(57)【要約】  ルシフェラーゼとルシフェリンリサイクリングタンパク質とをコードする構築物で細胞を形質転換し、ルシフェリンを該細胞内に導入し、該細胞からの生物発光シグナルをモニターすることを含んでなる、細胞内ＡＴＰおよび／または遺伝子発現の測定方法を提供する。新規ルシフェリンリサイクリングタンパク質も記載されており、これは、光学活性酵素基質の製造におけるその使用と共に、特許請求されている。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ルシフェラーゼとルシフェリンリサイクリングタンパク質とをコードする構築物で細胞を形質転換し、ルシフェリンを該細胞内に導入し、該細胞からの生物発光シグナルをモニターすることを含んでなる、細胞内ＡＴＰおよび／または遺伝子発現の測定方法。
【請求項２】
細胞内ＡＴＰレベルをモニターするために使用する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ルシフェラーゼの発現をモニターするために使用する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
該細胞をルシフェリンと接触させ、ｐＨを５未満に減少させた後、該アッセイを開始し、ついで該細胞を生理的ｐＨ条件に戻す、前記請求項のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
さらに、該細胞を、それがＬ−システインラセマーゼを発現するよう形質転換する、前記請求項のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
該細胞が、前記の第１のルシフェラーゼとは異なるＫｍ値および異なる波長出力を有するもう１つのルシフェラーゼを発現しうる、前記請求項のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
（ｉ）ルシフェラーゼ酵素をコードする核酸配列と、（ｉｉ）ルシフェリンリサイクリングタンパク質をコードする核酸配列とを含んでなるＤＮＡ構築物。
【請求項８】
ルシフェラーゼとルシフェリンリサイクリングタンパク質とを含む融合タンパク質を発現するよう（ｉ）の核酸配列と（ｉｉ）の核酸配列とが連結されている、請求項７記載のＤＮＡ構築物。
【請求項９】
（ｉｉｉ）もう１つのルシフェラーゼ酵素をコードする核酸配列と、（ｉｖ）Ｌ−システインラセマーゼ酵素をコードする核酸配列とから選ばれる１以上の追加的成分を更に含む、請求項７または請求項８記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１０】
単一のベクターを含む、請求項７〜９のいずれか１項記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１１】
細胞の共形質転換において使用しうる２以上のベクターを含む、請求項７〜９のいずれか１項記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１２】
請求項７〜１１のいずれか１項記載のＤＮＡ構築物で形質転換された細胞。
【請求項１３】
哺乳類細胞または植物細胞である、請求項１２記載の細胞。
【請求項１４】
該ルシフェリンリサイクリングタンパク質が配列番号１、６２もしくは６３のタンパク質またはそのルシフェリンリサイクリング断片またはこれらのいずれかの変異体である、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法、請求項７〜１１のいずれか１項記載のＤＮＡ構築物または請求項１２〜１３のいずれか１項記載の細胞。
【請求項１５】
該ルシフェリンリサイクリングタンパク質が、配列番号３、配列番号３９、配列番号５９もしくは配列番号６１を含むルシフェリンリサイクリングタンパク質またはそのルシフェリンリサイクリング断片もしくは変異体である、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法、請求項７〜１１のいずれか１項記載のＤＮＡ構築物または請求項１２〜１３のいずれか１項記載の細胞。
【請求項１６】
該ルシフェリンリサイクリングタンパク質が、配列番号５９を含むルシフェリンリサイクリングタンパク質またはそのルシフェリンリサイクリング断片もしくは変異体である、請求項１５記載の方法、ＤＮＡ構築物または細胞。
【請求項１７】
発光虫種から入手可能なルシフェリンリサイクリングタンパク質またはそのルシフェリンリサイクリング断片またはそれに対して少なくとも６０％の相同性を有するタンパク質。
【請求項１８】
該発光虫種がラムピリス・ノクチルカ（Ｌａｍｐｙｒｉｓ  ｎｏｃｔｉｌｕｃａ）である、請求項１８記載のルシフェリンリサイクリングタンパク質。
【請求項１９】
配列番号３、配列番号３９もしくは配列番号５９またはルシフェリンリサイクリング断片またはこれらのいずれかの変異体を含む、請求項１７または請求項１８記載のルシフェリンリサイクリングタンパク質。
【請求項２０】
配列番号３もしくは配列番号３９またはルシフェリンリサイクリング断片またはこれらのいずれかの変異体を含む、請求項１７〜１９のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項２１】
配列番号５９またはルシフェリンリサイクリング断片またはこれらのいずれかの変異体を含む、請求項１７〜１９のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項２２】
配列番号５９を含む、請求項２１記載のタンパク質。
【請求項２３】
異なる種のルシフェラーゼリサイクリングタンパク質遺伝子において見出されるエキソンによりコードされる断片を含んでなるキメラルシフェラーゼリサイクリングタンパク質。
【請求項２４】
該エキソンの少なくとも１つが発光虫種の遺伝子に由来する、請求項２３記載のキメラルシフェラーゼリサイクリングタンパク質。
【請求項２５】
該エキソンの少なくとも１つがホタル種の遺伝子に由来する、請求項２３または請求項２４記載のキメラルシフェラーゼリサイクリングタンパク質。
【請求項２６】
ラムピリス・ノクチルカ（Ｌａｍｐｙｒｉｓ  ｎｏｃｔｉｌｕｃａ）ルシフェラーゼリサイクリング遺伝子のエキソン２、３、４および５によりコードされる断片に連結された、フォチヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼリサイクリング遺伝子のエキソン１によりコードされる断片を含む、請求項２３〜２５のいずれか１項記載のキメラルシフェラーゼリサイクリングタンパク質。
【請求項２７】
ルシフェラーゼ酵素とルシフェラーゼリサイクリングタンパク質とを含んでなる融合タンパク質。
【請求項２８】
該ルシフェリンリサイクリングタンパク質が請求項１７〜２６のいずれか１項記載のタンパク質である、請求項１８記載の融合タンパク質。
【請求項２９】
請求項１７〜２８のいずれか１項記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項３０】
配列番号４または配列番号３１〜３７のいずれか１つを含む、請求項２９記載の核酸。
【請求項３１】
配列番号４０またはその変異体を含む、請求項２９記載の核酸。
【請求項３２】
配列番号５８またはその変異体を含む、請求項２９記載の核酸。
【請求項３３】
ｃＤＮＡ配列である、請求項２９記載の核酸。
【請求項３４】
