(57)【要約】本発明は、正常および癌性子宮内膜細胞に存在する新規に同定された核酸分子およびポリペプチドに関し、これには、当該核酸およびポリペプチドの断片、変異体および誘導体が含まれる。本発明はまた、本発明のポリペプチドに対する抗体、並びに本発明のポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストにも関する。本発明はまた、本発明の核酸分子、ポリペプチド、抗体、アゴニストおよびアンタゴニストを含む組成物、並びにこれらの組成物を使用する方法にも関する。これらの使用は、子宮体癌および子宮内膜における非癌性の疾患状態の同定、診断、モニタリング、病期分類、画像化および処置、子宮内膜組織の同定、本発明のポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストのモニタリングおよび同定および／または設計を含む。当該使用はまた、遺伝子治療、トランスジェニック動物および細胞の作製、並びに処置および研究用の操作された子宮内膜組織の作製を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号４７３〜６６６のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸分子；
（ｂ）配列番号１〜４７２の核酸配列を含む核酸分子；
（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）の核酸分子に選択的にハイブリダイズする核酸分子；または
（ｄ）（ａ）もしくは（ｂ）の核酸分子と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸分子
を含む、単離核酸分子。
【請求項２】
核酸分子がｃＤＮＡである、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
核酸分子がゲノムＤＮＡである、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項４】
核酸分子がＲＮＡである、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項５】
核酸分子が哺乳類の核酸分子である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項６】
核酸分子がヒトの核酸分子である、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項７】
試料中の子宮内膜特異的核酸（ＥＳＮＡ）の存在を決定する方法であって、
（ａ）試料を配列番号１〜４７２の核酸分子と、該核酸分子が子宮内膜特異的核酸に選択的にハイブリダイズする条件下で接触させる工程；および
（ｂ）該核酸分子の試料中のＥＳＮＡへのハイブリダイゼーションを検出する工程、
を含み、ここでハイブリダイゼーションの検出が、試料中のＥＳＮＡの存在を示す、前記方法。
【請求項８】
請求項１に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項９】
請求項８に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１に記載の核酸分子によってコードされるポリペプチドを産生する方法であって：
（ａ）１または２以上の発現制御配列に作動可能に連結した核酸分子を含む宿主細胞を提供する工程、および
（ｂ）ポリペプチドが産生される条件下で宿主細胞を培養する工程を含む、前記方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の核酸分子によってコードされるポリペプチド。
【請求項１２】
（ａ）配列番号４７３〜６６６と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または
（ｂ）配列番号１〜４７２の核酸配列を含む核酸分子に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択される単離ポリペプチド。
【請求項１３】
（ａ）配列番号４７３〜６６６と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または
（ｂ）配列番号１〜４７２の核酸配列を含む核酸分子に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド
に特異的に結合する、抗体またはその断片。
【請求項１４】
試料中の子宮内膜特異的タンパク質の存在を決定する方法であって：
（ａ）試料を、好適な試薬と、試薬が、配列番号４７３〜６６６に対する少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む子宮内膜特異的タンパク質と、選択的に相互作用する条件の下で接触させる工程；および
（ｂ）試薬の、試料中の子宮内膜特異的タンパク質との相互作用を検出し、ここで、結合の検出が、試料中の子宮内膜特異的タンパク質の存在を示す工程
を含む、前記方法。
【請求項１５】
患者における子宮体癌の存在および転移を診断またはモニタリングする方法であって、
（ａ）（ｉ）配列番号４７３〜６６６のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、核酸分子；
（ｉｉ）配列番号１〜４７２の核酸配列を含む核酸分子；
（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の核酸分子に選択的にハイブリダイズする、核酸分子；
（ｉｖ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の核酸分子に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、核酸分子；
（ｖ）配列番号４７３〜６６６に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；または
（ｖｉ）配列番号１〜４７２の核酸配列を含む核酸分子に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸分子によりコードされる、アミノ酸配列を含むポリペプチド
の量を決定する工程および；
（ｂ）患者の試料中の決定された核酸分子またはポリペプチドの量を、正常な対照中の子宮内膜特異的マーカーの量に対して比較する工程を含み；ここで、正常な対照中の核酸分子またはポリペプチドの量に対して比較された、試料中の核酸分子またはポリペプチドの量における差異が、子宮体癌の存在に関連する、前記方法。
【請求項１６】
患者における癌のリスクまたは癌の存在を検出するためのキットであって、前記キットが、
（ａ）配列番号４７３〜６６６のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、核酸分子；
（ｂ）配列番号１〜４７２の核酸配列を含む核酸分子；
（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）の核酸分子に選択的にハイブリダイズする、核酸分子；
（ｄ）（ａ）もしくは（ｂ）の核酸分子に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、核酸分子；または
（ｅ）配列番号４７３〜６６６に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；または
（ｆ）配列番号１〜４７２の核酸配列を含む核酸分子に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸分子によりコードされる、アミノ酸配列を含むポリペプチド
の存在を決定するための手段を含む、前記キット。
【請求項１７】
子宮体癌を有する患者を処置する方法であって、
（ａ）配列番号４７３〜６６６のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、核酸分子；
（ｂ）配列番号１〜４７２の核酸配列を含む核酸分子；
（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）の核酸分子に選択的にハイブリダイズする、核酸分子；
（ｄ）（ａ）もしくは（ｂ）の核酸分子に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、核酸分子；
（ｅ）配列番号４７３〜６６６に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；または
（ｆ）配列番号１〜４７２の核酸配列を含む核酸分子に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸分子によりコードされる、アミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる組成物を、これを必要としている患者に投与する工程を含み、ここで、前記投与により、核酸分子またはポリペプチドを発現する子宮体癌細胞に対する免疫応答が誘発される、前記方法。
【請求項１８】
請求項１２に記載のポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする核酸を含むワクチン。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、その全体が参照によって本明細書に組込まれる2001年12月21日提出の米国仮出願第60/342,751号に基づく優先権の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、核酸およびポリペプチドの断片、変異体並びに誘導体を含む、正常のおよび腫瘍性の子宮内膜細胞に存在する、新たに同定された核酸およびポリペプチドに関する。また本発明は、本発明のポリペプチドに対する抗体並びに本発明のポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストに関する。また本発明は、本発明の核酸、ポリペプチド、抗体、翻訳後修飾（ＰＴＭ）、変異体、誘導体、アゴニストおよびアンタゴニストを含む組成物並びにこれら組成物の使用のための方法に関する。これらの使用には、子宮体癌および子宮内膜における非癌性疾患状態の同定、診断、モニタリング、病期分類、画像化および処置、子宮内膜組織の同定およびモニタリング、並びに本発明のポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストの同定および／または設計が含まれる。使用はまた、遺伝子治療、抗体またはアンチセンス分子を含むが、これらには限定されない治療分子、形質転換動物および細胞の作出並びに処置および研究のための操作された子宮内膜組織の作出を含む。
【０００３】
発明の背景
子宮体癌（ＥＣ）は、米国における女性骨盤性器の最も重要な浸潤性新生物である。C. Paul Morrow & John P. Curtin, Etiology and Detection of Gynecologic Cancer, in Synopsis of Gynecologic Oncology 3 (C. Paul Morrow & John P. Curtin eds., 5th ed. 1998)［以下Morrow & Curtin I］。３５，０００近くの新たな症例が、１９９７年について概算され、これはほぼ、子宮頸癌と卵巣癌とを合計した症例の数である。同上。ＥＣは、主に閉経後の女性において発生し、平均診断年齢は５８歳である。症例のわずか２〜５％が、４０歳未満の女性において診断される。同上。白人女性は、黒人女性よりも、ＥＣの高いリスクを有し、それぞれの生涯リスクは、２．４および１．３である。同上。子宮肉腫は、癌腫よりもはるかに一般的ではなく、すべての子宮癌のわずか４．３％を占めるに過ぎない。同上、５頁。
【０００４】
多くの危険要因が、ＥＣと関連しており、これらのうち最も重要なのは、外因性または内因性の、過剰なエストロゲンである。Chen, L. M. et al., Oncology 13(12): 1665-70 (1999); Greven, K. M. & Corn, B. W., Curr. Probl. Cancer 21(2): 65-127 (1997)。他の要因には、肥満、遅い閉経および放射線療法が含まれる。上記Morrow & Curtin I、４頁。乳癌、結腸癌もしくは卵巣癌の病歴、またはＥＣ、多嚢胞卵巣疾患、ホルモン的に活性な卵巣間質性腫瘍または甲状腺機能低下症の家族歴を有するこれらの患者はすべて、ＥＣを発生する上昇したリスクを示す。同上、３〜４頁。ＥＣのリスクを減少させる要因には、経口避妊薬および、不思議なことに喫煙の組み合わせが含まれる。同上、４頁。
【０００５】
分子生物学の観点から、研究により、ＥＣと、Ｋ−ｒａｓおよびＥＲＢＢ−２プロトオンコジーン並びにｐ５３腫瘍抑制遺伝子における突然変異を含む多くの遺伝子突然変異との間の関係が明らかになった。Jeff Boyd, Molecular Genetics of Gynecologic Cancers, in Synopsis of Gynecologic Oncology 524-26 (C. Paul Morrow & John P. Curtin eds., 5th ed. 1998)。さらに、遺伝した子宮体癌（すべての症例の５％未満）のほぼすべてが、遺伝性非ポリープ性結腸直腸癌と関連して発生し、これは、これ自体、ｈＭＳＨ２、ｈＭＬＨ１またはｈＰＭＳ２遺伝子における突然変異から発生する。同上、５１９〜２０頁。
【０００６】
現在、ＥＣの存在を検出するのに適切な大量スクリーニング手法は存在せず、１〜５％の女性のみが、無症候性であるうちに診断される。上記Morrow & Curtin I、１０頁；C. Paul Morrow & John P. Curtin, Tumors of the Endometrium, in Synopsis of Gynecologic Oncology 157 (C. Paul Morrow & John P. Curtin eds., 5th ed. 1998)［以下Morrow & Curtin II］。現在のスクリーニング手法は、症候性であるか、または特に高いリスクのカテゴリーに該当する女性、例えばＥＣを有すると診断された閉経後の女性の９０％より多くが経験している症候である、閉経後出血を経験している女性向けである。上記Morrow & Curtin I、１０頁；上記Morrow & Curtin II、１５７頁。このような女性について、子宮内膜生検は、診断のための常習的なコースである。上記Morrow & Curtin I、１０頁；Walter J. Burdette, Cancer: Etiology, Diagnosis, and Treatment 162 (1998)。子宮内膜の厚さを測定するための超音波の使用は、生検に対する有効な補完となっている。上記Morrow & Curtin I、１０頁。
【０００７】
子宮内膜の「ストライプ」が、厚さ１０ｍｍより大きい場合において、１０〜２０％の患者が、癌腫または過形成を経験しており、従って子宮内膜生検を受けなければならない。同上。いくつかの場合において、子宮頸細胞診により、ＥＣの診断がもたらされ、特にここで、（１）多数の組織球が、閉経後スメアにおいて発見され、（２）「正常の」外見を有する子宮内膜細胞が、月経サイクルの後半の間に、または閉経の後に見出され、および（３）異常な、または悪性の腺細胞が、すべての年齢において発見される。同上、１０〜１１頁。ＥＣが、一般的に初期の段階において診断され、従って婦人科癌の最も治療可能な部類に考えられている一方、より後期の段階にある、または不所望な組織学所見を有する女性は、顕著な病的状態および死を被る。Yamada, S. D & McGonigle, K. F., Curr. Opin. Obstet. Gynecol. 10(1): 57-60 (1998)。
【０００８】
ＥＣが診断された後に、ＥＣを外科的に病期分類するが、これには、典型的に、子宮摘出術および両側卵管卵巣摘出術が含まれる。上記Chen et al. 。ＥＣを病期分類するために一般的に用いられる、１つの分類システムは、Union Internationale Contre le Cancerにより考案された、ＴＮＭシステムである。AJCC Cancer Staging Handbook 3 (Irvin D. Fleming et al. eds., 5th ed. 1998)。このシステムは、いくつかの段階に分けられ、この各々は、原発腫瘍（Ｔ）、局所リンパ節（Ｎ）および遠位転移（Ｍ）に関する癌成長の程度を評価する。同上。
【０００９】
病期０は、局所のリンパ節転移を伴わず（Ｎ０）、遠位の転移を伴わない（Ｍ０）、上皮内癌（Ｔｉｓ）により特徴づけられる。同上、１８４頁。病期ＩＡ、ＩＢ、ＩＣ、ＩＩＡおよびＩＩＢは、病期０と、腫瘍分類に関してのみ異なる。同上、１８４〜８５頁。病期１Ａは、子宮内膜に限定された腫瘍を含み（Ｔ１ａ）、病期ＩＢは、子宮筋層の半分までの腫瘍浸潤を特徴とし（Ｔ１ｂ）、病期ＩＣは、子宮筋層の半分を超える腫瘍浸潤を含む（Ｔ１ｃ）。同上。対照的に、病期ＩＩＡは、子宮頸管内膜腺のみの浸潤を含み（Ｔ２ａ）、一方病期ＩＩＢは、子宮頸間質の浸潤を含む（Ｔ２ｂ）。同上。病期ＩＩＩＡおよびＩＩＩＢはまた、病期０と、腫瘍病期に関してのみ異なり、病期ＩＩＩＡは、漿膜および／または付属器中への浸潤（直接または転移により）、および／または、腹水または腹膜洗浄物中に癌細胞が存在することにより特徴づけられ（Ｔ３ａ）、病期ＩＩＩＢは、膣（直接または転移により）が冒される（Ｔ３ｂ）。同上。しかし、病期ＩＩＩＣは、腫瘍分類Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３ａ、Ｔ３ｂ、局所のリンパ節転移（Ｎ１）のいずれか１つを含むが、遠位転移を含まない（Ｎ０）。同上。病期ＩＶＡは、膀胱粘膜および／または腸粘膜中への腫瘍浸潤（Ｔ４）、すべてのＮ分類を含むが、遠位転移を含まない（Ｎ０）。同上。最後に、病期ＩＶＢは、すべてのＴ分類、すべてのＮ分類および遠位転移（Ｍ１）により特徴づけられる。同上。
【００１０】
ＥＣの処置に関して、完全な腹式子宮摘出術および両側卵管卵巣摘出術は、ＥＣ療法の「基礎」として記載されている。上記Greven & Corn 。外科手術に加えて、照射は、単独で、またはアジュバントレジメンの一部として、ＥＣを処置するのに高度に有効である；実際に、慣用の外科手術を受けることができないいくらかの女性を、照射のみで治療する。同上；Greven, K.M. et al., Int'l J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 39(2): 413-18 (1997)。医師はまた、最も有効な全身投与剤として作用するシスプラチン、ドキソルビシン、パクリタキセルおよびプロゲスチンでの化学療法に対するいくつかの陽性の応答を観察した。上記Greven & Corn,；上記Chen et al.；Augustin A. Garcia & J. Tate Thigpen, Principles of Chemotherapy, in Synopsis of Gynecologic Oncology 427-29 (C. Paul Morrow & John P. Curtin eds., 5th ed. 1998)。しかし、化学療法は、一般的に、ＥＣを処置するにあたり有用性が限定されており、応答は、典型的には短命である。上記Burdette、１６３頁。
【００１１】
以上より、子宮癌の再発を検出、診断、モニタリング、病期分類、予後判定および防止するために用いられる手順は、患者の転帰に大きな重要性を有することが明らかである。さらに、現在の手順は、その各々の分析において有用である一方、その特異性、感受性、感染度および／またはその費用により制限される。このように、最小の侵襲性および合理的な費用を伴って、細胞、組織または体液中の新規なマーカーを検出することにより作用する、高度に特異的であり、感受性の高い手順が、高度に望ましい。
【００１２】
従って、ヒトが、子宮癌を発生する傾向があるか否かを予測するための、子宮癌を診断するための、疾患の進行をモニタリングするための、子宮癌を病期分類するための、子宮癌が転移したか否かを決定するための、および子宮癌を画像化するための、一層感受性であり、正確な方法に対する大きい必要性がある。また、子宮癌の一層良好な処置に対する必要性がある。
【００１３】
発明の要約
本発明は、子宮体癌および子宮内膜における非癌性の疾患状態を同定、診断、モニタリング、病期分類、画像化および処置するため；子宮内膜組織を同定およびモニタリングするため；そして、本発明のポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストを同定および設計するために用いることができる、核酸分子、ポリペプチドおよびこれに対する抗体、核酸およびポリペプチドの変異体および誘導体、アゴニストおよびアンタゴニストを提供することによって、当該技術分野における多くのニーズを解決する。本発明はまた、遺伝子治療、トランスジェニック動物および細胞の作製方法、並びに処置および研究用の操作された子宮内膜組織の作製方法を提供する。
【００１４】
本発明の１つの観点は、子宮内膜細胞、子宮内膜組織および／または子宮内膜器官に特異的な核酸分子に関する。これらの子宮内膜特異的核酸（ＥＳＮＡ）は、天然に存在するｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡもしくはこれらの核酸の１つの断片であることができるか、または天然に存在しない核酸分子であることができる。ＥＳＮＡがゲノムＤＮＡである場合には、ＥＳＮＡは、子宮内膜特異的遺伝子（ＥＳＧ）である。ＥＳＮＡがＲＮＡである場合には、これは、ＥＳＧによりコードされた子宮内膜特異的転写物である。他のスプライシングおよび転写修飾により、１つのＥＳＧは、多くの子宮内膜特異的ＲＮＡをコードすることができる。
【００１５】
好ましい態様において、核酸分子は、子宮内膜に特異的なポリペプチドをコードする。さらに好ましいのは、配列番号４７３〜６６６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子である。他の好ましい態様において、核酸分子は、配列番号１〜４７２の核酸配列を含む。本明細書中に列挙するＥＳＮＡ配列について、ＤＥＸ０３７７＿００１．ｎｔ．１は、配列番号１に相当する。複数のスプライス変異体を有する配列については、各々のスプライス変異体に関して、基本配列ＤＥＸ０３７７＿００１．ｎｔ．１に、ＤＥＸ０３７７＿００１．ｎｔ．２などが続く。対応するペプチドの配列を、ＤＥＸ０３７７＿００１．ａａ．１などとして列挙する。すべてのヌクレオチドおよびペプチドのマッピングについては、以下の例１のセクション中の表を参照されたい。
【００１６】
本発明のこの観点はまた、子宮内膜特異的タンパク質（ＥＳＰ）をコードする核酸分子に選択的にハイブリダイズするか、もしくはこれに対する実質的な配列類似性を示すか、または、ＥＳＮＡに選択的にハイブリダイズするか、もしくはこれに対する実質的な配列類似性を示す核酸分子に関する。本発明の１つの態様において、核酸分子は、ＥＳＰ、またはＥＳＮＡの対立遺伝子変異体をコードする核酸分子の対立遺伝子変異体を含む。他の態様において、核酸分子は、ＥＳＰをコードする核酸配列の一部またはＥＳＮＡの核酸配列の一部を含む。
【００１７】
さらに、本発明のこの観点は、ＥＳＮＡの全部もしくは一部の転写および／または翻訳、あるいはＥＳＰの全部もしくは断片をコードする核酸分子の転写および／または翻訳を制御する１種または２種以上の発現制御配列をさらに含む、核酸分子に関する。
【００１８】
本発明の他の観点は、本発明の核酸分子を含むベクターおよび／または宿主細胞に関する。好ましい態様において、ベクターおよび／または宿主細胞の核酸分子は、ＥＳＰの全部または断片をコードする。他の好ましい態様において、ベクターおよび／または宿主細胞の核酸分子は、ＥＳＮＡの全部または一部を含む。本発明のベクターおよび宿主細胞は、ポリペプチド、特に本発明のＥＳＰの組み換え産生において有用である。
【００１９】
本発明の他の観点は、本発明の核酸分子によりコードされたポリペプチドに関する。ポリペプチドは、断片または全長タンパク質のいずれかを含むことができる。好ましい態様において、ポリペプチドは、ＥＳＰである。しかし、本発明のこの観点はまた、一部の融合タンパク質がＥＳＰである、突然変異タンパク質（ミューテイン）並びに、本明細書中に提供したＥＳＮＡの対立遺伝子変異体によりコードされたタンパク質およびポリペプチドに関する。
【００２０】
本発明の他の観点は、本発明のポリペプチドに特異的に結合する、抗体および他のバインダーに関する。従って、本発明の抗体またはバインダーは、ＥＳＰ、ミューテイン、融合タンパク質および／または本明細書中に提供したＥＳＮＡの対立遺伝子変異体によりコードされた相同タンパク質またはポリペプチドに特異的に結合する。
【００２１】
本発明の他の観点は、本発明の核酸分子およびポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストに関する。本発明のアゴニストおよびアンタゴニストを用いて、子宮体癌および子宮内膜における非癌性疾患状態を処置し、操作された子宮内膜組織を作出することができる。
【００２２】
本発明の他の観点は、核酸分子を用いて、本明細書中に記載した核酸分子と比較して、同様の、または同一の核酸配列を有する核酸分子を検出または増幅するための方法に関する。このような方法は、子宮体癌および子宮内膜における非癌性疾患状態の同定、診断、モニタリング、病期分類、画像化および処置において有用である。このような方法はまた、子宮内膜組織の同定および／またはモニタリングにおいて有用である。さらに、本発明の１または２以上の核酸分子のレベルの測定は、既知の他のマーカー、特に上述の子宮体癌の背景の項において記載したものと組み合わせて、パネルの一部として診断に有用であり得る。
【００２３】
本発明の他の観点は、本発明の核酸分子を、遺伝子治療において、形質転換動物および細胞を作出するために、並びに処置および研究のための操作された子宮内膜組織の作出のために用いることに関する。
【００２４】
本発明の他の観点は、本発明のポリペプチドを、好ましくはこれに対する抗体を用いて検出するための方法に関する。このような方法は、子宮体癌および子宮内膜における非癌性疾患状態を同定、診断、モニタリング、病期分類、画像化および処置するのに有用である。さらに、本発明の１または２以上のポリペプチドのレベルの測定は、既知の他のマーカー、特に上述の子宮体癌の背景の項において記載したものと組み合わせて、子宮体癌を同定、診断、モニタリング、病期分類、画像化するのに有用であり得る。また、本発明のポリペプチドを用いて、子宮内膜組織を同定および／またはモニタリングし、操作された子宮内膜組織を作出することができる。
【００２５】
本発明のさらに他の観点は、本発明の核酸およびアミノ酸配列を蓄積するコンピュータ可読な手段に関する。コンピュータ可読な手段の記録は、本発明の配列を、他の配列に対して比較、整列および秩序づけするため、配列を読み取り、表示するために、アクセスすることができる。さらに、核酸および／またはアミノ酸配列および／またはこれらのレベルの測定に関するコンピュータ記録を、単独で、または他のマーカーと組み合わせて用いて、子宮内膜関連疾患を診断することができる。
【００２６】
発明の詳細な説明
定義および一般的な技術
本明細書中に別記のない限り、本発明に関して用いられる科学的および技術的用語は、当業者に通常理解されている意味を有するものとする。さらに、状況により特に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。一般的に、本明細書中に記載された細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝子およびタンパク質および核酸化学並びにハイブリダイゼーションに関して用いられる用語、およびその技術は、当該技術分野においてよく知られ、通常用いられているものとする。一般的に、別記のない限り、本発明の方法および技術は、当該技術分野においてよく知られた慣用の方法に従って、本明細書中で引用され、議論されている種々の一般的な、およびより専門的な参考文献に記載されたとおりに行われる。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) および Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Press (2001); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992, および2000の補遺); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology - 4th Ed., Wiley & Sons (1999); Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990); および Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999)を参照。
【００２７】
酵素反応および精製技術は、製造者の仕様書に従い、当該技術分野において通常なされているとおりに、または本明細書に記載のとおりに行う。本明細書中に記載された分析化学、合成有機化学並びに医薬品化学および薬化学に関して用いられる用語、並びにその実験手順および技術は、当該技術分野においてよく知られ、通常用いられているものである。標準的な技術を、化学合成、化学分析、薬剤の製造、製剤および送達、並びに患者の処置に用いる。
【００２８】
以下の用語は、別記のない限り、以下の意味を有すると理解されるものとする。
本発明の「核酸分子」は、ヌクレオチドの重合形態を指し、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖の両方、並びに上記の合成形態および混合重合体を含む。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、またはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾形態を指す。本明細書中で用いる「核酸分子」は、「核酸」および「ポリヌクレオチド」の類義語である。用語「核酸分子」は、別記のない限り、通常、少なくとも１０塩基長の分子を指す。この用語は、ＤＮＡの一本鎖および二本鎖形態を含む。加えて、ポリヌクレオチドは、天然に存在するおよび／または天然に存在しないヌクレオチド結合によって結合した天然に存在するヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドの一方または両方を含み得る。
【００２９】
ヌクレオチドを、核酸分子配列において、単一の文字記号により表す。以下の表は、核酸分子における記号位置を占めることができるヌクレオチドまたはヌクレオチドの群を同定する記号を列挙する。Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry (NC-IUB), Nomenclature for incompletely specified bases in nucleic acid sequences, Recommendations 1984., Eur J Biochem. 150(1):1-5 (1985)参照。
【００３０】
【表１】
2005521385.tif 000002
【００３１】
核酸分子は、化学的または生化学的に修飾されてもよく、または非天然のもしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含んでもよく、これらは当業者によって容易に理解されるだろう。かかる修飾は、例えば、標識、メチル化、１または２以上の天然に存在するヌクレオチドの、類縁体による置換、無電荷結合(例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバメートなど)、電荷結合(例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど)、ペンダント部分(例えば、ポリペプチド)、インターカレーター(例えば、アクリジン、プソラレンなど)、キレータ、アルキレータ、および修飾された結合(例えば、アルファアノマー核酸など)などのヌクレオチド間修飾を含む。「核酸分子」の用語はまた、一本鎖構造、二本鎖構造、部分的に二重化された構造、三重化された構造、ヘアピン状の構造、環状構造およびパドロック構造を含む、任意のトポロジー構造を含む。水素結合および他の化学的相互作用を介して所定の配列と結合するその能力について、ポリヌクレオチドを模倣する合成分子もまた含まれる。かかる分子は当該技術分野で知られており、例えば、分子の主鎖においてペプチド結合がリン酸結合で置換されているものを含む。
【００３２】
「遺伝子」は、ポリペプチドをコードする核酸配列、およびポリペプチドをコードする核酸配列の周囲の発現制御配列を含む核酸分子として定義される。例えば、遺伝子は、プロモーター、１または２以上のエンハンサー、ポリペプチドをコードする核酸配列、下流の調節配列、および、場合によっては、ＲＮＡの発現の調節に関与する他の核酸配列を含み得る。当該技術分野でよく知られているとおり、真核生物の遺伝子は、通常エクソンおよびイントロンの両方を含有する。「エクソン」の用語は、ゲノムＤＮＡ中に見出される核酸配列であって、成熟ｍＲＮＡ転写物にコンティグ配列を提供することが生物情報学的に予測され、および／または実験的に確認されているものを指す。「イントロン」の用語は、ゲノムＤＮＡ中に見出される核酸配列であって、成熟ｍＲＮＡ転写物に寄与しないが、むしろ転写の過程中に「スプライスアウト」されることが予測され、および／または確認されているものを指す。
【００３３】
核酸分子またはポリペプチドは、核酸分子もしくはポリペプチドが特定の種から単離された場合、または、核酸分子もしくはポリペプチドが特定の種から単離した核酸分子もしくはポリペプチドと相同である場合は、その特定の種に「由来」する。
【００３４】
「単離された」または「実質的に純粋な」核酸またはポリヌクレオチド(例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡまたは混合された重合体)は、本来の宿主細胞において、ネイティブなポリヌクレオチドに本来付随していた他の細胞成分、例えばリボソーム、ポリメラーゼ、またはそれが本来結びついていたゲノム配列から実質的に分離されたものである。この用語は、(１)天然に存在する環境から取り出された、(２)「単離ポリヌクレオチド」が天然に見出されるポリヌクレオチドの全部または部分と結びついていない、(３)天然では連結していないポリヌクレオチドと作動可能に連結している、(４)天然ではより長い配列の部分として存在しない、または(５)天然では見出せないヌクレオチドまたはヌクレオシド間結合を含む、核酸またはポリヌクレオチドを包含する。用語「単離された」または「実質的に純粋な」はまた、組換えまたはクローンＤＮＡ単離物、化学的に合成されたポリヌクレオチド類縁体、または異種の系で生物学的に合成されたポリヌクレオチド類縁体に関して用いることができる。用語「単離核酸分子」は、宿主細胞染色体の非相同的な部位に組み込まれた核酸分子、ネイティブ断片の非相同配列への組換え融合体、エピソームまたは宿主細胞染色体に組み込まれたものとして存在する組換えベクターを含む。
【００３５】
核酸分子の「部分」は、参照核酸分子の少なくとも１０塩基の部分的なコンティグ配列を含む核酸分子を指す。好ましくは、１つの部分は参照核酸分子の少なくとも１５〜２０塩基を含む。理論的には、１７ヌクレオチドの核酸配列は、３ギガ塩基のヒトゲノムにおいて１回より少ない頻度でランダムに存在し、従って、ゲノム的複雑さを有する核酸混合物において参照配列をユニークに同定することができる核酸プローブを提供するのに十分な長さである。好ましい部分は、少なくとも６個の連続したアミノ酸配列(少なくとも１８ヌクレオチドの断片)をコードできる核酸配列を含むものである。なぜなら、それらは参照核酸によってコードされたポリペプチドのエピトープをマッピングするのに有用である、ペプチドの発現または合成を導くのに有用だからである。その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる、例えばGeysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002 (1984)並びに米国特許第4,708,871号および第5,595,915号を参照。部分はまた、参照核酸分子の少なくとも２５、３０、３５もしくは４０ヌクレオチド、または、参照核酸分子の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００もしくは５００ヌクレオチドを含み得る。核酸分子の部分は、他の核酸配列を含まなくてもよい。あるいはまた、核酸の部分は、他の核酸分子からの他の核酸配列を含んでもよい。
【００３６】
用語「オリゴヌクレオチド」は、一般的に２００塩基またはそれより短い長さを含む核酸分子を指す。この用語は、しばしば一本鎖デオキシリボヌクレオチドをさすが、同様に、とりわけ、一本鎖または二本鎖リボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、および二本鎖ＤＮＡを指すことができる。好ましくは、オリゴヌクレオチドは１０〜６０塩基長であり、最も好ましくは１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０塩基長である。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５または６０塩基長である。オリゴヌクレオチドは、例えばプローブもしくはプライマーとして用いるために、一本鎖でもよく、または、例えば突然変異遺伝子の構築に用いるために、二本鎖であってもよい。本発明のオリゴヌクレオチドは、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれかであることができる。オリゴヌクレオチドは、核酸分子について上記で論じたとおり、誘導体化または修飾されることができる。
【００３７】
一本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、しばしば、自動オリゴヌクレオチド合成装置において実行されるものなどの化学的方法により合成される。しかしながら、オリゴヌクレオチドは、インビトロ組換えＤＮＡ媒介技術を含む種々の他の方法、並びに細胞および生体でのＤＮＡ発現により作製することができる。まず化学的に合成したＤＮＡは、典型的に、５’ホスフェートなしで得られる。かかるオリゴヌクレオチドの５’末端は、組換えＤＮＡ分子形成に典型的に用いられるＤＮＡリガーゼを使用する連結反応によるホスホジエステル結合形成の基質ではない。かかるオリゴヌクレオチドの連結が望ましい場合には、キナーゼおよびＡＴＰを使用するような標準的技術によりホスフェートを付加することができる。化学的に合成したオリゴヌクレオチドの３’末端は、遊離の水酸基を一般的に有しており、Ｔ４ＤＮＡリガーゼなどのリガーゼの存在下において、別のオリゴヌクレオチドなどの別のポリヌクレオチドの５’ホスフェートと容易にホスホジエステル結合を形成するだろう。周知の様に、この反応は、望ましい場合、連結前に当該他のポリヌクレオチド（１または２以上）の５’ホスフェートを除去することで選択的に阻止することができる。
【００３８】
本明細書中で用いられている用語「天然に存在するヌクレオチド」は、天然に存在するデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含む。本明細書中で用いる用語「修飾ヌクレオチド」は、修飾または置換糖基などを有するヌクレオチドを含む。本明細書中で用いる用語「核酸結合」は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニラデート、ホスホロアミデートなどのヌクレオチド結合を含む。その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、例えば、LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14:9081-9093 (1986); Stein et al. Nucl. Acids Res. 16:3209-3221 (1988); Zon et al. Anti-Cancer Drug Design 6:539-568 (1991); Zon et al., in Eckstein (ed.) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108, Oxford University Press (1991); Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990)および米国特許第5,151,510号を参照。
【００３９】
他に特定されていない限り、センス方向におけるポリヌクレオチド配列の左端は５’末端であり、配列の右端は３’末端である。加えて、センス方向におけるポリヌクレオチド配列の左方向は５’方向と呼び、一方、ポリヌクレオチド配列の右方向は、３’方向と呼ぶ。さらに、他に指示のない限り、本明細書中では、各ヌクレオチド配列は、デオキシリボヌクレオチドの配列として記載されている。しかしながら、与えられた配列は、ポリヌクレオチド組成に適切であるように解釈されることが意図される：例えば、単離された核酸がＲＮＡの組成であれば、与えられた配列は、ウリジンがチミジンについて置換したリボヌクレオチドを意味する。
【００４０】
用語「対立遺伝子変異体」は、２または３以上の代替的に天然に存在する遺伝子の形態の１つであって、各遺伝子がユニークなヌクレオチド配列を保有するものを指す。好ましい態様では、所定の遺伝子の異なる対立遺伝子は、類似または同一の生物学的特性を有する。
【００４１】
核酸配列の場合における、用語「配列同一性パーセント」は、最大に一致するように並べた場合に同一である２つの配列中の残基を指す。配列同一性比較の長さは、少なくとも約９ヌクレオチドの長さを超えてもよく、普通は少なくとも約２０ヌクレオチド、より普通には少なくとも約２４ヌクレオチド、典型的には少なくとも約２８ヌクレオチド、より典型的には少なくとも約３２ヌクレオチド、そして好ましくは少なくとも約３６ヌクレオチドまたはそれ以上であり得る。ヌクレオチド配列の同一性を測定するのに用いることができる、当該技術分野に知られている数多くの種々のアルゴリズムがある。例えば、ポリヌクレオチド配列は、Wisconsin Package Version 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin中のプログラムであるFASTA、GapまたはBestfitを用いて比較することができる。
【００４２】
例えば、プログラムFASTA2およびFASTA3を含むFASTAは、照会配列と検索配列との間の最良のオーバーラップ領域の配列および配列同一性パーセントを提供する(Pearson, Methods Enzymol. 183: 63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132: 185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol. 266: 227-258 (1996); Pearson, J. Mol. Biol. 276: 71-84 (1998)）。他に特定しない限り、特定のプログラムまたはアルゴリズムのデフォルトパラメータを用いる。例えば、核酸配列同士の配列同一性パーセントは、FASTAを用い、そのデフォルトパラメータ(ワードサイズ6およびスコアリングマトリックスについてはＮＯＰＡＭファクター)により、または、Ｇａｐを用いて、GCG Version 6.1で提供されているとおりのデフォルトパラメータにより決定することができる。
【００４３】
核酸配列への参照は、他に特定しない限り、その相補体を包含する。従って、特定の配列を有する核酸分子への参照は、その相補的な配列を有するその相補鎖を包含するものと理解されるべきである。相補鎖はまた、例えば、アンチセンス療法、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）阻害（ＲＮＡｉ）、三重鎖およびアンチセンスの組み合わせ、ハイブリダイゼーションプローブおよびＰＣＲプライマーにも有用である。
【００４４】
分子生物学の分野において、研究者は、用語「配列同一性パーセント」、「配列類似性パーセント」および「配列相同性パーセント」を同様の意味に用いている。本出願においては、これらの用語は、核酸配列のみに関して、同様の意味を有するものとする。
【００４５】
用語「実質的な類似性」または「実質的な配列類似性」は、核酸またはその断片を指す場合、適切なヌクレオチドの挿入または欠失とともに、他の核酸(またはその相補鎖)と最適に整列した場合、上記で論じたFASTA、BLASTまたはGapなどの、任意の周知の配列同一性のアルゴリズムにより測定したときに、ヌクレオチド塩基の少なくとも約50％、より好ましくは60％、普通にはヌクレオチド塩基の少なくとも約70％、より普通には少なくとも約80％、好ましくは少なくとも約90％、そしてより好ましくは少なくとも約95〜98％に、ヌクレオチド配列同一性があることを示す。
【００４６】
あるいはまた、実質的な類似性は、第１の核酸配列またはこの断片が、第２の核酸のアンチセンス鎖に、選択的なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする場合に、第１の核酸配列と第２の核酸配列との間に存する。典型的には、選択的なハイブリダイゼーションは、第１の核酸配列と第２の核酸配列との間に、少なくとも約55％の配列同一性−好ましくは少なくとも約65％、より好ましくは少なくとも約75％、そして最も好ましくは少なくとも約90％の配列同一性−が、少なくとも約14ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも17ヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも20、25、30、35、40、50、60、70、80、90または100ヌクレオチドの範囲にわたってある際に、第１の核酸配列と、第２の核酸配列のアンチセンス鎖との間に生じる。
【００４７】
核酸ハイブリダイゼーションは、塩濃度、温度、溶媒、ハイブリダイズする種の塩基組成、相補領域の長さ、およびハイブリダイズする核酸同士のヌクレオチド塩基のミスマッチの数などの条件により影響を受け、これらは当業者によって容易に理解される。核酸ハイブリダイゼーション実験の場面における「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」および「ストリンジェントな洗浄条件」は、多数の異なる物理学的パラメータに依存する。最も重要なパラメータは、ハイブリダイゼーションの温度、核酸の塩基組成、塩濃度および核酸の長さを含む。当業者は、いかにしてこれらのパラメータを変化させて特定のハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを達成するかを知っている。一般的に、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、具体的なＤＮＡハイブリッドの熱融解温度（Ｔｍ）より約25℃下で、特定の条件のセットの下で行われる。「ストリンジェントな洗浄」は、具体的なＤＮＡハイブリッドのＴｍより約5℃低い温度で、特定の条件のセットの下で行われる。Ｔｍは、標的配列の50％が、完全にマッチしたプローブにハイブリダイズする温度である。上記Sambrook (1989)、9.51頁を参照。
【００４８】
特定のＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＴｍは、式：
Tm = 81.5°C + 16.6 (log10[Na+]) + 0.41 (フラクションG + C) - 0.63 (％ ホルムアミド) - (600/l)
式中、ｌは塩基対で表したハイブリッドの長さである、
により予測することができる。
特定のＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのＴｍは、式：
Tm = 79.8°C + 18.5 (log10[Na+]) + 0.58 (フラクションG + C) + 11.8 (フラクションG + C)2 - 0.35（％ホルムアミド） - (820/l)
により予測することができる。
特定のＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＴｍは、式：
Tm = 79.8°C + 18.5(log10[Na+]) + 0.58 (フラクションG + C) + 11.8 (フラクションG + C)2 - 0.50 (％ ホルムアミド) - (820/l)
により予測することができる。
【００４９】
一般的に、Ｔｍは、２つの核酸配列同士のミスマッチ1％ごとに、1〜1．5℃ずつ低下する。従って、当業者は、標的核酸に対し、より高いまたは低い程度の配列同一性を有する配列を得るために、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件を変えることができる。例えば、標的核酸配列に対し10％までのミスマッチを含むハイブリダイズする核酸を得るには、完全にマッチするハイブリッドの計算されたＴｍから10〜15℃を減じ、次にそれに従って、ハイブリダイゼーションおよび洗浄温度を調節する。プローブ配列もまた、ある条件の下で二重鎖ＤＮＡに特異的にハイブリダイズして、三重鎖または他の高次ＤＮＡ複合体を形成し得る。かかるプローブの調製および好適なハイブリダイゼーション条件は当該技術分野でよく知られている。
【００５０】
サザンもしくはノザンブロットにおける、またはライブラリーをスクリーニングするための、100を超える相補的な残基を有する相補核酸配列のフィルタ上でのハイブリダイゼーションのための、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、42℃での、少なくとも10時間、好ましくは1晩(約16時間)の50％ホルムアミド／6×ＳＳＣである。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の他の例は、68℃、ホルムアミドなしでの、少なくとも10時間および好ましくは1晩の6×ＳＳＣである。中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の例は、55℃、ホルムアミドなしでの、少なくとも10時間および好ましくは1晩の6×ＳＳＣである。サザンもしくはノザンブロットにおける、またはライブラリーをスクリーニングするための、100を超える相補的な残基を有する相補核酸配列のフィルタ上でのハイブリダイゼーションのための、低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の例は、42℃での、少なくとも10時間の6×ＳＳＣである。
【００５１】
類似だが同一でない核酸配列を同定するためのハイブリダイゼーション条件は、実験的に、塩濃度を一定に(6×ＳＳＣ)保ちながらハイブリダイゼーション温度を68℃から42℃に変化させること、または、ハイブリダイゼーション温度および塩濃度を一定に(例えば42℃および6×ＳＳＣ)保ち、ホルムアミド濃度を50％から0％に変化させることによって同定することができる。ハイブリダイゼーションバッファーはまた、バックグラウンドを下げるためのブロッキング剤を含み得る。これらの剤は、当該技術分野においてよく知られている。上記Sambrook et al. (1989)、8.46および9.46-9.58頁を参照。また、上記Ausubel (1992)、上記Ausubel (1999)および上記Sambrook (2001)も参照。
