(57)【要約】  ＤｅｇＰプロテアーゼは細菌のペリプラズム空間からの変性タンパク質または凝集タンパク質の清掃に必須である。本発明は、ＤｅｇＰプロテアーゼ活性を変調することによる線毛形成細菌により引き起こされる疾患の治療および／または予防のための新規方法に関する。ＰａｐＡピリンサブユニットにおけるＤｅｇＰ切断部位の同定およびＤｅｇＰ活性を変調する物質を同定するための方法をも開示する。本発明はさらに切断可能なＤｅｇＰの基質である同定されたポリペプチドを提供する。本発明はＤｅｇＰプロテアーゼ活性を増強するポリペプチドの同定を提供する。本発明によりＤｅｇＰプロテアーゼをターゲッティングする新規クラスの抗感染薬の開発が容易になる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤｅｇＰまたはＤｅｇＰホモログのプロテアーゼ活性を変調する物質を同定するための方法であって、
切断可能な基質の存在下でＤｅｇＰまたはＤｅｇＰホモログに物質を添加するステップと、
前記切断可能な基質の切断の増強または抑制を検出し、それにより前記物質が前記プロテアーゼ活性を変調するかどうかを決定するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記切断可能な基質がＨＹＴＡＶＶＫＫＳＳＡＶ（配列番号３）、ＨＹＴＡＶＶＫ（配列番号４）、ＬＤＩＥＬＶＮＣＤＩＴＡ（配列番号５）、ＥＬＶＮＣＤＩ（配列番号６）、ＫＬＡＦＴＧＰＩＶＮＧＨ（配列番号７）、ＦＴＧＰＩＶＮＧＨＳＤＥ（配列番号８）、ＴＬＫＤＧＥＮＶＬＨＹＴ（配列番号９）、ＤＧＥＮＶＬＨ（配列番号１０）、ＮＶＬＨＹＴＡ（配列番号１１）、およびＮＧＨＳＤＥＬ（配列番号１２）からなる群から選択されるポリペプチドである請求項１の方法。
【請求項３】
前記ＤｅｇＰホモログがＤｅｇＳまたはＤｅｇＱである請求項１の方法。
【請求項４】
前記物質が前記プロテアーゼ活性を増強する請求項１の方法。
【請求項５】
前記物質が前記プロテアーゼ活性を抑制する請求項１の方法。
【請求項６】
前記物質がＤｅｇＰ活性を変調する請求項１の方法。
【請求項７】
ＤｅｇＰまたはＤｅｇＰホモログのプロテアーゼ活性を防御、抑制または増強することを含む、線毛形成細菌により引き起こされる疾患の治療または予防のための方法。
【請求項８】
ＨＹＴＡＶＶＫＫＳＳＡＶ（配列番号３）、ＨＹＴＡＶＶＫ（配列番号４）、ＬＤＩＥＬＶＮＣＤＩＴＡ（配列番号５）、ＥＬＶＮＣＤＩ（配列番号６）、ＫＬＡＦＴＧＰＩＶＮＧＨ（配列番号７）、ＦＴＧＰＩＶＮＧＨＳＤＥ（配列番号８）、ＴＬＫＤＧＥＮＶＬＨＹＴ（配列番号９）、ＤＧＥＮＶＬＨ（配列番号１０）、ＮＶＬＨＹＴＡ（配列番号１１）、およびＮＧＨＳＤＥＬ（配列番号１２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項９】
ＤｅｇＰまたはＤｅｇＰホモログのプロテアーゼ活性を変調するための方法であって、
ＤｅｇＰまたはＤｅｇＰホモログのプロテアーゼ活性を変調するのに十分な量の切断可能な基質の存在下で、切断不能な基質または切断可能な基質からなる群から選択される１つまたは複数の物質をＤｅｇＰまたはＤｅｇＰホモログに添加することを含む、方法。
【請求項１０】
前記ＤｅｇＰホモログがＤｅｇＱまたはＤｅｇＳである請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記プロテアーゼ活性が抑制される請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記物質が切断可能な基質である請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記切断可能な基質がＨＹＴＡＶＶＫＫＳＳＡＶ（配列番号３）、ＨＹＴＡＶＶＫ（配列番号４）、ＬＤＩＥＬＶＮＣＤＩＴＡ（配列番号５）、ＥＬＶＮＣＤＩ（配列番号６）、ＫＬＡＦＴＧＰＩＶＮＧＨ（配列番号７）、ＦＴＧＰＩＶＮＧＨＳＤＥ（配列番号８）、ＴＬＫＤＧＥＮＶＬＨＹＴ（配列番号９）、ＤＧＥＮＶＬＨ（配列番号１０）、ＮＶＬＨＹＴＡ（配列番号１１）、およびＮＧＨＳＤＥＬ（配列番号１２）からなる群から選択されるポリペプチドである請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記プロテアーゼ活性が増強される請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記物質がアミノ酸配列ＫＳＭＣＭＫＬＳＦＳ（配列番号１３）を含むポリペプチドである請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
ＤｅｇＰまたはＤｅｇＰホモログのプロテアーゼ活性を変調する物質およびそのキャリアを含む組成物。
【請求項１７】
前記物質がＨＹＴＡＶＶＫＫＳＳＡＶ（配列番号３）、ＨＹＴＡＶＶＫ（配列番号４）、ＬＤＩＥＬＶＮＣＤＩＴＡ（配列番号５）、ＥＬＶＮＣＤＩ（配列番号６）、ＫＬＡＦＴＧＰＩＶＮＧＨ（配列番号７）、ＦＴＧＰＩＶＮＧＨＳＤＥ（配列番号８）、ＴＬＫＤＧＥＮＶＬＨＹＴ（配列番号９）、ＤＧＥＮＶＬＨ（配列番号１０）、ＮＶＬＨＹＴＡ（配列番号１１）、およびＮＧＨＳＤＥＬ（配列番号１２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記物質がアミノ酸配列ＫＳＭＣＭＫＬＳＦＳ（配列番号１３）を有するポリペプチドである請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
ペニシリン、セファロスポリン、アミノグリコシド、スルホンアミド、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ポリミキシン、抗マイコバクテリア薬、および尿路防腐薬からなる群から選択される少なくとも１つの抗菌物質をさらに含む請求項１６に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
病原性グラム陰性細菌は多くの病理学的症状、例えば菌血症、細菌関連性の下痢、髄膜炎、および腎盂腎炎、膀胱炎、尿道炎などの尿路感染症を引き起こす。
【背景技術】
【０００２】
尿路感染症（ＵＴＩ）は女性の罹患率の主要な原因である。尿路感染症の全体的な重要性にかかわらず、これらの疾患の治療または防御のための新規の治療計画の開発にはほとんど努力が向けられていない。現在は、従来の抗生物質（例えばペニシリン、セファロスポリン、アミノグリコシド、スルホンアミド、テトラサイクリン、ニトロフラントイン、およびナリジクス酸）を用いてこれらの感染を治療する。抗生物質耐性の出現が、これらの感染の治療に対する重大な障害になることが予測される。実際に、尿路疾患における複数の抗生物質耐性が既に検出されており、そして増加しつつある。ＵＴＩの女性の評価および治療の年間コストは１０億ドルを超えると推定される。さらに、院内感染に随伴される４０億ドルの年間コストおよそ４分の１が、ＵＴＩの結果である。ＵＴＩのグラム陰性の原因細菌の中では、大腸菌が優勢である。
【０００３】
