(57)【要約】固体基質（１１）上の複数の被検体検出用の検出器具と、該器具の調製方法と、分析および診断手順へのこれらの利用が説明される。前記検出器具は、検出スポットのアレイとともに加工される固体基質（１１）を含み、該検出スポットは汎用結合リガンド（１３）によって基質（１１）に結合した被検体センサー（１５）を有する。汎用結合リガンド（２２）は、多機能アレイを作成するために、複数の被検体センサー（２５Ａ、２５Ｂおよび２５Ｃ）を結合することができる。前記検出器具の調製工法と、マイクロプリント法を用いるアッセイ方法とが説明される。
2005524059.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）基質と、（ｂ）該基質上の検出スポットのアレイとを含む被検体検出器具であって、
前記検出スポットのそれぞれは、被検体センサーと第１の結合リガンドとを含み、
（ｉ）前記被検体センサーは前記結合リガンドによって前記基質に結合され、
（ｉｉ）異なる前記被検体について複数の前記被検体センサーがあり、
（ｉｉｉ）同一の第１の結合リガンドが２個または３個以上の異なる前記被検体センサーに用いられる、被検体検出器具。
【請求項２】
前記結合リガンドは前記基質に直接固定化される、請求項１に記載の被検体検出器具。
【請求項３】
２個または３個以上の異なる前記被検体センサーに用いられる第２の結合リガンドを含む、請求項１または２に記載の被検体検出器具。
【請求項４】
前記基質は側鎖のフッ化アシル基を有し、前記検出スポットは前記結合リガンドと前記側鎖のフッ化アシル基との共有結合によって前記基質上に固定化される、前記請求項のいずれか１つに記載の被検体検出器具。
【請求項５】
前記結合リガンドおよび被検体センサーは、プリントすることによって実質的に局在したスポットの予め定められたパターンで前記基質に適用される、前記請求項のいずれか１つに記載の被検体検出器具。
【請求項６】
前記結合リガンドは、タンパク質か、酵素か、糖質か、核酸か、オリゴヌクレオチドか、ポリヌクレオチドか、アプタマーか、ハプテンか、薬物か、色素か、有機低分子か、細胞か、細胞の断片か、レセプターか、細胞表面結合剤か、これらの類似体、ミミック、コンジュゲートまたは複合体かのうちの１つである、前記請求項のいずれか１つに記載の被検体検出器具。
【請求項７】
前記結合リガンドは、プロテインＡ、ビオチンまたはストレプトアビジンのうちの１つである、前記請求項のいずれか１つに記載の被検体検出器具。
【請求項８】
前記被検体センサーは抗体である、前記請求項のいずれか１つに記載の被検体検出器具。
【請求項９】
前記被検体センサーのそれぞれは、核酸と、タンパク質と、糖質と、色素と、ハプテンと、薬物と、レセプターと、細胞断片または細胞と、これらの類似体、ミミック、コンジュゲートまたは複合体とからなるグループから独立に選択される、前記請求項のいずれか１つに記載の被検体検出器具。
【請求項１０】
前記検出スポットのアレイは実質的に局在したスポットのマトリクスでできている、前記請求項のいずれか１つに記載の被検体検出器具。
【請求項１１】
前記アレイの検出スポットのそれぞれは、スポットの直径が少なくとも１０ミクロンである、前記請求項のいずれか１つに記載の被検体検出器具。
【請求項１２】
前記アレイの検出スポットのそれぞれは、スポットの直径が約７５ミクロンないし１５０ミクロンである、前記請求項のいずれか１つに記載の被検体検出器具。
【請求項１３】
前記検出スポットのアレイは１００ないし４００個のスポットでできている、前記請求項のいずれか１つに記載の被検体検出器具。
【請求項１４】
サンプル中の複数の異なる被検体を検出する方法であって、
（ａ）請求項１に記載の被検体検出器具を選択するステップと、
（ｂ）実質的に前記基質の前記検出スポット上のみに分析サンプルを戴置するステップとを含む、方法。
【請求項１５】
（ａ）未結合のサンプルを除去するために前記基質を洗浄するステップと、
（ｂ）実質的に前記基質の前記検出スポット上のみに検出標識を戴置するステップとをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
（ａ）前記基質から未結合の前記検出標識を洗浄するステップと、
（ｂ）結合した前記検出標識を検出するステップとをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記分析サンプルは、プリントすることによって、実質的に前記検出スポット上のみに戴置される、請求項１４、１５および１６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１８】
前記検出標識は、プリントすることによって、実質的に前記検出スポット上のみに戴置される、請求項１４、１５および１６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１９】
サンプル中の複数の異なる被検体を検出するための方法であって、
（ａ）（ｉ）基質と、（ｉｉ）該基質上の検出スポットのアレイとを含む被検体検出器具を選択するステップと、
（ｂ）実質的に前記検出スポットのそれぞれの上のみに２個または３個以上の分析サンプルをプリントするステップとを含み、
前記検出スポットのそれぞれは、被検体センサーと結合リガンドとを含み、
前記被検体センサーは前記結合リガンドによって前記基質に結合する、方法。
【請求項２０】
結合リガンドスポットのアレイ上に複数の被検体センサーを戴置することを含む、被検体検出器具の調製方法であって、
前記被検体センサーのそれぞれは異なる前記被検体に用いられ、同一の前記結合リガンドが２個または３個以上の異なる前記被検体センサーに用いられ、前記センサーのそれぞれがプリントすることによって、実質的に前記結合リガンドスポットのそれぞれの上にのみ戴置される、被検体検出器具の調製方法。
【請求項２１】
被検体センサーのアレイ上に分析サンプルを戴置することを含む、サンプル中の被検体の検出方法であって、
前記被検体のアレイは２個または３個以上の異なる被検体センサースポットでできており、前記分析サンプルはプリントすることによって実質的に前記被検体センサーのそれぞれの上にのみ戴置される、サンプル中の被検体の検出方法。
【請求項２２】
実質的に前記被検体センサースポットのそれぞれの上にのみ検出標識をプリントすることをさらに含む、請求項１９、２０、２１または２２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２３】
前記被検体センサーの少なくとも１つは、ストレプトアビジン、プロテインＡまたはビオチンのうちの１つである、請求項１９、２０、２１または２２のうちのいずれか１つに記載の方法。
【請求項２４】
前記被検体センサースポットの少なくとも１つは抗体を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
複数ステップ合成のための方法であって、
（ａ）基質を選択するステップと、
（ｂ）前記基質上に結合リガンドスポットのアレイを戴置するステップと、
（ｃ）前記結合リガンドスポットのアレイ上に１個または２個以上の合成試薬を戴置するステップとを含み、
異なる合成に用いる複数の異なる試薬があり、同一の前記結合リガンドが２個または３個以上の異なる合成に用いられ、前記合成試薬はプリントすることによって実質的に前記結合リガンドスポットのそれぞれの上にのみ戴置される、複数ステップ合成のための方法。
【請求項２６】
前記合成試薬は、核酸またはアミノ酸の誘導体である、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微視的な、または、小型化された（ｍｉｎｉａｔｕｒｅ）、化学あるいは生化学センサー、プローブおよび線量計（ｄｏｓｉｍｉｔｅｒ）のような分析器具と、これらの器具の空間的に分解された分析領域の調製と、これらの器具を用いる分析検出方法とに関する。
【背景技術】
【０００２】
本願は、２００２年４月２３日出願の米国特許出願第１０／１２８，２８１号「多機能マイクロアレイおよび方法」に基づく優先権を主張し、該出願の内容は引用によりその全体がここに取り込まれる。
【０００３】
