(57)【要約】  本発明は、カテキン化合物、アスコルビン酸、プロリンおよびリジンを含む調製物に関する。また本発明は、カテキン化合物、アスコルビン酸、プロリンおよびリジンを含む調製物を使って新生物性疾患を治療する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
マトリックスメタロプロテイナーゼを阻害するのに有効な、カテキン化合物、抗酸化剤、プロリンおよびリジンを含む生化学物質の調製物。
【請求項２】
前記カテキン化合物が、エピカテキン類、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、およびエピガロカテキンガレートからなる群より選択される、請求項１に記載の調製物。
【請求項３】
前記カテキン化合物がエピガロカテキンガレートである、請求項１に記載の調製物。
【請求項４】
前記抗酸化剤が、アスコルビン酸、トコフェロール類、トコトリエノール類、カロチノイド類、グルタチオン、α−リポ酸、ユビキノール類、バイオフラボノイド類、およびカルニチンからなる群より選択される、請求項１に記載の調製物。
【請求項５】
前記抗酸化剤がアスコルビン酸である、請求項１に記載の調製物。
【請求項６】
前記アスコルビン酸が、アスコルビン酸前駆体、アスコルビン酸代謝産物およびアスコルビン酸塩からなる群より選択される、請求項５に記載の調製物。
【請求項７】
前記抗酸化剤がさらに葉酸を含む、請求項１に記載の調製物。
【請求項８】
前記葉酸がフォレートである、請求項７に記載の調製物。
【請求項９】
さらにセレンを含む、請求項１に記載の調製物。
【請求項１０】
前記セレンが、セレナイトおよびセレン酸メチルからなる群より選択される、請求項９に記載の調製物。
【請求項１１】
前記マトリックスメタロプロテイナーゼが、マトリックスメタロプロテイナーゼ１、マトリックスメタロプロテイナーゼ２、マトリックスメタロプロテイナーゼ３、マトリックスメタロプロテイナーゼ４、マトリックスメタロプロテイナーゼ５、マトリックスメタロプロテイナーゼ６、マトリックスメタロプロテイナーゼ７、マトリックスメタロプロテイナーゼ８、マトリックスメタロプロテイナーゼ９、マトリックスメタロプロテイナーゼ１０、マトリックスメタロプロテイナーゼ１１、マトリックスメタロプロテイナーゼ１２、およびマトリックスメタロプロテイナーゼ１４からなる群より選択される、請求項１に記載の調製物。
【請求項１２】
前記マトリックスメタロプロテイナーゼがマトリックスメタロプロテイナーゼ２である、請求項１に記載の調製物。
【請求項１３】
前記マトリックスメタロプロテイナーゼがマトリックスメタロプロテイナーゼ９である、請求項１に記載の調製物。
【請求項１４】
必要としている患者に、マトリックスメタロプロテイナーゼを阻害するのに有効な、カテキン化合物、抗酸化剤、プロリンおよびリジンを含む生化学物質の調製物を投与することによって、マトリックスメタロプロテイナーゼ活性の上昇に関連するヒト疾患を治療する方法。
【請求項１５】
前記カテキン化合物が、エピカテキン類、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、およびエピガロカテキンガレートからなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記カテキン化合物がエピガロカテキンガレートである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗酸化剤が、アスコルビン酸、トコフェロール類、トコトリエノール類、カロチノイド類、グルタチオン、α−リポ酸、ユビキノール類、バイオフラボノイド類、およびカルニチンからなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗酸化剤がアスコルビン酸である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記アスコルビン酸が、アスコルビン酸前駆体、アスコルビン酸代謝産物およびアスコルビン酸塩からなる群より選択されるアスコルベートをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗酸化剤がさらに葉酸を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記葉酸がフォレートである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記調製物がさらにセレンを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
前記セレンが、セレナイトおよびセレン酸メチルからなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
前記ヒト疾患が、新生物性疾患、炎症性疾患、感染性疾患、心血管疾患、変性疾患、神経疾患および自己免疫疾患からなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２５】
カテキン化合物、抗酸化剤、プロリンおよびリジンを含む調製物の有効量を投与することを含む、細胞外マトリックスの過剰な分解に関係する新生物性疾患を治療する方法。
【請求項２６】
前記カテキンが、エピカテキン類、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、およびエピガロカテキンガレートからなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記カテキンがエピガロカテキンガレートである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗酸化剤が、アスコルビン酸、トコフェロール類、トコトリエノール類、カロチノイド類、グルタチオン、α−リポ酸、ユビキノール類、バイオフラボノイド類、およびカルニチンからなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗酸化剤がアスコルビン酸である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記アスコルビン酸がさらにアスコルビン酸前駆体、アスコルビン酸代謝産物およびアスコルビン酸塩を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗酸化剤がさらに葉酸を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
前記葉酸がフォレートである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記調製物がさらにセレンを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３４】
前記セレンが、セレナイトおよびセレン酸メチルからなる群より選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
請求項１に記載の薬理学的調合物。
【請求項３６】
薬理学的調合物が経口投与、非経口投与または局所適用に使用される、請求項１に記載の薬学的調合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カテキン化合物を他の食物成分と組み合わせてマトリックスメタロプロテイナーゼの阻害に使用することに関する。より具体的には、本発明は、カテキン、アスコルビン酸、リジンおよびプロリンを含む調製物を、新生物性疾患の治療に使用することに関する。
【背景技術】
【０００２】
緑茶には、カテキン類とも呼ばれるポリフェノール化合物が存在し、癌を含む様々な疾病に対する防護になると言われている（Ｍｕｋｈｔａｒ  Ｈ．，Ａｈｍｅｄ  Ｎ．  Ａｍ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｎｕｔｒ．  ７１：１６９８Ｓ−１７０２Ｓ頁、２０００年）。Ｓａｄｚｕｋａらは、緑茶の経口投与によってドキソルビシンの腫瘍阻害効果が強化されることを、マウスで示した。