【００５２】
洗浄条件もまた、ストリンジェンシー条件を変化させるために変えることができる。ストリンジェントな洗浄条件の例は、65℃で15分間の0．2×ＳＳＣ洗浄である(ＳＳＣバッファーについては、上記Sambrook (1989)を参照)。しばしば、高いストリンジェンシーの洗浄の前に、過剰なプローブを除去するために、低いストリンジェンシーの洗浄がなされる。100塩基対より多い二重鎖ＤＮＡのための中程度のストリンジェンシーの洗浄の例は、45℃での15分間の1×ＳＳＣである。かかる二重鎖のための低ストリンジェンシーの洗浄の例は、40℃での15分間の4×ＳＳＣである。一般的に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおける無関係なプローブについて観察されたものより2倍以上高いシグナル対ノイズ比は、特異的ハイブリダイゼーションの検出を示す。
【００５３】
本明細書で定義するとおり、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、互いに実質的に同一のポリペプチドをコードする場合は、依然として互いに実質的に類似である。これは、例えば、核酸が、遺伝子コードの冗長性により許容される高度のコドンの縮重を用い、合成的にまたは組換え的に創出された場合に生じる。
【００５４】
100ヌクレオチド長より短い核酸分子のための(例えばオリゴヌクレオチドプローブのための)ハイブリダイゼーション条件は、式：
Tm = 81.5°C + 16.6(log10[Na+]) + 0.41(フラクション G+C) -(600/N)
式中、Ｎは長さの変化であり、[Na+]は１Ｍ以下である、
により計算することができる。上記Sambrook (1989)、11.46頁を参照。100ヌクレオチドより短いプローブのハイブリダイゼーションに関しては、ハイブリダイゼーションは、通常、ストリンジェントな条件(Ｔｍより5〜10℃下)のもと、高濃度(0.1〜1.0 pmol/ml)のプローブを用いて行う。同上、p. 11.45。ミスマッチプローブ、縮重プローブのプールまたは「ゲスマー（guessmer）」を用いたハイブリダイゼーションの決定、並びにハイブリダイゼーション溶液および実験的にハイブリダイゼーション条件を決定する方法は、当該技術分野でよく知られている。例えば、上記Ausubel (1999）；上記Sambrook (1989)、11.45-11.57頁参照。
【００５５】
用語「消化」または「ＤＮＡの消化」は、ＤＮＡ中のある配列にのみ作用する制限酵素によるＤＮＡの触媒的切断を指す。本明細書中で参照する種々の制限酵素は、市販されており、その反応条件、コファクターおよび使用上の他の必要事項は知られており、当業者には日常的である。分析の目的では、典型的には、1μｇのプラスミドまたはＤＮＡ断片が、約20μｌの反応バッファー中の約2単位の酵素で消化される。プラスミドの構築のためにＤＮＡ断片を単離する目的では、典型的に5〜50μｇのＤＮＡが、比例した大きな容積の20〜250単位の酵素で消化される。特定の制限酵素のための適切なバッファーおよび基質量は、下記に参照するものなどの標準的な実験室マニュアルに記載されており、それらは販売者によって特定されている。37℃での約１時間のインキュベーション時間が通常用いられるが、条件は、標準的な手順、供給者の説明および反応の細目に応じて変わることがある。消化の後、反応を分析することができ、断片は、アガロースまたはポリアクリルアミドゲルを介した電気泳動により、当業者に日常的なよく知られた方法を用いて、精製することができる。
【００５６】
用語「連結」は、最も頻繁には2本鎖ＤＮＡである、２または３以上のポリヌクレオチドの間にホスホジエステル結合を形成する過程を指す。連結のための技術は当該技術分野でよく知られており、連結のためのプロトコルは標準的な実験室マニュアルおよび参考文献、例えば上記Sambrook (1989)に記載されている。
【００５７】
ゲノム由来の「シングルエクソンプローブ」は、エクソンの少なくとも一部(「参照エクソン」)を含み、高ストリンジェンシーの条件下、参照エクソンを含む転写物由来の核酸に検出可能にハイブリダイズすることができるが、参照エクソンを欠く核酸とは高ストリンジェンシーの条件下で検出可能にハイブリダイズしないプローブである。シングルエクソンプローブは、典型的には、さらに、エクソン部分の最初の末端に隣接した、ゲノム中のエクソンに同様に隣接する第1のイントロン配列および／または遺伝子間配列を含み、ゲノム中のエクソンに同様に隣接する第２のイントロン配列および／または遺伝子間配列を含み得る。ゲノム由来のシングルエクソンプローブの最小長は、上記で論じたとおり、エクソン部分が、転写物由来核酸に高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするのに十分な長さであるための要件により決められる。ゲノム由来のシングルエクソンプローブの最大長は、プローブが、１エクソン以下の部分を含むための要件により決められる。シングルエクソンプローブは、ゲノム中のプローブ配列の残りに連続して見出されないプライミング配列であって、ＰＣＲおよび他の増幅ベースの技術に有用なプライミング配列を含んでもよい。他の観点においては、本発明は、本明細書中に開示されたＥＳＮＡに基づくシングルエクソンプローブに関する。
【００５８】
１つの態様において、用語「マイクロアレイ」は、基体に結合した多数の核酸を有する「核酸マイクロアレイ」を指し、多数の結合した核酸のそれぞれへのハイブリダイゼーションは、個別に検出可能である。基体は非孔質または多孔質でも、平坦または非平坦でも、ユニット型（unitary）または分散型（distributed）でもよい。核酸マイクロアレイは、Schena (ed.), DNA Microarrays: A Practical Approach (Practical Approach Series), Oxford University Press (1999); Nature Genet. 21(1)(suppl.):1 - 60 (1999); Schena (ed.), Microarray Biochip: Tools and Technology, Eaton Publishing Company/BioTechniques Books Division (2000)でそのように呼ばれているすべてのデバイスを含む。さらに、これらの核酸マイクロアレイは、基体に結合した多数の核酸を含み、ここで、該多数の核酸は、とりわけBrenner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(4):1665-1670 (2000)に記載のとおり、単一の平坦な基体上ではなく、むしろ多数のビーズ上に配置されている。
【００５９】
核酸マイクロアレイの例は、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第
【表２】
2005521385.tif 000003
号明細書中に見出すことができる。
【００６０】
他の態様において、「マイクロアレイ」はまた、多数のポリペプチドの基体に結合したコレクションを有する、「ペプチドマイクロアレイ」または「タンパク質マイクロアレイ」を指すことができ、多数の結合したポリペプチドの各々への結合は、個別に検出可能である。あるいはまた、ペプチドマイクロアレイは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ファージディスプレイバインダー、酵母２ハイブリッドバインダー、アプタマーが含まれるが、これらには限定されない多数のバインダーを有することができ、これは、特異的に、本発明のポリペプチドの結合を検出することができる。アレイは、本発明のポリペプチドの自己抗体検出に基づくことができる。Robinson et al., Nature Medicine 8(3):295-301 (2002)参照。ペプチドアレイの例は、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、WO 02/31463、WO 02/25288、WO 01/94946、WO 01/88162、WO 01/68671、WO 01/57259、WO 00/61806、WO 00/54046、WO 00/47774、WO 99/40434、WO 99/39210、WO 97/42507および米国特許第6,268,210、5,766,960、5,143,854号明細書中に見出すことができる。
【００６１】
さらに、ＥＳＮＡまたはＥＳＰのレベルの決定を、マルチプレックス方式で、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、WO 02/29109、WO 02/24959、WO 01/83502、WO 01/73113、WO 01/59432、WO 01/57269、WO 99/67641に記載されている手法を用いて実施することができる。
【００６２】
用語「突然変異体」、「突然変異した」または「突然変異」は、核酸配列に適用される場合、核酸配列中のヌクレオチドが、参照核酸配列に比べ、挿入、欠失または変化を受け得ることを意味する。１つの座に単一の変化が生じてもよく(点突然変異)、または複数のヌクレオチドが、単一の座において挿入され、欠失しまたは変更されてもよい。さらに、１または２以上の変化が、核酸配列中の任意の数の座で生じてもよい。本発明の好ましい態様においては、核酸配列は、ＥＳＰをコードする野生型の核酸配列であるか、またはＥＳＮＡである。核酸配列は、下記に記載の変異導入技術の方法を含む、当該技術分野で知られた任意の方法によって突然変異させることができる。
【００６３】
用語「エラープローンＰＣＲ」は、ＤＮＡポリメラーゼのコピー信頼性が低い、ＰＣＲ産物の全長にわたり高率の点突然変異が得られるような条件下でＰＣＲを行う方法を指す。例えば、Leung et al., Technique 1: 11-15 (1989)およびCaldwell et al., PCR Methods Applic. 2: 28-33 (1992)を参照。
【００６４】
用語「オリゴヌクレオチドを利用した変異導入」は、対象となる任意のクローンＤＮＡセグメントにおける部位特異的突然変異の創出を可能にする方法を指す。例えば、Reidhaar-Olson et al., Science 241: 53-57 (1988)を参照。
【００６５】
用語「アセンブリＰＣＲ」は、小ＤＮＡ断片の混合物からのＰＣＲ産物のアセンブリを伴う方法を指す。多数の異なるＰＣＲ反応が、同一のバイアル中で平行して生じ、１つの反応の産物が、他の反応の産物をプライミングする。
【００６６】
用語「セクシャルＰＣＲ変異導入」または「ＤＮＡシャッフリング」は、異なるが高度に関連したＤＮＡ配列のＤＮＡ分子同士のインビトロでの強制的な相同組換えと組合わされたエラープローンＰＣＲ法を指し、これは、配列類似性に基づくＤＮＡ分子のランダムな断片化と、それに引き続くエラープローンＰＣＲ反応におけるプライマー伸長による交差の固定によりもたらされる。例えばStemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 10747-10751 (1994)を参照。ＤＮＡシャッフリングは、いくつかの関連遺伝子の間で行うことができる(「ファミリーシャッフリング」)。
【００６７】
用語「インビボ変異導入」は、対象となる任意のクローンＤＮＡにおけるランダム突然変異を創出する方法を指し、これは、１または２以上のＤＮＡ修復経路に突然変異を有する大腸菌などの細菌株におけるＤＮＡの増殖を伴う。これらの「ミューテーター」株は、野生型の親よりも高いランダム突然変異率を有する。ミューテーター株でのＤＮＡの増殖は、最終的にＤＮＡ中にランダム突然変異を生じさせる。
【００６８】
用語「カセット変異導入」は、二本鎖ＤＮＡ分子の小領域を、天然配列とは異なる合成オリゴヌクレオチド「カセット」で置き換える任意の方法を指す。オリゴヌクレオチドは、しばしば完全におよび／または部分的にランダム化された天然配列を含む。
【００６９】
用語「リカーシブアンサンブル変異導入」は、フェノタイプ的に関連する突然変異体の多様な集団であって、その構成要素のアミノ酸配列が異なるものを作出するために開発された、タンパク質操作（タンパク質変異導入）用のアルゴリズムを指す。この方法は、連続する一連のコンビナトリアルカセット変異導入を制御するために、フィードバック機構を用いる。例えば、Arkin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 7811-7815 (1992)を参照。
【００７０】
用語「エクスポネンシャルアンサンブル変異導入」は、ユニークで機能的な突然変異体の高いパーセンテージを有するコンビナトリアルライブラリーを創出するための方法を指し、ここでは、残基の小さな群が並行してランダム化されて、そのそれぞれの変化位置において、機能的タンパク質をもたらすアミノ酸を同定する。例えば、Delegrave et al., Biotechnology Research 11: 1548-1552 (1993); Arnold, Current Opinion in Biotechnology 4: 450-455 (1993)を参照。
【００７１】
「作動可能に連結された」発現制御配列は、発現制御配列が、対象遺伝子を制御するために対象遺伝子に隣接しているか、または、対象遺伝子を制御するためにtransで、もしくは、離れて作用する連結を指す。
【００７２】
本明細書中で用いる用語「発現制御配列」は、それが作動可能に連結しているコード配列の発現に影響するのに必要なポリヌクレオチド配列を指す。発現制御配列は、核酸配列の転写、転写後イベントおよび翻訳を制御する配列である。発現制御配列は、適切な転写開始配列、終止配列、プロモーター配列およびエンハンサー配列；スプライシングおよびポリアデニル化シグナルなどの有効なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を増強する配列（例えば、リボソーム結合部位）；タンパク質の安定性を増強する配列；および所望により、タンパク質分泌を増強する配列を含む。かかる制御配列の性質は、宿主生物に依存して異なる；原核生物においては、かかる制御配列は、一般的にプロモーター、リボソーム結合部位、および転写終止配列を含む。用語「制御配列」は、最小限、その存在が発現に必須なすべての要素を含むこととし、また、その存在が有利な追加の要素、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列を含むことができる。
【００７３】
本明細書中で用いる用語「ベクター」は、それが連結した他の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指すものとする。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、これは、追加のＤＮＡセグメントを連結することができる環状の二本鎖ＤＮＡループを指す。他のベクターは、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）および酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含む。他のタイプのベクターは、ウイルスベクターであり、ここでは、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノム中に連結することができる。細菌細胞に感染するウイルスベクターをバクテリオファージと呼ぶ。ある種のベクターは、導入された宿主細胞中で自律的に複製することが可能である（例えば、細菌由来の複製を有する細菌ベクター）。他のベクターは、宿主細胞への導入によって、宿主細胞のゲノムに組み込まれることができ、それによって宿主ゲノムとともに複製する。さらにまた、ある種のベクターは、それが作動可能に連結している遺伝子の発現を導くことができる。かかるベクターを本明細書中では、「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と呼ぶ。一般的に、組換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。本明細書中では、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが、最も多く用いられるベクター形態であることから、同じ意味に用いることができる。しかしながら、本発明は、同等の機能を果たす他の形態の発現ベクターを含むものとする。
【００７４】
本明細書中で用いる用語「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）は、その中に組換え発現ベクターが導入された細胞を指すものとする。かかる用語は、特定の対象細胞だけでなく、かかる細胞の子孫を指すものと理解されるべきである。突然変異かまたは環境的な影響によって、後続の世代にある種の変更が生じ得るため、かかる子孫は、実際のところ、親細胞と同一でない場合があり得るが、それでも依然として本明細書中で用いる用語「宿主細胞」の範囲に含まれる。
【００７５】
本明細書中で用いる熟語「オープンリーディングフレーム」およびその同等の略語である「ＯＲＦ」は、その全体を連続したアミノ酸配列に翻訳することができる、転写物由来の核酸の部分を指す。そのように定義されているので、ＯＲＦは、ヌクレオチドで測った場合、正確に3で割り切れる長さを有する。そのように定義されているので、ＯＲＦは、天然タンパク質の全体をコードする必要はない。
【００７６】
本明細書中で用いられている熟語「ＯＲＦコードペプチド」は、ＯＲＦの予想されたまたは実際の翻訳物である。
【００７７】
本明細書中で用いる熟語である、参照核酸配列の熟語「縮重変異体」は、標準的な遺伝子コードを用いて直接翻訳されて、参照核酸配列から翻訳されたのと同一のアミノ酸配列を提供できる、すべての核酸配列を含むことを意味する。
【００７８】
用語「ポリペプチド」は、天然に存在するおよび天然に存在しないタンパク質およびポリペプチド並びにポリペプチド断片およびポリペプチドの突然変異体、この誘導体および類縁体を包含する。ポリペプチドは、モノマーであってもポリマーであってもよい。さらに、ポリペプチドは単一のポリペプチド中に、そのそれぞれが１または２以上の異なる活性を有する、多数の異なるモジュールを含んでもよい。本発明の好ましいポリペプチドは、本発明の核酸分子によってコードされたＥＳＰ、またはこの断片、突然変異体、類縁体および誘導体を含む。
【００７９】
用語「単離タンパク質」または「単離ポリペプチド」は、その起源または由来する給源に起因して、（1）ネイティブな状態でそれに随伴する天然に結びついた要素に結びついておらず、（2）同一の種からの他のタンパク質を含まず、（3）異なる種からの細胞によって発現されており、または（4）天然に存在しない、タンパク質またはポリペプチドである。従って、化学的に合成された、またはそれが天然に由来する細胞とは異なる細胞系で合成されたポリペプチドは、その天然に結びついた要素から「単離」されている。ポリペプチドまたはタンパク質はまた、当該技術分野でよく知られているタンパク質精製技術を用いて、単離によって、天然に結びついた要素から実質的にフリーにすることができる。
【００８０】
タンパク質またはポリペプチドは、試料の少なくとも約60％〜75％が、単一の種類のポリペプチドを示す場合は、「実質的に純粋」であり、「実質的に均一」であり、または「実質的に純化」されている。ポリペプチドまたはタンパク質は、単量体であっても多量体であってもよい。実質的に純粋なポリペプチドまたはタンパク質は、典型的には、約50％、60％、70％、80％または90％ W/W、より普通には約95％のタンパク質試料を含み、そして好ましくは、99％を超えて純粋である。タンパク質の純度または均一性は、当該技術分野でよく知られている多くの手段、例えば、タンパク質試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動と、それに引き続く当該技術分野でよく知られている染色でゲルを染色することによる、単一のポリペプチドバンドの視覚化などによって決定することができる。ある目的のためには、ＨＰＬＣまたは精製のための当該技術分野でよく知られた他の手段を用いることによって、より高い解像度を提供することができる。
【００８１】
用語「断片」は、本明細書中で本発明のポリペプチドに関して用いる際には、全長ＥＳＰに比較して、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失を有するポリペプチドを指す。好ましい態様では、断片は、断片のアミノ酸配列が、天然に存在するポリペプチド中の対応する位置と同一である、コンティグ配列である。断片は、典型的には、少なくとも5、6、7、8、9または10アミノ酸長、好ましくは少なくとも12、14、16または18アミノ酸長、より好ましくは少なくとも20アミノ酸長、より好ましくは少なくとも25、30、35、40または45アミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも50または60アミノ酸長、そしてさらにより好ましくは少なくとも70アミノ酸長である。
【００８２】
「誘導体」は、本明細書中で本発明のポリペプチドに関して用いる際には、一次構造配列ではＥＳＰに実質的に類似しているが、例えばＥＳＰでは見出されないインビボまたはインビトロの化学的および生化学的修飾を含むポリペプチドを指す。かかる修飾としては、例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合的な付着、ヘム部分の共有結合的な付着、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合的な付着、脂質または脂質誘導体の共有結合的な付着、ホスファチジルイノシトールの共有結合的な付着、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫化、アルギニン化などの転移ＲＮＡ誘導性のタンパク質へのアミノ酸付加、およびユビキチン化が挙げられる。
【００８３】
他の修飾としては、例えば、放射性核種による標識、および種々の酵素的修飾が挙げられ、これらは当業者によって容易に認識される。ポリペプチドを標識するための多様な方法、および、かかる目的に有用な多様な置換基または標識は当該技術分野でよく知られており、１２５Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃおよび３Ｈなどの放射性同位体、標識化抗リガンド（antiligand）に結合するリガンド（例えば抗体）、フルオロフォア、化学発光剤、酵素および標識リガンドの特異的結合対の構成要素として機能することができる抗リガンドを含む。標識の選択は、要求される感度、プライマーとの結合の容易性、安定性の要件、および利用可能な機材に依存する。ポリペプチドを標識するための方法は当該技術分野でよく知られている。上記Ausubel (1992)；上記Ausubel (1999)を参照。
【００８４】
用語「融合タンパク質」は、異種のアミノ酸配列に結合した本発明のポリペプチドを指す。融合タンパク質は、それらが、２または３以上の異なるタンパク質から２または３以上の所望の機能的要素を含むように構築することができるため、有用である。融合タンパク質は、対象となるポリペプチドからの少なくとも10の連続したアミノ酸、より好ましくは少なくとも20または30のアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも40、50または60のアミノ酸、より一層好ましくは少なくとも75、100または125のアミノ酸を含む。融合タンパク質は、異なるタンパク質またはペプチドをコードする核酸配列とフレームになったポリペプチドまたはその断片をコードする核酸配列を構築し、その後融合タンパク質を発現することにより、組換え的に製造することができる。あるいはまた、融合タンパク質は、ポリペプチドまたはその断片を他のタンパク質と架橋することにより、化学的に製造することができる。
【００８５】
用語「類縁体」は、ポリペプチド類縁体および非ペプチド類縁体の両方を指す。本明細書中で用いる用語「ポリペプチド類縁体」は、アミノ酸配列の部分と実質的な同一性を有するが、非天然アミノ酸または非天然残基間結合を含む、少なくとも25アミノ酸のセグメントを含むポリペプチドを指す。好ましい態様では、類縁体は、天然のポリペプチドと同じかまたは類似の生物活性を有する。典型的には、ポリペプチド類縁体は、天然に存在する配列に対して保存的アミノ酸置換（または挿入もしくは欠失）を含む。類縁体は、典型的には、少なくとも20アミノ酸長、好ましくは少なくとも50アミノ酸長またはそれ以上であり、しばしば全長の天然に存在するポリペプチドと同じ長さであることができる。
【００８６】
用語「非ペプチド類縁体」は、参照ポリペプチドと類似の特性を有する化合物を指す。非ペプチド化合物はまた、「ペプチドの模倣体」または「ペプチド模倣体」と呼ばれることもある。かかる化合物は、しばしばコンピュータ化された分子モデリングの補助によって開発される。有用なペプチドと構造的に類似しているペプチドの模倣体は、同等の効果をもたらすために用いることができる。一般的に、ペプチド模倣体は、模範となる（paradigm）ポリペプチド（即ち、所望の生化学的特性または薬理学的活性を有するポリペプチド）と構造的に類似であるが、当該技術分野でよく知られている方法により、-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH=CH-（シスおよびトランス）、-COCH2-、-CH(OH)CH2-、および-CH2SO-からなる群から選択される結合で随意に置換されている、１または２以上のペプチド結合を有する。コンセンサス配列の１または２以上のアミノ酸の、同タイプのＤ−アミノ酸（例えば、Ｌ−リジンの代わりにＤ−リジン）での系統的な置換はまた、より安定なペプチドを創出するのに用いることもできる。さらに、コンセンサス配列または実質的に同一なコンセンサス配列の変種を含む制限された（constrained）ペプチドは、当該技術分野で知られた方法によって創出することができる（Rizo et al., Ann. Rev. Biochem. 61:387-418 (1992)）。例えば、ペプチドを環化する分子内ジスルフィド架橋を形成することが可能な内部システイン残基を付加することができる。
【００８７】
用語「突然変異体」または「ミューテイン」は、本発明のポリペプチドに言及する際には、ＥＳＰのアミノ酸配列に比べ、１または２以上のアミノ酸の置換、挿入または欠失を含むアミノ酸配列に関する。ミューテインは、ある位置の単一のアミノ酸が別のアミノ酸に変わっている、１または２以上のアミノ酸点置換、１または２以上のアミノ酸が、天然に存在するタンパク質の配列中で、それぞれ挿入または欠失している、１または２以上の挿入および／または欠失、および／またはアミノ末端もしくはカルボキシ末端の一方または両方におけるアミノ酸配列の切断を有し得る。さらに、ミューテインは、天然に存在するタンパク質と同一または異なる生物活性を有し得る。例えば、ミューテインは、増大したまたは低減した生物活性を有し得る。ミューテインは野生型タンパク質に対し少なくとも50％の配列類似性を有し、好ましいのは、60％の配列類似性、より好ましいのは70％の配列類似性である。さらにまた好ましいのは、ＥＳＰに対し、80％、85％または90％の配列類似性を有するミューテインである。さらにより好ましい態様においては、ミューテインは95％の配列同一性、さらにより好ましくは97％、さらにより好ましくは98％および、さらにより好ましくは99％の配列同一性を示す。配列類似性は、GAPもしくはBESTFITなどの任意の一般的な配列分析アルゴリズムまたは他の変法のスミス−ウオーターマン(Smith-Waterman)整列によって測定することができる。T.F. Smith and M. S. Waterman, J. Mol. Biol. 147:195-197 (1981)およびW.R. Pearson, Genomics 11:635-650 (1991)を参照。
【００８８】
好ましいアミノ酸置換は：（1）タンパク質分解への感受性を減らすもの、（2）酸化への感受性を減らすもの、（3）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変化させるもの、（4）結合親和性または酵素活性を変化させるもの、および（5）かかる類縁体の別の物理化学的または機能的特性を付与しまたは変更するものである。例えば、単一または多数のアミノ酸置換（好ましくは保存的アミノ酸置換）が、天然に存在する配列（好ましくは、分子間接触を形成するドメイン（１または２以上）の外部のポリペプチド部分）になされ得る。好ましい態様では、アミノ酸置換は中程度の保存的置換または保存的置換である。より好ましい態様では、アミノ酸置換は保存的置換である。
【００８９】
保存的アミノ酸置換は、親配列の構造的特徴を実質的に変えてはならない（例えば、代わりのアミノ酸は、親配列に存在するヘリックスを乱し、または、親配列を特徴付ける別のタイプの二次構造を乱す傾向があってはならない）。当該技術分野で認識されているポリペプチドの二次および三次構造の例は、Creighton (ed.), Proteins, Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Company (1984); Branden et al. (ed.), Introduction to Protein Structure, Garland Publishing (1991); Thornton et al., Nature 354:105-106 (1991)に記載されている。
【００９０】
本明細書で用いる場合、20種の通常アミノ酸およびその略称は、従来の用法に従う。Golub et al. (eds.), Immunology - A Synthesis 2nd Ed., Sinauer Associates (1991)を参照。20種の通常アミノ酸の立体異性体（例えばD−アミノ酸）、α-,α-二置換アミノ酸、N-アルキルアミノ酸などの非天然アミノ酸、および他の非通常アミノ酸もまた、本発明のポリペプチドの好適な構成要素であり得る。非通常アミノ酸の例としては：4-ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタメート、ε-N,N,N-トリメチルリジン、ε-N-アセチルリジン、O-ホスホセリン、N-アセチルセリン、N-ホルミルメチオニン、3-メチルヒスチジン、5-ヒドロキシリジン、s-N-メチルアルギニン、並びに他の類似のアミノ酸およびイミノ酸（例えば4-ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明細書で用いられるポリペプチド表記法では、標準的な用法および慣習に従い、左手方向はアミノ末端方向であり、右手方向はカルボキシ末端方向である。
【００９１】
「相同性」または「相同な」は、本発明のポリペプチドを指す際には、ＥＳＰのコードされたアミノ酸配列に類似した配列および類似の生物活性または機能を有する、異なる生物からのポリペプチドを意味する。２つのポリペプチドは「相同」であるといわれるが、これは、ポリペプチド同士に進化論上の関連性があることを必ずしも暗示しない。その代わり、用語「相同」は、２つのポリペプチドが類似のアミノ酸配列および類似の生物活性または機能を有することを意味すると定義される。好ましい態様では、相同なポリペプチドは、ＥＳＰに対し50％の配列類似性を示すものであり、好ましいのは60％の配列類似性、より好ましいのは70％の配列類似性である。さらにより好ましいのは、ＥＳＰに対し80％、85％または90％の配列類似性を示す相同ポリペプチドである。より一層好ましい態様では、相同ポリペプチドは95％、97％、98％または99％の配列類似性を示す。
【００９２】
「配列類似性」が、ポリペプチドに関して用いられる場合、同一でない残基の位置は、しばしば保存的アミノ酸置換によって異なることが認められている。好ましい態様では、「配列類似性」を有するポリペプチドは、保存的または中程度に保存的なアミノ酸置換を含む。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば電荷または疎水性）の側鎖（R基）を有する他のアミノ酸残基で置換されたものである。一般的に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的には変化させないだろう。２または３以上のアミノ酸配列が、保存的置換によって互いに異なる場合、置換の保存的性質について修正するために、配列同一性パーセントまたは類似の程度を上方に修正できる。この修正をする手段は、当業者によく知られている。例えばPearson, Methods Mol. Biol.  24: 307-31 (1994)を参照。
【００９３】
例えば、以下の6の群は、それぞれ互いに保存的置換であるアミノ酸を含んでいる：
1）セリン（S）、スレオニン（T）；
2）アスパラギン酸（D）、グルタミン酸（E）；
3）アスパラギン（N）、グルタミン（Q）；
4）アルギニン（R）、リジン（K）；
5）イソロイシン（I）、ロイシン（L）、メチオニン（M）、アラニン（A）、バリン（V）、および
6）フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）。
【００９４】
あるいはまた、保存的置換は、Gonnet et al., Science 256: 1443-45 (1992)に開示されたPAM250対数尤度マトリクス中で正の値を有する任意の変化である。「中程度に保存的な」置換は、PAM250対数尤度マトリクス中で負でない値を有する任意の変化である。
【００９５】
配列同一性とも呼ばれる、ポリペプチドについての配列類似性は、典型的には、配列分析ソフトを用いて測定する。タンパク質分析ソフトは、保存的アミノ酸置換を含む、種々の置換、欠失および他の変更に割当てた類似性尺度を用いて、類似配列をマッチングする。例えば、GCGは、異なる種の生物からの相同ポリペプチドなどの関連性の深いポリペプチド同士、または野生型タンパク質とそのミューテインとの間の配列相同性もしくは配列同一性を決定するために、デフォルトパラメータで用いることができる「Gap」および「Bestfit」などのプログラムを備えている。例えば、GCG Version 6.1を参照。他のプログラムとしては、上記で論じたFASTAが挙げられる。
【００９６】
本発明の配列を他の生物からの多数の配列を含むデータベースと比較する場合に好ましいアルゴリズムは、コンピュータプログラムBLAST、特にblastpまたはtblastnである。例えば、Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990); Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-402 (1997)を参照。blastp用の好ましいパラメータは：
期待値：10（デフォルト）
フィルター：seg（デフォルト）
ギャップを開くための負担（cost）：11（デフォルト）
ギャップを広げるための負担：1（デフォルト）
最大アラインメント：100（デフォルト）
ワードサイズ：11（デフォルト）
表示数（No. of descriptions）：100（デフォルト）
ペナルティマトリクス：BLOSUM62
である。
【００９７】
相同性のために比較されるポリペプチド配列の長さは、一般的には少なくとも約16アミノ酸残基、普通は少なくとも約20残基、より普通には少なくとも約24残基、典型的には少なくとも約28残基であり、そして好ましくは約35残基より多い。多数の異なる生物からの配列を含むデータベースを検索する場合、アミノ酸配列を比較するのが好ましい。
【００９８】
アミノ酸配列を用いたデータベース検索のための、blastp以外のアルゴリズムは、当該技術分野で知られている。例えば、ポリペプチド配列は、GCG Version 6.1中のプログラムであるFASTAを用いて比較することができる。FASTA（例えばFASTA2およびFASTA3）は、照会配列と検索配列との間の最良のオーバーラップ領域のアラインメントと配列同一性パーセントを提供する(上記Pearson (1990)；上記Pearson (2000))。例えば、アミノ酸配列同士の配列同一性パーセントは、FASTAを用いて、GCG Version 6.1で提供されるそのデフォルトまたは推奨パラメータ（ワードサイズ2およびPAM250スコアリングマトリクス）で決定することができる。
【００９９】
「抗体」は、インタクトな免疫グロブリン、または、分子種、例えば本発明のポリペプチドへの特異的結合についてインタクトな抗体と競合するその抗原結合部分を指す。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術により、またはインタクト抗体の酵素的もしくは化学的切断により作製することができる。抗原結合部分は、とりわけ、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、dAbおよび相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、ダイアボディ(diabody)、および、ポリペプチドに特異的抗原結合性を付与するのに十分な免疫グロブリンの部分を少なくとも含むポリペプチドを含む。Fab断片は、VL、VH、CL、およびCH1ドメインからなる一価の断片であり；F(ab')2断片は、ヒンジ領域のジスルフィド架橋によって結合した2個のFab断片を含む二価の断片であり；Fd断片は、VHおよびCH1ドメインからなり；Fv断片は、抗体の短腕のVLおよびVHドメインからなり；そしてdAb断片は、VHドメインからなる。例えば、Ward et al., Nature 341: 544-546 (1989)を参照。
【０１００】
本明細書中で用いる「特異的に結合する」および「特異的結合」は、抗体および第一の分子種とともに混合されている他の分子種への結合に優先して、第一の分子種に結合する抗体の能力を意味する。抗体は、それが第一の分子種に特異的に結合する場合、特別に、第一の分子種を「認識する」という。
【０１０１】
一本鎖抗体（scFv）は、VLおよびVH領域が組になり、これらを単一のタンパク質鎖として作出されること可能にする合成リンカーを介して、一価の分子を形成している抗体である。例えば、Bird et al., Science 242: 423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988)を参照。ダイアボディは、二価の両特異的抗体であって、VHおよびVLドメインが単一のポリペプチド鎖上に発現されているが、同一鎖上の２つのドメイン間の対合を許容するには短すぎるリンカーを用いており、これによって、該ドメインを他の鎖の相補ドメインと対合することを余儀なくさせ、２つの抗原結合部位が創出されるものである。例えば、Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993); Poljak et al., Structure 2: 1121-1123 (1994)を参照。１または２以上のCDRは、共有結合的に、または非共有結合的に分子中に組み込まれて、それを免疫付着因子（immunoadhesin）にすることができる。免疫付着因子は、CDR（１または２以上）をより大きなポリペプチド鎖の部分として組み込んでもよく、CDR（１または２以上）を他のポリペプチド鎖に共有結合させてもよく、または、CDR（１または２以上）を非共有結合的に組み込んでもよい。CDRにより、免疫付着因子は、対象となる特定の抗原に特異的に結合することができる。キメラ抗体は、１の抗体からの１または２以上の領域と１または２以上の他の抗体の１または２以上の領域とを含む抗体である。
【０１０２】
抗体は、１または２以上の結合部位を有することができる。1より多い結合部位がある場合、該結合部位は互いに同一でもよく、または異なっていてもよい。例えば、天然に存在する免疫グロブリンは、２つの同一の結合部位を有し、一本鎖抗体またはFab断片は、１つの結合部位を有するが、「二重特異性」または「二重機能性」抗体は、２つの異なる結合部位を有する。
【０１０３】
「単離抗体」は、（1）そのネイティブな状態で随伴している、他の天然に結び付いた抗体を含む、天然に結び付いた構成要素と結び付いていない抗体、（2）同一の種からの他のタンパク質を含まない抗体、（3）異なる種からの細胞によって発現されている抗体、または（4）天然に存在しない抗体である。精製抗体を含む精製タンパク質を、天然には結び付いていない構成要素によって安定化できることが知られている。天然には結び付いていない構成要素は、アルブミン（例えばBSA）などのタンパク質、またはポリエチレングリコール（PEG）などの化学物質であってもよい。
【０１０４】
「中和抗体」または「阻害抗体」は、ポリペプチドの活性を阻害し、または通常それに結合するリガンドへのポリペプチドの結合を遮断する抗体である。「活性化抗体」は、ポリペプチドの活性を増大させる抗体である。
【０１０５】
用語「エピトープ」は、免疫グロブリンまたはＴ細胞レセプターに特異的に結合することが可能な任意のタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は、通常アミノ酸または糖側鎖などの、化学的に活性な表面分子群からなり、通常は、特異的な三次元構造的特性並びに特異的な電荷特性を有する。抗体は、解離定数が1μＭより低く、好ましくは100ｎＭより低く、そして最も好ましくは10ｎＭより低い場合に抗原を特異的に結合するという。
【０１０６】
用語「患者」は、ヒトおよび動物対象を含む。
本明細書および特許請求の範囲を通して、単語「含む」、または「含み」または「含んでいる」などの変化形は、記載された整数または整数の群を包含することを意味するが、いずれの整数または整数の群の排除も意味しないと理解される。
【０１０７】
用語「子宮内膜特異的」は、体内の他の組織に比較して、子宮内膜に優勢に発現されている核酸分子またはポリペプチドを指す。好ましい態様では、「子宮内膜特異的」核酸分子またはポリペプチドは、体内のいずれの他の組織よりも１．５倍高いレベルで検出される。より好ましい態様では、「子宮内膜特異的」核酸分子またはポリペプチドは、体内のいずれの他の組織よりも２倍高いレベルで、より好ましくは体内のいずれの他の組織よりも５倍高い、尚一層好ましくは少なくとも10倍、15倍、20倍、25倍、50倍または100倍高く検出される。核酸分子レベルは、ノザンブロットハイブリダイゼーションなどの核酸ハイブリダイゼーション、または定量的ＰＣＲによって測定することができる。ポリペプチドレベルは、ウェスタンブロット分析などの、タンパク質レベルを正確に定量することで知られている任意の方法によって測定することができる。
【０１０８】
核酸分子、調節配列、ベクター、宿主細胞およびポリペプチド作製のための組換え的方法
核酸分子
本発明の１つの側面は、子宮内膜または子宮内膜細胞もしくは組織に特異的な単離核酸分子、またはかかる核酸分子に由来する単離核酸分子を提供する。これらの単離された子宮内膜特異的核酸（ＥＳＮＡ）は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡもしくはこれらの組み合わせ、これらの核酸のうちの１つの断片を含んでもよく、または、天然に存在しない核酸分子であってもよい。ＥＳＮＡは、動物から由来することができる。好ましい態様では、ＥＳＮＡは、ヒトまたは他の哺乳類から由来する。より好ましい態様では、ＥＳＮＡは、ヒトまたは他の霊長類から由来する。さらにより好ましい態様では、ＥＳＮＡは、ヒトから由来する。
【０１０９】
好ましい態様において、核酸分子は、子宮内膜に特異的なポリペプチド、即ち子宮内膜特異的ポリペプチド（ＥＳＰ）をコードする。より好ましい態様において、核酸分子は、配列番号４７３〜６６６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。他の高度に好ましい態様においては、核酸分子は、配列番号１〜４７２の核酸配列を含む。本明細書中に記載されている核酸分子のヌクレオチド配列を、いくつかのＤＮＡ分子を、公共の、または私有のデータベースのいずれかから組み立てることにより、決定した。基礎をなすいくつかのＤＮＡ配列は、自動シークエンサー（例えばMegaBACE（登録商標）１０００、Amersham Biosciences, Sunnyvale, CA, USA）を用いた、直接または間接の、少なくとも１つの酵素重合反応（例えば、逆転写および／またはポリメラーゼ連鎖反応）の結果である。
【０１１０】
本発明の核酸分子はまた、ＥＳＮＡまたはこの相補体もしくはアンチセンスをコードする核酸分子に選択的にハイブリダイズする配列を含むことができる。ハイブリダイズする核酸分子は、ポリペプチドをコードするか、もしくはコードしないことができ、またはＥＳＰをコードするか、もしくはコードしないことができる。しかし、好ましい態様において、ハイブリダイズする核酸分子は、ＥＳＰをコードする。一層好ましい態様において、本発明は、配列番号４７３〜６６６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子または核酸分子のアンチセンス配列に選択的にハイブリダイズする核酸分子を提供する。さらにより好ましい態様において、本発明は、配列番号１〜４７２の核酸配列を含む核酸分子に選択的にハイブリダイズする核酸分子、またはこのアンチセンス配列を提供する。
【０１１１】
好ましくは、核酸分子は、ＥＳＰをコードする核酸分子または核酸分子のアンチセンス配列に、低いストリンジェンシー条件下で、選択的にハイブリダイズする。さらに好ましくは、核酸分子は、ＥＳＰをコードする核酸分子または核酸分子のアンチセンス配列に、中程度のストリンジェンシー条件下で、選択的にハイブリダイズする。最も好ましくは、核酸分子は、ＥＳＰをコードする核酸分子または核酸分子のアンチセンス配列に、高いストリンジェンシー条件下で、選択的にハイブリダイズする。好ましい態様において、核酸分子は、低い、中程度の、または高いストリンジェンシー条件下で、配列番号４７３〜６６６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、核酸分子または核酸分子のアンチセンス配列にハイブリダイズする。より好ましい態様において、核酸分子は、低い、中程度の、または高いストリンジェンシー条件下で、配列番号１〜４７２から選択された核酸配列を含む核酸分子または核酸分子のアンチセンス配列にハイブリダイズする。
【０１１２】
本発明の核酸分子はまた、ＥＳＰをコードする核酸または核酸分子をコードする相補体に対して顕著な配列類似性を示す核酸配列を含むことができる。この態様において、核酸分子が、ヒトＥＳＰをコードする核酸分子に顕著な配列同一性を示すのが好ましい。より好ましいのは、配列番号４７３〜６６６のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子に対して、顕著な配列類似性を示す、核酸分子である。顕著な配列類似性により、ＥＳＰをコードする核酸分子と少なくとも６０％の配列同一性を有する核酸分子、より好ましくは、少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％およびさらにより好ましくは少なくとも８５％の配列同一性を有する核酸分子、例えば配列番号４７３〜６６６のアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。より好ましい態様において、同様の核酸分子は、ＥＳＰをコードする核酸分子と少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、尚より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するものである。この態様において最も好ましいのは、ＥＳＰをコードする核酸分子と、少なくとも９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％の配列同一性を有する、核酸分子である。
【０１１３】
本発明の核酸分子はまた、ＥＳＮＡまたはこの相補体に対する顕著な配列類似性を示すものを含む。この態様において、核酸分子は、配列番号１〜４７２の核酸配列を有する核酸分子に対する顕著な配列類似性を示すのが好ましい。顕著な配列類似性により、ＥＳＮＡと少なくとも６０％の配列同一性を有する核酸分子、例えば配列番号１〜４７２の核酸配列を有するもの、より好ましくは、少なくとも７０％、さらにより好ましくは、少なくとも８０％およびさらにより好ましくは、少なくとも８５％の核酸配列を有する核酸分子を意味する。より好ましいのは、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、さらにより好ましくは少なくとも９８％および尚より好ましくは少なくとも９９％の、ＥＳＮＡとの配列同一性を有する核酸分子である。最も好ましいのは、少なくとも９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％の、ＥＳＮＡとの配列同一性を有する核酸分子である。
【０１１４】
実質的な配列類似性を示す核酸分子は、ＥＳＮＡまたはＥＳＰをコードする核酸分子と、その全長にわたり配列同一性を示す配列および、その全長の一部分のみにわたって類似する配列を含む。この場合、該部分は、ＥＳＮＡまたはＥＳＰをコードする核酸分子の少なくとも50ヌクレオチド、好ましくは少なくとも100ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも150または200ヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも250または300ヌクレオチド、尚より一層好ましくは少なくとも400または500ヌクレオチドである。
【０１１５】
実質的に類似の核酸分子は、他の種に由来する天然に存在するもの、とりわけ他の霊長類に由来するものであって、該類似の核酸分子が、配列番号４７３〜６６６と顕著な配列同一性を示すアミノ酸配列をコードする、または、配列番号１〜４７２のヌクレオチド配列と顕著な配列同一性を示すものであることができる。この類似の核酸分子はまた、ＥＳＮＡが遺伝子ファミリーの成員である場合、ヒトからの天然に存在する核酸分子であってもよい。この類似の核酸分子はまた、限定されずに、家畜化種、例えばイヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ウシ、ウマおよびブタ；並びに、例えばサル、キツネ、ライオン、トラ、クマ、キリン、シマウマなどの野生動物を含む、霊長類ではない哺乳類種に由来する天然に存在する核酸分子であってもよい。実質的に類似の核酸分子はまた、鳥類または爬虫類などの、非哺乳類種に由来する天然に存在する核酸分子であってもよい。天然に存在する実質的に類似の核酸分子は、ヒトまたは他の種から直接単離することができる。別の態様では、実質的に類似の核酸分子は、核酸分子のランダム突然変異によって実験的に製造されたものであってもよい。別の態様では、実質的に類似の核酸分子は、ＥＳＮＡの指向性（directed）突然変異によって実験的に作製されたものであってもよい。好ましい態様において、実質的に類似の核酸分子は、ＥＳＮＡである。
