(57)【要約】本発明は原発性ＣＮＳ腫瘍に関し、腫瘍体積を減少させ、原発性ＣＮＳ腫瘍を有する哺乳類における生存の長さを延長し、それにより原発性ＣＮＳ腫瘍のための処置を与えるための有用な組成物及び方法を提供する。本発明は腫瘍体積の減少及び動物生存の延長のための化合物の同定の方法にも関し、従ってそれは原発性ＣＮＳ腫瘍の処置に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類突然変異ＢＥＨＡＢ分子又はそのフラグメントをコードする単離された核酸。
【請求項２】
単離された核酸が配列番号：４に示される核酸配列への９９．７％同一性を有する、哺乳類突然変異ＢＥＨＡＢ分子をコードする単離された核酸。
【請求項３】
単離された核酸が配列番号：４に示される核酸配列を含む請求項２の単離された核酸。
【請求項４】
哺乳類突然変異ＢＥＨＡＢ分子のアミノ酸配列が配列番号：３に示されるアミノ酸配列を含む、哺乳類突然変異ＢＥＨＡＢ分子をコードする単離された核酸。
【請求項５】
哺乳類突然変異ＢＥＨＡＢ分子を含む単離されたポリペプチド。
【請求項６】
哺乳類突然変異ＢＥＨＡＢ分子が配列番号：３に示されるアミノ酸配列への９９．６％同一性を有する、哺乳類突然変異ＢＥＨＡＢ分子を含む単離されたポリペプチド。
【請求項７】
核酸がさらにそれに共有結合されたタグポリペプチドをコードする核酸を含む請求項１の単離された核酸。
【請求項８】
該タグポリペプチドがｍｙｃタグポリペプチド、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタグポリペプチド、緑色蛍光タンパク質タグポリペプチド、ｍｙｃ−ピルビン酸キナーゼタグポリペプチド、Ｈｉｓ６タグポリペプチド、インフルエンザウィルス血球凝集素タグポリペプチド、フラッグ（ｆｌａｇ）タグポリペプチド及びマルトース結合タンパク質タグポリペプチドより成る群から選ばれる請求項７の単離された核酸。
【請求項９】
核酸がさらにそれに操作可能に連結されたプロモーター／調節配列を規定する核酸を含む請求項１の単離された核酸。
【請求項１０】
請求項１の単離された核酸を含むベクター。
【請求項１１】
ベクターがさらにそれに操作可能に連結されたプロモーター／調節配列を規定する核酸を含む請求項１０のベクター。
【請求項１２】
請求項１の単離された核酸を含む組換え細胞。
【請求項１３】
請求項１０のベクターを含む組換え細胞。
【請求項１４】
哺乳類ＢＥＨＡＢ分子又はそのフラグメントをコードする単離された核酸に相補的な、アンチセンス配向にある単離された核酸。
【請求項１５】
核酸が配列番号：５に示される核酸配列に相補的である請求項１４の単離された核酸。
【請求項１６】
請求項１４の単離された核酸を含む組換え細胞。
【請求項１７】
請求項１４の単離された核酸を含むベクター。
【請求項１８】
哺乳類に有効量のＢＥＨＡＢ切断阻害剤を投与し、それにより該哺乳類における原発性ＣＮＳ腫瘍を処置することを含んでなる、哺乳類における原発性ＣＮＳ腫瘍を処置するための方法。
【請求項１９】
該ＢＥＨＡＢ切断阻害剤が抗体、タンパク質、プロテアーゼ阻害剤及びペプチドミメティック（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）より成る群から選ばれる請求項１８の方法。
【請求項２０】
該抗体がＢＥＨＡＢ又はそのフラグメントに特異的に結合する請求項１９の方法。
【請求項２１】
該タンパク質が配列番号：３に示されるアミノ酸配列又はそのフラグメントを含む請求項１９の方法。
【請求項２２】
哺乳類に有効量のＢＥＨＡＢ発現阻害剤を投与し、それにより該哺乳類における原発性ＣＮＳ腫瘍を処置することを含む、哺乳類において原発性ＣＮＳ腫瘍を処置するための方法。
【請求項２３】
該ＢＥＨＡＢ発現阻害剤がリボザイム及びアンチセンス核酸より成る群から選ばれる請求項２２の方法。
【請求項２４】
該アンチセンス核酸がＢＥＨＡＢ分子又はそのフラグメントをコードする単離された核酸に相補的である請求項２３の方法。
【請求項２５】
該リボザイムがＢＥＨＡＢ分子又はそのフラグメントをコードする単離された核酸に相補的である請求項２３の方法。
【請求項２６】
哺乳類に有効量のＢＥＨＡＢ切断産物の活性の阻害剤を投与し、それにより該哺乳類における原発性ＣＮＳ腫瘍を処置することを含んでなる、哺乳類における原発性ＣＮＳ腫瘍の処置法。
【請求項２７】
該ＢＥＨＡＢ切断産物の活性の阻害剤が抗体である請求項２６の方法。
【請求項２８】
該抗体がＢＥＨＡＢ切断産物に特異的に結合する請求項２７の方法。
【請求項２９】
第１の哺乳類から生物学的試料を得、該生物学的試料中のＢＥＨＡＢ核酸分子の量を評価し、該生物学的試料中のＢＥＨＡＢ核酸分子の量を、他の点では同一である第２の哺乳類から得られる生物学的試料中のＢＥＨＡＢ核酸分子の量と比較し、ここで該他の点では同一である第２の哺乳類からの該生物学的試料中のＢＥＨＡＢ核酸分子の量と比較してより高い該第１の哺乳類からの該生物学的試料中のＢＥＨＡＢ核酸分子の量が、第１の該哺乳類が原発性ＣＮＳ腫瘍に悩んでいることの指標となり、それにより哺乳類における原発性ＣＮＳ腫瘍を診断することを含んでなる、哺乳類における原発性ＣＮＳ腫瘍の診断法。
【請求項３０】
該生物学的試料が血液、神経組織、脳脊髄液、尿、唾液及び脳組織より成る群から選ばれる請求項２９の方法。
【請求項３１】
哺乳類に原発性ＣＮＳ腫瘍のための処置を施す前、その間又は後の該哺乳類中のＢＥＨＡＢ分子の量を評価し、ここで該原発性ＣＮＳ腫瘍のための処置を施す前の該哺乳類中の該ＢＥＨＡＢ分子の該量と比較して、原発性ＣＮＳ腫瘍のための該処置を施している間もしくはその後の該哺乳類中の該ＢＥＨＡＢ分子のより高いもしくはより低い量が該哺乳類における原発性ＣＮＳ腫瘍のための該処置の有効性の指標となり、それにより該哺乳類における原発性ＣＮＳ腫瘍のための該処置の有効性を評価することを含んでなる、哺乳類における原発性ＣＮＳ腫瘍のための処置の有効性の評価法。
【請求項３２】
該原発性ＣＮＳ腫瘍のための処置が化学療法、放射線治療及び外科手術より成る群から選ばれる請求項３１の方法。
【請求項３３】
細胞を試験化合物と接触させ、該細胞におけるＢＥＨＡＢ分子発現のレベルを、該試験化合物と接触していない他の点では同一である細胞におけるＢＥＨＡＢ分子発現のレベルと比較し、ここで該試験化合物と接触していない該他の点では同一である細胞におけるＢＥＨＡＢ分子発現のレベルと比較して該試験化合物と接触した該細胞におけるＢＥＨＡＢ分子発現のより高いもしくはより低いレベルが、該試験化合物が細胞における該ＢＥＨＡＢ分子の発現に影響することの指標となり、それにより細胞における該ＢＥＨＡＢ分子の発現に影響する化合物を同定することを含んでなる、細胞におけるＢＥＨＡＢ分子の発現に影響する化合物の同定法。
【請求項３４】
請求項３３の方法により同定される化合物。
【請求項３５】
細胞を試験化合物と接触させ、該細胞におけるＢＥＨＡＢ分子発現のレベルを、該試験化合物と接触していない他の点では同一である細胞におけるＢＥＨＡＢ分子発現のレベルと比較し、ここで該試験化合物と接触していない該他の点では同一である細胞におけるＢＥＨＡＢ分子発現のレベルと比較して該試験化合物と接触した該細胞におけるＢＥＨＡＢ分子発現のより高いもしくはより低いレベルが、該試験化合物が細胞における該ＢＥＨＡＢ分子の発現を減少させることの指標となり、それにより細胞における該ＢＥＨＡＢ分子の発現を減少させる化合物を同定することを含んでなる、細胞におけるＢＥＨＡＢ分子の発現を減少させる化合物の同定法。
【請求項３６】
請求項３５の方法により同定される化合物。
【請求項３７】
細胞を試験化合物と接触させ、該細胞におけるＢＥＨＡＢ切断のレベルを、該試験化合物と接触していない他の点では同一である細胞におけるＢＥＨＡＢ切断のレベルと比較し、ここで該試験化合物と接触していない該他の点では同一である細胞におけるＢＥＨＡＢ切断のレベルと比較して該試験化合物と接触した該細胞におけるＢＥＨＡＢ切断のより高いもしくはより低いレベルが、該試験化合物が細胞におけるＢＥＨＡＢ切断を阻害することの指標となり、それにより細胞におけるＢＥＨＡＢ切断を阻害する化合物を同定することを含んでなる、細胞におけるＢＥＨＡＢ切断を阻害する化合物の同定法。
【請求項３８】
無細胞系を試験化合物と接触させ、該無細胞系におけるＢＥＨＡＢ切断のレベルを、該試験化合物と接触していない他の点では同一である無細胞系におけるＢＥＨＡＢ切断のレベルと比較し、ここで該試験化合物と接触していない該他の点では同一である無細胞系におけるＢＥＨＡＢ切断のレベルと比較して該試験化合物と接触した該無細胞系におけるＢＥＨＡＢ切断のより高いもしくはより低いレベルが、該試験化合物が無細胞系におけるＢＥＨＡＢ切断を阻害することの指標となり、それにより無細胞系におけるＢＥＨＡＢ切断を阻害する化合物を同定することを含んでなる、無細胞系におけるＢＥＨＡＢ切断を阻害する化合物の同定法。
【請求項３９】
突然変異ＢＥＨＡＢ分子又はそのフラグメントをコードする単離された核酸分子ならびに製薬学的に許容され得る担体を含む組成物のＢＥＨＡＢ切断阻害量を含んでなり、さらにアプリケーター及び使用のための指示マニュアルを含んでなる、原発性ＣＮＳ腫瘍の処置のためのキット。
【請求項４０】
単離された突然変異ＢＥＨＡＢポリペプチド又はそのフラグメントならびに製薬学的に許容され得る担体を含んでなる組成物のＢＥＨＡＢ切断阻害量を含んでなり、さらにアプリケーター及び使用のための使用説明資料を含んでなる、原発性ＣＮＳ腫瘍の処置のためのキット。
【請求項４１】
哺乳類ＢＥＨＡＢ分子又はそのフラグメントと特異的に結合する抗体ならびに製薬学的に許容され得る担体を含んでなる組成物のＢＥＨＡＢ切断阻害量を含んでなり、さらにアプリケーター及び使用のための使用説明資料を含んでなる、原発性ＣＮＳ腫瘍の処置のためのキット。
【請求項４２】
哺乳類ＢＥＨＡＢ分子又はそのいくつかのフラグメントをコードする単離された核酸に相補的な単離された核酸ならびに製薬学的に許容され得る担体を含んでなる組成物のＢＥＨＡＢ分子発現阻害量を含んでなり、該相補的核酸はアンチセンス配向にあり、さらにアプリケーター及び使用のための使用説明資料を含んでなる、原発性ＣＮＳ腫瘍の処置のためのキット。
【請求項４３】
ＢＥＨＡＢ切断産物又はそのフラグメントと特異的に結合する抗体ならびに製薬学的に許容され得る担体を含んでなる組成物のＢＥＨＡＢ切断産物阻害量を含んでなり、さらにアプリケーター及び使用のための使用説明資料を含んでなる、原発性ＣＮＳ腫瘍の処置のためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願へのクロス・リファレンス
本出願は３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に従い、２００１年７月１７日申請の米国暫定特許出願第６０／３０６，０４６号への優先を与えられる。
【０００２】
連邦により後援された研究又は開発に関する記載
本発明は米国政府から得られる基金により一部支持されており（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｇｒｕｎｔ  Ｎｕｍｂｅｒｓ  ＥＹ０６５１１及びＮＳ３５２２８）、従って米国政府は本発明にある権利を有することができる。
【背景技術】
【０００３】
神経膠腫、原発性脳腫瘍は抑制及び処置が困難なことで有名である。脳に転移した二次性腫瘍又は非−膠性腫瘍と異なり、神経膠腫はガン組織と健康な脳の間に十分に区画された境界がないことを特徴とする独特の浸潤能力を示す。外科手術、化学療法及び放射線治療を含む通常の治療は多くの場合、神経膠腫の浸潤性のために部分的に有効であるのみの処置又は無効な処置である。従って、神経膠腫に苦しんだ患者の予後は常に厳しい。
【０００４】
多くの場合に予後が否定的であるのみでなく、神経膠腫の診断も同様に困難で経費のかかるプロセスである。脳腫瘍の検出は、すべての医療施設において容易に利用できるわけではない経費のかかる画像化装置を必要とし、画像化の結果の確認は通常侵襲的且つ危険な腫瘍の外科手術的試料採取を必要とする。
【０００５】
脳における細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の性質は、ガン細胞の浸潤能力において役割を果たし得る。正常な発育の間、脳の細胞外マトリックスの組成は劇的に変化する。発育している脳における細胞増殖、移動、ニューロン及び膠の自然の発達（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）ならびに脈管形成は細胞の動きを許す可溶性マトリックス中で起こる。しかしながら成熟した発育した脳においては、細胞の運動性は顕著に低下し、成熟細胞を細胞相互作用に安定化する（非特許文献１）。
【０００６】
発育した脳において悪性腫瘍が周りの組織に浸潤するために用いる機構は著しく異なる。例えばいくつかの悪性細胞はそれら自身のＥＣＭ分子、例えばヒアルロン酸（ＨＡ）を生産することができ、それにより隣接する環境の均衡及び構造を変える（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６）。さらに腫瘍細胞は、それらの細胞レセプターの組成を変えることにより、例えばＨＡ結合分子ＲＨＡＭＭ及びＣＤ４４をアップレギュレーションすることにより、ＥＣＭ分子とのそれらの相互作用を変えることができる（非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０）。さらに悪性細胞は、タンパク質分解酵素を生産して周りのＥＣＭを消化することにより、存在する正常なマトリックスを崩壊させることができる（非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３）。腫瘍細胞の隣接組織への浸潤を助長する機構は多様であるが、それはおそらく、浸潤性表現型を最も良く特徴付けているマトリックス分子の生産及び消化を含む、周りのマトリックスの組成を変更する悪性腫瘍の能力である。
【０００７】
浸潤プロセスにおけるプロテアーゼの役割は、ほとんどすべての組織型の腫瘍において示されており（非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３）、高い悪性度分類の神経膠腫の浸潤性において強く関連付けられている（非特許文献１４、非特許文献１５、非特許文献１６、非特許文献１７、非特許文献１８、非特許文献１９、非特許文献２０）。マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰｓ）、特にＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９が神経膠腫において高度にアップレギュレーションされること、ならびにこれらのプロテアーゼの阻害が神経膠腫の浸潤性を低下させることができることを多くの文献が示している（非特許文献２１、非特許文献２２、非特許文献２３、非特許文献２４、非特許文献２５、非特許文献２６、非特許文献１６、非特許文献１７、非特許文献１８）。しかしながら、原発性腫瘍の処置のためにＭＭＰ阻害剤を用いる臨床的試みは、重症且つ有害な副作用のために期待にそむくものであった（非特許文献２７）。
【０００８】
神経膠腫浸潤性及び腫瘍進行において重要な役割を果たす脳ＥＣＭ分子の１つは、脳−濃縮ヒアルロナン結合（ｂｒａｉｎ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ）（ＢＥＨＡＢ）タンパク質である（Ｈｏｃｋｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７年，特許文献１）。ＢＥＨＡＢはタンパク質のプロテオグリカン縦列反復ファミリーのメンバーであり、ヒアルロナン結合ドメインを有するＧＰＩ−固定タンパク質（ＧＰＩ−ａｎｃｈｏｒｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）と分泌タンパク質の両方として存在する（非特許文献２８、非特許文献２９、非特許文献３０）。最近の研究は、ＢＥＨＡＢが脳特異的タンパク質であり、それはヒト脳において発育が進行すると共にダウンレギュレーションされることを示している（非特許文献３１）。重要なことに、今日までに検定されたほとんどすべての成人ヒト神経膠腫試料において、ＢＥＨＡＢは約７００％アップレギュレーションされている（非特許文献３２、非特許文献３１）。
【０００９】
ＢＥＨＡＢ切断は神経膠腫の進行において顕著な役割を果たす。Ｍａｔｔｈｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．による最近の研究（非特許文献３３）は、ＢＥＨＡＢがメタロプロテイナーゼによりＧｌｕ３９５−Ｓｅｒ３９６の間で切断されて５０ｋＤａ及び９０ｋＤａのフラグメントとなるが、ＭＭＰによっては切断されないことを示した。代わりにＢＥＨＡＢはジスインテグリンのメンバー及びメタロプロテイナーゼのトロンボスポンジンモチーフ（ＡＤＡＭＴＳ）群を有するメタロプロテイナーゼ、特にＡＤＡＭＴＳ４によって切断される。
【００１０】
不運なことに、有害な副作用の故に、通常のメタロプロテイナーゼ阻害剤は神経膠腫の処置のために無効な方法であることがわかった。通常の方法を用いる神経膠腫の診断及び処置の両方の固有の危険ならびにメタロプロテイナーゼ阻害剤のような比較的新しい処置管理の失敗があって、一次性中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍の診断及び処置の両方のための方法がずっと前から要求されている。本発明はこの要求を満たす。
【非特許文献１】Ｈｏｃｋｆｉｅｌｄ著，Ｓｅｍｉｎ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１９９０年，１：５５−６３
【非特許文献２】Ｄｅｌｐｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，１９９７年，７２：９４２−９４８
【非特許文献３】Ｋｏｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．著．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９９年，５９：１１４１−１１４５
【非特許文献４】Ｔｕｒｌｅｙ著．Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，１９９２年，１１：２１−３０
【非特許文献５】Ｔｚａｎａｋａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．著．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９７年，７９：３２３−３３２
【非特許文献６】Ｚｅｔｔｅｒ著．Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９３年，４：２１９−２２９
【非特許文献７】Ｇｏｌｄｂｒｕｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．著．Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｃｈｉｒｕｒｇｉｃａ，１９９９年，１４１：２９５−３０５
【非特許文献８】Ｈａｌｌ  ａｎｄ  Ｔｕｒｌｅｙ著，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１９９５年，２６：２２１−２２９
【非特許文献９】Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｃｅｌｌ，１９９５年，８２：１９−２８
【非特許文献１０】Ｍｅｒｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４年，５４：３９８８−３９９２
【非特許文献１１】Ｆｕｒｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１９９４年，７０：７８１−７８３
【非特許文献１２】Ｍｉｇｎａｔｔｉ  ａｎｄ  Ｒｉｆｋｉｎ著，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，１９９３年，７３：１６１−１９５
【非特許文献１３】Ｓｔｅｔｌｅｒ−Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．著，ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９３年，７：１４３４−１４４１
【非特許文献１４】ＤｅＣｌｅｒｃｋ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９１年，５１：２１５１−２１５７
【非特許文献１５】Ｍｏｈａｎａｍ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１９９４年，２２：１５３−１６０
【非特許文献１６】Ｎａｋａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，１９９４年，８１：６９−７７
【非特許文献１７】Ｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９３年．５３：２２０８−２２１１
【非特許文献１８】Ｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１９９４年，１８：１２９−１３８
【非特許文献１９】Ｖａｉｔｈｉｌｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，１９９２年，７７：５９５−６００
【非特許文献２０】Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２２：１３９−１５１
【非特許文献２１】Ｄｅｒｙｕｇｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９７年，１１０：２４７３−２４８２
【非特許文献２２】Ｆｏｒｓｙｔｈ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，１９９９年，７９：１８２８−１８３５
【非特許文献２３】Ｈａｍａｓｕｎａ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，１９９９年，８２：２７４−２８１
【非特許文献２４】Ｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，１９９６年，１４：１２−１８
【非特許文献２５】Ｓａｗａｙａ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，１９９６年，１４：３５−４２
【非特許文献２６】Ｕｈｍ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，１９９６年，１４：４２１−４３３
【非特許文献２７】Ｈｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｇｒｏｃｈｏｗ著，Ｄｒｕｇｓ，２０００年，５９：１０４３−１０５５
【特許文献１】米国特許第５，６３５，３７０号明細書
【非特許文献２８】Ｊａｗｏｒｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１９９４年，１２５：４９５−５０９
【非特許文献２９】Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９４年，２６９：１０１１９−１０１２６
【非特許文献３０】Ｓｅｉｄｅｎｂｅｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９５年，２７０：２７２０６−２７２１２
【非特許文献３１】Ｇａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｇｅｎｅ，２０００年，２５６：１３９−１４７
【非特許文献３２】Ｊａｗｏｒｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９６年，５６：２２９３−２２９８
【非特許文献３３】Ｍａｔｔｈｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０００年，２７５：２２６９５−２２７０３
【発明の開示】
【００１１】
発明の概略
本発明は哺乳類突然変異ＢＥＨＡＢ分子又はそのフラグメントをコードする単離された核酸を含む。１つの側面において、単離された核酸は配列番号：４に示される核酸配列への９９．７％同一性を有する。他の側面において、単離された核酸は配列番号：４に示される核酸配列を含む。
【００１２】
さらに別の側面において、本発明は哺乳類突然変異ＢＥＨＡＢ分子をコードする単離された核酸を含み、ここで哺乳類突然変異ＢＥＨＡＢ分子のアミノ酸配列は配列番号：３に示されるアミノ酸配列を含む。
【００１３】
哺乳類突然変異ＢＥＨＡＢ分子を含む単離されたポリペプチドも本発明に含まれる。１つの側面において、哺乳類突然変異ＢＥＨＡＢ分子は配列番号：３に示されるアミノ酸配列への９９．６％同一性を有する。
【００１４】
１つの態様において、本発明の単離された核酸はさらに、そこに共有結合したタグポリペプチドをコードする核酸を含む。好ましくは、タグポリペプチドはｍｙｃタグポリペプチド、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタグポリペプチド、緑色蛍光タンパク質タグポリペプチド、ｍｙｃ−ピルビン酸キナーゼタグポリペプチド、Ｈｉｓ６タグポリペプチド、インフルエンザウィルス血球凝集素タグポリペプチド、フラッグ（ｆｌａｇ）タグポリペプチド及びマルトース結合タンパク質タグポリペプチドより成る群から選ばれる。
【００１５】
他の側面において、本発明の単離された核酸はさらに、それに操作可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結したプロモーター／調節配列を規定する（ｓｐｅｃｉｆｙｉｎｇ）核酸を含む。
【００１６】
さらに本発明は、本発明の単離された核酸を含有するベクターを含む。１つの態様において、ベクターはさらに、それに操作可能に連結されたプロモーター／調節配列を規定する核酸を含む。
【００１７】
本発明の単離された核酸を含む、又は本発明のベクターを含む組換え細胞も含まれる。
【００１８】
本発明はさらに、哺乳類ＢＥＨＡＢ分子又はそのフラグメントをコードする単離された核酸に相補的な単離された核酸を含み、相補的な核酸はアンチセンス配向にある。１つの側面において、核酸は配列番号：５に示される核酸配列に相補的である。１つの態様において、哺乳類ＢＥＨＡＢ分子又はそのフラグメントを含む組換え細胞及びベクターを提供し、相補的な核酸はアンチセンス配向にある。
【００１９】
本発明は哺乳類における原発性ＣＮＳ腫瘍を処置するための方法も含む。その方法は、哺乳類に有効量のＢＥＨＡＢ切断阻害剤を投与し、それにより哺乳類における原発性ＣＮＳ腫瘍を処置することを含む。１つの側面において、ＢＥＨＡＢ切断阻害剤は抗体、タンパク質、プロテアーゼ阻害剤及びペプチドミメティック（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）より成る群から選ばれる。１つの態様において、抗体はＢＥＨＡＢ又はそのフラグメントに特異的に結合する。他の態様において、タンパク質は配列番号：３に示されるアミノ酸配列又はそのフラグメントを含む。
