(57)【要約】新規ＢＡＣＥタンパク質、その結晶構造、その核酸分子、及びそれらを製造及び使用する方法並びにそれらの使用、とりわけＢＡＣＥのインヒビターの解明が開示及び請求されており、また、ＢＡＣＥのインヒビター及びそれを製造及び使用する方法も開示及び請求されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢＡＣＥの触媒性ドメイン又はリフォールディングに関する必要性を排除する正確なジスルフィド結合で結晶化するのに適しているＢＡＣＥの形態、並びに／又は、アポＢＡＣＥ結晶又は浸漬させて複合体を得ることができるアポＢＡＣＥ結晶、並びに／又は、酵素の生理学的ｐＨで又はその近傍ですなわち約ｐＨ５．６と約ｐＨ５．８の間で成長する結晶を有するＢＡＣＥの結晶形態、並びに／又は、Ｃ２の空間群を有するＢＡＣＥの結晶形態、並びに／又は、セルの寸法がａ＝２３６．６３Å、２３６．６３Å±標準偏差（０．２Å）若しくは２３６．６３Å±３．０Å、ｂ＝１０５．０２Å、１０５．０２Å±標準偏差（０．２Å）若しくは１０５．０２Å±３．０Å、及びｃ＝６２．５９Å、６２．５９Å±標準偏差（０．２Å）若しくは６２．５９Å±３．０Å、及びβ＝１０１．３２°、１０１．３２°±標準偏差（０．２°）若しくは１０１°と１０８°の間でＢＡＣＥの３つのコピーを含有する結晶の非対称性ユニットを伴うか、又は、セルの寸法がａ＝２３８．３Å、２３８．３Å±標準偏差（０．２Å）若しくは２３８．３Å±３．０Å、ｂ＝１０７．４Å±標準偏差（０．２Å）若しくは１０７．４Å±３．０Å、及びｃ＝６０．４Å、６０．４Å±標準偏差（０．２Å）若しくは６０．４Å±３．０Å、及びβ＝１０１．８９°、１０１．８９°±標準偏差（０．２°）若しくは１０１°と１０８°の間であり、そして／又は、前記のいずれか若しくは全てに対応するか又はその結果であるＸ線回折像を有し、そして／又は、前記のいずれか若しくは全てに対応するか又はその結果であるＸ線回折像を有し、そして／又は、非対称性のユニットで分子のコピー数の増加と共にＣ２からＰ２１までの空間群転移を有するが、アポＢＡＣＥ結晶をリガンドに浸漬した場合、セル寸法及びＰ２１形態のパッキングはＣ２結晶形態のものと非常に関連性があるＢＡＣＥ結晶；並びに／又は、３Åよりも良好な解像度を有するＢＡＣＥ結晶、並びに／又は表５の座標により定義される構造を有するＢＡＣＥ結晶。
【請求項２】
表５の座標により定義される構造を有するＢＡＣＥ結晶。
【請求項３】
酵素の生理学的ｐＨ又はその近傍で成長するアポＢＡＣＥ結晶。
【請求項４】
アポＢＡＣＥ結晶、又は浸漬させて複合体を得ることができるアポＢＡＣＥ結晶。
【請求項５】
酵素の生理学的ｐＨ又はその近傍で成長する結晶を有する、ＢＡＣＥの結晶形態又はその機能的部分。
【請求項６】
約ｐＨ５．６と約ｐＨ５．８の間のｐＨで結晶が成長する、請求項５に記載のＢＡＣＥの結晶形態又はその機能的部分。
【請求項７】
Ｃ２の空間群を有し、且つ、セルの寸法がａ＝２３６．６３Å、２３６．６３Å±標準偏差（０．２Å）若しくは２３６．６３Å±３．０Å、ｂ＝１０５．０２Å、１０５．０２Å±標準偏差（０．２Å）若しくは１０５．０２Å±３．０Å、及びｃ＝６２．５９Å、６２．５９Å±標準偏差（０．２Å）若しくは６２．５９Å±３．０Å、及びβ＝１０１．３２°、１０１．３２°±標準偏差（０．２°）若しくは１０１°と１０８°の間で３つのＢＡＣＥコピーを含有する非対称性結晶ユニットを伴うか、又は、セルの寸法がａ＝２３８．３Å、２３８．３Å±標準偏差（０．２Å）若しくは２３８．３Å±３．０Å、ｂ＝１０７．４Å±標準偏差（０．２Å）若しくは１０７．４Å±３．０Å、及びｃ＝６０．４Å、６０．４Å±標準偏差（０．２Å）若しくは６０．４Å±３．０Å、及びβ＝１０１．８９°、１０１．８９°±標準偏差（０．２°）若しくは１０１°と１０８°の間であり、そして／又は前記のいずれか若しくは全てに対応するか又はその結果であるＸ線回折像を有し、そして／又は前記のいずれか若しくは全てに対応するか又はその結果であるＸ線回折像を有し、そして／又は非対称性のユニットで分子のコピー数の増加と共にＣ２からＰ２１までの空間群転移を有するが、アポＢＡＣＥ結晶をリガンドに浸漬した場合、セル寸法及びＰ２１形態のパッキングはＣ２結晶形態のものと非常に関連性があるＢＡＣＥの結晶形態又はその機能的部分。
【請求項８】
天然基質又は天然若しくは生理学的に活性部位内に生じる基質以外の１つ以上のリガンドを含有する活性部位を有するＢＡＣＥの結晶形態又はその機能的部分。
【請求項９】
請求項２から８のいずれか一項に記載のＢＡＣＥ結晶を１つ以上の被験サンプルに暴露すること、及びリガンド−ＢＡＣＥ複合体が形成されるかどうかを決定することを含む、リガンドスクリーニング又は同定のための方法。
【請求項１０】
１つ以上の被験サンプルの存在下で、ＢＡＣＥのタンパク質又はその機能的部分を共結晶化することにより、ＢＡＣＥのタンパク質又はその機能的部分を被験サンプルに暴露する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項２から８のいずれか一項に記載のＢＡＣＥを、１つ以上の被験サンプル溶液に浸漬させる、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
ＢＡＣＥの触媒性ドメイン又はその機能的部分内に適合する潜在的リガンドを同定又は設計するためのコンピューター支援方法であって、
プロセッサ、データ保存システム、入力装置、及び出力装置を備えるプログラム化されたコンピューターを使用することを含み、（ａ）前記入力装置を介してプログラム化されたコンピューターにＢＡＣＥ触媒性ドメインの原子サブセットの３次元座標を含むデータを、リガンド−ＢＡＣＥ複合体からの構造情報を任意に伴って入力し、それによりデータセットを作製する工程；（ｂ）前記プロセッサを用いて、前記コンピューターデータ保存システムに保存された化学構造のコンピューターデータベースと前記データセットを比較する工程；（ｃ）コンピューター法を用いて前記データベースから前記データセットに構造的に類似する部分を有する化学構造を選択する工程；（ｄ）コンピューター法を用いて前記データセットに構造的に類似する部分を有する化学構造のモデルを構築する工程；及び（ｅ）前記データセットに類似する部分を有する選択された化学構造を前記出力装置に出力する工程を含み、及び１つ以上の選択された化学構造を合成する工程を任意に含み；前記合成され選択された化学構造をＢＡＣＥと接触させて前記合成された化学構造がＢＡＣＥの触媒性ドメイン内に適合し、及び／又はＢＡＣＥを阻止するかどうかを確定する工程を更に任意に含む；又は
表５の座標により定義されるＢＡＣＥの構造を提供すること、候補モデュレーター分子の構造を提供すること、及び候補物質の構造を表５のＢＡＣＥの構造に適合させることを含む；又は
ＢＡＣＥの表５の少なくとも２つの原子の座標（「選択された座標」）を提供すること、候補モデュレーター分子の構造を提供すること、及び候補物質の構造をＢＡＣＥの選択された座標に適合させることを含む；又は
ＢＡＣＥの少なくとも１つのサブドメインの座標を提供すること、候補モデュレーター分子の構造を提供すること、及び候補物質の構造をＢＡＣＥのサブドメインに適合させることを含む；
化学構造若しくは候補モデュレーターを入手若しくは合成すること、及び化学構造若しくは候補モデュレーターをＢＡＣＥと接触させて化学構造若しくは候補モデュレーターがＢＡＣＥと相互作用する能力を決定すること、又は、化学構造若しくは候補モデュレーターを入手若しくは合成すること、前記化学構造若しくは候補モデュレーターとＢＡＣＥとの複合体を形成すること、及び複合体を分析して前記化学構造若しくは候補モデュレーターがＢＡＣＥと相互作用する能力を決定すること、を更に任意に含む前記方法。
【請求項１３】
請求項９から１２のいずれか一項に記載の方法を用いて選択される化学構造を有する化合物であって、ＢＡＣＥのモデュレーターである前記化合物。
【請求項１４】
請求項７に記載の結晶構造又はその結晶構造を擬似する構造に結晶化する触媒性ドメインのアミノ酸配列を含む、ＢＡＣＥタンパク質又はその機能的部分。
【請求項１５】
野生型ＢＡＣＥ又はジェンバンク受け入れ番号Ｐ５６８１７のＢＡＣＥと比較した場合、グリコシル化を防御するか又は結晶化及び／若しくは秩序ある回折良好な結晶成長を促進するために、１つ以上の変異又はトランケーションを有するＢＡＣＥタンパク質又はその機能的部分。
【請求項１６】
ジェンバンク受け入れ番号Ｐ５６８１７と比較した場合、アミノ酸（「ａａ」）１５３での変異、ａａ１７２での変異、ａａ２２３での変異、ａａ３５４での変異の１つ以上を有し、且つ、トランケーションを１つ以上有する、請求項１５に記載のＢＡＣＥタンパク質又はその機能的部分。
【請求項１７】
各々の変異がアスパラギンからグルタミンである、請求項１６に記載のＢＡＣＥタンパク質又はその機能的部分。
【請求項１８】
ジェンバンク受け入れ番号Ｐ５６８１７を参照すると、トランケーションがＴｈｒ２２からＳｅｒ４５３にわたってＢＡＣＥに存在する、請求項１６に記載のＢＡＣＥタンパク質又はその機能的部分。
【請求項１９】
ジェンバンク受け入れ番号Ｐ５６８１７を参照すると、全ての変異が存在し且つ各々がアスパラギンからグルタミンであり、そしてＴｈｒ２２からＳｅｒ４５３にわたってＢＡＣＥにトランケーションが存在する、請求項１６に記載のＢＡＣＥタンパク質又はその機能的部分。
【請求項２０】
精製を促進するためのタグ、タンパク質の細胞培養培地への分泌を促進するか又は増加させる非ＢＡＣＥシグナル配列、及び不完全なプロペプチド切断から生じる種の区別を可能にするタグのいずれかを１つ以上更に含む、請求項１４から１９のいずれか一項に記載のＢＡＣＥタンパク質又はその機能的部分。
【請求項２１】
精製を促進するためのタグがＨＩＳタグであり、非ＢＡＣＥシグナル配列がバキュロウイルスシグナル配列であり、そして種の区別を可能にするタグがＦＬＡＧタグである、請求項２０に記載のＢＡＣＥタンパク質又はその機能的部分。
【請求項２２】
精製を促進するためのタグ、非ＢＡＣＥシグナル配列及び区別を可能にするタグの全てが存在する、請求項２１に記載のＢＡＣＥタンパク質又はその機能的部分。
【請求項２３】
精製を促進するためのタグ、タンパク質の細胞培養培地への分泌を促進するか又は増加させる非ＢＡＣＥシグナル配列、及び不完全なプロペプチド切断から生じる種の区別を可能にするタグのいずれかを１つ以上含有するＢＡＣＥタンパク質又はその機能的部分。
【請求項２４】
精製を促進するためのタグがＨＩＳタグであり、非ＢＡＣＥシグナル配列がバキュロウイルスシグナル配列であり、そして種の区別を可能にするタグがＦＬＡＧタグである、請求項２３に記載のＢＡＣＥタンパク質又はその機能的部分。
【請求項２５】
精製を促進するためのタグ、非ＢＡＣＥシグナル配列及び区別を可能にするタグの全てが存在する、請求項２４に記載のＢＡＣＥタンパク質又はその機能的部分。
【請求項２６】
請求項１４から２５のいずれか一項に記載のＢＡＣＥタンパク質又はその機能的部分をコードする単離された核酸分子又はその機能的部分。
【請求項２７】
野生型ＢＡＣＥ由来のヌクレオチド配列でありＢＡＣＥタンパク質もまたコードするものからのサイレント変異を介して低減したＧＣ含量を有する、請求項２６に記載の単離された核酸分子。
【請求項２８】
請求項２６に記載の核酸分子を含む又は発現するベクター又は細胞。
【請求項２９】
請求項２７に記載の核酸分子を含む又は発現するベクター又は細胞。
【請求項３０】
ウイルスベクター又は細菌ベクター又は哺乳動物細胞又はＤＮＡプラスミドである、請求項２８に記載のベクター又は細胞。
【請求項３１】
ウイルスベクター又は細菌ベクター又は哺乳動物細胞又はＤＮＡプラスミドである、請求項２９に記載のベクター又は細胞。
【請求項３２】
バキュロウイルスベクター又は昆虫細胞である、請求項３０又は３１に記載のベクター又は細胞。
【請求項３３】
特定のベクター又は細胞系で生成されたＢＡＣＥの全量を増強する及び／又はプロセシングされたタンパク質の分画を増加させるエンハンサーをコードする核酸分子を更に含む、請求項２６に記載のベクター又は細胞。
【請求項３４】
特定のベクター又は細胞系で生成されるＢＡＣＥの全量を増強する及び／又はプロセシングされたタンパク質の分画を増加させるエンハンサーをコードする核酸分子を更に含む、請求項２７に記載のベクター又は細胞。
【請求項３５】
エンハンサーがプロホルモンコンバターゼである、請求項３３又は３４に記載のベクター又は細胞。
【請求項３６】
プロホルモンコンバターゼがフリンである、請求項３５に記載のベクター又は細胞。
【請求項３７】
ＢＡＣＥタンパク質又はその機能的部分をコードする核酸分子並びにベクター又は細胞系で生成されるＢＡＣＥの全量を増強する及び／又はプロセシングされたタンパク質の分画を増加させるエンハンサーをコードする核酸分子を含むベクター又は細胞。
【請求項３８】
エンハンサーがプロホルモンコンバターゼである、請求項３７に記載のベクター又は細胞。
【請求項３９】
（i）ＢＡＣＥをコードする核酸分子、及び（ii）エンハンサーをコードする核酸分子を含む、別個にパッケージングされた核酸分子を含有する、請求項３７に記載のベクター又は細胞を生成するためのキット。
【請求項４０】
請求項２６若しくは２７に記載の核酸分子、又は、請求項２８から３４若しくは請求項３７のいずれか一項に記載のベクター若しくは細胞の核酸分子、を発現することを含むＢＡＣＥタンパク質を入手するための方法。
【請求項４１】
ベクター又は細胞において、請求項３９に記載のキットの核酸分子を発現すること含む、ベクター又は細胞の核酸分子を発現することを含むＢＡＣＥタンパク質を入手するための方法。
【請求項４２】
請求項１４から２５のいずれか一項に記載のＢＡＣＥタンパク質を適当な溶媒に溶解すること及び同一物をインヒビターの存在下又は不在下のいずれかで結晶化することを含むＢＡＣＥタンパク質又はその機能的部分を結晶化するための方法であって、組換えにより又はベクターによるその発現によりＢＡＣＥを生成すること、該生成されたＢＡＣＥを回収すること、及び回収されたＢＡＣＥから結晶を成長させることを、更に任意に含む方法。
【請求項４３】
インヒビターがＯＭ９９−２である請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
請求項１４から２５のいずれか一項に記載のＢＡＣＥタンパク質の結晶を入手すること及びそのＸ線回折パターンを入手することを含むＢＡＣＥタンパク質又はその機能的部分の結晶構造を決定するための方法。
【請求項４５】
ＢＡＣＥタンパク質又はその機能的部分のＢＡＣＥ結晶を１つ以上の被験サンプルに暴露すること、及びリガンド−ＢＡＣＥ複合体が形成されるかどうかを決定することを含む、リガンドをスクリーニング及び設計又は同定するための方法であって、ＢＡＣＥ又はその機能的部分が、占有されていない活性部位を有し且つ請求項５から８のいずれか一項に記載のものである、前記方法。
【請求項４６】
１つ以上の被験サンプルの存在下でＢＡＣＥ又はその機能的部分を共結晶化すること、又は１つ以上の被験サンプルの溶液にＢＡＣＥ又はその機能的部分を浸漬することのいずれかによりＢＡＣＥを被験サンプルに暴露する請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
ＢＡＣＥの触媒性ドメイン又はその機能的部分内に適合する潜在的リガンドを同定又は設計するためのコンピューター支援方法であって、
プロセッサ、データ保存システム、入力装置、及び出力装置を備えるプログラム化されたコンピューターを使用することを含み、（ａ）前記入力装置を介してプログラム化されたコンピューターに請求項５から８のいずれか一項に記載のＢＡＣＥ触媒性ドメイン又はその機能的部分の原子サブセットの３次元座標を含むデータを、リガンド−ＢＡＣＥ複合体からの構造情報を任意に伴って入力し、それによりデータセットを作製する工程；（ｂ）前記プロセッサを用いて、前記コンピューターデータ保存システムに保存された化学構造のコンピューターデータベースと前記データセットを比較する工程；（ｃ）コンピューター法を用いて前記データベースから前記データセットに構造的に類似する部分を有する化学構造を選択する工程；（ｄ）コンピューター法を用いて前記データセットに構造的に類似する部分を有する化学構造のモデルを構築する工程；及び（ｅ）前記データセットに類似する部分を有する選択された化学構造を前記出力装置に出力する工程を含み、及び１つ以上の選択された化学構造を合成する工程を任意に含み；前記合成され選択された化学構造をＢＡＣＥと接触させて前記合成された化学構造がＢＡＣＥの触媒性ドメイン内に適合し、及び／又はＢＡＣＥを阻止するかどうかを確定する工程を更に任意に含む；又は
表５の座標により定義されるＢＡＣＥの構造を提供すること、候補モデュレーター分子の構造を提供すること、及び候補物質の構造を表５のＢＡＣＥの構造に適合させることを含む；又は
ＢＡＣＥの表５の少なくとも２つの原子の座標（「選択された座標」）を提供すること、候補モデュレーター分子の構造を提供すること、及び候補物質の構造をＢＡＣＥの選択された座標に適合させることを含む；又は
ＢＡＣＥの少なくとも１つのサブドメインの座標を提供すること、候補モデュレーター分子の構造を提供すること、及び候補物質の構造をＢＡＣＥのサブドメインに適合させることを含む；
化学構造若しくは候補モデュレーターを入手若しくは合成すること、及び化学構造若しくは候補モデュレーターをＢＡＣＥと接触させて化学構造若しくは候補モデュレーターがＢＡＣＥと相互作用する能力を決定すること、又は、化学構造若しくは候補モデュレーターを入手若しくは合成すること、前記化学構造若しくは候補モデュレーターとＢＡＣＥとの複合体を形成すること、及び複合体を分析して前記化学構造若しくは候補モデュレーターがＢＡＣＥと相互作用する能力を決定すること、を更に任意に含む前記方法。
【請求項４８】
請求項４５から４７のいずれか一項に記載の方法で同定されるリガンド。
【請求項４９】
請求項１４から２５のいずれか一項に記載のＢＡＣＥタンパク質又はその機能的部分、及び化合物がＢＡＣＥのモデュレーターであるかどうかを決定する手段、を含むアッセイ。
【請求項５０】
請求項１４から２５のいずれか一項に記載のＢＡＣＥタンパク質又はその機能的部分により誘導される抗体。
【請求項５１】
請求項１４から２５のいずれか一項に記載のＢＡＣＥタンパク質又はその機能的部分のインヒビター。
【請求項５２】
請求項５１に記載のインヒビターを含む組成物。
【請求項５３】
請求項４８に記載のリガンドを含む組成物。
【請求項５４】
請求項１３に記載のリガンドを含む組成物。
【請求項５５】
請求項４９に記載のアッセイの生成物を含む組成物。
【請求項５６】
請求項５１に記載のＢＡＣＥタンパク質又はその機能的部分のインヒビターを投与することを含む、ＢＡＣＥ又はＡβ若しくはそのフラグメントの生成を阻止するか、それを必要とする個体においてＡＤを処置するための方法。
【請求項５７】
請求項１３に記載のリガンドを投与することを含む、ＢＡＣＥ又はＡβ若しくはそのフラグメントの生成を阻止するか、それを必要とする個体においてＡＤを処置するための方法。
【請求項５８】
請求項４８に記載のリガンドを投与することを含む、ＢＡＣＥ又はＡβ若しくはそのフラグメントの生成を阻止するか、それを必要とする個体においてＡＤを処置するための方法。
【請求項５９】
配列番号：５のアミノ酸配列又は配列番号：５と９８．８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むＢＡＣＥ。
【請求項６０】
配列番号：５のアミノ酸配列を有する、請求項５９に記載のＢＡＣＥ。
【請求項６１】
請求項５９又は６０に記載のＢＡＣＥをコードする核酸分子。
【請求項６２】
配列番号：４若しくは１０の配列又は配列番号：４若しくは１０の配列と９５．６％以上の同一性を有する配列を含む単離された核酸分子。
【請求項６３】
配列番号：４の配列を有する、請求項６２に記載の単離された核酸分子。
【請求項６４】
配列番号：１０の配列を有する請求項６３に記載の単離された核酸分子。
【請求項６５】
請求項６２から６４のいずれか一項に記載の単離された核酸分子を含むベクター又は細胞。
【請求項６６】
バキュロウイルスベクター又は昆虫細胞である請求項６５に記載のベクター又は細胞。
【請求項６７】
請求項５９又は６０のいずれか一項に記載のＢＡＣＥのインヒビター。
【請求項６８】
請求項５９又は６０に記載のＢＡＣＥにより誘導される抗体。
【請求項６９】
ＢＡＣＥタンパク質又はその機能的部分のＢＡＣＥ結晶を１つ以上の被験サンプルに暴露すること、及びリガンド−ＢＡＣＥ複合体が形成されるかどうかを決定することを含む、リガンドをスクリーニング及び設計又は同定するための方法であって、ＢＡＣＥ又はその機能的部分が、占有されていない活性部位を有し且つ請求項５９又は６０に記載のものである、前記方法。
【請求項７０】
１つ以上の被験サンプルの存在下でＢＡＣＥ若しくはその機能的部分を共結晶化すること、又は１つ以上の被験サンプルの溶液にＢＡＣＥ若しくはその機能的部分を浸漬することのいずれかによりＢＡＣＥを被験サンプルに暴露する、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
ＢＡＣＥの触媒性ドメイン又はその機能的部分内に適合する潜在的リガンドを同定又は設計するためのコンピューター支援方法であって、
プロセッサ、データ保存システム、入力装置、及び出力装置を備えるプログラム化されたコンピューターを使用することを含み、（ａ）前記入力装置を介してプログラム化されたコンピューターに請求項５９又は６０に記載のＢＡＣＥ触媒性ドメイン又はその機能的部分の原子サブセットの３次元座標を含むデータを、リガンド−ＢＡＣＥ複合体からの構造情報を任意に伴って入力し、それによりデータセットを作製する工程；（ｂ）前記プロセッサを用いて、前記コンピューターデータ保存システムに保存された化学構造のコンピューターデータベースと前記データセットを比較する工程；（ｃ）コンピューター法を用いて前記データベースから前記データセットに構造的に類似する部分を有する化学構造を選択する工程；（ｄ）コンピューター法を用いて前記データセットに構造的に類似する部分を有する化学構造のモデルを構築する工程；及び（ｅ）前記データセットに類似する部分を有する選択された化学構造を前記出力装置に出力する工程を含み、及び１つ以上の選択された化学構造を合成する工程を任意に含み；前記合成され選択された化学構造をＢＡＣＥと接触させて前記合成された化学構造がＢＡＣＥの触媒性ドメイン内に適合し、及び／又はＢＡＣＥを阻止するかどうかを確定する工程を更に任意に含む；又は
表５の座標により定義されるＢＡＣＥの構造を提供すること、候補モデュレーター分子の構造を提供すること、及び候補物質の構造を表５のＢＡＣＥの構造に適合させることを含む；又は
ＢＡＣＥの表５の少なくとも２つの原子の座標（「選択された座標」）を提供すること、候補モデュレーター分子の構造を提供すること、及び候補物質の構造をＢＡＣＥの選択された座標に適合させることを含む；又は
