(57)【要約】  分析のために、標的タンパク質または標的タンパク質のアレイを提示するための方法が開示される。この方法は、コード配列を形成する工程；基材上のウェル中に、このコード配列、および選択されたタンパク質合成条件下で標的タンパク質を発現し得るタンパク質合成成分を配置する工程であって、このウェルは、第二のコイル形成ペプチドで官能化された表面を有する、工程；このような条件下でこのコード配列を発現する工程であって、ここで、このように合成された標的タンパク質は、コイル−コイルヘテロダイマー形成によってこのウェルに結合し、従って、捕捉された形態で、このウェルにおいて分析のために提示される、工程；ならびにこのウェルを洗浄して未結合の成分を除去する工程、を包含する。
2005514913.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
固相分析のために標的タンパク質を調製するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）基材上のウェル中で混合物を形成する工程であって、該混合物は、以下：
（ｉ）以下：
（Ａ）第一のコイル形成ペプチドをコードする第一の核酸配列であって、該第一のコイル形成ペプチドは、選択された電荷を有し、かつ第二の反対に荷電したコイル形成ペプチドと相互作用して、安定なαヘリックスコイルドコイルヘテロダイマーを形成する、第一の核酸配列；および
（Ｂ）該標的タンパク質をコードする第二の核酸配列、
を含む、コード配列；
（ｉｉ）該ウェル中の選択されたタンパク質合条件下で該標的タンパク質を発現し得るタンパク質合成成分であって、該ウェルは、該第二のコイル形成ペプチドで官能化された表面を有する、タンパク質合成成分、
を含有する、工程；
（ｂ）該標的タンパク質が合成され、そしてコイル−コイルヘテロダイマー形成によって該ウェルに結合し、従って、捕捉された形態で、該ウェルにおいて分析のために提示されるような条件下で、該混合物を反応させる、工程；ならびに
（ｃ）該ウェルを洗浄して、未結合の成分を除去する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記コード配列は、前記第一の核酸配列が前記第二の核酸配列とインフレームであるように、該第一の核酸配列を含むクローニングベクターの切断可能な部位において、該第二の核酸配列をクローニングすることによって形成される、方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、前記クローニングベクターは、５’から３’の方向で、以下：
（ａ）転写および翻訳開始領域；
（ｂ）前記標的タンパク質をコードする核酸が挿入され得る、切断可能な部位；
（ｃ）前記第一の核酸配列；
（ｄ）転写および翻訳終結領域、
を含み、かつこれらに作動可能に連結される、方法。
【請求項４】
請求項２に記載の方法であって、前記クローニングベクターは、５’から３’の方向で、以下：
（ａ）転写および翻訳開始領域；
（ｂ）前記第一の核酸配列；
（ｃ）前記標的タンパク質をコードする核酸が挿入され得る、切断可能な部位；
（ｄ）転写および翻訳終結領域、
を含み、かつこれらに作動可能に連結される、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、前記コード配列は、以下の工程：
（ａ）前記第一の核酸配列を前記第二の核酸配列に連結して、キメラコード配列を形成する工程；および
（ｂ）該キメラコード配列にハイブリダイズし、そして該キメラコード配列を増幅するように設計されたＰＣＲプライマーを用いて、該キメラコード配列を増幅する工程、
によって形成される、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、前記コード配列は、以下の工程：
（ａ）前記第二の核酸配列を必要に応じてキャップ除去する工程であって、該第二の核酸配列がｍＲＮＡ分子である、工程；
（ｂ）以下：
（ｉ）前記第一のコイル形成ペプチドをコードする前記第一の核酸配列、および
（ｉｉ）３’末端に向かって転写するように配向された転写開始領域、
を含む第一のオリゴヌクレオチドプライマーを、該ｍＲＮＡ分子の５’末端に連結して、ＲＮＡテンプレートを形成する工程；
（ｃ）逆転写酵素、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、およびオリゴヌクレオチドｄＴ配列を含む第二のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、該ＲＮＡテンプレートを逆転写して、第一鎖ｃＤＮＡを形成する工程；
（ｄ）該第一鎖ｃＤＮＡから該ｍＲＮＡを除去する工程；
（ｅ）該第一鎖ｃＤＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、および該第一のプライマー配列の少なくとも１２ヌクレオチドを含む第三のオリゴヌクレオチドプライマーをインキュベートして、二重鎖ｃＤＮＡを形成する工程；
（ｆ）ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、該ｃＤＮＡの３’末端の少なくとも１２ヌクレオチドに相補的な第四のオリゴヌクレオチドプライマー、およびその第二鎖の３’末端の少なくとも１２ヌクレオチドに相補的な第五のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、該二重鎖ｃＤＮＡを増幅する工程；
によって形成される、方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、前記コード配列が、以下の工程：
（ａ）必要に応じて前記第二の核酸配列をキャップ除去する工程であって、該第二の核酸配列が、ｍＲＮＡ分子である、工程；
（ｂ）該ｍＲＮＡ分子の５’末端に第一のオリゴヌクレオチドプライマーを連結して、ＲＮＡテンプレートを形成する工程；
（ｃ）逆転写酵素、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、およびオリゴヌクレオチドｄＴ配列を含む第一のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、該ＲＮＡテンプレートを逆転写して、第一鎖ｃＤＮＡを形成する工程；
（ｄ）該第一鎖ｃＤＮＡから該ｍＲＮＡを除去する工程；
（ｅ）該第一鎖ｃＤＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、および該第一のプライマー配列の少なくとも１２ヌクレオチドを含む第二のオリゴヌクレオチドプライマーをインキュベートして、二重鎖ｃＤＮＡを形成する工程；
（ｆ）該二重鎖ｃＤＮＡを、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、ならびに以下：
（ｉ）該ｃＤＮＡの第一鎖の３’末端の少なくとも１２ヌクレオチドに相補的な領域；および
（ｉｉ）クローニングベクター中の第一の制限酵素部位と適合性の制限酵素部位、
を含む第三のオリゴヌクレオチドプライマー、および以下：
（ｉ）その第二鎖の３’末端の少なくとも１２ヌクレオチドに相補的な領域；および
（ｉｉ）該クローニングベクター中の第二の制限酵素部位と適合性の制限酵素部位、
を含む第四のオリゴヌクレオチドプライマー、を用いて増幅する工程；
（ｇ）該第一および第二の制限酵素部位にて切断し得る制限酵素を用いて、該増幅産物および該クローニングベクターを消化する工程；ならびに
（ｈ）該消化された増幅産物を該クローニングベクター中にクローニングする工程、
によって形成される、方法。
【請求項８】
請求項５または６に記載の方法であって、前記増幅産物が、以下：
（ａ）該増幅産物中の翻訳開始領域を認識するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用して、前記テンプレート配列をインビトロで転写する工程；および
（ｂ）該転写産物を、適切なインビトロの無細胞翻訳系と合わせる工程、
をさらに包含することによって、インビトロで翻訳される、方法。
【請求項９】
請求項２または７に記載の方法であって、前記目的の核酸配列が、以下：
（ａ）前記コード配列の下流を切断する制限酵素を用いて、前記クローニングベクターを線状化する工程；
（ｂ）該クローニングベクター中の翻訳開始領域を認識するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用して、前記テンプレート配列をインビトロで転写する工程；および
（ｃ）該転写産物を、適切なインビトロの無細胞翻訳系と合わせる工程、
をさらに包含することによって、インビトロで翻訳される、方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法であって、前記コード配列が、該コード配列を翻訳し得る細胞中に形質転換またはトランスフェクトされ、ここで、前記タンパク質合成成分が、該細胞を含む、方法。
【請求項１１】
複数の標的タンパク質の提示を実施するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）基材中の複数のウェルの各々に、複数の異なる配列の核酸分子のうちの選択された１つを添加する工程であって、該ウェルは、その中に第一のコイル形成ペプチドを有し、該核酸分子の各々は、第二のコイル形成ペプチドをコードする共通配列を捕捉する部分および標的タンパク質をコードする異なる配列を標的化する部分を有する、工程；
（ｂ）選択されたタンパク質発現条件下で、該異なる配列の核酸分子を発現し得るタンパク質合成成分を含有する溶液で、該ウェルを満たす工程；
（ｃ）このような条件下で該異なる配列の核酸分子の発現を促進する工程であって、各ウェル中で発現される該標的細胞は、コイル−コイルヘテロダイマー形成によって該ウェルに結合し、従って、補足された形態で、該ウェルにおいて分析のために提示される、工程；ならびに
（ｄ）該ウェルを洗浄して、未結合の成分を除去する工程、
を包含する、方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、前記基材が、９６ウェルのアレイである、方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の方法であって、前記基材が、前記溶液を保持し得るウェルを有する、ＭＡＬＤＩ−ＭＳプレートである、方法。
【請求項１４】
インビトロの無細胞翻訳系と共に使用するための、固相分析のために１つ以上のタンパク質を提示するためのキットであって、該キットは、以下：
