(57)【要約】  陰イオン交換材料を使用する、生体サンプル混合物から負に帯電した小さい分子を除去するための方法およびデバイス（１０）。
2005514014.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体サンプル混合物から、負に帯電した小さい有機分子を除去する方法であって、
陰イオン交換材料を含む表面を提供するステップと、
約６，０００未満の分子量を有する、負に帯電した小さい有機分子を含む生体サンプル混合物を提供するステップであって、前記生体サンプル混合物が、核酸増幅反応混合物および核酸標識反応混合物からなる群から選択されるステップと、
前記生体サンプル混合物から前記負に帯電した小さい有機分子の少なくとも一部を除去するために、前記生体サンプル混合物を、前記陰イオン交換材料を含む表面と接触させるステップと、
を含む方法。
【請求項２】
生体サンプル混合物から、負に帯電した小さい有機分子を除去する方法であって、
負に帯電したポリマーで部分的に被覆された陰イオン交換材料を含む表面を提供するステップと、
生体サンプル混合物を提供するステップと、
前記生体サンプル混合物から、前記負に帯電した小さい有機分子の少なくとも一部を除去するために、前記生体サンプル混合物を、前記負に帯電したポリマーで部分的に被覆された陰イオン交換材料を含む表面と接触させるステップと、
を含む方法。
【請求項３】
前記負に帯電したポリマーが、高分子電解質である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記負に帯電した高分子電解質が、ポリスチレンスルホン酸、ポリビニルホスホン酸、ポリビニルホウ酸、ポリビニルスルホン酸、ポリビニル硫酸、ポリスチレンホスホン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、リグノスルホネート、カラギーナン、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、それらの塩類、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記陰イオン交換材料が、四級化窒素を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記生体サンプル混合物が、核酸シークエンシング反応混合物である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記負に帯電した小さい有機分子が、色素標識ターミネーター、プライマー、分解された色素分子、デオキシヌクレオチド三リン酸、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記負に帯電した小さい有機分子が、色素標識ターミネーターを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記色素標識ターミネーターが、ジデオキシヌクレオチド三リン酸、ジデオキシヌクレオチド二リン酸、ジデオキシヌクレオチド一リン酸、ジデオキシヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記生体サンプル混合物と、前記負に帯電したポリマーで部分的に被覆された陰イオン交換材料を含む表面との接触が、前記生体サンプル混合物から実質的に全ての前記色素標識ターミネーターを除去するのに有効な条件で実行される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記生体サンプル混合物が、ＰＣＲ反応混合物である、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
前記負に帯電した小さい有機分子が、プライマー、分解された色素分子、デオキシヌクレオチド三リン酸、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記生体サンプル混合物と、前記負に帯電したポリマーで部分的に被覆された陰イオン交換材料を含む表面との接触が、前記生体サンプル混合物から実質的に全てのプライマーを除去するのに有効な条件で実行される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記負に帯電した小さい有機分子が、約６，０００未満の分子量を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
前記生体サンプル混合物と、前記負に帯電したポリマーで部分的に被覆された陰イオン交換材料を含む表面との接触が、接触している間ずっと攪拌することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
マイクロ流体デバイス内で実行される、請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
生体サンプル混合物から、負に帯電した小さい有機分子を除去する方法であって、
負に帯電した高分子電解質で部分的に被覆された第四級アンモニウムイオンを含む表面を提供するステップと、
生体サンプル混合物を提供するステップと、
前記生体サンプル混合物から、前記負に帯電した小さい有機分子の少なくとも一部を除去するために、前記生体サンプル混合物を、前記負に帯電した高分子電解質で部分的に被覆された第四級アンモニウムイオンを含む表面と接触させるステップと、
を含む方法。
【請求項１８】
生体サンプル混合物から、負に帯電した小さい有機分子を除去する方法であって、
負に帯電した高分子電解質で部分的に被覆された第四級アンモニウムイオンを含む表面を提供するステップと、
生体サンプル混合物を提供するステップと、
前記生体サンプル混合物から、前記負に帯電した小さい有機分子の少なくとも一部を除去するために、前記生体サンプル混合物を、前記負に帯電した高分子電解質で部分的に被覆された第四級アンモニウムイオンを含む表面と接触させるステップと、
を含み、
前記生体サンプル混合物が、核酸増幅反応混合物を含む、
方法。
【請求項１９】
マイクロ流体デバイス内で実行される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
生体サンプル混合物から、負に帯電した小さい有機分子を除去する方法であって、
陰イオン交換材料を含む表面を含む少なくとも１つのプロセスアレイを含むデバイスを提供するステップと、
生体サンプル混合物を、前記少なくとも１つのプロセスアレイ内に提供するステップであって、前記生体サンプル混合物が、約６，０００未満の分子量を有する、負に帯電した小さい有機分子を含むステップと、
前記生体サンプル混合物を、前記少なくとも１つのプロセスアレイ内で移動させるステップであって、前記生体サンプル混合物から、前記負に帯電した小さい有機分子の少なくとも一部を除去するのに十分な時間、前記生体サンプル混合物および前記陰イオン交換材料を含む表面が接触したままであるステップと、
を含む方法。
【請求項２１】
生体サンプル混合物から、負に帯電した小さい有機分子を除去する方法であって、
負に帯電したポリマーで部分的に被覆された陰イオン交換材料を含む表面を含む少なくとも１つのプロセスアレイを含むデバイスを提供するステップと、
生体サンプル混合物を、前記少なくとも１つのプロセスアレイ内に提供するステップと、
前記生体サンプル混合物を、前記少なくとも１つのプロセスアレイ内で移動させるステップであって、前記生体サンプル混合物から、前記負に帯電した小さい有機分子の少なくとも一部を除去するのに十分な時間、前記生体サンプル混合物および前記負に帯電したポリマーで部分的に被覆された陰イオン交換材料を含む表面が接触したままであるステップと、
を含む方法。
【請求項２２】
前記負に帯電したポリマーが、高分子電解質である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記負に帯電した高分子電解質が、ポリスチレンスルホン酸、ポリビニルホスホン酸、ポリビニルホウ酸、ポリビニルスルホン酸、ポリビニル硫酸、ポリスチレンホスホン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、リグノスルホネート、カラギーナン、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、それらの塩類、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記陰イオン交換材料が、第四級アンモニウムイオンを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記生体サンプル混合物が、核酸シークエンシング反応混合物である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記負に帯電した小さい有機分子が、色素標識ターミネーター、プライマー、分解された色素分子、デオキシヌクレオチド三リン酸、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記負に帯電した小さい有機分子が、色素標識ターミネーターを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記色素標識ターミネーターが、ジデオキシヌクレオチド三リン酸、ジデオキシヌクレオチド二リン酸、ジデオキシヌクレオチド一リン酸、ジデオキシヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記生体サンプル混合物および前記負に帯電したポリマーで部分的に被覆された陰イオン交換材料を含む表面が、前記生体サンプル混合物から、実質的に全ての前記色素標識ターミネーターを除去するのに有効な条件で接触される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記生体サンプル混合物が、ＰＣＲ反応混合物である、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
前記負に帯電した小さい有機分子が、プライマー、分解された色素分子、デオキシヌクレオチド三リン酸、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記生体サンプル混合物および前記負に帯電したポリマーで部分的に被覆された陰イオン交換材料を含む表面が、前記生体サンプル混合物から、実質的に全ての前記プライマーを除去するのに有効な条件で接触される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記負に帯電した小さい有機分子が、約６，０００未満の分子量を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項３４】
前記生体サンプル混合物および前記負に帯電したポリマーで部分的に被覆された陰イオン交換材料を含む表面が、接触した状態で攪拌される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３５】
前記少なくとも１つのプロセスアレイが、充填チャンバ、少なくとも１つの処理チャンバ、および前記充填チャンバと前記少なくとも１つの処理チャンバとを接続する少なくとも１つの流通路を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３６】
生体サンプル混合物から、負に帯電した小さい有機分子を除去する方法であって、
負に帯電した高分子電解質で部分的に被覆された第四級アンモニウムイオンを含む表面を含む少なくとも１つのプロセスアレイを含むデバイスを提供するステップと、
生体サンプル混合物を、前記少なくとも１つのプロセスアレイ内に提供するステップと、
前記生体サンプル混合物を、前記少なくとも１つのプロセスアレイ内で移動させるステップであって、前記生体サンプル混合物から、前記負に帯電した小さい有機分子の少なくとも一部を除去するのに十分な時間、前記生体サンプル混合物および前記負に帯電した高分子電解質で部分的に被覆された第四級アンモニウムイオンを含む表面が接触したままであるステップと、
を含む方法。
【請求項３７】
前記生体サンプル混合物が、核酸増幅反応混合物を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記生体サンプル混合物および前記負に帯電した高分子電解質で部分的に被覆された第四級アンモニウムイオンを含む表面が、接触した状態で攪拌される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
生体サンプル混合物から負に帯電した小さい有機分子を除去する際に使用するためのデバイスにおいて、
複数のプロセスアレイを含み、各プロセスアレイが、以下：
各処理チャンバが生体サンプル混合物を収容するためのボリュームを画定する、複数の処理チャンバ；および
前記複数の処理チャンバを接続する少なくとも１つの流通路；
を含み、さらに、
陰イオン交換材料を含むプロセスアレイの少なくとも１つの内側の表面、
を含むデバイス。
【請求項４０】
複数の弁をさらに含み、前記弁の少なくとも１つが、前記少なくとも１つの流通路に沿って位置する、請求項３９に記載のデバイス。
【請求項４１】
前記複数のプロセスアレイが、複数の独立したプロセスアレイを含む、請求項３９に記載のデバイス。
【請求項４２】
前記複数のプロセスアレイが、前記デバイス上に放射状に配列されている、請求項３９に記載のデバイス。
【請求項４３】
前記陰イオン交換材料を含む表面が、負に帯電したポリマーで部分的に被覆された陰イオン交換材料を含む、請求項３９に記載のデバイス。
【請求項４４】
前記負に帯電したポリマーが、高分子電解質である、請求項４３に記載のデバイス。
【請求項４５】
前記陰イオン交換材料、前記負に帯電したポリマー、またはその両者が、パターン塗布される、請求項４３に記載のデバイス。
【請求項４６】
１つ以上の貯蔵容器、および表面に接着され、かつ前記１つ以上の貯蔵容器を取り巻くカバーフィルムが付いた表面を含む分析容器であって、前記カバーフィルムが、バッキング、および前記バッキングの少なくとも１つの主表面上に配置されかつ前記容器表面と接触している接着剤を含み、前記接着剤の少なくとも一部が、その上に配置された陰イオン交換材料を有する、分析容器。
【請求項４７】
前記陰イオン交換材料が、第四級アンモニウムイオンを含む、請求項４６に記載の分析容器。
【請求項４８】
前記陰イオン交換材料が、負に帯電したポリマーで部分的に被覆されている、請求項４６に記載の分析容器。
【請求項４９】
前記負に帯電したポリマーが、高分子電解質である、請求項４８に記載の分析容器。
【請求項５０】
前記陰イオン交換材料、前記負に帯電したポリマー、またはその両者が、パターン塗布される、請求項４８に記載の分析容器。
【請求項５１】
生体サンプル混合物を収容するように構成された複数の貯蔵容器を含む分析容器であって、少なくとも１つの貯蔵容器が、その中に配置された、負に帯電したポリマーで部分的に被覆された陰イオン交換材料を含む表面を含む、分析容器。
【請求項５２】
前記陰イオン交換材料が、第四級アンモニウムイオンを含み、前記負に帯電したポリマーが、負に帯電した高分子電解質である、請求項５１に記載の分析容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
水溶性色素（たとえば、蛍光、化学発光、可視、および近赤外）は、生物学的反応の成分を標識およびモニターするために、分子生物学でごく普通に使用される。多くの下流使用を続ける前に、残留色素ならびに他の有機分子を除去すべきことがよくある。したがって、本発明は、特に、低容量、マイクロ流体デバイスで、生物学的混合物から、色素および他の有機分子を除去することに関する。
【背景技術】
【０００２】
生物学的反応において、サンプル処理量を増加させ、かつサンプル当たりの使用試薬量を減少させる（それによって、サンプル当たりの費用を低減させる）ためには、ハイ・スループット、低容量、一体型マイクロ流体デバイスが大いに必要である。少量のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および核酸サイクルシークエンシング反応は、小型形式に組み入れるのに好適な標準分子生物学技術の例である。両用途における、残留プライマー、核酸鋳型、色素、および他の有機分子の除去は、一般に、さらなる下流使用の前に必要である。