小型化された化学あるいは生化学センサー器具は、ＤＮＡ分析（非特許文献１、２、３および４）と、免疫グロブリン利用アッセイ（非特許文献５）と、免疫診断およびスクリーニングアッセイ（非特許文献６および７）とのようなさまざまな化学的および生化学的な診断および合成の用途に利用されてきた。これらのセンサー器具は、一般的に、固体基質と、被検体センサー（例えば、捕捉剤）のような被検体特異的試薬とを含む。これらのシステムでは、分析サンプルおよび試薬は、バルクで前記センサーに送達される。バルクサンプルの送達は、前記センサーの表面全体を浸して、前記サンプルを前記センサーに均一に分布させる。その後の処理ステップで、シグナル発色試薬および／または濯ぎ試薬のような他の試薬も前記センサーにバルクで送達される。これらのセンサー器具は、数個のサンプルを同一の基質で処理するのに利用できる。しかし、同一のサンプルおよび試薬が前記センサーの表面全体に送達されるため、ハイスループットで複数のサンプルを分析することはこれらのシステムにおける課題である。
【非特許文献１】Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、Ｅ．Ｍ．ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９９２、ｖｏｌ．１３、ｐｐ．１００８−１０１７
【非特許文献２】Ｐｅａｓｅ、Ａ．Ｃ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９４、ｖｏｌ．９１、ｐｐ．５０２２−５０２６
【非特許文献３】Ｓｃｈｅｎａ、Ｍ．ら、、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９５、ｖｏｌ．２７０、ｐｐ．４６７−４７０
【非特許文献４】Ｍａｔｓｏｎ、Ｒ．Ｓ．ら、Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９９５、ｖｏｌ．２２４、ｐｐ．１１０−１１６
【非特許文献５】Ｅｌｋｉｎｓ  Ｒ．ら、Ｊ．Ｉｎｔ’ｌ  Ｆｅｄ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、１９９７、ｖｏｌ．９、ｐｐ．１００−１０９
【非特許文献６】Ｍｅｎｄｏｚａ、Ｌ．Ｇ．ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９９９、ｖｏｌ．２７、ｐｐ．７７８−７８８
【非特許文献７】Ｊｏｏｓ、Ｔ．Ｏ．、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、２０００、ｖｏｌ．２１、ｐｐ．２６４１−２６５０
【０００４】
マイクロタイタープレートのフォーマットに基づいて単一の捕捉剤を用いる小型化されたアッセイシステムも知られている。これらのアッセイシステムは、蒸発と、不十分な吸引および分注（ｄｉｓｐｅｎｓｅ）の流体力学的特性とのような小体積の送達に伴う問題を未だに克服していない。
【０００５】
個別のアッセイ部位に基づくその他の小型化されたアッセイシステムも知られている（非特許文献８）。これらのシステムは、前記被検体特異的試薬を前記固体基質に付着することに関連する問題を完全に克服するには至っていない。前記被検体特異的試薬の前記固体基質への不完全な付着は、前記試薬が溶液中に浸出するという結果をもたらすことがある。試薬が溶液中に浸出するときには、シグナルを提供できないので不正確な結果をもたらす。前記被検体特異的試薬を前記基質に付着させる試みは、前記固体基質の複雑かつ高価な操作を行うこと、および、前記捕捉剤を前記固体基質の表面に固定化するために、各被検体特異的試薬を共有結合連結剤で誘導体化することを含む。非特許文献９、１０および１１と特許文献１とを参照せよ。例えば、アレイは固体基質の表面全体を連結剤で活性化することによって加工された。その後被検体特異的試薬が、プリント、スタンプあるいはその他のやり方で前記活性化固体基質にパターン模様を描いて配置された。パターン模様のあるゾーンの間の未使用の連結剤は、アレイを作り上げるために、不活性化されるか、不動態化される。これらのシステムは、大量の連結剤を使用することに伴う廃液のためにコストがかかることがある。
【非特許文献８】Ｍａｔｓｏｎ、Ｒ．Ｓ．ら、Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９９４、ｖｏｌ．２１７、ｐｐ．３０６−３１０
【非特許文献９】Ｓｉｌｚｅｌ、Ｊ．Ｗ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｒｅｓ．、（１９９８）４４：２０３６−２０４３
【非特許文献１０】Ｌｉｎｄｍａｒｋ、Ｒ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８３）、６２：１−１３
【非特許文献１１】Ｍａｔｓｏｎ、Ｒ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（１９８８）４５８：６７−７７
【特許文献１】米国特許第６，１１０，６６９号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがってマイクロセンサー技術を用いる先行技術の分析検出システムは、以下の短所の１個または２個以上をかかえている。（１）前記固体基質へのバルクサンプル送達による試薬の無駄、（２）多重サンプル分析としては不十分なスループット、（３）前記被検体特異的捕捉剤の前記固体基質への不十分な付着、および、（４）不十分な、あるいは、高価な分注および吸引の流体力学的機構。したがって、試薬の無駄を最小限にする低コストの流体送達システムが用いられ、基質に被検体特異的試薬を十分に付着させる、ハイスループット検出器具の必要性は存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
本発明は、これらの必要性を満たす検出器具および方法についてのものである。前記被検体検出器具は、検出スポットのアレイを基質に有する。それぞれの検出スポットは１個または２個以上の結合リガンドによって前記基質に結合された被検体センサーを有し、異なる被検体について複数の異なる前記被検体センサーがあり、同一の前記結合リガンドが２または３以上の異なる前記被検体センサーについて用いられる。前記基質は側鎖のフッ化アシル官能基を有する場合があり、前記結合リガンドを前記側鎖のフッ化アシル官能基に共有結合で結合することによって前記検出スポットを前記基質に直接固定化する。
【０００８】
前記分析検出器具は、２個または３個以上の異なる前記被検体センサーに使用される第２の結合リガンドを有する場合がある。前記結合リガンドおよび／または前記被検体センサーのそれぞれは、プリントによって実質的に局在したスポットの予め定められたパターンで前記基質に適用されることがある。前記結合リガンドは、タンパク質か、酵素か、糖質か、核酸か、オリゴヌクレオチドか、ポリヌクレオチドか、アプタマーか、ハプテンか、薬物か、色素か、有機低分子か、細胞か、細胞の断片か、レセプターか、細胞表面結合剤か、これらの類似体、ミミック（ｍｉｍｉｃｋｓ）、コンジュゲートまたは複合体かの１つであってもよい。より具体的には、前記結合リガンドは、プロテインＡ、ビオチンまたはストレプトアビジンのうちの１つであってもよい。
【０００９】
前記分析検出器具の被検体センサーは、それぞれが個別に、抗体か、核酸か、タンパク質か、糖質か、色素か、ハプテンか、薬物か、レセプターか、細胞の断片または細胞か、これらの類似体、ミミック、コンジュゲート、あるいは、これらの複合体かであってもよい。
【００１０】
前記分析検出器具は検出スポットのアレイを有することがあり、該アレイは、約１００ないし４００個のスポットを有する実質的に局在したスポットのマトリクスを含む。前記アレイ中の各検出スポットは、約１０ミクロンの直径を有するか、あるいは、より大きな約５００ミクロンの直径のスポットを有する場合がある。本発明の好ましいが必要ではない側面では、前記アレイ上の検出スポットは、約７５ミクロンから約１５０ミクロンまでであってもよい。
【００１１】
被検体を検出する方法では、サンプル中の複数の異なる被検体が、上述の器具を選択して、前記基質の実質的に前記検出スポット上のみに分析サンプルを戴置することによって検出されることがある。前記方法は、未結合のサンプルを除去するための前記基質を線上すること、および、検出標識を前記基質の実質的に前記検出スポット上のみに戴置することをさらに含むことがある。
【００１２】
本発明による別の被検体検出方法では、基質と、該基質上の検出スポットのアレイとを含む分析器具が選択されることがある。この分析器具では、各検出スポットは被検体センサーと結合リガンドとを含む。この方法によると、複数、すなわち、２個または３個以上の分析サンプルが、実質的に前記検出スポットのそれぞれの上のみにプリントされる。
