(57)【要約】第１の態様において、本発明は生物試料中の異なる個体を起源とするＤＮＡ種を識別するための方法を特徴とする。これらの方法は、母体試料中の胎児ＤＮＡを識別または検出するため、あるいは臓器提供者のＤＮＡを臓器被提供者のＤＮＡから識別するために用いることができる。好ましい実施形態において、ＤＮＡ種は、ＤＮＡメチル化の差異などＤＮＡ種における後成的差異を観察することによって識別される。第２の態様において、本発明は、母親から得た生物試料中の胎児ＤＮＡを検出することにより、胎児における遺伝的異常を検出する方法を特徴とする。第３の態様において、本発明は臓器提供者を起源とするＤＮＡ種を臓器被提供者を起源とするＤＮＡ種から識別するための方法を特徴とする。第４の態様において、本発明は、生物試料中の異なる個体を起源とするＤＮＡ種を識別するためのキットを特徴とする。
2005501566.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物試料中の異なる個体を起源とするＤＮＡ種を識別するための方法であって、前記ＤＮＡ種間の後成的差異を決定する工程を含む方法。
【請求項２】
後成的差異は、ＤＮＡメチル化の差異であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生物試料は血漿または血清であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
生物試料は血液であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
一方の個体が妊婦であり、他方の個体が未出生の胎児であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
一方の個体が移植の被提供者であり、他方の個体が臓器提供者であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
移植は骨髄移植であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
後成的差異を有するＤＮＡ種の濃度を測定する工程をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項９】
後成的差異は、ＤＮＡメチル化の差異であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
ＤＮＡメチル化の差異を検出するために、生物試料またはＤＮＡ種に亜硫酸水素ナトリウムを加える工程をさらに含む請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
ＤＮＡメチル化の差異を検出するために、メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応を実施する工程をさらに含む請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
ＤＮＡメチル化の差異を検出するために、ＤＮＡのシーケンシングを行う工程をさらに含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
ＤＮＡメチル化の差異を検出するために、プライマー伸長法を実施する工程をさらに含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
生物試料は母体の血漿または血清であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項１５】
母体の血漿または血清中の胎児ＤＮＡの濃度を測定する工程をさらに含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
測定された胎児ＤＮＡの濃度は、疾患を予測、監視または診断もしくは予後判定するために用いられることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
後成的指標は、胎児または母体の疾患に関連づけられていることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
疾患は染色体異数性であることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
染色体異数性は２１トリソミー（ダウン症候群）であることを特徴とする請求項１８に
記載の方法。
【請求項２０】
疾患は子癇前症であることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
疾患は刷り込み不全であることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
疾患はプラーダー‐ヴィリ症候群であることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
疾患はエンジェルマン症候群であることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
胎盤中の胎児細胞における後成的差異を、母体血漿または血清中の胎児特異的マーカーとして用いることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項２５】
提供者と被提供者のＤＮＡの濃度を測定する工程をさらに含む請求項６に記載の方法。
【請求項２６】
移植の被提供者の臨床経過を予測するために前記測定を用いることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
一方の個体が男性で、他方の個体が女性であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
後成的マーカーは、女性個体の不活性化されたＸ染色体であることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
不活性化されたＸ染色体上のメチル化されたＤＮＡ配列が、女性個体を起源とするＤＮＡを検出するために用いられることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
後成的差異は、細胞内部で解析されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
後成的差異は、ｉｎ  ｓｉｔｕメチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応を用いて解析されることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
後成的差異は、細胞を個体から選別または単離するために用いられることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
後成的差異は、個体からＤＮＡを精製するために用いられることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
生物試料中の異なる個体を起源とするＤＮＡ種を識別するためのキットであって、ＤＮＡ種のメチル化状態を確認するための１つ以上の試薬を含むキット。
【請求項３５】
母親由来ＤＮＡのメチル化状態を確認するための１つ以上の試薬は、亜硫酸水素ナトリウムであることを特徴とする請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
ＤＮＡの存在を検出するための１つ以上の試薬をさらに含む請求項３４に記載のキット。
【請求項３７】
生物試料中に存在するＤＮＡの量を増幅するための１つ以上の試薬をさらに含む請求項３４に記載のキット。
【請求項３８】
ＤＮＡ試料を得るための１つ以上の装置をさらに含む請求項３４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一試料中の異なる個体を起源とするＤＮＡの検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
体液中に異なる個体を起源とするＤＮＡが存在していることは、多くの臨床上および生物学上の状況において周知の生物学的現象である。例えば、骨髄移植後、移植の被提供者の造血系は、種々の割合の提供者（ドナー）の細胞と被提供者（レシピエント）の細胞から構成されることになる。提供者の細胞または被提供者の細胞の量の確認は、性別（マンギオーニ（Ｍａｎｇｉｏｎｉ）ら、Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  第２０巻：９６９〜７３頁（１９９７））やＤＮＡ多型（ロークス（Ｒｏｕｘ）ら、Ｂｌｏｏｄ  第７９巻：２７７５〜８３頁（１９９２））を含む、提供者と被提供者との間の遺伝的差異を検出することによって行われてきた。この手法には、解析する領域が提供者と被提供者との間の遺伝的差異を保持していない場合に、現手法による分析が不可能となるという必然の結果を伴う。
