(57)【要約】生物または化学分析を行うための装置および方法が提供される。装置は、支持板から突出した三次元マイクロカラムのアレイを備えている。各マイクロカラムは、支持板から離れた比較的平坦な第１表面を有する。多数の異なる生体物質のアレイを第１表面に付着させてよい。装置は、既存のウェルを持つマイクロタイタプレートと組み合わせて使用する場合、ハイスループット能力のためにマイクロアレイを用いた結合アッセイの効率を改善できる。
2005528582.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸のハイブリダイゼーションと、化学分子、ペプチド、タンパク質、脂質、膜、およびウイルス粒子のアッセイと、細胞トランスフェクションと、細胞リバーストランスフェクションとからなる群より選択される、生物または化学分析を実施するための装置において、
a)  支持構造体、
b)  該支持構造体から離れて突出した多数のマイクロカラムであって、
c)  前記支持構造体から離れた第１表面および少なくとも第２表面をそれぞれが有するマイクロカラム、および
d)  各第１表面上に付着した生体物質の多数の試料のアレイ、
を有し、
e)  前記各マイクロカラムが、マイクロタイタプレートの対応するウェル内に適合するようなサイズに構成されている、
ことを特徴とする装置。
【請求項２】
a)  支持構造体、
b)  該支持構造体の表面から垂直に離れるようにそれぞれが延在している複数のマイクロカラムであって、
c)  第１表面および少なくとも第２表面をそれぞれが有するマイクロカラム、および
d)  各マイクロカラムの前記第１表面上に位置する複数のマイクロピン、
を有し、
e)  各マイクロピンが、異なる生体物質が付着した表面を有し、各マイクロカラムの前記第１表面上に多数の生体物質のアレイ構造を形成している、
ことを特徴とするアレイ。
【請求項３】
支持構造体；該支持構造体の平坦表面から離れて突出し、前記支持構造体から離れた第１表面と少なくとも第２表面を有する少なくとも一つのマイクロカラム；および前記第１表面上に配置された格子状網状構造により画成された複数の収容空間内に配置された多数の異なる生体物質のシート；を有してなることを特徴とするアレイ。
【請求項４】
前記生体物質が、前記収容空間の網状構造内に直線アレイ状に配置されていることを特徴とする請求項３記載のアレイ。
【請求項５】
生体または化学アッセイを実施するのに適したアセンブリにおいて、
a)  (1)支持構造体、(2)該支持構造体から離れて突出した複数のマイクロカラムであって、(3)前記支持構造体から離れた第１表面と少なくとも第２表面とをそれぞれが有するマイクロカラム、を有する製品、
b)  前記各マイクロカラムをその中に挿入できる対応する数のウェルを持つマイクロタイタプレート、および
c)  (1)前記各マイクロカラムの前記第１表面上、(2)前記各ウェルの内面上、または(3)それらの両方、に固定化された複数の生体または化学物質、
を有することを特徴とするアセンブリ。
【請求項６】
前記生体物質をイメージングするときに、前記マイクロカラムを保持するための物理的アダプタをさらに有することを特徴とする請求項５記載のアセンブリ。
【請求項７】
前記複数のマイクロカラムが６個から４８個のマイクロカラムを持つ試験片に配置されていることを特徴とする請求項５記載のアセンブリ。
【請求項８】
前記マイクロタイタプレート中の少なくとも一つのウェルが、該ウェルの底部壁の周囲に亘り配置されたスペーサを有し、該スペーサが、前記ウェルの底部と前記マイクロカラムの第１表面との間の毛管空間を維持することを特徴とする請求項５記載のアセンブリ。
【請求項９】
共用洗浄を行うための第２トレイをさらに有することを特徴とする請求項５記載のアセンブリ。
【請求項１０】
前記マイクロタイタプレートが、底部壁の周囲に沿って疎水性であり、中央領域では親水性である底部壁を持つウェルを有することを特徴とする請求項５記載のアセンブリ。
【請求項１１】
アッセイを実施する方法において、
a)  支持構造体から離れて突出した多数のマイクロカラムであって、前記支持構造体から離れた第１表面と少なくとも第２表面とをそれぞれが有するマイクロカラムを備えた装置を提供し、
b)  前記マイクロカラムの数に対応した数のウェルを持つマイクロタイタプレートを提供し、
c)  1)前記各マイクロカラムの前記第１表面上、2)前記各ウェルの内面上、または3)それらの両方上、に生体物質の多数の試料のアレイを固定化し、
d)  前記装置を逆さにし、それによって、各マイクロカラムの前記第１表面が各ウェルの内面に向けられており、
e)  前記マイクロカラムを前記ウェルに嵌め込み、
f)  アッセイ試薬溶液を導入し、
g)  アッセイを実施する、
各工程を有してなることを特徴とする方法。
【請求項１２】
前記アッセイ溶液を前記マイクロカラム中を延在する流体導管中に通して導入する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１３】
a)  各マイクロカラムの前記第１表面と各ウェルの内面との間に毛管空間を形成し、b)前記装置を激しく動かして、前記アッセイ溶液中で前記生体物質を反応させる各工程をさらに含むことを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記マイクロカラムを前記ウェルから取り出し、前記第１表面をイメージングする各工程を含むことを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
a)  前記マイクロカラムを第２のマイクロタイタプレート中で洗浄し、
b)  前記第１表面を乾燥させ、
c)  前記マイクロカラムの第１表面上のアレイに結合した生体分析物を研究し、定量する、
各工程をさらに含むことを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
平坦な第１表面と少なくとも第２表面をそれぞれ有するマイクロカラムのアレイがそこから延在している平坦な支持構造体を有してなるバイオセンサ装置において、各第１表面にグレーティングが組み込まれており、一連の生体物質が、直線様式で前記第１表面上に配列され、配置されていることを特徴とするバイオセンサ装置。
【請求項１７】
前記第１表面が導波路コーティングを有することを特徴とする請求項１８記載のバイオセンサ装置。
【請求項１８】
前記生体物質が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、プラスミド、ペプチド、タンパク質、脂質、膜、化学分子、薬剤化合物、ウイルス粒子、細胞、亜細胞成分、および細胞生成物を含むことを特徴とする請求項１，２，３，５，１１または１６記載の発明。
【請求項１９】
前記生体物質がｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１，２，３，５，１１または１６記載の発明。
【請求項２０】
前記生体物質がタンパク質またはペプチドを含むことを特徴とする請求項１，２，３，５，１１または１６記載の発明。
【請求項２１】
前記生体物質が化学分子または薬剤化合物を含むことを特徴とする請求項１，２，３，５，１１または１６記載の発明。
【請求項２２】
前記生体物質の多数の異なる試料が直線アレイとして配列されていることを特徴とする請求項１，２，３，５，１１または１６記載の発明。
【請求項２３】
前記マイクロカラムが、９６ウェル、３８４ウェル、または１５３６ウェルいずれかの行列でアレイに形成されていることを特徴とする請求項１，２，３，５，１１または１６記載の発明。
【請求項２４】
前記マイクロカラムが、ガラス材料、ポリマー材料、金属材料、セラミック材料および複合材料からなる群より選択される材料から製造されていることを特徴とする請求項１，２，３，５，１１または１６記載の発明。
【請求項２５】
前記頂面が、アミノプロピルシラン処理ガラス、石英、合成シリカ、ポリプロピレン、ポリスチレン、ナイロンフィルタ、金、銀、白金、クロム、およびケイ素からなる群より選択される材料を有することを特徴とする請求項１，２，３，５，１１または１６記載の発明。
【請求項２６】
前記マイクロカラムが前記支持構造体から該マイクロカラムを通って前記第１表面まで延在する中空空洞を有することを特徴とする請求項１，２，３，５，１１または１６記載の発明。
【請求項２７】
前記中空空洞が、入口と出口、および該入口と該出口とを接続するマイクロチャンネルを有することを特徴とする請求項２６記載の発明。
【請求項２８】
前記各マイクロカラムが、該マイクロカラムのシャフトの長さを通って約９９．５％以下延在し、光ファイバイメージング部材を収容できる中空空洞を有することを特徴とする請求項１，２，３，５，１１または１６記載の発明。
【請求項２９】
前記装置が、
a)  前記マイクロカラムの第１表面上に位置する複数のマイクロピンであって、
b)  1)親水性湿潤面、および少なくとも一つの疎水性非湿潤側面、または
2)多数の流体接触角で流体を捕捉する粗い微小頂面、を有するマイクロピンをさらに備え、異なる種類の生体物質が、前記湿潤面または前記粗い微小頂面に付着していることを特徴とする請求項１記載の請求項１，２，３，５，１１または１７記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【優先権の主張】
【０００１】
本発明は、その内容をここに引用する、マイケル・ディー・ブラッディ(Micheal D. Brady)等により、２００１年９月７日に出願された米国仮特許出願第６０／３１７６６０号の優先権を主張するものである。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、生体分析のための装置および方法に関する。本発明は、特に、ハイスループット・アッセイまたは他の生物学的実験を行うために既存のマイクロタイタプレートと組み合わせて用いてもよい、三次元の突起表面を持つアレイに関する。
【背景技術】
【０００３】
ハイスループット・スクリーニングにおいて生体標的および候補となる薬剤化合物が急増し、ヒトゲノムの特徴付けへの関心が増したために、多くの遺伝子およびそれらがコード化しているタンパク質の迅速、効率的かつ再現性のある研究の需要が増えてきた。時間や限られた量の試料などの基本的な制約により、分析の効率が影響を受けることがある。現行の装置は、精密で感度が高いが、一つの装置において異なる実験試薬または条件の異なるアッセイを数多く同時に大量に実施するのには向いていない。
【０００４】
現在、「ＤＮＡチップ」としても知られているマイクロアレイは、一回の実験で同時に数千の遺伝子を研究するための強力な器具として登場した。ＤＮＡアレイ技術には、ゲノムおよび薬学研究、並びに医学診断に幅広い用途がある。そのような用途の例としては、遺伝子の発見、遺伝子発現モニタリング、多型スクリーニング、薬剤の発見、および臨床試験モニタリングが挙げられる。ＤＮＡアレイの最初の様式は、スライド当たり約１００から約６０，０００の遺伝子を含有するガラススライドまたはナイロンフィルタであった。これらのマイクロアレイは、一つの実験条件下での多数の試料の大量処理に焦点を当てていた。この様式は、試料当たり多くの遺伝子を分析することができるが、残念ながら、異なる並行したアッセイ条件下での多くの異なる試料のハイスループット分析にとっては助けにはなっていない。