（ａ）複数のウェルを含む基材であって、各ウェルは、選択された電荷を有し、かつ第二の反対に荷電したコイル形成ペプチドと相互作用して、安定なαヘリックスコイルドコイルヘテロダイマーを形成し得る、第一のコイル形成ペプチドで官能化されている、基材；
（ｂ）クローニングベクターであって、該クローニングベクターは、５’から３’の方向で、以下：
（ｉ）転写および翻訳開始領域；
（ｉｉ）該第二のコイル形成ペプチドをコードする核酸配列；
（ｉｉｉ）転写および翻訳終結領域、
を含み、かつこれらに作動可能に連結される、クローニングベクター；
（ｃ）該ベクターはまた、異種タンパク質をコードする核酸が、（ｉ）と（ｉｉ）との間、または（ｉｉ）と（ｉｉｉ）との間に挿入され得る切断可能部位を有する、ベクター、
を備える、キット。
【請求項１５】
多重化したインビトロの無細胞タンパク質合成系であって、以下：
（ａ）複数のウェルを含む基材であって、各ウェルは、選択された電荷を有し、かつ第二の反対に荷電したコイル形成ペプチドと相互作用して、安定なαヘリックスコイルドコイルヘテロダイマーを形成し得る、第一のコイル形成ペプチドに結合されている、基材；
（ｂ）該ウェルの各々において、以下：
（ｉ）以下：
（Ａ）第一のコイル形成ペプチドをコードする第一の核酸配列であって、該第一のコイル形成ペプチドは、選択された電荷を有し、かつ第二の反対に荷電したコイル形成ペプチドと相互作用して、安定なαヘリックスコイルドコイルヘテロダイマーを形成する、第一の核酸配列；および
（Ｂ）該標的タンパク質をコードする第二の核酸配列、
を含む、コード配列；
（ｉｉ）該ウェル中の選択されたタンパク質合条件下で該標的タンパク質を発現し得るタンパク質合成成分であって、該ウェルは、該第二のコイル形成ペプチドで官能化された表面を有する、タンパク質合成成分、
が含まれ、これにより、
該標的タンパク質が合成され、そしてコイル−コイルヘテロダイマー形成によって該ウェルに結合し、従って、捕捉された形態で、該ウェルにおいて分析のために提示されるような条件下で、該混合物が反応する、
多重化したインビトロの無細胞タンパク質合成系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、米国特許仮出願番号６０／３１４，３３３（２００１年８月２２日出願）および米国特許仮出願番号６０／３７５，６２７（２００２年４月２５日出願）の利益を主張し、これら両方の出願は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、分析のために標的タンパク質または標的タンパク質のアレイを提示するための方法、および本発明の実施において使用するためのキットに関する。
【０００３】
（参考文献）
【０００４】
【数１】
2005514913.tif 000003
【背景技術】
【０００５】
（発明の背景）
タンパク質は、細胞の主要な成分である。タンパク質は、細胞の形状、構造および機能を決定する。タンパク質は、別個の化学的特性を各々が有する、２０種の異なるアミノ酸によって構築される。この多様性により、異なるタンパク質の化学的特性および生物学的特性における大きな多能性が可能となる。これまでにない速度で新規タンパク質が発見されているという事実にもかかわらず、高スループットの方法がないことに主に起因して、タンパク質の構造研究および機能研究は後れを取っている。
【０００６】
タンパク質を研究するプロセスの間に、タンパク質を固体支持体上に固定および提示することがしばしば必要である。例えば、ウェスタンブロット分析およびタンパク質発現ライブラリーのファージディスレイスクリーニングにおいて、タンパク質は、非共有結合により固定される。免疫沈降およびアフィニティ精製のようないくつかの他の適用において、因子（例えば、抗体およびリガンド）は、その第一級アミン、スルフヒドリルまたは他の反応性基を介して、固体支持体（例えば、アガロースビーズ）に共有結合により結合体化される。固体支持体にペプチドおよびタンパク質を直接固定するための多くの方法が存在するが、これらの結合したタンパク質は、ときどき、固定後に、他のタンパク質またはリガンドと相互作用する能力を喪失する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、他のタンパク質と相互作用する能力を保持するタンパク質を固体支持体上に提示するための改善された技術の必要性が存在する。この方法は、基礎研究および臨床医学の両方のために、複数のタンパク質を迅速かつ詳細に分析することを可能にする。このような技術は、タンパク質−タンパク質、タンパク質−低分子およびタンパク質−核酸の相互作用を、異なる条件のアレイの下でモニタリングする際に、非常に価値がある。本発明は、これらの必要性を満たすように設計される。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
従って、１つの局面において、本発明の目的は、固相分析のために標的タンパク質を提示する方法を提供することである。この方法を実施することに関与する工程には、基材上のウェル中で混合物を形成する工程が挙げられる。この混合物は、第一のコイル形成ペプチドをコードする第一の核酸配列を含むコード配列（この第一のコイル形成ペプチドは、選択された電荷を有し、かつ第二の反対に荷電したコイル形成ペプチドと相互作用して、安定なαヘリックスコイルドコイルヘテロダイマーを形成し得る）；および標的タンパク質をコードする第二の核酸配列を含有する。この混合物はまた、このウェル中の選択されたタンパク質合成条件下でこの標的タンパク質を発現し得るタンパク質合成成分を含む。このウェルは、第二のコイル形成ペプチドによって官能化された表面を有する。この標的タンパク質が合成され、そしてコイル−コイルヘテロダイマー形成を介してこのウェルに結合し、従って、捕捉された形態でこのウェル中で分析のために提示される条件下で、この混合物を反応させる。次いで、このウェルを洗浄して、未結合の成分を除去する。
【０００９】
１実施形態において、このコード配列は、第一の核酸配列が第二の核酸配列とインフレームであるように、第一の核酸配列を含むクローニングベクターの切断可能な部位に第二の核酸配列をクローニングすることによって形成される。
【００１０】
別の実施形態において、クローニングベクターは、５’から３’の方向で、以下の構成要素を含み、かつこれらに作動可能に連結される：転写および翻訳開始領域；前記標的タンパク質をコードする核酸が挿入され得る、切断可能な部位；前記第一の核酸配列；ならびに転写および翻訳終結領域。あるいは、第一の核酸配列は、切断可能部位の下流に存在する。
【００１１】
なお別の実施形態において、コード配列を形成することは、以下の工程を包含する：第一の核酸配列を第二の核酸配列に連結して、キメラコード配列を形成する工程；およびこのキメラコード配列にハイブリダイズし、そしてこのキメラコード配列を増幅するように設計されたＰＣＲプライマーを用いて、このキメラコード配列を増幅する工程。あるいは、コード配列を形成することは、以下の工程を包含し得る：第二の核酸配列を必要に応じてキャップ除去する工程であって、この第二の核酸配列はｍＲＮＡ分子である、工程；第一のオリゴヌクレオチドプライマーを、このｍＲＮＡ分子の５’末端に連結して、ＲＮＡテンプレートを形成する工程であって、この第一のオリゴヌクレオチドプライマーは、第一のコイル形成ペプチドをコードする第一の核酸配列、および３’末端に向かって転写するように配向された転写開始領域、を含む、工程；逆転写酵素、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、およびオリゴヌクレオチドｄＴ配列を含む第二のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、このＲＮＡテンプレートを逆転写して、第一鎖ｃＤＮＡを形成する工程；この第一鎖ｃＤＮＡからｍＲＮＡを除去する工程；ならびに該第一鎖ｃＤＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、および該第一のプライマー配列の少なくとも１２ヌクレオチドを含む第三のオリゴヌクレオチドプライマーをインキュベートして、二重鎖ｃＤＮＡを形成する工程；ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、ｃＤＮＡの３’末端の少なくとも１２ヌクレオチドに相補的な第四のオリゴヌクレオチドプライマー、および第二鎖の３’末端の少なくとも１２ヌクレオチドに相補的な第五のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、二重鎖ｃＤＮＡを増幅する工程。コード配列を形成することは、以下の工程を包含し得る：必要に応じて第二の核酸配列をキャップ除去する工程であって、この第二の核酸配列はｍＲＮＡ分子である、工程；このｍＲＮＡ分子の５’末端に第一のオリゴヌクレオチドプライマーを連結して、ＲＮＡテンプレートを形成する工程；逆転写酵素、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、およびオリゴヌクレオチドｄＴ配列を含む第一のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、このＲＮＡテンプレートを逆転写して、第一鎖ｃＤＮＡを形成する工程；第一鎖ｃＤＮＡからｍＲＮＡを除去する工程；第一鎖ｃＤＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、および第一のプライマー配列の少なくとも１２ヌクレオチドを含む第二のオリゴヌクレオチドプライマーをインキュベートして、二重鎖ｃＤＮＡを形成する工程；この二重鎖ｃＤＮＡを、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、ならびに第三のオリゴヌクレオチドプライマー（ｃＤＮＡの第一鎖の３’末端の少なくとも１２ヌクレオチドに相補的な領域；およびクローニングベクター中の第一の制限酵素部位と適合性の制限酵素部位を含む）および第四のオリゴヌクレオチドプライマー（その第二鎖の３’末端の少なくとも１２ヌクレオチドに相補的な領域；およびクローニングベクター中の第二の制限酵素部位と適合性の制限酵素部位を含む）を用いて増幅する工程；第一および第二の制限酵素部位にて切断し得る制限酵素を用いて、増幅産物およびクローニングベクターを消化する工程；ならびに消化された増幅産物をこのクローニングベクター中にクローニングする工程。
【００１２】