【００１３】
本発明は検出器具の調製方法と被検体の検出方法とを規定する。これらの方法においては、結合リガンド、被検体センサー、分析サンプルおよび／またはその後の処理のための試薬のうちの１個または２個以上あるいは全てが前記基質上にプリントされる場合がある。１つの方法では、分析サンプルは、該分析サンプルを前記検出スポット上にプリントすることによって、実質的に前記検出スポット上のみに戴置される。洗浄するステップおよびシグナル発色試薬を適用するステップのようなその後の処理をするステップも、前記試薬を前記基質上にプリントすることによって実行されることがある。別の方法では、分析検出器具は、結合リガンドスポットのアレイ上にある複数の被検体センサーをプリントすることによって調製される。この方法では、前記被検体センサーのそれぞれは異なる被検体に用いられ、同一の結合リガンドが２個または３個以上の異なる前記被検体センサーに用いられる。サンプル中の被検体の別の検出方法では、分析サンプルは、プリントすることによって、実質的に被検体センサースポット上にのみ戴置される。この方法では、前記被検体センサースポットのアレイは、２個または３個以上の異なる被検体センサーを含む。この方法によると、検出標識その他の処理のための試薬および発色試薬も、前記被検体センサースポット上にプリントされることがある。
【００１４】
本発明は、基質が選択され、該基質上に結合リガンドスポットのアレイが戴置される、複数ステップの合成方法を規定する。１個または２個以上の合成試薬が結合リガンドスポットの前記アレイ上に戴置される。この方法では、異なる合成ごとに複数の異なる試薬があり、同一の結合リガンドが２個または３個以上の異なる合成に用いられ、前記合成試薬は、プリントすることによって、実質的に各結合リガンドスポット上にのみ戴置される。
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明は、生物学的または化学的な材料のさらなる反応、結合、複合体形成または検知のために、分析用試薬、センサーその他の生物学的または化学的な材料を、固体基質上にパターン模様で固定化することを含む用途に適用可能である。本発明に適用可能なシステムの例は、さまざまななアレイに基づく臨床アッセイシステムと、固相合成化学システムとを含む。本発明は、乱用薬物、感染症および血液被検体を同定するための臨床的な分析および研究と、新薬発見、構造−機能研究、法医学、環境試験、化学的曝露線量測定、化学合成、オリゴヌクレオチドおよびペプチドの合成、コンビナトリアルライブラリ作成、細胞に基づくアッセイ等に利用可能である。
【００１６】
本発明によると、汎用結合リガンドが基質（すなわち、固体支持体または固体基質）に既知のパターンで付着される。その後被検体センサーのような多重反応性の生物学的または化学的な材料が、鋳型またはアレイを作成するために、前記汎用結合リガンドに付着される。前記鋳型またはアレイは、（アッセイシステムの場合）多重分析用の分析サンプルと、あるいは、（合成化学的な用途の場合）その他の生物学的または化学的な材料とさらに反応されることがある。
【００１７】
反応結合リガンドを採用することは、被検体センサーのような反応性の化学的または生物学的な材料のそれぞれを個別に誘導体化することを要せずに基質表面に付着させることを可能にするので、化学的または生物学的な材料が前記基質上に適切に付着（すなわち、固定化）する。
【００１８】
本発明で説明される汎用結合リガンドを採用することは、誘導体化された被検体特異的な試薬のような、分析用および合成用のアレイ作成に用いられる普通に利用可能な「既製品の（ｏｆｆ  ｔｈｅ  ｓｈｅｌｆ）」生物学的または化学的な材料の使用を可能にする。このやり方で作成されたアレイは、多重ハイスループット分析または合成に利用可能である。本発明は、微視的な、あるいは、小型化された多機能性の化学的または生物学的なセンサー、プローブ、線量計その他の分析器具に特に利用される。
【００１９】
前記汎用結合リガンドは、結合リガンド、汎用結合試薬または汎用連結剤ともいう。前記結合リガンドは、さまざまな生物学的または化学的な材料を固体基質に付着または連結することができる、化合物、複合体、リガンドまたは試薬である。代表的な結合リガンドは、プロテインＡまたはプロテインＧのような抗リガンドタンパク質と、ストレプトアビジンのようなレセプターとを含む。好ましいが必要ではない汎用結合リガンドは、プロテインＡおよびストレプトアビジンである。他の結合リガンドは、フィブロネクチンのような細胞付着因子である。従来のアビジンおよびビオチンで標識された試薬を用いることが好ましい本発明による単一成分アレイも、作成可能である。
【００２０】
本発明の好ましいが必要ではない実施態様では、前記結合リガンドは、該結合リガンドを基質に共有結合で付着することによって、該基質に直接固定化される。前記汎用結合リガンドは、前記基質を活性化（すなわち誘導体化）することによって、該基質に共有結合で付着されることがある。前記基質は、熱、放射線または当業者に知られた化学的技術によって活性化される場合がある。
【００２１】
本発明の技術分野では固体支持体および固体基質ともいう本発明に有用な基質は、多孔性または非孔性の材料であって、前記結合リガンドと、対応する分析用または合成用アレイとを支持することができる。本発明に有用な基質は既知であり、該基質を本発明に応用する技術は本明細書の開示内容を参照する当業者によって理解されるであろう。例えば基質は、ポリマー材料、ガラス、セラミック、ゲル、膜、天然繊維、シリコーン、金属およびこれらの複合材料を含むがこれらに限定されない素材から加工される場合がある。前記固体基質は、具体的な用途に応じてさまざまな形状およびサイズで加工できる。実施例は、プレート、シート、フィルムおよび糸を含む。好ましいが必要ではない形状は、マイクロプレートのような平面的な表面を有し、自動診断システムによって取り扱うことができる形状である。
【００２２】
好ましいが必要ではない本発明の側面では、前記基質は、フッ化アシル官能基が付着した少なくとも１つの表面を有するポリマー材料から前記基質を加工することによって活性化される。フッ化アシル官能基で誘導体化された基質は、側鎖のカルボキシル基を有するポリマー材料か、カルボキシル基を支持するように修飾でき、適当な試薬と反応してフッ化アシル基を形成することができるポリマー材料かを含む、広範囲のポリマー材料から調製することができる。側鎖のフッ化アシル基を有するポリマー材料から加工された固体基質の説明は、米国特許第６，１１０，６６９号明細書に含まれ、引用によってここに取り込まれる。活性化された基質は、不活性な固体基質をフッ化アシル基を付着したポリマーでコーティングすることによって調製することもできる。その他の共有結合による付着化学反応は、無水物、エポキシド、アルデヒド、ヒドラジド、アジ化アシル、アジ化アリル、ジアゾ化合物、ベンゾフェノン、カルボジイミド、イミドエステル、イソチオシアナート、ＮＨＳエステル、ＣＮＢｒ、マレイミド、トシル酸、トレシルクロリド、無水マレイン酸およびカルボニルジイミダゾールに適用可能であるが、これらに限定されない。非共有結合的な手段や、その他の吸着機構による付着は、前記結合リガンドが前記固体支持体に付着しつづけて前記被検体センサーを結合することができるかぎり、適用可能である。
【００２３】
本発明によると、広く多様な特製アレイまたは鋳型が、生物学的または化学的な材料を前記汎用結合リガンドのアレイに連結することによって、調製できる。ここで用いられるところの「生物学的な材料」および「化学的な材料」という用語は、生物学的または化学的な、化合物と、複合体と、リガンドと、細胞と、被検体センサーのような分析用試薬とを含むが、これらに限定されない。生物学的または化学的な材料を、前記固体基質に連結された汎用結合リガンドに付着させる利点は、前記材料の浸出が低減または回避されることである。
【００２４】
