(57)【要約】本発明は、コラゲナーゼあるいはコラゲナーゼを含む酵素の組み合わせを局所的に注入する閉塞動脈の経皮的インターベンションに関する。本発明は、慢性的に閉塞された動物の管及び腔を治療するための方法であり、それはタンパク質分解酵素を含有している製剤を治療上有効な量閉塞しているアテローム硬化型プラークの近傍に投与し、血管形成術前の待機時間待ち、続いて血管形成術ガイドワイヤーでプラークを通過させることにより行われる。本発明の、慢性動脈閉塞を発達させる生体内動物モデルは、次のような段階で与えられる。動物動脈のセグメントを分離し、動物動脈の分離された動脈セグメントの血液の流れを閉塞性の結紮糸で止め、急性血栓性閉塞を形成するために局所的にトロンビンを分離された動脈セグメントに注入し、急性血栓性閉塞が慢性線維性閉塞に変わるまで待つ。
2005503820.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物動脈のセグメントを分離し、
分離された前記セグメントの血液の流れを閉塞用の結紮糸で止め、
前記セグメントに局所性トロンビンを注入し、急性血栓性閉塞を形成し、
急性血栓性閉塞が慢性線維性閉塞に変わる間待機する
ことにより行われる慢性動脈閉塞生体内動物モデルを作成する方法。
【請求項２】
動物を麻酔し、
動脈にアクセスするために切開し、そして、
動脈セグメントを分離するために、結紮糸を少なくとも５mm離して縫合する
ことにより行われる請求項１に記載の動物モデルを作成する方法。
【請求項３】
針を使用して動脈セグメントにウシ・トロンビン溶液を注入し、
最初の待機期間待ち、
閉塞の形成の有無を決定するため結紮糸を緩め、
順行的な血液の流れがまだ存在しているかどうかを決定し、
順行的な血液の流れがまだ存在している場合に、さらにウシ・トロンビン溶液を動脈セグメントに注入し、
急性血栓性閉塞が形成されるまで繰り返し、
結紮糸を取り除くことにより行われる請求項１に記載の動物モデルを作成する方法。
【請求項４】
最初の待機時間が、少なくとも２０分である請求項３に記載の動物モデルを作成する方法。
【請求項５】
急性血栓性閉塞が慢性線維性閉塞に変わる間が、１０から２５週間である請求項１に記載の動物モデルを作成する方法。
【請求項６】
動物が、ウサギ、ブタ、イヌ、ヒツジ、ラット及び非ヒト霊長類からなる群より選択される請求項１に記載の動物モデルを作成する方法。
【請求項７】
動脈が、大腿部動脈、腸骨動脈、頚動脈、及び冠動脈からなる群より選択される請求項１に記載の動物モデルを作成する方法。
【請求項８】
動物動脈の分離された動脈セグメントの血液の流れを閉塞用の結紮糸で止め、急性血栓性閉塞を形成するために局所性トロンビンを動脈セグメントに注入し、急性血栓性閉塞が慢性線維性閉塞に変わる間待機する手段を有する慢性動脈閉塞生体内動物モデル。
【請求項９】
タンパク質分解酵素を含有している製剤を閉塞しているアテローム硬化型プラークの近傍に治療上有効な量投与し、
血管形成術前の待機期間待ち、
血管形成術ガイドワイヤーで前記のプラークを通過させる
ことにより行われる慢性的に閉塞された動物の管及び腔を処置する方法。
【請求項１０】
血管形成術前の待機期間が、約１から１０８時間である請求項９に記載の動物の管及び腔を処置する方法。
【請求項１１】
血管形成術前の待機期間が、約１２から８６時間である請求項１０に記載の動物の管及び腔を処置する方法。
【請求項１２】
血管形成術前の待機期間が、約７２時間である請求項１１に記載の動物の管及び腔を処置する方法。
【請求項１３】
ワイヤー上にある血管形成術カテーテルをガイドワイヤー上、蛍光透視の導きにより閉塞された管又は腔にまで進め、
低圧でバルーンを膨らませ、
ガイドワイヤーを取り除き、
タンパク質分解酵素を含有している製剤を管又は管腔に注入し、
製剤が暴露する待機期間を待ち、
血管形成術の器具を除く
ことにより行われる請求項９に記載の動物の管及び腔を処置する方法。
【請求項１４】
タンパク質分解酵素を含有している製剤が、閉塞に近い管及び閉塞に近い管腔のいずれかに注入される請求項１３に記載の動物の管及び腔を処置する方法。
【請求項１５】
タンパク質分解酵素を含有している製剤が、閉塞の近位部に直接的に存在する請求項１３に記載の動物の管及び腔を処置する方法。
【請求項１６】
タンパク質分解酵素を含有している製剤の注入が、血管形成術カテーテルのワイヤーポートを通して行われる請求項１３に記載の動物の管及び腔を処置する方法。
【請求項１７】
タンパク質分解酵素を含有している製剤の注入が、注入針を通して行われる請求項１３に記載の動物の管及び腔を処置する方法。
【請求項１８】
タンパク質分解酵素を含有している製剤の注入が、カテーテルを通して行われる請求項１３に記載の動物の管及び腔を処置する方法。
【請求項１９】
バルーンが、約１から５気圧で膨らまされる請求項１３に記載の動物の管及び腔を処置する方法。
【請求項２０】
バルーンが、約４気圧で膨らまされる請求項２０に記載の動物の管及び腔を処置する方法。
【請求項２１】
タンパク質分解酵素を含有している製剤が、低圧下で注入される請求項１３に記載の動物の管及び腔を処置する方法。
【請求項２２】
タンパク質分解酵素を含有している製剤が、約０．５気圧から３．５気圧の圧力下で注入される請求項２１に記載の動物の管及び腔を処置する方法。
【請求項２３】
タンパク質分解酵素を含有している製剤が、約１から２気圧の圧力下で注入される請求項２２に記載の動物の管及び腔を処置する方法。
【請求項２４】
製剤が暴露する待機期間が、少なくとも１０分である請求項１３に記載の動物の管及び腔を処置する方法。
【請求項２５】
製剤が暴露する待機期間が、約２０分から１００分間である請求項２４に記載の動物の管及び腔を処置する方法。
【請求項２６】
製剤が暴露する待機期間が、約５０分から８０分間である請求項２５に記載の動物の管及び腔を処置する方法。
【請求項２７】
製剤が暴露する待機期間が、約６０分間である請求項２６に記載の動物の管及び腔を処置する方法。
【請求項２８】
タンパク質分解酵素を含有している製剤が、マトリックスメタロプロテイナーゼ、セリンエラスターゼ、トリプシン、中性プロテアーゼ、キモトリプシン、アスパルターゼ、システイナーゼ及びクロストリペインからなる群より選択されるタンパク質分解酵素及び、ヒト精製マトリックス分解酵素を含む請求項９に記載の動物の管及び腔を処置する方法。
【請求項２９】
タンパク質分解酵素を含有している製剤が、コラゲナーゼ、タイプ１Ａコラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、ストロメライシンからなる群より選択されるマトリックスプロテイナーゼ及び、ヒト精製マトリックス分解酵素を含む請求項２８に記載の動物の管及び腔を処置する方法。
【請求項３０】
タンパク質分解酵素を含有している製剤が、コラゲナーゼを含有している製剤を含む請求項２８に記載の動物の管及び腔を処置する方法。
【請求項３１】
タンパク質分解酵素を含有している製剤の治療上有効な量が、５０から２０００μｇのタイプ１Ａコラゲナーゼを含む請求項９に記載の動物の管及び腔を処置する方法。
【請求項３２】
動物管のセグメントを分離し、
分離された動物管のセグメント中の流体の流れを閉塞用の結紮糸で止め、
急性閉塞を形成するため局所性の硬化性薬剤を分離されたセグメントに注入し、
急性閉塞が慢性線維性閉塞に変わる間待つ
ことにより行われる慢性閉塞生体内動物モデルを作成する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コラゲナーゼあるいはコラゲナーゼを含む酵素の配合物の局所注入を使用する閉塞動脈の経皮的処置の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
[問題の範囲]
慢性完全閉塞（CTO）は、診断上カテーテル挿入法を受ける患者に非常によく見出だされる。血管形成術を受ける患者の最大２０％が、１箇所あるいはそれ以上の慢性完全冠動脈閉塞を持つと報告されている（非特許文献１参照）。バルーン式血管形成術は、CTOに対する治療様式の一つであり、１９８２年初めて成功が報告された（非特許文献２参照）。冠動脈インターベンション（PCI）は、年々増加し続けており、１９９８年には世界中で百万例以上行われ（非特許文献３参照）、そのうちの１０％から１５％がCTOに対してである（非特許文献４〜７参照）。しかし、PCIはCTO患者集団に重大な制限があるので、臨床家はしばしば、これらの患者にバイパス手術を適用するか、（しばしば有効ではない）薬物療法を続ける。心筋の中の生存に適した領域を供給している血管に一つあるいはそれ以上のCTOが存在していることが、PCIを試みようとするよりむしろバイパス手術を適用する最もありふれた理由である。
【０００３】
[PCIの限界]
CTOに対するPCIの主要な限界は狭窄症の（しかし完全に閉塞されてはいない）動脈の場合に比べて術式の成功率が減少することや、高い再狭窄率にある。再狭窄問題は冠動脈ステントの使用により改善されてきた（非特許文献８から１０参照）。しかしながら、術式の成功率は、親水性のガイドワイヤーのような血管形成術の器具のある程度の改善により、１９８０年代（非特許文献１１、１２参照）の５０から６０％、１９９０年代（非特許文献５、１３〜１５参照）の６０から７０％へと、過去２０年間で適度な改善を示したにすぎない（非特許文献１６、１７参照）。対照的に、PCIは狭窄的ではあるが。非閉塞の動脈において９５％を超える成功率を誇る。実際、試みがなされるのは一般的に成功に対して合理的な見込みがあると思われる病変にのみであるので、７０％という成功率はおそらくCTOに対するPCIの成功を過大に評価したものであろう。術式の成功を予知できるいくつかの病変の特徴が同定されており、血管形成術へと進むかどうかの決定に影響を及ぼす。閉塞期間はしばしば確認するのが困難であるが、重要な予測の指標である。このことが信頼度を持って推定されている例では、最近の冠動脈閉塞（すなわち３ヶ月未満の期間）は２つの研究ではそれぞれ７４％、８９％の事例で拡張に成功したと報告されている（非特許文献５、１３参照）。しかしながら、閉塞期間が３ヶ月を超えると成功率はそれぞれ５９％、４５％に下がる。術式の失敗を予測可能にする他の変数には、閉塞された区域の病変の長さ（１５ｍｍ以上）や（非特許文献１、１８、１９参照）、ブリッジングした側枝の存在、閉塞されたセグメントやより小さな血管サイズに通じる先細りになったファンネルの欠如が含まれる（非特許文献２０参照）。また、機能的な完全閉塞（検出可能な連続性はないが、末梢セグメントのかすかな遅い順行的血行のあるほぼ完全な閉塞）の場合よりも絶対的な閉塞（末梢の血行が全くない）の方が失敗率は高い（非特許文献６、１９、２１参照）。
【０００４】
[なぜPCIは慢性完全閉塞では失敗するのか？]