この増幅産物は、この増幅産物中の翻訳開始領域を認識するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用して、テンプレート配列をインビトロで転写する工程；およびこの転写産物を、適切なインビトロの無細胞翻訳系と合わせる工程、をさらに包含することによって、インビトロで翻訳され得る。目的の核酸配列は、コード配列の下流を切断する制限酵素を用いて、このクローニングベクターを線状化する工程；このクローニングベクター中の翻訳開始領域を認識するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用して、テンプレート配列をインビトロで転写する工程；およびこの転写産物を、適切なインビトロの無細胞翻訳系と合わせる工程、をさらに包含することによって、インビトロで翻訳され得る。
【００１３】
１つの実施形態において、配置する（ｐｌａｃｉｎｇ）は、コード配列を翻訳し得る細胞（この細胞はタンパク質合成の構成要素を含む）中に、このコード配列を形質転換またはトランスフェクトすることを含む。
【００１４】
別の局面において、本発明は、複数の標的タンパク質の提示を実施するための方法を企図する。この方法を実施する際の工程としては、以下が挙げられる：基材における複数のウェルの各々（各ウェルは、その中に第１のコイル形成ペプチドを有する）に、複数の異なる配列の核酸分子（各々は、第２のコイル形成ペプチドをコードする共通配列捕捉部分および標的タンパク質をコードする異なる配列標的部分を有する）のうちの選択された１つを添加する工程；選択されたタンパク質合成条件下で、これらのウェルを異なる配列核酸分子を発現し得るタンパク質合成構成要素を含む溶液で満たす工程；このような条件下で異なる配列核酸分子の発現を促進する工程（ここで各ウェルにおいて発現された標的タンパク質は、コイル−コイルへテロダイマー形成を介して、ウェルに結合し、従って、ウェル中での分析のために、捕捉形態で提示される）；およびウェルを洗浄し、未結合の成分を除去する工程。
【００１５】
１つの実施形態において、この基材は、９６ウェルのアレイである。別の実施形態において、この基材は、この溶液を保持し得るウェルを有するＭＡＬＤＩ−ＭＳプレートである。
【００１６】
なお別の局面において、本発明は、無細胞インビトロ翻訳系で使用するための固相分析のための１つ以上の標的タンパク質を提示するためのキットを含む。このキットは、複数のウェルを有する基材（各ウェルは、選択された電荷を有し、そして第２の逆に荷電したコイル形成ペプチドと相互作用して安定なα−ヘリックスコイルド−コイルヘテロダイマーを形成し得る第１のコイル形成ペプチドで機能付与されている）；５’−３’方向で、操作可能に連結された（ｉ）転写開始領域および翻訳開始領域、（ｉｉ）第２のコイル形成ペプチドをコードする核酸配列、（ｉｉｉ）転写終結領域および翻訳終結領域を含むクローニングベクター、を含む。このベクターはまた、標的タンパク質をコードする核酸が（ｉ）と（ｉｉ）との間または（ｉｉ）と（ｉｉｉ）との間に挿入され得る切断部位を有する。
【００１７】
さらに別の局面において、本発明は、多重インビトロ無細胞タンパク質合成系を含む。この系は、複数のウェルを含む基材を含み、各ウェルは、ウェルに結合された、選択された電荷を有し、そして第２の逆に荷電したコイル形成ペプチドと相互作用して安定なα−ヘリックスコイルド−コイルヘテロダイマーを形成し得る第１のコイル形成ペプチドを有する。各ウェル中に、（ｉ）（Ａ）選択された電荷を有し、そして第２の逆に荷電したコイル形成ペプチドと相互作用して安定なα−ヘリックスコイルド−コイルヘテロダイマーを形成し得る第１のコイル形成ペプチドをコードする第１の核酸配列、および（Ｂ）標的タンパク質をコードする第２の核酸配列を含むコード配列が含まれる。各ウェルはまた、ウェル中で、選択されたタンパク質合成条件下で標的タンパク質を合成し得るタンパク質合成構成要素を含み、このウェルは、第２のコイル形成ペプチドで機能付与された表面を有する。この混合物は、標的タンパク質が合成され、そしてコイル−コイルヘテロダイマー形成を介してウェルに結合し、故に各ウェルにおいて捕捉形態で分析のために提示されるような条件下で反応する。
【００１８】
本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、以下の本発明の詳細な説明が、添付の図面と合わせて読まれた場合に、より完全に理解される。
【００１９】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
他に示されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明の分野の当業者に対して有する意味と同じ意味を有する。当業者は、当該分野の定義および用語について、特にＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌ  ＦＭら（１９９３）に向けられる。本発明が記載の特定の方法論、プロトコル、および試薬に制限されない（これらは、変動し得るので）ことが、理解されるべきである。
【００２０】
本明細書中に引用される全ての刊行物および特許は、本発明と関連して使用され得る組成物および方法論を記載および開示するために、本明細書中に参考として明白に援用される。
【００２１】
本明細書中で使用される場合、用語「支持体」は、それに薬剤が堆積および固定される材料をいう。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、用語「ペプチド」は、ペプチド結合によって連結された単鎖のアミノ酸残基を形成する化合物をいう。本明細書中で使用される場合、用語「タンパク質」は、用語「ペプチド」と同意語であり得るか、またはさらに、２つ以上のペプチドの複合体を称し得る。
【００２３】
用語「核酸分子」は、ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子およびｃＤＮＡ分子を含む。遺伝コードの縮重の結果として、所定のペプチド（例えば、Ｅ−コイルおよびＫ−コイル）をコードする多数のヌクレオチド配列が、作製され得ることが理解される。
【００２４】
「異種」核酸構築物または配列は、それが発現される細胞に対してネイティブでない配列の一部を有する。制御配列に関して、異種は、実際には同じ遺伝子（その発現を現在制御している）を制御するために機能しない制御配列（すなわちプロモーターまたはエンハンサー）をいう。一般的に、異種核酸配列は、その細胞に内在性でも、異種核酸配列が存在するゲノムの一部でもなく、そして感染、トランスフェクション、微量注入、エレクトロポレーションなどによって細胞に付加されている。「異種」核酸構築物は、ネイティブの細胞中に見られる制御配列／ＤＮＡコード配列の組合せと同じであるか、または異なる制御配列／ＤＮＡコード配列の組合せを含み得る。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」は、異なる宿主細胞間を移すために設計された核酸構築物をいう。「発現ベクター」は、外来細胞において異種ＤＮＡフラグメントを組み込み、そして発現する能力を有するベクターをいう。多くの原核生物発現ベクターおよび真核生物発現ベクターが、市販されている。適切な発現ベクターの選択は、当業者の知識内である。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、「発現カセット」または「発現ベクター」は、標的細胞内またはインビトロで特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントを有する、組換え的または合成的に作製された核酸構築物である。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス、または核酸フラグメントに組み込まれ得る。代表的に、発現ベクターの組換え発現カセット部分は、他の配列もあるが、転写される核酸配列およびプロモーターを含む。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、用語「プラスミド」は、クローニングベクターとして使用される環状の二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ構築物をいい、そしてプラスミドは、多くの細菌およびいくつかの真核生物において、染色体外自己複製遺伝因子を形成する。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、用語「選択マーカーをコードするヌクレオチド配列」は、宿主細胞中で発現し得るヌクレオチド配列をいい、そしてこの選択マーカーの発現が、発現された遺伝子を含む細胞に、対応する選択薬剤の存在下で増殖する能力を与える。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、用語「プロモーター」および「転写開始因子」は、下流の遺伝子の転写を指向するように機能する核酸配列をいう。一般的に、プロモーターは、標的遺伝子が発現されている宿主細胞に適切である。プロモーターは、他の転写制御核酸配列および翻訳制御核酸配列（「制御配列」とも呼ばれる）と共に所定の遺伝子を発現するために必要である。一般的に、転写制御核酸配列および翻訳制御核酸配列としては、プロモーター配列、リボゾーム結合部位、転写開始配列および転写停止配列、翻訳開始配列および翻訳停止配列、ならびにエンハンサー配列またはアクチベータ配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
本明細書中で規定される場合、「キメラ遺伝子」または「異種核酸構築物」は、制御エレメントを含む、異なる遺伝子の部分から構成され得る非ネイティブ遺伝子（すなわち、宿主中に導入されている遺伝子）をいう。宿主細胞の形質転換のためのキメラ遺伝子構築物は、代表的には異種タンパク質コード配列に作動可能に連結された転写制御領域（プロモーター）から構成されるか、または選択マーカーキメラ遺伝子においては形質転換された宿主細胞に抗生物質耐性を付与するタンパク質をコードする選択マーカー遺伝子に作動可能に連結された転写制御領域（プロモーター）から構成される。宿主細胞への形質転換のための、本発明の代表的なキメラ遺伝子は、構成的または誘導性である転写調節領域、タンパク質コード配列、および終結配列を含む。キメラ遺伝子構築物はまた、標的タンパク質の分泌が所望される場合、シグナルペプチドをコードする第２のＤＮＡ配列を含み得る。
【００３１】
