(57)【要約】本発明は、Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａｅ  ｂａｒｂａｔａｅから単離された生物学的に活性な画分を単離するためのプロセス、このような画分を含む組成物、および病理学的な血管新生と関連する状態を処置する際のそれらの使用に関する。本発明は、キノコであるＳｃｕｔｅｌｌａｒｉａｅ  ｂａｒｂａｔａｅから、ＥＳＢａ、ＥＳＢｂおよびＡＳＢ０３と本明細書中で称される、薬学的に活性な画分を単離するためのプロセスを提供する。本発明は、増殖阻害量の本発明の画分を細胞に送達することによる、内皮細胞の増殖を阻害するための方法を提供する。本発明はまた、抗血管新生量の本発明の画分を組織に送達することによる、組織における血管新生を阻害する方法を提供する。癌を含む種々の疾患を処置する方法もまた、本明細書中で提供される。
2005501816.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａｅ  ｂａｒｂａｔａｅの組成物から、ＡＳＢ０３と称される生物学的に活性な画分を調製するためのプロセスであって、該プロセスは、有機溶媒中の可溶性の画分を抽出する工程であって、該画分は、約２００ｎｍ〜約５００ｎｍの吸光度を有する、工程を包含する、プロセス。
【請求項２】
請求項１に記載のプロセスであって、該プロセスは、以下の工程：
（ａ）有効量のＳｃｕｔｅｌｌａｒｉａｅ  ｂａｒｂａｔａｅを有効量の熱水中に浸して、液体抽出物を得る工程；
（ｂ）該抽出物を濾過して、ＥＳＢａと称される濾液を得る工程；
（ｃ）該濾液を有効量の有機溶媒で抽出して、ＥＳＢｂを得る工程；
（ｄ）該抽出物を濃縮する工程；および
（ｅ）約２００ｎｍと約４５０ｎｍとの間の吸光度を有する画分を単離して、ＡＳＢ０３を単離する工程、
を包含する、プロセス。
【請求項３】
請求項１に記載のプロセスであって、該プロセスは、以下の工程：
（ａ）Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａｅ  ｂａｒｂａｔａｅの液体抽出物から少なくとも２回エタノールで抽出することにより、上清を得る工程；
（ｂ）少なくとも３回メタノールで抽出することにより濃縮上清を得る工程；
（ｃ）該メタノールを窒素ガスによりエバポレートする工程；
（ｄ）約１２〜１８ｍｌの水中に該抽出物を再懸濁して、乾燥する工程；
（ｅ）薬学的に受容可能なキャリア中に再懸濁して、溶液を形成する工程；
（ｆ）Ｃ−１８ミニカラムに該溶液を流す工程；
（ｇ）少なくとも約３５ｍｌの水で該カラムを洗浄する工程；
（ｈ）少なくとも１５ｍｌの２５％メタノールでカラムを洗浄する工程；
（ｉ）該メタノールを窒素ガスによりエバポレートする工程；
（ｊ）液体キャリア中に該抽出物を再懸濁する工程；ならびに
（ｋ）Ｃ−１８疎水性ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより活性画分を得て、約２００ｎｍ〜約５００ｎｍの吸光度を有する、ＡＳＢ０３と称される生物学的に活性な抽出物を得る工程、
を包含する、プロセス。
【請求項４】
請求項１に記載のプロセスによって得られる、生物学的に活性な抽出物。
【請求項５】
請求項４に記載の抽出物および薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。
【請求項６】
請求項４に記載の抽出物および抗脈管形成薬剤または免疫刺激薬剤を含む、組成物。
【請求項７】
内皮細胞の増殖を阻害するための方法であって、該方法は、増殖阻害量の請求項４に記載の抽出物を該細胞に送達する工程を包含する、方法。
【請求項８】
組織における血管新生を阻害する方法であって、該方法は、抗血管新生量の請求項４に記載の抽出物を該組織に送達する工程を包含する、方法。
【請求項９】
被験体における病理学的新生血管形成と関連する障害を処置する方法であって、該方法は、治療有効量の請求項４に記載の抽出物を被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、前記障害が、癌、関節炎状態、新生血管ベースの皮膚科学的状態、糖尿病性網膜炎、再狭窄、カポージ肉腫、加齢性黄斑変性、毛細管拡張症、緑内障、ケロイド、角膜移植拒絶、創傷肉芽化、血管線維腫、オースラー−ウェーバー症候群、心筋新脈管形成および強皮症からなる群より選択される、方法。
【請求項１１】
前記障害が、乾癬性関節炎、慢性関節リウマチおよび変形性関節症からなる群より選択される関節炎状態である、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１２】
前記送達する工程が、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与および経皮投与からなる群より選択される、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１３】
前記被験体が動物である、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記動物が、愛玩動物、家畜またはヒト患者からなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
新生血管形成または内皮細胞増殖を阻害するための治療剤についてスクリーニングするための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）該薬剤を、適切な細胞サンプルまたは組織サンプルと接触させる工程；
（ｂ）適切な細胞または組織の別個のサンプルを、治療有効量の請求項４に記載の抽出物と接触させる工程；および
（ｃ）工程（ａ）のサンプルの増殖を、工程（ｂ）のサンプルの増殖と比較する工程であって、ここで、工程（ｂ）のサンプルと同じかまたは類似する程度まで該増殖を阻害する工程（ａ）の任意の薬剤は、新生血管形成または内皮細胞の増殖を阻害するための治療剤である、工程、
を包含する方法。
【請求項１６】
前記接触させる工程が、インビトロまたはインビボである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項７、８または９のいずれか１項に記載の方法であって、該方法は、有効量の抗脈管形成薬剤または抗脈管形成治療を投与または送達する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１８】
請求項７、８または９のいずれか１項に記載の方法であって、抗腫瘍治療または抗腫瘍薬剤を送達または投与する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１９】
宿主における病理学的新生血管形成と関連する障害を処置するためのキットであって、該キットは、治療有効量の請求項４に記載の抽出物および使用のための指示書を備える、キット。
【請求項２０】
請求項１９に記載のキットであって、前記障害が、癌、関節炎状態、新生血管ベースの皮膚科学的状態、糖尿病性網膜炎、カポージ肉腫、加齢性黄斑変性、再狭窄、毛細管拡張症、緑内障、ケロイド、角膜移植拒絶、創傷肉芽化、血管線維腫、オースラー−ウェーバー症候群、心筋脈管形成および強皮症からなる群より選択される、キット。
【請求項２１】
