(57)【要約】本発明は、Ｍ−ＣＳＦおよびＩＬ−３を含む培養培地中での単球の培養による、ヒト単球由来の脱分化した、プログラム可能な成熟幹細胞の生成に関する。本発明はさらに、脱分化した、プログラム可能な幹細胞を含む薬学的調製物、ならびに標的細胞および標的組織の生成のためのこれらの幹細胞の使用に関する。本発明に従う幹細胞は、分化した単球の特徴的なＣＤ１４表面抗体に加えて、代表的な多能性マーカーＣＤ９０、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３およびＣＤ１３５のうちの少なくとも１つ、好ましくは２つまたは３つを発現する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト単球起源の、脱分化した、プログラム可能な幹細胞の生成のためのプロセスであって、該プロセスは、以下：
ａ）単球が、ヒト血液から単離されること；
ｂ）該単球が、細胞増殖因子Ｍ−ＣＳＦを含む、適切な培養培地中で増殖すること；
ｃ）該単球が、工程ｂ）と同時かまたは工程ｂ）の後に、ＩＬ−３を含む培養培地中で培養されること；および
ｄ）該ヒトの成熟した脱分化したプログラム可能な幹細胞が、培養培地から該細胞を分離することによって得られること；
を特徴とする、プロセス。
【請求項２】
前記工程ｃ）の培養培地に、メルカプト化合物がさらに添加されることを特徴とする、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
メルカプト化合物が使用され、該化合物中では少なくとも１つの炭素基が、硫黄に結合しており、炭化水素基が、１つ以上のさらなる官能基で置換され得ることを特徴とする、請求項２に記載のプロセス。
【請求項４】
前記メルカプト化合物が、２−メルカプトエタノールまたはジメチルスルホキシドであることを特徴とする、請求項２または請求項３に記載のプロセス。
【請求項５】
工程ｃ）の後および工程ｄ）の前に、前記細胞が、生物学的に受容可能な有機溶媒と接触されることを特徴とする、請求項１〜請求項４に記載のプロセス。
【請求項６】
前記生物学的に受容可能な有機溶媒が、１〜４個の炭素原子を有するアルコールであることを特徴とする、請求項５に記載のプロセス。
【請求項７】
前記アルコールが、エタノールであることを特徴とする、請求項６に記載のプロセス。
【請求項８】
前記細胞が、前記生物学的に受容可能な有機溶媒の気相と接触されることを特徴とする、請求項５〜請求項７に記載のプロセス。
【請求項９】
工程ｄ）の後に、前記細胞が、適切な細胞培養培地中に懸濁されることを特徴とする、請求項１〜請求項８に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記培地が、ＲＰＭＩまたはＤＭＥＭであることを特徴とする、請求項９に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記培地が、サイトカインまたはＬＩＦを含むことを特徴とする、請求項９または請求項１０に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記細胞が、液体培地中に懸濁され、続いて急速凍結されることを特徴とする、請求項９〜請求項１１に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記培地が、細胞培養培地であることを特徴とする、請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１４】
ヒト単球起源の、脱分化した、プログラム可能な幹細胞。
【請求項１５】
請求項１〜１３のプロセスによって得られ得る、請求項１４に記載の幹細胞。
【請求項１６】
請求項１４または請求項１５に記載の、脱分化した、プログラム可能な幹細胞を含む、薬学的組成物。
【請求項１７】
標的細胞および標的組織を生成するための、請求項１４または請求項１５に記載の、脱分化した、プログラム可能な幹細胞の使用。
【請求項１８】
請求項１７に記載の使用であって、以下：
ａ）所望の標的細胞を含む組織が破砕されること；
ｂ）該標的細胞および／または該標的細胞のフラグメントが、該破砕された組織から得られること；
ｃ）該標的細胞および／または該標的細胞のフラグメントが、適切な培養培地中でインキュベートされること；
ｄ）該培養培地の上清が、標的細胞馴化培地としてインキュベーション中およびインキュベーション後に収集されること；ならびに
ｅ）該所望の標的細胞への前記幹細胞の再プログラミング／分化のために、該幹細胞が、該標的細胞馴化培地の存在下で増殖されること；
を特徴とする、使用。
【請求項１９】
脂肪細胞、ニューロンおよびグリア細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、肝細胞もしくは島細胞の生成のための、請求項１７または請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記脱分化した、プログラム可能な幹細胞が、１つ以上の遺伝子でトランスフェクトされることを特徴とする、請求項１〜請求項１３に記載のプロセス。
【請求項２１】
膜結合型単球特異的表面抗原であるＣＤ１４と、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３およびＣＤ１３５からなる群から選択される少なくとも１つの多能性マーカーとによって特徴付けられる、請求項１４に記載の、ヒト単球起源の、脱分化した、プログラム可能な幹細胞。
【請求項２２】
前記脱分化した、プログラム可能な幹細胞が、１つ以上の遺伝子でトランスフェクトされていることを特徴とする、請求項１４、請求項１５または請求項２１に記載の幹細胞。
【請求項２３】
適切な培地中に、請求項１４、請求項１５、請求項２１または請求項２２に記載の、脱分化した、プログラム可能な幹細胞を含む、幹細胞調製物。
【請求項２４】
肝硬変の処置のための薬学的組成物の調製のための、請求項１４、請求項１５、請求項２１または請求項２２に記載の、脱分化した、プログラム可能な幹細胞の使用。
【請求項２５】
膵不全の処置のための薬学的組成物の調製のための、請求項１４、請求項１５、請求項２１または請求項２２に記載の、脱分化した、プログラム可能な幹細胞の使用。
【請求項２６】
急性腎不全または慢性腎不全の処置のための薬学的組成物の調製のための、請求項１４、請求項１５、請求項２１または請求項２２に記載の、脱分化した、プログラム可能な幹細胞の使用。
【請求項２７】
ホルモン機能不全の処置のための薬学的組成物の調製のための、請求項１４、請求項１５、請求項２１または請求項２２に記載の、脱分化した、プログラム可能な幹細胞の使用。
【請求項２８】
心筋梗塞の処置のための薬学的組成物の調製のための、請求項１４、請求項１５、請求項２１または請求項２２に記載の、脱分化した、プログラム可能な幹細胞の使用。
【請求項２９】
肺塞栓症の処置のための薬学的組成物の調製のための、請求項１４、請求項１５、請求項２１または請求項２２に記載の、脱分化した、プログラム可能な幹細胞の使用。
【請求項３０】
発作の処置のための薬学的組成物の調製のための、請求項１４、請求項１５、請求項２１または請求項２２に記載の、脱分化した、プログラム可能な幹細胞の使用。
【請求項３１】
皮膚損傷の処置のための薬学的組成物の調製のための、請求項１４、請求項１５、請求項２１または請求項２２に記載の、脱分化した、プログラム可能な幹細胞の使用。
【請求項３２】
標的細胞および標的組織のインビボにおける生成のための薬学的組成物の調製のための、請求項１４、請求項１５、請求項２１または請求項２２に記載の、脱分化した、プログラム可能な幹細胞の使用。
【請求項３３】
前記膜結合型表面抗原ＣＤ１４により特徴付けられる請求項１４、請求項１５、請求項２１または請求項２２に記載の前記幹細胞を再プログラミングすることによって得られる、分化した、単離された、標的体細胞および／または標的体組織。
【請求項３４】
脂肪細胞、ニューロンおよびグリア細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、肝細胞ならびに島細胞からなる群から選択される、請求項３３に記載の標的体細胞および／または標的体組織。
【請求項３５】
１つ以上の遺伝子でトランスフェクトされていることを特徴とする、請求項３３または請求項３４に記載の標的体細胞および／または標的体組織。
【請求項３６】
請求項１４、請求項１５、請求項２１または請求項２２に記載の脱分化した、プログラム可能な幹細胞あるいは請求項３３〜請求項３５に記載の標的体細胞および／または標的体組織でコーティングされた、移植可能な材料。
【請求項３７】
前記材料がプロテーゼであることを特徴とする、請求項３６に記載の移植可能な材料。
【請求項３８】
前記プロテーゼが、心臓弁プロテーゼ、管プロテーゼ、骨プロテーゼおよび関節プロテーゼからなる群から選択されることを特徴とする、請求項３７に記載の移植可能な材料。
【請求項３９】
前記移植可能な材料が、請求項１４、請求項１５、請求項２１または請求項２２に記載の脱分化した、プログラム可能な幹細胞または請求項３３〜請求項３５に記載の標的細胞を含む、人工的キャリア材料および／または生物学的キャリア材料であることを特徴とする、請求項３６に記載の移植可能な材料。  
【請求項４０】
前記キャリア材料が、人体中への導入のためのバッグまたはチャンバであることを特徴とする、請求項３９に記載の移植可能な材料。
【請求項４１】
インスリンの供給のための人工島細胞ポートチャンバとしての使用のための薬学的構築物の生成のための、請求項３３に記載の島細胞を含む請求項４０に記載のバッグまたはチャンバの使用。
【請求項４２】
手術後の乳房構築のためならびに形成矯正および／または美容矯正の場合に使用するための、薬学的構築物の製造のための請求項３３に記載の脂肪細胞を含む請求項４０に記載のバッグまたはチャンバの使用であって、該薬学的構築物は、脂肪細胞で満たした人工ポリマーを含む、使用。
【請求項４３】
請求項３６または請求項４０に記載の移植可能な材料であって、請求項３３に記載の分化した単離された標的体細胞を含む、半透性のポートチャンバ系であることを特徴とする、移植可能な材料。
【請求項４４】
内分泌疾患、代謝病または止血性疾患のインビボにおける処置のための薬学的構築物の製造のための、請求項４３に記載の半透性のポートチャンバ系の使用。
【請求項４５】
ヒト単球起源の脱分化した、プログラム可能な幹細胞の生成のための、Ｍ−ＣＳＦおよびＩＬ−３の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（説明）
本発明は、ヒト単球に由来する、成人の脱分化したプログラム可能な幹細胞ならびに、それらの製造および体細胞と体組織を製造するためのその使用に関する。本発明の特に好ましい実施形態に従って、これらの細胞は、自己由来のヒト幹細胞、すなわち、起源細胞から製造された幹細胞および／またはこの幹細胞から製造された体細胞によって処置されるべき患者に由来する単球を起源に持つ、細胞である。
【背景技術】
【０００２】
当該分野において、用語「幹細胞」とは、（ａ）自己再生能力、ならびに（ｂ）その非対称的に分割する能力に起因する、少なくとも１つ、およびしばしば多くの専門化した細胞型を形成する能力を有する細胞をいう（Ｄｏｎｏｖａｎ，Ｐ．Ｊ．、Ｇｅａｒｈａｒｔ，Ｊ．、Ｎａｔｕｒｅ  ４１４：９２〜９７（２００１）を参照のこと）。用語「多能性の（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）」とは、本質的にヒトおよび動物の体の全ての可能な細胞型に分化させ得る幹細胞をいう。これまでのところ、このような幹細胞は、胚性組織または胚性の癌（精巣腫瘍）から得られるのみであった（Ｄｏｎｏｖａｎ，Ｐ．Ｊ．、Ｇｅａｒｈａｒｔ，Ｊ．、同じ箇所を参照のこと）。胚性幹細胞の使用は、広範囲にわたる公的な議論の対象であり（特にドイツにおいて）、極めて問題があると考えられている。胚性幹細胞に関連する倫理的問題および法的問題に加えて、これらの細胞の治療的使用もまた、困難に直面している。もともと、胚性幹細胞は、これらの細胞から発生した分化細胞または分化組織（以降では、体性標的細胞または体性標的組織という）の潜在的レシピエントに対して、異質であるドナー生体から得られる。そのため、これらの標的細胞は、拒絶応答という形態で、潜在的レシピエントに急速な免疫学的応答を引き起こすことが予測される。
【０００３】
幹細胞はまた、成人の異なる組織から、すなわち分化した個体から単離され得る。当該分野では、このような幹細胞は、「多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）成人幹細胞」といわれる。体内で、それらは、組織の再生および組織の恒常性において、役割を果たしている。胚性多能性幹細胞と成人多能性幹細胞との間の本質的な違いは、それぞれの細胞から得られ得る分化組織の数である。これはおそらく、多能性幹細胞は、精子細胞または精子を生産し得る細胞に由来し、一方で成人多能性幹細胞は、精子を生産し得ない成人個体の体または体幹に由来するという事実に起因する（Ｄｏｎｏｖａｎ，Ｐ．Ｊ．、Ｇｅａｒｈａｒｔ，Ｊ．、同じ箇所、９４頁を参照のこと）。
【０００４】
しかし、成人の幹細胞の取得と使用に関する実際の問題は、このような細胞の希少性にある。従って、幹細胞は、骨髄ではほんの１：１０，０００、末梢血液中では１：２５０，０００、および肝臓では１：１００，０００しか存在しない。そのため、このような幹細胞の取得は、患者にとって非常に費用がかかり、ストレスがかかる。さらに、臨床的治療のために必要な大量の細胞の生成は、これまでのところ、適切な費用で行うことはほとんど不可能である。
【０００５】
このことは、皮膚細胞、筋肉細胞、心筋細胞、肝臓細胞、島細胞、神経細胞、ニューロン、骨細胞、軟骨細胞、内皮細胞および脂肪細胞などが置き換えられるべき枠組みの範囲内での「組織工学」の形態で、または細胞治療として、破壊された組織を処置する可能性についての一定に増加し続けている必要性とは対照的である。
【０００６】
この関連において、西洋世界の全住民の年齢および疾患プロフィールの予測可能な発達は決定的であり、それにより、米国やカナダを含む西ヨーロッパの全住民の健康分野および治療分野において、今後１０年以内に徹底的な転換点が予測される。ドイツ連邦共和国のみでは、人口統計学的な発達は、２０１５年までに、４５〜６４歳のグループの人口は２１％の増加をし、６５歳以上のグループは２６％の増加をすることを、示唆している。これは、患者の構造および処置を必要とする疾患範囲において、変化を生じさせるはずである。予測されるように、心臓−循環器系の疾患（高血圧、心筋梗塞）、動脈硬化および代謝疾患に起因する脈管疾患、代謝疾患（例えば、糖尿病）、肝臓代謝における疾患、腎臓病および加齢に関連する退化による骨格系の疾患、ならびに神経細胞およびグリア細胞の損失による大脳の変性疾患が増加し、革新的な処置概念を必要とする。
【０００７】
これらの事実によって、組織（肝臓、骨、軟骨、筋肉、皮膚など）の代表的な分化細胞へとプログラムされ得る幹細胞を得るための、参加する専門家による国内的な研究開発および国際的な研究開発の巨大な努力が、説明される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そのため、本発明が解決しようとする課題は、利用可能な成人幹細胞を製造する工程にある。成人幹細胞の生成は、倫理的問題および／または法的問題を生じることが無い。成人幹細胞は、計画される治療的使用において、必要な量を正当な製造費ですぐに利用することが可能である。そして、成人幹細胞は、「細胞的治療薬」として使用される場合、問題の患者において、細胞の拒絶に関する副作用または言及するほどの副作用を起こさず、そして腫瘍、特に悪性腫瘍の誘導を起こさない。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明に従って、この問題は、ヒト単球から脱分化したプログラム可能な細胞（本発明の目的のために、以降「幹細胞」という）を製造することにより、解決される。用語「脱分化」は、当業者にとっては周知である（例えば、Ｗｅｉｓｓｍａｎ  Ｉ．Ｌ．、Ｃｅｌｌ  １００：１５７〜１６８、図４、（２０００）を参照のこと）。それは、成人のすでに専門化（分化）した体細胞を幹細胞の状態、すなわち、逆に多くの細胞型に移転し得る（プログラムされ得る）細胞に退行させることを表す。驚くべきことに、本発明に従うプロセスは、単球の脱分化を誘導することが、実証された。この方法により生産された幹細胞は、非常に多くの種々の標的細胞／標的組織に、変形され得（プログラムされ得）る（実施例を参照のこと）。本発明に従う幹細胞は、分化した単球の特徴的なＣＤ１４表面抗体に加えて、代表的な多能性マーカーＣＤ９０、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３およびＣＤ１３５のうちの少なくとも１つ、好ましくは２つまたは３つを発現する。特定の好ましい様式において、本発明に従って製造された幹細胞は、ＣＤ１４表面抗体ならびに４つの多能性マーカーＣＤ９０、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３およびＣＤ１３５を発現する（実施例２、表１を参照のこと）。好ましくは、本発明の幹細胞は、膜結合型の単球特異的表面抗体ＣＤ１４ならびに、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３およびＣＤ１３５からなる群から選択される少なくとも１つの多能性マーカーを発現する。より好ましくは、本発明の幹細胞は、少なくとも１つの多能性マーカーＣＤ１２３および／またはＣＤ１３５と組み合わせて、ＣＤ１４抗原を有する。３％未満、好ましくは１％未満の本発明に従う幹細胞が、ＣＤ３４抗原を発現する。最も好ましくは、本発明の幹細胞は、ＣＤ３４抗原を発現しない。このように、初めて成人幹細胞が利用可能となり、この幹細胞は、短時間以内に、好ましくは自己の組織へ再プログラムされ得る。