生物学的な被検体を同定するためのアレイ利用アッセイシステムは、被検体特異的な生物学的識別分子の分析サンプルとの反応を伴うのが典型的である。前記被検体特異的な生物学的識別分子は、関心のある被検体と、該関心のある被検体を検出するのに使用可能な蛍光検出色素のようなレポータ分子とに相互作用する。生物学的識別分子は、ここおよび本発明の技術分野では被検体センサー、レセプター、捕捉リガンド、捕捉分子、捕捉剤および分析反応剤（ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｒｅａｃｔａｎｔｓ）ともいう。本発明の目的のためには被検体センサーは、標的被検体を識別して、該標的被検体と反応または結合することができる化学的または生化学的な分子である。ここで用いられるところの被検体センサーという用語は、イオン、酵素、ＤＮＡ断片、抗体、抗原、リガンド、ハプテンその他の生体分子を含むが、これらに限定されない。例えば前記標的被検体がポリヌクレオチドのときには、前記被検体センサーは前記標的被検体に相補的なポリヌクレオチドの場合がある。前記標的被検体がレセプターまたはリガンドのときには、前記被検体センサーは前記標的被検体をそれぞれが識別するリガンドまたはレセプターの場合がある。被検体センサーは、被検体と反応できる蛍光レポータ分子か、ウイルス、菌類、動物および哺乳類の細胞または断片のような特異的な微生物および細胞を検出するための特異的結合ペアのメンバーかの場合がある。被検体センサーのその他の例は、抗体捕捉剤の役割を果たすモノクローナル抗体である。この例では前記抗体によって認識されるエピトープが、該エピトープに特異的な標識抗体によって結合される。さらに別の例では前記標的被検体は、被検体センサーとしての役割を果たす固定化された細胞に送達される薬物であってもかまわない。
【００２５】
本発明の実施態様によると、標的被検体および被検体センサーの両方ともレポータ分子で標識できる。レポータ分子の例は、色素、化学発光化合物、酵素、蛍光化合物、金属複合体、磁性粒子、ビオチン、ハプテン、高周波送信器および放射発光化合物（ｒａｄｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）を含むが、これらに限定されない。当業者はこの開示内容を参照して、特定の標的被検体を検出するために用いるべきレポータ分子のタイプを容易に決定することができる。
【００２６】
本発明の好ましいが必要ではない側面では、被検体センサーは、該被検体センサーを汎用結合リガンドに連結することによって、固体基質表面に固定化される。結合リガンドによって基質に結合された被検体センサーは、ここでは検出スポットという。
【００２７】
図１は、本発明の検出器具の調製を示す。図１に示すとおり、基質１１は、フッ化アシル基（ＣＯ−Ｆ）とともに示される。汎用結合リガンド（プロテインＡとして示される）１３は、前記フッ化アシル基と反応して、前記汎用結合リガンドを基質１４に共有結合で付着させる。被検体センサー１５は前記汎用結合リガンドと基質との複合体に連結され、基質１１に固定化される。
【００２８】
活性化された固体基質上に作成された汎用結合リガンドアレイは、マイクロアッセイシステムで特に有用である。微視的なスポットが敏感に検出でき、希釈溶液中の被検体を定量できる。好ましいが必要ではない本発明の側面では、多重被検体アレイ、マトリクスまたは鋳型を含む器具が作成できる。前記多重被検体アレイは、スポットのアレイ中の単一の汎用結合リガンドを、活性化された固体基質に連結して汎用結合リガンドアレイを作成することによって作成される。本発明によると、被検体特異的なセンサーは、多重被検体検出スポットのアレイを作成するために、前記汎用結合リガンドアレイに連結されることがある。本発明の別の側面では２個または３個以上の汎用結合リガンドが、アレイを作成するために用いられることがある。この開示の目的では「スポット」という用語は、前記基質またはアレイ器具上の領域、部位またはゾーンをいう。前記アレイ器具のスポット数は、アッセイの必要に応じて変更できる。アレイは、少なくとも２個のスポットを含み、１０，０００個またはそれ以上のスポットを含む場合もある。本発明の好ましいが必要ではない側面では、検出スポットのアレイは、１６ないし４８００個のスポットを含むが、最も好ましくは約１００から４００個までのスポットを含む。
【００２９】
被検体特異的な検出スポットは、数十個または数百個の被検体が同時に定量的に分析できるように、複雑なサンプル混合液と接触させられることがある。検出スポットのアレイは、同一の結合リガンドおよび複数の被検体センサーか、複数の結合リガンドおよび複数の被検体センサーかのいずれかでできている場合がある。好ましいが限定的ではない実施例では、実施するアッセイの数は、市販のマイクロタイタープレートのウェルの数に対応して、９６個、３８６個または１５３６個の倍数である。代替的に、アッセイの試薬貯液槽の必要を満たすためにその他のマイクロウェルプレートが加工されてもかまわない。
【００３０】
本発明のこの特定の側面の利点は、小型化された支持プラットホームがより小さいサンプルサイズと試薬体積とを可能にすることであり、これは、スケールの節約と、時間の節約とにつながることがある。さらにマイクロアレイを利用する分析器は、従来のマクロアッセイのフォーマットと同等か、より高い感度を達成できる。
【００３１】
本発明は、フィルム、プレート、ウェルその他の固体基質に固定化された、空間的に分解された被検体検知スポットの調製方法を提供する。前記複数の被検体特異的検出アレイを採用するアッセイ処理方法も提供される。
【００３２】
本発明によると、汎用結合リガンドアレイは、この開示を参照して、当業者に知られた従来の手作業の適用技術によって作成することができる。好ましいが必要ではない実施態様では、マイクロアレイプリント技術が、前記汎用結合リガンドアレイを固体基質上に調製するために用いられることがある。この実施態様によると、汎用結合リガンドは、該汎用結合リガンドをマトリクス中の固体基質上のスポットにプリントすることによって、固体基質上に固定化される。
【００３３】
汎用結合リガンドアレイは、熱インクジェットプリント技術を利用して、汎用結合リガンドを選択された固体基質表面の部位にアレイ状のパターンで「プリント」することによっても作成することができる。ジェットプリンタおよびピエゾ電子マイクロジェットプリント技術とを利用するプリント技術は、米国特許第４，８７７，７４５号明細書に説明され、引用によりここに取り込まれる。本発明で用いられるパターン配列方法は、熱ジェットプリント法、ピエゾジェットプリント法、スタンプ法、スプレー法、エンボス法および光微小リソグラフィー法を含むがこれらに限定されない本発明の範囲内で、変更することができる。
【００３４】
プリント技術は、マイクロアッセイを実行し、微小液滴中で化学反応を実行するするための手段として、アッセイテストスポットを用意して、被検体および試薬をこれらのスポットに送達する、整列された微小プリント法にも利用される場合がある。この開示の目的のためには、被検体および試薬をアッセイテスト部位に送達するためにプリント技術を採用することは、「オーバープリント（ｏｖｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ）法」または「オーバープリントアッセイ」という。例えば、従来のビットマップ図形バイナリコマンドを採用するヒューレットパッカードＴｈｉｎｋＪｅｔ（商標）デスクトッププリンタが、４個の異なるプリントヘッドを整列して、（プリントするステップとステップとの間に基質がプリンタから取り外されない場合には）Ｘ方向およびＹ方向の両方に１０ミクロン以内で基質にオーバープリントするために使うことができる。より洗練されたシステムは、基質をプリントするステップとステップとの間で取り外すことを可能にする指標定位（ｉｎｄｅｘｉｎｇ）を提供する。本発明は、分析中のサンプルを定量的に特定のスポットに移動するために利用することもできる。
【００３５】
好ましいが必要ではない本発明の側面によると、検出スポット（すなわち、アッセイテスト部位）が、汎用結合リガンドスポットのアレイを基質上にプリントし、該汎用結合リガンドスポットのアレイの上に被検体センサーをオーバープリントすることによって、基質上に作成される。マイクロアレイヤー（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｅｒ）の位置決めは、０．５ないし１ミクロンの精度で利用でき、検出スポットの高密度アレイを作成できる。したがって検出スポットは、約１０ミクロンのスポット直径でアレイ上に作成できる。代替的に、本発明の必要ではない別の側面では、例えば親和性の低い結合リガンド又は被検体センサーを用いて大きい直径の検出スポットを用いることが望ましい。したがって検出スポットは、約５００ミクロンのスポット直径でアレイ上に作成できる。好ましいが必要ではない本発明の側面ではアレイ上の検出スポットは、約７５ミクロンから約１５０ミクロンまでのスポット直径の場合がある。
【００３６】
