(57)【要約】細胞内へのウイルスの進入を促進させるキメラ膜貫通蛋白質であって、（ｉ）ウイルスと結合することができる細胞外ドメイン：および（ｉｉ）細胞内内在化シグナルとを含む。
2005503777.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラ膜貫通蛋白質であって、
（ｉ）ウイルスと結合することができる細胞外ドメイン、及び
（ｉｉ）細胞内内在化シグナル
を含む蛋白質。
【請求項２】
前記細胞外ドメインが抗体フラグメントである、請求項１に記載の蛋白質。
【請求項３】
前記抗体フラグメントが抗体重鎖の可変領域及び抗体重鎖の可変領域を含む、請求項２に記載の蛋白質。
【請求項４】
前記細胞外ドメインが、ウイルスのコート蛋白質に結合することができる、細胞表面受容体またはそのフラグメントを含む、請求項１に記載の蛋白質。
【請求項５】
前記ウイルスが、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＲＳＶ、インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス、狂犬病ウイルス、コクサッキーウイルスまたはライノウイルスから選択される、前記請求項のいずれか一項に記載の蛋白質。
【請求項６】
前記ウイルスがＨＩＶである、前記請求項のいずれか一項に記載の蛋白質。
【請求項７】
前記細胞外ドメインが、ｇｐ１２０／１６０に対する抗体、または前記抗体のフラグメントである、請求項６に記載の蛋白質。
【請求項８】
前記細胞外ドメインが、ＣＤ４、またはＨＩＶと結合することができるそのフラグメントである、請求項６に記載の蛋白質。
【請求項９】
前記ウイルスがＨＣＶである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の蛋白質。
【請求項１０】
前記細胞外ドメインが、Ｅ２蛋白質に対する抗体、または前記抗体のフラグメントである、請求項９に記載の蛋白質。
【請求項１１】
前記細胞外ドメインが、ＣＤ８１、またはＨＣＶと結合することができるそのフラグメントである、請求項９に記載の蛋白質。
【請求項１２】
前記内在化シグナルが、恒常的に再循環する受容体から得られる、前記請求項のいずれか一項に記載の蛋白質。
【請求項１３】
前記受容体が、低密度リポ蛋白質受容体（ＬＤＬＲ）、トランスフェリン受容体（ＴＦＲ）、カチオン依存性マンノース−６−リン酸受容体（ＣＤ−Ｍａｎ−６−ＰＲ）、カチオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体（ＣＩ  Ｍａｎ−６−ＰＲ）、ポリＩｇ受容体、またはアシアロ糖蛋白質受容体（ＡＳＧＰＲ）Ｈ１サブユニットである、請求項１２に記載の蛋白質。
【請求項１４】
前記蛋白質が前記受容体の細胞内ドメイン全体を含む、請求項１２または１３に記載の蛋白質。
【請求項１５】
前記蛋白質が前記受容体のフラグメントを含む、請求項１２または１３に記載の蛋白質。
【請求項１６】
前記フラグメントが４〜４０アミノ酸の長さである、請求項１５に記載の蛋白質。
【請求項１７】
前記蛋白質が、２つ以上の恒常的に再循環する受容体のそれぞれのフラグメントを含むキメラ細胞内ドメインを含む、請求項１２、１３、１５または１６のいずれか一項に記載の蛋白質。
【請求項１８】
前記請求項のいずれか一項に記載される蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項１８に記載されるポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２０】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載される蛋白質を含む細胞。
【請求項２１】
請求項２０に記載される細胞を作製する方法であって、細胞に、請求項１８に記載されるポリヌクレオチドまたは請求項１９に記載されるベクターで形質導入すること、そして請求項１〜１７のいずれか一項に記載される蛋白質の発現を得るために好適な条件のもとで前記細胞を維持することを含む方法。
【請求項２２】
前記蛋白質の細胞外ドメインに結合することができるウイルスに感染している、請求項２０に記載の細胞。
【請求項２３】
非ヒト細胞である、請求項２２に記載の細胞。
【請求項２４】
細胞が肝臓細胞であり、前記ウイルスがＨＣＶである、請求項２２または２３に記載の細胞。
【請求項２５】
前記ウイルスがＨＩＶである、請求項２２または２３に記載の細胞。
【請求項２６】
請求項２２に記載される細胞を作製する方法であって、請求項２０に記載される細胞をウイルスと接触させることを含み、前記接触が、前記ウイルスが前記蛋白質に結合するために好適な条件のもとで行われる方法。
【請求項２７】
請求項２０及び２２〜２５のいずれか一項に記載される細胞を含む、遺伝子組換え非ヒト動物。
【請求項２８】
抗ウイルス剤を同定するための方法であって、
（ｉ）請求項２２に記載される細胞、または請求項２２に記載される細胞を含む非ヒト遺伝子組換え動物を提供すること。
（ｉｉ）前記の細胞または動物を試験剤と接触させること、及び
（ｉｉｉ）ウイルス感染をモニターすること
を含み、それによって試験剤が抗ウイルス活性を有するかどうかを決定する方法。
【請求項２９】
ウイルス感染を防止または阻害することができる抗ウイルスワクチンまたは抗ウイルス剤を同定する方法であって、
（ｉ）請求項２０に記載される細胞、または請求項２０に記載される細胞を含む非ヒト遺伝子組換え動物を提供すること、
（ｉｉ）前記の細胞または動物を試験剤と接触させること、
（ｉｉｉ）前記の細胞または動物を、前記蛋白質に結合することができるウイルスと接触させること、及び
（ｉｖ）試験剤がウイルス感染を防止または制限するかどうか決定すること
を含む方法。
【請求項３０】
工程（ｉｉ）において、前記試験剤が前記動物に投与される、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の方法であって、工程（ｉｉｉ）または工程（ｉｖ）において、
（ａ）細胞死をモニターすること、
（ｂ）ウイルス複製をモニターすること、
（ｃ）蛋白質合成をモニターすること、及び
（ｄ）前記細胞のウイルス蛋白質表面の存在をモニターすること
の１つ以上を含む方法。
【請求項３２】
請求項２８〜３１のいずれか一項に記載される方法によって同定された、抗ウイルス剤またはワクチン。
【請求項３３】
ウイルス感染の治療的または予防的処置に使用するための医薬品の製造における、請求項３２に記載される薬剤またはワクチンの使用。
【請求項３４】
前記ウイルス感染がＨＣＶまたはＨＩＶ感染である、請求項３１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はウイルス感染に関する。特に、本発明は、細胞内へのウイルスの進入を促進させるために設計された蛋白質、そのような蛋白質を含む細胞及び非ヒト遺伝子組換え動物、ならびにそのような細胞及び動物にウイルスを感染させる方法に関する。本発明はまた、抗ウイルス剤を試験及びスクリーニングするための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルスが感染を確立するためには、ウイルスは、最初に、細胞に進入しなければならない。例えば、ヒト免疫不全症ウイルスＩ型（ＨＩＶ−１）の感染では、ウイルスのエンベロープ蛋白質ｇｐ１２０／１６０が細胞表面のＣＤ４分子に結合し、その後、共受容体と相互作用することが伴う。これにより、ウイルスと細胞膜との融合が生じる。ＨＩＶ−１ウイルスの取り込みを、ＣＤ４及びそれぞれのケモカイン受容体を同時発現させることによって異種の細胞株において再構築することができる。このことは、細胞型及び種に特異的な感染が、一般には、ウイルス受容体によって媒介されるレベルで決定されることを示唆している。
【０００３】
他のウイルスが細胞に進入する機構はあまりよく理解されておらず、また適切な細胞型システムを利用することができない。例えば、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、肝細胞の細胞表面に発現するＣＤ８１受容体に構造蛋白質Ｅ２を介して結合すると考えられている。だが、ＣＤ８１は細胞表面に広く発現しており、従って、肝細胞に対するウイルス向性を説明することができないので、ウイルス進入を媒介する際のＣＤ８１の役割には議論の余地がある。さらに、キメラＨＣＶエンベロープ蛋白質を使用する細胞融合アッセイにおいて、ヒトＣＤ８１の過剰発現は細胞融合活性に影響しないことが示されている。多くのウイルスの場合、その細胞受容体はさらに一層十分に特徴づけられていない。
【０００４】
受容体により媒介されるエンドサイトーシスのプロセスによって、細胞はその形質膜を細胞表面の受容体に結合した分子と一緒に取り込むが、そのようなエンドサイトーシスのプロセスが、狂犬病ウイルス、ヘルペスウイルス、セムリキ森林ウイルス、アフリカブタコレラウイルス及びＨＩＶウイルスを含むいくつかのウイルスによる細胞進入の経路として関係している。しかしながら、ＣＤ８１は取り込み効率が悪く、このことが、ＣＤ８１過剰発現細胞が適度な許容性を有するだけであり、そして、そのような細胞には、ＨＣＶが再現性良く感染することができない理由の１つであり得ると報告されている。
【０００５】
トランスフェリン受容体（ＴＦＲ）及び低密度リポ蛋白質受容体（ＬＤＬＲ）などの恒常的に循環する受容体は被覆小窩において恒常的にクラスター化され、そして迅速に取り込まれ、酸性エンドソームに輸送され、最終的には細胞表面に戻され、再使用され得る。そのような受容体の恒常的な取り込みは、その細胞質ドメインにおける様々な内在化シグナルによって媒介される。これらの内在化シグナルは、正常なエンドサイトーシスを受けない蛋白質に再循環性を付与し得る、自身により決定された構造的モチーフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
（発明の要約）
本発明は、ウイルスに結合することができる細胞外ドメインと、細胞内内在化シグナルとを含むキメラ蛋白質が、そのような蛋白質を発現する細胞にウイルスを進入させることができ、従って、ウイルス感染を確立させることができるという発見に基づいている。特に、本発明者らは、エンドサイトーシスシグナル及び膜固定シグナルを操作して免疫グロブリン重鎖のＣ末端に入れ、そしてこれらのキメラ抗体が細胞表面に呈示され、エンドサイトーシスを受けることを示している。本発明者らは、これらの細胞表面抗体が大きい親和性でＨＩＶ−１ウイルスと結合することができ、そのような結合により、ウイルスがヒト腎臓細胞株に取り込まれることを示している。
【０００７】
さらに、本発明者らは、ＣＤ８１のＮ末端またはＣ末端のいずれかをトランスフェリン受容体（ＴＦＲ）または低密度リポ蛋白質（ＬＤＬＲ）の細胞質ドメインとそれぞれ連結することによって２つのＣＤ８１キメラ受容体を構築し、そしてこれらのＣＤ８１キメラ体が、野生型ＣＤ８１よりも良好な取り込み効率を有することを見出している。さらに、本発明者らは、これらの受容体の取り込み効率が、テトラサイクリンで誘導可能な細胞培養システムによって産生されたＨＣＶビリオンによる、野生型ＣＤ８１受容体またはキメラＣＤ８１受容体のいずれかを過剰発現する培養された肝臓細胞の感染性と相関することを示している。
【０００８】
そのようなキメラ蛋白質を発現する細胞及び非ヒト遺伝子組換え動物は、新規な薬学的薬剤を同定するための方法において有用である。これらの薬剤は、ウイルス感染症の治療的処置及び／または予防的処置において使用することができる。
【０００９】
従って、本発明は、
・下記の（ｉ）及び（ｉｉ）を含むキメラ膜貫通蛋白質：
（ｉ）ウイルスと結合することができる細胞外ドメイン、及び
（ｉｉ）細胞内内在化シグナル；
・本発明の蛋白質をコードするポリヌクレオチド；
・本発明のポリヌクレオチドを含むベクター；
・本発明の蛋白質またはポリペプチドまたはベクターを含む細胞；
・本発明の蛋白質を含み、前記蛋白質に結合することができるウイルスが感染している細胞；
・本発明の細胞を含む遺伝子組換え非ヒト動物；
・抗ウイルス剤を同定するための方法であって、
（ｉ）本発明の蛋白質を発現する細胞、または本発明の蛋白質を発現する細胞を含む非ヒト遺伝子組換え動物を提供すること（この場合、そのような細胞または動物はウイルスに感染している）、
（ｉｉ）前記の細胞または動物を試験剤と接触させること、及び
（ｉｉｉ）ウイルス感染をモニターすること
を含み、
それにより、試験剤が抗ウイルス活性を有するかどうかを決定する方法；
・ウイルス感染を防止または阻害することができる抗ウイルスワクチンまたは抗ウイルス剤を同定する方法であって、
（ｉ）本発明の蛋白質を発現する細胞、または本発明の蛋白質を発現する細胞を含む非ヒト遺伝子組換え動物を提供すること、
（ｉｉ）前記の細胞または動物を試験剤と接触させること、
（ｉｉｉ）前記の細胞または動物を、前記蛋白質に結合することができるウイルスと接触させること、及び
（ｉｖ）試験剤がウイルス感染を防止または制限するかどうかを決定すること
を含む方法；
を提供する。
【００１０】
（発明の詳細な説明）
本発明は、
（ｉ）ウイルスと結合することができる細胞外ドメイン、及び
（ｉｉ）細胞内内在化シグナル
を含むキメラ膜貫通蛋白質、またはいくつかの実施形態では、本質的にはそれらからなるキメラ膜貫通蛋白質を提供する。
【００１１】
本発明の蛋白質は単一のポリペプチドを含むことができ、または２つ以上の結合したポリペプチドを含むことができる。好ましくは、本発明の蛋白質は単一のポリペプチドまたは２つの結合したポリペプチドを含む。
【００１２】
蛋白質が２つ以上のポリペプチドを含むとき、ポリペプチドの１つ以上が膜貫通ドメインを含むことことができる。細胞外ドメイン及び細胞内内在化シグナルは、同じポリペプチドの一部であってもよく、または結合したペプチドに存在してもよい。２つ以上のポリペプチドの結合は、典型的には、すべての結合したポリペプチドの恒常的な取り込みをもたらす。
【００１３】
細胞外ドメイン
細胞外ドメインはウイルスと結合することができる。ウイルスはＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスであり得る。ウイルスは一本鎖ウイルスまたは二本鎖ウイルスであり得る。ウイルスは、フラビウイルス、ピコルナウイルス、ミクソウイルスまたはヘルペスウイルスであり得る。
【００１４】
典型的には、ウイルスに対する細胞外ドメインの結合は、細胞外ドメインがウイルス蛋白質と相互作用することによって生じる。一般に、このウイルス蛋白質はウイルスの細胞表面に発現している。例えば、ウイルスがＨＩＶである場合、蛋白質の細胞外ドメインは、典型的には、ｇｐ１２０／１６０に結合することができる。ウイルスがＨＣＶである場合、細胞外ドメインは、典型的には、Ｅ２に結合することができる。ウイルスがＡ型インフルエンザウイルスである場合、細胞外ドメインは、典型的には、赤血球凝集素に結合することができる。ウイルスが単純ヘルペスウイルスである場合、細胞外ドメインは、典型的には、糖蛋白質Ｃに結合することができる。ウイルスがライノウイルスである場合、細胞外ドメインは、典型的には、様々な外部蛋白質ＶＰに結合することができる。ウイルスがエプスタイン−バールウイルスである場合、細胞外ドメインは、典型的には、糖蛋白質ｐｇ３５０に結合することができる。
【００１５】
細胞外ドメインがウイルスに結合する能力は、任意の好適なアッセイを使用して測定することができる。典型的には、細胞外ドメインがウイルスに結合する能力は、細胞外ドメインがウイルス蛋白質に結合することをモニターすることによって測定される。蛋白質／蛋白質相互作用をモニターするための数多くの方法が当該分野では知られており、例えば、共沈殿アッセイ、同時精製アッセイ及び重層アッセイなどが知られている。
【００１６】