【００１０】
本発明に従う幹細胞の生成は、患者にとって、完全に安全であり、自己使用の場合、自己血液提供に匹敵する。通常の治療選択（上を参照）に要求される幹細胞の量（１０８〜１０９細胞）が、費用効率よく、血液の採取後、１０〜１４日以内に利用可能となる。さらに、治療に提供される細胞生産物は、自己使用の場合、細胞およびレシピエントが好ましくは遺伝学的に同一であるので、細胞の拒絶応答に関する免疫学的問題を全く生じない。
【００１１】
本発明に従う幹細胞はまた、動物実験および培養細胞において、単球を起源に持つ細胞（本発明に従う幹細胞が、これから得られる）に起因して、単に予測されるだけの結果である、悪性疾患の発生に関して、危険性はないことが証明されている。
【００１２】
ヒト単球に起源を持つ、脱分化したプログラム可能な幹細胞の製造のための、本発明に従うプロセスの必須の工程として、以下の工程を包含する：
（ａ）ヒト血液からの単球の単離；
（ｂ）マクロファージコロニー刺激因子（以降では、Ｍ−ＣＳＦという）を含む細胞培養培地を含む適切な培養容器において、単球を増殖させる工程；および
（ｃ）インターロイキン−３（ＩＬ−３）の存在下で、単球を培養する工程；および
（ｄ）細胞を培養培地から分離することにより、脱分化したプログラム可能なヒト幹細胞を得る工程。
【００１３】
本プロセスの特に好ましい実施形態に従って、工程ｂ）において、Ｍ−ＣＳＦおよびＩＬ−３は、同時に細胞培地に加えられる。
【００１４】
しかし、工程ｂ）において、最初は、単球を増殖させるためにＭ−ＣＳＦを細胞培地に加えるのみであり、そしてその後で細胞培養培地にＩＬ−３を加えることが可能である。
【００１５】
最終的に、工程ｂ）のプロセスはまた、最初に、単球をＭ−ＣＳＦのみを含む細胞培養培地中で増殖させ、次いで、培地を細胞から分離し、ＩＬ−３を含む第２の培地を使用するという方法で、実行し得る。
【００１６】
本発明の好ましい実施形態に従って、工程ｂ）の培養培地は、培養容器の底に接着した細胞から分離され、そして、細胞を底から取り外し、細胞を単離することにより、脱分化したプログラム可能なヒト幹細胞が得られる。
【００１７】
本発明の好ましい実施形態に従って、細胞は、硫黄化合物の存在下でさらに培養される。この培養は、上述の工程ｂ）に続く別の工程で実行され得る。しかし、この培養はまた、培養培地にさらに硫黄化合物を加えることで、好ましくは培養の始めの時点ですでに加えられていることによって、工程ｂ）で実行され得る。
【００１８】
驚くべきことに、本発明に従うプロセスは、単球の脱分化を誘導した。ここで、脱分化の結果として生じた成人幹細胞は、脱分化した単球に代表的なＣＤ１４表面抗原に加えて、多能性マーカーＣＤ９０、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３およびＣＤ１３５の少なくとも１つ以上、好ましくは全ても発現していた（表１を参照のこと）。好ましくは、本発明の幹細胞は、膜結合型の単球特異的表面抗体ＣＤ１４および、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３およびＣＤ１３５からなる群から選択される少なくとも１つの多能性マーカーを発現する。より好ましくは、本発明の幹細胞は、少なくとも多能性マーカーＣＤ１２３および／またはＣＤ１３５と組み合わせて、ＣＤ１４抗原を有する。本発明に従う幹細胞の３％未満、好ましくは１％未満が、ＣＤ３４抗原を発現する。最も好ましくは、本発明の幹細胞が、ＣＤ３４抗原を発現しない。それぞれのマーカー（表面抗原）の発現は、標準的な免疫アッセイ手順を使用して、それぞれの検出されるべき抗原に特異的な市販の抗体により証明される（実施例２を参照のこと）。
【００１９】
細胞は、増殖プロセスと脱分化プロセスの間、それぞれの培養容器の底に接着するので、脱分化の完了後に、細胞を工程ｂ）の培養培地から分離し、それらを底からはがすことが必須である。本発明の好ましい実施形態に従って、底に接着している細胞を取り外す前に、細胞培地の上清を取り除き、その後で、接着している細胞を、好ましくは新鮮な培養培地でリンスする。リンスの後で、底に接着している細胞に、新鮮な培養培地を再び加え、そして細胞を底から離す工程を行った（実施例１３を参照のこと）。
【００２０】
好ましい実施形態に従って、工程ｃ）の後で工程ｄ）の前に、細胞は、生物学的に十分に許容できる有機溶媒と接触させられる。生物学的に十分に許容できる有機溶媒は、１〜４炭素原子を有するアルコールであり得、エタノールの使用が好ましい。
【００２１】
更なる実施形態において、工程ｃ）の後で工程ｄ）の前に、細胞は、生物学的に十分に許容できる有機溶媒の気相と接触させられる。
【００２２】
取り外しは、さらにまた、機械的に実行され得るが、（例えば、トリプシンの使用による）酵素的取り外しプロセスが好ましい。
【００２３】
このようにして得られた脱分化したプログラム可能な幹細胞は、培地中で自由に浮かんでおり、直接的に再プログラムするプロセスに移すことも可能であるし、または数日間、培養倍地中に置いておくことも可能である。後者の場合、プログラム可能性の成熟前の損失を避けるために、好ましくは、サイトカインまたはＬＩＦ（赤白血球病（ｌｅｕｋａｅｍｉａ）阻害因子）が培地に加えられる（Ｄｏｎｏｖａｎ，Ｐ．Ｊ．、Ｇｅａｒｈａｒｔ，Ｊ．、ｌｏｃ．ｃｉｔ．、Ｐａｇｅ９４を参照のこと）。最終的に、細胞は、プログラム可能性を損なうことなく、貯蔵のために深く凍結され得る。
【００２４】
本発明に従う幹細胞は、膜結合型の単球特異的ＣＤ１４表面抗原に加えて、ＣＤ９０、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３およびＣＤ１３５からなる群から選択される少なくとも１つの多能性マーカーを表面に有する点で、これまでに公知である胚に起源を持つ多能性幹細胞、および異なる組織に由来する公知の成人幹細胞とは異なる。好ましくは、本発明の幹細胞は、膜結合型の単球特異的表面抗原ＣＤ１４ならびに、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３およびＣＤ１３５からなる群から選択される少なくとも１つの多能性マーカーを有する。より好ましくは、本発明の幹細胞は、少なくとも１つの多能性マーカーＣＤ１２３および／またはＣＤ１３５と組み合わせて、ＣＤ１４抗原を有する。本発明に従う幹細胞の３％未満、好ましくは１％未満が、ＣＤ３４抗原を発現する。最も好ましくは、本発明の幹細胞が、ＣＤ３４抗原を発現しない。
【００２５】
本発明に従うプロセスを使用して生産される幹細胞は、任意の体細胞に再プログラムされ得る。幹細胞を再プログラムするプロセスは、当該分野では公知である（例えば、Ｗｅｉｓｓｍａｎ  Ｉ．Ｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：１４４２〜１４４６（２０００）およびＩｎｓｉｇｈｔ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ａｒｔｉｃｌｅｓ  Ｎａｔｕｒｅ  ４１４：９２〜１３１（２００１）、ならびにハンドブック「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、Ａｔａｌａ，Ａ．、Ｌａｎｚａ，Ｒ．Ｐ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ  ０−１２−４３６６３６−８；学会カタログ図書館カード番号２００１８８７４７のを参照のこと）。
【００２６】
本発明に従う幹細胞の再プログラムによって得られた、独立した体性の標的分化細胞および／または体性の標的分化組織は、さらに単球の膜結合型ＣＤ１４分化マーカーを有する。さらに、本発明に従うこれらの体性標的細胞および／またはこれらの体性標的組織の３％未満、好ましくは１％未満が、ＣＤ３４抗原を発現する。最も好ましくは、これらの細胞が、ＣＤ３４抗原を発現しない。実施例１１で示すように、本発明に従う幹細胞に由来する肝細胞は、単球に代表的なＣＤ１４表面マーカーを発現するが、一方で、同時にそれらは、肝細胞に代表的なアルブミンタンパク質を生産する。そのために、本発明に従う幹細胞に由来する肝細胞は、天然の肝細胞とは区別され得る。同様に、膜結合型ＣＤ１４表面マーカーが、本発明に従う幹細胞に由来するインスリン生産細胞上で検出された（実施例９）。
【００２７】
本発明の１つの実施形態において、脱分化したプログラム可能な幹細胞は、標的細胞および標的組織のインビトロでの生産のために使用され得る（実施例を参照のこと）。そのために、本発明に従う幹細胞の分化（再プログラム化）により得られ、そして膜結合型ＣＤ１４表面抗原を有する独立した分化組織細胞もまた、本発明の対象である。
【００２８】
本発明に従う幹細胞は、それぞれの標的細胞および／またはそのフラグメントがインキュベートされている（実施例６〜８を参照のこと）培養培地の上清を含む培地中で幹細胞を増殖させることにより、好ましくは、インビトロで単純かつ確実に所望の標的細胞（例えば、肥満細胞（実施例６を参照のこと）、神経細胞およびグリア細胞（実施例３を参照のこと）、内皮細胞（実施例５を参照のこと）、ケラチノサイト（実施例８を参照のこと）、肝細胞（実施例７を参照のこと）および島細胞（ランゲルハンス島、実施例９を参照のこと））に分化させられる。このような上清は、以降は「標的細胞条件付き培地」という。
【００２９】
そのために、本発明に従う脱分化した幹細胞の分化（プログラム化）のために、以下の手順が、使用され得る：
ａ）所望の標的細胞を含むか、またはそれから構成される組織を破壊する；
ｂ）組織細胞（標的細胞）および／またはこれらのフラグメントを得る；
ｃ）標的細胞および／またはこれらのフラグメントを適切な培養培地でインキュベートする；
ｄ）インキュベーションの間およびインキュベーションの後で、培養培地の上清を収集して、標的細胞条件付き培地とする；ならびに
ｅ）脱分化した幹細胞の所望の標的細胞または標的組織への再プログラム／分化のために、幹細胞を標的細胞条件付き培地の存在下で、増殖させる。
【００３０】
標準的な細胞培養培地が、培養培地として使用され得る（実施例を参照のこと）。培地は、好ましくは、成長因子（例えば、上皮増殖因子）を含む。
【００３１】
標的細胞および／またはこれらのフラグメント（「細胞ペレット」）のインキュベーションは、５〜１５日、好ましくは１０日にわたって、実行される。上清、すなわち標的細胞条件付き培地は、好ましくは、２〜４日ごとに取り除かれ、新鮮な培地に置き換えられる。このようにして集められた上清は、無菌条件下で、別々に濾過されるか、または集められ、およそ−２０℃で保存し得るし、あるいは幹細胞をプログラムするために、直接使用され得る。上述のように、幹細胞の所望の標的細胞へのプログラム化は、それぞれの標的細胞で条件付けられた培地の存在下で、幹細胞を増殖させることにより、実行される（実施例を参照のこと）。成長培地は、好ましくは、標的細胞に特定の成長因子（例えば、「肝細胞成長因子」または「ケラチノサイト増殖因子」）をさらに含む（実施例を参照のこと）。
【００３２】
本発明の１つの実施形態において、本発明に従う脱分化したプログラム可能な幹細胞は、標的細胞および標的組織をインビボで生産するための薬学的組成物の生産のために、そのまま使用される。
【００３３】
このような薬学的調剤は、生理学的に十分に許容できる培地に懸濁させた本発明に従う幹細胞を含み得る。適切な培地は、例えば、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）または２０％のヒトアルブミン溶液を有する生理食塩水などである。
【００３４】
これらの薬学的製剤は、本発明に従う生存する脱分化したプログラム可能な幹細胞を含み、これらの幹細胞は、表面にＣＤ１４表面マーカーおよび多能性幹細胞マーカーＣＤ９０、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３および／またはＣＤ１３５の少なくとも１つ以上を、調剤中に存在する総細胞数に対して、少なくとも１、２、３、４、５、６、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０％、好ましくは６０％または７０％、特に好ましくは８０％または９０％および極めて好ましくは１００％の量で有し、必要に応じて、薬学的に十分に許容できるアジュバントおよび／またはキャリア物質をさらに有する。
【００３５】
幹細胞調剤は、本発明に従う生存する脱分化したプログラム可能な幹細胞を含み得、これらの幹細胞は、表面にＣＤ１４表面マーカーおよび多能性幹細胞マーカーＣＤ９０、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３および／またはＣＤ１３５の少なくとも１つ以上を、調剤中に存在する総細胞数に対して、少なくとも１、２、３、４、５、６、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８または５９％、好ましくは少なくとも６０％の量で有する。細胞によって十分に許容される細胞培地または輸送培地（例えば、ＰＢＳまたはＲＰＭＩなど）中の細胞懸濁液または深く凍らせた適切な貯蔵培地（例えば、５０％ヒトアルブミンおよび１０％ＤＭＳＯを含むＲＰＭＩ）中の細胞調剤が、好ましい。
【００３６】
生きている細胞数および、従って、上述の組成物中のこれらの割合は、「トリパンブルー色素排除技術」によって、光学的に決定され得る。これは、生存細胞は、この染料の使用によって非生存細胞と光学的に区別され得るためである。
【００３７】
一般的に、十分な数の機能的幹細胞が存在しても、薬学的調剤中に存在する細胞のいくつかが、本発明に従う脱分化したプログラム可能な幹細胞の基準を満たしていない場合、臨床的使用には不適当である。しかし、このような調剤において、非脱分化細胞を、本発明に従う脱分化した細胞に代表的な表面マーカーに基づいて、当該分野で公知のプロセスの手段により、除去し、本質的に純粋な形態で所望の細胞を含むようにすることも可能である。適切なプロセスの１つの例が、「免疫磁性ビーズ選別」である（Ｒｏｍａｎｉｅｔａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９６：１３７〜１５１（１９９６）を参照のこと）。
【００３８】
幹細胞は、特定の細胞型の細胞群と直接接触させることで、同時にインビボでこの型の細胞に分化させる能力を、さらに有する。再分化され得る細胞を使用する組織生産のプロセス（「組織工学」）は、当該分野で公知である。例えば、Ｗａｎｇ，Ｘ．ら（「Ｌｉｖｅｒ  ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ  ａｄｕｌｔ  ｍｏｕｓｅ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ」Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５８（２）：５７１−５７９（２００１））は、ＦＡＨ（フマリルアセト酢酸加水分解酵素）欠失マウスにおいて、マウスの膵臓の特定の成人細胞でさえも、肝細胞に変形し得、この肝細胞が、これらの動物における代謝的欠損を完全に補い得ることを示した。さらなる例が、Ｌａｇａｓｓｅら、「Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｃａｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ  ｉｎｔｏ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、６（１１）：１２２９−１２３４（２０００）の実験である。著者らは、骨髄由来の造血幹細胞が、ＦＡＨ欠失マウスへのインビボで移転させた後で、肝細胞に変形し得、そこで代謝的欠損を完全に補い得ることを示している。Ｇｒｏｍｐｅ  Ｍ．による総説（Ｇｒｏｍｐｅ  Ｍ．、「Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｌｉｖｅｒ  Ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ」Ｈｕｍ．Ｃｅｌｌ、１２：１７１〜１８０（１９９９））もまた参照のこと。