グラム陰性細菌（例えば大腸菌、インフルエンザ菌、腸炎菌、サルモネラ・チフィムリウム（ネズミチフス菌、Salmonella typhimurium、百日咳菌、ペスト菌、エルシニア・エンテロコリチカ(肺炎桿菌、Yersinia enterocolitica)、ヘリコバクター・ピロリおよびクレブシエラ菌）の種々の上皮組織に付着する能力は、感染性の重要な因子である。一例としては、大腸菌は腎臓からの尿の一方向性流出にかかわらず、上皮細胞に付着する。
【０００４】
多くの例えば前記した細菌感染の開始および持続は、細胞外コロニー形成、内部移行またはその他の細胞性応答が生じるかどうかを決定する結合事象を促進するアクセス可能な立体配置での微生物の表面での付着因子の提示を必要とすると考えられる。付着因子はしばしば、性線毛(pili)、繊毛(fimbriae)、またはフィブリル(fibrillae)としても知られている、長く細い繊維状のヘテロ多量体タンパク質付属器の構成要素である。細菌付着事象はしばしば線毛先端に位置する付着因子と、しばしば膜随伴複合糖質の炭水化物構造を含む宿主細胞の特異的レセプター構造との間の立体化学的適合性の結果である。
【０００５】
大腸菌の尿路疾患性株は、尿路上皮細胞に存在するレセプターに結合するＰ線毛を発現する。付着性Ｐ線毛は、大腸菌の腎盂腎炎株に随伴される毒性決定因子である。少なくとも１１個の遺伝子が機能的Ｐ線毛の生合成および発現に関与している；全ｐａｐ遺伝子クラスタのＤＮＡ配列は、決定されている。Ｐ線毛は線毛ロッドに末端同士で結合した柔軟性のある付着性フィブリルから構成されるヘテロ重合体繊維からなる。線毛ロッドは右回りのらせん円筒状に整列されたＰａｐＡタンパク質サブユニットの反復からなる。各線毛ロッドの遠位末端から伸びる先端フィブリルは大部分、開口らせん立体構造に整列されたＰａｐＥの反復サブユニットからなることが見出された。ＰａｐＧ付着因子は先端フィブリルの遠位末端に局在し、その位置は真核細胞の糖脂質レセプターを認識するその能力を最大にすると考えられる。２つのより少ない線毛構成要素であるＰａｐＦおよびＰａｐＫは先端フィブリルに見出された、特殊化されたアダプタータンパク質である。ＰａｐＦは付着因子部分をフィブリルに連結するが、ＰａｐＫはフィブリルを線毛ロッドに結合する。Ｐ線毛繊維の構成要素の構造により、ＰａｐＧ付着因子を提示する尿路疾患性大腸菌により用いられる真核細胞レセプターに対する計略が表らかになる。柔軟性のないＰａｐＡロッドは、付着因子を細菌細胞表面でＬＰＳおよびその他の成分により引き起こされる干渉から遠ざかる方向に伸びるが、柔軟性のあるフィブリルにより、ＰａｐＧ立体自由性が尿路上皮のジガラクトシド部分を認識し、そして結合することが可能になる。
【０００６】
ＤｅｇＰ（ＨｔｒＡ、プロテアーゼＤｏ）プロテアーゼは、大腸菌のペリプラズムのミスフォールディングおよび凝集タンパク質の除去に必須の多機能タンパク質である。ＤｅｇＰは大腸菌における数十種のプロテアーゼの１つであり、そして事実上全てのグラム陰性細菌、シアノバクテリア、マイコバクテリアにおいて、および高等生物：酵母およびヒトにおいてホモログを有することが解っている（ＰａｌｌｅｎおよびＷｒｅｎ、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２６（２）：２０９−２２１（１９９７））。ＤｅｇＰホモログはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（２つのホモログ）などの多くのグラム陽性細菌で記載されている（Ｊｏｎｅｓら、Ｉｎｆｅｃｔ．＆  Ｉｍｍｕｎ．６９（９）：５５３８−５５４５（２００１）；Ｎｏｏｎｅら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２：１５９２−１５９９（２０００）；Ｐｏｑｕｅｔら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５：１０４２−１０５１（２０００）；Ｓｍｅｄｓら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０：６１４８−６１５３（１９９８））。大腸菌にはＤｅｇＰの２つのホモログ、ＤｅｇＱおよびＤｅｇＳがある（Ｋｏｌｍａｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：５９２５−５９２９（１９９６）；ＷａｌｌｅｒおよびＳａｕｅｒ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：１１４６−１１５３（１９９６））。ＫｏｌｍａｒらはＤｅｇＱがＤｅｇＰに対して類似の特異性を有することを示唆している。ＤｅｇＰは命名により示されるように、数回再発見されている（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ：Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｃ．Ｎｉｅｈａｒｄｔ編、ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ、Ｗｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ、９３８−９５４頁（１９９６）のＭｉｌｌｅｒ、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ」；ＰａｌｌｅｎおよびＷｒｅｎ（１９９７）；Ｓｅｏｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７６：７３０−７３６（１９９１））。ＤｅｇＰ（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ：分解）の命名はペリプラズムにおける不安定融合タンパク質の蓄積を可能にする大腸菌における変異の最初のマッピングを意味する（ＳｔｒａｕｃｈおよびＢｅｃｋｗｉｔｈ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：１５７６−１５８０（１９８８）；Ｓｔｒａｕｃｈら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：２６８９−２６９６（１９８９））。Ｈｔｒ（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ：熱ショック制御）の名称は、同一遺伝子におけるトランスポゾン挿入の結果、温度感受性増殖表現型に至ったことを示す（Ｌｉｐｉｎｓｋａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１６：１００５３−１００６６（１９８８））。最後に、ＤｅｇＰもまた、大腸菌において温度感受性増殖表現型を付与す���変異体であるので、同様にプロテアーゼ「Ｄｏ」と称される（Ｓｅｏｌら（１９９１））。「ＤｅｇＰ」の名称は本明細書全体で、大腸菌タンパク質に言及する場合に用いる。
【０００７】