【０００５】
第２の装置は、マイクロタイタプレートとしても知られている、マルチウェル・プレートである。現在、生体試料のハイスループット分析のための最も普及した様式である、マルチウェル・プレート様式は、業界で標準化されており、機械で扱い易い、すなわちロボット式自動操作に適合している。マルチウェル様式は、研究者が、多くの異なる実験条件下で試料を並行して処理することを可能にするが、ウェル当たり比較的少数の試料に限られている。以前は、試料サイズ、人件費、および分析時間などの実際的な検討事項により、多重分析へのマルチウェルプレートの使用が制限されていた。一般に、結合アッセイのために、ウェル当たり一種類だけの表面結合分子が固定化される。個々のマルチウェルプレートにおいては、ウェル当たり一回だけ読取りを行うことができる。もちろん、これにより、単位試料当たりに収集できる情報量が制限されてしまう。
【０００６】
しかしながら、これら二種類の様式の利点に鑑みて、選択的な核酸配列のより小さな「テーマ」アレイに相当な関心が寄せられた。ある種のテーマアレイは、個々のウェル内に各アレイがあるように核酸の多数のアレイを生成するように、マルチウェルプレート内のウェルの底部にプリントされている。このアレイ中のアレイにより、異なる多数の試料を並行して分析できる。特許文献１および２は、生体物質がウェルの底面に配列されているこの種のマルチウェルプレートアレイを説明するのに役立つ２つの実例である。これらの特許出願の両方の内容をここに引用する。
【特許文献１】国際公開第９８／２９７３６号パンフレット
【特許文献２】国際公開第００／７９００８号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、マイクロタイタプレートの底部にプリントされたアレイを用いて並行実験を行うのは、めんどうなことが多い。例えば、洗浄工程などの、全てのウェルに共通した工程でさえも、各個別のウェル中への多大なピペット操作が必要である。さらに、試料の画像検出が少なくとも２つの要因によって複雑となり得る。第１に、試料はウェル内の深くに位置しているので、試料にアクセスすると、陰およびエッジ効果により潜在的に画像が歪むという問題が生じる。第２に、プレートの下から検出を行う場合、試料は、各ウェルの底面の凹凸により生じる歪みにさらされ得る。
【０００８】
それゆえ、より効率的なアレイ・プラットフォームが、大容量のアッセイまたは診断において研究を行う薬学、生物学、または臨床のユーザにとって非常に魅力的であろう。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、ある態様において、ＤＮＡマイクロアレイの大容量の大量処理能力を、「アレイ中のアレイ」のマイクロタイタプレート技術に関連する利点と組み合わせたものである。本発明は、一部、平坦面を持つ支持構造体、および、ここで、「マイクロカラム」または「マイクロピラー」のいずれかと呼ばれる、平坦面から突出した複数の三次元プラットフォームを有する装置を含む。マイクロカラムは、支持構造体から離れた第１表面すなわち頂面および少なくとも第２表面すなわち側面を有する。マイクロカラムは、全設計を様々な手段により製造するのを容易にする中実またはモノリス構造を有することが好ましく、また支持構造体から延在する様々な高さのシャフトを有する。マイクロカラムは、ガラス、石英、溶融石英、ケイ素、金属、ポリマー、プラスチック、セラミック、または複合材などの数多くの材料から製造することができる。
【００１０】
多くの可能性のある実施の形態の内の一つによれば、第１表面は、実質的に平坦であり、バイオサイトの組織的アレイを付着させるための比較的大きい表面積を持つ。言い換えれば、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、脂質膜、または他の核酸または細胞物質などの関心のある生体物質の多数の異なる試料のアレイを、各マイクロカラムの頂部にプリントまたは他の方法で固定化できる。第１表面の実際のサイズに応じて、様々な数のバイオサイトのアレイを調製し、各マイクロカラムに付着させることができる。各マイクロカラムは、生体試料のマイクロアレイとして機能する。各マイクロカラムは、対応するマイクロタイタプレートのウェル内に適合できる物理的寸法を持つ。この現在の様式により、一つのアッセイ装置を使用して、多数の実験条件下で様々な生体試料の同時の並行分析が可能になる。したがって、対応するマイクロタイタプレート内の各ウェルは、互いのウェルと同じかまたは異なる実験条件または試薬を含んでもよい。ある実施の形態において、試薬または試料を固定化されたバイオサイトのアレイに直接導入できるように、マイクロカラムのシャフトを通って中空の導管が延在していてもよい。
【００１１】
別の実施の形態によれば、各マイクロカラムの第１表面は露出されたままであってよい。生体プローブのアレイが結合アッセイのために各マイクロプレートのウェルの底面にある場合、効果的に蒸発を減少させ、少量反応におけるＤＮＡハイブリダイゼーションなどに関する結合効率を増加させる小型反応チャンバを形成するように、一連のマイクロカラムを各ウェル内のカバースリップとして用いてもよい。上述したような構成により、従来のマイクロプレートベースのアレイの機能を著しく改善することができる。アレイがマイクロカラムの頂面とウェルの底面の両方に配置されているこの実施の形態の配列により、全体のハイスループット能力が増し、また、あるアレイを他のアレイのための対照とすることができるであろう。この設計により、同じ反応において異なる種を一緒にサンプリングすることができるであろう。すなわち、ある種類の生体分子または化学分子をある表面に、別の種類のものを他の表面に固定化してもよい（例えば、ある表面に抗体またはタンパク質のアレイを、他の表面にオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡのアレイを配置する）。
【００１２】
本発明の別の態様は、生物または化学アッセイを行う方法を包含する。マイクロカラムのアレイを、実質的に任意の幾何学形状、サイズ、または行列構成（例えば、６，８，９６，１９２，３８４，５７６，１５３６ウェル等）のマイクロタイタプレートと共に用いてもよい。この方法は、支持構造体から離れた第１表面および少なくとも一つの第２表面を各々が持つ、支持構造体から突出した多数のマイクロカラムを有する装置を提供し；マイクロカラムの数に相当する数のウェルを持つマイクロタイタプレートを提供し；1)各マイクロカラムの第１表面、2)各ウェルの内面（例えば、底面）、または3)それら両方のいずれかに、生体物質の多数の異なる試料のアレイを固定化し；装置を逆にして、それによって、各マイクロカラムの第１表面を各ウェルの底面に方向付け；マイクロカラムをウェル中に挿入し；アッセイの試薬溶液を導入して、アッセイを行う；各工程を有してなる。この方法はさらに、各マイクロカラムの第１表面と、各ウェルの内面との間に毛管空間を形成し；装置を激しく動かして、アッセイ溶液中で生体物質を反応させる各工程を含んでもよい。この方法はさらに、アッセイ溶液を、マイクロカラムを通って延在している流体導管に通して導入する工程を含む。この方法はさらに、ウェルからマイクロカラムを取り出し；第２のマイクロタイタプレート内で洗浄し；第１表面を乾燥させ、第１表面を画像化し；マイクロカラムの第１表面上のアレイに結合した生体分析物を研究または定量する各工程を含んでもよい。
【００１３】
ウェルは、核酸ハイブリダイゼーション、酵素アッセイ、脂質、化学分子、または細胞に基づく（例えば、細胞のトランスフェクションまたはリバーストランスフェクション）アッセイまたはイムノアッセイなどの様々な用途のためのアッセイ溶液を含んでもよい。細胞のリバーストランスフェクションを含む実施の形態において、異なる種類の発現されたＤＮＡ配列のアレイを各マイクロカラムにプリントすることができ、次いで、細胞は、ＤＮＡ上のアレイに置かれる（比較と説明のために、ビー・アイ・フューアー(B.I.Feuer)等による米国特許出願第０９／９６２０５４号およびディー・エム・サバティーニ(D.M.Sabatini)等による国際公開第０１／２００１５号パンフレットを参照のこと。これらの両方をここに引用する）。
【００１４】
本発明の利点の一つは、反応溶液を物理的に撹拌して、生物学的反応を促進する可能性である。マイクロカラムのアレイは、対応するマイクロタイタプレートとは物理的に別個の要素であるので、各ウェル内の溶液を「かき混ぜる」（すなわち、物理的に上下に、左右に動かしたり、またはくるくる回したり）ことが出来るようになる。このかき混ぜ作用により、固定化された生体プローブとそれらの標的との微量流体相互作用が増す。従来のマイクロタイタプレート技法では、この種の物理的撹拌を行うことはできない。さらに、本発明は、ほとんどの現行のマイクロタイタプレートで行っている少量の試薬および試料で行うことができる。これにより、アッセイを行うために必要な反応体が少なくて済むので、多くはない試料を節約でき、費用も節約できる。
【００１５】
さらに、別の実施の形態によれば、マイクロピンがマイクロカラムの第１表面から突出していてもよい。生体物質の試料を、各マイクロピンの頂面に付着させても差し支えない。各マイクロピンは、最小の頂面の面積を有しており、標的分子の非特異的結合を生じるかもしれない周辺領域を持たないので、試料を画像化するときに、バックグラウンド信号を減少させる可能性が得られる。マイクロピンは、試料のバイオサイトを周囲領域から上に離して上昇させる。この周囲領域は、画像化したときにはバックグラウンドとなる。二光子蛍光イメージング、顕微鏡法、または分光法などのイメージング技法を用いてもよい。
【００１６】
本発明は、ある実施の形態において、生化学または細胞アッセイ様式において、化学分子または薬剤化合物のスクリーニングにマイクロカラムを使用する方法にも関する。各マイクロカラムの第１表面上またはマイクロプレートの底部上いずれかにある化学プローブアレイは、異なるタイプの標的（例えば、精製タンパク質、膜、炭水化物、または核酸）または細胞物質による直接標識または非標識結合アッセイに使用してもよい。さらに、マイクロカラムに基づく装置は、第１表面上のアレイからの、薬剤化合物などの化学分子の光誘起放出に用いてもよい。標的プール中で活性化合物を選択的に放出し、同定するために、フォトマスクを用いてもよい。
【００１７】
本発明の追加の特徴および利点が、以下の詳細な説明に述べられている。先の一般的な議論および以下の詳細な説明と実施例の両者は、本発明の単なる例示であり、特許請求の範囲に記載された本発明の性質および特徴を理解するための概要または構成を与えることを意図したものであるのが理解されよう。
【００１８】
定      義