【００３９】
本発明に従う脱分化した幹細胞のインビボでの分化についての適用の特に好ましい形態は、細胞集団との直接接触により幹細胞のその場での分化を可能にするような、体内の１つの特定の細胞集合体への幹細胞の注射、幹細胞の注入または幹細胞の移植である。注射または注入に関して、細胞は、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に入れて、投与され得る。
【００４０】
これに関連する適切な例のうちの好ましい例が、肝硬変、膵不全、急性腎不全または慢性腎不全、ホルモンの機能低下、心筋梗塞、肺塞栓、脳卒中または皮膚の傷害である。
【００４１】
そのために、本発明の好ましい実施形態は、肝硬変、膵不全、急性腎不全または慢性腎不全、ホルモンの機能低下、心筋梗塞、肺塞栓、脳卒中または皮膚の傷害の処置を目的とする種々の薬学的組成物の生産のための、脱分化したプログラム可能な幹細胞の使用である。
【００４２】
本発明に従う幹細胞から得られ得る標的細胞の治療的使用において、多くの概念が使用可能である（上記のＳｃｉｅｎｃｅ  ２８７：１４４２〜１４４６（２０００）およびＮａｔｕｒｅ  ４１４：９２〜１３１（２００１）を参照のこと）。
【００４３】
さらに好ましい適用は、本発明に従う脱分化した幹細胞の腹膜への注射に関する。注射された幹細胞は、それを取り囲む細胞の影響に起因して、そこで腹膜細胞へ分化する。腎不全の患者の腹膜透析の例において、これらの細胞は、半浸透膜を介して腎機能を引き継ぎ得、そして腎臓に依存するゴミ物質を腹膜へ放出し得る。ここで、ゴミ物質は、透析を介して腹膜から除去される。
【００４４】
したがって、幹細胞の再プログラムによって得られ、膜結合ＣＤ１４抗原によって特徴付けられる、単離した体性標的分化細胞および／または体性標的分化組織もまた、本発明の対象である。これらの体性標的細胞および／または体性標的組織は、好ましくは、脂肪細胞、神経細胞およびグリア細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、肝細胞および島細胞を含む。
【００４５】
しかし、細胞はまた、器官に直接的に導入され、再構築され得る。導入は、対応する分化した細胞または分化し得る細胞で覆われたマトリクス構築物を介して実行され得る。マトリクス構築物は、一般的に生分解性であり、そのため、新たに導入された細胞が、そこに存在する細胞と共に増殖する間に、体内から消える。この観点から、例えば、島細胞、肝細胞、脂肪細胞、皮膚細胞、筋肉細胞、心筋細胞、神経細胞、骨細胞、内分泌細胞などの形態の細胞移植、好ましくは自己移植が、再構築（例えば、器官の部分的な外科的切除の再構築）、修復（例えば、外傷後の修復）または支持的使用（例えば、器官機能の欠失または不全の症例における使用）の補償のために考慮される。
【００４６】
本発明に従う幹細胞およびそれらから得られる標的細胞が、移植可能材料をコーティングして生体適合性を高めるために、さらに使用され得る。従って、分化したプログラム可能な幹細胞または標的体細胞および／もしくは標的組織でコートされた移植可能材料もまた、本発明の対象である。本発明の１つの実施形態に従って、これらの移植可能材料は、プロテーゼである。特に好ましい実施形態において、これらのプロテーゼは、心臓弁、血管のプロテーゼ、骨のプロテーゼおよび関節のプロテーゼである。
【００４７】
移植可能材料はまた、分化したプログラム可能な幹細胞または標的体細胞を含む、人工キャリア材料および／または生物学的キャリア材料であり得る。この点に関して、このキャリア材料はまた、人体への挿入のためのバッグまたはチャンバでもあり得る。
【００４８】
本発明の１つの実施形態において、本発明に従って分化した体細胞である膵島細胞を含むこのようなバッグは、インスリン供給のための人工膵島細胞ポートチャンバとして使用される、薬学的構築物の生成のために使用される。
【００４９】
本発明のさらなる実施形態に従い、本発明に従って分化した体細胞である脂肪細胞を含むバッグまたはチャンバは、外科手術後の胸部の構築のため、そして形成矯正および／または美容矯正がさらに必要な場合のための薬学的構築物として、脂肪細胞で満たされた人工ポリマーの生成のために使用される。
【００５０】
さらに、広範な種々の起源の内分泌細胞を含む半透過性ポートチャンバシステムが、内分泌障害、代謝障害または造血障害の治療のために、インビボで使用され得る。このような内分泌細胞の例は、チロキシン、ステロイド、ＡＤＨ、アルドステロン、メラトニン、セロトニン、アドレナリン、ノルアドレナリン、ＴＳＨ、ＬＨ、ＦＳＨ、レプチン、コレシストキニン、ガストリン、インスリン、グルカゴン、または凝固因子（Ｃｌｏｔｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ）を産生する細胞である。
【００５１】
従って、分化した単離体標的細胞を含む、半透過性ポートチャンバシステムである移植可能材料もまた、本発明の対象である。これらの半透過性チャンバシステムは、本発明の異なる実施形態において、内分泌障害、代謝障害または造血障害のインビボでの治療のための薬学的構築物の生成のために、使用される。
【００５２】
本発明に従う、幹細胞から得られた標的細胞は、さらに、例えば、解毒反応を行うための体外のバイオリアクターにおける細胞培養として使用され得る。この使用の形態は、急性状態の場合（例えば、肝細胞バイオリアクターとしての急性肝不全の場合）に特に関連する。
【００５３】
上述の構築物の生成および対応する治療プロセスの実施は、当該分野ですでに幾度も記載されている。例えば、以下の総説を比較のこと：Ｌａｌａｎ，Ｓ．ら「Ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｎ  ｓｕｒｇｅｒｙ」Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｓｕｒｇ．２５：１４５８−１４６６（２００１）；Ｎａｓｓｅｒｉ，Ｂ．Ａ．ら「Ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ：ａｎ  ｅｖｏｌｖｉｎｇ  ２ｌｓｔ−ｃｅｎｔｕｒｙ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｏ  ｐｒｏｖｉｄｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ」Ｓｕｒｇｅｒｙ  １３０：７８１−７８４（２００１）およびＦｕｃｈｓ  Ｊ．Ｒ．ら，「Ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｌｎｇ：ａ  ２１ｓｔ  ｃｅｎｔｕｒｙ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｔｏ  ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ」Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．７２：５７７−５９１（２００１）。
【００５４】
最後に、本発明に従う多能性幹細胞は、トランスジェニック改変およびトランスジェニック治療の分野に、広く広がる。本発明の好ましい実施形態に従い、分化したプログラム可能な幹細胞自体もしくは体標的細胞および／または最終的にこれらから分化した標的組織は、１つ以上の遺伝子によってトランスフェクトされる。このようにして、特定の器官（例えば肝臓または腎臓など）の代謝を維持するために必要な１つ以上の遺伝子が、回復され、そして／または支持されるか、あるいは再導入される。例えば、これに由来する幹細胞または肝細胞は、ＦＡＨ（フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ（ｆｕｍａｒｏｙｌａｃｅｔｏａｃｅｔａｔｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ））遺伝子でトランスフェクトされ得る。ＦＡＨ欠損マウスモデルにおいて、１０００個のＦＡＨ陽性ドナー肝細胞の脾臓内注射は、肝臓を６〜８週間後に完全に再増殖（ｒｅｐｏｐｕｌａｒｉｓｅ）させ、そして肝硬変に至る代謝欠損を完全に補うために十分であった（Ｇｒｏｍｐｅ，Ｍ．ら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１２：２６６  ｆｆ．（１９９６）を参照のこと）。
【００５５】
同様に、幹細胞のトランスフェクションまたはプログラミングにより幹細胞から得られたそれぞれの標的細胞（例えば、造血細胞、肝細胞、卵巣細胞、筋肉細胞、神経細胞、ニューロン、グリア細胞、軟骨細胞または骨細胞など）の、「多剤耐性遺伝子」によるトランスフェクションにより、拡張された根本的な化学治療が、悪性疾患の場合に、対応する造血細胞再構築可能にされ得るか、または、放射線耐性が、生成され得る。
【００５６】
本発明は、以下のように詳細に説明される：
本発明に従うプロセスの出発物質は、ヒト血液由来の単球である。これらは、好ましくは自己単球（すなわち、本発明に従う幹細胞またはそれから産生される標的細胞により処置されるべき患者の血液に起源する単球）である。
【００５７】
単球を得るため、抗凝固剤を用いた公知の様式での標準的処置の後、血液は、まず、好ましくは遠心分離により、血漿ならびに白血球および赤血球に分離され得る。遠心分離の後、血漿は、上清において見出される；この下には、白血球全てを含む層が存在する。この層はまた、「バフィコート」とも呼ばれる。この下には、赤血球（ヘマトクリット）を含む相が存在する。
【００５８】
次いで、「バフィコート」層は、単離され、そして、例えば、公知のプロセスを使用する遠心分離によって、単球を得るために、分離される。好ましい改変型プロセスに従って、変異の「バフィコート」層は、リンパ球分離培地上（例えば、Ｆｉｃｏｌｌ  Ｈｙｐａｑｕｅ）にコーティングされ、そして遠心分離される。さらなる遠心分離およびリンスにより、単球画分が、血液から得られる（実施例１を参照のこと）。
【００５９】
全血から単球を得るための代替のプロセスの例は、「蛍光活性化細胞ソーティング（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ）」（ＦＡＣＳ）、「免疫磁気ビーズソーティング（Ｉｍｍｎｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄ  Ｓｏｒｔｉｎｇ）」（Ｒｏｍａｎｉら．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９６：１３７−１５１（１９９６）を参照）および「磁気活性化細胞ソーティング（Ｍａｇｎｅｔｉｃ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ）」（ＭＡＣＳ）またはいわゆる「ロゼッティングプロセス（Ｒｏｓｅｔｔｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｓｓ）」（Ｇｍｅｌｉｇ−Ｍｅｙｌｉｎｇ，Ｆ．ら「Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｅｐａｒａｔｉａｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ａｎｄ  ｎｏｎ−Ｔ  ｃｅｌｌｓ」Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ．３３：５−８（１９７７）を参照）である。
【００６０】
本発明に従って、単球は、任意の単離されたヒト血液から得られ得、そしてこの血液は、脾臓、リンパ節または骨髄のような器官に由来し得る。器官から単球を得ることは、ヒト血液からの単球の分離が、例えば貧血または白血病の場合に、不可能であるかまたは十分な量でない場合に特に考慮され、そして、同種異系の使用の場合、多器官除去のフレームワーク範囲内であれば、脾臓が、単球単離の供給源として、使用可能である。
【００６１】
本発明に従った十分な量の幹細胞の産生のために、最初に単球を増殖させることが必須である。この目的のために、単球に適切な増殖培地が使用され得、ここで、本発明に従い、上記培地は、Ｍ−ＣＳＦ（マクロファージコロニー刺激因子）を含む。Ｍ−ＣＳＦ（ＣＳＦ−１とも呼ばれる）は、単球、線維芽細胞および内皮細胞によって産生される。培養培地中のＭ−ＳＣＦの濃度は、２〜２０μｇ／ｌ、好ましくは４〜６μｇ／ｌ、そして特に好ましい様式においては５μｇ／ｌの量であり得る。
【００６２】
単球上で、Ｍ−ＣＳＦは、特定のｃ−Ｆｍｓレセプター（ＣＳＦ−１Ｒとも呼ばれる）に結合する。このｃ−Ｆｍｓレセプターは、専ら単球の表面上に存在し、Ｍ−ＣＳＦとのみ結合する（Ｓｈｅｒｒ  Ｃ．Ｊ．ら，Ｃｅｌｌ  ４１（３）：６６５−６７６（１９８５））。Ｍ−ＣＳＦとレセプターとの間の特定の相互作用は、単球の分裂を誘導し、単球が培養される培地は、レセプターに結合してこれを活性化し得る、Ｍ−ＣＳＦまたはそのアナログを含む。ＧＭ−ＳＣＦ（顆粒球−単球コロニー刺激因子）およびＧ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）のような他の増殖因子は、ｃ−Ｆｍｓレセプターに対する親和性を欠いているために、単球の分裂を誘導し得ないため、不適である。
【００６３】
このプロセスの特に好ましい実施形態において、Ｍ−ＳＣＦおよびＩＬ−３は、このプロセスの工程（ｂ）において、同時に細胞培地に加えられる。培地中のＩＬ−３の濃度は、０．２〜１μｇ／ｌ、好ましくは０．３〜０．５μｇ／ｌ、そして特に好ましい様式においては０．４μｇ／ｌの量であり得る。
【００６４】
しかし、工程（ｂ）において最初にＭ−ＣＳＦのみを細胞培地に加え、そしてその後、ＩＬ−３のみを加えることもまた、可能である。
【００６５】
さらなる実施形態において、培養容器は、最初はＭ−ＣＳＦのみを含む細胞培地のみを含み、次いで、細胞の分離後、ＩＬ−３を含む第２細胞培地により置換される。
【００６６】
本発明の好ましい実施形態に従って、このプロセスの工程（ｂ）における細胞は、硫黄化合物（例えば、メルカプト化合物（少なくとも１つの炭化水素基が硫黄に結合され、そして上記の炭化水素基は、１つ以上の官能基と置換され得る））の存在下でさらに培養される。メルカプト化合物は、炭化水素基に結合される少なくとも１つのメルカプト基（−ＳＨ）を有する化合物として定義される。このような硫黄化合物のさらなる使用により、単球起源の細胞の分化によって得られた、１つ以上の幹細胞マーカー（ＣＤ９０、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３およびＣＤ１３５）を発現する多数の幹細胞が、増加し得る。
【００６７】
官能基は、好ましくはヒドロキシル基および／またはアミン基である。特に好ましい実施形態において、硫黄化合物は、２−メルカプトエタノールである。さらに好ましい実施形態において、硫黄化合物は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である。
【００６８】
使用される硫黄化合物の量は、硫黄に対して、約４〜約２００μｍｏｌ／ｌの範囲であり得る。約１００μｍｏｌ／ｌが、好ましい。
【００６９】
２−メルカプトエタノールが使用される場合、培地は、約３μｌ〜約１３μｌ、好ましくは約７μｌ／ｌの２−メルカプトエタノールを含むべきである。
【００７０】
ＩＬ−３および必要に応じて、硫黄化合物による処理は、Ｍ−ＣＳＦを用いた培養による単球の増殖と同時もしくはその後に行われ得、増殖と同時のＩＬ−３および必要に応じた硫黄化合物を用いた処理が、好ましい。増殖および分化は、一緒になって、１０日以内続くべきであり、そして、ＩＬ−３および必要に応じた硫黄化合物を用いた処理は、少なくとも３日、多くとも１０日、好ましくは６日に渡って行われるべきである。
【００７１】
従って、本発明に従い、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＬ−３および好ましくはメルカプト化合物を同時に含む培地における単球の培養の場合、培養容器の底から細胞を剥がすまでの培養期間は、少なくとも３日で多くとも１０日であり、好ましくは５〜８日であり、そして特に好ましくは６日である。
【００７２】