ガイドワイヤーでCTOを通過することができないことがPCIが失敗する圧倒的な理由であり、失敗の７５％以上を占める（非特許文献５、１９参照）。マグナム（登録商標）ワイヤーのような完全閉塞のために特別にデザインされた新しいタイプのガイドワイヤー（非特許文献２２参照）、低速回転性血管形成術装置（非特許文献２３、２４参照）、ニ量体レーザー動力ガイドワイヤー（プリマ（登録商標）完全閉塞装置）（非特許文献２５〜２７参照）をもたらした最近の技術革新は従来のガイドワイヤー技術と比較して成功率を改善していない（非特許文献２８、２９参照）。このように、線維性完全閉塞を推し進めるためにより硬くて力のあるガイドワイヤーを設計するという純粋に機械的なアプローチには限定的な効果しかない。血栓溶解療法は急性冠動脈閉塞の治療には有効であるが、動脈慢性閉塞のほんの少数が長期の血栓溶解注入で治療されており、限定的な結果しか得られず（非特許文献３０、３１参照）、この戦略はほとんど捨てられている。血管形成術の結果を改善するために慢性閉塞動脈を薬理的に治療したという他の公表された報告はない。
【０００５】
[なぜCTOは開けられるべきか？]
慢性閉塞動脈によって栄養される心筋領域はそれでも生存可能であり、とくに広範な側枝に関連しているゆっくりと進行している閉塞の状況の場合にはそのようなことがいえる。心筋の需要が増加した状況（運動、食後、ストレス）では、側枝を通過する血液の流れが不十分なので、心筋の乏血はCTOの共通の続発症である。結果として、CTOという設定において、重度の狭心症がPCIを試みた際の最もよくある原因である。生存可能な心筋への不十分な血液供給の状況（冬眠心筋と名づけられている）はまた、心不全につながる潜在的に可逆的な心筋の機能障害の主な原因となる。さらに、CTOがより短い予後の前兆になるという蓄積しつつあるデータがある。ほぼ完全な閉塞患者と比較して完全な閉塞患者の方が２年間で調整された死亡率が高いという報告がされている（非特許文献３２参照）。平均４年間フォローされた一枝病の患者において、重度の狭心症（３％）よりもCTO患者（１５％）の方が有意に高い死亡率が見られた（非特許文献３３参照）。最近のデータによるとCTOの血管再生は左心室の機能（心不全の主な決定要因である）及び、可能な長期死亡率を改善する（非特許文献３４から３８参照）。スレオとその同僚たちはCTO治療に失敗した場合に比べて成功した場合に１０年間の生存に有意の増加があることを示した（７３．５％対６５．１％）（非特許文献７参照）。動脈の開存による生存の利点は心室の頻拍性不整脈の減少、後期電位差の欠如及び迷走神経の保存を伴う心筋の増大した電気的安定性によるものであろう。
【０００６】
[マトリックスメタロプロテアーゼの実験的使用]
コラゲナーゼ処方は、長い間試験管内での細胞培養研究に用いられてきた。これらの処方は周囲のマトリックスを分解することにより細胞を組織から分離する働きをし、これらの細胞は細胞培養に用いられる。コラゲナーゼ処方を生体内での研究に用いたという報告はほとんどない。ラットでの大脳内出血の実験モデルが全身に細菌性のコラゲナーゼ（タイプＸＩやタイプＶＩＩ）またはコラゲナーゼとヘパリンの組み合わせを直接尾状核に注入することで開発されてきた（非特許文献４８から５０参照）。このモデルでは、注入後１０分すると赤血球が大尾状核の血管の周りに蓄積し、４時間広範な出血が観られるが、これはおそらく壁の薄い大脳内血管の中にある間質型コラーゲン及び基底膜コラーゲンを分解することによるものである（非特許文献４９参照）。
【０００７】
ケレニとその同僚たちは（非特許文献５１参照）、ラビットアテローム硬化型のモデルにおいて、コラーゲンを含むいくつかの異なった酵素の使用に関して報告した。これらの酵素は、二重バルーンカテーテルを通して運ばれ、その中で二つの風船が膨らみ酵素が膨らんだ二つの風船の間にある空間に注入される。これらの酵素は最大３０分間その場に放置され、その後すぐに動脈が取り除かれた。このモデルでは、ラビットは高コレストロールの食事を与えられ、その結果、最低限に狭窄な（約３０％）それゆえ閉塞ではない、つまりガイドワイヤーや血管形成術バルーンカテーテルの通過にとって障害である適度なアテローム硬化型プラークが発達した。さまざまな酵素（トリシンやパパインのみ又はコラゲナーゼとの組み合わせ）の放出はしばしばプラークの溶解という結果になっただけではなく、動脈の中膜に広範なダメージを引き起こした。コラゲナーゼそれ自体はほとんど効果がなかった。これらの研究は血管壁内の細胞外マトリックスを分解するのにコラゲナーゼを使う原理を支えるだけでなく、特に壁の薄い動脈において、高用量でのそのような療法の可能な限界についての注意をも支える。
【０００８】
さらに、これらの研究はどれも、慢性閉塞動脈という独特な臨床状況に取り組んではいない。慢性閉塞動脈では、動脈の長い区域が完全に閉塞され、バルーン式血管形成術や、ステント術を実行するのに絶対必要となるガイドワイヤーの通過できない。加えて、この特異的な設定（慢性完全閉塞）での正確な酵素の組成や量、局所伝達ストラタジーやガイドワイヤーの通過を試みる前の酵素の最適な放置期間のような、有効な治療的アプローチの変数については知られていない。慢性閉塞動脈の実験的研究は最適な動物モデルの欠如により限定されてきた。こうして、一般的にアテローム硬化型のプラークに対して、コラゲナーゼのマトリックス分解性特質の利用を支持するいくつかの実験的基礎はあるが、慢性完全冠動脈閉塞はアテローム硬化型疾患の独特な症状である。
【０００９】
いくつかの公開された特許は、血管中のアテローム硬化型プラークの量を減らすためにコラゲナーゼ又は他のマトリックス分解酵素を使用することに対していくつかの請求項を含んでいる。特許文献１において、カレンドフは酵素前駆体[線維芽細胞のコラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、多形核のコラゲナーゼ、顆粒球コラゲナーゼ、ストロメライシンＩ、ストロメライシンＩＩ、又はエラスターゼ]を、試薬―プラーク複合体を形成するためにアテローム硬化型プラークに特異的に結合する試薬（好ましくは二機能性の抗体）に結合することにより、酵素をアテローム硬化型プラークに向ける方法を教えている（カラム１６；６１〜６６行参照）。酵素前駆体はまた試薬に結合するが、それから切断によって活性化され、プラークの構成成分を溶解することができる酵素へと変えられる（カラム４２、１９〜３２行参照）。
【００１０】
特許文献２（ディットロウ）と特許文献３（ビニ）において、マトリックス分解酵素の伝運搬をアテローム硬化型プラークへと導く同様の方法を教えている。ディットロウはCDRを付加した抗体あるいはアテローム硬化型プラークを消化可能な酵素に接合したフラグメントを含む試薬を用いる方法を教えている（カラム５、１１〜１５行）。ビニはフィブリン（ノゲン）溶解性の効果を改善するために、フィブリン溶解性のマトリックスメタロプロテアーゼを優先的にフィブリン（ノゲン）基質に向けられる抗体のような生物学的な標的分子に特異性をもつ成分に結合する方法を教えている（カラム１４、１〜１０行）。しかしながら、これらの酵素運搬方法はおそらく非閉塞動脈に関連するものだけであり、特に全身性のアテローム動脈硬化疾患に関連するものである。これらが教えてくれるものは、閉塞された、それは完全な閉塞によりほとんど循環している血液の流れを受け取らないのであるが、動脈での血管形成術の実行という特異的な設定には適用可能ではない。このような設定では、ずっと高濃度の酵素が必要とされ、それは局所化された運搬システムを通して達せられるにすぎない。さらには、これらの酵素の正確な運搬条件や量は、動脈壁の外側の層（中膜と外膜）にダメージを与えることなく、閉塞性プラークの構成要素と基質を十分に変えることを確かにするために最適化されなければならない。特許文献２において、ビニは、好ましくはMMP-３あるいはMMP-７のようなフィブリン溶解性のマトリックスメタロプロテアーゼによって、フィブリン（ノゲン）の分解を引き起こす方法を教えている。この特許は、大量の血栓とフィブリンを含み急性心筋梗塞や突然死の原因となる急性動脈閉塞に関連している。その方法は、生体内原位置において血栓を分解するためにフィブリン溶解性のマトリックスメタロプロテアーゼが被験者に投与される血栓溶解療法の手段として生体内で行われる。しかしながら、このようなフィブリン溶解性のマトリックスメタロプロテアーゼの適用は、大量なコラーゲンとその他の細胞外マトリックス構成要素や非常に少量のフィブリンやフィブリノゲンを含む慢性閉塞動脈での血管形成術を実行する際の問題に関連していない。加えて、上で述べたように、全身的な運搬方法は局在的な動脈閉塞には関連がない。
【００１１】
要約すると、CTOは極めて限定的にしか成功しないPCI病変の中の重要な一集団のままであり、それは主にガイドワイヤーで閉塞を通り抜けることができないことによるものである。これらプラークの線維性があり、コラーゲンが豊富であるという特徴が、ガイドワイヤーを通すのに根底的な障害となっている。症候性慢性完全閉塞の患者の大部分は、しばしば限定的な効果しかない薬物療法か侵入型のバイパス手術により処置される。重大な狭心症を引き起こすことに加えて、CTOはまた、左心室機能の劣化に関連していたり、狭窄的な（しかし閉塞ではない）病変あるいはうまく拡張された慢性閉塞より、おそらくよ生存可能性が低いという強い証拠がある。CTOのステント術が、血管形成術の他の限界であった長期の開存性を有意に改善してきた。従って、経皮的なインターベンションによる完全閉塞の開口は十分に活用されておらず、新しいアプローチを必要としていることを現在の証拠は示している。
【００１２】
血管形成術を好適に行うために必要なものとして、ガイドワイヤーが閉塞を通過するのを容易にするために、プラークを処置する方法が必要とされている。特に、従来のガイドワイヤーでの通過を容易にするために、これら閉塞性の繊維性プラークにおけるコラーゲンの内容と構造を化学的に変える必要がある。従来の血管形成術ガイドワイヤーによって通過できない慢性動脈閉塞を処置する研究開発方法を容易にするために、慢性完全動脈閉塞の動物モデルに対するさらなる必要性がある。
【特許文献１】
米国特許第６０２５４７７号
【特許文献２】
米国特許法第５８１１２４８号
【特許文献３】
米国特許法第６０２０１８１号
【非特許文献１】
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【非特許文献２】
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【非特許文献３】
トポル（Topol）  EJ,  セルイス（Serruys）  PW.  Frontiers  in  interventional  cardiology.  Circulation  1998;98:  1802-1820
【非特許文献４】
デトレ（Detre）  K,  ホルブコレ（Holubkove）  r,  ケルシー（Kelsey）  S,  カウリー（Cowley）  M,  ケント（Kent  ）W,  ウィリアムズ（Williams）  D,  ミラー（Myler）  R,  ファクソン（Faxon）  Dら.  Percutaneous  transluminal  angioplasty  in  1985-1986  and  1977-1981.  The  Heart,  Lung,  and  Blood  Institute  Registry.  N  Engl  J  Med  1988;318:265-270