この出願に用いている「生体物質」または「生体分析物」という用語は、様々な生体分子または物質を称する。これらの分子としては、以下に限定するものではないが、核酸配列（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、プラスミド等）、ペプチド、タンパク質、脂質、タンパク質または脂質膜、有機または無機化学分子（例えば、製薬または他の化合物）、ウイルス粒子、真核または原核細胞、亜細胞成分または細胞小器官、および他の物体が挙げられる。「生体物質」は、表面に固定化された生体分子または物質を称するために用い、一方で、「生体分析物」は、結合アッセイを行った後に生体物質に後で付着する生体分子または物質を称することが好ましい。
【００１９】
ここで用いている「バイオサイト」という用語は、プローブまたは他の機能として使用するための少なくとも一種類の固定化された生体物質を有してなる、アレイの活性表面、またはベース材料上の別個の区域、スポットまたはサイトを称する。
【００２０】
ここで用いている「マイクロカラム」、「マイクロピラープラットフォーム」、または「プラットフォーム」という用語は、様々な垂直寸法（高さ）の三次元に突出した表面および生体物質を付着させることのできる設計を称する。図１および２の群に見られるように、生体物質１が、支持構造体１２から離れて位置する、各マイクロカラムの第１表面３上のアレイに配列されていることが好ましい。各マイクロカラムは必ずしも、高さに沿って一定の断面寸法を持つ一つのピラーの形状である必要はない。垂直寸法４に沿って様々な断面寸法を持つ他の設計も、これら他の設計で支持構造体１２の一般平面から突出した実質的に平らなすなわち平坦な第１表面３を体現している限り、本発明の範囲に含まれる。各マイクロカラムが支持構造体に対して直交していることが好ましい。
【００２１】
この出願に用いている「マイクロタイタプレート」、「マイクロプレート」、または「マルチウェルプレート」という用語は、生体または化学分析に用いられる様々な設計のウェルプレートまたはリザーバプレートを称する。「ウェル」または「マイクロタイタウェル」という用語は、ウェル６自体に関する。ウェルの実際の数は本発明にとって限定となるものではないが、マイクロタイタプレートは、液体培地を収容するための少なくとも一つのリザーバまたはウェルを有するどのようなプレートをも含む。そのようなマイクロタイタプレートは、一つの大きなリザーバから１，５３６より多い個々のウェルを有するものまでに及ぶが、好ましい実施の形態においては、６，８，１２，２４，４８，９６，３８４，４８０，５７６，または１５３６のウェル等を含む。他の中間の構成も本発明に含まれる。
【００２２】
ここで用いている「マイクロピン」という用語は、マイクロカラムの第１表面から垂直に延在する非常に微細なロッドまたはピン状の構造体を称する。各マイクロピン１６は第１表面１６ａおよび少なくとも第２表面１６ｂを有する。マイクロピンは、様々な材料から様々な様式で形成できるであろう。ロッド、ピンまたはファイバの形状を持つ、ガラス、石英、溶融石英、ケイ素、金属、ポリマー、プラスチック、セラミック、または複合材などの材料を、実際に用途に応じて用いて差し支えない。マイクロピンは、円柱状であり、一定の半径Ｒの円形断面を有することが好ましい。しかしながら、異なる断面形状（例えば、楕円形、正方形、三角形、多角形等）を持つ他の実施の形態が本発明の状況から排除されるものでは決してない。
【００２３】
ここで用いている「平坦支持体」または「支持構造体」という用語は、三次元プラットフォームがそこから突出している任意の剛性の実質的に平らな基板またはプレートを含んでよい。支持構造体は、例えば、マイクロタイタプレートの蓋を形成してもよい。支持構造体は、ガラス、セラミック、ポリマーまたはプラスチックのスライドまたは板、もしくは金属の試験片またはシートを含んでも差し支えない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明は、ある態様において、生物分析および化学分析のための装置を具体化する。本発明は、マイクロアレイ技術をマルチウェルプレート技術と組み合わせて、多重様式で小さなテーマアレイの遺伝子に関する部分または他の生物学的部分のハイスループット分析のための単純であるが、非常に効果的な手段を一つの装置で提供する。並行分析に関する利点により、研究者達は、ハイスループット能力を求めて様々な装置および方法を開発するように動議付けられた。例えば、モンク(Monk)等は、ここに引用する米国特許第６０２２７００号明細書において、生体試料の調製装置、および高解像度のシングルまたはマルチラベル、二次元または三次元の蛍光顕微鏡において、培養細胞を調製し、視覚化するためのその装置の使用方法を記載している。支持部材の表面に付着した細胞などの生体試料を、顕微鏡のレンズで研究することができる。モンク等の設計は、支持部材に付着した生体試料を視覚化するのに使用できるが、アッセイ溶液中の生体試料を研究し、定量するための手段というわけではない。モデリン(Modlin)等は、ここに引用する米国特許出願公開第２００１／０００６４１７号明細書において、固体表面間に挟まれた小容量の試料を収容し、分析するための装置および方法の別の実施の形態を記載した。モデリンの装置は、装置で読み出すときに、光路にある未結合のルミノフォア(luminophore)の量を減少または変化させるために流体を移動させる光学装置の一部として働く。未結合ルミノフォアは、バックグラウンド信号を増大させるので、光学分析に干渉してしまうことがある。
【００２５】
本発明によれば、アレイ装置の基本設計は、支持構造体の平面から突出した少なくとも一つの、好ましくは、複数の部材を含む。概念的には、本発明は、「裏返し」にひっくり返して、各アッセイの実施および装置の製造をかなり容易に出来るようにしたマイクロタイタウェルとして見ることができる。マイクロカラム１０として知られている各部材は、支持構造体から離れた実質的に平坦すなわち平らな第１表面３および少なくとも一つの第２表面５を有する。マイクロカラムはモノリス構造であることが好ましい。各マイクロカラムの平坦な第１表面は、比較的大きく、好ましくは、均一に滑らかな区域を有する。
【００２６】
マイクロカラムは露出された第１表面を提供する。この露出された第１表面は、多数の生体プローブの試料をプリントするまたは付着させるために、マイクロタイタウェルの底部よりもアクセスし易い。複数のバイオサイト１ａは、例えば、様々なプリント方法により、直線アレイ（例えば、８×１２、１０×１０、１２×１２、１６×２４、２５×２５、３２×４８、５０×５０、７５×７５、１００×１００、これらより多いか少ない構成）に配置された各マイクロカラムの第１表面上に付着させることができる。バイオサイトの実際の数や配置は、必ずしも限定要因ではない。バイオサイトの直線配置の利点の一つは、マイクロカラムが、特に、ゲノムまたは核用途にとって、生体物質の既知の位置合わせ精度を有することである。このことは研究者にとって都合よく、複雑なラベリング法に頼る必要がなくなる。それゆえ、各マイクロカラムは、マイクロアレイの様式で多数の異なる生体物質のアレイを受け入れる。
【００２７】
さらに、マイクロカラムの露出した第１表面は、プローブのアレイと溶液中で結合する生体部分を研究するために、容易にアクセスできる。例えば、この表面に、アッセイを検討するためにイメージング装置により接近して近づけられてもよい。本発明は、光学装置の一部ではなく、むしろ、溶液中のバックグラウンド信号を減少させる必要なく画像化できる生体プローブのアレイを固定化するための支持体を一部に備えている。アッセイ後、マイクロカラムをウェルから取り出して、アレイに結合した関心のある生体分析物を画像化する前に乾燥させる。
【００２８】
本発明のマイクロカラム装置は、好ましくは、標準的な行列構成の物理的寸法を持つマイクロタイタウェルプレートと一緒に働くように設計されている。それゆえ、各マイクロカラムは、対応するサイズのウェルまたは貯蔵部内に適合する、物理的寸法−直径（断面の幅）および高さ−を持つことが好ましい（例えば、約５ｍｍの直径を持つ標準的な９６ウェル行列、約３ｍｍの直径を持つ３８４ウェル行列、または約０．５ｍｍの直径を持つ１５３６ウェルの設計、もしくはそれらの間の任意のサイズ）。各対応するウェルの実際のサイズは、様々であってよく、必ずしも、マイクロカラムの制限要因となるわけではない。マイクロカラムは、約０．１ｍｍから約１０ｃｍまでのサイズに及ぶ断面直径を有していてよい。
【００２９】
図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄおよび１Ｅは、本発明の異なる実施の形態によるマイクロカラム１０を示す概略図である。オリゴヌクレオチドまたはＤＮＡプローブなどの生体物質の多数のアレイをマイクロカラムの第１表面に固定化することができる。図１Ａは、図３Ｂに示したような標準的な９６ウェルマイクロタイタプレート１４と一緒に使用するための、９６カラムの直線行列１０ａに配列された一組のマイクロカラム１０を有する平坦支持構造体１２の上から見た斜視図を示している。図１Ａの実施の形態によれば、三次元マイクロカラムのアレイを持つ支持構造体またはプレートは、約５．０±０．２インチ（約１２．５±０．５ｃｍ）長×約３．３±０．２インチ（約８．３±０．５ｃｍ）幅を持つ９６ウェル様式の標準的なマイクロタイタプレートと等しい長さおよび幅の寸法を有する。図３に並んで見えるように、図３Ａのマイクロカラム行列１０ａは、図３Ｂのマイクロタイタプレート１４のウェルに対応し、その中に嵌り込む。
【００３０】
図１Ｂは、平坦な支持構造体１２上の一つの典型的なマイクロカラム１０プラットフォームの拡大図を示している。生体物質のアレイ２が、マイクロカラム１０の第１表面３上に付着せしめられている。別の実施の形態において、図１Ｃは、マイクロカラム１０の第１表面３上に位置する、多数のマイクロピン１６、または棒状突出部を有してなるプラットフォームの拡大図を示している。マイクロピン１６は、マイクロカラム１０の第１表面３の平面から離れて延在し、好ましくは、マイクロカラムの第１表面の平面に対して垂直に方向付けられている。生体物質１の試料は、各マイクロピン１６の第１表面に付着せしめられている。各マイクロピンの第１表面１６ａは、実質的に平坦すなわち平らであることが好ましいが、丸まっていても、半球状でも、または一点を持つ円錐であっても差し支えない。マイクロピン１６は、少なくとも二種類の可能性のある方法により、生体物質１の液体試料を採集または保持する。ある態様では、マイクロピンは、第１の親水性湿潤表面および少なくとも第２の疎水性非湿潤表面１６ｂを有することができる。湿潤表面により、生体物質を付着させ、非湿潤表面によって取り囲むことができる。第２の別の態様では、流体取込みにより濡れる粗面化された頂面を用いても差し支えない。すなわち、流体は、多数の流体接触角のために取り込まれる。マイクロカラム１０の頂部に位置するマイクロピン１６の実際の数は制限要因ではなく、好ましくは、マイクロピン１６の集団は約１０や２０未満から、約１００以上のアレイまでに及んでも差し支えない。
