(57)【要約】アレイ形成とおよび生体分子または細胞の固定化とのための基質の調製方法が説明される。前記方法は、固体支持体を用意すること、および、化学的プラズマ重合工法によって前記表面にポリマーコーティングを蒸着することを含む。前記ポリマーコーティングは、生体分子または細胞を付着することができる、少なくとも１つの側鎖官能基を含む。前記ポリマーコーティングの材料は、その表面特性が前記側鎖官能基と前記生体分子または細胞との間の結合を増強するようなやり方で選択されることが好ましい。生体分子および細胞の固定化用基質も提供される。前記基質は、ポリマー材料でできた固体支持体を含む。前記固体支持体は、第１の生体分子または第１の細胞をその表面に付着するのに適当な、少なくとも１つの第１の側鎖官能基を有する。前記基質は、前記基質の表面に蒸着されたポリマーコーティングを含む。前記ポリマーコーティングは、第１の生体分子または第１の細胞の第１の官能基への付着を増大させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子または細胞のアレイを形成するための基質の調製方法であって、
（ａ）表面を有する固体支持体を用意するステップと、
（ｂ）前記生体分子または細胞を付着することができる少なくとも１つの側鎖官能基を含むポリマーコーティングを前記表面に化学的プラズマ重合工法によって蒸着するステップとを含む、方法。
【請求項２】
前記ポリマーコーティングはカルボキシル化ポリマーを含み、前記ステップ（ｂ）は、
（ｃ）少なくとも１つの側鎖カルボキシル基を含むカルボキシル化ポリマーコーティングを前記表面に化学的プラズマ重合工法によって蒸着するステップと、
（ｄ）前記カルボキシル基を生体分子または細胞を付着することができる官能基に転化することによって前記カルボキシル化ポリマーコーティングを活性化するステップとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記蒸着するステップ（ｃ）は、
（ｅ）カルボキシル化モノマーと前記固体支持体とをプラズマチャンバーに導入するステップと、
（ｆ）カルボキシル化ポリマーを形成するための遊離ラジカル重合と、形成された前記カルボキシル化ポリマーの前記固体支持体への吸着とに十分な条件下で、前記プラズマチャンバー内の高周波プラズマ放電（ＲＦＰＤ）を提供することによって、前記カルボキシル化ポリマーコーティングを前記固体支持体に形成するステップとを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記カルボキシル化モノマーは、アクリル酸モノマー、ビニル酢酸モノマー、カルボキシ−シランモノマー、カルボキシ−シラノールモノマー、メタシレート（ｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ）またはアシレート（ａｃｙｌａｔｅ）のモノマーおよびこれらの混合物からなるグループから選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記活性化するステップは、前記カルボキシル基をフッ化アシル基に転化することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記活性化するステップは、（ジエチルアミノ硫黄）トリフルオリド（ＤＡＳＴ）、フッ化シアヌル酸および六フッ化リン酸テトラメチルフルオロホルマジニウムからなるグループから選択される試薬に、カルボキシル化ポリマーコーティングを反応させることを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記モノマーまたはポリマーコーティングの吸着を増強するための前記固体支持体の表面を前処理するステップを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記前処理するステップは、前記表面のプラズマエッチングまたはプラズマ誘導酸化を行うことを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記化学的プラズマ重合工法は、最初に前記基質を、アルゴン、ヘリウム、その他の希ガスのプラズマ中で処理すること、および、前記プラズマチャンバー内にモノマーまたはポリマーを導入して、該モノマーまたはポリマーが前記基質と反応できるようにすることを含む、プラズマ誘導グラフト法によって達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記化学的プラズマ重合工法は、化学的蒸着工法およびプラズマ誘導グラフト法からなるグループから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ステップ（ｂ）のポリマーコーティングに、前記側鎖官能基と前記生体分子または細胞との間の結合を増強する表面特性を付与する材料を選択するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリマーコーティングは、疎水性、親水性、双性イオン型またはこれらの組み合わせである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記生体分子または前記細胞の外部表面は疎水性で、前記選択するステップは、前記ステップのポリマーコーティングに疎水性を付与する材料を選択することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記生体分子または前記細胞の外部表面は親水性で、前記選択するステップは、前記ステップ（ｂ）のポリマーコーティングに親水性を付与する材料を選択することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記生体分子または前記細胞の外部表面は陽イオンおよび陰イオンの両方の官能性を有し、前記選択するステップは前記ステップ（ｂ）のポリマーコーティングに、前記生体分子または細胞とのイオン相互作用をすることができる双性イオン型の特性を付与することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記側鎖官能基は、フッ化アシル、無水物、オキシラン、アルデヒド、ヒドラジド、アジ化アシル、アジ化アリル、ジアゾ化合物、ベンゾフェノン、カルボジイミド、イミドエステル、イソチオシアナート、ＮＨＳエステル、ＣＮＢｒ、マレイミド、トシル酸、トレシルクロリド、無水マレイン酸およびカルボニルジイミダゾールからなるグループから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記コーティングは、第１の生体分子または第１の細胞に対する反応性がある第１のタイプの官能基と、第２の生体分子または第２の細胞に対する反応性がある第２のタイプの官能基とを含む、少なくとも２つのタイプの側鎖官能基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記蒸着するステップ（ｃ）は、
（ｇ）曝露され被覆された領域を形成するために前記固体支持体をマスクするステップと、
（ｈ）曝露された前記領域に前記ポリマーコーティングを蒸着するステップとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記蒸着するステップの前に、反応性のプラズマを用いて表面官能基を生成させるために、前記曝露された領域を前処理するステップを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前処理された前記曝露された領域を表面官能基で独立かつ部位特異的にコーティングするステップを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１に記載の方法によって調製された、生体分子または細胞を固定化するための基質。
【請求項２２】
前記固体支持体は不活性な材料でできている、請求項２１に記載の基質。
【請求項２３】
前記不活性な材料は、ポリマー材料、セラミック材料、金、銀、チタン、その他の金属、天然繊維、シリコーン、ガラスおよびこれらの複合材料からなるグループから選択される、請求項２１に記載の基質。
【請求項２４】
前記固体支持体は、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリスルホン、二フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）、テフロン、これらの複合材料、ブレンド品および誘導体からなるグループから選択されるポリマー材料である、請求項２１に記載の基質。
【請求項２５】
前記固体支持体は、多孔性または非孔性の材料でできている、請求項２１に記載の基質。
【請求項２６】
前記固体支持体は、スライド、シート、フィルム、マイクロタイタープレート、ビーズ、膜、発泡体、繊維、糸またはゲルの形状である、請求項２１に記載の基質。
【請求項２７】
前記固体支持体は、第１の生体分子または第１の細胞を付着するのに適当な少なくとも１つの第１の側鎖官能基を有し、前記コーティングは、第２の生体分子または第２の細胞を付着するのに適当な少なくとも１つの第２の側鎖官能基を含む、請求項２１に記載の基質。
【請求項２８】
