(57)【要約】本発明は、パイパー・ベテルの葉の抽出液から、又は他の原料から単離されたクロロゲン酸化合物の、急性及び慢性骨髄性白血病及びリンパ性白血病の治療を目的とした新規の使用に関する。本発明はまた、医薬として許容される添加物と共に、クロロゲン酸を含む、急性及び慢性骨髄性白血病及びリンパ性白血病の治療を目的とした医薬組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物及びヒトにおける急性及び慢性骨髄性白血病のための医薬組成物であって、前記組成物が、パイパー・ベテル(Piper betel)の草本部分のいずれか又は他の天然又は合成原料のいずれかから単離される有効量のクロロゲン酸(ＣＡ)及び/又は３-ｏ-ｐ-クマリル・キナ酸(ＰＣＱ)、並びに医薬として許容される添加剤を含む、前記組成物。
【請求項２】
前記添加剤が、タンパク質、炭水化物、糖などの栄養素、滑石、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、炭酸カルシウム、スターチ-ゼラチン・ペースト、及び/又は医薬として許容される担体、賦形剤、希釈剤、又は溶媒からなる群から選ばれる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ＣＡとＰＣＱの比率が、１：０〜１：１０の範囲で、組成物中に存在し、リンパ腫を含む固形腫瘍の治療に有効である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物が、経口、静脈内、筋肉内、又は皮下経路を通して投与される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物が、１〜５０ｍｇ/(体重)ｋｇ/日の範囲の投与量レベルで、少なくとも４週間投与される、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物が、４週間〜１２週間の範囲で投与される、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
細胞型Ｋ５６２の白血病細胞系列２×１０6/ｍｌ/ウェルの増殖阻害が、ＣＡ２５μｇ/ｍｌの投与量レベルで、２０％以下である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
細胞型Ｋ５６２の白血病細胞系列２×１０6/ｍｌ/ウェルの増殖阻害が、ＰＣＱ２５μｇ/ｍｌの投与量レベルで、４％以下である、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
細胞型Ｋ５６２の白血病細胞系列２×１０6/ｍｌ/ウェルの増殖阻害が、ＣＡ及びＰＣＱ各々２５μｇ/ｍｌを含む投与量レベルで、４４％以下である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
細胞型Ｕ９３７の白血病細胞系列２×１０6/ｍｌ/ウェルの増殖阻害が、ＣＡ２５μｇ/ｍｌの投与量レベルで、１６.６７％以下である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
細胞型Ｕ９３７の白血病細胞系列２×１０6/ｍｌ/ウェルの増殖阻害が、ＰＣＱ２５μｇ/ｍｌの投与量レベルで、２.０８％以下である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
細胞型Ｕ９３７の白血病細胞系列２×１０6/ｍｌ/ウェルの増殖阻害が、ＣＡ及びＰＣＱ各々２５μｇ/ｍｌを含む投与量レベルで、５０％以下である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
ＣＭＬ白血病細胞の白血病細胞系列２×１０6/ｍｌ/ウェルの増殖阻害が、ＣＡ２５μｇ/ｍｌの投与量レベルで、２.３８％以下である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
ＣＭＬ白血病細胞の白血病細胞系列２×１０6/ｍｌ/ウェルの増殖阻害が、ＰＣＱ２５μｇ/ｍｌの投与量レベルで、２.３８％以下である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
ＣＭＬ白血病細胞の白血病細胞系列２×１０6/ｍｌ/ウェルの増殖阻害が、ＣＡ及びＰＣＱ各々２５μｇ/ｍｌを含む投与量レベルで、２０.３％以下である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
