用可能である。例えば、特定のヌクレオチド配列のレファレンス配列に対する類似性パーセントは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎの相同性アルゴリズムに、欠点スコアリング表及び６ヌクレオチド位置のギャップペナルティを用いることにより、決定することができる。
【００２３】
発明のコンテクストにおいて類似性パーセントを確立するための別の方法は、Ｊｏｈｎ  Ｆ．Ｃｏｌｌｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｎｅ  Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋにより開発され、エジンバラ大学が著作権を有し、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）により配給されるプログラムのＭＰＳＲＣＨパッケージを使用することである。この一揃いのパッケージから、  Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用することができ、その際、欠点パラメーターを上記スコアリング表に用いる（例えば、１２のギャップオープンペナルティ、１のギャップ伸長ペナルティ、及び６のギャップ）。生成されたデータから、「Ｍａｔｃｈ」の値は「配列類似性」を反映する。配列間の同一性パーセント又は類似性パーセントを計算するための他の適当なプログラムは、当業界において一般的に知られており、例えば、別のアラインメントプログラムはＢＬＡＳＴであり、欠点パラメーターを使用する。例えば、ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰは以下の欠点パラメーターを用いて使用することができる：遺伝子コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記載＝５０配列；ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥによる分類；データベース＝非重複、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ翻訳＋Ｓｗｉｓｓプロテイン＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は以下のインターネットアドレス：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴに見出すことができる。
【００２４】
あるいは、相同領域間で安定な二重鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、続く一本鎖特異的ヌクレアーゼによる消化、及び消化された断片のサイズ決定により、相同性を決定することができる。実質相同なＤＮＡ配列は、その特定の系に関して規定されるとおりに、例えばストリンジェントな条件下でサザンハイブリダイゼーション実験により同定することができる。適当なハイブリダイゼーション条件を規定することは、当業者の範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，前掲；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，前掲；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，前掲を参照されたい。
【００２５】
「ＧＤＮＦバリアント」は、レファレンスＧＤＮＦ分子の生物学上活性な誘導体、又は所望の活性、例えば本明細書におけるニューロン親和活性を保持したそのような誘導体の一部を意味する。一般的に、用語「バリアント」は、天然分子と比較して、一つ又はそれより多いアミノ酸の付加、置換（一般的には性質上保存的）及び／又は欠失を有する天然ポリペプチドの配列及び構造を有する化合物であって、上記修飾がニューロン親和性活性を破壊しない限りにおいての、化合物を意味する。好ましくは、バリアントは、天然分子と同じ生物活性を少なくとも有する。ＧＤＮＦバリアントをコードするポリペプチドを作成する方法は当業界公知であり、以下においてさらに記載される。
【００２６】
ＧＤＮＦ欠失バリアントに関して、欠失は一般的に約１から３０の残基、より通常には約１から３０残基、そして典型的には約１から５の連続する残基、又は上記の範囲内のあらゆる整数の範囲にわたる。Ｎ末端、Ｃ末端及び内部の欠失が意図される。欠失は、一般的には、最大限の生物活性を保存するために、他のＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーとの間で低い相同性の領域に導入される。欠失は、典型的には、影響されるドメイン、例えばシステイン架橋においてＧＤＮＦ蛋白質生成物の三次元構造を保存するために選択される。欠失バリアントの非限定例は、ＧＤＮＦの１−４０のＮ末端アミノ酸を欠く末端削除型ＧＤＮＦ蛋白質生成物、又はＧＤＮＦのＣ末端残基を欠くバリアント又はそれらの組み合わせを含む。
【００２７】
ＧＤＮＦの付加バリアントに関しては、１残基から１００又はそれより多い残基を含むポリペプチドの長さのＮ末端及び／又はＣ末端の融合、並びに１又は複数のアミノ酸残基の内部の付加を含む。内部付加は、一般的に、約１−１０残基、より典型的には約１−５残基、そして通常は約１−３のアミノ酸残基、又は上記の範囲内のあらゆる整数の範囲にわたる。Ｎ末端付加の例は、ＧＤＮＦのＮ末端への異種Ｎ末端シグナル配列の融合、並びに他のニューロン親和性因子由来のアミノ酸配列の融合を含む。
【００２８】
ＧＤＮＦ置換バリアントは、ＧＤＮＦアミノ酸配列の少なくとも一つのアミノ酸残基が除去されて、その場所に異なるアミノ酸残基が挿入されている。そのような置換バリアントは、アミノ酸の変化をもたらしてももたらさなくてもよい、種集団における天然に生じるヌクレオチド配列変化により特徴付けされる、対立遺伝子バリアントを含む。特に好ましい置換体は、性質が保存されており、即ち、それらの側鎖に関連があるアミノ酸のファミリーの中で生じる置換体である。特定すれば、アミノ酸は、一般的には次の４つのファミリーに分類される：酸性−−アスパラギン酸及びグルタミン酸；（２）塩基性−−リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性−−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；及び（４）非電荷極性−−グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは、ときどき、芳香族アミノ酸に分類される。例えば、ロイシンからイソロイシン又はバリンへ、アスパラギン酸からグルタミン酸へ、スレオニンからセリンへの孤立した（isolated）置換又はアミノ酸の構造上関連があるアミノ酸への類似の保存的置換は、生物学上の活性に主な作用は有さない。
【００２９】
例えば、ＧＤＮＦ分子は、分子の所望の機能が保持される限り、約５−１０までの保存的又は非保存的アミノ酸置換、又は約１５−２５までの保存的又は非保存的アミノ酸置換さえ、あるいは５−２５の間の任意の整数を含んでよい。当業者は、当業界でよく知られた技術を用いることにより変化を寛容することができる目的分子の領域を容易に決定してよい。
【００３０】
ＧＤＮＦのアミノ酸配列の特定の変異は、グリコシル化部位（例えば、セリン、スレオニン、又はアスパラギン）への修飾を含んでよい。グリコシル化の不在又はほんの一部のグリコシル化は、アスパラギン−リンクのグリコシル化認識部位又はＯ−リンクの糖質の付加により修飾された分子のあらゆる部位におけるアミノ酸の置換又は欠失によりもたらされる。アスパラギン−リンクのグリコシル化認識部位は、適当な細胞性グリコシル化酵素により特異的に認識されるトリペプチド配列を含む。これらのトリペプチド配列は、Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｔｈｒ又はＡｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒであり、式中、ＸａａはＰｒｏ以外の如何なるアミノ酸でもあり得る。グリコシル化認識部位の第１又は第３アミノ酸の一つ又は両方における様々なアミノ酸の置換又は欠失（第２位におけるアミノ酸の欠失）は、修飾されたトリペプチド配列において非グリコシル化をもたらす。即ち、適当な変更されたヌクレオチド配列の発現は、その部位においてグリコシル化されないバリアントを生じさせる。あるいは、ＧＤＮＦアミノ酸配列を修飾して、グリコシル化部位を追加してよい。
【００３１】
変異導入のためにＧＤＮＦアミノ酸残基又は領域を同定する方法は、当業界でよく知られている。そのような方法の一つは、「アラニンスキャニング変異導入」として知られる。例えば、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：１０８１−１０８５を参照。この方法においては、標的残基のアミノ酸残基又はグループを同定し（例えば、電荷を有する残基、例えば、Ａｒｇ，Ａｓｐ，Ｈｉｓ，Ｌｙｓ及びＧｌｕ）、そして中性又は陰性荷電したアミノ酸（もっとも好ましくは、アラニン又はポリアラニン）に置き換えることにより、アミノ酸の、細胞内外の周囲水性環境との相互作用に影響させる。置換に対する機能上の感度を証明するそれらのドメインは、置換の部位において追加又は別の残基を導入することにより洗練させる。即ち、アミノ酸配列のバリエーションを導入するための標的部位を決定し、アラニンスキャニング又はランダム変異導入をＤＮＡ配列の対応する標的コドン上で実施し、そして発現されたＧＤＮＦバリアントを、所望の活性の最適な組み合わせ及び活性の程度に関してスクリーニングする。
【００３２】
変異導入のために多いに興味のある部位は、様々な種からのＧＤＮＦ蛋白質中に見出されるアミノ酸が側鎖の容積（bulk）、電荷及び／又は疎水性に関して実質異なる部位である。興味のある別の部位は、様々な種から選られたＧＤＮＦ様蛋白質の特定の残基が同一である部位である。そのような位置は蛋白質の生物活性に関して一般的には重要である。最初に、これらの部位は、相対的に保存された様式にて置換される。そのような置換が生物学上の活性に変化をもたらすならば、より実質的な変化（具体例の置換）を導入し、及び／又は他の付加又は欠失を作成してよく、結果の生成物を活性に関してスクリーニングする。
【００３３】
ＧＤＮＦ活性のアッセイは当業界公知である。例えば、下でより完全に記載される様々なインビトロモデル系の何れもＧＤＮＦ活性の測定のために使用できる。
「運動ニューロン異常」は、運動機能を有するニューロン、即ち、運動性インパルスを運搬するニューロンを襲う疾患を意味する。そのようなニューロンは、「運動ニューロン」とも呼ばれる。これらのニューロンは、限定ではないが、骨格筋繊維を刺激するアルファ繊維を生じる前方の（anterior）脊髄のアルファニューロン；錘外及び錘内の筋肉繊維を刺激するベータ繊維を生じる前方の脊髄のベータニューロン；筋紡錘体の錘内繊維を刺激するガンマ（紡錘運動）繊維を生じる前方の脊髄のガンマニューロン；求心性インパルスが生じる筋肉以外の筋肉を供給する異側性の（heteronymous）ニューロン；求心性インパルスが生じる筋肉を供給する同側性の（homonymous）ニューロン；その細胞体が脊髄の軸の灰色の柱の中に位置し、そしてその末端が骨格筋内にある下部（lower）末梢ニューロン；介在ニューロンからのインパルスを受取る抹消ニューロン；及び運動皮質から大脳神経の運動核又は脊髄の軸の灰色の柱へインパルスを伝導する大脳皮質内の上部（upper）ニューロンを含む。
【００３４】
運動ニューロン異常の非限定例は、様々な筋萎縮症、例えば遺伝性脊髄筋萎縮を含む遺伝性筋萎縮症、急性幼児期脊髄筋萎縮症、例えばベルドニッヒ−ホフマン（Werdnig-Hoffman）疾患、子供の進行性筋萎縮症、例えば近位、遠位タイプ及び延髄タイプ、近位、肩甲骨腓骨（scapuloperoneal）、顔面肩甲骨上腕骨（facioscapulohumeral）、遠位タイプを含む青年期及び成人の発症、筋委縮性測索硬化症（ＡＬＳ）及び本来の測索硬化症（ＰＬＳ）を含む。当該用語には運動ニューロンの障害も含まれる。
【００３５】
「骨格筋」は、骨に結合しており、且つ、少なくとも一つの関節を一般には横切る平行に走る筋のある筋肉を意味する。科学的には、これらの筋肉は、しばしば、「ムスクリスケレッティ（musculi skeleti）」と呼ばれる。
【００３６】
「ベクター」は、あらゆる遺伝子要素、例えば、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミッド、染色体、ウイルス、ビリオン等を意味し、正確な調節プロモーターに連結させた場合に複製することができ、そして細胞間で遺伝子配列を輸送することができる。即ち、上記の用語は、クローニング媒体及び発現媒体、並びにウイルスベクターを含む。
【００３７】
「ＡＡＶベクター」は、アデノ随伴ウイルス由来のベクターを意味し、限定ではないが、ＡＡＶ−１，ＡＡＶ−２，ＡＡＶ−３，ＡＡＶ−４，ＡＡＶ−５，ＡＡＶ−６，ＡＡＶ−７及びＡＡＶ−８を含む。ＡＡＶベクターは、全部又は一部を欠損したＡＡＶ野生型遺伝子、好ましくはｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子を一つ又はそれより多く有するが、機能する周辺ＩＴＲ配列を保持することができる。機能性ＩＴＲ配列はＡＡＶビリオンのレスキュー、複製及びパッケージングに必要である。即ち、ＡＡＶベクターは、ウイルスの複製及びパッケージングにシスにおいて必要なそれらの配列（例えば、機能性ＩＴＲｓ）を少なくとも含むものと本明細書では定義される。当該ＩＴＲｓは野生型のヌクレオチド配列である必要はなく、当該配列が機能性レスキュー、複製及びパッケージングを提供する限り、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失又は置換により変更されてよい。
【００３８】
「ＡＡＶヘルパー機能」は、次には生産性ＡＡＶ複製に関してトランスに機能するＡＡＶ遺伝子産物を提供するために発現され得るＡＡＶ由来のコーディング配列を意味する。即ち、ＡＡＶヘルパー機能は、主要なＡＡＶオープンリーディングフレーム（ＯＲＦｓ）、ｒｅｐとｃａｐの両方を含む。Ｒｅｐ発現産物は、多くの機能を有することが示され、とりわけ、ＤＮＡ複製の認識、結合及びニッキング；ＤＮＡヘリカーゼ活性；及びＡＡＶ（又は他の異種）プロモーターからの転写の変調を含む。Ｃａｐ発現産物は、必要なパッケージング機能を供給する。ＡＡＶヘルパー機能は、本明細書においては、ＡＡＶベクターから欠落したトランスのＡＡＶ機能を補償することに使用される。
【００３９】
用語「ＡＡＶヘルパー構築物」は、目的のヌクレオチド配列のデリバリーのための形質導入ベクターを生成するのに使用されるＡＡＶベクターから欠損させたＡＡＶ機能を提供するヌクレオチド配列を含む核酸分子を一般には意味する。ＡＡＶヘルパー構築物は、溶解性ＡＡＶ複製に必要な欠落したＡＡＶ機能を補償するためにＡＡＶのｒｅｐ及び／又はｃａｐ）遺伝子の一時的発現を提供するのに使用される；しかしながら、ヘルパー構築物はＡＡＶのＩＴＲｓを欠き、そしてそれらを複製することもパッケージすることもできない。ＡＡＶヘルパー構築物は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミッド、ウイルス、又はビリオンの形態であり得る。Ｒｅｐ及び／又はＣａｐ発現産物をコードする多数のＡＡＶヘルパー構築物及びベクターが記載されてきた。例えば、米国特許第６，００１，６５０号、第５，１３９，９４１号及び第６，３７６，２３７号；Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２８；及びＭｃＣａｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２９３６−２９４５を参照。
【００４０】
用語「アクセサリー機能」は、ＡＡＶがその複製に依存する、非ＡＡＶ由来のウイルス機能及び／又は細胞の機能を意味する。即ち、当該用語は、ＡＡＶ複製に必要な蛋白質及びＲＮＡｓを捕獲し（capture）、ＡＡＶ遺伝子転写、ステージ特異的なＡＡＶのｍＲＮＡのスプライシング、ＡＡＶのＤＮＡ複製、Ｃａｐ発現産物の合成及びＡＡＶキャプシッドアッセンブリーに関与するそれらのモイエティを含む。ウイルスに基づくアッセンブリー機能は、公知のヘルパーウイルス、例えばアデノウイルス、ヘルペスウイルス（ヘルペスシンプレックスウイルスタイプ−１以外）及びワクシニアウイルスのいずれかに由来し得る。
【００４１】