第１および第２の官能基は同じで、フッ化アシル、無水物、オキシラン、アルデヒド、ヒドラジド、アジ化アシル、アジ化アリル、イソチオシアナート、ＮＨＳエステル、ＣＮＢｒ、マレイミド、トシル酸、トレシルクロリド、無水コハク酸およびカルボニルジイミダゾールからなるグループから選択される、請求項２７に記載の基質。
【請求項２９】
第１および第２の官能基は異なり、フッ化アシル、無水物、オキシラン、アルデヒド、ヒドラジド、アジ化アシル、アジ化アリル、イソチオシアナート、ＮＨＳエステル、ＣＮＢｒ、マレイミド、トシル酸、トレシルクロリド、無水コハク酸およびカルボニルジイミダゾールからなるグループから選択される、請求項２７に記載の基質。
【請求項３０】
前記ポリマーコーティングは、シランまたはシラノール化合物の単層である、請求項２１に記載の基質。
【請求項３１】
前記ポリマーコーティングは、前記固体支持体上の少なくとも２つのシランまたはシラノール化合物の混合物の単層である、請求項２１に記載の基質。
【請求項３２】
少なくとも１つのシランまたはシラノール化合物は疎水性で、少なくとも１つのシランまたはシラノール化合物は生体分子または細胞を付着することができる側鎖官能基を有する、請求項３１に記載の基質。
【請求項３３】
少なくとも１つのシランまたはシラノール化合物は親水性で、少なくとも１つのシランまたはシラノール化合物は生体分子または細胞を付着することができる側鎖官能基を有する、請求項３１に記載の基質。
【請求項３４】
生体分子または細胞を固定化するための基質であって、
第１の生体分子または第１の細胞を表面に付着させるのに適当な少なくとも１つの第１の側鎖官能基を有する、ポリマー材料でできた固体支持体と、
第１の生体分子または第１の細胞の第１の官能基への付着を増大させる、前記基質の表面に蒸着されたポリマーコーティングとを含む、基質。
【請求項３５】
前記ポリマーコーティングは、疎水性、親水性、双性イオン型、または、これらの組み合わせである、請求項３４に記載の基質。
【請求項３６】
前記生体分子または前記細胞の外部表面が疎水性のときには、前記ポリマーコーティングは疎水性であり、
前記生体分子または前記細胞の外部表面が親水性のときには、前記ポリマーコーティングは親水性であり、
前記生体分子または前記細胞の外部表面が陽イオンおよび陰イオンの両方の官能性を有するときには、前記ポリマー表面は双性イオン型である、請求項３５に記載の基質。
【請求項３７】
前記コーティングは、第２の生体分子または第２の細胞を付着するのに適当な少なくとも１つの第２の側鎖官能基を含む、請求項３４に記載の基質。
【請求項３８】
第１および第２の官能基は同じで、前記官能基は、フッ化アシル、無水物およびオキシランからなるグループから選択される、請求項３７に記載の基質。
【請求項３９】
第１および第２の官能基は異なり、前記官能基は、フッ化アシル、無水物およびオキシランからなるグループから選択される、請求項３７に記載の基質。
【請求項４０】
生体分子および細胞を固体支持体に付着させる方法であって、
（ａ）生体分子または細胞を用意するステップと、
（ｂ）表面を有する固体支持体を用意するステップと、
（ｃ）コーティングされた基質を形成するために、前記生体分子または細胞を付着することができる少なくとも１つの側鎖官能基を含むポリマーコーティングを前記表面に化学的プラズマ重合工法によって蒸着するステップと、
（ｄ）前記生体分子または細胞の前記側鎖官能基との結合を可能にする条件下で、前記生体分子または細胞を前記コーティングされた基質に接触させるステップとを含む、方法。
【請求項４１】
前記生体分子は、核酸、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質、糖質、脂質およびこれらの類似体からなるグループから選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記生体分子は、増幅されたＤＮＡ、ｃＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡおよびｍＲＮＡからなるグループから選択されるポリヌクレオチドである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
複数の生体分子または細胞が用意され、前記接触させるステップは、前記コーティングされた基質の離散した場所で、前記複数の生体分子または細胞を側鎖官能基に接触させることを含み、バイオアレイが形成される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記接触させるステップは、ジェットプリント法、固体または開口キャピラリ素子接触プリント法、微小流体力学的チャンネルプリント法、シルク・スクリーン法および、電気化学的または電磁気的な力に基づくプリント装置を用いる技術からなるグループから選択される技術によって実施される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
前記接触させるステップは、前記生体分子または細胞を前記固体支持体にスポッティングすることによって実施される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
（ａ）複数の生体分子または細胞を用意するステップと、
（ｂ）表面を有する固体支持体を用意するステップと、
（ｃ）コーティングされた基質を形成するために、前記生体分子または細胞を付着することができる少なくとも１つの側鎖官能基を含むポリマーコーティングを前記表面に化学的プラズマ重合工法によって蒸着するステップと、
（ｄ）前記コーティングされた基質の離散した場所の前記側鎖官能基と、前記生体分子または細胞とを結合させてバイオアレイを形成することを可能にする条件下で、前記生体分子または細胞を前記側鎖官能基と接触させるステップとを含む方法によって調製されるバイオアレイ。
【請求項４７】
前記固体支持体は、流体の流れに対する物理的な障害によって隔離された離散した領域であって、ウェルか、溝か、架台か、疎水性または親水性のパッチか、打ち抜きの接着性の貯液槽かの形状の領域を有する平面的な器具の形状にプラスチックから加工される、請求項４６に記載のバイオアレイ。
【請求項４８】
前記固体支持体はマイクロプレートである、請求項４７に記載のバイオアレイ。
【請求項４９】
前記固体支持体は、スライドか、フィルムか、マイクロタイタープレートか、ビーズか、膜か、発泡体か、繊維か、糸か、ゲルかの形状である、請求項４６に記載のバイオアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的には、アレイ状に整列することにより生体分子または細胞を固定化するための基質を調製する方法に関し、具体的には、生体分子または細胞の結合するために、側鎖（ｐｅｎｄａｎｔ）官能基でコーティングされたポリマーを有する基質に関する。本発明は、ポリマーでコーティングされた基質を利用して調製されたバイオアレイにも関する。
【背景技術】
【０００２】
最近、ポリヌクレオチド、タンパク質および細胞をさまざまな固体表面に固定化することによってバイオアレイを構築することに多大な関心が集中してきた。ポリヌクレオチドのアレイは、遺伝子発現解析と、ＤＮＡ合成および配列決定と、突然変異体検出と、多型性スクリーニングと、連鎖解析と、遺伝子転写産物中の選択的スプライシング変異体のスクリーニングとに用いられて成功してきた（特許文献１および２）。タンパク質のアレイは、免疫アッセイと、酵素アッセイと、パターンに配列された細胞の増殖と、ペプチドライブラリと、光学的データ記憶と、画像検出および処理とに利用されてきた（非特許文献１）。細胞のアレイは、生物学的活性のある化合物に対する細胞の生理学的な応答のハイスループットでハイコンテントなスクリーニングが必要な薬剤の発見において有用であることがわかってきた（特許文献３）。
【特許文献１】米国特許第５，４７４，７９６号明細書
【特許文献２】米国特許第６，０３７，１２４号明細書
【非特許文献１】Ａ．Ｓ．ＢｌａｗｓおよびＷ．Ｍ．Ｒｅｉｃｈｅｒｔ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １９：５９５−６０９、１９９８
【特許文献３】米国特許第６，１０３，４７９号明細書
【０００３】
生体分子および細胞を固体支持体に固定化するために利用可能な方法は、吸着、紫外線クロスリンキングおよび共有結合付着を含めてさまざまある。生体分子の表面への吸着は、イオン結合、疎水結合またはファンデルワールス力の引力によって駆動される、比較的簡単な方法である。しかしこの方法は、生体分子および細胞の前記基質への十分に安定な固定化を提供しない。また前記方法は、バイオアレイ構築において望ましい、生体分子および細胞の正確な付着を実現することができない。
【０００４】
紫外線クロスリンキングは、紫外線照射によって活性化されるときに標的生体分子と結合可能になる、光化学的な分子種を用いる基質の誘導体化を伴う。しかしこの方法は、ランダムな工程であって、正確なアレイ構築ができない。さらに、光化学的な分子種を用いで誘導体化された基質は、紫外光に敏感で、保存および使用に困難が生じる。
【０００５】