【００２０】
さらに哺乳類における原発性ＣＮＳ腫瘍を処置するための方法が本発明に含まれる。その方法は、哺乳類に有効量のＢＥＨＡＢ発現阻害剤を投与し、それにより哺乳類における原発性ＣＮＳ腫瘍を処置することを含む。１つの側面において、ＢＥＨＡＢ発現阻害剤はリボザイム及びアンチセンス核酸より成る群から選ばれる。１つの態様において、アンチセンス核酸はＢＥＨＡＢ分子又はそのフラグメントをコードする単離された核酸に相補的である。他の態様において、リボザイムはＢＥＨＡＢ分子又はそのフラグメントをコードする単離された核酸に相補的である。
【００２１】
さらに哺乳類における原発性ＣＮＳ腫瘍の処置法が含まれる。その方法は、哺乳類に有効量のＢＥＨＡＢ切断産物の活性の阻害剤を投与し、それにより哺乳類における原発性ＣＮＳ腫瘍を処置することを含む。１つの側面において、ＢＥＨＡＢ切断産物の活性の阻害剤は抗体である。１つの態様において、抗体はＢＥＨＡＢ切断産物に特異的に結合する。
【００２２】
本発明はさらに、哺乳類における原発性ＣＮＳ腫瘍の診断法を含む。その方法は、第１の哺乳類から生物学的試料を得、生物学的試料中のＢＥＨＡＢ核酸分子の量を評価し、生物学的試料中のＢＥＨＡＢ核酸分子の量を、他の点では同一である第２の哺乳類から得られる生物学的試料中のＢＥＨＡＢ核酸分子の量と比較し、ここで他の点では同一である第２の哺乳類からの生物学的試料中のＢＥＨＡＢ核酸分子の量と比較してより高い第１の哺乳類からの生物学的試料中のＢＥＨＡＢ核酸分子の量が、第１の哺乳類が原発性ＣＮＳ腫瘍に悩んでいることの指標となり、それにより哺乳類における原発性ＣＮＳ腫瘍を診断することを含む。
【００２３】
１つの側面において、生物学的試料は血液、神経組織、脳脊髄液、尿、唾液及び脳組織より成る群から選ばれる。
【００２４】
さらに、哺乳類における原発性ＣＮＳ腫瘍のための処置の有効性の評価法が含まれる。その方法は、哺乳類に原発性ＣＮＳ腫瘍のための処置を施す前、その間又は後の哺乳類中のＢＥＨＡＢ分子の量を評価し、ここで原発性ＣＮＳ腫瘍のための処置を施す前の哺乳類中のＢＥＨＡＢ分子の量と比較して、原発性ＣＮＳ腫瘍のための処置を施している間もしくはその後の哺乳類中のＢＥＨＡＢ分子のより高いもしくはより低い量が哺乳類における原発性ＣＮＳ腫瘍のための処置の有効性の指標となり、それにより哺乳類における原発性ＣＮＳ腫瘍のための処置の有効性を評価することを含む。
【００２５】
１つの側面において、原発性ＣＮＳ腫瘍のための処置は化学療法、放射線治療及び外科手術より成る群から選ばれる。
【００２６】
さらに、細胞におけるＢＥＨＡＢ分子の発現に影響する化合物の同定法を提供する。その方法は、細胞を試験化合物と接触させ、細胞におけるＢＥＨＡＢ分子発現のレベルを、試験化合物と接触していない他の点では同一である細胞におけるＢＥＨＡＢ分子発現のレベルと比較し、ここで試験化合物と接触していない他の点では同一である細胞におけるＢＥＨＡＢ分子発現のレベルと比較して試験化合物と接触した細胞におけるＢＥＨＡＢ分子発現のより高いもしくはより低いレベルが、試験化合物が細胞におけるＢＥＨＡＢ分子の発現に影響することの指標となり、それにより細胞におけるＢＥＨＡＢ分子の発現に影響する化合物を同定することを含む。
【００２７】
前記の方法により同定される化合物も含まれる。
【００２８】
本発明はさらに、細胞におけるＢＥＨＡＢ分子の発現を減少させる化合物の同定法を提供する。その方法は、細胞を試験化合物と接触させ、細胞におけるＢＥＨＡＢ分子発現のレベルを、試験化合物と接触していない他の点では同一である細胞におけるＢＥＨＡＢ分子発現のレベルと比較し、ここで試験化合物と接触していない他の点では同一である細胞におけるＢＥＨＡＢ分子発現のレベルと比較して試験化合物と接触した細胞におけるＢＥＨＡＢ分子発現のより高いもしくはより低いレベルが、試験化合物が細胞におけるＢＥＨＡＢ分子の発現を減少させることの指標となり、それにより細胞におけるＢＥＨＡＢ分子の発現を減少させる化合物を同定することを含む。
【００２９】
さらに、前記の方法により同定される化合物を提供する。
【００３０】
本発明は、細胞におけるＢＥＨＡＢ切断を阻害する化合物の同定法も含む。その方法は、細胞を試験化合物と接触させ、細胞におけるＢＥＨＡＢ切断のレベルを、試験化合物と接触していない他の点では同一である細胞におけるＢＥＨＡＢ切断のレベルと比較し、ここで試験化合物と接触していない他の点では同一である細胞におけるＢＥＨＡＢ切断のレベルと比較して試験化合物と接触した細胞におけるＢＥＨＡＢ切断のより高いもしくはより低いレベルが、試験化合物が細胞におけるＢＥＨＡＢ切断を阻害することの指標となり、それにより細胞におけるＢＥＨＡＢ切断を阻害する化合物を同定することを含む。
【００３１】
さらに、無細胞系におけるＢＥＨＡＢ切断を阻害する化合物の同定法を提供する。その方法は、無細胞系を試験化合物と接触させ、無細胞系におけるＢＥＨＡＢ切断のレベルを、試験化合物と接触していない他の点では同一である無細胞系におけるＢＥＨＡＢ切断のレベルと比較し、ここで試験化合物と接触していない他の点では同一である無細胞系におけるＢＥＨＡＢ切断のレベルと比較して試験化合物と接触した無細胞系におけるＢＥＨＡＢ切断のより高いもしくはより低いレベルが、試験化合物が無細胞系におけるＢＥＨＡＢ切断を阻害することの指標となり、それにより無細胞系におけるＢＥＨＡＢ切断を阻害する化合物を同定することを含む。
【００３２】
原発性ＣＮＳ腫瘍の処置のためのキットも含まれる。そのキットは突然変異ＢＥＨＡＢ分子又はそのフラグメントをコードする単離された核酸分子ならびに製薬学的に許容され得る担体を含む組成物のＢＥＨＡＢ切断阻害量を含み、キットはさらにアプリケーター及びその使用のための指示マニュアルを含む。
【００３３】
さらに、キットが単離突然変異ＢＥＨＡＢポリペプチド又はそのフラグメントならびに製薬学的に許容され得る担体を含む組成物のＢＥＨＡＢ切断阻害量を含む原発性ＣＮＳ腫瘍の処置のためのキットが含まれ、キットはさらにアプリケーター及びその使用のための使用説明資料を含む。
【００３４】
さらに、キットが哺乳類ＢＥＨＡＢ分子又はそのフラグメントと特異的に結合する抗体ならびに製薬学的に許容され得る担体を含む組成物のＢＥＨＡＢ切断阻害量を含む原発性ＣＮＳ腫瘍の処置のためのキットが含まれ、キットはさらにアプリケーター及びその使用のための使用説明資料を含む。
【００３５】
キットが哺乳類ＢＥＨＡＢ分子又はそのいくつかのフラグメントをコードする単離された核酸に相補的な単離された核酸ならびに製薬学的に許容され得る担体を含む組成物のＢＥＨＡＢ分子発現阻害量を含み、相補的核酸はアンチセンス配向にある原発性ＣＮＳ腫瘍の処置のためのキットも提供し、キットはさらにアプリケーター及びその使用のための使用説明資料を含む。
【００３６】
原発性ＣＮＳ腫瘍の処置のための他のキットも含まれる。キットはＢＥＨＡＢ切断産物又はそのフラグメントと特異的に結合する抗体ならびに製薬学的に許容され得る担体を含む組成物のＢＥＨＡＢ切断産物阻害量を含み、キットはさらにアプリケーター及びその使用のための使用説明資料を含む。
【００３７】
図面の簡単な説明
本発明の例示の目的で、本発明のある態様を図面に描く。しかしながら本発明は、図面に描かれる態様の正確な配置及び手段に制限されない。
【００３８】
図１Ａ〜１Ｃを含む図１は、全長及び／又は突然変異ＢＥＨＡＢを用いて安定に（図１Ｃ）又は一過的に（図１Ａ及び１Ｂ）トランスフェクションされた細胞からの培地のウエスタンブロット分析の像を描いている。図１Ａは全長（ＦＬ）及び突然変異（ＮＶＹ）ＢＥＨＡＢを用いて一過的にトランスフェクションされた細胞からの培地のウエスタンブロットを描いている。両細胞系は１４５ｋＤａの全長タンパク質の強い染色を示す。対照的に、ＮＶＹ突然変異体においてはＢ５０抗体を用いて切断産物が検出されなかったが、ＦＬを用いてトランスフェクションされた細胞の培地においては５０ｋＤａの切断産物が検出された。図１Ｂは２μｇのＦＬ構築物及び０、１、２又は４μｇのＮＶＹ突然変異体構築物を用いて一過的に共−トランスフェクションされた細胞からの培地のウエスタンブロットを描いている。ＮＶＹ突然変異体のトランスフェクションは全長ＢＥＨＡＢの量を増加させたが、Ｂ５０抗体を用いてわかる通り、正常なＢＥＨＡＢの切断に影響を有していなかった。図１Ｃは全長（ＦＬ）及び突然変異（ＮＶＹ）ＢＥＨＡＢを用いて安定にトランスフェクションされた細胞からの培地のウエスタンブロットを描いている。ＢＥＨＡＢの発現をＣＮＳ−１−ＦＬ及びＣＮＳ−１−ＮＶＹ細胞においてＢ６及びＢ５０抗体を用いて調べた。一過的トランスフェクションの場合と同様に、ＣＮＳ−１−ＦＬを用いて安定にトランスフェクションされた細胞はＢＥＨＡＢを生産し且つ切断させたが、ＣＮＳ−１−ＮＶＹを用いて安定にトランスフェクションされた細胞は、全長タンパク質を生産したがそれを切断させなかった。
【００３９】
図２Ａ及び２Ｂを含む図２は、細胞増殖及び細胞死への安定なトランスフェクションの影響を描いている。ＣＮＳ−１−ＦＬ、ＣＮＳ−１−ＧＦＰ及びＣＮＳ−１−ＮＶＹ安定細胞系を、細胞増殖（図２Ａ）及び細胞死（図２Ｂ）へのＣＮＳ−１−ＦＬ、ＣＮＳ−１−ＧＦＰ及びＣＮＳ−１−ＮＶＹトランスフェクションの影響に関し、親のＣＮＳ−１細胞と比較した。図２Ａは、ＭＴＴアッセイを用い、７日間に及ぶ細胞増殖を描くグラフである。データは吸光度における変化を示す。ＣＮＳ−１−ＦＬ、ＣＮＳ−１−ＧＦＰ及びＣＮＳ−１−ＮＶＹを用いるトランスフェクションは細胞増殖に影響を有していなかった。図２Ｂは、ＬＤＨアッセイを用いて評価される時の７日間に及ぶ細胞死を描くグラフである。ＣＮＳ−１−ＦＬ、ＣＮＳ−１−ＧＦＰ及びＣＮＳ−１−ＮＶＹを用いるトランスフェクションは細胞死に影響を有していなかった。
【００４０】
図３Ａ〜３Ｄを含む図３は、腫瘍体積へのＣＮＳ−１−ＦＬ、ＣＮＳ−１−ＧＦＰ及びＣＮＳ−１−ＮＶＹを用いるトランスフェクションの影響を描いている。安定にトランスフェクションされた細胞を８日間、ラットにおいて頭蓋内に移植し、生ずる腫瘍の相対的寸法を組織学的に評価した。図３ＡはＣＮＳ−１−ＧＦＰ細胞から誘導される代表的腫瘍の像を描いている。図３ＢはＣＮＳ−１−ＦＬ細胞から誘導される代表的腫瘍の像を描いている。図３ＣはＣＮＳ−１−ＮＶＹ細胞から誘導される代表的腫瘍の像を描いている。ＣＮＳ−１−ＦＬ腫瘍はＣＮＳ−１−ＧＦＰ及びＣＮＳ−１−ＮＶＹ腫瘍より大きく且つより浸潤性である。図３ＤはＣＮＳ−１−ＦＬ、ＣＮＳ−１−ＧＦＰ及びＣＮＳ−１−ＮＶＹ細胞から誘導される腫瘍の体積を描くグラフである。これらのデータは画像分析及び体積再構築により定量され、個々のデータポイントは星印により示されている。
【００４１】
図４は、ＣＮＳ−１−ＦＬ、ＣＮＳ−１−ＧＦＰ及びＣＮＳ−１−ＮＶＹを用いて安定にトランスフェクションされた細胞から誘導される腫瘍の、動物生存への影響を描くグラフである。ＣＮＳ−１−ＦＬ腫瘍を有する動物は、ＣＮＳ−１−ＧＦＰ腫瘍又はＣＮＳ−１−ＮＶＹ腫瘍を有する動物より有意に短時間生存した。ＣＮＳ−１−ＮＶＹ腫瘍を有する動物における生存は、ＣＮＳ−１−ＧＦＰ標準腫瘍を有する動物における生存と有意に異ならなかった。
【００４２】
発明の詳細な記述
脳の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の操作は、原発性ＣＮＳ腫瘍の進行及び浸潤性表現型において重要な役割を果たす。ＥＣＭの１つの成分、脳−濃縮ヒアルロナン結合（ＢＥＨＡＢ）タンパク質は神経膠腫細胞運動性及びかくして浸潤性において極めて重要である。本明細書で開示されるデータは、ＢＥＨＡＢ機能及び／又は切断に影響を与えることが、原発性ＣＮＳ腫瘍を有する動物において、腫瘍寸法の減少及び生存時間の延長を媒介することを、初めて示す。従って本発明は、神経膠腫、稀突起膠腫、星状細胞腫、神経膠肉腫、多形性膠芽腫、リンパ腫及び脳傷害に続く反応性グリオーシス（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｇｌｉｏｓｉｓ）を含むがこれらに限られない原発性ＣＮＳ腫瘍の処置のための組成物及び方法を含む。
【００４３】
本発明は、哺乳類における原発性ＣＮＳ腫瘍の診断のための組成物及び方法も含む。すなわち、本明細書に開示されるデータは、本明細書に開示される方法を用いて神経膠腫、稀突起膠腫、星状細胞腫及び神経膠肉腫を含むがこれらに限られない原発性ＣＮＳ腫瘍を哺乳類において診断できることを示す。
定義
本明細書で用いられる場合、以下の用語のそれぞれはこの節でそれと関連付けられる意味を有する。
【００４４】
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は本明細書で、冠詞の文法上の目的語の１つ又は１つより多く（すなわち少なくとも１つ）を指すために用いられる。例えば「ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ」は１つの要素又は１つより多い要素を意味する。
【００４５】
「増幅」は、例えば逆転写、ポリメラーゼ連鎖反応及びリガーゼ連鎖反応により、ポリヌクレオチド配列をコピーし、かくしてより多数のポリヌクレオチド分子に拡大する手段を指す。
【００４６】
本明細書で用いられる場合、「抗体」という用語は、抗原上の特異的エピトープに特異的に結合することができる免疫グロブリン分子を指す。抗体は天然の供給源から又は組換え供給源から誘導される無損傷の免疫グロブリンであることができ、無損傷の免疫グロブリンの免疫反応性部分であることができる。抗体は典型的には免疫グロブリン分子の四量体である。本発明における抗体は、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ）２ならびに一本鎖抗体及びヒト化抗体を含む多様な形態で存在することができる（Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９９９年；Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．著，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９年；Ｈｏｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８８年，８５：５８７９−５８８３；Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８年，２４２：４２３−４２６）。
【００４７】
本明細書で用いられる場合、「合成抗体」という用語により、組換えＤＮＡ法を用いて作られる抗体、例えば本明細書に記載するようなバクテリオファージにより発現される抗体を意味する。該用語は、抗体をコードするＤＮＡ分子の合成により作られた抗体も意味するとみなされるべきであり、そのＤＮＡ分子は抗体タンパク質又は抗体を規定するアミノ酸配列を発現し、ここでＤＮＡ又はアミノ酸配列は、当該技術分野において利用可能であり且つ周知の合成ＤＮＡもしくはアミノ酸配列法を用いて得られた。
【００４８】
「アンチセンス」は特定的に、タンパク質をコードする二本鎖ＤＮＡ分子の非−コーディング鎖の核酸配列あるいは非−コーディング鎖に実質的に相同な配列を指す。本明細書で定義される場合、アンチセンス配列は，タンパク質をコードする二本鎖ＤＮＡ分子の配列に相補的である。アンチセンス配列がＤＮＡ分子のコーディング鎖のコーディング部分のみに相補的である必要はない。アンチセンス配列はタンパク質をコードするＤＮＡ分子のコーディング鎖上に規定される調節配列に相補的であることができ、その調節配列はコーディング配列の発現を調節する。
【００４９】
「アプリケーター」という用語により、その用語が本明細書で用いられる場合、本発明の突然変異ＢＥＨＡＢ核酸、タンパク質及び／又は抗−ＢＥＨＡＢ抗体ならびにアンチセンスＢＥＨＡＢ核酸を哺乳類に投与するための、皮下シリンジ、ピペットなどを含むがこれらに限られないいずれかの装置を意味する。
【００５０】
「ＢＥＨＡＢ」、「正常なＢＥＨＡＢ」又は「内在性ＢＥＨＡＢ」は、該用語が本明細書で同義語的に用いられる場合、哺乳類におけるその自然な存在状態で存在する脳−濃縮ヒアルロナン結合分子を指し、他にブレビカンとして既知である。
【００５１】
「生物学的試料」は、その用語が本明細書で用いられる場合、ＢＥＨＡＢの発現のレベル、存在するＢＥＨＡＢタンパク質の量又は両方を評価するために用いられ得る、哺乳類から得られる試料を意味する。そのような試料には血液試料、神経組織試料、脳試料及び脳脊髄液試料が含まれるがこれらに限られない。
【００５２】
本明細書で「切断」は、ポリペプチドにおける２個のアミノ酸の間のペプチド結合が解離し、それにより２個のアミノ酸を含むポリペプチドを少なくとも２個のフラグメントに分離することを指すために用いられる。
【００５３】
本明細書で「切断阻害剤」は、切断を担うプロテアーゼの滴定（ｔｉｔｒａｔｉｎｇ）、切断部位の遮断又は他に、切断部位をプロテアーゼに認識不可能にすることにより、ポリペプチドの切断を妨げる分子、化合物又は組成物を指すために用いられる。
【００５４】
「切断阻害量」は本明細書で、切断阻害剤の有効量を指すために用いられる。
【００５５】
「切断産物」は本明細書で、最初のポリペプチドの２個もしくはそれより多いフラグメントへの切断から生ずる、最初のポリペプチドのフラグメントを指すために用いられる。例えば１４５ｋＤａのＢＥＨＡＢタンパク質の切断産物には９０ｋＤａ及び５０ｋＤａのフラグメントが含まれる。
【００５６】
「ＢＥＨＡＢをコードする核酸の一部又は全部に相補的」により、ＢＥＨＡＢタンパク質をコードしない核酸の配列を意味する。むしろ、細胞中で発現されている配列はＢＥＨＡＢタンパク質をコードする核酸の非−コーディング鎖に同一であり、かくしてＢＥＨＡＢタンパク質をコードしない。
【００５７】
本明細書で用いられる場合、「相補的」及び「アンチセンス」という用語は完全に同義的なわけではない。「アンチセンス」は特定的に、タンパク質をコードする二本鎖ＤＮＡ分子の非−コーディング鎖の核酸配列又は非−コーディング鎖に実質的に相同である配列を指す。本明細書で用いられる場合、「相補的」は２個の核酸、例えば２個のＤＮＡ分子の間のサブユニット配列相補性の広い概念を指す。両方の分子中のあるヌクレオチド位置が互いに正常に塩基対合できるヌクレオチドにより占められている場合、核酸はこの位置において互いに相補的であると考えられる。かくしてそれぞれの分子中の実質的数（少なくとも５０％）の対応する位置が互いに正常に塩基対合できるヌクレオチド（例えばＡ：Ｔ及びＧ：Ｃヌクレオチド対）により占められている場合、２個の核酸は互いに相補的である。本明細書で定義される場合、アンチセンス配列はタンパク質をコードする二本鎖ＤＮＡ分子の配列に相補的である。アンチセンス配列がＤＮＡ分子のコーディング鎖のコーディング部分のみに相補的である必要はない。アンチセンス配列はタンパク質をコードするＤＮＡ分子のコーディング鎖上に規定される調節配列に相補的であることができ、その調節配列はコーディング配列の発現を調節する。
【００５８】
遺伝子の「コーディング領域」は遺伝子のコーディング鎖のヌクレオチド残基及び遺伝子の非−コーディング鎖のヌクレオチドから成り、それらはそれぞれ遺伝子の転写により生産されるｍＲＮＡ分子のコーディング領域と相同であるか又はそれに相補的である。
【００５９】
ｍＲＮＡ分子の「コーディング領域」も、ｍＲＮＡ分子の翻訳の間に転移ＲＮＡ分子のアンチコドン領域と対を形成する（ｍａｔｃｈｅｄ）か、又は停止コドンをコードするｍＲＮＡ分子のヌクレオチド残基から成る。かくしてコーディング領域はｍＲＮＡ分子によりコードされる成熟タンパク質中に存在しないアミノ酸残基（例えばタンパク質輸出シグナル配列中のアミノ酸残基）に対応するヌクレオチド残基を含み得る。
【００６０】
「コードする」は、遺伝子、ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡのようなポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列が、限定されたヌクレオチドの配列（すなわちｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｍＲＮＡ）又は限定されたアミノ酸の配列を有する他のポリマー及び巨大分子を生物学的プロセスにおいて合成するための鋳型として働く固有の性質ならびにそれから生ずる生物学的性質を指す。かくして遺伝子は、転写及びその遺伝子に対応するｍＲＮＡの翻訳が細胞又は他の生物学的系においてタンパク質を生産する場合、タンパク質をコードする。そのヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列に同一であり且つ通常配列表に示されるコーディング鎖ならびに遺伝子もしくはｃＤＮＡの転写のための鋳型として用いられる非−コーディング鎖の両方を、タンパク質又はその遺伝子もしくはｃＤＮＡの他の産物をコードすると言うことができる。
【００６１】
２個の領域が互いに隣接しているか、又は２個の領域が約１０００個以下のヌクレオチド残基、好ましくは約１００個以下のヌクレオチド残基により隔てられている場合、オリゴヌクレオチドの第１の領域はオリゴヌクレオチドの第２の領域に「隣接している」。
【００６２】
本明細書で用いられる場合、核酸に適用される「フラグメント」という用語は、通常長さが少なくとも約２０個のヌクレオチド、典型的には少なくとも約５０個のヌクレオチド、より典型的には約５０〜約１００個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約１００〜約５００個のヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも約５００個のヌクレオチド〜約１０００個のヌクレオチド、さらにもっと好ましくは少なくとも約１０００個〜約１５００個、さらに好ましくは少なくとも約１５００個のヌクレオチド〜約２０００個のヌクレオチド、さらにもっと好ましくは少なくとも約２０００個〜約２５００個、さらに好ましくは少なくとも約２５００個のヌクレオチド〜約２６００個のヌクレオチド、さらにもっと好ましくは少なくとも約２６００個〜約２６５０個であることができ、そして最も好ましくは核酸フラグメントは長さが約２６５２個のヌクレオチドより長いであろう。
【００６３】
タンパク質に適用される場合、ＢＥＨＡＢの「フラグメント」は長さが約２０個のアミノ酸である。より好ましくは、ＢＥＨＡＢのフラグメントは長さが約１００個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも約２００個、さらに好ましくは少なくとも約３００個、より好ましくは少なくとも約４００個、さらに好ましくは少なくとも約５００個、より好ましくは約６００個そしてもっと好ましくは、より好ましくは、少なくとも約７００個、さらに好ましくは少なくとも約８００個、より好ましくは約８５０個、そしてもっと好ましくは少なくとも約８８４個のアミノ酸である。
【００６４】
本明細書で用いられる場合、「使用説明資料」は、本発明の組成物のその明示されている使用のための有用性を伝えるために用いられ得る出版物、記録、図及び他の表現媒体を含む。例えば本発明のキットの使用説明資料を、組成物を含有する容器に添付するか、あるいは組成物を含有する容器と一緒に輸送することができる。あるいはまた、受容者により使用説明資料及び組成物が組み合わせて（ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）用いられるつもりで、使用説明資料を容器と別に輸送することができる。
【００６５】
「単離された核酸」は、自然に存在する状態でそれに隣接している配列から分離された核酸セグメント又はフラグメント、例えば通常フラグメントに隣接している配列、例えば自然にそれが存在するゲノム中でフラグメントに隣接している配列から取り出されたＤＮＡフラグメントを指す。その用語は、自然に核酸に伴う他の成分、例えば細胞中で自然にそれに伴うＲＮＡ又はＤＮＡ又はタンパク質から実質的に精製された核酸にも適用される。従ってその用語は、例えばベクター中、自律複製プラスミドもしくはウィルス中、又は原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡ中に導入された、あるいは他の配列と無関係に分離された分子として（例えばＰＣＲ又は制限酵素消化により生産されるｃＤＮＡ又はゲノムもしくはｃＤＮＡフラグメントとして）存在する組換えＤＮＡを含む。それは追加のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡも含む。
【００６６】
「突然変異ＢＥＨＡＢ」は本明細書で、アミノ酸配列がプロテアーゼによる切断を阻害するように変更された脳濃縮ヒアルロナン結合分子を指すために用いられる。
【００６７】
対象に適用される「自然に存在する」は、対象が自然において見出され得ることを指す。例えば自然における供給源から単離され得、且つ人間によりことさら変更されていない、生物（ウィルスを含む）中に存在するポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は、自然に存在するものである。
【００６８】
本発明の範囲内で、通常存在する核酸塩基に関する以下の略字を用いる。「Ａ」はアデノシンを指し、「Ｃ」はシチジンを指し、「Ｇ」はグアノシンを指し、「Ｔ」はチミジンを指し、「Ｕ」はウリジンを指す。
【００６９】
他にことわらなければ、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重形（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ）であり、同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質及びＲＮＡをコードするヌクレオチド配列はイントロンを含むことができる。
【００７０】
２個のポリヌクレオチドを「操作可能に連結した」と記述することにより、一本鎖もしくは二本鎖核酸部分が、２個のポリヌクレオチドの少なくとも１方がそれを特徴付ける生理学的影響を他方に及ぼすことができるようなやり方で核酸部分内に配置された２個のポリヌクレオチドを含むことを意味する。例えば遺伝子のコーディング領域に操作可能に連結されたプロモーターは、コーディング領域の転写を助長する（ｐｒｏｍｏｔｅ）することができる。
【００７１】
「ポリヌクレオチド」は、核酸の一本鎖又は平行及び逆平行鎖を意味する。かくしてポリヌクレオチドは一本鎖又は二本鎖核酸であることができる。
【００７２】
「核酸」という用語は、典型的に大きなポリヌクレオチドを指す。
【００７３】
「オリゴヌクレオチド」という用語は典型的に短いポリヌクレオチド、一般的には約５０個以下のヌクレオチドを指す。ヌクレオチド配列がＤＮＡ配列（すなわちＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）により示される場合、これは「Ｕ」が「Ｔ」にとって代わったＲＮＡ配列（すなわちＡ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）も含むことが理解されるであろう。
【００７４】
本明細書で、ポリヌクレオチド配列を記述するために通常の表示法を用いる：一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側の末端は５’−末端であり；二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向は５’−方向と言われる。
