(57)【要約】本発明は、バイオテクノロジープロセスを実施する能力が増強された真菌性微生物に関する。特に、本発明は、有用な生成物がペントースを含むバイオマスから産生されるバイオテクノロジー過程におけるレドックス補因子の再生の改良に関する。本発明によれば、微生物は、ＮＡＤＰに結合したグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ配列で形質転換される。本発明を用いて、例えば、農業および林業製品、局地的な廃棄物などの生物学的材料から人類に有用な生成物を提供することができる。このような有用な生成物の例は、エタノール、乳酸、ポリヒドロキシアルカノエート、アミノ酸、脂肪、ビタミン、ヌクレオチド、および広汎な種類の酵素および医薬品である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオテクノロジープロセスを実施する能力が増強された真菌微生物であって、ＮＡＤＰに結合したグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ配列で形質転換されていることを特徴とする、真菌微生物。
【請求項２】
ＮＡＤＰ−グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼが真菌由来である、請求項１に記載の真菌微生物。
【請求項３】
ＤＮＡ配列が配列番号１またはその機能性変異体を含んでなる、請求項１または２に記載の真菌微生物。
【請求項４】
バイオテクノロジープロセスがＬ−アラビノースまたはＤ−キシロースを炭素源として包含する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の真菌微生物。
【請求項５】
生物を更に操作して、他のＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨに関連した反応を抑制する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の真菌微生物。
【請求項６】
有用生成物が、請求項１〜５のいずれか一項に記載の真菌微生物によって炭素源から生成される、炭素源から有用な工業用生成物を製造する方法。
【請求項７】
炭素源がペントースを含む、請求項６に記載の炭素源から有用な工業用生成物を製造する方法。
【請求項８】
有用な工業用生成物がエタノールである、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の真菌微生物を用いることを特徴とする、グルコースを含む炭素源からポリヒドロキシブチレートを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、（複数の）バイオテクノロジープロセスを実施する能力が増強された真菌微生物に関する。特に、本発明は、ペントースを含むバイオマスから有用生成物を生成するバイオテクノロジープロセスにおけるレドックス補因子の再生の改良に関する。
【０００２】
背景技術
本出願は、微生物、特に酵母および他の真菌の代謝反応を用いて、農業および林業製品、局地的な廃棄物、および他のバイオマス源などの生物学的材料から、人類に有用な生成物を提供する工業的プロセスを意味するバイオテクノロジープロセスの効率化に関する。このような有用な生成物の例は、エタノール、乳酸、ポリヒドロキシアルカノエート、アミノ酸、脂肪、ビタミン、ヌクレオチド、および広汎な種類の酵素および医薬品である。
【０００３】
幾つかの代謝反応は、レドックス補因子対であるニコチンアミドジヌクレオチドホスフェート／還元型ニコチンアミドジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨ）と結びついており、他のものはレドックス補因子対であるニコチンアミドジヌクレオチド／還元型ニコチンアミドジヌクレオチド（ＮＡＤ／ＮＡＤＨ）と結びついている。一般的に、補因子ＮＡＤ／ＮＡＤＨは主として異化反応に関係しており、補因子ＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨは主として同化反応に関係している。通常、バイオテクノロジープロセスの生産的経路は、過剰のＮＡＤＰを生じる。ペントース醗酵はその一例である。ペントース醗酵では、Ｌ−アラビノースおよびＤ−キシロース経路を介して、幾つかの異化反応はＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨ補因子に結びついている（図１参照）。
【０００４】
Ｄ−キシロースのエタノール（または乳酸）への醗酵は、レドックス中性であるが、異なるレドックス補因子を用いて、レドックス補因子不均衡を生じる。キシロースレダクターゼはＮＡＤＰＨを利用して、ＮＡＤＰを生成する。他のレドックス段階は、キシリトールデヒドロゲナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、およびアルコールデヒドロゲナーゼであり、それらのそれぞれはＮＡＤ／ＮＡＤＨレドックス補因子対を利用している。このレドックス補因子不均衡の結果、ＮＡＤＰＨは他の反応、例えばＣＯ２生成に結びついているペントースリン酸経路の酸化的部分によって再生されなければならない。ＣＯ２は求められていない生成物であり、Ｄ−キシロースのエタノール（または乳酸）への転換は最早レドックス中性ではない（図２）。結果として、キシリトールのような他の求められていない生成物も生成する。
【０００５】
従って、特に真菌性ペントース（Ｄ−キシロースおよびＬ−アラビトール）醗酵でのＮＡＤＰ（Ｈ）補因子を再生することができることが好都合である。ＮＡＤＰ（Ｈ）補因子を再生するための効率的方法は、この工程を厳密な酸素制御によって余り影響されないようにし、酸素の必要性が減少しまたは嫌気性ペントース（Ｄ−キシロースおよびＬ−アラビノース）醗酵を促進するので、バイオテクノロジー上有益である。嫌気性ペントース醗酵は極めて遅く且つ望ましくない副生成物が生成するので、醗酵条件を最適にするには半嫌気性条件が必要である（Jeffries and Jin, 2000）。これには、実際には、制御された曝気、すなわち技術的に複雑な工程が必要である。ペントース醗酵の生成物は、一般に廉価なバルク生成物（エタノールなど）である。これには、嫌気性醗酵のような廉価な生産工程が必要である。嫌気性醗酵は技術的に容易であり、極めて大規模に行うことができる。しかしながら、現在行われている嫌気性Ｄ−キシロース醗酵では、主としてキシリトールとＣＯ２のような求められていない副生成物が生じる（Toivari et al. 2001）。Ｄ−キシロースからキシリトールとＣＯ２の生成は、レドックス中性である。レドックス中性転換の化学量論は、キシリトール１０モルとＣＯ２５モルがＤ−キシロース１１モルから生成することである。これは、Ｄ−キシロース還元において生成するＮＡＤＰがＣＯ２を生成する反応において還元されてＮＡＤＰＨとなる場合には明らかにエタノールおよびＣＯ２の生成に関する好ましい反応である。ＮＡＤＰをＣＯ２生成に直接関連していない方法で還元することができるときには、キシリトールおよびＣＯ２からエタノールおよびＣＯ２へ生成物の方向を変えることによって、環境上有利な一層経済的（廉価な）工程とすることができる。
【０００６】
特許出願ＷＯ９９／４６３６３号明細書（Aristidou et al.）では、エタノールおよびアミノ酸のような有用な生成物を更に効率的に生成する改良された特性を有するバイオテクノロジーで用いられる生成微生物が開示された。オキシドレダクターゼをコードする少なくとも一種類の組換えＤＮＡ分子で形質転換されている微生物が提供されており、ＮＡＤ／ＮＡＤＨとＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨに対して異なる補酵素特異性以外は少なくとも一種類の共通の基質を有する一対のオキシドレダクターゼをこの対の両方の構成員を同一の細胞区画、好ましくはサイトゾルで同時に発現させるやり方で発現させるようにした。これにより、異なる補因子を用いる環状酸化および還元反応を介してトランスヒドロゲナーゼ活性が導入される。
