(57)【要約】新規化合物２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースが提供される。該化合物は、Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースの、２’および３’レジオアイソマーの混合物であり、２’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースから非酵素的に形成され、アセチル化ペプチドおよびＮＡＤ＋とのＳｉｒ２酵素の反応の、新たに発見された産物である。２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースの類似体も提供される。加えて、２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースを調製する方法、試験化合物がＳｉｒ２酵素の阻害剤であるかどうかを決定する方法、組成物におけるＳｉｒ２活性を検出する方法、アセチル化ペプチドを脱アセチル化する方法、および、アセチル化ペプチドの該脱アセチル化を阻害する方法が提供される。２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースのプロドラッグも、提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースの、精製された調製物。
【請求項２】
細胞中で増加した安定性を呈する２’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースまたは３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースの類似体であって、ここで該２’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースおよび該３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボース両方が、エステル酸素を有するアセテート基、および２つのリン原子間の酸素を含む類似体。
【請求項３】
ＣＦ２、ＮＨ、またはＳが、２つのリン原子間の前記エステル酸素または前記酸素を置換する、請求項２に記載の類似体。
【請求項４】
ＣＦ２、ＮＨ、またはＳが独立に、２つのリン原子間の前記エステル酸素および前記酸素を置換する、請求項２に記載の類似体。
【請求項５】
ＣＦ２、ＮＨ、またはＳが、前記エステル酸素を置換する、請求項３または４に記載の類似体。
【請求項６】
ＣＦ２が、２つのリン原子間の前記エステル酸素および／または前記酸素を置換する、請求項３または４に記載の類似体。
【請求項７】
ＣＦ２が、前記エステル酸素を置換する、請求項３に記載の類似体。
【請求項８】
２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースを調製する方法であって、該方法は、
Ｓｉｒ２酵素を、ＮＡＤ＋、および該Ｓｉｒ２のアセチル化されたペプチド基質と、該ペプチドを脱アセチル化するに充分な条件下および時間、反応混合物中で組み合わせ；それから
該反応混合物から、該２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースを同定し精製すること
を含む方法。
【請求項９】
前記２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースが、前記反応混合物からクロマトグラフィーにより精製される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースが、前記反応混合物からＨＰＬＣにより精製される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースが、セファデックス−ＤＥＡＥカラム上で前記反応混合物から精製される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースが、前記ペプチドが脱アセチル化された後に放射能標識されるように、前記ＮＡＤ＋が放射能標識される、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＮＡＤ＋が、その５’位にて１４Ｃにより放射能標識される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記アセチル化されたペプチド上のアセチル基が放射能標識される、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記アセチル化されたペプチド基質が少なくとも２つのアミノ酸からなり、ここでこれらのアミノ酸の内の少なくとも１つが、そのε−アミノ部分にてアセチル化されるリジン残基からなる、請求項８〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記アセチル化されたペプチド基質が、少なくとも３つのアミノ酸残基からなる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記アセチル化されたペプチド基質が、少なくとも５つのアミノ酸残基からなる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記アセチル化されたペプチド基質が、少なくとも１０アミノ酸残基からなる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記アセチル化されたペプチド基質が、少なくとも１５アミノ酸残基からなる、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記アセチル化されたペプチド基質が、少なくとも１８アミノ酸残基からなる、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記アセチル化されたペプチド基質が、ｐ５３の制御ドメインのアセチル化された領域に相同的である、請求項８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記アセチル化されたペプチドがＪＢ１１またはＪＢ１２を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記アセチル化されたペプチド基質が、アセチル化されたｐ５３である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記アセチル化されたペプチド基質が、ヒストンのアセチル化された領域に相同的である、請求項８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記アセチル化されたペプチドが、アセチル化されたヒストンである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記Ｓｉｒ２酵素が原核細胞由来である、請求項８〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記Ｓｉｒ２酵素が古細菌由来である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記Ｓｉｒ２酵素が真正細菌由来である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記Ｓｉｒ２酵素が真核細胞由来である、請求項８〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記Ｓｉｒ２酵素がイースト菌由来である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記Ｓｉｒ２酵素がヒト由来である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
試験化合物がＳｉｒ２酵素の阻害剤であるかどうかを決定する方法であって、該方法は、
該試験化合物を、該Ｓｉｒ２酵素、ＮＡＤ＋、およびＳｉｒ２のアセチル化されたペプチド基質と、該試験化合物の非存在下に該ペプチドを脱アセチル化するに充分な条件下および時間、反応混合物中で組み合わせ；
該アセチル化されたペプチドから産生された２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースを定量し；それから
産生された２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースの量を、同じ条件下にではあるが該試験化合物なしで産生された２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースの量と比較すること
を含み、ここで該試験化合物なしの場合よりもより少ない２’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースおよび／または３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースの存在が、該試験化合物が該Ｓｉｒ２酵素の阻害剤であることを指し示す方法。
【請求項３３】
前記２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースが、前記反応混合物をクロマトグラフィーに付した後に定量される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記クロマトグラフィーがＨＰＬＣである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記クロマトグラフィーがセファデックス−ＤＥＡＥカラム上にある、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記ペプチドが脱アセチル化された後に、前記２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースが放射能標識されるように、前記ＮＡＤ＋が放射能標識される、請求項３２〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＮＡＤ＋が、その５’位にて１４Ｃにより放射能標識される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記アセチル化されたペプチド上のアセチル基が放射能標識される、請求項３２〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記アセチル化されたペプチド基質が少なくとも２つのアミノ酸からなり、ここでこれらのアミノ酸の内の少なくとも１つが、そのε−アミノ部分にてアセチル化されるリジン残基を含む、請求項３２〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記アセチル化されたペプチド基質が、少なくとも３つのアミノ酸残基からなる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記アセチル化されたペプチド基質が、少なくとも５つのアミノ酸残基からなる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記アセチル化されたペプチド基質が、少なくとも１０アミノ酸残基からなる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記アセチル化されたペプチド基質が、少なくとも１５アミノ酸残基からなる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記アセチル化されたペプチド基質が、少なくとも１８アミノ酸残基からなる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
前記アセチル化されたペプチド基質が、ｐ５３の制御ドメインのアセチル化された領域に相同的である、請求項３２〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記アセチル化されたペプチドがＪＢ１１またはＪＢ１２を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記アセチル化されたペプチド基質が、アセチル化されたｐ５３である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記アセチル化されたペプチド基質が、ヒストンのアセチル化された領域に相同的である、請求項３２〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記アセチル化されたペプチドが、アセチル化されたヒストンである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記Ｓｉｒ２酵素が原核細胞由来である、請求項３２〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記Ｓｉｒ２酵素が古細菌由来である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記Ｓｉｒ２酵素が真正細菌由来である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記Ｓｉｒ２酵素が真核細胞由来である、請求項３２〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記Ｓｉｒ２酵素がイースト菌由来である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記Ｓｉｒ２酵素がヒト由来である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
Ｓｉｒ２酵素を阻害する方法であって、該方法は、該Ｓｉｒ２酵素を、請求項３２〜５５のいずれか１項に記載の方法により見出された阻害剤と組み合わせることを含む方法。
【請求項５７】