細胞外ドメインは抗体またはそのフラグメントを含むことができる。好ましくは、細胞外ドメインは、ウイルス蛋白質に特異的に結合することができる抗体フラグメントを含む。抗体または他の蛋白質は、それらが特異的である蛋白質に優先的な親和性または大きい親和性で結合するとき、蛋白質に「特異的に結合する」が、それ以外の蛋白質には実質的に結合せず、または結合せず、またはほんの低い親和性で結合するだけである。抗体の特異的な結合能力を測定するための競合的結合アッセイまたは免疫放射測定アッセイに対する様々なプロトコルが当該分野では広く知られている（例えばＭａｄｄｏｘら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８，１２１１〜１２２６，１９９３を参照のこと）。そのような免疫アッセイでは、典型的には、特定の蛋白質とその抗体との複合体の形成、及び複合体形成の測定が伴う。好適な抗体フラグメントには、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、及びＦａｂ’フラグメント、ならびに単鎖抗体が含まれる。
【００１７】
好ましくは、ウイルスに結合することができる抗体フラグメントは重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域を含む。典型的には、重鎖及び軽鎖は、それらがウイルス蛋白質に対する結合部位を形成するように結合する。
【００１８】
好ましくは、重鎖フラグメントが膜貫通ドメインに融合させられる。典型的には、軽鎖フラグメントは膜貫通ドメインを含まず、非共有結合的な蛋白質−蛋白質相互作用によって重鎖と結合する。一般に、重鎖及び軽鎖はジスルフィド結合によって結合する。従って、重鎖及び軽鎖のフラグメントはともに、完全な抗体分子においてジスルフィド結合を形成する１つ以上のシステイン残基を含有することが好ましい。
【００１９】
細胞外ドメインは、ウイルスに結合することができる細胞表面受容体またはそのフラグメントを含むことができる。ウイルス（好ましくは、ウイルス表面の特定の蛋白質）を認識し、それに結合する細胞表面蛋白質はどれも、細胞外ドメインを形成することができる。例えば、ウイルスがＨＩＶである場合には、細胞表面受容体はＣＤ４であり、ウイルスがＨＣＶである場合には、細胞表面受容体はＣＤ８１であり、ウイルスがＡ型インフルエンザウイルスである場合には、受容体はシアル酸であり、ウイルスが単純ヘルペスウイルスである場合には、受容体はグリコサミノグリカンのヘパラン硫酸であり、ウイルスがライノウイルスである場合には、受容体はＩＣＡＭ−１であり、ウイルスがエプスタイン−バールウイルスである場合には、受容体はＣ３ｄである。本発明の蛋白質は、細胞表面受容体に由来する細胞内領域及び膜貫通領域を、その受容体に由来する細胞外領域に加えて含むことができる。
【００２０】
細胞内ドメイン
本発明の膜貫通蛋白質は細胞内内在化シグナルを含む。用語「内在化シグナル」は、このポリペプチド領域を含む蛋白質が、細胞表面に存在するとき、エンドサイトーシスによって恒常的に取り込まれるように細胞内のエンドサイトーシス装置と相互作用するポリペプチドの領域を示す。内在化シグナルを含む蛋白質は、典型的には、エンドサイトーシス区画と細胞表面との間で恒常的に再循環される。
【００２１】
内在化シグナルは、典型的には、重要な残基の化学的及び空間的なパターンが密なターン構造と一致する４残基または６残基の取り込みモチーフを含む。そのようなモチーフは、典型的には、芳香族のアミノ末端残基と、芳香族または大きい疎水性のいずれかのカルボキシ末端残基とを含む。そのようなシグナルは当該分野では広く知られており、例えば、Ｃｏｌｌａｗｎ（１９９１）ＥＭＢＯ  Ｊ．１０，３２４７〜３２５３及び、Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３，６３４〜６４１において知られている。
【００２２】
細胞内内在化シグナルは、典型的には、恒常的に再循環される受容体に由来するシグナルである。そのような受容体には、低密度リポ蛋白質受容体（ＬＤＬＲ）、トランスフェリン受容体（ＴＦＲ）、カチオン依存性マンノース−６−リン酸受容体（ＣＤ−Ｍａｎ−６−ＰＲ）、カチオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体（ＣＩ−Ｍａｎ−６−ＰＲ）、ポリＩｇ受容体、及びアシアロ糖蛋白質受容体（ＡＳＧＰＲ）が含まれる。
【００２３】
本発明の蛋白質の細胞内ドメインは、恒常的に再循環する受容体またはそのフラグメントの細胞内ドメイン全体を含むことができる。本発明の蛋白質の膜貫通領域もまた、恒常的に再循環する受容体に由来し得る。恒常的に再循環する受容体のフラグメントは、典型的には、少なくとも１つの内在化シグナルを含む。好ましくは、そのようなフラグメントは、長さが４〜４０アミノ酸であり、例えば、５、６、７、８、９または１０アミノ酸から２０、２５、３０または３５アミノ酸までである。
【００２４】
本発明の蛋白質の細胞内ドメインは、第１の恒常的に再循環する受容体のフラグメントと、第２の恒常的に再循環する受容体のフラグメントとを含むことができる。そのようなキメラ細胞内ドメインは、典型的には、それぞれの再循環する受容体に由来する少なくとも１つの内在化シグナルを含む。
【００２５】
本発明の蛋白質の取り込みは、例えば、本発明の蛋白質を発現する細胞の表面を、本発明の蛋白質の細胞外ドメインに結合する抗体またはウイルスまたは他の分子にさらし、細胞を細胞外の抗体またはウイルスでインキュベートし、表面に結合した抗体またはウイルスを除くために洗浄し、そして取り込まれた抗体またはウイルスの量を測定することによって測定することができる。典型的には、１時間のインキュベートの後、３０％以上の蛋白質、例えば、４０％以上、５０％以上、または６０％以上の蛋白質が取り込まれる。好ましくは、７０％以上の、例えば、８０％以上または９０％以上の蛋白質が１時間後に取り込まれる。
【００２６】
ポリヌクレオチド
本発明はまた、本発明の蛋白質をコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドはＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。好ましくは、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。ポリヌクレオチドは典型的には単離される。本発明によるポリヌクレオチドは、本発明の蛋白質を製造する際に有用である。
【００２７】
本発明にはまた、本発明の蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターが含まれる。そのような発現ベクターは、蛋白質の発現を可能にするために、分子生物学の分野では日常的に構築されており、例えば、プラスミドＤＮＡ、ならびに、場合により必要な、正しい向きに置かれる適切な開始因子、プロモーター、エンハンサー及び他のエレメント（例えば、ポリアデニル化シグナルなど）の使用を伴うことがある。これに関連するさらなる例として、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，ＣＳＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓが参照される。
【００２８】
好ましくは、ベクターにおける本発明のポリヌクレオチドは、宿主細胞によるコード配列の発現をもたらすことができる制御配列に機能的に連結される。用語「機能的に連結された」は、記載された構成成分が、それらの意図された様式でそれらを機能させることができる関係にある並置状態を示す。コード配列に「機能的に連結された」調節配列（プロモーターなど）は、コード配列の発現が、調節配列と適合し得る条件のもとで達成されるような様式で配置される。
【００２９】
ベクターは、例えば、複製起点、任意で前記ポリヌクレオチドを発現させるためのプロモーター、及び任意でプロモーターの調節因子を備えた、プラスミド、ウイルスまたはファージベクターであり得る。ベクターは、細菌プラスミドの場合には１つ以上の選択マーカー遺伝子（例えば、抗生物質耐性遺伝子）を含むことができる。ベクターはインビトロで、例えばＤＮＡまたはＲＮＡを製造するために、あるいは宿主細胞（例えば哺乳動物宿主細胞）に形質導入または形質転換するために、使用することができる。
【００３０】
プロモーター及び他の発現調節シグナルは、発現するよう設計された宿主細胞と適合し得るように選択することができる。好ましくは、宿主細胞は哺乳動物細胞である。β−アクチンプロモーターなどの哺乳動物プロモーターを使用することができる。組織特異的なプロモーターが好ましい。当該分野では様々なウイルスプロモーターを容易に得ることができるので、これらもまた使用することができる。例えば、モロニーマウス白血病ウイルスの長末端反復（ＭＭＬＶ  ＬＴＲ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＩＥプロモーター、及びＨＳＶプロモーター。
【００３１】
細胞
本発明にはまた、本発明の蛋白質を発現させるために改変された細胞が含まれる。そのような細胞は、典型的には、インビトロで提供される。細胞の培養物を提供することができる。この細胞は、好ましくは哺乳動物細胞であり、例えば、マウス細胞、ヒト細胞または他の霊長類細胞などである。本発明のポリペプチドをコードするベクターを哺乳動物細胞に挿入することによって改変され得る細胞の特定の例は、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＢＨＫ、３２３、ＣＯＳ、Ｈｕｈ７、ＨｅｐＧ２、及びＵ９３７細胞である。細胞株は一過性に形質導入されることができ、または好ましくは、細胞株は安定的に形質導入される。一般に、細胞株は、本発明の蛋白質の細胞表面での発現を可能にする。
【００３２】
本発明の蛋白質を発現する細胞は、典型的には、細胞に本発明のベクターで形質導入し、蛋白質の発現を得るために好適な条件のもとで細胞を維持することによって得られる。
【００３３】
本発明にはまた、本発明の蛋白質を発現する細胞であって、前記細胞において発現した本発明の蛋白質の細胞外ドメインが結合することができるウイルスに結合する細胞、またはそのようなウイルスに感染している細胞が含まれる。本発明の蛋白質を発現する細胞は、ウイルスが本発明の蛋白質に結合するために好適な条件のもとで細胞をウイルスと接触させることによってウイルスを感染させることができる。細胞のウイルス感染は任意の好適な手段によって検出することができる。例えば、ウイルスにさらした後、細胞の表面に結合したウイルスを酸洗浄によって除き、細胞を透過処理し、ウイルスに対する抗体で染色して、細胞内に取り込まれたウイルスを検出することができる。
【００３４】
遺伝子組換え動物
本発明の蛋白質は遺伝子組換え非ヒト動物の細胞で発現させることができる。遺伝子組換え非ヒト動物は、典型的には、生物医学研究において一般的に使用されている種のものであり、好ましくは実験室系統である。好適な動物には、非ヒト霊長類及び齧歯類が含まれる。本発明の動物は、齧歯類で、特に、マウス、ラット、モルモット、フェレット、スナネズミまたはハムスターであることが好ましい。最も好ましくは、本発明の動物はマウスである。
【００３５】
本発明の非ヒト遺伝子組換え動物は、任意の適切なプロトコルを使用して作製することができる。好適な方法は、
（ｉ）本発明の好適な細胞を作製すること、
（ｉｉ）細胞を本発明の動物で発育させること、及び
（ｉｉｉ）任意に、該動物の純系を維持すること
を含む。
【００３６】
本発明の発現ベクターは、マイクロインジェクションによって非ヒト動物の胚に導入することができる。あるいは、胚幹細胞を使用することができる。どのような方法が取られるとしても、その場合、遺伝子組換え動物が作製される。得られる始祖動物を繁殖させることができる。前核マイクロインジェクション法が好ましく、この場合、本発明のベクターが非ヒト動物の受精卵母細胞の前核に注入される。
【００３７】
遺伝子組換え動物は、任意の好適な様式で本発明のポリヌクレオチド（導入遺伝子）の存在について分析することができる。典型的には、動物から得られたゲノムＤＮＡが、ポリヌクレオチドのコード配列におけるＰＣＲプライマーを使用してスクリーニングされる。結果は、典型的には、陽性サンプルから得られた遺伝子ＤＮＡをブロットし、放射能標識された本発明のポリヌクレオチドでプローブすることによって確認される。遺伝子組換え動物の細胞における本発明の蛋白質の発現を、例えば、抗Ｆ（ａｂ’）抗体、または本発明の蛋白質の細胞外ドメインを含む細胞表面受容体の細胞外ドメインに対する抗体を使用する免疫ブロット技術を使用して明らかにすることができる。
【００３８】
本発明の遺伝子組換え非ヒト動物には、遺伝子組換え動物の細胞において発現する発明の蛋白質の細胞外ドメインに結合することができるウイルスを感染させることができる。遺伝子組換え動物には、任意の好適な方法によりウイルスサンプルにさらすことによってウイルスを感染させることができる。
【００３９】
典型的なウイルスサンプルは、別の感染した動物（ヒトを含む）から調製された感染性の血清、インビトロ培養物から得られる感染細胞もしくは上清などの感染性の組織培養調製物、または感染性のＲＮＡ調製物を含むことができる。典型的には、ウイルスサンプルが遺伝子組換え動物に直接投与される。例えば、動物をウイルスの静脈内注射によって感染させることができる。ウイルスは、任意の適切な投薬量で投与することができる。典型的な用量は０．１ｍｌのウイルス感染血清であり得るが、好ましくは０．２〜０．５ｍｌである。
【００４０】
本発明の遺伝子組換え動物は、特定の組織型または細胞型にウイルスが感染するように特定の組織型または細胞型において本発明の蛋白質を発現させることができる。本発明の蛋白質の組織特異的発現または細胞特異的発現が、本発明のポリペプチドが組織特異的なプロモーターに機能的に連結される発現ベクターを使用して達成される。例えば、ＨＣＶはヒト肝臓細胞に感染する。従って、ＨＣＶに結合することができる本発明の蛋白質を発現する遺伝子組換え動物は肝臓特異的な様式で蛋白質を発現することが好ましい。同様に、ＨＢＶと結合することができる本発明の蛋白質を肝臓細胞において発現させること、ＨＩＶと結合することができる本発明のタンパクをＴ細胞及び／または脳細胞において発現させること、狂犬病ウイルスと結合することができる本発明のタンパクを神経筋肉接合部において発現させること、３型レオウイルスと結合することができる本発明のタンパクをニューロンにおいて発現させること、そしてロタウイルスと結合することができる本発明のタンパクを腸上皮において発現させることが好ましい。
【００４１】
スクリーニング方法
本発明による細胞及び遺伝子組換え動物は、潜在的な抗ウイルス剤をスクリーニング及び試験する際の方法において使用することができる。抗ウイルス剤は、細胞内へのウイルス進入、ウイルスの生存、ウイルスの蛋白質合成、ウイルスの複製、またはウイルスの広がりを阻害することができる。従って、抗ウイルス剤は、ウイルス感染を防止するためのワクチンとして、またはウイルス感染症を処置するための治療剤として使用することができる。
【００４２】
抗ウイルス剤を同定するための方法は、典型的には、
（ｉ）本発明の蛋白質を発現する細胞、または本発明の蛋白質を発現する非ヒト遺伝子組換え動物を提供すること、
（ｉｉ）前記の細胞または動物にウイルスを感染させること、
（ｉｉｉ）前記の細胞または動物を試験剤と接触させること、及び
（ｉｖ）ウイルス感染をモニターすること
を含み、それにより、試験剤が抗ウイルス活性を有するかどうかを決定する。
【００４３】
ウイルス感染を防止するために好適な抗ウイルス剤を同定するための方法は、典型的には、
（ｉ）本発明の蛋白質を発現する細胞、または本発明の蛋白質を発現する非ヒト遺伝子組換え動物を提供すること、
