(57)【要約】本発明の種々の実施態様は、ヒトのタンパク質修飾および維持分子(PMMM)と、PMMMを同定およびコードするポリヌクレオチドとを提供する。本発明の実施例はまた、発現ベクター、宿主細胞、抗体、アゴニストおよびアンタゴニストをも提供する。本発明の別の実施態様はまた、PMMMの異常発現に関連する疾患を、診断、治療または予防する方法をも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下からなる群から選択した単離されたポリペプチド。
(a)  SEQ ID NO:1-40（配列番号１乃至40）からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド
(b)  SEQ ID NO:1-3、SEQ ID NO:7-13、SEQ ID NO:20、 SEQ ID NO:22、 SEQ ID NO:25-26、SEQ ID NO:28、 SEQ ID NO:32および SEQ ID NO:36からなる群から選択した或るアミノ酸配列に対して少なくとも90％が同一であるような天然アミノ酸配列を含むポリペプチド
(c)  SEQ ID NO:35およびSEQ ID NO:40からなる群から選択した或るアミノ酸配列に対して少なくとも9１％が同一であるような天然アミノ酸配列を含むポリペプチド
(d)  SEQ ID NO:31のアミノ酸配列に対して少なくとも92％が同一であるような天然アミノ酸配列を持つポリペプチド
(e)  SEQ ID NO:30のアミノ酸配列に対して少なくとも93％が同一であるような天然アミノ酸配列を含むポリペプチド
(f)  SEQ ID NO:23のアミノ酸配列に対して少なくとも97％が同一であるような天然アミノ酸配列を含むポリペプチド
(g)  SEQ ID NO:33およびSEQ ID NO:37からなる群から選択したアミノ酸配列に対して少なくとも99％が同一であるような天然アミノ酸配列を含むポリペプチド
(h)  SEQ ID NO:14-19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:34およびSEQ ID NO:38-39からなる群から選択した或るアミノ酸配列に対して少なくとも90％が同一であるような天然アミノ酸配列を含むポリペプチド
(i)  SEQ ID NO：1-40からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および
（j)  SEQ ID NO:1-40からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片
【請求項２】
SEQ ID NO:1-40からなる群から選択したアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
請求項1のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項2のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
SEQ ID NO:41−80からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含む請求項4に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項3に記載のポリヌクレオチドへ機能的に連結したプロモーター配列を有する組換えポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項6に記載の組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞。
【請求項８】
請求項6に記載の組換えポリヌクレオチドを有する遺伝形質転換生物。
【請求項９】
請求項1のポリペプチドを生産する方法であって、
(a)  前記ポリペプチドの発現に好適な条件下で、請求項1のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチドで形質転換される細胞を培養する過程と、
(b)  そのように発現した前記ポリペプチドを回収する過程とからなる方法。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:1-40からなる群から選択した或るアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
請求項1に記載のポリペプチドと特異結合するような単離された抗体。
【請求項１２】
以下からなる群から選択した単離されたポリヌクレオチド。
(a)  SEQ ID NO:41-80からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
(b)  SEQ ID NO:41-66、SEQ ID NO:68-75、SEQ ID NO:77-80からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列に対して少なくとも90％が同一であるような天然ポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
(c)  SEQ ID NO:76のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも93％が同一であるような天然ポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
(d)  SEQ ID NO:67のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも96％が同一であるような天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド
(e)  (a)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
(f)  (b)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
(g)  (c)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
(h)  (d)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
(i)  (a)〜(h)のRNA等価物
【請求項１３】
請求項12に記載のポリヌクレオチドの少なくとも60の連続したヌクレオチドを持つ、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項12に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
(a)  前記サンプル中の前記標的ポリヌクレオチドに相補的な配列を持つ少なくとも20の連続したヌクレオチドを持つプローブを用いて前記サンプルをハイブリダイズする過程と、
(b)  前記ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出し、該複合体が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程とを含む方法。
【請求項１５】
前記プローブが少なくとも60の連続したヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
請求項12に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
(a)  ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、
(b)  前記の増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の有無を検出し、該標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項1のポリペプチドと、薬剤として許容できる賦形剤とを含むことを特徴とする組成物。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:1-40からなる群から選択されたアミノ酸配列を持つことを特徴とする、請求項17の組成物。
【請求項１９】
機能的なPMMMの発現の低下に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療が必要な患者に請求項17の組成物を投与することを含むことを特徴とする治療方法。
【請求項２０】
請求項1のポリペプチドのアゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
(a)  請求項１のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝すステップと、
(b)  前記サンプルにおいてアゴニスト活性を検出する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項20に記載の方法で同定したアゴニスト化合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを含むことを特徴とする組成物。
【請求項２２】
機能的なPMMMの発現の低下に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療が必要な患者に請求項21の組成物を投与することを含むことを特徴とする治療方法。
【請求項２３】
請求項1のポリペプチドのアンタゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
(a)  請求項１のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝すステップと、
(b)  前記サンプルにおいてアンタゴニスト活性を検出する過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項23の方法で同定したアンタゴニスト化合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを有する組成物。
【請求項２５】
機能的なPMMMの過剰な発現に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療が必要な患者に請求項24の組成物を投与することを含むことを特徴とする治療方法。
【請求項２６】
請求項1のポリペプチドに特異結合する化合物をスクリーニングする方法であって、
(a)  請求項1のポリペプチドを適切な条件下で少なくとも1つの試験化合物と混合する過程と、
(b)  請求項1のポリペプチドの試験化合物との結合を検出し、それによって請求項１のポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程を含む方法。
【請求項２７】
請求項1のポリペプチドの活性をモジュレート（調節）する化合物をスクリーニングする方法であって、
(a)  請求項1のポリペプチドの活性が許容される条件下で、請求項1のポリペプチドを少なくとも1つの試験化合物と混合する過程と、
(b)  請求項1に記載のポリペプチドの活性を試験化合物の存在下で算定する過程と、
(c)  試験化合物の存在下での請求項1に記載のポリペプチドの活性を、試験化合物の不存在下での請求項1に記載のポリペプチドの活性と比較する過程を含み、試験化合物の存在下での請求項1に記載のポリペプチドの活性の変化が、請求項1に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物を標示することを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項5の配列を持つ標的ポリヌクレオチドの発現を改変するのに効果的な化合物をスクリーニングする方法であって、
(a)  前記標的ポリヌクレオチドの発現に好適な条件下で、該標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝露する過程と、
(b)  前記標的ポリヌクレオチドの発現改変を検出する過程と、
(c)  可変量の前記化合物の存在下と前記化合物の不存在下で、前記標的ポリヌクレオチドの発現を比較する過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項２９】
試験化合物の毒性を算定する方法であって、
(a)  核酸を含む生物学的サンプルを前記試験化合物で処理する過程と、
(b)  処理した前記生物学的サンプルの核酸と、請求項12のポリヌクレオチドの少なくとも20の連続するヌクレオチドを持つプローブをハイブリダイズさせる過程であって、このハイブリダイゼーションゼーションが、前記プローブと前記生物学的サンプル中の標的ポリヌクレオチドとの間で特異的なハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で行われ、前記標的ポリヌクレオチドが、請求項12のポリヌクレオチドまたはその断片のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである、前記過程と、
(c)  ハイブリダイゼーション複合体の収量を定量する過程と、
(d)  前記処理された生物学的サンプル中のハイブリタイゼーション複合体の量を、処理されていない生物学的サンプル中のハイブリタイゼーション複合体の量と比較する過程とを含み、前記処理された生物学的サンプル中のハイブリタイゼーション複合体の量の差が、前記試験化合物の毒性を標示するような方法。
【請求項３０】
生物学的サンプル中のPMMMの発現に関連する症状または疾患に対する診断試験する方法であって、
(a)  前記生物学的サンプルと請求項11の抗体との混合を、前記抗体が前記ポリペプチドに結合し、抗体とポリペプチドとの複合体を形成するのに適した条件下で行う過程と、
(b)  前記複合体を検出する過程とを含み、前記複合体の存在が、前記生物学的サンプル中の前記ポリペプチドの存在と相関することを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項11の抗体であって、
(a)  キメラ抗体
(b)  単鎖抗体
(c)  Fab断片
(d)  F（ab'）2 断片
(e)  ヒト化抗体のいずれかである抗体。
【請求項３２】
請求項11に記載の抗体と、許容できる賦形剤とを有する組成物。
【請求項３３】
被検者のPMMMの発現に関連する病状又は疾患の診断方法であって、請求項32に記載の組成物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３４】
請求項32に記載の組成物であって、さらに標識を含むもの。
【請求項３５】
被検者のPMMMの発現に関連する病状又は疾患の診断方法であって、請求項34に記載の組成物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項11の抗体の特異性を持つポリクローナル抗体を調製する方法であって、
(a)  抗体反応を誘発する条件下で、SEQ ID NO:1-40からなる群から選択したアミノ酸配列またはその免疫原性断片を含むポリペプチドを用いて動物を免疫化する過程と、
(b)  前記動物から抗体を単離する過程と、
(c)  前記単離された抗体を前記ポリペプチドでスクリーニングし、それによって、SEQ ID NO：1-40からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異結合するポリクローナル抗体を同定する過程とを含むような方法。
【請求項３７】
請求項36の方法で産生したポリクローナル抗体。
【請求項３８】
請求項37のポリクローナル抗体と好適なキャリアとを有する組成物。
【請求項３９】
請求項11に記載の抗体の特異性を有するモノクローナル抗体を作製する方法であって、
(a)  抗体反応を誘発する条件下で、SEQ ID NO:1-40からなる群から選択したアミノ酸配列またはその免疫原性断片を含むポリペプチドを用いて動物を免疫化する過程と、
(b)  前記動物から抗体産出細胞を単離する過程と、
(c)  前記抗体産出細胞と不死化した細胞とを融合して、モノクローナル抗体を産出するハイブリドーマ細胞を形成する過程と、
(d)  前記ハイブリドーマ細胞を培養する過程と、
(e)  SEQ ID NO：1-40からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異結合するようなモノクローナル抗体を前記培養物から単離する過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項39に記載の方法で産出したモノクローナル抗体。
【請求項４１】
請求項40に記載のモノクローナル抗体と適切なキャリアとを有する組成物。
【請求項４２】
Fab発現ライブラリのスクリーニングによって前記抗体を産出することを特徴とする、請求項11に記載の抗体。
【請求項４３】
組換え免疫グロブリンライブラリをスクリーニングすることにより産出される、請求項11に記載の抗体。
【請求項４４】
サンプル中のSEQ ID NO:1-40からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドを検出する方法であって、
(a)  請求項11に記載の抗体と前記ポリペプチドとの特異結合を許容する条件下で、前記抗体と1サンプルとをインキュベートする過程と、
(b)  特異結合を検出する過程とを含み、該特異結合が、SEQ ID NO：1-40からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドがサンプル中に存在することを標示することを特徴とする方法。
【請求項４５】
SEQ ID NO:1-40 からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドを精製する方法であって、
(a)  請求項11に記載の抗体と前記ポリペプチドとの特異結合を許容する条件下で、前記抗体と１サンプルとをインキュベートする過程と、
(b)  前記サンプルから前記抗体を分離し、SEQ ID NO:1-40からなる群から選択したアミノ酸配列を含む精製ポリペプチドを得る過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４６】
マイクロアレイの少なくとも1つのエレメントが請求項13に記載のポリヌクレオチドであるマイクロアレイ。
【請求項４７】
ポリヌクレオチド群を有する或るサンプルの発現プロファイルを作製する方法であって、
(a)  サンプル中のポリヌクレオチドを標識化する過程
(b)  ハイブリダイゼーション複合体が形成されるのに適した条件下で請求項46のマイクロアレイのエレメントとサンプル中の標識化ポリヌクレオチドとを接触させる過程と、
(c)  サンプル中のポリヌクレオチドの発現を定量する過程を含む方法
【請求項４８】
固体基板上の固有の物理的位置に付着された種々のヌクレオチド分子を有するアレイであって、少なくとも1つの前記ヌクレオチド分子が、或る標的ポリヌクレオチドの少なくとも30の連続したヌクレオチド群と特異的にハイブリダイズ可能な最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列を含み、前記の標的ポリヌクレオチドが請求項12に記載のポリヌクレオチドであることを特徴とするアレイ。
【請求項４９】
請求項48に記載のアレイで、前記の最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの配列が前記の標的ポリヌクレオチドの少なくとも30の連続したヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
【請求項５０】
請求項48に記載のアレイで、前記の最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの配列が前記の標的ポリヌクレオチドの少なくとも60の連続したヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
【請求項５１】
請求項48に記載のアレイで、前記のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの最初の配列が前記の標的ポリヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
【請求項５２】
請求項48に記載のアレイで、マイクロアレイであることを特徴とするアレイ。
【請求項５３】
請求項48に記載のアレイで、前記のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの最初の配列を有するヌクレオチド分子にハイブリダイズした前記の標的ポリヌクレオチドを有することを特徴とするアレイ。
【請求項５４】
請求項48に記載のアレイで、或るリンカーが少なくとも１つの前記のヌクレオチド分子と前記の固体基板とを連結していることを特徴とするアレイ。
【請求項５５】
請求項48に記載のアレイで、該基板上の固有の物理的位置の各々が複数のヌクレオチド分子を含み、任意の単一の固有の物理的位置でのその複数のヌクレオチド分子は同一の配列を有し、該基板上の固有の物理的位置の各々は、該基板上の別の固有の物理的位置でのヌクレオチド分子群の配列とは異なる或る配列を有するヌクレオチド分子群を含むことを特徴とするアレイ。
【請求項５６】
SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項５７】
SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項５８】
SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項５９】
SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６０】
SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６１】
SEQ ID NO:6のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６２】
SEQ ID NO:7のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６３】
SEQ ID NO:8のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６４】
SEQ ID NO:9のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６５】
SEQ ID NO:10のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６６】
SEQ ID NO:11のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６７】
SEQ ID NO:12のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６８】
SEQ ID NO:13のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６９】
SEQ ID NO:14のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７０】
SEQ ID NO:15のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７１】
SEQ ID NO:16のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７２】
SEQ ID NO:17のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７３】
SEQ ID NO:18のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７４】
SEQ ID NO:19のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７５】
SEQ ID NO:20のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７６】
SEQ ID NO:21のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７７】
SEQ ID NO:22のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７８】
SEQ ID NO:23のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７９】
SEQ ID NO:24のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項８０】
SEQ ID NO:25のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項８１】
SEQ ID NO:26のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項８２】
SEQ ID NO:27のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項８３】
SEQ ID NO:28のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項８４】
SEQ ID NO:29のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項８５】
SEQ ID NO:30のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項８６】
SEQ ID NO:31のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項８７】
SEQ ID NO:32のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項８８】
SEQ ID NO:33のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項８９】
SEQ ID NO:34のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項９０】
SEQ ID NO:35のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項９１】
SEQ ID NO:36のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項９２】
SEQ ID NO:37のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項９３】
SEQ ID NO:38のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項９４】
SEQ ID NO:39のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項９５】
SEQ ID NO:40のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項９６】
SEQ ID NO:41のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９７】
SEQ ID NO:42のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９８】
SEQ ID NO:43のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９９】
SEQ ID NO:44のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１００】
SEQ ID NO:45のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０１】
SEQ ID NO:46のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０２】
SEQ ID NO:47のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０３】
SEQ ID NO:48のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０４】
SEQ ID NO:49のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０５】
SEQ ID NO:50のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０６】
SEQ ID NO:51のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０７】
SEQ ID NO:52のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０８】
SEQ ID NO:53のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０９】
SEQ ID NO:54のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１０】
SEQ ID NO:55のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１１】
SEQ ID NO:56のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１２】
SEQ ID NO:57のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１３】
SEQ ID NO:58のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１４】
SEQ ID NO:59のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１５】
SEQ ID NO:60のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１６】
SEQ ID NO:61のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１７】
SEQ ID NO:62のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１８】
SEQ ID NO:63のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１９】
SEQ ID NO:64のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２０】
SEQ ID NO:65のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２１】
SEQ ID NO:66のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２２】
SEQ ID NO:67のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２３】
SEQ ID NO:68のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２４】
SEQ ID NO:69のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２５】
SEQ ID NO:70のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２６】
SEQ ID NO:71のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２７】
SEQ ID NO:72のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２８】
SEQ ID NO:73のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２９】
SEQ ID NO:74のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３０】
SEQ ID NO:75のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３１】
SEQ ID NO:76のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３２】
SEQ ID NO:77のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３３】
SEQ ID NO:78のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３４】
SEQ ID NO:79のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３５】
SEQ ID NO:80のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の核酸群、これら核酸がコードするタンパク質修飾および維持分子に関する。また、これらの核酸とタンパク質とを利用した胃腸障害、心血管障害、自己免疫／炎症疾患、細胞増殖異常、発生・発達障害、上皮障害、神経疾患、および生殖障害、内分泌疾患、膵臓疾患、副腎疾患および代謝異常、並びに脂質、銅および糖質代謝障害、性腺ステロイドホルモン、免疫系に関連する疾患および感染症の診断、治療、及び予防に関する。本発明はまた、タンパク質修飾および維持分子の核酸配列およびアミノ酸配列の発現における、外因性化合物の効果のアセスメントに関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質分子の修飾や維持の調節を行う細胞性過程によって、その機能、高次構造、安定化および分解が調整される。これらの各々の過程はキナーゼ、ホスファターゼ、プロテアーゼ、プロテアーゼインヒビター、異性化酵素、転移酵素および分子シャペロンなどの主要な酵素またはタンパク質によって媒介される。
【０００３】
キナーゼ
キナーゼは、高エネルギーのリン酸基の、アデノシン三リン酸(ATP)から標的タンパク質のヒドロキシアミノ酸残基であるセリン、トレオニン、またはチロシンへの転移を触媒する。リン酸基が付加されると、受容体分子における局所電荷が変化し、それによって内部構造が変化し、分子間接触に影響し得る。可逆的なタンパク質リン酸化は、真核細胞の細胞内での様々な現象を調節するために広く利用されている。一般的な哺乳動物細胞における活性なタンパク質の10％以上がリン酸化していると推定される。ホルモン、神経伝達物質、成長因子、および分化因子を含む細胞外シグナルは、キナーゼを活性化することがあり、そのようなキナーゼは細胞表面受容体、または最終的なエフェクタータンパク質の活性体として存在する場合があり、さらにシグナル伝達経路上のどこかに存在する場合もある。キナーゼは、解糖などの基本的な代謝プロセスから細胞周期の調節、分化、およびシグナル伝達カスケードによる細胞外環境との情報交換に至る細胞機能の全てに関与する。細胞内におけるタンパク質の不適切なリン酸化は、細胞周期の進行および細胞分化における変化に関連する。細胞周期における変化は、アポトーシスの誘発や癌の誘発に関連することが示されている。細胞分化における変化は、生殖系、免疫系、および骨格筋の、疾患や障害に関連することが示されている。プロテインキナーゼには２つのクラスがある。一方のクラスのプロテインチロシンキナーゼ（PTK）はチロシン残基をリン酸化し、他方のクラスであるプロテインセリン／トレオニンキナーゼ（STK）はセリン残基およびトレオニン残基をリン酸化する。数種のPTKおよびSTKは、両方のファミリーの構造的な特徴を有し、チロシン残基およびセリン／トレオニン残基の両方に対して特異性（二重特異性）を有する。ほとんど全てのキナーゼは、キナーゼファミリー特有の特定の残基群および配列モチーフ群を含む保存された250〜300のアミノ酸からなる触媒ドメインを含む(Hardie, G及びS. Hanks (1995) The Protein Kinase Facts Book, Vol I, Academic Press, San Diego CA. 17-20ページを参照)。
【０００４】
ホスファターゼ
ホスファターゼ(脱リン酸酵素)は、加水分解によってタンパク質からリン酸基を除く。ホスファターゼは細胞におけるリン酸化の度合いの決定に必須であり、キナーゼと共に代謝酵素活性、細胞増殖、細胞の成長および分化、細胞接着、および細胞周期の進行などの重要な細胞プロセスを調節する。プロテインホスファターゼは、ホスホアミノ酸基質選択性に基づいて、セリン／トレオニン特異性またはチロシン特異性のいずれかによって特徴づけられる。数種のホスファターゼ（DSP：二重特異性ホスファターゼ）は、リン酸化したチロシン、セリン、またはトレオニン残基に作用し得る。プロテインセリン／トレオニンホスファターゼ(PSP)は、細胞内での多くのcAMP仲介性ホルモン応答の重要な制御因子である。プロテインチロシンホスファターゼ(PTP)は、細胞周期および細胞シグナル伝達プロセスにおいて重要な役割を果たす。
【０００５】
プロテアーゼ
プロテアーゼは、タンパク質鎖やペプチド鎖のバックボーンを形成するペプチド結合のところでタンパク質とペプチドを切断する。タンパク質分解は、細胞内外で生じる、最も重要で頻発する酵素反応の1つである。タンパク質分解は、新生ポリペプチドの活性化と成熟、誤ってフォールディングされたタンパク質や損傷したタンパク質の分解、および細胞内のペプチド代謝回転の制御に関する。プロテアーゼは、胚の発達、傷の治癒、および、通常の発育において、消化、内分泌機能、組織の再構築に関係している。プロテアーゼは、調節タンパク質の半減期に影響することで、調節過程における役割を果たしうる。プロテアーゼは、炎症、血管新生、腫瘍の撒布と転移、循環器疾患、神経系疾患、細菌性感染・寄生性感染・ウイルス性感染などの病態の病因や進行に関わる。
【０００６】
プロテアーゼは基質のどこを切断するかによって分類できる。エキソペプチダーゼにはアミノペプチダーゼ、ジペプジルペプチダーゼ、トリペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、ペプチジル−ジペプチダーゼ、ジペプチダーゼ、およびオメガペプチダーゼが含まれ、基質の末端の残基を切断する。エンドペプチダーゼにはセリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、およびメタロプロテアーゼが含まれ、ペプチド内部の残基で切断する。活性部位の構造、作用機序、および全体的三次元構造に基づき、哺乳動物プロテアーゼは四つの主なカテゴリーに分類されている(Beynon, R.J.およびJ.S. Bond (1994) Proteolytic Enzymes: A Practical Approach, Oxford University Press, New York, NY, 1-5ページ参照)。
【０００７】
セリンプロテアーゼ
セリンプロテアーゼ（SP）は、サイズが大きく広範なタンパク質分解酵素ファミリーで、消化酵素のトリプシンやキモトリプシン、補体カスケードや血液凝固カスケードの成分、並びに、細胞内部および細胞外基質において高分子の分解や代謝回転を制御する酵素を含む。20以上のサブファミリーのうち、ほとんどは6つの一族に分けることができ、そのそれぞれに共通の祖先をもつ。これら6つの一族は、進化の点で少なくとも4つの異なる祖先の系統を引いていると仮定されている。SPという名前は、ほとんどのファミリーの活性触媒部位に見られるセリン残基の存在に由来する。活性部位は、触媒トライアッド、すなわち、触媒にとって重要な保存アスパラギン、ヒスチジン、セリン残基のセットによって定義される。これらの残基は、基質結合を促進する電荷リレーネットワークを形成する。活性部位外のその他の残基は、触媒中に形成される四面体遷移中間状態（tetrahedral transition intermediate）を安定化するオキシアニオンホール（oxyanion hole）を形成する。SPは広範囲にわたる基質をもち、基質特異性によってサブファミリーへ細分できる。主なサブファミリーの名称は、それらが切断する残基に由来する。すなわち、トリパーゼはアルギニンまたはリジンに、アスパーゼはアスパラギン酸に、キマーゼはフェニルアラニンまたはロイシンに、メターゼはメチオニンに、セラーゼはセリンにそれぞれ由来する（Rawlings, N.D. および A.J. Barrett (1994) Methods Enzymol. 244:19-61）。
【０００８】
哺乳類セリンプロテアーゼのほとんどは、酵素前駆体すなわち、タンパク質分解によって活性化される不活性な前駆体として合成される。例えば、トリプシノーゲンはエンテロペプチダーゼによって、その活性型であるトリプシンに変換される。エンテロペプチダーゼは、トリプシノーゲンからN末端断片を取り除く腸管プロテアーゼである。残った活性断片がトリプシンで、そのトリプシンが他の膵臓酵素の前駆体を活性化する。同様に、トロンビンの前駆体であるプロトロンビンのタンパク質分解は、3つの別々のポリペプチド断片を生成する。N末端断片は放出されるが、活性なトロンビンを構成するほかの2つの断片は、ジスルフィド結合を介して結合したままである。
【０００９】
最大のSPサブファミリーは、キモトリプシン（S1）サブファミリーとサブチリシン（S8）サブファミリーの2つである。キモトリプシンファミリーのメンバーの中には、このファミリーに特有の2つの構造的ドメインを含んでいるものがある。クリングルドメインは、さまざまなコピー数で見られる、3重ループでジスルフィドクロスリンクしたドメインである。クリングルドメインは、膜、他のタンパク質、または、リン脂質などのメディエーターの結合、およびタンパク質分解活性の制御の役割を果たしていると考えられている（PROSITE PDOC00020）。アップル（Apple）ドメインは90アミノ酸反復ドメインで、それぞれが6つの保存されたシステインを含んでいる。3つのジスルフィド結合が、第1と第6、第2と第5、第3と第4のシステインを連結する（PROSITE PDOC00376）。アップルドメインは、タンパク質間相互作用に関する。S1ファミリーのメンバーには、トリプシン、キモトリプシン、凝固第IX因子から凝固第XII因子、補体のB因子、C因子、D因子、グランザイム、カリクレイン、組織プラスミノゲンアクチベーター、および、ウロキナーゼプラスミノゲンアクチベーターが含まれる。サブチリシンファミリーは、真正細菌、古細菌、真核生物、ウイルスに見られるメンバーをもつ。サブチリシンには、タンパク質プロセシングエンドペプチダーゼのケキシンとフリン、および、下垂体プロホルモン転換酵素のPC1、PC2、PC3、PC6とPACE4が含まれる（Rawlings and Barrett、前出）。
【００１０】
SPは、正常な多くのプロセスにおける機能をもち、その内のいくつかは疾病の原因あるいは治療に関係していると推定されている。エンテロキナーゼは腸内消化のイニシエーターで腸の刷子縁に見られ、そこでエンテロキナーゼは酸性プロペプチドをトリプシノーゲンから切断して活性トリプシンを産生する（Kitamoto, Y. 他(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7588-7592)。アンジオテンシンIIおよびアンジオテンシンIIIや［des-Arg9］ブラジキニンといったペプチドを切断するリソソームセリンペプチダーゼであるプロリルカルボキシペプチダーゼは、セリンカルボキシペプチダーゼファミリーおよびプロリルエンドペプチダーゼファミリーのメンバーと配列相同性を共有している（Tan, F. 他(1993) J. Biol. Chem. 268:16631-16638)。プロテアーゼであるニューロプシンは、神経シグナル伝達に反応して海馬状隆起でのシナプス形成とニューロン結合性に影響する可能性がある（Chen, Z.-L. 他(1995) J. Neurosci. 15:5088-5097）。組織プラスミノゲンアクチベーターは、発作（Zivin, J.A. (1999) Neurology 53:14-19）および心筋梗塞（Ross, A.M. (1999) Clin. Cardiol. 22:165-171）の緊急の処置に有効である。いくつかの受容体（PAR：プロテイナーゼ活性化受容体）は消化管全体にわたって高度に発現し、タンパク質分解による細胞外ドメイン切断によって活性化される。PARに対する主要なアゴニストであるトロンビン、トリプシンやマスト細胞トリプターゼは、アレルギーや炎症性の状態の際に放出される。プロテアーゼによるPAR活性化の制御は有望な治療標的であると示唆されている(Vergnolle, N. (2000) Aliment. Pharmacol. Ther. 14:257-266; Rice, K.D. 他(1998) Curr. Pharm. Des. 4:381-396)。前立腺特異抗原（PSA）は、前立腺の上皮細胞によってのみ合成され分泌されるカリクレイン様セリンプロテアーゼである。血清PSAは前立腺癌において増加し、癌進行のモニタリングと治療に対する反応との最も敏感な生理学的マーカーである。PSAはまた、ある転移性腫瘍の起源が前立腺であると同定できる（Brawer, M.K. および P.H. Lange (1989) Urology 33:11-16）。
【００１１】
シグナルペプチダーゼ
小胞体(ER)への移動過程の機構には伸長するタンパク質上でのN末端シグナルペプチドの認識が関わる。シグナルペプチドはタンパク質と付着したリボソームを小胞体膜の或る受容体に誘導する。ポリペプチド鎖は小胞体膜の細孔を通過してその内腔に入るが、N末端シグナルペプチドは膜表面に付着したままになる。この過程は小胞体内にあるシグナルペプチダーゼが該タンパク質から該シグナルペプチドを切断し、該タンパク質を小胞体内腔に放出されると完了する。
【００１２】
シグナルペプチダーゼは、数種のタンパク質からシグナルペプチドをプロセシングする役割を果たす、すべての原核細胞および真核細胞のタイプに見られるSPの特殊クラスである。シグナルペプチドは、タンパク質のアミノ末端ドメインであり、リボソーム集合部位から特定の細胞内の位置あるいは細胞外の位置にタンパク質を導く。いったんタンパク質が搬出されると、シグナルペプチダーゼによるシグナル配列の除去および翻訳後プロセシング（例えば、グリコシル化あるいはリン酸化）によってタンパク質が活性化する。シグナルペプチダーゼは、酵母と哺乳類の両方でマルチサブユニット複合体として存在する。イヌのシグナルペプチダーゼ複合体は5つのサブユニットから構成され、そのすべてがミクロソーム膜に結合しており、その膜を1回以上貫通する疎水性領域を含んでいる（Shelness, G.S. および G. Blobel (1990) J. Biol. Chem. 265:9512-9519）。これらのサブユニットの中には、複合体を膜の上の適切な位置に固定するのに役立つものもある一方、実際の触媒活性を含むものもある。
【００１３】
トロンビンは、血液凝固過程で不可欠の役割をもつセリンプロテアーゼである。肝臓で合成されるプロトロンビンは、因子Xaによって活性なトロンビンに変換される。活性化されたトロンビンが溶解性のフィブリノーゲンを切断して、ポリマー形成するフィブリン（主要な血液凝固成分）に変える。さらに、トロンビンはフィブリンの架橋形成で役割を果たす因子第XIIIaを活性化する。
【００１４】
トロンビンはまた、以前にトロンビン受容体として知られるプロテアーゼ活性化受容体１（PAR-1）から41残基のアミノ末端ペプチドのタンパク質分解性プロセシングを介して、血小板凝固を刺激する。アミノ末端ペプチドの切断は、新しいアミノ末端を露出させる他に、PAR-１の細胞内取り込みにも関連している可能性がある（Stubbs, M.T. および Bode, W. (1994) Curr. Opin. Struct. Biol. 4:823-832、Ofoso, F.A. 他 (1998) Biochem. J. 336:283285）。トロンビンは、PAR-1の切断を介して血小板活性化を刺激させるに加えて、血小板の表面上で糖タンパクＶを切断して血小板の凝集を誘導する。糖タンパクＶは、無傷の血小板上で主要なトロンビン基質であるらしい。糖タンパクＶを欠く血小板は、PAR-１の切断に必要なトロンビンに過敏である。哺乳動物の正常な止血に血小板の凝固が必要であるが、過剰な血小板凝固は、動脈血栓症、アテローマ性動脈、急性心筋梗塞、および発作を起こし得る（Ramakrishnan, V. 他 (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:13336-13341 およびその内で引用された文献を参照）。
【００１５】
プロテアーゼの別のファミリーは活性部位にセリンをもち、その活性をATP加水分解に依存している。これらのプロテアーゼは、ATP/GTP結合モチーフであるP-loopの存在によって同定されうる調節ATPaseドメインとタンパク質分解コアドメインを含む（PROSITE PDOC00803）。このファミリーのメンバーは、真核ミトコンドリアマトリックスプロテアーゼ、Clpプロテアーゼ、およびプロテアソームを含む。Clpプロテアーゼは元来、植物の葉緑体で発見されたが、原核細胞および真核細胞の両方に広がっていると考えられている。早発性捻転ジストニーの遺伝子は、Clpプロテアーゼに関連する或るタンパク質をコードする（Ozelius, L.J. 他(1998) Adv. Neurol. 78:93-105)。
【００１６】
プロテアソームは幾つかの細菌や全ての真核細胞に見られる細胞内プロテアーゼ複合体で、細胞生理における重要な役割を果たす。プロテアソームは大きい(~2000 kDa)多サブユニット複合体で、中央触媒コアに、活性部位が中央の空洞に向いた4つの七員環状に配列された多様なプロテアーゼを含む。末端のATPアーゼサブユニット群は空洞の外部ポートを覆っており、基質が入るのを調節する（概説はSchmidt, M. 他(1999) Curr. Op. Chem. Biol. 3:584-591参照)。プロテアソームはユビキチン抱合システム（UCS）に関連し、このシステムは、転写や細胞周期進行といった細胞プロセスを活性化または抑圧する機能をもつタンパク質など、全タイプの細胞タンパク質の分解の主要経路となる（Ciechanover, A. (1994) Cell 79:13-21）。UCS経路において、分解の標的となるタンパク質は、小さな熱安定タンパク質であるユビキチンに抱合される。そして、ユビキチン化されたタンパク質は、プロテアソームによって認識され分解される。結果として得られるユビキチンペプチド複合体はユビキチンカルボキシル末端加水分解酵素によって加水分解され、遊離ユビキチンはUCSによる再利用のために放出される。ユビキチン-プロテアソーム系は有糸分裂周期キナーゼ、腫瘍性タンパク質、癌抑制遺伝子(P53)、シグナル伝達に関連する細胞表面受容体、転写調節因子、および突然変異または損傷したタンパク質の分解に関与する(Ciechanover, 前出）。この経路は、嚢胞性線維症、アンジェルマン症候群、リドル症候群を含む数多くの疾病に結びつけられている（Schwartz, A.L.およびA. Ciechanover (1999) Annu. Rev. Med. 50:57-74の概説を参照）。マウスの癌原遺伝子であるUnpは或る核ユビキチンプロテアーゼをコードし、その過剰発現はNIH3T3細胞の発癌性形質転換を起こさせる。この遺伝子のヒト相同体は、肺の小さな細胞腫瘍や肺腺癌において常に増加している（Gray, D.A. (1995) Oncogene 10:2179-2183）。ユビキチンカルボキシル末端加水分解酵素は、リンパ芽球性白血病細胞株が、分裂しない成熟状態に分化することに関与する（Maki, A. 他(1996) Differentiation 60:59-66)。ニューロンでは、ユビキチンカルボキシル末端加水分解酵素（PGP 9.5）発現は、ヒト神経変性疾患に起こる異常な構造において強度である（Lowe, J. 他(1990) J. Pathol. 161:153-160)。
【００１７】
システインプロテアーゼ
システインプロテアーゼ（CP）は、前駆体タンパク質のプロセシングから細胞内分解にわたる多様な細胞プロセスに関与している。知られているCPの約半数は、ウイルス内にのみ存在する。CPは、触媒がチオエステル中間体を介して進行し近くのヒスチジン残基とアスパラギン残基によって促進される活性部位での主な触媒残基としてシステインをもつ。或るグルタミン残基も重要であるが、それはオキサニオン穴の形成を助けるからである。2つの重要なCPファミリーに、パパイン様酵素（C1）およびカルパイン（C2）がある。パパイン様ファミリーのメンバーは、一般的にリソソーム型あるいは分泌され、したがって、プロペプチドと同様にシグナルペプチドと合成される。ほとんどのメンバーは、構造的重要性をもつ可能性のあるプロペプチドに保存モチーフをもつ（Karrer, K.M. 他(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3063-3067）。パパインファミリーのメンバーの3次元構造は、2つの葉の間に位置する触媒部位をもつ2葉分子を示す。パパインにはカテプシンB、C、 H、 Lおよび S、或る種の植物アレルゲン、並びにジペプチジルペプチダーゼが含まれる(総説は Rawlings, N.D. およびA.J. Barrett (1994) Methods Enzymol. 244:461-486を参照されたい)。
【００１８】
広範に発現するCPがある一方で、免疫系細胞によってのみ産生されるCPもある。特記すべきは、炎症部位に移動して組織修復に関与する分子を分泌する単球、マクロファージ、および他の細胞によってCPが産生されることである。これら修復分子の過剰は数種の疾患で役割を果たす。慢性関節リウマチなどの自己免疫疾患において、システインペプチダーゼカテプシンCの分泌は、コラーゲン、ラミニン、エラスチン、およびその他の骨の細胞外マトリックスに見られる構造タンパク質を分解する。そのような分解によって弱められた骨はまた、腫瘍浸潤と転移を受けやすくなる。カテプシンLの発現は、リューマチ様滑膜の破壊を悪化させる単核細胞の流入にも寄与し得る(Keyszer, G.M. (1995) Arthritis Rheum. 38:976-984)。
【００１９】
ヒトカテプシンOは新規なシステインプロテアーゼで、ウサギのOC2に94%同一であり、また、ヒトカテプシンSおよびカテプシンLのどちらにも50%の同一である。ヒトカテプシンOは酸性のpHでフィブリノーゲンに対して強力なエンドプロテアーゼ活性を示す。成熟型タンパク質は215アミノ酸を含み、一つの潜在的N-グリコシル化部位を有する。カテプシンOの遺伝子は骨巨細胞腫および卵巣で発現される。骨巨細胞腫でカテプシンO遺伝子の発現レベルが極めて高いことは、骨再形成および骨関連疾患における主要な役割を果たすことを示唆している(Shi, G. P. 他(1995) FEBS Lett. 357:129-134; Bromme, D. および Okamoto, K. (1995) Biol. Chem. Hoppe Seyler 376:379-384)。
【００２０】
カルパインは、N末端触媒ドメインとC末端カルシウム結合ドメインの両方を含むカルシウム依存性細胞質エンドペプチダーゼである。カルパインは、それぞれのアイソフォームに特有の触媒サブユニットと異なるアイソフォームに共通の調節サブユニットからなるプロ酵素ヘテロダイマーとして発現される。各サブユニットは、１つのカルシウム結合EFハンドドメインを有する。調節サブユニットはまた、酵素が細胞膜と結合できるようにする疎水性グリシンリッチドメインを１つ含む。カルパインは増加した細胞内カルシウム濃度によって活性化され、高次構造に変化を起こさせ、限られた自己分解を誘導する。結果として得られる活性分子は、その活性のためにより低いカルシウム濃度を必要とする（Chan, S.L. および M.P. Mattson (1999) J. Neurosci. Res. 58:167-190）。カルパインの発現は他の組織でも見られるが、主にニューロンに見られる。ALS、パーキンソン病およびアルツハイマー病等のいくつかの慢性神経変性疾患はカルパイン発現の増加と関連している(Chan および Mattson, 前出)。細胞骨格のカルパイン仲介性分解は、頭部損傷による脳障害に寄与することが提唱されている(McCracken, E. 他(1999) J. Neurotrauma 16:749-761)。カルパイン3は主に骨格筋に発現し、肢帯型筋ジストロフィータイプ2Aの原因である（Minami, N. 他(1999) J. Neurol. Sci. 171:31-37)。
【００２１】
チオールプロテアーゼの別のファミリーのカスパーゼは、アポトーシスの開始段階と実行段階に関与している。プロアポトーシス性シグナルは、タンパク質分解カスパーゼカスケードを引き起こすイニシエーターカスパーゼを活性化でき、標的タンパク質の加水分解と典型的なアポトーシス細胞死に導く。2つの活性部位残基、システインとヒスチジンは、触媒機序に関与すると考えられている。カスパーゼは最も特異的なエンドペプチダーゼの1つで、アスパラギン酸残基の後で切断する。カスパーゼは不活性酵素前駆体として合成され、この前駆体は、小さなスペーサー領域によって分離される1つの大きな（p20）サブユニットと1つの小さな（p10）サブユニット、および、１つの可変N末端プロドメインからなる。このプロドメインは、アポトーシスに正または負に影響しうる補助因子と相互作用する。活性化シグナルが、特異的アスパラギン酸残基（カスパーゼ1の番号付け規則ではD297）の自己タンパク質分解切断およびスペーサーとプロドメインの除去を引き起こし、p10/p20ヘテロダイマーを残す。これらのヘテロダイマーの2つが、その小サブユニットを介して相互作用し、触媒的に活性な四量体を形成する。カスパーゼファミリーのいくつかのメンバーの長いプロドメインが、プロカスパーゼの二量体化と自己プロセシングを促進していることが示されている。幾つかのカスパーゼはそのプロドメインに「デスエフェクタードメイン」を含み、それによって、他のカスパーゼおよび、FADDタンパク質会合細胞死受容体（death receptor）との自己活性化複合体に、あるいはTNF受容体複合体に、カスパーゼが補充されうる。さらに、カスパーゼファミリーの異なるメンバーからの2つの二量体が会合して、結果として得る四量体の基質特異性を変えることができる。内在性カスパーゼ阻害剤（アポトーシスタンパク質阻害剤（IAP））もまた存在する。これらの相互作用のすべてはアポトーシスの制御に対して明らかな影響を持っている( Chan および Mattson, 前出; Salveson, G.S. および V.M. Dixit (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:10964-10967に概説されている)。
【００２２】
カスパーゼは数多くの疾病に結びつけられる。いくつかのカスパーゼを欠いているマウスは、神経上皮のアポトーシス不全により神経系に重度の欠陥をもっており、致死が早くなる。他のマウスは炎症応答における重症な欠損を示すが、これはカスパーゼがIL-1b、またおそらくは他の炎症性サイトカインのプロセッシングを担っているからである(Chan および Mattson、前出）。牛痘ウイルスとバキュロウイルスはカスパーゼを標的とし、宿主細胞の死を回避して感染の成功を促進する。さらに、エイズ、神経変性疾患および虚血性損傷において不適切なアポトーシスの増加が報告されているが、細胞死の減少は癌に関連している(Salveson および Dixit、前出; Thompson, C.B. (1995) Science 267:1456-1462)。
