(57)【要約】生物学的基質（１）上の第２結合部位（５）に対するリガンドを同定する方法が開示される。この方法は、この生物学的基質（１）上の第１結合部位（３）および第２結合部位（５）に結合する第１多重結合化合物（４）の存在下において、生物学的基質上の第１結合部位（３）に結合するプローブ化合物（２）の結合に対する試験体化合物（９）の影響を決定する工程を包含する。首尾良い候補化合物は、第２結合部位に結合するための第１多重結合化合物に匹敵し、そして第１多重結合化合物の結合を生物学的基質に低減させる。第１多重結合化合物の低減された結合は、プローブ化合物の増大した結合により、検出され得る。
2005501218.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的基質上の第２結合部位に対するリガンドを同定する方法であって、該生物学的基質上の第１結合部位および該第２結合部位に結合する第１多重結合化合物の存在下において、該生物学的基質上の第１結合部位に結合するプローブ化合物の結合に対する候補化合物の影響を決定する工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記第１多重結合化合物が、前記生物学的基質上の第２結合部位に弱く結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プローブ化合物が、放射標識されている、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記候補化合物の影響が、該候補化合物へ曝露する場合および曝露しない場合における結合したプローブ化合物に由来する放射能を測定することにより決定される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第１化合物が、該第１化合物のＫｄの５〜１０倍の範囲の濃度で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記プローブ化合物が、該プローブ化合物のＫｄ未満の濃度で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記候補化合物が、１００〜１０００μＭの範囲の濃度で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記生物学的基質が、膜レセプター、膜チャネル、酵素または高分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
複数の候補化合物の影響が、マルチウェルプレートで測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記生物学的基質上の第１結合部位に結合するリガンドフラグメントおよび前記候補化合物のフラグメントを含む第２多重結合化合物を調製する工程、ならびに該生物学的基質への該第２多重結合化合物の結合を決定する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記候補化合物が、式Ｘ−Ｈであり、および前記フラグメントが、式Ｘである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
複数の異なる第２化合物が調製される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１化合物および第２化合物の構造が、それぞれ式Ｉおよび式ＩＩ：
【数１】
2005501218.tif 000015
により表され：
ここで：
Ｒ１ａおよびＲ１ｂは、それぞれ、前記生物学的基質上の第１結合部位に結合可能なフラグメントを含む有機基を表し；
Ｒ２ａは、該生物学的基質上の第２結合部位に結合可能なフラグメントを含む有機基を表し、
Ｌａは、該生物学的基質上の第１結合部位および第２結合部位のそれぞれに対する、Ｒ１ａおよびＲ１ｂの両方の結合を許容する適正な位置に、Ｒ１ａ基およびＲ２ａ基を配置するリンカー基を表し；
Ｒ２ｂは、首尾良い候補化合物のフラグメントを含む有機基を表し；そして
Ｌｂは、Ｒ１ｂおよびＲ２ｂの相対位置を制約するリンカー基を表す、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記第２化合物が、下式：
【数２】
2005501218.tif 000016
である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