【００７５】
新生ＲＮＡ転写産物への５’から３’へのヌクレオチドの付加の方向は転写方向と言われる。ｍＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖は「コーディング鎖」と呼ばれ；ＤＮＡ上の参照点に対して５’に位置するＤＮＡ鎖上の配列は「上流配列」と呼ばれ；ＤＮＡ上の参照点に対して３’であるＤＮＡ鎖上の配列は「下流配列」と呼ばれる。
【００７６】
ポリヌクレオチドの「一部」は、ポリヌクレオチドの少なくとも約２０個の連続したヌクレオチド残基を意味する。ポリヌクレオチドの一部がポリヌクレオチドのすべてのヌクレオチド残基を含み得ることは理解される。
【００７７】
本明細書で、「原発性ＣＮＳ腫瘍」は、ガン細胞が体の他の部分に発し、脳に転移したのではない点で、脳内に起源を有する新生物形成（ｎｅｏｐｌａｓｉａ）を指すために用いられる。原発性ＣＮＳ腫瘍の例には神経膠腫，十分に分化した星状細胞腫、未分化星状細胞腫、多形性膠芽腫、脳室上衣腫、稀突起膠腫、神経節細胞腫、混合性神経膠腫、脳幹神経膠腫、視神経神経膠腫、髄膜腫、松果体腫瘍、下垂体腫瘍、下垂体腺腫、反応性グリオーシス、始原神経外胚葉腫瘍、神経線維腫、リンパ腫、血管腫瘍及びリンパ腫が含まれるがこれらに限られない。
【００７８】
「原発性ＣＮＳ腫瘍の処置」は本明細書で、腫瘍の体積又は腫瘍の症状もしくは兆候を患者が経験する頻度あるいは両方を含む原発性ＣＮＳ腫瘍の症状の重度が軽減するか、あるいは腫瘍進行のための時間又は生存時間が延長される状況を指すために用いられる。
【００７９】
「プライマー」は、指定されるポリヌクレオチド鋳型に特異的にハイブリッド形成し、相補的ポリヌクレオチドの合成のための開始点を与えることができるポリヌクレオチドを指す。そのような合成は、合成が誘導される条件下、すなわちヌクレオチド、相補的ポリヌクレオチド鋳型及び重合のための薬剤、例えばＤＮＡポリメラーゼの存在下にポリヌクレオチドプライマーが置かれる時に起こる。プライマーは典型的には一本鎖であるが、二本鎖であることができる。プライマーは典型的にはデオキシリボ核酸であるが、多様な合成の及び自然に存在するプライマーが多くの用途に有用である。プライマーは、それがハイブリッド形成するように指定される鋳型に相補的であり、合成の開始のための部位として働くが、鋳型の正確な配列を反映している必要はない。そのような場合、鋳型へのプライマーの特異的なハイブリッド形成はハイブリッド形成条件のストリンジェンシーに依存する。プライマーを例えば発色性、放射性又は蛍光性部分で標識し、検出可能な部分として用いることができる。
【００８０】
「プローブ」は、他のポリヌクレオチドの指定される配列に特異的にハイブリッド形成できるポリヌクレオチドを指す。プローブは標的である相補的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリッド形成するが、鋳型の正確な相補的配列を反映している必要はない。そのような場合、標的へのプローブの特異的なハイブリッド形成はハイブリッド形成条件のストリンジェンシーに依存する。プローブを例えば発色性、放射性又は蛍光性部分で標識し、検出可能な部分として用いることができる。
【００８１】
「組換えポリヌクレオチド」は、自然に結合したのではない配列を有するポリヌクレオチドを指す。増幅された、又は集合した（ａｓｓｅｍｂｌｅｄ）組換えポリヌクレオチドを適したベクター中に含めることができ、ベクターを適した宿主細胞の形質転換に用いることができる。
【００８２】
組換えポリヌクレオチドは非−コーディング機能（例えばプロモーター、複製起点、リボソーム−結合部位など）を果たすこともできる。
【００８３】
組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞は「組換え宿主細胞」と呼ばれる。遺伝子が組換えポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞において発現される遺伝子は、「組み換えポリペプチド」を生産する。
【００８４】
「組換えポリペプチド」は、組換えポリヌクレオチドが発現されると生産されるものである。
【００８５】
「ポリペプチド」はアミノ酸残基から成るポリマー、関連する自然に存在する構造的変異体及びペプチド結合を介して結合している自然には存在しない合成のそれらの類似体、関連する自然に存在する構造的変異体及び自然には存在しない合成のそれらの類似体を指す。合成ポリペプチドは、例えば自動化ポリペプチド合成機を用いて合成することができる。
【００８６】
「タンパク質」という用語は、典型的には大きなポリペプチドを指す。
【００８７】
「ペプチド」という用語は、典型的には短いポリペプチドを指す。
【００８８】
本明細書で、ポリペプチド配列を表現するために通常の表示法を用いる：ポリペプチド配列の左側の末端はアミノ−末端であり；ポリペプチド配列の右側の末端はカルボキシル−末端である。
【００８９】
本明細書で用いられる場合、「プロモーター／調節配列」という用語は、プロモーター／調節配列に操作可能に連結された遺伝子の産物の発現に必要な核酸配列を意味する。いくつかの場合にこの配列はコアプロモーター配列であることができ、他の場合、この配列はエンハンサー配列及び遺伝子産物の発現に必要な他の調節要素も含むことができる。プロモーター／調節配列は、例えば組織特異的やり方で遺伝子産物を発現するものであることができる。
【００９０】
本明細書で用いられる場合、「特異的に結合する」という用語により、ＢＥＨＡＢタンパク質のエピトープを認識し且つ結合するが、試料中の他の分子を実質的に認識しないか、又はそれに結合しない抗体を意味する。
【００９１】
「治療的」処置は、病理学的兆候（ｓｉｇｎｓ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）を示す患者に、それらの兆候を減じるか又は除去する目的で施される処置である。
【００９２】
化合物の「治療的に有効な量」は、化合物が投与される患者に有益な効果を与えるのに十分な化合物の量である。
【００９３】
本明細書で用いられる場合、「トランスジーン」は、アミノ酸配列をコードする核酸に操作可能に連結されたプロモーター／調節配列をコードする核酸を含む外来性核酸配列を意味し、その外来性核酸は動物又は細胞によりコードされる。
【００９４】
「ベクター」は単離された核酸を含み、単離された核酸を細胞の内部に送達するために用いられ得る要素（ｍａｔｔｅｒ）の組成物である。線状ポリヌクレオチド、イオン性又は両親媒性化合物を伴うポリヌクレオチド、プラスミド及びウィルスを含むがこれらに限られない多数のベクターが当該技術分野において既知である。かくして「ベクター」という用語は自律複製プラスミド又はウィルスを含む。その用語は、核酸の細胞中への転移を助長する非−プラスミド及び非−ウィルス化合物、例えばポリリシン化合物、リポソームなどを含むともみなされねばならない。ウィルスベクターの例にはアデノウィルスベクター、アデノ−関連ウィルスベクター、レトロウィルスベクターなどが含まれるがこれらに限られない。
【００９５】
「発現ベクター」は、発現されるべきヌクレオチド配列に操作可能に連結された発現調節配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは発現のために十分なシス−作用要素を含む；発現のための他の要素は宿主細胞により供給されるか、あるいは試験管内発現系中にあることができる。発現ベクターはコスミド、プラスミド（例えば裸の，又はリポソーム中に含有された）及び組換えポリヌクレオチドが導入されたウィルスのような当該技術分野において既知のすべてのものを含む。
記述
Ｉ．単離された核酸
Ａ．センス核酸
本発明は哺乳類突然変異ＢＥＨＡＢ分子又はそのフラグメントをコードする単離された核酸を含み、ここで核酸は配列番号：４の配列を有する核酸と少なくとも約９９．７％の同一性を共有する。哺乳類は好ましくは人間である。好ましくは、核酸は本明細書で開示される配列番号：４に約９９．８％相同であり、より好ましくは、そして最も好ましくは約９９．９％相同である。さらにもっと好ましくは、核酸は配列番号：４である。本発明の単離された核酸は本発明の突然変異ＢＥＨＡＢタンパク質をコードするＲＮＡ又はＤＮＡ配列ならびにヌクレオチド配列が無細胞である場合か又はそれが細胞と連合している（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）場合にヌクレオチド配列をより安定にするＤＮＡ又はＲＮＡの化学的変更を含むその変更形態を含むとみなされるべきである。ヌクレオチドの化学的変更を用いて、ヌクレオチド配列が細胞により吸収される有効性又はそれが細胞において発現される有効性を強化することもできる。ヌクレオチド配列の変更の組み合わせのすっかり全部が本発明に包含される。
【００９６】
本発明は、本明細書に開示される核酸及びアミノ酸配列のみに限られるとみなされるべきではない。本発明を備えると、本明細書に開示される突然変異ＢＥＨＡＢポリヌクレオチドをコードする他の哺乳類突然変異ＢＥＨＡＢ核酸の形成のための実験的詳細の節において本明細書中に記述される方法（例えば特定部位の突然変異誘発、フレームシフト突然変異など）ならびに当該技術分野において周知の方法又は未開発の方法に従うことにより、突然変異ＢＥＨＡＢタンパク質をコードする他の核酸が得られ得ることが、当該技術分野における熟練者に容易に明らかになる。
【００９７】
さらに、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．著（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９年）及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．著（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ  ＆  Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９７年）に記載されている方法のような、当該技術分野において周知の組換えＤＮＡ法を用いる突然変異ＢＥＨＡＢの誘導体又は変異形態の形成に、他の複数の方法を用いることができる。
【００９８】
ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を変えることによりタンパク質又はポリペプチドにおいてアミノ酸の変更を導入するための方法は当該技術分野において周知であり、やはりＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．著（同上，１９８９年）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．著（同上，１９９７年）に記載されている。
【００９９】
本発明は哺乳類突然変異ＢＥＨＡＢをコードする核酸を含み、ここでタグポリペプチドをコードする核酸がそこに共有結合している。すなわち本発明は、タグポリペプチドをコードする核酸配列が突然変異ＢＥＨＡＢポリペプチドをコードする核酸に共有結合しているキメラ核酸を包含する。そのようなタグポリペプチドは当該技術分野において周知であり、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｍｙｃ、ｍｙｃ−ピルビン酸キナーゼ（ｍｙｃ−ＰＫ）、Ｈｉｓ６、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、インフルエンザウィルス血球凝集素タグポリペプチド、フラッグタグポリペプチド（ＦＬＡＧ）及びグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグポリペプチドが含まれる。しかしながら本発明は、上記で挙げたタグポリペプチドをコードする核酸に限られるとは全くみなされるべきでない。むしろ、これらのタグポリペプチドに実質的に類似の方法で働き得るポリペプチドをコードするいずれの核酸配列も本発明に含まれるとみなされるべきである。
【０１００】
タグポリペプチドをコードする核酸を含む核酸を用い、細胞、組織及び／又は完全な生物（例えば哺乳類の胚）内に突然変異ＢＥＨＡＢを配置し、細胞から分泌される突然変異ＢＥＨＡＢを検出し、且つ細胞における突然変異ＢＥＨＡＢの単数もしくは複数の役割を研究することができる。さらに、タグポリペプチドの付加は「タグを付けられた」タンパク質の単離及び精製を容易にし、本発明のタンパク質を容易に生産及び精製できるようにする。
【０１０１】
Ｂ．アンチセンス核酸
ある状況ではＢＥＨＡＢの発現を阻害するのが望ましいことがあり得、従って本発明はＢＥＨＡＢ発現の阻害のために有用な組成物を含む。かくして本発明は、哺乳類ＢＥＨＡＢ分子をコードする核酸の一部もしくは全部に相補的な単離された核酸を特徴とし、その核酸は転写に関してアンチセンス配向にある。好ましくは、アンチセンス核酸は配列番号：５又はそのフラグメントと少なくとも約９９．７％の相同性を有する核酸と相補的である。好ましくは核酸は、配列番号：５の配列又はそのフラグメントを有する哺乳類ＢＥＨＡＢをコードする核酸の一部もしくは全部に相補的な核酸に約９９．８％相同であり、最も好ましくは約９９．９％相同であり、それは転写に関してアンチセンス配向にある。最も好ましくは、核酸は配列番号：５又はそのフラグメントである核酸の一部もしくは全部に相補的である。そのようなアンチセンス核酸はＢＥＨＡＢ分子の発現、機能又は両方を阻害するように働く。
【０１０２】
あるいはまた、本発明のアンチセンス分子を合成により作り、次いで細胞に与えることができる。約１０〜約３０、より好ましくは約１５個のヌクレオチドのアンチセンスオリゴマーが好ましく、それはそれらが容易に合成され且つ標的細胞中に導入されるからである。本発明により包含される合成アンチセンス分子には、非変更オリゴヌクレオチドと比較して向上した生物学的活性を有する、当該技術分野において既知のオリゴヌクレオチド誘導体が含まれる（引用することによりその記載事項全体が本明細書の内容となるＣｏｈｅｎ著，Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９８９年；Ｔｕｌｌｉｓ，米国特許第５，０２３，２４３号明細書，１９９１年を参照されたい）。
ＩＩ．単離されたポリペプチド
本発明は哺乳類突然変異ＢＥＨＡＢ分子を含む単離されたポリペプチドも含む。好ましくは、哺乳類突然変異ＢＥＨＡＢ分子を含む単離されたポリペプチドは、配列番号：３のアミノ酸配列又はそのいくつかのフラグメントを有するポリペプチドに少なくとも約９９．６％相同である。好ましくは、単離されたポリペプチドは配列番号：３又はそのいくつかのフラグメントに約９９．７％相同であり、より好ましくは約９９．８％相同であり、より好ましくは、そして最も好ましくは約９９．９％相同である。最も好ましくは、突然変異ＢＥＨＡＢ分子を含む単離されたポリペプチドは配列番号：３である。
【０１０３】
本発明は、本明細書に開示される突然変異ＢＥＨＡＢ分子を含むタンパク質又はペプチドの類似体も提供する。類似体は保存的なアミノ酸配列の相違により、又は配列に影響しない変更により、あるいは両方により、自然に存在するタンパク質又はペプチドと異なっていることができる。例えばタンパク質又はペプチドの一次配列を変更するが通常その機能を変更しない同類アミノ酸変更を行なうことができる。同類アミノ酸置換は典型的には以下の群内の置換を含む：
グリシン、アラニン；
バリン、イソロイシン、ロイシン；
アスパラギン酸、グルタミン酸；
アスパラギン、グルタミン；
セリン、トレオニン；
リシン、アルギニン；
フェニルアラニン、チロシン。
【０１０４】
修飾（通常一次配列を変えない）にはポリペプチドの生体内もしくは試験管内化学的誘導体化、例えばアセチル化又はカルボキシル化が含まれる。グリコシル化の修飾、例えばポリペプチドの合成及び処理の間の、又はさらなる処理段階におけるポリペプチドのグリコシル化パターンの変更により；例えばグリコシル化に影響する酵素、例えば哺乳類グリコシル化もしくは脱グリコシル化酵素にポリペプチドを暴露することによりなされる修飾も含まれる。リン酸化アミノ酸残基を有する配列、例えばホスホチロシン、ホスホセリン又はホスホトレオニンも包含される。
【０１０５】
タンパク質分解に対するポリペプチドの抵抗性を向上させるか又は溶解性を最適化するか又は治療薬としてそれらをより適したものとするように、通常の分子生物学的方法を用いて変更されたポリペプチドも含まれる。そのようなポリペプチドの類似体には自然に存在するＬ−アミノ酸以外の残基、例えばＤ−アミノ酸又は自然に存在しない合成アミノ酸を含有するものが含まれる。本発明のペプチドは、本明細書に挙げられるいずれかの特定の例としての方法の産物に限られない。
【０１０６】
本発明は本発明のペプチドの（又はそれをコードするＤＮＡの）「誘導体」及び「変異体」も包含するとみなされるべきであり、その誘導体及び変異体は、得られるペプチド（又はＤＮＡ）が本明細書で挙げられる配列に同一でないが、ペプチドが本発明の突然変異ＢＥＨＡＢペプチドの生物学的／生化学的性質を有する点で本明細書に開示されるペプチドと同じ生物学的性質を有するように、１個もしくはそれより多いアミノ酸において変えられている（又はペプチドをコードするヌクレオチド配列に言及する時は１個もしくはそれより多い塩基対において変えられている）突然変異ＢＥＨＡＢペプチドである。
【０１０７】
突然変異ＢＥＨＡＢタンパク質の生物学的性質には、細胞から分泌されるか又はＧＰＩ−結合を介して固定されるペプチドの能力、プロテアーゼにより切断されない能力などが含まれるとみなされるべきであるが、それらに限られない。
【０１０８】
熟練者は本明細書に提示される開示に基づいて、突然変異ＢＥＨＡＢの生物学的活性が、脳組織において発現される、脳組織において検出される、細胞から分泌される、細胞に固定される、プロテアーゼにより切断されない分子又は化合物の能力などを包含するがこれらに限られないことを理解するであろう。「突然変異ＢＥＨＡＢの活性」は、ＥＣＭ又は脳脊髄液中で循環するか又は脳において局部的に生産される突然変異ＢＥＨＡＢの効果を含む。突然変異ＢＥＨＡＢの生物学的活性は中でも腫瘍進行、腫瘍浸潤性、腫瘍体積及び寸法、動物の生存などを媒介するか、それと関連するか、又は両方である。
ＩＩＩ．ベクター
他の関連する側面において本発明は、好ましくは核酸が核酸によりコードされるタンパク質の発現を指示することができるように、プロモーター／調節配列を含む核酸に操作可能に連結された哺乳類突然変異ＢＥＨＡＢをコードする単離された核酸を含む。かくして本発明は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．著（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９年）及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．著（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ    Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９７年）に記載されているもののような、発現ベクター及び細胞における外来性ＤＮＡの付随発現を伴う細胞中への外来性ＤＮＡの導入のための方法を包含する。
【０１０９】
単独の、又は検出可能なタグポリペプチドに融合した突然変異ＢＥＨＡＢの、正常には正常なＢＥＨＡＢを発現する細胞における発現は、タグを有するかもしくは有していないタンパク質の発現を駆動するように働くプロモーター／調節配列に操作可能に連結された所望の核酸を含むプラスミド、ウィルス又は他の型のベクターを形成することにより、ベクターが導入される細胞において行なわれ得る。遺伝子の構成的発現の駆動に有用な多くのプロモーター／調節配列が当該技術分野において利用でき、例えば両方とも本明細書に開示される実験で用いられたサイトメガロウィルス即時型プロモーターエンハンサー配列、ＳＶ４０初期プロモーターならびにラウス肉腫ウィルスプロモーターなどが含まれるがこれらに限られない。さらに、突然変異ＢＥＨＡＢをコードする核酸の誘導可能な、及び組織特異的発現は、タグを有するかもしくは有していない突然変異ＢＥＨＡＢをコードする核酸を誘導可能もしくは組織特異的プロモーター／調節配列の調節下に置くことにより行なわれ得る。この目的のために有用な組織特異的もしくは誘導可能なプロモーター／調節配列の例にはＭＭＴＶ  ＬＴＲ誘導可能プロモーター及びＳＶ４０後期エンハンサー／プロモーターが含まれるがこれらに限られない。さらに、金属、グルココルチコイドなどのような誘導剤に応答して誘導される当該技術分野において周知のプロモーターも本発明に包含される。かくして本発明は、既知もしくは未知であり、プロモーター／調節配列に操作可能に連結された所望のタンパク質の発現を駆動することができるいずれのプロモーター／調節配列の使用をも含むことが認識されるであろう。
【０１１０】
ベクターを用いる突然変異ＢＥＨＡＢの発現は、多量の組換え的に生産されるタンパク質の単離を可能にする。さらに、正常なＢＥＨＡＢの発現が疾患、障害又はそのような発現に関連する状態を引き起こす場合、プロモーター／調節配列により駆動される突然変異ＢＥＨＡＢの発現は、突然変異ＢＥＨＡＢが与えられる遺伝子の治療を含むがそれに限られない有用な治療学を与えることができる。突然変異ＢＥＨＡＢの投与が有用であり得る、発現のレベルの向上、タンパク質の量又はタンパク質もしくはその切断産物の切断及び／又は活性のレベルの向上と関連する疾患、障害又は状態には原発性ＣＮＳ腫瘍、神経膠腫，十分に分化した星状細胞腫、未分化星状細胞腫、多形性膠芽腫、脳室上衣腫、稀突起膠腫、神経節細胞腫、混合性神経膠腫、脳幹神経膠腫、視神経神経膠腫、髄膜腫、松果体腫瘍、下垂体腫瘍、下垂体腺腫、始原神経外胚葉腫瘍、神経線維腫、血管腫瘍、リンパ腫などが含まれ得るがこれらに限られない。
【０１１１】
従って本発明は正常なＢＥＨＡＢ発現、翻訳、切断及び／又は活性の阻害法を含むのみでなく、本発明はＢＥＨＡＢ発現、タンパク質量、切断及び／又は活性の低下に関連する方法も含み、それは、ＢＥＨＡＢ発現、切断及び／又は活性の低下あるいは突然変異ＢＥＨＡＢ発現及び／又は活性の向上が有効な治療学を与えるのに有用であり得るからである。
【０１１２】
特定のプラスミドベクター又は他のＤＮＡベクターの選択は本発明において制限因子ではなく、多様すぎる程の（ｗｉｄｅ  ｐｌｅｔｈｏｒａ  ｏｆ）ベクターが当該技術分野において周知である。さらに、特定のプロモーター／調節配列を選び、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列にそれらのプロモーター／調節配列を作動的に結合させることは、十分に熟練者の技術の範囲内である。そのような方法は当該技術分野において周知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．著（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９年）及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．著（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ    Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９７年）に記載されている。
【０１１３】
かくして本発明は、哺乳類突然変異ＢＥＨＡＢをコードする単離された核酸を含有するベクターを含む。ベクター中への所望の核酸の導入及びベクターの選択は当該技術分野において周知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．著（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９年）及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．著（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ    Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９７年）に記載されている。
【０１１４】
本発明は、そのようなベクターを含有する細胞、ウィルス、プロウィルスなども含む。ベクター及び／又は外来性核酸を含む細胞の形成のための方法は当該技術分野において周知である。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．著（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９年）及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．著（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ    Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９７年）を参照されたい。
【０１１５】
突然変異ＢＥＨＡＢをコードする核酸を種々のプラスミドベクター中にクローニングすることができる。しかしながら、本発明はプラスミド又はいずれかの特定のベクターに制限されるとみなされるべきではない。そうではなくて、本発明は容易に入手可能であり及び／又は当該技術分野において周知である多様すぎる程のベクターを包含するとみなされるべきである。
ＩＶ．組換え細胞
本発明は、中でも突然変異ＢＥＨＡＢをコードする単離された核酸、それに相補的なアンチセンス核酸、ＢＥＨＡＢもしくはその切断産物に特異的に結合する抗体をコードする核酸などを含有する組換え細胞を含む。１つの側面において、突然変異ＢＥＨＡＢをコードする核酸の一部をコードするプラスミドを用いて組換え細胞を一過的にトランスフェクションすることができる。核酸は細胞ゲノム中に組込まれる必要も，細胞中で発現される必要もない。さらに細胞は原核もしくは真核細胞であることができ、本発明はいずれかの特定の細胞系もしくは細胞型に制限されるとみなされるべきではない。そのような細胞にはニューロン、神経細胞、脳細胞、神経膠腫−由来細胞系、神経膠細胞系、非−神経膠細胞系、幹細胞系などが含まれるがこれらに限られない。
【０１１６】
さらに、トランスジーン−含有細胞、すなわち組換え細胞の目的が頭蓋内腫瘍の発生に限られるとみなされるべきではないことに注意することは重要である。むしろ本発明は、哺乳類突然変異ＢＥＨＡＢをコードする単離された核酸を含む原核細胞及び真核細胞を含むがそれらに限られない、哺乳類突然変異ＢＥＨＡＢをコードする核酸が導入されているいずれの細胞型をも含むとみなされるべきである。
【０１１７】
本発明は真核細胞を含み、それは、本発明のトランスジーンがその中に導入され、所望の遺伝子によりコードされるタンパク質がそれから発現され、ここでそれがその細胞中に以前には存在しなかったかもしくは発現されなかったか、あるいはそれが今回トランスジーンが導入される前と異なるレベルで、もしくは状況下で発現される場合に、利益が得られる。そのような利益には、所望の遺伝子の発現を実験室において試験管内で、又は細胞が宿る哺乳類において研究することができるシステム、導入される遺伝子を含む細胞を研究、診断及び治療の道具として用いることができるシステムならびに哺乳類における選ばれる疾患状態に関する新しい診断及び治療の道具の開発に有用な哺乳類モデルが作られるシステムが与えられたことが含まれ得る。