【００２３】
アスパルチルプロテアーゼ
アスパルチルプロテアーゼ（AP）は、キモシン、レニン、胃ペプシン、リソソームプロテアーゼのカテプシンDとEを含む。大部分のレトロウィルスはpolポリタンパク質の一部として通常APをコードする。酸プロテアーゼとも呼ばれるAPは2つのドメインからなる単量体酵素で、各々のドメインは半分の活性部位とそれ自身の触媒アスパラギン酸残基を含む。APはpH2から3の範囲で最も活性が高く、アスパラギン酸残基の1つはイオン化されもう1つは中性になる。APのペプシンファミリーは分泌酵素を多く含み、すべてシグナルペプチドおよびプロペプチドが付いて合成されるようである。ほとんどのファミリーのメンバーは3つのジスルフィドループをもち、最初の約5残基のループが最初のアスパラギン酸に続き、第2の5〜6残基ループが第2アスパラギン酸の前にあり、第3で最大のループはC末端の方にある。一方、レトロペプシンはペプシンの単一ドメインに類似する。またホモ二量体として活性化し、各レトロペプシン単量体は半分の活性部位に寄与する。レトロペプシンはウイルス性ポリタンパク質のプロセシングに必要である。
【００２４】
APは多様な組織における役割をもち、そのいくつかは疾病に関連する。レニンは、電解質バランスと血圧の制御を担っているホルモン、アンジオテンシンのプロセシングにおいて第1段階を媒介している（Crews, D.E. および S.R. Williams (1999) Hum. Biol. 71:475-503の概説を参照）。カテプシンの異常な調整と発現は、多様な炎症性の病状において明らかである。カテプシンDの発現は、慢性関節リウマチおよび骨関節炎の患者から取った滑膜組織において増加している。カテプシンの増加した発現および差次的制御は、さまざまな癌の潜在的な転移性と関係がある（Chambers, A.F. 他(1993) Crit. Rev. Oncol. 4:95-114)。
【００２５】
メタロプロテアーゼ
メタロプロテアーゼは活性のために金属イオンを必要とし、通常はマンガンか亜鉛である。マンガン金属酵素の例としては、アミノペプチダーゼPおよびヒトのプロリンジペプチダーゼ（PEPD）が含まれる。アミノペプチダーゼPは、さまざまな炎症性反応において活性化されるノナペプチドであるブラジキニンを分解できる。アミノペプチダーゼPは、冠状動脈の虚血および再灌流傷害に関係すると考えられている。アミノペプチダーゼP阻害剤の投与は、ラットにおいて心臓を保護する効果をもつことが示されている（Ersahin, C. 他 (1999) J. Cardiovasc. Pharmacol. 34:604-611）。亜鉛依存メタロプロテアーゼのほとんどは、亜鉛結合ドメインにおける共通の配列をもつ。活性部位は、亜鉛リガンドとして作用する2つのヒスチジンと、第1ヒスチジンまでの触媒グルタミン酸C末端とからなる。このシグネチャ配列を含んでいるタンパク質はメトジンシンとして知られており、アミノペプチダーゼN、アンジオテンシン変換酵素、ニューロリシン、マトリックスメタロプロテアーゼ、および、アダマリシン（ADAMS）が含まれる。代替の配列が亜鉛カルボキシペプチダーゼに見られ、3つすべての保存残基（2つのヒスチジンと1つのグルタミン酸）が亜鉛結合に関与している。
【００２６】
ブタ膵臓性プレプロカルボキシペプチダーゼA1(prePCPA1)は膵液から分泌されるメタロプロテアーゼであるカルボキシペプチダーゼ（CPA）の酵素前駆体である。prePCPA1のヌクレオチド配列のオープンリーディングフレームは長さ1260ヌクレオチドであり、419アミノ酸のタンパク質をコードする。成熟型酵素前駆体の分子量は45561 Daである。この酵素のアミノ酸配列はプロカルボキシペプチダーゼA1 のアミノ酸配列に85%の同一性、またプロカルボキシペプチダーゼA2のアミノ酸配列に55%の同一性を示す(Darnis S. (1999) Eur. J. Biochem. 259:719725)。
【００２７】
アンジオテンシン変換酵素およびアミノペプチダーゼを含む数多くの中性メタロエンドペプチダーゼは、ペプチドホルモンの代謝に関与している。例えば、高血圧性ラットの副腎および神経下垂体に高度のアミノペプチダーゼB活性が見られる(Prieto, I. 他(1998) Horm. Metab. Res. 30:246-248)。オリゴペプチダーゼM／ニューロリシンは、ニューロテンシンと同様にブラジキニンを加水分解できる（Serizawa, A. 他(1995) J. Biol. Chem 270:2092-2098)。ニューロテンシンは脳の神経伝達物質として作用しうる血管作動性ペプチドで、脳では食物摂取の制限に関与すると考えられる（Tritos, N.A.他(1999) Neuropeptides 33:339-349)。
【００２８】
マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）は、細胞外マトリックス（ECM）の成分を分解できる少なくとも23の酵素のファミリーである。MMPはN末端触媒ドメインをもつZn2+エンドペプチダーゼである。このファミリーのほとんどのすべてのメンバーは、ヒンジペプチドと、ECMの基質分子または組織によって産生される阻害剤（TIMP：組織メタロプロテアーゼ阻害因子; Campbell, I.L. およびA. Pagenstecher (1999) Trends Neurosci. 22:285-287）に結合できるC末端ドメインをもつ。フィブロネクチン様リピート、膜貫通ドメイン、またはC末端ヘモペキシナーゼ様ドメインの存在は、コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、ストロメライシン、および膜タイプMMPサブファミリーにMMPを分類するのに使用できる。不活性型においては、活性部位のZn2+イオンはプロ配列のシステインと相互作用する。活性化因子は、Zn2+とシステインの間の相互作用、すなわち、「システインスイッチ」を妨害して、活性部位を曝露させる。これは酵素を部分的に活性化し、その酵素はプロペプチドを切断して完全に活性になる。MMPは、セリンプロテアーゼであるプラスミンとフリン(furin)とによってしばしば活性化される。MMPは、しばしば阻害剤との化学量論的で非共有結合の相互作用によって調整されるので、プロテアーゼの、阻害剤に対するバランスが、組織恒常性において非常に重要である（概説はYong, V.W. 他 (1998) Trends Neurosci. 21:75-80）。
【００２９】
MMPは、骨関節炎（Mitchell, P. 他 (1996) J. Clin. Invest. 97:761-768）、アテローム硬化性プラーク破裂（Sukhova, G.K. 他 (1999) Circulation 99:2503-2509）、大動脈瘤（Schneiderman, J. 他 (1998) Am. J. Path. 152:703-710）、不治の傷（Saarialho-Kere, U.K. 他 (1994) J. Clin. Invest. 94:79）、骨吸収（Blavier, L. および J.M. Delaisse (1995) J. Cell Sci. 108:3649）、年齢に関連する黄斑変性症（Steen, B. 他 (1998) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39:2194）、肺気腫（Finlay, G.A. 他 (1997) Thorax 52:502）、心筋梗塞（Rohde, L.E. 他 (1999) Circulation 99:3063）、および、拡張型心筋症（Thomas, C.V. 他 (1998) Circulation 97:1708）を含む数多くの疾病に結びつけられる。MMP阻害剤は、ラットにおいて乳癌と実験的腫瘍の転移を阻止し、マウスにおいては、ルイス肺癌、血管腫、およびヒト卵巣癌の異種移植を阻止する（Eccles, S.A. 他 (1996) Cancer Res. 56:2815-2822; Anderson 他 (1996) Cancer Res. 56:715-718; Volpert, O.V. 他 (1996) J. Clin. Invest. 98:671-679; Taraboletti, G. 他 (1995) JNCI 87:293-298; Davies, B. 他 (1993) Cancer Res. 53:2087-2091）。MMPはアルツハイマー病において活性である場合がある。いくつかのMMPは多発性硬化症に結びつけられ、MMP阻害剤の投与により症状のいくつかを軽減できる（前出のYong 他の概説参照）。
【００３０】
メタロプロテアーゼの別のファミリーはADAM（「或るディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼドメイン：A Disintegrin And Metalloprotease Domain」から命名）で、非常に近縁のアダマリシン（ヘビ毒メタロプロテアーゼ（SVMP））とそのドメインを共有している。ADAMは、細胞表面接着分子とプロテアーゼの両方の特徴を組み合せ、１つのプロドメイン、１つのプロテアーゼドメイン、１つのディスインテグリンドメイン、１つのシステインリッチドメイン、１つの上皮成長因子リピート、１つの膜貫通ドメイン、および、１つの細胞質内尾部を含んでいる。上記した最初の3つのドメインはSVMPにも見られる。ADAMは、4つの潜在的機能をもつ。すなわち、タンパク質分解、接着、シグナル伝達、融合である。ADAM類はメトジンシン亜鉛結合配列を共有し、TIMP-1など幾つかのMMPアンタゴニストによって抑制される。
【００３１】
ADAMは、精子と卵子の結合と融合、筋芽細胞融合、および、サイトカイン、サイトカイン受容体、接着タンパク質、その他細胞外タンパク質ドメインの、タンパク質-外部ドメインのプロセシングや分断といったプロセスに関与すると考えられる（Schlondorff, J. および C.P. Blobel (1999) J. Cell. Sci. 112:3603-3617）。クズバニアン（Kuzbanian）タンパク質はNOTCH経路の基質（おそらくNOTCH自身）を切断し、ショウジョウバエの神経発達における側抑制のプログラムを活性化する。2つのADAMであるTACE（ADAM 17）とADAM 10は、脳内のアミロイド前駆体タンパク質のプロセシングにおいて類似した役割をもつと提案されている（Schlondorff および Blobel、前出）。TACEはTNF活性化酵素としても同定されている（Black, R.A. 他(1997) Nature 385:729-733)。TNFは感染あるいは外傷に反応して宿主防御を起動させるのに重要な多面的サイトカインであるが、過剰になると重度の損傷を引き起こすことがあり、しばしば自己免疫疾患において過剰産生される。TACEは、膜結合型プロTNFを切断して可溶型を放出する。他のADAMは、他の膜結合型分子の同様のタイプのプロセシングに関与している可能性がある。
【００３２】
ADAMTSサブファミリーのタンパク質は、ADAMファミリーのメタロプロテアーゼの全特徴をもち、さらに１つのトロンボスポンジンドメイン（TS）を含む。プロトタイプADAMTSがマウスで同定されており、心臓および腎臓で発現され、炎症誘発性刺激によって上方制御される（Kuno, K.他(1997) J. Biol. Chem. 272:556-562)。現在まで、11のメンバーがヒトゲノム解析機構（HUGO; http://www.gene.ucl.ac.uk/users/hester/adamts.html#Approved）によって認識されている。このファミリーのメンバーは、軟骨に圧縮性などの重要な機械的特性をもたらし関節炎の発生時に失われる高分子量プロテオグリカンのアグリカンを分解する。したがって、アグリカンを分解する酵素は、関節軟骨の分解を阻止し遅くする魅力的な標的と考えられている（Tortorella, M.D. (1999) Science 284:1664-1666; Abbaszade, I. (1999) J. Biol. Chem. 274:23443-23450などを参照）。他のメンバーは、血管新生阻害の可能性（Kuno 他、前出） とコラーゲンプロセシング（Colige, A. 他 (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2374-2379）の両方またはいずれか一方をもつと報告されている。
【００３３】
プロテアーゼインヒビター
プロテアーゼインヒビターおよびその他のプロテアーゼ活性調節因子は、プロテアーゼの活性および効果を制御する。プロテアーゼインヒビターは、蛋白分解障害の動物モデルにおける病因を制御すると報告された（Murphy, G. (1991) Agents Actions Suppl. 35:69-76）。システインプロテアーゼの低分子量インヒビターであるシスタチン濃度の低下は腫瘍の悪性進行と相関する (Calkins, C. 他(1995) Biol. Biochem. Hoppe Seyler 376:71-80)。プロテアーゼインヒビターのシスタチンスーパファミリーは、直線的に配列され、タンデムにリピートされるジスルフィドループの特定パターンを特徴とする(Kellermann, J.他(1989) J. Biol. Chem. 264:14121-14128)。serpin(セルピン)は哺乳動物血漿セリンプロテアーゼのインヒビターである。多くのserpinが、哺乳動物における血液凝固カスケードおよび／または補体カスケードの調節に作用する。SP32は哺乳類の先体プロテアーゼであるアクロシンの正の制御因子である。SP32はプロ酵素であるプロアクロシンと結合し、この酵素を先体マトリックスに詰める助けをする（Baba, T. 他(1994) J. Biol. Chem. 269:10133-10140)。セリンプロテアーゼインヒビターのKunitzファミリーは１つ以上の「Kunitzドメイン」によって特徴づけられる。Kunitzドメインは一連のシステイン残基を含み、それらは約５０個のアミノ酸残基の間隔で規則的に離れた位置にあり、３つの鎖内ジスルフィド結合を形成する。このファミリーのメンバーには、アプロチニン、組織因子経路インヒビター（TFPI-1およびTFPI-2）、インターαトリプシンインヒビター(ITI)、およびビクニン（bikunin）が含まれる (Marlor, C.W. 他(1997) J. Biol. Chem. 272:12202-12208)。このファミリーのメンバーは、カリクレインおよびプラスミンなどのセリンプロテアーゼに対する強力なインヒビター（ナノモル範囲において）である。アプロチニンは、術中血液損失の抑制に有用である。
真核細胞内で合成される全てのタンパク質の大部分は、小胞体(ER)の細胞質ゾル面で合成される。これらの未熟タンパク質は、細胞内の他の小器官に送られるか、または分泌される前に、小胞体内腔に輸送され翻訳後修飾が行われる必要がある。これらの修飾にはタンパク質折り畳みやジスルフィド結合形成およびN結合グリコシル化がある。
【００３４】
タンパク質異性化酵素
ER内でのタンパク質の折り畳みは、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ(PDI)とペプチジル-プロリルイソメラーゼ(PPI)の2種類の主なタンパク質イソメラーゼによって補助される。PDIはシステイン残基における遊離スルフヒドリル基の酸化を触媒してタンパク質内に分子内ジスルフィド結合を形成する。オリゴペプチドおよびタンパク質における幾つかのプロリンイミド結合の異性化を触媒する酵素であるPPIは多くのタンパク質を最終的機能的高次構造に折り畳む際の律速段階の一つを支配するとみなされる。シクロフィリンは、元来、免疫抑制薬シクロスポリンAの主要な受容体として同定された主なクラスのPPIを指す(Handschumacher, R.E. 他(1984) Science 226:544-547）。
【００３５】
タンパク質のグリコシル化
タンパク質における、大部分の可溶性分泌および膜結合タンパク質の、アスパラギン残基結合寡糖類によるグリコシル化もまた、ER(小胞体)において行われる。この反応は、膜結合酵素である寡糖類転移酵素によって触媒される。この「N結合」グリコシル化の正確な目的は知られていないが、寡糖類の存在は糖タンパク質をプロテアーゼ消化に対して耐性にする傾向がある。さらに、セレクチンと呼ばれる細胞表面タンパク質に付着した寡糖類は、細胞間接着過程において作用することがわかっている (Alberts, B. 他(1994) Molecular Biology of the Cell Garland Publishing Co., New York, NY. 608ページ)。タンパク質の「O-結合」グリコシル化もまた、小胞内においてセリンまたはトレオニン残基のヒドロキシル基へのN−アセチルガラクトサミンの付加、次いで、他の糖残基の最初の残基への連続的付加によって生じる。この過程は、各々が特定の供与体の糖ヌクレオチドおよび受容体分子に特異的である一連の糖転移酵素によって触媒される(Lodish, H. 他(1995) Molecular Cell Biology, W. H. Freeman and Co., New York, NY 700-708ページ)。多くの場合、N−結合型およびO−結合型のオリゴ糖はどちらも、タンパク質の分泌または血漿膜糖タンパク質の細胞表面への移動に必要であると思われる。
【００３６】
更なるグリコシル化機序はERにおいて特異的にリソソーム酵素を標的としてリソソームへ向かわせ、それらの分泌を妨げる。ER(小胞体)内のリソソーム酵素は形質膜タンパクおよび分泌タンパクのようにN結合性オリゴサッカライドを受け入れるが、更に一つまたは二つのマンノース残基がリン酸化される。マンノース残基のリン酸化は二段階で生じ、最初の段階はN-アセチルグルコサミンリン酸転移酵素によるN-アセチルグルコサミンリン酸残基の付加であり、二番目はホスホジエステラーゼによるN-アセチルグルコサミン基の除去である。リン酸化されたマンノース残基は次に該リソソーム酵素をマンノース6リン酸受容体に向かわせ、該受容体が該酵素をリソソーム小胞に輸送する(前出のLodish 他、708-711ページ)。
【００３７】
シャペロン
分子シャペロンは、未成熟タンパク質の適切な折り畳みや、不適切に折り畳まれたものの畳み直し、タンパク質サブユニット群のアセンブリ、および折り畳まれていないタンパク質の膜貫通輸送を補助するタンパク質である。シャペロンはまた、細胞が短時間高温に晒された後、劇的に発現が増加される傾向があるため熱ショックタンパク質(hsp)と呼ばれている。この後者の特性は、おそらく、高温によって変性されたタンパク質は再折り畳みされる必要があるためと思われる。シャペロンはそれらの配置、機能および分子量にしたがって幾つかのクラスに分けることができ、hsp60、TCP1、hsp70、hsp40 (DnaJとも呼ばれる)およびhsp90が含まれる。例えばhsp90はステロイドホルモン受容体に結合し、リガンドの無い場合の転写を阻止し、ホルモンの存在下で受容体のリガンド結合ドメインの折り畳みを正常化する(Burston, S.G.およびA.R. Clarke (1995) Essays Biochem. 29:125-136)。Hsp60とhsp70シャペロンは新しく合成されたタンパク質の輸送と折り畳みを助ける。Hsp70はタンパク質の折り畳みの早期に作用し、新しく合成されたタンパク質がリボソームを離れる前に結合し、ミトコンドリアまたはERにタンパク質を輸送した後、折り畳まれたタンパク質を遊離する。hsp10とともにHsp60は誤って折り畳まれたタンパク質と結合し、タンパク質が正しく折り畳み直される機会を与える。すべてのシャペロンは不完全に折り畳まれたタンパク質上の疎水性パッチへの親和性と、ATPを加水分解する能力を共有する。ATP加水分解のエネルギーが使われ、適切に折り畳まれた状態のhsp結合タンパク質が遊離する(前出Alberts, B.他、214、571-572ページ)。
【００３８】
推定ヒトリジル酸化酵素様3(ヒトLOXL3)は754アミノ酸を含む。このタンパク質は、４つのヒスチジル残基を持つ１つの銅結合部位、キノン補酵素と周囲配列との形成におけるLOX酵素に関与するとされているリジル残基とチロシル残基、および１つのサイトカイン受容体様ドメインを有する。これはまた、そのN末端領域に４つのスカベンジャー受容体システインリッチ(SRCR)ドメインを有する。これらのSRCRドメインの２番目と４番目は短縮されている。さらに、潜在的BMP-1切断部位は存在しない。cDNAをコードする遺伝子は染色体2p13.3にマップされ、その3'末端でHtrA2セリンプロテアーゼ遺伝子と重複している。中枢神経系、ニューロン、および白血球はヒトLOXL3を発現する。この遺伝子は14エクソンを含み、LOXL3の少なくとも二つの選択的スプライス変異体（エクソン5とエクソン8を欠失する）がある（(JourdanLe Saux, C. 他(2001) Genomics 74:211-218)。
【００３９】
発現プロファイル作成
マイクロアレイは、生物分析に用いる分析ツールである。マイクロアレイには複数の分子を有し、それらは或る固体支持体の表面で空間的に分布し、その表面と安定して結合している。ポリペプチド、ポリヌクレオチド、および/または抗体のマイクロアレイが開発され、その種々の用途には例えば遺伝子配列決定、遺伝子発現モニタリング、遺伝子マッピング、細菌同定、創薬、コンビナトリアルケミストリがある。
【００４０】
特にマイクロアレイを用いる領域は遺伝子発現分析である。アレイ技術は、単一の多型遺伝子の発現や、多数の関連遺伝子または無関係の遺伝子の発現プロファイルを探求する簡単な方法を提供し得る。単一遺伝子の発現を試験するときは、アレイを用いて或る特定遺伝子又はその変異体の発現を検出する。発現プロファイルを試験するときは、アレイは次のような遺伝子を同定するプラットフォームを提供する。即ちどの遺伝子が組織特異的か、毒性アッセイにおいてテストされる物質に影響されるか、シグナル伝達カスケードの一部であるか、ハウスキーピング機能を実行するか、又は、特定の遺伝的素因や、条件、疾患、又は障害に、特異的に関連する遺伝子であるかの同定である。
遺伝子発現プロファイル作成の潜在的応用は特に、疾患の、診断、予後診断、および治療の向上に関わる。例えば、糖尿病患者に由来の組織に発現されるレベルと配列との双方を、正常組織に発現されるレベルおよび配列と比較しうる。
【００４１】
肺癌
遺伝子発現プロファイル作成の潜在的応用は、肺癌のような癌の診断、予後、および治療の向上に特に関連している。肺癌は、米国男性の癌死の主因であり、女性の癌死の第2の原因である。肺癌症例の大部分は喫煙に起因すると考えられており、第三世界におけるタバコ消費の増加から肺癌の蔓延が予想されている。気管支上皮をタバコの煙に曝露すると組織形態が変化するようであり、それが癌の前兆であると考えられている。肺癌は、4つの組織病理的に異なる群に分けられる。3群（扁平上皮癌、腺癌、大細胞癌）は、非小細胞肺癌(NSCLC)に分類される。第4群の癌は、小細胞肺癌(SCLC)という。NSCLCを合わせると全症例の約70％になり、SCLCは約18％である。肺癌の発生と進行に関する分子生物学および細胞生物学的理解は不完全である。
【００４２】
3番染色体での欠失は肺癌に一般的であり、この領域に腫瘍抑制遺伝子の存在を示すと思われる。K-rasの活性化突然変異は肺癌で一般的に見られ、この疾患の1つのマウスモデルの基礎である。
【００４３】
前脂肪細胞
遺伝子発現プロファイル作成の潜在的応用は特に、肥満症の、診断、予後診断、および治療の向上に関わる。脂肪組織の最重要の機能は、脂肪を摂食時に貯蔵し空腹時に放出する能力である。白色脂肪組織は過剰エネルギー使用時のための主なエネルギー備蓄部位であり、その第一目的は、エネルギー欠乏時の動員性(mobilization)である。いかにして種々の分子が、脂肪過多症と、生理的および病態生理的な諸状況でのエネルギーバランスを調節するかを理解すれば、ヒト肥満症の新規の治療法を開発しうる。脂肪組織はまた、インスリンの重要な標的組織の１つである。II型糖尿病における脂肪生成とインスリン耐性とは連関しており、興味深い関係を示す。II型糖尿病の殆どの患者は肥満であり、肥満は次にインスリン耐性を生じる。
【００４４】
脂肪細胞の生物学の、これまでの研究の大半に、形質転換したマウス前脂肪細胞株が利用されている。マウス前脂肪細胞の分化を刺激する培養条件は、ヒトの初代前脂肪細胞の分化を誘発する条件とは異なる。また、初代細胞は二倍体であるため、異数体の細胞株以上にin vivo条件を反映すると思われる。ヒトの脂肪生成期の遺伝子発現プロフィールを理解すれば、脂肪過多症調節の根本機序を理解できる。更に、脂肪生成の遺伝子発現プロフィールを、正常体重ドナーと肥満ドナーとで比較すれば、非常に重要な遺伝子群、すなわち肥満とII型糖尿病との潜在的な薬物標的の同定が可能となる。
【００４５】
ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γアゴニスト
チアゾリジンジオン（thiazolidinedione) (TZD)は、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（PPARγ）のアゴニストとして作用する。PPARγは、核ホルモン受容体スーパーファミリのメンバーである。TZDは、高血糖、高インスリン血、および高血圧の低減を、一部にはグルコース代謝を促進して、また糖新生を阻害して行う。PPARγとそのアゴニストとの役割は、広範な病態で実証されている。この病態には例えば糖尿病、肥満、高血圧、アテローム硬化、多嚢胞卵巣症候群、乳癌、前立腺癌、脂肪肉腫、および結腸癌を含む。
【００４６】
TZD他のPPARγアゴニストがインスリン感受性を増強する機序は充分に理解されていないが、PPARγが脂肪生成を促進する能力に関わると思われる。培養した前脂肪細胞で異所的に発現されたPPARγは、脂肪細胞分化の強力な誘発因子である。TZDをインスリンおよび他の因子と併用するとまた、培地でのヒト前脂肪細胞の分化を増強できる(Adams 他(1997) J. Clin. Invest. 100:3149-3153)。種々のTZDが脂肪生成をin vitro で促進する相対的な効力は、それらのin vivoでのインスリン感作効果と、PPARγにin vitroで結合し活性化するそれらの能力との双方に比例する。興味深いことに、大網脂肪貯蔵(omental adipose depots)に由来する脂肪細胞は、TZDの効果に不応である。これが示唆するところでは、TZD類のインスリン感作効果は、それらが脂肪生成を皮下脂肪貯蔵において促進する能力の結果である(Adams 他、同上)。更に、PPARγ遺伝子の優性阻害突然変異（dominant negative mutations）の同定が、二名の非肥満例でなされている。彼らには重度のインスリン耐性、高血圧、および、顕性の非インスリン依存性糖尿病(NIDDM)がみられた(Barroso 他(1998) Nature 402:880-883)。
【００４７】
NIDDMは最も多い型の糖尿病であり、糖尿病は慢性代謝病であって世界に１．４３億人の患者がいる。NIDDMの特徴は異常なグルコースと脂質との代謝であり、その原因は、末梢インスリン耐性と、欠陥のあるインスリン分泌とが組み合わさっている。NIDDMは複雑な進行性の病因を持ち、高度の遺伝率をも持つ。多数の合併症が糖尿病に併発し(例えば心臓病、卒中、腎不全、網膜症、および末梢神経障害を含む)、高い罹患率と死亡率との一因となっている。
【００４８】
分子レベルでPPARγは、リガンド活性化転写因子として機能する。リガンドの存在下でPPARγはレチノイドX受容体(RXR)と共にヘテロ二量体を形成する。この二量体は標的遺伝子の転写を活性化する。この標的遺伝子は、或るPPARγ応答エレメント（PPRE）の１つ以上のコピーを持つ。脂質の貯蔵と代謝とに重要な多くの遺伝子がPPREをもち、PPARγ標的として同定されている。これには例えばPEPCK、aP2、LPL、ACS、およびFAT-Pを含む(Auwerx, J. (1999) Diabetologia 42:1033-1049)。多数のPPARγリガンドが同定されている。このリガンドとしては例えば種々の脂肪酸代謝産物や、合成薬物のうちのTZDクラス(例えばピオグリタゾン：Pioglitazone およびロシグリタゾン：Rosiglitazone (BRL49653))並びに、数種の非グリタゾン系チロシン類似体(例えばGI262570 および GW1929)を含む。プロスタグランジン誘導体である15-dPGJ2は、PPARγの強力な内因性リガンドである。
【００４９】
PPARγの発現は脂肪内では非常に高いが、骨格筋では殆ど検出されない。骨格筋は体内における、インスリンに刺激されたグルコース処理の主要部位である。PPARγの中程度の発現はまた、大腸、腎臓、肝臓、血管平滑筋、造血細胞、およびマクロファージに見られる。脂肪でのPPARγの高発現が示唆するところでは、TZD類のインスリン感作効果は、脂肪組織における、１つ以上のPPARγ調節遺伝子(PPARγ regulated genes)の発現における変容の結果である。PPARγ標的遺伝子群を同定すれば、糖尿、肥満その他の症状の為のより良い薬物設計と、新規治療戦略の開発とに寄与するであろう。
【００５０】
PPARγ標的遺伝子を同定する体系的な試みが、肥満と糖尿との数種のげっ歯類モデルでなされている(Suzuki 他(2000) Jpn. J. Pharmacol. 84:113-123; Way 他(2001) Endocrinology 142:1269-1277）。しかし、深刻な欠点がげっ歯類遺伝子発現研究にはある。それは、ヒトとげっ歯類モデルでの、脂肪生成、糖尿、および肥満の、顕著な差異である(Taylor (1999) Cell 97:9-12; Gregoire 他(1998) Physiol.Reviews 78:783-809)。したがって、ヒト組織の初代培養におけるTZD調節遺伝子を同定するための、偏向のない手法が、PPARγ活性に関連する疾患の分子的原理を充分に解明するのに必要である。
【００５１】
大腸癌
遺伝子発現プロファイル作成の潜在的応用は、結腸癌のような癌の診断、予後、および治療の向上に特に関連している。結腸直腸癌は米国の癌死亡で二番目に高い。結腸癌は、全症例の９０％が55才以上に発症しているため老化に関連している。広く受け入れられている仮説は、いくつかの起因する遺伝子突然変異が長年にわたる罹患により蓄積されることである。結腸直腸癌における遺伝子的変化の本質を理解するために、遺伝性疾患を重視した多くの研究がなされている。最初に知られた遺伝性疾患である、家族性大腸ポリポーシス(FAP)は腺腫性ポリープ症Coli遺伝子(APC)における突然変異によって生じ、そのタンパク質の切断形態または不活性形態を生じる。この癌抑制遺伝子は染色体５ｑにマップされている。二番目によく知られている遺伝性疾患は遺伝性非ポリープ症結腸直腸癌(HNPCC)で、これはミスマッチの修復遺伝子における突然変異によって生じる。
【００５２】
遺伝性大腸癌の発症率は低く、大部分の結腸直腸癌は散発的であるが、遺伝性疾患の研究から理解されることが一般に適用され得る。例えば、APCにおける体細胞の突然変異は無差別の結腸腫瘍の少なくとも80%に発生する。APCの変異は、疾患における開始事象であると見なされる。他の突然変異が続いて起こる。大腸直腸癌の約50％にはrasの活性化突然変異があり、85％にはp53の不活性化突然変異がある。これら遺伝子の変化が、大腸癌での遺伝子発現変化をもたらす。これらの突然変異の下流の標的と、これらが癌の発症と進行において果たす役割についてはあまり理解されていない。
【００５３】
卵巣癌
遺伝子発現プロファイル作成の潜在的応用は、卵巣癌のような癌の診断、予後診断、および治療の向上に特に関連している。卵巣癌は婦人科癌の死亡の主な原因となっている。卵巣癌の主なものは上皮細胞から由来しており、上皮卵巣癌の患者の70%は疾患の後期段階にある。その結果、この疾患に対する長期的生存率は極めて低い。卵巣癌の早期マーカを同定できれば、生存率を大きく増加できるであろう。卵巣癌につながる分子的現象は十分理解されていない。わかっている異常のいくつかにはp53の突然変異とミクロサテライトの不安定性がある。
【００５４】
乳癌
遺伝子発現プロファイル作成の潜在的応用は、乳癌のような癌の診断、予後、および治療の向上に特に関連している。180,000例を超える新規発症の乳癌が毎年診断されており、乳癌による死亡率は45〜54歳の女性の全死亡の10%に近い(Gish, K. (1999) AWIS Magazine 28:7-10)。ただし、限局性乳癌の早期診断に基づく生存率は極めて高い(97％)。これに対して、病期が進行し腫瘍が乳房外に進展した場合は22％である。現在の臨床乳癌検診の手法は感度と特異性とを欠いており、乳癌の包括的な遺伝子発現プロファイルを開発する努力がなされている。このプロファイルを従来のスクリーニング法とともに用いれば、乳癌の診断と予後診断とを向上し得る（Perou, C.M. 他(2000) Nature 406:747-752)。
2種の遺伝子、BRCA1とBRCA2との突然変異が女性乳癌の大きな素因となることが知られており、この変異は親から子へ受け渡されるようである(前出Gish)。しかし、このタイプの遺伝性乳癌はわずかに乳癌の約5％〜9％であり、大多数の乳癌の原因は非遺伝性突然変異であり、乳腺上皮細胞での変異である。
【００５５】
上皮成長因子(EGF)とその受容体であるEGFRとの発現と、ヒト乳癌との関係は、特に良く研究されている(Khazaie, K. 他(1993) Cancer and Metastasis Rev. 12:255-274とその中の参照文献に、この分野が概説されている）。EGFRの過剰発現、特にエストロゲン受容体の下方制御と結びついた発現は、乳癌患者の不良な予後のマーカーである。また、乳腺腫瘍転移におけるEGFR発現は、しばしば原発腫瘍に比して上昇するので、EGFRが腫瘍の進行と転移とに関わることを示唆している。これを支持する証拠が蓄積されている。それはEGFが、転移の潜在能に関する細胞機能に対する効果を持つという証拠である。この機能とは例えば、細胞運動性、走化性、分泌、および分化である。erbB受容体ファミリー（EGFRはその１つである）の他のメンバーの発現の変化も、乳癌に関わるとされている。erbB受容体（例えばHER-2/neu、HER-3、HER-4）およびそれらのリガンドの乳癌における豊富さは乳癌の発生機序におけるそれらの機能的重要性を示しており、したがって乳癌治療の標的を提供しうる(Bacus, S.S.他(1994) Am. J. Clin. Pathol. 102:S13-S24)。その他の既知の乳癌マーカーとしては、或るヒトの分泌型frizzledタンパク質のmRNA（乳腺腫瘍では下方制御される）、マトリクスG1aタンパク質(ヒト乳癌細胞で過剰発現)、Drg1すなわちRTP(この遺伝子の発現は結腸腫瘍、乳腺腫瘍、前立腺腫瘍で低下)、maspin（この腫瘍抑制遺伝子は浸潤性乳癌で下方制御）、およびCaN19（S100蛋白ファミリーのメンバーであり、本ファミリーは全て、乳癌細胞では正常乳腺上皮細胞に比して下方制御）を含む(Zhou, Z. 他(1998) Int. J. Cancer 78:95-99; Chen, L. 他(1990) Oncogene 5:1391-1395; Ulrix, W. et al (1999) FEBS Lett 455:23-26; Sager, R. 他(1996) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 213:51-64;およびLee, S. W. 他(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2504-2508)。
【００５６】
種々の病期のヒト乳癌の乳腺上皮細胞に由来する細胞株は、悪性転換と腫瘍進行とのプロセスを研究するのに有用なモデルを提供する。その理由は、これらの細胞株が、その親腫瘍の多くの特性を、長い培養期間にわたり保持することが示されているからである(Wistuba, I.I. 他(1998) Clin.Cancer Res.4:2931-2938）。こうしたモデルが特に有用なのは、ヒト乳腺上皮細胞の表現型と分子との特徴を、悪性転換の種々の病期で比較する場合である。
【００５７】
当分野には、胃腸障害、心血管疾患、自己免疫／炎症疾患、細胞増殖異常、発生・発達障害、上皮性疾患、神経疾患、生殖障害、内分泌疾患、膵臓疾患、副腎疾患および代謝異常、同様に脂質、銅および糖質代謝異常、性腺ステロイドホルモン、免疫系に関連する疾患および感染症の診断、予防、および治療のための、核酸とタンパク質とを含む新規組成の要望がある。
【発明の開示】
【発明の効果】
【００５８】
本発明の種々の実施態様は、総称して「PMMM」、個別にはそれぞれ「PMMM-1」、「PMMM-2」、「PMMM-3」、「PMMM-4」、「PMMM-5」、「PMMM-6」、「PMMM-7」、「PMMM-8」、「PMMM-9」、「PMMM-10」、「PMMM-11」、「PMMM-12」、「PMMM-13」、「PMMM-14」、「PMMM-15」、「PMMM-16」、「PMMM-17」、「PMMM-18」、「PMMM-19」、「PMMM-20」、「PMMM-21」、「PMMM-22」、「PMMM-23」、「PMMM-24」、「PMMM-25」「PMMM-26」、「PMMM-27」、「PMMM-28」、「PMMM-29」、「PMMM-30」、「PMMM-31」、「PMMM-32」、「PMMM-33」、「PMMM-34」、「PMMM-35」、「PMMM-36」、「PMMM-37」、「PMMM-38」、「PMMM-39」、および、「PMMM-40」と呼ぶ、タンパク質修飾および維持分子である、精製ポリペプチドを提供し、また、これらのタンパク質とそれらをコードするポリヌクレオチドとを利用した疾患と病状との検出、診断、および治療の方法を提供する。幾つかの実施態様はまた、精製したタンパク質修飾および維持分子、並びに/またはそれらをコードするポリヌクレオチドを用いて創薬過程を促進する方法、例えば効力、用量、毒性、および薬理の決定の方法を提供する。関連する幾つかの実施態様は、精製したタンパク質修飾および維持分子、並びに/またはそれらをコードするポリヌクレオチドを用いて疾患と病状との病原を調査する方法を提供する。
【００５９】
或る実施態様は、(ａ)SEQ ID NO:1-40からなる群から選択されたアミノ酸配列を持つポリペプチドと、(ｂ)SEQ ID NO:1-40からなる群から選択されたアミノ酸配列と90％以上同一であるあるいは少なくとも約90％同一である天然アミノ酸配列を持つポリペプチドと、(ｃ)SEQ ID NO:1-40からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片と、（ｄ）SEQ ID NO:1-40とからなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片、とで構成される群から選択された単離したポリペプチドを提供する。別の実施態様は、SEQ ID NO:1-40のアミノ酸配列を持つ単離したポリペプチドを提供する。
【００６０】
また別の実施態様は(ａ)SEQ ID NO:1-40からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｂ)SEQ ID NO:1-40からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を持つ或る天然アミノ酸配列を有するポリペプチド、(ｃ)SEQ ID NO:1-40からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、または(ｄ)SEQ ID NO:1-40からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリヌクレオチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施態様では、該ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:1-40からなる群から選択した或るポリペプチドをコードする。別の実施態様では、ポリヌクレオチドはSEQ ID NO:41-80からなる群から選択される。
【００６１】
また別の実施態様は、(ａ)SEQ ID NO:1-40からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｂ)SEQ ID NO:1-40からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｃ)SEQ ID NO:1-40からなる群から選択した或るアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および(ｄ)SEQ ID NO:1-40からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に連結したプロモーター配列を持つ組換えポリヌクレオチドを提供する。別の実施態様は、この組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞を提供する。更に別の実施態様は、この組換えポリヌクレオチドを持つ遺伝形質転換生物を提供する。
【００６２】
別の実施態様は、(ａ)SEQ ID NO:1-40からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドと、(ｂ)SEQ ID NO:1-40からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％以上の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチドと、(ｃ)SEQ ID NO:1-40からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片と、(ｄ)SEQ ID NO:1-40からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、とからなる群から選択したポリペプチドを製造する一方法を提供する。製造方法は、(ａ)或る細胞を該ポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、この細胞を組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換する過程と、(ｂ)そのように発現したポリペプチドを回収する過程からなる。この組換えポリヌクレオチドは、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対し機能的に連結したプロモーター配列を持つ。
【００６３】
更に別の実施態様は、(ａ)SEQ ID NO:1-40からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｂ)SEQ ID NO:1-40からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｃ)SEQ ID NO:1-40からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および(ｄ)SEQ ID NO:1-40からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドに特異結合する、単離された抗体を提供する。
【００６４】
また更に別の実施態様は、(ａ)SEQ ID NO:41-80からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(ｂ)SEQ ID NO:41-80からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(ｃ)(ａ)に相補的なポリヌクレオチド、(ｄ)(ｂ)に相補的なポリヌクレオチド、および(ｅ)(ａ)〜(ｄ)のRNA等価物、からなる群から選択した、単離されたポリヌクレオチドを提供する。別の実施態様で該ポリヌクレオチドは、少なくとも約20、30、40、60、80、または100の連続したヌクレオチド群からなる場合がある。
【００６５】
また別の実施態様は、サンプル中に標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって該標的ポリヌクレオチドが(ａ)SEQ ID NO:41-80からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(ｂ)SEQ ID NO:41-80からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(ｃ)(ａ)に相補的なポリヌクレオチド、(ｄ)(ｂ)に相補的なポリヌクレオチド、および(ｅ)(ａ)〜(ｄ)のRNA等価物、からなる群から選択される方法を提供する。検出方法は、（ａ）サンプル中の上記標的ポリヌクレオチドに相補的な或る配列からなる少なくとも２０の連続したヌクレオチド群からなる或るプローブを用いて該サンプルをハイブリダイズする過程と、（ｂ）該ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する過程からなる。該プローブと該標的ポリヌクレオチドあるいはその断片との間でハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で、プローブは、該標的ポリヌクレオチドに対し特異的にハイブリダイズする。或る関連した実施態様で本法は、該ハイブリダイゼーション複合体の量の検出を含みうる。また別の実施態様で該プローブは、少なくとも約20、30、40、60、80、または100の連続したヌクレオチド群からなる場合がある。
【００６６】
また更に別の実施態様は、サンプル中に標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって該標的ポリヌクレオチドが(ａ)SEQ ID NO:41-80からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(ｂ)SEQ ID NO:41-80からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(ｃ)(ａ)に相補的なポリヌクレオチド、(ｄ)(ｂ)に相補的なポリヌクレオチド、および(ｅ)(ａ)〜(ｄ)のRNA等価物、からなる群から選択される方法を提供する。検出方法は、(ａ)ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、(ｂ)該増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の有無を検出する過程からなる。或る関連した実施態様で本法は、該増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の量の検出を含みうる。
【００６７】
別の実施態様は、或る有効量のポリペプチドと薬物として許容し得る或る賦形剤とからなる、或る組成物を提供する。有効量のポリペプチドは、(ａ)SEQ ID NO:1-40からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｂ)SEQ ID NO:1-40からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然のアミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｃ)SEQ ID NO:1-40からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および(ｄ)SEQ ID NO:1-40からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択される。一実施態様では、その組成物は、SEQ ID NO:1-40からなる一群から選択されたアミノ酸配列を含むことができる。 他の実施態様は、機能的PMMMの発現の低下に関連した疾患やその症状の治療方法を提供し、その内にはそのような治療を必要とする患者にこの組成物を投与することが含まれる。
【００６８】
また別の実施態様は、(ａ)SEQ ID NO:1-40からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｂ)SEQ ID NO:1-40からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｃ)SEQ ID NO:1-40からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および(ｄ)SEQ ID NO:1-40からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択したポリペプチドのアゴニストとしての有効性を確認するために、或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、(ａ)該ポリペプチドを有するサンプルを或る化合物に曝す過程と、(ｂ)サンプル中のアゴニスト活性を検出する過程からなる。別の実施態様は、この方法で同定したアゴニスト化合物と許容される医薬用賦形剤とを有する、或る組成物を提供する。また別の実施態様は、機能的PMMMの発現の低下を伴う疾患や症状の治療を要する患者への、この組成物の投与方法を提供する。
【００６９】
また更に別の実施態様は、(ａ)SEQ ID NO:1-40からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｂ)SEQ ID NO:1-40からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｃ)SEQ ID NO:1-40からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および(ｄ)SEQ ID NO:1-40からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択したポリペプチドのアンタゴニストとしての有効性を確認するために、或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、(ａ)該ポリペプチドを有するサンプルを或る化合物に曝す過程と、(ｂ)サンプル中のアンタゴニスト活性を検出する過程からなる。別の実施態様は、この方法で同定したアンタゴニスト化合物と許容される医薬用賦形剤とを有する、或る組成物を提供する。更に他の実施例は、機能的PMMMの過剰発現に関連した疾患や症状の治療方法を提供し、また、そのような治療を必要とする患者にこの組成物を投与することが含まれる。
【００７０】
別の実施態様は、(a)SEQ ID NO:1-40からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチド、(b)SEQ ID NO:1-40からなる群から選択したアミノ酸配列に少なくとも90％同一であるあるいは少なくとも約90％同一である天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、(c)SEQ ID NO:1-40からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または(ｄ)SEQ ID NO:1-40からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択されたポリペプチドに特異結合する化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、(a）ポリペプチドを適切な条件下で少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、(b)試験化合物とのポリペプチドの結合を検出し、それによって、該ポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程とを含む。
【００７１】
また別の実施態様は、(ａ)SEQ ID NO:1-40からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｂ)SEQ ID NO:1-40からなる群から選択したアミノ酸配列との少なくとも９０％または少なくとも約９０％の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｃ)SEQ ID NO:1-40からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および(ｄ)SEQ ID NO:1-40からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドの活性をモジュレートする或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、(ａ)該ポリペプチドの活性にとり許容し得る条件下で、該ポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、(ｂ)該ポリペプチドの活性をこの試験化合物の存在下で算定する過程と、(ｃ)この試験化合物の存在下での該ポリペプチドの活性をこの試験化合物の不存在下での該ポリペプチドの活性と比較する過程からなり、この試験化合物の存在下での該ポリペプチドの活性の変化は、該ポリペプチドの活性をモジュレートする化合物を標示する。
【００７２】
また更に別の実施態様は、SEQ ID NO:41-80からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つ標的ポリヌクレオチドの発現を改変する効果に関し、或る化合物をスクリーニングする一方法を提供する。この方法は、(ａ)この標的ポリヌクレオチドを有するサンプルを或る化合物に曝露する過程と、(ｂ)この標的ポリヌクレオチドの発現の改変を検出する過程と、(ｃ)可変量のこの化合物の存在下でのこの標的ポリヌクレオチドの発現と、この化合物の不在下での発現とを比較する過程とからなる。
【００７３】
別の実施態様は、試験化合物の毒性の算定方法を提供する。この方法には、以下の過程がある。(ａ)核酸群を有する生体サンプルを試験化合物で処理する過程。(ｂ)処理済み生体サンプルの核酸群をハイブリダイズする過程。この過程には、次のようなプローブを用いる。(i)SEQ ID NO:41-80からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(ii)SEQ ID NO:41-80からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(iii)(i)に相補的な配列を持つポリヌクレオチド、(iv)(ii)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、(v)(i)〜(iv)のRNA等価物、からなる群から選択した或るポリヌクレオチドの少なくとも２０の連続したヌクレオチド群からなるプローブである。ハイブリダイゼーションは、上記プローブと生体サンプル中の標的ポリヌクレオチドとの間に特異的ハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で生じる。上記標的ポリヌクレオチドは、(i)SEQ ID NO:41-80からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(ii)SEQ ID NO:41-80からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％または少なくとも約９０％の同一性を有する天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(iii)(i)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、(iv)(ii)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、(v)(i)〜(iv)のRNA等価物、からなる群から選択する。あるいは標的ポリヌクレオチドは、上記(i)〜(v)からなる群から選択したポリヌクレオチド配列の断片を持つ場合がある。毒性の算定方法には更に、以下の過程がある。(ｃ)ハイブリダイゼーション複合体の量を定量する過程と、(ｄ)処理済み生体サンプル中のハイブリダイゼーション複合体の量を、非処理の生体サンプル中のハイブリダイゼーション複合体の量と比較する過程である。処理済み生体サンプル中のハイブリダイゼーション複合体の量の差異が、試験化合物の毒性を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７４】
（本発明の記載について）
本発明のタンパク質、核酸、および方法について説明するが、その前に、説明した特定の装置、材料および方法に本発明の実施態様が限定されるものではなく、修正され得ることを理解されたい。また、ここで使用する専門用語は特定の実施態様を説明する目的で用いたものに過ぎず、本発明の範囲を限定することを意図したものではないことも併せて理解されたい。
【００７５】
補足請求および明細書中で用いている単数形の「或る」および「その（この）」の表記は、文脈から明らかにそうでないとされる場合を除いて複数のものを指す場合もあることに注意されたい。したがって、例えば「或る宿主細胞」と記されている場合にはそのような宿主細胞が複数あることもあり、「或る抗体」と記されている場合には1個以上の抗体、および、当業者に公知の抗体の等価物などについても言及している。
【００７６】
本明細書中で用いる全ての技術用語および科学用語は、特に定義されている場合を除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書で説明するものと類似あるいは同等の任意の装置、材料および方法を用いて本発明の実施または試験を行うことができるが、ここでは好適な装置、材料、方法について説明する。本発明で言及する全ての刊行物は、刊行物中で報告されていて且つ本発明の種々の実施態様に関係して用い得る、細胞株、プロトコル、試薬およびベクターについて説明および開示する目的で引用しているものである。本明細書のいかなる開示内容も、本発明が先行技術の効力によってこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【００７７】
（定義）
用語「PMMM」は、天然、合成、半合成或いは組換え体など全ての種（特にウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ及びヒトを含む哺乳動物）から得られる実質的に精製されたPMMMのアミノ酸配列を指す。
【００７８】
用語「アゴニスト」は、PMMMの生物学的活性を強めたり、模倣する分子を指す。このアゴニストは、PMMMに直接相互作用するか、或いはPMMMが関与する生物学的経路の成分と作用して、PMMMの活性を調節するタンパク質、核酸、糖質、小分子、任意の他の化合物や組成物を含み得る。
【００７９】
用語「対立遺伝子変異配列」は、PMMMSをコードする遺伝子の別の形を指す。対立遺伝子変異体群は、核酸配列における少なくとも１つの突然変異から生じ得る。また、変容したmRNA群を生じ得る。また、この変異体が生じ得るポリペプチドの構造または機能は、変容することもしないこともある。或る遺伝子は、その天然型の対立遺伝子変異体を全く持たない場合もあり、１個以上持つこともある。対立遺伝子変異体を生じさせる通常の変異性変化は一般に、ヌクレオチドの自然な欠失、付加または置換による。これら各種の変化は、単独であるいは他の変化と共に、或る配列内で１回以上、生じ得る。
【００８０】