前記Ｓｉｒ２酵素が生存細胞である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記生存細胞がバクテリア細胞である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記生存細胞が真核細胞である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記生存細胞がイースト菌細胞である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記生存細胞が哺乳類細胞である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記哺乳類細胞が生存哺乳類中にある、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記哺乳類がヒトである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記哺乳類が、ｐ５３−ＤＮＡ結合の欠落により誘導されるガンに関するリスクに晒されているか、またはこのガンを患っている、請求項６２または６３に記載の方法。
【請求項６５】
組成物中のＳｉｒ２の活性を検出する方法であって、該方法は、
該組成物を、ＮＡＤ＋、およびＳｉｒ２のアセチル化されたペプチド基質と、Ｓｉｒ２活性の存在下に該ペプチドを脱アセチル化するに充分な条件下および時間、反応混合物中で組み合わせ；それから
２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースを測定し；ここで、２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースの存在が、該組成物中のＳｉｒ２活性の存在を指し示す方法。
【請求項６６】
前記２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースが、前記反応混合物をクロマトグラフィーに付した後に測定される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記クロマトグラフィーがＨＰＬＣである、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記クロマトグラフィーがセファデックス−ＤＥＡＥカラム上にある、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
前記ペプチドが脱アセチル化された後に、前記２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースが放射能標識されるように、前記ＮＡＤ＋が放射能標識される、請求項６５〜６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
前記ＮＡＤ＋が、その５’位にて１４Ｃにより放射能標識される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
前記アセチル化されたペプチド上のアセチル基が放射能標識される、請求項６５〜６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
前記アセチル化されたペプチド基質が少なくとも２つのアミノ酸からなり、ここでこれらのアミノ酸の内の少なくとも１つが、そのε−アミノ部分にてアセチル化されるリジン残基を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項７３】
前記アセチル化されたペプチド基質が、少なくとも３つのアミノ酸残基からなる、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記アセチル化されたペプチド基質が、少なくとも５つのアミノ酸残基からなる、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
前記アセチル化されたペプチド基質が、少なくとも１０アミノ酸残基からなる、請求項７２に記載の方法。
【請求項７６】
前記アセチル化されたペプチド基質が、少なくとも１５アミノ酸残基からなる、請求項７２に記載の方法。
【請求項７７】
前記アセチル化されたペプチド基質が、少なくとも１８アミノ酸残基からなる、請求項７２に記載の方法。
【請求項７８】
前記アセチル化されたペプチド基質が、ｐ５３の制御ドメインのアセチル化された領域に相同的である、請求項６５〜７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
前記アセチル化されたペプチドがＪＢ１１またはＪＢ１２を含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記アセチル化されたペプチド基質が、アセチル化されたｐ５３である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
前記アセチル化されたペプチド基質が、ヒストンのアセチル化された領域に相同的である、請求項６５〜７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８２】
前記アセチル化されたペプチドが、アセチル化されたヒストンである、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記組成物が原核細胞の抽出物である、請求項６５〜８２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
前記組成物が真核細胞からの抽出物である、請求項６５〜８２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
前記組成物がイースト菌からの抽出物である、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記組成物がヒトからの抽出物である、請求項８４に記載の方法。
【請求項８７】
前記Ｓｉｒ２活性が定量される、請求項６５〜８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８８】
アセチル化されたペプチドを脱アセチル化する方法であって、該方法は、該ペプチドを、Ｓｉｒ２酵素およびＮＡＤ＋と組み合わせることを含み、ここで、該アセチル化されたペプチドがヒストンではない方法。
【請求項８９】
前記アセチル化されたペプチドが少なくとも２つのアミノ酸からなり、ここでこれらのアミノ酸の内の少なくとも１つが、そのε−アミノ部分にてアセチル化されるリジン残基を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記アセチル化されたペプチドが、少なくとも３つのアミノ酸残基からなる、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記アセチル化されたペプチド基質が、少なくとも５つのアミノ酸残基からなる、請求項８９に記載の方法。
【請求項９２】
前記アセチル化されたペプチド基質が、少なくとも１０アミノ酸残基からなる、請求項８９に記載の方法。
【請求項９３】
前記アセチル化されたペプチド基質が、少なくとも１５アミノ酸残基からなる、請求項８９に記載の方法。
【請求項９４】
前記アセチル化されたペプチド基質が、少なくとも１８アミノ酸残基からなる、請求項８９に記載の方法。
【請求項９５】
前記アセチル化されたペプチドが、アセチル化されたｐ５３である、請求項８８〜９４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９６】
前記ペプチドが生存細胞中にある、請求項８８〜９５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９７】
Ｓｉｒ２酵素が、前記細胞中へトランスフェクションされるＳｉｒ２遺伝子により産生される、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記生存細胞が哺乳類中にある、請求項９６または９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記哺乳類がヒトである、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
アセチル化されたペプチドの脱アセチル化を阻害する方法であって、該方法は、該アセチル化されたペプチドを、請求項３２〜５５のいずれか１項に記載の方法により決定されたＳｉｒ２阻害剤と混合することを含む方法。
【請求項１０１】
前記アセチル化されたペプチドがヒストンである、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記アセチル化されたペプチドがｐ５３である、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０３】
前記ペプチドが生存細胞中にある、請求項１００〜１０２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記生存細胞が哺乳類細胞である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記哺乳類細胞が生存哺乳類中にある、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記哺乳類がヒトである、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記ペプチドがｐ５３であり、前記哺乳類が、ｐ５３−ＤＮＡ結合の欠落により誘導されるガンに関するリスクに晒されているか、またはこのガンを患っている、請求項１０２〜１０６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０８】
アセチル化されたペプチドの脱アセチル化を阻害する方法であって、該アセチル化されたペプチドを、請求項２〜７のいずれか１項に記載の２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースまたは２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースの類似体と混合することを含む方法。
【請求項１０９】
前記アセチル化されたペプチドがヒストンである、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記アセチル化されたペプチドがｐ５３である、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１１】
前記アセチル化されたペプチドが生存細胞中にある、請求項１０８〜１１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記生存細胞が原核細胞である、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
前記生存細胞が真核細胞である、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１４】
前記生存細胞が哺乳類細胞である、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
前記哺乳類細胞が生存哺乳類中にある、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
前記哺乳類がヒトである、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記ペプチドがｐ５３であり、前記哺乳類が、ｐ５３−ＤＮＡ結合の欠落により誘導されるガンに関するリスクに晒されているか、またはこのガンを患っている、請求項１１０
〜１１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１８】
２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースのプロドラッグであって、該プロドラッグが、エステラーゼ感受性結合により部分と共有結合された２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースを含み、ここで該プロドラッグは２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースよりもより容易に細胞中へ透過可能である当該プロドラッグ。
【請求項１１９】
前記部分がサリチレートである、請求項１１８に記載のプロドラッグ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［連邦がスポンサーとなった研究に関しての陳述］
本発明は、ＮＩＨグラントＮｏ．ＡＩ３４３４２の下に、米国政府の支援と共になされた。米国政府は本発明に対し、所定の権利を持つ。
【背景技術】
【０００２】
［（１）本発明の分野］
本発明は一般に、酵素産物および活性に関する。より特には、本発明はＳｉｒ２酵素の産物および活性の発見に関する。
【０００３】
［（２）関連技術の記載］
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【０００４】
Ｓｉｒ２ｐ類似の酵素は、バクテリアからヒトまで広く保存されている１，２。イースト菌では、これらのタンパク質はヒストンに近づき７，８、それらを脱アセチル化する９−１２ことにより、他のタンパク質と複合体を形成し、沈黙クロマチンとなる３−６。Ｓｉｒ２酵素は、バクテリアの酵素ｃｏｂＢというホスホリボシルトランスフェラーゼ（転移酵素）１３の同族体であり、これは、Ｓｉｒ２ｐが脱アセチル化反応において、共基質としてＮＡＤ＋を用いるという知見１０，１４，１２に至った。ＮＡＤ＋に関するこの普通ではない要求性は化学量論的であり１４、β−１’−ＡＡＤＰＲ１５，１６または恐らく２’−ＡＡＤＰＲ１６，１７であると本来提案された新規産物を生成する。Ｓｉｒ２−Ａｆ１と呼ばれるＡｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓからのＳｉｒ２ｐ同族体の結晶構造が最近、その活性部位にて結合されたＮＡＤ＋と共に決定された。該構造は、β−１’−ＡＡＤＰＲ１８を産生する触媒メカニズムの関連で解釈された。溝が、この結合したＮＡＤ＋のＣ’１の隣で、基質タンパク質のアセチル−リジン側鎖に結合すると提案され、このペプチド側鎖およびＮＡＤ＋間でのアセチル基転移に関する基質機構を提供する１８。