【０１１８】
より多量の突然変異ＢＥＨＡＢが疾患、障害又は正常なＢＥＨＡＢ発現、切断及び／又は活性と関連する状態の処置もしくは軽減に有用であり得る場合に、細胞、組織又は完全な哺乳類に突然変異ＢＥＨＡＢを与えるために、突然変異ＢＥＨＡＢをコードする単離された核酸を発現する細胞を用いことができる。そのような疾患、障害又は状態には原発性ＣＮＳ腫瘍、神経膠腫，十分に分化した星状細胞腫、未分化星状細胞腫、多形性膠芽腫、脳室上衣腫、稀突起膠腫、神経節細胞腫、混合性神経膠腫、脳幹神経膠腫、視神経神経膠腫、髄膜腫、松果体腫瘍、下垂体腫瘍、下垂体腺腫、始原神経外胚葉腫瘍、神経線維腫、血管腫瘍、リンパ腫などが含まれ得るがこれらに限られない。従って本発明は、突然変異ＢＥＨＡＢ発現、タンパク質量及び／又は活性の向上が疾患、障害もしくは状態の処置もしくは軽減に有用であり得る場合に、正常なＢＥＨＡＢ発現、翻訳、切断及び／又は活性を低下させるかもしくは妨げるための、突然変異ＢＥＨＡＢを発現する細胞を含む。
【０１１９】
通常の熟練者は、本明細書に提示される開示に基づき、本発明の「ノック−イン」又は「ノック−アウト」ベクターがそれぞれ置換されるべきかもしくは欠失させられるべき核酸の２つの部分に相同な少なくとも２つの配列を含むことがわかるであろう。２つの配列は遺伝子に隣接する配列と相同であり；すなわち１つの配列は正常なＢＥＨＡＢをコードする核酸のコード配列の５’部分におけるかもしくはその近くの領域と相同であり、他の配列は最初のものからさらに下流である。通常の熟練者は、本明細書に提示される開示に基づき、本発明がいずれかの特定の隣接核酸配列に制限されないことがわかるであろう。そうではなくて、ターゲティングベクターは、哺乳類ゲノムからもしくはその中にそれぞれ、例えば正常なＢＥＨＡＢのいくらかもしくは全部を除去する（すなわち「ノック−アウト」ベクター）か又は突然変異ＢＥＨＡＢもしくはそのフラグメントをコードする核酸を挿入する（すなわち「ノック−イン」ベクター）２つの配列を含むことができる。ターゲティングベクターの決定的な特徴は、反対、すなわち「ノック−アウト」ベクターの場合には正常なＢＥＨＡＢ読み取り枠（ＯＲＦ）の５’及び３’末端に向かって位置する２つの配列の、相同的組換えによる欠失／挿入が起こって正常なＢＥＨＡＢをコードする核酸の全部もしくは一部が哺乳類染色体上のある位置から欠失することをそれが可能にするのに十分な部分をそれが含むことである。
【０１２０】
トランスジーンならびにノック−イン及びノック−アウトターゲティングベクターの設計は当該技術分野において周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．著（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９年）及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．著（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ    Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９７年）などのような標準的論文に記載されている。ターゲティングベクター中で用いられるべきＢＥＨＡＢコーディング領域に隣接するかもしくはそれ内の上流及び下流部分は、既知の方法に基づいてならびに、哺乳類ＢＥＨＡＢ及び突然変異ＢＥＨＡＢの核酸配列及びアミノ酸配列を含んで、本明細書で提示される開示に基づく本明細書で開示される記述に従って容易に選ばれ得る。これらの配列を備え、当該技術分野における通常の熟練者は本発明のトランスジーン及びノック−アウトベクターを構築することができるであろう。
【０１２１】
当該技術分野における熟練者には、本開示に基づき、正常なＢＥＨＡＢタンパク質の量の減少、ＢＥＨＡＢ及び／又はＢＥＨＡＢ切断産物活性のレベルの低下あるいは両方を含む細胞にはＢＥＨＡＢ発現の阻害剤（例えばアンチセンスもしくはリボザイム分子、合成抗体又はイントラボディー（ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ））を発現する細胞が含まれるがこれらに限られないことがわかるであろう。
【０１２２】
哺乳類細胞を培養中に維持するために有用な方法及び組成物は当該技術分野において周知であり、ここで哺乳類細胞はマウス、ラット、人間などから得られる細胞を含むがこれらに限られない哺乳類から得られる。
【０１２３】
腫瘍進行及び浸潤性へのＢＥＨＡＢの量の定性的及び定量的変更の効果を研究するために、本発明の組換え細胞を用いることができる。これは、ＢＥＨＡＢが分泌され且つヒアルロナン結合ドメインを有していることが、ＢＥＨＡＢがＥＣＭの機能、組成又は活性に含まれることを示すからである。さらに、治療及び／又は診断目的に用いるための突然変異ＢＥＨＡＢの生産のために、組換え細胞を用いることができる。すなわち、突然変異ＢＥＨＡＢを発現する組換え細胞を用い、ＢＥＨＡＢ発現、活性及び／又は切断に関連するか又はそれにより引き起こされる疾患、障害又は状態の処置又は軽減のために投与され得る多量の精製及び単離突然変異ＢＥＨＡＢを生産することができる。
【０１２４】
あるいはまた、突然変異ＢＥＨＡＢを発現する組換え細胞を生体外及び生体内治療において投与することができ、ここで組換え細胞を投与することはそれによりタンパク質を細胞、組織及び／又は哺乳類に投与することである。さらに組換え細胞はＢＥＨＡＢレセプター及びＢＥＨＡＢシグナリング経路の発見に有用である。
【０１２５】
細胞がＢＥＨＡＢを発現しないように、又は切断可能性を欠いた突然変異ＢＥＨＡＢを発現するように細胞が操作されている本発明の組換え細胞を、哺乳類自身の細胞（例えば神経細胞、脳細胞など）又は同系間の適合ドナーの細胞が本明細書の他の箇所で記載される通りに組換え的に操作され（例えばアンチセンス核酸又はノック−アウトベクターを挿入し、それによりＢＥＨＡＢ発現レベル及び／又はタンパク質量が組換え細胞中で減少するようにすることにより）、組換え細胞が受容哺乳類に投与される生体外及び生体内細胞治療において用いることもできる。この方法で、減少した量でＢＥＨＡＢを発現する組換え細胞を、自身の細胞が増加した量のＢＥＨＡＢを発現する哺乳類に投与し、それにより本明細書の他の箇所で開示されるような向上したＢＥＨＡＢ発現と関連するかもしくはそれにより媒介される疾患、障害又は状態を処置もしくは軽減することができる。
Ｖ．抗体
ＢＥＨＡＢ、ＢＥＨＡＢ切断産物又はそのフラグメントに特異的に結合する抗体も含まれる。
【０１２６】
当該技術分野における熟練者は、本明細書に提示される開示に基づき、ＢＥＨＡＢ及び／又はＢＥＨＡＢ切断産物に特異的に結合する抗体がＢＥＨＡＢタンパク質又はその免疫原部分、好ましくは本明細書の他の箇所で議論される切断部位と結合することを理解するであろう。１つの態様において、抗体はアミノ酸配列、配列番号：６を含む哺乳類ＢＥＨＡＢに向けられる。
【０１２７】
ポリクローナル抗体の形成は、所望の動物に抗原を接種し、例えばＨａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．著（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８８年）に記載されている方法のような標準的抗体生産法を用い、抗原に特異的に結合する抗体をそれから単離することにより行なわれる。そのような方法は、マルトース結合タンパク質又はグルタチオン（ＧＳＨ）タグポリペプチド部分及び／又はＢＥＨＡＢタンパク質を免疫原性とするような部分（例えばキーホールリンペットヘモシアニン、ＫＬＨと共役したＢＥＨＡＢ）のような他のタンパク質の部分ならびにそれぞれネズミ及び／又はヒトＢＥＨＡＢアミノ酸残基を含む部分を含有するキメラタンパク質で動物を免疫化することを含む。キメラタンパク質は、ＢＥＨＡＢをコードする適した核酸（例えば配列番号：５）をこの目的に適したプラスミドベクター、例えばこれらに限られないがｐＭＡＬ−２又はｐＣＭＸ中にクローニングすることにより生産される。ＢＥＨＡＢ及びその一部に特異的に結合する抗体の生産のための他の方法は、Ｍａｔｔｈｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．著（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０００年，２７５：２２６９５−２２７０３）に詳細に記載されている。
【０１２８】
しかしながら、本発明は全長ＢＥＨＡＢに結合するポリクローナル抗体のみに制限されるとみなされるべきではない。むしろ本発明は、本明細書の他の箇所で定義される哺乳類ＢＥＨＡＢ又はその一部への他の抗体を含むとみなされるべきである。さらに本発明は、中でもＢＥＨＡＢに結合し、且つウエスタンブロット上に、組織においてＢＥＨＡＢを位置決定できる組織の免疫組織学的染色において、ならびにＢＥＨＡＢの少なくとも一部をコードする核酸を用いて一過的にもしくは安定してトランスフェクションされた細胞の免疫蛍光鏡検法において存在するＢＥＨＡＢに結合することができる抗体を包含するとみなされるべきである。
【０１２９】
当該技術分野における熟練者には、本明細書に提示される開示に基づき、抗体がタンパク質のいずれかの部分と特異的に結合でき、全長タンパク質を用いてそれに関して特異的な抗体を形成できることがわかるであろう。しかしながら、本発明は免疫原として全長タンパク質を用いることに制限されない。むしろ本発明は、哺乳類ＢＥＨＡＢと特異的に結合する抗体の生産のためのタンパク質の免疫原部分の使用を含む。すなわち本発明はＢＥＨＡＢタンパク質の免疫原部分又は抗原決定基、例えば切断部位を含むエピトープ又はタンパク質分解的切断により作られる新しい抗原部位を用いて動物を免疫化することを含む。
【０１３０】
ウサギ又はマウスのような、しかしそれらに限られない動物をＢＥＨＡＢタンパク質又はその一部を用いて免疫化することにより、あるいはＢＥＨＡＢの少なくとも一部を含むタンパク質又は例えば適したＢＥＨＡＢアミノ酸残基を含む部分と共有結合したマルトース結合タンパク質タグポリペプチド部分を含むタグポリペプチド部分を含有する融合タンパク質を用いて動物を免疫化することにより、抗体を生産することができる。当該技術分野における熟練者には、本明細書に提示される開示に基づき、ＢＥＨＡＢに特異的に結合する抗体を生産するために、これらのタンパク質の比較的小さいフラグメントも使用できることがわかるであろう。
【０１３１】
当該技術分野における熟練者には、本明細書に提示される開示に基づき、ＢＥＨＡＢの切断部位を含むエピトープ又はＢＥＨＡＢの切断産物上に存在するエピトープに対する抗体の形成のために、単離ＢＥＨＡＢポリペプチドの種々の部分を使用できることがわかるであろう。ＢＥＨＡＢの配列及びタンパク質の種々のエピトープ及び切断産物を位置決定する詳細な分析を備えると、熟練者は、本明細書に提示される開示に基づき、当該技術分野において周知の方法又は未開発の方法を用いて哺乳類ＢＥＨＡＢポリペプチドの種々の部分に特異的な抗体をいかにして得るかを理解するであろう。
【０１３２】
従って熟練者には、本明細書に提示される開示に基づき、本発明がＢＥＨＡＢ活性を中和及び／又は阻害する（例えば必要なＢＥＨＡＢ切断産物レセプター／リガンド相互作用又はＢＥＨＡＢ切断の阻害により）抗体を包含し、その抗体はＢＥＨＡＢ又はＢＥＨＡＢ切断産物を認識できることがわかるであろう。
【０１３３】
本発明は、本明細書で開示される抗体又は本発明のタンパク質のいずれかの特定の免疫原部分のみに制限されるとみなされるべきではない。むしろ本発明は、ＢＥＨＡＢ又はその一部への、あるいは配列番号：６のアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも約％の相同性を共有するタンパク質への、本明細書の他の箇所で定義される他の抗体を含むとみなされるべきである。好ましくは、ポリペプチドはＢＥＨＡＢ（配列番号：６）に約１％相同、より好ましくは約５％相同、より好ましくは約１０％相同、さらにもっと好ましくは約２０％相同、より好ましくは約３０％相同、好ましくは約４０％相同、より好ましくは約５０％相同、さらにもっと好ましくは約６０％相同、より好ましくは約７０％相同、さらにもっと好ましくは約８０％相同、好ましくは約９０％相同、より好ましくは約９５％相同、さらにもっと好ましくは約９９％相同そして最も好ましくは約９９．９％相同である。
【０１３４】
当該技術分野における熟練者には、本明細書に提示される開示に基づき、抗体を使用して関連するタンパク質を細胞中で位置決定でき、且つそれにより認識される抗原の細胞プロセスにおける単数もしくは複数の役割を研究できることがわかるであろう。さらに、ウエスタンブロッティング及び酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）のような、しかしこれらに限られない周知の方法を用いて生物学的試料中に存在するタンパク質を検出し、及び、又はその量を測定するために抗体を用いることができる。さらに、当該技術分野において周知の方法を用いて抗体の同族抗原を免疫沈降させる及び／又はイムノ−アフィニティー精製するために抗体を用いることができる。さらに、細胞におけるＢＥＨＡＢの量又はＢＥＨＡＢ切断産物の量を減少させ、それにより細胞におけるＢＥＨＡＢ又はＢＥＨＡＢ切断産物の単数もしくは複数の影響を阻害するために抗体を用いることができる。かくして哺乳類の細胞もしくは組織又は哺乳類自身に抗体を投与することにより、必要なＢＥＨＡＢレセプター／リガンド相互作用が従って阻害され、ＢＥＨＡＢ切断の影響も阻害される。当該技術分野における熟練者は、抗−ＢＥＨＡＢ抗体を用いるＢＥＨＡＢ切断の阻害は腫瘍寸法の減少、生存の延長などを含み得るがこれらに限られないことを理解するであろう。
【０１３５】
当該技術分野における熟練者には、本明細書に提示される開示に基づき、本発明が脳におけるＢＥＨＡＢ切断を阻害するためにＢＥＨＡＢと特異的に結合する抗体を経口的、非経口的、脳室内、包膜内、実質内に、あるいは複数の経路により投与することを包含することがわかるであろう。投与は生物工学的に操作された（ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）ポリマーによる、直接注入による、オマヤレザバー（脳脊髄液に抗ガン剤を送達するために用いられる頭皮下に移植される装置）あるいは神経外科学の技術分野における熟練者に周知の他のそのような手段を介する送達を含むことができる。
【０１３６】
本発明はポリクローナル、モノクローナル，合成抗体などを包含する。当該技術分野における熟練者は、本明細書に提示される開示に基づき、本発明の抗体の決定的な特徴は抗体がＢＥＨＡＢと特異的に結合することであることを理解するであろう。すなわち本発明の抗体はＢＥＨＡＢ又はそのフラグメント（例えばその免疫原部分又は抗原決定基）をウエスタンブロット上で、細胞の免疫染色において認識し、当該技術分野において周知の標準的方法を用いてＢＥＨＡＢを免疫沈降させる。
【０１３７】
タンパク質又はペプチドの全長又はペプチドフラグメントに向けられたモノクローナル抗体は、いずれかの周知のモノクローナル抗体製造法、例えばＨａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．著（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８８年）及びＴｕｓｚｙｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．著（Ｂｌｏｏｄ，１９８８年，７２：１０９−１１５）に記載されている方法を用いて製造することができる。化学合成法を用いて多量の（ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ  ｏｆ）所望のペプチドを合成することもできる。あるいはまた、所望のペプチドをコードするＤＮＡをクローニングし、多量のペプチドの生産に適した細胞中で適したプロモーター配列から発現させることもできる。ペプチドに向けられたモノクローナル抗体は、本明細書で言及される標準的方法を用い、ペプチドで免疫化されたマウスから形成される。
【０１３８】
当該技術分野において利用でき且つ例えばＷｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．著（Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９２年，１２：１２５−１６８）及びそこで引用されている参照文献に記載されている方法を用い、本明細書に記載される方法を用いて得られるモノクローナル抗体をコードする核酸をクローニングし且つ配列決定することができる。
【０１３９】
さらに、例えばＷｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．著（Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９２年，１２：１２５−１６８）及びそこで引用されている参照文献ならびにＧｕ  ｅｔ  ａｌ．著（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈｅｍａｔｏｃｙｓｔ．１９９７年，７７：７５５−７５９）に記載されている方法を用い、本発明の抗体を「ヒト化する」ことができる。本発明は、ＢＥＨＡＢのエピトープと特異的に反応性のヒト化抗体の使用も含む。そのような抗体はＢＥＨＡＢ又はそのフラグメントに特異的に結合することができる。本発明のヒト化抗体はヒトのフレームワーク（ｈｕｍａｎ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）を有し、且つＢＥＨＡＢ又はそのフラグメントと特異的に反応性の抗体、限られるわけではないが典型的にはマウス抗体からの１つもしくはそれより多い相補性決定領域（ＣＤＲｓ）を有する。かくして例えば人体に適応させたＢＥＨＡＢへの抗体は原発性ＣＮＳ腫瘍、例えば神経膠腫，十分に分化した星状細胞腫、未分化星状細胞腫、多形性膠芽腫、脳室上衣腫、稀突起膠腫、神経節細胞腫、混合性神経膠腫、脳幹神経膠腫、視神経神経膠腫、髄膜腫、松果体腫瘍、下垂体腫瘍、下垂体腺腫、始原神経外胚葉腫瘍、神経線維腫、血管腫瘍、リンパ腫などの処置において有用である。
【０１４０】
本発明において用いられる抗体を人体に適応させる場合、Ｑｕｅｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（米国特許第６，１８０，３７０号明細書）、Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．著（Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９２年，１２：１２５−１６８）及びそこで引用されている参照文献又はＧｕ  ｅｔ  ａｌ．著（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈｅｍａｔｏｃｙｓｔ．１９９７年，７７（４）：７５５−７５９）に記載されている通りに抗体を形成することができる。Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．において開示されている方法は部分的に、アクセプターヒトフレームワーク領域をコードするＤＮＡ切片に結合した、所望の抗原、例えばＢＥＨＡＢに結合することができるドナー免疫グロブリンからの重鎖及び軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲｓ）をコードする組換えＤＮＡ切片を発現することにより生産される、人体に適応させた免疫グロブリンを設計することに向けられている。一般的にＱｕｅｅｎの特許における発明は、実質的にいずれの人体に適応させた免疫グロブリンの設計にも向けられる適用可能性を有している。Ｑｕｅｅｎは、ＤＮＡ切片が典型的には、自然に伴われているか又は異種のプロモーター領域を含む、人体に適応させた免疫グロブリンコーディング配列に操作可能に連結された発現調節ＤＮＡ配列を含むであろうと説明している。発現調節配列は、真核宿主細胞を形質転換もしくはトランスフェクションすることができるベクター中の真核プロモーター系であることができるか、あるいは発現調節配列は原核宿主細胞を形質転換もしくはトランスフェクションすることができるベクター中の原核プロモーター系であることができる。プロモーターが適した宿主中に導入されると、宿主は導入されたヌクレオチド配列の高いレベルの発現に適した条件下に維持され、所望通り、人体に適応させた軽鎖、重鎖、軽／重鎖二量体又は無損傷の抗体、結合フラグメント又は他の免疫グロブリン形態の収集及び精製が続くことができる（引用することによりその記載事項が本明細書の内容となるＢｅｙｃｈｏｋ著，Ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７９年）。
【０１４１】
多様なヒト細胞からのヒト不変領域（ＣＤＲ）ＤＮＡ配列を周知の方法に従って単離することができる。好ましくはヒト不変領域ＤＮＡ配列は、引用することによりその記載事項が本明細書の内容となる国際出願公開第７／０２６７１号パンフレットに記載されているような不朽化Ｂ−細胞から単離される。本発明の抗体の生産において有用なＣＤＲｓは同様に、ＢＥＨＡＢに結合することができるモノクローナル抗体をコードするＤＮＡから誘導され得る。そのようなヒト化抗体を周知の方法を用いて、マウス、ラット、ウサギ又は他の脊椎動物を含むがこれらに限られない、抗体を生産できる通常の哺乳類源において形成することができる。不変領域及びフレームワークＤＮＡ配列のために適した細胞ならびに抗体が発現され且つ分泌される宿主細胞を複数の供給源、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡから得ることができる。
【０１４２】
上記で議論したヒト化抗体に加え、本来の抗体配列への他の変更を容易に設計することができ、当該技術分野における熟練者に周知の種々の組換えＤＮＡ法を用いて製造することができる。さらに多様な異なるヒトフレームワーク領域を単独で又は組み合わせて、ＢＥＨＡＢに向けられるヒト化抗体のための基礎として用いることができる。一般に遺伝子の変更は多様な周知の方法、例えば特定部位の突然変異誘発を用いて容易に行なわれ得る（Ｇｉｌｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ著，Ｇｅｎｅ，１９７９年，８：８１−９７；Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｎａｔｕｒｅ，１９８７年，３２８：７３１−７３４）。
【０１４３】
あるいはまた、ファージ抗体ライブラリを作ることができる。ファージ抗体ライブラリを作るために、ファージ表面上で発現されるべき所望のタンパク質、例えば所望の抗体を発現する細胞、例えばハイブリドーマから単離されるｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリを最初に得る。ｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーは逆転写酵素を用いて作られる。免疫グロブリンフラグメントを規定するｃＤＮＡをＰＣＲにより得、得られるＤＮＡを適したバクテレオファージベクター中にクローニングし、免疫グロブリン遺伝子を規定するＤＮＡを含むバクテリオファージＤＮＡライブラリを作る。異種ＤＮＡを含むバクテリオファージライブラリを作るための方法は当該技術分野において周知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．著（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９年）に記載されている。
【０１４４】
所望の抗体をコードするバクテリオファージを操作し、その表面上でタンパク質が、その対応する結合タンパク質、例えば抗体が向けられている抗原への結合にそれが利用できるようなやり方で、現れるようにすることができる。かくして特定の抗体を発現するバクテリオファージを、対応する抗原を発現する細胞の存在下でインキュベーションすると、バクテリオファージは細胞に結合するであろう。抗体を発現しないバクテリオファージは細胞に結合しないであろう。そのような選別法（ｐａｎｎｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）は当該技術分野において周知であり、例えばＷｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．著（Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９９２年，１２：１２５−１６８）に記載されている。
【０１４５】
上記で記載したもののような方法は、Ｍ１３バクテリオファージディスプレー（ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｓｅ  ｄｉｓｐｌａｙ）を用いるヒト抗体の生産のために開発された（Ｂｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．著，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９４年，５７：１９１−２８０）。本質的に、抗体−生産細胞の集団から得られるｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリを形成する。ｍＲＮＡは転位した免疫グロブリン遺伝子をコードし、かくしてｃＤＮＡは同じものをコードする。増幅されたｃＤＮＡをＭ１３発現ベクター中にクローニングし、表面上でヒトＦａｂフラグメントを発現するファージのライブラリを形成する。問題の抗体を現すファージを抗原結合により選択し、バクテリア中で増殖させ、可溶性ヒトＦａｂ免疫グロブリンを生産する。かくして通常のモノクローナル抗体合成と対照的に、この方法はヒト免疫グロブリンを発現する細胞ではなくてヒト免疫グロブリンをコードするＤＮＡを不朽化する。
【０１４６】
示したばかりの方法は、抗体分子のＦａｂ部分をコードするファージの形成を記述している。しかしながら、本発明はＦａｂ抗体をコードするファージの形成のみに限られるとみなされるべきではない。むしろ、単鎖抗体をコードするファージ（ｓｃＦｖ／ファージ抗体ライブラリ）も本発明に含まれる。Ｆａｂ分子は全Ｉｇ軽鎖を含み、すなわちそれらは軽鎖の可変及び不変領域の両方を含むが、重鎖の可変領域及び第１不変領域ドメイン（ＣＨ１）のみを含む。単鎖抗体分子はＩｇ  Ｆｖフラグメントを含有するタンパク質の一本鎖を含む。Ｉｇ  Ｆｖフラグメントは抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域のみを含み、そこに含有される不変領域を有していない。Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．著（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９１年，２２２：５８１−５９７）に記載されている方法に従って、ｓｃＦｖ  ＤＮＡを含むファージライブラリを作ることができる。そのようにして作られるファージの、所望の抗体の単離のための選別は、Ｆａｂ  ＤＮＡを含むファージライブラリに関して記載した方法に類似の方法で行なわれる。