Ｄ−ルシフェリンのような光学活性酵素基質の製造方法であって、該基質の酸化形態（例えば、オキシルシフェリン）を、前記請求項のいずれか１項記載のリサイクリングタンパク質、および該変換を行うのに必要ないずれかの他のアミノ酸（例えば、システイン）と接触させることを含んでなる製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に、ルシフェラーゼとルシフェリンとを含む生物発光シグナル伝達系の用途、ならびに該方法において使用する或る新規遺伝子およびタンパク質、ならびに該系において使用する要素の製造に関する。
【０００２】
生物発光シグナル伝達系はよく知られており、バイオテクノロジーにおける、特に、微生物の検出の分野における広範な用途、または細胞活性の研究における生理的レポーターとしての広範な用途を有する
最も一般的な生物発光シグナル伝達系の１つは、ホタルおよび発光虫のような生物において天然で見出される酵素ルシフェラーゼと酵素基質ルシフェリンとの組合せを利用するものである。すべての細胞内で見出されるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の存在下、ルシフェラーゼはルシフェリンを酸化してオキシルシフェリン、システインおよび生物発光シグナルを生成し、このシグナルは、例えばルミノメーターを使用してモニターすることが可能である。
【０００３】
該シグナル伝達反応は以下のとおりに表すことができる。
【０００４】
【化１】
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【０００５】
しかし、オキシルシフェリンは該反応のインヒビターであり、このことは、そのような系で生成したシグナルが非常に短寿命であることを意味する。さらに、適当かつ測定可能なシグナルの生成が保証されるためには、いずれの反応系にも相当過剰なＤ−ルシフェリンを供給する必要がある。そのような系を利用する、微生物などの検出のためのアッセイの具体例には、例えばＷＯ  ９４／１７２０２およびＷＯ  ９６／０２６６５に記載のものが含まれる。
【０００６】
細胞内ＡＴＰ濃度は、細胞の健康状態または発生段階に応じて１０倍以上変動しうる。細胞内ＡＴＰレベルの変動を測定しうることは、例えば薬物、毒素、ホルモン、環境因子または疾患が細胞に及ぼす効果を研究する手段として非常に重要である。
【０００７】
ＡＴＰの濃度をインビボで分析するための種々の方法が当技術分野で示唆されている。例えば、Ｄｅｍｅｎｔｉｅｖａら，（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃｏｗ）Ｖｏｌ  ６１，Ｎｏ．７においては、組換えルシフェラーゼを使用してＡＴＰの全存在量を計算し、推定全細胞体積で割ることにより、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＡＴＰの細胞内濃度が測定された。
【０００８】
そのような間接的アプローチでは、せいぜい、実際のＡＴＰ濃度の推定値しか得ることができない。
【０００９】
ルシフェラーゼは遺伝子発現（インビボ）用のマーカーとして使用されることがあり、この場合、その細胞内産生は特定の遺伝的制御要素に関連している。ルシフェリンは外的に加えられ、細胞内ＡＴＰ濃度は、ほとんどすべての条件下で、該酵素を飽和させる。したがって、遺伝子発現のスイッチ・オンは、生成した活性ルシフェラーゼの量に応じて定量的に放出される光により表示される。
【００１０】
一般には、測定されるのはルシフェラーゼの濃度である。ついでこの濃度は別の事象（例えば、プロモーターの効率）と相関される。ＡＴＰに対するミカエリス・メンテン定数Ｋｍが小さなルシフェラーゼ（例えば、ＷＯ  ９６／２２３７６を参照されたい）を使用した場合には、周囲の［ＡＴＰ］の変化がアッセイを妨げないことが保証されることが公知である。
【００１１】
突然変異ルシフェラーゼ（これは、通常より高いミカエリス・メンテン定数Ｋｍを有するため、インビボで行う細胞ＡＴＰアッセイにおいて特に有用でありうる）がＷＯ  ９８／４６７２９に記載されている。当技術分野で既に公知のルシフェラーゼより高いＫｍを有するルシフェラーゼを使用することにより、定常状態ＡＴＰ濃度を広範囲で測定するためにこれらの酵素を使用する可能性。これは、一般的に言えば、酵素速度（光強度により測定した場合のＶ）と基質濃度（ルシフェリンが過剰の場合は、ＡＴＰの基質濃度）との関係が以下のとおりになるからである。
Ｖ＝Ｖｍ ．［ＡＴＰ］／Ｋｍ＋［ＡＴＰ］
【００１２】
したがって、Ｋｍが周囲の［ＡＴＰ］より大きい（または類似した大きさである）場合にだけ、［ＡＴＰ］の変化と光強度との間に或る程度の比例が認められると理解されうる。Ｋｍが周囲の［ＡＴＰ］より遥かに小さい場合には、［ＡＴＰ］の変化は、測定される光強度に、明らかな影響を及ぼさないであろう。光検出が高感度になればなるほど、測定可能な「Ｖ」の変化は小さくなり、評価される［ＡＴＰ］範囲に関するＫｍは小さくなりうることが明らかである。
【００１３】
ある用途（例えば、インビボ測定）においては、Ｋｍが４００μｍ〜１．４ｍＭ、例えば５００μｍ、６００μｍ、１ｍＭなどであるルシフェラーゼを使用するのが好都合かもしれない。しかし、前記の考察から理解されうるように、主な基準は、Ｋｍが、評価される予想［ＡＴＰ］範囲より遥かに小さくはないということである。
【００１４】
血液細胞の生理学的アッセイに重要な個々の予想［ＡＴＰ］範囲は３００μｍ〜１ｍＭ、より詳しくは、３８０μｍ〜６２０μｍである（前記Ｓｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｋｉｔ，カタログＮｏ．３６６を参照されたい）。肝細胞のような他の哺乳類細胞の場合、［ＡＴＰ］範囲は２．５ｍＭ〜６ｍＭである（前記Ｄｅｍｅｎｔｉｅｖａら，（１９９６）を参照されたい）。ＷＯ  ９６／２２３７６に記載されているような組換えルシフェラーゼの使用は、これらの範囲における連続的アッセイに特に適している。
【００１５】
しかし、そのようなすべてのアッセイ、および細胞の健康状態の生理学的レポーターとして用いるアッセイ（例えば、薬物のスクリーニングにおけるものなど）においては、細胞は、ルシフェラーゼ酵素を発現するように形質転換されるのが望ましい。しかし、前記のとおり、ルシフェリンは外的に添加されなければならない。不都合なことに、ルシフェリンは、生理的に許容されるｐＨであるとは一般にはみなされないｐＨ５未満の場合にのみ、細胞透過性となる。したがって、通常の細胞アッセイへのこの試薬の添加は容易ではない。細胞のＡＴＰレベルを長期間にわたりモニターするためには、この低いｐＨをその期間にわたり維持する必要があるが、それ自体が細胞に悪影響を及ぼす可能性がある。このことは、このタイプのアッセイの用途（特に、骨のおれる方法が要求されるハイスループットスクリーニングの場合）を制限する。
【００１６】
さらに、ルシフェラーゼ酵素は組換えＤＮＡ技術により製造されうるが、Ｄ−ルシフェリンは、一般には、所望のＤ異性体と望ましくないＬ異性体との混合物として合成法により製造され、この場合、Ｌ異性体を、使用前に分離する必要がある。これは不経済な方法である。
【００１７】
米国特許第５，８１４，５０４号は、オキシルシフェリンおよびＤ−システインと組合された場合にホタルＤ−ルシフェリンを生成する、ホタル種から単離された４０ｋＤのタンパク質を記載している。このタンパク質は、ルシフェラーゼ／ルシフェリン反応系からの発光シグナルの持続性を改善するのに、および該反応において使用するルシフェラーゼおよびルシフェリンの量を減少させるのに有用であるとされている。このタンパク質を使用するホタルルシフェリンの製造方法も記載されている。このタンパク質のアミノ酸配列および対応ｍＲＮＡ（フォチヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）由来のもの）は、それぞれアクセッション番号ＢＡＢ６０７００およびアクセッション番号ＡＢ０６２７８６としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