（ｉｉ）前記の細胞または動物を試験剤と接触させること、
（ｉｉｉ）前記の動物または細胞を、前記蛋白質に結合することができるウイルスと接触させること、及び
（ｉｖ）ウイルス感染をモニターすること
を含み、それにより、試験剤がウイルス感染を防止または制限するかどうかを決定する。
【００４４】
本発明の非ヒト遺伝子組換え動物がこの方法において利用される場合、試験剤及び／またはウイルスを任意の好適な方法によって前記動物に投与することができる。好適な投与方法の様々な例が本明細書中に含まれる。
【００４５】
本発明の蛋白質を発現する細胞は、任意の好適な方法によって試験剤とインビトロで接触させることができる。細胞は試験剤で灌流することができ、または試験剤を、細胞を浸す培養培地に加えることができる。試験剤を直接的に細胞に導入することができる。当該分野で知られている任意の好適な技術を使用して、試験剤を培養細胞に導入することができる。そのような広く知られている技術には、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ならびに、リポフェクタント、ＤＥＡＥ−デキストラン及びリン酸カルシウムなどの形質導入剤の使用を伴う方法が含まれる。
【００４６】
ウイルス感染を任意の好適な方法によってモニターすることができる。例えば、宿主細胞の死、ウイルス複製、蛋白質合成、または宿主細胞の表面におけるウイルス蛋白質の存在をモニターすることができる。ウイルス感染をモニターするための好適な方法が、Ｃｈｅｓｅｂｒｏ及びＷｅｈｒｌｙ（１９８８），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２，３７７９〜３７８８及びＰｉｎｃｕｓら（１９８９），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２，３０７０〜３０７５に記載される。
【００４７】
ＨＩＶ感染を、市販のキットを使用してモニターすることができる。例えば、ＨＩＶの長末端反復（ＬＴＲ）に対するＨＩＶ−１ｐ２４  ＥＬＩＳＡキット（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）またはＲＴ−ＰＣＲキット；ＮＡＳＢＡ［核酸配列に基づく増幅］（Ａｍｐｌｉｃａｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ））を使用することができる。好適なアッセイが下記の文書にも記載される：Ｓｔｅｉｇｅｒら（１９９１），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３４（２）：１４９〜１６０、Ｂｙｒｎｅら（１９９８），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６（９）：４１６５、Ｖａｎｄａｍｍｅら（１９９５），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５２（１−２）：１２１〜１３２及び、Ｂｏｌｔｏｎら（１９８７），Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５（８）：１４１１〜１４１５。
【００４８】
ＨＣＶ感染を、５’非コード領域に対する定量的ＲＴ−ＰＣＲ用の市販キット（Ｃｈｉｒｏｎ  ｂＤＮＡシグナル増幅法）または定性的ＲＴ−ＰＣＲ用の市販キット（Ｃｏｂａｓ  ａｍｐｌｉｃｏｒ，Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用してモニターすることができる。好適なアッセイの使用が、Ｌｕｎｅｌら（１９９９）、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２９（２）：５２８〜５３５、Ｙｅｈら（１９９７），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６５（２）：２１９〜２２６及びＪａｃｏｂら（１９９７），Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．１０７（３）：３６２〜３６７にも記載される。
【００４９】
ＨＢＶ感染を定量的ＰＣＲ（Ｃｈｉｒｏｎ  ｂＤＮＡシグナル増幅法；Ｃｏｂａｓ  ａｍｐｌｉｃｏｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）；Ｄｉｇｅｎｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリダイゼーション））によってモニターすることができる。好適なアッセイが、Ｋｈａｋｏｏら（１９９６），Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．５０（２）：１１２〜１１６及びＣｈｅｎら（１９９５），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５３（１）：１３１〜１３７に記載される。
【００５０】
試験物質は１ｎＭ〜１０００μＭの濃度で使用することができ、好ましくは１μＭ〜１００μＭの濃度で、より好ましくは１μＭ〜１０μＭの濃度で使用することができる。抗ウイルス活性を有する試験物質は、ウイルス感染を、対照の動物または細胞におけるウイルス感染と比較して５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上低下させることができる。
【００５１】
好適な試験物質には、コンビナトリアル・ライブラリ、規定された化学的な実体及び化合物、ペプチド及びペプチド模倣体、オリゴヌクレオチド及び天然産物ライブラリ（ディスプレイ（例えばファージ・ディスプレイ・ライブラリ）など）、そして抗体産物が含まれる。
【００５２】
典型的には、有機分子がスクリーニングされ、好ましくは、５０〜２５００ダルトンの分子量を有する小さい有機分子がスクリーニングされる。候補の生成物は、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン類、ピリミジン類、それらの誘導体または構造的アナログまたは組合せを含む生物分子であり得る。候補の薬剤は、合成化合物または天然化合物のライブラリを含む広範囲の供給源から得られる。知られている薬理学的薬剤を、構造的アナログを製造するために、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などの誘導された化学的修飾またはランダムな化学的修飾に供することができる。
【００５３】
治療的使用
本発明の方法によって同定された薬剤は、治療によりヒトまたは動物の身体を、治療的または予防的に処置する方法において使用することができる。本発明は、ウイルスに感染した患者を処置するための方法を提供し、この場合、この方法は、本発明による薬剤の抗ウイルス活性を決定する方法により同定された薬剤の治療効果的な量を患者に投与することを含む。患者は、一般に、抗ウイルス剤が抗ウイルス活性を有することが示されているウイルスに感染している。患者は、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、ＲＳＶ、ライノウイルス、コクサッキーウイルスまたはＨＢＶに感染していてもよい。好ましくは、ウイルス感染症に感染した患者は、そのウイルス感染症の症状に苦しんでいる。例えば、ＨＣＶ感染患者は、好ましくは、Ｃ型肝炎に苦しんでいる。
【００５４】
本発明は、ウイルス感染の危険性を有する対象を処置するための方法を提供し、この場合、この方法は、本発明の方法により同定された薬剤の予防効果的な量を前記対象に投与することを含む。本発明はまた、ウイルスに感染しているが、ウイルスによって引き起こされる疾患の症状に苦しんでいない患者を、患者が前記疾患を発症することを妨げるために処置するための方法を提供する。この方法は、疾患症状の発症を妨げることにおいて効果的である量の薬剤をウイルス感染患者に投与することを含む。
【００５５】
治療的処置は感染の早期段階で施されることが好ましい。ウイルス感染の合併症（例えば、Ｃ型肝炎の合併症である肝硬変、門脈高圧症、肝細胞ガンなど）もまた、本発明の方法により同定された薬剤を使用して処置することができる。
【００５６】
ウイルス感染症を治療により処置する方法において使用される薬剤は、典型的には、感染症に苦しんでいる患者の状態を改善し、かつ／または感染症の症状を回復させる。
【００５７】
ウイルス感染またはウイルス感染によって引き起こされる疾患を予防的に処置する方法において使用される薬剤は、典型的には、感染から生じる症状の１つ以上の重篤度を低下させ、かつ／または１つ以上の感染症状の発生を妨げることができる。
【００５８】
上記に概略されたスクリーニング方法に従って同定された薬剤は、製薬分野では日常的であるように、そしてＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，第１７版，１９８５年（その開示を参照としてその全体を本明細書中に組み込む）に詳しく記載されるように、標準的な薬学的に受容可能なキャリア及び／または賦形剤とともに配合することができる。ウイルス感染症を処置する方法において使用される組成物及び医薬品は投薬形態物に配合することができる。本発明の方法によって同定された治療剤を含む医薬品は、患者への投与に好適な形態にすることができ、例えば、錠剤、カプセルもしくは液体形態物にすることができ、または薬剤師による調製のために好適な高濃度形態物にすることができる。
【００５９】
薬剤は、例えば、経口経路、口内経路、肛門経路、肺経路、鼻腔経路、膣経路、静脈内経路、動脈内経路、肝臓内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、皮下経路または他の適切な投与経路などを介する外用経路または非経口経路によって投与することができる。
【００６０】
薬剤の治療効果的な量が患者に投与される。感染を妨げるために十分な薬剤の量が、ウイルス感染の危険性にある対象に投与される。治療剤の用量は、様々なパラメーターに従って、特に、使用される物質；処置される患者の年齢及び体重及び状態；投与経路；そして必要とされる処置法に従って決定され得る。医師は、任意の特定の患者について、要求される投与経路及び投薬量を決定することができる。典型的な１日用量は、特定の薬剤の活性、処置される患者の年齢及び体重及び状態、疾患のタイプ及び重篤度、そして投与頻度及び投与経路に従って、約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重である。好ましくは、１日の投薬量レベルは５ｍｇ〜２ｇである。
【００６１】
免疫系を刺激して、ウイルスの蛋白質に対して特異的な抗体を産生させることによってウイルス感染を妨げることができる薬剤が、好ましくは、単回用量で投与される。１回以上のさらなる投薬が、肝炎感染に対する長期間にわたる保護のためには必要になることがある。さらなる投薬を、最初の投薬の後の１〜１５年の期間の後に、例えば、１、２、３、４、５、８、１０、１２または１５年後に施すことができる。定期的な投薬を、最初の投薬後に定期的な間隔で、例えば、３、５、８、１０または１５年の間隔で施すことができる。
【００６２】
哺乳動物の免疫系を刺激して、ウイルスの蛋白質に対して特異的な抗体を産生させることによってウイルス感染を妨げることができる薬剤は、好ましくは、核酸である。ＲＮＡまたはＤＮＡなどの核酸（好ましくは、ＤＮＡ）が、哺乳動物の細胞において発現させることができるベクターの形態で提供される。
【００６３】
そのような核酸は、任意の利用可能な技術によって動物に投与することができる。例えば、核酸は注射によって、好ましくは皮内または皮下または筋肉内に導入することができる。あるいは核酸は、粒子媒介による遺伝子送達などの核酸送達デバイスを使用して、皮膚を横断して直接的に送達することができる。核酸は、例えば、鼻腔内投与、経口投与、膣内投与、直腸内投与によって、皮膚または粘膜表面に局所的に投与することができる。
【００６４】
核酸構築物の取り込みを、いくつかの知られている形質導入技術によって高めることができる。例えば、そのような技術には、様々な形質導入剤の使用が含まれる。これらの薬剤の例には、カチオン性薬剤（例えば、リン酸カルシウム及びＤＥＡＥ−デキストラン）、及びリポフェクタント（例えば、リポフェクタム及びトランスフェクタム）が含まれる。投与される核酸の投薬量は変化させることができる。典型的には、核酸は１ｐｇ〜１ｍｇの範囲で投与され、好ましくは、粒子媒介による遺伝子送達については１ｐｇ〜１０μｇの核酸が投与され、他の経路については１０μｇ〜１ｍｇが投与される。
【００６５】
下記の実施例により、本発明が例示される。
【実施例】
【００６６】
（材料及び方法）
細胞株
ＳＶ４０に由来するラージＴ抗原を有するヒト胚腎臓細胞株２９３及びその誘導体２９３ＴをＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ヴァージニア州，米国）から購入した。Ｈｕｈ７細胞をヒューマンサイエンス振興財団（中央区，大阪，日本）から得た。ＨｅｐＧ２細胞及びＵ９３７細胞もまたＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入した。すべての細胞は、２ｍＭのＬ−グルタミン、１．５ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウム、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム及び１０％のウシ胎児血清を含有するＥＭＥＭまたはＤＭＥまたはＭＥＭにおいて、３７℃、５％ＣＯ２で培養された。
【００６７】
（実施例１）
野生型ＣＤ８１及びキメラ型ＣＤ８１及び短縮型ＨＣＶ  Ｅ２（ａａ３８４〜６６１）の発現構築物の作製
ヒト全長野生型ＣＤ８１（ＣＤ８１ＷＴ）のｃＤＮＡをＵ９３７細胞の総細胞ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ（プライマーＣ１及びプライマーＣ２、表１）によって得て、ｐｃＤＮＡ３．１＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，カリフォルニア州，米国）のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ部位にクローン化した。ＣＤ８１−トランスフェリン受容体キメラ（ＣＤ８１−ΔＴＦＲ）については、Ｎ末端の細胞質ドメインを全長トランスフェリン受容体からＰＣＲ（プライマーＣ３及びプライマーＣ４、表１）によって得て、ｐｃＤＮＡ３−ＣＤ８１ＷＴのＮ末端に連結した（ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ）。ＣＤ８１−ＬＤＬＲキメラ（ＣＤ８１−ΔＬＤＬＲ）については、ＬＤＬＲのＣ末端の細胞質ドメインを、ＨｅｐＧ２細胞の総細胞ＲＮＡを使用するＲＴ−ＰＣＲによって得た（Ｃ５及びＣ６、表１）。その後、ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ法によって停止コドンが除かれたｐｃＤＮＡ３−ＣＤ８１ＷＴクローンのＣ末端に連結した（ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩ）。これらの異なる構築物の概略図が図１Ａに示される。
【００６８】
ＨＣＶ  Ｅ２のｃＤＮＡのａａ３８４〜６６１の配列を、遺伝子型１ｂのＨＣＶ−Ｓ１のＨＣＶゲノム（Ｌｉｍら、Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  ２３，８９〜９５，２００１）からＰＣＲ増幅し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得られるｐＳｅｃＴａｇＣのＢａｍＨＩ部位及びＥｃｏＲ５部位にクローン化した。使用されたプライマーはＣ７及びＣ８である（表１）。