核酸が別の核酸配列との機能的関係に配置される場合、核酸は「作動可能に連結される」。例えば、ポリペプチドが、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、分泌リーダーをコードするＤＮＡがポリペプチドのためのＤＮＡに作動可能に連結される；プロモーターまたはエンハンサーが、配列の転写に作用する場合、プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列に作動可能に連結される；あるいはリボゾーム結合部位が翻訳を促進するように位置付けられる場合、リボゾーム結合部位は、コード配列に作動可能に連結される。一般的に、「作動可能に連結される」は、連結されるＤＮＡ配列が連続的であり、そして分泌リーダーの場合、連続的かつリーディングフェーズの中にある。しかし、エンハンサーは、連続的でなくてよい。連結は、都合の良い制限部位でのライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来の手順に従って使用される。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡのセグメントを意味し、遺伝子は、コード領域の前の領域および後ろの領域（例えば、５’非翻訳（５’ＵＴＲ）配列または「リーダー」配列および３’ＵＴＲ配列または「トレイラー」配列、ならびに個々のコードセグメント（エキソン）間の介在配列（イントロン）を含んでも含まなくてもよい。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、「組換え」は、細胞またはベクター（異種核酸配列の導入によって改変されているか、またはこの細胞は、そのようにして改変された細胞に由来する）への参照を含む。したがって、例えば、組換え細胞は、ネイティブ（非組換え）形態の細胞内に同一の形態で見られない遺伝子を発現するか、またはそうでなければ、ヒトの介入の結果として異常に発現されるか、下方発現されるか、または全く発現されないネイティブ遺伝子を発現する。
【００３４】
細胞への核酸配列の挿入に関連して、用語「導入される」は、「トランスフェクション」、または「形質転換」もしくは「形質導入」を意味し、そして真核生物細胞または原核生物細胞への核酸配列の組み込み（ここで、核酸配列は、細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、プラスチド、またはミトコンドリアＤＮＡ）に組み込まれ得るか、自律性のレプリコンに変換され得るか、または一過性に発現され得る（例えば、トランスフェクトされたｍＲＮＡ））に対する参照を含む。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、用語「発現」は、それによって遺伝子の核酸配列に基づいてポリペプチドが産生されるプロセスをいう。このプロセスは、転写および翻訳の両方を含む。
【００３６】
用語「シグナル配列」は、細胞外への成熟形態のタンパク質の分泌を促進する、タンパク質のＮ末端部分のアミノ酸配列をいう。成熟形態の細胞外タンパク質は、シグナル配列を欠き、シグナル配列は、分泌プロセスの間に切り取られる。
【００３７】
用語「宿主細胞」は、ベクターを含み、そして発現構築物の複製、または転写および翻訳（発現）を支持する細胞を意味する。本発明における使用のための宿主細胞は、原核生物細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）または真核細胞生物（例えば、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、両生類細胞または哺乳動物細胞）であり得る。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、用語「活性な」および「生物学的に活性な」は、特定の標的タンパク質に関連する生物学的活性（例えば、酵素活性）をいう。このことは、所定のタンパク質の生物学的活性が、代表的に当業者によりそのタンパク質によると考えられる任意の生物学的活性をいうことに従う。
【００３９】
（ＩＩ．キット）
便宜上、本発明において使用される基材および規定量の試薬は、組み合わせて包装されたキットにおいて提供され得る。故に、１つの局面において、本発明は、複数の標的タンパク質の提示を実施するためのキットを提供する。図１は、キット１０の平面図であり、キット１０は基材１４および、必要に応じて、カバーリング１６（これは、透明であり得、そして基材に取り付けられる）を備える。この基材は、複数の個別のウェル２０を備える。図２に示すように、基材１４中の各ウェル２０は、選択された電荷を有し、そして第２の逆に荷電したコイル形成ペプチドと相互作用して安定なα−ヘリックスコイルド−コイルヘテロダイマーを形成し得る第１のコイル形成ペプチド３０で機能付与されている。２つの逆に荷電したペプチドは、自発的に自己アセンブルし、ヘテロダイマー複合体になる。コイルド−コイルヘテロダイマーの相互作用は、下記の第ＩＶ節においてさらに記載される。
【００４０】
任意の適合性の基材が、本発明と併せて使用され得る。この基材（通常は固体）は、種々の有機材料または無機材料の任意のもの、あるいはそれらの組合せ（単なる例として、プラスチック（例えば、ポリプロピレンまたはポリスチレン）；セラミック；シリコン；（ヒューズド）シリカ、石英またはガラス（これらは、例えばガラス顕微鏡スライドまたはガラスカバースリップの厚さを有し得る）；紙（例えば、濾紙）；ジアゾ化セルロース；ニトロセルロースフィルター；ナイロン膜；またはポリアクリルアミドもしくは他の型のゲルパッド（例えば、フィルム（種々の慣用的な従来の方法のうちの任意のものによって湿ったゲルを乾燥させることにより調製される）を含む、エアロゲルで作製されるエアロパッドまたはエアロビーズ（これは、例えば、非常に多孔性の固体である）））であり得る。アッセイを実施する方法が光学的検出を包含する場合、光を通す基材は有用である。好ましい実施形態において、この基材は、マルチウェル（例えば、組織培養プレート（例えば、２４ウェルプレート、９６ウェルプレート、２５６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、８６４ウェルプレートまたは１５３６ウェルプレート））のプラスチック表面である。別の好ましい実施形態において、この基材は、Ｍａｔｒｉｘ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−Ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）における使用のために適切なプレートである。ＭＡＬＤＩ−ＭＳを実施する例示的な方法は、米国特許第６，１１１，２５１号（本明細書中にその全体が参考として明白に援用される）に記載される。タンパク質を結合および同定するための、さらなる基材および方法は、米国特許第６，０２７，９４２号および同第５，７１９，０６０号（これらの両方は、本明細書中にその全体が参考として援用される）に見出され得る。
【００４１】
ＭＡＬＤＩ−ＭＳは、バイオポリマーおよびペプチド、タンパク質およびＤＮＡフラグメントのような物質の質量決定のための方法として確立されている。この方法では、分析される物質は、代表的に、マトリクス材料の溶液中に配置され、そして支持体または基材上にコーティングされる。この溶質をエバポレートし、固体マトリクス中に分析物を残し、次いでこれに照射をして、分析物分子および合成ポリマーの脱離を引き起こす。この脱離プロセスは、炭化、断片化または化学的に分解させることなく、分離および検出のための質量分析器または類似の機器に、大きな生物学的分子を放出するために特に有用である。
【００４２】
この基材は、空間的に離れており、そしてアドレス可能であるか、または同定可能である領域を備える。各領域は、それらに結合したコイルド−コイルペプチド３０を含む。１つの実施形態において、これらの領域は、液体の透過に耐性である任意の物理的障壁によって互いに離され得る。別の実施形態において、ＭＡＬＤＩ−ＭＳプレートのような基材がそこにエッチング処理されて、別個の浅いウェルを有し得る。あるいは、基材は、分離またはウェルのない領域（例えば、平坦な表面）を備え得、そして個々の領域は、別個の領域の輪郭を描く構造物（例えば、プラスチックまたはガラスの一片）を被せることによってさらに規定され得る。この流域の相対的方向性は、正方形または長方形の表面あるいは他の表面内の平行なアレイまたは垂直なアレイ、円形の基材内の放射状に広がるアレイ、または線状のアレイを含む（しかし、これらに限定されない）種々の形態のうちの任意の形態を取り得る。領域内の結合したコイル形成ペプチドの数は、１つ、または好ましくは少なくとも２つであり得る。１つの実施形態において、領域内の、結合したコイル形成ペプチドの密度は、約１×１０２〜約１×１０１５分子／ｍｍ２の間、好ましくは約１×１０４〜約１×１０１２分子／ｍｍ２の間、より好ましくは約１×１０６〜約１×１０１０分子／ｍｍ２の間、そして最も好ましくは約８．５×１０１１分子／ｍｍ２である。
【００４３】
このキットはまた、下記の第ＩＩＩＡ節に記載されるような、第２のコイル形成ペプチドをコードする核酸配列を含むクローニングベクターを含み得る。さらに、このキットは、下記の第ＩＩＩＣ節により詳細に記載されるようなインビトロ翻訳系を含み得る。このキットはまた、種々の緩衝化培地を含み得、これらのうちのいくつかは、上記の構成要素のうちの１つ以上を含み得る。
【００４４】
このキット中の種々の試薬の相対量は、本発明のタンパク質提示方法論を実施するために必要な濃度の試薬を提供するために、広範に変動され得る。適切な状況下で、キット中の試薬のうちの１つ以上は、賦形剤（これは、溶解の際に、本発明に従う方法またはアッセイを実施するための適切な濃度を有する試薬溶液を提供する）を含む、通常、凍結乾燥された乾燥粉末として提供され得る。各試薬は、別個の容器内に梱包され得るか、またはいくつかの試薬は、交差反応性および有効期間が許容する１つの容器内に組み合され得る。
【００４５】
このキットはまた、上記のように本発明に従う方法の説明書を含み得る。この指示書は、例えば、表面の第１のコイル形成ペプチドの説明、いくつのペプチドが存在するかの表示およびそれらが配置される表面の場所の表示を含み得る。この指示書はまた、結合したペプチドと発現されたタンパク質とを会合させるためのプロトコル（例えば、インビトロ翻訳のための条件および試薬、インキュベーションの温度および時間、ならびに非会合の分子を除去（例えば、洗浄）するための条件および試薬などを含み得る。さらにこの指示書は、本出願において開示されるパラメータ、条件または実施形態のうちの任意のものを含み得る。
【００４６】
（ＩＩＩ．コード配列の形成および発現）
（Ａ．ベクター構築）