【００３１】
図１Ｄおよび１Ｅは、試験キットに用いてもよい他の実施の形態を示している。図１Ｄは３つのマイクロカラムを持つ試験片１８を示しており、図１Ｅは８つのマイクロカラムを持つ試験片１８ａを示している。これらは、それぞれ、対応する３ウェルおよび８ウェルを持つプレート試験片に用いることができる。マイクロカラム試験片の設計において、６，１２，１６，２４，３２，または４８のマイクロカラムなどの他の可能性のある変更種も考えられる。
【００３２】
図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄおよび２Ｅは別のマイクロカラムの設計を示している。図２Ａの装置は典型的な円柱形状である。図２Ｂは砂時計形のマイクロカラムを示している。断面寸法は、基部の頂部から底部まで進むにつれて、狭くなり、次いで広くなるように変化する。図２Ｃは逆さの切頭体を示し、一方で、図２Ｄは、プレート部分２０が第１表面３を形成し、ステム２がマイクロカラム１０の基部を形成している、いわゆる「プレート・アンド・ステム」設計を持つマイクロカラムを示している。この設計は、「平頭釘」と形容してもよい。図２Ｅは正方形のマイクロタイタウェルのための正方形形状を示している。図２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、およびそれらの変種の特定の設計により、マイクロタイタプレート中の試料間でのクロストークを防ぐことができる。マイクロカラムの第１表面３の全表面積を犠牲にせずに、マイクロタイタウェルの側壁とマイクロカラムとの間の空間または距離が増えれば、毛管作用に関連する潜在的な汚染問題が避けられるであろう。マイクロカラムをマイクロタイタウェル中に挿入するとき、反応流体は、ウェルの側壁とマイクロカラムとの間の空間で上方に運ばれることは少ないであろう。
【００３３】
図４に示した別の実施の形態は、その内容をここに引用する、ボレリ(Borrelli)等の国際公開第９９／５５４６０号および同第９９／５５４６１号の各パンフレットに詳細に記載されている、「スライス・アレイ」２４が第１表面３に取り付けられたマイクロカラム１０を含んでいる。この実施の形態では、生体物質１の付着またはプリントを大幅に単純化できる。スライス・アレイ技法によれば、延伸された毛管イメージング・リザーバの小サイズの部分から非常に薄いスライスを切除する。各スライスは、厚さが約４ｎｍから約１０ｎｍまでであることが好ましいが、どのようなスライス厚も可能であろう。これらのスライスは、延伸された毛管イメージング・リザーバのチャンネル壁により形成された格子状網状構造２４ａであって、各々が側壁および開放頂部と底部を持つ、生体試料および異なる公知の結合実在物のための、複数の収容空間を画成する格子状網状構造を有してなるシートの形態をとる。
【００３４】
ある設計によれば、予め成形されたシールを、マイクロカラムの基部またはそれに対応するマイクロタイタウェルの開口部のいずれか、または両方の周りに、もしくはマルチウェルプレート全体の周囲に備えてもよい。図５Ａは、エラストマーまたはゴム製の環２６を基部に持つマイクロカラム１０を示している。環２６は、マイクロタイタウェル６の上側の縁に適合し、図５Ｂに示したもののように、マイクロカラム１０がマイクロタイタウェル中に導入されたときにマイクロタイタウェル６を密封するように設計されている。シール２６ａは、例えば、図５Ｃに示すように、マイクロタイタプレートの蓋として、マイクロカラム１０を保持する平坦な支持構造体１２の外側すなわち周囲縁に沿って位置していても差し支えない。両方の種類の密封特徴により、アッセイの展開中の試料の二次汚染を防いだり、プレート内の試料の微環境または液体試薬の蒸発を調節することにより、アッセイの変わり易さを最小にできるであろう。さらに、個別の温度制御装置を各マイクロカラム中に備え付けて、アッセイの展開における温度の融通性を大きくできるであろう。
【００３５】
本発明は、アッセイを行う方法も包含する。図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃの描写は、本発明の方法の実施の形態によって、どのようにマイクロカラムを使用できるかを示している。図６Ａは、図３Ｂのマイクロタイタプレートからの多数の対応するマイクロタイタウェル６を示している。図６Ｂは、図１Ｂに示した種類の多数のマイクロカラム１０プラットフォームの拡大斜視図を示している。図６Ｃは、マイクロカラム１０とマイクロタイタウェル６との間の相互作用を示している（代わりに、図６Ｄ、６Ｅおよび６Ｆは、それぞれ、マイクロタイタウェル６、図１Ｃに示した種類のマイクロピン１６を持つマイクロカラム１０プラットフォーム、およびそれらの相互作用を示している）。この方法は、多数の工程を有してなる。最初に、少なくとも一つのマイクロカラムを有する装置を提供する。多数の異なる生体物質の試料のアレイを、1)各マイクロカラムの第１表面；2)各ウェルの底面；または3)それら両方のいずれかに固定化する。具体的には、多くの異なる生体物質１を、各マイクロカラム１０の第１表面３のアレイ内に一緒に配置する。アッセイを行う準備ができたときに、マイクロカラムを逆にし、それによって、各マイクロカラムの第１表面が各ウェルの底面に向き、マイクロタイタプレート内の対応するウェルまたはリザーバ中に挿入するかまたは他の様式で係合させる。様々な試薬溶液を用いても差し支えない。所望の用途に応じて、試薬は、ＤＮＡハイブリダイゼーション、タンパク質・抗体アッセイ、または細胞トランスフェクションおよび細胞リバーストランスフェクションアッセイのためのものであって差し支えない。各マイクロカラム１０は、第１表面−またはマイクロピン１６の第１表面−がマイクロタイタウェル６の底部壁３０またはリザーバと直接接触せず、むしろ、底部壁３０と密接に接近するだけとなるような仕様に設計されている。装置全体は、生体物質１の液体試薬２８との反応を促進させるために、手または機械のいずれかにより、物理的に撹拌しても差し支えない。反応が完了した後、装置を取り出し、第１表面を画像化して、生体または化学反応を研究する。
【００３６】
本発明をマイクロプレートと共に使用すると、効率的な低容量結合反応のためのアッセイチャンバが得られる。マイクロカラム１０の逆さの第１表面とマイクロタイタウェル６の対向している底部壁３０との間に一定の毛管空間３２を維持するために、様々な手段を使用して差し支えない。例えば、図７に示したもののように、少なくとも３つのスペーサ３４を一組用いてもよい。スペーサ３４は、第１表面３の平面に対して実質的に垂直な方向に第１表面の縁から、または第２のまたは側面５から（図示せず）突出している。別の配置および実施の形態において、３つのスペーサは半球状ビーズの形態をとっても差し支えなく、これらのビーズは、第１表面がマイクロカラムの第２表面と接触する第１表面の縁近くの第１表面上に等距離で配置されている。また、第１表面の縁に沿って延在する、わずかに突出した連続エッジまたはビーズも考えられる。
【００３７】
あるいは、２つの対向表面３，３０の間の毛管空間３２内で一定の距離を維持するために、他の種類のスペーサを用いてもよい。図８Ａ、８Ｂおよび８Ｃに示されているように、隆起リブ３６またはフランジ３８いずれかなどのこれらスペーサがマイクロタイタウェル内に配置されている。図８Ａにおいて、リブ３６が、マイクロタイタウェル６の側壁４０と交わる底部壁３０の周囲に沿って底部壁３０上に配置されている。図８Ｂおよび８Ｃから分かるように、底部壁と側壁の接合部には、フランジ３８が側壁から内側に延在している。フランジ３８は、階段状（図８Ｂ）、三角形（図８Ｃ）、ビーズまたはだぼのものなどの四つ切りの円、もしくは他の形状のいずれの形状をとっていても差し支えない。リブ３６またはフランジ３８は、第１表面３上に固定化されているであろうどのようなバイオサイト１ａにも接触せずに、マイクロカラムの第１表面３の縁が載置される表面を提供する。図８Ｄの断面に見られるように、縁４２はフランジ３８に接触して置かれており、したがって、第１表面は、マイクロタイタウェルの底部壁に対向し、そこから間隔が置かれている。これらの実施の形態によれば、スペーサ、リブまたはフランジの高さが、マイクロカラムの第１表面からマイクロタイタウェルの底部壁までの間隔の実際の距離（毛管空間）を決定する。
【００３８】
アレイ技術の進歩にもかかわらず、感度が良好な生体分子および生体反応を検出する能力はまだ、生物学、分子学、薬学、および医学の用途にとって重大な要望のままである。従来のマイクロアレイに固有の問題の内の一つは、信号対雑音比がかなり不十分であることであり、これは、非常に敏感な用途にとって問題となる。検出感度の増大は、信号を増大させることとは対照的に、バックグラウンドノイズを除去することにより、最も効率的に対処される。
【００３９】
本発明は、特に、マイクロピンを用いた実施の形態において、生体分子および生体反応を検出するための感度を改善することができる。理論により拘束することを意図するものではないが、各マイクロピンは、ピンの先端で活性化光が集光するような特定の設計で形成されていてもよく、二光子蛍光イメージング、顕微鏡、または分光法を用いて非線形検出を行うのに用いてもよい（例えば、Y.Shen et al., Applied Physics Letters, 2000,76(1), 1-3; X.Wang et al., J.Biomed.Opt., 2001,6(3), 319-325を参照のこと）。イメージングするときにバックグラウンドの一部となる周囲領域から離して生体物質を物理的に上昇させ、検出の焦点区域をピンの最初にものに移動させることにより、バックグラウンドの平面よりも上に焦点深さだけ、光学的に識別する能力を増加させることができ、それゆえ、作業者は、感度が大きく、バックグラウンド信号が小さいことにより、試料をより容易に画像化できる。マイクロピンアレイの三次元構成により、空間認識による高感度検出のための独特な光学素子を使用できる。さらに、増大した感度により、利点が加わる。高感度の器具により、作業者は、生体反応における非常にわずかな変化も検出でき、分析を行うための生体物質および試薬を今ほど多く必要としないであろう。これらの要因の両方により、費用を相当減少させることができ、作業者は、入手の限られた生体試料を節約できる。
【００４０】
別の用途において、本発明のマイクロカラムの設計は、質量分析のための器具として使用できるであろう。一般に、質量分析において、レーザビームにより試料をイオン化させる。マイクロプレート設計に基づく現在の技術は、レーザが到達するのがより困難なウェルの底部に試料が位置しているので、ある程度制約されている。マイクロカラムの露出された第１表面上に固定化された生体物質は、レーザにとってより容易にアクセスできる。それゆえ、マイクロカラムによって、質量分析（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ）装置にとってハイスループット分析がより容易になる。
【００４１】