【００６９】
表１．構築物のクローニング及びウイルス転写物の検出のために使用されたプライマー
【表１】
2005503777.tif 000003
【００７０】
（実施例２）
安定なＨｕｈ７クローンの表面における高レベルのＣＤ８１発現
一過性形質導入実験を、ＱＩＡＧＥＮ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，カリフォルニア州，米国）から得られるＥｆｆｅｃｔｅｎｅ（商標）形質導入試薬を製造者のプロトコルに従って使用して行った。野生型ＣＤ８１を発現する安定なＣＤ８１クローン（ＣＤ８１ＷＴ）、トランスフェリン受容体の細胞質ドメインの６１アミノ酸とＮ末端で融合されたＣＤ８１を発現する安定なＣＤ８１クローン（ＣＤ８１−ΔＴＦＲ）、及びＬＤＬ受容体の細胞質ドメインの５０アミノ酸とＣ末端で融合されたＣＤ８１を発現する安定なＣＤ８１クローン（ＣＤ８１−ΔＬＤＬＲ）を、ＢＩＯＲＡＤ社（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，カリフォルニア州，米国）の遺伝子パルサー装置を使用して、２０μｇのＤＮＡを約５×１０６個のＨｕｈ７細胞に０．２５ｋボルトでエレクトロポレーションすることによって作製した。細胞を１ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｓｂｕｒｇ，メリーランド州，米国）において増殖させることによって選択し、単一コロニーを単離して、ＣＤ８１受容体及びＬＤＬ受容体及びトランスフェリン受容体に対して特異的な抗体を使用するＦＡＣＳｃａｎ分析によって表面発現について分析した。安定なＨｕｈ７クローンを集め、ＰＢＳで洗浄し、１×１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。０．５ｍｌの細胞を、ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，カリフォルニア州，米国）から得られるマウス抗ヒトＣＤ８１抗体またはイソ型が一致する対照で４℃で３０分間インキュベートして、洗浄し、そしてフィコエリトリンとコンジュゲート化されたヤギ抗マウス抗体（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，米国）で再びインキュベートした。細胞を洗浄して、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎフローサイトメーター（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，カリフォルニア州，米国）で分析した。生細胞を選び、合計で１００００事象を分析あたり集めた。野生型ＣＤ８１を発現する安定なＨｕｈ７細胞について、高発現クローンをＦＡＣＳ分取によって単離した。形質導入されていない親のＨｕｈ７は低レベルのＣＤ８１受容体を発現し、これに対して、３つの安定なクローン（ＣＤ８１ＷＴ、ＣＤ８１−ΔＴＦＲ及びＣＤ８１−ΔＬＤＬＲ）はすべて高レベルの発現を示した（図１Ｂ）。これらの３つの安定なクローンにおける内因性のトランスフェリン受容体及びＬＤＬ受容体の発現レベルは、非形質導入Ｈｕｈ７細胞におけるこれらの受容体のレベルと大きく異なっていなかった。内因性のＣＤ８１受容体及びＬＤＬ受容体及びトランスフェリン受容体を発現する２９３Ｔ細胞が陽性対照として使用された。トランスフェリン受容体及びＬＤＬ受容体に対するＦＡＣＳｃａｎ分析を、ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ及びＯｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，マサチューセッツ州，米国）からそれぞれ得られる抗体を使用して行った。
【００７１】
（実施例３）
キメラ受容体のＣＤ８１−ΔＴＦＲ及びＣＤ８１−ΔＬＤＬＲはＣＤ８１よりも効率的に取り込む
５０×１０５個の細胞を６ウエルプレートに置床し、一晩付着させた。０．５ｍｌの１０μｇ／ｍｌのＣＤ８１モノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，カリフォルニア州，米国）を細胞に３７℃で１時間重層した。氷で１０分間冷却した後、結合していない抗体を冷ＰＢＳの３回の洗浄によって除き、表面に結合した抗体を、細胞を冷０．２Ｍ酢酸／０．５Ｍ  ＮａＣｌで５分間インキュベートすることによって剥ぎ取り、その後、ＰＢＳで洗浄した。細胞を集め、ＬａｅｍｍｌｉのＳＤＳ緩衝液に溶解して、ウエスタン分析に供した。簡単に記載すると、総蛋白質を１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離して、ニトロセルロースメンブランに転写した。その後、メンブランを５％脱脂乾燥乳でブロッキングして、ヤギ抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート化抗体（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，イリノイ州，米国）で１時間インキュベートし、その後、増強化学発光法（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して検出を行った。
【００７２】
抗体（表面に結合した抗体及び取り込まれた抗体の両方）の重鎖が、ＣＤ８１ＷＴ細胞、ＣＤ８１−ΔＴＦＲ細胞及びＣＤ８１−ΔＬＤＬＲ細胞において認められた（結合していない抗体を表面から除くためにＰＢＳで洗浄後）（図２）。予想された通り、非形質導入Ｈｕｈ７細胞に対する抗ＣＤ８１抗体の結合はほとんど認められなかった。さらに５分間の酸洗浄が、表面に結合したＣＤ８１抗体を除くために使用されたとき、３０％までの抗ＣＤ８１抗体（表面に結合した抗体及び取り込まれた抗体の総量が１００％に正規化された）が、Ｈｕｈ７−ＣＤ８１ＷＴ細胞の細胞内画分に残存した（図２）。抗体に１時間以上さらすことによってもまた、Ｈｕｈ７−ＣＤ８１ＷＴ細胞における抗ＣＤ８１抗体の細胞内蓄積の著しい増大は生じなかった。
【００７３】
Ｈｕｈ７−ＣＤ８１−ΔＴＦＲ及びＨｕｈ７−ＣＤ８１−ΔＬＤＬＲにおいて、より大きな割合（７０％）の抗ＣＤ８１抗体が取り込まれた。このことは、２つの再循環する受容体（トランスフェリン受容体及びＬＤＬ受容体）に由来する細胞質ドメインをＣＤ８１に融合することにより、受容体の取り込み効率が大きく増大したことを示している（図２）。これらの細胞質ドメインをＣＤ８１のＮ末端（ＣＤ８１−ΔＴＦＲ）またはＣ末端（ＣＤ８１−ΔＬＤＬＲ）で融合することにより、ＣＤ８１の取り込みが同じ程度に増大するようであった。
【００７４】
野生型ＣＤ８１受容体及びキメラＣＤ８１受容体の細胞内局在化を明らかにするために、細胞を３．７％ホルムアルデヒドで室温において１０分間固定し、その後、０．２％トリトンＸ−１００での１０分間の透過処理、１％の精製ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）を含むＰＢＳでの３０分間のブロッキング、抗ＣＤ８１モノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）での２時間のインキュベート、最後にＦＩＴＣコンジュゲート化ヤギ抗マウス抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）での１時間のインキュベートを行った。スライドをＭＲＣ１０２４レーザー共焦点顕微鏡（ＢＩＯＲＡＤ）に載せ、写真を撮影した。
【００７５】
３つの安定な細胞株のすべてにおいて、核の周りにおける斑点状の染色が認められた。このことは、エンドソーム構造体への野生型ＣＤ８１受容体及びキメラＣＤ８１受容体の細胞内局在化を示している。
【００７６】
取り込み後の受容体の経路を明らかにするために、生細胞を抗ＣＤ８１抗体で１時間重層し、その後、表面に結合した抗体を酸ではぎ取った。その後、細胞を前記のように透過処理し、取り込まれた抗ＣＤ８１抗体の存在についてＦＩＴＣコンジュゲート化ヤギ抗マウス抗体でプローブした。Ｈｕｈ７−ＣＤ８１−ΔＴＦＲ細胞及び−ＣＤ８１−ΔＬＤＬＲ細胞について、強い細胞内染色が認められ、このことは、抗ＣＤ８１抗体が取り込まれ、リガンドと受容体との間での脱共役が通常的に生じている区画であるエンドソームに輸送されたことを示している。野生型ＣＤ８１のより低い取り込み効率と一致して、Ｈｕｈ７−ＣＤ８１ＷＴ細胞は、細胞内染色がこの実験ではほとんどないことを示していた。
【００７７】
ＣＤ８１受容体の取り込みに対するプローブとしての細胞内（すなわち、酸で除去されない）ＣＤ８１抗体の測定は比較に過ぎず、そして、取り込まれた抗体の一部が分解され得るので、そのような測定は過小評価であるかもしれないことに留意しなければならない。例えば、抗体の迅速な細胞内分解が取り込みの後に生じているからである。
【００７８】
（実施例４）
キメラ受容体のＣＤ８１−ΔＴＦＲ及びＣＤ８１−ΔＬＤＬＲは、ＣＤ８１と比較して、細胞表面のより大きい再循環を受ける
様々な安定クローンの細胞表面における野生型ＣＤ８１及びキメラＣＤ８１の両方の下方調節及び再発現の割合を、ＦＡＣＳｃａｎ分析によって８時間の期間にわたって測定した。細胞を１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ８１モノクローナル抗体で１〜８時間インキュベートし、続いてＰＢＳで洗浄し、その後、ＦＡＣＳｃａｎ分析を上記に記載されるように行い、細胞表面における受容体の量を測定した。細胞の平均蛍光をそれぞれの時点について測定した。
【００７９】
一般に、野生型ＣＤ８１分子及びキメラＣＤ８１分子はともに４時間の循環プロフィルを受けた（図３）。ＣＤ８１ＷＴ及びＣＤ８１−ΔＴＦＲはともに、類似するプロフィルを示し、最大の取り込み及び再発現がともに２時間の期間内に生じた（図３）。ＣＤ８１−ΔＬＤＬＲ分子の下方調節が、抗体に３時間さらした後、最大に生じ、再発現はその１時間後に生じた（図３）。それにもかかわらず、両方のキメラＣＤ８１分子は、ＣＤ８１ＷＴと比較して、より大きな程度に取り込まれた：３７℃で２時間及び６時間のインキュベートの後、ＣＤ８１ＷＴのほんの３３％及び１３％と比較した場合、ＣＤ８１−ΔＴＦＲ分子の６０％まで及び４４％までが、そしてＣＤ８１−ΔＬＤＬＲ分子の７９％まで及び５０％までがそれぞれ取り込まれた（表２）。ＣＤ８１−ΔＬＤＬＲ分子の場合、これらは下方調節され続け、８２％まで及び８３％までの取り込みが、３時間及び６時間のインキュベートが終了したときにそれぞれ生じていた（表２）。さらに、表面におけるキメラＣＤ８１分子の再発現は、野生型ＣＤ８１よりも著しく顕著であった。表面ＣＤ８１−ΔＴＦＲ分子の９０％及び１５０％の増大、そして表面ＣＤ８１−ΔＬＤＬＲ分子の３２５％及び５６６％の増大が、抗体でのインキュベートが３〜４時間及び７〜８時間の期間内にそれぞれ認められ、これは、同じ期間でのＣＤ８１ＷＴにおけるほんの４７％及び３３％の再発現と比較された（表２）。
【００８０】
表２：幾何平均蛍光
【表２】
2005503777.tif 000004
【００８１】
（実施例５）
Ｈｕｈ７安定クローンの細胞表面に対するＨＣＶ  Ｅ２蛋白質の可溶性形態の結合
Ｅ２の分泌された可溶性形態（これはＣ末端の疎水性膜貫通アンカーを有しない）を、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を使用するｐＳｅｃＴａｇＣ−Ｅ２による一過性形質導入によって２９３Ｔ細胞において発現させた。形質導入の３日後、培養培地を清澄化して、分泌されたＥ２蛋白質をＮＴＡ−ニッケルセファロースビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）に捕捉した。ビーズをＰＢＳで洗浄し、Ｅ２を１Ｍイミダゾール溶液で溶出し、その後、遠心分離によるろ過（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，マサチューセッツ州，米国）を行い、イミダゾールを除いた。ｐＳｅｃＴａｇベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）には、マウスＩｇＧκ鎖のＶ−Ｊ２−Ｃ領域に由来する分泌シグナルが含まれる。
【００８２】
事実上すべての発現したＥ２蛋白質が増殖培地に分泌され、ＮＴＡ−ニッケルセファロースビーズで精製され得る。これは、発現したＥ２蛋白質がＣ末端のポリヒスチジンタグと融合しているからである。還元剤の非存在下、精製された蛋白質はＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、２つのバンドをもたらした：１１１ｋＤａを越える高分子量の化学種（８０％まで）及び７０ｋＤａまでの化学種（２０％まで）（図４Ａ）。還元剤の添加は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、高分子量化学種の解離をもたらし、７０ｋＤａのバンドのみをもたらした（図４Ａ）。このことは、精製されたＥ２の大部分が、還元剤の添加により解離し得るジスルフィド連結による凝集体（＞１１１ｋＤａ）の形態であることを示唆している。モノマーＥ２は、ペプチド配列から予測される分子量（３６ｋＤａまで）よりも低い移動度（７０ｋＤａ）を示した。このことは、この蛋白質が高度にグリコシル化されていたことをしている。
【００８３】
１％ＢＳＡを含むＰＢＳにおけるＥ２蛋白質の混合集団を、細胞表面の受容体に対するＥ２結合を評価するために、細胞の単層培養物に４時間重層した。１％ＢＳＡを含むＰＢＳにおけるＥ２を細胞に４時間重層した。細胞を冷ＰＢＳで３回洗浄し、ＬａｅｍｍｌｉのＳＤＳ緩衝液に溶解し、結合したＥ２を、Ｅ２蛋白質に融合されたＣ末端のｍｙｃタグを検出するための抗ｃ−ｍｙｃモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を使用してウエスタン分析によって測定した。
【００８４】
図４Ｂには、Ｅ２が、Ｈｕｈ７−ＣＤ８１ＷＴ、Ｈｕｈ７−ＣＤ８１−ΔＴＦＲ及びＨｕｈ７−ＣＤ８１−ΔＬＤＬＲには結合したが、非形質導入Ｈｕｈ７細胞には結合しなかったことが示される。これらの結果は、Ｅ２が、これらの安定な細胞株のすべてに存在するＣＤ８１の細胞外ドメインに結合し得ることを示唆している。しかし、結合したＥ２が４時間後に検出されただけであるので、会合速度は極めて遅いようであった。これは、凝集したＥ２オリゴマーではなく、モノマーＥ２のみがＣＤ８１と結合できることが以前に示されているので、この系で発現したモノマーＥ２の濃度が低いためであると考えられる。
【００８５】
（実施例６）
キメラ受容体のＣＤ８１−ΔＴＦＲ及びＣＤ８１−ΔＬＤＬＲはＨｕｈ７細胞内へのＨＣＶビリオンの効率的な進入を媒介する
ＨＣＶの進入を助ける安定なＣＤ８１−Ｈｕｈ７クローンの能力を、誘導可能な全長のＨＣＶゲノムを安定に発現するＨｕｈ７細胞（クローンＳＨ９；Ｌｉｍら，２００１）をテトラサイクリン（ｔｅｔ）（Ｓｉｇｍａ）の存在下または非存在下で５日間培養することによって試験した。この場合、培養後、培養培地を取り出し、２５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、小分けにして−８０℃で凍結した。８００μｌの培養培地を６０ｍｍのペトリ皿において２．５×１０５個のＨｕｈ７細胞及び安定なＣＤ８１−Ｈｕｈ７クローンに重層した。細胞には１．２ｍｌの完全培地が加えられ、そして３７℃で６〜８時間インキュベートし、その後ＰＢＳで６回洗浄して、４ｍｌの新鮮な培地を加え、３７℃で５日間再びインキュベートした。期間が終了したとき、細胞をＰＢＳで３回洗浄して、総細胞ＲＮＡを、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬから得られるＴｒｉｚｏｌ試薬を用いて製造者のプロトコルに従って抽出し、その後、５ＵのＤＮａｓｅＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ウィスコンシン州，米国）による処理を３７℃で３０分間行った。