本発明のある側面では、被検体センサー、標的被検体および試薬のようなアッセイの構成部分の１つまたは全てが、プリント技術によって前記検出スポットに送達できる。１個または２個以上の分析用試薬が、プリント技術を用いて前記検出スポットのそれぞれに戴置できる。前記送達は並列的なやり方で達成できる。例えばマイクロＥＬＩＳＡが、並列的なやり方で、捕捉抗体、抗原およびレポータ分子のようなアッセイの全ての構成部分を、固体基質の表面に部位特異的に分注するために用いられる場合がある。
【００３７】
本発明のこの側面は、図２に概念的に示される。図２に示されるとおり、インクジェットプリンタまたは類似の装置が、アッセイテスト部位（すなわち、検出スポット）のアレイを作成するために、汎用結合リガンドおよび複数の被検体センサーを分注する。図２に示されるとおり第１段階では、汎用結合リガンドが基質上にプリントされる。第１段階では、インクジェットプリントヘッド２１が汎用結合リガンド２２の液滴を分注する。第２段階では、インクジェットプリントヘッド２３および２４が複数の被検体センサー２５Ａ、２５Ｂおよび２５Ｃを分注する。第３段階では、インクジェットプリントヘッド２６が関心のある被検体２８を含む分析サンプルを分注し、インクジェットプリントヘッド２７がシグナル発色試薬（すなわち、検出試薬）２９を分注する。
【００３８】
本発明の利点は、ここに説明されたオーバープリント技術の採用で、試薬の消費量を従来の９６ウェルマイクロタイタープレートアッセイで用いられた試薬の消費量より１０００倍低減することができたことである。さらなる利点として、〜２ピコグラム（スポットあたり８ｘ１０６個の分子）の検出レベルが、スポットあたり４．７ないし３７．５ピコグラム（１．９ｘ１０７ないし１．５ｘ１０８個の分子）の捕捉抗体で達成できる。ここに説明されるオーバープリント技術の採用は超微量サンプル分析を提供できる。さらに、ハイスループットが、アレイを並列的なやり方で処理することによって達成される。精密プリントおよび環境制御でのさらなる進歩が、さらなる超微量サンプル分析と、より小さな基質上の検出スポットの体積の増大とにつながることが意図される。
【００３９】
図３は、ここに説明するとおり、多重分析用の検出スポットのアレイを作成するために汎用結合リガンドとしてプロテインＡを採用するマイクロアッセイシステムを示す。図３に示すとおり、プロテインＡは汎用結合リガンドとして用いられる。前記汎用結合リガンドは、汎用結合リガンドスポットのアレイを作成するために、マトリクス中の（フッ化アシル活性化プラスチック基質として示される）活性化された基質に連結される。図３、例３ａ）に示されるとおり、さまざまな抗体が、検出スポットのアレイを作成するために、前記プロテインＡのスポットに送達されることがある。前記抗体検出スポットのアレイは抗原を弁別することができる。図３、例３ｂ）は、抗体検出スポットアレイがどのように多重免疫アッセイで利用されるかを示す。図３、例３ｂ）では、一群の抗原またはリガンドを認識する異なるヤギ抗体を認識する、異なるウサギ抗体が、複合免疫アッセイシステムを達成するために用いられる。図３、例３ｃ）はリガンド結合アッセイを示す。プロテインＡが前記汎用結合リガンドとして用いられるとき、プロテインＡは免疫グロブリンのＦｃ領域に優先的かつ可逆的に結合する。例えば、Ｌａｎｇｏｎｅ、Ｊ．Ｊ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９８２、ｖｏｌ．５５、ｐｐ．２７７−２９６を参照せよ。プロテインＡアレイに結合する抗リガンド抗体またはＦｃ−リガンドコンジュゲートが、特製リガンドアッセイを作成するために調製されることがある。図３、例３）では、前記抗体はＦｃ部分だけに減縮され、該Ｆｃ部分はレセプター結合アッセイに用いられることがある一連のレセプターとコンジュゲートされる。被検体に続いて、前記捕捉されたＦｃまたは抗体が酸性条件下で解離でき、前記プロテインＡアレイはさらなる使用のために再生される。
【００４０】
好ましいが必要ではない本発明の側面では、プロテインＡアレイはプロテインＡスポットを基質上にプリントすることによって作成される。前記アレイの追加の構成要素は、プリントすることによって試薬を特定のプロテインＡスポットに微量分注することによって構築できる。好ましいが必要ではない本発明の側面では、プロテインＡは、塩基性ｐＨバッファーシステムで調製される。ジェットプリント用には、ＬｉＣｌ、ｐＨ９−１０のバッファー溶液が好ましい。手作業のプリントまたは接触プリント用には、重炭酸−炭酸ナトリウム、ｐＨ９−１０のバッファー溶液が好ましい。ジェットプリント用の好ましいが必要ではない工程では、プロテインＡは水溶液に溶解され、フッ化アシル活性化成形エチレンメタクリル酸共重合体基質上に液滴状で分注される。プリントされた前記基質は、終夜室温で乾燥される。それから、残存する反応基は、例えば、カゼインタンパク溶液中に１時間浸漬して、蒸留水中で濯ぐことによってブロックされる。その後、プロテインＡ結合リガンドスポットのアレイは、風乾されて、室温で保存させる場合がある。
【００４１】
ストレプトアビジンは、多重分析用の汎用結合リガンドスポットのアレイを作成するために用いられることがある。本発明のこの側面では、ストレプトアビジンは、結合リガンドスポットのアレイを作成するために前記基質上にプリントされる。前記ストレプトアビジン結合リガンドアレイは、多重アッセイ用の検出スポットのアレイを作成するために、前記ストレプトアビジン結合リガンドアレイに特異的な相補的に標識された試薬（すなわち、被検体センサー）と反応させられる。相補的に標識された試薬の１つの例はビオチン化抗体である。
【００４２】
アビジンは、アレイを作成するための汎用結合リガンドとしても用いられることがある。図４に示すとおり、アビジンは、アビジン汎用結合リガンドアレイを作成するために、基質に連結される。図４の第１段階では、アビジンスポット４１が、インクジェットプリンタ４３を用いて基質４２上にプリントされる。（例えば、Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ社から市販されている「ＰｈｏｔｏＬｉｎｋ」のような）光活性化連結剤が、前記アビジンを前記基質上に固定化するために用いられる。本発明の１つの実施態様では、プリント後に、前記連結剤を含むアビジンスポットはＵＶ光を照射されるが、該ＵＶ光はアビジンと基質との間の共有結合形成を開始する。本発明は、前記照射と、その後の結合リガンド４４の前記基質への固定化とを、特異的な生物学的材料（すなわち、被検体センサー）の連結の前に行うことを可能にする。例えばこれは図４の第２段階に示される。前記汎用結合リガンドの予備照射は、臨界状態の用途での生物学的な被検体センサーに対するＵＶによる損傷を低減することができる。
【００４３】
図４に示す第２段階は、第１段階の直後である場合も、そうでない場合もあるが、第２段階では第２のプリントヘッド４５は、被検体特異的なビオチン化検知試薬４６（すなわち、ビオチン化被検体センサー）で満たされる。これらの被検体センサーの例は、ビオチン化モノクローナルマウス抗ヒトＩｇＧ３またはＩｇＧ４抗体を含む。好ましいが必要ではない本発明の側面では、ビオチン化被検体センサー４６は、先に分注されたアビジンスポット４１と整列するように配置される。この場所のアビジン−リンカー残基が親水性であることのため、プリントされたビオチン化被検体センサー４６を既に存在するアビジン４１のスポット上に引き寄せる。アビジン４１とビオチン化被検体センサー４６とが乾燥する前に混合し反応して、生成物４７を形成し、該生成物は固体基質４２上で乾燥する。前記ビオチン化でとスポットは、前記基質上のアビジンに結合され、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の定量アッセイを実施するために用いられることがある。前記工程が繰り返されて、検出スポットのアレイをプリントするためにさらなるビオチン化被検体センサーをアビジン４１のスポット上にプリントすることもある。
【００４４】
ここに説明されたオーバープリント法は、被検体センサーで実際に標識された領域よりも前記基質の全表面積を数桁広くできるため、従来の代替策の多くに比べて優れている。さらに、非特異的結合のような基質の全表面積を活性化することに伴う問題は、ここに説明された器具および方法を用いて回避することができる。基質の全表面積を活性化することは、未使用の部位の不動態化（ｐａｓｓｉｖａｔｉｏｎ）を必要とする。不動態化それ自体は、さらなるステップを追加し、アレイ加工に伴うコストおよび時間を増加させるため、望ましくない場合がある。また、不動態化された連結材料の表面特性は、最適な結果を得るために注意深く検討されなければならない。