好ましい実施形態において、本発明のプロセスが、工程（ｂ）において単球が最初にＭ−ＣＳＦだけを含む培地において増殖されるような方法で実行される場合、このような培地中での増殖は、少なくとも２日間、好ましくは３日間、特に好ましくは４日間、最長７日間にわたって行われ得、そして、ＩＬ−３および必要に応じたメルカプト化合物の存在下でのその後の培養は、さらに３日に渡って行われ得る。しかし、好ましくは、Ｍ−ＣＳＦだけを含む培地における培養が、最長４日しか続かない場合、その後、ＩＬ−３および必要に応じたメルカプト化合物の存在下の培養が、３日間、４日間、５日間、または６日間に渡って続く。
【００７３】
実施例２および実施例１３で記載のように、増殖および脱分化の両方を実行するため、単球は、単離後、Ｍ−ＣＳＦ、およびＩＬ−３ならびに好ましくは硫黄化合物（特にメルカプトエタノールまたはＤＥＭＳＯ）を含む、培地中に移される。
【００７４】
これらの接着特性に起因して、単球および単球から産生された幹細胞は、プロセスの間、それぞれの培養容器の底に接着している。本発明の好ましい実施形態に従って、培地は、工程（ｃ）の後、培養容器の底に接着している細胞から分離され、廃棄される。好ましくは、その後、培地と共に底に接着している細胞をリンスする工程が続き、次いで、細胞を新鮮な培地で覆う（実施例１３を参照）。
【００７５】
この工程において、上記の増殖および分化の培地は、培地ならびに標準細胞培地（例えばＲＰＭＴ）として使用され得る。
【００７６】
本発明のさらに好ましい実施形態に従い、プロセスの最後において培地中に自由に浮遊する幹細胞の数を増加させるために、細胞は、工程（ｃ）の最後でかつ工程（ｄ）の前に、生物学的に許容性の良好な有機溶媒中と接触される。溶媒の量は、１０μｌ〜１ｍｌの範囲に及び得る。これは、好ましくは１〜４個の炭素を有するアルコールであり、エタノールの添加が特に好ましい。特に好ましい実施形態に従い、細胞は、上記で規定した生物学的に許容性の良好な有機溶媒の気相（好ましくはエタノールの気相）と接触される（実施例２を参照）。有機溶媒（特に好ましくはエタノール気相）への露出時間は、４〜１２時間であるべきであり、好ましくは８〜１０時間である。
【００７７】
本発明に従うプロセスは、好ましくは、培養容器中で実行され、この表面は、以前にウシ胎仔ウシ血清（ＦＣＳ）でコーティングされている（実施例２を参照）。あるいは、男性ドナー由来のヒトＡＢ血清もまた、使用され得る。ＦＣＳによるコーティングは、使用前に培養容器の表面をＦＣＳで覆い、しばしの露出時間（特に２〜１２時間、特に好ましい様式においては７時間）の後、表面に接着していないＦＣＳを適切な様式で除去することによって、実行され得る。
【００７８】
有機溶媒を用いた処理が、工程（ｃ）の後（必要に応じて培地を交換した後）に行われる場合、この処理工程において細胞は既にある程度剥がれている。（さらなる）剥離は、例えば、微細な細胞スクレーパー、スパーテル、またはピペットのチップを用いて、機械的に行われ得る（実施例１３を参照のこと）。
【００７９】
このプロセスの好ましい実施形態に従い、完全な剥離は、適切な酵素（例えば、トリプシン）を用いる処理により行われる（実施例２を参照のこと）。細胞は、トリプシン溶液（０．１〜０．０２５ｇ／ｌ、好ましくは０．０５ｇ／ｌ）に、２〜１０分間、３５℃〜３９℃（好ましくは３７℃）で、ＣＯ２存在下で曝される。
【００８０】
次いで、標準的方法によりトリプシン活性をブロックし、そして、工程（ｄ）の終わりに、自由に浮遊する脱分化したプログラム可能な幹細胞は、標準的方法で（例えば、遠心分離され、そして１つの実施形態においては適切な細胞培養物に懸濁されることにより）得られ得る。ここで、それらは利用可能であり、所望の標的細胞に即座に分化させるために適切な培地中（例えば、ＲＰＭＩ中またはＤＭＥＭ中）に懸濁されている。しかし、これらはまた、培地中に数日保存されてもよい。好ましい実施形態において、これらの細胞が、脱分化したプログラム可能な幹細胞として約４８時間以上培養物中で保存される場合、この培地は、サイトカインまたはＬＩＦ因子（白血病阻害因子）を含む（Ｎａｔｕｒｅ  ４１４：９４（２００１，Ｄａｎａｖａｎ，Ｐ．Ｊ．，Ｇｅａｒｈａｒｄｔ．Ｊ．，ｌｏｃ．ｃｉｔ．）を参照のこと）。このような因子を含む培地において、幹細胞は、少なくとも１０日間、脱分化プログラム可能な幹細胞として維持され得る。
【００８１】
好ましい実施形態において、細胞は、液体培地中のより長い保存のために懸濁され、急速冷凍される。生細胞の急速冷凍のためのプロトコールは、当該分野で公知である。Ｇｒｉｆｆｉｔｈ  Ｍ．ら，「Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｃｏｒｎｅａ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」，Ａｔａｌａ  Ａ．，Ｌａｎｚａ  Ｒ．Ｐ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ２００２，第４章，１３１〜１４０頁を、参照のこと。本発明に従う幹細胞の急速冷凍のために好ましい懸濁培地は、ＦＣＳ−含有ＤＭＥＭである（実施例２を参照のこと）。
【００８２】
本発明は、実施例を参照して、以下でさらに例示され、記載される。
【００８３】
実施例で規定されない場合、使用される媒体および物質の組成は、以下の通りである：
１．ペニシリン／ストレプトマイシン溶液：
１ｍｌの生理学的塩化ナトリウム溶液（ＮａＣｌ  ０．９％）あたり、１０，０００単位のペニシリン（ペニシリンＧのナトリウム塩として）および１０００μｇのストレプトマイシン（ストレプトマイシンサルフェートとして）。
２．トリプシン−ＥＤＴＡ
０．５ｇのトリプシンおよび０．２ｇのＥＤＴＡ（４  Ｎａ）／ｌ。
３．インスリン
ヒト、組換え体、Ｅ．ｃｏｌｉ中で産生、約２８単位／ｍｇ。
４．Ｌ−グルタミン含有ＲＰＭＩ  １６４０（１×液体（１１８７５））
ＲＰＭＩ（Ｒｏｓｅｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）培地１６４０は、富化された処方物であり、哺乳動物細胞において、広範に使用され得る。
【００８４】
【表１】
2005521405.tif 000002
５．ＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝食塩水）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．９８：１６７（１９５４）参照：
【００８５】
【表２】
2005521405.tif 000003
６．２−メルカプトエタノール
合成用品質；含有量＞９８％、密度１．１１５〜１．１１６、例えば、Ｍｏｍｏ  Ｊ．ら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．７３：４９６１（１９５１）参照。
【００８６】
７．Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ：
リンパ球分離培地（ショ糖／エピクロロヒドリン−共重合体  Ｍｇ  ４００，０００；密度１．０７７、ジアトリゾエートナトリウムで調製）。
【００８７】
８．レチノイン酸（ｒｅｔｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）
ＰＢＳ  １．５ｍｌ中ビタミンＡ酸（Ｃ２０Ｈ２８Ｏ２）３００μｌ（１ｍＭ相当）。ニューロンおよびグリア細胞のプログラミングのための培地としては、１０ｍｌ培地に１５０μｌ（１０−６Ｍ相当）を使用する。
【００８８】
９．ＤＭＥＭ
ダルベッコ改変イーグル培地（高グルコース）
Ｄｕｌｂｅｃｃｏ，Ｒ．ら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８：３９６（１９５９）；Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｄ．ら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １２：１５８（１９６０）；Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ６：２（１９９３）参照。
【００８９】
１０．Ｌ−グルタミン
液体：２９．２ｍｇ／ｍｌ。
【００９０】
１１．コラゲナーゼＩＩ型
Ｒｏｄｂｅｌｌ，Ｍ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３９：３７５（１９６４）参照。
【００９１】
１２．インターロイキン−３（ＩＬ−３）
Ｅ．ｃｏｌｉからの組換えヒトＩＬ−３（Ｙａｎｇ  Ｙ．Ｃ．ら，Ｃｅｌｌ  ４７：１０（１９８６））；１３３アミノ酸残基（成熟ＩＬ−３を含む）および１３４アミノ酸残基（およそ１：２の比率でメチオニル形態を含む）を含む；計算分子量約１７．５ｋＤ；比活性１×１０３Ｕ／μｇ；（Ｒ＆Ｄ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  Ｎｏ．２０３−ＩＬ）。
【００９２】
１３．マクロファージ−コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）
Ｅ．ｃｏｌｉからの組換えヒトＭ−ＣＳＦ；モノマー（１８．５ｋＤ）として１３５アミノ酸を含む（Ｎ末端メチオニンを含む）；３７ｋＤの分子量のホモダイマーとして存在する；（ＳＩＧＭＡ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  Ｎｏ．Ｍ  ６５１８）。
【００９３】
１４．抗体
実施例において使用される、抗原（ＣＤ１４、ＣＤ３１、ＣＤ９０、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３５）に対する抗体は、市販されている。これらを、以下の供給源から入手した：
ＣＤ１４：ＤＡＫＯ、モノクローナルマウス抗ヒトＣＤ１４、単球、クローンＴＵＥＫ４、コード番号Ｍ  ０８２５、Ｌｏｔ  ０３６、０２．０２．０１版；  
ＣＤ３１：ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、モノクローナルマウス抗ラットＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ−１）、クローンＴＬＤ−３Ａ１２、カタログ番号  ２２７１１Ｄ、０．５ｍｇ；
ＣＤ９０：Ｂｉｏｚｏｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ、  Ｓｅｒｏｔｅｃ、マウス抗Ｈｕｍａｎ  ＣＤｗ９０、クローン番号Ｆ１５−４２−１、ＭＣＡＰ９０、バッチ番号  ０６９９；
ＣＤ１１７：ＤＡＫＯ、モノクローナルマウス抗ヒトＣＤ１１７、ｃ−ｋｉｔ、クローン番号１０４Ｄ２、コード番号Ｍ  ７１４０、Ｌｏｔ  ０１６、０４．０５．００版；  
ＣＤ１２３：Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．、マウス抗ヒトＣＤ１２３抗体、クローン９Ｆ５、カタログ番号ＲＤＩ−ＣＤ１２３−９Ｆ５；  
ＣＤ１３５：Ｓｅｒｏｔｅｃ、マウス抗ヒトＣＤ１３５、ＭＣＡ１８４３、クローン番号ＢＶ１０Ａ４Ｈ２。
【実施例】
【００９４】
（実施例１）
（全血からの単球の分離）
血液凝固を避け、細胞に栄養を与えるため、３チャンババッグセット内の４５０ｍｌの全血を、６３ｍｌの安定化溶液（１リットルのＨ２Ｏにつき、３．２７ｇのクエン酸、２６．３ｇのクエン酸三ナトリウム、２５．５ｇのデキストロース、および２２．２２ｇのジヒドロキシリン酸ナトリウムを含んだ）と混合した。この溶液のｐＨ値は、５．６〜５．８に達した。
【００９５】
次いで、この混合物の「強遠心（ｓｈａｒｐ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）」を行い、血液成分を、４０００ｒｐｍで７分間、２０℃で分離した。これは、血球成分と非血球成分との３層別化を生じた。バッグのセットをこの目的で提供されたプレス機内に挿入することにより、次いで、赤血球をバッグ下部内に押しやり、血漿をバッグ上部に押しやり、そしてバッグ中間部内に「バフィコート」を残した（これは、容量で約５０ｍｌを含んだ）。
【００９６】
５０ｍｌの量の、新鮮に得られた「バフィコート」を、次いで、各々２５ｍｌの２つの部分に分け、次いで、そのそれぞれを、事前に２つの５０ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブに入れておいた２５ｍｌのＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ分離培地でコートした。
【００９７】
この混合物を、ブレーキをかけずに２５００ｒｐｍで、３０分間遠心分離した。その後、赤血球および死んだ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ相の下にある「バフィコート」中に、なお存在する。一方、単球を含む白血球細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ上の白い中間相として、分離される。
【００９８】
次いで、単球の白い中間層を、慎重にピペットで取り出し、１０ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）と混合した。
【００９９】
次いで、この混合物を、３回に分けて、１０分間１８００ｒｐｍで遠心分離した；上清を、それぞれの遠心分離後にピペットで取り出し、そして新鮮なＰＢＳを加えて満たした。
【０１００】
遠心分離容器（Ｆａｌｃｏｎチューブ）の底に集まった細胞堆積物は、単核細胞画分（すなわち、単球）を含んだ。
【０１０１】
（実施例２）
（単球の増殖および脱分化）
一方で単球の培養および増殖を、一方でこの細胞の脱分化を、以下の組成の栄養培地中で、１回の工程で実行した：
【０１０２】
【表３】
2005521405.tif 000004
この栄養培地は、２．５μｇ／５００ｍｌのＭ−ＣＳＦおよび０．２μｇ／５００ｍｌのインターロイキン−３（ＩＬ−３）を、さらに含んだ。
【０１０３】
実施例１において単離された単球を、６チャンバウェルプレート（ウェル１つにつき直径３０ｍｍ）の５つのチャンバのそれぞれに、１チャンバあたり約１０５細胞の量で移し、それぞれ２ｍｌの上述の栄養培地で満たした。６ウェルプレートを、純粋な、不活性化ＦＣＳで事前に満たし、そしてＦＣＳを約７時間後にデカントし、このようにして、ＦＣＳコートしたプレートを得た。１ウェルあたりの正確な用量の細胞数を、公知のプロセス（Ｈａｙ  Ｒ．Ｊ．，「Ｃｅｌｌ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ中，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ２００２，第４章，５５−８４頁を参照）に従って決定した。
【０１０４】
６ウェルプレートをその蓋で覆い、３７℃のインキュベーター内に６日間保存した。細胞は、２４時間後にチャンバの底に沈着した。２日ごとに、上清をピペットで捨て、６ウェルプレートのチャンバを、それぞれ２ｍｌの新鮮な栄養培地で再度満たした。
【０１０５】
６日目に、２ｍｌの７０％エタノールを、６ウェルプレートの空いたままであった６つ目のチャンバに入れ、このプレートを、再び閉じ、インキュベーター内で３７℃にてさらに１０時間保存した。
【０１０６】
その後、ＰＢＳで１：１０に希釈した１ｍｌのトリプシン溶液を、ウェルプレートの細胞を含むチャンバそれぞれにピペットで入れた。閉じたウェルプレートを、３７℃で５分間、５％のＣＯ２下で、インキュベーター内に置いた。
【０１０７】
その後、トリプシン活性を、１ウェルにつき２ｍｌのＲＰＭＩ  １６４０培地の添加により、ブロックした。それぞれのチャンバの中の全上清（１ｍｌトリプシン＋２ｍｌ培地）をピペットで取り出し、１５ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブ中にプールし、１０分間１８００ｒｐｍで遠心分離した。次いで、上清を捨て、そして沈殿物を、新鮮なＲＰＭＩ  １６４０培地（２ｍｌ／１０５細胞）と混合した。
【０１０８】
この細胞懸濁液を、異なった標的細胞へと分化させるために、直接使用し得る。
【０１０９】
あるいは、遠心分離およびトリプシン含有上清の廃棄後、細胞を、ＤＭＳＯ／ＦＣＳ（凍結媒体として）と混合し、１０６／ｍｌの濃度で急速凍結した。
【０１１０】
この凍結培地は、９５％のＦＣＳと５％のＤＭＳＯとを含んだ。いずれの場合も、約１０６細胞を、１ｍｌの培地中に取り、以下の工程で冷却した：
氷上で３０分間；
−２０℃で２時間（事前に冷却しておいたスチロポール箱中で）；
−８０℃で２４時間（スチロポール中で）；
チューブ中で、液体窒素（Ｎ２）中で−１８０℃で保存する。
【０１１１】