【００１８】
ルシオラ・クルシアタ（Ｌｕｃｉｏｌａ  ｃｒｕｃｉａｔａ）およびルシオラ・ラテラリス（Ｌｕｃｉｏｌａ  ｌａｔｅｒａｒｉｓ）由来の他のルシフェラーゼ・リサイクリング（ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ）酵素の配列も公開されている（それぞれＢＡＢ８５４７９およびＢＡＢ８５４７８を参照されたい）。
【００１９】
本出願人は、このタイプのタンパク質およびそれらをコードする核酸の更なる用途を開発し、発光虫から入手可能な、関連活性を有するタンパク質の更なる新規例を見出した。
【００２０】
本発明は、ルシフェラーゼとルシフェリンリサイクリングタンパク質とをコードする構築物で細胞を形質転換し、ルシフェリンを該細胞内に導入し、該細胞からの生物発光シグナルをモニターすることを含んでなる、細胞内ＡＴＰおよび／または遺伝子発現の測定方法を提供する。
【００２１】
「ルシフェリンリサイクリングタンパク質」またはＬＲＥなる語は、オキシルシフェリンおよびシステインをルシフェリンに変換するタンパク質を意味する。そのようなタンパク質の一例としては、米国特許第５，８１４，５０４号に記載されているものが挙げられるが、後記で更に詳しく説明するとおり、本出願人は、更なるタンパク質をクローニングし配列決定し、これらも本発明のもう１つの態様を構成する。
【００２２】
本発明の方法は、細胞内ＡＴＰレベルをモニターするために用いることが可能である。その代わりに又はそれに加えて、本発明の方法は、ルシフェラーゼ遺伝子またはルシフェラーゼリサイクリング遺伝子の発現をモニターするために用いることが可能である。なぜなら、生成シグナルは、これらのいずれかの遺伝子の発現レベルと関連しているからであり、ルシフェラーゼの発現に、より直接的に関連している。
【００２３】
本発明の方法は、インビボ遺伝子発現が、安定な光出力で表示されうるという顕著な利点を有する。該細胞アッセイの開始時に、ｐＨ５への短時間の曝露の途中で、１回分の投入量のルシフェリンを該細胞内に導入することが可能である。ついで該アッセイ中は該細胞を生理的ｐＨに維持することが可能である。該系においてはルシフェリンは急速に消費されるが、該細胞内で発現されたルシフェリンリサイクリングタンパク質および該細胞内に存在するシステイン（特に、Ｄ−システイン）の作用により、生成したオキシルシフェリンが再びＤ−ルシフェリンに変換される。
【００２４】
その結果、読取りが容易なシグナルを与える比較的安定な光出力が達成されうる。このタイプの系に特有の利点が認められうる。
【００２５】
ルシフェラーゼ酵素およびルシフェリンリサイクリングタンパク質は、２つの別々のタンパク質として該細胞内で発現されうる。この場合、該細胞を形質転換するために使用する構築物は２成分構築物（一方の成分は、ルシフェラーゼ酵素をコードする遺伝子を含有し、もう一方の成分は、ルシフェリンリサイクリングタンパク質をコードする遺伝子を含有する）でありうる。好ましくは、ルシフェラーゼ酵素とルシフェリンリサイクリングタンパク質とは、融合タンパク質として一緒に発現される。ルシフェラーゼ活性とリサイクリング活性とを遺伝的に連結させることにより、該反応の動力学（インビボまたはインビトロ）が、より有利なものとなる。そのような融合タンパク質は、本発明のもう１つの態様を構成する。
【００２６】
必要に応じて、例えば、細胞がＬ−システインラセマーゼを発現するよう該細胞を更に形質転換することにより、Ｄ−システインの細胞含量を増加させることが可能である。
【００２７】
好ましい実施形態においては、細胞が２つのルシフェラーゼ酵素（一方は、比較的高いＫｍ値を有し、もう一方は比較的低いＫｍ値を有する）を発現するよう、該細胞を形質転換する。適切には、これらは、区別されうる種々の波長の出力を有する。この系においては、該アッセイの有用な範囲が拡張されうる。その代わりに又はそれに加えて、それはレシオメトリック（ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ）アッセイの実施を可能にし、この場合、高いＫｍのルシフェラーゼの活性が、低いＫｍのルシフェラーゼの活性と比較される。このようにして、細胞生理学を継続的にモニターすることが可能である。例えば、スクリーニングするサンプルの細胞毒または他の悪影響を迅速に検出することが可能であろう。
【００２８】
比較的低いＫｍ値を有するルシフェラーゼ突然変異体の具体例はＷＯ  ９６／２２３７６に記載されており、これらを本発明において使用することが可能である。
【００２９】
本発明の方法において使用する細胞の形質転換に使用する新規構築物は、本発明のもう１つの態様を構成する。したがって、本発明は更に、（ｉ）ルシフェラーゼ酵素をコードする核酸配列と、（ｉｉ）ルシフェリンリサイクリングタンパク質をコードする核酸配列とを含んでなるＤＮＡ構築物を提供する。これらの要素は、好ましくは、適当なプロモーターの制御下にある。該要素が２つのタンパク質として発現される場合には、ルシフェラーゼ酵素をコードする核酸配列は第１のプロモーターの制御下にあり、ルシフェリンリサイクリングタンパク質をコードする核酸配列は第２のプロモーターの制御下にある。
【００３０】
しかし、好ましくは、これらの要素の核酸配列は、ルシフェラーゼとルシフェリンリサイクリング酵素との融合タンパク質を発現するように連結される。この場合、該核酸配列は単一のプロモーターの制御下にある。
【００３１】
前記のとおり、該構築物は、適切には、（ｉｉｉ）もう１つのルシフェラーゼ酵素をコードする核酸配列と、（ｉｖ）Ｌ−システインラセマーゼ酵素をコードする核酸配列とから選ばれる１以上の追加的な成分を含みうる。要素（ｉｉｉ）および（ｉｖ）は、適切には、それぞれ第３および第４のプロモーターの制御下にある。
【００３２】
該構築物は、適切には、細胞の形質転換において使用しうる１以上のベクターの形態である。該構築物の要素が２以上のベクター上に存在する場合、これらは、標的細胞を共形質転換するために使用することが可能である。
【００３３】
このようにして形質転換される細胞は真核細胞または原核細胞でありうる。細胞アッセイには、哺乳類細胞または植物細胞のような真核細胞が要求されると予想されうる。当技術分野において一般的であるとおり、ベクターおよびプロモーターとしては、標的細胞型において活性なものが選ばれる。
【００３４】
本発明の構築物中で使用する核酸は、特定された活性を有するタンパク質をコードする。当技術分野において一般的であるとおり、これらの核酸中で使用するコドンの少なくともいくつかを標的細胞種に「最適化」させることが好ましいかもしれない。例えば、特定の細胞型は、特定の比率のＧＣ含量を有する核酸を、より有効に発現し、遺伝暗号の縮重の結果として、これに類似したＧＣ含量比率を該核酸が有するようコドンを選択することが可能である。
【００３５】
前記要素（ｉ）および／または（ｉｉｉ）の核酸配列の具体例は当技術分野においてよく知られている。それらは、適切には、熱安定性、Ｋｍ値および比色性のような所望の特性を有するルシフェラーゼをコードする。本発明の構築物中で使用する核酸により適切にはコードされる突然変異ルシフェラーゼの具体例は、ＥＰ−Ａ−０５２８４４８、ＷＯ９５／２５７９８、ＷＯ  ９６／２２３７６、ＷＯ  ９８／４６７２９、ＷＯ  ００／２４８７８、ＷＯ  ０１／３１０２８、ＷＯ  ９９／１４３３６およびＷＯ  ０１／２０００２に記載されている。