【００４５】
本発明の別の側面は、サンプル中の複数の異なる標的被検体を検出する方法を含む。図５を参照して、本発明の方法は第１の前処理段階を含む。第１の前処理段階では複数の被検体を検出するための検出器具５２が選択されるが、該検出器具は、固体基質５２Ａと、該固体基質上の検出スポット５２Ｂのアレイとを含む。各検出スポットは、結合リガンド５２Ｄによって前記基質上に固定化された被検体センサー５２Ｃを含む。
【００４６】
第２の分析段階では、分析サンプルが基質５３の上に戴置される。好ましいが必要ではない本発明の側面では、前記サンプルは、この開示内容を参照する当業者に理解されるであろうプリント技術によって、前記基質上に離散した液滴状態でプリントできる。好ましいが必要ではない本発明の別の側面では、前記サンプルは、サンプルのある１つの液滴が隣接するサンプルの液滴に流入したり接触したりすることが実質的に起こらないように、離散した液滴またはスポットの状態で、実質的に前記検出スポットのみの上の基質にプリントされる。洗浄するステップ５５Ａおよび５５Ｃと、前記基質上を試薬で標識するステップ５５Ｂとのような次の分析処理ステップ５４が実行される。好ましいが必要ではない本発明の側面では、前記処理ステップで適用される洗浄および標識用の試薬も、実質的に前記検出スポットの上のみにプリントされる。
【００４７】
第３の検出および解釈の段階５６では、被検体の有無が、関心のある被検体との結合、複合体化または会合をした検出標識のそれぞれ有無を決定することによって検出できる。被検体標識の検出方法と前記検出の結果の解釈とは既知であり、当業者はこの開示内容を参照して理解するであろう。検出方法の例は、蛍光、リン光、ＵＶ、放射能標識等を含むが、これらに限定されない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
本発明による活性化基質（すなわち、プラスチック基質）の調製は、実施例１に示される。
【実施例１】
【００４９】
活性化基質の調製
（ジエチルアミノ）硫黄トリフルオリド（ＤＡＳＴ）は、ＳｙｎＣｈｅｍ社（オハイオ州、Ａｕｒｏｒａ）から入手し、精製することなく使用された。ＤＡＳＴ試薬は、ジクロロメタンで５％ｖ／ｖに希釈されたＤＡＳＴからなる。エチレンメタクリル酸共重合体（ＥＭＡ）は、デュポン社から入手され、さまざまな形状に成形され、ＤＡＳＴを直接用いてフッ化アシル活性化型に転化された（１２）。ポリプロピレン（ＰＰ）シートの厚さ２０ミル（ｍｉｌ）のＣｏｎｔｏｕｒ２９（Ｇｏｅｘ社、ウィスコンシン州、Ｊａｎｅｓｖｉｌｌｅ）が、高周波プラズマアミノ化工法を用いて表面アミノ化された（４）。アミノ化された前記ポリプロピレンシートは、次に、無水コハク酸を用いてカルボキシル型に転化された。カルボキシル化されたＰＰは、前記ＤＡＳＴ試薬を用いてフッ化アシルに修飾された。
【実施例２】
【００５０】
プロテインＡの活性化基質への共有結合による連結
本発明によるプロテインＡの活性化基質（すなわち、プラスチック基質）への共有結合による連結は、実施例２に示される。プロテインＡおよびある種の抗体は、Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手された。追加の抗体および抗原は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入された。フッ化アシル活性化プラスチック基質は、エチレンメタクリル酸共重合体（ＥＭＡ）またはＭａｔｓｏｎ、Ｒ．Ｓ．ら、Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９８４、ｖｏｌ．２１７、ｐｐ．３０６−３１０に説明されるプラスチックアミノ化ポリプロピレンである、カルボキシル基またはアミノ基の先端が切り取られた（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）熱可塑性プラスチックとＤＡＳＴとの反応から調製された。プロテインＡマイクロアレイは、ＢｉｏＤｏｔ３２００ディスペンサー（Ｃａｒｔｅｓｉａｎ）を用いる非接触分注か、３８４ピンＨＤＲＴを装備したＢｉｏｍｅｋ（登録商標）２０００を用いる接触プリント法かのいずれかによって作成された。アルカリフォスファターゼ用の蛍光沈殿基質であるＥＬＦ試薬（ＥＬＦ−９７内在性フォスファターゼ検出キット、モレキュラープローブ社）は、シグナル発色用に用いられた。デジタル画像がＣＣＤカメラシステム（Ｔｅｌｅｒｉｓ２、ＳｐｅｃｔｒａＳｏｕｒｃｅ社）を用いて得られた。３５０ｎｍの励起光がＵＶミネラル光を用いて発生され、シグナルの発光は１０ｎｍの帯域幅のレンズフィルタを用いて５２０ｎｍで集光された。１６ビットの画像はＩｍａＧｅｎｅソフトウェア（ＢｉｏＤｉｓｃｏｖｅｒｙ社）を用いて解析され、計算および画像表示のために８ビット数値としてエクセルのスプレッドシート（マイクロソフト）に転送された。
【００５１】
プロテインＡは、塩基性ｐＨバッファーメジウム中でフッ化アシル活性化基質に連結された。具体的な連結条件はプリント方法に応じて変更された。これらは以下に説明される。
【実施例３】
【００５２】
ＨＤＲＴを用いる接触プリント法
予め脱イオン水中に２．５ｍｇ／ｍＬで再構成されたプロテインＡが、炭酸−重炭酸ナトリウムバッファー、１Ｍ、ｐＨ９中でさらに１ｍｇ／ｍＬに希釈された。前記溶液は分注のために３８４ウェルマイクロプレートに分配された。フッ化アシル活性化ポリプロピレンのシート（２０ミル）が、両面粘着テープでマイクロタイタープレートの蓋に取り付けられ、Ｂｉｏｍｅｋ（商標）プレートホルダーに設置された。プロテインＡは標準のＢｉｏｗｏｒｋ（登録商標）ソフトウェアを用いて作成された３ｘ３サブアレイパターンでフッ化アシルポリプロピレンの表面に分注された。３８４個までのサブアレイが前記活性化プラスチック基質の表面にこのやり方で９ｃｍ  ｘ  １２ｃｍの面積に作成された。前記ディスペンサーのそれぞれのピンは、２−３ｎＬを送達し、各部位に全部で５回分注された（１０ないし１５ｎＬのプロテインＡ溶液）。前記アレイは、前記Ｂｉｏｍｅｋの作業面の適当な指標定位（ｉｎｄｅｘｉｎｇ）を維持するために、アッセイを通じて前記マイクロプレートの蓋に付着したままであった。前記プロテインＡマイクロアレイは、非特異的吸着を低減するために、カゼイン（５０ｍＭ炭酸バッファー、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．５中の１ｍｇ／ｍＬカゼイン）中で１時間室温でブロックされた。その後炭酸バッファー中での最後の濯ぎを行った。
【実施例４】
【００５３】
プロテインＡの非接触プリント
基質上へのプロテインＡの非接触プリントが実施例４で示される。
【００５４】
〜１ｍｇ／ｍＬのプロテインＡが基質へのジェットプリントのためにｐＨ１０の１Ｍ  ＬｉＣｌ溶液に溶解された。前記ＬｉＣｌ溶液は、ポリプロピレン基質よりも親水性が強い前記ＥＭＡ表面の液滴を保持するためのキャリヤとして用いられた。ＬｉＣｌ／プロテインＡ溶液は、たんぱく質の凝集物を除去するために、０．４５  Ｆｍ  Ｚ−Ｓｐｉｎ  Ｐｌｕｓ（商標）遠心フィルタを通してろ過された。約１６ｎＬの液滴が成形されたフッ化アシル活性化エチレンメタクリル酸基質（面積１ｃｍ  ｘ  １ｃｍ）上に分注された。前記Ｃａｒｔｅｓｉａｎの３２００ＢｉｏＤｏｔディスペンサーが、前記表面に中心から中心までの間隔が約３００ミクロンの９ｘ９アレイパターン状にプロテインＡ溶液の液滴を戴置するのに用いられた。プロテインＡをプリントする工程は２ないし５回のオーバープリントで繰り返された。後のプリントは、ユーザソフトウェアのインターフェースによって指示されたのと同じスポットの場所に正確に行われた。プリントの後、前記マイクロアレイは前記ディスペンサープラットホームから取り出され、２５°Ｃ１時間のインキュベーションのために保湿チャンバーに移された。それから前記マイクロアレイはデシケータ内に置かれた。室温で終夜乾燥した後、残存する反応基は、前記マイクロアレイをカゼイン溶液（５０ｍＭ炭酸−重炭酸ナトリウムバッファー、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．５中の２ｍｇ／ｍＬカゼイン）中で１時間浸漬することによってブロックされた。脱イオン水中での短時間の濯ぎに続いて、前記マイクロアレイは３０分間２５°Ｃで風乾され、室温で保存された。
【実施例５】
【００５５】
オーバープリントアッセイ