【００８６】
これらの細胞から得られた培養培地におけるウイルス粒子の存在を、抗Ｅ２モノクローナル抗体と一緒に結合したビーズを使用する抗体捕捉法の後、ＲＴ−ＰＣＲによって測定した。５μｇの抗Ｅ２（Ｈ５２、これはＤｕｂｕｉｓｓｏｎ，Ｊ，Ｆｌｉｎｔら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３，６２３５〜６２４４，１９９９からの贈与による）を１０μｌ（充填容量）のプロテインＡ／Ｇビーズ（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）に４℃で一晩結合させた。ビーズはＰＢＳで２回洗浄し、培養培地で４℃下２時間インキュベートした。インキュベート後、ビーズをＰＢＳで徹底的に洗浄し、その後、ＲＴ−ＰＣＲを行った。培養培地の前処理については、培養培地を抗体、結合ビーズ（抗Ｅ２または対照としての抗ｃ−ｍｙｃ）でインキュベートした後、ビーズを４℃で１４０００ｒｐｍにおいて５分間遠心分離し、培養培地を除き、細胞に重層したことを以外は、類似するプロトコルを行った。
【００８７】
プラス及びマイナス鎖のＲＮＡを検出するためのＲＴ−ＰＣＲ用プライマーが表１に示される。５μｌ容量のＲＮＡを、４２℃で１時間、特異的なアンチセンスプライマー及び２００ＵのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（商標）（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ．Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して逆転写し、その後、１００℃で１時間の加熱処理、そして、２．５μｇのＲＮａｓｅＡによる３７℃で３０分間の処理を行った。ＰＣＲを、Ｐｌａｔｉｎｉｕｍ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて行った。最初のＰＣＲ反応を、５０μｌの総容量において５μｌのテンプレートを用いて行い、続いて、２回目のＰＣＲを、１μｌの最初のＰＣＲ反応液を用いて行った。プラス鎖のＲＮＡを検出するために、ＰＣＲを、Ｐ１及びＰ４を用いて行い、その後、Ｐ２及びＰ３またはＰ５を用いて行った。マイナス鎖のＲＮＡを検出するために、ＲＴを、タグ化プライマーＰ１−ＴＡＧ（Ｌａｎｆｏｒｔら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０２，６０６〜６１４，１９９４）を使用して行った。１回目のＰＣＲを、ＴＡＧ及びＰ４を用いて行い、２回目をＴＡＧ及びＰ３またはＰ５を用いて行った。ＰＣＲ条件は下記の通りである：９５℃で３分間、その後続けて、９５℃で２０秒間、６０℃（プラス鎖）または４９℃（マイナス鎖）で２０秒間、７２℃で３０秒間からなる３０サイクル、そして７２℃で８分間の最後の伸長。増幅産物を３％アガロースゲルでの臭化エチジウム染色によって可視化した。
【００８８】
ＰＣＲ増幅によって得られた生成物の特異性を明らかにするために、２５μｌのＰＣＲ産物をＨｙｂｏｎｄ  Ｎ＋メンブラン（ＵＳＢ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）にサザンブロットした。ハイブリダイゼーションを、５’ＮＣＲのｎｔ６８〜９７に対応する３２Ｐ末端標識オリゴヌクレオチド（ＨＣＶプローブ）を１ｍｌのハイブリダイゼーション緩衝液（６×ＳＳＣ、１×デンハルト溶液、０．０５％ピロリン酸ナトリウム、及び１００μｇ／ｍｌの剪断サケ精子ＤＮＡ）あたり５ｎｇの標識ＤＮＡで用いて行った。フィルターを６５℃で１４〜１６時間インキュベートし、その後、１×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳ及び０．５×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳにおいて６５℃で２回洗浄した。その後、フィルターを風乾して、−７０℃で４〜１２時間、オートラジオグラフィーフィルムに感光させた。すべてのオートラジオグラフの定量をＢＩＯＲＡＤデンシトメーターで行った。
【００８９】
陽性のＲＴ−ＰＣＲ産物がｔｅｔ処理細胞の培養培地で認められたが、非処理の細胞では認められなかった（図５、レーン１及び３）。さらに、これらの生成物は、ｔｅｔ処理細胞から得られた培養培地でインキュベートした後にＤＮａｓｅＩ及びＲＮａｓｅＡでビーズを処理した後も依然として認められた（図５、レーン４）。このことは、これらのバンドが、培地におけるＤＮＡまたはＲＮＡからの混入の結果でなかったことを示している。
【００９０】
培養培地を新鮮な親のＨｕｈ７細胞またはＣＤ８１発現のＨｕｈ７細胞のいずれかに６〜８時間にわたって重層し、その後、細胞を徹底的に洗浄して、新鮮な培地で５日間インキュベートした。続いて、総ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲを行って、ウイルス転写物の存在についてアッセイした。プラス鎖のＲＮＡは、感染性の培地にさらされた５日後、親のＨｕｈ７細胞ではほとんど見出されなかった（図６、レーン１）。他方で、少量のウイルス転写物が、ＣＤ８１ＷＴを過剰発現するＨｕｈ７細胞において見出された（図６、レーン２）。Ｈｕｈ７−ＣＤ８１−ΔＬＤＬＲ及びＨｕｈ７−ＣＤ８１−ΔＴＦＲはともに、増大したレベルのウイルス転写物を示し（図６、レーン３及び４）、その値は、細胞ＧＡＰＤＨで正規化された後では、Ｈｕｈ７−ＣＤ８１ＷＴについて認められる値の少なくとも２．６倍及び６．９倍大きかった（図６）。対照の非誘導細胞に由来する培地を感染させた細胞からは、ウイルス産物が得られなかった。
【００９１】
ウイルス複製が感染細胞で実際に生じていたことを確実にするために、マイナス鎖の存在を、タグ化リバースプライマーを利用するＬａｎｆｏｒｄら（１９９４）により記載される方法を使用して測定した。タグ化リバースプライマー及び２つの異なるフォワードプライマーの組合せを使用して、本発明者らは、４つの細胞株におけるマイナス転写物の発現傾向が類似していることを見出した（図６）。親のＨｕｈ７細胞では生成物が認められず、一方で、Ｈｕｈ７−ＣＤ８１−ΔＬＤＬＲ細胞及びＨｕｈ７−ＣＤ８１−ΔＴＦＲ細胞はともに、Ｈｕｈ７−ＣＤ８１ＷＴ細胞と比較して、より多くのマイナス転写物を含有した（図６）。それらはそれぞれ、細胞ＧＡＰＤＨで正規化された後では、後者よりも２．７〜５．８倍及び２．８〜１０．７倍多かった。
【００９２】
上記の感染研究から得られた結果の信憑性を確認するために、阻止実験を、抗Ｅ２抗体及び抗ＣＤ８１抗体を使用して行った。最初に、ｔｅｔ処理されたＨＣＶ−Ｈｕｈ７細胞から得られた培養培地を、抗Ｅ２抗体または対照の抗ｃ−ｍｙｃ抗体でコーティングされたビーズと２時間プレインキュベートし、その後、新鮮なＨｕｈ７−ＣＤ８１ＷＴ細胞または−ＣＤ８１−ΔＴＦＲ細胞に重層した。その後、細胞をさらに５日間インキュベートして、ウイルス転写物の存在について前記のように分析した。抗ｃ−ｍｙｃビーズとの培地のプレインキュベートでは、プラス及びマイナス鎖の両方の転写物がＲＴ−ＰＣＲ（図７Ａ及びＢ、レーン３）の後で認められたので、Ｈｕｈ７−ＣＤ８１ＷＴ細胞及び−ＣＤ８１−ΔＴＦＲ細胞の両方の感染を阻止することができなかった。抗Ｅ２ビーズとのプレインキュベートでは、生成物が得られなかった（図７Ａ及びＢ、レーン４）ので、これらの細胞のウイルス感染は完全に阻止された。
【００９３】
別の阻止実験において、Ｈｕｈ７−ＣＤ８１ＷＴ細胞及び−ＣＤ８１−ΔＴＦＲ細胞を２．５ｍｇ／ｍｌの抗ヒトＣＤ８１抗体または抗マウスＣＤ８１抗体で３０分間プレインキュベートし、その後、感染性培地での６〜８時間のインキュベートを行った。予想されるように、ウイルスのＲＴ−ＰＣＲ産物がＨｕｈ７−ＣＤ８１ＷＴ細胞及びＨｕｈ７−ＣＤ８１−ΔＴＦＲ細胞の両方において認められた（図７Ａ及びＢ、レーン５）ので、対照の抗マウスＣＤ８１抗体は感染を阻止することができなかった。抗ヒトＣＤ８１抗体は、Ｈｕｈ７−ＣＤ８１ＷＴ細胞における感染を妨げたが、Ｈｕｈ７−ＣＤ８１−ΔＴＦＲ細胞における感染を妨げなかった（図７Ａ及びＢ、レーン６を比較のこと）。この違いに対する理由は不明であるが、ＣＤ８１−ＷＴと比較して、ＣＤ８１−ΔＴＦＲの再循環がより顕著であることに関連しているかもしれない（図３もまた参照のこと）。
【００９４】
（実施例７）
ハイブリドーマ９０２からの抗ｇｐ１２０抗体の重鎖（ＩｇＨ）及び軽鎖（ＩｇＬ）ｃＤＮＡの単離
抗ｇｐ１２０ハイブリドーマ９０２の免疫グロブリンの重鎖（ＩｇＨ）及び軽鎖（ＩｇＬ）をコードするｃＤＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲ法によって得た。抗ＨＩＶ−１ＬＡＶ／ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢのｇｐ１２０ＩｇＧ１モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ９０２（カタログ番号５２１）をＮＩＨ  ＡＩＤＳ研究＆参考試薬プログラム（Ｃｈｅｓｅｂｒｏ＆Ｗｅｈｒｌｙ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２，３７９９〜３７８８，１９８８；Ｐｉｎｃｕｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２，３０７０〜３０７５，１９８９）から得た。総ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，カリフォルニア州，米国）を使用してこのハイブリドーマから抽出し、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＲＮａｓｅ逆転写酵素（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，メリーランド州，米国）を使用してｃＤＮＡに転写した。その後、ＰＣＲ反応を、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，インディアナ州，米国）から得られるＥｘｐａｎｄロングテンプレートＰＣＲシステムと、下記のプライマーとを使用して行った。
【００９５】
ＩｇＬ：
フォワード：５’ＡＣＣＡＴＧＡＡＧＴＴＴＣＣＴＴＣＴＣＡＡＣＴＴＣＴＧＣＴＣＴＴＣＣ  ３’
リバース：５’ＧＣＧＣＣＧＴＣＴＡＧＡＡＴＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡ  ３’
ＩｇＨ：
フォワード：５’ＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＲＡＡＴＧＳＡＳＣＴＧＧＧＴＹＷＴＹＣＴＣＴＴ  ３’及び
５’ＡＣＴＡＧＴＣＧＡＣＡＴＧＧＡＣＴＣＣＡＧＧＣＴＣＡＡＴＴＴＡＧＴＴＴＴＣＣＴ  ３’
（Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｙ＝ＣまたはＴ；Ｓ＝ＣまたはＧ；Ｗ＝ＡまたはＴ）
リバース：５’ＴＴＡＴＴＴＡＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＧＣＴＣＴＴ  ３’
【００９６】
ＰＣＲ産物を、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，カリフォルニア州，米国）を使用してｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクターにクローン化し、プラスミドのＤＮＡ配列決定を分子細胞生物学研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）の中核施設において行った。２００ｎｇの二本鎖テンプレート及び１０ｎｇのプライマーが、ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，カリフォルニア州，米国）からのＴａｑ  ＤｙｅＤｅｏｘｙターミネーターサイクル配列決定キット及び自動化ＤＮＡシーケンサー３７３を用いたジデオキシ法のために使用された。
【００９７】
ハイブリドーマから得られる分泌された抗体をプロテインＡ／Ｇビーズ（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，マサチューセッツ州，米国）に捕捉して、ビーズをＰＢＳで徹底的に洗浄し、その後、結合した蛋白質を、１００℃で５分間の加熱によってＬａｅｍｍｌｉのＳＤＳ緩衝液で溶出し、１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離した。５５ｋＤａまで及び約２０ｋＤａまでにおける２つの主要なバンドをゲルから切り出して、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ装置でのエドマン配列決定のために製造者のプロトコルに従って処理した。
【００９８】
ハイブリドーマ９０２によって分泌された抗体の成熟型の重鎖及び軽鎖のＮ末端を配列決定することにより、ＥＶＱＬＱＱＳＧＡＥ及びＤＩＱＭＴＱＳＳＳＹのペプチド配列がそれぞれ得られた。成熟抗体のこれらの配列は、それらのｃＤＮＡによりコードされる蛋白質のアミノ酸番号１８以降及びアミノ酸番号２１以降とそれぞれ一致した。従って、これにより、正しい免疫グロブリン遺伝子が単離されていることが確認された（図８）。
【００９９】
（実施例８）
発現ベクターへのＩｇＬ及びＩｇＨのクローニングならびにキメラ蛋白質の構築
ＩｇＬをｐＸＪ４１ｎｅｏのＫｐｎＩ部位及びＮｏｔＩ部位にクローン化し、そしてＩｇＨをｐＣｅｐ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＫｐｎＩ部位及びＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローン化した。
【０１００】
キメラ重鎖ＩｇＨ−ΔＣＩ−ＭＰＲを、ＣＩ−ＭＰＲの膜貫通ドメイン及び細胞質テール（ａａ２３０５〜２４９２）を全長ＩｇＨクローンのＣ末端に融合することによって構築した。同様に、ＩｇＨ−ΔＬＤＬＲを、ＬＤＬＲの膜貫通領域及び細胞質末端部（ａａ７９０〜８６０）を付加することによって構築した。ヒトカチオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体（ＣＩ−ＭＰＲ）のＣ末端１８８ａａ及びヒト低密度リポ蛋白質受容体（ＬＤＬＲ）の７１ａａを、上記に記載されるように、ＨｅｐＧ２細胞から得られた総細胞ＲＮＡを使用したＲＴ−ＰＣＲによって得た。使用されたプライマーは下記の通りであった：
ＣＩ−ＭＰＲフォワード：５’ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＧＴＣＧＧＣＧＣＧＧＴＧＣＴＣＡＧＣ  ３’
ＣＩ−ＭＰＲリバース：５’ＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＡＧＡＧＧＴＣＣＴＣＧＴＣ  ３’
ＬＤＬＲフォワード：５’ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＴＧＴＣＣＡＴＴＧＴＣＣＴＣＣＣＣＡＴＣ  ３’
ＬＤＬＲリバース：５’ＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＣＧＣＣＡＣＧＴＣＡＴＣＣＴＣＣＡＧ  ３’