単球起源の、脱分化したプログラム可能な幹細胞の細胞集団（上述のプロセスで産生した）の、免疫組織化学表現型分類、各々１０５細胞で行い、サイトスピン（ｃｙｔｏｓｐｉｎ）調製物として、さらなる組織化学的染色のために、スライド上に固定した（Ｗａｔｓｏｎ，Ｐ．「Ａ  ｓｌｉｄｅ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ；  ａｎ  ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｏｎ  ａ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ  ｓｌｉｄｅ．」Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，６８：４９４−５０１（１９６６））。この後、細胞を、Ｃｏｒｄｅｌｌ，Ｊ．Ｌ．ら（文献は下記を参照）によって記載された技術を用いて、ＡＰＡＡＰ赤色複合物によって染色し得た。他に示さない限り、添加した一次抗体を、ＰＢＳで１：１００に希釈し、この濃度の抗体をそれぞれにつき２００μｌ使用した。モノクローナル抗体を、表１に列挙した細胞抗原エピトープに対する一次抗体として使用した。図６は、染色したサイトスピン調製物および対応する幹細胞マーカー（ＣＤ９０、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３およびＣＤ１３５）の証明を示す。
【０１１２】
【数１−１】
2005521405.tif 000005
【０１１３】
【数１−２】
2005521405.tif 000006
（表１）
（本発明に従う幹細胞の抗原発現）
【０１１４】
【表４】
2005521405.tif 000007
目盛り付けを、検出された抗原陽性に対応して示した。この抗原陽性は、相応して指定した培地に対応して、単球の培養４日後〜９日後から明らかになり、そして目盛り付けを、対応するサイトスピン呈色の、ネガティブコントロールとの検鏡比較を介して行った（呈色は、一次抗体なしで観察した）。
【０１１５】
＋    一次抗体による細胞の明らかな呈色反応；
＋＋  一次抗体による細胞の強い呈色反応。
【０１１６】
代表的な幹細胞の形態（図６を参照）を備えた７０％より多い生細胞を有するサイトスピン調製物だけを評価した。これらの細胞の１％未満しか、ＣＤ３４抗原を発現しなかった。
【０１１７】
（実施例３）
（成体幹細胞由来のニューロンおよびグリア細胞の産生）
ニューロンおよびグリア細胞の産生を、直径１００ｍｍのシャーレ中で行った。シャーレを調製するため、５ｍｌの純粋不活性化ウシ胎仔ウシ血清（ＦＣＳ）をそれぞれのシャーレに入れ、それによって底を覆った。７時間後、シャーレの底に接着しなかった部分のＦＣＳを、ピペットで除去した。実施例２に従って産生した約１０６個の細胞を、調製したシャーレの１枚に入れ、そして以下の組成の栄養培地を１０ｍｌ加えた：
【０１１８】
【表５】
2005521405.tif 000008
この栄養培地は、１×１０−６Ｍ／５００ｍｌの量のレチノイン酸を、さらに含んだ。
【０１１９】
使用した幹細胞の、ニューロンおよびグリア細胞への再プログラミング／分化を、１０日以内に行い、培地を約３日おきに交換した。この期間の後、細胞は、ほとんどがチャンバの底に接着し、幹細胞について上て述べたのと同じ様式の、プレートの底からの簡潔なトリプシン処理により、剥離し得た。
【０１２０】
（実施例４）
（ニューロン前駆細胞、ニューロンおよびグリア細胞の証拠）
脱分化したプログラム可能な幹細胞により誘導された標的細胞の後ほどでの免疫組織化学的特徴づけのために、単球から産生した幹細胞（１０５細胞／ガラス蓋）を、６ウェルプレート（チャンバにつき、直径３０ｍｍ）の底に置かれたガラス蓋（２０ｍｍ×２０ｍｍ）に供給し、１ウェルプレートにつき栄養培地（２ｍｌ）で培養した。それぞれの標的細胞の分化後、これらを、以下のように固定した：栄養培地（上清）の除去後、培養した標的細胞を、２ｍｌのメタノールの添加（１０分間効果があった）により固定した。その後、エタノールをピペットで除去し、そしてウェルプレートを、ＰＢＳ（毎回２ｍｌずつ）で２回洗浄した。この後、細胞を、Ｃｏｒｄｅｌｌ．Ｊ．Ｌ．，ら、「Ｉｍｍｕｎｏｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｏｆ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ａｎｄ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＡＰＡＡＰ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）．」Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３２：２１９−２２９（１９９４）に記載される技術を使用して、ＡＰＡＡＰ赤色複合物によって染色し得た。別に特定しない限り、加えた一次抗体を、ＰＢＳで１：１００に希釈し、各々２００μｌのこの濃度の抗体を、６ウェルのそれぞれにピペットで入れた。
【０１２１】
ニューロン前駆細胞を、Ｓ１００−抗原に対する抗体で細胞を染色することにより検出した（図１の中央の写真を参照（×２００））。
【０１２２】
ニューロンを、対応する特異的抗体（ＰＢＳで１：３００に希釈した一次抗体）を用いて、シナプトフィジンＭＡＰ２（微小管関連タンパク質２）またはニューロフィラメント６８の特異的発現により、検出した（図１右側の写真、×２００）。
【０１２３】
グリア細胞（例えば、星状細胞）を、ＧＦＡＰ（膠線維関連タンパク質）の検出（一次抗体をＰＢＳで１：２００に希釈した）によって同定した（図１左側の写真、×２００）。
【０１２４】
ニューロンおよびグリア細胞の分離を、ＭＡＰ２（ニューロン）またはＧＦＡＰ（グリア細胞）に対して特異的な抗体を使用し、例えば、Ｃａｒｍｉｏｌ  Ｓ．，「Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ」Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ２００２，第２章，１９〜３５頁において記載されるプロセスに従って、ＭＡＣＳ（Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ）によって行った。
【０１２５】
染色によって可視になった細胞型を、図１に示す。
【０１２６】
（実施例５）
（単球起源の脱分化したプログラム可能な成体幹細胞からの内皮細胞の産生）
内皮細胞の培養のため、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（Ｂｅｃｋｔｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，ＤＥ）を、マトリックスとして使用した。このマトリックスは、フィブロネクチン、ラミニンならびにコラーゲンＩおよびコラーゲンＩＶを含む。
【０１２７】
凍結したマトリックスを、１２時間かけて、冷蔵庫内で４℃でゆっくりと解凍した。この期間の間、その状態が変わった。すなわち、元々固体のマトリックスが、ふかふか／液状になった。この状態において、これを、４８ウェルプレート（１ウェルにつき直径１０ｍｍ）に、それぞれのウェルの底が覆われるように入れた。
【０１２８】
適用の後、ゲルが底で接着層として固まるまで、プレートを室温で３０分間に保った。
【０１２９】
その後、１ウェルにつき約１×１０２細胞を、栄養培地を添加し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上でインキュベートした（実施例２で記載のように）。
【０１３０】
４〜５日後、最初の管状細胞鎖が現れ、６〜８日後には、３次元細胞ネットワークに発達した。この細胞上で、内皮マーカーであるＣＤ３１および第ＶＩＩＩ因子を、それぞれの特異的一次抗体（ＰＢＳで１：１００に希釈したものをそれぞれ２００μｌ）を用いて同定し得た。
【０１３１】
代替のプロセスにおいて、液化マトリックスを、脈管プロテーゼに適用し、次いで、脱分化したプログラム可能な成体幹細胞でコートした（実施例２に従う）。約６日後、環状様式でプロテーゼをコートした内皮細胞ローンを同定し得た。
【０１３２】
対応する内皮特異的抗体（上を参照）で染色することにより、可視になった内皮細胞を、図２に示す。中央の図において、細胞を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上の５日間のインキュベーション後に示す。第１の管状鎖を、個々の細胞凝集物と結合した。濃茶で示した細胞は、ＣＤ３１抗原を発現する（×２００、黄色のフィルターを用いた）。８日後、３次元ネットワーク構造の形成の増大が起こる（抗ＣＤ３１抗原染色、×２００、黄色のフィルターを用いた）。１２日後、新規に分化したＣＤ３１＋細胞（Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上で培養されていた）が、多層の壁構造を有する血管様３次元管（既に形態学的に血管を連想する）を形成する。ここで、ほぼ全ての細胞が、ＣＤ３１抗原を発現することが認識される（右側の写真、ＣＤ３１呈色、×４００、青色フィルター）。
【０１３３】
（実施例６）
（脂肪細胞（ｆａｔ  ｃｅｌｌ）（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）の生成）
Ａ：実施例２による成体幹細胞から脂肪細胞へのプログラミング／分化のために、まず、馴化培地を生成した。この目的のために、単球もまた由来する血液由来の２０ｇの自己由来脂肪組織（すなわち、同じヒトドナー由来の脂肪組織）を、以下の通りに処理した：
最初に、この脂肪組織をペトリ皿において破砕し、そしてその破砕組織片を、篩（孔径１００μｍ）に通した。
【０１３４】
その後、そのようにして得た懸濁物を、直径１００ｍｍのペトリ皿へと移し、３０ｍｇのコラゲナーゼＩＩ型という内容物を含む１０ｍｌのＤＭＥＭ培地を添加した。この混合物を室温（２２℃±２℃）で約６０分間放置して、このコラゲナーゼに脂肪細胞に対して効力を発揮させた。
【０１３５】
その後、この混合物を５０ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブに移し、このチューブを１８００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。
【０１３６】
遠心分離後、この上清を捨て、脂肪細胞および前駆細胞からなる細胞ペレットを、以下の組成の培地８ｍｌ中に採り、ペトリ皿（直径１００ｍｍ）においてインキュベーター中で３７℃にて１０日間インキュベートした。
【０１３７】
【表６】
2005521405.tif 000009
このインスリン溶液は、２ｍｌの酢酸水（４０ｍｌのＨ２Ｏおよび０．４ｍｌの氷酢酸からなる）中に溶解した１８ｍｇのインスリン（Ｓｉｇｍａ  １−０２５９）を含んだ。この溶液を、酢酸水で１：１０に希釈した。
【０１３８】
１０日間にわたるインキュベーションの間、脂肪細胞馴化培地（ＦＣＣＭ）が上清を形成した。この上清を、各場合において２日間〜４日間後に、新鮮な栄養培地で置換した。各培地交換の間に得られたＦＣＣＭを滅菌濾過に供し、そして−２０℃で貯蔵した。その後、１０ｍｌの上記ＦＣＣＭを、実施例２に従う約１０６個の幹細胞と一緒に、ペトリ皿（直径１００ｍｍ）中に導入した。脂肪空胞を含む第１前駆細胞が、４日間後に可視化した（図３Ａ）。６日間後、単一脂肪細胞群が出現した。これらを、スーダンレッドで染色し得た（図３Ｂおよび３Ｃ）。１０日間後、これらの細胞の代表的な凝集およびクラスター形成が存在し、それらはすでに、この段階で脂肪組織と顕微鏡により観察され得る（図３Ｄ）。従って、図３Ａ〜３Ｄにおいて染色することにより可視化された脂肪細胞は、コントロール３Ｅおよび３Ｆとは極めて異なる。図３Ｅは、６日間栄養培地（実施例２において示される）において培養されたがその栄養培地にＩＬ−３および２−メルカプトエタノールは添加されなかった、単球起源の細胞を示す。この後、ＦＣＣＭが添加された。これらの細胞は、脂肪細胞へと分化不可能であった。図３Ｆは、（実施例２に従って）完全培地を用いて６日間培養され、その後、（実施例２に従う）ＦＣＣＭの代わりに栄養培地を用いてさらに６日間処理された、細胞を示す。従って、上記ＦＣＣＭは、脂肪細胞への分化についてのシグナルを提供するために必要な成分を含む。
【０１３９】
図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、および３Ｄにおけるスーダンレッドを用いる細胞染色は、Ｐａｔｒｉｃｋ  Ｊｒ．，Ｃ．Ｗ．ら「Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｂｒｅａｓｔ」Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ２００２，第４章、１４１〜１４９頁により記載される方法により行った。
【０１４０】
Ｂ：スーダンレッドを用いる染色によって脂肪細胞の表現型決定することに加えて、その脂肪細胞の分子生物学的特徴付けを、ｍＲＮＡレベルで実行して、使用した脂肪細胞馴化培地を用いる対応するプログラミングの後で、その脂肪細胞の遺伝的プログラムが対応する変化を起こすか否か、そして脂肪細胞について記載される代表的なメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）転写物が、プログラム可能な単球からプログラムされた脂肪細胞において同定され得るか否かを検討した。脂肪細胞代謝に代表的な２つのｍＲＮＡ配列を、単球起源の分化したプログラム可能な幹細胞から単離したＲＮＡサンプルからポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し、そして並列試験混合物において、プログラムされた脂肪細胞から増幅した。すなわち、この２つのｍＲＮＡ配列は、「ペルオキシソーム増殖活性化レセプターγ」（ＰＰＡＲＧ−ｍＲＮＡ）（Ｔｏｎｔｏｎｏｚ，Ｐ．ら「Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｂｙ  ＰＰＡＲ  ｇａｍｍａ  ２，ａ  ｌｉｐｉｄ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ」Ｃｅｌｌ  ７９：１１４７〜１１５６（１９９４），ｇｅｎｅ  ｂａｎｋ登録コード番号；ＮＭ＿００５０３７）および「レプチン（肥満ホモログ、マウス）」ｍＲＮＡ（Ｚｈａｎｇ，Ｙ．ら、「Ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｏｂｅｓｅ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｈｕｍａｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ」Ｎａｔｕｒｅ  ３７２：４２５〜４３２（１９９４），ｇｅｎｅ  ｂａｎｋ登録コード番号：ＮＭ＿０００３２０）であった。
【０１４１】
この目的のために必要なＲＮＡ単離、逆転写方法、および望ましいｍＲＮＡ配列のＰＣＲ増幅条件を、当該分野の技術水準で詳細に記載された通り実行した。Ｕｎｇｅｆｒｏｒｅｎ  Ｈ．ら、「Ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｆａｓ  ａｎｄ  Ｆａｓ  ｌｉｇａｎｄ  ｙｅｔ  ａｒｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｔｏ  Ｆａｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ」Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：１７４１〜１７４９（１９９８）を参照のこと。
【０１４２】
この目的のために、ＰＣＲ増幅のために作製した個々のプライマーは、順方向プライマーおよび逆方向プライマーがｍＲＮＡ配列に結合するように選択した。それらのプライマーの染色体遺伝子中の相同領域は、２つの別個のエキソン中に存在し、そしてそれらは、大きなイントロンにより互いから隔てられている。それにより、得られる増幅フラグメントが、その細胞中に含まれるｍＲＮＡに由来し、染色体ＤＮＡ中に存在する配列には由来しないことが確実にされ得た。詳細には、以下のプライマー配列を、ＰＰＡＲ−γおよびレプチンについて選択した。
【０１４３】
ＰＰＡＲ−γ：順方向プライマー；２６５〜２８８（エキソン１における対応する遺伝子配列）、逆方向プライマー：４８７〜４６５（エキソン２における対応する遺伝子配列）、これは、４８７−２６５ｂｐ＝２２３ｂｐの増幅フラグメントを生じる（図３Ｇを参照のこと）。図３Ｇによりさらに示されるように、微量の転写されたＰＰＡＲ−γ特異的ｍＲＮＡが、プログラム可能な幹細胞および腫瘍細胞株ＨＬ−６０（ヒト前骨髄性白血病細胞株）において同定され得るが、脂肪細胞自体においてよりも有意に狭いシグナルバンドである。対照的には、脂肪細胞特異的タンパク質であるレプチンは、逆転写酵素ＰＣＲによってｍＲＮＡレベルでプログラム可能な幹細胞に由来する脂肪細胞においてのみ検出され得る。
