(57)【要約】本出願は、FADDタンパク質およびリン酸化p38-MAPKからなる群より選択される少なくとも1つのタンパク質を、インビボ腫瘍の非存在に関するマーカーとして使用することに関する。この使用はさらに、FasLタンパク質をインビボ腫瘍の存在に関するマーカーとして用いることによって補完しうる。FADDタンパク質およびリン酸化p38-MAPKのそれぞれの量は腫瘍発達に伴って実際に減少し、時にはゼロになるが、一方、FasL発現は増大する。FADDタンパク質は腫瘍細胞からその細胞外環境へと分泌される。FADDタンパク質の細胞量が少なく、細胞外量が多いことは、化学療法に対する抵抗性の予測指標である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞性FADDタンパク質、細胞性リン酸化p38-MAPKおよび細胞外FADDタンパク質からなる群より選択される少なくとも1つのタンパク質の、腫瘍状態の生物学的指標としてのインビトロ使用。
【請求項２】
少なくとも1つのタンパク質を腫瘍の存在／非存在の状態の指標として用いることを特徴とする、請求項1記載のインビトロ使用。
【請求項３】
少なくとも1つのタンパク質を腫瘍の発達／縮退の状態の指標として用いることを特徴とする、請求項1記載のインビトロ使用。
【請求項４】
細胞性FADDおよび／または細胞性リン酸化p38-MAPKの量を、腫瘍の存在もしくは非存在または腫瘍の発達もしくは縮退の細胞指標として用いることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項記載のインビトロ使用。
【請求項５】
細胞外FADDタンパク質の量を、腫瘍の存在もしくは非存在または腫瘍の発達もしくは縮退の細胞外指標として用いることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項記載のインビトロ使用。
【請求項６】
腫瘍が甲状腺腺腫または甲状腺腺癌などの腺腫または腺癌であることを特徴とする、請求項2〜5のいずれか一項記載のインビトロ使用。
【請求項７】
細胞性または細胞外FADDタンパク質を、腫瘍の化学療法抵抗性または腫瘍の腫瘍感受性の予測的な生物学的指標として用いることを特徴とする、請求項1記載のインビトロ使用。
【請求項８】
FADDタンパク質を、抗骨髄性腫瘍化学療法に対する腫瘍抵抗性または腫瘍感受性の予測的指標として用いることを特徴とする、請求項7記載のインビトロ使用。
【請求項９】
腫瘍を代表する細胞内に存在する細胞性FADDタンパク質の量を、化学療法抵抗性または化学療法感受性の予測的指標として用いることを特徴とする、請求項7または8記載のインビトロ使用。
【請求項１０】
腫瘍を代表する細胞の細胞外環境に存在する細胞外FADDタンパク質の量を、化学療法抵抗性または化学療法感受性の予測的指標として用いることを特徴とする、請求項7または8記載のインビトロ使用。
【請求項１１】
抗腫瘍化学療法が、αインターフェロン療法などのインターフェロン療法、標準的導入補助療法、ドキソルビシンなどのアントラサイクリン療法、標準的または高用量のシタラビン療法およびベペシド療法、単独または併用で用いられる細胞分裂抑制剤からなる群より選択されることを特徴とする、請求項7〜10のいずれか一項記載のインビトロ使用。
【請求項１２】
腫瘍がCMLまたはAMLなどの骨髄性腫瘍であることを特徴とする、請求項7〜11のいずれか一項記載のインビトロ使用。
【請求項１３】
腫瘍の非存在／存在の状態を判定するためのインビトロ法であって、
該腫瘍と疑われるものの細胞が、健常であるがそれ以外の点では同等な細胞に比して異常に少ない量に相当するFADDタンパク質の量を含むか否か、および／または、該腫瘍と疑われるものの細胞が、健常であるがそれ以外の点では同等な細胞に比して異常に多い放出量に相当するFADDタンパク質の量を細胞外に放出したか否かを評価する段階を含むことを特徴とし、
異常に少ない細胞量に相当する細胞性FADD量および／または異常に多い放出量に相当するFADDタンパク質の細胞外放出が腫瘍の存在を示し、
異常に少ない細胞量に相当しない細胞性FADD量および／または異常に多い放出量に相当しないFADDタンパク質の細胞外放出が腫瘍の非存在を示す、インビトロ法。
【請求項１４】
腫瘍の非存在／存在の状態を判定するためのインビトロ法であって、
該腫瘍と疑われるものの細胞が、健常であるがそれ以外の点では同等な細胞に比して異常に少ない量に相当するリン酸化p38-MAPKの量を含むか否かを評価する段階を含むことを特徴とし、
異常に少ない細胞量に相当する細胞性リン酸化p38-MAPKの量が腫瘍の存在を示し、
異常に少ない細胞量に相当しない細胞性リン酸化p38-MAPKの量が腫瘍の非存在を示す、インビトロ法。
【請求項１５】
腫瘍が、BがAよりも後である、時点Aと時点Bとの間にさらに発達したか否かを判定するためのインビトロ法であって、
該腫瘍の細胞が時点Aに比して時点Bの方が有意に少ないFADDタンパク質の量を含むか否か、および／または該腫瘍の細胞の細胞外環境が時点Aに比して時点Bの方が有意に多いFADDタンパク質の量を含むか否かを評価する段階を含むことを特徴とし、
有意に少ない細胞性FADD量および／または有意に多い細胞外FADD量が、該腫瘍が時点Aと時点Bとの間にさらに発達したことを示し、
有意に少なくはない細胞性FADD量および／または有意に多くはない細胞外FADD量が、該腫瘍が時点Aと時点Bとの間にさらに発達してはいないことを示す、インビトロ法。
【請求項１６】
腫瘍が、BがAよりも後である、時点Aと時点Bとの間にさらに発達したか否かを判定するためのインビトロ法であって、
該腫瘍の細胞が時点Aに比して時点Bの方が有意に少ないリン酸化p38-MAPKの量を含むか否かを評価する段階を含むことを特徴とし、
細胞性リン酸化p38-MAPKの有意に少ない量が、該腫瘍が時点Aと時点Bとの間にさらに発達したことを示し、
時点Aに比して時点Bで有意に少なくはない細胞性リン酸化p38-MAPKの量が、該腫瘍が時点Aと時点Bとの間にさらに発達してはいないことを示す、インビトロ法。
【請求項１７】
腫瘍が甲状腺腺腫または腺癌などの腺腫または腺癌であることを特徴とする、請求項13〜16のいずれか一項記載のインビトロ法。
【請求項１８】
腫瘍の非存在／存在および／または腫瘍発達の非存在／存在の状態を判定するためのキットであって、
‐FADDタンパク質と特異的に結合しうる少なくとも1つの化合物、および／またはこのような化合物を生成しうる少なくとも1つの生物学的単位、この少なくとも1つの化合物または生物学的単位は選択的に生理的緩衝液中に含まれ、および／または選択的に固体支持体と結合している、ならびに
‐FADDタンパク質を、それが細胞に存在すること／存在しないことが腫瘍の非存在／存在および／もしくは腫瘍発達の非存在／存在の状態を示す、ならびに／またはその細胞発現レベルがそのような状態と相関する、細胞指標として用いるための適切な指示書、
を含むことを特徴とするキット。
【請求項１９】
腫瘍の非存在／存在および／または腫瘍発達の非存在／存在の状態を判定するためのキットであって、
‐リン酸化p38-MAPKと特異的に結合しうる少なくとも1つの化合物、および／またはこのような化合物を生成しうる少なくとも1つの生物学的単位、この少なくとも1つの化合物または生物学的単位は選択的に生理的緩衝液中に含まれ、および／または選択的に固体支持体と結合している、ならびに
‐リン酸化p38-MAPKを、それが細胞に存在すること／存在しないことが腫瘍の非存在／存在および／もしくは腫瘍発達の非存在／存在の状態を示す、ならびに／またはその細胞発現レベルがそのような状態と相関する、細胞指標として用いるための適切な指示書、
を含むことを特徴とするキット。
【請求項２０】
腫瘍の非存在／存在および／または腫瘍発達の非存在／存在の状態を判定するためのキットであって、
‐FADDタンパク質と特異的に結合しうる少なくとも1つの化合物、および／またはこのような化合物を生成しうる少なくとも1つの生物学的単位、この少なくとも1つの化合物または生物学的単位は選択的に生理的緩衝液中に含まれ、および／または選択的に固体支持体と結合している、ならびに
‐FADDタンパク質を、それが細胞外に存在しないこと／存在することが腫瘍の非存在／存在および／もしくは腫瘍発達の非存在／存在の状態を示す、ならびに／またはその細胞外存在レベルがそのような状態と相関する、細胞外指標として用いるための適切な指示書、
を含むことを特徴とするキット。
【請求項２１】
抗腫瘍化学療法に対する腫瘍の抵抗性の予測のためのインビトロ法であって、該化学療法を実行する必要がなく、以下の段階、
‐該抗腫瘍化学療法の対象である細胞を代表する細胞内に存在する細胞性FADDタンパク質の量を測定する段階、
この際、該測定された細胞性FADD量が、THP1細胞株（ATCC TIB202）またはU937細胞株（ATCC CRL1593）などの、FADDを発現する不死化骨髄細胞株またはリンパ細胞株の細胞内に存在する細胞性FADDタンパク質の量を有意に下回る場合、好ましくは2分の1である場合には、該腫瘍は該化学療法に対して抵抗性であると判定される、
ならびに／または以下の段階、
‐該抗骨髄性腫瘍化学療法の対象である細胞の細胞外環境に存在するFADDタンパク質の量を測定する段階、
この際、該測定された細胞外FADD量が、健常であるがそれ以外の点では同等な細胞の細胞外環境で観察される細胞外FADDタンパク質の標準的正常量の少なくとも2倍である場合には、該腫瘍は該化学療法に対して抵抗性であると判定される、
ただし前提条件として、健常であるがそれ以外の点では同等な細胞で観察される細胞性FADDタンパク質の標準的正常量はゼロと有意に異なる、
を含むことを特徴とするインビトロ法。
【請求項２２】
腫瘍がCMLまたはAMLなどの骨髄性腫瘍であることを特徴とする、請求項21記載のインビトロ法。
【請求項２３】
抗腫瘍化学療法に対する抵抗性または感受性の状態の予測のためのキットであって、
‐FADDタンパク質と特異的に結合しうる少なくとも1つの化合物、および／またはこのような化合物を生成しうる少なくとも1つの生物学的単位、この少なくとも1つの化合物または生物学的単位は選択的に生理的緩衝液中に含まれ、および／または選択的に固体支持体と結合している、ならびに
‐FADDタンパク質を、それが細胞に存在しないことが該抗骨髄性腫瘍化学療法に対する抵抗性を示す、および／またはその細胞発現レベルがそのような抵抗性と負の相関にある、および／またはそれが細胞に存在することが該抗骨髄性腫瘍化学療法に対する感受性を示す、および／またはその細胞発現レベルがそのような感受性と正の相関にある、細胞指標として用いるための適切な指示書、
を含むことを特徴とするキット。
【請求項２４】
抗腫瘍化学療法に対する抵抗性の状態の予測のためのキットであって、
‐FADDタンパク質と特異的に結合しうる少なくとも1つの化合物、および／またはこのような化合物を生成しうる少なくとも1つの生物学的単位、この少なくとも1つの化合物または生物学的単位は選択的に生理的緩衝液中に含まれ、および／または選択的に固体支持体と結合している、ならびに
‐FADDタンパク質を、それが細胞外に存在することが該抗骨髄性腫瘍化学療法に対する抵抗性を示す、および／またはその細胞外存在レベルがそのような抵抗性と正の相関にある、細胞外指標として用いるための適切な指示書、
を含むことを特徴とするキット。
【請求項２５】
抗腫瘍活性化合物を同定するための方法であって、該抗腫瘍活性化合物を、FADDタンパク質が腫瘍細胞から、または少なくともインビトロ培養前は組織学的に非腫瘍性であって腫瘍誘導物質を添加せずに標準的正常接着-集密化条件下で増殖しているもしくは増殖したインビトロ培養甲状腺濾胞細胞から、放出されるのを防ぐ化合物に関するスクリーニングによって選択することを特徴とする方法。
【請求項２６】
化合物が生物における抗腫瘍活性を有しうるか否かを判定するためのインビトロ法であって、以下の段階、
‐組織学的に非腫瘍性である甲状腺濾胞細胞（TFC）を、インビトロ増殖のために、該TFCの正常な接着および集密化を可能にする基質組成、温度および時間の条件下におく段階、
‐該化合物を該インビトロ培養TFCとの接触下におく段階、
‐細胞性FADDタンパク質の量および細胞性リン酸化p38-MAPKの量からなる群より選択される少なくとも1つの細胞量を、該化合物との該接触後に該TFCにおいて測定する段階、
この際、測定された細胞量が、該化合物と接触させなかった同等のインビトロ増殖TFCで観察される（それぞれの）対照細胞量を有意に上回る場合、または健常エクスビボTFCで測定される標準的（それぞれの）正常細胞量と有意な差がない場合には、該化合物は該生物において抗腫瘍活性を有しうると判定される、
ならびに／または以下の段階、
‐組織学的に非腫瘍性である甲状腺濾胞細胞（TFC）を、インビトロ増殖のために、該TFCの正常な接着および集密化を可能にする基質組成、温度および時間の条件下におく段階、
‐該化合物を該インビトロ培養TFCとの接触下におく段階、
‐細胞外FADDタンパク質の量を、該化合物との該接触後に該TFCの細胞外環境で測定する段階、
この際、測定された細胞外FADD量が、該化合物と接触させなかった同等のインビトロ増殖TFCの細胞外環境で観察される対照細胞外FADD量を有意に下回る場合、または健常エクスビボTFCの細胞外環境で測定される標準的正常細胞外FADD量と有意な差がない場合には、該化合物は該生物において抗腫瘍活性を有しうると判定される、
を含むことを特徴とする、インビトロ法。
【請求項２７】
組織学的に非腫瘍性であるTFCに対して、インビトロ増殖のためにおく前に、コラゲナーゼH処理を行うことを特徴とする、請求項26記載のインビトロ法。
【請求項２８】
抗腫瘍活性が抗腺腫活性または抗腺癌活性であることを特徴とする、請求項26または27記載のインビトロ法。
【請求項２９】
腫瘍誘導物質の非存在下で、化合物が生物における抗腫瘍活性を有しうるか否かを判定するためのキットであって、
‐少なくとも1つの組織学的に非腫瘍性である甲状腺濾胞細胞（TFC）、
‐少なくとも1つの抗FADDおよび／または抗ホスホ-p38-MAPK化合物、ならびに
‐この／これらのTFCを腫瘍誘導物質を添加せずにインビトロで増殖させた場合に、該化合物がFADDタンパク質の該TFCからの放出を防ぐか否かを評価するための適切な指示書、
を含むことを特徴とするキット。
【請求項３０】
化合物が生物における腫瘍誘発活性を有する確率が高いか低いかを評価するためのインビトロ法であって、以下の段階、
‐該化合物を該生物の細胞またはその代表的な生物モデルの細胞との接触下におく段階、
‐細胞性FADDタンパク質の量および細胞性リン酸化p38-MAPKの量からなる群より選択される少なくとも1つの細胞量を該接触させた細胞において測定する段階、
この際、該測定された細胞量が、非腫瘍性かつ非接触性であるがそれ以外の点では同等な細胞で観察される標準的（それぞれの）正常細胞量を有意に下回る場合には、該化合物は該生物において腫瘍誘発活性を有する可能性が高いと判定され、
該測定された細胞量が該標準的（それぞれの）正常細胞量を有意に下回らない場合には、該化合物は該生物において腫瘍誘発活性を有する確率が低いと判定される、
ならびに／または以下の段階、
‐該化合物を該生物の該細胞またはその代表的な生物モデルの細胞との接触下におく段階、
‐該生物またはその代表的な生物モデルの細胞の細胞外環境に存在する細胞外FADDタンパク質の量を該接触させた細胞において測定する段階、
この際、該測定された細胞外量が、非腫瘍性かつ非接触性であるがそれ以外の点では同等な細胞の細胞外環境で観察される細胞外FADDタンパク質の標準的正常量を有意に上回る場合には、該化合物は該生物において腫瘍誘発活性を有する可能性が高いと判定され、
該測定された細胞外量がFADDタンパク質の標準的正常細胞外量を有意に上回らない場合には、該化合物は該生物において腫瘍誘発活性を有する確率が低いと判定される、
ただし前提条件として、非腫瘍性かつ健常であるがそれ以外の点では同等な細胞で観察されるFADDタンパク質および／またはリン酸化p38-MAPKの標準的正常細胞量はそれぞれ、ゼロと有意に異なる、
を含むことを特徴とするインビトロ法。
【請求項３１】
腫瘍誘発活性が腺腫誘発活性または腺癌誘発活性であることを特徴とする、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
化合物が生物における腫瘍誘発活性を有する確率が高いか低いかを評価するためのキットであって、少なくとも1つの抗FADD特異的化合物（および選択的に非担癌生物モデル）ならびにFADDタンパク質における細胞性減少を腫瘍誘発性指標として用いるための適切な指示書を含むことを特徴とするキット。
【請求項３３】
化合物が生物における腫瘍誘発活性を有する確率が高いか低いかを評価するためのキットであって、少なくとも1つの抗FADD特異的化合物（および選択的に非担癌生物モデル）ならびにFADDタンパク質の細胞外放出を腫瘍誘発性指標として用いるための適切な指示書を含むことを特徴とするキット。
【請求項３４】
化合物が生物における腫瘍誘発活性を有する確率が高いか低いかを評価するためのキットであって、少なくとも1つの抗ホスホ-p38-MAPK特異的化合物（および選択的に非担癌生物モデル）ならびにリン酸化p38-MAPKの細胞性減少を腫瘍誘発性指標として用いるための適切な指示書を含むことを特徴とするキット。
【請求項３５】
FADDタンパク質および／またはリン酸化p38-MAPK特異的に結合しうる化合物、またはこのような化合物を生成しうる生物学的単位の、生物に腫瘍があるか否かを代表的生物試料で判定するための、および／または抗腫瘍化学療法に対する腫瘍の抵抗性の予測のための、および／または適用される抗腫瘍治療が生物において有効である、もしくはそう考えられる、もしくはそうでないことを判定するための、および／または化合物が生物における抗腫瘍活性を有しうるか否かを判定するための、および／または化合物が生物において腫瘍誘発活性を有する確率が高いか低いかを評価するための、インビトロ使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
アポトーシスまたはプログラム細胞死は、発生およびホメオスタシスにかかわるプロセスである。腫瘍壊死因子（TNF）受容体／TNFファミリーのメンバーであるFasおよびFasリガンド（FasL）はこのプロセスと関連づけられている。Fasは体内のほとんどの細胞の表面に構成的に発現されるが、FasLの発現パターンはそれよりも限定的である。FasLは活性化Tリンパ球の表面に発現され、細胞傷害性、および活性化誘導細胞死（AICD）による免疫応答の調節に寄与する。FasLは精巣のセルトリ細胞および眼の前房細胞でも発現され、受容体Fasを発現する浸潤性リンパ球を死滅させることによってこれらの部位の免疫特権状態に寄与する。最近、Fas／FasL相互作用は浸潤性の細胞傷害性リンパ球のアポトーシスを誘導するだけでなく、Fas／FasL相互作用を介して自らの増殖も刺激するという可能性を示す新たな概念が登場している。
【０００２】
Fas経路の調節不全は増殖不全性（hypoproliferative）障害または過剰増殖性障害の原因となり、これらはそれぞれアポトーシスの過剰または不足に起因する。いくつかの報告は、腫瘍細胞表面でのFasL発現により、これらの細胞が免疫系を逃れることが可能になると提唱しているが（カウンターアタック（counter-attack）モデル）、この点についてはまだ議論がある。通常、腫瘍細胞がFas分子およびFasL分子を共発現すると、それはFasを介した細胞死に対する耐性を獲得する。細胞死シグナルを遮断するために起こりうる調節機構のうち、Fasもしくはカスパーゼ8などのアポトーシス誘発分子のダウンレギュレーション、またはFLIP（FLICE阻害タンパク質）などのアポトーシス抑制分子のアップレギュレーションが、腫瘍進行の際に報告されている。
【０００３】
感受性細胞において、リガンドによるFasの活性化は、引き続いてアダプター分子FADD（デス（death）ドメインを有するFas関連タンパク質）の動員を招き、これが続いてFLICE／カスパーゼ8を活性化し、このプロセスによりアポトーシスが引き起こされる。アポトーシス抑制タンパク質の1つであるFLIPは、カスパーゼ8とアダプター分子FADDとの会合を阻止することにより、細胞をプログラム細胞死から防御する。
【０００４】
Fas受容体に対する第2のアダプター分子であるDaxx（Fasデスドメイン関連タンパク質）は、Fasの下流にある異なるシグナル伝達経路を規定する。これはASK1（アポトーシスシグナル調節性キナーゼ1）中間体を介してJun N末端キナーゼ（JNK）経路またはp38マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（p38 MAPK）経路を独立に活性化する。Daxxシグナル伝達が細胞死または増殖の誘導をもたらすか否かは不明である。JNK経路は一般にアポトーシスをもたらすように思われるが、p38キナーゼはアポトーシス誘発作用を有するともアポトーシス抑制作用を有するとも記載されている。このため、最終的な結果は、細胞の種類およびその分化状態といった複数の要因に依存するようである。
【０００５】
キナーゼRIP（受容体相互作用性タンパク質）は最近、Fasを介したカスパーゼ依存的または非依存的な細胞死を伝達しうるFasの第3のアダプターであることが示され、これにより、Fasシグナル伝達経路の複雑性はさらに増した。
【発明の開示】
【０００６】