【０００５】
機械論的および熱力学的な考えからは、Ｓｉｒ２ｐによるこのＮＡＤ＋依存性脱アセチル化は通常ではない反応であり、これは、Ｌｙｓ（リジン）Ｎ−脱アセチル化反応が、加水分解だけで達成する程単純だからである。加水分解およびＡＤＰ−リボースのアセテート体への転移の明らかな組み合わせは、産物としてアセチル−ＡＤＰ−リボース（ＡＡＤＰＲ）を形成し、未知の機能を有する新たな代謝物を生成する１５−１７。
【０００６】
現在までの証拠は、ヒストンがＳｉｒ２酵素のｉｎ  ｖｉｖｏ基質であることを指し示す。しかしながら、ヒストンを欠くサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）のような真正細菌のゲノムは、Ｓｉｒ２−類似タンパク質をコード化する１９。同様に、Ｓｉｒ２ｐをコード化する古細菌のゲノムも、ヒストン類似のタンパク質をコード化するが、それらのヒストンは、真核細胞のヒストンにおいてリジンのアセチル化の突出した部位であるＮ−末端尾部を欠く。１古細菌種であるＡｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓは、４７％同一である２つの異なるＳｉｒ２−類似脱アセチル化酵素をコード化し、これらの内の１つ（Ｓｉｒ２Ａｆ１）のＸ線構造が最近決定された１８。Ｓｉｒ２Ａｆ２は、生化学的により更に特徴付けられ、定められた基質に関してｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性である１２。
【０００７】
Ｓｉｒ２ｐによるヒストンの脱アセチル化は、クロマチンを活性状態から沈黙状態へと変換させる主要な反応であると提案されている９，１０，１２。この示唆は、Ｓｉｒ２ｐタンパク質が、研究された全てのイースト菌の沈黙化複合体２８における唯一の保存されたＳＩＲファミリーの一員であることを示す沈黙化複合体の研究により支持される。カロリー制限はＳｉｒ２ｐ活性を上昇させ、寿命を延ばすことがあり、沈黙化は種々の微生物において潜在的な生物学的効果を持っていることがあるであろうことを示す２９，３０。ＮＡＤ＋に対しての要求性、および沈黙化因子が細胞の酸化還元状態を「感知」し得る証拠は、Ｓｉｒ２ｐファミリーの構成員が、幅広い役割を有する独特なアミド−加水分解酵素であることを示唆する１２，３１。
【０００８】
ヒストン基質なしの微生物中へのＳｉｒ２ｐファミリーの酵素の分布、および複数のＳｉｒ２タンパク質をコード化する真核細胞のゲノムは、種々の基質を伴う脱アセチル化酵素のファミリーを示唆する。突然変異誘発実験は、Ｓｉｒ２ｐの触媒中心ドメインに隣接するＮ−およびＣ−末端領域が、異なる標的へそれを向かわせるのを補助することを示唆する３２。真核細胞中の殆どのＳｉｒ２タンパク質がその核中に位置されるが３３、他は細胞質性であるか３４−３６、またはミトコンドリア性でさえあり（Ｏｎｙａｎｇｏ、Ｃｅｌｉｃ、Ｂｏｅｋｅ、およびＦｅｉｎｂｅｒｇ；未公開の観察）、このことは更なる基質を示唆する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
［本発明の要約］
本発明は、２つの発見に基づいている。第１の発見は、アセチル化ペプチドおよびＮＡＤ＋とのＳｉｒ２の反応産物が２’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースであるという決定である。この２’アセチル基は、３’ヒドロキシル（水酸基）と異性化可能であり、平衡がこの２’および３’形の間で形成されるまで、その逆異性化がよりゆっくり起こる。これ故に、このＳｉｒ２反応は究極的に、２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースの産生を引き起こす（図１０）。
【００１０】
第２の発見は、Ｓｉｒ２酵素が、ヒストン以外のペプチドを脱アセチル化することである。このようなペプチドの例は、アセチル化されたｐ５３およびこれの断片である。実施例１に記載された実験結果に基づけば、当業者であれば、Ｓｉｒ２酵素が少なくとも２つのアミノ酸を有する如何なるアセチル化されたペプチドをも脱アセチル化すると予期するであろうし、ここでこれらのアミノ酸の内の少なくとも１つは、そのε−アミノ部分にてアセチル化されるリジン残基を含む。
【００１１】
従って、本発明は、細胞中で増加した安定性を呈する２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースおよびこれの類似体（アナローグ）の精製された調製物に関する。
【００１２】
本発明は、２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースを調製する方法にも関する。該方法は、Ｓｉｒ２酵素を、ペプチドを脱アセチル化するに充分な条件下および時間、反応混合物中でＮＡＤ＋、およびＳｉｒ２のアセチル化された該ペプチド基質と組み合わせ、それから該反応混合物から２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースを同定して精製することを含む。
【００１３】
加えて、本発明は、試験化合物がＳｉｒ２酵素の阻害剤であるかどうかを決定する方法に関する。該方法は、該試験化合物を、該試験化合物の非存在下にペプチドを脱アセチル化するに充分な条件下および充分な時間、該Ｓｉｒ２酵素、ＮＡＤ＋、およびＳｉｒ２のアセチル化されたペプチド基質と組み合わせ、このアセチル化されたペプチドから産生された２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースを定量し、それから産生された２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボース量を、同じ条件下ではあるが該試験化合物を用いずに産生された２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボース量と比較することを含む。これらの方法では、該試験化合物なしの場合よりもより少ない２’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースおよび／または３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースの存在が、該試験化合物が該Ｓｉｒ２酵素の阻害剤であることを指し示す。
【００１４】
他の実施形態では、本発明は、組成物中でのＳｉｒ２の活性を検出する方法に関する。該方法は、該組成物を、ＮＡＤ＋、およびＳｉｒ２のアセチル化されたペプチド基質と、Ｓｉｒ２活性の存在下に該ペプチドを脱アセチル化するに充分な条件下および充分な時間組み合わせ、それから２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースを測定することを含む。２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースの存在は、該組成物中でのＳｉｒ２活性の存在を指し示す。
【００１５】
本発明は加えて、アセチル化されたペプチドを脱アセチル化する方法に関する。該方法は、Ｓｉｒ２酵素と該ペプチドを組み合わせることを含む。これらの実施形態の新規な態様においては、このアセチル化されたペプチドはヒストンではない。
【００１６】
加えて、本発明は、アセチル化されたペプチドの脱アセチル化を阻害する方法に関する。該方法は、このアセチル化されたペプチドを、２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースまたはこれの類似体と混合することを含む。
【００１７】
追加の実施形態においては、本発明は、２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースのプロドラッグに関する。該プロドラッグは、エステラーゼに感受性の結合により、部分と共有結合された２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースを含む。これらの実施形態においては、該プロドラッグは、２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースよりもより容易に細胞中へ透過することが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
［本発明の詳細な説明］
本明細書中で使用されるように、「ＡＡＤＰＲ」は、アセチルアデノシン２リン酸リボースを意味する。１’−、２’−および３’−ＡＡＤＰＲはそれぞれ、ＡＡＤＰＲの１’−Ｏ、２’−Ｏおよび３’−Ｏレジオアイソマー（位置異性体）を意味する。「２’／３’−ＡＡＤＰＲ」または「２’／３’−Ｏ−ＡＡＤＰＲ」は、２’−ＡＡＤＰＲおよび３’−ＡＡＤＰＲの混合物を意味する（図１０）。「ＡＤＰＲ」は、アデノシン２リン酸リボースを意味する。
【００１９】
本明細書中で使用されるように、「Ｓｉｒ２」は、当業者により理解されるであろうように、今知られているかまたは今後発見される、沈黙情報制御因子（regulator）２、またはそれのオルトローグ（ortholog）もしくはパラローグ（paralog）のいずれかを意味する。
【００２０】
本明細書中で使用されるように、「ＨＰＬＣ」は高速液体クロマトグラフィーを意味し；「ＮＭＲ」は核磁気共鳴を意味し；および「ＭＳ」は質量分析または質量分析機を意味する。
【００２１】
本明細書中で使用されるように、「トランスフェクション」は、ＤＮＡによりコード化される遺伝子が細胞により発現されることが可能なように、該細胞中へ該ＤＮＡを挿入する過程である。該ＤＮＡは該細胞中で、一過的に発現され、または安定に発現され得る。
【００２２】
本明細書中で使用されるように、「ペプチド」は、少なくとも２つのアミノ酸の配列である。ペプチドは、タンパク質を包含する長いアミノ酸配列と同様、短いアミノ酸配列からなり得る。
【００２３】
本明細書中で使用されるように、「ＮＡＤ＋」は、ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドを意味する。
【００２４】
本発明は、２つの発見に基づいている。第１の発見は、アセチル化ペプチドおよびＮＡＤ＋とのＳｉｒ２の反応産物が２’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースであるという決定である。この２’アセチル基は、平衡がこの２’および３’形の間で形成されるまで、３’ヒドロキシル（水酸基）へと移動可能である。これ故に、このＳｉｒ２反応は究極的には、２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースの産生を引き起こす（「２’／３’−ＡＡＤＰＲ」、図１０）。このことは、該反応産物がβ−１’−ＡＡＤＰＲである１５，１６という以前に保持された信念と対照的である。２’／３’−ＡＡＤＰＲは、以前には記載されていない。Ｓｉｒ２は代謝的に価値のあるＮＡＤ＋を使用して２’／３’−ＡＡＤＰＲを産生するので、およびこの産物２’／３’−ＡＡＤＰＲは代謝的に不安定なので、当業者であれば、該産物がシグナル経路の開始剤として有用らしいと理解するであろう。該２’／３’−ＡＡＤＰＲ産物は、組成物中でのＳｉｒ２活性を決定および定量するために、ならびにＳｉｒ２酵素を阻害するために、中でもＳｉｒ２酵素の阻害剤に関して試験するためにも有用である。２’／３’−ＡＡＤＰＲに関してのこれらの使用は、更に以降に記載される。
【００２５】
本発明ヘ至る第２の発見は、Ｓｉｒ２酵素が、ヒストン以外のペプチドを脱アセチル化することである。このようなペプチドの例は、アセチル化されたｐ５３およびこれの断片である。実施例に記載された実験結果に基づけば、当業者であれば、Ｓｉｒ２酵素が少なくとも２つのアミノ酸を有する如何なるアセチル化されたペプチドをも脱アセチル化すると予期するであろうし、ここでこれらのアミノ酸の内の少なくとも１つは、そのε−アミノ部分にてアセチル化されるリジン残基を含む。この知見は当業者を、Ｓｉｒ２酵素が以前に認められたよりも、転写を制御することにおいて、遙かにより広範な役割を持っていると信じさせるであろうが、これは、Ｓｉｒ２酵素が如何なるアセチル化されたタンパク質をも脱アセチル化し得ると今や理解されるからである。
【００２６】
従って、本発明は、２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースの精製された調製物に関する。本明細書中で使用されるように、「精製された」とは、天然に見出されるであろうよりも、組成物のより大きな割合を占めることを意味する。好ましくは、この精製された調製物は、少なくとも５０％の２’／３’−ＡＡＤＰＲである溶解物（塩を除外する）を持つ水性組成物である。より好ましくは、この精製された調製物は、少なくとも７５％の２’／３’−ＡＡＤＰＲである。更により好ましい実施形態では、この精製された調製物は、少なくとも９０％の２’／３’−ＡＡＤＰＲである。該調製物の純度は、当業界において既知の如何なる手段によっても決定され得る。２’／３’−ＡＡＤＰＲの純度を決定する好ましい方法は、ＨＰＬＣにより、例えば以下の実施例に記載の方法による。
【００２７】
生存細胞または細胞抽出物もしくは組織抽出物において、もし内因性エステラーゼの作用が捕捉されなければ、該２’／３’−ＡＡＤＰＲは一般に非常に寿命が短い。２’／３’−ＡＡＤＰＲのこの短命な性質は、エステラーゼの攻撃に付されるエステル酸素原子に関してよく知られた置換基の使用を通じて、エステラーゼの作用からの増大した安定性を持つように設計される２’−ＡＡＤＰＲまたは３’−ＡＡＤＰＲの類似体を使用することにより、回避され得る。２’−ＡＡＤＰＲおよび３’−ＡＡＤＰＲ中のこれらのエステラーゼに弱い酸素原子は、このリボースとこのアセテート基を結び付けるエステル酸素であると理解され、該エステル酸素は、その２つのリン原子間にあるであろう。当業界において知られているように、これらのエステル酸素原子のいずれかもしくは両方の、ＣＦ２、ＮＨ、またはＳでの置換は、エステラーゼの作用に対する増大した耐性により、実質的により安定である２’−ＡＡＤＰＲまたは３’−ＡＡＤＰＲ類似体を提供すると期待されるであろう。
