(57)【要約】成熟し得ない樹状細胞が調製され得ることが、明らかになった。これらの細胞は、Ｔ細胞にシグナルを提供し得る（１）が、副刺激シグナルを提供し得ない（２）。従って、永久的に未成熟な樹状細胞により刺激されるＴ細胞は、アネルギーとなる。その結果、その樹状細胞は、免疫原性であるというよりも寛容原性である。一般的に、この細胞は、ＣＤ４０−、ＣＤ８０−かつＣＤ８６−であり、リポ多糖のような炎症媒介物質により刺激された場合もそのままである。この細胞は、接着性胚性細胞をＧＭ−ＣＳＦの存在下で培養することにより、容易に調製され得る。
2005521403.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
未成熟でありかつ成熟し得ない、樹状細胞。
【請求項２】
Ｔ細胞に抗原を提示可能である樹状細胞であって、該樹状細胞は、ＣＤ４０−ＣＤ８０−かつＣＤ８６−であり、そして該樹状細胞は、炎症媒介物質により刺激された際にＣＤ４０−ＣＤ８０−かつＣＤ８６−のままである、細胞。
【請求項３】
休止状態または炎症媒介物質により刺激された時のいずれかにて、Ｔ細胞にシグナル１を送達し得るが、シグナル２を該Ｔ細胞に提供し得ない、樹状細胞。
【請求項４】
インビトロでＥＳ細胞から分化した、寛容原性樹状細胞。
【請求項５】
請求項１〜４のうちのいずれか１項に記載の細胞であって、該細胞は不死である、細胞。
【請求項６】
請求項１〜５のうちのいずれか１項に記載の細胞であって、該細胞は正常な核型を有する、細胞。
【請求項７】
請求項１〜６のうちのいずれか１項に記載の細胞であって、該細胞はヒトの細胞である、細胞。
【請求項８】
請求項９〜１５のうちのいずれか１項に記載の方法により得られる、細胞。
【請求項９】
幹細胞から寛容原性抗原提示細胞を調製するためのプロセスであって、
該幹細胞から該寛容原性細胞への分化を引き起こす１種以上のサイトカイン存在下で該幹細胞を培養する工程
を包含する、プロセス。
【請求項１０】
請求項９に記載のプロセスであって、前記幹細胞は胚性幹細胞である、プロセス。
【請求項１１】
請求項９または請求項１０に記載のプロセスであって、前記幹細胞はヒト幹細胞である、プロセス。
【請求項１２】
請求項９〜１１のうちのいずれか１項に記載のプロセスであって、前記幹細胞が、前記寛容原性細胞に分化する前に胚様体へと発生する、プロセス。
【請求項１３】
請求項９〜１２のうちのいずれか１項に記載のプロセスであって、前記寛容原性細胞への分化が接着培養で起こる、プロセス。
【請求項１４】
請求項９〜１３のうちのいずれか１項に記載のプロセスであって、フィーダー層が使用されない、プロセス。
【請求項１５】
請求項９〜１４のうちのいずれか１項に記載のプロセスであって、前記サイトカインがＧＭ−ＣＳＦである、プロセス。
【請求項１６】
医薬としての使用のための、請求項１〜８のうちのいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１７】
自己免疫反応を抑制するための医薬の製造における、請求項１〜８のうちのいずれか１項に記載の細胞の使用。
【請求項１８】
レシピエントにおける移植片拒絶を抑制するための医薬の製造における、請求項１〜８のうちのいずれか１項に記載の細胞の使用。
【請求項１９】
レシピエントにおける移植片拒絶を抑制する方法であって、請求項１〜８のうちのいずれか１項に記載の細胞を該レシピエントに投与する、方法。
【請求項２０】
移植片をレシピエントに移植する方法または使用であって、請求項１〜８のうちのいずれか１項に記載の細胞の該レシピエントへの投与もまた包含する、方法。
【請求項２１】
請求項１８〜２０のうちのいずれか１項に記載の方法または使用であって、前記移植片が、心臓、肺、腎臓、肝臓、膵臓、ランゲルハンス島、膵臓性β細胞または他のインスリン産生細胞、角膜、骨髄、または神経組織である、方法または使用。
【請求項２２】
請求項１８〜２０のうちのいずれか１項に記載の方法または使用であって、前記樹状細胞が前記移植片と組織適合性である、方法または使用。
【請求項２３】
患者における自己免疫反応を抑制する方法であって、請求項１〜８のうちのいずれか１項に記載の細胞が該患者に投与される、方法。
【請求項２４】
（ａ）請求項１〜８のうちのいずれか１項に記載の細胞と、（ｂ）レシピエントに移植するための組織移植片とを含む、キットであって、（ａ）と（ｂ）とは組織適合性である、キット。
【請求項２５】
請求項１〜８のうちのいずれか１項に記載の細胞と、薬学的キャリアとを含む、組成物。
【請求項２６】
請求項９〜１５のうちのいずれか１項に記載のプロセスにおいて使用するための幹細胞であって、該幹細胞は遺伝子操作されている、細胞。
【請求項２７】
請求項２６に記載の幹細胞であって、該幹細胞の樹状細胞への分化を促進するポリペプチドをコードするように、該幹細胞は遺伝子操作されている、細胞。
【請求項２８】
請求項２６に記載の幹細胞であって、該幹細胞は、免疫応答を下方制御する１種以上の表面タンパク質を発現または過剰発現するように遺伝子操作されている、細胞。
【請求項２９】
請求項２６に記載の幹細胞であって、該幹細胞はＴ細胞の活性化を促進する表面タンパク質および／または分泌タンパク質を発現しないかまたは過少発現するように遺伝子操作されている、細胞。
【請求項３０】
請求項２６に記載の幹細胞であって、該幹細胞は自殺遺伝子を含むように遺伝子操作されている、細胞。
【請求項３１】
請求項２６に記載の幹細胞であって、該幹細胞は系統選択に適したマーカーを含むように遺伝子操作されている、細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書中で引用される文献は、その全体が、参考として援用される。本発明は，移植分野にある。特に、本発明は移植片拒絶抑制の分野にある。本発明は、移植片レシピエントに、抗移植片Ｔ細胞を寛容する抗原提示細胞を投与することにより達成される。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物の免疫系は、個体を感染因子から保護し、そして腫瘍増殖を防ぐことにおいて、中心的役割を果たしている。しかし、同じ免疫系が、血縁関係を持たないドナーからの細胞移植片、組織移植片、そして器官移植片の拒絶といった、望まれない効果を生じ得る。さらに、この免疫系は、機能不全になり得、そして自己免疫として知られているプロセスにより個体自らの組織の破壊を引き起こし得る。
【０００３】
免疫抑制剤は、有害な免疫応答の問題に対する解答を提供したが、これら薬剤は、問題の応答を選択的には標的としない。このような薬剤の使用は、適切な応答および、望まれない応答の両方の体系的な抑制を引き起こし、感染および腫瘍の制御の失敗を導き得る。しかし、免疫応答の根底にある機能メカニズムがより理解されるようになったので、望まれない応答の特異的な排除が、医学における目標になった［１］。
【０００４】
多くの様式で、免疫応答は、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）により制御されており、これらＴ細胞が、免疫非応答または寛容の誘発の標的となっている［２］。Ｔ細胞上で出される一定範囲の表面タンパク質が、天然のリガンドまたはこれらリガンドからの合成ペプチドと共に標的となり、Ｔ細胞応答に対する効果が認められている［３，４］。しかし、これらは、免疫抑制剤のように機能し、さらなる介入無くしては、特定のＴ細胞を標的としない。
【０００５】
インビボでＴ細胞応答が、通常は厳重に制御されていることは明らかであり、別の細胞集団が、おそらくこの制御機能を行っていると考えられている。この状況において、樹状細胞（ＤＣ）が、広範囲に渡って研究されている［５−９］。ＤＣは、多くの免疫応答で最も重要な役割の一つを有し、Ｔ細胞を独特に刺激も寛容もし得ると認められている。ＤＣは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）と関連したＴ細胞にこれら抗原からのペプチドを提示するため、抗原を感知しエンドサイトーシス（マクロピノサイトーシス、ファゴサイトーシス、そしてクラスリン媒介性エンドサイトーシス）を介して処理し得る［１０］。Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）が、ＭＨＣ上のその特異的なペプチドを、認識する場合これは、シグナル１として知られる。このシグナルだけでは、Ｔ細胞を活性化するのに十分ではなく、単離して提供すると、アネルギーを引き起こすことによって、Ｔ細胞を寛容することが明らかにされた。炎症刺激の存在下、ＤＣは、Ｔ細胞表面のリガンドと相互作用するＤＣ表面の副刺激（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）分子を成熟させ、そしてアップレギュレートし、それによってＴ細胞を活性化するシグナル２を提供し得る。しかし、ＤＣが、活性化しているか、または寛容原性であるかを決定する特徴は、現在解明されつつある。