より安定で正確な生体分子の固定化手段は表面への共有結合である。しかし、天然の生体分子と未修飾の基質との間の相互作用は弱いので、効率的な結合を促進するためには、生体分子とその基質との化学的修飾がしばしば必要になる。例えば特許文献４は、核酸を１級アミンで修飾した後、修飾された該核酸を遊離アルデヒド基を有する固体基質に還元剤存在下で反応させることを開示する。ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミン基、ヒドラジン基、エポキシド基、ブロモアセチル基、マレイミド基およびチオール基を含む、さまざまな活性官能基を有するように修飾された基質に生体分子を固定化するその他多くの報告がある（例えば、特許文献５の従来技術の項の説明と、非特許文献１とを参照せよ）。
【特許文献４】米国特許第５，２１５，８８２号明細書
【特許文献５】米国特許第６，０１３，７８９号明細書
【０００６】
他の研究者は、生体分子の固定化に、シラン（ｓｉｌａｎｅ）のような２官能基性のクロスリンカーを使ってきた（特許文献１）。最近、フッ化アシルで活性化された基質に未修飾生体分子を固定化することが、本発明の承継人によって報告された（特許文献６）。しかし基質表面の化学的な誘導体化は、しばしば、電荷の総和（ｎｅｔ  ｃｈａｒｇｅ）を生成し、その後の手順の間に、化学的に修飾された基質との生体分子の望ましくない非特異的な静電気的結合を起こす。
【特許文献６】米国特許第６，２６８，１４１号明細書
【０００７】
さらに生体高分子および基質の表面特性が適合しないときには、該基質が高濃度の反応性官能基を含む場合であっても、生体分子、特に生体高分子を基質に付着させることは極めて困難である。例えば親水性表面は、疎水性の生体高分子を寄せ付けない作用を有するが、それは、水溶液中での前記生体高分子がかかる表面に接近することがエネルギー的に不利だからである（特許文献７）。
【特許文献７】米国特許第５，２５０，６１３号明細書
【０００８】
生体高分子の固体支持体への自発的な吸着を阻止すると同時に、該生体高分子の固定化を改善するために、特許文献７は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）誘導体の親水性非イオン性ポリマーとの水溶性コンジュゲートを負の電荷を有する固体表面に吸着させて、それから、該表面と生体高分子とを反応させることを開示している。代替的に特許文献７は、前記親水性非イオン性ポリマーを前記生体高分子に結合させて、それから、得られた産物をＰＥＩと反応させて、コンジュゲートを形成し、該コンジュゲートが負の電荷を有する前記表面に吸着されることを示唆する。しかしこの方法は、表面に負電荷を誘起すること、および、非イオン性ポリマーとＰＥＩとの間のグラフトポリマーを生成することを含む、複数の複雑なステップを要する。
【０００９】
最近、ＰＥＩ層を有する固体基質をアミノ修飾されたポリヌクレオチドのアレイフォーマットでの固定化に用いる別の方法が記載された（特許文献８）。しかしこの方法も複数のステップを要する。したがって、かかる技術によって製造されたアレイは、かなり高価で、いつでも一定の質を保つわけではない。さらにこの方法は、生体高分子のそれぞれの液滴がアレイの所望の場所に留まることを担保するために、該生体高分子に増粘剤を添加する必要がある。かかる増粘剤の添加は、アレイの生体分子結合能に悪い影響を与える場合がある。
【特許文献８】米国特許第６，１５０，１０３号明細書
【００１０】
多くの研究者は、マイクロアレイを構築するために、市販のポリマーでコーティングされたガラススライドを使ってきた。しかしポリ−Ｌ−リジンでコーティングされたガラススライドのような市販の基質は、付着に用いられる化学的特性が劣悪であり、アクリルアミドまたはグルタールアルデヒドを用いてスライドをディップコーティング処理またはスプレー処理して調製されたその他の基質は、貯蔵寿命が限られていて、コーティングされた表面が不均一な場合がある。また例えば核酸のような、１つのタイプの生体分子の付着のために設計された市販の基質は、例えばタンパク質のような他の生体分子の付着には適さない場合がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、既存の方法および基質は、生体分子または細胞のアレイを作成するための便利で、安価で、信頼できる手順を提供しない。そこで、よりコスト効率が高く、迅速で、信頼できる、柔軟なバイオアレイ構築方法を開発することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の概要
したがって、基質の物理化学的特性を該基質に付着されるべき生体分子の特性に合わせて調整する（ｔａｉｌｏｒ）ことができるようにすることが本発明の目的である。常温常圧条件において安定で、安価で、物理的に頑丈な、相応の貯蔵寿命を固定化基質に提供することが、本発明のさらなる目的である。生体分子および細胞を位置特異的な場所に高密度で固定化するために適する表面を有する基質を提供することが、本発明の別の目的である。
【００１３】
これらおよびその他の本発明の目的は、新規な化学的特性と、（例えば、疎水性、親水性、双性イオン型（ｚｗｉｔｔｅｒｉｏｎｉｃ））の選択された表面特性とを不活性または活性化された固体基質に導入する柔軟なコーティング工程を用いることによって達成される。したがって本発明の１つの側面は、生体分子または細胞を固定化するための基質を調製する方法を提供することである。前記方法は、
（ａ）表面を有する固体基質を用意するステップと、
（ｂ）生体分子または細胞を付着することができる少なくとも１つの側鎖官能基を含むポリマーのコーティングを、化学的プラズマ重合工法（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｌａｓｍａ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ）によって、前記表面に蒸着するステップとを含む。１つの実施態様では、前記化学的プラズマ重合工法は化学的蒸着（ＣＶＤ）である。別の実施態様では、前記化学的プラズマ重合工法はプラズマ誘導グラフト（ｐｌａｓｍａ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）である。
【００１４】
本発明のポリマーコーティングは、カルボキシル化ポリマー、すなわち、カルボキシル基を含むポリマーを含む場合がある。前記カルボキシル化ポリマーコーティングは、カルボキシル基を、生体分子または細胞を付着することができる官能基に転化（ｃｏｎｖｅｒｔ）することによって、活性化される場合がある。１つの実施態様では前記カルボキシル化ポリマーは、カルボキシル基をフッ化アシル基に転化することによって活性化される。
【００１５】
前記ポリマーコーティングの材料は、その表面特性が前記側鎖官能基と前記生体分子または細胞との間の結合を増強するようなやり方で、選択されることが好ましい。１つの実施態様では前記ポリマーコーティングの材料は、前記ポリマーコーティングと付着されるべき生体分子または細胞との間の、イオン結合、疎水結合またはファンデルワールス力を含む非共有結合性の引力を最大化するように選択される。例えば前記生体分子または前記細胞の外部表面が疎水性のときには、前記ポリマーコーティングは疎水性であることが好ましい。
【００１６】
本発明の別の側面は、前記方法によって調製された生体分子および細胞を固定化するための基質に向けられる。
【００１７】
別の側面では本発明は、生体高分子または細胞を固定化するための基質を提供する。前記基質はポリマー材料製の固体支持体を含む。前記固体支持体は、第１の生体分子または第１の細胞を表面に付着するのに適する、少なくとも１つの第１の側鎖官能基を有する。前記基質はさらに、該基質の表面に蒸着されたポリマーコーティングを含む。前記ポリマーコーティングは、第１の生体分子または第１の細胞の第１の官能基への付着を増大させる。
【００１８】
別の側面では本発明は、生体分子および細胞を固体支持体に付着させる方法を提供する。前記方法は、
（ａ）生体分子または細胞を用意するステップと、
（ｂ）固体支持体を用意するステップと、
（ｃ）コーティングされた基質を形成するために、前記生体分子または細胞を付着させることができる少なくとも１つの側鎖官能基を含むポリマーコーティングを、化学的プラズマ重合工法によって前記支持体の表面に蒸着させるステップと、
（ｄ）前記生体分子または細胞と前記側鎖官能基との結合を可能にする条件下で、該生体分子または細胞を前記コーティングされた基質に接触させるステップとを含む。
【００１９】
本発明のさらなる側面は、
（ａ）複数の生体分子または細胞を用意するステップと、
（ｂ）表面を有する固体支持体を用意するステップと、
（ｃ）コーティングされた基質を形成するために、前記生体分子または細胞を付着させることができる少なくとも１つの側鎖官能基を含むポリマーコーティングを、化学的プラズマ重合工法によって前記支持体の表面に蒸着させるステップと、
（ｄ）前記生体分子または細胞と側鎖官能基とが結合してバイオアレイを形成することを可能にする条件下で、前記コーティングされた基質の離散した位置にある側鎖官能基と前記生体分子または細胞とを接触させるステップとを含む方法によって、調製されたバイオアレイを提供することである。
【００２０】
本発明は、多くの経済的および技術的な利点を提供する。当業者は、本発明のコーティング処理が、未処理の状態で不活性な材料に、官能基を迅速かつ均一に導入することができることを理解する。さらに、本発明のポリマーコーティングの表面特性は、生体分子−基質間または細胞−基質間の結合を増強するために、付着されるべき生体分子の表面特性と容易に適合される場合がある。したがって本発明は、従来技術の複数のステップからなる方法の短所を克服する、多用途かつコスト効率の高いバイオアレイ構築方法を提供する。