【０００３】
このような除去方法が使用される１例は、出発サンプル（たとえば、血液、細菌溶解物等々の生サンプル）からの、完成したサンプル（たとえば、精製された核酸物質）の調製にある。たとえば、所望の材料の精製サンプルを高濃度で得るためには、一般に、出発サンプルをＰＣＲ向けに調製し、その後ＰＣＲ法を実施して、所望の一般的なＰＣＲ反応生成物を得る。その後、一般的なＰＣＲ反応生成物は、たとえば、シークエンシング、クローニング、遺伝子型特定、および科学捜査用途を含む様々な分子生物学的用途で、使用することができる。
【０００４】
蛍光に基づくＤＮＡシークエンシング用途では、ＤＮＡ配列断片を分析する前に、組み入れられていないダイターミネーター（すなわち、ジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）等の、色素標識したジデオキシターミネーター）を、好ましくは、反応混合物から除去すべきである。ダイターミネーター分子の濃度を十分に低下できないことは、ＤＮＡ配列情報を著しく分かりにくくする可能性がある色素人工物（すなわち、他の色素含有分子、たとえばジデオキシヌクレオチド二リン酸（ｄｄＮＤＰ）、ジデオキシヌクレオチド一リン酸（ｄｄＮＭＰ）、およびジデオキシヌクレオシド等の色素標識したジデオキシターミネーター）につながる。シークエンシング反応精製は、特にキャピラリー電気泳動（ＣＥ）シーケンサーを使用するとき、配列分析前のサンプル調製における望ましいステップである。
【０００５】
従来、ＰＣＲまたはサイクルシークエンシング反応の完了後、その生成物は、一般に、アルコール（エタノールまたはイソプロパノール）沈殿またはゲル濾過クロマトグラフィのいずれかで精製される。ポリアルキレングリコールおよびビオチン−ストレプトアビジン相互作用を使用する他のプロトコールも、シークエンシング反応浄化に使用されてきた。限外濾過膜、フェノール／クロロホルム抽出、および酵素処理は、ＰＣＲおよびシークエンシング反応混合物の精製によく使用される、他の方法である。
【０００６】
ＰＣＲおよび核酸シークエンシング反応を精製するための、このような従来の技術は、マイクロ流体デバイスに組み入れるのに適していることは証明されていない。アルコール沈殿は、揮発性で可燃性の試薬を使用する。サイズ排除クロマトグラフィでよく使用されるヒドロゲル類（たとえば、架橋デキストラン類）は、生成物から不純物を効率よく分離するために、大きいカラム床体積（サンプルの体積に比して１０倍）を必要とする。先ず、比較的大量の水でゲルを膨潤させ、遠心分離し、実質的に即座に充填するが、それは、これらの材料は脱水するとすぐにひび割れする傾向があるためである。ビオチン−ストレプトアビジンが介在する精製は、生成物を効率よく捕捉するために通例使用されるビオチニル化プライマーの使用を必要とする。ビオチニル化生成物は、一般に、ストレプトアビジン処理した常磁性粒子上に捕捉され、磁石を用いて不純物から物理的に分離される。あるいは、ＰＣＲまたは核酸配列決定生成物のハイブリダイゼーションに基づく精製（ＨＢＰ）は、特別にデザインされたキャプチャータグを含有するプライマーを使用することによって実施される。生物学的マトリックスからの核酸断片の分離は、キャプチャータグを、固体支持体に結合した相補鎖にハイブリダイズすることによって達成することができる。ビオチン法もＨＢＰ法も、すすぎ工程に引き続いて、基材からシークエンシングまたはＰＣＲ産物を溶離することを必要とする。ビオチン−ストレプトアビジン法およびＨＢＰ精製法は、不純物を含まないＰＣＲおよびシークエンシング断片を生成するが、両手法とも、特注のプライマーを必要とし、これは厄介でかつ高価である。
【０００７】
残留ダイターミネーターをＤＮＡシークエンシング反応から除去するための代替手法は、反応混合物を酵素（たとえば、エビ・アルカリホスファターゼ）で処理して、残留ヌクレオチド三リン酸を脱ホスホリル化することを含む。色素標識したジデオキシヌクレオチド三リン酸からリン酸基を切断することにより、シークエンシングゲルにおける色素標識ヌクレオチドの移動度は変化するが、残留色素部分は、これらの手順で反応混合物から除去されないため、サンプルをシーケンサーに注入する前に、やはり排除しなければならない。これは、一般に、後続の消化産物のアルコール沈殿によって実施される。
【０００８】
ＰＣＲおよびシークエンシング産物は、カオトロピック剤を使用して、核酸断片をビーズおよびシリカゲル膜上に吸着させることにより、効果的に精製することができる。不純物（たとえば、残留プライマー、色素、および塩類）を基材からすすぎ落とし、そして精製された生成物を、溶離することができる。マイクロ流体デバイスという状況では、この多段結合／すすぎ／溶離精製スキームも、厄介な可能性がある。
【０００９】
好ましくない物質（たとえば、色素）を、サイクルシークエンシング（たとえば、サンガー・サイクリング（Ｓａｎｇｅｒ  ｃｙｃｌｉｎｇ））反応混合物から除去するまた別の方法は、常磁性粒子の使用を含む。ダイターミネーター除去材料を組み入れる好適な常磁性粒子の１例は、ＲＡＰＸＴＲＡＣＴという商品名で、ワシントン州ボセルのプロリンクス・インク（Ｐｒｏｌｉｎｘ  Ｉｎｃ．，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）から販売されている。こうした材料のさらなる例（およびそれらの使用方法）は、２００１年６月２８日出願の、強化されたサンプル処理デバイス、システムおよび方法（ＥＮＨＡＮＣＥＤ  ＳＡＭＰＬＥ  ＰＲＯＣＥＳＳＩＮＧ  ＤＥＶＩＣＥＳ，ＳＹＳＴＥＭＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ）と題する、米国特許出願第０９／８９４，８１０号明細書に記載されている。しかし、残念なことに、このような粒子を用いる場合、粒子は、水和状態のままでなければならず、これによって、粒子充填デバイスを前もって製造できる能力が制限される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、色素および他の有機分子を、生物学的混合物、たとえば核酸増幅反応混合物（たとえば、ＰＣＲまたはサイクルシークエンシング反応混合物）から除去するための方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、生物学的混合物、すなわち、ペプチド−および／またはヌクレオチド含有物質等の生体物質を含有するサンプルを処理する方法を提供する。具体的には、本発明は、陰イオン交換材料を使用して、負に帯電した有機分子（たとえば、色素、プライマー、プローブ、ｄＮＴＰ類、ダイターミネーター、たとえばｄｄＮＴＰ、ｄｄＮＤＰ、ｄｄＮＭＰ、およびヌクレオシド）を、生体サンプル混合物から除去する方法を提供する。こうした方法は、固相抽出技術に基づく。こうした方法は、必要に応じて、ハイ・スループット、低容量一体型マイクロ流体デバイスに、特にＰＣＲおよびＤＮＡシークエンシング用に開発中のものに、組み入れることができるため、有利である。
【００１２】
本発明は、負に帯電した小さい有機分子を、生体サンプル混合物から除去する方法を提供する。好ましくは、該生体サンプル混合物は、核酸増幅反応混合物（たとえば、ＰＣＲ反応混合物または核酸シークエンシング反応混合物）等の、生体サンプル混合物である。
【００１３】
ここで、好ましくない分子の「除去」は、このような分子を固相材料に付着させ、望ましい生成物を溶液中に残存させておくことを含む。これは、望ましい生成物を固相材料に付着させること、好ましくない分子を洗い流すこと、および望ましい生成物を溶離して、それらを固相材料から除去することを含む従来の溶離方法とは、著しく異なる。
【００１４】
一実施形態において、方法は：陰イオン交換材料を含む表面を提供するステップと；約６，０００未満の分子量を有する、負に帯電した小さい有機分子を含む生体サンプル混合物であって、核酸増幅反応混合物（たとえば、ＰＣＲ反応混合物またはシークエンシング反応混合物）および核酸標識反応混合物からなる群から選択される生体サンプル混合物を提供するステップと；該生体サンプル混合物を、陰イオン交換材料を含む表面と接触させて、負に帯電した小さい有機分子の少なくとも一部を、該生体サンプル混合物から除去するステップと；を含む。
【００１５】
別の実施形態において、方法は：負に帯電したポリマー（好ましくは、高分子電解質）で部分的に被覆された陰イオン交換材料（好ましくは、第四級アンモニウムイオン等の四級化窒素含有基を含む）を含む表面を提供するステップと；生体サンプル混合物を提供すること；および該生体サンプル混合物を、負に帯電したポリマーで部分的に被覆された陰イオン交換材料を含む表面と接触させて、負に帯電した小さい有機分子の少なくとも一部を、該生体サンプル混合物から除去するステップと；を含む。
【００１６】
別の実施形態において、方法は：陰イオン交換材料を含む表面を有する少なくとも１つのプロセスアレイを含むデバイス（たとえば、マイクロ流体デバイス）を提供するステップと；生体サンプル混合物が、約６，０００未満の分子量を有する負に帯電した小さい有機分子を含む、生体サンプル混合物を、少なくとも１つのプロセスアレイ内に提供するステップと；生体サンプル混合物を少なくとも１つのプロセスアレイ内で移動させるステップであって、該負に帯電した小さい有機分子の少なくとも一部を、該生体サンプル混合物から除去するのに十分な時間、該生体サンプル混合物および陰イオン交換材料を有する該表面が接触したままであるステップと；を含む。
【００１７】
また別の実施形態において、方法は：負に帯電したポリマー（好ましくは、高分子電解質）で部分的に被覆された陰イオン交換材料（好ましくは、第四級アンモニウムイオン）を含む表面を有する少なくとも１つのプロセスアレイを含むデバイスを提供するステップと；生体サンプル混合物を、少なくとも１つのプロセスアレイ内に提供するステップと；該生体サンプル混合物を、該少なくとも１つのプロセスアレイ内で移動させるステップであって、該小さい負に帯電した分子の少なくとも一部を、該生体サンプル混合物から除去するのに十分な時間、該生体サンプル混合物および負に帯電したポリマーで部分的に被覆された陰イオン交換材料を含む該表面が接触したままであるステップと；を含む。
【００１８】
該生体サンプル混合物がシークエンシング反応混合物であるとき、該小さい負に帯電した分子は、一般に、色素標識ターミネーター、プライマー、分解した色素分子、デオキシヌクレオチド三リン酸、およびそれらの混合物からなる群から選択される。好ましくは、このようなサンプルの場合、本方法は、該生体サンプル混合物から実質的に全ての色素標識ターミネーターを除去するのに有効な条件で実行される。
【００１９】
該生体サンプル混合物がＰＣＲ反応混合物であるとき、該負に帯電した小さい分子は、一般に、プライマー、分解した色素分子、デオキシヌクレオチド三リン酸、およびそれらの混合物からなる群から選択される。好ましくは、このようなサンプルの場合、本方法は、該生体サンプル混合物から実質的に全てのプライマーを除去するのに有効な条件で実行される。
【００２０】
本発明はまた、本発明の方法を実行するために使用することができるデバイスも提供する。このようなデバイスは、たとえば、マイクロ流体デバイスおよびマイクロタイタープレート等の、分析容器を包含する。
【００２１】
一実施形態では、デバイスは：複数の処理チャンバであって、それぞれが、生体サンプル混合物を収容するためのボリュームを画定する処理チャンバ；および複数の処理チャンバを接続する少なくとも１つの流通路；陰イオン交換材料（好ましくは、第四級アンモニウムイオン）を含むプロセスアレイの少なくとも１つの内側の表面；を含む、複数のプロセスアレイを含む。好ましくは、該デバイスは、複数の弁をさらに含み、弁の少なくとも１つは、少なくとも１つの流通路に沿って位置する。好ましくは、本デバイスの中の、該陰イオン交換材料を含む表面は、負に帯電したポリマー（好ましくは、高分子電解質）で部分的に被覆された陰イオン交換材料も含む。好ましくは、該陰イオン交換材料および／または該負に帯電したポリマーは、パターン塗布されている。
【００２２】
本デバイスのまた別の実施形態において、本発明は、１つ以上の貯蔵容器、および表面に接着されかつ該１つ以上の貯蔵容器を取り巻くカバーフィルムが付いた表面を含み；該カバーフィルムは、バッキング、およびバッキングの少なくとも１つの主表面上に配置され、かつ容器表面と接触している接着剤を含み；該接着剤の少なくとも一部が上に配置された陰イオン交換材料（好ましくは、第四級アンモニウムイオン）を有する、分析容器を提供する。好ましくは、該陰イオン交換材料は、負に帯電したポリマー（好ましくは、高分子電解質）で部分的に被覆されている。好ましくは、該陰イオン交換材料および／または該ポリマーは、パターン塗布されている。
【００２３】
さらに別の実施形態では、生体サンプル混合物の収容に合わせて改造された複数の貯蔵容器を含み、少なくとも１つの貯蔵容器が、中に配置された負に帯電したポリマー（好ましくは、高分子電解質）で部分的に被覆された陰イオン交換材料（好ましくは、第四級アンモニウムイオン）を含む表面を含む、分析容器が提供される。
【００２４】
本発明の例示的実施形態に関して、本発明の方法の、これらおよび他の特徴および利点を、以下に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明の方法は、生体サンプル混合物を処理するための固相抽出技術を使用して、このような混合物中に含まれる小さい有機分子（たとえば、約６，０００未満の分子量を有する分子）の少なくとも一部を除去する。これらの小さい分子は、一般に負に帯電しているため、固相抽出材料は、一般に陰イオン交換材料である。該生体サンプル混合物（すなわち、ペプチド−および／またはヌクレオチド−含有物質等の生体物質を含有するサンプル）は、好ましくは、生物学的反応混合物（たとえば、ＰＣＲまたはサイクルシークエンシングまたは他の核酸増幅反応混合物）である。該小さい有機分子は、好ましくは、生物学的反応における残留物質または生物学的反応に組み入れられていない物質（分解生成物を含む）（たとえば、色素、プライマー、プローブ、ｄＮＴＰ、ダイターミネーター、たとえばｄｄＮＴＰ、ｄｄＮＤＰ、ｄｄＮＭＰ、およびヌクレオシド）である。注目すべきは、本発明の固相抽出材料を使用することにより、望ましくない分子は、好ましくは優先的に固相材料に付着し、かつ望ましい生成物は生体サンプル溶液中に残存することである。
【００２６】
本発明で使用するのに適した核酸増幅反応混合物の例としては：ａ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；ｂ）自律的配列複製（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（３ＳＲ）および鎖置換増幅（ＳＤＡ）等の標的ポリヌクレオチド増幅方法；ｃ）分枝鎖ＤＮＡ増幅等の、標的ポリヌクレオチドに付着したシグナルの増幅に基づく方法；ｄ）リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）およびＱＢレプリカーゼ増幅（ＱＢＲ）等の、プローブＤＮＡの増幅に基づく方法；ｅ）ライゲーション活性化転写（ＬＡＴ）等の転写に基づく方法および核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）；ｆ）サンガー・シークエンシング法（Ｓａｎｇｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）等のサイクルシークエンシング反応；およびｇ）修復連鎖反応（ＲＣＲ）およびサイクリングプローブ反応（ＣＰＲ）等の様々な他の増幅方法等が挙げられるが、この限りではない。
【００２７】
このような方法は、ＰＣＲ反応混合物、核酸シークエンシング反応混合物、核酸標識反応混合物、またはハイブリダイゼーション反応混合物、特にＰＣＲ、核酸配列決定、および核酸標識反応混合物、とりわけＰＣＲまたは核酸サイクルシークエンシングあるいは他の核酸増幅反応混合物の浄化に使用するのに特に望ましい。すなわち、本発明の方法は、所望の核酸増幅反応生成物（たとえば、ＰＣＲまたはシークエンシング反応生成物）から、残留反応物およびそれらの分解生成物（たとえば、ｄｄＮＤＰ等々の望ましくない色素含有分子）を除去するのに特に望ましい。残留色素（近赤外、蛍光、化学発光、ＵＶ、および可視を含む）または望ましくない色素含有分子および他の小さい有機分子の除去は、多数の他のゲノミクス用途およびプロテオミクス用途（たとえば、ライゲーション反応およびタンパク質またはペプチドアフィニティ結合反応）でも重要であろう。