前記障害が、乾癬性関節炎、慢性関節リウマチおよび変形性関節症からなる群より選択される関節炎状態である、請求項２０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本出願は、米国仮出願６０／２５４，９８６（２０００年１２月１２日出願）（その内容は、本明細書によって本開示の中に参考として援用される）の米国特許法第１１９条（ｅ）項の下での利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、薬学分野の発明である。詳細には、本発明は、疾患を予防および処置するための抗脈管形成医薬の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
新脈管形成は、新規脈管構造が、既に存在する毛細血管からの成長によって生じるプロセスである。このプロセスにおいて、内皮細胞は、基底膜の支持がタンパク質分解酵素によって分解されるときに、この基底膜からはがされる。次いでこれらの細胞は、親血管から出て移動し、分裂し、そして新しく分化した脈管構造を形成する（Ｒｉｓａｕ，（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８６：６７１−６７４；Ｗｉｌｔｉｎｇら（１９９５）Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．４１（４）：２１９−２３２）。種々の異なる生物学的因子が、血管形成の制御において機能することが見出されている（Ｂｕｓｓｏｌｉｎｏら（１９９７）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  ２２（７）：２５１−２５６；ＦｏｌｋｍａｎおよびＤ’Ａｍｏｒｅ（１９９６）Ｃｅｌｌ  ８７：１１５３−１１５５）。これらとしては、種々の機能を有するタンパク質、例えば、増殖因子、細胞表面レセプター、プロテアーゼ、プロテアーゼインヒビター、および細胞外マトリックスタンパク質が挙げられる（ＡｃｈｅｎおよびＳｔａｃｋｅｒ（１９９８）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．７９：２５５−２６５；ＤｅｖａｌａｒａｊａおよびＲｉｃｈｍｏｎｄ（１９９９）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２０（４）：１５１−１５６；Ｈａｎａｈａｎ（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：４８−５０；Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅら（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：５５−６０；Ｓｕｒｉら（１９９６）Ｃｅｌｌ  ８７：１１７１−１１８０；Ｓａｔｏら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ  ３７６：７０−７４；ＭｉｇｎａｔｔｉおよびＲｉｆｋｉｎ（１９９６）Ｅｎｚｙｍｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ４９：１１７−１３７；Ｐｉｎｔｕｃｃｉら（１９９６）Ｓｅｍｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈｅｍｏｓｔ  ２２（６）５１７−５２４；ＶｅｒｎｏｎおよびＳａｇｅ（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４７（４）：８７３−８８３；Ｂｒｏｏｋｓら（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：５６９−５７１；Ｋｏｃｈら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ  ３７６：５１７−５１９）。脈管形成プロセスの複雑性およびその発達を制御する因子の多様性によって、インビボにおいて血管形成を制御するための治療介入に対する、有用な多くの点が提供される。
【０００４】
新脈管形成は、通常、胚発生の間、増殖の間、および特別な場合（例えば、創傷治癒および女性の生殖周期）に、慎重に制御された様式で生じる（ＷｉｌｔｉｎｇおよびＣｈｒｉｓｔ（１９９６）Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ  ８３：１５３−１６４；ＧｏｏｄｇｅｒおよびＲｏｇｅｒｓ（１９９５）Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２：３２９−３４３；Ａｕｇｕｓｔｉｎら（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４７（２）：３３９−３５１）。新脈管形成プロセスにおけるいくつかの重要な工程は、以下である：１）増殖因子（すなわち、血管内皮増殖因子、ＶＥＧＦ）シグナル伝達；２）マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）およびＶＥＧＦレセプター相互作用；３）増殖因子シグナル伝達の部位への内皮細胞移動；ならびに４）内皮細胞細管形成。病的な新脈管形成は、腫瘍増殖および転移癌、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、および他の炎症性疾患（例えば、乾癬）を含む、多数のヒト疾患において中心的な役割を果たす（Ｆｏｌｋｍａｎ（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．１（１）：２７−３１；Ｐｏｌｖｅｒｉｎｉ（１９９５）Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  ３８（２）：１０３−１１２；Ｈｅａｌｙら（１９９８）Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｕｐｄａｔｅ  ４（５）：７３６−３９６）。これらの場合、疾患の進行は、持続性の無秩序な新脈管形成によって駆動される。例えば、慢性関節リウマチにおいて、新規毛細血管は、関節を浸潤し、そして軟骨を破壊する。糖尿病性網膜症において、網膜中の毛細血管は、硝子液を浸潤し、出血させ、そして失明を引き起こす。重要なことに、腫瘍増殖および転移（ｍｅｔａｓｔｉｓｉｓ）は、新脈管形成依存性である。最も原発性の固形腫瘍は、長い無血管状態を経る（この間に、増殖は、約１〜２ｍｍの直径に制限される）。この大きさまで、腫瘍細胞は、受動拡散によって必要な酸素および栄養分の供給を得ることができる。これらの微視的な腫瘍塊は、最終的に新脈管形成へと切り替わり、腫瘍塊を血管新生する毛細血管の出芽（ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ）を開始するために周囲の血管を補充し、離れた位置への腫瘍の拡大および悪性細胞の転移の持続可能性を提供する。病的な新脈管形成の間に生じる生物学的事象の理解は大いに前進したが、脈管形成をインビボで制御するために有用である有効な薬学的化合物は、現在存在しない。従って、新脈管形成を制御し得る有効な治療は、多数のヒト疾患を軽減する可能性を有する。
【０００５】