用語「アクセサリー機能ベクター」は、アクセサリー機能を提供するヌクレオチド配列を含む核酸分子を一般には意味する。アクセサリー機能ベクターは、適当な宿主細胞にトランスフェクトでき、宿主細胞中でのＡＡＶビリオンの生成をのちにサポートすることができる。当該用語から表現上除外されるのは、自然界に存在するような感染性ウイルス粒子、例えばアデノウイルス、ヘルペスウイルス、又はワクシニアウイルス粒子である。即ち、アクセサリー機能ベクターはプラスミド、ファージ、トランスポゾン又はコスミッドの形態であり得る。
【００４２】
特に、アデノウイルス遺伝子の完全相補体はアクセサリーヘルパー機能に必要でないことが証明された。特に、ＤＮＡ複製及び後期遺伝子合成ができないアデノウイルスの変異体はＡＡＶ複製に関して許容性であることが示された。Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７０）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．９：２４３；Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ，（１９７１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４５：３１７。同様に、Ｅ２Ｂ及びＥ３領域内の変異体はＡＡＶの複製をサポートすることが示されたため、Ｅ２ＢとＥ３領域はアクセサリー機能を提供することにおそらくは関与しないことを示す。Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １２６：５０５。しかしながら、Ｅ１領域に欠損を有するか又は欠失したＥ４領域を有するアデノウイルスは、ＡＡＶの複製をサポートできない。即ちＥ１Ａ及びＥ４領域は、直接又は間接の何れかにてＡＡＶ複製に必要らしい。Ｌａｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４１：８６８；Ｊａｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１９２５；Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １２６：５０５。他の特性決定されたＡｄ変異体は：Ｅ１Ｂ（Ｌａｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２），前掲；Ｊａｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１），前掲；Ｏｓｔｒｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １０４：５０２）；Ｅ２Ａ（Ｈａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７５）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．２９：２３９；Ｓｔｒａｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１７：１４０；Ｍｅｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：５６７）；Ｅ２Ｂ（Ｃａｒｔｅｒ，Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓ  Ｈｅｐｅｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，Ｉ  ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐａｒｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｓ編纂、１９９０）中；Ｅ３（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３），前掲）；及びＥ４（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３），前掲；Ｃａｒｔｅｒ（１９９５））を含む。Ｅ１Ｂコーディング領域に変異を有するアデノウイルスにより提供されたアクセサリー機能の研究は矛盾する結果を生じたが、Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：２０６−２１０は、最近、Ｅ１Ｂ５５ｋがＡＡＶのビリオンの生産に必要であり、一方、Ｅ１Ｂ１９ｋは必要ないことを報告した。さらに、国際公開ＷＯ９７／１７４５８及びＭａｔｓｈｕｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：９３８−９４５は、様々なＡｄ遺伝子をコードするアクセサリー機能ベクターを記載する。
【００４３】
特に好ましいアクセサリー機能ベクターは、アデノウイルスＶＡ  ＲＮＡコーディング領域、アデノウイルスＥ４  ＯＲＦ６コーディング領域、アデノウイルスＥ２Ａ  ７２ｋＤコーディング領域、アデノウイルスＥ１Ａコーディング領域、及び完全なＥ１Ｂ５５ｋコーディング領域を欠くアデノウイルスＥ１Ｂ領域を含む。そのようなベクターは、国際公開ＷＯ０１／８３７９７に記載されている。
【００４４】
「有効なｒＡＡＶビリオンの生産をサポートすることができる」は、アデノウイルスヘルパーウイルスによる宿主細胞への感染に際して得ることができたものと実質均等か又はそれより大きなレベルにて特定の宿主細胞内でｒＡＡＶビリオンの生産を補償するのに十分なアクセサリー機能をアクセサリー機能ベクター又はアクセサリー機能系が提供する能力を意味する。即ち、アクセサリー機能ベクター又はアクセサリー機能系が有効なｒＡＡＶビリオンの生産をサポートする能力は、アクセサリーベクター又はアクセサリー系を用いて得られるｒＡＡＶビリオンの力価を、感染性アデノウイルスによる感染を用いて得られる力価と比較することにより、決定できる。より特定すれば、アクセサリー機能ベクター又はアクセサリー機能系は、均等な数の宿主細胞から得られるウイルスの量が、アデノウイルス感染を用いて得られる量よりも決して約２００倍を超えないか、より好ましくはアデノウイルス感染を用いて得られる量よりも決して約１００倍を超えないか、そしてもっとも好ましくはアデノウイルス感染を用いて得られる量と実質均等か又はそれより大きい場合に、感染性アデノウイルスを用いて得られるのと実質均等か又はそれより大きな、有効なｒＡＡＶビリオンの生産をサポートする。
【００４５】
「組換えウイルス」は、例えば、異種核酸構築物の粒子への付加又は挿入により、遺伝的に変更されたウイルスを意味する。
「ＡＡＶビリオン」は、完全なウイルス粒子、例えば野生型（ｗｔ）ＡＡＶウイルス粒子（ＡＡＶキャプシッド蛋白質コートを付随した直鎖状一本鎖ＡＡＶ核酸ゲノムを含む）を意味する。このことについて、相補性センスの何れか、例えば「センス」又は「アンチセンス」鎖の何れかの一本鎖ＡＡＶ核酸分子を何れか一つのＡＡＶビリオンにパッケージすることができ、そして両鎖は等しい感染性である。
【００４６】
「組換えＡＡＶビリオン」又は「ｒＡＡＶビリオン」は、本明細書においては、両側にＡＡＶのＩＴＲｓを有する目的の異種ヌクレオチド配列を封入したＡＡＶ蛋白質の殻を含む、感染性複製欠損ウイルスとして定義する。ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶベクター、ＡＡＶヘルパー機能及びそれに導入されたアクセサリー機能を有していた適当な宿主細胞ないで生産される。この様式において、宿主細胞は、ＡＡＶベクター（目的の組換えヌクレオチド配列を含む）をのちの遺伝子デリバリーのために感染性組換えビリオン粒子にパッケージするのに必要なＡＡＶポリペプチドをコードすることができるようにする。
【００４７】
用語「トランスフェクション」は細胞による外来ＤＮＡの取り込みを意味し、外来ＤＮＡが細胞膜の内部に導入された場合に細胞は「トランスフェクトされる」。多数のトランスフェクション技術が当業界において一般的に知られている。例えば、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，及びＣｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｇｅｎｅ  １３：１９７を参照。そのような技術は、一つ又はそれより多い外来ＤＮＡ、例えばヌクレオチド組込みベクター及び他の核酸分子を、適当な宿主細胞に導入するために使用できる。
【００４８】
用語「宿主細胞」は、例えば、微生物、酵母細胞、昆虫細胞、及び哺乳類細胞であって
ＡＡＶヘルパー構築物、ＡＡＶヘルパープラスミド、アクセサリー機能ベクター、又は他の転移ＤＮＡのレシピエントとして使用できるか又は使用されてきたものを意味する。当該用語は、トランスフェクトされたオリジナル細胞の子孫を含む。即ち、本明細書において使用される「宿主細胞」は、外来ＤＮＡ配列をトランスフェクトされた細胞を一般的に意味する。単一の親細胞の子孫は、形態上、又はゲノミック又は全ＤＮＡ相補に関して、自然変異、偶発的変異及び故意の変異のために、オリジナルの親と必ずしも完全に同一でなくてよい。
【００４９】
本明細書において使用される、用語「細胞系」は、連続又は延期されたインビトロにおける生育及び分割が可能な細胞の集団を意味する。しばしば、細胞系は、単一の始原細胞由来のクローン性集団である。自発的変化又は誘導された変化がそのようなクローン性集団の保存又は輸送の間に核型に生じ得ることは、当業界においてさらに知られている。よって、注目された細胞系由来の細胞は、祖先細胞又は培養物と完全に同一でなくてよく、そして注目された細胞系はそのようなバリアントを含む。
【００５０】
用語「異種（heterologous）」は、コーディング配列及び調節配列のような核酸配列に関する場合、普通は連結していない配列、及び／又は普通は特定の細胞に付随しない配列を意味する。即ち、核酸構築物又はベクターの「異種」領域は、自然界においては他の分子と結合して見出されない別の核酸分子の中又は該核酸分子に連結した核酸のセグメントである。例えば、核酸構築物の異種領域は自然界においてコーディング配列に結合して見いだされない配列を周囲に有するコーディング配列を含み得る。異種コーディング配列の別の例は、コーディング配列自体が自然界に見いだされない構築物である（例えば、天然配列とは異なるコドンを有する合成配列）。同様に、普通は細胞内には存在しない構築物により形質転換された細胞はこの発明の目的のためには、異種である。対立遺伝子バリエーション又は自然に生じる変異事象は本明細書においては、異種ＤＮＡを生じない。
【００５１】
「コーディング配列」又は特定の蛋白質を「コードする」配列は、適当な制御配列の調節下におかれたときに、インビトロ又はインビボにおいて転写されて（ＤＮＡの場合）、ポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸配列である。コーディング配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドン及び３’（カルボキシ）末端の翻訳停止コドンにより決定される。コーディング配列は、限定ではないが、原核又は真核のｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、原核又は真核ＤＮＡからのゲノミックＤＮＡ配列、及び合成ＤＮＡ配列さえ含み得る。転写終結配列は、通常、コーディング配列に対して３’に位置する。
【００５２】
「核酸」配列は、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列を意味する。当該用語は、ＤＮＡ及びＲＮＡの公知の塩基アナログの何れをも含む配列を捕らえ、例えば、限定ではないが、４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュードイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルシュードウラシル、１−エンチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノーシルクエオシン、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンチルアデニン、ウラシル−５−オキサロ酢酸メチルエステル、ウラシル−５オキサロ酢酸、オキシブトキソシン、シュードウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、シュードウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、及び２，６−ジアミノプリンである。
【００５３】
用語ＤＮＡ「調節配列」は、プロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流制御ドメイン、複製オリジン、内部リボソームエントリー部位（「ＩＲＥＳ」）、エンハンサー、等を集合して意味し、レシピエント細胞内でのコーディング配列の複製、転写及び翻訳を集合的に提供する。上記の選択されたコーディング配列が適当な宿主細胞内で複製され、転写され、そして翻訳される限り、これらの調節配列の全部が常に存在する必要はない。
【００５４】
用語「プロモーター」は、本明細書においては、その通常のセンスにおいて、ＤＮＡ制御配列を含むヌクレオチド領域を意味し、制御配列はＲＮＡポリメラーゼを結合して、下流の（３’−方向）コーディング配列の転写を開始することができる遺伝子に由来する。転写プロモーターは「誘導可能なプロモーター」（当該プロモーターに作動可能に連結したポリヌクレオチド配列の発現が分析物、コファクター、制御蛋白質等により誘導される）、「抑圧可能なプロモーター」（当該プロモーターに作動可能に連結したポリヌクレオチド配列の発現が分析物、コファクター、制御蛋白質等により誘導される）、及び「構成的プロモーター」を含み得る。
【００５５】
「作動可能に連結された（operably linked）」は、記載された成分が配列されてそれらの通常の機能を実行するような要素の配列を意味する。即ち、コーディング配列の作動可能に連結された調節配列は、コーディング配列の発現をもたらすことができる。調節配列は、それらがその発現を支持するように機能する限り、コーディング配列と連続している必要はない。即ち、たとえば、介在の、非翻訳の、さらに転写されない配列が、プロモーター配列とコーディング配列の間に存在することができ、そしてプロモーター配列はコーディング配列に対して「作動可能に連結」しているとさらに考えることができる。
【００５６】
ヌクレオチド配列に関して言及される場合の「単離された」は、示された分子が同じ種類の他の生物学上のマクロ分子の実質上の不在下で存在することを意味する。即ち、「特定のポリペプチドをコードする単離された核酸分子」は、問題のポリペプチドをコードしない他の核酸分子を実質上含まない核酸分子を意味する；しかしながら、当該分子は組成物の基本的な特性に有害な影響を持たないいくつかの塩基又はモイエティを含んでよい。
【００５７】
本発明を通して特定の核酸分子中のヌクレオチド配列の相対位置を記載するために、特定のヌクレオチド配列が別な配列に対して「上流」、「下流」、「３’」又は「５’」に位置する場合のように、命名されつつあるＤＮＡ分子の「センス」又は「コーディング」鎖の位置は当業界において慣用であることは理解されるべきである。
【００５８】
与えられたＡＡＶポリペプチドの「機能上の相同物」又は「機能上の均等物」は、天然ポリペプチド配列由来の分子、並びに、所望の結果を達成するためにレファレンスＡＡＶ分子に類似の様式にて機能する組換え生産されたか又は化学合成されたポリペプチドを含む。即ち、ＡＡＶのＲｅｐ６８又はＲｅｐ７８の機能上の相同体は、組込み活性が保持される限り、内部又はそのアミノ末端又はカルボキシ末端において起こるあらゆる単一又は複数のアミノ酸の付加、置換及び／又は欠失を含む、それらのポリペプチドの誘導体及びアナログを含む。
【００５９】
与えられたアデノウイルスのヌクレオチド領域の「機能上の相同物」又は「機能上の均等物」は、異種アデノウイルス血清型由来の類似の領域、別のウイルス又は細胞源由来のヌクレオチド領域、並びに、所望の結果を達成するためにレファレンスヌクレオチド領域に類似の様式にて機能する組換え生産されたか又は化学合成されたポリヌクレオチドを含む。即ち、アデノウイルスＶＡ  ＲＮＡ遺伝子領域又はアデノウイルスＥ２ａ遺伝子領域の機能上の相同体は、当該相同体がバックグラウンドを超える検出可能なレベルにおいてＡＡＶビリオンの生産をサポートするようにその固有のアクセサリー機能を提供する能力を保持する限り、上記領域内に起こるあらゆる単一又は複数のヌクレオチドの付加、置換及び／又は欠失を含む、そのような遺伝子の領域の誘導体及びアナログを含む。
【００６０】