【０１４７】
本発明は、重鎖及び軽鎖可変領域をそれらがほとんどすべての可能な特異性を含むように合成することができる合成ファージディスプレーライブラリも含むとみなされるべきである（Ｂａｒｂａｓ著，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９９５年，１：８３７−８３９；ｄｅ  Ｋｒｕｉｆ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９５年，２４８：９７−１０５）。
ＶＩ．方法
Ａ．原発性ＣＮＳ腫瘍の処置の方法
本発明は部分的に、ＢＥＨＡＢが原発性ＣＮＳ腫瘍進行、浸潤性及び脳腫瘍を有する哺乳類の生存時間において有意な役割を果たすという新規な発見に基づいている。本明細書に開示されるデータにより示される通り、ＢＥＨＡＢ切断は原発性ＣＮＳ腫瘍の進行に力を与え、切断の阻害及び／又はＢＥＨＡＢ及びその切断産物の機能の阻害を哺乳類における原発性ＣＮＳ腫瘍のための処置として用いることができる。原発性ＣＮＳ腫瘍を処置する場合も診断する場合もすべての場合に、最も好ましい哺乳類は人間である。
【０１４８】
本発明は哺乳類、好ましくは人間における原発性ＣＮＳ腫瘍の処置の方法を含む。これは、本明細書の他の箇所で開示されるデータにより示される通り、ＢＥＨＡＢの切断及び／又はＢＥＨＡＢ切断産物の機能、生物学的活性及び発現が原発性ＣＮＳ腫瘍の進行及び浸潤性に決定的だからである。従って、本明細書で示されるデータから明らかな通り、ＢＥＨＡＢの切断の阻害及び／又はＢＥＨＡＢ切断産物の機能、生物学的活性及び発現の阻害は、原発性ＣＮＳ腫瘍のための処置として役立つことができる。当該技術分野における熟練者には、本開示に基づき、ＢＥＨＡＢの切断の阻害が中でも神経膠腫，十分に分化した星状細胞腫、未分化星状細胞腫、多形性膠芽腫、脳室上衣腫、稀突起膠腫、神経節細胞腫、混合性神経膠腫、脳幹神経膠腫、視神経神経膠腫、髄膜腫、松果体腫瘍、下垂体腫瘍、下垂体腺腫、始原神経外胚葉腫瘍、神経線維腫、血管腫瘍、リンパ腫、反応性グリオーシスなどの処置のための重要且つ新規な治療学を与えることがわかるであろう。当該技術分野における熟練者には、原発性ＣＮＳ腫瘍がＣＮＳ、すなわち脳及び脊髄への傷害から生ずることもわかるであろう。これらの傷害から生ずる腫瘍は当該技術分野において周知であり、多くの場合に反応性グリオーシスと呼ばれる。反応性グリオーシスは例えばＳｔｒｅｉｔ著（Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．，２０００年，２８：２８−３０）に詳細に記載されている。本発明は哺乳類、好ましくは人間における反応性グリオーシスの処置のための方法を含む。
【０１４９】
ＢＥＨＡＢ切断の阻害剤を哺乳類に投与し、それによりＢＥＨＡＢ切断を減少させ、治療的利益を与える。熟練者には、本明細書に提示される開示に基づき、既知の、又は将来開発されるべき広範囲の方法を用いてＢＥＨＡＢ切断を阻害できることがわかるであろう。すなわち本発明は、哺乳類におけるＢＥＨＡＢの切断を阻害し、それにより原発性ＣＮＳ腫瘍の進行及び浸潤性を妨げることを包含する。本発明は哺乳類におけるＢＥＨＡＢ切断の阻害のための方法、例えば切断部位の遮断、切断を担うプロテアーゼの滴定（ｔｉｔｒａｔｉｎｇ）及び切断不可能なＢＥＨＡＢ突然変異体の発現もしくは投与を開示する。これは、本明細書に開示されるデータにより示される通り、ＢＥＨＡＢの切断に影響を与えることが、腫瘍寸法の減少及び原発性ＣＮＳ腫瘍に苦しむ哺乳類における生存時間の延長を含むがこれらに限られない多様な効果を媒介し、それにより原発性ＣＮＳ腫瘍のための新規且つ有力な治療学を与えるからである。
【０１５０】
熟練者はさらに、本開示及び本明細書に提示されるデータを備えると、ＢＥＨＡＢ及び／又はその切断産物の機能、生物学的活性及び発現の阻害剤を哺乳類に投与することが原発性ＣＮＳ腫瘍を有する哺乳類に有益な治療学を与えることを理解するであろう。本発明は、ＢＥＨＡＢの発現ならびに切断産物及び／又はそれらのリガンドの結合を減少させるかもしくは妨げるための方法を含む。本明細書に開示されるデータにより示される通り、ＢＥＨＡＢの量の増加及びＢＥＨＡＢ切断産物の生物学的活性の向上は、原発性ＣＮＳ腫瘍の進行の増進を媒介し、生存率の低下及びより大きな腫瘍を生ずる。従ってＢＥＨＡＢ発現あるいはＢＥＨＡＢ切断産物発現及び／又は機能の阻害のための方法は本発明に含まれる。
【０１５１】
熟練者は、ＢＥＨＡＢ切断の阻害が切断部位の遮断、切断を担うプロテアーゼの滴定及び切断不可能なＢＥＨＡＢ突然変異体の発現及び／又は投与を包含することを理解するであろう。本発明は、タンパク質上の切断部位の遮断によるＢＥＨＡＢの切断の阻害のための方法を含む。本明細書に開示される通り、切断部位はＢＥＨＡＢタンパク質のＧｌｕ３９５−Ｓｅｒ３９６を含む。従ってプロテアーゼにとってこの切断部位に近づけないことは、ＢＥＨＡＢの切断を妨げることができる。従って本発明は、プロテアーゼが切断部位に近づくのを遮断することによるＢＥＨＡＢの切断の阻害のための方法を含む。例えばタンパク質の切断部位を含む部分に対する抗体あるいは切断部位と相互作用するペプチド又は小分子は、プロテアーゼがタンパク質に近づくのを遮断し、それによりＢＥＨＡＢ切断を阻害するであろう。熟練者には、本明細書に開示される開示及びデータを備えると、抗体が切断部位を含む短いペプチド又はＢＥＨＡＢタンパク質のもっと大きな部分に特異的に結合することができ、但し、抗体は切断部位を遮断するということがわかるであろう。
【０１５２】
ＢＥＨＡＢへの抗体の形成の方法は当該技術分野において周知であり（Ｍａｔｔｈｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０００年，２７５：２２６９５−２２７０３）、本明細書の他の箇所で開示されている。さらに、タンパク質のあるエピトープに特異的に結合する抗体の生産のための方法は当該技術分野において周知であり、本明細書及び他のどこかに開示されている標準的方法を用いて行なわれ得、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．著（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８８年）を参照されたい。
【０１５３】
当該技術分野における熟練者には、抗体をタンパク質として、タンパク質をコードする核酸構築物として、又は両方として投与できることがわかるであろう。本明細書の他の箇所で開示される多数のベクター及び他の組成物ならびに方法が、タンパク質又はタンパク質をコードする核酸構築物を細胞又は組織に投与するために周知である。従って本発明は、ＢＥＨＡＢに関して特異的な抗体又は抗体（合成抗体）をコードする核酸を投与する方法を含む（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９年）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ    Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９７年）。
【０１５４】
当該技術分野における熟練者は、本明細書に提示される開示に基づき、抗体を投与し、それが哺乳類中に存在するＢＥＨＡＢ上の切断部位を遮断するようにできることを理解するであろう。さらに本発明は、ＢＥＨＡＢと特異的に結合する抗体又は抗体をコードする核酸を投与することを包含し、ここで分子はさらに、抗体がＢＥＨＡＢに結合してそのＧＰＩ−固定発現もしくは分泌を妨げるように、細胞内保持配列を含む。多くの場合に「イントラボディー」と呼ばれるそのような抗体は当該技術分野において周知であり、例えばＭａｒａｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第６，００４，４９０号明細書）及びＢｅｅｒｌｉ  ｅｔ  ａｌ．著（Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，１９９６年，３８：１１−１７）に記載されている。かくして本発明は、ＢＥＨＡＢが哺乳類中に存在する場合にＢＥＨＡＢ切断を阻害することを含む方法ならびにその細胞膜上にＧＰＩ−固定された形態もしくはその分泌された形態で存在するＢＥＨＡＢを阻害することを含むＢＥＨＡＢ切断の阻害の方法及び将来既知となるそのような方法を包含する。
【０１５５】
本発明は、ＢＥＨＡＢ切断を担うプロテアーゼの阻害によりＢＥＨＡＢ切断を阻害するための方法も包含する。これは、本明細書に提示されるデータから明らかな通り、ＢＥＨＡＢがある特定の部位でプロテアーゼにより切断するが、ＢＥＨＡＢの切断の阻害が中でもより小さい腫瘍体積及び動物生存率の向上を生ずるからである。従って本発明は、ＢＥＨＡＢを切断させるプロテアーゼの阻害によるＢＥＨＡＢ切断の阻害の方法を含む。
【０１５６】
当該技術分野における熟練者には、プロテアーゼの阻害が有効量のプロテアーゼ阻害剤を哺乳類に投与することを含むことがわかるであろう。そのような阻害剤には、メタロプロテイナーゼ組織阻害因子２、メタロプロテイナーゼ組織阻害因子３、小分子、ＢＥＨＡＢを切断させるプロテアーゼに特異的に結合する抗体などを含む化学化合物が含まれるが、これらに限られない。特異的プロテアーゼ阻害剤は当該技術分野において周知であり、例えばＭａｒｔｅｌ−Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．著（Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔ．Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．，２００１年，１５：８０５−２９）において議論されている。熟練者は、本開示及び本明細書の記述を備えると、いかにしてプロテアーゼ阻害剤を哺乳類に投与するかを容易に理解し、従って本発明は原発性ＣＮＳ腫瘍のための処置としてのプロテアーゼ阻害剤を包含する。
【０１５７】
本発明は、ＢＥＨＡＢ切断を担うプロテアーゼの滴定によるＢＥＨＡＢ切断の阻害のための方法も包含する。これは、本明細書に提示されるデータから明らかな通り、ＢＥＨＡＢはある特定の部位でプロテアーゼにより切断するが、本発明の突然変異ＢＥＨＡＢは生体内及び試験管内アッセイの両方において測定される通り、プロテアーゼにより切断し得ないからである。さらに、ＢＥＨＡＢを切断させるプロテアーゼは体内で、他のメタロプロテイナーゼと比較して限られた量で及び限られた位置に存在する。従って切断不可能なＢＥＨＡＢはプロテアーゼを滴定することができ、従ってそれは内在性ＢＥＨＡＢの切断に利用され得ない。当該技術分野における熟練者には、プロテアーゼの滴定が哺乳類、好ましくは人間における、ＢＥＨＡＢの切断に利用できるプロテアーゼの機能的濃度（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を低下させる物質を与えることを包含することがわかるであろう。プロテアーゼの滴定はさらに、プロテアーゼが認識して結合する物質を与え、ＢＥＨＡＢの切断に利用できるプロテアーゼ又はプロテアーゼ活性部位の数を減少させることを含む。
【０１５８】
本明細書の他の箇所でさらに十分に記載する通り、突然変異体、ＢＥＨＡＢの切断不可能形態を発現する腫瘍は、内在性ＢＥＨＡＢの存在下においても、中でもより小さい腫瘍体積及び動物における生存率の向上を生ずる。これらのデータは、細胞中に内在性ＢＥＨＡＢが存在しても、さらに切断不可能なＢＥＨＡＢが存在することは、当該技術分野において受け入れられている生体内原発性ＣＮＳ腫瘍モデルにおいて原発性ＣＮＳ腫瘍の進行を低下させることを示している。データはさらに、外来性突然変異ＢＥＨＡＢを発現する腫瘍を外来性の正常なＢＥＨＡＢを発現する腫瘍と比較すると、突然変異ＢＥＨＡＢを発現する腫瘍はより小さく且つより長い動物生存時間を生ずることを示している。いずれかの特定の理論に縛られることは望まないが、本明細書で示されるデータは、切断不可能なＢＥＨＡＢ突然変異体がＢＥＨＡＢ切断を担うプロテアーゼを滴定し、切断の減少の結果として腫瘍進行の低下が起こることを示している。
【０１５９】
熟練者には、本開示及び本明細書に開示されるデータに基づき、プロテアーゼに関する切断不可能な基質が腫瘍寸法の減少により腫瘍進行を抑制し、原発性ＣＮＳ腫瘍に苦しむ動物における生存率を向上させることがわかるであろう。従って本発明は、ＢＥＨＡＢを切断させるプロテアーゼの滴定による原発性ＣＮＳ腫瘍の処置のための方法を含む。
【０１６０】
ＢＥＨＡＢを切断させるプロテアーゼの滴定に用いられる化合物にはペプチド、タンパク質、ミメトープ（ｍｉｍｅｔｏｐｅｓ）及びペプチドミメティックが含まれるが、これらに限られない。本明細書の他の箇所で開示される通り、切断不可能なＢＥＨＡＢ（突然変異ＢＥＨＡＢ、配列番号：３）は切断部位の周りのアミノ酸配列における突然変異、特定的にはＧｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−ＧｌｙのＧｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ（それぞれ配列番号：１及び配列番号：２）への突然変異を有する本来のＢＥＨＡＢタンパク質を含む。当該技術分野における熟練者には、全長突然変異ＢＥＨＡＢから誘導されるペプチドが配列番号：３に示される全長突然変異ＢＥＨＡＢタンパク質と同じプロテアーゼ滴定性を示すことができることが容易にわかるであろう。それにより、本発明は全長突然変異ＢＥＨＡＢタンパク質及びプロテアーゼ滴定活性を有する切り取られた（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）突然変異ＢＥＨＡＢペプチドを包含する。
【０１６１】
本明細書で用いられる場合、アミノ酸は下記の表に示される通り、それらの完全な名前により、それらに対応する３文字コードにより、又はそれらに対応する１文字コードにより示される：
完全な名前 ３文字コード １文字コード
アスパラギン酸                Ａｓｐ                Ｄ
グルタミン酸                  Ｇｌｕ                Ｅ
リシン                        Ｌｙｓ                Ｋ
アルギニン                    Ａｒｇ                Ｒ
ヒスチジン                    Ｈｉｓ                Ｈ
チロシン                      Ｔｙｒ                Ｙ
システイン                    Ｃｙｓ                Ｃ
アスパラギン                  Ａｓｎ                Ｎ
グルタミン                    Ｇｌｎ                Ｑ
セリン                        Ｓｅｒ                Ｓ
トレオニン                    Ｔｈｒ                Ｔ
グリシン                      Ｇｌｙ                Ｇ
アラニン                      Ａｌａ                Ａ
バリン                        Ｖａｌ                Ｖ
ロイシン                      Ｌｅｕ                Ｌ
イソロイシン                  Ｉｌｅ                Ｉ
メチオニン                    Ｍｅｔ                Ｍ
プロリン                      Ｐｒｏ                Ｐ
フェニルアラニン              Ｐｈｅ                Ｆ
トリプトファン                Ｔｒｐ                Ｗ
本発明のペプチドは、Ｓｔｅｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．著（Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，１９８４年，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）により記載されている、及びＢｏｄａｎｓｚｋｙ  ａｎｄ  Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ著（Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８４年）により記載されている標準的な十分に確立された固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）により容易に製造することができる。初めに、適切に保護されたアミノ酸残基を誘導体化された不溶性のポリマー性支持体、例えば架橋されたポリスチレン又はポリアミド樹脂にそのカルボキシル基を介して結合させる。「適切に保護された」は、アミノ酸のα−アミノ基上及び側鎖官能基上の両方における保護基の存在を指す。側鎖保護基は一般に合成を通じて用いられる溶媒、試薬及び反応条件に安定であり、最終的ペプチド産物に影響しない条件下で除去可能である。オリゴペプチドの段階的合成は、最初のアミノ酸からのＮ−保護基の除去及び所望のペプチドの配列中の次のアミノ酸のカルボキシル末端のそこへのカップリングにより行なわれる。このアミノ酸も適切に保護される。入ってくるアミノ酸のカルボキシルを、反応性基の形成（ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ）、例えばカルボジイミド、対称酸無水物又はヒドロキシベンゾトリアゾールもしくはペンタフルオロフェニルエステルのような「活性エステル」基の形成により活性化して、支持体に結合したアミノ酸のＮ−末端と反応させることができる。
【０１６２】
固相ペプチド合成法の例には、α−アミノ保護基としてｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルを用いるＢＯＣ法及びアミノ酸残基のα−アミノの保護のために９−フルオレニルメチルオキシカルボニルを用いるＦＭＯＣ法が含まれ、それらの両方法は当該技術分野における熟練者により周知である。
【０１６３】
Ｎ−及び／又はＣ−遮断基の導入も固相ペプチド合成法に通例の案を用いて行なわれ得る。例えばＣ−末端遮断基の導入のために、所望のペプチドの合成は典型的には、樹脂からの切断が所望のＣ−末端遮断基を有するペプチドを生ずるように化学的に修飾された支持樹脂を固相として用いて行なわれる。例えばＣ−末端が一級アミノ遮断基を有するペプチドを得るために、ｐ−メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）樹脂を用いて合成を行ない、ペプチド合成が完了する時にフッ化水素酸を用いる処理が所望のＣ−末端的にアミド化されたペプチドを放出するようにする。同様に、Ｃ−末端におけるＮ−メチルアミン遮断基の導入はＮ−メチルアミノエチル−誘導体化ＤＶＢ樹脂を用いて行なわれ、それはＨＦ（フッ化水素酸）処理されるとＮ−メチルアミド化Ｃ−末端を有するペプチドを放出する。エステル化によるＣ−末端の遮断も通常の方法を用いて行なわれ得る。これは樹脂／遮断基組み合わせの使用を伴い、それは樹脂からの側鎖ペプチドの放出を可能にし、続くエステル官能基の生成のための所望のアルコールとの反応を許す。メトキシアルコキシベンジルアルコール又は同等のリンカーを用いて誘導体化されたＤＶＢ樹脂と組み合わされたＦＭＯＣ保護基をこの目的に用いることができ、支持体からの切断はジクロロメタン中のＴＦＡにより成される。次いで例えばＤＣＣを用いて適切に活性化されたカルボキシル官能基のエステル化を所望のアルコールの添加により行なうことができ、エステル化されたペプチド産物の脱保護及び単離が続く。
【０１６４】
合成されるペプチドがまだ樹脂に結合している間に、例えば適した無水物及びニトリルを用いる処理により、Ｎ−末端遮断基の導入を行なうことができる。例えばＮ−末端におけるアセチル遮断基の導入のために、樹脂とカップリングしたペプチドをアセトニトリル中の２０％無水酢酸を用いて処理することができる。Ｎ−遮断ペプチド産物を次いで樹脂から切断させ、脱保護し、続いて単離することができる。
【０１６５】
化学的又は生物学的合成法から得られたペプチドが所望のペプチドであることを保証するために、ペプチド組成の分析を行なわなければならない。高分解能質量分析を用いてペプチドの分子量を決定することにより、そのようなアミノ酸組成分析を行なうことができる。あるいはまた、もしくはさらに、酸水溶液中でペプチドを加水分解し、混合物の成分を分離し、ＨＰＬＣ又はアミノ酸分析器を用いて同定し、定量することにより、ペプチドのアミノ酸含有率を確認することができる。ペプチドを順に分解し、アミノ酸を順番に同定するタンパク質シークエンサーを用いてペプチドの配列を明確に決定することもできる。
【０１６６】
その使用の前にペプチドを精製して汚染物を除去する。これに関し、ペプチドは、適した監督官庁（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｃｉｅｓ）により示される標準を満たすように、又は特定の使用のために精製されるであろうことがわかるであろう。必要な純度のレベルを得るために、例えばＣ４−、Ｃ８−もしくはＣ１８−シリカのようなアルキル化シリカカラムを用いる逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含む複数の通常の精製法のいずれか１つを用いることができる。精製を達成するために、有機含有率が増加する勾配移動相、例えば通常少量のトリフルオロ酢酸を含有する水性緩衝液中のアセトニトリルが一般に用いられる。イオン交換クロマトグラフィーを用い、ペプチドをそれらの電荷に基づいて分離することもできる。
【０１６７】
当該技術分野における熟練者には、ＢＥＨＡＢを切断させるプロテアーゼを滴定することができる突然変異ＢＥＨＡＢタンパク質又はペプチドを、突然変異ＢＥＨＡＢタンパク質又はペプチドをコードする単離された核酸として哺乳類に投与できることが容易にかるであろう。細胞又は哺乳類において所望のタンパク質を発現させる方法は当該技術分野において周知であり、本開示及び本明細書中のデータと組み合わせると、熟練者は過度の実験なしで細胞又は哺乳類において突然変異ＢＥＨＡＢタンパク質又はペプチドを発現させることができるであろう。
【０１６８】
当該技術分野における熟練者には、細胞又は哺乳類におけるタンパク質又はペプチドの発現のために、所望のタンパク質又はペプチドをコードする単離された核酸を含むベクター又は発現ベクターの細胞又は哺乳類中への導入を含む多くの方法が存在することがわかるであろう。熟練者にはさらに、ベクターが配列番号：４の単離された核酸又はいくつかのその生物学的に活性な部分を含むことができることがわかるであろう。
【０１６９】
本発明は、本発明の突然変異ＢＥＨＡＢタンパク質及びペプチドのミメトープも含む。本明細書で用いられる場合、突然変異ＢＥＨＡＢタンパク質又はペプチドのミメトープは、そのような突然変異ＢＥＨＡＢタンパク質又はペプチドの活性（例えばＢＥＨＡＢを切断させるプロテアーゼを滴定し、それにより本来のＢＥＨＡＢの切断を妨げる能力）を模倣することができるいずれかの化合物を指し、それは多くの場合、ミメトープが突然変異ＢＥＨＡＢタンパク質又はペプチドを模倣した構造を有するからである。しかしながら、ミメトープが機能的にタンパク質を模倣している限り、ミメトープが突然変異ＢＥＨＡＢタンパク質又はペプチドに類似の構造を有している必要はないことに注意するべきである。ミメトープは：それらの分解され易さが低下するように変更されたペプチド；抗−イディオタイプ及び／又は触媒性抗体又はそれらのフラグメント；単離タンパク質の非−タンパク質性免疫原部分（例えば炭水化物構造）；核酸を含む合成もしくは天然有機もしくは無機分子；ならびに／あるいは他のペプチドミメティック化合物であることができるが、それらに限られない。コンピューターが画く本発明の突然変異ＢＥＨＡＢタンパク質又はペプチドの構造を用いて、本発明のミメトープを設計することができる。オリゴヌクレオチド、ペプチド又は他の有機分子のような分子の無作為な試料を作り、そのような試料を、対応する結合パートナー（例えばＢＥＨＡＢを切断させるプロテアーゼ又は抗−ＢＥＨＡＢ抗体）を用いるアフィニティークロマトグラフィー法によってスクリーニングすることにより、ミメトープを得ることもできる。好ましいミメトープは、本発明の突然変異ＢＥＨＡＢタンパク質又はペプチドに、特に突然変異ＢＥＨＡＢタンパク質の切断部位に構造的及び／又は機能的に類似のペプチドミメティック化合物である。ミメトープ及びペプチドミメティックの形成のための方法は当該技術分野において周知であり、例えばＫａｚｍｉｅｒｓｋｉ著（Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｖｏｌ．２３），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ  ＮＪ，１９９９年）において詳細に記載されている。
【０１７０】
本発明は、哺乳類におけるＢＥＨＡＢの発現及び／又は活性を阻害するための方法も含む。熟練者は、本開示及び本明細書に開示されるデータを備えると、より高いレベルのＢＥＨＡＢ発現が腫瘍寸法を増加させ、原発性ＣＮＳ腫瘍に苦しむ哺乳類における生存率を低下させることを理解するであろう。すなわち、本明細書の他の箇所で示されるデータは、ＢＥＨＡＢを過剰発現する原発性ＣＮＳ腫瘍を有する哺乳類が、正常な量のＢＥＨＡＢを発現する哺乳類又は突然変異ＢＥＨＡＢを発現する哺乳類と比較すると、より大きな腫瘍体積及びより短い生存時間を有することを初めて示している。かくして熟練者には、原発性ＣＮＳ腫瘍の処置の方法がＢＥＨＡＢ発現の阻害を包含することが確かにわかるであろう。
【０１７１】
ＢＥＨＡＢ発現及び／又は活性の阻害剤を哺乳類に投与し、それによりＢＥＨＡＢを減少させ、治療的利益を与える。熟練者には、本明細書に提示される開示に基づき、当該技術分野において周知の、又は将来開発されるべき多様すぎるほどの方法を用いてＢＥＨＡＢを阻害できることがわかるであろう。すなわち、本発明はＢＥＨＡＢ発現の阻害、例えば転写及び／又は翻訳の阻害を包含する。これは、本明細書の他の箇所で開示されるデータにより示される通り、ＢＥＨＡＢ発現及び／又は活性のレベルの低下が腫瘍寸法の減少及び生存率の向上を含むがこれらに限られない多様な効果を媒介したからである。かくしてＢＥＨＡＢの阻害はタンパク質をコードする核酸の翻訳及び／又は転写の阻害を含むが、これらに限られない。
【０１７２】
さらに熟練者（ｒｏｕｔｉｎｅｅｒ）は、本明細書の他の箇所に提示される開示に基づき、ＢＥＨＡＢの阻害が分子の生物学的活性の阻害を含むがそれらに限られないことを理解するであろう。これは、本明細書の他の箇所に開示されるデータが示す通り、ＢＥＨＡＢ活性の阻害が、ＢＥＨＡＢが内在性プロテアーゼにより切断しない点で、原発性ＣＮＳ腫瘍の進行を制限するからである。これらのデータは、ＢＥＨＡＢ活性の阻害が原発性ＣＮＳ腫瘍などのような、しかしそれに限られない疾患の処置のために治療的利益を与えることを示している。