【０１１６】
本発明の核酸分子はまた、ＥＳＮＡまたはＥＳＰをコードする核酸の対立遺伝子変異体を含むものとする。例えば、真核生物のゲノムにおいては、単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰｓ)がしばしば起こり、１つの種の1個体から決定された配列は、集団内に存在する他の対立遺伝子形態と異なり得る。140万を超えるＳＮＰｓがすでにヒトゲノムにおいて同定されている、International Human Genome Sequencing Consortium, Nature 409: 860-921 (2001)。単一のヌクレオチドより多い、小さい欠失および挿入を有する変異体はまた、一般的な集団において見出され、そしてしばしばタンパク質の機能を変えない。さらに、アミノ酸置換は、天然の対立遺伝子変異体の中で頻繁に生じ、しばしばタンパク質機能を実質的に変化させない。
【０１１７】
好ましい態様では、対立遺伝子変異体は、遺伝子の変異体であり、ここで、該遺伝子は、ＥＳＰをコードするｍＲＮＡに転写されている。より好ましい態様では、遺伝子は、配列番号４７３〜６６６のアミノ酸配列を含むＥＳＰをコードするｍＲＮＡに転写されている。別の好ましい態様では、対立遺伝子変異体は、遺伝子の変異体であり、ここで、遺伝子は、ＥＳＮＡであるｍＲＮＡに転写されている。より好ましい態様では、遺伝子は、配列番号１〜４７２の核酸配列を含むｍＲＮＡに転写されている。また、好ましいのは、対立遺伝子変異体が、対象となる種、特にヒト中の天然に存在する対立遺伝子変異体であることである。
【０１１８】
本発明の核酸分子はまた、本発明の核酸配列の部分を含む核酸配列を含む。該部分は、ポリペプチドをコードしてもしていなくてもよく、そして、ＥＳＰであるポリペプチドをコードしてもしなくてもよい。好ましい態様では、該部分はＥＳＰをコードする。１つの態様では、核酸分子は、ＥＳＮＡの部分を含む。他の態様では、核酸分子は、ＥＳＮＡにハイブリダイスするまたは、ＥＳＮＡに対し実質的な配列類似性を示す核酸分子の部分を含む。他の態様では、核酸分子は、ＥＳＮＡの対立遺伝子変異体である核酸分子の部分を含む。尚他の態様では、核酸分子は、ＥＳＰをコードする核酸分子の部分を含む。１つの部分は、少なくとも10ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも15、17、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400または500ヌクレオチドを含む。核酸の部分の最大サイズは、全長タンパク質をコードする核酸分子の配列より1ヌクレオチド短いものである。
【０１１９】
本発明の核酸分子はまた、下記に記載するように、融合タンパク質、相同タンパク質、ポリペプチド断片、ミューテインおよびポリペプチド類縁体をコードする核酸配列を含む。
【０１２０】
本発明の核酸分子はまた、ネイティブ核酸分子の修飾を含む核酸配列を含む。このような修飾の例には、ネイティブでないヌクレオシド間結合、合成後修飾または変化したヌクレオチド類縁体を含むが、これらには限定されない。当業者は、行うことができる修飾のタイプが、核酸分子の意図された使用に依存することを認識している。例えば、核酸分子がハイブリダイゼーションプローブとして用いられる際には、かかる修飾の範囲は、もたらされる核酸の配列を識別する塩基対合を許容するものに限定される。インビトロまたはインビボで、ＲＮＡまたはタンパク質の直接の発現のために用いる際には、かかる修飾の範囲は、核酸が、重合基質として正しく機能することを許容するものに限定される。単離核酸が治療剤として用いられる際には、修飾は単離核酸に毒性を付与しないものに限定される。
【０１２１】
従って、１つの態様では、核酸分子は、放射性標識またはフルオロフォアなどの直接検出可能な標識を組み込んだヌクレオチド類縁体、またはビオチンもしくは種々のハプテンなどの、その後の反応によって視覚化できる標識を組み込んだヌクレオチド類縁体を含むことができる。標識核酸分子は、特に、ハイブリダイゼーションプローブとして有用である。
【０１２２】
一般的な放射性標識類縁体は、α-32P-dATP、α-32P-dCTP、α-32P-dGTP、α-32P-dTTP、α-32P-３’dATP、α-32P-ATP、α-32P-CTP、α-32P-GTP、α-32P-UTP、α-35S-dATP、γ-35S-GTP、γ-33P-dATPなどのように、33P、32Pおよび35Sで標識されたものを含む。
【０１２３】
本発明の核酸に容易に組み込まれる市販の蛍光ヌクレオチド類縁体は、Cy3-dCTP、Cy3-dUTP、Cy5-dCTP、Cy3-dUTP (Amersham Biosciences, Piscataway, New Jersey, USA)、フルオレセイン-12-dUTP、テトラメチルローダミン-6-dUTP、テキサスレッド(登録商標)-5-dUTP、カスケードブルー(登録商標)-7-dUTP、BODIPY(登録商標)FL-14-dUTP、BODIPY(登録商標)TMR-14-dUTP、BODIPY(登録商標)TR-14-dUTP、ローダミングリーン(登録商標)-5-dUTP、オレゴングリーン(登録商標)488-5-dUTP、テキサスレッド(登録商標)-12-dUTP、BODIPY(登録商標)630/650-14-dUTP、BODIPY(登録商標)650/665-14-dUTP、アレクサフルオール（Alexa Fluor）(登録商標)488-5-dUTP、アレクサフルオール(登録商標)532-5-dUTP、アレクサフルオール(登録商標)568-5-dUTP、アレクサフルオール(登録商標)594-5-dUTP、アレクサフルオール(登録商標)546-14-dUTP、フルオレセイン-12-UTP、テトラメチルローダミン-6-UTP、テキサスレッド(登録商標)-5-UTP、カスケードブルー(登録商標)-7-UTP、BODIPY(登録商標) FL-14-UTP、BODIPY(登録商標)TMR-14-UTP、BODIPY(登録商標)TR-14-UTP、ローダミングリーン(登録商標)-5-UTP、アレクサフルオール(登録商標)488-5-UTP、アレクサフルオール(登録商標)546-14-UTP (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR, USA)を含む。また、他のフルオロフォアを有するヌクレオチドをカスタム合成することもできる。Henegariu et al., Nature Biotechnol. 18: 345-348 (2000)を参照。
【０１２４】
その後の標識のためにヌクレオチドに一般的に結合されるハプテンは、ビオチン(ビオチン-11-dUTP、Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, USA、ビオチン-21-UTP、ビオチン-21-dUTP、Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA, USA)、ジゴキシゲニン(DIG-11-dUTP、アルカリ不安定、DIG-11-UTP、Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, IN, USA)、およびジニトロフェニル(ジニトロフェニル-11-dUTP、Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, USA)を含む。
【０１２５】
本発明の核酸分子は、核酸中への標識ヌクレオチド類縁体の組み込みによって標識できる。かかる類縁体は、ＤＮＡ分子については、ニックトランスレーション、ランダムプライミング、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)、末端トランスフェラーゼテーリング、およびオーバーハングのエンドフィリング、並びに、ＲＮＡ分子については、例えばＴ７、Ｔ３およびＳＰ６などのファージプロモーターから誘導されるインビトロでの転写などによる、酵素重合によって組み込むことができる。このような各標識手法のために、市販のキットが容易に入手可能である。類縁体は、自動化された固相化学合成の最中に組み込むこともできる。標識はまた、核酸合成後に組み込むこともでき、５’リン酸塩および３’ヒドロキシルは検出可能な標識の合成後の共有結合による付着に好都合な部位を提供する。
【０１２６】
他の合成後の手法はまた、核酸の内部標識を可能にする。例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびペプチド核酸（ＰＮＡ）中のグアニン残基のＮ７(および、より少ない程度ではあるが、アデニン塩基)と反応するシスプラチン試薬を用いて、核酸とフルオロフォア標識との間に安定した配位複合体を提供することで、フルオロフォアを付着させることができる(Universal Linkage System)(Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, USA およびAmersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USAから入手可能)；Alers et al., Genes, Chromosomes & Cancer 25: 301- 305 (1999); Jelsma et al., J. NIH Res. 5: 82 (1994); Van Belkum et al., BioTechniques 16: 148-153 (1994)を参照。あるいはまた、核酸は、アリールアザイド化学を用いて、標的核酸に光学的または熱的に結合しているジスルフィド含有リンカー(FastTag(登録商標)試薬, Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA)を用いて標識することができる；還元後、遊離チオールが、ハプテン、フルオロフォア、糖、アフィニティーリガンドまたは他のマーカーとの結合に利用できる。
【０１２７】
１または２以上の独立のまたは相互作用性の標識を、本発明の核酸分子に組み込むことができる。例えば、フルオロフォア、およびその近くでは蛍光を消光するように作用する部分の両方を組み込んで、蛍光消光のリリースを介して特異的ハイブリダイゼーションを報告し、またはヌクレオチド外（exonucleotidic）除去を報告することができる。その開示の全体が参照により本明細書中に組み込まれる、例えばTyagi et al., Nature Biotechnol. 14: 303-308 (1996); Tyagi et al., Nature Biotechnol. 16: 49-53 (1998); Sokol et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 11538-11543 (1998); Kostrikis et al., Science 279: 1228-1229  (1998); Marras et al., Genet. Anal. 14: 151-156 (1999); Holland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7276-7280 (1991); Heid et al., Genome Res. 6(10): 986-94 (1996); Kuimelis et al., Nucleic Acids Symp. Ser. (37): 255-6 (1997);並びに米国特許第5,846,726号、第5,925,517号、第5,723,591号および第5,538,848号を参照。
【０１２８】
本発明の核酸分子はまた、１または２以上のネイティブのホスホジエステルヌクレオシド間結合を、よりヌクレアーゼ耐性のヌクレオシド間結合に変更することによって修飾することができる。Hartmann et al. (eds.), Manual of Antisense Methodology: Perspectives in Antisense Science, Kluwer Law International (1999); Stein et al. (eds.),  Applied Antisense Oligonucleotide Technology, Wiley-Liss (1998); Chadwick et al. (eds.), Oligonucleotides as Therapeutic Agents - Symposium No. 209, John Wiley & Son Ltd (1997)を参照。かかる変更されたヌクレオシド間結合は、しばしば、技術または標的遺伝子修正のために望まれる。Gamper et al., Nucl. Acids Res. 28(21): 4332-4339 (2000)。天然ｄｓＲＮＡまたはその糖、リン酸塩もしくは塩基に修飾されたｄｓＲＮＡのいずれかを用いることができる、二本鎖ＲＮＡ阻害については、その開示の全体が参照により本明細書中に組み込まれる、Hannon, Nature 418(11): 244-251 (2002); Fire et al., in WO 99/32619; Tuschl et al. in US2002/0086356; Kruetzer et al. in WO 00/44895を参照；環状アンチセンスについては、その開示の全体が参照により本明細書中に組み込まれる、Koolの米国特許第5,426,180号を参照。
【０１２９】
修飾オリゴヌクレオチド主鎖としては、限定されることなく、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルホスホネートおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデートを含むホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル並びにボラノホスフェートであって、通常の３’−５’結合を有するもの、これらの２’−５’結合類縁体、およびヌクレオシド単位の隣接した組が３’−５’から５’−３’または２’−５’から５’−２’に結合したものがあげられる。上記のリン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定されることなく、米国特許第
【表３】
2005521385.tif 000004
号が挙げられ、その開示の全体は、参照により本明細書中に組み込まれる。好ましい態様では、修飾ヌクレオシド間結合は、アンチセンス技術用に用いることができる。
【０１３０】
他の修飾オリゴヌクレオチド主鎖は、リン原子は含まないが、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合されたヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１もしくは２以上の短鎖へテロ原子もしくは複素環式ヌクレオシド間結合によって形成される主鎖を有する。これらは、モルホリノ結合(一部ヌクレオシドの糖部分から形成されている)を有するもの；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン主鎖；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネートおよびスルホンアミド主鎖；アミド主鎖；並びに混合されたＮ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２の構成部分を有するその他のものを含む。上記主鎖の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定されることなく、米国特許第
【表４】
2005521385.tif 000005
号が挙げられ、その開示の全体は、参照により本明細書中に組み込まれる。
【０１３１】
他の好ましい核酸分子においては、糖およびヌクレオシド間結合の両方が、ペプチド核酸(ＰＮＡ)などの新規な基で置換されている。ＰＮＡ化合物では、核酸のホスホジエステル主鎖は、アミド含有主鎖で、特にアミド結合で連結された反復するＮ−(2−アミノエチル)グリシンユニットによって置換されている。核酸塩基は、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に、典型的には、メチレンカルボニル結合で結合している。ＰＮＡは、ペプチド合成プロトコル変法を用いて合成することができる。ＰＮＡオリゴマーは、ＦｍｏｃおよびｔＢｏｃ法の両方によって合成することができる。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定されることなく、米国特許第5,539,082、5,714,331および5,719,262号が挙げられ、その開示の全体は、参照により本明細書中に組み込まれる。自動ＰＮＡ合成は、市販の合成機で容易に達成できる(例えば、“PNA User’s Guide,” Rev. 2, February 1998, Perseptive Biosystems Part No. 60138, Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA参照)。
【０１３２】
ＰＮＡ分子は、多数の理由で有利である。第１に、ＰＮＡ主鎖は非荷電なので、ＰＮＡ／ＤＮＡおよびＰＮＡ／ＲＮＡ二重鎖は、ＤＮＡ／ＤＮＡおよびＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖でみられるより、高い熱安定性を有する。ＰＮＡ/ＤＮＡまたはＰＮＡ/ＲＮＡ二重鎖のＴｍは、一般的に、対応するＤＮＡ／ＤＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖のＴｍよりも１塩基対当たり１℃高い（１００ｍＭのＮａＣｌ中で）。第２に、ＰＮＡ分子はまた、ＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖形成が起こらない条件下、低いイオン強度で、安定なＰＮＡ／ＤＮＡ複合体を形成することができる。第３に、ＰＮＡはまた、ＰＮＡ／ＤＮＡのミスマッチが、ＤＮＡ／ＤＮＡのミスマッチより不安定であるため、相補ＤＮＡへの結合における一層高い特異性を示す。混合したＰＮＡ／ＤＮＡの１５マーにおける単一のミスマッチは、Ｔｍを８〜２０℃(平均１５℃)下げる。対応するＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖では、単一のミスマッチは、Ｔｍを４〜１６℃(平均１１℃)下げる。ＰＮＡプローブは、ＤＮＡプローブより顕著に短くすることができるので、その特異性は高い。第４に、ヌクレアーゼおよびプロテアーゼは核酸塩基側鎖を有するＰＮＡポリアミド主鎖を認識しないので、ＰＮＡオリゴマーは、酵素による分解に抵抗性であり、これらの化合物の半減期はインビボおよびインビトロの両方で長くなる。例えば、Ray et al., FASEB J. 14(9): 1041-60 (2000); Nielsen et al., Pharmacol Toxicol. 86(1): 3-7 (2000); Larsen et al., Biochim Biophys Acta. 1489(1): 159-66 (1999); Nielsen, Curr. Opin. Struct. Biol. 9(3): 353-7 (1999), and Nielsen, Curr. Opin. Biotechnol. 10(1): 71-5 (1999)を参照。
【０１３３】
核酸分子は、核酸分子の全長にわたってそのネイティブの構造に比べて修飾されていてもよく、または、その不連続な部分に限局されていてもよい。後者の例としては、不連続なＤＮＡおよびＲＮＡドメインを有し、標的遺伝子修復およびＰＣＲ反応変法に用いることができるキメラ核酸を合成することができ、これは、その開示の全体が参照によって本明細書中に組み込まれる、Misra et al., Biochem. 37: 1917-1925 (1998)；およびFinn et al., Nucl. Acids Res. 24: 3357-3363 (1996)並びに米国特許第5,760,012号および第5,731,181号にさらに記載されている。
【０１３４】
他に特記のない限り、本発明の核酸分子は、所望の用途に適切な任意のトポロジー的構造を含むことができる；この用語は、従って、とりわけ、１本鎖、２本鎖、三重鎖、四重鎖、部分的２本鎖、部分的三重鎖、部分的四重鎖、分枝状、ヘアピン状、環状およびパドロック状構造を明白に包含する。パドロック構造およびその有用性は、Baneur et al., Curr. Opin. Biotechnol. 12: 11-15 (2001); Escude et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 14: 96(19):10603-7 (1999);およびNilsson et al., Science 265(5181): 2085-8 (1994)にさらに記載されている。三重鎖および四重鎖構造、並びにその有用性は、Praseuth et al., Biochim. Biophys. Acta. 1489(1): 181-206 (1999); Fox, Curr. Med. Chem. 7(1): 17-37 (2000); Kochetkova et al., Methods Mol. Biol. 130: 189-201 (2000); Chan et al., J. Mol. Med. 75(4): 267-82 (1997); Rowley et al., Mol Med 5(10): 693-700 (1999); Kool, Annu Rev Biophys Biomol Struct. 25: 1-28 (1996)に総括されている。
【０１３５】
核酸分子をプローブおよびプライマーとして用いる方法
本発明の単離核酸分子は、ゲノムおよび転写物由来核酸試料の両方において、ハイブリダイズする核酸を検出、特徴付けおよび定量し、そこからハイブリダイズする核酸を単離するためのハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。溶液中で遊離している場合、かかるプローブは、典型的には、しかし常にではなく、検出可能に標識されている；マイクロアレイにおけるように、基体に結合している場合、かかるプローブは、典型的には、しかし常にではなく、標識されていない。
【０１３６】
１つの態様では、本発明の単離核酸分子は、ＥＳＮＡの遺伝子中の総変化、例えば欠失、挿入、転座およびＥＳＮＡ遺伝子座の重複を、染色体のスプレッド(chromosome spreads)に対する蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)を介して、検出および特徴付けするためのプローブとして用いることができる。例えばAndreeff et al. (eds.), Introduction to Fluorescence In Situ Hybridization: Principles and Clinical Applications, John Wiley & Sons (1999)を参照。本発明の単離核酸分子は、例えば制限断片長多型のサザンブロットによる検出を用いて、微小なゲノムの変化を評価するためのプローブとして用いることができる。本発明の単離核酸分子は、本発明の核酸分子を含むゲノムクローンを単離するためのプローブとして用いることができ、それをその後配列レベルで欠失、挿入、転座および置換(１塩基多型、ＳＮＰｓ）を同定するために制限マッピングおよびシークエンシングすることができる。
あるいはまた、分子ビーコンなどの検出技術を用いることができる。Kostrikis et al. Science 279:1228-1229 (1998)参照。
【０１３７】
本発明の単離核酸分子はまた、転写由来核酸試料においてＥＳＮＡを検出、特徴付けおよび定量し、並びにそこからＥＳＮＡを単離するためのプローブとして用いることができる。１つの態様では、本発明の単離核酸分子は、全ＲＮＡ試料またはポリ-Ａ＋選択ＲＮＡ試料のノザンブロットによって、ｍＲＮＡを検出し、長さによって特徴付けし、そして定量するためのハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。他の態様では、本発明の単離核酸分子は、組織切片に対するインサイチュでのハイブリダイゼーションによって、ｍＲＮＡを検出し、位置によって特徴付けし、そして定量化するためのハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。例えば、Schwarchzacher et al., In Situ Hybridization, Springer-Verlag New York (2000)を参照。他の好ましい態様では、本発明の単離核酸分子は、ｃＤＮＡライブラリー中のクローンの発現を測定するための、またはｃＤＮＡライブラリーからハイブリダイズする核酸分子を単離するためのハイブリダイゼーションプローブとして用いることができ、これにより、限定されることなく、欠失、挿入、置換、切断、代替的なスプライス形態および単一ヌクレオチド多型の同定を含む、ＥＳＮＡにハイブリダイズするｍＲＮＡの配列レベルでの特徴付けが可能になる。さらに他の好ましい態様では、本発明の核酸分子は、マイクロアレイに用いることができる。
【０１３８】
上述のすべてのプローブ技術は、当業者の間で好適であり、上記Sambrook (2001)；上記Ausubel (1999)；および Walker et al. (eds.), The Nucleic Acids Protocols Handbook, Humana Press (2000)などの標準的なテキストに、より詳細に記載されている。
【０１３９】
他の態様では、本発明の核酸分子は、本発明の核酸分子に選択的にハイブリダイズする第２の核酸分子を同定および／または増幅するためのプローブまたはプライマーとして用いることができる。この態様では、プローブまたはプライマーはＥＳＰをコードする核酸分子に由来するのが好ましい。より好ましくは、プローブまたはプライマーは、配列番号４７３〜６６６のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子に由来する。また好ましいのは、ＥＳＮＡに由来するプローブまたはプライマーである。より好ましいのは、配列番号１〜４７２のヌクレオチド配列を有する核酸分子に由来するプローブまたはプライマーである。
【０１４０】
一般的に、プローブまたはプライマーは、少なくとも10ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも12、より好ましくは少なくとも14、そしてより一層好ましくは少なくとも16または17ヌクレオチド長である。より一層好ましい態様では、プローブまたはプライマーは、少なくとも18ヌクレオチド長、より一層好ましくは少なくとも20ヌクレオチド、そしてより一層好ましくは少なくとも22ヌクレオチド長である。プライマーおよびプローブはまた、長さにおいてより長くてもよい。例えば、プローブまたはプライマーは、25ヌクレオチド長、または30、40もしくは50ヌクレオチド長であってもよい。オリゴヌクレオチドプローブを用いて核酸ハイブリダイゼーションを達成する方法は、当該技術分野でよく知られている。例えば、上記Sambrook et al., 1989の短いプローブの放射性標識を説明した第11章、および11.31-11.32および11.40-11.44頁、並びにプローブハイブリダイゼーションのための具体的な条件(pp. 11.50-11.51)を含む、オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション条件を説明したpp. 11.45-11.53を参照。
【０１４１】
プライマーを用いた増幅を達成する方法もまた、当該技術分野でよく知られている。ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を行う方法は、とりわけ、McPherson, PCR Basics: From Background to Bench, Springer Verlag (2000); Innis et al. (eds.), PCR Applications: Protocols for Functional Genomics, Academic Press (1999); Gelfand et al. (eds.), PCR Strategies, Academic Press (1998); Newton et al., PCR, Springer-Verlag New York (1997); Burke (ed.), PCR: Essential Techniques, John Wiley & Son Ltd (1996); White (ed.), PCR Cloning Protocols: From Molecular Cloning to Genetic Engineering, Vol. 67, Humana Press (1996);およびMcPherson et al. (eds.), PCR 2: A Practical Approach, Oxford University Press, Inc. (1995)にまとめてある。ＲＴ−ＰＣＲを行うための方法は、例えば、Siebert et al. (eds.), Gene Cloning and Analysis by RT-PCR, Eaton Publishing Company/Bio Techniques Books Division, 1998; およびSiebert (ed.), PCR Technique:RT-PCR, Eaton Publishing Company/ BioTechniques Books (1995)に集められている。
【０１４２】
ＰＣＲおよびハイブリダイゼーション法は、対立遺伝子変異体、相同核酸分子および断片を含む本発明の核酸分子を同定および／または単離するのに用いることができる。ＰＣＲおよびハイブリダイゼーション法はまた、本発明の相同タンパク質、類縁体、融合タンパク質またはミューテインをコードする本発明の核酸分子を同定、増幅および／または単離するために用いることができる。本明細書中に記載した核酸プライマーは、転写物由来またはゲノムＤＮＡをテンプレートとして用い、本発明の核酸分子の増幅をプライミングするのに用いることができる。
【０１４３】
これらの核酸プライマーはまた、例えば、ＳＮＰ検出のための1塩基伸長(ＳＢＥ)をプライミングするのに用いることができる（例えば、その開示の全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第6,004,744号を参照）。
【０１４４】
ローリングサークル増幅などの等温増幅法もまた、現在ではよく記載されている。例えば、その開示の全体が参照によって本明細書に組み込まれるSchweitzer et al., Curr. Opin. Biotechnol. 12(1): 21-7 (2001)；国際公開WO 97/19193およびWO 00/15779並びに米国特許第5,854,033号および第5,714,320号を参照。ローリングサークル増幅は、ＳＮＰ検出を容易にするために、他の技術と組合わせることができる。例えば、Lizardi et al., Nature Genet. 19(3): 225-32 (1998)を参照。
【０１４５】
本発明の核酸分子は、基体と共有結合で、または非共有結合で結合していてもよい。基体は非孔質または多孔質でも、平坦または非平坦でも、ユニット型または分散型でもよい。結合した核酸分子は、ハイブリダイゼーションプローブとして用いることができ、標識されていても非標識でもよい。好ましい態様では、結合した核酸分子は非標識である。
【０１４６】
１つの態様では、本発明の核酸分子は、多孔質の基体、例えば、典型的には、ニトロセルロース、ナイロンまたは正電荷誘導体化ナイロン（positively charged derivatized nylon）を含む膜に結合している。本発明の核酸分子は、標識された核酸試料、例えば、転写物由来の核酸試料中に存在するハイブリダイズする核酸分子を検出するのに用いることができる。他の態様では、核酸分子は、限定されることなくガラス、アモルファスシリコン、結晶シリコンまたはプラスチックを含む、固体基体に結合している。プラスチックの例としては、限定されることなく、ポリメチルアクリル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリメチルメタクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリアセタール、ポリスルホン、酢酸セルロース、硝酸セルロース、ニトロセルロース、またはこれらの混合物が挙げられる。固体基体は、長方形、円盤状および球状を含む、任意の形態であることができる。好ましい態様では、固体基体は、顕微鏡スライドまたはスライド形状の基体である。
【０１４７】
本発明の核酸分子は、支持基体の表面に共有結合で付着させ、または、予想される非共有結合相互作用またはそのある組み合わせによって、変性および接着を容易にするカオトロピック剤中で、誘導体化した表面に適用することができる。本発明の核酸分子は、多数の他の核酸が競合的に結合した基体に結合することができ、多数の結合核酸のそれぞれへのハイブリダイゼーションを個別に検出できる。低い密度、例えば、多孔質の膜では、これらの基体に結合した集合体は、典型的にはマイクロアレイと呼ばれる；高い密度、典型的には、ガラスなどの固体支持体では、これらの基体に結合した多数の核酸の集合体は、口語的にマイクロアレイと呼ばれる。本明細書で用いる場合、用語マイクロアレイは、すべての密度のアレイを含む。従って、本発明の他の側面は、１または２以上の本発明の核酸分子を含むマイクロアレイを提供することである。
【０１４８】
尚他の態様において、本発明は、本明細書中に開示されたＥＳＮＡに基づくシングルエクソンプローブに関する。
【０１４９】
発現ベクター、宿主細胞およびポリペプチドを作製するための組換え的方法
本発明の他の側面は、１または２以上の本発明の単離核酸分子を含むベクター、およびかかるベクターが導入された宿主細胞を提供する。
【０１５０】
ベクターは、とりわけ、本発明の核酸分子を宿主細胞内で増殖させるため(クローニングベクター)、本発明の核酸分子を異種生物に由来する宿主細胞間で受け渡すため(シャトルベクター)、本発明の核酸分子を宿主細胞の染色体中に挿入するため(挿入ベクター)、本発明の核酸分子のセンスまたはアンチセンスＲＮＡ転写物をインビトロまたは宿主細胞内で発現させるため、および本発明の核酸分子によってコードされるポリペプチドを、単独で、または異種のポリペプチドとの融合タンパク質として発現させるため(発現ベクター)に用いることができる。ベクターはこれまでに当該技術分野でよく知られており、とりわけ、Jones et al. (eds.), Vectors: Cloning Applications: Essential Techniques (Essential Techniques Series), John Wiley & Son Ltd. (1998); Jones et al. (eds.), Vectors: Expression Systems: Essential Techniques (Essential Techniques Series), John Wiley & Son Ltd. (1998); Gacesa et al., Vectors: Essential Data, John Wiley & Sons Ltd. (1995); Cid-Arregui (eds.), Viral Vectors: Basic Science and Gene Therapy, Eaton Publishing Co. (2000); Sambrook (2001)、上記; Ausubel (1999)、上記に記載されている。さらに、種々のベクターが市販されている。既存のベクターの使用およびその改変は当業者の間で好適である。従って、本明細書では、基本的な特徴しか説明する必要はない。
【０１５１】
核酸配列は、それを適切な発現ベクター中の発現制御配列に作動可能に連結し、この発現ベクターを、適切な単細胞宿主を形質転換するために用いることによって、発現させることができる。発現制御配列は、核酸配列の転写、転写後イベントおよび翻訳を制御する配列である。この発明の核酸配列の、発現制御配列へのかかる作動可能な連結は、勿論、すでに該核酸配列の一部とはなっていない場合は、翻訳開始コドン、ＡＴＧまたはＧＴＧの、該核酸配列の上流の正しいリーディングフレームにおける提供を含む。
【０１５２】
多様な宿主／発現ベクターの組み合わせを、この発明の核酸配列の発現に用いることができる。有用な発現ベクターは、例えば、染色体性、非染色体性、および合成核酸配列のセグメントからなってもよい。
【０１５３】
１つの態様では、原核細胞を、適切なベクターとともに用いることができる。原核宿主細胞は、しばしば、クローニングおよび発現に用いられる。好ましい態様では、原核宿主細胞は、大腸菌、シュードモナス属、バチルス属およびストレプトマイセス属を含む。好ましい態様では、本発明の核酸分子を発現させるために、細菌性宿主細胞を用いる。細菌性宿主用の有用な発現ベクターは、大腸菌、バチルス属またはストレプトマイセス属からのものなどの、細菌性プラスミド、例えば、pBluescript、pGEX-2T、pUCベクター、col E1、pCR1、pBR322、pMB9およびそれらの派生物、広宿主域プラスミド、例えばRP4、ファージＤＮＡ、例えば、NM989、λGT10およびλGT11などのラムダファージの多数の派生物、並びに例えばM13および線状1本鎖ファージＤＮＡなどの他のファージを含む。大腸菌が宿主として用いられる場合、選択マーカーは、同様に、グラム陰性細菌での選択性について選ばれる：例えば、典型的なマーカーは、アンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、ストレプトマイシンおよびゼオシンなどの抗生剤への耐性を付与する；栄養要求性のマーカーもまた用いることができる。
【０１５４】
他の態様では、酵母、昆虫、哺乳類または植物細胞などの真核宿主細胞を用いることができる。酵母細胞、典型的にはS. cerevisiaeは、相同的組換えによる遺伝子変化のターゲティングの容易性、および組換え的に発現したタンパク質を用いて遺伝的欠陥を容易に補充する能力のために、真核生物の遺伝子研究に有用である。酵母細胞は、相互作用するタンパク質成分を、例えば、ツーハイブリッドシステムの使用を介して、同定するのに有用である。好ましい態様では、酵母細胞は、タンパク質発現に有用である。酵母に用いるための本発明のベクターは、典型的には、しかし常にではなく、酵母で用いるのに好適な複製起点、および酵母で機能する選択マーカーを含む。酵母ベクターは、酵母組み込みプラスミド(例えばYIp5)および酵母複製プラスミド(YRpおよびYEp型プラスミド)、酵母中心体プラスミド(YCp型プラスミド)、YLｐと呼ばれる酵母線状プラスミド、pGPD-2、2μプラスミドおよびこれらの派生物、並びにGietz et al., Gene, 74: 527-34 (1988)に記載されているような(YIplac、YEplacおよびYCplac)改善されたシャトルベクターに基づく酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含む。酵母ベクターにおける選択マーカーは、種々の栄養要求性マーカーを含み、その最も一般的なものは、(Saccharomyces cerevisiaeにおいて)URA3、HIS3、LEU2、TRP1およびLYS2であり、これは、ura3-52、his3-D1、leu2-D1、trp1-D1およびlys2-201などの特異的な栄養要求性の突然変異を補充する。
【０１５５】
昆虫細胞を、高効率のタンパク質発現用に選択することができる。宿主細胞がSpodoptera frugiperdaからのもの、例えば、Sf9およびSf21細胞系、並びにexpresSF（登録商標）細胞(Protein Sciences Corp., Meriden, CT, USA)である場合、ベクター複製方法は、典型的にはバキュロウイルスの生活環に基づく。典型的には、バキュロウイルストランスファーベクターは、野生型AcMNPVポリヘドリン遺伝子を、対象となる異種遺伝子で置換するために用いられる。野生型ゲノムにおいてポリヘドリン遺伝子に隣接する配列は、トランスファーベクターの発現カセットの５’および３’に位置している。AcMNPV ＤＮＡでのコトランスフェクションの後、相同的組換えイベントがこれらの配列間で生じ、対象となる遺伝子およびポリヘドリンまたはｐ10プロモータを担持する組換えウイルスがもたらされる。選択は、lacZ融合活性の視覚的なスクリーニングに基づくことができる。
【０１５６】
宿主細胞はまた、哺乳類細胞であってもよく、これらは、薬剤として意図されているタンパク質の発現のため、並びにタンパク質または生理学的経路の潜在的なアゴニストおよびアンタゴニストのスクリーニングのために特に有用である。自律的な染色体外での複製を対象とする哺乳類ベクターは、典型的には、ウイルス性の起源、例えば、ＳＶ４０起源（広いＴ抗原を発現している、例えばCOS1およびCOS7細胞などの細胞系での複製用）、パピローマウイルス起源、または長期のエピソーム性の複製のためのＥＢＶ起源（例えば、EBV EBNA-1遺伝子産物およびアデノウイルスE1Aを構成的に発現している293-EBNA細胞で用いるため）を含むだろう。組込み、および従って哺乳類染色体の部分としての複製を対象とするベクターは、ＳＶ４０起源などの、哺乳類細胞で機能的な複製起点を含むことができるが、必須ではない。アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、および種々の哺乳類レトロウイルスなどのウイルスに基づくベクターは、典型的には、ウイルスの複製方法に従って複製するだろう。哺乳類細胞で用いるための選択マーカーは、ネオマイシン（Ｇ４１８）、ブラスチシジン、ヒグロマイシンおよびゼオシンへの耐性、並びにＨＡＴ培地を用いたプリンサルベージ経路に基づく選択を含むが、これらには限定されない。
【０１５７】
哺乳類細胞での発現は、種々のプラスミド、例えばpSV2、pBC12BIおよびp91023など、並びに溶菌性ウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルスおよびバキュロウイルス）、エピソームウイルスベクター（例えば、ウシパピローマウイルス）、およびレトロウイルスベクター（例えば、マウスのレトロウイルス）を用いて達成することができる。昆虫細胞に有用なベクターは、バキュロウイルスベクターおよびpVL 941を含む。
【０１５８】
植物細胞もまた、典型的には植物ウイルス（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）由来のベクターレプリコン、および植物における好適性について選ばれた選択マーカーによる発現に用いることができる。
【０１５９】
異なる宿主細胞のコドンの使用は異なり得ることが知られている。例えば、植物細胞およびヒト細胞は、特定のアミノ酸をコードするためのコドンの選好において異なり得る。結果として、ヒトｍＲＮＡは、植物、細菌または昆虫宿主細胞に、有効に翻訳されないことがある。従って、本発明の他の態様は、コドンの最適化を対象とする。本発明の核酸分子のコドンは、該核酸分子でコードされたアミノ酸配列を変化させることなく、可能な限り、宿主細胞内に天然に含まれている遺伝子に類似するように、変更することができる。
【０１６０】
本発明の核酸分子を発現させるために、多種多様な発現制御配列のいずれをも、これらのベクターに使用することができる。かかる有益な発現制御配列は、上述の発現ベクターの構造遺伝子に結びついた発現制御配列を含む。転写を制御する発現制御配列は、例えば、プロモーター、エンハンサーおよび転写終止部位を含む。真核細胞において、転写後イベントを制御する発現制御配列は、スプライシング供与および受容部位、並びに転写されたＲＮＡの半減期を変更する配列、例えば、ポリ（Ａ）付加を導く配列またはＲＮＡ結合タンパク質のための結合部位を含む。翻訳を制御する発現制御配列は、リボソーム結合部位、特定の細胞区画への、またはその内部でのポリペプチドの標的化された発現を導く配列、並びに翻訳の速度または効率を変更する５’および３’非翻訳領域中の配列を含む。
【０１６１】
原核生物、例えば大腸菌のための有用な発現制御配列の例は、プロモーター、しばしば、ファージプロモーター、例えば、ラムダファージｐＬプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔｒｐおよびｌａｃプロモーターに由来するハイブリッド、バクテリオファージＴ７プロモーター（Ｔ７ポリメラーゼを発現するために操作された大腸菌細胞において）、ＴＡＣまたはＴＲＣシステム、ラムダファージの主要オペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、またはaraBADオペロンを含むだろう。原核生物発現ベクターは、ａｓｐＡターミネーターなどの転写ターミネーター、コンセンサスリボソーム結合部位および翻訳終止コドンなどの、翻訳を促進する要素をさらに含み得る。Schomer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8506-8510 (1986)。
【０１６２】
酵母細胞、典型的にはS. cerevisiaeのための発現制御配列は、CYC1プロモーター、GAL1プロモーター、GAL10プロモーター、ADH1プロモーター、酵母α接合系のプロモーターまたはGPDプロモーターなどの酵母プロモーターを含み、典型的には、ＣＹＣ１またはＡＤＨ１遺伝子からの転写終止シグナルなどの、転写の終止を促進する要素を有する。
【０１６３】
哺乳類細胞におけるタンパク質発現に有用な発現ベクターは、哺乳類細胞中で活性のあるプロモーターを含む。これらのプロモーターは、哺乳類ウイルスに由来するもの、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の前初期遺伝子からのエンハンサー-プロモーター配列、ラウス肉腫ウイルスの長い末端反復（RSV LTR）からのエンハンサー-プロモーター配列、ＳＶ４０からのエンハンサー-プロモーター、並びにアデノウイルスの初期および後期プロモーターを含むが、これらには限定されない。他の発現制御配列は、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖酵素のためのプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーターを含む。他の発現制御配列は、対象となるＥＳＮＡを含む遺伝子からのものを含む。しばしば、発現は、後期ＳＶ４０ポリアデニル化部位、並びにウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）遺伝子からのポリアデニル化シグナルおよび転写終止配列などのポリアデニル化部位、並びにリボソーム結合部位の組込みによって増強される。さらにまた、ベクターはウサギβ-グロビン遺伝子のイントロンＩＩなどのイントロン、およびＳＶ４０スプライスエレメントを含むことができる。
【０１６４】
好ましい核酸ベクターはまた、選択的または増幅可能なマーカー遺伝子、および対象遺伝子のコピー数を増幅するための手段を含む。かかるマーカー遺伝子は、当該技術分野でよく知られている。核酸ベクターは、安定化配列（例えば、ｏｒｉまたはＡＲＳ様配列およびテロメア様配列）をまた含んでもよく、または、代替的に宿主細胞ゲノムへの指向性もしくは非指向性組込み（directed or non-directed integration）を促進するように設計してもよい。好ましい態様では、この発明の核酸配列は、対象となるコードされた核酸配列を含むタンパク質をコードするＲＮＡの高レベルの発現を可能にする発現ベクター中のフレームに挿入される。核酸クローニングおよびシークエンシング方法は、当業者によく知られており、上記Sambrook (1989)、上記Sambrook (2000)；および上記Ausubel (1992)、上記Ausubel (1999)を含む、各種の実験室マニュアルに記載されている。生物学的試薬、化学試薬および免疫学的試薬の製造者からの製品情報もまた、有用な情報を提供する。
【０１６５】
発現ベクターは、構成型（constitutive）または誘導型のいずれかであることができる。誘導型ベクターは、lacオペロンで調節されているtrcプロモーター、およびトリプトファンで調節されるpLプロモーター、デキサメタゾンで誘導可能なＭＭＴＶ−ＬＴＲプロモーターなどのいずれかの天然誘導型（naturally inducible）のプロモーターを含み、または、合成プロモーター、および／または隣接プロモーターに誘導型の制御を付与する付加要素を含むことができる。誘導型の合成プロモーターの例は、ハイブリッドPlac/ara-1プロモーターおよびPLtetO-1プロモーターである。PLtetO-1プロモーターは、ラムダファージのＰＬプロモーターからの高い発現レベルを利用するが、ラムダ抑制部位を、Ｔｎ10テトラサイクリン耐性オペロンのオペレーター２の２つのコピーで置き換え、このプロモーターは、Ｔｅｔ抑制タンパク質によって厳密に抑制され、テトラサイクリン（Ｔｃ）および無水テトラサイクリンなどのＴｃ誘導体に応答して誘導される。ベクターはまた、これらが、グルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）およびエストロゲン応答要素（ＥＲＥ）などの、ベクターがそれぞれのホルモンレセプターを有する細胞での発現のために用いられた場合にホルモン誘導性を付与することができる、ホルモン応答要素を含むため、誘導型となってもよい。発現のバックグラウンドのレベルを低減するために、昆虫ホルモンであるエクジソンに応答する要素を、エクジソンレセプターの共発現と共に、代わりに用いることができる。
【０１６６】
本発明の１つの態様では、発現ベクターは、発現されたポリペプチドを、精製および／または視覚化を容易にする小タンパク質タグに融合するように設計することができる。このようなタグは、例えばＮｉＮＴＡ樹脂(Qiagen Inc., Valencia, CA, USA)またはＴＡＬＯＮ（登録商標）樹脂（コバルト固定化アフィニティクロマトグラフィー媒体、Clontech Labs, Palo Alto, CA, USA）を用いた、固定化金属アフィニティクロマトグラフィーによる融合タンパク質の精製を容易にするポリヒスチジンタグを含む。融合タンパク質は、キチン結合タグおよび自己切断性のインテインを含むことができ、これにより、融合タグの自己除去（self-removal）を伴うキチンベースの精製が可能になる（IMPACT（登録商標）システム、New England Biolabs, Inc., Beverley, MA, USA）。あるいはまた、融合タンパク質は、カルモジュリンアフィニティ樹脂による精製を可能にするカルモジュリン結合ペプチドタグ(Stratagene, La Jolla, CA, USA)、または、アビジン樹脂とその後のタグの除去を用いたインビボでビオチン化されたタンパク質の精製を可能にする、ビオチンカルボキシラーゼキャリアタンパク質の特異的に切断可能な断片(Promega, Madison, WI, USA)を含むことができる。
【０１６７】