【０１０１】
その後、ＰＣＲ産物を、ＨｉｎｄＩＩＩ部位及びＮｏｔＩ部位を使用してｐＣｅｐ４−ＩｇＨの３’末端に連結して、キメラ重鎖のＩｇＨ−ΔＣＩ−ＭＰＲ及びＩｇＨ−ΔＬＤＬＲをそれぞれ得た。
【０１０２】
（実施例９）
キメラＩｇＨはＩｇＬと結合し、キメラ組換え抗体が細胞表面に発現する
一過性形質導入実験を、ＱＩＡＧＥＮ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，カリフォルニア州，米国）から得られるＥｆｆｅｃｔｅｎｅ（商標）形質導入試薬を製造者のプロトコルに従って使用して行った。ＩｇＬ鎖を恒常的に発現する安定なクローンを作製するために、２０μｇのＤＮＡを約５×１０６個の２９３細胞と混合して、ＢＩＯＲＡＤ社（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，カリフォルニア州，米国）遺伝子パルサー装置を使用して０．２５ｋボルトでエレクトロポレーションした。細胞を、０．４ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）において増殖させることによって選択し、単一コロニーを単離して、総蛋白質をウエスタン分析によって分析した。高レベルのＩｇＬを発現する１つの単一クローンを、その後、同じ様式で様々なＩｇＨ  ＤＮＡと再度形質導入して、細胞を、０．２ｍｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ（Ｒｏｃｈｅ）において増殖させることによって選抜した。単一コロニーを単離し、総蛋白質をウエスタン分析によって分析した。
【０１０３】
形質導入細胞をＨＢＳ緩衝液（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＮＰ４０）に溶解して、総蛋白質濃度を、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，イリノイ州，米国）から得られるＣｏｓｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓ試薬によって測定した。３０ｕｇの総蛋白質を１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離して、ニトロセルロースメンブランに転写した。その後、メンブランを５％脱脂乾燥乳でブロッキングした。ＩｇＬ蛋白質を検出するために、ブロットを、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，カリフォルニア州，米国）から得られる西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート化抗軽鎖抗体で一晩インキュベートし、その後、増強化学発光法（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用した検出を行った。重鎖については、ブロットのＨＲＰコンジュゲート化ヤギ抗マウス抗体（Ｐｉｅｒｃｅ）でのインキュベートを、検出前に行った。
【０１０４】
各キメラ重鎖を全長の軽鎖（ＩｇＬ）と一緒にそれぞれ一過性発現することにより、重鎖及び軽鎖のほとんどが細胞内に保持されることが示された。対照的に、元となったＩｇＨをＩｇＬと一緒に形質導入することにより、培養培地への組換え抗体の分泌がもたらされた（図９Ａ）。さらに、重鎖がプロテインＡ／Ｇビーズ（これはＩｇＨの定常領域に結合する）により捕捉されたときにも、ＩｇＬ蛋白質の解離が生じたので、種々の重鎖及び軽鎖の間における正しい結合が溶液中で生じている（ＩｇＨに対する培養培地、またはＩｇＨ−ΔＣＩ−ＭＰＲ及びＩｇＨ−ΔＬＤＬＲに対する細胞溶解物のいずれか）（図９Ａ）。
【０１０５】
細胞表面の発現をＦＡＣＳｃａｎ分析によって分析した：一過性形質導入２９３Ｔ細胞を集め、ＰＢＳで洗浄して、１×１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。０．５ｍｌの細胞をＦＩＴＣとのコンジュゲート化ヤギ抗Ｆ（ａｂ’）２抗体（９ｕｇ／ｍｌ）（Ｐｉｅｒｃｅ）で、４℃下で３０分間インキュベートし、洗浄して、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎフローサイトメーター（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，カリフォルニア州，米国）で分析した。
【０１０６】
ＦＡＣＳｃａｎ分析は、ＩｇＨ−ΔＣＩ−ＭＰＲまたはＩｇＨ−ΔＬＤＬＲとの複合体型ＩｇＬが細胞表面に発現し、その結果、抗Ｆ（ａｂ’）２抗体（ＦＩＴＣコンジュゲート化）と結合することができることを示した（図９Ｂ）。対照的に、元のＩｇＨ及びＩｇＬで形質導入された細胞は抗Ｆ（ａｂ’）２抗体と結合することができなかった。
【０１０７】
（実施例１０）
細胞表面に呈示されたキメラ抗体は取り込みを受ける
高レベルの重鎖及び軽鎖を発現する安定なクローンの２９３−ＩｇＨ−ΔＭ６ＰＲ及び２９３−ＩｇＨ−ΔＬＤＬＲを２９３細胞への形質導入から得た（図９Ｃ）。これらのクローンが抗Ｆ（ａｂ’）２抗体と結合しこれを取り込むことができるかどうかを明らかにするために、下記に記載されるように、生細胞に抗Ｆ（ａｂ’）２抗体を重層して、エンドサイトーシスを行わせ、その後、ＰＢＳによる洗浄、細胞の固定、そして共焦点顕微鏡観察を行った。
【０１０８】
３０，０００個の生細胞を、ポリＤ−リシン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，米国）で処理された４ウェルのＰｅｒｍａｎｏｘスライドチャンバー（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐ．，イリノイ州，米国）に置床して、一晩付着させた。その後、０．２ｍｌの７．５μｇ／ｍｌのヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）２−ＦＩＴＣ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ）を細胞に３７℃で１時間重層した。その後、プレートを氷上で５分間冷却し、その後結合していない抗体を冷ＰＢＳでの３回の洗浄により除いた。表面に結合した抗体をはぎ取るために、細胞を冷０．２Ｍ酢酸／０．５Ｍ  ＮａＣｌで５分間さらにインキュベートし（Ｈａｉｇｌｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５，１２３９，１９８０）、その後ＰＢＳで洗浄した。細胞を３．７％ホルムアルデヒドで室温において１０分間固定し、その後、ＰＢＳで洗浄した。スライドをＭＲＣ１０２４レーザー共焦点顕微鏡（ＢＩＯＲＡＤ）に載せ、写真を撮影した。
【０１０９】
多量の総（表面及び細胞内）抗Ｆ（ａｂ’）２抗体が２９３−ＩｇＨ−ΔＣＩ−Ｍ６ＰＲ細胞及び２９３−ＩｇＨ−ΔＬＤＬＲ細胞で認められたが、親の２９３細胞では認められなかった。さらなる酸洗浄が、細胞固定の前に、表面に結合した抗Ｆ（ａｂ’）２抗体を除くために含められたときには、取り込まれた抗Ｆ（ａｂ’）２抗体が２９３−ＩｇＨ−ΔＣＩ−ＭＰＲ及び２９３−ＩｇＨ−ΔＬＤＬＲ細胞で認められ、細胞内の斑点様構造体に局在化していた。これらのデータは、安定なクローンが、正しく組み立てられたキメラ抗体を細胞表面に発現していること、そしてこれらのキメラ抗体が迅速に取り込まれ得ることを示していた。
【０１１０】
（実施例１１）
ハイブリドーマにより分泌された抗体及び組換え抗体はインビトロでＨＩＶ−１ＭＣ９９ＩＩＩＢΔＴａｔ−Ｒｅｖウイルスと結合することができる
弱毒化ＨＩＶ−１ＭＣ９９ＩＩＩＢΔＴａｔ−Ｒｅｖウイルスは、ｔａｔ及びｒｅｖを恒常的に発現するＣＥＭ−ＴＡＲＴ細胞で増殖し得るだけであるので、高力価ＨＩＶ−１ウイルスの安全な供給源である。ＨＩＶ−１ＭＣ９９ＩＩＩＢΔＴａｔ−Ｒｅｖウイルス（カタログ番号１９４３）及びＣＥＭ−ＴＡＲＴ細胞（カタログ番号１９４４）をＮＩＨ  ＡＩＤＳ研究＆参考試薬プログラムから得た。ウイルスは、前記に記載されるように増殖させ、−７０℃で保存された。
【０１１１】
ハイブリドーマ９０２によって分泌される抗体がＨＩＶ−１ＭＣ９９ＩＩＩＢΔＴａｔ−Ｒｅｖウイルス上のｇｐ１２０エンベロープ蛋白質を認識し得ることを確認するインビトロ結合実験のために、ハイブリドーマ９０２から得られる分泌された抗体をプロテインＡ／Ｇ（これはＩｇＨの定常領域に結合する）に捕捉し、その後、ＰＢＳ＋０．２％ＮＰ４０で洗浄し、次いで、同じ緩衝液で１０倍に希釈されたＨＩＶ−１ＭＣ９９ＩＩＩＢΔＴａｔ−Ｒｅｖウイルスとの一晩のインキュベートを行った。ビーズを洗浄して、結合したウイルスを、ＬａｅｍｍｌｉのＳＤＳ緩衝液においてビーズを煮沸することによって溶出し、そして抗ｇｐ１２０抗体（ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ，マサチューセッツ州，米国）を使用してウエスタン分析によって検出した。２９３Ｔ細胞の一過性形質導入の後に培養培地に分泌された抗体を同じ様式でウイルス結合について試験した。
【０１１２】
図１０に示されるように、ハイブリドーマによって分泌された抗体、またはＩｇＬ及びＩｇＨで一過性形質導入された２９３Ｔ細胞によって分泌される抗体を吸着したビーズはウイルスと結合することができた。細胞がＩｇＨのみで形質導入されたときには、ウイルスの結合が認められなかった。
【０１１３】
（実施例１２）
２９３−ＩｇＨ−ΔＣＩ−ＭＰＲ及び２９３−ＩｇＨ−ΔＬＤＬＲを発現する細胞はＨＩＶ−１ＭＣ９９ＩＩＩＢΔＴａｔ−Ｒｅｖウイルスと結合し、これを取り込む
重層実験を、ウイルスが１時間及び３時間にわたって重層され、その後に表面に結合したウイルスを除くための酸洗浄、そして細胞の固定が行われたこと以外は、抗Ｆ（ａｂ’）２抗体について上記に記載されるように行った。その後、細胞を０．２％トリトン−Ｘ１００で１０分間透過処理し、１％の精製ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）を含むＰＢＳで３０分間ブロッキングして、その後、抗ＨＩＶ−ｐ２４モノクローナル抗体（ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｃ．）での２時間インキュベートを行い、続いてＦＩＴＣコンジュゲート化ヤギ抗マウス抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，カリフォルニア州，米国）での１時間のインキュベートを行った。
【０１１４】
２９３−ＩｇＨ−ΔＭ６ＰＲ及び２９３−ＩｇＨ−ΔＬＤＬＲの生細胞を、３７℃で１時間または３時間にわたって、上記に記載されるようにＭＣ９９ＩＩＩＢΔＴａｔ−Ｒｅｖウイルスで重層し、その後、いずれかの表面に結合したウイルスを除くために酸洗浄を行った。細胞を固定し、透過処理を行い、その後、細胞内部のいずれかのウイルスの染色を、抗ＨＩＶ−ｐ２４抗体を用いて行った。１時間後、強い細胞内染色が２９３−ＩｇＨ−ΔＣＩ−Ｍ６ＰＲ細胞及び２９３−ＩｇＨ−ΔＬＤＬＲ細胞の両方で認められたが、親の細胞では認められなかった。ウイルスは１時間以内に、取り込まれゴルジ様の細胞内構造体に輸送されたようであった。３時間後に、さらにより強い細胞内染色が認められ、細胞はより大きく収縮したようであった。このことは、取り込まれたウイルスが、細胞に対して何らかの細胞傷害的な作用を有し得ることを示している。
【０１１５】
（実施例１３）
キメラ抗体ＩｇＬ／ＩｇＨ−ΔＣＩ−Ｍ６ＰＲを発現する細胞は偽型ＨＩＶウイルスに感染されうる
２９３−ＩｇＨ−ΔＣＩ−ＭＰＲ（クローン９）及び２９３−ＩｇＨ−ΔＬＤＬＲ（クローン１０）の安定なクローンをＦＡＣＳｃａｎ分析によってキメラ抗体の表面発現について分析した。２９３−ＩｇＨ−ΔＣＩ−ＭＰＲ細胞は、２９３−ＩｇＨ−ΔＬＤＬＲ細胞よりも大きい、抗体の表面発現を示した（図１１Ａ）。細胞に偽型ウイルスＨＸＢ２（Ｈｅ及びＬａｎｄａｕ，１９９５，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６９：４５８７〜４５９２）を感染させた。この偽型ウイルスは、ｎｅｆ遺伝子内に挿入されたルシフェラーゼ遺伝子を含有しており、このレポーターウイルスによる細胞の感染が、市販の試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，米国）を使用して細胞の溶解物に存在するルシフェラーゼ遺伝子産物の量を明らかにすることによって測定された。ＰＭＡ処理については、感染後８４時間で、感染細胞を１００ｎＭのＰＭＡで１８時間処理し、その後、細胞を溶解して、ルシフェラーゼ活性についてアッセイした。２９３−ＩｇＨ−ΔＣＩ−ＭＰＲは、ＰＭＡで処理された感染細胞でのみ、ルシフェラーゼ活性（非処理細胞の場合の９倍以下の大きさ）を示したが、ＰＭＡで処理されなかった感染細胞では示さなかった（図１１Ｂ）。このことは、２９３−ＩｇＨ−ΔＣＩ−ＭＰＲ細胞では、取り込まれたウイルスの複製が可能であることを示している。２９３−ＩｇＨ−ΔＬＤＬＲ細胞は、ＰＭＡ処理の後でさえも、著しいルシフェラーゼ活性を示さなかった。このことは、２９３−ＩｇＨ−ΔＣＩ−ＭＰＲと比較して、これらの細胞の表面におけるキメラ抗体の発現がより低いためであると考えられる（図１１Ａ参照）。
【０１１６】
（実施例１４）
材料及び方法
ＨＣＶ感染患者からの血清
血清サンプルを、ＨＣＶ感染が国立大学病院（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，シンガポール）で追跡調査されている２名の患者から得た。これらの２つの血清におけるＨＣＶ  ＲＮＡの量を分子診断センター（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  Ｃｅｎｔｒｅ、国立大学病院、シンガポール）においてブランチドＤＮＡ法（Ｑｕａｎｔｉｐｌｅｘ  ＨＣＶ−ＲＮＡアッセイ；Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，カリフォルニア州，米国））によって定量し、そして残ったサンプルは−８０℃で保存された。患者Ａ及び患者Ｂの血清のウイルス量は、それぞれ、６３．４×１０６当量／ｍｌ及び＞１２０×１０６当量／ｍｌであった。これらのサンプルのさらなる試験が必要ないことが確認された後、患者は、医師の承諾を受けて、実験のために本発明者らの研究室に移された。
【０１１７】
ＨＣＶ粒子の取り込み
５×１０５個の細胞を６ｃｍのペトリ皿に置床して、一晩付着させた。細胞（約５０％コンフルエント）をＦＢＳ非含有ＤＭＥＭで２回洗浄し、その後、希釈された血清（１００μｌの血清を９００μｌのＦＢＳ非含有ＤＭＥＭ培地で）を添加して、下記に記載されるように、非処理であるか、または界面活性剤で処理するか、または抗体で前処理した。細胞を３７℃のインキュベーター（５％ＣＯ２）に少なくとも８時間置き、その後、ＦＢＳ非含有ＤＭＥＭで徹底的に洗浄した。最後に、２ｍｌの完全ＤＭＥＭ培地を細胞に加えて、細胞をインキュベーターに戻した。２日後、細胞をトリプシン処理して、すべての細胞をさらなるインキュベートのために１５ｃｍのプレートに移した。さらに５日後、細胞をトリプシン処理して、集め、ＤＥＰＣ処理（Ｓｉｇｍａ）ＰＢＳで２回洗浄して、直ちに使用するか、または−８０℃で保存した。
【０１１８】
界面活性剤を用いた実験については、血清をＦＢＳ非含有ＤＭＥＭで１０倍に希釈し、滅菌ろ過されたデオキシコール酸塩溶液（Ｓｉｇｍａ、０．５％保存液）を０．０５％の最終濃度に加えて、４℃で４時間混合した。バイオビーズ（ＢＩＯＲＡＤ）を（ＤＥＰＣ処理ＰＢＳを使用して）製造者のプロトコルに記載されるように調製し、２ｍｌのビーズスラリーを界面活性剤処理された血清に加えて、４℃で一晩インキュベートした。この段階で、細胞に対する何らかの毒性作用を防止するために、界面活性剤が血清から除かれた。その後、ビーズを重力によって沈降させ、上清を注意深く除去して、細胞に重層した。