【００３６】
適当なＬ−システインラセマーゼ酵素（前記の要素（ｉｖ））の具体例は当技術分野において公知である。例えば、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）（ＥｃｏＣｙｃデータベース上ではＥＣ  ５．１．１．１０と称される）由来の低い基質特異性を有する酵素アミノ酸ラセマーゼはＬ−アミノ酸からＤ−アミノ酸への変換を触媒することが公知である。
【００３７】
本発明の構築物の要素（ｉｉ）において使用しうる核酸の一例は、後記図２に示す配列番号１のタンパク質またはそのルシフェリンリサイクリング断片もしくは変異体をコードする。このタンパク質はフォチヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）から入手可能である。
【００３８】
ルシフェリンリサイクリング酵素の他の公知具体例としては、ルシオラ・クルシアタ（Ｌｕｃｉｏｌａ  ｃｒｕｃｉａｔａ）およびルシオラ・ラテラリス（Ｌｕｃｉｏｌａ  ｌａｔｅｒａｌｉｓ）のようなルシオラ（Ｌｕｃｉｏｌａ）種から入手可能なタンパク質が挙げられる。そのような配列の特定の具体例は、後記配列番号６２および６３に記載されている。したがって、本発明の構築物中に含まれる核酸は、配列番号６２もしくは６３のタンパク質またはそのルシフェリンリサイクリング断片またはこれらのいずれかの変異体をコードしうる。
【００３９】
本発明で用いる「断片」なる語は、要求される酵素活性を有する基本配列の１以上の部分を意味する。これらは欠失突然変異体でありうる。一般的に言えば、該部分は、該基本配列の少なくとも１２アミノ酸、好ましくは少なくとも２０アミノ酸を含む。
【００４０】
「変異体」なる語は、対立遺伝子変異体および、複数の遺伝子コピーの存在の結果として別の遺伝子座に見出される変異体を含む。また、「変異体」なる語は、配列中の１以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されている点で、それが由来する基本アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列、またはそれをコードする核酸配列を含む。アミノ酸が、概ね類似した特性を有する別のアミノ酸により置換されている場合、アミノ酸の置換は「保存（同類）的」であるとみなされうる。非保存的置換は、アミノ酸が、異なるタイプのアミノ酸により置換されている場合である。大まかに言って、該ポリペプチドの生物活性を変化させない場合には、少数の非保存的置換しか可能でない。適切には、変異体は基本配列に対して少なくとも６０％相同であり、好ましくは少なくとも７５％相同であり、より好ましくは少なくとも９０％相同である。この場合の相同性は、例えば、ｋタプル：２、ギャップペナルティ：４、ギャップ長ペナルティ：１２、標準ＰＡＭスコアリングマトリックスでリップマン−ピアソン（Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ）のアルゴリズムを使用して判定することが可能である（Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．およびＰｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．，Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  Ｓｅａｒｃｈｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，ｖｏｌ．２２７，１４３５−１４４１）。
【００４１】
配列番号１をコードする核酸の特定の具体例としては、後記図２に配列番号２として示すｍＲＮＡ配列が挙げられる。配列番号１のタンパク質をコードする適当なゲノム配列の一例として、後記図４に示す配列番号１１が挙げられる。
【００４２】
もう１つの実施形態においては、本発明の構築物は、ラムピリス・ノクチルカ（Ｌａｍｐｙｒｉｓ  ｎｏｃｔｉｌｕｃａ）のような発光虫種から得たルシフェリンリサイクリングタンパク質またはそのルシフェリンリサイクリング断片またはこれらのいずれかの変異体をコードする核酸を要素（ｉｉ）として含む。
【００４３】
特に、該核酸は、後記図１０に示す配列番号３を含むルシフェリンリサイクリングタンパク質、または図１２に示す配列番号３９を含むルシフェリンリサイクリングタンパク質、または図１６に示す配列番号５９を含むルシフェリンリサイクリングタンパク質、またはこれらのいずれかのルシフェリンリサイクリング断片もしくは変異体をコードする。
【００４４】
配列番号３、配列番号３９または配列番号５９を含むルシフェリンリサイクリングタンパク質は新規であり、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％、より一層好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の相同性または同一性を有するルシフェリンリサイクリング断片およびこれらのいずれかの変異体と共に、それら自体が本発明の更なる態様を構成する。
【００４５】
本発明の特定の実施形態は、後記図１０に示す配列番号３を含むルシフェリンリサイクリングタンパク質を含む。
【００４６】
本発明のもう１つの実施形態は、図１２に示す配列番号３９を含むルシフェリンリサイクリングタンパク質を含む。
【００４７】
本発明の好ましい実施形態は、図１６の配列番号５９を含むルシフェリンリサイクリングタンパク質を含む。
【００４８】
そのようなタンパク質、特に、配列番号５９のタンパク質は、ラムピリス・ノクチルカ（Ｌａｍｐｙｒｉｓ  ｎｏｃｔｉｌｕｃａ）から入手可能であり、したがって、対立遺伝子変異体もこの種から入手可能である。後記実施例１に記載のとおり、該配列をクローニングし、部分的に配列決定した。しかし、該クローニング法は直接的なものではなかった。それは１つには、ルシフェリンリサイクリングタンパク質の天然遺伝子中に存在するらしい大きなイントロンの存在によるものであった。
【００４９】
さらに、本発明は、配列番号３を含むルシフェリンリサイクリングタンパク質、配列番号３９を含むルシフェリンリサイクリングタンパク質、または配列番号５９を含むルシフェリンリサイクリングタンパク質、またはそれらのルシフェリンリサイクリング断片、またはこれらのいずれかの変異体（ただし、少なくとも６０％の相同性または同一性を有するもの）をコードする核酸を提供する。特に、本発明の核酸は、配列番号３、配列番号３９または配列番号５９を含むルシフェリンリサイクリングタンパク質をコードする。
【００５０】
配列番号３をコードするそのような配列の一例としては、図１０に示すゲノム配列（イントロンを含む）配列番号４が挙げられる。配列番号３９のタンパク質をコードする核酸配列の一例としては、図１２に示す配列番号４０が挙げられる。適当なｃＤＮＡ配列は、例示されているイントロン（配列番号４１）を伴わない配列番号４、または図１２に示す配列番号３８を含む。特に、該核酸は、図１６に示す配列番号５８のものである。
【００５１】
特定の種から入手可能なタンパク質に加えて、キメラルシフェリンリサイクリング酵素を、種々の種に由来する酵素の断片を組合せることにより製造することが可能である。この場合、該断片は、適切には、該ゲノム配列内で見出される個々のエキソンにコードされる領域を含む。例えば、一般には、これらのタンパク質をコードする遺伝子配列は、例えば後記図５、６、７、１０、１２および１４に示すとおり、種々のサイズの４個のイントロンにより互いに連結された５個のエキソンを含有することが判明している。キメラルシフェリンリサイクリングタンパク質は、適切には、前記配列内のエキソンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶに対応する５個のエキソンの組合せを含む。
