(57)【要約】  本発明は、多重特異性を有する多価結合タンパク質、ならびにこれらの薬剤をＶＨおよびＶＬドメインから製造する方法に関する。結合タンパク質は３つ以上の結合部位を有するものであり、少なくとも１つの結合部位はハプテン部分と結合し、かつ、少なくとも２つの部位は標的抗原と結合する。本発明はさらに、ヒスタミン−スクシニル−グリシル（ＨＳＧ）部分を含む分子への親和性を有する少なくとも１つの結合部位、および癌胎児性抗原（ＣＥＡ）への親和性を有する少なくとも２つの結合部位を有する二重特異性三価ヘテロダイマー、ならびにＨＳＧ部分を含む分子への親和性を有する少なくとも１つの結合部位、ＣＥＡへの親和性を有する少なくとも１つの結合部位、および金属キレート錯体  インジウム−ＤＴＰＡへの親和性を有する少なくとも１つの結合部位を有する三重特異性三価ヘテロダイマーに関する。さらに、本発明は、適切な宿主におけるこれら機能的ヘテロダイマーの発現に有用な組換えベクターに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
診断薬、治療薬、またはその組合せを標的に送達するためのキットであって、
ａ．３つ以上の結合部位を含んでなり、少なくとも１つの結合部位がハプテン部分に対する親和性を有するものであり、かつ、少なくとも２つの結合部位が標的抗原に対する親和性を有するものである、多価多重特異性結合タンパク質、および
ｂ．診断薬、治療薬もしくはその組合せ、結合分子、および２つの前記結合タンパク質との同時結合が可能となる位置に配置された少なくとも２つのハプテン部分を含んでなる担体分子
を含んでなる、キット。
【請求項２】
ハプテン部分に対する親和性を有する第一の結合部位、ならびに各々が同一または異なる標的抗原であってもよい標的抗原に対する親和性を有する第二および第三の結合部位を含んでなる、多価多重特異性結合タンパク質。
【請求項３】
標的抗原がヒト疾患に関連する結合部位である、請求項２に記載の結合タンパク質。
【請求項４】
ヒト疾患に関連する結合部位が、癌結合部位、自己免疫疾患結合部位、感染症結合部位、循環器疾患結合部位、および炎症性疾患結合部位からなる群から選択されるものである、請求項３に記載の結合タンパク質。
【請求項５】
第一の結合部位がヒスタミン−スクシニル−グリシル（ＨＳＧ）部分を含む分子に対する親和性を有するものであり、かつ、第二および第三の結合部位がそれぞれ癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に対する親和性を有するものである、請求項２に記載の結合タンパク質。
【請求項６】
マウス、ヒト化、もしくはヒト配列またはその組合せを含んでなる、請求項５に記載の結合タンパク質。
【請求項７】
第一の結合部位が、互いに結合してＨＳＧ抗原結合部位を形成する第一および第二のポリペプチドを含んでなるものである、請求項５に記載の結合タンパク質。
【請求項８】
第一のポリペプチドが６７９ ＭＡｂのＶＨポリペプチド（図４、配列）を含んでなるものであり、かつ、第二のポリペプチドが６７９ ＭＡｂのＶＫポリペプチド（図４、配列）を含んでなるものである、請求項７に記載の結合タンパク質。
【請求項９】
第一のポリペプチドがｈ６７９ ＭＡｂのＶＨポリペプチド（図５、配列）を含んでなるものであり、かつ、第二のポリペプチドがｈ６７９ ＭＡｂのＶＫポリペプチド（図５、配列）を含んでなるものである、請求項７に記載の結合タンパク質。
【請求項１０】
第二の結合部位が、互いに結合して第一のＣＥＡ抗原結合部位を形成する第三および第四のポリペプチドを含んでなるものである、請求項８に記載の結合タンパク質。
【請求項１１】
第三のポリペプチドがｈＭＮ１４ ＭＡｂのＶＨポリペプチド（図６、配列）を含んでなるものであり、かつ、第四のポリペプチドがｈＭＮ１４ ＭＡｂのＶＫポリペプチド（図６、配列）を含んでなるものである、請求項１０に記載の結合タンパク質。
【請求項１２】
第三の結合部位が、互いに結合して第二のＣＥＡ抗原結合部位を形成する第五および第六のポリペプチドを含んでなるものである、請求項８に記載の結合タンパク質。
【請求項１３】
第五のポリペプチドがｈＭＮ１４ ＭＡｂのＶＨポリペプチド（図６、配列）を含んでなるものであり、かつ、第六のポリペプチドがｈＭＮ１４ ＭＡｂのＶＫポリペプチド（図６、配列）を含んでなるものである、請求項１２に記載の結合タンパク質。
【請求項１４】
第一および第四のポリペプチドが第一のリンカーによって連結され、第四および第五のポリペプチドが第二のリンカーによって連結され、第二および第三のポリペプチドが第三のリンカーによって連結され、かつ、第三および第六のポリペプチドが第四のリンカーによって連結された、請求項１２に記載の結合タンパク質。
【請求項１５】
第一のリンカーおよび第三のリンカーがそれぞれ１６アミノ酸残基を含んでなり、かつ、第二のリンカーおよび第四のリンカーがそれぞれ５アミノ酸残基を含んでなる、請求項１４に記載の結合タンパク質。
【請求項１６】
第一および第三のポリペプチドが第一のリンカーによって連結され、第三および第五のポリペプチドが第二のリンカーによって連結され、第二および第四のポリペプチドが第三のリンカーによって連結され、かつ、第四および第六のポリペプチドが第四のリンカーによって連結された、請求項１２に記載の結合タンパク質。
【請求項１７】
第一のリンカーおよび第三のリンカーがそれぞれ１６アミノ酸残基を含んでなり、かつ、第二のリンカーおよび第四のリンカーがそれぞれ５アミノ酸残基を含んでなる、請求項１６に記載の結合タンパク質。
【請求項１８】
ヘテロダイマーである、請求項５に記載の結合タンパク質。
【請求項１９】
第一、第二、第三、第四、第五および第六のポリペプチドが、それぞれ第一、第二、第三、第四、第五および第六のｃＤＮＡによってコードされる、請求項１２に記載の結合タンパク質。
【請求項２０】
第一、第二、第三、第四、第五および第六のｃＤＮＡが図４および６（配列）に示すヌクレオチド配列を含んでなるものである、請求項１９に記載の結合タンパク質。
【請求項２１】
請求項２０に記載の結合タンパク質をコードする第一、第四、および第五のｃＤＮＡを含んでなる、核酸分子。
【請求項２２】
請求項２０に記載の結合タンパク質をコードする第二、第三、および第六のｃＤＮＡを含んでなる、核酸分子。
【請求項２３】
請求項２０に記載の結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、発現カセット。
【請求項２４】
プラスミドである、請求項２３に記載の発現カセット。
【請求項２５】
請求項２４に記載のプラスミドを含んでなる、宿主細胞。
【請求項２６】
結合タンパク質を製造する方法であって、請求項２５に記載の宿主細胞を適切な培地で培養すること、および前記培地から結合タンパク質を分離することを含んでなる、方法。
【請求項２７】
第一、第二、第三、第四、第五および第六のポリペプチドが、それぞれ第一、第二、第三、第四、第五および第六のｃＤＮＡによってコードされる、請求項１４に記載の結合タンパク質。
【請求項２８】
第一、第二、第三、第四、第五および第六のｃＤＮＡが図４および６（配列）に示すヌクレオチド配列を含んでなるものである、請求項２７に記載の結合タンパク質。
【請求項２９】
第一、第三、および第五のｃＤＮＡが第一の単一核酸分子上に存在する、請求項２７に記載の結合タンパク質。
【請求項３０】
第二、第四、および第六のｃＤＮＡが第二の単一核酸分子上に存在する、請求項２９に記載の結合タンパク質。
【請求項３１】
請求項３０に記載の結合タンパク質をコードする核酸分子を含んでなる、発現カセット。
【請求項３２】
プラスミドである、請求項３１に記載の発現カセット。
【請求項３３】
請求項３２に記載のプラスミドを含んでなる、宿主細胞。
【請求項３４】
結合タンパク質を製造する方法であって、請求項３３に記載の宿主細胞を適切な培地で培養すること、および前記培地から結合タンパク質を分離することを含んでなる、方法。
【請求項３５】
診断薬、治療薬もしくはその組合せ、結合部分、および１以上の結合タンパク質の結合部位との同時結合が可能となる位置に配置された２以上のハプテン部分を含んでなる、担体分子。
【請求項３６】
担体分子に対するハプテンのモル置換比率を決定するためのスクリーニング方法であって、ハプテン結合反応後に担体分子の混合物を精製すること、および精製した混合物を金属結合アッセイに付して前記モル置換比率を決定することを含んでなる、方法。
【請求項３７】
診断薬、治療薬、またはその組合せを標的に送達する方法であって、
ａ．それを必要とする被験体に、請求項５に記載の結合タンパク質を投与すること、
ｂ．ある量の非結合タンパク質が被験体の血流から除去されるのに十分な時間待つこと、および
ｃ．前記被験体に、結合タンパク質の結合部位と結合する、診断薬、治療薬、またはその組合せを含んでなる担体分子を投与すること
を含んでなる、方法。
【請求項３８】
担体分子が、第一の結合タンパク質の１つの結合部位および第二の結合タンパク質の第二の結合部位と結合するものである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
診断薬または治療薬が、同位元素、薬剤、毒素、サイトカイン、ホルモン、増殖因子、複合体、放射性核種、および金属からなる群から選択されるものである、請求項３７に記載の方法。 
【請求項４０】