【非特許文献５】
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【非特許文献８】
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【非特許文献１６】
レファーブレ（Lefevre）  T.  ルーヴァード（Louvard）  Y.  ルーベレ（Loubeyre）  C.    ヅマス（Dumas）  P.  ピーチャウド（Piechaud）  JF.  クロル（Krol）  M.  ベンスリマン（Benslimane）  A.  プレンチャンド（Premchand）  RK.  モリス（Morice）  MC.  A  randomized  study  comparing  two  guidewire  strategies  for  angioplasty  of  chronic  total  coronary  occlusion.  American  Journal  of  Cardiology  2000;85:1144-7.
【非特許文献１７】
カフラー（Kahler）  J.  コスター（Koste）  R.  ブロックホフ（Brockhoff）  C.  レイマース（Reimers）  J.  バルダス（Baldus）  S.  テレス（Terres）  W.    メイナーツ（Meinertz）  T.  ハム（Hamm）  CW.  Initial  experience  with  a  hydrophilic-coated  guidewire  for  recanalization  of  chronic  coronary  occlusions.  Cathet  Cardiovasc  Interven  2000;49:45-50.
【非特許文献１８】
マイエロ（Maiello）  L,  コロンボ（Colombo）  A,  ギアツッシー（Giatuossi）  R,  ら.  Coronary  angioplasty  of  chronic  occlusions:  factors  predictive  of  procedural  success.  Am  Heart  J  1992;124:581-4
【非特許文献１９】
ピューマ（Puma）  JA,  スケッチ（Sketch）  MH,  チャング（Tcheng）  JE,  ら.  Percutaneous  revascularization  of  chronic  coronary  occlusions-  an  overview.  J  Am  Coll  Cardiol  1995;26:1-11
【非特許文献２０】
タン（Tan）  W,  スルケ（Sulke）  AN,  タウブ（Taub）  NA,  ワッツ（Watts）  E,  スォートン（Sowton）  E.  Determinants  of  success  of  coronary  angioplasty  in  patients  with  a  chronic  total  occlusion:  a  multiple  logistic  regression  model  to  improve  selection  of  patients.  Br  Heart  J  1993;70:126-31
【非特許文献２１】
セルイス（Serruys）  PW,  ウマス（Umans）  V,  ヘインドリックス（Heyndrickx）  GR,  ら.  Elective  PTCA  of  totally  occluded  coronary  arteries  not  associated  with  acute  myocardial  infarction:  short  term  and  long-term  results.  Eur  Heart  J  1985;6:2-12
【非特許文献２２】
ヤウプ（Jaup）  T,  アレマン（Allemann）  Y,  アーバン（Urban）  P,  ドルツ（Dorsaz）  PA,  チャテライン（Chatelain）  P,  ブルゾステック（Brzostek）  T,  ヴェリエ（Verine）  V,  ルチシャウザー（Rutishauser）  W,  メイヤー（Meier）  B.  The  Magnum  wire  for  percutaneous  coronary  balloon  angioplasty  in  723  patients.  J  Invas  Cardiology  1995;7:259-64.
【非特許文献２３】
リース（Rees）  MR,  ミカリス（Michalis）  LK.  Activated-guidewire  technique  for  treating  chronic  coronary  artery  occlusion.  Lancet  1995;346:943-4.
【非特許文献２４】
リース（Rees）  MR,  ミカリス（Michalis）  LK,  パッパ（Pappa）  EC,  ルーカス（Loukas）  S,  ゴーデノヴェノス（Goudevenos）  JA,  シデリス（Sideris）  DA.  The  use  of  soft  and  flexible  guidewires  in  the  treatment  of  chronic  total  coronary  occlusions  by  activated  guidewire  angioplasty.  Br  J  Radiol  1999;72:162-7.
【非特許文献２５】
ハンバーガー（Hamburger）  JN,  ら.  Recanalization  of  chronic  total  coronary  occlusions  with  a  laser  guide  wire:  a  pilot  study.  J  Am  Coll  Cardiol  1997;30:649-656
【非特許文献２６】
オエスターレ（Oesterle）  SN,  ビットル（Bittl）  JA,  レオン（Leon）  MB,  ら.  Laser  wire  for  crossing  chronic  total  occlusions:  A  learning  phase  results  from  the  U.S.  TOTAL  trial.  Total  Occlusion  Trial  with  Angioplasty  by  Using  a  Laser  Wire.  Cathet  Cardiovasc  Diagn  1998;44:235-243
【非特許文献２７】
ショーファー（Schofer）  J,  ラウ（Rau）  T,  シュルター（Schluter）  M,  マッテイ（Mathey）  DG.  Short-term  results  and  intermediate-term  follow-up  of  laser  wire  recanalization  of  chronic  coronary  artery  occlusions:  a  single  center  experience.  J  Am  Coll  Cardiol  1997;30:1722-1728
【非特許文献２８】
ジャクシュ（Jacksch）  R,  パパダキス（Papadakis）  E,  ロザノスキー（Rosanowski）  C,  トーカー（Toker）  Y.  Comparison  of  three  different  techniques  in  reopening  chronic  coronary  artery  occlusion  [abstract].  Circulation  1992;86:  Suppl  I-I-781
【非特許文献２９】
シェルイス（Serruys）  PW,  ハンバーガー（Hamburger）  JN,  クーレン（Koolen）  JJ,  ファジャデット（Fajadet）  J,  ハウデ（Haude）  M,  クルエス（Klues）  H,  セアブラ・ゴエス（Seabra-Gomes）  R,  コルコス（Corcos）  T,  ハン（Hamm）  C,  ピッツーリー（Pizzuli）  L,  メイヤー（Meier）  B,    マッテイ（Mathey）  D,  フィエック（Fleck）  E,  タエイマンス（Taeymans）  Y,  メルカート（Melkert）  R.  テニセン（Teunissen）  Y.  サイマン（Simon）  R.  Total  occlusion  trial  with  angioplasty  by  using  laser  guidewire.  The  TOTAL  trial.  Eur  Heart  J  2000;21:1797-805.
【非特許文献３０】
ルオッコ（Ruocco）  NA,  クリエー（Currier）  JW,  カコブス（Jacobs）  AK,ライアン（Ryan）  TJ,  ファクソン（Faxon）  DP.  Experience  with  low-dose  intracoronary  recombinant  tissue-type  plasminogen  activator  for  nonacute  total  occlusions  before  percutaneous  transluminal  coronary  angioplasty.  Am  J  Cardiol  1991;68:1609-13
【非特許文献３１】
チィダー（Zidar）  FJ,  カプラン（Kaplan）  BM,  オニール（O'Neill）  WW,    ジョーンズ（Jones）  DE,  シュレイバー（Schreiber）  TL,  サイファン（Safian）  RD,  アジュルニ（Ajluni）  SC,  ソボルスキー（Sobolski）  J,  ティミス（Timmis）  GC,  グリネス（Grines）  CL.  Prospective,  randomized  trial  of  prolonged  intracoronary  urokinase  infusion  for  chronic  total  occlusions  in  native  coronary  arteries.  J  Am  Coll  Cardiol  1996;27:1406-12.