【０００３】
カテキン類の抗癌活性は、癌細胞の増殖およびそれらの転移に関わるいくつかの因子に対するカテキン類の作用に関係しうる。カテキン類は、ヒト癌腫細胞で、細胞周期停止を引き起こすことが知られている（Ａｈｍａｄ  Ｎ．，Ｆｅｙｅｓ  Ｄ．Ｋ．，Ｎｉｅｍｉｎｅｎ  Ａ．Ｌ．，Ａｇａｒｗａｌ  Ｒ．，Ｍｕｋｈｔａｒ  Ｈ．Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  ８９：１８８１−１８８６頁、１９９７年）。緑茶から得られるポリフェノール画分は、腫瘍によって誘導されるサイトカインや炎症を防ぐことが示されている。
【０００４】
ポリフェノール化合物は緑茶中に乾燥重量で３０％含まれている。これにはフラバノール類、フラバンジオール類、フラボノイド類、およびフェノール酸類が含まれる。フラバノール類は緑茶のポリフェノール類では最も豊富に存在し、一般にカテキン類と呼ばれている。緑茶には、４つの主要カテキン類、すなわち１）（−）−エピカテキン、２）（−）−エピカテキン−３−ガレート、３）（−）−エピガロカテキン、および４）（−）−エピガロカテキン−３−ガレート（ＥＧＣＧ）が含まれている。これらカテキン類のうち、ＥＧＣＧは緑茶に含まれる主要ポリフェノール成分である。
【０００５】
ＥＧＣＧは強力な抗酸化化合物であり（Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２６５：２３６−２５７頁、１９９６年）、緑茶の抗癌活性の一因となりうる。カテキン化合物は血管新生過程を妨げることによってその抗転移活性を発揮すると報告されている（Ｃａｏ  Ｙ．，Ｃａｏ  Ｒ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３９８：３８１頁、１９９９年）。ＥＧＣＧは、ヒトの癌でもっとも高頻度に発現される酵素の一つであるウロキナーゼ（ｕ−プラスミノーゲン活性化因子）の活性を妨害することも示されている（Ｊａｎｋｕｎ  Ｊ．，Ｓｅｌｍａｎ  Ｓ．Ｈ．，Ｓｗｉｅｒｃｚ  Ｒ．，Ｓｋｒｚｙｐｃｚａｋ  Ｊ．Ｅ．  Ｎａｔｕｒｅ：３８７−５６７頁、１９９７年）。
【０００６】
しかし、ヒトでのポリフェノール類の生物学的利用率は、極めて低いことが立証されている（Ｃｈｅｎ  Ｌ．，Ｌｅｅ  Ｍ．Ｊ．，Ｙａｎｇ  Ｃ．Ｓ．  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．  Ｄｉｓｐｏｓ．  ２５：１０４５−１０５０頁、１９９７年；Ｙａｎｇ  Ｃ．Ｓ．，Ｃｈｅｎ  Ｌ．，Ｌｅｅ  Ｍ．Ｊ．，Ｂａｌｅｎｔｉｎｅ  Ｄ．Ａ．，Ｋｕｏ  Ｍ．Ｃ．，Ｓｃｈａｎｔｚ  Ｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｏｌ．  Ｂｉｏｍａｒｋ．  Ｐｒｅｖ．  ７：３５１−３５頁、１９９８年；Ｂｅｌｌ  Ｊ．Ｒ．，Ｄｏｎｏｖａｎ  Ｊ．Ｌ．，Ｗｏｎｇ  Ｒ．，Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  Ｈ．，Ｇｅｒｍａｎ  Ｊ．Ｂ．，Ｗａｌｚｅｍ  Ｒ．Ｌ．，Ｋａｓｉｍ  Ｋ．  Ａｍ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｎｕｔｒ．  ７１：１０３−１０８頁、２０００年；Ｓｈｅｒｒｙ  Ｃｈｏｗ  Ｈ．Ｈ．，Ｃａｉ  Ｙ．，Ａｌｂｅｒｔｓ  Ｄ．Ｓ．，Ｈａｋｉｍ  Ｉ．，Ｄｏｒｒ  Ｒ．，Ｓｈａｈｉ  Ｆ．，Ｃｒｏｗｅｌｌ  Ｊ．Ａ．，Ｙａｎｇ  Ｓ．Ｃ．，Ｈａｒａ  Ｈ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｏｌ．  Ｂｉｏｍａｒｋ．  Ｐｒｅｖ．  １０：５３−５８頁、２００１年。ここに挙げた文献は参照により本明細書にそのまま組み込まれる。この低い組織濃度が、ＥＧＣＧを含むポリフェノール類の治療的価値を著しく低下させている。新生物性疾患の治療に有効な、より良いポリフェノール類含有調製物を見いだすことが、常に求められている。本発明者らは、驚くべきことに、新生物性疾患に対して強力な抗増殖および抗転移活性を発揮することができる、カテキン類、アスコルビン酸、プロリンおよびリジンを含む調製物を見い出した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ヒトの疾患を治療するのに有効な、カテキン、抗酸化剤、プロリンおよびリジンを含む生化学物質の調製物に関する。
【０００８】
本発明は、マトリックスメタロプロテイナーゼを阻害するのに有効な、カテキン、抗酸化剤、プロリンおよびリジンを含む生化学物質の調製物に関する。
【０００９】
本発明は、細胞外マトリックスの過剰な分解に関係する新生物性疾患を治療する方法であって、カテキン化合物、抗酸化剤、プロリンおよびリジンを含む調製物の有効量を投与することを含む方法に関する。
【００１０】
図１は乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ２３１）の細胞増殖に対するＥＧＣＧの阻害効果を表す。
【００１１】
図２は乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ２３１）の細胞増殖に対するＥＧＣＧ、アスコルビン酸、プロリンおよびリジンの組合せの相乗的阻害効果を表す。
【００１２】
図３は結腸癌細胞（ＨＣＴ１１６）の細胞増殖に対するＥＧＣＧ、アスコルビン酸、プロリンおよびリジンの組合せの相乗的阻害効果を表す。
【００１３】
図４はＥＧＣＧ（２０μｇ／ｍｌ）が乳癌細胞によるマトリゲル浸潤を約２５％阻害することを表す。アスコルビン酸、プロリンおよびリジンの組合せは約６５％阻害する。アスコルビン酸、プロリンおよびリジンをＥＧＣＧ（２０μｇ／ｍｌ）と組み合わせると、マトリゲル浸潤が完全に（約１００％）阻害される。
【００１４】
図５はアスコルビン酸、プロリンおよびリジンとＥＧＣＧ（２０μｇ／ｍｌ）との組合せが、メラノーマ細胞（Ａ２０５８）によるマトリゲル浸潤を相乗的に１００％まで阻害することを表す。
【００１５】
図６は乳癌細胞によって分泌されるＭＭＰ２の活性をＥＧＣＧが低下させることを示すザイモグラムを表す。
【００１６】
図７はマトリゲル浸潤アッセイ後のメラノーマ細胞の正常な形態を表す。
【００１７】
もう一つの実施形態として、本発明は、新生物性疾患および様々な他の疾病に対して相乗効果が得られるように、茶抽出物、赤ワイン中に存在するカテキン類を、他の食物成分と一緒に含む調製物に関する。本願が取り扱う食物成分には、本願に詳述するものが含まれるが、それらに限るわけではない。
【００１８】
カテキン化合物は、ビタミンＥやグルタチオンなど他の抗酸化剤、他のフラビノイド類、葉酸のような促進剤、およびマトリックスメタロプロテイナーゼの活性を適切に修飾することが知られているセレンのような金属と組み合わせて使用することができ、そうすることにより、ＥＧＣＧがその抗腫瘍活性を明示しうる濃度である有効濃度を、下げることが可能になるだろう。
【００１９】
もう一つの実施形態として、本発明は、正常体細胞から癌性細胞へのトランスフォーメーションを減少させるのに有効な、カテキン類含有調製物に関する。
【００２０】
もう一つの実施形態として、本発明は、癌性細胞の細胞増殖を防止すること、ならびに細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を消化する様々なマトリックスメタロプロテイナーゼの合成、分泌および／または活性を減少させることに有効な、カテキン類含有調製物に関する。
【００２１】