【０００７】
環状酸化および還元反応は、下記の反応を引き起こすことができ、これらはＮＡＤ／ＮＡＤＨとＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨの補酵素対を平衡させる傾向がある。
【化１】
2005507255.tif 000002
【０００８】
ＮＡＤ／ＮＡＤＨとＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨの比がほぼ同一になるまで反応（１）および（２）の同時操作を続行することが期待されるが、これら二対の酸化還元電位は極めて類似しているからである。
【０００９】
特許公報ＵＳ５，８３０，７１６号明細書では、微生物を用いるターゲット物質を製造する方法が開示されている。この方法では、微生物は、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）から還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰＨ）を生成するその能力を増加することによって、Ｌ−アミノ酸のようなターゲット物質の生成が培地中で増加するように改質されている。微生物がＮＡＤＨからＮＡＤＰＨを生成する能力は、微生物のニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ活性を増加することによって増加する。
【００１０】
ＮＡＤＰＨを再生するための更に効率的な系が、基質から生成物への主要な代謝経路から真のＮＡＤＰを生成する多くのバイオテクノロジープロセスを改良するために、依然として必要とされている。このようなプロセスは、ペントースのエタノール、ラクテートおよび他の生成物への醗酵、および炭水化物からポリアルカノエート、幾つかのアミノ酸、および脂質の産生を包含する。
【発明の概要】
【００１１】
本発明の目的は、（複数の）バイオテクノロジープロセスを実施する能力が増強された真菌性微生物を提供することである。これは、本発明に従って、ＮＡＤＰに結合したグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ （ＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨ；ＥＣ１．２．１．１３）をコードする遺伝子で真菌を形質転換することによって達成される。この遺伝子産物を用いれば、ＮＡＤＰＨがペントース醗酵または他のプロセスで有益なカルボン酸反応で再生される。
【００１２】
好ましくは、ＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨは真菌由来であり、これをコードするＤＮＡ配列は配列番号１またはその機能性変異体（functional variant）を含んでなる。本発明は、形質転換した微生物がＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨ補酵素対の還元型であるＮＡＤＰＨ形態を再生する新規な手段を有するように、ＮＡＤＰに結合したＧＡＰＤＨをコードするＤＮＡ配列で形質転換した工業用微生物を提供する。酵母および他の真菌、およびほとんどの他の微生物では、ＧＡＰＤＨは主要な代謝経路での一段階であり、これにより、糖はピルベート、および更に細胞材料および醗酵最終生成物に転換される。本発明の形質転換微生物は二種類のＧＡＰＤＨ酵素であって、ＮＡＤと共に働くものおよびＮＡＤＰと共に働くもう一つのものを有している。形質転換生物はこれら二種類の酵素を介して相対フラックスを自動的に調節して、他の代謝段階で要求されるＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＨを再生する。
【００１３】
遺伝子工学技術を用いれば、ＮＡＤＰおよびＮＡＤに結合したＧＡＰＤＨ酵素をコードする遺伝子の相対発現レベルを調節して、例えば、生成物形成に用いた条件では、ＮＡＤに結合した酵素のレベルを減少させまたは実際に省略することにより、ＧＡＰＤＨ反応におけるＮＡＤＰの使用を増加するようにすることもできる。本発明の形質転換微生物により、所望する反応（例えば、ペントースのエタノールまたはラクテートへの転換、糖の脂質またはアミノ酸またはポリヒドロキシアルカノエートへの転換）がＮＡＤＰＨの真の消費体である場合、一層効率的なバイオテクノロジープロセスが得られる。形質転換微生物では、ＮＡＤＰＨは導入したＮＡＤＰに結合したＧＡＰＤＨによって再生されることができる。これは所望するプロセス自身によって用いられる主要な代謝経路における一段階であり、炭素基質を消耗するか容量が限定されるかまたはその両方である副反応（例えば、ペントースリン酸経路の酸化的分岐）によってＮＡＤＰＨを再生する必要性を低下させるか、または必要性をなくす。「一層効率的なバイオテクノロジープロセス」という表現は、基質に対して所望生成物を一層の高収率で、一層大きな容量生産性で（単位時間当たり単位反応装置当たりの生成物の質量として測定）、一層大きな比速度で（単位時間当たり生産微生物の単位質量当たりの生成物の質量として測定）、かつ、望ましくない副生成物をより少量で産生し、一層安い費用で、例えば、一層単純な醗酵装置または少ない曝気で操作することができ、またはこれらの利点の２つ以上を有する、工業的過程を包含する。
【００１４】
本発明は、本発明の実施に用いることができるKluyveromyces lactis由来のＮＡＤＰに結合したＧＡＰＤＨをコードするＤＮＡ配列を提供する。本発明は、ＮＡＤＰに結合したＧＡＰＤＨ活性を有するタンパク質をコードし且つ本発明の実施に用いることができる他のＤＮＡ配列を見出す方法も提供する。更に、ＮＡＤＰに結合したＧＡＰＤＨのアミノ酸配列のある種の特徴であって、当業者が、本発明の実施に用いることができるＮＡＤＰに結合したＧＡＰＤＨ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列を認識し、またはこのようなＤＮＡ配列をＮＡＤに結合したＧＡＰＤＨ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列から遺伝子工学処理より作製することができるものが開示される。
【００１５】
本発明は、本発明の目的とするＮＡＤＰに結合したＧＡＰＤＨを発現させるのに用いることができる適当な構成的プロモーターを提供する。しかしながら、他のプロモーターを用いることができ、幾つかの宿主および生物学的過程については、誘導または抑制プロモーターからＮＡＤＰに結合したＧＡＰＤＨを発現するのが有利であることがある。
【００１６】
本発明を、添付の図面および例を参照することによって詳細に説明する。これらの例は、態様の幾つかを示すのに用いられるだけであり、発明の範囲を制限しようとするものではない。
【発明の具体的説明】
【００１７】