同位元素が、９０Ｙ、１１１Ｉｎ、１３１Ｉ、９９ｍＴｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１７７Ｌｕ、６７Ｃｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、および２１１Ａｔからなる群から選択されるものである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
薬剤が担体分子と結合する医薬である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
金属が、ガドリニウムおよび造影剤からなる群から選択されるものである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
造影剤が、ＭＲＩ造影剤、ＣＴ造影剤、および超音波造影剤からなる群から選択されるものである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
ヒト疾患を検出または治療する方法であって、
ａ．それを必要とする被験体に、請求項２に記載の結合タンパク質を投与すること、
ｂ．ある量の結合していない結合タンパク質が被験体の血流から除去されるのに十分な時間待つこと、および
ｃ．前記被験体に、結合タンパク質の結合部位と結合する、診断薬、治療薬、またはその組合せを含んでなる担体分子を投与すること
を含んでなる、方法。
【請求項４５】
ヒト疾患が、癌、自己免疫疾患、感染症、循環器疾患、および炎症性疾患からなる群から選択されるものである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
ヒスタミン−スクシニル−グリシル（ＨＳＧ）部分を含む分子に対する親和性を有するＨＳＧ結合部位、金属キレート錯体  インジウム−ＤＴＰＡに対する親和性を有する金属キレート錯体  インジウム−ＤＴＰＡ結合部位、および各々が癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に対する親和性を有するＣＥＡ結合部位を含んでなる、多価多重特異性結合タンパク質。
【請求項４７】
マウス、ヒト化、またはヒト配列を含んでなる、請求項４２に記載の結合タンパク質。
【請求項４８】
図８および９のヌクレオチド配列によってコードされる、請求項４２に記載の結合タンパク質。
【請求項４９】
図８および９のヌクレオチド配列を含んでなる、核酸分子
【請求項５０】
請求項４９に記載の核酸分子を含んでなる、発現カセット。
【請求項５１】
プラスミドである、請求項５０に記載の発現カセット。
【請求項５２】
請求項２４に記載のプラスミドを含んでなる、宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、多重特異性を有する多価結合タンパク質、ならびにこれらの薬剤をＶＨおよびＶＬドメインから製造する方法に関する。結合タンパク質は３つ以上の結合部位を有するものであり、少なくとも１つの結合部位はハプテン部分と結合し、かつ、少なくとも２つの部位は標的抗原と結合する。本発明はさらに、ヒスタミン−スクシニル−グリシル（ＨＳＧ）部分を含む分子への親和性を有する少なくとも１つの結合部位、および癌胎児性抗原（ＣＥＡ）への親和性を有する少なくとも２つの結合部位を有する二重特異性三価ヘテロダイマー、ならびにＨＳＧ部分を含む分子への親和性を有する少なくとも１つの結合部位、ＣＥＡへの親和性を有する少なくとも１つの結合部位、および金属キレート錯体  インジウム−ＤＴＰＡへの親和性を有する少なくとも１つの結合部位を有する三重特異性三価ヘテロダイマーに関する。さらに、本発明は、宿主細胞におけるこれら機能的組換えタンパク質の発現に有用な組換えベクターに関する。
【発明の背景】
【０００２】
人工の結合タンパク質、特に、モノクローナル抗体および人工抗体または抗体断片は幅広く試験されており、これらは、癌、自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、および循環器疾患をはじめとする種々のヒト疾患の検出および治療において重要なものであることがわかってきた[Filpula and McGuire, Exp. Opin. Ther. Patents (1999) 9: 231-245頁]。例えば、放射性同位元素で標識した抗体は、患者への注入後に、当技術分野において利用可能な検出器を用いて腫瘍を可視化する目的で分析されている。抗体または抗体由来医薬品の臨床的有用性は、主として、特定の標的抗原とのその結合能に依存している。選択性は、とりわけ、診断薬または治療薬が体内の正常組織に対して毒性がある場合に、ヒト疾患の検出および治療段階において診断薬または治療薬、例えば、同位元素、薬剤、毒素、サイトカイン、ホルモン、増殖因子、複合体、放射性核種、または金属を標的位置に送達するのに有用である。
【０００３】
抗体系の主要な制限については、Goldenberg, The American Journal of Medicine (1993) 94: 298-299頁に記載されている。検出および治療技術において好ましいパラメーターは、標的細胞が存在する部位に厳密に限局された注入投与の量、および摂取率、すなわち、正常組織周辺の放射能濃度に対する特異的に結合した抗体の濃度の比率である。抗体を血流に注入すると、それは代謝を受けて排出されるため、数多くのコンパートメントを通過する。抗体は、標的細胞抗原の位置を突きとめ、これと結合することが可能でなければならないが、その一方で体の他の部分を通過する必要がある。抗原ターゲッティングを制御する因子としては、位置、大きさ、抗原密度、抗原接近可能性、病理組織の細胞組成、およびターゲッティングする抗体の薬物動態学的特性が挙げられる。抗体による腫瘍ターゲッティングに特異的に影響を与えるその他の因子としては、腫瘍およびその他の組織の両方における標的抗原の発現、および放射性標識した抗体の血液クリアランスの遅延による骨髄毒性が挙げられる。
【０００４】
標的腫瘍細胞と一体化させる、ターゲッティングする抗体の量は、腫瘍の血管形成および抗体浸透を妨げる障害、ならびに腫瘍内圧力によって影響を受ける。非標的器官、例えば、肝臓、腎臓または骨髄による非特異的摂取が、特に骨髄照射によって用量制限毒性を引き起こすことが多い放射免疫治療において、この技術のもう１つの可能性ある制限である。
【０００５】
提案された一つの解決法が、「親和性増強系（Affinity Enhancement System）」（ＡＥＳ）と呼ばれる、特に、診断用または治療用放射性同位元素を有する抗体による腫瘍ターゲッティングの欠陥を克服するよう設計された技術である[米国特許第５，２５６，３９５号(1993), Barbet et al., Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals (1999) 14: 153-166頁]。ＡＥＳは、放射性標識した二価ハプテン、ならびに標的腫瘍および放射性ハプテンの両方を認識する抗腫瘍／抗ハプテン二重特異性抗体を必要とする。この技術では、二重特異性抗体を患者に注入すること、および二重特異性抗体を標的腫瘍に局在させることを必要とする。結合していない抗体が血流から除去されるのに十分な時間の後、放射性標識したハプテンを投与する。ハプテンは標的細胞の部位に位置する抗体−抗原複合体と結合し、診断上または治療上の効用をもたらす。結合していないハプテンは体内から除去される。Barbetは、二重特異性抗体が腫瘍表面と結合すると、二価ハプテンが二重特異性抗体と架橋するという可能性を記述している。結果として、放射性標識した複合体は、より安定化され、より長い時間腫瘍に留まる。
【０００６】
さらに、二重特異性または三重特異性トリアボディ(triabody)を作製する従来の方法には問題がある。これらの方法は、その各々がＶＬドメインと直接連結されたＶＨドメインからなる３つの異なるポリペプチドの合成を教示するものである。ＶＨ１／ＶＬ１の特異性に対しては二価であり、ＶＨ２／ＶＬ２の特異性に対しては一価である二重特異性トリアボディの場合、３つのポリペプチドはＶＨ１−ＶＬ２、ＶＨ２−ＶＬ１、およびＶＨ１−ＶＬ１である。３つの特異性(ＶＨ１／ＶＬ１、ＶＨ２／ＶＬ２、およびＶＨ３／ＶＬ３)の各々に対して一価である三重特異性トリアボディでは、３つのポリペプチドはＶＨ１−ＶＬ２、ＶＨ２−ＶＬ３、およびＶＨ３−ＶＬ１である。いずれの設計の各ポリペプチドも、それ自身と結合するか、または２つの他のポリペプチドと結合することによってトリアボディを形成する可能性があるため、最大１０の異なるトリアボディを作製し得るが、正しい構造は１つだけである。テトラボディ(tetrabody)概念に基づく多重特異性四量体を作製するための同様のアプローチでは、第四のポリペプチドを加えることによって起こり得る副生物の数が拡大されるだけである。
【０００７】
さらに、タンデムダイアボディ(diabody)などの多重特異性の多価設計もまた、欠点を有することがある。一般に好まれるその他の抗体では、２つの異なる抗体のＶＨおよびＶＬドメインの両方からなるポリペプチドがそれ自身の上に折り重なって、各々の特異性に対して一価性の二重特異性単鎖が生じる可能性がある場合には、恐らく、ホモダイマーは容易には形成し得ない。実際には、いずれの場合にも、タンデムダイアボディの代わりに二重特異性単鎖構造をもたらすタンデムダイアボディ設計をもとにして、いくつかの構築物が作製された(Rossi and Chang、未発表の結果)。よって、同じポリペプチドに両方のタイプが存在する場合、特に、同種のＶＨおよびＶＬドメイン間の距離が十分に長く、フレキシブルである場合には、ＶＨおよびＶＬドメインの鎖内対合が明らかに起こり得る。