【非特許文献３２】
ルオッコ（Ruocco）  NA  Jr,  リング（Ring）  ME,  ホルブコブ（Holubkov）  R,  ヤコブス（Jacobs）  AK,  デトレ（Detre）  KK,  ファクソン（Faxon）  DP.  Results  of  coronary  angioplasty  of  chronic  total  occlusions:  the  National  Heart,  Lung,  and  Blood  Institute  1985-1986  Percutaneous  Transluminal  Angioplasty  Registry.  Am  J  Cardiol  1992;69:69-76
【非特許文献３３】
トラッペ（Trappe）  HJ,  リクトレン（Lichtlen）  PR,  クライン（Klein）  H,  ウェンチィフ（Wenzlaff）  P,  ハートウィング（Hartwig）  CA.  Natural  history  of  single  vessel  disease.  Risk  of  sudden  coronary  death  in  relation  to  coronary  anatomy  and  arrhythmia  profile.  Eur  Heart  J  1989;10:514-524
【非特許文献３４】
ドゥザヴィック（Dzavik）  V,  ビーンランヅ（Beanlands）  DS,  デイビス（Davies）  RF,  レディ（Leddy）  D,  マークイス（Marquis）  J-F,  テオ（Teo）  KK,  ルディ（Ruddy）  TD,  バートン（Burton）  JR,  ヒューメン（Humen）  DP.  Effects  of  late  percutaneous  transluminal  coronary  angioplasty  of  an  occluded  infarct-related  coronary  artery  on  left  ventricular  function  in  patients  with  a  recent  (<6  weeks)  Q-  wave  acute  myocardial  infarction  (Total  Occlusion  post-Myocardial  Infarction  Intervention  Study  [TOMIIS]-  A  pilot  study.  Am  J  Cardiol  1994;73:856-61
【非特許文献３５】
ピツェッティ（Pizzetti）  G,  ベロッティ（Belotti）  G,  マルゴナト（Margonato）  A,  カペレッティ（Cappelletti）  A,  チエルチィア（Chierchia）  S.  Coronary  recanalization  by  elective  angioplasty  prevents  ventricular  dilatation  after  anterior  myocardial  infarction.  J  Am  Coll  Cardiol  1996;28:837-45
【非特許文献３６】
シルネス（Sirnes）  PA.  マイレング（Myreng）  Y.  モルスタッド（Molstad）  P.  ボナージー（Bonarjee）  V.  Golf  S.  Improvement  in  left  ventricular  ejection  fraction  and  wall  motion  after  successful  recanalization  of  chronic  coronary  occlusions.  Eur  Heart  J  1998;19:273-81.
【非特許文献３７】
ダンチン（Danchin）  N.  アンギオイ（Angioi）  M.  カドール（Cador）  R.    トリコエ（Tricoche）  O.  ディビオン（Dibon）  O.  ジュイリエーレ（Juilliere）  Y.  クイリエーレ（Cuilliere）  M.  チェリアー（Cherrier）  F.  Effect  of  late  percutaneous  angioplastic  recanalization  of  total  coronary  artery  occlusion  on  left  ventricular  remodeling,  ejection  fraction,  and  regional  wall  motion.  American  Journal  of  Cardiology  1996;78:729-35.
【非特許文献３８】
エンゲルステイン（Engelstein）  E.  テレス（Terres）  W.  ホフマン（Hofmann）  D.  ハンセン（Hansen）  L.  ハム（Hamm）  CW.  Improved  global  and  regional  left  ventricular  function  after  angioplasty  for  chronic  coronary  occlusion.  Clin  Invest  1994;72:442-7.
【非特許文献３９】
スリバッタサ（Srivatsa）  SS,  エドワーズ（Edwards）  WD,  ブース（Boos）  CM,  グリル（Grill）  DE,  サンギオージー（Sangiorgi）  GM,  ガラット（Garratt）  KN,  シュワルツ（Schwartz）  RS,  ホルメス（Holmes）  DR  Jr.  Histologic  correlates  of  angiographic  chronic  total  coronary  artery  occlusions:  influence  of  occlusion  duration  on  neovascular  channel  patterns  and  intimal  plaque  composition.  J  Am  Coll  Cardiol  1997;29:955-63
【非特許文献４０】
メイヤー（Meier）  B.  Chronic  Total  Occlusion.  In:  Textbook  of  Interventional  Cardiology.  Editior:  E.  Topol.  W.B.Saunders,  Philadelphia  1994:318-338
【非特許文献４１】
バートス（Bartos）  F,  レドヴィナ（Ledvina）  M.  Collagen,  elastin,  and  desmosines  in  three  layers  of  bovine  aortae  of  different  ages.  Exp  Gerontol  1979;14:21-26
【非特許文献４２】
ホドダ（Hosoda）  Y,  カワノ（Kawano）  K,  ヤマサワ（Yamasawa）  F,  イシ（Ishii）  T,  シバタ（Shibata）  T,  イナヤマ（Inayama）  S.  Age  dependent  changes  of  collagen  and  elastin  content  in  human  aorta  and  pulmonary  artery.  Angiology  1984;35:615-21
【非特許文献４３】
マイネ（Mayne）  R.  Collagenous  proteins  of  blood  vessels.  Arteriosclerosis  1986;6:585-593
【非特許文献４４】
カツダ（Katsuda）  S,  オクダ（Okada）  Y,  ミナモト（Minamoto）  T,  オダ（Oda）  Y,  マツイ（Matsui）  Y,  ナカニシ（Nakanishi）  I.  Collagens  in  human  atherosclerosis:  immunohistochemical  analysis  using  collagen  type-specific  antibodies.  Arterioscler  Thromb  1992;12:494-502
【非特許文献４５】
ウェスナー（Woessner）  JF  Jr.  Matrix  metalloproteinases  and  their  inhibitors  in  connective  tissue  remodelling.  FASEB  J  1991;5:2145-2154
【非特許文献４６】
マトリシアン（Matrisian）  LM.  The  matrix-degrading  metalloproteinases.  Bioessays  1992;14:455-463
【非特許文献４７】
ドレリー（Dollery）  CM,  マクウェワンMcEwan）  JR,  ヘニー（Henney）  AM.  Matrix  metalloproteinases  and  cardiovascular  disease.  Circ  Res  1995;77:863-868
【非特許文献４８】
ローゼンバーグ（Rosenberg）  GA,  ムン・ブリス（Mun-Bryce）  S,  ウェスリー（Wesley）  M,  コーンフェルド（Kornfeld）  M.  Collagenase-induced  intracerebral  hemorrhage  in  rats.  Stroke  1990;21:801-807
【非特許文献４９】
ローゼンバーグ（Rosenberg）  GA,  エストラダ（Estrada）  EY.  Atrial  natriuretic  peptide  blocks  hemorrhagic  brain  edema  after  4-hour  delay  in  rats.  Stroke  1995;26:874-877
【非特許文献５０】
デル  ビギオ（Del  Bigio）  MR,  ヤン（Yan）  H-J,  ブイスト（Buist）  R,  ピーリング（Peeling）  J.  Experimental  intracerebral  hemorrhage  in  rats:  magnetic  resonance  imaging  and  histopathological  correlates.  Stroke  1996;27:2312-2318
【非特許文献５１】