【０００６】
一つの決定的特徴は、ＤＣの成熟状態であると思われる。成熟したＤＣは、ＴＣＲに抗原を提示し得かつ、必要な副刺激シグナル／活性化シグナルを提供し得るという点でＴ細胞を活性化するのに必要な表面分子全てを持っているのに対して、未成熟なＤＣは、通常、その表面に低いレベルの抗原提示分子を持つのみである。従って、未成熟なＤＣはＴ細胞を活性化し得ない［１１］。しかし、成熟の表現型を持つＤＣが、Ｔ細胞の活性化誘導性細胞死を促し［１２］、従って、寛容を誘発することが示されているので、成熟状態は、免疫原性のいつも信頼できる指標であるわけではない。
【０００７】
免疫制御におけるＤＣの機能は、多様なＤＣのサブセットと系統の観点からも説明されている。ＤＣの表現型マーカーおよび機能は、ＤＣを異なるグループ［１３］（例えば、骨髄系ＤＣとリンパ系ＤＣ）に区分するために使用されている。免疫原性ＤＣおよび寛容原性ＤＣの両者の例は、それぞれのサブセットで説明されている［１４］。
【０００８】
寛容原性ＤＣの詳細な特徴および表現系は、はっきりしないが、寛容誘発に様々なタイプのＤＣを使用する幾つかの試みがあった。
【０００９】
寛容誘発に使用され得る、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）内の前駆体に由来する未成熟なＤＣの生産は、参考文献１５と１６で説明されている。しかし、この方法には、欠点がある。特に、これらのＤＣは従来の条件で完全に免疫原性の細胞に成熟され獲る。そのため、インビボで成熟する可能性は、特にレシピエントの炎症部位では高い。さらに、初代細胞の遺伝子操作は難しく、それらはまた、完全に免疫原性の細胞に成熟し得る。また、寛容原性細胞は、ドナーの組織に適合しなくてはいけないことから、この寛容誘発の方法では、個々のドナーのＰＢＭＣ内前駆体からＤＣが作られる必要があり、これは、費用がかかる。
【００１０】
移植片に対する寛容誘発のための細胞誘導において重要な目的は、細胞をドナーの組織と適合させることである。胚性（ＥＳ）細胞は、様々な細胞および組織に分化出来るため、ＥＳ細胞は移植のための細胞へ、およびドナーに適合した寛容原性細胞へも分化し得る。従って、幹細胞からのＤＣ前駆体は、寛容原性または免疫原性いずれかであるＤＣを生産するよう操作され得る。マウスＥＳ細胞からＤＣを生産する方法は、参考文献１７と１８で説明されている。これら方法は、結果として、インビトロでリポ多糖類と共に培養することにより成熟され得る免疫賦活性のＤＣの生成を生じる。実際、これら樹状細胞由来のＥＳ細胞は、精製されたＴ細胞からＤＣと同じハプロタイプの他の細胞に対する強い同種移植片応答を促す。従って、これらＤＣは、同種移植に対する寛容誘導に有用ではない。
【００１１】
抗原特異的寛容誘発のさらなる方法は、ＤＣといった抗原提示細胞の成熟を、特定の細胞表面レセプターのアゴニストを用いることにより止めることである［１９、２０］。この方法は移植を待つかまたは自己免疫疾患に羅患している各個体から、寛容原性ＡＰＣを生成することを必要とするので、費用がかかる。さらにＡＰＣの成熟の抑制は、（例えばアゴニストが提供されなくなった時）逆転され得、これは、寛容原性ＡＰＣが免疫原性になり、移植片拒絶または自己免疫をひどくするので、患者にとって悲惨な結果を招く可能性がある。
【００１２】
類似の方法が参考文献２１で説明されているが、この方法は、ＮＦ−κＢを隔離するために、オリゴＤＮＡデコイを使用することに基づいている。しかし、上記のように、この方法は、もしＤＣへのオリゴＤＮＡの提供が終了すると、反転する傾向があるので、不十分である。
【００１３】
参考文献２２と２３は、ＤＣの成熟を抑制する薬剤の使用による移植片に対する寛容誘発ならびに免疫毒素投与によるレシピエントのＴ細胞集団の減少を説明している。この方法は、移植片への免疫応答の減少に効果的であると示し得る一方、この方法は、抗原特異的でないので、患者にとって、大変危険な結果を招き得る。全身免疫抑制は、患者を二次感染および癌に対して非常に感受性にさせる。
【００１４】
最後に、血球フェレーシス由来の単核細胞からＤＣを産生するための、ＴＮＦαおよび他の炎症媒介物質の使用は、参考文献２４と２５で説明されている。しかし、この方法は、免疫原性ＤＣを生産し得るので、移植寛容誘発に有用でありそうもない。
【００１５】
移植片特異的（すなわち、非全身的）様式で寛容であり、Ｔ細胞に対して副刺激シグナル２を提示することが本質的にできず、遺伝子操作を受けやすく、移植片組織に簡単に適合し、個々の患者に対し適合しなくても良い、免疫原状態への反転傾向がない、簡単に入手でき、発癌性で無い、樹状細胞を提供することが、本発明の目的である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者は、Ｔ細胞に抗原を提示し得る（それにより、シグナル１を提供する）が、副刺激シグナル２を提供し得ない、抗原提示細胞（ＡＰＣ）が調製可能であることを発見した。本発明は、成熟し得ない樹状細胞を調製可能であるという驚くべき発見に基づいている。これら細胞は、Ｔ細胞にシグナル１を提供し得るが、副刺激シグナル２は提供し得ない。永久に未成熟な樹状細胞により刺激されたＴ細胞は、それゆえアネルギーとなり、それゆえ、その樹状細胞は免疫原性ではなく寛容原性である。移植片組織のハプロタイプと一致する寛容原性細胞を提供することにより、抗移植片Ｔ細胞は除去される。
【００１７】
（本発明の寛容原性細胞）
本発明は、未成熟でありかつ成熟し得ない樹状細胞を提供する。
【００１８】
天然の未成熟樹状細胞と異なり、そして参考文献１１と１７で説明されている樹状細胞と対照的に、本発明の樹状細胞は、例えば、リポ多糖類（ＬＰＳ）、細胞壊死因子α（ＴＮＦ−α）、フィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）、またはコンコナバリンＡ（ＣｏｎＡ）といった炎症媒介物質により刺激された場合に成熟し得ない。本発明の樹状細胞はＴ細胞に抗原を提示し、その結果、シグナル１を提供し得るが、副刺激シグナル２を提供し得ない。なぜなら、これらの細胞は、未成熟状態のままであるからである。
【００１９】
本発明はまた、シグナル１をＴ細胞に送達（抗原提示）し得るが、休止状態または炎症媒介物質により刺激された時のいずれにおいても、シグナル２をＴ細胞に提供し得ない、樹状細胞を提供する。
【００２０】
本発明はまた（ａ）Ｔ細胞に抗体を提示し得、（ｂ）ＣＤ４０−、ＣＤ８０−、かつＣＤ８６−であり、（ｃ）炎症媒介物質により刺激された際にＣＤ４０−、ＣＤ８０−、かつＣＤ８６−のままである、樹状細胞を提供する。
【００２１】
ＣＤ４０、ＣＤ８０、かつＣＤ８６は、副刺激分子である。本発明の細胞は、したがって、寛容原性であり、非免疫原性である。これら細胞は、インビトロおよびインビボでＴ細胞同種抗原に対するＴ細胞寛容を誘発し得る。
【００２２】
本発明の細胞は、好ましくは、ＭＨＣ−ＩＩ＋である。ＭＨＣ−ＩＩの発現は、低いレベルであっても、これら細胞がＣＤ４Ｔ細胞（ヘルパーＴ細胞）を寛容するのを許容する。この細胞は、ＭＨＣ−Ｉ＋であってもＭＨＣ−Ｉ−であってもよい。ＭＨＣ−Ｉの発現は、ＣＤ８Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞）を寛容することが望ましい時にのみ特に必要である。細胞の詳細なＭＨＣ−Ｉ表現型かつＭＨＣ−ＩＩ表現型、および必要な発現レベルは、望ましい寛容化のタイプに依存するが、全体的な細胞の要件は、Ｔ細胞に抗原を提示し得ることである。
【００２３】
本発明の細胞は、好ましくは、ＣＤ３４−であり、すなわちそれは、造血幹細胞でない。
【００２４】
この細胞は、ＣＤ１１ｃ−であり得る。ＣＤ１１ｃは、成熟樹状細胞の表面上に提示されたインテグリンであり、補体カスケードのｉＣ３ｂタンパク質に結合する際に役割を果たしている。ＣＤ１１ｃ−細胞は、ｉＣ３ｂタンパク質に結合することにより、補体カスケードを活性化し得ないので、炎症応答は有利に減少する。
