(57)【要約】天然もしくは組換えワクシニアまたは痘瘡抗原（例えば、Ｂ５Ｒ、Ａ３３Ｒ、痘瘡Ｂ７Ｒ、キメラＢ５Ｒ／Ｂ７Ｒ遺伝子産物または任意の変異体アイソフォーム）に対する完全ヒト抗体を記載する。このヒト抗体は、抗体ライブラリーから選択される。このライブラリーは、好ましくは、免疫されたヒト源から生成される。特に有用な実施形態において、このヒト抗体は、完全ヒト抗体または抗体フラグメントであり、１つ以上のワクシニア抗原または痘瘡抗原に対して少なくとも１×１０−８Ｍの結合親和性を有し、ウイルスを中和する能力を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワクシニア細胞外被ウイルスタンパク質、痘瘡細胞外被ウイルスタンパク質およびＢ５Ｒ／Ｂ７Ｒキメラタンパク質からなる群から選択される１つ以上の抗原に対して少なくとも１×１０−８Ｍの結合親和性を有し、且つワクシニアウイルスを中和する能力を有する、完全ヒト抗体または抗体フラグメント。
【請求項２】
Ｂ５Ｒ、Ａ３３Ｒおよび痘瘡Ｂ７Ｒからなる群から選択される抗原に結合する、請求項１に記載の完全ヒト抗体または抗体フラグメント。
【請求項３】
単鎖抗体である、請求項１に記載の完全ヒト抗体または抗体フラグメント。
【請求項４】
ヘテロ二量体抗体である、請求項１に記載の完全ヒト抗体または抗体フラグメント。
【請求項５】
抗体フラグメントである、請求項１に記載の完全ヒト抗体または抗体フラグメント。
【請求項６】
抗体を同定するための方法であって、以下：
ワクシニア細胞外被ウイルスタンパク質、痘瘡細胞外被ウイルスタンパク質およびＢ５Ｒ／Ｂ７Ｒキメラタンパク質からなる群から選択される１つ以上の抗原に対する抗体を産生するヒト被験体から得られる細胞から単離されるＲＮＡを用いてコンビナトリアルライブラリーを調製する工程；
ワクシニア細胞外被ウイルスタンパク質、痘瘡細胞外被ウイルスタンパク質およびＢ５Ｒ／Ｂ７Ｒキメラタンパク質からなる群から選択される１つ以上の抗原に対して少なくとも１×１０−８Ｍの結合親和性を有し、且つワクシニアウイルスを中和する能力を有する抗体についてのコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする工程；
を包含する、方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、抗体についてのコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする前記工程が、Ｂ５Ｒ、Ａ３３Ｒおよび痘瘡Ｂ７Ｒからなる群から選択される抗原に結合する抗体を同定する、方法。
【請求項８】
コンビナトリアルライブラリーを調製するための方法であって、以下：
ワクシニア細胞外被ウイルスタンパク質からなる群から選択される１つ以上の抗原に対する抗体を産生するヒト被験体から細胞を得る工程；
該細胞からＲＮＡを単離する工程；および
ワクシニア細胞外被ウイルスタンパク質からなる群から選択される１つ以上の抗原に対する抗体の少なくとも一部をコードする該ＲＮＡの配列を増幅する工程
を包含する、方法。
【請求項９】
薬学的組成物であって、以下：
ワクシニア細胞外被ウイルスタンパク質、痘瘡細胞外被ウイルスタンパク質およびＢ５Ｒ／Ｂ７Ｒキメラタンパク質からなる群から選択される１つ以上の抗原に対して少なくとも１×１０−８Ｍの結合親和性を有し、且つワクシニアウイルスを中和する能力を有する、完全ヒト抗体または抗体フラグメント；ならびに
薬学的に受容可能なビヒクル
を含む、薬学的組成物。
【請求項１０】
前記完全ヒト抗体または抗体フラグメントが、Ｂ５Ｒ、Ａ３３Ｒおよび痘瘡Ｂ７Ｒからなる群から選択される抗原に結合する、請求項９に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記完全ヒト抗体または抗体フラグメントが単鎖抗体である、請求項９に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
前記完全ヒト抗体または抗体フラグメントがヘテロ二量体抗体である、請求項９に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