ペントース醗酵のような異化反応においてレドックス補因子ＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨを再生することができる考えられるタンパク質およびそれらの相当する遺伝子を見出すため、ＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨに結合したタンパク質およびそれらの相当する遺伝子を見出すための下記のスクリーニング法を用いることができる。このスクリーニング法では、ホスホグルコースイソメラーゼをコードするＰＧＩ１遺伝子に欠失を有するSaccharomyces cerevisiaeを用いた。この欠失により、S. cerevisiaeはグルコース上で増殖することができない（Boles et al., 1993）。グルコースについて致死表現型を生じるこの欠失は、ペントースリン酸経路の酸化的部分におけるＮＡＤＰＨの過剰産生に関係していると考えられる（Boles et al., 1993）。しかしながら、Kluyveromyces lactisはホスホグルコースイソメラーゼ遺伝子を欠失していてもグルコース上で増殖することができ、すなわち、このＮＡＤＰＨ過剰産生と対抗することができる（Gonzales Siso et al., 1996）。従って、本発明者らは、ホスホグルコースイソメラーゼ遺伝子に欠失を有するS. cerevisiae株をKluyveromyces lactis由来の遺伝子ライブラリーで形質転換し、グルコース上での増殖についてスクリーニングした。このスクリーニングにおいて、数個のオープンリーディングフレームを有するＤＮＡ断片を見出した。トランスポゾンをＤＮＡ断片にランダムに挿入し、グルコース上で増殖を回復しなかったトランスポゾン挿入を分析した。この手法を用いて、本発明者らは、グルコース上で増殖を回復することができたオープンリーディングフレームを同定した。このオープンリーディングフレームは、ＮＡＤ−ＧＡＰＤＨに対して高い相同性を有していた。本発明者らは、更にこのオープンリーディングフレームを検討した。この目的のために、本発明者らはそれを過剰発現させ、酵素活性を分析して、これがＮＡＤＰと共に活性を有することを見出した。本発明者らは、ヒスチジンタグを加えた後に酵素を更に精製し、オープンリーディングフレームがＮＡＤよりＮＡＤＰに優先的であり、すなわち、これはＮＡＤ−ＧＡＰＤＨ（ＥＣ１．２．１．１２）ではなく、ＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨ（ＥＣ１．２．１．１３）であることを見出した。植物を除く真核生物およびそこでは、酵母によっては行われない反応である光合成に関与しているものにおけるＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨについて文献に報告が見られないので、このことは驚くべきことである。ＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨは、配列番号１を含んでなるＤＮＡ配列によってコードされる。
【００１８】
グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）は、非リン酸化酵素（ＧＡＰＮ，ＥＣ１．２．１．８）およびリン酸化酵素として知られている。リン酸化酵素については、ニコチンアミドジヌクレオチド（ＮＡＤ）依存性酵素（ＮＡＤ−ＧＡＰＤＨ，ＥＣ１．２．１．１２）およびニコチンアミドジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰ）依存性酵素（ＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨ，ＥＣ１．２．１．１３）が知られている。ＮＡＤ−ＧＡＰＤＨは解糖酵素であり、原核生物および真核生物で高度に保存される。ＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨは、細菌で知られている（例えば、Koksharova et al. 1998, Fillinger et al., 2000）。植物については、光合成によるＣＯ２同化に関与し且つ葉緑体に存在しているＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨが知られている（Cerff 1982）。葉緑体のＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨは、２種類のサブユニットＡおよびＢを有する（Shih et al., 1991, Baalmann et al., 1996）。他の真核生物のＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨは知られていない。
【００１９】
本発明において、本発明者らは、共通の基質を有するが補酵素特異性が反対である２種類のオキシドレダクターゼ、すなわちＮＡＤ−ＧＡＰＤＨ（ＥＣ１．２．１．１２）およびＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨ（１．２．１．１３）を有する。しかしながら、これは、必ずしも環状酸化−還元反応を生じない。Ｄ−キシロース醗酵について図３に示すように、Ｄ−キシロース３モルの還元に用いられるＮＡＤＰＨ３モルはＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨを介して再生することができる。キシリトールデヒドロゲナーゼおよびＮＡＤ−ＧＡＰＤＨによって用いられるＮＡＤは、アルコールデヒドロゲナーゼによって再生される。Ｄ−キシロース３モルのエタノール５モルおよびＣＯ２５モルへの醗酵は、トランスヒドロゲナーゼ反応なしで行われ、この点で本発明が特許公報ＵＳ５，８３０，７１６号明細書および特許出願ＷＯ９９／４６，３６３号明細書と異なっている。
【００２０】
ＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨは、ＣＯ２産生と対になったＮＡＤＰからＮＡＤＰＨへの還元を有することが望ましくないプロセスでは有益であることがある。一例はヘキソース醗酵である。微生物は醗酵中に増殖するので、過剰のＮＡＤＨおよびＮＡＤＰを産生する（Oura, 1972）。エタノール産生は、過剰のＮＡＤＨの再酸化に必要なグリセロール産生、および過剰のＮＡＤＰの還元に必要なエタノール１モル当たり１モルを上回るＣＯ２の産生を伴う。これらの反応により、醗酵可能な炭水化物でのエタノールの収率が減少する。ＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨを用いると、ＮＡＤＰは余計にＣＯ２を産生することなくＮＡＤＰを還元することができ、グリセルアルデヒド−３−リン酸プールを用いることによりＮＡＤＰを還元することによって、ＮＡＤＨのＮＡＤ−ＧＡＰＤＨによる産生が減少し、従ってグリセロールの産生が減少し、すなわちＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨを導入することによってヘキソース醗酵におけるエタノールの収率を増加し且つ望ましくない副生成物であるグリセロールとＣＯ２の形成を減少させることができる。本発明は、この方法で、さらに一層効率的に且つ少ない汚染でヘキソース炭水化物から環境に優しい燃料アルコールの産生を行う。
【００２１】
ＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨは、ペントース醗酵で好都合に用いることもできる。本発明により、Ｄ−キシロースおよびＬ−アラビノースをレドックス中性な方法でレドックス補因子不均衡を生じることなく醗酵させてエタノールとすることができる。例３および５では、Ｄ−キシロースを一層効率的に醗酵させてエタノールとすることを示す。エタノールは、Ｄ−キシロースから一層高収率で産生され、キシリトールやＣＯ２のような望ましくない副生成物は少ない。
【００２２】
これは例３に示されており、嫌気性キシロース醗酵に対するＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨの効果を示している。ＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨを過剰発現する株は、モル比で約３０%少ないキシリトールと約４０%少ないＣＯ２を生成する。その結果、エタノールが一層高収率で生成し、すなわち同量のＤ−キシロースから約３０%多くのエタノールが生成する。
【００２３】
収率向上および副生成物形成の減少に加えて、組換え菌株がバイオテクノロジープロセスを実施する能力の増強が、生成物形成の速度向上、プロセス条件における代謝活性の延長、または酸素要求量の減少であって、これら総ての因子はプロセスの効率を増加させるものであるものとして見ることができる。
【００２４】