【００２５】
この細胞は、ＣＤ１４−であり得る。ＣＤ１４は、ＬＰＳレセプターで、ＣＤ１４−細胞は、炎症媒介物質により刺激されない。
【００２６】
本発明の細胞は、以下のマーカー表現型のうち１つを有してもよいし、有さなくてもよい：ＣＤ１ｄ−、ＣＤ５４＋、ＣＤ９５−、ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ８α＋。
【００２７】
「−」は、問題のタンパク質が、細胞内において、その機能がその細胞により表わされるのに充分に高いレベルでは発現していないことを意味する。（例えば、ＣＤ４０−細胞はＣＤ４０媒介性副刺激表現型を表さない。）発現がまったく存在しないこともあり得る（例えば、遺伝的ノックアウトでのように）が、タンパク質の機能が表れない程に充分に発現が低い（例えば、バックグランドレベルや基礎レベルより上に検出されない）場合、完全な欠失は、いつも必要というわけではない。発現レベルを測定する一つの方法は、ＦＡＣＳアッセイであり、「−」は、抗マーカー抗体（例えば、抗ＣＤ４０、抗ＣＤ８０、抗ＣＤ８６など）の存在下およびその抗体の非存在下において本発明の細胞間で、充分なシグナルの差が存在しないことを、代表的には、意味する（例えば、図２を参照のこと）。
【００２８】
逆に、「＋」は、問題のタンパク質が、その細胞によりその機能が表れる細胞内レベルで発現されることを、意味している（例えば、Ｔ細胞はＭＨＣ−ＩＩ＋細胞と相互作用し得る）。発現のレベルは、野生型の樹状細胞で観察されるレベルより低くても、同じであっても、または高くてもよい。ＦＡＣＳアッセイによって、「＋」は、抗マーカー抗体の存在／非存在によって有意なシグナルのシフト（例えば≧１／２ｌｏｇ）が生じる事を意味する。
【００２９】
好ましくは、本発明の細胞は不死でない（すなわち、この細胞は、培養で永遠には増殖し得ない）。好ましくは、本発明の細胞は、非腫瘍原性であり、そして正常な核型を有し得る。
【００３０】
好ましくは、本発明の細胞は、ヒト細胞である。
【００３１】
本発明の細胞は、クローンであり得る。
【００３２】
本発明の細胞は、骨髄系樹状細胞またはリンパ系樹状細胞であり得る。
【００３３】
好ましくは、本発明の細胞は、非分化状態に反転せず、免疫原性樹状細胞にさらに分化しないという意味で、安定である。このような変化は有害である。なぜなら、移植片に対するレシピエントの免疫系を寛容するのではなく、免疫原性細胞が刺激（ｐｒｉｍｅ）され、従って移植組織を非常にすばやく拒絶するからである。同様に、好ましい細胞は、成熟可能な状態に反転不能であり、これら寛容原性には、外来性分子（例えば、アゴニストまたはオリゴＤＮＡ）の存在を必要としない。参考文献１９，２０、および２１の樹状細胞と比較したとき、これは重要な利点である。
【００３４】
このように、本発明の細胞は、好ましくは、ｉ）１つ以上のＮＦ−κＢ結合部位を含む一本鎖または二本鎖のオリゴデオキシヌクレオチド（例えば一本の鎖当たり２５個以下のヌクレオチドからなる）、および／あるいは、ｉｉ）ＣＤ３６のアゴニスト、ＣＤ５１アゴニスト、トロボスポンジンレセプターアゴニストを含まない。
【００３５】
好ましくは、本発明の細胞は、エンドサイト−シス可能である。これらの細胞はまた、ファゴサイト−シスをし得る。本発明の細胞は、エンドサイト−シスまたはファゴサイト−シスの間に、クラスＩＩ  ＭＨＣの発現をアップレギュレートしないことが、好ましい。
【００３６】
好ましくは、本発明の細胞は、インビトロの培養で少なくとも４週間（例えば、少なくとも６週間、少なくとも８週間、またはもっと長く）生存し得る。
【００３７】
好ましくは、本発明の細胞は、インビトロで幹細胞（例えば、ＥＳ細胞）から分化する。そのため、本発明はインビトロで幹細胞から（好ましくは、ＥＳ細胞から）分化した寛容原性樹状細胞を提供する。
【００３８】
本発明の細胞は、多くの方法により調製され得る。最も簡便には、本発明の細胞は、培養中の幹細胞の分化を引き起こす適切な成長因子の添加により、調製されるが、本発明の細胞は、樹状細胞の成熟に重要なタンパク質の機能的発現を（例えば、遺伝子操作によって、アンチセンスによって、アンタゴニストの使用によって）防止することによっても、調製され得る。
【００３９】
（分化の方法）
本発明は、幹細胞から寛容原性抗体提示細胞を調製するプロセスを提供し、本方法は、その幹細胞を寛容原性細胞へと分化させる１種以上のサイトカインの存在下で、その幹細胞を培養する工程を包含する。その後、この寛容原性細胞は、培養培地から回収され得る。
【００４０】
本発明のプロセスで使用される幹細胞は、任意の多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞または多分化能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞であり得、特に造血系統を生じるものであり得る。多分化能性細胞は、３つの主要な胚細胞層に由来するどの細胞にも発達する能力を有す。成体幹細胞、胎盤幹細胞、胎児幹細胞、臍帯幹細胞は全て使用し得るが、好ましい幹細胞は、ＥＳ細胞である。本発明は、胚性腫瘍（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＥＣ））細胞または胚性生殖（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｇｅｒｍ（ＥＧ））細胞の使用を含む（例えば、２６）。
【００４１】
本発明のプロセスにおいて使用する前に、これらの幹細胞を入手し（例えば、非分化状態で）、そして維持するための方法は、周知である。
【００４２】
ＥＳ細胞は、インビトロでの培養で永久に増殖できる胚から単離された細胞である。ＥＳ細胞は、多分化能性である。すなわち、ＥＳ細胞は、成体動物を構成する全ての細胞型をインビボで生じる能力を持つ。マウスＥＳ細胞（例えば、参考文献２７）およびヒトＥＳ細胞（例えば、参考文献２８および２９）は容易に入手可能である。その非分化増殖のための条件は、周知である（参考文献３０〜４０）。いくつかのＥＳ細胞は、適切には全能性というよりもむしろ多能性であると言われる。なぜなら、そのＥＳ細胞は、ある細胞型（特に栄養膜）を形成出来ないが、ヒトＥＳ細胞からの栄養膜形成は報告されている［４１］からである。
【００４３】
ヒト幹細胞および特にヒトＥＳ細胞は、ヒト患者との適合性を確実にするために、本発明に従う使用のために好ましい。しかし、ヒトでない患者が処置される場合には、他の生物由来の（例えば、ヒトでない霊長類またはマウス由来の）幹細胞が使用され得る。ヒトでない幹細胞はまた、異種移植で用いられる技術と組み合わせてヒト投与に使用され得る。
【００４４】
ヒトＥＳ細胞は、マウスＥＳ細胞と同じレベルに未だ到達していないが、ヒトＥＳ細胞の増殖および分化の知識は、どのようにヒト造血幹細胞などの様々な前駆体から、寛容を誘発する能力を有する造血系統の細胞を誘導するかに関する情報のように（例えば、参考文献１３および４５〜４９）、進歩している（例えば、参考文献３９〜４４）。
【００４５】
好ましくは、この幹細胞は、ブッシュ大統領による２００１年８月９日の演説で概説された基準に従ってＵＳ連邦基金に対し適格なヒトＥＳ細胞株である。さらに好ましくは、この幹細胞は、ＮＩＨ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙから入手出され得る幹細胞である。
【００４６】
ヒトＥＳ細胞は、ＨＥＳ−１またはＨＥＳ−２であり得る［５０］。
【００４７】
好ましくは、分化の前に、ＥＳ細胞は、適切な抑制因子（例えば、マウスＥＳ細胞には白血病抑制因子（ＬＩＦ））を含む培地中にて未分化状態で維持される。
【００４８】
好ましくは、細胞は、ゲル化前のフラスコ（例えば０．１％ゼラチンと）中で、未分化状態で維持される。このようにして、本発明の方法は、フィ−ダー細胞の使用を避けることができ、従って参考文献１８と異なり、分化前のＥＳ細胞培養の間にフィ−ダー層を使わないことが、好ましい。
【００４９】