前記完全ヒト抗体または抗体フラグメントが抗体フラグメントである、請求項９に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（背景）
（技術分野）
本開示は、一般にワクシニアウイルスまたは痘瘡ウイルス（天然痘）の影響に対して有用なヒト抗体に関し、さらにより具体的には、ウイルスに結合するかまたはウイルスを立体的に妨害して細胞の感染を防ぐ、ヒト抗体の同定に関する。
【０００２】
（関連分野の背景）
何世紀もの間、ワクシニアウイルスは、天然痘から人類を保護するために使用され、そしてなお、利用可能な最良の予防処置である。しかし、一般公衆におけるこのワクチンの使用は、小さいが実際の有害反応（死を含む）の危険性に起因して中止された。さらに、ＡＩＤＳ流行は、免疫−易感染性の患者がワクシニアへの曝露によって重大な影響を受け得るので、天然痘ワクチン接種の再導入の困難を増大した。さらに弱毒化したワクシニア株（例えば、短潜伏期性によって設計されたＮＹＶＡＣ株）が、他の疾病に対する組換えワクチンを設計する過程で、長年にわたって開発された。Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第１８８巻、２１７〜２３２頁（１９９２）を参照のこと。新しいワクチンキャンペーンが着手された場合、これらの株は有用であり得る。
【０００３】
ワクシニアウイルスの低分子インヒビターの優れた総説は、Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．（２００１年４月）３８２〜３９７頁に見出され得る。多くの薬剤がこの総説中に示され、これらの薬剤が、動物モデルにおけるインビトロまたはインビボの、ワクシニアに対するある程度の効果を有することが示された。残念ながら、これらの化合物の多くは、ワクシニアへの曝露前または曝露の直後に与えられた場合、予防に対してのみ有用である。シドフォビア（ｃｉｄｏｆｏｖｉｒ）のみが、ヒトにおける限定された使用が実際に見られ、これは他のポックスウイルス疾患を有するＡＩＤＳ患者において試みられ、且つ効果的であった。いくつかの動物モデルにおいて、シドフォビアは、１回の用量しか必要とせず、そして感染の数日後（疾病期間中）に与えられた場合でさえ保護し得た。現在、シドフォビアは、天然痘感染が万一突発した場合に利用可能な唯一の治療法である。
【０００４】
ポリクローナル抗体を用いて、インビトロおよびインビボにおける関連ワクシニアウイルスの中和が起こることが示された。Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第２５４巻，７１〜８０頁（１９９９）；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第２８０巻，１３２〜１４２頁（２００１）を参照のこと。ヒトＦａｂライブラリーがワクシニアウイルスに対して免疫したドナーから生成され、そしてインビトロでワクシニアウイルスを中和し得る多くのＦａｂが同定され、これらは、ＥＬＩＳＡにおいてサルポックスウイルスと交差反応した。Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第２５８巻，１８９〜２００頁（１９９９）を参照のこと。残念ながら、これらの抗体は、任意の特定のワクシニア抗原に特異的であるようには設計されず、むしろ多種多様な分子を含む溶解物に対してパニングされた。
【０００５】
細胞外被ウイルス（ＥＥＶ）は、感染周期の間、ウイルスの小さな部分を構成するが、これらのウイルスは、明らかに、インビボにおけるウイルスの広い伝播性を担い、そして保護は、ＥＥＶタンパク質に対する免疫応答と関連する。多くの異なるＥＥＶタンパク質（特に、Ａ３３Ｒ遺伝子産物、Ｂ５Ｒ遺伝子産物およびＬ１Ｒ遺伝子産物）が、動物モデルに基づく、感染の阻害のための標的として示唆された。米国公開出願２００２０００９４４７Ａ１（この開示は、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。