(57)【要約】本発明は、炎症プロセスに関連したNHR-タンパク質、及び炎症疾患にポジティブに影響を及ぼすための、そのようなNHR-タンパク質の機能の変調に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
物質が、過剰活性化されたマクロファージにおいて脱調節されたNHR-タンパク質の機能のアクチベーター又はインヒビターであるかどうかを決定する方法であって、
NHR-タンパク質の望ましい機能のインヒビター又はアクチベーターであるかどうかを試験する物質を、NHR-タンパク質又はNHR-タンパク質機能を有するそれらの変種、変異体もしくは断片と接触させる工程、及び
望ましい機能が阻害又は活性化されたかどうかを測定する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
望ましい機能の阻害又は活性化を直接的に測定する、請求項1記載の方法。
【請求項３】
望ましい機能の阻害又は活性化を間接的に測定する、請求項1記載の方法。
【請求項４】
NHR-タンパク質が、哺乳類NHR-タンパク質である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
NHR-タンパク質が、ヒトNHR-タンパク質である、請求項4記載の方法。
【請求項６】
分析を、細胞システムを用いて行う、請求項1記載の方法。
【請求項７】
分析を、細胞非含有システムを用いて行う、請求項1記載の方法。
【請求項８】
前記NHR-タンパク質が、ERRα(配列番号:1)；及び、NR4A1(配列番号:2)からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項９】
ERRα(配列番号:1)又は同じ機能を有するそれらの変種、変異体もしくは断片を使用する、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
NR4A1(配列番号:2)又は同じ機能を有するそれらの変種、変異体もしくは断片を使用する、請求項8記載の方法。
【請求項１１】
機能が、DNA認識及び／又はDNA結合である、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
機能が、タンパク質認識及び／又はタンパク質結合である、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
マクロファージにおいて発現されたNHR-タンパク質の発現レベルを決定することを含む、過剰活性化されたマクロファージにおいて脱調節されたNHR-タンパク質の発現レベルを決定する方法。
【請求項１４】
前記マクロファージが、哺乳類マクロファージである、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
前記マクロファージが、ヒトマクロファージである、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
前記NHR-タンパク質が、ERRα(配列番号:1)；及び、NR4A1(配列番号:2)からなる群より選択される、請求項13記載の方法。
【請求項１７】
前記発現レベルを、マクロファージにおけるNHR-タンパク質をコードしている核酸のレベルを決定することにより決定する、請求項13又は16記載の方法。
【請求項１８】
前記発現レベルを、NHR-タンパク質のレベルを決定することにより決定する、請求項13又は16記載の方法。
【請求項１９】
慢性炎症性気道疾患を診断又は経過観察するための方法である、請求項13〜18のいずれか1項記載の方法。
【請求項２０】
慢性炎症性気道疾患が、慢性気管支炎及びCOPDからなる群より選択される、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
分析を、炎症部位から入手可能なマクロファージ又はその一部を用いて行う、請求項13記載の方法。
【請求項２２】
物質が、過剰活性化されたマクロファージにおいて脱調節されたNHR-タンパク質の機能のアクチベーター又はインヒビターであるかどうかを決定する試験システムであって、少なくとも1種のNHR-タンパク質又はNHR-タンパク質機能を有するそれらの変種もしくは変異体もしくは断片を含むことを特徴とするシステム。
【請求項２３】
前記NHR-タンパク質が、ERRα(配列番号:1)；及び、NR4A1(配列番号:2)からなる群より選択される、請求項22記載の試験システム。
【請求項２４】
NHR-タンパク質を発現している細胞を含む、請求項23記載の試験システム。
【請求項２５】
過剰活性化されたマクロファージにおいて脱調節されたNHR-タンパク質のアクチベーター又はインヒビターであることが決定された物質。
【請求項２６】
疾患の治療のための、過剰活性化されたマクロファージにおいて脱調節されたNHR-タンパク質のアクチベーター又はインヒビターである物質。
【請求項２７】
前記疾患が、慢性炎症性気道疾患である、請求項26記載の物質。
【請求項２８】
前記慢性炎症性気道疾患が、慢性気管支炎及びCOPDからなる群より選択される、請求項27記載の物質。
【請求項２９】
過剰活性化されたマクロファージにおいて脱調節されたNHR-タンパク質のアクチベーター又はインヒビターであることが決定された少なくとも1種の物質を含有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項３０】
慢性炎症性気道疾患を治療するための医薬組成物を調製するための、NHR-タンパク質のアクチベーター又はインヒビターであることが決定された物質の使用。
【請求項３１】
慢性炎症性気道疾患が、慢性気管支炎及びCOPDからなる群より選択される、請求項30記載の物質の使用。
【請求項３２】
慢性炎症性気道疾患の治療法であって、該治療が必要である生物に、NHR-タンパク質のアクチベーター又はインヒビターであることが決定された少なくとも1種の物質を含有する医薬組成物の適量を投与する工程を含むことを特徴とする治療法。
【請求項３３】
哺乳類を治療するための、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
ヒトを治療するための、請求項32記載の方法。
【請求項３５】
慢性気管支炎及びCOPDからなる群より選択される慢性炎症性気道疾患を治療するための方法である、請求項32記載の方法。
【請求項３６】
NHR-タンパク質のアクチベーター又はインヒビターであることが決定された物質を投与する工程を含むことを特徴とする、マクロファージにおけるNHR-タンパク質を選択的に変調する方法。
【請求項３７】
マクロファージが、慢性炎症性気道疾患に関連している、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
慢性炎症性気道疾患が、慢性気管支炎及びCOPDからなる群より選択される、請求項37記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
序説
本発明は、炎症プロセス、特にマクロファージが重要な役割を果たす慢性炎症性気道疾患の変調（modulation）分野に関する。本発明にしたがえば、前記炎症プロセスは、前記プロセスに中心的に関与することが確認された核内ホルモン受容体タンパク質の生物学的活性に影響を与えることにより変調される。