実質的に、図面を参照して本明細書中で記載したとおりに、生物学的基質上の第２結合部位に対するリガンドを同定する、方法。
【請求項１６】
候補化合物が、生物学的基質の第２結合部位に対するリガンドであるか否かを決定する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）（ｉ）該生物学的基質の第１結合部位に結合するプローブ化合物および（ｉｉ）該生物学的基質の第１結合部位および第２結合部位に結合する第１多重結合化合物の存在下において、候補化合物と、該第１結合部位および第２結合部位を含む生物学的基質とを接触させる工程；
（ｂ）工程（ａ）における該生物学的基質の第１結合部位に結合するプローブ化合物の量を決定する工程；
（ｃ）該候補化合物の非存在下において、該プローブ化合物および該第１の多重結合化合物と該生物学的基質とを接触させる場合に該第１結合部位に結合するプローブ化合物の予め決定された量と、工程（ｂ）において決定されたプローブ化合物の量とを比較する工程、
を包含する、方法。
【請求項１７】
生物学的基質の第２結合部位に対する複数の候補化合物の相対結合親和性を決定する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）（ｉ）該生物学的基質の第１結合部位に結合するプローブ化合物および（ｉｉ）該生物学的基質の第１結合部位および第２結合部位に結合する第１多重結合化合物の存在下において、該複数の候補化合物の各々と、該第１結合部位および第２結合部位を含む生物学的基質とを接触させる工程；
（ｂ）工程（ａ）において該候補化合物の各々について、該生物学的基質の第１の結合部位に結合するプローブ化合物の量を決定する工程；
（ｃ）該候補化合物の各々について、工程（ｂ）において決定されたプローブ化合物の量を比較する工程、
を包含する、方法。
【請求項１８】
前記生物学的基質上の第１結合部位に結合するリガンドフラグメントおよび候補化合物のフラグメントを含む第２多重結合化合物を調製する工程、ならびに該生物学的基質への該第２多重結合化合物の結合を決定する工程をさらに包含する、請求項１６または１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的活性を有する化合物を同定するための方法に関する。より詳細には、本発明は、基質に結合することが知られている多重結合化合物を用いることにより、生物学的基質に結合するリガンドを同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物学的系の機能は、この系における生物学的基質に結合するリガンドの作用により調節され得、その結果、生物学的応答を誘発する。このリガンドが、内因性リガンドの作用を模倣し得る場合はアゴニストとよばれ、また内因性リガンドの作用を阻害し得る場合はアンタゴニストとよばれる。多くの生物学的に有用な化合物（例えば、医薬、農薬および植物成長制御因子など）が、このような場合、リガンドとして作用する。
【０００３】
リガンドは、選択的に生物学的基質に結合し、その結果、いかなる他の生物学的系においても、生物学的応答を誘発しないということは、一般的に非常に重要である。リガンドが、生物学的基質に強力に結合し、その結果、低濃度のリガンドのみが、生物学的応答を誘発するのに必要とされることもまた一般的に重要である。
【０００４】
時間の経過に伴って、生物学的系は進化し、これらの内因性リガンドが、強力かつ選択的に、それらのそれぞれの生物学的基質に結合する。
【０００５】
生物学的な基質に、強力かつ選択的に結合する外因性リガンドを同定するための方法が開発されてきたが、これらの方法は、時間を費やし、多数の候補物の作製および試験を必要とする。
【０００６】
ひとつの方法は、試験の生物学的系において生物学的応答を誘発させるための候補物の能力を測定する工程、次いで、別の生物学的系、または全生物体において生物学的応答を誘発しない能力を測定することによって活性な候補物の選択性の評価する工程を包含する。
【０００７】
別の方法は、公知のリガンド（例えば内因性リガンドまたはアゴニスト）を置換させるための候補物の能力を測定する工程を包含する。この方法においては、公知のリガンドがプローブとして用いられる。これは、放射標識され得、候補物の存在下または非存在下において、生物学的基質に結合するかまたは結合しない公知のリガンドの量を測定するのを容易にする。
【０００８】