Ａ３３Ｒは、タンパク質産物として最良の保護を与えるように見えるが、保護が抗体力価と相関しないので、Ａ３３Ｒは明らかに非中和化メカニズムを介して保護を達成する。Ｌ１Ｒ遺伝子産物（ミリスチル化タンパク質）は、細胞内成熟ウイルス（ＩＭＶ）中に位置している。Ｌ１Ｒ単独の使用またはワクチンとしてのＡ３３Ｒと組み合わせた使用は、マウスにおいて部分的保護を生じ得る。中和の一次病巣は、Ｂ５Ｒ遺伝子産物（ｇｐ４２、補体活性化調節因子スーパーファミリー）であるように見える。このＢ５Ｒ遺伝子産物は、ＩＭＶとは対照的に、ワクシニアウイルスの細胞外被上にのみ見出される。しかし、Ｂ５Ｒ単独に対する抗体を中和することが、天然痘感染に対して保護するか否かは公知ではない。
【０００６】
ワクチン接種の非存在下では、天然痘感染を処置する能力は制限され、そしてワクシニアおよび／または天然痘ウイルスに対するいくつかの治療の形態を提供することが所望される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（要旨）
天然もしくは組換えワクシニアまたは痘瘡抗原（例えば、Ｂ５Ｒ、Ａ３３Ｒ、痘瘡Ｂ７Ｒ、キメラＢ５Ｒ／Ｂ７Ｒ遺伝子産物または任意の変異体アイソフォーム）に対する完全ヒト抗体を記載する。このヒト抗体は、抗体ライブラリーから選択される。このライブラリーは、好ましくは、免疫されたヒト源から生成される。特に有用な実施形態において、このヒト抗体は、ワクシニアまたは痘瘡ＥＥＶタンパク質に対して少なくとも１×１０−８Ｍの親和性を有し、ウイルスを中和する。
【０００８】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本開示に従うヒト抗体は、完全な抗体または抗体フラグメントであり得る。抗体は、ヘテロニ量体または単鎖抗体であり得る。「ヘテロニ量体」との用語は、抗体または抗体フラグメントの軽鎖および重鎖が、天然に存在する抗体において見られるように、ジスルフィド結合を介して互いに結合されることを意味する。単鎖抗体は、リンカー配列を介して連結される抗体の軽鎖および重鎖可変領域を有する。
【０００９】
本発明のヒト抗体を、抗体ライブラリーをスクリーニングすることによって同定する。抗体ライブラリーを作製およびスクリーニングするための技術は、当業者の範囲内である。ＲａｄｅｒおよびＢａｒｂａｓ，Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２０００）、Ｌｅｒｎｅｒらの米国特許第６，２９１，１６１号ならびに同時係属の米国仮出願番号６０／３２３，４５５および米国仮出願番号６０／３２３，４００（これらの開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。
【００１０】
一般に、本開示に従う抗体ライブラリーの作製の第一工程は、１つ以上のワクシニアまたは痘瘡抗原（例えば、ウイルスＥＥＶタンパク質）に対する抗体を産生する個体由来の細胞を収集する工程を包含する。代表的に、このような個体をウイルスに曝露する。抗体を産生するかまたは含む、組織由来の細胞を、感染または免疫化の約７日後に個体から収集する。適切な組織としては、血液および骨髄が挙げられる。
【００１１】
一旦細胞が収集されると、当業者に公知の技術を用いてこれらの細胞からＲＮＡを抽出し、コンビナトリアル抗体ライブラリーを作製する。通常、コンビナトリアル抗体ライブラリーを作製する技術は、抗体またはそのタンパク質（例えば、抗体の単離されたＲＮＡを用いた軽鎖および／または重鎖）をコードする標的配列を増幅する工程を包含する。従って、例えば、天然に多様な抗体ｍＲＮＡのサンプルを初めとして、第一鎖ｃＤＮＡが、テンプレートを提供するために生成され得る。次いで、ライブラリーを作製するために、従来のＰＣＲ技術または他の増幅技術が使用され得る。
【００１２】