【０００３】
他の例として、妊娠中に母体の血漿および血清中の胎児ＤＮＡを検出することがすでに実証されている（ロー（Ｌｏ）ら、Ｌａｎｃｅｔ  第３５０巻：第９０７６号：４８５〜７頁（１９９７））。この技術は、母体の血漿および血清から単離した胎児ＤＮＡを、非侵襲的な出生前診断に使用できることを実証している（ロー（Ｌｏ）ら、Ｎ  Ｅｎｇ  Ｊ  Ｍｅｄ、第３３９巻（２４）：１７３４〜８頁（１９９８）；ファース（Ｆａａｓ）ら、Ｌａｎｃｅｔ  第３５２巻（９１３５）：１１９６頁（１９９８）；アミカッチ（Ａｍｉｃｕｃｃｉ）ら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  第４６巻（２）：３０１頁（２０００）；チェン（Ｃｈｅｎ）ら、Ｐｒｅｎａｔ  Ｄｉａｇｎ  第２０巻（４）：３５５〜７頁（２０００）；サイトウ（Ｓａｉｔｏ）ら、Ｌａｎｃｅｔ  第３５６巻：１１７０頁（２０００））。この現象の臨床への応用は、母体の血漿および血清中に上記の胎児ＤＮＡが比較的高い絶対濃度および相対濃度で循環していることに助けられてきた（ロー（Ｌｏ）ら、Ａｍ  Ｊ．  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  第６２巻：７６８〜７７５頁（１９９８））。この手法を用いて、胎児のＲｈ因子（Ｄ）の状態（ロー（Ｌｏ）ら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇ  Ｊ  Ｍｅｄ  第３３９巻：１７３４〜１７３８頁（１９９８））、筋緊張性ジストロフィー（アミカッチ（Ａｍｉｃｕｃｃｉ）ら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  第４６巻：３０１〜３０２頁（２０００））、軟骨無形成症（サイトウ（Ｓａｉｔｏ）ら、Ｌａｎｃｅｔ  第３５６巻：１１７０頁（２０００））およびある種の染色体転座（チェン（Ｃｈｅｎ）ら、Ｐｒｅｎａｔ  Ｄｉａｇ  第２０巻：３３５〜３５７（２０００）；チェン（Ｃｈｅｎ）ら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  第４７巻：９３７〜９３９頁（２００１））を含む多くの状態の非侵襲的出生前検出が達成されてきている。これらの現行の手法のいずれも、母親のＤＮＡ配列とは遺伝的に識別可能な父親から受け継いだＤＮＡ配列の検出を利用している（ビアンチ（Ｂｉａｎｃｈｉ）、Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  第６２巻（４）：７６３頁（１９９８））。具体的には、母体の血漿または血清中において、母親から受け継がれた胎児ＤＮＡを検出することは不可能であると考えられていた。同様の限界が、母体の血液の細胞画分から単離した胎児有核細胞の検出についても記載されている（ロー（Ｌｏ）ら、Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，第７３１巻：２０４頁（１９９４））。
【０００４】
その他に、癌患者から異常にメチル化されたＤＮＡを検出した事例もある。そうした事例は、肺（エステラー（Ｅｓｔｅｌｌｅｒ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  第５９巻（１）：６７頁（１９９９））や肝臓の癌（ウォン（Ｗｏｎｇ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  第５９巻（１）：７１頁（１９９９））を含む様々な癌を有した患者について報告されている。
【０００５】
最近では、後成的現象、すなわちＤＮＡ配列の変化を伴わずに表現型を変えるプロセスの生物学に大きな関心が寄せられている（ウォルフェ（Ｗｏｌｆｆｅ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  第２８６巻：４８１〜４８６頁（１９９９））。最も特徴づけの進んでいる後成的プロセスの１つとしてＤＮＡメチル化がある（ウォルフェ（Ｗｏｌｆｆｅ）ら、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ．第１０巻：Ｒ４６３〜Ｒ４６５頁（１９９９））。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＤＮＡ種の間の遺伝的ではなく後成的（エピジェネティックな）差異を用いて、生物の体液中の異なる個体を起源とするＤＮＡ種を識別する方法の価値は非常に高いと考えられる。例えば、母体試料中の胎児ＤＮＡを後成的に検出することにより、さらに別のスクリーニングや診断方法が可能になるという顕著な利点が提供されるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
第１の態様において、本発明は、生物試料中の異なる個体を起源とするＤＮＡ種を識別するための方法を特徴とする。好ましい実施形態において、本発明の方法は、母体試料中の胎児ＤＮＡを識別または検出するために、あるいは臓器被提供者のＤＮＡから臓器提供者のＤＮＡを識別するために用いられる。
【０００８】
当業者であれば、個体から得られた生物試料は任意の体液または細胞試料から採取しうることを認識しているであろうが、好ましい実施形態において、体液は血漿または血清である。好ましい実施形態において、ＤＮＡ種は、ＤＮＡメチル化の違いなど、ＤＮＡ種における後成的差異を観察することによって識別される。例えば、１つのＤＮＡ種が男性からものであり、１つのＤＮＡ種が女性からのものであるような状況において、後成的マーカーは、女性個体の不活性化されたＸ染色体とすることができる。そのような実施形態では、不活性化Ｘ染色体上のメチル化されたＤＮＡ配列を用いて、女性個体を起源とするＤＮＡを検出することができる。いくつかの実施形態では、後成的差異を細胞内部で解析することができる。さらに、いくつかの実施形態において、後成的差異を、ｉｎ  ｓｉｔｕメチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応を用いて解析することもできる。さらに、後成的差異を、それぞれの個体由来の細胞を選別または単離するために、あるいはそれぞれの個体からＤＮＡを精製するために用いることもできる。本発明に従う方法は、ＤＮＡ種の濃度を測定しながら実施しても、測定せずに実施してもよいが、好ましい実施形態においては、それぞれの後成的差異をもつＤＮＡ種の濃度が測定される。ＤＮＡメチル化の差異を後成的マーカーとするような実施形態において、このような濃度測定には、それぞれのＤＮＡメチル化の差異を測定することが伴う。特に好ましい実施形態において、亜硫酸水素ナトリウムを生物試料かＤＮＡ種に直接加えて、ＤＮＡメチル化の差異を検出する。しかしながら、他の実施形態において、当業者によって周知のように、メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応を、ＤＮＡメチル化差異を検出するために用いることもできる。さらに別の実施形態において、ＤＮＡシーケンシングまたはプライマー伸長法を用いてメチル化の差異を検出することもできる。
【０００９】
第２の態様において、本発明は、母親から得た生物試料中の胎児ＤＮＡを検出することにより、胎児における異常を検出する方法を特徴とする。本発明に従う方法は、ＤＮＡメチル化の差異などの後成的マーカーに基づいて母体ＤＮＡから胎児ＤＮＡを識別することにより、母体試料中の胎児ＤＮＡを検出することを図る。このような方法を用いると、遺伝的異常もしくは遺伝性の疾病を予示する胎児ＤＮＡを同定することができ、これにより出生前診断のための方法が提供される。これらの方法は、疾病状態にメチル化の変化が伴うと同定されている任意かつ全ての妊娠関連症状に適用することができる。診断可能な疾病の例としては、例えば、子癇前症、限定はされないが２１トリソミーを含む染色体異数性、プラーダー‐ヴィリ症候群およびエンジェルマン症候群が挙げられる。
【００１０】
本発明の第１の態様の広義の識別方法と同様に、母親から得る生物試料は好ましくは血漿または血清である。母体と胎児のＤＮＡ間の識別は、母体の血漿または血清中の胎児ＤＮＡの濃度を定量しながら実施してもよいし、定量せずに実施してもよい。胎児ＤＮＡを定量する実施形態において、測定された濃度は、妊娠関連疾患を予測、監視または診断もしくは予後判定するために用いることができる。好ましい実施形態では、胎児由来の個々の後成的指標（マーク）が胎児疾患に関連づけられ、いくつかの実施形態では、胎盤中の胎児細胞内の後成的特徴が母体の血漿または血清における胎児特異的指標（マーカー）として用いられる。
【００１１】