リガンドを同定するための別の方法は、米国特許第５，６９８，４０１号（Ｆｅｓｉｋ）に開示される。この方法は、１５Ｎ標識生物学的基質およびＮＭＲ技術を利用する。この方法において、候補物の存在下での生物学的基質の１５Ｎ／１Ｈ２次元相関スペクトルが、候補物の非存在下での１５Ｎ／１Ｈ２次元スペクトルと比較される。候補物の異なる濃度において得られたスペクトルの比較により、生物学的基質と候補物との間の解離定数Ｋｄが、決定され得る。
【０００９】
国際特許出願公報ＷＯ００／００８２３は、化学的反応基を含む（または化学的反応基を含むように修飾された）生物学的基質により、化学的修飾基と反応し得る試験化合物に曝露されるリガンドを同定する方法を開示する。この方法は、生物学的基質に対して結合親和性を有する試験化合物が、結合親和性を有さない試験化合物よりも、化学的反応基とより有利に反応する傾向があると想定される。
【００１０】
生物学的基質は、リガンドが結合し得る１つ以上の部位を含み得、リガンドに関して増してきている最近の関心は、生物学的基質上の１つより多くの結合部位に結合する能力を有することである（Ｂｏｒｍａｎ，Ｓ．、２０００年１０月９日、Ｃ＆ＥＮ、４８−５３）。このような化合物またはリガンドは、多重結合または多価の化合物またはリガンドとしてみなされる。これらの多重結合化合物は、２つ以上の結合領域または一部分または１つ以上のリンカーと連結される部分またはリガンドフラグメントを含む。これらのリンカーは、結合領域の相対位置および配置を制約する。その結果、各々の結合領域は、生物学的基質上のそれぞれの結合部位に同時に結合し得る。この生物学的基質は、単一ユニットまたは２つ以上のユニットのクラスターを構成し得、この場合、多価化合物は、２つ以上のユニット上での結合部位に同時に結合し得る。
【００１１】
多重結合リガンドは、一価リガンドよりも生物学的基質に、より強力かつ選択的に結合する。これは、多価結合領域の存在により、リガンド全体が結合しないことにはならなそうであることを意味するからであり、２つの異なる生物学的基質が、同じ相対位置において同じ多重結合を有することがないからである。
【００１２】
ＷＯ９９／４２４７６およびＷＯ９９／６４０３２は、多重結合リガンドを同定するための反復方法を開示し、この中で、候補物が、多様なリンカーを介して公知のリガンドの多様なフラグメントを連結させ、次いで候補物は、多重結合特性を有するかどうか決定することにより調製される。首尾良い候補物は、生物学的基質上の異なる結合部位に結合可能であり、そしてこのような方法で、それぞれの結合部位に同時に結合し得るリンカーによって提示する、公知のリガンドのフラグメントを含む。
【００１３】
ＷＯ９９／４２４７６およびＷＯ９９／６４０３２において開示されるこの方法の出願は、高度に強力かつ選択的なリガンドの迅速な同定を可能にする。しかし、他の方法についての必要性は、残存するままである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
現在、リガンドを同定するために発明された方法は、別の結合部位に結合するリガンドを同定するための生物学的基質上の１つの結合部位に対するリガンドの結合親和性を利用する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
従って、１つの局面に従って、本発明は、生物学的基質上の第２結合部位に対するリガンドを同定するための方法を提供し、これは、生物学的基質上の第１結合部位および第２結合部位に結合する第１多重結合化合物の存在下において、生物学的基質上の第１結合部位に結合するプローブ化合物の結合に対する、候補化合物の影響を測定する工程を含む。
【００１６】
首尾良い候補化合物は、第２結合部位に結合するための第１多重結合化合物に匹敵し、そして第１多重結合化合物の結合を生物学的基質に低減させる。第１多重結合化合物の低減された結合は、プローブ化合物の増大した結合により、検出され得る。
【００１７】
従って、別の局面において、本発明は、候補化合物が、生物学的基質の第２の結合部位に対するリガンドであるかどうか決定する方法を提供する。この方法は、以下：
（ａ）（ｉ）生物学的基質の第１結合部位に結合するプローブ化合物および（ｉｉ）生物学的基質の第１結合部位および第２結合部位と結合する第１多重結合化合物の存在下において、第１結合部位および第２結合部位を含む生物学的基質を、候補化合物と接触させる工程；
（ｂ）工程（ａ）における生物学的基質の第１の結合部位に結合するプローブ化合物の量を決定する工程；ならびに
