(57)【要約】本発明は一般式（Ｉ）のリン脂質を、専らホスホリパーゼＤを用いてリン脂質混合物から、かつ有機溶剤を使用せずに製造する方法において、緩衝液不含の相においてホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）及び少なくとも１種の二価の金属イオンを用いて、第１段階でホスファチジル酸（ＰＡ）を製造し、かつ第２段階でホスファチジル酸から一般式（ＩＩ）Ｒ３−Ｈ［式中、Ｒ３は前記の意味を有する］の少なくとも１種の化合物を用いて一般式（Ｉ）の少なくとも１種のリン脂質を製造することを特徴とする方法に関する。ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール及び／又はホスファチジルグリセリンが生成物として得られる。本発明のもう一つの態様においては、ＰＬＤは前記の方法の両方の段階において同一又は異なり、その際、後者の場合には該方法の第１及び第２段階のためのｐＨ値は異なり、その際、該値は特に６．５〜８．０、殊に５．０〜７．５である。新規の方法により、生成物を高い収率及び優れた収率で得ることができ、それによって食品工業利用及び医薬品利用のために該生成物が適当である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）
【化１】
2005501559.tif 000004
［式中、
Ｒ１及びＲ２は互いに無関係に飽和の、一不飽和又は多不飽和のＣ１０〜Ｃ３０−アシル基を表し、かつ
Ｒ３は
【化２】
2005501559.tif 000005
を意味する］のリン脂質を、専らホスホリパーゼＤを用いてリン脂質混合物から、かつ有機溶剤を使用せずに製造する方法において、緩衝液不含の相においてホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）及び少なくとも１種の二価の金属イオンを用いて、第１段階でホスファチジル酸（ＰＡ）を製造し、かつ第２段階においてホスファチジル酸から一般式（ＩＩ）Ｒ３−Ｈ［式中、Ｒ３は前記の意味を有する］の少なくとも１種の化合物を用いて一般式（Ｉ）の少なくとも１種のリン脂質を製造することを特徴とする方法。
【請求項２】
ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール及び／又はホスファチジルグリセリンを得る、請求項１記載の方法。
【請求項３】
リン脂質混合物としてレシチン、特に有利には大豆レシチン、ナタネ油レシチン及び／又は卵黄レシチンを使用する、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
リン脂質混合物を全反応混合物に対して１．０〜２０．０質量％の量で、かつ特に有利には分散液として使用する、請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
ＰＬＤがストレプトマイセス、アクチノマヅラ、ラッカセイ、ニンジン及び／又はキャベツに由来する、請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
反応混合物のｐＨ値が４．０〜９．０である、請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
反応温度が１０〜６０℃である、請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
二価の金属イオンとしてＣａ２＋、Ｍｇ２＋及び／又はＺｎ２＋を使用する、請求項１から７までのいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
金属イオン濃度が１．０〜１００ｍＭである、請求項１から８までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
ＰＬＤを０．１〜１０００単位／ｇ（使用されるリン脂質）の量で使用する、請求項１から９までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
第１の方法段階及び第２の方法段階において使用されるＰＬＤが同一である、請求項１から１０までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
ＰＬＤがストレプトマイセス種及び／又はアクチノマヅラ種に由来する、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ＰＬＤが両方の方法段階において異なる、請求項１から１０までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