マクロファージが重要な役割を果たす慢性炎症性気道疾患の例は慢性気管支炎（ＣＢ）である。ＣＢは気道気流を制限する場合と制限しない場合とがあり、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を含む。ＣＢは下記のいくつかの障害症状を含む複合疾患である：咳と粘液の過剰分泌を特徴とする慢性気管支炎、小気道の疾患（炎症および気管支周囲線維症を含む）、および気道気流制限。ＣＢは急速で不可逆的な肺機能低下を特徴とする。ＣＢ発症の主要な危険因子は継続的喫煙である。全喫煙者の約２０％のみがＣＢに罹患しているだけであるので、遺伝的素因もまた本疾患に関与していると考えられる。
ＣＢ発症初期の最初の事象は、小気道および大気道に影響を与える炎症である。喫煙によって惹起された過敏症はマクロファージおよび好中球を誘引し、それらの数は喫煙者の喀痰で増加している。絶え間ない喫煙は、損傷部位に炎症性細胞を補充する、マクロファージ、好中球および上皮細胞由来の介在物質の放出によって肺の炎症反応の進行をもたらす。これまでのところ、ＣＢの進行をもとに戻すために利用可能な治療法は存在しない。喫煙の停止は肺機能の低下を減少させることができる。
今日まである程度の軽快を患者に提供できるほんのわずかな薬剤が知られているに過ぎない。長期持続性β２−作動薬および抗コリン作動薬が一過性の気管支拡張を達成するために用いられる。炎症現象に対する種々の拮抗薬、例えばＬＴＢ4−インヒビターが研究されている。
慢性炎症性気道疾患を治療する薬剤の提供が引続き要請されている。慢性炎症性気道疾患は炎症性免疫細胞の活性化の要因となる。したがって炎症プロセスの発生源を排除するためにマクロファージの機能を変調する薬剤が希求される。
【０００２】
発明の開示
本発明では、炎症プロセス、特に慢性炎症性気道疾患、より具体的には慢性気管支炎またはＣＯＰＤに中心的に関与するマクロファージは、健常なドナーまたは過敏状態のドナー由来のマクロファージの遺伝子発現パターンと異なる、差次的に発現される核酸配列パターンおよびタンパク質発現パターンを示すことが見出された（過敏状態のドナーは活性化状態のマクロファージを含んでいる）。したがって、マクロファージは種々の炎症症状下で種々の活性化レベルを示す。例えば本発明では、ＣＯＰＤに罹患している喫煙者の炎症性プロセスに関与するマクロファージは健常な喫煙者のマクロファージとは異なる遺伝子発現パターンを示すことが明らかにされ、このことは、ＣＯＰＤ喫煙者ではマクロファージは異なる状態（以下では“過剰活性化”状態と称する）にあることを示唆する。本発明は、マクロファージの過剰活性化または過剰活性化状態の維持に必要な核内ホルモン受容体タンパク質を変調する物質の特定を可能にすることによって、マクロファージの過剰活性化の阻害または過剰活性化状態の減少の可能性を提供する。
本明細書で用いられる“慢性炎症性気道疾患”という用語には、例えば慢性気管支炎（ＣＢ）および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）が含まれる。“慢性炎症性気道疾患”という用語の好ましい意味はＣＢおよびＣＯＰＤであり、より好ましい意味はＣＢまたはＣＯＰＤである。
【０００３】
本発明は、過剰活性化マクロファージではないマクロファージと比較した場合異なる態様で過剰活性化マクロファージで発現される核酸配列の特定をベースにしている。そのような核酸配列は核内受容体タンパク質をコードし、前記タンパク質は、炎症性プロセス、好ましくは慢性炎症性気道疾患に必要なマクロファージの過剰活性化または過剰活性化状態の維持に必要である。そのような差次的に発現される核酸配列またはそのような核酸配列によってコードされるタンパク質は以下ではまた、それぞれ本発明の差次的に発現される核酸配列またはタンパク質と称される。特に、本発明は、差次的に発現される核酸配列およびタンパク質の発現パターンによるマクロファージの表現型と炎症プロセスにおけるマクロファージの関与との間のつながりを教示し、したがって種々の応用の基礎を提供する。例えば、本発明は、本発明のマクロファージタンパク質または本発明の差次的発現核酸配列の発現レベルを決定する方法および試験システムを提供し、それによって、例えば哺乳類、好ましくはヒト、特に炎症性プロセス（好ましくは慢性炎症性気道疾患、より好ましくは慢性気管支炎またはＣＯＰＤ）にあるヒトにおける過剰活性化マクロファージが関与する炎症性プロセスの診断またはモニター方法を提供する。本発明はまた、本発明の差次的に発現される核酸配列またはタンパク質の手段によって物質を特定する方法に関する。前記物質は、本発明の差次的に発現される核酸配列またはタンパク質を変調し（すなわち前記に対してインヒビターまたはアクチベーターとして作用し）、それによってマクロファージの過剰活性化を阻害または過剰活性化状態を減少させて慢性炎症性プロセスにポジティブな影響を与え、それによって前記疾患に罹患している哺乳類、好ましくはヒトの治療を可能にする。本発明はまた、前記のような本発明の差次的に発現される核酸配列またはタンパク質をマクロファージで選択的に変調する方法に関する。前記方法は、前記のタンパク質または差次的に発現される核酸配列の変調物質であると判定された物質を投与することを含む。本発明は、炎症性プロセスに対する治療を必要とする生物を治療するために前記物質を使用することを含む。
【０００４】
本発明では第一の段階で、本発明の差次的に発現される核酸配列が特定される。前記核酸配列は、過剰活性化されていないマクロファージと比較して過剰活性化マクロファージでは異なる発現パターンを有する。
簡潔にするために、本記載では特にＣＯＰＤに必要なマクロファージの研究が取り扱われるが、同様な結果は他の慢性炎症性気道疾患、例えば他の慢性気管支炎症状をもつ患者に由来するサンプルに関しても得ることができる。異なる発現パターンの解明によって、以下の実施例で実証されるように、炎症プロセスで中心的に関与するマクロファージの活性化状態に依存して発現される一連の差次的発現核酸が特定される。
簡単に記せば、そのような本発明の差次的に発現される核酸配列は、すなわち、例えばＣＯＰＤの炎症部位および前記疾患に罹患していないがタバコの煙への暴露のような同じ過敏症状下にあるコントロール生物の対応する部位に由来する過剰活性化マクロファージから得られる細胞または細胞抽出物を用いた比較発現プロファイリング実験によって特定される。
【０００５】
第二の段階では、差次的に発現された核酸配列によってコードされるタンパク質（すなわち前記タンパク質は過剰活性化を仲介するかまたは過剰活性化状態を維持する役割を果たす）が特定される。本発明の差次的に発現される核酸配列類を特定し、本発明の核内受容体タンパク質として作用するタンパク質類をコードすることができる（前記タンパク質は、過剰活性化されていないマクロファージでコントロールレベルよりも低いまたは高いレベルで本発明にしたがって過剰活性化されたマクロファージで発現されるという特徴を有する）。本発明のそのようなタンパク質は以下ではＮＨＲ−タンパク質（“核内ホルモン受容体タンパク質”）と称される。
本発明のＮＨＲ−タンパク質の好ましい例はエストロゲン関連受容体α（ＥＲＲα、配列番号１および７）または核内受容体サブファミリー４グループＡメンバー１（ＮＲ４Ａ１、配列番号２および８）である（前記は配列表に示されている）。