【０００８】
２つの異なるＦａｂ’フラグメントの化学的架橋によって作製した二重特異性多価抗体を、適用可能な二価ハプテンとともに使用することが成功に終わっており、動物モデルおよびヒト患者の両方における腫瘍ターゲッティングの改善のためのＡＥＳの有用性が確認されている。しかしながら、当技術分野ではＡＥＳにおいて有用である組換えＤＮＡ技術による二重特異性抗体の作製の必要性が残されている。具体的には、標的抗原での抗体摂取の増大、血中の抗体の減少、毒性医薬からの正常組織および正常細胞の最適な防御を示す抗体の必要性が残されている。さらに、多価性および多重特異性のｓｃＦｖベースの薬剤の製造に関連する問題を克服する結合タンパク質の必要性が残されている。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、多重特異性を有する多価結合タンパク質、ならびにこれらの薬剤をＶＨおよびＶＬドメインから製造する方法に関する。結合タンパク質は３つ以上の結合部位を有するものであり、少なくとも１つの結合部位はハプテン部分と結合し、かつ、少なくとも２つの部位は標的抗原と結合する。本発明はさらに、ヒスタミン−スクシニル−グリシル（ＨＳＧ）部分を含む分子への親和性を有する少なくとも１つの結合部位、および癌胎児性抗原（ＣＥＡ）への親和性を有する少なくとも２つの結合部位を有する二重特異性三価タンパク質、ならびにＨＳＧ部分を含む分子への親和性を有する少なくとも１つの結合部位、ＣＥＡへの親和性を有する少なくとも１つの結合部位、および金属キレート錯体  インジウム−ＤＴＰＡへの親和性を有する少なくとも１つの結合部位を有する三重特異性三価結合タンパク質に関する。さらに、本発明は、宿主（好ましくは微生物宿主）におけるこれら機能的結合タンパク質の発現に有用な組換えベクターに関する。
【００１０】
本発明の一つの態様は、ハプテン部分および標的抗原と結合する二重特異性三価ヘテロダイマー、ならびに宿主（好ましくは微生物宿主）におけるこれら機能的組換えタンパク質の発現に有用な組換えベクターに関する。
【００１１】
第二の態様によれば、ＨＳＧ部分を含む分子に対する親和性を有する少なくとも１つの結合部位、およびＣＥＡに対する親和性を有する少なくとも２つの結合部位を有する二重特異性三価ヘテロダイマー、ならびに宿主（好ましくは微生物宿主）におけるこれら機能的ヘテロダイマーの発現に有用な組換えベクターが提供される。これらのヘテロダイマーは組換えＤＮＡ技術によって作製され、これによりＨＳＧおよびＣＥＡに対して特異的な親和性を示す新規ＡＥＳが提供される。
【００１２】
第三の態様によれば、ＨＳＧ部分を含む分子に対する親和性を有する少なくとも１つの結合部位、ＣＥＡに対する親和性を有する少なくとも１つの結合部位、および金属キレート錯体  インジウム−ＤＴＰＡに対する親和性を有する少なくとも１つの結合部位を有する三重特異性三価ヘテロダイマーが提供される。この態様には、微生物宿主におけるこれら機能的ヘテロダイマーの発現に有用な組換えベクターが含まれる。これらのヘテロダイマーは組換えＤＮＡ技術によって作製され、これにより新規ＡＥＳが提供される。
【００１３】
本発明の第四の態様は、診断薬、治療薬、またはその組合せを標的に送達する方法に関する。この方法は、薬剤を必要とする被験体に前記結合タンパク質を投与すること、ある量の非結合タンパク質が被験体の血流から除去されるのに十分な時間待つこと、および前記担体分子を投与することを含む。本発明のさらなる態様によれば、上述の薬剤の標的への送達方法を用いて、ヒト疾患を検出または治療する方法が提供される。
【００１４】
本発明の一つの目的は、ハプテン部分および抗原と結合することが可能な結合タンパク質を作製することである。本発明の他の目的は、多重特異性抗体をコードするＤＮＡの配列を含み、かつ、微生物宿主細胞において容易に発現されるベクターを作製することである。さらに、本発明は、組換えＤＮＡ技術によってヘテロダイマーを作製する方法を包含する。この方法は、前記宿主細胞を適切な培地で培養すること、および培地からヘテロダイマーを分離することを含む。さらに、本発明は、図４〜７（配列）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなるｃＤＮＡクローン群から選択される核酸分子に関する。６７９−ｓｃＦｖ−Ｌ５およびｈＭＮ１４−ｓｃＦｖ−Ｌ５についての核酸のＤＮＡコード配列およびコードされる対応アミノ酸は、それぞれ図４および６（配列）に記載されている。ｍ７３４ ＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡは図７に記載されている。
【好ましい実施形態の詳細な説明】
【００１５】
特に断りのない限り、可算名詞("a"または"an")は１つ以上のものを意味する。
【００１６】
本発明の一つの実施態様は、多重特異性を有する多価結合タンパク質、ならびにこれらの薬剤をＶＨおよびＶＬドメインから製造する方法に関する。結合タンパク質は３つ以上の結合部位を有するものであり、少なくとも１つの結合部位はハプテン部分と結合し、かつ、少なくとも２つの部位は標的抗原と結合する。本発明はさらに、ヒスタミン−スクシニル−グリシル（ＨＳＧ）部分を含む分子に対する親和性を有する少なくとも１つの結合部位、および癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に対する親和性を有する少なくとも２つの結合部位を有する二重特異性三価ヘテロダイマー、ならびにＨＳＧ部分を含む分子に対する親和性を有する少なくとも１つの結合部位、ＣＥＡに対する親和性を有する少なくとも１つの結合部位、および金属キレート錯体  インジウム−ＤＴＰＡに対する親和性を有する少なくとも１つの結合部位を有する三重特異性三価ヘテロダイマーに関する。さらに、本発明は、微生物宿主におけるこれら機能的ヘテロダイマーの発現に有用な組換えベクターに関する。
【００１７】
構造的に、完全抗体は４つのポリペプチド鎖を含むＹ形ユニットの１以上のコピーからなる。２つの鎖は重鎖と呼ばれる１つのポリペプチドの同一コピーであり、２つの鎖は軽鎖と呼ばれる１つのポリペプチドの同一コピーである。各ポリペプチドは個々のＤＮＡによって、または連結されたＤＮＡ配列によってコードされる。２つの重鎖は１つ以上のジスルフィド結合によって互いに連結されており、各軽鎖は１つのジスルフィド結合によって一方の重鎖と連結されている。各鎖には、重鎖および軽鎖のそれぞれについて、ＶＨおよびＶＬと呼ばれるＮ末端可変領域があり、Ｆｖ断片と呼ばれる１対のＶＨおよびＶＬの非共有結合が１つの抗原結合部位を形成している。
【００１８】
個々のＦｖ断片は低タンパク質濃度および生理学的条件下にて解離する傾向があり[Glockshuber et al., Biochemistry (1990) 29: 1362-1367頁]、その用途は限られている。安定性を向上させ、潜在的有用性を高めるために、ＶＨドメイン（またはＶＬ）のＣ末端が、長さを変えることが可能なペプチドリンカーを介してＶＬドメイン（またはＶＨ）のＮ末端と連結されている組換え単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片が作製され、広範囲にわたって調査されている。[最近の総説に関しては、Hudson and Kortt, J. Immunological methods (1999) 231: 177-189頁を参照]。ｓｃＦｖは、米国特許第４，９４６，７７８号(1990)および米国特許第５，１３２，４０５号（1992）に開示されている方法によって作製可能である。
【００１９】
１２アミノ酸残基長を超えるリンカー（例えば、１５または１８残基リンカー）を有するｓｃＦｖは、同一鎖のＶＨおよびＶＬドメイン間の相互作用を可能にし、一般に、モノマー、ヘテロダイマーおよび少量の高分子量マルチマーの混合物を形成する[米国特許第４，６４２，３３４号(1987); Kortt et al., Eur. J. Biochem. (1994) 221: 151-157頁]。しかしながら、５個以下のアミノ酸残基のリンカーを有するｓｃＦｖは、同一鎖のＶＨおよびＶＬドメインの分子内対合を妨げ、異なる鎖のＶＨおよびＶＬドメインの対合を促進する。３〜１２残基間のリンカーは、主にダイマーを形成する[Atwell et al., Protein Engineering (1999) 12: 597-604頁]。０〜２残基間のリンカーでは、ｓｃＦｖのトリマー構造（トリアボディと呼ばれる）、テトラマー構造（テトラボディと呼ばれる）またはより高度なオリゴマー構造が有用である。しかしながら、オリゴマー化の正確なパターンは、リンカーの長さに加えて、組成、ならびにＶドメインの方向性によって異なると考えられる。例えば、抗ノイラミニダーゼ抗体ＮＣ１０のｓｃＦｖは、０残基リンカーによって、主にトリマー（ＶＨからＶＬへの方向)またはテトラマー（ＶＬからＶＨへの方向)を形成した[Dolezal et al., Protein Engineering (2000) 13: 565-574頁]。１および２残基リンカーを用いてＮＣ１０から構築したｓｃＦｖに関しては、ＶＨからＶＬへの方向では主にヘテロダイマーを形成し[Atwell et al., Protein Engineering (1999) 12: 597-604頁]、これに対して、ＶＬからＶＨへの方向ではテトラマー、トリマー、ダイマー、および高分子量マルチマーの混合物を形成した[Dolezal et al., Protein Engineering (2000) 13: 565-574頁]。ＶＨからＶＬへの方向に抗ＣＤ１９抗体ＨＤ３７から構築したｓｃＦｖに関しては、０残基リンカーでは専らトリマーを形成し、１残基リンカーでは専らテトラマーを形成した[Le Gall et al., FEBS Letters (1999) 453: 164-168