【００２８】
これ故に、幾つかの実施形態では、本発明は、細胞中で増大した安定性を呈する２’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースまたは３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースの類似体に関する。これらの好ましい類似体は、このアセチルエステル酸素または２つのリン原子間の酸素の代わりに、ＣＦ２、ＮＨまたはＳを含む。最も好ましい置換は、ＣＦ２である。該アセチルエステル酸素の置換は、特に好ましい。他の好ましい実施形態では、該エステル酸素およびこれら２つのリン原子間の酸素両方が、独立にＣＦ２、ＮＨまたはＳで置換される。
【００２９】
２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボース産物は、当業界における数多くの化学的または酵素的方法のいずれかにより調製され得る。好ましくは、該２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースは、ペプチドを脱アセチル化するに充分な条件下および時間、反応混合物中でＳｉｒ２酵素を、ＮＡＤ＋、および該Ｓｉｒ２のアセチル化されたペプチド基質と組み合わせることにより、該Ｓｉｒ２酵素を使用して調製される。該２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースは、該反応混合物から同定され精製され得る。好ましくは、該２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースは、クロマトグラフィー、例えばＨＰＬＣにより精製される。幾つかの実施形態では、２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースの単離および／または定量は、放射能により標識されたＮＡＤ＋を使用することにより有利に簡単化され得、それで該２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースは、該ペプチドが脱アセチル化された後、放射能により標識される。例えば、それらの方法の非限定例に関しては、実施例２を参照。あるいは、当業者であれば、放射性アセテートにより標識されたアセチル化ペプチドも２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースを標識するであろうと理解するであろう。この標識された２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースは、より簡単な分離方法を見越したものであり、ここでこの標識された２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースは、放射能標識されたＮＡＤ＋またはアセチル化されたペプチド基質から、例えばセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）−ＤＥＡＥカラムを用いて、分離されることだけを必要とする（例えば、実施例２および図１１参照）。一旦この放射能標識基質（単数または複数）から分離されれば、放射能標識された２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースは、例えばシンチレーションにより容易に定量され得、これは、Ｓｉｒ２の定量または阻害活性の決定が望まれる場合、以下に記載の方法にとって有用である。
【００３０】
以前に議論されたように、これらのアミノ酸の内の少なくとも１つがそのε−アミノ部分にてアセチル化されるリジン残基であれば、少なくとも２つのアミノ酸の如何なるアセチル化されたペプチドも、Ｓｉｒ２に関しての基質として有用に働き得ると信じられている。このアセチル化されたペプチドは、３、５、１０、１５、１８またはこれより多いアミノ酸残基を包含する、如何なる数のアミノ酸をも含み得る。知られているように、好ましい特定の配列はないが、殆どの脱アセチル化は、１組の塩基性アミノ酸において起きる。例えば、引用文献１０および実施例１参照。
【００３１】
好ましい実施形態では、このアセチル化されたペプチド基質は、ｐ５３、例えば実施例に記載のペプチドＪＢ１１またはＪＢ１２の、制御ドメインのアセチル化された領域に相同的である。アセチル化されたｐ５３は、Ｓｉｒ２に関しても有用な基質である。
【００３２】
他の実施形態では、このアセチル化されたペプチド基質は、ヒストンのアセチル化領域、またはアセチル化されたヒストンそれ自体に相同的である。
【００３３】
記載されるこの酵素反応は、Ｓｉｒ２Ａｆ１を例外として、如何なるＳｉｒ２酵素にも関するものであると予期される（実施例参照）。記載される反応を触媒するであろうよく知られたＳｉｒ２酵素は、中でも、Ｓｉｒ２Ａｆ２、ヒトＳｉｒ２Ａ、イースト菌Ｓｉｒ２ｐ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａからのＳｉｒ２Ｔｍ、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍからのｃｏｂＢを包含する。有用な酵素は、古細菌および真正細菌を包含する原核細胞由来のもの、ならびにイースト菌およびヒトを包含する真核細胞由来のものを包含する。
【００３４】
本明細書中で使用されるように、用語「〜に由来する」とは、Ｓｉｒ２酵素に関する場合、（ａ）天然に該酵素を産生する微生物から抽出されたか、または（ｂ）該微生物からのＳｉｒ２酵素をコード化する遺伝子から、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにて翻訳されたことを意味する。これは、異種微生物中へトランスフェクションされた遺伝子、例えばヒト由来のＳｉｒ２遺伝子、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、イースト菌、哺乳類細胞、または何も操作されていない哺乳類中へトランスフェクションされたヒトＳｉｒ２遺伝子から翻訳された遺伝子を包含する。
【００３５】
更なる実施形態では、本発明は、試験化合物がＳｉｒ２酵素の阻害剤であるかどうかを決定する方法に関する。該方法は、以下の段階：
該試験化合物を、該Ｓｉｒ２酵素、ＮＡＤ＋、およびＳｉｒ２のアセチル化されたペプチド基質と、該試験化合物の非存在下に該ペプチドを脱アセチル化するに充分な条件下および時間、反応混合物中で組み合わせ；
このアセチル化されたペプチドから産生される２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースを定量し；その後、
産生された２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースの量を、同じ条件下ではあるが該試験化合物なしで産生された２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースの量と比較すること
を含む。これらの方法において、該試験化合物なしよりも該試験化合物ありで、２’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースおよび／または３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースがより少なく存在するということは、該試験化合物が該Ｓｉｒ２酵素の阻害剤であることを指し示す。
【００３６】
これらの方法は、２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースを正常には産生する如何なるＳｉｒ２酵素を用いても、潜在的な阻害剤を評価するに有用である。これらの反応に有用なペプチドは、以前に記載されたＳｉｒ２ペプチド基質のいずれをも包含する。以前に議論されたように、放射能標識されたＳｉｒ２基質を使用することは、これらの方法を簡単化し得る。
【００３７】
関連した実施形態では、本発明は、Ｓｉｒ２酵素を阻害する方法に関する。該方法は、前に直接記載された方法により見出された阻害剤と該Ｓｉｒ２酵素を組み合わせることを含む。これらの方法では、２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースを正常には産生する如何なるＳｉｒ２酵素も、有用な標的である。阻害されるべきＳｉｒ２酵素は、生存細胞内にあり得、ここで該阻害剤は、当業界において知られているように、該阻害剤の化学的特徴に依存して、数多くの方法のいずれかにより、該細胞中へ挿入される。例えば、該生存細胞は、ヒト細胞を包含するイースト菌または哺乳類の細胞のような、バクテリア細胞または真核細胞であり得る。該哺乳類細胞は、生存哺乳類内にあり得る。幾つかの有用な実施形態では、該哺乳類はｐ５３−ＤＮＡ結合の欠損により誘導されるガンのリスクに晒され、またはこのガンを患っている。それらの実施形態では、このＳｉｒ２阻害剤は、Ｓｉｒ２をｐ５３の脱アセチル化から防ぎ、これ故にｐ５３ＤＮＡ結合を増加させると期待されるであろう。
【００３８】
本発明は、組成物中のＳｉｒ２の活性を検出する方法にも関する。該方法は以下の段階：
該組成物を、ＮＡＤ＋、およびＳｉｒ２のアセチル化されたペプチド基質と、Ｓｉｒ２活性の存在下に、該ペプチドを脱アセチル化するに充分な条件下および時間組み合わせ；それから、
２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースを測定すること
を含む。これらの実施形態では、２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースの存在は、該組成物中でのＳｉｒ２活性の存在を指し示す。これらの方法は、以前に記載された放射能標識された基質を包含する、アセチル化された如何なるペプチド基質を用いても、使用され得る。
【００３９】
本発明の更なる実施形態は、アセチル化されたペプチドを脱アセチル化する方法に関する。該方法は、該ペプチドをＳｉｒ２酵素と組み合わせることを含む。これらの実施形態の新規の態様では、このアセチル化されたペプチドは、ヒストンではない。以前に記載の方法を用いる場合、２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースを産生する如何なるＳｉｒ２酵素も、これらの方法にとって有用であり；これらの方法は、少なくとも２つのアミノ酸からなるアセチル化された如何なるペプチドの脱アセチル化にとっても有用であると期待されるであろうが、ここでこれらのアミノ酸の内少なくとも１つは、そのε−アミノ部分においてアセチル化されるリジン残基を含む。
【００４０】
本発明は、アセチル化されたペプチドの脱アセチル化を阻害する方法にも関する。該方法は、以前に記載の方法により決定されたＳｉｒ２阻害剤とこのアセチル化されたペプチドを混合することを含む。これらの方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、アセチル化された如何なるペプチドの脱アセチル化をも阻害するに有用である。例えば、このアセチル化されたペプチドは、生存細胞、例えば、任意にヒトのような生存哺乳類中の細胞であり得る哺乳類細胞中にあり得る。有用な実施形態は、ｐ５３−ＤＮＡ結合の欠損により誘導されたガンのリスクに晒されているか、またはこのガンを患っている哺乳類中のｐ５３の脱アセチル化を阻害することである。
【００４１】
よく知られているように、酵素反応の産物は、一般に同じ酵素の阻害剤である。このようなことはＳｉｒ２に関しても真実であることが知られており、ここではニコチンアミドが該酵素を阻害する４６。我々はまた、ＡＤＰＲがＡｆＳｉｒ２の潜在的阻害剤であることを示した（実施例１参照）。これ故に、２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースがＳｉｒ２を阻害するであろうとも期待されるであろう。従って、本発明は、アセチル化されたペプチドのＳｉｒ２指向性脱アセチル化を阻害する方法に関する。該方法は、このアセチル化されたペプチドを、２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースまたは以前に記載の２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースの類似体のいずれかと混合することを含む。これらの方法にとって好ましいペプチドは、ヒストンおよびｐ５３を包含する。これらの方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏでは有用であるが、好ましい実施形態では、このアセチル化されたペプチドは、生存細胞中にある。該生存細胞は、原核細胞、または好ましくは真核細胞であり得る。該真核細胞は哺乳類細胞であり得、任意にヒトのような生存哺乳類中にある。有用なことには、該哺乳類は、ｐ５３−ＤＮＡ結合の欠損により誘導されるガンのリスクに晒されているか、またはこのガンを患っている。
【００４２】
加えて、本発明は、２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースのプロドラッグに関する。該プロドラッグは、エステラーゼ感受性結合により部分と共有結合された２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースを含む。これらの実施形態では、該プロドラッグは、２’／３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースよりもより容易に、細胞中へ透過可能である。このようなプロドラッグを作る多くの方法が、知られている。１例は、部分としてサリチレートを使用する、例えばＫｈａｍｎｅｉおよびＴｏｒｒｅｎｃｅ４７に記載の方法を使用する方法である。
【実施例】
【００４３】