本発明のＮＨＲ−タンパク質の生物学的活性（すなわち本発明にしたがって炎症プロセスにおいてマクロファージの介入を仲介する活性）は、例えば反応性ＤＮＡエレメントの認識および／または結合（前記ＤＮＡエレメントはそれと結合しているＤＮＡの転写に影響を与え、前記は例えばＥＲＲα反応性エレメント（ＥＲＲＥ）またはステロイド生成因子反応性エレメント（ＳＦＲＥ）である）、または例えば与えられた転写活性をもたらす他のタンパク質の認識および／または結合に左右される。本発明のＮＨＲ−タンパク質の生物学的活性は転写活性への影響に限定されない。前記の他に、本発明のＮＨＲ−タンパク質の生物学的活性には、例えば転写活性に左右されない機構を介するアポトーシスの調節（regulation）が含まれる。
【０００６】
本発明はまた、上記に記載した好ましいタンパク質、主にＮＨＲ−タンパク質の機能的同等物（functional equivalent）、誘導体（derivative）、変種（variant）、変異体（mutant）および断片（fragment）に関する。本出願で機能的とは、その生物学的活性（例えばＤＮＡおよび／またはタンパク質の認識）に必要なそれぞれ対応するＮＨＲ−タンパク質の機能を有することを意味する。
本発明にしたがえば、コントロールレベルより低いレベルで発現されるＮＨＲ−タンパク質の生物学的活性は好ましくは活性化され、マクロファージの過剰活性化を阻害またはマクロファージの過剰活性化状態を減少させ、一方コントロールレベルより高いレベルで発現されるＮＨＲ−タンパク質の生物学的活性は好ましくは阻害され、マクロファージの過剰活性化を阻害またはマクロファージの過剰活性化状態を減少させる。
ある実施態様では、本発明は、ある物質がＮＨＲ−タンパク質のアクチベーターまたはインヒビターであるか否かを決定する試験方法に関する。ＮＨＲ−タンパク質は慢性炎症性気道疾患に中心的に関与し、炎症を仲介する役割を果たすので、ＮＨＲ−タンパク質の生物学的活性を変調する物質は慢性炎症性気道疾患の治療に用いることができるか、または前記物質の機能を最適化させ前記最適化させた物質が慢性炎症性気道疾患の治療に適するようにする指標物質として用いることができる。
ある物質が過剰活性化マクロファージで脱調節（deregulate）されたＮＨＲ−タンパク質の機能のアクチベーターまたはインヒビターであるか否かを判定する方法は以下の工程を含むことを特徴とすることができる：ＮＨＲ−タンパク質またはＮＨＲ−タンパク質機能をもつその変種、変異体もしくは断片を、ＮＨＲ−タンパク質の所望の機能のアクチベーターまたはインヒビターであるか否かを試験しようとする物質と接触させ、前記所望の機能が阻害または活性化されるか否かを測定する。前記所望の機能は本発明のＮＨＲ−タンパク質の生物学的活性であろう。前記測定は、直接、例えば前記タンパク質と前記物質の直接結合の測定を可能にする周知の方法を用いて直接実施してもよいし、または例えば前記タンパク質と前記物質の結合について結論を引き出すことができる周知のレポーター系を用いて実施してもよい。本発明の方法を実施するために、本発明の試験システムを用いることができる。
【０００７】
本発明はまた、ある物質がＮＨＲ−タンパク質機能のアクチベーターまたはインヒビターであるか否かを判定する試験システムに関する。本発明の方法を実施するために有用な試験システムは、細胞系または細胞を含まない系である。例えば、本発明のある実施態様は、測定可能な情報として例えばレポーター遺伝子（例えばルシフェラーゼなど）の発現を用いて、差次的に発現される核酸配列の発現レベルに作用する物質を試験することができるようにデザインされた試験システムに関する。本発明の別の実施態様は、ある機能（例えばＮＨＲ−タンパク質の認識および／または結合活性）と直接相互作用するか、または天然または人工的であるが適切なＮＨＲ−タンパク質のアクチベーター（例えば適切なリガンド）によってＮＨＲ−タンパク質機能の活性化に干渉する物質を試験することができるようにデザインされた試験システムに関する。
本発明の試験システムは例えば当分野で周知の成分を含む。例えば細胞非含有系は、例えばＮＨＲ−タンパク質またはその機能的同等物、誘導体、変種、変異体または断片、可溶形もしくは結合形としてまたは細胞内区画もしくは細胞小胞中に存在するＮＨＲ−タンパク質またはその機能的同等物、誘導体、変種、変異体または断片をコードする核酸を含むことができる。適切な細胞系には例えば適切な原核細胞または真核細胞が含まれ、前記は、例えばＮＨＲ−タンパク質またはその機能的同等物、誘導体、変種、変異体または断片、前記ＮＨＲ−タンパク質またはその機能的同等物、誘導体、変種、変異体または断片をコードする核酸を含む細胞である。本発明の前記試験システムでの使用に適切な細胞は、遺伝子組換え技術によって、例えば所望のＮＨＲタンパク質またはその機能的同等物、誘導体、変種、変異体もしくは断片の発現に適した組換えベクターによる形質転換またはトランスフェクション後に得ることができる。また前記細胞は、所望のＮＨＲタンパク質またはその機能的同等物、誘導体、変種、変異体もしくは断片を発現している天然の供給源から単離された細胞株または細胞でもよい。本発明の試験システムは、天然又は人工のＮＨＲタンパク質リガンドを、興味の対象となる物質がＮＨＲタンパク質のインヒビター又はアクチベーターであるかどうかの試験にとって望ましい場合又は必要な場合に、含んでいてもよい。
【０００８】
本発明の試験方法は、読み値を測定すること、例えば試験システムにおける表現型の変化、例として、細胞システムが使用される場合、細胞の表現型の変化がモニタリングされることを含む。このような変化は、例えば下記実施例において詳述されるような、天然の又は人工の反応における変化、例えばNHR-タンパク質の活性化又は阻害に対する細胞のレポーター遺伝子発現における変化であることができる。
【０００９】
本発明の試験方法は、一方では物質は本発明のインヒビター又はアクチベーターであるかどうかの決定に適したハイスループット試験に有用であるが、例えばハイスループット試験において同定されたヒット又はリード物質の二次的試験又はバリデーションにも有用である。
【００１０】
本発明は、NHR-タンパク質のインヒビター又はアクチベーターであることを本発明の方法で同定された物質にも関する。本発明の物質は、本発明のNHR-タンパク質の機能を変調すること、好ましくは活性化又は阻害すること変調することが可能であるいずれかの化合物である。NHR-タンパク質の機能を活性化又は阻害する方法の例は、該NHR-タンパク質の発現レベルに影響することによる。別のNHR-タンパク質の機能を活性化又は阻害する方法の例は、物質をNHR-タンパク質の直接結合に適用し、これにより該NHR-タンパク質の機能ドメインを活性化又は阻止することであり、これは適用された物質の性質に応じて、可逆的又は不可逆的に行うことができる。
【００１１】
従って、NHR-タンパク質の生物学的活性を活性化又は阻害するのに有用な物質は、差次的に発現された核酸配列の発現に作用する物質、例えば、対応する遺伝子又は調節配列にハイブリダイズし、これにより遺伝子発現に影響を及ぼす核酸断片を含む。
【００１２】
従って本発明は、例えば、NHR-タンパク質の遺伝子をコードしている核酸配列、又はそのような核酸配列の断片、誘導体、変異体もしくは変種である物質に関し、この核酸配列又はそれらの断片、誘導体、変異体もしくは変種は、遺伝子発現レベル、例えばアンチセンス核酸、リボザイムとして適した核酸分子、又は三重らせん形成について影響を及ぼすことが可能である。