オーバープリント法の一般的な工法は図２に示される。プロテインＡマイクロアレイの調製（第１段階）の後、一連の抗体が個々の部位に送達された（第２段階）。未結合の捕捉抗体を除去するための濯ぎに続いて、抗原が前記アレイに送達されて、同様に処理された（第３段階）。最後のステップ（第４段階）では、シグナル発色試薬が前記アレイの個々の部位に戴置された。これで終夜の工程が終了する。それから、前記マイクロアレイは前記プリントステージから取り出され、シグナルがＣＣＤカメラシステムを用いて読み取られた。
【００５６】
第１の実験は、図６に示される。９ｘ９のプロテインＡマイクロアレイがＥＭＡ成形部分に作成され、ＢｉｏＤｏｔディスペンサーの作業面上に取り付けられたペグボード（ｐｅｇｂｏａｒｄ）で再定位された。捕捉抗体（すなわち、被検体センサー）は５０ｍＭ  炭酸バッファー、０，１％  Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ８．５中で１ｍｇ／ｍＬに調製され、３８４ウェルマイクロタイタープレートのウェルに分配された。異なる抗体溶液が前記アレイの構成要素に分注された。前記９ｘ９プロテインＡマイクロアレイは、１列おきにウサギ抗ヤギＩｇＧかヒトＩｇＧかのいずれかを分注してオーバープリントされた。このやり方で、ウサギ免疫グロブリン４列と、宿主と免疫グロブリン５列ができた。それから前記マイクロアレイは取り出されて、前記抗体が前記プロテインＡ部位に完全に結合することができるように、１時間２５°Ｃの保湿チャンバー内に入れられた。その後、前記成形部分は、未結合の抗体を除去するために洗浄液に浸され、その後、ＢｉｏＤｏｔのステージに戻された。それから抗原（ヤギ抗ビオチンＩｇＧ）が前記アレイの全ての列に分注され、同様にインキュベーションされた。短時間濯いだ後、前記アレイ全体が、ビオチン化アルカリフォスファターゼとの３０分間のインキュベーションと、濯ぎとを経て、さらに３０分間室温でＥＬＦ試薬を用いてシグナルが発色された。
【実施例６】
【００５７】
完全自動化オーバープリントアッセイ
実施例５は半自動化フォーマットでのオーバープリント試薬の能力を示す。実施例６は本発明の完全自動化オーバープリントアッセイを示す。
【００５８】
検出スポットのアレイはここに説明されたとおりに作成された。Ｂｉｏｍｅｋ（登録商標）２０００ロボットワークステーションが部位特異的な試薬とバルク試薬の両方を前記アレイに自動的に送達するために採用された。この実施例では、前記アレイは工程の間ずっと作業面に置かれたままであった。３８４−ＨＤＲＴが少量の試薬を前記アレイの特定の部位に送達するのに用いられ、Ｐ１０００ピペットツールがバルクの濯ぎ試薬を分注するのに用いられた。グリッパツールが、前記アレイシートから過剰な試薬を吸い取るため、および、前記プレートをインキュベーションの間覆うために用いられた。被検体（抗原）と、レポータ抗体とは前記ＨＤＲＴを用いて前記アレイ上の個々のスポットに送達され、インキュベーションされ、前記Ｐ１０００ピペットツールを用いて濯がれた。それぞれの場合で、試薬送達の最適体積が決定され、各部位への繰り返し分注の回数が必要に応じて変更された。たいていの場合には、少なくとも５−７回の繰り返しが必要であった。前記工程の各段階の最後で、マイクロプレートの蓋の内側に取り付けられた濾紙を用いて前記アレイを拭いて乾燥した。吸い取り紙は前記グリッパツールによってつまみとられて吸い取りのために前記アレイプレートの上に置かれた。試薬の持ち込みを避けるために新しい吸い取り紙を用いて、各濯ぎサイクルごとに繰り返された。レポータ抗体のオーバープリントの後、ストレプトアビジン−アルカリフォスファターゼコンジュゲートがプリントされた。最後の段階で、発色試薬のＥＬＦ−９７が適用された。シグナルはＣＣＤカメラシステムを用いてオフラインで取り込まれた。
【実施例７】
【００５９】
抗原検出
ＨＤＲＴがプロテインＡの５ｘ９アレイ中の３ｘ３サブアレイ（９個のレプリカ）をプリントするのに用いられた（第１段階）。次にウサギ抗ヤギが、１：５０（〜１５０ｐｇ／スポット）から１：１０００（〜７．５ｐｇ／スポット）までのさまざまな希釈で、前記プロテインＡ（３ｘ３）サブアレイ上に２回繰り返しでオーバープリントされた（第２段階）。プロテインＡサブアレイの最上段は、各希釈率での抗原との非特異的な結合（ＮＳＢ）のレベルを測定するために、捕捉抗体でオーバープリントされなかった。オンラインの濯ぎの後、前記抗原（ビオチン−ヤギ抗ヒト抗体、２００ｎｇ／ｍｌ）が、１：１０（〜２００ｐｇ／スポット）ないし１：１０００（〜２ｐｇ／スポット）ｖ／ｖの希釈で各サブアレイ上にオーバープリントされた（第３段階）。１時間のインキュベーションの後、前記マイクロアレイは、上述のとおり濯ぎと拭き取り乾燥とを行った。次に、ストレプトアビジン−アルカリフォスファターゼコンジュゲートがオーバープリントされ、各部位がＥＬＦ試薬を用いて発色させられた（第４段階）。得られた画像が図７に示される。抗原についての最低検出閾値（ｌｏｗｅｒ  ｌｅｖｅｌ  ｏｆ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）が決定された。非競合免疫アッセイフォーマット（ＬＬＤ＝３Ｂ０（ＳＤ）、ここでＢ０はバックグランドシグナルの平均強度で、ＳＤは対応する標準偏差）に基づいて、図８に示すとおり、２ｐｇ／スポットの抗原感度が達成された。これは、抗原が、３１ないし２５０ｎｇ／ｍＬの範囲の抗原サンプルを達成するために、１：８００から１：６４００ｖ／ｖまでの希釈系列で希釈された追加実験から確認された。したがって、かかる溶液から適用された抗原は、捕捉抗体のスポットあたりピコグラム以下の抗原の送達に対応する。同様に、捕捉抗体は４．７ｐｇ／スポットから１８．８ｐｇ／スポットまでを達成するような希釈系列で希釈された。結果は図９に示すとおり、１．２５ｐｇないし２．５ｐｇの適用された抗原がバックグランド以上で検出された。有利なことには、図１０に示すとおり、これは、より希薄な抗体密度で達成された。
【００６０】
請求の範囲、要約および図面を含む本明細書に開示された全ての特徴と、開示されたいずれかの方法または工法の全てのステップとは、かかる特徴および／またはステップの少なくとも一部が相互に排除的な組み合わせを除いて、いかなる組み合わせで組み合わされてもかまわない。請求の範囲、要約および図面を含む本明細書に開示されたそれぞれの特徴は、そうでないと明示的に表明されないかぎり、同一、均等または類似の目的に役立つ代替的な特徴によって置換できる。したがって、そうでないと明示的に表明されないかぎり、開示されたそれぞれの特徴は、均等または類似の特徴の一連の上位概念の１つの実施例にすぎない。
【００６１】
具体的な機能を実行するための「手段」または具体的な機能を実行するための「ステップ」を明示的に表明しない請求項のいかなる構成要素も、米国特許法第１１２条に規定される「ステップ」のための「手段」として解釈されるべきではない。
【００６２】
本発明はある種の好ましい実施態様を参照してかなり詳細に説明されたが、他の実施態様がありうる。したがって、添付する請求の範囲は、この開示に含まれる好ましい実施態様の記載に限定されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】本発明の検出器具の調製を示す概念図。
【図２】本発明の汎用マイクロアレイの好ましい調製方法を示す概念図。
【図３】プロテインＡをアレイ中の汎用結合リガンドとして採用する本発明のアッセイシステムの概念図。
【図４】アビジン−ビオチン複合体を採用する本発明のマイクロアレイの概念図。
【図５】本発明の方法のステップを示すフロー・チャート。
【図６】抗体のオーバープリントを用いる本発明のプロテインＡマイクロアレイの概念図。
【図７】プリント技術を用いる本発明の免疫アッセイの概念図。
【図８】図７の免疫アッセイの結果を示すグラフ。
【図９】図７の少量の抗体装荷時の抗原力価測定の結果を示すグラフ。
【図１０】図７の少量の捕捉抗体装荷時のＬＬＤの決定結果を示すグラフ。
【符号の説明】
【００６４】
１１、４２    基質
１２    フッ化アシル基
１３、２２    汎用結合リガンド
１４    汎用結合リガンドの付着した基質
１５、２５Ａ、２５Ｂ、２５Ｃ、５２Ｃ    被検体センサー
１６    固定化された被検体センサー
２１、２３、２４、２６、２７    インクジェットプリントヘッド
２８    被検体
２９    試薬
４１    アビジンスポット
４３    インクジェットプリンタ
４４、５２Ｄ    結合リガンド