精製されたＤｅｇＰは、基質としてカゼインを用いるインビトロアッセイにおいて機能的なプロテアーゼ活性を呈するが、この基質における活性は微弱である（Ｌｉｐｉｎｓｋａら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：１７９１−１７９７（１９９０））。Ｌｉｐｉｎｓｋａら（Ｌｉｐｉｎｓｋａら（１９９０））は、カゼインにおける活性がフルオロリン酸ジイソプロピルにより抑制され、いずれかその他の公知のプロテアーゼインヒビターにより抑制されなかったことを実証し、これはＤｅｇＰが活性部位セリン残基を含有することを示唆している。興味深いことに、ＤｅｇＰは古典的なセリンプロテアーゼインヒビターであるフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）により抑制されず、これはＤｅｇＰの作用様式の相違を示唆している（Ｋｏｌｍａｒ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅｓ、Ｂａｒｒｅｔｔら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、英国（１９９８）のＫｏｌｍａｒ、「ＤｅｇＰ  ｏｒ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ＤＯ  ＣＬＡＮ  ＳＡ」；Ｌｉｐｉｎｓｋａら（１９９０））。セリン２１０およびヒスチジン１０５（セリンプロテアーゼ触媒３つ組の２つの構成要素）での部位特異的変異誘発は、インビトロおよびインビボでＤｅｇ機能を危うくした；すなわちセリン２１０またはヒスチジン１０５変異を担持する株は、高温での成長に感受性があった（Ｓｋｏｒｋｏ−Ｇｌｅｎｅｋら、Ｇｅｎｅ  １６３：４７−５２（１９９５））。最近の研究では、ＤｅｇＰはシャペロンおよびプロテアーゼの双方として機能することが示されている；低温（２８℃）では、シャペロンの機能は優勢であろ、そして高温（４５℃）にシフトした後、プロテアーゼ機能が活性化される（Ｓｐｉｅｓｓら、Ｃｅｌｌ  ９７：３３９−３４７（１９９９））。ＤｅｇＰの合成はσE：細胞外ストレスに直面して生存するのに必須である遺伝子を調節する、いわゆる「ストレス」σ因子により調節される（Ｒａｉｎａら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５（８）：５００９−５９２１（１９９３）；Ｒｏｕｖｉｅｒｅら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：１０３２−１０４２（１９９５））。この応答は部分的にＣｐｘＡ／ＣｐｘＲ２成分制御系により制御される（ＤａｎｅｓｅおよびＳｉｌｈａｖｙ、Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐ．１１：１１８３−１１９３（１９９７）；Ｄａｎｅｓｅら、Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐ．９：３８７−３９８（１９９５））。最近、Ｊｏｎｅｓら（Ｊｏｎｅｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１６：６３９４−６４０４（１９９７））は、線毛サブユニットの発現が対応する(cognate)ペリプラズムシャペロンの不在下で（このような条件が線毛サブユニット凝集を招く）ｄｅｇＰプロモーターの活性化を招くことを実証した。
【０００８】
最初に同定されたＤｅｇＰに関するインビボ標的は、コリシンＡ溶解（ｃｏｌｉｃｉｎ  Ａ ｌｙｓｉｓ）タンパク質（Ｃａｌ）であった（Ｃａｖａｒｄら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：６３１６−６３２２（１９８９））。ＤｅｇＰは、Ｃａｌのアシル化前駆体形態を２つのフラグメントに切り取ることが見出されている。成熟Ｃａｌも、またｄｅｇＰ変異株において高レベルで蓄積された（Ｃａｖａｒｄら（１９８９））。同定されたＤｅｇＰ標的の第２のファミリーは、細菌ピリンである。Ｋ８８およびＫ９９ピリンサブユニットはｄｅｇＰ変異株において高レベルで蓄積されることが見出された（Ｂａｋｋｅｒら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５（４）：８７５−８８６（１９９１））。この現象のより詳細な研究により、Ｐピリン、特にＰａｐＡおよびＰａｐＧはＤｅｇＰプロテアーゼの基質であることが実証された（Ｊｏｎｅｓら（１９９７））。Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ非線毛付着タンパク質ＨＭＷ１およびＨＭＷ２もまたインビボでＤｅｇＰの基質であることが見出された（Ｓｔ．Ｇｅｍｅ  ＩＩＩおよびＧｒａｓｓ、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２７：６１７−６３０（１９９８））。加えて、Ｓｐｉｅｓｓら（Ｓｐｉｅｓｓら（１９９９））は最近、大腸菌のＭａｌＳタンパク質がインビトロでＤｅｇＰにより十分に分解されることを実証した。
【０００９】
ここ数年で、ＤｅｇＰがいくつかの病原性生物に有毒な因子であることを実証するかなり多くのデータが蓄積されている。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｎｕｒｉｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、およびＹｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａでは、ｈｔｒＡヌル（ｎｕｌｌ）は毒性が低減されるかまたは取り除かれていることが見出された（Ｅｌｚｅｒら、Ｒｅｓ．Ｖｅｔｅｒｉｎ．Ｓｃｉ．６０：４８−５０（１９９６ａ）；Ｅｌｚｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６４：４８３８−４８４１（１９９６ｂ）；Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：４０１−４０７（１９９１）；Ｌｉら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６４：２０８８−２０９４（１９９６）；Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、Ｒｅｓ．Ｖｅｔｅｒｉｎ．Ｓｃｉ．６３：１６５−１６７（１９９７）；Ｔａｃｋｅｔら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５：４５２−４５６（１９９７））。ｈｔｒＡヌル変異は、酸化ストレスに対してより感受性があり、そして免疫細胞により死滅することが見出された。さらに、ｈｔｒＡ損傷は、ワクチン株として実施するためのチフス菌(Salmonella typhi)（Ｔａｃｋｅｔら（１９９７）；Ｔａｃｋｅｔら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６８（３）：１１９６−１２０１（２０００））およびネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)（Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６８（１０）：６０４１−６０４３（２０００））の双方の弱毒化に有用であることが見出された。