（ｃ）候補化合物の非存在下においてプローブ化合物および第１の多重結合化合物と生物学的基質が接触する場合に第１結合部位に結合するプローブ化合物の予め決定された量と、工程（ｂ）において決定されたプローブ化合物の量とを比較する工程、
を包含する。
【００１８】
候補化合物が、生物学的基質の第２結合部位に対するリガンドである場合、プローブ化合物の多くは、候補化合物の非存在下よりも候補化合物の存在下において、生物学的基質の第１結合部位に結合する。
【００１９】
さらに、候補化合物の相対的な結合親和性は、各々の候補化合物の存在下における、生物学的基質に結合するプローブ化合物の相対量を比較することにより、本発明の方法を用いて決定され得る。従って、なお別の局面において、本発明は、生物学的基質の第２結合部位に対する多数の候補化合物の相対的な結合親和性を決定する方法を提供し、この方法は以下；
（ａ）（ｉ）生物学的基質の第１結合部位に結合するプローブ化合物および（ｉｉ）生物学的基質の第１結合部位および第２結合部位に結合する第１多重結合化合物の存在下において、第１結合部位および第２結合部位を含む生物学的基質を、複数の候補化合物の各々と接触させる工程；
（ｂ）工程（ａ）における各々の候補化合物に対する生物学的基質の第１の結合部位に結合するプローブ化合物の量を決定する工程；
（ｃ）各々の候補化合物について、工程（ｂ）において決定されたプローブ化合物の量を比較する工程、
を包含する。
【００２０】
上記方法において、各々の候補化合物は、好ましくはアッセイさるか、または別個にスクリーニングされる。各々の候補化合物の存在下における生物学的基質の第１結合部位に結合するプローブ化合物の量は、第２結合部位に対する候補化合物の親和性、第２の結合部位に対する各々の候補化合物の相対的な親和性が決定され得ることに関連する。
【００２１】
（発明の詳細な説明）
本発明は、第１多重結合化合物およびプローブ化合物を用いて、生物学的基質上の第２結合部位に対するリガンドを同定する方法を提供する。
【００２２】
好ましくは、第１多重結合化合物は、生物学的基質上で、第２結合部位に弱く結合する。次いで、候補化合物により、生物学的基質由来の化合物を置換することがより容易となる。第１多重化合物が第２結合部位へより強力に結合するほど、この生物学的基質由来の化合物を置換するのに必要とされる候補化合物の濃度がより高くなる。
【００２３】
この生物学的基質は、第１結合部位および第２結合部位を含む、任意の生物学的物質であり得る。これは、単一ユニットまたは２つ以上の隣接したユニットのクラスターを構成し得、それらの各々は１つ以上の結合部位を含み得る（すなわち、第１結合部位および第２結合部位は、同じまたは異なる生物学的基質またはユニット上に存在し得る）。このように、例えば、生物学的基質は、１、２、３、４、５、それより多いユニットを構成し得、これらは、２〜１００結合部位を含み得る。
【００２４】
この生物学的基質は、例えば、タンパク質、炭水化物または核酸などの生体高分子を含み得る。
【００２５】
この生物学的基質は、好ましくは膜レセプター、膜チャネル（イオンチャネル）、酵素または高分子である。生物学的基質の例としては、ムスカリンＭ２レセプターがある。
【００２６】
この生物学的基質は、膜に結合し得、そして公知の方法（例えば、リコンビナント技術）により得られ得る。
【００２７】
このプローブ化合物は、例えば、放射標識、蛍光、化学発光であり得る。放射標識は、例えば、トリチウム（３Ｈ）であり得る。
【００２８】
所定の生物学的基質に対するプローブ化合物として使用するのに適切な物質は、当該分野で周知である。代表的には、プローブ化合物のＫｄは、１００ｎＭ未満であり、好ましくは１０ｎＭ未満である。例えば、トリチウム化したＮ−メチルスコパルアミンは、ムスカリンＭ２レセプターに対するプローブ化合物として使用され得る。
【００２９】
この第１多重結合化合物、および生物学的基質上の第１部位および第２部位に結合するそれらの能力は、当該分野で公知であり得る。第１多重結合化合物が公知でない場合、好ましい第１化合物は、以下のように誘導され得る：
当該分野で公知である場合、例えば、Ｘ線結晶学から、生物学的基質は、公知の距離だけ離れた第１結合部位および第２結合部位を含み、各々の結合部位に対するリガンドは公知であり、次いで第１多重結合化合物は、リガンドのフラグメントをリンカーを介して連結することにより同定され得る。このリンカーは、例えば、非分枝または分枝のアルキル鎖またはエーテル鎖であり得、必要に応じて、１つ以上の炭素−炭素二重結合または三重結合を含み得る。必要とされるリガンドが公知である場合、第１多重結合化合物を同定するための方法例は、例えば特許文献３および特許文献４において見出され得る。