ＢＡＣＥの少なくとも１つのサブドメインの座標を提供すること、候補モデュレーター分子の構造を提供すること、及び候補物質の構造をＢＡＣＥのサブドメインに適合させることを含む；
ＢＡＣＥの触媒性ドメイン又はその機能的部分内に適合する、可能性のあるリガンドを同定又は設計するためのコンピューターを用いる方法であって、
化学構造若しくは候補モデュレーターを入手若しくは合成すること、及び化学構造若しくは候補モデュレーターをＢＡＣＥと接触させて化学構造若しくは候補モデュレーターがＢＡＣＥと相互作用する能力を決定すること、又は、化学構造若しくは候補モデュレーターを入手若しくは合成すること、前記化学構造若しくは候補モデュレーターとＢＡＣＥとの複合体を形成すること、及び複合体を分析して前記化学構造若しくは候補モデュレーターがＢＡＣＥと相互作用する能力を決定すること、を更に任意に含む前記方法。
【請求項７２】
請求項６８から７１のいずれか一項に記載の方法で同定されるリガンド。
【請求項７３】
請求項５８又は５９に記載のＢＡＣＥタンパク質又はその機能的部分、及び化合物がＢＡＣＥのモデュレーターであるかどうかを決定するための手段を含むアッセイ。
【請求項７４】
請求項６７に記載のインヒビターを含む組成物。
【請求項７５】
請求項７２に記載のリガンドを含む組成物。
【請求項７６】
請求項７３に記載のアッセイの生成物を含む組成物。
【請求項７７】
請求項６７に記載のＢＡＣＥタンパク質若しくはその機能的部分のインヒビターを投与することを含む、ＢＡＣＥ又はＡβ若しくはそのフラグメントの生成を阻止するか、それを必要とする個体においてＡＤを処置するための方法。
【請求項７８】
請求項７２に記載のリガンドを投与することを含む、ＢＡＣＥ又はＡβ若しくはそのフラグメントの生成を阻止するか、それを必要とする個体においてＡＤを処置するための方法。
【請求項７９】
ＢＡＣＥ又はＡβ若しくはそのフラグメントの生成を阻止するか、又はそれを必要とする個体においてＡＤを処置するための、組成物又は医薬品を調製するための請求項５１に記載されるＢＡＣＥタンパク質又はその機能的部分のインヒビターの使用。
【請求項８０】
ＢＡＣＥ又はＡβ若しくはそのフラグメントの生成を阻止するか、又はそれを必要とする個体においてＡＤを処置するための、組成物又は医薬品を調製するための請求項１３に記載のＢＡＣＥタンパク質又はその機能的部分のインヒビターの使用。
【請求項８１】
ＢＡＣＥ又はＡβ若しくはそのフラグメントの生成を阻止するか、又はそれを必要とする個体においてＡＤを処置するための、組成物又は医薬品を調製するための請求項４８に記載のＢＡＣＥタンパク質又はその機能的部分のインヒビターの使用。
【請求項８２】
治療において使用するための請求項５１に記載されるＢＡＣＥタンパク質又はその機能的部分のインヒビターの使用。
【請求項８３】
ＢＡＣＥ又はＡβ若しくはそのフラグメントの生成を阻止するか、又はそれを必要とする個体においてＡＤを処置するための、組成物又は医薬品を調製するための請求項６７に記載のＢＡＣＥタンパク質又はその機能的部分のインヒビターの使用。
【請求項８４】
ＢＡＣＥ又はＡβ若しくはそのフラグメントの生成を阻止するか、又はそれを必要とする個体においてＡＤを処置するための、組成物又は医薬品を調製するための請求項７２に記載のＢＡＣＥタンパク質又その機能的部分のインヒビターの使用。
【請求項８５】
ＢＡＣＥ若しくは潜在的モデュレーターとＢＡＣＥとの複合体に関して構造を作製するか、又は合理的な化合物若しくは薬物設計を実施するためのコンピューターシステムであって、表５に記載の原子座標データであってＢＡＣＥ若しくは少なくとも１つのそのサブドメインの３次元構造を定義するデータであるか、ＢＡＣＥに関する構造因子データであって表５の原子座標データから誘導可能であるデータのいずれかを含有する前記システム。
【請求項８６】
表５に記載の原子座標データであってＢＡＣＥ若しくは少なくとも１つのそのサブドメインの３次元構造を定義するデータであるか、ＢＡＣＥに関する構造因子データであって表５の原子座標データから誘導可能であるデータのいずれか備えるコンピューター可読媒体。
【請求項８７】
請求項８５に記載のコンピューターシステム、請求項８３に記載のコンピューター可読媒体、ＢＡＣＥ若しくは少なくとも１つのそのサブドメインの３次元構造、又はＢＡＣＥに関する構造因子データであって表５の原子座標データから誘導可能であるデータをユーザーに提供することを含むビジネス方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、概して可溶性ベータ部位ＡＰＰ切断酵素（ＢＡＣ）触媒性ドメイン（例えばＢＡＣＥのアスパルチルプロテアーゼドメイン）およびＸ線結晶学により得られる対応する構造情報に関する。
【０００２】
さらに、本発明は、以下のいずれか１つまたはそれ以上に関する：
ＢＡＣＥの触媒性ドメイン、すなわちリフォールディングに関する必要性を排除する正確なジスルフィド結合で結晶化するのに適しているＢＡＣＥの形態および／またはＢＡＣＥの供給源にかかわらず、リガンド結合を伴わないＢＡＣＥ結晶であるアポＢＡＣＥ結晶および／またはリガンドに浸漬させて複合体を得ることができるアポＢＡＣＥ結晶および／または酵素の生理学的ｐＨでまたはその近くで、例えば約ｐＨ５．６と約ｐＨ５．８の間で成長する結晶を有し、そして／またはＣ２の空間群を有し、およびセルの寸法はａ＝２３６．６３Åもしくは２３６．６３Å±標準偏差（０．２Å）もしくは２３６．６３Å±セル変動性３Å、ｂ＝１０５．０２Åもしくは１０５．０２Å±標準偏差（０．２Å）もしくは１０５．０２Å±セル変動性３Å、およびｃ＝６２．５９Åもしくは６２．５９Å±標準偏差（０．２Å）または６２．５９Å±セル変動性３Åおよびβ＝１０１．３２°もしくは１０１．３２°±標準偏差（０．２°）、１０１°と１０８°の間でＢＡＣＥの３つのコピーを含有する結晶の非対称性ユニットを伴う（例えばＰＭ９９−２の存在下での成長に由来する）か、またはセルの寸法はａ＝２３８．３Åもしくは２３８．３Å±標準偏差（０．２Å）もしくは２３８．３Å±セル変動性３Å、ｂ＝１０７．４Åもしくは１０７．４Å±標準偏差（０．２Å）もしくは１０７．４Å±セル変動性３Å、およびｃ＝６０．４Åもしくは６０．４Å±標準偏差（０．２Å）もしくは６０．４Å±セル変動性３Åおよびβ＝１０１．８９°もしくは１０１．８９°±標準偏差（０．２°）もしくは１０１°と１０８°の間（例えばＰＭ９９−２の不在下で成長した結晶に由来する）であり、そして／または前記のいずれかもしくは全てに対応するかまたはその結果であるＸ線回折像を有しているＢＡＣＥの結晶形態；
例えば阻止または変調リガンドのごときリガンドと浸漬させて複合体、例えばタンパク質・リガンド複合体を得ることができるアポＢＡＣＥ結晶；
例えば合理的な薬物設計、およびＸ線結晶学によるリガンドスクリーニングおよび設計のための方法において使用するための；ＢＡＣＥすなわち天然の基質または天然にもしくは生理学的に活性部位内で生じる基質以外の１つまたはそれ以上のリガンドを含有する活性部位を有するＢＡＣＥの結晶形態またはＢＡＣＥの供給源にかかわらず、リガンド結合を有さないアポＢＡＣＥ結晶；
触媒性ドメインのアミノ酸配列、有利には結晶構造または結晶構造を擬似する構造に結晶化するアミノ酸配列を含んでなる、含有する、有する、から本質的に構成されるおよび／または構成されるＢＡＣＥタンパク質（「ＢＡＣＥタンパク質」なる用語に含まれる）、例えば別のＢＡＣＥタンパク質（例えばジェンバンク受け入れ番号Ｐ５６８１７）と比較した場合、１つまたはそれ以上の：例えばグリコシル化を防御するかまたは結晶化および／もしくは規則正しく、十分に回折する結晶の成長を促進するアミノ酸（「ａａ」）１５３での変異、例えばアスパラギンからグルタミン、グリコシル化を防御するかまたは結晶化および／もしくは規則正しく、十分に回折する結晶の成長を促進するａａ１７２での変異、例えばアスパラギンからグルタミン、グリコシル化を防御するかまたは結晶化および／もしくは規則正しく、十分に回折する結晶の成長を促進するａａ２２３での変異、例えばアスパラギンからグルタミン、グリコシル化を防御するかまたは結晶化および／もしくは規則正しく、十分に回折する結晶の成長を促進するａａ３５４での変異、例えばアスパラギンからグルタミン、および１つまたはそれ以上のトランケーション（例えばＴｈｒ２２からＳｅｒ４５３にわたるＢＡＣＥ）（それによりかかるタンパク質は場合によっては１つまたはそれ以上の：例えば精製を促進するＨｉｓタグ（ＨＩＳ６タグ）のごときタグ；タンパク質の細胞培養培地への分泌を促進するかまたは増加させる非ＢＡＣＥシグナル配列、例えばバキュロウイルスｇｐ６７シグナル配列のごときバキュロウイルスシグナル配列；および不完全なプロペプチド切断（および望む場合分離）を生じる種の区別を可能にするＦＬＡＧタグのごときタグ；を含むこともできる）を有するＢＡＣＥタンパク質；
例えばジェンバンク受け入れ番号Ｐ５６８１７に関連する、グリコシル化を防御するかまたは結晶化および／もしくは規則正しく、十分に回折する結晶の成長を促進する１つまたはそれ以上の変異：例えばグリコシル化を防御するかまたは結晶化および／もしくは規則正しく、十分に回折する結晶の成長を促進するアミノ酸（「ａａ」）１５３での変異、例えばアスパラギンからグルタミン、グリコシル化を防御するかまたは結晶化および／もしくは規則正しく、十分に回折する結晶の成長を促進するａａ１７２での変異、例えばアスパラギンからグルタミン、グリコシル化を防御するかまたは結晶化および／もしくは規則正しく、十分に回折する結晶の成長を促進するａａ２２３での変異、例えばアスパラギンからグルタミン、グリコシル化を防御するかまたは結晶化および／もしくは規則正しく、十分に回折する結晶の成長を促進するａａ３５４での変異、例えばアスパラギンからグルタミン、および１つまたはそれ以上のトランケーション（例えばＴｈｒ２２からＳｅｒ４５３にわたるＢＡＣＥ）：を有するＢＡＣＥタンパク質；
１つまたはそれ以上の：例えば精製を促進するＨｉｓタグ（ＨＩＳ６タグ）のごときタグ；タンパク質の細胞培養培地への分泌を促進するかまたは増加させる非ＢＡＣＥシグナル配列、例えばバキュロウイルスｇｐ６７シグナル配列のごときバキュロウイルスシグナル配列；および不完全なプロペプチド切断（および望む場合分離）を生じる種の区別を可能にするＦＬＡＧタグのごときタグ：を含むＢＡＣＥタンパク質；
これもまた前記をコードする野生型ＢＡＣＥに由来するヌクレオチド配列からのサイレント変異によりＧＣ含量を低減されているものを含む触媒性ドメインのアミノ酸配列、有利には結晶構造または結晶構造を擬似する構造に結晶化するアミノ酸配列を含んでなる、含有する、有する、から本質的に構成されるおよび／または構成されるいずれかの前記のタンパク質および／またはアミノ酸配列および／または遺伝子産物を含むＢＡＣＥタンパク質または少なくとも１つのその機能的タンパク質をコードする１つまたはそれ以上の核酸分子（例えば単離された核酸分子）；
いずれか１つまたはそれ以上の核酸分子および／またはＢＡＣＥタンパク質（後者はとりわけ、遺伝子産物とそれとの同時発現がある場合、前記のＢＡＣＥタンパク質を含むことができる）、エンハンサー（とりわけ、ベクターまたは細胞系がバキュロウイルスおよび／または昆虫細胞である場合、特定のベクターまたは細胞系で生成されるＢＡＣＥ全量を増強し、および／または酵素のごときプロセシングされたタンパク質、例えばコンバターゼまたは転写エンハンサーまたは翻訳エンハンサーまたは転写および翻訳の双方のエンハンサー、例えばプロホルモンコンバターゼ例えばプロホルモンコンバターゼ・フリンの分画を増加させる）を含有するおよび／または発現するベクターまたは細胞（例えばバキュロウイルスのごときウイルスベクター、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のごとき細菌性ベクター、ＣＨＯ細胞のごとき哺乳動物細胞、またはＤＮＡプラスミド）、そして従って核酸分子および／またはＢＡＣＥタンパク質およびエンハンサーをコードする核酸分子を含有するおよび／または発現するベクターまたは細胞、ならびにそれの同時発現のためのベクターまたは細胞で使用するための、別個にパッケージングされたかかる同時発現のための単離された核酸分子を含有するキット、例えば（i）核酸分子をコードするＢＡＣＥタンパクおよび（ii）エンハンサーをコードする核酸分子を含んでなる別個にパッケージングされた核酸分子を含有するキット；
ベクターまたは細胞を介するかまたはそれによる、核酸分子によりコードされるおよび／もしくは前記したベクターまたは細胞に含まれるものの、ならびに／または遺伝子産物および／もしくはアミノ酸配列および／もしくはＢＡＣＥタンパク質の（それの同時発現を含む）、またはＢＡＣＥタンパク質をコードするその他の核酸分子の、とりわけ、ベクターまたは細胞系がバキュロウイルスおよび／または昆虫細胞である場合、特定のベクターまたは細胞系で生成されるＢＡＣＥ全量を増強し、および／または酵素、例えばコンバターゼ、例えばプロホルモンコンバターゼ、例えばプロホルモンコンバターゼ・フリンの分画を増加させる遺伝子産物を伴う発現；
触媒性ドメインのアミノ酸配列を含んでなる、含有する、有する、から本質的に構成されるおよび／または構成されるＢＡＣＥタンパク質および／またはアミノ酸配列および／または遺伝子産物を結晶化する方法；
触媒性ドメインのアミノ酸配列を含んでなる、含有する、有する、から本質的に構成されるおよび／または構成されるＢＡＣＥタンパク質および／またはアミノ酸配列および／または遺伝子産物の結晶構造を決定するための方法；
例えばスクリーニングアッセイ、例えば薬物または患者のスクリーニングアッセイにおける、またはそのため（例えばかかるアッセイにおいて有用な触媒性ドメインに対するおよび／またはＢＡＣＥタンパク質に対する抗体を作製するため）の生成物の作製における核酸分子によりコードされるものおよび／または遺伝子産物および／またはアミノ酸配列および／またはＢＡＣＥタンパク質の使用、ならびにそのためのかかるアッセイおよび生成物、およびかかる使用もしくはアッセイおよび／またはかかる使用もしくはアッセイのための成分を調製するための核酸分子、ベクターもしくは細胞の使用、方法および／またはベクターもしくは細胞を介する前記した発現；
かかるアッセイからの産物（「アッセイ産物」）、ならびにかかるアッセイ産物および／またはかかるアッセイ産物のための成分を調製するための核酸分子、ベクターもしくは細胞の使用、方法および／またはベクターもしくは細胞を介する前記した発現；
ＢＡＣＥのインヒビターもしくはモデュレーターおよび／またはＡβもしくはそのフラグメントの生成のインヒビターもしくはモデュレーター、例えば本発明のアッセイにより、および／または本発明のＢＡＣＥタンパク質に接触する、および結合するかまたはそうでなければ阻止もしくは変調することにより決定されるようなかかるインヒビターもしくはモデュレーター、例えばリフォールディングに関する必要性を排除する正確なジスルフィド結合で結晶化するのに適しており、占有されていないかまたは実質的に占有されていない活性部位を有しているＢＡＣＥの形態および／または酵素の生理学的ｐＨでまたはその近くで、例えば約ｐＨ５．６と約ｐＨ５．８の間で成長する結晶を有し、そして／またはＣ２の空間群を有し、およびセルの寸法はａ＝２３６．６３Åもしくは２３６．６３Å±標準偏差（０．２Å）もしくは２３６．６３Å±セル変動性３Å、ｂ＝１０５．０２Åもしくは１０５．０２Å±標準偏差（０．２Å）もしくは１０５．０２Å±セル変動性３Å、およびｃ＝６２．５９Åもしくは６２．５９Å±標準偏差（０．２Å）または６２．５９Å±セル変動性３Åおよびβ＝１０１．３２°もしくは１０１．３２°±標準偏差（０．２°）、１０１°と１０８°の間でＢＡＣＥの３つのコピーを含有する結晶の非対称性ユニットを伴う（例えばＰＭ９９−２の存在下での成長に由来する）か、またはセルの寸法はａ＝２３８．３Åもしくは２３８．３Å±標準偏差（０．２Å）もしくは２３８．３Å±セル変動性３Å、ｂ＝１０７．４Åもしくは１０７．４Å±標準偏差（０．２Å）もしくは１０７．４Å±セル変動性３Å、およびｃ＝６０．４Åもしくは６０．４Å±標準偏差（０．２Å）もしくは６０．４Å±セル変動性３Åおよびβ＝１０１．８９°もしくは１０１．８９°±標準偏差（０．２°）もしくは１０１°と１０８°の間（例えばＰＭ９９−２の不在下で成長した結晶に由来する）であり、そして／または前記のいずれかもしくは全てに対応するかまたはその結果であるＸ線回折像を有している結晶を有しているＢＡＣＥの形態を結合するおよび／または阻止するおよび／または変調するおよび／または相互作用する化合物または組成物（もちろん、あるとすればＢＡＣＥの公知のインヒビター、モデュレーターおよび／またはＡβもしくはそのフラグメントの生成のインヒビター、モデュレーターを排除する）；
例えばＢＡＣＥ活性および／またはＡβもしくはそのフラグメントに関与する疾病、症状、疾患等、例えばアルツハイマー病（ＡＤ）の処置における、および／またはかかる処置のための医薬品の処方におけるかかるアッセイ産物および／またはインヒビターおよび／またはモデュレーターの使用、ならびにかかる処置および／もしくはその成分のためのおよび／または、とりわけ、前記のいずれかの使用を含むかかる医薬品を調製するための方法が含まれるかかる医薬品および／またはその成分を調製するための核酸分子、ベクターもしくは細胞の使用、方法および／またはベクターもしくは細胞を介する前記した発現；
ならびに結晶化されたＢＡＣＥまたは少なくともその機能的部分の構造座標を伴うコード化されたデータ保存媒体。かかるデータ保存材料はかかる構造、またはその構造相同体をコンピュータースクリーン上で３次元グラフィック表現として表示することができる。本発明は、また類似のまたは相同性タンパク質またはタンパク質複合体の構造を解析するための構造座標を用いる方法にも関する。加えて本発明は、ＢＡＣＥまたはその相同体に結合する阻止化合物などの化合物をスクリーニングおよび設計するために構造座標を使用する方法に関する。本発明は、またＢＡＣＥインヒビターと複合したＢＡＣＥの組成物および結晶にも関する。国際公開公報第０１／３７１９４号参照。
【０００３】
種々の文献が本明細書にて引用されている。本明細書における引用は参照リストの文献に対する引用の目的に、例えば参照リストに列挙された文献に対する（複数の）著者および発行年引用の目的に、または参照リストに列挙されるかまたはされていなくてもよい文献に対する本明細書における全引用によることができる。
【０００４】
本明細書に引用された種々の文献のいずれかが本発明に関する先行技術であるとは認められていない。本明細書の発明者と同じ名前の１人または複数の著者または発明者を有している文献は本明細書における本発明に関する著者によるものではない文献である。
【０００５】
本明細書に引用した全ての文献（「本明細書で引用した文献」）および本明細書で引用した文献にて引用されたまたは参照された全ての文献は出展明示により本明細書に一部とする。同様に、本明細書にて引用された文献および本明細書にて引用された文献において引用された文献の教示は本発明の実施および利用に用いることができる。
【発明の背景】
【０００６】
アルツハイマー病（ＡＤ）は全世界の２０００万人のヒトが患っていると推定され、そして痴呆の最も一般的な形態であると考えられている（Ｎｅｗｓｄａｙ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、２００１年７月６日  金曜日、市内版、Ａ２４頁）。ＡＤは脳に蓄積し、そしてアルツハイマー病患者の精神衰弱に寄与すると考えられているアミロイド斑および細胞内神経原繊維変化を特徴とする進行性の痴呆である。
【０００７】
ベータアミロイドタンパク質（Ａβ）はアミロイド斑の主要な構成要素であり、これはＡＤの特徴である（Ｄｅ  ＳｔｒｏｏｐｅｒおよびＫｏｎｉｇ、１９９９）。
【０００８】
Ａβは２つのプロテアーゼ、β−およびγ−セクレターゼによるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）と称されるＩクラス膜貫通タンパク質の特異的切断により形成される３９−４２アミノ酸残基ペプチド（Ａβフラグメント）である。
【０００９】
β−セクレターゼはＭｅｔ６７１およびＡｓｐ６７２（番号付けはＡＰＰの７７０アミノ酸アイソフォームに対応する）残基間でＡＰＰを切断してＡβのＮ末端を形成する。ペプチドの第２の切断はγ−セクレターゼに随伴され、ＡβペプチドのＣ末端を形成する。β−およびγ−セクレターゼは各々Ａβドメインのアミノおよびカルボキシ末端を切断する。第３の酵素であるα−セクレターゼはＡβフラグメントの１６および１７残基間でＡβドメイン内のＡＰＰを切断することが最近同定された（Ｈｏｗｌｅｔｔら、２０００）。
【００１０】
Ａβの沈着を阻止および／または変調する潜在治療能力は多くのグループにセクレターゼ酵素を単離および特徴づけさせ、そしてその可能性のあるインヒビターを同定する動機を与えている（例えば国際公開公報第０１／２３５３３  Ａ２号、欧州特許第０８５５４４４Ａ２号、国際公開公報第００／１７３６９号、国際公開公報第００／５８４７９号、国際公開公報第００／４７６１８号、国際公開公報第０１／００６６５号；国際公開公報第０１／００６６３号；米国特許第６２４５８８４号（Ｈｏｏｋ）、米国特許第６２２１６６７号（Ｒｅｉｎｅｒら）、米国特許第６２１１２３５号（Ｗｕら））。実際に、一般的な新聞で「製薬会社は切断過程の遮断を目指すガンマ・セクレターゼインヒビターと称される医薬品を研究している」とも報じている（Ｎｅｗｓｄａｙ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、２００１年７月６日  金曜日、市内版、Ａ２４頁）。
【００１１】
結果的に、最近これらの酵素に関する多くの可能性のある候補物質が文献に報告されている：いくつかのグループはβ−セクレターゼ活性を有するアスパラギン酸プロテアーゼを同定および単離している（Ｈｕｓｓａｉｎら、１９９９；Ｌｉｎら、２０００；Ｙａｎら、１９９９；Ｓｉｎｈａら、１９９９およびＶａｓｓａｒら、１９９９）。文献ではβ−セクレターゼはＡｓｐ２（Ｙａｎら、１９９９）、ベータ部位ＡＰＰ切断酵素（ＢＡＣＥ）（Ｖａｓｓａｒら、１９９９）またはメマプシン−２（Ｌｉｎら、２０００）としても知られている。
【００１２】