【００５２】
適切には、該キメラ酵素は、ラムピリス・ノクチルカ（Ｌａｍｐｙｒｉｓ  ｎｏｃｔｉｌｕｃａ）のような発光虫種に由来するルシフェリンリサイクリング遺伝子のエキソンにコードされる少なくとも１つの断片、好ましくは、４個までの断片を含有する。例えば、本出願人は、フォチヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）配列のエキソン１を、該遺伝子内のエキソン２、３、４および５に対応するラムピリス・ノクチルカ（Ｌａｍｐｙｒｉｓ  ｎｏｃｔｉｌｕｃａ）ルシフェリンリサイクリング酵素の断片にスプライシングすることにより、ルシフェリンリサイクリング酵素を製造した。
【００５３】
そのような酵素の一例を後記配列番号６１に例示する。この配列およびルシフェリンリサイクリング断片およびこれらのいずれかの変異体は、配列番号６０のようなこれらのタンパク質をコードする核酸配列と共に、本発明のもう１つの態様を構成する。
【００５４】
本発明の新規タンパク質は、合成Ｄ−ルシフェリンおよび他の光学活性酵素基質の製造に使用することが可能である。例えば、それらは、ホスファターゼまたはβ−ガラクトシダーゼ酵素の光学活性基質の再生に使用することが可能である。
【００５５】
したがって、さらにもう１つの態様においては、本発明は、Ｄ−ルシフェリンのような光学活性酵素基質の製造方法であって、該基質の酸化形態（例えば、オキシルシフェリン）を、配列番号３もしくは配列番号３９を含むリサイクリングタンパク質またはそのルシフェリンリサイクリング断片またはこれらのいずれかの変異体（ただし、少なくとも６０％の相同性または同一性を有するもの）、および該変換を行うのに必要な任意の他のアミノ酸（例えば、システイン）と接触させることを含んでなる製造方法を提供する。
【００５６】
該反応は、適切には、水性溶媒のような適当な溶媒中、該リサイクリング酵素が活性である温度（これは、関与する個々の酵素に応じて様々となろう）で行う。例えば、該反応は、生理的に許容されるバッファー、例えば２５ｍＭ〜５０ｍＭ  ホスファートまたはＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ６．５〜７．５）の存在下、２０〜３０℃の範囲の反応温度で行うことが可能である。
【００５７】
次に、後記で説明する添付図面を参照しながら実施例により本発明を更に詳しく説明することとする。
【実施例１】
【００５８】
ラムピリス・ノクチルカ（Ｌａｍｐｙｒｉｓ  ｎｏｃｔｉｌｕｃａ）からのＬＲＥ遺伝子のクローニングおよび配列決定
西洋発光虫（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｇｌｏｗ−ｗｏｒｍ）であるラムピリス・ノクチルカ（Ｌａｍｐｙｒｉｓ  ｎｏｃｔｉｌｕｃａ）を２０００年から２００２年にかけてイングランド南部で採集した。全ゲノムＤＮＡを、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＰＣＲ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して雌試料から抽出した。凍結乾燥フォチヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）試料（Ｓｉｇｍａ）から、同様の方法でゲノムＤＮＡを抽出した。
【００５９】
ラムピリス・ノクチルカ（Ｌ．ｎｏｃｔｉｌｕｃａ）の抽出物から相同遺伝子配列を増幅することを試みるために、一連の普遍的プライマーを設計するために、ＧＥＮＥＢＡＮＫから入手した公開されているフォチヌス・ピラリス（Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓ）ＬＲＥ  ｍＲＮＡ配列（配列番号２）を使用した。しかし、これらの試みは失敗した。通常のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いる増幅は多数の産物を与えたが、これらはすべて、非特異的アンプリコンであるらしかった。
【００６０】
これらの問題を克服するために、本出願人は、後記図３に示すとおり、全フォチヌス・ピラリス（Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓ）ＬＲＥ遺伝子を増幅するために１組の５つのプライマー（配列番号５〜９）を設計した。この図には、配列番号２上のこれらのプライマーの位置も示されている。
【００６１】
これらのプライマーを使用する増幅の結果、追加的な配列情報を得た。最初の配列をこれらの配列と組合せることにより、フォチヌス・ピラリス（Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓ）ＬＲＥ遺伝子の完全配列コンティグを得（配列番号１１）、それを図４に示す。この図においては、完全な遺伝子配列がｍＲＮＡ配列（配列番号２）に対して整列されている。エキソンと特徴づけした。それは陰影で示されている。
【００６２】
保存アミノ酸配列に基づき、フォチヌス・ピラリス（Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓ）ＬＲＥのラムピリス・ノクチルカ（Ｌ．ｎｏｃｔｉｌｕｃａ）ホモログの小さな領域を増幅するために、普遍的プライマーを設計した。これらは、６つのフォワードプライマー（配列番号１２〜１８）および５つのリバースプライマー（配列番号１９〜２３）からなるものであった。それらのプライマーの配列と、アミノ酸配列（配列番号１）に対するそれらの位置とを図５に示す。
【００６３】
ＬＲＥ普遍的プライマーＦＯＲ５（配列番号１７）およびＬＲＥ普遍的ＲＥＶ３（配列番号２２）を使用して、ラムピリス・ノクチルカ（Ｌ．ｎｏｃｔｉｌｕｃａ）から３５０塩基対のＰＣＲ産物を増幅した。これを配列決定し（配列番号２４）、図６に示すとおり、これはフォチヌス・ピラリス（Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓ）ＬＲＥ  ｍＲＮＡ中の配列およびゲノム配列（それぞれ配列番号２５および２６）に対して相同性を有することが示された。これは、ラムピリス・ノクチルカ（Ｌ．ｎｏｃｔｉｌｕｃａ）にホモログＬＲＥが実際に存在することを保証するものであった。
【００６４】
ラムピリス・ノクチルカ（Ｌ．ｎｏｃｔｉｌｕｃａ）ＬＲＥ遺伝子に沿って５’および３’ゲノム歩行を行うために、この情報を用いて、４つのプライマー（配列番号２７〜３０）を設計した。これらのプライマーの配列と配列番号２４〜２６上の位置とを図７に示す。
【００６５】
これらのプライマーを使用する５’および３’ゲノム歩行実験の結果、５’および３’の両末端から６つのクローンを得、これらを前向きおよび後向きの両方で配列決定した。得られたコンティグは、元の３５０ｂｐ配列の下流の完全配列を含んでいた。５’末端における配列はフォチヌス・ピラリス（Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓ）におけるエキソン／イントロンＩのいずれの領域に対しても相同性を有さない。該歩行配列のすべての、図８に示すコンティグは、該アライメントにおいて３以上の対立遺伝子を与えた。このことは、フォチヌス・ピラリス（Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓ）におけるこの遺伝子に関して２以上の遺伝子座が存在しうることを示唆している。