従来より、薬学的化合物は、所望の薬学的特性について合成化学化合物をスクリーニングし、次いでそれらをインビボで毒性および効果について試験することによって、開発されてきた。この方法で選択された化合物は、しばしば、インビボで毒性の副作用を有し、そしてこのアプローチは、疾患治療のための有効な新脈管形成インヒビターの開発において成功していない。より最近では、分子生物学の技術が、新脈管形成インヒビターを開発するために適用されている。実験モデルにおいて脈管形成を制御する新脈管形成のタンパク質インヒビターが発見されている：例えば、アンジオスタチン（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら（１９９４）Ｃｅｌｌ  ７９（２）：３１５−３２８）およびエンドスタチン（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら（１９９７）Ｃｅｌｌ  ８８（２）：２７７−２８５）。それにもかかわらず、このようなタンパク質治療を実施するには費用がかかり、そしてこのようなタンパク質治療は、処方することおよび被験体に送達することが難しいことが見出されている。現在、タンパク質新脈管形成インヒビターはなお、疾患患者のための治療医薬に開発される必要がある。従って、患者に安全に投与され得、そして脈管内皮細胞の病的増殖を阻害するのに有効であり得る治療化合物に対する必要性が存在する。本発明は、この目的のために有用である組成物および方法を提供し、そして関連する利点も同様に提供する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の開示）
本発明は、Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａｅ  ｂａｒｂａｔａｅから薬学的に活性な画分（「抽出物」、「化合物」、または「薬物」とも称される）を抽出するためのプロセスを提供する。１つの局面において、このプロセスは、Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａｅ  ｂａｒｂａｔａｅの高温（少なくとも約６０℃、より好ましくは、約１００℃）煎じ汁（ｔｅａ）から、画分（これは、約２００ｎｍと約４００ｎｍとの間の吸光度を有する、有機溶媒中で可溶性である）を抽出する工程である。この画分を得るための１つの手段は、有効量の熱水に有効量のＳｃｕｔｅｌｌａｒｉａｅ  ｂａｒｂａｔａｅを浸漬させて液体抽出物を得ること、次いでその抽出物を濾過して濾液を得ることによる。これは、有効量の有機溶媒で抽出される。この溶媒は、窒素下で除去され、ペレットは、水中に再懸濁される。この懸濁液は濃縮され、薬学的に活性な画分は、クロマトグラフィーによって分離される。これらの方法により獲得可能な薬学的に活性な画分（すなわち、ＥＳＢａ、ＥＳＢｂおよびＡＳＢ０３）もまた、本明細書中で提供される。
【０００７】
本発明は、細胞に増殖阻害量の本発明の画分を送達することによって、内皮細胞の増殖を阻害するための方法を提供する。これらは、組織に血管新生量の画分を送達することによって、その組織中の血管新生を阻害するために有用である。癌を含む種々の疾患を処置する方法もまた、本明細書中に提供される。
【０００８】
（発明を実施するための様式）
本開示を通して、種々の刊行物、特許および公開された特許明細書が、同定した引用によって参照される。これらの刊行物、特許および公開された特許明細書の開示は、本発明が属する技術水準をより完全に記載するために、本明細書によって参考として本開示に援用される。
【０００９】
本発明の実施は、他に示されない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、有機化学、生化学および免疫学の従来の技術（これらは、当該分野の技術範囲内である）を利用する。このような技術は、文献に完全に説明される。
【００１０】
（定義）
本明細書中に使用される場合、特定の用語は、以下に規定される意味を有し得る。
【００１１】
本明細書および特許請求の範囲に使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、その文脈が他に明確に記載しない限り、複数形の参照を含む。例えば、用語「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」は、複数の細胞（これらの混合を含む）を含む。
【００１２】
本明細書中に使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、組成物および方法が言及された要素を含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）が、他のものを除外しないことを意味することが、意図される。「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、組成物および方法を規定するために使用される場合、その組み合わせに対していずれの本質的に重要な他の要素を除外することを意味するべきである。従って、本明細書中に規定される要素から本質的になる組成物は、単離方法および精製方法に由来する微量の夾雑物および薬学的に受容可能なキャリア（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水、防腐剤など）を除外しない。「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、他の成分および本発明の組成物を投与するための実質的な方法の工程の微細な構成要素さえも排除することを意味するべきである。これらの変換用語の各々によって規定される実施形態は、本発明の範囲内である。
【００１３】
全ての数値指定（例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度、および分子量）（範囲を含む）は近似であり、０．１の変化で（＋）または（−）に変化する。必ずしも明確に示されるわけではないが、全ての数値指定は、用語「約」が先行することが、理解されるべきである。必ずしも明確に示されるわけではないが、本明細書中に記載される試薬が、単に例示であり、それらの等価物が当該分野で周知であることもまた、理解されるべきである。
【００１４】
用語「単離された」は、その化合物が通常、自然状態で関連している構成要素（細胞性およびその他の構成要素）から分離された状態を意味する。
【００１５】
「被験体」または「宿主」は、脊椎動物、好ましくは動物または哺乳動物、より好ましくはヒト患者である。哺乳動物としては、マウス、サル、ヒト患者、家畜動物、競技用動物、および愛玩動物を含むがこれらに限定されない。
【００１６】
用語「癌」、「新生物」、および「腫瘍」は交換可能に使用され、単数または複数のいずれかの形態で、悪性の形質転換を受け、宿主生物に対して病原性となった細胞をいう。原発性の癌細胞（すなわち、悪性形質転換部位付近から獲得された細胞）は、十分に確立された技術（特に、組織学的試験）により、非癌性細胞と容易に識別され得る。本明細書中で使用される場合、癌細胞の定義は、原発性の癌細胞だけでなく、癌細胞祖先から誘導された任意の細胞も含む。これらとして、転移した癌細胞、ならびに癌細胞から誘導されたインビトロ培養物および細胞株が挙げられる。通常、固形腫瘍として現れる型の癌をいう場合、「臨床的に検出可能」な腫瘍は、腫瘍塊に基づき（例えば、ＣＡＴスキャン、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、Ｘ線、超音波、または触診法のような手順により）検出可能な腫瘍である。この定義を満たすために、生化学的知見または免疫学的知見は単独では不十分であり得る。
【００１７】