図３Ａおよび図３Ｂは、コード配列５０（または発現カセット）を含む、インビトロ発現系またはインビボ発現系における操作のために設計された、本発明における使用のための発現ベクターを例示する。この発現ベクターは、コード配列から下流および上流の随伴配列５２および随伴配列５４を有する。このコード配列は、図３Ａに示されるように、目的の配列６２のＣ末端においてコイルド−コイル領域６０を有し得る。あるいは、図３Ｂに示されるように、コード配列５０のコイルド−コイル領域６０は、目的の配列６２のＮ末端にあり得る。
【００４７】
随伴配列は、プラスミドまたはウイルス起源の随伴配列であり、そしてベクターが宿主細胞中で複製されることを可能にするように、ベクターに必要な特性を提供する。適切な形質転換ベクターは、以下に記載される。発現プラスミドの適切な構成要素（転写開始因子および翻訳開始因子、目的のタンパク質をコードするコード配列およびコイルド−コイル領域、ならびに適切な転写終結因子および翻訳終結因子を含む）はまた、以下に考察される。３つの例示的なプラスミドは、ｐＥＴ−１７ｂ［ｐＭＡ２］プラスミド、ｐＥＴ−１７ｂ［ｐＳ１Ａ］プラスミドおよびｐＥＴ−１７ｂ［ｃＭｙｃ−Ｅ］プラスミドである。
【００４８】
（Ａ１．転写開始因子および翻訳開始因子）
本発明の転写開始因子は、インビトロまたはインビボの背景において、コード配列の転写を開始し得る任意の配列であり得る。従って、転写開始因子は、一般的に、その転写開始因子配列からのインビトロ転写に適切な、利用可能なＲＮＡポリメラーゼ酵素を有する必要がある。この転写開始因子は、例えば、Ｔ３プロモーターまたはＳＰ６プロモーターであり得る。これらのプロモーターは、二本鎖線状ＤＮＡテンプレートからインビトロでｍＲＮＡを作製するために、対応するＴ３ＲＮＡポリメラーゼまたはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼと併せて使用される。好ましくは、転写開始因子は、Ｔ７プロモーター（配列番号５）であり、Ｔ７プロモーターは、以下に記載されるようなＴ７転写終結因子と併せて使用される。このプロモーターは、天然の配列または代替的に合成配列であり得る。二本鎖ＤＮＡにおいて、転写開始因子は、下流を転写するように方向付けられたコード配列の上流である。
【００４９】
（Ａ２．転写終結因子および翻訳終結因子）
発現カセットの終結制御領域は、転写開始領域を有するネイティブであり得るか、または別の供給源由来であり得る。転写の終結領域は、発現を増強するために、特に、ｍＲＮＡの安定性について選択され得る。好ましくは、転写終結因子は、Ｔ７転写終結因子（配列番号６）である。
【００５０】
（Ａ３．ベクターの構築）
本発明のヌクレオチド配列は、インビトロ発現系において、目的のタンパク質に結合されたハイブリッドコイルド−コイル領域を作製するために有用である。このようにして、本発明のハイブリッドポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、発現カセット中に提供される。このような発現カセットは、制御領域の転写制御下にあるようにヌクレオチド配列を挿入するための、複数の制限部位を有して提供され得る。
【００５１】
上記のように、コイルド−コイル領域は、目的のタンパク質のＣ末端またはＮ末端のいずれかにあり得る。目的のタンパク質についてと同様に、ハイブリッドポリペプチド中に存在する他の要素の各々は、公知の天然に存在するポリペプチド配列であり得るか、または合成的に誘導され得る（本明細書中に記載されるような、ハイブリッドポリペプチドの機能に悪影響を及ぼさない、任意のそれらの改変体を含む）。「悪影響を及ぼす」は、その要素の改変形態を含むことが、その要素のネイティブ形態を含むハイブリッドポリペプチドに比べて減少したそのハイブリッドペプチドの生物活性を生じることを意図する。
【００５２】
発現カセットの調製において、種々のヌクレオチド配列フラグメントが、適切な方向性および、必要に応じて、適切なリーディングフレーム中にある配列を提供するために操作され得る。このような目的で、アダプターまたはリンカーが、ヌクレオチドフラグメントを結合するために使用され得るか、他の操作が、便利な制限部位、余分なヌクレオチドの除去、制限部位の除去などを提供するために含まれ得る。この目的で、インビトロ変異誘発、プライマー修復、制限、アニーリング、再置換（例えば、トランジションおよびトランスバージョン）が、含まれ得る。詳細には、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）を参照のこと。
【００５３】
本発明の発現カセットは、レプリコン（例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、ミニ染色体）にライゲーションされ、それによって、インビボで自律ＤＮＡ複製し得る発現ベクターを形成し得る。好ましくは、このレプリコンは、プラスミドである。このようなプラスミド発現ベクターは、クローニング目的のために原核生物宿主内で安定に維持されることを可能にする、１つ以上の複製系において維持される。
【００５４】
図３Ａおよび図３Ｂは、インビトロ翻訳系におけるハイブリッドポリペプチドの発現での使用のための例示的な形質転換ベクターを示す。ベクター構築の詳細は、実施例１Ｂにおいて示される。
【００５５】
（Ｂ．ＰＣＲ産物の形成）
コード配列は、第１の核酸配列を、第２の核酸配列にライゲーションして、キメラコード配列を形成させ、そしてキメラコード配列にハイブリダイズし、そして増幅するように設計されたＰＣＲプライマーを用いてキメラコード配列を増幅することによって形成され得る。第１の核酸配列は、選択された電荷を有し、そして第２の逆に荷電したコイル形成ペプチドと相互作用して安定なα−ヘリックスコイルド−コイルヘテロダイマーを形成し得る第１のコイル形成ペプチドをコードするべきである。第２の核酸配列は、目的の標的タンパク質をコードする。
【００５６】
選択された配列とハイブリダイズするＰＣＲプライマーの設計は、当該分野で公知である。例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、および同第４，８００，１５９号；ならびにＩｎｎｉｓら、（１９９０）（これらの各々は、その全体が本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【００５７】
コード配列を形成するための本発明の代替方法は、細胞または組織からのｍＲＮＡを単離することである。ＲＮＡ単離の方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１巻、４．１．１−４．２．９頁および４．５．１−４．５．３頁、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９３．において教示される。ｍＲＮＡ分子は、ポリＡテールで終わるヌクレオチド配列を含み、そして一本鎖である。図５Ａおよび図５Ｂにおいて例示されるように、ｍＲＮＡ１５５は、当該分野で標準の方法によって、脱キャップ（ｄｅｃａｐ）され得る。例えば、酵素および試薬（ＲＮＡを脱キャップするためのタバコ酸ピロホスファターゼを含む）は、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＥｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入され得る。第１のオリゴヌクレオチドプライマー１５０は、一本鎖ＲＮＡを一本鎖ＤＮＡにライゲーションし得るリガーゼ（例えば、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ）で、ｍＲＮＡの５’末端にライゲーションされる。第１のプライマーは、ｍＲＮＡの３’末端に向かって転写するように方向付けられた転写開始領域を含む。１つの実施形態において、第１のプライマーはまた、第１のコイル形成ペプチドをコードする第１の核酸配列を含む。上記で考察されたように、転写開始領域は、インビトロ転写を促進し得る任意の転写開始配列（例えば、Ｔ７プロモーター配列、Ｔ３プロモーター配列、またはＳＰ６プロモーター配列を含む）であり得る。一般的にこれらのプロモーターは、適切なＲＮＡポリメラーゼ酵素（これは、インビトロ転写を達成する）と対をなす。
【００５８】
オリゴヌクレオチドｄＴ配列を有する第２のプライマー１６０は、センスｍＲＮＡ鎖の逆転写を達成するために、逆転写酵素および適切な緩衝液ならびにデオキシリボヌクレオチド三リン酸とともに反応物に添加される。１つの実施形態において、第２のプライマーは、少なくとの１０連続したｄＴのオリゴヌクレオチドｄＴ配列を有する。次いで、ｍＲＮＡは、任意の適切な手段（例えば、ＮａＯＨまたはＲＮａｓｅの添加を包含する）によって除去され得る。
【００５９】
この段階で、一本鎖ｃＤＮＡが生成され、そしてこれらは５’〜３’までの第２プライマー配列、ｍＲＮＡに対する相補的配列および第１プライマー配列が含む。次いで、第１プライマー１５０、または第１プライマーの少なくとも１２ヌクレオチド配列が、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシリボヌクレオチドトリホスフェートを用いた１本鎖アンチセンス鎖からの２本鎖ｃＤＮＡ１６５の生成反応（図５Ｃに示す）に用いられ得る。２本鎖ｃＤＮＡから、インビトロ反応で、ＲＮＡポリメラーゼ存在下で、ｃＲＮＡを生成し得る。このＲＮＡポリメラーゼは、プロモーター配列に対して適切である。例えば、Ｔ７プロモーターが使用される場合、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、インビトロ転写反応を触媒するために用いられる。このｃＤＮＡはまた、５’プライマーおよび３’プライマーを用いて増幅され得、各プライマーは、異なる配列に対して相補的である。各増幅プライマーは、Ｎ末端またはＣ末端のコイルドコイルペプチドをコードするＤＮＡ配列を含み得る、クローニングベクター内の第１制限酵素部位と適合する制限酵素部位を含み得る。この増幅は、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ）、デオキシリボヌクレオチドトリホスフェート、ならびにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のための適切な緩衝液および温度条件を用いて実行される。
【００６０】
このｃＤＮＡはまた、他の操作（実験、ならびに他の増幅および分析）を実施するために、ベクターにライゲーションされ得る。直鎖状２本鎖ｃＤＮＡから、コード配列をインビトロで転写および翻訳し得る。発現用ベクターには、哺乳動物発現ベクター、酵母発現ベクター、両生類発現ベクターまたは昆虫発現ベクターを含む、任意の真核生物発現ベクターまたは原核生物発現ベクターが含まれ得る。ｃＤＮＡは、直鎖テンプレートから配列決定され得るか、または配列決定ベクター内に配置され得る。