エタノール収率を更に増加させ、ＣＯ２およびキシリトール収率を減少させるために、追加の改良法を用いることができる。これらは、（１）ＮＡＤＰについて本発明のＮＡＤＰに結合したＧＡＰＤＨと競合する反応の減少、および（２）ＮＡＤＰについてＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨの容量または親和性の増加を含む。
【００２５】
１）  競合反応の減少
ＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨを介するＮＡＤＰＨの再生は、ＮＡＤＰＨを再生するための唯一の方法ではない。ペントースリン酸経路酸化的部分を介するような他の経路が、ＮＡＤＰについて競合する。このＮＡＤＰＨの再生は、ＣＯ２生成と対になっている。このまたは同様な経路を阻害しまたは欠失することも、有益である可能性がある。例５では、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼがＮＡＤＰについて競合し、且つＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨの過剰発現と共に相当するＺＷＦ１遺伝子の欠失はエタノール生成に更に有益な効果を有し、すなわち、エタノールはキシリトールまたはＣＯ２のような望ましくない副生成物を犠牲にして一層高収率で生成することを示す。
【００２６】
例５では、ＮＡＤＰについての競合反応を減少させることにより、望ましくない副生成物の生成を更に減少させることができ、これによってエタノール収率を増加することができることを示す。遺伝子をグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼについて欠失させること、ＮＡＤＰについて競合し且つ同時にＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨを過剰発現する反応によって、望ましくないキシリトールの生成を更に２０%だけ減少させることができた。ＮＡＤＰについて競合する他の反応は、ＮＡＤＰ依存性アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼＡＬＤ６およびイソクエン酸デヒドロゲナーゼＩＤＰＩ−３を包含する。
【００２７】
ＮＡＤＰについて競合するこれらおよび他の反応は、様々な方法で抑制することができる。反応を触媒する酵素をコードする遺伝子は、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼについて例５に記載する方法で欠失することができる。このような遺伝子を崩壊させて、最早機能的デヒドロゲナーゼを生成しないようにすることもできる。遺伝子のプロモーターを（例えば、オープンリーディングフレームの配列上流の部分の欠失によって）変更させ、酵素の発現レベルを減少するが、なくならないようにすることもできる。触媒される反応が微生物にとって有益であり、例えば、完全な抑制により微生物の増殖が防止されるようになる場合には、これは好都合である可能性がある。実際には、実験はほとんど必要でないが、完全な抑制により増殖が防止されると、これは直ちに明らかであり、明らかな利点を有する一層穏和な方法を用いることができるからである。同様に、突然変異を競合酵素の活性部位に導入して、その触媒効率を減少させるが、なくならないようにすることができる。例えば、競合酵素のＮＡＤＰについてのＫｍを増加させた突然変異は十分であるが、このような突然変異の動力学的効果を特定する必要はない。デヒドロゲナーゼの活性部位配列は、当業者が確認することができる。
【００２８】
２）  ＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨの容量の増加
ＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨの容量または親和性を増加させるために、発現レベルを増加させることができ、またはＮＡＤＰＨに一層高い親和性を有するＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨを用いることができる。
【００２９】
競合反応の減少またはＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨの容量増加はペントース醗酵だけでなく、ＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨが正の効果を有する他の例についても有益である。
【００３０】
ここでは、K. lactis由来のＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨのＤ−キシロース経路を含むS. cerevisiaeの菌株への導入を記載する。当業者にとって、別の真菌または他の真核生物由来の同様な酵素を見出すことは容易である。ＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨの導入は、細菌性、真菌性または別の真核生物由来のものであろうと、その供給源には関わりなく有益である可能性がある。
【００３１】
細菌および植物由来のＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨが知られている。本発明では、真菌由来のＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨを説明する。ＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨは、例えば、ＮＡＤ−ＧＡＰＤＨのアミノ酸配列の変更を介して、生成することができる。
【００３２】
例えば、本明細書に開示されたＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨの配列を、既知のＮＡＤおよびＮＡＤＰ特異性およびある程度のアミノ酸同一性の他のデヒドロゲナーゼの配列および最良の場合には三次元構造が知られている配列と比較することにより、当業者は、補因子特異性に関与しているタンパク質配列中のアミノ酸を予測することができる。この知見により、位置指定突然変異誘発を用いて、補因子特異性を変化させることができ、すなわち、ＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨを位置指定突然変異誘発によってＮＡＤ−ＧＡＰＤＨから作製することができる。異種ＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨの発現が困難な場合には、突然変異誘発によってＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨを作製することが有利である可能性がある。所望の変化を、ランダム法を用いて行うこともできる。
【００３３】
配列中で、酵素の補因子特異性に重要なアミノ酸を見出すことができる方法の一例は、下記の通りである。ＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨのアミノ酸配列を、異なる特異性を有する異なる生物由来のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列と共に整列し、これを既知の構造情報と比較すると、４６アミノ酸であるアスパラギンが重要である可能性が示唆される（Fillinger et al., 2000も参照されたい）。総てのＮＡＤ−ＧＡＰＤＨにおいて、相当するアミノ酸は負に帯電したアスパラギン酸である。利用可能な構造情報から、ＮＡＤＰの負に帯電したリン酸は、ＮＡＤＰが活性部位に結合しているとき、すなわち負電荷間の好ましくない相互作用のためにＮＡＤ−ＧＡＰＤＨがＮＡＤＰを用いないときには、この部分にあると予想される。負に帯電したアスパラギン酸を、K. lactisのＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨについて本明細書に開示したアスパラギンのような中性残基または正に帯電したアミノ酸に変化させることによって、ＮＡＤ−ＧＡＰＤＨの特異性を変化させて、ＮＡＤＰを用いることもできるようにすることができる。