他の有用な代替物として、本発明のポリペプチドは、グルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼへの融合として発現されることができ、グルタチオンへの結合の親和性および特異性により、グルタチオン-スーパーフロー樹脂(Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, USA)などのグルタチオンアフィニティ樹脂を用いた、その後の遊離グルタチオンでの溶離による精製が可能になる。他のタグはとしては、例えば、抗Ｘｐｒｅｓｓ抗体により検出可能なＸｐｒｅｓｓエピトープ(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)、抗ｍｙｃタグ抗体により検出可能なｍｙｃタグ、抗Ｖ５抗体により検出可能なＶ５エピトープ(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)、抗ＦＬＡＧ（登録商標）抗体により検出可能なＦＬＡＧ（登録商標）エピトープ(Stratagene, La Jolla, CA, USA)、および抗ＨＡ抗体により検出可能なＨＡエピトープが挙げられる。
【０１６８】
発現されたポリペプチドの分泌のために、ベクターは、リーダーペプチドなどの、分泌シグナルをコードする適切な配列を含むことができる。例えば、pSecTag2ベクター(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)は、種々の哺乳類細胞系からの組換えタンパク質の有効な分泌のための、マウスIgカッパー鎖のV-J2-C領域からの分泌シグナルを担持する、5.2 kbの哺乳類発現ベクターである。
【０１６９】
発現ベクターはまた、精製および／または同定タグよりも大きなポリペプチドへの異種核酸インサートによってコードされるタンパク質を融合するように設計することができる。有用なタンパク質融合体としては、コードされたタンパク質をファージまたは細胞の表面への提示、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）様発色団を有するものなどの本来的な蛍光タンパク質への融合、ＩｇＧＦｃ領域への融合を可能にするもの、およびツーハイブリッドシステムで用いるための融合体が挙げられる。
【０１７０】
ファージディスプレイ用のベクターは、コードされたポリペプチドを、例えば、Ｍ１３などの線状ファージの表面に提示するために、遺伝子ＩＩＩタンパク質（ｐＩＩＩ）または遺伝子ＶＩＩＩタンパク質（ｐＶＩＩＩ）に融合する。Barbas et al., Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001); Kay et al. (eds.), Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, Inc., (1996); Abelson et al. (eds.), Combinatorial Chemistry (Methods in Enzymology, Vol. 267) Academic Press (1996)を参照。酵母ディスプレイ用のベクター、例えばpYD1酵母ディスプレイベクター(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)は、α-アグルチニン酵母接着レセプターを用いてS. cerevisiaeの表面に組換えタンパク質を提示する。哺乳類ディスプレイ用のベクター、例えば、pDisplay（登録商標）ベクター(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)は、Ｎ-末端細胞表面標的化シグナル、および血小板由来増殖因子レセプターのＣ-末端膜貫通アンカリングドメインを用いて、組換えタンパク質を標的化する。
【０１７１】
異種核酸によってコードされたタンパク質を、基質非依存性の、本来的に蛍光な、Aequorea victoriaからの緑色蛍光タンパク質（「GFP」）の発色団およびその変異体に融合する、広範な種類のベクターが現在存在する。ＧＦＰ様発色団は、A. victoriaＧＦＰ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号AAA27721、Renilla reniformis GFP、FP583 (ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号AF168419) (DsRed)、FP593 (AF272711)、FP483 (AF168420)、FP484 (AF168424)、FP595 (AF246709)、FP486 (AF168421)、FP538 (AF168423)およびFP506 (AF168422)などの天然に存在するタンパク質において見出されたＧＦＰ様発色団から選択することができ、発色団の内在的な蛍光を保つ必要があるために、必要とされるネイティブタンパク質は限られている。蛍光に必要な最小のドメインを決定する方法は、当該技術分野で知られている。Li et al., J. Biol. Chem. 272: 28545-28549 (1997)を参照。
【０１７２】
あるいはまた、ＧＦＰ様発色団は、天然で見出されたものから改変されたＧＦＰ様発色団から選択することができる。かかる改変ＧＦＰ様発色団を操作し、単独でのおよびタンパク質融合の一部としての蛍光活性についてこれらをテストする方法は、当該技術分野でよく知られている。Heim et al., Curr. Biol. 6: 178-182 (1996)およびPalm et al., Methods Enzymol. 302: 378-394 (1999)を参照。多様なかかる改変発色団は、現在市販されており、本発明の融合タンパク質に容易に用いることができる。これらは、EGFP（「増強GFP」）、EBFP（「増強青色蛍光タンパク質」）、BFP2、EYFP（「増強黄色蛍光タンパク質」）、ECFP（「増強シアン蛍光タンパク質」）またはシトリンを含む。EGFP（例えば、その開示の全体が参照によって本明細書に組み込まれるCormack et al., Gene 173: 33-38 (1996)、米国特許第6,090,919および5,804,387号を参照）は、プラスミドおよびウイルス両方の種々のベクターで見出され、市販されている(Clontech Labs, Palo Alto, CA, USA)；EBFPは哺乳類細胞での発現用に最適化されている一方、本来のクラゲのコドンを保っているBFP2は、細菌で発現することができる（例えば、Heim et al., Curr. Biol. 6: 178-182 (1996)およびCormack et al., Gene 173: 33-38 (1996)を参照）。
【０１７３】
これらの青方シフト（blue-shifted）変異体を含むベクターは、Clontech Labs（Palo Alto, CA, USA)から入手可能である。EYFP、ECFP（例えばHeim et al., Curr. Biol. 6: 178-182 (1996)、Miyawaki et al., Nature 388: 882-887 (1997)を参照）およびシトリン（例えばHeikal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 11996-12001 (2000)を参照）もまたClontech Labsから入手可能である。GFP用発色団はまた、その開示の全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第6,124,128号、第6,096,865号、第6,090,919号、第6,066,476号、第6,054,321号、第6,027,881号、第5,968,750号、第5,874,304号、第5,804,387号、第5,777,079号、第5,741,668号、および第5,625,048号に記載されたものを含む、他の改変GFPから得ることができる。また、Conn (ed.), Green Fluorescent Protein (Methods in Enzymology, Vol. 302), Academic Press, Inc. (1999); Yang et al., J Biol Chem, 273:8212-6 (1998); Bevis et al., Nature Biotechnology, 20:83-7 (2002)を参照。これらのGFP変異体のそれぞれのGFP様発色団は、本発明の融合タンパク質に有効に含めることができる。
【０１７４】
IgGFc領域への融合は、FcRnレセプター（FcRpレセプターおよびブランベルレセプター、FcRbとも呼ばれる）との相互作用を介して、タンパク質医薬製品の血清半減期を増加させ、これは、その開示の全体が参照によって本明細書に組み込まれる国際特許出願第WO 97/43316号、第WO 97/34631号、第WO 96/32478号、第WO 96/18412にさらに記載されている。
【０１７５】
本発明のポリペプチドを、長期間、高収率で組換えにより作製するためには、安定発現が好ましい。安定発現は、選択マーカーを有するベクターの宿主細胞ゲノムへの組込みと、それに引き続くこれら組込み体（integrants）の選択によって容易に達成される。pUB6/V5-His A、BおよびC（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)などのベクターは、広範な哺乳類組織タイプおよび細胞系での、異種タンパク質の高レベルの安定発現のために設計されている。pUB6/V5-Hisは、ヒトユビキチンC遺伝子のプロモーター／エンハンサー配列を用いて、組換えタンパク質の発現を導く：293、CHO、およびNIH3T3細胞での発現レベルは、CMVおよびヒトEF-1aプロモーターからのレベルに匹敵する。bsd遺伝子は、有効な抗生剤ブラスチシジンによって、安定にトランスフェクトされた哺乳類細胞の迅速な選択を可能にする。
【０１７６】
典型的にはモロニーマウス白血病ウイルスに由来する、複製能力のないレトロウイルスベクターもまた、組み込まれたプロウイルスを有する安定なトランスフェクタントを創出するのに有用である。レトロウイルスの高効率の形質導入機構は、RetroPack（登録商標）PT 67、EcoPack2（登録商標）293、AmphoPack-293およびGP2-293細胞系（すべてClontech Laboratories, Palo Alto, CA, USAから入手可能）などの種々のパッケージング細胞系の利用可能性と相俟って、広い宿主域に高効率で感染することを可能にする；感染の多重度を変えることにより、組み込まれたプロウイルスのコピー数が容易に調節される。
【０１７７】
勿論、すべてのベクターおよび発現制御配列が、この発明の核酸分子を発現するために、等しく良好に機能するわけではない。また、すべての宿主が同じ発現系で、等しく良好に機能するわけでもない。しかしながら、当業者は、過度の実験なしに、そして、この発明の範囲から離れることなく、これらのベクター、発現制御配列および宿主の中から、選択をなしえる。例えば、ベクターの選択においては、宿主を考慮に入れなければならない。なぜなら、ベクターはその中で複製する必要があるからである。ベクターのコピー数、このコピー数を制御する能力、もしある場合は、組込みを制御する能力、および、ベクターによってコードされる、抗生剤または他の選択マーカーなどの任意の他のタンパク質の発現もまた考慮するべきである。本発明はさらに、本発明のベクターを含む宿主細胞を包含し、該ベクターは細胞中にエピソームで存在するか、または宿主細胞の染色体に全部または一部が組み込まれる。他の考慮すべき事項の中で、そのいくつかは上記されているが、宿主細胞株は、発現されたポリペプチドを所望の様式でプロセシングするその能力について選択することができる。かかるポリペプチドの翻訳後修飾としては、限定されることなく、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化が挙げられ、そして、かかる翻訳後修飾を伴うＥＳＰを提供するのが、本発明の１つの側面である。
【０１７８】
発現制御配列を選択する際には、多様な因子を考慮に入れるべきである。これらは、例えば、配列の相対的強度、その制御性、および、特に潜在的な二次構造に関する、この発明の核酸配列とのその適合性を含む。単細胞宿主は、選択したベクターとのその適合性、この発明の核酸配列によってコードされた産物の毒性、その分泌特性、ポリペプチドを正しく折りたたむその能力、その発酵または培養の要求性、およびこの発明の核酸配列によってコードされた産物のそれらからの精製の容易性を考慮して選択すべきである。
【０１７９】
組換え核酸分子、そして特に、この発明の発現ベクターは、この発明のポリペプチドを、異種宿主細胞で、組換えポリペプチドとして発現させるのに用いることができる。この発明のポリペプチドは全長であってもよく、または、この発明による核酸分子から組換え的に発現した全長より短いポリペプチド断片であってもよい。かかるポリペプチドは、類縁体、誘導体およびミューテインを含み、生物活性を有しても有しなくてもよい。
【０１８０】
本発明のベクターはまた、挿入された異種核酸からのＲＮＡのインビトロでの転写を可能にする要素をしばしば含む。かかるベクターは、典型的には、核酸インサートに隣接するファージプロモーター、例えば、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６からのものなどを含む。しばしば、２つの異なるかかるプロモーターが、挿入された核酸に隣接し、センス鎖およびアンチセンス鎖両方のインビトロでの個別の産生を可能にする。
【０１８１】
形質転換および宿主細胞に核酸を導入する他の方法（例えば、接合、プロトプラスト形質転換または融合、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコートペレット（high velocity DNA-coated pellets）、ウイルス感染およびプロトプラスト融合）は、当該技術分野でよく知られた多様な方法によって達成することができる（例えば、上記Ausubelおよび上記Sambrook et al、を参照）。細菌、酵母、植物または哺乳類細胞は、発現ベクター、例えばプラスミド、コスミドなどで形質転換またはトランスフェクトされ、ここで該発現ベクターは対象となる核酸を含む。あるいはまた、細胞は、対象となる核酸を含むウイルス発現ベクターで感染させることができる。宿主細胞、ベクターおよび用いる形質転換方法に依存して、ポリペプチドの一過性または安定発現は、構成型または誘導型となるだろう。当業者は、ポリペプチドを一過性にまたは安定的に発現させるかどうか、および、タンパク質を構成的にまたは誘導的に発現させるかどうかを決めることができる。
【０１８２】
多種多様な単細胞性宿主細胞が、この発明のＤＮＡ配列を発現するのに有用である。これらの宿主は、よく知られた真核生物宿主および原核生物宿主、例えば、真菌、酵母の菌株、Spodoptera frugiperda (SF9)などの昆虫細胞、ＣＨＯなどの動物細胞、並びに組織培養における植物細胞を含むことができる。適切な宿主細胞の代表的な例としては、限定されることなく、大腸菌、Caulobacter crescentus、ストレプトマイセス種、およびSalmonella typhimuriumなどの細菌細胞；Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Pichia pastoris、Pichia methanolicaなどの酵母細胞；Spodoptera frugiperdaからのもの、例えば、Sf9およびSf21細胞系、およびexpresSF（登録商標）細胞(Protein Sciences Corp., Meriden, CT, USA)、Drosophila S2細胞、およびTrichoplusia ni High Five（登録商標）細胞 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)などの昆虫細胞系；および哺乳類細胞が挙げられる。典型的な哺乳類細胞としては、BHK細胞、BSC 1細胞、BSC 40細胞、BMT 10細胞、VERO細胞、COS1細胞、COS7細胞、チャイニーズハムスター卵巣 (CHO)細胞、3T3細胞、NIH 3T3細胞、293細胞、HEPG2細胞、HeLa細胞、L細胞、MDCK細胞、HEK293細胞、WI38細胞、マウスES細胞系(例えば、129/SV、C57/BL6、DBA-1、129/SVJ系統からのもの)、K562細胞、Jurkat細胞、およびBW5147細胞が挙げられる。他の哺乳類細胞系はよく知られており、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC) (Manassas, VA, USA) およびCoriell Cell Repositories(Camden, NJ, USA)の国立一般医学研究所(NIGMS) Human Genetic Cell Repositoryから容易に入手できる。子宮内膜に由来する細胞または細胞系が特に好ましい。なぜなら、それらはよりネイティブな翻訳後プロセシングを提供し得るからである。特に好ましいのはヒト子宮内膜細胞である。
【０１８３】
組換えタンパク質のトランスフェクション、発現および精製の特定の詳細は、十分に文書化されており、当業者に理解されている。細菌細胞発現系における外来遺伝子の組換え的産生に用いるそれぞれの工程の種々の技術的側面についてのさらなる詳細は、当該技術分野の多数のテキストおよび実験室マニュアルに見出すことができる。例えば、上記Ausubel  (1992)、上記Ausubel (1999)、上記Sambrook (1989)および上記Sambrook (2001)を参照。
【０１８４】
本発明のベクターおよび核酸分子を宿主細胞に導入するための方法は、当該技術分野でよく知られている；技術の選択は、第一に、導入する具体的なベクターおよび選択した宿主細胞に依存する。
【０１８５】
核酸分子およびベクターは、多数の方法で、大腸菌などの原核生物に導入することができる。例えば、ラムダファージベクターは、典型的には、パッケージング抽出物（例えば、Gigapack（登録商標）パッケージング抽出物、Stratagene, La Jolla, CA, USA）を用いてパッケージングされ、そしてパッケージングされたウイルスを用いて大腸菌を感染させる。
【０１８６】
プラスミドベクターは、典型的には、ケミカルコンピテントまたはエレクトロコンピテント細菌細胞に導入される。大腸菌細胞は、例えばCaCl2、またはMg2+、Mn2+、Ca2+、Rb+またはK+の溶液、ジメチルスルホキシド、ジチオトレイトールおよびヘキサミンコバルト（ＩＩＩ）での処置でケミカルコンピテントにすることができ、Hanahan, J. Mol. Biol. 166(4):557-80 (1983)、そして、ベクターはヒートショックにより導入する。多種多様なケミカルコンピテント株は市販されてもいる（例えば、Epicurian Coli（登録商標）XL10-Gold（登録商標）ウルトラコンピテント細胞(Stratagene, La Jolla, CA, USA)、DH5αコンピテント細胞(Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, USA)、およびTOP10ケミカルコンピテント大腸菌キット(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA))。細菌細胞は、エレクトロコンピテントとして、種々のプレパルス処置によって、エレクトロポレーションによる外生的ＤＮＡを取り込むことができる；ベクターは、エレクトロポレーションにより導入され、その後引き続き選択培地中で成長する。膨大な種類のプロトコルが、BioRad (Richmond, CA, USA)により提供されている。
【０１８７】
ベクターは、酵母細胞に、スフェロプラスト化（spheroplasting）、リチウム塩での処置、エレクトロポレーション、またはプロトプラスト融合によって導入することができる。スフェロプラストは、通常はグルスラーゼ（Glusulase）と呼ばれる、巻貝の腸の抽出物（snail-gut extract）、またはArthrobacter luteusからの酵素であるザイモリアーゼなどの加水分解酵素の、浸透圧安定剤、典型的には1Ｍのソルビトールの存在下における細胞壁の部分を除去する作用によって調製される。ＤＮＡをスフェロプラストに加え、混合物をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とCa2+との溶液で共沈殿する。続いて、細胞をソルビトールの溶液に再懸濁し、溶融寒天（molten agar）と混合し、その後、ソルビトールを含む選択プレートの表面に層化する。
【０１８８】
リチウム媒介性形質転換では、酵母細胞を、酢酸リチウムで処理して、細胞壁を透過性にし、ＤＮＡを加え、細胞をＰＥＧで共沈殿する。細胞を短時間のヒートショックに供し、ＰＥＧおよび酢酸リチウムがなくなるまで洗浄し、続いて、通常の選択培地を含むプレートに播種する。特別に調製した1本鎖キャリアＤＮＡおよびある種の有機溶媒を用いることにより、増大した形質転換頻度を得る。Schiestl et al., Curr. Genet. 16(5-6): 339-46 (1989)。
【０１８９】
エレクトロポレーションでは、新たに成長した酵母の培養物を、典型的には洗浄し、ソルビトールなどの浸透圧保護剤中に懸濁し、ＤＮＡと混合し、そして細胞懸濁液をエレクトロポレーションデバイスでパルスする。続いて、細胞を選択培地を含むプレートの表面に播種する。Becker et al., Methods Enzymol. 194: 182-187 (1991)。エレクトロポレーションによる形質転換の効率は、ＰＥＧ、1本鎖キャリアＤＮＡおよび対数増殖期後期にある細胞を用いることにより、100倍以上高めることができる。ＹＡＣなどの大型の構築物は、プロトプラスト融合によって導入することができる。
【０１９０】
哺乳類細胞および昆虫細胞は、パッケージングされたウイルスベクターによって直接感染させ、または、化学的もしくは電気的手段によってトランスフェクトすることができる。化学的トランスフェクションでは、ＤＮＡはCaPO4で共沈殿するか、またはリポソーム系および非リポソーム系の脂質ベースの剤を用いて導入することができる。CaPO4トランスフェクションについては市販のキットが入手可能であり(CalPhos（登録商標）哺乳類トランスフェクションキット、Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, USA)、脂質媒介性トランスフェクションは、LIPOFECTAMINE（登録商標）2000、LIPOFECTAMINE（登録商標）試薬、CELLFECTIN（登録商標）試薬およびLIPOFECTIN（登録商標）試薬（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)、DOTAPリポソーム系トランスフェクション試薬、FuGENE 6、X-tremeGENE Q2、DOSPER、(Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN USA)、Effectene（登録商標）、PolyFect（登録商標）、Superfect（登録商標）(Qiagen, Inc., Valencia, CA, USA)などの市販の試薬を用いて行うことができる。哺乳類細胞をエレクトロポレーションするためのプロトコルは、例えば；Norton et al. (eds.), Gene Transfer Methods: Introducing DNA into Living Cells and Organisms, BioTechniques Books, Eaton Publishing Co. (2000)に見出すことができる。他のトランスフェクション技術としては、粒子衝撃によるトランスフェクションおよびマイクロインジェクションが挙げられる。例えば、Cheng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(10): 4455-9 (1993)、Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(24): 9568-72 (1990)を参照。
【０１９１】
組換え的に作製された本発明のタンパク質の作製の後に、任意に精製を行うことができる。
【０１９２】
組換え的に発現されたタンパク質の精製は、現在十分当業者の範囲内であり、従ってここでは詳述する必要はない。例えば、Thorner et al. (eds.), Applications of Chimeric Genes and Hybrid Proteins, Part A: Gene Expression and Protein Purification (Methods in Enzymology, Vol. 326), Academic Press (2000)、Harbin (ed.), Cloning, Gene Expression and Protein Purification : Experimental Procedures and Process Rationale, Oxford Univ. Press (2001)、Marshak et al., Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)、およびRoe (ed.), Protein Purification Applications, Oxford University Press (2001)を参照。
【０１９３】
しかし、簡潔に述べると、精製タグが、かかるタグの付加した発現ベクターの使用を介して融合されている場合、精製は、少なくとも部分的には、該タグに適切な手段、例えば、ポリヒスチジンタグのための固定化金属アフィニティクロマトグラフィーの使用などによって行うことができる。当該技術分野に一般的な他の技術としては、硫酸アンモニウム分画、免疫沈降、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（fast protein liquid chromatography）（ＦＰＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、および分取ゲル電気泳動が挙げられる。
【０１９４】
断片ムテイン、相同タンパク質、対立遺伝子変異体、類縁体および誘導体を含むポリペプチド
本発明の他の側面は、本明細書に記載した核酸分子によってコードされるポリペプチドに関する。好ましい態様では、ポリペプチドは、子宮内膜特異的ポリペプチド（ＥＳＰ）である。より一層好ましい態様では、ポリペプチドは、配列番号４７３〜６６６のアミノ酸配列を含むか、または配列番号４７３〜６６６のアミノ酸配列を有するポリペプチドに由来する。本明細書で定義されるポリペプチドは、上記で論じたように組換え的に作製してもよく、天然にタンパク質を発現している細胞から単離してもよく、または、本明細書の教示に従って、そして当業者によく知られた方法を用いて化学的に合成してもよい。
【０１９５】
本発明のポリペプチドはまた、ＥＳＰの部分または断片を含んでもよい。好ましい態様では、断片は、配列番号４７３〜６６６からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドに由来する。ＥＳＰ全体の部分または断片を含む本発明のポリペプチドは、ＥＳＰであってもなくてもよい。例えば、全長ポリペプチドは子宮内膜特異的であってもよく、一方、その断片は子宮内膜と同様に他の組織に見出されてもよい。ＥＳＰではないポリペプチドは、それが断片、類縁体、ミューテイン、相同タンパク質または誘導体であるかどうかにかかわらず、特に動物を免疫して抗ＥＳＰ抗体を調製するのに有用である。好ましい態様では、該部分または断片はＥＳＰである。本発明のポリペプチドがＥＳＰかどうかを決定する方法は、下記で説明してある。
【０１９６】
また、少なくとも6個の連続したアミノ酸の断片を含む、本発明のポリペプチドが、参照タンパク質のＢ細胞およびＴ細胞エピトープのマッピングに有用である。その開示の全体が参照によって本明細書に組み込まれる、例えばGeysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002 (1984)、並びに米国特許第4,708,871号および第5,595,915号を参照。かかるエピトープマッピングに有用であるために、該断片は、それ自体、免疫原性であり、イムノドミナントエピトープの一部であり、またネイティブな抗体により認識される必要はないので、本発明のポリペプチドの少なくとも6アミノ酸の断片はすべて、かかる研究において有用性を有する。
【０１９７】
少なくとも8個の連続したアミノ酸、しばしば少なくとも15個の連続したアミノ酸の断片を含む、本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドを認識する抗体を惹起するためのイムノゲンとして有用である。例えばLerner, Nature 299: 592-596 (1982); Shinnick et al., Annu. Rev. Microbiol. 37: 425-46 (1983); Sutcliffe et al., Science 219: 660-6 (1983)を参照。上述の参考文献にさらに記載されているとおり、タンパク質などのキャリアに結合した事実上すべての8マーは、免疫原性であることが明らかになり、結合したペプチドについての抗体を惹起することができる；従って、本発明のポリペプチドの少なくとも8アミノ酸の断片のすべては、イムノゲンとしての有用性を有する。
【０１９８】
少なくとも8、9、10または12個の連続したアミノ酸の断片を含むポリペプチドはまた、抗体への（エピトープマッピングでのように）、および多量体複合体におけるサブユニットなどの天然の結合パートナーへの、または対象タンパク質のレセプターもしくはリガンドへの、ポリペプチド全体またはその一部の結合の競合阻害剤として有用である；この競合阻害は、対象となるポリペプチドに特異的に結合する分子の同定および分離を可能にする。その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第5,539,084号および第5,783,674号を参照。
【０１９９】
本発明のポリペプチドは、従って、好ましくは、少なくとも6アミノ酸長、典型的には、少なくとも8、9、10または12アミノ酸長、そしてしばしば少なくとも15アミノ酸長である。しばしば、本発明のポリペプチドは、少なくとも20アミノ酸長、さらには25アミノ酸、30アミノ酸、35アミノ酸または50アミノ酸長またはこれ以上である。勿論、少なくとも75個のアミノ酸、100個のアミノ酸またはさらには150個のアミノ酸を有するより大型のポリペプチドもまた有用であり、ときには好ましい。
【０２００】
当業者は、ポリペプチドをコードする核酸分子、例えばＥＳＮＡを切断し、ついでそれを組換え的に発現させることによって断片を作製することができる。あるいはまた、全長ポリペプチドの一部を化学的に合成することによって断片を作製することができる。また、組換えポリペプチドまたは単離された天然に存在するポリペプチドのいずれかを酵素的に切断することによって、断片を作製することもできる。ポリペプチド断片を作成する方法は、当該技術分野でよく知られている。例えば上記Sambrook (1989)；上記Sambrook (2001)；上記Ausubel (1992)；および上記Ausubel (1999)を参照。１つの態様では、断片のみを含むポリペプチド、好ましくはＥＳＰの断片を、ＥＳＰポリペプチドの化学的または酵素的切断によって作製することができる。好ましい態様では、ポリペプチド断片は、断片、好ましくはＥＳＰをコードする本発明の核酸分子を、宿主細胞中で発現させることによって作製される。
【０２０１】
本発明のポリペプチドはまた、突然変異体、融合タンパク質、相同タンパク質および対立遺伝子変異体を含むものとする。
【０２０２】
突然変異タンパク質またはミューテインは、天然に存在するポリペプチドと比べて同一のまたは異なる特性を有してもよく、ネイティブなポリペプチドのアミノ酸配列と比べて、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、重複、欠失、再編成または置換を含む。タンパク質の機能を変化させない微小な欠失および挿入はしばしばみられる。ミューテインは子宮内膜特異的であってもなくてもよい。好ましくは、ミューテインは子宮内膜特異的である。より好ましくは、ミューテインは、配列番号４７３〜６６６のアミノ酸配列と比べて、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、重複、欠失、再編成または置換を含むポリペプチドである。従って、好ましい態様では、ミューテインは、配列番号４７３〜６６６のアミノ酸配列を含むＥＳＰに対し、少なくとも50％の配列同一性、より好ましくは少なくとも60％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも70％の配列同一性、より一層好ましくは少なくとも80％の配列同一性を示すものである。より一層好ましい態様では、ミューテインは、配列番号４７３〜６６６のアミノ酸配列を含むＥＳＰに対し、少なくとも85％、より好ましくは90％、さらにより好ましくは95％または96％、そしてより一層好ましくは少なくとも97％、98％、99％または99.5％の配列同一性を示す。
【０２０３】
ミューテインは、天然に存在する突然変異細胞、組織または生物から単離することによって作製することができる。ミューテインは、実験的に変異導入された細胞、組織または生物から単離することによって作製することができる。あるいはまた、ミューテインは、ポリペプチドの化学的操作によって、例えば、合成的または半合成的な化学的技法を用いてアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に変化させることによって作製することができる。好ましい態様では、ミューテインは、天然に存在する核酸分子に比べて突然変異した核酸分子を含む宿主細胞から作製される。例えば、本発明の核酸配列に１または２以上の突然変異を導入し、次いでそれを組換え的に発現させることによってポリペプチドのミューテインを作製することができる。これらの突然変異は標的化することができ、この場合は特別にコードされたアミノ酸が変化しており、または非標的化することができ、この場合は、ポリペプチド内のランダムにコードされたアミノ酸が変化している。
【０２０４】
ランダムアミノ酸変化を伴うミューテインは、以下に説明するとおり、具体的な生物活性または特性について、特に該ポリペプチドが子宮内膜特異的かどうかをスクリーニングすることができる。複数のランダム突然変異を、当該技術分野でよく知られた方法によって、例えば、エラープローンＰＣＲ、シャッフリング、オリゴヌクレオチドを用いた変異導入、アセンブリＰＣＲ、セクシャルＰＣＲ変異導入、インビボ変異導入、カセット変異導入、リカーシブアンサンブル変異導入、エクスポネンシャルアンサンブル変異導入および部位特異的変異導入によって、遺伝子に導入することができる。標的化されたアミノ酸変化またはランダムアミノ酸変化を有するミューテインを作製する方法は、当該技術分野でよく知られている。全体が参照によって本明細書に組み込まれる、例えば上記Sambrook (1989)；上記Sambrook (2001)；上記Ausubel (1992)；およびAusubel (1999)、並びに米国特許第 5,223,408号を参照。
【０２０５】
本発明はまた、本発明のポリペプチドと相同なポリペプチドを意図する。好ましい態様では、ポリペプチドはＥＳＰと相同である。より一層好ましい態様では、ポリペプチドは、配列番号４７３〜６６６のアミノ酸配列を有する群から選択されるＥＳＰと相同である。相同ポリペプチドは、ＥＳＰ、好ましくは配列番号４７３〜６６６のアミノ酸配列を含むＥＳＰと顕著な配列同一性を示すものを意味する。顕著な配列同一性とは、相同ポリペプチドが、配列番号４７３〜６６６のアミノ酸配列を含むＥＳＰと、少なくとも50％の配列同一性、より好ましくは少なくとも60％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも70％、尚より好ましくは少なくとも80％の配列同一性を示すことを意味する。より好ましいのは、配列番号４７３〜６６６のアミノ酸配列を含むＥＳＰに対し、少なくとも85％、より好ましくは90％、さらにより好ましくは95％または96％、そして尚より一層好ましくは少なくとも97％または98％の配列同一性を示す相同ポリペプチドである。最も好ましくは、相同ポリペプチドは、配列番号４７３〜６６６のアミノ酸配列を含むＥＳＰに対し、少なくとも99％、より好ましくは99.5％、さらにより好ましくは99.6％、99.7％、99.8％または99.9％の配列同一性を示す。好ましい態様では、相同ポリペプチドのアミノ酸置換は、上記で論じたとおり、保存的なアミノ酸置換である。
【０２０６】
本発明の相同ポリペプチドはまた、ＥＳＮＡまたはこのアンチセンス配列に選択的にハイブリダイズする核酸分子によってコードされたポリペプチドを含む。この態様では、相同ポリペプチドは、本明細書で定義された低いストリンジェンシー、中程度のストリンジェンシーまたは高いストリンジェンシー条件下で、ＥＳＮＡにハイブリダイズする核酸分子によってコードされるのが好ましい。より好ましいのは、配列番号１〜４７２からなる群から選択されたＥＳＮＡにハイブリダイズする核酸配列によってコードされた、相同ポリペプチドまたは、本明細書で定義された低いストリンジェンシー、中程度のストリンジェンシーまたは高いストリンジェンシー条件下で、ＥＳＰ、好ましくは配列番号４７３〜６６６のＥＳＰをコードする核酸分子にハイブリダイズする核酸分子によってコードされた、相同ポリペプチドである。
【０２０７】
本発明の相同ポリペプチドは、天然に存在し、他の種に由来するもの、特に、チンパンジー、ゴリラ、アカゲザルまたはヒヒなどの他の霊長類に由来するものであって、相同ポリペプチドが、配列番号４７３〜６６６のものと顕著な配列同一性を示すアミノ酸配列を含むものであってもよい。相同ポリペプチドはまた、ＥＳＰがポリペプチドのファミリーの成員である際には、ヒトからの天然に存在するポリペプチドであってもよい。相同的ポリペプチドはまた、限定されずに、家畜種、例えば、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスター、ウシ、ウマ、ヤギまたはブタを含む、霊長類ではない哺乳類種に由来する、天然に存在するポリペプチドであってもよい。相同ポリペプチドはまた、鳥類または爬虫類などの哺乳類ではない種に由来する、天然に存在するポリペプチドであってもよい。
【０２０８】
天然に存在する相同タンパク質は、ヒトまたは他の種から直接単離してもよい。あるいはまた、天然に存在する相同ポリペプチドをコードする核酸分子を単離し、相同ポリペプチドを組換え的に発現させるために用いてもよい。相同ポリペプチドはまた、核酸分子のランダム突然変異とその後の核酸分子の発現によって、実験的に作製されたものであってもよい。あるいはまた、相同ポリペプチドは、ＥＳＰのコードされたアミノ酸を変化させるための１または２以上のコドンの特異的突然変異（directed mutation）によって実験的に作製されたものであってもよい。好ましい態様において、相同ポリペプチドは、ＥＳＰであるポリペプチドをコードする。
【０２０９】
タンパク質の関連性はまた、第２の機能的テストである、第1のタンパク質が、第2のタンパク質の抗体への結合を競合的に阻害する能力を用いて特徴付けすることができる。従って、本発明の他の側面は、本明細書中で詳細に説明したものと配列が同一である単離ポリペプチドを提供するだけでなく、本発明の種々の単離ポリペプチドの全部または一部への抗体の結合を競合的に阻害する単離ポリペプチド（「交差反応性タンパク質」）を提供する。かかる競合阻害は、当該技術分野でよく知られているイムノアッセイを用いて容易に決定することができる。
【０２１０】
上記で論じたとおり、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰｓ）は真核生物のゲノムで頻繁に生じ、１つの種の１つの個体から決定された配列は、集団内に存在する他の対立遺伝子の形態と異なり得る。従って、本発明のポリペプチドはまた、ＥＳＰをコードする核酸分子の対立遺伝子変異体によってコードされるものをも含むものとする。この態様では、ポリペプチドが、配列番号４７３〜６６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子の対立遺伝子変異体によってコードされるのが好ましい。一層好ましいのは、ポリペプチドが、配列番号１〜４７２からなる群から選択される核酸配列を有する遺伝子の対立遺伝子変異体によってコードされることである。
【０２１１】
本発明のポリペプチドはまた、本発明による核酸分子によってコードされる誘導体ポリペプチドを含む。この態様では、ポリペプチドがＥＳＰであるのが好ましい。また好ましいのは、配列番号４７３〜６６６からなる群から選択されたアミノ酸配列を有し、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化されている誘導体ポリペプチドまたは他のＰＴＭである。他の好ましい態様では、誘導体は、例えば125I、32P、35Sおよび3Hなどの放射性同位体によって標識されている。他の好ましい態様では、誘導体は、フルオロフォア、化学発光剤、酵素、および標識されたリガンドの特異的結合対の成員として機能し得る抗リガンドによって標識されている。
【０２１２】
ポリペプチド修飾は当業者によく知られており、科学的文献に詳細に記載されている。数種の特に一般的な修飾である、例えば、グリコシル化、脂質付加、硫化、グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰ−リボシル化は、ほとんどの基本的なテキスト、例えば、Creighton, Protein Structure and Molecular Properties, 2nd ed., W. H. Freeman and Company (1993)などに記載されている。多数の詳細な総説がこの主題について利用可能であり、例えば、Johnson (ed.), Posttranslational Covalent Modification of Proteins, pgs. 1-12, Academic Press (1983)中、Woldによって提供されているもの、Seifter et al., Meth. Enzymol. 182: 626-646 (1990)およびRattan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 663: 48-62 (1992)などがある。
【０２１３】
本発明のポリペプチドが翻訳後修飾される傾向があるかどうかは、ポリペプチドの配列を分析し、翻訳後修飾のための部位を示すペプチドモチーフがあるかどうかを決定することにより決定することができる。翻訳後修飾の予測を可能にする、多くのコンピュータプログラムがある。例えば、www.expasy.org（２００２年１１月１１日アクセス）参照。これは、タンパク質ソーティングシグナルおよび局在部位の予測のためのＰＳＯＲＴ、シグナルペプチド切断部位の予測のためのＳｉｇｎａｌＰ、ミトコンドリア標的化配列の予測のためのＭＩＴＯＰＲＯＴおよびプレドター(Predotar)、哺乳類タンパク質におけるＯ型グリコシル化部位の予測のためのＮｅｔＯＧｌｙｃ、プレニル化アンカーおよび切断部位の予測のためのビッグＰＩプレジクターおよびＤＧＰＩ並びに真核タンパク質におけるＳｅｒ、ＴｈｒおよびＴｙｒリン酸化部位の予測のためのＮｅｔＰｈｏｓを含む。また、ＧＣＧに含まれるものなどの他のコンピュータプログラムを用いて、翻訳後修飾ペプチドモチーフを決定することができる。
【０２１４】
翻訳後修飾のタイプの一般的な例には、以下のものが含まれるが、これらには限定されない：（Ｚ）−デヒドロブチリン；１−コンドロイチン硫酸−Ｌ−アスパラギン酸エステル；１’−グリコシル−Ｌ−トリプトファン；１’−ホスホ−Ｌ−ヒスチジン；１−チオグリシン；２’−（Ｓ−Ｌ−システイニル）−Ｌ−ヒスチジン；２’−［３−カルボキサミド（トリメチルアンモニオ）プロピル］−Ｌ−ヒスチジン；２’−アルファ−マンノシル−Ｌ−トリプトファン；２−メチル−Ｌ−グルタミン；２−オキソブタン酸；２−ピロリドンカルボン酸；３’−（１’−Ｌ−ヒスチジル）−Ｌ−チロシン；３’−（８アルファ−ＦＡＤ）−Ｌ−ヒスチジン；３’−（Ｓ−Ｌ−システイニル）−Ｌ−チロシン；３’，３”，５’−トリヨード−Ｌ−チロニン；３’−４’−ホスホ−Ｌ−チロシン；３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン；３’−メチル−Ｌ−ヒスチジン；３−メチル−Ｌ−ランチオニン；３’−ホスホ−Ｌ−ヒスチジン；４’−（Ｌ−トリプトファン）−Ｌ−トリプトフィルキノン；
【０２１５】
４２Ｎ−システイニル−グリコシルホスファチジルイノシトールエタノールアミン；４３−（Ｔ−Ｌ−ヒスチジル）−Ｌ−チロシン；４−ヒドロキシ−Ｌ−アルギニン；４−ヒドロキシ−Ｌ−リジン；４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン；５’−（Ｎ６−Ｌ−リジン）−Ｌ−トパキノン；５−ヒドロキシ−Ｌ−リジン；５−メチル−Ｌ−アルギニン；アルファ−１−ミクログロブリン−Ｉｇアルファ複合体発色団；ビス−Ｌ−システイニルビス−Ｌ−ヒスチジノ二鉄ジスルフィド；ビス−Ｌ−システイニル−Ｌ−Ｎ３’−ヒスチジノ−Ｌ−セリニル四鉄テトラスルフィド；コンドロイチン硫酸Ｄ−グルクロニル−Ｄ−ガラクトシル−Ｄ−ガラクトシル−Ｄ−キシロシル−Ｌ−セリン；Ｄ−アラニン；Ｄ−アロ−イソロイシン；Ｄ−アスパラギン；
【０２１６】
デヒドロアラニン；デヒドロチロシン；デルマタン４−硫酸Ｄ−グルクロニル−Ｄ−ガラクトシル−Ｄ−ガラクトシル−Ｄ−キシロシル−Ｌ−セリン；Ｄ−グルクロニル−Ｎ−グリシン；ジピロリルメタンメチル−Ｌ−システイン；Ｄ−ロイシン；Ｄ−メチオニン；Ｄ−フェニルアラニン；Ｄ−セリン；Ｄ−トリプトファン；グリシンアミド；グリシンオキサゾールカルボン酸；グリシンチアゾールカルボン酸；ヘムＰ４５０−ビス−Ｌ−システイン−Ｌ−チロシン；ヘム−ビス−Ｌ−システイン；ヘムジオール−Ｌ−アスパルチルエステル−Ｌ−グルタミルエステル；ヘムジオール−Ｌ−アスパルチルエステル−Ｌ−グルタミルエステル−Ｌ−メチオニンスルホニウム；ヘム−Ｌ−システイン；ヘム−Ｌ−ヒスチジン；ヘパラン硫酸Ｄ−グルクロニル−Ｄ−ガラクトシル−Ｄ−ガラクトシル−Ｄ−キシロシル−Ｌ−セリン；ヘムＰ４５０−ビス−Ｌ−システイン−Ｌ−リジン；ヘキサキス−Ｌ−システイニル六鉄ヘキサスルフィド；
【０２１７】
ケラタン硫酸Ｄ−グルクロニル−Ｄ−ガラクトシル−Ｄ−ガラクトシル−Ｄ−キシロシル−Ｌ−スレオニン；Ｌオキソアラニン−乳酸；Ｌフェニル乳酸；１’−（８アルファ−ＦＡＤ）−Ｌ−ヒスチジン；Ｌ−２’，４’，５’−トパキノン；Ｌ−３’，４’−ジヒドロキシフェニルアラニン；Ｌ−３’，４’，５’−トリヒドロキシフェニルアラニン；Ｌ−４’−ブロモフェニルアラニン；Ｌ−６’−ブロモトリプトファン；Ｌ−アラニンアミド；Ｌ−アラニルイミダゾリノングリシン；Ｌ−アリシン；Ｌ−アルギニンアミド；Ｌ−アスパラギンアミド；Ｌ−アスパラギン酸４−リン酸無水物；Ｌ−アスパラギン酸１−アミド；Ｌ−ベータ−メチルチオアスパラギン酸；Ｌ−ブロモヒスチジン；Ｌ−シトルリン；Ｌ−システインアミド；Ｌ−システイングルタチオンジスルフィド；Ｌ−システインメチルジスルフィド；
【０２１８】
Ｌ−システインメチルエステル；Ｌ−システインオキサゾールカルボン酸；Ｌ−システインオキサゾリンカルボン酸；Ｌ−システインペルスルフィド；Ｌ−システインスルフェン酸；Ｌ−システインスルフィン酸；Ｌ−システインチアゾールカルボン酸；Ｌ−システイニルホモシトリルモリブデン七鉄ノナスルフィド；Ｌ−システイニルイミダゾリノングリシン；Ｌ−システイニルモリブドプテリン；Ｌ−システイニルモリブドプテリングアニンジヌクレオチド；Ｌ−シスチン；Ｌ−エリスロ−ベータ−ヒドロキシアスパラギン；Ｌ−エリスロ−ベータ−ヒドロキシアスパラギン酸；Ｌ−ガンマ−カルボキシグルタミン酸；Ｌ−グルタミン酸１−アミド；Ｌ−グルタミン酸５−メチルエステル；Ｌ−グルタミンアミド；Ｌ−グルタミル５−グリセリルホスホリルエタノールアミン；Ｌ−ヒスチジンアミド；Ｌ−イソグルタミル−ポリグルタミン酸；
【０２１９】
Ｌ−イソグルタミル−ポリグリシン；Ｌ−イソロイシンアミド；Ｌ−ランチオニン；Ｌ−ロイシンアミド；Ｌ−リジンアミド；Ｌ−リジンチアゾールカルボン酸；Ｌ−リシノアラニン；Ｌ−メチオニンアミド；Ｌ−メチオニンスルホン；Ｌ−フェニルアラニンチアゾールカルボン酸；Ｌ−フェニルアラニンアミド；Ｌ−プロリンアミド；Ｌ−セレノシステイン；Ｌ−セレノシステイニルモリブドプテリングアニンジヌクレオチド；Ｌ−セリンアミド；Ｌ−セリンチアゾールカルボン酸；Ｌ−セリルイミダゾリノングリシン；Ｌ−Ｔ−ブロモフェニルアラニン；Ｌ−スレオニンアミド；Ｌ−チロキシン；Ｌ−トリプトファンアミド；Ｌ−トリプトフィルキノン；Ｌ−チロシンアミド；Ｌ−バリンアミド；メソランチオニン；Ｎ−（Ｌ−グルタミル）−Ｌ−チロシン；Ｎ−（Ｌ−イソアスパルチル）−グリシン；Ｎ−（Ｌ−イソアスパルチル）−Ｌ−システイン；Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−Ｌ−アラニン；Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｌ−プロリン；Ｎ２−アセチル−Ｌ−リジン；Ｎ２−スクシニル−Ｌ−トリプトファン；Ｎ４−（ＡＤＰ−リボシル）−Ｌ−アスパラギン；Ｎ４−グリコシル−Ｌ−アスパラギン；Ｎ４−ヒドロキシメチル−Ｌ−アスパラギン；Ｎ４−メチル−Ｌ−アスパラギン；Ｎ５−メチル−Ｌ−グルタミン；Ｎ６−１−カルボキシエチル−Ｌ−リジン；Ｎ６−（４−アミノヒドロキシブチル）−Ｌ−リジン；Ｎ６−（Ｌ−イソグルタミル）−Ｌ−リジン；Ｎ６−（ホスホ−５’−アデノシン）−Ｌ−リジン；Ｎ６−（ホスホ−５’−グアノシン）−Ｌ−リジン；
【０２２０】
Ｎ６，Ｎ６，Ｎ６−トリメチル−Ｌ−リジン；Ｎ６，Ｎ６−ジメチル−Ｌ−リジン；Ｎ６−アセチル−Ｌ−リジン；Ｎ６−ビオチニル−Ｌ−リジン；Ｎ６−カルボキシ−Ｌ−リジン；Ｎ６−ホルミル−Ｌ−リジン；Ｎ６−グリシル−Ｌ−リジン；Ｎ６−リポイル−Ｌ−リジン；Ｎ６−メチル−Ｌ−リジン；Ｎ６−メチル−Ｎ６−ポリ（Ｎ−メチル−プロピルアミン）−Ｌ−リジン；Ｎ６−ムレイニル−Ｌ−リジン；Ｎ６−ミリストイル−Ｌ−リジン；Ｎ６−パルミトイル−Ｌ−リジン；Ｎ６−ピリドキサルホスフェート−Ｌ−リジン；Ｎ６−ピルビン酸２−イミニル−Ｌ−リジン；Ｎ６−レチナール−Ｌ−リジン；Ｎ−アセチルグリシン；Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン；Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニン；Ｎ−アセチル−Ｌ−アスパラギン酸；Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン；Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン酸；Ｎ−アセチル−Ｌ−イソロイシン；Ｎ−アセチル−Ｌ−メチオニン；Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリン；Ｎ−アセチル−Ｌ−セリン；Ｎ−アセチル−Ｌ−スレオニン；Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシン；Ｎ−アセチル−Ｌ−バリン；Ｎ−アラニル−グリコシルホスファチジルイノシトールエタノールアミン；Ｎ−アスパラギニル−グリコシルホスファチジルイノシトールエタノールアミン；Ｎ−アスパルチルグリコシルホスファチジルイノシトールエタノールアミン；Ｎ−ホルミルグリシン；Ｎ−ホルミル−Ｌ−メチオニン；Ｎ−グリシル−グリコシルホスファチジルイノシトールエタノールアミン；Ｎ−Ｌ−グルタミル−ポリ−Ｌ−グルタミン酸；Ｎ−メチルグリシン；Ｎ−メチル−Ｌ−アラニン；Ｎ−メチル−Ｌ−メチオニン；Ｎ−メチル−Ｌ−フェニルアラニン；