第３の態様において、本発明は、臓器提供者を起源とするＤＮＡ種を、臓器被提供者のＤＮＡ種から識別するための方法を特徴とする。本発明の第１の態様の広義の識別方法と同様に、得られる生物試料は好ましくは血漿または血清である。臓器提供者からのＤＮＡと臓器被提供者からのＤＮＡとの間の識別、または潜在的臓器提供者からのＤＮＡと潜在的臓器被提供者からのＤＮＡとの間の識別は、生物試料中のＤＮＡの濃度を定量しながら実施してもよいし、定量せずに実施してもよい。本実施形態は、移植が骨髄移植である事例において特に有用である。このような測定は、特に臓器拒絶反応に関して移植の被提供者の臨床経過を予測するために用いることができる。
【００１２】
第４の態様において、本発明は、生物試料中の異なる個体を起源とするＤＮＡを識別するためのキットを特徴とする。そのようなキットは、例えば、母体生物試料中の胎児ＤＮＡの有無を識別または検出するために、あるいは、臓器提供者または潜在的臓器提供者由来のＤＮＡを、臓器被提供者または潜在的臓器被提供者由来のＤＮＡから識別するために有用である。本発明のキットは、母体ＤＮＡのメチル化状態を確認するための亜硫酸水素ナトリウムなど１つ以上の試薬と、ＤＮＡの有無を検出するためのゲルなど１つ以上の試薬とを含む。さらに、上記キットは、試料中に存在するＤＮＡの量を増幅するための１つ以上の試薬、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応増幅を実施するための１つ以上の試薬などを含んでいてもよい。そのような試薬は当業者によって周知である。さらに、上記キットは、母体ＤＮＡ試料を得るための１つ以上の装置を含んでいてもよい。そのような装置は当業者によって周知である。特に本発明のキットは、遺伝的異常、例えば胎児中に存在するＤＮＡ配列の全部または一部における変異、置換または欠失などに全体的または部分的に起因する疾病を診断するために用いることができる。診断しうる疾病の例としては、例えば、子癇前症、限定はされないが２１トリソミーを含む染色体異数性、プラーダー‐ヴィリ症候群およびエンジェルマン症候群が挙げられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
第１の態様において、本発明は、生物試料中の異なる個体を起源とするＤＮＡ種を識別するための方法を特徴とする。好ましい実施形態において、本発明の方法は、母体試料中の胎児ＤＮＡを識別または検出するために、あるいは臓器被提供者のＤＮＡから臓器提供者のＤＮＡを識別するために用いられる。
【００１４】
当業者であれば、個体由来の生物試料は任意の体液または細胞試料から採取しうることを認識しているであろうが、好ましい実施形態において、体液は血漿または血清である。好ましい実施形態において、ＤＮＡ種は、ＤＮＡメチル化の違いなど、ＤＮＡ種における後成的差異を観察することによって識別される。例えば、１つのＤＮＡ種が男性からものであり、１つのＤＮＡ種が女性からのものであるような状況において、後成的マーカーは、女性個体の不活性化されたＸ染色体とすることができる。そのような実施形態では、不活性化Ｘ染色体上のメチル化されたＤＮＡ配列を用いて、女性個体を起源とするＤＮＡを検出することができる。いくつかの実施形態では、後成的差異を細胞内部で解析することができる。さらに、いくつかの実施形態において、後成的差異は、ｉｎ  ｓｉｔｕメチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応を用いて解析することもできる。さらに、後成的差異は、それぞれの個体由来の細胞を選別または単離するために、あるいはそれぞれの個体からＤＮＡを精製するために用いることもできる。本発明に従う方法は、ＤＮＡ種の濃度を測定しながら実施しても、測定せずに実施してもよいが、好ましい実施形態においては、それぞれの後成的差異をもつＤＮＡ種の濃度が測定される。ＤＮＡメチル化の差異を後成的マーカーとするような実施形態において、このような濃度測定には、それぞれのＤＮＡメチル化の差異を測定することが伴う。特に好ましい実施形態において、亜硫酸水素ナトリウムを生物試料かＤＮＡ種に直接加えて、ＤＮＡメチル化の差異を検出する。しかしながら、他の実施形態において、当業者によって周知のように、メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応を、ＤＮＡメチル化差異を検出するために用いることもできる。さらに別の実施形態において、ＤＮＡシーケンシングまたはプライマー伸長法を用いてメチル化の差異を検出することもできる。
【００１５】
本明細書中で用いる「生物試料」という用語は、生きた生物から得たあらゆる体液もしくは細胞試料またはそれらの混合物を包含するものとする。具体的には、上記用語は組織バイオプシー、血清、血漿または羊水試料を含む。
【００１６】
本明細書中で用いる「後成的差異」という用語は、一次ヌクレオチド配列以外の任意の分子上または構造上の差異を包含するものとする。例えば、上記用語はメチル化の差異を含みうる。
【００１７】
本明細書中で用いる「ＤＮＡ」という用語は、ポリヌクレオチド、遺伝子断片、および完全な遺伝子配列などの、２つ以上のヌクレオチドからなる任意の配列を包含するものとする。
【００１８】
本明細書中で用いる「メチル化特異的ＰＣＲ」という用語は、ＤＮＡを亜硫酸水素ナトリウムで処理してからＰＣＲ増幅に供する方法を記述するために用いられる。この技法は、ＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理することにより、メチル化されていないシトシン残基がウラシルに変換されるという原理に基づいている。一方、メチル化されているシトシン残基は変化しない。したがって、亜硫酸水素変換後のメチル化ゲノム領域と非メチル化ゲノム領域のＤＮＡ配列は異なり、配列特異的ＰＣＲプライマーによって識別可能である。
【００１９】
本発明は、従来技術の限界を克服するためにゲノム刷り込みの現象を利用している。ゲノム刷り込みにおいて、ＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列を変えることなく生化学的に修飾される。このプロセスによって、胎児と母体のＤＮＡに異なる修飾が生じれば、この違いを母体の血漿および血清中の母体ＤＮＡからの胎児ＤＮＡの識別に活用することができる。この現象は、母体血液の細胞画分中における母体細胞からの胎児細胞の識別にも用いることができる。さらに、この原理は、胎児／乳児の体内に入った母体の細胞またはＤＮＡを検出するために用いることもできる（ロー（Ｌｏ）ら、Ｂｌｏｏｄ  第８８巻（１１）：４３９０〜５頁（１９９６）；ロー（Ｌｏ）ら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ，第４６巻（９）：１３０１〜９頁（２０００）；マロネイ（Ｍａｌｏｎｅｙ）ら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  第１０４巻（１）：４１〜７頁（１９９９））。この現象は、骨髄移植後（ロー（Ｌｏ）ら、Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  第８９巻（３）：６４５〜９頁（１９９５））や固形臓器移植後（スターズル（Ｓｔａｒｚｌ）ら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ  第６巻（３）：２９２〜８頁（１９９７）；ロー（Ｌｏ）ら、Ｌａｎｃｅｔ  第３５１巻（９１１２）：１３２９〜３０頁（１９９８）；チャン（Ｚｈａｎｇ）、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  第４５巻（１０）：１７４１〜６頁（１９９９））など、個人の体内に細胞またはＤＮＡ配列が存在することが見いだされる多くの他の臨床上の状況において用いることができる。
【００２０】
本発明により、母体血漿／血清中の胎児ＤＮＡに対する性別非依存性および多型非依存性マーカーの開発が可能になる。性別非依存性および多型非依存性の胎児マーカーを開発するためには、栄養膜中で選択的かつ特異的にメチル化されるＤＮＡ配列を用いればよい（オーゲーン（Ｏｈｇａｎｅ）ら、Ｄｅｖ  Ｇｅｎｅｔ、第２２巻（２）：１３２〜４０頁（１９９８））。これにより、母親の血漿／血清中で容易に検出できるのは男の胎児に由来するＤＮＡの存在だけだという（Ｙ染色体を標的として用いることによる）現行の限界を克服できる（ロー（Ｌｏ）ら、Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ、第６２巻（４）：７６８頁（１９９８））。本発明は、胎児と母体のＤＮＡの配列差異に依存することのなくそのような識別を行う検出方法を提供する（タン（Ｔａｎｇ）ら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  第４５巻（１１）：２０３３〜５頁（１９９９）；パートル（Ｐｅｒｔｌ）ら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  第１０６巻：４５〜４９頁（２０００））。