本発明の好ましい実施形態が、以下の実施例に記載される。本明細書中の請求項の範囲内の他の実施形態は、本明細書中で開示される本発明の明細または実施の考慮から、当業者には明らかであろう。実施例と一緒に、本明細書は、実施例に伴う請求項により指し示される本発明の範囲および精神と共に、例示的であるだけと考えられるものと意図される。
【００４４】
［実施例１．Ｓｉｒ２の産物、メカニズム、および基質に関する研究］
［方法］
［酵素精製およびアッセイ］
Ｓｉｒ２酵素は、天然酵素１９として精製されたＳｉｒ２Ａｆ１およびＡｆ２を除いて、ＧＳＴ融合物として精製された。［３Ｈ］−アセチル化鶏ヒストンに関する活性に関してのアッセイは、記載されたように１９行われた。ペプチドは、Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ  ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇおよびＳｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｆａｃｉｌｉｔｙにより合成され、使用前にＲＰ−１８カラム上でＨＰＬＣにより精製された。ペプチドＪＢ１１およびＪＢ１２は、以下のように脱アセチル化に関してアッセイされた。ペプチドＪＢ１２Ｄ（脱アセチル型）が標準として作られ、ＨＰＬＣ上ＪＢ１２産物のピークと共に移動された。ペプチドＪＢ１１およびＪＢ１２に関しては、１００μｇのペプチドが、５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、５０ｍＭのＮａＣｌ中３０℃にて終夜、１０μｇのＧＳＴ−Ｓｉｒ２ｐおよび２００ｍＭのＮＡＤと共にインキュベートされた。反応産物は、Ｃ−１８分析カラムおよびアセトニトリルの０〜１００％勾配を有するＳｔａｒクロマトグラフィー・ワークステーション上で分離された。その流速は０．４ｍＬ／分であり；吸収は２１０ｎｍにてモニターされた。同じ反応条件が、インキュベーションがＡｆ２Ｓｉｒ２およびＴｍＳｉｒ２に関しては５５℃にて、ＧＳＴ−Ｓｉｒ２Ａに関しては３７℃にて行われたことを除き、Ａｆ２Ｓｉｒ２、ＴｍＳｉｒ２およびＧＳＴ−Ｓｉｒ２Ａに関して使用された。ＨＰＬＣ分離後集められたＨＰＬＣのフラクション（５００μＬ）が、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＳＴＲの器械上、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析により分析された。
【００４５】
［ＧＳＴ−ｐ３００の精製およびｐ５３との反応］
ＧＳＴ−ｐ３００が、Ｓｈｅｌｌｅｙ  Ｂｅｒｇｅｒから好意により贈られたプラスミドｐＧＥＸ−２Ｔ−ｐ３００２９から精製された。発現ベクターを含有するバクテリア細胞が、３００μＭのＩＰＴＧ  ＯＤ６００＝０．６を用いて誘導され、６時間３０℃にて成長させられた。細胞が集められ、タンパク質が製造者らの説明書に従ってグルタチオン−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）４Ｂビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して精製された。
【００４６】
アセチル−ｐ５３が、調製されたｐ５３のｃＤＮＡおよび細胞抽出物１，１２を含有する発現ベクターｐＲＢ１６で形質転換されたイースト菌株ＹＰＨ５００から調製された。４．６ｍｇのタンパク質を含有する抽出物が、４℃にて１時間、アガロース（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に共役した１２μｇの抗ｐ５３抗体ＤＯ−１と共にインキュベートされた。該ビーズは洗浄され、３０℃にて１時間、ＨＡＴ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１０％のグリセロール、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、５０ｍＭのＮａＣｌ、および４ｍＭの酪酸ナトリウム）中、５μｇのＧＳＴ−ＣＢＰおよび３７．５ｍＬの［３Ｈ］−アセチル−ＣｏＡ（３．７Ｃｉ／ｍｍｏｌ、６７μＭ、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）と共にインキュベートされた。アセチル化後、ビーズは洗浄され、４つのチューブ中へと分割された。各々１０μＬを含有し、３時間、５μｇのＧＳＴ−Ｓｉｒ２Ａ（３７℃）、ＧＳＴ−Ｓｉｒ２（３０℃）、およびＡｆ２Ｓｉｒ２（５５℃）、２００μＭのＮＡＤ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、および５０ｍＭのＮａＣｌと共にインキュベートされた（最終体積３０μＬ）。コントロールの反応は、３７℃にて酵素なしであった。脱アセチル化後、ビーズが洗浄され、タンパク質がＳＤＳサンプル緩衝液の添加および煮沸により放出された。これらのサンプルは１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離された。電気泳動後、これらのサンプルはＰＶＤＦ膜へと移され、免疫ブロットが、製造者らの説明書に従って、０６−７５８抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）またはＤＯ−１を使用して行われた。
【００４７】
［分析の方法］
試薬および緩衝液が販売者から得られた。ＮＡＤおよびそれの産物のＨＰＬＣ分離が、Ｗａｔｅｒｓ２４８７  ２波長ＵＶ／Ｖｉｓ検出器またはＷａｔｅｒｓ９９６ＰＤＡ多波長検出器に適合されて、Ｗａｔｅｒｓ６００ポンプ／コントローラー中で行われた。ＨＰＬＣクロマトグラムは、他に指し示されなければ、２６０ｎｍの吸収を用いて集められた。ＨＰＬＣを介した速度論的研究が、温度制御を有する、プログラム可能なＷａｔｅｒｓ７１７オートサンプラーを使用して行われた。１Ｈ  ＮＭＲ研究は、コンピューター化された温度制御を有する、３００ＭＨｚまたは６００ＭＨｚのＢｒｕｋｅｒ分光器上で行われた。ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ実験は、キャピラリーＭｉｃｒｏＴｅｃｈＣ−１８カラムに組み合わされたＰｅｒｓｅｐｔｉｖｅＭａｒｉｎｅｒＥＳＩ−ＴＯＦ、またはＦｉｎｎｉｇａｎＬＣＱ機器を使用して行われた。
【００４８】
［β−１’−ＡＡＤＰＲの合成］
報告４３されたように、ＣＤ３８が発現されて精製された。１００ｍｇのＮＡＤ＋が、５ｍＬの４ＭのＮａＯＡｃ、ｐＨ６．５中に溶解された。この溶液に、５０ｍＭのＮａＯＡｃ、ｐＨ５．０中に溶解された５０μｇのＣＤ３８酵素が加えられた。３７℃での終夜のインキュベーションの後、この材料は濾過され（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｂｉｏｍａｘ  １０Ｋ  ＮＭＷＬ遠心分離濾過装置）、１９ｍｍ×３００ｍｍの寸法のＷａｔｅｒｓＣ−１８プレパラティブ（分取）カラム上へと注入され、４ｍＬ／分の流速にて０．５％ＴＦＡで溶出された。ＮＡＤ＋の前に溶出するピーク（それぞれ、４０分対５０分）が、集められて凍結乾燥された。この産物（収率２８％）は、ＭＳおよびＮＭＲにより特徴付けられ、β−１’−ＡＡＤＰＲであると決定された。データー：１Ｈ  ＮＭＲ  Ｄ２Ｏ  ｄ（８．６１、ｓ、１Ｈ）、（８．３８、ｓ、１Ｈ）、（６．１４、ｄ、１Ｈ）、（５．８６、ｓ、１Ｈ）、（４．５、ｍ、１Ｈ）、（４．３５、ｍ、１Ｈ）、（４．１８〜４．００、ｍ、６Ｈ）、（２．０２、ｓ、３Ｈ）。ＭＳ（陰イオン）６００ａｍｕ。ＭＳ／ＭＳ（６００）：５４０、３５２および３３３ａｍｕ。
【００４９】
［３’−ＡＡＤＰＲの精製およびＮＭＲの特徴付け］
ＮＭＲ解析用のＳｉｒ２Ａｆ２産物は、５ｍＬの４０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．２５）中、３００μｇのＳｉｒ２Ａｆ２酵素、２０ｍｇのＮＡＤ＋、および７０ｍｇのＪＢ１２ペプチドのインキュベーション（４０℃、終夜）により得られた。この反応は、１０，０００ＭＷのカットオフ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｂｉｏｍａｘ  １０Ｋ  ＮＭＷＬ遠心分離濾過装置）を通した濾過により、クウェンチ（反応を停止させること）された。この濾過物のフラクション（１ｍＬ）が、２５ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ６．０）で予め平衡化されたＤＥＡＥ  Ａ−５０カラム（１ｍＬ）上へ装填された。２ｍＬの２５ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ６．０）、３ｍＬの１００ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ６．０）、および２ｍＬの１ＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ６．０）を用いた溶出が、産物のフラクションを与えた。最後の３つの１ｍＬのフラクションは、ＭＳおよびＨＰＬＣにより示されるように、６０％〜１００％のアセチル−Ｏ−ＡＤＰ−リボースを含有した。２’−ＡＡＤＰＲおよび３’−ＡＡＤＰＲの分離は、２ｍＬ／分の流速にて（５ｍＬの注入体積）１ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ５．０）で溶出された、セミ−プレパラティブＣ−１８カラムを使用して達成された。最大ピーク（３’−ＡＡＤＰＲ）は１４分にて溶出し、ロータリー・エバポレーターに付されて、高度真空下に３０分未満、２℃にて乾燥された。この材料のＨＰＬＣクロマトグラム（５０ｍＭの酢酸アンモニウム溶出液、７．８ｍｍ×３００ｍｍの寸法のセミ−プレパラティブＣ−１８カラムを用いた）は、それが９５％純粋であることを指し示した。この材料は、Ｄ２Ｏ中氷で冷やされた状態に保たれ、１Ｈ  ＮＭＲが、０〜２５℃で変動するプローブ温度を用いて測定された。１Ｄならびに２Ｄ  ＣＯＥＳＹおよびＮＯＥＳＹ実験が行われ、３’−ＡＡＤＰＲの定まった帰属を提供し、この材料の２’アイソマー（異性体）への時間依存性変換が観測された。３’−ＡＡＤＰＲ  １Ｈ  ＮＭＲ、Ｄ２Ｏ、δ（８．５２、ｓ、１Ｈ）、（８．２２、ｓ、１Ｈ）、（６．０９、ｄ、１Ｈ）、（５．３２、ｄ、１Ｈ、βアイソマー）、（５．１７、ｄ、１Ｈ、αアイソマー）、（５．０２、ｍ、１Ｈ）、（４．７、ｍ、１Ｈ）、（４．４５、ｍ、１Ｈ）、（４．３２、ｍ、１Ｈ）、（４．２３、ｍ、１Ｈ）、（４．１４、ｍ、２Ｈ）、（４．１２６、ｍ、１Ｈ）、（３．９５、ｍ、２Ｈ）、（２．０５、ｓ、３Ｈ）。ＮＯＥ（２．０５、５．０２）、ＣＯＥＳＹの交差ピーク（５．０２、４．２３）、（５．３２、４．２３）、（５．１７、４．２３）。ＭＳ（陰イオンモード）：６００、５４０および３４６ａｍｕ。
【００５０】
［２’−ＡＡＤＰＲの精製およびＮＭＲの特徴付け］
２’−ＡＡＤＰＲアイソマーが、前記ＨＰＬＣクロマトグラム中の第２のピークとして溶出した。ＨＰＬＣ（５０ｍＭの酢酸アンモニウム、ｐＨ５．０）は、２’−ＡＡＤＰＲが容易に３’−ＡＡＤＰＲへと変換することを示した。２’−ＡＡＤＰＲは、ＨＰＬＣのピークの積分により決定された４７：６７の比（２’−ＡＡＤＰＲ：３’−ＡＡＤＰＲ）にて、３’−ＡＡＤＰＲをそれと共に平衡に到達させることにより特徴付けられた。ＣＯＥＳＹおよびＮＯＥＳＹの交差ピーク、および１Ｈ  ＮＭＲデーターは、全特徴化を可能にした：２’−ＡＡＤＰＲ  １Ｈ  ＮＭＲ、Ｄ２Ｏ、δ（８．５２、ｓ、１Ｈ）、（８．２２、ｓ、１Ｈ）、（６．０９、ｄ、１Ｈ）、（５．３９、ｄ、１Ｈ、βアイソマー）、（５．２０、ｓ、１Ｈ、αアイソマー）、（４．８７、ｍ、１Ｈ）、（４．７、ｍ、１Ｈ）、（４．４５、ｍ、１Ｈ）、（４．３２、ｍ、１Ｈ）、（４．２３、ｍ、１Ｈ）、（４．１４、ｍ、２Ｈ）、（４．１２６、ｍ、１Ｈ）、（３．９５、ｍ、２Ｈ）、（２．１２、ｄ、３Ｈ）。ＮＯＥ（２．１２、４．８７）、ＣＯＥＳＹの交差ピーク（４．０２、４．８７）、（５．３９、４．８７）、（５．２０、４．８７）。ＭＳ（陰イオンモード）：６００、５４０、３４６。
【００５１】
［２’−および３’−ＡＡＤＰＲの相互変換速度］
２’−および３’−ＡＡＤＰＲ両方のサンプルが１５℃にてインキュベートされ、４０分間隔にてＨＰＬＣにより解析された（Ｃ−１８カラム；５０ｍＭの酢酸アンモニウム、ｐＨ５．０）。与えられたの時間での３’−アイソマーのパーセンテージは、式
３’−ＡＡＤＰＲ（％）＝Ｐａｅｘｐ（−ｋｔ）＋Ｐｆ      （Ｐａ＋Ｐｆ＝Ｐ０）
に適合され、式中Ｐａは、時刻０における平衡上の３’−アイソマーのパーセンテージであり、ｔは時間であり、ｋは該変換に関する第１次の速度定数である。Ｐｆは平衡でのパーセンテージであり、Ｐ０は初期のパーセンテージである。ＨＰＬＣおよびＮＭＲ解析は、時間の関数としての２’−および３’−アイソマー濃度を樹立した。ＮＭＲは、０℃にて１０％ｄ４−メタノール／９０％Ｄ２Ｏ中であるか、または２０℃にて１００％Ｄ２Ｏ中であった。
【００５２】
［産物産生の順序を同定するための、Ｓｉｒ２Ａｆ２の低温研究］
Ｓｉｒ２Ａｆ２触媒による脱アセチル化反応が８℃にて行われ、産物形成の順序が決定された。４０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ６．２）中１５０μＭのＮＡＤ＋、３００μＭのペプチドＪＢ１２を含有する２００μＬの溶液が８℃に冷却され、それから１μＬの９μｇ／μＬのＳｉｒ２Ａｆ２が、この反応を開始するために加えられた。反応が、０．５％ＴＦＡを溶出液として使用するＨＰＬＣによりアッセイされた。１７分および２０分におけるピール（ｐｅａｌ、組み合わせ）が、３０分間隔にて、３’−および２’−ＡＡＤＰＲを定量するために使用された。
【００５３】
［Ｓｉｒ２ｐ反応産物の低温１Ｈ  ＮＭＲ解析］
９５％Ｄ２Ｏ中１．７ｍｇのＳｉｒ２Ａｆ２酵素、５０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ６．３）の溶液が、遠心分離濾過を使用して、５５０μＬへと濃縮された。このサンプルは、２ｍｇのＪＢ１２ペプチドと混合され、６００ＭＨｚＮＭＲ分光器中５℃に冷却された。スペクトルが得られ、９９％Ｄ２Ｏ中５０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ６．３）中の２８０μＬの氷で冷やされた２２ｍＭのＮＡＤ＋溶液が、該反応を開始するために加えられた。１Ｈ  ＮＭＲ１Ｄスペクトルが、５℃にて１８時間に亘る間隔にて得られた。