PMMMをコードする「変異」核酸配列は、様々なヌクレオチドの欠失、挿入、或いは置換が起こっても、PMMM と同じポリペプチド或いはPMMM の機能特性の少なくとも１つを備えるポリペプチドを指す。この定義には、PMMMをコードするポリヌクレオチドの正常な染色体の遺伝子座ではない位置での対立遺伝子変異配列との不適当或いは予期しないハイブリダイゼーション、並びにPMMMをコードするポリヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可能な或いは検出困難な多型性を含む。コードされたタンパク質も変異され得り、サイレント変化を生じPMMMと機能的に等価となるアミノ酸残基の欠失、挿入、或いは置換を含み得る。意図的なアミノ酸置換は、生物学的或いは免疫学的にPMMMの活性が保持される範囲で、残基の、極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／または両親媒性、についての1つ以上の類似性に基づいて成され得る。例えば負の荷電アミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸があり、正の荷電アミノ酸にはリジンおよびアルギニンがありうる。親水性値が近似した極性無電荷側鎖を持つアミノ酸としては、アスパラギンとグルタミン、およびセリンとトレオニンを含みうる。親水性値が近似した無電荷側鎖を持つアミノ酸としては、ロイシンとイソロイシンとバリン、グリシンとアラニン、およびフェニルアラニンとチロシンを含みうる。
【００８１】
用語「アミノ酸」および「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質配列、あるいはそれらのいずれかの断片を指し、天然分子または合成分子を指し得る。ここで「アミノ酸配列」は天然のタンパク質分子のアミノ酸配列を指すものであり、「アミノ酸配列」及び類似の語は、アミノ酸配列を、列挙したタンパク質分子に関連する完全な本来のアミノ酸配列に限定しようとするものではない。
【００８２】
用語「PMMM」は、天然、合成、半合成或いは組換え体など全ての種（特にウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ及びヒトを含む哺乳動物）から得られる実質的に精製されたPMMMのアミノ酸配列を指す。
【００８３】
用語「アゴニスト」は、PMMMの生物学的活性を強めたり、模倣する分子を指す。このアゴニストは、PMMMに直接相互作用するか、或いはPMMMが関与する生物学的経路の成分と作用して、PMMMの活性を調節するタンパク質、核酸、糖質、小分子、任意の他の化合物や組成物を含み得る。
【００８４】
用語「対立遺伝子変異配列」は、PMMMSをコードする遺伝子の別の形を指す。対立遺伝子変異体群は、核酸配列における少なくとも１つの突然変異から生じ得る。また、変容したmRNA群を生じ得る。また、この変異体が生じ得るポリペプチドの構造または機能は、変容することもしないこともある。或る遺伝子は、その天然型の対立遺伝子変異体を全く持たない場合もあり、１個以上持つこともある。対立遺伝子変異体を生じさせる通常の変異性変化は一般に、ヌクレオチドの自然な欠失、付加または置換による。これら各種の変化は、単独であるいは他の変化と共に、或る配列内で１回以上、生じ得る。
【００８５】
PMMMをコードする「変異」核酸配列は、様々なヌクレオチドの欠失、挿入、或いは置換が起こっても、PMMM と同じポリペプチド或いはPMMM の機能特性の少なくとも１つを備えるポリペプチドを指す。この定義には、PMMMをコードするポリヌクレオチドの正常な染色体の遺伝子座ではない位置での対立遺伝子変異配列との不適当或いは予期しないハイブリダイゼーション、並びにPMMMをコードするポリヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可能な或いは検出困難な多型性を含む。コードされたタンパク質も変異され得り、サイレント変化を生じPMMMと機能的に等価となるアミノ酸残基の欠失、挿入、或いは置換を含み得る。意図的なアミノ酸置換は、生物学的或いは免疫学的にPMMMの活性が保持される範囲で、残基の、極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／または両親媒性、についての1つ以上の類似性に基づいて成され得る。例えば負の荷電アミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸があり、正の荷電アミノ酸にはリジンおよびアルギニンがありうる。親水性値が近似した極性無電荷側鎖を持つアミノ酸としては、アスパラギンとグルタミン、およびセリンとトレオニンを含みうる。親水性値が近似した無電荷側鎖を持つアミノ酸としては、ロイシンとイソロイシンとバリン、グリシンとアラニン、およびフェニルアラニンとチロシンを含みうる。
【００８６】
用語「アミノ酸」および「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質配列、あるいはそれらのいずれかの断片を指し、天然分子または合成分子を指し得る。ここで「アミノ酸配列」は天然のタンパク質分子のアミノ酸配列を指すものであり、「アミノ酸配列」及び類似の語は、アミノ酸配列を、列挙したタンパク質分子に関連する完全な本来のアミノ酸配列に限定しようとするものではない。
【００８７】
「増幅」は、或る核酸配列の付加的複製物を作製する行為に関する。増幅には、当該分野で公知の、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術または他の核酸増幅技術を用いうる。
【００８８】
用語「アンタゴニスト」は、PMMMの生物学的活性を阻害或いは減弱する分子である。アンタゴニストは、PMMMに直接相互作用するか、或いはPMMMが関与する生物学的経路の成分と作用して、PMMMの活性を調節する抗体、anticalin、核酸、糖質、小分子、任意の他の化合物や組成物などのタンパク質を含み得る。
【００８９】
「抗体」の語は、抗原決定基と結合することができる、無傷の免疫グロブリン分子やその断片、例えばFab,、F(ab')2 及びFv断片を指す。PMMM ポリペプチドと結合する抗体は、抗体を免疫する小ペプチドを含む無傷の分子またはその断片を用いて作製可能である。マウス、ラット、ウサギなどの動物を免疫化するために用いるポリペプチドまたはオリゴペプチドの由来は、RNAの翻訳の場合や、または化学合成があり得る。また、それらは所望により、担体タンパク質に抱合し得る。通常用いられる担体であってペプチドと化学結合する担体の例は、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン、および、スカシガイのヘモシアニン（KLH）などがある。結合したこのペプチドは、前記動物を免疫化するために用いる。
【００９０】
「抗原決定基」の語は、特定の抗体と接触する、分子の領域（即ちエピトープ）を指す。タンパク質またはタンパク質断片を用いて宿主動物を免疫化する場合、該タンパク質の多数の領域が、抗原決定基（タンパク質の特定の領域または３次元構造）に特異結合する抗体の産生を誘発し得る。抗原決定基は、或る抗体への結合について、無傷の抗原（すなわち免疫応答を引き出すために用いられる免疫原）と競合し得る。
【００９１】
用語「アプタマー」は、特定の分子標的に結合する核酸またはオリゴヌクレオチドを指す。アプタマーはin vitroでの進化プロセスに由来する（例えば、SELEX（Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichmentの略、試験管内選択法）、米国特許第5,270,163号に記述）。これは、大規模なコンビナトリアルライブラリ群から標的特異的アプタマー配列を選択するプロセスである。アプタマーの組成は二本鎖または一本鎖であり、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体または他のヌクレオチド様分子を含み得る。アプタマーの各ヌクレオチド成分は修飾された糖基を持つことがあり（例えば、リボヌクレオチドの2'-OH基は2'-Fまたは2'-NH2によって置換され得る）、これは、ヌクレアーゼへの抵抗性または血中でのより長い寿命など、所望の特性を向上し得る。アプタマーを他の分子(例えば高分子量キャリア)と抱合させることにより、循環系からのこのアプタマーのクリアランスを遅らせ得る。アプタマーは、たとえば架橋剤の光活性化によって各々の同族リガンドと特異的に架橋させうる（Brody, E.N.およびL. Gold (2000) J. Biotechnol. 74:5-13）。
【００９２】
「intramer」の用語はin vivoで発現されるアプタマーを意味する例えば、ワクシニアウイルスに基づく或るRNA発現系を用いて、白血球の細胞質内で特定のRNAアプタマー類が高レベルに発現されている（Blind, M.他(1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3606-3610)。
【００９３】
「スピーゲルマー（spiegelmer）」の語はＬ-ＤＮＡ、Ｌ-ＲＮＡその他の左旋性ヌクレオチド誘導体またはヌクレオチド様分子を含むアプタマーを指す。左旋性ヌクレオチド群を持つアプタマー類は、右旋性ヌクレオチド群を持つ基質に通常は作用する、天然酵素類による分解に耐性がある。
【００９４】
用語「アンチセンス」は、或る特定の核酸配列を有するポリヌクレオチドの「センス」（コーディング）鎖との塩基対を形成し得る任意の組成物を指す。アンチセンス組成物としては、DNAや、RNAや、ペプチド核酸（PNA）や、修飾された主鎖結合たとえばホスホロチオ酸、メチルホスホン酸またはベンジルホスホン酸などを有するオリゴヌクレオチドや、修飾された糖基たとえば2'-メトキシエチル糖または2'-メトキシエトキシ糖などを有するオリゴヌクレオチドや、あるいは修飾された塩基たとえば5-メチルシトシン、2'-デオキシウラシルまたは7-デアザ-2'-デオキシグアノシンなどを有するオリゴヌクレオチドがあり得る。アンチセンス分子は、化学合成または転写など、任意の方法で製造することができる。相補的アンチセンス分子は、細胞に導入されると、細胞が産生した天然核酸配列との塩基対を形成し二重鎖を形成して転写または翻訳を妨害する。「負」または「マイナス」という表現は、ある参考DNA分子のアンチセンス鎖を意味し、「正」または「プラス」という表現は、ある参考DNA分子のセンス鎖を意味しうる。
【００９５】
「生物学的に活性」の語は、天然分子の構造的機能、調節機能または生化学的機能を有するタンパク質を指す。同様に、用語「免疫学的に活性」または「免疫原性」は、天然或いは組換え体のPMMM、合成のPMMMまたはそれらの任意のオリゴペプチドが、適当な動物或いは細胞の特定の免疫応答を誘発して特定の抗体と結合する能力を指す。
【００９６】
「相補(的)」または「相補性」の語は、塩基対形成によってアニーリングする2つの一本鎖核酸の間の関係を指す。例えば、配列「5'A-G-T3'」は、相補配列「3'T-C-A5'」と対を形成する。
【００９７】
「〜のポリヌクレオチドを含む（持つ）組成物」または「〜のポリペプチドを含む（持つ）組成物」は、所定のポリヌクレオチド配列若しくはポリペプチドを持つ、任意の組成物を指す。この組成物には、乾燥製剤または水溶液が含まれ得る。PMMM若しくはPMMMの断片をコードするポリヌクレオチドを含む組成物は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。これらプローブは、凍結乾燥形態で貯蔵でき、また、糖質などの安定化剤と結合させ得る。ハイブリダイゼーションにおいては、塩(例えばNaCl)、界面活性剤(例えばドデシル硫酸ナトリウム；SDS)および他の成分(例えばデンハート液、粉乳、サケ精子DNAなど)を有する水溶液中に、プローブを分散させ得る。
【００９８】
「コンセンサス配列」は、不要な塩基を除くためにDNA配列解析を繰り返し行い、XL-PCRキット(Applied Biosystems, Foster City CA)を用いて５'および／または３'の方向に伸長され、再度シークエンシングされた核酸配列、またはGELVIEW フラグメント結合システム(Accelrys, Burlington MA)またはPhrap(University of Washington, Seattle WA)などのフラグメント結合用コンピュータプログラムを用い1つ以上のオーバーラップするcDNAやESTまたはゲノムDNA断片からアセンブリされた核酸配列を指す。伸長及びアセンブリの両方を行ってコンセンサス配列を作製する配列もある。
【００９９】
「保存的なアミノ酸置換」は、置換がなされた時に元のタンパク質の特性を殆ど損なわないと予測されるような置換、即ちタンパク質の構造と特に機能が保存され、そのような置換による大きな変化がない置換を指す。下表は、タンパク質中で元のアミノ酸と置換可能で、保存的アミノ酸置換と認められるアミノ酸を示している。
2005507658.tif 000002
【０１００】
保存的なアミノ酸置換では通常、（ａ）置換領域におけるポリペプチドのバックボーン構造、例えばβシートやα螺旋構造、（ｂ）置換部位における分子の電荷または疎水性、および／または（ｃ）側鎖の大部分、を保持する。
【０１０１】
「欠失」は、結果的に１個若しくは数個のアミノ酸残基またはヌクレオチドが失われてなくなるようなアミノ酸またはヌクレオチド配列における変化を指す。
【０１０２】
「誘導体」の語は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの化学修飾を指す。例えば、アルキル基、アシル基、ヒドロキシル基またはアミノ基による水素の置換は、ポリヌクレオチドの化学修飾に含まれ得る。誘導体ポリヌクレオチドは、天然分子の生物学的または免疫学的機能を少なくとも１つは保持しているポリペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドは、次のようなプロセスによって修飾されたポリペプチドである。すなわち、グリコシル化、ポリエチレングリコール化（pegylation）、あるいは任意の同様なプロセスであって、誘導元のポリペプチドの少なくとも１つの生物学的若しくは免疫学的機能を保持するプロセスである。
【０１０３】
「検出可能な標識」は、測定可能なシグナルを生成することができ、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに共有結合または非共有結合するようなレポーター分子または酵素を指す。
【０１０４】
「差次的発現」は少なくとも2つの異なったサンプルを比較することによって決められる、増加（上方調節）、あるいは減少（下方調節）、または遺伝子発現またはタンパク発現の欠損を指す。このような比較は例えば、処理済サンプルと不処理サンプル、または病態サンプルと健常サンプルとの間で行われ得る。
【０１０５】
「エキソンシャフリング」は、異なるコード領域（エキソン）の組換えを意味する。或るエキソンは、コードするタンパク質の１つの構造的または機能的ドメインを意味し得るため、安定した下部構造群の新たな組合せによって新規のタンパク質群をアセンブリすることが可能であり、新たなタンパク質機能の進化を促進できる。
【０１０６】
用語「断片」は、PMMMまたはPMMMをコードするポリヌクレオチドの、固有の部分であって、その親配列（parent sequence）と配列は同一でありうるが親配列より長さが短いものを指す。或る断片は、最長で定義された配列の全長から１ヌクレオチド／アミノ酸残基を差し引いた長さを有し得る。例えば或る断片は、約5〜約1000の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有し得る。プローブ、プライマー、抗原、治療用分子として、或いはその他の目的のために用いられる断片は、少なくとも5、10、15、16、20、25、30、40、50、60、75、100、150、250若しくは500の、連続したヌクレオチド或いはアミノ酸残基の長さであり得る。断片は、或る分子の特定領域から優先的に選択し得る。例えば、或るポリペプチド断片は、定義された或る配列内に見られるような或るポリペプチドの最初の２５０または５００アミノ酸（または最初の２５％または５０％）から選択した、或る長さの連続したアミノ酸を持ち得る。これらの長さは明らかに例として挙げているものであり、本発明の実施態様では、配列表、表および図面を含む本明細書が支持する任意の長さであり得る。
【０１０７】
SEQ ID NO:41-80の断片は、例えば、この断片を得たゲノム内の他の配列とは異なる、SEQ ID NO:41-80を特異的に同定する固有のポリヌクレオチド配列の領域を持ちうる。SEQ ID NO:41-80の或る断片を本発明の方法の1つ以上の実施態様、例えばハイブリダイゼーションおよび増幅技術に、またはSEQ ID NO:41-80を関連ポリヌクレオチドから区別する類似の方法に用い得る。SEQ ID NO:41-80の断片の正確な長さ及び断片に対応するSEQ ID NO:41-80の領域は、断片に対する意図した目的に基づき当業者が慣例的に決定することが可能である。
【０１０８】
SEQ ID NO:1-40の或る断片は、SEQ ID NO:41-80の或る断片によってコードされる。SEQ ID NO:1-40の或る断片は、SEQ ID NO:1-40を特異的に同定する固有のアミノ酸配列の領域を持ち得る。例えばSEQ ID NO:1-40の或る断片を、SEQ ID NO:1-40を特異的に認識する抗体の開発における免疫原性ペプチドとして用い得る。SEQ ID NO:1-40の或る断片の正確な長さは、また、この断片が対応するSEQ ID NO:1-40の領域は、その断片に意図する目的に基づき、本明細書に記載する、または当分野で既知の1つ以上の分析法で判定し得る。
【０１０９】
「完全長」ポリヌクレオチドとは、少なくとも１つの翻訳開始コドン（例えばメチオニン）と、それに続く１オープンリーディングフレームおよび翻訳終止コドンを有する配列である。或る「完全長」ポリヌクレオチド配列は、或る「完全長」ポリペプチド配列をコードする。
【０１１０】
「相同性」の語は、２つ以上のポリヌクレオチド配列または２つ以上のポリペプチド配列の配列類似性、選択性、または配列同一性を意味する。
【０１１１】
ポリヌクレオチド配列に適用される「一致率」または「〜％同一」の語は、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされた少なくとも２つ以上のポリヌクレオチド配列間で一致する同一残基の割合を意味する。標準化アルゴリズムは、2配列間のアラインメントを最適化するため、標準化された再現性のある方法で比較対象の2配列内にギャップ群を挿入し得るので、2つの配列をより有意に比較できる。
【０１１２】
ポリヌクレオチド配列間の一致率(同一性)を判定するには、当分野で既知の、または本明細書に記載の、１つ以上のコンピュータアルゴリズムまたはプログラムを用い得る。例えば一致率を判定するには、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメントプログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムの、デフォルトのパラメータ群を用い得る。このプログラムは、LASERGENEソフトウェアパッケージ(一組の分子生物学的分析プログラム)(DNASTAR, Madison WI)の一部である。CLUSTAL Vは、Higgins, D.G.およびP.M. Sharp (1989; CABIOS 5:151-153)、並びにHiggins, D.G.他(1992; CABIOS 8:189-191)に記載がある。ポリヌクレオチド配列を２つ１組でアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ktuple=2、gap penalty=5、window=4、「diagonals saved」=4と設定する。デフォルトとして「重みづけされた」残基の重みづけ表を選択する。
【０１１３】
あるいは、米国国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)のBasic Local Alignment Search Tool(BLAST)が、一般的に用いられ且つ入手自由な用い得る配列比較アルゴリズム一式を提供している(Altschul, S.F.他（1990）J. Mol. Biol. 215:403-410）。BLASTアルゴリズムは幾つかの情報源から入手可能であり、メリーランド州ベセスダにあるNCBIおよびインターネット（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）からも入手可能である。BLASTソフトウェア一式には様々な配列分析プログラムが含まれており、既知のポリヌクレオチド配列を種々のデータベースから得た別のポリヌクレオチド配列とアラインメントする「blastn」もその１つである。その他にも、２つのヌクレオチド配列をペアワイズで直接比較するために用いる「BLAST 2 Sequences」と称されるツールも利用可能である。「BLAST 2 Sequences」は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlにアクセスして、対話形式で利用ができる。「BLAST 2 Sequences」ツールは、blastn 及び blastp（以下に記載）の両方に用いることができる。BLASTプログラムは、一般的には、ギャップ(gap)などのパラメータをデフォルト設定にセットして用いる。例えば、２つのヌクレオチド配列を比較するには、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12（2000年4月21日）を用いてblastnを実行し得る。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
【０１１４】
Matrix: BLOSUM62
Reward for match: 1
Penalty for mismatch: -2
Open Gap: 5 and Extension Gap: 2 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 11
Filter: on
【０１１５】
一致率は、ある定義された配列の全長（例えば特定のSEQ IDナンバーで定義された配列）について測定し得る。或いは、より短い長さ、例えば、定義された、より大きな配列から得られた断片（例えば少なくとも20、30、40、50、70、100または200の連続したヌクレオチドの断片）の長さについて一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図および配列表を含めた本明細書に記載された配列が支持する任意の断片長を用いて、一致率を測定し得る或る長さを説明し得ることを理解されたい。
【０１１６】
高度の同一性を示さない核酸配列が、それにもかかわらず遺伝暗号の縮重が原因で、類似のアミノ酸配列をコードする場合がある。この縮重を利用して核酸配列内で変化を生じさせて、全ての核酸配列が実質上同一のタンパク質をコードするような多数の核酸配列を生成し得ることを理解されたい。
【０１１７】
ポリペプチド配列に用いられる用語「一致率」または「〜％同一」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる２つ以上のポリペプチド配列間の一致する同じ残基の百分率のことである。ポリペプチド配列アラインメントの方法は公知である。保存的アミノ酸置換を考慮するアラインメント方法もある。既に詳述したこのような保存的置換は通常、置換部位の電荷および疎水性を保存するので、ポリペプチドの構造を（したがって機能も）保存する。ポリペプチド配列に用いられる用語「類似率」または「〜％類似」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる２つ以上のポリペプチド配列間の同じ残基の一致および保存的置換を含む残基の一致率を意味する。一方、保存的置換は、ポリペプチド配列間の一致率の計算には含まれない。
【０１１８】
ポリペプチド配列間の一致率は、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメントプログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトのパラメータを用いて決定できる（既に説明したのでそれを参照されたい）。CLUSTAL Vを用いてポリペプチド配列をペアワイズアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ktuple=1、gap penalty=3、window=5、「diagonals saved」=5と設定される。PAM250マトリクスが、デフォルトの残基重み付け表として選択される。
【０１１９】
あるいは、NCBI BLASTソフトウェア一式を用い得る。例えば、２つのポリペプチド配列をペアワイズで比較する場合、「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12（2000年4月21日）のblastpをデフォルトパラメータに設定して用い得る。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
【０１２０】
Matrix: BLOSUM62
Open Gap: 11 and Extension Gap: 1 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 3
Filter: on
【０１２１】
一致率は、ある定義されたポリペプチド配列の全長（例えば特定のSEQ IDナンバーで定義された配列）について測定し得る。或いは、より短い長さ、例えば、定義された、より大きなポリペプチド配列から得た断片（例えば少なくとも15、20、30、40、50、70、または150の連続した残基の断片）の長さについて一致率を測定しうる。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図および配列表を含めた本明細書に記載された配列が支持する任意の断片長を用いて、一致率を測定し得る或る長さを説明し得ることを理解されたい。
【０１２２】
「ヒト人工染色体（HAC）」は、約６kb（キロベース）〜１０MbのサイズのDNA配列を含み得る、染色体の複製、分離及び維持に必要な全ての要素を含む直鎖状の微小染色体である。
【０１２３】
用語「ヒト化抗体」は、もとの結合能力を保持しつつよりヒトの抗体に似せるために、非抗原結合領域のアミノ酸配列が変えられた抗体分子を指す。
【０１２４】
「ハイブリダイゼーション」とは、所定のハイブリダイゼーション条件下で、ある一本鎖ポリヌクレオチドがある相補的な一本鎖と塩基対を形成するアニーリングのプロセスである。特異的ハイブリダイゼーションは、2つの核酸配列が高い相補性を共有することの指標である。特異的ハイブリダイゼーション複合体は許容されるアニーリング条件下で形成され、１回以上の「洗浄」ステップ後もハイブリダイズされたままである。洗浄ステップは、ハイブリダイゼーションプロセスのストリンジェンシーを決定する際に特に重要であり、よりストリンジェントな条件では、非特異結合（すなわち完全には一致しない核酸鎖対間の結合）が減少する。核酸配列のアニーリングに関する許容条件は、当業者が慣例的に決定できる。アニール条件はどのハイブリダイゼーション実験でも一定であり得るが、洗浄条件は、所望のストリンジェンシー、したがってハイブリダイゼーション特異性を得るように、実験ごとに変更し得る。アニーリングが許容される条件は、例えば、温度が６８℃で、約６×SSC、約１％（w/v）のSDS、並びに約１００μｇ／ｍｌのせん断して変性したサケ精子DNAが含まれる。
【０１２５】
一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは或る程度、洗浄ステップを実行する温度を基準にして表すことができる。このような洗浄温度は通常、所定のイオン強度及びpHにおける特定の配列の融点（Tm）より約５〜２０℃低くなるように選択する。このTmは、所定のイオン強度およびpHの条件下で、完全一致プローブに標的配列の５０％がハイブリダイズする温度である。Tmを計算する式および核酸ハイブリダイゼーション条件はよく知られており、Sambrook, J.およびD.W. Russell (2001; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第３版、1−３巻、, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor NY, ９章)に見られる。
【０１２６】
本発明のポリヌクレオチド間のストリンジェンシーの高いハイブリダイゼーションでは、約０．２x SSC及び約0.1％のSDSの存在中で、約６８℃で１時間の洗浄過程を含む。或いは、約６５℃、６０℃、５５℃または４２℃の温度で行ってもよい。SSC濃度は、約０.１％のSDS存在下で、約０.１〜２×SSCの範囲で変更し得る。通常は、ブロッキング剤を用いて非特異ハイブリダイゼーションを阻止する。このような遮断試薬には、例えば、約１００〜２００μｇ／ｍｌのせん断され変性したサケ精子DNAが含まれる。特定条件下で、例えばRNAとDNAのハイブリダイゼーションでは、有機溶剤、例えば約３５〜５０％v/vの濃度のホルムアミドを用いることもできる。洗浄条件の有用なバリエーションは、当業者には自明であろう。ハイブリダイゼーションは、特に、高ストリンジェント条件下では、ヌクレオチド間の進化的な類似性を示唆し得る。進化的類似性は、ヌクレオチド群、およびヌクレオチドがコードするポリペプチド群について、或る同様の役割を強く示唆する。
【０１２７】
用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基間の水素結合の形成によって形成された、２つの核酸配列の複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体は、溶解状態で形成し得る(C0tまたはR0t解析など)。あるいは、一方の核酸が溶解状態で存在し、もう一方の核酸が固体支持体(例えば紙、膜、フィルタ、チップ、ピンまたはガラススライド、あるいは他の適切な基板であって細胞若しくはその核酸が固定される基板)に固定されているような２つの核酸間に形成され得る。
【０１２８】
用語「挿入」或いは「付加」は、１個以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチドがそれぞれ追加されるアミノ酸配列或いはポリヌクレオチド配列の変化を指す。
【０１２９】
「免疫応答」は、炎症、外傷、免疫異常症、伝染性疾患または遺伝性疾患に関連する症状を指し得る。これらの症状は、細胞及び全身の防御系に作用し得る種々の因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、その他のシグナル伝達分子の発現によって特徴づけることができる。
【０１３０】
「免疫抗原性断片」とは、哺乳動物等の生命体に導入されると免疫応答を誘発し得るようなPMMMのポリペプチドまたはオリゴペプチド断片である。「免疫抗原性断片」の語には、本明細書中で開示したような或いは当分野で既知であるような任意の抗体産出方法において有用なPMMMの任意のポリペプチドまたはオリゴペプチド断片も含まれる。
【０１３１】
用語「マイクロアレイ」は、基板上の複数のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体またはその他の化合物の構成を指す。
【０１３２】
用語「エレメント」または「アレイエレメント」は、マイクロアレイ上に固有の指定された位置を有する、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体またはその他の化合物を指す。
【０１３３】
用語「調節」は、PMMMの活性の変化を指す。例えば、調節によって、PMMMのタンパク質活性、或いは結合特性、またはその他の生物学的特性、機能的特性或いは免疫学的特性の変化が起こる。
【０１３４】
「核酸」および「核酸配列」の語は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはこれらの断片を指す。「核酸」および「核酸配列」の語はまた、ゲノム起源または合成起源のDNAまたはRNAであって一本鎖または二本鎖であるかあるいはセンス鎖またはアンチセンス鎖を意味し得るようなDNAまたはRNAや、ペプチド核酸(PNA)や、任意のDNA様またはRNA様物質を指すこともある。
【０１３５】
「機能的に連結した」は、第１の核酸配列と第２の核酸配列が機能的な関係にある状態を指す。例えば、或るプロモーターが或るコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合には、そのプロモーターはそのコード配列に機能的に連結している。機能的に連結したDNA配列群は非常に近接するか連続的に隣接することがあり、また、2つのタンパク質コード領域を結合するために必要な場合は同一リーディングフレーム内にあり得る。
【０１３６】
「ペプチド核酸（PNA）」は、末端がリジンで終わるアミノ酸残基のペプチドのバックボーンに結合した、少なくとも約５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを含む、アンチセンス分子または抗遺伝子剤を指す。末端のリジンは、この組成に溶解性を与える。PNAは、相補的一本鎖DNAまたはRNAに優先的に結合して転写の伸長を停止させる。ポリエチレングリコール化することにより、細胞におけるPNAの寿命を延長し得る。
【０１３７】
PMMMの「翻訳後修飾」には、脂質化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ラセミ化、蛋白分解性切断及びその他の当分野で既知の修飾を含まれ得る。 これらのプロセスは、合成或いは生化学的に生じ得る。生化学的修飾は、PMMMの酵素環境に依存し、細胞の種類によって異なり得る。
【０１３８】
「プローブ」とは、同一、対立遺伝子、あるいは関連する核酸の検出に用いる、PMMMやそれらの相補体、またはそれらの断片をコードする核酸のことである。プローブは、単離されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであって、検出可能な標識またはレポーター分子に接着した配列である。典型的な標識には、放射性同位元素、リガンド、化学発光剤、および酵素がある。「プライマー」は、短い核酸、通常はDNAオリゴヌクレオチドであり、相補的塩基対を形成することで標的ポリヌクレオチドにアニーリングされ得る。プライマーは次に、DNAポリメラーゼ酵素により、標的DNA鎖に沿って伸長され得る。プライマー対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による、核酸の増幅(および同定)に用い得る。
【０１３９】
本発明に用いるプローブおよびプライマーは通常、既知の配列の、少なくとも15の連続したヌクレオチド群からなる。特異性を高めるため、長めのプローブおよびプライマー、例えば開示した核酸配列の少なくとも２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または少なくとも１５０の連続したヌクレオチドからなるようなプローブおよびプライマーも用い得る。これよりもかなり長いプローブおよびプライマーもある。表、図面および配列表を含む本明細書が支持する、任意の長さのヌクレオチドを用い得るものと理解されたい。
【０１４０】
プローブとプライマーとの調製および使用方法は例えばSambrook, J.およびD.W. Russell (2001; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版, 1-3巻, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor NY), Ausubel, F.M.他(1999; Short Protocols in Molecular Biology, 第4版, John Wiley & Sons, New York NY),およびInnis, M.他（1990; PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego CA）などの参照文献に記載がある。PCRプライマー対を既知の配列から得るには、例えば、そのためのコンピュータプログラム、例えばPrimer（Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge MA）を用い得る。
【０１４１】
プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの選択は、そのような目的のために本技術分野で既知のソフトウェアを用いて行う。例えばOLIGO 4.06ソフトウェアは、最大で各１００ヌクレオチドのPCRプライマー対の選択に有用であり、オリゴヌクレオチドおよび、最大５,０００までの大きめのポリヌクレオチドであって最大３２キロベースのインプットポリヌクレオチド配列から得た配列を分析するのにも有用である。類似のプライマー選択プログラムには、拡張能力のための追加機能が組込まれている。例えば、PrimOUプライマー選択プログラム(テキサス州ダラスにあるテキサス大学南西部医療センターのゲノムセンターから一般向けに入手可能)は、メガベース配列から特定のプライマーを選択することが可能であり、したがってゲノム全体の範囲でプライマーを設計するのに有用である。Primer3プライマー選択プログラム（Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research（マサチューセッツ州ケンブリッジ）より入手可能）によって、ユーザーは、プライマー結合部位として避けたい配列を指定できる「非プライミングライブラリ（mispriming libｒary）」を入力できる。Primer3は特に、マイクロアレイのためのオリゴヌクレオチドの選択に有用である(後二者のプライマー選択プログラムのソースコードは、それぞれの情報源から得てユーザー固有のニーズを満たすように修正し得る)。PrimerGenプログラム（英国ケンブリッジ市の英国ヒトゲノムマッピングプロジェクト-リソースセンターから一般向けに入手可能）は、多数の配列アラインメントに基づいてプライマーを設計し、それによって、アラインメントされた核酸配列の最大保存領域または最小保存領域のいずれかとハイブリダイズするようなプライマーの選択を可能にする。従って、このプログラムは、独自のものであれ保存されたものであれ、オリゴヌクレオチドとポリヌクレオチド断片との同定に有用である。上記選択方法のいずれかによって同定したオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド断片は、ハイブリダイゼーション技術において、例えばPCRまたはシークエンシングプライマーとして、マイクロアレイエレメントとして、あるいは核酸のサンプルにおいて完全または部分的相補的ポリヌクレオチドを同定する特異プローブとして有用である。オリゴヌクレオチドの選択方法は、上記の方法に限定されるものではない。
【０１４２】
本明細書における「組換え核酸」は天然の配列ではなく、2つ以上の配列の離れたセグメントを人工的に組み合わせた核酸である。この人為的組合せはしばしば化学合成によって達成するが、より一般的には核酸の単離セグメントの人為的操作によって、例えばSambrook および Russellの文献（前出）に記載されているような遺伝子工学的手法によって達成する。組換え核酸の語は、単に核酸の一部が付加、置換または欠失により改変された核酸も含む。しばしば組換え核酸には、プロモーター配列に機能的に連結した核酸配列が含まれる。このような組換え核酸は、例えばある細胞を形質転換するために使用されるベクターの一部と成し得る。
【０１４３】
或いはこのような組換え核酸は、ウイルスベクターの一部と成すことができ、ベクターは例えばワクシニアウイルスに基づくものであり得る。そのようなベクターは哺乳類に接種され、その組換え核酸が発現されて、その哺乳類内で防御免疫応答を誘導するように使用することができる。
【０１４４】
「調節因子」は、通常は遺伝子の非翻訳領域に由来する核酸配列であり、エンハンサー、プロモーター、イントロン及び５'及び３'の非翻訳領域（UTR）を含む。調節エレメントは、転写、翻訳またはRNA安定性を制御する宿主タンパク質またはウイルスタンパク質と相互作用する。
【０１４５】
「レポーター分子」は、核酸、アミノ酸または抗体の標識に用いられる化学的または生化学的な部分である。レポーター分子には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、色原体、基質、補助因子、阻害因子、磁気粒子およびその他の当分野で既知の成分がある。
【０１４６】
DNA分子に対する「RNA等価物」は、基準となるDNA分子と同じ直鎖の核酸配列から構成されるが、全ての窒素性塩基のチミンがウラシルで置換され、糖鎖のバックボーンがデオキシリボースではなくリボースからなる。
【０１４７】
用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられている。PMMM、PMMMをコードする核酸、またはその断片を含むと推定されるサンプルは、体液と、細胞からの抽出物や細胞から単離された染色体や細胞内小器官、膜と、細胞と、溶液中に存在するまたは基板に固定されたゲノムDNA、RNA、cDNAと、組織と、組織プリント等を含み得る。
【０１４８】
用語「特異的結合」及び「特異的に結合する」は、タンパク質若しくはペプチドと、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、若しくは任意の天然若しくは合成の結合組成物との間の相互作用を指す。この相互作用は、タンパク質の特定の構造(例えば抗原決定基すなわちエピトープ)であって結合分子が認識する構造の有無に依存する。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、遊離した標識Ａ及びその抗体を含む反応において、エピトープＡ（つまり遊離した、標識されていないＡ）を含むポリペプチドの存在が、抗体に結合する標識されたＡの量を低減させる。
【０１４９】
用語「実質的に精製された」は、自然の環境から取り除かれてから、単離或いは分離された核酸配列或いはアミノ酸配列であって、自然に結合している組成物が少なくとも約６０％除去されたものであり、好ましくは約７５％以上の除去、最も好ましくは約９０％以上除去されたものを指す。
【０１５０】
「置換」とは、一つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドをそれぞれ別のアミノ酸またはヌクレオチドに置き換えることである。
【０１５１】
用語「基板」は、任意の好適な固体或いは半固体の支持物を指し、膜及びフィルター、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁気または非磁気ビーズ、ゲル、チューブ、プレート、ポリマー、微小粒子、毛細管が含まれる。基板は、ウェル、溝、ピン、チャネル、孔など、様々な表面形態を有することができ、基板表面にはポリヌクレオチドやポリペプチドが結合する。
【０１５２】
「転写イメージ(transcript image)」または「発現プロファイル（プロフィール）」は、所定条件下での所定時間における特定の細胞の種類または組織による集合的遺伝子発現のパターンを指す。
【０１５３】
「形質転換(transformation)」とは、外来DNAが受容細胞に導入されるプロセスのことである。形質転換は、当該分野で公知の種々の方法に従って自然条件または人工条件下で生じ得るものであり、外来性の核酸配列を原核宿主細胞または真核宿主細胞に挿入する、任意の既知の方法を基にし得る。形質転換の方法は、形質転換する宿主細胞の種類によって選択する。限定するものではないが形質転換方法には、バクテリオファージあるいはウイルス感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、熱ショック、リポフェクションおよび微粒子銃を用いる方法がある。「形質転換された細胞」には、導入されたDNAが自律的に複製するプラスミドとして或いは宿主染色体の一部として複製可能である安定的に形質転換された細胞が含まれる。さらに、限られた時間に一過的に導入DNA若しくは導入RNAを発現する細胞も含まれる。
【０１５４】
ここで用いる「遺伝形質転換生物体(transgenic organism)」とは任意の生物体であり、限定するものではないが動植物を含み、生物体の１個以上の細胞が、ヒトの関与によって、例えば本技術分野でよく知られているトランスジェニック(transgenic)技術によって導入された異種核酸を有する。核酸の細胞への導入は、直接または間接的に、細胞の前駆物質に導入することによって、計画的な遺伝子操作によって、例えば微量注射法によって或いは組換えウイルスでの感染によって行う。別の実施態様で核酸の導入は、組換えウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターを感染させて成し得る (Lois, C. 他(2002) Science 295:868-872）。遺伝子操作の語は、古典的な交雑育種あるいは体外受精を指すものではなく、組換えDNA分子の導入を指す。本発明に基づいて企図される遺伝形質転換生物には、細菌、藍藻、真菌、および動植物がある。本発明の単離されたDNAは、本技術分野で知られている方法、例えば感染、形質移入、形質転換またはトランス接合によって宿主に導入することができる。本発明のDNAをこのような生物体に移入する技術はよく知られており、前出のSambrookおよびRussellなどの参照文献に提示される。
【０１５５】
特定の核酸配列の「変異体」は、核酸配列１本全部の長さに対して特定の核酸配列と少なくとも４０％の相同性を有する核酸配列であると定義する。 その際、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（1999年5月7日）を用いてblastnを実行する。このような核酸対は、所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示し得る。或る変異体は、例えば「対立遺伝子」変異体（前述）、「スプライス」変異体、「種」変異体または「多型性」変異体として記載し得る。スプライス変異体は参照分子との顕著な同一性を有し得るが、mRNAプロセシング中のエキソン群の選択的スプライシングによって通常、より多数またはより少数のヌクレオチドを有することになる。対応するポリペプチドは、追加機能ドメイン群を有するか、あるいは参照分子には存在するドメイン群が欠落していることがある。種変異体は、種によって異なるポリヌクレオチドである。結果的に生じるポリペプチドは通常、相互に有意のアミノ酸同一性を持つ。多型変異体は、或る種の個体間における、或る特定遺伝子のポリヌクレオチド配列内での変異である。多型変異配列はまた、ポリヌクレオチド配列の１つのヌクレオチドが異なる「１塩基多型性」（SNP）も含み得る。SNPの存在は、例えば特定の集団、病態または病態性向を示し得る。
【０１５６】
特定のポリペプチド配列の「変異体」は、ポリペプチド配列の１本の長さ全体で特定のポリペプチド配列に対して少なくとも40％の配列相同性または配列類似性を有するポリペプチド配列として定義される。定義づけには、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（1999年5月7日）を用いてblastpを実行する。このようなポリペプチド対は、そのポリペプチドの一方の所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性または配列類似性を示し得る。「増幅」は、或る核酸配列の付加的複製物を作製する行為に関する。増幅には、当該分野で公知の、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術または他の核酸増幅技術を用いうる。
【０１５７】
用語「アンタゴニスト」は、PMMMの生物学的活性を阻害或いは減弱する分子である。アンタゴニストは、PMMMに直接相互作用するか、或いはPMMMが関与する生物学的経路の成分と作用して、PMMMの活性を調節する抗体、anticalin、核酸、糖質、小分子、任意の他の化合物や組成物などのタンパク質を含み得る。
【０１５８】
「抗体」の語は、抗原決定基と結合することができる、無傷の免疫グロブリン分子やその断片、例えばFab,、F(ab')2 及びFv断片を指す。PMMM ポリペプチドと結合する抗体は、抗体を免疫する小ペプチドを含む無傷の分子またはその断片を用いて作製可能である。マウス、ラット、ウサギなどの動物を免疫化するために用いるポリペプチドまたはオリゴペプチドの由来は、RNAの翻訳の場合や、または化学合成があり得る。また、それらは所望により、担体タンパク質に抱合し得る。通常用いられる担体であってペプチドと化学結合する担体の例は、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン、および、スカシガイのヘモシアニン（KLH）などがある。結合したこのペプチドは、前記動物を免疫化するために用いる。
【０１５９】
「抗原決定基」の語は、特定の抗体と接触する、分子の領域（即ちエピトープ）を指す。タンパク質またはタンパク質断片を用いて宿主動物を免疫化する場合、該タンパク質の多数の領域が、抗原決定基（タンパク質の特定の領域または３次元構造）に特異結合する抗体の産生を誘発し得る。抗原決定基は、或る抗体への結合について、無傷の抗原（すなわち免疫応答を引き出すために用いられる免疫原）と競合し得る。
【０１６０】
用語「アプタマー」は、特定の分子標的に結合する核酸またはオリゴヌクレオチドを指す。アプタマーはin vitroでの進化プロセスに由来する（例えば、SELEX（Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichmentの略、試験管内選択法）、米国特許第5,270,163号に記述）。これは、大規模なコンビナトリアルライブラリ群から標的特異的アプタマー配列を選択するプロセスである。アプタマーの組成は二本鎖または一本鎖であり、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体または他のヌクレオチド様分子を含み得る。アプタマーの各ヌクレオチド成分は修飾された糖基を持つことがあり（例えば、リボヌクレオチドの2'-OH基は2'-Fまたは2'-NH2によって置換され得る）、これは、ヌクレアーゼへの抵抗性または血中でのより長い寿命など、所望の特性を向上し得る。アプタマーを他の分子(例えば高分子量キャリア)と抱合させることにより、循環系からのこのアプタマーのクリアランスを遅らせ得る。アプタマーは、たとえば架橋剤の光活性化によって各々の同族リガンドと特異的に架橋させうる（Brody, E.N.およびL. Gold (2000) J. Biotechnol. 74:5-13）。
【０１６１】
「intramer」の用語はin vivoで発現されるアプタマーを意味する例えば、ワクシニアウイルスに基づく或るRNA発現系を用いて、白血球の細胞質内で特定のRNAアプタマー類が高レベルに発現されている（Blind, M.他(1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3606-3610)。
【０１６２】
「スピーゲルマー（spiegelmer）」の語はＬ-ＤＮＡ、Ｌ-ＲＮＡその他の左旋性ヌクレオチド誘導体またはヌクレオチド様分子を含むアプタマーを指す。左旋性ヌクレオチド群を持つアプタマー類は、右旋性ヌクレオチド群を持つ基質に通常は作用する、天然酵素類による分解に耐性がある。
【０１６３】
用語「アンチセンス」は、或る特定の核酸配列を有するポリヌクレオチドの「センス」（コーディング）鎖との塩基対を形成し得る任意の組成物を指す。アンチセンス組成物としては、DNAや、RNAや、ペプチド核酸（PNA）や、修飾された主鎖結合たとえばホスホロチオ酸、メチルホスホン酸またはベンジルホスホン酸などを有するオリゴヌクレオチドや、修飾された糖基たとえば2'-メトキシエチル糖または2'-メトキシエトキシ糖などを有するオリゴヌクレオチドや、あるいは修飾された塩基たとえば5-メチルシトシン、2'-デオキシウラシルまたは7-デアザ-2'-デオキシグアノシンなどを有するオリゴヌクレオチドがあり得る。アンチセンス分子は、化学合成または転写など、任意の方法で製造することができる。相補的アンチセンス分子は、細胞に導入されると、細胞が産生した天然核酸配列との塩基対を形成し二重鎖を形成して転写または翻訳を妨害する。「負」または「マイナス」という表現は、ある参考DNA分子のアンチセンス鎖を意味し、「正」または「プラス」という表現は、ある参考DNA分子のセンス鎖を意味しうる。
【０１６４】
「生物学的に活性」の語は、天然分子の構造的機能、調節機能または生化学的機能を有するタンパク質を指す。同様に、用語「免疫学的に活性」または「免疫原性」は、天然或いは組換え体のPMMM、合成のPMMMまたはそれらの任意のオリゴペプチドが、適当な動物或いは細胞の特定の免疫応答を誘発して特定の抗体と結合する能力を指す。
【０１６５】
「相補(的)」または「相補性」の語は、塩基対形成によってアニーリングする2つの一本鎖核酸の間の関係を指す。例えば、配列「5'A-G-T3'」は、相補配列「3'T-C-A5'」と対を形成する。
【０１６６】
「〜のポリヌクレオチドを含む（持つ）組成物」または「〜のポリペプチドを含む（持つ）組成物」は、所定のポリヌクレオチド配列若しくはポリペプチドを持つ、任意の組成物を指す。この組成物には、乾燥製剤または水溶液が含まれ得る。PMMM若しくはPMMMの断片をコードするポリヌクレオチドを含む組成物は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。これらプローブは、凍結乾燥形態で貯蔵でき、また、糖質などの安定化剤と結合させ得る。ハイブリダイゼーションにおいては、塩(例えばNaCl)、界面活性剤(例えばドデシル硫酸ナトリウム；SDS)および他の成分(例えばデンハート液、粉乳、サケ精子DNAなど)を有する水溶液中に、プローブを分散させ得る。
【０１６７】
「コンセンサス配列」は、不要な塩基を除くためにDNA配列解析を繰り返し行い、XL-PCRキット(Applied Biosystems, Foster City CA)を用いて５'および／または３'の方向に伸長され、再度シークエンシングされた核酸配列、またはGELVIEW フラグメント結合システム(Accelrys, Burlington MA)またはPhrap(University of Washington, Seattle WA)などのフラグメント結合用コンピュータプログラムを用い1つ以上のオーバーラップするcDNAやESTまたはゲノムDNA断片からアセンブリされた核酸配列を指す。伸長及びアセンブリの両方を行ってコンセンサス配列を作製する配列もある。
【０１６８】
「保存的なアミノ酸置換」は、置換がなされた時に元のタンパク質の特性を殆ど損なわないと予測されるような置換、即ちタンパク質の構造と特に機能が保存され、そのような置換による大きな変化がない置換を指す。下表は、タンパク質中で元のアミノ酸と置換可能で、保存的アミノ酸置換と認められるアミノ酸を示している。
2005507658.tif 000003
【０１６９】
保存的なアミノ酸置換では通常、（ａ）置換領域におけるポリペプチドのバックボーン構造、例えばβシートやα螺旋構造、（ｂ）置換部位における分子の電荷または疎水性、および／または（ｃ）側鎖の大部分、を保持する。
【０１７０】
「欠失」は、結果的に１個若しくは数個のアミノ酸残基またはヌクレオチドが失われてなくなるようなアミノ酸またはヌクレオチド配列における変化を指す。
【０１７１】
「誘導体」の語は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの化学修飾を指す。例えば、アルキル基、アシル基、ヒドロキシル基またはアミノ基による水素の置換は、ポリヌクレオチドの化学修飾に含まれ得る。誘導体ポリヌクレオチドは、天然分子の生物学的または免疫学的機能を少なくとも１つは保持しているポリペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドは、次のようなプロセスによって修飾されたポリペプチドである。すなわち、グリコシル化、ポリエチレングリコール化（pegylation）、あるいは任意の同様なプロセスであって、誘導元のポリペプチドの少なくとも１つの生物学的若しくは免疫学的機能を保持するプロセスである。
【０１７２】
「検出可能な標識」は、測定可能なシグナルを生成することができ、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに共有結合または非共有結合するようなレポーター分子または酵素を指す。
【０１７３】
「差次的発現」は少なくとも2つの異なったサンプルを比較することによって決められる、増加（上方調節）、あるいは減少（下方調節）、または遺伝子発現またはタンパク発現の欠損を指す。このような比較は例えば、処理済サンプルと不処理サンプル、または病態サンプルと健常サンプルとの間で行われ得る。
【０１７４】
「エキソンシャフリング」は、異なるコード領域（エキソン）の組換えを意味する。或るエキソンは、コードするタンパク質の１つの構造的または機能的ドメインを意味し得るため、安定した下部構造群の新たな組合せによって新規のタンパク質群をアセンブリすることが可能であり、新たなタンパク質機能の進化を促進できる。
【０１７５】
用語「断片」は、PMMMまたはPMMMをコードするポリヌクレオチドの、固有の部分であって、その親配列（parent sequence）と配列は同一でありうるが親配列より長さが短いものを指す。或る断片は、最長で定義された配列の全長から１ヌクレオチド／アミノ酸残基を差し引いた長さを有し得る。例えば或る断片は、約5〜約1000の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有し得る。プローブ、プライマー、抗原、治療用分子として、或いはその他の目的のために用いられる断片は、少なくとも5、10、15、16、20、25、30、40、50、60、75、100、150、250若しくは500の、連続したヌクレオチド或いはアミノ酸残基の長さであり得る。断片は、或る分子の特定領域から優先的に選択し得る。例えば、或るポリペプチド断片は、定義された或る配列内に見られるような或るポリペプチドの最初の２５０または５００アミノ酸（または最初の２５％または５０％）から選択した、或る長さの連続したアミノ酸を持ち得る。これらの長さは明らかに例として挙げているものであり、本発明の実施態様では、配列表、表および図面を含む本明細書が支持する任意の長さであり得る。
【０１７６】
SEQ ID NO:41-80の断片は、例えば、この断片を得たゲノム内の他の配列とは異なる、SEQ ID NO:41-80を特異的に同定する固有のポリヌクレオチド配列の領域を持ちうる。SEQ ID NO:41-80の或る断片を本発明の方法の1つ以上の実施態様、例えばハイブリダイゼーションおよび増幅技術に、またはSEQ ID NO:41-80を関連ポリヌクレオチドから区別する類似の方法に用い得る。SEQ ID NO:41-80の断片の正確な長さ及び断片に対応するSEQ ID NO:41-80の領域は、断片に対する意図した目的に基づき当業者が慣例的に決定することが可能である。
【０１７７】
SEQ ID NO:1-40の或る断片は、SEQ ID NO:41-80の或る断片によってコードされる。SEQ ID NO:1-40の或る断片は、SEQ ID NO:1-40を特異的に同定する固有のアミノ酸配列の領域を持ち得る。例えばSEQ ID NO:1-40の或る断片を、SEQ ID NO:1-40を特異的に認識する抗体の開発における免疫原性ペプチドとして用い得る。SEQ ID NO:1-40の或る断片の正確な長さは、また、この断片が対応するSEQ ID NO:1-40の領域は、その断片に意図する目的に基づき、本明細書に記載する、または当分野で既知の1つ以上の分析法で判定し得る。
【０１７８】
「完全長」ポリヌクレオチドとは、少なくとも１つの翻訳開始コドン（例えばメチオニン）と、それに続く１オープンリーディングフレームおよび翻訳終止コドンを有する配列である。或る「完全長」ポリヌクレオチド配列は、或る「完全長」ポリペプチド配列をコードする。
【０１７９】
「相同性」の語は、２つ以上のポリヌクレオチド配列または２つ以上のポリペプチド配列の配列類似性、選択性、または配列同一性を意味する。
【０１８０】
ポリヌクレオチド配列に適用される「一致率」または「〜％同一」の語は、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされた少なくとも２つ以上のポリヌクレオチド配列間で一致する同一残基の割合を意味する。標準化アルゴリズムは、2配列間のアラインメントを最適化するため、標準化された再現性のある方法で比較対象の2配列内にギャップ群を挿入し得るので、2つの配列をより有意に比較できる。