Ｂｏｕｃｈｅｒら（Ｂｏｕｃｈｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：５１１−５２３（１９９６））は、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)のムコイド型への変換、いわゆる嚢胞性繊維症表現型は２つのｈｔｒＡホモログに関連することが実証された。最近の報告では、Ｐｅｄｅｒｓｏｎら（Ｐｅｄｅｒｓｏｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９（４）：２５６９−２５７９（２００１））はレジオネラ菌(Legionella pneumophilia)におけるｈｔｒＡヌル変異が毒性に関して減弱化されることを実証した。最近では、ｄｅｇＰは、化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)において挿入により不活性化され、そして温度および酸化感受性に至り、並びにマウスモデルにおいて毒性が弱められることが見出された（Ｊｏｎｅｓら（２００１））。
【００１０】
初期のインビボデータにより、いわゆるシャペロン先導物質集合体経路（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ−ｕｓｈｅｒ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｐａｔｈｗａｙ）のピリンサブユニットが、ＤｅｇＰ基質であることが示唆された（Ｂａｋｋｅｒら（１９９１））。対応する(cognate)シャペロン（ＰａｐＤ）の不在下でのピリンサブユニットタンパク質の発現の結果、野生型（ＤｅｇＰ＋）細菌のペリプラズムにおけるサブユニットの蓄積に失敗し、そしてｄｅｇＰ変異株はペリプラズムにおける高レベルのピリンサブユニットタンパク質を蓄積することが見出された（Ｂａｋｋｅｒら（１９９１）；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ：Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｃ．Ｎｉｅｈａｒｄｔ編、ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ、Ｗｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ、２７３０−２７５６頁（１９９６）のＨｕｌｔｇｒｅｎら、「Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｄｈｅｓｉｎｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ」；Ｈｕｌｔｇｒｅｎら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４５：３８３−４１５（１９９１）；Ｊｏｎｅｓら（１９９７））。毒性および蓄積の双方はペリプラズムシャペロンをコードするｐａｐＤ、またはｄｅｇＰでの補完により抑制された（Ｊｏｎｅｓら（１９９７））。以前に、我々はＰ線毛のＰａｐＡサブユニットの精製のためのスキームを開発し、そしてこのタンパク質がＤｅｇＰプロテアーゼにより効率よく切断される天然の基質であることを実証した。本発明では、我々はまたＰａｐＡ配列内の３つの切断部位を同定し、そしてペプチド基質の１つのタンパク質溶解性切断に必須である決定因子を特徴づけした。
【発明の開示】
【００１１】
本発明は、ＤｅｇＰプロテアーゼ活性を変調することにより線毛形成細菌により引き起こされる疾患の治療および／または予防の方法を提供する。本発明は、ＰａｐＡピリンサブユニットのＤｅｇＰ切断部位の同定およびＤｅｇＰ活性を変調する基質を同定するための方法を提供する。本発明は、ＤｅｇＰの基質を切断する、同定されたポリペプチドを提供する。本発明は、ＤｅｇＰプロテアーゼ活性を増強するポリペプチドの同定を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
一般的に言って、本出願で用いた用語は、これらの用語が当分野で理解されている様式に合致する。
【００１３】
「変調する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」とは酵素等の野生型活性を増強、増加、抑制または低減する方法、条件または作用物質を意味する。
【００１４】
「変調された活性」とは、タンパク質により変調されたいずれかの活性、条件、疾患または表現型を意味する。この変調は、例えば基質の抑制、活性化、結合、もしくは放出による、化学的、もしくは構造的のいずれかによる修飾のような、例えば直接アゴニストもしくはアンタゴニスト効果により、またはさらなる因子が関与し得る直接もしくは間接的相互作用により生じ得る。この変化は、触媒活性および／または基質に対する結合における増加／低減でよい。
【００１５】
「ＤｅｇＰ」は、大腸菌のペリプラズムのミスフォールディングおよび凝集タンパク質の除去に必須である多機能タンパク質を意味する。ＤｅｇＰは、本発明では、ＨｔｒＡおよびプロテアーゼＤｏとも称する。「ＤｅｇＰホモログ」は、ＤｅｇＰに対して高度な相同性を有する別の大腸菌タンパク質である別のプロテアーゼ、例えばＤｅｇＱおよびＤｅｇＳを意味する。実施例では大腸菌のＤｅｇＰに言及するが、本発明はこの生物に限定するものではなく、そしてその他のＤｅｇＰのグラム陰性ホモログ、クラミジアおよびＤｅｇＰホモログを有する特定のグラム陽性細菌を包含することを意図している。
【００１６】
本発明は、切断可能な基質の存在下でＤｅｇＰまたはＤｅｇＰホモログに基質を添加し、そして該切断可能な基質の切断の増強または抑制を検出し、それにより該物質が該プロテアーゼ活性を変調するかどうかを決定することにより、ＤｅｇＰまたはＤｅｇＰホモログのプロテアーゼ活性を変調する物質を同定するための方法を提供する。
【００１７】
好ましい実施形態では、この方法で用いる切断可能な物質はＨＹＴＡＶＶＫＫＳＳＡＶ（配列番号３）、ＨＹＴＡＶＶＫ（配列番号４）、ＬＤＩＥＬＶＮＣＤＩＴＡ（配列番号５）、ＥＬＶＮＣＤＩ（配列番号６）、ＫＬＡＦＴＧＰＩＶＮＧＨ（配列番号７）、ＦＴＧＰＩＶＮＧＨＳＤＥ（配列番号８）、ＴＬＫＤＧＥＮＶＬＨＹＴ（配列番号９）、ＤＧＥＮＶＬＨ（配列番号１０）、ＮＶＬＨＹＴＡ（配列番号１１）、およびＮＧＨＳＤＥＬ（配列番号１２）からなる群から選択されるポリペプチドであり、これはＤｅｇＰにより切断されたとして同定されたＰａｐＡピリンサブユニットペプチドである。
【００１８】
好ましい実施形態では、ＤｅｇＰホモログはＤｅｇＳおよびＤｅｇＱである。
【００１９】
別の好ましい実施形態では、この方法の物質はプロテアーゼ活性を増強する。別の好ましい実施形態では、この物質はプロテアーゼ活性を抑制する。特に好ましい実施形態では、この物質はＤｅｇＰ活性を変調する。