Fas／FasL経路のシグナル伝達機構の複雑性が今なお増していることを受けて、本発明者らはまず、Fas／FasL相互作用が特に興味深い役割を果たしている特定のモデル、すなわち甲状腺臓器を選択することとした。実際、甲状腺濾胞細胞（TFC）におけるFas経路の役割については盛んな議論があり、数多くの研究の対象となっている。全体的な概念は、正常甲状腺細胞はFas分子を構成的に発現し、FasL発現は橋本甲状腺炎（HT）、グレーブス病および癌を含む、甲状腺のさまざまな病的状態の下で起こりうるというものである。甲状腺細胞のFasL発現が有益であるか有害であるかはさらに複雑であり、甲状腺疾患の種類に依存することは確実である。例えば、橋本甲状腺炎（HT）では、HT甲状腺細胞間のFas-FasL相互作用が細胞の自殺／同胞殺し（fratricide）を招き、その結果として甲状腺機能低下をもたらすと考えられる。これに対して、癌およびグレーブス病におけるTFCによるFasL発現は、甲状腺細胞が免疫系を逃れることを補助するとみなされている。本発明者らの関心を引いた観察所見は、TFCは通常の状態ではFas媒介性細胞死に対して抵抗性であること、および、ある報告ではIL-1βまたはIFNγの投与後にはTFCの高度のFas媒介性アポトーシスが得られることが示され、一方、別の報告ではそれらが同じ条件下で細胞死を誘導できないがIL-1βとIFNγを併用すると奏功することが示され、さらに別の報告ではIL-1βおよび／またはIFNγはTFCのアポトーシスを誘導せず、逆に増殖の阻止が示されているということである。このように、一致をみない実験結果から派生している議論のために、全体的なFas経路の調節の問題、さらには特に甲状腺臓器におけるFas経路の調節の問題を実験的に取り扱うことは困難であった。
【０００７】
これらの技術的問題に直面して、本発明者らは次に、対象をインビボモデルに、すなわち甲状腺腫瘍を発生するように遺伝的に操作された非ヒト哺乳動物に向けることをさらに選択した。特に、アデニル酸シクラーゼの構成的活性化によって腫瘍を発生するトランスジェニックマウスを用いることを選択した。これらのマウスには8カ月齢までは何ら異常がなく、その後に過形成が生じ、続いてマウスの遺伝的背景に応じて過機能性甲状腺腺腫または腺癌を発症する。このようなアデニル酸シクラーゼの構成的活性化はヒト甲状腺中毒性腺腫の約30％およびヒト甲状腺癌の10％で観察されている。本発明者らはそれにより、ヒト腫瘍を研究するための強力なモデルであるという特別な特徴を有する非ヒトモデルを選択した。
【０００８】
続いて本発明者らはさらに、Fasカスケードに関与する多数のシグナル伝達分子をgspトランスジェニックマウスで検討すること、3種類の技法（半定量的RT-PCR、ウエスタンブロット法および免疫組織化学）を組み合わせてmRNAおよびタンパク質の両方を検出して定量すること、ならびにタンパク質を発現する細胞の位置を特定することを選択した。
【０００９】
このようにして得られた結果から、インビボ条件下では、非トランスジェニック（NTG）マウスの正常甲状腺濾胞細胞（TFC）は、トランスジェニックマウスの病的でない腺と同じように、FasL分子を発現しないことが示されている。これに対して、インビボでの腫瘍発達の際にはFasL発現が獲得され、腺腫／腺癌の方が過形成甲状腺よりも発現が高度である。腫瘍細胞上でのこのFasLのアップレギュレーションは、Fasシグナル伝達経路の諸分子のダウンレギュレーションと相関している。
【００１０】
3種類の既知のFas受容体アダプター（FADD、Daxx、RIP）のうち、高度に調節されているのはFADDのみであった。さらに、腫瘍発達時のこのFADD調節には極めて顕著な特徴がある：実際、本発明者らは、腫瘍内部にFADD mRNAは存在するものの、FADDタンパク質の発現は極めて弱いか完全に消失していることを見いだした。
【００１１】
本発明者らはさらに、エクスビボで正常甲状腺細胞がFADD mRNAおよびタンパク質の両方を発現する場合に、それらを標準的なインビトロTFC培養条件下におくとFADD発現が起こらなくなることを観察した。また、いくつかの腫瘍細胞株、例えばK562細胞株などはFADDを発現するが、対応するエクスビボ腫瘍、例えばK652細胞株の場合にはCML（慢性骨髄性白血病）は、実際にFADDを発現しないことも観察した。このため、インビトロ培養物または樹立細胞株に基づくこのような先行技術の結果を、現実のインビボ条件にそのまま置き換えることはできない。このような先行技術の実験は重大なアーチファクトを被っていることは別として、本発明者らはそれにより、FADDの非存在下では、Fas-シグナル伝達がより迅速な細胞増殖を引き起こす（そしてアポトーシスは引き起こさない）ことを示している。
【００１２】
本発明者らはまた、インビボでの腫瘍発達時に、FADDの除去下でのFasシグナル伝達は主としてDaxx-ASK1経路を介して作用し、腫瘍増殖時にASK1発現が大きく増強されることも示している。このDaxx-ASK1経路の下流キナーゼに関して、本発明者らはASK1／SEK1／JNK経路、さらにはASK1／MKK3／p38-MAPK経路がインビボ腫瘍発達時に強く阻害されることを示している。より詳細には、インビボ腫瘍発達の際に以下のことを示している：
‐MKK3総発現量の低下がみられる、
‐MKK3／MKK6タンパク質のうち、MKK6タンパク質のみが活性化される、
‐p38-MAPKの活性化が阻害され（ホスホ-p38-MAPKの減少）、この阻害はMKK3総発現量の低下と相関する、
‐SEK1タンパク質の総発現量は大きく増加するが、SEK1のthr261ホスホ-活性型の量は大きく減少する、および
‐SAPK／JNKタンパク質は非病的臓器ではthr183およびthr185の両方の部位でリン酸化されるが、過形成性臓器および腫瘍ではホスホ-SEK1依存的なthr183リン酸化が起こらないために一リン酸化される。
【００１３】
すなわち、本発明者らは、非病的臓器から腫瘍へのトランスフォーメーションのプロセスの際に以下のことを示した：
1）FasL発現が増大する、
2）FADDタンパク質は消失するがFADD mRNAは消失しない、
3）DaxxおよびRIPの量は有意な影響を受けない、
4）FADDの非存在下でのFasシグナル伝達はDaxxを介したシグナルをもたらすがRIPを介したシグナルはもたらさない、
5）ASK1発現量の増加がみられる（Daxx-ASK1経路）、
6）FADDタンパク質の消失はp38-MAPKの不活性化状態（p38-MAPKリン酸化の阻害）と相関する、
7）SAPK／JNKタンパク質の二リン酸化から一リン酸化への転換がみられる、
8）SEK1タンパク質総発現量の増加がみられ、これはSEK1のthr261ホスホ-活性型の減少を伴う、
9）FADDの非存在下でのFasシグナル伝達はアポトーシスではなく細胞増殖を促進する。
【００１４】
これは、FADDタンパク質の自然消失を現実のインビボでの病的結果と関連づけ、リン酸化p38-MAPKタンパク質の減少がFADDタンパク質のこの減少と密接に相関していることを明らかにした、初の事例である。
【００１５】
実際、FADDに関する先行技術の結果は、FADD機能に欠陥があるように人為的に操作されたモデルのみを対象にしている。遺伝子ターゲティングまたはドミナントネガティブ干渉性変異体の発現に基づくモデルがTリンパ球に関してそのように記載されており、Fasによって誘導されるアポトーシスに対する抵抗性がT細胞に付与されることが示されている（Newtonら、1998, EMBO Journal 17(3): 706-718）。これらのモデルでは、操作されたFADD欠陥がマイトジェン誘導性T細胞増殖の阻害ももたらしており、このことはFADDがアポトーシスシグナルおよび増殖シグナルおよび／または生存シグナルを伝達する可能性を示す。その反対に、もう1つのモデルは、rag-1-/-マウスにおける操作されたFADD欠陥が胸腺リンパ腫の発症を誘導したことを示しており、これはFADDがリンパ腫抑制因子としても作用する可能性を示す（Newtonら、2000, EMBO Journal Vol. 19 No.5 pp.931-941）。これらの先行技術のモデルは主として、FADDタンパク質が、その発現時期、組織および組織の発生状況に応じてさまざまな作用を有する可能性を示している。
【００１６】
本インビボ腫瘍モデルにおいて、本発明者らは、インビボ非担癌（tumour-free）健常生物との比較により、腫瘍の発達過程でFADD発現の自然消失がみられること、より詳細にはFADDが翻訳後調節を受けることを示す。これは、FADDタンパク質の減少が腫瘍進行の信頼できるマーカーであること、および、リン酸化p38-MAPKの密接に相関した減少がみられることの初の記載である。
【００１７】
特定の状態の「マーカー」によって、当業者は、前記状態と正の相関にある技術的特徴（含有量または含有量の変化）を意味する。指標（indicator）はより一般的な用語であるが、これは正の相関のほかに負の相関のことも意味する。
【００１８】
Fasが調節される機序を解明するためにFADDの機能を人為的に故意に改変した先行技術のモデルはいずれも、インビボでの腫瘍進行の際にFADD発現が実際に消失すること、この消失がFADDタンパク質には影響を及ぼすがFADD mRNAには影響を及ぼさないこと、およびこれと相関してリン酸化p38-MAPKも減少するようであることを示していない。この点に関して特に指摘しておくべきことは、本発明によれば、DaxxおよびRIPの明らかな調節はみられず、一方、DaxxおよびRIPは先行技術モデルではアポトーシス増強因子として記載されていた（例えば、米国特許第5,674,734号 Lederら；米国特許第6,159,731号 Yangらを参照）。このことは、ある特定の分子に欠損があるように操作され、それによってこの特定の分子が腫瘍発達を促進する（または反対に防止する）ことを示すためのモデルからは、この特定の分子が実際に腫瘍の発達（または縮退）の生物マーカーであるという推論を行うことはできないことを例示している。
【００１９】
腺腫／腺癌の非ヒト哺乳動物モデルに関して本発明者らによって得られたものと同等な結果はさらに、ヒト患者および他の種類の腫瘍、例えば特に急性および慢性の骨髄性白血病で得られている（以下の実施例5および6を参照）：骨髄性白血病患者から採取した血液細胞試料において測定されたFADDタンパク質発現の低下は疾患の悪性度と確実に相関している。これらの結果はいずれも、細胞性FADDタンパク質および／またはリン酸化p38-MAPKの減少が、インビボでの腺腫、腺癌、骨髄性白血病などの腫瘍の状態に関する信頼性のあるマーカーであること、ならびにそれをヒト個体ならびに非ヒト動物に適用しうることを十分に裏づけている。
【００２０】
腫瘍発達の際に細胞性FADDタンパク質は消失するがFADD mRNAは消失しないという興味深い実証結果を受けて、本発明者らはさらにこのような翻訳後調節が働く様式に注目した。
【００２１】
さまざまな機序候補を検討して、本発明者らは、FADDタンパク質が実際に腫瘍トランスフォーメーション中の細胞から細胞外環境へと分泌または排出されることを示した。特に、この分泌／排出機構が実際にヒト癌患者で起こっており、FADDタンパク質が腫瘍細胞から消失し、血清中に検出されることを示した。また、FADDタンパク質が分泌／排出型では30〜33kDa前後の分子量として検出され、細胞発現型は分子量が約28〜29kDAであること、および30〜33kDaの細胞外型を2-メルカプトエタノールなどの還元剤で処理すると28〜29kDa型となることも示しており、このことは細胞外に分泌／排出されたFADDタンパク質は別の実体とジスルフィド結合または架橋によって連結されることを示唆している。
【００２２】
これらの驚くべき新たな特徴から生まれる医学的応用に深く携わる中で、本発明者らは、腺腫、腺癌、骨髄性腫瘍（特にCMLおよびAMLなどの骨髄性白血病）などの腫瘍の発達に関する臨床的分析により、細胞性FADDタンパク質の量に関して観察されたものと並行して、細胞外FADDタンパク質の量が腫瘍の状態と相関すること（細胞性FADDタンパク質とは鏡像のように反対の様式で）が観察されることも示した：すなわち、大量または正常を上回る量の細胞外FADDタンパク質は腫瘍の存在、発達または高悪性度と相関し、ゼロ、少量または正常未満の量の細胞外FADDタンパク質は腫瘍の非存在、縮退または低悪性度と相関する。
【００２３】
換言すれば、本発明者らは以下のことを示した：
‐細胞性FADDタンパク質の消失およびそれと相関する細胞性リン酸化p38-MAPKの消失は、インビボでの腫瘍の存在または発達に関する信頼性のある細胞マーカーであり、細胞外FADDタンパク質の出現はインビボでの腫瘍の存在または発達に関する信頼性のある細胞外マーカーである、その反対に、
‐細胞性FADDタンパク質および細胞性リン酸化p38-MAPKの非消失または再出現はインビボでの腫瘍の非存在または縮退に関する信頼性のある細胞マーカーであり、細胞外FADDタンパク質の非出現または消失はインビボでの腫瘍の存在または発達に関する信頼性のある細胞外マーカーである。
【００２４】
特に、これらの関係が、腺腫、腺癌に関して、より詳細には甲状腺腺腫または腺癌に関して特に信頼性が高いことを示している。
【００２５】
本発明者らはさらに、細胞性FADDタンパク質の量および／またはFADDタンパク質の細胞外の量が、化学療法に対する抵抗性の予測指標となりうることを示している。特に、細胞性FADDタンパク質の量の少なさまたは細胞外FADDタンパク質の量の多さと化学療法に対する抵抗性の状態との間に（統計学的に有意な）正の相関があることを示している。特に以下のことを示している：
‐FADDタンパク質の細胞性発現がゼロ、低レベルまたは正常未満のレベルであることは抗骨髄性腫瘍化学療法に対する抵抗性と相関し（正の相関）、一方、FADDタンパク質の細胞性発現が正常または正常を上回るレベルにあることは抗骨髄性腫瘍化学療法に対する感受性と相関する（正の相関）、および
‐FADDタンパク質が高レベルまたは正常を上回るレベルで細胞外に存在することは抗骨髄性腫瘍化学療法に対する抵抗性と相関する（正の相関）。
【００２６】
しかし、FADDタンパク質がゼロ、低レベル、正常未満レベルまたは正常レベルで細胞外に存在することに関しては、必ずしも単独で確定的なデータではないことを指摘しておく必要がある；このため、この場合にはFADDの細胞性発現のレベルを評価することが推奨される：このFADD細胞レベルがゼロ、低いまたは正常未満であると評価される場合には抵抗性があるという結論を信頼性を伴って導くことができ、このFADD細胞レベルがゼロ、低いまたは正常未満でなければ感受性があるという結論を信頼性を伴って導くことができる。
【００２７】
本発明はしたがって、抗腫瘍（および／または抗有糸分裂）化学療法に対する抵抗性についての予後予測のため、特にCML（慢性骨髄性白血病）またはAML（急性骨髄性白血病）に対する化学療法などの抗骨髄性腫瘍化学療法に対する抵抗性についての予後予測のためのFADDタンパク質の使用にも関する。換言すれば、本発明は、化学療法抵抗性（chemo-resistant）骨髄性腫瘍または化学療法感受性骨髄性腫瘍の診断を可能にする手段に関する。
【００２８】
すなわち、FADDタンパク質が、特別な種類の腫瘍のインビボでの発達、すなわち標準的な抗腫瘍化学療法に対して抵抗する能力を有する腫瘍のインビボでの発達があるか否かを明らかにするための、信頼性のある細胞性および細胞外の指標であることを示している。化学療法抵抗性とのこの関係が、CMLまたはAMLなどの骨髄性腫瘍に関して特に信頼性が高いことを示している。
【００２９】
本発明はしたがって、動物における腫瘍の存在または発達を診断するため、試験的な抗腫瘍治療のインビボでの有効性を判定するため、およびインビボでの腫瘍誘発活性に関して化合物の危険性のスコアを決定するために役立つ方法およびキットを提供する。
【００３０】
本発明者らは特に、このFADD分泌／排出機構に特に基づく診断、予後判定および治療的応用、特に腫瘍の細胞外環境の試料（例えば、血清）に対して首尾良く実施しうる取り扱いが容易な診断手段、実際には奏功しえない化学療法で患者を治療するのを回避することを可能にする（それにより、化学療法薬に対して望ましくない抵抗性が生じるのを回避することも可能にする）予測手段、および、FADDが細胞外に放出されるのを防止する抗腫瘍特性を利用する治療的に有用な手段を提供する。
【００３１】
本特許出願はしたがって、概して、FADDタンパク質およびリン酸化p38-MAPKからなる群より選択されるタンパク質を、腫瘍指標、とりわけインビボ腫瘍に関する生物学的指標として用いることに関する。実際に、
‐細胞性FADDタンパク質の量がゼロ、正常未満または減少していることは腫瘍の存在または発達を示し、細胞外FADDタンパク質の量が多い、正常を上回るまたは増加していることも腫瘍の存在または発達の指標である、および
‐細胞性FADDタンパク質の量が正常、正常を上回るまたは増加していることは腫瘍の非存在または縮退を示し、細胞外FADDタンパク質の量がゼロ、正常未満、正常または減少していることも腫瘍の非存在または縮退の指標である。
【００３２】
これらの関係は、腺腫および腺癌に関して、より詳細には甲状腺の腺腫および腺癌に関して特に信頼性が高い。前記腫瘍が哺乳動物、特にヒト患者などのある動物に存在する、または存在すると疑われる場合には、前記細胞外環境は例えば、血清または血漿でありうる。
【００３３】
上に示した通り、さらに以下の実施例でも例示する通り、FADDの発現レベルならびにリン酸化p38-MAPKの量は非腫瘍動物の組織または体液中では高いことが実際に非常に一般的であり、これらの組織または体液から腫瘍が発生した場合には劇的に低下し、時にはゼロとなる。これに並行する特徴として、FasLの発現が増大する。
【００３４】
細胞性FADDタンパク質および／またはリン酸化p38-MAPKの減少を検出することに加えて、本発明によれば、さらにFasLタンパク質を、その発現の増大によって動物に腫瘍が存在すること、発達中であること、または拡がりつつあることが示される細胞マーカーとして首尾良く利用する。しかし、アダプターFADDはFas経路のみに関与するわけではないことに注意が必要である：FADDはTNFR1、DR3、DR4およびDR5といったさまざまな他の細胞死受容体の経路にも関与する。
【００３５】
本明細書において、タンパク質の「量」または「含有量」とは、量（quantity）、濃度、存在レベル、発現レベルといった定量的な量のことを意味し、これはまた、存在／非存在の評価（ゼロと有意差のない量は非存在を意味する；非存在を存在と比較する場合、非存在は存在を下回る量を表し、存在は非存在を上回る量を表す）。
【００３６】
このような量は、ELISAまたはウエスタンブロット法などの、タンパク質の定性的または定量的な評価のために好都合な任意の技法によって測定しうる。続いてこのような量は濃度、OD値、バンド強度などの単位で表現される。定量的な技法の方が好ましい。
【００３７】
「有意な」という用語は、2つの量を比較するために用いられる場合、前記量を測定するために用いられる技法を用いた、この比較の結果が統計学的に有意であることを意味する。
【００３８】
当業者により適切であることが見いだされている任意の統計学的検定、例えば、フィッシャー検定、スチューデント検定を用いうる。
【００３９】
本発明はしたがって、腫瘍の非存在／存在または縮退／発達の状態を判定するための方法であって、前記状態が、
‐前記腫瘍もしくは腫瘍と疑われるものの細胞が、非腫瘍性であるがそれ以外の点では同等な細胞と比較した場合に、および／もしくはそれらが異常な量のFADDタンパク質を細胞外に放出した場合に、異常な量のFADDタンパク質を喪失したか否かを評価することによって、ならびに／または
‐前記腫瘍もしくは腫瘍と疑われるものの細胞が、非腫瘍性であるがそれ以外の点では同等な細胞と比較した場合に、異常に少ない量のリン酸化p38-MAPKを有するか否かを評価することによって、
判定されることを特徴とする方法を提供する。
【００４０】
当業者は当然ながら、非腫瘍性であるがそれ以外の点では同等な健常細胞である細胞との比較により、存在／非存在の評価を進めると考えられる（以下の実施例を参照されたい）。
【００４１】
本発明はこのため、動物などの生物において細胞が腫瘍細胞に変わったか否かを判定するための方法およびキットであって、
FADDタンパク質の量およびリン酸化p38-MAPKの量からなる群より選択される少なくとも1つの量を前記細胞において測定し、
この際、前記測定された量がゼロと有意な差がない、および／または非腫瘍性かつ健常であるがそれ以外の点では同等な細胞で観察される標準的正常（それぞれの）量を有意に下回る場合には、前記細胞は腫瘍細胞と判定され、ならびに
前記測定された量がゼロと有意に異なり、前記標準的（それぞれの）正常量と有意な差がないかそれを有意に上回る場合には、前記細胞は非腫瘍細胞と判定される、
ことを特徴とする方法およびキットを含む。
【００４２】
本方法は腺腫および腺癌に関して、より詳細には甲状腺の腺腫および腺癌に関して特に信頼性が高い。
【００４３】
FADDタンパク質の見かけの分子量はウエスタンブロット法によれば28〜30kDaであり、アミノ酸配列はヒトでは配列番号：23（アクセッション番号Q13158）であり、マウスでは配列番号：24（アクセッション番号NP_034305）である。細胞外（例えば、動物の血清中または血漿中）に放出された形態にある場合、FADDタンパク質はウエスタンブロット法では分子量約30〜33kDaとして検出され、そのため、ジスルフィド結合または架橋によってもう1つまたは他の実体と連結している可能性が非常に高い。
【００４４】
リン酸化p38-MAPKの見かけの分子量はウエスタンブロット法によれば42〜44kDaであり、p38-MAPKのアミノ酸配列はヒトでは配列番号：25（アクセッション番号Q16539）であり、マウスでは配列番号：26（アクセッション番号P47811）である。配列番号：23〜26は図7にも示されている。
【００４５】
FADDならびにリン酸化p38-MAPKは生理的条件下では遍在的な発現様式を示し、このことは動物組織または体液から採取した細胞の大多数が、非腫瘍性かつ健常な状態にある場合にはFADDタンパク質を発現するとともにリン酸化p38-MAPKを含んでおり、それらが腫瘍状態を生じた場合にはFADDタンパク質およびリン酸化p38-MAPKの量が減少するか存在しなくなることを意味する。本発明の方法はこのため、例外的に非担癌正常条件下でFADDを発現せず、活性化されているが非担癌性の正常条件下でリン酸化p38-MAPKを有しないと考えられる細胞を除く、動物細胞などの大多数の細胞にとって妥当である。この段階で、上に説明するとともに以下に例示するように、インビトロ培養物または樹立細胞株に対して行われる指標に間接的に依拠するのではなく（これは、これらの後者の実験条件がこの点に関してアーチファクトが入り込む可能性があるため（特に非腫瘍性甲状腺細胞の標準的なインビトロ培養物の場合がそうである）である）、例えばエクスビボ試料を分析することにより、実際にインビボに存在するFADDおよび／またはホスホ-p38-MAPKの量を検討することが本発明にとって第一に重要であることを思い起こす必要がある。