【０２２１】
Ｎ−ミリストイル−グリシン；Ｎ−パルミトイル−Ｌ−システイン；Ｎ−ピルビン酸２−イミニル−Ｌ−システイン；Ｎ−ピルビン酸２−イミニル−Ｌ−バリン；Ｎ−セリル−グリコシルホスファチジルイノシトールエタノールアミン；Ｎ−セリル−グリコシＥスフィンゴリピドイノイノシトールエタノールアミン；Ｏ−（ＡＤＰ−リボシル）−Ｌ−セリン；Ｏ−（ホスホ−５’−アデノシン）−Ｌ−スレオニン；Ｏ−（ホスホ−５’−ＤＮＡ）−Ｌ−セリン；Ｏ−（ホスホ−５’−ＤＮＡ）−Ｌ−スレオニン；Ｏ−（ホスホ−５’ｒＲＮＡ）−Ｌ−セリン；Ｏ−（ホスホリボシルデホスホ−コエンザイムＡ）−Ｌ−セリン；Ｏ−（ｓｎ−１−グリセロホスホリル）−Ｌ−セリン；Ｏ４’−（８アルファ−ＦＡＤ）−Ｌ−チロシン；Ｏ４’−（ホスホ−５’−アデノシン）−Ｌ−チロシン；Ｏ４’−（ホスホ−５’−ＤＮＡ）−Ｌ−チロシン；Ｏ４’−（ホスホ−５’−ＲＮＡ）−Ｌ−チロシン；Ｏ４’−（ホスホ−５’−ウリジン）−Ｌ−チロシン；Ｏ４−グリコシル−Ｌ−ヒドロキシプロリン；Ｏ４’−グリコシル−Ｌ−チロシン；Ｏ４’−スルホ−Ｌ−チロシン；Ｏ５−グリコシル−Ｌ−ヒドロキシリジン；Ｏ−グリコシル−Ｌ−セリン；Ｏ−グリコシル−Ｌ−スレオニン；オメガ−Ｎ−（ＡＤＰ−リボシル）−Ｌ−アルギニン；オメガ−Ｎ−オメガ−Ｎ’−ジメチル−Ｌ−アルギニン；オメガ−Ｎ−メチル−Ｌ−アルギニン；オメガ−Ｎ−オメガ−Ｎ−ジメチル−Ｌ−アルギニン；オメガ−Ｎ−ホスホ−Ｌ−アルギニン；Ｏ’オクタノイル−Ｌ−セリン；Ｏ−パルミトイル−Ｌ−セリン；
【０２２２】
Ｏ−パルミトイル−Ｌ−スレオニン；Ｏ−ホスホ−Ｌ−セリン；Ｏ−ホスホ−Ｌ−スレオニン；Ｏ−ホスホパンテテイン−Ｌ−セリン；フィコエリスロビリン−ビス−Ｌ−システイン；フィコウロビリン−ビス−Ｌ−システイン；ピロロキノリンキノン；ピルビン酸；Ｓヒドロキシシンナミル−Ｌ−システイン；Ｓ−（２−アミノビニル）メチル−Ｄ−システイン；Ｓ−（２−アミノビニル）−Ｄ−システイン；Ｓ−（６−ＦＷ−Ｌ−システイン；Ｓ−（８アルファ−ＦＡＤ）−Ｌ−システイン；Ｓ−（ＡＤＰ−リボシル）−Ｌ−システイン；Ｓ−（Ｌ−イソグルタミル）−Ｌ−システイン；Ｓ−１２−ヒドロキシファルネシル−Ｌ−システイン；Ｓ−アセチル−Ｌ−システイン；Ｓ−ジアセチルグリセロール−Ｌ−システイン；Ｓ−ジフィタニルグリセロールジエーテル−Ｌ−システイン；Ｓ−ファルネシル−Ｌ−システイン；Ｓ−ゲラニルゲラニル−Ｌ−システイン；Ｓ−グリコシル−Ｌ−システイン；Ｓ−グリシル−Ｌ−システイン；Ｓ−メチル−Ｌ−システイン；Ｓ−ニトロシル−Ｌ−システイン；Ｓ−パルミトイル−Ｌ−システイン；Ｓ−ホスホ−Ｌ−システイン；Ｓ−フィコビリビオリン−Ｌ−システイン；Ｓ−フィコシアノビリン−Ｌ−システイン；Ｓ−フィコエリスロビリン−Ｌ−システイン；Ｓ−フィトクロモビリン−Ｌ−システイン；Ｓ−セレニル−Ｌ−システイン；Ｓ−スルホ−Ｌ−システイン；テトラキス−Ｌ−システイニル二鉄ジスルフィド；
【０２２３】
テトラキス−Ｌ−システイニル鉄；テトラキス−Ｌ−システイニル四鉄テトラスルフィド；トランス−２，３−シス４−ジヒドロキシ−Ｌ−プロリン；トリス−Ｌ−システイニル三鉄テトラスルフィド；トリス−Ｌ−システイニル三鉄トリスルフィド；トリス−Ｌ−システイニル−Ｌ−アスパルテート四鉄テトラスルフィド；トリス−Ｌ−システイニル−Ｌ−システインペルスルフィド−ビス−Ｌ−グルタマト−Ｌ−ヒスチジノ四鉄ジスルフィドトリオキシド；トリス−Ｌ−システイニル−Ｌ−Ｎ３’−ヒスチジノ四鉄テトラスルフィド；トリス−Ｌ−システイニル−Ｌ−Ｎ１’−ヒスチジノ四鉄テトラスルフィド；およびトリス−Ｌ−システイニル−Ｌ−セリニル四鉄テトラスルフィド。
【０２２４】
ＰＴＭの追加の例は、Krishna, R. G. およびF. Wold (1998)に基づくDelta Massデータベースなどのウェブサイト中に見出すことができる。Posttranslational Modifications. Proteins - Analysis and Design. R. H. Angeletti. San Diego, Academic Press. 1: 121-206,; Methods in Enzymology, 193, J.A. McClosky (ed) (1990), 647〜660頁；Methods in Protein Sequence Analysis edited by Kazutomo Imahori and Fumio Sakiyama, Plenum Press, (1993) "Post-translational modifications of proteins" R.G. Krishna and F. Wold 167〜172頁；"GlycoSuiteDB: a new curated relational detabase of glycoprotein glycan structures and their biological sources" Cooper et al. Nucleic Acids Res. 29; 332-335 (2001) "O-GLYCBASE version 4.0: a revised database of O-glycosylated proteins" Gupta et al. Nucleic Acids Research, 27: 370-372 (1999)；および"PhosphoBase, a database of phosphorylation sites: release 2.0.", Kreegipuu et al. Nucleic Acids Res 27(1): 237-239 (1999)、またその開示の全体が参照によって本明細書に組み込まれる、WO 02/21139A2も参照。
【０２２５】
腫瘍形成は、しばしば、タンパク質の翻訳後修飾における変化により達成される。従って、他の態様において、本発明は、正常な細胞または組織からのポリペプチドの翻訳後修飾と比較して、変化した翻訳後修飾を有する、癌細胞または組織からのポリペプチドを提供する。多くの変化した翻訳後修飾が、知られている。１つの共通な変化は、リン酸化部位における変化であり、ここで、癌細胞または組織からのポリペプチドは、正常な組織からのポリペプチドと比較して、過剰リン酸化もしくは低リン酸化されるか、またはここで、ポリペプチドは、正常な細胞からのポリペプチドとは異なる残基でリン酸化される。
【０２２６】
他の一般的な変化は、グリコシル化部位の変化であり、ここで、癌細胞または組織からのポリペプチドは、正常な組織からのポリペプチドと比較して、いくらかグリコシル化されており、および／またはここで、癌細胞または組織からのポリペプチドは、非癌性細胞または組織からのポリペプチドとは異なるタイプのグリコシル化を有する。グリコシル化における変化は、極めて重要である。その理由は、炭水化物−タンパク質および炭水化物−炭水化物相互作用が、癌細胞増殖、播種および浸潤において重要であるからである。例えば、Barchi, Curr. Pharm. Des. 6: 485-501 (2000), Verma, Cancer Biochem. Biophys. 14: 151-162 (1994)およびDennis et al., Bioessays 5: 412-421 (1999)を参照。
【０２２７】
癌細胞において変化することができる、他の翻訳後修飾は、プレニル化である。プレニル化は、疎水性プレニル基（ファルネシルまたはゲラニルゲラニルのいずれか）のポリペプチドへの共有結合である。プレニル化は、細胞膜へのタンパク質の局在に必要であり、しばしばポリペプチドの機能に必要である。例えば、ＧＴＰアーゼシグナル伝達タンパク質のＲａｓスーパーファミリーは、細胞における機能のためにプレニル化されていなければならない。例えば、Prendergast et al., Semin. Cancer Biol. 10: 443-452 (2000)およびKhwaja et al., Lancet 355: 741-744 (2000)を参照。
【０２２８】
癌細胞において変化し得る、他の翻訳後修飾には、限定されずに、ポリペプチドのメチル化、アセチル化、アルギニル化またはアミノ酸残基のラセミ化が含まれる。これらの場合において、癌細胞からのポリペプチドは、非癌性細胞からの対応するポリペプチドと比較して、増加したかまたは減少した量の翻訳後修飾を示し得る。
【０２２９】
癌細胞における他のポリペプチド変化には、タンパク質の異常なポリペプチド切断および異常なタンパク質−タンパク質相互作用が含まれる。異常なポリペプチド切断は、通常は正常な細胞において起こらない、癌細胞におけるポリペプチドの切断、または、正常な細胞では切断されるポリペプチドの、癌細胞における切断の欠如であることができる。異常なタンパク質−タンパク質相互作用は、通常は互いに結合しないタンパク質間の共有結合架橋または非共有結合のいずれかであり得る。あるいはまた、癌細胞において、タンパク質は、非癌性細胞において結合する他のタンパク質に結合しないことができる。切断または、タンパク質−タンパク質相互作用における変化は、正常な細胞におけるポリペプチドと比較して、癌細胞におけるポリペプチドの過剰もしくは過小生成のためであるか、または癌細胞における１もしくは２以上のタンパク質の翻訳後修飾（上記参照）における変化のためであることができる。例えば、Henschen-Edman, Ann. N.Y. Acad. Sci. 936: 580-593 (2001)を参照。
【０２３０】
ポリペプチド翻訳後修飾における変化並びに、ポリペプチドの切断およびタンパク質−タンパク質相互作用における変化を、当該技術分野において知られているすべての方法により決定することができる。例えば、リン酸化における変化を、抗ホスホセリン、抗ホスホスレオニンもしくは抗ホスホチロシン抗体を用いることにより、またはアミノ酸分析により決定することができる。グリコシル化変化を、種々の糖残基に特異的な抗体を用いて、炭水化物シークエンシングにより、または、例えばＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により決定することが可能な糖タンパク質の大きさの変化により、決定することができる。プレニル化、ラセミ化、メチル化、アセチル化およびアルギニル化などの、翻訳後修飾の他の変化を、化学的分析、タンパク質シークエンシング、アミノ酸分析により、または特定の翻訳後修飾に特異的な抗体を用いることにより、決定することができる。タンパク質−タンパク質相互作用およびポリペプチドの切断における変化を、限定せずに、非変性ＰＡＧＥ（非共有結合性のタンパク質−タンパク質相互作用のため）、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ（共有結合性タンパク質−タンパク質相互作用およびタンパク質の切断のため）、化学的切断、タンパク質シークエンシングまたはイムノアッセイを含む、当該技術分野において知られているすべての方法により、分析することができる。
【０２３１】
他の態様では、本発明は、翻訳後修飾されたポリペプチドを提供する。１つの態様では、ポリペプチドを、翻訳後修飾の添加または除去により、酵素的に、または化学的に修飾することができる。例えば、ポリペプチドを、酵素的にグリコシル化または脱グリコシル化することができる。同様に、ポリペプチドを、ＭＡＰキナーゼ（例えばｐ３８、ＥＲＫもしくはＪＮＫ）またはチロシンキナーゼ（例えばＳｒｃもしくはｅｒｂＢ２）などの精製したキナーゼを用いて、リン酸化することができる。ポリペプチドはまた、合成化学により修飾することができる。あるいはまた、対象のポリペプチドを、所望の翻訳後修飾を有するポリペプチドを発現する細胞または組織から、単離することができる。
【０２３２】
他の態様では、対象のポリペプチドをコードする核酸分子を、コードされたポリペプチドを所望の様式で翻訳後修飾できる宿主細胞中に導入する。ポリペプチドが、所望の翻訳後修飾のためのモチーフを含まない場合には、ポリペプチドをコードする核酸分子の核酸配列を突然変異させることにより、翻訳後修飾を変化させて、それが、所望の翻訳後修飾のための部位を含むようにすることができる。翻訳後修飾され得るアミノ酸配列は、当該技術分野において知られている。例えば、ウェブサイトwww.expasy.org.上の前述のプログラムを参照。また、核酸分子を、コードされたポリペプチドを翻訳後修飾できる宿主細胞中に導入することができる。同様に、コードされたポリペプチドが翻訳後修飾モチーフを含まないように、核酸配列を突然変異させるか、または、ネイティブな核酸分子を、コードされたポリペプチドを翻訳後修飾できない宿主細胞中に導入することにより、翻訳後修飾された部位を欠失させることができる。
【０２３３】
よく知られているように、そして上記の通り、ポリペプチドは常には全体が線状ではないと理解される。例えば、ポリペプチドは、ユビキチン化の結果として分枝状であることができ、そしてこれらは、一般的に、天然のプロセシングイベントおよび天然には生じないヒトの操作によってなされたイベントを含む翻訳後イベントの結果として、分枝を有するまたは有しない環状であることができる。環状、分枝状および分枝環状ポリペプチドは、非翻訳的な天然のプロセスによって、および同様に、完全に合成的な方法によって合成することができる。修飾は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシ末端を含む、ポリペプチドのどこでも生じ得る。実際、共有結合的な修飾による、ポリペプチド中のアミノ基もしくはカルボキシル基またはその両方のブロックは、天然に存在するポリペプチドおよび合成ポリペプチドにおいて共通であり、そしてかかる修飾は本発明のポリペプチドにも同様に存在し得る。例えば、大腸菌で産生されたポリペプチドのアミノ末端残基は、タンパク質分解によるプロセシングの前は、殆ど常にＮ−ホルミルメチオニンである。
【０２３４】
有用な合成後（および翻訳後）修飾は、フルオロフォアなどの検出可能な標識への結合を含む。多種多様なアミン反応性およびチオール反応性のフルオロフォア誘導体が合成され、これらは、非変性条件下で、一方では、リジン残基のＮ−末端アミノ基およびイプシロンアミノ基と、他方では、システイン残基の遊離チオール基と反応する。
【０２３５】
タンパク質の、種々のアミン反応性またはチオール反応性フルオロフォアへの結合を可能にするキットが市販されている：例えばMolecular Probes, Inc. (Eugene, OR, USA)は、アレクサフルオール350、アレクサフルオール430、フルオレセイン-EX、アレクサフルオール488、オレゴングリーン488、アレクサフルオール532、アレクサフルオール546、アレクサフルオール568、アレクサフルオール594およびテキサスレッド-Xへタンパク質を結合するためのキットを提供している。
【０２３６】
多種多様な他のアミン反応性およびチオール反応性フルオロフォアが市販されており（Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, USA）、これは、アレクサフルオール（登録商標）350、アレクサフルオール（登録商標）488、アレクサフルオール（登録商標）532、アレクサフルオール（登録商標）546、アレクサフルオール（登録商標）568、アレクサフルオール（登録商標）594、アレクサフルオール（登録商標）647（Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, USAから入手可能なモノクローナル抗体標識キット）、BODIPY色素、例えば、BODIPY 493/503、BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY 530/550、BODIPY TMR、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY TR、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、カスケードブルー、カスケードイエロー、ダンシル、リサミンローダミンＢ、マリナブルー、オレゴングリーン488、オレゴングリーン514、パシフィックブルー、ローダミン6G、ローダミングリーン、ローダミンレッド、テトラメチルローダミン、テキサスレッド（Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, USAから入手可能)を含む。
【０２３７】
本発明のポリペプチドはまた、二価性架橋試薬を用いて、フルオロフォア、他のタンパク質、および他の巨大分子に結合することができる。一般的なホモ二価性試薬としては、例えば、APG、AEDP、BASED、BMB、BMDB、BMH、BMOE、BM[PEO]3、BM[PEO]4、BS3、BSOCOES、DFDNB、DMA、DMP、DMS、DPDPB、DSG、DSP (Lomant’s Reagent)、DSS、DST、DTBP、DTME、DTSSP、EGS、HBVS、Sulfo-BSOCOES、Sulfo-DST、Sulfo-EGS（すべてPierce, Rockford, IL, USAから入手可能)が挙げられ；一般的なヘテロ二価性架橋剤としては、
【表５】
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(すべてPierce, Rockford, IL, USAから入手可能)が挙げられる。
【０２３８】
全長ポリペプチドを含む本発明のポリペプチド、断片および融合タンパク質は、かかる架橋試薬を用いて、アミンまたはチオール反応性ではないフルオロフォアに結合させることができる。本発明のポリペプチドに有効に結合させることができる他の標識としては、放射性標識、超音波検査用造影試薬およびＭＲＩ造影剤が挙げられる。
【０２３９】
全長ポリペプチドを含む本発明のポリペプチド、断片および融合タンパク質はまた、架橋剤を用いて、ＫＬＨ、ウシチログロブリン、およびさらにはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのキャリアタンパク質に、抗ＥＳＰ抗体を惹起する目的で免疫原性を高めるために、有効に結合させることができる。
【０２４０】
全長ポリペプチドを含む本発明のポリペプチド、断片および融合タンパク質はまた、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に有効に結合させることができる；ＰＥＧ化は、補充療法のために静脈内投与されたタンパク質の血清半減期を増大させる。Delgado et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 9(3-4): 249-304 (1992)、Scott et al., Curr. Pharm. Des. 4(6): 423-38 (1998)、DeSantis et al., Curr. Opin. Biotechnol. 10(4): 324-30 (1999)。ＰＥＧモノマーは、緩和な条件下で直接的な付着を可能にするトレシルクロライド（2，2，2-トリフルオロエタンスルホニルクロライド）で活性化されたＰＥＧモノマーを用いるＰＥＧ化によって、タンパク質に直接またはリンカーを介して付着させることができる。
【０２４１】
本発明のポリペプチドはまた、本発明の核酸分子によってコードされるポリペプチドの類縁体を含む。好ましい態様では、このポリペプチドはＥＳＰである。より好ましい態様では、このポリペプチドは、配列番号４７３〜６６６のアミノ酸配列の一部または全部を有するポリペプチドに由来する。また好ましいのは、天然に存在するポリペプチドに比べ、１または２以上の、非天然アミノ酸の置換またはネイティブでない残基間結合を含む類縁体ポリペプチドである。１つの態様では、類縁体は、ＥＳＰと構造的に類似するが、１または２以上のペプチド結合が、-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH=CH-(シスおよびトランス)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-および-CH2SO-からなる群から選択された結合により置換されている。
【０２４２】
他の態様では、類縁体は、より安定なペプチドを創出するために、ＥＳＰの１または２以上のアミノ酸の、同型のＤ−アミノ酸との、または他の非天然アミノ酸との置換を含む。Ｄ−アミノ酸は、化学的なペプチド合成の最中に容易に組み込むことができる：Ｄ−アミノ酸で構成されたペプチドは、タンパク溶解性の攻撃により抵抗性である；Ｄ−アミノ酸の組込みはまた、ペプチドに特定の3次元コンホメーションを付与するために用いることができる。化学合成の最中に一般的に添加される他のアミノ酸類縁体としては、オルニチン、ノルロイシン、リン酸化アミノ酸（典型的には、ホスホセリン、ホスホスレオニン、ホスホチロシン）、Ｌ−マロニルチロシン（L-malonyltyrosine）、ホスホチロシンの非加水分解性類縁体（例えばKole et al., Biochem. Biophys. Res. Com. 209: 817-821 (1995)を参照）、および種々のハロゲン化フェニルアラニン誘導体が挙げられる。
【０２４３】
非天然アミノ酸は、固相化学合成の最中に、または組換え技術によって組み込むことができるが、前者の方が典型的で、より一般的である。ペプチドの固相化学合成は、当該技術分野で十分に確立されている。手順は、とりわけ、Chan et al. (eds.), Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (Practical Approach Series), Oxford Univ. Press (March 2000)、Jones, Amino Acid and Peptide Synthesis (Oxford Chemistry Primers, No 7), Oxford Univ. Press (1992)、およびBodanszky, Principles of Peptide Synthesis (Springer Laboratory), Springer Verlag (1993)に記載されている。
【０２４４】
また、検出可能な標識を有するアミノ酸類縁体を、誘導体および類縁体を提供するために、合成の最中に有効に組み込む。例えば、ビオチンは、ビオチノイル−（9−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−リジン（ＦＭＯＣビオシチン）(Molecular Probes, Eugene, OR, USA)を用いて付加することができる。ビオチンはまた、大腸菌BirA基質ペプチドの融合タンパク質への組込みによって、酵素的に付加することもできる。ダブシル−Ｌ−リジンのＦＭＯＣおよびｔＢＯＣ誘導体(Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, USA)は、ダブシル発色団を、合成の最中に、ペプチド配列の選択した部位に組み込むために用いることができる。蛍光共鳴エネルギートランスファー（ＦＲＥＴ）システムにおいて、ダブシルクエンチャーとの対合のための最も一般的なフルオロフォアである、アミノナフタレン誘導体ＥＤＡＮＳは、ＥＤＡＮＳ−ＦＭＯＣ−Ｌ−グルタミン酸または対応するｔＢＯＣ誘導体（両方ともMolecular Probes, Inc., Eugene, OR, USAから）を用いることによって、ペプチドの自動合成の最中に導入することができる。テトラメチルローダミンフルオロフォアは、(FMOC)-TMR-L-リジン（Molecular Probes, Inc. Eugene, OR, USA)を用いて、ペプチドの自動ＦＭＯＣ合成の最中に組み込むことができる。
【０２４５】
化学合成の最中に組込むことができる他の有用なアミノ酸類縁体としては、アリル側鎖保護を有するアスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、およびチロシンの類縁体(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA)が挙げられる；アリル側鎖により、環状、分枝鎖状、スルホン化、グリコシル化およびリン酸化ペプチドの合成が可能になる。
【０２４６】
化学合成の最中に組込むことが可能な多数の他のＦＭＯＣ保護非天然アミノ酸類縁体が市販されており、例えば、Fmoc-2-アミノビシクロ[2.2.1]ヘプタン-2-カルボン酸、Fmoc-3-エンド-アミノビシクロ[2.2.1] ヘプタン-2-エンド-カルボン酸、Fmoc-3-エキソ-アミノビシクロ[2.2.1]ヘプタン-2-エキソ-カルボン酸、Fmoc-3-エンド-アミノ-ビシクロ[2.2.1]ヘプト-5-エン-2-エンド-カルボン酸、Fmoc-3-エキソ-アミノ-ビシクロ[2.2.1]ヘプト-5-エン-2-エキソ-カルボン酸、Fmoc-シス-2-アミノ-1-シクロヘキサンカルボン酸、Fmoc-トランス-2-アミノ-1-シクロヘキサンカルボン酸、Fmoc-1-アミノ-1-シクロペンタンカルボン酸、Fmoc-シス-2-アミノ-1-シクロペンタンカルボン酸、Fmoc-1-アミノ-1-シクロプロパンカルボン酸、Fmoc-D-2-アミノ-4-(エチルチオ)酪酸、Fmoc-L-2-アミノ-4-(エチルチオ)酪酸、Fmoc-L-ブチオニン、Fmoc-S-メチル-L-システイン、Fmoc-2-アミノ安息香酸(アントラニル酸)、Fmoc-3-アミノ安息香酸、Fmoc-4-アミノ安息香酸、Fmoc-2-アミノベンゾフェノン-２’-カルボン酸、Fmoc-N-(4-アミノベンゾイル)-β-アラニン、Fmoc-2-アミノ-4,5-ジメトキシ安息香酸、Fmoc-4-アミノ馬尿酸、Fmoc-2-アミノ-3-ヒドロキシ安息香酸、Fmoc-2-アミノ-5-ヒドロキシ安息香酸、Fmoc-3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸、Fmoc-4-アミノ-3-ヒドロキシ安息香酸、Fmoc-4-アミノ-2-ヒドロキシ安息香酸、Fmoc-5-アミノ-2-ヒドロキシ安息香酸、Fmoc-2-アミノ-3-メトキシ安息香酸、Fmoc-4-アミノ-3-メトキシ安息香酸、Fmoc-2-アミノ-3-メチル安息香酸、Fmoc-2-アミノ-5-メチル安息香酸、Fmoc-2-アミノ-6-メチル安息香酸、Fmoc-3-アミノ-2-メチル安息香酸、Fmoc-3-アミノ-4-メチル安息香酸、Fmoc-4-アミノ-3-メチル安息香酸、Fmoc-3-アミノ-2-ナフトエ酸、Fmoc-D,L-3-アミノ-3-フェニルプロピオン酸、Fmoc-L-メチルドパ、Fmoc-2-アミノ-4,6-ジメチル-3-ピリジンカルボン酸、Fmoc-D,L-アミノ-2-チオフェン酢酸、Fmoc-4-(カルボキシメチル)ピペラジン、Fmoc-4-カルボキシピペラジン、Fmoc-4-(カルボキシメチル)ホモピペラジン、Fmoc-4-フェニル-4-ピペリジンカルボン酸、Fmoc-L-1,2,3,4-テトラヒドロノルハルマン-3-カルボン酸、Fmoc-L-チアゾリジン-4-カルボン酸が挙げられ、これらはすべてPeptide Laboratory (Richmond, CA, USA)から入手可能である。
【０２４７】
非天然残基はまた、サプレッサーｔＲＮＡ、典型的にはＵＡＧ終止コドンを認識するものを、所望の非天然アミノ酸の化学的アミノアシル化により操作することによって、生合成的に付加することができる。選択した終止コドンＵＡＧをタンパク質遺伝子の対象となる部位に導入するために、慣用の部位特異的変異導入を用いる。アシル化サプレッサーｔＲＮＡと突然変異遺伝子とがインビトロの転写／翻訳系で組合わされた場合、非天然アミノ酸はＵＡＧコドンに応答して組込まれて、このアミノ酸を特定の位置に含むタンパク質を与える。Liu et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 96(9): 4780-5 (1999）、Wang et al., Science 292(5516): 498-500 (2001)。
【０２４８】
融合タンパク質
本発明の他の側面は、本発明のポリペプチドの、非相同的ポリペプチドへの融合に関する。好適態様において、本発明のポリペプチドはＥＳＰである。さらに好適な態様において、非相同的ポリペプチドに融合される本発明のポリペプチドは、配列番号４７３〜６６６のアミノ酸配列の一部または全部を含有するか、またはそのミューテイン、相同的ポリペプチド、類縁体または誘導体である。さらにまた好適な態様において、融合タンパク質は、配列番号１〜４７２の核酸配列の全部もしくは一部を包含する核酸分子によりコードされているか、または選択的にハイブリダイズする核酸配列の全部もしくは一部を包含するか、または配列番号１〜４７２の核酸配列を包含する核酸分子に対して相同的である。
【０２４９】
本発明の融合タンパク質は、本発明のポリペプチドの少なくとも一個の断片を包含し、この断片は少なくとも６、代表的に少なくとも８、しばしば少なくとも１５、また通常少なくとも１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸長を有する。融合体に包含させる本発明のポリペプチドの断片は、有用に少なくとも２５アミノ酸長、少なくとも５０アミノ酸長であることができ、また少なくとも７５、１００アミノ酸長または１５０アミノ酸長であることさえできる。本発明のポリペプチド全体を包含する融合体は、特に有用である。
【０２５０】
本発明の融合タンパク質内に包含される非相同的ポリペプチドは、少なくとも６アミノ酸長、しばしば少なくとも８アミノ酸長、また好ましくは少なくとも１５、２０、または２５アミノ酸長である。さらに長いポリペプチド、例えばＩｇＧ Ｆｃ領域を、また完全タンパク質（例えば、ＧＦＰ発色団含有タンパク質）さえもを包含する融合体は、特に有用である。
【０２５１】
説明を、その全体を引用してここに組入れる、本発明のベクターおよび発現ベクターの説明について上記したように、本発明の融合タンパク質に包含させる非相同的ポリペプチドは有用に、組換え発現されたタンパク質の精製および／または可視化が促進されるように設計されているポリペプチドを包含することができる。例えば、Ausubelによる上記文献、１６章（１９９２年）。精製標識(tag)はまた、化学合成される融合体中に導入することができるが、化学合成は代表的に、ＨＰＬＣによる追加の精製で充分である充分な純度を提供する；しかしながら、上記可視化標識は、タンパク質が化学合成によって生成された場合でさえも、それらの有用性を保有し、またこのような包含は、本発明の融合タンパク質を本発明のポリペプチドの存在の直接的検出可能マーカーとして有用にする。
【０２５２】
上記でまた説明したように、本発明の融合タンパク質に包含させる非相同的ポリペプチドは有用に、分泌シグナルおよび／またはリーダー配列の組込みによって、組換え発現タンパク質の、原核生物宿主の細胞周辺腔または細胞外環境中への、または真核細胞の培養培地への分泌を促進する非相同的ポリペプチドを包含する。一例として、Ｈｉｓ6タグ付タンパク質は、Ｎｉアフィニティカラムで精製することができ、またＧＳＴ融合タンパク質はグルタチオンアフィニティカラムで精製することができる。同様に、ＩｇＧのＦｃドメインを包含する融合タンパク質は、プロテインＡまたはプロテインＧカラムで精製することができ、またエピトープタグ、例えばｍｙｃを含有する融合タンパク質は、抗−ｃ−ｍｙｃ抗体を含有する免疫親和性カラムを用いて精製することができる。このエピトープタグは、精製後に切断することができる酵素切断部位によって、必須遺伝子によりコードされるタンパク質から分離されていると好ましい。細胞表面上で発現させることができる融合タンパク質をコードする核酸分子に関する説明をまた、参照されたい。
【０２５３】
本発明の別の有用な融合タンパク質は、本発明のポリペプチドを酵母ツーハイブリッド系におけるベイトとして使用することを可能にする融合タンパク質を包含する。
【表６】
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を参照。代表的に、このような融合は、大腸菌（E.coli）LexAまたは酵母ＧＡＬ４ＤＮＡ結合性ドメインに対してなされる。核局限化シグナルに融合したベイトを発現する関連ベイトプラスミドを利用することができる。
【０２５４】
その他の有用な融合タンパク質は、上記されているように、ファージまたは細胞の表面にコードされたポリペプチドの表示、内在性蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）への融合、およびＩｇＧＦｃ領域への融合を可能にする融合タンパク質を包含する。
【０２５５】
本発明のポリペプチドはまた、タンパク質毒素、例えばシュードモナス外毒素Ａ、ジフテリア毒素、シガ毒素Ａ、炭疽菌毒素致死因子、リシン（ricin）へ有用に融合することができ、これにより本発明のタンパク質を結合しまたは取り込む細胞の除去を行うことができる。
【０２５６】
融合パートナーには、中でも、下記パートナーが包含される：ｍｙｃ、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ＧＳＴ、免疫グロブリン、β−ガラクトシダーゼ、ビオチンｔｒｐＥ、プロテインＡ、β−ラクタマーゼ、α−アミラーゼ、マルトース結合タンパク質、アルコールデヒドロゲナーゼ、ポリヒスチジン（例えば、当該ポリペプチドのアミノおよび／またはカルボキシル末端の６個のヒスチジン）、ｌａｃＺ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、酵母α交配因子、ＧＡＬ４転写活性化またはＤＮＡ結合ドメイン、ルシフェラーゼ、並びに血清タンパク質、例えばオボアルブミン、アルブミンおよびＩｇＧの定常ドメイン。一例として、上記Ausubel (1992)および上記Ausubel (1999)を参照。融合タンパク質はまた、特異的酵素切断にかかわる部位、例えば第ＸＩＩＩ因子、トリプシン、ペプシン、またはいずれかその他の当該技術分野で公知の酵素により認識される部位を含有することができる。上記したように、融合タンパク質は代表的に、当該技術分野で周知の技術（例えば、メリフィールド（Merrifield）合成）を用いて化学的に合成されるか、または化学架橋により生成される組換え核酸法によって形成される。
【０２５７】
融合タンパク質のもう一つの利点は、結合タンパク質またはＥＳＰに結合するその他の分子をスクリーニングするために、エピトープタグを使用して、融合タンパク質をアフィニティ結合によってプレートまたはカラムに結合させることができることにある。
【０２５８】
以下でさらに説明するように、本発明のポリペプチドは、ＥＳＰを含む本発明のポリペプチド並びにそれらの対立遺伝子変異体および相同体を特異的に認識する抗体を惹起するための特異的免疫原として容易に使用することができる。これらの抗体は次いで、中でも例えば血清などのタンパク質流体試料検出用ＥＬＩＳＡによる、組織試料中のタンパク質検出用免疫組織化学もしくはレーザー走査サイトメトリーによる、または細胞懸濁液中の細胞内タンパク質検出、例えば免疫沈降法によるものなどのＥＳＰの抗体による単離および／または精製、およびＥＳＰの特異的アゴニストまたはアンタゴニストとして使用するためのフローサイトメトリーによる、本発明のポリペプチド、特にＥＳＰにかかわるアッセイに特異的に使用することができる。
【０２５９】
ＥＳＰ、ミューテイン、相同的タンパク質または対立遺伝子変異体または本発明の融合タンパク質を包含する、本発明のポリペプチドが、当該技術分野で公知の方法によって機能するかを測定することができる。一例として、機能を保有しながら、変化に寛容である残基は、当該技術分野で公知の方法、例えばアラニンスキャニング突然変異誘発法、Cunningham et al., Science 244(4908): 1081-5 (1989)；トランスポゾンリンカースキャニング突然変異誘発法、Chen et al., Gene 263(1-2): 39-48 (2001)；相同体−およびアラニン−スキャニング突然変異誘発法の組み合わせ、Jin et al., J. Mol. Biol. 226(3): 851-65 (1992)；コンビナトリアルアラニンスキャニング法、Weiss et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 97(16): 8950-4 (2000)を使用し、公知残基でタンパク質を変更し、引続き機能アッセイすることにより、同定することができる。トランスポゾンリンカー走査キットは、市販されている（New England Biolabs, Beverly, MA, USA, カタログ番号 E7-102S; EZ::TN(登録商標) In-Frame Linker Insertion Kit, カタログ番号 EZI04KN, Epicentre Technologies Corporation, Madison, WI, USA）。
【０２６０】
本発明のポリペプチドまたは融合タンパク質の精製は周知であり、当業者の技術範囲内にある。例えば、Scopes, Protein Purification, 2d ed. (1987)を参照。組換え的に発現させたポリペプチドの精製は、上記で説明されている。化学合成されたペプチドの精製は、例えばＨＰＬＣによって容易に行うことができる。
【０２６１】
従って、本発明の単離ポリペプチドまたは融合タンパク質を、安定剤の存在または不存在下に、純粋な形態で、または実質的に純粋な形態で提供することは、本発明の１つの側面である。安定剤は、タンパク質様材料または非タンパク質様材料の両方を包含し、当該技術分野で周知である。アルブミンおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの安定剤は公知であり、また市販されている。
【０２６２】
本発明の単離ポリペプチドまたは融合タンパク質を治療剤として、例えばワクチンに、また代用治療剤として使用する場合、高レベルの純度が好適であるが、本発明による単離ポリペプチドはまた、より低い純度でも有用である。一例として、本発明による部分的に精製されたポリペプチドは、免疫原として使用することができ、これにより実験動物に抗体を産生させることができる。
【０２６３】
好適態様において、本発明の精製されたポリペプチドおよび実質的に精製されたポリペプチドは、検出可能な両性電解質、アクリルアミドモノマー、ビス−アクリルアミドモノマーおよびポリアクリルアミドを欠く組成物中にある。
【０２６４】
本発明によるポリペプチドまたは融合タンパク質は、基体に有用に結合させることができる。この基体は、多孔質または非孔質の、平坦または非平坦形態であることができ、結合は共有または非共有状態であることができる。例えば、本発明のペプチドを、アルブミンへの共有結合により安定化することができる。その内容の全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第5,876,969号を参照。
【０２６５】
例えば、本発明のポリペプチドまたは融合タンパク質は、有孔基体、慣用には、代表的にニトロセルロース、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）、またはカチオン性に誘導体化されている親水性ＰＶＤＦを包含する膜に有用に結合させることができる；このように結合された本発明のポリペプチドまたは融合タンパク質を用いて、例えば血清中の、本発明の不動化ポリペプチドまたは融合タンパク質に対して特異的に結合する抗体を検出および定量することができる。
【０２６６】
もう一つの例として、本発明のポリペプチドまたは融合タンパク質は、プラスチックなどの実質的に無孔な基体に有用に結合させることができ、これにより本発明の不動化タンパク質に対して特異的に結合する抗体、例えば血清中のものを検出および定量することができる。このようなプラスチックには、ポリメチルアクリル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリメチルメタアクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリアセタール、ポリスルホン、セルロースアセテート、セルロースナイトレート、ニトロセルロース、またはその混合物が包含される；このアッセイを標準的マイクロタイターディッシュで行う場合、このプラスチックは代表的に、ポリスチレンである。
【０２６７】
本発明のポリペプチドおよび融合タンパク質はまた、表面増強レーザー脱着イオン化源として使用するのに適する基体に結合させることもできる；このように結合された本発明のポリペプチドまたは融合タンパク質は、表面結合ポリペプチドまたは融合タンパク質に対して充分な親和性または結合活性をもって結合する二次タンパク質の結合、引続く検出に有用であって、これらの間の生物学的相互作用が示される。本発明のポリペプチドまたは融合タンパク質はまた、表面プラスモン共鳴検出法で使用するのに適する基体に結合させることができる；このように結合された本発明のポリペプチドまたは融合タンパク質は、表面結合ポリペプチドまたは融合タンパク質に対して充分な親和性または結合活性をもって結合する二次タンパク質の結合、引続く検出に有用であり、これによりこれらの間の生物学的相互作用が示される。
【０２６８】
抗体
他の側面において、本発明は、本発明の核酸分子によりコードされるポリペプチドに特異的に結合するその断片および誘導体を包含する抗体を提供する。好適態様において、これらの抗体は、ＥＳＰであるポリペプチド、またはその断片、ミューテイン、誘導体、類縁体もしくは融合タンパク質に対し特異的である。さらに好適な態様において、これらの抗体は、配列番号４７３〜６６６を包含するポリペプチド、またはその断片、ミューテイン、誘導体、類縁体もしくは融合タンパク質に対し特異的である。
【０２６９】
本発明の抗体は、そのネイティブな配座でタンパク質上に存在するか、またはいくつかの場合、例えばＳＤＳ中における可溶化によるなどして変性されたものとしてタンパク質上に存在する、線状エピトープ、不連続エピトープ、またはこのようなタンパク質もしくはタンパク質断片の立体配座エピトープに対し特異的であることができる。新規エピトープはまた、翻訳後修飾（ＰＴＭ）についての疾患の組織対正常組織の差異による場合もある。一例として、ＥＳＰの特定の部位は、癌性細胞ではグリコシル化されている場合があるが、正常細胞ではグリコシル化されている場合はなく、その逆もある。さらに、別のスプライス形態のＥＳＰは癌を示唆することができる。ＥＳＰのＣまたはＮ末端の示差的分解はまた、抗癌治療用のマーカーまたは標的であることができる。一例として、ＥＳＰは、癌細胞においてＮ末端が分解され、抗体が診断または治療用途で選択的に結合することができる新しいエピトープを暴露することができる。
【０２７０】
当該技術分野で周知のように、抗体が混合物中の分子種として識別することができる度合は、部分的に、混合物中の分子種の配座関連性に依存する；代表的に、本発明による抗体は、非ＥＳＰポリペプチドに対する偶発的な結合に対して、少なくとも２倍、さらに代表的には少なくとも５倍、典型的に１０倍、２５倍、５０倍、７５倍以上、また多くの場合、１００倍以上、また場合により、５００倍または１０００倍以上で識別するものとされる。本発明のタンパク質またはタンパク質断片の検出に使用する場合、この抗体をヒト子宮内膜に由来する試料中の本発明によるポリペプチドの存在の決定に使用することができるならば、本発明の抗体は充分に特異的である。
【０２７１】
代表的に、本発明によるタンパク質またはタンパク質断片に対する本発明の抗体（またはＩｇＭペンタマーの場合などでは抗体マルチマー）の親和性または結合活性は、少なくとも約１ｘ１０-6モル（Ｍ）、代表的に少なくとも約５ｘ１０-7Ｍ、１ｘ１０-7Ｍであり、少なくとも約１ｘ１０-8Ｍ、５ｘ１０-9Ｍ、１ｘ１０-10Ｍ、および１ｘ１０-13Ｍまでの親和性および結合活性は特別に有用である。
【０２７２】
本発明の抗体は、いずれかの鳥類、爬虫類、または哺乳動物種からの天然産生形態、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＹ、およびＩｇＡであることができる。
【０２７３】
頻度は低いが、ヒト抗体はヒトドナーまたはヒト細胞から直接採取することができる。このような場合において、本発明のポリペプチドに対する抗体は代表的に、本発明のポリペプチドによる偶発的免疫感作、例えば自己免疫性の免疫感作から生成される。このような抗体は代表的に、しかし常にではなく、ポリクローナルである。さらに、各ポリクローナル抗体は、単離し、次いでクローン化し、モノクローナルを生成することができる。
【０２７４】
ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現するトランスジェニック動物を用いてさらにしばしば得られ、このトランスジェニック動物は本発明のタンパク質免疫原により肯定的に（affirmatively）免疫感作することができる。ヒト抗体を産生することができるヒトＩｇトランスジェニックマウスおよび特定の免疫感作によるそこからのヒト抗体の産生方法は、中でも、それらの開示の全体が参照によって本明細書中に組入れられる、米国特許第6,162,963号、同第6,150,584号、同第6,114,598号、同第6,075,181号、同第5,939,598号、同第5,877,397号、同第5,874,299号、同第5,814,318号、同第5,789,650号、同第5,770,429号、同第5,661,016号、同第5,633,425号、同第5,625,126号、同第5,569,825号、同第5,545,807号、同第5,545,806号および同第5,591,669号に記載されている。このような抗体は代表的に、モノクローナルであり、代表的にマウス抗体の作製に関して開発された技術を用いて作製される。
【０２７５】
投与された抗体に対するレシピエントの免疫応答はしばしば、別種、例えばマウスから誘導された抗体の投与による場合に比較して実質的に小さいことから、本発明による抗体をインビボ診断または治療剤としてヒトに投与する場合、ヒト抗体が特に有用であり、またしばしば好適である。
【０２７６】
本発明のＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＹ、およびＩｇＡ抗体はまた、齧歯類（代表的にマウス、しかしまたラット、モルモットおよびハムスター）、ウサギ目（代表的にウサギ）などの哺乳類、およびまたさらに大型の哺乳動物、例えば、ヒツジ、ヤギ、ウシ、およびウマ；または産卵する鳥類もしくは爬虫類、例えば、ニワトリまたはワニを含む他の種から、有用に得られる。このような場合、トランスジェニックヒト抗体産生性非ヒト哺乳動物を用いると、偶発的免疫感作は不必要であり、またこの非ヒト哺乳動物は代表的に、本発明のポリペプチドを用い、標準的免疫感作方法に従い肯定的に免疫感作される。鳥類抗体の１つの形態は、２０００年５月２５日付けで公開されたＷＯ００／２９４４４に記載の技術を用いて産生させることができる。
【０２７７】
上記したように、キャリア、代表的にウシチログロブリン、キーホールリンペットヘモシアニン、またはウシ血清アルブミンなどのタンパク質に結合させる際には、その記載を参照によって本明細書に組入れる、上記のいずれかに記載されているような二官能性リンカーを都合良く使用して、本発明のポリペプチドの８個またはそれ以上の隣接アミノ酸の事実上すべての断片を免疫原として効果的に使用することができる。
【０２７８】
免疫原性はまた、本発明のポリペプチドを別の分子に融合させることによって授与することができる。例えば、本発明のポリペプチドは、分枝したポリリジンコアマトリクスに対する固相合成により生成させることができる；これらの多重抗原性ペプチド（ＭＡＰ）は、ワクチン作製において、高い純度、増大した結合活性、正確な化学的定義、および改良された安全性を提供する。Tam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5409-5413 (1988); Posnett et al., J. Biol. Chem. 263: 1719-1725 (1988)。
【０２７９】
非ヒト哺乳動物または鳥類を免疫感作するための方法は、当該技術分野で充分に確立されている。Harlow et al. (eds.), Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1998); Coligan et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc. (2001); Zola, Monoclonal Antibodies: Preparation and Use of Monoclonal Antibodies and Engineered Antibody Derivatives (Basics: From Background to Bench), Springer Verlag (2000); Gross M, Speck  J.Dtsch. Tierarztl. Wochenschr.  103: 417-422 (1996)を参照。免疫感作法はしばしば、フロイント完全アジュバントおよびフロイント不完全アジュバントなどのアジュバントを用いるか、用いない、多重免疫感作を包含し、また裸のＤＮＡによる免疫感作を包含することができる（Moss,  Semin. Immunol. 2: 317-327 (1990)）。
【０２８０】
非ヒト哺乳動物および鳥類からの抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであることができ、ポリクローナル抗体は本発明のポリペプチドの免疫組織化学的検出において或る利点を有し、モノクローナル抗体は本発明のポリペプチドの特定のエピトープの同定および識別に利点を有する。鳥類からの抗体は、ヒト血清または組織における本発明のポリペプチドの検出に特別の利点を有することがある（Vikinge et al., Biosens. Bioelectron. 13: 1257-1262 (1998)）。
【０２８１】
免疫感作後、本発明の抗体は、いずれか当該技術分野で許容される技法を用いて産生させることができる。このような技術は当該技術分野で周知であり、上記Coligan；上記Zola； Howard et al. (eds.), Basic Methods in Antibody Production and Characterization, CRC Press (2000); 上記Harlow； Davis (ed.), Monoclonal Antibody Protocols, Vol. 45, Humana Press (1995); Delves (ed.), Antibody Production: Essential Techniques, John Wiley & Son Ltd (1997);およびKenney, Antibody Solution: An Antibody Methods Manual, Chapman & Hall (1997)などの参考文献中に詳細に記載されている。
【０２８２】