【００２８】
これらの方法は、固相抽出技術に基づいており、ハイ・スループット、低容量一体型マイクロ流体デバイスに、特にＰＣＲおよびＤＮＡシークエンシング用に開発されたものに、好ましく組み入れることができる。一体型マイクロ流体デバイスで使用するためのＰＣＲまたはＤＮＡシークエンシング反応浄化固相抽出方法に望ましい幾つかの性質としては、たとえば：１）フロースルー式マイクロ流体デバイス内のスピンカラム、タイター・ウェル・プレート、あるいはウェルまたは経路に組み入れることができる、多孔性または非多孔性の材料の、カラム床体積に対して高い表面積比の使用；２）水和／膨潤を必要とせず、また脱水したときにひび割れする傾向がない、非ヒドロゲル系材料の使用；３）特別にデザインしたプライマーまたは多段階結合／すすぎ／溶離プロトコールの必要がない；４）揮発性または腐食性の溶媒がない；５）ＤＮＡ生成物を汚染したりまたは本デバイスの構造を危うくしたりする可能性のある浸出物がない；および６）色素および他の残留反応物は除去することができるが、かなりの量のＰＣＲまたはシークエンシング反応生成物は除去しないこと；などがある。
【００２９】
本発明の方法は、負に帯電した小さい分子（たとえば、ダイターミネーター等の、約６，０００未満の分子量を有する分子）の選択的除去には有効であるが、同様にしばしば負に帯電している、より大きい生成物分子（たとえば、シークエンシングラダー）は保持する、陰イオン交換材料を使用する。ここで、「小さい有機分子」は、所望の生成物分子ではない、ＰＣＲまたはシークエンシング反応混合物または他の核酸増幅反応混合物等の、生体サンプル混合物中の分子を指す。一般に、生体サンプル混合物から除去される小さい有機分子は、所望の生成物より小さい。好ましくは、生体サンプル混合物から除去される小さい有機分子は、約６，０００未満の分子量を有する。このような小さい分子は、本発明の固相抽出材料に付着する（すなわち、吸着する、吸収する、または他の方法で結合する）傾向があるが、約８，０００より大きい分子量を有する分子は、一般に、付着しない。中間の分子量の分子では、分子が小さいほど、付着する（すなわち、吸着する、吸収する、または他の方法で結合する）傾向が大きく、分子が大きいほど、付着する（すなわち、吸着する、吸収する、または他の方法で結合する）傾向が低い。一般に、所望のＰＣＲアンプリコンは、約５０より多い塩基対および約３３，０００より大きい分子量を有する。一般に、所望のシークエンシングラダーは、約１８より多い塩基および分子量約６，０００より大きい分子量を有する。
【００３０】
好ましくは、該陰イオン交換材料は、第四級アンモニウムイオン等の、結合した四級化窒素含有基を有する表面を含む。こうした第四級アンモニウムイオンは、たとえば、一般に、塩化物イオンと電荷バランスがとれているが、他の陰イオンを電荷バランスに使用してもよく、またヨウ化物、フッ化物、硝酸塩、亜硫酸水素塩、シアン化物、重炭酸塩、水酸化物、硫酸塩等々を交換することができる。このようなイオンの濃度は、所望の結果に合わせて調整することができる。たとえば、本明細書に記載されているある方法では、さらなる処理（たとえば、不動態化）の前に、陰イオン交換材料は、好ましくは、表面積１７３５ｍｍ2当たり少なくとも約０．０１マイクロモルの活性基（たとえば、塩化物の量として測定される第四級アンモニウムイオン）を含み、より好ましくは、表面積１７３５ｍｍ2当たり少なくとも約１０マイクロモルの活性基、さらにより好ましくは、表面積１７３５ｍｍ2当たり少なくとも約２０マイクロモルの活性基を含む。本発明のための陰イオン交換材料上の活性基数に上限はない。活性基数は一般に、何が市販されているかによって制御される。一般に、陰イオン交換材料は、さらなる処理（たとえば、不動態化）の前に、表面積１７３５ｍｍ2当たり約１０００マイクロモル以下の活性基（たとえば、塩化物の量として測定される第四級アンモニウムイオン）を含み、たいてい表面積１７３５ｍｍ2当たり約２００マイクロモル以下の活性基を含む。
【００３１】
陰イオン交換材料は、好ましくは、第四級アンモニウムイオンを含むが、他の正電荷をもつイオン、特に四級化窒素原子を含むものを、使用してもよい。好ましい材料は、一定の正電荷（すなわち、ｐＨに関係なく、特に８〜９のｐＨで、イオンは正に帯電している）を有する強陰イオン交換体を含む。これらは、たとえば、第四級アンモニウム陰イオン交換体（アンバーラート・タイプＩ（ＡＭＢＥＲＬＩＴＥ，Ｔｙｐｅ  Ｉ）という商品名で、ペンシルバニア州ベルフォンテのスペルコ（Ｓｕｐｅｌｃｏ，Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ，ＰＡ）から販売されているもの等）、第四級アルキルアミン陰イオン交換体（ダイヤイオン・タイプＩ（ＤＩＡＩＯＮ，Ｔｙｐｅ  Ｉ）という商品名で、スペルコ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）から販売されているもの等）、トリメチルベンジルアンモニウム陰イオン交換体（ダウエクス・タイプＩ（ＤＯＷＥＸ，Ｔｙｐｅ  Ｉ）という商品名で、スペルコ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）から販売されているもの等）、ジメチルエタノールアミン陰イオン交換体（アンバーラート・タイプＩＩ（ＡＭＢＥＲＬＩＴＥ，Ｔｙｐｅ  ＩＩ）という商品名で、スペルコ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）から販売されているもの等）、第四級アルキルアルカノールアミン陰イオン交換体（ダイヤイオン・タイプＩＩ（ＤＩＡＩＯＮ，Ｔｙｐｅ  ＩＩ）という商品名で、スペルコ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）から販売されているもの等）、およびジメチルエタノールベンジルアンモニウム陰イオン交換体（ダウエクス・タイプＩＩ（ＤＯＷＥＸ，Ｔｙｐｅ  ＩＩ）という商品名で、スペルコ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）から販売されているもの等）を包含する。さらに、使用条件で（たとえば、ｐＨ７未満で）で、かなりの数の正に帯電した種があれば、弱陰イオン交換体も本発明で使用することができる。これらは、ポリアミン類（アンバーライト（ＡＭＢＥＲＬＩＴＥ）、ダウエクス（ＤＯＷＥＸ）、およびデュオライト（ＤＵＯＬＩＴＥ）という商品名でスペルコ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）から販売されているもの等）およびアルキルアミン類（ダイヤイオン（ＤＩＡＩＯＮ）という商品名で販売されているもの等）を包含する。
【００３２】
好ましくは、第四級アンモニウム基を含有する、様々な固相抽出材料は、市販されている。上記のものに加えて、好適な市販されている材料としては、たとえば、イオン交換微小孔性膜などがある。１つのこのような市販されている膜は、ＳＢ−６４０７という商品名でニューヨーク、イースト・ヒルズにあるポール・コーポレーション（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ，ＮＹ）から販売されており、これは、外面にイオン交換能を有するように処理された、強塩基性の正に帯電したポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）／コポリマー膜である。イオン交換能は、第四級アンモニウム活性部位により提供される。このようなフィルターは、塩化物イオン形で提供され、また、さらなる処理（たとえば、不動態化）の前に、約０．４５μｍ（すなわち、ミクロンまたはμまたはμｍ）の孔径、約１５０μｍの厚さ、および表面積３４７０平方ミリメートル（ｍｍ2）当たり約２０マイクロ当量のイオン交換容量を有する。
【００３３】
好適な固相抽出材料は、様々な技術を使用して調製することができる。たとえば、シラン等の第四級アンモニウム官能化材料を使用して、たとえば、第四級アンモニウム基を、下にある基材（たとえば、単層という薄さであっても）に共有結合させてもよい。あるいは、ポリアルキレンイミン（たとえば、ポリエチレンイミン）等のアミン含有ポリマーを、メチルヨウ化物等の四級化剤で処理して、下にある基材上に第四級アンモニウムイオン基を形成してもよい。必要に応じて、四級化の前に、ポリアルキレンイミンを架橋してもよい。
【００３４】
また別の手法では、水溶性または水不溶性のポリクォット（Ｐｏｌｙｑｕａｔ）（すなわち、四級アンモニウムイオン基を含有するポリマー）を基材上に塗布してもよく、その後の架橋を伴ってもよくまたは伴わなくてもよい。好適な水溶性ポリマーとしては、たとえば、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）、ポリ（２−ヒドロキシ−３−メタクリルオキシプロピルトリメチルアンモニウムクロリド）、およびポリ（ブチルアクリレート−メタクリルオキシエチルトリメチルアンモニウムブロミド）などがある。好適な水不溶性ポリマーとしては、シントラン（ＳＹＮＴＲＡＮ）Ｈｘ３１−６５（トリメチルアミノエチルメタクリレートおよびメチルメタクリレート）およびシントラン（ＳＹＮＴＲＡＮ）Ｈｘ３１−４４（１−メトキシ−２−プロパノールアクリレートコポリマー）の商品名で、マサチュセッツ州カントンのインターポリマー・コーポレーション（Ｉｎｔｅｒｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｎｔｏｎ，ＭＡ）から販売されているもの等の第四級アクリルコポリマーなどがある。
【００３５】
該陰イオン交換材料は、必要に応じて、特に水溶性である場合、架橋してもよい。たとえば、陰イオン交換材料、またはその前駆物質を架橋するために使用することができるであろう架橋方法としては、加熱、紫外線（ｕｖ）または電子ビーム（ｅ−ビーム）、または化学的方法などがある。たとえば、熱活性化した化学架橋剤、たとえば多官能性グリシジルエーテル（たとえば、フェニルグリシジルエーテル、ブチルグリシジルエーテル）等を使用することにより、ポリクォット（Ｐｏｌｙｑｕａｔ）を架橋することができる。あるいは、不動態化方法は、水溶性材料を水不溶性にすることができる（たとえば、沈殿による）。
【００３６】
必要に応じて、該陰イオン交換材料は、それから形成されるフィルムの柔軟性を高めるために、可塑剤等の添加物も含むことができる。例としては、ゼラチンおよびジブチルフタレートなどが挙げられる。
【００３７】
さらなる処理（たとえば、不動態化）を行わない陰イオン交換材料（たとえば、結合した第四級アンモニウムイオン基を有する表面）は、本発明の分離方法で使用することができるが、一般に非選択的である。すなわち、望まれていない小さい分子（たとえば、ダイターミネーター）のみならず、所望の生成物（たとえば、ＤＮＡシークエンシングラダー）も除去する。さらなる処理を行わない陰イオン交換材料は、サンプル混合物中の所望の生成物の濃度は十分に大きいが、回収率がかなり低いような場合に、ある種の用途に適する。
【００３８】
しかし、好ましくはまた都合のよいことに、該陰イオン交換材料（たとえば、結合した第四級アンモニウムイオン）は、負に帯電したポリマーで、好ましくは負に帯電した高分子電解質で、部分的に被覆されている。陰イオン交換材料の正電荷（たとえば、第四級アンモニウムイオン基）の、この、負に帯電したポリマーによる部分的不動態化の結果として、正に帯電した部位は依然として、対イオンとの（一般には塩化物イオンとの）交換により、小さい分子の結合に利用できる。結果として、該表面はより選択的になり、より優れた回収率ならびに再現性をもたらす。注目すべきは、不動態化は、たとえば、陰イオン交換および沈殿によって、水溶性陰イオン交換材料も、水性サンプル混合物と共に使用するのに適するものにできることである。
【００３９】
好適な負に帯電したポリマーは、分子当たり複数の電荷を有するものまたは１つ以上の帯電した末端基を有するものを包含する。たとえば、該負に帯電したポリマーは、カルボキシレート等の負に帯電した末端基を有するポリアルキレンオキシド（好ましくは、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、ポリエチレン−プロピレンオキシド）、ならびに負に帯電した末端基で官能化されたシラン類およびポリエチレングリコールシラン類であってもよい。
【００４０】
好ましい負に帯電したポリマーは、イオン化溶媒に溶解したとき、構成単位のかなりの部分が電荷を担持する分子、一般に高分子である。好適な負に帯電した高分子電解質は、一般に１０，０００を超える分子量を有し、かつ好ましくは、生物学的混合物中の成分に対して低い非特異的結合を有するものである。好適な例としては、ポリスチレンスルホン酸（たとえば、ポリ（ナトリウム４−スチレンスルホネート）すなわちＰＳＳＡ）、ポリビニルホスホン酸、ポリビニルホウ酸、ポリビニルスルホン酸、ポリビニル硫酸、ポリスチレンホスホン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、リグノスルホネート、カラギーナン、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、およびそれらの塩類または他の誘導体などがある。必要に応じて、これらの様々な組合せを使用することができる。
【００４１】
該負に帯電したポリマー（たとえば、高分子電解質）は、負に帯電したポリマーが正に帯電した種をほんの一部（すなわち、完全にではなく）ブロックするように、陰イオン交換材料上に存在する。好ましくは、負に帯電したポリマーは、表面積１７３５ｍｍ2当たり少なくとも約０．０１５マイクログラム（μｇ）の量で、より好ましくは、少なくとも約０．０３ミリグラム（ｍｇ）の量で存在する。負に帯電したポリマー量の上限は、陰イオン交換材料中の活性基の数によって異なる。一般に、全ての活性な陰イオン交換基が該ポリマーによってブロックされない限り、すなわち、小さい分子を結合するためにまだ利用できる限り、上限はない。一般に、ポリマーは、表面積１７３５ｍｍ2当たり約５ｍｇ以下の量で、たいていは表面積１７３５ｍｍ2当たり約１ｍｇ以下の量で、陰イオン交換材料上に存在するが、はるかに高値（たとえば、表面積１７３５ｍｍ2当たり１００ｍｇ）のこともあり得る。
【００４２】
該負に帯電したポリマーは、一般に、水溶液として、陰イオン交換材料（たとえば、結合した第四級アンモニウムイオン基を上に有する表面）に塗布される。負に帯電したポリマーの好ましい惹起濃度（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）（すなわち、溶液の濃度）は、所望の生成物（たとえば、ＤＮＡ）の最高回収率をもたらすように、好ましくは色素を含有する小さい有機分子を実質的に完全に除去するように、選択される。一般に、脱イオン水中に少なくとも約０．０００１重量パーセント（重量％）の惹起濃度（たとえば、約４３４ｍｍ2の表面積を有する材料のサンプルを被覆する場合）が、好適な回収可能値をもたらす。一般に、高い惹起濃度で、回収率が上昇する；が、惹起濃度が閾値（たとえば、約４３４ｍｍ2の表面積を有する材料のサンプルを被覆する場合、１．０重量％）を超えるとき、色素を含有する小さい有機分子は、不完全に除去される可能性がある。この結果、十分なシグナル強度になるが、たとえば、シークエンシングクロマトグラムの品質不良が生じる可能性がある。
【００４３】
負に帯電したポリマーによる不動態化は、生成物（たとえば、ＤＮＡ）回収率の向上に加えて、サンプル処理（たとえば、ＰＣＲまたはシークエンシング反応混合物浄化）に要する時間を変える可能性がある。たとえば、市販のＰＥＳ膜の場合、高分子電解質等のポリマーの、高い惹起濃度（たとえば、約４３４ｍｍ2表面積を有するサンプルを被覆する場合、約０．０３重量％より高い濃度）は、色素を含有する小さい有機分子を実質的に完全に除去するために、より長い時間を要するという結果を招く。比較的長い処理（たとえば、浄化）時間（たとえば、約１０〜１５分）は、多くのサンプル混合物の手動処理には有用なこともある；が、マイクロ流体デバイスでは、処理時間を減少させることは好都合である。したがって、高分子電解質等のポリマーの、低い惹起濃度（たとえば、約４３４ｍｍ2の表面積を有するサンプルを被覆する場合、約０．００５重量％以下）は、このような用途に好ましい。