本発明は、例えば、NHR-タンパク質に直接結合するもしくはその活性化を妨害する、又は直接NHR-タンパク質に結合し、これによりその生物学的活性に影響を及ぼすような、抗体又は有機もしくは無機化合物である物質にも関する。
【００１３】
更なる局面において、本発明は、細胞中の、好ましくはマクロファージ中の、より好ましくは炎症部位から、更により好ましくは慢性炎症性気道疾患に罹患した対象の炎症部位から単離されたマクロファージ中の、NHR-タンパク質をコードしている核酸レベルを決定することによる、より好ましくは、代表的mRNAのレベルを決定する、又はNHR-タンパク質それ自身のレベルを決定することによる、NHR-タンパク質の発現レベルを決定する方法に関する。このような方法を、例えば、物質が本発明のアクチベーター又はインヒビターであるかどうかを決定するための前述の方法において、物質が、差次的に発現された核酸配列の発現レベルに影響を及ぼすことが可能であるかどうかを試験するために使用することができる。しかし、本発明において発現レベルを決定する方法は、例えば診断目的のために、マクロファージの活性化状態を試験するため、又は例えば経過観察のために、過剰活性化されたマクロファージにより引き起こされた疾患の治療の成功を調べるためにも使用することができる。該マクロファージは、好ましくは哺乳類の、より好ましくはヒト細胞である。従って本発明のマクロファージは、好ましくは哺乳類の炎症部位から得ることができ、より好ましくはヒトの炎症部位から得ることができる。従って本発明は、マクロファージ中におけるNHR-タンパク質をコードしている核酸、好ましくはmRNA、又はNHR-タンパク質それ自身の発現レベルを決定することを含む、慢性炎症疾患を診断、又はそのような疾患を経過観察、例えばそのような疾患の治療が必要な生物(being)の治療の成功を経過観察する方法にも関する。
【００１４】
本発明は更に、慢性炎症性気道疾患を治療するための本発明の物質の使用にも関する。別の本発明の態様は、アクチベーター又はインヒビターであることが決定された少なくとも1種の本発明の物質を含有する医薬組成物に関する。この組成物は、例えば、従来型の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠製造、摩砕、粉末化、乳化、カプセル封入、取込み又は凍結乾燥の工程により、それ自身公知の方式で製造することができる。
【００１５】
慢性炎症性気道疾患の治療のための薬剤として本発明の活性化又は阻害する物質を使用するために、この物質は、動物モデル、例えば炎症性気道疾患に罹患した動物又は本発明のNHR-タンパク質を発現しているトランスジェニック動物において試験することができる。
本発明の物質の毒性及び治療効能は、標準の薬学的手法により決定することができ、これはIC50、LD50及びED50を決定するために細胞培養及び動物実験を行うことを含む。得られたデータは、動物の、又はより好ましくはヒトの用量範囲を設定するために使用することができ、これは剤形(錠剤、カプセル剤、エアロゾル噴霧剤、アンプル剤など)及び投与経路(例えば、経皮、経口、頬内、鼻腔内、腸内、非経口、吸入、気管内、又は直腸内)に応じても変動するであろう。
【００１６】
本発明の少なくとも1種の物質を含有する医薬組成物は、従来の様式で処方することができる。このような処方を作成する方法は、例えば「レミントン薬科学」のような手引き書において認めることができる。本発明の少なくとも1種の物質の処方に有用な成分の例は、国際公開公報第99/18193にも開示されており、これは本願明細書に参照として組入れられている。
【００１７】
更なる局面において、本発明は、本発明の慢性炎症性気道疾患の治療法に関する。このような方法は、物質が、本発明に従いNHR-タンパク質のアクチベーター又はインヒビターであるかどうかを決定するための本発明の方法によりアクチベーター又はインヒビターであることが決定された少なくとも1種の物質を含有する医薬組成物を適量、このような治療が必要な生物へ、好ましくはヒトへ投与することを含む。
【００１８】
別の態様において、本発明は、本発明に従いNHR-タンパク質のアクチベーター又はインヒビターであることが決定された物質を投与することを含む、マクロファージにおけるNHR-タンパク質濃度を選択的に変調する方法に関する。
下記実施例は、本発明を例証する意味を持つが、限定として構成されたものではない。しかし、これらの実施例は、本発明の最も好ましい態様を説明している。
【００１９】
実施例1：発現プロファイリングの比較
以下は、NHR-タンパク質を同定するために、いかにして発現プロファイリング比較を行うことができるかを説明している。
1.1. 患者の選択
下記3群の対象について試験した：健常非喫煙者、健常喫煙者、及びCOPD患者。
肺機能を評価するために、対象は肺活量測定を行った。年齢及び身長を基にした簡単な計算を用い、結果を特徴付けた。COPD対象は、それらの推定FEV1 ％が＜70％である場合に包含した。健常喫煙者は、年齢及び喫煙歴は、COPD対象と合致したが、正常な肺機能を有した。健常非喫煙者は、正常な肺機能を有し、及び喫煙したことがなかった。後者の群は、喘息を除外するために、メタコリンチャレンジを行った。この技法は、漸増量のメタコリンを対象へ投与し、各用量間で肺活量測定することを必要としている。FEV1が20％低下した場合には、本試験を中止し、PC20を算出した。これは、FEV1 の20％低下を引き起こしたメタコリン用量であり、本発明者らは、喘息が存在しない証拠としては＞32の値が必要であるとした。対象は全員、通常のアレルゲンに対する皮膚穿刺試験を受け、陰性結果であることが要求された。これは、アトピー性の個人を除外した。併発症を除外するために、対象の病歴を追跡し、試験した。
【００２０】
1.2. BAL(気管支肺胞洗浄)手順
BAL前に、対象は、ミダゾラムで鎮静した。局所麻酔用スプレーを用い、咽喉裏側を麻酔した。オリンパス7mm気管支鏡を用いた。洗浄領域は、右肺中葉であった。滅菌生理食塩水250mlを注入し、直ちに吸引した。得られた吸引液はマクロファージを含有していた。
【００２１】
1.3. BALの処理
BALは、滅菌ガーゼを通してろ過し、デブリを除去した。細胞を、HBSSで2回洗浄し、1ml HBSS(Hank平衡塩溶液)中に再浮遊させ、計数した。15mlのFalconブルーキャップポリプロピレンを用い、マクロファージを遠心しペレットとし、Trizol試薬(Gibco BRL Life Technologies社)中に、細胞1000万個当りTrizol試薬1mlの濃度で再浮遊させ、その後-70℃で凍結した。
【００２２】
1.4. 差次的遺伝子発現解析
総RNAを、実施例1.3に従い得たマクロファージ試料から抽出した。Trizol中の細胞浮遊液を、ピペッティングにより均質化し、室温で5分間インキュベーションした。200μlクロロホルム／ml Trizolを添加し、この混合物を慎重に15秒間混合し、更に3分間室温でインキュベーションした。この試料を、10000gで15分間、4℃で遠心した。上層を新たな反応チューブに移し、及び0.5mlイソプロパノール／ml Trizolを添加し、室温で10分間かけて、RNAを沈殿させた。その後沈殿を、10000gで、10分間、4℃で微量遠心機を用い、ペレット化し、このペレットを75％エタノールで2回洗浄し、風乾し、DEPC-H2O中に再浮遊させた。