【００３０】
プローブ化合物の結合に対する候補化合物の影響は、当該分野において公知の技術を用いることによって、容易に決定され得る。例えば、このプローブ化合物が、放射標識される場合、候補化合物へ曝露する場合および曝露しない場合における結合プローブ化合物から放射能を測定することにより、この影響が決定され得る。首尾良い候補化合物は、生物学的基質への第１多重結合化合物の結合を低減させることによって、第１多重結合化合物により置換された放射標識プローブ化合物の量を低減させ、その結果、放射標識プローブ化合物が、生物学的基質上の第２結合部位に結合するための第１多重結合化合物と競合するのがより容易となる。結果として、結合したプローブ化合物からの放射能は、候補化合物への曝露がないよりある方がより高い。
【００３１】
各々の候補化合物の影響は、別個に測定され得るか、または複数の候補化合物の影響は、マルチウェルプレート中で測定され得る。簡便なマルチウェルプレートは、９６、３８４または１５３６ウェルプレートである。この候補化合物は、個々のウェルで、または群として、１つのウェルの各群において、別個にスクリーニングされ得る。次いで、候補化合物群が十分な結合を示す場合、この群のメンバーは、個々に評価され得る。個々の候補化合物の代わりに、候補化合物の群の初期スクリーニングは、スクリーニング工程を大幅に促進させ得、コンビナトリアルケミストリー技術により生成された候補化合物のライブラリーのスクリーニングまたは天然産生混合物（例えば、醗酵または生物（例えば、植物）から抽出することにより調製される）のライブラリーのスクリーニングを容易にする。
【００３２】
この方法では、第１多重結合化合物は、第１多重結合化合物のＫｄ値の５〜１０倍の範囲の濃度において容易に存在する。この濃度において、プローブ化合物は、有意に置換される。例えば、このプローブ化合物が、放射標識される場合、第１多重結合化合物およびプローブ化合物を含むウェルでさえも、放射能は、ほとんど検出されない。
【００３３】
このプローブ化合物は、プローブ化合物のＫｄ未満の濃度において、容易に存在する。
【００３４】
候補化合物は、約１μＭ〜約１ｍＭの範囲の濃度において容易に存在し；好ましくは１００μＭ〜５００μＭである。
【００３５】
この候補化合物は、試験のために、例えば、化合物の多様な集合からランダムに選択され得る。あるいは、候補化合物は、第２部位に結合する第１多重結合化合物の領域との、これらの構造的な類似性に基づいて選択され得る。例えば、第２部位に結合する第１多重結合化合物の領域が、アミンである場合、他のアミンが候補化合物として選択され得る。「複数の候補化合物」は、２つ以上；好ましくは２〜約１００，０００；より好ましくは２〜１００；およびよりさらに好ましく、２〜２０の候補化合物をいう。
【００３６】
首尾良い候補化合物は、それら自体、生物学的基質に対する強力かつ選択的なリガンドであると証明され得る。そうでない場合は、次いで下記の工程が行われ得る。
【００３７】
一旦、首尾良い候補化合物が同定されると、第２多重結合化合物が、調製され得る。生物学的基質上の第１結合部位に結合する部分またはリガンドフラグメント、および首尾良い候補化合物の一部またはフラグメントを含む。この候補フラグメントおよび第２多重結合化合物におけるそのフラグメントの位置は、生物学的基質上の第１結合部位および第２結合部位に結合するリガンドを見つける目的で、好ましくは第１多重結合化合物を越える効力を有するリガンドが選択される。
【００３８】
従って、１つの好ましい局面に従い、この方法はさらに第２多重結合化合物（生物学的基質上の第１結合部位に結合する部分またはリガンドフラグメント、およびこの候補化合物の部分およびフラグメントを含む）を調製する工程ならびに生物学的基質への第２多重結合化合物の結合を測定する工程を包含する。
【００３９】
候補化合物上の少なくとも１つの原子が、候補化合物を第２化合物に共有結合的に連結するために除去されなければならないので、候補化合物全体が、第２化合物に組み込まれ得ないことが理解される。例えば、候補化合物が式Ｘ−Ｈである場合、フラグメントは式Ｘであり得る。
【００４０】
首尾良い候補化合物の構造の一部は、候補化合物の生物学的基質への結合にほとんどまたは全く寄与しないかもしれないことが理解され得る。従って、第２多重結合化合物が生物学的基質上の第２部位に結合するために、候補化合物のフラグメントは、結合に寄与する候補化合物の構造の一部を含むことが必要とされる。さらに、この第２多重結合化合物を、生物学的基質上の第１部位および第２部位の両方に結合させるために、フラグメントは正確に位置づけされることが必要とされる。