【００３４】
Ｌ−アラビノース経路がＤ−キシロース経路と同様な補因子不均衡を生じるので、ＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨはＬ−アラビノース醗酵においても有益であることができる。
【００３５】
ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）は生物分解性プラスチックを製造するために商業的に製造されているが、法律により（例えば、ドイツ国で）使用が義務づけられている場合を除き、価格が高すぎて、広くは用いられていない。従って、ＰＨＡを生成する微生物プロセスの効率を改良することが望ましい。ＰＨＡの生合成では、グルコースを代謝してアセチル−ＣｏＡとし、２分子のＮＡＤＨ／アセチル−ＣｏＡ分子を生成し、アセチル−ＣｏＡを次に縮合してアセトアセチル−ＣｏＡとし、これをＮＡＤＰＨによって還元して３−ヒドロキシブチリルＣｏＡとする。従って、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡのそれぞれの分子の合成では、ＮＡＤＨ４分子を生成し、且つＮＡＤＰＨ１分子を必要とする。次に、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを重合してポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）とし、またはプロピオニル−ＣｏＡのような他のアセチル−ＣｏＡと共重合して、混合ＰＨＡを形成する。モノマー単位当たり１分子のＮＡＤＰＨが必要であり且つ４分子のＮＡＤＨが生成されることは、ＰＨＡを合成する微生物が、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼまたはイソクエン酸デヒドロゲナーゼのような反応を介してそれらの炭素フラックスの一部を転用して、ＮＡＤＰＨを生成し、その結果、上記で説明したように、過剰量のＣＯ２を生成し、炭素源を浪費することを意味している。同時に、ＮＡＤＨは再酸化しなければならず、更に炭素を損失しまたは酸素要求量が増加し、または両方を引き起こす。本発明に従って形質転換した生産微生物を用いることによって、ＮＡＤＨを犠牲にしてＮＡＤＰＨを生成する新しいメカニズムが提供される（総説について、例えば、Anderson and Dawes [1990]； Poirier et al. [1995]を参照されたい）。バイオマスのＣＯ２としての浪費は減少し、酸素の要求量も減少し、結果として曝気費用が減少する。
【００３６】
ＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨの導入は、S. cerevisiaeの菌株で有益であるだけでなく、天然でペントースを使用する酵母種のような他の真菌でも有益である。いずれの真菌種でも、これは、Ｄ−キシロース醗酵およびＬ−アラビノース醗酵において、またはレドックス補因子の不均衡が障害になる任意のバイオテクノロジープロセスにおいて、有益である。醗酵生成物は、エタノール、ラクテート／乳酸、または他の生成物であることができる。
【００３７】
酵素のアミノ酸配列を故意にまたは偶然に（例えば、ＰＣＲクローニングで）変化させ（例えば、部分を欠失または付加しまたはアミノ酸変化を導入）、変化した酵素が元の酵素と同じ反応を触媒することができるようにすることができることは、当業者に周知である。本発明は、このようなＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨの「機能活性」変異体をコードする組換えＤＮＡ配列を用いて実施することもできる。
【００３８】
本発明は、実施例で用いたプロモーターとは異なるプロモーターを有する組換えＤＮＡ分子で微生物を形質転換することによって実施することもできる。組換えＤＮＡ分子が完全な機能性酵素をコードするヌクレオチド配列を含むことは、必要でない。例えば、有益な効果は、ＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨの天然宿主を、天然プロモーターを修飾するＤＮＡ分子で形質転換することによって得て、ＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨの発現レベルを高めることができる。
【００３９】
宿主に遺伝子を形質導入または形質転換するための当該技術分野で知られているいずれの方法も、本発明に適しており、自律複製プラスミドベクターまたは人工染色体など様々な種類のベクターを用いることができる。形質転換遺伝子の単一または複数のコピーを染色体に機能的な発現可能な形態で組込むための当該技術分野で報告されている方法も、本発明に好適である。
【００４０】
本発明では、幾つかの場合には、形質転換遺伝子の発現を特異的な培養条件下でのみ引き起こすのが有利であることがあると思われる。例えば、最初に生物を所定の細胞密度まで増殖させ、次に形質転換遺伝子を発現させるのが有効であることができる。温度またはｐＨの変化、炭素または窒素源、またはホスフェートまたは銅のようなある種の有機または無機物質の培地での存在または非存在によって誘導することができるプロモーターが、知られている。
【００４１】
本発明を下記の例によって更に説明するが、これらの例は単に例示のためのものであり、どのような点においても発明の制限を意味するものではない。特に断らない限り、総ての生物工学的な手順は当該技術分野で慣用の方法を用いて行う。
【実施例】
【００４２】
例１：  適当なレドックス酵素のスクリーニング
S. cerevisiaeにおけるホスホグルコースイソメラーゼ遺伝子の欠失に基づいているＮＡＤＰ（Ｈ）関連のレドックス酵素のスクリーニング系を用いた。このような欠失を有する菌株（Δｐｇｉ１）はグルコース上で増殖することができず、これはＮＡＤＰＨの致死過剰産生に関係している（Boles et al., 1993）。Kluyveromyces lactisでは、このような欠失は同様な表現型を生じない（Gonzales Siso et al. 1996）。ホスホグルコースイソメラーゼ欠失を有するS. cerevisiaeを用い、Δｐｇｉ１突然変異体をグルコース上で増殖させるK. lactis遺伝子を見出す目的で、K. lactisゲノムライブラリーをグルコース上での増殖についてスクリーニングした。上記のようにして、ＮＡＤＰに結合したＧＡＰＤＨを見出した。従って、このスクリーニング法は、本発明の実施に適する遺伝子を提供する。
【００４３】
ライブラリースクリーニングのための宿主菌株の構築；S. cerevisiaeにおけるＰＧＩ１遺伝子の欠失：
S. cerevisiaeハプロイドの菌株ＣＥＮ．ＰＫ２のＰＧＩ１遺伝子を欠失した。プライマー３６４５および３６４６を用いるＰＣＲによって、S. cerevisiaeＰＧＩ１断片を得た。プライマー３６４６（5'-CGACCGGTCGACTACCAGCCTAAAAATGTC-3'）は、クローニングを促進するためのＳａｌＩ消化部位（下線部）を有し、プライマー３６４５（5'-GGCACGCTGCAGAGAGCGATTTGTTCACAT-3'）は、ＰｓｔＩ消化部位を有した。ＰＧＩ１断片をＳａｌＩおよびＰｓｔＩで消化し、pBluescript SK-ベクター（Stratagene）に連結した。生成するプラスミド（Ｂ１１８６）をＥｃｏＲＩおよびＢｓｔＢＩで消化し、ＰＧＩ１遺伝子の中央から７１５bpの断片を除いた。
【００４４】