第１の方法段階においてＰＬＤがストレプトマイセス・クロモフスカス、ラッカセイ、ニンジン及び／又はキャベツに由来する、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
第１段階のｐＨ値が６．５〜８．０であり、かつ第２段階のｐＨ値が５．０〜７．５である、請求項１３又は１４記載の方法。
【請求項１６】
ＰＬＤを、特に有利には共有結合及び／又は吸着結合の様式で固定化された形で使用する、請求項１から１５までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
一般式（ＩＩ）の化合物を０．１〜５．０モラーの濃度で使用する、請求項１から１６までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
第１の方法段階の反応時間が５〜２０時間であり、かつ第２の方法段階の反応時間が０．５〜５時間である、請求項１から１７までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
得られるリン脂質（混合物）をアルコール抽出によって精製する、請求項１から１８までのいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はリン脂質の製造方法に関する。
【０００２】
レシチンとも呼称されるリン脂質、例えば大豆レシチン及び卵黄レシチンは長い間食品、化粧品、染料、潤滑剤、磁気材料、飼料並びに医薬品及び農業化学製品で使用されている。この場合、酵素的ホスファチジル基転移反応によってリン脂質及びヒドロキシル基含有化合物から製造されるホスファチジル酸誘導体は、部分的に出発材料を凌駕している特性を示す。
【０００３】
ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）は、特に水の存在下にホスファチジル酸の加水分解による製造のために使用され、かつ二価の金属イオンが同時に存在する場合にはホスファチジル基は、ヒドロキシル基を有する受容体としてのアルコール化合物に転移しうる。
【０００４】
ホスホリパーゼＤが相応のホスファチジル基転移反応活性を示すために、二価の金属イオンの存在が必要不可欠である。同じリン脂質分子又はホスファチジル−グリセリンの間のホスファチジル基転移反応においてのみ二価の金属イオンの不在下に相応の活性が検出されるにすぎない。
【０００５】
従って、特に異なるリン脂質分子の間のホスファチジル基転移反応においては、該反応系は前記二価イオンと反応する物質を含有せず、二価イオンの作用下に相応の反応性を失うヒドロキシル基含有化合物を使用しないことが顧慮される。
【０００６】
更に、例えば主にＰＬＤ反応のために使用される５〜８のｐＨ値範囲において、二価イオン、特にカルシウムイオンで沈殿する緩衝液を使用しないことが顧慮される。
【０００７】
刊行物から、ＰＬＤを使用したリン脂質の製造方法を記載している多くの文献が公知である。
【０００８】
この場合、水相と有機相とからなる主に２相の系が大変重要である。それというのも生体膜の本来の主成分としてのリン脂質が両親媒性を有するからである。
【０００９】
ＰＬＤが化学量論量を超える量の水中でもエステル交換反応が可能であるにもかかわらず、一般に有機溶剤又は界面活性剤が使用される。それというのも使用される脂質基質は水不溶性であり、かつ前記脂質は水溶性のリポソーム分散液の形では酵素による反応が困難だからである。
【００１０】
従って酵素が水相中に可溶性であり、かつ供給される脂質が有機溶剤中に可溶性であって、その酵素反応が水と有機相との間の相境界で生じる２相系が従来の技術である。
【００１１】
界面活性剤又は有機溶剤の使用は、とりわけ医薬品又は食品の製造に関連して問題視されることがあり、かつ前記の２相条件下に常に所望の加水分解生成物のホスファチジル酸を生じるとは限らないので、ＰＬＤにより触媒されるエステル交換反応プロセスが純粋な水相中でも進行する可能性について調査された。
【００１２】
従ってＷＯ００／７７１８３号から、酵素（とりわけホスホリパーゼＤ）を、リン脂質、水、ヒドロキシル含有成分としてのアルコール又はアルコール誘導体のリポソーム懸濁液及び、必要であれば二価の金属カチオンを含有する水性媒体中に溶解させる、リン脂質の酵素触媒によるエステル交換又は加水分解のための相応の方法が公知である。引き続き該水性媒体にシリカゲルを添加し、こうして得られた混合物を撹拌する。
【００１３】
ホスファチジル酸の酵素による製造はＪＰ０４２６７８８２号に記載されている。この場合に、特異的な粒度を有するレシチン粉末を、ホスホリパーゼＣ及びホスホリパーゼＤを含有する大豆抽出物と一緒に均質化し、かつ引き続き２４時間反応させる。前記のようにして、ほぼ９６％のリン脂質がホスファチジル酸として得られる。
【００１４】