【００４４】
陰イオン交換材料（たとえば、第四級アンモニウムイオン基を含有する材料）、および特に、負に帯電したポリマー（たとえば、高分子電解質）で部分的に被覆された陰イオン交換材料（その全てを、本明細書では、「有効化学成分」と呼ぶ）を、様々な基材の表面に使用することができる。好適な基材としては、ビーズ、膜、接着剤被覆物品、フリット、フォーム、ゲル、マイクロ複製物品、または分析容器のチャネル／ウェルの壁上などがある。高表面積を有する基材は、接触面積を増大し、それによって処理能率を向上することができる。該基材は、酸素プラズマ、ダイアモンド様ガラス蒸着、コロナ処理、ｅ−ビームまたは紫外線、熱、ならびに他の類似した技術等の様々な処理によって、接着力／表面積を改良するために処理することができる。
【００４５】
このような基材は、多孔性であっても非多孔性であってもよい；が、多孔性材料は、カラム床体積に対する表面積比が大きいという利点を有し、フロースルー式の用途で特に有用である。好適な材料としては、脱色合成反応のための吸着クロマトグラフィで普通に使用される、高表面積の有機および無機材料などがある。
【００４６】
無機材料としては、たとえば、シリカゲル、アルミナ、ジルコニア、および珪藻土などがある。ゼオライト類（すなわち、アルミノケイ酸ナトリウムおよびカルシウム）等の分子篩を、同様の様式で使用することもできる。ゼオライト類は、サイズに基づいて、それらの孔内に小さいイオン種を選択的に捕らえることができるというさらなる利点を有する。多孔性セラミック粒子および膜（アルミナ、ジルコニア、シリカ、およびアルミノケイ酸塩）も使用することができる。
【００４７】
有機材料としては、たとえば、オリゴ糖類、ポリエステル類、ポリスルホン類、ポリカーボネート類、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ポリメチルメタクリレート類、セルロースエステル類、ポリエステル類、等々がある。多くの他の有機材料を使用することができ、それらは一般に、膜、フィルム、または粒子の形態で入手できる。
【００４８】
該陰イオン交換材料は、特に負に帯電したポリマー（たとえば、高分子電解質）で部分的に被覆されたとき、望ましくない小さい有機分子（たとえば、ダイターミネーター）を比較的強く結合するが、帯電効果およびサイズ効果に基づいて、大きい負に帯電した生成物分子（たとえば、ＤＮＡシークエンシングラダー）を退ける部位を提供し、それによって選択的浄化を可能にする。
【００４９】
陰イオン交換材料、好ましくはポリマー被覆陰イオン交換材料は、たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）後に、核酸アンプリコンの精製に効果的に使用することができる。周知の通り、ＰＣＲは、極めて少量の核酸（たとえば、ＤＮＡ）の分析を可能にする。簡単に記載すると、ポリメラーゼ酵素（たとえば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ）、過剰の２種のオリゴヌクレオチドプライマー（標的核酸鎖に相補的なプライマー伸長生成物の合成を誘導する条件下に置かれたとき、増幅すべき領域に隣接することができ、また合成開始点の役割を果たすことができる）、および遊離形のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ類、たとえば、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）を使用して、核酸分子（たとえば、ＤＮＡ鋳型）を繰り返し合成し、その結果、ある特定の配列を１００万倍以上増幅することになる。結果として生じる伸長または増幅生成物は、一般に、「ＰＣＲ産物」または「ＰＣＲアンプリコン」と呼ばれる。
【００５０】
該ＰＣＲ産物は、ＰＣＲ反応混合物中の他の材料（たとえば、プライマーおよびｄＮＴＰ類）ができるように、検出可能な標識すなわちタグを組み入れることが好ましい。したがって、標的核酸のＰＣＲ増幅は、好ましくは、検出可能なタグを含有する少なくとも１種のプライマーを使用することによって実施される。たとえば、特異的な紫外、可視、または赤外シグナルを生成するであろう、紫外、可視、または赤外吸収タグを使用することも可能であろう。多種多様なタグ（当該核酸を独自に同定するために使用される化学的部分）の例は、国際公開第９７／２７３２５号パンフレットに開示されている。特に好ましいこのようなタグは、蛍光剤または化学発光剤である。これらは、一般に、より高い電子状態からより低い電子状態に移る際に可視光を発する色素化合物であり、一般に、エネルギーの吸収と放出との間の時間間隔が比較的短く、一般に、およそ約１０-8〜約１０-3秒である。好適な蛍光または化学発光化合物は、フルオレセイン、ローダミン、ルシフェリン、ならびに当業者に周知の多種多様な他のものを包含する。
【００５１】
ＰＣＲが行われた後のＰＣＲ反応混合物の浄化において、望まれていない負に帯電した小さい分子は、残留プライマー（標識または未標識）、分解した色素分子（すなわち、色素標識プライマーから切断された色素分子またはそれらの断片）、およびｄＮＴＰ類（標識または未標識）を包含する。こうした分子の中で、プライマーを除去することが特に重要である。
【００５２】
本発明の方法を使用して、こうした組み入れられていない材料の１つ以上の少なくとも一部を、ＰＣＲ産物から分離できる（すなわち、ＰＣＲ反応混合物から除去される）ことが好ましい。一般に、より小さい分子（たとえば、ｄＮＴＰ類）は、より大きい分子（プライマー）より容易に除去される。より好ましくは、本発明の方法を使用して、残留プライマーの少なくとも約９０％および／またはｄＮＴＰ類の少なくとも約７０％が、ＰＣＲ反応混合物から除去される。さらにより好ましくは、残留プライマー、分解された色素分子、およびｄＮＴＰ類の１つ以上の実質的に全部（すなわち、少なくとも約９５％）が、所望のＰＣＲ産物から分離される。最も好ましくは、残留プライマー、分解された色素分子、およびｄＮＴＰ類の全ての、実質的に全部（すなわち、少なくとも約９５％）が、所望のＰＣＲ産物から分離される。プライマーの除去レベルは、オリグリーンｓｓＤＮＡ（ＯＬＩＧＲＥＥＮ  ｓｓＤＮＡ）計量試薬（オレゴン州ユージーンのモレキュラー・プローブズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ））、高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、およびキャピラリー電気泳動（ＣＥ）で測定することができる。ｄＮＴＰ類の除去レベルは、１２６０ｎｍにおける吸光度、ＨＰＬＣ、およびＣＥで測定することができる。
【００５３】
好ましくは、本発明の方法を使用して、所望のＰＣＲ産物（たとえば、ＤＮＡアンプリコン）の少なくとも約３０％が、ＰＣＲ反応混合物から回収される。より好ましくは、所望のＰＣＲ産物の少なくとも約５０％が、ＰＣＲ反応混合物から回収される。さらにより好ましくは、所望のＰＣＲ産物の少なくとも約７０％が、ＰＣＲ反応混合物から回収される。最も好ましくは、所望のＰＣＲ産物の少なくとも約９０％が、ＰＣＲ反応混合物から回収される。ＰＣＲ産物回収のレベルは、カリフォルニア州パロ・アルトにあるアジレント・テクノロジーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ．）から販売されているアジレント２１００バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ）で測定することができる。
【００５４】
ＰＣＲ反応混合物浄化のある方法では、該陰イオン交換材料は、さらなる処理（たとえば、不動態化）の前に、好ましくは、表面積１７３５ｍｍ2当たり少なくとも約１０マイクロモルの、しばしば最高約２００マイクロモルの、活性基（たとえば、塩化物の量として測定される第四級アンモニウムイオン）を含む。不動態化レベル（すなわち、負に帯電したポリマー（たとえば、高分子電解質）のレベル）は、概して、表面積１７３５ｍｍ2当たり少なくとも約０．０３ｍｇ、しばしば最高約３０ｍｇ、そして一般に１７３５ｍｍ2当たり５ｍｇ以下である。不動態化ポリマーの惹起濃度は、一般に、ＰＣＲの場合にシークエンシングの場合より２〜３倍高い。浄化は、好ましくは、室温で実行されるが、必要に応じて、より高い温度を使用することも可能であろう。一般的な浄化時間は約５分未満である。
【００５５】
こうした陰イオン交換材料、好ましくは、ポリマー被覆陰イオン交換材料は、たとえば、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）サイクリング後の、核酸（たとえば、ＤＮＡ）シークエンシングラダーの精製にも、効果的に使用することができる。周知の通り、サンガー・シークエンシング法（Ｓａｎｇｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）等のシークエンシング法は、配列決定すべき鋳型鎖を複製することによって、鋳型鎖（たとえば、ＤＮＡ鋳型）から、入れ子セットの断片を生成する。簡単に記載すると、未知の配列の核酸分子（たとえば、ＤＮＡ鋳型）を、核酸ポリメラーゼ、プライマー、遊離形のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ類、たとえば、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）、および４種の遊離形ジデオキシヌクレオチド三リン酸の１つ（ジデオキシヌクレオチドは、その３’末端が修飾されているため、他のヌクレオチドに結合することができず、従って、ジデオキシヌクレオチドが組み入れられると、鎖合成が停止する）と組み合せて、異なる長さの核酸セグメントのランダムサンプルを作る。従って、シークエンシング混合物は、塩類、酵素、組み入れられていないデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ類）、鋳型核酸、プライマー、および結果として生じた核酸配列決定ラダーを含有する。これらの種々の材料（たとえば、プライマーおよびｄＮＴＰ類）は、色素分子で標識されていてもよく、または未標識であってもよい。このような混合物は、色素標識ジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）等の組み入れられていない色素標識ジデオキシヌクレオチドターミネーターも含有し、これを加水分解（たとえば、残留ヌクレオチド三リン酸を脱ホスホリル化するために、エビ・アルカリホスファターゼ等のホスファターゼで酵素的に処理）して、色素標識人工物、たとえば色素標識ジデオキシヌクレオチド二リン酸（ｄｄＮＤＰ）、色素標識ジデオキシヌクレオチド一リン酸（ｄｄＮＭＰ）、および色素標識ジデオキシヌクレオシドを形成する。国際公開第０１／２５４９０号パンフレットに記載の通り、このような、組み入れられていない色素標識ターミネーターは、一般に、電気泳動の前に、ＤＮＡシークエンシングラダーから除去しなければならない。ここで、「色素標識ターミネーター」は、「ダイターミネーター」とも呼ばれ、ｄｄＮＴＰ、ｄｄＮＤＰ、ｄｄＮＭＰ、およびジデオキシヌクレオシドを包含する。特に好ましいこのような色素は、蛍光剤または化学発光剤であり、フルオレセイン、ローダミン、ルシフェリン等々を包含する。
【００５６】
サイクリングが行われた後のシークエンシング反応混合物の浄化において、望まれていない負に帯電した小さい分子は、残留プライマー（標識または未標識）、分解した色素分子（すなわち、色素標識ターミネーターから切断された色素分子またはそれらの断片）、ｄＮＴＰ（標識または未標識）、およびダイターミネーターを包含する。こうした分子の中で、ダイターミネーターを除去することが特に重要である。本発明の方法を使用して、こうした組み入れられていない材料の１つ以上の少なくとも一部を、シークエンシング産物から分離できる（すなわち、シークエンシング反応混合物から除去される）ことが好ましい。一般に、より小さい分子（たとえば、ｄＮＴＰ類）は、より大きい分子（プライマー）より容易に除去され、また、より高く帯電している分子は、さほど高く帯電していない分子より容易に除去される（たとえば、除去のしやすさは、ｄｄＮＴＰからｄｄＮＤＰ、ｄｄＮＭＰ、ヌクレオシドへと低減する）。より好ましくは、残留プライマー、分解された色素分子、ｄＮＴＰ類、およびダイターミネーターの１つ以上の実質的に全部（すなわち、少なくとも約９５％）が、シークエンシング産物から分離される。最も好ましくは、残留プライマー、分解された色素分子、ｄＮＴＰ類、およびｄｄＮＴＰの全ての実質的に全部（少なくとも約９５％）が、シークエンシング産物から分離される。注目すべきは、また好ましくは、本発明の方法を使用して、全てのダイターミネーターの少なくとも約９５％、より好ましくは、少なくとも約９８％、最も好ましくは、１００％が、シークエンシング産物から分離される。このような生成物は、次に、シークエンシングによって分析することができる。ダイターミネーターの除去レベルは、蛍光、ＣＥ、またはＨＰＬＣで測定することができる。
【００５７】
好ましくは、本発明の方法を使用して、所望のシークエンシング産物（たとえば、ＤＮＡラダー）の少なくとも約３０％が、サイクルシークエンシング反応混合物から回収される。より好ましくは、所望のシークエンシング産物の少なくとも約５０％が、サイクルシークエンシング反応混合物から回収される。さらにより好ましくは、所望のシークエンシング産物の少なくとも約７０％が、サイクルシークエンシング反応混合物から回収される。最も好ましくは、所望のシークエンシング産物の少なくとも約９０％が、サイクルシークエンシング反応混合物から回収される。生成物回収のレベルは、たとえば、ＣＥで測定することができる。
【００５８】
シークエンシング反応混合物浄化のある方法では、該陰イオン交換材料は、さらなる処理（たとえば、不動態化）の前に、好ましくは、表面積１７３５ｍｍ2当たり少なくとも約１０マイクロモル、しばしば最高約２００マイクロモルの、活性基（たとえば、塩化物の量として測定される第四級アンモニウムイオン）を含む。不動態化レベル（すなわち、負に帯電したポリマー（たとえば、高分子電解質）のレベル）は、概して、表面積１７３５ｍｍ2当たり約０．０３ｍｇ、しばしば最高約３０ｍｇ、そして一般に１７３５ｍｍ2当たり５ｍｇ以下である。浄化は、好ましくは、室温で実行されるが、必要に応じて、より高い温度を使用することも可能であろう。一般的な浄化時間は約５分未満である。
【００５９】
該有効化学成分、特に該ポリマー被覆陰イオン交換材料（たとえば、部分的に被覆された第四級アンモニウムイオン基）は、フロースルー式デバイスまたは非フロースルー形式に組み入れることができる。非フロースルー形式を使用する場合、反応混合物を、混合しながらまたは混合せずに、好ましくは混合しながら、所与の時間、インキュベートし、結果として生じる、少なくとも部分的に精製された生成物（たとえば、ＤＮＡアンプリコン）を含有する上澄を取り出して分析することができる。
【００６０】
有効化学成分を上に有する表面への小分子の拡散は、反応物質を十分に攪拌することにより改良することができる。これは、渦巻攪拌、振盪、加熱、超音波処理等々によって実施される。本質的に混合した結果として、より短い処理（たとえば、浄化）時間、よりよい生成物回収レベル、および／またはよりよい再現性を得ることができる。
【００６１】
本明細書に記載の有効化学成分、特にポリマー被覆陰イオン交換材料（たとえば、部分的に被覆された第四級アンモニウムイオン基）は、様々なデバイス、特に分析容器に組み入れることができる。本明細書で使用する、分析容器は、サンプル、試薬、または溶媒を、１つ以上の貯蔵容器内に収容するデバイスであって、濾過向けにデザインされていてもされていなくてもよい。例としては、アッセイ・プレート・アレイ（たとえば、マイクロタイタープレート）、複数のウェル、チャネル、または他の貯蔵容器を含む、分離したまたは連続した（たとえば、ストリップまたはテープ）構造、および９６ウェル・フィルタープレート・アセンブリに使用されるタイプ（たとえば、米国特許第５，６２０，６６３号明細書（エイスタ（Ａｙｓｔａ）ら）に記載のタイプ）のアレイなどが挙げられる。