本明細書中で使用される場合、「阻害（する）」は、組織中の内皮細胞の成長、増殖、または細胞分裂、あるいは血管形成を停止、遅延、または緩慢にすることを意味する。阻害をモニターするための方法としては、内皮細胞増殖アッセイ、血液含量の決定および血管構造の密度の定量的な決定による血管床（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｂｅｄ）の容積の測定が挙げられるが、これらに限定されない。培養物が細胞の混合物である場合、新生血管形成は、内皮細胞特異的マーカー（例えば、脈管形成因子、タンパク質分解酵素、および内皮細胞特異的細胞接着分子）を発現する細胞の定量的な測定によりモニタリングされる。
【００１８】
「組成物」は、活性因子と別の化合物または組成物（不活性（例えば、検出可能因子または標識）でも活性でもよい）（例えば、アジュバント）との組み合わせを意味することを意図とする。
【００１９】
「薬学的組成物」は、その組成物をインビトロ、インビボ、またはエキソビボでの診断用途または治療用途に適するようにするキャリア（不活性でも活性でもよい）と、活性薬剤との組み合わせを含むことを意図する。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、用語「薬学的に受容可能なキャリア」は、任意の標準的な薬学的キャリア（例えば、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、およびエマルジョン（油／水エマルジョンまたは水／油エマルジョン）、ならびに種々の型の湿潤剤を含む。この組成物はまた、安定化剤および防腐剤を含み得る。キャリア、安定化剤、およびアジュバントの例については、Ｍａｒｔｉｎ、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭ．ＳＣＩ．第１５版（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ（１９７５））を参照のこと。
【００２１】
「有効量」は、有益な結果または所望の結果をもたらすのに十分な量である。この量は、予防有効量（疾患または疾患の徴候が発症するのを予防するのに必要とされる量）と同一であるかまたは異なり得る。有効量は、１以上の投与、適用、または投薬量で投与され得る。
【００２２】
出願人は、Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａｅ  ｂａｒｂａｔａｅから薬学的に活性な画分を抽出するプロセスを同定した。１つの局面において、このプロセスは、Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａｅ  ｂａｒｂａｔａｅの高温（約１００℃）煎じ汁から、有機溶媒中で可溶性の画分を抽出することであり、ここでこの画分は、約２００ｎｍと約５００ｎｍとの間の吸光度、より好ましくは、約２００ｎｍと約４００ｎｍとの間の吸光度を有する画分である。この画分を得るための１つの手段は、有効量のＳｃｕｔｅｌｌａｒｉａｅ  ｂａｒｂａｔａｅを有効量の熱水中に浸して、液体抽出物を得ること、次いで、この抽出物を濾過して、濾液を得ることによる。この画分は、ＥＳＢａと称され、抗脈管形成特性を含む（図１および２を参照のこと）。この画分は濃縮され、食物および健康補助食品として摂取される（図１を参照のこと）。
【００２３】
これは、次いで、有効量の有機溶媒で抽出される。図１にも示される１つの局面において、この濃縮物は、まずエタノール（９５％）で洗浄し、次いで、無水メタノールで抽出し、濃縮して、抗脈管形成特性をまた保有するＥＳＢｂが単離される。
【００２４】
代替的実施形態において、ＥＳＢａと称される画分は、有機溶媒で抽出される（図１を参照のこと）。この溶媒は、窒素下で除去され、ペレットは水に再懸濁される。この懸濁液は濃縮され、薬学的に活性な画分がクロマトグラフィーにより分離される。
【００２５】
本発明者はまた、抽出物ＥＳＢａ、ＥＳＢｂ、および活性成分ＡＳＢ０３が、内皮細胞増殖を阻害し、抗脈管形成特性を有することを発見した。これらの知見に従って、本発明は、増殖阻害量の画分を内皮細胞に送達することにより、その細胞の増殖を阻害する方法を提供する。本発明はまた、抗血管形成量の本発明の画分を組織に送達することにより、組織中の血管形成を阻害する方法を提供する。
【００２６】
本発明の方法は、インビトロまたはインビボで実施され得る。インビトロで実施される場合、内皮細胞または血管形成した組織は、例えば、以下に例示するような当業者に周知の条件下で培養される。細胞および／または組織は、樹立細胞株由来であり得るか、または被験体から獲得した生検サンプルから培養され得る。次いで、この画分は、培養培地に直接添加されるか、または薬学的組成物の成分として送達される。
【００２７】
全ての治療が、各個人に対して有効ではないので、各患者に対する有効性を評価するインビトロアッセイは有効である。本発明の方法は、組成物または治療が、内皮細胞または血管形成の病理学的増殖に関連する、患者の特定の疾患を処置するか否かを決定する手段を提供する。例えば、組織生検は、患者から単離され、そして有効量の薬学的組成物または本明細書中で定義されるような治療と、細胞の成長および増殖に有効な条件下で接触される。従来手順（例えば、本明細書中に記載されるＣＰＡＥアッセイ）により決定される病理学的な細胞の増殖の阻害は、本発明の組成物および／または治療が患者の処置に有効であり得ることを示す。
【００２８】
本発明はまた、被験体に治療有効量または増殖阻害量の本発明の画分またはその薬学的に受容可能な誘導体、塩またはプロドラッグを投与することにより、被験体における病理的な新生血管形成に関連する障害を処置する方法を提供する。この文脈で使用する場合、「処置する」こととは、病理的な新生血管形成および新生血管形成の減少に関連する症候を緩和することを意味する。このような状態としては、関節炎状態、新生血管形成に基づく皮膚科学的状態、糖尿病性網膜症、カポージ肉腫、加齢性黄斑変性、再狭窄、毛細管拡張症（ｔｅｌａｎｇｅｃｔａｓｉａ）、緑内障、ケロイド、角膜移植拒絶、創傷肉芽化（ｇｒａｎｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）、血管線維腫、オスラー−ウェバー症候群、心筋の新脈管形成、および強皮症が挙げられるが、これらに限定されない。関節炎状態の例は、乾癬性関節炎、慢性関節リウマチ、および変形性関節症からなる群より選択される。癌および固形腫瘍の処置については、「処置」することとは、血管の成長を阻害し、腫瘍増殖のためにその腫瘍により必要とされる腫瘍細胞／癌細胞のための栄養の欠如を生じることを含む。腫瘍および成長は、大きさが減少し、消失する可能性がある。関節炎状態を処置するための投与は、軟骨組織（特に、関節）における血管形成の減少を生じる。これにより、これらの領域における運動性および可撓性が増加する。乾癬の処置については、投与は、皮膚科学的な症状（例えば、瘡蓋形成（ｓｃａｂｂｉｎｇ）、剥離（ｆｌａｋｉｎｇ）、および皮膚表面下の目に見える血管）を減少させる。糖尿病性網膜症において、本発明の画分の投与は、網膜における本質部分以外の（ｅｘｔｒａｎｅｏｕｓ）血管の形成を減少させる。これにより、視界が妨害されない。カポージ肉腫の処置において、本発明の画分の投与は、血管の成長および／またはさらなる形成を阻害し、それによって、病巣形成および／または腫瘍が生じるのを阻害する。
【００２９】
画分を被験体（例えば、マウス、ラット、またはヒト患者）に投与する場合、この画分は、薬学的に受容可能なキャリアに添加され得、そして被験体に全身投与、経口投与、経皮投与、または局所投与される。治療量は、経験的に決定され得、処置される病理状態、処置される被験体、および治療方法において使用される活性画分の形態の毒性と共に変化する。活性画分は、経口送達、静脈内送達、腹膜内送達、または経皮送達され得る種々の形態にある。動物に投与される場合、この方法は、活性画分の効力をさらに確認するのに有用である。