ＨＩＳ３遺伝子は、酵母発現ベクターｐＲＳ４２３からＤｒｄＩ消化によって得た。ＨＩＳ３断片をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼによって平滑化し、pBluescript SK-ＥｃｏＲＶ部位に連結した。このプラスミド（Ｂ１１８５）をＥｃｏＲＩとＣｌａＩで消化し、ＨＩＳ３遺伝子を有する１．５kbの断片をＥｃｏＲＩおよびＢｓｔＢＩで消化したＢ１１８６プラスミドに連結した。生成するプラスミドを、Ｂ１１８７と命名した。
【００４５】
ＰＧＩｌ＋ＨＩＳ３断片を、Ｂ１１８７プラスミドからＳａｌＩおよびＭｕｎＩ消化によって放出し、S. cerevisiae株ＣＥＮ．ＰＫ２をこの断片で形質転換した。Ｌｉ−アセテート法（Hill et al., 1991; Gietz al., 1992）を用いて、酵母形質転換を行った。酵母形質転換体を、S. cerevisiaeＰＧＩ１遺伝子由来の断片をプローブとして用いてサザンブロット法によって確認した。次に、生成する菌株ＣＥＮ．ＰＫ２Δｐｇｉ１を用いて、スクリーニングした。
【００４６】
K. lactisゲノムライブラリーの構築およびスクリーニング
K. lactisゲノムライブラリーを、Brummer et al., 2001によって報告された方法によってＬＥＵ２マーカー遺伝子を有する酵母マルチコピーベクター中に構築した。このライブラリーを、ＣＥＮ．ＰＫ２Δｐｇｉ１酵母株に形質転換した。形質転換体をＳＣ−ｌｅｕ＋２%フルクトース＋０．１%グルコースを含む培地で培養した。２日間の培養後、１．３×１０６個の形質転換体をプレートから０．９%ＮａＣｌにプールした。
【００４７】
酵母ライブラリースクリーニングのために、ライブラリーからの６０００個の独立したクローンを、ＳＣ−ｌｅｕ＋２%フルクトース＋０．１%グルコースを含む培地で培養した。３日間の培養後、プレートのコロニーをＳＣ−ｌｅｕ＋０．１%グルコースプレートに複製した。複製プレートを、９日間培養した。７２個の増殖の遅いコロニーを、ＳＣ−ｌｅｕ＋０．１%グルコースプレートにストリークした。
【００４８】
ＰＣＲ分析を行い、グルコース上で増殖したクローンがホスホグルコースイソメラーゼをコードするK. lactisＲＡＧ２遺伝子を有するかどうかを決定した。ＰＣＲは、K. lactisＲＡＧ２について特異的プライマー４７１９および４７２０を用いて行った。５′−プライマー４７１９はＡＴＧから３２０bp下流であり（5'-CACTGAAGGACGTGCTGTGT-3'）、３′−プライマー４７２０はＡＴＧから１１５０bp下流である（5'-AGCTGGGAATCTGTGCAAGT-3'）。
【００４９】
ＰＣＲ分析を、１８種類のコロニーについて行った。K. lactisＲＡＧ２遺伝子を持たない６個のクローンを、ＰＣＲ分析によって見出した。プラスミド−ＤＮＡをこれらの６個のクローンから抽出し、E. coliで形質転換し、更に分析を行った。
【００５０】
プラスミドをＣＥＮ．ＰＫ２ Δｐｇｉ１酵母株に再形質転換し、形質転換体をグルコース上での増殖について試験した。２個のクローンが、グルコース上での増殖を回復することができた。インサートの部分シークエンシングは、２個のクローンが同一であることを示唆していた。プラスミドの一つをＢ１５１３と呼んだ。
【００５１】
スクリーニングの生成物の同定
回収したプラスミドは、１０kbと予想されるインサートを有していた。トランスポゾンを、「鋳型生成系（Template generation system）」（Finnzymes）によりプラスミドにランダムに挿入した。１０種類の異なるトランスポゾン挿入（トランスポゾンおよびベクターからのプライマーを用いるＰＣＲによって判定）を選択した。次に、それらを、０．１%Ｄ−グルコース上での増殖について試験したＣＥＮ．ＰＫ２Δｐｇｉ１株に再形質転換した。２%Ｄ−フルクトース＋０．０５%Ｄ−グルコース上に保持されているが、０．１%Ｄ−グルコース上で増殖を示さない株から、プラスミドを回収し、トランスポゾン配列のプライマーで配列決定した。Ｄ−グルコース上で増殖を回復することができなかったプラスミドは、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）に高い相同性を有するオープンリーディングフレームに挿入されたトランスポゾンを有した。後でＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨであることが明らかになる酵素のアミノ酸配列は、配列番号：２によって示される。これは、分子質量が３９０３０Daである３５６アミノ酸のタンパク質である。これは、ヌクレオチド配列の配列番号１のヌクレオチド３８４〜１４５１のヌクレオチド配列におけるオープンリーディングフレームによってコードされる。
【００５２】
例２：  ＧＡＰＤＨ同族体のクローニングおよび発現、ＮＡＤＰＨ−ＧＡＰＤＨ活性の試験
K. laclisＧＡＰＤＨ同族体の酵母発現ベクターｐＹＥＳ２へのクローニング：
ＧＡＰＤＨ同族体を、下記のプライマー：ＧＡＰＢＡＭＨ：AAGGATCCAAGCGTCTCCTTAAACACCAGCおよびＧＡＰＨＩＮＤ：ATAAAGCTTAAGATGCCCGATATGACAAACGAATCTTCを用いることによって例１からのプラスミドＢ１５１３からＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲにおけるアニーリング温度は６５℃であった。ＰＣＲ生成物をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIIIで消化し、ｐＹＥＳ２ベクター（Invitrogen）の多重クローニング部位の相当する部位に連結した。ｐＹＥＳ２は、ガラクトース誘導プロモーターとターミネーターとの間に多重クローニング部位を有する酵母発現ベクターである。生成するベクターを、Ｂ１６１２と命名した。
【００５３】
S. cerevisiaeでのK. lactisＧＡＰＤＨ同族体の発現
上記からのプラスミドＢ１６１２およびコントロールとしてのｐＹＥＳ２を、S. cerevisiae菌株ＣＥＮ．ＰＫ２に形質転換した。生成する株を、２０ｇ／ｌ Ｄ−グルコースおよび２０ｇ／ｌ Ｄ−ガラクトースを含む選択培地上で増殖させた。光学密度１で細胞を回収し、細胞抽出物を調製した。細胞抽出物は、０．５g細胞（新鮮重量）、５００mgガラスビーズ（０．４mm直径）、および１ｍｌ緩衝液（１０mMリン酸ナトリウム，pH７．０にプロテアーゼ阻害剤を加えたもの）を混合することによって調製した。次に、抽出物を用いて、酵素活性分析を行った。ＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨ酵素活性は、５００mMトリエタノールアミン，pH７．８、１mMＡＴＰ、２mMＭｇＣｌ２、０．２mMＮＡＤＰＨ、３−ホスホグリセレートキナーゼを含む緩衝液中で測定した。反応を開始するため、グリセレート−３−リン酸を５mMの最終濃度で加えた。活性は、３４０nmでのＮＡＤＰＨ吸光度の減少から計算した。ＮＡＤＰＨ−ＧＡＰＤＨ活性は、０．０５ｎｋａｔ／ｍｇ抽出タンパク質であった。エンプティーｐＹＥＳ２プラスミドを形質転換したコントロールでは、０．００６ｎｋａｔ／ｍｇであった。
【００５４】
例３：  S. cerevisiae株におけるK. lactisＧＡＰＤＨ同族体のＤ−キシロース醗酵に対する効果