頁]。
【００２０】
２つ以上のｓｃＦｖ分子の非共有結合によって、多価であるが単一特異的な機能的ダイアボディ、トリアボディおよびテトラボディが形成され得るため、２つ以上の異なるｓｃＦｖ分子の同様の結合によっては、適切に構築されれば、機能的多重特異性ｓｃＦｖマルチマーが形成される可能性がある。多価性を有する単一特異性ダイアボディ、トリアボディ、およびテトラボディは、５個以下のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを用いて得られている。二重特異性ダイアボディは、一般に、２つの異なるｓｃＦｖのヘテロダイマーであり、各ｓｃＦｖはショートリンカーによって別の抗体のＶＬドメインと連結された１つの抗体由来のＶＨドメインを含んでなる。数種類の二重特異性ダイアボディは、一方のシストロンにＶＨ１−リンカー−ＶＬ２を含んでなる組換え遺伝子構築物、およびもう一方のシストロンにＶＨ２−リンカー−ＶＬ１を含んでなる第二の組換え遺伝子構築物を含む２シストロン性発現ベクターを用いて作製されている[Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90: 6444-6448頁；Atwell et al., Molecular Immunology (1996) 33: 1301-1302頁；Holliger et al., Nature Biotechnology (1997) 15: 632-631頁；Helfrich et al., Int. J. Cancer (1998) 76: 232-239頁；Kipriyanov et al., Int. J. Cancer (1998) 77: 763-772頁；Holiger et al., Cancer Research (1999) 59: 2909-2916頁を参照]。ｓｃＦｖを構築する方法は、米国特許第４，９４６，７７８号(1990)および米国特許第５，１３２，４０５号(1992)に開示されている。ｓｃＦｖに基づく多価多重特異性結合タンパク質を製造する方法は、二重特異性ダイアボディについては米国特許第５，８３７，２４２号(1998)、米国特許第５，８４４，０９４号(1998)およびＷＯ−９８／４４００１(1998)に、タンデムダイアボディについてはＰＣＴ／ＤＥ９９／０１３５０に開示されている。二重特異性抗体は、組み換え工学、化学結合、およびクアドローマ技術(quadroma technology)などの方法によって作製することができる。多価性および多重特異性を有するｓｃＦｖベースの薬剤を、一方の鎖が少なくとも２つの抗体に由来するＶＨドメインからなり、もう一方の鎖が対応するＶＬドメインからなる２つのポリペプチド鎖を構築することにより製造する方法は、米国特許第５，９８９，８３０号(1999)および米国特許第６，２３９，２５９号(2001)に開示されている。
【００２１】
多重特異性および多価抗原結合タンパク質をＶＨおよびＶＬドメインから製造する他の方法が、米国特許第５，９８９，８３０号および同第６，２３９，２５９号に開示されている。このような多価および多重特異性抗原結合タンパク質は、一方のポリペプチド鎖がペプチドリンカーによって直列につながれた２つ以上のＶＨドメイン（同じまたは異なる抗体に由来するもの）からなり、もう一方のポリペプチド鎖がペプチドリンカーによって直列につながれた相補的ＶＬドメインからなる２つのポリペプチド鎖をコードする２シストロン性ベクターを発現させることによって得られる。
【００２２】
つい最近、二元的な特異性を有する四価タンデムダイアボディ（ｔａｎｄａｂと呼ばれる)についても報告された[Cochlovius et al., Cancer Research (2000) 60: 4336-4341頁]。二重特異性ｔａｎｄａｂは２つの同じポリペプチドのダイマーであり、その各々のポリペプチドは、自己会合の際に２つの異なる特異性それぞれについての２つの可能性ある結合部位の形成を容易にする方向に連結された２つの異なる抗体の４つの可変領域(ＶＨ１、ＶＬ１、ＶＨ２、ＶＬ２）を含む。
【００２３】
本発明の一つの実施態様によれば、非共有結合により３つの結合部位を形成する２つの異種ポリペプチド鎖を含んでなる二重特異性三価ターゲッティングタンパク質が提供され、前記３つの結合部位のうち、２つの部位は１つの標的に対する親和性を有し、第三の部位は、診断薬および／または治療薬用の担体と結合し得るハプテンに対する親和性を有する。好ましい実施態様によれば、結合タンパク質は２つのＣＥＡ結合部位と１つのＨＳＧ結合部位を有する。二重特異性三価ターゲッティング剤は２つの異なるｓｃＦｖを有し、１つのｓｃＦｖは、ショートリンカーによってもう１つの抗体のＶＬドメインと連結された１つの抗体に由来する２つのＶＨドメインを含み、第二のｓｃＦｖは、ショートリンカーによって他の抗体のＶＨドメインと連結された第一の抗体由来の２つのＶＬドメインを含む。多価多重特異性薬剤をＶＨおよびＶＬドメインから製造する方法によると、宿主生物においてＤＮＡプラスミドから合成される各鎖は、多価性および多重特異性を有する薬剤を１つのＶＨ鎖の１つのＶＬ鎖との非共有結合によって作製することができるように、全てＶＨドメイン（ＶＨ鎖）で構成されるか、または全てＶＬドメイン（ＶＬ鎖）で構成される。例えば、三価の三重特異性薬剤を形成する場合、ＶＨ鎖は、各々が、長さを変えることが可能なペプチドリンカーによって連結される異なる特異性の抗体由来の３つのＶＨドメインのアミノ酸配列からなり、ＶＬ鎖は、ＶＨ鎖に用いられるものと同様のペプチドリンカーによって連結される相補的ＶＬドメインからなる。抗体のＶＨおよびＶＬドメインは逆平行に結合するため、本発明において好ましい方法は、以下のダイアグラムに示すように、ＶＨ鎖のＶＨドメインとは逆の順序に配置されたＶＬ鎖のＶＬドメインを有する。
【００２４】
ＶＨ鎖：ＮＨ２−−−−−ＶＨ１−Ｌａ−ＶＨ２−Ｌｂ−ＶＨ３−−−−ＣＯＯＨ
ＶＬ鎖：ＮＨ２−−−−−ＶＬ３−Ｌｂ−ＶＬ２−Ｌａ−ＶＬ１−−−−ＣＯＯＨ
【００２５】
ペプチドリンカーＬａおよびＬｂは同じであってもよいし、または異なっていてもよい。
【００２６】
価数または特異性の数を増やすように、より多くの可変領域を含めることができる。例えば、以下に示す２つのポリペプチドは、２つの特異性の各々に対して二価である四価二重特異性ダイマーを形成し得る。
【００２７】
ＶＨ鎖：ＮＨ２−−−ＶＨ１−Ｌａ−ＶＨ１−Ｌｂ−ＶＨ２−Ｌｃ−ＶＨ２−−ＣＯＯＨ
ＶＬ鎖：ＮＨ２−−−ＶＬ２−Ｌｃ−ＶＬ２−Ｌｂ−ＶＬ１−Ｌａ−ＶＬ１−−ＣＯＯＨ
【００２８】
ペプチドリンカーＬａ、Ｌｂ、およびＬｃは同じであってもよいし、または異なっていてもよい。各鎖の可変領域の順序が各特異性の機能活性の保持に重要であるか否かはまだ決定されていない。
【００２９】
本発明のさらなる実施態様では、抗原特異的ヘテロダイマーを構築するためのＶＨおよびＶＬドメインを作製するために、３つのモノクローナル抗体、６７９、ｈＭＮ１４、および７３４が用いられる。ｈＭＮ１４および７３４を作製し、これらを使用する方法は、全開示内容が引用することにより本明細書の一部とされる米国出願第０９／３３７，７５６号、第０９／８２３，７４６号および第１０／１５０，６５４号に記載されている。６７９と呼ばれるマウスモノクローナル抗体（ＩｇＧ１、Ｋ）は高い親和性でトリペプチド部分ヒスタミンスクシニルグリシル（ＨＳＧ）を含む分子と結合する（Morel et al, Molecular immunology, 27, 995-1000頁, 1990)。６７９の可変領域（ＶＨおよびＶＫ）についてのヌクレオチド配列は決定されている(Qu et al、未発表の結果)。ＶＫは、抗体軽鎖、ＶＬの２つのイソタイプのうちの１つである。２つのイソタイプの機能は同じである。図１に示すように、６７９ヘテロダイマーを発現させるための遺伝子構築物（６７９−ｓｃＦｖ−Ｌ５）の設計は次の特徴を有している：１）ＶＨのカルボキシル末端はペプチドリンカーＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（Ｇ４Ｓ）によってＶＫのアミノ末端と連結されている。Ｇ４Ｓペプチドリンカーを使用することによって分泌されたポリペプチドのヘテロダイマーへの二量化を可能にし、ＨＳＧの２つの結合部位を形成する。２）ｐｅｌＢリーダーシグナルペプチド配列はＶＨ遺伝子の前に配置し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のペリプラスム空間でのポリペプチドの合成を容易にする。３）６ヒスチジン（Ｈｉｓ）残基をカルボキシル末端に付加してＩＭＡＣによる精製を可能にする。６７９−ｓｃＦｖ−Ｌ５の核酸のＤＮＡコード配列および対応するコードされるアミノ酸を図４（配列）に示す。図１では、ｐｅｌＢリーダーペプチドのタンパク質分解除去後の成熟ポリペプチドの棒線画およびＨＳＧ結合部位を含む６７９ヘテロダイマーの棒線画も示している。６７９はマウス抗体に対する有害反応を回避するために、ヒト化することができるし、または完全にヒトであってもよい。
【００３０】