【００２１】
上記およびその他の本発明の特徴と、その実現方法とは、添付する図面とともに以下の説明を参照することによって、より明らかになり、最もよく理解される。これらの図面は、本発明の典型的な実施態様を示すものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【００２２】
発明の詳細な説明
本発明の１つの側面は、生体分子または細胞の固定化用基質の調製方法を提供する。前記方法は、
（ａ）表面を有する固体支持体を用意するステップと、
（ｂ）前記生体分子または細胞を付着することができる少なくとも１つの側鎖官能基を含むポリマーコーティングを前記表面に、化学的プラズマ重合工法によって蒸着させるステップとを含む。
【００２３】
ここで用いられるところの「生体分子」という用語は、核酸と、ポリヌクレオチドと、ポリペプチドと、タンパク質と、糖質と、脂質と、薬物と、色素のようなハプテンその他の低分子有機分子と、これらの類似体とをいう。ここで用いられるところの「ポリヌクレオチド」は、別々の断片の形態で、あるいは、より大きな構築体の構成成分としてのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーをいう。ここで用いられるところの「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡか、ＲＮＡか、ＰＮＡ（ペプチド核酸）のようなＤＮＡの類似体か、合成オリゴヌクレオチドかでもかまわない。前記ＤＮＡは、１本鎖または２本鎖ＤＮＡか、ＰＣＲ法で増幅されたＤＮＡかでもかまわない。前記ＲＮＡはｍＲＮＡでもかまわない。前記ＤＮＡまたはＲＮＡは、ジデオキシヌクレオチドを含む場合がある。
【００２４】
前記ポリヌクレオチドの長さは、３ｂｐないし１０ｋｂの場合がある。本発明の１つの実施態様によると、ポリヌクレオチドの長さは、約５０ｂｐないし１０ｋｂの範囲内で、好ましくは、１００ｂｐないし１．５ｋｂの範囲内である。本発明の別の実施態様によると、合成オリゴヌクレオチドの長さは、約３ないし１００ヌクレオチドの範囲内である。本発明のさらなる実施態様によると、前記オリゴヌクレオチドの長さは、約４０ないし８０ヌクレオチドの範囲内である。本発明のさらに別の実施態様によると、前記オリゴヌクレオチドの長さは、約１５ないし２０ヌクレオチドの範囲内である。
【００２５】
ここで用いられるところの「ポリペプチド」という用語は、１個のアミノ酸のα−カルボキシル基が別のアミノ酸のα−アミノ基とペプチド結合によって連結された、アミノ酸のポリマーをいう。タンパク質は、ジスルフィド結合によって連結された１個または２個以上のポリペプチドを含む場合がある。前記タンパク質の例は、抗体、抗原、リガンド、レセプター等を含むが、これらに限定されない。
【００２６】
ここで用いられるところの「細胞」という用語は、生きている単細胞または死んでいる単細胞か、多細胞、組織または細胞の断片か、細胞膜か、リポソーム調製物か、ミトコンドリア、リボソームまたは核のような細胞内小器官のいずれかをいう。接着性および非接着性の両方の細胞タイプが固定化される場合がある。細胞は、ヒト毛細血管内皮細胞、ＨｅＬａ細胞、Ａ５４９細胞およびＢＴ−４７４のような乳ガン細胞株を含むが、これらに限定されない。ある種の細胞株は、フィブロネクチンその他の細胞を安定化する細胞外マトリクスタンパク質の同時接着（ｃｏ−ａｄｈｅｓｉｏｎ）を必要とする。テトラペプチドのＲＧＤＳのようなある種のペプチドが、タンパク質と細胞との結合を増強するために付着される場合がある。
【００２７】
本発明の目的のためには、本発明の固体支持体は、ポリマーコーティング蒸着用の表面を提供するいかなる材料でもかまわない。固体支持体の例は、ポリマー材料およびセラミック材料、ガラス、セラミック、天然繊維、シリコーン、金属およびこれらの複合材料を含むが、これらに限定されない。本発明の１つの実施態様によると、本発明の固体支持体は、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリスルホン、ＰＶＤＦ、テフロン（登録商標）、これらの複合材料、ブレンド品または誘導体のようなポリマー材料でできている場合がある。
【００２８】
ここで用いられるところの「化学的プラズマ重合工法」という用語は、ポリマー材料の形成を補助し、開始し、あるいは、触媒するために化学的プラズマを利用することを伴う。化学的プラズマ重合工法の例は、化学的蒸着（ＣＶＤ）およびプラズマ誘導グラフトか、これらの組み合わせかを含むが、これらに限定されない。
【００２９】
薄層有機フィルムのＣＶＤは、セラミックまたは陶器の材料の装飾的なコーティングから、半導体チップ表面の回路配線接続経路（ｃｉｒｃｕｉｔ  ｉｎｔｅｒｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｒｉｎｇ  ｐａｔｈ）、切削工具およびベアリングの表面の耐摩耗性コーティングまでの多数の技術領域においてうまく利用されてきた。例えば、米国特許第４，０９１，１６６号明細書は、ひっかき傷または擦れ傷に対する耐久性を増大させるために、３フッ化ホウ素を含む、光学的な基質または熱可塑性基質の蒸着を開示する。米国特許第５，５１４，４２４号明細書は、水と固体との間の摩擦係数を低減し、前記表面の撥水性を向上させるために、プラズマ誘導重合によって得られたフッ化ポリマーの薄層を前記固体に蒸着することを説明する。米国特許第６，２８７，９９０号明細書は、半導体素子を形成するために、基質に低誘電率被膜を蒸着することを開示する。
【００３０】
ＣＶＤ法によって蒸着されたフィルムは、調製が容易であること、均一であること、複雑な基質を相似的に被覆すること、さまざまなな基質に優秀な接着性を示すこと、および、独特な化学的特性を発揮できることを含む、多くの望ましい特性を示す。さらに、被覆されたフィルムは前記基質の内部に著しく浸透することはないので、前記基質の機械的特性に影響を与えない（米国特許第５，００２，７９４号および第５，１５３，０７２号明細書）。しかし本発明以前は、前記ＣＤＶ法はバイオアレイの調製には用いられてはいなかった。これはおそらく従来技術は、プラズマ蒸着フィルムを化学特性が明白でないものとして扱ってきたからである（米国特許第５，００２，７９４号および第５，１５３，０７２号明細書）。
【００３１】
プラズマ誘導グラフトは、例えば、タンパク質の結合を増大するようにポリ（アクリル酸）をＰＴＦＥにグラフトするため、あるいは、タンパク質の吸着および細胞の付着を低減するためのポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）のプラスチックへのグラフトに用いられてきた。
【００３２】
化学的プラズマ重合工法は、生体分子および細胞の基質への結合を促進するために、望ましい側鎖官能基を前記基質に導入するのに用いられる場合があることが、本発明の予想されない発見である。さらに、前記化学的プラズマ重合工法は、固体支持体の表面特性を付着されるべき生体分子または細胞の表面特性に適合させて、これらの間の表面相互作用を向上させるために、前記個体支持体の表面を選択的に修飾するのに用いられる場合があることが、本発明の発見である。さらに本発明の基質がバイオアレイとして用いられるとき、表面修飾は、付着した捕捉プローブ（ｃａｐｔｕｒｅ  ｐｒｏｂｅ）と被検体との間のその後の結合を有益なように増強する場合がある。
【００３３】
化学的プラズマ重合によるポリマー材料の固体支持体への蒸着は、周知の処理工法であって、ここでは詳細に説明することはない。例えばＣＶＤが用いられるとき、コーティングされるべき前記固体支持体はプラズマチャンバー内に配置されるが、該プラズマチャンバーは、望ましい圧力まで減圧または加圧されるのが典型的である。前記支持体に蒸着されるべきコーティング材料は、前記チャンバー内で生成されるか、あるいは、該チャンバーに導入され、気体の蒸気と固体の粒子状物質とを含むプラズマ状態にある。前記プラズマは、前記コーティング材料の原子、分子、イオンおよび分子の塊状物（ａｇｇｌｏｍｅｒａｔｅｓ）と、望ましい反応剤および望ましくない不純物のいずれかの原子、分子、イオンおよび分子の塊状物とを含む場合がある。前記コーティングまたは蒸着の工程それ自体は、前記プラズマ状のコーティング粒子がコーティングされるべき前記支持体表面に凝集することによって進行する。前記蒸着チャンバーは、該チャンバーから不純物をパージするために、蒸着「運転（ｒｕｎ）」の前に減圧される場合があるが、一般には化学的蒸着は、常圧または陽圧（常圧より高い圧力）の圧力レベルで実施される（米国特許第６，１３９，９６４号明細書）。
【００３４】
プラズマ誘導グラフトでは、基質は、アルゴンまたはヘリウムのプラズマのような希ガスのプラズマで最初に前処理される。それから、モノマーまたはポリマーが前記プラズマチャンバー内に導入されて、前記基質と反応させられる。化学的蒸着工法（ＣＶＤ）では、重合は蒸気相内で開始される。例えばシリコーンのコーティングは、シランのＣＶＤ工法で表面に形成することができる。前記コーティングは、高圧蒸気ガス状化合物の蒸着の結果である。これらは基質の表面に運ばれ、該基質表面またはその近傍での熱蒸着反応によって、前記コーティングが形成されるのが通常である。