RNAの純度を向上するために、Qiagen RNeasy総RNA単離キット(Qiagen社)によるRNAクリーンアップを行った。RNAの純度は、アガロースゲル電気泳動により決定し、濃度を260nmでのUV吸収により測定した。
【００２３】
各RNA 5μgを用いてcDNA合成した。第一鎖及び第二鎖の合成は、SuperScript Choiceシステム(Gibco BRL Life Technologies社)により行った。総容量で11μl RNA及び1μl 100μM T7-(dt)24 プライマー(配列：ggccagtgaa ttgtaatacg actcactata gggaggcggt tttttttttt tttttttttt ttt、配列番号:9)を、70℃で10分間加熱し、その後氷上で2分間冷却した。最終濃度の1xの第一鎖緩衝液、濃度10mMのDTT、及び最終濃度0.5mMのdNTP混合液を添加し、総容量18μlとした。この反応混合液を、42℃で2分間インキュベーションし、Superscript II逆転写酵素(200U/μl)2μlを添加した。第二鎖合成のためには、1.15x第二鎖緩衝液、230μM dNTPs、10U E.coli DNAリガーゼ(10U/μl)、E.coli DNAポリメラーゼ(10U/μl)、RNase H (2U/μl)を含有する混合液130μlを、第一鎖合成の反応液に添加し、ピペットにより慎重に混合した。第二鎖合成を、16℃で2時間行い、その後T4 DNAポリメラーゼ(5U/μl)2μlを添加し、16℃で5分間インキュベーションし、この反応を、0.5M EDTAを10μl添加することにより停止した。
【００２４】
cRNA合成前に、二本鎖cDNAを精製した。このcDNAを、等容量のフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)と混合し、cDNAを未結合のヌクレオチドから分離するために、微量遠心機において、フェーズロックゲル(Eppendorf社)のゲルマトリックスにより遠心した。水相を、酢酸アンモニウム及びエタノールで沈殿した。引き続き、cDNAをin vitro転写に用いた。cRNA合成は、ENZO BioArray High Yield RNA Transcript Labeling Kitを、製造業者のプロトコールに従い使用して行った(ENZO Diagnostics社)。簡単に述べると、cDNAを、1x HY反応緩衝液、1xビオチン標識したリボヌクレオチド、1x DTT、1x RNaseインヒビター混合液及び1x T7 RNAポリメラーゼと共に、総容量40μlで、37℃で5時間インキュベーションした。その後この反応混合液を、RNeasyカラム(Qiagen社)を通して精製し、cRNAを酢酸アンモニウム及びエタノールで沈殿し、最後にDEPC-処理水中に再懸濁した。濃度を、260nmのUV分光法により測定した。残留するcRNAを、1x断片化緩衝液(5x断片化緩衝液：200mM Tris酢酸、pH8.1、500mM KOAc, 150mM MgOAc)中で、94℃で35分間インキュベーションした。
【００２５】
DNAチップのハイブリダイゼーションのために、cRNA 15μgを使用し、50pMビオチン-標識した対照B2オリゴヌクレオチド、配列：gtcgtcaaga tgctaccgtt cagga (配列番号:10)、1x cRNAカクテル、0.1mg/mlニシン精子DNA、0.5mg/mlアセチル化されたBSA、1x MES(2-[N-モルホリノ]-エタンスルホン酸)ハイブリダイゼーション緩衝液と、総容量300μlで混合した。このハイブリダイゼーション混合液を、99℃で5分間加熱し、45℃で10分間冷却し、混合液200μlを用い、プローブアレイに充填した。ハイブリダイゼーションを、45℃で60rpmで16時間実行した。
ハイブリダイゼーション後、チップ上のハイブリダイゼーション混合液を300μlのストリンジェントでない洗浄緩衝液(100mM MES、100mM NaCl、0.01％ Tween 20)と交換した。このチップを、Affymetrix Fluidicsステーションに挿入し、EukGE-WS2プロトコールに従い、洗浄及び染色を行った。チップ1個当りの染色液は、1x 染色緩衝液(100mM MES、1M NaCl、0.05％ Tween 20)、2mg/ml BSA、10μg/ml SAPE(ストレプトアビジンフィコエリスリン)(Dianova社)600μlからなり、抗体溶液は、1x 染色緩衝液、2mg/ml BSA、0.1mg/mlヤギIgG、3μg/mlビオチン化抗体からなる。洗浄及び染色手順の後、チップを、HP Gene Array Scanner (Hewlett Packard社)上で走査した。
【００２６】
データ解析は、COPD喫煙者から単離したRNAとハイブリダイズしたチップと、健常喫煙者から単離したRNAとハイブリダイズしたチップの間で、対のある比較により行った。
以下に、差次的に発現された遺伝子、及び本発明の方法により同定されたそれらの機能を説明する。
【００２７】
実施例 2: ERRα(エストロゲン-関連受容体α)
COPDの個体において一貫してアップレギュレーションされたことが同定された遺伝子は、エストロゲン-関連受容体α(ERRα)をコードしている。エストロゲン-関連受容体αは、核ホルモン受容体スーパーファミリーの希少メンバー(orphan member)である。これは、ERRα応答配列(ERRE)の単独のコンセンサスの半分-位置(single consensus half-site)、及びステロイド生合成因子1受容体応答配列(SFRE)に結合する(Vanackerら、1999)。それらのプロモーター領域にこれらの部位を伴う遺伝子は、ERRαによる転写活性化を標的化することが分かっている。これらの遺伝子は、例えば中鎖アシルCoAデヒドロゲナーゼ(MCAG)、オステオポンチン、及び甲状腺ホルモン受容体αである(Vanackerら、1998)。MCAGの活性化のために、ERRαは、in vivoにおけるエネルギー平衡の調節に関連することが推定される(Sladekら、1997)。
ERRα(acc. L38487)は、COPD喫煙者において、健常喫煙者と比べ一貫してアップレギュレーション(42％)されたことがわかった。これは、「変化の倍数(FC)」値で示した(表1)。COPD喫煙者及び健常喫煙者を比較するふたつの個別の群に関するp値は、0.03及び0.15であった。
【００２８】
表1：閉塞性喫煙者及び健常喫煙者の間の比較のための変化の倍数値(FC)。平均で2.3倍アップレギュレーションされ、中央値は1.6倍であった。
2005503787.tif 000002
【００２９】
ERRαのクローニング