【００２１】
ＰＣＲなどの分子検出方法の開発により、骨髄移植（ＢＭＴ）後のキメラ現象を監視するための多くの強力なツールが提供されてきた。性別が不一致の場合のＢＭＴ後キメラ現象の検出に最も広く用いられているＰＣＲに基づいた試験のうちの１つは、Ｙ染色体上の配列に対するＰＣＲである（ロー（Ｌｏ）ら、Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  第８９巻：６４５〜９頁（１９９５））。この戦略の限界は、提供者が男性で被提供者が女性である場合にしか使用できないことにある。本発明は、提供者が女性で被提供者が男性である場合にも適用しうるシステムを提供する。Ｘ染色体の不活性化（Ｌｙｏｎｉｚａｔｉｏｎ）現象は女性のみに存在するという事実を用いて、女性特異的マーカーを開発することができる。この現象では、女性個体中の２つのＸ染色体のうちの１つが、多数の不活性化遺伝子内に生じるメチル化を伴ってランダムに不活性化される。これにより、過剰な男性ＤＮＡの中で女性ＤＮＡを検出するアッセイが可能となり、提供者が女性で被提供者が男性であるＢＭＴにも適用することができる。
【００２２】
第２の態様において、本発明は、母親から得た生物試料中の胎児ＤＮＡを検出することにより、胎児における異常を検出する方法を特徴とする。本発明に従う方法は、ＤＮＡメチル化の差異などの後成的マーカーに基づいて母体ＤＮＡから胎児ＤＮＡを識別することにより、母体試料中の胎児ＤＮＡを検出することを図る。このような方法を用いると、異常もしくは疾病を予示する胎児ＤＮＡを同定することができ、これにより出生前診断のための方法が提供される。上記の方法は、疾病状態にメチル化の変化が伴うと同定されている任意かつ全ての妊娠関連症状に適用することができる。診断可能な疾病の例としては、例えば、子癇前症、限定はされないが２１トリソミーを含む染色体異数性、プラーダー‐ヴィリ症候群およびエンジェルマン症候群が挙げられる。
【００２３】
本発明の第１の態様の広義の識別方法と同様に、母親から得た生物試料は好ましくは血漿または血清である。母体と胎児のＤＮＡ間の識別は、母体の血漿または血清中の胎児ＤＮＡの濃度を定量しながら実施してもよいし、定量せずに実施してもよい。胎児ＤＮＡを定量する実施形態において、測定された濃度は、妊娠関連疾患を予測、監視または診断するために用いることができる。好ましい実施形態では、胎児由来の個々の後成的指標が胎児疾患に関連づけられ、いくつかの実施形態では、胎盤中の胎児細胞内の後成的特徴が母体の血漿または血清における胎児特異的マーカーとして用いられる。
【００２４】
本発明は、ＤＮＡ配列の点では母体ＤＮＡから識別可能でなくてもよい、差異的にメチル化された胎児ＤＮＡ配列を、非侵襲的出生前診断用マーカーとして利用する。この新規な手法により、従来の手法においては情報性のない胎児と母親とのペアが出生前診断に対して情報性のあるペアに変わりうる。したがって、本発明は、新世代の非侵襲的出生前試験を構築することのできる土台を提供する。
【００２５】
本発明の方法は、妊婦の血漿または血清中の、胎児を起源とする差異的にメチル化されたＤＮＡを検出することに基づいている。差異的にメチル化されたＤＮＡ配列（単一ヌクレオチド多型を含んでいてもよい）は、好ましくはメチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって検出されるが、原理的には差異的にメチル化されたＤＮＡに対する任意の検出方法を用いることができる。この手法によって、従来は情報性のなかった胎児ＤＮＡマーカーを出生前診断のために用いることができるようになる。
【００２６】
本発明により、ＤＮＡ配列のメチル化状態の変化を伴う胎児または母親のあらゆる疾患の存在を検出または予測することが可能になる。例としては、例えばプラーダー‐ヴィリ症候群（クボタ（Ｋｕｂｏｔａ）ら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  第１６巻（１）：１６〜７頁（１９９７））などの刷り込み不全が挙げられる。本発明は、刷り込み不全であると示唆されてきた子癇前症（グレーブス（Ｇｒａｖｅｓ）、Ｒｅｐｒｏｄ  Ｆｅｒｔｉｌ  Ｄｅｖ  第１０巻（１）：２３〜９頁（１９９８））に対する新しいタイプの試験を提供する。本発明は、メチル化の変化を伴う可能性のあるダウン症候群（２１トリソミー）（ユ（Ｙｕ）ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  第９４巻（１３）：６８６２〜７頁（１９９７））を含む染色体異数性に対する新しいタイプの試験を提供する。
【００２７】
本発明は、母親と胎児の間のＤＮＡメチル化の差異を用いることにより、母体血漿中の胎児ＤＮＡの検出における従来技術の限界を克服することを特徴とする。
第３の態様において、本発明は、臓器提供者を起源とするＤＮＡ種を、臓器被提供者のＤＮＡ種から識別するための方法を特徴とする。本発明の第１の態様の広義の識別方法と同様に、得られる生物試料は好ましくは血漿または血清である。臓器提供者からのＤＮＡと臓器被提供者からのＤＮＡとの間の識別、または潜在的臓器提供者からのＤＮＡと潜在的臓器被提供者からのＤＮＡとの間の識別は、生物試料中のＤＮＡの濃度を定量しながら実施してもよいし、定量せずに実施してもよい。本実施形態は、移植が骨髄移植である事例において特に有用である。このような測定は、特に臓器拒絶反応に適用された場合の被移植者の臨床経過を予測するために用いることができる。
【００２８】
第４の態様において、本発明は、生物試料中の異なる個体を起源とするＤＮＡを識別するためのキットを特徴とする。そのようなキットは、例えば、母体生物試料中の胎児ＤＮＡの有無を識別または検出するために、あるいは、臓器提供者または潜在的臓器提供者由来のＤＮＡを、臓器被提供者または潜在的臓器被提供者由来のＤＮＡから識別するために有用である。本発明のキットは、母体ＤＮＡのメチル化状態を確認するための亜硫酸水素ナトリウムなど１つ以上の試薬と、ＤＮＡの有無を検出するためのゲルなど１つ以上の試薬とを含む。さらに、上記キットは、試料中に存在するＤＮＡの量を増幅するための１つ以上の試薬、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応増幅を実施するための１つ以上の試薬などを含んでいてもよい。そのような試薬は当業者によって周知である。さらに、上記キットは、母体ＤＮＡ試料を得るための１つ以上の装置を含んでいてもよい。そのような装置は当業者によって周知である。特に本発明のキットは、遺伝的異常、例えば胎児中に存在するＤＮＡ配列の全部または一部における変異、置換または欠失または重複などに全体的または部分的に起因する疾病を診断するために用いることができる。診断しうる疾病の例としては、例えば、子癇前症、限定はされないが２１トリソミーを含む染色体異数性、プラーダー‐ヴィリ症候群およびエンジェルマン症候群が挙げられる。
【実施例１】
【００２９】
（新規な後成的手法を用いた骨髄移植後キメラ現象の検出）
（材料と方法）
（被験者と試料）
本研究では、女性の提供者から骨髄移植を受けた４人の男性の被提供者と、１７人の健常被験者とを採用した。（ロー（Ｌｏ）ら、Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  第６２巻：７６８〜７５頁（１９９８））に記載されているようにして、すべての採取したＥＤＴＡ血試料由来の軟膜（ＢＣ）を回収し、−２０℃で保存した。
【００３０】
（ＤＮＡ単離）
Ｎｕｃｌｅｏｎ（登録商標）ＤＮＡ抽出キット（スコットラブス（Ｓｃｏｔｌａｂｓ）社）を製造者の推奨に従って使用して、ＢＣからＤＮＡを抽出した。
【００３１】
（亜硫酸水素塩による変換）
ＤＮＡ試料の亜硫酸水素塩による修飾は、製造者の指示に従ってＣｐＧｅｎｏｍｅ（登録商標）ＤＮＡ修飾キット（インターゲン（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ））を用いて実施した。亜硫酸水素塩による変換を行うことにより、メチル化されていないシトシン残基がウラシルに変換されるが、メチル化されているシトシン残基は変化しない（ハーマン（Ｈｅｒｍａｎ）ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  第９３巻：９８２１〜６頁（１９９６））。その後、亜硫酸水素塩による変換後のメチル化されたＤＮＡとメチル化されていないＤＮＡの間の配列の差異を、異なるＰＣＲプライマーを用いて識別する。亜硫酸水素塩による変換反応においては１μｇのＢＣ  ＤＮＡを用いた。
【００３２】
（メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ））