ＥＳＴデータベース分析（Ｈｕｓｓａｉｎら、１９９９）；発現クローニング（Ｖａｓｓａｒら、１９９９）；予測されるＣ．ｅｌｅｇａｎｓタンパク質の公のデータベースからのヒト相同体の同定（Ｙａｎら、１９９９）およびヒト脳からタンパク質を精製するための最終的なインヒビターの利用（Ｓｉｎｈａら、１９９９）のごとき多くの実験的研究法を用いてＢＡＣＥが同定された。このように、３つの異なる実験的研究法を用いる５つのグループが同一酵素の同定に至り、ＢＡＣＥがβ−セクレターゼであると強く主張している。特許文献にも記載が為されている：国際公開公報第９１／１３９０４号、欧州特許第５１８９５５号、欧州特許第７３２３９９号、国際公開公報第９２／０３５４２号、国際公開公報第９２／０７０６８号、国際公開公報第９６／４０８８５号、欧州特許第８７／１７２０号、米国特許第５９４２４００号および第５７４４３４６号、欧州特許第８５５４４４号、欧州特許第１０３７９７７号、国際公開公報第００／１７３６９号、国際公開公報第０１／２３５３３号、国際公開公報第００４７６１８号、国際公開公報第００／５８４７９号、国際公開公報第０１／００６６３号、国際公開公報第０１／００６６５号、欧州特許第８４８０６２号、米国特許第６０２５１８０号および第６１６２６３９号、欧州特許第１０４７７８８号および国際公開公報第９９／３３９６３号、国際公開公報第９９／４６２８１号、国際公開公報第９８／１１２３６号、米国特許第５９４２４００号ならびに国際公開公報第９４／１３３１９号。
【００１３】
実際に、ＢＡＣＥは部分的に活性なプロ酵素として合成される膜結合タンパク質であり、脳組織において最も豊富に発現される。これが主要なβ−セクレターゼ活性を示すと考えられている。
【００１４】
ＢＡＣＥ活性はＡβ生成における律速段階であると考えることができる。これによりアルツハイマー病およびＡβまたはそのフラグメント（例えばアミロイド斑およびアミロイド血管障害はまたとりわけ、トリソミー２１またはダウン症候群、オランダ型アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血（ＨＣＨＷＡ−Ｄ）を有する個体の脳に特徴的である；米国特許第号６２１１２３５をも参照）に関与するその他の疾病の病理学においてＢＡＣＥが特に興味深いものなり、そして従ってアルツハイマー病および／またはかかるその他の疾病に対する処置としての薬物の開発のための重要な候補になる。
【００１５】
さらに、一般的な新聞、Ｎｅｗｓｄａｙ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）２００１年７月６日  金曜日、市内版、Ａ２４頁で報じられるように、その日の科学版には、Ｈｏｗａｒｄ  Ｈｕｇｈｅｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの研究者Ｔｈｏｍａｓ  Ｓｕｄｈｏｆによる、ガンマ・セクレターゼが別の機能に関与し得るが、これらの知見をヒトに適用されるかまたはどの遺伝子に関係し得るかは解っていないことを示唆しているインビトロ知見が含まれている。それにもかかわらず、ＢＡＣＥのＡβまたはそのフラグメントの生成の阻止に関係するガンマ・セクレターゼの阻止が本発明により志向される論点を有し得る。
【００１６】
アルツハイマー病を進行させる可能性は年齢と共に高まり、そして世界の老齢人口が増加するにつれてこの疾患はより大きな問題になりつつある。加えて、ＡＤに対して家族性連関があり、そして結果的にスウェーデン変異（ここで変異したＡＰＰはかなり改善されたＢＡＣＥの基質を形成する）として知られているＡＰＰの二重変異を有しているいずれかの個体はＡＤを進行させる、そしてまた若年時にＡＤを進行させる非常に大きな機会を有している（スウェーデン型ＡＰＰを含んでなるトランスジェニックげっ歯類に関する米国特許第６２４５９６４号もまた参照）。
【００１７】
従って、例えば特定の結晶構造を有しているかまたは本明細書にて前記した構造を有しているＢＡＣＥタンパク質から確定されたそのインヒビターまたはモデュレーターによりＢＡＣＥタンパク質を阻止および／または変調することにより；Ａβおよびその部分の沈着を阻止および／または変調することは有用であろう。
【００１８】
それ故に、ＢＡＣＥ活性を低減させるかまたは遮断する薬物は、脳またはＡβもしくはそのフラグメントが沈着する別のところにおけるＡβレベルおよびＡβのフラグメントのレベルを低減させ、そして従ってアミロイド斑の形成およびＡＤまたはＡβもしくはそのフラグメントの沈着に関係するその他の疾病の進行を遅延させる（Ｙａｎｋｎｅｒ、１９９６；Ｄｅ  ＳｔｒｏｏｐｅｒおよびＫｏｎｉｇ、１９９９）。
【００１９】
さらに、ベータ・セクレターゼを含んでなる反応系は、例えばインヒビターまたはモデュレーターを同定するためのスクリーニングアッセイにおいて有用であることが確定されており、そしてベータ・セクレターゼに対して産生した抗体はスクリーニングおよび別のアッセイに有用であることが確定されており（例えば米国特許第６２２１６４５号および本明細書に引用した別の文献を参照のこと）、そして従って、本発明は、抗体作製におけるかかかるアッセイで同様に有用である。
【００２０】
哺乳動物細胞（Ｖａｓｓａｒら、１９９９；Ｈａｓｓａｉｎら、１９９９）、昆虫細胞（Ｍａｌｌｅｎｄｅｒら、２００１）および細菌細胞（Ｌｉｎら、２０００）に関する異種性発現系を用いる、本発明のＢＡＣＥとは異なる、特定の活性な組換えＢＡＣＥの生成が為されている。これらのＢＡＣＥの生成は本発明を実施するために過度な実験を必要としないことを示しているが、これらの先行の系は本発明により指摘される欠点を有していた。
【００２１】
実際に、本発明の以前は、例えばリフォールディングに関する必要性を排除する正確なジスルフィド結合で結晶化するのに適しており、占有されていないかまたは実質的に占有されていない活性部位を有している改善された結晶構造を伴う可溶性組換えＢＡＣＥタンパク質および／または酵素の生理学的ｐＨでまたはその近くで、例えば約ｐＨ５．６と約ｐＨ５．８の間で成長する結晶を有し、そして／またはＣ２の空間群を有し、およびセルの寸法はａ＝２３６．６３Åもしくは２３６．６３Å±標準偏差（０．２Å）もしくは２３６．６３Å±セル変動性３Å、ｂ＝１０５．０２Åもしくは１０５．０２Å±標準偏差（０．２Å）もしくは１０５．０２Å±セル変動性３Å、およびｃ＝６２．５９Åもしくは６２．５９Å±標準偏差（０．２Å）または６２．５９Å±セル変動性３Åおよびβ＝１０１．３２°もしくは１０１．３２°±標準偏差（０．２°）、１０１°と１０８°の間でＢＡＣＥの３つのコピーを含有する結晶の非対称性ユニットを伴う（例えばＰＭ９９−２の存在下での成長に由来する）か、またはセルの寸法はａ＝２３８．３Åもしくは２３８．３Å±標準偏差（０．２Å）もしくは２３８．３Å±セル変動性３Å、ｂ＝１０７．４Åもしくは１０７．４Å±標準偏差（０．２Å）もしくは１０７．４Å±セル変動性３Å、およびｃ＝６０．４Åもしくは６０．４Å±標準偏差（０．２Å）もしくは６０．４Å±セル変動性３Åおよびβ＝１０１．８９°もしくは１０１．８９°±標準偏差（０．２°）もしくは１０１°と１０８°の間（例えばＰＭ９９−２の不在下で成長した結晶に由来する）であるＢＡＣＥ結晶形態、ならびにそのアミノ酸配列、それをコードする核酸分子および本明細書で論じる本発明の別の実施形態を生成する必要性があった。
【００２２】
加えて、結晶構造および対称性の研究が進んでいる（例えばＣｏｔｔｏｎおよびＷｉｌｋｉｎｓｏｎ、Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、第４版、１９８０）、とりわけ、第２章）。Ｘ線結晶学、またはより一般的な結晶学は確立され、十分に研究された技術であり、それにより結晶において分子がどのように見えるのかを３次元画像として最もよく表現され得るものが提供され；そして薬物コアを同定するための別の技術がある（例えばフラグメント基盤のスクリーニングに関する国際公開公報第９８／５７１５５号参照）。米国特許第６１２８５８２号、第６１５３５７９号、第６０７７６８２号、および第６０３７１１７号、ならびにＰＣＴ公開国際公開公報第０１／３７１９４号および国際公開公報第００／４７７６３号でも構造基盤の薬物設計およびホモロジーモデリングの観点からさらなる情報に関して記載されている。
【００２３】
これらの技術を本明細書で開示したＢＡＣＥ結晶およびタンパク質、とりわけ、野生型ＢＡＣＥにおいて典型的に見出されるリガンドを全く伴わないものと共に用いて、ＢＡＣＥを阻止または変調する、例えば結合または相互作用する化合物を合理的に設計することができ；そして本明細書で開示したＢＡＣＥ結晶およびタンパク質と組み合わせたこれらの技術の使用は、技術分野においてこれまでに教示または示唆されていないと考えられる。
【発明の目的および要旨】
【００２４】
本発明は、１つまたはそれ以上の以下の実施形態を提供することができるが、本明細書で別途に開示される発明を排除しない。
【００２５】
１つの実施形態では本発明は、ＢＡＣＥの触媒性ドメイン、例えばリフォールディングに関する必要性を排除する正確なジスルフィド結合で結晶化するのに適しているＢＡＣＥの形態および／または占有されていないかまたは実質的に占有されていない活性部位を有しているＢＡＣＥタンパク質（ＢＡＣＥの供給源にかかわらず、リガンド結合を伴わないアポＢＡＣＥ結晶）および／または酵素の生理学的ｐＨでまたはその近くで、例えば約ｐＨ５．６と約ｐＨ５．８の間で成長する結晶を有し、そして／またはＣ２の空間群を有し、およびセルの寸法はａ＝２３６．６３Åもしくは２３６．６３Å±標準偏差（０．２Å）もしくは２３６．６３Å±セル変動性３Å、ｂ＝１０５．０２Åもしくは１０５．０２Å±標準偏差（０．２Å）もしくは１０５．０２Å±セル変動性３Å、およびｃ＝６２．５９Åもしくは６２．５９Å±標準偏差（０．２Å）または６２．５９Å±セル変動性３Åおよびβ＝１０１．３２°もしくは１０１．３２°±標準偏差（０．２°）、１０１°と１０８°の間でＢＡＣＥの３つのコピーを含有する結晶の非対称性ユニットを伴う（例えばＰＭ９９−２の存在下での成長に由来する）か、またはセルの寸法はａ＝２３８．３Åもしくは２３８．３Å±標準偏差（０．２Å）もしくは２３８．３Å±セル変動性３Å、ｂ＝１０７．４Åもしくは１０７．４Å±標準偏差（０．２Å）もしくは１０７．４Å±セル変動性３Å、およびｃ＝６０．４Åもしくは６０．４Å±標準偏差（０．２Å）もしくは６０．４Å±セル変動性３Åおよびβ＝１０１．８９°もしくは１０１．８９°±標準偏差（０．２°）もしくは１０１°と１０８°の間（例えばＰＭ９９−２の不在下で成長した結晶に由来する）であり、そして／または前記のいずれかもしくは全てに対応するかまたはその結果であるＸ線回折像を有し、そして／または非対称性のユニットで分子のコピー数の増加と共にＣ２からＰ２１までの空間群転移を有するが、一方アポＢＡＣＥ結晶をリガンドに浸漬した場合、セル寸法およびＰ２１形態のパッキングはＣ２結晶形態のものと非常に関連性がある、ＢＡＣＥの結晶形態を提供する。
【００２６】
本発明は、同様に例えば阻止または変調リガンドのごときリガンドで浸漬して複合体、例えばタンパク質−リガンド複合体を得ることができる例えばアポＢＡＣＥ結晶を提供する。
【００２７】
別の実施形態では本発明は、例えば合理的な薬物設計ならびにＸ線結晶学によるリガンドスクリーニングおよび設計のための方法において使用するための；ＢＡＣＥの起源にかかわらず、ＢＡＣＥの結晶形態または天然の基質もしくは活性部位内に天然にもしくは生理学的に生じる基質以外に１つもしくはそれ以上のリガンドを含有する活性部位を有するＢＡＣＥまたはリガンド結合を伴わないアポＢＡＣＥ結晶を提供する。
【００２８】
この点に関して、本発明は、例えばＸ線結晶学および／または核磁気共鳴（ＮＭＲ）によるリガンドスクリーニングおよび設計のための方法をさらに提供する。方法にはリガンド結合を伴わない（すなわちＢＡＣＥの供給源に関わらず、占有されていない活性部位を伴う）アポ結晶またＢＡＣＥ結晶を１つまたはそれ以上の被験サンプルに暴露し、そしてリガンド−ＢＡＣＥ複合体が形成されるかどうかを決定する、例えばＸ線結晶回折パターンを入手してリガンド−ＢＡＣＥ複合体が形成されるかどうかを決定するか、またはＮＭＲを用いてかかる複合体が形成されるかどうかを決定することが含まれ得る。１つまたはそれ以上の被験サンプルの存在下でＢＡＣＥを共結晶化すること、または１つまたはそれ以上の被験サンプルの溶液にＢＡＣＥを浸漬することのいずれかによりＢＡＣＥを被験サンプルに暴露することができる。リガンド−ＢＡＣＥ複合体からの構造情報を用いてより堅固に結合する、より特異的に結合する、より良好な生物学的活性を有する、またはより安全なプロファイルを有するリガンドを設計することができる。国際公開公報第９９／４５３７９号を参照。
【００２９】
従って本発明は、プロセッサ、データ保存システム、入力装置、および出力装置を含んでなるプログラム化されたコンピューターを用いて、（ａ）該入力装置を介してプログラム化されたコンピューターにＢＡＣＥ触媒性ドメイン、例えば本明細書で提供されるＢＡＣＥタンパク質の原子のサブセットの３次元座標を含んでなるデータおよび／またはリガンド−ＢＡＣＥ複合体からの構造情報を伴うかかる情報を入力し、それによりデータセットを作製すること；（ｂ）該プロセッサを用いて、該コンピューターデータ保存システムに保存された化学構造のコンピューターデータベースと該データセットを比較すること；（ｃ）コンピューター法を用いて該データベースから該データセットに対して構造的に相補的である部分を有する化学構造を選択すること；（ｄ）場合によってはコンピューター法を用いて該データセットに対して構造的に相補的である部分を有する化学構造のモデルを構築すること；および（ｅ）該データセットに対して相補的である部分を有する選択された化学構造を該出力装置に出力すること：の工程を含んでなり、場合によっては１つまたはそれ以上の選択された化学構造を合成し；さらに場合によっては該合成され選択された化学構造をＢＡＣＥと接触させて該合成された化学構造がＢＡＣＥの触媒性ドメイン内に適合し、および／またはＢＡＣＥを阻止もしくは変調もしくは相互作用するかどうかを確定する、ＢＡＣＥの触媒性ドメイン内に適合する可能性のあるリガンドを同定または設計するためのコンピューターを用いる方法をさらに提供する。米国特許第５８３５３８２号参照。
【００３０】
このように、ＢＡＣＥのインヒビターもしくはモデュレーターまたはＢＡＣＥと相互作用する化合物を合理的に同定および／または設計することができる。そして、この点に関して、当業者はＢＡＣＥのインヒビターもしくはモデュレーターまたはＢＡＣＥと相互作用する化合物の合理的な設計および／または同定において入力されるかまたは用いられる情報の一部として、野生型ＢＡＣＥ触媒性ドメインに見出された生成物を用いることができると記載されている。さらに、ＢＡＣＥのインヒビターは競合的、非競合的、不競合的または非可逆性でよく；そしてＢＡＣＥのインヒビターは技術的および商業的に非常に興味深い。
【００３１】
本発明は、また触媒性ドメインのアミノ酸配列、有利には結晶構造または結晶構造を擬似する構造に結晶化するアミノ酸配列を含んでなる、含有する、有する、から本質的に構成されるおよび／または構成されるＢＡＣＥタンパク質（「ＢＡＣＥタンパク質」なる用語に含まれる）、例えば別のＢＡＣＥタンパク質（例えばジェンバンク受け入れ番号Ｐ５６８１７）と比較した場合、１つまたはそれ以上の：例えばグリコシル化を防御するかまたは結晶化および／もしくは規則正しく、十分に回折する結晶の成長を促進するアミノ酸（「ａａ」）１５３での変異、例えばアスパラギンからグルタミン、グリコシル化を防御するかまたは結晶化および／もしくは規則正しく、十分に回折する結晶の成長を促進するａａ１７２での変異、例えばアスパラギンからグルタミン、グリコシル化を防御するかまたは結晶化および／もしくは規則正しく、十分に回折する結晶の成長を促進するａａ２２３での変異、例えばアスパラギンからグルタミン、グリコシル化を防御するかまたは結晶化および／もしくは規則正しく、十分に回折する結晶の成長を促進するａａ３５４での変異、例えばアスパラギンからグルタミン、および１つまたはそれ以上のトランケーション（例えばＴｈｒ２２からＳｅｒ４５３にわたるＢＡＣＥ）（それによりかかるタンパク質は場合によっては１つまたはそれ以上の：例えば精製を促進するＨｉｓタグ（ＨＩＳ６タグ）のごときタグ（米国特許第６０２０１４３号参照）；タンパク質の細胞培養培地への分泌を促進するかまたは増加させる非ＢＡＣＥシグナル配列、例えばバキュロウイルスｇｐ６７シグナル配列のごときバキュロウイルスシグナル配列（米国特許第６２４５５３２号および第５５１６６５７号参照）；および不完全なプロペプチド切断（および望む場合分離）を生じる種の区別を可能にするＨＡまたはＦＬＡＧタグのごときタグ（米国特許第６１９０８７４号および第６０８３７３２号参照）；を含むこともできる）を有するＢＡＣＥタンパク質をも提供する。
【００３２】
本発明は、従って、例えばジェンバンク受け入れ番号Ｐ５６８１７に関連する、グリコシル化を防御するかまたは結晶化および／もしくは規則正しく、十分に回折する結晶の成長を促進する１つまたはそれ以上の変異：例えばグリコシル化を防御するかまたは結晶化および／もしくは規則正しく、十分に回折する結晶の成長を促進するアミノ酸（「ａａ」）１５３での変異、例えばアスパラギンからグルタミン、ならびに／またはグリコシル化を防御するかまたは結晶化および／もしくは規則正しく、十分に回折する結晶の成長を促進するａａ１７２での変異、例えばアスパラギンからグルタミン、ならびに／またはグリコシル化を防御するかまたは結晶化および／もしくは規則正しく、十分に回折する結晶の成長を促進するａａ２２３での変異、例えばアスパラギンからグルタミン、ならびに／またはグリコシル化を防御するかまたは結晶化および／もしくは規則正しく、十分に回折する結晶の成長を促進するａａ３５４での変異、例えばアスパラギンからグルタミン、ならびに１つまたはそれ以上のトランケーション（例えばＴｈｒ２２からＳｅｒ４５３にわたるＢＡＣＥ）：を有するＢＡＣＥタンパク質をさらに提供する。
【００３３】
有利には、ＢＡＣＥタンパク質は４つ全ての変異およびトランケーションを有している。
【００３４】
本発明は、さらに１つまたはそれ以上の：例えば精製を促進するＨｉｓタグ（ＨＩＳ６タグ）のごときタグ；タンパク質の細胞培養培地への分泌を促進するかまたは増加させる非ＢＡＣＥシグナル配列、例えばバキュロウイルスｇｐ６７シグナル配列のごときバキュロウイルスシグナル配列；および不完全なプロペプチド切断（および望む場合分離）を生じる種の区別を可能にするＦＬＡＧタグのごときタグ：を含むＢＡＣＥタンパク質を提供する。
【００３５】
さらに本発明は、これもまた前記をコードする野生型ＢＡＣＥに由来するヌクレオチド配列からのサイレント変異によりＧＣ含量を低減されているものを含む触媒性ドメインのアミノ酸配列、有利には結晶構造または結晶構造を擬似する構造に結晶化するアミノ酸配列を含んでなる、含有する、有する、から本質的に構成されるおよび／または構成されるいずれかの前記のタンパク質および／またはアミノ酸配列および／または遺伝子産物を含むＢＡＣＥタンパク質または少なくとも１つのその機能的タンパク質をコードする１つまたはそれ以上の核酸分子（例えば単離された核酸分子）を提供する。
【００３６】
さらに別の実施形態では、本発明は、いずれか１つまたはそれ以上の核酸分子および／またはＢＡＣＥタンパク質（後者はとりわけ、遺伝子産物とそれとの同時発現がある場合、前記のＢＡＣＥタンパク質を含むことができる）、エンハンサー（とりわけ、ベクターまたは細胞系がバキュロウイルスおよび／または昆虫細胞である場合、特定のベクターまたは細胞系で生成されるＢＡＣＥ全量を増強し、および／または酵素のごときプロセシングされたタンパク質、例えばコンバターゼまたは転写エンハンサーまたは翻訳エンハンサーまたは転写および翻訳の双方のエンハンサー（米国特許第６１３００６６号、第６００４７７７号、第５９９００９１号参照）、例えばプロホルモンコンバターゼ例えばプロホルモンコンバターゼ・フリンの分画を増加させる（Ｌａｐｒｉｓｅら、１９９８参照））を含有するおよび／または発現するベクターまたは細胞（例えばバキュロウイルスのごときウイルスベクター、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のごとき細菌性ベクター、ＣＨＯ細胞のごとき哺乳動物細胞、またはＤＮＡプラスミド）、そして従って核酸分子および／またはＢＡＣＥタンパク質およびエンハンサーをコードする核酸分子を含有するおよび／または発現するベクターまたは細胞、ならびにそれの同時発現のためのベクターまたは細胞で使用するための、別個にパッケージングされたかかる同時発現のための単離された核酸分子を含有するキット、例えば（i）核酸分子をコードするＢＡＣＥタンパクおよび（ii）エンハンサーをコードする核酸分子を含んでなる別個にパッケージングされた核酸分子を含有するキットを提供する。
【００３７】
従って本発明は、またベクターまたは細胞を介するかまたはそれによる、核酸分子によりコードされるおよび／もしくは前記したベクターまたは細胞に含まれるものの、ならびに／または遺伝子産物および／もしくはアミノ酸配列および／もしくはＢＡＣＥタンパク質の（それの同時発現を含む）、またはＢＡＣＥタンパク質をコードするその他の核酸分子の、とりわけ、ベクターまたは細胞系がバキュロウイルスおよび／または昆虫細胞である場合、特定のベクターまたは細胞系で生成されるＢＡＣＥ全量を増強し、および／または酵素、例えばコンバターゼ、例えばプロホルモンコンバターゼ、例えばプロホルモンコンバターゼ・フリンの分画を増加させる遺伝子産物を伴う発現を提供する。
【００３８】
本発明は、ＢＡＣＥの独特な結晶構造に関係するので、本発明は、触媒性ドメインのアミノ酸配列を含んでなる、含有する、有する、から本質的に構成されるおよび／または構成されるＢＡＣＥタンパク質および／またはアミノ酸配列および／または遺伝子産物を結晶化する方法を提供する。
【００３９】
同様に、本発明は、触媒性ドメインのアミノ酸配列を含んでなる、含有する、有する、から本質的に構成されるおよび／または構成されるＢＡＣＥタンパク質および／またはアミノ酸配列および／または遺伝子産物の結晶構造を決定するための方法を提供する。
【００４０】
本発明は、さらに、例えばスクリーニングアッセイ、例えば薬物または患者のスクリーニングアッセイにおける、またはそのため（例えばかかるアッセイにおいて有用な触媒性ドメインに対するおよび／またはＢＡＣＥタンパク質に対する抗体を作製するため）の生成物の作製における核酸分子によりコードされるものおよび／または遺伝子産物および／またはアミノ酸配列および／またはＢＡＣＥタンパク質の使用、ならびにそのためのかかるアッセイおよび生成物、およびかかる使用もしくはアッセイおよび／またはかかる使用もしくはアッセイのための成分を調製するための核酸分子、ベクターもしくは細胞の使用、方法および／またはベクターもしくは細胞を介する前記した発現を企図する。
【００４１】
かかるアッセイからの産物（「アッセイ産物」）、ならびにかかるアッセイ産物および／またはかかるアッセイ産物のための成分を調製するための核酸分子、ベクターもしくは細胞の使用、方法および／またはベクターもしくは細胞を介する前記した発現は本発明の範囲に含まれる。
【００４２】
本発明のＢＡＣＥタンパク質をこのタンパク質を阻止または変調または相互作用する化合物をスクリーニングするのに用いることができる。かかる化合物は細胞または細胞分画、天然の生成物または化学ライブラリーの混合物から同定することができる。
【００４３】