現在利用できるスライドスキャナーを使用してマイクロカラムの最初のものの上にあるアレイの検出を促進するために、光学素子でマイクロカラムアレイを保持するように、「アダプタ」を用いてもよい。図９は６つのマイクロカラムの一試験片のためのアダプタを示している。アダプタは、黒または濃い色いずれかの硬質ゴムまたはポリマー材料から製造されており、光学式走査のための適切な位置にアレイの第１表面を配置するために、各マイクロカラムの周りに収まる。アダプタは、各マイクロカラムの縁を覆って、視覚的にバイオサイトを隔離し、エッジ効果の歪みを防ぐであろう。特定の設計に応じて、アダプタは、屈折、複屈折またはイメージングプロセス中の他の光拡散などの光学干渉を除去できる。現行の走査装置または他の観察方法いずれかにより適合するマイクロカラムアレイを作製するために、他のアダプタの様式も考えられる。例えば、一体部品として形成できるか、または製造後にマイクロカラムのアレイに嵌められる、マイクロカラムの全アレイを同時に画像化できるようなアダプタを製造できる。アレイを、約５．０±０．２インチ（約１２．５±０．５ｃｍ）の長さ、約３．３±０．２インチ（約８．３±０．２ｃｍ）の幅、約０．５６±０．０２インチ（約１．４±０．０５ｃｍ）の高さの標準的なマイクロプレートの寸法に適合させるために、アダプタは、各マイクロカラムの第１表面のより容易なロボット式の取扱いおよび直接走査に有利に働くであろう。
【００４２】
他の実施の形態において、各マイクロカラムは、内部空洞を持つシャフトを有していてもよい。この空洞には、潜在的に、多くの用途がある。ある用途によれば、本発明は、追加のウェルを必要とせずに、標準的なマイクロプレート中の蒸発および混合の問題を解決する。ある概念にしたがって図１４に示されているように、中空空洞５０は、支持構造体１２から離れた第１表面３まで、マイクロカラム中に延在する。中空空洞は、試薬または他の流体を直接、マイクロカラムの表面にあるバイオサイトのアレイの下に位置するマイクロタイタウェルの区域に導入するための（例えば、ピペットチップ５７または注射針により）導管として使用してもよい。マイクロカラム中の各中空空洞５０は、試料溶液を運び、混合するための、直径が約５００μｍ以下のマイクロチャンネル５６、入口５２および出口５４を有する。図１４は、中心を通る、またはマイクロカラムの側部にずれたいずれかの、中空導管５０の２つの可能性のある位置を示している。各マイクロカラムは、ピラーの周辺に亘りまたは中心に位置する多数の（例えば、１〜６個の）中空導管を有していてもよい。ここに引用する米国特許出願第１０／１５５５４０号の明細書には、マイクロカラム中の中空導管の設計および用途がより詳しく記載されている。
【００４３】
例えば、先に詳述した方法によれば、生体物質１の直線アレイ２を最初にマイクロカラム１０の第１表面３上に付着させる。マイクロカラムプレートを逆にしたとき、第１表面３は下向きになり、これを標準的なマイクロプレートのウェル６中に挿入する。アッセイ混合物５８を、図１５に示したように、マイクロカラム１０中の中空導管５０を通してマイクロタイタウェル中に注入する。各マイクロカラムは、各ウェル中に導入される全ての試薬または試料溶液上のカバースリップとして効果的に働くので、マイクロカラムはウェルからの蒸発を最小にする。使用されるアッセイ混合物の量は、各中空ピラーの生体物質がプリントされた表面と対応するマイクロタイタウェルの底部との間の距離（間隙）を変更することにより調節できる。マイクロピラーの第１表面とウェルの底部との間の比較的密接な距離のために、表面張力または静水力により、アッセイ流体は、アレイ状の生体物質の下の区域に制限される。この特性によって、アッセイを行うのに必要な試薬の容量が減少するだけでなく、生体物質への試薬溶液の直接の使用が局所化され、さらに、アッセイ中ずっと微量流体流を促進さえするかもしれない。ある方法によれば、アッセイ混合物をピペットで上下にして、微小真空または吸引を形成してもよく、これにより、インキュベーション中の微量流体の混合が促進される。
【００４４】
マイクロカラムプレートおよび中空ピラーは、ガラスまたはポリマーもしくはそれら両方の組合せから製造して差し支えない。ガラス製の中空ピラーをマイクロカラムプレートに使用することが好ましい。図１６に示したように、装置は、使用前に中に挿入される中空ガラスピラー６４を保持できる中空ポリマーキャップ６０を備えたポリマープレートを含んでいてもよい。ポリマープレート６２は、射出成形技法により製造でき、中空ガラスピラーはガラス延伸技法により製造できる。また、中空ピラー１０ａを含むマイクロカラムプレート全体は、画像化するときにそれ自体が生体蛍光を発しないポリマー材料から射出成形してもよい。
【００４５】
第２の用途によれば、中空空洞は、そこを通り抜けずに、マイクロカラムの第１表面の直前まで延在してよい。この空洞は、おそらく、マイクロカラムのシャフトの長さの約９９．５％から９８．５％以下まで延在してよい。この空洞中に、光ファイバなどのセンサおよび検出装置を配置することができる。そのようなセンサにより、より高感度で、マイクロカラムの第１表面の向こう側に付着した生体試料を視覚化または検出できるであろう。そのような状況にあるマイクロカラムは、必然的に、高い光学品質の透明材料から製造されていることが明らかである。
【００４６】
さらに別の実施の形態において、マイクロカラムは、そこに生体物質が付着している磁性ビーズのより速くより容易な抽出を促進するために適用してもよい。任意の形状または形態および所定のサイズと磁場強度の磁石がマイクロカラムの設計に組み込まれる。この設計には、ロッドまたはディスク形状いずれかの磁石を提供し、この磁石をマイクロカラム中に挿入するかまたは一体成形する各工程を含む。マルチウェルプレートのウェル中に挿入されるマイクロカラムの有効端部で、すなわち、第１表面とその周囲の第２表面で磁力が最も集中しているように磁石を配置すべきである。反応容器から溶液を吸引する必要なく、生物学的製剤を持つ多くの金属または磁性ビーズと即座に結合する能力により、反転時間が大幅に減少し、生体アッセイのハイスループットが全体に増加する。
【００４７】
本発明の装置は、製造が比較的容易である。マイクロカラムおよびそれらの支持構造体の両方は、多数の異なる材料から製造できる。前述したように、これらの材料は、ガラスまたは石英、合成石英、セラミック、または金属などの無機物であっても、またはポリプロピレン、ポリスチレン、ナイロン膜などのポリマーまたはコポリマーのような有機物、もしくは複合材料であって差し支えない。本発明の装置は、クロム、金、白金、またはケイ素などの金属表面を有していても差し支えない。マイクロカラムは、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンなどのポリマーまたはコポリマー材料を用いて、比較的滑らかな第１表面を持つマイクロカラム形態に射出成形しても差し支えない。
【００４８】
ガラス製マイクロカラムは、気相成長法などにより、支持基体の一体部分として成形しても、より機械的なプロセスにより、ガラスドエル（例えば、ホウケイ酸ガラス、アルミノホウケイ酸ガラス、アルミノケイ酸ガラス、溶融シリカまたは他のケイ酸塩高含有（＞８５重量％）ガラス）、石英、ケイ素、またはセラミック材料から切断し、適合する材料の平坦な基体上に搭載しても差し支えない。
【００４９】
最初の成形後、マイクロカラムの第１表面、第２表面、または他の表面、もしくは他の部分またはそれらの組合せの化学修飾を行って、所望の生体反応性および生体適合性を達成しても差し支えない。成形したマイクロカラムの頂面に、ペプチド、タンパク質、脂質、ＤＮＡ、細胞成分等の生体分子を、共有結合または非共有の静電結合により固定化できるようにする、アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、または無水物基等の官能基でコーティングとして修飾しても差し支えない。このコーティングは、基体上にその場で形成しても、後に基体に施してもよい。
【００５０】
ポリマー材料について、反応性官能基を持つコポリマーを用いて、マイクロカラムを成形しても差し支えない。例えば、ポリ（スチレン−コ−マレイン酸無水物）（ＳＭＡ）を用いて、第１アミノ基またはヒドロキシル基を含有する分子が共有結合により付着させられる反応性無水物基を含有する表面が生成される。
【００５１】
一方で、ガラス基体について、ガラス製マイクロカラムの第１表面は、有機コーティングで化学修飾してもよい。次いで、所望の生体物質の試料を、例えば、接触ピンプリント法またはインクジェットプリント法のいずれかを用いて、各マイクロカラムの第１表面上にプリントまたは他の様式で付着させる。例えば、ガラス表面は、シラン処理により修飾しても差し支えない。ガンマ−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＧＡＰＳ）により修飾した基体により、ＤＮＡ分子をＤＮＡアレイの製造において付着させることができる。
【００５２】
各マイクロカラムの第１表面は、金属薄膜またはコーティングを有していてもよい。金属薄層を形成するために、多種類の金属をプラスチック表面またはガラス表面のいずれかの上に蒸着させることができる。可能性のある金属膜としては、アルミニウム、クロム、チタン、タンタル、ニッケル、亜鉛、鉛、鉄、銅、マグネシウム、マンガン、カドミウム、タングステン、コバルト、ステンレス鋼、およびそれらの合金または酸化物が挙げられる。好ましい実施の形態において、金属表面は、白金、金、または銀を含む貴金属膜により被覆されている。特に好ましい実施の形態において、前記コーティングは金または金の合金を含む。マイクロカラムの表面上に金の薄いコーティングを形成するために、電子ビーム蒸着を用いてもよい。金の金属膜は、厚さが約６０ｎｍから約５００ｎｍであってよい。別の実施の形態において、金属膜は約１ｎｍから約１μｍの厚さである。脂質膜および／またはタンパク質、核酸、リガンドなどの生体物質は、金属表面に付着し、自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）を形成できる。金属被覆マイクロカラムは、質量分析にとっても有用である。上述したように、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ質量分析装置に適合するマイクロカラムを製造すると、タンパク質またはタンパク質／ペプチド断片、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および他の小さな有機化合物などの様々な分子の無標識検出が可能となる。
【００５３】