【００４１】
従って、例えば、第１および第２の多重結合化合物の構造は、それぞれ式Ｉおよび式ＩＩにより表され得る：
【００４２】
【数３】
2005501218.tif 000003
ここで：
Ｒ１ａおよびＲ１ｂの各々は、生物学的基質上の第１結合部位に結合可能なフラグメントを含む有機基を示し；
Ｒ２ａは、生物学的基質上の第２結合部位に結合可能なフラグメントを含む有機基を示し；
Ｌａは、生物学的基質上の第１結合部位および第２結合部位のそれぞれへのＲ１ａおよびＲ１ｂの両方の結合を許容するための適正な位置に、Ｒ１ａ基およびＲ２ａ基を配置させるリンカー基を示し；
Ｒ２ｂは、首尾良い候補化合物のフラグメントを含む有機基を示し；そして
Ｌｂは、Ｒ１ｂおよびＲ２ｂの相対位置を制約するリンカー基を示す。
【００４３】
ムスカリンＭ２レセプター上の第１結合部位および第２結合部位に結合する式Ｉの第１多重結合化合物の例は、以下の式：
【００４４】
【化１】
2005501218.tif 000004
の化合物である。
【００４５】
都合よくは、Ｒ１ｂは、Ｒ１ａと同じである。
【００４６】
首尾良い候補化合物の式がＸ−Ｈである場合、Ｒ２ｂは、例えばＸである。
【００４７】
いくつかの場合において、ＬｂはＬａと同じであり、例えばＲ２ｂはＸである。
【００４８】
式Ｈ−Ｘの候補化合物の例は、以下の式：
【００４９】
【化２】
2005501218.tif 000005
の化合物である。
【００５０】
従って、第２化合物は、例えば式
【００５１】
【数４】
2005501218.tif 000006
であり得る。
【００５２】
従って、式ＩＩ’の化合物の例は、以下の式：
【００５３】
【化３】
2005501218.tif 000007
の化合物である。
【００５４】
結合に寄与する候補化合物の構造の部分は、本明細書に記載されるように、プローブ化合物、第１多重結合化合物および複数の候補化合物を用いて、構造活性相関研究を実行することにより決定され得る。この構造活性相関研究において、この候補化合物の構造は、どの部分が結合に重要であるかを決定するために、意図的に変化され得る。この研究の結果より、第２化合物の残基に結合され得るフラグメント上の点を決定することもまた可能であるはずである。
【００５５】
好ましくは、複数の異なる第２化合物が調製され、生物学的基質に対する各々の結合が決定される。複数の第２化合物は、例えば、フラグメント上の異なる位置を通して結合される異なるフラグメントまたは同じフラグメントを含み得る。
【００５６】
都合良くは、第２化合物が第１多重結合化合物と同じの方法で調製され得るように、候補化合物が選択される。例えば、第１化合物が以下のプロセス（Ａ）：
【００５７】
【数５】
2005501218.tif 000008
（ここで、Ｚ１は化学的反応性基を示す）によって調製され得る場合、類似のプロセス：
【００５８】
【数６】
2005501218.tif 000009
により調製するために使用され得る式Ｈ−Ｘの候補化合物が使用され得る。
【００５９】
例えば、Ｈ−Ｒ２ａおよび式Ｈ−Ｘの各々の候補化合物は、アミンを表し得、そしてＺ１は、ハロゲン原子または有機スルホニルオキシ基などの、脱離原子または脱離基を表し得る。
【００６０】
あるいは、第１多重結合化合物が、以下のプロセス（Ｂ）：
【００６１】
【数７】
2005501218.tif 000010
（ここで、Ｚ２は、化学的反応性基を示す）によって調製され得る場合、式Ｈ−Ｘの候補化合物は、第２化合物が類似のプロセス：
【００６２】
【数８】
2005501218.tif 000011
により調製され得るように選択される。
【００６３】
両方の場合において、第２化合物の結合領域の相対位置は、第１化合物におけるそれらの位置に対して保持され、これにより第２化合物が、生物学的基質上の第１結合部位および第２結合部位の両方に結合する可能性が増大することが理解される。プロセス（Ａ）においても、出発物質は、候補化合物自体であり、従ってこのプロセスが好ましいことが理解される。
【００６４】