【００３５】
「プラズマ」はイオン化されたガスであることが最も好ましく、該イオン化ガスは電磁場から十分なイオン化エネルギーを得て、長距離電磁力を発揮する。プラズマエネルギー源は、直流、交流、高周波マイクロ波、衝撃波およびレーザを含むが、これらに限定されない。低温プラズマ処理は、高周波プラズマ放電（ＲＦＰＤ）、マイクロ波プラズマ放電（ＭＦＰ）およびコロナ放電（ＣＤ）を含む。かかる処理は、すべて、固体材料の表面のみに影響を与えるのが典型的で、前記材料の残りの部分は修飾されないままで残る。好ましい実施態様では、ＲＦＰＤが利用される。
【００３６】
プラズマ発生装置は商業的に入手可能である。例えば特に好ましいプラズマ発生装置は、Ｐｌａｓｍａ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社、カリフォルニア州、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙから入手できる（型番号ＰＳ０１５０Ｅ  ｒａｄｉｏ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）。かかる装置は、ガス導入、電力、プラズマ放電時間等の条件を容易に選択し、変更し、最適化し、制御することができるため、好ましい。これらのパラメーターは、電力量（典型的にはワット単位）が大きすぎたり、あるいは、プラズマ放電時間が長すぎたりする場合には、ポリマーコーティングの物理的条件が不利な影響を被ることを主な理由として、ほとんど実験しないで最適化することができる。かかる不利な影響は、「脆弱な（ｂｒｉｔｔｌｅ）」ポリマー媒体ができることによって明らかになるのが典型的である。したがって当業者は、ポリマーコーティングの効率的な化学的プラズマ蒸着のための条件を最適化する能力がある。
【００３７】
広範囲の電力設定、周波数および前記ポリマー表面のプラズマに対する曝露時間を用いてもかまわない。有利な結果を提供するこれら３つのパラメーターの範囲は、約１０ないし約５００ワット、より好ましくは約１００ないし約４００ワットの直流または交流の電力レベルである。曝露時間は、約０．１から約３０分間までで、最も好ましくは約２−１０分間である。高周波を用いることが好ましく、約１ＭＨｚから約５０ＭＨｚまでの範囲内が好ましく、１０−２０ＭＨｚが最も好ましい。
【００３８】
本発明のポリマーコーティングは、望ましい官能基および表面特性を有する予め形成されたポリマーのＣＶＤによって形成されることがある。代替的には、化学的プラズマ重合と、望ましい官能基を有するモノマーの蒸着とを同時に行うことで、本発明のポリマーコーティングが形成される場合がある。
【００３９】
本発明のポリマーコーティングは、生体分子または細胞の共有結合による結合ができる側鎖官能基を有するいずれかのポリマーを含む場合がある。かかる側鎖官能基の例は、フッ化アシル、無水物、オキシラン（ｏｘｉｒａｎｅｓ）、アルデヒド、ヒドラジド、アジ化アシル、アジ化アリル、ジアゾ化合物、ベンゾフェノン、カルボジイミド、イミドエステル、イソチオシアナート、ＮＨＳエステル、ＣＮＢｒ、マレイミド、トシル酸、トレシルクロリド、無水マレイン酸およびカルボニルジイミダゾールを含むが、これらに限定されない。当業者は、これらの官能基は、生体分子および細胞の外層の求核性官能基と反応して、生体分子または細胞を共有結合で結合することを理解するであろう。
【００４０】
本発明の支持体の側鎖官能基と反応しうる、生体分子に存在する求核性官能基の例は、アミノ基、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基およびリン酸基を含むが、これらに限定されない。
【００４１】
同様に、本発明の支持体の側鎖官能基と反応しうる、細胞の外層に存在する求核性官能基は、糖タンパク表面抗原のグリコシルヒドロキシル基と、リジン、アルギニンおよびヒスチジンのようなタンパク質側鎖のアミノ基またはヒドロキシル基（チロシン、トリプトファン）残基と、表面タンパク質のアスパラギン酸、グルタミン酸のカルボキシル側鎖とを含むが、これらに限定されない。同様に、ある種のリン脂質および糖脂質は、共有結合による付着ができるヒドロキシル基およびアミノ基の頭部官能基を含む。求核反応性は、以下の順序に従う。
【００４２】
【化１】
2005524058.tif 000002
【００４３】
ここで、Ｒは、前記生体分子の適当な側鎖官能基をさす。
【００４４】
代替的に前記ポリマーコーティングは、生体分子および細胞の共有結合による付着に適する官能基を形成するように誘導体化されうるポリマーを含む場合がある。例えば１つの実施態様では、前記ポリマーコーティングはカルボキシル化ポリマーを含み、前記方法の前記蒸着するステップ（ｂ）は、
（ｃ）少なくとも１つの側鎖のカルボキシル基を含むカルボキシル化ポリマーコーティングを前記表面に化学的プラズマ重合法によって蒸着するステップと、
（ｄ）前記カルボキシル基を生体分子または細胞を付着することができる官能基に転化することによって、前記カルボキシル化ポリマーコーティングを活性化するステップと、
（ｅ）カルボキシル化モノマーと前記固体支持体とをプラズマチャンバー内に導入するステップと、
（ｆ）カルボキシル化ポリマーを形成する前記カルボキシル化モノマーを遊離ラジカル重合し、形成された前記カルボキシル基を含むポリマーを前記固体支持体にさらに吸着するのに十分な条件下で、ＲＦＰＤを前記プラズマチャンバー内に提供することによって、前記固体支持体に前記カルボキシル化ポリマーコーティングを形成するステップとを含む。
【００４５】
望ましい側鎖官能基を有する重合可能なモノマーのいずれかを本発明のポリマーコーティングを形成するために用いてもよい。プラズマ蒸着によって生成するポリマーフィルムの化学構造を制御する方法は、当業者に知られており（例えば、米国特許第５，１５３，０７２号明細書を参照せよ。）、ここでは詳しく説明しない。例えば１つの実施態様では反応基は、シランの化学特性を利用して付加される。例えばエポキシ基は３−グリシドキシプロピルＴＭＳ（トリメチルシラン、ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｉｌａｎｅ）を用いて、チオール基は３−メルカプトプロピルＴＭＳを用いて、アミノ基は３−アミノプロピルＴＭＳを用いて、それぞれ導入される場合がある。
【００４６】
カルボキシル化ポリマーコーティングが望ましいときには、前記重合可能なモノマーは、好ましくはカルボキシル基を含むべきである。適当なカルボキシル基を含むモノマーの例は、アクリル酸モノマー、ビニル酢酸モノマー、カルボキシ−シランモノマー、カルボキシ−シラノールモノマー、メタシレート（ｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ）モノマーおよびアシレート（ａｃｙｌａｔｅ）モノマーおよびこれらの混合物を含むが、これらに限定されない。
【００４７】
図１に示す１つの実施態様では、アクリル酸モノマー（Ｉ）が、不活性な基質とともにプラズマチャンバー内に導入される（ステップ（ａ））。ＲＦＰＤが電極間に発生し、前記カルボキシル基を含むポリマーがＣＶＤによって前記基質の表面に吸着されるようになる遊離ラジカル重合を起こす（ステップ（ｂ））。その後、前記カルボキシル基はフッ化アシルに転化される（ステップ（ｃ））。図１に示す別の実施態様では、シラン化合物（ＩＩ）が重合され、ＣＶＤによって前記固体支持体に蒸着される。
【００４８】
本発明は、カルボキシル基の具体的な活性化の化学的機構に限定されない。したがって、フッ化アシル活性化が本発明の１つの実施態様で用いられてはいるものの、ＮＨＳエステルおよびカルボニルジイミダゾールのように、利用してもよいその他多くの化学的機構がある。
【００４９】
フッ化アシル活性化が用いられるときには、活性化するステップは、前記カルボキシル基をフッ化アシル基に転化することを含む。本発明によると、前記固体支持体にフッ化アシル官能基を形成するために適当な試薬は、カルボキシル反応性フッ化試薬を含む。最も好ましい試薬は、（ジエチルアミノ硫黄）トリフルオリド（ＤＡＳＴ）である。その他の適当な試薬は、フッ化シアヌル酸（ｃｙａｎｕｒｉｃ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ）または六フッ化リン酸テトラメチルフルオロホルマジニウム（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｆｌｕｏｒｏｆｏｒｍａｄｉｎｉｕｍ  ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を含む。ポリマーのカルボキシル基がフッ化アシル基に転化されてもよい条件は、過去に記載されている（米国特許第６，２６８，１４１号明細書）。類似の条件が本発明のポリマーコーティングのカルボキシル基を活性化するのに利用されてもよいため、かかる条件はここでは説明しない。
【００５０】
前記固体支持体の表面を前処理することは、前記ポリマーコーティングの縮合、重合および吸着を増強する。１つの実施態様では、プラズマエッチングが表面前処理の方法として用いられる。表面前処理の他の方法は、当業者に知られており、例えば、硫酸のような強酸を用いるか、あるいは、６価クロム無水酢酸混液を用いる化学的酸化を含むが、これに限定されない。