「伝達−増強されたデリバリー」は、薬剤のあらゆる非マニュアルデリバリーを意味する。本発明のコンテクストにおいては、ＡＡＶの伝達−増強されたデリバリー（ＣＥＤ）の例は、注入ポンプ又は浸透ポンプにより達成することができる。ＣＥＤのより詳細な説明は以下に見いだされる。
【００６１】
用語「対象（subject）」、「個体（individual）」又は「患者」は本明細書においては交換可能に使用され、脊椎動物、好ましくは哺乳類を意味する。哺乳類は、限定ではないが、マウス、サル、ヒト、農場の動物、変種動物（sport animals）及びペットを含む。
【００６２】
「有効な量」は、有益又は所望の効果をもたらすのに十分な量である。有効な量は、一回又は複数回の投与、塗布（application）又は投薬量にて投与することができる。
Ｂ．一般的方法
本発明は、ＡＡＶベクター媒介性ＧＤＮＦ遺伝子デリバリーが一回の筋肉内注射後にＧＤＮＦの永続性かつ十分な（substantial）発現をもたらすとの驚くべき発見に基づく。本明細書中の実施例に示されるとおり、十分なＧＤＮＦの発現は、多数の筋肉繊維において達成されて、筋肉においてナノグラムレベルに到達し、そして神経筋の接合点に蓄積した。発現は少なくとも１０カ月間存続した。さらに、発現されたＧＤＮＦは、軸索を通して対応する脊髄の運動ニューロンへ逆行して輸送された。トランスジーンＧＤＮＦは、運動ニューロンの変性を予防し、筋肉内へ刺激する軸索を保護し、そして筋肉の萎縮を阻害した。顕著なことに、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）動物モデルにおけるＡＡＶ−ＧＤＮＦの四肢の注射は疾患の開始を延期させ、運動性不全の進行を遅延させ、そして処置された動物において寿命を延長させた。これらの機能上の利益に一致して、著しい組織病理学的な改善、例えば脊髄の運動ニューロンの損失及び萎縮の減少、より頻繁で完全な神経筋接続、及び筋繊維萎縮の減少も観察された。従って、組換えＡＡＶビリオンを通したＧＤＮＦのデリバリーは、運動ニューロン疾患、例えばＡＬＳを治療するための強力且つ有効な方法を提供する。
【００６３】
本明細書に記載される方法は、例えば筋肉内注射による、組換えＡＡＶビリオンの筋肉組織、好ましくは骨格筋への直接の生体内の注射、並びに治療のためにあとで対象に導入され得る筋肉細胞のインビトロ形質導入を提供する。本明細書に記載された方法は、多くの運動ニューロン疾患、例えば何れかの様々な筋萎縮症、例えば遺伝性脊髄筋萎縮を含む遺伝性筋萎縮症、急性幼児期脊髄筋萎縮症、例えばベルドニッヒ−ホフマン（Werdnig-Hoffman）疾患、子供の進行性筋萎縮症、例えば近位、遠位タイプ及び延髄タイプ、近位、肩甲骨腓骨（scapuloperoneal）、顔面肩甲骨上腕骨（facioscapulohumeral）、遠位タイプを含む青年期及び成人の発症、筋委縮性測索硬化症（ＡＬＳ）及び本来の測索硬化症（ＰＬＳ）を治療するのに使用できる。
【００６４】
上記のとおり、ＧＤＮＦは膠細胞において同定されるか又は膠細胞から得られてよい蛋白質であって、神経親和性の活性を呈する蛋白質である。ＧＤＮＦはその天然形態においてホモダイマーとして存在する３９ｋＤａのグリコシル化された蛋白質である。ＧＤＮＦは最初にプレプロＧＤＮＦポリペプチドとして翻訳されて、当該分子のシグナル配列と「プロ」部分の蛋白質分解プロセシングがＧＤＮＦの成熟形態も生産をもたらす。ヒト及び齧歯類においては、単一の遺伝子が異なるスプライスされた形態を生じる。例えば、米国特許第６，３６２，３１９号を参照。両方の形態が、コンセンサスシグナルペプチド配列及び蛋白質分解プロセシングのためのコンセンサス配列を含む。蛋白質分解は同一の成熟１３４アミノ酸残基の形態を生じさせる。即ち、本ＡＡＶベクターにおける使用のためのＧＤＮＦポリペプチドはこれらの形態の一方又は両方をコードしてよく、完全なプロセシング分子、プレ分子、プロ分子、成熟ＧＤＮＦポリペプチド、又はこれらの形態の生物学上活性なバリアントをコードしてよく、上で定義されたとおりである。
【００６５】
多数のＧＤＮＦポリペプチド及びアミノ酸配列が公知である。３つの代表的な哺乳類ＧＤＮＦ配列を本明細書の図７、８及び９に記載する。特に、ヒトＧＤＮＦヌクレオチド及びアミノ酸の配列を図７に示す（配列番号１及び２）。ラットのＧＤＮＦのヌクレオチド及びアミノ酸の配列を図８に示し（配列番号３及び４）、そしてマウスのＧＤＮＦヌクレオチド及びアミノ酸の配列を図９に示す（配列番号５及び６）。ラットとヒトの間の相同の程度は約９３％であり、そして全ての哺乳類のＧＤＮＦは同様に高度の相同性を有する。別のＧＤＮＦのヌクレオチド及びアミノ酸の配列は当業界で知られている。例えば、米国特許第６，２２１，３７６号及び第６，３６３，３１９号及びラット及びヒトの配列に関してはＬｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９３）２６０：１１３０−１１３２、並びにヒトの配列に関して、ＮＣＢＩ受け入れ番号ＡＹ０５２８３２，ＡＪ００１８９６，ＡＦ０６３５８６及びＬ１９０６３；ラットの配列に関して、ＮＣＢＩ受け入れ番号ＡＦ１８４９２２，ＡＦ４９７６３４，Ｘ９２４９５，ＮＭ０１９１３９；ジャイアントパンダの配列に関して、ＮＣＢＩ受け入れ番号ＡＦ５１６７６７；マウスの配列に関して、ＮＣＢＩ受け入れ番号ＸＭ１２２８０４，ＮＭ０１０２７５，Ｄ８８３５１Ｓ１，Ｄ４９９２１，Ｕ３６４４９，Ｕ３７４５９，Ｕ６６１９５；ニッポニアニッポンの配列に関して、ＮＣＢＩ受け入れ番号ＡＦ４６９６６５；ブタオザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）の配列に関して、ＮＣＢＩ受け入れ番号ＡＦ１０６６７８；及びゼブラフィッシュの配列に関して、ＮＣＢＩ受け入れ番号ＮＭ１３１７３２及びＡＦ３２９８５３を参照。上記のとおり、これらの何れの配列、並びにそれらのバリアント、例えばこれらの配列の実質上相同且つ機能上均等な配列も、本方法における用途を見いだす。
【００６６】
ＡＡＶデリバリーされたＧＤＮＦポリヌクレオチドの効果は、当業界公知の上記疾患の多数の動物モデルの何れにおいても試験することができる。例えば、運動ニューロン疾患、例えばＡＬＳの研究のための科学的に受け入れられて広く使用されている動物モデルは、ＡＬＳにリンクした変異体Ｃｕ／Ｚｎスーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ１）遺伝子のトランスジェニックマウス（ｍＳＯＤ１Ｇ９３Ａ及び／又はｍＳＯＤ１Ｇ３７Ｒ）である。これらのマウスは、家族性ＡＬＳの臨床上の特性及び病理特性の多くと共に、優性遺伝する成人発症性の麻酔性疾患を発症する。例えば、Ｇｕｒｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４）２６４：１７７２−１７７５；Ｎａｇａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ（２００２）７２：５４１−５４８を参照。他の動物モデルは、２つの天然に生じるマウスのモデルを含む（進行性運動神経障害（ｐｍｍ）及びよろめき（wobbler））。例えば、これらのマウスモデルの記載に関しては、Ｈａｅｇｇｇｅｌｉ  ａｎｄ  Ｋａｔｏ，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．（２００２）３３５：３９−４３を参照。運動ニューロン疾患、例えばＡＬＳを研究することにおける使用のための様々な動物モデルの総説に関しては、例えば、Ｊａｎｋｏｗｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｐ．（２００２）２：４５７−４６４；Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｊ．Ｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．（１９９９）６：３１０−２０；及びＢｏｒｃｈｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．（１９９８）８：７３５−７５７を参照。
【００６７】
さらに、いくつかのインビトロモデル系が公知であり、細胞、組織培養、及び運動ニューロン疾患の研究のための方法を使用する。例えば、グルタミン酸刺激神経に供されたラットの脊髄は運動ニューロンの変性を予防することにおける神経親和性因子の有効性を試験するためのモデル系として有用である。Ｃｏｒｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．（１９９９）６：３３５−３４６。ＡＬＳを研究することにおける使用のためのインビトロ系の考察については、例えば、Ｂａｒ，Ｐ．Ｒ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（２０００）４０５：２８５−２９５；Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．（２０００）２４７  Ｓｕｐｐｌ  １：１２８−３６；Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．（２０００）５：３−１３を参照。
【００６８】
他の神経変性性疾患の動物モデルは記載されており、ＡＬＳに加えて、運動ニューロン疾患の治療におけるＡＡＶデリバリーしたＧＤＮＦポリヌクレオチドの治療上の効果を上昇させるために有用である。例えば、脊髄及び延髄の筋肉萎縮（ＳＢＭＡ）を評価するためのトランスジェニックマウスモデルに関しては、Ｋａｔｓｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ（２００２）３５：８４３−８５４；ヒトの麻酔性小児麻痺に関する動物モデルの記載に関しては、Ｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．（２００２）３３：９７−１０７を参照。
【００６９】
ＧＤＮＦコーディング配列を含む組換えＡＡＶビリオンは、以下において詳細に記載される業界で認識された様々な技術を用いて生産してよい。野生型のＡＡＶ及びヘルパーウイルスは、ｒＡＡＶビリオンを生産するために必要な複製機能を提供するために使用してよい（例えば、米国特許第５，１３９，９４１号を参照）。あるいは、よく知られたヘルパーウイルスの一つによる感染と組み合わせて、ヘルパー機能遺伝子を含むプラスミドを複製機能の源として使用することができる（例えば、米国特許第５，６２２，８５６号及び米国特許第５，１３９，９４１号を参照）。同様に、アクセサリー機能遺伝子を含むプラスミドを野生型ＡＡＶによる感染と組み合わせて使用することにより、必要な複製機能を提供することができる。これらの３つのアプローチは、ｒＡＡＶベクターと組み合わせて使用された場合に、ｒＡＡＶビリオンを生産するのに各々十分である。当業界で公知の他のアプローチも、当業者により使用されて、ｒＡＡＶビリオンを生産することができる。
【００７０】
本発明の好ましい態様において、ｒＡＡＶビリオンを生産するためにトリプルトランスフェクション法（米国特許第６，００１，６５０号に記載された）が使用されるが、この方法が感染性ヘルパーウイルスの使用を必要としないためであり、如何なる検出可能なウイルスの存在もなしにｒＡＡＶビリオンが生産されることを可能にする。これは、ｒＡＡＶビリオン生産のための３つのベクターの使用により達成される：ＡＡＶヘルパー機能ベクター、アクセサリー機能ベクター、及びｒＡＡＶ発現ベクター。当業者は、しかしながら、これらのベクターによりコードされる核酸配列が様々な組み合わせにより２つ又はそれより多いベクター上に提供され得ることを理解する。
【００７１】
本明細書において説明されるとおり、ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、多産性ＡＡＶ複製及びキャプシッドへの封入のためにトランスで機能する「ＡＡＶヘルパー機能」配列（即ち、ｒｅｐ及びｃａｐ）をコードする。好ましくは、ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、如何なる検出可能なｗｔのＡＡＶビリオン（即ち、機能するｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を含むＡＡＶビリオン）をも生じることなく、有効なＡＡＶベクターの生産を支持する。そのようなベクターの例であるｐＨＬＰ１９は、米国特許第６，００１，６５０号に記載される。ＡＡＶヘルパー機能ベクターのｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は上記のとおり、公知のＡＡＶ血清型の何れかに由来し得る。例えば、ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、ＡＡＶ−２由来のｒｅｐ遺伝子及びＡＡＶ−６由来のｃａｐ遺伝子を有してよい；当業者は他のｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子の組み合わせが可能であることを認識し、限定する特徴はｒＡＡＶビリオンの生産を支持する能力である。
【００７２】
アクセサリー機能ベクターは、ＡＡＶが複製のために依存する非ＡＡＶ由来のウイルス機能及び／又は細胞機能（即ち、「アクセサリー機能」）のヌクレオチド配列をコードする。当該アクセサリー機能はＡＡＶの複製に必要なそれらの機能を含み、限定ではないが、ＡＡＶ遺伝子転写、ステージ特異的ＡＡＶ  ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶのＤＮＡ複製、ｃａｐ発現産物の合成、及びＡＡＶキャプシッドアッセンブリーの活性化に関与するモイエティを含む。ウイルスに基づくアクセサリー機能は、よく知られたヘルパーウイルスに、例えばアデノウイルス、ヘルペスウイルス（ヘルペスシンプレックスウイルスタイプ−１以外）及びワクシニアウイルスのいずれかに由来し得る。好ましい態様においては、アクセサリー機能プラスミドｐＬａｄｅｎｏ５を用いる（ｐＬａｄｅｎｏ５の詳細に関しては、米国特許第６，００４，７９７号に記載されている）。このプラスミドは、ＡＡＶベクターの生産のためのアデノウイルスアクセサリー機能の完全なセットを提供するが、複製能を有するアデノウイルスを形成するのに必要な成分を欠く。
【００７３】
さらなる発明の理解のため、より詳細な考察が、組換えＡＡＶ発現ベクター、ＡＡＶヘルパー機能及びアクセサリー機能、ＡＡＶビリオンを含む組成物、並びにビリオンのデリバリーに関して、以下に提供される。
組換えＡＡＶ発現ベクター
組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）発現ベクターは、転写の方向に、転写開始領域を含む調節要素、目的のＧＤＮＦポリヌクレオチド及び転写終結領域を作動可能に連結された成分として少なくとも提供する周知の技術を用いて構築される。調節要素は、哺乳類筋肉細胞において機能するように選択される。作動可能に連結された成分を含む結果の構築物に機能性ＡＡＶ  ＩＴＲ配列を結合させる（５’及び３’）。
【００７４】
ＡＡＶ  ＩＴＲ領域のヌクレオチド配列は公知である。例えば、Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７９３−８０１；Ｂｅｒｎｓ，Ｋ．Ｉ．”Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ”ｉｎ  ＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌＶｉｒｏｌｏｇｙ，第２版、（Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，編纂）をＡＡＶ−２配列に関しては参照されたい。発明のベクター中で使用されるＡＡＶのＩＴＲｓは野生型のヌクレオチド配列を有する必要はなく、そしてヌクレオチドの挿入、欠失又は置換により変更されてよい。さらに、ＡＡＶのＩＴＲｓはいくつかのＡＡＶ血清型の何れかに由来してよく、限定ではないが、ＡＡＶ−１，ＡＡＶ−２，ＡＡＶ−３，ＡＡＶ−４，ＡＡＶ−５，ＡＡＶ−６，ＡＡＶ−７及びＡＡＶ−８等を含む。さらに、ＡＡＶ発現ベクター中において選択されたヌクレオチド配列を周囲に有する５’及び３’ＩＴＲｓは、それらが意図するように機能する、即ち、宿主細胞ゲノム又はベクターからの目的の配列の切り出し及びレスキューを可能にし、そしてＡＡＶのＲｅｐ遺伝子産物が細胞内に存在する場合にレシピエント細胞ゲノムへのＤＮＡ分子の組込みを可能にさせる限り、同じＡＡＶ血清型又は単離物と同一か、又は、に由来する必要はない。
【００７５】