【００４６】
当業者はこのため、それらが腫瘍状態を有しない場合に被験組織、体液または細胞が実際にFADDタンパク質および／またはリン酸化p38-MAPKをインビボで発現していることを確かめ、それによって本明細書の以後では標準的（それぞれの）正常量と称する量を測定するために、バイオテクノロジーにおける標準的手順である通常の対照分析を進めることが求められる。非腫瘍性の健常条件下では、FADDは実際に発現されるはずであり、p38-MAPKは細胞が活性化されるとリン酸化されるはずである。
【００４７】
本出願はしたがって、全体的に、FADDタンパク質およびリン酸化p38-MAPKからなる群より選択される少なくとも1つのタンパク質を、腫瘍状態の指標として用いることに関する。本明細書において、「腫瘍状態」とは、増殖または増殖能といった、腫瘍の医学的に重要な任意の特性を意味する。このため、この用語には、存在／非存在または発達／縮退の状態、さらには化学療法抵抗性／化学療法感受性の状態が含まれる。
【００４８】
FADDタンパク質およびリン酸化p38-MAPKは、腫瘍の非存在に関する構成的な細胞マーカーを構成しうる。事実、この種のタンパク質の細胞量は腫瘍の存在／非存在または発達／縮退に関する細胞指標となりうる。同様に、FADDタンパク質の細胞外の量は腫瘍の存在／非存在または発達／縮退に関する細胞外指標となりうる。
【００４９】
前記腫瘍は好ましくは腺腫または腺癌であり、より好ましくは甲状腺腺腫または腺癌である。前記腫瘍はインビボ腫瘍であることが好都合である。
【００５０】
この使用をさらに、FasLタンパク質をインビボ腫瘍の存在に関する細胞マーカーとして用いる段階によって補完することもできる。FADDタンパク質およびリン酸化p38-MAPKの（それぞれの）細胞量は実際に腫瘍発達に伴って減少し、時にはゼロになるが、FasL発現は増大する。したがって、本発明のすべての方法および使用は、FasLタンパク質の有無の検出またはその細胞量の測定を含むことが好都合である。このような検出または測定は、抗FasL特異的抗体（例えば、Alexis Biochemicals社による抗FasL IgG2A H11；Santa Cruz Biotechnology社から入手可能なウサギポリクローナル抗FasL抗体Q20およびC20、それぞれref.sc-956およびref.sc-957；Oncogene Research社から入手可能なウサギポリクローナル抗FasL（Ab-3）、ref. PC105；BD PharMingen社から入手可能なマウスモノクローナル抗FasL（G247-4）、ref.65431A；マウスモノクローナル抗FasL（NOK-1）、BD PharMingen ref. 65321A；BD PharMingen社から入手可能なマウスモノクローナル抗FasL（NOK-2）、ref. 65331A）などの抗FasL特異的化合物によって行いうる。
【００５１】
このようなインビボ腫瘍には特に、腺腫などの良性腫瘍のほかに、腺癌などの癌が含まれる。FADDタンパク質および／もしくはリン酸化p38-MAPKの発現の非存在またはその細胞量が異常に少ないことは、甲状腺中毒性腺腫、甲状腺癌に関する特に信頼性が高いマーカーである。これらのマーカーは、生物における、特に哺乳動物などの動物、好都合にはヒト個体における、腫瘍の検出のために用いることができる。
【００５２】
本発明の第1の面によれば、本出願は以下のものに関する：
‐腫瘍の非存在／存在の状態を判定するためのインビトロ法であって、
前記腫瘍と疑われるものの細胞が、健常であるがそれ以外の点では同等な細胞に比して異常に少ない量に相当するFADDタンパク質（細胞性FADD）の量を含むか否か、および／または、前記腫瘍と疑われるものの細胞が、健常であるがそれ以外の点では同等な細胞に比して異常に多い放出量に相当するFADDタンパク質（細胞外FADD）の量を細胞外に放出したか否かを評価する段階を含むことを特徴とし、
異常に少ない細胞量に相当する細胞性FADD量および／または異常に多い放出量に相当するFADDタンパク質の細胞外放出は腫瘍の存在を示し、
異常に少ない細胞量に相当しない細胞性FADD量および／または異常に多い放出量に相当しないFADDタンパク質の細胞外放出は腫瘍の非存在を示す、インビトロ法、
‐腫瘍の非存在／存在の状態を判定するためのインビトロ法であって、
前記腫瘍と疑われるものの細胞が、健常であるがそれ以外の点では同等な細胞に比して異常に少ない量に相当するリン酸化p38-MAPKの量を含むか否かを評価する段階を含むことを特徴とし、
異常に少ない細胞量に相当する細胞性リン酸化p38-MAPKの量は腫瘍の存在を示し、
異常に少ない細胞量に相当しない細胞性リン酸化p38-MAPKの量は腫瘍の非存在を示す、インビトロ法、
‐腫瘍が、BがAよりも後である、時点Aと時点Bとの間にさらに発達したか否かを判定するためのインビトロ法であって、
前記腫瘍の細胞が時点Aに比して時点Bの方が有意に少ないFADDタンパク質の量を含むか否か、および／または前記腫瘍の細胞の細胞外環境が時点Aに比して時点Bの方が有意に多いFADDタンパク質の量を含むか否かを評価する段階を含むことを特徴とし、
有意に少ない細胞性FADD量および／または有意に多いFADDタンパク質の細胞外量は、前記腫瘍が時点Aと時点Bとの間にさらに発達したことを示し、
有意に少なくはない細胞性FADD量および／または有意に多くはないFADDタンパク質の細胞外量は、前記腫瘍が時点Aと時点Bとの間にさらに発達してはいないことを示す、インビトロ法、
‐腫瘍が時点Aと時点B（BはAよりも後である）との間にさらに発達したか否かを判定するためのインビトロ法であって、
前記腫瘍の細胞が時点Aに比して時点Bの方が有意に少ないリン酸化p38-MAPKの量を含むか否かを評価する段階を含むことを特徴とし、
リン酸化p38-MAPKの有意に少ない細胞量は前記腫瘍が時点Aと時点Bとの間にさらに発達したことを示し、
有意に少なくはない細胞性リン酸化p38-MAPKの量は前記腫瘍が時点Aと時点Bとの間にさらに発達してはいないことを示す、インビトロ法。
【００５３】
より詳細には、本出願は、腫瘍と疑われるものが発達もしくは拡大したか否か、または発達中もしくは拡大中であるか否か、またはこの種の腫瘍が存在しないか寛解もしくは回復に近いまで縮退したか否かを判定するための方法に関する。本方法は、以下の段階、
‐前記腫瘍と疑われるものを代表する細胞内に存在するFADDタンパク質の細胞量、および前記腫瘍と疑われるものを代表する細胞内に存在する細胞性リン酸化p38-MAPKの量からなる群より選択される、少なくとも1つの細胞量を測定する段階、
この際、前記測定された細胞量がゼロと有意な差がない、および／または非腫瘍性かつ健常であるがそれ以外の点では同等な細胞で観察される（それぞれの）標準的正常細胞量を有意に下回る場合には、前記腫瘍は発達もしくは拡大した、または発達中もしくは拡大中であると判定され、
前記測定された細胞量がゼロと有意に異なり、前記（それぞれの）標準的正常細胞量を有意に下回らない場合には、前記腫瘍は腫瘍が存在しないか寛解もしくは回復に近いまで縮退したと判定される、
ならびに／または、以下の段階、
‐前記腫瘍と疑われるものを代表する細胞の細胞外環境に存在するFADDタンパク質の細胞外量を測定する段階、
この際、前記FADDタンパク質の測定された細胞外量が、非腫瘍性かつ健常であるがそれ以外の点では同等な細胞で観察されるFADDタンパク質の標準的正常細胞外量を有意に上回る場合には、前記腫瘍は発達もしくは拡大した、または発達中もしくは拡大中であると判定され、
前記FADDタンパク質の測定された細胞外量がゼロと有意な差がない、および／または前記FADDタンパク質の標準的正常細胞外量を有意に上回らない場合には、前記腫瘍は存在しないか寛解もしくは回復に近いまで縮退したと判定される、
ただし前提条件として、非腫瘍性かつ健常であるがそれ以外の点では同等な細胞で観察されるFADDタンパク質および／またはリン酸化p38-MAPKの標準的正常細胞量はそれぞれ、ゼロと有意に異なる、
を含むことを特徴とする。
【００５４】
本方法は、腺腫および腺癌に対して、より詳細には甲状腺の腺腫および腺癌に対して特に適している。
【００５５】
タンパク質の細胞量を測定するためには、前記腫瘍を代表する細胞試料を、前記腫瘍と疑われるものを有する生物から、またはその生物学的代表物（例えば、腺腫または腺癌の疑いのある組織試料など）からの採取によって用意しうる。
【００５６】
タンパク質の細胞外量を測定するためには、前記腫瘍と疑われるものを有する生物から、またはその生物学的代表物からの採取により、前記疑われる腫瘍を代表する細胞の細胞外環境を代表する細胞外試料を用意しうる。前記疑われる腫瘍が腺腫または腺癌である場合、前記細胞外環境は例えば血清または血漿でありうる。
【００５７】
本方法を実行するためには、標準的（それぞれの）正常量を測定することが強く推奨され、これは、この（これらの）標準的（それぞれの）正常量が実際にゼロと有意に異なることを確かめるため（それによってFADDおよびリン酸化p38-MAPKマーカーを分析中の具体的な事例に適用しうることを確認するため）に、腫瘍を含まず、したがって健常であるかどうかを試験される具体的な試料において見いだされる必要がある。
【００５８】
「正常な」または「健常な」材料によって、当業者は、無病状態を確実に代表しうる材料、すなわち組織学的観点で非担癌性であって、しかも腫瘍材料と接触も連結もしていない材料のことを意味している。このような「正常な」または「健常な」材料はこのため無病生物に由来し、腫瘍材料と隣接または連結した材料に相当すべきではないが、これはこのような隣接または連結した材料を陰性対照とみなすには正当な疑いの余地がないとは言えないためである。
【００５９】
前記標準的（それぞれの）正常量は、複数の正常量の、好ましくは少なくとも5つの正常量の、より好ましくは少なくとも10つの正常量の、（それぞれの）平均値であることが好ましい。
【００６０】
このような標準的（それぞれの）正常量は、それらが、測定されたものを正確に比較する（それによって正確な診断を可能する）ための厳密な基準値になるという点でも有用である。しかし、このような正確性は必ずしも常に必要ではないことに注意が必要である：例えば、FADDタンパク質および／またはリン酸化p38-MAPKの完全な非存在は、これらのタンパク質が非腫瘍性の正常なインビボ条件下で存在することが確かめられていれば、それ自体で、腫瘍が存在すること、または発達中であることを結論づけるのに十分である。
【００６１】
より詳細には、本出願は、腫瘍が発達もしくは拡大の段階にあるか否か、それが安定化の段階にあるか否か、またはそれが縮退、寛解または回復の段階にあるか否かを判定するための方法であって、
a. 前記腫瘍を代表する細胞内に存在するFADDタンパク質の細胞量、および前記腫瘍を代表する細胞内に存在する細胞性リン酸化p38-MAPKの量からなる群より選択される、少なくとも1つの細胞量を測定する段階、この際、この（これらの）測定された細胞量は測定された第1の細胞量と呼ばれる、
b. 段階a.を反復する段階、しかし後の時点で、この（これらの）測定された量は測定された第2の細胞量と呼ばれる、
この際、前記測定された第2の細胞量が前記測定された（それぞれの）第1の細胞量を有意に下回る場合には前記腫瘍は発達または拡大の段階にあると判定され、
前記測定された第2の細胞量が前記測定された（それぞれの）第1の細胞量と有意な差がない場合、前記腫瘍は安定化の段階にあると判定され、
前記測定された第2の細胞量が前記測定された（それぞれの）第1の細胞量を有意に上回る場合、前記腫瘍は縮退、寛解または回復の段階にあると判定される、
および／または、以下の段階、
c. 前記腫瘍を代表する細胞の細胞外環境に存在するFADDタンパク質の量を測定すること、この測定された量は測定された第1の細胞外FADD量と呼ばれる、
d. 段階c.を反復する段階、しかし後の時点で、この（これらの）測定された量は測定された第2の細胞外FADD量と呼ばれる、
この際、前記測定された第2の細胞外FADD量が前記測定された第1の細胞外FADD量を有意に上回る場合には前記腫瘍は発達または拡大の段階にあると判定され、
前記測定された第2の細胞外量が前記測定された第1の細胞外量と有意な差がない場合、前記腫瘍は安定化の段階にあると判定され、
前記測定された第2の細胞外量が前記測定された第1の細胞外量を有意に下回る場合、前記腫瘍は縮退、寛解または回復の段階にあると判定される、
ただし前提条件として、非腫瘍性かつ健常であるがそれ以外の点では同等な細胞で観察されるFADDタンパク質および／またはリン酸化p38-MAPKの標準的正常細胞量はそれぞれ、ゼロと有意に異なる、
を含むことを特徴とする方法に関する。
【００６２】
本方法は、腺腫および腺癌に対して、より詳細には甲状腺の腺腫および腺癌に対して特に適している。
【００６３】
前記腫瘍に対して、段階a.の後であるが段階b.の前、および／または段階c.の後であるが段階d.の前に、試験的な抗腫瘍療法を行いうる。
【００６４】
本出願はまた、腺腫、腺癌、より詳細には甲状腺腺腫、甲状腺腺癌などの腫瘍の非存在／存在および／またはその発達の非存在／存在を判定するためのキットであって、
‐FADDタンパク質および／またはリン酸化p38-MAPKと特異的に結合しうる少なくとも1つの化合物、および／またはこのような化合物を生成しうる少なくとも1つの生物学的単位、この少なくとも1つの化合物または生物学的単位は選択的には生理的緩衝液中に含まれ、および／または選択的には固体支持体と結合している、ならびに
‐・FADDタンパク質および／またはリン酸化p38-MAPKを、腫瘍の非存在に関するマーカーとして、より詳細には、それが細胞に存在することが前記腫瘍の非存在および／もしくは縮退もしくは発達の非存在を示す、および／もしくはその細胞発現レベルがそれらと正の相関にある、ならびに／またはそれが細胞に存在しないことが前記腫瘍の存在および／もしくは発達を示す、および／もしくはその細胞発現レベルがそれらと負の相関にある、細胞指標として用いるため、ならびに／または
・FADDタンパク質を、腫瘍の存在に関する細胞外マーカーとして、より詳細には、それが細胞外に存在することが腫瘍の存在および／もしくは発達を示す、および／もしくはその細胞外存在レベルがそれらと正の相関にある、ならびに／またはそれが細胞外に存在しないことが腫瘍の非存在および／もしくは縮退もしくは腫瘍発達の非存在を示す、および／もしくはその細胞外存在レベルがそれらと負の相関にある、細胞外指標として用いるため、
の適切な指示書、
を含むキットにも関する。
【００６５】
より詳細には、本出願は、抗腫瘍化学療法に対する抵抗性または感受性の予測のためのFADDタンパク質の使用に関する。前記腫瘍を代表する細胞内および／またはこのような細胞の細胞外環境におけるFADDタンパク質の量は実際に、前記抗腫瘍化学療法に対する抵抗性または感受性の予測指標として用いることができる。前記化学療法は抗骨髄性腫瘍化学療法であることが好ましい。抗腫瘍化学療法の例には、αインターフェロン療法などのインターフェロン療法、標準的導入補助療法、ドキソルビシンなどのアントラサイクリン療法、標準的または高用量のシタラビン療法およびベペシド（vepeside）療法、単独または併用で用いられる細胞分裂抑制剤（cytostatic）が含まれる。
【００６６】
本発明はしたがって、インビボを対象とする抗骨髄性腫瘍化学療法に対するヒト患者の抵抗性を予測する、抗腫瘍化学療法に対する抵抗性に関するインビトロ基盤での予測を提供する。言い換えれば、本発明は、インビボの化学療法抵抗性または化学療法感受性の骨髄性白血病を診断するのに有用なインビトロ手段を提供する。
【００６７】
本出願はしたがって、前記化学療法を実行する必要のない、抗腫瘍化学療法に対する生物の抵抗性の予測のための方法であって、前記化学療法の対象である骨髄性腫瘍を代表する細胞から、FADDタンパク質が、非腫瘍性かつ健常であるがそれ以外の点では同等な細胞のものを大きく上回る量で放出されたことを判定することを含むことを特徴とする方法に関する。この化学療法抵抗性の予測のためには、前記腫瘍はCMLまたはAMLなどの骨髄性腫瘍であることが好ましい。
【００６８】
本発明によれば、抗腫瘍化学療法に対する腫瘍の抵抗性の予測のための方法は、このため、前記化学療法を実行する必要なしに行うことができる。これは以下の段階、
‐前記抗腫瘍化学療法の対象である細胞を代表する細胞内に存在するFADDタンパク質の細胞量を測定する段階、
この際、前記測定された FADD細胞量が、THP1細胞株（ATCC TIB202）もしくはU937細胞株（ATCC CRL1593）などの、FADDを発現する不死化骨髄細胞株またはリンパ細胞株の細胞内に存在するFADDタンパク質の細胞量に相当する基準量を有意に下回る場合、好ましくは前記測定された FADD細胞量が前記基準量の1.5分の1、より好ましくは1.7分の1、非常に好ましくは1.8分の1、最も好ましくは2分の1である場合には、前記腫瘍は前記化学療法に対して抵抗性であると判定される、
ならびに／または以下の段階を含む：
‐前記抗骨髄性腫瘍化学療法の対象である細胞の細胞外環境に存在するFADDタンパク質の量を測定する段階、
この際、前記測定された細胞外FADD量が、非腫瘍性かつ健常であるがそれ以外の点では同等な細胞の細胞外環境で観察されるFADDタンパク質の標準的正常細胞外量の少なくとも2倍、好ましくは少なくとも2.5倍である場合に、前記腫瘍は前記化学療法に対して抵抗性であると判定される、
ただし前提条件として、非腫瘍性かつ健常であるがそれ以外の点では同等な細胞で観察されるFADDタンパク質の標準的正常細胞量はゼロと有意に異なる。
【００６９】
THP1細胞株およびU937細胞株はいずれもATCCから入手可能である（それぞれアクセッション番号TIB202およびCRL1593）。それらは、インビトロで標準的な培養条件下、例えば、以下の実施例に記載するように、標準的な完全RPMI培地（RPMI 1640 Life Technologies、5％ウシ胎仔血清および100U／mlペニシリン、100μg／mlストレプトマイシンを添加）上にて37℃およびCO２ 5％で増殖させることができる。
【００７０】
前記骨髄性腫瘍はCMLまたはAMLであることが好ましい。細胞外環境は例えば、動物の血清または血漿でありうる。
【００７１】
本出願はまた、抗腫瘍化学療法、特に抗CMLまたは抗AML化学療法などの抗骨髄性化学療法に対する抵抗性または感受性の予測のためのキットであって、
‐FADDタンパク質と特異的に結合しうる少なくとも1つの化合物、および／またはこのような化合物を生成しうる少なくとも1つの生物学的単位、この少なくとも1つの化合物または生物学的単位は選択的には生理的緩衝液中に含まれ、および／または選択的には固体支持体と結合している、ならびに
‐FADDタンパク質を、
・前記抗骨髄性腫瘍化学療法に対する感受性に関する細胞マーカーとして、より詳細には、それが細胞に存在しないことが前記抗骨髄性腫瘍化学療法に対する抵抗性を示す、および／もしくはその細胞発現レベルがそのようなそのような抵抗性と負の相関にある、および／もしくはそれが細胞に存在することが前記抗骨髄性腫瘍化学療法に対する感受性を示す、および／もしくはその細胞発現レベルがそのような感受性と正の相関にある、細胞指標として、
ならびに／または、FADDタンパク質を、
・前記抗骨髄性腫瘍化学療法に対する抵抗性に関する細胞外マーカーとして、より詳細には、それが細胞外に存在することが前記抗骨髄性腫瘍化学療法に対する抵抗性を示す、および／もしくはその細胞外存在レベルがそれと正の相関にある、細胞外指標として、
用いるための適切な指示書、
を含むことを特徴とするキットにも関する。
【００７２】
選択的には、本発明による抵抗性の予測キットは、THP1細胞株またはU937細胞株といったFADDを発現する不死化骨髄細胞株またはリンパ細胞株も含みうる。
【００７３】
腫瘍の存在／非存在または発達／縮退を判定するための方法、および腫瘍の悪性度の高さ／低さを判定するための方法に基づき、本発明はまた、ある治療が効率の高い抗腫瘍治療であるか否か、またはそう考えられるか否かを判定するための方法も提供する。
【００７４】
本方法は、適用される治療が、動物に存在する、または発達中もしくは拡大中である腫瘍を治療する、またはその増殖を停止させるのに有効であるか否か、またはそう考えられるか否かを判定し、以下の段階、
‐前記治療の経過中もしくは終了時に前記腫瘍を代表する細胞内に存在するFADDタンパク質の細胞量、および前記治療の経過中もしくは終了時に前記腫瘍を代表する細胞内に存在する細胞性リン酸化p38-MAPKの量からなる群より選択される少なくとも1つの細胞量を測定する段階、
この際、前記測定された細胞量が、非腫瘍性かつ健常であるがそれ以外の点では同等な細胞で観察される（それぞれの）標準的正常細胞量を有意に下回らない場合には、前記治療は前記腫瘍に対して有効であると判定される、
および／または、以下の段階を含むことを特徴とする：
‐前記治療の経過中もしくは終了時に前記腫瘍を代表する細胞の細胞外環境に存在するFADDタンパク質の細胞外量を測定する段階、
この際、前記測定された細胞外量がゼロと有意な差がない、および／または非腫瘍性かつ健常であるがそれ以外の点では同等な細胞で観察されるFADDタンパク質の標準的正常細胞外量を有意に上回らない場合には、前記治療は前記腫瘍に対して有効と判定される、
ただし前提条件として、非腫瘍性かつ健常であるがそれ以外の点では同等な細胞で観察されるFADDタンパク質および／またはリン酸化p38-MAPKの標準的正常細胞量はそれぞれ、ゼロと有意に異なる。
【００７５】
「腫瘍を代表する細胞」によって、当業者は、この腫瘍から採取された腫瘍細胞などの、この腫瘍の本質的な特徴を有する腫瘍細胞のことを意味する。
【００７６】
前記細胞量または細胞外量を測定するためには、前記治療の経過中もしくは終了時に、前記腫瘍の代表的な試料として、前記腫瘍を有する生物またはその代表的な生物モデル（同等の腫瘍が存在するか発達中または拡大中である）から得られた生物（細胞または細胞外）試料を用意することができる。哺乳動物、特にヒト個体などの動物に腫瘍が存在または発達している場合、前記細胞外環境は血清または血漿であってよい。
【００７７】
前記標準的正常細胞量または細胞外量は、信頼性のある陰性対照であるためには、当然ながら、非担癌生物および健常生物に対して行われた測定に由来すべきである。