【００５１】
本発明の好ましい実施態様では、基質の調製方法は、前記ポリマーコーティング用の材料を選択するステップをさらに含む。前記材料は、生体分子または細胞の共有結合のために望ましい側鎖官能基を有するポリマーコーティングを形成できる能力によって選択される。最も好ましい実施態様では、前記材料は、蒸着されたポリマーコーティングが、該コーティングと前記生体分子または細胞との間の非共有結合性相互作用が最大になるような表面特性を有するように選択される。イオン結合、疎水結合およびファンデルワールス力を含むこれらの非共有結合性相互作用は、前記生体分子または細胞の前記基質の官能基への共有結合を補充する。
【００５２】
１つの実施態様では、前記ポリマーコーティングの表面特性は、付着されるべき生体分子または細胞の表面特性と、これらの間の親和力とを最大にするために適合させる。例えば、前記生体分子または前記細胞の外部表面が疎水性のとき、前記ポリマーコーティングは疎水性であることが好ましい。ポリマーコーティングは、その構造から水を排除するときか、あるいは、容易に感知できるような濡れ（ｗｅｔｔｉｎｇ）状態になることを下になった表面が許さず、親水性の生体分子の吸着を阻止するときかに、疎水性とされる。疎水性ポリマー表面の接触角（▲記号▼、水）は、一般に、１００°以上であるが、▲記号▼４５°が親水性表面では観察される。疎水性コーティングを形成するのに用いられる場合があるポリマー材料の例は、アルキルチオール、アルキルシランおよびこれらの混合物を含むが、これらに限定されない。例えば、プラズマ重合の際に基質に導入されるメチルメタシレート（ｍｅｔｈｙｌ  ｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ）およびヘマメチルジシロキサンのモノマーは、カルボキシル基を含む疎水性ポリマーを形成するために用いられる場合がある。相対的な表面疎水性の変化は、さまざまなプラズマ表面処理で達成できる。例えばＰＤＭＳの酸素プラズマ酸化の後で、さまざまなアルキルトリクロロシランが、接触角の異なる自己組織化単層（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ、ＳＡＭｓ）を形成することができる。
【００５３】
上の段落中の「▲記号▼」は以下の記号である。
【００５４】
【化２】
2005524058.tif 000003
【００５５】
前記生体分子または前記細胞の外部表面が親水性のときには、前記ポリマーコーティングは親水性であることが好ましい。ポリマーコーティングは、水および親水性生体分子による表面の濡れを許すとき、親水性とされる。親水性コーティングを形成するための用いられる場合があるポリマー材料の例は、ポリエチレングリコール、ポリカルボン酸およびポリリジンを含むが、これらに限定されない。
【００５６】
最後に、前記生体分子または前記細胞の外部表面が陽イオンおよび陰イオンの両方の官能性を有するとき、前記ポリマーコーティングは双性イオン型であることが好ましい。ポリマーコーティングは、陰イオンおよび陽イオンの両方の電荷を有するとき、双性イオン型とされる。双性イオン型コーティングを形成するために用いられる場合があるポリマー材料の例は、双性イオン型シラン、双性イオン型デタージェントまたはその他の界面活性剤を含むが、これらに限定されない。当業者は、本発明の主な長所の１つが、関心のある生体分子および細胞の付着に合わせて調整された表面特性を有する基質の製造を可能にする、制御された重合およびコーティング方法の利用であることを理解するであろう。
【００５７】
本発明の別の実施態様では、前記ポリマーコーティングは、蒸着されるとき異なる表面特性を有する局部的な領域を形成するポリマー材料の混合物を含む。例えば前記コーティングの一部は疎水性で、別の部分は親水性または双性イオン型であってもかまわない。かかる混合されたコーティングは、異なるタイプの生体分子または細胞を同一の支持体に付着することが望ましいときに、特に有用であるかもしれない。同様にポリマー材料の混合物は、異なるタイプの生体分子または細胞に対して反応性がある少なくとも２つの側鎖官能基のタイプを有するコーティングを製造するために用いられる場合がある。したがってこの実施態様は、異なるタイプの生体分子または細胞を含むバイオアレイの構築に特に有用な場合がある。
【００５８】
例えば１つの実施態様では、前記固体支持体上に蒸着されたポリマーコーティングは、単一のシランか、シラノール化合物か、シランまたはシラノール化合物の混合物かの単層である。シランまたはシラノール化合物の混合物が用いられるとき、それぞれの化合物は、異なる官能基および／または表面特性を有する場合がある。シランまたはシラノールの混合物、例えば、疎水性シランと反応性シラン（側鎖官能基を有するシラン）との混合物、あるいは、親水性シランと反応性シランとの混合物が、付着されるべき生体分子または細胞との表面相互作用を最適化するために用いられる場合がある。
【００５９】
例えば、ｎ−オクタデシルトリメトキシシランの自己組織化単層（ＳＡＭ）はＳｉＯ２表面に形成される場合がある。それから、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）がこのＳＡＭ表面に単層を形成する。前記ＢＳＡは、抗体のような他の生体分子を固定化するための足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）として用いられる場合がある。前記基質表面の離散した位置にＳＡＭをプリントして、ＳＡＭコーティングおよびのｉＯ２の表面パターンを作ることが可能である。前記ＳｉＯ２表面は、その他の官能基を含むポリマーを有する新しい表面を形成するために、異なるＳＡＭｓでコーティングされるか、あるいは、プラズマ重合に供される。したがって、細胞表面抗原を認識する抗体が特異的な細胞タイプを固定化するために用いられることもあり、他の周囲の領域は、細胞成長因子か、例えばフィブロネクチンのような安定化剤かを固定化するために用いられることもある。
【００６０】
本発明の別の側面は、追加の表面官能基を位置特異的に付着させて表面コーティングパターンを作るための、プラズマ反応による固体支持体表面の修飾に向けられる。したがってプラスチック基質は、例えば、曝露された領域と被覆された領域とを形成するための離散した孔を有するメッシュで前記基質を覆うことによって、物理的にマスクされる場合がある。前記曝露された領域は、その後、反応性プラズマを用いてアミンまたはヒドロキシル基のような表面官能基を生成するために、プラズマで酸化、エッチングその他の処理を施される。例えば、プラスチック基質はＣＦ４−Ｏ２のプラズマ中で酸化およびエッチングされるか、アンモニアプラズマ蒸着処理で前記曝露された表面にアミノ基が導入される場合がある。このようにして、前記曝露された領域は表面処理され、被覆された領域は元々の状態の基質のまま残される。その後前記マスクは除去されてもよく、前記パターンができた基質は、さらに、プラズマ重合の際にコーティングされる場合がある。
【００６１】
代替的に、プラズマ処理された前記曝露された領域は、他の表面官能基で独立かつ位置特異的にコーティングされる場合がある。これは、異なる隣接した表面化学特性を生じさせるために処理された領域および／または未処理の領域化学物質をプリントすることによって達成されることがある。例えば酸化された領域は前記曝露された領域を親水性にするカルボキシル基を含む場合がある一方、前記未処理の領域は疎水性のままで残る。その後タンパク質のような生体分子が、反応性のカルボキシルエステルの形成を触媒するＥＤＡＣ／ＮＨＳのような縮合剤の存在下で、前記タンパク質のリジン残基を前記基質のカルボキシル基と反応させることによって、前記曝露された領域に共有結合で付着させる場合がある。今度は、これらが前記タンパク質の側鎖のアミノ基と縮合する。アリルアルコールのプラズマは、ポリエチレンオキシドを前記曝露された領域にグラフトするための用いることができる、表面のヒドロキシル基を生成する。かかる表面は、実質的に低減されたタンパク質吸着を示す。
【００６２】
本発明は、前記方法によって調製された、生体分子または細胞を固定するための基質を提供する。本発明の基質は生物学的活性の評価または同定用の生体分子および細胞のアレイの調製に特に有用であるため、１つの実施態様では、前記固体支持体は少なくとも１つの平らな表面を有する器具の形態をしている。前記固体支持体のサイズは、変化させることができ、固定化された前記生体分子および細胞の最終的な用途に依存する。当業者は、例えば、小型化された固体支持体に固定化された生体高分子のアレイが多年にわたって開発されてきたことを理解する。これらの固体支持体は、ｍｍ２のオーダーのサイズの面積を有し、それぞれが異なる生体高分子を前記小型化された固体支持体の異なる位置特異的な場所に付着した、多数の異なる固定化された体高分子を有することがある。
【００６３】
ディップスティック（ｄｉｐ  ｓｔｉｃｋ）状の固体支持体も本発明の範囲内である。本発明の技術分野で知られているとおり、ディップスティックは、典型的には、各辺が数センチメーターの長方形をしている。他方、全ゲノム配列決定用の大きなポリヌクレオチドのような生体高分子のアレイは、１メーター以上の寸法を有する場合がある。特殊な試験設備を含む多数の異なる試験技術に適合するために、適当な固体支持体が、さまざまな形状のいずれであっても、型に入れて作ることができる。