【００６１】
（Ｃ．インビトロでのＲＮＡおよびタンパク質の合成）
（Ｃ１．ＲＮＡ合成）
上記のようにＰＣＲ増幅産物としてのコード配列または上記に記載されるベクター中にクローニングされるコード配列は、転写開始領域を認識するＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼおよび適切な成分を用いるインビトロでのテンプレート配列の転写によって、インビトロで翻訳され得る。図４Ａ〜４Ｅは、インビトロでの、本発明を用いたＲＮＡ転写物の作製に関する工程を例証する。これらの図は、図３Ａおよび図３Ｂに示されるプラスミド１１０様プラスミドを示す。これらのベクターは、ベクター１００に挿入したマルチクローニングサイト１０８内に目的の領域１０４の配列およびコイルドコイル領域１０６の配列を含むキメラ遺伝子１０２を有する。所望されれば、このプラスミドは、図４Ｃに示すように、コード配列から転写配列までの下流を切断する適切な制限酵素を用いて直線化され得る。あるいは、プローブ上のベクター配列の存在が、後の適用を妨害しない場合、転写物は、そのテンプレートとしてインタクトなプラスミドを用いて合成され得る。
【００６２】
所望されれば、そのＤＮＡをインビトロ転写反応に使用する前に、直線化されたプラスミドＤＮＡまたはインタクトなプラスミドＤＮＡを、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールを用いて抽出し、エタノール沈殿し、そしてＴＥまたは水中に懸濁し得る。適切なＲＮＡポリメラーゼおよびＮＴＰを含むＲＮＡ合成反応成分を、直線化したプラスミドＤＮＡまたはインタクトなプラスミドＤＮＡと共にインキュベートし、ＲＮＡ転写物を作製する。このＤＮＡテンプレートをＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅＩを用いて除去し得、図４Ｅのように精製ＲＮＡ転写物を作製した。インビトロでのＲＮＡ合成のための例示的方法は、Ｍｅｌｔｏｎ，１９８４に記載される。
【００６３】
（Ｃ２．タンパク質合成）
ＲＮＡ合成に続き、転写産物１７０を、図７Ａ〜図７Ｂに示すように、適切なインビトロ翻訳系を併用し、Ｎ末端またはＣ末端のいずれか一方にコイルドコイル領域を含む標的タンパク質を作製し得る。インビトロ翻訳系で作製される標的タンパク質１７５は、基板結合コイルドコイルペプチド１８５を介して基板１８０に結合し得る。インビトロタンパク質合成を実施するための例示的な方法は、Ｌｅｉｂｏｗｉｔｚら（１９９１）、Ｌｅｓｌｅｙら（１９９１）；ならびに米国特許第５，９６８，７６７号および同第６，３２２，９７０号に記載され、各々は、その全体が本明細書中で参考として明らかに援用される。
【００６４】
所望されれば、翻訳前に合成ＲＮＡ分子をキャップ化し得る。インビトロで合成されるキャップ化ＲＮＡ分子は、翻訳に有効なテンプレートである（例えば、ＫｒｉｅｇおよびＭｅｌｔｏｎ（１９８４）を参照のこと）。合成転写物の翻訳前のキャッピングに有効な系およびプロトコルは、市販の販売業者（例えば、Ｐｅｏｍｅｇａ，ＷＩ；ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏｍ）から入手し得る。
【００６５】
（Ｄ．宿主細胞内でのタンパク質合成）
インビトロでの翻訳の代わりとして、先に記載した適切なベクター２０１に含まれ、図６Ａに示したコード配列２０２を、コイルドコイルドメイン２０３を有する目的のタンパク質２０４の発現のために、宿主細胞に形質転換またはトランスフェクトし得る。この宿主細胞を、形質転換またはトランスフェクトの前または後に、基板２０６のウェル内に置き、そしてコイルドコイルドメインを有する目的のタンパク質の発現に有効な条件を共し得る。この発現ハイブリッドポリペプチド２００は、宿主細胞から分泌され、そして各ウェルにおいてコイルドコイルペプチド２０５に結合し得る。ハイブリッドペプチド２００が分泌されない場合、その宿主細胞は、タンパク質２００が、その細胞から放出され、そして表面結合コイルドコイルペプチド２０５に結合し得るように溶解され得る。次いでこのウェルを洗浄し、非結合成分を除去し得る。タンパク質の発現および細胞の溶解の例示的な方法は、米国特許第６，２３８，８６１号および同第５，４９６，５４９号に記載され、これらの両方とも、参考としてその全体が本明細書中に明らかに援用される。
【００６６】
宿主細胞は、種々の標準的な技術（エレクトロポレーション、微小粒子衝撃（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、スフェロプラスト生成法、またはホールセル法（例えば、塩化リチウムおよびポリエチレングリコールを含む方法）（Ｃｒｅｇｇら，１９８５；Ｌｉｕら，１９９２；Ｗａｔｅｒｈａｍら，１９９６；ならびにＣｒｅｇｇおよびＲｕｓｓｅｌ，１９９８））を用いて、上記に記載の発現構築物で形質転換される。
【００６７】
本発明の基本的な方法には必要ないが、プロモーター配列（例えば、真核細胞系（例えば、酵母プロモーター、哺乳動物プロモーター、または昆虫プロモーター）で機能するプロモーター）は、これらの細胞系における発現を促進するために、ベクター配列内に含まれ得る。発現または他の目的のための、これらのさらなるプロモーター配列は、上述した細胞の存在しないインビトロでの転写のために用いられるプロモーターとは区別され得る。
【００６８】
１つの実施形態において、組換発現ベクターは、目的の配列のＣ末端またはＮ末端にＥペプチド（配列番号１）をコードする核酸配列のコピーを含むように操作される。このプラスミドは、選択的ハイブリッドポリペプチド発現のための誘導性のプロモーター（例えば、ＩＰＴＧ誘導性プロモーター）、遺伝子挿入のためのマルチクローニングサイト、クローン選択のためのアンピシリン耐性遺伝子および単純に精製するために新しく作製したハイブリッドポリペプチドを細胞膜周辺腔に配向させるためのシグナル配列を含み得る。目的の配列のＣ末端にＥペプチドをコードする核酸配列を含ませるコード配列の例示的な操作方法は、Ｔｒｉｐｅｔら，１９９６に記載される。あるいは、発現ベクターは、目的の配列のＣ末端またはＮ末端にＫペプチド（配列番号２）、またはそれらの改変体を含み得る。本発明において有用なさらなるコイルドコイルペプチドは、米国特許第６，１６５，３３５号、同第６，１３０，０３７号、同第５，９５５，３７９号および同第５，８２４，４８３号に見出され得、これらは参考としてその全体が本明細書中に援用される。
【００６９】
（ＩＶ．αヘリックスコイルドコイル複合体の処方）
第１コイル形成ペプチドおよび第２コイル形成ペプチドを、αヘリックスコイルドコイルへテロ２量体の形成を促進する条件下で一緒に混合する場合、それらは相互作用して、２サブユニットαヘリックスコイルドコイルヘテロ２量体複合体を形成する。αヘリックスコイルドコイルコンホメーション中のペプチドは、各ペプチドの１次構造よって決定される特徴的な様式で互いに相互作用する。αヘリックスの３次構造は、その結果、１次配列中の７つのアミノ酸残基が、２つのαヘリックスのターンにほぼ対応する。あるいは、αヘリックスコンホメーションを生じる１次アミノ酸配列は、７つの各残基の単位（７連子（ｈｅｐｔａｄｓ）といわれる）に分解され得る。このヘテロ２量体サブユニットペプチドは、１列に並んだ一連の７連子で構成される。７連子の配列が、ヘテロ２量体サブユニットペプチド内で特に繰り返される場合、この７連子は、「用語リスト」または単純に「リピート」といわれ得る。
【００７０】
１次コイル形成ペプチドおよび２次コイル形成ペプチドは、平行または逆平行のいずれかの配置で、ヘテロ２量体コイルドコイルヘリックス（コイルドコイルヘテロ２量体）に組み立てられ得る。平行配置において、これらの２つのヘテロ２量体サブユニットペプチドヘリックスが同じ方向（アミノ末端からカルボキシ末端へ）を有するように、この２つのヘテロ２量体サブユニットペプチドヘリックスを並べた。逆平行配置において、１つのヘリックスのアミノ末端が他のヘリックスのカルボキシ末端と並ぶように（逆もまた同様に）、これらのヘリックスを配置する。
【００７１】
このようなヘテロ２量体サブユニットは、ＰＣＴ特許出願ＷＯ  ９５／３１４８０「Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ」、１９９５年１１月２３日公開（参考としてその全体が本明細書中に援用される）に記載される。例示的なサブユニットは、本明細書中で、Ｋ−コイル（リジン残基によって電荷が優位に供給される正電荷サブユニットといわれる）およびＥ−コイル（グルタミン酸残基によって電荷が優位に供給される負電荷サブユニットといわれる）といわれる。上記に記載される適用からの好ましい例としては、配列番号１〜配列番号２が挙げられる。Ｋ−コイルおよびＥ−コイルはまた、Ｋ−コイルおよびＥ−コイルのリピートを含み得、それぞれへテロ２量体サブユニットペプチドとして用いる。
【００７２】
上記で参照した適用において示した指導に従って設計したへテロ２量体サブユニットペプチドは、代表的に、平行方向  対  逆平行方向でのアセンブリのための優先度を示す。例えば、配列番号３および配列番号４によって同定される例示的なペプチドは、（ＷＯ  ９５／３１４８０出願で検討したように）他のペプチド配列として平行配置のヘテロ２量体を形成する。目的のタンパク質を第１コイル形成ペプチドに付着させる場合、一般に、ヘテロ２量体の遠位末端で目的のタンパク質を付着させることが望ましい。特に、ヘテロ２量体が、平行配置を形成する場合、第２コイル形成ペプチドは、好ましくは、Ｃ末端で基板表面に固着され、そしてこの目的のタンパク質は、Ｎ末端で第１コイル形成ペプチドに結合される。
【００７３】
記載したように、ヘテロ２量体中の２つサブユニットペプチドのうちの１つが、基板に固着され、そして他のペプチドは、提示を意図する目的のタンパク質を含む。両方の場合、このペプチドは、合成後に合成または誘導され、必要とされる付着機能を提供し得る。一般に、大部分の結合方法は、大腸菌形成ペプチドのいずれかの大腸菌形成活性を失わせもせず、そのような結合は、目的の結合タンパク質の活性を失わせもしない。
【００７４】
第２コイル形成ペプチドの改変を考慮すると、このペプチドは、そのＮ末端またはＣ末端のいずれかで合成され、基板表面とペプチドのヘリックス形成部分との間のスペーサーとして機能し得るさらなる末端ペプチドを保有し得る。あるいは、第２個コイル形成ペプチドは、高親和性結合反応（例えば、ペプチドに保持されるビオチン部分とその表面に共有結合したアビジン分子との間）を介して基板表面に付着し得る。
【００７５】