【００２０】
本発明は、ＤｅｇＰまたはＤｅｇＰホモログのプロテアーゼ活性を防御、抑制または増強することを含む、線毛形成細菌により引き起こされる疾患の治療または予防のための方法を提供する。ＤｅｇＰが、細胞ペリプラズム空間からの変性または凝集タンパク質の分解に寄与する毒性因子であることは、前記の背景のセクションおよび以下の実施例から当業者には明白であろう。従って、ＤｅｇＰプロテアーゼ活性の抑制は、ペリプラズム空間におけるピリンサブユニットの有毒な蓄積に至り、これは罹患率および／または致死率の上昇、または細菌の感染性の低下に至り得る。しかしながら、ＤｅｇＰプロテアーゼ活性の増強はまた、細菌の有害な結果、例えば必要なピリンサブユニットの枯渇をも有し得る。このように、ＤｅｇＰプロテアーゼ活性の増強または抑制のいずれかは線毛形成細菌の病原性を低減し得る。
【００２１】
本発明では、ＤｅｇＰプロテアーゼにより効率よく切断される、ＰａｐＡピリンサブユニットにおける切断部位が同定されている。従って、本発明はアミノ酸配列ＨＹＴＡＶＶＫＫＳＳＡＶ（配列番号３）、ＨＹＴＡＶＶＫ（配列番号４）、ＬＤＩＥＬＶＮＣＤＩＴＡ（配列番号５）、ＥＬＶＮＣＤＩ（配列番号６）、ＫＬＡＦＴＧＰＩＶＮＧＨ（配列番号７）、ＦＴＧＰＩＶＮＧＨＳＤＥ（配列番号８）、ＴＬＫＤＧＥＮＶＬＨＹＴ（配列番号９）、ＤＧＥＮＶＬＨ（配列番号１０）、ＮＶＬＨＹＴＡ（配列番号１１）、およびＮＧＨＳＤＥＬ（配列番号１２）を含む単離されたポリペプチドを提供する。これらの配列は本発明で実施したアッセイにおいてＰａｐＡピリンサブユニットのＤｅｇＰプロテアーゼ部位として同定された。本発明のペプチドを例えばアミノ安息香酸および／またはジアミノプロピオンアミドジニトロフェニルで修飾することができ、そしてさらに本発明に従って実施することができることは、当業者に明らかであろう。いずれかの修飾されたペプチドを、例えば実施例で詳記するアッセイで試験して、このような修飾がＤｅｇＰプロテアーゼ活性の変調においてペプチドの活性に影響するかどうかを決定することができる。以下の実施例で記載するように、たいていの場合、ＤｅｇＰの切断可能な同定された基質は、疎水性残基対を含有することが観察された。
【００２２】
本発明のアミノ酸化合物は、指定されたクラスのアミノ酸残基に関して部分的に定義されたポリペプチドである。ポリペプチドホモログは、以下に記載するアミノ酸クラス内の保存アミノ酸置換体を含む。概してアミノ酸残基を以下のような４つの主なサブクラスに下位分類することができる。
【００２３】
酸性：残基は生理学的ｐＨでのＨ+イオンの喪失により負の電荷を有し、そしてペプチドが生理学的ｐＨで水性溶媒中にある場合、それが含まれるペプチドの立体配置における表面位置を探し求めるために、残基は水溶液に引き寄せられる。
【００２４】
塩基性：残基は生理学的ｐＨでのＨ+イオンとの会合により正の電荷を有し、そしてペプチドが生理学的ｐＨで水性溶媒中にある場合、それが含まれるペプチドの立体配置における表面位置を探し求めるために、残基は水溶液に引き寄せられる。
【００２５】
中性／無極性：残基は生理学的ｐＨで荷電していないが、ペプチドが水性溶媒中にある場合、それが含まれるペプチドの立体配置における内部位置を探し求めるために、残基は水溶液に追い払われる。これらの残基を「疎水性」とも称する。
【００２６】
中性／極性：残基は生理学的ｐＨで荷電していないが、ペプチドが水性溶媒中にある場合、それが含まれるペプチドの立体配置における外部位置を探し求めるために、残基は水溶液に引き寄せられる。
【００２７】
もちろん、個々の残基分子の統計学的収集において、いくつかの分子は荷電しており、いくつかは荷電しておらず、そして大なり小なりの程度で水性溶媒に引き寄せられるかまたはそこから追い払われる。「荷電した」の定義に適合するためには、有意なパーセンテージ（少なくともおよそ２５％）の個々の分子が生理学的ｐＨで荷電している。極性または無極性としての分類に必要な吸引または反発の程度は任意であり、従って、本発明により具体的に企図されるアミノ酸は一方または他方に分類されている。具体的には名前を挙げていないが、たいていのアミノ酸を公知の挙動に基づいて分類することができる。
【００２８】
アミノ酸残基を環状または非環状、および芳香性または非芳香性の、残基の側鎖置換基に関して自明の分類として、並びに小型または大型としてさらに下位分類することができる。残基が全部で４個またはそれ以下の炭素原子を含有する場合、小型であると考えられ、カルボキシル炭素を含む。小型残基はもちろん、必ず非芳香性である。
【００２９】
第２級アミノ酸プロリンは、技術的には天然／無極性／大型／環状および非芳香性の群に入るが、ペプチド鎖の第２級立体配置に及ぼすその公知の影響のために特別な場合であり、従って、この定義された群には含まれない。
【００３０】
その他のアミノ酸置換体を本発明の範囲内のペプチド化合物に含めることもでき、そしてその構造に従って、この一般的なスキーム内で分類することができる。
【００３１】
本発明の全ての化合物は医薬的に許容される塩またはエステルの形態でよい。塩は、例えばＮａ+、Ｋ+、Ｃａ+2、Ｍｇ+2等でよく；エステルは概して１〜６炭素のアルコールのエステルである。
【００３２】
本発明は、ＤｅｇＰまたはＤｅｇＰホモログのプロテアーゼ活性を変調するのに十分な量の切断可能な基質の存在下で、切断不能な基質または切断可能な基質からなる群から選択される１つまたは複数の物質をＤｅｇＰまたはＤｅｇＰホモログに添加することを含む、ＤｅｇＰまたはＤｅｇＰホモログの該プロテアーゼ活性を変調する方法を提供する。
【００３３】
好ましい実施形態では、ＤｅｇＰホモログはＤｅｇＱまたはＤｅｇＳである。別の好ましい実施形態では、プロテアーゼ活性は抑制される。別の好ましい実施形態では、変調物質は切断可能な基質である。特に好ましい実施形態では、切断可能な基質はＨＹＴＡＶＶＫＫＳＳＡＶ（配列番号３）、ＨＹＴＡＶＶＫ（配列番号４）、ＬＤＩＥＬＶＮＣＤＩＴＡ（配列番号５）、ＥＬＶＮＣＤＩ（配列番号６）、ＫＬＡＦＴＧＰＩＶＮＧＨ（配列番号７）、ＦＴＧＰＩＶＮＧＨＳＤＥ（配列番号８）、ＴＬＫＤＧＥＮＶＬＨＹＴ（配列番号９）、ＤＧＥＮＶＬＨ（配列番号１０）、ＮＶＬＨＹＴＡ（配列番号１１）、およびＮＧＨＳＤＥＬ（配列番号１２）からなる群から選択されるポリペプチドである。別の好ましい実施形態では、プロテアーゼ活性が増強される。特に好ましい実施形態では、該物質はＫＳＭＣＭＫＬＳＦＳ（配列番号１３）のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００３４】
本発明はＤｅｇＰまたはＤｅｇＰホモログのプロテアーゼ活性を変調する物質およびそのキャリアを含む組成物を提供する。この組成物は診断用または医薬用用途を有し得る。例えば、本発明のアッセイにより同定されたＤｅｇＰまたはＤｅｇＰホモログ機能の小型分子インヒビターを新規抗感染薬として用いることができる。さらに、小型ペプチド分子、例えば本発明で切断部位として同定されたものを融合タンパク質「リンカー」として用いることができる。このようなリンカーは大腸菌での過剰発現および精製用に生成するのが困難であるタンパク質を安定化する。次いでＤｅｇＰまたはＤｅｇＰホモログを用いて、精製の間に融合タンパク質を切断することができる。