ＡＡＶベクターにおける使用のための適当なＧＤＮＦポリヌクレオチド分子は約５キロベース（ｋｂ）未満のサイズになる。選択されたポリヌクレオチド配列を、対象の生体内でその転写及び発現を指示する調節要素に作動可能に連結される。そのような調節要素は選択された遺伝子に通常付随する調節配列を含み得る。あるいは、異種調節配列を用いることができる。有用な異種調節配列は、一般に、哺乳類又はウイルスの遺伝子をコードする配列に由来するものを含む。例は、限定ではないが、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター、ＧＦＡＰプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルスＬＴＲプロモーター；アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ  ＭＬＰ）；ヘルペスシンプレックスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えばＣＭＶの極初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ），ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、合成プロモーター、ハイブリッドプロモーター等を含む。さらに、非ウイルス遺伝子由来の配列、例えばメタロチオネイン遺伝子も、本明細書では用いる。そのようなプロモーターの配列は、例えば、ストラタジーン（サンディエゴ、ＣＡ）から市販されている。
【００７６】
本発明の目的のために、筋肉特異的及び誘導可能なプロモーター、エンハンサー等が特別に使用される。そのような調節要素は、限定ではないが、アクチン及びミオシン遺伝子ファミリー由来のもの、例えば、ｍｙｏＤ遺伝子ファミリー（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：７６１−７６６）；筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ−２（Ｃｓｅｒｊｅｓｉ  ａｎｄ  Ｏｌｓｏｎ（１９９１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１：４８５４−４８６２）；ヒト骨格筋アクチン遺伝子由来の調節要素（Ｍｕｓｃａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７：４０８９−４０９９）及び心臓アクチン遺伝子；筋肉クレアチンキナーゼ配列要素（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９：３３９３−３３９９）及びマウスクレアチンキナーゼエンハンサー（ｍＣＫ）要素；骨格筋高速痙攣トロポニンＣ遺伝子由来の調節要素、低速痙攣トロポニンＣ遺伝子及び低速痙攣トロポニンＩ遺伝子；低酸素症誘導性核因子（Ｓｅｍｅｎｚａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：５６８０−５６８４；Ｓｅｍｅｎｚａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２３７５７−２３７６３）；ステロイド誘導性要素及びプロモーター、例えばグルココルチコイド応答性要素（ＧＲＥ）（Ｍａｄｅｒ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５６０３−５６０７）；ＲＵ４８６誘導のための融合コンセンサス要素；テトラサイクリン制御された遺伝子発現を提供する要素（Ｄｈａｗａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２１：２３３−２４０；Ｓｈｏｃｋｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：６５２２−６５２６）；及び誘導性合成ヒト化プロモーター（Ｒｉｖｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．２：１０２８−１０３２）由来のものを含む。これら及び他の制御要素は、休止した生体内の筋肉の生理を模倣するインビトロ筋原細胞を用いて潜在する生体内の有効性に関して試験することができる。
【００７７】
ＡＡＶのＩＴＲｓに結合させた目的のＧＲＥポリヌクレオチド分子を有するＡＡＶ発現ベクターは、そこから切り出された主要なＡＡＶオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦｓ」）を有していたＡＡＶゲノムに選択された配列を直接挿入することにより、構築することができる。ＩＴＲｓの十分な部分が残ることにより複製機能及びパッケージング機能を可能にする限り、ＡＡＶゲノムの別の部分も欠失させることができる。そのような構築物は、当業界でよく知られている技術を用いてデザインすることができる。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号及び米国特許第５，１３９，９４１号；国際公開ＷＯ９２／０１０７０（１９９２年１月２３日公開）及びＷＯ９３／０３７６９（１９９３年３月４日公開）；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３９８８−３９９６；Ｖｉｎｃｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９０（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：５３３−５３９；Ｍｕｚｙｃｚｋａ（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９；Ｋｏｔｉｎ（１９９４）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７９３−８０１；Ｓｈｅｋｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ（１９９４）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：１６５−１６９；及びＡｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１８６７−１８７５を参照。
【００７８】
あるいは、ＡＡＶのＩＴＲｓを、ウイルスゲノムから、又は別のベクター中に存在する選択された核酸構築物の同じ融合された５’及び３’を含むＡＡＶベクターから、標準ライゲーション技術、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，前掲に記載された技術を用いて切り出すことができる。例えば、ライゲーションは、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ  ＤＴＴ，３３μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ，１０ｍＭ−５０ｍＭ  ＮａＣｌ，及び４０μＭ  ＡＴＰ，０．０１−０．０２（Ｗｅｉｓｓ）ユニットのＴ４  ＤＮＡリガーゼ、０℃（「粘着末端」のライゲーションに関して）又は１ｍＭ  ＡＴＰ，０．３−０．６（Ｗｅｉｓｓ）ユニットのＴ４  ＤＮＡリガーゼ、１４℃（「平滑末端」のライゲーションに関して）の何れかにおいて達成することができる。分子間の「粘着末端」ライゲーションは、通常、３０−１００μｇ／ｍｌの全ＤＮＡ濃度にて実施される（５−１００ｎＭ全末端濃度）。ＩＴＲｓを含むＡＡＶベクターは、例えば、米国特許第５，１３９，９４１号に記載されている。特に、いくつかのＡＡＶベクターがその中に記載されており、アメリカンタイプカルチャーコレクション（「ＡＴＣＣ」）から、受け入れ番号５３２２２，５３２２３，５３２２４，５３２２５及び５３２２６にて入手可能である。
【００７９】
さらに、一つ又は複数の核酸配列のＡＡＶ  ＩＴＲ配列の整列された（arranged）５’３’を含むように、キメラ遺伝子を合成により生産することができる。キメラ遺伝子配列の哺乳類筋肉細胞内での発現のための好ましいコドンを使用することができる。全キメラ配列を標準法により調製されたオーバーラッピングオリゴヌクレオチドからアッセンブルさせる。例えば、Ｅｄｇｅ（１９８１）Ｎａｔｕｅ  ２９２：７５６；Ｎａｍｂａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２３：１２９９；Ｊａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８４）２５９：６３１１を参照。
【００８０】
発明の目的のためには、ＡＡＶ発現ベクターからｒＡＡＶビリオンを生産するための適当な宿主細胞は、異種ＤＮＡ分子のレシピエントとして使用できるか又は使用されたことがあり、且つ懸濁液中で生育することができる、微生物、酵母細胞、昆虫細胞、及び哺乳類細胞を含む。当該用語は、トランスフェクトされたオリジナルの細胞の子孫を含む。即ち、本明細書にて使用される「宿主細胞」は、概して、外来ＤＮＡ配列によりトランスフェクトされた細胞を意味する。安定なヒト細胞系からの細胞、２９３（例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクションから受け入れ番号ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５７３にて入手可能）が、本発明の実施においては好ましい。特に、ヒト細胞系２９３は、アッセンブルウイルスタイプ−５のＤＮＡ断片により形質転換されたヒト胚腎臓細胞系であり（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９）、そしてアッセンブルウイルスのＥ１ａ及びＥ１ｂ遺伝子を発現する（Ａｉｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ９４：４６０）。２９３細胞系は容易にトランスフェクトされて、ｒＡＡＶビリオンを生産するための特に便利なプラットフォームを提供する。
ＡＡＶヘルパー機能
上記のＡＡＶ発現ベクターを含む宿主細胞は、ＡＡＶのＩＴＲｓを周囲に有するヌクレオチド配列を複製してウイルス粒子に封入することによりｒＡＡＶのビリオンを生産するため、ＡＡＶヘルパー機能を提供することができるようにしなければならない。ＡＡＶヘルパー機能は、一般に、のちに生産性ＡＡＶ複製のために機能するＡＡＶ遺伝子産物を提供するように発現され得るＡＡＶ由来のコーディング配列である。ＡＡＶヘルパー機能は、本明細書においては、ＡＡＶ発現ベクターから欠けた必要なＡＡＶ機能を補償する。即ち、ＡＡＶヘルパー機能は、主要なＡＡＶのＯＲＦｓ、即ちｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子領域、又はその機能性相同物の一方又は両方を含む。
【００８１】
「ＡＡＶ  ｒｅｐコーディング領域」は、複製蛋白質Ｒｅｐ７８，Ｒｅｐ６８，Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０をコードするＡＡＶゲノムの当業界で認識される領域を意味する。これらのＲｅｐ発現産物は、多くの機能を有することが示され、ＤＮＡ複製のＡＡＶオリジンの認識、結合及びニッキング、ＤＮＡヘリカーゼ活性及びＡＡＶ（又は他の異種）プロモーターからの転写の変調を含む。Ｒｅｐ発現産物は、ＡＡＶゲノムを複製するのに集合的に必要とされる。ＡＡＶのｒｅｐコーディング領域の記載に関しては、例えば、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９；及びＫｏｔｉｎ（１９９４）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７９３−８０１を参照。ＡＡＶのｒｅｐコーディング領域の適当な相同物は、ＡＡＶ−２のＤＮＡ複製に媒介することも知られているヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）ｒｅｐ遺伝子を含む（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０４：３０４−３１１）。
【００８２】
「ＡＡＶ  ｃａｐコーディング領域」は、キャプシッド蛋白質ＶＰ１，ＶＰ２，及びＶＰ３，又はそれらの機能性相同物をコードするＡＡＶゲノムの当業界で認識される領域を意味する。これらのＣａｐ発現産物は、ウイルスのゲノムをパッケージングするのに集合的に必要なパッケージング機能を供給する。ＡＡＶのｃａｐコーディング領域の記載に関しては、例えば、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．ａｎｄ  Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（前掲）を参照。
【００８３】
ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶ発現ベクターのトランスフェクションの前又は同時に、ＡＡＶ発現ベクターにより宿主細胞をトランスフェクトすることにより、宿主細胞へ導入される。ＡＡＶヘルパー構築物は、即ち、生産性ＡＡＶ感染に必要な失われたＡＡＶ機能を補うために、ＡＡＶ  ｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子の少なくとも一時的な発現を提供するのに使用される。ＡＡＶヘルパー構築物は、ＡＡＶ  ＩＴＲｓを欠き、そしてそれらを複製することもパッケージすることもできない。
【００８４】
これらの構築物は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミッド、ウイルス、又はビリオンの形態であり得る。多数のＡＡＶヘルパー構築物が記載されており、例えば、一般に使用されるプラスミドｐＡＡＶ／Ａｄ及びｐＩＭ２９＋４５はＲｅｐ及びＣａｐ発現産物の両方をコードする。例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２８；及びＭｃＣａｒｔｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２９３６−２９４５を参照。他の多数のベクターが記載されており、Ｒｅｐ及び／又はＣａｐ発現産物をコードする。例えば、米国特許第５，１３９，９４１号を参照。
【００８５】
ＡＡＶ発現ベクター及びＡＡＶヘルパー構築物の両者は、一つ又は複数のオプションの選択可能マーカーを含むように構築することができる。適当な選択可能マーカーは、細胞を適当な培地において生育させた時に、選択可能マーカーを含む核酸構築物をトランスフェクトされたそれら細胞に、耐性又は感受性を授与するか、それら細胞に色を伝達するか、又はそれら細胞の抗原特性を変化させる遺伝子を含む。発明の実施において有用ないくつかの選択可能マーカー遺伝子は、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子（アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ））を含み、Ｇ４１８に対する耐性を授与することにより哺乳類細胞においての選択を可能にする（シグマ、セントルイス、Ｍｏ．から市販）。他の適当なマーカーは、当業者に知られている。
ＡＡＶアクセサリー機能
宿主細胞（又はパッケージング細胞）も、ｒＡＡＶビリオンを生産するために、非ＡＡＶ由来の機能、又は「アクセサリー機能」を提供できるようにされなければならない。アクセサリー機能は、ＡＡＶがその複製のために依存する非ＡＡＶウイルス機能及び／又は細胞機能である。即ち、アクセサリー機能は、ＡＡＶの複製において必要な少なくともそれら非ＡＡＶ蛋白質及びＲＮＡｓを含み、ＡＡＶ遺伝子の転写、ステージ特異的ＡＡＶ  ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶのＤＮＡ複製、Ｃａｐ発現産物の合成及びＡＡＶキャプシッドアッセンブリーを含む。ウイルスに基づくアクセサリー機能は、公知の何れかのヘルパーウイルスに由来し得る。
【００８６】
特に、アクセサリー機能は、当業者に知られた方法を用いて、宿主細胞内に導入されて、のちに宿主細胞内で発現することができる。典型的には、アクセサリー機能は、非関連のヘルパーウイルスを宿主細胞に感染させることにより提供される。多数の適当なヘルパーウイルスが公知であり、アデノウイルス；ヘルペスウイルス、例えばヘルペスシンプレックスウイルスタイプ１及び２；及びワクシニアウイルスを含む。非ウイルス性アクセサリー機能も本明細書においては用途を見いだし、例えば、様々な公知の薬剤の何れかを用いた細胞同調により提供されるものである。例えば、Ｂｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４０：２４１−２４７；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １４７：２１７−２２２；Ｓｃｈｌｅｈｏｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １５２：１１０−１１７を参照。