【０１８１】
ポリヌクレオチド配列間の一致率(同一性)を判定するには、当分野で既知の、または本明細書に記載の、１つ以上のコンピュータアルゴリズムまたはプログラムを用い得る。例えば一致率を判定するには、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメントプログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムの、デフォルトのパラメータ群を用い得る。このプログラムは、LASERGENEソフトウェアパッケージ(一組の分子生物学的分析プログラム)(DNASTAR, Madison WI)の一部である。CLUSTAL Vは、Higgins, D.G.およびP.M. Sharp (1989; CABIOS 5:151-153)、並びにHiggins, D.G.他(1992; CABIOS 8:189-191)に記載がある。ポリヌクレオチド配列を２つ１組でアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ktuple=2、gap penalty=5、window=4、「diagonals saved」=4と設定する。デフォルトとして「重みづけされた」残基の重みづけ表を選択する。
【０１８２】
あるいは、米国国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)のBasic Local Alignment Search Tool(BLAST)が、一般的に用いられ且つ入手自由な用い得る配列比較アルゴリズム一式を提供している(Altschul, S.F.他（1990）J. Mol. Biol. 215:403-410）。BLASTアルゴリズムは幾つかの情報源から入手可能であり、メリーランド州ベセスダにあるNCBIおよびインターネット（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）からも入手可能である。BLASTソフトウェア一式には様々な配列分析プログラムが含まれており、既知のポリヌクレオチド配列を種々のデータベースから得た別のポリヌクレオチド配列とアラインメントする「blastn」もその１つである。その他にも、２つのヌクレオチド配列をペアワイズで直接比較するために用いる「BLAST 2 Sequences」と称されるツールも利用可能である。「BLAST 2 Sequences」は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlにアクセスして、対話形式で利用ができる。「BLAST 2 Sequences」ツールは、blastn 及び blastp（以下に記載）の両方に用いることができる。BLASTプログラムは、一般的には、ギャップ(gap)などのパラメータをデフォルト設定にセットして用いる。例えば、２つのヌクレオチド配列を比較するには、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12（2000年4月21日）を用いてblastnを実行し得る。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
【０１８３】
Matrix: BLOSUM62
Reward for match: 1
Penalty for mismatch: -2
Open Gap: 5 and Extension Gap: 2 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 11
Filter: on
【０１８４】
一致率は、ある定義された配列の全長（例えば特定のSEQ IDナンバーで定義された配列）について測定し得る。或いは、より短い長さ、例えば、定義された、より大きな配列から得られた断片（例えば少なくとも20、30、40、50、70、100または200の連続したヌクレオチドの断片）の長さについて一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図および配列表を含めた本明細書に記載された配列が支持する任意の断片長を用いて、一致率を測定し得る或る長さを説明し得ることを理解されたい。
【０１８５】
高度の同一性を示さない核酸配列が、それにもかかわらず遺伝暗号の縮重が原因で、類似のアミノ酸配列をコードする場合がある。この縮重を利用して核酸配列内で変化を生じさせて、全ての核酸配列が実質上同一のタンパク質をコードするような多数の核酸配列を生成し得ることを理解されたい。
【０１８６】
ポリペプチド配列に用いられる用語「一致率」または「〜％同一」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる２つ以上のポリペプチド配列間の一致する同じ残基の百分率のことである。ポリペプチド配列アラインメントの方法は公知である。保存的アミノ酸置換を考慮するアラインメント方法もある。既に詳述したこのような保存的置換は通常、置換部位の電荷および疎水性を保存するので、ポリペプチドの構造を（したがって機能も）保存する。ポリペプチド配列に用いられる用語「類似率」または「〜％類似」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる２つ以上のポリペプチド配列間の同じ残基の一致および保存的置換を含む残基の一致率を意味する。一方、保存的置換は、ポリペプチド配列間の一致率の計算には含まれない。
【０１８７】
ポリペプチド配列間の一致率は、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメントプログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトのパラメータを用いて決定できる（既に説明したのでそれを参照されたい）。CLUSTAL Vを用いてポリペプチド配列をペアワイズアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ktuple=1、gap penalty=3、window=5、「diagonals saved」=5と設定される。PAM250マトリクスが、デフォルトの残基重み付け表として選択される。
【０１８８】
あるいは、NCBI BLASTソフトウェア一式を用い得る。例えば、２つのポリペプチド配列をペアワイズで比較する場合、「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12（2000年4月21日）のblastpをデフォルトパラメータに設定して用い得る。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
【０１８９】
Matrix: BLOSUM62
Open Gap: 11 and Extension Gap: 1 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 3
Filter: on
【０１９０】
一致率は、ある定義されたポリペプチド配列の全長（例えば特定のSEQ IDナンバーで定義された配列）について測定し得る。或いは、より短い長さ、例えば、定義された、より大きなポリペプチド配列から得た断片（例えば少なくとも15、20、30、40、50、70、または150の連続した残基の断片）の長さについて一致率を測定しうる。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図および配列表を含めた本明細書に記載された配列が支持する任意の断片長を用いて、一致率を測定し得る或る長さを説明し得ることを理解されたい。
【０１９１】
「ヒト人工染色体（HAC）」は、約６kb（キロベース）〜１０MbのサイズのDNA配列を含み得る、染色体の複製、分離及び維持に必要な全ての要素を含む直鎖状の微小染色体である。
【０１９２】
用語「ヒト化抗体」は、もとの結合能力を保持しつつよりヒトの抗体に似せるために、非抗原結合領域のアミノ酸配列が変えられた抗体分子を指す。
【０１９３】
「ハイブリダイゼーション」とは、所定のハイブリダイゼーション条件下で、ある一本鎖ポリヌクレオチドがある相補的な一本鎖と塩基対を形成するアニーリングのプロセスである。特異的ハイブリダイゼーションは、2つの核酸配列が高い相補性を共有することの指標である。特異的ハイブリダイゼーション複合体は許容されるアニーリング条件下で形成され、１回以上の「洗浄」ステップ後もハイブリダイズされたままである。洗浄ステップは、ハイブリダイゼーションプロセスのストリンジェンシーを決定する際に特に重要であり、よりストリンジェントな条件では、非特異結合（すなわち完全には一致しない核酸鎖対間の結合）が減少する。核酸配列のアニーリングに関する許容条件は、当業者が慣例的に決定できる。アニール条件はどのハイブリダイゼーション実験でも一定であり得るが、洗浄条件は、所望のストリンジェンシー、したがってハイブリダイゼーション特異性を得るように、実験ごとに変更し得る。アニーリングが許容される条件は、例えば、温度が６８℃で、約６×SSC、約１％（w/v）のSDS、並びに約１００μｇ／ｍｌのせん断して変性したサケ精子DNAが含まれる。
【０１９４】
一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは或る程度、洗浄ステップを実行する温度を基準にして表すことができる。このような洗浄温度は通常、所定のイオン強度及びpHにおける特定の配列の融点（Tm）より約５〜２０℃低くなるように選択する。このTmは、所定のイオン強度およびpHの条件下で、完全一致プローブに標的配列の５０％がハイブリダイズする温度である。Tmを計算する式および核酸ハイブリダイゼーション条件はよく知られており、Sambrook, J.およびD.W. Russell (2001; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第３版、1−３巻、, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor NY, ９章)に見られる。
【０１９５】
本発明のポリヌクレオチド間のストリンジェンシーの高いハイブリダイゼーションでは、約０．２x SSC及び約0.1％のSDSの存在中で、約６８℃で１時間の洗浄過程を含む。或いは、約６５℃、６０℃、５５℃または４２℃の温度で行ってもよい。SSC濃度は、約０.１％のSDS存在下で、約０.１〜２×SSCの範囲で変更し得る。通常は、ブロッキング剤を用いて非特異ハイブリダイゼーションを阻止する。このような遮断試薬には、例えば、約１００〜２００μｇ／ｍｌのせん断され変性したサケ精子DNAが含まれる。特定条件下で、例えばRNAとDNAのハイブリダイゼーションでは、有機溶剤、例えば約３５〜５０％v/vの濃度のホルムアミドを用いることもできる。洗浄条件の有用なバリエーションは、当業者には自明であろう。ハイブリダイゼーションは、特に、高ストリンジェント条件下では、ヌクレオチド間の進化的な類似性を示唆し得る。進化的類似性は、ヌクレオチド群、およびヌクレオチドがコードするポリペプチド群について、或る同様の役割を強く示唆する。
【０１９６】
用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基間の水素結合の形成によって形成された、２つの核酸配列の複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体は、溶解状態で形成し得る(C0tまたはR0t解析など)。あるいは、一方の核酸が溶解状態で存在し、もう一方の核酸が固体支持体(例えば紙、膜、フィルタ、チップ、ピンまたはガラススライド、あるいは他の適切な基板であって細胞若しくはその核酸が固定される基板)に固定されているような２つの核酸間に形成され得る。
【０１９７】
用語「挿入」或いは「付加」は、１個以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチドがそれぞれ追加されるアミノ酸配列或いはポリヌクレオチド配列の変化を指す。
【０１９８】
「免疫応答」は、炎症、外傷、免疫異常症、伝染性疾患または遺伝性疾患に関連する症状を指し得る。これらの症状は、細胞及び全身の防御系に作用し得る種々の因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、その他のシグナル伝達分子の発現によって特徴づけることができる。
【０１９９】
「免疫抗原性断片」とは、哺乳動物等の生命体に導入されると免疫応答を誘発し得るようなPMMMのポリペプチドまたはオリゴペプチド断片である。「免疫抗原性断片」の語には、本明細書中で開示したような或いは当分野で既知であるような任意の抗体産出方法において有用なPMMMの任意のポリペプチドまたはオリゴペプチド断片も含まれる。
【０２００】
用語「マイクロアレイ」は、基板上の複数のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体またはその他の化合物の構成を指す。
【０２０１】
用語「エレメント」または「アレイエレメント」は、マイクロアレイ上に固有の指定された位置を有する、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体またはその他の化合物を指す。
【０２０２】
用語「調節」は、PMMMの活性の変化を指す。例えば、調節によって、PMMMのタンパク質活性、或いは結合特性、またはその他の生物学的特性、機能的特性或いは免疫学的特性の変化が起こる。
【０２０３】
「核酸」および「核酸配列」の語は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはこれらの断片を指す。「核酸」および「核酸配列」の語はまた、ゲノム起源または合成起源のDNAまたはRNAであって一本鎖または二本鎖であるかあるいはセンス鎖またはアンチセンス鎖を意味し得るようなDNAまたはRNAや、ペプチド核酸(PNA)や、任意のDNA様またはRNA様物質を指すこともある。
【０２０４】
「機能的に連結した」は、第１の核酸配列と第２の核酸配列が機能的な関係にある状態を指す。例えば、或るプロモーターが或るコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合には、そのプロモーターはそのコード配列に機能的に連結している。機能的に連結したDNA配列群は非常に近接するか連続的に隣接することがあり、また、2つのタンパク質コード領域を結合するために必要な場合は同一リーディングフレーム内にあり得る。
【０２０５】
「ペプチド核酸（PNA）」は、末端がリジンで終わるアミノ酸残基のペプチドのバックボーンに結合した、少なくとも約５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを含む、アンチセンス分子または抗遺伝子剤を指す。末端のリジンは、この組成に溶解性を与える。PNAは、相補的一本鎖DNAまたはRNAに優先的に結合して転写の伸長を停止させる。ポリエチレングリコール化することにより、細胞におけるPNAの寿命を延長し得る。
【０２０６】
PMMMの「翻訳後修飾」には、脂質化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ラセミ化、蛋白分解性切断及びその他の当分野で既知の修飾を含まれ得る。 これらのプロセスは、合成或いは生化学的に生じ得る。生化学的修飾は、PMMMの酵素環境に依存し、細胞の種類によって異なり得る。
【０２０７】
「プローブ」とは、同一、対立遺伝子、あるいは関連する核酸の検出に用いる、PMMMやそれらの相補体、またはそれらの断片をコードする核酸のことである。プローブは、単離されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであって、検出可能な標識またはレポーター分子に接着した配列である。典型的な標識には、放射性同位元素、リガンド、化学発光剤、および酵素がある。「プライマー」は、短い核酸、通常はDNAオリゴヌクレオチドであり、相補的塩基対を形成することで標的ポリヌクレオチドにアニーリングされ得る。プライマーは次に、DNAポリメラーゼ酵素により、標的DNA鎖に沿って伸長され得る。プライマー対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による、核酸の増幅(および同定)に用い得る。
【０２０８】
本発明に用いるプローブおよびプライマーは通常、既知の配列の、少なくとも15の連続したヌクレオチド群からなる。特異性を高めるため、長めのプローブおよびプライマー、例えば開示した核酸配列の少なくとも２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または少なくとも１５０の連続したヌクレオチドからなるようなプローブおよびプライマーも用い得る。これよりもかなり長いプローブおよびプライマーもある。表、図面および配列表を含む本明細書が支持する、任意の長さのヌクレオチドを用い得るものと理解されたい。
【０２０９】
プローブとプライマーとの調製および使用方法は例えばSambrook, J.およびD.W. Russell (2001; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版, 1-3巻, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor NY), Ausubel, F.M.他(1999; Short Protocols in Molecular Biology, 第4版, John Wiley & Sons, New York NY),およびInnis, M.他（1990; PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego CA）などの参照文献に記載がある。PCRプライマー対を既知の配列から得るには、例えば、そのためのコンピュータプログラム、例えばPrimer（Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge MA）を用い得る。
【０２１０】
プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの選択は、そのような目的のために本技術分野で既知のソフトウェアを用いて行う。例えばOLIGO 4.06ソフトウェアは、最大で各１００ヌクレオチドのPCRプライマー対の選択に有用であり、オリゴヌクレオチドおよび、最大５,０００までの大きめのポリヌクレオチドであって最大３２キロベースのインプットポリヌクレオチド配列から得た配列を分析するのにも有用である。類似のプライマー選択プログラムには、拡張能力のための追加機能が組込まれている。例えば、PrimOUプライマー選択プログラム(テキサス州ダラスにあるテキサス大学南西部医療センターのゲノムセンターから一般向けに入手可能)は、メガベース配列から特定のプライマーを選択することが可能であり、したがってゲノム全体の範囲でプライマーを設計するのに有用である。Primer3プライマー選択プログラム（Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research（マサチューセッツ州ケンブリッジ）より入手可能）によって、ユーザーは、プライマー結合部位として避けたい配列を指定できる「非プライミングライブラリ（mispriming libｒary）」を入力できる。Primer3は特に、マイクロアレイのためのオリゴヌクレオチドの選択に有用である(後二者のプライマー選択プログラムのソースコードは、それぞれの情報源から得てユーザー固有のニーズを満たすように修正し得る)。PrimerGenプログラム（英国ケンブリッジ市の英国ヒトゲノムマッピングプロジェクト-リソースセンターから一般向けに入手可能）は、多数の配列アラインメントに基づいてプライマーを設計し、それによって、アラインメントされた核酸配列の最大保存領域または最小保存領域のいずれかとハイブリダイズするようなプライマーの選択を可能にする。従って、このプログラムは、独自のものであれ保存されたものであれ、オリゴヌクレオチドとポリヌクレオチド断片との同定に有用である。上記選択方法のいずれかによって同定したオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド断片は、ハイブリダイゼーション技術において、例えばPCRまたはシークエンシングプライマーとして、マイクロアレイエレメントとして、あるいは核酸のサンプルにおいて完全または部分的相補的ポリヌクレオチドを同定する特異プローブとして有用である。オリゴヌクレオチドの選択方法は、上記の方法に限定されるものではない。
【０２１１】
本明細書における「組換え核酸」は天然の配列ではなく、2つ以上の配列の離れたセグメントを人工的に組み合わせた核酸である。この人為的組合せはしばしば化学合成によって達成するが、より一般的には核酸の単離セグメントの人為的操作によって、例えばSambrook および Russellの文献（前出）に記載されているような遺伝子工学的手法によって達成する。組換え核酸の語は、単に核酸の一部が付加、置換または欠失により改変された核酸も含む。しばしば組換え核酸には、プロモーター配列に機能的に連結した核酸配列が含まれる。このような組換え核酸は、例えばある細胞を形質転換するために使用されるベクターの一部と成し得る。
【０２１２】
或いはこのような組換え核酸は、ウイルスベクターの一部と成すことができ、ベクターは例えばワクシニアウイルスに基づくものであり得る。そのようなベクターは哺乳類に接種され、その組換え核酸が発現されて、その哺乳類内で防御免疫応答を誘導するように使用することができる。
【０２１３】
「調節因子」は、通常は遺伝子の非翻訳領域に由来する核酸配列であり、エンハンサー、プロモーター、イントロン及び５'及び３'の非翻訳領域（UTR）を含む。調節エレメントは、転写、翻訳またはRNA安定性を制御する宿主タンパク質またはウイルスタンパク質と相互作用する。
「レポーター分子」は、核酸、アミノ酸または抗体の標識に用いられる化学的または生化学的な部分である。レポーター分子には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、色原体、基質、補助因子、阻害因子、磁気粒子およびその他の当分野で既知の成分がある。
【０２１４】
DNA分子に対する「RNA等価物」は、基準となるDNA分子と同じ直鎖の核酸配列から構成されるが、全ての窒素性塩基のチミンがウラシルで置換され、糖鎖のバックボーンがデオキシリボースではなくリボースからなる。
【０２１５】
用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられている。PMMM、PMMMをコードする核酸、またはその断片を含むと推定されるサンプルは、体液と、細胞からの抽出物や細胞から単離された染色体や細胞内小器官、膜と、細胞と、溶液中に存在するまたは基板に固定されたゲノムDNA、RNA、cDNAと、組織と、組織プリント等を含み得る。
【０２１６】
用語「特異的結合」及び「特異的に結合する」は、タンパク質若しくはペプチドと、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、若しくは任意の天然若しくは合成の結合組成物との間の相互作用を指す。この相互作用は、タンパク質の特定の構造(例えば抗原決定基すなわちエピトープ)であって結合分子が認識する構造の有無に依存する。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、遊離した標識Ａ及びその抗体を含む反応において、エピトープＡ（つまり遊離した、標識されていないＡ）を含むポリペプチドの存在が、抗体に結合する標識されたＡの量を低減させる。
【０２１７】
用語「実質的に精製された」は、自然の環境から取り除かれてから、単離或いは分離された核酸配列或いはアミノ酸配列であって、自然に結合している組成物が少なくとも約６０％除去されたものであり、好ましくは約７５％以上の除去、最も好ましくは約９０％以上除去されたものを指す。
【０２１８】
「置換」とは、一つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドをそれぞれ別のアミノ酸またはヌクレオチドに置き換えることである。
【０２１９】
用語「基板」は、任意の好適な固体或いは半固体の支持物を指し、膜及びフィルター、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁気または非磁気ビーズ、ゲル、チューブ、プレート、ポリマー、微小粒子、毛細管が含まれる。基板は、ウェル、溝、ピン、チャネル、孔など、様々な表面形態を有することができ、基板表面にはポリヌクレオチドやポリペプチドが結合する。
【０２２０】
「転写イメージ(transcript image)」または「発現プロファイル（プロフィール）」は、所定条件下での所定時間における特定の細胞の種類または組織による集合的遺伝子発現のパターンを指す。
【０２２１】
「形質転換(transformation)」とは、外来DNAが受容細胞に導入されるプロセスのことである。形質転換は、当該分野で公知の種々の方法に従って自然条件または人工条件下で生じ得るものであり、外来性の核酸配列を原核宿主細胞または真核宿主細胞に挿入する、任意の既知の方法を基にし得る。形質転換の方法は、形質転換する宿主細胞の種類によって選択する。限定するものではないが形質転換方法には、バクテリオファージあるいはウイルス感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、熱ショック、リポフェクションおよび微粒子銃を用いる方法がある。「形質転換された細胞」には、導入されたDNAが自律的に複製するプラスミドとして或いは宿主染色体の一部として複製可能である安定的に形質転換された細胞が含まれる。さらに、限られた時間に一過的に導入DNA若しくは導入RNAを発現する細胞も含まれる。
【０２２２】
ここで用いる「遺伝形質転換生物体(transgenic organism)」とは任意の生物体であり、限定するものではないが動植物を含み、生物体の１個以上の細胞が、ヒトの関与によって、例えば本技術分野でよく知られているトランスジェニック(transgenic)技術によって導入された異種核酸を有する。核酸の細胞への導入は、直接または間接的に、細胞の前駆物質に導入することによって、計画的な遺伝子操作によって、例えば微量注射法によって或いは組換えウイルスでの感染によって行う。別の実施態様で核酸の導入は、組換えウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターを感染させて成し得る (Lois, C. 他(2002) Science 295:868-872）。遺伝子操作の語は、古典的な交雑育種あるいは体外受精を指すものではなく、組換えDNA分子の導入を指す。本発明に基づいて企図される遺伝形質転換生物には、細菌、藍藻、真菌、および動植物がある。本発明の単離されたDNAは、本技術分野で知られている方法、例えば感染、形質移入、形質転換またはトランス接合によって宿主に導入することができる。本発明のDNAをこのような生物体に移入する技術はよく知られており、前出のSambrookおよびRussellなどの参照文献に提示される。
【０２２３】
特定の核酸配列の「変異体」は、核酸配列１本全部の長さに対して特定の核酸配列と少なくとも４０％の相同性を有する核酸配列であると定義する。 その際、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（1999年5月7日）を用いてblastnを実行する。このような核酸対は、所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示し得る。或る変異体は、例えば「対立遺伝子」変異体（前述）、「スプライス」変異体、「種」変異体または「多型性」変異体として記載し得る。スプライス変異体は参照分子との顕著な同一性を有し得るが、mRNAプロセシング中のエキソン群の選択的スプライシングによって通常、より多数またはより少数のヌクレオチドを有することになる。対応するポリペプチドは、追加機能ドメイン群を有するか、あるいは参照分子には存在するドメイン群が欠落していることがある。種変異体は、種によって異なるポリヌクレオチドである。結果的に生じるポリペプチドは通常、相互に有意のアミノ酸同一性を持つ。多型変異体は、或る種の個体間における、或る特定遺伝子のポリヌクレオチド配列内での変異である。多型変異配列はまた、ポリヌクレオチド配列の１つのヌクレオチドが異なる「１塩基多型性」（SNP）も含み得る。SNPの存在は、例えば特定の集団、病態または病態性向を示し得る。
【０２２４】
特定のポリペプチド配列の「変異体」は、ポリペプチド配列の１本の長さ全体で特定のポリペプチド配列に対して少なくとも40％の配列相同性または配列類似性を有するポリペプチド配列として定義される。定義づけには、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（1999年5月7日）を用いてblastpを実行する。このようなポリペプチド対は、そのポリペプチドの一方の所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性または配列類似性を示し得る。
【０２２５】
（発明）
本発明の種々の実施態様は、新規のヒトタンパク質修飾および維持分子(PMMM)、PMMMをコードするポリヌクレオチド、並びに、これらの組成物を利用した胃腸障害、心血管障害、自己免疫／炎症疾患、細胞増殖異常、発生・発達障害、上皮障害、神経疾患、および生殖障害、内分泌疾患、膵臓疾患、副腎疾患および代謝疾患、脂質、銅および糖質代謝障害、性腺ステロイドホルモン、免疫系に関連する疾患および感染症の診断、治療、及び予防に関する。
【０２２６】
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド実施態様およびポリペプチド実施態様の命名の概略である。各ポリヌクレオチドおよびその対応するポリペプチドは、１つのIncyteプロジェクト識別番号(IncyteプロジェクトID)に相関する。各ポリペプチド配列は、ポリペプチド配列識別番号（ポリペプチドSEQ ID NO:）とIncyteポリペプチド配列番号（IncyteポリペプチドID）によって表示した。各ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドSEQ ID NO:）とIncyteポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（IncyteポリヌクレオチドID）によって表示した。列６は、本発明のポリペプチド配列とポリヌクレオチド配列とに対応する物理的完全長クローン群のIncyte ID番号を示す。完全長クローンは、列３に示すポリペプチド配列に対して少なくとも95%の配列同一性を持つポリペプチドをコードする。
【０２２７】
表２は、GenBankタンパク質(genpept)データベースとPROTEOMEデータベースとに対するBLAST分析で同定した、本発明のポリペプチド実施態様に相同な配列群を示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド配列識別番号（ポリペプチド SEQ ID NO:）と、それに対応するIncyteポリペプチド配列番号（IncyteポリペプチドID）を示す。列3は、最も近いGenBank相同体のGenBank識別番号(GenBank ID NO:)と、最も近いPROTEOMEデータベース相同体のPROTEOMEデータベース識別番号(PROTEOME ID NO:)とを示す。列４は、各ポリペプチドとその相同体１つ以上との間の一致に関する確率スコアを示す。列５はGenBankおよびPROTEOMEデータベースの相同体の注釈を示し、更に該当箇所には関連する引用文献も示す。これらすべては特にこの参照により開示に含まれる。
【０２２８】
表２は、本発明のポリペプチドの多様な構造的特徴を示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド配列識別番号（SEQ ID NO:）と、それに対応するIncyteポリペプチド配列番号（IncyteポリペプチドID）を示す。列３は、各ポリペプチドのアミノ酸残基数を示す。列４および列５は各々、GCG配列分析ソフトウェアパッケージのMOTIFSプログラム(Accelrys, Burlington MA)によって決定された、潜在的なリン酸化およびグリコシル化部位を示す。列６は、シグネチャ配列、ドメイン、およびモチーフを持つアミノ酸残基を示す。列７はタンパク質の構造／機能の分析のための分析方法を示し、該当箇所には更に、分析方法に用いた検索可能なデータベースを示す。
【０２２９】
表２及び表２は共に、本発明の各々のポリペプチドの特性を要約しており、それらの特性は、請求の範囲に記載されたポリペプチド群がタンパク質修飾および維持分子であることを確立している。例えば、SEQ ID NO:2はカテプシンO2 (GenBank ID g1195556)にT41残基からM288残基まで100%また、M1残基からE43 残基まで95%同一であることがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって確認された（表2参照）。BLAST確率スコアは共に1.8e-158であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:2は細胞質内リソソーム/空胞に局在し、プロテアーゼ機能を有しており、ヒトカテプシンO（カテプシンK）であることが、PROTEOMEデータベースを用いたBLAST解析によって確認された。SEQ ID NO:2はまた、１つのパパインファミリシステインプロテアーゼドメインを有するが、これは隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメイン群のPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された（表２参照）。BLIMPS、MOTIFS、およびPROFILESCANおよび他のBLAST 解析よりのデータは、SEQ ID NO:2 がカテプシンOである更なる補強証拠を提供する。また他の例として、SEQ ID NO:4はヒト前立腺特異抗原 (GenBank ID g618464) とM1残基からR68残基まで100%の同一性、K69残基からP218残基まで99%の同一性を有することがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって示された（表2参照）。BLAST確率スコアは2e-118であり、これは観測されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:4はセリンプロテアーゼ活性を有し、カリクレインセリンプロテアーゼであることがPROTEOMEデータベースを用いたBLAST解析によって確認された。SEQ ID NO:4はまた、１つのトリプシンドメインを有するが、これは隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメイン群のPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された（表２参照）。BLIMPS、MOTIFS、BLASTおよびPROFILESCAN解析よりのデータは、SEQ ID NO:4 がトリプシンファミリーのセリンプロテアーゼである更なる補強証拠を提供する。別の例において、SEQ ID NO:10は残基F123から残基I824までヒトジペプチジルペプチダーゼ (GenBank ID g11095188)に99%の同一性を有するが、これはBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって同定された（表2参照）。BLAST確率スコアは0.0であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:10は細胞下領域に局在し、ペプチダーゼ機能を有しており、ジペプチジルアミノペプチダーゼ8であることが、PROTEOMEデータベースを用いたBLAST解析によって確認された。SEQ ID NO:10はまた、１つのプロリルオリゴペプチダーゼドメインを有するが、 これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された（表２参照）。BLIMPS、MOTIFS、およびPROFILESCAN解析からのデータは、SEQ ID NO:10 がペプチダーゼである更なる補強証拠を提供する。別の例においてSEQ ID NO:14は、M1残基からI429残基までが96％、V412残基からN945残基までが、ヒトUnpEL(ユビキチン特異的プロテアーゼ) (GenBank ID g2656141)に対して100％同一であると、Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)で判定された（表2参照）��BLAST確率スコアは0.0であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:14はまたユビキチン特異的プロテアーゼであるタンパク質に相同性を有し、小細胞肺癌細胞株において変容した発現を有することがPROTEOMEデータベースを用いたBLAST解析によって確認された。SEQ ID NO:14はまた、１つのユビキチンカルボキシル末端加水分解酵素ファミリドメインを有するが、これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された（表２参照）。BLIMPS及びMOTIFS解析よりのデータは、SEQ ID NO:14がユビキチン特異的プロテアーゼである更なる補強証拠を提供する。別の例においてSEQ ID NO:27は、I49残基からH521残基までが93％、M1残基からV58残基までが93％、ヒトシャペロニン含有 t-複合体ポリペプチド 1、eta サブユニット (GenBank ID g2559010)に対して同一であると、Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)で判定された（表2参照）。BLAST確率スコアは共に1.4e-272であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:27はまた、細胞骨格に局在し、シャペロンとして働き、細胞質内シャペロニン含有TCP-1 (CCT)のetaサブユニットであるタンパク質に相同性を有することがPROTEOMEデータベースを用いたBLAST解析によって確認された。SEQ ID NO:27はまた、１つのTCP-1/cpn60シャペロニンファミリードメインを有するが、これは隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメイン群のPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された（表２参照）。BLIMPS、MOTIFSおよび追加BLAST解析のデータは、SEQ ID NO:27がシャペロニン含有t-複合体ポリペプチド1、etaサブユニットである更なる補強証拠を提供する。別の例において、SEQ ID NO:34はM1残基からN83残基までが97%、A82残基からM146残基までが100%、ヒトサイクロフィリン(cyclophilin) (GenBank ID g3647230、各々M1 からD83 と  A113 から M177まで)に同一であることがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって確認された  （表2参照）。BLAST確率スコアは1.8e-75であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:34はさらに核に局在するタンパク質と相同性を有し、ペプチジルプロリルイソメラーゼ活性を有し、サイクロフィリンであることがPROTEOMEデータベースを使ったBLAST解析によって示された。SEQ ID NO:34はまた、1つのシクロフィリン型ペプチジル-プロリルシス-トランス異性化酵素ドメインを有するが、これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された（表２参照）。BLIMPS、BLAST、 MOTIFSおよび PROFILESCAN解析のデータは、SEQ ID NO:34がサイクロフィリンペプチジルプロリルイソメラーゼのクラスのメンバーである更なる補強証拠を提供する。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5-9、SEQ ID NO:11-13、SEQ ID NO:15-26、SEQ ID NO:28-33およびSEQ ID NO:35-40は、同様に分析し、注釈を付けた。SEQ ID NO:１−40の解析のためのアルゴリズム及びパラメータは表７に記述する。
【０２３０】
表４に示すように、完全長ポリヌクレオチド実施態様は、cDNA配列またはゲノムDNA由来のコード(エキソン)配列を用いて、あるいはこれら２種類の配列を任意に組合せてアセンブリした。列１は本発明の各ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドSEQ ID NO）および対応するIncyteポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（Incyte ID）、および塩基対の各ポリヌクレオチド配列の長さを示している。列２は、完全長ポリヌクレオチド実施態様のアセンブリに使われたｃDNA配列および／またはゲノム配列のヌクレオチド開始位置（5'）と停止位置（3'）、およびSEQ ID NO:41-80 を同定するか、またはSEQ ID NO:41-80と、関連するポリヌクレオチド配列とを区別する技術(例えば、ハイブリダイゼーション技術または増幅技術)に有用なポリヌクレオチドの断片のヌクレオチド開始位置(5')と終了位置(3')を示す。
【０２３１】
表４の列２に記載したポリヌクレオチド断片は、特に例えば組織特異的cDNAライブラリ群やプールしたcDNAライブラリ群に由来するIncyte cDNA群を指す場合もある。或いは列２に記載のポリヌクレオチド断片は、完全長ポリヌクレオチドのアセンブリに寄与したGenBank cDNAまたはESTを指す場合もある。さらに、列2のポリヌクレオチド断片は、ENSEMBL（The Sanger Centre、英国ケンブリッジ）データベースから由来した配列（即ち「ENST」命名を含む配列）を同定し得る。或いは、列2で記述されたポリヌクレオチド断片は、NCBI RefSeq Nucleotide Sequence Records データベースから由来する場合もあり（即ち「NM」または「NT」の命名を含む配列）、またNCBI RefSeq Protein Sequence Recordsから由来する場合もある（即ち「NP」の命名を含む配列）。または列2のポリヌクレオチド断片は、「エキソンスティッチング（exon-stitching）」アルゴリズムにより結び合わせたcDNA及びGenscan予想エキソンの両方のアセンブリ体を意味する場合がある。例えば、FL_XXXXXX_N1_N2_YYYYY_N3_N4 と同定されるポリヌクレオチドは、アルゴリズムが適用される配列のクラスターの識別番号がXXXXXXであり、アルゴリズムにより生成される予測の番号がYYYYY であり、（もし存在すれば）N1,2,3..が解析中に手動で編集された可能性のある特定のエキソンであるような「縫合された(stitched)」配列である(実施例５参照)。または、列2のポリヌクレオチド断片は「エキソンストレッチング（exon-stretching）」アルゴリズムにより結び合わせたエキソンのアセンブリ体を指す場合もある。例えば、FLXXXXXX_gAAAAA_gBBBBB_1_Nとして同定されるポリヌクレオチド配列は、「ストレッチされた」配列である。XXXXXXはIncyteプロジェクト識別番号、gAAAAAは「エキソンストレッチング」アルゴリズムを適用したヒトゲノム配列のGenBank識別番号、gBBBBBは一番近いGenBankタンパク質相同体のGenBank識別番号またはNCBI RefSeq 識別番号であり、Nは特定のエキソンを指す（実施例５を参照）。あるRefSeq配列が「エキソンストレッチング」アルゴリズムのためのタンパク質相同体として使用された場合では、RefSeq識別子（「NM」、「NP」、または「NT」によって表される）が、GenBank識別子（即ち、gBBBBB）の代わりに使用される場合もある。
【０２３２】
あるいは、接頭コードは、手動で編集された構成配列、ゲノムDNA配列から予測された構成配列、または組み合わされた配列解析方法に由来する構成配列を同定する。次の表は、構成配列の接頭コードと、接頭コードに対応する配列分析方法の例を列記する（実施例４と５を参照）。
2005507658.tif 000004
【０２３３】
場合によっては、最終コンセンサスポリヌクレオチド配列を確認するために、表４に示すような配列の適用範囲と重複するIncyte cDNA適用範囲が得られたが、該当するIncyte cDNA識別番号は示さなかった。
【０２３４】
表５は、Incyte cDNA配列を用いてアセンブリされた完全長ポリヌクレオチドのための代表的なcDNAライブラリを示している。代表的なcDNAライブラリとはIncyte cDNAライブラリであり、これは、最も頻繁にはIncyte cDNA配列群によって代表されるが、これら配列は、上記ポリヌクレオチドをアセンブリおよび確認するために用いられた。cDNAライブラリを作製するために用いた組織およびベクターを表５に示し、表６で説明している。
【０２３５】
本発明はまた、PMMM の変異体も含む。PMMM変異体の種々の実施態様は、PMMMの機能的或いは構造的特徴の少なくとも１つを持ちうる他、該PMMMアミノ酸配列に対して少なくとも約80％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約90％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも約95％のアミノ酸配列同一性を持ちうる。
【０２３６】
種々の実施態様もまた、PMMMをコードするポリヌクレオチドをも含む。或る例では、PMMMをコードするSEQ ID NO:41-80からなる群から選択された配列を有するポリヌクレオチド配列が本発明に含まれている。配列表に示したSEQ ID NO:41−80のポリヌクレオチド配列は、窒素系塩基のチミンがウラシルに置換され、糖鎖のバックボーンがデオキシリボースではなくリボースからなる等価RNA配列を含む。
【０２３７】
本発明はまた、PMMMをコードするポリヌクレオチドの変異体を含む。詳細には、このような変異体ポリヌクレオチドは、PMMMをコードするポリヌクレオチドとの、少なくとも約70％のポリヌクレオチド配列同一性、あるいは少なくとも約85％のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも約95％ものポリヌクレオチド配列同一性を持つこととなる。本発明の或る実施態様では、SEQ ID NO:41-80からなる群から選択された核酸配列と少なくとも約70％、或いは少なくとも約85％、または少なくとも約95％ものポリヌクレオチド配列同一性を有するようなSEQ ID NO:41-80からなる群から選択された配列を有するポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。上記の任意のポリヌクレオチドの変異体は、PMMMの機能的若しくは構造的特徴を少なくとも１つ有するポリペプチドをコードし得る。
【０２３８】
さらに、或いは別法では、本発明のポリヌクレオチド変異体は、PMMMをコードするポリヌクレオチドのスプライス変異体である。或るスプライス変異体はPMMMをコードするポリヌクレオチドとの顕著な配列同一性を持つ部分複数を有し得るが、mRNAプロセッシング中のエキソン群の選択的スプライシングによって生ずる、配列の数ブロックの付加または欠失により、通常、より多数またはより少数のポリヌクレオチドを有することになる。或るスプライス変異体には、約70％未満、または約60％未満、あるいは約50％未満のポリヌクレオチド配列同一性が、PMMMをコードするポリヌクレオチドとの間で全長に渡って見られるが、このスプライス変異体の幾つかの部分には、PMMMをコードするポリヌクレオチドの各部との、少なくとも約70％、あるいは少なくとも約85％、または少なくとも約95％、なおまたは100％の、ポリヌクレオチド配列同一性を有することとなる。例えば、SEQ ID NO:43 の配列を含むポリヌクレオチドとSEQ ID NO:52の配列を含むポリヌクレオチドは互いにスプライス変異体であり、またSEQ ID NO:44 の配列を含むポリヌクレオチド、SEQ ID NO:69の配列を含むポリヌクレオチドは互いにスプライス変異体であり、SEQ ID NO:46の配列を含むポリヌクレオチド、SEQ ID NO:49の配列を含むポリヌクレオチドおよびSEQ ID NO:50 の配列を含むポリヌクレオチドは互いにスプライス変異体である。上記のスプライス変異体は何れも、PMMMの機能的或いは構造的特徴の少なくとも１つを有する或るポリペプチドをコードし得る。
【０２３９】
遺伝暗号の縮重により作り出され得るPMMMをコードする種々のポリヌクレオチド配列には、自然発生する任意の既知の遺伝子のポリヌクレオチド配列と最小の類似性しか有しないものも含まれることを、当業者は理解するであろう。したがって本発明には、可能コドン選択に基づく組合せの選択によって産出し得るあらゆる可能なポリヌクレオチド配列のバリエーションを企図する。これらの組み合わせは、天然のPMMMのポリヌクレオチド配列に適用される標準的なトリプレット遺伝暗号を基に作られ、全てのそのような変異が明確に開示されているとみなす。
【０２４０】
PMMMとその変異体とをコードするポリヌクレオチドは一般に、好適に選択されたストリンジェンシー条件下で天然PMMMのポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能であるが、非天然コドン群を含めるなどの実質的に異なるコドン使用を有するPMMM或いはその誘導体をコードするポリヌクレオチドを作り出すことは、有益であり得る。宿主が特定コドンを利用する頻度に基づき、特定の真核宿主または原核宿主に発生するペプチドの発現率を高めるようコドンを選択し得る。コードされたアミノ酸配列を変えずに、PMMM 及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に変更する別の理由は、天然の配列から作られる転写物より例えば長い半減期など好ましい特性を備えるRNA転写物を作ることにある。
【０２４１】
本発明はまた、PMMM及びその誘導体をコードするポリヌクレオチドまたはそれらの断片を完全に合成化学によって作り出すことも含む。作製後、当分野で周知の試薬を用いて、この合成ポリヌクレオチドを任意の様々な入手可能な発現ベクター及び細胞系中に挿入し得る。更に、合成化学を用いてPMMMまたはその任意の断片をコードする或るポリヌクレオチドに突然変異を誘導し得る。
【０２４２】
本発明の実施態様には、種々のストリンジェンシー条件下で、請求項に記載のポリヌクレオチド、特に、SEQ ID NO:41-80に示す配列を持つポリヌクレオチド、及びそれらの断片群にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド群が含まれる(Wahl, G.M.およびS.L. Berger (1987) Methods Enzymol.152:399-407、Kimmel, A.R.(1987)Methods Enzymol.152:507-511）。
アニーリングおよび洗浄条件を含むハイブリダイゼーションの条件は、「定義」に記載した。
【０２４３】
DNAシークエンシングの方法は当分野では周知であり、本発明のいずれの実施態様にも、DNAシークエンシング方法を用い得る。DNAシークエンシング方法には酵素を用い得る。例えばDNAポリメラーゼ１のクレノウ断片、SEQUENASE（US Biochemical, Cleveland OH）、Taqポリメラーゼ（Applied Biosystems）、熱安定性T7ポリメラーゼ（Amersham Biosciences, Piscataway NJ）を用い得る。あるいは、例えばELONGASE増幅システム（Invitrogen, Carlsbad CA）において見られるように、ポリメラーゼと校正エキソヌクレアーゼとを併用し得る。好適には、MICROLAB2200液体転移システム（Hamilton, Reno, NV）、PTC200サーマルサイクラー（MJ Research, Watertown MA）およびABI CATALYST 800サーマルサイクラー（Applied Biosystems）などの装置を用いて配列の準備を自動化する。次に、ABI 373或いは377 DNAシークエンシングシステム（Applied Biosystems）、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム（Amersham Biosciences）または当分野で既知の他のシステムを用いてシークエンシングを行う。結果として得た配列を、当分野で周知の種々のアルゴリズムを用いて分析する（Ausubel他、前出、7章; Meyers, R.A. (1995) Molecular Biology and Biotechnology, Wiley VCH, New York NY, 856-853ページ）。
【０２４４】
当分野で周知の、PCR法をベースにした種々の方法と、部分的ヌクレオチド配列とを利用して、PMMMをコードする核酸を伸長し、プロモーターや調節エレメントなど、上流にある配列を検出し得る。例えば、使用し得る方法の１つである制限部位PCR法は、ユニバーサルプライマーおよびネステッドプライマーを用いてクローニングベクター内のゲノムDNAからの未知の配列を増幅する方法である(Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic.2:318-322)。別の方法にインバースPCR法があり、これは多岐の方向に伸長するプライマー群を用いて、環状化した鋳型から未知の配列を増幅する方法である。鋳型は、或る既知のゲノム遺伝子座およびその周辺の配列群からなる制限酵素断片群から得る(Triglia, T.他(1988) Nucleic Acids Res.16:8186）。
第３の方法としてキャプチャPCR法があり、これにはヒトおよび酵母人工染色体DNAの既知の配列群に隣接するDNA断片群をPCR増幅する方法を含む(Lagerstrom, M.他(1991) PCR Methods Applic.1:111119）。
この方法では、PCRを行う前に、複数の制限酵素の消化およびライゲーション反応を用い、未知の配列領域内に組換え二本鎖配列を挿入し得る。未知の配列群を検索するために用い得る、他の複数の方法も当分野で既知である（例えばParker, J.D.他(1991) Nucleic Acids Res.19:30553060）。
更に、PCR、ネステッドプライマー類、およびPROMOTERFINDERライブラリ類（Clontech, Palo Alto CA）を用いて、ゲノムDNAをウォーキングし得る。この手順は、ライブラリ類をスクリーニングする必要がなく、イントロン／エキソン接合部の発見に有用である。全てのPCRベースの方法では、市販ソフトウェア、例えばOLIGO 4.06プライマー分析ソフトウェア（National Biosciences, Plymouth MN）或いは別の好適なプログラムを用いて、長さが約２２〜３０ヌクレオチド、GC含有率が約５０％以上で、温度約６８℃〜７２℃で鋳型に対してアニーリングするように、プライマー群を設計し得る。
【０２４５】
完全長cDNA群をスクリーニングする際は、より大きなcDNA群を含むようにサイズ選択されたライブラリ群を用いるのが好ましい。更にランダムプライマーのライブラリは遺伝子群の5'領域を有する配列群をしばしば含んでおり、オリゴd(T)ライブラリが完全長cDNAを作製できない状況に対して好適である。ゲノムライブラリ群は、5'非転写調節領域への、配列の伸長に有用であろう。
【０２４６】
市販のキャピラリー電気泳動システム群を用いて、シークエンシングまたはPCR産物のサイズを分析し、またはそのヌクレオチド配列を確認し得る。具体的には、キャピラリーシークエンシングは、電気泳動分離のための流動性ポリマーと、４つの異なるヌクレオチド特異的な、レーザーで刺激される蛍光色素と、発光された波長の検出に利用するCCDカメラとを有し得る。出力／光の強度は、適切なソフトウェア（Applied Biosystems社のGENOTYPER、SEQUENCE NAVIGATOR等）を用いて電気信号に変換し得る。サンプルのロードからコンピュータ分析及び電子データ表示までの全プロセスがコンピュータ制御可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しないようなDNA小断片のシークエンシングに特に適している。
【０２４７】
本発明の別の実施様態では、PMMMをコードするポリヌクレオチドまたはその断片を組換えDNA分子にクローニングして、適切な宿主細胞内にPMMM、その断片または機能的等価物を発現させることが可能である。遺伝暗号に固有の縮重により、実質的に同じ或いは機能的に等価のポリペプチドをコードする別のポリヌクレオチドが作られ得り、これらの配列をPMMMの発現に利用可能である。
【０２４８】
様々の目的で、PMMMをコードする配列群を改変するために、当分野で一般に既知の複数の方法を用いて、本発明のポリヌクレオチド群を組換えることができる。この組換えの多様な目的には、遺伝子産物のクローン化、あるいはプロセッシングおよび／または発現のモディフィケーションが含まれるが、これらに限定されるものではない。遺伝子断片と合成オリゴヌクレオチドとの、ランダムな断片化およびPCR再アセンブリによるDNAシャッフリングを用い、ヌクレオチド配列を組換え得る。例えば、オリゴヌクレオチドを介した部位特異的変異導入を利用して、新規な制限部位の作製、グリコシル化パターンの改変、コドン選択性の変更、スプライス変異体の生成などを起こす突然変異を導入し得る。
【０２４９】
本発明のヌクレオチドは、MOLECULARBREEDING（Maxygen Inc., Santa Clara CA, 米国特許第5,837,458号、Chang, C.-C.他(1999) Nat. Biotechnol. 17:793-797; Christians, F.C. 他(1999) Nat. Biotechnol. 17:259-264; Crameri, A. 他(1996) Nat. Biotechnol. 14:315-319)などのDNAシャッフリング技術の対象となり得る。これにより、生物活性または酵素活性、あるいは他の分子や化合物と結合する能力など、PMMMの生物学的特性を改変あるいは改良し得る。DNAシャッフリングは、PCRを介する遺伝子断片組換えを用いて遺伝子変異体のライブラリを作製するプロセスである。ライブラリはその後、所望の特性を持つ遺伝子変異体群を同定する、選択またはスクリーニングの手順を経る。続いて、これら好適な変異体をプールし、更に反復してDNAシャッフリングおよび選択／スクリーニングを行い得る。従って、「人工的な」育種及び急速な分子の進化によって遺伝的多様性が生み出される。例えば、ランダムな点突然変異を持つ単一の遺伝子の断片を組換えて、スクリーニングし、その後所望の特性が最適化されるまでシャッフリングし得る。あるいは、所定の遺伝子の断片群を同種または異種のいずれかから得た同一遺伝子ファミリーの相同遺伝子の断片と組換えて、自然に生じる複数遺伝子の遺伝的多様性を、定方向の、制御可能な方法で最大化できる。
【０２５０】