【００５４】
［Ｓｉｒ２ｐ産物としてのβ−１’−ＡＡＤＰＲの消失］
基準となるβ−１’−ＡＡＤＰＲが、１００μＭ、４０ｍＭのリン酸緩衝液中、ｐＨ６．２５にて、５５℃にて１時間インキュベートされ、２’−または３’−ＡＡＤＰＲアイソマーの産生に関して、ＨＰＬＣにより分析された。この結果得られたクロマトグラムは、コントロールと比較して、β−１’−ＡＡＤＰＲにおける変化がないこと、および２’−または３’−ＡＡＤＰＲの産生がないことを示した。
【００５５】
［２’−および３’−ＡＡＤＰＲ中へのＨ２１８Ｏの取り込み］
２００μＬのＨ２１８Ｏ中（９４．５％、４０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．０）を含有）２μｇのＳｉｒ２Ａｆ２、および１００μｇのＪＢ１２ペプチド、および３００ｍＭのＮＡＤ＋を含有する反応が、５５℃にてインキュベートされ、溶出液として０．５％蟻酸を用いたＬＣＭＳ陰イオンモードのＣ−１８キャピラリーカラム上への注入によりアッセイされた。ペプチド、ＮＡＤ＋、ＡＤＰＲ、およびＡＡＤＰＲが、よく溶解された。１８Ｏインキュベーション対１６ＯコントロールのＭＳが、単一の１８Ｏ取り込みによる、ＡＡＤＰＲに関する２ａｍｕの質量増加（６０２対６００）を指し示した。１６Ｏおよび１８Ｏ両方のサンプルのＭＳ／ＭＳが、ＨＯＯＣＣＨ３の喪失によるｍ／ｚ＝５４０にて観測された主要断片と同じであり、１８Ｏがこのアセテート基中へ取り込まれることを確立した。１８Ｏ反応からの２’−および３’−ＡＡＤＰＲの精製は、両方が単一の１８Ｏを取り込むことを確立した。
【００５６】
［酸触媒１８Ｏ交換反応］
Ｈ２１６ＯまたはＨ２１８Ｏ（前記のような）を含有するＳｉｒ２反応は、１０％ｄ４−酢酸中２体積のＨ２１６ＯまたはＨ２１８Ｏでクウェンチされた。ＬＣＭＳによる分析（前記のような）およびＭＳ／ＭＳ（分子質量および断片化）は：（１６Ｏ、Ｓｉｒ２Ａｆ２反応、１８Ｏ、Ｈ＋）Ｍ−＝６０２、断片＝５４２；（１８Ｏ、Ｓｉｒ２ｐ反応、１８Ｏ、Ｈ＋）Ｍ−＝６０４、断片＝５４２、５４０；（１８Ｏ、Ｓｉｒ２ｐ反応、１６Ｏ、Ｈ＋）Ｍ−＝６０２、断片＝５４０；（１６Ｏ、Ｓｉｒ２ｐ反応、１６Ｏ、Ｈ＋）Ｍ−＝６００、断片＝５４０を与えた。ＡＤＰＲサンプルは、コントロールのようにクウェンチ溶媒中でインキュベートされ、この結果は以下の通りであった：（１６Ｏ、Ｈ＋）Ｍ−＝５５８；（１６Ｏ、ｐＨ７．５）Ｍ−＝５５８；（１８Ｏ、Ｈ＋）Ｍ−＝５６０；（１８Ｏ、ｐＨ７．５）Ｍ−＝５５８。同様の結果が、イースト菌Ｓｉｒ２ｐを用いて得られた。
【００５７】
［ＮＡＤ＋類似体としてのＡｒａ−Ｆ−ＮＡＤ＋］
Ａｒａ−Ｆ  ＮＡＤ＋は、ＡＤＰ−リボシル−トランスフェラーゼの阻害剤であり、Ｓｉｒ２Ａｆ２を評価するために使用された。Ａｒａ−Ｆ−ＮＡＤ＋は、以前に報告されたように合成された４４。ａｒａ−Ｆ−ＮＡＤ＋（５０μＭ）の存在下での、Ｓｉｒ２Ａｆ２（１０μｇ）によるペプチドＪＢ１２（３００μＭ）の脱アセチル化が、ｐＨ６．２５の２００μＬの４０ｍＭのリン酸カリウム中で試験された。ａｒａ−Ｆ−ＮＡＤ＋の変化は、Ｃ−１８逆相ＨＰＬＣにより検出されなかった。ＨＰＬＣ分析を伴う、３００μＭのペプチドおよび１０μのＳｉｒ２Ａｆ２（２０μＬ）の存在下での、ａｒａ−Ｆ−ＮＡＤ＋の５ｍＭ［カルボニル−１４Ｃ］−ニコチンアミド（５５ｍＣｉ／ｍｍｏｌ；Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いたインキュベーションは、ａｒａ−Ｆ−ＮＡＤ＋中には放射能が取り込まれないことを指し示した。コントロールは、ＪＢ１２−［カルボニル−１４Ｃ］−ペプチドと共に行われ、ＮＡＤ＋は、ＮＡＤ＋への［カルボニル−１４Ｃ］−ニコチンアミド交換を確立し、このＳｉｒ２塩基交換反応を確かなものとした。第２のコントロールは、交換酵素としてＡＤＰ−リボシル−トランスフェラーゼＣＤ３８を使用し、［１４Ｃ］ニコチンアミドおよびａｒａ−Ｆ−ＮＡＤ＋間の１００％の塩基交換を示した。Ｓｉｒ２Ａｆ２のａｒａ−Ｆ−ＮＡＤ＋による阻害は、ｐＨ６．２５のリン酸カリウム緩衝液中の３００μＭのＪＢ１２ペプチドの存在下に、Ｓｉｒ２Ａｆ２酵素（７μＭ）およびａｒａ−Ｆ−ＮＡＤ＋（２０μＭ）のインキュベーションにより評価された。ａｒａ−Ｆ−ＮＡＤ＋を欠く反応混合物が、コントロールであった。ポジティブ・コントロールは同じ反応成分を使用したが、５μＭのａｒａ−Ｆ−ＮＡＤ＋の存在下に、ＣＤ３８は５００ｎＭであった。反応は、１５０μＭのＮＡＤ＋を加えることにより、６時間後に開始された。反応は、ＨＰＬＣを使用して、触媒回転数に関して評価された。Ｓｉｒ２Ａｆ２の触媒回転数は、これらの反応条件下に、ａｒａ−Ｆ−ＮＡＤ＋により阻害されなかった。
【００５８】
［結果］
［アセチルｐ５３および断片は、Ｓｉｒ２脱アセチル化酵素の基質である］
ヒストンは、イースト菌および他の微生物において、Ｓｉｒ２タンパク質に関する主要な基質であると提案されている。しかしながら、多くのタンパク質が、リジンのε−アミノ基においてアセチル化される２４。よく特徴付けられた例はｐ５３であり、リジン３７３および３８２において、アセチル化される。合成の１８−ｍｅｒペプチドは、それらの位置においてアセチル化されたｐ５３断片に対応し、Ｓｉｒ２酵素と共にインキュベーションされた。試験された全ての酵素は、Ｓｉｒ２Ａｆ１を除くが、Ｓｉｒ２Ａｆ２、ヒトＳｉｒ２Ａおよびイースト菌Ｓｉｒ２を包含し、３７３残基（ＪＢ１１）および３８２残基（ＪＢ１２）上でアセチル化されたペプチドを脱アセチル化した（図１Ａ；表１）。更なる実験は、ＪＢ１２がＪＢ１１よりも、Ｓｉｒ２Ａｆ２に関して＞４倍良い基質であることを指し示した（図１Ｂ、１Ｆ）。ヒストンおよびヒストン由来ペプチドの脱アセチル化を伴う場合のように、ｐ５３ペプチドの脱アセチル化は、絶対的にＮＡＤ＋に依存していた。脱アセチル化は、Ｃ−１８カラム上でのＨＰＬＣ（図１Ｂ、Ｅ〜Ｇ）、および基質および産物のピークの質量のＭＳ決定（図１Ｃ、Ｄ、Ｆ挿絵）による、基質および産物の分離により、直接確かめられた。
【００５９】
Ｓｉｒ２Ａｆ２および他のＳｉｒ２様酵素が、全長の天然アセチル化ｐ５３についての活性に関しても試験された。天然のアセチル化されたｐ５３は、ｐ３００でｉｎ  ｖｉｔｒｏにて免疫沈降されたｐ５３をアセチル化することにより得られた。該免疫沈降はモノクローナル抗体ＤＯ−１を使用し、ｐ５３のＮ−末端に対して生じた。それは、ｐ５３のアセチル化された形態およびアセチル化されていない形態の両方を沈降させた。アセチル化されたｐ５３は、Ｓｉｒ２酵素の存在下および非存在下にインキュベートされた（図１Ｈ）。これらのタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離され、ｐ５３の全ての形態に結合する抗体であるＦＬ−３９３を用いた場合同様、３７３および３８２番目の位置にてアセチル化されたｐ５３に特異的な抗体を用いて、免疫ブロットされた。試験された全ての３つのＳｉｒ２ｐ酵素は、ｐ５３を脱アセチル化した（図１Ｈ）。
【００６０】
【表１】
2005528331.tif 000002
【００６１】
［活性および反応産物が、幾つかのＳｉｒ−２様脱アセチル化酵素と共に保存される］
試験されたＳｉｒ２酵素（イースト菌Ｓｉｒ２ｐ、Ｓｉｒ２Ａｆ１および２、Ｓｉｒ２Ｔｍ、ｃｏｂＢ、およびヒトＳｉｒ２Ａ）のｐ５３脱アセチル化酵素活性は、系統的に保存されている。これらの酵素は、２つのクラス中へと分類される：（１）試験された全ての生理学的基質（何も操作されていないヒストン、天然ｐ５３、ペプチドＪＢ１１およびＪＢ１２）に関するタンパク質活性の優性なクラス、および（２）化学的にアセチル化されたｐ５３１８に関して活性であると報告されているが、ここで試験された全ての基質に関しては不活性である、例外であるＳｉｒ２Ａｆ１。
【００６２】
ＨＰＬＣにより観測されたこの反応の産物は、古細菌のＳｉｒ２Ａｆ、ヒトＳｉｒ２Ａ、イースト菌Ｓｉｒ２ｐ、および真正細菌ｃｏｂＢおよびＳｉｒ２Ｔｍタンパク質から精製された酵素により触媒される反応中の、ニコチンアミド、ＡＤＰ-リボース、およびＡＡＤＰＲを包含する。ＡＡＤＰＲは全てのケースにおいて形成され、同様にＡＤＰ-リボースの量を変動させた。
【００６３】
［β−１’−ＡＡＤＰＲの化学合成］
このＳｉｒ２反応のＡＡＤＰＲ産物は、β−１’−ＡＡＤＰＲに関して予期される質量を持っているが、同じ質量が、２’−ＡＡＤＰＲおよび３’−ＡＡＤＰＲに関して予期される１５，１６。我々は、種々の以前に報告された方法により２５、基準となるβ−１’−ＡＡＤＰＲを合成した。この保持されている糖加水分解酵素ＣＤ３８は、ｐＨ６．５にて飽和（４Ｍ）酢酸ナトリウム中ミリモーラーの濃度のＮＡＤ＋と共にインキュベートされた場合（合成および構造に関しては、図８のスキーム１Ａ参照）、ミリグラム量のβ−１’−ＡＡＤＰＲアイソマーを形成した。標準β−１’−ＡＡＤＰＲ（図２中のＮＭＲ参照）およびＳｉｒ２ｐにより生成されたＡＡＤＰＲのＨＰＬＣ比較は、これらの２つの化合物が区別されることを示した（それぞれ保持時間２８分および３２分）。Ｓｉｒ２ｐ由来ＡＡＤＰＲおよびβ−１’−ＡＡＤＰＲ間の化学的同一性における違いは、ＭＳ／ＭＳ研究により確かめられ、それらの質量は同じであるが、Ｓｉｒ２ｐ産物およびβ−１’−ＡＡＤＰＲの断片化パターンが異なることを示した（図３）。
【００６４】
［Ｓｉｒ２ｐ反応からの２’−および３’−ＡＡＤＰＲの特徴付け］
該Ｓｉｒ２ｐ反応産物は、１００ｍｇのＪＢ１２ペプチド、３０ｍｇのＮＡＤ＋、および３００μｇの酵素を含有する反応中で産生され、アニオン交換およびＨＰＬＣクロマトグラフィーにより精製された。７５０μＬの体積の氷で冷やされたＤ２Ｏ中に溶解されたサンプルは、１Ｈ  ＮＭＲ解析の前に、約９５％純粋であると決定された。
【００６５】
該Ｓｉｒ２ｐ産物の該１Ｈ  ＮＭＲ（図２、真ん中のパネル）は、β−１’−ＡＡＤＰＲのそれとは異なるが、そのアセテート部分は、２．１ｐｐｍにおけるそのメチルの共鳴に基づき存在する（図２、１番上および１番下のパネル）。このサンプルが終夜の冷蔵後再び解析されると、この１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは変化した。そのマイナー・ピーク（図２、真ん中のパネル）が、より充分に発展されるようになり（図２、１番下のパネル）；引き続いてのスペクトルは、ピークの安定な比が確立されたことを指し示した。ＨＰＬＣ解析は、２６０ｎｍにおいて吸収する２つのピークを与えた。ＭＳおよびＭＳ／ＭＳによる分析は、両方の分子イオンが６００（ｍ/z、陰イオンモード）のＡＡＤＰＲの予見された質量を持っていて、両方ともが同じ断片化パターンを持っていることを確認し、このことは強く、ＡＡＤＰＲの２’−および３’−レジオアイソマーとしての産物を支持した（「方法」を参照）。
【００６６】
［２’−および３’−ＡＡＤＰＲアイソマーの同定］
我々は、精製されたてのＡＡＤＰＲに関する、０℃にて１０％ｄ４−メタノール、９０％Ｄ２Ｏ中行われた２Ｄ  ＮＭＲ実験（ＣＯＥＳＹおよびＮＯＥＳＹ）に基づき、２’−および３’−ＡＡＤＰＲアイソマーとして、これらの２つの種を同定した。これらのスペクトルは、まずＨＰＬＣにより単離され特徴付けられた該アイソマーが、１組の完全なＣＯＥＳＹの交差ピークならびにこのアセチルのメチル基およびＨ３’へと帰属されたピークの間のＮＯＥに基づき、該３’−アイソマーであることを明確に実証した。３’−アイソマーの２’−アイソマーへの変換は、６７：４７の平衡に到達し、該２’−アイソマーは、２’−および３’−両方のアイソマーを含有するサンプル中で特徴付けられた。この２’−の帰属は、完全な１組のＣＯＥＳＹ交差ピークならびにこのアセチルのメチル基およびＨ２’へと帰属されたピークの間のＮＯＥによってなされた（図９）。
【００６７】
ＮＭＲおよびＨＰＬＣ法はそれぞれ、１５℃および２０℃における平衡混合物を提供する３’−アイソマーの２’−アイソマーへの相互変換を実証した。両方法に関する重ね合わせプロット（図４）は指数減衰曲線に適合され、アセチルの転移に関する０．３２時間−１の第１次速度定数ｋ３’から２’への決定を可能にした（図４、上のパネル）。この平衡定数Ｋは、該２’−および３’−アイソマーのＨＰＬＣピークの積分に基づいて、１５℃にて１．４であると見出された。ｋ３’から２’へに関して計算された値はこれ故に、０．４５時間−１であった。そのアノマー形態に関する平衡を包含する、アセチル基転移の全体の平衡および速度論的記載が、図８のスキーム１Ｂに示される。
【００６８】
［該２’−および３’−アイソマーの産生の順序］
Ｓｉｒ２ｐによるＡＡＤＰＲレジオアイソマー生成の順序が、５℃における１Ｈ  ＮＭＲ実験において確立された（「方法」参照）。重ね合わせられたスペクトル（図５）は、該２’−アイソマーがこの反応において早くに出来上がり、その後該３’−アイソマーの産生を伴うことを明らかにする。これらのそれぞれのレジオアイソマーのＣ１’−Ｈαおよびβフォームからの各ピークは、よく共鳴された。この結果は、ＡＡＤＰＲ産生に関しての速度論的な順序が、３’の前に２’であることを確立する（図８のスキーム１Ｃ）。Ｓｉｒ２ｐの触媒速度は、相互変換の該速度定数を、５℃にて２０のｋｃａｔ／ｋ２’から３’へ比で上回る。
【００６９】
［Ｈ２１８Ｏの、産物中への取り込み］
Ｓｉｒ２ｐに関しての反応化学量論（図８のスキーム１Ｃ）は、２つの新たな酸素原子が、ＡＡＤＰＲ中へと取り込まれることを指し示す。これらの酸素原子の内の１つ以上は水から来る１４，１６，１８ことが、仮定されている。このＳｉｒ２ｐの脱アセチル化反応は、ＡＤＰＲがアセテートへと転移されるＡＤＰ−リボシル転移反応に組み合わされたアミノリジンおよびアセテートを与える加水分解反応として見なされ得る。
【００７０】