【００６２】
好ましい分析容器は、さらなる修飾をせずに、流体を直接加えることが可能な開放系の１つ以上の貯蔵容器（たとえば、ウェルまたはチャネル）を提供する。容器、好ましくは該容器の貯蔵容器を、密閉するために、一般に、カバーフィルムを分析容器の長さおよび幅に沿って貼付し、閉鎖系を作る。好ましくは、この結果として、個々に密閉された封入物を生じ、これは、実質的に連続構造であってもまたは分離した（すなわち、不連続）構造であってもよい。
【００６３】
密封膜の役割をする、カバーフィルムは、バッキング（好ましくは、透明のバッキング）上に配置された、接着剤、好ましくは、感圧接着剤を含んでもよい。該接着剤は、従来の分析容器が製造される材料（好ましくはポリオレフィン類、ポリスチレン、ポリカーボネート、またはそれらの組合せ）によく接着し、高温保存および低温度保存（たとえば、約−８０〜約２００℃）の間ずっと接着を維持し、同時にサンプル蒸発に対して効果的な密封を提供し、かつ実質的に、生体サンプル混合物の成分に溶解したりまたは他の方法で生体サンプル混合物の成分と反応しないように選択される。したがって、接着剤のタイプは、生体サンプル混合物から好ましくない材料を除去するのを妨害（たとえば、ＤＮＡを結合する、溶解する等々）しない限り、重要ではない。好ましい接着剤としては、生物学的反応が実行される分析デバイスのカバーフィルム上に一般に使用されるものなどがある。好ましい接着剤は、たとえば、国際公開第００／４５１８０号パンフレットおよび国際公開第００／６８３３６号パンフレットに記載の、ポリ−αオレフィン類およびシリコーン類を包含する。
【００６４】
本明細書に記載の有効化学成分は、様々な方法で該分析容器に組み入れることができる。たとえば、該有効化学成分は、１つ以上の貯蔵容器の壁に塗布してもよく、１つ以上の貯蔵容器内に配置されるフロースルー式膜の形態であってもよく、１つ以上の貯蔵容器内に配置されたフィルム（連続していてもまたは不連続であってもよく、あるいは複数の断片の形態であってもよい）に塗布してもよく、あるいは、接着剤被覆カバーフィルムの接着剤上に塗布してもよい。該有効化学成分（陰イオン交換材料（たとえば、第四級アンモニウムイオン）または負に帯電したポリマーのいずれかまたはその両者）は、パターン塗布することができる。
【００６５】
本明細書に記載の有効化学成分、特にポリマー被覆陰イオン交換材料（たとえば、部分的に被覆された第四級アンモニウムイオン基）は、ハイ・スループットマイクロ流体デバイス特に適しており、その結果として、従来の意味での溶離（すなわち、結合した所望の生成物から好ましくない成分を洗い流し、続いて所望の生成物を取り外す）の必要をなくすばかりでなく、試薬および時間を節約する。このようなデバイスは、一般に、少量の反応の精製に、低カラム床体積浄化媒体を必要とする。該有効化学成分は、様々な方式でマイクロ流体デバイスに組み入れることができる。
【００６６】
一実施形態では、マイクロ流体デバイスの接着剤被覆カバーフィルム（または内壁）は、好ましくは、該有効化学成分（たとえば、ポリクォット（Ｐｏｌｙｑｕａｔ）に引き続いてＰＳＳＡ溶液）でパターン塗布することができる。この塗布は、特にパターン塗布は、噴霧乾燥、浸漬被覆、ブラシ塗布、ナイフ塗布、ロール塗布、インクジェット塗布、スクリーン印刷、静電付着等々の様々な方法で実施することができる。未精製の生体サンプル混合物、たとえば、ＰＣＲまたはＤＮＡシークエンシング反応混合物を、チャンバの上面および底面のいずれかまたは両者の上に有効化学成分を含有する浄化チャンバ内に噴き入れることができる。混合、渦巻攪拌、振盪によって、またはデバイスの壁（従順な材料で作製されている）の圧迫を介して、溶液とチャンバ壁との密接な接触を保証することにより、この反応の速度を高めることができる。精製された反応混合物を回収すれば、その後の分析は（たとえば、ＤＮＡシークエンシング機器に注入することにより）すぐにできる。
【００６７】
別の実施形態では、有効化学成分を上に有する固相材料を、マイクロ流体区画またはチャネルの中に配置することができる。たとえば、接続された２つの処理チャンバ、処理チャンバの少なくとも１つおよび／または少なくとも２つの処理チャンバの間の連絡（すなわち、流通路）によって画定される少なくとも１つのボリュームを含む少なくとも１つのプロセスアレイを有するデバイスは、固相材料を含むことができる。この配列で、該固相材料が多孔性材料の形態である場合、未精製の生体サンプル溶液、たとえば、ＰＣＲまたはＤＮＡシークエンシング反応混合物は、該固相材料を通過し、十分な滞留時間、望ましくない成分（たとえば、余分の組み入れられていないダイターミネーター）を捕らえることが可能である。あるいは、該固相材料が非多孔性材料の形態である場合、未精製の生体サンプル溶液は、該材料のそばを通る。サンプルと固相材料との接触面積は、固相材料の選択によって、より大きい表面積の範囲内で拡大することができる。精製された反応混合物を回収すると、たとえば、ＤＮＡシークエンシング機器に注入するとすぐに行われるように、その後の分析の準備が整っている。
【００６８】
本発明の方法は、様々なデバイスで使用することができるが、幾つかの好適なデバイスの様々な例示的実施形態は、たとえば、２００１年６月２８日出願の、強化されたサンプル処理デバイス、システムおよび方法（ＥＮＨＡＮＣＥＤ  ＳＡＭＰＬＥ  ＰＲＯＣＥＳＳＩＮＧ  ＤＥＶＩＣＥＳ，ＳＹＳＴＥＭＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ）と題する、米国特許出願第０９／８９４，８１０号明細書、および２００１年６月２８日出願の、サンプル処理デバイス（ＳＡＭＰＬＥ  ＰＲＯＣＥＳＳＩＮＧ  ＤＥＶＩＣＥＳ）と題する米国特許出願第０９／８９５，０１０号明細書に記載されている。他の使用可能なデバイス構築物は、たとえば、２０００年６月２８日出願の、熱処理デバイスおよび方法（ＴＨＥＲＭＡＬ  ＰＲＯＣＥＳＳＩＮＧ  ＤＥＶＩＣＥＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ）と題する、米国仮特許出願第６０／２１４，５０８号明細書；２０００年６月２８日出願の、サンプル処理デバイス、システムおよび方法（ＳＡＭＰＬＥ  ＰＲＯＣＥＳＳＩＮＧ  ＤＥＶＩＣＥＳ，ＳＹＳＴＥＭＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ）と題する、米国仮特許出願第６０／２１４，６４２号明細書；２０００年１０月２日出願の、サンプル処理デバイス、システムおよび方法（ＳＡＭＰＬＥ  ＰＲＯＣＥＳＳＩＮＧ  ＤＥＶＩＣＥＳ，ＳＹＳＴＥＭＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ）と題する、米国仮特許出願第６０／２３７，０７２号明細書；２００１年１月６日出願の、サンプル処理デバイス、システムおよび方法（ＳＡＭＰＬＥ  ＰＲＯＣＥＳＳＩＮＧ  ＤＥＶＩＣＥＳ，ＳＹＳＴＥＭＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ）と題する、米国仮特許出願第６０／２６０，０６３号明細書；２００１年４月１８日出願の、強化されたサンプル処理デバイス、システムおよび方法（ＥＮＨＡＮＣＥＤ  ＳＡＭＰＬＥ  ＰＲＯＣＥＳＳＩＮＧ  ＤＥＶＩＣＥＳ，ＳＹＳＴＥＭＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ）と題する、米国仮特許出願第６０／２８４，６３７号明細書；および２００１年６月２８日出願の、サンプル処理デバイスおよび担体（ＳＡＭＰＬＥ  ＰＲＯＣＥＳＳＩＮＧ  ＤＥＶＩＣＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＲＲＩＥＲＳ）と題する米国特許出願第０９／８９５，００１号明細書に記載されている。
【００６９】
本明細書に記載の方法は、マイクロ流体デバイスのプロセスアレイに含まれている生物学的反応混合物から、色素または他の有機分子を少なくとも部分的に除去することが必要な、様々な異なる方法で使用することができる。このような方法の例は、デバイスのプロセスアレイでも実施することが可能なまたは可能でない、化学反応混合物、たとえば、核酸増幅の浄化を含む。浄化のための陰イオン交換化学に必要な試薬（たとえば、ＰＳＳＡで部分的に被覆されたポリクォット（Ｐｏｌｙｑｕａｔ））の一部または全部は、製造時にデバイス内に存在してもよく、デバイスの製造後にプロセスアレイに充填してもよく、サンプルの導入直前にプロセスアレイに充填してもよく、あるいはプロセスアレイに充填する前に、サンプルと混合してもよい。
【００７０】
好ましい方法は、２００１年６月２８日出願の、強化されたサンプル処理デバイス、システムおよび方法（ＥＮＨＡＮＣＥＤ  ＳＡＭＰＬＥ  ＰＲＯＣＥＳＳＩＮＧ  ＤＥＶＩＣＥＳ，ＳＹＳＴＥＭＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ）と題する米国特許出願第０９／８９４，８１０号明細書に例示されているもの等の、複数のプロセスアレイを有するデバイスの使用を含む。各プロセスアレイは、好ましくは、概して、デバイス上に放射状に配列されている（たとえば、遠心力が、流体を、チャンバからチャンバに順次移動させることができるように）、多数のチャンバ（たとえば、充填チャンバ、および反応チャンバまたは浄化チャンバ等の処理チャンバ）を含む。各アレイ内のチャンバは、幾つかの実施形態では、必要に応じて移動を制御するための弁構造を含んでもよい、チャネルまたは他の導管を使用して、流体連通している。
【００７１】
このようなデバイスを使用して、出発サンプル材料、たとえば、溶血細胞を、充填チャンバ内に供給する。出発サンプル材料が充填チャンバから第１の処理チャンバに移動するときに濾過するために、フィルターを備えることが好ましい。第１の処理チャンバは、好ましくは、供給されたとき、たとえば各チャンバ内で乾燥された、好適なＰＣＲプライマーを含む。各チャンバは、出発サンプル材料に対して実施しようとしている調査の性質に応じて、同一プライマーを含んでもよく、または異なるプライマーを含んでもよい。サンプルを充填する前に、処理チャンバ内にプライマーを提供する代わりの一法は、好適なプライマーを出発サンプル材料と共に、充填チャンバに加える方法である（但し、存在する場合、プライマーはフィルターを通過できる）。
【００７２】
出発サンプル材料およびあらゆる必要なプライマーを処理チャンバ内に配置した後、選択された遺伝物質のＰＣＲ増幅に適した条件で、処理チャンバ内の材料を熱的に循環させる。
【００７３】
ＰＣＲ増幅法の完了後、各第１処理チャンバ内の材料を、別のフィルターチャンバ（各処理チャンバごとに１つのフィルターチャンバ）に進めて、増幅された材料から、好ましくない材料、たとえば、ＰＣＲプライマー、フィルターで除去されなかった出発サンプル中の好ましくない材料等々を、除去することが可能である。該フィルターチャンバは、たとえば、チャンバの表面上に塗布された有効化学成分を含む。あるいは、またはさらに、フィルターチャンバは、サンプル浄化（たとえば、色素除去）に関して上述した固相材料を含んでもよい。このようなデバイスに有効化学成分が含まれる領域は、チャンバであってもよく、または２つのチャンバ間を接続することによって画定されるボリューム内であっても、またはその両者であってもよい。
【００７４】
フィルターチャンバ内のサンプル材料の浄化後、たとえば、第２処理チャンバで受ける温熱条件の適切な制御により、第１処理チャンバ内で増幅された遺伝物質をシークエンスサイクリングするために、各第１処理チャンバからの濾過されたＰＣＲ増幅生成物を、第２処理チャンバに移動させる。
【００７５】
シークエンスサイクリング（たとえば、サンガー・シークエンシング（Ｓａｎｇｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ））法の完了後、各第２処理チャンバ内の材料を、別のフィルターチャンバ（各処理チャンバごとに１つのフィルターチャンバ）に進めて、シークエンシングラダーから、好ましくない材料（たとえば、シークエンシングプライマー、ｄｄＮＴＰ等々）を除去することが可能である。該フィルターチャンバは、たとえば、チャンバの表面上に被覆された有効化学成分を含む。あるいは、またはさらに、フィルターチャンバは、サンプル浄化（たとえば、色素除去）のために、上述の固相材料を含んでもよい。また、有効化学成分は、チャンバ内にあってもよく、またはチャンバ間のチャネルにあってもよい。
【００７６】
本発明は、サンプル混合物を処理（たとえば、浄化）するためのデバイスも提供する。該サンプル材料は、様々な態様で：反射層（たとえば、金属層）；デバイスの回転中に冷却を増強するためのバッフル構造；濾過材料を捕捉するためのキャプチャプラグ；選択的に開放することができる弁機構、処理チャンバ内の温度をモニター／制御するための温度指示器、エネルギー吸収を高めるための処理チャンバ内の吸収材料；等々の１つ以上を含んでもよいデバイス内の複数の処理チャンバに位置してもよい。様々な実施形態において、該デバイスは、試薬、フィルター、および他のサンプル処理材料を、処理チャンバ内に含んでもよい。
【００７７】
本発明のデバイスの温度制御の長所の中で最たるものは、チャンバ対チャンバの温度一様性、チャンバ対チャンバの類似した温度変化率、および熱エネルギーが加えられるまたは処理チャンバから除去される速い速度である。こうした温度制御の長所に寄与できること以外に、該デバイスの特徴の中で最たるものは、デバイス内に反射層（たとえば、金属製）を含むこと、デバイスから熱エネルギーを除去するのに役立つバッフル構造、およびデバイスの低熱質量である。温度指示器をデバイス内に包含することにより、処理中ずっと、デバイスを回転させているときでも、チャンバ温度の強力な制御を達成することが可能である。
【００７８】
本発明の原理に準拠して製造された１つの例示的なデバイスを、図１に示す。デバイス１０は、好ましくは、図１に示すような、円形のディスクの形状であるが、回転させることができる任意の他の形状を、好ましい円形ディスクの代わりに使用することも可能であろう。図１のデバイス１０は、基材２０、第１層３０、および第２層４０を含む多層複合構造である。
【００７９】
該デバイスは、複数の処理チャンバ５０を含み、それぞれが、サンプルおよびサンプルと共に熱的に循環させる他の材料を入れるためのボリュームを画定する。図解したデバイス１０は、９６個の処理チャンバ５０を包含するが、本発明に従って製造されるデバイスに関連して提供される処理チャンバの正確な数は、必要に応じて、９６より多くても、または９６未満であってもよいことが理解されるであろう。
【００８０】
図解したデバイス１０内の処理チャンバ５０は、ウェルの形態であるが、本発明のデバイス内の処理チャンバは、毛細管、通路、チャネル、溝、または任意の他の適当に画定されたボリュームの形態で提供することが可能である。処理チャンバ５０は、共通充填チャンバ６２と一緒に、サンプルを処理チャンバ５０に配送するための配送システムを提供する流通路６０と流体連通している。充填チャンバ６２を介したデバイス１０へのサンプルの導入は、遠心力によってサンプル材料を外に向かって移動させるように、デバイス１０を、回転の中心軸の周りを回転させることによって実施することが可能である。デバイス１０を回転させる前に、流通路６０を通って処理チャンバ５０に送達するために、サンプルを充填チャンバ６２に導入してもよい。処理チャンバ５０および／または流通路６０は、空気を逃がすための出入り口および／またはサンプル材料を処理チャンバ５０に配送するのに役立つ特徴を含んでもよい。あるいは、配送過程の間に、閉鎖系配送システム、すなわち、処理チャンバ５０および／または流通路６０内部の空気も逃げる開口部を通って材料を導入することができるシステムを提供することも可能であろう。別の代替法では、真空または圧力の助けを借りて、サンプル材料を処理チャンバ５０に充填することも可能であろう。
【００８１】