ＭＳＰアッセイは、前掲のハーマン（Ｈｅｒｍａｎ）らによって記載されているプロトコールを改変したものである。メチル化された配列に対しては、プライマーＭ‐ｆｏｒ（５’‐ＧＣＧＡＧＣＧＴＡＧＴＡＴＴＴＴＴＣＧＧＣ‐３’）およびＭ‐ｒｅｖ（５’‐ＡＡＣＣＡＡＡＴＡＡＣＣＴＡＴＡＡＡＡＣＣＴＣＴＡＣＧ‐３’）を設計し、メチル化されていない配列に対しては、プライマーＵ‐ｆｏｒ（５’‐ＧＴＴＧＴＧＡＧＴＧＴＡＧＴＡＴＴＴＴＴＴＧＧＴ‐３’）およびＵ‐ｒｅｖ（５’‐ＣＡＡＡＴＡＡＣＣＴＡＴＡＡＡＡＣＣＴＣＴＡＣＡ‐３’）を設計した。５μＬの亜硫酸水素塩で処理したＤＮＡを、５μＬの１０×ＴａｑＭａｎ（登録商標）バッファＡ（ＰＥアプライドバイオシステムズ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｐｍｏｌ  ｄＮＴＰｓ、それぞれ２０ｐｍｏｌの対応するＭＳＰプライマー、および１．２５Ｕ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ＰＥアプライドバイオシステムズ）を含む５０μＬのＰＣＲ反応系に加えた。最初に９５℃で８分間の変性工程を実施した後、反応混合物を４５回の熱サイクル（各サイクルは、メチル化された対立遺伝子：９５℃４５秒間、５８℃３０秒間、７２℃２０秒間；メチル化されていない対立遺伝子：９５℃４５秒間、５０℃３０秒間、７２℃２０秒間）に供した。その後、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって解析した。
【００３３】
（結果）
本実験は、アンドロゲン受容体遺伝子のメチル化ＤＮＡ配列および非メチル化ＤＮＡ配列を検出するためのＭＳＰアッセイを提供する。全体で、６人の男性と１１人の女性の健常被験者を採用した。すべての男性対照被験者において、予想通り試料中にはメチル化されていないアンドロゲン受容体遺伝子しか検出されなかった（図１Ａ）。対照的に、女性対照被験者においては非メチル化とメチル化の両方のアンドロゲン受容体遺伝子ＤＮＡ配列が観察された（図１Ａ）。これらの女性被験者におけるメチル化アンドロゲン受容体遺伝子と非メチル化アンドロゲン受容体遺伝子の検出比率は、それぞれ１００％および８２％であった。ＤＮＡ試料をＭＳＰアッセイから除外した場合には、陽性のシグナルは全く観察されなかった（図１Ａ）。興味深いことに、メチル化および非メチル化の両方のＤＮＡ配列に対する陽性のシグナルが、性別が不一致な骨髄移植を受けた被提供者の男性全員（１００％）において観察されたことから、女性提供者に由来する細胞が男性被提供者の血液循環中に存在していることがわかる。
【００３４】
上記結果から、女性個体由来の不活性化Ｘ染色体上のメチル化された遺伝子を、キメラ現象研究における女性特異的マーカーとして利用できることが初めて実証された。このアッセイは、男性と女性の細胞またはＤＮＡの混合物を用いる移植後キメラ現象の他のタイプの研究にも適用可能である。例としては、固形臓器移植後の細胞キメラ現象（スターズル（Ｓｔａｒｚｌ）ら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ  第６巻：２９２〜８頁（１９９７））、移植後の血漿中ＤＮＡキメラ現象（ロー（Ｌｏ）ら、Ｌａｎｃｅｔ  第３５１巻：１３２９〜３０頁（１９９８））および尿中ＤＮＡキメラ現象（チャン（Ｚｈａｎｇ）ら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  第４５巻：１７４１〜６頁（１９９５））が挙げられる。さらに、最近では妊娠中の母親から胎児への細胞およびＤＮＡの受け渡しにも大きな関心が寄せられている（ロー（Ｌｏ）ら、Ｂｌｏｏｄ  第８８巻：４３９０〜５頁（１９９６）；マロネイ（Ｍａｌｏｎｅｙ）ら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  第１０４巻：４１〜７頁（１９９９）；ロー（Ｌｏ）ら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  第４６巻：１３０１〜９頁（２０００））。開発される後成的マーカーは、男性の子孫における母体起源のキメラ現象にも用いることができなければならない。
【００３５】
このアッセイは、例えば、リアルタイムＰＣＲ技術を用いて定量的な方法に発展させることもできる（ロー（Ｌｏ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  第５９巻：３８９９〜９０３頁（１９９９））。このような発展によって、我々は特定の人におけるキメラ現象のレベルを監視することができるようになる。臨床的には、そのようなアッセイがＢＭＴにおける移植片受容性を監視する役割を果たすものと思われる。尿中または血漿中のＤＮＡキメラ現象の場合には、そのようなアッセイは移植片の拒絶を監視するために用いることもできるであろう。
【実施例２】
【００３６】
（母体血漿中の胎児ＤＮＡを検出するための戦略としての、胎児と母親間での差異的なＤＮＡメチル化）
本実験では、ヒトＩＧＦ２‐Ｈ１９遺伝子座内の差異的にメチル化される領域を、母体血漿中の後成的マーカーとして用いることにより、胎児が母親から受け継いだ対立遺伝子を検出可能であることを実証する。これらの結果は、母体血漿中の胎児ＤＮＡの出生前診断の可能性を大きく広げ、母体血漿中の性別や多型に依存しない胎児特異的マーカーの開発、ならびに刷り込み不全やある種の染色体異数性の出生前診断に対する新しい戦略を可能にする。
【００３７】
（材料と方法）
（被験者と試料）
試料はインフォームドコンセントを行った上で妊婦より採取した。全部で、２１人の妊娠第２期（１７〜２１週）および１８人の妊娠第３期（３７〜４２週）の女性を本研究のために採用した。採用した被験者のいずれも、現妊娠において子癇前症でも早期分娩でもなかった。母体のＥＤＴＡ血試料および胎児羊水試料を、上述のようにして（ロー（Ｌｏ）ら、Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  第６２巻：７６８〜７７５頁（１９９８））妊娠第２期の妊婦から採取した。妊娠第３期の妊婦については、正常な経膣分娩の２〜３時間前に母体のＥＤＴＡ血試料を採取した。胎児臍帯のＥＤＴＡ血試料も上述のようにして（ロー（Ｌｏ）ら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  第４６巻：１９０３〜１９０６頁（２０００））分娩後直ちに採取した。採取したすべての血液試料由来の血漿および軟膜は、血漿試料を１６，０００ｇで再度遠心分離したことを除いては、上述のようにして（ロー（Ｌｏ）ら、Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  第６２巻：７６８〜７７５頁（１９９８））採集し、−２０℃で保存した。羊水試料は４℃で保存した。
【００３８】
（ＤＮＡ単離）
ＤＮＡは血漿および羊水試料より、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｂｌｏｏｄキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を用いて抽出した。典型的には、１カラムにつきＤＮＡ抽出のために８００μＬの血漿または羊水を用いた。溶出体積としては５０〜１１０μＬを用いた。ＤＮＡは、製造者の推奨に従ってＮｕｃｌｅｏｎ（登録商標）ＤＮＡ抽出キット（スコットラブス（Ｓｃｏｔｌａｂｓ））を用いて軟膜より抽出した。
【００３９】
（ＤＭＲ多型領域の遺伝子型決定）
ヒトＩＧＦ２‐Ｈ１９遺伝子座中のＤＭＲは、２つの４５０ｂｐ反復単位と７つの４００ｂｐ反復単位を含む（ナカガワ（Ｎａｋａｇａｗａ）ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  第９８巻：５９１〜５９６頁（２００１））（図２）。ＤＭＲ中のＡ／Ｇ  ＳＮＰ（前掲のナカガワ（Ｎａｋａｇａｗａ）ら）を本実験におけるマーカーとして選択した（図２）。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、母体ＤＮＡ試料および胎児ＤＮＡ試料中のＳＮＰを増幅した。プライマーは、ヒトＨ１９遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号ＡＦ１２５１８３）の配列を用いて設計した。典型的には、母体の軟膜、臍帯軟膜または羊水から精製した２〜５μＬの溶出ＤＮＡを、２．５μＬの１０×ＴａｑＭａｎ（登録商標）バッファＡ（ＰＥアプライドバイオシステムズ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、６．２６ｐｍｏｌ  ｄＮＴＰｓ、５ｐｍｏｌ  プライマー（順方向：５’‐ｇｇＡＣＧＧＡＡＴＴＧＧＴＴＧＴＡＧＴＴ‐３’；逆方向：５’‐ＡＧＧＣＡＡＴＴＧＴＣＡＧＴＴＣＡＧＴＡＡ‐３’）および０．６２５Ｕ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ＰＥアプライドバイオシステムズ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を含む２５μＬのＰＣＲ反応系に加えた（９５℃８分間に続いて、９５℃１分間、５６℃２０秒間、７２℃２０秒間のサイクルを３５サイクル）。順方向プライマーについては、上記の場合のヌクレオチドはＨ１９配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号ＡＦ１２５１８３）の７９２７〜７９４４位に対応させた。逆方向プライマーについては、ヌクレオチドはＨ１９配列の８３０９〜８３２９位に相補的なものとした。その後、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動およびＤＮＡシーケンシングによって解析した。