ケレニー（Kerenyi）  T,  メルケル（Merkel）  V,  スザボルクス（Szabolcs）  Z,  プスクタイ（Pusctai）  P,  ナダシィー（Nadasy）  G.  Local  enzymatic  treatment  of  atherosclerotic  plaques.  Experimental  and  Molecular  Pathology  1988;49:330-338
【非特許文献５２】
ストラウス（Strauss）  BH,  ロビンソン（Robinson）  R,  バチェラー（Batchelor）  WB,  チスホルム（Chisholm）  RJ,  ラヴィ（Ravi）  G,  ナタラジャン（Natarajan）  MK,  ローガン（Logan）  RA,  メタ（Mehta）  SR,  レヴィ（Levy  ）DE,  エツリン（Ezrin）  AM,  キーリー（Keeley）.  In  vivo  collagen  turnover  following  experimental  balloon  angioplasty  injury  and  the  role  of  matrix  metalloproteinases.  Circ  Res  1996;79:541-550
【非特許文献５３】
ホンローサー（Hohnloser）  SH,  P  フランク（Franck）  P,  クリンゲンヘーベン（Klingenheben）  T,  ザベル（Zabel）  M,  ジャスト（Just）  H.  Open  infarct  artery,  late  potentials,  and  other  prognostic  factors  in  patients  after  acute  myocardial  infarction  in  the  thrombolytic  era.  A  prospective  trial.  Circulation  1994;90:1747-56
【非特許文献５４】
ヘルモシロ（Hermosillo）  AG,  ドラド（Dorado）  M,  カサノバ（Casanova）  JM,  ポンセ・デ・レオン（Ponce  de  Leon）  S,  コッシオ（Cossio）  J,  カーセノヴィッチ（Kersenovich）  S,  コリン（Colin）  L,  イツラルデ（Iturralde）  P.  Influence  of  infarct-related  artery  patency  on  the  indexes  of  parasympathetic  activity  and  prevelance  of  late  potentials  in  survivors  of  acute  myocardial  infarction.  J  Am  Coll  Cardiol  1993;22:695-706
【非特許文献５５】
フイクリ（Huikuri）  HV,  コイスチネン（Koistinen）  MJ,  アイラクシン（Airaksinen）  KE,  イカヘイモ（Ikaheimo）  MJ.  Significance  of  perfusion  of  the  infarct  related  coronary  artery  for  susceptibility  to  ventricular  tachyarrhythmias  in  patients  with  previous  myocardial  infarction.  Heart  1996;76:91-92（発明の要約）
【００１３】
慢性動脈閉塞生体動物モデルを作成する方法は、次の段階からなる。動物動脈のセグメントを分離し、動物動脈の分離された動脈セグメントの血液の流れを閉塞性の結紮糸で止め、急性血栓性閉塞を形成するために局所性トロンビンを動脈セグメントに注入し、急性血栓性閉塞が慢性繊維性閉塞に変わる間待機する。
【００１４】
慢性的に閉塞された動物の管及び腔を処置する方法が与えられている。その方法での最初の段階は、タンパク質分解酵素を含有している製剤を閉塞しているアテローム硬化型プラークの近傍に治療上有効な量投与し、次に続くのが、血管形成術ガイドワイヤーでプラークを通過させる前の血管形成術前の待機期間である。待機期間の後に続いて、プラークは血管形成術ガイドワイヤーで通過される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
慢性的に閉塞された動物の管及び腔を処置する方法が与えられている。その方法での最初の段階は、タンパク質分解酵素を含有している製剤を閉塞しているアテローム硬化型プラークの近傍に治療上有効な量投与し、次に続くのが、血管形成術ガイドワイヤーでプラークを通過させる前の血管形成術前の待機期間である。待機期間の後に続いて、プラークは血管形成術ガイドワイヤーで通過される。
【００１６】
本発明により、慢性閉塞の術式の結果を有意に改善する方法が記述される。マトリックスメタロプロテアーゼファミリーに属しているマトリックス分解酵素、セリンエステラーゼ、トリプシン、中性プロテアーゼ、キモトリプシン、アスパルターゼ、システイナーゼ、クロストリペインを含むタンパク質分解酵素を含有している製剤を治療上有効な量局所的に運搬する方法は、閉塞しているプラークのマトリックス内容物を効果的に変えることができるが、それは閉塞された動脈の中膜層や、隣接する非閉塞動脈セグメントにこれらの酵素の悪影響を及ぼすことなくガイドワイヤーの通過を有意に容易にし、実質上術式成功率を改善するような方法である。
【００１７】
[ヒト冠動脈での慢性完全閉塞の病理学]
CTOにおいて、基礎となるアテローム硬化型プラークは主に石灰化繊維質であり（Srivatsa  SS,  Edwards  WD,  Boos  CM,  Grill  DE,  Sangiorgi  GM,  Garratt  KN,  Schwartz  RS,  Holmes  DR  Jr.  Histologic  correlates  of  angiographic  chronic  total  coronary  artery  occlusions:  influence  of  occlusion  duration  on  neovascular  channel  patterns  and  intimal  plaque  composition.  J  Am  Coll  Cardiol  1997;29:955-63参照）、平滑筋細胞、細胞外のマトリックスとカルシウム、さまざまな量の細胞内、細胞外脂質からなっている（Meier  B.  Chronic  Total  Occlusion.  In:  Textbook  of  Interventional  Cardiology.  Editior:  E.  Topol.  W.B.Saunders,  Philadelphia  1994:318-338参照）。炎症細胞が一般に見られる（Srivatsa  SS,  Edwards  WD,  Boos  CM,  Grill  DE,  Sangiorgi  GM,  Garratt  KN,  Schwartz  RS,  Holmes  DR  Jr.  Histologic  correlates  of  angiographic  chronic  total  coronary  artery  occlusions:  influence  of  occlusion  duration  on  neovascular  channel  patterns  and  intimal  plaque  composition.  J  Am  Coll  Cardiol  1997;29:955-63参照）。コラーゲンは細胞外マトリックスの主な構造的構成要素であり、乾燥重量（Bartos  F,  Ledvina  M.  Collagen,  elastin,  and  desmosines  in  three  layers  of  bovine  aortae  of  different  ages.  Exp  Gerontol  1979;14:21-26及びHosoda  Y,  Kawano  K,  Yamasawa  F,  Ishii  T,  Shibata  T,  Inayama  S.  Age  dependent  changes  of  collagen  and  elastin  content  in  human  aorta  and  pulmonary  artery.  Angiology  1984;35:615-21参照）の５０％までを占めており、アテローム硬化型プラークの線維性ストロマの中ではタイプＩとＩＩＩが優勢を占めている（ＩＶ、Ｖ、ＶＩは少量である）（Mayne  R.  Collagenous  proteins  of  blood  vessels.  Arteriosclerosis  1986;6:585-593及びKatsuda  S,  Okada  Y,  Minamoto  T,  Oda  Y,  Matsui  Y,  Nakanishi  I.  Collagens  in  human  atherosclerosis:  immunohistochemical  analysis  using  collagen  type-specific  antibodies.  Arterioscler  Thromb  1992;12:494-502参照）。期間が一年未満のCTOでは、プロテオグリカンがまた、内膜の中に通常みられる。血栓形成はさまざまな程度に寄与し、基礎となるアテローム硬化型プラークの程度に依存しており、結果として単一層あるいは多層の血塊になりうる。時間が経つと、血栓は組織化され、コラーゲンに富む線維性の組織（フィブロインティマル  ハイパープラシア（fibrointimal  hyperplasia）として知られている）に変わり、結局は、基礎となるアテローム硬化型プラークに組み込まれる（Meier  B.  Chronic  Total  Occlusion.  In:  Textbook  of  Interventional  Cardiology.  Editior:  E.  Topol.  W.B.Saunders,  Philadelphia  1994:318-338参照）。最近発達したフィブロインティマル  ハイパープラシア（fibrointimal  hyperplasia）は、完全閉塞を通過するために血管形成術ガイドワイヤーが横切らなければならないもっとも可能性のある構造である。より昔に組織されたコラーゲンに富む線維組織は現在の血管形成術の技術では通過の成功にとって障害である。管腔内でもっとも最近に形成された線維性組織の存在が当発明のコラーゲン療法のターゲットである。内膜プラークの新生血管の通路がまた、閉塞期間に関わらず、CTO（７５％以上の）にはよく観られる（Srivatsa  SS,  Edwards  WD,  Boos  CM,  Grill  DE,  Sangiorgi  GM,  Garratt  KN,  Schwartz  RS,  Holmes  DR  Jr.  Histologic  correlates  of  angiographic  chronic  total  coronary  artery  occlusions:  influence  of  occlusion  duration  on  neovascular  channel  patterns  and  intimal  plaque  composition.  J  Am  Coll  Cardiol  1997;29:955-63参照）。閉塞を通るいくつかの新しい経路の形成（動脈内の動���）、そして/あるいは、脈管の血管の拡大（すなわち橋状側枝）は閉塞されたセグメントを通る血管に栄養素とコラゲナーゼのような潜在的な試薬を運搬する。しかしながら、これらの小さな経路は症状を防ぐために十分な末端冠状動脈灌流を与えるのに十分でない。