アッセイは溶液中で本発明のＢＡＣＥポリペプチドと候補化合物を混合し、そして混合物中のＢＡＣＥ活性を測定することを含んでなってよい。酵素活性に及ぼす影響を測定する代わりに、化合物のＢＡＣＥポリペプチドへの結合（または公知のインヒビターの結合との競合）を測定することもまた有利である。また別に、膜貫通性領域を含有するＢＡＣＥタンパク質の種類を細胞において発現させ、そしてこれらの細胞（またはこれらの細胞から調製された膜）を候補化合物と共にインキュベートすることができる。次いでＢＡＣＥ活性に及ぼす影響を、混合物に添加されたか、または細胞において同時発現したかのいずれかの適当な基質の切断の測定により評価することができる。
【００４４】
またタンパク質またはタンパク質に対する抗体を用いて標準的な技術によりレセプターを同定することもできる。これには、非限定例としては、ＢＡＣＥタンパク質が標識されており、そして推定されるレセプターの供給源と接触しているリガンド結合または架橋アッセイ、および表面プラスモン共鳴のごとき生物物理学的技術などがある。
【００４５】
本発明は、さらに、ＢＡＣＥのインヒビターもしくはモデュレーターまたはＢＡＣＥと相互作用する化合物もしくは組成物および／またはＡβもしくはそのフラグメントの生成のインヒビターもしくはモデュレーター、例えば本発明のアッセイにより、および／または本発明のＢＡＣＥタンパク質に接触する、および結合するかまたはそうでなければ阻止もしくは変調することにより決定されるようなかかるインヒビターもしくはモデュレーター、例えばリフォールディングに関する必要性を排除する正確なジスルフィド結合で結晶化するのに適しており、占有されていないかまたは実質的に占有されていない活性部位を有しているＢＡＣＥの形態および／または酵素の生理学的ｐＨでまたはその近くで、例えば約ｐＨ５．６と約ｐＨ５．８の間で成長する結晶を有し、そして／またはＣ２の空間群を有し、およびセルの寸法はａ＝２３６．６３Åもしくは２３６．６３Å±標準偏差（０．２Å）もしくは２３６．６３Å±セル変動性３Å、ｂ＝１０５．０２Åもしくは１０５．０２Å±標準偏差（０．２Å）もしくは１０５．０２Å±セル変動性３Å、およびｃ＝６２．５９Åもしくは６２．５９Å±標準偏差（０．２Å）または６２．５９Å±セル変動性３Åおよびβ＝１０１．３２°もしくは１０１．３２°±標準偏差（０．２°）、１０１°と１０８°の間でＢＡＣＥの３つのコピーを含有する結晶の非対称性ユニットを伴う（例えばＰＭ９９−２の存在下での成長に由来する）か、またはセルの寸法はａ＝２３８．３Åもしくは２３８．３Å±標準偏差（０．２Å）もしくは２３８．３Å±セル変動性３Å、ｂ＝１０７．４Åもしくは１０７．４Å±標準偏差（０．２Å）もしくは１０７．４Å±セル変動性３Å、およびｃ＝６０．４Åもしくは６０．４Å±標準偏差（０．２Å）もしくは６０．４Å±セル変動性３Åおよびβ＝１０１．８９°もしくは１０１．８９°±標準偏差（０．２°）もしくは１０１°と１０８°の間（例えばＰＭ９９−２の不在下で成長した結晶に由来する）であり、そして／または前記のいずれかもしくは全てに対応するかまたはその結果であるＸ線回折像を有している結晶を有しているＢＡＣＥの形態を結合するおよび／または阻止するおよび／または変調するおよび／または相互作用する化合物または組成物（もちろん、あるとすればＢＡＣＥの公知のインヒビター、モデュレーターおよび／またはＡβもしくはそのフラグメントの生成のインヒビター、モデュレーターを排除する）を企図する。
【００４６】
そして、本発明は、例えばＢＡＣＥ活性および／またはＡβもしくはそのフラグメントに関与する疾病、症状、疾患等、例えばアルツハイマー病（ＡＤ）の処置における、および／またはかかる処置のための医薬品の処方におけるかかるアッセイ産物および／またはインヒビターおよび／またはモデュレーターおよび／またはリガンド、および／またはＢＡＣＥと相互作用する組成物もしくは化合物の使用、ならびにかかる処置および／もしくはその成分のためのおよび／または、前記のいずれかの使用を含むかかる医薬品を調製するための方法が含まれるようなかかる医薬品および／もしくはその成分を調製するための核酸分子、ベクターもしくは細胞の使用、方法および／またはベクターもしくは細胞を介する前記した発現を提供する。
【００４７】
別の実施形態では、本発明は、配列番号：５のアミノ酸配列を含んでなるベータ部位ＡＰＰ切断酵素を提供し；有利には、アミノ酸配列は触媒ドメインを含んでなり、そしてここで酵素は本明細書で定義されるような結晶性形態である。
【００４８】
もう１つの実施形態では、組換えベータ部位ＡＰＰ切断酵素は配列番号：５のアミノ酸配列（図１Ｂ、２Ａ、８）、およびかかる酵素をコードする核酸分子；例えば配列番号：４または１０を含んでなる核酸分子（図１Ａ、２Ｂ、７）を含んでなる。
【００４９】
さらに、とりわけ、本明細書に記載する核酸分子およびそれに由来するポリペプチド、例えば前記した核酸分子（図２Ｂ、７）およびそれから発現されたポリペプチド（図２Ａ、８）に関して、本発明は、さらに、少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％または約７７％の同一性または相同性（「実質的に相同または同一である」）、有利には少なくとも約８０％または約８３％、例えば少なくとも約８５％または約８７％の同一性または相同性（「有意に相同または同一である」）、さらに有利には少なくとも約９５％、例えば少なくとも約９７％、約９８％、約９９％またはさらには約１００％の同一性または相同性（「非常に高度に相同または同一である」から「同一である」まで、または約８４から１００％の同一性は「高度に保存された」と考えられる）を有する；ならびに有利には、これらのポリペプチドは本明細書に開示するような結晶構造を得て、そして核酸分子は本明細書に開示するような結晶構造を得るポリペプチドをコードする。さらに、とりわけ、本発明の特定のアミノ酸配列は国際公開公報第０１／２３５３３号の配列３２に９８．８％の同一性を有し、そして本発明の特定の核酸分子は国際公開公報第０１／２３５３３号の配列２５に９５．６％の同一性を有しているので、本発明のポリペプチドが本明細書に開示する配列に９８．８％以上の同一性を有し、そして本発明の核酸分子が本明細書に開示する配列に９５．６％以上の同一性を有していることは有利である（そしていずれかの前記した配列を排除することを意図する）。本発明は、またこれらの核酸分子およりポリペプチドを、本明細書のまたは前記した核酸分子およびポリペプチドと同一の様式で使用することができる。
【００５０】
ヌクレオチド配列相同性をＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒの、そしてＮＣＢＩで利用可能な「Ａｌｉｇｎ」プログラム（「線形空間において最適なアラインメント」、ＣＡＢＩＯＳ  ４、１１−１７（１９８８）、出展明示により本明細書の一部とする）を用いて決定することができる。また別にまたは加えて、例えば「相同性」または「同一性」なる用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列に関して、２つの配列間の相同性の定量的な測定を示すことができる。配列相同性パーセントを（Ｎｒｅｆ−Ｎｄｉｆ）＊１００／Ｎｒｅｆとして算出することができ、ここでＮｄｉｆは整列させた場合の２つの配列における非同一性残基の全数であり、そしてここでＮｒｅｆは１つの配列における残基の数である。従って、ＤＮＡ配列ＡＧＴＣＡＧＴＣはＡＡＴＣＡＡＴＣと７５％の配列類似性を有する（Ｎｒｅｆ＝８；Ｎｄｉｆ＝２）。
【００５１】
また別にまたは加えて、配列に関する「相同性」または「同一性」は同一のヌクレオチドまたはアミノ酸の位置の数を２つの配列の短いほうのヌクレオチドまたはアミノ酸の数で割ったものを意味し、ここで２つの配列のアラインメントはＷｉｌｂｕｒおよびＬｉｐｍａｎアルゴリズム（ＷｉｌｂｕｒおよびＬｉｐｍａｎ、ＰＮＡＳ，ＵＳＡ  ８０：７２６（１９８３）、出展明示により本明細書の一部とする）に従って、例えば２０ヌクレオチドのウィンドウサイズ、４ヌクレオチドのワードサイズ、およびギャップペナルティー４を用いて決定することができ、そしてアラインメントを含む配列データのコンピューター分析および解釈は市販により入手可能なプログラム（例えばＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ（商標）スイート、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．カリフォルニア州）を用いて便宜的に実施することができる。ＲＮＡ配列が類似していると称されるか、またはＤＮＡ配列とある程度の配列同一性もしくは相同性を有している場合、ＤＮＡ配列におけるチミジン（Ｔ）はＲＮＡ配列のウラシル（Ｕ）と等価であると見なされる（図で用いたアラインメントをも参照）。
【００５２】
本発明の範囲内のＲＮＡ配列は、ＤＮＡ配列におけるチミジン（Ｔ）をＲＮＡ配列におけるウラシル（Ｕ）と等価であると見なすことにより、ＤＮＡ配列から誘導することができる。
【００５３】
加えてまたは別に、アミノ酸配列類似性または同一性または相同性を、ＢｌａｓｔＰプログラムを用いて決定することができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｅｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７）、出展明示により本明細書の一部とする）を用いて決定でき、そしてＮＣＢＩで入手可能である。以下の参照（各々を出展明示により本明細書の一部とする）は２つのタンパク質のアミノ酸残基の相対的な同一性または相同性を比較するためのアルゴリズムを提供し、そして加えてまたは別に、前記に関して、これらの参照における教示を用いて相同性または同一性パーセントを決定することができる：Ｎｅｅｄｌｍａｎ  ＳＢおよびＷｕｎｓｃｈ  ＣＤ、「２つのタンパク質のアミノ酸配列における類似性に関する検索に適用できる一般法」、Ｊ．Ｋｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３（１９７０）；Ｓｍｉｔｈ  ＴＦおよびＷａｔｅｒｍａｎ  ＭＳ、「生物配列の比較」、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９（１９８１）；Ｓｍｉｔｈ  ＴＦ，Ｗａｔｅｒｍａｎ  ＭＳおよびＳａｄｌｅｒ  ＪＲ、「核酸配列機能的ドメインの統計的特徴付け」、Ｎｕｃｌ．Ａｃｅｄｓ  Ｒｅｓ．１１：２２０５−２２２０（１９８３）；Ｆｅｎｇ  ＤＦおよびＤｏｌｉｔｔｌｅ  ＲＦ、「正確な系統樹に対する必要条件としての進歩的な配列アラインメント」、Ｊ．ｏｆ  Ｍｏｌｅｃ．Ｅｖｏｌ２５：３５１−３６０（１９８７）；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＤＧおよびＳｈａｒｐ  ＰＭ、「マイコンピューターにおける迅速なおよび感受性のある配列多重配列アラインメント」、ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３（１９８９）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＪＤ、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＤＧおよびＧｉｂｓｏｎ  ＴＪ、「Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｗ：配列重量測定、位置特異的ギャップペナルティーおよび加重マトリックス選択による進歩的な多重配列アラインメントの感受性の改善」、Ｎｕｃｌ．Ａｃｅｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３−４８０（１９９４）ならびにＤｅｖｅｒｅｕｓ  Ｊ、Ｈａｅｂｅｒｌｉｅ  ＰおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ  Ｏ、「ＶＡＸのための包括的な一連の配列分析プログラム」、Ｎｕｃｌ．Ａｃｅｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７−３９５（１９８４）。
【００５４】
この様式では、開示された特定の配列に対するかかる相同性を有する核酸分子およびポリペプチドを理解することにより、本発明は、開示された配列に対する相同体を本明細書の用語に含めることを想定する。
【００５５】
開示されたアミノ酸配列の相同体（図２Ａ、８）に関して、これらの相同体が本明細書で定義された結晶構造を有しているのが有利であり；そして開示されたヌクレオチド配列の相同体（図２Ａ、８）に関して、これらの相同体が本明細書で定義された結晶構造を有するＢＡＣＥタンパク質をコードするのが有利である。
【００５６】
さらに、本発明の核酸分子に関して、本発明は、核酸分子に等価のコドンを含む。例えば、本発明がアミノ酸配列「Ａ」を有する「Ｘ」タンパク質およびタンパク質Ｘをコードする「Ｎ」を含む場合、本発明は、核酸分子Ｎとは異なる１つまたはそれ以上のコドンによりこれもまたタンパク質Ｘをコードする核酸分子を含む。
【００５７】
加えて、本発明の核酸分子に関して、本発明は、ストリンジェント条件下で本明細書に開示する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子を含む。
【００５８】
とりわけ、タンパク質が同一または実質的に同一の本明細書に開示する結晶構造を有している場合、ストリンジェント条件下で本明細書に開示するアミノ酸配列をコードする核酸分子にハイブリダイズするこれらの核酸分子は本明細書で論じる類似性、相同性または同一性を有するタンパク質を提供できるので、本明細書に開示するアミノ酸配列に関して、本発明は、本明細書に開示するアミノ酸配列をコードする核酸分子、およびストリンジェント条件下で本明細書に開示するアミノ酸配列をコードする核酸分子にハイブリダイズする核酸分子を含む。
【００５９】
特定の実施形態では、本発明は、さらにＯＭ９９−２の存在下およびＯＭ９９−２の不在下で、共にＣ２の空間群を有している、そして／または前記のいずれかもしくは全てに対応するかまたはその結果であるＸ線回折像を有し、そして／または非対称性のユニットで分子のコピー数の増加と共にＣ２からＰ２１までの空間群転移を有するが、一方アポＢＡＣＥ結晶をリガンドに浸漬した場合、セル寸法およびＰ２１形態のパッキングはＣ２結晶形態のものと非常に関連性がある、共に可溶性ＢＡＣＥ触媒ドメインの結晶形態を提供する。ＯＭ９９−２の存在下で成長した結晶のセル寸法（図３Ａ）はａ＝２３６．６３Å、ｂ＝１０５．０２Å、およびｃ＝６２．５９Åおよびβ＝１０１．３２°ならびにＢＡＣＥの３つのコピーを含有する結晶の非対称性ユニットである。ＯＭ９９−２の不在下で成長した結晶のセル寸法（図３Ｂ）はａ＝２３８．３Å、ｂ＝１０７．４Å、およびｃ＝６０．４Åならびにβ＝１０１．８９°である。しかしながら、本発明の開示から明らかであるように、本発明は、ＯＭ９９−２またはその他のいずれかのものの存在下または不在下で成長している結晶に限定するものではなく、そしてセル寸法は記載した値からセル寸法の全ての方向で変化し得る、例えば記載したセル寸法の値がその値±標準偏差（０．２Å）または±セル変動性３Åでよく、そして記載したベータ角度は変化でき、例えば記載したベータ角度は、例えば１０１．３２°または１０１．８９°またはその値±標準偏差（０．２°）もしくは１０１°と１０８°の間でよい。
【００６０】
本発明のＢＡＣＥ結晶はより良好な解像度を有することができ、すなわち数値的には３Å以下である。
【００６１】
本発明は、さらに、ＢＡＣＥのＢＡＣＥ触媒性ドメインの活性部位に結合する可能性のある化合物を選択することおよび本明細書に記載するようなかかる化合物を使用することを含む、薬物スクリーニングアッセイにおいて本発明の結晶を用いる方法を提供する。
【００６２】
本発明は、さらに結晶化されたＢＡＣＥまたは少なくともその機能的部分の構造座標を伴うコード化されたデータ保存媒体。かかるデータ保存材料はかかる構造、またはその構造相同体をコンピュータースクリーン上で３次元グラフィック表現として表示することができる。本発明は、また類似のまたは相同性タンパク質またはタンパク質複合体の構造を解析するための構造座標を用いる方法にも関する。加えて本発明は、ＢＡＣＥまたはその相同体に結合する阻止化合物などの化合物をスクリーニングおよび設計するために構造座標を使用する方法に関する。本発明は、またＢＡＣＥインヒビターと複合したＢＡＣＥの組成物および結晶にも関する。国際公開公報第０１／３７１９４号参照。
【００６３】
本開示では、「含んでなる」、「含んでなっている」、「含有している」および「有している」等は米国特許法に帰する意味を有し、そして「含む」、「含んでいる」等；「本質的に構成されている」または「本質的に構成される」は同様に米国特許法に帰する意味を有し、そしてその用語は無制限であり、引用されているものの基本的または新規の特性が引用されているもののほかのものの存在により変化されない限り、引用されているもののほかのものの存在を可能にするが、先行技術の実施形態は排除する。
【００６４】
これらのおよびその他の実施形態は開示されるか、または以下の詳細な記載から明らかであり、そして以下の詳細な記載に包含される。
【詳細な説明】
【００６５】
以下の詳細な説明は実施例により本発明を説明しているが、本発明を記載した特定の実施形態に限定することを意図するものではなく、参照のために本明細書の一部とする添付の図面と組み合わせて理解され得る。
【００６６】
本発明は、ＢＡＣＥの触媒性ドメイン、または正確なジスルフィド結合で結晶化するのに適しているＢＡＣＥの形態に関係する。正確なジスルフィド結合とはＢＡＣＥの触媒性ドメインまたは機能性を保持するＢＡＣＥタンパク質の生物学的に活性なコンフォメーションのジスルフィド結合を意味する。正確なジスルフィド結合を有することによりＢＡＣＥの触媒性ドメインまたは占有されていないかもしくは実質的に占有されていない活性部位を有しているＢＡＣＥタンパク質（ＢＡＣＥの供給源にかかわらず、リガンド結合を伴わないＢＡＣＥ結晶であるアポＢＡＣＥ結晶）ならびに／または酵素の生理学的ｐＨでまたはその近くで、例えば約ｐＨ５．６と約ｐＨ５．８の間で成長する結晶を有し、そして／またはＣ２の空間群を有し、およびセルの寸法はａ＝２３６．６３Åもしくは２３６．６３Å±標準偏差（０．２Å）もしくは２３６．６３Å±セル変動性３Å、ｂ＝１０５．０２Åもしくは１０５．０２Å±標準偏差（０．２Å）もしくは１０５．０２Å±セル変動性３Å、およびｃ＝６２．５９Åもしくは６２．５９Å±標準偏差（０．２Å）または６２．５９Å±セル変動性３Åおよびβ＝１０１．３２°もしくは１０１．３２°±標準偏差（０．２°）、１０１°と１０８°の間でＢＡＣＥの３つのコピーを含有する結晶の非対称性ユニットを伴う（例えばＰＭ９９−２の存在下での成長に由来する）か、またはセルの寸法はａ＝２３８．３Åもしくは２３８．３Å±標準偏差（０．２Å）もしくは２３８．３Å±セル変動性３Å、ｂ＝１０７．４Åもしくは１０７．４Å±標準偏差（０．２Å）もしくは１０７．４Å±セル変動性３Å、およびｃ＝６０．４Åもしくは６０．４Å±標準偏差（０．２Å）もしくは６０．４Å±セル変動性３Åおよびβ＝１０１．８９°もしくは１０１．８９°±標準偏差（０．２°）もしくは１０１°と１０８°の間（例えばＰＭ９９−２の不在下で成長した結晶に由来する）であり、そして／または前記のいずれかもしくは全てに対応するかまたはその結果であるＸ線回折像を有し、そして／または非対称性のユニットで分子のコピー数の増加と共にＣ２からＰ２１までの空間群転移を有するが、一方アポＢＡＣＥ結晶をリガンドに浸漬した場合、セル寸法およびＰ２１形態のパッキングはＣ２結晶形態のものと非常に関連性があるＢＡＣＥの結晶形態をリフォールディングする必要性が排除される。
【００６７】
本発明は、さらに、例えば合理的な設計またはＢＡＣＥのインヒビターもしくはモデュレーターの同定における；これらのＢＡＣＥタンパク質の発現およびその使用に関係する。
【００６８】
本発明のＢＡＣＥ組換えタンパク質はバキュロウイルス発現系を介して昆虫細胞において有利に発現され、そして可溶性であり、そしてグリコシル化されない。タンパク質のＣ末端トランケーションにより可溶性が増大され、膜貫通性および細胞質性領域を除去できるが、一方グリコシル化部位で変異を導入することによりグリコシル化を除去することができる。対照的に（Ｔａｎｇら）国際公開公報第０１／００６６３号（Ｔａｎｇら）、国際公開公報第０１／００６６５号（Ｔａｎｇら）、Ｈｏｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０：１５０−１５３（２０００）は細菌における結晶化のためにＣ末端トランケートされたメマプシン２を生成した。従って、可溶性で、活性なタンパク質を得るためにリフォールディングが必要である。しかしながら、リフォールディング／精製の間に同定されていないタンパク質溶解活性のためにＮ末端領域が喪失された。さらに結晶化研究のために用いられた最終タンパク質は種の混合物であり、大部分がＬｅｕ４３でＮ末端を有していた（成熟Ｎ末端はＧｌｕ４６である）。Ｔａｎｇ／Ｈｏｎｇ結晶構造と本発明との比較に関しては後記の表４を参照。
【００６９】
例示したＢＡＣＥタンパク質は：１）精製を促進するためにＣ末端に付加されたＨｉｓ６タグ；２）タンパク質のグリコシル化を避けるためのアミノ酸１５３、１７２、２２３および３５４の４つの潜在的グリコシル化部位でアスパラギン残基のグルタミンへの変異；３）フリン切断により作製されたＮ末端；４）プロセシングされたタンパク質とプロセシングされていないタンパク質の区別を可能にするためのプロペプチドのＮ末端に付加されたＦＬＡＧオリゴヌクレオチドタグ；および５）ｇｐ６バキュロウイルスタンパク質に由来するシグナルペプチドと共に発現される。
【００７０】