もう一つの実施形態として、本発明は、カテキン類、アスコルビン酸、プロリンおよびリジンを含む上述の調製物を、経口投与するか、または局所適用で投与することによって、新生物性状態を予防および治療する方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、これらは本発明の限定を意味するわけではない。
【００２３】
一般実験条件
（ａ）細胞株
ＡＴＣＣから入手した以下の癌細胞株を研究に使用した。
（ｉ）ヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ２３１
（ｉｉ）ヒト結腸癌細胞ＨＣＴ１１６
（ｉｉｉ）ヒトメラノーマ細胞Ａ２０５８
（ｂ）細胞増殖研究
ヒト癌細胞の細胞増殖に対するカテキン類および食物調製物の効果を調べるために、ＡＴＣＣ（細胞株の供給者）によって指定された培養条件を使って、様々なヒト癌細胞株を２４穴プレートで培養した。細胞を（コンフルエントに達するまで）一般に３〜４日間培養した。生体染色剤（ＭＴＴ）で細胞を染色した後、染色剤溶液のＯＤを決定することによって、培養ウェル中の細胞の総数を決定した。ＭＴＴは死細胞だけを染色し、染色剤取り込み量は培養物中の死細胞の数と相関関係にある。阻害百分率は治療群のＯＤを対照群のＯＤと比較することによって計算した。
（ｃ）マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）浸潤研究
マトリゲル（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）インサートを、適合する２４穴プレートで使用して、マトリゲル浸潤研究を行った。このアッセイは癌転移を評価するための信頼できるアッセイである。
【００２４】
約１０％の血清を含む培養培地を使って、ヒト線維芽細胞を２４穴プレートに播種し、生育させた。線維芽細胞がコンフルエントに達したら、血清を含む培養培地を取り除き、新鮮な無血清培地で置き換えた。カテキン化合物と食物調製物との組合せを無血清培地に添加し、ヒト癌細胞をマトリゲルインサートの上面に播種した。
【００２５】
１８時間後に培地を取り除いた。一部の培地をザイモグラム研究のためにとっておいた。インサートの上面にある細胞を綿棒でそっとこすり落とした。マトリゲル膜を貫通してマトリゲルの下面に移動した細胞をクイック・ステイン（Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｉｎ）で染色し、顕微鏡下で計数した。
（ｄ）ザイモグラム研究
マトリゲル浸潤研究で得た培地（２５〜３０μｌ）をノベックス（Ｎｏｖｅｘ）ザイモグラムゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にのせた。そのゲルプレートを、製造者の推奨するとおりに展開し、染色した。マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）バンドを、それらの既知の分子量に基づいて同定した。
（ｅ）形態学的研究
マトリゲル膜の下面に移動したヒト癌細胞の形態をクイック・ステインで染色し、顕微鏡下（１００倍）で撮影した。
【実施例１】
【００２６】
ヒト乳癌細胞（ＭＤＡ  ＭＢ２３１）の細胞増殖に対するエピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）の阻害効果
これらの研究では、５×１０４個の乳癌細胞（ＭＤＡ  ＭＢ２３１）を、２４穴プレートの各ウェルに播種した。対照群とは、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加したライボビッツ（Ｌｉｅｂｏｖｉｔｚ）培地で生育させた乳癌細胞を指す。治療群とは、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）と０、１０、２０、５０、１００または２００ｍｇ／ｍｌのＥＧＣＧとを添加したライボビッツ培地で生育させた乳癌細胞を指す。プレートを大気中（ＣＯ２の補充なし）で４日間インキュベートした。