急性及び慢性骨髄性白血病(ＡＭＬ及びＣＭＬ)並びにリンパ性白血病を治療することを目的とし、パイパー・ベテル(Piper betel)の草本部分のいずれか又は別の原料のいずれかから単離されるクロロゲン酸(ＣＡ)及び/又は３-ｏ-ｐ-クマリル・キナ酸(ＰＣＱ)を、医薬として許容される添加剤と組み合わせて含む医薬組成物を投与することによる、請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項１７】
ＣＡ及びＰＣＱの両方が、パイパー・ベテル(Piper betel)の草本部分のいずれかから単離されるか、又は合成的に調製される、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
対象が、哺乳動物、好ましくはヒトから選ばれる、請求項１６に記載の使用。
【請求項１９】
前記添加剤が、タンパク質、炭水化物、糖などの栄養素、滑石、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、炭酸カルシウム、スターチ-ゼラチン・ペースト、及び/又は医薬として許容される担体、賦形剤、希釈剤、又は溶媒からなる群から選ばれる、請求項１６に記載の使用。
【請求項２０】
ＣＡとＰＣＱの比率が、１：０〜１：１０の範囲で前記組成物中に存在し、リンパ腫を含む固形腫瘍の治療に有効である、請求項１６に記載の使用。
【請求項２１】
前記組成物が、経口、静脈内、筋肉内、又は皮下経路を通して投与される、請求項１６に記載の使用。
【請求項２２】
前記組成物が、１〜５０ｍｇ/(体重)ｋｇの投与量レベルで、１日あたり少なくとも１回、４週間投与される、請求項１６に記載の使用。
【請求項２３】
前記組成物が、４週間、及び３ヶ月間まで投与される、請求項１６に記載の使用。
【請求項２４】
細胞型Ｋ５６２の白血病細胞系列２×１０6/ｍｌ/ウェルの増殖阻害が、ＣＡ２５μｇ/ｍｌの投与量レベルで、２０％以下である、請求項１６に記載の使用。
【請求項２５】
細胞型Ｋ５６２の白血病細胞系列２×１０6/ｍｌ/ウェルの増殖阻害が、ＰＣＱ２５μｇ/ｍｌの投与量レベルで、４％以下である、請求項１６に記載の使用。
【請求項２６】
細胞型Ｋ５６２の白血病細胞系列２×１０6/ｍｌ/ウェルの増殖阻害が、ＣＡ及びＰＣＱ各々２５μｇ/ｍｌを含む投与量レベルで、４４％以下である、請求項１６に記載の使用。
【請求項２７】
細胞型Ｕ９３７の白血病細胞系列２×１０6/ｍｌ/ウェルの増殖阻害が、ＣＡ２５μｇ/ｍｌの投与量レベルで、１６.６７％以下である、請求項１６に記載の使用。
【請求項２８】
細胞型Ｕ９３７の白血病細胞系列２×１０6/ｍｌ/ウェルの増殖阻害が、ＰＣＱ２５μｇ/ｍｌの投与量レベルで、２.０８％以下である、請求項１６に記載の使用。
【請求項２９】
細胞型Ｕ９３７の白血病細胞系列２×１０6/ｍｌ/ウェルの増殖阻害が、ＣＡ及びＰＣＱ各々２５μｇ/ｍｌを含む投与量レベルで、５０％以下である、請求項１６に記載の使用。
【請求項３０】
ＣＭＬ白血病細胞の白血病細胞系列２×１０6/ｍｌ/ウェルの増殖阻害が、ＣＡ２５μｇ/ｍｌの投与量レベルで、２.３８％以下である、請求項１６に記載の使用。
【請求項３１】
ＣＭＬ白血病細胞の白血病細胞系列２×１０6/ｍｌ/ウェルの増殖阻害が、ＰＣＱ２５μｇ/ｍｌの投与量レベルで、２.３８％以下である、請求項１６に記載の使用。
【請求項３２】
ＣＭＬ白血病細胞の白血病細胞系列２×１０6/ｍｌ/ウェルの増殖阻害が、ＣＡ及びＰＣＱ各々２５μｇ/ｍｌを含む投与量レベルで、２０.３％以下である、請求項１７に記載の使用。
【請求項３３】
急性及び慢性骨髄性白血病(ＡＭＬ及びＣＭＬ)並びにリンパ性白血病の治療方法であって、該方法が、パイパー・ベテル(Piper betel)の草本部分のいずれか、又は他の原料のいずれかから単離されるクロロゲン酸(ＣＡ)及び/又は３-ｏ-ｐ-クマリル・キナ酸 (ＰＣＱ)の有効量を、医薬として許容される添加物と組み合わせて含む医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項３４】
ＣＡ及びＰＣＱの両方が、パイパー・ベテル(Piper betel)の草本部分のいずれかから単離されるか、又は合成的に調製される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
対象が、哺乳動物、好ましくはヒトから選ばれる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記添加剤が、タンパク質、炭水化物、糖などの栄養素、滑石、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、炭酸カルシウム、スターチ-ゼラチン・ペースト、及び/又は医薬として許容される担体、賦形剤、希釈剤、又は溶媒からなる群から選ばれる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