【００３５】
好ましい実施形態では、組成物の物質はＨＹＴＡＶＶＫＫＳＳＡＶ（配列番号３）、ＨＹＴＡＶＶＫ（配列番号４）、ＬＤＩＥＬＶＮＣＤＩＴＡ（配列番号５）、ＥＬＶＮＣＤＩ（配列番号６）、ＫＬＡＦＴＧＰＩＶＮＧＨ（配列番号７）、ＦＴＧＰＩＶＮＧＨＳＤＥ（配列番号８）、ＴＬＫＤＧＥＮＶＬＨＹＴ（配列番号９）、ＤＧＥＮＶＬＨ（配列番号１０）、ＮＶＬＨＹＴＡ（配列番号１１）、およびＮＧＨＳＤＥＬ（配列番号１２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。別の好ましい実施形態では、組成物はＫＳＭＣＭＫＬＳＦＳ（配列番号１３）のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。別の実施形態では、組成物はさらに少なくとも１つの抗菌薬を含み、該薬物はペニシリン、セファロスポリン、アミノグリコシド、スルホンアミド、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ポリミキシン類、抗マイコバクテリア薬、および尿路防腐薬からなる群から選択される。
【００３６】
前記で開示した方法により検定される物質を無作為に選択するかまたは合理的に選択もしくは設計することができる。本明細書で用いるように、薬物をＤｅｇＰ単独の、またはその関連する物質等との関連性に関与する特定の配列を考慮することなく、無作為に選択する場合、物質は無作為に選択されたと言われる。無作為に選択された薬物の実例は化学的ライブラリーもしくはペプチドコンビナトリアルライブラリー、または生物の増殖ブロスの使用である。
【００３７】
本発明の物質は例えばペプチド、小型分子、ビタミン誘導体、および炭水化物でよい。当業者は本発明の薬物の構造特性に関して制限がないことを容易に理解できる。
【００３８】
当分野で公知の標準的な固相（または液相）ペプチド合成方法を用いて本発明のペプチド物質を調製することができる。加えて、これらのペプチドをコードするＤＮＡを市販入手可能なオリゴヌクレオチド合成装置を用いて合成し、そして標準的な組換え生成系を用いて組換えにより生成することができる。核酸によりコードされていないアミノ酸を含める場合、固相ペプチド合成を用いるポリペプチドの生成が必要である。
【実施例】
【００３９】
以下の実施例は本発明の好ましい実施形態を実証することを意図するものであり、限定であると考えるものではない。
【００４０】
ＰａｐＡのＤｅｇＰ切断部位およびタンパク質溶解の同定並びにＤｅｇＰプロテアーゼ活性の増強
［材料および方法］
《株および遺伝子構築》
ＤＨ５α（Ｈａｎａｈａｎ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６：５５７−５８０（１９８３））およびＩＮＶαＦ’（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）をクローニング工程で使用した。ＫＳ２７２（ＭＣ１０００［Ｆ−Δ（ａｒａ−ｌｅｕ）７６９７  ｇａｌＥ  ｇａｌＫ  ΔｌａｃＸ７４  ｒｐｓＬ（ｓｔｒr）］）をＤｅｇＰの発現に使用した（Ｓｔｒａｕｃｈら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：２６８９−２６９６（１９８９））。ＫＳ４７４（ＫＳ２７２  ｄｅｇＰ：：ｋａｎ）をＰａｐＡ−６Ｈ４Ａの生成に使用した。Ｔ．Ｓｉｌｈａｖｙから提供されたｐＫＳ１７（Ｓｔｒａｕｃｈら（１９８９））をＤｅｇＰの過剰発現および精製に使用した。以前に記載されているように（ＭｏｒｒｉｓｏｎおよびＤｅｓｒｏｓｉｅｒｓ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４（３）：４５４−４５７（１９９３））、ＰａｐＡリーダープロセシング部位のすぐ下流に６個のヒスチジンコドンを挿入するように設計されたプライマーを用いてｐａｐＡのＰＣＲクローニングを実施した。ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を含むように変異ｐａｐＡ遺伝子を増幅し、ｐＭＭＢ５６６へのクローニングを促進し（Ｆｕｒｓｔｅら、Ｇｅｎｅ  ４８（１）：１１９−１３１（１９８６））、ｐＣＬ１００を作製した。ｐａｐＡ遺伝子のリーダープロセシング部位の下流で６個のヒスチジンコドンおよび２個のアラニンコドンを挿入するように設計されたプライマーを用いて、同一の様式でｐＣＬ１０１を構築した。ＰａｐＤ発現プラスミド、ｐＨＪ９２０３は以前に記載されている（Ｊｏｎｅｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１６：６３９４−６４０６（１９９７））。
【００４１】
《ＰａｐＡ−６Ｈ４Ａ発現および精製》
Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス（Ｄｉｆｃｏ、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓｐａｒｋｓ、メリーランド州）中１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン、１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンの存在下でＫＳ４７４／ｐＣＬ１０１／ｐＨＪ９２０３をＡ600＝０．８まで増殖させ、そのときＩＰＴＧを１．０ｍＭまで添加し、そしてアラビノースを０．５％まで添加した。培養物を９０分間インキュベートし、細菌を収集し、そして以前に記載されたように（Ｊｏｎｅｓら（１９９７））およそ２５ｇ（湿重量）の細胞からペリプラズムを調製した。ペリプラズムを２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ＝８．５に対して透析し、そして製造者（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、カリフォルニア州）により記載されるようにバッチ処理でＴａｌｏｎ金属アフィニティービーズに適用した。室温で６０分間インキュベートし、そして２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ＝８、１００ｍＭのＮａＣｌで３回洗浄した後、結合複合体を０．１Ｍのイミダゾールで溶出するか、または代替として、シャペロン−サブユニット複合体を２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ＝８、１００ｍＭのＮａＣｌ、６．０ＭのグアニジンＨＣｌ（または８．０Ｍ  尿素）に再懸濁することにより変性し、４５℃で６０分間インキュベートした。グアニジンＨＣｌはシャペロン−サブユニット複合体の分解に関して我々の思い通りに最良に作用することが見出された。バッファーおよび変性剤での洗浄によりシャペロンを除去し、そして０．１Ｍのイミダゾールを用いてＴａｌｏｎ樹脂からＰａｐＡ−６Ｈ４Ａを溶出した。ＤｅｇＰによる効率のよい切断のために、ＰａｐＡ−６Ｈ４Ａを還元およびカルボキシメチル化に供した。４００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ＝８．５、５．０ｍＭのＥＤＴＡ、０．１１Ｍの２−メルカプトエタノールからなるバッファー中でグアニジンＨＣｌ変性ＰａｐＡ−６Ｈ４Ａを還元し、そして４℃で２時間インキュベートした。還元したタンパク質を０．２１Ｍ  ヨード酢酸と共に４℃で１時間インキュベートすることによりカルボキシメチル化した。次いで切断アッセイで使用するために、タンパク質を２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ＝８．５に対して透析した。