【０１７３】
本発明は、ＢＥＨＡＢをコードする核酸の発現の阻害によるＢＥＨＡＢの阻害を包含する。遺伝子の発現の阻害のための方法は当該技術分野における通常の熟練者に周知であり、リボザイム又はアンチセンス核酸分子の使用を含む。
【０１７４】
アンチセンス核酸分子は、ｍＲＮＡ分子のいくらかの部分に相補的なＤＮＡ又はＲＮＡ分子である。細胞中に存在する場合、アンチセンス核酸は存在するｍＲＮＡ分子にハイブリッド形成し、遺伝子産物への翻訳を阻害する。アンチセンス核酸分子を用いる遺伝子の発現の阻害は当該技術分野において周知であり（Ｍａｒｃｕｓ−Ｓｅｋｕｒａ著，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８８年，１７２：２８９）、細胞中でアンチセンス核酸分子を発現する方法もそうである（Ｉｎｏｕｅ，米国特許第５，１９０，９３１号明細書，１９９３年）。
【０１７５】
本発明はリボザイムを用いてＢＥＨＡＢの発現を阻害することを包含する。遺伝子発現の阻害のためのリボザイムの使用は当該技術分野における通常の熟練者に周知である（Ｃｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９２年，２６７：１７４７９−１７４８２；Ｈａｍｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８９年，２８：４９２９−４９３３；Ａｌｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，１６８，０５３号明細書，１９９２年）。リボザイムは、他の一本鎖ＲＮＡ分子を切断する能力を有する触媒性ＲＮＡ分子である。リボザイムは配列特異的であることが既知であり、従って特定のヌクレオチド配列を認識するように変更し（Ｃｅｃｈ著，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｎ．，１９８８年，２６０：３０３０−３０３４）、特定のｍＲＮＡ分子の選択的切断を可能にすることができる。ＢＥＨＡＢのヌクレオチド配列が当該技術分野において周知であることを得て（Ｈｏｃｋｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，６３５，３７０号明細書，１９９７年）、当該技術分野における通常の熟練者は、開示及び本明細書の内容となる参照文献を備えて過度の実験なしでアンチセンスポリヌクレオチド又はリボザイムを合成することができる。
【０１７６】
熟練者にはさらに、本開示及び本明細書に示されるデータを備えると、ＢＥＨＡＢの切断が原発性ＣＮＳ腫瘍の進行を媒介することがわかるであろう。いずれかの特定の理論に縛られることは望まないが、ＢＥＨＡＢは正常には内在性的に少量で発現され、正常な発現の間に必ずしも原発性ＣＮＳ腫瘍を引き起こさないが、ＢＥＨＡＢの切断又はさらに特定的に切断事象の産物は哺乳類における原発性ＣＮＳ腫瘍の進行を媒介すると理論付けることができる。それにより、当該技術分野における熟練者にわかる通り、ＢＥＨＡＢ切断産物の活性の阻害を原発性ＣＮＳ腫瘍に苦しむ哺乳類の処置の方法として用いることができる。
【０１７７】
本発明は、本発明の方法を実施するための適した抗体、タンパク質もしくはペプチド、ミメトープ、ペプチドミメティック及び／又は単離された核酸の製薬学的組成物の使用も包含し、組成物は適した抗体、タンパク質もしくはペプチド、ミメトープ、ペプチドミメティック及び／又は単離された核酸ならびに製薬学的に許容され得る担体を含む。
【０１７８】
本明細書で用いられる場合、「製薬学的に許容され得る担体」という用語は、それを用いて適した抗体、タンパク質もしくはペプチド、ミメトープ、ペプチドミメティック及び／又は単離された核酸を合わせることができ、且つ合わせた後に適した抗体、タンパク質もしくはペプチド、ミメトープ、ペプチドミメティック及び／又は単離された核酸を哺乳類に投与するために用いることができる化学的組成物を意味する。
【０１７９】
本発明の実施のために有用な製薬学的組成物は、１ｎｇ／ｋｇ／日〜１００ｍｇ／ｋｇ／日の投薬量を送達するために投与され得る。１つの態様において、本発明は哺乳類において１μＭ〜１０μＭの本発明の化合物の濃度を生ずる投薬量の投与を意図している。
【０１８０】
本発明の方法で有用な製薬学的組成物は経口用固体調剤、点眼剤、座薬、エアゾール、局所用もしくは他の類似の調剤において全身的に投与され得る。それらをＣＮＳ中に直接、包膜内に、脳室内に、実質内に、直接注入を介して、又は生物工学的に操作されたポリマーを介して投与することができる。適した抗体、タンパク質もしくはペプチド、ミメトープ、ペプチドミメティック及び／又は単離された核酸の他に、そのような製薬学的組成物は製薬学的に許容され得る担体及び薬剤投与を強化且つ容易にすることが知られている他の成分を含有することができる。他の可能な調剤、例えばナノ粒子、リポソーム、再閉赤血球及び免疫学的に基づく系を、本発明の方法に従って適したヒペリシン誘導体を投与するために用いることもできる。
【０１８１】
本明細書に記載される方法のいずれかを用いて同定される化合物を調製し、本明細書に開示される疾患の処置のために哺乳類に投与することができる。
【０１８２】
本発明は、本明細書で開示される疾患の処置のために有用な化合物を活性成分として含む製薬学的組成物の調製及び使用を包含する。そのような製薬学的組成物は、患者への投与に適した形態における活性成分のみから成ることができるか、あるいは製薬学的組成物は活性成分及び１種もしくはそれより多い製薬学的に許容され得る担体、１種もしくはそれより多い追加の成分又はこれらのある組み合わせを含むことができる。当該技術分野において周知の通り、活性成分は生理学的に許容され得るエステル又は塩の形態で、例えば生理学的に許容され得るカチオンもしくはアニオンと組み合わされて製薬学的組成物中に存在することができる。
【０１８３】
本明細書で用いられる場合、「製薬学的に許容され得る担体」という用語は、それを用いて活性成分を合わせることができ、且つ合わせた後に患者に活性成分を投与するために用いることができる化学的組成物を意味する。
【０１８４】
本明細書で用いられる場合、「生理学的に許容され得る」エステル又は塩という用語は、製薬学的組成物の他のいずれの成分とも適合性であり、組成物が投与されるべき患者に有害でない活性成分のエステル又は塩の形態を意味する。
【０１８５】
本明細書に記載される製薬学的組成物の調剤は、既知の、又は薬理学の技術分野において今後開発されるいずれかの方法により調製することができる。一般にそのような調製法は、活性成分を担体又は１種もしくはそれより多い他の補助成分と一緒にし、次いで必要なら、又は望ましいなら、生成物を所望の単−もしくは多−投薬単位に成形又は包装する段階を含む。
【０１８６】
本明細書に提示される製薬学的組成物の記述は主に人間への医療用投与に適した製薬学的組成物に向けられているが、熟練者はそのような組成物が一般的にすべての種類の哺乳類への投与に適していることを理解するであろう。組成物を種々の動物への投与に適したものとするための、人間への投与に適した製薬学的組成物の変更は十分に理解されており、通常の熟練獣医薬理学者は、もし行なうとしても通常の実験のみを用いてそのような変更を設計し、且つ行なうことができるであろう。本発明の製薬学的組成物の投与が意図されている患者には人間及び他の霊長類、牛、豚、馬、羊、猫及び犬のような商業的に適切な（ｒｅｌｅｖａｎｔ）哺乳類、ネズミ類（ラット及びマウスを含む）を含む哺乳類、鶏、あひる、がちょう及び七面鳥のような商業的に適切な鳥類を含む鳥類が含まれることが意図されているが、これらに限られない。
【０１８７】
本発明の方法において有用な製薬学的組成物を、経口的、直腸的、膣的、非経口的、局所的、肺的、鼻内、頬的、眼的、包膜内、脳室内、実質内投与経路又は他の投与の経路に適した調剤において調製するか、包装するか又は販売することができる。意図されている他の調剤には射出されるナノ粒子、リポソーム調剤、活性成分を含む再閉赤血球及び免疫学的に基づく系が含まれる。
【０１８８】
本発明の製薬学的組成物をばらで、一単位投薬量として又は複数の一単位投薬量として調製するか、包装するか又は販売することができる。本明細書で用いられる場合、「単位投薬量」は、あらかじめ決められる量の活性成分を含む製薬学的組成物の分離された量である。活性成分の量は一般に、患者に投与されるであろう活性成分の投薬量又はそのような投薬量の簡便な割合、例えばそのような投薬量の二分の一又は三分の一に等しい。
【０１８９】
本発明の製薬学的組成物中の活性成分、製薬学的に許容され得る担体及び追加の成分の相対的量は、処置される患者の正体、大きさ及び状態ならびにさらに組成物が投与されるべき経路に依存して変わるであろう。例えば組成物は０．１％〜１００％（ｗ／ｗ）の活性成分を含むことができる。
【０１９０】
本発明の製薬学的組成物は、活性成分の他に、さらに１種もしくはそれより多い追加の製薬学的に活性な薬剤を含むことができる。特に意図されている追加の薬剤には制吐薬及び掃去剤、例えばシアニド及びシアネート掃去剤が含まれる。
【０１９１】
通常の方法を用い、本発明の製薬学的組成物の制御された放出の（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−ｒｅｌｅａｓｅ）又は徐放性の調剤を作ることができる。
【０１９２】
経口的投与に適した本発明の製薬学的組成物の調剤を、それぞれあらかじめ決められる量の活性成分を含有する錠剤、硬質もしくは軟質カプセル、サッシェ、トローチ又はロゼンジを含むがこれらに限られない分離された固体の投薬単位の形態で調製するか、包装するか又は販売することができる。経口的投与に適した他の調剤には粉末状又は顆粒状調剤、水性もしくは油性懸濁剤、水性もしくは油性溶液あるいは乳剤が含まれるがこれらに限られない。
【０１９３】
本明細書で用いられる場合、「油性」液は炭素−含有液体分子を含み且つ水より低い極性を示すものである。
【０１９４】
活性成分を含む錠剤は、例えば場合により１種もしくはそれより多い追加の成分と一緒に活性成分を圧縮又は成形することにより製造することができる。場合により１種もしくはそれより多い結合剤、滑沢剤、賦形剤、界面活性剤及び分散剤と混合されていることができる粉末もしくは顆粒調製物のような流動性の形態における活性成分を、適した装置において圧縮することにより、圧縮錠剤を製造することができる。活性成分、製薬学的に許容され得る担体及び少なくとも混合物を湿らせるのに十分な液体の混合物を適した装置において成形することにより、成形錠剤を製造することができる。錠剤の製造に用いられる製薬学的に許容され得る賦形剤には不活性希釈剤、顆粒化及び崩壊剤、結合剤ならびに滑沢剤が含まれるがこれらに限られない。既知の分散剤にはポテトデンプン及びナトリウムデンプングリコレートが含まれるがこれらに限られない。既知の界面活性剤にはラウリル硫酸ナトリウムが含まれるがこれらに限られない。既知の希釈剤には炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、微結晶性セルロース、リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウム及びリン酸ナトリウムが含まれるがこれらに限られない。既知の顆粒化及び崩壊剤にはコーンスターチ及びアルギン酸が含まれるがこれらに限られない。既知の結合剤にはゼラチン、アラビアゴム、予備−ゼラチン化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン及びヒドロキシプロピルメチルセルロースが含まれるがこれらに限られない。既知の滑沢剤にはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸及びタルクが含まれるがこれらに限られない。
【０１９５】
錠剤をコーティングしないことができるか、あるいはそれらを既知の方法を用いてコーティングし、患者の胃腸管における崩壊を遅れさせ、それにより活性成分の持続性の放出及び吸収を与えることができる。例えば錠剤のコーティングのためにグリセリルモノステアレート又はグリセリルジステアレートのような材料を用いることができる。さらに例えば米国特許第４，２５６，１０８号；４，１６０，４５２号；及び４，２６５，８７４号明細書に記載されている方法を用いて錠剤をコーティングし、浸透的に（ｏｓｍｏｔｉｃａｌｌｙ）制御された放出の錠剤を形成することができる。錠剤はさらに、製薬学的にすばらしく且つ口に合う調製物を得るために、甘味料、風味料、着色剤、防腐剤又はこれらの何らかの組み合わせを含むことができる。
【０１９６】
生理学的に分解可能な組成物、例えばゼラチンを用い、活性成分を含む硬質カプセルを作ることができる。そのような硬質カプセルは活性成分を含み、且つさらに例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウム又はカオリンのような不活性固体希釈剤を含む追加の成分を含有することができる。
【０１９７】
生理学的に分解可能な組成物、例えばゼラチンを用い、活性成分を含む軟質ゼラチンカプセルを作ることができる。そのような軟質カプセルは活性成分を含み、それは水又は油媒体、例えばピーナッツ油、液体パラフィンもしくはオリーブ油と混合されていることができる。
【０１９８】
経口的投与に適した本発明の製薬学的組成物の液体調剤を液体形態で、又は使用前に水又は他の適したビヒクルを用いて再構築することを目的とする乾燥製品の形態で調製、包装又は販売することができる。
【０１９９】
水性もしくは油性ビヒクル中で活性成分を懸濁させるための通常の方法を用い、液体懸濁剤を調製することができる。水性ビヒクルには例えば水及び等張食塩水が含まれる。油性ビヒクルには例えばアーモンド油、油性エステル類、エチルアルコール、植物油、例えばアラキス、オリーブ、ゴマもしくはココナツ油、分別された植物油及び鉱油、例えば液体パラフィンが含まれる。液体懸濁剤はさらに懸濁化剤、分散もはくは湿潤剤、乳化剤、粘滑薬、防腐剤、緩衝剤、塩類、風味料、着色剤及び甘味料を含むがこれらに限られない１種もしくはそれより多い追加の成分を含むことができる。油性懸濁剤はさらに増粘剤を含むことができる。既知の懸濁化剤にはソルビトールシロップ、水素化食用脂肪、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム、アラビアゴム及びセルロース誘導体、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースが含まれるがこれらに限られない。既知の分散もしくは湿潤剤には天然に存在するホスファチド類、例えばレシチン、アルキレンオキシドと脂肪酸との、長鎖脂肪族アルコールとの、脂肪酸とヘキシトールから誘導される部分的エステルとの、あるいは脂肪酸とヘキシトール無水物から誘導される部分的エステルとの縮合産物（例えばそれぞれポリオキシエチレンステアレート、ヘプタデカエチレンオキシカテコール、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレート及びポリオキシエチレンソルビタンモノオレート）が含まれるがこれらに限られない。既知の乳化剤にはレシチン及びアラビアゴムが含まれるがこれらに限られない。既知の防腐剤にはメチル、エチルもしくはｎ−プロピル−パラ−ヒドロキシベンゾエート、アスコルビン酸およびソルビン酸が含まれるがこれらに限られない。既知の甘味料には例えばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、スクロース及びサッカリンが含まれる。油性懸濁剤のための既知の増粘剤には例えばビスワックス、硬質パラフィン及びセチルアルコールが含まれる。
【０２００】
水性もしくは油性溶媒中の活性成分の溶液は、液体懸濁剤と実質的に同じ方法で調製され得、主な相違は活性成分が溶媒中に懸濁されるのではなくて溶解されることである。本発明の製薬学的組成物の溶液は、液体懸濁剤に関して記載されている成分のそれぞれを含むことができ、懸濁化剤は必ずしも溶媒中における活性成分の溶解を助けないであろうことが理解されるであろう。水性溶媒には例えば水及び等張食塩水が含まれる。油性溶媒には例えばアーモンド油、油性エステル類、エチルアルコール、植物油、例えばアラキス、オリーブ、ゴマもしくはココナツ油、分別された植物油及び鉱油、例えば液体パラフィンが含まれる。
【０２０１】
既知の方法を用いて本発明の製薬学的調製物の粉末状及び顆粒状調剤を調製することができる。そのような調剤を患者に直接投与することができ、例えば錠剤の形成のため、カプセルに充填するため、又はそれに水性もしくは油性ビヒクルを加えることにより水性もしくは油性懸濁剤もしくは溶液を調製するために用いることができる。これらの調剤のそれぞれはさらに１種もしくはそれより多い分散もしくは湿潤剤、懸濁化剤及び防腐剤を含むことができる。追加の賦形剤、例えば充填剤及び甘味料、風味料もしくは着色剤もこれらの調剤中に含まれることができる。
【０２０２】
本発明の製薬学的組成物を水中油型乳剤もしくは油中水型乳剤の形態で調製、包装もしくは販売することもできる。油相は植物油、例えばオリーブもしくはアラキス油、鉱油、例えば液体パラフィン又はこれらの組み合わせであることができる。そのような組成物はさらに１種もしくはそれより多い乳化剤、例えば天然に存在するゴム、例えばアラビアゴム又はトラガカントゴム、天然に存在するホスファチド類、例えば大豆もしくはレシチンホスファチド、脂肪酸とヘキシトール無水物の組み合わせから誘導されるエステル類もしくは部分的エステル類、例えばソルビタンモノオレートならびにそのような部分的エステルとエチレンオキシドの縮合産物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレートを含むことができる。これらの乳剤は例えば甘味料もしくは風味料を含む追加の成分を含有することもできる。
【０２０３】
本発明の製薬学的組成物を直腸的投与に適した調剤において調製、包装もしくは販売することができる。そのような組成物は例えば座薬、保持浣腸調製物（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｅｎｅｍａ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）及び直腸もしくは結腸洗浄のための溶液の形態にあることができる。
【０２０４】
通常の室温（すなわち約２０℃）において固体であり、患者の直腸温度（すなわち健康な人間において約３７℃）において液体である非−刺激性の製薬学的に許容され得る賦形剤と活性成分を合わせることにより、座薬調剤を作ることができる。適した製薬学的に許容され得る賦形剤にはココアバター、ポリエチレングリコール及び種々のグリセリドが含まれるがこれらに限られない。座薬調剤はさらに酸化防止剤及び防腐剤を含むがこれらに限られない種々の追加の成分を含むことができる。
【０２０５】
活性成分を製薬学的に許容され得る液体担体と合わせることにより、保持浣腸調製物又は直腸もしくは結腸洗浄のための溶液を作ることができる。当該技術分野において周知の通り、浣腸調製物を患者の直腸の解剖学的構造に適応させた送達装置を用いて投与することができ、その中に包装することができる。浣腸調製物はさらに酸化防止剤及び防腐剤を含むがこれらに限られない種々の追加の成分を含むことができる。
【０２０６】
本発明の製薬学的組成物を、膣的投与に適した調剤において調製、包装又は販売することができる。そのような組成物は例えば座薬、含浸もしくはコーティングされた膣内に挿入可能な材料、例えばタンポン、灌注液調製物又はジェルもしくはクリーム又は膣洗浄のための溶液の形態にあることができる。
【０２０７】
材料に化学的組成物を含浸させるかもしくはコーティングするための方法は当該技術分野において既知であり、表面上に化学的組成物を堆積もしくは結合させる方法、材料の合成の間に材料の構造中に化学的組成物を導入する方法（すなわち生理学的に分解可能な材料を用いるような）ならびに水性もしくは油性溶液もしくは懸濁液を吸収剤材料中に吸収させ、続いて乾燥するかもしくは乾燥しない方法が含まれるが、これらに限られない。
【０２０８】
灌注液調製物又は膣洗浄のための溶液は、活性成分を製薬学的に許容され得る液体担体と合わせることにより調製され得る。当該技術分野において周知の通り、灌注液調製物を患者の膣の解剖学的構造に適応させた送達装置を用いて投与することができ、その中に包装することができる。灌注液調製物はさらに酸化防止剤、抗生物質、抗菌剤及び防腐剤を含むがこれらに限られない種々の追加の成分を含むことができる。
【０２０９】
本明細書で用いられる場合、製薬学的組成物の「非経口的投与」は、患者の組織の物理的侵害を特徴とする投与及び組織における傷を介する製薬学的組成物の投与の経路を含む。かくして非経口的投与は、組成物の注入、外科手術的切開を介する組成物の適用、組織−浸透性非−外科手術的傷を介する組成物の適用などによる製薬学的組成物の投与を含むがこれらに限られない。特に非経口的投与は皮下、腹腔内、筋肉内、胸骨内注射及び腎臓透析輸液法を含むがこれらに限られないことが意図されている。
【０２１０】
非経口的投与に適した製薬学的組成物の調剤は、製薬学的に許容され得る担体、例えば無菌水又は無菌の等張食塩水と合わされた活性成分を含む。そのような調剤をボーラス投与又は連続的投与に適した形態で調製、包装もしくは販売することができる。注入可能な調剤はを単位投薬形態で、例えばアンプル中又は防腐剤を含有する多−投薬量容器中で調製、包装もしくは販売することができる。非経口的投与のための調剤には油性もしくは水性ビヒクル中の懸濁剤、溶液、乳剤、ペースト及び移植可能な徐放性もしくは生分解性調剤が含まれるがこれらに限られない。そのような調剤はさらに懸濁化剤、安定剤又は分散剤を含むがこれらに限られない１種もしくはそれより多い追加の成分を含むことができる。非経口的投与のための調剤の１つの態様において、適したビヒクル（例えば発熱物質を含有しない無菌の水）を用いて再構築してから再構築された組成物を非経口的に投与するための乾燥（すなわち粉末もしくは顆粒）形態で活性成分が与えられる。
【０２１１】
無菌の注入可能な水性もしくは油性懸濁剤もしくは溶液の形態で製薬学的組成物を調製、包装もしくは販売することができる。この懸濁剤もしくは溶液は既知の技術に従って調製され得、活性成分の他に本明細書に記載される分散剤、湿潤剤又は懸濁化剤のような追加の成分を含むことができる。無毒性の非経口的に許容され得る希釈剤もしくは溶媒、例えば水又は１，３−ブタンジオールを用いてそのような無菌の注入可能な調剤を調製することができる。他の許容され得る希釈剤及び溶媒にはリンゲル液、等張塩化ナトリウム溶液及び固定油、例えば合成モノ−もしくはジ−グリセリド類が含まれるがこれらに限られない。他の有用な非経口的に投与され得る調剤には微結晶性形態で、リポソーム調製物中に、あるいは生分解性ポリマーシステムの成分として活性成分を含むものが含まれる。徐放もしくは移植のための組成物は製薬学的に許容され得るポリマー性もしくは疎水性材料、例えばエマルション、イオン交換樹脂、わずかに可溶性のポリマー又はわずかに可溶性の塩を含むことができる。
【０２１２】
局所的投与に適した調剤には液体もしくは半−液体調製物、例えばリニメント剤、ローション，水中油型もしくは油中水型乳剤、例えばクリーム、軟膏もしくは塗布剤及び溶液又は懸濁剤が含まれるがこれらに限られない。局所的に投与可能な調剤は例えば約１％〜約１０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含むことができるが、活性成分の濃度は溶媒中の活性成分の溶解性限界（ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ  ｌｉｍｉｔ）のように高いことができる。局所的投与のための調剤はさらに、本明細書に記載される１種もしくはそれより多い追加の成分を含むことができる。
【０２１３】
口腔前庭を介する肺的投与に適した調剤において本発明の製薬学的組成物を調製、包装又は販売することができる。そのような調剤は、活性成分を含み且つ約０．５〜約７ナノメーター、好ましくは約１〜約６ナノメーターの範囲内の直径を有する乾燥粒子を含むことができる。そのような組成物は簡便には、粉末を分散させるようにプロペラントの流れを向けることができる乾燥粉末溜めを含む装置を用いるか、あるいは密閉容器中で低−沸点プロペラント中に溶解もしくは懸濁された活性成分を含む装置のような自己−推進溶媒／粉末−分配容器を用いる投与のための乾燥粉末の形態にある。好ましくはそのような粉末は、粒子の少なくとも９８重量％が０．５ナノメーターより大きい直径を有し、粒子の数による少なくとも９５％が７ナノメーター未満の直径を有するような粒子を含む。より好ましくは、粒子の少なくとも９５重量％が１ナノメーターより大きい直径を有し、粒子の数による少なくとも９０％が６ナノメーター未満の直径を有する。乾燥粉末組成物は好ましくは糖のような固体微粉末希釈剤を含み、簡便には単位投薬形態で与えられる。
【０２１４】
低沸点プロペラントには一般に大気圧において６５ｏＦ未満の沸点を有する液体プロペラントが含まれる。一般にプロペラントは組成物の５０〜９９．９％（ｗ／ｗ）を構成することができ、活性成分は組成物の０．１〜２０％（ｗ／ｗ）を構成することができる。プロペラントはさらに液体非−イオン性又は固体アニオン性界面活性剤あるいは固体希釈剤（好ましくは活性成分を含む粒子と同じ大きさの粒度を有する）のような追加の成分を含むことができる。
【０２１５】
肺的送達のために調製される本発明の製薬学的組成物は、溶液、懸濁液もしくは遅延−放出ポリマーの滴の形態で活性成分を与えることもできる。そのような調剤を、活性成分を含む、場合により無菌であることができる水性もしくは希アルコール性溶液もしくは懸濁剤として調製、包装又は販売することができ、噴霧療法もしくは噴霧装置を用いて簡便に投与することができる。そのような調剤はさらにサッカリンナトリウムのような風味料、揮発性油、緩衝剤、界面活性剤又はヒドロキシ安息香酸メチルのような防腐剤を含むがこれらに限られない１種もしくはそれより多い追加の成分を含むことができる。この投与経路により与えられる滴は、好ましくは約０．１〜約２００ナノメーターの範囲内の平均直径を有する。
【０２１６】
肺的送達のために有用であるとして本明細書に記載される調剤は、本発明の製薬学的組成物の鼻内送達にも有用である。
【０２１７】
鼻内投与に適した他の調剤は、活性成分を含み且つ約０．２〜５００マイクロメーターの平均粒子を有する粗い粉末である。そのような調剤は鼻呼吸が用いられる方法で、すなわち外鼻孔の近くに保持される粉末の容器からの鼻の通過を介する急速な吸入により投与される。
【０２１８】
他の調剤は、遅延−放出ポリマー中に導入される活性成分である。そのようなポリマーは製薬の技術分野において周知であり、例えば米国特許第（４，７２８，５１２；４，７２８，５１３；５，０８４，２８７；５，２８５，１８６）号明細書に詳細に記載されている。
【０２１９】
鼻的投与に適した調剤は、例えば大体０．１％（ｗ／ｗ）のような少量から１００％（ｗ／ｗ）のような多量の活性成分を含むことができ、さらに本明細書に記載される１種もしくはそれより多い追加の成分を含むことができる。
【０２２０】