【００８７】
あるいは、アクセサリー機能は、上で定義されたアクセサリー機能ベクターを用いて提供することができる。例えば、米国特許第６，００４，７９７号及び国際公開番号ＷＯ０１／８３７９７を参照。アクセサリー機能を提供する核酸配列は、天然源、例えばアデノウイルス粒子のゲノムから得るか、又は、当業界公知の組換え法又は合成法を用いて構築することができる。上記のとおり、アデノウイルスの遺伝子の完全な相補体はアクセサリーヘルパー機能に必要でないことが証明された。特に、ＤＮＡ複製及び後期遺伝子合成が不可能なアデノウイルス変異体がＡＡＶ複製に関して許容性であることが示された。Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７０）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．９：２４３；Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ，（１９７１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４５：３１７。同様に、Ｅ２Ｂ及びＥ３領域内の変異体はＡＡＶ複製をサポートすることが示されたので、Ｅ２ＢとＥ３領域はおそらくアクセサリー機能を提供することに関与していないことが示される。Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １２６：５０５。しかしながら、Ｅ１領域内のアデノウイルスの欠損、又はＥ４領域に欠損を有するアデノウイルスはＡＡＶ複製をサポートすることができない。即ち、Ｅ１ＡとＥ４領域はＡＡＶ複製に直接又は間接の何れかにおいて必要であるらしい。Ｌａｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４１：８６８；Ｊａｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１９２５；Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １２６：５０５。他の特性決定されたＡｄ変異体は、Ｅ１Ｂ（Ｌａｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２），前掲；Ｊａｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）前掲；Ｏｓｔｒｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １０４：５０２）；Ｅ２Ｂ（Ｈａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２９：２３９；Ｓｔｒａｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１７：１４０；Ｍｅｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３５：６６５；Ｊａｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２９２７；Ｍｅｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：５６７）；Ｅ２Ｂ（Ｃａｒｔｅｒ，Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓ  Ｈｅｌｐｅｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，Ｉ  ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ中（Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ編纂、１９９０））；Ｅ３（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３），前掲）；及びＥ４（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３），前掲；Ｃａｒｔｅｒ（１９９５））を含む。Ｅ１Ｂコーディング領域に変異を有するアデノウイルスにより提供されるアクセサリー機能の研究は相反する結果を生じたが、Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：２０６−２１０は、最近、Ｅ１Ｂ５５ｋがＡＡＶビリオンの生成に必要であるのに対して、Ｅ１Ｂ１９ｋはそうでないと報告した。さらに、国際公開ＷＯ９７／１７４５８及びＭａｔｓｕｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．ｍ（１９８８）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ��ｐｙ  ５：９３８−９４５は、様々なＡｄ遺伝子をコードするアクセサリー機能ベクターを記載する。特に好ましいアクセサリー機能ベクターは、アデノウイルスＶａ  ＲＮＡコーディング領域、アデノウイルスＥ４  ＯＲＦ６コーディング領域、アデノウイルスＥ２Ａ  ７２ｋＤコーディング領域、アデノウイルスＥ１Ａコーディング領域、及びアデノウイルスのＥ１Ｂ５５ｋコーディング領域を欠くＥ１Ｂ領域を含む。そのようなベクターは国際公開ＷＯ０１／８３７９７に記載されている。
【００８８】
ヘルパーウイルスの宿主細胞への感染又はアクセサリー機能ベクターによる宿主細胞へのトランスフェクションの結果として、アクセサリー機能が発現されて、ＡＡＶヘルパー構築物をトランス活性化して、ＡＡＶ  Ｒｅｐ及び／又はＣａｐ蛋白質を生成する。Ｒｅｐ発現産物は、組換えＤＮＡ（目的ＤＮＡを含む）をＡＡＶ発現ベクターから切り出す。Ｒｅｐ蛋白質は、ＡＡＶゲノムを複製することにも作用する。発現されたＣａｐ蛋白質はキャプシッド内にアッセンブルされて、組換えＡＡＶゲノムがキャプシッド内にパッケージングされる。即ち、生産性ＡＡＶの複製が結果として起こり、ＤＮＡがｒＡＡＶビリオン内にパッケージングされる。
【００８９】
組換えＡＡＶ複製の後、ｒＡＡＶビリオンが宿主細胞から様々な慣用の精製法、例えばカラムクロマトグラフィー、ＣｓＣｌ勾配等により精製できる。例えば、複数のカラムの精製工程を用いることができ、例えば、アニオン交換カラム、親和性カラム及び／又はカチオン交換カラム上での精製である。例えば、国際公開番号ＷＯ０２／１２４５５を参照。さらに、感染を用いてアクセサリー機能を発現させるなら、周知の方法を用いて残りのヘルパーウイルスを不活性化することができる。例えば、アデノウイルスは約６０℃の温度に例えば２０分間又はそれ以上加熱することにより不活性化することができる。この処理はヘルパーウイルスのみを有効に不活性化するが、ＡＡＶは極めて熱に安定であるのに対して、ヘルパーアデノウイルスは熱に不安定だからである。
【００９０】
目的のＧＤＮＦヌクレオチド配列を含む結果のｒＡＡＶビリオンを、次に、以下に記載する技術を用いて遺伝子デリバリーに使用することができる。
組成物
組成物は治療上有効な量、即ち、問題の疾患の状態の兆候を減じるか又は改善するのに十分な量、又は所望の利益を授与するのに十分な量の、目的のＧＤＮＦを生じるための十分な遺伝物質を含むことになる。当該組成物は、薬学上受容可能な賦形剤も含むことになる。そのような賦形剤は、それ自体が組成物を受ける個体に有害な抗体の産生を誘導しない何れの薬剤をも含み、そして不当な障害性を伴わずに投与してよいものである。薬学上受容可能な賦形剤は、限定ではないが、ソルビトール、様々なＴＷＥＥＮ化合物の何れか、流体、例えば、水、塩水、グリセロール及びエタノールを含む。薬学上受容可能な塩はその中に含まれることができ、例えば、ミネラル酸塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩等；及び有機酸の塩、例えば酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩等を含む。さらに、補助物質、例えば湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤等をそのような媒質中に存在させてよい。薬学上受容可能な賦形剤のさらなる考察はＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＴＣＥＳ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．１９９１）において利用可能である。
【００９１】
一つの特に有用な製剤は、組換えＡＡＶビリオンを、一つ又はそれより多い２水酸基又はポリ水酸基のアルコール及び任意に洗浄剤、例えばソルビタンエステルと適当に組み合わせて含む。例えば、国際公開番号ＷＯ００／３２２３３を参照。
【００９２】
この明細書の教示を考慮した当業者には明らかなとおり、加えなければならないウイルスベクターの有効な量は経験により決定され得る。代表的な投薬量は以下に詳述される。投与は１用量にて、連続的又は断続的に、治療の期間を通して、行うことができる。投与のもっとも有効な手段及び用量を決定する方法は、当業者には知られており、ウイルスベクター、治療の組成物、標的細胞、及び治療される対象により変更されることになる。単一の投与及び複数の投与は、治療する外科医により選択される用量レベル及びパターンを用いて実施することができる。
【００９３】
一つより多いトランスジーンがデリバリーされる組換え体ビリオンにより発現できることは理解されるべきである。あるいは、別のベクター、各発現する一つ又はそれより多い別のトランスジーンも、本明細書に記載されるとおりにデリバリーすることができる。さらに、本発明の方法によりデリバリーされるウイルスベクターを他の適当な組成物及び治療剤と化合することも意図される。トランスジーンが誘導可能なプロモーターの制御下にある場合、特定の全身性にデリバリーされる化合物、例えば、ムリステロン、ポナステロン、テトラサイクリン又はアウフィン（aufin）を投与することにより、トランスジーンの発現を制御してよい。
ＡＡＶのビリオンのデリバリー
組換えＡＡＶビリオンは、生体内又はインビトロ（エクスビボとも呼ばれる）何れかの形質導入系を用いて筋肉細胞へ導入してよい。インビトロ形質導入の場合、所望のレシピエント細胞、好ましくは筋肉細胞を対象から取り出し、ｒＡＡＶビリオンにより形質導入し、そして対象に再導入することになる。あるいは、同系の細胞又は異種個体の細胞を使用するが、それらの細胞は対象において不適当な免役応答を生じないものである。
【００９４】
形質導入された細胞の対象へのデリバリー及び導入のための適当な方法は、記載されている。例えば、組換えＡＡＶビリオンを形質導入される細胞と適当な培地内で化合することにより細胞をインビトロにて形質導入し、そしてそれらの細胞は、慣用の技術、例えばサザンブロット及び／又はＰＣＲ又は選択可能マーカーを用いることによりスクリーニングすることができる。形質導入された細胞は、上記のとおり、あとで、薬剤組成物中に製剤化することができ、そして当該組成物は上記のとおり様々な技術により対象へ、１又はそれより多い投薬量にて導入することができる。
【００９５】
組換えＡＡＶビリオン又はインビトロにて形質導入された細胞は、針、カテーテル又は関連する装置を用いた注射により、当業界で知られた技術を用いて、直接筋肉にデリバリーしてよい。生体内デリバリーに関しては、ｒＡＡＶビリオンを薬剤組成物中に製剤化し、そして１又はそれより多い投薬量を直接示された様式にて投与してよい。治療ウイルス有効な投薬量は、約１０８／ｋｇから１０１６／ｋｇのオーダーのｒＡＡＶビリオン、より好ましくは１０１０／ｋｇから１０１４／ｋｇ、そしてさらにより好ましくは１０１１／ｋｇから１０１３／ｋｇのｒＡＡＶビリオン（又はウイルスゲノム、「ｖｇ」とも呼ばれる）又はこれらの範囲内のあらゆる値を含む。
【００９６】
組換えＡＡＶビリオンの投与の一つの様式は、伝達増強されたデリバリー（ＣＥＤ）系を使用する。この様式において、組換えビリオンは、筋肉の大きな面積にわたり、多くの細胞にデリバリーされ得る。さらに、デリバリーされたベクターは有効に筋肉細胞内でトランスジーンを発現する。如何なる伝達増強されたデリバリー装置もウイルスベクターのデリバリーに適しているかもしれない。好ましい態様において、上記装置は浸透ポンプ又は注入ポンプである。浸透ポンプ及び注入ポンプの両方とも様々な供給者、例えば、Ａｌｚｅｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｌｚａ  Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから市販されている。典型的には、ウイルスベクターはＣＥＤ装置を通して以下のとおりにデリバリーされる。カテーテル、カニューラ又は他の注射装置は、選択された対象の適切な筋肉、例えば骨格筋内に挿入される。ＣＥＤデリバリーの詳細な記載は、米国特許第６，３０９，６３４号を参照。
【００９７】
筋肉を伴う特定の用途を見いだすことになる他の投与様式は、筋肉内へのベクターの分散を増加させるための、ヒスタミン又は隔離された（isolated）手足の潅流（手足への血管の供給が問題の組成物の注入の前に全身の循環から隔離される（isolated））を使用し、全ての技術は当業界公知である。例えば、Ｓｃｈａａｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｔｒａ  Ｃｏｒｐｏｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．（２００２）３４：１３０−１４３；Ｌｅｊｅｕｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎ．Ａｍ．（２００１）１０：８２１−８３２；Ｆｒａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＯＲＮ  Ｊ．（１９９９）７０：６４２−６４７，６４９，６５１−６５３を参照。
Ｃ．実験
以下は、本発明を実施するための特定の態様の実施例である。実施例は例示の目的のために提示され、どちらにしろ本発明の範囲を限定することを意図しない。
【００９８】
使用された数に関して正確さを補償する努力はなされたが（例えば、量、温度、等）、いくつかの実験エラー及び偏差はもちろん許容されるべきである。
実施例１
組換えＡＡＶベクターの構築
ＡＡＶデリバリーされたＧＤＮＦとその内因性の対照物を識別するため、組換え融合ＧＤＮＦ蛋白質をコードするＡＡＶベクターを構築し、ＦＬＡＧエピトープに対する特異的抗体による認識のためにＦＬＡＧペプチドで標識した（ＡＡＶ−ＧＤＮＦ−ＦＬＡＧ）。簡単に言えば、ＡＡＶベクタープラスミドｐＡＡＶ−ＧＤＮＦ−ＦＬＡＧは、前に記載されたｐＡＡＶ−ＧＤＮＦプラスミド（Ｆａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．（１９９８）２４８：６１−６４）から誘導した。このプラスミドは、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の極初期プロモーター下でカルボキシル末端がＦＬＡＧ配列（ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号：５））で標識され、ヒト成長ホルモンの第１イントロン及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のポリアデニル化シグナルをＡＡＶ−２ゲノムのインバーテッドターミナルリピート（ＩＴＲｓ）の間に有する、マウスのＧＤＮＦのｃＤＮＡを含む（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ（１９９７）２０３：１４９−１５７）。
【００９９】
ＡＡＶベクタープラスミドｐＡＡＶ−ＬａｃＺ、補助プラスミドｐＨＬＰ１９及びプラデノールは、以前に記載された（Ｆａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．（１９９８）２４８：６１−６４；Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（２０００）１１：１５０９−１５１９）。プラデノ５は米国特許第６，００４，７９７号に記載される。半芝生状のヒト２９３細胞に対して一時的にベクタープラスミド及びヘルパープラスミドをカルシウムリン酸共沈殿法を用いてトランスフェクトさせた。トランスフェクションから７２時間後に、細胞を回収して、凍結及び溶解の循環により溶解した。ＡＡＶベクター（ＡＡＶ−ＧＤＮＦ−ＦＬＡＧ及びＡＡＶ−ＬａｃＺ）は、２回の連続するＣｓＣｌ勾配を用いて前に記載されたとおりに精製した（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９８）５：９３８−９４５）。定量性ＤＮＡドットブロットハイブリダイゼーション分析により評価したところ、ＡＡＶ−ＧＤＮＦ−ＦＬＡＧの最終粒子の力価は１．６ｘ１０１３ベクターゲノムコピー／ｍｌであり、そしてＡＡＶ−ＬａｃＺは２．１ｘ１０１３ベクターゲノムコピー／ｍｌであった。