【００７８】
本方法は生物自体（例えば、動物個体）に対して行いうるが、当然ながら、同等の腫瘍が存在するか発達中または拡大中である代表的モデルに対して行うことが、このようなモデルが入手可能であれば、好ましい。このような代表的モデルは、治療効率を判定する必要のある生物がヒト患者である場合には特に有用である。すなわち、このようなモデルは、同等の腫瘍が存在するか発達中である非ヒト哺乳動物であってよく、（例えば、前記ヒト患者において発現されるものと同じタイプの腫瘍を発現するように遺伝的に操作されたマウス、ウサギ、イヌまたはサル、例えば、Greenbergら、1995、Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92: 3439-3443（その内容は参照として本明細書に組み入れられる）に記載された前立腺癌のTRAMPマウスモデル）。
【００７９】
治療の「経過中」にこの治療が無効であると結論づけるためには、当業者は当然ながら、この特定の治療が、試験的に治療を受けている特定の動物に対して有意な抗腫瘍活性を示すことが合理的に期待される程度に十分に長い期間にわたって治療を適用した後に、前記腫瘍マーカーの量を分析することを選択すると考えられる。代替的または補足的に、当業者は、前記治療が前記動物の体内で有益な効果を生じうるか否か、またはそれがそうである可能性が非常に低いか否かを判断するために、このマーカー量分析を治療の経過中に数回繰り返し、それによって治療の効果を適用時間の関数として判定することを選択してもよい。最小限の有害な副作用で信頼性のある結論に達するのに必要な最短期間を決定することは、医師または臨床家の非常に一般的な専門技術に属する実験的または臨床的な最適化の問題である。
【００８０】
本発明はまた、適用される治療が、存在するが発達中でも拡大中でもない腫瘍に対して高度に有効であるか否かもしくはそう考えられるか否か、またはそれがこの種の腫瘍に対して有効でないか否かもしくはそう考えられるか否かを判定するためのより鋭敏な方法も提供する。これらの方法は腺腫および腺癌に関して、より詳細には甲状腺の腺腫および腺癌に関して特に信頼性が高い。
【００８１】
適用される治療が、存在するが発達中でも拡大中でもない腫瘍に対して高度に有効であるか否かもしくはそう考えられるか否か、またはそれがこの種の腫瘍に対して有効でないか否かもしくはそう考えられるか否かを判定するための、この種のより鋭敏な方法の一つは、以下の段階、
‐前記治療の経過中もしくは終了時の前記腫瘍を代表する細胞内に存在するFADDタンパク質の細胞量、および前記治療の経過中もしくは終了時の前記腫瘍を代表する細胞内に存在するリン酸化p38-MAPKの細胞量からなる群より選択される少なくとも1つの細胞量を測定する段階、
この際、前記測定された細胞量が、治療を受けていないがそれ以外の点では同等な対照細胞で観察される（それぞれの）対照細胞量を有意に上回る場合には、前記治療は前記腫瘍に対して有効と判定され、
前記測定された細胞量が前記（それぞれの）対照細胞量を有意に上回らない場合には、前記治療は前記腫瘍に対して有効でないと判定される、
ならびに／または以下の段階を含む：
‐前記治療の経過中もしくは終了時の前記腫瘍を代表する細胞の細胞外環境に存在するFADDタンパク質の量を測定する段階、
この際、前記測定された細胞外FADD量が、治療を受けていないがそれ以外の点では同等な 対照細胞の細胞外環境で観察されるFADDタンパク質の対照細胞外量を有意に下回る場合には、前記治療は前記腫瘍に対して有効と判定され、
前記測定された細胞外FADD量が前記FADDタンパク質の対照細胞外量を有意に下回らない場合には、前記治療は前記腫瘍に対して有効でないと判定される、
ただし前提条件として、非腫瘍性かつ健常であるがそれ以外の点では同等な細胞で観察されるFADDタンパク質および／またはリン酸化p38-MAPKの標準的正常細胞量はそれぞれ、ゼロと有意に異なる。
【００８２】
前記タンパク質の量を測定するためには、前記治療の経過中もしくは終了時に、前記腫瘍の代表として、前記腫瘍を有する生物またはその代表的な生物モデル（同等の腫瘍が存在する）から得られた生物（細胞または細胞外）試料を用意することができる。
【００８３】
適用される治療が、発達または拡大の段階にある腫瘍に対して有効であるか否かもしくはそう考えられるか否か、またはそれがこの種の腫瘍に対して有効でないか否かもしくはそう考えられるか否かを判定するための、もう1つのこの種のより鋭敏な方法は、以下の段階、
‐前記治療の経過中もしくは終了時の前記腫瘍を代表する細胞内に存在するFADDタンパク質の細胞量、および前記治療の経過中もしくは終了時の前記腫瘍を代表する細胞内に存在するリン酸化p38-MAPKの細胞量からなる群より選択される少なくとも1つの細胞量を測定する段階、
この際、前記測定された細胞量が、治療を受けていないがそれ以外の点では同等な対照細胞で観察される（それぞれの）対照細胞量を有意に下回らない場合には、前記治療は前記腫瘍に対して有効と判定され、
前記測定された細胞量が前記（それぞれの）対照細胞量を有意に下回る場合には、前記治療は前記腫瘍に対して有効でないと判定される、
ならびに／または以下の段階を含む：
‐前記治療の経過中もしくは終了時の前記腫瘍を代表する細胞の細胞外環境に存在するFADDタンパク質の量を測定する段階、
この際、前記測定された細胞外FADD量が、治療を受けていないがそれ以外の点では同等な 対照細胞の細胞外環境で観察されるFADDタンパク質の対照細胞外量を有意に上回らない場合には、前記治療は前記腫瘍に対して有効と判定され、
前記測定された細胞外FADD量が前記FADDタンパク質の対照細胞外量を有意に上回る場合には、前記治療は前記腫瘍に対して有効でないと判定される、
ただし前提条件として、非腫瘍性かつ健常であるがそれ以外の点では同等な細胞で観察されるFADDタンパク質および／またはリン酸化p38-MAPKの標準的正常細胞量はそれぞれ、ゼロと有意に異なる。
【００８４】
前記タンパク質の量を測定するためには、前記治療の経過中もしくは終了時に、前記腫瘍の代表として、前記腫瘍を有する生物またはその代表的な生物モデル（同等の腫瘍が存在する）から得られた生物（細胞または細胞外）試料を用意することができる。
【００８５】
抗腫瘍治療が有効である場合には治療された生物はこの治療に対して感受性があると言われ、抗腫瘍治療が有効でないか有効でなくなった場合には試験的に治療された生物はこの治療に対して抵抗性であるか抵抗性になったと言われることを考えれば、ある治療が有効であるか否かを判定するための本発明の方法を、腫瘍が存在するか発達中または拡大中である動物が試験的な抗腫瘍治療に対して感受性があるか否か、またはこの動物がこの試験的な治療に対して抵抗性であるか否かを判定するための方法とみなすこともできる。
【００８６】
全く同じように、抗腫瘍治療を受けた動物の抵抗性または感受性の程度は腫瘍の悪性度を反映すると言われることを考えれば、ある治療が有効であるか否かを判定するための本発明による方法を、腫瘍発生の悪性度が高い（適用される治療に対する抵抗性、治療が有効でない）か否か、またはその悪性度が低い（適用される治療に対する感受性、治療が有効）か否かを判定するための方法とみなすこともできる。
【００８７】
本発明のこれらの方法は、このため、適用される治療を必要に応じて調整および最適化することを可能にし、ならびに最も重要なこととして、その継続がいずれにしても腫瘍の治療または停止に奏功しないと考えられ、さらには患者にとって有害な可能性すらある治療を回避することを可能にする。
【００８８】
本出願はまた、ある化合物が、存在するか発達中または拡大中である腫瘍の増殖の治療または停止のための抗腫瘍活性化合物として有用でありうるか否かを判定するための方法であって、以下の段階、
‐前記化合物を前記腫瘍を代表する細胞と接触させる段階、
‐前記接触させた細胞内に存在するFADDタンパク質の細胞量、および前記接触させた細胞内に存在するリン酸化p38-MAPKの細胞量からなる群より選択される少なくとも1つの細胞量を測定する段階、
この際、前記測定された細胞量が、非腫瘍性かつ健常であるがそれ以外の点では同等な細胞で観察される（それぞれの）標準的正常細胞量を有意に下回らない場合には、前記化合物は前記腫瘍の増殖の治療または停止のための抗腫瘍活性化合物として有用であると判定される、
ならびに／または以下の段階、
‐前記化合物を前記腫瘍を代表する細胞と接触させる段階、
‐前記接触させた細胞の細胞外環境に存在するFADDタンパク質の細胞外量を測定する段階、
この際、前記測定された細胞外量がゼロと有意な差がない、および／または非腫瘍性かつ健常であるがそれ以外の点では同等な細胞で観察されるFADDタンパク質の標準的正常細胞外量を有意に上回らない場合には、前記化合物は前記腫瘍の増殖の治療または停止のための抗腫瘍活性化合物として有用と判定される、
ただし前提条件として、非腫瘍性かつ健常であるがそれ以外の点では同等な細胞で観察されるFADDタンパク質および／またはリン酸化p38-MAPKの標準的正常細胞量はそれぞれ、ゼロと有意に異なる、
を含む方法にも関する。
【００８９】
より詳細には、本出願は、ある化合物の抗腫瘍活性化合物としての有用性を判定するためのより鋭敏な方法であって、腺腫および腺癌に関して、より詳細には甲状腺の腺腫および腺癌に関して特に信頼性が高い方法に関する。
【００９０】
ある化合物が、存在するが発達中でも拡大中でもない腫瘍に対する抗腫瘍活性化合物として有効でありうるか否かを判定するためのこのような方法の一つは、以下の段階、
‐前記化合物を前記腫瘍を代表する細胞と接触させる段階、
‐前記接触させた細胞内に存在するFADDタンパク質の細胞量、および前記接触させた細胞内に存在するリン酸化p38-MAPKの細胞量からなる群より選択される少なくとも1つの細胞量を測定する段階、
この際、前記測定された細胞量が、接触させていないがそれ以外の点では同等な細胞で観察される（それぞれの）対照細胞量を有意に上回る場合には、前記化合物は抗腫瘍活性化合物として有用であると判定され、
前記測定された細胞量が前記（それぞれの）対照細胞量を有意に上回らない場合には、前記化合物は抗腫瘍活性化合物として有用でないと判定される、
ならびに／または以下の段階を含む：
‐前記化合物を前記腫瘍を代表する細胞と接触させる段階、
‐前記接触させた細胞の細胞外環境に存在するFADDタンパク質の量を測定する段階、
この際、前記測定された細胞外FADD量が、接触させていないがそれ以外の点では同等な細胞の細胞外環境で観察されるFADDタンパク質の対照細胞外量を有意に下回る場合には、前記化合物は前記腫瘍に対する抗腫瘍活性化合物として有用と判定され、
前記測定された細胞外FADD量が、前記FADDタンパク質の対照細胞外量を有意に下回らない場合には、前記化合物は前記腫瘍に対する抗腫瘍活性化合物として有用でないと判定される、
ただし前提条件として、非腫瘍性かつ健常であるがそれ以外の点では同等な細胞で観察されるFADDタンパク質および／またはリン酸化p38-MAPKの標準的正常細胞量はそれぞれ、ゼロと有意に異なる。
【００９１】
ある化合物が、発生または拡大の段階にある腫瘍に対する抗腫瘍活性化合物として有用でありうるか否かを判定するための、もう1つのこのような方法は、以下の段階、
‐前記化合物を前記腫瘍を代表する細胞と接触させる段階、
‐前記接触させた細胞内に存在するFADDタンパク質の細胞量、および前記接触させた細胞内に存在するリン酸化p38-MAPKの細胞量からなる群より選択される少なくとも1つの細胞量を測定する段階、
この際、前記測定された細胞量が、接触させていないがそれ以外の点では同等な細胞で観察される（それぞれの）対照細胞量を有意に下回らない場合には、前記化合物は前記腫瘍に対する抗腫瘍活性化合物として有用であると判定され、
前記測定された細胞量が前記（それぞれの）対照細胞量を有意に下回る場合には、前記化合物は抗腫瘍活性化合物として有用でないと判定される、
ならびに／または以下の段階を含む：
‐前記化合物を前記腫瘍を代表する細胞と接触させる段階、
‐前記接触させた細胞の細胞外環境に存在するFADDタンパク質の量を測定する段階、
この際、前記測定された細胞外FADD量が、接触させていないがそれ以外の点では同等な細胞の細胞外環境で観察されるFADDタンパク質の対照細胞外量を有意に上回らない場合には、前記化合物は前記腫瘍に対する抗腫瘍活性化合物として有用と判定され、
前記測定された細胞外FADD量が、前記FADDタンパク質の対照細胞外量を有意に上回る場合には、前記化合物は前記腫瘍に対する抗腫瘍活性化合物として有用でないと判定される、
ただし前提条件として、非腫瘍性かつ健常であるがそれ以外の点では同等な細胞で観察されるFADDタンパク質および／またはリン酸化p38-MAPKの標準的正常細胞量はそれぞれ、ゼロと有意に異なる。
【００９２】
以上に定義した通りの、腫瘍の非存在／存在および／または縮退／発生を判定するためのキットは、ある治療が腫瘍に対して有効であるか否かもしくはそう考えられるか否か、またはある化合物が腫瘍に対する抗腫瘍活性化合物として有用であるか否かもしくはそう考えられるか否かを判定するためのキットともなる。したがって、このようなキットは本出願に含まれる。
【００９３】
「抗腫瘍活性」または「腫瘍誘発活性」とは、本明細書において、生物における腫瘍の発達にとってそれぞれ不都合または好都合な活性のことを意味し、特にそれぞれ、非担癌生物における腫瘍抑制活性または腫瘍誘導活性のことを意味する。
【００９４】
本発明者らが、（特に組織学的な観点から）非腫瘍性細胞と考えられる樹立細胞株およびいくつかの初代細胞培養物（少なくとも初期には組織学的に非腫瘍性である甲状腺濾胞細胞（TFC）など）が、腫瘍誘導物質と接触しないで、実際に、正常な標準的インビトロ条件下でFADDの発現および／またはp38-MAPKのリン酸化を放出することを示しているため、このような培養物または細胞株は有用なインビトロ腫瘍モデル（細胞性FADDおよびホスホ-p38-MAPKの喪失）である。本出願はこのため、本発明のさらにもう1つの面によれば、ある化合物が抗腫瘍活性を有するか否かを判定するためのインビトロモデルとしての、このようなインビトロ培養物または樹立細胞株の使用であって、腫瘍誘導物質の非存在下での前記化合物と前記組織学的に非腫瘍性であるインビトロ培養物または樹立細胞株との接触による使用、にも関する。このような使用は、腺腫および腺癌に関して、より詳細には甲状腺の腺腫および腺癌に関して特に信頼性が高い。
【００９５】
本出願は、より詳細には、ある化合物が、動物、特に哺乳動物、好都合にはヒト個体などの生物において抗腫瘍活性を有しうるか否かを、腫瘍誘導物質を用いる必要なく、判定するための方法であって、腺腫および腺癌に関して、より詳細には甲状腺の腺腫および腺癌に関して特に信頼性が高い方法に関する。
【００９６】
このような方法の一例は、以下の段階、
‐（少なくとも培養前の初期には）組織学的に非腫瘍性である甲状腺濾胞細胞（TFC）を、インビトロ増殖のために、前記TFCの接着および集密化を可能にする基質組成、温度および時間の条件（すなわち、腫瘍誘導物質を添加しない、TFC培養のための標準的な正常条件）の下におく段階、
‐前記化合物を前記インビトロ培養TFCとの接触下におく段階、
‐細胞性FADDタンパク質の量および細胞性リン酸化p38-MAPKの量からなる群より選択される少なくとも1つの細胞量を、前記化合物との前記接触後に前記TFCにおいて測定する段階、
この際、測定された細胞量が、前記化合物と接触させなかった同等のインビトロ増殖TFCで観察される（それぞれの）対照細胞量を有意に上回る場合、またはエクスビボ健常TFCで測定される標準的（それぞれの）正常細胞量と有意な差がない場合には、前記化合物は前記生物において抗腫瘍活性を有しうると判定される、
ならびに／または以下の段階、
‐（少なくとも培養前の初期には）組織学的に非腫瘍性である甲状腺濾胞細胞（TFC）を、インビトロ増殖のために、前記TFCの接着および集密化を可能にする基質組成、温度および時間の条件（すなわち、TFC培養のための標準的な正常条件）の下におく段階、
‐前記化合物を前記インビトロ培養TFCとの接触下におく段階、
‐細胞外FADDタンパク質の量を、前記化合物との前記接触後に前記TFCの細胞外環境で測定する段階、
この際、測定された細胞外FADD量が、前記化合物と接触させなかった同等のインビトロ増殖TFCで観察される対照細胞外FADD量を有意に下回る場合、またはエクスビボ健常TFCで測定される標準的正常細胞外FADD量と有意な差がない場合には、前記化合物は前記生物において抗腫瘍活性を有しうると判定される、
を含むことを特徴とする。
【００９７】
前記組織学的に非腫瘍性であるTFCは、任意の健常生物、特に健常ヒト個体を含む任意の健常哺乳動物から採取することができ、判定を行う必要のあるものと同じ動物種から採取することが好ましい。
【００９８】
前記化合物がFADDタンパク質の量および／またはリン酸化p38-MAPKに対して影響を及ぼすか否かを示すために必要な接触時間は、当然ながら、試験を行う個々の化合物に依存する。任意の化合物を用いて明らかな結果を得るために先験的に必要な最短時間は、通常、当業者の平均的な専門技術に属する。代替的または補足的に、当業者は、前記少なくとも1つの量を、前記TFCが増殖を停止するまで、時間の関数として測定することを選択することもできる。
【００９９】
前記インビトロ培養物とすることを意図した前記組織学的に非腫瘍性であるTFCに対して、インビトロ培養の前にコラゲナーゼH処理を行ってもよい。
【０１００】
前記TFCのインビトロ増殖のための適切な条件には、特別かつ印象的なことに、5％ウシ胎仔血清を添加したRPMI 1640培地上にて37℃で5〜6日間といった、正常の標準的培養条件が含まれる。
【０１０１】
候補化合物の例には特に、MAPキナーゼ経路（甲状腺腫瘍）の修飾物質が含まれる。
【０１０２】
したがって、本出願は、腫瘍誘導物質の非存在下で、ある化合物がある生物において抗腫瘍活性を有しうるか否かを判定するためのキットであって、
‐前記化合物と接触させることを意図した、少なくとも1つの組織学的に非腫瘍性である甲状腺濾胞細胞（TFC）、
‐少なくとも1つの抗FADDおよび／または抗ホスホ-p38-MAPK化合物、
‐および場合によっては、これらのTFCを腫瘍誘導物質を添加せずにインビトロで増殖させた場合に、前記化合物が、前記TFCからFADDタンパク質が放出されるのを防止するか否かを評価するための適切な指示書、
を含むことを特徴とするキットにも関する。
【０１０３】
インビトロで増殖させた組織学的に非腫瘍性であるTFCはFADDの発現およびp38-MAPKのリン酸化を放出するため、本発明の方法、キットおよび使用には、それらの実行のために腫瘍誘導物質を必要としないという利点がある。
【０１０４】
本発明によれば、候補化合物の中から抗腫瘍活性化合物を同定するための方法は、FADDタンパク質が腫瘍細胞またはインビトロ培養甲状腺濾胞細胞から放出されるのを防ぐ化合物に関するスクリーニングによって該抗腫瘍活性化合物を選択することを含む。候補化合物の例には特に以下のものが含まれる：
‐アクチンフィラメントと関連のある細胞移動の阻害物質、例えばサイトカラシンおよびラトランクリンなど、
‐ゴルジ装置と関連のある細胞移動の阻害物質、例えばブレフェルジンAなど、
‐ATP依存性の小胞輸送の阻害物質、例えばN-エチルマレイミドなど、
‐MAPキナーゼ経路の修飾物質。
【０１０５】
本発明のさらにもう1つの面によれば、本出願はまた、化合物がインビボで腫瘍、特に癌に関して有すると考えられる危険性のスコアを決定するための手段にも関する。これらの手段は、特に腺腫および腺癌に関して、より詳細には甲状腺の腺腫および腺癌に関して信頼性が高い。
【０１０６】
本出願はしたがって、化合物が、動物などの生物、好都合にはヒト個体などの哺乳動物において腫瘍誘導活性を有する確率が高いか低いかを評価するための方法に関する。これは、以下の段階、
‐前記化合物を、前記生物の細胞またはその代表的な生物モデルの細胞との接触下におく段階、
‐FADDタンパク質の細胞量およびリン酸化p38-MAPKの細胞量からなる群より選択される少なくとも1つの細胞量を前記接触させた細胞において測定する段階、
この際、前記測定された細胞量が、非腫瘍性かつ非接触性であるがそれ以外の点では同等な細胞で観察される標準的（それぞれの）正常細胞量を有意に下回る場合には、前記化合物は前記生物において腫瘍誘発活性を有する可能性が高いと判定され、
前記測定された細胞量が前記標準的（それぞれの）正常細胞量を有意に下回らない場合には、前記化合物は前記生物において腫瘍誘発活性を有する確率が低いと判定される、
ならびに／または以下の段階、
‐前記化合物を、前記化合物を前記生物の細胞またはその代表的な生物モデルの細胞との接触下におく段階、
‐前記生物またはその代表的な生物モデルの細胞の細胞外環境に存在するFADDタンパク質の細胞外量を測定する段階、
この際、前記測定された細胞外量が、非腫瘍性かつ非接触性であるがそれ以外の点では同等な細胞の細胞外環境で観察されるFADDタンパク質の標準的正常細胞外量を有意に上回る場合には、前記化合物は前記生物において腫瘍誘発活性を有する可能性が高いと判定され、
前記測定された細胞外量がFADDタンパク質の標準的正常細胞外量を有意に上回らない場合には、前記化合物は前記生物において腫瘍誘発活性を有する確率が低いと判定される、
ただし前提条件として、非腫瘍性かつ健常であるがそれ以外の点では同等な細胞で観察されるFADDタンパク質および／またはリン酸化p38-MAPKの標準的正常細胞量はそれぞれ、ゼロと有意に異なる、
を含むことを特徴とする。
【０１０７】
本方法は、任意の動物、特に哺乳動物、より詳細にはヒト個体に対して特に有用である。医療および安全性の目的から、本方法の実行には、非担癌性で健常なその代表的生物モデルを用いることが好ましい。このようなその代表的な生物モデルは、前記動物がヒト個体である場合には、マウス、サル、ウサギ、イヌなどのインビボモデルであってよく、腫瘍が発生する前記動物から感受性の代表として前記動物から採取した細胞または組織の培養によって入手可能な培養物などのインビトロモデルであってもよいが、ただし前提条件として、FADDタンパク質の量および／またはリン酸化p38-MAPKの量はこの培養物において時間経過に伴って減少しない（特に非腫瘍性甲状腺細胞の標準的なインビトロ培養物の場合は減少すると考えられる）。