本発明で使用するのに、例えばＢＡＣＥまたはＢＡＣＥをコードする核酸分子を発現するのに可能なベクターには、非限定例としては：昆虫細胞用には、ｐＦａｓｔＢＡｃｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｐＦａｓｔＢＡｃＤｕａｌ  ｐＦａｓｔＢＡｃ１（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｐＢｌｕｅＢａｃ  IIIまたはｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓバキュロウイルスベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州）；細菌細胞用には、ｐＥＴ−３（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）および哺乳動物細胞用には、ｐＪＴ４（さらに以下で論じる）、ｐｃＤＮＡ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州）およびｐＳＶ−ＳＰＯＴＲ  １（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、メリーランド州）などがある。このように、例えば細菌系、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、またはウイルスベクター系、およびＤＮＡプラスミド系などのいずれかの適当なベクターをＢＡＣＥ触媒性ドメインもしくはタンパク質の発現に、または本発明の核酸分子の複製および／または発現に用いることができる。ＢＡＣＥまたはＢＡＣＥをコードする核酸分子を発現するためのベクターまたは組換え体またはプラスミドを作製するための方法はいずれかの望ましい方法、例えば本明細書引用された文献に開示された、または：米国特許第４６０３１１２号、第４７６９３３０号、第５１７４９９３号、第５５０５９４１号、第５３３８６８３号、第５４９４８０７号、第４７２２８４８号、第４７４５０５１号、第４８７９２３６号、第５７６２９３９号、第５８５８３６８号、第６２２４８８２号、第６１０３５２６号、第４７６９３３１号、第５５９１４３９号、第５５５２１４３号、第５５９１６３９号、第５５８９４６６号、第５５８０８５９号、第６１３００６６号、第６００４７７７号、第５９９００９１号、および第６１５６５６７号における方法によるかまたはそれに類似する方法でよい。しかしながら、バキュロウイルス系および昆虫細胞が本発明では好ましい。
【００７１】
本発明のベクターまたは組換え体により作製された発現産物は感染したもしくはトランスフェクトされた細胞または培養培地から単離および／または精製されているたが有利である。
【００７２】
ＢＡＣＥ触媒性ドメインをコードするＤＮＡ配列はベクター中で制御エレメントに機能的に連結されて存在できる。本発明の１つの実施形態では、昆虫宿主細胞は組換えｈＢＡＣＥ  ｓｙｎｔｈ  ｈｉｓ／ｐＦａｓｔｂａｃバキュロウイルスＤＮＡでトランスフェクトされ、それによりＢＡＣＥ触媒性ドメインの発現に至るのが好ましい。本発明の別の実施形態では、昆虫宿主細胞はＦＵＲＩＮ／ｐＦａｓｔＢａｃ  ＤｕａｌバキュロウイルスＤＮＡでトランスフェクトされ、それによりフリンの発現に至るのが好ましい。組換え分子でのトランスフェクションおよび同時トランスフェクションを技術分野で公知の方法を用いて行うことができる。
【００７３】
宿主細胞を組換え発現プラスミドで安定してトランスフェクトするか、もしくは一過性にトランスフェクトするか、または組換えウイルスベクターにより感染してよい。宿主細胞には原核細胞、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、真菌系、例えば出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫、例えばＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ  ＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ＳＦ−９）細胞およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ＳＦ−２１）細胞、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ＳＦ−９００＋、米国特許第６１０３０６６号）に由来する永久細胞系、ならびに哺乳動物永久細胞系、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）およびＳＶ４０形質転換されたアフリカミドリザル腎臓細胞（ＣＯＳ）などがある。
【００７４】
本発明は、「変異体」を企図し、ここで「変異体」は、元来のまたは合成ＢＡＣＥ触媒性ドメインにおける少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置換することにより、ならびに／または元来のポリペプチド内のまたは元来のＢＡＣＥ触媒性ドメインに対応するポリペプチドのＮおよび／もしくはＣ末端でアミノ酸残基を付加および／または欠失することにより得られ、そしてそれが誘導される元来のＢＡＣＥ触媒性ドメインと実質的に同一の３次元構造を有するポリペプチドを意味する。同様に、本発明は、「擬似物質」；例えば実質的に同一の本明細書に開示するＢＡＣＥの結晶構造を有するタンパク質を企図する。擬似物質は変異体でよい。実質的に同一の３次元構造を有するということは、変異体が誘導される元来のＢＡＣＥ触媒性ドメインの原子構造座標と重ね合わせた場合、元来の触媒性ドメインの少なくとも約５０％から１００％のＣα原子が重ね合わせに含まれる場合、約２．０Å以下の２乗平均平方根偏差（ｒ．ｍ．ｓ．ｄ．）を有する原子構造座標のセットを有することを意味する。変異体または擬似物質はβセクレターゼ活性を有し得るが、有することが必要ではない。
【００７５】
表５の座標はオングストロームで、小数第３位までの原子位置の測定値を提供する。座標は３次元で形状を定義する位置の相対的なセットであり、それにより異なる起源および／または軸および／または空間群を有する座標および／または空間群の全く異なるセットが類似のまたは同一の形状を定義することが可能になる。さらに、残基バックボーン原子に関して表５で提供される座標に重ね合わせる場合、残基のバックボーン原子の２乗平均平方根偏差（すなわちタンパク質アミノ酸残基の窒素−炭素−炭素バックボーン原子）が１．５Å未満（好ましくは１．０Å未満、そしてさらに好ましくは０．５Å未満）であるように、構造の原子の相対的な原子位置を変化させることにより、概して、ＢＡＣＥインヒビターまたはモデュレーターの構造基盤の設計または同定のためにその構造特性および可能性の双方に関して、表５の構造に実質的に同一である構造になる。同様に、表５の水分子および／または基質分子の数および／または位置を変化させることは、概してＢＡＣＥインヒビターもしくはモデュレーターの構造基盤の設計の可能性に影響しない。従って、本発明の実施形態であると本明細書に記載する目的のために：表５座標を異なる起源および／または軸に置き換える；残基バックボーン原子に関して表５で提供される座標に重ね合わせる場合、構造の原子の相対的原子位置を２乗平均平方根偏差が１．５Å未満（好ましくは１．０Å未満、そしてさらに好ましくは０．５Å未満）であるように変化させる；ならびに／または水分子および／もしくは基質分子の数および／もしくは位置を変化させる場合、これは本発明の範囲内である。従って、本明細書における表５のデータに対する言及は、表の１つまたはそれ以上の値がこのように変化する座標データを含む。「２乗平均平方根偏差」とは平均からの偏差の２乗の相加平均の平方根を意味する。
【００７６】
本明細書で用いる「結晶または結晶構造」または「結晶形態」：とは結晶形態にあるペプチドを意味する。この用語はまた本明細書で記載する共結晶をも含む。「共結晶」なる用語は成分の混合物、すなわち（複数の）ポリペプチドおよび（複数の）化合物を含有する溶液から形成された結晶を意味する。かかる化合物には、限定ではなく例示によると、コファクター、基質、基質アナログ、インヒビター、アロステリックエフェクター等がある。化合物にはＯＭ９９−２、ＯＭ９９−１およびスタチン基盤のペプチドなどがある（Ｍａｒｃｉｎｋｅｖｉｃｉｅｎｅ  Ｊ．、Ｌｕｏ  Ｙ．、Ｇｒａｃｉａｎ，ＮＲ．、Ｃｏｍｂｓ  Ａｐ．およびＣｏｐｅｌａｎｄ，ＲＡ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７６：２３７９０−２３７９４（２００１））。浸漬された結晶は、結晶が１つの成分（ポリペプチド）から生成されている場合、そして次に別の成分を（複数の）化合物に浸漬させる。
【００７７】
例えばＢＡＣＥのインヒビターを決定するためのリガンドと活性部位の間で検出される「結合」はリガンドと活性部位の間の「関連性」であり；そして「関連性」は化学物質すなわち化合物またはその部分またはフラグメントとタンパク質のＢＡＣＥ触媒性ドメインまたはその部分またはフラグメントとの近接性の状態を意味する。関連性は、すなわち並列がエネルギー的に、例えば水素結合、ファンデルワールス、静電気性もしくは疎水性相互作用に有利である場合、非共有結合性でよく、または共有結合性でよい。
【００７８】
「活性部位」とは基質ペプチド結合および切断が生じるＢＡＣＥドメインのその部位を意味する。それはインヒビターまたはリガンドにより遮断されることを求められるＢＡＣＥの部位である。ＢＡＣＥタンパク質の「機能的部分」は少なくとも活性部位を含む。
【００７９】
「結晶学的に関連性のある二量体」は、二量体を含んでなる２つの分子に関連する対称軸または平面が結晶格子の対称軸または平面に一致する２つの分子の二量体であり、一方「結晶学的に関連性のない二量体」は二量体を含んでなる２つの分子が関係する対称軸または平面が結晶格子の対称軸または平面に一致しない２つの分子の二量体である。そして「バイローバル（Ｂｉｌｏｂａｌ）構造」はＢＡＣＥタンパク質の２つの球状の葉を意味し、そしてタンパク質のアミノおよびカルボキシ末端半分に対応する。
【００８０】
ＢＡＣＥタンパク質はシグナル配列、プロペプチド、触媒性アスパルチルプロテアーゼドメイン、膜貫通領域およびＣ末端細胞質性領域を含有する。小胞体を移行中にＢＡＣＥはゴルジ装置で構成性Ｎ末端プロセシングを受け、ここでプロペプチドはフリン様プロテアーゼにより切断される（Ｂｅｎｎｅｔら、２０００；Ｃｒｅｅｍｅｒｓら、２００１）。さらに具体的には、ＢＡＣＥはグリコシル化、ジスルフィド結合形成およびプロペプチドプロセシングなどの一連の翻訳後修飾を受ける。ＨａｎｉｕらはＢＡＣＥが４つの部位でＮ−グリコシル化され（Ａｓｎ−１５３、Ａｓｎ−１７２、Ａｓｎ−２２３およびＡｓｎ−３５４）、そして外部ドメインの６個のＣｙｓ残基が３つの分子内ジスルフィド結合を形成する（Ｃｙｓ２１６−Ｃｙｓ４２０、Ｃｙｓ２７８−Ｃｙｓ３３３およびＣｙｓ３３０−Ｃｙｓ３８０）ことを示した。
【００８１】
本発明は、ＢＡＣＥの触媒性ドメインに対応する結晶性ポリペプチドに関する。好ましくは、結晶性触媒性ドメインはより良好な、すなわち数値的に３．０Å未満の解像度までの３次元Ｘ線回折構造の決定を可能にするのに十分な品質である。本発明は、またポリペプチドの調製および結晶化にも関する。ポリペプチド自体およびその結晶構造に由来する情報を用いてＢＡＣＥを分析および修飾し、ならびに触媒性ドメインと相互作用する化合物を同定することができる。これによりＢＡＣＥを阻止もしくは変調するかまたはＢＡＣＥと相互作用するかまたはＢＡＣＥと関連する化合物の合理的な設計または同定が可能になり；その化合物は治療的価値を有している。
【００８２】
結晶性ＢＡＣＥ
本発明の結晶は概して結晶形態のＢＡＣＥ触媒性ドメインに対応する実質的に純粋なポリペプチドを含んでなる。
【００８３】
本発明の結晶性ＢＡＣＥ触媒性ドメインは合成ＢＡＣＥドメインに限定されないと理解すべきである。実際に、本発明の結晶は元来のＢＡＣＥ触媒性ドメインおよびＢＡＣＥ触媒性ドメインの擬似物質をも含む。
【００８４】
ＢＡＣＥドメインの３次元構造に有意に干渉しないアミノ酸置換、欠失および付加はある程度、置換、付加または欠失を生じるＢＡＣＥドメインの領域に依存する。高度な可変性領域における非保存置換および保存置換は分子の３次元構造を有意に崩壊することなく容認され得る。高度に保存された領域または有意な２次構造を含有する領域では、保存アミノ酸置換が好ましい。
【００８５】
保存アミノ酸置換は技術分野で公知であり、そして関係するアミノ酸残基の極性、荷電性、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性の性質における類似性に基づいて為された置換を含む。例えば、陰性に荷電したアミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸などがあり；陽性に荷電したアミノ酸にはリジンおよびアルギニンなどがあり；類似の親水性値を有する非荷電性極性ヘッド群のアミノ酸には以下のものなどがある：ロイシン、イソロイシン、バリン；グリシン、アラニン；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；フェニルアラニン、チロシン。その他の保存アミノ酸置換は技術分野で公知である。
【００８６】
ポリペプチドの精製を助ける等のためにポリペプチドをコードするｃＤＮＡに便宜的なクローニング部位を提供するために、ＢＡＣＥ触媒性ドメインに対してアミノ酸を置換、欠失および／または付加するのがとりわけ、有利であるまたは便利である場合もある。ＢＡＣＥ触媒性ドメインの３次元構造を実質的に変化しないかかる置換、欠失および／または付加は当業者には明らかであろう。
【００８７】
本明細書で企図する変異体は酵素活性を呈する必要がないことは留意すべきである。実際に、ＢＡＣＥドメインのβ−セクレターゼ活性を干渉するが、ドメインの３次元構造を有意に変化しないアミノ酸置換、付加または欠失がとりわけ、本発明により企図される。かかる結晶性ポリペプチド、またはそこから得られた原子構造座標を用いて元来のドメインに結合する化合物を同定することができる。
【００８８】
本発明の座標は概して１つまたはそれ以上の化合物と関連する結晶性ＢＡＣＥドメインポリペプチドを含んでなる。関連性は共有結合または非共有結合でよい。かかる化合物には、非限定例としては、コファクター、基質、基質アナログ、インヒビター、アロステリックエフェクター等がある。
【００８９】
ポリペプチドの生成
本明細書で記載する合成および変異ＢＡＣＥ触媒性ドメインポリペプチドを技術分野で公知の技術を用いて全体的にまたは部分的に化学合成することができる（例えばＫｏｃｈｅｎｄｏｅｒｆｅｒ  ＧＣ、「薬物発見における化学的タンパク質合成」、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ４：２０５−２１４（２００１）参照）。また別に、当業者に公知の方法を用いて、合成または変異ＢＡＣＥ触媒性ドメインコード化配列および適当な転写／翻訳調節シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法にはインビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術およびインビボ組換え／遺伝子組換えなどがある。例えばＭａｎｉａｔｉｓら、１９８９に記載される技術を参照。
【００９０】
種々の宿主−発現ベクター系を利用して、ＢＡＣＥドメインコード化配列を発現することができる。これらには、非限定例としては、ＢＡＣＥドメインコード化配列を含有する組換えウイルス（例えばバキュロウイルス）で感染した昆虫細胞系または動物細胞系；微生物、例えば組換えバクテリオファージＤＮＡで形質転換された細菌、ＢＡＣＥドメインコード化配列を含有するプラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターおよびＢＡＣＥドメインコード化配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母などがある。これらの形質転換の発現エレメントはその強度および特異性で変化する。利用する宿主／ベクター系に依存して、構成性および誘導プロモーターなどのいずれかの多くの適当な転写および翻訳エレメントを発現ベクターに使用することができる。例えば、昆虫細胞系においてクローニングする場合、プロモーター、例えばバキュロウイル・ポリヘドリンプロモーターを使用することができ；細菌系では、誘導プロモーター、例えばバクテリオファージ．ｍｕ．のｐＬ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモーター）等を使用することができ；哺乳動物細胞系でクローニングする場合、哺乳動物細胞のゲノムに由来する（例えばメタロチオニンプロモーター）または哺乳動物ウイルスに由来する（例えばアデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）プロモーターを使用することができ、そしてＢＡＣＥ触媒性ドメインＤＮＡの複数のコピーを含有する細胞系を作製する場合、ＳＶ４０−、ＢＰＶ−およびＥＢＶ−基盤のベクターを適当な選択マーカーと共に使用することができる。
【００９１】
ポリペプチドの結晶化および結晶構造の特徴付け
バッチ、液体ブリッジ、透析、蒸気拡散およびハンギングドロップ法（例えばＭｃＰｈｅｒｓｏｎ、１９８２；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ、１９９０；Ｗｅｂｂｅｒ、１９９１）などのタンパク質結晶学の分野で公知である慣用される手段により本発明の結晶を得ることができる。
【００９２】
概して、本発明の結晶は、タンパク質を沈殿させるのに必要な濃度をほんの少し下回る濃度で沈殿剤を含有する水性バッファーに、実質的に純粋な合成ＢＡＣＥドメインポリペプチドを溶解させることにより成長させる。蒸発を調節することにより水分を除去して沈殿状態を作り、これを結晶成長が停止するまで維持する。
【００９３】
本発明の好ましい実施形態では、元来の結晶は蒸気拡散によりハンギングドロップで成長する（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ、１９８２および１９９０）。この方法では、ポリペプチド／沈殿剤溶液は、結晶を生成するのに最適な沈殿剤濃度を有する大きな水性液貯蔵器を伴う閉鎖された容器内で平衡にすることができる。概して、等量の実質的に純粋なポリペプチド溶液を等量の貯蔵器溶液と混合し、結晶化に必要な濃度の約半分の沈殿剤濃度を得る。貯蔵器の上部を密封するカバースリップの下にこの溶液を小滴として懸濁する。密封された容器を通常２から６週間、結晶が成長するまで静置する。
【００９４】
従って、本発明は、例えば適当な宿主および／またはベクターを介する、例えば昆虫細胞における発現による組換え生成によりＢＡＣＥタンパク質を生成すること、ＢＡＣＥを収集することおよび収集したＢＡＣＥから結晶を成長させることを含んでなるＢＡＣＥを結晶化するための方法を提供する。このように生成されたＢＡＣＥはＸ線回折分析に適している。そして、結晶を成長させることはいずれかの適当な手段でよく、斑銀グドロップ法が有利である。
【００９５】
結晶および原子構造座標の使用
本発明の結晶、およびとりわけ、そこから得られた原子構造座標は広範な用途を有している。新規治療薬を開発するための研究法として、結晶（アポまたは共複合化のいずれか）および構造座標（アポまたは共複合化のいずれか）はβ−セクレターゼ活性を阻止する化合物を同定するのにとりわけ、有用である。
【００９６】
本明細書に記載する構造座標を、別の合成または変異ＢＡＣＥドメインの結晶構造およびかかるドメインとリガンド、例えばインヒビター、アゴニスト、アンタゴニスト等との共結晶の構造を決定するフェージングモデルとして用いることができる。構造座標およびそこから得られた３次元構造のモデルを用いて、合成または変異ＢＡＣＥドメインの溶液基盤の構造、例えば核磁気共鳴（ＮＭＲ）により得られたものの解明を助けることもできる。
【００９７】
表５のＢＡＣＥ結晶の構造の提供により当業者は、ＢＡＣＥの作用メカニズムに関して詳細な洞察を行うことができる。この洞察により、ＢＡＣＥの阻止、またはＡβもしくはそのフラグメントの生成、またはＡＤまたはＡβもしくはそのフラグメントの生成に関与する障害（ＢＡＣＥの阻止により処置できる障害）の処置にそれを必要とする個体において使用することができるＢＡＣＥのインヒビターを設計する手段が提供される。
【００９８】
ＢＡＣＥの結晶構造の提供によりＢＡＣＥのモデュレーター、例えばインヒビターに関する薬物発見、同定、および設計のための新規研究法が可能になる。従って、本発明は、：座標または表５の同定座標により同定されるＢＡＣＥの構造を提供すること；候補モデュレーターまたはインヒビターの構造を提供すること；および表５のＢＡＣＥの構造に対する候補物質の構造を適合させること：を含んでなる合理的な薬物設計または同定のためのコンピューター基盤の方法を提供する。
【００９９】
また別の実施形態では、該方法は基質またはリガンドが結合するポケットをモデル化するために、活性部位または結合領域の周辺にある目的のＢＡＣＥの原子の座標を用いることができる。これらの座標を用いて、次いで候補モデュレーター分子に対して「シリコ」スクリーニングする空間を定義することができる。従って、本発明は、：ＢＡＣＥの表５の最後の２つの原子の座標を提供すること（「選択された座標」）；候補モデュレーターまたはインヒビターの構造を提供すること；およびＢＡＣＥの選択された座標に候補物質の構造を適合させること：を含んでなる合理的な薬物設計または同定のためのコンピューター基盤の方法を提供する。
【０１００】
実際には、活性部位および結合領域を現す表５の座標により定義されるＢＡＣＥの十分な数の原子をモデル化するのが望ましい。従って、少なくとも５個、有利には少なくとも１０個、さらに有利には少なくとも５０個、そしてさらに有利には少なくとも１００個のＢＡＣＥ構造の原子の座標を提供することができる。
【０１０１】
従って、本発明の方法は、活性部位または結合領域の周辺にある目的のＢＡＣＥのサブドメインを用いることができ、そして本発明は、：少なくとも１つのＢＡＣＥのサブドメインの座標を提供すること；ＢＡＣＥの候補モデュレーターまたはインヒビターの構造を提供すること；および提供されたＢＡＣＥのサブドメインの座標に候補物質の構造を適合させること：を含んでなる同定または合理的な薬物設計のためのコンピューター基盤の方法を提供する。
【０１０２】
これらの方法は場合によっては候補物質を同定することを含んでもよく、そして場合によってはさらに候補物質をＢＡＣＥと接触させて結合および／または阻止があるかどうかを試験することを含んでもよい。
【０１０３】
「適合させる」とは自動的または半自動的手段により、候補物質の少なくとも１つの原子とＢＡＣＥの少なくとも１つの原子との間の相互作用を決定すること、およびかかる相互作用が安定である程度を算出することを意味する。相互作用には、荷電によりもたらされる引力、反発力、立体の考慮等などがある。「サブドメイン」とは少なくとも１つの、例えば２、３、または４つの、２次構造の完全な（複数の）エレメントを意味し得る。ＢＡＣＥの特定の領域には表５で同定されたものなどがある。
【０１０４】
ＢＡＣＥのモデュレーターはＢＡＣＥのインヒビターまたは別の方法でその特異性もしくは活性に影響する化合物でよい。有利にはモデュレーターはインヒビターである。
【０１０５】
候補モデュレーター分子の構造の提供の工程は、活性部位との相互作用に関して化合物のデータベースをコンピューターによりスクリーニングすることによる化合物の選択に関係する。例えば、可能性のあるモデュレーターに関する３−Ｄ記述子を誘導することができ、幾何学的および機能的制約を含む記述子は活性部位の構造および化学的特性から誘導される。次いで記述子を用いて化合物データベースに問い合わせを行うことができ、可能性のあるモデュレーターは記述子の特徴に良好な適合性を有する化合物である。実際には、記述子を仮想のファルマコフォアの型にできる。