マイクロピンの製造方法は、実際の所望のサイズおよび用途によるであろう。説明のために、コーニング社(Corning Incorporated)により開発された、マイクロピンを製造する多数の特許方法を以下に論じるが、同様の結果を達成できる当該技術分野で知られた他の方法もこの開示の範囲に含まれる。ポリマーマイクロピンを製造する実例の一つは、安価な使捨て形態のための射出成形によるものである。アレイの特定の用途と必要性により、各マイクロピンは、直径が約１０マイクロメートルから約２５０マイクロメートルまでである。各マイクロピンは、約５０マイクロメートルから約２００マイクロメートルの直径であることが好ましい。バーチ(Birch)等に発行され、その内容をここに引用する、米国特許第６０５１１９０号明細書に詳細に記載されているような、マイクロアレイプリントヘッドを調製するために使用されるもののような様式で、生体物質をマイクロピンの頂部に付着させる。バーチ等の特許によれば、少なくとも一つのロッドまたはピン状の構造体を持ち器具を用いて、生体物質または化学物質を含有する少量の液体を移送する。器具の各ロッドは、湿潤性表面および非湿潤性である少なくとも第２表面を持つ。このロッドを、所定の時間に亘り所定の温度で、液体を含有する貯蔵部中に浸漬する。ロッドを取り出したときに、液滴がロッドの湿潤性端部上に保持されている。非常に微細なシリカ製マイクロピンは、反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）プロセスを使用する工程を含む、第２の手法により製造しても差し支えない。ＲＩＥプロセスにより、アレイの実際の用途に応じて、直径が、約１マイクロメートルから約４００マイクロメートル、好ましくは、約５０マイクロメートルから約２５０マイクロメートルに及ぶサイズを持つマイクロピンを製造することができる。ＲＩＥプロセスによれば、フォトレジストの厚い層で被覆された研磨シリカウェハーをイメージングし、現像し、次いで、誘電結合プラズマにより、またはそれを用いずに、エッチングする。フォトレジストマスクの像の形状（例えば、円形、正方形、三角形、多角形等）がピンの形状を画成する。ＲＩＥプロセスは、マイケル・ビー・ブラッディー(Michael B. Brady)等による、「Pin Plate for Use in Array Printing and Method for Making the Pin Plate」と題する、コーニング社に譲渡され、ここに引用する、米国特許出願第０９／９６２８３１号明細書に詳細に論じられている。
【００５４】
他の技法としては、フォトマスクを使用して、感光性ガラスの選択した区域を紫外線に露出するものなどの従来の製造プロセスが挙げられる。次いで、露出された区域をフッ化水素酸でエッチングして、マイクロピンを形成する。もしくは、ある実例は、フォトレジスト材料中にマスターピンプレート像を形成し、マスターピンプレートのシリコーン製レプリカを注型する各工程を含む。
【００５５】
さらに別の実施の形態において、本発明は、マイクロカラムから形成され、導波路で被覆され、グレーティングがエンボス加工されたバイオセンサ装置を提供して、無標識様式で実時間相互作用分析を可能にする。この実施の形態は、現行のバイオセンサ装置の基本的な制限、特に、比較的低いスループットの試料処理を克服できるかもしれない。マイクロタイタウェルプレートはより高いスループットを与えるが、それらのプレートは、連続流のための流体工学が現在得られていないので、実時間相互作用のモニタに容易には利用できない。それゆえ、実時間測定からの反応速度パラメータ（ｋon（Ｍ-1ｓ-1）、ｋoff（ｓ-1））の演算は難しく、物質移動制限結合および横立体効果のために、エラーとなる傾向にある（Lahiri et al., Langmuir, 1999, 15, 7186-7198参照のこと）。
【００５６】
バイオセンサ装置は、様々な手段によりマイクロカラム上に製造することができる。好ましい手段は熱可塑性加工によるものである。熱可塑性加工は、高温および高圧を用いて、軟化したポリマーを可塑変形する工程を含む。その時間のほとんどで、これらの極端な状況には、使用する成形型および工具をスチールから製造する必要がある。ガラス基板およびシリコン基板にグレーティング構造をパターニングするために、一般に、リソグラフィー（例えば、電子ビームリソグラフィーおよび紫外線リソグラフィー）および（レーザによる）直接書刻技法が用いられている。その後、マイクロレプリケーション技法を用いて、グレーティングの微細パターンを担持する金属基板を形成しても差し支えない。スチール基板上への直接パターニングにより、プロセスが大幅に単純になる。
【００５７】
例えば、波長以下のグレーティングのパターニングは、電子ビームを用いて、高感度レジストに書き込む工程を含む。この作業は主に、ガラス状表面に行われているが、ここで、工具鋼の表面にその操作を行うことをここで提案する。この場合、金属表面は電子ビーム用レジストにより被覆されており、グレーティングの線をレジストに書き込むことができ、スチール製基板の対応する区域が露出されるであろう。この時点で、二通りの手段に従うことができる。第１に、新たな金属を露出された区域の内側に堆積させることができる。したがって、グレーティングの線を上に作製する。あるいは、第２に、金属を選択的に除去しても差し支えない。言い換えれば、パターニングされたレジストをエッチング用マスクとして使用しても差し支えない。それゆえ、グレーティングの線は、隣接する露出区域から金属をエッチングで除去することにより、レジストの下に形成される。これは、モノリス工具または個々の挿入物をパターニングする場合に当てはまる。
【００５８】
所望のグレーティングパターンを担持している金属底部プレートを位置合せし、多数の孔を有するプレートと一緒に積み重ねることができる。ポリマー材料を孔に入れ込み、この孔で、グレーティングのパターンが複製される。ポリマーが硬化したときに、成形型からマイクロカラムを引き抜く。各マイクロカラムは、第１表面上にグレーティングの複製を担持している。いわゆるモノリス手法によれば、底部プレートおよび関連するマイクロカラムアレイは、一試験片に製造できる。再度、前記装置は、個々のパターン担持プラグが中に挿入される、図１６に示した概念と類似のキャリヤプレートからなっていて差し支えない。この第２の構成は、モジュラ手法と呼ばれ、これは、工具の個々のグレーティング区域を、それらが損傷した場合に交換できるという利点を示す。
【００５９】
本発明によるマイクロカラムをベースとしたバイオセンサの使用方法は、以下の工程を含んでもよい。最初に、平衡に相当する安定信号（Ｓeq）が観察されるまで、マイクロプレートの各ウェル内に収容された標的部分の溶液中に、第１表面に生体プローブが固定化されているマイクロカラムを浸漬する。反応速度論を推測するためではなく、平衡に到達したかをモニタするためだけに、この結合相で実時間測定を用いてもよいであろう。Ｓeq／Ｃ対Ｓeqのプロットにより、１／Ｋdと等しい傾斜が得られるであろう。ここで、Ｃはプローブ溶液の濃度であり、Ｋd（＝ｋoff／ｋon）は平衡解離定数である。次いで、フラッシュ用すなわち洗浄用の緩衝液を連続的に流しながら、マイクロカラムを浴中に浸漬し、解離による信号の降下を実時間でモニタする。例えば、各マイクロカラムに一つずつの浴があっても、マイクロカラムの全アレイのための一つの大きな浴があっても差し支えない。再結合は、ｋoffの測定においてアーチファクトを生じ得るので、洗浄用緩衝液に可溶性標的を過剰に加えて、解離したプローブを捕捉しても差し支えない。プローブの無限希釈は、容易に実施でき、ｋoffの都合のよい精密な測定が可能となる。この方法には、ｋon（Ｋd-1／ｋoff）より精密な間接的な測定を含む利点がいくつかある。
【００６０】
生化学または細胞アッセイのために、マイクロカラムに固定化された化学または薬剤分子を、マイクロプレートの底部で培養した細胞に挿入する実施の形態にしたがって、マイクロカラムを用いてもよい。次いで、薬剤分子は、例えば、アッセイ反応中に、共有結合により結合された場合には、能動的に解放されるか（例えば、フォトマスクを通しての露光により開裂される結合）、または非共有結合により結合された場合には、受動的に解放される（例えば、単純な拡散）。例えば、媒質中で遊離している薬剤分子は、移動し、細胞上の標的と結合する。
【００６１】
本発明はまた、生体アッセイを行うのに適したキットまたはアセンブリに関する。生体または化学アッセイを行うのに適したアセンブリは、(a)支持構造体、(b)支持構造体から離れて突出した複数のマイクロカラムを有する製品であって、(c)各マイクロカラムが支持構造体から離れた第１表面および少なくとも第２表面を有するものである製品と；各マイクロカラムをその中に挿入できる対応する数のウェルを持つマイクロタイタプレートと；1)各マイクロカラムの第１表面、2)各ウェルの内面（例えば、底面）、または3)その両方に固定化された複数の異なる生体物質とを備えているであろう。
【００６２】
マイクロタイタプレート中の各ウェルは、ウェルの底部壁の周囲に亘り位置するスペーサを持ち、このスペーサは、ウェルの底部とマイクロカラムの第１表面との間に毛管空間を維持する。別の実施の形態において、マイクロタイタウェルは底部壁３０を持ち、この底部壁は、底部壁が側壁４０と接触する周囲近くに沿って疎水性４４であり、底部壁の中央区域では親水性４６であるように処理されている。この特性が、図１０Ａ、１０Ｂ、および１０Ｃに示されている。水性試薬４８は、図１０Ａのウェルに加えられると、図１０Ｂに示したように、ウェルの底部の中央にある親水性領域内に収容される。図１０Ｃは、図１０Ｂの状態の三次元斜視図であり、マイクロカラム１０の生体アレイ２の真下にある区域に制限されている液体試薬４８を示しており、これにより、試薬とアレイとの接触を最適に出来る。このアセンブリはさらに、一般的な洗浄を行うための第２トレイ、および／またはアレイまたはそこに結合した生体分析物のいずれかを画像化するときにマイクロカラムを保持するための物理的アダプタを備えていてもよい。
【００６３】
本発明のマイクロカラムアレイの設計には、マイクロタイタプレートのウェルの底部の深い場所にプリントされたアレイよりも優れた利点が数多くある。より重要な利点の数例を示す。第１に、この新たな設計により、研究者は、一つの装置で多数の試料を操作し、処理するより単純な手段を得る。例えば、現行のマイクロタイタプレートで洗浄工程を行うためには、通常、液体をピペットにより個々のマイクロタイタウェル中へとそこから出し入れする操作を数多く行わなければならない。これは、実施するのが退屈な作業である。マイクロカラムにより、その必要がなくなる。従来のマイクロタイタプレートのアレイとは異なり、マイクロカラムをそれらの反応ウェルから抜き出し、異なる個々の洗浄ウェルまたは共通の洗浄容器中に再度挿入するだけでよく、これにより、洗浄工程が単純になる。マイクロカラムはマイクロタイタプレートと連携するように設計されているので、一般的なアッセイの調製工程や反応工程、読取工程でさえも全て一つの装置で行うことができる。
【００６４】
第２に、より効率的な反応の速度論のために、マイクロカラムを激しく動かして、アッセイの試薬溶液を混合しても差し支えない。この特徴により、微量流体流れが生じ、プローブおよび標的分子の相互作用と分散が増し、反応速度がより速くなる。マイクロカラムはマイクロタイタウェルの底部に非常に近接させることができるので、それほど多くの液体容積を必要としない。少量の流体および試料を使用するだけでよく、これにより、費用と物質の両方が節約できる。
【００６５】