【００６６】
これを更に図９に示す。図９は、ラムピリス・ノクチルカ（Ｌ．ｎｏｃｔｉｌｕｃａ）の５’ＵＴＲゲノム歩行配列を示す。１つの個体において、該遺伝子の３つの異なる対立遺伝子形態が示され（配列番号１０、６４および６５）、このことは、該遺伝子のコピーが２以上存在することを示唆している。この図においては、エキソンＩＩは、示されている配列中のアルギニンおよび８５５位から開始する。
【００６７】
３’ＵＴＲゲノム歩行配列（示されていない）は、１つの個体に該遺伝子の２つの異なる形態が存在することを示唆した。
【００６８】
ラムピリス・ノクチルカ（Ｌ．ｎｏｃｔｉｌｕｃａ）ＬＲＥタンパク質の主要部分の配列、およびこの実験から誘導されたコード配列を、図１０にそれぞれ配列番号３および配列番号４として示す。
【００６９】
４つの異なる個体からのいくつかの対立遺伝子変異体を、図１１に配列番号３１〜３７として示す。
【００７０】
驚くべきことに、ラムピリス・ノクチルカ（Ｌ．ｎｏｃｔｉｌｕｃａ）のイントロンＩはフォチヌス・ピラリス（Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓ）のイントロンＩより相当に小さいことが判明した。イントロンＩおよびエキソンＩ以降の完全なリードアウトを得た。ラムピリス・ノクチルカ（Ｌａｍｐｙｒｉｓ  ｎｏｃｔｉｌｕｃａ）のルシフェリンリサイクリングタンパク質の完全な遺伝子配列、推定ｍＲＮＡおよびタンパク質配列を、図１２にそれぞれ配列番号４０、４１および３９として示す。
【実施例２】
【００７１】
ルシフェリンリサイクリングタンパク質の製造
ラムピリス・ノクチルカ（Ｌａｍｐｙｒｉｓ  ｎｏｃｔｉｌｕｃａ）のＬＲＥ遺伝子配列（図１４）に基づき、各エキソンを個別に増幅する５組のプライマー（ＮＯＣ  ＬＲＥ  ＥＸ１〜５）を設計した（図１５、表１）。
【００７２】
表１  オリゴヌクレオチドおよび配列の一覧。下線付きの塩基は制限酵素部位を示す。
【００７３】
【表１】
2005509426.tif 000004
【００７４】
該増幅断片の３’末端に単一のデオキシアデノシン残基が付加される可能性を最小限に抑えるために、プルーフリーディングＰＦＵポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してＰＣＲを行った。
【００７５】
ＰＣＲ産物を２％  アガロースゲル上で分離し、該ゲルから切り出し、アガロース・クリーンアップ（ｃｌｅａｎ  ｕｐ）・カラム（ＡＢ  Ｇｅｎｅ）を使用して抽出した。第１連結ラウンドにおいては、２個のエキソンペアを互いに連結した。連結反応は１６℃で一晩行った。該連結反応物の０．２μｌを第２  ＰＣＲラウンドにおいて使用した。エキソンの各連結ペアには、１つのフォワードプライマーと１つのリバースプライマーとを使用して、連続的産物を増幅した（図１５）。電気泳動、ゲルの切り出しおよびクリーン・アップを、前記のとおりに行った。第２ラウンドの連結において、エキソンＰＣＲ産物の２つのペアを互いに連結した。ＰＣＲ増幅は連続的産物を与え、ついでそれを、残りのエキソンとの最終連結において使用した。
【００７６】
逐次的に連結された全５個のエキソンを含有する最終ＰＣＲ産物を、ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してクローニングし、ダイターミネーションキット（Ｂｅｃｋｍａｎ）を使用して配列決定して連続的なオープンリーディングフレームを確認し、このようにして完全な転写産物−ＬｎｏｃＬＲＥ１（図１６）を得た。フォチヌス・ピラリス（Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓ）とラムピリス・ノクチルカ（Ｌ．ｎｏｃｔｉｌｕｃａ）との間にはＬＲＥのエキソン１における見掛け上の違いが存在するため、フォチヌス・ピラリス（Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓ）特異的プライマー（表１）を使用してフォチヌス・ピラリス（Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓ）のエキソン１を増幅し、これをラムピリス・ノクチルカ（Ｌ．ｎｏｃｔｉｌｕｃａ）のエキソン２〜５上にスプライシングしてキメラＬＲＥ−ＣｈｉｍＬＲＥ１（図１７）を得ることにした。
【００７７】
配列の特徴
エキソン連結介在ＰＣＲにより得た２つの転写産物（ＬｎｏｃＬＲＥ１およびＣｈｉｍＬＲＥ１）はそれぞれ８６４ｂｐ長および９０３ｂｐ長である。両方の配列（それぞれ配列番号５８および６０）は、推定アミノ酸配列（それぞれ配列番号５９および６１）と共に図１６および１７に示されている。これらのアミノ酸配列は、既に報告されている他のＬＲＥ配列と整列させて示されており（図１８）、アミノ酸の同一性（％）は表２に示されている。
【００７８】
表2  3つの公開されているLRE配列、すなわち、Luciola cruciata - Lcru LRE（BAB85479）、Luciola lateraris - Llat LRE（BAB85478）およびPhotinus pyralis - Ppyr LRE（BAB60700）に対するLnocLRE1およびChimLRE1のアミノ酸同一性（％）
【００７９】
【表２】
2005509426.tif 000005
【００８０】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の安定な発現株への形質転換
選択したベクターにおける正しい配向および発現が可能となるようＰＣＲ増幅に制限酵素部位含有プライマーを使用することにより、両方のＬＲＥ配列を適当な発現ベクターに導入することが可能である。プライマーは、Ｎｃｏ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉ部位を有するよう設計した（表１）。ＰＣＲ産物の制限酵素消化は、付着末端クローニング部位、すなわち、５’末端のＮｃｏ  Ｉ部位および３’末端のＸｈｏ  Ｉ部位の変換をもたらす。
【００８１】
ＬＲＥ配列の発現に使用しうる個々のベクターはｐＥＴ−２８ａ（図１９）および１６ｂクローニングベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）である。前者は、Ｃ末端Ｈｉｓタグを有するタンパク質を与える。後者は天然タンパク質の産生をもたらす（前記のクローニング法を参照されたい）。
【００８２】
ｐＥＴプラスミド内にクローニングされた標的遺伝子は強力なＴ７プロモーターの制御下にあり、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有する宿主内での発現を要する。これは、ＢＬ２１（ＤＥ３）宿主株のＤＥ３溶原菌によりもたらされる。しかし、ｐＥＴ組換え体は発現株（ＤＥ３）内では不安定となる場合があるため、安定な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ）プラスミド内でプラスミドを維持する。ついで、誘導前に、組換えプラスミドを発現株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ内に形質転換することが可能である。発現株ｐＬｙｓＳは高いストリンジェンシーの発現をもたらす。
【００８３】