【００４２】
《ＤｅｇＰプロテアーゼの精製》
全ペリプラズムからＤｅｇＰを精製し、これを以前に記載されたように調製した（Ｊｏｎｅｓら（１９９７））。およそ３０ｇ（湿重量）の細胞を用いてペリプラズムを調製した。３３ｍＭのＭＥＳ、３３ｍＭのＨＥＰＥＳ、３３ｍＭの酢酸塩、ｐＨ＝５．９に対して透析した後、ペリプラズムをＨｉＴｒａｐ  Ｓカチオン交換カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）に適用した。ＤｅｇＰは直線的な塩グラジエントのおよそ１００ｍＭのＮａＣｌで溶出した。ピークタンパク質分画を０．５Ｍの硫酸アンモニウムに調整し、そしてＨＩＣブチルカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に適用した。ＤｅｇＰを約０．３Ｍの硫酸アンモニウムで疎水性カラムから溶出した。ブチルカラムから溶出したピーク分画に現れた６個全てのバンドをアミノ末端配列分析によりＤｅｇＰ種として同定した。
【００４３】
《全タンパク質切断アッセイ》
２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ＝８からなるバッファー中４５℃で３０分から１５時間までタンパク質溶解アッセイを実施した。５ｍＭのＭｇＣｌ2またはＣａＣｌ2を後者のアッセイに添加し、そして２価カチオンへの依存性を確認し、ＥＤＴＡを１０ｍＭで添加した。指示される場合、ＰａｐＧ付着因子のカルボキシ末端から誘導した配列ＫＳＭＣＭＫＬＳＦＳを有する切断不能ペプチドであるＳＰＣＪ１をアッセイに補充した（２００μＭ）。
【００４４】
《ペプチドスキャニング（ＰｅｐＳｐｏｔｓ（商標））》
３アミノ酸残基でシフトした、７ｍｅｒおよび１２ｍｅｒの様式のＰａｐＡ配列の重複ペプチドスキャニングライブラリーをＳＰＯＴ合成技術により調製し、アミノ末端でアミノ安息香酸にコンジュゲートし、連続セルロース膜（ＰｒｏｔｅａｓｅＳｐｏｔｓ（商標））に（カルボキシ末端を）連結し、そしてＪｅｒｉｎｉ  ＡＧ（Ｂｅｒｌｉｎ、ドイツ）により検定した。精製されたＤｅｇＰを前記したように調製し、そして２０ｍＭ  リン酸塩バッファー、ｐＨ＝７、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2を用いて９６ウェルマイクロプレート様式で検定した（０．２８ｍｇ／ｍｌ）。１、４、および２８時間にアリコートをアッセイプレートから除去し、そして遊離した蛍光を定量した（発光−３２５ｎｍ、発光−４２０ｎｍ）。
【００４５】
《ペプチド切断アッセイ》
以下の３つのペプチドを蛍光近接ペプチド切断アッセイに使用した。
ＳＰＣＪ−１２−Ａｂｚ−ＨＹＴＡＶＶＫＫＳＳＡＶ−ＤＡＰ（Ｄｎｐ）−ＮＨ2（配列番号１４）
ＳＰＣＪ−１３−Ａｂｚ−ＨＹＴＡＶＶＫ−ＤＡＰ（Ｄｎｐ）−ＮＨ2（配列番号１５）
ＳＰＣＪ−１４−Ａｂｚ−ＨＹＴＡＳＳＫ−ＤＡＰ（Ｄｎｐ）−ＮＨ2（配列番号１６）
（ここで、蛍光基Ａｂｚはアミノ安息香酸であり、そしてクエンチ基ＤＡＰ（Ｄｎｐ）−ＮＨ2はジアミノプロピオンアミドジニトロフェニルである。）２００ｐＭから１ｎＭの範囲の濃度でペプチドをアッセイに使用した。０．５から５μｇの範囲の濃度でＤｅｇＰをアッセイに添加した。アッセイバッファーは２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ＝７．５、５ｍＭのＣａＣｌ2からなる。切断反応物を４５℃でインキュベートし、そしてＷａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ2Ｖ  １４２０  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  ＨＴＳ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｗａｌｌａｃ  Ｏｙ、Ｔｕｒｋｕ、フィンランド）により３０分間隔で読んだ。３４０ｎｍでの励起を利用する蛍光検出および発光を４２０ｎｍでモニター観察した。
【００４６】
《切断部位マッピング》
ペプチドの精製および切断反応の生成物を１００％のアセトニトリル／０．０５％のトリフルオロ酢酸までのグラジエントによりＣ１８  ５μ  ＳＴ  ４．６／２５０  Ｓｅｐｈａｓｉｌカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で実施した。凍結乾燥した切断反応物（５ｍｌ）を２％のアセトニトリル／０．０６５％のトリフルオロ酢酸に再懸濁して、Ｃ１８カラムに適用した。ペプチドおよび切断生成物を含有する分画を凍結乾燥して、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  質量分析器により質量を決定した。０．１％のトリフルオロ酢酸、３３％のアセトニトリル中マトリックス？−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＨＣＣＡ）５ｍｇ／ｍｌ溶液を用いてＭＡＬＤＩ分析を行った。分析物を１：３でマトリックスと混合した。特注のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器を用いてスペクトルを生成した。
【００４７】
《その他の方法》
以前に記載されているように（Ｄｏｄｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：３６７０−３６７４（１９９３）；Ｓｌｏｎｉｍら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１１（１３）：４７４７−４７５６（１９９２））タンパク質をＰＶＤＦ膜に移してシークエンシングに備え、そしてアミノ末端配列決定のためにＭｉｄｗｅｓｔ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｉｎｃ，（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ミズーリ州）に分配した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析を以前に記載されているように実施した（Ｄｏｄｓｏｎら（１９９２）；Ｓｌｏｎｉｍら（１９９２））。以前に記載されているように（Ｊｏｎｅｓら、（１９９７））毒性アッセイを実施した。ＥｎｚＣｈｅｋアッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，ｅｕｇｅｎｅ，オレゴン州）を製造者の指示書に従って使用し、適当なフィルターセットを有するＴｅｃａｎＳｐｅｃｔｒＦｌｕｏｒ  Ｐｌｕｓ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ、ノースキャロライナ州）を用いて読んだ。