要するに、このような技術は、中でも、ハイブリドーマによるモノクローナル抗体の生成および免疫グロブリン遺伝子またはその断片を発現するように操作された宿主細胞からの抗体またはその断片もしくは誘導体の発現を包含する。これら２種の生成方法は、相互に排他的ではない：本発明のポリペプチドに特異的な抗体をコードする遺伝子は、ハイブリドーマからクローン化することができ、次いで別の宿主細胞で発現させることができる。これら２種の方法を一緒に行う必要は必ずしもない：例えば、本発明のポリペプチドに特異的な抗体をコードする遺伝子は、記載を、その全体の引用によりここに組入れる、米国特許第5,627,052号にさらに記載されているように、所望のタンパク質に特異的であることが知られているＢ細胞から、または抗体ディスプレイファージから、直接にクローン化することができる。
【０２８３】
宿主細胞における組換え発現は、本発明の抗体の断片または誘導体が所望される場合、特に有用である。
完全抗体、抗体断片または抗体誘導体の組換え抗体生成用の宿主細胞は、原核生物または真核生物であることができる。
原核生物宿主は、本発明のファージディスプレイ抗体の生成に特に有用である。
【０２８４】
抗体可変領域断片を、例えば遺伝子ＩＩＩタンパク質（ｐＩＩＩ）または遺伝子ＶＩＩＩタンパク質（ｐＶＩＩＩ）に融合させて、Ｍ１３などの線状ファージの表面上に表示させるファージディスプレイ抗体技法は、現時点で充分に確立されている。例えば、
【表７】
2005521385.tif 000008
を参照。最近になって、このようなライブラリーからの抗体断片の産生、増殖、選別（pan）、および使用に要する技術および方法は承認されている。例えば：上記Barbas (2001)；上記Kay；および上記Abelsonを参照。
【０２８５】
代表的に、ファージディスプレイ抗体断片は、ｓｃＦｖ断片またはＦａｂ断片であり；所望により、ディスプレイファージから完全抗体への可変領域のクローン化および追加の原核生物または真核生物宿主細胞における充分な長さを有する抗体の発現により、完全な長さの抗体を生成させることができる。真核細胞はまた、本発明による抗体、抗体断片および抗体誘導体の発現に有用である。例えば、本発明の抗体断片は、ピチア パストリス（Pichia pastoris）およびサッカロマイセス セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）で生成させることができる。例えば、
【表８】
2005521385.tif 000009
を参照。
【０２８６】
抗体断片および誘導体を包含する本発明の抗体は、昆虫細胞で生成させることもできる。例えば、
【表９】
2005521385.tif 000010
を参照。
【０２８７】
本発明の抗体、並びにその断片および誘導体はまた、植物細胞、特にトウモロコシまたはタバコにおいて産生させることもできる。
【表１０】
2005521385.tif 000011
【０２８８】
抗体断片および誘導体を包含する本発明の抗体は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物ミルク中に産生させることもできる。例えば、
【表１１】
2005521385.tif 000012
を参照。
【０２８９】
本発明の抗体、抗体断片および抗体誘導体の組換え発現に有用な哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞および骨髄腫細胞を包含する。Verma et al., J. Immunol. Methods 216(1-2):165-81 (1998)には、抗体の発現にかかわる細菌、酵母、昆虫および哺乳動物発現系を発表し、比較している。本発明の抗体はまた、Merk et al., J. Biochem. (Tokyo) 125(2): 328-33 (1999)およびRyabova et al., Nature Biotechnol. 15(1): 79-84 (1997)にさらに説明されているように、無細胞翻訳によって生成させることもでき、またPollock et al., J. Immunol. Methods 231(1-2): 147-57 (1999)にさらに説明されているように、トランスジェニック動物のミルク中に生成させることもできる。
【０２９０】
本発明はさらに、１種もしくは２種以上の本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体断片、本発明の単離核酸分子によりコードされた１種もしくは２種以上のポリペプチドに特異的に結合する抗体断片、あるいはその結合を１種もしくは２種以上の本発明のポリペプチドにより、または本発明の単離核酸によりコードされる１種もしくは２種以上のポリペプチドにより競合的に阻害することができる抗体断片を提供する。このような有用な断片の中には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ）’2および単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片がある。その他有用な断片は、Hudson, Curr. Opin. Biotechnol. 9(4): 395-402 (1998)に記載されている。
【０２９１】
本発明はまた、１種もしくは２種以上の本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体誘導体、本発明の単離核酸分子によりコードされる１種もしくは２種以上のポリペプチドに特異的に結合する抗体誘導体、あるいはその結合を１種もしくは２種以上の本発明のポリペプチドにより、または本発明の単離核酸分子によりコードされる１種または２種以上のポリペプチドにより競合的に阻害することができる抗体誘導体に関する。
【０２９２】
このような有用な誘導体の中には、キメラ、霊長類化、およびヒト化抗体があり；このような誘導体はヒトにおいては免疫原性に乏しく、従って非ヒト哺乳動物種からの未修飾抗体に比較して、インビボ投与に適している。他の有用な方法は、抗体の血清半減期を増大させるためのＰＥＧ化である。
【０２９３】
キメラ抗体は代表的に、１種の動物、代表的にヒトの定常領域に融合された別の１種の動物、代表的にマウスの免疫グロブリンの重鎖および／または軽鎖可変領域（ＣＤＲおよびフレームワーク残部（residues）を共に包含する）を含有する。例えば、記載を、全体の参照によりここに組入れる、
【表１２】
2005521385.tif 000013
および米国特許第5,807,715号を参照。霊長類化およびヒト化抗体は代表的に、非ヒト霊長類またはヒト抗体のＶ領域フレームワーク中にグラフトされたマウス抗体からの重鎖および／または軽鎖ＣＤＲを包含し、通常ヒト定常領域をさらに包含する。開示全体を参照によりここに組入れる、
【表１３】
2005521385.tif 000014
。本発明によるもう１種の有用な抗体誘導体は、ヘテロマー状抗体複合体および抗体融合体、例えばダイアボディ（二重特異性抗体）、単鎖ダイアボディ、およびイントラボディ（intrabodies）を包含する。
【０２９４】
本発明の抗体をコードする核酸は、本発明の抗体のクローン化または発現用の組換えベクターを形成する別の核酸に作動可能に結合させることができるものと考えられる。従って、本発明は、真核生物の形質導入用であるか、トランスフェクション用であるかまたは遺伝子治療用であるかに関係なく、コード配列またはその一部を含有する全部の組換えベクターを包含する。このようなベクターは、当業者に公知である慣用の分子生物学的技術を用いて調製することができ、フレームワークおよびＣＤＲまたはその一部を包含する免疫グロブリンＶ−領域用のＤＮＡコード配列、並びに細胞内移送用のシグナル配列を伴うか、または伴わない適当なプロモーターを含有することができる。このようなベクターは、当業者に公知である慣用の技術によって真核細胞中に形質導入することができ、もしくはトランスフェクションすることができるかまたは、遺伝子治療に用いることができる（Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 90: 7889-7893 (1993); Duan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 91: 5075-5079 (1994)）。
【０２９５】
その断片および誘導体を包含する本発明による抗体は、有用に標識することができる。従って、本発明のもう一つの側面は、１種もしくは２種以上の本発明のポリペプチドに特異的に結合する標識した抗体、本発明の単離核酸分子によりコードされる１種もしくは２種以上のポリペプチドに特異的に結合する標識した抗体、あるいはその結合を１種もしくは２種以上の本発明のポリペプチドにより、または本発明の単離核酸分子によりコードされる１種もしくは２種以上のポリペプチドにより競合的に阻害することができる標識した抗体を提供することにある。標識の選択は、部分的に、所望の用途に依存する。
【０２９６】
例えば、本発明の抗体を組織試料の免疫組織化学染色に用いる場合、この標識は有用に、検出可能な生成物の生成および局所的沈着を触媒する酵素であることができる。代表的に抗体に結合し、それらの免疫組織化学的可視化を可能にする酵素は周知であり、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）およびウレアーゼを包含する。目視で検出できる生成物の生成および沈着用の代表的基質は、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）；ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）；ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）；ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＰＮＰＧ）；３’，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）；３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）；４−クロロ−１−ナフトール（ＣＮ）；５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート（ＢＣＩＰ）；ＡＢＴＳ（登録商標）；ＢｌｕｏＧａｌ；ヨードニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）；ニトロブルーテトラゾリウムクロライド（ＮＢＴ）；フェナジンメソサルフェート（ＰＭＳ）；フェノールフタレインモノホスフェート（ＰＭＰ）；テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）；テトラニトロブルーテトラゾリウム（ＴＮＢＴ）；Ｘ−Ｇａｌ；Ｘ−Ｇｌｕｃ；およびＸ−グルコシドを包含する。
【０２９７】
別種の基質を用いて、発光性である局所沈着生成物を生成させることができる。一例として、過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の存在により、環状ジアシルヒドラジド化合物、例えばルミノールの酸化を触媒させることができる。この酸化の直後、ルミノールは励起状態（中間反応生成物）であり、光を放射することによって基底状態に減衰する。光放射の強力な増強は、増強剤、例えばフェノール系化合物によってもたらされる。利点には、放射線を用いることなく、また少量のみの抗体を要して、高感度、高解像力、および迅速な検出が得られることが包含される。例えば、Thorpe et al., Methods Enzymol. 133: 331-53 (1986); Kricka et al., J. Immunoassay 17(1): 67-83 (1996);およびLundqvist et al., J. Biolumin. Chemilumin. 10(6): 353-9 (1995)を参照。このような強化化学発光検出（ＥＣＬ）用キットは市販されている。抗体はまた、コロイド状金を用いて標識することができる。
【０２９８】
もう一つの例として、本発明の抗体を、例えばフローサイトメトリーによる検出、走査型レーザーサイトメトリーによる検出、または蛍光イムノアッセイに使用する場合、これらはフルオロフォアにより標識すると有用であることができる。本発明の抗体に有用に結合させることができる広く種々のフルオロフォア標識が存在する。フローサイトメトリー用途の場合、細胞外検出用および細胞内検出用の両方において、共通して有用なフルオロフォアは、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）、ぺリジニンクロロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ）、テキサスレッド（Texas Red）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、蛍光共鳴エネルギータンデムフルオロフォア、例えば、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＰＥ−Ｃｙ５、ＰＥ−Ｃｙ５．５、ＰＥ−Ｃｙ７、ＰＥ−テキサスレッド、およびＡＰＣ−Ｃｙ７であることができる。
【０２９９】
別種のフルオロフォアは、中でも、アレクサフルオール（登録商標）３５０、アレクサフルオール（登録商標）４８８、アレクサフルオール（登録商標）５３２、アレクサフルオール（登録商標）５４６、アレクサフルオール（登録商標）５６８、アレクサフルオール（登録商標）５９４、アレクサフルオール（登録商標）６４７（Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR,USAから入手することができるモノクローナル抗体標識キット）；ＢＯＤＩＰＹ染料、例えばＢＯＤＩＰＹ ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５、カスケードブルー、カスケードイエロー、ダンシル、リッサミンローダミンＢ（lissamine rhodamine B）、マリナブルー、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５１４、パシフィックブルー、ローダミン６Ｇ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、テトラメチルローダミン、テキサスレッド（Molecular Probes, Inc. Eugene, OR, USAから入手することができる）、およびＣｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７を包含し、これら全部がまた、本発明の抗体の蛍光標識に有用である。標識したアビジン、ストレプトアビジン、カプトアピジンまたはニュートラアビジンを用いる二次検出の場合、本発明の抗体はビオチンにより有用に標識することができる。
【０３００】
本発明による抗体を、例えばウエスタンブロット用途に用いる場合、これらは放射性同位元素、例えば33Ｐ、32Ｐ、35Ｓ、3Ｈ、および125Ｉにより有用に標識することができる。別の例として、本発明による抗体を放射性免疫治療に用いる場合、この標識は有用には、
【表１４】
2005521385.tif 000015
であることができる。
【０３０１】
もう一つの例として、本発明の抗体をインビボ診断用途に用いる場合、これらはＭＲＩ造影剤、例えばガドリニウムジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）に結合させることによって（Lauffer et al., Radiology 207(2): 529-38 (1998)）、または放射性同位元素標識することによって検出可能にすることができる。
理解されるように、上記標識の使用は、その用途が記載された用途に制限されない。
【０３０２】
その断片および誘導体を包含する本発明による抗体はまた、毒素に結合させることができ、これにより本発明によるポリペプチドを表示および／または発現する細胞に対して毒素の除去作用を標的化することができる。通常、このようなイムノトキシンにおける抗体は、シュードモナス外毒素Ａ、ジフテリア毒素、シガ毒素Ａ、炭疽菌毒素致死因子、またはリシンに結合させる。Hall (ed.), Immunotoxin Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, vol. 166), Humana Press (2000);およびFrankel et al. (eds.), Clinical Applications of Immunotoxins, Springer-Verlag (1998)を参照。
【０３０３】
本発明による抗体は、基体に有用に結合させることができ、従って本発明のもう一つの側面は、基体に結合されている１種もしくは２種以上の本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体、本発明の単離核酸分子によりコードされる１種もしくは２種以上のポリペプチドに特異的に結合する抗体、あるいはその結合を１種もしくは２種以上の本発明のポリペプチドにより、または本発明の単離核酸分子によりコードされる１種もしくは２種以上のポリペプチドにより競合的に阻害することができる抗体を提供することにある。基体は、多孔質または非多孔質で平坦または非平坦であることができる。例えば、本発明による抗体は、濾過媒体、例えば免疫親和性クロマトグラフィー目的用のＮＨＳ−活性セファロースまたはＣＮＢｒ−活性化セファロースに有用に結合させることができる。例えば、本発明による抗体は、代表的にビオチン−ストレプトアビジン相互反応によって、常磁性ミクロスフェアに有用に結合させることができ、このミクロスフェアは次いで、本発明のポリペプチドを発現または表示する細胞の単離に使用することができる。もう一つの例において、本発明の抗体は、ＥＬＩＳＡ用のマイクロタイタープレートの表面上に有用に結合させることができる。
【０３０４】
上記したように、本発明による抗体は原核生物および真核生物細胞で産生することができる。従って、本発明のもう一つの側面において、本発明による抗体を発現する細胞を提供し、これら細胞にはハイブリドーマ細胞、Ｂ細胞、形質細胞、および本発明による抗体を発現させるために組換えにより修飾された宿主細胞が包含される。
【０３０５】
尚他の側面において、本発明は、１種もしくは２種以上の本発明のＥＳＰに特異的に結合するか、または本発明のＥＳＮＡによりコードされるポリペプチドに特異的に結合するように進化させたアプタマーを提供する。
【０３０６】
要約すると、本発明の教示が提供されることによって、当業者は本発明による抗体の生物学的性質の変更に使用することができ、所定の抗体分子の安定性もしくは半減期、免疫原性、毒性、親和性もしくは収率を増加または減少させる方法を含む、種々の方法、または特定の用途にさらに適するようにすることができるいずれか別の方法によってそれを変更する方法を入手することができる。
【０３０７】
トランスジェニック動物および細胞
他の側面では、本発明は、本発明の核酸分子を含むトランスジェニック細胞および非ヒト生物を提供する。好ましい態様では、トランスジェニック細胞および非ヒト生物は、ＥＳＰをコードする核酸分子を含む。好ましい態様では、ＥＳＰは配列番号４７３〜６６６から選択されるアミノ酸配列、またはその断片、ミューテイン、相同タンパク質もしくは対立遺伝子変異体を含む。他の好ましい態様では、トランスジェニック細胞および非ヒト生物は、本発明のＥＳＮＡ、好ましくは配列番号１〜４７２からなる群から選択されるヌクレオチド配列、またはその部分、実質的に類似の核酸分子、対立遺伝子変異体もしくはハイブリダイズする核酸分子を含む、ＥＳＮＡを含む。
【０３０８】
他の態様では、トランスジェニック細胞および非ヒト生物は、ヒトＥＳＧの内在性オーソログの標的化された破壊または置換を有する。トランスジェニック細胞は、胚性幹細胞または体細胞であることができる。トランスジェニック非ヒト生物は、キメラ、非キメラへテロ接合体、および非キメラホモ接合体であることができる。トランスジェニック動物を作製する方法は、当該技術分野でよく知られている。例えば、
【表１５】
2005521385.tif 000016
を参照。
【０３０９】
本発明の核酸分子を動物に導入して、トランスジェニック動物の創始系統を作製するために、当該技術分野で知られている任意の技術を用いることができる。かかる技法としては、前核（pronuclear）マイクロインジェクション（例えば全体を参照によって本明細書中に組み込む、
【表１６】
2005521385.tif 000017
を参照）；生殖系列、胚盤胞または胚中へのレトロウイルス媒介遺伝子移入（例えば、Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82: 6148-6152 (1985)を参照）；胚性幹細胞における遺伝子ターゲティング（例えば、Thompson et al., Cell 56: 313-321 (1989)を参照）；細胞または胚のエレクトロポレーション（例えば、Lo, 1983, Mol. Cell. Biol. 3: 1803-1814 (1983)を参照）；遺伝子銃を用いた導入（例えば、Ulmer et al., Science 259: 1745 (1993)を参照）；胚性多能性幹細胞への核酸構築物の導入および胚盤胞への幹細胞の移し戻し；および精子媒介性遺伝子移入（例えば、Lavitrano et al., Cell 57: 717-723 (1989)を参照）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３１０】
他の技術としては、例えば、静止状態にした培養胚、胎児または成人細胞からの核の、除核卵母細胞への核移入が挙げられる（例えば、Campell et al., Nature 380: 64-66 (1996); Wilmut et al., Nature 385: 810-813 (1997)を参照)。本発明は、そのすべての細胞に導入遺伝子（即ち、本発明の核酸分子）を持つトランスジェニック動物、並びに、その細胞のすべてではないが、いくつかに移入遺伝子を持つ動物、即ちモザイク動物またはキメラ動物を提供する。
【０３１１】
導入遺伝子は、単一の導入遺伝子として、または、コンカテマー状、例えば頭−頭タンデムまたは頭−尾タンデム状に、複数のコピーとして組込むことができる。導入遺伝子はまた、例えばLasko et al. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6232-6236 (1992)の教示にしたがい、特定の細胞タイプに選択的に導入し、活性化させることができる。かかる細胞タイプ特異的な活性化に必要な調節配列は、対象となる特定の細胞タイプに依存し、それは当業者には明らかであろう。
【０３１２】
トランスジェニック動物が一旦創出されれば、組換え遺伝子の発現は、標準的な技法を利用してアッセイされ得る。初期スクリーニングは、導入遺伝子の組み込みが起ったことを確認すべく動物組織を分析するために、サザンブロット分析またはＰＣＲ技法により達成され得る。トランスジェニック動物の組織における導入遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルはまた、動物から得られた組織試料のノーザンブロット分析、インサイチュハイブリダイゼーション分析、および逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）が含まれるが、これらに限定されない技法を用いて評価してもよい。トランスジェニック遺伝子発現組織の試料はまた、導入遺伝子産物に特異的な抗体を用いて、免疫細胞化学的に、または免疫組織化学的に評価してもよい。
【０３１３】
創始動物が一旦作製されれば、それらを、繁殖、同系交配、異系交配、または交雑させて、特定の動物コロニーを作製してもよい。かかる繁殖戦略の例としては、別個の系統を樹立するために、１つよりも多い組み込み部位を有する創始動物を異系交配すること；各導入遺伝子の付加的発現の効果が理由で、高いレベルで導入遺伝子を発現する複合遺伝子導入をもたらすために、別個の系統を同系交配させること；発現を増大させ、かつＤＮＡ分析による動物のスクリーニングの必要性をなくすために、所定の組み込み部位に関してホモ接合性の動物を生産するために、ヘテロ接合性のトランスジェニック動物を交雑させること；複合へテロ接合性またはホモ接合性系統を生産するために、別個のホモ接合性系統を交雑させること；および対象となる実験モデルに適切な、明瞭なバックグラウンドに導入遺伝子を配置させるために繁殖させることが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３１４】
本発明のトランスジェニック動物は、本発明のポリペプチドの生物機能を説明し、異常発現に関連した症状および／または疾患を研究し、かかる症状および／または疾患を改善するのに効果的な化合物をスクリーニングするのに有用な動物モデル系を含むが、これに限定されない用途を有する。
【０３１５】
トランスジェニック動物を標的遺伝子の破壊によって創出する方法も、当該技術分野でよく知られている。一般的に、内在性標的遺伝子に相同ないくつかのヌクレオチド配列を含むようにベクターを設計する。ベクターを細胞に導入し、それが、染色体の配列との相同組換えを介して、内在性遺伝子に組込まれ、それによって内在性遺伝子の機能を破壊できるようにする。導入遺伝子はまた、特定の細胞タイプに選択的に導入することができ、こうしてこの細胞タイプでのみ、内在性遺伝子が不活性化される。例えば、Gu et al., Science 265: 103-106 (1994)を参照。かかる細胞タイプ特異的な不活性化に必要な調節配列は、対象となる特定の細胞タイプに依存しており、当業者には明らかだろう。例えば、Smithies et al., Nature 317: 230-234 (1985)、Thomas et al., Cell 51: 503-512 (1987)、Thompson et al., Cell 5: 313-321 (1989)を参照。
【０３１６】
１つの態様では、選択マーカーおよび／またはネガティブ選択マーカーを用いて、または用いずに、内在性核酸配列（遺伝子のコード領域または調節領域のいずれか）に相同的なＤＮＡに隣接した突然変異体である本発明の非機能性核酸分子（または完全に非関連のＤＮＡ配列）を使用して、インビボで本発明のポリペプチドを発現する細胞をトランスフェクトすることができる。別の態様では、当該技術分野にて既知の技法を用いて、対象となる遺伝子を含有するが、発現はしない細胞におけるノックアウトを創出する。標的相同組換えを介したＤＮＡ構築物の挿入は、結果として標的遺伝子の不活性化を招く。かかるアプローチは、研究および農業の分野に特に適しており、そこで胚性幹細胞の改変を用いて、不活性な標的遺伝子を有する動物の子孫を創出することができる。例えば、Thomas、上記およびThompson、上記を参照。しかしながら、組換えＤＮＡ構築物が、当業者には明らかであろう適切なウイルスベクターを用いて、必要とされる部位にインビボで直接的に投与されるか、または標的化されるという条件で、このアプローチは、ヒトにおける使用にルーチンで適合され得る。
【０３１７】
本発明のさらなる態様では、本発明のポリペプチドを発現するように遺伝子操作された細胞、または、あるいはまた本発明のポリペプチドを発現しないように遺伝子操作された（例えば、ノックアウト）細胞は、患者にインビボで投与される。かかる細胞は、動物、もしくは患者、またはＭＨＣ適合ドナーから得てもよく、線維芽細胞、骨髄細胞、血液細胞（例えば、リンパ球）、脂肪細胞、筋細胞、内皮細胞などを含むことができるが、これらに限定されない。細胞は、組換えＤＮＡ技法を用いて、インビトロで遺伝子操作されて、細胞に本発明のポリペプチドのコード配列を導入するか、あるいは例えば形質導入（ウイルスベクター、および好ましくは細胞ゲノムに導入遺伝子を組み込むベクターを用いて）、またはプラスミド、コスミド、ＹＡＣ、裸のＤＮＡ、エレクトロポレーション、リポソーム等の使用を含むが、これらに限定されないトランスフェクション手法により、本発明のポリペプチドに関するコード配列および／または内在性調節配列を崩壊させる。
【０３１８】
本発明のポリペプチドのコード配列は、強力な構成型もしくは誘導型プロモーターまたはプロモーター／エンハンサーの制御下に置くことにより、本発明のポリペプチドの発現および好ましくは分泌を達成することができる。本発明のポリペプチドを発現および好ましくは分泌する操作細胞を全身的に、例えば、循環中、または腹腔内にて患者に導入することができる。
【０３１９】
あるいはまた、細胞をマトリックス中に組み込み、体内へ移植することができ、例えば、遺伝子操作した線維芽細胞を、皮膚移植片の一部として移植することができ；遺伝子操作した内皮細胞を、リンパ管または血管移植片の一部として移植することができる。例えば、各々その全体が参照により本明細書に組込まれる米国特許第5,399,349号および第5,460,959号を参照。
【０３２０】
投与されるべき細胞が非自系または非ＭＨＣ適合細胞である場合、それらは、導入細胞に対する宿主免疫応答の発生を防ぐ既知の技法を用いて、投与され得る。例えば、細胞は、直に接している細胞外環境との構成成分の交換が可能だが、導入細胞が宿主免疫系により認識されることが不可能なカプセル化形態で導入されてもよい。
【０３２１】
本発明のトランスジェニックおよび「ノックアウト」動物は、本発明のポリペプチドの生物機能を説明し、異常な発現に関連した症状および／または疾患を研究し、かかる症状および／または疾患を改善するのに効果的な化合物をスクリーニングするのに有用な動物モデル系を含むが、これらに限定されない用途を有する。
【０３２２】
コンピュータ可読な手段
本発明のもう一つの側面は、本発明の核酸およびアミノ酸配列を保存するためのコンピュータ可読な手段である。好適態様において、本発明は、本明細書に記載されている配列番号４７３〜６６６および配列番号１〜４７２を一組の完全配列またはいずれかの組合せ配列として保存するためのコンピュータ可読な手段を提供する。このコンピュータ可読な手段の記録は、読取りおよび表示のため、並びに、或る基準に適合するデータ、配列の比較、一組の基準に適合する配列の整列または順序などにかかわるクエリーに対するデータのロケーションを可能にするプログラムを適用するためのコンピュータシステムに接続させるためにアクセスすることができる。
【０３２３】
本発明の核酸およびアミノ酸配列は、検索分析に有用であるデータベースにおける、また配列分析アルゴリズムにおける構成要素として特に有用である。ここで用いられている「本発明の核酸配列」および「本発明のアミノ酸配列」の用語は、コンピュータ可読な形態に縮小されるか、もしくは縮小することができるか、または保存することができる、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドのいずれかの検出可能な化学的または物理的特徴を意味する。これらに制限されないものとして、これらにはクロマトグラフィー走査データまたはピークデータ、写真データまたはそこからの走査データ、および質量分析のデータが包含される。
【０３２４】
本発明は、本発明による配列がそこに保存されているコンピュータ可読な媒体を提供する。コンピュータ可読な媒体は、１種または２種以上の下記のものを包含することができる：本発明の核酸配列の配列を包含する核酸配列；本発明のアミノ酸配列を包含するアミノ酸配列；少なくとも一つの上記配列が本発明の核酸配列の配列を包含する一組の核酸配列；少なくとも一つの上記配列が本発明のアミノ酸配列の配列を包含する一組のアミノ酸配列；１種または２種以上の本発明による核酸配列の配列を包含する核酸配列を表す一組のデータ；本発明のアミノ酸配列の配列を包含するアミノ酸配列をコードする核酸配列を表す一組のデータ；少なくとも一つの上記配列が本発明の核酸配列の配列を包含する一組の核酸配列；少なくとも一つの上記配列が本発明のアミノ酸配列の配列を包含する一組のアミノ酸配列；本発明の核酸配列の配列を包含する核酸配列を表す一組のデータ；本発明のアミノ酸配列の配列を包含するアミノ酸配列をコードする核酸配列を表す一組のデータ。コンピュータ可読な媒体は、情報またはデータの保存に用いられるいずれかの合成物であることができ、例えば市販のフロッピー(登録商標)ディスク、テープ、ハードドライブ、コンパクトディスクおよびビデオディスクを包含する。
【０３２５】
本発明によりまた、文字配列、特に遺伝子配列の分析方法が提供される。好適な配列分析方法は、例えば配列相同性分析、例えば、同一性および類似性の分析、ＲＮＡ構造分析、配列のアセンブリ、分岐論的分析、配列モチーフ分析、オープンリーディングフレーム決定、核酸塩基の呼び出し、およびシークエンシングクロマトグラムピーク分析の方法を包含する。
【０３２６】
コンピューターベースの方法は、核酸配列の同一性または類似性の特定を行うために提供する。この方法は、コンピュータ可読な媒体において本発明の核酸の配列を包含する核酸配列を用意する工程；およびこの核酸配列を少なくとも１種の核酸またはアミノ酸配列と比較して、配列同一性または類似性を確定する工程；を包含する。
【０３２７】
コンピューターベースの方法はまた、アミノ酸相同性の同定を行うために提供し、この方法は、コンピュータ可読な媒体において本発明のアミノ酸の配列を包含するアミノ酸配列を用意する工程；およびこのアミノ酸配列を少なくとも１種の核酸またはアミノ酸配列と比較して、相同性を確定する工程；を包含する。
【０３２８】
コンピューターベースの方法はさらにまた、単一核酸配列中に核酸配列を重複させるアセンブリのために提供する。この方法は、コンピュータ可読な媒体において本発明の核酸の配列を包含する第一の核酸配列を用意する工程；およびこの第一の核酸配列と第二の核酸配列との間の少なくとも一つの重複領域についてスクリーニングする工程；を包含する。さらに、本発明は、核酸またはタンパク質のいずれかに関連する発現のパターンを、コンピュータベースの方法において用いて、疾患を診断する方法を含む。
【０３２９】
子宮体癌の診断方法
本発明はまた、癌の定量的および定性的診断アッセイ方法、並びに、子宮体癌を有するか、もしくは有する恐れがあるヒト患者における、または子宮体癌を発病するリスクを有する患者におけるＥＳＮＡまたはＥＳＰの発現と、正常ヒト対照におけるＥＳＮＡまたはＥＳＰの発現とを比較することによって、癌を検出、診断、モニタリング、病期分類および予見する方法に関する。本発明の目的に関して、「ＥＳＮＡの発現」または「ＥＳＮＡ発現」は、細胞、組織、臓器または患者全体中の、当該技術分野で公知のいずれかの方法により測定することができるＥＳＮＡｍＲＮＡの量または当該技術分野で公知のいずれかの方法により測定することができる転写のレベルを意味する。同様に、「ＥＳＰの発現」または「ＥＳＰ発現」の用語は、当該技術分野で公知のいずれかの方法により測定することができるＥＳＰの量または当該技術分野で公知のいずれかの方法により測定することができるＥＳＮＡの翻訳のレベルを意味する。
【０３３０】
本発明は、患者における子宮体癌の診断方法を提供し、この方法は、細胞、組織、臓器または体液中のＥＳＮＡまたはＥＳＰレベルの変化について、好ましくは同一タイプの正常ヒト対照の細胞、組織、臓器または体液中のＥＳＮＡまたはＥＳＰのレベルと比較することによって分析する方法を提供し、この方法において、或る場合において患者におけるＥＳＮＡまたはＥＳＰのレベル対正常ヒト対照の増加または減少は、子宮体癌の存在に関連するか、または疾患の好発性に関連する。もう一つの好適態様において、本発明は、正常対照からのｍＲＮＡに比較したＥＳＧのｍＲＮＡの構造における変化を分析することによる患者における子宮体癌の診断方法を提供する。これらの変化には、これらに制限されないものとして、異常スプライシング、ポリアデニル化における変化および／または５’ヌクレオチドキャッピングにおける変化が包含される。さらにもう一つの好適態様において、本発明はＥＳＰの変化を正常患者からのＥＳＰに比較して分析することによる患者の子宮体癌の診断方法を提供する。これらの変化には、例えばＥＳＰのグリコシル化および／またはリン酸化などの翻訳後修飾、または細胞内のＥＳＰ局在化の変化を含む変化が包含される。
【０３３１】
本発明の目的のために、診断は、ＥＳＮＡまたはＥＳＰレベルを用いて、患者における疾患の存在または不存在を決定することを意味する。当業者に理解されるように、他の診断パラメーターの測定は、疾患についての適切な処置の決定的な診断または決定に必要であり得る。決定は、臨床家、医師、試験実験室、または、ＯＴＣ検査を利用した患者が実施することができる。患者は、疾患の症候を有することができるか、または無症候性であることができる。さらに、本発明のＥＳＮＡまたはＥＳＰレベルを、スクリーニングマーカーとして用いて、さらなる試験または生検が必要かどうかを決定することができる。さらに、ＥＳＮＡまたはＥＳＰレベルを用いて、疾患に対する脆弱性または感受性を決定することができる。
【０３３２】
好適態様において、ＥＳＮＡの発現は、配列番号４７３〜６６６から選択されるアミノ酸配列、その相同体、対立遺伝子変異体または断片をコードするｍＲＮＡの量を決定することにより測定される。さらに好適な態様において、測定されるＥＳＮＡ発現は、配列番号１〜４７２、またはそのハイブリダイズする核酸、相同的核酸もしくは対立遺伝子変異体、またはこれらの核酸分子のいずれかの一部から選択されるＥＳＮＡｍＲＮＡの発現レベルである。ＥＳＮＡ発現は、当該技術分野で公知のいずれかの方法、例えば上述の方法によって測定することができ、このような方法にはノーザンブロットによるｍＲＮＡ発現の測定、定量的または定性的逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、マイクロアレイ法、ドットブロットもしくはスロットブロット法、またはインサイチュハイブリダイゼーション法が包含される。
【０３３３】
例えば、上記Ausubel(1992)；上記Ausubel(1999)；上記Sambrook(1989)；および上記Sambrook(2001)を参照。ＥＳＮＡ転写は、対象となるＥＳＧのプロモーターに接続されたレセプター遺伝子を用いるか、または核ラン−オフアッセイを行う方法を包含する当該技術分野で公知のいずれかの方法により測定することができる。ｍＲＮＡ構造の変化、例えば異常スプライシング変異体は、当業者に公知のいずれかの方法により測定することができ、このような方法にはＲＴ−ＰＣＲ、引続くシークエンシング分析または制限分析が包含される。必要に応じて、ＥＳＮＡ発現は、公知対照、例えば正常子宮内膜核酸と比較して、発現の変化を検出することができる。
【０３３４】
もう一つの好適態様において、ＥＳＰの発現は、配列番号４７３〜６６６、その相同体、対立遺伝子変異体または断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＥＳＰのレベルを決定することによって測定される。このようなレベルは好ましくは、正常および異常レベルの決定を包含し、少なくとも１種の細胞、組織、臓器および／または体液で決定する。即ち、一例として、正常対照の体液、細胞または組織試料に比較したＥＳＮＡまたはＥＳＰの過剰または過少発現を診断する本発明による診断アッセイは、子宮体癌の存在の診断に使用することができる。ＥＳＰの発現レベルは、当該技術分野で公知のいずれかの方法、例えば上記記載の方法により決定することができる。
【０３３５】
好適態様において、ＥＳＰ発現レベルは、ラジオイムノアッセイ、競合−結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング、ＦＡＣＳ、免疫組織化学法、免疫沈降法、プロテオミクス手法：二次元ゲル電気泳動（２Ｄ電気泳動）および無ゲルベースの手法、例えば質量分析またはタンパク質相互作用プロファイリングにより決定することができる。例えば、上記Harlow(1999)；上記Ausubel(1992)；および上記Ausubel(1999)を参照。ＥＳＰ構造における変化は、当該技術分野で公知のいずれかの方法により測定することができ、このような方法は、例えばホスホセリン、ホスホスレオニンまたはホスホチロシン残基を特異的に認識する抗体を使用する方法、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２Ｄ  ＰＡＧＥ）を使用する方法および／またはタンパク質のアミノ酸残基を化学的に分析する方法を包含する。同上。
【０３３６】
好適態様において、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）またはＥＬＩＳＡが用いられる。ＥＳＰに特異的な抗体は、これがすでに利用できる状態にない場合には調製する。好適態様において、この抗体はモノクローナル抗体である。抗−ＥＳＰ抗体を固体支持体に結合させ、次いでこの固体支持体上のいずれかの遊離タンパク質結合部位をタンパク質、例えばウシ血清アルブミンによりブロッキングする。ＥＳＰが抗−ＥＳＰ抗体に結合する条件下に、この固体支持体上で抗体とともに対象となる試料をインキュベートする。試料を取り除き、この固体支持体を洗浄して、未結合物質を除去し、次いでこの固体支持体に検出可能な試薬（ＲＩＡの場合、放射活性物質、またＥＬＩＳＡの場合、酵素）に結合されている抗−ＥＳＰ抗体を添加し、次いで標識した抗体に対するＥＳＰの結合が生じる条件下にインキュベートする。結合後、未結合の標識した抗体を、洗浄により除去する。ＥＬＩＳＡの場合、１種または２種以上の基質を添加して、試料中のＥＳＰの量に基づく着色した反応生成物を生成させる。ＲＩＡの場合、この固体支持体を当該技術分野で公知のいずれかの方法により放射能減衰シグナルについて計量する。ＲＩＡおよびＥＬＩＳＡの両方にかかわる定量的結果は代表的に、標準曲線を参照して得られる。
【０３３７】
ＥＳＰレベルの別の測定方法は当該技術分野で公知である。一例として、競合アッセイを用いることができ、この方法では、抗ＥＳＰ抗体を固体支持体に結合させ、この固体支持体とともに割当てられた量の標識されたＥＳＰおよび対象となる試料をインキュベートする。固体支持体に結合された標識したＥＳＰの量は、試料中のＥＳＰの量と相関させることができる。
【０３３８】
プロテオミクス手法の中で、２Ｄ ＰＡＧＥは周知の技術である。血清などの試料からの各タンパク質の単離は、等電点および分子量によるタンパク質の順次的分離を用いて達成される。代表的に、ポリペプチドが等電点により先ず分離され（第一次元）、次いで電流を用いてサイズにより分離される（第二次元）。一般に、第二次元分離は第一次元分離に対して直角である。相違する配列を有する２種のタンパク質のいずれも、サイズおよび電荷の両方に基づき同一ではないことから、２Ｄ ＰＡＧＥの結果は、各タンパク質が特別のスポットを占有する略矩形のゲルである。化学的もしくは抗体プローブによるスポットの分析、または引続くタンパク質マイクロシークエンシングは、所定のタンパク質の相対的存在量および試料中のタンパク質の同一性を明らかにすることができる。
【０３３９】
ＥＳＮＡの発現レベルは、当該技術分野で公知のいずれかの方法により決定することができ、かかる方法には、ＰＣＲおよびその他の核酸法、例えば診断および種々の悪性腫瘍のモニタリングのための悪性細胞の検出に使用することができるリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）および核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）が包含される。例えば、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）は、数千の別種のｍＲＮＡ種の複合混合物中における特定のｍＲＮＡ集団の存在の検出に使用することができる強力な技術である。ＲＴ−ＰＣＲにおいて、ｍＲＮＡ種を先ず、酵素、逆転写酵素を用いて相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写する；このｃＤＮＡを次いで、標準ＰＣＲ反応でのように増幅させる。
【０３４０】
固体支持体上に整列された特定のＤＮＡ分子（例えば、オリゴヌクレオチド）へのハイブリダイゼーションは、対象となる１種または２種以上のＥＳＮＡの発現の検出および発現レベルの定量の両方に使用することができる。この方法において、１種または２種以上のＥＳＮＡの全部または一部を基体に固定する。ＲＮＡを含有し得る対象となる試料、例えば全ＲＮＡもしくはポリＡ選択ｍＲＮＡまたはＲＮＡの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）コピーを、ハイブリダイゼーションが固体支持体上のＤＮＡと対象となる試料中の核酸分子との間で生じる条件下に、固体支持体とともにインキュベートする。基体に結合したＤＮＡと試料中の核酸分子との間のハイブリダイゼーションは、数種の手段により検出し、また定量することができ、このような手段は、これらに制限されないものとして、核酸分子またはハイブリッドが検出されるように設計された二次分子に対する放射能標識または蛍光標識を包含する。
【０３４１】
上記試験は、種々の細胞、体液および／または組織抽出物、例えば患者から得られたホモジネートまたは可溶化組織に由来する試料に対し行うことができる。組織抽出物は、組織生検および解剖材料から日常的に得られる。本発明において有用な体液は、血液、尿、唾液またはいずれか他の身体分泌液またはその派生物を包含する。本明細書中で用いる「血液」は、全血、血漿、血清、循環上皮細胞、構成成分またはすべての血液の派生物を包含する。
【０３４２】
体液中の検出に加えて、本発明のタンパク質および核酸は、細胞捕集技術による検出に適する。全細胞を、磁気分離などの種々の方法により捕集することができる。開示の全体が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第5,200,084号；同第5,186,827号；同第5,108,933号；同第4,925,788号。上皮細胞を、ダイナビーズ(Dynabeads)（登録商標）またはセレクション(CELLection)（登録商標）(Dynal Biotech, Oslo, Norway)などの製品を用いて、捕集することができる。あるいはまた、血液のフラクション、例えば上皮細胞を含むバフィーコートフラクション（５ｍｌの血液から単離された５０ｍｍの細胞）を、捕集することができる。さらに、癌細胞を、その開示の全体が参照によって本明細書に組み込まれる、WO 00/47998に記載されている技術を用いて捕集することができる。細胞が捕集または濃縮された後、タンパク質または核酸を、本出願に記載した手段により検出する。あるいはまた、核酸を、血液試料から直接捕集することができる。開示の全体が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第6,156,504号、同第5,501,963号；またはWO 01/42504参照。
【０３４３】
好適態様において、ＥＳＮＡまたはＥＳＰの発現にかかわり試験される標本は、これらに制限されないものとして、子宮内膜組織、細胞培養において増殖した子宮内膜細胞、血液、血清、リンパ節組織およびリンパ液を包含する。もう一つの好適態様において、特に原発性子宮体癌の転移が知られているか、または予測される場合、標本には、これらに制限されないものとして、脳、骨、骨髄、肝臓、肺、結腸および副腎からの組織が包含される。一般に、これらの組織は、生検により試料採取することができ、この生検には、これらに制限されないものとして、針生検、例えば経胸腔針吸引、頸部縦隔鏡検査、内視鏡リンパ節生検、ビデオ補助胸腔鏡、試験開胸、骨髄生検、および骨髄吸引が包含される。
【０３４４】
本発明による全方法は、場合により、ＥＳＮＡまたはＥＳＰの発現レベルの測定に加え、１種または２種以上の別種癌マーカーの発現レベルの測定を包含することができる。かなりの場合、さらに１種の癌マーカーの使用は誤った陽性または誤った陰性の可能性を減少させる。一態様において、１種または２種以上の別種の癌マーカーは、本明細書に記載されているような別種のＥＳＮＡまたはＥＳＰを包含する。本発明で有用な別種の癌マーカーは、検査される癌に依存し、当業者にとって公知である。好適態様において、特定のＥＳＮＡまたはＥＳＰに加え、少なくとも１種の別種の癌マーカーを測定する。さらに好適な態様において、少なくとも２種の別種の追加の癌マーカーを使用する。さらにまた好適態様において、少なくとも３種、さらに好ましくは少なくとも５種、さらにまた好ましいものとして少なくとも１０種の追加の癌マーカーを使用する。
【０３４５】
診断
一側面において、本発明は子宮体癌を有するものと予測される患者からの試料中の１種または２種以上のＥＳＮＡまたはＥＳＰの発現レベルおよび／または構造変化を決定する方法を提供する。一般に、この方法は、患者から試料を得る工程、ＥＳＮＡおよび／またはＥＳＰの発現レベルまたは構造変化を決定する工程、および次いでＥＳＮＡまたはＥＳＰの発現レベルから患者が子宮体癌を有するかを確定する工程を包含する。一般に、ＥＳＮＡまたはＥＳＰの発現が対照に比較して高い場合、子宮体癌が示唆され、またＥＳＮＡまたはＥＳＰの発現レベルが、好ましくは正常ヒト対照の同一細胞、組織または体液に比較し、少なくとも１．５倍高い場合、さらに好ましくは少なくとも２倍高い場合、尚一層好ましくは５倍高い場合、さらにまた好ましくは少なくとも１０倍高い場合、診断アッセイは陽性であると考えられる。これに対して、対照に比較して低いＥＳＮＡまたはＥＳＰ発現が子宮体癌を示唆する場合、ＥＳＮＡまたはＥＳＰの発現レベルが、好ましくは正常ヒト対照の同一細胞、組織または体液に比較し、少なくとも１．５倍低い、および一層好ましくは少なくとも２倍低い、尚一層好ましくは５倍低い、さらにまた好ましくは少なくとも１０倍低いならば、この診断アッセイは陽性であると考えられる。正常ヒト対照は、相違する患者から、または同一患者の冒されていない組織からのものであることができる。
【０３４６】
本発明はまた、子宮体癌が患者において転移されたかを診断する方法を提供する。その子宮体癌が転移されたかは、種々の組織の１種または２種以上のＥＳＮＡおよび／またはＥＳＰの発現レベルおよび／または構造変化を測定することによって特定することができる。或る組織に対応する非癌性組織（例えば別の個人からの同一組織）よりも高レベルでＥＳＮＡまたはＥＳＰが或る組織中に存在する場合であって、高レベルのＥＳＮＡまたはＥＳＰ発現が子宮体癌に関連する場合、転移が示唆される。同様に、或る組織に対応する非癌性組織よりも低レベルでＥＳＮＡまたはＥＳＰが或る組織中に存在する場合であって、低レベルのＥＳＮＡまたはＥＳＰ発現が子宮体癌に関連する場合、転移が示唆される。さらにまた、子宮体癌に関連する構造的に変化したＥＳＮＡまたはＥＳＰの存在はまた、転移を示唆する。
【０３４７】
一般に、対照に比較してＥＳＮＡまたはＥＳＰの高発現が転移を示唆する場合であって、正常ヒト対照の好ましくは同一細胞、組織または体液に比較し、ＥＳＮＡまたはＥＳＰの発現レベルが少なくとも１．５倍高い、一層好ましくは少なくとも２倍高い、尚一層好ましくは５倍高い、さらに一層好ましくは少なくとも１０倍高いならば、転移にかかわるアッセイは陽性であると考えられる。これに対して、対照に対して低いＥＳＮＡまたはＥＳＰの発現が転移を示唆する場合であって、正常ヒト対照の好ましくは同一細胞、組織または体液に比較し、ＥＳＮＡまたはＥＳＰの発現レベルが少なくとも１．５倍低い、および一層好ましくは少なくとも２倍低い、尚一層好ましくは５倍低い、さらに一層好ましくは少なくとも１０倍低いならば、転移にかかわるアッセイは陽性であると考えられる。
【０３４８】
病期分類