【０１０６】
いずれにせよ、ＢＡＣＥの３次元構造の決定により、ＢＡＣＥの新規のおよび特異的なモデュレーターの設計に関する基礎が提供される。例えば、ＢＡＣＥの３次元構造を知ることから、コンピューターモデル化プログラムを用いて、ＢＡＣＥの可能性のある、または確認された活性部位、例えば結合部位またはその他の構造または機能的特徴と相互作用することが予測される異なる分子を設計または同定することができる。
【０１０７】
さらに具体的には、可能性のあるＢＡＣＥ活性のモデュレーターを、ドッキングプログラム、例えばＧＲＡＭ、ＤＯＣＫまたはＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｗａｌｔｅｒｓら、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  ３（４）：１６０−１７８（１９９８）；およびＤｕｎｂｒａｃｋら、Ｆｏｌｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｓｉｇｎ  ２：２７−４２（１９９７）参照）を用いるコンピューターモデル化を使用することにより試験して、可能性のあるＢＡＣＥのモデュレーターを同定することができる。この手順は、可能性のあるモデュレーター（例えばインヒビター）の形状および化学的構造がどのように良好に酵素と結合するかを確認するために、可能性のあるモデュレーターのＢＡＣＥに対する適合化を含むことができる。
【０１０８】
また、ＢＡＣＥの活性部位または結合部位のコンピューター補助の、手動試験を実施することもできる。種々官能基を有する分子と酵素表面との間の可能性のある相互作用部位を決定するプログラム、例えばＧＲＩＤ（Ｐ．Ｇｏｏｄｆｏｒｄ、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２８：８４９−８５７（１９８５））プログラムを用いて活性部位または結合部位を分析して変調化合物の部分構造を予測することもできる。
【０１０９】
コンピュータープログラムを用いて２つの結合パートナー、例えばＢＡＣＥおよび候補インヒビターの引力、反発力、立体障害を推定することができる。概して、より堅固に適合するほど、立体障害が少なくなり、そして引力が増し、これらの特性はより堅固な結合定数と合致するので、可能性のあるモデュレーターはより強力である。さらに、候補モデュレーターの設計がさらに特異的であるほど、別のタンパク質と同様に相互作用しない可能性が高くなる。これは別のタンパク質との望ましくない相互作用に起因する、可能性のある副作用を最低限にする傾向がある。
【０１１０】
別の実施形態では、本発明は、ＢＡＣＥに結合するＢＡＣＥのモデュレーターの構造を決定するための方法を提供し、該方法は（ａ）本発明によるＢＡＣＥの結晶を提供すること；（ｂ）結晶を該モデュレーターに浸漬させること；および（ｃ）該ＢＡＣＥモデュレーター複合体の構造を決定すること；を含んでなる。
【０１１１】
本発明は、さらに、インシリコ法の代わりに、またはそれに加えて、結合活性を有する化合物を選択するための化合物の高速大量処理スクリーニングに関する。結合活性を示すこれらの化合物は可能性のある候補モデュレーターとして選択され、そしてさらに共結晶化により、または浸漬により、Ｘ線分析用にＢＡＣＥで結晶化される。得られたＸ線構造を種々の目的で表５の構造と比較することができる。例えばかかる化合物により為された接触がＢＡＣＥにより為されたものと重複する場合、ＢＡＣＥおよび別の化合物の接触を含有する残基を含んでなる新規分子を提供することができる。
【０１１２】
好ましい適合特性、例えば候補物質およびＢＡＣＥ間の強力な引力を有するものを決定することにより可能な結合候補モデュレーターまたはインヒビターを設計、同定、または選択すると、次いでこれらを活性に関してスクリーニングすることができる。結果的に、本発明は、さらに：候補モデュレーターまたはインヒビターを入手または合成すること；および候補モデュレーターまたはインヒビターをＢＡＣＥと接触させて候補物質がＢＡＣＥを阻止または変調または相互作用する能力を決定すること；を含む。後者の工程では、候補物質をその機能を決定するための条件下でＢＡＣＥと接触させるのが有利である。かかるアッセイを実施する代わりに、またはそれに加えて、本発明は、：候補モデュレーターを入手または合成すること；ＢＡＣＥと候補物質の複合体を形成すること；および例えばＸ線回折またはＮＭＲまたはその他の手段により複合体を分析して、候補物質がＢＡＣＥと相互作用する能力を決定すること；を含んでなることができる。次いでＢＡＣＥに対する候補物質の結合性についての詳細な構造情報を得ることができ、この情報に鑑み、可能性のあるモデュレーターの構造または機能性に対する調整を行い、ＢＡＣＥに対する結合性を改善することができる。必要な場合、これらの工程を繰り返し、そして再度繰り返すことができる。有利には、接触工程では、可能性のあるモデュレーターを基質および典型的にはバッファーの存在下でＢＡＣＥと接触させ、可能性のあるモデュレーターの、ＢＡＣＥの機能を変化させる能力を決定する。
【０１１３】
本発明は、さらに表５の構造座標を用いることにより、未知の構造のＢＡＣＥ相同体の３次元構造を決定する方法に関する。例えば、未知の構造のＢＡＣＥ相同体に関するＸ線結晶学的またはＮＭＲ分光学的データが提供される場合、表５で定義されるようなＢＡＣＥの構造を用いて、技術分野で公知の技術により、例えばＸ線結晶学の場合フェーズモデリングによりそのデータを解釈して、ＢＡＣＥ相同体に関して可能性のある構造を提供することができる。従って、本発明の方法は：未知の構造のＢＡＣＥ相同対のアミノ酸配列の表現をＢＡＣＥのアミノ酸配列と共に整列させてアミノ酸配列の相同性領域を対合させること；ＢＡＣＥの対応する領域の表５に定義されるような構造に関して未知構造のＢＡＣＥの対合した相同性領域の構造をモデル化すること；および、（例えば好ましい相互作用が未知構造のＢＡＣＥ内で形成されるような、および／または低エネルギーのコンフォメーションが形成されるような）対合した該相同性領域の構造を実質的に保存する未知の構造のＢＡＣＥに関するコンフォメーションの決定を含んでなることができる。「相同生成物領域」は同一であるかまたは類似性を有する２つの配列、例えば脂肪族、芳香族、極性、陰性に荷電、または陽性に荷電、側鎖化学基のアミノ酸残基と表される。相同性領域における同一および類似の残基はしばしば当業者により、各々「不変性の」および「保存された」と表される。有利には、大１および大３の公知はコンピューターモデリングにより実施する。相同性モデリングは技術分野で公知の技術である（Ｇｒｅｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１０５５（１９８５）；およびＢｌｕｎｄｅｌｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７２：５１３（１９８８））。
【０１１４】
該して、アミノ酸配列の比較は既知の構造のポリペプチドのアミノ酸配列を未知の構造のポリペプチドのアミノ酸配列と共に整列化することにより達成される。次いで配列のアミノ酸を比較し、そして相同であるアミノ酸の群を一緒にグループ分けする。この方法によりポリペプチドの保存された領域が検出され、そしてアミノ酸挿入および欠失が明らかになる。市販により入手可能なアルゴリズムによりアミノ酸配列間の相同性を決定することができる。本明細書に別途記載したものに加えて、アメリカ国立バイオテクノロジーセンターにより提供されるプログラムＢＬＡＳＴ、ギャップＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴＩＮ、およびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴの記載も行う。これらのプログラムはこの目的のためにこの技術分野で広く用いられ、そして２つのアミノ酸配列の相同領域を整列させることができる。
【０１１５】
既知および未知の構造を有するポリペプチドのアミノ酸配列を一度整列させると、既知構造を有するポリペプチドのコンピューター表示で保存アミノ酸の構造が、構造が未知であるポリペプチドの対応するアミノ酸に移される。例えば、既知構造のアミノ酸配列のチロシンを、未知の構造のアミノ酸配列の対応する相同性アミノ酸であるフェニルアラニンと置換することができる。非保存領域に位置するアミノ酸の構造を標準的なペプチド幾何学を用いて、または分子シミュレーション技術、例えば分子ダナミクスにより手動で割り当てることができる。全体構造の絞込みは分子ダナミクスおよび／またはエネルギー最小化により行うことができる。
【０１１６】
インシリコでＢＡＣＥを用いる本発明の実施形態は、前記の本発明の実施形態により得られたＢＡＣＥの相同性モデルに同等に適用させることができ、そしてこれはさらに別の本発明の実施形態を成す。従って、本明細書に記載した方法によりＢＡＣＥのコンフォメーションが決定されたので、本明細書に記載するような合理的な薬物または化合物設計または同定のコンピューター基盤の方法においてかかるコンフォメーションを用いることができる。
【０１１７】
本発明は、さらに：ＢＡＣＥの結晶を提供すること、例えば本発明に従って、結晶をモデュレーターで浸漬すること；およびＢＡＣＥ−モデュレーター複合体の構造を決定すること；を含んでなるＢＡＣＥに結合するＢＡＣＥのモデュレーターの構造を決定するための方法を提供する。また別に、または加えて、ＢＡＣＥおよびモデュレーターを共結晶化することができる。
【０１１８】
本発明に従ってモデュレーターを入手および特徴づけしたので、本発明は、さらに：モデュレーターの不在下で、ＢＡＣＥがセクレターゼ活性を呈することができる条件下でＢＡＣＥを提供すること；モデュレーター化合物を提供すること（例えばモデュレーターおよびＢＡＣＥを接触させること）；ＢＡＣＥの活性がモデュレーター化合物の存在により変化する程度を決定すること；を含んでなるＢＡＣＥの活性を変調するための方法を提供する。
【０１１９】
本発明は、さらに、ＢＡＣＥまたはＢＡＣＥの複合体およびモデュレーターに関して構造を作製することおよび／または合理的な薬物設計を実施することを企図する系、例えばコンピューター系を提供する。系は：表５によるかまたは相同性モデリングによりそこから誘導される原子座標データ、該データはＢＡＣＥまたは少なくとも１つのそのサブドメインの３次元構造を定義する；またはＢＡＣＥに関する構造因子、該構造因子データは表５の原子座標データから誘導することができる；を含有することができる。本発明は、また：表５によるかまたは相同性モデリングによりそこから誘導される原子座標、該データはＢＡＣＥまたは少なくとも１つのそのサブドメインの３次元構造を定義する；またはＢＡＣＥに関する構造因子、該構造因子データは表５の原子座標データから誘導することができる；を含むコンピューター可読媒体にも関する。「コンピューター可読媒体」とは、コンピューターにより直接読み出しおよびアクセスできるいずれかの媒体を意味し、そしてこれには、非限定例としては：磁気性保存媒体、例えばフロッピーディスク、ハード保存媒体および磁気テープ；光学保存媒体、例えば光ディスクまたはＣＤ−ＲＯＭ；電気的保存媒体、例えばＲＡＭおよびＲＯＭ；ならびにこれらのカテゴリーのハイブリッド、例えば磁性／光学媒体などがある。かかるコンピューター可読媒体を提供することにより、原子座標データを日常的にモデルＢＡＣＥまたはそのサブドメインにアクセスさせることができる。例えばＲＡＳＭＯＬ（Ｓａｙｌｅら、ＴＩＢＳ  ２０：３７４（１９９５））は構造決定および／または合理的な薬物設計のための原子座標データのアクセスおよび分析を可能にする、公に入手可能なソフトウェアパッケージである。本発明は、さらにかかるコンピューター可読媒体および／またはコンピューターシステムおよび／または原子座標データへのアクセスをユーザーに提供することにより仕事をする方法を含み、例えば媒体および／または原子座標データは、例えば登録により、インターネットまたはグローバル・コミュニケーション／コンピューター・ネットワークを介してユーザーにアクセス可能にできるか；または登録によりコンピューターシステムをユーザーに利用可能にすることができる。原子座標から誘導することができる構造因子データ（例えばＢｌｕｎｄｅｌｌら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、ＬｏｎｄｏｎおよびＳａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（１９７６）参照）はとりわけ、例えば差フーリエ電子密度マップを算出するのに有用である。このように、コンピューター可読媒体および／またはコンピューターシステムおよび／または原子座標データのためのさらなる用途ならびにそれをユーザーに提供するためのさらなる理由がある。「コンピューターシステム」とは本発明の原子座標を分析するために用いられるハードウェア手段、ソフトウェア手段およびデータ保存手段を意味する。本発明のコンピューターを用いるシステムのミニマム・ハードウェア手段は中央処理装置（ＣＰＵ）、入力手段、出力手段、およびデータ保存手段を含んでなることができる。望ましくは、構造データを可視化するためにモ���ターを提供するデータ保存手段はＲＡＭまたは本発明のコンピューター可読媒体にアクセスするためのその他の手段でよい。かかるシステムの実例はＳｉｌｉｃｏｎ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  ＩｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄおよびＳｕｎ  ＭｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓランニングＵｎｉｘベース、Ｗｉｎｄｏｗｓ  ＮＴまたはＩＢＭ  ＯＳ／２オペレーティング・システムから入手可能なマイクロコンピューター・ワークステーションでよい。
【０１２０】
本発明は、また：複合体からのＸ線結晶学回折データおよびＢＡＣＥまたはその少なくとも１つのサブドメインの３次元構造を用いて複合体の差フーリエ電子密度マップを作製すること；有利には、表５による原子座標データにより定義されるような３次元構造であること；を含んでなるＢＡＣＥの複合体および可能性のあるモデュレーターを分析する方法をも提供する。
【０１２１】
かかる複合体を結晶化することができ、そしてＸ線回折法を用いて、例えばＧｒｅｅｒら、Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７：１０３５−１０５４（１９９４）に記載される研究法に従って分析することができ、そして浸漬させたまたは共結晶化させたＢＡＣＥおよび解析された非複合ＢＡＣＥの構造のＸ線回折パターンに基づいて差フーリエ電子密度マップを算出することができる。次いでこれらのマップを用いて特定のモデュレーターがＢＡＣＥに結合するかおよび／またはＢＡＣＥのコンフォメーションを変化させるかどうか、およびどこでかを決定することができる。ＣＣＰ４コンピューターパッケージ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｐｒｏｊｅｃｔ、Ｎｏ．４  ＣＣＰ４スイート：タンパク質結晶学のためのプログラム、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  Ｄ５０：７６０−７６３（１９９４））のプログラムのごときプログラムを用いて電子密度マップを算出することができる。マップの可視化のために、モデル構築プログラム、例えば「ＱＵＡＮＴＡ」（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ、Ｊｏｎｅｓら、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  Ａ４７：１１０−１１９（１９９１））を用いることができる。
【０１２２】
表５はＯＭ９９−２と複合化したＢＡＣＥに関する原子座標データを提供し、そして独特な数字で各原子を列挙している；各アミノ酸残基における化学的エレメントおよびその位置、エレメントが位置するアミノ酸残基、チェーン識別子、残基の数、結晶学的な軸に関して各々の原子の原子位置（Å）を定義する座標（例えばＸ、Ｙ、Ｚ）、各々の位置での原子の占有、「Ｂ」、その原子中心の周りの原子の動きを説明する等方性置換パラメーター（Å２）、ならびに原子数。
【０１２３】
とりわけ、別の酵素、例えば類似の酵素と比較を行う場合、ＢＡＣＥの３Ｄ構造の決定によりＢＡＣＥの可能性のある（複数の）活性部位についての重要な情報が提供される。この情報を例えば（複数の）活性部位のための可能性のある結合リガンドを同定するコンピューターを用いる技術により、薬物設計のための連結フラグメント研究法を可能にすることにより、およびＸ線結晶学分析のごとき分析を用いて結合リガンドの同定および位置決定を可能にすることにより、ＢＡＣＥの合理的な設計に用いることができる。
【０１２４】
Ｇｒｅｅｒら（前記）はコンピューターモデリング、タンパク質−リガンド複合体形成、およびＸ線分析の反復配列に基づくリガンド設計の反復研究法に関する。チミジル酸シンターゼインヒビターはＧｒｅｅｒにより設計され；そしてＢＡＣＥインヒビターもまたこの方法で設計することができる。例えばＢＡＣＥのＧＲＩＤ（Ｐ．Ｇｏｏｄｆｏｒｄ、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２８：８４９−８５７（１９８５））または解析された３Ｄ構造を用いて、ＢＡＣＥの（複数の）活性部位の機能を補完する、可能性のあるＢＡＣＥのモデュレーターを設計することができる。可能性のあるモデュレーターを合成し、ＢＡＣＥと複合体を形成させることができ、そして次いで複合体を例えばＸ線結晶学、ＮＭＲまたはその組み合わせにより分析して結合化合物の実際の位置を同定することができる。
【０１２５】
複合体中の可能性のあるモデュレーター化合物の位置の決定により、それとＢＡＣＥとの相互作用の決定が可能になる。これにより当業者が、ＢＡＣＥに関する化合物の親和性および特性を分析し、そしてこれらの特性のいずれかまたは双方を増加または減少させる化合物への修飾を提起することが可能になる。従って、次に分析（例えばＸ線分析）、結果に鑑みて、必要なまたは望ましい場合、化合物の構造および／または官能基を調整し、そして望ましい化合物が得られるまで合成および分析配列を反復することができる。構造基盤の薬物設計のための関連する研究法は本明細書で引用した別の文献、およびＢｏｈａｃｅｋら、Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １６：３−５（１９９６）でも論じられている。
【０１２６】
ＢＡＣＥ  ３Ｄ構造の決定の結果として、合理的な薬物設計のためのより純粋なコンピューターにより技術を用いてＢＡＣＥモデュレーターを設計することもできる；例えば、標的レセプターの原子座標に関する正確な情報を必要とする自動化リガンド−レセプタードッキングプログラム（Ｊｏｎｅｓら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：６５２−６５６（１９９５）参照）を用いてＢＡＣＥモデュレーターまたはインヒビターを設計または同定することができる。
【０１２７】
薬物設計のための連結フラグメント研究法もまた標的の原子座標に関する正確な情報を必要とする。それ自体はモデュレーター化合物でない、ＢＡＣＥの領域に結合する可能性を有する小型化合物を化学結合により会合させて可能性のあるモデュレーターを提供することができる。従って、これらの研究法の元にある基本的な構想は１つ以上の、例えば複数のまたは多くのリガンドの標的分子への結合位置を決定し、次いでその相対的結合位置が保存されるように、リガンドを一緒に結び付ける分子足場を構築することである。コンピューターを用いてリガンドを提供し、そしてコンピューターシステムにおいてモデル化するか、または実験設定で提供することができ、その場合、本発明による結晶が提供され、そして分析、例えばＸ線分析、およびその位置決定の前に、別個にまたは混合プールで浸漬された１つ以上の、例えば複数のまたは多くのリガンドが結晶に提供される。
【０１２８】
２つまたはそれ以上のリガンドの結合部位を決定し、そして例えばＧｒｅｅｒらの反復技術によりこのように結び付けられてさらに絞り込むことができる可能性のあるリード化合物を形成できる。仮想の連結フラグメント研究法に関してはＶｅｒｌｉｎｄｅら、Ｊ．ｏｆ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｉｄｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｓｉｇｎ  ６：１３１−１４７（１９９２）ならびにＸ線研究法に関しては、Ｓｋｕｋｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：１５３１−１５３４（１９９６）およびＳｔｏｕｔら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ６：８３９−８４８（１９９８）参照。ＢＡＣＥモデュレーターを設計および／または同定するためのこれらのまたはその他の研究法の使用（例えば本明細書に引用した特許文献、例えば前記の背景のセクションを参照）はＢＡＣＥ構造の決定により可能になる。
【０１２９】
本明細書で記載した構造基盤の多くの技術および研究法はＸ線研究法を用いてタンパク質との複合体における可能性のあるモデュレーターの結合位置を同定する。これを行う一般的な方法は複合体でＸ線結晶学を実施し、差フーリエ電子密度マップを作製し、そして電子密度の特定のパターンを可能性のあるモデュレーターと関係付けることである。しかしながら、マップを作製するために（Ｂｌｕｎｄｅｒら（前記）参照）、前もってタンパク質の３Ｄ構造（または少なくともタンパク質構造因子）を知ることが重要である。従って、ＢＡＣＥ構造の決定もまた、ＢＡＣＥと可能性のあるモデュレーターとの複合体の差フーリエ電子密度マップの作製を可能にし、これは合理的な化合物および／または薬物の設計または同定の過程において大きな補助となり得る。
【０１３０】