Ｄ−キシロース醗酵のため、ＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨ遺伝子を、ＡＤＨＩプロモーターにより酵母発現ベクターに連結した。従って、ＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨを、下記のプライマーであって、それぞれがＢａｍＨＩ部位を含むもの（ＢａｍＨＩ部位に下線を付している） AAGGATCCAAGATGCCCGATATGACAAACGAATCTTCおよびAAGGATCCAAGCGTCTCCTTAAACACCAGCを用いたこと以外は例２に記載の通りにＰＣＲによって増幅した。次に、ＰＣＲ生成物をＴＯＰＯベクター（Invitrogen）にクローニングし、生成するベクターからの１kbＢａｍＨＩ断片をｐＶＴ１０２ＵのＢａｍＨＩ部位に連結した（Vernet et al., 1987）。生成するベクター（Ｂ１７３１）を、次にS. cerevisiae株（Ｈ２２１７，Aristidou et al 1999）に形質転換し、キシロース経路の酵素を過剰発現し、すなわちキシロースレダクターゼ（ＸＲ）、キシリトールデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）およびキシルロキナーゼ（ＸＫ）をゲノムに組込んだ。コントロールとして、ＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨを欠いていることを除き、同じ株を用いた。代わりに、これは、エンプティーベクターｐＶＴ１０２Ｕを含んでいた。両株を用いて、純粋なＤ−キシロースを嫌気性条件下で醗酵した。最初に、細胞を、酵母窒素ベース（Difco）およびウラシルを除く総てのアミノ酸、および１．６ｌの容量中に炭素源としての３０ｇ／ｌ Ｄ−グルコースを含む培地中で、３０℃、pH５．０および２ｌ／分のエンプティー気流速で増殖させた。４８時間後、Ｄ−キシロース溶液０．４lを加えてＤ−キシロースの最終濃度が５０ｇ／ｌとなるようにしたとき、バイオマスは３〜４ｇ／ｌであり、エタノール濃度は０．５〜１ｇ／ｌであった。気体流を、流速が０．１ｌ／分の窒素に代えた。液体試料を採取し、乾燥重量についてＨＰＬＣによってエタノール、キシロースおよびキシリトール、および他成分について分析した。出口気体を、マススペクトル分析法によって分析した。結果を、図３および４に示す。このような醗酵の主生成物は、キシリトール、エタノールおよびＣＯ２である。ＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨを導入すると、生成したエタノール対キシリトールのモル比が増加した。ＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨなしでは、キシリトールとエタノールのモル濃度は同様である。ＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨを導入すると、キシリトールの生成は約３０%だけ減少する（図４）。Ｄ−キシロースについてのエタノール収率も、影響を受ける。最大理論収率は、１．６７モルエタノール／１モルＤ−キシロースである。コントロールでは、生成エタノール対消費Ｄ−キシロースモル比は０．４４であり、これは理論収率の２６%であり、ＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨを用いると、消費Ｄ−キシロース対生成エタノールのモル比は０．５７であり、これは理論収率の３４%であった（図４）。ＣＯ２収率も影響を受ける。３０〜９０時間の期間におけるＣＯ２生成を分析し、これを同じ期間のエタノール生成と比較した。ＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨを用いると、ＣＯ２対エタノールのモル比は、コントロールでは１．９１であったのに比較して、１．１５である。
【００５５】
例４：  ＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨ精製物
ＮＡＤＰＨ−ＧＡＰＤＨを精製するため、タンパク質のＮ−末端における６ヒスチジンの付加タグを用いて酵母で過剰発現させた。これを、例２および３と同様に、ＰＣＲによってクローニングした。プライマーは、ＢａｍＨＩ制限部位を有する遺伝子の開始についてはAAGGATCCAAGATGCCCGATATGACAAACGAATCTTCであり、６ヒスチジンの導入を有する遺伝子の終了についてはAAGGATCCTTAATGATGATGATGATGATGAACACCAGCTTCGAAGTCCTTTTGAGCCであり、ＢａｍＨＩ制限部位には下線を付した。ＰＣＲ生成物を最初にＴＯＰＯベクター（Invitrogen）にクローニングし、ＴＯＰＯベクター由来のＢａｍＨＩ断片を次にＰＧＫ１プロモーターを有する酵母発現ベクター（Ｂ１１８１）のＢｇｌII部位に連結した。この酵母発現ベクターは、酵母発現ベクターｐＭＡ９１（Mellor et al., 1983）をＨｉｎｄIIIで消化し、ＢｇｌIIクローニング部位を有するＰＧＫ１プロモーター／ターミネーターを含む生成する１．８kb断片をＹＥｐｌａｃｌ９５ベクター（Gietz and Sugino, 1988）のＨｉｎｄIII部位に連結した。次に、プラスミドを、ホスホグルコースイソメラーゼ遺伝子に突然変異を有する酵母菌株に形質転換した。プラスミドはグルコース上で増殖を回復することができ、ヒスチジンタグが酵素活性に影響しないことを示していた。次に、Ｈｉｓタグ付きタンパク質をＮｉＮＴＡカラム（Qiagen）で精製した。このようにして精製したタンパク質を、次に図６に示すように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。酵素はほとんど純粋である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるタンパク質のほぼ８０〜９０%は、約４０kDaの単一バンドである。活性は、例２に記載した通り、２００μMＮＡＤＰＨまたは２００μMＮＡＤＨを用いて測定した。ＮＡＤＰＨを用いると、活性は１４０ｎｋａｔ／ｍｇであり、ＮＡＤＨを用いると、活性は４７ｎｋａｔ／ｍｇであった。
【００５６】
例５：  Ｄ−キシロース醗酵についてのＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨの存在下でのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの欠失の効果
Δｚｗｆｌ欠失株の構築
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）をコードするＺＷＦ１遺伝子は、S. cerevisiaeゲノムＤＮＡを鋳型として用いるＰＣＲによって得た。特異的プライマー３９９４ （5'-GCTATCGGATCCAAGCTTAGGCAAGATGAGTGAAGGTT-3'）および４００６（5'-GCTATCGGATCCAAGCTTAGTGACTTAGCCGATAAATG-3'）を用いた。両プライマーは、クローニングを促進するためのＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII部位を有した。制限部位には、下線を付している。ＰＣＲから得たＺＷＦ１断片をＢａｍＨＩで消化し、pBluescript SK−プラスミド（Stratagene）に連結した。生成するプラスミドＢ１７６８を、ＢｇｌIIで消化した。消化において、１０６３bp断片がＺＷＦ１遺伝子の中央から放出された。消化したベクターを、Mung Bean Nucleaseで平滑化した。ＨＩＳ３マーカー遺伝子は、pRS423プラスミド（Christianson et al., 1992）からＢｓｍＢＩおよびＤｒａIII消化によって得た。ＨＩＳ３遺伝子を含む１５９１bp断片をMung Bean Nucleaseで平滑化し、ＢｇｌIIで消化して平滑化したＢ１７６８ベクターに連結した。生成するプラスミドを、Ｂ１７６９と命名した。ＺＷＦ１欠失カセットをＢ１７６９プラスミドからＢａｍＨＩ消化によって放出し、S. cerevisiae株Ｈ２２１７（例３参照）をＬｉ−アセテート法により断片を用いて形質転換した。ＺＷＦ１遺伝子の欠失は、ＰＣＲ分析、サザンブロット分析、およびＧ６ＰＤＨ酵素活性分析によって確かめた。
【００５７】
Ｇ６ＰＤＨ酵素活性測定のための細胞抽出物は、ガラスビーズを用いて酵母細胞を１０mMＮａ−リン酸，pH７．０緩衝液中で粉砕することによって調整した。プロテアーゼ阻害剤ＰＭＳＦ（最終濃度１mM）およびペプスタチンＡ（０．０１ｍｇ／ｍｌ）を、抽出緩衝液に加えた。活性は、Cobas Miraアナライザー（Roche）で測定した。活性は、１０mMＮａ−リン酸，pH７．０および１mMＮＡＤＰを含む緩衝液中で測定し、１０mMＧ６ＰＤＨを出発試薬として用いた。Ｇ６ＰＤＨ活性は、Δｚｗｆｌ欠失株では見られなかった。