【００３０】
動物モデルの例として、ヌードマウス（Ｂａｌｂ／ｃ  ＮＣＲ  ｎｕ／ｎｕ雌、Ｓｉｍｏｎｓｅｎ、Ｇｉｌｒｏｙ、ＣＡ）は、各々、本明細書中に記載されるような約１０５〜約１０９の病理細胞を皮下接種される。移植が完成した場合、この画分が、例えば、移植物付近に皮下注入することにより投与される。移植物の大きさの減少を決定するための測定は、１週間に２回、ベニアカリパス（ｖｅｎｉｅｒ  ｃａｌｉｐｅｒ）を用いて二次元的に実施される。
【００３１】
Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ（Ｍａｉｎｅ）からのＭＲＬ／ｌｐｒマウス（ＭＲＬ／ＭｐＪ−Ｆａｓｌｐｒ）は、関節炎状態における有効性を試験またはモニターするのに有用である。ポジティブな治療上の利益としては、動物の関節および後足の減少した膨張ならびに減少した軟骨組織の分解が挙げられ、これらはＸ線によってモニターされ得る。
【００３２】
インビボ投与は、処置過程を通して、単一用量で、複数用量で、連続的に、または断続的に実施され得る。投与の最も有効な手段および投薬量を決定する方法は、当業者に周知であり、治療に使用される組成物、治療の目的、処置される標的細胞、および処置される被験体と共に変化する。単一の投与または複数の投与は、処置する専門医により選択された用量レベルおよびパターンで実施され得る。適切な投薬処方物および活性画分を投与する方法は、以下に記載される。
【００３３】
本発明の組成物および薬学的処方物は、医薬の製造において、および従来手順（例えば、薬学的組成物中の活性成分）に従って投与することによりヒトおよび他の動物を処置するために使用され得る。
【００３４】
この画分または化合物は、経口投与、鼻腔内投与、非経口投与されるか、または吸入療法により投与され得、錠剤、トローチ剤、顆粒、カプセル剤、丸剤、アンプル、坐剤、またはエアロゾル形態の形態を取り得る。これらはまた、水性または非水性希釈剤中の活性成分の懸濁物、溶液、およびエマルジョン、シロップ、顆粒、または粉末の形態を取り得る。本発明の活性成分に加えて、薬学的組成物はまた、他の薬学的活性成分を含み得る。
【００３５】
活性画分は、任意の適切な経路（経口、直腸、経鼻、局所（経皮、エアロゾル、頬側および舌下を含む）、膣、非経口（ｐａｒｅｎｔａｌ）（皮下、筋内、静脈内および皮内を含む）および肺が挙げられる）によって、治療のために投与され得る。好ましい経路は、レシピエントの状態および年齢、ならびに処置される疾患によって変化することがまた、理解される。
【００３６】
活性画分の適切な投薬は、疾患の型および重篤度および段階に依存し得、そして患者ごとに変化し得ることが理解される。最適投薬量は、本発明の処置における全ての危険性または有害な副作用に対する治療利益のレベルのバランスに関連する。
【００３７】
理想的には、抽出物（「薬物」）またはこの抽出物を含む組成物は、疾患部位で、活性化合物の濃度がピークに達するように投与されるべきである。これは、例えば、薬物の静脈内注射（必要に応じて、生理食塩水中）、または経口投与（例えば、活性成分を含む錠剤、カプセルもしくはシロップ）によって達成され得る。この薬物の望ましい血液レベルは、疾患組織内に、治療量の活性成分を提供するための連続的な注入によって維持され得る。有効な組み合わせの使用は、各個別の治療化合物または薬物が単独で使用される場合に必要とされ得るよりも、各成分薬剤のより低い全投薬量を必要とする治療的組み合わせを提供し、それによって有害な副作用を低減させることが意図される。
【００３８】
活性画分または化合物は単独で投与される可能性があるが、この活性画分または化合物のための１つ以上の薬学的に受容可能なキャリアおよび必要に応じて他の治療剤と一緒に、上記に規定されるような少なくとも１つの活性成分を含む薬学的処方物として示されることが好ましい。各キャリアは、処方物の他の成分に適合可能であり、患者に有害でないという意味で「受容可能」でなければならない。
【００３９】
処方物には、経口、直腸、経鼻、局所（経皮、頬側および舌下を含む）、膣、非経口（皮下、筋内、静脈内および皮内を含む）および肺投与にとって適切な処方物が含まれる。処方物は、単位投薬形態で都合よく提供され得、そして薬学の分野において周知の任意の方法によって調製され得る。このような方法は、活性成分を、１つ以上の補助的成分を構成するキャリアと結合させる工程を包含する。一般的に、処方物は、活性成分と液体キャリアまたは細かく粉砕した固体キャリアあるいはそれら両方とを結合させて、均一かつ密に調製され、次いで必要に応じて、その製品を成形する。
【００４０】
経口投与に適切な本発明の処方物は、例えば、カプセル、カシェ剤または錠剤のような別個の単位（これらの各々は所定の量の活性成分を含んでいる）として；粉剤または顆粒として；水性または非水性液体中の溶液または懸濁液として；あるいは水中油液体エマルジョンもしくは油中水液体エマルジョンとして提供され得る。これらの活性成分はまた、ボーラス、舐剤またはペーストで示され得る。
【００４１】
錠剤は、必要に応じて１つ以上の補助成分と共に、圧縮または成形によって作製され得る。圧縮錠剤は、自由流動形態（例えば、必要に応じて結合剤（例えば、ポビドン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、滑沢剤、不活性希釈剤、保存剤、崩壊剤（例えば、グリコール酸ナトリウムデンプン（ｓｏｄｉｕｍ  ｓｔａｒｃｈ  ｇｌｙｃｏｌａｔｅ）、架橋したポビドン、架橋したカルボキシルメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤または分散剤と混合された、粉剤または顆粒）の活性成分を適切な機械で圧縮することによって調製され得る。成形された錠剤は、不活性液体希釈剤を用いて湿らせた粉末化化合物の混合物を、適切な機械で成形することによって作製され得る。錠剤は必要に応じてコートされ得るか、または刻み目を付けられ（ｓｃｏｒｅ）得、そして例えば、種々の割合のヒドロキシプロピルメチルセルロースを用いて、その中に活性成分の徐放または制御放出を提供するように処方されて、所望の放出プロフィールを提供し得る。錠剤は、必要に応じて、腸溶性コーティングと共に提供され、胃以外の腸の部分での放出を提供し得る。
【００４２】
口における局所投与のために適切な処方物としては、ロゼンジ（通常、ショ糖およびアラビアゴムまたはトラガカントゴムである風味付けした基剤中に活性成分を含む）；香錠（ゼラチンおよびグリセリンまたはショ糖およびアラビアゴムのような不活性な基剤中に活性成分を含む）；ならびにマウスウォッシュ（適切な液体キャリア中に活性成分を含む）が挙げられる。
【００４３】
本発明に従う局所投与のための薬学的組成物は、軟膏、クリーム、懸濁液、ローション、粉末、溶液、ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾルまたは油として処方され得る。あるいは、処方物は、活性成分、および必要に応じて１つ以上の賦形剤もしくは希釈剤に浸漬させた、包帯または接着ギブスのようなパッチまたは包帯を含み得る。
【００４４】
眼または他の外部組織（例えば、口および皮膚）の疾患のために、処方物は、好ましくは、活性成分を含む、局所的な軟膏またはクリームとして適用される。軟膏にて処方される場合、薬物は、パラフィン系または水混和性の軟膏基剤のいずれかと共に使用され得る。あるいは、薬物成分は、水中油クリーム基剤と共にクリーム中に処方され得る。