ＣＡとＰＣＱの比率が、１：０〜１：１０の範囲で、組成物中に存在し、リンパ腫を含む固形腫瘍の治療に有効である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記組成物が、経口、静脈内、筋肉内、又は皮下経路を通して投与される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
前記組成物が、１〜５０ｍｇ/(体重)ｋｇの投与量レベルで、一日あたり少なくとも１回、４週間投与される、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
前記組成物が、４週間〜３ヶ月間投与される、請求項３３に記載の方法。
【請求項４１】
細胞型Ｋ５６２の白血病細胞系列２×１０6/ｍｌ/ウェルの増殖阻害が、ＣＡ２５μｇ/ｍｌの投与量レベルで、２０％以下である、請求項３３に記載の方法。
【請求項４２】
細胞型Ｋ５６２の白血病細胞系列２×１０6/ｍｌ/ウェルの増殖阻害が、ＰＣＱ２５μｇ/ｍｌの投与量レベルで、４％以下である、請求項３３に記載の方法。
【請求項４３】
細胞型Ｋ５６２の白血病細胞系列２×１０6/ｍｌ/ウェルの増殖阻害が、ＣＡ及びＰＣＱ各々２５μｇ/ｍｌを含む投与量レベルで、４４％以下である、請求項３３に記載の方法。
【請求項４４】
細胞型Ｕ９３７の白血病細胞系列２×１０6/ｍｌ/ウェルの増殖阻害が、ＣＡ２５μｇ/ｍｌの投与量レベルで、１６.６７％以下である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４５】
細胞型Ｕ９３７の白血病細胞系列２×１０6/ｍｌ/ウェルの増殖阻害が、ＰＣＱ２５μｇ/ｍｌの投与量レベルで、２.０８％以下である、請求項１６に記載の使用。
【請求項４６】
細胞型Ｕ９３７の白血病細胞系列２×１０6/ｍｌ/ウェルの増殖阻害が、ＣＡ及びＰＣＱ各々２５μｇ/ｍｌを含む投与量レベルで、５０％以下である、請求項３３に記載の方法。
【請求項４７】
ＣＭＬ白血病細胞の白血病細胞系列２×１０6/ｍｌ/ウェルの増殖阻害が、ＣＡ２５μｇ/ｍｌの投与量レベルで、２.３８％以下である、請求項３３に記載の方法。
【請求項４８】
ＣＭＬ白血病細胞の白血病細胞系列２×１０6/ｍｌ/ウェルの増殖阻害が、ＰＣＱ２５μｇ/ｍｌの投与量レベルで、２.３８％以下である、請求項３３に記載の方法。
【請求項４９】
ＣＭＬ白血病細胞の白血病細胞系列２×１０6/ｍｌ/ウェルの増殖阻害が、ＣＡ及びＰＣＱ各々２５μｇ/ｍｌを含む投与量レベルで、２０.３％以下である、請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、パイパー・ベテル(Piper betel)の葉の抽出液から単離されたクロロゲン酸(ＣＡ)による、急性及び慢性骨髄性白血病(ＡＭＬ及びＣＭＬ)並びにリンパ性白血病の治療に関する。急性(ＡＭＬ)及び慢性(ＣＭＬ)骨髄性白血病、並びにリンパ性白血病は致死性であり、白血病性の細胞を破壊することに向けられた薬剤はなく、通常非特異性であり、それゆえ通常の細胞に有害な影響を与える化学療法に対してほとんど反応しない。パイパー・ベテル成分(クロロゲン酸)での治療の独特の性質は、骨髄癌細胞及びリンパ癌細胞を殺し、他の通常細胞に影響しない。
【背景技術】
【０００２】
背景及び先行技術文献
骨髄性白血病は、通常２つの群に分けられる：急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)と慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)である。ＡＭＬは、骨髄中の骨髄細胞数の増加及び該細胞の成熟の停止によって特徴付けられる。米国では、年間のＡＭＬ発症率は、約１００,０００人中２.４人であり、年齢に依存して連続的に増加し、６５歳以上の成人で１００，０００人中１２.６人のピークに達する。ＣＭＬは、造血性幹細胞の悪性のクローン性疾患である。発症年齢の中央値は５３歳であるが、ＣＭＬは子供を含む全ての年齢群で発症する。ＣＭＬの自然病歴は、良性の慢性段階から、３〜５年の内に、又はそれより早く、急速に致死的急性転換へ進行する。ＣＭＬの予防は、臨床医薬の甚大な進歩にもかかわらず、不十分である(１)。ＣＤ３３は、骨髄細胞分化過程における特異的かつ有用なマーカーである(２)。モノクローナル抗体によるＣＤ３３の結合が、アポトーシスを誘導し、その結果in vitroにおけるＡＭＬ及びＣＭＬ細胞の増殖阻害をもたらしたということを、最近の報告は示唆した(２，３)。ＣＤ３３の骨髄特異的発現を利用し、抗癌剤と結合されたヒト化抗-ＣＤ３３モノクローナル抗体は、ＡＭＬ患者において試され、有意な成功をもたらした(４)。