【００５８】
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするＺＷＦ１遺伝子を、キシロースレダクターゼ、キシリトールデヒドロゲナーゼおよびキシルロキナーゼの遺伝子が例３に記載の通りにゲノムに組込まれているS. cerevisiaeで欠失させた。
【００５９】
次に、生成する菌株を、ＰＧＫ１プロモーター下でＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨを有する多重コピー発現ベクターで形質転換した。この発現ベクターを作製するため、例３に記載されているようにＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨを有する１kbＢａｍＨＩ断片を、例４に記載されているようにＢ１１８１ベクターのＢｇｌII部位に連結した。コントロール株は、ｚｗｆｌ欠失株におけるエンプティーベクターＢ１１８１で作製した。４個の株、株１：ＧＤＰ１，ＧＡＰＤＨについての遺伝子を発現する株； 株２：コントロール，エンプティーベクターを有する株； 株３：ＧＤＰ１Δｚｗｆｌ, ｚｗｆｌ欠失のバックグラウンドにおけるＧＡＰＤＨについての遺伝子を発現する株；および株４：Δｚｗｆｌ，ｚｗｆｌ欠失およびエンプティープラスミドを有する株、を比較した。総ての株は、ゲノムに組込まれたＤ−キシロースレダクターゼ、キシリトールデヒドロゲナーゼおよびキシルロキナーゼをコードする遺伝子も有している。次に、これらの株を用いて、例３に記載されているようにＤ−キシロースを嫌気性条件下で醗酵させた。結果は、表１および２、および図８、９および１０にまとめてある。
【００６０】
表１
例５に記載の醗酵のまとめ。嫌気性醗酵の１２０時間中のＤ−キシロース消費を、同じ期間中のエタノール、キシリトールおよびＣＯ２の生成と比較する。
【表１】
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【００６１】
【表２】
2005507255.tif 000004
【００６２】
例６：
１４Ｃ標識したＤ−キシロースを有するＤ−グルコースＤ−キシロース混合物上での嫌気性振盪フラスコ培養。初期のバイオマスは、乾燥重量が０．３６５ｇ／ｌであった。上記のようなＤ−グルコースＤ−キシロース混合物中で酵母懸濁液１００ｍｌを、３０℃での嫌気生活を確保するためのウォーターロック（waterlock）を有する１００ｍｌ三角フラスコ中でマグネティックスターラー攪拌を行った。醗酵は７５時間であった。醗酵後、エタノールを培地５０ｍｌから蒸留し、５０ｍｌの容積まで満たした。次に、全エタノールを、Anton-Paar DMA58密度計を用いて蒸留物の密度を測定することによって測定した。Ｄ−キシロース由来のエタノールは、蒸留物の放射能から推定した。
【００６３】
総ての株は、ＸＲ、ＸＤＨおよびＸＫを組込んだ株から誘導され、前例に記載されている。
【００６４】
表３
例６の結果のまとめ。醗酵時間後の乾燥重量、総エタノールおよびＤ−キシロースからのエタノールを、様々な株および初期糖組成について示す。「キシロースからの理論量の%」とは、総てのＤ−キシロースが消費された場合のキシロースのモル数当たりのエタノール５／３モルである理論収率と比較した%で示したキシロース由来のエタノールの画分である。
【表３】
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【００６５】
参考文献
【表４】
2005507255.tif 000006
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2005507255.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】Ｌ−アラビノースおよびＤ−キシロースについての真菌性経路を示す。Ｌ−アラビノースを、２還元および２酸化段階を含む経路でＤ−キシルロース−５−ホスフェートに転換する。還元段階はＮＡＤＰＨの酸化と対になっており、酸化段階はＮＡＤの還元と対になっている。Ｄ−キシロースを、１還元および１酸化を含む同様な方法で異化する。ここでもまた、還元はＮＡＤＰＨの酸化と対になっており、酸化はＮＡＤの還元と対になっている。
【図２】Ｄ−キシロース醗酵におけるレドックス補因子を示す。Ｄ−キシロース３モルのエタノール５モルおよびＣＯ２５モルへの醗酵はレドックス中性である。しかしながら、異なるレドックス補因子が用いられ、すなわちＮＡＤＰおよびＮＡＤＨは十分には再生されず、レドックス補因子の不均衡を生じる。ＮＡＤＰは、例えば、ペントースリン酸経路の酸化的部分によって再生することができる。これによって余剰ＣＯ２が生成し、全体的プロセスは最早レドックス中性ではなくなる。
【図３】ＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨを用いるＤ−キシロース醗酵におけるレドックス補因子を示す。Ｄ−キシロース３モルのＤ−キシルロース３モルへの転換では、ＮＡＤＰ３モルおよびＮＡＤＨ３モルを生成する。Ｄ−キシルロース３モルから、グリセルアルデヒド−３−リン酸（ＧＡＰ）を生成することができる。ＧＡＰ３モルは、ＮＡＤＰ３モルを再生処理してＮＡＤＰＨとすることができる。他のＧＡＰ２モルを用いて、ＮＡＤ２モルをＮＡＤＨに還元する。全部で５モルのＮＡＤＨを生成し、これはアルコールデヒドロゲナーゼによって再生して、エタノールを生成することができた。エタノール５モルおよびＣＯ２５モルの生成は補因子中性である。
【図４】ＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨを過剰発現する菌株（黒塗り記号）およびＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨ活性を持たない相当するコントロール（白抜き記号）での嫌気性Ｄ−キシロース醗酵の際のエタノールおよびキシリトール生成を示す。濃度は、ｍＭ／ｇ乾燥重量で示す。
【図５】ＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨを過剰発現する菌株（黒塗り記号）およびＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨ活性を持たない相当するコントロール（白抜き記号）での嫌気性Ｄ−キシロース醗酵の際のエタノール生成およびＤ−キシロース消費を示す。濃度は、ｍＭ／ｇ乾燥重量で示す。
【図６】ヒスチジンタグを有する精製ＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図７】ＺＷＦ１欠失を有し且つＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨを過剰発現する菌株での嫌気性Ｄ−キシロース醗酵の際のエタノールおよびキシリトール生成（三角形）を示す。詳細は、例５で説明する。比較のため、図４からのエタノールおよびキシリトール生成を含めている。黒塗り記号はエタノール生成を表し、白抜き記号はキシリトールを表している。四角形はコントロール菌株についてのものであり、黒塗り丸は例３に記載した通りのＮＡＤＰ−ＧＡＰＤＨを過剰発現する菌株についてのものである。
【図８】例５に記載の菌株を用いる嫌気性Ｄ−キシロース醗酵の際のエタノール生成を示す。
【図９】例５に記載の菌株における嫌気性Ｄ−キシロース醗酵の際のキシリトール生成を示す。
【図１０】例５に記載の菌株における嫌気性Ｄ−キシロース醗酵の際のＤ−キシロース消費を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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