【００２７】
その期間が終わったら、培養培地を取り除き、各ウェル中の細胞をＭＴＴで染色した。過剰のＭＴＴ染色剤を洗い流した。ＭＴＴ染色した癌細胞をＤＭＳＯ溶液１ｍｌに溶解した。その溶液の光学密度（ＯＤ）をウェルごとに決定した。各ウェルのＯＤは死細胞の数に正比例した。ＥＧＣＧＴの不在下で培養した後にＭＴＴ染色した癌細胞のＯＤを参照試料として使用し、これを１００とみなした。阻害百分率は次の式を使って計算した：阻害率（％）＝（参照試料のＯＤ−試験処理試料のＯＤ）／参照試料のＯＤ×１００％。
【００２８】
２０、５０、１００および２００μｇ／ｍｌのＥＧＣＧは、ヒト癌細胞の細胞増殖を、それぞれ３、３４、６６および７０％阻害した（図１）。１０μｇ／ｍｌのＥＧＣＧは細胞増殖を阻害しなかった。
【実施例２】
【００２９】
ヒト癌細胞（ＭＤＡ  ＭＢ２３１）の細胞増殖に対するアスコルビン酸、プロリンおよびリジンと様々な濃度のＥＧＣＧとの組合せの阻害効果
これらの研究でも一般的手順は実施例１の場合と同じである。
【００３０】
これらの研究では基礎培養培地に以下の物質を添加した：
ｉ）アスコルビン酸（１００μＭ）＋プロリン（１４０μＭ）、
ｉｉ）アスコルビン酸（１００μＭ）＋プロリン（１４０μＭ）＋リジン（４００μＭ）、
ｉｉｉ）アスコルビン酸（１００μＭ）＋プロリン（１４０μＭ）＋リジン（４００μＭ）および２０ｍｇ／ｍｌ  ＥＧＣＧ、
ｉｖ）アスコルビン酸（１００μＭ）＋プロリン（１４０μＭ）＋リジン（４００μＭ）および５０ｍｇ／ｍｌ  ＥＧＣＧ、または
ｖ）アスコルビン酸（１００μＭ）＋プロリン（１４０μＭ）＋リジン（４００μＭ）および１００ｍｇ／ｍｌ  ＥＧＣＧ。
【００３１】
アスコルビン酸＋プロリンでは細胞増殖の阻害が起こらなかった。アスコルビン酸＋プロリン＋リジンでは細胞増殖が約１４％阻害された（図２）。アスコルビン酸＋プロリン＋リジンと２０μｇ／ｍｌのＥＧＣＧとの組合せでは、２０％の阻害が起こった（図２）。２０μｇ／ｍｌのＥＧＣＧだけの場合は、３％の阻害しか起こらなかった（実施例１）。このように、アスコルビン酸、プロリンおよびリジンの組合せは、ＥＧＣＧと相乗的に作用して、癌細胞増殖を阻害する。
【実施例３】
【００３２】
ヒト結腸癌細胞（ＨＣＴ１１６）の細胞増殖に対するアスコルビン酸、プロリンおよびリジンと様々なレベルのＥＧＣＧとの組合せの阻害効果
この研究では、５％ＣＯ２雰囲気下、１０％ウシ胎仔血清を含むマッコイ（ＭｃＣｏｙ）５Ａ培地で、ヒト結腸癌細胞を生育させた。一般的手順および検討した処理は実施例２で用いたものと同じである。
【００３３】
アスコルビン酸、プロリンおよびリジンとＥＧＣＧとの組合せは、細胞増殖に対する阻害効果を、０％から２０μｇ／ｍｌ  ＥＧＣＧでは３１％まで、５０μｇ／ｍｌ  ＥＧＣＧでは約９５％まで、相乗的に増加させた（図３）。
【００３４】
癌細胞によるマトリゲルの浸潤に対するＥＧＣＧならびにアスコルビン酸、プロリンおよびリジンの組合せの阻害効果
【実施例４】
【００３５】
乳癌細胞（ＭＤＡ  ＭＢ２３１）によるマトリゲル越しの浸潤に対する段階的レベルのＥＧＣＧならびにアスコルビン酸、プロリンおよびリジンと様々なレベルのＥＧＣＧとの組合せの阻害効果
マトリゲル浸潤アッセイの一般的手順については上述した。このアッセイでは、各インサート上に、ヒト乳癌細胞（５×１０４個）を播種した。様々な添加物をライボビッツ（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ）培地に加えた。プレートを培養器中、ＣＯ２を補充していない大気下でインキュベートした。
【００３６】
培地中に２０μｇ／ｍｌまたは５０μｇ／ｍｌのＥＧＣＧを含む調製物は、乳癌細胞による浸潤を、それぞれ約２６％および約１００％阻害した。培地中のアスコルビン酸（１００μＭ）＋プロリン（１４０μＭ）＋リジン（４００μＭ）が６５％の阻害を引き起こしたのに対して、アスコルビン酸（１００μＭ）＋プロリン（１４０μＭ）＋リジン（４００μＭ）と２０μｇ／ｍｌのＥＧＣＧとの組合せは、癌細胞浸潤を完全に阻害（１００％阻害）した（図４）。