４５    第２のプリントヘッド
４６    ビオチン検知試薬
４７    生成物
５２    検出器具
５２Ａ    固体基質
５２Ｂ    検出スポット
【図１】
2005524059.tif 000003
【図２】
2005524059.tif 000004
【図３】
2005524059.tif 000005
【図４】
2005524059.tif 000006
【図５】
2005524059.tif 000007
【図６】
2005524059.tif 000008
【図７】
2005524059.tif 000009
【図８】
2005524059.tif 000010
【図９】
2005524059.tif 000011
【図１０】
2005524059.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成17年3月30日(2005.3.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）基質と、（ｂ）該基質上の検出スポットのアレイとを含む被検体検出器具であって、
前記検出スポットのそれぞれは、被検体センサーと第１の結合リガンドとを含み、
（ｉ）前記被検体センサーは前記結合リガンドによって前記基質に結合され、
（ｉｉ）異なる前記被検体について複数の前記被検体センサーがあり、
（ｉｉｉ）同一の第１の結合リガンドが２個または３個以上の異なる前記被検体センサーに用いられる、被検体検出器具。
【請求項２】
前記結合リガンドは前記基質に直接固定化される、請求項１に記載の被検体検出器具。
【請求項３】
２個または３個以上の異なる前記被検体センサーに用いられる第２の結合リガンドを含む、請求項１または２に記載の被検体検出器具。
【請求項４】
前記基質は側鎖のフッ化アシル基を有し、前記検出スポットは前記結合リガンドと前記側鎖のフッ化アシル基との共有結合によって前記基質上に固定化される、請求項１−３のいずれか１つに記載の被検体検出器具。
【請求項５】
前記結合リガンドおよび被検体センサーは、プリントすることによって実質的に局在したスポットの予め定められたパターンで前記基質に適用される、請求項１−４のいずれか１つに記載の被検体検出器具。
【請求項６】
前記結合リガンドは、タンパク質か、酵素か、糖質か、核酸か、オリゴヌクレオチドか、ポリヌクレオチドか、アプタマーか、ハプテンか、薬物か、色素か、有機低分子か、細胞か、細胞の断片か、レセプターか、細胞表面結合剤か、これらの類似体、ミミック、コンジュゲートまたは複合体かのうちの１つである、請求項１−５のいずれか１つに記載の被検体検出器具。
【請求項７】
前記結合リガンドは、プロテインＡ、ビオチンまたはストレプトアビジンのうちの１つである、請求項１−６のいずれか１つに記載の被検体検出器具。
【請求項８】
前記被検体センサーは抗体である、請求項１−７のいずれか１つに記載の被検体検出器具。
【請求項９】
前記被検体センサーのそれぞれは、核酸と、タンパク質と、糖質と、色素と、ハプテンと、薬物と、レセプターと、細胞断片または細胞と、これらの類似体、ミミック、コンジュゲートまたは複合体とからなるグループから独立に選択される、請求項１−８のいずれか１つに記載の被検体検出器具。
【請求項１０】
前記検出スポットのアレイは実質的に局在したスポットのマトリクスでできている、請求項１−９のいずれか１つに記載の被検体検出器具。
【請求項１１】
前記アレイの検出スポットのそれぞれは、スポットの直径が少なくとも１０ミクロンである、請求項１−１０のいずれか１つに記載の被検体検出器具。
【請求項１２】
前記アレイの検出スポットのそれぞれは、スポットの直径が約７５ミクロンないし１５０ミクロンである、請求項１−１１のいずれか１つに記載の被検体検出器具。
【請求項１３】
前記検出スポットのアレイは１００ないし４００個のスポットでできている、請求項１−１２のいずれか１つに記載の被検体検出器具。
【請求項１４】
サンプル中の複数の異なる被検体を検出する方法であって、
（ａ）請求項１に記載の被検体検出器具を選択するステップと、
（ｂ）実質的に前記基質の前記検出スポット上のみに分析サンプルを戴置するステップとを含む、方法。
【請求項１５】
（ｃ）未結合のサンプルを除去するために前記基質を洗浄するステップと、
（ｄ）実質的に前記基質の前記検出スポット上のみに検出標識を戴置するステップとをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
（ｅ）前記基質から未結合の前記検出標識を洗浄するステップと、
（ｆ）結合した前記検出標識を検出するステップとをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記分析サンプルは、プリントすることによって、実質的に前記検出スポット上のみに戴置される、請求項１４、１５および１６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１８】
前記検出標識は、プリントすることによって、実質的に前記検出スポット上のみに戴置される、請求項１４、１５および１６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１９】
サンプル中の複数の異なる被検体を検出するための方法であって、
（ａ）（ｉ）基質と、（ｉｉ）該基質上の検出スポットのアレイとを含む被検体検出器具を選択するステップと、
（ｂ）実質的に前記検出スポットのそれぞれの上のみに２個または３個以上の分析サンプルをプリントするステップとを含み、
前記検出スポットのそれぞれは、被検体センサーと結合リガンドとを含み、
前記被検体センサーは前記結合リガンドによって前記基質に結合する、方法。
【請求項２０】
結合リガンドスポットのアレイ上に複数の被検体センサーを戴置することを含む、被検体検出器具の調製方法であって、
前記被検体センサーのそれぞれは異なる前記被検体に用いられ、同一の前記結合リガンドが２個または３個以上の異なる前記被検体センサーに用いられ、前記センサーのそれぞれがプリントすることによって、実質的に前記結合リガンドスポットのそれぞれの上にのみ戴置される、被検体検出器具の調製方法。
【請求項２１】
被検体センサーのアレイ上に分析サンプルを戴置することを含む、サンプル中の被検体の検出方法であって、
前記被検体センサーのアレイは２個または３個以上の異なる被検体センサーのスポットでできており、前記分析サンプルはプリントすることによって実質的に前記被検体センサーのそれぞれの上にのみ戴置される、サンプル中の被検体の検出方法。
【請求項２２】
実質的に前記被検体センサーのスポットのそれぞれの上にのみ検出標識をプリントすることをさらに含む、請求項１９または２１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２３】
実質的に前記被検体センサーのスポットのそれぞれの上にのみ検出標識をプリントすることをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記被検体センサーの少なくとも１つは、ストレプトアビジン、プロテインＡまたはビオチンのうちの１つである、請求項１９、２１または２２のうちのいずれか１つに記載の方法。
【請求項２５】
前記被検体センサーの少なくとも１つは、ストレプトアビジン、プロテインＡまたはビオチンのうちの１つである、請求項２０または２３のうちのいずれか１つに記載の方法。
【請求項２６】
前記被検体センサーのスポットの少なくとも１つは抗体を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記被検体センサーのスポットの少なくとも１つは抗体を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
複数ステップ合成のための方法であって、
（ａ）基質を選択するステップと、
（ｂ）前記基質上に結合リガンドスポットのアレイを戴置するステップと、
（ｃ）前記結合リガンドスポットのアレイ上に１個または２個以上の合成試薬を戴置するステップとを含み、
異なる合成に用いる複数の異なる試薬があり、同一の前記結合リガンドが２個または３個以上の異なる合成に用いられ、前記合成試薬はプリントすることによって実質的に前記結合リガンドスポットのそれぞれの上にのみ戴置される、複数ステップ合成のための方法。
【請求項２９】
前記合成試薬は、核酸またはアミノ酸の誘導体である、請求項２８に記載の方法。
【国際調査報告】
2005524059.tif 000013