【０１１９】
前処理実験については、１ｍｌの希釈された血清（１００μｌの血清を９００μｌのＦＢＳ非含有ＤＭＥＭで）を、１０μｇの抗ＨＣＶ  Ｅ２抗体（Ａｕｓｔｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）または抗ｃ−ｍｙｃ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）のいずれか、及び１００μｌのプロテインＡ／Ｇビーズ（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）で、４℃下で一晩インキュベートした。その後、ビーズを遠心分離し、上清を細胞に重層した。ビーズをＤＥＰＣ処理ＰＢＳで２回洗浄して、総ＲＮＡを製造者のプロトコルに従ってＴｒｉｚｏｌ  ＬＳ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）との免疫複合体から抽出し、３０μｌのＤＥＰＣ処理水に再懸濁した。各ＲＮＡサンプル（非希釈、１０×、３０×及び１００×希釈）を、下記に記載されるように、陽性鎖のＨＣＶ  ＲＮＡについて試験した。
【０１２０】
ＲＮＡ抽出、逆転写及びネステッドＰＣＲ
３×１０６個以下の細胞からの総ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を製造者のプロトコルに従って用いて抽出し、６０μｌのＤＥＰＣ処理水に再懸濁した。５μｌのＲＮＡを５ＵのＲＮａｓｅ非含有ＤＮａｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ドイツ）で３７℃において１時間処理し、その後、１００℃で１０分間加熱することによってＤＮａｓｅＩを不活性化した。その後、陽性鎖のＨＣＶ  ＲＮＡを検出するために、５μｌのＤＮａｓｅＩ処理されたＲＮＡを、４２℃で１時間、１０μｌの最終容量においてアンチセンスプライマー２０９（表３）、ｄＮＴＰ（Ｒｏｃｈｅ）及び１００ＵのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＲＮａｓｅＨ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を使用して逆転写し、その後７０℃で１５分間加熱することによる不活性化を行った。この生成物をネステッドＰＣＲに対するテンプレートとして使用した。最初のＰＣＲ反応を、外部プライマー（アンチセンスプライマー２０９及びセンスプライマー９３９、表３）を５μｌのテンプレートとともに使用して２５μｌの総容量において行い、次いで、２回目のＰＣＲを、内部プライマー組（アンチセンスプライマー２１１及びセンスプライマー９４０、表３）をテンプレートとして最初のＰＣＲ反応液１μｌとともに使用して行った。
【０１２１】
陰性鎖のＨＣＶ  ＲＮＡを検出するために、Ｌａｎｆｏｒｄら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０２，６０６〜６１４，１９９４により考案されたタグ化プライマー法を使用した。５μｌのＤＮａｓｅＩ処理されたＲＮＡを、タグ化プライマーＴＡＧＮＣ１（センス、表３）が代わりに使用されたことを除いて、上記のように逆転写した。逆転写酵素を不活性化させた後、テンプレートを、何らかの残留するＲＮＡを分解するために、０．１ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡ（Ｓｉｇｍａ）で３７℃において３０分間さらに処理した。その後、５μｌのテンプレートを、外側プライマー組、ＴＡＧ及びアンチセンス２０９（表３）を使用する１回目のＰＣＲのために使用した。この後、内側プライマー組。ＴＡＧ及びアンチセンス２１１（表３）を使用する２回目のＰＣＲを、テンプレートとしての１回目のＰＣＲから得られた生成物の１μｌを使用して行った。
【０１２２】
細胞ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡを、類似する細胞数がそれぞれの実験で使用されたことを調べるために使用し、この場合、この目的のために、１μｌのＤＮａｓｅＩ処理されたＲＮＡを、オリゴｄＴ（Ｒｏｃｈｅ）が代わりに使用されたことを除いて、上記にように使用した。ここで１μｌのテンプレートが、プライマー、ＧＡＰＤＨフォワード及びＧＡＰＤＨリバース（表３）を使用する１回のＰＣＲのために使用された。
【０１２３】
すべてのＰＣＲは、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，カリフォルニア州，米国）から得られるＴｉｔａｎｉｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用して２５μｌの最終容量において行われた。ＰＣＲ条件は下記の通りである：９５℃で２分間、その後、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分からなる３５サイクル、そして７２℃で１０分間の最後の伸長。陽性鎖及び陰性鎖のウイルス転写物に対する２回目のＰＣＲから得られた増幅産物（２５μｌ）、またはＧＡＰＤＨに対する１回のＰＣＲから得られた増幅産物を、３％アガロースゲルで分離して、臭化エチジウムによる染色の後、ＵＶ光のもとで視覚化した。
【０１２４】
サザンハイブリダイゼーション
サザンブロッティングのために、陰性鎖のＲＴ−ＰＣＲ産物をアガロースゲルで分離し、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎメンブラン（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）にブロットした。ハイブリダイゼーションを、５’ＮＣＲ内の配列に対応するオリゴヌクレオチド（ＨＣＶプローブ、表１）をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）によって［γ−３２Ｐ］ｄＡＴＰ（ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，マサチューセッツ州，米国）で５’標識して用いて行った。ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂハイブリダイゼーション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）及び１０μｇ／ｍｌの剪断サケ精子ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ）をハイブリダイゼーションのために使用した。フィルターを６０℃で１４〜１６時間インキュベートし、その後、２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳで２回、そして１×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳで２回、室温で洗浄し、最後に０．１×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳで６０℃において２回洗浄した。フィルターをサランラップに包み、オートラジオグラフィーフィルムに−８０℃で１２〜２４時間露光させた。
【０１２５】
ＴＡクローニング及び配列分析
アガロースゲルで分離した後、陽性鎖のＲＴ−ＰＣＲ産物を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得られるＴＡクローニングキットを使用してｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクターに連結した。それぞれの連結から得られる少なくとも３つのクローンを（Ｍ１５フォワード及びＭ１５リバースの両方のプライマーを用いて）配列決定して、同一であることを確認した。配列を、ＭｅｇＡｌｉｇｎソフトウエア（ＤＮＡＳｔａｒ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ウィスコンシン，米国）を使用して配列比較した。
【０１２６】
すべての構築物のＤＮＡ配列決定が分子細胞生物学研究所の中核施設において行われた。２００ｎｇの二本鎖テンプレート及び１０ｎｇのプライマーが、ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，カリフォルニア州，米国）から得られるＴａｑ  ＤｙｅＤｅｏｘｙターミネーターサイクル配列決定キット及び自動化ＤＮＡシーケンサー３７３を用いたジデオキシ法のために使用された。
【０１２７】
結果
キメラ受容体、ＴｆＲ−ＣＤ８１は、Ｈｕｈ７細胞内へのＨＣＶ粒子の効率的な進入を媒介する
本発明者らは、ＨＣＶの進入を媒介する安定なＨｕｈ７クローンの能力を試験した。２名のＨＣＶ感染患者（Ａ及びＢ）から得られた血清を非形質導入Ｈｕｈ７細胞またはＨｕｈ７−ＣＤ８１ＷＴ細胞またはＨｕｈ７−ＴｆＲ−ＣＤ８１細胞に８時間までの時間重層し、その後これらの細胞を徹底的に洗浄して、新鮮な培地で７日間にわたり再びインキュベートした。続いて、総ＲＮＡを細胞から抽出して、ネステッドＲＴ−ＰＣＲを行い、ＨＣＶ粒子の取り込みの指標として陽性鎖のウイルス転写物の存在についてアッセイした。遺伝子型が最初不明であったので、ＲＴ−ＰＣＲのために使用されたプライマーの配列は、すべての知られているＨＣＶ変化体の間で十分に保存されている５’非コード領域（５’ＮＣＲ）内の領域から選ばれた。これらのプライマー（表３）は、代表的な１ｂ単離体ＨＣＶ−ＢＫ（Ｔａｋａｍｉｚａｗａら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５，１１０５〜１１１３，１９９１；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｍ５８３３５）のヌクレオチド位置（ｎｔ）３６〜７３（センス）及びｎｔ３３１〜２７９（アンチセンス）に対応しており、そしてＨＣＶ単離体を遺伝子型決定するために文献において一般的に使用されるプライマーに類似している。
【０１２８】
図１２Ａには、患者Ａ由来の血清を使用して得られた結果が示される。陽性鎖のＨＣＶに特異的なＲＴ−ＰＣＲ産物が非形質導入Ｈｕｈ７細胞またはＨｕｈ７−ＣＤ８１ＷＴ細胞では検出されず、しかし、強いシグナルがＨｕｈ７−ＴｆＲ−ＣＤ８１細胞に対して観測されたが、このことは、著しい量のＨＣＶ粒子がＨｕｈ７−ＴｆＲ−ＣＤ８１細胞に取り込まれたことを示している（図１２Ａ、パネルＩ）。同じ実験が、患者Ｂ由来の血清を用いて行われたとき、本発明者らは、最初、非形質導入Ｈｕｈ７細胞またはＨｕｈ７−ＣＤ８１ＷＴ細胞またはＨｕｈ７−ＴｆＲ−ＣＤ８１細胞については陽性鎖のＲＴ−ＰＣＲ産物を見出さなかった（図１２Ｂ、パネルＩ、レーン１〜３）。患者血清におけるウイルス粒子は一部がリポ蛋白質及び／または抗ウイルス抗体（ＩｇＧ）で厚く覆われていることが報告されているので、本発明者らは、患者血清を０．０５％の穏和な界面活性剤（デオキシコール酸塩）で処理した後に実験を繰り返した。この方法では、リポ蛋白質／ＩｇＧがウイルス粒子から穏やかに除かれ、抗ＨＣＶ  Ｅ２抗体によってグリッドに捕捉され、電子顕微鏡で見ることができるエンベロープ化ウイルスがもたらされることが報告されていた。注目すべきことではあるが、界面活性剤による処理の後、ウイルス粒子の効率的な取り込みがＨｕｈ７−ＴｆＲ−ＣＤ８１細胞について認められたが、非形質導入Ｈｕｈ７細胞またはＨｕｈ７−ＣＤ８１ＷＴ細胞については認められなかった（図１２Ｂ、パネルＩ、レーン４〜６）。
【０１２９】
活性なウイルス複製の指標である陰性鎖ＲＮＡの存在を、Ｌａｎｆｏｒｄら，１９９４によって考案された鎖特異的なタグ化ＲＴ−ＰＣＲ法を使用して試験した。再度、生成物は、非形質導入Ｈｕｈ７細胞及びＨｕｈ７−ＣＤ８１ＷＴ細胞に関しては得られなかったが、一方Ｈｕｈ７−ＴｆＲ−ＣＤ８１細胞は、臭化エチジウムでの染色の後、ＵＶ光のもとで弱いＲＴ−ＰＣＲ産物を示した（図１２Ａ及びＢ、パネルＩＩＩ）。さらなる確認がサザンブロット分析によって得られた（図１２Ａ及びＢ、パネルＩＶ）。観測された低レベルの陰性鎖ＲＮＡは、Ｈｕｈ７細胞における低レベルの複製のためであると考えられるか、または使用された時点（感染後７日）が最適でなかったということが考えられる。より後の時点で集められた細胞の分析が、このことを検討するために必要である。例えば、陰性鎖の断続的な検出が感染初代ヒト肝細胞において報告されている。
【０１３０】
患者Ａ及びＢに由来するＲＴ−ＰＣＲ産物（Ｈｕｈ７−ＴｆＲ−ＣＤ８１細胞）をｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結して、挿入物の配列を決定した。患者Ａに由来するＲＴ−ＰＣＲ産物（２０５ｂｐ）の配列は、代表的な遺伝子型１ｂ、ＨＣＶ−ＢＫ、配列（Ｔａｋａｍｉｚａｗａら，１９９１；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｍ５８３３５）の対応する５’ＮＣＲ領域と同一であり、患者Ｂの場合は２つのミスマッチを示す（図１２Ｃ）。従って、患者Ａ及び患者Ｂはともに、ＨＣＶ遺伝子型１ｂに感染している可能性が最も高い。
【０１３１】
抗Ｅ２抗体での患者血清の前処理により、Ｈｕｈ７−ＴｆＲ−ＣＤ８１細胞内へのＨＣＶ粒子の取り込みは消滅した
患者Ａの残った血清は、上記に記載された重層実験の後、凍結された。この場合、この血清は、グリコシル化Ｅ２蛋白質を検出することができる（データ示さず）抗Ｅ２抗体が、ＨＣＶ粒子を血清から免疫沈殿させることができるかどうかを試験するために、解凍されて使用された。血清を抗ＨＣＶ  Ｅ２抗体または対照抗体（抗ｃ−ｍｙｃ抗体）及びプロテインＡ／Ｇでインキュベートした後、ビーズを洗浄し、ＲＮＡを抽出して、ＲＴ−ＰＣＲを行い、ビーズと結合した陽性鎖ＨＣＶ  ＲＮＡについて検出を行った。図１３Ａに示されるように、一部のウイルスＲＮＡが抗ＨＣＶ  Ｅ２抗体及び抗ｃ−ｍｙｃ抗体の両方によって免疫沈殿した。しかし、抽出されたＲＮＡが１０倍、３０倍及び１００倍希釈され、その後ＲＴ−ＰＣＲが行われたとき、ＲＴ−ＰＣＲ産物は、１０倍希釈及び３０倍希釈での抗ＨＣＶ  Ｅ２抗体についてのみ認められたが、対照の抗ｃ−ｍｙｃ抗体については認められなかったが、このことは、抗ＨＣＶ  Ｅ２抗体により免疫沈殿したＨＣＶ粒子の量が、抗ｃ−ｍｙｃ抗体による場合よりも１０〜３０倍多かったことを示している（図１３Ａ）。
【０１３２】
抗ＨＣＶ  Ｅ２抗体または抗ｃ−ｍｙｃ抗体で前処理された血清が、その後、Ｈｕｈ７−ＴｆＲ−ＣＤ８１細胞に重層するために使用された。その後、細胞を、前記のように、陽性鎖のＨＣＶ  ＲＮＡの存在について試験した。図１３Ｂに示されるように、抗Ｅ２抗体で前処理された血清が重層されたＨｕｈ７−ＴｆＲ−ＣＤ８１細胞では陽性鎖のＲＴ−ＰＣＲが認められないように、抗Ｅ２抗体により、著量のウイルス粒子が血清から除かれている（図１３Ｂ、レーン５）。対照的に、血清が抗ｃ−ｍｙｃ抗体で前処理されたときには、陽性鎖のＲＴ−ＰＣＲ産物が明瞭に検出された（図１３Ｂ、レーン６）。
【０１３３】
この場合、本発明者らはまた、非形質導入Ｈｕｈ７細胞と、Ｈｕｈ７−ＣＤ８１ＷＴ、Ｈｕｈ７−ＴｆＲ−ＣＤ８１及びＨｕｈ７−ＣＤ８１−ＬＤＬＲ細胞との間における取り込み効率を比較するため、重層実験を繰り返した。Ｈｕｈ７−ＣＤ８１−ＬＤＬＲ細胞は、図１２Ａ及びＢに記載される最初の２回の重層実験では使用されなかった。結果は、陽性鎖のＲＴ−ＰＣＲ産物がＨｕｈ７−ＴｆＲ−ＣＤ８１及びＨｕｈ７−ＣＤ８１−ＬＤＬＲ細胞で認められたが、非形質導入Ｈｕｈ７またはＨｕｈ７−ＣＤ８１ＷＴ細胞では認められなかったことを示した（図１３Ｂ、レーン１〜４）。