ERRαは、ヒト腎臓から抽出した総RNAからクローニングした。RNA 5μgを、cDNAへ、5 ngオリゴ(dt)18プライマー、1x 第一鎖緩衝液、10mM DTT、0.5mM dNTPs及び2U Superscript II (Gibco BRL社)により、42℃で50分間逆転写した。その後、反応を、70℃で15分間で終結させ、cDNA濃度を、UV-分光測定により決定した。ERRαの増幅のために、cDNA 100ng及びERRαの配列-特異性プライマー10pmole(フォワードプライマー：ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggcta tgggattgga gatgagctc；配列番号:3、及びリバースプライマー：ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt cagtccatca tggcctcgag；配列番号:4)をPCRに用いた。反応条件は、Taq DNA-ポリメラーゼにより、94℃で2分間、94℃で30秒間、53℃で30秒間、72℃で90秒間を35サイクル、その後72℃で7分間であった。反応混合物は、2％アガロースゲル上で分離し、約1000bpのバンドを切出し、QIAEX II抽出キット(Qiagen社)で精製した。精製したバンドの濃度を決定し、約120ngを、Gatewayシステム(Life Technologies社)のドナーベクターであるpDONR201の300ng、1x BPクロナーゼ反応緩衝液、BPクロナーゼ酵素混合液と共に、総容量20μlで、25℃で60分間、インキュベーションした。その後反応液を、プロテアーゼK 2μlと共に、37℃で10分間インキュベーションした。次にこの反応混合物を、コンピテントDB3.1細胞へ電気穿孔し、カナマイシン-含有プレート上に播種した。クローンを配列決定により証明した。データベースエントリー(acc. X51416)と同じ配列を持つ、pDONR-ERRαと称されるクローンを、更なる実験に使用した。
【００３０】
ERRαのトランスフェクションベクターの作成
1.1において説明したERRαを含有するベクターを用い、ERRαのcDNAを、ERRαがCMVプロモーターの制御下で発現される、Gatewayクローニングシステム(Life Technologies社)の「attR1」及び「attR2」組換え部位を含む発現ベクターpcDNA3.1(+)/attRへ転移した。「エントリーベクター」pDONR-ERRαの150ngを、「デスティネーションベクター」pcDNA3.1(+)/attRの150ng、LRクロナーゼ酵素混合物4μl、LRクロナーゼ反応緩衝液4μlと混合し、TE (Tris/EDTA)を加え20μlとし、25℃で60分間インキュベーションした。その後、プロテアーゼK溶液2μlを添加し、37℃で10分間インキュベーションした。氷上で細胞をDNAと30分間インキュベーションした後、この反応混合物1μlを、42℃で30秒間の熱ショックにより、50μl DH5αへ形質転換した。細胞の熱ショック後、S.O.C. 450μlを添加し、かつ細胞を37℃で60分間インキュベーションした。細胞(100μl)を、アンピシリン100μg/mlを含有するLBプレート上に播種し、一晩インキュベーションした。
挿入断片としてERRαを伴うpcDNA3.1(+)/attRを含むコロニーを、pcDNA/ERRαと命名し、トランスフェクション試験に用いた。
【００３１】
ERRαのトランスフェクション
単球細胞株を、35mmのペトリ皿に播種し、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、2mMグルタミン、及び1x非必須アミノ酸を補充した10％ FCSを含有するRPMI 1640培地中で、一晩培養した。集密度50〜80％に増殖した細胞を、トランスフェクションに使用した。FuGene6 (Roche Biochemicals社)の6μlを、血清非含有の培養培地100μlへ添加し、室温で5分間平衡化した。その後精製したpcDNA/ERRαを2μg、予め希釈したFuGene6溶液へ添加し、穏やかに混合し、更に室温で15分間インキュベーションした。培地を、細胞から吸引し、及び新鮮な培地4mlを、これらの細胞に添加した。FuGene6/DNA溶液を細胞へ滴下し、培地に均等に渦巻きを起こすことにより分布させた。48時間後、培地を吸引し、10％FCS、2mMグルタミン、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、及び200μg/ml G418を含有するRPMI 1640と交換した。その後5日間は、培地を毎日交換し、細胞の単独のコロニーが認められるまで、死細胞及びデブリを洗浄除去した。単独のコロニーを、クローニングシリンダーで分離し、及び100μlの1x トリプシン/EDTAを添加することによりそれらを表面から放出することにより単離した。細胞は、クローニングシリンダーから、培地4mlへと移し、6ウェル-プレートに播種した。単独のクローンを増幅し、いくつかのクローンにおけるERRαの発現を、ウェスタンブロットにより試験した。ERRαの最高の発現を伴う細胞クローンを、更なる試験に用いた。
【００３２】
組換えERRαの発現
1.1.に説明したERRαを含むベクターを用い、ERRαのcDNAを、Gatewayクローニングシステム(Life Technologies社)の「attR1」及び「attR2」組換え部位を含む発現ベクターgpET28abc/attRへと転移した。これらのベクターは、T7プロモーターの制御下での細菌における組換えhis-タグ付きERRαの発現をもたらした。「エントリーベクター」pDONR-ERRαの150ngを、「デスティネーションベクター」gpET28abc/attRの150ng、LRクロナーゼ酵素混合物4μl、LRクロナーゼ反応緩衝液4μlと混合し、TE (Tris/EDTA)で20μlとし、25℃で60分間インキュベーションした。その後、プロテアーゼK溶液2μlを添加し、37℃で10分間インキュベーションした。氷上で細胞をDNAと30分間インキュベーションした後、この反応混合物1μlを、42℃で30秒間の熱ショックにより、50μl DH5αへ形質転換した。細胞の熱ショック後、S.O.C. 450μlを添加し、かつ細胞を37℃で60分間インキュベーションした。細胞(100μl)を、アンピシリン100μg/mlを含有するLBプレート上に播種し、一晩インキュベーションした。
正確なリーディングフレーム内のhis-タグに融合されたERRαを伴うgpET28abc/attRを含むコロニーを、gpET/ERRαと命名し、細菌におけるERRαの発現に用いた。
【００３３】
組換えERRαの精製
100μg/mlアンピシリンを含有するLBブロス1Lに、pDONR-ERRαを保持するE. coli M15(pREP4)の一晩培養物0.5mlを接種した。この培養物を、OD600が0.6となるまで、37℃で激しく振盪しながらインキュベーションした。1mM IPTGの添加により発現を誘導し、この培養物を更に4時間増殖した。細胞は、4000xgで20分間の、4℃での遠心分離により収集した。ペレットは-20℃で凍結した。