２μｌの各連結反応物を１００μｌのコンピテント細胞（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ）に加え、４２℃の熱ショックに４５秒間付した。氷上で２分間のインキュベーションの後、０．９ｍｌのＳＯＣを加え、該サンプルを、３７℃で振とうしながら１時間インキュベートした。５０μｇ／ｍｌ  アンピシリン（ｐＥＴの場合）および３４μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコール（ｐＬｙｓＳの場合）を含有するＬＢプレート上で、組換え体を選択する。
【００８４】
発現株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ内への２５μｇの形質転換の前に、組換え体を配列決定することが可能である。
【００８５】
過剰発現
各構築物の一晩培養物（３ｍｌ）（５０μｇ／ｍｌ  アンピシリンおよび３４μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコールを含有するＬＢ内）を使用して、１Ｌの培養物に接種した。誘導前に、培養物を分割して対照（未誘導サンプル）および試験（誘導サンプル）を得た。すべての試験サンプルを１ｍＭ  イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で０．４５〜０．６の光学濃度（Ａ６００）で３〜５時間誘導した。タンパク質の発現を調べるために、未誘導培養および誘導培養の両方の１ｍｌのサンプルをペレット化した。
【００８６】
各ペレットに、１００〜２００μｌの１×ＳＤＳ可溶化バッファー（ＳＢ）を加え、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル分析（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ，Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．（１９７０）．Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅａｄ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ４．Ｎａｔｕｒｅ  ２２７（２５９）：６８０−８５）の前に該サンプルを５分間沸騰させた。
【００８７】
変性およびＳＤＳ−ＰＡＧＥの前に、いずれかのタンパク質調製物の液体画分に等容量の２×ＳＢを加えた。
【００８８】
【表３】
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【００８９】
１０％  分解ゲルおよび４％  濃縮用ゲルを使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを調製する。それをＴｒｉｓ／グリシン／ＳＤＳバッファー［０．０２５Ｍ  Ｔｒｉｓ、０．１９２Ｍ  グリシン、０．１％  ＳＤＳ（ＩＣＮ）］中、２５〜３０ｍＡ／ゲルで約１時間にわたり泳動に付す。タンパク質を、振とうしながらクーマシーブルー中でインキュベート（１時間）することにより可視化し、タンパク質のバンドが明らかに見られるようになるまで脱染剤（以下を参照されたい）で脱染する。
【００９０】
【表４】
2005509426.tif 000007
【００９１】
タンパク質の精製
誘導された培養（５００ｍｌ）を集め、２０ｍｌのバッファーに再懸濁させる。超音波処理（２５秒間のオン、２０秒間のオフの１０サイクル）、および遠心分離（１４０００ｒｐｍ、２０分間）後の上清の採取により、可溶性粗抽出物（清澄化サンプル）を調製する。ＴＡＬＯＮアフィニティー樹脂を製造業者の指示（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に従い使用して、Ｈｉｓタグ付きタンパク質を精製する。ＴＥＬＯＮ樹脂は固定化コバルト２＋を使用するものであり、ポリヒスチジンタグ付きタンパク質に対する選択性の増強をもたらす。
【００９２】
精製されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより可視化し、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）アッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ｍ．（１９７６）Ａ  ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｇｒａｍ  ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｙｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８−５４）に従い定量することが可能である。
【実施例３】
【００９３】
ルシフェラーゼリサイクリング酵素を使用するインビボアッセイ
通常の方法を用いて全細胞を形質転換して、それがＬＲＥおよびホタルルシフェラーゼ活性を発現するようにする。これらの細胞を、０．６ｍＭ  Ｄ−ルシフェリンを含有する低ｐＨバッファー（最大ｐＨ５．０）中、（細胞型に応じて）０．５〜１０分間インキュベートする。
【００９４】
ついで該細胞を該低ｐＨバッファーから取り出し、洗浄し、中性バッファーに再懸濁させる。あるいは、適当なアルカリを使用して、該低ｐＨバッファーを中和する。ついで、ルミノメーターまたは他の光検出装置を使用して、該細胞から放出された生物発光を検出し、測定することが可能である。これは、ＡＴＰを細胞内で測定するためのインビボアッセイをもたらす。
【実施例４】
【００９５】
ルシフェラーゼリサイクリング酵素を使用するインビトロアッセイ
アッセイされるＡＴＰを含有するサンプルを、２５ｍＭ  Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．８）、４．０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１〜１０μｇのホタルルシフェラーゼおよび本発明の０．１〜２０μｇの組換えＬＲＥまたは同様に本発明の０．１〜４０μｇの精製組換えルシフェラーゼ−ＬＲＥ融合タンパク質、０．５〜５ｍＭ  Ｄ−システインならびに２５０μＭ  Ｄ−ルシフェリンを含有する反応混合物に加える。ルミノメーターまたは他の光検出装置を使用して、該サンプルのＡＴＰ含量の尺度として、該反応からの光出力を検出し、測定する。
【００９６】
本明細書に記載のすべての参考文献を参照により本明細書に組み入れることとする。本発明の範囲および精神から逸脱しない本発明の他の修飾が当業者に明らかであろう。本発明は特定の好ましい実施形態に関して記載されているが、本発明はそのような特定の実施形態に不当に限定されるものではないと理解されるべきである。実際のところ、本発明を実施するための記載されている態様の種々の修飾が当業者に明らかであり、それらは特許請求の範囲の範囲内であると意図される。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】図１は、ラムピリス・ノクチルカ（Ｌ．ｎｏｃｔｉｌｕｃａ）において見出されるルシフェリンリサイクリングタンパク質（酵素）（ＬＲＥ）をコードする遺伝子の特徴づけのための実験計画および得られた結果を図式的に示す。
【図２】図２は、ＮＣＢＡデータベースから得たフォチヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）ＬＲＥ  ｍＲＮＡ配列および対応タンパク質配列（それぞれ配列番号２および配列番号１）を示す。