【００４５】
所望の場合、クリーム基剤の水相は、例えば、少なくとも約３０％  ｗ／ｗの多価アルコール（すなわち、２つ以上のヒドロキシル基を有するアルコール（例えば、プロピレングリコール、ブタン−１，３−ジオール、マンニトール、ソルビトール、グリセロールおよびポリエチレングリコールならびにそれらの混合物））を含み得る。局所処方物は、望ましくは、皮膚または他の罹患した領域を通る活性画分の吸収または浸透を増強する化合物を含み得る。このような真皮浸透増強剤の例としては、ジメチルスルホキシドおよび関連するアナログが挙げられる。
【００４６】
本発明のエマルジョンの油相は、任意の公知の様式において、公知の成分から構成され得る。この相は、乳化剤（他の点では、排出促進剤として公知）のみを含み得るが、望ましくは、脂肪または油か、あるいは脂肪および油の両方と、少なくとも１つの乳化剤との混合物を含む。好ましくは、親水性乳化剤が、安定化剤として作用する親油性乳化剤と共に含まれる。油および脂肪の両方が含まれることもまた、好ましい。同時に、安定化剤を伴うか、または伴わない乳化剤は、いわゆる乳化ワックスを構成し、そしてそのワックスは、油および／もしくは脂肪と一緒に、いわゆる乳化軟膏基剤（これは、クリーム処方物の油状分散相を形成する）を構成する。
【００４７】
本発明の処方物における使用のために適切な排出促進剤およびエマルジョン安定化剤としては、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｓｐａｎ８０、セトステアリルアルコール、ミリスチルアルコール、グリセリルモノステアレートおよびラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる。
【００４８】
薬学的エマルジョン処方物においておそらく使用される大部分の油状物における活性化合物の可溶性は、非常に低いので、処方のために適切な油または脂肪の選択は、所望の美的特性の達成に基づく。従って、クリームは、好ましくは、チューブまたは他の容器からの漏出を避けるために適切な粘稠度を有する、非脂肪性、非着色性および洗浄可能な製品であるべきである。直鎖または分枝鎖の、一塩基性アルキルエステルまたは二塩基性アルキルエステル（例えば、ジ−イソアジペート、ステアリン酸イソセチル、ココナツ脂肪酸のプロピレングリコールジエステル、ミリスチン酸イソプロピル、オレイン酸デシル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、２−エチルへキシルパルミテート、またはＣｒｏｄａｍｏｌ  ＣＡＰとして公知の分枝鎖エステルの混合物）が使用され得る。最後の３つが好ましいエステルである。これらは、必要とされる特性に依存して、単独または組み合わせて使用され得る。あるいは、融点の高い脂質（例えば、白色ソフトパラフィンおよび／または流動パラフィン）または他の鉱物油が使用され得る。
【００４９】
眼への局所投与のために適切な処方物はまた、点眼剤を含み、ここで、活性成分は、適切なキャリア（特に、活性成分用の水性溶媒）に溶解されるか、または懸濁される。直腸投与のための処方物は、適切な基剤（例えば、ココアバターまたはサリチル酸塩を含む）と共に坐剤として示され得る。
【００５０】
膣投与のために適切な処方物は、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、発泡剤または噴霧処方物として示され得、これらは、活性成分と併せて、適切であることが当該分野において公知のキャリアを含む。
【００５１】
経鼻投与のために適切な処方物（キャリアは固体である）は、例えば、約２０〜約５００ミクロンの間の範囲の粒子サイズを有する、粗い粉末を含み、これは、鼻から吸い込む様式（すなわち、鼻に密着させた、散剤の容器から鼻腔を通って迅速に吸入される）により投与される。適切な処方物は、活性成分の水性溶液または油性溶液を含み、ここで、キャリアは、例えば、鼻内噴霧、点鼻剤としての投与、またはネブライザーによるエアロゾル投与による投与のための液体である。
【００５２】
非経口投与のために適切な処方物は、処方物を、意図されたレシピエントの血液と等張性にする水性および非水性の等張滅菌注射溶液（これらは、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤および溶質を含み得る）；ならびに水性および非水性の滅菌懸濁液（これらは、懸濁剤および増粘剤およびリポソームまたは他の微粒子系（これらは、化合物が血液成分もしくは１つ以上の器官を標的化するように設計される）を含み得る）、を含む。これらの処方物は、単回用量または複数回用量の密封容器（例えば、アンプルおよびバイアル）において示され得、そして使用直前に、滅菌液体キャリア（例えば、注射用水）の添加だけを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存され得る。即席の注射溶液および懸濁液は、先に記載した種類の滅菌の散剤、顆粒および錠剤から調製され得る。
【００５３】
好ましい単位投薬量の処方物は、本明細書中で上に列挙されるような、薬物成分の、一日用量または単位、一日準用量（ｓｕｂｄｏｓｅ）またはそれらの適切な一部を含む処方物である。それらは、さらなる活性薬物（例えば、抗腫瘍剤、抗癌剤、抗脈管形成剤または免疫増強剤）もまた含み得る。
【００５４】
上記に特に言及される成分に加えて、本発明の処方物は、問題となる処方物の型を考慮して、当該分野における慣用的な他の薬剤を含み得ることが理解されるべきである（例えば、経口投与に適切な薬剤は、甘味剤、増粘剤および矯味矯臭剤のようなさらなる薬剤を含み得る）。
【００５５】
同一の抽出物（「薬物」）または組成物はまた、獣医学の処方物の形態において使用されるために示され得、これは、例えば、当該分野で慣用的な方法によって調製され得る。
【００５６】
本発明はさらに、新血管形成または内皮細胞増殖を阻害するための治療剤についてスクリーニングする方法を提供する。このスクリーニングは以下を包含する：
（ａ）薬剤と適切な細胞サンプルまたは組織サンプルとを接触させる工程；
（ｂ）適切な細胞または組織の別個のサンプルと、治療有効量の本発明の抽出物またはその抽出物を含有する薬学的に受容可能な組成物とを接触させる工程；および
（ｃ）工程（ａ）のサンプルの増殖と、工程（ｂ）のサンプルの増殖とを比較する工程であって、ここで、工程（ｂ）のサンプルと同一または類似した程度に増殖を阻害する工程（ａ）のどの薬剤も、新血管形成または内皮細胞増殖を阻害するための治療剤である。
【００５７】
本明細書中で使用される場合、適切なサンプルは、内皮細胞を含む任意のサンプルを意図する。本方法は、本明細書中で記載されるように、インビトロまたはインビボで実施され得る。
【００５８】
被験体における病理学的な新血管形成に関連する疾患を障害を処置するためのキットもまた、本発明によって提供される。このキットは、治療有効量の抽出物および使用のための指示書を含む。このキットは、以下からなる群より選択される障害を処置するために有用である：関節炎状態、脈管新生に基づく皮膚科学的状態、糖尿病性網膜炎症、カポージ肉腫、加齢性筋肉変性、再狭窄、毛細管拡張症、緑内障、ケロイド、角膜移植拒絶、創傷の肉芽化、血管線維腫、オスラー−ウェバー症候群、心筋の新脈管形成、強皮症、乾癬性関節炎、慢性関節リウマチおよび変形性関節症。
【００５９】
以下の実施例は例示することが意図され、本発明を限定することを意図しない。
【実施例】
【００６０】
（実施例１）
（活性画分の単離および精製）