【０１４４】
コントロールとして使用されるプログラム可能な幹細胞（ｐｒｏｇｒ．ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、ならびにヒト腫瘍細胞株ＨＬ−６０、Ｐａｎｃ−１、およびＷＩ−３８は、レプチンを転写しない。ネガティブコントロールとして、逆転写酵素を添加しなかったすべてのサンプル（ｆａｔ  ｃｅｌｌ／−ＲＴ）およびＨ２Ｏサンプルを、同時に測定した。ポジティブコントロールにおけるＧＡＰＤＨ「ハウスキーピング」遺伝子の同定によって、個々のＰＣＲ増幅工程が、個別の混合物において適切に実行されたことを確認した。
【０１４５】
（実施例７）
（肝臓細胞（肝細胞）の生成）
Ａ：実施例２に従う単球起源の脱分化したプログラム可能な幹細胞から肝臓細胞へのプログラミングのために、まず、馴化培地を生成した。この目的のために、４０ｇのヒト肝臓組織を以下のように処理した。
【０１４６】
まず、その肝臓組織をＰＢＳ中で数回リンスして、赤血球を基本的には除去した。その後、この組織を、ペトリ皿中で破砕し、そして室温にて約４５分間、解離溶液とともにインキュベートした。この解離溶液は、４０ｍｌのＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）、ＰＢＳで１：１０希釈した１０ｍｌのトリプシン溶液、および３０ｍｇのコラゲナーゼＩＩ型からなった（Ｒｏｄｂｅｌ  Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３９：３７５（１９６４））。４５分間のインキュベーションの後、その組織片を篩に通した（実施例６を参照のこと）。
【０１４７】
その後、その混合物を５０ｍｌ  Ｆａｌｃｏｎチューブに移し、ＰＢＳで５０ｍｌまで満たし、そして１８００ｒｐｍにて１０分間遠心分離した。
【０１４８】
遠心分離の後、上清を捨て、そして肝臓細胞を含む細胞ペレットを、５０ｍｌのＰＢＳで再度洗浄し、そして遠心分離した。そのようにして生成した上清を、再度捨て、そして細胞ペレットを以下の組成の培地２５ｍｌ中に採り、そしてインキュベーター中３７℃にて１０日間、細胞培養フラスコ（２５０ｍｌ容）においてインキュベートした：
（肝臓細胞増殖培地）
【０１４９】
【表７】
2005521405.tif 000010
この栄養培地は、さらに５μｇ（１０ｎｇ／ｍｌ）の上皮増殖因子を含んだ（Ｐａｓｃａｌｌ，Ｉ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１２：３１３（１９９４））。インスリン溶液の組成は、実施例６に記載される通りであった。
【０１５０】
１０日間継続したインキュベーションの間、肝臓細胞馴化培地（ＬＣＣＭ）が上清として形成した。この上清を、それぞれ、２日間〜４日間後に、新鮮な栄養培地で置換した。各場合の培地交換の間に得た個々のＬＣＣＭを滅菌濾過（０．２μｍ孔径を有するフィルター）に供し、そして−２０℃で貯蔵した。
【０１５１】
その後、１×１０６個の脱分化した幹細胞を、以下の組成の培地１０ｍｌを用いて、ペトリ皿（径１００ｍｍ）または培養フラスコ中で培養した。
【０１５２】
（肝臓細胞分化培地）
【０１５３】
【表８】
2005521405.tif 000011
肝細胞増殖因子（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｙ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２０：７（１９９６））を、濃度４０ｎｇ／ｍｌで使用した。２〜３日間後、平坦な多角形の一倍体細胞または二倍体細胞への形態変化が、観察され得た（図４Ａ）。１０〜１２日間後、脱分化した幹細胞から生じた肝細胞を、図４Ｂおよび４Ｃにおいて示されるように、肝臓特異的抗原であるα−フェトプロテインの免疫組織化学的検出（Ｊａｃｏｂｓｅｎ，Ｇ．Ｋ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｐａｔｈｏｌ．５：２５７〜６６（１９８１））によって同定し得た。
【０１５４】
Ｂ：α−フェトプロテインの免疫組織化学的同定による肝細胞の表現型決定に加えて、ｍＲＮＡレベルでのその肝細胞の分子生物学的特徴付けを行い、使用した肝臓細胞馴化培地を用いる対応するプログラミングの後に、その幹細胞の遺伝的プログラムが対応する変化をするか否か、および本発明に従う幹細胞から生じる肝細胞において肝臓細胞に代表的であると記載されるメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）転写物が同定され得るか否かを検討した。この目的のために、肝細胞に代表的な５つの異なるｍＲＮＡ配列の存在を、単球起源の脱分化したプログラム可能な幹細胞から単離したＲＮＡサンプルにおいて、およびその幹細胞のプログラミングにより得られた肝細胞由来の並列試験サンプルにおいて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって試験した。詳細には、これは、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓアルブミンｍＲＮＡ（Ｌａｗｎ，Ｒ．Ｍ．ら「Ｔｈｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｕｂｕｍｉｎ  ｃＤＮＡ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ．」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．９：６１０３〜６１１４（１９８１）、ｇｅｎｅ  ｂａｎｋ登録コード番号：ＮＭ−０００４７７）、α−フェトプロテインｍＲＮＡ（Ｍｏｒｉｎａｇａ  Ｔ．ら「Ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｌｐｈａ−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｍＲＮＡ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：４６０４〜４６０８（１９８３），ｇｅｎｅ  ｂａｎｋ登録コード番号：Ｖ０１５１４）、ヒトカルバミルホスファターゼシンセターゼＩ  ｍＲＮＡ（Ｈａｒｇｕｃｈｉ，Ｙ．ら、「Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ａ  ｃＤＮＡ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｃａｒｂａｍｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  Ｉ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｙｐｅｒａｍｍｏｎｅｍｉａ」Ｇｅｎｅ  １０７：３３５〜３４０（１９９１），ｇｅｎｅ  ｂａｎｋ登録コード番号Ｄ９０２８２）、Ｈｏｍｏ  ｓｐｉｅｎｓ凝固因子ＩＩ（トロンビン、Ｆ２）ｍＲＮＡ（Ｄｅｇｅｎ，Ｓ．Ｊ．ら、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２２：２０８７〜２０９７（１９８３）、ｇｅｎｅ  ｂａｎｋ登録コード番号ＮＭ−０００５０６）、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ凝固因子ＶＩＩ（血清プロトロンビン変換加速因子、Ｆ７）ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ  Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｊｅｃｔ．Ｄｉｒｅｃｔ  Ｓｕｂｍｉｓｓｉｏｎ，０６−Ｆｅｂ−２００２，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ  ２０８９４，ＵＳＡ，ｇｅｎｅ  ｂａｎｋ登録コード番号ＸＭ−０２７５０８）。
【０１５５】
この逆転写酵素法および望ましいｍＲＮＡ配列のＰＣＲ増幅条件に必要なＲＮＡ単離を、当該分野技術水準において詳細に記載される通りに実行した。Ｕｎｇｅｆｒｏｒｅｎ  Ｈ．ら、「Ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｆａｓ  ａｎｄ  Ｆａｓ  ｌｉｇａｎｄ  ｙｅｔ  ａｒｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｔｏ  Ｆａｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ」Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：１７４１〜１７４９（１９９８）を参照のこと。
【０１５６】
ＰＣＲ増幅のための個々のプライマーは、順方向プライマーおよび逆方向プライマーが、２つの別個のエキソン中に染色体遺伝子中の相同領域が存在しそして大きなイントロンによって互いに隔てられている、ｍＲＮＡ配列に結合するように選択した。この方法で、得られる増幅フラグメントが、この細胞中に含まれるｍＲＮＡに由来し、染色体ＤＮＡ中に存在する配列には由来しないことを確実にし得る。
【０１５７】
下記に示されるプライマー配列を選択した；個々のＰＣＲ分析の結果を、図４Ｄにおいて再現する。本発明に従う脱分化したプログラム可能な幹細胞は、図４Ｄにおいて、「ｐｒｏｇｒ．ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ」と称され、これらのプログラミングによって誘導される肝細胞は、「ｐｒｏｇｒ．ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ」と称される。
【０１５８】
α−フェトプロテイン：順方向プライマー：１４５８〜１４７８（エキソン１における対応する遺伝子配列）、逆方向プライマー：１７５８〜１７３５（エキソン２における対応する遺伝子配列）、これは、１７５８−１４５８ｂｐ＝３９１ｂｐの増幅フラグメントを生じる。図４Ｄを参照のこと。
【０１５９】
図４に示されるように、プログラム可能な幹細胞（ｐｒｏｇｒ．ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）（これ自体は、α−フェトプロテインについての同定可能な特異的ｍＲＮＡ転写物を含まない）を、このｍＲＮＡ転写物を含む（３０１ｂｐの分子量を有する正のバンド）肝細胞（ｐｒｏｇｒ．ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）へとプログラムし得る。これはまた、図４Ｂおよび４Ｃにおいて示されるような、α−フェトプロテインの免疫組織化学的検出能を説明する。ポジティブコントロール（すなわち、ヒト肝臓組織および肝臓腫瘍細胞株ＨｅｐＧ２）はまた、α−フェトプロテイン特異的ｍＲＮＡを転写する。なぜなら、３０１ｂｐのバンドが確証するからである。
【０１６０】
アルブミン：順方向プライマー１４５０〜１４７３（エキソン１における対応する遺伝子配列）、逆方向プライマー：１８６８〜１８４４（エキソン２における対応する遺伝子配列）、これは、１８６８−１４５０ｂｐ＝４１９ｂｐの増幅フラグメントを生じた。図４Ｄを参照のこと。
【０１６１】
図４Ｄは、プログラム可能な幹細胞においてすでに転写された微量のアルブミン特異的ｍＲＮＡを示し、一方、その幹細胞のプログラミングにより得られる肝細胞、ならびに正常肝臓組織および腫瘍細胞株ＨｅｐＧ２（これらは、両方ともポジティブコントロールとして使用した）は、明確なバンドによって認識され得るように、そのｍＲＮＡを強く発現する。
【０１６２】
カルバミルホスファターゼシンセターゼＩ：順方向プライマー：３１３５〜３１５７（エキソン１における対応する遺伝子配列）、逆方向プライマー：４６３５〜４６１３（エキソン２における対応する遺伝子配列）、これは、４５３５−３１３５＝１５００ｂｐの増幅フラグメントを生じる。図４Ｄを参照のこと。
【０１６３】
カルバミルホスファターゼシンセターゼＩは、肝細胞に特異的な酵素を示し、この酵素は、「尿素サイクル」における尿素の代謝の代謝において重要な役割を果す。この解毒化機能は、機能性肝細胞によって保証される。図４Ｄが示すように、プログラム可能な幹細胞から生じた肝細胞とポジティブコントロール（ヒト肝臓組織およびＨｅｐＧ２腫瘍細胞株）の両方において、カルバミルホスファターゼシンセターゼＩに特異的なｍＲＮＡバンド（１５００ｂｐ）を、同定し得る。プログラムされた肝細胞（ｐｒｏｇｒ．ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）についてのｍＲＮＡバンドのいくらか弱い発現は、培養皿中で利用可能な基質が欠如していることに起因する。
【０１６４】
凝固因子ＩＩ：順方向プライマー：１４５８〜１４８１（エキソン１における対応する遺伝子配列）、逆方向プライマー：１９０１〜１８７７（エキソン２における対応する遺伝子配列）、これは、１９０１−１４５８＝４４４ｂｐの増幅フラグメントを生じる。図４Ｄを参照のこと。
【０１６５】
同様に、この肝細胞特異的タンパク質は、プログラムされた肝細胞（ｐｒｏｇｒ．ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）およびヒト肝臓組織由来のポジティブコントロールにおいて、ｍＲＮＡレベルで４４４ｂｐのバンド発現によってのみ検出され得、一方、このプログラム可能な肝細胞（ｐｒｏｇｒ．ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）は、このバンドを示さない。すなわち、この遺伝子は、図４Ｄにおいて観察され得るように、この細胞において転写されない。
【０１６６】
凝固因子ＶＩＩ：順方向プライマー：７２５〜７４７（エキソン１における対応する遺伝子配列）、逆方向プライマー：１２８９〜１２６８（エキソン２における対応する遺伝子配列）、これは、１２８９−７２５＝５６５ｂｐの増幅フラグメントを生じる。図４を参照のこと。
【０１６７】
凝固因子ＩＩの場合のように、このタンパク質はまた、プログラムされた肝細胞（ｐｒｏｇｒ．ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）およびポジティブコントロール（ヒト肝臓組織）においてのみ転写される（６５６ｂｐのバンドを参照のこと）が、凝固因子ＩＩよりも弱い。プログラム可能な幹細胞もネガティブコントロール（Ｈ２Ｏ）も、この特異的ｍＲＮＡバンドを示さない。
【０１６８】
グリセリンアルデヒドデヒドロゲナーゼ：この遺伝子（「ハウスキーピング遺伝子とも呼ばれる）は、どの真核生物細胞においても検出され得、そしてこの遺伝子は、ＰＣＲ増幅がすべてのサンプルにおいて適切に実行されたか否かのコントロールとして役立つ。この遺伝子は、並行して測定される。この遺伝子は、個々の細胞サンプルからの規定量のＲＮＡの添加から生じる。
【０１６９】
ネガティブコントロールとして、Ｈ２Ｏサンプルを、すべての試験において同時測定した。このＨ２ＯにＲＮＡが混入していない場合、ＰＣＲの間に増幅物は生成されず、そしてバンドは検出されない（従って、対比コントロールとして役立つ）。
【０１７０】
（実施例８：皮膚細胞（ケラチノサイト）の生成）
皮膚細胞中の実施例２による単球起源の脱分化したプログラム可能な幹細胞のプログラミングのために、馴化培地を最初に作製した。この目的のために、１〜２ｃｍ２の完全ヒト皮膚を、以下の通りに加工した。皮膚材料を、最初に、無菌条件下で、皮下組織から遊離させた。次いで、この組織を、激しく攪拌することにより、合計１０回、無菌容器中でＰＢＳを用いて洗浄した。２回目の洗浄後、この組織を、マークの無くなった結合組織の残部から、再度遊離させた。
【０１７１】
次いで、皮膚材料を、直径６０ｍｍのペトリ皿中に配置し、ＰＢＳで１：１０希釈した３ｍｌのトリプシン溶液と混合し、そして切断して小片（約０．５〜１ｍｍ３）にした。この後、ＰＢＳで１：１００希釈した３ｍｌのトリプシン溶液をこの混合物に再度添加し、そしてこの混合物を断続的に攪拌しながら３７℃で６０分間インキュベートした。
【０１７２】
次いで、より大きな粒子を沈澱させ、そしてケラチノサイトを含む上清を注ぎ出し、そして８００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ここで生じた上清をピペットで除去し、そして細胞ペレットを、以下の組成の３ｍｌの培地中に溶解し、そして３７℃にてインキュベータ中で１５日間、ペトリ皿（内径１００ｍｍ）中でインキュベートした。