ｈＭＮ１４はＣＥＡと特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体（Ｍａｂ）である(Shevitz et al, J. Nucl. Med., suppl., 34, 217頁, 1993；米国特許第６，２５４，８６８号(2001))。元々のＭａｂはマウスであり、ヒト化抗体試薬は現在、ヒト抗マウス抗体応答を減少させるのに用いられている。この抗体の可変領域を発現構築物（ｈＭＮ１４−ｓｃＦｖ−Ｌ５)へと組み込んだ。図２に示すように、ｈＭＮ１４ヘテロダイマーを発現させるための遺伝子構築物（ｈＭＮ１４−ｓｃＦｖ−Ｌ５）の設計は次の特徴を有している：１）ＶＨのカルボキシル末端はペプチドリンカーＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（Ｇ４Ｓ）によってＶＫのアミノ末端と連結されている。Ｇ４Ｓペプチドリンカーを使用することによって分泌されたポリペプチドのヘテロダイマーへの二量化を可能にし、ＣＥＡの２つの結合部位を形成する。２）ｐｅｌＢリーダー配列はＶＨ遺伝子の前に配置し、大腸菌のペリプラスム空間でのポリペプチドの合成を容易にする。３）６ヒスチジン（Ｈｉｓ）残基をカルボキシル末端に付加してＩＭＡＣによる精製を可能にする。ｈＭＮ１４−ｓｃＦｖ−Ｌ５の核酸のＤＮＡコード配列および対応するコードされるアミノ酸を図６（配列）に示す。図２では、ｐｅｌＢリーダーペプチドのタンパク質分解除去後の成熟ポリペプチドの棒線画およびＣＥＡ結合部位を含むｈＭＮ１４ヘテロダイマーの棒線画も示している。
【００３１】
７３４は高い親和性で金属キレート錯体  インジウム−ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）と結合する、指定されたマウスモノクローナル抗体である。図２に示すように、７３４ヘテロダイマーを発現させるための遺伝子構築物(７３４−ｓｃＦｖ−Ｌ５)の設計は次の特徴を有している：１）ＶＨのカルボキシル末端はペプチドリンカーＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（Ｇ４Ｓ）によってＶＫのアミノ末端と連結されている。Ｇ４Ｓペプチドリンカーを使用することによって分泌されたポリペプチドのヘテロダイマーへの二量化を可能にし、ＨＳＧの２つの結合部位を形成する。２）ｐｅｌＢリーダーシグナルペプチド配列はＶＨ遺伝子の前に配置し、大腸菌のペリプラスム空間でのポリペプチドの合成を容易にする。３）６ヒスチジン（Ｈｉｓ）残基をカルボキシル末端に付加してＩＭＡＣによる精製を可能にする。７３４−ｓｃＦｖ−Ｌ５の核酸のＤＮＡコード配列および対応するコードされるアミノ酸を図７（配列）に示す。図３では、ｐｅｌＢリーダーペプチドのタンパク質分解除去後の成熟ポリペプチドの棒線画およびＩｎ−ＤＴＰＡ結合部位を含む７３４ヘテロダイマーの棒線画も示している。７３４は、マウス抗体に対する有害反応を回避するために、ヒト化することができるし、または完全にヒトであってもよい。
【００３２】
２シストロン性発現ベクターを一連のサブクローニング手順によって構築した。三価二重特異性６７９ｘｈＭＮ１４ｘｈＭＮ１４の２シストロン性発現カセットを、宿主細胞において染色体外自己複製遺伝因子を形成する小型の二本鎖ＤＮＡであるプラスミド内に含めてもよい。クローニングベクターは微生物宿主細胞において自己複製可能なＤＮＡ分子である。本発明はさらに、二重特異性三価ヘテロダイマーを発現するベクターを包含する。宿主細胞は増殖を目的としてベクターを受け入れ、宿主細胞が分裂するたびにベクターは複製する。一般的に用いられる宿主細胞は大腸菌(Escherichia Coli(E. Coli))であるが、その他の宿主細胞も利用可能である。宿主細胞の増殖を通じて可能となる組換え抗体断片の大量生産により、これらの抗体は有望な送達系となる。
【００３３】
２シストロン性カセットが大腸菌において発現すると、いくつかのポリペプチドが折り畳まれ、自然発生的に可溶性の二重特異性三価ヘテロダイマーが形成される。例示した二重特異性三価ヘテロダイマーは、互いに相互作用してＨＳＧに対して高い親和性を有するＨＳＧ結合部位を形成する２つのポリペプチド、および結合してＣＥＡ抗原に対して高い親和性を有する２つのＣＥＡ結合部位を形成する４つのポリペプチドを有する。抗原は特異的な抗体によって捕捉され、架橋している抗原および抗体分子の非共有相互作用によって結合される抗原−抗体複合体を形成する。三重特異性三価ヘテロダイマーは、互いに相互作用してＨＳＧに対して高い親和性を有するＨＳＧ結合部位を形成する２つのポリペプチド、結合してＣＥＡ抗原に対して高い親和性を有するＣＥＡ結合部位を形成する２つのポリペプチド、および結合して金属キレート錯体  インジウム−ＤＴＰＡに対して高い親和性を有する金属キレート錯体  インジウム−ＤＴＰＡ結合部位を形成する２つのポリペプチドを有する。
【００３４】
６７９ｘｈＭＮ１４ｘｈＭＮ１４二重特異性ヘテロダイマーの発現用の２つの構築物が設計され、構築され、調査されている。ＢＳ６またはＢＳ８（〜８０ｋＤ）はＣＥＡの２つの結合部位およびＨＳＧの１つの結合部位を含む。ＢＳ６は、２つのポリペプチド上における各Ｖドメインの配置がＢＳ８とは異なっている。ＢＳ６を構成するポリペプチドはｈＭＮ１４ＶＨ−（Ｌａ）−ｈＭＮ１４ＶＫ−（Ｌｂ）−６７９ＶＨ−６Ｈｉｓおよび６７９ＶＫ−（Ｌｂ）−ｈＭＮ１４ＶＨ−（Ｌａ）−ｈＭＮ１４ＶＫ−６Ｈｉｓである。ＢＳ８を含んでなるポリペプチドはｈＭＮ１４ＶＨ−（Ｌ５）−ｈＭＮ１４ＶＨ−（Ｌｂ）−６７９ＶＨ−６Ｈｉｓおよび６７９ＶＫ−（Ｌｂ）−ｈＭＮ１４ＶＫ−（Ｌａ）−ｈＭＮ１４ＶＫ−６Ｈｉｓである。ＢＳ６の場合、ｈＭＮ１４ ＭＡｂのＶＨポリペプチドは、オリゴペプチドリンカーによって６７９ ＭＡｂのＶＨポリペプチドと連結されているｈＭＮ１４ ＭＡｂのＶＫポリペプチドと、オリゴペプチドリンカーによって連結されており、６７９ ＭＡｂのＶＫポリペプチドは、オリゴペプチドリンカーによってｈＭＮ１４  ＭＡＢのＶＫポリペプチドと連結されているｈＭＮ１４ ＭＡｂのＶＨポリペプチドと、オリゴペプチドリンカーによって連結されている。各鎖が６７９ｘｈＭＮ１４ｘｈＭＮ１４二重特異性三価ヘテロダイマーの半分を形成する。ＢＳ８は、オリゴペプチドリンカーによって６７９ ＭＡｂのＶＨポリペプチドと連結されているｈＭＮ１４ ＭＡｂのＶＨポリペプチドと、オリゴペプチドリンカーによって連結されているｈＭＮ１４ ＭＡｂのＶＨポリペプチド、ならびにオリゴペプチドリンカーによってｈＭＮ１４ ＭＡｂのＶＫポリペプチドと連結されているｈＭＮ１４ ＭＡｂのＶＫポリペプチドと、オリゴペプチドリンカーによって連結されている６７９ ＭＡｂのＶＫポリペプチドからなる。各鎖が６７９ｘｈＭＮ１４ｘｈＭＮ１４ヘテロダイマーの半分を形成する。ＢＳ６およびＢＳ８のオリゴペプチドリンカーは同じであってもよいし、または異なっていてもよい。ＢＳ６の第一および第二のポリペプチド配列についての核酸のＤＮＡコード配列および対応するコードされるアミノ酸は、ｈＭＮ１４ＶＨ−（Ｌａ）−ｈＭＮ１４ＶＫ−（Ｌｂ）−６７９ＶＨ−６Ｈｉｓおよび６７９ＶＫ−（Ｌｂ）−ｈＭＮ１４ＶＨ−（Ｌａ）−ｈＭＮ１４ＶＫ−６Ｈｉｓであり、ＢＳ８の場合では、ｈＭＮ１４ＶＨ−（Ｌａ）−ｈＭＮ１４ＶＨ−（Ｌｂ）− ６７９ＶＨ−６Ｈｉｓおよび６７９ＶＫ−（Ｌｂ）−ｈＭＮ１４ＶＫ−（Ｌａ）−ｈＭＮ１４ＶＫ−６Ｈｉｓであり、ここで、ｈＭＮ１４ＶＨおよびＶＫ、ならびに６７９ＶＨおよびＶＫは各々、図６および４（配列）に示している。
【００３５】
三重特異性三価結合タンパク質、ＴＳ１は、ＣＥＡの１つの結合部位、ＨＳＧの１つの結合部位、および金属キレート  インジウム−ＤＴＰＡの１つの結合部位を有する。ＴＳ１を構成するポリペプチドは、ｈＭＮ１４ＶＨ−（Ｌａ）−７３４ＶＨ−（Ｌｂ）−６７９ＶＨおよび６７９ＶＫ−（Ｌｂ）−７３４ＶＫ−（Ｌａ）−ｈＭＮ１４ＶＫである。ＴＳ１では、ｈＭＮ１４ ＭＡｂのＶＨポリペプチドが、オリゴペプチドリンカーによって６７９ ＭＡｂのＶＨポリペプチドと連結されている７３４ ＭＡｂのＶＨポリペプチドと、オリゴペプチドリンカーによって連結されており、６７９ ＭＡｂのＶＫポリペプチドが、オリゴペプチドリンカーによってｈＭＮ１４ ＭＡｂのＶＫポリペプチドと連結されている７３４ ＭＡｂのＶＫポリペプチドと、オリゴペプチドリンカーによって連結されている。各鎖がｈＭＮ１４ｘ７３４ｘ６７９三重特異性三価ヘテロダイマーの半分を形成する。リンカーは同じであってもよいし、または異なっていてもよい。ｍ７３４ＶＨおよびＶＫは図７（配列）に示している。
【００３６】
これらの二重特異性三価結合タンパク質の最終的な用途は、ＨＳＧ含有ペプチドによって運ばれる診断薬または治療薬のその後の特異的な送達を目的としたＣＥＡ陽性腫瘍のプレターゲッティングに向けたものである。これらのヘテロダイマーは、親和性の増強および所望の位置での滞留時間の延長を考慮して、２つの標的抗原と選択的に結合する。ＢＳ６およびＢＳ８は、二価ＣＥＡ結合および循環時間の延長により高レベルの腫瘍摂取を達成する能力を有するため、魅力的なプレターゲッティング剤である。さらに、非抗原結合ヘテロダイマーを迅速に体内から除去し、正常組織の曝露を最小限に抑える。診断薬および治療薬としては、同位元素、薬剤、毒素、サイトカイン、ホルモン、増殖因子、複合体、放射性核種、および金属を挙げることができる。例えば、ガドリニウム金属は磁気共鳴画像診断(magnet resonance imaging)に用いられ、ＭＲＩ造影剤、ＣＴ造影剤、および超音波造影剤もまた利用される。放射性核種の例は、例えば、９０Ｙ、１１１Ｉｎ、１３１Ｉ、９９ｍＴｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１７７Ｌｕ、６７Ｃｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、および２１１Ａｔである。その他の放射性核種も診断薬および治療薬として利用可能である。これらの薬剤へと設計される特異性に応じて、免疫応答の誘導によって、または放射性ハプテンまたは薬剤−ハプテン複合体を用いるＡＥＳ技術と組み合わせて達成し得る、癌、自己免疫疾患および感染症の治療に用いることが可能である。三重特異性および四重特異性薬剤は、血液サンプル中の特異的な標的細胞の検出および区別に有用であり得る。