変性リン脂質の製造方法はＥＰ−ＰＳ３９９５４４号に記載されている。それによればリン脂質とホスホリパーゼＤとを反応させてホスファチジル酸及び窒素含有塩基にして、かつ更なる酵素（ホスホリパーゼＣ、ホスホジエステラーゼ又は酸ホスファターゼ）によって、両者の酵素との反応を有利には同時に行ってジグリセリド及びリン塩基に加水分解する。両者の反応段階は緩衝液及び有機溶剤、例えばアルキルカルボキシレート、アルカン、炭化水素などからなる２相系で行われる。
【００１５】
Ｍ．カマタ他（M. Kamata et. al.）［Yukagaku, 1993, 42(4), 297-301］はホスファチジルコリン含有の大豆リン脂質をホスホリパーゼＤを用いて定量的に反応させてホスファチジル酸又はホスファチジルグリセリンにすることを記載している。この場合、ホスファチジルコリンのホスファチジル酸への加水分解並びにホスファチジルコリンのホスファチジルグリセリンへのホスファチジル基転移反応は５．６もしくは４．８のｐＨ値で実施される。競合的な加水分解の回避のためにｐＨ調整は酢酸緩衝液で行われた。
【００１６】
ＥＰ−Ａ１２２３２２２号は、リン脂質をヒドロキシル基を有する受容体の存在下にホスホリパーゼＤにさらす、出発材料としてのリン脂質の塩基交換のための方法が記載されている。水性系で実施される前記の反応では、リン脂質は担持材料上に結合されており、受容体成分及びホスホリパーゼＤは遊離形で使用される。
【００１７】
欧州特許２８５４２１号により、ホスファチジル基受容体の存在下でのリン脂質に対するホスホリパーゼＤの作用によるホスファチド酸（Phosphatidsaeure）誘導体の製造方法が保護されている。前記方法は、実質的に二価の金属イオンの不在下に実施されかつホスホリパーゼＤを所望のホスファチジル化反応が進行するように刺激する有機溶剤によるホスホリパーゼＤの活性化段階を特徴としている。
【００１８】
先行技術に記載される方法では、特に使用されるリン脂質をリポソーム形で溶解せねばならず、又はＰＬＤが到達可能にするためにリン脂質をその使用前にまず相応の担持材料に結合させねばならないことは欠点である。
【００１９】
確かにＤＥ−ＯＳ１９９１７２４９号からＰＬＤを用いて純粋な水性の１相系におけるホスファチジルセリンの製造方法が記載されているが、使用されるレシチン、反応のｐＨ値、実際に使用される温度又は酵素起源についてのより厳密な説明はなく、そのために追試は不可能である。
【００２０】
最後に欧州特許出願ＥＰ１２３１２１３号からホスファチドの製造方法は公知であり、該方法は確かに専ら水相中で、かつＰＬＤの存在下に実施されるが、実施例によれば所望のｐＨ条件を保証しうるために強制的に不可欠な好適な緩衝液が使用される。
【００２１】
従って本発明の課題は、一般式（Ｉ）
【００２２】
【化１】
2005501559.tif 000002
［式中、
Ｒ１及びＲ２は互いに無関係に飽和の、一不飽和又は多不飽和のＣ１０〜Ｃ３０−アシル基を表し、かつ
Ｒ３は
【００２３】
【化２】
2005501559.tif 000003
を意味する］のリン脂質を製造するにあたり、専らホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）を用いてリン脂質混合物から所望の生成物を、有機溶剤を使用することなく得る方法を提供することである。
【００２４】
前記課題は、水性の緩衝液不含の相においてホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）及び少なくとも１種の二価の金属イオンによって第１段階でホスファチジル酸（ＰＡ）を、かつ第２段階でホスファチジル酸から少なくとも１種の一般式（ＩＩ）Ｒ３−Ｈ［式中、Ｒ３は式（Ｉ）で既に挙げた意味を有する］の化合物を用いて少なくとも１種の一般式（Ｉ）のリン脂質を製造する相応の方法によって解決された。式（ＩＩ）の化合物としては、セリン、コリン、エタノールアミン、イノシトール及びグリセリン（３個の酸素原子の１つを介して結合される）が該当する。
【００２５】
意想外にも、ホスファチジル酸の中間段階を介して行われる本発明による方法によって、使用されるリン脂質に複雑な前処理をすることなく、担持材料を反応混合物から後続の反応の後に分離することなく、又は相転移条件を遵守することなく所望のリン脂質が高い純度及び収率で得られることが判明した。
【００２６】
本発明による方法は、特にホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセリン又はこれらの任意の混合物の製造のために適当であると示され、これは公知の方法に対して付加的に利点を提供する。
【００２７】
また出発材料に関しても、本発明による方法は全く制限を受けず、そのために有利であるリン脂質混合物のレシチン及び本願では特に大豆レシチン、ナタネ油レシチン及び／又は卵黄レシチンが推奨される。
【００２８】