処理チャンバ５０、付随流通路６０、および充填チャンバ６０は全て結合して、デバイス１０上に多数のプロセスアレイを形成し、各プロセスアレイは、処理チャンバ５０の１つ、処理チャンバ５０を充填チャンバ６２に接続する流通路６０、および充填チャンバ６２それ自体を含む。該プロセスアレイは、好ましくは、デバイス１０上に、放射状に配列されている。
【００８２】
図２〜４を参照すると、図１のデバイス１０の代わりに使用することができるプロセスアレイの異なる配列を有する代替デバイス１１０が描写されている。図２で見られるデバイス１１０は、多数の独立したプロセスアレイを含み、それぞれが、充填チャンバ１６２ならびに処理チャンバ１５０ａ、１５０ｂおよび１５０ｃを接続する流通路１６０ａおよび１６０ｂを含む。デバイス１１０上のプロセスアレイは、異なるプロセスアレイが互いに流体連通していないという意味で独立しており、図１のデバイス１０上のプロセスアレイは流体連通しているが、そうではなくて、互いに離れており、別個である。
【００８３】
プロセスアレイがデバイス１１０の中心から放射状に配列されていることは好ましい。結果としてデバイスの回転を使用して、サンプル材料を、チャンバおよび流通路を介して漸次除去することができる。描写したデバイス１１０は、１６のプロセスアレイを含むが、本発明に関連して使用されるデバイスは、任意の所望の数のプロセスアレイを含んでもよいことが理解されるであろう。さらに、デバイス１１０の各プロセスアレイは、１個の充填チャンバ、および流通路によって順次接続された３個の処理チャンバを含むが、本発明のプロセスアレイは、たった２個の相互に連絡したチャンバを含んでもよいことを理解すべきである。
【００８４】
図３は、デバイス１１０上の１つのプロセスアレイの拡大図であり、図４は、図３のプロセスアレイの一部の断面図である。各プロセスアレイは、流通路１６０ａを介して第１の処理チャンバ１５０ａに接続された充填チャンバ１６２を含む。第１の処理チャンバ１５０ａは、次には、流通路１６０ｂを介して、第２の処理チャンバ１５０ｂに接続されている。第２の処理チャンバ１５０ｂは、描写されているプロセスアレイでは、充填チャンバ１６２から最も遠くに位置する第３の処理チャンバ１５０ｃに接続されている。材料を、充填チャンバ１６２から第３の処理チャンバ１５０ｃに向けてプロセスアレイ内を移動させる場合、充填チャンバ１６２は、処理チャンバ１５０ａ、１５０ｂまたは１５０ｃより、デバイスの回転の軸に近接して位置することが好ましいであろう。
【００８５】
図４の断面図は、本発明に関連して使用することができるであろうデバイスの１つの可能性がある構造物の、多数の他の特徴を表す。該構造物は、デバイスの特徴が形成されるコア１８０を含む。コア１８０の一表面１８２は、それに付いているカバーフィルム１８４を含んでもよい。該カバーフィルム１８４は、任意の好適な構造のものであってもよいが本明細書に記載の接着剤カバーフィルムが好ましいであろう。
【００８６】
処理チャンバ１５０ａのボリュームを包囲するために、処理チャンバ１５０ａの底部も、コア１８０の表面１８８に付いているカバー１８６を含んでもよい。カバー１８４と同様に、カバー１８６は、接着剤、たとえば本明細書に記載の感圧接着剤を使用してコア１８０に付けられており、またコア１８０で密封することが好ましいであろう。カバー１８６は、処理チャンバ１５０ａ内への、および処理チャンバ１５０ａからの、熱エネルギー移行を増強する金属層の形態で提供されることが好ましいであろう。幾つかの実施形態では、カバー１８６は、たとえば、２００１年６月２８日出願の、強化されたサンプル処理デバイス、システムおよび方法（ＥＮＨＡＮＣＥＤ  ＳＡＭＰＬＥ  ＰＲＯＣＥＳＳＩＮＧ  ＤＥＶＩＣＥＳ，ＳＹＳＴＥＭＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ）と題する、米国特許出願第０９／８９４，８１０号明細書に記載されている、環形構造の形態で提供することも可能である。
【００８７】
第１の処理チャンバ１５０ａは、それ以外は概ね円形であろう、第１の処理チャンバ１５０ａの境界に突き出たリップの形態の弁構造１７０ａを含む。リップ１７０ａは、たとえば、図４で見られるような、下部を切り取った、処理チャンバ１５０ａのボリューム内に伸張した形態である。リップ１７０ａに開口部が提供されるとき、処理チャンバ１５０ａ内のサンプル材料は、第２の処理チャンバ１５０ｂに送達するための流通路１６０ｂ内に移動できることが望ましい。リップ１７０ａに開口部が存在しなければ、流通路１６０ｂを介した、第２の処理チャンバ１５０ｂへの材料の移動は、別の状況では第１の処理チャンバ１５０ａから流通路１６０ｂへのサンプル材料の流入を防止するようにカバー１８４に接触して封鎖するリップ１７０ａによって阻止される。
【００８８】
リップ１７０ａは、好ましくは、厚さが減少した領域１７２ａを含むことが可能である。これは、図４の断面図で最もよく分かる。領域１７２ａが、たとえば、穴があけられているか、さもなければそれを通して形成される開口部を含むように変形されている場合、処理チャンバ１５０ａのボリューム内に置かれているサンプル材料は、チャンバから、第２の処理チャンバ１５０ｂに送達するための流通路１６０ｂに移動することができる。
【００８９】
必要ではないが、領域１７２ａの厚さの減少は、多数の利点を提供することが可能である。領域１７２ａの厚さの減少によって、たとえば、所望の開口部を提供するために、リップ１７０ａに容易に穴をあけることが可能な位置を限定することが可能性である。すなわち、領域１７２ａを取り囲むリップ１７０ａのより厚い部分は、リップ１７０ａに穴をあけてそれを通る開口部を形成するために使用することができるであろう技術のいずれによっても、穴あけに抵抗する。リップ１７０ａに穴をあけるために使用することができるであろう技術としては、たとえば、機械的貫通（たとえば、ピン、針等々を使用）、レーザーアブレーション等々がある。厚さが減少した領域１７２ａの、もう１つの潜在的利点は、たとえば、処理チャンバおよび流通路と一緒に、コア層１８０に成型できることである。
【００９０】
本明細書に記載のもの等のデバイスは、たとえば、ＰＣＲ、サンガー・シークエンシング（Ｓａｎｇｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）等々の方法を実施するのに適しているが、本発明のデバイスは、実施することが可能なこのような方法の生成物を、デバイスから浄化することに限定されるであろう。
【００９１】
図１〜４に描写されているもの等のプロセスアレイを含むデバイスの回転を使用して、サンプル材料、および処理チャンバ内に存在する他のあらゆる材料（たとえば、試薬等々）の、機械的攪拌を介した混合を容易にすることが可能である。機械的攪拌は、回転の軸の周りを、デバイスを反対方向に振動させることによって実施される。振動は、様々な因子、たとえば、処理チャンバのサイズ／形状、処理チャンバ内の材料の量、サンプル材料の粘度、温度、安定性等々によって、振動数および／または大きさは様々であってもよい。たとえば、約１〜約１００ヘルツ（Ｈｚ）の振動数でデバイス１０を振動することによって混合を実施することは有用であろう。振動の大きさは、たとえば、約５〜約３６０°であってもよい。
【００９２】
機械的攪拌は、たとえば、ＰＣＲ、サンガー・サイクリング（Ｓａｎｇｅｒ  ｃｙｃｌｉｎｇ）、ＰＣＲ反応混合物の浄化、シークエンシング反応混合物の浄化の間、ならびに本明細書に記載のマイクロ流体デバイスで実施することができる様々な他の方法の間に、実施することができる。同様に、回転による機械的攪拌、または他の手段を、本明細書に記載のデバイスのいずれかで実施することができる。
【実施例】
【００９３】
本発明の目的および利点を以下の実施例によってさらに説明するが、これらの実施例に列挙されている特定の材料およびその量、ならびに他の条件および詳細が、本発明を不当に制限すると解釈すべきではない。
【００９４】
実施例１：シークエンシング反応浄化用ＰＥＳ／ＰＳＳＡ膜カラムの調製。
ＳＢ−６４０７という商品名でニューヨーク、イースト・ヒルズにあるポール・コーポレーション（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ，ＮＹ）から販売されているポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）／コポリマーイオン交換膜の、直径４７ミリメートル（４７ｍｍ）のディスクを、メタノールに短時間浸して、膜を十分に湿らせ、次いで蒸留水で洗浄してから、脱イオン水に溶解したポリ（ナトリウム４−スチレンスルホネート）（ＰＳＳＡ）溶液に移した。該ＰＥＳ膜は、膜表面にグラフトされた第四級アンモニウム基を含有する。このＰＥＳ膜を、以下に示す様々な重量％のＰＳＳＡ溶液（惹起濃度）に一晩浸漬し、次いで蒸留水で４回洗浄し、風乾させた。
【００９５】
０．０１〜０．１重量％のＰＳＳＡ惹起濃度を有するＰＥＳ膜を、上述の通りに調製した。ＰＳＳＡ被覆ＰＥＳ膜のディスク（４ｍｍ直径）を、ポリエチレンポレックス（Ｐｏｒｅｘ）フリット（ポアサイズ５０〜１００μｍ；ジョージア州フェアバーンにあるポレックス・コーポレーション（Ｐｏｒｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｆａｉｒｂｕｒｎ，ＧＡ）から入手）を取り付けた直径４ｍｍのカラム内に留置し、止め輪（４ｍｍ直径）を膜の上に載せて、膜を適所に維持した。ビッグダイ（ＢＩＧＤＹＥ）ミックス２μｌ、ＤＮＡ鋳型２００ナノグラム（ｎｇ）、およびプライマー１．６ピコモルを含有する、４分の１強度のビッグダイ・ターミネーターズ（ＢＩＧＤＹＥ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ）ｖ  ２．０（カリフォルニア州フォスター・シティにあるアプライド・バイオシステムズ・インク（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ））サイクルシークエンシング反応混合物１０マイクロリットル（１０μｌ）を、製造業者の説明書に従って、ＧＥＮＥＡＭＰ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００  サーモサイクラー（アプライド・バイオシステムズ・インク（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．））で、サーモサイクルに付した。未精製のシークエンシング反応混合物（ダイターミネーターおよびそれらの加水分解生成物、ＤＮＡ鋳型、Ｔａｑポリメラーゼ、緩衝液、ｄＮＴＰ類、およびプライマーを含有する）５〜１０マイクロリットル（５〜１０μｌ）を、各カラム上にピペットで移し、サンプルを７５０×ｇで２分間遠心分離して、溶離液を回収した。滅菌水１０〜１５マイクロリットル（１０〜１５μｌ）を各サンプルに加え、サンプルの質を評価するために、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）および逆相高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）で分析した。
【００９６】
実施例２：キャピラリー電気泳動および逆相ＨＰＬＣを使用した、ビッグダイ・ターミネーターズ（ＢＩＧＤＹＥ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ）ｖ  ２．０シークエンシング反応の浄化用ＰＥＳ／ＰＳＳＡ膜のスクリーニング。
ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０または３１００ジェネティック・アナライザー（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）（アプライド・バイオシステムズ・インク（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．））によるシークエンシング分析の前に、シークエンシング反応混合物を浄化するための、具体的にはダイターミネーターを除去し、かつシークエンシングラダーを回収するための、材料の性能を評価するための分析ツールとして、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）および逆相ＨＰＬＣを使用した。
【００９７】
キャピラリー電気泳動：内径７５μｍ、長さ３０ｃｍ（検出器まで２０ｃｍ）の溶融石英毛細管を使用した、蛍光検出器（４８８ナノメートル（ｎｍ）励起、５３０ｎｍ〜７００ｎｍ発光）付ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）Ｐ／ＡＣＥ  ＭＤＱキャピラリー電気泳動機（カリフォリニア州フラートンのベックマン・コールター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ））を用いて、精製したシークエンシング反応（実施例１に記載の通りに精製した）のキャピラリー電気泳動分析を実施した。泳動は、ランニングバッファーとして５０ミリモル濃度（ｍＭ）Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．５）を使用して、５００ボルト・パー・センチメートル（Ｖ／ｃｍ）（計１５ＫＶ）で実施した。サンプル注入は、６９０パスカルで５秒間、行った。使用した条件は、ダイターミネーター（４つの塩基、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃに対応する４つのｄｄＮＴＰ全てが、３．２分の保持時間を有する１つのピークとして）およびその分解生成物（２．２分の保持時間を有する１つのピークとして）および複合シークエンシングラダー（４．１分の保持時間を有する１つのピークとして）の良好な分離をもたらした。シークエンシングラダーおよびダイターミネーター濃度は、様々な検体のピーク面積を積分することによって得た。各サンプルごとに、検体値からベースラインを減じ、結果として得られた検体濃度を、出発シークエンシング反応のパーセンテージとして表した。ＣＥの結果は、ダイターミネーターおよびその分解生成物含量は、最初の濃度の２％未満まで低下し、また溶液中のＤＮＡ含量は、出発濃度の少なくとも３０％であることを示した。この傾向は、０．０１〜０．１重量％の範囲のＰＳＳＡ惹起濃度に当てはまる（表１）。これらのデータから、ダイターミネーター除去およびシークエンシングラダー回収は、ＰＳＳＡ不動態化レベルによって異なることが分かった。特に良好なシークエンシングデータの場合、サンプルは、以下の２つの条件：１）ダイターミネーター除去は、９８％を超えている；および２）シークエンシングラダーの回収は、少なくとも３０％である；を満たしていた。
【００９８】
【表１】
2005514014.tif 000003
【００９９】
逆相ＨＰＬＣ：４７４走査蛍光検出器および９９６光ダイオードアレイ検出器およびＣ１８カラムを備えたウォーターズ・アライアンス（Ｗａｔｅｒｓ  ＡＬＬＩＡＮＣＥ）２６９０分離モジュール（マサチュセッツ州ミルフォードのウォーターズ・コーポレーション（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ））を用いて、精製したシークエンシング反応（実施例１に記載の通りに精製）のＨＰＬＣ分析を実施した。使用した移動相は、１分当たり０．１ミリリットル（ｍｌ／分）の流速を有する、７０％酢酸トリエチルアミン（ＴＥＡａＣ）および３０％アセトニトリルであった。精製したシークエンシング反応の２．５μｌサンプルを注入し、泳動時間は１５分間であった。蛍光検出器を使用して分析を行ったところ、使用した条件は、ダイターミネーター（４つの塩基、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃに対応する４つのｄｄＮＴＰ全てが、１つのピークとして）およびそれらの分解生成物（１つのピークとして）の良好な分離をもたらした。ダイターミネーター濃度は、様々な検体のピーク面積を積分することによって得た。各サンプルごとに、検体値からベースラインを減じ、結果として得られた検体濃度を、出発シークエンシング反応のパーセンテージとして表した。また、得られたデータから、ダイターミネーター除去は、ＰＳＳＡ不動態化レベルによって異なることが分かった。特に良好なシークエンシングデータの場合、ダイターミネーター除去は、９８％を超えていた。これらの結果は、キャピラリー電気泳動を使用して得た結果と良好な関係があった。