【００３７】
さらに、本発明は、組み合わせて機能的構造を形成するのに２つの相補的ポリペプチドを必要とするだけであり、同一のポリペプチドが結合することは決してないため、多数の副生物を形成するという問題が回避される。そのため、ポリペプチド鎖の不適切な対合によって不活性な混入物質が形成されることはない。本発明は、各ポリペプチド鎖がＶＨまたはＶＬドメインしか含んでいないことから、他方のポリペプチド鎖と結合する場合にのみ機能的構造を形成することができるため、分子内対合の問題が回避される。本発明は、各ポリペプチド鎖がＶＨまたはＶＬドメインしか含んでいない（ＢＳ８およびＴＳ１）ことから、またはそれらが奇数のＶＨおよびＶＬドメインからなる（ＢＳ６）ことから、相補鎖と結合する場合に機能的構造だけを形成することができるため、分子内対合の問題が回避される。Davis et al.は、一方が少なくとも２つの抗体由来のＶＨドメインからなり、もう一方が対応するＶＬドメインからなる２つのポリペプチド鎖の対合に基づく多価多重特異性タンパク質の構築の同様のアプローチを開示している（米国特許第５，９８９,８３０号(1999)および米国特許第６，２３９,２５９号(2001))が、多価多重特異性分子各々の分子的同一性を確立する証拠はほとんど掲載されていない。
【００３８】
本発明によれば、診断または治療を目的とする診断薬または治療薬の標的への送達には、患者に前記結合タンパク質を投与すること、ある量の結合していないタンパク質が患者の血流から除去されるのに十分な時間待つこと、および結合タンパク質の結合部位と結合する診断薬または治療薬を投与することが含まれる。診断にはさらに、公知の技術による結合タンパク質の検出工程が必要である。診断用または治療用担体分子は、診断上または治療上有効な薬剤、結合部分、および１以上のハプテン部分を含んでなる。このハプテン部分は、該ハプテン部分の結合タンパク質との同時結合が可能となる位置に配置される。
【００３９】
本発明による結合タンパク質および診断薬または治療薬の哺乳動物への投与は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸腔内、くも膜下、局所カテーテルを通じた潅流によって、または直接病変内局注によってもよい。注入により結合成分を投与する場合、投与は持続注入または単一回もしくは複数回ボーラスによってもよい。
【００４０】
混合されていない診断薬または治療薬および二重特異性抗体は、医薬上許容される注入ビヒクル、好ましくは生理学的ｐＨおよび濃度のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中において、ヒト治療用および診断用キットとして提供することができる。調製物は、特に、ヒトでの使用を目的とする場合には、好ましくは無菌である。このようなキットの任意の成分としては、安定剤、バッファー、標識試薬、放射性同位元素、常磁性化合物、クリアランスを高めるための第二の抗体、および従来のシリンジ、カラム、バイアルなどが挙げられる。
【００４１】
前記多価多重特異性結合タンパク質は、癌、自己免疫疾患、感染症、循環器疾患および炎症性疾患をはじめとする種々のヒト疾患の診断および治療に有用である。この実施態様では、標的抗原は、癌結合部位、自己免疫疾患結合部位、感染症結合部位、循環器疾患結合部位、および炎症性疾患結合部位など、ヒト疾患に関連する結合部位である。
【００４２】
本発明の範囲において有用な抗体および抗原としては、上記のような特性を有するｍＡｂが挙げられ、限定されるものではないが、癌においては、次のｍＡｂの使用が考えられる：ＬＬ１（抗ＣＤ７４）、ＬＬ２（抗ＣＤ２２）、ＲＳ７（抗上皮糖タンパク質−１（ＥＧＰ−１））、ＰＡＭ−４およびＫＣ４（ともに抗ＭＵＣ１）、ＭＮ−１４（抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ））、Ｍｕ−９（抗結腸特異的抗原−ｐ）、Ｉｍｍｕ３１（抗α−フェトプロテイン）、ＴＡＧ−７２（例えば、ＣＣ４９）、Ｔｎ、Ｊ５９１（抗ＰＳＭＡ）およびＧ２５０（抗炭酸脱水酵素ＩＸｍＡｂ）。これらの複合体を用いてターゲッティングし得るその他の有用な抗原としては、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＢｒＥ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０（例えば、Ｃ２Ｂ８、ｈＡ２０、１Ｆ５  Ｍａｂ）ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ８０、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ受容体、Ｐ１ＧＦ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＰＳＭＡ、ガングリオシド、ＨＣＧ、ＥＧＦ−２（例えば、１７−１Ａ）、ＣＤ３７、ＨＬＤ−ＤＲ、ＣＤ３０、Ｉａ、Ａ３、Ａ３３、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＫＳ−１、Ｌｅ（ｙ）、Ｓ１００、ＰＳＡ、テネイシン、葉酸受容体、Ｔｈｏｍａｓ‐Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、腫瘍血管新生抗原、Ｇａ７３３、ＩＬ−２、Ｔ１０１、ＭＡＧＥ、Ｌ２４３またはその組合せが挙げられる。数多くの上記の抗体および抗原、ならびに本発明の範囲において有用なさらなる抗体および抗原（例えば、抗ＣＳＡＰ、ＭＮ−３および抗顆粒球抗体）は、引用することにより全開示内容が本明細書の一部とされる、２００２年１１月１５日出願の"Use of Multi-specific, Non-covalent Complexes for Targeted Delivery of Therapeutics,"と題する米国仮出願第６０／４２６，３７９号、２００２年３月１日出願の"RS7 Antibodies,"と題する米国仮出願第６０／３６０，２２９号、２００２年２月１４日出願の"Anti-CD20 Antibodies and Fusion Proteins Thereof and Mehods of Use,"と題する米国仮出願第６０／３５６，１３２号、２００１年１１月２８日出願の"Anti-DOTA Antibody,"と題する米国仮出願第６０／３３３，４７９号、２００１年７月３１日出願の"Polymeric Delivery Systems,"と題する米国仮出願第６０／３０８，６０５号、２００２年３月１日出願の"Antibody point mutations for enhancing rate of clearance,"と題する米国仮出願第６０／３６１，０３７号、２００２年３月１日出願の"Internalizing Anti-CD-74 Antibodies and Methods of Use,"と題する米国仮出願第６０／３６０，２５９号、２００１年１０月１日出願の"Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies,"と題する米国出願第０９／９６５，７９６号、２００１年１２月２６日出願の"Labeling Targeting Agents With Gallium-68 and Gallium-67,"と題する米国仮出願第６０／６０／３４２，１０４号、２００２年４月５日出願の"Labeling Targeting Agents With Gallium-68 and Gallium-67,"と題する米国出願第１０／１１６，１１６号、２００２年８月１日出願の"Alpha-Fetoprotein Immu31 Antibodies and Fusion Proteins and Methods of Use Thereof,"と題する米国仮出願第６０／３９９，７０７号、２００２年６月１４日出願の"Monoclonal Antibody hPAM4,"と題する米国仮出願第６０／３８８，３１４号、および２００２年９月３０日出願の"Chimeric, Human and Humanized Anti-granulocyte Antibodies and Methods of Use,"と題する米国仮出願第６０／４１４,３４１号に開示されている。
【００４３】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、迅速に内在化した後、再び発現され、プロセシングされ、細胞表面に提示されて、細胞による循環免疫複合体の連続摂取および付着を可能にする抗体が用いられる。最も好ましい抗体／抗原対の例は、ＬＬ１ 抗ＣＤ７４ ｍＡｂ（不変鎖、クラスII特異的シャペロン、Ｉｉ）である。ＣＤ７４抗原は、Ｂ細胞リンパ腫、特定のＴ細胞リンパ腫、黒色腫および特定のその他の癌（Ong et al., Immunology 98: 296-302頁 (1999)）、ならびに特定の自己免疫疾患において高度に発現される。