幹細胞は一般に、寛容原性細胞へ分化する前に胚様体（ＥＢ）へと発生し得る。このＥＢ自体は、寛容原性ではない。ＥＢは、ＥＳ細胞、ＥＧ細胞またはＥＣ細胞が懸濁培養で増殖する時（例えば、細胞接着を阻止する非接着性表面に配置した時）に形成される細胞の凝集体である。ＥＢは、液体懸濁培養で自然に発生し、そしてこれには、いかなる特定のサイトカインの存在をも必要としない。ＥＢは、当該分野で広く認識されており、ヒト（例えば、参考文献４２および５５〜５９）ならびにマウスの細胞の両方から慣用的に生成され得る（例えば、参考文献５１〜５４）。出発幹細胞が接着培養中にある場合、それらはＥＢ形成前に、機械的脱凝集の使用、酵素処理（例えば、トリプシン、パパイン、コラゲナーゼなどを用いる）そして／または、金属イオンキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ，ＥＧＴＡ）などを含む方法により、組織培養表面から解離され得る。分化を最適に進めるには、ＥＢは、好ましくは、自由に浮遊する。
【００５０】
サイトカイン存在下での分化の間、細胞は（ＥＢとは異なり）、接着培養で（例えば、プラスチック表面上で）維持されることが好ましい。接着のあと、ＥＢは、外側へ向かって移動する間質細胞のコロニーを生じる。７〜１０日間培養の後、本発明の寛容原性細胞は、周辺近くで発達し、９０％近い純度で収集され得る。
【００５１】
参考文献１８と異なり、ＥＢの分化の間にフィーダー層を使わないことが、好ましい。ゲル化前のフラスコ（例えば０．１％ゼラチンを含む）を代わりに使用し得る。これにより、培養培地中の不確定因子の存在を有利に回避する。
【００５２】
サイトカインが、代表的には、ＥＢが培養または維持されている培地に添加される。好ましくは、このサイトカインは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）である。これは、１種以上のさらなるサイトカイン（例えばインターロイキン−３（ＩＬ−３）、ＴＮＦ−α、ＦＬＴ３−リガンド）との組み合わせと使用され得るが、これら３種のさらなるサイトカイン単独ではいずれも、望ましい分化を引き起こすのに充分ではない。本発明の方法は、必要に応じて、ＩＬ−３の非存在下、ＴＮＦ−αの非存在下、および／またはＦＬＴ３−リガンドの非存在下で実施され得る。この培養培地は、ＦＬＴ３−リガンド（Ｆｌｔ３−Ｌ）およびＴＮＦ−α（両方とも成熟樹状細胞の生成を支持すると以前に報告された）などの化合物を好ましくは、欠く。
【００５３】
培養培地中のＧＭーＣＳＦの濃度は、一般には通常５〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲、例えば、１０〜５０ｎｇ／ｍｌ、２０〜３０ｎｇ／ｍｌまたは約２５ｎｇ／ｍｌである。６ｎｇ／ｍｌまでのＩＬ−３の添加は寛容原性細胞の発生に影響しないようであるが、生産される細胞の収量をわずかに上昇させる。
【００５４】
ＧＭ−ＣＳＦの種々の形態および誘導体が入手可能であり、そして本発明において使用され得る。例えば、それは、血液から精製され得るか、組換えにより発現され得るか（例えば、６０、６１）、またはＧＭ−ＣＳＦを分泌する細胞の培養上清から精製され得る。あるいは、そのサイトカインは、培養培地中にそれらを分泌する細胞を含めることにより、提供され得る。精製された組換えサイトカインの培養培地への添加が、好まれる。
【００５５】
サイトカインは、好ましくは、幹細胞と同じ種由来である（例えば、ヒト幹細胞と一緒にヒトＧＭ−ＣＳＦを使用する）。
【００５６】
培養培地は、血清を含んでも良いし、無血清であってもよい。無血清培地が使用される場合、代わりに血清置換物を使用することが好ましい。
【００５７】
（成熟タンパク質の機能的発現の抑制）
本発明の培養方法は、成熟不能な樹状細胞を提供する。同じ効果は、ＣＤ４０、ＣＤ８０（Ｂ７−１）およびＣＤ８６（Ｂ７−２）などの機能的シグナル２タンパク質の発現を抑制または防止するための方法によっても達成されるが、この培養方法が好ましい。
【００５８】
例えば、シグナル２タンパク質をコードする遺伝子の発現が、防止され得る。これは、そのコード配列および／または調節配列を除去または変異させるためのノックアウト変異を含み得る。適切なノックアウト変異は、遺伝子ターゲティングなどの技術を使用して、達成され得る。発現はまた、アンチセンス技術（例えば、参考文献６２〜６５など）または、ＲＮＡｉを使ったＲＮＡサイレンシング（例えば、参考文献６６〜６９など）を使用しても阻止され得るが、その可逆的な性質のため、このような技術は好まれない。
【００５９】
代替法として、重要なアミノ酸残基を変異することによってシグナル２タンパク質の機能を抑制し得る（例えば、参考文献７０，７１，７２など）。
【００６０】
これらの技術は、単独でかまたは組み合わせて使用し得る。例えば、ＣＤ４０発現は、ノックアウト変異により防止され得、ＣＤ８０発現は、アンチセンスにより防止され得、かつＣＤ８６は変異により阻害され得る。しかし、一般に、永久的な防止技術が好まれる。
【００６１】
（免疫療法的方法および免疫予防方法）
本発明は、レシピエントにおける移植片拒否を抑制する方法を提供し、この方法において、本発明の樹状細胞は、レシピエントへ投与される。
【００６２】
本発明はまた、医薬としての使用のための本発明の樹状細胞の使用を提供する。
【００６３】
本発明はまた、レシピエントにおける移植片拒絶を抑制するための医薬の製造における、本発明の樹状細胞の使用を提供する。
【００６４】
本発明の細胞は、純粋な形態でかまたは他の型の細胞と組み合わせて、患者に投与され得る。しかし、不死細胞、幹細胞および／または、成熟しているかまたは、成熟可能な樹状細胞と一緒に投与されるべきでないことが、好ましい。
【００６５】
本発明の細胞は、一種以上の抗炎症因子、抗凝固薬、および／またはヒト血清アルブミン（好ましくは組換え体）といった他の活発性因子と一緒に、典型的には同じ注射で、患者に投与され得る。
【００６６】
一般にこの細胞は、注射により（例えば血液に）レシピエントに投与される。静脈内注射が好ましい。肝門脈が好ましい投与経路である。従って、本発明は、本発明の細胞を含むシリンジを提供する。
【００６７】
一般に、この細胞は、基本的には培養を抜け出た形態で、患者に投与される。しかし、いくつかの場合では、この細胞は、生産と投与との間に処理され得る。例えば、この細胞は、その細胞が分裂できないのを確実にするために、投与前に照射され得る。この細胞は、投与前に、目的の抗原に曝され得る。この細胞は、生産と投与との間に保存（例えば、低温保存）され得る。
【００６８】
この細胞は、移植片に対する寛容を増強するのに有効な量で投与される。患者に送達する細胞の数は、レシピエントの体重、免疫系の活性、およびその細胞の寛容原性効力を含む、多数のパラメータに基づく。典型的な細胞数は、体重１ｋｇ当たり約１０６〜１０８細胞である。
【００６９】
この細胞は、薬学的キャリアとの組み合わせと送達され得る。このキャリアは、その細胞の生存を支持する細胞培養培地を含み得る。この培地は、レシピエントにおける免疫応答を誘起するのを回避するために無血清である。一般的この培地は動物由来の生成物（例えばＢＳＡ）を好ましくは含まない。一般的に、このキャリアは、緩衝化されており。そして／または発熱物質を含まない。
【００７０】
本発明は、移植片をレシピエントに移植するための方法を提供し、この方法は、その移植片と共に本発明の樹状細胞を投与することを含む。本発明はまた、本発明の樹上細胞の患者への投与を含む、移植片レシピエントにおける寛容を増強する方法を提供する。
【００７１】
この樹状細胞は、移植片の前に（すなわち寛容化前に）かまたは実質的に同時に、投与され得る。移植片の前（例えば、少なくとも１日前、好ましくは少なくとも３日前、そして典型的には少なくとも５日前，６日前，７日前，８日前，９日前または１０日前）にこの細胞を投与することが好ましい。
【００７２】
本発明はまた、移植片に対する寛容を維持するための方法を提供し、この方法は、本発明の樹状細胞を、移植片を受けた患者へ投与をすることを含む。これは、ブースター（ｂｏｏｓｔｅｒ）寛容を提供する。
【００７３】
本発明はまた、（ａ）本発明の寛容原性細胞と、（ｂ）レシピエントに移植するための組織移植片とを含むキットを提供し、（ａ）と（ｂ）とは、組織適合性のハプロタイプ（例えば、ＨＬＡハプロタイプ）である。
【００７４】
この移植片は、移植に適した任意の組織、器官または細胞（例えば、心臓、肺、腎臓、肝臓、膵臓、ランゲルハンス島、膵臓β細胞または他のインスリン産生細胞、角膜、軟骨、骨髄、または神経組織など）であり得る。この移植片は、ドナーから採取されても、またはインビトロで増殖されてもよい。好ましくは、この移植片は、インビトロで幹細胞から増殖される。