【実施例５】
【００３７】
ヒトメラノーマ細胞（Ａ２０５８）によるマトリゲル越しの浸潤に対する段階的レベルのＥＧＣＧならびにアスコルビン酸、プロリンおよびリジンと様々なレベルのＥＧＣＧとの組合せの阻害効果
マトリゲル浸潤アッセイの一般的手順については上述した。各インサート上に、ヒトメラノーマ細胞（Ａ２０５８）（５×１０４個）を播種した。様々な添加物をＤＭＥＭに加えた。プレートを培養器中、５％ＣＯ２雰囲気下でインキュベートした。
【００３８】
アスコルビン酸（１００μＭ）＋プロリン（１４０μＭ）＋リジン（４００μＭ）の組合せは１３％の阻害しか引き起こさなかったが、アスコルビン酸（１００μＭ）＋プロリン（１４０μＭ）＋リジン（４００μＭ）と２０μｇ／ｍｌ  ＥＧＣＧとの組合せは、マトリゲル越しのメラノーマ細胞の浸潤を完全に防止した（図５）。
【００３９】
ザイモグラム研究
【実施例６】
【００４０】
ヒト乳癌細胞（ＭＤＡ  ＭＢ２３１）によるＭＭＰ２産生に対する段階的レベルのＥＧＣＧの効果
マトリゲル浸潤アッセイ（実施例４）で様々な処理を行って得た培地を、ノベックス・ザイモモグラム・ゲル（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）にのせた。プレートを、製造者の推奨するとおりに展開し、染色した。マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）バンドを、それらの既知分子量に基づいて同定した（図６）。
【００４１】
マトリゲル浸潤アッセイで得た培養培地のザイモグラムから、培地中の２０μｇ／ｍｌ  ＥＧＣＧは、ＭＭＰ２の産生を減少させ、ＭＭＰ９の産生を完全に阻害することが分かった（図６）。ＥＧＣＧの濃度を５０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌにすると、ＭＭＰ２とＭＭＰ９の活性はどちらも完全に阻害された（図６）。
【００４２】
細胞形態
【実施例７】
【００４３】
ヒトメラノーマ細胞（Ａ２０５８）の細胞形態に対するＥＧＣＧならびにアスコルビン酸、プロリンおよびリジンの組合せの効果
基礎培地中の癌細胞がマトリゲル越しに移動した時の顕微鏡写真を図７に示す。培地にアスコルビン酸（１００μＭ）＋プロリン（１４０μＭ）＋リジン（４００μＭ）の組合せを入れると、細胞の形態が変化した（図８）。核の明確な拡大を伴う細胞の膨張が明瞭だった。培地中のアスコルビン酸（１００μＭ）＋プロリン（１４０μＭ）＋リジン（４００μＭ）の組合せに２０μｇ／ｍｌのＥＧＣＧを加えると、広範なアポトーシス性変化が起こった（図９）。
【００４４】
実施例１〜７に記載したこれらの知見は、ＥＧＣＧをアスコルビン酸＋プロリン＋リジンの組合せと共に使用すると、ＥＧＣＧが強い相乗効果を発揮することを示している。したがって、ＥＧＣＧとアスコルビン酸＋プロリン＋リジンとの組合せの驚くべき相乗効果により、ＥＧＣＧの抗増殖および抗転移活性を、比較的低いその組織濃度でも、十分に利用することが可能になることを、これらの研究は示している。
【００４５】
したがって、カテキン類の有効レベルを、実現可能な組織内でのレベルに近づけることができるので、これらの知見は極めて重要である。
【００４６】
癌細胞の増殖およびそれらの酵素のアップレギュレーションは活性酸素種（ＲＯＳ）の濃度上昇によって起こることが示唆されている。この場合、トコフェロール類、カロチノイド類などの様々な生体抗酸化剤の組合せを、ユビキノール類、ビフラボノイド類、リポ酸、カルニチンのような他の促進剤と共に使用することにより、上述の疾患を治療するための、より強力な相乗的混合物が得られるだろう。
【００４７】
カテキン化合物を含む組合せは、相乗的活性を発揮するので、より低い組織カテキン類レベルで、極めて高効率な抗癌活性を達成することが可能になるという、驚くべき観察結果を、本発明は提供する。上述の知見は、新生物性疾患の予防および治療に、様々な成分を、異なる成分と組み合わせて、有効なレベルで使用する可能性を開くものである。