同様に、リンパ性白血病も２つの群に分けられる：急性リンパ性白血病(ＡＬＬ)と慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)である。リンパ性白血病は、Ｔ細胞及びＢ細胞系列を冒し、そして子供に蔓延する。パイパー・ベテル葉抽出液に関する、抗骨髄性活性は以前に特許請求され(２０００年１２月１２日付けの特許出願番号PCT/IN00/00118)、そしてＡＭＬ及びＣＭＬの治療のための活性因子である3-o-p-クマリル・キナ酸(３-o-p-Coumaryl quinic acid)は、２００２年５月３０日に米国仮特許出願第60/384,163号(299/ＮＦ/2002)で特許請求された。
【０００３】
それゆえ、出願人の以前の発見は、急性及び慢性骨髄性白血病及びリンパ性白血病を治療するため、ベテルの葉の抽出液の分画から単離されたクロロゲン酸(ＣＡ)に関して出願する本特許と、直接一致する。クロロゲン酸は、抗アレルギー活性を有することが知られている(５)。ＣＡはまた、肝臓及び腎臓のグルコース-６-脱リン酸システムを阻害する(６)。ＣＡは、上皮性リポオキシゲナーゼ活性及びＴＰＡ誘導性耳炎症の阻害剤である(７)。ＣＡはまた、マウス皮膚におけるＴＰＡ誘導性腫瘍増殖に阻害性効果を与えた(７)。ＣＡの抗-ＨＩＶ活性もまた報告された(８)。腫瘍促進の阻害がＣＡに起因したが、抗白血病活性を含む確立された腫瘍に対する抗-腫瘍活性は、ＣＡについて報告されていない。本特許出願に於いて、ＣＡの抗白血病活性及び抗腫瘍活性は、初めて特許請求された。
【０００４】
パイパー・ベテルの葉は、強い辛味の芳香風味を有し、そしてインドにおいて咀嚼剤として広く使用されている。一般的に、成長を止めたが、まだもろくなっていない成熟又は過成熟した葉は、咀嚼に使用される。咀嚼目的の基礎製剤は、消石灰及びカテキューを塗りつけ、それにアレカナットの削りくずを加えたベテルの葉からなり；ココナッツ削りくず、クローブ、カルダモン、フェンネル、カンゾウ(liquorice)粉末、ナツメグ、及びタバコなどの香味が好みによって使用される。ある場所において、調製されたパイパー・ベテルの葉製剤は銀又は金のフィルムで包まれる。該製剤は、咀嚼剤として、多くの性質：該製剤は、芳香薬、消化薬、興奮薬、及び駆風薬であるということについて信頼されている。医薬的に、カタル性および肺性感染に有用である。該製剤はパップ剤としても使用される。アレカナット及び他の添加物と、ベテル葉を咀嚼する効果は、唾液腺の活性化と口粘膜の炎症である。赤色の着色は、アレカナットの色素のせいであり、該色は、石灰及びカテキューのアルカリ性の作用下では色を明白にする。温和な程度の刺激が作り出され、暖かさと幸福感の感覚をもたらし、他に快い匂いを与える。該葉の芳香価値を決定する最も重要な因子は、存在する精油の量及び特に性質である。異なる地域からのベテルの葉は、匂いと風味が変化する。最も辛い物は、サーンチー産(Sanchi Type)であり、一方、最もマイルドで甘い物はヴァラナシ産である。
【０００５】
ベテルの葉は、精油を含み、精油の量は、葉の種類に従って、０.７〜２.６％で変わりうる。精油はフェノール類、及びテルペン類からなる。フェノール油の割合が高いほど、品質がよい。チャビベトール(chavibetol)(ベテル・フェノール；４-アルキル-２-ヒドロキシ-１メトキシベンゼン)と名づけられるオイゲノールの異性体は、ベテル油の独特の成分であると考えられる。インド産のベテル油は、主成分としてフェノール性成分を含み、そして様々な呼吸器官系の問題を治療する際に、局所適用として又はうがい薬として使用される。該油は、駆風の性質を有する。該油は、哺乳動物の中枢神経系に異なる作用を示す。精油及び葉の抽出液は、幾つものグラム陽性菌及びグラム陰性菌、例えばミクロロコッカス ピオゲネス アルブス変種(Micrococcus pyogenes var. Albus)、バチルス サチリス(Bacillus subtilis)、及びビー.メガテリウム(B. Megaterium)、ジプロコッカス・ニューモニア(Diplococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、エスケリキア コリ(Escherichia coli)、サルモネラ チホサ(Salmonella typhosa)、ビブリオ コマ(Vibrio comma)、シゲラ ジセンテリア(Shigella dysenteriae)、プロテウス ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス ソラナカエルム(Pdseudomonas solanacaerum)、サルシナ ルタ(Sarcina lutea)、及びエルウィナ カルトロラ(Erwinia carotorora)などに対する活性を有する。