マイクロカラム設計の第３の有利な特徴は、比較的大きく平坦なマイクロカラムの第１表面であり、これにより、試料を読み出すための水準面が与えられる。生体試料は、比較的露出された突出平面上に位置し、これは、イメージングにとって良いことであり、マイクロタイタプレートに関連する干渉のいくつかとは異なり、ＣＣＤカメラまたはレーザスキャナによる検出がより容易になる。
【００６６】
本発明は、スループットを増大させるための様々な用途にとっての単純かつ的確な解決策であると考えられる。それぞれ第１表面上に多数の生体試料が付着しているマイクロカラムのアレイは、異なる生体試料の高容量スループットのアッセイについての、生物学的薬剤または研究、並びに医療および臨床用途における増大している需要に、イメージングの感度を増大させながら、うまく対処できる。マイクロタイタウェルの制限された底部に付着した生体物質およびこの物質をそこに配置することに関連する困難の代わりに、マイクロカラムにより、マイクロアレイのもののような、直線配列で開放された各第１表面上に関心のある多くの異なる生体試料のアレイを研究者はプリントできる。同じ表現型について多数の患者の試料をスクリーニングするためなどに、同じアレイ装置での多数の異なる試料の並行分析が、より容易かつ迅速に行うことができるであろう。
【実施例１】
【００６７】
マイクロカラムベースのアレイプラットフォームの概念が有効であることを確認するために、ガラス製マイクロカラムでＤＮＡマイクロアレイ・ハイブリダイゼーション実験を行った。各ガラス製マイクロカラムの第１表面を研磨し、ガンマ−アミノプロピルトリメチルシラン（ＧＡＰＳ）コーティングにより処理した。ガラススライド様式とマイクロカラム様式を比較するために、現行のＧＡＰＳ処理スライドで並行マイクロアレイ・ハイブリダイゼーション実験を行った。以下の表１に示した、１０個のヒトの遺伝子を表す１０個の異なるＰＣＲ断片を、デカルト式(Cartesian)ピンプリンタを用いて、ガラス製マイクロカラム上およびＧＡＰＳ被覆スライド上にプリントした。ハイブリダイゼーション混合物中のＣｙ３およびＣｙ５−ｃＤＮＡプローブ比は、１ｘ＝１４ｎｇであった。
【表１】
2005528582.tif 000003
【００６８】
表２は、マイクロカラム上およびスライド上の各ＰＣＲ断片の相対位置を要約している。
【表２】
2005528582.tif 000004
【００６９】
これら二種類のアレイ様式で、シアニン５−およびシアニン３−標識ｃＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーションを並行に行った。ハイブリダイゼーション検出のダイナミック・レンジを評価するために、各遺伝子について所定量のＣｙ５−標識ｃＤＮＡプローブを、各遺伝子についてＣｙ３−標識ｃＤＮＡプローブの滴定を用いてハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションの手順は次のようなものであった。1)プレハイブリダイゼーション：スライドおよびマイクロカラムアレイを、２×ＳＳＣ／０．０５％  ＳＤＳ／０．２％  ＢＳＡ中において４２℃で１０分間、１×ＳＳＣ中において室温で２分間、および０．２×ＳＳＣ中において室温で２分間に亘り三回、インキュベーションした；2)ハイブリダイゼーション：７５μｍのハイブリダイゼーション溶液を用いた；3)洗浄：アレイを、２×ＳＳＣ／０．０５％  ＳＤＳ中において４２℃で５分間に亘り二回、１×ＳＳＣ中において室温で５分間に亘り二回、および０．２×ＳＳＣ中において室温で三回洗浄した。スライドについて、溶液をスライド上のアレイの上に配置し、カバースリップにより被覆した。マイクロカラムアレイにいて、溶液を９６ウェルプレートのウェル内に配置し、マイクロカラムの第１表面上のアレイが溶液中に浸されるように、マイクロカラムをウェル中に挿入した。アレイをこのようにして４２℃で一晩インキュベーションした。次いで、アレイを乾燥させ、ＧｅｎｅＰｉｘスキャナを用いて走査した。
【００７０】
図１１Ａのスライドベースのアレイから得たハイブリダイゼーション結果を、図１１Ｂのマイクロカラムにプリントしたアレイから得た結果と比較した。図１１Ａおよび１１Ｂは、それぞれ、ＧＡＰＳ処理スライドおよびガラス製マイクロカラムに行ったｃＤＮＡハイブリダイゼーションの走査画像である。ＧＡＰＳスライドおよびマイクロカラム上でのハイブリダイゼーションの感度および品質は、実際には区別できない。これらの結果は、アレイアッセイにマイクロカラムプレートのプラットフォームを使用する実現可能性を実証している。
【００７１】
異なるハイブリダイゼーション条件を用いた並行アレイアッセイを実施するのにマイクロカラム装置を使用できることを実証するために、一般的なガラス支持体に取り付けられた３つのＧＡＰＳ処理ガラス製マイクロカラム上に３つの同じアレイをプリントした。これらのアレイは、各マイクロカラム上にプリントされたヒトβ−アクチン遺伝子の１．５ｋＢ  ＰＣＲ断片の８×８パターンからなるものであった。Ｃｙ３−およびＣｙ５−標識−アクチンＰＣＲ断片をプローブとして用いた。図１２Ａに示すように、各マイクロカラムについて所定量（２５０ｎｇ）のＣｙ３−標識β−アクチンプローブを用い、マイクロカラムで様々な量（５，２５，および１００ｎｇ）のＣｙ５−標識β−アクチンプローブを用いて、ハイブリダイゼーションを行った。アレイ装置をウェル中に挿入し、マイクロカラムを５０マイクロリットルのハイブリダイゼーション溶液中に浸すことにより、１×８−Ｓｔｒｉｐｗｅｌｌプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標））の３つのウェル内で並行ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション条件は、インキュベーション時間が１時間であったことを除いて、上述した実施例と同様であった。洗浄工程後、マイクロカラムアレイを、図９に示したアダプタ装置を用いてＧｅｎｅＰｉｘスキャナにより走査した。３つのマイクロカラムのこのようにして得られた走査画像が図１２Ａに示されている。
【表３】
2005528582.tif 000005
【００７２】
各マイクロカラムについてＣｙ３−およびＣｙ５−プローブハイブリダイゼーションのレベルを比較するために、各マイクロカラム上の６４バイオサイトのＣｙ３およびＣｙ５信号強度を平均化した。図１２Ｂに示したように、平均Ｃｙ５信号強度はマイクロカラム１番から２番に、マイクロカラム２番から３番に確実に上昇し、一方で、Ｃｙ３信号強度は一定のままであり、ハイブリダイゼーションに用いたＣｙ５およびＣｙ３プローブ条件を反映していた。それゆえ、マイクロカラム装置を用いた、３つの異なるハイブリダイゼーション条件を並行にうまくアッセイでき、ハイスループットアッセイ器具としての有効性を実証した。
【実施例２】
【００７３】
本発明のマイクロカラム装置をマルチウェルプレートと共に使用することには、少なくとも２つの重大な利点がある。その利点としては、アッセイ容量を最小にし、アッセイの感度を増大させる能力が挙げられる。これらの特徴の両方は、ウェルの底面とマイクロカラムの第１表面との間に形成された間隙の比較的小さな容量に関係する。例えば、本発明によるガラス製マイクロカラムは、チャンバの底面として取り付けられたＧＡＰＳ被覆ガラススライドを持つ対応するシリコーン製チャンバ（Vivascience, flexiPERM micro 12）中に挿入したときに、スライドおよびマイクロカラムの対向表面間に１７５μｍの間隙を形成する。その間隙を満たすのに必要なのは、少量の溶液だけである。それぞれが２５の遺伝子スポットを持つ多数のｃＤＮＡアレイを、チャンバのウェルに対応する位置でＧＡＰＳ被覆スライド上にプリントした。表４および５は、それぞれ、スライド上の各遺伝子の身元および位置を要約している。上述したように、標識プローブを、対照並びにミトマイシンＣ処理ＨｅｐＧ２細胞からのＲＮＡで生成した。各標識付け反応において、約２μｇの全ＲＮＡを用いた。このようにして得られたＣｙ３およびＣｙ５−標識プローブを、３０μｌのハイブリダイゼーション反応（＝３０μｌ中の１ｘ）中に用いた。溶液の容量が減少し、プローブ濃度が増大したアッセイの有効性を検証するために、本出願人は、条件を表４に要約している４種類の試験を行った。第１に、３０μｌのハイブリダイゼーション混合物中１×プローブ濃度を用いて、マイクロカラムを使用しない対照アッセイを行った。第２のアッセイでは、９μｌのハイブリダイゼーション混合物の減少した量において１×プローブ濃度を用いた。第３と第４のアッセイにおいて、本出願人はマイクロカラムをウェル中に挿入した。第３のアッセイでは、９μｌのハイブリダイゼーション混合物中１×プローブ濃度を用いた。第４のアッセイでは、９μｌのハイブリダイゼーション混合物中３×プローブ濃度を用いた。
【表４】
2005528582.tif 000006
【００７４】
各ウェル内のアレイ状にあるハイブリダイゼーション溶液中にｃＤＮＡのプローブを配置した。４２℃での４時間後、アレイを洗浄し、走査した。
【００７５】
図１７Ａおよび１７Ｂは、ガラススライドの表面上のアレイの画像を示している。図１７Ｂは拡大した生体アレイを示している。図１７Ｂの上側の４つのアレイに示したように、アッセイ１（３０μｌ、１×）および２（９μｌ、１×）においてカバースリップとして働くマイクロカラムを用いずに、ハイブリダイゼーションを行った。アッセイ３（９μｌ、１×）および４（９μｌ、３×）において、図１７Ｂの下側の４つのアレイは、各々マイクロカラムで覆った。
【００７６】
図１８Ａ〜Ｅは、ハイブリダイゼーションの実験結果を要約している一連のグラフを示している。図１８Ａにおいて、ハイブリダイゼーションデータの定量分析により、アッセイ３ではずっと少量（９μｌ）のハイブリダイゼーション溶液を用いたけれども、同じプローブ濃度を用いたアッセイ１（３０μｌ）に見られたものと実質的に同等のハイブリダイゼーション信号が生じたことが明らかになった。アッセイ３におけるマイクロカラム装置の存在により、蒸発が防がれ、ハイブリダイゼーション反応速度が上昇した。マイクロカラムを使用せずに減少した量のハイブリダイゼーション溶液を用いたアッセイ２におけるハイブリダイゼーションでは、インキュベーション際中に枯渇した。それゆえ、従来の量の３分の１未満のアッセイ容量を用いても、カバーとしてマイクロカラムを利用したアッセイでは、匹敵するハイブリダイゼーション信号で効果的にハイブリダイゼーションできる。さらに、同じ絶対量のプローブを小容積で用いたアッセイ４において、Ｃｙ３およびＣｙ５標識の両方について匹敵する平均信号強度は、従来のアッセイ１において観察されたものよりも３．５倍以上大きかった。この現象は、おそらく、増大したプローブ濃度によるものである。それゆえ、マイクロカラム装置は、ハイスループットの９６ウェルマイクロプレートアレイのアッセイにおけるように、プローブの量が限られているアッセイにおいて、より大きいハイブリダイゼーション信号を発生させるのに役立つであろう。
【表５】