本発明は、Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａｅ  ｂａｒｂａｔａｅを含む組成物から、生物学的に活性な画分を調製するためのいくつかの実施形態を提供する。１つの局面において、（図１に示される）プロセスは、有機溶媒中に溶解性の画分を抽出して、約２００ｎｍと約５００ｎｍとの間の吸光度、より好ましくは、約２００ｎｍと約４００ｎｍとの間の吸光度を有する活性画分を得る工程を包含する。さらなる局面において、この画分は、約２６０ｎｍと約３３０ｎｍとの間の吸光度を有する。
【００６１】
１つの実施形態において、１０ｇの乾燥Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａｅ  ｂａｒｂａｔａｅと約３００ｍｌの熱した（少なくとも約６０℃、およびより好ましくは、約１００℃）二重蒸留水をの組み合わせから抽出することを必要とする。これを、約５分〜約３０分浸し、次いで、孔サイズ約２２〜２５ミクロンを有する適切なフィルター材料を通して濾過する。適切なフィルターは、オートクレーブ処理可能かつ滅菌可能であり、多くの化学的溶媒に対して耐性である。１つの適切なフィルターは、市販のＭｉｒａｃｌｏｔｈである。この抽出物（ＥＳＢａ、図１を参照のこと）は、抗脈管形成特性を有することが示された。これは、食物もしくは健康補助食品として使用され得るか、または食品もしくは健康補助食品として使用するためにさらに処理され得る。
【００６２】
「煎じ汁」を、有機溶媒（例えば、エタノールもしくはメタノール）、または他の類似の有機溶媒を使用して、少なくとも３回抽出し、次いで、２回と５回の間で、より好ましくは４回、メタノールで抽出する。抽出物（ＥＳＢｂ、図１を参照のこと）はまた、抗脈管形成を有する。これは、食物もしくは健康補助食品として使用され得るか、または食品もしくは健康補助食品として使用するためにさらに処理され得る。
【００６３】
ＥＳＢｂは、濃縮（例えば、水中への溶解、および凍結乾燥）によりさらに処理され得る。次いで、この凍結乾燥物は、カラムクロマトグラフィーを使用して、活性画分ＡＳＢ０３へ分離され（図１を参照のこと）て、約２００ｎｍ〜約５００ｎｍの吸光度、より好ましくは、約２００ｎｍと約４００ｎｍとの間の吸光度、最も好ましくは、約３００ｎｍと約４００ｎｍとの間の吸光度を有する画分を得る。
【００６４】
代替的実施形態において、活性画分を得るための工程は、以下のとおりである：
（ａ）有効量のＳｃｕｔｅｌｌａｒｉａｅ  ｂａｒｂａｔａｅを、熱した二重蒸留水中に少なくとも５分間浸す；
（ｂ）次いで、この液体を、約１０分間遠心分離し（２０００ｒｐｍにて）、Ｗａｔｍａｎ濾紙で濾過する（沈殿物は廃棄される）。
【００６５】
（ｃ）粗製抽出物を一晩凍結乾燥して、ＥＳＢａを得る。
【００６６】
（ｄ）９５％エタノールで洗浄し、遠心分離した後、ペレットを有効量の有機溶媒で抽出して、より純粋な抽出物を得る。
【００６７】
（ｅ）この有機溶媒（例えば、メタノール）を、窒素ガスでエバポレートする。
【００６８】
（ｆ）乾燥した懸濁液を、少なくとも約１２〜約１８ｍｌの水と混合し、一晩凍結乾燥して、ＥＳＢｂを得る。
【００６９】
（ｇ）これを、薬学的に受容可能なキャリア（例えば、二重蒸留水）中に再懸濁し得る。
【００７０】
（ｈ）クロマトグラフィー分離のためにカラムにこの溶液を流す。ＡＣ−１８カラムは１つのこのようなカラムである。２５％メタノール溶液を使用して、吸着した画分、すなわち活性な画分を溶出する。
【００７１】
（ｉ）窒素ガスの流れによりメタノールをエバポレートする。
【００７２】
（ｊ）抽出物を水中に再懸濁し、凍結乾燥する。
【００７３】
（ｋ）次いで、これを、例えば、カラムクロマトグラフィー（例えば、０〜１００％勾配でのＨＰＬＣ）を使用して分画して、ＡＳＢ０３を得る。
【００７４】
（実施例２）
図３は、ＡＳＢ０３と称される活性画分を単離するための別の手順を示す。この実施形態において、粗製抽出物を、上記実施例１に記載のように得、次いで、Ｇ−２５−３００（２５×４０ｃｍ）カラムを使用して分画する。図４は、Ｇ−２５カラムから単離された異なる画分の抗脈管形成活性を示す。画分を、流速２ｍｌ／分にてカラムを流すことにより得た。画分２２〜３０は、ＣＰＡＥアッセイ（以下に記載される）を使用して決定されるように、生物学的に活性であった。
【００７５】
（実施例３）
（内皮細胞アッセイ（「ＣＰＡＥ」））
このアッセイを、改変（ＬｉａｎｇおよびＷｏｎｇ（１９９９）ＡＮＧＩＯＧＥＮＥＳＩＳ：ＦＲＯＭ  ＴＨＥ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＴＯ  ＩＮＴＥＧＲＡＴＩＶＥ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＹ（Ｍａｒａｄｏｕｄａｋｉｓ編、Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を伴うＣｏｎｎａｌｌｙら（１９８６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５２：１３６−４の手順に従って実行した。ウシ肺動脈内皮（ＣＰＡＥ）細胞を、２４ウェル培養プレートにて、１ウェルあたり１０，０００細胞でプレートする。３７℃、５％ＣＯ２にて約６０時間増殖インキュベーションした後、１投薬量のサンプル（約５０μｌ〜約１００μｌ）を、各サンプルウェルに添加し、３０分間再びインキュベートする。インキュベーションの後、細胞を、倒立顕微鏡下で肉眼にてアッセイして、細胞の存在を検出し、ＥＣＣアッセイの使用により検出する。両方の方法を使用して、各ウェル中の内皮細胞の存在または非存在を検出する。サンプルを含まないコントロール細胞を使用し、通常通り増殖させた。
【００７６】
（実施例４）
（ＣＡＭアッセイ）
絨毛尿膜（ＣＡＭ）アッセイ（Ｎｇｕｙｅｎ，Ｍ．ら（１９９４）Ｍｉｃｒｏｖａｓ．Ｒｅｓ．４７：３１−４０）を使用して、活性画分、抽出物または化合物の効力をインビボモデルにおいて決定する。受精した鶏卵をＫｉｎｇｓ  Ｖａｌｌｅｙ  Ｆａｒｍｓ（Ｋｉｎｇｓｂｕｒｇ，ＣＡ）から入手し、加湿チャンバ中で３７℃にてインキュベートする。卵を１日に１回、４日間、１８０°回転させ、そのときに、以下のように卵殻中に窓を切る：まず、卵を９５％エタノールで拭き、小さな孔を、卵の平滑な端部に配置して、そこに存在する気嚢を破壊する。１ｃｍ２の「窓」をハクソー（２５歯／インチ）を使用して卵殻から除去すると、膜は、卵殻から落ちる。滅菌したＨｏｗａｒｄ’ｓ  Ｒｉｎｇｅｒ溶液を使用して、任意の過剰な卵殻断片を洗い流した。
【００７７】
次いで、卵を、セロハンテープ（登録商標）で密封し、インキュベーターに戻す。４〜７日後、窓を再び開け、滅菌カバーグラスを、参照点として働くように配置する。試験のために、ＣＡＭ中の血管間に滅菌針で孔を作製し、少量のサンプルを孔に適用し、次いで再び密閉した。ラクトースをコントロールとして使用した。ＣＡＭ上での血管発生の任意の阻害について、４日間、毎日観察した。
【００７８】
（実施例５）
（ＭＭＰアッセイ）