精油及び抽出液はまた、アスペルギルス ニガー(Asperigillus niger)、及びエー.オリザ(A.Oryzae)、クルブラリア ルナタ(Curvularia lunata)、及びフサリウム オキシスポルム(Fusarium oxysporum)に対する抗真菌活性を示した。 精油は、原生動物、パラマエセウム カウダタム(Paramaeceum caudatum)に対して、約5分で致死性であることが発見された(５)。葉の水蒸気蒸留液は、ミコバクテリウム チベルクロシス(Mycobacterium tyberculosis)に対する活性を示した。
【０００６】
【化１】
2005531593.tif 000002
【発明の開示】
【０００７】
発明の目的
本発明の主な目的は、急性及び慢性骨髄性白血病及びリンパ性白血病の治療のための、パイパー・ベテルの葉抽出液又は他の原料から単離されるクロロゲン酸化合物の新規の使用を提供することである。
【０００８】
本発明の別の目的は、急性及び慢性骨髄性白血病及びリンパ性白血病の治療のための、クロロゲン酸化合物を担体と共に含む新規の医薬組成物を提供することである。
【０００９】
本発明のさらなる別の目的は、ＡＭＬ、ＣＭＬ、及びリンパ性白血病を治療するために、パイパー・ベテルの葉又は他の草本部分からの活性分画を単離する方法を提供することである。
【００１０】
本発明のさらなる別の目的は、ＡＭＬ、ＣＭＬ、及びリンパ性白血病を治療に関する生理活性を有するパイパー・ベテルの全ての草本部分から活性成分を単離する単純化された方法を提供することである。
【００１１】
本発明の更なる別の目的は、ＡＭＬ、ＣＭＬ、及びリンパ性白血病の治療のための、パイパー・ベテルの葉又は他の草本部分からの薬草生成物を提供することである。
【００１２】
本発明の更なる別の目的は、ＡＭＬ、ＣＭＬ、及びリンパ性白血病の治療のための、パイパー・ベテルの葉から精製された薬草クロロゲン酸を提供することである。
【００１３】
本発明の更なる別の目的は、ＡＭＬ、ＣＭＬ、及びリンパ性白血病の治療のため、パイパー・ベテルの葉又は他の草本部分から抽出液を製造する方法を提供することである。
【００１４】
本発明の更なる別の目的は、ＡＭＬ、ＣＭＬ、及びリンパ性白血病の治療のため、パイパー・ベテルの葉又は他の草本部分から抽出液を製造する単純化された方法を提供することである。
【００１５】
本発明の更なる別の目的は、ＡＭＬ、ＣＭＬ、及びリンパ性白血病を治療するための、パイパー・ベテルの葉からクロロゲン酸を製造する方法を提供することである。
【００１６】
本発明の更なる別の目的は、リンパ種を含む固形癌を治療するための、パイパー・べテルの葉又は他の草本部分から精製された薬草クロロゲン酸を提供することである。
【００１７】
本発明の更なる別の目的は、急性及び慢性骨髄性白血病、リンパ性白血病、並びにリンパ腫を含む固形癌を治療するための、(いずれの原料から単離されるか又は合成的に調製される)クロロゲン酸の新しい使用を提供することである。
【００１８】
発明の要約
従って、本発明は、急性及び慢性骨髄性白血病及びリンパ性白血病を治療するための、パイパー・ベテルの葉抽出液又は他の原料から単離されたクロロゲン酸化合物の新規の使用を提供する。さらに、本発明は、動物及びヒトにおける急性及び慢性骨髄性白血病の医薬組成物を提供し、該組成物は、パイパー・ベテルのいずれの草本部分又は他のいずれの天然又は合成原料から単離される有効量のクロロゲン酸(ＣＡ)及び/又は３-ｏ-ｐ-クマリル・キナ酸(ＰＣＱ)、並びに医薬として許容される添加剤を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
発明の詳細な記載
従って、本発明は、動物及びヒトにおける急性及び慢性骨髄性白血病のための医薬組成物を提供し、前記組成物は、パイパー・ベテルのいずれの草本部分又は他の天然若しくは合成原料から単離される有効量のクロロゲン酸及び/又は３-ｏ-ｐ-クマリル・キナ酸(ＰＣＱ)、及び医薬として許容される添加剤を含む。
【００２０】
本発明のある態様では、添加剤は、タンパク質、炭水化物、糖などの栄養素、滑石、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、炭酸カルシウム、スターチ-ゼラチンペースト及び/又は医薬として許容される担体、賦形剤、希釈剤、又は溶剤からなる群から選ばれる。
【００２１】
別の態様では、ＣＡとＰＣＱの比は、１：０〜１：１０の範囲で組成物中に存在し、該組成物はリンパ腫を含む固形腫瘍の治療に有効である。
【００２２】
さらに別の態様では、前記組成物は、経口、静脈内、筋肉内、又は皮下経路を通して投与される。