一旦、第２多重結合化合物が、生物学的基質上の第１結合部位および第２結合部位の両方に結合したことが見出されると、この第２多重結合化合物は、生物学的基質上の第１結合部位に対する他のリガンドを同定するために、第２結合部位に結合するプローブ化合物とともに用いられ得る。これらの他のリガンドは、生物学的基質上の第１結合部位および第２結合部位に結合する化合物をさらに同定するために順に用いられ得る。従って、生物学的基質上の第１部位および第２部位に結合する第１多重結合化合物から始まる、本発明に従う方法は、第１結合領域および第２結合領域のそれぞれに結合する第１多重結合化合物の領域における置換を提供することにより、生物学的基質への結合を最適化するために使用され得る。
【００６５】
本発明は、二価化合物の同定について特に詳細にされてきたが、原則的に、本発明に従う方法により同定され得る多重結合化合物の原子価に対する制限は無いことが理解される。例えば、第１多重結合化合物および／または第２化合物は、２〜１００の原子価を有し得る。従って、本発明に従う方法は、生物学的基質上の第１結合部位および第２結合部位へ結合し得、かつ生物学的基質上の第３結合部位に結合し得る化合物のフラグメントを含み得る第３の化合物を調製する工程、および生物学的基質へのこの第３の化合物の結合を決定する工程をさらに包含し得る。
【００６６】
本発明を、ここで図を参照して、より詳細に記載する。
【００６７】
図１は、生物学的基質（１）、生物学的基質上の第１部位（３）に結合する放射標識プローブ化合物（２）、生物学的基質上の第１部位（３）および第２部位（５）に結合する第１多重結合化合物（４）の図を示す。第１多重結合化合物は、生物学的基質上の第１部位に結合する第１結合領域（６）、生物学的基質上の第２部位に結合する第２結合領域（７）および第１領域と第２領域を連結するリンカー（８）を含む。
【００６８】
図２は、生物学的基質（１）、生物学的基質上の第１部位（３）に結合する放射標識プローブ化合物（２）、生物学的基質上の第１部位（３）および第２部位（５）に結合する第１多重結合化合物（４）、ならびに生物学的基質上の第２結合部位（５）に強力に結合する候補化合物（９）の図を示す。この候補化合物は、生物学的基質から第１多重結合化合物を置換し、そしてプローブ化合物（２）は、生物学的基質上の第１結合部位に結合している。
【００６９】
図３は、生物学的基質（１）、生物学的基質上の第１部位（３）に結合する放射標識プローブ化合物（２）、生物学的基質上の第１部位（３）および第２部位（５）に結合する第１多重結合化合物（４）、ならびに生物学的基質上の第２部位（５）に弱く結合する候補化合物（１０）の図を示す。この候補化合物は、生物学的基質から第１多重結合化合物を置換しないので、プローブ化合物（２）は、生物学的基質上の第１結合部位に結合しない。
【００７０】
候補化合物をウェルに添加した後、内容物をインキュベートし、次いで、生物学的基質を濾過によりウェルの未結合内容物から分離する。次いで、この生物学的基質から発した放射能を測定した。図４は、異なる化合物について測定した放射能を示す。生物学的基質の第２結合部位に強力に結合する候補化合物が、生物学的基質へのプローブ化合物の高い結合を生じ、結果として高測定レベルの活性を生じる。結合の弱い候補化合物は、低い放射能を生じる。
【実施例】
【００７１】
以下の実施例は、本発明を例証する。
【００７２】
（実施例Ａ）
（４−ピペリジルＮ−（２−ビフェニル）カルバメートの合成）
【００７３】
【化４】
2005501218.tif 000012
工程１：５０ｍＬ密閉チューブに、無水アセトニトリル（４０ｍＬ）中の２−ビフェニリルシアネート（８ｇ、４１ｍｍｏｌ）を添加した。この溶液に、Ｎ−ベンジル−４−ピペリジノール（９．８ｇ、５１．２５ｍｍｏｌ）を添加し、そして、このチューブをシリコンオイル浴に部分的に浸して８５℃まで加熱した。１６時間後、この反応混合物を冷却し、そして減圧下で濃縮して、１−ベンジル−４−ピペリジルＮ−（２−ビフェニル）カルバメートを得、これはさらに精製せずに、次の工程に使用した。
【００７４】
工程２：１−ベンジル−４−ピペリジルＮ−（２−ビフェニル）カルバメート（１２．５ｇ、３２．３ｍｍｏｌ）を、無水メタノール（１５０ｍＬ）およびギ酸（２５ｍＬ、６６０ｍｍｏｌ）に溶解し、そしてこの溶液を、ガス状の窒素で１５分間フラッシュした。１０％炭素担持パラジウム（３ｇ）を添加し、この反応混合液を窒素雰囲気下で攪拌した。１８時間後、この反応混合物を、セライト（Ｃｅｌｉｔｅ）に通して濾過し、そして、この濾液を濃縮して黄色固体を得た。この固体を０．１Ｎ  塩酸（３００ｍＬ）とジエチルエーテル（３００ｍＬ）との間で分配した。この水層をジエチルエーテルで洗浄し、次いで１Ｎ  水酸化ナトリウム溶液でｐＨ１２にアルカリ化した。沈殿した白色固体を酢酸エチルに抽出した。この酢酸エチル層を硫酸マグネシウムで乾燥し、そして乾固するまでエバポレートして、４−ピペリジルＮ−（２−ビフェニル）カルバメート（６．６３ｇ、６９％）を無色の固体として得た。ＭＳ＝２９６．９ＭＨ＋。