反応媒体として専ら水が使用されるにもかかわらず、使用されるべきリン脂質混合物は意想外に大量に使用できる。その点で、本発明は、その都度のリン脂質混合物を全反応混合物に対して１．０〜２０．０質量％の量で使用することが見込まれ、その際、相応の分散液は十分に有利であると判明した。
【００２９】
またＰＬＤは制限を受けず、ストレプトマイセス、アクチノマヅラ、ラッカセイ、ニンジン及び／又はキャベツに由来するホスホリパーゼＤが特に有用である。
【００３０】
ホスホリパーゼについての最適ｐＨが６〜７のｐＨ値であるという一般に通用する見解に対して、本発明による方法は４．０〜９．０の反応混合物のｐＨ値で実施できる。
【００３１】
また反応温度に関しても、比較的広い範囲が可能であり、その際反応温度は１０〜６０℃が有利であると見なされる。
【００３２】
今まで知られている方法から使用される二価の金属イオンによる困難性は再三知られているが、１相の水性系中で実施される本発明による方法は、沈殿反応、酵素活性の低減又は使用されるＯＨ基含有化合物との相互作用を伴わずにＣａ２＋イオン、Ｍｇ２＋イオン及び／又はＺｎ２＋イオンの存在下に実施できる。
【００３３】
有利な金属イオン濃度として本発明は１．０〜１００ｍＭの濃度を見込んでいる。
【００３４】
特に良好な変換成果は、０．１〜１０００単位／ｇ（使用されるリン脂質（混合物））であるＰＬＤ量で達成できる。
【００３５】
本発明による方法は極めて問題なく実施できることは、既に挙げられた反応条件の他にも、第１及び第２の方法段階で使用されるＰＬＤが同一であってよいという事実を示し、そのために本発明はこの変法も特に有利であると見なされる。この場合に、ストレプトマイセス種及び／又はアクチノマヅラ種に由来するＰＬＤ変体が特に適当である。
【００３６】
しかしながら、本発明は、ＰＬＤが両方の方法段階で異なる変体も考慮される。
【００３７】
この場合に、本発明は、第１の方法段階でストレプトマイセス・クロモフスカス、ラッカセイ、ニンジン及び／又はキャベツに由来するＰＬＤを使用することが特に有利であるとみなされる。この場合に、第１段階のｐＨ値が６．５〜８．０であり、かつ第２の方法段階のｐＨ値が５．０〜７．５である場合に同様に有利であると見なされる。
【００３８】
通常は使用されるＰＬＤは遊離形で純粋な水性反応媒体中で使用される。規定の使用ケースに関しては、相応のＰＬＤ又は使用されるＰＬＤ混合物が固定化された形で使用される場合に有利なことがあり、その際、特に共有及び／又は吸着的な結合様式が考えられる。酵素のために適当な担持材料は、例えばシリカゲル、例えばクロマトグラフィーカラムに使用されるシリカゲル、また大表面積を有する別の不活性材料、例えばケイソウ土、活性炭、ベントナイト及び樹脂又は立体的に構成された吸着体である。
【００３９】
また本発明により製造反応のために予定される第三の成分、一般式（ＩＩ）の化合物はどの様式でも重要であると見なされないが、有利には０．１〜５．０モラーの濃度で使用すべきである。
【００４０】
有利な反応時間として、本発明によれば第１の方法段階のためには５〜２０時間の時間が見込まれ、かつ第２の方法段階のためには０．５〜５時間の時間が見込まれている。
【００４１】
確かに得ようとする生成物は１相系での簡単なプロセス実施に基づいて特に良好な品質及び高い純度で得られるが、特定の使用又は再加工のケースでは得られるリン脂質又はこれらを含有する混合物はアルコール抽出によって精製してよく、これは本発明によって同様に考慮される。
【００４２】
全体として、本発明による方法によって特に環境に優しくかつ簡単に実施されるべき変法が考えられ、それに基づいて、得られるリン脂質（混合物）は最終生成物、特に食品添加剤として又は例えばいわゆる機能的食品において問題なくかつ更なる後作業なく使用できる。更に後精製段階は残留する母液に関しては必要ないので、該母液はそれを含有するＰＬＤと一緒に、かつ再生工程なくしてもすぐに再び使用できる。
【００４３】
以下の実施例はリン脂質の製造のための本発明による方法の利点を明らかにしている。
【００４４】
実施例
以下の実施例において、リン脂質の製造は本発明によれば１相の水性系において２つの方法段階で、第１の段階においてホスファチジル酸をＰＬＤによるＣａ２＋イオンの存在下でのリン脂質成分の酵素的加水分解によって製造することで実施した。反応温度は３５〜６０℃であり、微生物由来のホスホリパーゼＤが５０〜１５００単位／ｍＭ（リン脂質）に相当する量で使用され、その際、反応混合物のｐＨ値は５．５〜８．０であった。
【００４５】
第２の方法段階において、反応条件は第１の方法段階に対して、ＯＨ基含有成分としてＬ−セリンを、特に使用されるリン脂質の量を過剰増大する量で添加することが変更された。反応混合物のｐＨ値は第２の方法段階では４．０〜６．０であり、かつ温度は２０〜６０℃であった。
【００４６】