【００７５】
一般的にこの樹状細胞は、その移植片と組織適合性であるハプロタイプ（例えば、ＨＬＡハプロタイプ）を有する。これは、その樹状細胞が、レシピエントをその移植片からの抗原に対してのみ寛容化することを可能にする。同じ幹細胞からその樹状細胞とその移植片とを得ることにより、これは、都合よく達成され得る。これはまた、従来のＨＬＡ適合によっても達成され得る。その樹状細胞がその移植片に適合していない場合、その樹状細胞は、その移植片抗原に前もって曝されなければならない。間接的な経路でなく直接的な経路によるＴ細胞への抗原提示を支持するので、適合は有利である。
【００７６】
この樹状細胞は、そのレシピエントと実質的に異なるハプロタイプを有することが、好ましい。このことは、樹状細胞が、有害な非自己抗原（例えば、ウィルス抗原）に対してレシピエントを寛容化する危険を減少させる。しかし、移植片とレシピエントのハプロタイプとの間の差が大きくなればなるほど、本発明の樹状細胞による強い寛容化についての要求も大きくなる。所定のどの患者にとっても、理想的な位置は、これら２つの競合する要求の妥協案である。
【００７７】
本発明の細胞は、移植片抗原を前もって負荷され得る。
【００７８】
その移植片とレシピエントとが同じ種由来である（すなわち、同種移植）ことが好ましいが、本発明はまた、その移植片とレシピエントとが異なる種由来である場合（すなわち、異種移植）でも適用され得る。異種移植が使用される場合、そのレシピエントへ、さらなる抗異種応答因子投与をすることが望ましくあり得る。免疫抑制剤が投与され得るが、好ましくは、寛容誘導と適合性であるもの（例えばラパマイシンであってシクロスポリンでない）が投与され得る。
【００７９】
好ましくは、この樹状細胞と移植片とは同じ種由来である。
【００８０】
本発明の寛容原性樹状細胞は、その寛容原性細胞と同じハプロタイプの他の細胞に対して寛容（すなわち非応答性）であるように、同種異系Ｔ細胞を誘導するために、インビトロで使用され得る。これは、その同種異系Ｔ細胞をこの寛容原性細胞と一緒に、例えば、３日間またはそれより長く（例えば、４日間，５日間，６日間，７日間，８日間）培養することによって達成され得る。これらの同種異系Ｔ細胞がこの寛容原性細胞から（例えば洗浄し一晩放置することによって）、分離される場合、その同種異系Ｔ細胞は、この寛容原性細胞と同じハプロタイプを有する細胞または組織と一緒にインビトロで配置され得、この寛容原性細胞と同じハプロタイプを有する何らかの細胞に前に曝されていない同種異系Ｔ細胞、または、この寛容原性細胞と同じハプロタイプを有する細胞に曝されていた同種異系Ｔ細胞に比べて、この寛容原性細胞に以前に曝されていたこれらの同種異系Ｔ細胞は、それらが他の２つのシナリオから得た同種異系細胞と比較して、有意には増殖しないという点で、寛容性である。
【００８１】
（自己免疫）
移植片拒絶抑制する際に有用だけでなく、本発明の樹状細胞は、自己反応性Ｔ細胞を寛容化することにより、自己免疫疾患の処置において使用され得る。
【００８２】
本発明は、患者における免疫反応を抑制する方法を提供し、この方法において、本発明の樹状細胞は、患者に投与される。
【００８３】
本発明はまた、自己免疫反応を抑制するための医薬の製造における、本発明の樹状細胞の使用を提供する。
【００８４】
一般的に、これら投与の方法および手段は、免疫療法的方法および免疫予防的方法について上記したものと同様である。しかし、主な違いは、その樹状細胞が、自己免疫患者に由来する幹細胞に由来することである。
【００８５】
（本発明のプロセスにおいて使用するための幹細胞の遺伝子操作）
幹細胞は、一般的に、本発明のプロセスにおいて使用される前に、遺伝子操作されており得る。同様に、この幹細胞の分化した誘導体は、本発明のプロセスが実施された後、遺伝子操作され得る。
【００８６】
例えば、細胞は、この幹細胞から樹状細胞への分化を促すポリペプチド（例えば、転写因子）をコードするように、遺伝子操作されており得る。
【００８７】
このペプチドの発現は制御され得、ゆえに、この発現は、この幹細胞自体において起こるか、またはこの発現は、この幹細胞の誘導体において（例えば、胚様体において）起こる。これは、内因性の遺伝子の活性化および／または、外因性の遺伝子の導入を含み得る。
【００８８】
同様に、細胞は、寛容原性表現型から離れる分化を支持するかまたは、寛容原性表現型の発達を抑制する、ポリペプチド（例えば、転写因子）を過小発現するかまたは発現しないように、遺伝子操作されており得る。例えば、遺伝子はノックアウトされ得るか、または、アンチセンス技術もしくはＲＮＡサイレンシング技術を用いて抑制され得る。
【００８９】
細胞は、免疫応答をダウンレギュレートする表面タンパク質（例えば、Ｆａｓ−リガンド、ＣＴＬＡ−４リガンド、または  Ｎｏｔｃｈリガンド）を発現するか過剰発現するように遺伝子操作されており得る。これは、樹状細胞の非免疫原性の性質をさらに増強し得る。
【００９０】
細胞は、Ｔ細胞の活性化を表面タンパク質および／または分泌タンパク質（例えば、ＣＤ４０，ＣＤ８０，やＣＤ８６）を、発現しないかまたは発現するように遺伝子操作されており得る。これは、樹状細胞の非免疫原性の性質をさらに増強し得る。これは、典型的には、ノックアウト技術の使用によるが、このような遺伝子の発現または活性を防止する他の様々な方法が、十分に実証されている［７３］。
【００９１】
細胞は、「自殺遺伝子」を含むように遺伝子操作されており得る。これは、移植治療に使用されるための細胞調製物中に残り得る未分化幹細胞、または移植後の細胞を破壊するフェ−ルセーフ機構としてそれらの幹細胞に由来するすべての細胞（分化または未分化）のような細胞を、選択的に殺す方法を提供する。自殺遺伝子は、細胞の機能に対して目に見える直接的な効果を持たないタンパク質産物をコードする。しかし、そのタンパク質産物は、変換されなければ無毒な物質（しばしば、プロドラッグと呼ばれる）を有毒な代謝産物に変換する能力によって、毒性を与えることが可能である。自殺遺伝子技術は、癌細胞を化学療法に対してより感受性にする手段として、そしてまた、レトロウイルス遺伝子治療の安全特性として、開発された。自殺遺伝子とプロドラッグとのいくつかの組み合わせが、当該分野で公知であり（例えば、参考文献７４）、それらとしては、ＨＳＶチミジル酸キナーゼ＋ガンシクロビルまたはアシクロビル；Ｅ．ｃｏｌｉシトシンジアミナーゼ＋５−フルオロシトシン；Ｅ．ｃｏｌｉニトロレダクターゼ＋ＣＢ１９５４などが挙げられる。好ましくは、自殺遺伝子は、未分化幹細胞、または移植に好ましくない他の細胞（例えば腫瘍または腫瘍原性細胞）において発現されているプロモーターの制御下にある。その場合、適切なプロドラッグを使用して、未分化細胞は、分化細胞には影響することなく培養から除かれ得る。適切なプロモーターとしては、Ｏｃｔ３／４［７５］，Ｏｃｔ６［７６］、Ｒｅｘ−１［７７］およびＧｅｎｅｓｉｓ［７８］などをコードする遺伝子のプロモーターが挙げられる。しかし、例えば、レシピエントにおいてその移植片が有害であると分かった場合に、患者における移植片の選択的な死滅を許容するフェ−ルセーフ機構として使用するために、組織特異的プロモーターまたは誘導性プロモーターもまた使用され得るが、自殺遺伝子は、構成的なプロモーターの制御下にある。
【００９２】
細胞は、所望の細胞型を特異的に選ぶ技術（例えば、選択的マーカーと連結した組織特異的プロモーターを含む、前もって挿入した組換え構築物に基づく）である系統選択のために、適切なマーカーを挿入するために、遺伝子操作されており得る。適切な遺伝子プロモーターとしては、発生に重要な因子（例えばＣＤ１１ｂ）および樹状細胞特徴的なタンパク質（例えば、ＣＤ８３）が挙げられるが、これらに限定されない。適切な選択マーカー遺伝子としては、薬物選択遺伝子（例えばＧ４１８耐性遺伝子、ｎｅｏ，ｈｙｇｒｏ，ｐｕｒｏ，ｚｅｏ，ｂｓｄ，ＨＰＲＴ）、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ，ＤｓＲｅｄ）のような可視マーカーおよび、自動化した細胞選別による選択を容易にする遺伝子（例えば、細胞表面抗原をコードする遺伝子）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９３】