Ｐ．Ｃ．Ｂｒｏｏｋｓら（１９９６）は、「Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ＭＭＰ−２  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｏｆ  ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  αｖβ３」、Ｃｅｌｌ  ８５：６８３−９３において、マトリックスメタロプロテイナーゼとαｖ／β３インテグリンとの相互作用に対するインビトロアッセイを記載する。ＭＭＰ−２／αｖβ３インテグリン複合体に対する実験サンプルの効果は、このサンプルの作用機構が、脈管形成経路のこの区域の任意の破壊を含むか否かを決定する。これは、この実験サンプルが、αｖβ３インテグリンとのＭＭＰ−２の相互作用を阻害し得るか否かを試験する工程を包含する。最初に、これを、ＭＭＰ−２に対する抗体を使用するＥＬＩＳＡによって行い、そしてサンプルに対するこれらの抗体の結合を試験する。陽性の結果が生じるか否かのさらなる研究を続ける。ＭＭＰ−２の公知の天然のインヒビターであるＴＩＭＰ−２（マトリックスメタロプロテアーゼ−２の組織インヒビター）を、コントロールとして使用する。
【００７９】
（実施例６）
（内皮細胞細管／索形成アッセイ）
マトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌ）（１０ｍｇ／ｍｌを６０μｌ；Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｌａｂ  ＃３５４２３）を、氷冷した９６ウェルプレートの各ウェルに配置する。このプレートを、１５分間室温に置き、次いで３７℃で３０分間インキュベートして、マトリゲルの重合を可能にする。一方で、ＨＵＶＥＣを、ＥＧＭ−２（Ｃｌｏｎｅｔｉｃ  ＃  ＣＣ３１６２）中で、２×１０５細胞／ｍｌの濃度で調製する。この試験化合物を、同じ培地中に所望の濃度（５つの濃度レベル）の２×で調製する。細胞（５００μｌ）および２×の画分または化合物（５００μｌ）を混合し、この懸濁物の２００μｌを、重合したマトリゲル上に二連で配置する。２４時間のインキュベーション後、Ｂｉｏｑｕａｎｔ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍを使用して、各濃度について三連で写真を撮影する。薬物効果（ＩＣ５０）を、形成された索／細管の長さおよび連結の数を測定することによって、未処理のコントロールと比較して評価する。ＴＮＰ−４７０（ＮＳＣ  ６４２４９２）およびパクリタキセル（ＮＳＣ  １２５９７３）を、参照化合物として使用する。
【００８０】
（実施例７）
（内皮細胞移動アッセイ）
移動を、４８ウェルのＢｏｙｄｅｎチャンバおよび８μｍの孔サイズのコラーゲン被覆した（１０μｌ／ｍｌラット尾部コラーゲン；Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）ポリカーボネートフィルタ（Ｏｓｍｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．）を使用して評価する。下のチャンバウェルは、２７〜２９μｌのＤＭＥＭ培地単独（基準）または化学誘引物質を含有する培地（ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦまたはＳｗｉｓｓ  ３Ｔ３細胞馴化培地）を受ける。上のチャンバは、画分もしくは化合物有りまたは無しでＤＭＥＭ＋１％ＢＳＡ中に調製されたＨＵＶＥＣ細胞懸濁物（１×１０６細胞／ｍｌ）４５μｌを受ける。３７℃で５時間のインキュベーション後、膜をＰＢＳでリンスし、固定し、そしてＤｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ溶液中で染色する。フィルタを、移動した細胞を下に向けてガラススライド上に配置し、上部の細胞を、Ｋｉｍｗｉｐｅを使用して除去する。試験を、４〜６回複製して実行し、５つの視野を各ウェルから計数する。陰性の非刺激コントロール値を、刺激コントロールから差し引き、そして画分または化合物で試験した値およびデータを、平均移動細胞±Ｓ．Ｄ．でプロットする。ＩＣ５０を、このプロットしたデータから算定する。ＴＮＰ−４７０（ＮＳＣ  ６４２４９２）およびパクリタキセル（ＮＳＣ  １２５９７３）を、参照化合物として使用する。
【００８１】
上記の発明を、理解を明確にする目的のために、例示および実施例によって、いくらか詳細に記載してきたが、特定の変化および改変が実行されることが、当業者に明らかである。例えば、当業者に明らかなように、本発明の方法は、１以上の既知の抗腫瘍、抗脈管形成または免疫増強の治療剤および組成物（例えば、サメ軟骨、チロスフィンゴシン（ｔｙｒｏｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ）またはスフィンゴシン）と組み合わせられ得る。従って、記載および実施例は、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲を限定するとは解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】図１〜５は、本発明の例示的なプロセスを示す。しかし、常に明確に述べられるとは限らないが、記載される試薬が単に例示であり、そしてそのような等価物が当該分野で周知であることは、理解されるべきである。以下は、例であり、そしてその等価物は、本発明の範囲内である。図１は、食物および健康補助食品として有用であるＥＳＢａおよびＥＳＢｂと称される活性画分を単離するための手順を示す。ＥＳＢａは、第１の凍結乾燥工程の後の植物からの最初の抽出物からのプロセスにおける第１の粗製抽出物である。この抽出物は、抗脈管形成特性を含む。第２の粗製抽出物であるＥＳＢｂは、このプロセスの継続により得られる。第１の凍結乾燥後、精製は、９５％エタノール洗浄、次いで、無水メタノール抽出を行うことにより続けられる。このプロセスは、ＥＳＢａにおいて見出される活性画分をさらに単離することを見出した。このエタノール洗浄／メタノール抽出からの抽出物は、水に溶解され、次いで、凍結乾燥され、より濃縮され、より純粋なＥＳＢｂとよばれるＳｃｕｔｅｌｌａｒｉａｅ  ｂａｒｂａｔａｅからの活性抽出物を生じる。このより濃縮され、より純粋な抽出物は、最初に水に溶解し、次いで、Ｃ−１８ミニカラムに吸着させることによりさらに精製される。水で洗浄した後、吸着された活性成分は、２５％メタノール洗浄により、Ｃ−１８ミニカラムから脱着される。精製されたＡＳＢ０３は、０〜１００％メタノール勾配による、ＨＰＬＣ  Ｃ−１８疎水性カラムの溶出液から得られる。全ての画分、ペレット、および懸濁液は、抗脈管形成が失われていないか、またはなくしていないかを確認する各工程の後に、ＣＰＡＥアッセイを使用してアッセイする。
【図２】図２は、Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａｅ  ｂａｒｂａｔａｅのメタノール抽出物のＣ−１８疎水性クロマトグラフィーからのＨＰＬＣ溶出液を示す。
【図３】図３は、Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａｅ  ｂａｒｂａｔａｅからのＡＳＢ０３の抽出および精製のための別の手順を示す。
【図４】図４は、Ｇ−２５カラムを使用した、ＡＳＢ０３の抗脈管形成活性の分析の結果を示すグラフである。
【図５】図５（パネルＡ、ＢおよびＣ）は、Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａｅ  ｂａｒｂａｔａｅから単離されたＨＰＬＣ  Ｃ−１８クロマトグラフィー抽出物からのＡＳＢ０３の活性画分のＵＶ分光光度計分析を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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