【００１８】
当発明は、慢性的に閉塞された動物の管及び腔の処置方法に向けられる。「動物の管及び腔」というフレーズは、当発明の方法が、医学的及び、獣医学的な適用があるという点において、ヒト及びその他の動物種にあてはまる。さらには、当発明の方法は、根幹、ファロピウス管、胆管、副鼻腔、尿管、尿道、動脈、静脈及び動脈の導管に用いられる静脈移植片のような線維性のコラーゲンに富む組織を含む閉塞された管や腔に適用されるかもしれない。ここで教えられた方法は本来、冠動脈の閉塞に関して開発されたが、腸骨動脈、大腿部動脈、頚動脈あるいは鎖骨下動脈のような、閉塞された非冠状動脈に用いることができる。ここで教えられた方法の日常的な適合は、静脈、静脈移植片、根管、ファロピウス管、胆管、副鼻腔、尿管、尿道を含む、閉塞された全身の管及び腔への適用が企図されている。
【００１９】
[動物モデル]
本発明は、病変がガイドワイヤーによって通過できないので、血管形成術が受け入れられない慢性閉塞動脈の処置に対してのこれまでに試みられたことのないアプローチに相当する。慢性閉塞の実験モデルはこれまでは利用可能ではなかった。今まで、慢性閉塞の独特な特質が慢性閉塞を通過するのを難しくしてきたが、その特質には、高コラーゲン内容物や治療に対して閉塞部分の直接的な接触を制限する閉塞の長さが含まれる。コラゲナーゼの効果を評価するのに、当発明にそって生体内慢性完全閉塞動物モデルが開発された（図１）。動物モデルは、限定はされないが、うさぎ、豚、犬、羊、ラットそして非人間霊長類を含むあらゆる典型的な研究室テスト動物に関連して確立されうる。投与量や時間は種やボディサイズでの変化を計算するために調整を必要とするかもしれない。症例とする目的のために、当発明の動物モデルは、重量３．０〜３．５ｋｇの雄のニュージーランド白ウサギに関してこれから記述される。
【００２０】
その方法の最初の工程は、動物動脈（図１に描かれているような大腿部の動脈）の動脈セグメントを分離し、閉塞用の結紮糸で、動物動脈の分離された動脈セグメントの中の血液の流れを止める。この段階は本発明の好適な実施例、すなわちイソフルランで雄ウサギを麻酔し、次に両側の鼠径部以下を切開することで達成される。それから、大腿部動脈のセグメントを分離するために、結紮糸は少なくとも約５ｍｍ間隔で縫合された。好適な実施例では、結紮糸は約１５ｍｍ間隔で縫合された。結紮糸は動脈セグメントを分離するだけでなく、物理的に閉塞する。
【００２１】
その方法の次の工程は、急性血栓性閉塞を形成するために、局所性トロンビンを動脈セグメントに注入することである。この段階は１００IUのウシトロンビン溶液（トロンボスタット（登録商標）、パルケ-デイビス）を分離された動脈セグメントに注入するために２７ゲージニードルを使用することで実行される。少なくとも２０分の待ち時間後、閉塞が形成されたかどうかを確かめるため、縫合が緩められた。このことは、順行的な血液の流れがまだ存在していたかどうかを確かめるために、結紮糸（典型的には縫合糸）を緩めることで達成される。もし、順行的な血液の流れがまだ存在するなら、急性閉塞が作られるまで一回ないしは２回の追加のトロンビン注射が同様の技術を使って行われる。典型的には、結紮糸は全部で６０分間適用され、それから取り除かれる。
【００２２】
待機期間がその後に続きが、その間に急性血栓性閉塞が慢性線維性閉塞に変換される。待機期間は１０週間〜２５週間である。適切な待つ期間を決定するために、動脈の開存性が血管造影法（動脈のアクセスのために左頚動脈を使用）によって平均１６週間（±４）で査定される。
【００２３】
慢性閉塞の生体内動物モデルを開発するという現在の方法は、根管、ファロピウス管、胆管、副鼻腔、尿管、尿道、静脈、静脈移植片のような線維性のあるコラーゲンに富む組織を含む他の全身的なもの及び腔に適用されうると信じられている。その方法は次のような段階から成っている。選択された動物管のセグメントを分離し、動物管の分離されたセグメントの中に、少なくとも約５ｍｍ間隔で閉塞用の結紮糸で縫合し、管を通る体液の流れを止め、それから（テトラサイクリンや他の選択した腔や管に最適な薬剤のような）局所的な硬化性の薬剤を、急性閉塞を形成するためセグメントに注入する。そして急性閉塞が慢性線維性閉塞に変わる間待機する。
【００２４】
[慢性完全閉塞モデルの病理学]
大腿部動脈の持続的な閉塞を示した最初の２検体のラビット（１０週と１５週目）において、慢性閉塞の病理組織の特徴が発達しているということを確認するために、動脈が取り除かれ、病理学的に調べられた。慢性的な、線維性のある閉塞には、明白なフィブリン残留物を欠く最小のものがあった（図１）。成熟した線維性組織に加えて、多数の小さな腔内の血管の経路があり、時には細胞外脂質沈着物、色素で満たされたマクロファージやリンパ球があった。内側の層には、血管の石灰化、及び/または、炎症があるという証は全くなかった。閉塞されたセグメントはまた、隣接する開存性の動脈セグメントに対して実質的な内向きのリモデリングを起こした。慢性閉塞モデルの共通の特徴は、介在する線維性の組織を持ついくつかの部位で内側の弾性的な薄膜の崩壊であった。これらの変化はすべて、慢性的ヒト冠動脈完全閉塞に類似している。
【００２５】
このモデルはたくさんの治療上の挑戦を特徴づけている。平均的な閉塞の長さは約２８ｍｍ（１４ｍｍ〜５６ｍｍの範囲）であり、前記冠動脈インターベンションが試みられるであろう、大部分の臨床的な冠状動脈閉塞よりも実質的に長い。また、閉塞された管腔と全体の血管サイズは内向きのリモデリングのため極めて小さかった。
【００２６】
[慢性的に閉塞された動物の管及び腔の処置方法]
本説明及び請求項ではタンパク質分解酵素を含む製剤」に対する言及がなされている。当発明はタンパク質分解酵素が、マトリックスメタロプロテイナーゼ、セリンエラスターゼ、トリプシン、中性プロテアーゼ、キモトリプシン、アスパルターゼ、システイナーゼ及びクロストリペインからなるグループから選択されるということを企図している。マトリックスメタロプロテイナーゼ（MMPｓ）は、フィブロネクチン、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカンそしてラミニンを含む細胞外マトリックス（ECM）構成成分の分解を引き起こす亜鉛を含む酵素の集まりである。これらのECM構成成分は閉塞しているアテローム硬化型プラークの重要な構成成分である。MMPは通常の胚形成、炎症、傷の治癒そして腫瘍浸潤に重要な役割を果たしている（Woessner  JF  Jr.  Matrix  metalloproteinases  and  their  inhibitors  in  connective  tissue  remodelling.  FASEB  J  1991;5:2145-2154及びMatrisian  LM.  The  matrix-degrading  metalloproteinases.  Bioessays  1992;14:455-463参照）。これらの酵素は大まかには３つのグループ：コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、ストロメライシンに分類される。コラゲナーゼは間質型コラーゲン分解の細胞外経路における最初の媒介物であり（Dollery  CM,  McEwan  JR,  Henney  AM.  Matrix  metalloproteinases  and  cardiovascular  disease.  Circ  Res  1995;77:863-868参照）、コラーゲン分子内の特定部位で切断し、その結果コラーゲン分子は細胞外空間にある他の中性プロテアーゼ（例えばゼラチナーゼ）に感受的になる。タンパク質分解性酵素を含む製剤はコラゲナーゼ、タイプ１Aコラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、ストロメライシンからなるグループから選択されたマトリックスメタロプロテイナーゼからなることが好ましい。タンパク質分解性の酵素を含む製剤は単独であるいは他の酵素との組み合わせであろうと、コラゲナーゼを含有することがもっとも好ましい。ここでの説明における「コラゲナーゼ製剤」の使用についての言及は当発明の好適な実施例を例証することを意図しており、限定することを意図していないということを理解されるべきである。
【００２７】
従来の血管形成術ガイドワイヤー（直径0.014インチまたは0.018インチ）（図２A）で横断できない冠動脈のような慢性的に閉塞された動物の管及び腔の処置方法は、次のような段階からなる。治療上有効な量のタンパク質分解性の酵素を含む製剤を閉塞しているアテローム硬化型プラークの近傍に投与する。血管形成術ガイドワイヤーでのプラークを通過させる前の血管形成術前の待機時間を待つ段階、それから血管形成術ガイドワイヤーでプラークを通過させる。
【００２８】
治療上有効な量のタンパク質分解性の酵素を含む製剤を投与する工程は次のように行われる。血管造影法によって冠動脈が完全に閉塞されているということを決定した後、ワイヤー上にある血管形成術バルーン式カテーテルが、蛍光透視法のガイダンスを使ってガイドワイヤー上を閉塞された冠動脈の中に向かって前進する。もし、閉塞が従来の0.014インチまたは0.018インチの冠動脈血管形成術ガイドワイヤーで通過できないなら（図２B）、ワイヤーは取り除かれる。血管形成術バルーンは、投与中コラゲナーゼ製剤の近位の流出を防ぐために、約１気圧から５気圧の範囲の低圧で膨らまされる。血管形成術バルーンの膨張は、約４気圧の圧力が望ましい（図２C）。コラゲナーゼを含む製剤は、膨張したバルーンと閉塞の間の小さな空間にゆっくりと入る。図２Cに描かれているように、コラゲナーゼを含む製剤は、血管形成術バルーンカテーテルのワイヤーポートを通して、直接注入される。注入は、約０．５気圧から３．５気圧の圧力で行われる。注入は、１気圧から２気圧の間の低圧で起こるのが好ましい。製剤はまた、注入針或いはカテーテルを通して、閉塞自体の近位部分に直接注入される。
【００２９】