別の実施態様によれば、PMMMをコードするポリヌクレオチドは、当分野で周知の１つ以上の化学的方法を用いて、全体あるいは一部が合成可能である(Caruthers, M.H. 他. (1980) Nucleic Acids Symp. Ser. 7:215-223; Horn, T.他(1980) Nucleic Acids Symp. Ser. 7:225-232)。或いはPMMM自体またはその断片の合成に、当分野で既知の化学的方法を用い得る。例えば種々の液相または固相技術を用いてペプチド合成を行い得る(Creighton, T. (1984) Proteins, Structures and Molecular Properties, WH Freeman, New York NY,55-60ページ; Roberge, J.Y.他(1995) Science 269:202-204）。自動合成はABI 431Aペプチドシンセサイザ（Applied Biosystems）を用いて達成し得る。更にPMMMのアミノ酸配列または任意のその一部は、直接的な合成の際の変更、及び／または他のタンパク質の配列または任意のその一部からの配列との組み合わせにより、天然のポリペプチド配列を有するポリペプチドまたは変異体ポリペプチドを作製することが可能である。
【０２５１】
このペプチドは分取用高速液体クロマトグラフィーで実質的に精製し得る(Chiez, R.M.およびF.Z. Regnier (1990) Methods Enzymol. 182:392-421)。この合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析またはシークエンシングで確認できる(前出Creighton, 28-53ページ)。
【０２５２】
生物学的に活性なPMMMを発現させるために、PMMMをコードするポリヌクレオチドまたはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入する。 この発現ベクターは、好適な宿主に挿入されたコード配列の転写及び翻訳の調節に必要なエレメントを含む。必要なエレメントとしては、ベクター内およびPMMMをコードするポリヌクレオチドにおける調節配列（例えばエンハンサー、構成型および発現誘導型のプロモーター、５'および３'の非翻訳領域など）が含まれる。必要なエレメント群は、強度および特異性が様々である。また、特定の開始シグナルを用いて、PMMMをコードするポリヌクレオチドのより効果的な翻訳を達成することが可能である。開始シグナルの例には、ATG開始コドンと、コザック配列など近傍の配列とが含まれる。PMMM をコードするポリヌクレオチド配列、およびその開始コドンや、上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入された場合は、更なる転写制御シグナルや翻訳制御シグナルは必要ないこともある。しかしながら、コード配列あるいはその断片のみが挿入される場合は、インフレームATG開始コドンなど外来性の翻訳制御シグナルが発現ベクターに含まれるようにすべきである。外来性の翻訳エレメント及び開始コドンは、様々な天然物及び合成物を起源とし得る。用いられる特定の宿主細胞系に好適なエンハンサーを含めることで発現の効率を高めることが可能である(Scharf, D.他(1994) Results Probl.Cell Differ.   20:125-162）。
【０２５３】
当業者に周知の方法を用いて、PMMM をコードするポリヌクレオチド、好適な転写及び翻訳調節エレメントを含む発現ベクターを作製することが可能である。これらの方法としては、in vitro組換えDNA技術、合成技術、およびin vivo遺伝的組換えがある(SambrookおよびRussell,前出、1-4,および8章; Ausubel他、前出、1、3,および15章)。
【０２５４】
種々の発現ベクター／宿主系を利用して、PMMMをコードするポリヌクレオチドの保持及び発現が可能である。限定するものではないがこのような発現ベクター／宿主系には、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換させた細菌や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌など微生物や、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、CaMVまたはタバコモザイクウイルス、TMV）または細菌発現ベクター（例えばTiプラスミドまたはpBR322プラスミド）で形質転換させた植物細胞系、動物細胞系がある(SambrookおよびRussell、前出; Ausubel他、前出; Van Heeke, G.およびS.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509; Engelhard, E.K.他(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227、Sandig, V.他(1996) Hum.Gene Ther.7:1937-1945、Takamatsu, N. (1987) EMBO J. 6:307-311;『マグローヒル科学技術年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology) (1992) McGraw Hill, New York NY, 191-196ページ、Logan, J.およびT. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659、Harrington, J.J. 他(1997) Nat. Genet. 15:157-355)。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルス由来の発現ベクター、または種々の細菌性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ポリヌクレオチドを標的器官、組織または細胞集団へ送達することができる(Di Nicola, M.他(1998) Cancer Gen. Ther. 5:350-356; Yu, M.他(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6340-6344; Buller, R.M.他(1985) Nature 317:813-815; McGregor, D.P.他(1994) Mol. Immunol. 31:219-226; Verma, I.M.およびN. Somia (1997) Nature 389:239-242)。本発明は使用する宿主細胞によって限定されない。
【０２５５】
細菌系では、多数のクローニングベクター及び発現ベクターが、PMMMをコードするポリヌクレオチドの使用目的に応じて選択可能である。例えばPMMMをコードするポリヌクレオチドの慣例的なクローニング、サブクローニング、増殖には、PBLUESCRIPT(Stratagene, La Jolla CA)またはPSPORT１プラスミド(Invitrogen)などの多機能の大腸菌ベクターを用いることができる。ベクターの多数のクローニング部位にPMMMをコードするポリヌクレオチドを連結反応するとlacＺ遺伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌の同定のための比色スクリーニング法が可能となる。更にこれらのベクターは、クローニングされた配列におけるin vitro転写、ジデオキシのシークエンシング、ヘルパーファージによる一本鎖のレスキュー、入れ子欠失の生成にも有用であろう（Van Heeke, G. および S.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509）。例えば、抗体の産生のためなどに多量のPMMM が必要な場合は、PMMM の発現をハイレベルで誘導するベクターが使用できる。例えば、強力な誘導SP6バクテリオファージプロモーターまたは誘導T7バクテリオファージプロモーターを持つベクターが使用できる。
【０２５６】
PMMMの発現に酵母の発現系の使用が可能である。α因子、アルコールオキシダーゼ、PGHプロモーター等の構成的プロモーターまたは誘導的プロモーターを有する多数のベクターが、出芽酵母菌（Saccharomyces cerevisiae） またはピキア酵母（Pichia pastoris）に使用可能である。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質の、分泌か細胞内での保持かのどちらかを指示するものであり、安定した増殖のために宿主ゲノムの中に外来ポリヌクレオチド配列群を組み込むことを可能にする(Ausubel他、前出; Bitter, G.A.他(1987) Methods Enzymol.153:516-544; Scorer, C.A.他(1994) Bio/Technology 12:181-184)。
植物系もPMMMの発現に使用可能である。PMMMをコードするポリヌクレオチドの転写は、ウイルスプロモーター、例えば単独あるいはTMV由来のオメガリーダー配列と組み合せて用いられるようなCaMV由来の35Sおよび19Sプロモーターによって促進される（Takamatsu, N. (1987) EMBO J. 6:307311）。あるいは、RUBISCOの小サブユニットなどの植物プロモーター、または熱ショックプロモーターを用い得る(Coruzzi, G.他(1984) EMBO J. 3:1671-1680; Broglie, R.他(1984) Science 224:838-843; Winter, J.他(1991) Results Probl.Cell Differ.  17:85105）。
これらの作成物を、植物細胞に、直接DNA形質転換または病原体媒介した形質移入で導入できる（『マグローヒル科学技術年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology)(1992) McGraw Hill, New York NY,191-196ページ）。
【０２５７】
哺乳類細胞においては、多数のウイルスベースの発現系を利用し得る。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、後発プロモーター及び３連リーダー配列からなるアデノウイルス転写物／翻訳複合体にPMMMをコードするポリヌクレオチドを結合し得る。アデノウイルスゲノムの非必須のＥ１またはＥ３領域への挿入することにより、感染した宿主細胞にPMMMを発現する生ウイルスを得ることが可能である（Logan, J.及びShenk, T.（1984）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659）。更に、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサーなどの転写エンハンサーを用いて、哺乳類宿主細胞における発現を増大させ得る。SV40またはEBVをベースにしたベクターを用いてタンパク質を高レベルで発現させることもできる。
【０２５８】
また、ヒト人工染色体（HAC）類を用いて、或るプラスミドに含まれ得る断片やプラスミドから発現し得る断片より大きなDNA断片群を送達し得る。治療のために約６kb〜１０MbのHACsが作製され、従来の送達方法（リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、またはベシクル）で送達されている(Harrington, J.J.他(1997) Nat. Genet. 15:157-355)。
【０２５９】
哺乳動物系の組換えタンパク質の長期にわたる産生のためには、株化細胞におけるPMMM の安定した発現が望ましい。例えば、発現ベクターを用いて、PMMM をコードするポリヌクレオチドを株化細胞に形質転換することが可能である。このような発現ベクターは、ウイルス起源の複製及び／または内在性の発現要素や、同じ或いは別のベクターの上の選択マーカー遺伝子を含む。ベクターの導入後、選択培地に移す前に強化培地で約１〜２日間、細胞を増殖させ得る。選択可能マーカーの目的は選択剤への抵抗性を与えることであり、選択可能マーカーの存在により、導入した配列の発現に成功するような細胞の成長および回収が可能となる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖できる。
【０２６０】
任意の数の選択系を用いて、形質転換細胞株を回収できる。限定するものではないがこのような選択系には、tk−細胞のために用いられる単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子と、apr−細胞のために用いられる単純ヘルペスウイルスのアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子がある(Wigler, M.他(1977) Cell 11:223-232; Lowy, I. 他(1980) Cell 22:817-823)。また、選択の基礎として代謝拮抗物質、抗生物質あるいは除草剤への耐性を用いることができる。例えばdhfrはメトトレキセートに対する耐性を与え、neoはアミノグリコシドであるネオマイシンおよびG-418に対する耐性を与え、alsはクロルスルフロンに対する耐性を、patはホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を各々与える(Wigler, M. 他(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3567-3570; Colbere-Garapin, F.他(1981) J. Mol. Biol. 150:1-14)。更なる選択可能な遺伝子、例えばtrpBとhisDとが記載され、これらは代謝物についての細胞要求を変容させる（Hartman, S.C.およびR.C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047-8051）。可視マーカー、例えばアントシアニン、緑色蛍光タンパク質（GFP；Clontech）、βグルクロニダーゼ及びその基質βグルクロニド、またはルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリン等を用いてもよい。これらのマーカーを用いて、形質転換体を同定するだけでなく、特定のベクター系に起因しうる一過性或いは安定したタンパク質発現を定量することも可能である（Rhodes, C.A. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131）。
【０２６１】
マーカー遺伝子発現の有無によって当該の遺伝子の存在が示唆されても、その遺伝子の存在および発現の確認が必要な場合もある。例えば、PMMMをコードする配列がマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、PMMMをコードするポリヌクレオチドを含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により同定可能である。または、１つのプロモーターの制御下でマーカー遺伝子がPMMM  をコードする配列とタンデムに配置することも可能である。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は通常、タンデム遺伝子の発現も示す。
【０２６２】
一般に、PMMMをコードするポリヌクレオチドを持ち、PMMMを発現する宿主細胞は、当業者に周知の種々の方法を用いて特定できる。これらの方法には、DNA−DNA或いはDNA−RNAハイブリダイゼーションや、PCR法、核酸或いはタンパク質の検出及び／または数量化のための膜系、溶液ベース、或いはチップベースの技術を含むタンパク質生物学的試験法または免疫学的アッセイが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０２６３】
特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらかを用いるPMMM  の発現の検出及び計測のための免疫学的な方法は、当分野で周知である。 このような技法には、酵素に結合した免疫吸着剤検定法（ELISA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、フローサイトメーター（FACS）などがある。PMMM 上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、２部位のモノクローナルベースイムノアッセイ（two-site, monoclonal-based immunoassay）が好ましいが、競合の結合アッセイも用いることもできる。これらのアッセイおよび他のアッセイは、当分野で周知である(Hampton, R.他(1990) Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St. Paul MN, Sect.IV; Coligan, J.E.他(1997) Current Protocols in Immunology, Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience, New York NY; Pound, J.D. (1998) Immunochemical Protocols, Humana Press, Totowa NJ)。
【０２６４】
多岐にわたる標識方法および抱合技術が当業者に知られており、様々な核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイにこれらの技術を用い得る。PMMM をコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ或いはPCRプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いるPCR増幅が含まれる。別法として、PMMMをコードするポリヌクレオチド群、またはその任意の断片群を、mRNAプローブを生成するためのベクターにクローニングできる。このようなベクターは、当分野において知られており、市販もされており、T7、T3またはSP6などの好適なRNAポリメラーゼおよび標識されたヌクレオチドを加えて、in vitroでRNAプローブの合成に用いることができる。これらの方法は、例えばAmersham Biosciences、Promega（Madison WI）、U.S. Biochemicalなどの種々の市販キットを用いて実行できる。検出を容易にするために用い得る好適なレポーター分子あるいは標識には、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子のほか、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、色原体などがある。
【０２６５】
PMMMをコードするポリヌクレオチドで形質転換した宿主細胞を、細胞培地での該タンパク質の発現と回収とに好適な条件下で培養しうる。形質転換細胞から製造されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用される配列、ベクター、あるいはその両者に依存する。PMMM  をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜及び真核細胞膜を透過するPMMM  の分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理解されよう。
【０２６６】
更に、宿主細胞株の選択は、挿入したポリヌクレオチドの発現をモジュレートする能力、または発現したタンパク質を所望の形に処理する能力によって行い得る。限定するものではないがこのようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化がある。タンパク質の「プレプロ」または「プロ」形を切断する翻訳後のプロセシングを利用して、タンパク質の標的への誘導、折りたたみ及び／または活性を特定することが可能である。翻訳後の活性のための、特定の細胞機構および特徴的な機序を持つ、種々の宿主細胞（例えばCHO、HeLa、MDCK、HEK293、WI38など）は、American Type Culture Collection（ATCC, Manassas, VA）から入手可能であり、外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実にするように選択し得る。
【０２６７】
本発明の別の実施例では、PMMMをコードする天然のポリヌクレオチド、修飾されたポリヌクレオチド、または組換えのポリヌクレオチドを上記した任意の宿主系の融合タンパク質の翻訳となる異種配列に連結させ得る。例えば、市販の抗体によって認識できる異種部分を含むキメラPMMM タンパク質が、PMMM の活性のインヒビターに対するペプチドライブラリのスクリーニングを促進し得る。異種タンパク質部分および異種ペプチド部分はまた、市販されている親和性マトリックスを用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。限定されるものではないがこのような部分には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（GST）、マルトース結合タンパク質（MBP）、チオレドキシン（Trx）、カルモジュリン結合ペプチド（CBP）、6-His、FLAG、c-myc、赤血球凝集素（HA）がある。GSTは固定化グルタチオン上で、MBPはマルトース上で、Trxはフェニルアルシンオキシド上で、CBPはカルモジュリン上で、そして6-Hisは金属キレート樹脂上で、同族の融合タンパク質の精製を可能にする。FLAG、c-mycおよび赤血球凝集素（HA）は、これらのエピトープタグを特異的に認識する市販のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を用いた、融合タンパク質の免疫親和性精製を可能にする。また、PMMM をコードする配列と異種タンパク質配列との間にあるタンパク質分解切断部位を融合タンパク質が含むように遺伝子操作すると、PMMM が精製の後に異種部分から切断され得る。融合タンパク質の発現および精製方法は、前出のAusubel他(前出、10および16章)に記載がある。市販されている種々のキットを用いて融合タンパク質の発現および精製を促進することもできる。
【０２６８】
本発明の別の実施例では、TNTウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽抽出系(Promega)を用いてin vitroで放射能標識したPMMMの合成が可能である。これらの系は、T7、T3またはSP6プロモーターに機能的に連結したタンパク質コード配列群の、転写と翻訳とを共役させる。翻訳は、例えば35Sメチオニンのような放射能標識したアミノ酸前駆体の存在下で起こる。
【０２６９】
PMMM或いはその断片またはその変異体を用いて、PMMMに特異結合する化合物をスクリーニングすることができる。１つ以上の試験化合物を用いて、PMMMへの特異的な結合をスクリーニングすることが可能である。種々の実施様態において、PMMMに対する特異結合について、1、 2、 3、 4、 5、 10、 20、 50、 100 または 200 の試験化合物をスクリーンすることができる。試験化合物の例として、抗体、アンティカリン(anticalins)、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えばリガンドや受容体）、または小分子が挙げられる。
【０２７０】
関連の実施態様で、PMMM変異体を用いて試験化合物たとえば抗体の、PMMMへの結合や、PMMM変異体へ、または組み合わせたPMMMおよび/または1つ以上のPMMM変異体への結合をスクリーニングできる。ある実施様態においては、SEQ ID NO:1-40の配列の正確な配列を有するPMMMではなく、PMMMの変異体に結合する化合物のスクリーニングにPMMMの変異体を用いることができる。このようなスクリーニングを行うために使うPMMM変異体はPMMMに約50%から約99%の範囲で配列同一性を有し得る。また、種々の実施様態で60%、70%、75%、80%、85%、90%,および95%の配列同一性を有することができる。
【０２７１】
或る実施態様でPMMMへの特異結合スクリーニングで同定された化合物は、PMMMの天然リガンドに密接に関連する場合があり、例えばリガンドやその断片であり、または天然基質や、構造的または機能的な擬態物質（mimetic）、あるいは自然結合パートナーである(Coligan, J.E. 他 (1991) Current Protocols in Immunology 1(2):5章)。別の実施様態では、こうして同定した化合物は、受容体PMMMの天然リガンドであり得る(Howard, A.D. 他.(2001) Trends Pharmacol.Sci.22:132-140; Wise, A. 他(2002) Drug Discovery Today 7:235-246)。
【０２７２】
別の実施態様で、PMMMへの特異的結合のためのスクリーニングで同定される或る化合物はPMMMが結合する天然受容体、少なくとも該受容体の或る断片、または例えばリガンド結合部位や結合ポケットの全体または一部を含む該受容体の或る断片に、密接に関連し得る。例えば該化合物は、シグナルを伝播可能なPMMM受容体の場合や、シグナルを伝播できないPMMMおとり受容体の場合がある(Ashkenazi, A.およびV.M. Divit (1999) Curr. Opin. Cell Biol. 11:255-260、Mantovani, A. 他(2001) Trends Immunol. 22:328-336)。該化合物は既知の技術を用いて合理的に設計できる。こうした技術の例としては、化合物エタネルセプト（etanercept）(ENBREL; Amgen Inc., Thousand Oaks CA)作製に用いた技術を含む。エタネルセプトは、ヒトのリウマチ様関節炎の治療に有効である。エタネルセプトは遺伝子操作されたp75腫瘍壊死因子(TNF)受容体ダイマーであり、ヒトIgG1 のFc部分に連結されている(Taylor, P.C. 他(2001) Curr. Opin. Immunol. 13:611-616)。
【０２７３】
ある実施態様においては、類似した、あるいは異なる特異性を持つ2つ以上の抗体を、PMMM、PMMMの断片またはPMMMの変異体への結合についてスクリーニングすることができる。こうしてスクリーニングした抗体の結合特異性を選択し、PMMMの特定の断片または変異体を同定できる。１つの実施態様で、PMMMの特定の断片または変異体を優先的に同定できる結合特異性を持つ抗体を選択できる。別の実施態様で、PMMM産生の増加、低下、或いは異常を有する特定の疾患または病状を優先的に診断できる結合特異性を持つ抗体を選択できる。
【０２７４】
１つの実施態様で、anticalinを、PMMMまたはその断片あるいは変異体への特異結合につきスクリーニングできる。anticalinはリポカリン足場に基づいて作成されたリガンド結合タンパク質である(Weiss, G.A. 及び H.B. Lowman (2000) Chem. Biol. 7:R177-R184、Skerra, A. (2001) J. Biotechnol. 74:257-275)。リポカリン類のタンパク構造には８本鎖逆平行βストランドを持つ或るβバレルを含むことがあり、このバレルはその開放端で4つのループを支持する。これらのループはリポカリンの天然リガンド結合部位を形成し、この部位はin vitro でアミノ酸置換によって再度人工操作して、新規な結合特異性を与えることができる。このアミノ酸置換は当分野で既知の方法または本明細書に記載の方法を用いて行うことができる。また、保存的置換(例えば、結合特異性を変えないような置換)、あるいは、結合特異性を少し、中等度、または大きく変えるような置換を行うこともできる。
【０２７５】
一実施態様では、PMMMに特異的に結合、もしくは刺激または阻害する化合物のスクリーニングには、分泌タンパク質或いは細胞膜上のタンパク質の何れか一方としてPMMMを発現する適切な細胞の作製が含まれる。好適な細胞としては、哺乳類、酵母、ショウジョウバエ、または大腸菌からの細胞が含まれうる。PMMM を発現する細胞またはPMMM を含有する細胞膜断片を試験化合物と接触させて、DMEまたは化合物の何れかの結合、刺激または阻害を分析する。
【０２７６】
或るアッセイでは単に試験化合物がポリペプチドに結合するのを試験でき、結合を、フルオロフォア、放射性同位体、酵素抱合体または他の検出可能な標識により検出する。例えば、このアッセイは、少なくとも１つの試験化合物を、溶液中の或いは固体支持物に固定されたPMMM と結合させるステップと、PMMM とこの化合物との結合を検出するステップを含み得る。別法で該アッセイは、標識された競合物の存在下での試験化合物の結合の検出または測定を行うことができる。更にこのアッセイは、無細胞再構成標本、化学ライブラリ、または、天然物の混合物を用いて実施でき、試験化合物（群）は、溶液中で遊離させるか固体支持体に固定する。
【０２７７】
アッセイを用いて、或る化合物が、その天然リガンドに結合する能力、および/または、その天然リガンドの、その天然受容体への結合を阻害する能力を評価しうる。こうしたアッセイの例としては、米国特許第5,914,236号および第6,372,724号に記載されたような放射ラベルアッセイを含む。関連した実施態様では、1つ以上のアミノ酸置換が或るポリペプチド化合物(受容体など)に導入され、その天然リガンドに結合する能力を向上または改変しうる(Matthews, D.J. および J.A. Wells. (1994) Chem. Biol. 1:25-30)。別の関連した実施態様では、1つ以上のアミノ酸置換が或るポリペプチド化合物(リガンドなど)に導入され、その天然受容体に結合する能力を向上または改変しうる(Cunningham, B.C.およびJ.A. Wells (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3407-3411; Lowman, H.B.他(1991) J. Biol. Chem. 266:10982-10988)。
【０２７８】
PMMMまたはその断片、あるいはPMMMの変異体を用いて、PMMMの活性を変調する化合物をスクリーニングすることができる。このような化合物としては、アゴニスト、アンタゴニスト、部分的アゴニストまたは逆アゴニストなどが含まれ得る。一実施例では、PMMMの活性が許容される条件下でアッセイを実施し、そのアッセイでは少なくとも1つの試験化合物をPMMMと混合し、試験化合物の存在下でPMMMの活性を試験化合物不在下でのPMMMの活性と比較する。試験化合物の存在下でのPMMM の活性の変化は、PMMM の活性を調整する化合物の存在を示唆する。別法では、試験化合物をPMMM の活性に適した条件下でPMMM を含むin vitroまたは無細胞再構成系と結合させてアッセイを実施する。これらアッセイの何れかにおいて、PMMM の活性をモジュレートする試験化合物は間接的に結合することが可能であり、試験化合物と直接接触する必要がない。少なくとも１つ、または複数の試験化合物をスクリーニングすることができる。
【０２７９】
別の実施例では、胚性幹細胞（ES細胞）における相同組換えを用いて動物モデル系内で、PMMM またはその哺乳動物相同体をコードするポリヌクレオチドを「ノックアウト」する。このような技術は当技術分野において周知であり、ヒト疾患動物モデルの作製に有用である(例えば米国特許第5,175,383号および第5,767,337号を参照)。例えば129/SvJ細胞系などのマウスES細胞は初期のマウス胚に由来し、培地で増殖させることができる。このES細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子(neo: Capecchi, M.R.(1989)Science 244:1288-1292)などのマーカー遺伝子で破壊した、当該の遺伝子を持つベクターで形質転換する。このベクターは、相同組換えにより、宿主ゲノムの対応する領域に組込まれる。或いは、Cre-loxP系を用いて相同組換えを行い、組織特異的または発生段階特異的に目的遺伝子をノックアウトする(Marth, J.D. (1996) Clin. Invest. 97:1999-2002、Wagner, K.U.他(1997) Nucleic Acids Res.25:4323-4330）。
【０２８０】
形質転換したES細胞を同定し、例えばC57BL/6マウス株などから採取したマウス細胞胚盤胞に微量注入する。これらの胚盤胞を偽妊娠メスに外科的移植し、得られるキメラ子孫の遺伝子型を決定し、これらを交配させてヘテロ接合性系またはホモ接合性系を作製する。このようにして作製した遺伝子組換え動物は、潜在的な治療薬や毒物で検査されうる。
【０２８１】
PMMM をコードするポリヌクレオチドをin vitroでヒト胚盤胞由来のES細胞において操作することが可能である。ヒトES細胞は、内胚葉、中胚葉および外胚葉の細胞タイプを含む、少なくとも８つの別々の細胞系統に分化する可能性を有する。これらの細胞系統は、例えば神経細胞、造血系統および心筋細胞に分化する（Thomson, J.A.他(1998) Science 282:1145-1147）。
【０２８２】
PMMM をコードするポリヌクレオチドを用いて、ヒト疾患をモデルとした「ノックイン」ヒト化動物（ブタ）または遺伝子組換え動物（マウスまたはラット）を作製することが可能である。ノックイン技術を用いて、PMMM をコードするポリヌクレオチドの或る領域を動物ES細胞に注入し、注入した配列を動物細胞ゲノムに組み込ませる。形質転換細胞を胞胚に注入し、胞胚を上記のように移植する。遺伝子組換え子孫または近交系について試験し、潜在的医薬品を用いて処理し、ヒトの疾患の治療に関する情報を得る。別法では、例えばPMMMを乳汁内に分泌するなどPMMMを過剰発現する哺乳動物近交系は、このタンパク質の簡便な源泉ともなり得る（Janne, J. 他 (1998) Biotechnol. Annu. Rev. 4:55-74）。
【０２８３】
（治療）
PMMMの領域とタンパク質修飾およびメンテナンス分子の領域との間に、例えば配列及びモチーフの内容における化学的及び構造的類似性が存在する。さらに、PMMMを発現する組織の例は、表６および実施例11に見られる。従って、PMMMは胃腸障害、心血管障害、自己免疫／炎症疾患、細胞増殖異常、発生・発達障害、上皮障害、神経疾患、生殖障害、内分泌障害、膵臓疾患、副腎疾患、および代謝異常、並びに脂質、銅および糖質代謝障害、性腺ステロイドホルモンと免疫系に関連する疾患、および感染症において、或る役割を果たすと考えられる。PMMMの発現若しくは活性の増大に関連する疾患の治療においては、PMMMの発現または活性を低下させることが望ましい。また、PMMMの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、PMMMの発現または活性を増大させることが望ましい。
【０２８４】
従って、一実施例において、PMMM の発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、患者にPMMM またはその断片や誘導体を投与することが可能である。限定されるものではないが、胃腸障害の内には、燕下障害、消化性食道炎、食道攣縮、食道狭窄、食道癌、消化不良、消化不良、胃炎、胃癌、摂食障害、吐き気、嘔吐、胃不全麻痺、胞状浮腫および幽門浮腫、腹部アンギナ、胸焼け、胃腸炎、腸閉塞、腸管感染、消化性潰瘍、胆石症、胆嚢炎、胆汁鬱滞、膵臓炎、膵臓癌、胆道疾患、肝炎、高ビリルビン血症、肝硬変、肝臓の受動的鬱血、肝臓癌、伝染性大腸炎、潰瘍大腸炎、潰瘍性直腸炎、クローン病、ホイップル病、マロリーワイス症候群、結腸癌、結腸閉塞、過敏性大腸症候群、短腸症候群、下痢、便秘、胃腸出血、後天性免疫不全症候群（AIDS）、腸疾患、黄疸、肝性脳症、肝腎症候群、肝臓脂肪症、血色素症、ウィルソン病、α1アンチトリプシン欠乏症、ライ症候群、原発性硬化性胆管炎、肝臓梗塞、門脈閉塞および血栓症、小葉中心性壊死、肝紫斑症、肝静脈血栓症、肝中心静脈閉塞症、子癇前症、子癇、急性妊娠脂肪肝、妊娠肝内胆汁鬱滞、肝腫瘍（結節過形成、腺腫、および癌）があり、また、内分泌疾患の中には原発脳腫瘍及び腺腫、妊娠性梗塞、下垂体切除、動脈瘤、血管奇形、血栓症、感染症、免疫異常、頭部外傷による合併症などの病変から起こる視床下部及び下垂体の障害と、性機能低下及びシーハン症候群、尿崩症、カルマン病、ハンド‐シュラークリスチャン病、レトラ‐シヴェ病、サルコイドーシス、エンプティセラ症候群、小人症を含む下垂体機能不全に関連した障害と、良性線種によって発生しやすい不適当抗利尿ホルモン（ADH）分泌症候群（SIADH）及び先端巨大症、巨人症を含む下垂体亢進に関連した障害と、甲状腺腫及び粘液水腫、細菌感染性急性甲状腺炎、ウイルス感染性亜急性甲状腺炎、自己免疫性甲状腺炎（橋本病）、クレチン病を含む甲状腺機能低下症に関連した障害と、甲状腺中毒症及びその様々な型、グレーブス病、前脛骨粘液水腫、中毒性多結節性甲状腺腫、甲状腺癌、プランマー病を含む甲状腺機能亢進症と、Conn病（chronic hypercalemia）を含む副甲状腺機能亢進症と、１型または２型糖尿病及び合併症などの膵臓疾患と、例えば副腎皮質の過形成、癌腫や腺腫、アルカローシス関連高血圧症、アミロイド症、低カリウム血、クッシング病、リドル症候群、Arnold-Healy-Gordon症候群、褐色細胞腫瘍、アジソン病などの副腎関連障害と、例えば女性の異常プロラクチン産生、不妊症、子宮内膜症、月経周期摂動、多嚢胞卵巣疾患、高プロラクチン血症、ゴナドトロピン単独欠損（isolated gonadotropin deficiency）、無月経、乳汁漏出症、半陰陽、多毛症及び男性化、乳癌、閉経後の骨粗鬆症、男性のライジッヒ細胞不全、男性更年期、胚芽細胞無形成症、ライジッヒ細胞腫瘍に関連した性機能亢進、アンドロゲン受容体の欠如に関連したアンドロゲン耐性、５α−還元酵素症候群、女性化乳房などの性腺ステロイドホルモン関連疾患とが含まれ、 免疫疾患の中には、炎症、光線性角化症、後天性免疫不全症候群（AIDS）及びアジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免���性甲状腺炎、気管支炎、骨膜包炎、胆嚢炎、肝硬変、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、胎児性赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、発作性夜行性血色素尿、肝炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、混合型結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨髄線維症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、真性赤血球増多症、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、本態性血小板血症、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、外傷、リンパ腫、白血病および骨髄腫を含む造血性癌が含まれ、感染症には、アデノウイルス、アレナウイルス、ブンヤウイルス（bunyavirus）、カリチウイルス（calicivirus）、コロナウイルス、フィロウイルス、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルス、フラビウイルス、オルソミクソウイルス、パルボウイルス、パポーバウイルス、パラミクソウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、レオウイルス、レトロウイルス、ラブドウイルス、トガウイルスに分類されるウイルス病原体による感染や、細菌による感染（肺炎球菌、ブドウ球菌、連鎖球菌、バシラス菌、コリネバクテリウム、クロストリジウム、髄膜炎菌、淋菌、リステリア、モラクセラ、キンゲラ、ヘモフィルス、レジオネラ、百日咳菌類(ボルデテラ)や、シゲラ、サルモネラ、カンピロバクターを含むグラム陰性腸内細菌、シュードモナス、ビブリオ、ブルセラ、野兎病菌類(フランシセラ)、エルシニア、バルトネラ、norcardium、放線菌、ミコバクテリウム、spirochaetale、リケッチア、クラミジア、マイコプラズマに分類）、真菌感染(分類はアスペルギルス、ブラストミセス、皮膚糸状菌、クリプトコッカス、コクシジオイデス、malasezzia、ヒストプラスマ、または他の真菌症起因菌)、寄生虫感染(分類はプラスモディウムすなわちマラリア原虫、寄生性アメーバ、リーシュマニア、トリパノソーマ、トキソプラズマ、ニューモシスチスカリニ、腸内原虫(ジアルジアなど)、トリコモナス、組織線虫(旋毛虫など)、腸管寄生線虫(回虫など)、リンパ管フィラリア線虫、吸虫(住血吸虫など)、および条虫（サナダムシなど）)が含まれ、代謝系の疾患の中には、アジソン病、脳腱黄色腫症、先天性副腎過形成、クマリン耐性（coumarin resistance）、嚢胞性繊維症、糖尿病、脂肪性肝硬変、フルクトース-１、６−ジホスファターゼ欠乏症、ガラクトース血症、甲状腺腫、グルカゴノーマ、糖原病、遺伝性果糖不耐症、副腎皮質機能亢進症（Hyperadrenalism）、副甲状腺機能亢進症、副甲状腺機能低下症、高コレステロール血症、甲状腺機能亢進症、低血糖症、甲状腺機能低下症、脂肪過剰血症、脂質ミオパシー、脂肪ジストロフィー症、リソソーム蓄積症、マノシドーシス、ノイラミニナーゼ欠損症、肥満、骨粗しょう症、フェニルケトン尿症、プソイドビタミンD欠損くる病、炭水化物代謝障害(例えば、先天性II型異常赤血球産生症性貧血、糖尿病、インスリン依存型真性糖尿病、非インスリン依存型真性糖尿病、ガラクトースエピメラーゼ欠乏症、糖原病、リソソーム蓄積症、果糖尿、五炭糖尿症)、およびピルビン酸代謝の先天性異常、脂肪肝のような脂質代謝異常、胆汁うっ滞、原発性胆汁性肝硬変、カルニチン欠乏症、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ欠乏症、ミオアデニレートデミナーゼ欠乏症、高トリグリセリド血症、ファブリー病などの脂質貯蔵病、ゴーシェ病、ニーマン‐ピック病、変染色性白質ジストロフィー、副腎性白質ジストロフィー、GM２にガングリオシドーシス、セロイドリポフスチン症、無β‐リポ蛋白血症、タンジアー病、リポ蛋白過剰血症、脂肪異栄養症、脂肪腫症、急性皮下脂肪組織炎、播種性脂肪組織壊死症、有痛脂肪症、リポイド副腎過形成、最小変化症、脂肪腫、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症を伴った高コレステロール血症、原発性低αリポ蛋白血症、甲状腺症機能低下症、腎臟病、肝疾患、レシチン-コレステロールアシルトランスフェラーゼ欠乏症、脳腱黄色腫症、シトステロール血症、低コレステロール血症、テイ‐サックス病、サンドホフ病、高脂血症、脂肪過剰血症、脂質筋障害、およびMenke病のような銅代謝疾患、ウイルソン病、およびエーレルス‐ダンロー症候群IX型糖尿病が含まれ、また心血管疾患として、動静脈瘻、アテローム性動脈硬化症、高血圧、脈管炎、レイノー病、静脈奇形、動脈解離、静脈瘤、血栓静脈炎及び静脈血栓、血管の腫瘍、血栓崩壊の合併症、バルーン血管形成術（balloon angioplasty）、血管置換術、大動脈冠動脈バイパス術移植手術（coronary artery bypass graft surgery）などの血管疾患と、うっ血性心不全、虚血性心疾患、狭心症、心筋梗塞、高血圧性心疾患、変性弁膜性心疾患、石灰化大動脈弁狭窄症、先天性２尖大動脈弁、僧帽弁輪状石灰化（mitral annular calcification）、僧帽弁脱出、リウマチ熱、リウマチ性心疾患、感染性心内膜炎、非細菌性血栓性心内膜炎、全身性紅斑性狼瘡の心内膜炎、カルチノイド心疾患、心筋症、心筋炎、心膜炎、腫瘍性心疾患、先天性心臓疾患、心臓移植の合併症などが含まれ、自己免疫／炎症性の疾患の中には、後天性免疫不全症候群（AIDS）及びアジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、アテローム性硬斑破裂、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ性外胚葉ジストロフィー（APECED）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、関節軟骨変性、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷が含まれ、細胞増殖異常には日光性角化症、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌が含まれ、発生または発達障害の中には尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ‐ベッカー型筋ジストロフィー、癲癇、性腺形成異常、WAGR症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神薄弱）、スミス‐マジェニス症候群(Smith- Magenis syndrome)、脊髄形成異常症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症、遺伝性神経病（シャルコー‐マリー‐ツース病、神経線維腫症）、甲状腺機能低下症、水頭症、発作障害（Syndenham舞踏病(Syndenham's chorea)、脳性小児麻痺）、脊髄二分裂、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感覚神経性聴力損失が含まれ、上皮性疾患には、発汗異常性湿疹、アレルギー性接触皮膚炎、毛孔性角化症、肝斑、白斑、光線性角化症、基底細胞癌、扁平細胞癌、脂漏性角化症、毛嚢炎、単純疱疹、帯状疱疹、水痘、カンジダ症、皮膚糸状菌症、疥癬、虫刺され、サクランボ色血管腫、ケロイド、皮膚線維腫、先端線維性軟疣、蕁麻疹、一過性棘融解性皮膚症、乾燥症、湿疹、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、手湿疹、貨幣状湿疹、慢性単純性苔癬、皮脂減少性湿疹、鬱血性皮膚炎および鬱血性潰瘍化、脂漏性皮膚炎、乾癬、扁平苔癬、薔薇色粃糠疹、膿痂疹、膿瘡、皮膚糸状菌症、癜風、疣、尋常性座瘡、赤鼻、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、腫瘍随伴性天疱瘡、類天疱瘡、妊娠性疱疹、疱疹状皮膚炎、リニアIgA病、後天性表皮水疱症、皮膚筋炎、紅斑性狼瘡、強皮症、紅皮症、脱毛症、修飾皮膚損傷、毛細血管拡張、色素脱失、色素沈着過剰、小胞／水疱、発疹、皮膚薬物反応、丘疹結節皮膚損傷、慢性不治傷、光過敏症、単純型表皮水疱症、表皮剥離性角質増殖症、表皮溶解性掌蹠角皮症および非表皮溶解性掌蹠角皮症、シーメンス水疱性魚鱗癬、剥脱性魚鱗癬、手掌角化症および足底角化症、掌蹠角化症、掌蹠角皮症、点状角化症、メースマン角膜ジストロフィー、先天性爪肥厚、白色海綿状母斑、多発性皮脂嚢腫症、上皮性母斑／表皮溶解性角質増殖型、連珠毛、裂毛症、慢性肝炎／特発性肝硬変、および、結腸直腸過形成が含まれ、神経の疾患の中には、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキソン病及びその他の錐体外路障害、筋萎縮性側策硬化及びその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患、プリオン病（クールー、クロイツフェルト‐ヤコブ病、ゲルストマン症候群、及びGerstmann  -Straussler-Scheinker症候群を含む）、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病及び代謝病��神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管芽腫（cerebelloretinal hemangioblastomatosis）、脳３叉神経血管症候群、ダウン症候群を含む中枢神経系性の精神薄弱及び他の発生障害、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄障害、筋ジストロフィー及びその他の神経筋障害、末梢神経疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎、遺伝性、代謝性、内分泌性、及び中毒性の筋疾患、重症筋無力症、周期性四肢麻痺、精神病（気分性、不安性の障害、分裂病性疾患）、季節性障害（SAD）、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群、ジストニー、分裂病性精神障害、帯状疱疹後神経痛、及びトゥーレット病と、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核部変性症、及び家族性の前頭側頭性健忘症とが含まれ、生殖系疾患には、プロラクチン産生障害、不妊症（卵管疾患、排卵欠損症、子宮内膜症）、性周期障害、月経周期障害、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣過刺激症候群、子宮内膜癌、卵巣癌、子宮筋腫、自己免疫疾患、子宮外妊娠、催奇形、乳がん、繊維嚢胞性乳房疾患、乳漏症、精子形成破壊、精子異常生理、精巣癌、前立腺癌、良性前立腺肥大、前立腺炎、パイロニー病、性交不能、男性乳癌、女性化乳房が含まれる。
【０２８５】
別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むPMMM の発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、PMMM またはその断片や誘導体を発現し得るベクターを患者に投与することも可能である。
【０２８６】
更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むPMMM の発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、実質的に精製されたPMMM を含む組成物を好適な医薬用キャリアと共に患者に投与することも可能である。
【０２８７】
更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むPMMM の発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、PMMM の活性を調節するアゴニストを患者に投与することも可能である。
【０２８８】
更なる実施例では、PMMM の発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、患者にPMMM のアンタゴニストを投与することが可能である。このような疾患の例としては、上記のような胃腸障害、心血管障害、自己免疫／炎症疾患、細胞増殖異常、発生・発達障害、上皮障害、神経疾患、生殖障害、内分泌障害、膵臓疾患、副腎疾患、および代謝異常、並びに脂質、銅および糖質代謝障害、性腺ステロイドホルモンと免疫系に関連する疾患、および感染症があり、またこれらに限定されない。一実施態様では、PMMM と特異的に結合する抗体が直接アンタゴニストとして、或いはPMMM を発現する細胞または組織に薬剤を運ぶターゲッティング機構或いは送達機構として間接的に用いられ得る。
【０２８９】
別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むPMMM の発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、PMMM をコードするポリヌクレオチドの相補配列を発現するベクターを患者に投与することも可能である。
【０２９０】
別の実施態様では、任意のタンパク質、アゴニスト、アンタゴニスト、抗体、相補配列、またはベクター実施態様を、別の適切な治療薬と組合せて投与できる。併用療法で用いる好適な治療薬は、当業者が従来の医薬原理に従って選択し得る。治療薬と組合せることにより、上記した種々の疾患の治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法により、少量の各薬物で治療効力を得ることが可能となり、それによって副作用の可能性を低減し得る。
【０２９１】
PMMMのアンタゴニストは、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能である。 詳しくは、精製されたPMMM を用いて抗体を作ったり、治療薬のライブラリをスクリーニングしてPMMM  と特異的に結合するものの同定が可能である。PMMM の抗体も、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能である。 このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖、Fabフラグメント、及びFab発現ライブラリによって作られたフラグメントが含まれる。但し、これらに限定されるものではない。或る実施態様では、中和抗体（すなわち二量体形成を阻害する抗体）を治療に用い得る。一本鎖抗体（例えばラクダまたはラマ由来）は強力な酵素阻害剤である可能性があり、ペプチド擬態物質の設計において、また免疫吸着剤とバイオセンサーとの開発において適用を持つようである(Muyldermans, S. (2001) J. Biotechnol. 74:277-302)。
【０２９２】
抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、ヒト及びその他のものを含む種々の宿主が、PMMM または任意の断片、または免疫原性の特性を備えるそのオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。限定するものではないがこのようなアジュバントには、フロイントアジュバントと、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲルアジュバントと、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、スカシガイのヘモシアニン（KLH）、ジニトロフェノールなどの界面活性剤とがある。ヒトに用いられるアジュバントの中では、BCG(カルメット‐ゲラン杆菌)およびコリネバクテリウム‐パルバム(Corynebacterium parvum)が特に好ましい。
【０２９３】
PMMM に対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド、または断片は、少なくとも約５個のアミノ酸からなり、一般的には約１０個以上のアミノ酸からなるものが好ましい。これらのオリゴペプチド、ペプチドまたは断片はまた、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と実質的に同一であることが望ましい。PMMM アミノ酸の短いストレッチは、KLHなどの別のタンパク質の配列と融合し、キメラ分子に対する抗体を産生され得る。
【０２９４】
PMMM に対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって、抗体分子を産生する任意の技術を用いて作製することが可能である。限定するものではないがこのような技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびEBV-ハイブリドーマ技術がある(Kohler, G.他(1975) Nature 256:495-497; Kozbor, D.他(1985) J. Immunol. Methods 81:31-42; Cote, R.J.他 (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030;  Cole, S.P.他(1984) Mol.Cell Biol. 62:109-120）。
【０２９５】
更に、「キメラ抗体」作製のために開発された技術、例えば、ヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺伝子をスプライシングするなどの技術が、好適な抗原特異性および生物学的活性を有する分子を得るために用いられる(Morrison, S.L. 他(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855、Neuberger, M.S. 他(1984) Nature 312:604-608; Takeda, S.他(1985) Nature 314:452-454)。別法では、当分野で周知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して、PMMM特異性一本鎖抗体を生成する。関連した特異性を有するがイディオタイプ組成が異なるような抗体を、ランダムな組合せの免疫グロブリンライブラリからチェーンシャッフリングによって産生することもできる（Burton D.R. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10134-10137）。
【０２９６】
抗体の産生は、リンパ球集団におけるin vivo産生の誘導によって、或いは文献に開示されているように非常に特異的な結合試薬の免疫グロブリンのライブラリまたはパネルのスクリーニングによっても行い得る(Orlandi, R. 他(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833-3837; Winter, G.他(1991) Nature 349:293-299)。
【０２９７】
PMMM に対する特異的な結合部位を含む抗体断片も得ることができる。例えば、限定するものではないが、このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって作製されるF（ab'）2 断片と、F（ab'）2 断片のジスルフィド架橋を還元することによって作製されるFab断片とがある。あるいは、Fab発現ライブラリを作製することによって、所望の特異性を持つモノクローナルFab断片を迅速且つ容易に同定することが可能となる(Huse, W.D.他(1989) Science 246:1275-1281）。
【０２９８】
種々の免疫学的検定（イムノアッセイ）を用いてスクリーニングすることにより、所望の特異性を有する抗体を同定し得る。確立された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の何れかを用いる競合的な結合、または免疫放射線活性のための数々のプロトコルが、当分野では周知である。 通常このようなイムノアッセイには、PMMM  とその特異性抗体との間の複合体形成の計測が含まれる。二つの非干渉性PMMM エピトープに対して反応性のモノクローナル抗体を用いる、２部位モノクローナルベースのイムノアッセイが一般に利用されるが、競合的結合アッセイも利用することができる(Pound、前出)。
【０２９９】
ラジオイムノアッセイ技術と共にScatchard分析などの様々な方法を用いて、PMMMに対する抗体の親和性を評価する。親和性を結合定数Kaで表すが、このKaは、平衡状態の下でPMMM抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモル濃度で除して得られる値である。多数のPMMM エピトープに対して親和性が不均一なポリクローナル抗体試薬のＫａは、PMMM に対する抗体の平均親和性または結合活性を表す。特定のPMMM エピトープに単一特異的なモノクローナル抗体試薬のＫａは、親和性の真の測定値を表す。Ka値が１０９〜１０１２liter／ｍｏｌの高親和性抗体医薬は、PMMM抗体複合体が過酷な処理に耐えなければならないイムノアッセイに用いるのが好ましい。Ka値が１０６〜１０７liter／ｍｏｌの低親和性抗体医薬は、PMMMが抗体から最終的に活性化状態で解離する必要がある免疫精製（immunopurification）及び類似の処理に用いるのが好ましい。 (Catty, D. (1988) Antibodies, Volume I: A Practical Approach. IRL Press, Washington, DC; Liddell, J. E. および Cryer, A. (1991) A Practical Guide to Monoclonal Antibodies, John Wiley & Sons, New York NY)。
【０３００】