【０１００】
実施例３：ＰＥＳ／ＰＳＳＡ膜カラムを用いたビッグダイ・ターミネーターズ（ＢＩＧＤＹＥ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ）ｖ  ２．０シークエンシング反応浄化。
様々なＰＥＳ／ＰＳＳＡ膜カラムを、実施例１に記載の通りに調製した。未精製の４分の１強度のシークエンシング反応混合物（ダイターミネーターおよびそれらの加水分解生成物、ＤＮＡ鋳型、Ｔａｑポリメラーゼ、緩衝液、ｄＮＴＰ類、およびプライマーを含有する）５〜１０マイクロリットル（５〜１０μｌ）を、各カラム上にピペットで移し、サンプルを実施例１に記載の通りに精製した。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０ジェネティック・アナライザー（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）（アプライド・バイオシステムズ・インク（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．））で急速シークエンシングモジュールを使用して、この精製したシークエンシング反応を分析した。結果として得られた電気泳動図を質（たとえば色素斑、Ｎｓの数）について手動でチェックし、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）を介して入手できるＢＬＡＳＴプログラムを使用して、参考配列と比較した。加えて、フレッド（Ｐｈｒｅｄ）ベース・コーリング・プログラム（マサチュセッツ州デダムのコドンコード・コープ（Ｃｏｄｏｎｃｏｄｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｄｅｄｈａｍ，ＭＡ））を使用して、この電気泳動図を分析した。フレッド（Ｐｈｒｅｄ）プログラムは、極めて正確な、塩基特異的品質スコアを生み出す。この品質スコアは、品質を評価するための理想的なツールである。ＰＥＳ／ＰＳＳＡ膜カラムを使用して精製したシークエンシング反応について作成されたフレッド（Ｐｈｒｅｄ）品質スコアを、下表２に示す。結果から、ＰＥＳ／ＰＳＳＡ膜は、業界基準と考えられる、ＣＥＮＴＲＩＳＥＰカラム（ニュージャージー州アデルフィアのプリンストン・セパレーションズ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ａｄｅｌｐｈｉａ，ＮＪ））を使用して作成されたデータに匹敵する、良好なシークエンシングデータをもたらすことが分かった。成功した反応の平均読み取り長さは４００塩基であり、そのベース・コーリング確度は９７〜９８％であった。
【０１０１】
【表２】
2005514014.tif 000004
【０１０２】
実施例４：マイクロ流体ディスクおよびＰＥＳ／ＰＳＳＡ膜を使用したビッグダイ・ターミネーターズ（ＢＩＧＤＹＥ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ）ｖ  ２．０シークエンシング反応浄化。
積層ポリプロピレンディスク（直径８０ｍｍ、厚さ０．０３０インチ（厚さ７６２μｍ））に放射状に配列された８つのデュプリケート処理レーンからなる簡素化したマイクロ流体ディスクを使用した。各処理レーンは、１本のチャネル（深さ０．０１０インチ（深さ２５４μｍ）、幅０．０１５インチ（幅３８１μｍ））で出力チャンバ（円形ウェル、直径４ｍｍ、半径２９．０ｍｍの上に位置する）に接続された、１つの、入力および浄化の共用チャンバ（半径１６．５ｍｍの上に位置する、円形ウェル、直径７．１１ｍｍ）で構成されていた。
【０１０３】
浄化は、実施例１に記載の通りに調製したＰＥＳ／ＰＳＳＡ膜を使用して行った。最適レベルの不動態化のために、０．００１〜０．１重量％ＰＳＳＡのＰＳＳＡ惹起濃度を使用した。該膜のディスク（直径３．２ｍｍ）を、粘着性カバーフィルム（９７９５Ｒアドバンスト・シーリング・テープ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｓｅａｌｉｎｇ  Ｔａｐｅ）、ミネソタ州セント・ポールのスリーエム・メディカル・スペシャリティーズ（３Ｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ））上に配置し、これを、膜が浄化チャンバの最上部／または底部を覆うように、登録済の膜と共にマイクロ流体ディスク上に貼り合わせた。ビッグダイ（ＢＩＧＤＹＥ）ミックス２μｌ、ＤＮＡ鋳型２００ｎｇ、およびプライマー１．６ピコモルを含有する５マイクロリットル（５μｌ）の未精製の４分の１強度のビッグダイ・ターミネーターズ（ＢＩＧＤＹＥ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ）ｖ  ２．０シークエンシング反応混合物を、浄化チャンバに導入し、最高２０分間、置いておいた。膜と接触させながらこの溶液を混合することにより、浄化を実行するのに要する時間が減少した。この時間を過ぎると、未精製のシークエンシング溶液（ダイターミネーターおよびそれらの加水分解生成物、ＤＮＡ鋳型、Ｔａｑポリメラーゼ、緩衝液、ｄＮＴＰ類、およびプライマーを含有する）中の比較的小さい分子は、膜に結合され、シークエンシングラダーは、溶液中に残された。この溶液を浄化チャンバから除去し、引き続いて滅菌水で１０〜１５μｌに希釈することにより、シークエンシングの準備が整ったサンプルが得られた。
【０１０４】
このサンプルを、標準シークエンシング条件で、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００ジェネティック・アナライザー（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）（アプライド・バイオシステムズ・インク（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．））で分析した。実施例３に記載のＢＬＡＳＴおよびフレッド（Ｐｈｒｅｄ）プログラムを使用して、結果として得られた電気泳動図を、質およびベースコーリング確度に関して手動でチェックした。マイクロ流体ディスク内のＰＥＳ／ＰＳＳＡ膜を使用して精製したシークエンシング反応について作成されたフレッド（Ｐｈｒｅｄ）品質スコアを下表３に示す。結果から、ＰＥＳ／ＰＳＳＡ膜は、ＣＥＮＴＲＩＳＥＰカラムを使用して作成されたデータに匹敵する良好なシークエンシングデータを与えることが分かった。成功した反応の平均読み取り長さは６００塩基であり、そのベースコーリング確度は９７〜９８％であった。
【０１０５】
【表３】
2005514014.tif 000005
【０１０６】
実施例５：ポリクォット（Ｐｏｌｙｑｕａｔ）／ＰＳＳＡ被覆接着剤を用いたビッグダイ・ターミネーターズ（ＢＩＧＤＹＥ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ）ｖ  ２．０シークエンシング反応浄化。
ゼラチン（ミズーリ州セント・ルイスのシグマ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓｅ，ＭＯ）から販売されている、ウシ血清由来の７５ブルーム）２．７５グラム（ｇ）を、脱イオン水１９ｍｌと配合し、溶解するまで６０〜７０℃に加熱することにより、第四級アンモニウムイオン基を含有する層を調製した。６０：４０比のプロピレングリコールメチルエーテル：水に溶解したトリメチルアミノエチルメタクリレートおよびメチルメタクリレートのコポリマーのポリクォット（Ｐｏｌｙｑｕａｔ）溶液（３．５ｍｌ）（シントラン（ＳＹＮＴＲＡＮ）  Ｈｘ３１−６５という商品名で、マサチュセッツ州カントンのインターポリマー・コーポレーション（Ｉｎｔｅｒｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｎｔｏｎ，ＭＡ）から販売されている）を、ヘロキシ・モディファイヤー（ＨＥＬＯＸＹ  Ｍｏｄｉｆｉｅｒ）４８という商品名で、テキサス州ハウストンのレゾルーション・パーフォーマンス・プロダクツ（Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）から市販されている、加熱活性化された化学架橋剤（脂肪族トリグリシジルエーテル）４〜５滴と共に加えた。酸素プラズマ処理した感圧シリコーン接着剤（９７９５Ｒアドバンスト・シーリング・テープ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｓｅａｌｉｎｇ  Ｔａｐｅ）、ミネソタ州セント・ポールのスリーエム・メディカル・スペシャリティーズ（３Ｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ））のサンプルを、この溶液に浸し、溶媒を除去するために１１５〜１２０℃にて１５分間加熱し、次いで脱イオン水で十分に洗浄して、厚さ１３μｍのフィルムを形成した。次いで、この被覆接着剤を、ＰＳＳＡの０．００１〜０．０６重量％溶液中に一晩浸漬し、水で再度洗浄し、風乾した。
【０１０７】
上述のポリクォット（Ｐｏｌｙｑｕａｔ）／ＰＳＳＡ被覆接着剤を、実施例４に記載のマイクロ流体ディスク（図２）の浄化チャンバの最上部／または底部に適用した。この実施例では、シークエンシング反応混合物５μｌ（ビッグダイ（ＢＩＧＤＹＥ）ｖ  ２．０ミックス１μｌ、鋳型２００ｎｇ、およびプライマー１．６ピコモルを含有する）を、本デバイスの処理チャンバ内で循環させ、弁を開き、未精製の反応混合物を浄化用処理チャンバに入れ、１２〜１４Ｈｚの振動数にて２０°の角変異で短時間（１０分未満）、ディスクを振盪することにより、このデバイスを機械的に攪拌し、次いで、精製した反応混合物を出すために、第２の弁を開いた。精製された反応を取り出して、標準シークエンシング条件で、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００ジェネティック・アナライザー（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）（アプライド・バイオシステムズ・インク（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．））で分析した。
【０１０８】
実施例３に記載の通りにＢＬＡＳＴおよびフレッド（Ｐｈｒｅｄ）プログラムを使用して、結果として得られた電気泳動図を、質およびベースコーリング確度に関して、手動でチェックした。マイクロ流体ディスク内のポリクォット（Ｐｏｌｙｑｕａｔ）／ＰＳＳＡ被覆接着剤を使用して精製したシークエンシング反応について作成されたフレッド（Ｐｈｒｅｄ）品質スコアを、下表４に示す。この結果から、ポリクォット（Ｐｏｌｙｑｕａｔ）／ＰＳＳＡ被覆接着剤は、ＣＥＮＴＲＩＳＥＰカラムを使用して作成されたデータに匹敵する良好なシークエンシングデータを与えることが分かった。成功した反応の平均読み取り長さは６５０塩基であり、そのベースコーリング確度は９７〜９８％であった。
【０１０９】
【表４】
2005514014.tif 000006
【０１１０】
実施例６：ポリクォット（Ｐｏｌｙｑｕａｔ）／ＰＳＳＡ被覆ポリカーボネートを用いた、ビッグダイ・ターミネーターズ（ＢＩＧＤＹＥ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ）ｖ  ２．０シークエンシング反応浄化。
方法１．ゼラチン（ミズーリ州セント・ルイスのシグマ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓｅ，ＭＯ）から販売されている、ウシ血清由来の７５ブルーム）２．７５グラム（ｇ）を脱イオン水１９ｍｌと配合し、溶解するまで６０〜７０℃に加熱することにより、第四級アンモニウムイオン基を含有する層を調製した。６０：４０比のプロピレングリコールメチルエーテル：水に溶解したトリメチルアミノエチルメタクリレートおよびメチルメタクリレートのコポリマーのポリクォット（Ｐｏｌｙｑｕａｔ）溶液（３．５ｍｌ）（シントラン（ＳＹＮＴＲＡＮ）  Ｈｘ３１−６５という商品名で、マサチュセッツ州カントンのインターポリマー・コーポレーション（Ｉｎｔｅｒｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｎｔｏｎ，ＭＡ）から販売されている）を、テキサス州ハウストンのレゾルーション・パーフォーマンス・プロダクツ（Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）から市販されているヘロキシ・モディファイヤー（ＨＥＬＯＸＹ  Ｍｏｄｉｆｉｅｒ）４８化学架橋剤４〜５滴と共に加えた。酸素プラズマ処理したポリカーボネートのサンプルを、３００ｍｍ間隙で針金被覆し、溶媒を除去するために１１５〜１２０℃にて１５分間加熱し、次いで脱イオン水で十分に洗浄して、厚さ２．６μｍのフィルムを形成した。次いで、この被覆接着剤を、ＰＳＳＡの０．０００１〜０．１重量％溶液中に一晩浸漬し、水で再度洗浄し、風乾した。
【０１１１】
方法２．６０：４０比のプロピレングリコールメチルエーテル：水に溶解したトリメチルアミノエチルメタクリレートおよびメチルメタクリレートのコポリマーのポリクォット（Ｐｏｌｙｑｕａｔ）溶液（３ｍｌ）（シントラン（ＳＹＮＴＲＡＮ）Ｈｘ３１−６５という商品名で、マサチュセッツ州カントンのインターポリマー・コーポレーション（Ｉｎｔｅｒｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｎｔｏｎ，ＭＡ）から販売されている）を、テキサス州ハウストンのレゾルーション・パーフォーマンス・プロダクツ（Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）から市販されているヘロキシ・モディファイヤー（ＨＥＬＯＸＹ  Ｍｏｄｉｆｉｅｒ）４８架橋剤３滴と共に、ジエチレングリコールブチルエーテル３ｍｌ、ジブチルフタレート（可塑剤）２０μｌに加えた。酸素プラズマ処理したポリカーボネートのサンプルを、３００ｍｍ間隙で針金被覆し、一晩風乾し、溶媒を除去するために１１５〜１２０℃にて１５分間加熱し、次いで脱イオン水で十分に洗浄して、厚さ２．６μｍの乾燥フィルムを形成した。次いで、この被覆接着剤を、ＰＳＳＡの０．０００１〜０．１重量％溶液中に一晩浸漬し、水で再度洗浄し、風乾した。
【０１１２】
ポリクォット（Ｐｏｌｙｑｕａｔ）／ＰＳＳＡ被覆ポリカーボネートを、実施例４に記載の通りに、マイクロ流体ディスク（図２）の浄化チャンバの最上部および／または底部に適用した。未精製のビッグダイ（ＢＩＧＤＹＥ）ｖ  ２．０  ４分の１強度のシークエンシング反応５マイクロリットル（５μｌ）を浄化チャンバに導入し、実施例５に記載の通りに精製した。精製されたサンプルをマイクロ流体ディスクから取り出して、標準シークエンシング条件で、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００ジェネティック・アナライザー（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）（アプライド・バイオシステムズ・インク（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．））で分析した。
【０１１３】
実施例３に記載の通りにＢＬＡＳＴおよびフレッド（Ｐｈｒｅｄ）プログラムを使用して、結果として得られた電気泳動図を、質およびベースコーリング確度に関して、手動でチェックした。マイクロ流体ディスク内のポリクォット（Ｐｏｌｙｑｕａｔ）／ＰＳＳＡ被覆ポリカーボネートを使用して精製したシークエンシング反応について作成されたフレッド（Ｐｈｒｅｄ）品質スコアを、下表５に示す。この結果から、ポリクォット（Ｐｏｌｙｑｕａｔ）／ＰＳＳＡ被覆ポリカーボネートは、ＣＥＮＴＲＩＳＥＰカラムを使用して作成されたデータに匹敵する良好なシークエンシングデータを与えることが分かった。成功した反応の平均読み取り長さは６００〜６５０塩基であり、そのベースコーリング確度は９７〜９８％であった。
【０１１４】
【表５】
2005514014.tif 000007
【０１１５】