幹細胞は、寛容が望まれる抗原をコードするように遺伝子操作されており得る。その抗原は、発現され、プロセシングされ、そして提示される。従って、本発明の寛容原性細胞は、この抗原を認識するＴ細胞をアネルギーする。
【００９４】
上での遺伝子操作は、単独で使用され得るか、または２つ以上が組み合わせて使用され得る。
【００９５】
幹細胞の遺伝子操作は、ゲノムへのランダムな組込みを介してかまたは、好ましくは、遺伝子ターゲティングによって生じ得る。代替法としてこの操作は、適当な場合、染色体外遺伝因子として維持されるベクター（例えばプラスミド）を使用し得る。ヒトＥＳ細胞を含むＥＳ細胞のトランスフェクション［５９］は周知である。
【００９６】
ランダムな組込みでは、適切なポリペプチドをコードするベクターが幹細胞に挿入され得る。典型的に、適切なポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結された遺伝子プロモーターを含む発現ベクターの使用によって、発現は、達成される。そのポリペプチドをコードするＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノム配列または両者の混合物であり得る。プロモーターは構成的発現または誘導的発現を指向し得る。プロモーターはまた、組織特異的であり得る。構成的プロモーターの例としては、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）からのプロモーター、伸長因子１α（ＥＦ１α）からのプロモーター、βーアクチンからのプロモーター、またはＳＶ４０からのプロモーターが挙げられる。誘導性遺伝子プロモーターの例としては、薬物またはリガンド（例えば、ミフェプリストン、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、エクジソン、ＦＫ１０１２，またはラパマイシン）に応答して発現構築物のプロモーター領域に、可逆的に結合するキメラトランスアクチベーターから構成される系が挙げられる。好ましくは、プロモーターはＰＧＫ遺伝子に由来する。
【００９７】
ゲノムへのランダムな組込みによる組換え構築物の付加に対する代替法は、相同組換えによるインサイチュでの、遺伝子の正確な変化である（遺伝子ターゲッティングと呼ばれる）。これは、導入するＤＮＡと染色体ＤＮＡとの間での相同組換えによる、遺伝子の正確な、所定の改変である。遺伝子ターゲティングは培養細胞（最も一般的には胚幹細胞）において選択したＤＮＡ配列を挿入するため、置換するため、再配列するため、または除くために使用され得る［例えば、参考文献７９］。その遺伝子の改変は、誘導細胞の治療価値を下げるいかなる有害な影響（例えば、発癌性の形質転換）も避けるように予め決定され得るので、ある状況では、ランダムな位置での発現ベクターの単純な導入よりも、遺伝子ターゲッティングが好まれ得る。
【００９８】
遺伝子ターゲッティングは、その遺伝子の天然のプロモーターまたは他の調節領域を改変または置換することによって、目的の遺伝子の構成的発現または誘導的発現を達成するのに使用され得る。例えば、遺伝子プロモーターは、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター（例えば、ＰＧＫ）で置き換えられ得る。または、構成的発現を導くエレメントが、内因性遺伝子プロモーターに隣接して加える。ＥＳ細胞において遺伝子ターゲッティングによるこのような改変を、達成する方法は、当該分野で周知である。
【００９９】
幹細胞以外の細胞に対して遺伝子操作を行い、それから、その遺伝子操作を幹細胞に移入（例えば、除核した幹細胞核を移入することにより）または幹細胞に生じ得る胚に移入する（例えば、除核した卵母細胞に核を移入することにより）ことも可能である。これらのアプローチの両方は、遺伝子操作された幹細胞を間接的に提供する。
【０１００】
（スクリーニングアッセイ）
本発明の細胞は、樹状細胞の成熟に関与する因子を同定するために、野生型の細胞と比較し得る。例えば、それらの２つの細胞のｍＲＮＡの集団を、核酸アレイを使用して、分析し得る。
【０１０１】
（本発明を行うための様式）
（１）１２９／Ｐ２マウスからのＥＳ細胞の誘導および維持）
ＨＭ−１マウス胚性幹細胞を１２９／Ｐ２マウス株から入手した［８０］。組織培養フラスコをＨＭ−１細胞の接着を促すために、ＰＢＳ中０．１％ゼラチンで前もって覆っておき、それらと完全培地（１０％  熱非働体胎仔血清（ＦＣＳ）、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、２ｍＭ  非必須アミノ酸および５０μＭ  ２−メルカプトエタノールを補充しＢＨＫ−２１培地）で維持した。その細胞を未分化状態で保つために、白血病抑制因子（ＬＩＦ）を培地に加えた。細胞を、５％ＣＯ２を含む３７℃の培養器で維持した。
【０１０２】
（２）ＨＭ−１からの寛容原性細胞の生成）
未分化ＨＭ−１細胞のＴ２５フラスコがコンフルエントであった時、軽くトリプシン処理した。その結果、すべて単独の細胞とは反対に細胞の塊が現れた。チューブの底に細胞の塊を集めるために、９００ｒｐｍで２分間洗って、上清を注意深く除き、塊を、ＬＩＦを含まない５ｍｌの完全培地にやさしく再懸濁した。１．５〜２×１０５細胞／細胞塊を１０ｍｌ完全培地中で９０ｍｍバアクテリアプラスチックディッシュ上にプレートした。これら条件下で、ＨＭ−１細胞は、バクテリアプラスチックに接着できなかったが、上清に残り、そこでその細胞は、増殖し続けて胚様体を形成した。ＥＢは、培養して４日目までには巨視的な球体になり、１０〜１２日目までには嚢胞性の外見をとった。細胞を、５％ＣＯ２を含む３７℃の培養器で維持した。４日目で、ＥＢを常用のチューブに移し、６０〜８０μｌを、６ウェル組織培養プレートのそれぞれのウェルに加えた。２５ｎｇ／ｍｌ組換えマウスＧＭ−ＣＳＦおよび１０００Ｕ／ｍｌの組換えマウスＩＬ−３を補充した完全培地を、２ｍｌ／ウェルに加えた。細胞を、５％ＣＯ２を含む３７℃の培養器で維持した。
【０１０３】
培養２４時間以内に、ＥＢはプラスチックに接着し、半径方向外側に向かって移動する分化細胞の成長（主に間質細胞）が現れた。寛容原性細胞のクラスターが、４〜５日目までに現れ、８〜１０日目までにそのクラスターは、寛容原性細胞を収集するために充分大きくなった（図１）。その寛容原性細胞のうちのいくらかはプラスチックに強く接着したが、寛容原性細胞のそのほとんどが、下に横たわるＥＢ由来の間質細胞の層に軽く接着していた。それらを、優しいピペッティングにより収集し得、いらない破片を除去するために７０μｍの細胞濾過器に通し、寛容原性細胞の産生を支持する間質層は、無傷のままなので、寛容原性細胞の収集を、４〜５週間、繰り返し続け得る。
【０１０４】
（３）ＩＬ３を用いないＨＭ−１からの寛容原性細胞の産生）
ＥＢを上記のように産生し、６ウェルプレートに播種したが、ＩＬ３は培地に加えなかった。ＧＭ−ＣＳＦ（ＩＬ３は無い）を含む培地における寛容原性細胞の産生は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ３を含む培地と、基本的に同じ割合で起きた。ＧＭ−ＣＳＦ集団の表現型とＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ３集団の表現型との間において検出可能な差は存在しなかった。
【０１０５】
（４）さらなるサイトカイン）
上記したように、寛容原性樹状細胞は、ＥＳ細胞をＧＭ−ＣＳＦ存在下で（必要に応じて、ＩＬ３と組み合わせて）培養することにより入手され得た。他の組換えサイトカイン（ＴＮＦ−αおよびＦｌｔ３−Ｌ）を、単独でかまたは組み合わせて試験した。その結果は以下の通りである：
【０１０６】
【表１】
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（５）ＥＳ細胞由来の寛容原性細胞の特徴付け）
（５．１）表現型）