【００４８】
プロリンおよびリジンが、単にプロリンおよびリジンだけに限定されないことは、当業者には理解されるだろう。本発明の範囲には、リジン誘導体およびその前駆体、プロリン誘導体およびその前駆体が包含されるものとする。
【００４９】
抗酸化剤アスコルビン酸がアスコルビン酸の誘導体および前駆体を包含すべきであることは、当業者には理解されるだろう。
【００５０】
他の生体抗酸化剤には、トコフェロール類およびその関連化合物、トランス−レチノイン酸およびその関連化合物、カロチノイド類およびその関連化合物、グルタチオンおよびその関連化合物、ユビキノール類およびその関連化合物、葉酸類およびその関連化合物、バイオフラボノイド類およびその関連物質、ならびにセレン化合物などがある。
【００５１】
臨床的応用
本発明は、抗酸化剤、プロリンおよびリジンと組み合わせたカテキンの予防的および治療的使用に関する。カテキンと抗酸化剤、プロリンおよびリジンとの併用は、ヒト疾患の治療における当該カテキン化合物の効率を増大させる。
【００５２】
ヒト疾患として、例えば新生物性疾患、炎症状態、感染性疾患、心血管疾患、および細胞外マトリックスの分解を伴う他の病的状態が挙げられるが、これらに限るわけではない。そのような状態には、異常な血管新生、病的な血管内異物侵入、慢性関節リウマチ、変形性関節症、アテローム性動脈硬化、拡張型心筋症、肺気腫、および他の慢性状態が含まれる。
【００５３】
本発明は、本願に記載する調製物の有効量を投与することによって、細胞外マトリックスの分解を伴うヒト疾患、例えばｉ）新生物性疾患、ｉｉ）炎症状態（アレルギー、肺気腫、慢性関節リウマチ、変形性関節症、歯周炎、神経皮膚炎を含むが、これらに限らない）、ｉｉｉ）感染性疾患（普通感冒、インフルエンザ、肝炎、ヘルペス、ＨＩＶなどのウイルス感染、肺炎、結核、髄膜炎、淋疾、梅毒などの細菌感染、および／または真菌疾患を含むが、これらに限らない）、ｉｖ）心血管疾患（アテローム動脈硬化、心筋症、血管形成術後の再狭窄を含むが、これらに限らない）、ｖ）変性疾患（骨粗鬆症および関節炎を含むが、これらに限らない）、ｖｉ）神経障害（アルツハイマー病、多発性硬化症を含むが、これらに限らない）、およびｖｉｉ）自己免疫疾患（関節炎を含む、これに限らない）などを治療および予防する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ２３１）の細胞増殖に対するＥＧＣＧの阻害効果を表す。
【図２】図２は乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ２３１）の細胞増殖に対するＥＧＣＧ、アスコルビン酸、プロリンおよびリジンの組合せの相乗的阻害効果を表す。
【図３】図３は結腸癌細胞（ＨＣＴ１１６）の細胞増殖に対するＥＧＣＧ、アスコルビン酸、プロリンおよびリジンの組合せの相乗的阻害効果を表す。
【図４】図４はＥＧＣＧ（２０μｇ／ｍｌ）が乳癌細胞によるマトリゲル浸潤を約２５％阻害することを表す。
【図５】図５はアスコルビン酸、プロリンおよびリジンとＥＧＣＧ（２０μｇ／ｍｌ）との組合せが、メラノーマ細胞（Ａ２０５８）によるマトリゲル浸潤を相乗的に１００％まで阻害することを表す。
【図６】図６は乳癌細胞によって分泌されるＭＭＰ２の活性をＥＧＣＧが低下させることを示すザイモグラムを表す。
【図７】図７はマトリゲル浸潤アッセイ後のメラノーマ細胞の正常な形態を表す。
【図８】図８はアスコルビン酸、プロリンおよびリジンの組合せによって誘発されるメラノーマ細胞の形態変化を表す。
【図９】図９はアスコルビン酸、プロリンおよびリジンとＥＧＣＧとの組合せのアポトーシス効果を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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