注入後、製剤暴露の待機期間である約１０分から１００分の間、コラゲナーゼを含む製剤は膨張した血管形成術バルーンによって正しい位置に保持される。待ち時間は、約５０から８０分間であるのが好ましい。好適な実施例に従って、製剤暴露の待ち時間は約６０分間であり、その後血管形成術の設備は取り除かれる（図２Ｄ）。
【００３０】
タンパク質分解酵素を含む製剤の治療上効果的な量は、約５０〜２０００μｇのタイプIAコラゲナーゼからなるということが見出されている。
【００３１】
タンパク質分解酵素を含む製剤を治療上効果的な量投与し、血管形成術の器具を取り除いた後、約１〜１０８時間の血管形成術前待機時間が必要とされる。７２時間の待機時間後に一番良い結果が得られるが、約１２〜８６時間の待機時間が好ましいということが見出されている。待機時間は酵素を含んでいる製剤が閉塞セグメントの長さに沿って拡散し、コラーゲンを十分に分解し閉塞しているプラークを柔らかくするのに必要とされる。
【００３２】
動脈壁（内膜）のコラーゲンが管腔を閉塞しているプラークコラーゲンと同じくらいこの療法に脆弱であるとすれば、コラゲナーゼの量は極めて低く効果的でないか、極めて高く動脈壁の過剰なダメージ及び弱めることを避けられない。しかし、閉塞性のプラーク内に新しく形成されたコラーゲンはマトリックスメタロプロテイナーゼの効果にもっとも脆弱である。通常の動脈内膜層のコラーゲンは血管壁の発達初期に形成し、非常に遅い代謝回転で広範に交差結合している。対比して、閉塞性の血栓の組織化効果を生じる内膜のプラークの発達はさまざまな橋かけ結合やコラーゲンのようなMMPによる酵素的な分解に感受性を持つ、もっとも最近合成されたコラーゲンを含む非常にダイナミックな過程である。もっとも最近組織された血栓は、血管形成術ガイドワイヤーが完全閉塞を通過するために横切ることができるもっとも可能性のある病変の部分である。このようにして、この最近形成され、管腔内にある比較的緩い線維性の組織は、当発明の治療方法の重要な標的である。７２時間後に、患者は、カテーテル処置検査室に帰り、オペレーターは再び、従来の血管形成術ガイドワイヤーで完全閉塞を通過しようと試み、その後血管形成術が続く（図２E）。
【００３３】
その治療の成否及び有効性を査定するために、多数の試験管内、生体内での研究が行われてきた。それらの研究は、ヒストリチクス菌の醗酵から得られた商業的に利用可能な細菌性コラゲナーゼ製剤である、タイプ１Aのコラゲナーゼ（シグマ社製）で行われてきた。この酵素製剤は一般的に、細胞培養のために細胞を組織標本から分離するのに用いられる。この製剤はまた、少量のクロストリペイン、中性プロテアーゼ、トリプシンのような活性物を含む。タイプ１Aのコラゲナーゼ（シグマ社製）はヒストリチクス菌の醗酵から得られる細菌性のコラゲナーゼである。投与量の範囲はその範囲での効果及び動脈壁構造でのコラゲナーゼ製剤の保温期間を評価したインビトロアッセイの結果に基づいている。狭窄のアテローム硬化型プラークを含むヒトの冠動脈は死体解剖で得られる。動脈のセグメントは３ｍｍ断面に切られ、培養ウェルの中のアガーゲルに乗せられた。これにより、細いピペットでコラゲナーゼを直接管腔に選択的に運搬できた。こうして、閉塞性のあるプラークのみがコラゲナーゼ製剤と直接接触があり、これは生体内でのコラゲナーゼの腔での運搬方法に類似していた。４時間から１８時間の保温期間の後、上部の用量範囲では血管の深層にいくらかのダメージがあったが、１００〜５００μｇ/ml量のタイプ１Aコラゲナーゼは、閉塞しているプラークを明確に試験管内で分解しているということが示された。
【００３４】
閉塞の残留性を確認した後、ワイヤー上の血管形成術バルーン式カテーテル（直径３．０ｍｍ）が５Ｆ外筒を通して左頚動脈の中を進み、閉塞された大腿部動脈に近接した腸骨動脈に透視法によって導かれた。２つの従来の０．０１４インチ冠動脈血管形成術ガイドワイヤー[ウィズダム（登録商標）、（コルディス）及びチョイス  PT（登録商標）、（ボストンサイエンティフィック）（Boston  Scientific）]で閉塞を通過させる試みがなされた。もしオペレーターがガイドワイヤーで通過させることができないならば、病変は研究に入った。その後、血管形成術バルーン式カテーテルが閉塞部分にまで進められ、スケーリング装置として既知のバルーンの長さ（マーカー間２０ｍｍ）を用いて閉塞長が測られた。そのバルーンは、酵素溶液が隣接部に流れ出ることを防ぐため４気圧にまで膨らまされた。それからガイドワイヤーが取り除かれ、タイプ１Aコラゲナーゼ（n=33動脈、総量１００〜４５０μｇ）或いはプラセボ（n=24動脈）を含む１．５ｍｌの溶液を投与するためにワイヤーポートが用いられた。酵素製剤は、約１〜２気圧でゆっくりと運搬された。
【００３５】
血管形成術バルーン式は上限を６０分として膨張されたままだった。コラゲナーゼ投与の完了後１時間以内の慢性閉塞（n=10）を横断しようとする最初の試みは、すべて失敗だった。他の試みは、すべてコラゲナーゼ（n=23）及びプロセボ（n=24）いずれかの投与後７２時間経って行われた。最初のコラゲナーゼ処理された動脈の２検体のうちの１検体７２時間後にうまく通過された後、残りの動脈（n=45）はオペレーターが知ることなしにランダムにプラセボ或いはコラゲナーゼ処理された。７２時間後の閉塞を通過する試みは、右頚動脈を切断し、上記に述べられたように血管形成術バルーン式カテーテルを置くことで動脈の循環を評価した後になされた。血管形成術ガイドワイヤー（ウィズダム（登録商標）及びチョイス（登録商標））で通過される距離を評価し、真腔の中にガイドワイヤーが残っているのを確かにするために頻繁にコントラストの注入が行われた。病変が通過されるか、大きな解離が作られか、異なったワイヤーで多数の試みがなされた上でさらなる進歩がみられない時まで、ワイヤーを通そうとする試みが続けられた。病変をうまく通過させたことは、閉塞セグメントを越えて末端血管床でのワイヤーの先端の自由な動きにより血管造影法的に確認された。ワイヤー通過の後、血管形成術は全く行われず、その結果動脈の構造は分析のために無傷のままであろう。術式の終わりにウサギは殺され、大腿動脈が解剖され、組織学的分析に送られた（モバット及びエイチアンドディー（Movat  and  H&E））)閉塞セグメントにつき、少なくとも３つの横断面が調べられた。
【００３６】
[統計]
ガイドワイヤーを用いての閉塞通過の成功率の差異を評価するのにフィッシャーの直接確率検定が用いられた。ｐ値＜0.05が統計的に有意であると考えられた。
【００３７】
[閉塞長]
コラゲナーゼ処理された動脈（２９．５+/-８．６ｍｍ）とプラセボ処理された動脈（２７，９+/-８．７ｍｍ）の間で閉塞長に有意な差はなかった。
【００３８】
[７２時間後、慢性閉塞を通過させる際の血管造影の成功率]
プラセボ処理された動脈（７/24、29％）に比べてコラゲナーゼ処理された動脈（14/23、61％）に、ガイドワイヤーの通過の成功について有意の増加があった。
【表１】
2005503820.tif 000003
【００３９】
[通過の試み後の動脈病理学]
血管造影がガイドワイヤーの通過の成功を示した場合には、組織学により、ガイドワイヤーが閉塞性の内膜プラークを通過した場所に、血液で満たされた血管の通路の存在を確認した（図４Ａ及び図５Ａ）。また、いくつかのプラーク崩壊の証拠があった。血管造影法的精査のないワイヤーの通過に失敗した場合には、病変は、高密度な線維性のプラーク、プラーク血管新生、いくつかの炎症細胞浸潤及び、線維性の組織で構成された内部弾性板にしばしば亀裂が観られる慢性完全閉塞モデルと同一であった（図４Ｂ及び図５Ｂ）。これらのケースにはワイヤーに傷があるという証拠は全くなかった。血管造影法的精査によるワイヤー通過の失敗の場合には、これらのワイヤーの経路が、中膜そして時には、外膜又は外膜の周囲の空間にある内膜プラークの外側にあることが明白であった。コラーゲン処理された動脈とプラセボ処理された動脈の間には血管壁のダメージ（内弾性板または内壁の崩壊のような）の程度には同定可能な差は全くなかった。
【００４０】
[慢性完全閉塞でのコラゲナーゼ効果の２４時間分析]
コラゲナーゼ製剤が実際のところ、閉塞性動脈プラークで構造及び細胞外マトリックスタンパク質に影響を及ぼしているというのを決定するために、さらに６つの動脈（３コラゲナーゼ[４５０μｇ]、３プラセボ）が薬物投与後２４時間で取り除かれた。混乱させるよなガイドワイヤーの効果なしでのコラーゲンの効果を評価するために、これらの閉塞を通過させるガイドワイヤーの試みはなされなかった。その動脈は、またＭＭＰ−１タンパク質、コラーゲン分解産物及びゼラチナーゼ活性の存在が評価された。
【００４１】
[間質型コラゲナーゼ（ＭＭＰ−１）ウェスタンブロット分析]
凍結された動脈は液体窒素の中で微粉砕され、氷冷抽出バッファー（ココドリック酸(cocodylic  acid)  10mM,  塩化ナトリウム（NaＣl）  150mM,  塩化亜鉛（ZnCl2）20mM,  （アジカナトリウム（NaN3 ）1.5mM  そしてSDS（ドデシル硫酸ナトリウム）  1%  w/v）で抽出された。コラーゲン分解産物の同定のために５０μｇのタンパク質を含む抽出物が還元性条件下、４〜２０％トリス-グリシンゲルで分画され、ニトロセルロースメンブレン上に電気転移された（バイオラド社製）。COL  2  3/4  C  ポリクローナルウサギIgG（HDM  Diagnostics  &  Imaging  Inc,  Toronto）が一次抗体として１０００倍希釈で使われ、抗ウサギIgG-HRP（サンタクルーズバイオテクノロジー社製）が２次抗体として用いられた。間質型コラゲナーゼ（ＭＭＰ−１）タンパク質を同定するために、５０μｇのタンパク質を含む抽出物が非還元性条件下で分離され、ニトロセルロース膜上に電気ブロットされた。抗ＭＭＰ−１モノクローナル抗体(カルバイオケム（Calbiochem））が１００倍希釈で一次抗体として使用され、抗マウスIgG-HRP（サンタクルーズバイオテクノロジー社製）が２次抗体として使用された。２次抗体を明らかにするため化学発光検出システム（イーシーエル（ECL）  プラス、アマシャム）が使われ、オートラジオグラフィが後に続いた。
【００４２】
コラゲナーゼ及びプラセボ処理された動脈、どちらにおいても間質型コラゲナーゼ（ＭＭＰ−１）ウェスタンブロット分析は、約９３ｋＤでバンドの存在を示したが、これは間質コラゲナーゼ（ＭＭＰ−１）の存在を確認している（図７）。このバンドはプラセボ処理された動脈よりもコラゲナーゼ処理された動脈において顕著に増加したが、これは処置後２４時間でコラゲナーゼ処理された動脈中に間質コラゲナーゼ（ＭＭＰ−１）が増加したことを示している。
【００４３】
[ゼラチナーゼ酵素電気泳動法]