【００４４】
抗ＣＤ７４抗体により好適に治療される疾患としては、限定されるものではないが、非ホジキンリンパ腫、黒色腫および多発性骨髄腫が挙げられる。標的細胞の表面での短期間のＣＤ７４抗原の連続発現後に、抗原の内在化、および抗原の再発現を受けて、標的ＬＬ１抗体が、それが「ペイロード」として運ぶ化学療法成分とともに内在化されることを可能にする。このことによって、このような細胞の内部に蓄積されるＬＬ１−化学療法薬免疫複合体の高い治療上の濃度が実現可能となる。内在化されたＬＬ１−化学療法薬免疫複合体は、リソソームおよびエンドソームを通じて循環され、標的細胞内において化学療法成分が活性型で放出される。
【００４５】
他の態様では、本発明は、被験体を治療する方法であって、治療上有効な量の本発明の好ましい実施態様による治療用複合体を被験体に投与することを含んでなる方法に関する。本発明の好ましい実施態様による治療用複合体によって治療し得る疾患としては、限定されるものではないが、Ｂ細胞悪性腫瘍（例えば、非ホジキンリンパ腫および慢性リンパ性白血病、例えば、ＬＬ２ ｍＡｂを用いる；米国特許第６，１８３，７４４号を参照）、内胚葉由来の消化器系上皮の腺癌、乳癌および非小細胞肺癌などの癌、ならびにその他の癌腫、肉腫、神経膠腫、骨髄性白血病などが挙げられる。特に、悪性固形腫瘍または造血器新生物、例えば、胃腸、肺、乳房、前立腺、卵巣、精巣、脳またはリンパ腺の腫瘍、肉腫または黒色腫によって産生されるか、またはそれと関連した抗原、例えば、腫瘍胎児抗原に対する抗体を使用することが有利である。
【実施例】
【００４６】
以下の実施例は本発明の具体例の例示であり、特許請求の範囲を限定するものとして使用するべきではない。
【００４７】
実施例１−大腸菌内でＢＳ８を発現するためのプラスミドの構築
本発明により導入された概念を用いて、ＣＥＡに対して二価、ＨＳＧに対しては一価である二重特異性三価分子（ＢＳ８）を以下の２つのポリペプチドの二量化によって得た：
ＶＨ鎖：ｈＭＮ１４ＶＨ−ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＭ−ｈＭＮ１４ＶＨ−ＧＧＧＧＳ−６７９ＶＨ
ＶＬ鎖：６７９ＶＫ−ＧＧＧＧＳ−ｈＭＮ１４ＶＫ−ＬＥＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳ−ｈＭＮ１４ＶＫ
【００４８】
２つのポリペプチドのＤＮＡ配列を標準分子生物学技術を用いてｐＥＴ−ＥＲベクター、２シストロン性細菌発現プラスミドへと設計した。発現の際には、各ポリペプチドは大腸菌のペリプラスム空間での合成に向けるアミノ末端のｐｅｌＢリーダー配列およびＩＭＡＣによる精製に関連するカルボキシル末端の６Ｈｉｓアフィニティータグを有する。我々は、二重特異性薬剤、その後続いてＣＥＡまたはＷＩ２（ｈＭＮ１４に対するラット抗ｉｄモノクローナル抗体）の連続注入時の応答単位のさらなる増大を測定することによるＨＳＧ結合センサーチップを用いるＢＩＡｃｏｒｅによって２つのポリペプチドが実際に、ＣＥＡとは二価で結合し、ＨＳＧとは一価で結合する二重特異性ヘテロダイマーを形成することを示した。
【００４９】
この具体例では、ｈＭＮ１４ ＭＡｂのＶＨポリペプチドは、１６アミノ酸残基リンカーによって６７９ ＭＡｂのＶＨポリペプチドと連結されている５アミノ酸残基リンカーによってｈＭＮ１４ ＭＡｂのＶＫポリペプチドと連結されており、６７９ ＭＡｂのＶＫポリペプチドは、５アミノ酸残基リンカーによってｈＭＮ１４  ＭＡＢのＶＫポリペプチドと連結されている１６アミノ酸残基リンカーによってｈＭＮ１４ ＭＡｂのＶＨポリペプチドと連結されている。各鎖が６７９ｘｈＭＮ１４ｘｈＭＮ１４二重特異性、三価ヘテロダイマーの半分を形成する。
【００５０】
あるいは、ＶＨおよびＶＬドメインの両方からなる各鎖が対合の際に多価多重特異性結合部位を形成するよう作製されていてもよい。このような例は以下に記載するようにＢＳ６によって提供される。
【００５１】
実施例２−大腸菌内でＢＳ６を発現するためのプラスミドの構築
本発明により導入された概念の改変を用いて、ＣＥＡに対して二価、ＨＳＧに対しては一価であるさらなる二重特異性三価分子（ＢＳ６）を以下の２つのポリペプチドの二量化によって得た：
ｈＭＮ１４ＶＨ−ＧＧＧＧＳ−ｈＭＮ１４ＶＫ−ＬＥＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳ−６７９ＶＨ
６７９ＶＫ−ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＭ−ｈＭＮ１４ＶＨ−ＧＧＧＧＳ−ｈＭＮ１４ＶＫ
【００５２】
ＢＳ６は特異的なポリペプチド鎖のドメインの配置がＢＳ８とは異なっている。ＢＳ８の各鎖は全てＶＨドメインで構成されるか、または全てＶＬドメインで構成される。ＢＳ６のポリペプチド鎖は、その代わりに２つのＶＨと１つのＶＬまたは１つのＶＨと２つのＶＬで構成される。ＢＳ６では、ｈＭＮ１４ＶＨおよびｈＭＮ１４ＶＫ間のリンカーがたった５個のアミノ酸残基であり、それがそれらの鎖内結合を妨げる。
【００５３】
ＢＳ６の２つのポリペプチドのＤＮＡ配列を標準分子生物学技術を用いてｐＥＴ−ＥＲベクターへと設計した。発現の際には、各ポリペプチドはアミノ末端のｐｅｌＢリーダー配列およびカルボキシル末端の６Ｈｉｓアフィニティータグを有する。我々はＢＩＡｃｏｒｅによって２つのポリペプチドが実際に、ＣＥＡとは二価で結合し、ＨＳＧとは一価で結合する二重特異性ヘテロダイマーを形成することを示した。
【００５４】
この具体例では、ＢＳ６は１６アミノ酸残基リンカーによって６７９ ＭＡｂのＶＨポリペプチドと連結されている５アミノ酸残基リンカーによってｈＭＮ１４ ＭＡｂのＶＫポリペプチドと連結されているｈＭＮ１４ ＭＡｂのＶＨポリペプチドおよび５アミノ酸残基リンカーによってｈＭＮ１４ ＭＡｂのＶＫポリペプチドと連結されている１６アミノ酸残基リンカーによってｈＭＮ１４ ＭＡｂのＶＨポリペプチドと連結されている６７９  ＭＡＢのＶＫポリペプチドからなる。各鎖が６７９ｘｈＭＮ１４ｘｈＭＮ１４二重特異性、三価ヘテロダイマーの半分を形成する。
【００５５】
実施例３−大腸菌内でＴＳ１を発現するためのプラスミドの構築
本発明により導入された概念を用いて、ＣＥＡ、ＨＳＧおよびＩｎ−ＤＴＰＡの結合部分を有する三重特異性三価分子(ＴＳ１)を以下の２つのポリペプチドの二量化によって得た：
ＶＨ鎖：ｈＭＮ１４ＶＨ−（Ｌ１５）−７３４ＶＨ−(Ｌ１５）−６７９ＶＨ 
ＶＬ鎖：６７９ＶＫ−（Ｌ１５）−７３４ＶＫ−（Ｌ１５）−ｈＭＮ１４ＶＫ
【００５６】
２つのポリペプチドのＤＮＡ配列を標準分子生物学技術を用いてｐＥＴ−ＥＲベクターへと設計した。（図８および９を参照）。発現の際には 各ポリペプチドは大腸菌のペリプラスム空間での合成に向けるアミノ末端のｐｅｌＢリーダー配列およびＩＭＡＣによる精製に関連するカルボキシル末端の６Ｈｉｓアフィニティータグを有する。我々はＢＩＡｃｏｒｅおよびＥＬＩＳＡによって２つのポリペプチドが実際に、ＣＥＡ、ＨＳＧおよびＩｎ−ＤＴＰＡに対する結合能を有する二重特異性ヘテロダイマーを形成することを示した。
【００５７】
この具体例では、ｈＭＮ１４ ＭＡｂのＶＨポリペプチドは、１５アミノ酸残基リンカーによって６７９ ＭＡｂのＶＨポリペプチドと連結されている１５アミノ酸残基リンカーによって７３４ ＭＡｂのＶＨポリペプチドと連結されており、６７９  ＭＡＢのＶＫポリペプチドは、１５アミノ酸残基リンカーによってｈＭＮ１４  ＭＡＢのＶＫポリペプチドと連結されている１５アミノ酸残基リンカーによってｈＭＮ１４ ＭＡｂのＶＫポリペプチドと連結されている。ＴＳ１では、各々の1５個のアミノ酸残基リンカーが配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ− Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒを有している。各鎖がｈＭＮ１４ｘ７３４ｘ６７９三重特異性、三価ヘテロダイマーの半分を形成する。
【００５８】
実施例４−多重特異性を有する多価薬剤の使用
本発明は、三価二重特異性、三価三重特異性、四価二重特異性、四価三重特異性、または四価四重特異性であってよいin vivoターゲッティング剤の製造に最も有効に用いられる。三価二重特異性（３−２Ｓ）薬剤は２つの異なる抗体（ＶＨ１／ＶＬ１およびＶＨ２／ＶＬ２）の可変領域から誘導され、２つの抗体によって認識される抗原またはエピトープとの結合が可能である。結合は１つの特異性に対して二価、もう１つの特異性に対しては一価である。３−２Ｓ薬剤はダイアグラム１に示す２つの異種ポリペプチド鎖の二量化によって作製される。
【００５９】
ダイアグラム１．三価二重特異性薬剤
ＶＨ鎖：ＶＨ１−Ｌａ−ＶＨ１−Ｌｂ−ＶＨ２
ＶＬ鎖：ＶＬ２−Ｌｃ−ＶＬ１−Ｌｄ−ＶＬ１
【００６０】
３つのＶＨまたはＶＬドメインの特定の順序を変更してもよく、ペプチドリンカー（Ｌａ、Ｌｂ、Ｌｃ、Ｌｄ）は同じであってもよいし、または異なっていてもよい。 
【００６１】
三価三重特異性（３−３Ｓ）薬剤は３つの異なる抗体（ＶＨ１／ＶＬ１、ＶＨ２／ＶＬ２、およびＶＨ３／ＶＬ３）の可変領域から誘導され、３つの抗体によって認識される抗原またはエピトープとの結合が可能である。結合は３つの異なる特異性の各々に対して一価である。３−３Ｓ薬剤はダイアグラム２に示す２つの異種ポリペプチド鎖の二量化によって作製される。
【００６２】
ダイアグラム２．三価三重特異性薬剤
ＶＨ鎖：ＶＨ１−Ｌａ−ＶＨ２−Ｌｂ−ＶＨ３