ＡＡＤＰＲ産物のＭＳ解析により伴われた１８Ｏ水中での反応は、産物の質量が、水からＡＡＤＰＲ中への単一の１８Ｏの取り込みと一致して、２ａｍｕ増加されることを指し示した。この１８Ｏを富ませること（６５％）は、この水アッセイにおける初期の１８Ｏ含量と同じであった（図５、挿絵）。ＭＳ分析（時間範囲３０分〜２４時間）を伴う、ｐＨ７．５における２体積の１６Ｏ水中または１０％ｄ４−酢酸中での、これらのサンプルの希釈は、１８Ｏ含量が変わらないことを示した（表２）。１８Ｏ取り込みの部位はこれ故に、該２’−ＡＡＤＰＲおよび３’−ＡＡＤＰＲ分子中の、交換不可能な酸素原子である。
【００７１】
該１８Ｏ原子は、２’−および３’−ＡＡＤＰＲ分子のアセテート部分中か、または該産物の１’−ＯＨ中に存在し得るであろう。室温において３時間の、１０％ｄ４−酢酸中での非標識化ＡＤＰＲならびに１８Ｏ中の２’−および３’−ＡＡＤＰＲのインキュベーションは、これらの分子中への単一の１８Ｏの取り込みに一致して２ａｍｕ質量を増加させたが、中性条件下では、質量におけるこのような変化は観測されなかった。該１’−ＯＨのみが、この交換に一致している。１０％ｄ４−酢酸および１８Ｏ水でインキュベーションされた場合、１８Ｏ含有Ｓｉｒ２ｐ反応由来の２’−および３’−ＡＡＤＰＲは、第２の１８Ｏを該ＡＡＤＰＲ分子（質量＝６０４）中へ取り込み、これは、該１’−ＯＨのアイソトープ交換に一致し、無保護のヒドロキシル（水酸基）の存在を実証した（図５、挿絵）。
【００７２】
交換実験は、ＭＳ／ＭＳ研究と組み合わされ、この化学的解釈を強化した（表２）。１８Ｏ水中での２’−および３’−ＡＡＤＰＲの酸触媒交換反応は、５４２ａｍｕの断片を与え、これは、単一の１８Ｏのそのリボース部分中への取り込みと一致している。１６Ｏまたは１８Ｏ水中で進行されるＳｉｒ２ｐの反応は、アセテートの喪失から起源を発する５４０ａｍｕ断片に至った。これ故に、溶媒から得られる交換不可能な１８Ｏ原子は、２’−および３’−アセテートのカルボニル酸素中へ取り込まれる。
【００７３】
【表２】
2005528331.tif 000003
【００７４】
［阻害剤ａｒａ−Ｆ−ＮＡＤ＋基質反応、交換、および阻害］
Ａｒａ−Ｆ−ＮＡＤ＋は、多くのＡＤＰ−リボシル転移酵素２６に関しての強力な阻害剤であり、これは、その２’位におけるＯＨに関するフッ素の置換が、ａｒａ−Ｆ−ＮＡＤ＋を、ＮＡＤ＋よりもおおよそ５０倍より安定にし２６、これ故に、酵素−ＡＤＰ−リボースの共有結合性中間体２７の化学的な捕捉を可能にするからである。Ａｒａ−Ｆ−ＮＡＤ＋は、脱アセチル化または交換反応において、基質として働かなかった。コントロールは、放射能標識されたニコチンアミド（５ｍＭ）を容易にａｒａ−Ｆ−ＮＡＤ＋へと交換し、Ｓｉｒ２ｐはニコチンアミドを５０μＭのＮＡＤ＋へとこれらの条件下交換した。Ａｒａ−Ｆ−ＮＡＤ＋は、ＣＤ３８を使用したコントロールに関してのそれの活性にも関わらず、ペプチドの存在下または非存在下に、Ｓｉｒ２ｐを不活化しなかった。これ故に、ａｒａ−Ｆ−ＮＡＤ＋は、このＳｉｒ２ｐ反応において不活性である。
【００７５】
［議論］
我々はここに、それに由来するアセチル化されたヒトｐ５３腫瘍抑制因子およびペプチドが、幅広い種々のＳｉｒ２ｐに関する優れたｉｎ  ｖｉｔｒｏ基質であることを示す。アセチル化は、効率的な配列特異的ＤＨＡ結合の活性化に関して要求されるので、脱アセチル化酵素の作用は、細胞中でｐ５３活性を減少させると予見される。以前の研究は、ｐ５３、および脱アセチル化酵素のＲｐｄ３ファミリー間の複雑な関係を示している。ｐ５３は所定の遺伝子座にて抑制因子として作用し、該Ｒｐｄ３ヒストン脱アセチル化酵素関連因子であるＳｉｎ３ｐは、このような抑制を媒介する３７。逆説的に、１つの研究は、ｐ５３それ自体が、少なくとも過剰に発現された場合３８、Ｒｐｄ３ファミリーの脱アセチル化酵素に関する基質になり得ることを示唆する。Ｓｉｒ２ｐによるｐ５３の脱アセチル化は、それの活性が細胞の代謝または酸化還元状態を介して間接的に調節されるようにするであろう。このことは特に、ＤＮＡの損傷と関連する酸化ストレスを伴って、意味をなすであろう。しかしながら、我々の研究は、ｐ５３に関して、Ｓｉｒ２タンパク質の間において如何なる特異性も指し示さない。ヒストンを効率的に脱アセチル化するそれらの酵素は、それらが古細菌由来である場合でさえ、ｐ５３に関してもよく作動する。他の実験室からの最近の仕事も、非生理学的基質であるアセチル化されたＢＳＡが、Ｓｉｒ２ａｆ１に関する基質であることを示す１８。これ故に、もしＳｉｒ２ｐがｐ５３活性を調節することにおいて制御的な役割を演じるのであれば、このようなＮＡＤ＋制御による脱アセチル化反応を特異的なものとする未同定の因子または条件があるはずである。
【００７６】
［Ｓｉｒ２ｐの産物］
Ｓｉｒ２ｐの脱アセチル化の産物としての２’−ＡＡＤＰＲの同定は、Ｓｉｒ２が独特のタイプのＮＡＤ＋依存性酵素を代表するという見方を強化した。Ｓｉｒ２ｐの産物は、β−１’−ＡＡＤＰＲであると提案されており１５〜１７、Ｍｉｎら１８からのＳｉｒ２ｐのＸ線結晶構造は、この種の形成の観点から解釈された。この産物は、やはり該Ｓｉｒ２ｐ反応に似たニコチンアミド交換反応を触媒する他のＡＤＰ−リボシル・トランスフェラーゼ（転移酵素）の先例から示唆された。ＮＡＤ＋糖加水分解酵素およびＣＤ３８の両方が、ベータ構造（configuration）を有する産物を形成し、両方が塩基交換反応を触媒する。これ故に、該Ｓｉｒ２ｐ産物に対しての提案は、既知の酵素学１５〜１７の論理的な拡張であった。塩基交換は、ＡＤＰＲ求電子物質の酵素安定化、または共有結合した酵素中間体の形成２７を要求し、このことは正常には、結果的に１−β−立体化学を有する求核物質へのＡＤＰＲの転移をもたらす。我々は、基準となるβ−１’−ＡＡＤＰＲを合成し、Ｓｉｒ２ｐにより形成されるこの産物の内いずれも、この化合物に対応しないことを確立した。β−１’−ＡＡＤＰＲに関して観測された安定性も、それが該Ｓｉｒ２ｐ反応中の中間体ではないことを確立する。Ｓｉｒ２ｐの触媒部位から放出されるこの産物は、２’−および３’−アセチル・アイソマーのＳｉｒ２ｐ非依存性混合物を形成する２’−ＡＡＤＰＲである。このアセチル基の化学交換は結果的に、１５℃にてほぼ６７：４７の２’：３’平衡比を与える。該交換は、この温度では、０．４５時間−１および０．３２時間−１の速度にて起こる。３７℃の生理学的温度では、該平衡は６０分以内に確立されるであろう。これ故に、Ｓｉｒ２ｐ作用の下流のカスケードが、２’−から３’−ＡＡＤＰＲへの自然な変換により定められ得るであろうということが想起され得る。各レジオアイソマーは、１’αおよびβアノマーの形態で存在し、ＮＭＲにより区別可能な４つの種を生成する（図８のスキーム１Ｂ）。このα／βアノマー平衡は速い（＞５０秒−１）。
【００７７】
［２’−ＡＡＤＰＲを生成するＳｉｒ２ｐ触媒段階］
２’−ＡＡＤＰＲの形成は、その２’−ヒドロキシル（水酸基）が、この化学メカニズムのある段階にて求核物質として作用することを要求する。該２’−ヒドロキシルの参加が、示唆されている。該２’−ヒドロキシルは、アミド部分を脱アセチル化するために、該求核物質として直接作用すると提案された１６。この直接の２’−求核物質メカニズムは、Ｓｉｒ２ｐから放出された２’−ＡＡＤＰＲ中の単独の１８Ｏ標識としての、その１’位における溶媒水からの１８Ｏの取り込みを要求する。しかしながら、ＭＳ分析は、１８Ｏがそのアセチル基中に現れることを確立したが、これ故に、該２’−ヒドロキシル基の第１の求核物質としての作用を除外することが出来る。
【００７８】
ＡＤＰＲ転移の脱アセチル化との組み合わせを調和させるには、この反応は、ＡＤＰ−リボシル化毒素により触媒されるＡＤＰ−リボシル転移反応に比較され得、ここでこれらの酵素は、弱い求核物質により攻撃される非常に反応性のＡＤＰ−リボオキソカルベニウムイオンを生成する。例えば、コレラ毒素においては、ＡＤＰＲは、ＡＤＰ−リボースの立体化学の反転を伴ってＮＡＤ＋からＡｒｇへと転移され、α−１’−置換ＡＤＰＲ−アミデートを生成する３９。このＳｉｒ２ｐ反応における同じ戦略が、そのＮ−アセチル−リジンのアシル酸素をとらえてＯ−アルキル−アミデートを生成する、ＡＤＰ−リボ−オキソカルベニウムイオンを生成する（図８のスキーム１Ｄ）。Ｏ−アルキル−アミデートは化学的に活性化され、水中で自然に加水分解し、無保護のアミンおよびエステルを形成する４０，４１。Ｓｉｒ２ｐに関しては、これらはこの脱アセチル化されるリジンおよびこのα−１’−ＡＡＤＰＲに対応する。このようにして更に特徴付けられた全てのＡＤＰ−リボース転移反応の遷移状態研究は、強力なリボ−オキソカルベニウムイオン求電子物質が生成されて、ＡＤＰＲ転移に関する化学４２を容易にすることを示す。
【００７９】
このメカニズムは、脱アセチル化酵素活性を欠く突然変異酵素においてさえ１８、ニコチンアミド交換に関するペプチド基質の要求性を説明する。２’−ＡＡＤＰＲを形成し得る、２つの可能な反応経路がある。第１においては、前記Ｏ−アルキル−アミデート中間体は、２’−レジオ化学へとアイソマー化して観測された産物を与える１’−置換α−ＡＡＤＰＲへと加水分解する（図７のメカニズムＡ；図８のスキーム１Ｄ）。あるいは、その２’−ヒドロキシルが、該Ｏ−アルキル−アミデート中間体を攻撃して、環状アシルオキソニウムを生成し、それから加水分解により、観測された２’−ＡＡＤＰＲ産物を形成し得るであろう（図７のメカニズムＢ；図８のスキーム１Ｅ）。
【００８０】
［該α−１’−ＡＡＤＰＲ中間体の性質］
Ｓｉｒ２Ａｆ２を使用して５℃にて行われた低温ＮＭＲ研究は、α−１’−ＡＡＤＰＲの積算に関する証拠を与えなかった。これ故に、α−１’−ＡＡＤＰＲから２’−ＡＡＤＰＲへの変換は、この酵素の触媒速度以上で起こるが、これは該α−１’−ＡＡＤＰＲに関する検出レベルが該酵素の濃度に近かったからである。この２’−から３’−ＡＡＤＰＲへの相互変換は、２０の因子によるｋｃａｔよりもより遅く、この２’−アイソマーの酵素依存的産生は、ＮＭＲにより観測された（図４）。これらの結果と最も一致したメカニズムは、この１’−Ｏ−アルキルアミデート上でのこの２’−ヒドロキシルの攻撃であり、該酵素に関する２’−ＡＡＤＰＲ形成の前駆体として、１’−２’置換アシル−オキソニウム構造を形成する（図７のメカニズムＢ；図８のスキーム１Ｅ）。
【００８１】
［Ｈ２１８Ｏ取り込みからの標識パターン］
このＡＡＤＰＲ産物中での１８Ｏ水からの単一の１８Ｏ原子の取り込みにより、水が、この触媒メカニズムにおける参加者として確認された。この酸素原子は、そのアセチル基の交換不可能な酸素である。単一の水分子メカニズムの、およびそのＣ１’−ヒドロキシルにおける酸により交換可能な酸素の確認が、そのアミドカルボニルの炭素におけるアシル−酸素−Ｃ１’結合の形成、および水の攻撃を確かなものにする。
【００８２】
［Ｘ線構造が、観測された産物の形成と一致している］
Ｓｉｒ２−Ａｆ１のＸ線構造の初期の検査１８は、共有結合性のＡＤＰＲの転移およびβ−立体化学の結果を支持する、ＮＡＤ＋の結合距離内に推定される求核性残基はないことを示す。我々の実験結果においてライトを浴びた構造の新鮮な観点は興味を惹くものであり、これは該ＮＡＤ＋のα面が結合されたアセチルによる攻撃から妨げられず、その２’−ヒドロキシルが該酵素中の如何なる側鎖にも結合されていないことが見出される。実際、モデル化研究は、ｐ５３のＣ−末端ペプチドのＮＭＲ構造のＳｉｒ２Ａｆ１の結晶構造中への簡単な嵌め込みを可能にした（図６）。このモデルにおいては、そのアセチル酸素は、Ｓｉｒ２Ａｆ１へのそのニコチンアミド結合のα面に接近するように、実際に完璧に位置されている。更に、その３’ヒドロキシルの近くに位置されるヒスチジンは、脱アセチル化酵素の機能に必須である突然変異の誘発により示されており、該ＮＡＤ＋分子の底面が、触媒機能を満たす酸−塩基転移経路に付されることを示唆する。
【００８３】
［Ｓｉｒ２ｐメカニズムの要約］
これらの結果の総合は、図８のスキーム１Ｅの反応段階に対する強力な支持を提供する。殆どのヒストン脱アセチル化酵素は単なる加水分解酵素であり−Ｎ−アセチル基の加水分解は化学的に単純であり、エネルギー的に好ましい反応である。共基質としての代謝的に価値あるＮＡＤ＋の消費に関する生物学的合理性は、基質によるシグナル伝達を包含することがある；ＮＡＤ＋のレベルは、Ｓｉｒ２ｐに基づいた遺伝子制御をコントロールする細胞のエネルギー状態および酸化還元状態をシグナル伝達することがある。第２の可能性は、この反応が、これらの新規化合物２’−および３’−ＡＡＤＰＲの生成によるＳｉｒ２ｐのシグナル伝達経路を開始させるということである。これらの分子は、代謝においては以前には認められておらず、シグナル伝達経路の他の開始剤に共通な化学的不安定性の特徴を担持している。幾つかのＳｉｒ２ｐ同族体が細胞質性であり３５，３６、化学的にアセチル化されたＢＳＡ１８またはｐ５３のような他の非ヒストンタンパク質からアセチル基を受容出来るという最近の証拠は、細胞の成長における遙かにより広範な役割、およびアセチル−転移酵素反応による転写制御を示唆する。Ｓｉｒ２ｐ産物の同定は、これらの経路の更なる調査のためのツールを提供し、この異常ＡＤＰ−リボシル−転移酵素に特異的に設計された阻害剤に関する情報を提供する。
【００８４】
［実施例２．Ｓｉｒ２およびＳＩＲ２の阻害剤に関する改良されたアッセイ］
以上で議論されたように、Ｓｉｒ２のＮＡＤ＋との反応、および適切なタンパク質またはペプチドアセチル供与体は、２’および３’−Ｏ−アセチル−ＡＤＰＲ（ＡＡＤＰＲ）および脱アセチル化されたタンパク質もしくはペプチドを産生する。Ｓｉｒ２活性の検出は、該ＡＡＤＰＲ産物の産生を測定することにより、効果的に行われ得る。これに関する以前の方法は、産物を検出するためのＨＰＬＣの使用に基づいていた。既知の方法によるＮＡＤ＋の放射化学的標識化により、放射能により標識化されたＡＡＤＰＲの産生および定量が、セファデックス−ＤＥＡＥカラム上での未反応のＮＡＤ＋からのＡＡＤＰＲの速い分離により達成された。
【００８５】
行われた通りの方法は、以下の通りである：