【０１００】
実施例２
ＡＡＶ−ＧＤＮＦ−ＦＬＡＧのインビトロ発現
ＧＤＮＦ−ＦＬＡＧ融合蛋白質のインビトロ発現を検出するため、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞（例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクションから受け入れ番号ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５７３にて容易に入手可能）を、３５ｍｍの直径の皿に植えて、完全培地中で一晩増殖を許容した。細胞を、ＡＡＶ−ＧＤＮＦ−ＦＬＡＧ又はＡＡＶ−ＬａｃＺ（０．５−１８ｘ１０３ベクターゲノムコピー／細胞）により、２％ウシ胎児血清を付加した培地中で形質導入した。形質導入の４８時間後に、条件培地（ＣＭ）及び細胞溶解物を回収した。
【０１０１】
ＣＭ及び２９３細胞溶解物の中のＧＤＮＦレベルをＥＬＩＳＡ（ＧＤＮＦ  Ｅｍａｘ免役アッセイシステム、プロメガ）により測定した。細胞溶解物の中の検出のため、細胞を溶解バッファー（１３７ｘ１０−３ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ，２０ｘ１０−３ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ［ｐＨ８．０］，１％  ＮＰ４０，１０％グリセロール、プロテアーゼ阻害剤カクテルタブレットコンプリートミニ［ロッシュ］を付加）中でホモジェナイズし、超音波処理し、そして４℃において遠心分離した。上清を酸性化し、次にアッセイ前にｐＨ７．４までに中和した。酸性化は神経親和性因子の検出を向上させると報告されている（Ｏｋｒａｇｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．（１９９７）１４５：５９２−５９６）。３通りのサンプルを、プロメガにより提供された詳細なプロトコルに従い、９６ウエルプレート中で加工した。簡単に言えば、プレートを抗ＧＤＮＦモノクローナル抗体でコートし、ブロックし、そしてＧＤＮＦ標準又はサンプルと共にインキュベートした。次に、プレートを連続してチキン抗ヒトＧＤＮＦポリクローナル抗体、抗チキンＩｇＹパーオキシダーゼコンジュゲート、続いてパーオキシダーゼの基質及びテトラメチルベンジジン溶液とインキュベートして発色させた。反応は１Ｎ  ＨＣｌにより停止し、そして吸収を４５０ｎｍにて読んだ。ＧＤＮＦのレベルはｐｇ／ｍｇ組織として表現した。アッセイ感度は１６ｐｇ／ｍｌから１，０００ｐｒ／ｍｌの範囲であった。
【０１０２】
ＥＬＩＳＡ分析は、ＡＡＶ−ＧＤＮＦ−ＦＬＡＧ形質導入細胞中の高いレベルのＧＤＮＦ発現及び分泌を示した（図１Ａ及び１Ｂ）。予測されたとおり、ＣＭ中のＧＤＮＦレベルは細胞溶解物よりもはるかに高く、ＧＤＮＦが細胞から分泌され得たことを示す。さらに、検出された範囲において、ＣＭ及び細胞溶解物中のＧＤＮＦの量は、細胞あたりのベクターゲノムコピーの投薬量依存性の増加を示した。非形質導入細胞又はＡＡＶ−ＬａｃＺ形質導入２９３細胞においては、２９３のレベルがはるかに低く、かろうじてＥＬＩＳＡ分析の検出限界である。
【０１０３】
実施例３
注射された腓腹筋内のＧＤＮＦの生体内発現
オスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（７週齢）に、ＡＡＶ−ＧＤＮＦ−ＦＬＡＧ（ｎ＝３２）又はＡＡＶ−ＬａｃＺ（ｎ＝２１）ビリオンを左の後肢の腓腹筋内（２４ｍｌのＰＢＳ中２ｘ１０１０ウイルスゲノムコピー／３部位）へ、経皮にて、２７ゲージの針を備えたマイクロシリンジを用いて注射した。にせものの対照として、右の腓腹筋に同じ容量のＰＢＳを注射した。実験期間中に、何の罹患率も道徳（morality）も観察されなかった。示された時間において（図２を参照）、腓腹筋を切開し、液体窒素冷却イソペンタン中で素早く凍結し、そしてＥＬＩＳＡ分析又はクリオスタット切片化のために−８０℃に保存した。マウスを次に氷冷ＰＢＳ、続いてパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）により潅流した。脊髄を切開し、４％のＰＦＡにより後で固定し（post-fixed）、そして１０％、２０％及び３０％蔗糖中に連続して４℃において一晩浸すことにより冷凍防御した（cryoprotected）。凍結した筋肉組織の連続横断クリオスタット切片（１０ｍｍ）を解凍してスライドにマウントして、ゼラチンでコートし、そして−８０℃における保存の前に完全に乾燥させた。腰部の脊髄の連続横断切片を凍結したミクロトームの上で３０ｍｍ厚に切り、そしてＰＢＳ中で４℃において保存した。
【０１０４】
ＧＤＮＦのＥＬＩＳＡｓは上で記載されたとおりに実施した。ｂ−ガラクトシダーゼ（ｂ−Ｇａｌ）の組織化学のために、筋肉切片を固定して、４−６時間ｂ−Ｇａｌ染色溶液（５００ｍｇ／ｍｌ  Ｘ−Ｇａｌ，５ｍＭ  ヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）カリウム、５ｍＭ  ヘキサシアノ鉄（ＩＩ）カリウム、及び２ｍＭ  塩化マグネシウム、ＰＢＳ中）中で３７℃において染色した。脊髄サンプルは自由に浮遊する切片として染色し、そしてゼラチンマウントしたスライス中にマウントして乾燥した。切片は、検出のためのエオシンにより対比染色した。トランスジーンのＧＤＮＦを内因性のＧＤＮＦから区別する目的で、腓腹筋クリオスタット切片に抗ＦＬＡＧ抗体を用いた免役組織化学染色を実施した。筋肉切片を固定して、０．３％のＨ２Ｏ２で処理し、次に、抗ＦＬＡＧ抗体（１：１０００、ウサギポリクローナル抗ＦＬＡＧ抗体）と一晩４℃においてインキュベートし、ウサギＩｇＧに対するビオチン化二次抗体（１：４００）と２時間インキュベートし、そしてアビジン−ビオチン化パーオキシダーゼ複合体法（Ｖｅｃｔａｓｔａｔｉｎ  ＡＢＣ  ｌｏｔｓ．ベクターラボラトリーズ社、バーリンゲーム、ＣＡ）を用いて、３，３−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を発色源として用いて可視化した。二重の免役蛍光染色に関しては、筋肉及び脊髄の切片をマウス−オン−マウスキット（Ｍ．Ｏ．Ｍ．キット）（ベクターラボラトリーズ、バーリンゲーム、ＣＡ）を用いて製造者の指示に従い染色した。筋肉の切片に使用した一次抗体は、マウス抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（１：５００、シグマ）及びウサギ抗ＧＤＮＦ抗体（１：１０００、サンタクルズ）であった。脊髄切片に関しては、抗体はウサギ抗ＦＬＡＧ抗体（１：１０００、シグマ）及びマウス抗ＮｅｕＮ抗体（１：２００、ケミコン）であった。切片は、次に、ローダミン又はＦＩＴＣコンジュゲートされた対応する二次抗体と、検出のためにインキュベートした。筋肉切片の抗ＦＬＡＧ抗体及びα−ブンガロトキシンによる二重免役蛍光染色に関しては、切片をウサギ抗ＦＬＡＧ抗体と最初にインキュベートし、次に、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ウサギ二次抗体及びテトラメチル
−ローダミンコンジュゲートされたα−ブンガロトキシン分子プローブ（１：４００、モリキュラープローブ社、ユージーン、合衆国）とインキュベートした。α−ブンガロトキシンはブンガラスマルチシンクタス（Ｂｕｎｇａｒｕｓ  ｍｕｌｔｉｃｉｎｃｔｕｓ）から抽出されるペプチドであり、高い親和性をもって神経筋の接合点のシナプス後の膜においてニコチン性ＡｃｈＲのａ−サブユニットに特異的に結合する。免役蛍光染色された切片を観察し、そして共焦点レーザースキャニング顕微鏡（ＴＣＳ  ＮＴ；ライカ、ハイデルベルグ、ドイツ）を用いて写真を撮った。
【０１０５】
ＡＡＶ−ＧＤＮＦ−ＦＬＡＧを注射した腓腹筋内のＧＤＮＦレベルのＥＬＩＳＡによる検出は、ＧＤＮＦ発現が注射の１４日後に検出でき、最初の２カ月にわたり徐々に増加し、６カ月にわたり顕著な減少なしに安定したままであることを示し、そして次に、注射の８カ月目から僅かな減少を示した（図２）。実質的な発現は少なくとも１０カ月間維持され、それは試験された最後の時間点である。ＡＡＶ−ＬａｃＺベクター又はＰＢＳを注射された腓腹筋は極めて低レベルのＧＤＮＦしか示さなかった。
【０１０６】
ＡＡＶ−ＧＤＮＦ−ＦＬＡＧを注射された腓腹筋においては、実質上且つ持続したＦＬＡＧのための免役反応性シグナルが多数の筋繊維内で、注射後２週から１０カ月目まで検出された。抗ＧＤＮＦ抗体及び抗ＦＬＡＧ抗体による二重の免役蛍光染色は、ＧＤＮＦ及びＦＬＡＧの免役反応性の同時局在を示したことから、ＧＤＮＦ−ＦＬＡＧ融合蛋白質の存在を証明する。強い免役反応性が筋繊維鞘の付近で濃縮されたことから、生体内でのその筋繊維による有効な分泌を示唆する。ＡＡＶ−ＬａｃＺを注射された筋肉又はＰＢＳを注射された筋肉においては、ほんの僅かに弱いＧＤＮＦのシグナルしか筋繊維鞘内では検出できなかったし、ＦＬＡＧの免役シグナルは観察されなかった。これはＥＬＩＳＡの結果と一致し、ＡＡＶ−ＬａｃＺを注射されたか又はＰＢＳを注射された筋肉内でＥＬＩＳＡにより検出されたＧＤＮＦが内因性のＧＤＮＦであったことを示した。
【０１０７】
要約すると、実質上のトランスジーンＧＤＮＦが生体内で発現されて、発現が各腓腹筋からナノグラムレベルほどに到達し、そして少なくとも１０カ月だけは持続した。弱い減少が注射後８カ月に始まったことが観察され、他のグループの公表された結果（Ｖｅｒｍａ  ａｎｄ  Ｓｏｍｉａ，Ｎａｔｕｒｅ（１９９７）３８９：２３９−２４２）並びに我々のストリアタム（striatum）における未公表の結果と一致する。特定の理論に拘束されないが、発現のこの減少は、プロモーターのシャットオフ、ベクターゲノムの分解、及び／又は形質導入された筋繊維の代謝回転によるのかもしれない（Ｖｅｒｍａ  ａｎｄ  Ｓｏｍｉａ，Ｎａｔｕｒｅ（１９９７）３８９：２３９−２４２；Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ  ａｎｓ  Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９８）９：４７０−４７５）。
【０１０８】
神経親和性の論理に従えば、神経突起がそれらの標的に接合することにより、ニューロンの生存のための標的由来の神経親和性因子への接近を獲得する。特定すれば、神経親和性因子は合成されて、神経親和性因子依存性軸索の標的により放出され、それは軸索の末端上で受容体により結合されて、受取られ（taken up）、そして逆行して細胞の本体へ輸送される（ＤｅＳｔｅｆａｎｏ，Ｐ．Ｓ．，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．（１９９３）１２４：５６−６９）。トランスジーンデリバリーされたＧＤＮＦ−ＦＬＡＧもＧＤＮＦの神経親和性理論に従うか否かを決定するために、抗ＦＬＡＧ抗体及びローダミンをコンジュゲートされたα−ブンガロトキシンによる二重免役蛍光染色を腓腹筋切片上で実施した。共焦点顕微鏡は、ＦＬＡＧに関してのα−ブンガロトキシンによるより強い免役反応性を示したことから、トランスジーンＧＤＮＦ−ＦＬＡＧ融合蛋白質の神経筋の接合点（ＮＭＪｓ）領域に対する濃度を示す。ＮＭＪｓにおけるトランスジーンＧＤＮＦの蓄積は、神経親和性理論と一致して、ＮＭＪが、標的由来の神経親和性因子として神経末端により受取られたトランスジーンＧＤＮＦのための部位であることを示唆した。ＡＡＶ−ＬａｃＺ−又はＰＢＳ−注射切片において、ＮＭＪｓを示すローダミンシグナルのみが検出でき、ＦＬＡＧ免役反応性シグナルはできなかった。ＡＡＶ−ＬａｃＺベクターを注射した腓腹筋においては、ｂ−ｇａｌ活性が多数の筋繊維中において検出できたが、発現パターンはトランスジーンＧＤＮＦと完全に異なっていた。発現は注射後２週間から１０カ月間続いた。これらの結果は、腓腹筋へのＡＡＶ−ＧＤＮＦ−ＦＬＡＧの１回の注射がトランスジーンＧＤＮＦの持続的且つ実質的な発現を媒介できることを示し、筋繊維鞘の近辺に主に分散して、ＮＭＪｓにおいて蓄積された。
【０１０９】
抗ＦＬＡＧ抗体により検出された筋肉内のトランスジーンＧＤＮＦ−ＦＬＡＧ融合蛋白質の分配は、正常なヒト筋肉において観察された内因性ＧＤＮＦのそれと類似する（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．（１９９８）４０２：３０３−３１２）。
【０１１０】
標的由来の神経親和性因子として、骨格筋により生産された内因性ＧＤＮＦは、逆行性軸索輸送により、標的筋肉組織から脊髄内の運動ニューロン細胞本体へ作用する（functions）（Ｍｉｔｓｕｍｏｔｏ，Ｈ．，Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ（１９９９）２２：１０００−１０２１；Ｌｅｉｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（１９９９）１９：９３２２−９３３１）。受容体媒介性のＧＤＮＦの逆行性輸送はラットの運動ニューロンにおいて記載された（Ｌｅｉｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（１９９９）１９：９３２２−９３３１）。逆行性輸送の生理学上の意義は完全に理解されていないが、軸索−標的の伝達及びニューロンの生存性において決定的に重要であると考えられており、おそらくは、シグナル形質導入の複合体の運搬を反映する（Ｎｅｅｔ  ａｎｄ  Ｃａｐｅｎｏｔ，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．（２００１）５８：１２２１−１２３５）。
【０１１１】
トランスジーンＧＤＮＦ−ＦＬＡＧ融合蛋白質も逆行して筋肉から脊髄運動ニューロンへ輸送できたか否かを決定するために、抗ＦＬＡＧ抗体及び抗ＮｅｕＮ（ニューロンの特異的マーカー）抗体を用いた二重免役染色を、腓腹筋の神経分布に符合する腰椎（lumber）の４から６の脊髄切片上で実施した。ＦＬＡＧの免役反応性は、ＡＡＶ−ＧＤＮＦ−ＦＬＡＧを注射した部位に対して同じ側の前角（ventral horn）の大きなサイズのＮｅｕＮ陽性細胞二重検出された。それらのサイズの大きさ（直径２０ｍｍを超える）、前角の分布及びＮｅｕＮ陽性の特徴は、これらのＦＬＡＧ免役反応性細胞がａ−運動ニューロンであることを示唆した。内因性ＧＤＮＦからの干渉を排除した抗ＦＬＡＧ抗体を用いたので、これは、運動ニューロン中のトランスジーンＧＤＮＦ−ＦＬＡＧの融合蛋白質の存在を証明した。対照的に、反対側の前角並びにＡＡＶ−ＬａｃＺを注射されたマウス又はＰＢＳを注射されたマウスにおいては、ＦＬＡＧ染色は検出されなかった。筋肉内の広い分布のｂ−ガラクトシダーゼシグナルにも拘わらず、ＡＡＶ−ＬａｃＺ注射されたマウスからの脊髄切片の符合する前角においては、ｂ−ガラクトシダーゼシグナルが検出されなかった。
【０１１２】
即ち、トランスジーンＧＤＮＦが脊髄の同じ側の前角の運動ニューロンにおいて検出されるのに成功し、ＡＡＶ−ＧＤＮＦ−ＦＬＡＧ注射の後の腓腹筋内のその検出が結果として生じた。トランスジーンＧＤＮＦは３つの異なる経路：全身性デリバリー、ＡＡＶベクターの逆行性輸送又は融合蛋白質自身の逆行性輸送を通して脊髄にデリバリーされたのかもしれない。運動ニューロン内のトランスジーンＧＤＮＦの限定された分布及び同じ側の提示、並びに血液−脳バリアーのその通過不能性は、脊髄への全身性のデリバリーの可能性を排除する。従って、ｂ−ガラクトシダーゼシグナルはＡＡＶ−ＬａｃＺを注射されたマウスの脊髄運動ニューロンにおいては検出されなかったため、ＡＡＶベクター自身は逆行性輸送によりデリバリーされなかったことを示す。これは、脊髄中に検出されたトランスジーンＧＤＮＦ−ＦＬＡＧ融合蛋白質が、筋肉から運動ニューロンへのこの蛋白質の逆行性軸索輸送由来であって、ＡＡＶベクター自体ではなかったことを証明する。これは、前の報告と一致する（Ｋｏｒｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２９０：７６７−７７３；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（２００２）９：３８１−３８９）。アデノウイルス及びレンチウイルスベクターの逆行性軸索輸送は報告されている（Ｇｈａｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（１９９５）２：１３２−１３７；Ｈａａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅ４；Ｄｅｓｍａｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２００１）４：１４９−１５６）が、本発見までに、ＡＡＶデリバリー遺伝子産物の大量の逆行性軸索輸送を支持する決定的な証拠はいまだかつて報告されていない。