【０１０８】
培養物は、候補化合物との接触下におかれていない場合（対照培養）にそれらを生きた状態または増殖状態に保つために適切な、温度、培地組成、空気（CO２量、O２量）、湿度、明るさの条件下に置かれて保たれる必要がある。標準的正常条件下にある非腫瘍性甲状腺細胞の培養物はFADDタンパク質およびリン酸化p38-MAPKの量の減少を誘導することを本発明者らが示しているため、このような培養物は甲状腺細胞培養物ではない必要がある；このことは、このような甲状腺細胞培養物に関する本発明のマーカーの標準的（それぞれの）正常量は徐々にゼロと有意に差がない値に向かうことを意味する。しかし、このような培養物は、例えば、肝細胞培養物であってよい。本発明に従って進める最良のやり方は、本発明のマーカーの量が、当業者によって選択された特定の培養物に関して、時間経過に伴って減少しないことを確かめることである。試験が行われる候補化合物の例には特にキナーゼ機能の阻害物質が含まれる。
【０１０９】
本出願はまた、化合物が生物において腫瘍誘発活性、および腺腫誘発活性または腺癌誘発活性、より詳細には甲状腺腺腫誘発活性または甲状腺腺癌誘発活性を有する確率が高いか低いかを評価するためのキットにも関する。このようなキットは以下のものを含む：
‐少なくとも1つの抗FADDおよび／または抗リン酸化p38-MAPK特異的化合物、ならびに選択的に細胞培養物などの非担癌生物モデル、ならびに
‐FADDタンパク質および／またはリン酸化p38-MAPKを腫瘍誘発性指標として用いるための適切な指示書、より詳細には、FADDタンパク質の細胞性減少もしくは細胞外放出、またはリン酸化p38-MAPKの細胞性減少を腫瘍誘発性指標として用いるための適切な指示書。
【０１１０】
本出願はさらに全体的には、FADDタンパク質および／またはリン酸化p38-MAPKと特異的に結合しうる化合物、またはこのような化合物を生成しうる生物学的単位の、生物に腫瘍があるか否かを代表的生物試料で判定するための、および／または抗腫瘍化学療法に対する腫瘍の抵抗性の予測のための、および／または適用される抗腫瘍治療が生物において有効である、もしくはそう考えられる、もしくはそうでないことを判定するための、および／または化合物が生物における抗腫瘍活性を有するか否かを判定するための、および／または化合物が生物において腫瘍誘発活性を有する確率が高いか低いかを評価するための使用に関する。
【０１１１】
本出願によれば、したがって、生物に腫瘍があるか否かを代表的生物試料で判定するために、および／または抗腫瘍化学療法に対する腫瘍の抵抗性の予測のために、および／または適用される抗腫瘍治療が生物において有効である、もしくはそう考えられる、もしくはそうでないことを判定するために、および／または化合物が生物における抗腫瘍活性を有するか否かを判定するために、および／または化合物が生物において腫瘍誘発活性を有する確率が高いか低いかを評価するために有用な生成物を生成するための方法であって、FADDタンパク質および／またはリン酸化p38-MAPKと特異的に結合する化合物の生成によって前記生成物を生成する段階、および選択的にその後に検出標識をこの抗FADDおよび／または抗リン酸化p38-MAPK特異的化合物と結合させる段階を含むことを特徴とする方法が提供される。
【０１１２】
FADDタンパク質および／またはリン酸化p38-MAPKタンパク質が試料中に存在するか否かを検出するため、さらには、それらがそれぞれ存在する量を可能であれば検出するために、当業者は、タンパク質の検出および定量のための任意の標準的手順を用いうる（例えば、「タンパク質科学における最新プロトコール（Current Protocols in Protein Science）」、Coligan John E.ら編、2001. John Wiley & sons Inc.；および「免疫学における最新プロトコール（Current Protocols in Immunology）」、Coligan John E.ら編、2001. John Wiley & Sons Inc.を参照のこと、これらの全体は参照として本明細書に組み入れられる）。このような検出は通常、特異的に結合しうるFADDタンパク質および／またはリン酸化p38-MAPKと特異的に結合しうる化合物を用いて行われる。
【０１１３】
したがって、本発明は、FADDタンパク質および／またはリン酸化p38-MAPKと特異的に結合しうる化合物、またはこのような化合物を生成しうる生物学的単位を、生物に腫瘍があるか否かを代表的生物試料で判定するため、および／または抗腫瘍治療が生物において有効である、もしくはそう考えられる、もしくはそうでないことを判定するために用いることに関する。これはより詳細には、生物に腫瘍が存在するか否か、および／または抗腫瘍治療が生物において有効である、もしくはそう考えられる、もしくはそうでないことを判定するための方法およびキットを含む。
【０１１４】
生物に腫瘍が存在するか否か、および／または抗腫瘍治療が生物において有効である、もしくはそう考えられる、もしくはそうでないことを判定するために有用な生成物を生成するための、本発明による生成のための方法は、FADDタンパク質および／またはリン酸化p38-MAPKと特異的に結合する化合物の生成によって前記生成物を入手する段階、および可能性としてはその後に検出標識をこの抗FADDおよび／または抗リン酸化p38-MAPK特異的化合物と結合させる段階を含むことを特徴とする。
【０１１５】
生物に腫瘍が存在するか否か、および／または抗腫瘍治療が生物において有効である、もしくはそう考えられる、もしくはそうでないことを判定するための本発明のキットは、以下のものを含むことを特徴とする：
‐FADDタンパク質および／またはリン酸化p38-MAPKと特異的に結合しうる少なくとも1つの化合物、および／またはこのような化合物を生成しうる少なくとも1つの生物学的単位、この少なくとも1つの化合物または生物学的単位は可能性としては生理的緩衝液中に含まれ、および／または可能性としては固体支持体と結合している、ならびに
‐FADDタンパク質および／またはリン酸化p38-MAPKを、インビボ腫瘍が存在しないことのマーカーとして用いるための適切な指示書。
【０１１６】
FADDおよび／またはリン酸化MAPKと特異的に結合しうる化合物とは、本明細書において、この化合物を抗体-抗原型反応に適した条件下においた場合に、この化合物がその標的とは抗体-抗原型の結合反応を示しうるが、同じ条件下で、この化合物が動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、最も好ましくはヒト細胞の他の非標的分子化合物とは抗体-抗原型の明らかな反応を示さないことを意味する。このような特異的化合物は、MAPキナーゼファミリーの他のタンパク質、および、FADDタンパク質のデスドメインと相同なデスドメイン（相同性が80％またはそれ以上、好ましくは70％またはそれ以上、最も好ましくは60％またはそれ以上）を有するタンパク質とは交差反応しないことが好都合である。
【０１１７】
抗体-抗原型反応に適した条件の例には、タンパク質の検出および／または定量のための標準的なアッセイ条件、例えば、標準的ELISA条件、免疫（組織）化学条件、標準的ウエスタン／ドット／スロットブロット条件（例示的な免疫化学およびウエスタンブロット法の標準的手順については以下の実施例を参照、同じくHarlowら（「抗体-実験マニュアル（Antibodies - A Laboratory Manual）」、Cold Spring Harbor Laboratory、1988、Edward HarlowおよびDavid Lane編も参照のこと、その全体は参照として本明細書に組み入れられる；Les Editions Inserm. 1987. 「免疫学の技法、免疫酵素学の技法（Techniques en Immunologie. Techniques Immuno-enzymatiques）」、Th., Terninck & S., Avrameas.、「タンパク質科学における最新プロトコール（Current Protocols in Protein Science）」、Coligan John E.ら編、2001. John Wiley & Sons Inc.；および「免疫学における最新プロトコール（Current Protocols in Immunology）」、Coligan John E.ら編、2001. John Wiley & Sons Inc.、これらの全体は参照として本明細書に組み入れられる）。
【０１１８】
前記検出および／または定量のためには、前記試料を膜もしくはチップなどの固体支持体上に固定化してもよく、または凍結および切断して切片にしてもよい。
【０１１９】
または、分析中の試料に前記結合化合物の標的があることを検出するために当業者はFACS分析を用いることもできる（例えば、「細胞測定における最新プロトコール（Current Protocols in Cytometry）」、J. Paul, Robinson編、2001. John Wiley & Sons Inc.を参照、その全体は参照として本明細書に組み入れられる）。例えば、分析しようとする細胞の透過化処理を行い、標的抗原の細胞内検出のために用いることもできる。
【０１２０】
このような特異的化合物には特に、FADDタンパク質および／またはリン酸化p38-MAPKに対して特異的な抗体が含まれる。さらに、前記バイオテクノロジー的単位を、このような抗体を産生しうるハイブリドーマとして用いることができる。この抗体は一価抗体でも二価抗体でもよく、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。このような抗体の例には、Santa Cruz Biotechnology社によって製品照会番号MC19として販売されているポリクローナルヤギ抗FADD IgG、およびCell Signalling Technology社から販売されている抗ホスホ-p38-MAPK（thr180／tyr182）抗体と、ポリクローナルヤギ抗FADD IgG（M-19 - 以前の照会番号はref. MC-19-）Santa Cruz Biotechnology ref. sc-6036；ポリクローナルヤギ抗FADD IgG（N-18）Santa Cruz Biotechnology ref. sc-1172；ポリクローナルウサギ抗FADD IgG（125-140）Calbiochem ref. 341282；ポリクローナルウサギ抗ホスホ-p38-MAPK（thr180／tyr182）Cell Signalling Technology ref. 9211が含まれる。
【０１２１】
その他のこのような抗体は、当業者により、例えば、Harlowら（「抗体-実験マニュアル（Antibodies - A Laboratory Manual）」、Cold Spring Harbor Laboratory、1988、Edward HarlowおよびDavid Lane編）（その全体は参照として本明細書に組み入れられる）に記載されたように、当技術分野における標準的方法に従って作製することができる。
【０１２２】
このような抗FADDおよび／または抗ホスホ-p38-MAPK特異的抗体はモノクローナル抗体であってもよい。診断用途のためには、モノクローナル抗体の方が好ましい。適切なモノクローナル抗体は、KohlerおよびMilstein、1975（Nature 256: 495-497「規定の特異性を備えた抗体を分泌する融合細胞の連続培養（Continuous cultures of fused cells secreting antibodies of predefined specificity）」）（その全体は参照として本明細書に組み入れられる）に記載されたものなどの、従来の技法によって作製することができる。適切なモノクローナル抗体の例には、例えば、MBL International Corporation（200 Dexter Ave. Suite D Watertown, MA 02472, USA）によって販売されている抗FADD mAb［製品照会番号M033-3（1F7、マウスIgG1）およびMO35-3（4G3、マウスIgG1）］が含まれる。
【０１２３】
このような化合物は、このようなポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体または二重特異性抗体（diabody）の断片または誘導体でもよいが、ただし前提条件として、この断片または誘導体は、以上に定義した通りの抗FADDおよび／または抗ホスホ-p38-MAPK特異性を保持している。このような断片の例には特に、F(ab')2断片、Fab断片、Fv断片が含まれる。このような誘導体の例には特に、一価および二価の一本鎖抗体（scFv）、ジスルフィド結合安定化Fv抗体断片（dsFv）、二重特異性dsFv-dsFv'構築物が含まれる。
【０１２４】
このような抗FADDおよび／または抗ホスホ-p38-MAPK特異的化合物は、例えば、
i.‐FADDタンパク質および／またはリン酸化p38-MAPKに対する動物の免疫処置、
‐このようにして産生された抗体の採取、ならびに
‐上記のようにFADDおよび／またはリン酸化p38-MAPKと結合するが他の内因性タンパク質とは交差反応しない、抗マウスFADD（M-19）Santa Cruz Biotechnology ref. sc-6036および／または抗ヒトFADD（125-140）Calbiochem ref. 341282および／または抗マウスおよびヒトホスホ-p38-MAPK Cell Signalling Technology ref. 9211などの抗FADDおよび／または抗ホスホ-p38-MAPK抗体と競合する抗体の単離により、または
ii.‐このような抗FADDおよび／または抗ホスホ-p38-MAPK特異的抗体のFv、FabまたはF(ab')2断片の単離により、または
iii.‐このような抗FADDおよび／または抗ホスホ-p38-MAPK特異的抗体のCDR断片を、抗体骨格の構造を有する分子構造に対して接枝（graft）することにより、または
iv.‐大腸菌などの宿主細胞に、このような抗FADDおよび／もしくは抗ホスホ-p38-MAPK特異的抗体の、このようなFv、FabもしくはF(ab')2断片の、またはこのような接枝分子構造の、ポリヌクレオチド配列を機能的にクローニングして、前記ポリヌクレオチド配列の転写および翻訳を通じてこの宿主細胞によって産生された産物を回収することにより、入手しうる。
【０１２５】
動物に腫瘍が存在するか否か、および／または試験的な抗腫瘍治療が有効であるか否かを判定するための本発明の前記キットは、前記少なくとも1つの結合化合物とその標的との結合の検出のために適した検出用標識も含みうる。
【０１２６】
このような検出用標識の例には、例えば、結合性化合物と結合させうる蛍光性標識または放射性標識が含まれる。
【０１２７】
その他の例には、前記結合性化合物と結合しうる二次抗体、例えば、このような結合をECL基質上でのインキュベーション後に可視化しうる西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗体（Amersham Pharmacia Biotech）、または、このような結合をFast-red基質（Acros organics）上のアルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジン（Amersham Life Science）とのインキュベーション後に可視化しうるビオチン化結合二次抗体（Vector）などが含まれる。
【０１２８】
本発明のすべての方法、キットおよび使用において、FasLタンパク質（その発現は腫瘍の発達に伴って増大する）の細胞量を、FADDタンパク質および／またはリン酸化p38-MAPKの細胞量の検出に加えて測定することが、非腫瘍性であるがそれ以外の点では同等な条件下で観察される標準的正常FasL細胞量に比してこの量が増加するか否かを判定し、それによって生物に腫瘍が存在するか発達中であることを、および／または試験的な抗腫瘍治療が有効でないことを、および／または被験化合物がインビボ腫瘍誘導活性を有する可能性が高いことを、および／または化合物が抗腫瘍活性も抗有糸分裂インビボ活性も有しないことを確認するために好都合である。
【０１２９】
以下の実施例は例示を目的として提供するものであり、本発明の範囲を限定することを意図してはいない。それらは、当業者にとって明らかな本発明のさまざまな態様および利点を示している。これらの実施例においては、以下の図に対する言及がなされる。
【０１３０】
実施例1：腫瘍が甲状腺腺腫／腺癌非ヒト哺乳動物モデルで発達する時には、FADD発現が消失し（FADD mRNAは消失しない）、それと相関してリン酸化p38-MAPKが減少する
Fasカスケードの分子のいくつかの検出には多数のアーチファクトの可能性があり、議論も存在するため、本発明者らは、インビボ腫瘍モデルにおいてFasカスケードの多数のシグナル伝達分子の存在について検討すること、ならびに3種類の技法（半定量的RT-PCR、ウエスタンブロット法および免疫組織化学）を組み合わせてmRNAおよびタンパク質の両方を検出して定量すること、およびタンパク質を発現する細胞の位置を特定することを選択した。
【０１３１】
本発明者らが選択したインビボ腫瘍モデルは、gspトランスジェニックマウスである。甲状腺において、グアニンヌクレオチド刺激因子（Gs）はチロトロピン刺激に応答してアデニル酸シクラーゼを活性化し、サイクリックAMPレベルの上昇およびその後の甲状腺細胞増殖をもたらす。Gs因子のαサブユニットの変異（gsp変異）はアデニル酸シクラーゼの構成的な活性化をもたらし、これはヒト甲状腺中毒性腺腫の約30％およびヒト甲状腺癌の10％で認められる。マウス甲状腺上皮細胞を対象として変異型のGsαサブユニットを発現するトランスジェニックマウス（gspトランスジェニックマウス）は、ヒト甲状腺腫瘍を研究するための強力なモデルである。これらのマウスは8カ月齢までは何ら異常がなく、その後に過形成が生じ、続いてマウスの遺伝的背景に応じて過機能性甲状腺腺腫（Michiels、1994、PNAS Vol. 91 pp. 10488-10492）または腺癌を発症する。
【０１３２】
本発明者らの結果は、非トランスジェニック（NTG）マウスの正常TFCが、トランスジェニックマウスの病的でない腺と同じく、FasL分子を発現しないことを示している。これに対して、腫瘍発達の際にはFasL発現が獲得され、腺腫／腺癌の方が過形成甲状腺よりも発現が高度であった。腫瘍細胞上でのこのFasLのアップレギュレーションは、Fasシグナル伝達経路の諸分子のダウンレギュレーションと相関していた。Fas受容体の3種類のアダプターのうち、FADDのみが高度に調節されていた。特に本発明者らは、腺腫／腺癌において内部にFADD mRNAは存在するものの、FADDタンパク質の発現は極めて弱いか完全に消失していることを見いだした。さらに、本発明者らは、甲状腺細胞のインビトロモデルを用いることにより、FADDの非存在下ではFas-シグナル伝達がより迅速な細胞増殖（これは特定のDaxxシグナル伝達によるように思われる）を引き起こすことを見いだした。
【０１３３】
材料および方法
マウス
gspトランスジェニックマウスについては別に記載されている（Michiels、1994、前記に引用した参考文献）。CBA／J雌性マウスをIffa Credo（L'Arbresle、France）から購入し、7〜10週齡の時点ですべての実験に用いた。マウスはすべて、食物および水を自由に摂取しうる標準的な環境条件下で飼育し、実験の1週間前から環境に順応させた。腺腫／腺癌発達はT４およびT３血清レベルの測定によってモニターした。
【０１３４】
初代甲状腺細胞の培養
甲状腺組織を対照CBA／J雌性マウスから入手した。マウスを屠殺し、混入性の白血球を除去するための心腔内穿刺後に2つの甲状腺葉を切り出した。採取した葉を37℃の1.5mg／mlコラゲナーゼH（Boehringer Mannheim）溶液中で30分間消化処理した。続いて甲状腺細胞を、5％ウシ胎仔血清、100U／mlペニリシン（Life Technologies）、100μg／mlストレプトマイシン（Life Technologies）および5.10-5 2-メルカプトエタノールを添加した37℃のRPMI 1640培地（Life Technologies）（完全培養液）中で培養した。洗浄によって非接着細胞を除去し、TFC純培養物を得た。細胞は5〜6日間の培養後にサブコンフルエンスに達した。
【０１３５】
初代肝細胞の培養
BALB／c肝細胞の調製は、若干の変更を除いて、Mazierら、1985（Science Vol. 227 pp. 440-442）に従って行った。簡潔に述べると、コラゲナーゼ（Boehringer Mannheim、Germany）による肝臓断片の潅流によって細胞を単離し、その後に60％Percoll勾配（Pharmacia Biotech、Uppsala、Sweden）によって精製した。精製した肝細胞は、トリパンプルー色素排除試験により、少なくとも95％の生存性および純度を示した。それらを、5％FCS（Gibco）および1％ペニリシン-ストレプトマイシン溶液（100倍貯蔵液、Gibco）を添加したウィリアムE培地（Gibco、Irvine、UK）中で培養した後に、3.5％CO２雰囲気下にて37℃で24時間インキュベートした。
【０１３６】
半定量的RT-PCR
gspトランスジェニックマウスの甲状腺を腫瘍発達のさまざまな段階で採取し、500μl〜1mlの「Tri-Reagent per thyroid」（Molecular Research Center）を用いて細胞からRNAを単離した。インビトロ培養モデルに関しては、TFCを24ウェル平底プレート（Costar）中で約105個／ウェルの密度で最終容積1mlとして培養した。サブコンフルエンスに達した時点で、甲状腺細胞培養物をPBSで洗浄し、250μl／ウェルのTri-Reagentを用いて細胞からRNAを単離した。混入性のDNAはDNAse（Ozyme）処理によって除去した。逆転写はSuperscript II逆転写酵素（Life Technologies）を用いて2μgの全RNAに対して行った。続いてADNc（50ng）を、0.5U Taqポリメラーゼ（Life Technologies）を用いるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって増幅した。PCRのために用いた特異的プライマーは以下の通りとした。