１５０μＭのペプチドＪＢ１２（ｐ５３を主体としている）および１５０ｍＭの［５’−１４Ｃ］ＮＡＤ＋（１サンプルにつき１０００００ｃｐｍの特異的な活性）を含有する３００μＬの５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．２、または７．０もしくは７．５）が、３０分〜４時間で変動する期間、５μＬの緩衝液（イースト菌同族体Ｓｉｒ２ｐまたはＡｒｃｈａｅｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ  ＡＦ２Ｓｉｒ２）中の３μｇのＳｉｒ２酵素と反応させられた。反応完結時に、５０μＬ分取された反応混合物が、ドライアイス上で凍結された。４時間後、全てのチューブが解凍され、ｐＨ７．０の２５ｍＭの酢酸アンモニウムで予め平衡化された１ｍＬのＤＥＡＥセファデックス・カラム上へと装填された。６ｍＬの２５ｍＭの酢酸アンモニウムが、該カラムを通じて溶出され、１ｍＬのフラクション中に集められた。該カラムは引き続き、６ｍＬの５００ｍＭの酢酸アンモニウムで溶出され、１ｍＬのフラクション中に再び集められた。各カラム・フラクションは、９ｍＬのシンチレーション液の添加によりカウントされ、シンチレーション・カウンター中へ置かれた。これらの溶出物に関するプロファイルは、図１１に示される。この方法を使用すると、前記未反応ＮＡＤ＋が最初に溶出し（フラクション１〜６）、それからＡＡＤＰＲが溶出する（フラクション７〜１２）。１００ｃｐｍを上回るフラクションの総合は、時刻０におけるカウントで、差し引かれた（図１２）。ＡＡＤＰＲ対ＮＡＤの検出に関しての感度は、５０μＬ中５μＭ、換言すれば、２５０ピコモルのＡＡＤＰＲである。
【００８６】
この方法は、ＮＡＤ＋の非Ｓｉｒ２性分解に関するコントロールと組み合わされた場合、生物学的抽出物中でのＳｉｒ２活性の検出への数多くの適用を持つ。我々は、適切なアセチル供与体基質と組み合わされた場合、Ｓｉｒ２を含有する抽出物がＡＡＤＰＲを産生し得、活性が前記のカラムの方法論を介したＡＡＤＰＲの形成により直接測定され得ることを示した。Ｓｉｒ２活性を発現しているバクテリア抽出物中でのＡＡＤＰＲの検出は、純粋な酵素の添加の代わりに全細胞ホモジェネートが添加されたことを除き、前記のものと同様に行われた。未誘導化細胞、または突然変異の不活性なＳｉｒ２を産生するように誘導された細胞を使用するコントロールは、ＡＡＤＰＲの産生を示さなかったが、これはこのアッセイにより決定された通りであり、ＮＡＤ＋の分解は起こらなかった。このアッセイの感度は、生物学的に関連した濃度（５μＭ）に恐らく近いＡＡＤＰＲの検出を見越したものである。
【００８７】
この方法の利点は、該アッセイのスピード（これは、２０サンプルまでに関しては、４〜７時間のみ要求する）、および該Ｓｉｒ２反応の独特な産物であるＡＡＤＰＲの直接の検出に対するそれの信頼性である。該方法はまた、純粋な形態のＡＡＤＰＲの簡単な精製を可能にするが、これは、想到される分離もまた、ＡＡＤＰＲを反応混合物中の他の成分から分離するよう機能するからである。細胞のＳｉｒ２作用から精製されたＡＡＤＰＲはその後、ＨＰＬＣもしくはＭＳにより化学構造において証明され得、またはもう１つ別の特定のアッセイにおいて使用され得る。
【００８８】
この方法の更なる適用は、Ｓｉｒ２活性の阻害剤の発見および評価を包含する。Ｓｉｒ２作用に関する小分子の作用の発見および定量的評価は、治療化合物へと至る潜在能力を持っている。Ｓｉｒ２阻害を検出するためのＡＡＤＰＲの利用は、細胞中でのＳｉｒ２作用の単独で独特な産物を検出することに依る。この方法においては、この反応は前記のように行われ、種々の濃度において加えられる潜在的阻害剤を用いる。Ｓｉｒ２に関する反応速度は、最速でありその傾きに等しい、反応の進行の初期の線形相を使用することにより各サンプルにおいて決定される。該反応の阻害剤は、減少された速度を示す。阻害は式：
１／ν＝１／Ｖｍａｘ（１＋［Ｉ］／Ｋｉｉ）＋Ｋｍ／Ｖｍａｘ（１＋［Ｉ］／Ｋｉ）
により定量され、式中ＫｍおよびＶｍａｘは、該阻害剤との競合（拮抗）結合に付される基質のミカエリス定数を記述するのに使用されるパラメーターであり、［Ｉ］は、該阻害剤の濃度であり、ＫｉおよびＫｉｉは、競合および非競合結合定数である。この方法は、１ｍＭ程の高さの結合親和性を有するＫｉ値を有する競合阻害剤を発見すると期待されるであろうし、実際に、１００μＭ以下の範囲の結合親和性を有する阻害剤を同定し得る。１つの実施形態では、該方法は、２００μＭの阻害剤の、１００μＭのＮＡＤ＋およびペプチド基質を含有する３００μＬの反応混合物への添加を含む。
【００８９】
ハムスター卵巣細胞およびラット肝を包含する幾つかの抽出物の調査は、ＡＡＤＰＲがＡＤＰＲおよびアセテートへ分解し得る、高いエステラーゼ活性が存在することを示した。ＡＡＤＰＲまたは放射能で標識されたＡＡＤＰＲの使用は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＡＡＤＰＲを分解または利用するこれらのエステラーゼ（または他の酵素）を特徴付け、発見するための戦略である。特に、ＡＡＤＰＲの分解は、ＨＰＬＣまたはＴＬＣアッセイにより測定され得る。放射能による標識が使用される場合、この目的に必要なＡＡＤＰＲの量は、２５０ピコモル程度に少なくし得る。
【００９０】
ＡＡＤＰＲの産生を伴う場合のように、ＡＡＤＰＲ分解を検出する、ＡＡＤＰＲに基づく方法の使用は、細胞中でこの化合物を利用する活性を問う手段として、独特なＳｉｒ２反応産物を与える。対時間での分解の定量は、活性を利用するＡＡＤＰＲだけでなく、この活性を阻害し得る化合物をも発見する方法を提供する。小分子化合物による細胞中でのＡＡＤＰＲの分解の阻害は、細胞中でＡＡＤＰＲの作用を増加させることが出来、これ故に、細胞の内側でのＳｉｒ２の作用の唯一の独特な産物の寿命の延長を介して、Ｓｉｒ２の効果を延長する。
【００９１】
パラ−ニトロフェニルアセテート（４００ｎｍ）からのパラ−ニトロフェノールの放出により測定された場合の、ＤＥＡＥにより分離されたラット肝抽出物のエステラーゼ活性が、図３に示される。これは、肝細胞においてＡＡＤＰＲが付される、エステラーゼに富んだ固有のバックグラウンドを示す。この広範なエステラーゼ活性を問う基質としてのＡＡＤＰＲの使用は、細胞の内側でのＡＡＤＰＲ特異的エステラーゼを決定するのに使用され得る。１つの戦略は、一般の基質の活性に対して測定されるＡＡＤＰＲ産物に関する活性の特異性の測定として、ＡＡＤＰＲエステラーゼ活性／パラ−ニトロフェニルアセテートエステラーゼ活性の比を使用することである。酵素学的な理論は、酵素活性が、該酵素がそのために設計された基質に関して最適化されることを仮定する。これ故に、活性比は、ＡＡＤＰＲを認識するように設計された酵素に関して、最も高くあるべきである。
【００９２】
ＡＡＤＰＲに似ている小分子阻害剤を使用するような他の戦略も、用いられ得る。図１３に示されるように、これらのエステラーゼは、ｍＭ濃度のＡＡＤＰＲ類似体の添加に対して鋭敏である。
【００９３】
以上の観点から、本発明の幾つかの利点が達成され、他の利点が得られることが、分かるであろう。
【００９４】
本発明の範囲から逸脱せずに、前記方法および組成物において種々の変更がなされ得るであろうから、前記記載中に含有される全ての事項、および添付の図面に示される全ての事項が、例示的なものとして、限定するニュアンスではなく解釈されるようにされることが意図される。
【００９５】
本明細書中引用された全ての引用文献が援用される。本明細書中のこれらの引用文献についての議論は、著者らによりなされた主張を要約するだけであると意図され、如何なる引用文献も先行技術を構成しないという確認がなされる。出願人は、これらの引用された引用文献の正確さおよび適切さに挑む権利を保持する。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】図１は、ｐ５３および誘導ペプチドの図式、ＨＰＬＣのトレースおよび免疫ブロットが、Ｓｉｒ２ｐおよび関連タンパク質の基質であることを示す。Ａ．太字の残基は、ＪＢ１１および１２中のアセチル・リジン、ならびにＪＢ１２Ｄ中のリジンである。Ｂ−Ｇ．基質および産物ピークのＨＰＬＣ分離（数値は保持時間である）およびＭＳ分析（数値はａｍｕである）。Ｂ．Ｓｉｒ２ｐとのＪＢ１１の反応のＨＰＬＣ分析。Ｃ，Ｄ．パネルＢ中のＨＰＬＣからの２つの主要なピーク（産物、Ｃ；基質、Ｄ）のＭＳ。Ｅ．ペプチドＪＢ１２のＨＰＬＣ。Ｆ．Ｓｉｒ２ｐでの処理を伴うペプチドＪＢ１２のＨＰＬＣ。挿絵はＭＳの主要なピーク。Ｇ．ペプチドＪＢ１２およびＪＢ１２Ｄの混合物のＨＰＬＣ。Ｈ．イースト菌中で発現され、抗ｐ５３ＤＯ−１で免疫沈降され、ｐ３００でｉｎ  ｖｉｔｒｏでアセチル化された全長のｐ５３に関するｐ５３活性。上のパネルは、リジン３７３および３８２に特異的な抗アセチルｐ５３抗体で免疫ブロットされる。下のパネルは、アセチル化および脱アセチル化された形態のｐ５３に対して反応性の抗体ＦＬ−３９３で免疫ブロットされる。
【図２】図２は、ＳＩＲ２産物の構造に関する種々の調製物のＮＭＲのトレースを示す。１番上のパネル：Ｄ２Ｏ中β−１’−ＡＡＤＰＲの１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ）。真ん中のパネル：Ｄ２Ｏ中１５℃での３’−ＡＡＤＰＲの１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ）。１番下のパネル：２’−および３’−ＡＡＤＰＲアイソマーの平衡を示す、２０℃にて数時間経過した真ん中のパネルからのサンプル（６００ＭＨｚ）。
【図３】図３は、Ｓｉｒ２ｐ由来のＡＡＤＰＲおよびβ−１’−ＡＡＤＰＲのＭＳ／ＭＳ比較を示す。
【図４】図４は、ＡＡＤＰＲの構造に関するプロットおよびクロマトグラムを示す。左上方のパネル：１５℃にて５時間に亘る、３’−ＡＡＤＰＲの２’−ＡＡＤＰＲアイソマーへの変換を示す、ＨＰＬＣクロマトグラムの時間依存性。下方のパネル：１０℃における、時間の関数としての、３’（αおよびβ）ＡＡＤＰＲ（多数）および２’（αおよびβ）ＡＡＤＰＲ（少数）のレジオアイソマー数における変化を示す、１Ｄ（１次元）１Ｈ  ＮＭＲスペクトルの重ね合わせプロット。右上方パネル：ＨＰＬＣにより測定された、１５℃における、時間の関数としての３’Ｏ−アセチル−ＡＤＰＲアイソマーのプロット。実線の曲線は、本文中において記載される第１次の関数に対しての最も良い適合を表す。破線は、２４時間のインキュベーション後のＨＰＬＣのピーク面積の積分により決定された平衡を表す。
【図５】図５は、５℃にて採られた１Ｄ１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ）の重ね合わせプロットを示し、１０ｍＭのＮＡＤ＋の存在下に５０ｍＭのＳｉｒ２Ａｆ２により触媒された２’−ＡＡＤＰＲ（ｄ５．１５（２’β）および４．９３（２’α）における共鳴）の初期の形成、および１．５ｍＭのＪＢ１２ペプチドを示す。より遅い時刻の点は、２’−ＡＤＰＲの３’−ＡＤＰＲへの変換（ｄ５．０４（３’β）および４．８８（３’α）における共鳴）を例示する。スペクトルは、１．０時間毎に時間で区切られる。挿絵：反応中および／またはクウェンチ（反応を止める処理）中の、アイソトープで標識された水での処理後の、Ｓｉｒ２Ａｆ２反応由来のＡＡＤＰＲの分子イオンのＭＳスペクトル。１番上のパネルは、１０％ｄ４−酢酸を含有するＨ２１８Ｏによるクウェンチを伴った、１８Ｏ水中室温にて３時間のＳｉｒ２Ａｆ２反応由来のイオンを示す。真ん中のパネルは、クウェンチなしの１８Ｏ水中でのＳｉｒ２Ａｆ２反応由来のイオンを示す。１番下のパネルは、クウェンチなしの無標識の水中でのＳｉｒ２Ａｆ２反応由来のイオンを示す。他の条件に関しての結果および実験の詳細は、表２および表２の脚注においてリストアップされる。
【図６】図６は、Ｓｉｒ２Ａｆ１１８の活性部位の空洞中へ嵌ったアセチル−リジンの側鎖を示す２つの図式を示す。左右のパネルはそれぞれ、ペプチド骨格および空間充填モデルである。３８２番残基におけるＮ−アセチル−リジンからのアセチル酸素は、ＮＡＤ＋のＣ１’のファン・デル・ワールス接触内にある。このアセチル部分は、適切な攻撃位置に置かれ得、α立体化学を有するアシル−Ｏ−Ｃ１’結合を形成する。３８２番のＮ−アセチル化リジンを含有するｐ５３Ｃ末端ペプチドは、スキームモデルのみである。
【図７】図７は、アセチルリジン残基のアミドのカルボニルの、２’−ＯＨの求核攻撃により開始される、ＳＩＲ２（Ａ）脱アセチル化メカニズムに関して提案された、２つの代わりの脱アセチル化メカニズムを示す。メカニズムＡは、ＨｉｓのＡｌａへの突然変異がニコチンアミド交換を除外するであろうから、考えにくい。３’−ＯＨヘ結合された１１６番のＨｉｓは、３’−ＯＨを介するプロトン移動リレー・メカニズムを通じて２’−ＯＨを活性化する塩基触媒として作用する。（Ｂ）脱アセチル化メカニズムは、ニコチンアミド結合の開裂の下流での、２’−ＯＨの攻撃による１’−Ｏ−アミデートの分解に依存する。メカニズムＢは、２’−ＯＨ活性化前にニコチンアミド交換を可能にし、このＨｉｓからＡｌａへの突然変異に関して報告されたこの交換と一貫している。
【図８】図８は、本明細書中議論される種々の反応スキームを示す。  スキーム１Ａ．β−１’−ＡＡＤＰＲのＣＤ３８触媒による合成。  スキーム１Ｂ．２’−置換および３’−置換のαおよびβＡＡＤＰＲの観測された平衡、ならびに関連した１５℃での平衡分子数。  スキーム１Ｃ．Ｓｉｒ２ｐ触媒脱アセチル化における、ＮＡＤ＋からの反応の列記。  スキーム１Ｄ．２’−ＡＡＤＰＲへの転移を伴った、ａ−１’−ＡＡＤＰＲを生成する、ＡＤＰ−リボシル化依存脱アセチル化。  スキーム１Ｅ．２’−ＡＡＤＰＲ、３’−ＡＡＤＰＲ、および１８Ｏ標識化産物を生成する、ＡＤＰ−リボシル化依存Ｓｉｒ２ｐ触媒脱アセチル化メカニズム。
【図９】図９は、２’／３’−Ｏ−ＡＡＤＰＲのＮＭＲトレースを示す。
【図１０】図１０は、２’／３’−Ｏ−ＡＡＤＰＲの構造を示す。
【図１１】図１１は、ＮＡＤ＋およびペプチドＪＢ１２と一緒でのＳｉｒ２の異なる時間のインキュベーションにおけるＳｉｒ２活性を測定するための、ＮＡＤ＋およびＡＡＤＰＲの分離を示す。最小インキュベーション時間は、３０分である。
【図１２】図１２は、カラム単離ＡＡＤＰＲおよび放射能アッセイにより測定された場合の、対時間Ｓｉｒ２媒介ＡＡＤＰＲ産生を示すグラフである。
【図１３】図１３は、ｍＭ濃度のＡＡＤＰＲ様Ｓｉｒ２阻害剤化合物（Ｉ）の存在下でのパラ−ニトロフェニル・アセテートを使って測定されたエステラーゼ活性に比較した、ＤＥＡＥ分離肝抽出物（ｎｏＩ）中でのパラ−ニトロフェニル・アセテートを使って測定されたエステラーゼ活性を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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