【０１１３】
結論として、上記の実施例は、腓腹筋へのＡＡＶ−ＧＤＮＦ−ＦＬＡＧ注射は神経末端におけるトランスジーンＧＤＮＦの連続の源を供給し、そして脊髄中の運動ニューロン本体へＧＤＮＦをデリバリーするための安全で持続性且つ特異的な方法を構成することを証明する。これは、ＧＤＮＦのようにトランスジーンＧＤＮＦ−ＦＬＡＧ融合蛋白質が完全に保持されるとの以前の結果と共に、運動ニューロン疾患の治療のためのＡＡＶ媒介性遺伝子治療の利用性を示す。
【０１１４】
実施例４
ＡＬＳマウスの筋肉内のＧＤＮＦトランスジーンの発現
ＡＡＶ媒介性のＧＤＮＦのデリバリーが運動ニューロン疾患、例えばＡＬＳを治療するのに有用であるか否かを決定するために、以下の研究を実施した。
【０１１５】
Ａ．材料と方法
組換えＡＡＶビリオンの投与。Ｇ９３ＡヒトＳＯＤ１変異を有するオスのトランスジェニックマウス（ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ）を、ザジャクソンラボラトリーズ（The Jackson Laboratories）（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から得た。ｐＡＡＶ−ＧＤＮＦ−ＦＬＡＧ、ｐＡＡＶ−ＬａｃＺ、補助プラスミドｐＨＬＰ１９及びプラデノールは前記のとおりであった。ＡＡＶベクターは、上掲のベクタープラスミドとヘルパープラスミドを以前に記載されたとおりに（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（２００２）９：３８１−３８９）三重にトランスフェクションすることにより、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞中で生産させた。簡単に言えば、半芝生状の２９３細胞に一時的にリン酸カルシウム法を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後に、細胞を回収して２サイクルの凍結−解凍の溶解に供した（ドライアイス−エタノールと３７℃の浴槽の間を交互にする）。ＡＡＶベクターを２つの連続する塩化セシウム密度勾配により精製して、
定量性ＤＮＡドットブロットハイブリダイゼーションにより最終粒子力価を測定した。
【０１１６】
投与の前に、ＡＡＶベクターをＰＢＳ中で１ｘ１０１１ゲノムコピー／１００μｌに希釈した。９週齢目に、四肢に（腓腹筋及び上腕三頭筋）ＡＡＶ−ＧＤＮＦベクターを注射された一つの処理群（ｎ＝１２）又はそれぞれＡＡＶ−ＬａｃＺベクター（ｎ＝６）及び媒体（ｎ＝５）を注射された２つの対照群の一つに、ＡＬＳマウスをランダムに割り当てた。用量は、腓腹筋については３０μｌ、そして上腕三頭筋については２０μｌであった。ＡＡＶ−ＬａｃＺベクター及び媒体を注射されたマウスは実験期間を通して試験された全ての可変物に関して区別不可能であったため、上記の２つの群は分析に関して一つの対照群であると考えた。別の亜群（ｎ＝７）においては、全てのマウスが、左前肢及び後肢に注射されたＡＡＶ−ＧＤＮＦベクターを、そして右前肢に注射されたＡＡＶ−ＬａｃＺを有した。
【０１１７】
挙動及び死亡率の試験。試験前に、マウスを最初に３日間、ロータロッド装置（Ｒｏｔａ−Ｒｏｄ／７６５０；Ｕｇｏ  Ｂｒａｓｉｌｅ，Ｃｏｍｅｒｉｏ，イタリア）に通じるようにした。検出のため、５、１０及び２０ｒｐｍの速度で回転するロッドの上にマウスを置き、そしてロッド上でマウスが残った（remained）各時間を自動で記録した。疾患の発症は、前に記載されたとおり（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８８：３３５−３３９）、２０ｒｐｍの速度で７分間ロータロッドの上でマウスが残れなかった時間として定義された。マウスが７分よりも長くロッドの上で残れたら、試験を完了して、７分とスコアした。マウスがもはや仕事を実行できなくなるまで、２日毎に試験した。死亡率は、仰向けになった位置においてその背後に置かれたときにマウスが３０分以内に常態に戻れなかった場合の、死亡齢をスコアした（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８８：３３５−３３９）。
【０１１８】
組織の調製。犠牲にする１週前に、神経のトレーサーコレラ毒素サブユニットＢ（ＣＴＢ）（０．１％）をマウスの腓腹筋に対して両側に注射することにより、処理された筋肉を刺激する軸索を残した運動ニューロンを選択的に標識した。示された時間において、腓腹筋を切り出し、秤量し、液体窒素で冷やしたイソペンタン中で素早く冷却し、そして免役組織化学分析又はＧＤＮＦ  ＥＬＩＳＡ分析のために−８０℃に保存した。筋肉を切り出した後に、マウスに氷冷ＰＢＳ、続いて４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を潅流した。脊髄を切り出し、４％のＰＦＡの中で４時間後固定し、そして次に蔗糖中で連続して凍結防止した。
【０１１９】
ＧＤＮＦ  ＥＬＩＳＡ。筋肉のＧＤＮＦレベルを測定するために、組織をｗ／ｖ比で１００ｍｇ／ｍｌの、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤を含む溶解バッファー（１３７ｘ１０−３ｍｏｌ／１ＮａＣｌ，２０ｘ１０−３ｍｏｌ／１Ｔｒｉ，ｐＨ８．０，１％ＮＰ−４０、及び１０％グリセロール）中でホモジェナイズし、超音波処理し、次に１２，０００ｘｇにて遠心分離した。上清を酸性化し、アッセイの前にｐＨ７．４に中和した。ＧＤＮＦの組織レベルを、ＥＬＩＳＡキット（ＧＤＮＦ  Ｅｍａｘ  ＩｍｍｕｎｏＡｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ；Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、供給者の支持書に従い測定した。ＧＤＮＦのレベルは蛋白質のミリグラムあたりのピコグラムとして表した。アッセイ感度は１６から１０００ｐｇ／ｍｌの範囲であった。
【０１２０】
免役組織化学。筋肉切片（１０μｍ）を冷たいアセトン中で固定し、そして一次抗体としてのウサギ抗ＦＬＡＧポリクローナル抗体（１：１０００；シグマ、セントルイス、ＭＯ）及び二次抗体としてのビオチン化抗ウサギ抗体を二次抗体（１：４００；サンタクルズバイオテクノロジー、サンタクルズ、ＣＡ）とインキュベートした。アビジン−ビオチン−パーオキシダーゼ複合体法（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣキット；ベクターラボラトリーズ、バーリンゲーム、ＣＡ）により３，３−ジアミノベンジジンを発色源として用いて、切片を可視化した。
【０１２１】
筋肉の二重免役蛍光染色のために、切片を連続して、ブロッキング溶液、ポリクローナルウサギ抗ＦＬＡＧ抗体（１：５００；シグマ）、ＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：２００；サンタクルズバイオテクノロジー）、及びテトラメチルローダミンーコンジュゲートα−ブンガロトキシン（モリキュラープローブ、ユージーン、ＯＲ）とインキュベートした。共焦点スキャニング顕微鏡下で切片を検査して写真を撮った（ＴＣＳ  ＮＴ；ライカ、ハイデルベルグ、ドイツ）。
【０１２２】
脊髄の形態学上の分析のために、連続の横断切片（３０μｍ）をＮｉｓｓｌ，ＳＭＩ−２２又はＣＴＢ免役染色のために得た。自由浮遊切片は、ＳＭＩ−３２に関してはマウスオンマウスキット（Ｍ．Ｏ．Ｍキット）（ベクターラボラトリーズ、バーリンゲーム、ＣＡ）により製造者の指示書に従い免役組織化学染色した。ＣＴＢ免役反応のために処理された切片は、５％ウサギ血清によりブロックし、次に抗ＣＴＢ抗体（１：１００００、ＣＴＢに対するヤギ血清；リストバイオロジック）とインキュベートした。
【０１２３】
脊髄の二重免役染色のために、切片を、１０％の正常ヤギ血清及びＭ．Ｏ．Ｍキットを付加したブロッキング溶液によりそれぞれ１時間ブロックし、次に、連続してポリクローナルウサギ抗ＦＬＡＧ抗体（１：２５０；シグマ）及びモノクローナルマウス抗ＳＭＩ−３２抗体（１：５００）と一晩４℃においてインキュベートした。ＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧ（マウスに吸収された、１：２００；サンタクルズバイオテクノロジー）及びローダミンコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（１：２００；サンタクルズバイオテクノロジー）との室温における２時間のインキュベーションの後に、切片を共焦点レーザースキャニング顕微鏡下で検査して写真を撮った。
【０１２４】
形態計測分析及び細胞計数。形態計測分析を、ＫＳイメージ分析ソフトウエアを用いてＣＣＤカメラを用いて捕捉されたイメージ上に実施した（ツアイス、オーバーコッヘン、ドイツ）。筋肉繊維の平均面積をランダムに選択されたエリア内の１０００を超える繊維のカウントから珪酸した。脊髄の運動ニューロンの数を比較するため、前に記載されたとおりに（Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔ．（２０００）２５：４０２−４０５）、各群において、頸部及び腰椎の仙骨の拡大に及ぶＮｉｓｓｌ染色及びＳＭＩ−３２及びＣＴＢ免役染色切片内でニューロンを計数した。各マウスにおいて、各６番の連続切片内の少なくとも２０切片を計数に供した。以下の基準に合致する大きな細胞プロファイルのみを含んだ：明瞭な核と核仁を含む、中央の管からの側線の下の前角の中の位置及び少なくとも一つの密なプロセスの所有。
【０１２５】
統計分析。繰り返しの測定値ＡＮＯＶＡ、続く、群間の複数の比較のためのチューキーの（Tukey's）正当な有意差により、データを統計分析した（ＳｔａｔＶｉｅｗ  ５．０ソフトウエア；ＳＡＳ，ケアリー、ＣＡ）。
【０１２６】
Ｂ．結果
ＡＬＳマウスの筋肉内のＧＤＮＦトランスジーン発現
上記の方法を用いてＥＬＩＳＡにより腓腹筋内のＧＤＮＦの量を測定した。１１０日齢目（注射の７週後）に、ＡＡＶ−ＧＤＮＦベクター処理したマウスのＧＤＮＦレベルは、７９８５．０±８７４．０ｐｇ／ｍｇ蛋白質であり、対照のＡＬＳ群（６２．２±２０．５ｐｇ／ｍｇ蛋白質；ｐ＜０．０１；ｎ＝４）よりも１２０倍より高い。死んだときに、ＡＡＶ−ＧＤＮＦベクター処理したＡＬＳマウスは筋肉内ＧＤＮＦ発現の低下を示す蛍光があった（３２８１．７±６６７．０ｐｇ／ｍｇ蛋白質）。ＧＤＮＦの低下はＡＬＳマウスにおける形質導入された筋肉繊維の重度の萎縮に帰すると推測されたが、なぜならば安定なＧＤＮＦ発現が齢を適合させた野生型マウスにおいて少なくとも８カ月続き得たからである。これらのデータは、ＡＡＶ−ＧＤＮＦベクターが疾患の最終段階まで、ＡＬＳマウス内の実質上のトランスジェニック遺伝子ＧＤＮＦ発現を推進できたことを示唆した。
【０１２７】
筋肉内のトランスジェニックＧＤＮＦの分配のパターンを、免役検出の手段により検査した。ＦＬＡＧはトランスジーンＧＤＮＦをその内因性対応物から区別するためのタグとして使用した。ＡＡＶ−ＧＤＮＦベクターを注射されたマウスにおいては、強いＦＬＡＧ免役反応性が多数の筋繊維において、１１０日齢及び疾患の最終段階において検出された。表面が斑点で覆われた染色及び網状の染色が筋肉の横断切片において観察され、筋繊維鞘の近傍に強い免役反応性が主に局在したことから、トランスジーン由来のＧＤＮＦが周囲の領域へ有効に分泌されたことを示唆した。実質上のＦＬＡＧシグナルは、疾患の最終段階において萎縮した筋繊維において、なお検出できた。
【０１２８】
さらに、抗ＦＬＡＧ抗体及びα−ブンガロトキシンによる二重の免役蛍光染色を実施した。α−ブンガロトキシンは、ＮＭＪｓのシナプス後の膜上の高い親和性をもってアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）に特異的に結合する分子プローブである。結果は、ＦＬＡＧに関してさらに強い免役反応性がα−ブンガロトキシンシグナルと共に局在したことを示したので、トランスジーンＧＤＮＦがＮＭＪｓの領域内で大いに濃縮されたことが示される。予測されたとおり、ＡＡＶ−ＬａｃＺベクター又は媒体により処理された筋肉は、あらゆる時間点において抗ＦＬＡＧに関しての免役染色を呈さなかった。
【０１２９】
ベクターにより処理された筋肉の保存
１１０日齢目において、対照ＡＬＳマウスの腓腹筋は、日齢の適合した野生型マウスにおける腓腹筋の約半分の重量しかなかった（９５．８±１９．４対１８３．０±２２．２ｍｇ；ｎ＝５）。しかしながら、ＡＡＶ−ＧＤＮＦベクター処理したＡＬＳマウスの腓腹筋は同じ日齢の対照のＡＬＳマウスの腓腹筋よりも約１．６８倍重かった（１６０．１±３２．９ｍｇ；ｐ＜０．０１；ｎ＝５）。
【０１３０】
１１０日齢の対照ＡＬＳマウスの筋肉の組織学分析は、重度の神経性萎縮に一致した、小さくて鋭角に角張った（acutely angulated）繊維の広まった群を明らかにした。平均筋繊維面積は大きく減少し（１０５３．８±５８１．０μｍ２；ｎ＝４）、日齢の適合した野生型マウスにおける面積の約３０％であった（３５１７．６±６１３．５μｍ２；ｎ＝５）。対照的に、ＡＡＶ−ＧＤＮＦベクターにより処理された筋肉は、より一致した繊維サイズを伴う神経性萎縮の証拠はほとんど示さず、平均筋繊維面積（２２５２．８±１０３５．２μｍ２；ｎ＝５）は野生型マウスの面積の約７１％に達し、そして対照ＡＬＳ群の面積の２倍を超える。さらに、筋繊維の対照ＡＬＳマウスに観察された小さな直径への顕著なシフトが、ＡＡＶ−ＧＤＮＦベクター処理された群において明らかに和らぎ（図３）、そして＜２０μｍの萎縮した筋繊維のパーセンテージが顕著に低下した（対照ＡＡＶ群の２４％対ＡＡＶ−ＧＤＮＦベクター処理群の９％）。
【０１３１】
脊髄の運動ニューロンへのトランスジェニックＧＤＮＦの逆行性輸送
脊髄の腰部運動ニューロンへのＧＤＮＦの逆行性軸索輸送は、成体マウスにおいて証明された（Ｌｅｉｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（１９９９）１９：９３２２−９３３１）。即ち、トランスジーンＧＤＮＦがＡＬＳマウスにおいて脊髄運動ニューロンへ逆行性輸送される可能性を検査した。この目的のため、トランスジーンＧＤＮＦ内のＧＤＮＦタグを用いることにより、内因性ＧＤＮＦによる結果の干渉を回避した。ＳＭＩ−３２は非リン酸化神経フィラメント（ＮＰ−ＮＦｓ）を特異的に認識する、よく特性決定された抗体であり、よって、運動ニューロンの信頼できるマーカーとして機能する（Ｃａｒｒｉｅｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（１９９６）１６：４０６９−４０７９）。即ち、ＳＭＩ−３２及びＦＬＡＧ抗体を用いて、ＡＬＳマウスからの脊髄切片上にて二重免役染色を実施した。１１０日齢目に、筋肉内ＡＡＶ−ＧＤＮＦベクター注射の７週後にＡＬＳマウスの対応する前角の中のＳＭＩ−３２陽性細胞においてＦＬＡＧ免役シグナルが検出できたが、他方、対照群のＡＬＳマウスの脊髄においてはＦＬＡＧシグナルが観察されなかった。これは、片側だけ処理したＡＬＳマウスの亜群においてさらに証明された；ＦＬＡＧシグナルがＡＡＶ−ＧＤＮＦベクター注射側と同じ側の前角の運動ニューロン中においてのみ検出でき、反対側のＡＡＶ−ＬａｃＺベクター注射の側には検出できなかった。β−ガラクトシダーゼシグナルはＡＡＶ−ＬａｃＺベクターを注射された筋肉内で広く検出されたが、脊髄の対応する前角内では全く観察されなかった。
【０１３２】