【０１３４】
まとめると、（２つの異なる患者血清を使用する）３つの独立した実験において、陽性鎖ＨＣＶ  ＲＮＡの取り込みがＨｕｈ７−ＴｆＲ−ＣＤ８１細胞において一貫して認められたが、非形質導入Ｈｕｈ７細胞またはＨｕｈ７−ＣＤ８１ＷＴ細胞では認められなかった。そして、１つの実験において、Ｈｕｈ７−ＣＤ８１−ＬＤＬＲ細胞内への陽性鎖ＨＣＶ  ＲＮＡの取り込みもまた認められた。抗ＨＣＶ  Ｅ２抗体を用いた患者血清の前処理によりＨＣＶ粒子が効率的に除かれ、その結果、ウイルスＲＮＡの取り込みがＨｕｈ７−ＴｆＲ−ＣＤ８１細胞については認められなかった（図１３Ｂ）ことは、ＨＣＶ  Ｅ２蛋白質が、以前の研究と一致して、ＣＤ８１に対する直接的なリガンドであることを示唆している。本発明者らは、トランスフェリン及びＬＤＬ受容体に由来するエンドサイトーシスシグナルタグをＣＤ８１のＮ末端またはＣ末端のいずれかの細胞質ドメインへと設計することによって、ＨＣＶ感染患者の血清におけるウイルス粒子のＨｕｈ７細胞内への取り込みを誘発させることができると結論した。
【０１３５】
表３．ウイルス転写物の検出のために使用されたプライマー
【表３】
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【０１３６】
１すべてのＨＣＶヌクレオチド位置（ｎｔ）は、代表的な遺伝子型１ｂ単離体ＨＣＶ−ＢＫ（１７，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｍ５８３３５）に対する参照である。制限部位に対応する配列が斜体字で示される。
【０１３７】
２配列は、Ｇａｒｓｏｎら，Ｌａｎｃｅｔ  ３３６，８７８〜８７９，１９９０において使用されたプライマーと同じである。
【０１３８】
３配列は、Ｏｋａｍｏｔｏら，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．６０，２１５〜２２２，１９９０において使用されたプライマーと同じである。
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】図１Ａは、野生型ＣＤ８１及びトランスフェリン受容体（ＴＦＲ）及び低密度リポ蛋白質受容体（ＬＤＬＲ）の膜トポロジーならびにＣＤ８１キメラ体の予測されるトポロジーを示す概略図である。σ及びνは、キメラ受容体を形成させるためにＣＤ８１に融合されたＬＤＬＲ及びＴＦＲの細胞質ドメインをそれぞれ表す。図１Ｂは、親のＨｕｈ７クローン及び安定に形質導入されたＨｕｈ７クローンにおけるＣＤ８１受容体及びトランスフェリン受容体及びＬＤＬ受容体の表面発現のＦＡＣＳｃａｎ分析の結果を示す。細胞を特異的な抗体（抗ＣＤ８１または抗ＴＦＲまたは抗ＬＤＬＲ）で染色し、その後フィコエリトリンコンジュゲート化ヤギ抗マウスＩｇＧで染色した（無色のヒストグラム）。中黒のヒストグラムは、フィコエリトリンコンジュゲート化抗体のみによる染色を表した。内因性受容体を発現する２９３Ｔ細胞が陽性対照として使用された。
【図２】野生型ＣＤ８１及びキメラＣＤ８１による抗ＣＤ８１抗体の取り込みのウエスタン分析の結果を示す。細胞溶解物における総ＩｇＧは、生細胞に抗体を３７℃で１時間エンドサイトーシスさせた後、表面に結合した抗体及び取り込まれた抗体の両方を表す。取り込まれたＩｇＧのみが、酸洗浄を使用して、表面に結合した抗体のすべてを除いた後、細胞溶解物に残った。細胞内熱ショック７０蛋白質Ｈｓｐ７０の発現が正規化のために使用された。
【図３】ＦＡＣＳｃａｎ分析によって測定された、Ｈｕｈ７安定クローンの細胞表面における野生型ＣＤ８１受容体及びキメラＣＤ８１受容体の両方の下方調節及び再発現の割合を示す。ＣＤ８１受容体の表面発現が、細胞を抗ＣＤ８１抗体と３７℃で種々の時間インキュベートして、徹底的に洗浄し、そして抗ＣＤ８１抗体及びフィコエリトリンコンジュゲート化ヤギ抗マウスＩｇＧでインキュベートした後に測定された。その場合、平均蛍光がそれぞれの時点について計算された。
【図４】図４Ａは、非還元条件下では、Ｅ２が高分子量の凝集体として主に存在し、ほんの小さい割合がモノマーとして存在することを示す。還元剤の存在下では、すべての凝集体が解離して、モノマーを形成した。短縮型のＥ２蛋白質が２９３Ｔ細胞において発現し、そしてこの蛋白質はＣ末端においてｍｙｃタグに融合されているので、抗ｍｙｃ抗体を使用して検出された。対照の細胞はベクターのみで形質導入された。図４Ｂは、短縮型のＥ２蛋白質が、野生型ＣＤ８１またはキメラＣＤ８１を過剰発現するＨｕｈ７安定クローンに結合することを例示する。これは、Ｅ２蛋白質を細胞の単層培養物に３７℃で４時間重層した後に観測された。非形質導入Ｈｕｈ７細胞に対するＥ２の結合は観測されなかった。β−アクチンの発現により、全細胞溶解物の負荷量が等しいことが示された。
【図５】誘導可能な全長のＨＣＶゲノムを安定に発現するＨｕｈ７細胞から得られた培養培地におけるウイルス転写物の存在についてアッセイするために行われたＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。陽性のＲＴ−ＰＣＲ産物が、テトラサイクリンで５日間誘導された細胞から得られた培養培地において（抗Ｅ２抗体による抗体捕捉の後に）観測され、これらの産物は、ＤＮａｓｅＩ及びＲＮａｓｅＡによる処理の後も依然として観測された。細胞がテトラサイクリンで誘導されなかった場合、生成物が観測されなかった。
【図６】感染性培地にさらされた後におけるＨｕｈ７安定クローンにおけるウイルス転写物の存在についてアッセイするために行われたＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。Ｈｕｈ７−ＣＤ８１ＷＴは少量のウイルス転写物を示しており、一方で、親のＨｕｈ７細胞では何も検出されなかった。Ｈｕｈ７−ＣＤ８１−ΔＬＤＬＲ発現細胞及びＨｕｈ７−ＣＤ８１−ΔＴＦＲ発現細胞は、Ｈｕｈ７−ＣＤ８１ＷＴと比較して、プラス及びマイナス鎖の両方のウイルスＲＮＡの増大したレベルを示した。このことは、これらの細胞におけるウイルスの取り込み及び複製の増大を示している。細胞ＧＡＰＤＡが正規化のために使用され、陽性対照は、ＨＣＶ全長ゲノムで形質導入された細胞から得られたＲＮＡを使用して行われた。
【図７】図７Ａはウイルス感染実験の結果を示す。レーン２〜４：ウイルス転写物が、抗Ｅ２抗体で前処理された感染性培地が重層されたＨｕｈ７−ＣＤ８１ＷＴ細胞では観測されず、一方で、前処理されない感染性培地または対照の抗ｃ−ｍｙｃ抗体で前処理された感染性培地で細胞が重層されたときには、ウイルス転写物が観測された。レーン５及び６：感染性培地を加える前に抗ヒトＣＤ８１抗体（抗ｈＣＤ８１）で細胞がプレインキュベートされたときには、ウイルス転写物がＨｕｈ７−ＣＤ８１ＷＴ細胞では観測されなかった。一方、抗マウスＣＤ８１抗体（抗ｍＣＤ８１）でのプレインキュベートはＨｕｈ７−ＣＤ８１ＷＴ細胞の感染に影響しなかった。陰性対照は、非感染性の培地が重層された細胞を使用して行われた。図７Ｂは、Ｈｕｈ７−ＣＤ８１−ΔＴＦＲ細胞に対して行われた阻止実験の結果を示す。抗Ｅ２による前処理は感染を妨げた（レーン２〜４）。しかし、Ｈｕｈ７−ＣＤ８１−ΔＴＦＲの感染は抗ヒトＣＤ８１抗体によって阻止されなかった（レーン５）。これは、野生型ＣＤ８１と比較して、ＣＤ８１−ΔＴＦＲキメラ受容体の取り込み効率がより大きいためであると考えられる。
【図８】オープンリーディングフレーム及び可変領域を示す、ハイブリドーマ９０２から単離されたＩｇＨ鎖の部分配列（Ａ）及びＩｇＬ鎖の部分配列（Ｂ）を示す。エドマン配列決定により決定された成熟蛋白質のＮ末端配列には下線が付けられている。
【図９】図９ＡはＩｇＨ及びＩｇＬが相互に結合したことを示すウエスタン分析の結果を示す。一過性形質導入された細胞から得られた培養培地（分泌型／細胞外蛋白質を含む）及び細胞溶解物（細胞の溶解により放出された細胞内蛋白質）をプロテインＡ／Ｇビーズとインキュベートし、結合したＩｇＨ及びＩｇＬをウエスタン分析によって検出した。ＩｇＨ及びＩｇＬで形質導入された細胞は両方の鎖を培養培地に分泌し、そして、プロテインＡ／Ｇビーズを用いたＩｇＨの捕捉はまたＩｇＬ蛋白質の解離をもたらしたので、それらは相互に結合していた。ＩｇＬ及びキメラＩｇＨ（ＩｇＨ−ΔＣＩ−Ｍ６ＰＲまたはＩｇＨ−ΔＬＤＬＲ）で形質導入された細胞については、重鎖が細胞内に見出された。このことは、それらが膜と結合していたことを示している。図９Ｂは、細胞の平均蛍光が非形質導入細胞と同じであったので、ＩｇＨ及びＩｇＬで一過性形質導入された細胞が細胞表面に抗体を発現しなかったことを例示するＦＡＣＳｃａｎ分析の結果を示す。対照的に、ＩｇＬ及びキメラＩｇＨ（ＩｇＨ−ΔＣＩ−Ｍ６ＰＲまたはＩｇＨ−ΔＬＤＬＲ）で形質導入された細胞は大きい平均蛍光を示した。このことは、抗体が細胞表面に発現したことを示している。図９Ｃは、ＩｇＬ及びＩｇＨ−ΔＣＩ−Ｍ６ＰＲまたはＩｇＨ−ΔＬＤＬＲで形質導入された２９３細胞の安定クローンの細胞溶解物における重鎖抗体及び軽鎖抗体の発現を示す。
【図１０】ハイブリドーマ９０２による培養培地、またはＩｇＬ及びＩｇＨで一過性形質導入された２９３細胞による培養培地に分泌され、プロテインＡ／Ｇビーズに捕捉された抗体を使用して免疫沈殿させたＨＩＶ−１ＭＣ９９ＩＩＩＢΔＴａｔ−Ｒｅｖウイルスに存在するｇｐ１２０を検出するためのウエスタン分析の結果を例示する。ＩｇＨのみで形質導入された細胞から得られた培養培地が使用されたときには、ウイルスが検出されなかった。
【図１１】図１１Ａは、抗マウスＦＩＴＣコンジュゲート化Ｆ（ａｂ’）２抗体を使用してＦＡＣＳｃａｎ分析によって測定されたとき、ＩｇＬ及びＩｇＨ−ΔＣＩ−Ｍ６ＰＲ（クローン９）またはＩｇＨ−ΔＬＤＬＲ（クローン１０）で形質導入された２９３細胞の安定なクローンの細胞表面におけるキメラ抗体の発現を示す（無色のヒストグラム）。中黒のヒストグラムは非染色細胞を表した。非形質導入細胞が対照として使用された。図１１Ｂは、ｎｅｆ遺伝子内に挿入されたルシフェラーゼレポーター遺伝子を含む偽型ウイルスのＨＩＶ  ＨＢＸ２株（Ｈｅ及びＬａｎｄａｕ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９，４５８７〜４５９２，１９９５）を感染させた後、安定に形質導入されている２９３−ＩｇＨ−ΔＣＩ−ＭＰＲ（クローン９）細胞におけるルシフェラーゼ活性のＰＭＡ誘導を示す。ＰＭＡで処理されなかった感染２９３−ＩｇＨ−ΔＣＩ−ＭＰＲ細胞はルシフェラーゼ活性を示さなかった。非形質導入（ＵＮＴ）細胞または２９３−ＩｇＨ−ΔＬＤＬＲ（クローン１０）細胞はいずれも、著しいルシフェラーゼ活性を示さなかった。
【図１２】Ｈｕｈ７−ＴｆＲ−ＣＤ８１細胞におけるＨＣＶの取り込み及び複製を示す。ネステッドＲＴ−ＰＣＲが、２名のＨＣＶ感染患者（Ａ及びＢ）から得られた血清にさらされた後のＨｕｈ７安定クローンにおけるウイルス転写物の存在についてアッセイするために行われた。細胞ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡが、類似する細胞数が実験で使用されたことを調べるために使用された（パネルＩＩ）。（Ａ）細胞が患者Ａ由来の血清にさらされた後、著しい量の陽性鎖のＨＣＶ  ＲＮＡがＨｕｈ７−ＴｆＲ−ＣＤ８１細胞で検出されたが、非形質導入Ｈｕｈ７細胞及びＨｕｈ７−ＣＤ８１ＷＴ細胞では検出されなかった（パネルＩ、陽性鎖のＲＴ−ＰＣＲ産物が、臭化エチジウム染色の後、ＵＶ光のもとで視覚化された）。陰性鎖のＨＣＶ  ＲＮＡもまた、Ｈｕｈ７−ＴｆＲ−ＣＤ８１細胞でのみ検出された（陰性鎖のＲＴ−ＰＣＲ産物が、臭化エチジウム染色の後、ＵＶ光のもとで視覚化され（パネルＩＩＩ）、特異的なプローブを用いたサザンブロットによって分析された（パネルＩＶ））。（Ｂ）患者Ｂ由来の血清が、細胞に重層するために直接使用されたとき、陽性鎖または陰性鎖のウイルス転写物が、非形質導入Ｈｕｈ７細胞、Ｈｕｈ７−ＣＤ８１ＷＴ細胞またはＨｕｈ７−ＴｆＲ−ＣＤ８１細胞では検出されなかった（非処理、レーン１〜３、パネルＩ、ＩＩＩ及びＩＶ）。血清が、細胞に重層する前に０．０５％デオキシコール酸塩で前処理されたときには、陽性鎖のＲＴ−ＰＣＲ産物がＨｕｈ７−ＴｆＲ−ＣＤ８１細胞で観測されたが、非形質導入Ｈｕｈ７細胞及びＨｕｈ７−ＣＤ８１ＷＴ細胞では観測されなかった（０．０５％デオキシコール酸塩、レーン４〜６、パネルＩ）。陰性鎖のＲＴ−ＰＣＲが、Ｈｕｈ７−ＴｆＲ−ＣＤ８１細胞についてだけ、臭化エチジウム染色後のＵＶ光のもとで（パネルＩＩＩ）、そしてサザンブロット分析（パネルＩＶ）によって検出され得る。（Ｃ）患者Ａまたは患者Ｂに由来する血清が重層されたＨｕｈ７−ＴｆＲ−ＣＤ８１細胞から得られる陽性鎖のＲＴ−ＰＣＲ産物をｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクターに連結して、両方向から配列決定した。配列を、遺伝子型１ｂに対するＨＣＶ−ＢＫ（Ｔａｋａｍｉｚａｗａら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ６５，１１０５〜１１１３，１９９１；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｍ５８３３５）及び遺伝子型１ａに対するＨＣＶ−１（Ｃｈｏｏら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８８，２４５１〜２４５５，１９９１；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｍ６２３２１）の代表的な単離体から得られる対応する５’非コード領域に関して配列を比較した。ＨＣＶ−ＢＫに一致するヌクレオチドが示され、ミスマッチが四角で囲まれている。左側に示されるヌクレオチド番号はＨＣＶ−ＢＫにおけるヌクレオチド位置を示す。
【図１３】患者血清が抗ＨＣＶ  Ｅ２抗体で前処理されたとき、ＨＣＶ粒子の取り込みが行われなかったことを示す。図１２Ａに示される重層実験の後、患者Ａ由来の残った血清は−８０℃で再凍結され、これらの実験のために後で再び解凍された。（Ａ）血清を抗ＨＣＶ  Ｅ２抗体または抗ｃ−ｍｙｃ抗体（陰性対照）及びプロテインＡ／Ｇビーズで免疫沈殿させた。洗浄後、ＲＮＡを免疫複合体から抽出し、陽性鎖のＨＣＶ  ＲＮＡの存在について種々の希釈で分析した。一部のＨＣＶ  ＲＮＡが両方の抗体によって免疫沈殿した（未希釈、レーン２及び６）が、著しく多い（１０〜３０×）ＨＣＶ  ＲＮＡが、抗ｃ−ｍｙｃ抗体（レーン２〜５）に対するよりも、抗Ｅ２抗体（レーン６〜９）に対して結合した。ＲＴ−ＰＣＲ産物が、抗Ｅ２抗体によって免疫沈殿させたＲＮＡが１０×及び３０×に希釈されたときも依然として検出されたが、これらの希釈での抗ｃ−ｍｙｃ抗体については、ＲＴ−ＰＣＲ産物が観測されなかった。ＤＮＡマーカーがレーン１に負荷された（ｂｐは塩基対を表す）。（Ｂ）ＲＴ−ＰＣＲが、患者Ａ由来の血清にさらされた後のＨｕｈ７安定クローンにおける陽性鎖のウイルス転写物の存在についてアッセイするために行われた。陽性鎖のＲＴ−ＰＣＲ産物がＨｕｈ７−ＴｆＲ−ＣＤ８１細胞（レーン４）及びＨｕｈ７−ＣＤ８１−ＬＤＬＲ細胞（レーン１）で観測されたが、非形質導入Ｈｕｈ７細胞（レーン２）またはＨｕｈ７−ＣＤ８１ＷＴ細胞（レーン３）では観測されなかった。陽性鎖のＲＴ−ＰＣＲ産物が、抗ＨＣＶ  Ｅ２抗体で前処理された血清が重層されれたＨｕｈ７−ＴｆＲ−ＣＤ８１細胞（レーン５）では観測されず、一方、細胞が対照の抗ｃ−ｍｙｃ抗体で前処理された血清で細胞が重層されたとき（レーン６）には、陽性鎖ＲＴ−ＰＣＲ産物が観測された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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