【００６４】
本発明の１つの実施態様によると、本発明の固体支持体は、多孔性または非孔性の材料で作られる場合がある。本発明の別の実施態様によると、本発明の固体支持体は、糸、シート、フィルム、ゲル、膜、ビーズ、プレートその他の構造の形状の場合がある。本発明のさらなる実施態様によると、固体支持体は、ウェルか、溝か、架台か、疎水性または親水性のパッチか、ウェルを形成する、打ち抜きの接着性のある貯液槽または薄層状のガスケットの打ち抜きか、その他の流体の流れの物理的な障害物かの形状をした、離散し隔離された領域を有する平面的な器具の形状にプラスチックから加工される場合がある。かかる固体支持体の例は、マイクロプレート等を含むが、これらに限定されない。
【００６５】
１つの実施態様では、前記固体支持体は、前記生体分子または細胞の共有結合ができない不活性な材料でできている。かかる不活性な材料は、未修飾なポリマー材料、セラミック材料、金属、天然繊維、シリコーン、ガラスおよびこれらの複合材料を含む。
【００６６】
別の実施態様では前記固体支持体は、第１の生体分子または第１の細胞を付着するために適当な少なくとも１つの第１の側鎖官能基を有する、例えばポリマーのような材料を含む。この実施態様では、前記ポリマーコーティングは、第２の生体分子または第２の細胞を共有結合するために適当な少なくとも１つの第２の側鎖官能基を含む場合がある。第１および第２の側鎖官能基が、同じ場合も、異なる場合もある。第１および第２の官能基は、前記生体分子または細胞を共有結合で結合するいずれかの官能基である。例えば第１および第２の官能基は、フッ化アシル、無水物、オキシラン、アルデヒド、ヒドラジド、アジ化アシル、アジ化アリル、ジアゾ化化合物、ベンゾフェノン、カルボジイミド、イミドエステル、イソチオシアナート、ＮＨＳエステル、ＣＮＢｒ、マレイミド、トシル酸、トレシルクロリド、無水マレイン酸およびカルボニルジイミダゾールからなるグループから独立に選択される場合がある。
【００６７】
好ましい実施態様では、第１の官能基を付着した下になる支持体が、生体分子または細胞を結合する前記支持体の能力を向上させるポリマー材料でコーティングされる。例えば、前記ポリマーコーティングの材料は、より親水性（あるいは、疎水性または双性イオン型か、電荷または親和性に基づく分子識別）の第１の官能基の周囲の局所的な環境を提供するように選択される。電荷を有する官能基は、硫酸基からのような形式電荷を提供する。親和性原子団は、抗体、プロテインＡ等のリガンド結合ドメインを含むことがある。第１の官能基の周囲の局所的な環境を変化させることによって、前記生体分子または細胞の吸着の増強が達成される場合がある。その後、前記基質に吸着された生体分子または細胞は、第１の官能基とより効率的に結合するであろう。
【００６８】
別の実施態様では、本発明の化学的プラズマ重合工法が、下になる支持体の数より反応部位の数を増加させるために用いられる。例えば、ある一定数の第１の側鎖官能基を有する支持体がある場合に、前記生体分子および細胞の結合に寄与する第２の側鎖官能基を有するポリマーコーティングを作ることができる。したがって、より高密度に配置された生体分子または細胞を結合する原子団が形成されうる。
【００６９】
本発明の基質は、生体分子および細胞の付着に非常に適する。したがってさらなる側面では、本発明は、生体分子および細胞を固体支持体に付着させる方法を提供する。前記方法は、
（ａ）生体分子または細胞を用意するステップと、
（ｂ）表面を有する固体支持体を用意するステップと、
（ｃ）前記生体分子または細胞を付着することができる少なくとも１つの側鎖官能基を含むポリマーコーティングを、前記表面に化学的プラズマ重合工法によって蒸着するステップと、
（ｄ）前記生体分子または細胞と、前記側鎖官能基との結合を可能にする条件下で、コーティングされた前記基質に前記生体分子または細胞を接触させるステップとを含む。
【００７０】
前記生体分子または細胞は、該生体分子または細胞の前記固体支持体への付着を可能にするのに十分な条件下で接触させることによって、本発明の前記コーティングされた基質に付着する。ある条件が十分であるとされるのは、前記生体分子または前記細胞の外部表面が、前記生体分子または細胞と前記基質との共有結合による付着のために前記ポリマーコーティングの側鎖官能基と反応できる場合である。例えば側鎖官能基がフッ化アシルである場合、米国特許第６，２６８，１４１号明細書に説明されるとおり、ポリヌクレオチドのような生体分子は、前記ポリマーコーティングに含まれるフッ化物基の前記生体分子の求核基との置換によって固体支持体に付着される場合がある。
【００７１】
例えば、５’アミノ修飾されたオリゴヌクレオチドは、フッ化アシル、アルデヒドまたはエポキシドのような末端官能基で活性化される表面ポリマーと反応する。糖タンパク質の糖質官能基は、過ヨウ素酸でアルデヒドに酸化される場合があり、該アルデヒドは、今度は、表面のヒドラジド基を含むポリマー支持体と反応する。同様に、酵母、細菌その他の微生物のような細胞は、グルタールアルデヒド処理によって前記固体支持体に付着される場合がある。
【００７２】
ＨｅＬａ細胞または３Ｔ３細胞は、間接的に、フィブロネクチンで覆われた表面との会合によって最もよく付着する。フィブロネクチンは、グルタールアルデヒドのクロスリンキングによって共有結合で付着する。脂質は、頭部官能基の反応によって表面に共有結合で付着する。例えばアミン頭部官能基（Ｒ−ＰＯ３Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３＋）を有するフォスファチジルエタノールアミンは、ＳＰＤＰのようなヘテロ二機能性クロスリンキング剤を介して、チオール基で活性化された表面に連結されうる。逆にリン脂質の尾部官能基は、アルキル鎖を含むポリマーの自己組織化単層に覆われた表面に吸着によって付着する場合がある。
【００７３】
側鎖官能基がフッ化アシルで、生体分子がポリヌクレオチドである本発明の１つの実施態様によると、コーティングされた前記基質に前記ポリヌクレオチドを接触させるステップは、好ましくは中性または塩基性のｐＨを有する、水溶性バッファーの存在下で実施される。前記フッ化アシル官能基を中性または塩基性ｐＨの条件下で前記ポリヌクレオチドと接触させることは、前記ポリヌクレオチドを前記ポリマーコーティングの表面に直接的に付着させることにつながる。本発明の目的のためには、塩基性ｐＨ条件とは、８より高いｐＨを有する条件をいう。塩基性ｐＨ条件は、前記ポリヌクレオチドの前記固体支持体への付着を可能にする場合に十分であるとされる。本発明の１つの実施態様によると、本発明の塩基性ｐＨ条件は、約９ないし１２のｐＨを有する。前記塩基性ｐＨ条件は、用いる方法に応じて変更されてもかまわない。当業者は、本発明の開示を参照して、具体的な付着反応の塩基性ｐＨ条件を容易に確認することができる。
【００７４】
本発明のコーティングされた基質は、本発明の技術分野で知られた方法によって生体分子および細胞に接触される場合がある。例えば、前記接触させるステップは、ソレノイドまたはピエゾ素子で駆動される非接触型ジェットプリント法によって実施されてもよい。代替的に、固体または開口キャピラリ素子コンタクトプリント法（ｓｏｌｉｄ  ｏｒ  ｏｐｅｎ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｄｅｖｉｃｅ  ｃｏｎｔａｃｔ  ｐｒｉｎｔｉｎｇ）、微小流体力学的チャンネルプリント法、シルクスクリーン法および電気化学的または電磁気的な力に基づくプリント素子を用いる技術が用いられる場合がある。
【００７５】
前記コーティングされた基質は、手作業のスポッティングによって生体分子に曝露される場合もある。手作業のスポッティングの例は、ピペッタまたはＢｉｏｍｅｋ（商標）のピンツールで手作業でスポッティングすることを含むが、これらに限定されない。この場合、好ましい水溶性塩基はｐＨ範囲９ないし１０の重炭酸−炭酸ナトリウムの場合がある。別の実施態様では、前記固体支持体はジェットプリント法によって未修飾のポリヌクレオチドに曝露される。市販のジェットプリンタを用いる熱インクジェットプリント法と、米国特許第４，８７７，７４５号明細書に説明されるピエゾ電子マイクロジェットプリント法とが、未修飾のポリヌクレオチドを固体支持体にスポッティングするために利用可能である。この場合には、水溶性塩基は、ｐＨ約１０ないし１２のＬｉＣｌ塩溶液の場合がある。
【００７６】
本発明のコーティングされた基質は、生体分子または細胞が固体支持体に接触される限り、いかなる方法によって前記生体分子または細胞に曝露されてもかまわないことが理解されるべきである。ここに明示的に記載されていない他の水性バッファーシステムも、生体分子または細胞と前記コーティングされた基質とが互いに接触するとき、該バッファーシステムが前記生体分子または細胞の前記コーティングされた基質への付着を可能にする十分な条件を提供する限り、本発明に利用される場合があることも理解されるべきである。
【００７７】