【００４０】
（亜硫酸水素塩による変換）
ＤＮＡ試料の亜硫酸水素塩による修飾は、製造者の指示に従ってＣｐＧｅｎｏｍｅ（登録商標）ＤＮＡ修飾キット（インターゲン（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ））を用いて実施した。亜硫酸水素塩による変換を行うことにより、メチル化されていないシトシン残基はウラシルに変換されるが、メチル化されているシトシン残基には変化がないはずである（ハーマン（Ｈｅｒｍａｎ）ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  第９３巻：９８２１〜９８２６頁（１９９６））。その後、亜硫酸水素塩による変換後のメチル化されたＤＮＡとメチル化されていないＤＮＡとの間の配列の差異を、異なるＰＣＲプライマーを用いて識別することができた。一般に、亜硫酸水素塩による変換反応においては、１μｇの母体血液もしくは臍帯血由来の軟膜ＤＮＡ、または母体血漿もしくは羊水から精製した９３μＬの溶出ＤＮＡを用いた。次いで亜硫酸水素塩で処理したＤＮＡを、２５〜５０μＬの１μ  Ｔｒｉｓ‐ＥＤＴＡ中に溶出させた。
【００４１】
（メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ））
ＭＳＰアッセイは、前述（Ｈｅｒｍａｎら  １９９６）のようなプロトコールを改変したものである。亜硫酸水素塩処理した５μＬのＤＮＡを、５μＬの１０×ＴａｑＭａｎ（登録商標）バッファＡ（ＰＥアプライドバイオシステムズ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｐｍｏｌ  ｄＮＴＰｓ、それぞれ２０ｐｍｏｌの対応するＭＳＰプライマー（図２）、および１．２５Ｕ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ＰＥアプライドバイオシステムズ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を含む５０μＬのＰＣＲ反応系に加えた。メチル化された配列に対しては、プライマーＭ‐ｆｏｒおよびＭ‐ｒｅｖ（図２）を設計し、メチル化されていない配列に対しては、プライマーＵ‐ｆｏｒおよびＵ‐ｒｅｖ（図２）を設計した。最初に９５℃で８分間の変性工程を実施した後、反応混合物を５０回（軟膜および羊水ＤＮＡ）または５６回（血漿ＤＮＡ）の熱サイクル（各サイクルは、メチル化された対立遺伝子：９５℃４５秒間、５５℃２０秒間、７２℃２０秒間；メチル化されていない対立遺伝子：９５℃４５秒間、４９℃２０秒間、７２℃２０秒間）に供した。その後、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって解析した。反応産物は、ＤＮＡシーケンシングまたはプライマー伸長アッセイのために、Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ（登録商標）Ｓ‐３００ＨＲカラム（アマシャムファルマシア（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ））を用いて精製した。
【００４２】
（ＤＮＡシーケンシング）
精製したＰＣＲ産物をＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅターミネータ・サイクルシーケンシング・レディ反応キット（ＰＥアプライドバイオシステムズ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））およびＰＣＲ産物の対応する順方向プライマーを用いてシーケンシングした。シーケンシング産物はＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）３１０ジェネティクアナライザー（ＰＥアプライドバイオシステムズ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を用いて解析した。
【００４３】
（プライマー伸長アッセイ）
２μＬの精製ＭＳＰ産物を、５０μＭ  ｄｄＡＴＰ（２’，３’−ジデオキシアデニン三リン酸）、５０μＭ  ｄＧＴＰ、５０μＭ  ｄＴＴＰ、０．２ｐｍｏｌ  Ｃｙｓ‐５‐標識プライマー（５’‐ＧＧＧＴＴＡＴＴＴＧＧＧＡＡＴＡＧＧＡＴＡＴＴＴＡ‐３’）、４Ｕ  ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）（アマシャムファルマシア（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ））および１．４３μＬ濃縮バッファを含む２５μＬの反応系に加えた。反応系を、９５℃３０秒間、５１℃２０秒間、７２℃２０秒間を１サイクルとする４０回の熱サイクルに供した。Ｃｙｓ‐５‐標識プライマーは、２５ヌクレオチド（ｎｔ）の長さを有し、多型部位はプライマーの３’末端から２ｎｔ離れたところにあった。Ａ対立遺伝子については、多型部位でのｄｄＡＴＰの取り込みによって連鎖の終結が起こり、２７ｎｔ（すなわち２５＋２ｎｔ）の伸長産物を生じることになる。Ｇ対立遺伝子については、プライマーの３’末端から５ｎｔ離れた次のＡ残基まで鎖の伸長が継続するので、３０ｎｔ（すなわち２５＋５ｎｔ）の伸長産物が生じることになる。反応産物は１４％変性ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動し、ＡＬＦ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）シーケンサ（アマシャムファルマシア（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ））を用いて分析した。データはＡｌｌｅｌｅＬｉｎｋｓ（登録商標）プログラム（アマシャムファルマシア（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ））によって解析した。
【００４４】
（結果）
（ＤＭＲの遺伝子型決定）
この研究には３９人の妊婦を採用した。ＤＭＲ内のＳＮＰにおける母体の遺伝子型（図２）は、軟膜ＤＮＡからのＰＣＲ産物の直接シーケンシングによって決定した。考えられる各遺伝子型を有する妊婦の数は、１７人（ＧＧ，４３．６％）、１６人（ＡＧ，４１．０％）および６人（ＡＡ，１５．４％）であった。
【００４５】
（二多型性（ｂｉａｌｌｅｌｉｃ）多型に対してヘテロ接合の女性由来の血漿中胎児ＤＮＡの検出）
ＳＮＰに対してヘテロ接合（すなわちＡＧ）の１６人の女性を選んでさらなる実験を行った。これは二多型性の多型であるので、以前の基準に基づけば、これらの女性は、母体血漿中の胎児ＤＮＡの検出に関して、この多型遺伝子座に情報性を有するとは考えられないであろう（ロー（Ｌｏ）ら、Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  第７３１巻：２０４〜２１３頁（１９９４）；ビアンチ（Ｂｉａｎｃｈｉ）  Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  第６２巻：７６３〜７６４頁（１９９８））。この遺伝領域の差異的なメチル化により上記限界を克服できることを実証するために、母体ＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理し、図２に示したプライマーを用いてＭＳＰにより増幅した。同様に、羊水（妊娠第２期試料）または臍帯血の軟膜（妊娠第３期試料）から単離した胎児ＤＮＡをＰＣＲおよびＭＳＰに供して、胎児の対立遺伝子の刷り込み状態を判定した。
【００４６】