2005528582.tif 000007
【００７７】
表６は、スライド上のアレイ中の表５の各遺伝子の相対位置を示している。
【表６】
2005528582.tif 000008
【実施例３】
【００７８】
本発明のマイクロカラム装置のさらに別の用途に、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）用途がある。アドレナリンβ1受容体（Biosignal Pachard）のアレイを膜上に調製し、ここに引用する、ラヒリ(Lahiri)等の「Arrays of Biological Membranes and Methods and Use Thereof」と題する米国特許出願第０９／８５４７８６号明細書に記載されているもののような様式のロボット・ピンプリンタを用いて、３つの隣接したマイクロカラム上にプリントした。これらのガラス製マイクロカラムは、金の薄層で被覆し、ＧＡＰＳで官能化した。官能化金コーティングの化学調製、付着および反応についての具体的な説明も、米国特許出願第０９／８５４７８６号明細書に詳述されている。官能化した金の表面が、普通の被覆されていないガラス表面より優れた信号対雑音比を生じることが示されている。リガンド結合のアッセイを行うために、リガンド結合緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＭｇＣｌ2、ｐＨ７．４、０．１％のＢＳＡ）中に蛍光標識されたβ1受容体リガンド（bodipy-TMR CGP12177）（５ｎＭ）を含有する１×８−Stripwellプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標））のウェル中にマイクロカラムを挿入した。ｂｏｄｉｐｙ−ＴＭＲ  ＣＧＰ１２１７７の結合特異性を検証するために、過剰の未標識リガンド（マイクロカラム２番については１０μＭのＣＰＧおよびマイクロカラム３番については１０μＭのプロプラノロール（β1アンタゴニスト））と共にインキュベーションすることにより、第２と第３のマイクロカラムで競合実験を行った。約１時間のインキュベーション後、マイクロカラムを取り出し、洗浄し、走査して、アレイ上のリガンド結合を評価した。ｂｏｄｉｐｙ−ＴＭＲ  ＣＧＰ１２１７７のβ1受容体への結合は、マイクロカラム１番にプリントされたアレイの高い蛍光信号により見られた。過剰の未標識リガンドと共にインキュベーションしたものでは（マイクロカラム２番および３番）、蛍光信号が著しく減少しており、このことは、結合特異性を示している。これらのアッセイの結果が図１３Ａおよび１３Ｂに示されている。これらの実験により、マイクロカラムにプリントされた受容体アレイでハイスループットのリガンド結合アッセイを都合よく実施できることが示された。
【００７９】
本発明を実施例により説明してきたが、本発明は、具体的に開示した実施の形態に制限されるものではなく、本発明の精神および範囲から逸脱せずに様々な改変および変更を行えることが当業者には理解されるであろう。したがって、変更が、特許請求の範囲により定義された本発明の範囲から逸脱しない限りは、それらの変更は本発明に包含されると考えるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１Ａ】本発明のある実施の形態による、９６個の三次元の円柱状プラットフォームを一組備えた平坦な支持体の上からの斜視図
【図１Ｂ】本発明のある実施の形態による、第１表面すなわち頂面に付着された生体物質のアレイを持つ、図１Ａの一つの円柱状プラットフォームの拡大図
【図１Ｃ】本発明のある実施の形態による、第１表面に一組のマイクロピンが配置されている一つの円柱状プラットフォームの拡大図
【図１Ｄ】本発明による、３個のマイクロカラムを持つ一試験片の斜視図
【図１Ｅ】本発明による、８個のマイクロカラムを持つ一試験片の斜視図
【図２】図２Ａ〜２Ｅは、マイクロカラムの他の実施の形態の斜視図
【図３】９６個のマイクロカラムのアレイを持つプラットフォーム（図３Ａ）が、９６ウェルのマイクロタイタプレート（図３Ｂ）に対応している様子を示す、それらを並べて示す斜視図
【図４】本発明のある実施の形態による、第１表面に付着した生体物質の「薄切りアレイ」を持つマイクロカラムの概略図
【図５Ａ】対応するマイクロタイタプレートの開口部を密封するための、マイクロカラムの基部に位置するシールを持つ実施の形態の拡大図
【図５Ｂ】図５Ａに示した実施の形態のマイクロタイタウェルとの相互作用を示す概略図
【図５Ｃ】プレートの外周にシールを持つ９６個のマイクロカラムのアレイを有するプレートの斜視図
【図６Ａ】図３Ｂのマイクロタイタプレートからの多数のウェルの部分概略図
【図６Ｂ】図１Ｂの実施の形態による多数のマイクロカラムの部分概略図
【図６Ｃ】図６Ａのマイクロカラムと図６Ｂのマイクロタイタウェルが、アッセイを実施する本発明の方法の実施の形態により一緒に機能する方式を示す概略図
【図６Ｄ】図３Ｂのマイクロタイタプレートからの多数のウェルの部分概略図
【図６Ｅ】図１Ｃの実施の形態によるマイクロピンを持つ多数のマイクロカラムの部分概略図
【図６Ｆ】図６Ｄのマイクロカラムと図６Ｅのマイクロタイタウェルが、アッセイを実施する本発明の方法の実施の形態により一緒に機能する方式を示す概略図
【図７】マイクロカラムの第１表面の縁に沿って位置するスペーサの実施の形態を示す斜視図
【図８Ａ】マイクロカラムの第１表面と底部との間の毛管空間のために一定の距離を維持するための、マイクロタイタウェルの底部の周囲位置する突出したリブタイプのスペーサを示す概略図
【図８Ｂ】マイクロカラムの第１表面と底部との間の毛管空間のために一定の距離を維持するための、フランジタイプのスペーサの一つの実施の形態を示す概略図
【図８Ｃ】マイクロカラムの第１表面と底部との間の毛管空間のために一定の距離を維持するための、フランジタイプのスペーサの別の実施の形態を示す概略図
【図８Ｄ】マイクロカラムの第１表面とマイクロタイタウェルの底部との間の毛管空間を維持するためのフランジ上に載置されている第１表面を示す断面図
【図９】光学走査装置に使用するためにマイクロカラムアレイを適所に保持するアダプタを示す図
【図１０】図１０Ａは、底面が疎水領域と親水領域の両方を有するように処理されている、マイクロタイタウェルの底面を示す正面図、図１０Ｂは、ウェルの底面の中心部の親水領域内に収容され、周囲に沿った疎水領域からは排除されている液体試薬を示す正面図、図１０Ｃは、図１０Ｂの状況の三次元斜視図
【図１１】図１１Ａは、従来のスライドベースのアレイの画像、図１１Ｂは、マイクロカラムの第１表面上の一組の生体試料を示す画像（各試料は、同じ条件下で並行して展開された）
【図１２Ａ】本発明のある実施の形態を用いて、３つの異なる条件下で行った３つの実験の擬似着色の画像
【図１２Ｂ】図１２Ａの３つの実験に用いた３つのマイクロカラム上の多数のバイオサイトについての平均信号強度の棒グラフ
【図１３Ａ】本発明のある実施の形態を用いて行ったＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）用途のためのリガンド結合アッセイのハイスループット実験の擬似着色の画像
【図１３Ｂ】図１３Ａの実験結果の平均信号強度の棒グラフ
【図１４】入口と出口、および試料の輸送と混合のためのマイクロチャンネルを持つ中空のマイクロカラムプレートの概略図（説明目的で、入口と出口の２つの異なる位置が示されている）
【図１５】反応試料を、中空のマイクロカラムプレートを通って、マイクロタイタウェル中に注入できる様式を示す概略図（インキュベーション中に試料をピペットで出し入れすることにより、微量流体の混合を促進できる）
【図１６】ガラスまたはポリマー材料の交換できる中空ピラー挿入体を有する中空マイクロカラムプレートの概略図
【図１７】図１７Ａは生物アレイの画像、図１７Ｂは、図１７Ａの個々の生物アレイの拡大図
【図１８】図１８Ａ〜Ｅは図１７Ａおよび１７Ｂのアレイの定量分析を示すグラフ
【符号の説明】
【００８１】
１    生体物質
２    アレイ
３    第１表面
５    第２表面
６    ウェル
１０    マイクロカラム
１２    支持構造体
１６    マイクロピン
５０    空洞
５６    マイクロチャンネル
【図１Ａ】
2005528582.tif 000009
【図１Ｂ】
2005528582.tif 000010
【図１Ｃ】
2005528582.tif 000011
【図１Ｄ】
2005528582.tif 000012
【図１Ｅ】
2005528582.tif 000013
【図２Ａ】
2005528582.tif 000014
【図２Ｂ】
2005528582.tif 000015
【図２Ｃ】
2005528582.tif 000016
【図２Ｄ】
2005528582.tif 000017
【図２Ｅ】
2005528582.tif 000018
【図３Ａ】
2005528582.tif 000019
【図３Ｂ】
2005528582.tif 000020
【図４】
2005528582.tif 000021
【図５Ａ】
2005528582.tif 000022
【図５Ｂ】
2005528582.tif 000023
【図５Ｃ】
2005528582.tif 000024
【図６Ａ】
2005528582.tif 000025
【図６Ｂ】
2005528582.tif 000026
【図６Ｃ】
2005528582.tif 000027
【図６Ｄ】
2005528582.tif 000028
【図６Ｅ】
2005528582.tif 000029
【図６Ｆ】
2005528582.tif 000030
【図７】
2005528582.tif 000031
【図８Ａ】
2005528582.tif 000032
【図８Ｂ】
2005528582.tif 000033
【図８Ｃ】
2005528582.tif 000034
【図８Ｄ】
2005528582.tif 000035
【図９】
2005528582.tif 000036
【図１０】
2005528582.tif 000037
【図１１】
2005528582.tif 000038
【図１２Ａ】
2005528582.tif 000039
【図１２Ｂ】
2005528582.tif 000040
【図１３Ａ】
2005528582.tif 000041
【図１３Ｂ】
2005528582.tif 000042
【図１４】
2005528582.tif 000043
【図１５】
2005528582.tif 000044
【図１６】
2005528582.tif 000045
【図１７】
2005528582.tif 000046
【図１８】
2005528582.tif 000047
【国際調査報告】
2005528582.tif 000048
2005528582.tif 000049
2005528582.tif 000050
2005528582.tif 000051
2005528582.tif 000052
2005528582.tif 000053
2005528582.tif 000054