ポリクローナル抗体製剤の抗体価および結合活性を更に評価して、後に使う或る適用例に対するこのような製剤の品質および適合性を決定することができる。例えば、少なくとも１〜２ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体、好ましくは５〜１０ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体を含むポリクローナル抗体医薬は一般に、PMMM抗体複合体を沈殿させなければならない処理に用いられる。抗体の特異性、抗体価、および結合力の評価手順、並びに、様々な適用例における抗体の品質と使用に対する指針については、一般に入手可能である(Catty, 前出; Coligan他、前出)。
【０３０１】
本発明の別の実施様態では、PMMMをコードするポリヌクレオチド、またはその任意の断片や相補配列が、治療目的で使用することができる。ある実施態様では、PMMMをコードする遺伝子のコーディング領域や調節領域に相補的な配列やアンチセンス分子（DNA、RNA、PNA、修飾ヌクレオチド）を設計して遺伝子発現を変更することができる。このような技術は当分野では周知であり、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは大きな断片が、PMMMをコードする配列の制御領域、またはコード領域に沿ったさまざまな位置から設計可能である（Agrawal, S., 編集 (1996) Antisense Therapeutics, Humana Press Inc., Totawa NJ 等を参照）。
【０３０２】
治療に用いる場合、アンチセンス配列を適切な標的細胞に導入するのに好適な、任意の遺伝子送達系を用いることができる。アンチセンス配列は、転写時に標的タンパク質をコードする細胞配列の少なくとも一部に相補的な配列を作製する発現プラスミドの形で、細胞内に送達し得る(Slater, J.E.他(1998) J. Allergy Clin. Immunol. 102:469-475; Scanlon, K.J.他(1995) 9:1288-1296)。アンチセンス配列はまた、細胞内に、ウイルスベクター例えばレトロウイルスおよびアデノ随伴ウイルスのベクターを用いて導入しうる(Miller, A.D. (1990) Blood 76:271; Ausubel他、前出; Uckert, W.およびW. Walther (1994) Pharmacol. Ther. 63:323-347)。その他の遺伝子送達機構には、リポソーム系、人工的なウイルスエンベロープおよび当分野で公知のその他のシステムが含まれる（Rossi, J.J. (1995) Br. Med. Bull. 51:217-225; Boado, R.J.他(1998) J. Pharm. Sci. 87(11):1308-1315、Morris, M.C.他(1997) Nucleic Acids Res. 25:2730-2736）。
【０３０３】
本発明の別の実施例では、PMMM  をコードするポリヌクレオチドを、体細胞若しくは生殖細胞の遺伝子治療に用いることが可能である。遺伝子治療を行うことにより、（i）遺伝子欠損症（例えばＸ染色体連鎖遺伝（Cavazzana-Calvo, M.他 (2000) Science 288:669-672）により特徴付けられる重症複合型免疫不全(SCID)-X1病の場合）、先天性アデノシンデアミナーゼ（ADA）欠損症に関連する重症複合型免疫不全症候群（Blaese, R.M. 他 (1995) Science 270:475-480、Bordignon, C.他 (1995) Science 270:470-475）、嚢胞性繊維症（Zabner, J.他 (1993) Cell 75:207-216: Crystal、R.G.他 (1995) Hum. Gene  Therapy 6:643-666、Crystal, R.G.他. (1995) Hum. Gene Therapy 6:667-703）、サラセミア（thalassamia）、家族性高コレステロール血症、第VIII因子若しくは第IX因子欠損に起因する血友病（Crystal, 35  R.G. (1995) Science 270:404-410、Verma, I.M. and Somia. N. (1997) Nature 389:239-242）を治療し、（ii）条件的致死性遺伝子産物を発現させ（例えば制御不能な細胞増殖に起因する癌の場合）、（iii）細胞内の寄生生物（例えばヒト免疫不全ウイルス(HIV)（Baltimore, D. (1988) Nature 335:395-396、Poescbla, E.他 (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:11395-11399）などヒトレトロウイルス、B型若しくはC型肝炎ウイルス（HBV、HCV）、Candida albicans及びParacoccidioides brasiliensis等の真菌寄生菌、並びにPlasmodium falciparum及びTrypanosoma cruzi等の原生動物寄生体に対する防御機能を有するタンパク質を発現させることができる。PMMMの発現若しくは調節に必要な遺伝子の欠損が疾患を引き起こす場合、導入した細胞の好適な集団からPMMMを発現させて、遺伝子欠損によって起こる症状の発現を緩和することが可能である。
【０３０４】
本発明の更なる実施例では、PMMM の欠損による疾患や異常症は、PMMM をコードする哺乳動物発現ベクターを作製して、これらのベクターを機械的手段によってPMMM 欠損細胞に導入することによって治療する。in vivoあるいはex vitroの細胞に用いる機械的導入技術には、(i)個々の細胞内への直接的なDNA微量注射法、(ii)遺伝子銃、(iii)リポソームを介した形質移入、(iv)受容体を介した遺伝子導入、および(v)DNAトランスポゾンの使用がある(Morgan, R.A. および W.F. Anderson(1993)Annu. Rev. Biochem. 62:191-217、Ivics, Z.(1997)Cell 91:501-510; Boulay, J-L. およびH. Recipon(1998)Curr. Opin. Biotechnol. 9:445-450)。
【０３０５】
PMMM の発現に効果的である発現ベクターには、限定するものではないが、PCDNA 3.1、EPITAG、 PRCCMV2、PREP、 PVAX、PCR2-TOPOTA ベクター (Invitrogen, Carlsbad CA)、 PCMVSCRIPT、 PCMV-TAG、PEGSH/PERV (Stratagene, La Jolla CA)およびPTETOFF、PTETON、 PTRE2、 PTRE2LUC、 PTKHYG (Clontech, Palo Alto CA)が含まれる。PMMMを発現させるために、（i）恒常的に活性なプロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（CMV）、ラウス肉腫ウイルス（RSV）、SV40ウイルス、チミジンキナーゼ（TK）、若しくはβ−アクチン遺伝子等）、(ii)誘導性プロモーター（例えば、市販されているT-REXプラスミド（Invitrogen）に含まれている、テトラサイクリン調節性プロモーター（Gossen, M. 及び H. Bujard (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:5547-5551; Gossen, M. 他 (1995) Science 268:1766-1769; Rossi, F.M.V. 及び H.M. Blau (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:451-456））、エクジソン誘導性プロモーター（市販されているプラスミドPVGRXR及びPINDに含まれている：Invitrogen）、FK506／ラパマイシン誘導性プロモーター、またはRU486／ミフェプリストーン誘導性プロモーター（Rossi, F.M.V. 及び H.M. Blau, 前出）、または（iii）正常な個体に由来するPMMMをコードする内因性遺伝子の天然のプロモーター若しくは組織特異的プロモーターを用いることが可能である。
【０３０６】
市販のリポソーム形質転換キット（例えばInvitrogen社のPerFect Lipid Transfection Kit）を用いれば、当業者は実験の各パラメータを最適化する努力をさほど要さず、ポリヌクレオチド群を、培養中の標的細胞群に送達し得る。別法では、リン酸カルシウム法（Graham. F.L. および A.J. Eb（1973）Virology 52:456-467）若しくは電気穿孔法（Neumann, E. 他(1982) EMBO J. 1:841-845)を用いて形質転換を行う。初代培養細胞にDNAを導入するためには、これら標準化された哺乳類形質移入プロトコルの修正が必要である。
【０３０７】
本発明の別の実施例では、PMMM の発現に関連する遺伝子欠損によって起こる疾患や異常症は、（i）レトロウイルス末端反復配列（LTR）プロモーター若しくは独立したプロモーターのコントロール下でATRS をコードするポリヌクレオチドと、（ii）好適なRNAパッケージングシグナルと、（iii）追加のレトロウイルス・シス作用性RNA配列及び効率的なベクターの増殖に必要なコーディング配列を伴うRev応答性エレメント（RRE）とからなるレトロウイルスベクターを作製して治療することができる。レトロウイルスベクター（例えばPFBおよびPFBNEO）はStratagene社から市販されており、刊行データ（Riviere, I. 他（1995）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6733-6737）に基づく。上記データは参照により開示に含まれる。このベクターは、好適なベクター産生細胞株（VPCL）において増殖される。VPCLは、各標的細胞上の受容体への向性を持つエンベロープ遺伝子を、またはVSVgなど汎親和性エンベロープタンパク質を発現する（Armentano, D. 他(1987) J. Virol. 61:1647-1650; Bender, M.A.他 (1987) J. Virol. 61:1639-1646; Adam, M.A. および A.D. Miller (1988) J. Virol. 62:3802-3806; Dull, T.他(1998) J. Virol. 72:8463-8471; Zufferey, R.他 (1998) J. Virol. 72:9873-9880)。Riggに付与された米国特許第5,910,434号（「Method for obtaining retrovirus packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant」）において、レトロウイルスパッケージング細胞株を得るための方法が開示されており、引用することをもって本明細書の一部とする。レトロウイルスベクター類の繁殖や、細胞集団（例えばCD4+Ｔ細胞群）の形質導入、および形質導入した細胞群の患者への戻しは、遺伝子治療分野では当業者に周知の手法であり、多数の文献に記載がある（Ranga, U.他(1997) J. Virol. 71:7020-7029; Bauer, G.他 (1997) Blood 89:2259-2267; Bonyhadi, M.L. (1997) J. Virol. 71:4707-4716; Ranga, U.他(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:1201-1206; Su, L. (1997) Blood 89:2283-2290)。
【０３０８】
或る実施様態では、アデノウイルス系遺伝子治療の送達系を用いて、PMMMの発現に関連する１つ以上の遺伝子異常を有する細胞にPMMMをコードするポリヌクレオチドを送達する。アデノウイルス系ベクター類の作製およびパッケージングについては、当業者に周知である。複製欠損型アデノウイルスベクター類は、種々の免疫調節タンパク質をコードする遺伝子群を、無損傷の膵島内に導入する目的で多様に利用し得ることが証明された（Csete, M.E.他(1995) Transplantation 27:263-268)。使用できる可能性のあるアデノウイルスベクターは、Armentanoに付与された米国特許第5,707,618号（「Adenovirus vectors for gene therapy」）に記載されており、引用することをもって本明細書の一部とする。アデノウイルスベクター類については、Antinozzi, P.A. 他(1999; Annu. Rev. Nutr. 19:511-544)並びにVerma, I.M.およびN. Somia (1997; Nature 18:389:239-242)を参照されたい。
【０３０９】
別の実施様態では、ヘルペス系遺伝子治療の送達系を用いて、PMMMの発現に関連する１以上の遺伝子異常を有する標的細胞にPMMMをコードするポリヌクレオチドを送達する。単純疱疹ウイルス（HSV）系のベクターは、HSV親和性の中枢神経細胞にPMMM  を導入する際に特に役立つ。ヘルペス系ベクター類の作製およびパッケージングは、当業者に公知である。或る複製適格性単純ヘルペスウイルス（HSV）１型系のベクターが、或るレポーター遺伝子の、霊長類の眼への送達に用いられている（Liu, X. 他(1999) Exp.Eye Res.169:385395）。
HSV-1ウイルスベクターの作製についても、DeLucaに付与された米国特許第5,804,413号（「Herpes simplex virus strains for gene transfer」）に開示されており、該特許の引用をもって本明細書の一部とする。米国特許第5,804,413号には、ヒト遺伝子治療を含む目的のために好適なプロモーターの制御下において細胞に導入される少なくとも１つの外在性遺伝子を有するゲノムを含む組換えHSV d92の使用についての記載がある。上記特許はまた、ICP4、ICP27及びICP22を欠失した組換えHSV系統の作製及び使用について開示している。HSVベクター類については、Goins, W.F. 他(1999; J. Virol. 73:519-532)および Xu, H.他(1994; Dev. Biol. 163:152-161)。クローン化したヘルペスウイルス配列群の操作、大ヘルペスウイルスゲノム（large herpesvirus genomes）の様々なセグメントを持つ複数のプラスミドを形質移入した後の組換えウイルスの産生、ヘルペスウイルスの成長および増殖、並びに細胞群へのヘルペスウイルスの感染は、当業者に公知の技術である。
【０３１０】
別の実施様態では、αウイルス（正の一本鎖RNAウイルス）ベクターを用いてPMMMをコードするポリヌクレオチドを標的細胞に送達する。プロトタイプのαウイルスであるセムリキ森林熱ウイルス（Semliki Forest Virus, SFV）の生物学的研究が広範に行われており、遺伝子導入ベクター類はSFVゲノムに基づく（Garoff, H. 及び K.-J. Li (1998) Cun. Opin. Biotech. 9:464-469）。αウイルスRNAの複製中に、ウイルスのカプシドタンパク質群を通常はコードする、サブゲノムRNAが産生される。このサブゲノムRNAは完全長ゲノムRNAよりも高レベルに複製するので、酵素活性（例えばプロテアーゼおよびポリメラーゼ）を持つウイルスタンパク質に比べてカプシドタンパク質群が過剰産生される。同様に、PMMM をコードする配列をαウイルスゲノムのカプシドをコードする領域に導入することによって、ベクター導入細胞において多数のPMMM をコードするRNAが産生され、高いレベルでPMMM が合成される。通常、αウイルスの感染は、数日以内の細胞溶解を伴う。一方、シンドビスウイルス（SIN）の或る変異体を有するハムスター正常腎臓細胞（BHK-21）群が持続的な感染を確立する能力は、αウイルス類の溶解複製を、遺伝子治療に応用し得るように好適に改変可能であることを示唆する（Dryga, S.A.他(1997) Virology 228:74-83)。様々な宿主にαウイルスを導入できることから、様々なタイプの細胞にPMMM を導入することできる。或る集団における或るサブセットの細胞群の特異的形質導入は、形質導入前に細胞の選別を必要とし得る。αウイルスの感染性cDNAクローンの操作方法、αウイルスのcDNAおよびRNAの形質移入方法およびαウイルスの感染方法は、当業者に公知である。
【０３１１】
転写開始部位（transcription initiation site）由来のオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子発現を阻害することも可能である。この位置は、例えばスタート部位(start site)から数えて約−１０と約＋１０の間である。同様に、三重らせん塩基対の形成方法を用いて阻害が可能となる。三重らせん対合は、ポリメラーゼ、転写因子または制御分子と結合できるように十分に開こうとする、二重らせんの能力を阻害するので有用である。三重鎖DNAを用いる最近の治療の進歩については文献に記載がある(Gee, J.E.他(1994) in Huber, B.E. および B.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing, Mt. Kisco NY, 163-177ページ）。相補配列またはアンチセンス分子もまた、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってmRNAの翻訳を妨害するように設計することができる。
【０３１２】
リボザイムは酵素的RNA分子であり、RNAの特異的切断を触媒するためにリボザイムを用いることもできる。リボザイム作用の機序は、相補的標的RNAへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションと、その後に起こるヌクレオチド鎖切断に関与している。例えば、遺伝子操作で作ったハンマーヘッド型リボザイム分子が、PMMMをコードするRNA分子の、内ヌクレオチド鎖切断を特異的且つ効果的に触媒できる可能性がある。
【０３１３】
任意の潜在的RNA標的内の特異的リボザイム切断部位は、GUA、GUU、GUC配列を含めたリボザイム切断部位について標的分子をスキャンすることによって先ず同定される。一度同定されると、切断部位を持つ標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０リボヌクレオチドの短いRNA配列が、そのオリゴヌクレオチドを機能不全にするような２次構造の特徴をもっていないかを評価することが可能になる。候補標的の適合性の評価も、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイを用いて相補的オリゴヌクレオチド群とのハイブリダイゼーションへの到達性をテストすることによって行い得る。
【０３１４】
相補リボ核酸分子およびリボザイムは、核酸分子合成のための当分野で既知の任意の方法を用いて作製し得る。作製方法には、固相ホスホラミダイト化学合成など、オリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法がある。或いは、PMMMをコードするDNA分子のin vitro及びin vivo転写によってRNA分子を産出し得る。このようなDNA配列は、T7やSP6などの好適なRNAポリメラーゼプロモーターを用いて多様なベクター内に取り込むことが可能である。あるいは、相補的RNAを構成的あるいは誘導的に合成するこれらのcDNA構築物を、細胞株、細胞または組織内に導入できる。
【０３１５】
細胞内の安定性を高め半減期を延ばすためRNA分子を修飾し得る。限定するものではないが可能な修飾としては、分子の５'末端、３'末端、あるいはその両方において隣接配列群を追加することや、分子の主鎖内においてホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエートまたは2' O-メチルを使用することが含まれる。この概念は、本来はPNA群の産出におけるものであるが、これら全ての分子に拡張できる。そのためには、内因性エンドヌクレアーゼによって容易には認識されない、アデニン、シチジン、グアニン、チミン、およびウリジンのアセチル−、メチル−、チオ−および同様の修飾型や、非従来型塩基、例えばイノシン、クエオシン（queosine）、ワイブトシン（wybutosine）を含める。
【０３１６】
本発明の別の実施態様では、本発明の1つ以上の選択したポリヌクレオチドの発現を改変、阻害、低減、または沈黙させるため、RNA干渉(RNAi)または、転写後遺伝子サイレンシング(PTGS)法を利用でき、これらは当該分野で既知である。RNAiは遺伝子サイレンシングの転写後モードであり、ここでは標的細胞に導入した二本鎖RNA (dsRNA)が相同遺伝子(即ちdsRNAの相補配列を持つ遺伝子)の発現を特異的に抑制する。これは標的遺伝子の発現を効率的にノックアウト、または実質的に低減する。PTGSはまた、DNAまたはDNA断片を用いても達成できる。RNAi法の記載はFire, A.他(1998; Nature 391:806-811)およびGura, T. (2000; Nature 404:804-808)がある。PTGSを開始するにはまた、選択した組織にDNAの相補セグメントを導入して行うことができ、これには本願記載の、または当該分野で既知の、遺伝子送達および/またはウイルスベクター送達法を用いる。
【０３１７】
RNAiを哺乳類細胞内で誘導するには、低分子干渉(small interfering)RNA、略称siRNAの利用で可能となる。siRNAはdsRNAの短いセグメント(通常、約21〜23ヌクレオチド長)であり、in vivo で、導入したdsRNAが内因性リボヌクレアーゼの作用で切断されて生じる。siRNAは、哺乳類でのRNAi効果のメディエータであると思われる。最も有効なsiRNAは、21ヌクレオチドdsRNAで2ヌクレオチドの3'オーバーハングを持つRNAのようである。siRNAを用いたRNAiの哺乳類細胞での誘導は、Elbashir, S.M.他(2001; Nature 411:494-498)に記載がある。
【０３１８】
siRNAを産生するには、間接的にdsRNAを標的細胞に導入するか、直接的に、本願記載または当該分野で既知の哺乳類トランスフェクション法および媒介物(例えば、リポソームを介したトランスフェクション、ウイルスベクター法、または他のポリヌクレオチド送達/導入法)で可能である。好適なsiRNAを選ぶには、AUG開始コドンから下流のヌクレオチド配列群について標的ポリヌクレオチドの転写物(例えばmRNA)を検討し、各ヌクレオチドと3'側の隣接する19〜23ヌクレオチドの出現を潜在的siRNA標的部位として記録して可能であり、21ヌクレオチド長を持つ配列が好ましい。標的siRNA部位として避けるべき領域としては、5'と3'の非翻訳領域(UTR)、および開始コドンに近い領域(75塩基以内)があり、理由は、これらは調節タンパク質結合部位が、より豊富なためである。UTR結合タンパクおよび/または翻訳開始複合体は、siRNPエンドヌクレアーゼ複合体の結合に干渉しうる。siRNAのために選択した標的部位は次に、適切なゲノムデータベース(例えばヒト等のもの)と比較でき、これにはBLASTまたは他の、当該分野で既知の配列比較アルゴリズムを用いる。標的配列の内、他のコード配列への有意な相同性を持つ配列は、考慮から除外できる。選択したsiRNAを産生するには、当該分野で既知の化学合成法で、またはin vitro転写に市販の方法とキット、例えばSILENCER siRNA作製キット(Ambion, Austin TX)を用いて可能である。
【０３１９】
別の実施態様で、長期の遺伝子サイレンシングおよび/またはRNAi効果を、選択した組織で誘導でき、これにはsiRNAを持続的に発現する発現ベクターを用いる。これを達成するには、操作してヘアピンRNA (shRNA：short hairpin RNA)を発現するようにした発現ベクターを用い、これには当該分野で既知の方法を用いる(例えばBrummelkamp, T.R.他(2002) Science 296:550-553; およびPaddison, P.J.他(2002) Genes Dev. 16:948-958参照)。これら及び関連の実施態様でshRNAを標的細胞に送達するには、当該分野で既知の発現ベクターを用い得る。siRNAの送達に好適な発現ベクターの一例はPSILENCER1.0-U6 (circular)プラスミド(Ambion)である。標的組織に送達されると、shRNAはin vivo でプロセスされてsiRNA様分子となり、これは遺伝子特異的サイレンシングを行える。
【０３２０】
種々の実施態様で、RNAiまたはPTGS法が標的にする遺伝子の発現レベルの判定は、mRNAおよび/またはタンパク質解析用のアッセイで行える。或る標的遺伝子のmRNAの発現レベル判定は、ノーザン解析法に例えばNORTHERNMAX-GLYキット(Ambion)を用いて、またマイクロアレイ法で、PCR法で、リアルタイムPCR法で、また他の、当該分野で既知または本願記載のRNA/ポリヌクレオチドアッセイで行える。標的遺伝子がコードするタンパク質の発現レベルの判定は、ウェスタン解析に当該分野で既知の標準技術を用いて行える。
【０３２１】
本発明の更なる実施例は、PMMMをコードするポリヌクレオチドの発現の変化に有効な化合物をスクリーニングする方法を含む。限定するものではないが特異ポリヌクレオチドの発現改変を起こすのに有効であり得る化合物には、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチドや、転写因子などのポリペプチド転写制御因子、および、特異ポリヌクレオチド配列と相互作用し得る非高分子化学物質がある。有効な化合物は、ポリヌクレオチド発現のインヒビターまたはプロモーターのいずれかとして作用することによりポリヌクレオチド発現を改変し得る。従って、PMMMの発現または活性の増加に関連する疾患の治療においては、PMMM をコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害する化合物が治療上有用であり、PMMM の発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、PMMM をコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に促進する化合物が治療上有用であり得る。
【０３２２】
種々の実施態様で、或る特定ポリヌクレオチドの発現を改変する際の有効性について、１つ以上の試験化合物をスクリーニングし得る。試験化合物を得るには、当分野で公知の任意の方法を用い得る。取得方法としては、以下の場合に有効な既知化合物の化学修飾がある。ポリヌクレオチドの発現を改変する場合と、既存の、市販のまたは私的な、天然または非天然の化学物質のライブラリから選択する場合と、標的ポリヌクレオチドの化学的および／または構造的特性に基づく化合物を合理的にデザインする場合と、組合せ的にまたは無作為に生成した化学物質のライブラリから選択する場合とである。PMMM をコードするポリヌクレオチドを含むサンプルは、少なくとも１つの試験化合物に曝露して得る。サンプルは例えば、無傷細胞、透過化処理した細胞、あるいはin vitro 無細胞系すなわち再構成生化学系があり得る。PMMMをコードするポリヌクレオチドの発現における変化は、当分野で通常知られている任意の方法でアッセイする。通常、PMMMをコードするポリヌクレオチドの配列に相補的なヌクレオチド配列を有するプローブを用いたハイブリダイゼーションにより、特異ヌクレオチドの発現を検出する。ハイブリダイゼーション量を定量することにより、１つ以上の試験化合物に曝露される、または曝露されないポリヌクレオチドの発現の比較のための基礎を形成し得る。試験化合物に曝露されるポリヌクレオチドの発現における変化の検出は、ポリヌクレオチドの発現を改変する際に試験化合物が有効であることを示す。或る特定ポリヌクレオチドの改変発現に有効な化合物のためのスクリーニングを実行でき、例えば分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）遺伝子発現系（Atkins, D. 他(1999) 米国特許第5,932,435号、Arndt, G.M. 他(2000) Nucleic Acids Res.28:E15）またはHeLa細胞等のヒト細胞株（Clarke, M.L. 他(2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 268:8-13）を用いて行い得る。本発明の或る特定の実施態様は、或る特定ポリヌクレオチド配列に対するアンチセンス活性について、オリゴヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸、修飾したオリゴヌクレオチド）のコンビナトリアルライブラリをスクリーニングする過程に関する（Bruice, T.W. 他(1997) 米国特許第5,686,242号、Bruice, T.W.他(2000) 米国特許第6,022,691号）。
【０３２３】
ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が利用可能であり、in vivo、in vitro及びex vivoの使用に対して同程度に適している。ex vivo治療の場合、ベクターを、患者から採取した幹細胞内に導入し、クローニング増殖して同患者に自家移植で戻すことができる。トランスフェクションによる、またはリポソーム注入やポリカチオンアミノポリマーによる送達は、当分野で周知の方法を用いて実行することができる（Goldman, C.K.他(1997) Nat. Biotechnol. 15:462-466）。
【０３２４】
上記の治療方法はどれも例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サルなどの哺乳類を含め、そうした治療が必要な任意の被験体に適用できる。
【０３２５】
本発明の或る更なる実施態様は、薬剤的に許容される或る賦形剤と共に処方される或る活性成分を一般に有する、或る組成物の投与に関する。賦形剤には例えば、糖、でんぷん、セルロース、ゴムおよびタンパク質がある。様々な剤型が広く知られており、詳細はRemington's Pharmaceutical Sciences（Maack Publishing, Easton PA）の最新版に記載されている。このような組成物は、PMMM、PMMMの抗体、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト、またはPMMMのインヒビターなどからなる。
【０３２６】
種々の実施態様で、本願に記載の組成物たとえば医薬組成物は、任意の数の経路によって投与でき、限定するものではないが経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸法がある。
【０３２７】
肺から投与する組成物は、液状または乾燥粉末状で調製し得る。このような組成物は通常、患者が吸入する直前にエアロゾル化する。小分子（例えば伝統的な低分子量有機薬）の場合には、速効製剤のエアロゾル送達は当分野で公知である。高分子（例えばより大きなペプチドおよびタンパク質）の場合には、当該分野において肺の肺胞領域を介しての肺送達が最近発達したことにより、インスリンなどの薬物を実用的に血液循環へ輸送することを可能にした（Patton, J.S. 他, 米国特許第5,997,848号などを参照）。肺送達は、針注射なしに投与でき、有毒な可能性のある浸透エンハンサーの必要性をなくす。
【０３２８】
本発明での使用に適した組成物には、所定の目的を達成するために必要なだけの量の活性成分を含有する組成物が含まれる。有効投与量の決定は、当業者の能力の範囲内で行う。
【０３２９】
PMMM  またはその断片を含む高分子を直接細胞内に送達するべく、特殊な形態に組成物が調製されるのが好ましい。例えば、細胞不透過性高分子を有するリポソーム製剤は、その高分子の細胞融合と細胞内送達とを促進し得る。別法では、PMMM  またはその断片をHIV Tat-1タンパク質からの短い陽イオンN末端部に結合することもできる。このようにして生成された融合タンパク質類は、或るマウスモデル系の、脳を含む全ての組織の細胞群に形質導入することがわかっている（Schwarze, S.R. 他(1999) Science 285:1569-1572）。
【０３３０】
任意の化合物に対して、先ず細胞培養アッセイ例えば新生物細胞の細胞培養アッセイにおいて、或いは動物モデル例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、サルまたはブタ等において、治療有効用量を推定できる。動物モデルはまた、好適な濃度範囲および投与経路を決定するためにも用い得る。このような情報を用いて、次にヒトに対する有益な投与量および投与経路を決定することができる。
【０３３１】
治療有効量は、症状や容態を回復させる、たとえばPMMMまたはその断片、PMMMの抗体、PMMMのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターなどの活性処方成分の量に関連する。治療有効性及び毒性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬剤手法によって、例えばED50（集団の５０％の治療有効量）またはLD50（集団の５０％の致死量）の統計を計算するなどして決定することができる。毒性効果の、治療効果に対する用量比が治療指数であり、LD50/ED50比として表すことができる。高い治療指数を示すような組成物が望ましい。細胞培養アッセイと動物実験とから得られたデータは、ヒトに用いる投与量の範囲の策定に用いられる。このような組成物に含まれる投与量は、毒性を殆どあるいは全く持たず、ED50を含むような血中濃度の範囲にあることが好ましい。投与量は、用いられる剤形、患者の感受性および投与の経路によってこの範囲内で変わる。
【０３３２】
正確な投与量は、治療が必要な被検者に関する要素を考慮して、実務医が決定することになる。充分なレベルの活性成分を与え、あるいは所望の効果を維持すべく、用法および用量を調整する。被検者に関する要素としては、病態の重症度、被検者の全身健康状態、患者の年齢、体重及び性別(ジェンダー)、投与の時間及び頻度、併用薬、反応感受性及び治療に対する応答等を考慮しうる。長時間作用性の組成物は、特定の製剤の半減期及びクリアランス速度によって３〜４日毎に１度、毎週、或いは隔週の間隔で投与し得る。
【０３３３】
通常の投与量は、投与経路にもよるが約0.1〜100,000μgで、合計で約1gまでとする。特定の投与量および送達方法に関するガイダンスは文献に記載されており、当該分野の実務医は通常それを利用することができる。当業者は、ヌクレオチドの処方では、タンパク質またはそれらのインヒビター類とは異なる処方を利用することになる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、症状、部位などに特異的なものとなる。
（診断）
別の実施例では、PMMM に特異的に結合する抗体が、PMMM の発現によって特徴付けられる疾患の診断、またはPMMM やPMMM のアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターで治療を受けている患者をモニターするためのアッセイに用いられる。診断目的に有用な抗体は、上記の治療の箇所で記載した方法と同じ方法で作成される。PMMM の診断アッセイには、抗体及び標識を用いてヒトの体液或いは細胞や組織から採取されたものからPMMM を検出する方法が含まれる。この抗体は、修飾して、または修飾せずに使用される。また、レポーター分子との共有結合または非共有結合で標識化できる。レポーター分子としては広くさまざまな種類が本分野で知られており、また使用可能であるが、そのうちのいくつかは上記で説明されている。
【０３３４】
PMMMを測定するためのELISA，RIA，及びFACSを含む種々のプロトコルは、当分野では周知であり、変わった或いは異常なレベルのPMMMの発現を診断する元となるものを提供する。正常或いは標準的なPMMM の発現の値は、複合体の形成に適した条件の下、正常な哺乳動物、例えばヒトなどの被験者から採取した体液または細胞とPMMM に対する抗体とを結合させることによって決定する。標準複合体形成量は、種々の方法、例えば測光法で定量できる。被験者のPMMM の発現の量、制御及び疾患、生検組織からのサンプルが基準値と比較される。標準値と被験体との偏差が、疾患を診断するパラメータを確定する。
【０３３５】
本発明の別の実施態様では、PMMMをコードするポリヌクレオチドを、診断目的で用い得る。用い得るポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド、相補的RNAおよびDNA分子、そしてPNAが含まれる。このポリヌクレオチドを用いて、疾患と相関し得るPMMMを発現する生検組織における遺伝子の発現を検出し定量する。この診断アッセイを用いて、PMMM の存在の有無、更に過剰な発現を調べ、治療中のPMMM 値の調節を監視する。
【０３３６】
一実施形態では、PMMMまたは近縁の分子をコードする遺伝子配列を含むポリヌクレオチドを検出可能なPCRプローブを用いたハイブリダイゼーションによって、PMMMをコードする核酸配列を同定することが可能である。プローブが高度に特異的な領域（例えば５'調節領域）から作られている、或いはやや特異性の低い領域（例えば保存されたモチーフ）から作られているかにかかわらず、そのプローブの特異性と、ハイブリダイゼーション或いは増幅のストリンジェントによって、そのプローブがPMMMをコードする自然界の配列のみを同定するかどうか、或いは対立遺伝子や関連配列コードする自然界の配列のみを同定するかどうかが決まるであろう。
【０３３７】
プローブはまた、関連する配列の検出に利用され、PMMM  をコードする任意の配列と少なくとも５０％の配列同一性を有し得る。目的の本発明のハイブリダイゼーションプローブには、DNAあるいはRNAが可能であり、SEQ ID NO:41-80の配列、或いはPMMM 遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンを含むゲノム配列に由来し得る。
【０３３８】
PMMMをコードするポリヌクレオチドに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブの作製方法には、PMMM及びPMMM誘導体をコードするポリヌクレオチドをmRNAプローブの作製のためのベクターにクローニングする方法がある。ｍＲＮＡプローブ作製のためのベクターは当該分野で既知であり、市販されており、適切なＲＮＡポリメラーゼ及び適切な標識されたヌクレオチドを加えることによって、in vitroでＲＮＡプローブを合成するために用いられ得る。ハイブリダイゼーションプローブは、種々のレポーター基によって標識され得る。レポーター基の例としては、32Pまたは35S等の放射性核種、或いはアビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合されたアルカリホスファターゼ等の酵素標識などが挙げられる。
【０３３９】
PMMMをコードするポリヌクレオチドを用いて、PMMMの発現に関連する疾患を診断することが可能である。限定されるものではないが、胃腸障害の内には、燕下障害、消化性食道炎、食道攣縮、食道狭窄、食道癌、消化不良、消化不良、胃炎、胃癌、摂食障害、吐き気、嘔吐、胃不全麻痺、胞状浮腫および幽門浮腫、腹部アンギナ、胸焼け、胃腸炎、腸閉塞、腸管感染、消化性潰瘍、胆石症、胆嚢炎、胆汁鬱滞、膵臓炎、膵臓癌、胆道疾患、肝炎、高ビリルビン血症、肝硬変、肝臓の受動的鬱血、肝臓癌、伝染性大腸炎、潰瘍大腸炎、潰瘍性直腸炎、クローン病、ホイップル病、マロリーワイス症候群、結腸癌、結腸閉塞、過敏性大腸症候群、短腸症候群、下痢、便秘、胃腸出血、後天性免疫不全症候群（AIDS）、腸疾患、黄疸、肝性脳症、肝腎症候群、肝臓脂肪症、血色素症、ウィルソン病、α1アンチトリプシン欠乏症、ライ症候群、原発性硬化性胆管炎、肝臓梗塞、門脈閉塞および血栓症、小葉中心性壊死、肝紫斑症、肝静脈血栓症、肝中心静脈閉塞症、子癇前症、子癇、急性妊娠脂肪肝、妊娠肝内胆汁鬱滞、肝腫瘍（結節過形成、腺腫、および癌）があり、また、内分泌疾患の中には原発脳腫瘍及び腺腫、妊娠性梗塞、下垂体切除、動脈瘤、血管奇形、血栓症、感染症、免疫異常、頭部外傷による合併症などの病変から起こる視床下部及び下垂体の障害と、性機能低下及びシーハン症候群、尿崩症、カルマン病、ハンド‐シュラークリスチャン病、レトラ‐シヴェ病、サルコイドーシス、エンプティセラ症候群、小人症を含む下垂体機能不全に関連した障害と、良性線種によって発生しやすい不適当抗利尿ホルモン（ADH）分泌症候群（SIADH）及び先端巨大症、巨人症を含む下垂体亢進に関連した障害と、甲状腺腫及び粘液水腫、細菌感染性急性甲状腺炎、ウイルス感染性亜急性甲状腺炎、自己免疫性甲状腺炎（橋本病）、クレチン病を含む甲状腺機能低下症に関連した障害と、甲状腺中毒症及びその様々な型、グレーブス病、前脛骨粘液水腫、中毒性多結節性甲状腺腫、甲状腺癌、プランマー病を含む甲状腺機能亢進症と、Conn病（chronic hypercalemia）を含む副甲状腺機能亢進症と１型または２型糖尿病及び合併症などの膵臓疾患と、例えば副腎皮質の過形成、癌腫や腺腫、アルカローシス関連高血圧症、アミロイド症、低カリウム血、クッシング病、リドル症候群、ArnoldHealy-Gordon症候群、褐色細胞腫瘍、アジソン病などの副腎関連障害と、例えば女性の異常プロラクチン産生、不妊症、子宮内膜症、月経周期摂動、多嚢胞卵巣疾患、高プロラクチン血症、ゴナドトロピン単独欠損（isolated gonadotropin deficiency）、無月経、乳汁漏出症、半陰陽、多毛症及び男性化、乳癌、閉経後の骨粗鬆症、男性のライジッヒ細胞不全、男性更年期、胚芽細胞無形成症、ライジッヒ細胞腫瘍に関連した性機能亢進、アンドロゲン受容体の欠如に関連したアンドロゲン耐性、５α−還元酵素症候群、女性化乳房などの性腺ステロイドホルモン関連疾患とが含まれ、 免疫疾患の中には、炎症、光線性角化症、後天性免疫不全症候群（AIDS）及びアジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、気管支炎、骨膜包炎、胆嚢炎、肝硬変、接触皮膚炎、���ローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、胎児性赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、発作性夜行性血色素尿、肝炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、混合型結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨髄線維症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、真性赤血球増多症、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、本態性血小板血症、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、外傷、リンパ腫、白血病および骨髄腫を含む造血性癌が含まれ、感染症には、アデノウイルス、アレナウイルス、ブンヤウイルス（bunyavirus）、カリチウイルス（calicivirus）、コロナウイルス、フィロウイルス、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルス、フラビウイルス、オルソミクソウイルス、パルボウイルス、パポーバウイルス、パラミクソウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、レオウイルス、レトロウイルス、ラブドウイルス、トガウイルスに分類されるウイルス病原体による感染や、細菌による感染（肺炎球菌、ブドウ球菌、連鎖球菌、バシラス菌、コリネバクテリウム、クロストリジウム、髄膜炎菌、淋菌、リステリア、モラクセラ、キンゲラ、ヘモフィルス、レジオネラ、百日咳菌類(ボルデテラ)や、シゲラ、サルモネラ、カンピロバクターを含むグラム陰性腸内細菌、シュードモナス、ビブリオ、ブルセラ、野兎病菌類(フランシセラ)、エルシニア、バルトネラ、norcardium、放線菌、ミコバクテリウム、spirochaetale、リケッチア、クラミジア、マイコプラズマに分類）、真菌感染(分類はアスペルギルス、ブラストミセス、皮膚糸状菌、クリプトコッカス、コクシジオイデス、malasezzia、ヒストプラスマ、または他の真菌症起因菌)、寄生虫感染(分類はプラスモディウムすなわちマラリア原虫、寄生性アメーバ、リーシュマニア、トリパノソーマ、トキソプラズマ、ニューモシスチスカリニ、腸内原虫(ジアルジアなど)、トリコモナス、組織線虫(旋毛虫など)、腸管寄生線虫(回虫など)、リンパ管フィラリア線虫、吸虫(住血吸虫など)、および条虫（サナダムシなど）)が含まれ、代謝系の疾患の中には、アジソン病、脳腱黄色腫症、先天性副腎過形成、クマリン耐性（coumarin resistance）、嚢胞性繊維症、糖尿病、脂肪性肝硬変、フルクトース-１、６−ジホスファターゼ欠乏症、ガラクトース血症、甲状腺腫、グルカゴノーマ、糖原病、遺伝性果糖不耐症、副腎皮質機能亢進症（Hyperadrenalism）、副甲状腺機能亢進症、副甲状腺機能低下症、高コレステロール血症、甲状腺機能亢進症、低血糖症、甲状腺機能低下症、脂肪過剰血症、脂質ミオパシー、脂肪ジストロフィー症、リソソーム蓄積症、マノシドーシス、ノイラミニナーゼ欠損症、肥満、骨粗しょう症、フェニルケトン尿症、プソイドビタミンD欠損くる病、炭水化物代謝障害(例えば、先天性II型異常赤血球産生症性貧血、糖尿病、インスリン依存型真性糖尿病、非インスリン依存型真性糖尿病、ガラクトースエピメラーゼ欠乏症、糖原病、リソソーム蓄積症、果糖尿、五炭糖尿症)、およびピルビン酸代謝の先天性異常、脂肪肝のような脂質代謝異常、胆汁うっ滞、原発性胆汁性肝硬変、カルニチン欠乏症、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ欠乏症、ミオアデニレートデミナーゼ欠乏症、高トリグリセリド血症、ファブリー病などの脂質貯蔵病、ゴーシェ病、ニーマン‐ピック病、変染色性白質ジストロフィー、副腎性白質ジストロフィー、GM２にガングリオシドーシス、セロイドリポフスチン症、無β‐リポ蛋白血症、タンジアー病、リポ蛋白過剰血症、脂肪異栄養症、脂肪腫症、急性皮下脂肪組織炎、播種性脂肪組織壊死症、有痛脂肪症、リポイド副腎過形成、最小変化症、脂肪腫、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症を伴った高コレステロール血症、原発性低αリポ蛋白血症、甲状腺症機能低下症、腎臟病、肝疾患、レシチン-コレステロールアシルトランスフェラーゼ欠乏症、脳腱黄色腫症、シトステロール血症、低コレステロール血症、テイ‐サックス病、サンドホフ病、高脂血症、脂肪過剰血症、脂質筋障害、およびMenke病のような銅代謝疾患、ウイルソン病、およびエーレルス‐ダンロー症候群IX型糖尿病が含まれ、また心血管疾患として、動静脈瘻、アテローム性動脈硬化症、高血圧、脈管炎、レイノー病、静脈奇形、動脈解離、静脈瘤、血栓静脈炎及び静脈血栓、血管の腫瘍、血栓崩壊の合併症、バルーン血管形成術（balloon angioplasty）、血管置換術、大動脈冠動脈バイパス術移植手術（coronary artery bypass graft surgery）などの血管疾患と、うっ血性心不全、虚血性心疾患、狭心症、心筋梗塞、高血圧性心疾患、変性弁膜性心疾患、石灰化大動脈弁狭窄症、先天性２尖大動脈弁、僧帽弁輪状石灰化（mitral annular calcification）、僧帽弁脱出、リウマチ熱、リウマチ性心疾患、感染性心内膜炎、非細菌性血栓性心内膜炎、全身性紅斑性狼瘡の心内膜炎、カルチノイド心疾患、心筋症、心筋炎、心膜炎、腫瘍性心疾患、先天性心臓疾患、心臓移植の合併症などが含まれ、自己免疫／炎症性の疾患の中には、後天性免疫不全症候群（AIDS）及びアジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、アテローム性硬斑破裂、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ性外胚葉ジストロフィー（APECED）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、関節軟骨変性、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷が含まれ、細胞増殖異常には日光性角化症、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌が含まれ、発生または発達障害の中には尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ‐ベッカー型筋ジストロフィー、癲癇、性腺形成異常、WAGR症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神薄弱）、スミス‐マジェニス症候群(Smith- Magenis syndrome)、脊髄形成異常症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症、遺伝性神経病（シャルコー‐マリー‐ツース病、神経線維腫症）、甲状腺機能低下症、水頭症、発作障害（Syndenham舞踏病(Syndenham's chorea)、脳性小児麻痺）、脊髄二分裂、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感覚神経性聴力損失が含まれ、上皮性疾患には、発汗異常性湿疹、アレルギー性接触皮膚炎、毛孔性角化症、肝斑、白斑、光線性角化症、基底細胞癌、扁平細胞癌、脂漏性角化症、毛嚢炎、単純疱疹、帯状疱疹、水痘、カンジダ症、皮膚糸状菌症、疥癬、虫刺され、サクランボ色血管腫、ケロイド、皮膚線維腫、先端線維性軟疣、蕁麻疹、一過性棘融解性皮膚症、乾燥症、湿疹、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、手湿疹、貨幣状湿疹、慢性単純性苔癬、皮脂減少性湿疹、鬱血性皮膚炎および鬱血性潰瘍化、脂漏性皮膚炎、乾癬、扁平苔癬、薔薇色粃糠疹、膿痂疹、膿瘡、皮膚糸状菌症、癜風、疣、尋常性座瘡、赤鼻、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、腫瘍随伴性天疱瘡、類天疱瘡、妊娠性疱疹、疱疹状皮膚炎、リニアIgA病、後天性表皮水疱症、皮膚筋炎、紅斑性狼瘡、強皮症、紅皮症、脱毛症、修飾皮膚損傷、毛細血管拡張、色素脱失、色素沈着過剰、小胞／水疱、発疹、皮膚薬物反応、丘疹結節皮膚損傷、慢性不治傷、光過敏症、単純型表皮水疱症、表皮剥離性角質増殖症、表皮溶解性掌蹠角皮症および非表皮溶解性掌蹠角皮症、シーメンス水疱性魚鱗癬、剥脱性魚鱗癬、手掌角化症および足底角化症、掌蹠角化症、掌蹠角皮症、点状角化症、メースマン角膜ジストロフィー、先天性爪肥厚、白色海綿状母斑、多発性皮脂嚢腫症、上皮性母斑／表皮溶解性角質増殖型、連珠毛、裂毛症、慢性肝炎／特発性肝硬変、および、結腸直腸過形成が含まれ、神経の疾患の中には、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキソン病及びその他の錐体外路障害、筋萎縮性側策硬化及びその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患、プリオン病（クールー、クロイツフェルト‐ヤコブ病、ゲルストマン症候群、及びGerstmann-Straussler-Scheinker症候群を含む）、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管芽腫（cerebelloretinal hemangioblastomatosis）、脳３叉神経血管症候群、ダウン症候群を含む中枢神経系性の精神薄弱及び他の発生障害、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄障害、筋ジストロフィー及びその他の神経筋障害、末梢神経疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎、遺伝性、代謝性、内分泌性、及び中毒性の筋疾患、重症筋無力症、周期性四肢麻痺、精神病（気分性、不安性の障害、分裂病性疾患）、季節性障害（SAD）、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群、ジストニー、分裂病性精神障害、帯状疱疹後神経痛、及びトゥーレット病と、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核部変性症、及び家族性の前頭側頭性健忘症とが含まれ、生殖系疾患には、プロラクチン産生障害、不妊症（卵管疾患、排卵欠損症、子宮内膜症）、性周期障害、月経周期障害、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣過刺激症候群、子宮内膜癌、卵巣癌、子宮筋腫、自己免疫疾患、子宮外妊娠、催奇形、乳がん、繊維嚢胞性乳房疾患、乳漏症、精子形成破壊、精子異常生理、精巣癌、前立腺癌、良性前立腺肥大、前立腺炎、パイロニー病、性交不能、男性乳癌、女性化乳房が含まれる。PMMMをコードするポリヌクレオチドは、サザーン法やノーザン法、ドットブロット法、或いはその他の膜系の技術、PCR法、ディップスティック（dipstick）、ピン（pin）、およびマルチフォーマットのELISA式アッセイ、および、変容したPMMM発現を検出するために患者から採取した体液或いは組織を利用するマイクロアレイに使用可能である。このような定性方法または定量方法は、当分野で公知である。
【０３４０】
或る特定の実施態様では、PMMMをコードするポリヌクレオチドは、関連する疾患、特に前記したこれらを検出するアッセイにおいて有用であり得る。PMMMをコードする配列に相補的なポリヌクレオチドを、標準的な方法で標識化し、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件の下、患者から採取した体液或いは組織のサンプルに加えることができる。好適なインキュベーション期間が経過したらサンプルを洗浄し、シグナルを定量して標準値と比較する。患者のサンプルのシグナルの量が対照サンプルに比較して著しく変化している場合は、そのサンプル内のPMMMをコードするポリヌクレオチド群のレベル変化の存在により、関連する疾患の存在が明らかになる。このようなアッセイは、動物実験、臨床試験における特定の治療効果を評価するため、あるいは個々の患者の治療をモニターするために用いることもできる。
【０３４１】
PMMMの発現に関連する疾患の診断の基準となるものを提供するために、発現の正常すなわち標準的なプロファイルが確立される。これは、ハイブリダイゼーション或いは増幅に好適な条件下で、動物或いはヒトの何れかの正常な被験者から抽出された体液或いは細胞と、PMMMをコードする配列或いはその断片とを結合させることにより達成され得る。実質的に精製されたポリヌクレオチドを既知量で用いて行った実験から得た値を正常な被検体から得た値と比較することにより、標準ハイブリダイゼーションを定量することができる。このようにして得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得たサンプルから得た値と比較することができる。標準値からの偏差を用いて疾患の存在を確定する。
【０３４２】
障害の存在が確定されて治療プロトコルが開始されると、患者の発現レベルが正常な被検者に観察されるレベルに近づき始めたかどうかを測定するため、ハイブリダイゼーションアッセイを定期的に繰り返し得る。経時的なアッセイから得られた結果を用いて、数日から数ヶ月の期間にわたる治療の効果を示し得る。
【０３４３】
癌に関しては、個体からの生検組織における異常な量の転写物（過少発現または過剰発現）の存在は、疾患の発生素質を示したり、実際に臨床症状が現れる前に疾患を検出する方法を提供し得る。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防処置または積極的な治療法を早くから利用し、それによって癌の発生または更なる進行を防止することが可能となる。
【０３４４】
PMMM をコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドのさらなる診断への利用には、PCRの利用が含まれ得る。これらのオリゴマーは、化学的に合成するか、酵素により生産するか、あるいはin vitroで産出し得る。オリゴマーは、好ましくはPMMMをコードするポリヌクレオチドの断片、或いはPMMMをコードするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、最適な条件下で、特定の遺伝子や条件を識別するために利用される。また、オリゴマーは、やや緩いストリンジェンシー条件下で、近縁のDNAあるいはRNA配列の検出、定量、あるいはその両方のため用いることが可能である。
【０３４５】
或る特定態様で、PMMMをコードするポリヌクレオチド群に由来のオリゴヌクレオチドプライマー類を用い一塩基多型(SNP)を検出し得る。SNPは、多くの場合にヒトの先天性または後天性遺伝病の原因となるような置換、挿入及び欠失である。限定はされないがSNPの検出法は、SSCP（single-stranded conformation polymorphism:一本鎖高次構造多型）と蛍光SSCP（fSSCP）がある。SSCPでは、PMMMをコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）でDNAを増幅する。このDNAは例えば、患部組織または正常組織、生検サンプル、体液などに由来し得る。ＤＮＡ内のＳＮＰは、一本鎖形状のＰＣＲ生成物の２次及び３次構造に差異を生じさせる。差異は非変性ゲル中でのゲル電気泳動法を用いて検出可能である。fSSCPでは、オリゴヌクレオチドプライマーを蛍光性に標識する。それによってＤＮＡシークエンシング機などの高処理機器でアンプリマー（amplimer）の検出が可能になる。更に、インシリコSNP（in silico SNP, isSNP）と呼ばれる配列データベース分析法は、共通のコンセンサス配列へアセンブリされるような個々のオーバーラップするDNA断片群の配列を比較することにより、多型性を同定し得る。これらのコンピュータベースの方法は、DNAの実験室での調製に、または統計モデルとDNA配列クロマトグラムの自動分析とを用いたシークエンシングのエラーに起因する配列変異を、フィルタリングして除去する。別の態様では、例えば高処理MASSARRAYシステム（Sequenom, Inc., San Diego CA）を用いた質量分析によりSNPを検出し、特徴付ける。
【０３４６】
SNPを利用して、ヒト疾患の遺伝的基礎を研究しうる。例えば少なくとも16種の一般的SNPが、インスリン非依存型糖尿病と関連している。SNPはまた、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血、慢性肉芽腫症等の単一遺伝子病の転帰の違いを研究するために有用である。例えば、マンノース結合レクチンであるMBL2における変異体群は、嚢胞性線維症における有害な肺の転帰との相関が示されている。SNPはまた、薬理ゲノム学においても有用性を持つ。薬理ゲノム学は、患者の薬物への応答（例えば命を脅かす毒性）に影響する遺伝的変異体の同定を行う。例えばNアセチル転移酵素における或る変異は、抗結核薬であるイソニアジドに応答しての末梢ニューロパシーの高い発症率と関連する。一方、ALOX5遺伝子のコアプロモータにおける或る変異の結果、5-リポキシゲナーゼ経路を標的とする或る抗喘息薬での治療に対する臨床応答が低下する。異なる集団群におけるSNPの分布の分析は、遺伝的浮動、突然変異、遺伝子組換え、遺伝子選択の調査に有用であり、集団の起源とその移動との追跡にも有用である(Taylor, J.G.他(2001) Trends Mol. Med. 7:507-512、Kwok, P.-Y.およびZ. Gu (1999) Mol. Med. Today 5:538-543、Nowotny, P. 他(2001) Curr. Opin. Neurobiol. 11:637-641)。