出発材料としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジルイノシトールを含有するリン脂質混合物を用い、該混合物を１５〜１７５ｍＭの量で使用した。特に出発材料として、２０〜２５質量％のホスファチジルコリン、１８〜２３質量％のホスファチジルエタノールアミン及び１２〜１５質量％のホスファチジルイノシトールからなるLucas Meyer社（現在のDegussa Texturant Systems Deutschland GmbH & Co. KG）のＥｐｉｃｕｒｏｎ（Ｒ）１００Ｐ並びに３０〜３５質量％のホスファチジルコリン、１５〜２０質量％のホスファチジルエタノールアミン及び８〜１３質量％のホスファチジルイノシトールを有するＥｐｉｃｕｒｏｎ（Ｒ）１３０（起源：前記参照）が適当である。
【００４７】
出発材料は、それぞれ反応開始前に水相中によく均質化させ、Ｃａ２＋イオン又はＭｇ２＋イオンを１００ｍＭの濃度で導入した。
【００４８】
使用されるＰＬＤはＲｏｅｈｍ社に従って（Ｅｕｐａｅｒｇｉｔ Ｃの使用下に）固定化された形で使用した。
【００４９】
例１
１．  まず１００ｍｌの水中のリン脂質混合物（２．２６ミリモル）及びＣａＣｌ２（１０ミリモル）の懸濁液をＮａＯＨ（０．１Ｍ）でｐＨ６．５〜７．５に調整した。次いで該反応をＰＬＤ（１０００〜１５００単位）を用いて撹拌下に４０℃において１６時間実施した。５時間後にホスファチジル酸の収率は最終値の９０％であり、これはＨＰＬＣ法によって確認された。
【００５０】
２．  こうして得られたホスファチジル酸を反応後に水相から濾過分離し、かつ何度も水で洗浄し、その際、コリン、エタノールアミンもしくはイノシトール及び塩成分を洗出させた。
【００５１】
３．  固定化ＰＬＤが沈殿物中に残留し、これを更に利用した。
【００５２】
４．  洗浄されたホスファチジル酸（１〜２ミリモル）を次いで再びホスファチジルセリン（ＰＳ）に変換した。このために該溶液（１０ｍＭ、水中）を先ず塩酸（０．１モル／ｌ）でｐＨ５．５に調整し、温度を３０℃に保持し、かつＣａＣｌ２（１００ｍＭ）並びにＬ−セリンを１０倍過剰で溶液に添加した。
【００５３】
５．  撹拌下に、こうして反応を１０時間進行させ、その際、４時間後のＰＳの収率は既に最終値の４０％であった。
【００５４】
６．  反応後に、該溶液をヘキサン／イソプロパノールで抽出し、かつＰＳをアセトン沈殿によって精製した。
【００５５】
７．  固定化ＰＬＤはその粒度に基づいて篩を用いて分離でき、再回収できた。
【００５６】
例２
１．  まず１００ｍｌの水中のリン脂質混合物（２．２６ミリモル）及びＣａＣｌ２（１０ミリモル）の懸濁液をＮａＯＨ（０．１Ｍ）でｐＨ＝７に調整した。次いで反応をＰＬＤ（１０００〜１５００単位）を用いて撹拌下に５０℃で１６時間実施した。５時間後に、ホスファチジル酸の収率は最終値の９０％であり、これはＨＰＬＣ法によって確認された。
【００５７】
２．  こうして得られたホスファチジル酸を反応後に水相から濾過分離し、水で何度も洗浄し、その際、コリン、エタノールアミンもしくはイノシトール及び塩成分を洗出させた。
【００５８】
３．  固定化されたＰＬＤがその粒度に基づいて篩によってＰＡ成分から分離でき、かつ再回収できた。
【００５９】
４．  ＰＳの製造のための更なる段階を例１（段階４〜７）に従って実施した。
【国際公開パンフレット】
2005501559.tif 000006
2005501559.tif 000007
2005501559.tif 000008
2005501559.tif 000009
2005501559.tif 000010
2005501559.tif 000011
2005501559.tif 000012
2005501559.tif 000013
2005501559.tif 000014
2005501559.tif 000015
2005501559.tif 000016
2005501559.tif 000017
2005501559.tif 000018
2005501559.tif 000019
2005501559.tif 000020
2005501559.tif 000021
2005501559.tif 000022
2005501559.tif 000023
【国際調査報告】
2005501559.tif 000024
2005501559.tif 000025
2005501559.tif 000026
2005501559.tif 000027
2005501559.tif 000028
2005501559.tif 000029
2005501559.tif 000030
2005501559.tif 000031
2005501559.tif 000032
2005501559.tif 000033