本発明はまた、ヒト患者における子宮体癌の病期分類方法を提供する。この方法は、子宮体癌を有するヒト患者を特定し、このようなヒト患者からの細胞、組織または体液を１種または２種以上のＥＳＮＡまたはＥＳＰの発現レベルおよび／または構造変化について分析することを包含する。先ず、種々の患者からの１種または２種以上の腫瘍を、当該技術分野で周知の手順に従い病期分類し、１種または２種以上のＥＳＮＡまたはＥＳＰの発現レベルを各病期について測定して、ＥＳＮＡおよびＥＳＰのそれぞれにかかわる標準発現レベルを得る。次いで、その癌の病期が不明である患者からの生物学的試料において、ＥＳＮＡまたはＥＳＰのＥＳＮＡまたはＥＳＰ発現レベルを決定する。この患者からのＥＳＮＡまたはＥＳＰ発現レベルを次いで、標準発現レベルと比較する。患者からのＥＳＮＡおよびＥＳＰの発現レベルと標準発現レベルとを比較することによって、当該腫瘍の病期を決定することができる。同一方法を、ＥＳＮＡまたはＥＳＰの構造変化を用いて行って、子宮体癌の病期を決定することができる。
【０３４９】
モニタリング
さらに、ヒト患者における子宮体癌のモニタリング方法を提供する。転移が存在するかを決定するために、または転移が存在したとして、転移が生じ始めた時点を決定するために、ヒト患者をモニタリングすることができる。また、前癌病変が癌になるか否かを決定するために、ヒト患者をモニタリングすることができる。また、治療、例えば化学療法、放射線治療または手術が子宮体癌を減少または消滅させたか否かを決定するために、ヒト患者をモニタリングすることができる。モニタリングにより、再発が存在したか否かを決定し、もしそうであればその性質を決定することができる。この方法は、子宮体癌についてモニタリングすることを望むヒト患者を特定し、このようなヒト患者からの細胞、組織または体液を１種または２種以上のＥＳＮＡまたはＥＳＰの発現レベルについて定期的に評価し、予め得たＥＳＮＡまたはＥＳＰ発現レベルに対し、経過時間にわたってそのＥＳＮＡまたはＥＳＰレベルを比較することを包含する。患者はまた、子宮体癌に関連するＥＳＮＡまたはＥＳＰの１種または２種以上の構造変化を測定することによってモニタリングすることもできる。
【０３５０】
ＥＳＮＡまたはＥＳＰの増加した発現が、転移、処置の失敗、または前癌病変の癌病変への転化に関連する場合、ＥＳＮＡまたはＥＳＰの発現レベルの増加の検出は、それぞれこの腫瘍が転移性であること、処置は失敗であること、または病変は癌であることを示唆する。これが真実である場合、減少した発現レベルは、転移がないこと、治療が効果的であること、または新生物病変への進行が失敗に終わっていることを示唆するものと、当業者は認識する。ＥＳＮＡまたはＥＳＰの発現減少が、転移、治療の失敗、または前癌病変の癌病変への転化に関連する場合、ＥＳＮＡまたはＥＳＰ発現レベルの減少の検出は、それぞれこの腫瘍が転移性であること、処置は失敗であること、または病変は癌であることを示唆する。好適態様において、ＥＳＮＡまたはＥＳＰのレベルは、前の患者サンプルと同一の細胞種、組織または体液から測定される。子宮体癌転移の開始にかかわる患者のモニタリングは、定期的に行い、好ましくは一年四回行うが、この頻度は多くても、または少なくてもよい。
【０３５１】
本明細書に記載されている方法はさらに、ＥＳＮＡおよび／またはＥＳＰの発現レベルの増加または減少を伴う疾患または障害の発生または発生のリスクを有する対象を特定するための予後アッセイとして利用することができる。本発明は、被験試料をヒト患者から採取し、１種または２種以上のＥＳＮＡおよび／またはＥＳＰを検出する方法を提供する。正常ヒト対照に比較した高レベル（または低レベル）のＥＳＮＡまたはＥＳＰの存在によって、癌、特に子宮体癌の発病に関するリスクを有する当該ヒト患者が診断される。本発明の１種または２種以上のＥＳＮＡおよび／またはＥＳＰの減少した（または増加した）発現または活性に対する治療剤の効果はまた、臨床試験におけるヒト患者のＥＳＮＡおよび／またはＥＳＰの発現レベルの分析によって、またはヒト細胞におけるなどのインビトロスクリーニングアッセイによって、モニタリングすることができる。この方法で、遺伝子発現パターンは、このような場合があるとして、試験される治療剤に対するヒト患者または細胞の生理学的応答を示すマーカーとしての役目を果たすことができる。
【０３５２】
遺伝子欠陥または突然変異の検出
本発明の方法はまた、ＥＳＧにおける遺伝子欠陥または突然変異の検出に使用し、これにより遺伝子欠陥を有するヒトが子宮体癌を発病しやすいかを決定することができ、またはどの遺伝子欠陥がヒトに存在する子宮体癌に対し応答性であるか、もしくは部分的に応答性であるかを決定することができる。遺伝子欠陥は、一例として、本発明のＥＳＧからの１種または２種以上のヌクレオチドの欠失、挿入および／または置換の存在、ＥＳＧの染色体再構成、ＥＳＧの異常修飾（例えば、ゲノムＤＮＡのメチル化パターン）、またはＥＳＧの対立遺伝子の喪失を確認することによって検出することができる。本発明のＥＳＧにおける、このような欠陥の検出方法は、本明細書の教示に従い当業者に知られている。
【０３５３】
非癌性子宮内膜疾病の検出方法
本発明はまた、非癌性子宮内膜疾病を有することが予測されるか、または有することが知られている患者からの試料中の１種または２種以上のＥＳＮＡおよび／またはＥＳＰの発現レベルおよび／または構造変化の決定方法を提供する。一般に、この方法は、患者から試料を採取する工程、ＥＳＮＡおよび／またはＥＳＰの発現レベルまたは構造変化を決定する工程、このＥＳＮＡまたはＥＳＰの発現レベルまたは構造変化を、正常子宮内膜対照と比較する工程、および次いで、当該患者が非癌性子宮内膜疾病を有するか否かを確認する工程を包含する。一般に、対照に比較して高いＥＳＮＡまたはＥＳＰ発現が特定の非癌性子宮内膜疾病を示唆する場合であって、ＥＳＮＡまたはＥＳＰの発現レベルが、正常ヒト対照の、好ましくは同一細胞、組織または体液中よりも少なくとも２倍高い、一層好ましくは５倍高い、さらに好ましくは少なくとも１０倍高い場合、この診断アッセイは陽性であると考えられる。これに対して、ＥＳＮＡまたはＥＳＰの対照に対して低い発現レベルが非癌性子宮内膜疾病を示唆する場合であって、ＥＳＮＡまたはＥＳＰの発現レベルが、正常ヒト対照の、好ましくは同一細胞、組織または体液中よりも少なくとも２倍低い、一層好ましくは少なくとも５倍低い、さらに一層好ましくは少なくとも１０倍低い場合、この診断アッセイは陽性であると考えられる。正常なヒト対照は、異なる患者から、または同一の患者の冒されていない組織からのものであることができる。
【０３５４】
当業者は、ＥＳＮＡおよび／またはＥＳＰを特定の非癌性子宮内膜疾病と関係付けられるかは、対象となる非癌性子宮内膜疾病を有する患者からの子宮内膜組織を採取し、次いでこの組織において、ＥＳＮＡおよび／またはＥＳＰが正常子宮内膜組織に比較して高レベルまたは低レベルで発現していることを決定することによって決定することができる。もう一つの態様において、ＥＳＮＡまたはＥＳＰが特定の非癌性子宮内膜疾病において構造変化を示すかは、対象となる非癌性子宮内膜疾病を有する患者からの子宮内膜組織を採取し、正常子宮内膜組織に比較して１種または２種以上のＥＳＮＡおよび／またはＥＳＰの構造変化を決定することによって決定することができる。
【０３５５】
子宮内膜組織の同定方法
もう一つの側面において、本発明は子宮内膜組織の同定方法を提供する。これらの方法は、例えば法医学、子宮内膜細胞の分化、および発達において、また組織工学において特に有用である。
【０３５６】
一態様において、本発明は、試料が子宮内膜組織であるか、または子宮内膜組織様特徴を有するかを決定する方法を提供する。この方法は、子宮内膜組織または子宮内膜組織様特徴を有する組織であると予想される試料を採取する工程、この試料が１種または２種以上のＥＳＮＡおよび／またはＥＳＰを発現するかを決定する工程、および試料が１種または２種以上のＥＳＮＡおよび／またはＥＳＰを発現した場合、試料は子宮内膜組織を含有するものと結論する工程を包含する。好適態様において、ＥＳＮＡは配列番号４７３〜６６６、またはその相同体、対立遺伝子変異体もしくは断片から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。
【０３５７】
さらに好適な態様において、ＥＳＮＡは配列番号１〜４７２、またはそのハイブリダイズする核酸、対立遺伝子変異体もしくは一部から選択されるヌクレオチド配列を有する。試料がＥＳＮＡを発現するかにかかわる決定は、当該技術分野で公知のいずれかの方法によって達成することができる。好適方法は、マイクロアレイに対するハイブリダイゼーション、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、および定量的または定性的ＲＴ−ＰＣＲを包含する。もう一つの好適態様において、この方法は、ＥＳＰが発現されるかについて決定することによって実施することができる。試料がＥＳＰを発現するかにかかわる決定は、当該技術分野で公知のいずれかの方法によって実施することができる。好適方法は、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡおよび２Ｄ  ＰＡＧＥを包含する。一態様において、ＥＳＰは配列番号４７３〜６６６、またはその相同体、対立遺伝子変異体もしくは断片から選択されるアミノ酸配列を有する。もう一つの好適態様において、少なくとも２種のＥＳＮＡおよび／またはＥＳＰの発現を決定する。さらに好適な態様において、少なくとも３種、さらに好ましくは４種、さらに一層好ましくは５種のＥＳＮＡおよび／またはＥＳＰの発現を決定する。
【０３５８】
一態様において、この方法は、未知試料が子宮内膜組織であるかについての決定に使用することができる。これは法医学において特に有用であり、この場合、顕微鏡またはその他の手段によって同定することができない組織の小さい損傷した小片を犯罪または事故現場から採取する。もう一つの態様において、この方法は、組織が子宮内膜組織に分化または成長するかについての決定に使用することができる。これは、種々の作用物質の細胞または組織培養物への添加効果のモニタリングに、例えば組織操作による新しい子宮内膜組織の生成に、重要である。これらの作用物質には、例えば成長および分化因子、細胞外マトリックスタンパク質および培地が包含される。組織発生および分化に対する効果を測定することができる別種の因子には、細胞または組織中への遺伝子転移、ｐＨの変更、水：空気界面および種々の別の培養条件が包含される。
【０３５９】
子宮内膜組織の生成および修飾方法
もう一つの側面において、本発明は操作された（engineered）子宮内膜組織または細胞の生成方法を提供する。一態様において、この方法は、細胞を用意する工程、この細胞中にＥＳＮＡまたはＥＳＧを導入する工程、およびこれらの細胞が子宮内膜組織細胞の１種または２種以上の特徴を示す条件下に、これらの細胞を成長させる工程を包含する。好適態様において、これらの細胞は多分化能を有する。当該技術分野で周知のように、正常子宮内膜組織は、多数の相違する細胞種を包含する。従って、一態様において、この操作された子宮内膜組織または細胞は、これらの細胞種の１種を包含する。もう一つの態様において、操作された子宮内膜組織または細胞は、１種より多い子宮内膜細胞種を含有する。さらに、これらの細胞または組織の培養条件は、子宮内膜細胞組織の完全な分化および成長を達成するための操作を必要とすることがある。培養条件の取り扱い方法は、当該技術分野で周知である。
【０３６０】
１種または２種以上のＥＳＰをコードする核酸分子は、細胞、好ましくは多能性細胞中に導入される。好適態様において、この核酸分子は、配列番号４７３〜６６６、またはその相同タンパク質、類縁体、対立遺伝子変異体もしくは断片から選択されるアミノ酸配列を有するＥＳＰをコードする。さらに好適な態様において、この核酸分子は、配列番号１〜４７２、またはそのハイブリダイズする核酸、対立遺伝子変異体もしくは一部から選択されるヌクレオチド配列を有する。もう一つの高度に好適な態様において、ＥＳＧが細胞中に導入される。発現ベクターおよび細胞中への核酸分子の導入方法は、当該技術分野で周知であり、上記文献に詳細に記載されている。
【０３６１】
人工子宮内膜組織は、子宮内膜機能のいくらか、または全部を失った患者の処置に使用することができる。
【０３６２】
医薬組成物
他の側面において、本発明は、本発明による核酸分子、ポリペプチド、融合タンパク質、抗体、抗体誘導体、抗体断片、アゴニスト、アンタゴニストまたはインヒビターを含有する医薬組成物を提供する。好適態様において、この医薬組成物は、ＥＳＮＡまたはその一部を含有する。さらに好適な態様において、ＥＳＮＡは配列番号１〜４７２、そこにハイブリダイズする核酸、その対立遺伝子変異体、またはこれと実質的な配列同一性を有する核酸からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する。もう一つの好適態様において、医薬組成物は、ＥＳＰまたはその断片を含有する。さらに好適な態様において、医薬組成物は、配列番号４７３〜６６６、これと相同的であるポリペプチド、このポリペプチドの全部もしくは一部を包含する融合タンパク質、またはその類縁体もしくは誘導体からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＥＳＰを含有する。もう一つの好適態様において、医薬組成物は、抗ＥＳＰ抗体、好ましくは配列番号４７３〜６６６からなる群から選択されるアミノ酸を有するＥＳＰ、またはこれと相同的であるポリペプチドに結合する抗体、このポリペプチドの全部もしくは一部を含有する融合タンパク質、またはその類縁体もしくは誘導体を含有する。
【０３６３】
このような組成物は代表的に、薬学的に許容される担体または賦形剤中に、および／または薬学的に許容される担体または賦形剤を用いて、本発明の治療剤を約０．１〜９０重量％の量で含有する。
医薬組成物は充分に確立された技術であり、さらにGennaro (ed.), Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed., Lippincott, Williams & Wilkins (2000); Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7th ed., Lippincott Williams & Wilkins (1999);およびKibbe (ed.), Handbook of Pharmaceutical Excipients American Pharmaceutical Association, 3rd ed. (2000)に記載されており、従って本明細書中で詳細に記載する必要はない。
【０３６４】
簡単には、本発明の医薬組成物の組成は、投与のために選択される経路に依存する。本発明で利用される医薬組成物は、経腸および非経口の両方を包含する種々の経路によって投与することができ、このような経路には、経口、静脈内、筋肉内、皮下、吸入、局所、舌下、直腸、動脈内、脊髄内、くも膜下、心室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内、肺内、および子宮内が包含される。
経口剤型は、患者によって消化される錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁剤などとして調剤することができる。
【０３６５】
経口投与用組成物の固形製剤は、適当な担体または賦形剤、例えば炭水化物またはタンパク質充填剤、例えば、乳糖、ショ糖、マンニトールまたはソルビトールを包含する糖；トウモロコシ、麦、米、ジャガイモ、またはその他の植物からのデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、または微結晶セルロースなどのセルロース類；アラビアゴムおよびトラガカントガムを包含するガム類；ゼラチンおよびコラーゲンなどのタンパク質類；カオリン、炭酸カルシウム、リン酸二カルシウム、塩化ナトリウムなどの無機化合物；およびアカシアおよびアルギン酸などの他の剤を含有することができる。
【０３６６】
分解および／または溶解を促進する剤を添加することができ、例えば架橋したポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはその塩、例えばアルギン酸ナトリウム塩、微結晶セルロース、トウモロコシデンプン、ナトリウムデンプングリコレート、およびアルギン酸を添加することができる。
使用することができる錠剤結合剤は、アカシア、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン（ポビドン（Povidone）（登録商標））、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ショ糖、デンプンおよびエチルセルロースを包含する。
使用することができる滑剤は、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、シリコーン液、タルク、ワックス類、油類、およびコロイド状シリカを包含する。
【０３６７】
前記材料を包含する充填剤、分解および／または溶解を促進する剤、錠剤結合剤および滑剤は、単独でまたは組み合わせて使用することができる。
固形経口剤型は、全体的に均一である必要はない。一例として、糖衣錠芯部を適当なコーティング、例えばアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタンを含有することができる濃縮糖溶液、ラッカー溶液、および適当な有機溶媒または溶媒混合物と組合せて使用することができる。
【０３６８】
本発明の経口剤型は、ゼラチンから形成されているプッシュ−フィット型（push-fit）カプセル剤、並びにゼラチンおよびコーティング、例えばグリセロールまたはソルビトールから形成されている軟質のシールされたカプセル剤を包含する。プッシュ−フィット型カプセル剤は、充填剤または結合剤、例えば、乳糖またはデンプン、滑剤、例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウム、および必要に応じて、安定剤と混合された活性成分を含有することができる。軟質カプセル剤において、活性化合物は安定剤を含有するか、または含有していない適当な液体、例えば脂肪油、液体、または液状ポリエチレングリコールに溶解または懸濁することができる。
さらに、錠剤または糖衣錠コーティングには染料または顔料を添加することができ、これにより製品を確認することができ、または活性化合物の量、すなわち用量を特定することができる。
【０３６９】
経口（経腸）投与用の医薬組成物の液体製剤は、水または他の水性ビヒクル中で調製され、種々の懸濁剤、例えばメチルセルロース、アルギネート、トラガカントガム、ペクチン、ケルジン（kelgin）、カラゲニン、アカシア、ポリビニルピロリドンおよびポリビニルアルコールを含有することができる。液体製剤はまた、溶液、エマルジョン、シロップ、およびエリキシルを包含し、活性成分（１種または２種以上）とともに湿潤剤、甘味剤および着色剤、並びに風味付与剤を含有することができる。
本発明の医薬組成物はまた、非経口投与用に調剤することができる。非経口投与用製剤は、水性または非水性の等張無菌注射溶液または懸濁液の形態であることができる。
【０３７０】
静脈注射剤の場合、水溶性形態の本発明による化合物を生理学的に許容される液状ビヒクル、例えば５％デキストロース（「Ｄ５」）、生理学的に緩衝されている塩類溶液、０．９％塩類溶液、ハンクス溶液（Hanks' solution）、またはリンゲル溶液中で調剤し、または凍結乾燥物として提供される場合、これらの液体と混合する。静脈用製剤は、担体、賦形剤または安定剤を含有することができ、これらには、これらに制限されないものとして、カルシウム、ヒト血清アルブミン、クエン酸塩、酢酸塩、塩化カルシウム、炭酸塩またはその他の塩が包含される。
【０３７１】
筋肉内製剤、例えば適当な可溶性形態の本発明による化合物の無菌製剤は、医薬用賦形剤、例えば注射用水、０．９％塩類溶液、または５％グルコース溶液に溶解し、次いで投与することができる。別法として、適当な不溶性形態の化合物を調製し、水性基剤または医薬として許容される油性基剤、例えば長鎖状脂肪酸のエステル（例えば、オレイン酸エチル）、脂肪油、例えば、ゴマ油、トリグリセライド類またはリポソーム中の懸濁液として投与することができる。
【０３７２】
組成物の非経口製剤は、種々の担体、例えば植物油、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、乳酸エチル、炭酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、エタノール、ポリオール類（グリセロール、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコールなど）を含有することができる。
水性注射用懸濁液はまた、懸濁液の粘度を高める物質、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランを含有することができる。非脂質ポリカチオンアミノポリマー類はまた、送達用に使用することができる。必要に応じて、この懸濁液はまた、適当な安定剤または高度に濃厚な溶液の生成を可能にするために化合物の溶解度を高める剤を含有することができる。
【０３７３】
本発明の医薬組成物はまた、注射可能な長期間貯蔵を可能にするように調剤することができる。この注射可能なデポ製剤は、生体分解性ポリマー、例えばポリ乳酸−ポリグリコライド中で化合物の微小カプセル封入マトリックスを形成することによって製造することができる。ポリマーに対する薬剤の割合および使用される特定のポリマーの性質に応じて、医薬放出速度を制御することができる。別の生体分解性ポリマーの例は、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）を包含する。デポ型注射用製剤はまた、身体組織に適合することができる微小エマルジョン中に医薬をトラップさせることによって製造される。
【０３７４】
本発明の医薬組成物は、局所投与することができる。局所使用の場合、本発明の化合物はまた、皮膚または鼻および喉の粘膜に施用するのに適する形態に調製することができ、またローション、クリーム、軟膏、液体スプレイまたは吸入液、点眼剤、チンキ、トローチ、または喉塗布剤の形態をとることができる。このような局所用製剤はさらに、活性成分の表面浸透を容易にするために、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のような化学化合物を含有することができる。別の経皮製剤、代表的に貼布型放出製剤において、医薬活性化合物は１種または２種以上の皮膚浸透剤、例えば２−Ｎ−メチル−ピロリドン（ＮＭＰ）またはアゾン（Azone）を用いて調剤することができる。局所用半固体軟膏製剤は代表的に、約１％〜２０％、例えば５〜１０％の濃度の活性成分を担体、例えば医薬用クリーム基剤中に含有する。
眼または耳に施用する場合、本発明の化合物は、軟膏、クリーム、ローション、ペイントまたは粉末として、疎水性または親水性基剤中で調剤される液状または半液状形態で存在することができる。
【０３７５】
直腸投与の場合、本発明の化合物は慣用の担体、例えばココアバター、ワックスまたはその他のグリセリドと混合されている座薬の形態で投与することができる。
吸入製剤はまた、容易に調剤することができる。吸入剤の場合、種々の粉末および液体製剤を調製することができる。エアロゾル製剤の場合、化合物または塩形態の化合物の無菌製剤を吸入器、例えば計量剤型吸入器およびネブライザーで使用することができる。エアゾル化形態は、呼吸器障害の処置に特に有用であることができる。
【０３７６】
あるいはまた、本発明による化合物は、送達時点で適当な薬学的に許容される担体中で再構成するのに適する粉末形態であることができる。
本発明の医薬組成物中の薬学的に活性な化合物は、種々の酸の塩として提供することができ、これらに制限されないものとして、塩酸塩、硫酸塩、酢酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩およびコハク酸塩を包含する。塩は、対応する遊離塩基形態に比較し、水性または別のプロトン性溶媒中にさらに溶解性である傾向を有する。
【０３７７】
医薬組成物を調製した後、これらは適当な容器内に包装することができ、適応症の処置用にラベルを付けることができる。
活性化合物は、意図する目的の達成に有効な量で存在させる。有効用量の決定は充分に、当業者の能力の範囲内にある。
【０３７８】
「治療有効用量」の用語は、活性成分、例えばＥＳＰポリペプチド、融合タンパク質またはその断片、ＥＳＰに特異的な抗体、ＥＳＰのアゴニスト、アンタゴニストまたはインヒビターの、疾患の兆候または症状を軽減するか、またはその進行を防止する量である；医療分野で理解されているように、治癒は、望ましいが必要ではない。
本発明の医薬剤の治療有効量は、最初にインビトロ試験、例えば細胞培養アッセイにより推定することができ、次いでモデル動物、通常マウス、ラット、ウサギ、イヌまたはブタにおいてアッセイする。動物モデルはまた、初期好適濃度範囲および投与経路の決定に使用することができる。
【０３７９】
一例として、ＥＤ50（全体の５０％で治療的に有効な用量）およびＬＤ50（全体の５０％を致死させる用量）は、動物モデル系の１種または２種以上の細胞培養において決定することができる。治療効果に対する毒性の用量比は、治療指数であり、ＬＤ50／ＥＤ50として表すことができる。大きい治療指数を示す医薬組成物は好適である。
細胞培養アッセイおよび動物実験から得られるデータは、ヒト用途用の初期用量範囲の組成に使用され、好ましくは僅かな毒性または無毒性のＥＤ50を包含する循環濃度範囲を提供する。投与後、または順次投与の間、活性剤の循環濃度は、当業者に周知の医薬動態因子、例えば使用される剤型、患者の感受性、および投与経路に依存して、この範囲内で変化する。
【０３８０】
正確な用量は、処置を要する対象に特異的な因子の観点から、実施者によって決定される。実施者が考慮することができる因子は、疾患状態の重篤度、対象の一般健康状態、年齢、体重、対象の性別、食事、投与の時期および頻度、医薬の組合せ（１または２以上）、反応への感受性、および治療に対する耐容／応答を包含する。長期作用性医薬組成物は、特定の製剤の半減期およびクリアランスに応じて、３〜４日間おきに、一週間おきに、または２週間おきに一回、投与することができる。
通常の用量は、投与経路に依存して、約１ｇの総量まで０．１から１００，０００マイクログラムまで変えることができる。治療剤が本発明によるタンパク質または抗体である場合、治療性タンパク質または抗体製剤は代表的に、０．０１ｍｇ〜３０ｍｇ／患者の体重ｋｇ（例えば、１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ）の一日薬用量で投与される。医薬製剤は、所望により、一日多回の用量で投与して、所望の総合一日薬用量を得ることができる。
【０３８１】
特定の剤型および送達方法にかかわる指針は、刊行物に提供されており、また一般に当該技術分野の実施者に利用することができる。当業者はタンパク質またはそれらのインヒビターについてよりも、ヌクレオチドについて相違する製剤を使用する。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、状態、場所などに特異的なものとされる。
医療技術の当業者にとって公知である慣用の方法を使用して、本発明の医薬製剤（１種または２種以上）を患者に投与することができる。本発明の医薬組成物は単独で、または別種の治療剤と組合せて、または別種の治療剤を介在させて投与することができる。
【０３８２】
治療方法
本発明はさらに、本発明の遺伝子における欠陥、例えば発現、活性、分布、場所および／または溶解性にかかわる欠陥を有する対象の処置方法を提供する。これらの欠陥は子宮内膜機能障害として現れる。本明細書で使用するものとして、「処置」は、疾患の一時的軽減および予防（防止）を包含する医学的に許容される全てのタイプの治療的介入を包含する。「処置」の用語は、僅かな改善を包含する疾患のいずれかの改善を包含する。これらの方法は、以下で説明する。
【０３８３】
遺伝子治療およびワクチン
本発明の単離核酸はまた、本発明によるポリペプチドのインビボ発現の誘導に使用することができる。インビボ発現は、遺伝子治療目的で、ベクター、代表的にウイルスベクター、多くの場合、複製不全レトロウイルス、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づくベクターから誘導することができる。インビボ発現はまた、「裸の」核酸ワクチン注射目的で、核酸に対して内因性のシグナルから誘導することができ、またはベクター、多くの場合、プラスミドベクター、例えばｐＶＡＸ１（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）から誘導することができ、さらに下記刊行物に記載されており、これらの開示を、それら全体の引用によりここに組入れる：米国特許第5,589,466号；同第5,679,647号；同第5,804,566号；同第5,830,877号；同第5,843,913号；同第5,880,104号；同第5,958,891号；同第5,985,847号；同第6,017,897号；同第6,110,898号；および同第6,204,250号。癌治療の場合、ベクターはまた、腫瘍選択性であると好ましい。一例として、Doronin et al., J. Virol. 75: 3314-24 (2001)を参照。
【０３８４】
本発明の治療方法のもう一つの態様において、本発明の核酸分子を含有する治療有効量の医薬組成物を投与する。この核酸分子は、ＥＳＰ、融合タンパク質またはその断片の発現を誘導するベクターにおいて、またはこのようなベクターを用いることなく、送達することができる。ＥＳＰの発現を誘導することができる核酸組成物を投与して、例えばネイティブなＥＳＰにおける欠陥を補足することができ、またはＤＮＡワクチンとして投与することができる。ウイルス、複製欠失レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴（ＡＡＶ）ウイルス、ヘルペスウイルス、またはワクシニアウイルスから誘導される発現ベクターは、ｃａｎプラスミドとして使用することができる。例えば、Cid-Arregui、上記を参照。好適態様において、この核酸分子は、配列番号４７３〜６６６のアミノ酸配列を有するＥＳＰ、またはその断片、融合タンパク質、対立遺伝子変異体もしくは相同体をコードする。
【０３８５】
さらにもう一つの本発明による治療方法において、ＥＳＰ、その融合体またはその断片を発現する宿主細胞を含有する医薬組成物を投与することができる。このような場合、細胞は代表的に、異種間または同種間拒絶が回避されるようにオーソロガスであり、またＥＳＰ産生または活性にかかわる欠陥を補足するために投与される。好適態様において、この細胞中の核酸分子は、配列番号４７３〜６６６のアミノ酸配列を有するＥＳＰ、またはその断片、融合タンパク質、対立遺伝子変異体もしくは相同体をコードする。
【０３８６】
アンチセンス投与
アンチセンス核酸組成物またはＥＳＧアンチセンス核酸の発現を誘導するベクターは、疾患の病態生理学的基礎として過剰産生または異常タンパク質が存在する状況において、ＥＳＧの転写および／または翻訳を下方調節するために投与される。
治療に有用なアンチセンス組成物は、ＥＳＧのコード領域または非コード領域に対し相補性的な配列を有することができる。一例として、転写開始部位から誘導されるオリゴヌクレオチド、例えば出発部位から−１０〜＋１０の位置にあるオリゴヌクレオチドは好適である。
【０３８７】
触媒的アンチセンス組成物、例えばＥＳＧ転写体に配列特異的にハイブリダイズすることができるリボザイム類はまた、治療に有用である。例えば、Phylactou, Adv. Drug Deliv. Rev. 44(2-3): 97-108 (2000); Phylactou et al., Hum. Mol. Genet. 7(10): 1649-53 (1998); Rossi, Ciba Found. Symp. 209: 195-204 (1997);およびSigurdsson et al., Trends Biotechnol. 13(8): 286-9 (1995)を参照。
【０３８８】
本発明による治療方法に有用な別種の核酸は、ＥＳＧゲノム座中またはその付近で三重らせんを形成することができる核酸である。このような三重らせん状オリゴヌクレオチドは、転写を抑制することができる。例えば、Intody et al., Nucleic Acids Res. 28(21): 4283-90 (2000); およびMcGuffie et al., Cancer Res. 60(14): 3790-9 (2000)を参照。このような三重鎖形成オリゴ（ＴＦＯ）を含有する医薬組成物は、疾患の病態生理学的基礎として過剰発現または異常タンパク質の生成が存在する状況で投与される。
【０３８９】
好適態様において、アンチセンス分子はＥＳＰ、好ましくは配列番号４７３〜６６６のアミノ酸配列、またはその断片、対立遺伝子変異体もしくは相同体を包含するＥＳＰをコードする核酸分子から誘導される。さらに好適な態様において、アンチセンス分子は、配列番号１〜４７２のヌクレオチド配列、またはその一部、対立遺伝子変異体、実質的に類似のもしくはハイブリダイズする核酸を有する核酸分子から誘導される。
【０３９０】
ポリペプチド投与
本発明による治療方法の一態様において、ＥＳＰ、融合タンパク質、断片、その類縁体または誘導体を含有する治療有効量の医薬組成物を、臨床的に重大なＥＳＰ欠陥を有する対象に投与する。
【０３９１】
タンパク質組成物は、例えばネイティブなＥＳＰの欠陥を補足するために投与される。別の態様において、タンパク質組成物はワクチンとして投与され、これによりＥＳＰに対する体液および／または細胞における免疫応答が惹起される。この免疫応答はＥＳＰ活性の調節に使用することができ、または免疫原に応じて、異常形態または異常に発現された形態、例えば突然変異体または不適当に発現したイソ型に対し免疫感作するために使用することができる。さらに別の態様において、毒素部分を含有するタンパク質融合体を投与して、ＥＳＰが異常蓄積する細胞を除去する。
【０３９２】
好適態様において、投与されたポリペプチドは配列番号４７３〜６６６のアミノ酸配列、またはその融合タンパク質、対立遺伝子変異体、相同体、類縁体もしくは誘導体を包含するＥＳＰである。さらに好適な態様において、このポリペプチドは、配列番号１〜４７２のヌクレオチド配列を有する核酸分子、またはその一部、対立遺伝子変異体、実質的に類似の核酸、もしくはハイブリダイズする核酸によってコードされる。
【０３９３】
抗体、アゴニストおよびアンタゴニスト投与
本発明による治療方法の別の態様において、治療有効量の本発明の抗体（その断片または誘導体を包含する）を含有する医薬組成物が投与される。周知のように、抗体組成物は、例えばＥＳＰ活性に拮抗させるために、または治療剤をＥＳＰが存在および／または蓄積している部位に標的化するために、投与される。好適態様において、この抗体は、配列番号４７３〜６６６のアミノ酸配列を有するＥＳＰ、またはその融合タンパク質、対立遺伝子変異体、相同体、類縁体もしくは誘導体に特異的に結合する。さらに好適な態様において、この抗体は、配列番号１〜４７２のヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされるＥＳＰ、またはその一部、対立遺伝子変異体、実質的に類似の核酸、もしくはハイブリダイズする核酸に特異的に結合する。
【０３９４】
本発明はまた、ＥＳＰに結合するか、またはＥＳＰの発現もしくは活性に対し調節効果を有するモジュレーターの特定方法を提供する。ＥＳＰの発現または活性を減少させるモジュレーター（アンタゴニスト）は、子宮体癌の処置に有用であると信じられている。このようなスクリーニングアッセイは、当業者にとって公知であり、これらに制限されないものとして、細胞に基づくアッセイおよび無細胞アッセイを包含する。ＥＳＰの領域に特異的に結合することがコンピュータ画像化により予測される小型分子をまた、子宮体癌の画像化および処置に使用するために、設計し、合成し、また試験することができる。さらに、分子ライブラリーを、本発明により同定されたＥＳＰに結合する分子の能力の評価によって、有効な抗癌剤についてスクリーニングすることができる。このライブラリーにおいて、ＥＳＰに対し結合可能性であるものと同定された分子は、子宮体癌処置における使用をさらに評価するための鍵となる候補である。好適態様において、これらの分子は細胞におけるＥＳＰの発現および／または活性を下方調節する。
【０３９５】
本発明による治療方法の別の態様において、ＥＳＰの非抗体アンタゴニストを含有する医薬組成物が投与される。ＥＳＰのアンタゴニストは、当該技術分野で一般的に知られている方法を用いて生成させることができる。特に、精製ＥＳＰを使用して、医薬剤のライブラリー、多くの場合に小型分子の組み合わせライブラリーをスクリーニングすることができ、これによりＥＳＰに特異的に結合し、ＥＳＰの少なくとも１種の活性に拮抗するものを特定することができる。
別の態様において、ＥＳＰのアゴニストを含有する医薬組成物が投与される。アゴニストは、アンタゴニストの同定に用いられる方法と類似の方法を用いて同定することができる。
【０３９６】
好適態様において、これらのアンタゴニストまたはアゴニストは、配列番号４７３〜６６６のアミノ酸配列を有するＥＳＰ、またはその融合タンパク質、対立遺伝子変異体、相同体、類縁体もしくは誘導体に特異的に結合し、それぞれ拮抗または作用する。さらに好適な態様において、これらのアンタゴニストまたはアゴニストは、配列番号１〜４７２のヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされるＥＳＰ、またはその一部、対立遺伝子変異体、実質的に類似の核酸、もしくはハイブリダイズする核酸に特異的に結合し、それぞれ拮抗または作用する。
【０３９７】
子宮内膜組織のターゲティング
本発明はまた、本発明によるポリペプチドまたはそれに対する抗体を治療剤に結合させ、治療剤を子宮内膜または子宮内膜の特定の細胞に送達できるようにする方法を提供する。好適態様において、抗ＥＳＰ抗体を治療剤と結合させ、次いでこのような治療剤を必要とする患者に投与する。子宮内膜組織が選択的に破壊されることが求められる場合、これらの治療剤は毒素であることができる。この方法は、子宮体癌細胞をターゲティングし、これらを殺滅するのに有用である。もう一つの態様において、この治療剤は成長因子または分化因子であることができる。これらは子宮内膜細胞の機能促進に有用である。
【０３９８】
もう一つの態様において、抗ＥＳＰ抗体は、例えば磁気共鳴画像化、ＣＴまたはＰＥＴを用いて検出することができる画像化剤に結合させることができる。この方法は、子宮内膜機能の決定およびモニタリングに、子宮体癌腫瘍の確定に、および非癌性子宮内膜疾病の確定に有用である。
【０３９９】
例
例１：遺伝子発現分析
慣用のCLASP実験
ＥＳＧを、データマイニングソフトウエアパッケージCLASP（登録商標）(Candidate Lead Automatic Search Program)を用いて、Incyte Genomics Inc (Palo Alto, CA)から入手できるLIFESEQ（登録商標）ゴールドデータベースにおける遺伝子発現データの系統的分析により、同定した。CLASP（登録商標）は、Incyteのデータベースを照会し、特定の組織タイプに特異的であり、癌を有する患者からの組織において示差的に発現する遺伝子を同定する、アルゴリズムのセットである。LifeSeq（登録商標）ゴールドは、いずれの遺伝子が、体中の種々の組織において発現するかについて、並びに正常な、および疾患の状態の両方における発現の動態についての情報を含む。CLASP（登録商標）は、先ず、LifeSeq（登録商標）ゴールドデータベースを、所定の組織タイプ、例えば乳房、卵巣および前立腺に分類する。CLASP（登録商標）は、各々の組織試料を、疾患状態により類別する。
【０４００】
疾患状態には、「健康」、「癌」、「癌と関連する」、「他の疾患」および「その他」が含まれる。疾患状態の類別により、組織および癌特異的分子標的を同定する能力が改善される。次に、CLASP（登録商標）は、（１）他の組織タイプと比較して、定められた組織タイプにおいて選択的に、および（２）同一の、または異なる組織に影響する他の疾患状態と比較して、「癌」疾患状態において示差的に発現する遺伝子の、同時並行検出を実施する。この分類は、発現レベルの最小の変化および、示差的な発現パターンが、統計学的に有意であると考えるべき遺伝子についての組織試料全域で観察されなければならない最小頻度を特定する、数学的および統計学的フィルターを用いることにより、達成される。CLASP（登録商標）アルゴリズムは、各々の組織タイプおよび各々の疾患状態にある、特定の遺伝子の相対的な存在量を定量する。
【０４０１】
本発明のＥＳＧを見出すために、以下の特定のCLASP（登録商標）プロフィルを用いた：組織特異的発現（CLASP1）、癌組織においてのみ検出可能な発現（CLASP2）、癌における最大の発現（CLASP4）および癌組織における示差的発現（CLASP5）。ｃＤＮＡライブラリーを、６０のユニークな組織タイプに分けた（LifeSeq（登録商標）の初期のバージョンは、４８の組織タイプを有していた）。遺伝子またはＥＳＴを、「遺伝子瓶」中にグループ分けし、ここで、各々の瓶は、一緒にグループ分けされた配列のクラスターであり、ここで、これらは、共通のコンティグを共有する。各々の遺伝子瓶についての発現レベルを、各々の組織タイプについて計算した。
【０４０２】
示差的発現の有意性を、異なるライブラリーにおける、および各々のライブラリー内の試料の大きさおよび相対的な遺伝子の存在量の変動を考慮して、正確な統計学的有意性検定で計算した（統計学的に有意な発現を決定するために用いた等式について、９８７頁の等式１および９８８頁の等式２を含む、Audic and Claverie "The significance of digital gene expression profiles," Genomi Res 7(10): 986-995 (1997)参照。この内容を、参照により組み込む）。示差的に発現した組織特異的遺伝子を、標的組織対すべての他の組織における存在量レベルのパーセンテージ（組織特異性）に基づいて、選択した。癌患者からの正常な組織または非癌性組織のライブラリーにおける、各々の遺伝子についての発現レベルを、腫瘍または疾患に関連する組織ライブラリーにおける発現レベルと比較した（癌特異性）。結果を、統計学的有意性について分析した。
【０４０３】
正確なCLASP（登録商標）プロフィル基準に適合する標的遺伝子の選択は、以下の通りであった：
（ａ）CLASP1：組織特異的発現：CLASP1候補として適格であるためには、遺伝子は、すべての他の組織と比較して、対象の組織における統計学的に有意な発現を示さなければならない。遺伝子が、９０％の信頼水準でこのような区別をつけた発現を示す場合にのみ、これは、CLASP1候補として選択される。
【０４０４】
（ｂ）CLASP2：癌組織においてのみ検出可能な発現：CLASP2候補として適格であるためには、遺伝子は、腫瘍組織における検出可能な発現並びに、正常な個体からのライブラリーおよび罹患した患者から得られた正常な組織からのライブラリーにおける検出不能な発現を示さなければならない。さらに、このような遺伝子はまた、対象の腫瘍組織に対するさらなる特異性を示さなければならない。
【０４０５】
（ｃ）CLASP4：癌における最大の示差的発現：CLASP4候補として適格であるためには、リードは、癌組織における最大の示差的発現を示す上位５０位の遺伝子の１つを示さなければならない。さらに、このような遺伝子はまた、対象の腫瘍組織についての他の特異性を示さなければならない。
【０４０６】
（ｄ）CLASP5：癌組織における示差的発現：CLASP5候補として適格であるためには、遺伝子は、すべての組織についての正常なライブラリーと比較して、対象の組織における腫瘍ライブラリーを示差的に発現しなければならない。遺伝子が、９０％の信頼水準でこのような示差的発現を示す場合にのみ、これは、CLASP5候補として選択される。
【０４０７】
配列番号１〜４７２についてのCLASPスコアを、以下に列挙する：
発現データは、多くの特異的なスプライス変異体については示していない。しかし、スプライス変異体ファミリーの少なくとも１つの転写物は、表中に示す発現データにより支持される。スプライス変異体は、種々の転写物の中で同様の領域を共有し得、従って１つの変異体についてのデータは、他のものに対して同等であり得る。この支持データは、依頼により入手可能である。各々の器官について、書式９−０．９９９９における２つの値がある。第１のものは、所定の器官における遺伝子の出現の数を表す。第２の数値は、所定の器官における遺伝子の発現の百分率を表す。
【０４０８】
【表１７】
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【０４０９】
【表１８】
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【０４１０】
【表１９】
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【０４１１】
【表２０】
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【０４１２】
【表２１】
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【０４１３】
【表２２】
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【０４１４】
【表２３】
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【０４１５】
【表２４】
2005521385.tif 000025
組織についての略語：
ＡＤＲ  副腎、ＢＬＤ  膀胱、ＢＬＯ  血液、ＢＬＶ  血管、ＢＲＮ  脳、ＣＯＮ  結合組織、ＥＳＯ  食道、ＦＴＳ  胎児、ＩＮＬ  大腸、ＩＮＳ  小腸、ＬＮＧ  肺、ＭＡＭ  乳房、ＮＲＶ  神経組織、ＯＶＲ  卵巣、ＰＡＮ  膵臓、ＰＮＳ  陰茎、ＰＲＯ  前立腺、ＳＰＬ  脾臓、ＳＴＯ  胃、ＳＹＮ  滑膜、ＴＨＲ  甲状腺、ＴＨＹ  胸腺、ＵＮＣ  混合組織、ＵＴＲ  子宮
【０４１６】
核酸（「ＮＴ」）配列番号；ＤＥＸ  ＩＤ；染色体位置（知られている場合）；読み取り枠（ＯＲＦ）位置；アミノ酸（「ＡＡ」）配列番号およびＡＡ  ＤＥＸ  ＩＤのマッピングを、以下の表に示す：
【０４１７】
【表２５】
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【０４１８】
【表２６】
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【０４１９】
【表２７】
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【０４２０】
【表２８】
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【０４２１】
【表２９】
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【０４２２】
【表３０】
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【０４２３】
【表３１】
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【０４２４】
【表３２】
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【０４２５】
【表３３】
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【０４２６】
【表３４】
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【０４２７】
本発明のポリペプチドについて、以下の特質が見出された。エピトープ、翻訳後修飾、シグナルペプチドおよび膜貫通ドメイン。抗原性（エピトープ）予測を、EMBOSSパッケージにおける抗原性モジュールにより実施した。Rice, P., EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Trends in Genetics 16(6): 276-277 (2000)。抗原性モジュールは、Kolaskar and Tongaonkarの方法を用いて、タンパク質配列の潜在的に抗原性の領域を予測する。Kolaskar, AS and Tongaonkar, PC., A semi-empirical method for prediction of antigenic determinants on protein antigens, FEBS Letters 276: 172-174 (1990)。本発明の翻訳後修飾（ＰＴＭ）およびＥＳＰの他のモチーフの例を、以下に列挙する。さらに、このような翻訳後修飾に特異的に結合する抗体は、診断薬または治療薬として有用であり得る。ＰＴＭおよび他のモチーフを、ProSite Dictionary of Proteins Sites and Patterns (Bairoch et al., Nucleic Acids Res. 25(1): 217-221 (1997))を用いることにより予測し、ＰＴＭを含む以下のモチーフを、本発明のＥＳＰについて予測した。
【０４２８】
シグナルペプチドを、SignalP 2.0を用いることにより、検出した。Nielsen et al., Protein Engineering 12, 3-9 (1999)を参照。タンパク質における膜貫通らせんの予測を、著者によるアプリケーションTMHMM 2.0, "currently the best performing transmembrane prediction program" (Krogh et al., Journal of Molecular Biology, 305(3): 567-580 (2001); Moller et al., Bioinformatics, 17(7): 646-653 (2001); Sonnhammer et al., A hidden Markov model for predicting transmembrane helices in protein sequences in Glasgow, et al. Ed. Proceedings of the Sixth International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology, 175〜182頁、Menlo Park, CA, 1998. AAAI Press)により実施した。また、PSORT IIプログラムを用いて、細胞局在を予測することができる。Horton et al., Intelligent Systems for Molecular Biology 5: 147-152 (1997)。以下の表は、以下の配列注釈を含む：シグナルペプチドの存在；ＴＭ（膜ドメインの数、配向および位置におけるトポロジー）；アミノ酸位置および抗原性指標（位置、ＡＩスコア、長さ）；ＰＴＭおよび他のモチーフ（タイプ、アミノ酸残基位置）。
【０４２９】
【表３５】
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【０４３０】
【表３６】
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【０４３１】
【表３７】
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【０４３２】
【表３８】
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【０４３３】
【表３９】
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【０４３４】