実施例７：ＰＥＳ／ＰＳＳＡ膜カラムを用いたビッグダイ・ターミネーターズ（ＢＩＧＤＹＥ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ）ｖ  ３．０シークエンシング反応浄化。
ＰＥＳ／ＰＳＳＡ膜の４ｍｍディスクを有するスピンカラムを、実施例１に記載の通りに調製した。ビッグダイ（ＢＩＧＤＹＥ）ミックス２μｌ、ＤＮＡ鋳型２００ｎｇおよびプライマー１．６ピコモルを含有する、４分の１強度のビッグダイ・ターミネーターズ（ＢＩＧＤＹＥ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ）ｖ  ３．０（アプライド・バイオシステムズ・インク（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．））サイクルシークエンシング反応混合物１０マイクロリットル（１０μｌ）を、製造業者の説明書に従って、ＧＥＮＥＡＭＰ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００  サーモサイクラー（アプライド・バイオシステムズ・インク（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．））で、サーモサイクルに付した。未精製の４分の１強度のシークエンシング反応混合物（ダイターミネーターおよびそれらの加水分解生成物、ＤＮＡ鋳型、Ｔａｑポリメラーゼ、緩衝液、ｄＮＴＰ類、およびプライマーを含有する）５〜１０マイクロリットル（５〜１０μｌ）を、各カラム上にピペットで移し、サンプルを実施例１に記載の通りに精製した。サンプルを、１０μｌに希釈し、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０ジェネティック・アナライザー（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）で、急速シークエンシングモジュール（アプライド・バイオシステムズ・インク（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．））を使用して分析した。結果として得られた電気泳動図を、実施例３に記載の通りにＢＬＡＳＴおよびフレッド（Ｐｈｒｅｄ）プログラムを使用して、質およびベースコーリング確度について、手動でチェックした。ＰＥＳ／ＰＳＳＡ膜で精製したビッグダイ（ＢＩＧＤＹＥ）ｖ  ３．０シークエンシング反応について作成されたフレッド（Ｐｈｒｅｄ）品質スコアを、下表６に示す。この結果から、ＰＥＳ／ＰＳＳＡ膜は、ＣＥＮＴＲＩＳＥＰカラムを使用して作成されたデータに匹敵する、良好なシークエンシングデータをもたらすことが分かった。成功した反応の平均読み取り長さは４００塩基であり、そのベースコーリング確度は９７〜９８％であった。
【０１１６】
【表６】
2005514014.tif 000008
【０１１７】
実施例８：ＰＥＳ／ＰＳＳＡ膜カラムを用いたダイナミックＥＴダイターミネーターズ（ＤＹＥｎａｍｉｃ  ＥＴ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ）シークエンシング反応浄化。
ＰＥＳ／ＰＳＳＡ膜の４ｍｍディスクおよび１．０ｍｍまたは４ｍｍの止め輪を有するスピンカラムを、実施例１に記載の通りに調製した。ダイナミックＥＴダイ（ＤＹＥｎａｍｉｃ  ＥＴ  Ｄｙｅ）ターミネータミックス２μｌ、ＤＮＡ鋳型２００ｎｇ、およびプライマー１．６ピコモルを含有する、４分の１強度のダイナミックＥＴダイターミネーター（ＤＹＥｎａｍｉｃ  ＥＴ  Ｄｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ）（ニュージャージー州ピスキャタウェイのアマーシャム・バイオサイエンシイーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））サイクルシークエンシング反応混合物１０マイクロリットル（１０μｌ）を、製造業者の説明書に従って、ＧＥＮＥＡＭＰ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００  サーモサイクラー（アプライド・バイオシステムズ・インク（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．））で、サーモサイクルに付した。未精製の４分の１強度のシークエンシング反応混合物（ダイターミネーターおよびそれらの加水分解生成物、ＤＮＡ鋳型、Ｔａｑポリメラーゼ、緩衝液、ｄＮＴＰ類、およびプライマーを含有する）５〜１０マイクロリットル（５〜１０μｌ）を、各カラム上にピペットで移し、サンプルを実施例１に記載の通りに精製した。サンプルを、１０μｌに希釈し、標準シークエンシング条件で、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００ジェネティック・アナライザー（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）（アプライド・バイオシステムズ・インク（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．））で分析した。結果として得られた電気泳動図を、実施例３に記載の通りにＢＬＡＳＴおよびフレッド（Ｐｈｒｅｄ）プログラムを使用して、質およびベースコーリング確度について、手動でチェックした。ＰＥＳ／ＰＳＳＡ膜で精製したダイナミックＥＴダイターミネーターシークエンシング反応について作成されたフレッド（Ｐｈｒｅｄ）品質スコアを、下表７に示す。この結果から、ＰＥＳ／ＰＳＳＡ膜は、ＣＥＮＴＲＩＳＥＰカラムを使用して作成されたデータに匹敵する、良好なシークエンスデータをもたらすことが分かった。成功した反応の平均読み取り長さは６００塩基であり、そのベースコーリング確度は９７〜９８％であった。
【０１１８】
【表７】
2005514014.tif 000009
【０１１９】
実施例９：９６ウェル・プレート・フォーマットでＰＥＳ／ＰＳＳＡ膜を用いたビッグダイ・ターミネーターズ（ＢＩＧＤＹＥ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ）ｖ  ２．０シークエンシング反応浄化。
フィルター材料を、様々な濃度のＰＳＳＡを負荷したＰＥＳ膜と取り替えることによって改変した米国特許第５，６２０，６６３号明細書（エイスタ（Ａｙｓｔａ）ら）に記載のタイプの９６ウェル濾過プレートを、以下の通りに構築した。不織布の最上部の適所に膜を維持するために、ＰＥＳ／ＰＳＳＡ膜（実施例１に記載の通りに調製した）のディスク（直径８ｍｍ）を、６７ｇｍｓ／ｍ2の坪量を有するスパンボンドポリプロピレン不織布（サウスキャロライナ州シンプソンビルにあるＢＢＡフィルトレーションから販売されているセレストラ（ＣＥＬＥＳＴＲＡ，ＢＢＡ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ，Ｓｉｍｐｓｏｎｖｉｌｌｅ，ＳＣ））および米国特許第５，６２０，６６３号明細書（エイスタ（Ａｙｓｔａ）ら）に記載の止め輪（直径４ｍｍまたは１．５ｍｍ）を取り付けたプレートのウェルに配置した。
【０１２０】
ビッグダイ（ＢＩＧＤＹＥ）ｖ  ２．０  ４分の１強度のシークエンシング反応混合物１０μｌを、上述の９６ウェルＰＥＳ／ＰＳＳＡ膜プレートのウェルに加え、プレート遠心分離機で、５００×ｇにて２分間、回転させた。溶離液を回収プレートに回収して、標準シークエンシング条件でＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００ジェネティック・アナライザー（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）（アプライド・バイオシステムズ・インク（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．））で分析した。結果として得られた電気泳動図を、実施例３に記載の通りにＢＬＡＳＴおよびフレッド（Ｐｈｒｅｄ）プログラムを使用して、質およびベースコーリング確度について、手動でチェックした。９６ウェルＰＥＳ／ＰＳＳＡ膜プレートで精製したビッグダイ（ＢＩＧＤＹＥ）ｖ  ２．０シークエンシング反応混合物用に作成したフレッド（Ｐｈｒｅｄ）品質スコアを、下表８に示す。この結果から、９６ウェルＰＥＳ／ＰＳＳＡ膜プレートは、ＣＥＮＴＲＩＳＥＰカラムを使用して作成されたデータに匹敵する良好なシークエンシングデータを与えることがわかる。成功した反応の平均読み取り長さは、９７％〜９８％のベースコーリング確度で６５０塩基であった。
【０１２１】
【表８】
2005514014.tif 000010
【０１２２】
実施例１０：ＰＥＳ／ＰＳＳＡ膜を使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）浄化。
簡単に記載すると、代表的なＰＣＲ反応は、２種のプライマーを各２００ｎＭ、４種のｄＮＴＰ類（ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）を各２００μＭ含有する。残留ｄＮＴＰ類およびプライマーは、その後の下流使用、たとえばシークエンシング反応で、妨害する可能性があるため、サーモサイクリング反応後の残留プライマーおよびｄＮＴＰの大部分を除去することが必要である。同時に、さらなる処理のために、十分な量のＰＣＲ産物を回収することが必要である。さらなる処理のために、プライマーおよびｄＮＴＰ類を除去し、ＰＣＲアンプリコンを回収し、ＰＣＲ反応を浄化する、ＰＥＳ／ＰＳＳＡ膜の能力を分析した。
【０１２３】
プライマー除去：様々なＰＥＳ／ＰＳＳＡ膜カラムを、実施例１に記載の通りに調製した。１×ＰＣＲ緩衝液（アプライド・バイオシステムズ・インク（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．））１０μｌ中に含まれる既知量（１〜１０ピコモル）のオリゴヌクレオチド（Ｍ１３／ＰＵＣシークエンシングプライマー（−４７）（２４マー）、マサチュセッツ州ベバリーのニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））を、カラムに加え、７５０×ｇで２分間回転させて、溶離液を回収した。オリグリーンｓｓＤＮＡ（ＯＬＩＧＲＥＥＮ  ｓｓＤＮＡ）計量試薬（オレゴン州ユージーンのモレキュラー・プローブズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ））を使用して、溶離液中に残存するプライマーの量を測定した。溶液中のプライマー使い残し（すなわち、浄化媒体に結合されなかった）量を、下表９に示す。これは、ＰＳＳＡ惹起濃度レベルによって左右された。０．０７５％ＰＳＳＡ濃度を負荷したＰＥＳ膜は、１ピコモルを負荷したとき、プライマーのほぼ１００％を結合することができたが、１０ピコモルのプライマーを負荷したとき、約８０％を結合した。
【０１２４】
【表９】
2005514014.tif 000011
【０１２５】
ｄＮＴＰ除去：様々なＰＥＳ／ＰＳＳＡ膜カラムを、実施例１に記載の通りに調製した。１×ＰＣＲ緩衝液（アプライド・バイオシステムズ・インク（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．））１０μｌ中に含まれる既知量のｄＮＴＰ類（８ｎＭ、４種のｄＮＴＰのそれぞれを等量含む）をカラムに加え、７５０×ｇで２分間回転させて、溶離液を回収した。分光光度計で２６０ｎｍにおける吸光度を使用して、溶離液中に残存するｄＮＴＰの量を測定した。溶液中のｄＮＴＰ類使い残し（すなわち、浄化媒体に結合されなかった）量を、下表１０に示す。これは、ＰＳＳＡ惹起濃度レベルによって左右された。０．０７５％ＰＳＳＡ濃度を負荷したＰＥＳ膜は、ｄＮＴＰ類の約８０％を結合することができた。
【０１２６】
【表１０】
2005514014.tif 000012
【０１２７】
ＰＣＲ産物回収：様々なＰＥＳ／ＰＳＳＡ膜カラムを、実施例１に記載の通りに調製した。１×ＰＣＲ緩衝液（アプライド・バイオシステムズ・インク（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．））１０μｌ中に含まれる、サイズが１５０〜９３０塩基対（ｂｐ）の範囲のＰＣＲアンプリコン（３５ｎｇ）の既知量を、カラムに加え、７５０×ｇで２分間回転させて、溶離液を回収した。ＤＮＡ  ７５００  ラブ・チップ・キット（アジレント・テクノロジーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を使用して、アジレント２１００バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ）で、溶離液中に残存するＰＣＲアンプリコンの量を測定した。溶液中のＰＣＲアンプリコン使い残し（すなわち、浄化媒体に結合されなかった）の量および回収率を、下表１１に示す。これは、ＰＳＳＡ惹起濃度レベルおよびＰＣＲアンプリコンのサイズによって左右された。０．０７５％ＰＳＳＡ濃度を負荷したＰＥＳ膜からのＰＣＲ産物の回収は、ＰＣＲアンプリコンのサイズによって５０％〜８０％の範囲であった。
【０１２８】
【表１１】
2005514014.tif 000013
【０１２９】
マイクロ流体ディスクにおけるＰＣＲ産物精製：ＰＥＳ／ＰＳＳＡ膜（０．０７５％ＰＳＳＡ濃度を負荷した）を含む反応チャンバおよび浄化チャンバを有するマイクロ流体ディスク（図２）を、実施例４に記載の通りに構築した。この実施例では、ＰＣＲカクテル（１×ＰＣＲ緩衝液、２種のプライマーを各２００ｎＭ、４種のｄＮＴＰ類を各２００μＭ、ＤＮＡ鋳型１ｎｇ、およびアンプリタグ（ＡｍｐｌｉＴａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（アプライド・バイオシステムズ・インク（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．））０．１２５単位を含有する）５μｌを、本デバイスの処理チャンバ内で循環させ、弁を開き、未精製の反応混合物を浄化用処理チャンバに入れ、１２〜１４Ｈｚの振動数にて２０°の角変異で短時間（１０分未満）、ディスクを振盪することにより、このデバイスを機械的に攪拌し、次いで、精製した反応混合物を出すために、第２の弁を開いた。この精製されたＰＣＲアンプリコンをシークエンシングに使用し、シークエンシング反応を、実施例１に記載の通りにＰＥＳ／ＰＳＳＡ膜（０．０２％ＰＳＳＡを負荷）カラムで精製し、標準シークエンシング条件でＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００ジェネティック・アナライザー（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）（アプライド・バイオシステムズ・インク（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．））で分析した。結果として得られた電気泳動図を、実施例３に記載の通りに評価した。電気泳動図は、良好なシークエンシングデータを与え、５００〜６００塩基（比較的大きいアンプリコン）で、≧２０のフレッド（Ｐｈｒｅｄ）スコアを得た。
【０１３０】
本明細書に開示されている特許、特許出願、および刊行物は、参照により、個々に組み入れたかのように、本明細書に（全体として）援用する。上述は、例証するためであって、制限するためでないと理解すべきである。本発明の様々な修正および変更は、本発明の範囲から逸脱することなく、前述の説明から当業者に明白になるであろうし、また、本発明は、本明細書に記載の例示的な実施形態に不当に制限されるものではないことを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１】本発明と関連して使用することができる一デバイスの平面図である。
【図２】本発明と関連して使用することができる代替デバイスを描写する図である。
【図３】図２のデバイス上の一プロセスアレイの拡大図である。
【図４】図３の線４−４に沿った、図３のプロセスアレイの一部の断面図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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