目的のタンパク質は、固体（ｓｏｌｉｄ−ｓｔａｔｅ）法、ＰＣＲ法、または組換法のいずれかによって、インビボまたはインビトロで合成され、組み立てられるヘテロ２量体において遠位方向に向けられる第１コイル形成ペプチドの末端に目的のタンパク質を含み得る。固体法による結合体の形成において、目的のタンパク質は、好ましくはＮ末端アミノ酸残基、またはヘテロ２量体の露出面に面した残基の１つに、共有結合する。好ましいカップリング基は、システイン残基のチオール基であり、これは標準的な方法で容易に改変される。他の有用なカップリング基としては、メチオニンのチオエステル、ヒスチジンのイミダゾリル基、アルギニンのグアニジニル基、チロシンのフェノール基およびトリプトファンのインドリル基があげられる。これらのカップリング基は、当業者に公知の反応条件を用いて誘導され得る。
【００７６】
標的タンパク質第１コイル形成ペプチド結合体３２、３３，３４（図２）を、表面固定化第２コイル形成ペプチド３０に結合させるために、これらペプチドを、ヘテロ２量体形成をに好都合な条件下で接触させる。コイルドコイルヘテロ２量体形成に好都合な例示的な媒体は、生理学的に適合する水溶液である（代表的には、約６〜約８の間のｐＨおよび約５０ｍＭ〜約５００ｍＭの間の塩濃度を有する）。好ましくは、この塩濃度は、約１００ｍＭと約２００ｍＭとの間である。例示的な良性媒体は、以下の組成を有する：５０ｍＭ  リン酸カリウム、１００ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７。同等に有効な媒体は、代替物（例えば、リン酸カリウムの代わりにリン酸ナトリウムおよび／またはＫＣｌの代わりにＮａＣｌ）によって作製され得る。ヘテロ２量体は、上記のｐＨおよび塩の範囲外の条件下の媒体で形成され得るが、いくつかの分子の相互作用およびヘテロ２量体対ホモ２量体の相対的安定性は、上記に詳細に記載した特徴と異なり得る。例えば、ヘテロ２量体を安定化する傾向にあるイオン基の間のイオン相互作用は、例えば、酸性ｐＨでのＧｌｕ側鎖のプロトン化、または例えば、塩基性ｐＨでのＬｙｓ側鎖の脱プロトン化に起因して、低ｐＨ値または高ｐＨ値で崩壊され得る。しかし、コイルドコイルへテロ２量体形成における低ｐＨ値および高ｐＨ値のこのような効果は、塩濃度の上昇によって克服され得る。
【００７７】
塩濃度の上昇は、イオン引力の安定化を中和し得るか、またはイオン反発力の不安定化を抑制し得る。特定の塩は、イオン間相互作用の中和において、より高い有効性を有する。例えば、Ｋ−コイルペプチドの場合、１Ｍ以上の濃度のＣｌＯ４−アニオンは、最大のαヘリックス構造の誘導に必要とされ、それに対して、３Ｍ以上の濃度のＣｌ−イオンは、同様の効果において必要とされる。低ｐＨおよび高ｐＨでのコイルドコイル形成におけるこの高い塩のヘリックス間効果はまた、ヘリックス間のイオン引力が、ヘリックス形成のために必要ではなく、コイルドコイルがヘテロ２量体対ホモ２量体として形成される傾向にあるか否かを制御することを示す。Ｅ−コイルペプチドおよびＫ−コイルペプチドはまた、共通に係る米国特許出願番号０９／６５４，１９１（Ａｔｔｏｒｎｅｙ  Ｄｏｃｋｅｔ＃：４８００−００１５．３１）（参考として本明細書中にその全体が明確に援用される）の実施例２のように、目的のタンパク質または他の生体分子に結合し得る。
【００７８】
（Ｖ．適用）
１つの局面において、本発明は、複数の標的タンパク質の提供を実行する方法を含む。一般に、複数の異なる配列の核酸分子から選択される、異なる配列の核酸分子が、基板中の複数のウェルの各々に、添加される。基盤における各ウェルは、第１のコイル形成ペプチドを有する。異なる配列の各核酸分子は、以下の２つの部分を有する：共通配列捕捉部位をコードする第２コイル形成ペプチド、および異なる配列の標的部位をコードする標的タンパク質。
【００７９】
基板中のウェルを、選択したタンパク質合成条件下で異なる配列の核酸分子の発現が可能であるタンパク質合成成分を含む溶液で満たす。次いで、異なる配列の核酸分子を発現させる。各ウェルで発現した標的タンパク質は、基板結合コイル形成ペプチドを有するコイル−コイルへテロ２量体形成を介してウェルに結合し、従って、捕捉形態におけるウェル内での分析が提示される。次いで、このウェルを洗浄して、結合していない成分を取り除き得る
１つの実施形態において、異なる配列の標的タンパク質は、各々、ｃＤＮＡ分子のライブラリーから選択される異なるｃＤＮＡ分子である。発現後、各ウェルに提示されるタンパク質は、図２に示されるように、異なる配列３６，３７，３８を有する。各ウェルで発現した標的タンパク質は、基板結合コイル形成ペプチドを有するコイル−コイルへテロ２量体形成を介してウェルに結合し、従って、捕捉形態におけるウェル内での分析が提示される。各タンパク質は、ｃＤＮＡライブラリーの代表である。次いで、提示されたタンパク質を、１つ以上の薬物に対してスクリーニングし、選択した薬物と相互作用するタンパク質を同定し得る。
【００８０】
図８に示されるように、別の実施形態において、異なる領域３０２、３０３において変異されたタンパク質３００を、所定の基板３１５上の各ウェルが同じタンパク質３０３の異なる変異体３０２または３０３を含むように、各ウェル３１０に配置する。例えば、９６ウェルプレートは、同じタンパク質の、９６種類の異なる変異体を有する。タンパク質または薬物を用いて、高親和性結合についてプレートをスクリーニングする。次いで、質量分析法を用いて、どの変異残基がタンパク質または薬物の結合親和性を増大させる原因であるかを同定する。
【００８１】
さらに別の実施形態において、異なる配列の各標的タンパク質は、同じＤＮＡ分子にコードされる。図９に示されるように、発現およびタンパク質結合の後、各ウェル４１０中に、提示されるタンパク質４００を、全て同定する。次いで、提示されるタンパク質を、異なる組成のパネルに対してスクリーニングし、提示されるタンパク質と相互作用する薬物を同定し得る。１つの実施形態において、化学的ライブラリーをプールに再分画し、次いで各プールを各ウェルに添加する。質量分析法を用いて、提示されるタンパク質に特異的に結合する化合物または化合物のプールを同定する。別の実施形態において、ＤＮＡライブラリーをプールに再分画し、次いで各プールを各ウェルに添加する。質量分析法を用いて、提示されるタンパク質に対して特異的なＤＮＡ結合配列を同定する。さらに別の実施形態において、提示されるタンパク質は、各ウェルに提示される酵素または酵素改変体である。潜在的な酵素基質のライブラリーをウェルに添加し、質量分析法を用いてウェル中の生成物の生成を同定するか；またはインヒビターを用いた場合の密着結合分子（ｔｉｇｈｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を同定する。
【００８２】
提示されるタンパク質を用いて、上記に記載されるように生化学的反応（例えば、タンパク質の相互作用、核酸の相互作用、低分子の相互作用など）をモニターし得る。例えば、抗原と抗体との間の特異的な相互作用の効率；レセプター（例えば、精製したレセプターまたは細胞膜に結合するレセプター）とそれらのリガンドとの間の特異的な相互作用の効率、アゴニストとアンタゴニストとの間の特異的な相互作用の効率；および酵素（例えば、プロテアーゼまたはキナーゼ）とそれらの基質との間の特異的な相互作用の効率、あるいは生成物に転換された基質量の増加または減少；ならびに他の多くのもの。このような生化学的アッセイは、標的タンパク質の性質の特徴付け、またはスクリーニングアッセイの基礎として用いられ得る。例えば、特定のプロテアーゼＸａおよびＶＩＩａの存在についてサンプルをスクリーニングするために、このサンプルを、標的タンパク質が個々のプロテアーゼである組合せについてアッセイし得る。提供される特定のプロテアーゼに対して特異的な蛍光発原質がプロテアーゼに結合しそして切断される場合、この基質は蛍光発光し、通常、結果として、例えば、２つのエネルギー移動対の間で切断されそして分離され、そしてシグナルを検出し得る。別の実施形態において、特定のキナーゼ（例えば、Ｓｒｃ、チロシンキナーゼ、またはＺＡＰ７０）の存在についてサンプルをスクリーニングするために、目的の１つ以上のキナーゼを含むサンプルを、結合した提供されるポリペプチドが目的のキナーゼの１つによって選択的にリン酸され得る組合せについてアッセイし得る。
【００８３】
認められた技術、日常的に決められる条件を用いて、サンプルを基質のアレイを用いて、適切な緩衝液中で、そして必要な補因子とともに、経験的に決定される時間にわたってインキュベートし得る。各反応物を、経験的に決定された条件下で処理（例えば、洗浄）して非結合成分および所望でない成分を除去した後、結合した成分を、質量分析法によって決定し得る。
【００８４】
別の実施形態において、提供されるタンパク質を用いて、提供されるタンパク質および所定のプローブの相互作用を調節する薬剤をスクリーニングし得る。薬剤は、プローブ、タンパク質またはタンパク質＋プローブで形成される複合体のいずれかとの直接的または間接的な相互作用によってタンパク質／プローブ相互作用を調節し得る。この調節は、多様な形態を可能にし、それらの調節としてはプローブに対するタンパク質の結合親和性の増加または減少、プローブのタンパク質への結合の競合的阻害または非競合的阻害である、タンパク質とプローブが結合する速度の増加または減少、あるいは場合によってはプローブ／タンパク質相互作用の増加または減少を導き得るプローブまたはタンパク質の活性の増加または減少が挙げられるが、これらに限定されない。このような薬剤は、合成されるかまたは天然に存在する基質であり得る。また、このような薬剤は、未改変の状態または他種との凝集体として用いられ得；そしてこれらの薬剤は、直接または特異的に結合基質を介して、結合メンバーに共有結合または非共有結合し得る。
【００８５】
前述から、本発明の目的および特徴が、いかに多様であるが理解され得る。
【００８６】
（表１）
（本発明を支持して供給される配列）
【００８７】
【表１】
2005514913.tif 000004
（ＶＩ．実施例）
以下の実施例は、本明細書中に記載される発明をさらに例証するが、本発明の範囲のいかなる限定も意図しない。
【００８８】
（実施例１）
（インビトロ発現ＭＳ研究）
（Ａ．要旨）
インビトロ発現質量分析法の研究は、インビボで発現されるタンパク質の同定について、ＭＡＬＤＩ−ＭＳを使用する。本研究の目的は、コイルドコイルタンパク質提示のプラットフォーム、インビトロでのタンパク質発現および質量分析法に基く、ハイスループットのタンパク質分析の可能性を試験することであった。一般に、Ｅコイル−タグ化融合タンパク質を、無細胞環境においてクローニングおよび発現し、そして発現したタンパク質を、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート上に固定したＫコイルペプチドによって、すぐに捕捉した。続いて、捕捉したＥコイルタグ化タンパク質を、ＭＡＬＤＩ−ＭＳによって検出した。