寛容原性細胞を上記のように、ＥＳ細胞から誘導し、表面マーカーの発現を一群のモノクローナル抗体を使用してフローサイトメトリーにより分析した（図２）。ＣＤ８α、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１），ＭＨＣクラスＩおよびＦ４／８０が寛容原性細胞の表面において高レベルで発現していた。ＣＤ１ｄ、Ｃｄ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ４０、クラスＩＩ  ＭＨＣ、ＣＤ９５（Ｆａｓ−リガンド）、ＣＤ８０（Ｂ７−１）およびＣＤ８６（Ｂ７−２）の低い発現または不十分な発現が寛容原性細胞上で観察された。ＣＤ１１ｃは、成熟樹状細胞特異的マーカーとして考えられているが、この分子の充分な発現は、どの条件下でも見られなかった。Ｆ４／８０の高発現は、本発明の細胞がマクロファージと似ていることを示唆するが、その形態および接着特性は、本発明の細胞がマクロファージでないことを示す。Ｂ７−１，Ｂ７−２、ＣＤ４０およびＭＨＣクラスＩＩの低い／不十分なレベルの発現は、その細胞が、未成熟樹状細胞であることを示唆する。
【０１０７】
従って、本明細書中で使用される同定方法によって、本発明の細胞は、未成熟樹状細胞として分類される。
【０１０８】
（５．２）活性）
寛容原性細胞をさらに特徴づけるため、それらのファゴサイトーシスおよびエンドサイトーシスの能力を試験した。その細胞は、上記のように、ＥＢから調製した。その細胞を、完全ＲＰＭＩ（すなわち、１０％熱−非働体化ＦＣＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭＬ−グルタミン、２ｍＭ  非必須アミノ酸および５０μＭ  ２−メルカプトエタノールを補充したＲＰＭＩ）で洗った。細胞を、ＦＩＴＣ標識ラテックスビーズ（ファゴサイト−シスを測定するために）もしくはＦＩＴＣ−デキストラン（ピノサイト−シスを測定するために）のいずれかを含むか、またはこれらを含まないに完全ＲＰＭＩに再懸濁し、４℃で２時間または３７℃で３０分間維持した。それから、細胞と洗浄し、ＰＥ標識した抗ＭＨＣ−ＩＩモノクローナル抗体で染色され、ＦＡＣＳにより分析した。３７℃では細胞は、ＦＩＴＣ−標識ラテックスビーズをファゴサイト−シスしたが、４℃でこれは起こらず、ＭＨＣクラスＩＩをアップレギュレートした。しかし、３７℃でこの細胞はＦＩＴＣ−デキストランをエンドサイト−シスしたが、４℃ではこれは起こらなかった一方で、ＦＩＴＣ−デキストランを用いる４℃での細胞または、ＦＩＴＣ標識ラテックスビーズ、ＦＩＴＣ−デキストランもいずれも用いない３７℃での細胞と比べて、ＭＨＣクラスＩＩをアップレギュレートしなかった。古典的な樹状細胞は、３７℃でＦＩＴＣ−デキストランをエンドサイト−シスすれば、ＭＨＣクラスＩＩをアップレギュレートする。このことは、本発明の樹状細胞が、成熟し得ないことをさらに示している。
【０１０９】
（５．３）成熟の欠如）
本発明の樹状細胞が成熟し得ないことのさらなる証拠は、高い濃度でのＬＰＳ（１〜１００μｇ／ｍｌ）、ＴＮＦα（２５〜２００ｎｇ／ｍｌ）、ＰＨＡ（１〜１００μｇ／ｍｌ）、またはＣｏｎＡ（１〜１００μｇ／ｍｌ）の存在下においてさえも成熟が誘導され得ないという事実である。この細胞は、上記のようにＥＢから調製し、上記の成熟誘発因子を含むかまたは含まない完全ＲＰＭＩで、２４時間または４８時間、培養した。これらの条件下で、これら細胞は、ＭＨＣ−ＩＩも副刺激分子Ｂ７−１およびＢ７−２もアップレギュレートしなかった（図３）。このように、本発明の細胞は、炎症性媒介物質の存在下において未成熟状態に留まる。また、マウスＴ細胞精製カクテルを使用したＳｔｅｍＳｅｐＴＭカラムにより精製された同種異系Ｔ細胞（Ｈ−２ｋであるＣＢＡ／Ｃａマウス由来）存在下での５日後、本発明の細胞は、未成熟状態で留まる。この挙動は、これら細胞が、インビボでの寛容戦略に使用され得る安定な寛容原性細胞であることを示す。
【０１１０】
（５．４）寛容の誘導）
本発明の細胞は、同種異系Ｔ細胞が、寛容原性細胞と、同じハプロタイプ（Ｈ−２ｂ）の他の細胞に対して寛容になることを誘導するためにインビトロで、使用され得る。樹状細胞は、上記ＥＢから調製され、完全ＲＰＭＩにおいて組織培養フラスコ中で２４時間、培養された。この間、樹状細胞は、プラスチックに接着する。同種異系Ｔ細胞（例えば、Ｈ−２κであるＣＢＡ／Ｃａマウス由来）を、マウスＴ細胞精製カクテルを使用したＳｔｅｍＳｅｐＴＭカラムにより精製し、その後、樹状細胞のフラスコに７日間加えた。同種異系Ｔ細胞を樹状細胞から洗浄し、一晩置き、それから樹状細胞と同じハプロタイプ（Ｈ−２ｂ）の１２９／ｓｆｖマウス由来の脾細胞または膵臓ランゲルハンス島と一緒に、インビトロに置いた。６日目、プレートを３Ｈ−チミジンでパルスし、７日目に増殖レベルを評価するために収集した。
【０１１１】
本発明の樹状細胞に前もって７日間曝されたＣＢＡ／ＣａＴ細胞は、樹状細胞と同じハプロタイプを持つどんな細胞にも前もって曝されていない細胞か、または樹状細胞と同じハプロタイプの脾細胞に曝されたＣＢＡ／ＣａＴ細胞と比べて、ほとんど増殖しなかった（図４）。Ｈ−２ｋレシピエン中のＴ細胞は、通常、Ｈ−２ｂ移植片を攻撃するが、Ｈ−２ｂ樹状細胞はこれを阻害し得た。従って、本発明の細胞は、寛容原性であり、そして抗原特異的寛容を誘導し得る。
【０１１２】
初代培養で寛容原性細胞に曝されたＣＢＡ／ＣａＴ細胞が、抗原特異性に関わらずに、ただ単に非応答性になったのでないという証拠は、寛容原性細胞に曝された細胞は、マイトジェン（ＣｏｎＡ）に対する反応において、寛容原性細胞に一度も曝されていない未処置のＣＢＡ／ＣａＴ細胞と同様に、なお少なくとも増殖し得るということである。
【０１１３】
（５．５）インビボでの免疫原性）
本発明の細胞は、２０〜３５日目で培養から収集され、ＥＳ由来の細胞（Ｈ−２ｂ）と違うハプロタイプ（Ｈ−２ｋ）を持つレシピエントマウスに静脈内注射された。このハプロタイプの違いが、レシピエントマウスにおける免疫応答を引き起こすことが予期された。
【０１１４】
コントロールとして、同じようなＨ−２ｋマウスに、Ｈ−２ｂマウス由来の脾臓細胞を注入した。再び、ハプロタイプの違いが、免疫応答を引き起こすことが期待された。さらなるコントロールとして、別のマウスのグループは、注入細胞を受けなかった。
【０１１５】
時間０（細胞の注入）後、様々な時間間隔で、マウスから脾臓を取り除き、脾細胞を単離した。これら細胞は、マウスの全ての主な免疫細胞の代表を含んでいる。これら細胞が、どのようなタイプの反応を注入細胞が引き起こした（想起応答）かを見るために、Ｈ−２ｂマウスからの脾臓細胞と一緒に培養された。結果は以下の通りである：
【０１１６】
【表２】
2005521403.tif 000004
このように、脾臓細胞注入をうけたマウスの想起応答は、主にインターフェロンγ（ＩＮＦγ）の産生であった。これは、外来細胞に対する厳格なＴ細胞反応と一貫する。これは、組織拒絶において予期される応答タイプであった。しかし、本発明の細胞をうけたマウスの想起応答は、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）の産生であった。それは、調節Ｔ細胞の存在を示めす。これらは、免疫寛容が誘導された場合に予期され得る。さらに、ＩＬ−１０は、脾臓細胞がインビトロでＨ−２ｋ細胞と一緒に培養された時にだけで見られた。これは、抗原特異性を示めす。
【０１１７】
全体として、これらの結果は、脾臓細胞の注射ではなく、本発明の細胞の静脈注射は、免疫寛容誘発を示す調節Ｔ細胞集団を誘発することを示唆する。
（６）ＣＢＡ  ＥＳ細胞からの寛容原性細胞の産生）
ＣＢＡマウス胚性幹細胞は、ＣＢＡマウス株から入手し［８１］、ＨＭ−１細胞について上記したように、維持した。ＣＢＡ  ＥＳ細胞から寛容原性細胞を誘導するための方法は、ＨＭ−１細胞に使用した方法と同様であった。未分化ＨＭ−１細胞のＴ２５フラスコがコンフルエントであった時、細胞を軽くトリプシン処理した。その結果、すべて単独の細胞とは反対に細胞の塊が現れた。それをチューブの底に細胞の塊を集めるために、９０００ｒｐｍで２分間洗浄し、上清を注意深く除き、そして塊を、ＬＩＦを含まない５ｍｌの完全培地にやさしく懸濁した。１．５〜２×１０５細胞／細胞塊を１０ｍｌ完全培地における９０ｍｍバアクテリアプラスチックディッシュ上にプレートした。これらの条件下で、ＣＢＡ  ＥＳ細胞はバクテリアプラスチックに接着できなかったが、上清に残り、そこで細胞は、増殖し続けてＥＢを形成した。これらの球体は、培養して４〜７日目までには巨視的になり、１０〜１４日目までには嚢胞性の外見をとった。細胞を、５％ＣＯ２を含む３７℃の培養器で維持した。
【０１１８】
４〜７日目で、ＥＢを常用のチューブに移し、６０〜８０μｌを６ウェル組織培養プレートのそれぞれのウェルに加えた。２ｍｌ／ウェルの２５ｎｇ／ｍｌ組換えマウスＧＭ−ＣＳＦを補充し、１０００Ｕ／ｍｌの組換えマウスＩＬ−３を補充しているかまたは補充していない完全培地を、加えた。細胞を、５％ＣＯ２を含む３７℃の培養器で維持した。