ゼラチンザイモグラフィは、以前記述されているように行われた（Strauss  BH,  Robinson  R,  Batchelor  WB,  Chisholm  RJ,  Ravi  G,  Natarajan  MK,  Logan  RA,  Mehta  SR,  Levy  DE,  Ezrin  AM,  Keeley.  In  vivo  collagen  turnover  following  experimental  balloon  angioplasty  injury  and  the  role  of  matrix  metalloproteinases.  Circ  Res  1996;79:541-550参照）。ゼラチンザイモグラフィは、コラゲナーゼ処理された動脈にのみ９２ｋＤのゼラチナーゼ（ＭＭＰ−９）の増加を示したが、プラセボ処理された動脈には全く明確な活性がなかった（図８）。溶解性のバンドは９２及び８２ｋＤに存在していたが、酵素前駆体とＭＭＰ−９の活性化型の両方を反映している。コラゲナーゼ及びプラセボ処理された動脈はどちらも７２-ｋＤゼラチナーゼ（ＭＭＰ−２）の証拠があった。
【００４４】
[コラーゲン分解産物]
分解されたコラーゲンは、還元性下で、開列したヒトタイプＩＩコラーゲンに対するポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロット解析によって評価された。コラーゲン分解産物はプラセボ処理された動脈とコラゲナーゼ処理された動脈の両方で同定されたが、コラゲナーゼ処理された動脈で著しい増加を示した（図９）。
【００４５】
[コラゲナーゼ或いはプラセボ処理された慢性閉塞動脈の病理学]
プラセボ処理された動脈のいずれにも存在しなかったが、コラゲナーゼ処理された動脈の３つ中２つで閉塞性のプラークの広範な分解が観られた（図１０）。プラセボ処理された動脈は以前に慢性完全閉塞モデルで描写された動脈と同一の病理があった。
【００４６】
慢性動脈閉塞を研究するための実験上のモデル、ガイドワイヤーの通過を容易にすることができるコラゲナーゼ含有製剤の構成要素と量が見出されてきた。急性血栓症を促進するために、トロンビン注入で補い、一時的に閉塞性のある結紮糸を適用することにより、ウサギの大腿動脈に慢性動脈閉塞モデルが開発され、そして急性血栓性閉塞が、慢性ヒト動脈閉塞に類似した慢性線維性閉塞に発達するのに平均１６週間待つ。４５０μｇのコラゲナーゼ含有製剤の局所的な運搬は、バルーンが膨張している間の６０分間以上にわたるワイヤー上にある血管形成術バルーンのワイヤーポートを通じて行われるが、それはコラーゲンの分解、ＭＭＰ-１及びＭＭＰ-９の増加及びプラセボ処理された動脈に比較して２４時間後の閉塞動脈内でのプラーク構成要素の実証可能な溶解を引き起こす。コラゲナーゼの局所的運搬は７２時間後のガイドワイヤーの通過成功率を増加させるが、コラゲナーゼ投与後１時間ではあてはまらない。このようにして、ガイドワイヤーの通過に先立ってコラゲナーゼがプラークを分解するのを可能にするのに２４〜７２時間の待機時間が必要とされる。閉塞プラークにおけるコラゲナーゼのこれらの効果は血管壁（内膜及び外膜）の外部層にダメージを与えたり、動脈瘤が形成することなく得られる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
図示と説明のために、本発明の好適な実施例が選択されたが、決して本発明の範囲を制限するものではない。本発明のある態様の好適な実施例が後に続く図面に示されている。
【図１】図１Ａから図１Ｄは、慢性的に閉塞されたラビットの大腿動脈の病状を示す図である（１２週間）Ｍ=内膜、Ａ＝外膜、Ａ、Ｂ=モバット（Movat）10ｘオリジナル(original)  C＝モバット（Movat）,20x;  D＝ヘマトリリンとエオジン(Hematolylin  and  Eosin)  20X。
図１Ａは、管腔（Ｌ）が線維性内膜病変により閉塞されていることを示す図である。
図１Ｂは、閉塞された管腔はまた小血管通路を含んでいることを示す図である。
図１Ｃは、小血管通路（矢印で示されている）の拡大図を示す図である。
図１Ｄは、閉塞された管腔（Ｌ）の線維性及び細胞性の構成成分を示す図である。
【図２】図２Ａから図２Ｄは、本発明に従う慢性的に閉塞された管及び腔の処置方法の実施例を示す図である。
図２Ａは、慢性完全動脈閉塞を示す図である。
図２Ｂは、ワイヤー上にある血管形成術バルーン式カテーテルを用いて閉塞を通過させるのに、２つの異なったガイドワイヤー(チョイス  PT（登録商標）及びウィズダム（登録商標）)では通過させることができなかったことを示す図である。
図２Ｃは、完全閉塞に最近接した膨張した血管形成術バルーン式カテーテルを示す図である。ガイドワイヤーが血管形成術バルーン式カテーテルのワイヤーポートから取り除かれコラゲナーゼが膨張した血管形成術バルーン（近位の流出を防ぐために）と閉塞された動脈のセグメントの間に注入される。
図２Ｄは、コラゲナーゼ溶液が動脈閉塞に沿って拡散し閉塞されたセグメントの一部分を分解していること示す図である。
図２Ｅは、コラゲナーゼ配置後７２時間後にガイドワイヤーが動脈閉塞を通過させることができたことを示す図である。閉塞性の動脈セグメントはコラゲナーゼによって部分的に分解され、ガイドワイヤーが動脈閉塞を超えて動脈の真腔を通過し、妨害のない動脈に入っていくことができる。
【図３】図３Ａから図３Ｆは、ウサギ大腿動脈慢性完全閉塞モデルにおけるワイヤー通過の試みの血管造影法の結果を示す図である。Ａ-C  コラゲナーゼ注入７２時間後の試みに成功  Ｄ-F：プラセボ注入７２時間後の試みに不成功  BI＝嚢のコントラスト  図３Ａは、コラゲナーゼ処理された動脈をガイドワイヤーで通過させようとする前に、血管造影図中の２本の矢印間に閉塞が明らかに観られることを示す図である。
図３Ｂは、ガイドワイヤー（矢印で指し示されている）で閉塞を通過させるのに成功したことを示す図である。
図３Ｃは、ガイドワイヤーでの通過後、解離が全く観られないことを示す図である。
図３Ｄは、プラセボ処理された動脈をガイドワイヤーで通過させようとする前に、血管造影図中の２本の矢印間に閉塞が明らかに存在していることを示す図である。
図３Ｅは、閉塞を横切ってガイドワイヤー（矢印）を前進させることができないことを示す図である。
図３Ｆは、完全閉塞の通過の試みに不成功の際、ガイドワイヤー解離（Ｄ）による管外遊出物コントラストが明らかに観られることを示す図である。
【図４Ａ】図４Ａは、コラゲナーゼ処理（４５０μｇ）された動脈内のワイヤー通過（赤血球で満たされた領域）の成功を示す図である。いくつかのプラークの消化が明らかに観られる。内弾性板（矢印）と中間層は無傷のままである。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ワイヤー通過が不成功のプラセボ処理された動脈を示す図である。広範で閉塞性の内膜プラーク（P）が存在する。
【図５】図５は、コラゲナーゼ注入後７２時間のガイドワイヤーの通過を示す図である。モバット（Movat）10ｘオリジナル(original)  Ｐ＝内膜プラーク（管腔閉塞する）、Ｗ＝ワイヤー通過部位、Ｍ＝中間層、Ad=外膜層  図５Ａは、コラゲナーゼ処理（４５０μｇ）された動脈内のワイヤー通過（赤血球で満たされた領域）の成功を示す図である。いくつかのプラークの消化が明らかに観られる。内弾性板（矢印）と中膜層は無傷のままである。
図５Ｂは、ワイヤー通過が不成功のプラセボ処理された動脈を示す図である。微小血管を持つ広範で閉塞性の内膜プラーク（Ｐ）が存在する。中膜の一部（３時と５時の間）が分解され、萎縮している。
【図６】図６は、処置後７２時間後における、プラセボ処理された動脈に比べてコラゲナーゼ処理された動脈に、ガイドワイヤー通過の成功に統計的に有意の差（ｐ＜0.03）があることを示す図である。無作為に処置され、オペレーターは処置の割り当てが見えなかった。
【図７】図７は、コラゲナーゼ及びプラセボ処理された動脈の処置後２４時間後における間質型コラゲナーゼ（MMP-1）のウェスタンブロット解析を示す図である。いずれかの処置を受ける慢性動脈閉塞は、およそ９３kDのところにバンドの存在を示したが、これは間質型コラゲナーゼ（MMP-1）の存在を確認している。このバンドはプラセボ処理された動脈（レーン３及び４）に比べてコラゲナーゼ処理された動脈（レーン１及び２）では著しく増大したが、これはコラゲナーゼ処理された動脈に間質型コラゲナーゼタンパク質が増加したことを示している。レーン５はコラゲナーゼ製剤の中にMMP-1タンパク質が存在していることを示しており、正の制御として流された。
【図８】図８は、慢性閉塞動脈を、コラゲナーゼ処理（レーン１）、及びプラセボ処理（レーン２）し、２４時間経過したそれぞれの動脈からのゼラチンザイモグラムを示す図である。コラゲナーゼ処理された動脈にのみ92ｋＤのゼラチナーゼ（MMP-９）の増加があり、プラセボ処理された動脈にはMMP-９活性は見られなかった。92ｋＤ及び８２ｋＤの位置に溶解性のバンドが存在していたが、これは、コラゲナーゼ処理された動脈中のMMP―９酵素前駆体及びMMP―９活性型の両方を反映している。また、コラゲナーゼ処理及びプラセボ処理された動脈は両方とも７２kDのゼラチナーゼ（MMP-2）のバンドが見られた。
【図９】図９は、慢性閉塞動脈内で、コラゲナーゼ処理（レーン１及び２）あるいはプラセボ処理（レーン３及び４）した後２４時間後の分解されたコラーゲン断片（コラーゲン断片のカルボキシ末端）に対するウェスタンブロット解析を示す図である。コラゲナーゼ処理された動脈のコラーゲン断片に著しい増加があった。
【図１０】図１０は、ガイドワイヤーで通過を試みようとしないでコラゲナーゼ処理及びプラセボ処理２４時間後の効果を示す図である。モバット（Movat）10ｘオリジナル(original)  Ｐ=内膜プラーク（管腔を閉塞する）、Ｍ＝中膜層、Ａｄ＝外膜層  図１０Ａは、以前は閉塞されていた管腔（Ｌ）内に広くプラークの消化があるコラゲナーゼ処理された動脈を示す図である。内弾性板（矢印）と中膜層は無傷のままである。
図１０Ｂは、微小血管を持つ広範で閉鎖性のある内膜プラーク（Ｐ）が存在するプラセボ処理された動脈が存在していることを示す図である。また、閉塞後の慢性リモデリング中に内弾性板（矢印で示されている）の極めて広範な崩壊及び中膜の萎縮がある。プラセボ処理された動脈は慢性完全閉塞モデルでこれまでに述べられた動脈に同一の病変を持っていた。
【図１】
2005503820.tif 000004
【図２】
2005503820.tif 000005
【図３】
2005503820.tif 000006
【図４Ａ】
2005503820.tif 000007
【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2005503820.tif 000012
【図９】
2005503820.tif 000013
【図１０】
2005503820.tif 000014
【国際公開パンフレット】
2005503820.tif 000015
2005503820.tif 000016
2005503820.tif 000017
2005503820.tif 000018
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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