FasL（425-bp）
2005513505.tif 000002
Fas（366-bp）
2005513505.tif 000003
FADD（695-bp）
2005513505.tif 000004
Daxx（478-bp）
2005513505.tif 000005
RIP（399-bp）
2005513505.tif 000006
FLICE（488-bp）
2005513505.tif 000007
FLIPL（389-bp）
2005513505.tif 000008
Bcl2（290-bp）
2005513505.tif 000009
Bcl-xl、Bad（361-bp）
2005513505.tif 000010
Bax（273-bp）
2005513505.tif 000011
対照として、βアクチン
2005513505.tif 000012
を用いた。
【０１３７】
PCR産物を2％アガロースゲルにかけ、臭化エチジウムを用いた染色によって可視化した。定量のために、cDNAの連続2倍希釈物を、アクチンプライマーを用いて25サイクルにわたって増幅した。続いて、等量のcDNAを用いたことを確認するために、同等量のβアクチンが得られるcDNAを24〜30サイクルのPCRによって増幅した。
【０１３８】
ウエスタンブロット法
gspトランスジェニックマウスの甲状腺を腫瘍発達のさまざまな段階で採取し、全タンパク質を、プロテインホスファターゼ阻害剤（1nMサイパーメトリン、30μMデフォスタチン（dephostatin）、50nMオカダ酸、20nMタウトマイシンおよび1mMオルトバナデート）を含む200μl〜1mlの可溶化バッファー（10mM Tris-HCl、150mM NaCl pH7.8、1％NP40、1mM PMSF、1μg／mlアプロチニンおよび1μg／mlロイペプチン）（Calbiochem）を用いて抽出した。インビトロ培養モデルに関しては、TFCを6ウェル平底プレート（Costar）中にて約250,000個／ウェルの密度で最終容積2mlとして培養した。サブコンフルエンスに達した時点で、甲状腺細胞培養物をPBSで洗浄し、全タンパク質を500μl／ウェルの可溶化バッファーで抽出した。試料濃度はマイクロBCAタンパク質アッセイ試薬キット（Pierce）を用いて決定した。SDS-ポリアクリルアミドゲルを用いる電気泳動を25μgの全タンパク質を用いて行い、その後にニトロセルロース（NEN）に移行させた。膜を5％乳（TBS 0.1％Tween 20中）により、室温（RT）で1時間ブロックした。特定のタンパク質は特異的一次抗体を適切な濃度で用いて検出した：抗マウスFasL（ラットIgG2a；H11）はAlexis Biochemicals社によって製造された；抗マウスFas（ウサギIgG；FL-335）；FADD（ヤギIgG；MC19）；Daxx（ウサギIgG；M112）；RIP（ウサギIgG；H-207）；カスパーゼ10（ウサギIgG；H-131）；ASK1（ヤギIgG；N-19）；SEK1／MKK4（ウサギIgG；C-20）；PTEN（ヤギIgG；N-19）；HSP27（ヤギIgG；M-20）；Apafl（ヤギIgG；N-19）；およびBcl2（ウサギIgG；Δc21）はいずれもSanta Cruz Biotechnology社から入手した；抗マウスカスパーゼ8およびBax抗体（いずれもウサギIgG）はChemicon社から入手した；抗マウスFLIP（ウサギIgG）はEuromedex社から、抗マウスカスパーゼ3プロフォーム（ヤギIgG；46）はTransduction Laboratories社から入手した；抗マウスカスパーゼ2 longおよびshort（マウスIgG1；G310-1248）およびBcl-xl（ウサギIgG）はいずれもPharmingen社から入手した；抗マウスホスホ-SEK1／MKK4（thr261）；SAPK／JNK；ホスホ-SAPK／JNK（thr183／tyr185）；MKK3；ホスホ-MKK3／MKK6（ser189／207）；p38-MAPK；ホスホ-p38-MAPK（thr180／tyr182）；Akt；ホスホ-Akt（ser473）；およびBadはいずれもCell Signalling Technology社から入手したウサギIgGである。TBS 0.1％ Tween 20で洗浄した後に、膜を西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させた二次抗体とともにRTで1時間インキュベートした。洗浄後にブロットをECL基質（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて現像した。
【０１３９】
免疫組織化学
凍結固定した5μm組織切片の免疫組織化学染色を、10μg／mlの一次抗体を用いてRTで1時間行った。ビオチン化結合二次抗体（Vector）に続いてアルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジン（Amersham Life Science）を用いた。陽性反応はFast-red基質（Acros organics）を添加することによって明らかとなった。染色の陽性および強度は、甲状腺標本に関する盲検評価によって2人が評価した。
【０１４０】
増殖アッセイ
TFCを、96ウェル平底プレート（Costar）中にて約125,000細胞／mlの密度で、クローンJo2抗Fas抗体（0.5μg／ml、Pharmingen）の非存在下または存在下で最終容積150μlとして培養した。甲状腺細胞の増殖は24時間〜120時間にわたって評価した。培養の最後の12時間には、甲状腺細胞に0.5μCiの[３H]チミジンによるパルス刺激を加えた。結果は6つのウェルの培養物の平均cpmとして表した。
【０１４１】
結果
得られた結果を以下の表1にまとめた。
（表1）正常状態から病的状態に至るまでのFasカスケード分子のmRNAおよびタンパク質のレベル
2005513505.tif 000013
-または+/-：バンド強度がゼロまたは極めて弱い
+：バンド強度が弱い、
++：バンド強度が中程度、
+++：バンド強度が強い。
【０１４２】
腫瘍発達過程でFasリガンド発現が獲得される
FasL発現はヒト甲状腺癌を含む種々の癌細胞で報告されているため、この分子の存在をマウス甲状腺腺腫および腺癌において検討した。腫瘍発達のさまざまな段階にある甲状腺を半定量的RT-PCRおよびウエスタンブロット法によって分析した。以前に記載した通り、NTGマウス由来の正常甲状腺組織からはFasL mRNAもFasLタンパク質も検出されなかった。gspトランスジェニックマウス由来の非病的甲状腺では、FasL mRNAおよびタンパク質はどの被験マウスにも存在せず（上の表1を参照、それぞれ図1Aおよび1Bも参照）、このことから導入遺伝子の発現だけではFasL分子は誘導されないことが示された。これに対して、過形成性甲状腺ではFasL mRNAおよびタンパク質が検出され、甲状腺腺腫および腺癌ではさらに高いレベルで検出された（表1ならびに図1Aおよび1B）。この結果から、罹患した葉のみがFasLに関して陽性であることが示された。さらに、可溶型のFasLが腺腫では常に検出され、膜結合型のFasLよりも強く発現されていた。これらの結果は甲状腺細胞が腫瘍発生過程でFasL発現を獲得することを示している。これに対して、RT-PCRおよびウエスタンブロット分析からは、Fas mRNAおよびタンパク質が非病的甲状腺および病的甲状腺の両者において区別されずに発現されることが示された（表1）。
【０１４３】
DaxxおよびRIPは腫瘍発達過程で連続的に発現されるが、アダプタータンパク質FADDは消失する
Fas受容体に対する3種類のアダプター分子の変化について、まず半定量的RT-PCR（表1および図2A）によって検討した。FADD、DaxxおよびRIPのmRNAはNTGおよびgspトランスジェニックマウスの甲状腺において検出可能であり、mRNA発現レベルには腫瘍増殖の経過に際して有意な変化はなかった。ウエスタンブロット分析では、高レベルのFADDタンパク質がgspマウスのすべての非病的甲状腺（3／3）および過形成性甲状腺（4／4）で検出された。注目されることに、FADDタンパク質の発現は腺腫および腺癌では極めて弱い（2／5）か完全に消失していた（3／5）（表1および図2Bパネル1）。免疫組織化学ではこれらの結果を裏づけるとともに、腺腫および腺癌ではFADDタンパク質の発現が限局領域に限定されるか完全に消失することが示された。これに対して、ウエスタンブロット法（表1および図2B）および免疫組織化学分析からは、RIPおよび約70kDa型のDaxxタンパク質がいずれもgspトランスジェニックマウスの腫瘍発達のすべての段階で発現されることが裏づけられた。腺腫／腺癌におけるDaxxタンパク質の発現には変化がないか、わずかに減少していた（図2Bパネル2）。甲状腺の腫瘍状態に関係なく、120kDa型のDaxxは核においてさえ検出不能であった。非病的甲状腺と比較して、腺腫におけるRIPタンパク質の発現は幾分増加していた（図2Bパネル3）。
【０１４４】
Daxxを介したシグナルはFADDの非存在下での主要なFasシグナル伝達経路である
以上の結果から、甲状腺腺腫／腺癌ではDaxxおよびRIPはいずれも発現されるが、FADDタンパク質は発現されないことが示された。次の段階は、DaxxおよびRIPシグナル伝達経路の下流エフェクタータンパク質を検討することである。アダプターDaxxとキナーゼ経路の中間体であるASK1タンパク質のウエスタンブロット分析により、この分子が腫瘍発達のすべての段階でgspトランスジェニックマウスの甲状腺で発現されること、およびASK1発現が腫瘍増殖時に強く増大することが示された（表1）。これに対して、RIPアダプターはカスパーゼ2の活性化に起因するアポトーシスを誘導することができる。ウエスタンブロット分析により、プロ-カスパーゼ2 long（48kDa）は検討したすべての甲状腺で、甲状腺の腫瘍状態とは関係なく高レベルに発現されていることが示された。これに対して、阻害型のカスパーゼ2（プロ-カスパーゼ2 short（35kDa）および／またはカスパーゼ2 long Proドメイン（15kDa）は腫瘍標本のみで発現されていた。Proカスパーゼ2 short（35kDa）は腺腫試料ではほとんど発現されなかったが、カスパーゼ2 long-Pro（15kDa）は高レベルに検出された（表1）。15kDa阻害型のカスパーゼ2は2つの過形成性甲状腺のうち1つで検出された。これらの結果から、RIP-カスパーゼ2経路はgspトランスジェニックマウスの腫瘍発達過程で誘導されうるが、これはこの状況での主なFas-シグナル伝達経路ではないことが示唆された。実際に、すべての腺腫は48kDaアポトーシス型のカスパーゼ2を発現したが、阻害型（35kDaおよび／または15kDa）のカスパーゼ2も同じく発現した。したがって、FADDの非存在下では、Fasシグナル伝達は主としてDaxx-ASK1経路を介して作用するように思われる。
【０１４５】
腫瘍発生時のキナーゼ経路の阻害
本発明者らはさらに、ウエスタンブロット分析により、ASK1の下流にある2つの主なキナーゼシグナル伝達経路について調べた。gspトランスジェニックマウスの甲状腺では完全なMKK3タンパク質が発現されていた。しかし、腫瘍発達時には発現が大きく低下した（表1）。活性型のキナーゼであるser189ホスホ-MKK3およびser207ホスホ-MKK6タンパク質はいずれも、本発明者らが用いた抗体によって独立に認識された。gsp甲状腺では甲状腺の腫瘍状態とは関係なく、リン酸化タンパク質が強く検出された（表1）。これらの結果から、過形成性甲状腺および腺腫では完全なMKK3はほとんど発現されず、MKK6タンパク質のみが活性化されることが示された。MKK3／MKK6の下流にあるキナーゼである総p38-MAPKの発現の平均はさまざまな群で同一であった（図3の上のパネル）。これに対して、p38リン酸化活性型の発現は腫瘍発達時に大きく低下した（図3の下のパネル）。実際、thr180／tyr182ホスホ-p38-MAPKタンパク質はgspトランスジェニックマウスのすべての非病的甲状腺において高レベルに検出されたが、この活性型のタンパク質の発現は過形成性甲状腺では弱く、腺腫では極めて弱いか認められなかった。さらに、p38-MAPK活性化の低下または非存在は総MKK3の発現の低下または非存在と相関した。ASK1による他のキナーゼ経路の活性化はSEK1／MKK4およびSAPK／JNK分子を結びつける。総SEK1タンパク質は腫瘍発達のすべての段階でgspマウスの甲状腺で検出されたが、発現レベルは腺腫の方が非病的甲状腺および過形成性甲状腺よりも高かった。これに対して、thr261ホスホ-SEK1活性型は非病的甲状腺の方が過形成性甲状腺または腺腫よりも強く発現された（表1）。総およびthr183／tyr185ホスホ-SAPK／JNKタンパク質の発現レベルはすべてのマウス群で同程度であったが、リン酸化タンパク質の見かけの分子量は非病的甲状腺の方が罹患甲状腺よりも高かった（表1）。これらの結果から、SAPK／JNKタンパク質は非病的甲状腺ではthr183部位およびtyr185部位の両方でリン酸化されるが、過形成性甲状腺および腺腫ではホスホ-SEK1依存的なthr183リン酸化が起こらないために一リン酸化されることが示唆された。SAPK／JNKの二リン酸化はキナーゼ活性のために必要であるため、これらの結果から、ASK1／SEK1／JNK経路ならびにASK1／MKK3／p38-MAPKシグナル伝達経路が腫瘍発達時には強く阻害されることが示された。
【０１４６】
インビトロ培養した甲状腺細胞はFADDタンパク質を発現しなかった
本発明者らは研究の過程で、正常な非トランスジェニックTFCのインビトロ培養を行い、Fasシグナル伝達経路の分子の存在を半定量的RT-PCRおよびウエスタンブロット分析によって検討した。驚くべきことに、培養甲状腺細胞においてFADD mRNAは発現されていたものの（図4A）、FADDタンパク質は検出されなかった（図4B）。さらなる検討により、コラゲナーゼHによる甲状腺組織の解離によってFADDタンパク質の発現の消失が誘導されること（図4B）、およびFADDタンパク質はその後は検出されず、10日間の培養後にも検出されないことが示された。以上の結果から、FADDタンパク質の消失が培養甲状腺細胞に固有の性質であるか、それとも一般化されたFADDタンパク質発現調節機構であるかを把握することが重要となった。肝細胞を甲状腺細胞と比較するために選択したが、これはそれらが上皮細胞であり、肝臓組織は甲状腺組織と同様に培養前にコラゲナーゼH処理を必要とするためである。エクスビボ肝臓、コラゲナーゼH処理した肝細胞およびインビトロ培養した肝細胞に対してウエスタンブロット分析を行った。エクスビボ肝臓はエクスビボ甲状腺と同様にFADDタンパク質を発現した（図4C）。しかし、TFCとは異なり、コラゲナーゼH処理した肝細胞およびインビトロ培養した肝細胞のウエスタンブロット法では、FADDタンパク質の存在が示された（図4C）。これらの結果から、FADDタンパク質の発現の喪失は甲状腺上皮細胞に限局していること、およびこのインビトロ培養系を甲状腺細胞によるFADDタンパク質発現調節の結果を解明するために用いうる可能性が示唆された。
【０１４７】
FADDの非存在下でのFasシグナル伝達はTFC増殖を増強する
FADDタンパク質の非存在でのFas／FasL相互作用の生物学的結果を評価するために、甲状腺細胞を抗Fas抗体の存在下および非存在下で培養し、甲状腺細胞の増殖を集密化に至るまで毎日評価した。図5は、24時間の処理後に、対照TFCおよび抗Fas処理TFCの増殖の間に有意差がみられなかったことを示している。それ以後、抗Fas抗体は、処理しなかったTFCに比してTFCの増殖を促進した。さらに、抗Fas抗体によって誘導される増殖は48時間、72時間および96時間の処理後には有意に増加した（それぞれ37％（p＜0.02）、49％（p＜0.05）および61％（p＜0.001））。培養物が集密に達した場合、対照TFCと抗Fasで処理したTFCの増殖の間にはそれ以上の差は検出されなかった（120時間の処理の後）。
【０１４８】
考察
マウス甲状腺濾胞細胞（TFC）のインビボでのトランスフォーメーション過程の際にFas／FasL経路に関与する多数の分子の発現を、複数の補完的な技法を用いることによって調べた。本発明者らは、非病的TFCから過形成性結節および腺腫または腺癌へのトランスフォーメーション過程の際に、1）FasL発現が増大する、2）FADDタンパク質は消失するがFADD mRNAは消失しない、3）FADDの非存在下でのFasシグナル伝達はDaxxを介したシグナルをもたらすがRIPを介したシグナルはもたらさない、4）FADDタンパク質の消失はp38-MAPKの不活性化状態と相関する、5）FADDの非存在下でのFasシグナル伝達はTFC増殖を促進する。これは、FADDタンパク質の自然消失を現実のインビボでの病的結果と関連づけた初の事例である。マウスでは、TFCを対象とする変異型のGsαサブユニットのトランスジェニック発現によって腺腫または腺癌が誘導される。これらのマウスでは、病変が8カ月齢前後から始まり、甲状腺腫瘍がその後に発生する。このような腫瘍発生を説明しうると考えられる病的イベントを解明するために、本発明者らはFas／FasL発現ならびにFasシグナル伝達分子を対象とした。実際、FasL発現は細胞にとって二重の利点があると考えられる。第1に、腫瘍細胞上でのFasL発現により、Fas受容体を発現する浸潤性リンパ球の排除が可能になると報告されている（カウンターアタックモデル）。第2に、Fas／FasL相互作用はFas標的細胞の細胞死を促進するだけでなく、同じFas＋細胞の増殖も賦活しうるという新たな概念が最近登場している。このため、腫瘍細胞上でのFasL発現は、侵襲性の細胞傷害性リンパ球のアポトーシスを誘導することにより、およびFas／FasL相互作用を介して自らの増殖を賦活することにより、これらの細胞に対して二重の利点を付与する。しかしながら、Fasによって媒介される増殖シグナルの伝達を維持しながら、細胞死シグナルを遮断するために腫瘍細胞で起こる調節機構についてはほとんど解明されていない。
【０１４９】
腫瘍発生時のFasL発現の増大がFADDタンパク質の消失と同時に起こるという事実は、FADDが存在しないことにより、腫瘍細胞が、Fas／FasLの共発現によって誘導されると考えられる自殺を免れることが可能になることを示唆する。
【０１５０】
gspトランスジェニックマウスにおいて、本発明者らの結果は、FADDタンパク質が腫瘍抑制機能を有する可能性を示した。実際に、FADDの非存在下でTFCにおけるFasシグナル伝達はアポトーシスではなく細胞増殖を促進するように思われる。事実、甲状腺細胞の培養モデルにおいて、本発明者らの結果は、FADDの非存在下での抗Fas抗体によるTFCの刺激が、非刺激細胞と比べてこれらの細胞の増殖亢進をもたらすことを示した。さらに、これらの結果は、甲状腺特異的FasLトランスジェニックマウスから単離したFasLを発現するTFCの増殖率が、非トランスジェニック培養甲状腺細胞よりも高いことによって裏づけられた。本発明者らの結果は、FADD発現の消失と同時に起こるFasLの増大が、甲状腺腫瘍細胞に対して複数の利点を付与すると考えられることを示している：1）Fasを介した細胞死に対する高度の抵抗性、2）Fasシグナル伝達を介した増殖の誘導、3）浸潤性リンパ球の排除の可能性。
【０１５１】
FADDはさまざまな細胞死受容体に共通するシグナル伝達分子である。TNFによるTNFR1（腫瘍壊死因子（TNF）受容体1）の刺激はアダプターTRADD（TNFR関連デスドメイン）の動員をもたらし、これは続いてFADDおよびTRAF2（TNFR関連因子2）と結合しうる。FADDタンパク質は甲状腺腺腫および腺癌では発現されないため、TNF刺激はTRAF2依存的な伝達シグナルのみをもたらすと考えられる。さらに、FADD欠乏性の胚性線維芽細胞はTNFR1により誘導されるアポトーシスに対して抵抗性であることが示されており、このことはFADDがTNFを介した細胞死に必須であることを示唆している。実際、本発明者らのインビトロ甲状腺細胞培養モデルにおいて、本発明者らは、FADD欠乏性のTFCがTNFαを介した細胞死に対して抵抗性であることを見いだしており、このことはgspトランスジェニックマウスが、Fasにより誘導されるアポトーシス抵抗性だけでなくTNFR1により誘導されるアポトーシス抵抗性も獲得するという概念を裏づける。DR3はTNFR1に類似しており、APO3L刺激によって同様のシグナル伝達分子を活性化することから、FADDはDR3（細胞死受容体3）誘導性アポトーシスにも必要である。TRAIL（TNF関連アポトーシス誘導リガンド）は腫瘍細胞の排除と関連づけられている。これらの細胞において、2種類の細胞死受容体、DR4（TRAIL-R1）およびDR5（TRAIL-R2）はアポトーシスシグナルを伝達しうる。TRAILを介した細胞死にFADDが必要であることは、DR4またはDR5が安定的にトランスフェクトされたFADD欠乏性の胚性線維芽細胞を用いて示された。さらに、初代甲状腺細胞ならびに甲状腺乳頭状癌に由来する細胞株KAT5は、DR4およびDR5を発現するが、TRAIL誘導性アポトーシスには抵抗することが示されている。これらのデータはいずれも、Fas、TNFR1、DR3、DR4およびDR5によって誘導されるアポトーシスがFADD分子を必要とすることを示しており、このことは、腺腫または腺癌が発達中のgspトランスジェニックマウスではこれらの細胞死経路がいずれも遮断されているという可能性を意味する。すなわち、FADDの欠乏は、細胞死受容体により誘導されるアポトーシスに対する複数の抵抗性を腫瘍細胞に付与し、複数の増殖経路への機会をもたらすと考えられる。
【０１５２】