【００２３】
さらに別の態様では、該組成物は、１日あたり１〜５０ｍｇ/(体重)ｋｇの範囲の投与量レベルで、少なくとも４週間投与される。
【００２４】
さらに別の態様では、該組成物は、４〜１２週間の範囲で投与される。
【００２５】
さらに別の態様では、細胞型Ｋ５６２の白血病細胞系列２×１０6/ｍｌ/ウェルの増殖阻害は、ＣＡ２５μｇ/ｍｌの投与量レベルで、２０％以下である。
【００２６】
さらに別の態様では、細胞型Ｋ５６２の白血病細胞系列２×１０6/ｍｌ/ウェルの増殖阻害は、ＰＣＱ２５μｇ/ｍｌの投与量レベルで、４％以下である。
【００２７】
さらに別の態様では、細胞型Ｋ５６２の白血病細胞系列２×１０6/ｍｌ/ウェルの増殖阻害は、ＣＡ及びＰＣＱ各々２５μｇ/ｍｌを含む投与量レベルで、４４％以下である。
【００２８】
さらに別の態様において、細胞型Ｕ９３７の白血病細胞系列２×１０6/ｍｌ/ウェルの増殖阻害は、ＣＡ２５μｇ/ｍｌの投与量レベルで、１６.６７％以下である。
【００２９】
さらに別の態様において、細胞型Ｕ９３７の白血病細胞系列２×１０6/ｍｌ/ウェルの増殖阻害は、ＰＣＱ２５μｇ/ｍｌの投与量レベルで、２.０８％以下である。
【００３０】
さらに別の態様において、細胞型Ｕ９３７の白血病細胞系列２×１０6/ｍｌ/ウェルの増殖阻害は、ＣＡ及びＰＣＱ各々２５μｇ/ｍｌを含むの投与量レベルで、５０％以下である。
【００３１】
さらに別の態様において、ＣＭＬ白血病細胞の白血病細胞系列２×１０6/ｍｌ/ウェルの増殖阻害は、ＣＡ２５μｇ/ｍｌの投与量レベルで、２.３８％以下である。
【００３２】
さらに別の態様において、ＣＭＬ白血病細胞の白血病細胞系列２×１０6/ｍｌ/ウェルの増殖阻害は、ＰＣＱ２５μｇ/ｍｌの投与量レベルで、２.３８％以下である。
【００３３】
さらに別の態様において、ＣＭＬ白血病細胞の白血病細胞系列２×１０6/ｍｌ/ウェルの増殖阻害は、ＣＡ及びＰＣＱの各々２５μｇ/ｍｌを含む投与量レベルで、２０.３％以下である。
【００３４】
１以上の態様は、パイパー・ベテルのいずれの草本部位又は他の原料から単離されたクロロゲン酸(ＣＡ)及び/又は３-ｏ-ｐ-クマリル・キナ酸(ＰＣＱ)の有効量を、医薬として許容される添加剤と組み合わせて含む医薬組成物を投与することによる、急性及び慢性骨髄性白血病(ＡＭＬ及びＣＭＬ)を治療するための組成物の使用を提供する。
【００３５】
本発明は、本明細書中の以下で実施例に関して記載されるが、該実施例は、例示のみであり、本発明の範囲をいずれの様式に於いて制限するために解釈されるべきではない。
【実施例】
【００３６】
実施例１：草本材料の収集
パイパー・ベテルの葉及び他の全草本部分を、異なる地域及びインドの西ベンガルからの登山者から収集した。証拠標本を、the Deptt. of Medicinal Chemistry at the Indian Inst. of Chemical Biology, 4 Raja S. C. Mullick Road, Kolkata-700 032に寄託した。
実施例２：クロロゲン酸化合物の単離
４.７Ｋｇのパイパー・ベテルの葉を新鮮に収集し、蒸留水で洗浄し、そして次に小片へと刻んだ。葉の小片を集めて、１.０ｌの蒸留水と混合し、そして混合ミキサーで徹底的にホモジェナイズした。ホモジェネートを微細チーズクロスに通して、大きい粒子をろ過して取り除き、そしてろ液を収集した。該過程を２〜３回繰り返した結果、最大収率を得た。混合されたろ液を次に遠心して、透明溶液の一定分量を収集し、そして半流動性物質になるまで凍結乾燥した。該物質は約１１０ｇｍであった。
【００３７】
生理活性、つまり白血病細胞の破壊について、収集された材料を試験した。その正の活性を観測した際、精製を開始した。１０ｇｍの上記材料を、セファデックス(Sephadex)ＬＨ-２０カラムに添加し、そして溶出剤として水、水-メタノール(１：１)、及びメタノールでクロマトグラフした。３つの異なる溶媒系からそうして得られた３つの異なる分画を、生理活性について別々に調べた。活性は、分画２、つまりメタノール-水(１：１)にのみ存在し、そして分画Ｅと名づけられた。インターシル(Intersil)ＯＤＳ-３分析カラムを使用して、分画Ｅを次にＨＰＬＣ分析に供した。カラムをメタノール-水-酢酸(２３：７６：１)で平行化し、流速を１.０ml/分で維持し、そしてピークを２８０ｎｍで同定した。保持時間(ＲＥ)に従って、異なるピークを３つの帯域、つまりＺA、ＺB、及びＺCに分割した(図１)。ＺAは４個の主要ピークを有し、一方ＺBは、かなり低〜中くらいの１０個のピークを有し、そしてＺCは２個の異なるピークを有した。３つの帯域ＺA、ＺB、及びＺCの生理活性を観察することが都合がよく、該帯域は、白血病細胞に関して、破壊活性について個々に試験された。３つの帯域全ては生理活性を示した。