ＶＬ鎖：ＶＬ３−Ｌｃ−ＶＬ２−Ｌｄ−ＶＬ１
【００６３】
３つのＶＨまたはＶＬドメインの特定の順序を変更してもよく、ペプチドリンカー（Ｌａ、Ｌｂ、Ｌｃ、Ｌｄ）は同じであってもよいし、または異なっていてもよい。
【００６４】
四価二重特異性（４−２Ｓ）薬剤は２つの異なる抗体（ＶＨ１／ＶＬ１およびＶＨ２／ＶＬ２）の可変領域から誘導され、２つの抗体によって認識される抗原またはエピトープとの結合が可能である。結合は２つの異なる特異性の各々に対して二価である。４−２Ｓ薬剤はダイアグラム３に示す２つの異種ポリペプチド鎖の二量化によって作製される。
【００６５】
ダイアグラム３．四価二重特異性薬剤
ＶＨ鎖：ＶＨ１−Ｌａ−ＶＨ１−Ｌｂ−ＶＨ２−Ｌｃ−ＶＨ２
ＶＬ鎖：ＶＬ２−Ｌｄ−ＶＬ２−Ｌｅ−ＶＬ１−Ｌｆ−ＶＬ１
【００６６】
４つのＶＨまたはＶＬドメインの特定の順序を変更してもよく、ペプチドリンカー（Ｌａ、Ｌｂ、Ｌｃ、Ｌｄ、ＬｅおよびＬｆ）は同じであってもよいし、または異なっていてもよい。
【００６７】
四価三重特異性（４−３Ｓ）薬剤は３つの異なる抗体（ＶＨ１／ＶＬ１、ＶＨ２／ＶＬ２、およびＶＨ３／ＶＬ３）の可変領域から誘導され、３つの抗体によって認識される抗原またはエピトープとの結合が可能である。結合は３つの特異性のうちの１つに対して二価、別の２つの特異性の各々に対しては一価である。４−３Ｓ薬剤はダイアグラム４に示す２つの異種ポリペプチド鎖の二量化によって作製される。
【００６８】
ダイアグラム４．四価三重特異性薬剤
ＶＨ鎖：ＶＨ１−Ｌａ−ＶＨ１−Ｌｂ−ＶＨ２−Ｌｃ−ＶＨ３
ＶＬ鎖：ＶＬ３−Ｌｄ−ＶＬ２−Ｌｅ−ＶＬ１−Ｌｆ−ＶＬ１
【００６９】
４つのＶＨまたはＶＬドメインの特定の順序を変更してもよく、ペプチドリンカー（Ｌａ、Ｌｂ、Ｌｃ、Ｌｄ、ＬｅおよびＬｆ）は同じであってもよいし、または異なっていてもよい。
【００７０】
四価四重特異性（４−４Ｓ）薬剤は４つの異なる抗体（ＶＨ１／ＶＬ１、ＶＨ２／ＶＬ２、ＶＨ３／ＶＬ３、およびＶＨ４／ＶＬ４）の可変領域から誘導され、４つの抗体によって認識される抗原またはエピトープとの結合が可能である。結合は４つの特異性の各々に対して一価である。４−４Ｓ薬剤はダイアグラム５に示す２つの異種ポリペプチド鎖の二量化によって作製される。
【００７１】
ダイアグラム５．四価四重特異性薬剤
ＶＨ鎖：ＶＨ１−Ｌａ−ＶＨ２−Ｌｂ−ＶＨ３−Ｌｃ−ＶＨ４
ＶＬ鎖：ＶＬ４−Ｌｄ−ＶＬ３−Ｌｅ−ＶＬ２−Ｌｆ−ＶＬ１
【００７２】
４つのＶＨまたはＶＬドメインの特定の順序を変更してもよく、ペプチドリンカー（Ｌａ、Ｌｂ、Ｌｃ、Ｌｄ、ＬｅおよびＬｆ）は同じであってもよいし、または異なっていてもよい。
【００７３】
これらの多価多重特異性薬剤を作製するための注目すべき抗体としては、ＣＥＡおよびＭＵＣ１などの腫瘍関連抗原に対して高い親和性を示す抗体、インジウム−ＤＴＰＡ、イットリウム−ＤＯＴＡなどの金属キレートに対して高い親和性を示す抗体、ヒスタミン−スクシニル−グリシンなどの特定のペプチドに対して高い親和性を示す抗体、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ７４などの細胞分化抗原に対して高い親和性を示す抗体、アルカリ性ホスファターゼなどの酵素に対して高い親和性を示す抗体、ＨＬＡ−ＤＲなどの臨床的に有用である可能性のある細胞表面マーカーに対して高い親和性を示す抗体が挙げられる。
【００７４】
本発明による組成物および方法に対して種々の修飾および変形をなし得ることは当業者ならば分かるであろう。よって、このような修飾および変形が添付する特許請求の範囲およびそれらの等価物の範囲にあるならば、本発明はそれらを包含することを表す。 
【００７５】
以上に引用した全ての刊行物の開示内容は、各々が個別に引用することにより本明細書の一部とされるのと同じ程度に、明示的にその全てが引用することにより本明細書の一部とされる。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】大腸菌において６７９−ｓｃＦｖ−Ｌ５発現プラスミドから合成され、６７９ヘテロダイマーを形成する６７９単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ポリペプチドの略図。プロセシングを受けていないポリペプチドの遺伝子構築物は、ｐｅｌＢシグナルペプチド、５アミノ酸リンカーであるＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（Ｇ４Ｓ）によって連結された６７９ＶＨコード配列およびＶＫコード配列、ならびにカルボキシル末端の６ヒスチジン（Ｈｉｓ）アフィニティータグを含む。この図では、ｐｅｌＢリーダーペプチドのタンパク質分解除去後の成熟ポリペプチドの棒線画およびＨＳＧ結合部位を含む６７９ヘテロダイマーの棒線画も示している。
【図２】大腸菌においてｈＭＮ１４−ｓｃＦｖ−Ｌ５発現プラスミドから合成され、ｈＭＮ１４ヘテロダイマーを形成するｈＭＮ１４ｓｃＦｖポリペプチドの略図。プロセシングを受けていないポリペプチドの遺伝子構築物は、ｐｅｌＢシグナルペプチド、５アミノ酸リンカーによって連結されたｈＭＮ１４ＶＨコード配列およびＶＫコード配列、ならびにカルボキシル末端の６ヒスチジンアフィニティータグを含む。この図では、ｐｅｌＢリーダーペプチドのタンパク質分解除去後の成熟ポリペプチドの棒線画、およびＣＥＡ結合部位を含むｈＭＮ１４ヘテロダイマーの棒線画も示している。
【図３】大腸菌において７３４−ｓｃＦｖ−Ｌ５発現プラスミドから合成され、７３４ヘテロダイマーを形成し得るｍ７３４−ｓｃＦｖポリペプチドの略図。プロセシングを受けていないポリペプチドの遺伝子構築物は、ｐｅｌＢシグナルペプチド、５アミノ酸リンカーによって連結された７３４ＶＨコード配列およびＶＫコード配列、ならびにカルボキシル末端の６ヒスチジンアフィニティータグを含む。この図では、ｐｅｌＢリーダーペプチドのタンパク質分解除去後の成熟ポリペプチドの棒線画、および金属キレート錯体  インジウム−ＤＴＰＡ結合部位を含む７３４ヘテロダイマーの棒線画も示している。
【図４】６７９−ｓｃＦｖ−Ｌ５についての核酸のコード配列およびコードされるアミノ酸。１〜６６はｐｅｌＢリーダーペプチドのコード配列である。７０〜４２６は６７９ＶＨのコード配列である。４２７〜４４１はリンカーペプチド（ＧＧＧＧＳ）のコード配列である。４４２〜７８０は６７９ＶＫのコード配列である。７８７〜８０４は６ヒスチジンアフィニティータグのコード配列である。
【図５】ｈ６７９−ｓｃＦｖ−Ｌ５についての核酸のコード配列およびコードされるアミノ酸。１〜６６はｐｅｌＢリーダーペプチドのコード配列である。７０〜４２６はｈ６７９ＶＨのコード配列である。４２７〜４４１はリンカーペプチド（ＧＧＧＧＳ）のコード配列である。４４２〜７８０はｈ６７９ＶＫのコード配列である。７８７〜８０４は６ヒスチジンアフィニティータグのコード配列である。
【図６】ｈＭＮ１４−ｓｃＦｖ−Ｌ５についての核酸のコード配列およびコードされるアミノ酸。１〜６６はｐｅｌＢリーダーペプチドのコード配列である。７０〜４２３はｈＭＮ１４ＶＨのコード配列である。４２４〜４３８はリンカーペプチド（ＧＧＧＧＳ）のコード配列である。４３９〜７５９はｈＭＮ１４ＶＫのコード配列である。７６６〜７８３は６ヒスチジンアフィニティータグのコード配列である。
【図７】ｍ７３４ＶＨおよびＶＬについての核酸のコード配列およびコードされるアミノ酸。
【図８Ａ】ＴＳ１のＶＨ鎖についてのＤＮＡコード配列および推定アミノ酸配列。１〜６３はｐｅｌＢリーダーペプチドのコード配列である。９０〜４０５はｈＭＮ１４ＶＨのコード配列である。４６９〜８１９はｍ７３４ＶＨのコード配列である。８６６〜１２２２はｍ６７９ＶＨのコード配列である。
【図８Ｂ】ＴＳ１のＶＨ鎖についてのＤＮＡコード配列および推定アミノ酸配列。１〜６３はｐｅｌＢリーダーペプチドのコード配列である。９０〜４０５はｈＭＮ１４ＶＨのコード配列である。４６９〜８１９はｍ７３４ＶＨのコード配列である。８６６〜１２２２はｍ６７９ＶＨのコード配列である。
【図９Ａ】ＴＳ１のＶＬ鎖についてのＤＮＡコード配列および推定アミノ酸配列。１〜６３はｐｅｌＢリーダーペプチドのコード配列である。７０〜４０８はｍ６７９ＶＫのコード配列である。４５２〜７６８はｍ７３４ＶＬのコード配列である。８２９〜１１４９はｈＭＮ１４ＶＫのコード配列である。
【図９Ｂ】ＴＳ１のＶＬ鎖についてのＤＮＡコード配列および推定アミノ酸配列。１〜６３はｐｅｌＢリーダーペプチドのコード配列である。７０〜４０８はｍ６７９ＶＫのコード配列である。４５２〜７６８はｍ７３４ＶＬのコード配列である。８２９〜１１４９はｈＭＮ１４ＶＫのコード配列である。
【図１】
2005514030.tif 000002
【図２】
2005514030.tif 000003
【図３】
2005514030.tif 000004
【図４】
2005514030.tif 000005
【図５】
2005514030.tif 000006
【図６】
2005514030.tif 000007
【図７】
2005514030.tif 000008
【図８Ａ】
2005514030.tif 000009
【図８Ｂ】
2005514030.tif 000010
【図９Ａ】
2005514030.tif 000011
【図９Ｂ】
2005514030.tif 000012
【配列表】
2005514030000001.app
【国際調査報告】
2005514030.tif 000013
2005514030.tif 000014
2005514030.tif 000015