本発明の実施態様によると、水溶液中に含まれる生体分子および細胞の濃度は、分子または細胞のタイプ、そのサイズ、構造その他の前記分子および細胞の溶解性および付着性に影響を与えるかもしれない因子に応じて変更してもよい。したがって、官能基の最適な表面密度を決定することが重要である。表面密度が低すぎるときには、付着は非効率的な場合がある。表面密度が高すぎるときには、付着は立体障害効果によって阻止される場合がある。例えば、付着したポリマーがポリヌクレオチドのとき、該ポリマーは５ｎＭないし４０μＭの範囲内であることが好ましい。前記ポリマーは５ｎＭないし５μＭの範囲内であることがより好ましい。細胞は、そのサイズに応じて、スポットあたり１０ないし１０００個付着される場合がある。同様に、他の生体分子の付着のために最適な表面密度は、ルーティン化した実験を通じて当業者によって容易に決定される場合がある。
【００７８】
本発明によると、生体分子または細胞の前記コーティングされた基質への付着の後で、望ましくないさらなる反応を起こさないように未反応の側鎖官能基を「ブロック」することが好ましい。本発明の目的のためには、前記固体支持体またはポリマーコーティングに含まれる側鎖官能基は、残存する反応基を不活性化することのできるいかなる化学物質によってブロックされてもかまわない。例えば未反応のフッ化アシル官能基は、水酸化アンモニウムと反応させられてカルボキシルアミドを形成するか、あるいは、エタノールと反応させられてエステルを形成するかしてもよい。しかし当業者はさまざまなブロッキング反応がありうることを認識するであろう。
【００７９】
上述のとおり、固定化された生体分子および細胞を用いる多くの用途は、生体分子および細胞が固体支持体表面で位置特異的な場所に固定化されることを要求する。固定化された生体分子または細胞のそれぞれが位置特異的な場所に配置されたグリッドおよび１  ｘ  ｎのアレイを含む、生体分子および細胞の整列したアレイを調製するために、前記コーティングされた基質の表面の予め選択された位置が、望ましい生体分子または細胞の溶液に曝露される。本発明によると、これは、ある量の生体分子または細胞の溶液を前記コーティングされた基質の予め選択された位置に適用することによって手作業で達成できる。代替的には、市販のジェットプリンタを利用する熱インクジェットプリント法と、米国特許第４，８７７，７４５号明細書に説明されるピエゾ電子マイクロジェットプリント法とが、選択されたコーティングされた基質表面位置を選択された生体分子または細胞でスポッティングするために利用されうる。
【００８０】
本発明のコーティングされた基質への生体分子および細胞の付着は、ジェノセンサーと、差次的遺伝子発現マイクロアレイのようなその他のアレイに基づくシステムとの構築に用いるのに非常に適している。その結果、本発明の別の側面は、
（ａ）複数の生体分子または細胞を用意するステップと、
（ｂ）表面を有する固体支持体を用意するステップと、
（ｃ）コーティングされた基質を形成するために、前記生体分子または細胞を付着できる少なくとも１つの側鎖官能基を含むポリマーコーティングを前記表面に化学的プラズマ重合工法によって蒸着するステップと、
（ｄ）前記生体分子または細胞と、前記コーティングされた基質の離散した場所に含まれる前記側鎖官能基とを結合させて、バイオアレイを形成することを可能にする条件下で、前記生体分子または細胞を前記離散した場所と接触させるステップとを含む方法によって調製される、バイオアレイを提供する。
【００８１】
本発明の生体分子が付着された固体支持体は、リガンド結合アッセイを実施するため、あるいは、逆ハイブリダイゼーション（プローブが付着される）またはサザンブロッティング（標的が付着される）のいずれかによるハイブリダイゼーションアッセイを実施するための装置として使用される場合がある。かかる装置は、免疫アッセイにも利用される場合がある。生物医学研究におけるバイオアレイの利用方法は当業者に周知で、ここでは説明しない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８２】
以下の実施例は、本発明の範囲を例示することを意図するものであって、限定することを意図するものではない。かかる実施例は、使用されるかもしれないものの典型ではあるが、当業者に知られた他の手順が代替的に用いられてもよい。実際、当業者は、ここの開示内容に基づいて、過度の実験を要することなく、さらなる実施態様を容易に想到し、作出することができる。
【実施例１】
【００８３】
ＲＦＰＤ−ＣＶＤ法によるアクリル酸またはビニル酢酸のポリマーコーティングのポリプロピレンシートまたはガラススライドへの蒸着
清浄なガラススライドおよび／またはポリプロピレンポリマーシートがプラズマチャンバー内に入れられた。前記材料は、ＲＦＰＤ（ｒａｄｉｏｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｐｌａｓｍａ  ｄｉｓｃｈａｒｇｅ、高周波プラズマ放電）法で開始された酸素プラズマ（〜１５０ないし〜１８０ｍｔｏｒｒ  Ｏ２、〜４５０ないし〜５００ワットの高周波出力、３分間）に供された直後に、アルゴン雰囲気下（〜２４０ｍｔｏｒｒ  Ａｒ、５００ワットの高周波出力、３分間）で前記チャンバー内に送達されたアクリル酸（またはビニル酢酸）モノマーのエアロゾルが導入された。プラズマ重合工法は、アルゴン雰囲気（〜１６５ｍｔｏｒｒ  Ａｒ、０ワットの高周波出力、３分間）中でクエンチされた。前記コーティング材料は、前記チャンバーから除去され、密封されたポリエチレン袋内に保存された。
【００８４】
アクリル酸（ＡＡ）およびビニル酢酸（ＶＡ）の蒸着は、本発明の新規な工法の最適条件を決定するためにさまざまな出力レベルで繰り返された。ＡＡ重合については、出力レベルは以下のとおり設定された。工法１（５００Ｗ）、工法２（２５０Ｗ）および工法３（３００Ｗ）。ＶＡ重合については、出力レベルは以下のとおり設定された。工法４（５００Ｗ）、工法５（２５０Ｗ）および工法６（３００Ｗ）。
【実施例２】
【００８５】
従来技術のＲＦＰＤ／ＮＨ３法による生体分子の固定化用基質の調製
ポリプロピレンポリマーシートがＲＦＰＤプラズマチャンバー内に入れられた。前記チャンバーは無水アンモニアガスで満たされた（〜２５０ｍｔｏｒｒ、ＮＨ３、４分間）。ＲＦＰＤは、アンモニア雰囲気（〜３００ｍｔｏｒｒ）中で２００ワットの高周波出力で２分間開始された。出力が停止されて、前記基質はアンモニア存在下でクエンチされ（〜２５０ｍｔｏｒｒ、２分間）、その後にアルゴン（〜２６５ｍｔｏｒｒ）で１０分間クエンチされた。表面がアミノ化された材料は、前記チャンバーから除去されて、密封されたポリエステルの袋に入れて保存された。
【実施例３】
【００８６】
本発明のコーティングされた基質と、従来技術のアミノ化基質との生体分子結合能の比較
ポリプロピレンスライド、マイクロプレートおよびガラススライドは、アクリル酸モノマーまたはビニル酢酸モノマーを用いるＲＦＰＤ−ＣＶＤ工法によってコーティングされた。核酸およびタンパク質は、これらの表面にうまく固定化された。
【００８７】
未使用の（ｖｉｒｇｉｎ）ポリプロピレンシート（２０ｍｍ）は、アンモニアガス雰囲気中でＲＦＰＤによって表面アミノ化処理され、カルボキシル基を形成するために無水コハク酸で誘導体化され、上述のとおり（従来技術の方法）フッ化アシル型に転化された。代替的に、未使用のポリプロピレンシートは、カルボキシル基を含むポリマーの表面コーティングを調製するためにＲＦＰＤ−ＣＶＤ工法に供され、今度は、フッ化アシル型に転化された。前記表面活性にアクセスするために、それぞれのシートは、以下のとおり、前記フッ化アシルの求核攻撃によって共有結合的に付着されたアミノ−ビオチン化合物（ＢＡＰＡ）でプリントされた。
【００８８】
【化３】
2005524058.tif 000004
【００８９】
ストレプトアビジン−アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）とのインキュベーション（ｐＨ７．２、２５°Ｃ、０．５時間）の後、前記シートは、酵素標識蛍光（ＥＬＦ）シグナル発色試薬（モレキュラープローブ社、オレゴン州、ユージーン）を用いて、ビオチン−ストレプトアビジン結合について比較された。アレイ全体にわたって典型的な蛍光スポットの対応する領域が統計解析用に選択された。前記アレイのそれぞれのこれら２つの領域（下部の２ｘ４サブアレイ、下部右側の１ｘ７サブアレイ）が比較され、平均および標準偏差が計算された。前記ＲＦＰＤ−ＣＶＤコーティング工法は、前記ＲＦＰＤ／ＮＨ３表面活性化工法に比べて著しく表面結合能が増大するようにみえた。
【００９０】
以上、かなり詳細に好ましい実施態様に関して説明したが、これらは開示内容または添付する請求の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。当業者の理解しえる範囲内での改変および変更は、添付する請求の範囲に該当するものとする。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】本発明のアレイ表面の形成とその生体分子結合への利用を示す工程図。
【図２】本発明の高周波プラズマ放電−化学的蒸着（ＲＦＰＤ−ＣＶＤ）法によって調製されたカルボキシル基を含むポリマーでコーティングされた基質と、従来技術のアンモニアガス雰囲気中でのＲＦＰＤ法により表面活性化処理された基質との表面結合能を比較する棒グラフ。
【図１】
2005524058.tif 000005
【図２】
2005524058.tif 000006
【国際調査報告】
2005524058.tif 000007
2005524058.tif 000008