【０１１９】
培養２４時間以内に、ＥＢはプラスチックに接着し、半径方向に外側に向かって移動する分化細胞の成長（主に間質細胞）が現れた。寛容原性細胞のクラスターが、１０〜１４日目までに現れ始め、２１日目までにクラスターは、寛容原性細胞を収集するのに充分大きくなった。寛容原性細胞のうちのいくらかはプラスチックに強く接着したが、ほとんどの寛容原性細胞は、下に横たわる細胞の層に軽く接着していた。それらを優しいピペッティングにより収集し得、いらない破片を除去するために７０μｍの細胞濾過器に通し得た。寛容原性細胞の産生を支持する間質層は、無傷のままなので、寛容原性細胞の収集を４〜５週間、繰り返し続けられ得た。
【０１２０】
（７）ＣＢＡ  ＥＳ細胞由来の寛容原性細胞の特徴付け／表現型）
ＣＢＡ  ＥＳ細胞由来の寛容原性細胞は、表面マーカーの発現について、一群のモノクローナル抗体を使用したフローサイトメトリーにより分析して、それらの表現型を決定した。ＣＤ１１ｂ、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）およびＦ４／８０は、寛容原性細胞の表面において発現していた。ＣＤ１１ｃおよびＭＨＣ−ＩＩの低いまたは不十分な発現が、寛容原性細胞上で観察された。
【０１２１】
本発明は、例としてのみ上記されており、本発明の範囲および趣旨内にありつつ、改変がなされることが、理解され得る。
【０１２２】
（参考文献：その内容は、完全に本明細書中に援用される）
【０１２３】
【表３】
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【０１２４】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】図１は、本発明のＥＳ細胞由来寛容原性細胞の位相差像を示す。これら細胞はＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ３を含む６ウェルのプレート中にＥＢを置いて１０日後の、寛容原性細胞のクラスターである。
【図２】図２は、様々な細胞マーカーの表面発現についてのモノクローナル抗体染色を使用した、本発明の寛容原性細胞の表現型のＦＡＣＳ分析を示す。
【図３】図３は、本発明の寛容原性細胞が成熟し得ないことを示す。ＬＰＳまたはＴＮＦαと一緒に寛容原性細胞をインキュベートした後の、ＦＡＣＳ分析により測定したＭＨＣ−ＩＩおよびＢ７−２（ＣＤ８６）の発現レベルを示す。
【図４】図４は、本発明の寛容原性細胞が同種異系Ｔ細胞を寛容する能力を２段階アッセイにより、示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年11月30日(2004.11.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
未成熟でありかつ成熟し得ない、樹状細胞。
【請求項２】
Ｔ細胞に抗原を提示可能である樹状細胞であって、該樹状細胞は、ＣＤ４０−ＣＤ８０−かつＣＤ８６−であり、そして該樹状細胞は、炎症媒介物質により刺激された際にＣＤ４０−ＣＤ８０−かつＣＤ８６−のままである、細胞。
【請求項３】
休止状態または炎症媒介物質により刺激された時のいずれかにて、Ｔ細胞にシグナル１を送達し得るが、シグナル２を該Ｔ細胞に提供し得ない、樹状細胞。
【請求項４】
インビトロでＥＳ細胞から分化した、寛容原性樹状細胞。
【請求項５】
請求項１〜４のうちのいずれか１項に記載の細胞であって、該細胞は不死である、細胞。
【請求項６】
請求項１〜５のうちのいずれか１項に記載の細胞であって、該細胞は正常な核型を有する、細胞。
【請求項７】
請求項１〜６のうちのいずれか１項に記載の細胞であって、該細胞はヒトの細胞である、細胞。
【請求項８】
請求項９〜１５のうちのいずれか１項に記載の方法により得られる、細胞。
【請求項９】
幹細胞から寛容原性抗原提示細胞を調製するためのプロセスであって、
該幹細胞から該寛容原性細胞への分化を引き起こす１種以上のサイトカイン存在下で該幹細胞を培養する工程
を包含する、プロセス。
【請求項１０】
請求項９に記載のプロセスであって、前記幹細胞は胚性幹細胞である、プロセス。
【請求項１１】
請求項９または請求項１０に記載のプロセスであって、前記幹細胞はヒト幹細胞である、プロセス。
【請求項１２】
請求項９〜１１のうちのいずれか１項に記載のプロセスであって、前記幹細胞が、前記寛容原性細胞に分化する前に胚様体へと発生する、プロセス。
【請求項１３】
請求項９〜１２のうちのいずれか１項に記載のプロセスであって、前記寛容原性細胞への分化が接着培養で起こる、プロセス。
【請求項１４】
請求項９〜１３のうちのいずれか１項に記載のプロセスであって、フィーダー層が使用されない、プロセス。
【請求項１５】
請求項９〜１４のうちのいずれか１項に記載のプロセスであって、前記サイトカインがＧＭ−ＣＳＦである、プロセス。
【請求項１６】
医薬としての使用のための、請求項１〜８のうちのいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１７】
自己免疫反応を抑制するための医薬の製造における、請求項１〜８のうちのいずれか１項に記載の細胞の使用。
【請求項１８】
レシピエントにおける移植片拒絶を抑制するための医薬の製造における、請求項１〜８のうちのいずれか１項に記載の細胞の使用。
【請求項１９】
レシピエントにおける移植片拒絶を抑制するための組成物であって、請求項１〜８のうちのいずれか１項に記載の細胞を含む、組成物。
【請求項２０】
移植片をレシピエントに移植するためのキットであって、請求項１〜８のうちのいずれか１項に記載の細胞および移植片を含む、キット。
【請求項２１】
請求項１８に記載の使用であって、前記移植片が、心臓、肺、腎臓、肝臓、膵臓、ランゲルハンス島、膵臓性β細胞または他のインスリン産生細胞、角膜、骨髄、または神経組織である、使用。
【請求項２２】
請求項１８に記載の使用であって、前記樹状細胞が、前記移植片と組織適合性である、使用。
【請求項２３】
患者における自己免疫反応を抑制するための組成物であって、請求項１〜８のうちのいずれか１項に記載の細胞を含む、組成物。
【請求項２４】
（ａ）請求項１〜８のうちのいずれか１項に記載の細胞と、（ｂ）レシピエントに移植するための組織移植片とを含む、キットであって、（ａ）と（ｂ）とは組織適合性である、キット。
【請求項２５】
請求項１〜８のうちのいずれか１項に記載の細胞と、薬学的キャリアとを含む、組成物。
【請求項２６】
請求項９〜１５のうちのいずれか１項に記載のプロセスにおいて使用するための幹細胞であって、該幹細胞は遺伝子操作されている、細胞。
【請求項２７】
請求項２６に記載の幹細胞であって、該幹細胞の樹状細胞への分化を促進するポリペプチドをコードするように、該幹細胞は遺伝子操作されている、細胞。
【請求項２８】
請求項２６に記載の幹細胞であって、該幹細胞は、免疫応答を下方制御する１種以上の表面タンパク質を発現または過剰発現するように遺伝子操作されている、細胞。
【請求項２９】
請求項２６に記載の幹細胞であって、該幹細胞はＴ細胞の活性化を促進する表面タンパク質および／または分泌タンパク質を発現しないかまたは過少発現するように遺伝子操作されている、細胞。
【請求項３０】
請求項２６に記載の幹細胞であって、該幹細胞は自殺遺伝子を含むように遺伝子操作されている、細胞。
【請求項３１】
請求項２６に記載の幹細胞であって、該幹細胞は系統選択に適したマーカーを含むように遺伝子操作されている、細胞。
【請求項３２】
請求項１９に記載の組成物であって、前記移植片が、心臓、肺、腎臓、肝臓、膵臓、ランゲルハンス島、膵臓性β細胞または他のインスリン産生細胞、角膜、骨髄、または神経組織である、組成物。
【請求項３３】
請求項１９に記載の組成物であって、前記樹状細胞が、前記移植片と組織適合性である、組成物。
【請求項３４】
請求項２０に記載のキットであって、前記移植片が、心臓、肺、腎臓、肝臓、膵臓、ランゲルハンス島、膵臓性β細胞または他のインスリン産生細胞、角膜、骨髄、または神経組織である、キット。
【請求項３５】
請求項２０に記載のキットであって、前記樹状細胞が、前記移植片と組織適合性である、キット。
【国際調査報告】
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