選択した１６例のうち、４例の妊娠第３期胎児試料および７例の妊娠第２期胎児試料からのメチル化された（すなわち父親から受け継いだ）対立遺伝子が、それぞれの母親のメチル化された対立遺伝子とは異なっていた（図３ａ，ｂ；パネル１と２を比較のこと）。この胎児と母親の間でのメチル化の差異によって、母体血漿から胎児の対立遺伝子を検出することができるかどうかを調べるために、これらの例から得た母体血漿ＤＮＡを亜硫酸水素塩で変換してからＭＳＰに供した。興味深いことに、父親から受け継いだメチル化された胎児対立遺伝子は、２例の第３期および４例の第２期母体血漿試料中でも検出された（図３ａ，ｂ；パネル３）。これらの観察結果が単に母体血漿中の異常にメチル化されたＤＮＡの存在によるものである可能性を排除するために、陽性例のうち１例から出生後の母体血漿試料（分娩後〜３．５年）をさらなる試験のために採取した。この出生後試料からは追加のメチル化された対立遺伝子は認められなかったことから（図３ａ、パネル４）、妊娠中の母体試料中の追加のメチル化対立遺伝子は、胎児起源のものであることがわかる。さらに、非情報性の例（ｎ＝４、データ示さず）の血漿中に陽性のシグナルは全く観察されなかったことから、このＭＳＰアッセイの特異性が実証された。まとめると、上記のデータは、母親と胎児の間でのメチル化の差異を用いることにより、既存の基準では情報性が有ると考えられていないケースにおいてさえ、母体血漿中の胎児ＤＮＡを検出できるようになることを示している。
【００４７】
（母親から受け継がれた胎児ＤＮＡの、母体血漿からの検出）
次に我々は、母親と胎児の間のメチル化の差異を用いて、胎児が母親から受け継いだ対立遺伝子を検出することができるようになるかどうかについて調べた。このタイプの分析は、以前は不可能であると考えられていた（ロー（Ｌｏ）ら、Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  第７３１巻：２０４〜２１３頁（１９９４）；ビアンチ（Ｂｉａｎｃｈｉ）、Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  第６２巻：７６３〜７６４頁（１９９８））。母親から受け継いだ対立遺伝子はメチル化されていないので、亜硫酸水素塩処理に続いて、プライマーＵ‐ｆｏｒおよびＵ‐ｒｅｖ（図２）を用いてメチル化されていない対立遺伝子を増幅した。分析した１６例のうち、３例の妊娠第３期および５例の妊娠第２期の母体試料が情報性を有していた。これらの例において、胎児は、母親のメチル化されていない対立遺伝子とは異なるメチル化されていない対立遺伝子を有していた。これらの結果は、上記の例において、母親が該胎児対立遺伝子を元々彼女の父親から受け継ぎ、その後胎児に受け渡したことを含意する。情報性を有する８例のうち、直接シーケンシングにおいて妊娠第３期試料のうち１例にごく弱い陽性のシグナルが観察された（図４ａ、パネル１とパネル２で比較）。
【００４８】
そこで我々は、上記の１つの陽性例に見られたシグナルが弱いこと、および母体血漿由来のメチル化されていない胎児対立遺伝子の検出率が低いことは、直接シーケンシング法の感度が低いことによるものであろうと考えた。検出の感度を高めるために、我々はより感度の高いプライマー伸長アッセイを用いて、ＭＳＰ反応産物からメチル化されていない胎児対立遺伝子を検出した。ＳＮＰはＡ／Ｇ多型であったので、ｄｄＡＴＰをプライマー伸長アッセイにおける反応基質として用いた。Ａ対立遺伝子およびＧ対立遺伝子から伸長した反応産物は、それぞれ２７および３０ヌクレオチド長であった。対応する母体軟膜試料中には、胎児特異的な反応産物は全く存在しなかった（図４ｂ、ｃ；母体ＢＣ）。驚くべきことに、胎児特異的な伸長産物は、２例の妊娠第３期母体血漿試料（図４ｂ、矢印）および１例の妊娠第２期母体血漿試料（図４ｃ、矢印）において観察されたことから、母体血漿中にメチル化されていない胎児ＤＮＡが存在することが分かった。対照として、情報性のないどの被験例もこのアッセイにおいては陽性を示さなかった（ｎ＝５、データ示さず）。これらの結果から、母親から受け継がれた胎児ＤＮＡ配列を母体血漿から検出するために後成的マーカーを使用するということの実行可能性が初めて実証された。
【００４９】
（考察）
上記の結果から、後成的マーカーを使用することにより、母体血漿中の胎児ＤＮＡを検出する際の従来の限界が克服されることが実証される。母親と胎児の間の後成的な差異を用いることにより、母体の対立遺伝子とは遺伝子としては区別のつかない、父親から受け継いだ胎児対立遺伝子を、母親の血漿から検出することができる。同様に、母親から受け継いだ胎児対立遺伝子を、母親の血漿から検出することができる。従って、この新規な後成的手法は、母体血漿中の胎児ＤＮＡを用いることのできる疾患のレパートリーを広げることであろう。
【００５０】
比較的感受性の低い方法、例えば直接シーケンシングやプライマー伸長法を用いた場合でも、本結果は、差異的にメチル化された胎児ＤＮＡ配列を母体血漿から検出できることを実証している。メチル化された対立遺伝子に対する同様のアッセイと比較して（図３）、母体血漿中のメチル化されていない胎児ＤＮＡの検出の感度は低かった（図４）。より感受性の高い検出システム、例えば対立遺伝子特異的ＰＣＲ（ニュートン（Ｎｅｗｔｏｎ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  第１７巻：２５０３〜２５１６頁（１９８９））やリアルタイムメチル化特異的ＰＣＲ（ロー（Ｌｏ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  第５９巻：３８９９〜３９０３頁（１９９９）；イーズ（Ｅａｄｓ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  第２８巻：Ｅ３２頁（２０００））などを用いることにより、血漿を用いる後成的分析の感度を高めることができるかもしれない。リアルタイムメチル化特異的ＰＣＲの開発は、循環中の腫瘍ＤＮＡの検出に対してはすでに達成されているように（カワカミ（Ｋａｗａｋａｍｉ）ら、Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  第９２巻：１８０５〜１８１１頁（２０００））、母体血漿中の胎児特異的メチル化を定量する可能性を切り開くことから特に興味深い。
【００５１】
母体血漿中の胎児ＤＮＡを常套的出生前診断ツールとして導入する可能性から、循環する胎児ＤＮＡに対する汎用マーカーの必要性についての問題が持ち上がってきた（ロー（Ｌｏ）ら、Ａｍ  Ｊ  ｈｕｍ  Ｇｎｅｔ  第６２巻：７６８〜７７５頁（１９９８）；アベント（Ａｖｅｎｔ）ら、Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ  第７８巻：１５５〜１６２頁（２０００））。そのようなマーカーに対する提案の大半は、これまでは母親と胎児との間の遺伝的多型現象を使用することに焦点を当ててきた（タン（Ｔａｎｇ）ら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  第４５巻：２０３３〜２０３５頁（１９９９）；パートル（Ｐｅｒｔｌ）ら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  第１０６巻：４５〜４９頁（２０００））。今回母体血漿中の胎児ＤＮＡ検出のために後成的マーカーを使用できる可能性が実証されたことから、母体血漿中における性別非依存性かつ多型非依存性の胎児マーカーを開発するための新しい手法が開拓される。これを実現できる１つの方法としては、組織特異的メチル化現象を利用することである（グルナウ（Ｇｒｕｎａｕ）ら、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  第９巻：２６５１〜２６６３頁（２０００））。栄養膜は、母体血漿中への胎児ＤＮＡの放出に関する有力な細胞集団であると示唆されてきたので、栄養膜特異的メチル化パターンを解明することにより、母体血漿中における汎用性の胎児後成的マーカーの開発が可能になる。生物学的には、組織特異的メチル化マーカーを使用すると、どのタイプの胎児細胞が母体血漿中への胎児ＤＮＡの放出に関与しているかに関する疑問に直接取り組むことができる。
【００５２】
母体血漿の後成的分析が、プラーダー‐ヴィリ症候群などのゲノム刷り込みに関連する疾患に適用できることは自明である（ファイファー（Ｐｆｅｉｆｅｒ）、Ｌａｎｃｅｔ  第３５６巻：１８１９〜１８２０頁（２０００））。この戦略は、刷り込まれた遺伝子が役目を果たしていると仮定されている子癇前症などの疾患診断の可能性も有しているかもしれない（グレーブス（Ｇｒａｖｅｓ）、Ｒｅｐｒｏｄ  Ｆｅｒｔｉｌ  Ｄｅｖ  第１０巻：２３〜２９頁（１９９８））。
【００５３】