【図３】図３は、フォチヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）ＬＲＥの全遺伝子を増幅するよう設計された一連のプライマーを示す。
【図４−１】図４は、ｍＲＮＡ配列（配列番号２）に対して整列された、フォチヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）のＬＲＥ遺伝子の完全な配列（配列番号１１）を示す。この図において、エキソンは陰影付きで示されている。
【図４−２】図４は、ｍＲＮＡ配列（配列番号２）に対して整列された、フォチヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）のＬＲＥ遺伝子の完全な配列（配列番号１１）を示す。この図において、エキソンは陰影付きで示されている。
【図４−３】図４は、ｍＲＮＡ配列（配列番号２）に対して整列された、フォチヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）のＬＲＥ遺伝子の完全な配列（配列番号１１）を示す。この図において、エキソンは陰影付きで示されている。
【図４−４】図４は、ｍＲＮＡ配列（配列番号２）に対して整列された、フォチヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）のＬＲＥ遺伝子の完全な配列（配列番号１１）を示す。この図において、エキソンは陰影付きで示されている。
【図５−１】図５は、保存アミノ酸配列に基づく、フォチヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）ＬＲＥまたはラムピリス・ノクチルカ（Ｌ．ｎｏｃｔｉｌｕｃａ）ホモログの小さな領域を増幅するよう設計された普遍的プライマー、およびアミノ酸配列（配列番号１）に対するそれらの位置を示す。
【図５−２】図５は、保存アミノ酸配列に基づく、フォチヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）ＬＲＥまたはラムピリス・ノクチルカ（Ｌ．ｎｏｃｔｉｌｕｃａ）ホモログの小さな領域を増幅するよう設計された普遍的プライマー、およびアミノ酸配列（配列番号１）に対するそれらの位置を示す。
【図６】図６は、フォチヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）ｍＲＮＡおよびＤＮＡ配列と整列された、ラムピリス・ノクチルカ（Ｌ．ｎｏｃｔｉｌｕｃａ）由来の３５０塩基対のＰＣＲ産物を示す。
【図７】図７は、５’および３’ゲノム歩行実験において使用したプライマーを示す。
【図８】図８は、ゲノム歩行実験から構築されたコンティグを示す。
【図９−１】図９は、３つの形態の遺伝子の存在を示す、ラムピリス・ノクチルカ（Ｌ．ｎｏｃｔｉｌｕｃａ）の５’ＵＴＲゲノム歩行配列を示す。
【図９−２】図９は、３つの形態の遺伝子の存在を示す、ラムピリス・ノクチルカ（Ｌ．ｎｏｃｔｉｌｕｃａ）の５’ＵＴＲゲノム歩行配列を示す。
【図１０】図１０は、ラムピリス・ノクチルカ（Ｌ．ｎｏｃｔｉｌｕｃａ）のＬＲＥを含むタンパク質配列（配列番号３）およびコンティグ核酸配列（配列番号４）を示す。
【図１１−１】図１１は、配列番号４およびいくつかの対立遺伝子変異体または他の変異体（４つの異なる個体に由来するもの）を示す。
【図１１−２】図１１は、配列番号４およびいくつかの対立遺伝子変異体または他の変異体（４つの異なる個体に由来するもの）を示す。
【図１１−３】図１１は、配列番号４およびいくつかの対立遺伝子変異体または他の変異体（４つの異なる個体に由来するもの）を示す。
【図１１−４】図１１は、配列番号４およびいくつかの対立遺伝子変異体または他の変異体（４つの異なる個体に由来するもの）を示す。
【図１２−１】図１２は、ラムピリス・ノクチルカ（Ｌ．ｎｏｃｔｉｌｕｃａ）のＬＲＥを含む完全なタンパク質配列（配列番号３９）、コード遺伝子核酸配列（配列番号４０）および推定ｍＲＮＡ配列（配列番号３８）を示す。
【図１２−２】図１２は、ラムピリス・ノクチルカ（Ｌ．ｎｏｃｔｉｌｕｃａ）のＬＲＥを含む完全なタンパク質配列（配列番号３９）、コード遺伝子核酸配列（配列番号４０）および推定ｍＲＮＡ配列（配列番号３８）を示す。
【図１２−３】図１２は、ラムピリス・ノクチルカ（Ｌ．ｎｏｃｔｉｌｕｃａ）のＬＲＥを含む完全なタンパク質配列（配列番号３９）、コード遺伝子核酸配列（配列番号４０）および推定ｍＲＮＡ配列（配列番号３８）を示す。
【図１３】図１３は、５５．７％のアミノ酸相同性を示す、フォチヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）のＬＲＥタンパク質配列（アクセッション番号ＢＡＢ６０７００）に対して整列されたラムピリス・ノクチルカ（Ｌ．ｎｏｃｔｉｌｕｃａ）の完全なルシフェリンリサイクリング酵素遺伝子配列から誘導された推定アミノ酸配列を示す。
【図１４−１】図１４は図１２に類似しているが、ゲノム配列（配列番号４０）内のイントロン領域の補正位置を示す。
【図１４−２】図１４は図１２に類似しているが、ゲノム配列（配列番号４０）内のイントロン領域の補正位置を示す。
【図１４−３】図１４は図１２に類似しているが、ゲノム配列（配列番号４０）内のイントロン領域の補正位置を示す。
【図１５】図１５は、エキソン連結介在ＰＣＲを用いたルシフェリン再生酵素（ＬＲＥ）ｃＤＮＡの構築を示す概要図である。
【図１６】図１６は、ラムピリス・ノクチルカ（Ｌ．ｎｏｃｔｉｌｕｃａ）ＬＲＥ１のＤＮＡ配列（配列番号４５）および推定アミノ酸配列（配列番号４６）を示す。
【図１７−１】図１７は、ラムピリス・ノクチルカ（Ｌ．ｎｏｃｔｉｌｕｃａ）ＬＲＥ１のＤＮＡ配列（配列番号４７）および推定アミノ酸配列（配列番号４８）を示す。
【図１７−２】図１７は、ラムピリス・ノクチルカ（Ｌ．ｎｏｃｔｉｌｕｃａ）ＬＲＥ１のＤＮＡ配列（配列番号４７）および推定アミノ酸配列（配列番号４８）を示す。
【図１８】図１８は、３つの公開されているＬＲＥ、すなわち、ルシオラ・クルシアタ（Ｌｕｃｉｏｌａ  ｃｒｕｃｉａｔａ）−Ｌｃｒｕ  ＬＲＥ（ＢＡＢ８５４７９）（配列番号６２）、ルシオラ・ラテラリス（Ｌｕｃｉｏｌａ  ｌａｔｅｒａｒｉｓ）−Ｌｌａｔ  ＬＲＥ（ＢＡＢ８５４７８）（配列番号６３）およびフォチヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）−Ｐｐｙｒ  ＬＲＥ（ＢＡＢ６０７００）（配列番号１）に対して整列された、ＬｎｏｃＬＲＥ１（ｌｎｏｃ  ＬＲＥ）（配列番号５９）およびＣｈｉｍＬＲＥ１（ｃｈｉｍ  ＬＲＥ）（配列番号６１）のアミノ酸配列を示す。
【図１９−１】図１９は、ｐＥＴ−２８ａ−ｃ（＋）クローニングベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）を示す。この図において、ＡはｐＥＴ−２８ａ（＋）のプラスミド地図であり、ＢはｐＥＴ−２８ａ−ｃ（＋）クローニング／発現領域の配列を示し、ここで、挿入部位は＊で示されている。
【図１９−２】図１９は、ｐＥＴ−２８ａ−ｃ（＋）クローニングベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）を示す。この図において、ＡはｐＥＴ−２８ａ（＋）のプラスミド地図であり、ＢはｐＥＴ−２８ａ−ｃ（＋）クローニング／発現領域の配列を示し、ここで、挿入部位は＊で示されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【国際調査報告】
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