【０１７３】
【表９】
2005521405.tif 000012
この栄養培地は、５μｇの上皮増殖因子（正確な詳細に関しては、実施例７を参照のこと）および５ｍｇのヒドロコルチゾン（Ｒｅｆ．Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ：１２，４８２８）を含んでいた。
【０１７４】
１５日間のインキュベーション期間の間、ケラチノサイト−細胞−馴化培地ＫＣＣＭが、上清として形成された。この上清を、いずれの場合も、２〜４日後、新鮮な栄養培地で交換した。各培地交換の間に得られたＫＣＣＭを無菌濾過に供し、そして−２０℃で保存した。
【０１７５】
次いで、１×１０６の脱分化した幹細胞を、ペトリ皿（内径１００ｍｍ）または培養フラスコ中、以下の組成の１０ｍｌの培地で培養した。
【０１７６】
【表１０】
2005521405.tif 000013
ケラチノサイト増殖因子を、Ｆｉｎｃｈら，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １１０：４４１（１９９６）によって記載される通りに、２５ｎｇ／ｍｌの濃度にて用いた。
【０１７７】
数日後、この細胞の形態変化が観察され得た。６日後、ケラチノサイト特異的抗原サイトケラチン５およびサイトケラチン６（これらは両方とも、用いられる一次抗体によって結合される）（Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．１６２：１１４（１９８６））が検出され得た（図５Ａ）。１０日後、明らかにより大きな個々の細胞の細胞接着が、培養中に既に生じており、これは、コンフルエントな細胞の可視の細胞組織の組み合わせを同定することを可能にした（図５Ｂ）。
【０１７８】
（実施例９：分化したプログラムされた幹細胞からのインスリン産生細胞の生成）
インスリン産生細胞の生成を、約２５０ｍｌの容積で平坦な壁を有する培養フラスコ（Ｔ７５細胞培養フラスコ）において行った。実施例１３に従って生成された約５×１０６個の細胞を、以下に示す約５ｍｌの培養培地（インスリン産生細胞のための分化培地）中に懸濁し、このフラスコに導入した後、さらなる１５ｍｌの培養培地と混合した。これらの細胞の分化のために、これらのフラスコを、３７℃および５％  ＣＯ２のインキュベータ中で水平位置にてインキュベートした。
【０１７９】
培養培地（Ｒａｍｅｙａ  Ｖ．Ｋ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，６（３），２７８−２８２（２０００）に従って改変した）：
【０１８０】
【表１１】
2005521405.tif 000014
この栄養培地は、１０ｎｇ／ｍｌの量の上皮増殖因子および２０ｎｇ／ｍｌの量の肝細胞増殖因子をさらに含んでいた。最初の１時間の間に、これらの細胞は培養容器の底部に接着する。これらの幹細胞の分化を、インスリン産生を参照してモニタリングした。この目的のために、この培養培地を約２〜３日間の間隔で交換し、細胞上清をそのたびに収集し、そして−２０℃で凍結した。培養フラスコの底部に接着している細胞は、実施例２に記載の通りのトリプシン処理によって剥離され得た。
【０１８１】
異なる時点で収集した上清のインスリン含有量を、ヒトインスリンに対するＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）（Ｂｒｕｈｎ  Ｈ．Ｄ．，Ｆｏｅｌｓｃｈ  Ｕ．Ｒ．（編），Ｌｅｈｒｂｕｃｈ  ｄｅｒ  Ｌａｂｏｒｍｅｄｉｚｉｎ：Ｇｒｕｎｄｌａｇｅｎ，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ，Ｋｌｉｎｉｋ  Ｐａｔｈｏｂｉｏｃｈｅｍｉｅ  ［Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐａｔｈｏｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ］（１９９９），１８９頁）によって測定し、そしてこの培地のブランクの読取値と比較した。図８において再現した結果は、これらの細胞が培養１４日後に最大レベルのインスリン産生に到達したことを示す。分化の過程で処理された細胞によって産生されたインスリン量は、１４日後に３μＵ／ｍｌまで増加したが、一方、ヒトインスリンはコントロール培地中で検出可能でなかった。図８におけるバーは各々、３つの独立した個々の実験から各々決定した３つの別個の値を表す。
【０１８２】
本発明に従ってインスリン産生細胞へと分化した、脱プログラムした幹細胞中でのインスリン産生の決定の次に、単球特異的表面抗原ＣＤ１４を依然として発現するインスリン産生細胞の比率を、脱分化を行った３週間後にも決定した。これらの細胞の大部分（約３０〜４０％）において、単球特異的抗原ＣＤ１４が３週間後にも検出可能であることが見出された。
【０１８３】
（実施例１０：脱分化したプログラム可能幹細胞からの肝細胞の生成の代替的方法）
実施例７に記載される通りの肝細胞−馴化培地（ＬＣＣＭ）の使用の代替法として、肝細胞への幹細胞の分化を、以下に示す栄養培地（Ｈａ）によって誘導した。幹細胞からの肝細胞の生成を、今度は、約２５０ｍｌの容量で平坦な壁を有する培養フラスコ（Ｔ７５−細胞培養フラスコ）中で行った。実施例１３に従って生成した約５×１０６個の細胞を、以下に示した約５ｍｌの改善培養培地（Ｈａ、肝細胞のための分化培地）中に導入し、これらのフラスコ中に導入した後、さらに１５ｍｌの培養培地と混合した。これらの細胞の分化のために、これらのフラスコを、３７℃および５％  ＣＯ２のインキュベータ中で水平位置にてインキュベートした。
【０１８４】
肝細胞のための分化培地（Ｈａ）（Ｓｃｈｗａｒｚら，「Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ａｄｕｌｔ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ  ｉｎｔｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌｓ」，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０（１０９），１２９１−１３０２（２００２）に従って改変した）：
【０１８５】
【表１２】
2005521405.tif 000015
この栄養培地はまた、線維芽細胞増殖因子−４（ＦＧＦ−４）を３ｎｇ／ｍｌの量で含んでいた。
【０１８６】
最初の１時間の間に、これらの細胞は、培養容器の底部に接着する。これらの幹細胞の分化を、アルブミン産生に関してモニタリングした。この目的のために、この培養培地を約２〜３日間の間隔で交換し、細胞上清をそのたびに収集し、そして−２０℃で凍結した。培養フラスコの底部に接着している細胞は、実施例２に記載の通りのトリプシン処理によって剥離され得た。
【０１８７】
異なる時点で収集した上清のアルブミン含有量を、ヒトアルブミンに関するＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．のプロトコルおよびＳｃｈｗａｒｚら，上記箇所による）によって測定し、そしてこの培地のブランクの読取値と比較した。図９に示した結果は、培養中の１４〜２８日間の期間の間のこれらの細胞のアルブミン産生が、ほぼ一定のままであったことを示す。測定を、Ｈａ培地の添加の時点に対して０日目（この培地のブランクの読取値）、１４日目、２１日目、２８日目および３０日目に行った。各々の場合に決定した値は、約５ｎｇ／ｍｌ、４５０ｎｇ／ｍｌ、４２５ｎｇ／ｍｌ、４４０ｎｇ／ｍｌおよび１６５ｎｇ／ｍｌに達した。図９におけるバーは各々、３つの独立した個々の実験から各々決定した３つの別個の値を表す。
【０１８８】
（実施例１１：脱分化した幹細胞に由来する肝細胞におけるアルブミンおよび単球特異的抗原ＣＤ１４の同時発現の決定）
脱分化した幹細胞に由来する肝細胞におけるアルブミンおよび単球特異的抗原ＣＤ１４の同時発現の決定を、一方では二重染色（Ａ）によって、他方ではＦＡＣＳ分析（Ｂ）によって行った。
【０１８９】
Ａ）実施例１０に従って肝細胞に分化した、本発明による幹細胞を、６ウェルプレート中、カバーグラス上で培養し、そして実施例４に記載の通りにメタノールで固定した。次いで、一方では抗原ＣＤ１４（単球の表現型マーカー）の、他方ではアルブミン（肝臓特異的マーカー）の同時発現を検出するために二重染色を行った。
【０１９０】
この目的のために、これらの細胞を、実施例４に記載の通りに、ＰＢＳ中に１：５０希釈した、ヒトアルブミンに対する一次抗体（ヒトアルブミンに対するモルモット抗体）とともに最初にインキュベートした。洗浄工程後、次いで、これらの細胞を、ＰＢＳ中にこれもまた１：５０希釈したマウス抗ラット二次抗体（これは、このモルモット抗体を結合する）とともに４５分間インキュベートした。次いで、染色プロセスを、ＡＰＡＡＰ赤色複合体を用いるＣｏｒｄｅｌｌ  Ｊ．Ｌ．ら（上記箇所）の方法を用いて実施例４に従って行った。
【０１９１】
２回目の染色工程に関して、次いで、これらの細胞を、一次抗体であるマウス抗ヒトＣＤ１４とともにインキュベートし、そして実施例４による洗浄工程に従って、ｄｅｍ  ＤＡＢ−Ｃｏｍｐｌｅｘ（褐色）（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いるＨｓｕ，Ｓ．Ｍ．ら、「Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ａｎｔｉａｖｉｄｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｎｄ  ａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｔｅｃｈｎｉｃｓ」Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．７５（６）：８１６−８２１（１９８１）の方法を用いたＶｅｃｔａｓｔａｉｎのＡＢＣ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ＫＩＴ（Ｖｅｃｔｏｒ）を用いて染色した。
【０１９２】
次いで、ヘマローン（ｈａｅｍａｌａｕｎ）を用いた核対比染色を、実施例４に記載の通りに行い、続いてＫａｉｓｅｒのグリセロールゼラチン中に包埋した。
【０１９３】
結果を図１０に示す。この図は、抗原ＣＤ１４の発現を褐色として示し、この発現は、肝細胞へのこれらの細胞の形態変換に並行してゆっくりと減少し、一方、赤色のアルブミン発現は、肝細胞の成熟が増すにつれて増加する。図１０における図番号４は、肝細胞馴化培地を用いた３週間の刺激後の細胞を示す。
【０１９４】
Ｂ）この二重マーキングと並行して、本発明に従って肝細胞へと分化した幹細胞を、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）分析に供した。
【０１９５】
実施例１０に従って本発明に従って肝細胞へと分化した幹細胞を、細胞スクレーパーを用いた培養フラスコからのこれらの細胞の機械的剥離によって最初に収集した。これらの細胞を、ＰＢＳを用いてフラスコから注意深くリンスし、そして各回１０ｍｌのＰＢＳ溶液中で２回洗浄した。この目的のために、ＰＢＳ溶液中の細胞懸濁物を１５ｍｌ遠心管に導入し、そして１６００ｒｐｍで沈澱させた。得られた細胞沈澱物をＰＢＳで希釈し、その結果、正確に１×１０５個の細胞を１００μｌ  ＰＢＳ中に存在させた。
【０１９６】
次いで、各々１０μｌのＦＩＴＣマーク抗ＣＤ１４抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）またはＦＩＴＣマーク抗アルブミン抗体（Ｂｅｃｋｍａｎｎ）およびＦＩＴＣマーク非特異的ＩｇＧ１マウス抗ヒト抗体を、この細胞懸濁物に添加した。２０分間のインキュベーション期間の後、これらの細胞を、５００μｌ  ＰＢＳ中に２回再懸濁し、そして各々１６００ｒｐｍにて５分間沈澱させ、次いで最終的に２００μｌ  ＰＢＳ中に取った。これらの細胞の再懸濁後、蛍光を、会社ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）からのＢＤ  ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ  フローサイトメーターを用いて測定した（Ｂｒｕｈｎ  Ｈ．Ｄ．，Ｆｏｅｌｓｃｈ  Ｕ．Ｒ．（編），Ｌｅｈｒｂｕｃｈ  ｄｅｒ  Ｌａｂｏｒｍｅｄｉｚｉｎ：Ｇｒｕｎｄｌａｇｅｎ，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ，Ｋｌｉｎｉｋ  Ｐａｔｈｏｂｉｏｃｈｅｍｉｅ［Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐａｔｈｏｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ］，３９５−４０３（１９９９）；およびＨｏｌｚｅｒ  Ｕ．ら，「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  Ｔｈ１  ａｎｄ  Ｔｈ２  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＤ４（＋）  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｓｉｍｉｌａｒ  ＴＣＲ  ａｖｉｄｉｔｙ」Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０（３）：１２１８−１２２３（２００３）を参照のこと）。結果の評価を、Ｍａｒｑｕｅｚ  Ｍ．Ｇ．ら「Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｉｎｔｒａ−ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎ  Ｗｉｓｔａｒ  ｒａｔｓ」．Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ４１（２）：１１５−１２２（２０００）を参照して、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＷｉｎＭＤＩプログラムを用いて行った。
【０１９７】
ＦＡＣＳ−Ａｎａｌｙｓｅの結果を、図１１に再現する。この図は、ＣＤ１４（上の行）およびアルブミン抗原（下の行）の発現を示す。これは、脱分化した単球（左側の列）および本発明に従って肝細胞へと分化した幹細胞（右側の列）において測定された。脱分化した単球では、ＣＤ１４の強い発現が検出され得たが、アルブミンの発現は検出できず、一方、脱分化した単球から発生した肝細胞では、ＣＤ１４のより弱い発現およびアルブミンの非常に強い発現が検出可能であった。
【０１９８】
（実施例１２：単球起源の脱分化したプログラム幹細胞のインビボでの使用）
プログラム可能幹細胞が、遺伝的に同一のレシピエント動物の肝臓への門脈を介した注射後、インビボで、肝臓中に存在するシグナル供与体によって特異的分化をする程度を明確にするために、雌性ＬＥＷラットの肝臓を、肝臓中に存在する肝細胞（肝臓実質細胞）をそれらの増殖活性に関して阻害するために、最初にレトルシン（ｒｅｔｒｏｒｓｉｎｅ）で処置した（Ｒｅｆ．Ｌａｃｏｎｅ，Ｅ．ら，「Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ，ｎｅａｒ−ｔｏｔａｌ  ｌｉｖｅｒ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｒａｔｓ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｒｅｔｒｏｒｓｉｎｅ」Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１５３：３１９−３２９（１９９８））。
【０１９９】
この目的のために、ＬＥＷラットに、３０ｍｇのピロリジジン（ｐｙｒｒｏｌｉｚｉｄｉｎｅ）アルカロイドレトルシンを１４日以内に２回腹腔内注射して与えた。続いて、このようにして処置した肝臓の８０％の切除を行い、続いて、１ｍｌ  ＰＢＳ中の５×１０５個のプログラム可能幹細胞を、残っている残存肝臓の門脈に投与した。この幹細胞を、実施例２に記載の通りに、雄性ＬＥＷラットの単球から得た。この幹細胞の投与の５日後、肝臓のパンチ生検を、肝臓の組織学的評価のために行い、そして幹細胞から分化した細胞型を、Ｈｏｅｂｅｅ，Ｂ．ら「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｔ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐａｉｎｔ  ｐｒｏｂｅｓ  ｂｙ  ｂｉｖａｒｉａｔｅ  ｆｌｏｗ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ｆｏｌｌｏｗｅｄ  ｂｙ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｉｍｅｄ−ＰＣＲ」Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．６６：２７７−２８２（１９９４）に詳述される通りに、Ｙ染色体特異的プローブを用いた蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によって検出した。