抗体ライブラリーのスクリーニングは、任意の公知の技術を用いて（例えば、所望のウイルス抗原に対するパニングによって）達成され得る。このように、Ｂ５Ｒ、Ｂ７Ｒ、Ａ３３ＲまたはＢ５Ｒ／Ｂ７Ｒキメラに結合する抗体が、同定され得る。ＲａｄｅｒおよびＢａｒｂａｓ，Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２０００）を参照のこと。あるワクシニア抗原がクローン化され、そして免疫原として用いるために組換え的に作製され得る。ワクシニア（いくつかの株）および痘瘡ウイルスの両方が、配列決定される。従って、組換えＥＥＶタンパク質の発現が、容易に達成され得る。例えば、ワクシニア由来のＢ５Ｒ遺伝子がクローン化され、バキュロウイルス系においてＣ末端膜ドメインを差し引いて発現される。Ｂ７Ｒは、ワクシニアＢ５Ｒの痘瘡オルソログであり、ワクシニアＢ５Ｒと９２．７％の相同性を共有する。クローン化Ｂ５Ｒ遺伝子は、Ｂ７Ｒとより密接に類似するように、重要なエピトープ領域において容易に改変され得る。Ｂ５ＲおよびＢ７Ｒに加えて、キメラＢ５Ｒ／Ｂ７Ｒタンパク質は、容易に調製され得る。少なくとも１×１０−８Ｍの結合親和性を有する抗体を単離し、そして中和能を試験する。中和能は、細胞レセプターとのウイルスの結合をブロックする抗体の能力を決定する、細胞アッセイで評価され得る。例えば、１４３Ｂｔｋ細胞を用いた中和アッセイまたはコメット（ｃｏｍｅｔ）形成の阻害を用いて、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２５４巻、７１〜８０頁（１９９９）に記載されるように、ウイルス阻害を評価し得る。一旦、１×１０−８Ｍより大きい結合親和性およびインビトロ中和能を有する抗体が同定されると、動物モデルにおいてインビボで試験され得る（例えば、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２５４巻、７１〜８０頁（１９９９）に記載される致死負荷試験（ｌｅｔｈａｌ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ））。
【００１３】
この様式で同定された抗体は、ワクシニアまたは痘瘡感染に対して有効な処置を有利に提供する。本抗体は完全ヒト抗体であるので、安全であり且つ容易に許容的である。さらに、抗イディオタイプ応答を急速に高めることなく、複数回用量を与え得る。全長抗体を使用する場合、（単鎖抗体と比較して）より高い親和性およびより大きいサイズであることが好ましくあり得る。なぜなら、全長抗体は、患者系（ｐａｔｉｅｎｔ’ｓ  ｓｙｓｔｅｍ）内においてより長い居留時間を提供するためである。
【００１４】
抗体投与の経路は、公知の方法（例えば、静脈内経路、腹腔内経路、大脳内経路、筋内経路、皮下経路、眼内経路、動脈内経路、鞘内経路、吸入経路または病変内経路による注射または注入、あるいは持続的放出系による注射または注入）に従う。抗体を、好ましくは、注入またはボーラス注射によって連続的に投与する。抗体を、局所的様式または全身的様式で投与し得る。
【００１５】
本抗体を、薬学的に受容可能なキャリアと混合して調製し得る。即時適用の化合物の処方および投与のための技術が、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ、最新版において見出され得る。この治療組成物は、好ましくは液体または（凍結乾燥された）粉末エアロゾルとして、静脈内に投与され得るかあるいは鼻または肺を通って投与され得る。この組成物はまた、所望の場合、非経口的にまたは皮下に投与され得る。系統的に投与される場合、この治療組成物は、無菌であり、発熱物質を含まず、そして然るべきｐＨ、等張性、および安定性を有する非経口的に受容可能な溶液中に存在すべきである。これらの条件は、当業者に公知である。
【００１６】
使用に適切な薬学的組成物は、本抗体の１つ以上が、意図される目的を達成するのに有効な量で含まれる組成物を含む。より具体的には、治療的有効量とは、疾患の症状を予防、軽減または改善し、あるいは処置された被験体の生存を延長するのに有効な抗体の量を意味する。治療的有効量の決定は、特に本明細書中に提供される詳細な開示を考慮して、当業者の能力の十分な範囲内である。治療的に有効な投薬量を、インビトロおよびインビボの方法で使用することによって決定し得る。
【００１７】