【００８９】
（Ｂ．実験の詳細）
リボソーム抽出物をＰｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ  Ｌｕｉｓ  Ｏｂｉｓｐｏ，ＣＡ）から購入したか、またはＥ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１＊（ＤＥ３）から社内で調製した。３つのＤＮＡ構築物（例えば、Ｔｎｌペプチド−Ｅコイル（ｐＭＡ２）、アクチンペプチド−Ｅコイル（ｐＳ１Ａ）、およびｃＭｙｃペプチド−Ｅコイル（ｃＭｙｃ−Ｅ））をＴ７プロモーター配列を含むＤＮＡプラスミドｐＥＴ−１７ｂにクローニングした。クローニングしたこれら３つのプラスミドのインビトロでの発現試験は、μｇ／ｍｌレベルのタンパク質が獲得され得ることを示した。Ｃｏａｓｔｅｒスルフヒドリル結合９６ウェルプレートを、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ａｃｔｏｎ，ＭＡ）から購入した。リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ，ｐＨ６．５）（１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．１μＭ  ジチオスレイトールを含む）中の１μｌ／ｍｌのＫコイル−チオールを、ウェル中で、室温で１時間インキュベーションすることによって、Ｋコイルペプチドをプレート上に共有結合的に固定した。プレート上の反応していないマレイミドを、１００μＭシステインを用いてブロッキングした。クローニングしたプラスミド、Ｓ３０リボソーム抽出物、緩衝液および必要な成分を含む１００μｌのインビトロ発現反応カクテルを、Ｋ−コイルを固定したプレートのウェルに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、このプレートを、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で５回洗浄し、１０ｍＭ  リン酸緩衝液（塩化ナトリウムを含まない）で３回洗浄した。結合したＥコイル−タグ化タンパク質を、０．０５％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ中の３０μｌの５０％  アセトニトリルで抽出した。１μｌの抽出物をＭＳ標的プレートのウェルに添加し、そして１μｌのマトリックス溶液（０．０５％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ中の１ｍｌの５０％  アセトニトリル中の４ｍｇのフェルラ酸（ｆｅｒｕｌｉｃ  ａｃｉｄ）および６ｍｇのシナピン酸）と混合した。この混合物をＭＡＬＤＩ−ＭＳ標的プレート上で室温で結晶化させ、最終的にＭｉｃｒｏｍａｓｓ  ＴＯＦ  ２Ｅ質量分析法機を用いて分析した。この質量分析法機に３３７ｎｍ窒素レーザーを備え付け、×２０ＫＶの加速電圧で、リニア陽イオンモードで操作した。多チャンネルプレート高質量検出器を、スペクトルの記録のために用いた。
【００９０】
（Ｃ．結果）
図１０Ｃは、市販の抽出物を用いて発現され、そしてＫコイル固定表面によって捕捉されたＴｎｌペプチドＥコイルタンパク質（ｐＭＡ２）の質量スペクトルを示す。図１０Ａは、発現反応カクテル中に単なるｐＥＴ−１７ｂプラスミドを用いたネガティブコントロールである。図１０Ｂは、システイン固定表面における融合タンパク質の非特異的結合示す。融合タンパク質の質量に対応するピークが、図１０Ｃで矢印によって示される。
【００９１】
図１１Ｃは、市販の抽出物を用いて発現され、そしてＫコイル固定表面によって捕捉されたアクチンペプチドＥコイルタンパク質（ｐＳ１Ａ）の質量スペクトルを示す。図１１Ａは、発現反応カクテル中に単なるｐＥＴ−１７ｂプラスミドを用いたネガティブコントロールである。図１１Ｂは、システイン固定表面における融合タンパク質の非特異的結合示す。融合タンパク質の質量に対応するピークが、図１１Ｃで矢印によって示される。
【００９２】
図１２Ｃは、市販の抽出物を用いて発現され、そしてＫコイル固定表面によって捕捉されるｃＭｙｃペプチドＥコイルタンパク質（ｃＭｙｃ−Ｅ）の質量スペクトルを示す。図１２Ａは、発現反応カクテル中に単なるｐＥＴ−１７ｂプラスミドを用いたネガティブコントロールである。図１２Ｂは、システイン固定表面における融合タンパク質の非特異的結合示す。融合タンパク質の質量に対応するピークが、図１２Ｃで矢印によって示される。
【００９３】
図１３Ｃは、社内抽出物を用いて発現させあれ、そしてＫコイル固定表面によって捕捉されたｃＭｙｃペプチドＥコイルタンパク質（ｃＭｙｃ−Ｅ）の質量スペクトルを示す。図１３Ａは、発現反応カクテル中に単なるｐＥＴ−１７ｂプラスミドを用いたネガティブコントロールである。図１３Ｂは、システイン固定表面における融合タンパク質の非特異的結合示す。融合タンパク質の質量に対応するピークが、図１３Ｃで矢印によって示される。
【００９４】
図１０〜図１３に示されるように、３つのクローン化プラスミドから発現されるＥコイルタグ化タンパク質は、Ｋコイル固定プレートによって捕捉され、そしてＭＳによって同定した（図中矢印によって示される）。図１０〜図１２は、社内抽出物を用いた結果（図１３）と比較した、市販のリボソーム抽出物から得られた結果を示す。この社内抽出物（図１３）は、非特異的結合を殆ど示さなかった。
【００９５】
本明細書中に記載される全ての刊行物および特許出願は、本発明が属する分野の当業者の技術水準を示す。全ての加工物および特許出願は、各々、個々の刊行物または特許出願が参考として具体的かつ個別に援用されるのと同じ程度まで、参考として本明細書中に援用される。
【００９６】
本発明は、特定の実施形態に関して記載されているが、種々の変更および改変が、本発明から逸脱することなくなされ得ることが、当業者に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】図１は、本発明の１つの実施形態に従って構成された標的タンパク質提示キットの斜視図である。
【図２】図２は、本発明の１つの実施形態に従って構成された、各ウェル中に異なる標的タンパク質を含む図１の提示キット中の矢印２−２の方向で描かれた断面図である。
【図３Ａ】図３Ａは、目的の配列およびＣ末端コイルド−コイルドメインを含むプラスミドｐＥＴ−１７ｂの特徴および関連する制限部位を示すマップである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、目的の配列およびＮ末端コイルド−コイルドメインを含むプラスミドｐＥＴ−１７ｂの特徴および関連する制限部位を示すマップである。
【図４】図４Ａ〜４Ｅは、本発明の１つの実施形態における、コード配列のインビトロ合成における工程を示す。
【図５】図５Ａ〜５Ｃは、本発明の１つの実施形態における、プライマーをｍＲＮＡに係留し、ｃＤＮＡを作製する工程を例示する。
【図６】図６Ａ〜６Ｃは、本発明の１つの実施形態に従って、標的タンパク質を作製し、そして基材に係留する工程を示す。
【図７】図７Ａ〜７Ｃは、本発明の１つの実施形態に従って、基材中で標的タンパク質をインビトロ翻訳し、そしてウェルに係留する工程を示す。
【図８】図８は、各ウェル中に異なる変異型標的タンパク質を含む図１の提示キット中の矢印２−２の方向で描かれた断面図である。
【図９】図９は、各ウェル中に同じ変異型標的タンパク質を含む図１の提示キット中の矢印２−２の方向で描かれた断面図である。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｃは、市販の抽出物を用いて発現され、そしてＫコイル固定化表面により捕捉されたＴｎｌペプチドＥコイルタンパク質（ｐＭＡ２）、および適切なコントロールの質量スペクトルを示す。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｃは、市販の抽出物を用いて発現され、そしてＫコイル固定化表面により捕捉されたアクチンペプチドＥコイルタンパク質（ｐＳ１Ａ）、および適切なコントロールの質量スペクトルを示す。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｃは、市販の抽出物を用いて発現され、そしてＫコイル固定化表面により捕捉されたｃＭｙｃペプチドＥコイルタンパク質（ｃＭｙｃ−Ｅ）、および適切なコントロールの質量スペクトルを示す。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｃは、社内（ｉｎ−ｈｏｕｓｅ）の抽出物を用いて発現され、そしてＫコイル固定化表面により捕捉されたｃＭｙｃペプチドＥコイルタンパク質（ｃＭｙｃ−Ｅ）、および適切なコントロールの質量スペクトルを示す。
【配列表】
2005514913.tif 000005
2005514913.tif 000006
【図１】
2005514913.tif 000007
【図２】
2005514913.tif 000008
【図３Ａ】
2005514913.tif 000009
【図３Ｂ】
2005514913.tif 000010
【図４】
2005514913.tif 000011
【図５】
2005514913.tif 000012
【図６】
2005514913.tif 000013
【図７Ａ】
2005514913.tif 000014
【図７Ｂ】
2005514913.tif 000015
【図７Ｃ】
2005514913.tif 000016
【図８】
2005514913.tif 000017
【図９】
2005514913.tif 000018
【図１０Ａ】
2005514913.tif 000019
【図１０Ｂ】
2005514913.tif 000020
【図１０Ｃ】
2005514913.tif 000021
【図１１Ａ】
2005514913.tif 000022
【図１１Ｂ】
2005514913.tif 000023
【図１１Ｃ】
2005514913.tif 000024
【図１２Ａ】
2005514913.tif 000025
【図１２Ｂ】
2005514913.tif 000026
【図１２Ｃ】
2005514913.tif 000027
【図１３Ａ】
2005514913.tif 000028
【図１３Ｂ】
2005514913.tif 000029
【図１３Ｃ】
2005514913.tif 000030
【国際調査報告】
2005514913.tif 000031
2005514913.tif 000032
2005514913.tif 000033