【００７５】
（実施例Ｂ）
（化合物Ａの合成）
アセトニトリル（４５ｍＬ）中の４−ピペリジルＮ−（２−ビフェニル）カルバメート（１．９５ｇ、６．６０ｍｍｏｌ）および１，９−ジブロモノナン（１．３４ｍＬ、６．６０ｍｍｏｌ）の混合物を８０℃に加熱する。１時間後、４−（３−フェニルプロピル）ピペリジン（１．３３ｇ、６．６０ｍｍｏｌ）をこの反応混合物に添加し、加熱を続ける。４時間後、この反応混合物を冷却し、減圧下で濃縮し、そしてＨＰＬＣで精製して所望の生成物を得る。
【００７６】
（実施例１）
（候補化合物のスクリーニング）
９６ウェルプレートの各ウェルに、以下を添加する：
ａ）化合物Ａ（リン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４）中、ウェル中の最終濃度が２００ｎＭ（化合物ＡのＫｄ値の１０倍）になるように添加）；
ｂ）トリチウム化Ｎ−メチルスコパラミン（ｓｃｏｐａｌａｍｉｎｅ）（３Ｈ−ＮＭＳ）（各ウェル中の最終濃度が１０ｎＭ（３Ｈ−ＮＭＳのＫｄ値の０．５倍）になるように添加）；
ｃ）最終濃度５００ｎＭの候補化合物（この候補化合物は、化合物Ｂおよび化合物Ｃを含むアミン（市販されている）から選択される）；
【００７７】
【化５】
2005501218.tif 000013
ならびに
ｄ）ヒトクローン化ムスカリンレセプター（周知の手順および試薬を用いてＣＨＯ細胞中のＭ２コードプラスミドの発現により調製された）を含む膜。
【００７８】
次いで、この９６ウェルプレートを３７℃で１時間インキュベートする。インキュベーション後、この膜を濾過して、未結合３Ｈ−ＮＭＳから結合３Ｈ−ＮＭＳを分離する。次いで、シンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）を添加し、このプレートを計測器に入れ、各ウェルの放射能を測定する。
【００７９】
次いで、各ウェルにおいて決定された放射能を、候補化合物の非存在下で、上記の手順を用いて測定された予め決定された放射能と比較する。首尾良い候補化合物（すなわち、レセプターの第２結合部位におけるリガンド）を含むウェルは、候補化合物の非存在下で測定された放射能と比較して高い放射能を示す。
【００８０】
さらに、より首尾良い候補化合物（すなわち、第２結合部位に対してより大きい親和性を有する化合物）を含むウェル中の放射能の量は、それほど首尾良くないかまったく首尾良くない候補化合物を含むウェル中の放射能の量よりも高い。なぜなら、このほり首尾良い候補化合物は、レセプターから化合物Ａをより多く置換し、その代わり、より多くの３Ｈ−ＮＭＳを結合させるからである。上記の手順において、化合物Ｂは、レセプターへ強く結合することが見出される（高い放射能が観察される）化合物Ｃと比較して、レセプターへ弱く結合することが見出される（低い放射能が観察される）。
【００８１】
次いで、化合物Ｄは、化合物Ａの調製に用いられた類似の方法により化合物Ｃから調製される。
【００８２】
【化６】
2005501218.tif 000014
次いで、レセプターへの化合物Ｄの結合は、３Ｈ−ＮＭＳを用いて測定される。化合物Ｄは、２ｎＭのＫｄ（これは化合物Ａより強力である）を有することが見出される。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】図１は、生物学的基質（１）、放射標識プローブ化合物（２）および第１多重結合化合物（３）の描写を示す。
【図２】図２は、生物学的基質（１）、放射標識プローブ化合物（２）、第１多重結合化合物（３）および候補化合物（９）の描写を示す；ここで、放射標識プローブ化合物および候補化合物は、生物学的基質に結合される。
【図３】図３は、生物学的基質（１）、放射標識プローブ化合物（２）、第１多重結合化合物（３）および候補化合物（９）の描写を示す；ここで、第１多重結合化合物は、生物学的基質に結合される。
【図４】図４は、各ウェルに候補化合物が添加され、そして生物学的基質が、そのウェルの任意の非結合内容物から濾過により分離された後の、測定された放射能のプロットを示す。
【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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