細胞を、氷上で解凍し、溶解緩衝液(50mM NaH2PO4、pH8.0、300mM NaCl、10mMイミダゾール)中で、2ml/g細胞ペレットとなるよう、再浮遊した。その後リゾチームを1mg/mlとなるよう添加し、及び氷上で30分間インキュベーションした。その後細胞を音波処理した(300Wで10秒間を6回のバースト)。10μg/ml RNase A及び5μg/ml DNase Iを添加し、氷上で10分間インキュベーションした。その後、10000xgで20分間、4℃でデブリを回転することにより、溶解液を透明とした。その後、プロテアーゼインヒビター(40μg/mlバシトラシン、4μg/mlロイペプチン、4μg/mlキモスタチン、10μg/mlペファブロック、100μM PMSF)を添加した。この溶解液に、Ni-NTA樹脂(Qiagen社)3mlを添加し、カラムに充填した。4℃で60分間、穏やかに振盪する間に、樹脂へ結合させた。その後、カラムの出口を開放し、樹脂を、洗浄緩衝液(50mM NaH2PO4、pH8.0、300mM NaCl、20mMイミダゾール)12mlで2回洗浄し、溶離緩衝液(50mM NaH2PO4、pH8.0、300mM NaCl、250mMイミダゾール)3mlにより4回溶離した。組換えタンパク質を含有する溶離した画分を、SDS-PAGEにより決定し、及び精製したタンパク質のタンパク質濃度を、Bradford法により決定した。
【００３４】
蛍光偏光アッセイ(特にERRαについて)
核ホルモン受容体とそのDNA結合部位の相互作用を直接阻害する物質を見つけるために、蛍光偏光アッセイを用いた。ERRαの結合部位(AGGTCA)を含む2種類の相補的オリゴを合成した。ひとつのオリゴ：acgggtagag gtcactgtga cctctacccg (配列番号:5)は、TAMRA-標識したチミジンを伴い合成した。相補的オリゴ：cgggtagagg tcacagtgac ctctacccgt (配列番号:6)は、標識せずに合成した。
両方のオリゴをアニーリングするために、TAMRA-標識したオリゴ10μM及び相補的オリゴ15μMを、10mM Tris/HCl、pH7.5、80mM NaCl、1mM EDTA中に混合した。オリゴを、95℃で5分間インキュベーションし(沸騰水が入った2Lのビーカー中の反応チューブ)、及び室温で一晩冷却した。DNA-結合アッセイは、96-ウェルFluotrac 200プレート(Greiner社)において行った。1個のウェル当り20nMのアニーリングしたオリゴ150μlを、10mM Tris/HCl、pH7.5、100mM NaCl、0.1mM EDTA、1％グリセロールを含有する反応緩衝液中、40nM核ホルモン受容体と共にインキュベーションした。27℃で2時間結合させた。本発明の物質を、濃度範囲0.1〜100ng/mlで添加した。蛍光を、Polarion蛍光光度計(Tecan社)によりモニタリングした。結合緩衝液及びオリゴを含有するウェルを、対照として用いた。蛍光光度計の検量のために、1nMフルオレセインを用いた。
【００３５】
ERRαにより引き起こされた表現型／細胞の作用
以下のアッセイを、ERRαで一過性又は安定してトランスフェクションした細胞株、例えばTHP-1(Tsuchiyaら、1980)、MonoMac 6 (Ziegler-Heitbrockら、1988)により行い、読み値を、偽-トランスフェクションした細胞と比較した。加えて、ERRαにより引き起こされた作用を阻害するために、本発明の物質を添加した。
【００３６】
サイトカイン産生及び放出
単球／マクロファージ細胞株を、10nM PMA、20ng/ml M-CSF、20ng/ml GM-CSF、20μg/ml LPS (Salmonella minnessota Re595由来)などの、様々な刺激で、細胞密度2.5〜5 x 105 細胞/mlで刺激した。細胞を、0、1、3、6、12、24、48及び72時間後に収集し、上清は更なる試験のために凍結し、細胞は、PBSで洗浄し、143mMβ-メルカプトエタノールが入ったRLT緩衝液(Qiagen RNeasy Total RNA Isolation Kit)400μl中に再浮遊し、このDNAを、20gの針で少なくとも5回剪断し、-70℃で貯蔵した。
タバコの煙による細胞の刺激は、煙を炊き込めた培地(smoke-enriched media)により行った。補充物を含まないRPMI培地100mlを、2本のタバコから出るタバコの煙で還流した。これらのタバコの煙を、50mlの注射筒で吸い込み(1本のタバコにつき50-ml容量の約20容量)、その後培地へ還流させた。その後、培地のpHを7.4に調節し、培地を0.2μmフィルターを通しろ過滅菌した。細胞を、煙を炊き込めた培地中に再懸濁し、1x106 細胞/mlの濃度で、37℃で10分間インキュベーションした。その後細胞を、RPMI 1640で2回洗浄し、先に示した時点で、フラスコ又は24-ウェルプレート(MonoMac 6)へ播種した。
総RNAを、Qiagen RNeasy Total RNA Isolation Kit (Qiagen社)により、製造業者のプロトコールに従い単離した。精製したRNAを、TaqMan分析に使用した。サイトカインTNFα、IL-1β、IL-8、及びIL-6の発現レベルを測定した。
【００３７】
分泌されたサイトカインの検出
培養及び刺激した細胞の上清中のタンパク質を、TCAを最終濃度10％となるよう添加し、沈殿した。沈殿物を、80％エタノールで2回洗浄し、及びペレットを、50mM Tris/HCl、pH7.4、10mM MgCl2、1mM EDTA中に再懸濁した。タンパク質濃度を、Bradford法により測定し、及び各試料50μgを、12％SDSポリアクリルアミドゲル上に載せた。ゲルを、PVDF-膜上にブロッティングし、TBSTを溶媒とする5％BSAで1時間ブロックし、及びヒトのTNFα、IL-1β、IL-8及びIL-6に対する市販の抗体と共に1時間インキュベーションした。TBSTで洗浄後、ブロットを、ホースラディッシュペルオキシダーゼを複合した抗-ヒトIgGと共にインキュベーションし、再度洗浄し、かつECLケミルミネセンスキット(Amersham社)により発色させた。バンドの強度は、BioMax X-線フィルム(Kodak社)により可視化し、デンシトメーターにより定量した。
【００３８】
分泌されたマトリックスメタロプロテアーゼ及び他のプロテアーゼの検出
この手法は、サイトカインのために使用されたものを同定する。ウェスタンブロットに使用された抗体は、ヒトのMMP-1、MMP-7、MMP-9、及びMMP-12に対するものであった。
【００３９】
分泌されたマトリックスメタロプロテアーゼの活性
プロテアーゼ活性は、蛍光基質により決定した。刺激した又はしていない細胞から単離した上清(前述)を、1μMの基質(Dabcyl-Gaba-Pro-Gln-Gly-Leu-Glu (EDANS)-Ala-Lys-NH2 (Novabiochem社))と共に、総容量50μl中で室温で5分間インキュベーションした。陽性対照は、1反応につき精製したMMP-12 125ngで行った。プロテアーゼ活性は、励起波長320nm及び放出波長405nmでの蛍光測定により決定した。
【００４０】
タンパク質分解活性及び細胞移動を決定する別のアッセイにおいて、化学走化性(Boyden社)チャンバーを使用した。このチャンバーの上側部分のウェルには、細胞(105 細胞／ウェル)を、Matrigelの8μm層で被覆したフィルター(Becton Dickinson社)上に配置した。下側コンパートメント内には、ロイコトリエンB4 (10ng/ml)、MCP-1(10ng/ml)のような、化学誘引物質を培地へ添加した。5日後、フィルターを取り出し、Matrigelを横断した下側表面上の細胞を、メタノールで固定し、Diff-Quik染色キット(Dade Behring社)で染色し、及び光学顕微鏡により3個の高出力視野(400x)で計数した。