【０２００】
図７Ａは、雌性レシピエント動物のレトルシン前処置８０％切除肝臓中への門脈内注射後５日目の、雄性ＬＥＷ幹細胞由来のＹ染色体ポジティブ（細胞核における赤色の点）肝細胞を示す。幹細胞注射後２５日目の同じ肝臓の選択的除去は、肝細胞、内皮細胞および胆管上皮へのこの幹細胞の分化を示す（図７Ｂ）。この時点で、この肝臓は、既にその正常なサイズに達しており、そして９０％を超える細胞が、Ｙ染色体を有している。このことから、単球起源の注射した同系のプログラム可能幹細胞が、インビボで、正常な代謝機能を有する肝臓の完全な回復をもたらし得ると結論付けられ得る。図７Ｃは、これに関連して、レストルシンの投与および８０％の肝臓切除後の、未処置のレシピエントラットに対して、幹細胞で処置したレシピエントラットのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線（１群あたりｎ＝４）を示す。
【０２０１】
機能のパラメータであるビリルビンおよびアンモニア（ＮＨ３）は、長期に生存する幹細胞処置動物の完全な代謝機能を証明する（図７Ｄおよび図７Ｅ）。
【０２０２】
（実施例１３：細胞培養フラスコ中での単球の増殖および脱分化）
一方では単球の培養および増殖を、そして他方ではより大規模でのこの細胞の脱分化を培養フラスコ中、同じ栄養培地中で行い、これをまた、ウェルプレート中での培養のためにも用いた（実施例２を参照のこと）。この栄養培地は、２．５μｇ／５００ｍｌ  Ｍ−ＣＳＦおよび０．２μｇ／５００ｍｌインターロイキン３（ＩＬ−３）を含んでいた。
【０２０３】
実施例１において単離した単球を、２５０ｍｌの容積で平坦な壁を有する培養フラスコ（Ｔ７５−細胞培養フラスコ）の底部に移した。約１０×１０６個の細胞を各フラスコに移し、そして各々の２０ｍｌの上記の栄養培地を充填した。フラスコあたりの正確な投与に関するこの細胞数の決定を、公知の手順に従って行った（Ｈａｙ  Ｒ．Ｊ．，「Ｃｅｌｌ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ」Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（２００２），第４章，５５−８４頁を参照のこと）。
【０２０４】
これらの細胞培養フラスコを、３７℃にて６日間、インキュベータ中でインキュベートした。２４時間後、細胞は、これらのフラスコの底部に沈降した。上清を２日毎に取り除き、そしてこれらのフラスコを各々２０ｍｌの新鮮な栄養培地で充填した。
【０２０５】
６日目に、栄養培地がピペットでフラスコから予め除去された後、これらのフラスコを各々１０ｍｌのＰＢＳで２回リンスした。これにより、フラスコの底部に接着しなかった全ての細胞が除去された。これらのフラスコの底部に接着して増殖する細胞を、その後、無菌細胞スクレーパーを用いてこれらのフラスコの底部から取り出した。ここで、ＰＢＳでリンスすることにより、分離された細胞をこれらのフラスコから取り出し、そして５０ｍｌ  Ｆａｌｃｏｎチューブ中にプールし、そして１８００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。その後、上清を捨て、そして沈澱物を、新鮮なＲＰＭＩ  １６４０培地（２ｍｌ／１０５細胞）中に再懸濁した。
【０２０６】
この細胞懸濁物は、種々の標的細胞へと分化させるために直接的に用いられ得る。
【０２０７】
あるいは、これらの細胞を、遠心分離後に凍結培地としてのＤＭＳＯ／ＦＣＳと混合し、そして１０６／ｍｌの濃度で急速凍結した。
【０２０８】
この凍結培地は、９５％  ＦＣＳおよび５％  ＤＭＳＯを含んでいた。約１０６個の細胞を１ｍｌのこの培地に取り、そして以下の工程に従って冷却した：
氷上で３０分間；
予め冷却したスチロポール（ｓｔｙｒｏｐｏｒ）ボックス中、−２０℃で２時間；
スチロポール中、−８０℃で２４時間；
−１８０℃の液体窒素（Ｎ２）中、チューブ中で保存した。
【図面の簡単な説明】
【０２０９】
【図１】図１は、ニューロンおよびグリア細胞への分化を示す。
【図２】図２は、内皮細胞への分化を示す。
【図３Ａ−Ｆ】図３Ａ〜Ｆは、スーダンレッドを用いる細胞染色を示す。
【図３Ｇ】図３Ｇは、単球のプログラム可能な幹細胞およびそれからプログラムされた脂肪細胞における脂肪細胞特異的な遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。
【図４Ａ−Ｃ】図４Ａ〜Ｃは、幹細胞のＬＣＧＭによる培養後６日目（Ａ）、１０日目（Ｂ）および１２日目（Ｃ）を示す。
【図４Ｄ】図４Ｄは、プログラム可能な幹細胞およびプログラムされた肝細胞における肝細胞特異的な遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。
【図５】図５は、ＫＣＧＭ（ケラチノサイト細胞馴化培地）での処理後６日目（Ａ）および１０日目（Ｂ）を示す。
【図６】図６は、単球起源の、脱分化したプログラム可能な幹細胞の幹細胞マーカーを示す。
【図７Ａ】図７Ａは、幹細胞由来の肝細胞におけるＹ染色体のＦＩＳＨによる検出を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、幹細胞に由来する肝細胞、内皮細胞および胆管上皮細胞におけるＹ染色体のＦＩＳＨによる検出を示す。
【図７Ｃ】図７Ｃは、レストルシンの投与および８０％の肝臓切除後の、未処置のレシピエントラットに対して、幹細胞で処置したレシピエントラットのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線（１群あたりｎ＝４）を示す。
【図７Ｄ】図７Ｄは、機能のパラメータであるビリルビンが、長期に生存する幹細胞処置動物の完全な代謝機能を証明する。
【図７Ｅ】図７Ｅは、機能のパラメータであるアンモニア（ＮＨ３）が、長期に生存する幹細胞処置動物の完全な代謝機能を証明する。
【図８】図８は、インスリン産生細胞を示す。
【図９】図９は、肝細胞様細胞のアルブミン産生の時間経過を示す。
【図１０】図１０は、単球由来の肝細胞を示す。
【図１１】図１１は、ＦＡＣＳ分析を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ−Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図４Ａ−Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年2月10日(2004.2.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト単球起源の、脱分化した、プログラム可能な幹細胞の生成のためのプロセスであって、該プロセスは、以下：
ａ）単離したヒト血液から得られた単球が、細胞増殖因子Ｍ−ＣＳＦを含む、適切な培養培地中で増殖すること；
ｂ）該単球が、工程ｂ）と同時かまたは工程ｂ）の後に、ＩＬ−３を含む培養培地中で培養されること；および
ｃ）該ヒトの成熟した脱分化したプログラム可能な幹細胞が、培養培地から該細胞を分離することによって得られること；
を特徴とする、プロセス。
【請求項２】
前記工程ｂ）の培養培地に、メルカプト化合物がさらに添加されることを特徴とする、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
メルカプト化合物が使用され、該化合物中では少なくとも１つの炭素基が、硫黄に結合しており、炭化水素基が、１つ以上のさらなる官能基で置換され得ることを特徴とする、請求項２に記載のプロセス。
【請求項４】
前記メルカプト化合物が、２−メルカプトエタノールまたはジメチルスルホキシドであることを特徴とする、請求項２または請求項３に記載のプロセス。
【請求項５】
工程ｂ）の後および工程ｃ）の前に、前記細胞が、生物学的に受容可能な有機溶媒と接触されることを特徴とする、請求項１〜請求項４に記載のプロセス。
【請求項６】
前記生物学的に受容可能な有機溶媒が、１〜４個の炭素原子を有するアルコールであることを特徴とする、請求項５に記載のプロセス。
【請求項７】
前記アルコールが、エタノールであることを特徴とする、請求項６に記載のプロセス。
【請求項８】
前記細胞が、前記生物学的に受容可能な有機溶媒の気相と接触されることを特徴とする、請求項５〜請求項７に記載のプロセス。
【請求項９】
工程ｃ）の後に、前記細胞が、適切な細胞培養培地中に懸濁されることを特徴とする、請求項１〜請求項８に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記培地が、ＲＰＭＩまたはＤＭＥＭであることを特徴とする、請求項９に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記培地が、サイトカインまたはＬＩＦを含むことを特徴とする、請求項９または請求項１０に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記細胞が、液体培地中に懸濁され、続いて急速凍結されることを特徴とする、請求項９〜請求項１１に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記培地が、細胞培養培地であることを特徴とする、請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１４】
膜結合型単球特異的表面抗原であるＣＤ１４と、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３およびＣＤ１３５からなる群から選択される少なくとも１つの多能性マーカーとによって特徴付けられる、ヒト単球起源の、脱分化した、プログラム可能な幹細胞。
【請求項１５】
請求項１〜１３のプロセスによって得られ得る、請求項１４に記載の幹細胞。
【請求項１６】
請求項１４または請求項１５に記載の、脱分化した、プログラム可能な幹細胞を含む、薬学的組成物。
【請求項１７】
標的細胞および標的組織を生成するための、請求項１４または請求項１５に記載の、脱分化した、プログラム可能な幹細胞の使用。
【請求項１８】
請求項１７に記載の使用であって、以下：
ａ）所望の標的細胞を含む組織が破砕されること；
ｂ）該標的細胞および／または該標的細胞のフラグメントが、該破砕された組織から得られること；
ｃ）該標的細胞および／または該標的細胞のフラグメントが、適切な培養培地中でインキュベートされること；
ｄ）該培養培地の上清が、標的細胞馴化培地としてインキュベーション中およびインキュベーション後に収集されること；ならびに
ｅ）該所望の標的細胞への前記幹細胞の再プログラミング／分化のために、該幹細胞が、該標的細胞馴化培地の存在下で増殖されること；
を特徴とする、使用。
【請求項１９】
脂肪細胞、ニューロンおよびグリア細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、肝細胞もしくは島細胞の生成のための、請求項１７または請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記脱分化した、プログラム可能な幹細胞が、１つ以上の遺伝子でトランスフェクトされることを特徴とする、請求項１〜請求項１３に記載のプロセス。
【請求項２１】
前記脱分化した、プログラム可能な幹細胞が、１つ以上の遺伝子でトランスフェクトされていることを特徴とする、請求項１４または請求項１５に記載の幹細胞。
【請求項２２】
適切な培地中に、請求項１４、請求項１５または請求項２１に記載の、脱分化した、プログラム可能な幹細胞を含む、幹細胞調製物。
【請求項２３】
肝硬変の処置のための薬学的組成物の調製のための、請求項１４、請求項１５または請求項２１に記載の、脱分化した、プログラム可能な幹細胞の使用。
【請求項２４】
膵不全の処置のための薬学的組成物の調製のための、請求項１４、請求項１５または請求項２１に記載の、脱分化した、プログラム可能な幹細胞の使用。
【請求項２５】
急性腎不全または慢性腎不全の処置のための薬学的組成物の調製のための、請求項１４、請求項１５または請求項２１に記載の、脱分化した、プログラム可能な幹細胞の使用。
【請求項２６】
ホルモン機能不全の処置のための薬学的組成物の調製のための、請求項１４、請求項１５または請求項２１に記載の、脱分化した、プログラム可能な幹細胞の使用。
【請求項２７】
心筋梗塞の処置のための薬学的組成物の調製のための、請求項１４、請求項１５または請求項２１に記載の、脱分化した、プログラム可能な幹細胞の使用。
【請求項２８】
肺塞栓症の処置のための薬学的組成物の調製のための、請求項１４、請求項１５または請求項２１に記載の、脱分化した、プログラム可能な幹細胞の使用。
【請求項２９】
発作の処置のための薬学的組成物の調製のための、請求項１４、請求項１５または請求項２１に記載の、脱分化した、プログラム可能な幹細胞の使用。
【請求項３０】
皮膚損傷の処置のための薬学的組成物の調製のための、請求項１４、請求項１５または請求項２１に記載の、脱分化した、プログラム可能な幹細胞の使用。
【請求項３１】
標的細胞および標的組織のインビボにおける生成のための薬学的組成物の調製のための、請求項１４、請求項１５または請求項２１に記載の、脱分化した、プログラム可能な幹細胞の使用。
【請求項３２】
前記膜結合型表面抗原ＣＤ１４により特徴付けられる請求項１４、請求項１５または請求項２１に記載の前記幹細胞を再プログラミングすることによって得られる、分化した、単離された、標的体細胞および／または標的体組織。
【請求項３３】
脂肪細胞、ニューロンおよびグリア細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、肝細胞ならびに島細胞からなる群から選択される、請求項３２に記載の標的体細胞および／または標的体組織。
【請求項３４】
１つ以上の遺伝子でトランスフェクトされていることを特徴とする、請求項３２または請求項３３に記載の標的体細胞および／または標的体組織。
【請求項３５】
請求項１４、請求項１５または請求項２１に記載の脱分化した、プログラム可能な幹細胞あるいは請求項３２〜請求項３４に記載の標的体細胞および／または標的体組織でコーティングされた、移植可能な材料。
【請求項３６】
前記材料がプロテーゼであることを特徴とする、請求項３５に記載の移植可能な材料。
【請求項３７】
前記プロテーゼが、心臓弁プロテーゼ、管プロテーゼ、骨プロテーゼおよび関節プロテーゼからなる群から選択されることを特徴とする、請求項３６に記載の移植可能な材料。
【請求項３８】
前記移植可能な材料が、請求項１４、請求項１５または請求項２１に記載の脱分化した、プログラム可能な幹細胞あるいは請求項３２〜請求項３４に記載の標的細胞を含む、人工的キャリア材料および／または生物学的キャリア材料であることを特徴とする、請求項３５に記載の移植可能な材料。     
【請求項３９】
前記キャリア材料が、人体中への導入のためのバッグまたはチャンバであることを特徴とする、請求項３８に記載の移植可能な材料。
【請求項４０】
インスリンの供給のための人工島細胞ポートチャンバとしての使用のための薬学的構築物の生成のための、請求項３２に記載の島細胞を含む請求項３９に記載のバッグまたはチャンバの使用。
【請求項４１】
手術後の乳房構築のためならびに形成矯正および／または美容矯正の場合に使用するための、薬学的構築物の製造のための請求項３２に記載の脂肪細胞を含む請求項３９に記載のバッグまたはチャンバの使用であって、該薬学的構築物は、脂肪細胞で満たした人工ポリマーを含む、使用。
【請求項４２】
請求項３５または請求項３９に記載の移植可能な材料であって、請求項３２に記載の分化した単離された標的体細胞を含む、半透性のポートチャンバ系であることを特徴とする、移植可能な材料。
【請求項４３】
内分泌疾患、代謝病または止血性疾患のインビボにおける処置のための薬学的構築物の製造のための、請求項４２に記載の半透性のポートチャンバ系の使用。
【請求項４４】
培養培地中におけるヒト単球起源の脱分化した、プログラム可能な幹細胞の生成のための、Ｍ−ＣＳＦおよびＩＬ−３の使用。
【国際調査報告】
2005521405.tif 000033
2005521405.tif 000034
2005521405.tif 000035