【００３８】
ＺCが、２つの特徴的なピークを、保持時間(Ｒt)１７.７７及び２６.６６分で有するということが、ここで注目されうる。Ｒt１７.７７分のピークは、かなりの活性を有し、そしてそれゆえその構造は、決定され、そして特許出願された(299/NF/2002;２００２年５月３０日付)。後者のピーク、つまりＲt２６.６６分のピークは、活性を全く示さなかった。
【００３９】
帯域ＺBは、様々な大きさの１０個のピーク(１〜１０)を含んだ。貯められた１〜１０個のピークの分画は、白血病細胞殺傷活性を示した。このため、全ての異なるピークが、生理活性について、個別にモニターされた。そのうちの主要ピークは、２、３、４、及び８のピークであり、それぞれＲt６.５８、７.１４、７.５６、及び１１.９７に対応し、それらは活性を示さなかった。それゆえ、微量ピークを、各々のピークについて繰り返された分画を収集して、その中に存在する活性分子の量を増大することにより、別々に試験した。これらのピーク、つまり１、５、６、７、９、及び１０(それらはＲt５.１６、８.３４、９.１６、９.６８、１３.９４、及び１４.６８に各々対応する)の活性を調査した際、ピーク番号６(Ｒt９.１６分)を除き、他のピークは、検出可能な活性を示さなかった。ピーク６(Ｒt９.１６分)に貯められた分画を凍結乾燥し、そしてＨＰＬＣを通し、鋭い単一のピークは、その純度を示した(図２)。該物質を、次にＩＲ、ＮＭＲ、及びマス・スペクトル分析に供して、構造を決定した。
【化２】
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【００４０】
こうして決定された構造は、該物質がクロロゲン酸又は３-カフェノイル・キナ酸、m.ｐ.２０５〜２０６℃ [α]D-３３.２５(Ｈ2Ｏ)(図３)であるということを示す。該クロロゲン酸は、純粋な形態で、市販されている。該物質を購入し、そしてパイパー・ベテルの葉から単離されたクロロゲン酸と比較した。該比較は、有用物質がクロロゲン酸であるということを明確にした。
【００４１】
以前に特許出願された構造は、３-p-クマリル・キナ酸であり、該物質は、ＣＤ３３+骨髄性細胞の破壊を示すが、ＣＤ３３-細胞の破壊を示さなかった。３-p-クマリル・キナ酸は、クロロゲン酸にとてもよく類似する。クロロゲン酸における芳香環のＣ-３位での水酸基の付加を除いて、他の構造は、正確に類似する。それゆえ、３-ｐ-クマリル・キナ酸以上のクロロゲン酸の更なる活性は、芳香環のＣ-３位における水酸基の存在のためであると提案されうる。該特異的な違いは、ＣＤ３３-及びＣＤ３３+細胞の両者、並びにリンパ白血病細胞を破壊するという点において、より広くかつ強い活性をクロロゲン酸に与えた。
【００４２】
帯域ＺAは、生理活性を示した。該帯域は、４つのピーク、つまり１、２、３、及び４を含み、それぞれはＲt０.６５、１.３２、１.８、及び２.５５に各々対応する。ＺAにおける個々のピークの分離が難しくなったので、活性を有するピークの位置は決定されなかった。
【００４３】
実施例３：骨髄性白血病患者からの末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)の調製
未加工血液(１０ｍｌずつ)を、前もって骨髄性白血病と診断された患者から抜き取った。ここである患者は、ＡＭＬと診断され、別の患者はＣＭＬと診断された。単核細胞を、フィコール/ハイパック(hypaque)密度勾配遠心法により分離した。
【００４４】
実施例４：赤白血病細胞系列Ｋ５６２の培養
該細胞系列を、米国微生物系統保存機関(American Type Culture Collection(ATCC)), VA, USAから得た。該細胞系列は、ＣＤ３３-であった。Ｋ５６２細胞をin vitroにおいて、１０％の熱失活ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ-１６４０培養液中で成長させた。 
【００４５】
実施例５：前単球細胞系列Ｕ９３７の培養
該細胞系列を、米国微生物系統保存機関(ＡＴＣＣ), VA, USAから得て、そして細胞系列Ｋ５６２で記載された通りにin vitroで成長させた。該細胞系列は、ＣＤ３３+である。
【００４６】
実施例６：in vitroにおける、骨髄性白血病患者のＰＢＭＣと、クロロゲン酸(ＣＡ)とのインキュベーション
骨髄性白血病患者のＰＢＭＣ(１×１０5〜２×１０6/ｍｌ)を、様々な濃度のＣＡと、４８時間３７℃で、５％ＣＯ2中でインキュベーションした。細胞を洗浄し、そして生存率を計測した。
【００４７】
実施例７：ＣＤ３３+細胞系列Ｕ９３７とＣＡとのインキュベーション