【表４０】
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【０４３５】
【表４１】
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【０４３６】
【表４２】
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【０４３７】
【表４３】
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【０４３８】
【表４４】
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【０４３９】
【表４５】
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【０４４０】
【表４６】
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【０４４１】
【表４７】
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【０４４２】
【表４８】
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【０４４３】
【表４９】
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【０４４４】
【表５０】
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【０４４５】
【表５１】
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【０４４６】
【表５２】
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【０４４７】
【表５３】
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【０４４８】
【表５４】
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【０４４９】
【表５５】
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【０４５０】
【表５６】
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【０４５１】
【表５７】
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【０４５２】
【表５８】
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【０４５３】
【表５９】
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【０４５４】
【表６０】
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【０４５５】
【表６１】
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【０４５６】
【表６２】
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【０４５７】
【表６３】
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【０４５８】
【表６４】
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【０４５９】
【表６５】
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【０４６０】
【表６６】
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【０４６１】
【表６７】
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【０４６２】
【表６８】
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【０４６３】
【表６９】
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【０４６４】
【表７０】
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【０４６５】
【表７１】
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【０４６６】
【表７２】
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【０４６７】
【表７３】
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【０４６８】
【表７４】
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【０４６９】
【表７５】
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【０４７０】
【表７６】
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【０４７１】
【表７７】
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【０４７２】
【表７８】
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【０４７３】
【表７９】
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【０４７４】
例２：遺伝子発現の相対的定量
蛍光性タックマン(Taqman）（登録商標）プローブを用いたリアルタイム定量的ＰＣＲは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性を利用する定量検出システムである。この方法は、５’をレポーター色素で、下流の３’をクエンチャー色素で標識した内部蛍光オリゴヌクレオチドプローブ（タックマン（登録商標））を用いる。ＰＣＲの間にＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性がレポーターを放出し、次にその蛍光をモデル７７００シークエンス検出システム（PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)のレーザー検出器により検出することができる。内在性対照の増幅を使用して、反応に添加された試料ＲＮＡの量が標準化され、逆転写酵素（ＲＴ）の効率が正規化される。シクロフィリン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、ＡＴＰアーゼ、または１８ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）のいずれかが内在性対照として用いられる。研究される全試料間の相対定量化を計算するために、１つの試料のための標的ＲＮＡレベルを結果比較のためのベース（キャリブレーター）として用いた。「キャリブレーター」に対する定量化は、比較法（User Bulletin #2:ABI PRISM 7700シークエンス検出システム）を用いて得ることができる。
【０４７５】
標的遺伝子の組織分布およびレベルを、正常組織および癌組織の全ての試料について評価する。全ＲＮＡは、正常組織、癌組織、および癌とそれに対応する対応隣接組織から抽出される。続いて逆転写酵素を用いて第１鎖ｃＤＮＡが調製され、各標的遺伝子に特異的なプライマーとタックマン（登録商標）プローブとを用いてポリメラーゼ連鎖反応が行われる。結果は、ABI PRISM 7700シークエンス検出装置を用いて分析される。絶対値は、キャリブレーター組織と比較した場合の特定組織中にある標的遺伝子の相対発現レベルである。
【０４７６】
当業者は、適切なプライマーを設計することができる。こうして、正常組織および他の癌組織に対するＥＳＮＡの相対発現レベルを決定することができる。すべての数値は、キャリブレータと比較してある。正常なＲＮＡ試料は市販のプールであり、異なる個体からの特定の組織の試料をプールすることによって作出されている。
【０４７７】
対応試料のペアにおけるＥＳＮＡの相対発現レベルもまた決定できる。対応ペアは、特定の組織についての癌試料からのｍＲＮＡ、およびその同一の個体からの同一の組織についての正常隣接試料からのｍＲＮＡによって形成される。すべての数値は、キャリブレータと比較してある。
【０４７８】
対応試料の分析において、ＥＳＮＡは、対象となる組織に対して高度の組織特異性を示す。これらの結果は、正常プール試料で得られた組織特異性の結果を確認するものである。さらに、癌試料、および同一の個体からの同系の正常隣接組織におけるｍＲＮＡ発現のレベルが比較される。この比較は、癌の状態についての特異性の指標を与える（例えば、癌試料における、正常隣接試料に比べて高いレベルのｍＲＮＡ発現）。
結局、高レベルの組織特異性に加えて、テストした対応試料におけるｍＲＮＡの過剰発現は、配列番号１〜４７２が、癌についての診断マーカーであることを示すものである。
【０４７９】
例３：タンパク質発現
ＥＳＮＡはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅され、ＥＳＮＡをコードする増幅ＤＮＡ断片が大腸菌での発現のためのｐＥＴ−２１ｄ内にサブクローニングされる。ＥＳＮＡのコード配列に加え、ＥＳＮＡのコード配列のＮＨ２末端に隣接する２個のアミノ酸、Ｍｅｔ−ＡｌａおよびＥＳＮＡのコード配列のＣＯＯＨ末端に隣接する６個のヒスチジンについてのコドンが、それぞれ開始Ｍｅｔ／制限部位および精製タグとして作用するために組み込まれる。
適切な分子量の過剰発現タンパク質バンドを、クマシーブルー染色されたポリアクリルアミドゲル上で観察することができる。このタンパク質バンドは、６×ヒスチジンタグに対するモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット分析により確認される。
ＥＳＰの大規模な精製は、６リットルの細菌培養物から得た細胞ペーストを用いて達成され、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を使用して精製される。全細胞溶解産物より分離された可溶性分画はニッケルキレート樹脂とともにインキュベートされた。カラムを充填し、カラム容量の５倍量の洗浄緩衝液で洗浄する。ＥＳＰは、各種濃度のイミダゾール緩衝液で段階的に溶出された。
【０４８０】
例４：融合タンパク質
ＩｇＧ分子のヒトＦｃ部分は、下記配列の５’および３’末端に及ぶプライマーを用い、ＰＣＲ増幅することができる。これらプライマーはまた、発現ベクター、好ましくは哺乳動物発現ベクターへのクローニングを容易にするのに好都合な制限酵素部位を持つべきである。例えば、ｐＣ４（受託番号２０９６４６）を用いる場合、ヒトＦｃ部分はＢａｍＨＩクローニング部位に連結できる。３’ＢａｍＨＩ部位が破壊されるべきであることに留意されたい。次に、ヒトＦｃ部分を含むベクターはＢａｍＨＩにより再度制限処理され、ベクターは直線化され、例２に記載のＰＣＲ法により単離された本発明のポリヌクレオチドがこのＢａｍＨＩ部位に連結される。このポリヌクレオチドは終止コドンなしにクローニングされ、さもなければ融合タンパク質は産生されないことに留意されたい。天然に存在するシグナル配列を用いて分泌タンパク質を産生する場合には、ｐＣ４は第２のシグナルペプチドを必要としない。あるいはまた、天然に存在するシグナル配列を使用しない場合には、ベクターは異種シグナル配列を含むように改変することができる。例えば、WO 96/34891を参照。
【０４８１】
例５：ポリペプチドからの抗体の産生
一般に、かかる手法は、ポリペプチド、またはより好ましくは分泌ポリペプチド発現細胞で、動物（好ましくは、マウス）を免疫化することを包含する。かかる細胞は、任意の適切な組織培養培地にて培養されてもよいが、１０％のウシ胎児血清（約５６℃にて不活性化される）を補充し、並びに非必須アミノ酸約１０ｇ／ｌ、ペニシリン約１，０００Ｕ／ｍｌ、およびストレプトマイシン約１００μｇ／ｍｌを補充したアール変法イーグル培地にて細胞を培養することが好ましい。かかるマウスの脾細胞を摘出し、適切な骨髄腫細胞系と融合させる。本発明によれば、いかなる適切な骨髄腫細胞系を用いてもよいが、ＡＴＣＣから入手可能な親骨髄腫細胞系（ＳＰ２０）を用いることが好ましい。融合後、得られたハイブリドーマ細胞は、ＨＡＴ培地にて選択的に保持され、続いてWands et al., Gastroenterology 80: 225-232 (1981)に記載されるように、限界希釈によりクローニングされる。
【０４８２】
次に、かかる選択により得られたハイブリドーマ細胞をアッセイして、ポリペプチドを結合することが可能な抗体を分泌するクローンを同定する。あるいはまた、ポリペプチドに結合することが可能なさらなる抗体を、抗イディオタイプ抗体を用いた二段階手法にて産生することができる。かかる方法は、抗体自身が抗原であるという事実を利用するものであり、従って、二次抗体に結合する抗体を得ることが可能である。この方法に従って、タンパク質特異的抗体を用いて、動物、好ましくはマウスを免疫化する。次に、かかる動物の脾細胞を用いて、ハイブリドーマ細胞を生産し、ハイブリドーマ細胞をスクリーニングして、タンパク質特異的抗体に結合する能力が、ポリペプチドにより阻止され得る抗体を産生するクローンを同定する。かかる抗体は、タンパク質特異的抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、それを用いて、動物を免疫化して、さらなるタンパク質特異的抗体の形成を誘発することができる。
【０４８３】
例６：ポリヌクレオチドに対応する遺伝子における変化の決定方法
ＲＮＡは、対象となる表現型を有する個々の患者または個体の家族から単離される。次いで、ｃＤＮＡを、当該技術分野において知られている方法を用いて、これらのＲＮＡ試料から産生する。上記Sambrook (2001)を参照。次いで、ｃＤＮＡを、配列番号１〜４７２において対象となる領域を取り囲むプライマーを用いるＰＣＲ用の鋳型として使用する。推奨されるＰＣＲ条件は、Sidransky et al., Science 252(5006): 706-9 (1991)に記載される緩衝溶液を用いて、９５℃での３０秒間、５２〜５８℃での６０〜１２０秒、および７０℃での６０〜１２０秒の３５サイクルから構成される。Sidransky et al., Science 278(5340): 1054-9 (1997)も参照。
【０４８４】
次に、SequiThermポリメラーゼ(Epicentre Technologies)を用いて、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼで５’末端において標識したプライマーを使用して、ＰＣＲ産物を配列決定する。選択エクソンのイントロン−エクソン境界もまた決定され、ゲノムＰＣＲ産物を分析して、結果を確認する。次に、疑われた突然変異を保有するＰＣＲ産物をクローニングして、配列決定して、直接配列決定の結果を確認する。Holton et al., Nucleic Acids Res., 19: 1156 (1991)に記載されるように、ＰＣＲ産物をＴ尾状(T-tailed)ベクターにクローニングし、Ｔ７ポリメラーゼ(United States Biochemical)を用いて配列決定する。病気に冒されていない個体に存在しない突然変異により、病気に冒された個体を同定する。
【０４８５】
ゲノム再配列もまた決定することができる。ゲノムクローンを、ジゴキシゲニンデオキシ−ウリジン５’−三リン酸塩(Boehringer Manheim)でニックトランスレーションし、Johnson et al., Methods Cell Biol. 35: 73-99 (1991)に記載されるように、ＦＩＳＨを実施する。標識プローブを用いたハイブリダイゼーションは、対応するゲノム座への特異的ハイブリダイゼーションのための、大過剰のヒトcot-1ＤＮＡを用いて行なわれる。
【０４８６】
４，６−ジアミノ−２−フェニルインドールおよびヨウ化プロピジウムで染色体を対比染色し、ＣおよびＲバンドの組合せを生じさせる。正確なマッピングのための整列画像（aligned image）は、冷却電荷結合素子カメラ(Photometrics, Tucson, AZ)および可変励起波長フィルターを併合したトリプルバンドフィルターセット(Chroma Technology, Brattleboro, VT)を用いて得られる。Johnson (1991)。画像収集、分析および染色体分画長測定は、ISee Graphicalプログラムシステム(Inovision Corporation, Durham, NC)を用いて行なう。プローブによりハイブリダイズされるゲノム領域の染色体変化は、挿入、欠失および転座として同定される。これらの変化は、関連疾患用診断マーカーとして用いられる。
【０４８７】
例７：生物学的試料においてポリペプチドの異常レベルを検出する方法
抗体−サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて、試料中、好ましくは生物試料中のポリペプチドを検出する。マイクロタイタープレートのウェルを、最終濃度０．２〜１０μｇ／ｍｌで、特異抗体により被覆する。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれかであり、上記の方法により産生される。ウェルへのポリペプチドの非特異的結合が低減するように、ウェルをブロッキングする。次に、被覆したウェルを、ポリペプチドを含有する試料とともに、室温にて２時間より長い時間インキュベートする。好ましくは、試料の連続希釈物を用いて、結果を確認すべきである。次に、プレートを脱イオン水または蒸留水で３回洗浄して、未結合のポリペプチドを除去する。次に、２５〜４００ｎｇの濃度の特異抗体−アルカリホスファターゼ複合体５０μｌを添加して、室温にて２時間インキュベートする。再びプレートを脱イオン水または蒸留水で３回洗浄して、未結合の複合体を除去する。各ウェルに、７５μｌの４−メチルウンベリフェリルホスフェート（ＭＵＰ）またはｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＮＰＰ）基質溶液を添加し、室温にて１時間インキュベートする。
【０４８８】
マイクロタイタープレートリーダーにより、反応を測定する。対照試料の連続希釈物を用いて、標準曲線を作成し、Ｘ軸上にポリペプチド濃度を（対数目盛）、Ｙ軸上に蛍光または吸光度（均等目盛）をプロットする。標準曲線を用いて、試料中のポリペプチド濃度を計算する。
【０４８９】
例８：ポリペプチドの製剤化
分泌ポリペプチド組成物は、個々の患者の臨床状態（特に、分泌ポリペプチド単独での処置の副作用）、送達部位、投与方法、投与のスケジューリング、および医師に既知の他の要素を考慮して、良質の医療のための原則（good medical practice）に沿った様式で、処方されて、投薬される。従って、本明細書の目的に関する「有効量」は、かかる考慮により決定される。
【０４９０】
一般的な提案として、１回用量あたり非経口的に投与される分泌ポリペプチドの薬学的総有効量は、約１μｇ／ｋｇ（患者の体重）／日〜１０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）／日の範囲であろうが、上述したように、これは治療上の判断に左右されるであろう。より好ましくは、この用量は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／日であり、ヒトに関して最も好ましくは、ホルモンに関して約０．０１〜１ｍｇ／ｋｇ／日である。連続的に与えられる場合、分泌ポリペプチドは、典型的には、１日あたり１〜４回の注射により、または例えば、ミニポンプを用いた連続皮下注入により、約１μｇ／ｋｇ／時〜約５０ｍｇ／ｋｇ／時の用量速度にて投与される。点滴バッグ（intravenous bag）溶液もまた、用いてもよい。変化を観察するのに必要な処置の期間、および処置後に応答が生じる間隔は、所望の効果に依存して変わるようである。
【０４９１】
本発明の分泌タンパク質を含有する薬学的組成物は、経口的に、経直腸的に、非経口的に、大槽内に、膣内に、腹腔内に、局所的に（パウダー、軟膏、ジェル、滴薬または経皮パッチによるものなど）、頬側に、または口腔もしくは鼻スプレーとして、投与される。「薬学的に許容し得る担体」は、無毒性の固形、半固形または液体賦形剤、希釈剤、カプセル用材料または任意のタイプの配合助剤を指す。本明細書で使用する「非経口」という用語は、静脈内、筋内、腹腔内、胸骨内、皮下、および関節内注射および注入を含む投与様式を指す。
【０４９２】
分泌ポリペプチドはまた、持続放出系により適切に投与される。持続放出性組成物の適切な例としては、造形品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態にある半透性ポリマーマトリックスが挙げられる。持続放出性マトリックスとしては、ポリラクチド（米国特許第3,773,919号およびEP 58,481、この内容全体を参照により本明細書中に組み込む）、Ｌ−グルタミン酸およびガンマ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Sidman, U. et al., Biopolymers 22: 547-556 (1983)）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（R. Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 (1981)、およびR. Langer, Chem. Tech. 12: 98-105 (1982)）、エチレンビニルアセテート（R. Langer et al.）、またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（EP 133,988）が挙げられる。持続放出性組成物はまた、リポソームエントラップポリペプチドを包含する。分泌ポリペプチドを含有するリポソームは、自体公知の方法により調製される：DE Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3688-3692 (1985)、Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4030-4034 (1980)、EP 52,322、EP 36,676、EP 88,046、EP 143,949、EP 142,641、日本国特許出願第83-118008号、米国特許第4,485,045号および第4,544,545号、並びにEP 102,324、この内容全体を参照により本明細書中に組み込む。通常、リポソームは、小さい（約２００〜８００オングストローム）単層型であり、そこでの脂質含量は、約３０ｍｏｌパーセントのコレステロールよりも高く、選択比率は、最適な分泌ポリペプチド治療に関して調節される。
【０４９３】
非経口投与に関して、一態様では、分泌ポリペプチドは、一般的にこれを所望の純度にて、単位投与量の注射可能な形態（溶液、懸濁液、またはエマルジョン）で、薬学的に許容し得る担体、即ち、使用する投与量および濃度にてレシピエントに無毒性であり、配合物の他の成分と併用可能（compatible）であるものと混合することにより配合される。
【０４９４】
例えば、配合物は、好ましくは、酸化剤、およびポリペプチドにとって有害であると知られている他の化合物を含まない。一般に、配合物は、液体の担体もしくは微細固体の担体またはその両方と、均一かつ緊密にポリペプチドを接触させることにより調製される。次に、必要な場合には、生成物を所望の配合物に成形する。好ましくは、担体は、非経口担体、より好ましくは、レシピエントの血液と等張である溶液である。かかる担体ビヒクルの例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液、およびブドウ糖溶液が挙げられる。固定油およびオレイン酸エチルのような非水性ビヒクル、並びにリポソームもまた、本発明に有用である。
【０４９５】
担体は適切に、等張性および化学的安定性を高める物質などの、少量の添加剤を含有する。かかる物質は、用いる投与量および濃度にて、レシピエントに対して無毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸、および他の有機酸またはそれらの塩などの緩衝液；アスコルビン酸などの酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンなどのアミノ酸；セルロースまたはその誘導体、グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含めた単糖類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの対イオン；および／またはポリソルベート、ポロクサマー、またはＰＥＧなどの非イオン性界面活性剤を含む。
【０４９６】
分泌ポリペプチドは、典型的に、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、約３〜８のｐＨにて、かかるビヒクル中で配合される。先述の賦形剤、担体または安定剤のうちのあるものの使用は、結果としてポリペプチド塩の形成を生じる結果となろうことは理解されるであろう。
【０４９７】
治療用投与のために使用されるべきポリペプチドはいずれも無菌であることができる。無菌状態は、滅菌濾過膜（例えば、０．２ミクロンの膜）を通した濾過により容易に達成される。治療用ポリペプチド組成物は一般に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針により突き刺すことが可能なストッパーを有する点滴溶液バッグまたはバイアルに入れられる。
【０４９８】
ポリペプチドは通常、単用量または複数用量容器、例えば、密封アンプルまたはバイアル中に、水溶液として、または再構成用凍結乾燥配合物として、保管されるであろう。凍結乾燥配合物の例として、１０ｍｌバイアルを滅菌濾過した１％（ｗ／ｖ）ポリペプチド水溶液５ｍｌで充填し、得られた混合物を凍結乾燥する。注入溶液は、注射用静菌水を用いて、凍結乾燥ポリペプチドを再構成することにより調製される。
【０４９９】
本発明はまた、本発明の医薬組成物の１または２以上の成分で充填された１または２以上の容器を含む医薬パックまたはキットを提供する。１または２以上のかかる容器には、医薬品または生物製品の製造、使用または販売を管轄する政府機関が定めた形式で書かれた、該機関による、ヒトへの投与に関する製造、使用または販売の承認を示す通知を添付することができる。さらに、本発明のポリペプチドは、他の治療的化合物と組合わせて用いることができる。
【０５００】
例９：ポリペプチドの減少したレベルを処置する方法
個体において分泌タンパク質の標準または正常発現レベルにおける減少により引き起こされる症状は、好ましくは分泌形態にある、本発明のポリペプチドを投与することにより処置できることが理解されるであろう。従って、本発明はまた、ポリペプチドの増加したレベルを必要とする個体を処置する方法であって、かかる個体においてポリペプチドの活性レベルを増加させるためのポリペプチドの量を含む医薬組成物を、かかる個体に投与することを含む方法を提供する。
例えば、ポリペプチドの減少したレベルを有する患者は、１日用量０．１〜１００μｇ／ｋｇのポリペプチドを６日間連続で受ける。好ましくは、ポリペプチドは分泌形態である。投与および処方に基づく投薬スキームの正確な詳細は、上記に提供されている。
【０５０１】
例１０：ポリペプチドの増加したレベルを処置する方法
アンチセンスまたはＲＮＡｉ技術を、本発明のポリペプチドの産生を抑制するために用いる。この技術は、癌などの様々な病因に起因するポリペプチド、好ましくは分泌形態のもののレベルを減少させる方法の一例である。
例えば、異常に増加したポリペプチドレベルを有すると診断された患者に、０．５、１．０、１．５、２．０および３．０ｍｇ／ｋｇ／日にて、２１日間、アンチセンスポリヌクレオチドを静脈内に投与する。この処置が十分に耐容された場合、この処置は７日の休止期間後に繰り返される。アンチセンスポリヌクレオチドの製剤化は、上記に提供されている。
【０５０２】
例１１：遺伝子療法を用いた処置の方法
遺伝子治療の一方法では、ポリペプチドを発現することが可能な線維芽細胞を、患者に移植する。一般に、線維芽細胞は、皮膚生検により対象から得られる。得られた組織を組織培養培地に置き、小片に分離する。組織の小片を組織培養フラスコの湿った表面上へ載せ、各フラスコにおいて約１０片を載せる。フラスコを裏返しにし、きつく閉めて、室温で一晩放置する。室温にて２４時間後、フラスコを裏返し、組織片をフラスコの底に固定させたままで、新鮮な培地（例えば、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地、１０％ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシン加）を添加する。次に、フラスコを３７℃にて約１週間インキュベートする。
【０５０３】
この時点で、新鮮な培地を添加し、続いて数日毎に取り換える。さらに２週間の培養の後、線維芽細胞の単層が現れる。単層をトリプシン処理し、大きなフラスコへはがし取る。モロニーマウス肉腫ウイルスの長い末端反復配列に隣接したｐＭＶ−７(Kirschmeier, P. T. et al., DNA, 7: 219-25 (1988))をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、仔ウシ腸ホスファターゼ（calf intestinal phosphatase）で処理する。アガロースゲル上で線状ベクターを分画し、ガラスビーズを用いて精製する。
【０５０４】
本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを、例３に記載のとおり、それぞれ５’および３’末端配列に相当するＰＣＲプライマー用いて増幅することができる。好ましくは、５’プライマーは、ＥｃｏＲＩ部位を含有し、３’プライマーは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む。等量のモロニーマウス肉腫ウイルス線状主鎖並びに増幅したＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存在下、一緒に添加する。得られた混合物を、２つの断片の連結に適した条件下において保持する。次に、連結混合物を用いて、バクテリアＨＢ  １０１を形質転換した後、ベクターが適切に挿入された対象の遺伝子を有することを確認する目的で、カナマイシンを含有する寒天上に播く。
【０５０５】
両栄養性ｐＡ３１７またはＧＰ＋ａｍｌ２パッケージング細胞を、１０％の仔ウシ血清（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシン加ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、コンフルエント密度に、組織培養で増殖させる。次に、遺伝子を含有するＭＳＶベクターを培地に添加し、パッケージング細胞をベクターで形質導入する。すると、パッケージング細胞は、遺伝子を含有する感染ウイルス粒子を生産する（パッケージング細胞は、今度はプロデューサー細胞と称される）。
【０５０６】
形質導入したプロデューサー細胞に、新鮮な培地を添加し、続いて、コンフルエントなプロデューサー細胞の１０ｃｍプレートから、培地を採取する。ミリポアフィルターを通して感染ウイルス粒子を含有する使用済培地を濾過して、剥離したプロデューサー細胞を除去し、続いてこの培地を用いて、線維芽細胞を感染させる。線維芽細胞のサブコンフルエントなプレートから、培地を除去し、プロデューサー細胞からの培地とすばやく入れ換える。この培地を除去し、新鮮な培地と入れ換える。
【０５０７】
ウイルスの力価が高い場合、実質的にすべての線維芽細胞は感染し、選択は必要ない。力価が非常に低い場合、ｎｅｏまたはｈｉｓのような選択可能なマーカーを有するレトロウイルスベクターを使用する必要がある。線維芽細胞がいったん効果的に感染したら、線維芽細胞を分析して、タンパク質が産生されるかどうかを決定する。
次に、操作した線維芽細胞を、単独で、またはcytodex3マイクロキャリアビーズ上においてコンフルエントまで増殖させた後に、宿主に移植する。
【０５０８】
例１２：インビボ遺伝子治療を用いた処置の方法
本発明の他の側面は、障害、疾患および症状を処置するために、インビボ遺伝子治療方法を用いることである。遺伝子治療方法は、ポリペプチドの発現を増加または減少させるための、裸の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ）配列の動物への導入に関する。
【０５０９】
本発明のポリヌクレオチドは、プロモーターに、または標的組織によって、ポリペプチド発現に必要な任意の他の遺伝要素に作動可能に連結されてもよい。かかる遺伝子治療並びに送達技術および方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Tabata H. et al. Cardiovasc. Res. 35 (3): 470-479 (1997); Chao J et al. Pharmacol. Res. 35(6): 517-522 (1997)、Wolff J. A. Neuromuscul. Disord. 7 (5): 314-318 (1997)、Schwartz B. et al. Gene Ther. 3 (5): 405-411 (1996)；およびTsurumi Y. et al. Circulation 94 (12): 3281-3290 (1996)；WO 90/11092、WO 98/11779、米国特許第5,693,622号、第5,705,151号、第5,580,859号を参照。この内容全体は、参照により本明細書に組込まれる。
【０５１０】
ポリヌクレオチド構築物は、組織（心臓、筋肉、皮膚、子宮内膜、肝臓、腸など）の間質腔への注射などの、動物細胞へ注射可能な物質を送達するいかなる方法により送達されてもよい。ポリヌクレオチド構築物は、薬学的に許容し得る液体または水性担体中で送達することができる。
【０５１１】
「裸の」ポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡという用語は、細胞への侵入を補佐、促進または助長するよう作用する、ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム配合物、リポフェクチンまたは沈殿剤などを含むいかなる送達ビヒクルも含まない配列を指す。しかしながら、本発明のポリヌクレオチドはまた、当業者に既知の方法により調製され得るリポソーム配合物（例えば、Felgner P. L. et al. Ann. NY Acad. Sci. 772: 126-139 (1995)、およびAbdallah B. et al. Biol. Cell 85 (1): 1-7 (1995)に教示されているもの）にて送達されてもよい。
【０５１２】
遺伝子治療方法において使用されるポリヌクレオチドベクター構築物は、好ましくは、宿主ゲノムに組み込まれず、複製が可能な配列を含有しないであろう構築物である。当業者に既知のいかなる強力なプロモーターも、ＤＮＡ発現を促進するために使用することができる。他の遺伝子治療技術と異なり、標的細胞へ裸の核酸配列を導入することの１つの主要な利点は、細胞におけるポリヌクレオチド合成の一過性の性質である。研究により、非複製ＤＮＡ配列が細胞に導入されて、最大６ヶ月の期間、所望のポリペプチドの産生を提供することができることがわかった。
【０５１３】
ポリヌクレオチド構築物は、筋肉、皮膚、脳、子宮内膜、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺、および結合組織を含む、動物内組織の間質腔へ送達され得る。組織の間質腔は、細胞間液、器官組織の細網線維間のムコ多糖マトリックス、管または房の壁における弾性線維、線維性組織のコラーゲン線維、または筋細胞を覆う結合組織内もしくは骨小腔中にある同じマトリックスを含む。循環血漿およびリンパ管のリンパ液により占有される腔も同様である。下記で論じる理由により、筋組織の間質腔への送達が好ましい。それらは、これらの細胞を含む組織への注射により利便性よく送達され得る。送達および発現は、未分化またはあまり完全には分化していない細胞、例えば、血液の幹細胞または皮膚線維芽細胞などにおいて達成され得るが、それらは、好ましくは、分化した永続性の非分裂細胞に送達され、そこで発現される。インビボの筋細胞は特に、ポリヌクレオチドを取り込み、発現するそれらの能力に優れている。
【０５１４】
裸のポリヌクレオチド注射に関して、有効投与量のＤＮＡまたはＲＮＡは、約０．０５μｇ／体重ｋｇ〜約５０ｍｇ／体重ｋｇの範囲であろう。好ましくは、投与量は、０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇであり、より好ましくは約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇであろう。当然のことながら、当業者が理解するように、この投与量は、注射の組織部位により変化するであろう。適切かつ有効な投与量の核酸配列は、当業者により容易に決定することができ、それは、処置する症状および投与経路に依存し得る。好ましい投与経路は、組織の間質腔への注射の非経口経路によるものである。しかしながら、特に子宮内膜もしくは気管支組織、咽喉または鼻の粘膜への送達用のエアロゾル配合物の吸入などの、他の非経口経路もまた使用してもよい。さらに、裸のポリヌクレオチド構築物は、血管形成中に、当該手順で使用されるカテーテルにより、動脈へ送達することができる。
【０５１５】
筋肉中に注射されたポリヌクレオチドのインビボでの用量反応効果は以下のように決定される。本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの産生のための適切な鋳型ＤＮＡを、標準的な組換えＤＮＡ方法論に従って調製する。鋳型ＤＮＡは、環状または線状のいずれであってもよく、それは裸のＤＮＡとして用いられるか、またはリポソームと複合体を形成する。次に、マウスの四頭筋に、様々な量の鋳型ＤＮＡを注射する。
【０５１６】
５〜６週齢の雌および雄Ｂａｌｂ／Ｃマウスを、２．５％アベルチン０．３ｍｌの腹腔内注射により麻酔する。腹側大腿上に１．５ｃｍの切開を施し、四頭筋を直接見えるようにする。筋肉の膝への遠位付着部位から約０．５ｃｍかつ約０．２ｃｍの深さで、１分にわたり、２７ゲージ針を通じて、１ｃｃの注射器内の担体０．１ｍｌ中の鋳型ＤＮＡを注射する。将来の位置確認のために注射部位上に縫合糸を設置し、皮膚をステンレススチール製クリップで閉じる。
【０５１７】
適切なインキュベーション時間（例えば、７日）の後、四頭筋全体を切除することにより、筋肉摘出物を調製する。個々の四頭筋の５番目毎の１５μｍ断面を、タンパク質発現のために組織化学的に染色する。タンパク質発現に関するタイムコースは、種々のマウス由来の四頭筋が異なる時間にて採取されることを除いて、同様の様式にて行なわれ得る。注射後の筋肉中のＤＮＡの永続性は、注射したマウスおよび対照マウスから全細胞ＤＮＡおよびＨＩＲＴ上清を調製した後に、サザンブロット分析により確定されてもよい。
【０５１８】
マウスでの上記実験の結果を用いて、裸のＤＮＡを用いた、ヒトおよび他の動物における適切な投与量および他の処置パラメータを外挿することができる。
【０５１９】
例１３：トランスジェニック動物
本発明のポリペプチドはまた、トランスジェニック動物にて発現させることもできる。マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブタ、小型ブタ（micro-pig）、ヤギ、ヒツジ、ウシ、並びに非ヒト霊長類、例えば、ヒヒ、サル、およびチンパンジーが含まれるが、これらに限定されないあらゆる種の動物を用いて、トランスジェニック動物を生み出してもよい。特定の態様では、本明細書中に記載された技術、またはその他当該技術分野で知られている技術が、本発明のポリペプチドを、遺伝子治療手法の一環として、ヒトにおいて発現させるのに用いられる。
【０５２０】
当該技術分野で既知の任意の技法を用いて、動物に導入遺伝子（即ち、本発明のポリヌクレオチド）を導入して、トランスジェニック動物の創始系統を生産してもよい。かかる技法としては、前核（pronuclear）マイクロインジェクション（Paterson et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 40: 691-698 (1994)、Carver et al., Biotechnology 11:1263-1270 (1993)、Wright et al., Biotechnology 9: 830-834 (1991); およびその内容の全体が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第4,873,191号）；生殖系列（Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82: 6148-6152 (1985)）、胚盤胞または胚へのレトロウイルス媒介性遺伝子移入；胚性幹細胞における遺伝子ターゲティング（Thompson et al., Cell 56: 313-321 (1989)）；細胞または胚へのエレクトロポレーション（Lo, 1983, Mol Cell. Biol. 3: 1803-1814 (1983)）；遺伝子銃を用いた本発明のポリヌクレオチドの導入（例えば、Ulmer et al., Science 259: 1745 (1993)を参照）；胚性多能性幹細胞への核酸構築物の導入および胚盤胞への幹細胞の移し戻し；および精子媒介性遺伝子移入（Lavitrano et al., Cell 57: 717-723 (1989)）が挙げられるが、これらに限定されない。かかる技法のレビューとして、Gordon, "Transgenic Animals", Intl. Rev. Cytol. 115: 171-229 (1989)を参照されたい。
【０５２１】
当該技術分野において既知のいかなる技法、例えば、静止状態へ誘導された培養胚細胞、胎児細胞または成人細胞からの核の、脱核卵母細胞への核移入(Campell et al., Nature 380: 64-66 (1966), Wilmut et al., Nature 385: 810813 (1997)）を用いて、本発明のポリヌクレオチドを含有するトランスジェニッククローンを生産してもよい。
【０５２２】
本発明は、すべての動物細胞において導入遺伝子を持つトランスジェニック動物、並びに、すべてではないが幾つかの細胞において導入遺伝子を持つ動物、即ちモザイク動物またはキメラ動物を提供する。導入遺伝子は、単一導入遺伝子として、またはコンカテマー、例えば、頭−頭タンデム、もしくは頭−尾タンデムのような多重コピーとして、組み込まれてもよい。導入遺伝子はまた、例えば、Lasko et al.の教示(Lasko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6232-6236 (1992)）に従って、特定の細胞タイプに選択的に導入されて、そこで活性化されてもよい。かかる細胞タイプ特異的な活性化に必要な調節配列は、対象の特定細胞タイプに依存し、それは当業者には明らかであろう。
【０５２３】
ポリヌクレオチド導入遺伝子が内因性遺伝子の染色体部位に組み込まれることが望ましい場合、遺伝子ターゲティングが好ましい。簡潔に述べると、かかる技法を利用する場合、内因性遺伝子に相同的な幾つかのヌクレオチド配列を含有するベクターを、内因性遺伝子のヌクレオチド配列へ、染色体配列との相同組換えにより組み込み、その機能を崩壊させる目的で設計する。導入遺伝子はまた、特定の細胞タイプへ選択的に導入されてもよく、従って、例えばGu et al. (Gu et al., Science 265: 103-106 (1994)）の教示に従って、その細胞タイプのみで内因性遺伝子を不活性化させる。かかる細胞タイプに特異的な不活性化に必要な調節配列は、対象の特定細胞タイプに依存し、それは当業者には明らかであろう。
【０５２４】
トランスジェニック動物がいったん創出されれば、組換え遺伝子の発現は、標準的な技法を利用してアッセイされ得る。初期スクリーニングは、導入遺伝子の組み込みが起ったことを確認すべく動物組織を分析するために、サザンブロット分析またはＰＣＲ技法により達成され得る。トランスジェニック動物の組織における導入遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルはまた、動物から得られた組織試料のノーザンブロット分析、インサイチュハイブリダイゼーション分析、および逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）が含まれるが、これらに限定されない技法を用いて評価してもよい。トランスジェニック遺伝子発現組織の試料はまた、導入遺伝子産物に特異的な抗体を用いて、免疫細胞化学的に、または免疫組織化学的に評価されてもよい。
【０５２５】
創始動物がいったん生産されれば、それらを、繁殖、同系交配、異系交配、または交雑させて、特定の動物コロニーを生産してもよい。かかる繁殖戦略の例としては：別個の系統を樹立するために、１つよりも多い組み込み部位を有する創始動物を異系交配すること；各導入遺伝子の付加的発現の効果が理由で、高いレベルで導入遺伝子を発現する複合遺伝子導入をもたらすために、別個の系統を同系交配させること；発現を増大させ、かつＤＮＡ分析による動物のスクリーニングの必要性をなくすために、所定の組み込み部位に関してホモ接合性の動物を生産するために、ヘテロ接合性のトランスジェニック動物を交雑させること；複合へテロ接合性またはホモ接合性系統を生産するために、別個のホモ接合性系統を交雑させること；および当該実験モデルに適切な明瞭なバックグラウンドに導入遺伝子を配置させるために繁殖させることが挙げられるが、これらに限定されない。
【０５２６】
本発明のトランスジェニック動物は、本発明のポリペプチドの生物機能を説明し、異常発現に関連した症状および／または疾患を研究し、かかる症状および／または疾患を改善するのに効果的な化合物をスクリーニングするのに有用な動物モデル系を含むが、これに限定されない用途を有する。
【０５２７】
例１４：ノックアウト動物
内因性の遺伝子発現はまた、標的（targeted）相同組換えを用いて、遺伝子および／もしくはそのプロモーターを不活性化または「ノックアウト」することにより低減することができる（例えば、Smithies et al., Nature 317: 230-234 (1985)、Thomas & Capecchi, Cell 51: 503512 (1987)、Thompson et al., Cell 5: 313-321 (1989)を参照）。あるいはまた、ＲＮＡｉ技術を用いることができる。例えば、内在性のポリヌクレオチド配列（遺伝子のコード領域または調節領域）に相同的なＤＮＡに隣接した突然変異体である本発明の非機能性ポリヌクレオチド（または完全に非関連のＤＮＡ配列）を、選択可能なマーカーおよび／またはネガティブ選択可能なマーカーを用いて、あるいは用いずに使用して、インビボで本発明のポリペプチドを発現する細胞をトランスフェクトすることができる。別の態様では、当該技術分野にて既知の技法を用いて、対象の遺伝子を含有するが、発現はしない細胞におけるノックアウトを生成する。標的相同組換えを介したＤＮＡ構築物の挿入は、結果として標的遺伝子の不活性化を招く。かかるアプローチは、研究および農業の分野に特に適しており、そこで胚性幹細胞の改変を用いて、不活性な標的遺伝子を有する動物の子孫を発生させることができる（例えば、上述のThomas & Capecchi 1987およびThompson 1989を参照）。しかしながら、組換えＤＮＡ構築物が、当業者には明らかであろう適切なウイルスベクターを用いて、インビボにおいて、必要とされる部位に直接的に投与されるか、または標的にされるという条件で、このアプローチは、ヒトにおける使用にルーチンで適合され得る。
【０５２８】
本発明のさらなる態様では、本発明のポリペプチドを発現するように遺伝子操作された細胞、あるいは本発明のポリペプチドを発現しないように遺伝子操作された（例えば、ノックアウト）細胞を、インビボにおいて患者に投与する。かかる細胞は、患者（即ち、ヒトを含む動物）、またはＭＨＣ適合ドナーから得てもよく、線維芽細胞、骨髄細胞、血液細胞（例えば、リンパ球）、脂肪細胞、筋細胞、内皮細胞などを含むことができるが、これらに限定されない。細胞は、組換えＤＮＡ技法を用いて、インビトロにおいて遺伝子操作されて、細胞に本発明のポリペプチドのコード配列を導入するか、あるいはまた例えば形質導入（ウイルスベクター、好ましくは細胞ゲノムに導入遺伝子を組み込むベクターを用いて）またはプラスミド、コスミド、ＹＡＣ、裸のＤＮＡ、エレクトロポレーション、リポソーム等の使用を含むが、これらに限定されないトランスフェクション手法により、本発明のポリペプチドに関するコード配列および／または内因性調節配列を崩壊させる。
【０５２９】
本発明のポリペプチドのコード配列は、強力な構成または誘導プロモーターまたはプロモーター／エンハンサーの制御下に置くことにより、本発明のポリペプチドの発現、および好ましくは分泌を達成することができる。本発明のポリペプチドを発現、および好ましくは分泌する操作細胞を全身的に、例えば、循環にて、または腹腔内にて患者に導入することができる。
【０５３０】
あるいはまた、細胞をマトリックス中に組み込み、体内へ移植することができ、例えば、遺伝子操作した線維芽細胞は、皮膚移植片の一部として移植することができる；遺伝子操作した内皮細胞は、リンパ管または血管移植片の一部として移植することができる（例えば、その内容全体が参照により本明細書に組込まれるAnderson et al.米国特許第5,399,349号、およびMulligan & Wilson、米国特許第5,460,959号を参照）。
【０５３１】
投与されるべき細胞が非自系または非ＭＨＣ適合細胞である場合、それらは、導入細胞に対する宿主免疫応答の発生を防ぐ既知の技法を用いて、投与され得る。例えば、細胞は、直に接している細胞外環境との構成成分の交換を可能にするものの、導入細胞が宿主免疫系により認識されることを可能にしないカプセル化形態で導入されてもよい。
【０５３２】
本発明のトランスジェニックおよび「ノックアウト」動物は、本発明のポリペプチドの生物機能を説明し、異常な発現に関連した症状および／または障害を研究し、かかる症状および／または疾患を改善するのに効果的な化合物をスクリーニングするのに有用な動物モデル系を含むが、これらに限定されない用途を有する。
【０５３３】
本発明の好ましい代表的な態様が記載されているが、当業者は、本発明が、限定のためではなく、例示の目的でのみ提示された、記載された以外の態様で実施できることを理解するだろう。本発明は、請求の範囲によってのみ限定される。
【配列表】
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【国際調査報告】
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