本明細書で記載する構造基盤の薬物設計もしくは化合物設計または同定のための研究法は、標的分子（この場合ＢＡＣＥ）との相互作用する可能性のある化合物を最初に同定することを含む。しばしばこれらの化合物は研究文献から公知である。しかしながら、これらが公知でない場合、または新規化合物を欲している場合、薬物または化合物設計または同定プログラムの最初の段階は、標的生体分子（この場合ＢＡＣＥ）の１つまたは複数の活性部位と相互作用する化合物を同定する目的で、化合物データベース（例えばＣａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅ）のコンピューター基盤のインシリコ・スクリーニングを含むことができる。スクリーニング選択基準は薬物動態特性、例えば代謝安定性および毒性に基づいてよい。しかしながら、ＢＡＣＥ構造の決定により、各ＢＡＣＥ活性部位の構造および化学的特性を同定することが可能になり、これにより今度は可能性のあるインヒビターに関する記述子の幾何学的および機能的制約を誘導することが可能になる。従って記述子は仮想３Ｄファルマコフォアの型でよく、これをデータベーススクリーニングに関する選択基準またはフィルターとして用いることもできる。
【０１３１】
本発明を用いて選択されたキメラ構造を有する化合物（ここで該化合物はＢＡＣＥモデュレーターまたはインヒビターである）は本発明のさらなる実施形態を為し；そしてかかる化合物を、例えばＢＡＣＥまたはＡβもしくはそのフラグメントの生成を阻止するか、またはＡＤまたはＢＡＣＥまたはＡβもしくはそのフラグメントの生成に関与するその他の疾病を処置するために、医学的処置の方法において使用することができる。ＢＡＣＥまたはＡβもしくはそのフラグメントの生成を阻止するか、またはＡＤまたはＢＡＣＥまたはＡβもしくはそのフラグメントの生成に関与するその他の疾病を処置するために、化合物を単独でまたはその他の処置と組み合わせて用いることができ；そしてかかる処置のための組み合わせ医薬品の調製において、または化合物およびその他の処置を含むキットにおいて化合物を用いることができる。
【０１３２】
さらに具体的にＢＡＣＥを参照すると、ＢＡＣＥはＮ末端触媒性ドメイン、膜貫通性ドメイン、および小型細胞質性ドメインからなる成熟酵素である、ペプシン様アスパルチルプロテイナーゼである。ＢＡＣＥはｐＨ４．５（Ｖａｓｓａｒら、１９９９）またはｐＨ５．０（Ｙａｎら、１９９９）で最適な活性を有し、そして酸性の細胞成分、例えばゴルジおよびエンドソームで見出される（Ｖａｓｓａｒら、１９９９およびＣａｐｅｌｌら、２０００）。ＢＡＣＥが現れて機能するエンドソームおよびトランスゴルジネットワークのｐＨはｐＨ４．５から６．０の範囲で変動し、平均ｐＨは５．０（Ｌｅｅら、１９９６）およびｐＨ５．４（Ｏｖｅｒｌｙら、１９９５）と記載されている。ＢＡＣＥは標準的なペプシンインヒビター、例えばペプスタチンでは阻止されない。触媒性ドメインマイナス膜貫通性および細胞質性ドメインが基質ペプチドに対する活性を有していることが示されている（Ｌｉｎら、２０００）。結果的には、この可溶性触媒性ドメインは結晶化研究に適しており、そしてこの結晶構造はインヒビター分子の設計のためのＢＡＣＥ活性部位の代表的な構造を提供する。理想的には、占有されていない活性部位を伴うＢＡＣＥの形態を結晶化するのが望ましい。これを用いて酵素の小型分子インヒビターに浸漬させ、そしてその結合様式を調査することができる。インヒビターの存在下および不在下の双方で成長させたＢＡＣＥの結晶は同一の空間群および類似のユニットセルパラメーターを有していると記載されている。これらの結晶をｐＨ５．６および５．８の間で、従ってＢＡＣＥの生物学的に適切なｐＨで成長させる。これはまた酵素の最適ｐＨにも近い。Ｃ２結晶形態をリガンドと浸漬させた場合、結晶中でいくつかの分子の再構築を生じ、その結果Ｃ２からＰ２１への空間群変化に至る。Ｐ２１形態のセル寸法およびパッキングＣ２形態のものと密接に関連している。ＢＡＣＥ結晶を生理学的に適切なｐＨで成長させるので、本発明に従って同定された化合物はさらに生物学的に適切である。作製されたリード化合物／インヒビターは治療価値が高く、そして実際に、とりわけ、プロトン化状態の変化に感受性があるこれらの化合物に関して、インビボでの阻止様式を反映する。
【０１３３】
ＢＡＣＥのプロおよびアスパルチルプロテアーゼドメインをコードする合成遺伝子を構築した（実施例１参照）。構築物はＴｈｒ２２からＳｅｒ４５３にわたる（番号付けは全長ＢＡＣＥ配列、例えばジェンバンク受け入れ番号Ｐ５６８１７、配列番号：６を参考にしている）。４つの可能性のあるグリコシル化部位（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ：アスパラギン−１５３、−１７２、−２２３および−３５４）の各々ではアスパラギン残基はグルタミンに変異させて、タンパク質のグリコシル化を防御した。サイレント変異をもコード化配列に導入して遺伝子のＧＣ含量を低減させた（図１Ａは本発明の合成ＤＮＡ配列とその他の野生型ＢＡＣＥ遺伝子とのアラインメントを示す）。Ｈｉｓ６ペプチドタグをタンパク質配列のＣ末端に付加してニッケル・アガロース上での精製を促進させた（実施例１参照）。
【０１３４】
タンパク質の双方の形態を、抗Ｈｉｓ６抗体を用いて検出することができる（図５参照）；プロペプチドを含有する、プロセシングされていない形態のみが抗ＦＬＡＧ抗体を用いて検出された。合成ＢＡＣＥ触媒性ドメイン配列に対するさらなる変化は、ＢＡＣＥシグナルの代わりにバキュロウイルスｇｐ６７シグナル配列の付加、プロペプチドのＮ末端へのＦＬＡＧタグの付加であった。ｇｐ６７シグナル配列はタンパク質の細胞培養培地への分泌を増加させ、そしてＦＬＡＧタグを付加して不完全なプロペプチド切断から生じる種間の区別（および分離が必要であるかどうかを決定すること）を可能にした（図６参照）。ＢＡＣＥバキュロウイルスで感染した昆虫細胞はプロセシングされたＢＡＣＥおよびプロセシングされていないＢＡＣＥの混合物を培養培地に分泌した。図２Ａは合成ＢＡＣＥ遺伝子によりコードされるポリペプチド配列を示す。
【０１３５】
前記したように、本発明は、本発明のＢＡＣＥタンパク質のインヒビター、例えばＢＡＣＥに、有利には非可逆的に結合して、好ましくはＡＤおよびその他の疾病に関する治療効果を有する化合物、組成物もしくは活性物質または成分を決定するためのアッセイまたは方法における本発明のＢＡＣＥタンパク質の使用を含む。ＢＡＣＥに結合する適当な化合物、組成物、活性物質または成分を決定した後、次いで化合物、組成物、活性物質または成分を投与用の組成物に処方し、そしてそれを必要とする対象に投与する。これらの治療薬を公知の処方で、公知の投与経路により、本明細書に引用する文献の教示に従って投与することができる。
【０１３６】
これらの治療薬は化学的な化合物ならびに／または抗体および／もしくはその部分または医薬的に許容される塩でよく、そして単独でまたは活性成分として医薬的に許容される担体、希釈剤およびベヒクル、ならびにその他の活性成分と組み合わせて投与することができる。
【０１３７】
化合物を経口、皮下または、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、および鼻内投与、ならびにくも膜下腔内および注入技術などの非経口的に投与することができる。
【０１３８】
人は一般にマウスまたはその他の実験動物よりも長期間処置され、そして処置の期間は疾患の経過期間および薬物の有効性に応じることは留意される。用量を１回投与用量または数日間にわたる複数回投与用量にできるが、１回投与用量が好ましい。従って、この開示および本明細書に引用した文献の技術および技術分野の知識により、過度な実験を行うことなく、動物実験、例えばラット、マウス等からヒトにまで増量させることができる。
【０１３９】
一般に処置の期間は疾患の経過期間および薬物の有効性および処置される患者に応じる。
【０１４０】
本発明の治療薬を非経口的に投与する場合、一般に注射用単位投与形態（溶液、懸濁液、乳濁液）に処方する。注射に適した医薬用処方には滅菌水溶液または分散液および注射用溶液または分散液に再構成するための滅菌粉末などがある。担体は例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、適当なその混合物および植物油を含有する溶媒または分散培地でよい。
【０１４１】
例えばコーティング、例えばレシチンの使用により、分散液の場合必要とされる粒子径を維持することにより、および界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持することができる。綿実油、ゴマ油、オリーブ油、大豆油、コーン油、ヒマワリ油または落花生油およびエステル、例えばイソプロピル・ミリステートのごとき非水性ベヒクルを化合物組成物のための溶媒系として使用することができる。
【０１４２】
さらに、抗微生物保存剤、抗酸化剤、キレート化剤およびバッファーなどの、組成物の安定性、滅菌性および等張性を増強する種々の添加剤を添加することができる。種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等により微生物の作用の防御を確実にすることができる。多くの場合、等張剤、例えば糖、塩化ナトリウム等を含むのが望ましい。吸収を遅延させる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用により注射用医薬形態の吸収を延長させることができる。しかしながら本発明に従って用いるいずれのベヒクル、希釈剤または添加剤も化合物と適合しなければならない。
【０１４３】
本発明を実施するのに利用する化合物を必要量の適当な溶媒中に、望む場合種々の量のその他の成分と共に組み込むことにより、滅菌注射用溶液を調製することができる。
【０１４４】
例えば治療用化合物を含んでなる本発明の薬理学的処方をいずれかの適合する担体、例えば種々ベヒクル、補助剤、添加剤、および希釈剤を含有する注射用処方で患者に投与することができるか；または本発明で利用する化合物を徐放性皮下移植片または標的分配系、例えばモノクローナル抗体、イオントフォレーシス、重合体マトリックス、リポソーム、およびマイクロスフェアの形態で患者に非経口的に投与することができる。
【０１４５】
本発明で利用する化合物の薬理学的処方を患者に経口的に投与することができる。慣用される方法、例えば化合物を錠剤、懸濁液、溶液、乳濁液、カプセル、粉末、シロップ等での化合物の投与が用いられる。化合物を経口的にまたは静脈内に分配し、そして生物学的活性を保持する公知の技術が好ましい。
【０１４６】
１つの実施形態では、本発明の処方を最初に投与し、その後さらに投与することにより維持することができる。例えば、本発明の処方を１つの型の組成物で投与し、そしてその後異なるかまたは同一の型の組成物でさらに投与することができる。例えば、本発明の処方を静脈内注射により投与して、血液レベルを適当なレベルにすることができる。次いで経口投与形態により患者のレベルを維持するが、患者の症状に依存して、その他の形態の投与を用いることもできる。
【０１４７】
投与する量は処置される患者で変化し、そして１日あたり１００ｎｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重に変化し、そして好ましくは１日あたり１０ｐｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ体重に変化する。例えば、この開示および技術分野の知識から当業者が投与量を容易に確認することができる。従って、当業者は組成物中のおよび本発明の方法で投与される化合物および最適な添加剤、ベヒクルおよび／または担体の量を容易に決定することができる。典型的には、補助剤または添加剤は一般にリン酸塩緩衝生理食塩水中０．００１から５０重量％溶液として用いられ、そして活性成分はマイクログラムからミリグラムのオーダーで、例えば約０．０００１から約５重量％、好ましくは約０．０００１から約１重量％、最も好ましくは約０．０００１から約０．０５重量％または約０．００１から約２０重量％、好ましくは約０．０１から約１０重量％、そして最も好ましくは約０．０５から約５重量％で存在する。もちろん、動物またはヒトに投与されるいずれかの組成物に関して、およびいずれかの特定の投与方法に関して；例えば適当な動物モデル、例えばげっ歯類、例えばマウスにおける致死量（ＬＤ）およびＬＤ５０を決定することにより毒性を；ならびに例えば血清の力価およびその分析により、適当な応答を引き出す（複数の）組成物の投与量、それの成分の濃度および（複数の）組成物を投与する時期；を決定するのが従って好ましい。かかる決定は当業者の知識、本開示および本明細書に引用した文献から過度な実験を必要としない。そして、逐次投与する時期は過度な実験なしに確認することができる。
【０１４８】
本発明治療薬を含んでなる組成物の実例には、開口部、例えば口、鼻、肛門、膣、口、胃内、粘膜（例えば経舌、歯槽、歯肉、嗅または呼吸粘膜）等、投与例えば懸濁液、シロップまたはエリキシル；および非経口、皮下、皮内、筋肉内または静脈内投与（例えば注射による投与）のための液体調製物、例えば滅菌懸濁液または乳濁液などがある。かかる組成物は適当な担体、希釈剤または賦形剤、例えば滅菌水、生理学的食塩水、グルコース等との混合物でよい。組成物を凍結乾燥することもできる。組成物は投与経路および望ましい調製物に依存して、補助的な物質、例えば湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、ゲル化または増粘添加剤、保存剤、着香剤、色素等を含有できる。過度な実験を行わずに適当な調製物を調製するために標準的な参考書、例えば「ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥ」第１７版（１９８５）（出展明示により本明細書の一部とする）を調べることができる。
【０１４９】
本発明の組成物は便宜的には液体調製物として、選択したｐＨまで緩衝化することができる例えば等張水溶液、懸濁液、乳濁液、または粘性の組成物として提供される。消化管吸収が好ましい場合、本発明の組成物を持続放出性であるかまたは液体充填物を有する、例えば腸への分配のために胃で溶解するゼラチンでカバーされた液体などの「固体」調製物を含む、丸剤、錠剤、カプセル、カプレット等の「固体」形態でよい。鼻または呼吸（粘膜）投与が望ましい場合、組成物を圧縮スプレー、ポンプディスペンサーまたはエアロゾルディスペンサーの形態でよく、そしてこれにより投薬することができる。エアロゾルは通常炭化水素により加圧されている。ポンプディスペンサーは好ましくは測定された用量か、または特定の粒子径を有する用量で投薬できる。
【０１５０】
本発明の組成物は、とりわけ、経口投与する場合、医薬的に許容される着香剤および／またはより目立つようにするための色素を含むことができる。粘性組成物はゲル、ローション、軟膏、クリーム等の形態でよく（例えば経皮投与）、そして典型的には粘性が約２５００から６５００ｃｐｓまでであるように十分量の増粘剤を含有するが、１００００ｃｐｓまでのさらなる粘性組成物を用いることができる。粘性組成物は、その範囲を超えると投与が困難になるので、好ましくは２５０００から５０００ｃｐｓまでの粘性を有する。しかしながら、その範囲を超えると組成物は固体またはゼラチン形態に近づくことができ、次いでこれは経口摂取用の嚥下丸剤として容易に投与される。
【０１５１】
液調製物は通常ゲル、その他の粘性組成物および固体組成物よりも容易に調製される。
加えて、液体調製物はとりわけ、注射または経口により、幾分かさらに便利に投与される。一方粘性組成物を適切な粘性範囲内で処方して、より長時間粘膜、例えば胃または鼻粘膜の裏層と接触させることができる。
【０１５２】
明らかに、適当な担体およびその他の添加剤の選択は実際の投与経路および特定の投与形態、例えば液体投与形態（例えば組成物が溶液、懸濁液、ゲルまたは別の液体形態に処方されることになっているかどうか）、または固体投与形態（例えば組成物が丸剤、錠剤、カプセル、カプレット、徐放形態または液体充填形態に処方されることになっているかどうか）の特性に依存する。
【０１５３】
溶液、懸濁液およびゲルは通常活性化合物に加えて多量の水（好ましくは精製水）を含有する。少量のその他の成分、例えばｐＨ調整剤（例えばＮａＯＨのごとき塩）、乳化剤、または分散化剤、緩衝化剤、保存剤、湿潤剤、ゼリー化剤（例えばメチルセルロース）、色素および／または着香剤もまた存在させてよい。組成物は等張でよい、すなわち血液および流涙液と同一の浸透圧を有することができる。
【０１５４】
本発明の組成物の望ましい等張性を塩化ナトリウム、またはその他の医薬的に許容される作用物質、例えばデキストロース、ホウ酸、酒石酸ナトリウム、プロピレングリコールまたはその他の無機もしくは有機溶質を用いて達成することができる。とりわけ、ナトリウムイオンを含有するバッファーには塩化ナトリウムが好ましい。
【０１５５】
医薬的に許容される増粘剤を用いて組成物の粘性を選択されたレベルで維持することができる。メチルセルロースが、容易におよび経済的に入手でき、そして一緒に作業し易いので好ましい。その他の適当な増粘剤には、例えば、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボマー等がある。増粘剤の好ましい濃度は選択される作用物質に依存する。重要な点は選択された粘性を達成する量を使用するということである。粘性組成物は通常かかる増粘剤の添加により溶液から調製される。
【０１５６】
医薬的に許容される保存剤を用いて組成物の有効期限を延ばすことができる。ベンジルアルコールが適当であるが、種々の保存剤、例えばパラベン、チメロサール、クロロブタノール、または塩化ベンザルコニウムなどを用いることもできる。保存剤の適当な濃度は全重量に基づいて０．０２％から２％であるが、選択された作用物質に依存して感知できる変化はあり得る。
【０１５７】
組成物の構成要素が活性化合物に関して化学的に不活性であるように選択されるべきであることは当業者に認識されよう。これは化学的および製薬的な原理において当業者にとって全く問題ではないか、または標準的な参考書を参照することにより、もしくは単純な実験により（過度な実験を含まない）本開示および本明細書に引用された文献から容易に問題を回避することができる。
【０１５８】
一般的に認められている手順に従って成分を混合することにより本発明の組成物を調製する。例えば選択された構成要素を単純にブレンダーで混合できるか、または次いで水または増粘剤および、ことによるとｐＨを調節するためにバッファーもしくは張力を調節するためにさらなる溶質を添加することにより、最終濃度および粘性に調整することができる濃縮混合物を生成するためのその他の標準的な装置で混合できるか。概してｐＨは約３から７．５でよい。組成物を投与形態でならびに医学および獣医学の分野で当業者に公知の技術により、年齢、性別、体重および特定の患者の症状、および投与お用いられる組成物形態（例えば固体対液体）のごとき因子を考慮に入れて投与することができる。ひとまたはその他の哺乳動物のための投与形態を過度な実験を行うことなく、当業者により、本開示、本明細書に引用された文献および技術分野の知識から決定することができる。
【０１５９】
最初の投与およびさらなる投与、または最初の投与の後に逐次投与を続けることを含む逐次投与のための適当な投与計画もまた変更可能であるが、それにもかかわらず、本開示、本明細書に引用された文献および技術分野の知識により確認することができる。
【０１６０】
従って、さらなる実施形態では本発明は、ＢＡＣＥを結合および／または阻止する化合物を確認するための本明細書の発明の方法から活性物質、成分または化合物またはＢＡＣＥインヒビターを含む治療用組成物を調製物するための方法、ならびにＢＡＣＥまたはＡβもしくはそのフラグメントの生成を阻止するかまたはＡＤもしくはその他の疾病を処置するための方法を含む。
【０１６１】
さらに、本明細書で論じるように、本発明のＢＡＣＥタンパク質は、それ自体アッセイおよび治療において有用である抗体の作製に有用である。本明細書に引用した文献から、抗ＢＡＣＥ抗体を容易に作製および使用することができ、そしてモノクローナル抗体を生成するための方法は当業者に公知であり、例えば米国特許第４１９６２６５号および第６２２１６４５号を参照。従って、本発明のＢＡＣＥタンパク質を用いて抗体を作製することができ、そして過度な実験を行うことなく抗体を使用することができる。
【０１６２】
ここで、以下の説明のために提供した非限定的な実施例により本発明をさらに説明する。
【実施例】
【０１６３】
実施例１：昆虫細胞におけるＢＡＣＥの生成
Ａ．遺伝子構築およびクローニング
オリゴヌクレオチド合成およびオーバーラップＰＣＲ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｅｉｎｃｅ  Ｌｔｄ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国）の組み合わせにより合成ＢＡＣＥ触媒性ドメイン配列を構築した。遺伝子のＧＣ含量を低減させるために合成中にＢＡＣＥ触媒性ドメイン配列内の特定の部位で変異を挿入した。次いで合成遺伝子を制限酵素Ｓａｌ１およびＮｏｔ１で切断して１４８９ｂｐのフラグメントを作製し、次いでこれを発現ベクターｐＦａｓｔＢａｃ１（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にサブクローン化し、そして標準的なＤＮＡシークエンシング法（例えばインサートの電気泳動および自動ＤＮＡ配列分析）によりＤＮＡ配列を確認した。
【０１６４】
ヒトフリンをコードするｃＤＮＡを制限酵素で切断して３２１６ｂｐのＳｍａ１  Ｘｍａ１フラグメントを作製し、次いでこれを発現ベクターｐＦａｓｔＢａｃ  Ｄｕａｌ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にサブクローン化した。
【０１６５】
Ｂ．バキュロウイルス作製および発酵
Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（商標）系（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、製造者の指示書に従って組換えバキュロウイルスを構築した。標準的なプロトコル（ＫｉｎｇおよびＰｏｓｓｅｅ（１９９２））に従って昆虫細胞およびバキュロウイルスに関わる操作を実施した。
【０１６６】
昆虫細胞においてプロホルモンコンバターゼ・フリンの発現は変異ＴＧＦ−βの発現を増加させることが示されている（Ｌａｐｒｉｓｅら、１９９８）のでフリンの同時発現のＢＡＣＥ生成に及ぼす影響を評価した、すなわち生成されたＢＡＣＥの全量はフリンの同時発現により増加しなかったが、プロセシングされたタンパク質の分画において全ＢＡＣＥの約３０％から約６０％までの再現性のある増加があった；この結果は全く驚くべきものであり、そして有利である。
【０１６７】
Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ  ＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｒｌｓｂａｄ、米国）はＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  Ｓｆ９細胞よりも高レベルのＢＡＣＥ発現が得られることが見出され、そしてこれを全てのタンパク質生成に使用した。Ｅｘｃｅｌｌ４０５培地（ＪＲＨ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有する２０から３０リットルの作業容量のバイオリアクター（Ａｐｐｌｉｋｏｎ  Ｄｅｐｅｎｄａｂｌｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓｃｈｉｅｄａｍ、オランダ）でタンパク質生成を実施した。各ウイルスの多重度感染（ＭＯＩ）０．１で、細胞密度１．５ｘ１０６セル／ｍｌで細胞を感染させた。発酵中にグルコース濃度を測定し、そして出発濃度を維持するように調整した。ウイルス感染の３日後、連続フロー遠心によりＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞を培地から除去し、そして超遠心により培地をおよそ３０倍濃縮した。
【０１６８】
Ｃ．ＢＡＣＥの精製
発現されたＢＡＣＥタンパク質を親和性クロマトグラフィーによりニッケル・アガロース樹脂上で精製した。最初に、発現されたＢＡＣＥタンパク質を含有する濃縮した培地を５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ８．０、５０ｍＭ  酢酸ナトリウム、３００ｍＭ  ＮａＣｌおよびＮｉ−ＮＴＡアガロース樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）１０ｍｌに対して透析し、そして前記バッファーで平衡にした。イミダゾール（Ｓｉｇｍａ）を添加して最終濃度５ｍＭにし、Ｐｅｆａｂｌｏｃ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｌｅｗｅｓ、英国）を０．１ｇ／ｌまで加え、そしてサンプルを４℃で一晩混合した。次いでニッケル・アガロース樹脂を空のカラムに充填し、そして５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌで、２８０ｎｍでの吸収が前記したバッファーの基底値に達するまで洗浄した。次いでカラムを４カラム容量の５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  イミダゾールで洗浄した。次いで５カラム容量の大きさで、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌから５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３００ｍＭ  イミダゾールまでの、直線イミダゾール濃度グラジエントでＢＡＣＥタンパク質を溶出し、典型的にはＢＡＣＥタンパク質およびその他の同時精製された夾雑タンパク質に相当する２８０ｎｍでの吸収ピークが得られた。
【０１６９】
ニッケル・クロマトグラフィーの後、ＢＡＣＥタンパク質をアニオン交換クロマトグラフィーにより精製し、セファクリルＳ−２００  ２００ｍｌを含有するＸＫ−５０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）でピークを含むＢＡＣＥタンパク質に相当する分画を２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．１、５ｍＭ  ＮａＣｌ（アニオン負荷バッファー）にバッファー交換し、そして次にＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑアニオン交換カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に負荷した。３５カラム容量の、１００％  負荷バッファーから１００％  溶出バッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．１、４００ｍＭ  ＮａＣｌ）までの直線塩グラジエントでタンパク質を溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析に基づいて分画をプールした。
【０１７０】
プールした分画をＨＩＣ負荷バッファー：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．１、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．９Ｎ  （ＮＨ４）２ＳＯ４に対して透析した。次いで最終サンプルをＨＩＣ負荷バッファーで平衡にしたＨＩＣカラム（Ｓｏｕｒｃｅ  ＰＨＥ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に負荷し、そして安定した基底値になるまで負荷バッファーで洗浄した。タンパク質溶解活性により作製された、ＢＡＣＥの差次的にプロセシングされた形態を、負荷バッファーから５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．１、５０ｍＭ  ＮａＣｌまでの、３５カラム容量のグラジエントを用いて別個のピークとして溶出した。
【０１７１】
ＢＡＣＥタンパク質の必要とされる形態を含有するピーク分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析に基づいてプールし、そして５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴに対して透析した。
【０１７２】
透析されたサンプルを１２ｍｌ容量まで濃縮し、そして５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴで予め平衡にしたセファクリルＳ−２００カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に直ぐに負荷し、溶出した後４℃で保存した。
【０１７３】
精製されたＢＡＣＥを、単量体タンパク質に予測される位置でサイズ排除カラムから溶出し、そして動的光散乱に供した場合、単分散性であった。異なるカラム工程の後の代表的なサンプルを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥを図５に示す。
【０１７４】
実施例２：ＢＡＣＥの結晶化
Ａ．結晶化
ハンギングドロップ蒸気拡散法によりＢＡＣＥの結晶を成長させ、この方法ではタンパク質溶液１μｌおよびウェル溶液（１００ｍＭ  クエン酸三ナトリウム、ｐＨ８．５、２００ｍＭ  ヨウ化アンモニウム、および１８−２０％  ＰＥＧモノメチルエーテル、５Ｋ）１μｌをカバースリップに載せ、そしてウェル溶液１ｍｌで２０℃で平衡にした。タンパク質濃度は５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ中５ｍｇ／ｍｌであった。２日後に小型のプリズム結晶が現れ、そして２週間後に最大サイズ０．２ｍｍｘ０．１ｍｍｘ０．１ｍｍまで成長させた。（図３ＡおよびＢ）。
【０１７５】
ＯＭ９９−２で複合化したＢＡＣＥの結晶（Ｇｈｏｓｈら、２０００）を類似の方法で成長させた。ＢＡＣＥを０．２ｍｇ／ｍｌの濃度で、過剰のインヒビターと共に混合し、そして４℃で１時間保持した。次いで１００００の分子量カットオフを有するセントリコンカラムを用いてＢＡＣＥタンパク質を５ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、そして前記のように結晶化用小滴を準備した。２日後に非複合化酵素と同一の形態学を有する結晶が現れ、そして最大サイズ０．２５ｍｍｘ０．１ｍｍｘ０．１ｍｍまで成長させた。
【０１７６】
インヒビターを伴わないＢＡＣＥおよびＯＭ９９−２の存在下でのＢＡＣＥの双方が空間群Ｃ２に属する結晶を形成した。ＰＭ９９−２の存在下で成長させた結晶に関するセル寸法（図３Ａ）はａ＝２３６．６３Å、ｂ＝１０５．０２Å、ｃ＝６２．５９Åおよびβ＝１０１．３２°であり、結晶の非対称性ユニットはＢＡＣＥの３つのコピーを含有した。インヒビターの不在下で成長させた結晶に関するセル寸法（図３Ｂ）はａ＝２３８．３Å、ｂ＝１０７．４Å、ｃ＝６０．４Å、ｂ＝１０１．８９°であった。
【０１７７】
アポ浸漬結晶実験：前記したようにインヒビターの不在下で成長させたＢＡＣＥの結晶インヒビターの溶液に１時間浸漬した。インヒビターを予めＤＭＳＯに溶解して１０ｍＭの濃度にし、そして次に前記したようにウェル溶液１０中１で希釈した。これを２０μｌマイクロブリッジに置き、そしてアポＢＡＣＥ結晶をそれに加えた。マイクロブリッジを密封し、そして３．５時間インキュベートした。
【０１７８】
Ｂ．データ収集および処理
ＯＭ９９−２との複合体としてのＢＡＣＥの構造を分子置換の方法を用いて２．６Åまで解析した。適当な抗凍結剤を含有する溶液中で凍結させた結晶に関して１００Ｋでデータを収集した。抗凍結剤溶液は１００ｍＭ  クエン酸三ナトリウム、ｐＨ５．８、２００ｍＭ  ヨウ化アンモニウム、１５％  ＰＥＧ  モノメチルエーテル  ５Ｋ、および２０％  ＰＥＧ４００から成る。結晶を抗凍結剤溶液に３０秒間浸した後、保存目的で液体窒素で凍結させた。Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ＦａｃｉｌｉｔｙでＭＡＲＣＣＤ検出器を用いて、０．９３４Ａの波長でビームラインＩＤ１４−２で、２．６Åまでデータを収集し、そしてＤ＊ｔｒｅｋ（Ｐｆｌｕｇｒａｔｈ，Ｊ．，１９９９）を用いて処理した。ＳＣＡＬＡを用いてデータセットを縮尺し、そしてＴＲＵＮＣＡＴＥを用いてプログラムのＣＣＰ４  スイートから強度を構造因子に変換した（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｐｒｏｊｅｃｔ、１９９４）。処理したデータに関する統計値を表１に列挙する。
【０１７９】
【表１】
2005503144.tif 000002
【０１８０】
この表はＢＡＣＥ／ＯＭ９９−２複合体の構造を解析するために用いた実験データの品質が良好であり、そしてそこから信頼性の高い構造を誘導できるほどに十分に完全であった。
【０１８１】
アポ結晶実験：次いで浸漬した結晶を除去し、前記したのと同一の割合でＤＭＳＯ中インヒビターと混合した抗凍結剤を含有する溶液（１００ｍＭ  クエン酸三ナトリウム、ｐＨ５．８、２００ｍＭ  ヨウ化アンモニウム、１５％  ＰＥＧ  モノメチルエーテル  ５Ｋ、および２０％  ＰＥＧ４００）に浸した。次いでＯＭ９９−２結晶に関して、結晶を凍結させ、そしてデータを収集した。ＡＤＳＣ検出器を用いてＥＳＲＦで、ステーションＩＤ１４−１にデータを収集した。
【０１８２】
Ｃ．構造決定および微調整
ＡＭＯＲＥプログラム（Ｎａｖａｚａ、１９９４）を用いて分子置換によりＢＡＣＥ／ＯＭ９９−２複合体の構造を解析した。分子置換解析はＡＭＯＲＥを直接適用したものではなかった。むしろ、これはＣＣＰ４、プログラムＰＯＬＡＲＲＦＮおよびＲＦＣＯＲＲの使用、ならびに、例えばこの組み合わせをそのように使用する、および、とりわけ、ＲＦＣＯＲＲをそのように使用する発明努力に関係した（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｐｒｏｊｅｃｔ、１９９４）。検索モデルはｐｄｂデータベース（１ＦＫＮ．ｐｄｆ）から取った１ＦＫＮの鎖（Ｈｏｎｇら、２０００）であった；検索範囲３５Åおよび解像度範囲８．０から３．０Åを用いてＲ因子０．３８および相関係数０．７１４の解析が得られた。この解析を、これもまたプログラムのＣＣＰ４スイートのプログラムＲＥＦＭＡＣ５を用いる微調整のための出発点として用いた（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｐｒｏｊｅｃｔ、１９９４）。最初のモデルではインヒビターであるＯＭ９９−２は不在であり、そしてＢＡＣＥの３つのコピー全ての活性部位で納得のいく電子密度が差フーリエマップで観察された。これにより分子置換への解析が正確であることが確認された。構造の微調整のサイクルを、ＱＵＡＮＴＡを用いるモデルの手動の復元に変更した（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州（１９９４）：分子シミュレーション）。分子のＮ末端およびＣ末端を復元し、アスパラギン残基１５３、１７２、２２３および３５４をグルタミン残基としてリモデリングした。インヒビター分子はＱＵＡＮＴＡを用いて電子密度に構築し（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州（１９９４）：分子シミュレーション）、そして最終的にはＤｅｎＩｎｔ（Ａｓｔｅｘ  インターナル・ソフトウェア・ライブラリー）を用いて水分子を付加した。微調整統計値を表２Ａに示す。
【０１８３】
インヒビターに浸漬したアポ結晶をＤ＊Ｔｒｅｋ（Ｐｆｌｕｇｒａｔｈ，Ｊ．、１９９９）を用いて処理し、そしてＴＲＵＮＣＡＴＥを用いてプログラムのＣＣＰ４  スイートから強度を構造因子に変換した（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｐｒｏｊｅｃｔ、１９９４）。
【０１８４】
これらの結晶の空間群はアポ形態（空間群Ｃ２）からセル寸法（図３Ａ）はａ＝６２．８Å、ｂ＝１０６．８Å、ｃ＝２２７．９Åおよびβ＝９３．６３°であるＰ２１に変化した。統計値を以下の表２Ｂに示す。
【０１８５】
浸漬したＢＡＣＥ／インヒビター複合体の構造をプログラムＡＭＯＲＥ（Ｎａｖａｚａ、１９９４）を用いて分子置換により解析した。検索モデルはＢＡＣＥ／ＯＭ９９−２構造からの単量体であった。検索範囲３５Åおよび解像度範囲１２から４Åを用いてＲ因子０．４２１および相関係数０．６３８の解析が得られた。この解析をプログラムＣＮＸ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州、１９９９：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ）およびＢＵＳＴＥＲ（Ｂｒｉｃｏｇｎｅ、ＡｃｔａＣｒｙｓｔ．Ｄ４９：３７−６０（１９９３））を用いる微調整のための出発点として用いた。最終微調整の統計値を以下の表２Ｃに示す。
【０１８６】
【表２Ａ】
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【０１８７】
このデータは最終構造の品質が良好であることを示しており、Ｒ因子は微調整したモデルが実験データとよく合致することを示している。理想値からのＲＭＳ偏差はモデルの幾何学が良好であり、前記のデータに合致することを示している。
【０１８８】
【表２Ｂ】
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【０１８９】
統計値は空間群がアポＢＡＣＥ（空間群Ｃ２）からセル寸法（図３Ａ）はａ＝６２．８、ｂ＝１０６．８Å、ｃ＝２２７．９Åおよびβ＝９３．６３°であるＰ２１に変化したことを示している。
【０１９０】
【表２Ｃ】
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【０１９１】
結果および考察
ＢＡＣＥ／ＯＭ９９−２のＣ２結晶構造の最終モデルは３つのタンパク質分子の１１６１残基を含有し、ＯＭ９９−２の３つのコピーおよび１８３は水分子を要求し、Ｒ因子０．２３１および遊離のＲ因子０．３１２であった。非対称ユニットはＢＡＣＥ分子の３つのコピー（図４ＡおよびＢ）、Ａ、ＢおよびＣを含有し、そのうちの２つ、ＢおよびＣは非結晶学的２回軸により関連する二量体を形成する。分子Ａはその結晶学的に関連する分子Ａと隣接する非対称性ユニットで類似の二量体を形成する。３つの独立した分子の全ての−２から３８５の残基の位置は電子密度によりうまく定義される。いずれかの分子でセリン−２を超える密度の証拠はなく、そして分子ＡおよびＣのＮ末端は、各々対称的に関連する分子ＢおよびＡのアスパラギン９８のＯＤ１と相互作用する。分子ＢのＮ末端は溶媒の領域にある。３つ全ての分子に関する電子密度の欠如はＮ末端のその他の残基が秩序ある構造を有していないことを示している。Ｃ末端での電子密度は残基Ａｓｎ３８５で終わり、Ｈｉｓ−ｔａｇのための別の終端に関する証拠はない。
【０１９２】
Ｃ２結晶形態に解析されるＢＡＣＥの個々の分子のバイローバル（Ｂｉｌｏｂａｌ）構造は、本質的にはＰ２１結晶形態に解析されるメマプシン２の構造と同一である。特異的変異により生じる相互作用を表３に示す。これには３つの別個のユニットの各々におけるＮおよびＣ末端ならびにＡｓｎ→Ｇｌｎ変異を含む。分子ＢのＧｌｎ１１１が結晶学的２回軸に接近して存在し、そして対称的に関連するＢ：１１１と相互作用する結晶の形成において、Ａｓｎ１１１からＧｌｎ１１１の変異が重要であるようだ。異なる電子密度は最初３つ全ての分子においてＯＭ９９−２に関して認められ、そしてインヒビター分子はこれに適合した。その位置は分子Ａに関してＰ４からＰ４’にうまく定義され、そしてＣ  Ｐ４’は分子Ｂにおいてそれほどうまく定義されなかった。活性部位は分子ＢおよびＣに関して解析するために空いているが、分子Ａの活性部位は部分的に対称的に関連する分子Ｃにより占有されている（Ｐ４’に近い）。
【０１９３】
【表３】
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【０１９４】
この表は、ＢＡＣＥ酵素に為されたたいていの変異が結晶パッキングに影響しない位置であることを示している。主な例外は残基Ｂ１１１の場合であり、これは結晶学的２回軸を越えて対称的に関連する分子と相互作用することを示している。
【０１９５】
【表４】
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【０１９６】
これはさらに、本発明がＴａｎｇ  ＰＣＴ公開およびＨｏｎｇの化学文献よりも新規で、進歩的で、創意性があることを実証している。
【０１９７】
以下の表５はＢＡＣＥの原子座標を提供する。
表５  原子座標
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このように本発明の好ましい実施形態を詳細に説明してきたが、多くの明白なその変化がその精神または範囲から逸脱せずに可能であるので、添付の請求の範囲により定義される本発明が前記の記載で示した特定の詳細により限定されるものではないことは理解されよう。
【０１９８】
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【図面の簡単な説明】
【０１９９】
【図１Ａ】本発明のＢＡＣＥ  ＤＮＡ配列（ＥＭＢＬ−ＡＦ１９０７２５．ＳＥＱ、ＥＭＢＬ−ＡＦ２００３４３．ＳＥＱ、およびＥＭＢＬ−ＡＦ２０９４３．ＳＥＱ）およびＢＡＣＥ  ＤＮＡ配列（ＢＡＣＥ  ｄｎａ．ＳＥＱ）（配列番号：１−４）のアラインメントを示し、これは本発明の新規性、非自明性および進歩性を説明している＊、＊＊。
【図１Ｂ】本発明のＢＡＣＥポリペプチドペプチド配列のアラインメント（ｂａｃｅｐｒｏｔ．ｐｒｏ）およびＢＡＣＥポリペプチド配列（Ｐ５６１８７．ｐｒｏ）（配列番号：５−６）のアラインメントを示し、これは本発明の新規性、非自明性および進歩性を説明している＊、＊＊。
【図２Ａ】本発明のＢＡＣＥヌクレオチド配列によりコードされる本発明のＢＡＣＥポリペプチド配列（配列番号：５）を示す。
【図２Ｂ】本発明のＢＡＣＥヌクレオチド配列（配列番号：４）を示す。
【図３Ａ】ＯＭ９９−２の存在下で成長させたＢＡＣＥ結晶の光学顕微鏡の写真を示す。
【図３Ｂ】いずれかの添加したインヒビター（ＯＭ９９−２）の不在下で成長させたＢＡＣＥ結晶の光学顕微鏡の写真を示す。
【図４Ａ】結晶学的セルの非対称性ユニットにおけるＢＡＣＥ単量体の並びを提供する図を示す（二量体青色（分子Ｃ）およびオレンジ色（分子Ｂ）分子、これはＴａｎｇら、国際公開公報第０１／００６６３号、Ｔａｎｇら、国際公開公報第０１／００６６５号、Ｈｏｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０：１５０−１５３（２０００）の二量体と相同である；ピンク色の分子（分子Ａ）は結晶学的に関連する分子と二量体を形成し、これは非結晶学的二量体と相同である）。
【図４Ｂ】ＢＡＣＥのユニットセルにおける分子のパッキングを提供する図を示す（非対称性ユニットのピンク色（分子Ａ）、オレンジ色（分子Ｂ）および青色（分子Ｃ）、これは結晶学的対称性により赤色（Ｄ）、紺色（Ｅ）および緑色（Ｆ）の分子に関連する）。
【図５】ＢＡＣＥのＳＤＳ−ＰＡＧＥ精製のゲルのコピーを示す。
【図６】本発明のＢＡＣＥタンパク質対Ｔａｎｇら、国際公開公報第０１／００６６３号、Ｔａｎｇら、国際公開公報第０１／００６６５号、Ｈｏｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０：１５０−１５３（２０００）のＢＡＣＥタンパク質の比較の図表示を示し（下向きの矢印はタンパク質溶解切断の部位であり、ＴＭは膜貫通領域であり、そしてｃｙｔは細胞質領域である）、これは本発明の新規性、非自明性および進歩性を説明している。
【図７】本発明のＢＡＣＥ  ＤＮＡ配列（例えばＥｐ８５５４４４．ｓｅｑ、国際公開公報第０１／００６６３号．ＳＥＱおよび国際公開公報第０１２３５３３号ｓｅｑ２５．ＳＥＱ）およびＢＡＣＥ  ＤＮＡ配列（ＢＡＣＥ  ｄｎａ．ＳＥＱ）（配列番号：７−９および４）のアラインメントを示し、これは本発明の新規性、非自明性および進歩性を説明している＊、＊＊＊。
【図８】本発明のＢＡＣＥアミノ酸配列のアラインメント（例えば国際公開公報第０１２３５３３号ＳＥＱ３２．ｐｒｏおよび国際公開公報第０１００６６３号．ＰＲＯ）およびＢＡＣＥアミノ酸配列（ｂａｃｅｐｒｏｔ．ｐｒｏ）（配列番号：１０−１１および５）のアラインメントを示し、これは本発明の新規性、非自明性および進歩性を説明している＊、＊＊＊。（＊は類似性および／または差異を示すために図色を符号化した）（＊＊はＥＭＢＬ−ＡＦ１９０７２５．ＳＥＱ、ＥＭＢＬ−ＡＦ２００３４３．ＳＥＱ、およびＥＭＢＬ−ＡＦ２０９４３．ＳＥＱはＥＭＢＬ配列である；Ｐ５６１８７．ｐｒｏはジェンバンク配列、受け入れ番号Ｐ５６１８７である。）（＊＊＊はＥｐ８５５４４４．ｓｅｑ、国際公開公報第０１００６６３号．ＳＥＱおよび国際公開公報第０１２３５３３号ｓｅｑ２５．ＳＥＱ、および国際公開公報第０１００６６３号．ＰＲＯは欧州特許出願８５５４４４、ならびにＰＣＴ公開国際公開公報第０１／００６６３号、国際公開公報第０１／２３５３３号、国際公開公報第０１／２３５３３号および国際公開公報第０１／００６６３号の配列である）
【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005503144.tif 000615
【国際調査報告】
2005503144.tif 000616
2005503144.tif 000617
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