【０３４７】
PMMMの発現を定量するために用い得る方法には、ヌクレオチドの放射標識またはビオチン標識、調節核酸の相互増幅（coamplification）、及び標準曲線から得た結果の補間もある(Melby, P.C.他(1993) J. Immunol. Methods 159:235-244、Duplaa, C.他(1993) Anal. Biochem. 212:229-236)。当該のオリゴマーまたはポリヌクレオチドが種々の希釈度で存在し、分光応答または比色反応によって定量が迅速になるような高処理フォーマットのアッセイを行うことによって、複数サンプルの定量速度を加速できる。
【０３４８】
更に別の実施態様では、本願に記載した任意のポリヌクレオチドに由来するオリゴヌクレオチドまたはより長い断片を、或るマイクロアレイにおけるエレメント群として用いることができる。多数の遺伝子の相対発現レベルを同時にモニターする転写イメージング技術にマイクロアレイを用いることが可能である。これについては、以下に記載する。マイクロアレイはまた、遺伝変異体、突然変異および多型性の同定に用いることができる。この情報を用いることで、遺伝子機能を決定し、疾患の遺伝的根拠を理解し、疾患を診断し、遺伝子発現の機能としての疾病の進行／退行をモニターし、疾病治療における薬物の活性を開発およびモニターすることができる。特に、患者にとって最もふさわしく、有効な治療法を選択するために、この情報を用いて患者の薬理ゲノムプロファイルを開発することができる。例えば、患者の薬理ゲノムプロファイルに基づき、患者に対して高度に効果的で副作用の最も少ない治療薬を選択することができる。
【０３４９】
別の実施例では、PMMM、PMMMの断片、PMMMに特異的な抗体をマイクロアレイ上のエレメントとして用いることができる。マイクロアレイを用いて、上記のようなタンパク質間相互作用、薬物−標的相互作用および遺伝子発現プロファイルをモニターまたは測定できる。
【０３５０】
或る実施態様は、或る組織または細胞タイプの転写イメージを作製する、本発明のポリヌクレオチドの使用に関連する。転写イメージは、特定の組織または細胞タイプによる、遺伝子発現の包括的パターンを表す。包括的遺伝子発現パターンは、所与の条件下で所与の時間に発現した遺伝子の数および相対存在量を定量することにより分析し得る（Seilhamer 他の米国特許第5,840,484号 「Comparative Gene Transcript Analysis」は特に引用することを以って本明細書の一部となす）。従って、特定の組織または細胞タイプの転写物または逆転写物全体に本発明のポリヌクレオチドまたはその相補体をハイブリダイズすることにより、転写イメージを生成し得る。一実施態様では、本発明のポリヌクレオチドまたはそれらの相補体が１マイクロアレイ上に複数エレメントの１サブセットを持つような高処理フォーマットでハイブリダイゼーションを発生させる。結果として得られる転写イメージは、遺伝子活性のプロファイルを提供するであろう。
【０３５１】
転写イメージは、組織、細胞株、生検、または他の生体サンプルから単離した転写物を用いて作製し得る。転写イメージはしたがって、組織または生検サンプルの場合にはin vivo、細胞株の場合にはin vitroでの遺伝子発現を反映する。
【０３５２】
本発明のポリヌクレオチドの発現のプロファイルを作製する転写イメージはまた、in vitroモデル系および医薬品の前臨床評価に、あるいは工業的または天然の環境化合物の毒性試験に関連して使用し得る。全ての化合物は、作用および毒性のメカニズムを標示し、しばしば分子フィンガープリントまたは毒性シグネチャ(toxicant signatures)と称される、特徴的な遺伝子発現パターンを惹起する（Nuwaysir, E.F. 他(1999) Mol. Carcinog. 24:153-159; Steiner, S.およびN.L. Anderson (2000) Toxicol. Lett. 112-113:467-471)。試験化合物が、既知の毒性を有する化合物のシグネチャと同様のシグネチャを有する場合には、毒性特性を共有している可能性がある。フィンガープリントまたはシグネチャは、多数の遺伝子および遺伝子ファミリからの発現情報を含んでいる場合に、最も有用且つ精緻である。理想的には、ゲノム全域にわたる発現の測定が、最高品質のシグネチャを提供する。たとえ発現が任意の試験された化合物によって変容しない遺伝子があったとしても、それらの発現レベルを残りの発現データをノーマライズするために使用できるため、それらの遺伝子も重要である。ノーマライズ手順は、種々の化合物で処理した後の発現データの比較に有用である。或る毒性シグネチャのエレメント群に遺伝子機能を割り当てることは毒性機序の解釈に役立つが、毒性の予測につながる、シグネチャ群の統計的マッチングには、遺伝子機能の知識は必要でない(例えばNational Institute of Environmental Health SciencesのPress Release 00-02、2000年2月29日, http://www.niehs.nih.gov/oc/news/toxchip.htm参照)。したがって、毒性シグネチャを用いる中毒学的スクリーニングの際に、全ての発現した遺伝子配列を含めることは、重要且つ望ましい。
【０３５３】
或る実施態様では、核酸を有する生体サンプルを試験化合物で処理することにより、この試験化合物の毒性を算定しうる。処理した生体サンプル中で発現した核酸は、本発明のポリヌクレオチドに特異的な１つ以上のプローブでハイブリダイズし、それによって本発明のポリヌクレオチドに対応する転写物レベルを定量し得る。処理した生体サンプル中の転写レベルを、無処理生体サンプル中のレベルと比較する。両サンプルの転写物レベルの差は、処理されたサンプル中で試験化合物が引き起こす毒性反応を示す。
【０３５４】
別の実施態様は、本発明で開示するポリペプチド群を用いた、或る組織または細胞タイプのプロテオームの分析に関する。プロテオームの語は、特定の組織または細胞タイプでのタンパク質発現の包括的パターンを指す。プロテオームの各タンパク質成分は、個々に更なる分析にかけることができる。プロテオーム発現パターンすなわちプロファイルは、所与の条件下で所与の時間に発現したタンパク質の数および相対存在量を定量することにより分析する。したがって、或る細胞のプロテオームのプロファイルは、特定の組織または細胞タイプのポリペプチドを分離および分析することにより作成し得る。或る実施態様では、１次元等電点電気泳動によりサンプルからタンパク質を分離し、２次元ドデシル硫酸ナトリウムスラブゲル電気泳動により分子量に応じて分離するような２次元ゲル電気泳動により、分離が達成される（前出SteinerおよびAnderson）。タンパク質は、通常はクーマシーブルー、あるいは銀染色液または蛍光染色液などの物質を用いてゲルを染色することにより、分散した、独自の位置にある点としてゲル中で可視化される。各タンパク質スポットの光学密度は、通常、サンプル中のタンパク質レベルに比例する。異なるサンプル、例えば試験化合物または治療薬で処理または未処理のいずれかの生体サンプルからの、同等に位置したタンパク質スポットの光学密度を比較し、処理に関連するタンパク質スポット密度の変化を同定する。スポット内のタンパク質は、例えば化学的または酵素的切断とそれに続く質量分析を用いる標準的な方法を用いて部分的にシークエンシングする。或るスポット内のタンパク質の同一性は、その部分配列を、好適には少なくとも５個の連続するアミノ酸残基を、当該のポリペプチド配列と比較することにより決定し得る。場合によっては、決定的なタンパク質同定のための更なる配列データが得られる。
【０３５５】
プロテオームのプロファイルは、PMMM に特異的な抗体を用いてPMMM 発現レベルを定量することによっても作成可能である。或る実施態様では、マイクロアレイ上のエレメントとしてこれら抗体を用い、マイクロアレイをサンプルに曝して各アレイエレメントへのタンパク質結合レベルを検出することにより、タンパク質発現レベルを定量する（Lueking, A. 他(1999) Anal. Biochem. 270:103-111、Mendoze, L.G.他(1999) Biotechniques 27:778-788)。検出は当分野で既知の様々な方法で行うことができ、例えば、チオール反応性またはアミノ反応性蛍光化合物とサンプル中のタンパク質を反応させ、各アレイエレメントにおける蛍光結合の量を検出し得る。
【０３５６】
プロテオームレベルでの毒性シグネチャも中毒学的スクリーニングに有用であり、転写レベルでの毒性シグネチャと並行に分析するべきである。いくつかの組織のいくつかのタンパク質については、転写物の存在量とタンパク質の存在量との相関が乏しいので（Anderson, N.L. および J. Seilhamer（1997）Electrophoresis 18:533-537）、転写イメージにはそれ程影響しないがプロテオームのプロファイルを改変するような化合物の分析において、プロテオーム毒性シグネチャは有用たり得る。更に、体液中の転写物の分析はmRNAの急速な分解のために困難なので、プロテオームのプロファイル作成はこのような場合により信頼でき、情報価値があり得る。
【０３５７】
別の実施態様では、タンパク質を含有する生体サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。処理された生体サンプル中で発現したタンパク質は、各タンパク質の量を定量し得るように分離する。各タンパク質の量を、未処理生物学的サンプル中の対応するタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質の量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する毒性反応を標示する。個々のタンパク質は、個々のタンパク質のアミノ酸残基をシークエンシングし、これら部分配列を本発明のポリペプチドと比較することにより同定する。
【０３５８】
別の実施態様では、タンパク質を含有する生体サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。生体サンプルから得たタンパク質は、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を用いてインキュベートする。抗体により認識されたタンパク質の量を定量する。処理された生物学的サンプル中のタンパク質の量を、未処理生物学的サンプル中のタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質の量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する毒性反応を標示する。
【０３５９】
マイクロアレイは、本技術分野で既知の方法で調製、使用し、分析しうる（Brennan, T.M. 他（1995）米国特許第5,474,796号、Schena, M. 他（1996）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619、Baldeschweiler 他（1995）PCT出願第WO95/251116号、Shalon, D.他（1995）PCT出願第WO95/35505号、Heller, R.A. 他(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2150-2155; Heller, M.J.他(1997) 米国特許第5,605,662号）。様々なタイプのマイクロアレイが公知であり、詳細については、Schena, M 編集(1999; DNA Microarrays:A Practical Approach, Oxford University Press, London)。
【０３６０】
本発明の別の実施例ではまた、PMMM をコードする核酸配列を用いて、天然のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを作製することが可能である。コード配列または非コード配列のいずれかを用いることができ、或る例では、コード配列より非コード配列の方が好ましい。例えば、多重遺伝子族のメンバー内でのコード配列の保存により、染色体マッピング中に望ましくないクロスハイブリダイゼーションが生じる可能性がある。核酸配列は、特定の染色体、染色体の特定領域または人工染色体構成、例えばヒト人工染色体（HAC）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC）、細菌P1構成、或いは単一染色体cDNAライブラリに対してマッピングされる(Harrington, J.J.他(1997) Nat. Genet. 15:345-355; Price, C.M. (1993) Blood Rev. 7:127-134; Trask, B.J. (1991) Trends Genet.7:149-154)。一度マッピングすると、核酸配列群を用いて、例えば或る病状の遺伝を特定染色体領域の遺伝とまたは制限酵素断片長多型(RFLP)と相関させるような遺伝子連鎖地図を開発し得る(Lander, E.S.およびD. Botstein (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7353-7357)。
【０３６１】
蛍光切片上ハイブリッド形成(FISH)は、他の物理地図および遺伝地図データと相関し得る(Heinz-Ulrich他(1995) in Meyers前出965-968ページ）。遺伝地図データの例は、種々の科学雑誌あるいはOnline Mendelian Inheritance in Man（OMIM）のウェブサイトに見られる。物理的な染色体地図上のPMMM をコードする遺伝子の位置と、特定の疾患との相関性、あるいは特定の疾患に対する素因との相関性は、この疾患と関連するDNAの領域の決定に役立ち得るため、ポジショナルクローニングの作業を促進し得る。
【０３６２】
確定した染色体マーカー類を用いた連鎖解析などの物理的マッピング技術、および染色体標本の切片上ハイブリッド形成法を用いて、遺伝地図を拡張することができる。例えばマウスなど別の哺乳類の染色体上に遺伝子を配置することにより、正確な染色体上の遺伝子座が未知でも、関連するマーカー類をしばしば明らかにし得る。この情報は、ポジショナルクローニングなどの遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を探る研究者にとって価値がある。いったん疾患または症候群に関与する遺伝子（群）が、血管拡張性失調症の11q22-23領域など、特定のゲノム領域へ遺伝連鎖によって大まかに限局されると、該領域にマップされる任意の配列は、更なる調査のための関連遺伝子あるいは制御遺伝子を提示している可能性がある(Gatti, R.A.他(1988) Nature 336:577-580)。転座、反転などに起因する、健常者、保因者、罹病者の三者間における染色体位置の相違を検出する場合にも、本発明のヌクレオチド配列を用い得る。
【０３６３】
本発明の別の実施例では、PMMM、その触媒作用断片或いは免疫原断片またはそのオリゴペプチドを、種々の任意の薬剤スクリーニング技術における化合物のライブラリのスクリーニングに用いることができる。薬物スクリーニングに用いる断片は、溶液中に遊離しているか、固体支持体に固定されるか、細胞表面上に保持されるか、細胞内に位置しうる。PMMM と検査する薬剤との結合による複合体の形成を測定してもよい。
【０３６４】
別の薬物スクリーニング技術は、当該のタンパク質に対して好適な結合親和性を有する化合物を高い処理能力でスクリーニングするために用いられる(Geysen他（1984）PCT出願WO84/03564）。この方法においては、多数の様々な低分子の試験用化合物を固体基板上で合成する。試験用化合物は、PMMM、或いはその断片と反応してから洗浄する。次ぎに、結合されたPMMM が、当分野で周知の方法で検出される。 精製されたPMMM はまた、前記した薬剤をスクリーニングする技術に用いられるプレート上で直接被覆することもできる。別法では、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持体に固定することもできる。
別の実施例では、PMMM と結合可能な中和抗体がDMEと結合するため試験用化合物と特に競合する、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる。この方法では、抗体が、PMMMと１つ以上の抗原決定因子を共有するどのペプチドの存在も検出する。
【０３６５】
別の実施例では、発展途上の分子生物学技術にPMMM をコードするヌクレオチド配列を用いて、限定はされないが、現在知られているトリプレット暗号及び特異的な塩基対相互作用などのヌクレオチド配列の特性に依存する新しい技術を提供することができる。
【０３６６】
更に詳細説明をしなくとも、当業者であれば以上の説明を以って本発明を最大限に利用できるであろう。従って、これ以下に記載する実施例は単なる例示目的にすぎず、いかようにも本発明を限定するものではない。
【０３６７】
本明細書において開示した全ての特許、特許出願及び刊行物、特に米国特許第60/329,689号、第60/335,703号、第60/348,887号、第60/334,145号、第60/337,451号、および第60/340,584号は、言及することをもって本明細書の一部となす。
【実施例】
【０３６８】
１  cDNAライブラリの作製
Incyte cDNA群の由来は、LIFESEQ GOLDデータベース (Incyte Genomics, Palo Alto CA)に記載されたcDNAライブラリ群である。幾つかの組織はホモジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネートに溶解し、他の組織はホモジナイズしてフェノールにまたは変性剤群の好適な混合液に溶解した。混合液の１例であるTRIZOL（Invitrogen）は、フェノールとグアニジンイソチオシアネートとの一相溶液である。結果として得た溶解物は、塩化セシウムのクッション液の上に重層して遠心分離するか、クロロフォルムで抽出した。イソプロパノールか、酢酸ナトリウムとエタノールか、いずれか一方、あるいは別の慣例的方法で、溶解物からRNAを沈殿させた。
【０３６９】
RNAの純度を高めるため、フェノールによるRNAの抽出および沈殿を、必要な回数繰り返した。場合によっては、DNアーゼでRNAを処理した。殆どのライブラリでは、オリゴd（T）連結常磁性粒子（Promega）、OLIGOTEXラテックス粒子（QIAGEN, Chatsworth CA）またはOLIGOTEX mRNA精製キット（QIAGEN）を用いて、ポリ（A）+RNAを単離した。別法では、別のRNA単離キット、例えばPOLY（A）PURE mRNA精製キット（Ambion, Austin TX）を用いて、組織溶解物からRNAを直接単離した。
【０３７０】
場合によってはStratagene社にRNAを提供し、同社が、対応するcDNAライブラリ群を作製した。そうでない場合は、UNIZAPベクターシステム（Stratagene）またはSUPERSCRIPTプラスミドシステム（Invitrogen）を用いて本技術分野で既知の推奨方法または類似の方法でcDNAを合成し、cDNAライブラリを作製した（前出Ausubel他、5章）。逆転写は、オリゴd（T）またはランダムプライマーを用いて開始した。合成オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖cDNAに連結し、好適な制限酵素または酵素群でcDNAを消化した。殆どのライブラリに対しcDNAのサイズ選択（300〜1000bp）には、SEPHACRYL S1000、SEPHAROSE CL2BまたはSEPHAROSE CL4Bカラムクロマトグラフィ（Amersham Biosciences）、あるいは分取用アガロースゲル電気泳動法を用いた。cDNAは好適なプラスミドのポリリンカーの、適合する制限酵素部位にライゲーションした。好適なプラスミドは、例えばPBLUESCRIPTプラスミド（Stratagene）、PSPORT1プラスミド（Invitrogen）PCDNA2.1プラスミド（Invitrogen）、PBK-CMVプラスミド（Stratagene）、PCR2−TOPOTAプラスミド（Invitrogen）、PCMV-ICISプラスミド（Stratagene）、pIGEN（Incyte Genomics, Palo Alto CA）、pRARE(Incyte Genomics)、またはplNCY（Incyte Genomics）、またはこれらの誘導体である。組換えプラスミドは、Stratagene社のXL1-Blue、XL1-BIueMRFまたはSOLR、あるいはInvitrogen社のDH5α、DH10BまたはElectroMAX DH10Bなど適格な大腸菌細胞に形質転換した。
【０３７１】
2  cDNAクローンの単離
実施例１のようにして得たプラスミドの、宿主細胞からの回収は、UNIZAPベクターシステム（Stratagene）を用いたin vivo切除によって、あるいは細胞溶解によって行った。プラスミドを精製する方法は、MagicまたはWIZARD Minipreps DNA精製システム（Promega）、AGTC Miniprep精製キット（Edge Biosystems, Gaithersburg MD）、QIAGEN社のQIAWELL 8 Plasmid、QIAWELL 8 Plus PlasmidおよびQIAWELL 8 Ultra Plasmid 精製システム、R.E.A.L. Prep 96プラスミド精製キットの中から少なくとも１つを用いた。プラスミドは、沈殿させた後、0.1mlの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥せずに４℃で保管した。
【０３７２】
別法ではハイスループットフォーマットで直接結合PCRを用い、宿主細胞溶解物からプラスミドDNAを増幅した(Rao, V.B.(1994)Anal. Biochem. 216:1-14)。宿主細胞の溶解および熱サイクリング過程は、単一反応混合液中で行った。サンプルをプロセスして384穴プレート内で保管し、増幅したプラスミドDNAの濃度をPICOGREEN色素（Molecular Probes, Eugene OR）およびFLUOROSKAN II蛍光スキャナ（Labsystems Oy, Helsinki, Finland）を用いて蛍光分析的に定量した。
【０３７３】
3  シークエンシング及び分析
実施例２に記載したようにプラスミド中に回収したIncyte cDNAを、以下に示すようにシークエンシングした。シークエンス反応は、標準的方法あるいは高処理装置、例えばABI CATALYST 800 サーマルサイクラー（Applied Biosystems）またはPTC-200 サーマルサイクラー（MJ Research）を、HYDRAマイクロディスペンサー（Robbins Scientific）またはMICROLAB 2200（Hamilton）液体転移システムと併用して処理した。cDNAのシークエンス反応は、Amersham Biosciences社が提供する試薬、またはABIシークエンシングキット、例えばABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reaction kit（Applied Biosystems）の試薬を用いて準備した。cDNAのシークエンス反応の電気泳動的分離と、標識したポリヌクレオチドの検出とには、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム（Amersham Biosciences）か、標準ABIプロトコルとベースコーリングソフトウェアとを用いるABI PRISM 373または377シークエンシングシステム（Applied Biosystems）か、あるいはその他の本技術分野で既知の配列解析システムを用いた。cDNA配列内のリーディングフレームは、標準的方法（前出Ausubel他、7章）を用いて同定した。いくつかのcDNA配列を選択し、実施例８に開示する技術で配列を伸長させた。
【０３７４】
Incyte cDNAに由来のポリヌクレオチド配列は、ベクター、リンカーおよびポリ(A)配列を除去し、あいまいな塩基をマスクして検証した。その際、BLASTと、動的プログラミングと、隣接ジヌクレオチド分析(dinucleotide nearest neighbor analysis)とに基づく、アルゴリズムとプログラムとを用いた。次に、Incyte cDNA配列またはそれらの翻訳の問い合わせを、以下のデータベース群に対して行った。すなわち、選抜した公共のデータベース群(例えばGenBankの霊長類、げっ歯類、哺乳類、脊椎動物、真核生物のデータベースと、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM)と、ヒト、ラット、マウス、線虫(Caenorhabditis elegans)、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)、分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe)およびCandida albicansからの配列群を持つPROTEOMEデータベース群(Incyte Genomics, Palo Alto CA)、および、隠れマルコフモデル(HMM)ベースのタンパク質ファミリーデータベース群、例えばPFAM、INCY、およびTIGRFAM (Haft, D.H. 他(2001) Nucleic Acids Res.29:41-43)、並びにHMMベースのタンパク質ドメインデータベースたとえばSMART(Schultz. J.他(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:5857-5864; Letunic, I. 他(2002) Nucleic Acids Res.30:242-244）。（HMMは、遺伝子ファミリーのコンセンサス１次構造を分析する確率的アプローチである。例えば、Eddy, S.R. (1996) Curr. Opin. Struct. Biol. 6:361-365を参照）。問合せは、BLAST、FASTA、BLIMPS、およびHMMERに基づくプログラムを用いて行った。Incyte cDNA配列をアセンブリし、完全長のポリヌクレオチド配列を産出した。あるいは、GenBank cDNA群、GenBank EST群、スティッチされた配列群、ストレッチされた配列群、またはGenscan予測コード配列群（実施例４および５を参照）を用い、Incyte cDNAのアセンブリ体群を完全長まで伸長させた。PhredとPhrapとConsedとに基づくプログラムを用いてアセンブリし、GenMarkとBLASTとFASTAとに基づくプログラムを用いて、cDNAのアセンブリ体を、オープンリーディングフレームについてスクリーニングした。完全長ポリヌクレオチド配列を翻訳し、対応する完全長ポリペプチド配列を得た。あるいは、或るポリペプチドは、完全長翻訳ポリペプチドの任意のメチオニン残基で開始し得る。完全長ポリペプチド配列群の続いての分析としての問い合わせを、GenBankタンパク質データベース群（genpept）、SwissProt、PROTEOMEデータベース群、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOMおよびProsite等のデータベースや、PFAM、INCY、およびTIGRFAM等の隠れマルコフモデル（HMM）ベースのタンパク質ファミリーデータベース群、並びにSMART等のHMMベースのタンパク質ドメインデータベース群に対し行った。完全長ポリヌクレオチド配列はまた、MACDNASIS PROソフトウェア（MiraiBio, Alameda CA）およびLASERGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いて分析する。ポリヌクレオチドとポリペプチドとの配列アラインメントは、MEGALIGNマルチシークエンスアラインメントプログラム（DNASTAR）に組込まれたCLUSTALアルゴリズムが指定する、デフォルトパラメータを用いて作製する。これは、アラインメントした配列間の一致率も計算する。
【０３７５】
表７は、Incyte cDNAと完全長配列との分析とアセンブリとに用いたツールとプログラムとアルゴリズムとの概略と、適用可能な説明、参照文献、閾値パラメータを示す。用いたツール、プログラム及びアルゴリズムを表７の列１に、それらの簡単な説明を列２に示す。列３は好適な参照文献であり、全ての文献の全体が、この参照により開示に含まれる。適用可能な場合には、列４は２つの配列が一致する強さを評価するために用いたスコア、確率値その他のパラメータを示す（スコアが高いほど、または確率値が低いほど、２配列間の相同性が高くなる）。
【０３７６】
完全長ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列のアセンブリ及び分析に用いる上記のプログラムは、SEQ ID NO:41-80のポリヌクレオチド配列断片の同定にも利用できる。 ハイブリダイゼーション及び増幅技術に有用である約２０〜約４０００ヌクレオチドの断片を表４の列2に示した。
【０３７７】
4  ゲノムDNAからのコード配列の同定及び編集
推定上のタンパク質修飾および維持分子類の同定には、先ずGenscan遺伝子同定プログラムを、公共のゲノム配列データベース(例えば、gbpriやgbhtg)に対して実行した。Genscanは汎用遺伝子同定プログラムであり、様々な生物からのゲノムDNA配列を分析する（Burge, C. および S. Karlin（1997）J. Mol. Biol. 268:78-94、Burge, C. および S. Karlin（1998）Curr. Opin. Struct. Biol. 8:346-354）。このプログラムは予測されたエキソン群を連結し、メチオニンから終止コドンに及ぶ、アセンブリされたcDNA配列を形成する。Genscanの出力は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列のFASTAデータベースである。Genscanが一度に分析する配列の最大範囲は、３０kbに設定した。これらのGenscan予測cDNA配列の内、どの配列がタンパク質修飾および維持分子をコードするかを判定するために、コードされるポリペプチドを、PFAMモデル群に対し、タンパク質修飾および維持分子について問合せて分析した。潜在的なタンパク質修飾および維持分子はまた、既にタンパク質修飾および維持分子としてアノテーションが付けられたIncyte cDNA配列に対する相同性を基に同定された。これら選択したGenscan予測配列を、次にBLAST分析により、公共データベースgenpeptおよびgbpriと比較した。必要であれば、genpeptからのトップBLASTヒットと比較することによりGenscan予測配列を編集し、余分なまたは省略されたエキソンなど、Genscanが予測した配列におけるエラーを補正した。BLAST分析はまた、Genscan予測配列の、いかなるIncyte cDNAまたは公共cDNA適用範囲の発見にも用いられ、したがって転写の証拠を提供した。Incyte cDNAカバレッジが利用できた場合には、この情報を用いてGenscan予測配列を補正または確認した。完全長ポリヌクレオチド配列は、実施例３に記載のアセンブリプロセスを用い、Incyte cDNA配列および／または公共cDNA配列でGenscan予測コード配列をアセンブリして得た。あるいは、完全長ポリヌクレオチド配列は、編集後または非編集のGenscan予測コード配列に、完全に由来する。
【０３７８】
5  ｃDNA配列データを使ったゲノム配列データのアセンブリ
スティッチ配列（Stitched Sequence）
部分cDNA配列群を伸長させるため、実施例４に記載のGenscan遺伝子同定プログラムが予測したエキソン群を用いた。実施例３に記載したようにアセンブリした部分cDNA群を、ゲノムDNAにマッピングし、また、関連するcDNA群と、１つ以上のゲノム配列からGenscan予測されたエキソン群とを有するクラスター群に分解した。cDNAとゲノムとの情報を統合すべく、グラフ理論および動的プログラミングに基づく或るアルゴリズムを用いて各クラスタを分析し、潜在的スプライス変異体群を生成した。配列群を続いて確認、編集または伸長し、完全長配列を創出した。区間の全長が、２つ以上の配列に在るような配列区間群をクラスター内で同定し、そのように同定された区間群は、推移性により、等しいと考えた。例えば、或る区間が、１つのcDNAと２つのゲノム配列とに在る場合、３つの区間は全て等しいと考えた。このプロセスにより、無関係だが連続したゲノム配列群を、cDNA配列で結び合わせて架橋し得る。このようにして同定された区間を、親配列（parent sequence）に沿って現われる順にステッチアルゴリズムで縫い合わせ、可能な最も長い配列および変異配列を作製する。１種類の親配列に沿って続く区間間の連鎖（cDNA−cDNAまたはゲノム配列−ゲノム配列）は、親の種類を変える連鎖（cDNA−ゲノム配列）より優先した。結果として得たスティッチ配列群を翻訳し、BLAST分析で公共データベースgenpeptおよびgbpriと比較した。Genscanが予測した不正確なエキソン群は、genpeptからのトップBLASTヒットとの比較により補正した。必要な場合、追加cDNA配列群を用いるかゲノムDNAの検査により、配列群を更に伸長させた。
【０３７９】
ストレッチ配列（Stretched Sequence）
部分DNA配列群を、BLAST分析に基づく１アルゴリズムで完全長まで伸長した。先ず、BLASTプログラムを用い、GenBankの霊長類、げっ歯類、哺乳類、脊椎動物および真核生物のデータベースなどの公共データベースに対し、実施例３に記載のようにアセンブリした部分cDNAを問い合わせた。次に、最も近いGenBankタンパク質相同体を、BLAST分析により、Incyte cDNA配列または実施例４に記載のGenScanエキソン予測配列のいずれかと比較した。得られた高スコアリングセグメント対（HSP）を用いてキメラ蛋白質を産出し、翻訳した配列をGenBank蛋白質相同体上にマッピングした。元のGenBankタンパク質相同体に対し、キメラタンパク質内では挿入または欠失が起こり得る。GenBankタンパク質相同体、キメラタンパク質またはその両方をプローブとして用い、公共のヒトゲノムデータベースから相同ゲノム配列を検索した。このようにして、部分的なDNA配列を、相同ゲノム配列の付加によりストレッチすなわち伸長した。結果として得られるストレッチ配列を検査し、完全遺伝子を有するか否かを判定した。
【０３８０】
６  PMMMをコードするポリヌクレオチドの染色体マッピング
SEQ ID NO:41-80をアセンブリするために用いた配列を、BLAST及びSmith-Watermanアルゴリズムを用いて、Incyte LIFESEQデータベース及び公共のドメインデータベースの配列と比較した。SEQ ID NO:41-80 と一致するこれらのデータベースの配列を、Phrapなどのアセンブリアルゴリズム（表７）を使用して、連続及びオーバーラップした配列のクラスターにアセンブリした。スタンフォード・ヒトゲノムセンター（SHGC）、ホワイトヘッド・ゲノム研究所（WIGR）、Genethonなどの公的な情報源から入手可能な放射線ハイブリッドおよび遺伝地図データを用いて、いずれかのクラスター化された配列が既にマッピングされているかを判定した。マッピングされた配列が或るクラスターに含まれている場合、そのクラスターの全配列が、個々の配列番号と共に、地図上の位置に割り当てられた。
【０３８１】
地図上の位置は、ヒト染色体の範囲または区間として表される。センチモルガン単位での或る区間の地図上の位置は、染色体の短腕（p-arm）の末端に対して測定する（センチモルガン（cM）は、染色体マーカー間の組換え頻度に基づく計測単位である。平均して、１cMは、ヒトDNAの１メガベース（Mb）にほぼ等しい。尤も、この値は、組換えのホットスポットおよびコールドスポットに起因して広範囲に変化する）。cM距離は、各クラスタ内に配列が含まれる放射線ハイブリッドマーカー類に対して境界を提供するGenethonによってマッピングされた遺伝マーカー群に基づく。NCBI「GeneMap'99」（http://www.ncbi.nlm.nih.gpv/genemap/）などの一般個人が入手可能なヒト遺伝子マップおよびその他の情報源を用いて、既に同定されている疾患遺伝子群が、上記した区間内若しくは近傍に位置するかを決定できる。
【０３８２】
PMMMポリヌクレオチドとパ―キンソン病との関連
数種の遺伝子は、常染色体優性型のパーキンソン病(PD)に連鎖を示すとして同定されている。PDは一般的な神経変性障害であり、運動緩慢、安静時振戦、筋強剛、および姿勢不安定を生じる。細胞質の好酸性封入体であるレビー小体と、ニューロン損失、特に黒質緻密部での損失が、PDの病理的特質である(Valente, E.M.他(2001) Am. J. Hum. Genet. 68:895-900)。レビー小体パーキンソン病は、特異的な常染色体優性疾患と思われている(Wakabayashi, K.他(1998) Acta Neuropath. 96:207-210)。若年性パーキンソニズムは、特異的な常染色体劣性疾患のようである(Matsumine, H.他(1997) Am. J. Hum. Genet. 60: 588-596, 1997) (Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM. Johns Hopkins University, Baltimore, MD. MIM Number: 168600: Sept. 9, 2002:ウェブURL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/)。
【０３８３】
或る疾患と染色体遺伝子座との関連はLODスコアによって判定できる。LODスコアは統計方法であり、これを用いて、遺伝病を持つ家系での2つ以上の遺伝子座の連鎖を試験する。lodスコアは、10を底とする、連鎖が存在する確率(odds)の対数である。連鎖の定義は、同一染色体上の2種の遺伝子が減数分裂を通じて共に遺伝される傾向である(Genetics in Medicine, 5版, (1991) Thompson, M.W.他 W.B. Saunders Co. Philadelphia)。Lodスコアが+3以上(連鎖の確率が1000:1 )の場合は、1000分の1の確率で特定のマーカーが影響を受けた個人に偶然に発見されることを示し、これは、二つの遺伝子座が関連している強力な証拠である。
【０３８４】
PDに関与するとされるこうした遺伝子の１つがPARK3で、2p13にマップされる(Gasser, T.他(1998) Nature Genet.18:262-265）。
染色体位置D2S441に在る或るマーカーは、lodスコア3.2をPARK3の領域に持つことがわかった。このマーカーは染色体区間D2S134〜D2S286に在るPARK3の疾患関連性を支持した(Gasser 他、前出)。第2染色体短腕上の83.88と94.05センチモルガンの間にマップされる染色体間隔D2S134とD2S286内に位置するマーカーは、D2S134 と D2S286の間の領域にマップされる遺伝子を同定するために使った。
【０３８５】
PMMMポリヌクレオチドは疾患または対象の他の生理学的過程に関連するマーカが位置する染色体領域内にマップされることが発見された。NCBIから入手できるゲノムコンティグを疾患遺伝子座にマップされるPMMMポリヌクレオチドの同定に使った。1Mbより長いコンティグは100kbの重複区分のあるIMｂの長さのサブコンティグに分解した。予備段階として、MEGABLAST (NCBI)に類似するアルゴリズムを用いてmRNA配列/マスクされたゲノムDNAコンティグ対形成を同定した。SIM4 (Florea, L. 他(1998) Genome Res. 8:967-74, 2000年5月バージョン)は高速処理用とストランド割当の信頼度のために最適化し、さらにｃDNA/ゲノム対形成の選択に用いた。SIM4選択のmRNA配列/ゲノムコンティグ対はさらに処理されて、ゲノムコンティグ上のPMMMポリヌクレオチドの正しい位置の決定とそのストランド同定を行った。
【０３８６】
ゲノムの9.65 Mb領域を網羅するSEQ ID NO:43は9.65 Mbのゲノム領域を網羅する2002年２月 GenbankリリースからのGBI:NT_005428_001.7にマップされたが、この領域にはPD関連遺伝子マーカーD2S134とD2S286をも含んでいる。したがって、SEQ ID NO:43とマーカーD2S134 および D2S286の間の最大距離は9.65 Mbである。このようにSEQ ID NO:43は一貫してPDと関連することを示す遺伝子マーカーに近接している。種々の実施例において、SEQ ID NO:43は以下の一つ以上に用いることができる。すなわち、i)2q12q22でのPD疾患領域へのヒトまたは家族の連鎖分析および、ii)骨関節炎およびインターロイキン発現の異常の診断的分析、並びにiii)PDのための薬物療法および/または他の治療の開発、である。
【０３８７】
7  ポリヌクレオチド発現の分析
ノーザン解析は遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験技術であり、特定の細胞種または組織からのRNAが結合している或る膜への、標識されたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを伴う(SambrookおよびRussell前出7章、Ausubel他前出4章)。
【０３８８】
類似の、BLASTを応用したコンピュータ技術を用いて、GenBankやLIFESEQ（Incyte Genomics）などのデータベースにおいて、同一または関連分子を検索した。ノーザン分析は、多数の膜系ハイブリダイゼーションよりも非常に速い。更に、任意の特定の一致を厳密なあるいは相同的なものとして分類するか否かを決定するため、コンピュータ検索の感度を修正できる。検索の基準は積スコアであり、次式で定義する。
【０３８９】
【数１】
2005507658.tif 000005
【０３９０】
積スコアは、2つの配列間の類似度と、配列が一致する長さとの両方を考慮している。積スコアは、0〜100のノーマライズされた値であり、次のようにして求める。BLASTスコアにヌクレオチドの配列一致率を乗じ、その積を2つの配列の短い方の長さの5倍で除する。BLASTスコアを計算するには、或る高スコアリングセグメント対（HSP）内の一致する各塩基に＋５のスコアを割り当て、各不一致塩基に−４を割り当てる。２つの配列は、２以上のHSPを共有し得る（ギャップにより隔離される）。２以上のHSPがある場合には、最高BLASTスコアのセグメント対を用いて積スコアを計算する。積スコアは、断片的オーバーラップとBLASTアラインメントの質とのバランスを表す。例えば積スコア１００は、比較した２つの配列の短い方の長さ全体にわたって１００％一致する場合のみ得られる。積スコア７０は、一端が１００％一致し、７０％オーバーラップしているか、他端が８８％一致し、１００％オーバーラップしているかのいずれかの場合に得られる。積スコア５０は、一端が１００％一致し、５０％オーバーラップしているか、７９％一致し、１００％オーバーラップしているかのいずれかの場合に得られる。
【０３９１】
或いは、PMMMをコードするポリヌクレオチドを、由来する組織に対して分析する。例えば幾つかの完全長配列は、少なくとも一部は、オーバーラップするIncyte cDNA配列群を用いてアセンブリする(実施例３を参照)。各cDNA配列は、ヒト組織から作製されたcDNAライブラリに由来する。各ヒト組織は、以下の臓器／組織カテゴリーの１つに分類される。すなわち心血管系、結合組織、消化器系、胎児構造、内分泌系、外分泌腺、女性生殖器、男性生殖器、生殖細胞、血液および免疫系、肝、筋骨格系、神経系、膵臓、呼吸器系、感覚器、皮膚、顎口腔系、非分類性／混合性または尿路である。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。同様に、各ヒト組織は、以下の疾患／条件カテゴリー、すなわち癌、細胞株、発達、炎症、神経性、外傷、心血管、プール、その他の１つに分類される。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。得られるパーセンテージは、PMMMをコードするcDNAの疾患特異的な発現を反映する。 cDNA配列およびcDNAライブラリ／組織の情報は、LIFESEQ GOLD データベース（Incyte Genomics, Palo Alto CA）から得ることができる。
【０３９２】
８  PMMMをコードするポリヌクレオチドの伸長
完全長ポリヌクレオチドを、完全長分子の適切な断片から設計したオリゴヌクレオチドプライマー群を用いて該断片を伸長させ産生する。或るプライマーは既知の断片の５'伸長を開始するべく合成し、別のプライマーは既知の断片の３'伸長を開始するべく合成した。開始プライマー群の設計にはOLIGO 4.06ソフトウェア（National Biosciences）或いは別の適切なプログラムを用い、長さが約22〜30ヌクレオチド、GC含有率が約50％以上となって約68〜約72℃の温度で標的配列にアニーリングするようにした。ヘアピン構造およびプライマー−プライマー二量体を生ずるようなヌクレオチド群の伸長は、全て回避した。
【０３９３】
選択したヒトcDNAライブラリ群を用い、配列を伸長した。２段階以上の伸長が必要または望ましい場合には、付加的プライマーあるいはプライマーのネステッドセットを設計した。
【０３９４】
高忠実度の増幅を当業者に周知の方法でのPCRで得た。PCRはPTC-200サーマルサイクラー(MJ Research, Inc.)での96穴プレートで行った。反応混合液は、鋳型DNA及び200nmolの各プライマーを有する。また、Mg２+と(NH4)2SO4と2−メルカプトエタノールを含む反応バッファー、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Biosciences)、ELONGASE酵素(Invitrogen)、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を含む。プライマーの組、PCI AとPCI Bに対して以下のパラメータで増幅を行った。ステップ1: 94℃, 3分、 ステップ 2: 94℃, 15 秒、ステップ 3: 60℃, 1 分、ステップ 4: 68℃, 2 分、 ステップ 5: ステップ2、3および 4を20回反復する。
ステップ6: 68℃、 5 分、ステップ7: 4℃で保存する。別法では、プライマーの組、T7とSK+に対して以下のパラメータで増幅を行った。ステップ1: 94℃, 3分、 ステップ 2: 94℃, 15 秒、ステップ 3: 57℃, 1 分、ステップ 4: 68℃, 2 分、 ステップ 5: ステップ2、3および 4を20回反復する。
ステップ6: 68℃、 5 分、ステップ7:  4℃で保存する。
【０３９５】
各ウェルのDNA濃度は、１X TE及び0.5μlの希釈していないPCR産物に溶解した100μlのPICOGREEN定量試薬(0.25％(v/v) PICOGREEN; Molecular Probes, Eugene OR)を不透明な蛍光光度計プレート(Corning Costar, Acton MA)の各ウェルに分配してDNAが試薬と結合できるようにして測定する。サンプルの蛍光を計測してDNAの濃度を定量すべく、プレートをFluoroskan  II （Labsystems Oy, Helsinki, Finland）でスキャンした。反応混合物のアリコット５〜１０μlを１％アガロースゲル上で電気泳動法によって解析し、どの反応が配列の伸長に成功したかを判定した。
伸長したヌクレオチドは、脱塩および濃縮して384穴プレートに移し、CviJIコレラウイルスエンドヌクレアーゼ（Molecular Biology Research, Madison WI）を用いて消化して音波処理またはせん断し、pUC 18ベクター（Amersham Biosciences）への再連結を行った。ショットガン・シークエンシングのために、消化したヌクレオチドを低濃度（0.6〜0.8％）のアガロースゲル上で分離し、断片を切除し、寒天をAgar ACE（Promega）で消化した。伸長したクローンをT4リガーゼ（New England Biolabs, Beverly MA）を用いてpUC 18ベクター（Amersham Biosciences）に再連結し、Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）で処理して制限部位オーバーハングを満たし、大腸菌細胞に形質移入した。形質移入した細胞を選択して抗生物質を有する培地に移し、それぞれのコロニーを切りとってLB/2xカルベニシリン培養液の384穴プレートに３７℃で一晩培養した。
【０３９６】
細胞を溶解して、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Biosciences)及びPfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を用いて以下の手順でDNAをPCR増幅した。ステップ1: 94℃, 3分、 ステップ 2: 94℃, 15 秒、ステップ 3: 60℃, 1 分、ステップ 4: 72℃, 2 分、 ステップ 5: ステップ2、3および 4を29回反復する。
ステップ6: 72℃、 5 分、ステップ7: 4℃で保存する。上記のようにPICOGREEN試薬(Molecular Probes)でDNAを定量した。DNA回収率が低いサンプルは、上記同一条件で再増幅した。サンプルは20％ジメチルスルホキシド（１：２,v/v）で希釈し、DYENAMICエネルギー移動シークエンシングプライマー、およびDYENAMIC DIRECT kit（Amersham Biosciences）またはABI PRISM BIGDYEターミネーターサイクルシークエンシングレディ反応キット（Terminator cycle sequencing ready reaction kit）（Applied Biosystems）を用いてシークエンスした。
【０３９７】
同様に、上記手順を用いて完全長ポリヌクレオチドを検証した。あるいは、完全長ポリヌクレオチドを用い、上記手順で、そのような伸長のために設計したオリゴヌクレオチド類と、或る適切なゲノムライブラリとを用いて５'調節配列を得た。
【０３９８】
９  PMMMをコードするポリヌクレオチドにおける１塩基多型性の同定
１塩基多型（SNP）として知られる一般的なDNA配列変異体が、SEQ ID NO:41-80において、LIFESEQデータベース（Incyte Genomics）を用いて同定された。同じ遺伝子からの配列群は共にクラスター化され、実施例３に述べたようにアセンブリされて、その遺伝子における全ての配列変異体の同定を可能にした。一連のフィルタからなるアルゴリズムを使って、SNPを他の配列変異体から区別した。前段フィルターは、最小限Phredクオリティスコア15を要求することにより大多数のベースコールのエラーを除去し、また、配列アライメントエラーや、ベクター配列、キメラおよびスプライス変異体の不適当なトリミングにより生じるエラーを取り除いた。染色体の高度解析の自動化手順により、推定SNPの近傍におけるオリジナルのクロマトグラムファイルが解析された。クローンエラーフィルタは統計的に生み出されたアルゴリズムを用いて、逆転写酵素、ポリメラーゼ、または体細胞突然変異によって引き起こされるエラーのような、実験処理時に導入されるエラーを識別した。クラスターエラーフィルターは、統計的に生み出されたアルゴリズムを用いて、近縁の相同体または偽遺伝子のクラスター化に起因するエラー、または非ヒト配列によるコンタミネーションにより生じたエラーを同定した。最後のフィルター群によって、免疫グロブリンまたはT細胞受容体に存在する重複(duplicates)とSNPが除去された。
【０３９９】
幾つかのSNPは、更なる特徴付けの為に選択された。選択は高処理MASSARRAYシステム（Sequenom, Inc.）を用いた質量分析によって行い、４群の異なるヒト集団におけるSNP部位での対立遺伝子頻度を分析した。白人集団は92個体（46名の男子、46名の女子）からなり、83名はユタ出身、4名はフランス人、3名はベネズエラ人、2名はアーミッシュの人々である。アフリカ集団は194個体（97名の男子、97名の女子）からなり、全員がアフリカ系アメリカ人である。ヒスパニック集団は324個体（162名の男子、162名の女子）からなり、全員がメキシコのヒスパニックである。アジア集団は126個体（64名の男子、62名の女子）からなり、報告された親の内訳は43％が中国人、31％が日本人、13％がコリアン、5％がベトナム人、8％が他のアジア人である。対立遺伝子頻度の分析は先ず白人集団においてなされ、幾つかの場合、SNPの内、対立遺伝子変異をこの集団において示さなかったSNPは、更に他の３集団においてテストされることは無かった。
【０４００】
１０  個々のハイブリダイゼーションプローブの標識化及び使用
SEQ ID NO:41-80から導き出されたハイブリダイゼーションプローブを用いて、cDNA、mRNA、またはゲノムDNAをスクリーニングする。約20塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記載するが、より大きなヌクレオチド断片に対しても本質的に同一の手順が用いられる。オリゴヌクレオチドは、OLIGO 4.06ソフトウェア(National Biosciences)等の最新ソフトウェアを用いて設計し、各オリゴマー５０pmolと、[γ-32P]アデノシン３リン酸(Amersham Biosciences)２５０μCiと、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(DuPont NEN, Boston MA)とを混合することにより標識する。標識したオリゴヌクレオチドは、SEPHADEX G-25超細繊分子サイズ排除デキストラン ビーズカラム（Amersham Biosciences）を用いて実質的に精製する。Ase I、Bgl II、Eco RI、Pst I、Xba IまたはPvu II（DuPont NEN）のいずれか１つのエンドヌクレアーゼで消化されたヒトゲノムDNAの、典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析において、毎分１０7カウントの標識されたプローブを有するアリコットを用いる。
【０４０１】
各消化物から得たDNAは、０.７％アガロースゲル上で分画してナイロン膜（Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH）に移す。ハイブリダイゼーションは、４０℃で１６時間行う。非特異的シグナル群を除去するため、最大で例えば０.１×クエン酸ナトリウム食塩水および０.５％ドデシル硫酸ナトリウムの条件下で、ブロット群を室温で順次洗浄する。オートラジオグラフィーまたはそれに代わるイメージング手段を用いてハイブリダイゼーションパターンを視覚化し、比較する。
【０４０２】
11  マイクロアレイ
或るマイクロアレイ上でのアレイエレメント群の連接または合成は、フォトリソグラフィ、ピエゾ式印刷（インクジェット印刷、前出のBaldeschweiler他などを参照）、機械的マイクロスポッティング技術およびこれらから派生した技術を用いて達成し得る。上記各技術において基板は、均一な、無孔の表面を持つ固体とすべきである(Schena, M., 編集 (1999) DNA Microarrays:A Practical Approach, Oxford University Press, London)。推奨する基板には、シリコン、シリカ、スライドガラス、ガラスチップおよびシリコンウェハがある。あるいは、ドットブロット法またはスロットブロット法に類似した手順を利用し、熱的、紫外線的、化学的または機械的結合手順を用いて基板の表面にエレメントを配置および結合させてもよい。通常のアレイは、利用可能な、当業者に公知の方法と機械とを用いて作製でき、任意の適正数のエレメントを有し得る(Schena, M. 他(1995) Science 270:467-470; Shalon, D.他(1996) Genome Res.6:639-645; Marshall, A. および J. Hodgson (1998) Nat. Biotechnol. 16:27-31)。
【０４０３】
完全長cDNA、発現配列タグ（EST）、またはその断片またはオリゴマーが、マイクロアレイのエレメントと成り得る。ハイブリダイゼーションに好適な断片またはオリゴマーを、LASERGENEソフトウェア（DNASTAR）など本技術分野で公知のソフトウェアを用いて選択することが可能である。アレイエレメント群を、生体サンプル中のポリヌクレオチド群とハイブリダイズする。生体サンプル中のポリヌクレオチドは、検出を容易にするために蛍光標識などの分子タグに抱合させる。ハイブリダイゼーション後、生体サンプルからのハイブリダイズされていないヌクレオチドを除去し、蛍光スキャナを用いて各アレイエレメントでのハイブリダイゼーションを検出する。あるいは、レーザー脱離および質量スペクトロメトリを用いてもハイブリダイゼーションを検出し得る。マイクロアレイ上の或るエレメントにハイブリダイズする各ポリヌクレオチドの、相補性の度合と相対存在度とを算定し得る。一実施態様におけるマイクロアレイの調製および使用について、以下に詳述する。
【０４０４】
組織または細胞サンプルの調製
総RNAを組織サンプルから単離するためグアニジニウムチオシアネート法を用い、ポリ(A)+RNA精製にオリゴ(dT)セルロース法を用いる。各ポリ(A)+RNAサンプルを、MMLV逆転写酵素、0.05pg/μlのオリゴ(dT)プライマー（21mer）、１×第一鎖合成バッファー、0.03unit/μlのRNアーゼ阻害因子、500μMのdATP、500μMのdGTP、500μMのdTTP、40μMのdCTP、40μMのdCTP-Cy3（BDS）またはdCTP-Cy5（Amersham Biosciences）を用いて逆転写する。逆転写反応は、GEMBRIGHTキット（Incyte Genomics）を用い、200ngのポリ（A）+RNAを含有する体積25ｍｌで行う。特異的対照ポリ(A)+RNAは、非コード酵母ゲノムDNAからin vitro転写により合成する。37℃で2時間インキュベートした後、各反応サンプル（1つはCy3、もう1つはCy5標識）は、2.5mlの0.5M水酸化ナトリウムで処理、85℃で20分間インキュベートし、反応を停止させてRNAを分解させる。サンプル精製には、２つの連続するCHROMA SPIN 30ゲル濾過スピンカラム（Clontech, Palo Alto CA）を用いる。混合後、２つの反応サンプルをエタノール沈殿させるため、１mlのグリコーゲン（１mg/ml）、60mlの酢酸ナトリウム、及び300mlの100％エタノールを用いる。サンプルは次に、SpeedVAC（Savant Instruments Inc., Holbrook NY）を用いて乾燥して仕上げ、１４μlの５×SSC／０.２％SDS中で再懸濁する。
【０４０５】
マイクロアレイの調製
本発明の配列を用いて、アレイエレメントを作製する。各アレイエレメントは、クローン化したcDNAインサート群と、ベクター群とを含有する細菌細胞群から増幅する。PCR増幅は、cDNAインサートに隣接するベクター配列群に相補的なプライマー類を用いる。３０サイクルのPCRで１〜２ngの初期量から５μgより大きい最終量までアレイエレメントを増幅する。増幅したアレイエレメントは、SEPHACRYL-400（Amersham Biosciences）を用いて精製する。
【０４０６】
精製したアレイエレメントは、ポリマーコートされたスライドグラス上に固定する。顕微鏡スライドグラス（Corning）は、0.1％のSDSおよびアセトン中で超音波洗浄し、処理の間および処理後に充分に蒸留水で洗浄する。スライドグラスは、４％フッ化水素酸（VWR Scientific Products Corporation（VWR）, West Chester PA）中でエッチングし、充分に蒸留水中で洗浄し、95％エタノール中で0.05％アミノプロピルシラン（Sigma）を用いてコーティングする。コーティングしたスライドは、110℃のオーブンで硬化させる。