頬的投与に適した調剤において本発明の製薬学的組成物を調製、包装又は販売することができる。そのような調剤は例えば通常の方法を用いて作られる錠剤又はロゼンジの形態にあることができ、例えば０．１〜２０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含むことができ、残りは口で溶解可能もしくは分解可能な組成物及び場合により本明細書に記載される１種もしくはそれより多い追加の成分を含む。あるいはまた、頬的投与に適した調剤は、活性成分を含む粉末又はエアゾールにされるかもしくは噴霧される溶液もしくは懸濁剤を含むことができる。そのような粉末状、エアゾールにされた又はエアゾールにされた調剤は、分散されると、好ましくは約０．１〜約２００ナノメーターの範囲内の平均粒度もしくは滴寸法を有し、さらに本明細書に記載される１種もしくはそれより多い追加の成分を含むことができる。
【０２２１】
眼的投与に適した調剤において本発明の製薬学的組成物を調製、包装又は販売することができる。そのような調剤は、例えば水性もしくは油性液体担体中の活性成分の０．１〜１．０％（ｗ／ｗ）溶液もしくは懸濁液を含む例えば点眼剤（ｅｙｅ  ｄｒｏｐｓ）の形態にあることができる。そのような点眼剤はさらに緩衝剤、塩類又は本明細書に記載される１種もしくはそれより多い他の追加の成分を含むことができる。他の有用な眼的に投与可能な調剤には、微結晶性形態又はリポソーム調製物において活性成分を含むものが含まれる。
【０２２２】
直接ＣＮＳ投与に適した調剤において本発明の製薬学的組成物を調製、包装又は販売することができる。そのような調剤は例えばオマヤレザバーにより、包膜内もしくは脳室内投与により、直接実質内注入により、遅延−放出ポリマーによりあるいは製薬学的及び神経学的分野において周知の他のそのような方法により投与される液体の形態にあることができる。
【０２２３】
本明細書で用いられる場合、「追加の成分」には以下の１種もしくはそれより多くが含まれるがこれらに限られない：賦形剤；界面活性剤；分散剤；不活性希釈剤；顆粒化及び崩壊剤；結合剤；滑沢剤；甘味料；風味料；着色剤；防腐剤；生理学的に分解可能な組成物、例えばゼラチン；水性ビヒクル及び溶媒；油性ビヒクル及び溶媒；懸濁化剤；分散もしくは湿潤剤；乳化剤；粘滑薬；緩衝剤；塩類；増粘剤；充填剤；乳化剤；酸化防止剤；抗生物質；抗菌剤；安定剤；ならびに製薬学的に許容され得るポリマー性もしくは疎水性材料。本発明の製薬学的組成物中に含まれ得る他の「追加の成分」は当該技術分野において既知であり、例えばＧｅｎａｒｏ，ｅｄ，．Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ，１９８５年に記載されており、それは引用することによりその記載事項が本明細書の内容となる。
【０２２４】
典型的には、哺乳類、好ましくは人間に投与され得る本発明の化合物の投薬量は、動物の体重のキログラム当たり１μｇ〜約１００ｇの量の範囲である。投与される正確な投薬量は、処置される動物の型及び疾患の状態の型、動物の年齢及び投与の経路を含むがこれらに限られないいくつかの因子に依存して変わるであろう。好ましくは、化合物の投薬量は動物の体重のキログラム当たり約１ｍｇ〜約１０ｇで変わるであろう。より好ましくは、投薬量は動物の体重のキログラム当たり約１０ｍｇ〜約１ｇで変わるであろう。
【０２２５】
化合物は毎日数回のように頻繁に哺乳類に投与され得るか、あるいはもっと頻繁でなく、例えば１日１回、１週間に１回、２週間毎に１回、１ヶ月に１回か又はさらにもっと頻繁でなく、例えば数ヶ月毎に１回又は１年に１回かそれより少なくそれを投与することができる。投薬の頻度は熟練者に容易に明らかになり、処置される疾患の型及び重度、動物の型及び年齢などのような、しかしこれらに限られないいくつかの因子に依存するであろう。
【０２２６】
Ｂ．原発性ＣＮＳ腫瘍の診断法
本発明はさらに、神経膠腫，十分に分化した星状細胞腫、未分化星状細胞腫、多形性膠芽腫、脳室上衣腫、稀突起膠腫、神経節細胞腫、混合性神経膠腫、脳幹神経膠腫、視神経神経膠腫、髄膜腫、松果体腫瘍、下垂体腫瘍、下垂体腺腫、始原神経外胚葉腫瘍、神経線維腫、血管腫瘍、リンパ腫などを含むがこれらに限られない、ＢＥＨＡＢに関連する原発性ＣＮＳ腫瘍、他の中枢神経系腫瘍及び他の神経病理学的障害の診断のための方法を包含する。これは、本明細書の他の箇所で開示されるデータにより示される通り、ＢＥＨＡＢ過剰発現が原発性ＣＮＳ腫瘍などの進行及び浸潤性と高度に関連しているからである。従って本発明は、哺乳類におけるＢＥＨＡＢの発現のレベルを決定する方法ならびに従って原発性ＣＮＳ腫瘍の診断の方法を含む。原発性ＣＮＳ腫瘍の処置であろうと診断であろうと、本明細書で言及されるすべての場合に最も好ましい哺乳類は人間である。
【０２２７】
本発明は哺乳類における原発性ＣＮＳ腫瘍の診断の方法を含む。その方法は、第１の哺乳類から生物学的試料を得、その試料中のＢＥＨＡＢのレベル（発現、量、活性）を、他の点では第１の哺乳類と同一であるが原発性ＣＮＳ腫瘍に苦しんでいない正常な第２の哺乳類から得られる試料中のＢＥＨＡＢのレベルと比較することを含む。他の点では同一である原発性ＣＮＳ腫瘍に苦しんでいない第２の哺乳類から得られる試料中のＢＥＨＡＢのレベルと比較してより高い第１の哺乳類からの試料中のＢＥＨＡＢのレベルは、第１の哺乳類が原発性ＣＮＳ腫瘍に悩んでいることの指標となる。これは、本明細書の他の箇所で開示される通り、ＢＥＨＡＢ発現のレベルの向上が中でもより大きな腫瘍体積及び生存率の低下と関連するからである。
【０２２８】
本発明はさらに哺乳類における原発性ＣＮＳ腫瘍進行の診断の方法を含む。本開示及び本明細書中のデータを備えると熟練者にわかる通り、ＢＥＨＡＢ切断は脳腫瘍の進行を媒介し、中でもより大きな腫瘍体積及び生存時間の短縮を生ずる。従って本発明は哺乳類における脳腫瘍進行の診断の方法を含む。その方法は、第１の哺乳類から生物学的試料を得、その試料中のＢＥＨＡＢ切断のレベルを、他の点では第１の哺乳類と同一であるが原発性ＣＮＳ腫瘍に苦しんでいないか、又は標準的神経学的指示薬を用いて当該技術分野における熟練者が容易に決定できる通り、第２の哺乳類における原発性ＣＮＳ腫瘍ほど速く進行していない原発性ＣＮＳ腫瘍に苦しんでいる正常な第２の哺乳類から得られる試料中のＢＥＨＡＢ切断のレベルと比較することを含む。他の点では同一である第２の哺乳類から得られる試料中のＢＥＨＡＢ切断のレベルと比較してより高い第１の哺乳類からの試料中のＢＥＨＡＢ切断のレベルは、第１の哺乳類がより速い速度で進行する原発性ＣＮＳ腫瘍に悩んでいることの指標となる。これは、本明細書の他の箇所で開示される通り、ＢＥＨＡＢ切断のレベルの向上が中でもより大きな腫瘍体積及び生存率の低下などと関連するからである。
【０２２９】
本開示及び本明細書中のデータを備えると、当該技術分野における熟練者には、ＢＥＨＡＢ切断のレベルの決定法がウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ及び当該技術分野において周知の他の免疫学−検出アッセイを含むがこれらに限られないことがわかるであろう。
【０２３０】
１つの側面において、生物学的試料は血液試料、神経学的組織生検、脳脊髄液試料、尿、唾液などより成る群から選ばれる。
【０２３１】
本発明は、哺乳類における原発性ＣＮＳ腫瘍のための処置の有効性を評価する方法を含む。その方法は、ＢＥＨＡＢ発現の増加により媒介されるか、又はそれと関連する疾患、障害又は状態（例えば原発性ＣＮＳ腫瘍など）のための特定の処置の経過の前、その間及び後にＢＥＨＡＢ発現、量及び／又は活性のレベルを評価することを含む。これは、本明細書の他の箇所で前に記載した通り、ＢＥＨＡＢ発現、量及び／又は活性の向上がより大きな腫瘍体積及び動物の生存率の低下と関連するか又はそれを媒介するからであり、それは原発性ＣＮＳ腫瘍の故の死亡率の向上の特徴である。
【０２３２】
かくしてＢＥＨＡＢ発現／量／活性への処置の経過の効果を評価することは、処置の有効性を示し、ＢＥＨＡＢ発現、量又は活性のより低いレベルは処置法が成功であることを示す。
【０２３３】
評価されるべき治療の経過には外科手術、化学療法、放射線治療及び／又は本明細書に開示される原発性ＣＮＳ腫瘍のための複数の治療様式が含まれ得るがこれらに限られない。
【０２３４】
本発明はＢＥＨＡＢ遺伝子の発現、量又は活性の検出のためのプローブ及びプライマーを包含する。本開示及び本明細書に開示されるデータを備えると、熟練者には、ＢＥＨＡＢ遺伝子のＤＮＡ又はＲＮＡに特異的にハイブリッド形成できるプローブが与えられることがわかるであろう。本発明の目的の場合、プローブが高もしくは中度のストリンジェンシー緊縮の条件下でＢＥＨＡＢ遺伝子にハイブリッド形成するが、非関連遺伝子に有意にもしくは検出可能的にハイブリッド形成しなかったら、それらはＢＥＨＡＢのＤＮＡ又はＲＮＡに「ハイブリッド形成でき」、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．著（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９年）を参照されたい。好ましくは、プローブは高ストリンジェンシー条件下、例えば６５℃における５Ｘ  ＳＳＰＥ，１Ｘ  Ｄｅｎｈａｒｄｔの溶液，０．１％ＳＤＳ中におけるハイブリッド形成ならびに６５℃における０．２Ｘ  ＳＳＣ，１Ｘ  Ｄｅｎｈａｒｄｔの溶液，０．１％ＳＤＳの存在下における非ハイブリッド形成プローブの除去のための少なくとも１回の洗浄で適したヌクレオチド配列にハイブリッド形成する。本明細書で他にことわる場合を除いて、プローブ配列はＢＥＨＡＢ遺伝子へのハイブリッド形成を可能にするが他の遺伝子からのＤＮＡ又はＲＮＡ配列にハイブリッド形成しないように設計される。プローブは、例えば患者から単離される血液、脳脊髄液、リンパ又は組織を含むがこれらに限られない生物学的試料中に存在する核酸にハイブリッド形成させるために用いられる。次いでハイブリッド形成したプローブが検出され、それにより所望の細胞核酸の存在が示される。熟練者には、ハイブリッド形成の前に細胞核酸をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような増幅法に供することができることがわかるであろう。あるいはまた、ＢＥＨＡＢ遺伝子を増幅し、増幅産物をＤＮＡ配列決定に供することができる。ＢＥＨＡＢ遺伝子をＤＮＡ配列分析により検出することができるか、あるいは特定の対立遺伝子へのハイブリッド形成を可能にするのに十分な条件下て且つ十分な時間、ＢＥＨＡＢ特異的オリゴヌクレオチドプローブとハイブリッド形成させることができる。典型的には、ハイブリッド形成緩衝液はテトラメチルアンモニウムクロリドなどを含有することができ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．著（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９年）を参照されたい。
【０２３５】
本発明の核酸プローブはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、核酸類似体（例えばペプチド核酸）又はそれらの組み合わせから成ることができ、長さが約１２ヌクレオチドのように少ないことができ、通常は長さが約１４〜１８ヌクレオチドであり、ＢＥＨＡＢ遺伝子の全配列のように大きいことができる。プローブの大きさの選択はプローブの用途にいくらか依存し、十分に当該技術分野における熟練の範囲内である。
【０２３６】
当該技術分野において周知の方法を用いて適したプローブを構築し、標識することができる。例えば１２塩基の比較的短いプローブを合成により形成し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて３２Ｐで標識することができる。約７５塩基から１．５ｋｂ未満までの比較的長いプローブは好ましくは例えば［α３２Ｐ］ｄＣＴＰ、ジゴキシゲニン−ｄＵＴＰ又はビオチン−ｄＡＴＰのような、しかしこれらに限られない標識された前駆体の存在下におけるＰＣＲ増幅により形成される。１．５ｋｂより大きいプローブは一般に、関連プローブを含有するプラスミドを用いて細胞をトランスフェクションし、トランスフェクションされた細胞を大量に増殖させ、トランスフェクションされた細胞から関連配列を精製することにより最も容易に増幅され、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．著（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９年）を参照されたい。
【０２３７】
例えば放射性マーカー、蛍光マーカー、酵素的マーカー及び発色マーカーを含む多様なマーカーによりプローブを標識することができる。３２Ｐの使用は特定のプローブのマーキング又は標識のためのほんの１つの例である。
【０２３８】
プローブを用いて試料中のＢＥＨＡＢ  ｍＲＮＡ又はＤＮＡの存在を検出できることは、本発明のこの側面の特徴である。しかしながら関連する試料が限られた数でしか存在しない場合、関連する配列を増幅してそれをもっと容易に検出できるように又は得られるようにするのが有益であり得る。
【０２３９】
選ばれた配列を増幅するために、例えばＲＮＡ増幅（Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９８８年，６：１１９７−１２０２；ｋｒａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｎａｔｕｒｅ，１９８９年，３３９：４０１−４０２；Ｌｏｍｅｌｉ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．，１９８９年，３５：１８２６−１８３１；米国特許第４，７８６，６００号明細書を参照されたい）及びリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）又はＰＣＲを用いるＤＮＡ増幅（米国特許第４，６８３，１９５；４，６８３，２０２及び４，８００，１５９号明細書）（切断可能な連鎖の使用を含む交互検出／増幅システムを記載している米国特許第４，８７６，１８７及び５，０１１，７６９号明細書も参照されたい）あるいは十分に当該技術分野における通常の熟練のレベル内である他の核酸増幅法を含む多様な方法を用いることができる。例えばＰＣＲに関し、当該技術分野において既知の通りにその方法を修正することができる。一次オリゴヌクレオチドの１つの中におけるバクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列の導入によりＰＣＲの転写増強を行なうことができ、抗−ＲＮＡ：ＤＮＡ抗体を用いて増強されたエミッター（ｅｍｉｔｔｅｒ）からの産物の免疫酵素的検出を行なうことができる（Ｂｌａｉｓ著，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９４年，６０：３４８−３５２）。ＰＣＲを逆ドット−ブロットハイブリッド形成と組み合わせて用いることもできる（Ｉｉｄａ  ｅｔ  ａｌ著，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１９９３年，１１４：１６７−１７２）。ＰＣＲ産物をｄＵＴＰの導入により定量的に分析することができ（Ｄｕｐｌａａ  ｅｔ  ａｌ．著，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９３年，２１２：２２９−２３６）、ＰＣＲ−遺伝子プローブ検出のために試料をフィルターサンプリングする（ｆｉｌｔｅｒ  ｓａｍｐｌｅｄ）ことができる（Ｂｅｊ  ｅｔ  ａｌ．著，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９１年，５７：３５２９−３５３４）。
【０２４０】
本発明は、ＢＥＨＡＢ  ＤＮＡの検出のためにＰＣＲ増幅が用いられるＢＥＨＡＢ過剰発現の検出の方法及び従って原発性ＣＮＳ腫瘍の診断の方法を包含する。例としてＤＮＡ試料を約９２ｏ〜約９５℃において変性させ、一本鎖ＤＮＡを生成させる。ＤＮＡ試料はＲＮＡから生成するｃＤＮＡであることができる。次いでプライマー中のＡＴ／ＧＣの割合及び当該技術分野において周知の他の因子に依存して約３７℃〜約７０℃において、特異的プライマーを一本鎖ＤＮＡにアニーリングさせる。プライマーを例えばＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ又は他の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いて約７２℃で拡張し、鋳型に反対の鎖を生成させる。これらの段階が１サイクルを構成し、それを繰り返して選択された配列を増幅することができる。より高い特異性のためにネステッドＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ）を行なうことができる。ネステッドＰＣＲでは、第１の増幅産物内の配列から誘導される第２組のプライマーを用いて第２の増幅が行なわれる。ＢＥＨＡＢの全コーディング領域を例えばｃＤＮＡから、それらの配列の決定に簡便なサイズであるフラグメント長の生成に適した数のプライマーを用いて増幅することができる。必要なプライマーの数は当該技術分野における熟練者に周知であろう。
【０２４１】
本発明はさらに増幅のためにＬＣＲ増幅が用いられる方法を含む。上流プライマーの５’塩基が所望の遺伝子中のユニーク塩基対にハイブリッド形成し、ＢＥＨＡＢ遺伝子を特異的に検出することができるようにＬＣＲプライマーを合成することができる。
【０２４２】
本発明の態様内で、自動化非−同位体的戦略においてプローブを用いることができ、その戦略では標的核酸配列がＰＣＲにより増幅され、次いで所望の産物が例えば測色的オリゴヌクレオチド連結アッセイ（ＯＬＡ）により決定される（Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９０年，８１：８９２３−８９２７）。
【０２４３】
選ばれた配列の増幅のためのプライマーは、ＢＥＨＡＢに高度に特異的であり、標的配列と安定な二重らせんを形成する配列から選ばれるべきである。当該技術分野において周知の通り、プライマーは又、自身もしくは他のプライマーと、特に３’末端において非−相補的でなければならず、二量体を形成してはならず、ＤＮＡの他の領域と二次構造もしくは二重らせんを形成してはならない。一般に約１８〜約２０ヌクレオチドのプライマーが好ましく、当該技術分野において周知の方法を用いて容易に合成することができる。当該技術分野において周知の方法を用い、ＰＣＲ産物及び他の核酸増幅産物を定量することができる（Ｄｕｐｌａａ  ｅｔ  ａｌ．著，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９３年，２１２：２２９−２３６；Ｈｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９３年，１１：１０２６−１０３０）。
【０２４４】
本開示及び本明細書に開示されるデータを備えると、熟練者は、哺乳類におけるＢＥＨＡＢ核酸の過剰発現を検出することができる診断学を開発できることを容易に理解するであろう。これは、本明細書の他の箇所のデータにより示される通り、正常な内在性ＢＥＨＡＢ発現を有する哺乳類又は切断不可能なＢＥＨＡＢ突然変異体の過剰発現を有する哺乳類と比較した時の哺乳類におけるＢＥＨＡＢの発現の増加が、より大きな腫瘍及び生存時間の短縮を生ずるからである。それにより、哺乳類又は細胞におけるＢＥＨＡＢ発現のレベルの決定を、中でも原発性ＣＮＳ腫瘍などの検出のための強力且つ新規な診断法として用いることができる。
【０２４５】
Ｃ．有用な化合物の同定法
本発明はさらに、細胞中におけるＢＥＨＡＢの発現に影響する化合物の同定の方法を含む。その方法は、細胞を試験化合物と接触させ、そのように接触した細胞におけるＢＥＨＡＢの発現のレベルを、化合物と接触していない他の点では同一である細胞におけるＢＥＨＡＢの発現のレベルと比較することを含む。試験化合物と接触していない他の点では同一である細胞におけるＢＥＨＡＢの発現のレベルと比較して、試験化合物と接触した細胞におけるＢＥＨＡＢの発現のレベルがより高いかもしくはより低い場合、これは試験化合物が細胞におけるＢＥＨＡＢの発現に影響することの指標となる。
【０２４６】
本発明は、ＢＥＨＡＢの発現に影響する化合物の同定法を包含する。本明細書に提示される開示に基づき、当該技術分野における熟練者には、プローブ（例えばＢＥＨＡＢと特異的に結合する抗体及び／又は核酸プローブ）を用いてＢＥＨＡＢの量の評価を行なうことができ、その方法がＢＥＨＡＢの発現に選択的に影響する化合物を同定できることがわかるであろう。そのような化合物はＢＥＨＡＢの発現の阻害に有用である。当該技術分野における熟練者は、そのような化合物がＢＥＨＡＢの発現の増加により媒介される及び／又はそれに関連する疾患、障害又は状態の抑制に有用であり得、例えばＢＥＨＡＢの量の増加が原発性ＣＮＳ腫瘍と関連し、ＢＥＨＡＢ発現が腫瘍体積の増加及び生存率の低下と関連することを理解するであろう。かくして本明細書に提示される開示に基づき、熟練者には、それがＢＥＨＡＢの発現を低下させるために有用であり得ることがわかるであろう。
【０２４７】
同様に、本発明は細胞におけるＢＥＨＡＢの発現を低下させる化合物の同定の方法を含む。その方法は、細胞を試験化合物と接触させ、化合物と接触した細胞におけるＢＥＨＡＢの発現のレベルを、化合物と接触していない他の点では同一である細胞におけるＢＥＨＡＢの発現のレベルと比較することを含む。試験化合物と接触しなかった細胞におけるレベルと比較して、化合物と接触した細胞におけるＢＥＨＡＢの発現のレベルがより低い場合、それは試験化合物が細胞におけるＢＥＨＡＢの発現を低下させることの指標となる。
【０２４８】
本発明は細胞におけるＢＥＨＡＢの切断を減少させる化合物の同定の方法も含む。その方法は、細胞を試験化合物と接触させ、化合物と接触した細胞におけるＢＥＨＡＢ切断のレベルを、化合物と接触していない他の点では同一である細胞におけるＢＥＨＡＢ切断のレベルと比較することを含む。化合物と接触しなかった細胞におけるレベルと比較して、化合物と接触した細胞におけるＢＥＨＡＢ切断のレベルがより低い場合、それは試験化合物が細胞におけるＢＥＨＡＢの切断を減少させることの指標となる。
【０２４９】
細胞におけるＢＥＨＡＢ切断を減少させる化合物は有用であり、それはＢＥＨＡＢ切断が原発性ＣＮＳ腫瘍進行及び浸潤性と関連することが本明細書で示されているからである。さらに、本明細書で開示されるデータは、ＢＥＨＡＢ切断がより大きな腫瘍体積及び動物の生存率の低下を媒介するか、又はそれらと関連することを示している。かくしてＢＥＨＡＢ切断を減少させる化合物の同定の方法を、原発性ＣＮＳ腫瘍を含むがこれに限られない種々の疾患の処置に用いることができる。
【０２５０】
熟練者にはさらに、本発明が細胞又は動物において有用な化合物の同定の方法に限られないことがわかるであろう。すなわち本発明は無細胞系において有用な化合物の同定の方法を含む。本明細書で用いられる場合、無細胞系は、反応が起こるのに必要な成分が存在するが細胞に伴っていない試験管内アッセイを指す。そのような成分には細胞酵素、転写因子、タンパク質、核酸などが含まれ得、但しそれらは実質的に細胞から自由である。本明細書のデータにより開示される通り、免疫沈降アッセイの使用などを含んでＢＥＨＡＢ切断アッセイを細胞又は動物から離れて行なうことができる。それにより、本発明は無細胞系において原発性ＣＮＳ腫瘍を処置するのに有用な化合物の同定の方法を含む。
【０２５１】
本明細書に提示される開示に基づき、当該技術分野における熟練者には、ＢＥＨＡＢをコードするｍＲＮＡの発現のレベルの決定により、細胞におけるＢＥＨＡＢの発現のレベルを測定できることがわかるであろう。あるいはまた、本明細書で抗−ＢＥＨＡＢ抗体を用いるウエスタンブロット分析を用いて例示される通り、ＢＥＨＡＢ生産及び切断を評価するために免疫学的方法を用いることにより、ＢＥＨＡＢの発現及び／又は切断のレベルを決定することができる。さらに、ノザンブロット及びＰＣＲアッセイなどのような核酸に基づく検出法を同様に用いることができる。さらに、ＢＥＨＡＢ活性及び／又は切断により影響を受け得る種々のパラメーター、例えば腫瘍体積、腫瘍浸潤性及び動物の生存率のレベルの決定により、細胞におけるＢＥＨＡＢ活性及び／又は切断のレベルを評価することもできる。かくして本明細書に提示される開示及び実施のための変形に基づき、当該技術分野における熟練者には、本明細書に開示されている方法及び将来開発され得る他の方法を含んで、細胞におけるＢＥＨＡＢ活性及び切断のレベルの評価のために用いられ得る当該技術分野において周知の多数の方法があることがわかるであろう。
【０２５２】
さらに、ＢＥＨＡＢ又はその切断産物と特異的に結合するタンパク質、例えばレセプター又は他のＢＥＨＡＢ−関連タンパク質を、例えば酵母２ハイブリッドアッセイを用いて同定することができる。酵母２ハイブリッドアッセイ法は当該技術分野において周知であり、十分に実証された方法、例えばＢａｒｔｅｌ  ａｎｄ  Ｆｉｅｌｄｓ著（Ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｒｙ，ＮＣ）に記載されている方法を用いて行なうことができる。従って、本明細書に提示される記載、例えばＢＥＨＡＢタンパク質の全アミノ酸及び核酸配列を備えると、当該技術分野における熟練者は、ＢＥＨＡＢ標的もしくはレセプタータンパク質のような、しかしこれらに限られないＢＥＨＡＢ又はその切断産物と特異的に結合するタンパク質を容易に同定することができる。
【０２５３】
当該技術分野における熟練者は、本明細書に提示される開示に基づき、本発明が本明細書の他の箇所で議論される方法を用いて同定される分子を包含することを理解するであろう。すなわちＢＥＨＡＢレセプタータンパク質又はＢＥＨＡＢ標的タンパク質のような、しかしそれらに限られないＢＥＨＡＢと関連する分子を用い、ＢＥＨＡＢ−関連タンパク質とのＢＥＨＡＢ切断産物相互作用により媒介される疾患、障害又は状態、例えば原発性ＣＮＳ腫瘍、神経膠腫，十分に分化した星状細胞腫、未分化星状細胞腫、多形性膠芽腫、脳室上衣腫、稀突起膠腫、神経節細胞腫、混合性神経膠腫、脳幹神経膠腫、視神経神経膠腫、髄膜腫、松果体腫瘍、下垂体腫瘍、下垂体腺腫、始原神経外胚葉腫瘍、神経線維腫、血管腫瘍及びリンパ腫のための治療学及び診断学を開発することができる。すなわち当該技術分野における熟練者には、ＢＥＨＡＢと特異的に結合する抗体の議論において本明細書の他の箇所でもっと十分に示される通り、ＢＥＨＡＢ切断産物レセプター／リガンド相互作用及び他のＢＥＨＡＢ結合相互作用の阻害によって細胞におけるＢＥＨＡＢ切断産物活性を阻害する治療学を開発するために、ＢＥＨＡＢ−関連タンパク質を用い得ることがわかるであろう。
【０２５４】
上記で開示された方法により同定されるＢＥＨＡＢ−関連タンパク質を、ＢＥＨＡＢ−関連タンパク質もしくはその一部と細胞を接触させることによりＢＥＨＡＢ相互作用を阻害するために直接用いることができるか、あるいはそれらを用いてＢＥＨＡＢとのＢＥＨＡＢ−関連タンパク質相互作用を阻害することができる抗体及び／又はペプチドミメティックを開発し、それによりＢＥＨＡＢ機能、活性及び切断を阻害することができる。かくしてＢＥＨＡＢレセプタータンパク質又はＢＥＨＡＢ切断産物タンパク質を含むＢＥＨＡＢ−関連タンパク質は有用であり、本発明により包含される。
ＶＩＩ．キット
本発明は、突然変異ＢＥＨＡＢをコードする核酸、突然変異ＢＥＨＡＢポリペプチド、ＢＥＨＡＢに特異的に結合する抗体、ＢＥＨＡＢをコードする核酸に相補的であるがアンチセンス配向にある核酸、ＢＥＨＡＢ切断産物への抗体を含む化合物、アプリケーター及び本発明の方法を実施するための化合物の使用を記載している使用説明資料を含む種々のキットを包含する。モデルキットを下記に記載するが、本開示を見ると、他の有用なキットの内容は熟練者に明らかであろう。これらのキットのそれぞれは本発明内に意図されている。