Fasを介したシグナル伝達は、3種類のアダプターを通して作動すると考えられる。FADDの非存在下では、DaxxおよびRIPタンパク質のみがFasを介したシグナルを伝達することができる。しかし、本発明者らは本明細書において、RIPシグナル伝達はFADD欠乏性の甲状腺では誘発されないこと、およびASK1中間体の発現が腺腫／腺癌では大きく増大するが、その結果としてp38-MAPKまたはJNK経路の活性化は起こらないことを示した。Daxxは現在もあまり解明されていない分子であるため、本発明者らはFADDの非存在下でFasにより誘導されるTFCの増殖機構に関して3つの仮説を立てた：1）Daxxシグナル伝達は、MKK3、MKK6およびSEK1／MKK4活性化の均衡を調節することにより、細胞増殖の直接の要因となる、2）Daxxは現時点では未知の細胞増殖伝達経路に導くアダプタータンパク質である、3）Daxxはこの現象とは関係せず、Fas受容体に対する現時点では未知のアダプターが増殖シグナルを伝達する（図6の概略図を参照のこと）。
【０１５３】
Fasの結合に応答した増殖の活性化は、これまでにさまざまな細胞種で記載されている。正常Tリンパ球集団におけるFas結合の結果は過去の抗原刺激に依存する。実際、Fas結合後には記憶CD4＋T細胞の増殖が誘導されるが、ナイーブCD4＋T細胞はインビトロでもインビボでもアポトーシスを起こす。ヒト皮膚線維芽細胞では、アポトーシスまたは増殖の誘導はFas受容体の発現レベルに依存する。抗Fas抗体はFas低発現性の線維芽細胞の増殖を促すが、抗Fas処理は炎症性皮膚に類似したFas高発現性線維芽細胞のアポトーシスを誘発する。さらに驚くべきことに、Fasを介したアポトーシスへの感受性が高い細胞である肝臓では、Fas結合が劇症肝炎を誘発する代わりにインビボ部分肝切除術後の臓器再生を促進しうる。これらのデータはいずれも、Fasを介したシグナルが、細胞の種類および環境条件に依存してアポトーシスまたは増殖のいずれかを引き起こしうることを示している。腫瘍細胞において抗Fasにより促進される細胞増殖は少数例報告されており、血液性腫瘍のほかに非血液性腫瘍にもかかわる。ヒト甲状腺癌細胞では、FasおよびFasLの両方が発現されるが、Fasの架橋によってカスパーゼ8の動員および活性化を誘導することは成功しなかったことが報告されている。このような細胞におけるFADDタンパク質の存在を検討することは、この分子の消失によってFasを介した細胞死に対する抵抗性および腫瘍細胞の高度の増殖を説明しうると考えられることから、興味深いと考えられる。
【０１５４】
さらに全体的なアプローチでは、FADD発現を、FasおよびFasL分子を発現するがFas誘導性アポトーシスに対して抵抗性である、あらゆる種類の癌において検討することもできる。真核細胞では、mRNAの翻訳は主としてキャップ依存性機構に起因し、これは真核生物開始因子4（eIF4）ファミリーのタンパク質と関連づけられる。多タンパク質複合体であるeIF4Fはm７GpppNキャップ構造を認識してmRNAのリボソームスキャニングを開始させることができる。これに対して、少数のmRNAはキャップ非依存的な機構によって翻訳される。この場合には、リボソームの進入が、内部リボソーム進入配列（IRES）と呼ばれるmRNAの5'末端にある特定の領域で起こる。このようなmRNAプロセシングを行うIRESは哺乳動物で報告されており、細胞増殖の制御と関連づけられている。その中でも、c-myc mRNAはキャップ依存的機構によってもキャップ非依存的機構によっても翻訳される。TRAILによって誘導されたHeLa細胞のアポトーシスの際には、IRESを介してc-myc mRNAの翻訳が起こること、およびp38-MAPKシグナル伝達経路がこのキャップ非依存的な翻訳に関係することが示されている。注目されることに、thr180／tyr182ホスホ-p38-MAPKの発現パターンはFADDのものと非常に類似している（図2Bおよび図3）。実際に、ホスホ-p38-MAPKおよびFADDタンパク質は非病的gsp甲状腺において発現され、いずれのタンパク質も腺腫／腺癌には存在しない。重要なこととして、キャップ部位はFADD mRNAには認められなかった。このことは、c-mycと同じように、FADD mRNAのキャップ非依存的翻訳の調節はp38-MAPK経路の活性化を介して起こることを示唆する。甲状腺腫瘍細胞において、p38-MAPKシグナル伝達の阻害は、いずれもアポトーシスに関与するFADDおよびc-mycを含め、キャップ非依存的なmRNA翻訳の遮断を招くと考えられる。これらのタンパク質、特にFADDの発現が存在しないことは、FasLシグナル伝達を細胞死経路から増殖経路へと逸脱させることにより、癌進行の一因となりうる。本発明者らのデータは、甲状腺腫瘍の発生におけるFas／FasL経路の新たな役割を示唆している。FADDタンパク質の非存在下、しかしながらFas分子およびFasL分子の存在下において、甲状腺細胞は、Fasおよび他の細胞死受容体を介したアポトーシスに対する高度の抵抗性、Fas／FasL相互作用を介した自らの増殖の賦活、ならびに免疫エスケープを可能にする浸潤性リンパ球へのカウンターアタックを含む、数多くの利点を有すると考えられる。
【０１５５】
FADDタンパク質の発現がいかにして消失するかの解明は、新たな治療アプローチを予想することを可能にする。実際、FasL＋甲状腺細胞におけるFADD機能の回復は、Fasを介した細胞死に対する高度の感受性を誘導するとともに、これらの細胞のFas誘導性増殖を抑制し、腫瘍縮退をもたらすと考えられる。さらに、今回の結果は、FasL発現および／またはアポトーシス誘導薬に対する高度の抵抗性が報告されているという、大部分の癌に共通する特徴を反映している可能性がある。
【０１５６】
実施例2：FADDタンパク質は正常甲状腺葉（腫瘍発達のモデル）から放出される
腫瘍細胞がFADDタンパク質の発現を喪失していることをさらに示すために、FADDタンパク質の消失に関するこのインビトロモデルにおけるこの翻訳後改変の基礎にある機序を探索する目的で、非担癌マウスから採取した正常甲状腺葉のインビトロ培養物に対して実験を行った。
【０１５７】
A．材料および方法
正常甲状腺葉のインビトロ培養：
非担癌マウス（Iffa Credo、L'Arbresle、Franceから購入したCBA／J雌性マウス）の正常甲状腺葉を採取し、直接分析するか（時点0のエクスビボ試料）、またはRPMI培地（RPMI 1640培地61870-010、Life Technologies）中で2分間から4時間までのさまざまな期間にわたってインキュベートした（2分；5分；10分；15分；30分；45分；1時間；4時間）。
【０１５８】
抗体：
用いた一次抗マウスFADD抗体（ヤギポリクローナルIgG）は、N末端（N-18、sc-1172、ロットH231、Santa Cruz Biotechnology）またはC末端（M-19 -以前の照会番号はref. MC-19-、sc-6036、ロットG 199、Santa Cruz Biotechnology）に対して特異的なものとした。この検討に用いた以下の対照AbはヤギポリクローナルIgG（Vector、BA-1000）とした。
【０１５９】
免疫組織化学法に関しては、ビオチン化ウサギ抗ヤギIgG（Vector、BA-5000）を二次Abとして用いた。ウエスタンブロット法およびELISA法に関しては、ペルオキシダーゼで標識した抗ヤギIgG（Ref. A5420；Sigma-Aldrich、Saint Quentin Fallavier、France）を二次抗体として用いた。
【０１６０】
免疫組織化学：
甲状腺葉を採取し、直ちに最適温度の培地（Tissue-Tek；Bayer、Elkhart、IN）で覆った上で、液体窒素上でイソペンタン中に浮遊させることによって緩徐に凍結させ、切断時まで-80℃で保存した。5〜7μmの切片を-18℃でクリオスタットにより作製し、SuperFrostplusスライド（Roth Sochiel、Lauterbourg、France）上に収集した。切片を一晩乾燥させ、使用時まで-80℃で保存した。染色の前に切片をアセトン中にて10分間固定し、10％正常ウマ血清の存在下で0.05M TBS、pH7.6中にて20分間インキュベートした上で、適切な一次Ab（10μg／ml）によって染色した（45分間）。ビオチンを結合させた二次Abは1μg／mlで用いた（30分間）。アビジン-アルカリホスファターゼ（Sigma、St. Louis, MO）第3段階（30分間）およびFastRed基質（Acros Organics、Noisy-Le-Grand、France）を特異的染色の可視化のために用いた。切片をヘマラム（Fisher Scientific、Pittsburgh、PA）で対比染色し、水性マウント（Aquatex；Merck、West Point、PA）中にマウントした。
【０１６１】
ウエスタンブロット法：
指定時点に上清を採取し、マイクロBCAタンパク質アッセイ試薬キット（Pierce、Rockford、Illinois）を用いてタンパク質濃度を測定した上で、使用時まで-20℃で保存した。甲状腺葉をPBSで洗浄し、全タンパク質を、プロテインホスファターゼ阻害剤の混合物を含む、可溶化バッファー（10mM Tris-HCl、150mM NaCl pH7.8、1％NP40、1mM PMSF、1μg／mlアプロチニンおよび1μg／mlロイペプチン）によって抽出した（Calbiochem-Novabiochem Corp., La Jolla、California）。
【０１６２】
いくつかの実験については、NP40 1％（Sigma-Aldrich、N-3516、Saint Quentin Fallavier、France）の代わりに、Triton 1％（Sigma-Aldrich、X-114、Saint Quentin Fallavier、France）またはChaps 2％（Sigma-Aldrich、C-9426、Saint Quentin Fallavier、France）を用いた。
【０１６３】
試料濃度をマイクロBCAタンパク質アッセイ試薬キット（Pierce、Rockford、Illinois）を用いて決定し、甲状腺葉または上清培養から入手したそれぞれ40μgまたは20μgの全タンパク質をSDS-PAGEにかけた上で、ニトロセルロース（NEN Life Sciences、Boston、Massachusetts）に移行させた。ブロッティングの後に、5％乳を含むTBS 0.1％Tween（登録商標） 20中に0.2μg／mlで用いた特異的一次抗FADD抗体（M-19、sc-6036、Santa Cruz Biotechnology）により、4℃で一晩かけて膜のプローブ検索を行った。ペルオキシダーゼ標識した抗ヤギIgG二次抗体を1:15,000希釈で用い、タンパク質を高感度化学発光法（Amersham Pharmacia Biotech）によって可視化した。
【０１６４】
ELISA法によるマウス上清中のFADDの検出：
平底マイクロタイタープレート（Costar、n゜3590）を50μlの上清（5μg／ml）によって4℃で一晩かけてコーティングした後に、PBS-Tween 20で4回洗浄した。空いた状態のタンパク質結合部位を、PBS-2％BSAを添加して室温（RT）で2時間おくことによってブロックした。PBS-Tween（登録商標） 20でさらに3回洗浄した後に、抗FADD（M19）抗体（1μg／ml、PBS-Tween 20-2％BSA中）を4℃で添加し、RTで2時間おいた。プレートをPBS-Tween（登録商標） 20で十分に洗浄した後に、PBS-Tween（登録商標）-BSA中にある1:40,000ペルオキシダーゼ結合抗ヤギIgG抗体（Sigma）を添加して室温で1時間おき、基質添加（TMB（3,3',5,5'-テトラメチル-ベンジジン）、Sigma ref. T-8665）によって比色反応を呈色させた。プレートを、Titertek（登録商標） Multiscan分光光度計（Dynatec MR5000、Guyancourt、France）を用いて450nmで読み取った。
【０１６５】
B．結果：
培養正常甲状腺葉の免疫組織化学：
インビトロ培養した正常甲状腺葉はインビトロ培養中にFADD発現を放出し、それにより、腫瘍発生のインビトロモデルとなる。このため、これらの培養物を免疫組織化学によって分析し、図8に示した図式的定義に従ってFADDの局在を評価した。
【０１６６】
a．C末端ターゲティング
第1の実験は抗FADD M-19（ヤギポリクローナル抗体）を一次抗体として用いて行った。このAbはFADDタンパク質のC末端部分を標的とする。
【０１６７】
エクスビボ甲状腺（時点0）：
M-19 Abの濃度が10μg／mLの場合、ピクノティック（picnotic）標識および濃い濾胞標識が核を取り囲む。《ピクノティック》標識とは、本明細書において、標的タンパク質の小胞性局在を惹起する粒状標識のことを意味する。
【０１６８】
2分時点の甲状腺：
ピクノティック標識および濃い濾胞標識が核を取り囲む。
【０１６９】
5分時点の甲状腺：
標識はエクスビボおよび2分時点の甲状腺で観察されたものよりも薄い；濾胞性の程度は少なく、より間質性であるように見える。
【０１７０】
10分時点の甲状腺：
核周囲の標識は薄くなり、ピクノティック性ではなくなる。膠質または間質空隙に存在する傾向がある。
【０１７１】
15分時点の甲状腺：
標識は非常に薄くなる。ピクノティック標識は核周囲から消失し、この時点では膠質が標識されるようになる。
【０１７２】
30分時点の甲状腺：
培養細胞はエクスビボ時点に戻ったように見え、核を取り囲むピクノティック標識を伴うが、それは幾分拡がっており、この「30分時点の甲状腺」の場合には間質空隙および膠質も標識される。
【０１７３】
1時間時点の甲状腺：
標識は30分の時点よりも薄くなる。ピクノティック標識は核周囲では弱く見えるが、膠質または間質レベルでは再び見いだされる。このことは培養細胞がFADDタンパク質の外分泌を再開する機序の裏づけとなる。
【０１７４】
b．N末端ターゲティング：
第2の実験は、FADDタンパク質のN末端部分を標的とするAbである抗FADD N-18を用いて行った。
【０１７５】
エクスビボ甲状腺（時点0）：
N-18 Abの濃度が10μg／mLの場合、標識は濾胞性およびピクノティック性である。標識強度は、C末端を標的とするM19 Abを用いて観察されたものよりも高度である。
【０１７６】
5分時点の甲状腺：
標識はエクスビボ甲状腺で観察されたものよりもはるかに薄い。このことは、FADDタンパク質が消失する速度が非常に迅速であるという見方を裏づける。標識はびまん性であってピクノティック性ではなく、間質空隙に位置する。
【０１７７】
10分時点の甲状腺：
標識は極めて薄く、濾胞外および間質性である；これはピクノティック性ではなく、膠質中には標識がみられない。
【０１７８】
15分時点の甲状腺：
濾胞性（非ピクノティック性）標識は10分時点よりも高度であるように見えるが、全体的な標識は非常に薄いままである。
【０１７９】
30分時点の甲状腺：
若干のピクノティック標識が濾胞を取り囲む。標識は濾胞外性であり、エクスビボ時点よりも薄い。
【０１８０】
1時間時点の甲状腺：
甲状腺は全く標識されなくなる。
【０１８１】
c．C末端およびN末端の両方のターゲティング：
第3の標識実験は、C末端を標的とするAb M-19およびN末端を標的とするAb N-18（各抗体とも10μg／mL）の両方の混合物を用いて行った。
【０１８２】
エクスビボ甲状腺（時点0）：
各抗体の濃度が10μg／mLの場合、標識強度は極めて高度である。標識は濾胞性であり、極めてピクノティック性に見える。
【０１８３】
5分時点の甲状腺：
標識はエクスビボ時点よりも薄いが、依然として濾胞性およびピクノティック性である。標識は間質性には見えず、むしろいくつかの濾胞に関しては濾胞内性に見える。
【０１８４】
10分時点の甲状腺：
標識は5分時点よりも薄く、主として濾胞性である。事実上、ピクノティック標識は認められない。
【０１８５】
15分時点の甲状腺：
標識は10分時点よりも高度であるが、エクスビボ時点よりは明らかに薄い。全体的な標識は濾胞性であり、いくつかの濾胞は濾胞内性に標識される。若干のピクノティック標識が観察されるが、少量に過ぎない。
【０１８６】
30分時点の甲状腺：
標識強度は15分時点で観察されるものと類似している、またはそれよりも薄い。標識は主として濾胞外性であり、エクスビボ時点よりも薄い。若干のピクノティック標識がみられる。
【０１８７】
1時間時点の甲状腺：
標識強度はエクスビボ時点および30分時点で観察されるものよりも極めて弱い。いくつかの甲状腺濾胞は事実上標識されない。膠質内ピクノティック標識が多数みられる。
【０１８８】
培養正常甲状腺葉に対するウエスタンブロット法の結果：
培養甲状腺葉から抽出したタンパク質に関するウエスタンブロット法により、これらの甲状腺細胞はインビトロ培養した場合にFADDタンパク質の発現を喪失することが裏づけられた。5〜10分間の培養後にすでに観察されていることから、このタンパク質消失は非常に迅速である。NP40の代わりにTritonまたはChapsを含む可溶化バッファーを用いた細胞タンパク質の抽出から同様の結果が得られ、それにより、タンパク質抽出物中にFADDが存在しないことはタンパク質の可溶化の問題には起因しないことが確かめられた。甲状腺培養物の4℃でのインキュベーション、またはブレフェルジンAを添加したRPMI培地中での1時間もしくは2時間にわたる甲状腺葉のインキュベーションにより、FADDタンパク質の発現の喪失は阻止されなかった。
【０１８９】
培養上清に対するウエスタンブロット法およびELISA法の結果：
培養上清のウエスタンブロット法およびELISA分析により、インビトロ培養を開始して早くも2分後には、FADDタンパク質が培養上清中に存在することが示されている。
【０１９０】
FADDタンパク質は、5分間、10分間、15分間、30分間、45分間、1時間および4時間のインビトロ培養後にも上清中に検出される。
【０１９１】
これらの培養上清において、FADDタンパク質は、ウエスタンブロット上で約30〜32kDaの分子量で検出される。
【０１９２】
さらに、培養上清の質量分析により、タンパク質のピークが33kDaに示された。正常甲状腺葉の1時間培養物の上清の質量分析を示した図17Aおよび17Bを参照のこと（SN+：2-メルカプトエタノールの存在下；SN-：2-メルカプトエタノールの非存在下）。図17Aは1時間培養物の上清の代表的な直接分析を示しており（Da単位での分子量の関数としてのピーク強度のパーセンテージ）、図17Bは、濃縮および塩の除去のためにC4カラム上で処理した上清に対して行った同様の分析を示している。2-メルカプトエタノールの非存在下では、約33kDaのタンパク質が上清中に観察されるが、2-メルカプトエタノールの存在下では、タンパク質の分子量は約28kDaである（図17A）。2-メルカプトエタノール、ならびに濃縮および上清から塩を除去するためのC4カラムでの処理の両方を行った場合、26kDa〜30kDaの間のピークの数は増加する。
【０１９３】
C．考察：
経時的な免疫組織化学分析からは、FADDのC末端部分を標的とする抗体、FADDのN末端部分を標的とする抗体、または両方の抗体の混合物のいずれを用いても、類似した結果が得られた。
【０１９４】
これらの免疫組織化学分析により、FADDタンパク質の発現が、正常甲状腺細胞のインビトロ培養物では喪失することが確認された。この喪失は5〜10分間の培養後に早くも観察される。
【０１９５】
培養上清の分析により、FADDタンパク質が排出機構によって消失することが示されている。FADDタンパク質の全体または一部は甲状腺濾胞の膠質中に分泌され、その後にトランスサイトーシスによって排出されると考えられる。
【０１９６】
これらの結果は、FADDタンパク質の局在性が細胞種および／または生理的状態の特徴である可能性も強く示唆する。
【０１９７】
FADDタンパク質は培養上清中に30〜32kDaの分子量で検出されるが、その正常な分子量は28kDa前後であるため、その排出の過程またはその後に、FADDが他の分子と複合体化したか何らかの形で結合したと考えられる。図17Aおよび17Bに示した質量分析の結果は、ジスルフィド結合がFADDをもう1つの実体またはその他の実体と結合させている可能性を示唆している。
【０１９８】
実施例3：FADDタンパク質は腺腫-腺癌に罹患したgspトランスジェニックマウスの血清中に存在し、血清中に35kDaの分子量で検出しうる
A．材料および方法：
マウス：
GspトランスジェニックマウスはMichiels、1994（PNAS Vol.91 pp. 10488-10492）に記載された通りに入手した。それらは8カ月齢までは何ら異常がなく、その後に過形成が生じ、続いて過機能性甲状腺腺腫または腺癌を発症する。
【０１９９】
非担癌健常マウスを対照として用いた（Iffa Credo、L'Arbresle、Franceから購入したCBA／J雌性マウス）。
【０２００】
gspトランスジェニックマウスの血清中のFADDタンパク質のウエスタンブロット法による検出：
疾患のさまざまな段階でマウスの血清を採取し、マイクロBCAタンパク質アッセイ試薬キット（Pierce、Rockford、Illinois）を用いてタンパク質濃度を決定した上で、使用時まで-20℃で保存した。血清から得た40μgの全タンパク質をSDS-PAGEにかけ、ニトロセルロース（NEN Life Sciences、Boston、Massachusetts）に移行させた。ブロッティングの後に、5％乳を含むTBS 0.1％Tween（登録商標） 20中に0.2μg／mlで用いた特異的一次抗FADD抗体（M-19、sc-6036、Santa Cruz Biotechnology）により、4℃で一晩かけて膜のプローブ検索を行った。二次抗体はペルオキシダーゼ標識した抗ヤギIgG二次抗体とした（Sigma-Aldrich、Saint Quentin Fallavier、France、ref. A5420）（1:15,000希釈）。正常マウスIgとの交差反応活性を避けるために、二次Abを1％正常マウス血清とともに4℃で30分間プレインキュベートした。タンパク質は高感度化学発光法（Amersham Pharmacia Biotech）によって可視化した。
【０２０１】
生存性に関する着色‐FADDタンパク質の放出は能動的プロセスである：
甲状腺葉をRPMI（ref. 61870-010 RPMI 1640培地、Life Technologies）中で1時間インキュベートした後に、生存性に関する着色剤（トリパンブルー）とともに5分間インキュベートし、直ちに最適温度の培地（Tissue-Tek；Bayer、Elkhart、IN）で覆った上で、液体窒素上でイソペンタン中に浮遊させることによって緩徐に凍結させ、切断時まで-80℃で保存した。6μm、10μmおよび20μmの切片を-18℃でクリオスタットにより作製し、SuperFrostplusスライド（Roth Sochiel、Lauterbourg、France）上に収集した。切片を一晩乾燥させ、使用時まで-80℃で保存した。その後に切片を顕微鏡によって観察した。