Ｕ９３７細胞(１×１０5〜２×１０6/ｍｌ)を、さまざまな濃度のＣＡで、４８時間３７℃で、５％ＣＯ2中でインキュベーションした。細胞を次に洗浄し生存率を計測した。
【００４８】
実施例８：ＣＤ３３-細胞系列Ｋ５６２とＣＡとのインキュベーション
Ｋ５６２細胞(１×１０5〜２×１０6/ｍｌ)を、様々な濃度のＣＡで４８時間、３７℃で５％ＣＯ2中でインキュベーションした。細胞を洗浄し、そして生存率を計測した。
【００４９】
実施例９：Ｔ-リンパ系細胞系列、Molt-４の培養
該細胞系列を米国微生物系統保存機関(ＡＴＣＣ), VA, USAから得て、そして細胞系列Ｋ５６２で記載された通りにin vitroで成長させた。
【００５０】
実施例１０：通常の個人からの末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)の調製
未加工血液を収集し、そして単核細胞をフィコール/ハイパック密度勾配遠心により分離した。
【００５１】
実施例１１：フローサイトメトリーによる細胞周期進行及びアポトーシスの分析
ＣＭＬ患者のＰＢＭＣを、１０％熱失活ウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ-１６４０培養液中で、ＣＡ(１００.０μｇ/ｍｌ)の存在下又は非存在下で３７℃で４８時間、５％ＣＯ2中で培養した。細胞を４０％エタノールで固定し、５００μｇ/ｍｌのＲｎａｓｅＡで処理し、続いて(Mitra etal., Molecular Medicine, 6: 527-541,2000)に記載されるようにフローサイトメトリーによりＤＮＡ量を分析するため、６９μＭのヨウ化プロピジウムで処理した。
【００５２】
実施例６、７、及び８の結果：
表１において示されるように、骨髄性白血病患者のＰＢＭＣ、ＣＤ３３+である前単球細胞系列Ｕ９３７、及びＣＤ３３-である赤白血病細胞系列Ｋ５６２を、クロロゲン酸により破壊した。
【００５３】
実施例９及び１０の結果
表２に示されるように、赤白血病細胞系列Ｋ５６２、前単球細胞系列Ｕ９３７、及びＣＭＬ患者の白血病細胞を、クロロゲン酸により破壊した。Ｔリンパ系細胞系列Ｍｏｌｔ-４は、より高い投与量を必要とした。対照的に、通常ドナーのＰＢＭＣは、実質的にＣＡにより影響されない。ＣＡの存在下又は不存在下における４８時間の培養後のＵ９３７、Ｋ５６２、ＣＭＬ患者のＰＢＭＣ、Ｍｏｌｔ-４、及び通常のＰＢＭＣの顕微鏡写真は、図４に示される。我々は、３-ｏ-ｐ-クマリル・キナ酸(ＰＣＱ)が、抗骨髄性白血病活性を有するということを以前に特許請求した(299/NF/2002; 30.05.2002)。本明細書中で、我々は、１：１の比率でのクロロゲン酸(ＣＡ)と３-ｏ-ｐ-クマリル・キナ酸の組み合わせることが、白血病細胞系列又は骨髄性白血病患者の白血病細胞を破壊する点で、ＣＡ又はＰＣＱ単独より効果的であるが、通常ドナーのＰＢＭＣには影響を及ぼさないということを示す(表３)。
【００５４】
実施例１１の結果
二日間の培養後に、１００.０μｇ/ｍｌのクロロゲン酸が、in vitroにおいて、ＣＭＬ患者の白血病細胞にアポトーシスを引き起こすということを、細胞-周期分析は示した。なぜなら、培養液のみで培養された細胞と比較して、ＣＭＬ患者の白血病細胞が、Ｓ、Ｇ2、又はＭ期で増加するからである(表４)。
【００５５】
【表１】
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【００５６】
【表２】
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【００５７】
【表３】
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【００５８】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、分画ＥのＨＰＬＣを表し、異なるピークの保持時間(ＲＥ)を３つの帯域、ＺA、ＺB、及びＺCに分割したことを示す。図１ａにおいて、該ピークを番号付けた(ＺAは、４個の主要ピークを有し、一方ＺBは、かなり低〜中くらいの１０個のピークを有し、そしてＺCは、２つの特徴的なピークを有した。)。
【図２】図２は、ピーク番号６の分画を凍結乾燥し、ＨＰＬＣに通して得た単一ピークである。
【図３】図３は、クロロゲン酸(ＣＡ)又は３-カフェオイル・キナ酸の構造を示す。
【図４】図４は、白血病細胞系列、ＣＡ処理後のＣＭＬ患者及び通常ドナーのＰＢＭＣの顕微鏡写真を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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