【０２５５】
１つの側面において、本発明は原発性ＣＮＳ腫瘍の処置のためのキットを含む。キットは本発明に関して本明細書に開示される方法と同じやり方で用いられる。要するに、本発明の突然変異ＢＥＨＡＢ分子をコードする核酸と細胞を接触させるためにキットを用いることができる。さらに、キットはアプリケーター及びキットの使用に関する使用説明資料を含む。これらの指示は本明細書に提示される実施例を簡単に具体化している。
【０２５６】
キットはさらに製薬学的に許容され得る担体を含む。組成物は、本明細書の他の箇所で示される適した量で与えられる。さらに投与の経路及び投与の頻度は本明細書の他の箇所で前に示した通りである。
【０２５７】
他の側面において、本発明は原発性ＣＮＳ腫瘍の処置のためのキットを含む。キットは本発明に関して本明細書に開示される方法と同じやり方で用いられる。要するに、本発明の突然変異ＢＥＨＡＢポリペプチド分子と細胞を接触させるためにキットを用いることができる。さらに、キットはアプリケーター及びキットの使用に関する使用説明資料を含む。これらの指示は本明細書に提示される実施例を簡単に具体化している。キットはさらに製薬学的に許容され得る担体を含む。組成物は、本明細書の他の箇所で示される適した量で与えられる。さらに投与の経路及び投与の頻度は本明細書の他の箇所で前に示した通りである。
【０２５８】
本発明はさらに原発性ＣＮＳ腫瘍の処置のためのキットを包含する。熟練者には、本明細書に示される方法に従ってキットを用いることができることがわかるであろう。キットはＢＥＨＡＢ又はそのフラグメントに結合する抗体、小分子又はペプチド、アプリケーター及び本明細書に提示される実施例に実質的に類似の使用説明資料を含む。キットはさらに製薬学的に許容され得る担体を含み、その組成、投与の経路及び投与の頻度は本明細書の他の箇所で前に開示された通りである。
【０２５９】
さらに本発明は、哺乳類ＢＥＨＡＢ分子又はそのフラグメントをコードする核酸に相補的なアンチセンス核酸を含むキットを包含する。本発明の方法に従ってそのようなキットを用い、ＢＥＨＡＢの発現の低下を媒介することができる。さらにキットはアプリケーター及びキットの使用に関する使用説明資料を含む。これらの指示は本明細書に提示される実施例を簡単に具体化している。キットはさらに製薬学的に許容され得る担体を含む。アンチセンス核酸及び製薬学的に許容され得る担体は、本明細書の他の箇所で示される適した量で与えられる。さらに、投与の経路及び投与の頻度は本明細書の他の箇所で前に示した通りである。
【０２６０】
本発明はさらに原発性ＣＮＳ腫瘍の処置のためのキットを包含する。要するに、キットはＢＥＨＡＢ切断産物又はそのフラグメントに特異的に結合する抗体、小分子又はペプチドを含み、本明細書の他の箇所に示される方法に従って用いられ得る。本発明のキットはさらにアプリケーター及びキットの使用に関する本明細書に示される方法に類似の使用説明資料を含む。キットは製薬学的に許容され得る担体も含み、その組成、投与の経路及び頻度ならびに投薬量は本明細書で前に示されている。
【０２６１】
実験的実施例
ここで以下の実施例に言及して本発明を記載する。これらの実施例は例示のみの目的で提示され、本発明は全くこれらの実施例に制限されるとみなされるべきではなく、むしろ本明細書に提示される記述の結果として明らかとなるすべての変形を包含するとみなされるべきである。
【０２６２】
ここでこの実施例において提示される実験で用いられる材料及び方法を記載する。
【０２６３】
部位特異的突然変異誘発：全長ＢＥＨＡＢ  ｃＤＮＡをＺｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．著（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８年，１８：２３７０−２３７６）に記載されている通りに、真核発現ベクターｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のＥｃｏＲ１部位中にクローニングした。ＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ部位特異的突然変異誘発キットを用い、製造者の案に従って（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、全長ＢＥＨＡＢ発現ベクターを突然変異させた。蛍光標識ジデオキシヌクレオチド鎖終結法を用いる配列決定により、適した突然変異の導入を確証した。
【０２６４】
細胞培養及びトランスフェクション：ＣＮＳ−１細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、１０％胎児ウシ血清（ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ中で生育させ、保持した。4日毎に細胞を分け（１：６〜１：１０）、再−平板培養した。７５％密集細胞を６０ｍｍの組織培養平板において平板培養し、４μｇの適した発現構築物及びＦｕｇｅｎｅ  ６を用い、製造者の案に従って（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）トランスフェクションした。要するに、ＤＮＡ及びＦｕｇｅｎｅ  ６を細胞と一緒にそれらの標準的培地中で６時間インキュベーションし、その後培地を除去し、新しい培地で終夜置き換えた。翌日、Ｇ−４１８（８０μｇ／μｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて細胞をトランスジーンの発現に関して選択した。Ｇ−４１８−補足培地中に細胞を２週間半保持することにより、トランスフェクションされた細胞の安定なプールを誘導した。選択の後、安定にトランスフェクションされた細胞のプールを、（４０μｇ／μｌ）の濃度でＧ−４１８を含有する培地中に保持した。
【０２６５】
試験管内増殖及び細胞死アッセイ：細胞増殖及び細胞死へのトランスフェクションの影響を評価した。両アッセイのために、２００μｌの培地中にウェル毎に４Ｘ１０４個の細胞の初期平板密度を有する９６ウェル組織培養平板において細胞を成育させた。ＭＴＴ（３，−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の細胞吸収により細胞増殖を測定した。要するに、１００μｌの培地を取り出し、細胞死アッセイのために保存した。残りの細胞及び培地に２５μｌのＭＴＴ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏのリン酸塩緩衝食塩水；ＤＰＢＳ中の２ｍｇ／ｍｌ）を加え、加湿されたインキュベーター（空気中で５％ＣＯ２）中で３７℃において３時間インキュベーションした。イソプロパノール中の４０ｍＭ塩酸の１００μｌを加えて得られる生成物を可溶化し、試料を３７℃で２時間インキュベーションした。マイクロプレートリーダーを用いて５５０ｎＭにおける吸光度を測定することにより、試料を四重に分析した。
【０２６６】
細胞死アッセイに１００μｌの無細胞培地を用いた。Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用い、製造者の指示に従って（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、培地を乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性に関して検定した。要するに、ＬＤＨによりピルベートに酸化され、ＮＡＤ＋をＮＡＤＨに還元するラクテートと一緒に培地をインキュベーションした。ジアホラーゼの存在下でＮＡＤＨは黄色のテトラゾリウム塩から赤いホルマザン塩への転換を触媒する。マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎＭにおける吸光度を測定することにより、試料を四重に分析した。
【０２６７】
動物研究：雌のＬｅｗｉｓラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を麻酔し（７５ｍｇ／ｋｇケタミン，５ｍｇ／ｋｇキシラジン）、耳内線から３．０ｍｍ下に切開バー（ｉｎｃｉｓｏｒ  ｂａｒ）を設定して定位装置（Ｄａｖｉｄ  Ｋｏｐｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｔｕｊｕｎｇａ，ＣＡ）内に置いた。約７０％〜８０％密集ＣＮＳ−１細胞を１００ｍｍの組織培養平板からトリプシンを用いて収穫した。細胞をＤＰＢＳ中で１回洗浄し、１μｇ／μｌのＭｇＣｌ２、１μｇ／μｌのＣａＣｌ２及び０．１％のグルコースが補足されたリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に、細胞の濃度がμｌ当たり１Ｘ１０５個であった阻害剤を用いる生存曲線の場合を除いて、μｌ当たり５Ｘ１０４個の細胞の濃度で懸濁させた。２６ゲージの斜角針（ｂｅｖｅｌｅｄ  ｎｅｅｄｌｅ）が取り付けられた１０μｌのＨａｍｉｌｔｏｎシリンジを用い、ブレグマに対して２．８ｍｍ後部、中線に対して２．２ｍｍ横及び硬膜に対して５．０ｍｍ腹側の座標において右視床中に視床内注入を行なった。３μｌの合計体積の細胞懸濁液を３分かけて注入し、針をさらに１分間その場所に残してからゆっくり引き出した。
【０２６８】
６時間毎に動物の健康及び生存率を評価した。横だおしにされてから１５秒以内に直立できなかった動物は生存の終点に達したと考え、犠牲にした。生存の最後の日に犠牲にした日を記録した。
【０２６９】
組織学：ラットを深く麻酔し、経心臓的にＰＢＳ、続いて氷−冷４％ＰＢＳ−パラホルムアルデヒドを灌流した。４０μＭの凍結切片を低温槽上で薄切りにし、トランスフェクションされたＣＮＳ−１細胞が移植された動物からの脳を冠状に薄切りにした。５番目の切片毎に腫瘍体積の評価のためにクレシルバイオレットで染色した。
【０２７０】
画像分析及び腫瘍体積評価：組織切片をＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ（ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｉｈ−ｉｍａｇｅ／）を用いて分析した。実験条件が隠された研究者により、腫瘍を通して５番目の切片毎に腫瘍面積を手動で区画した。Ｃａｌｖａｌｉｅｒｉの体型測定的体積の算定器（Ｃａｌｖａｌｉｅｒｉ’ｓ  ｅｓｔｉｍａｔｏｒ  ｏｆ  ｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｉｃ  ｖｏｌｕｍｅ）を用いて腫瘍体積を再構築した（Ｒｏｓｅｎ  ａｎｄ  Ｈａｒｒｙ著，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９０年，３５：１１５−１２４）。
【０２７１】
電気泳動及びウエスタン分析：試料を８％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動させ、次いでタンパク質を電気泳動によりニトロセルロースに転移させた（Ｌａｅｍｍｌｉ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｎａｔｕｒｅ，１９７０年，２２７：６８０−６８５；Ｔｏｗｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９７９年，７６：４３５０−４３５４）。ブロットをウサギのアフィニティー精製された抗血清（１：１０，０００）又はＢ５０（１：５０００）（Ｍａｔｔｈｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０００年，２７５：２２６９５−２２７０３）、続いてアルカリ性ホスファターゼ−共役ヤギ抗−ウサギＩｇＧ二次抗体（１：４０００，Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）と一緒にインキュベーションした。ニトロブルーテトラゾリウム及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイルホスフェートを用いて免疫反応性バンドを視覚化した。
【０２７２】
統計的分析：トランスフェクションされた細胞系が移植された動物の間の比較の有意性を、一元分散分析（ＡＮＯＶＡ）により決定した。試験管内増殖及び細胞死アッセイからの結果を４Ｘ７回（細胞系Ｘ日）繰り返される測定ＡＮＯＶＡを用いて分析した。
【０２７３】
この実施例で示される実験の結果をここで記述する。
【０２７４】
ＢＥＨＡＢ切断へのＮＶＹ突然変異の影響：原発性ＣＮＳ腫瘍におけるＢＥＨＡＢ切断の役割を調べるために、ＢＥＨＡＢ切断を遮断するか又は阻害する構築物を形成した。ＢＥＨＡＢ  Ｇｌｕ３９５−Ｓｅｒ３９６切断部位の突然変異の全長タンパク質の切断への影響を調べた。ＢＥＨＡＢ  Ｇｌｕ３９５−Ｓｅｒ３９６部位に非常に類似した切断部位を有するアグレカンについての以前の研究は、切断部位のすぐ下流の３個のアミノ酸のＡＲＧからＮＶＹへの突然変異が切断を完全に遮断することを示した（Ｆｏｓａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０００年，２７５：３３０２７−３３０３７）。従って部位特異的突然変異誘発を用い、ＢＥＨＡＢ切断へのＮＶＹ突然変異の影響を調べた。この突然変異はアミノ酸切断部位を３９３Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ３９８から３９３Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ３９８（それぞれ配列番号：１及び配列番号：２）に変えた。ＢＥＨＡＢ切断へのＮＶＹ突然変異の影響を評価するために、全長ＢＥＨＡＢ又は突然変異したＢＥＨＡＢ構築物を用いてＣＮＳ−１細胞を一過的にトランスフェクションし、得られるタンパク質をＢ６及びＢ５０抗体（それぞれＢＥＨＡＢ切断により生成するＣ−末端及びネオ−エピトープに特異的に結合する，Ｍａｔｔｈｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０００年，２７５：２２６９５−２２７０３）を用いるウエスタンブロットにより分析した。
【０２７５】
正常な及び突然変異したＢＥＨＡＢの両方を用いて一過的にトランスフェクションされた細胞はＢ６抗体を用いて示される通り、全長産物を生産した（図１Ａ）。正常な全長ＢＥＨＡＢは、Ｂ５０抗体を用いて示される通り、３９３Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ３９８切断部位において切断した。全く対照的に、ＮＶＹ突然変異構築物を用いてトランスフェクションされた細胞により多量の全長タンパク質が作られたが、切断は検出されなかった（図１Ａ）。ＢＥＨＡＢのＮＶＹ突然変異形態が完全に切断できなかったのかどうかを決定するために、Ｂ５０抗体を用いて試料を免疫沈降させ、微量のそのような切断産物を検出した。このより高感度のアッセイを用いても反応性産物は検出されず、ＮＶＹ突然変異が全長タンパク質の切断を完全に阻害したことを示した。
【０２７６】
正常な全長ＢＥＨＡＢ及びＮＶＹ構築物を用いてＣＮＳ−１細胞を共−トランスフェクションすることにより、ＢＥＨＡＢの切断へのＮＶＹ突然変異の影響をさらに調べた。これらの実験は、ＮＶＹ突然変異ＢＥＨＡＢが正常な基質の切断を阻害できるかどうかを決定するために設計された。２μｇの正常なＢＥＨＡＢ発現構築物及び０、１、２又は４μｇの突然変異したＢＥＨＡＢ構築物を用いて細胞を共−トランスフェクションした。ＮＶＹ突然変異構築物の添加は全長ＢＥＨＡＢの量を増加させたが、それはプロテアーゼが正常なＢＥＨＡＢタンパク質を切断させる能力に影響を有していなかった（図１Ｂ）。特定の理論に縛られることは望まないが、これらの結果は、ＢＥＨＡＢの突然変異形態自身は切断不可能であるが、それは必ずしもプロテアーゼを阻害しないことを示唆している。
【０２７７】
細胞増殖及び細胞死へのＮＶＹ突然変異体の影響：
細胞増殖及び細胞死へのＢＥＨＡＢのＮＶＹ切断部位突然変異の影響を評価するために、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現ベクター（ＣＮＳ−１−ＧＦＰ）、正常なＢＥＨＡＢ発現ベクター（ＣＮＳ−１−ＦＬ）又はＮＶＹ突然変異ベクター（ＣＮＳ−１−ＮＶＹ）を用いてＣＮＳ−１細胞を安定にトランスフェクションした。Ｇ４１８中で安定にトランスフェクションされた細胞のプールを選択し、上記の通りに分析した。一過的トランスフェクションを用いて観察された通り、ＣＮＳ−１−ＮＶＹ細胞のプールは全長ＢＥＨＡＢを生成したが、それを切断させなかった（図１Ｃ）。
【０２７８】
ＭＴＴアッセイを用い、安定にトランスフェクションされた細胞について試験管内で細胞増殖を分析した。ミトコンドリア呼吸鎖の酵素系であるスクシネート−テトラゾリウムレダクターゼ系によりＭＴＴを色素に転換し、それにより生存細胞の数の尺度を得た。７日間に及んで増殖を評価した。いずれのトランスフェクションされた細胞においても細胞増殖における差はなかった（図２Ａ）。さらにトランスフェクションされたプールのいずれもトランスフェクションされない親ＣＮＳ−１細胞からの差を示さなかった。
【０２７９】
ＬＤＨアッセイを用いて細胞死を評価した。ＬＤＨは正常には細胞質中のみに存在する酵素である。培地中でＬＤＨ活性を測定し、ここでＬＤＨは死亡したかもしくは死にかけている細胞により放出される場合にみに存在する。すべての細胞系において最初の４日間に及んで、約２％〜約３％の低いレベルの細胞死があった。しかしながらその後毎日細胞死はわずかに増加し、いずれの時点においてもいずれの細胞系の間でもパーセント細胞死における差はなかった（図２Ｂ）。従って、突然変異した構築物は切断不可能であるが、それは試験管内における細胞増殖又は死に明らかな影響を有していない。
【０２８０】
ＮＶＹ切断不可能ＢＥＨＡＢはＣＮＳ−１腫瘍の表現型に影響しない：以前の研究は、正常な全長ＢＥＨＡＢを用いてトランスフェクションされたＣＮＳ−１細胞がＧＦＰトランスフェクションされた標準より大きな腫瘍を形成することを示している。しかしながら、ＢＥＨＡＢを生産もしないし切断させもしない９Ｌ細胞において、全長ＢＥＨＡＢを用いるトランスフェクションは腫瘍の表現型を変化させない（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｊ．ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８年，１８：２３７０−２３７６）。腫瘍進行におけるＢＥＨＡＢ切断の役割を調べるために、上記の発現ベクターを用いて安定にトランスフェクションされたＣＮＳ−１細胞のプールを頭蓋内移植片として成長させた。腫瘍の移植から８日後、動物（ｎ＝８）に灌流し、それらの脳を組織学のために処理した。クレシルバイオレットを用いて５番目毎の切片を染色し、画像分析により腫瘍面積を見積もった。これらの分析から体積を再構築した。以前の結果と一致して、ＣＮＳ−１−ＦＬ腫瘍はＣＮＳ−ＧＦＰより大きく且つより浸潤性であった。ＣＮＳ−１−ＮＶＹ腫瘍は寸法においてＣＮＳ−１−ＧＦＰ腫瘍と有意に異ならなかった。しかしながら重要なことに、ＣＮＳ−１−ＮＶＹ腫瘍はＣＮＳ−１−ＦＬ腫瘍より有意に小さかった（表１，図３）。いずれかの特定の理論に縛られることは望まないが、これらの結果は、ＢＥＨＡＢの生産が単独では腫瘍進行の増進に不十分であるが、全長タンパク質の切断がこのプロセスに決定的な役割を果たすことを示している。
【０２８１】
突然変異したＢＥＨＡＢの腫瘍進行への影響をさらに調べるために、突然変異ＢＥＨＡＢ構築物の動物（ｎ＝６）生存への影響を調べた。ＣＮＳ−１−ＦＬ腫瘍が動物生存を低下させることが以前に発見された（Ｎｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２００１年，６１：７０５６−７０５９）。これらの結果と一致して、ＣＮＳ−１−ＦＬ腫瘍が移植された動物は、ＣＮＳ−１−ＧＦＰ腫瘍が移植された動物より平均３日早く生存の終点に達した。しかしながら、ＣＮＳ−１−ＮＶＹ移植動物は標準より早く生存の終点に達しなかった。実際には、ＣＮＳ−１−ＮＶＹ腫瘍を有する動物はＣＮＳ−１−ＧＦＰが移植された動物よりわずかに長く生存したが、今日までのこの研究における動物の数を以っては、差は有意ではない。ＣＮＳ−１−ＮＶＹ移植動物はＣＮＳ−１−ＦＬ移植動物より平均４日長く生存し、生存における２３％延長である（表１，図４）。
【０２８２】
【表１】
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【０２８３】
議論
以前の研究は、非−浸潤性腫瘍として成長する９Ｌ神経膠肉腫細胞系が、ＢＥＨＡＢの５’フラグメントを用いてトランスフェクションされると浸潤性となることを示している（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８年，１８：２３７０−２３７６）。しかしながら、全長ＢＥＨＡＢを用いる９Ｌ細胞のトランスフェクションは野生型９Ｌ細胞から腫瘍表現型を変化させない。全く対照的に、全長ＢＥＨＡＢを用いてトランスフェクションされたＣＮＳ−１細胞は腫瘍の寸法及び浸潤性が向上する。異なる細胞系の表現型における差は、これらの２種の細胞系のＢＥＨＡＢを切断させる能力における差により説明される。ＣＮＳ−１細胞は全長タンパク質をＧｌｕ３９５−Ｓｅｒ３９６切断部位において切断させ、９０ｋＤａ及び５０ｋＤａフラグメントを形成する。対照的に、９Ｌ細胞は全長タンパク質をタンパク質分解的に処理しない。さらに以前の研究は、ＣＮＳ−１細胞におけるＢＥＨＡＢ切断がＡＤＡＭＴＳ−４により媒介されることを示した（Ｍａｔｔｈｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０００年，２７５：２２６９５−２２７０３）。神経膠腫進行におけるＢＥＨＡＢ切断の役割は、突然変異した切断不可能な形態のＢＥＨＡＢを用いてトランスフェクションされたＣＮＳ−１細胞を用いて評価された。この構築物の腫瘍進行及び動物生存への影響が研究され、初めて神経膠腫の進行におけるＢＥＨＡＢ切断の役割を確実に示した。
【０２８４】
ＢＥＨＡＢ／ブレビカン切断部位の３９３Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ３９８から３９３Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ３９８（それぞれ配列番号：１及び配列番号：２）への突然変異はタンパク質を完全にＣＮＳ−１細胞により切断不可能にした。重要なことに、この切断不可能な突然変異体は正常な全長構築物と異なるラットＣＮＳ−１腫瘍への影響を有した。ＣＮＳ−１−ＦＬ腫瘍は標準腫瘍より大きく且つそれをを有する動物に対して動物の生存時間を短縮させたが、ＣＮＳ−１−ＮＶＹ腫瘍は標準腫瘍と表現型的には区別され得なかった。これらの研究は、原発性ＣＮＳ腫瘍におけるＢＥＨＡＢ機能において切断及びプロセッシングの両方が果たす決定的な役割を明確に示している。
【０２８５】
ＣＮＳ−１−ＮＶＹ腫瘍はＣＮＳ−１−ＦＬ腫瘍より小さかったが、表現型的に標準腫瘍に類似していた。この結果は、特にＣＮＳ−１細胞が脳中で成長すると内在性ＢＥＨＡＢを発現するように誘導されるという事実を見ると、神経膠腫におけるＢＥＨＡＢ切断−媒介効果の機構に関して情報を与える。従ってこれらの実験で用いられた３種の細胞系のすべては正常な量のＢＥＨＡＢを発現する；ＣＮＳ−１−ＦＬ腫瘍は内在性ＢＥＨＡＢの他に外来性ＢＥＨＡＢを切断可能な形態で発現し；ＣＮＳ−１−ＮＶＹ腫瘍は内在性ＢＥＨＡＢの他に外来性ＢＥＨＡＢを切断不可能な形態で発現する。従ってもしＮＶＹ突然変異体がＣＮＳ−１細胞腫瘍においてドミナントネガティブとして作用したら、ＣＮＳ−１−ＮＶＹ腫瘍はＢＥＨＡＢの正常な機能の崩壊により標準腫瘍（ＣＮＳ−１−ＧＦＰ）より有意に小さいことが予想され、それは事実ではない。むしろ、ＣＮＳ−１−ＮＶＹ腫瘍はその代わりに、標準腫瘍と比較してそれらの表現型において変化を生じない分子でトランスフェクションされたようであり、ＢＥＨＡＢの切断産物が全長タンパク質により媒介されない独特の相互作用及び／又は機能を媒介することを強く示唆している。例えばＢＥＨＡＢ切断産物が単にマトリックスを可溶化し、細胞の動きを可能にするなら、切断不可能なＢＥＨＡＢの生産はこの効果を妨害するであろう。しかしながら切断不可能な基質を有する、もしくは有していない腫瘍は非常に類似しているようである。これらの結果は、ＢＥＨＡＢ切断産物が全長タンパク質自身により媒介されない独特の機能を有することを示唆している。本明細書において明白なデータは、ＢＥＨＡＢ切断が原発性ＣＮＳ腫瘍の進行に力を与えること及びＢＥＨＡＢ切断の阻害が腫瘍進行を低下させ得ることを示している。これらの研究は、ＢＥＨＡＢ切断の阻害が重要な新しい治療戦略を与えることができ、従ってＢＥＨＡＢ切断又は切断産物の機能の阻害が原発性ＣＮＳ腫瘍の処置のための有効且つ新規な方法として働くであろうことを強く示している。
【０２８６】
本明細書で引用されたそれぞれの、及びすべての特許、特許出願及び公開文献の開示は、引用することによりその記載事項全体が本明細書の内容となる。
【０２８７】
特定の態様に言及して本発明を開示してきたが、本発明の真の精神及び範囲から逸脱することなく、当該技術分野における他の熟練者により本発明の他の態様及び変形が工夫され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、そのような態様及び同等の変形のすべてを含むとみなされることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０２８８】
【図１Ａ】全長（ＦＬ）及び突然変異（ＮＶＹ）ＢＥＨＡＢを用いて一過的にトランスフェクションされた細胞からの培地のウエスタンブロット。
【図１Ｂ】２μｇのＦＬ構築物及び０、１、２又は４μｇのＮＶＹ突然変異体構築物を用いて一過的に共トランスフェクションされた細胞からの培地のウエスタンブロット。
【図１Ｃ】全長（ＦＬ）及び突然変異（ＮＶＹ）ＢＥＨＡＢを用いて安定にトランスフェクションされた細胞からの培地のウエスタンブロット。
【図２Ａ】ＭＴＴアッセイを用い、７日間に及ぶ細胞増殖を描くグラフ。
【図２Ｂ】ＬＤＨアッセイを用いて評価される時の７日間に及ぶ細胞死を描くグラフ。
【図３Ａ】ＣＮＳ−１−ＧＦＰ細胞から誘導される代表的腫瘍の像。
【図３Ｂ】ＣＮＳ−１−ＦＬ細胞から誘導される代表的腫瘍の像。
【図３Ｃ】ＣＮＳ−１−ＮＶＹ細胞から誘導される代表的腫瘍の像。
【図３Ｄ】ＣＮＳ−１−ＦＬ、ＣＮＳ−１−ＧＦＰ及びＣＮＳ−１−ＮＶＹ細胞から誘導される腫瘍の体積を描くグラフ。
【図４】ＣＮＳ−１−ＦＬ、ＣＮＳ−１−ＧＦＰ及びＣＮＳ−１−ＮＶＹを用いて安定にトランスフェクションされた細胞から誘導される腫瘍の、動物生存への影響を描くグラフ。
【配列表】
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【図１Ａ−１Ｃ】
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【図２Ａ−２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【国際調査報告】
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