【００４１】
化学走化性アッセイ
化学走化性を決定するために、48ウェル化学走化性(Boyden)チャンバー(Neuroprobe社)を使用した。細胞を、FCS非含有のRPMI培地において24時間飢餓状態とした。化学誘引物質(50ng/ml IL-8、10ng/ml MCP-1、10nMリポキシンA4、ロイコトリエンB4 (10ng/ml)、MCP-1(10ng/ml))及び本発明の物質を、FCS非含有のRPMI培地に希釈し、かつ30μlを、下側コンパートメントのウェル内に配置した。ポリカーボネートフィルター(孔径8μm)により、上側コンパートメントは、下側コンパートメントから独立していた。細胞懸濁液(5x104) 50μlを、上側コンパートメントのウェル内に配置した。このチャンバーを、加湿した5％ CO2である大気中で、37℃で5時間インキュベーションした。その後フィルターを取り出し、上側の細胞を掻き取り、下側の細胞をメタノール中で5分間固定し、Diff-Quik染色セット(Dade Behring社)で染色した。移動した細胞を、光学顕微鏡により3個の高出力視野(400x)で計数した。
【００４２】
接着アッセイ
細胞を収集し、PBSで洗浄し、PBS及び1μM BCECF((2'-7'-ビス-(マルボキシエチル)-5(6')-カルボキシフルオレセインアセトキシメチル)エステル(Calbiochem社)中に再懸濁し(4x106/ml)、及び37℃で20分間インキュベーションした。細胞を、PBSで洗浄し、0.1％ BSAを含有するPBS中に再懸濁した(3.3x106/ml)。細胞3x105 個(90μl)を、ラミニン(Becton Dickinson社)で被覆した96-ウェル平底プレートの各ウェルに添加し、10分間沈降させた。本発明の物質を添加し、37℃で20分間インキュベーションした。細胞を、0.1％BSAを含有するPBSで洗浄し、接着細胞を、0.025M NaOH及び0.1％SDSの100μlで可溶化した。蛍光測定により、定量を行った。
【００４３】
ファゴサイトーシス
細胞懸濁液(2.5x104 細胞/ml)を、U937又はTHP-1を5ml含んだ6-ウェルプレート又はMonoMac6を2ml含んだ24-ウェルプレート中に播種し、本発明の物質の存在下で、加湿した5％ CO2である大気中で、37℃で1時間インキュベーションした。加熱により失活したSaccharomyces boulardiiの分散懸濁液40μl(20酵母/細胞)を、各ウェルに添加した。細胞を、更に3時間インキュベーションし、PBSで2回洗浄し、及び細胞を遠心した。細胞遠心(cytospin)調製物を、May-Grunwald-Giemsaで染色し、ファゴサイトーシスされた粒子を、光学顕微鏡により計数した。
【００４４】
エネルギーバランスの決定(特にERRαについて)
代謝過程に起因した細胞による培地の酸性化は、Cytosensorマイクロフィジオメーターシステム(Molecular Devices社、Grafelfing、独国)によりモニタリングした。ERRαの構成的活性キメラであるVP16/ERRα(Sladekら、1997)を安定して発現している単球細胞株1x106 細胞を、ERRαの結合部位としてNRRE1(核受容体応答配列1)を含む中鎖アシルCoAデヒドロゲナーゼ-ルシフェラーゼレポーター遺伝子構築体であるNRRE-MCAD-LUCにより一過性にトランスフェクションし(Sladekら、1997)、24時間増殖した。その後細胞を、RPMI 1640、2.5％FCS中のCytosensorカプセル(capsule)中に播種し、加湿した5％ CO2である大気中で、37℃で一晩増殖した。使用前に、細胞を、血清非含有RPMI 1640、10mM HEPES (pH7.4)で洗浄した。本発明の物質(0.1〜100ng/ml)を、ゼロ時に添加した。MCAD-媒介し及びERRα-駆動した培地の酸性化の阻害を、120分間にわたりモニタリングし、血清非含有RPMI 1640、10mM HEPES (pH7.4)で処理した細胞を100％として設定した。
【００４５】
実施例3：NR4A1 (核受容体サブファミリー4、グループA、メンバー1)
COPDの個人において一貫してダウンレギュレーションされることが同定されている遺伝子は、転写因子の核ホルモン受容体スーパーファミリーの希少メンバーであるNR4A1をコードしている。これは、核の増殖因子に反応して細胞増殖を媒介する。加えて、NR4A1は、転写活性から独立した機構により、アポトーシスも調節する。アポトーシス性刺激に対する反応において、NR4A1は、核から細胞質へと一転移され、そこでこれはミトコンドリアを標的とし、シトクロムc放出及びアポトーシスを誘導する(Liら、2000)。
NR4A1 (acc. D49728)は、COPD喫煙者において、健常喫煙者と比べ、ダウンレギュレーションされる(44％)ことが一貫して認められた。これは、「変化の倍数」値により示した(表2)。COPD喫煙者群と健常喫煙者群の比較のためのp値は、0.15及び0.009であった。
【００４６】
表2 ：閉塞性喫煙者及び健常喫煙者の間の比較のための変化の倍数値(FC)。平均で、NR4A1は、1.6倍ダウンレギュレーションされ、中央値は-1.4倍であった。
2005503787.tif 000003
【００４７】
このタンパク質は、クローニングし、並びにアッセイを、先に説明したクローニング及びアッセイと同様の方法で行った。
【００４８】
アポトーシスアッセイ(特にNR4A1について)
アポトーシス性細胞の数を決定するアッセイは、Roche Diagnostics社のターミナルトランスフェラーゼキット(カタログ番号220582)により行った。核ホルモン受容体を安定して発現している細胞株を、5x104 /mlで8-ウェル組織培養プレートに播種し、及びPMA(100ng/ml)で刺激し、アポトーシスを誘導した。同時に本発明の物質を、1〜1000ng/mlの範囲でこれらの細胞へ添加した。刺激の3〜6時間後、細胞を、PBS、1mM MgCl2で洗浄し、PBS中の 3％パラホルムアルデヒドで10分間固定し、PBS/50mM NH4Clで5分間処理を2回行った。その後細胞を、PBS/0.5％ Triton X-100で室温で5分間処理した。その後細胞を、PBSで2回洗浄し、1x トランスフェラーゼ緩衝液で10秒間平衡化した。トランスフェラーゼ緩衝液を除去した後、20μlの反応混合物(5x 反応緩衝液40μl、25mM CaCl2 20μl、dNTPローダミン(テトラメチルローダミン-5-2'-デスオキシ-ウリジン-6'-三リン酸)1μl、ターミナルトランスフェラーゼ2μl(2U)、137μlのH2Oで200μlとした反応混合物)を添加し、パラフィルムで被覆し、及び加湿した大気中、光を当てずに、室温で1時間インキュベーションした。50mM EDTA、50mM EGTAの添加により、この反応を停止し、PBSで2分間洗浄し、及び室温で5分間インキュベーションした。これらの試料を風乾し、グリセロールで被覆した。アポトーシス性細胞を示している標識細胞の割合(％)を、蛍光顕微鏡により決定した。
【００４９】
文献
ERRa
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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