実施例３において上で説明したとおり、運動ニューロン中に出現したトランスジーンＧＤＮＦは３つの可能な経路：全身性デリバリー、ＡＡＶベクターの逆行性輸送、又はＧＤＮＦ融合蛋白質自体の逆行性輸送に由来し得た。しかしながら、運動ニューロン中のトランスジェニックＧＤＮＦの制限された分布及び同じ側の提示、並びに血液−脳バリアーを通過できないという公知の性質は、脊髄へのその全身性デリバリーの可能性を除外する。これまで、ほとんどの報告は、ＡＡＶベクターが逆行性輸送されないか又はほんの限定された様式のみにおいて輸送されることを示す（Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．（１９９８）７９３：１６９−１７５；Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．（１９９８）１５０：１８３−１９４；Ａｌｉｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ（２０００）１１：２６６９−２６７３）。一つの最近の報告は、しかしながら、ＣＮＳ中のＡＡＶベクター自身の逆行性輸送を明らかにし、レポーターの緑の蛍光蛋白質がトレーサーとして使用された（Ｋａｓｐａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２００２）５：５０−５６）。即ち、ＡＡＶ粒子が対応する運動ニューロンへ輸送されたかもしれない可能性は完全に除外できない。しかしながら、運動ニューロンへ運ばれたベクターは極めて限定されると推定され、何故ならば形質導入された筋肉におけるその広い分布にも拘わらず、β−ガラクトシダーゼが対応する脊髄運動ニューロン内で検出されなかったからである。
【０１３３】
対照的に、ＡＡＶ−ＧＤＮＦ注射後には形質導入された筋肉及び対応する運動ニューロンの両方においてトランスジェニックＧＤＮＦが豊富に検出された。この発見は、以前の報告並びにβ−ガラクトシダーゼ活性に関する観察と組み合わせると、運動ニューロン中のトランスジェニックＧＤＮＦがＧＤＮＦ蛋白質の逆行性軸索輸送を通して主に得られることを示す。これは、以前の研究（Ｋｏｒｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２９０：７６７−７７３；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（２００２）９：３８１−３８９）に一致し、トランスジェニックＧＤＮＦが逆行性輸送されることを示す。筋肉繊維中のトランスジェニックＧＤＮＦがＮＭＪｓの領域に優先的に蓄積されたという発見も、仮定されたその逆行性輸送と矛盾しないが、何故ならば筋肉繊維から分泌される物質が逆行性輸送されるために吸い上げられる（taken up）軸索末端内にそれがあるからである。
【０１３４】
トランスジーンＧＤＮＦの脊髄運動ニューロン生存に対する効果
ＧＤＮＦの運動ニューロン生存に対する神経保護性効果を評価するため、１１０日齢の異なる群の脊髄運動ニューロンの数を比較した。脊髄のＮｉｓｓｌ染色は、対照ＡＬＳマウスの前角内の運動ニューロンの重大な損失を示した（図４Ａ）。対照的に、ＡＡＶ−ＧＤＮＦベクター処理したマウスにおいては、顕著に多数の運動ニューロンが頸部及び腰部のセグメントにおいて残った（図４Ａ）ことから、トランスジェニックＧＤＮＦの運動ニューロンに対する著しい保護性効果を示唆する。
【０１３５】
ＮＰ−ＮＦに関する染色は、ＡＬＳにおける損失の程度を評価するのに信頼できる手段であり、運動ニューロンの編成がＮＰ−ＮＦの脱リン酸化を誘導することにより、ＳＭＩ−３２染色耐性をもたらすことを示した（Ｔｓａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．（２０００）８６１：４５−５８）。ＮＰ−ＮＦを用いて運動ニューロンを評価するために染色を連続切片上で実施した。Ｎｉｓｓｌ染色の結果と一致して、ＡＡＶ−ＧＤＮＦベクターを処理したＡＬＳマウスは対照のＡＬＳ群と比較して顕著に多数のＳＭＩ−３２陽性運動ニューロンを有した（図４Ｂ）。即ち、運動ニューロンの変性、並びにＡＬＳマウスの脊髄の前角の異常なＮＦの脱リン酸化も、ＡＡＶ−ＧＤＮＦベクター投与の後には顕著に阻害された。即ち、ＳＭＩ−３２染色及びＮｉｓｓｌ染色の両者は、ＡＡＶ−ＧＤＮＦベクターデリバリーによる運動ニューロンの顕著な救済を証明した。
【０１３６】
１１０日齢で死んだＡＬＳマウスの片側のみ処理した群においては、ＡＡＶ−ＬａｃＺベクターを処理された反対側に比べて、ＡＡＶ−ＧＤＮＦベクターを注射された側に対して同じ側の腰部脊髄前角において、より多くの運動ニューロンが生存した（Ｎｉｓｓｌ染色、１７．１±３．２対１０．３±１．１；ＳＭＩ−３２陽性ニューロン、１５．６±１．８対８．８±３．２；ｐ＜０．０１；ｎ＝５）。即ち、これらの発見は、さらに、運動ニューロンに対する治療効果は、全身性デリバリーよりも、トランスジェニックＧＤＮＦの同じ側の逆行性輸送によりもたらされたことを示唆した。
【０１３７】
筋肉に対する運動ニューロン軸索突起の保守に対する効果
注射された筋肉に対しての機能性神経筋肉突起を保持した生存運動ニューロンを定量上評価するため、そのような運動ニューロンを犠牲にする１週前のマウスの両側の腓腹筋への神経系トレーサーＣＴＢの注射により選択的に標識した。１１０日齢目に、野生型マウスに比べて対照ＡＬＳマウスのほうがより少ないＣＴＢ−標識運動ニューロンが存在した。しかしながら、ＡＡＶ−ＧＤＮＦベクター処理をすると、より多くのＣＴＢ−標識された運動ニューロンが対照ＡＬＳマウスに比べて保持された（２０．７±４．９対１１．０±２．５％；ｎ＝４；ｐ＜０．０１）（図５Ａ）。トランスジェニックＧＤＮＦの筋肉へのデリバリーは、即ち、対応する運動ニューロンの軸索突起の保守において重要な役割を担った。
【０１３８】
ＣＴＢにより標識された生存運動ニューロンのより正確な形態計測上の評価のために、我々は、腰部の脊髄のそのようなニューロンのサイズ及び分布を次に測定した。１１０日齢で死んだＡＬＳマウスの対照群は、日齢の適合した野生型マウスよりも顕著に小さな面積のＣＴＢ標識ニューロンを呈し（３５３．１±１７３．８対７３３．７±２５２．０μｍ２；ｎ＝４；ｐ＜０．０１）、サイズ分配はより小さな方にシフトしたことから、ＣＴＢ−陽性運動ニューロンの顕著な萎縮が示される（図５Ｂ）。対照的に、ＡＬＳマウスのＡＡＶ−ＧＤＮＦベクター処理は、顕著に運動ニューロンの萎縮を減少させ（６０５．８±２４８．２μｍ２；ｎ＝４；ｐ＜０．０１対対照群）、そしてサイズ分布はより小さな方にシフトした。合わせて、これらの結果は、筋肉へのＧＤＮＦ遺伝子のデリバリーが生存を促進し、且つＡＬＳマウスにおいて標的筋肉への軸索突起により運動ニューロンの萎縮を阻害できることを示す。
【０１３９】
ＣＴＢは逆行性の方向においてニューロン細胞体へ軸索により（axonally）輸送されて、ニューロンのサイトプラズムを通して検出されたため（Ｌｌｅｗｅｌｌｙｎ−Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈ（２０００）１０３：８３−９０）、ＣＴＢ陽性運動ニューロンの検出は、それらがＡＡＶ−ＧＤＮＦベクターを注射された筋肉との完全な軸索の接続を保持することを意味する。即ち、ＣＴＢ標識は、Ｎｉｓｓｌ又はＮＰ−ＮＦ染色単独よりも正確に脊髄の運動ニューロンに対するトランスジェニックＧＤＮＦの効果を評価することを可能にさせる。この方法は、ＡＡＶ−ＧＤＮＦベクター処理したＡＬＳマウス内のＣＴＢにより標識された多数の大きな脊髄運動ニューロンを明らかにした。これらの発見は、合わせて、ＡＡＶ−ＧＤＮＦベクターの筋肉内注射が運動ニューロンの変性を遅らせることができ、それによりＡＬＳマウスにおいて機能性軸索を延長させることを示す。
【０１４０】
ＧＤＮＦはトランスジェニックＡＬＳマウスにおいて疾患の発症を遅らせ、運動動作を改善し、そして生存を延長させる
９週齢において四肢にＡＡＶ−ＧＤＮＦベクター、ＡＡＶ−ＬａｃＺベクター、又は媒体を注射されたＡＬＳマウスのあらゆる群が、ロータロッドによる定量によれば、１２週齢まで、類似の運動動作を示した。その後は、対照ＡＬＳマウスにおいて急速に低下したのに対し、ＡＡＶ−ＧＤＮＦベクター処理したマウスにおいては動作の低下が顕著に遅れた（ｐ＜０．０５）（図６Ａ−６Ｄ）ため、それらの運動力の顕著な保持を示唆する。ＡＡＶ−ＧＤＮＦベクター処理したＡＬＳマウスにおける動作の欠損の開始の平均齢は１１４．０±４．０ｄ（ｎ＝１２）であり、対照ＡＬＳマウスにおいては１０１．３±５．４ｄであり、違いは顕著であった（ｐ＜０．０１）（図６Ａ）。ＡＡＶ−ＧＤＮＦベクター処理は平均の生存を対照ＡＬＳマウスに比べて１６．６±４．１ｄ延長させた（ＡＡＶ−ＧＤＮＦベクター処理されたマウスにおいては１３８．９±９．２ｄ、対するに、対照ＡＬＳマウスにおいては１２２．３±５．７ｄ；ｎ＝８；ｐ＜０．０１）（図６Ｅ）。これらの結果は、ＡＡＶ−ＧＤＮＦベクターの両側の筋肉内注射が約１３％疾患の発症を遅らせ、そして約１４％トランスジェニックＡＬＳマウスの生存を延長させたことを意味する。
【０１４１】
しかしながら、動作の兆候が現れたら、特に後肢において、骨格筋の虚弱さ及び萎縮が全ての群の全てのマウスにおいて最終的に顕出した。発症から最後の段階までに経過した日数により評価すると、疾患の期間はＡＡＶ−ＧＤＮＦベクター処理マウスと対照ＡＬＳマウスの間に違いはなかった（２４．０±３．５対２１．０±３．５ｄ；ｐ＞０．０５）。ＧＤＮＦは分泌される蛋白質であるから、我々は、トランスジーン由来のＧＤＮＦの治療上の有益性が、ＡＡＶ−ＧＤＮＦベクター投与後の全身の循環によっても、もたらされたのか否かを評価した。ＡＡＶ−ＧＤＮＦベクターそれらの左の肢に、そしてＡＡＶ−ＬａｃＺベクターを右の肢に、片側処理したＡＬＳマウスの亜群においては、各マウスが１１０日齢まではＡＡＶ−ＧＤＮＦベクターを注射した肢をほぼ正常に動かした。しかしながら、反対側の肢は早くて９３日齢目に虚弱性を発症し、小さく丸まる歩様（wadding gait）があった。ＡＡＶ−ＧＤＮＦベクターを処理した肢の運動機能は良好なのにも拘わらず、対照ＡＬＳマウスに比べると、試験されたあらゆる速度においてロータロッド上の走破時間においてマウスは顕著な差異を示さなかった。この亜群の運動の欠損の平均発症時間も、対照ＡＬＳマウスに比して顕著な差異を示さなかった（１０２．７±３．１ｄ；ｎ＝７；ｐ＞０．０５）（図６Ｄ）。
【０１４２】
要約すると、四肢に注射をしたＡＡＶ−ＧＤＮＦ処理ＡＬＳマウスは、対照のＡＬＳマウスとは対照的に、はるかに良好な挙動上の動作を示し、疾患の発症が遅れ、そして寿命が伸び、それは運動ニューロンの病理の減衰と合致した。片側のみＡＡＶ−ＧＤＮＦ処理した亜群においては、ＧＤＮＦの挙動上の特徴及び病理上の特徴に対する治療効果は処理したのと同じ側のみに限定され、ＡＡＶ−ＬａｃＺベクター処理された側の運動動作の明らかな低下があった。しかしながら、ロータロッド上の運動動作及び疾患の発症は、対照群のそれらと同じままであった。即ち、治療上の有益性は全身デリバリーよりもむしろその逆行性輸送後の運動ニューロンに対するトランスジェニックＧＤＮＦの直接の作用によりほとんどもたらされたと推定される。
【０１４３】
ＡＡＶ−ＧＤＮＦベクターの片側投与は顕著に疾患の発症を遅らせて、ＡＬＳマウスの生存を改善したが、疾患の発症から死までの時間の長さを延長することはなかった。さらに、ＧＤＮＦの実質上の発現にも拘わらず、対照ＡＬＳマウスにおけるように、形態上の評価がそのような筋繊維の重度の萎縮及び脊髄の運動ニューロンの膨大な損失を証明した場合、ＡＡＶ−ＧＤＮＦベクター処理したマウスは最終的に最後の段階に到達した。病理上の変化がＡＬＳマウスにおいて無症候性の段階において起こり、そして膨大な運動ニューロンの死が最後の段階において起こるということが報告された（Ｄａｌ  Ｃａｎｔｏ  ａｎｄ  Ｇｕｒｎｅｙ，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．（１９９５）６７６：２５−４０；Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ（１９９５）１４：１１０５−１１１６；Ｍｏｕｒｅｌａｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９６）９３：５４７２−５４７７；Ｔｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９６）９３：３１５５−３１６０；Ｂｒｕｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８）２８１：１８５１−１８５４；Ｓｈｉｂａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．（１９９８）９５：１３６−１４２）。即ち、トランスジーンＧＤＮＦは、前角がマイルドな病理を有する場合に、無症候性の段階においてＡＬＳマウスの運動ニューロンに関してその最大の保護機能を呈するのかもしれない。疾患が発症されたら、しかしながら、ＧＤＮＦ遺伝子治療は膨大な運動ニューロンの死を容易には阻害しないか又は疾患の素早くて避けられない進行により干渉されるのかもしれない。上記の実験においては、９週齢目に処理を始めた。早い時期及び／又は他の神経親和性因子を伴うＧＤＮＦの投与（Ｂｉｌａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｙｏｔｒｏｐｈ，Ｌａｔｅｒａｌ  Ｓｃｌｅｒ．Ｏｔｈｅｒ  Ｍｏｔｏｒ  Ｎｅｕｒｏｎ  Ｄｉｓｏｒｄ．（２００１）２：８３−９１）は、良好な結果を導くかもしれない。
【０１４４】
上記の研究は、トランスジェニックＡＬＳマウスモデルへのＡＡＶ−ＧＤＮＦベクターの筋肉内注射が、筋肉内のＧＤＮＦの持続性の実質上の生合成及び対応する脊髄の運動ニューロンの逆行性の輸送をもたらすことを示す。ＡＬＳマウスにおいて最後の段階まで発現は持続したため、生物学上合成されたＧＤＮＦの筋肉の運動ニューロン軸索末端への連続の供給を補償する見込みがある。さらに、このトランスジーンの発現は、運動ニューロンの損失を顕著に防ぐだけではなく、疾患の顕示の著しい減衰及びトランスジェニックＡＬＳマウスの生存の延長を導く。さらに、ＡＡＶ−ＧＤＮＦベクター処理したＡＬＳマウスは、対照ＡＬＳマウスとは対照的に、はるかに良好な挙動上の動作を示した。
【０１４５】
従って、運動ニューロン疾患、例えばＡＡＶを治療するための新規な方法が提供される。主題の発明の好ましい態様を詳細に説明したが、請求の範囲により定義される発明の精神及び範囲から逸脱することなく明らかな変更がなされ得ることは理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】図１Ａ及び１Ｂは、ＥＬＩＳＡにより測定された、条件設定された培地及びＡＡＶ−ＧＤＮＦ−ＦＬＡＧ又はＡＡＶ−ＬａｃＺによる感染の４８後の２９３の細胞溶解物のＧＤＮＦレベルを示す。
【図２】図２は、感染後の様々な時間点における、注射されたマウスの腓腹筋のＧＤＮＦレベルを示す。
【図３】図３は、野生型、対照ＡＬＳ及びＡＡＶ−ＧＤＮＦ−処理したＡＬＳマウスの様々な直径の筋肉繊維の分配パーセントを示す。
【図４】図４Ａ−４Ｂは、野生型、対照ＡＬＳ及びＡＡＶ−ＧＤＮＦ−処理したＡＬＳマウスの脊髄運動ニューロンの数を示す。図４Ａは、前方の角（anterior horn）あたりのＮｉｓｓｌ染色されたニューロンの平均の数を示す。図４Ｂは、前方の角あたりのＳＭＩ−３２染色されたニューロンの平均の数を示す。
【図５】図５Ａ及び５Ｂは、対照ＡＬＳ及びＡＡＶ−ＧＤＮＦ−処理したＡＬＳマウスにおいて軸索の突起を保持した運動ニューロンに対するＧＤＮＦの効果を示す。図５Ａは、前方の角あたりのＣＴＢ標識された運動ニューロンの生存を示す。値は、ＣＴＢ／Ｎｉｓｓｌ比（前方の角あたりのニューロンの平均数）を表す。図５Ｂは、対照ＡＬＳ及びＡＡＶ−ＧＤＮＦ−処理したＡＬＳマウスにおける様々な直径の筋肉繊維の分布パーセントを示す。
【図６】図６Ａ−６Ｅは、ＧＤＮＦが疾患の発症を示し、運動性能力を改善し、そしてトランスジェニックＡＬＳマウスにおいて生存性を延長させることを証明する実験の結果を示す。図６Ａは、ＡＬＳマウスにおけるロータロッド欠損の発症の累積した確率を示す。図６Ｂは、５ｒｐｍにおけるロータロッド試験のＡＬＳマウスの能力を示す。図６Ｃは、１０ｒｐｍにおけるロータロッド試験のＡＬＳマウスの能力を示す。図６Ｄは、２０ｒｐｍにおけるロータロッド試験のＡＬＳマウスの能力を示す。図６Ｅは、生存の累積した確率を示す。
【図７】図７（配列番号：１及び２）は、ヒトプレプロＧＤＮＦのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す。成熟ＧＤＮＦ分子はアミノ酸位置７８−２１１にわたる。
【図８】図８（配列番号：３及び４）は、ラットプレプロＧＤＮＦのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す。成熟ＧＤＮＦ分子はアミノ酸位置７８−２１１にわたる。
【図９】図９（配列番号：６及び７）は、マウスプレプロＧＤＮＦのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す。成熟ＧＤＮＦ分子はアミノ酸位置１０７−２４０にわたる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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