前述の記載は、本開示に従う方法の多くの特定の詳細を含むが、これらの特定の詳細は、本発明の範囲における制限と解釈されるべきではなく、好ましい実施形態の例示としてのみ解釈されるべきである。当業者は、多くの他の可能な変異（これらの全ては、添付の請求項によって定義されるように、本発明の範囲内および精神内である）を構想する。従って、前述の記載は、例示であって、制限するものではないと見られるべきである。
【手続補正書】
【提出日】平成16年8月12日(2004.8.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワクシニア細胞外被ウイルスタンパク質、痘瘡細胞外被ウイルスタンパク質およびＢ５Ｒ／Ｂ７Ｒキメラタンパク質からなる群から選択される１つ以上の抗原に対して少なくとも１×１０−８Ｍの結合親和性を有し、且つワクシニアウイルスを中和する能力を有する、完全ヒト抗体または抗体フラグメント。
【請求項２】
Ｂ５Ｒ、Ａ３３Ｒおよび痘瘡Ｂ７Ｒからなる群から選択される抗原に結合する、請求項１に記載の完全ヒト抗体または抗体フラグメント。
【請求項３】
単鎖抗体である、請求項１に記載の完全ヒト抗体または抗体フラグメント。
【請求項４】
ヘテロ二量体抗体である、請求項１に記載の完全ヒト抗体または抗体フラグメント。
【請求項５】
抗体フラグメントである、請求項１に記載の完全ヒト抗体または抗体フラグメント。
【請求項６】
抗体を同定するための方法であって、以下：
ワクシニア細胞外被ウイルスタンパク質、痘瘡細胞外被ウイルスタンパク質およびＢ５Ｒ／Ｂ７Ｒキメラタンパク質からなる群から選択される１つ以上の抗原に対する抗体を産生するヒト被験体から得られる細胞から単離されるＲＮＡを用いてコンビナトリアルライブラリーを調製する工程；
ワクシニア細胞外被ウイルスタンパク質、痘瘡細胞外被ウイルスタンパク質およびＢ５Ｒ／Ｂ７Ｒキメラタンパク質からなる群から選択される１つ以上の抗原に対して少なくとも１×１０−８Ｍの結合親和性を有し、且つワクシニアウイルスを中和する能力を有する抗体についてのコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする工程；
を包含する、方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、抗体についてのコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする前記工程が、Ｂ５Ｒ、Ａ３３Ｒおよび痘瘡Ｂ７Ｒからなる群から選択される抗原に結合する抗体を同定する、方法。
【請求項８】
コンビナトリアルライブラリーを調製するための方法であって、以下：
ワクシニア細胞外被ウイルスタンパク質からなる群から選択される１つ以上の抗原に対する抗体を産生する、ヒト被検体から得られる細胞からＲＮＡを単離する工程；および
ワクシニア細胞外被ウイルスタンパク質からなる群から選択される１つ以上の抗原に対する抗体の少なくとも一部をコードする該ＲＮＡの配列を増幅する工程
を包含する、方法。
【請求項９】
薬学的組成物であって、以下：
ワクシニア細胞外被ウイルスタンパク質、痘瘡細胞外被ウイルスタンパク質およびＢ５Ｒ／Ｂ７Ｒキメラタンパク質からなる群から選択される１つ以上の抗原に対して少なくとも１×１０−８Ｍの結合親和性を有し、且つワクシニアウイルスを中和する能力を有する、完全ヒト抗体または抗体フラグメント；ならびに
薬学的に受容可能なビヒクル
を含む、薬学的組成物。
【請求項１０】
前記完全ヒト抗体または抗体フラグメントが、Ｂ５Ｒ、Ａ３３Ｒおよび痘瘡Ｂ７Ｒからなる群から選択される抗原に結合する、請求項９に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記完全ヒト抗体または抗体フラグメントが単鎖抗体である、請求項９に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
前記完全ヒト抗体または抗体フラグメントがヘテロ二量体抗体である、請求項９に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
前記完全ヒト抗体または抗体フラグメントが抗体フラグメントである、請求項９に記載の薬学的組成物。
【国際調査報告】
2005538689.tif 000002
2005538689.tif 000003