胎児の染色体異数性の出生前検出のために、母体血漿中の胎児ＤＮＡを応用できるかどうかは、この現象が発見されて以来激しく議論されてきた問題である（ロー（Ｌｏ）ら、Ｌａｎｃｅｔ  第３５０巻：４８５〜４８７頁（１９９７）；ビアンチ（Ｂｉａｎｃｈｉ）、Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  第６２巻：７６３〜７６４頁（１９９８））。異数性の妊娠中に循環する胎児ＤＮＡのレベルは正数性の妊娠の場合と比較して量的に異なることが発見され（ロー（Ｌｏ）ら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  第４５巻：１７４７〜１７５１頁（１９９９）；チョン（Ｚｈｏｎｇ）ら、Ｐｒｅｎａｔ  Ｄｉａｇｎ  第２０巻：７９５〜７９８頁（２０００））、この発見により、母体血漿から胎児が染色体異数性である危険性を評価するための方法が提案されている。最近になって母体血漿中（「血漿から取り出した細胞」）にアポトーシスを起こした胎児細胞が見つかり（バン・ウェイク（Ｖａｎ  Ｗｉｊｋ）ら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  第４６巻：７２９〜７３１頁（２０００））、母体血漿から異数性を検出するためのさらに別の手法が提案されている（プーン（Ｐｏｏｎ）ら、Ｌａｎｃｅｔ  第３５６巻：１８１９〜１８２０頁（２０００））。興味深いことに、本発明のデータは胎児の染色体異数性を検出するためのさらに別の潜在的手法を開拓するものでもある。これは異常なＤＮＡメチル化パターンは染色体異数性に関連する可能性があるという観察結果に基づいている（クロミツ（Ｋｕｒｏｍｉｔｓｕ）ら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  第１７巻：７０７〜７１２頁（１９９７）；ユ（Ｙｕ）ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  第９４巻：６８６２〜６８６７頁（１９９７））。したがって、母体血漿からこのような異常にメチル化された胎児ＤＮＡ配列を検出するための後成的マーカーを開発することができる。そのようなマーカーは、母体血漿中の胎児ＤＮＡの単純な定量（ロー（Ｌｏ）ら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  第４５巻：１７４７〜１７５１頁（１９９９）；チョン（Ｚｈｏｎｇ）ら、Ｐｒｅｎａｔ  Ｄｉａｇｎ  第２０巻：７９５〜７９８頁（２０００））に比べて高い特異性を有するとともに、「血漿から取り出した細胞」に基づく方法（プーン（Ｐｏｏｎ）ら、Ｌａｎｃｅｔ  第３５６巻：１８１９〜１８２０頁（２０００））と比べて大規模な用途により適している。
【００５４】
胎児後成的マーカーは、母体血液の細胞画分から単離した胎児細胞の分析においても用いることができる。これには、メチル化分析をｉｎ  ｓｉｔｕ様式で実施できることを示した最近のデータを活用する（ヌオボ（Ｎｕｏｖｏ）ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  第９６巻：１２７５４〜１２７５９頁（１９９９））。
【００５５】
母子輸送は双方向プロセスであるという最近の理解をもってすれば（ロー（Ｌｏ）ら、Ｂｌｏｏｄ  第８８巻：４３９０〜４３９５頁（１９９６）；マロネイ（Ｍａｌｏｎｅｙ）ら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  第１０４巻：４１〜４７頁（１９９９））、後成的マーカーは、母親から胎児への細胞およびＤＮＡの移動を調べるためにも用いることができる。このような手法は、他のタイプのキメラ現象、例えば移植後の造血のキメラ現象（スターズル（Ｓｔａｒｚｌ）ら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ  第６巻：２９２〜２９８頁（１９９７））および尿中ＤＮＡのキメラ現象（チャン（Ｚｈａｎｇ）ら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  第４５巻：１７４１〜１７４６頁（１９９９））などを調べるためにも応用できる。
【００５６】
ヒトゲノムについての理解の深まりやメチル化分析に対するハイスループットのアレイを用いる技術の開発に伴って（ヤン（Ｙａｎ）ら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  第６巻：１４３２〜１４３８頁（２０００））、有用な胎児後成的マーカーの数は今後数年のうちに急速に増加することが期待される。そうした開発によって、従来の母体血漿における遺伝的マーカーとともに、相乗的に用いることのできる臨床的に関連した胎児後成的マーカー群が提供されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１Ａ】アンドロゲン受容体遺伝子のメチル化ＤＮＡ配列および非メチル化ＤＮＡ配列を検出するアッセイの結果を示す図。全体として、６人の男性と１１人の女性の健常被験者を採用した。全男性対照被験者のなかでは、予想通りメチル化されていないアンドロゲン受容体遺伝子のみが試料中に検出された（図１Ａ）。対照的に、女性対照被験者においては非メチル化とメチル化の両方のアンドロゲン受容体遺伝子ＤＮＡ配列が観察された（図１Ａ）。これらの女性被験者におけるメチル化アンドロゲン受容体遺伝子と非メチル化アンドロゲン受容体遺伝子の検出比率は、それぞれ１００％および８２％であった。ＤＮＡ試料をアッセイから除外した場合には、陽性のシグナルは全く観察されなかった（図１Ａ）。
【図１Ｂ】アンドロゲン受容体遺伝子のメチル化ＤＮＡ配列および非メチル化ＤＮＡ配列を検出するアッセイの結果を示す図。興味深いことに、メチル化および非メチル化の両方のＤＮＡ配列に対する陽性のシグナルが、女性を提供者とするすべての男性の骨髄移植の被提供者において観察されたことから、女性提供者に由来する細胞が男性被提供者の血液循環中に存在していることがわかる。
【図２】ヒトＩＧＦ２‐Ｈ１９領域の差異的にメチル化される領域（ＤＭＲ）の模式図。２つの４５０ｂｐ反復単位（Ａ１およびＡ２）および７つの４００ｂｐ反復単位（Ｂ１〜Ｂ７）が示されている。調べた領域の上側のＤＮＡ鎖上の潜在的メチル化領域は、白丸で示されている。調べた単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）部位（Ａ／Ｇ）は、白四角で示されている。白抜き矢印は、それぞれメチル化された対立遺伝子（Ｍ）とメチル化されていない対立遺伝子（Ｕ）に特異的なＰＣＲ反応における順方向プライマー（ｆｏｒ）および逆方向プライマー（ｒｅｖ）の位置を示している。これらのＭＳＰプライマーの配列が示されている。亜硫酸水素処理したＤＮＡと未処理のＤＮＡとの間の配列の違いを太字イタリックで示し、メチル化（父親から受け継いだ）ＤＮＡおよび非メチル化（母親から受け継いだ）ＤＮＡとの間の配列の違いを太字下線で示す。
【図３Ａ】妊娠第３期の母体血漿中のメチル化された（父親から受け継いだ）胎児ＤＮＡの検出を示す図。母体軟膜（パネル１）、胎児軟膜または羊水（パネル２）、出生前母体血漿（パネル３）および出生後母体血漿（パネル４）試料中のメチル化された対立遺伝子のＤＮＡ配列が示されている。出生前母体血漿試料中にメチル化された胎児ＤＮＡが存在することが「＊」で示されている。多型（ＳＮＰ）部位は赤字で示されている。
【図３Ｂ】妊娠第２期の母体血漿中のメチル化された（父親から受け継いだ）胎児ＤＮＡの検出を示す図。母体軟膜（パネル１）、胎児軟膜または羊水（パネル２）、出生前母体血漿（パネル３）および出生後母体血漿（パネル４）試料中のメチル化された対立遺伝子のＤＮＡ配列が示されている。出生前母体血漿試料中にメチル化された胎児ＤＮＡが存在することが「＊」で示されている。多型（ＳＮＰ）部位は赤字で示されている。
【図４Ａ】母体血漿中のメチル化されていない（母親から受け継いだ）胎児ＤＮＡの検出を示す図。（ａ）直接シーケンシング法を用いて、母体軟膜（パネル１）および妊娠第３期母体試料（パネル２）中のメチル化されていないＤＮＡ配列を検出した。母体血漿中にメチル化されていない胎児ＤＮＡが存在する場合を「＊」で示す。
【図４Ｂ】母体血漿中のメチル化されていない（母親から受け継いだ）胎児ＤＮＡの検出を示す図。（ｂ）プライマー伸長アッセイを用いて２つの妊娠第３期母体血漿試料中のメチル化されていない胎児ＤＮＡ（矢印）を検出した。反応産物のサイズ（ｎｔ）が下に示されており、●は未使用プライマーを示し、□は検出された対立遺伝子を示す。
【図４Ｃ】母体血漿中のメチル化されていない（母親から受け継いだ）胎児ＤＮＡの検出を示す図。（ｃ）プライマー伸長アッセイを用いて妊娠第２期母体血漿試料中のメチル化されていない胎児ＤＮＡ（矢印）を検出した。プライマーのみ、非メチル化Ｇ対立遺伝子または非メチル化Ａ対立遺伝子を含む対照反応からの産物が示されている。反応産物のサイズ（ｎｔ）が下に示されており、●は未使用プライマーを示し、□は検出された対立遺伝子を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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