【０４０７】
米国特許第5,807,522号に記載の手順で、コーティングしたガラス基板にアレイエレメント群を付加する。この特許は、参照により開示に含まれる。平均濃度１００ng/μlのアレイエレメントDNA１μlを、高速ロボット装置（robotic apparatus）により、開放型キャピラリープリンティングエレメント（open capillary printing element）に充填する。装置はここで、スライド毎に約５nlのアレイエレメントサンプルを置く。
【０４０８】
マイクロアレイに、STRATALINKER UVクロスリンク機（Stratagene）を用いてUV架橋する。マイクロアレイは、室温において０.２％SDSで１度洗浄し、蒸留水で３度洗浄する。非特異結合部位をブロックするため、マイクロアレイのインキュベートをリン酸緩衝食塩水（PBS）（Tropix, Inc., Bedford MA）中に０.２％カゼイン、６０℃で３０分間行った後、前記のように０.２％SDSおよび蒸留水で洗浄する。
【０４０９】
ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション反応に用いる９μlのサンプル混合体には、Cy3またはCy5で標識したcDNA合成産物群の各０.２μgを、５×SSC,０.２％SDSハイブリダイゼーション緩衝液中に含む。サンプル混合体は、65℃まで５分間加熱し、マイクロアレイ表面上へ等分して1.8cm2のカバーガラスで覆う。アレイは、顕微鏡スライドより僅かに大きい空洞を有する防水チャンバーに移す。チェンバー内を湿度100％に保つため、140μlの5×SSCをチェンバーの１コーナーに加える。アレイを入れたチェンバーは、60℃で約6.5時間インキュベートする。アレイは、第１洗浄緩衝液中（１×SSC,0.1％SDS）において45℃で10分間洗浄し、第２洗浄緩衝液中（0.1×SSC）において45℃で10分間ずつ３回洗浄して乾燥させる。
【０４１０】
検出
レポーター標識したハイブリダイゼーション複合体を検出するには、Ｃｙ3の励起のために４８８nm、Ｃｙ5の励起のために６３２nmでスペクトル線を発生し得るInnova70混合ガス10Ｗレーザー（Coherent, Inc., Santa Clara CA）を備えた顕微鏡を用いる。励起レーザー光の焦点をアレイ上に置くため、２０×顕微鏡対物レンズ（Nikon, Inc., Melville NY）を用いる。アレイを有するスライドを、顕微鏡の、コンピュータ制御のX-Yステージに置き、対物レンズを通してラスタースキャンする。本実施例で用いる１.８cm×１.８cmのアレイは、解像度２０μmでスキャンする。
【０４１１】
２回の異なるスキャンで、混合ガスマルチラインレーザは２つのフルオロフォアを連続的に励起する。発光された光は波長に基づき分割され、２つのフルオロフォアに対応する２つの光電子増倍管検出器（PMT R1477, Hamamatsu Photonics Systems, Bridgewater NJ）に送られる。好適なフィルタ群をアレイと光電子増倍管との間に設置して、シグナルをフィルタする。用いるフルオロフォアの最大発光の波長は、Cy3では５６５nm、Cy5では６５０nmである。装置は両方のフルオロフォアからのスペクトルを同時に記録し得るが、レーザー源において好適なフィルタを用いて、フルオロフォア１つにつき１度スキャンし、各アレイを通常２度スキャンする。
【０４１２】
通常、各スキャンの感度を較正するため、cDNA対照種を或る既知濃度でサンプル混合体に添加し、対照種が発生するシグナル強度を用いる。アレイ上の或る特定の位置には或る相補DNA配列が含まれ、その位置におけるシグナルの強度をハイブリダイゼーション種の重量比1：100,000と相関させる。異なる源泉（例えば代表的な試験細胞および対照細胞など）からの２つのサンプルを、各々異なるフルオロフォアで標識し、異なる発現をする遺伝子群を同定するために単一のアレイにハイブリダイズする場合には、較正するcDNAのサンプルを２種のフルオロフォアで標識し、ハイブリダイゼーション混合液に各々等量を加えることによって較正を行う。
【０４１３】
光電子増倍管の出力をディジタル化するため、IBMコンパチブルPCコンピュータにインストールした12ビットRTI-835Hアナログディジタル（A/D）変換ボード（Analog Devices, Inc., Norwood MA）を用いる。ディジタル化したデータは、青色（低シグナル）から赤色（高シグナル）までの擬似カラースケールへのリニア20色変換を用いて、シグナル強度がマッピングされたイメージとして表示される。データは、定量的にも分析される。２つの異なるフルオロフォアを同時に励起および測定する場合には、各フルオロフォアの発光スペクトルを用いて、データは先ずフルオロフォア間の光学的クロストーク（発光スペクトルの重なりに起因する）を補正される。
【０４１４】
グリッドが蛍光シグナルイメージ上に重ねられ、それによって各スポットからのシグナルはグリッドの各エレメントに集められる。各エレメント内の蛍光シグナルが次に統合され、シグナルの平均強度に応じた数値が得られる。シグナル分析に用いるソフトウェアは、GEMTOOLS遺伝子発現分析プログラム（Incyte Genomics）である。少なくとも約２倍の発現変化、約2.5以上のシグナル/バックグランド比、および少なくとも約40％のエレメントスポットサイズを示すアレイエレメントが、差次的発現を示すとされる。
【０４１５】
発現
例えば、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:55、およびSEQ ID NO:57は乳癌と関連する差次的発現を示し、これはマイクロアレイ分析で判定した。SEQ ID NO:41の発現は、乳房腫瘍において、同じドナー群の正常組織とマッチさせて少なくとも2.8分の1に減少した。この腫瘍性乳房組織は、in situで浸潤性小葉癌の43才女性の右乳房の腫瘍から得た。この腫瘍は高分化型であり、13のリンパ節の中2つについて転移性であった。正常組織は同じドナーから全体的に関連しない乳房組織から得た。マッチさせた正常および腫瘍形成性乳房組織サンプルは、Huntsman Cancer Institute (Salt Lake City, UT)によって提供されている。さらに、乳房腫瘍進行の様々の段階を示すいくつかの腫瘍細胞株においてSEQ ID NO:55の発現を非悪性乳腺上皮細胞株、MCF-10Aでの発現と比較した。またSEQ ID NO:55の発現を、6種の腫瘍細胞株(MCF7、T-47D、 Sk-BR-3、BT20、MDA-mb-231および MDA-mb-435S)とMCF-10A細胞で比較し、MCF-10Aの増殖は供給者の推奨培地または限定無血清H14培地で70〜80%のコンフルエンスまで行って比較した。MCF-10Aは乳腺(管腔腺管の特徴を持つ)細胞株であり、或る36才の線維嚢胞性乳房疾患(fibrocystic breast disease)の女性から単離された。MCF-10Aは、細胞質ケラチン類、上皮性シアロムチン類、および乳脂肪小球（milkfat globule）抗原類を発現する。この細胞株はまたコラーゲン中で3次元成長を示し、またコンフルエントな培養でドームを形成する。MCF7は非悪性乳腺癌細胞株であり、或る69才の女性の胸水から単離された。MCF7 は、乳腺上皮の特徴、例えば細胞質エストロゲン受容体を介してエストラジオールをプロセスする能力、および、培養でドームを形成する能力などを保持している。T-47D乳癌細胞株は、浸潤性乳管癌を持つ或る54才の女性から得た胸水から単離された。Sk-BR-3は乳腺癌細胞株であり、或る43才の女性の悪性胸水から単離された。これはヌードマウスに注入すると、低分化腺癌を形成する。BT-20は、或る74才の女性から単離した腫瘍塊の薄切片から遊出した細胞群からin vitroで得た乳癌細胞株である。MDA-mb-231は乳房腫瘍細胞株であり、或る51才の女性の胸水から単離された。これは、ヌードマウス中およびALS処理したBALB/cマウス中で、低分化腺癌を形成する。これはまた、Wnt3癌遺伝子、EGF、およびTGF-αを発現する。MDA-mb-435Sは紡錘状の株であり親株(435)から進化した株で、これは1976年にR. Cailleauが、転移性乳管腺癌を持つ31歳女性の胸水から単離した。SEQ ID NO:55の発現は非悪性MCF-10A 細胞に比べてT-47D と BT-20細胞で少なくとも2倍増加した。さらに、上述の６つの乳房細胞腫瘍株でのSEQ ID NO:57の発現を、正常ドナーから由来した初代乳房上皮細胞株（HMEC）における発現と比較した。。SEQ ID NO:57の発現は、HMEC細胞と比較するとMCF7、T-47D、Sk-BR-3、BT-20およびMDA-mb-435Sにおいて少なくとも2倍増加した。したがって、様々な実施様態でSEQ ID NO:41、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57は下記の1つ以上の目的で使用することができる。すなわち、i)乳癌の治療のモニタリング、ii)乳癌の診断アッセイ、そしてiii)乳癌の治療法および/あるいは他の療法の開発である。
【０４１６】
別の実施例で、SEQ ID NO:41-42、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:49およびSEQ ID NO:78は肺癌と関連する差次的発現を示し、これはマイクロアレイ分析で判定した。
SEQ ID NO:41の発現は、５つの肺扁平上皮癌の中の1つにおいて、同じドナー群の正常組織とマッチさせて少なくとも2.4分の1に減少した。腫瘍性肺組織は66才男性の肺扁平細胞から得た。正常組織は同じドナーから肉眼で見て無併発の肺組織から得た。マッチングされた正常および腫瘍形成性肺組織サンプルは英国LiverpoolのRoy Castle Lung Cancer Foundationによって提供された。さらに、SEQ ID NO:42の発現は、4つの肺腺癌の中の1つにおいて、同じドナーの正常組織とマッチさせて少なくとも2.9倍増加した。SEQ ID NO:42の発現もまた、５つの肺扁平細胞癌の中の1つにおいて、同じドナーの正常組織とマッチさせて少なくとも2倍増加した。腫瘍性肺組織は73才男性の肺扁平細胞から得た。正常組織は同じドナーから肉眼的に見て無併発の肺組織から得た。別のマッチした組織の実験で、SEQ ID NO:46の発現は60%の顕性腫瘍細胞を含む肺扁平細胞癌組織において少なくとも２分の１に減少した。SEQ ID NO:49 の発現は、同じドナーの正常肺組織に比べると肺腫瘍組織において少なくとも2分の１に減少した。別のマッチした組織の実験では、SEQ ID NO:78の発現は、75才の女性から得た肉眼的に見て無併発の組織に比べると、、同じドナーの70%の顕性腫瘍細胞を含む肺扁平細胞癌組織において２倍以上増加した。したがって、様々な実施様態でSEQ ID NO:41-42、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:49およびはSEQ ID NO:78は下記の1つ以上の目的で使用することができる。すなわち、i)肺癌の治療のモニタリング、ii)肺癌の診断アッセイ、そしてiii)肺癌の治療法および/あるいは他の療法の開発である。
【０４１７】
別の例でSEQ ID NO:41は肥満症と関連して差次的発現を示し、これはマイクロアレイ分析で判定した。SEQ ID NO:41の発現は、肥満症と正常ドナーから得た未処理の脂肪細胞に比べると、同じドナー群からの処理されたヒト脂肪細胞において少なくとも2.3分の１まで、最小では11分の１まで減少した。正常なヒト初代皮下前脂肪細胞は、体重指数(BMI)が23.59の、28才の健常な女性(28才)の脂肪組織から単離された。肥満のヒト初代皮下前脂肪細胞は、体重指数(BMI)が32.47の、40才の健常な女性(28才)の脂肪組織から単離された。前脂肪細胞は培養して、それらを活性成分PPAR-γアゴニストとヒトインスリンを含む分化培養液中で培養することによって脂肪細胞に分化するように誘導した。ヒト前脂肪細胞はヒトインスリンとPPAR-γアゴニストで三日間処理し、その後、インスリンを含む培養液に切り替えて、24時間、48時間、４日間、1.1、2.1または2.6週間後に細胞を収集して分析した。分化した脂肪細胞が誘発剤の入っていない培養液中にある未処理の前脂肪細胞と比較された。位相差顕微鏡下の観察により、前脂肪細胞の80%から90%までが最終的に脂肪細胞に分化したことがわかった。
【０４１８】
別の例において、肥満症のヒト初代皮下前脂肪細胞は、体重指数(BMI)が27.7の、36才の健常な女性(28才)の脂肪組織から単離された。前脂肪細胞は培養して、それらを活性成分PPAR-γアゴニストとヒトインスリンを含む私的なの分化培養液中で培養することによって脂肪細胞に分化するように誘導した。ヒト前脂肪細胞はヒトインスリンとPPARアゴニストで三日間処理し、引き続き、インスリンのみを含む培養液に切り替えてさらに、5日間、9日間、および12日間処理した。分化した脂肪細胞が誘発剤の入っていない培養液中にある未処理の前脂肪細胞と比較された。60%以上の全体の分化率が15日間の培養の後に観察された。したがって、様々な実施様態でSEQ ID NO:41は以下の1つ以上の目的で使用することができる。すなわち、i)真性糖尿病および他の疾患（肥満症、高血圧症およびアテローム型動脈硬化など）の治療のモニタリング、ii) 真性糖尿病および他の疾患（肥満症、高血圧症およびアテローム型動脈硬化など）の診断アッセイ、およびiii) 真性糖尿病および他の疾患（肥満症、高血圧症およびアテローム型動脈硬化など）の治療法および/または他の治療の開発、である。マッチされた正常前脂肪細胞および肥満症脂肪細胞のサンプルはノースカロライナ州リサーチトライアングルパークのZen-Bioによって提供された。
【０４１９】
別の例でSEQ ID NO:63は大腸癌と関連して差次的発現を示し、これはマイクロアレイ分析で判定した。SEQ ID NO:63の発現は、S状結腸腫瘍組織において、同じドナー群の正常組織とマッチさせると少なくとも2分の1に減少した。腫瘍性組織は転移性胃肉腫(間質性腫瘍)から発症したS状結腸腫瘍の48才女性から得た。正常組織は同じドナーの肉眼的に無併発の乳房組織から得た。マッチさせた正常および腫瘍形成性S状結腸組織サンプルは、Huntsman Cancer Institute, (Salt Lake City, UT)によって提供される。したがって、様々な実施様態でSEQ ID NO:63は以下の1つ以上の目的で使用することができる。すなわち、i)結腸癌の治療のモニタリング、ii)結腸癌の診断アッセイ、そしてiii)結腸癌の治療法そして/あるいは他の療法の開発である。
【０４２０】
別の例でSEQ ID NO:78は卵巣癌と関連する差次的発現を示し、これはマイクロアレイ分析で判定した。SEQ ID NO:78の発現は、79才 の女性の卵巣腺癌患者ドナーの正常組織に比べて、同ドナーの卵巣腫瘍では少なくとも２倍増加した。マッチさせた正常および腫瘍形成性卵巣組織サンプルは、Huntsman Cancer Institute, (Salt Lake City, UT)によって提供された。したがって、様々な実施様態でSEQ ID NO:78は以下の1つ以上の目的で使用することができる。すなわち、i)卵巣癌の治療のモニタリング、ii)卵巣癌の診断アッセイ、そしてiii)卵巣癌の治療法そして/あるいは他の療法の開発である。
【０４２１】
１２  相補的ポリヌクレオチド
PMMMをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的な配列は、天然のPMMMの発現を低下させるため即ち阻害するために用いられる。約15〜30塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、これより小さなあるいは大きな配列の断片の場合でも、本質的に同じ手順を用いる。Oligo4.06ソフトウェア（National Biosciences）及びPMMMのコーディング配列を用いて、適切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最も独特な5'配列から相補的オリゴヌクレオチドを設計し、これを用いて、プロモーターがコード配列に結合するのを防止する。翻訳を阻害するためには、相補的なオリゴヌクレオチドを設計して、リボソームがPMMMをコードする転写物に結合するのを阻害する。
【０４２２】
１３  PMMMの発現
PMMMの発現及び精製は、細菌若しくはウイルスを基にした発現系を用いて行うことができる。細菌でPMMM が発現するために、抗生物質耐性及びcDNAの転写レベルを高める誘導性のプロモーターを含む好適なベクターにcDNAをサブクローニングする。このようなプロモーターとしては、lacオペレーター調節エレメントと併用するT5またはT7バクテリオファージプロモーター、およびtrp-lac（tac）ハイブリッドプロモーターが含まれるが、これらに限定するものではない。組換えベクターを、BL21（DE3）などの好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性をもつ細菌が、イソプロピルβ−Dチオガラクトピラノシド(IPTG)で誘発されるとPMMM を発現する。真核細胞でのPMMMの発現は、昆虫細胞株または哺乳動物細胞株に一般にバキュロウイスルスとして知られているAutographica californica核多角体病ウイルス(AcMNPV)の組換え型を感染させて行う。バキュロウイルスの非必須ポリヘドリン遺伝子を、相同組換え或いは転移プラスミドの媒介を伴う細菌の媒介による遺伝子転移のどちらかによって、PMMM をコードするcDNAと置換する。ウイルスの感染力は維持され、強力なポリヘドリンプロモーターによって高レベルのcDNA転写が行われる。組換えバキュロウイルスは、多くの場合は夜蛾の１種Spodoptera frugiperda（Sf9）昆虫細胞への感染に用いるが、ヒト肝細胞への感染に用いることもある。後者の感染の場合は、バキュロウイルスへの更なる遺伝的修飾が必要になる(Engelhard, E.K 他、(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227、Sandig, V.他(1996) Hum.Gene Ther. 7:1937-1945）。
【０４２３】
殆どの発現系では、PMMM が、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ(GST)、またはFLAGや6-Hisなどのペプチドエピトープ標識で合成された融合タンパク質となるため、未精製の細胞溶解物からの組換え融合タンパク質の親和性ベースの精製が素早く１回で行うことができる。GSTは日本住血吸虫からの26kDaの酵素であり、タンパク質の活性および抗原性を維持した状態で、固定化したグルタチオン上での融合タンパク質の精製を可能とする（Amersham Biosciences）。精製の後、GST部分を特定の操作部位でPMMM からタンパク分解的に切断できる。FLAGは8アミノ酸のペプチドであり、市販されているモノクローナルおよびポリクローナル抗FLAG抗体（Eastman Kodak）を用いた免疫親和性精製を可能にする。6ヒスチジン残基が連続して伸長した6-Hisは、金属キレート樹脂上での精製を可能にする（QIAGEN）。タンパク質の発現および精製の方法は、Ausubel他(前出、10および16章)に記載がある。これらの方法で精製したPMMMを直接用いて以下の実施例17、18、19、および20の、適用可能なアッセイを行うことができる。
【０４２４】
１４  機能的アッセイ
PMMM 機能は、哺乳動物細胞培養系において生理学的に高められたレベルでのPMMM をコードする配列の発現によって評価する。cDNAを高いレベルで発現する強いプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターにcDNAをサブクローニングする。選択されるベクターとしては、PCMV SPORTプラスミド（Invitrogen, Carlsbad CA）およびPCR 3.1プラスミド（Invitrogen）があり、どちらもサイトメガロウイルスプロモーターを持つ。リポソーム製剤あるいは電気穿孔法を用いて、5〜10μgの組換えベクターをヒト細胞株、例えば内皮由来または造血由来の細胞株に、一過的に形質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む1〜2μgのプラスミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入細胞と非形質移入細胞を区別する手段が与えられる。また、標識タンパク質の発現によって、組換えベクターからのcDNA発現を正確に予想できる。標識タンパク質は、例えば緑色蛍光タンパク質（GFP;Clontech）、CD64またはCD64-GFP融合タンパク質から選択できる。自動化された、レーザー光学に基づく技術であるフローサイトメトリー（FCM）を用いて、GFPまたはCD64-GFPを発現する形質移入された細胞を同定し、それらの細胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。FCMは、細胞死に先行するか或いは同時に発生する現象を診断する蛍光分子の取込を検出して計量する。このような現象として挙げられるのは、ヨウ化プロピジウムによるDNA染色によって計測される核DNA含量の変化、前方散乱光と90°側方散乱光によって計測される細胞サイズと粒度の変化、ブロモデオキシウリジンの取込量の低下によって計測されるDNA合成の下方調節、特異抗体との反応性によって計測される細胞表面及び細胞内におけるタンパク質の発現の変容、及びフルオレセイン抱合したアネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形質膜組成の変容とがある。フローサイトメトリー法については、Ormerod, M.G. (1994; Flow Cytometry, Oxford, New York NY)に記述がある。
【０４２５】
遺伝子発現におけるPMMM  の影響は、PMMM  をコードする配列とCD64またはCD64-GFPのどちらかが形質移入された高度に精製された細胞集団を用いて評価することができる。CD64またはCD64-GFPは、形質移入された細胞表面で発現し、ヒト免疫グロブリンG（IgG）の保存された複数の領域に結合する。形質転換された細胞と形質転換されない細胞とは、ヒトIgGかCD64に対する抗体のどちらかで被覆された磁気ビードを用いて分離することができる(DYNAL. Lake Success. NY)。 mRNAは、当分野で周知の方法で細胞から精製することができる。 PMMM 及び目的の他の遺伝子をコードするmRNAの発現は、ノーザン分析やマイクロアレイ技術で分析することができる。
【０４２６】
１５  PMMMに特異的な抗体の作製
実質的に精製されたPMMMを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（PAGE；例えば、Harrington, M.G.（1990）Methods Enzymol.182:488-495を参照）または他の精製技術で行い、これを用いて標準的なプロトコルで動物（例えばウサギ、マウスなど）を免疫化して抗体を作り出す。
【０４２７】
或いは、レーザGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いてPMMMアミノ酸配列を解析し、免疫原性の高い領域を決定する。そして対応するオリゴペプチドを合成し、このオリゴペプチドを用いて当業者によく知られている方法で抗体を生成する。例えばC末端付近或いは隣接する親水性領域等の、適切なエピトープの選択については、当分野で公知である（前出のAusubel, 他 11章）。
【０４２８】
通常は、長さ約15残基のオリゴペプチドを、FMOCケミストリを用いるABI 431Aペプチドシンセサイザ（Applied Biosystems）を用いて合成し、N-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（MBS）との反応によってKLH（Sigma-Aldrich, St. Louis MO）に結合させて、免疫原性を高める（前出Ausubel他）。完全フロイントアジュバントにおいて、オリゴペプチド-KLH複合体を用いてウサギを免疫化する。得られた抗血清の抗ペプチド活性及び抗DME活性を検査するには、ペプチドまたはPMMM を基板に結合し、１％BSAを用いてブロッキング処理し、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギIgGと反応させる。
【０４２９】
１６  特異的抗体を用いる天然PMMMの精製
天然PMMM 或いは組換えPMMM を、PMMM に特異的な抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィにより実質的に精製する。イムノアフィニティーカラムは、CNBr-活性化したSEPHAROSE（Amersham Biosciences）のような活性化クロマトグラフィー用レジンと抗PMMM抗体とを共有結合させることにより形成する。結合後に、製造者の使用説明書に従ってこのレジンをブロックし、洗浄する。
【０４３０】
PMMM を含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、PMMM を優先的に吸着できる条件で（例えば、界面活性剤の存在下において高イオン強度のバッファーで）そのカラムを洗浄する。そのカラムを、抗体とPMMM との結合を切るような条件で（例えば、ｐＨ２〜３のバッファー、或いは高濃度の尿素またはチオシアン酸塩イオンのようなカオトロピックイオンで）溶出させ、PMMM を回収する。
【０４３１】
１７  PMMMと相互作用する分子の同定
PMMMまたは生物学的に活性なその断片を、125I ボルトンハンター試薬で標識する（Bolton A.E.及びW.M. Hunter (1973) Biochem. J. 133:529-539）。マルチウェルプレートに予め配列しておいた候補の分子を、標識したPMMMと共にインキュベートし、洗浄して、標識したPMMM複合体を有する全てのウェルをアッセイする。様々なPMMM 濃度で得られたデータを用いて、候補分子と結合したPMMM の数量及び親和性、会合についての値を計算する。
【０４３２】
別法では、PMMMと相互作用する分子を、Fields, S.及びO. Song(1989, Nature 340:245-246)に記載の酵母２−ハイブリッドシステムやMATCHMAKERシステム(Clontech)などの２−ハイブリッドシステムに基づいた市販のキットを用いて分析する。
【０４３３】
PMMMはまた、ハイスループット型の酵母２ハイブリッドシステムを使用するPATHCALLINGプロセス（CuraGen Corp., New Haven CT）に用いて、遺伝子の２大ライブラリによってコードされるタンパク質間の全ての相互作用を判定できる（Nandabalan, K. 他(2000) 米国特許第6,057,101号）。
【０４３４】
１８  PMMM活性の実証
PMMM 活性は一般的免疫ブロット方法を用いて、または種々の特異的活性のアッセイを用いて実証でき、またそれらのいくつかを以下に概説する。一般的アプローチとして、PMMMコード配列を含むベクターで形質転換された細胞系または組織系は免疫ブロットを行うことによってPMMM活性をアッセイできる。形質転換された細胞はβ-メルカプトエタノールの存在下、SDS中で変性され、核酸はエタノール沈澱によって除去され、タンパク質はアセトン沈澱によって精製される。ペレットはpH 7.5の２０mMトリス緩衝液で再懸濁し、PMMMに特異的な抗体で前もってコーティングされたプロテインGセファロースと共にインキュベートする。洗浄後、Sepharoseビーズを電気泳動サンプルバッファ中で煮沸し、溶出したタンパク質をSDS-PAGEにかける。SDS-PAGE は免疫ブロットの膜に移し、一次抗体としてPMMMに特異的な抗体を用い、二次抗体として一次抗体に特異的な 125Iで標識されたIgG を用いてブロット上のバンドを視覚化し定量することによって、PMMM活性を測定する。
【０４３５】
PMMM キナーゼ活性は、γ−標識された32P-ATPの存在下で、PMMM によりタンパク質基質のリン酸化を定量化することによって測定される。PMMMをタンパク質基質、32P-ATP、及び好適なキナーゼバッファと共にインキュベートする。基質に組み込まれた32Pは、電気泳動法で遊離32P-ATPより分離され、組み込まれた32Pをラジオアイソトープカウンターでカウントする。組み込まれた32Pの量は、PMMMの活性に比例する。リン酸化した特異的アミノ酸残基の判定を、加水分解したタンパク質のホスホアミノ酸解析で行う。
【０４３６】
PMMMのホスファターゼ活性は、P-ニトロフェニルリン酸(PNPP)の加水分解によって測定する。PMMM は0.1%のβ-メルカプトエタノールの存在下、HEPESバッファ、pH 7.5、PNPP と共に37℃で60分間インキュベートする。この反応は10Nの水酸化ナトリウムを6 ml加えると停止し、PNPPの加水分解の結果、410nmでの吸光度の増加が分光光度計で測定される。このアッセイでは、光吸収の増加がPMMMの活性に比例する(Diamond, R.H. 他(1994) Mol. Cell. Biol. 14:3752-3762)。
【０４３７】
別法では、PMMM のホスファターゼ活性は、リン酸化したタンパク質基質から除去されたリン酸の量を測定して決定する。
【０４３８】
反応は、60mM Tris（pH7.6）、1mM EDTA、1mM EGTA、0.1％2-メルカプトエタノールおよび10μM基質、32P標識した適切なセリン／トレオニンまたはチロシンを含む最終量30μl中で、2nM或いは4nMの酵素と共に行なう。
【０４３９】
反応を基質で開始し、30℃で10〜15分間インキュベートする。反応は0.6 M HC1、90mM Na4P2O7、および2mM NaH2PO4中の4％(w/v)活性炭450μlでクエンチし、次に12,000×gで5分間遠心分離する。酸可溶性32Piを液体シンチレーションカウンターで定量する（Sinclair, C. 他(1999) J. Biol. Chem. 274:23666-23672)。
【０４４０】
PMMMプロテアーゼ活性は、種々の色素原分子で抱合した適切な合成ペプチド基質の加水分解によって測定される。この加水分解の程度は遊離された発色団の分光光度的(または蛍光定量的)吸光度によって定量される(Beynon, R.J. および J.S. Bond (1994) Proteolytic Enzymes:A Practical Approach, Oxford University Press, New York, NY, 25-55ページ)。ペプチドの基質はプロテアーゼ活性のカテゴリにしたがって設計される。このカテゴリーには、エンドペプチダーゼ(セリン、システイン、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ)、アミノペプチダーゼ(ロイシンアミノペプチダーゼ)、カルボキシペプチダーゼ(カルボキシペプチダーゼAおよびB、プロコラーゲンC-プロテイナーゼ)が含まれる。一般に使われる色素原は、2-ナフチルアミン、4-ニトロアニリンおよびフリルアクリル酸である。アッセイは室温で行い、適切なバッファに一定量の酵素および適切な基質を入れる。反応は光学的キュベットで行い、ペプチド基質の加水分解時に遊離される色素原の吸光度の増加または減少を測定する。このアッセイでは、吸光度の変化は酵素活性に比例する。
【０４４１】
あるいは、PMMMプロテアーゼ活性のアッセイは、蛍光共鳴エネルギー伝達 (FRET)を利用しており、このエネルギー伝達は適切なスペクトルの重複を持つ一つの供与体と一つの受容体の蛍光色素が極めて近傍にある場合に発生する。PMMM に特異的な切断部位を含む可動性ペプチドリンカーは、グリーン蛍光タンパク質の赤にシフトした変異体(RSGFP4) と青い変異体(BFP5) の間で融合する。この融合タンパク質は、エネルギー移動がBFP5からRSGFP4へと起こっていることを示唆するスペクトル特性を有する。この融合タンパク質をPMMMとインキュベートすると、その基質が切断され、2つの蛍光タンパク質が分離される。これは著しいエネルギー伝達の減少を伴い、これはPMMM を加える前後の発光スペクトルを比較することによって測定される（Mitra, R.D. 他 (1996) Gene 173:13-17）。このアッセイは生細胞内でも行われ得る。この場合、蛍光基質タンパク質は細胞中で恒常的に発現され、またPMMMが誘導ベクターで誘導され、よってPMMMの存在及び不在の両条件下でFRETがモニターされうる（Sagot, I. 他(1999) FEBS Letters 447:53-57）。
【０４４２】
ユビキチン加水分解酵素活性の或るアッセイは、ユビキチン前駆体の加水分解を測定する。アッセイは室温で行い、適切なバッファに一定量のPMMM と適切な基質を入れる。化学的に合成されたヒトユビキチン−バリンは基質として用いられ得る。基質からのC末端バリン残基の切断が、キャピラリー電気泳動法でモニターされる（Franklin, K.他(1997) Anal. Biochem. 247:305-309)。
【０４４３】
アルファ2-HS糖タンパク質(AHSG) のPMMM プロテアーゼ阻害物質の活性は、デキサメサゾンで処理したラット骨髄細胞培養(dex-RBMC)における骨形成活性の減少として測定される。アッセイは15%のウシ胎児血清、アスコルビン酸（50 ｍg/ml）、抗生物質（100 ｍg/mlのペニシリンG、50 ｍg/mlのゲンタマイシン、0.3 ｍg/mlのファンギゾン）、10 mMのB-グリセロリン酸、デキサメサゾン（10-8 M）を追加した最小必須培養液と種々の濃度のPMMMを含む96穴の培養プレートで12〜14日間で行う。培地内のミネラル化した組織形成を96穴プレートリーダーを用いて525 nmで吸光度を測定して定量する(Binkert, C. 他、(1999) J. Biol. Chem. 274:28514-28520)。
【０４４４】
インターアルファトリプシンインヒビター(ITI) に対するPMMM プロテアーゼ阻害物質の活性は、トリプシン活性の分光光度率の連続的測定によって測定され得る。このアッセイは、63 mM のリン酸ナトリウム、0.23 mM N a-ベンゾイル-L-アルギニンエチルエステル、0.06 mM の塩酸、100 ユニットのトリプシン、および種々の濃度のPMMMを含むpH 7.6 のアッセイバッファ中で石英キュベットで室温にて行う。倒置によって混合した直後に、A253 nm の増加を約5分間記録し、酵素活性を算出する（Bergmeyer, H.U. 他(1974) Meth. Enzym. Anal. 1:515-516)。
【０４４５】
ペプチジルプロリルシス/トランスイソメラーゼ活性のようなPMMM イソメラーゼの活性は、Rahfeld, J.U., 他  (1994) (FEBS Lett.  352: 180-184)によって記載されている酵素アッセイによって測定できる。このアッセイは、キモトリプシン（0.5 mg/ml）と種々の濃度のPMMM を含む35 mM のHEPES バッファー（pH 7.8）で10℃にて行う。これらのアッセイ条件下で、基質であるSuc-Ala-Xaa-Pro-Phe-4-NAはプロリル結合に関して平衡になり、トランス構造が80〜95%であり、シス構造が5〜20%である。ジメチルスルフォキシド（10 mg/ml）中に溶解したアリコット（2μl）の基質を上記の反応混合液に加える。シス異性体の基質のみがキモトリプシンによって切断される基質である。したがって、基質がPMMMによって異性化されると、生成物はキモトリプシンによって切断されて4-ニトロアニリドが生成され、これは390 nmでのその吸光度によって検出される。４-ニトロアニリドは時間依存性であり、またPMMM濃度依存的であると思われる。
【０４４６】
PMMMのガラクトシル基転移酵素活性は、UDP-ガラクトースからGlcNAc末端オリゴ糖鎖への放射標識したガラクトースの転移を測定して判定できる(Kolbinger, F.他(1998) J. Biol. Chem. 273:58-65)。サンプルは、 14μl のアッセイ用ストック溶液(180 mM のカコジル酸ナトリウム、pH 6.5、1mg/mlのウシ血清アルブミン、 0.26 mM のUDP-ガラクトース、2 μl のUDP-[3H]ガラクトース)、 1 μl の MnCl2 (500 mM)および 2.5μl の GlcNAcβO-(CH2)8-CO2Me (ジメチルスルホキシド中に37 mg/ml)で37℃にて60分間 インキュベートする。この反応は1mlの水を加えて停止させ、C18 Sep-Pak カートリッジ(Waters)に搭載し、カラムを2回5mlの水で洗浄して未反応のUDP-[3H]ガラクトースを除去する。[3H]ガラクトシル化GlcNAcβO-(CH2)8-CO2Meは水で洗浄する間はカラムに結合されたままであり、5mlのメタノールで溶出する。溶出された物質の放射活性は液体シンチレーション計数で測定され、これは開始サンプルのガラクトシル基転移酵素活性に比例する。
【０４４７】
熱または毒素によるPMMM誘導は、初代培養のヒト線維芽細胞またはCCL-13、 HEK293または HEP G2 (ATCC)のようなヒト細胞株を用いて実証され得る。PMMM の発現を加熱誘導するために、アリコットの細胞を42 ℃ で15、30または 60 分間インキュベートする。対照アリコートを37℃で同じ時間長、インキュベートする。PMMM の発現を毒素によって誘導するには、アリコットの細胞を 100μM の亜砒酸または20mMのアゼチジン-2-カルボン酸で0、3、 6または12 時間処理する。熱、亜砒酸またはアミノ酸類似体に晒した後、処理した細胞のサンプルを収集し、細胞溶解物を調製しウエスタンブロットで分析する。細胞は1% Nonidet P-40、0.15 M NaCl、50 mMのTris-HCl、5 mMのEDTA、2 mMのN-エチルマレイミド、2 mMのフッ化フェニルメチルスルホニル、1 mg/mlのロイペプチンおよび1 mg/mlのペプスタチンを含む溶解バッファ内で溶解する。20マイクログラムの細胞溶解液を8% SDS-PAGEゲル上で分離し、或る膜に移す。5%の非脂肪性粉ミルク/リン酸緩衝食塩水で1時間ブロックした後、2%の非脂肪性粉ミルク/リン酸緩衝食塩水中に好適な希釈度の抗PMMM 血清と共に、前記の膜を4℃で一晩インキュベートするか、または室温にて2〜4時間インキュベートする。次にこの膜を洗浄し、2％粉乳/リン酸緩衝食塩水で1:1000希釈の西洋わさびペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギIgGを用いてインキュベートする。リン酸緩衝食塩水に溶かした0.1%Tween 20で洗浄した後、化学発光を用いてPMMM タンパク質を検出し、対照と比較する。
【０４４８】
PMMMリシルヒドキシラーゼ活性は、[14C]リシンからヒドロキシ[14C]リシンの産生を測定して決定する。放射標識されたプロトコラーゲンを、アスコルビン酸、硫化鉄、ジチオスレイトール、ウシ血清アルブミン、およびカタラーゼを含むバッファー中のPMMMとインキュベートする。30分間のインキュベート後、反応を、アセトンを加えて停止させ、遠心する。沈降した物質を乾燥し、ヒドロキシ[14C]リジンを[14C]ホルムアルデヒドへ転換するため過ヨウ素酸で酸化し、次にトルエン中へ抽出する。トルエン中に抽出された14Cの量が、シンチレーション計数によって定量化され、それはサンプル中のPMMMの活性に比例する（Kivirikko, K., および Myllyla, R. (1982) Methods Enzymol. 82:245-304）。
【０４４９】
19  PMMM の基質の同定
ファージ表示ライブラリを用いてPMMMに対する最適な基質配列を同定できる。後にリンカーと既知の抗体エピトープが付いたランダム六量体を、繊維状ファージライブラリ内の遺伝子IIIのN末端伸長としてクローンする。遺伝子IIIはコートタンパク質をコードし、エピトープは各々のファージ粒子の表面に表示されることとなる。このライブラリを六量体がPMMM切断部位をコードすると、エピトープが除去されるようなタンパク分解条件のもとでPMMM とインキュベートする。エピトープを認識する抗体を、固定化したタンパク質Aとともに加える。なおもエピトープを持つ未切断ファージは遠心分離で除去する。次に、上澄み中のファージを増幅し、更に数回スクリーニングする。その後、個々のファージクローンを単離し、配列決定する。これらペプチド基質の反応速度論は実施例１8のアッセイを用いて試験でき、最適な切断配列が得られる(Ke, S.H. 他(1997) J. Biol. Chem. 272:16603-16609)。
【０４５０】
in vivo のPMMM基質のスクリーニングをするには、この方法を拡大してファージ粒子(T7SELECT10-3ファージディスプレイベクター、Novagen, Madison, WI) または酵母細胞(pYD1 酵母ディスプレイベクターキット、Invitrogen, Carlsbad, CA)の表面に提示されたcDNA発現ライブラリをスクリーニングすることができる。この場合、全体のcDNAが、遺伝子IIIと適切なエピトープの間に融合される。
【０４５１】
２０  PMMM阻害剤の同定
実施例１8のアッセイで説明したように、試験する化合物を、好適なバッファーおよび基質と共に、様々な濃度でマルチウェルプレートのウェルに分注する。PMMM 活性はそれぞれのウェルについて測定し、PMMM 活性を阻害するそれぞれの化合物の能力および容量反応動態（dose-response kinetics）を決定することができる。PMMM 活性を促進する分子の同定にも、このアッセイを用いることができる。
【０４５２】
別の実施例において、ファージ表示ライブラリを用いてペプチドPMMMインヒビターのスクリーニングをすることができる。インヒビターの候補はプロテアーゼに強く結合しているペプチドの内に見つけられる。この場合、マルチウェルプレートのウェルをPMMMで被覆し、ランダムペプチドファージディスプレーライブラリ、またはサイクリックペプチドライブラリでインキュベートする(Koivunen, E. 他(1999) Nature Biotech 17:768-774)。非結合ファージを洗い流し、選択したファージを増幅し、更に数回再スクリーニングする。候補は実施例18に記載のアッセイを用いてPMMM抑制活性をテストする。
【０４５３】
当業者には、本発明の範囲および趣旨から逸脱しない限りの、記載した本発明の、組成物、方法およびシステムの、種々の修正および変更については自明であろう。本発明が、新規かつ有用なタンパク質群およびそれらをコードするポリヌクレオチド群を提供し、これらを創薬過程に利用しうること、また本発明が、これらの組成を用いた、疾患と病態との検出、診断、および治療の方法を提供することは理解されよう。本発明について説明するにあたり幾つかの実施態様に関連して説明を行ったが、本発明の請求の範囲が、そのような特定の実施態様に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。このような実施態様の記載は完全であると考慮されるべきでなく、また本発明を開示したとおりの形態に限定するものでもない。更に、1つの実施態様の要素は、他の1つ以上の実施態様の要素と容易に組み換え得る。このような組み合わせにより、本発明の範囲にある多数の実施態様を形成し得る。本発明の範囲は、添付した請求の範囲およびそれらの等価物によって規定されるよう意図される。
【０４５４】
(表の簡単な説明)
表１は、本発明の完全長のポリヌクレオチド実施態様およびポリペプチド実施態様の命名の概略である。
【０４５５】
表２は、本発明のポリペプチド実施態様のGenBank識別番号と、最も近いGenBank相同体の注釈(annotation)と、PROTEOMEデータベース識別番号と、PROTEOMEデータベース相同体群の注釈とを示す。また、各ポリペプチドとその相同体（１つ以上）が一致する確率スコアも併せて示す。
【０４５６】
表２は、予測されるモチーフおよびドメインなど、ポリペプチド実施態様の構造的特徴を、ポリペプチドの分析に用いた方法、アルゴリズムおよび検索可能なデータベースと共に示す。
【０４５７】
表４は、ポリヌクレオチド実施態様をアセンブリするために用いたcDNAやゲノムDNA断片を、該ポリヌクレオチドの選択された断片と共に示す。
【０４５８】
表５は、ポリヌクレオチド実施態様の代表的cDNAライブラリを示す。
【０４５９】
表６は、表５に示したcDNAライブラリの作製に用いた組織およびベクターを説明する付表である。
【０４６０】
表７は、ポリヌクレオチドとポリペプチドの分析に用いたツール、プログラム、アルゴリズムを、適用可能な説明、参照文献および閾値パラメータと共に示す。
【０４６１】
【表１−１】
2005507658.tif 000006
【０４６２】
【表１−２】
2005507658.tif 000007
【０４６３】
【表１−３】
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【０４６４】
【表２−１】
2005507658.tif 000009
【０４６５】
【表２−２】
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【０４６６】
【表２−３】
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【０４６７】
【表２−４】
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【０４６８】
【表２−５】
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【０４６９】
【表２−６】
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【０４７０】
【表２−７】
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【０４７１】
【表２−８】
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【０４７２】
【表２−９】
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【０４７３】
【表２−１０】
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【０４７４】
【表２−１１】
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【０４７５】
【表２−１２】
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【０４７６】
【表２−１３】
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【０４７７】
【表２−１４】
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【０４７８】
【表２−１５】
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【０４７９】
【表２−１６】
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【０４８０】
【表２−１７】
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【０４８１】
【表２−１８】
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【０４８２】
【表２−１９】
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【０４８３】
【表２−２０】
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【０４８４】
【表２−２１】
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【０４８５】
【表２−２２】
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【０４８６】
【表２−２３】
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【０４８７】
【表２−２４】
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【０４８８】
【表２−２５】
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【０４８９】
【表２−２６】
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【０４９０】
【表２−２７】
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【０４９１】
【表３−１】
2005507658.tif 000036
【０４９２】
【表３−２】
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【０４９３】
【表３−３】
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【０４９４】
【表３−４】
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【０４９５】
【表３−５】
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【０４９６】
【表３−６】
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【０４９７】
【表３−７】
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【０４９８】
【表３−８】
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【０４９９】
【表３−９】
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【０５００】
【表３−１０】
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【０５０１】
【表３−１１】
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【０５０２】
【表３−１２】
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【０５０３】
【表３−１３】
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【０５０４】
【表３−１４】
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【０５０５】
【表３−１５】
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【０５０６】
【表３−１６】
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【０５０７】
【表３−１７】
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【０５０８】
【表３−１８】
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【０５０９】
【表３−１９】
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【０５１０】
【表３−２０】
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【０５１１】
【表３−２１】
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【０５１２】
【表３−２２】
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【０５１３】
【表３−２３】
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【０５１４】
【表３−２４】
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【０５１５】
【表３−２５】
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【０５１６】
【表３−２６】
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【０５１７】
【表３−２７】
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【０５１８】
【表３−２８】
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【０５１９】
【表３−２９】
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【０５２０】
【表３−３０】
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【０５２１】
【表３−３１】
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【０５２２】
【表３−３２】
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【０５２３】
【表３−３３】
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【０５２４】
【表３−３４】
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【０５２５】
【表３−３５】
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【０５２６】
【表３−３６】
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【０５２７】
【表３−３７】
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【０５２８】
【表４−１】
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【０５２９】
【表４−２】
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【０５３０】
【表４−３】
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【０５３１】
【表４−４】
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【０５３２】
【表４−５】
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【０５３３】
【表４−６】
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【０５３４】
【表４−７】
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【０５３５】
【表４−８】
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【０５３６】
【表４−９】
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【０５３７】
【表４−１０】
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【０５３８】
【表４−１１】
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【０５３９】
【表４−１２】
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【０５４０】
【表４−１３】
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【０５４１】
【表４−１４】
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【０５４２】
【表４−１５】
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【０５４３】
【表４−１６】
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【０５４４】
【表４−１７】
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【０５４５】
【表４−１８】
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【０５４６】
【表４−１９】
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【０５４７】
【表４−２０】
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【０５４８】
【表４−２１】
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【０５４９】
【表４−２２】
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【０５５０】
【表４−２３】
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【０５５１】
【表４−２４】
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【０５５２】
【表５−１】
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【０５５３】
【表５−２】
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【０５５４】
【表６−１】
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【０５５５】
【表６−２】
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【０５５６】
【表６−３】
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【０５５７】
【表６−４】
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【０５５８】
【表６−５】
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【０５５９】
【表６−６】
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【０５６０】
【表６−７】
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【０５６１】
【表７−１】
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【０５６２】
【表７−２】
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【０５６３】
【表７−３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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