【０２０２】
B．結果：
FADDタンパク質は腫瘍発生のさまざまな時点でgspトランスジェニックマウスの血清中に検出された：腺腫-腺癌段階のマウスはすべて（4匹中4匹）FADDタンパク質に関して血清陽性であり、その量は高値から低値にわたり、3匹の過形成性マウス中1匹はFADDタンパク質に関して高度に血清陽性であった（残る2匹の過形成マウスはFADDタンパク質に関して血清陰性であった）。対照非担癌マウス（マウス4匹中4匹とも）の血清中にFADDタンパク質は検出されなかった。
【０２０３】
gspトランスジェニックマウスの血清中ではFADDタンパク質は分子量35kDaとして検出されるが、その正常分子量は約28kDaである。上記の実施例2で示したように、FADDタンパク質は正常甲状腺細胞のインビトロ培養物（腫瘍発達時のFADD調節を模したFADD調節のインビトロモデル）の上清中では約30〜32kDaの分子量で検出される。FADDタンパク質が排出時にはもう1つの分子またはその他の分子と複合体化または何らかの形で結合しているという選択肢は、このため、インビボ非ヒトモデルでの観察所見と一致する。
【０２０４】
FADDタンパク質の発現を喪失したgspトランスジェニックマウスの甲状腺細胞はトリパンブルーとのインキュベーション後に染色されなかった。したがって、これらの細胞は生細胞であり、それらの原形質膜は透過性ではなかった。このことはFADDタンパク質の排出が能動的プロセスであり、甲状腺細胞膜の単純な透過化によるものではないことを示している。
【０２０５】
実施例4：FADDタンパク質発現の試験的な回復
A．材料および方法
甲状腺葉は正常CBA／J雌性マウス（Iffa Credo、L'Arbresle、France）から屠殺および心腔内穿刺の後に採取し、5％CO２雰囲気下のRPMI培地（RPMI 1640培地、ref. 61870-010、Life Technologies）中にて37℃でさまざまな期間にわたってインキュベートした（エクスビボ甲状腺 時点0、甲状腺2分間、甲状腺5分間、甲状腺10分間、甲状腺15分間、甲状腺30分間、甲状腺45分間、甲状腺1時間、甲状腺2時間、甲状腺4時間）。
【０２０６】
その一方で、それらに対して、37℃の5％CO２雰囲気下でさまざまな処理を1時間および／または2時間にわたって行った。
【０２０７】
処理は以下の通りとした：
‐4℃でのインキュベーション、
‐サイトカラシン（アクチンフィラメントに関連した細胞移動を阻害する）の存在下でのインキュベーション、
‐ブレフェルジンA（ゴルジ装置に関連した細胞移動を阻害する）の存在下でのインキュベーション、
‐オルトフェナントロリン（ADAMプロテアーゼを阻害する）の存在下でのインキュベーション、
‐アルコール（ある種の被験阻害物質のための溶媒である）の存在下でのインキュベーション。
【０２０８】
葉および培養上清を処理の終了時に採取し、上記の実施例2に記載したように、葉を可溶化して、甲状腺葉および培養上清におけるFADDタンパク質をその後にウエスタンブロット分析によってアッセイした。
【０２０９】
B．結果：
結果は図15A、15Bおよび16A、16Bに示されている。
【０２１０】
図15Aおよび15Bは、何も試験的な処理を行っていない、インビトロ培養した正常甲状腺葉の細胞からのFADD放出動態を示している（ウエスタンブロット法）。
【０２１１】
図16Aおよび16Bは、試験的な治療後の甲状腺葉および対応する培養上清のウエスタンブロット分析を示している：アッセイした処理の内容はブロットの最上部の各レーンの隣に示している。Lは葉を意味する；Sは上清を意味する。
【０２１２】
アッセイした処理はいずれも、FADDタンパク質が細胞外環境に排出されるのを停止させることはできなかった。さらに、2-メルカプトエタノールによる試料処理はFADDの見かけの分子量を28〜30kDaに低下させた（図16B）。この結果は質量分析によって裏づけられた（図17Aおよび17B、前記参照）。これらのデータにより、FADDタンパク質がその排出の経過中または排出後にジスルフィド架橋によって他の分子と結合するという可能性が裏づけられた。
【０２１３】
実施例5：骨髄性白血病の化学療法抵抗性ヒト患者の血液試料でもFADDの発現が消失している
急性または慢性骨髄性白血病（AMLまたはCML）との診断が確立しているヒト患者からの血液試料をFADD発現に関して検査した。検査した血液試料のすべてが腫瘍細胞を少なくとも80％含んでいた。このようにして得られた結果は以下の通りである。
【０２１４】
（表2）ヒトAML
2005513505.tif 000014
2005513505.tif 000015
S＝抗腫瘍化学療法に対する化学療法感受性
R＝抗腫瘍化学療法に対する化学療法抵抗
nd＝未測定
FADDの発現、ウエスタンブロット上の28〜30kDaバンドの強度により評価（盲検分析）：
‐ -または+/-：ゼロまたは極めて低い、
‐ +：低い、
‐ ++：中程度、
‐ +++：高い
【０２１５】
（表3）ヒトCML
2005513505.tif 000016
2005513505.tif 000017
FADDの発現、ウエスタンブロット上の28〜30kDaバンドの強度により評価（盲検分析）：
‐ -または+/-：ゼロまたは極めて低い、
‐ +：低い、
‐ ++：中程度、
‐ +++：高い
抗腫瘍療法＝IFNαの試験的治療、抵抗性の場合にはその後に骨髄同種移植（Fasを介した試験的なGVL効果）
STI：bcr-abl経路の遮断によってアポトーシスを誘導する薬剤
【０２１６】
実施例6：
‐FADDタンパク質はCMLおよびAMLヒト患者の血清中に検出される
‐CMLまたはAML細胞における低レベルのFADDタンパク質発現は、その患者の化学療法に対する抵抗性と相関する
‐CMLまたはAML患者の血清における高レベルのFADDタンパク質はこれらの患者の化学療法に対する抵抗性を予測させる
【０２１７】
A．材料および方法：
生物試料：
血液試料は治療前の診断時に患者から採取した。THP1、K562（CCL-243）およびジャーカット（クローンE6.1）細胞株はATCCから入手可能である（THP1アクセッション番号＝TIB202；K652アクセッション番号＝CCL-243；ジャーカットアクセッション番号＝TIB152）。
【０２１８】
ウエスタンブロット法：
単離した白血病細胞をPBSで洗浄し、プロテインホスファターゼ阻害剤の混合物（Calbiochem-Novabiochem Corp., La Jolla、California）を含む可溶化バッファー（10mM Tris-HCl、150mM NaCl pH7.8、1％NP40、1mM PMSF、1μg／mlアプロチニンおよび1μg／mlロイペプチン）を用いて全タンパク質を抽出した。試料濃度をマイクロBCAタンパク質アッセイ試薬キット（Pierce、Rockford、Illinois）を用いて決定し、30μgの全タンパク質をSDS-PAGEにかけた上で、ニトロセルロース（NEN Life Sciences、Boston、Massachusetts）に移行させた。ブロッティングの後に、5％BSAを含むTBS 0.1％Tween（登録商標）20中に1μg／mlで用いた特異的一次抗体：抗FADD抗体（125-140、Calbiochem、Calbiochem-Novabiochem Corp.）により、4℃で一晩かけて膜のプローブ検索を行った。二次抗体はペルオキシダーゼ標識した抗ヤギIgG二次抗体とした（Amersham Pharmacia Biotech、Orsay、France、1:5,000希釈）。タンパク質は高感度化学発光法（Amersham Pharmacia Biotech）によって可視化した。
【０２１９】
ELISA法：
96ウェルマイクロタイタープレート（Costar、n゜3590）を、ウサギ抗ヒトFADD Ig（125-140、Calbiochem ref. 341282）によってCi: 1mg／ml、Cf: 5μg／ml・PBS中、Vfを50μl／ウェルとして4℃で一晩かけてコーティングした後に、4回洗浄した（PBS 0.05％ Tween（登録商標）20）。空いた状態のタンパク質結合部位を、PBS-2％BSAを添加して室温で2時間おくことによってブロックした（Vf：200μl／ウェル）。PBS 0.05％ Tween（登録商標）20でさらに2回洗浄した後に、プレートをヒト血清（非希釈、その後はPBS 2％BSA 0.05％Tween（登録商標）20で1：2に連続希釈）でVfを50μl／ウェルとしてコーティングし、室温で2時間インキュベートした。さらに4回洗浄した後に（PBS 0.05％Tween（登録商標）20）、プレートを二次抗体（マウス抗ヒトFADD IgG1；クローンA66-2, BD Pharmingen ref. 556402‐以前の照会番号は65751A）でVfを50μl／ウェルとしてコーティングし、その後に室温で1時間インキュベートした。さらに5回の洗浄後に（PBS 0.05％Tween（登録商標）20）、プレートをペルオキシダーゼ結合抗体（抗マウスIgG1 PO Caltag ref. 32107）でCfを1〜8,000、PBS 2％BSA 0.05％Tween（登録商標）20中とし、Vfを5μl／ウェルとしてコーティングし、室温で1時間インキュベートした。PBS 0.05％Tween（登録商標）20中で5回洗浄した後に、酵素基質（TMB（3,3',5,5'-テトラメチル-ベンジジン）、Sigma ref. T-8665、Vf 50μl／ウェルとして）との室温（または37℃）での15分〜2時間のインキュベーションによって比色反応を呈色させた。比色反応はH２SO４ 2Nを25μl／ウェル添加することによって停止させる。プレートは、Titertek（登録商標） Multiscan分光光度計（Dynatec MR5000、Guyancourt、France）を用いて450nm（基準波長＝630nm）で読み取った。
【０２２０】
B．結果：
CML、AMLおよびALL細胞におけるFADDタンパク質の発現レベルの高さ／低さならびに化学療法に対する抵抗性の結果：
FADDタンパク質の発現を、28例の患者（CML 10例、新規（de novo）AML 15例およびALL 4例）の診断時の白血病細胞において分析した。
【０２２１】
いずれの患者においても試験は治療開始前に行った（CMLに対してはIFN-α、AML患者に対しては標準的導入補助療法またはその後に自己幹細胞移植を併用）。
【０２２２】
彼らの細胞に対するウエスタンブロット分析は、FADDの有無を彼らの病状と相関づけられるか否かを明らかにするために行った。このようなウエスタンブロット分析の代表的な結果を図9に示す（CML＝慢性骨髄性白血病；AML＝急性骨髄性白血病；ALL＝急性リンパ性白血病；THP1＝骨髄性細胞株；K562＝CML細胞株；ジャーカット＝ALL細胞株、各レーンの上にあるその他の記号は個々の患者を表す）。
【０２２３】
CML試料のウエスタンブロット分析により、FADDはIFN-α感受性患者の2例で発現されているが、IFN-αに対する抵抗性のある患者ではその発現は極めて低い（4／8）か検出されない（4／8）ことが示された。
【０２２４】
同様に、FADDは化学療法感受性のあるAML患者の白血病細胞では高発現されていた（5／7）。この7例中4例は長期的な完全寛解の状態にある。
【０２２５】
さらに、化学療法抵抗性患者におけるその発現は極めて低い（4／8）か検出されなかった（4／8）。
【０２２６】
ウエスタンブロットのバンドの強度（図9に示されている）を定量化し、OD値として表した。その結果は以下の通りである。
【０２２７】
（表4）CML患者の細胞性FADDに関するOD値
（基準細胞株であるTHP1およびK652は除く）
2005513505.tif 000018
【０２２８】
（表5）AML患者の細胞性FADDに関するOD値
（基準細胞株であるTHP1は除く）
2005513505.tif 000019
【０２２９】
これに対して、FADDタンパク質は化学療法感受性ALL試料では検出されず、化学療法抵抗性ALLの3例中2例では高発現されていた。
【０２３０】
以上をまとめると、本発明者らは、骨髄性白血病細胞におけるFADDタンパク質発現の非存在が、IFN-αまたは化学療法に対する抵抗性と相関することを観察した（p＝0.0002）。
【０２３１】
FADDタンパク質はCML患者およびAML患者の血清中に検出され、血清中のFADDレベルの高さはIFNαまたは化学療法に対する抵抗性と相関する：
白血病細胞の場合と同じく、血清試料の日付は診断の日、すなわち治療を開始する前である。血清中のFADDの検出はELISAアッセイによって行った。
【０２３２】
代表的な結果は以下の表および対応する図10〜14に示されているが、そこには各患者に関して測定したOD値をさまざまな希釈率で示している。
【０２３３】
試験的な治療に対する反応に関して、「R」は患者が治療に対して抵抗性であったことを意味し、「S」は患者が治療に対して感受性であったことを意味する。
【０２３４】
（表6）健常患者（対照）に関するOD値
2005513505.tif 000020
これらの結果のグラフ図は図10に示されている。
【０２３５】
（表7）CML患者に関するOD値：
2005513505.tif 000021
これらの結果のグラフ図は図11Aに示されている（非希釈試料）。
【０２３６】
（表8）CML患者のOD値（その他の試料希釈度）：
2005513505.tif 000022
これらの値のグラフ図は図11Bに示されている。
【０２３７】
（表9）AML患者に関するOD値：
2005513505.tif 000023
これらの結果のグラフ図は図12A（非希釈血清試料）および図12B（非希釈；1／10希釈；1／100希釈）に示されている。
【０２３８】
（表10）AML患者に関するOD値（その他の試料希釈度）
2005513505.tif 000024
これらの結果のグラフ図は図12Cに示されている。
【０２３９】
（表11）ALL患者に関するOD値：
2005513505.tif 000025
これらの結果のグラフ図は図13に示されている。
【０２４０】
（表12）測定したOD値の比較表：
2005513505.tif 000026
これらの結果のグラフ図は図14に示されている。
【０２４１】
FADDタンパク質はCML患者およびAML患者の血清中に検出され、少数の健常ドナーでも検出されるがそれは低レベルである。現時点で本発明者らには、これらの健常患者の血清中にFADDがこのように少量存在することが生理的現象であるかそれともアーチファクトであるかは不明である。
【０２４２】
CML患者において、血清中のFADDタンパク質の量は、αインターフェロン療法に対して抵抗性であることが後に示された患者（LER）の方が、IFNα感受性の患者（DELおよびHEN）よりも多かった。まったく同じように、AMLから後に完全寛解期に至った患者（患者PAQおよびBER）の血清中、および化学療法に対する感受性が後に示された患者（LYO）の血清中には、FADDタンパク質がほとんど存在しない。抵抗性患者5例のうち3例（AZU、ROCおよびCLA）はFADDタンパク質の血清レベルが非常に高く、一方、残りの2例の患者（VIMおよびMOU）の血清FADDレベルは治療に対して感受性であった患者で測定されたものと非常に類似していた。
【０２４３】
これらの結果は、腺腫および腺癌に関して示されたように（上の実施例1〜3を参照）、CMLまたはAMLが発生すると、FADDタンパク質が腫瘍細胞から細胞外環境（すなわち、患者の血清中）へと排出されることを裏づけるものである。
【０２４４】
血清中のFADDタンパク質の量の多さは、試験的な治療（CMLに対してはαインターフェロン療法、AMLに対しては標準的導入補助療法）に対する抵抗性と密接に相関している。このため、血清中のFADDタンパク質の量の検出および測定は、CML／AML標準治療に対する抵抗性／感受性を予測するための信頼性のあるツールとなる。
【０２４５】
しかし、FADDタンパク質が血清中にごく少量しか検出されない場合には、予測評価に関して明らかな結論に至るために、細胞によるFADD発現を評価することが強く推奨される：細胞性FADDの低発現はαインターフェロン療法または化学療法に対する抵抗性と相関し、その反対に細胞性FADDの高発現はαインターフェロン療法または化学療法に対する感受性と相関するため、細胞によるFADD発現レベルは真に信頼性のある優れたマーカーである。FADDの細胞での発現を回復させることにより、患者の化学療法抵抗性を低下させられる可能性がある。
【０２４６】
ALLに関してこれまでに得られた予備的データからは、FADD検査の予測的価値について同様の結論は得られていないが、これは感受性患者および抵抗性患者における血清FADDレベルが非常に低いか、健常ドナー血清における測定値と同程度であるためである。しかし、血清FADDレベルは細胞性FADDタンパク質レベルと逆相関しており（NGU：細胞+++、血清-；BED：細胞-、血清+）、このことは、FADDが細胞内に存在しない場合にはそれが血清中に排出されている可能性を示唆する。この逆相関の生理的意義については今後明らかにする必要がある。
【図面の簡単な説明】
【０２４７】
【図１Ａ−Ｂ】Fasリガンドの発現が腫瘍発達時に獲得されることを示している。図1Aは腫瘍発達のさまざまな段階にあるgspトランスジェニックマウスの甲状腺からのFasL mRNAの半定量的RT-PCRの代表的な結果を示しており、一方、図1Bはウエスタンブロット法でのFasLタンパク質に関する対応する分析を示している。増幅断片およびタンパク質のサイズが示されている。レーン7および8には、同じ腺腫の2つの葉によるFasL発現の違いが示されている。
【図２Ａ−Ｂ】アダプタータンパク質FADDが腫瘍発達の過程で消失することを示している。図2Aは、腫瘍発達のさまざまな段階にあるgspトランスジェニックマウスの甲状腺によるFADD、DaxxおよびRIP mRNA発現の半定量的RT-PCRを示している。同じ腺腫の2つの葉におけるアダプターmRNAの発現をレーン3および4に示している。増幅断片のサイズが示されている。図2Bは腫瘍発達のさまざまな段階にあるgspトランスジェニックマウスから得た甲状腺による3つのアダプター分子のウエスタンブロット分析を示している（FADD＝パネル1；Daxx＝パネル2；RIP＝パネル3）。タンパク質のサイズが示されている。
【図３】腫瘍発達、腫瘍発達のさまざまな段階にあるgspトランスジェニックマウスからの甲状腺による総（上のパネル）および活性リン酸化型（下のパネル）のp38-MAPK発現に関するウエスタンブロット分析を示すことにより、p38-MAPK経路が腫瘍発達の過程で阻害されることを示している。
【図４Ａ−Ｃ】インビトロ培養した甲状腺細胞がFADDタンパク質を発現しないことを示している。図4Aは、正常非トランスジェニックマウスからのエクスビボ肝臓および甲状腺細胞のインビトロ培養物によるFADD mRNA発現の半定量的RT-PCR分析を示している。図4Bおよび4Cは、正常非トランスジェニックマウスからのエクスビボ、コラゲナーゼH処理およびインビトロ培養を行った甲状腺細胞（図4B）または肝細胞（図4C）によるFADDタンパク質発現のウエスタンブロット分析を示している。肝細胞の2つの独立したインビトロ培養物をレーン3および4に示している。増幅断片およびタンパク質のサイズが示されている。
【図５】FADDの非存在下でFasシグナル伝達がTFC増殖を増強することを示している。正常甲状腺細胞を、クローンJo2抗Fas抗体に対する24時間〜120時間の曝露下または非曝露下で培養した。甲状腺細胞の増殖を、培養の最後の12時間に[３H]チミジンを添加することにより、集密に達するまで毎日評価した。データは対照培養物と対比した抗Fas培養物の増殖の増加率を表す。各点は6つのウェルの培養物の平均cpmである。対照TFCの増殖に関する値は343cpm〜1382cpmの範囲でさまざまであった。抗Fasで処理したTFCの増殖に関する値は392cpm〜1507cpmの範囲でさまざまであった。
【図６】Fas経路が調節される機構の概略図である。
【図７】ヒトおよびハツカネズミ（Mus musculus）のFADDおよびp38-MAPKのアミノ酸配列を示している。
【図８】免疫組織化学によって検出および観察されるFADD標識の図式的定義を示している。
【図９】白血病患者からの腫瘍細胞におけるFADDタンパク質の有無に関するウエスタンブロット分析を示している。
【図１０】健常ヒト個体（対照）から採取した血清試料におけるFADDタンパク質に関するELISA分析の結果を示している。
【図１１Ａ−Ｂ】CML患者から血清試料におけるFADDタンパク質に関するELISA分析の結果を示している。
【図１２Ａ−Ｃ】AML患者から血清試料におけるFADDタンパク質に関するELISA分析の結果を示している。
【図１３】ALL患者から血清試料におけるFADDタンパク質に関するELISA分析の結果を示している。
【図１４】健常／CML／AML／ALL患者の血清試料中のFADDタンパク質に関するELISA分析の結果を比較して表したものを示している。
【図１５Ａ−Ｂ】インビトロ培養した正常甲状腺葉の細胞からのFADD放出動態に関するウエスタンブロット分析を示している。
【図１６Ａ−Ｂ】インビトロ培養した正常甲状腺葉の細胞からのFADD放出を停止させるための試験的な治療に関するウエスタンブロット分析を示している。
【図１７Ａ−Ｂ】正常甲状腺葉の1時間培養物の上清の質量分析を示している（SN+：2-メルカプトエタノールの存在下；SN-：2-メルカプトエタノールの非存在下）：図17Aは1時間培養物の上清の直接分析を示している（Da単位での分子量の関数としてのピーク強度のパーセンテージ）、図17Bは、濃縮および塩の除去のためにC4カラム上で処理した上清に対して行った同様の分析を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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