【００４８】
［結果］
《ＰａｐＡ−６Ｈ４Ａの構築および精製》
シャペロン媒介線毛生合成の研究のための大きな障害は、ペリプラズムシャペロン不在下でピリンサブユニットが精製できないことである。これは部分的にＤｅｇＰプロテアーゼの不活性化により打破できる（Ｂａｋｋｅｒら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５（４）：８７５−８８６（１９９１））。しかしながら、Ｐ（Ｐａｐ）線毛由来のピリンサブユニットは、シャペロン不在下でＫＳ４７４において発現された場合、毒性が高いことが見出された（ｄｅｇＰ：：ｋａｎ）（Ｊｏｎｅｓら、（１９９７））。変性条件下の金属アフィニティークロマトグラフィーおよびＰａｐＡのアミノ末端へのアフィニティタグの付加を利用することにより、ピリンサブユニットを生成し、そして精製した。ＭｏｒｒｉｓｏｎおよびＤｅｓｒｏｓｉｅｒｓ（１９９３）の方法を用いて、ポリヒスチジンアフィニティータグ（６−ｈｉｓタグ）をコードする配列をｐａｐＡ遺伝子に挿入した。６−ｈｉｓタグはリーダープロセシング部位の直ぐ下流に位置し、それによりリーダープロセシングタンパク質がアフィニティー精製のための暴露されたアミノ末端６−ｈｉｓタグを含有するようになる。融合タンパク質をｐＭＭＢ６６にクローニングし、これをＩＰＴＧ誘導Ｐtacプロモーターの調節下に置いた（Ｆｕｒｓｔｅら（１９８６））。最初の構築物であるＰａｐＡ−６Ｈはうまくプロセシングされず、ペリプラズムに輸送されなかった（データは示していない）。我々は６−ｈｉｓアフィニティタグがリーダープロセシングかまたはＳｅｃ膜輸送機構との関与のいずれかを立体的に遮断するとの仮説をたてた。この遮断は２つのアラニン残基の添加により回避され、その結果４つのアラニン全てがＰａｐＡのリーダープロセシング部位から６−ｈｉｓタグを分離するように位置した。この構築物から発現されたＰａｐＡ−６Ｈ４Ａはうまくプロセシングされ、そしてペリプラズムに輸送された（図１）。さらにＰａｐＡ−６Ｈ４Ａはペリプラズムの安定性に関するペリプラズムシャペロンであるＰａｐＤとの相互作用に依存した（図１Ａ）。野生型ＰａｐＡと同様にＰａｐＡ−６Ｈ４Ａタンパク質はＰａｐＤシャペロンの不在下で誘導された場合、毒性である（Ｊｏｎｅｓら、（１９９７））。毒性はピリンサブユニットの誘導の後の細菌の成長不全で明白である（図２）。先の研究により、「非シャペロン化」サブユニットが内膜分画で生じ、そして不溶性凝集物を形成することが示された（Ｊｏｎｅｓら、（１９９７））。ＰａｐＡ−６Ｈ４Ａの毒性はＰａｐＤ（図２Ａ）またはＤｅｇＰ（図２Ｂ）のトランスでの同時発現により抑制された。
【００４９】
計画された実験用に十分なＰａｐＡを精製するために、ＫＳ４７４中ＰａｐＤの存在下でＰａｐＡ−６Ｈ４Ａを合成した（ｄｅｇＰ：：ｋａｎ）（Ｊｏｎｅｓら、（１９９７））。金属アフィニティークロマトグラフィー（ＭＡＣ）を用いて一括してＰａｐＤ−ＰａｐＡ複合体を全ペリプラズムから精製した（図１Ｂ）。シャペロンとＰａｐＡ−６Ｈ４Ａサブユニットを分離するために、ビーズ結合複合体を６．０Ｍ  グアニジンＨＣｌで変性した。シャペロンを除去するために１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ＝８プラス変性剤で洗浄した後、純粋なＰａｐＡ−６Ｈ４Ａを０．１Ｍのイミダゾールで溶出した（図１Ｂ）。変性したＰａｐＡ−６Ｈ４ＡがＰａｐＤの適当な結合パートナーであることを確認するために、シャペロンサブユニット複合体を再構築し、そしてＭＡＶで精製した（図１Ｃ）。変性したＰａｐＡ−６Ｈ４Ａを金属アフィニティー樹脂に適用し、洗浄したが、変性剤を除去しなかった。次いでビーズ結合タンパク質をＰａｐＤ富化ペリプラズム（データは示していない）または精製されたＰａｐＤ（図１Ｃ）のいずれかに希釈した。シャペロンサブユニット複合体を洗浄し、そして０．１Ｍ  イミダゾールでアフィニティー樹脂から溶出した（図１Ｃ、レーン３）。
【００５０】
ＤｅｇＰプロテアーゼの基質としての変性したＰａｐＡ−６Ｈ４Ａタンパク質を試験するために、樹脂結合、変性ＰａｐＡ−６Ｈ４ＡをＤｅｇＰ富化ペリプラズムまたは対照ペリプラズムに希釈し、そして室温で６０分間インキュベートした。結合タンパク質を０．１Ｍ  イミダゾールで溶出し、そしてクーマシーブルー染色および溶出した生成物のアミノ末端シークエンシングにより分析した（図１Ｄ）。２つの新規のバンドを同定した。〜４８ｋＤａバンドをＤｅｇＰプロテアーゼとして同定した。ＤｅｇＰ富化ペリプラズムで処理した後にのみ現れる〜１２ｋＤａバンド（ＰａｐＡ−ＮＨ2）をＰａｐＡのアミノ末端フラグメントとして同定した。このデータは、ＰａｐＡの切断に至るＰａｐＡとＤｅｇＰとの間の相互作用を定義する。
【００５１】
《ＤｅｇＰプロテアーゼの精製》
ＤｅｇＰを、飽和状態まで一晩（１５から２０時間）成長させた後、ＫＳ２７２／ｐＫＳ１７（Ｓｔｒａｕｃｈら（１９８９））から精製し、これはＤｅｇＰの高レベル発現を誘導するのに十分であった。培養物６リットルから調製した全ペリプラズムをＳＰセファロースのカチオン交換クロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐ  ＳＰ、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）（図３Ａ）により、続いてブチルセファロースの疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐブチル、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）（図３Ｂ）で分別した。この２工程精製方法によりおよそ９８％  純粋なＤｅｇＰプロテアーゼが得られた。図３に示す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で認められた「夾雑バンド」（小型矢印）はアミノ末端配列分析によりＤｅｇＰトランケートとして同定され、これは恐らく自己触媒切断の結果であろう（データは示していない）。ＤｅｇＰの精製された調製物を４５℃でインキュベートすることにより、トランケートバンドの蓄積に至った（データは示していない）。
【００５２】
《プロテアーゼ活性のアッセイ》
市販により入手可能なプロテアーゼアッセイであるＥｎｚＣｈｅｋ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、オレゴン州）を用いてカゼイン基質に及ぼすＤｅｇＰ調製物の切断活性を試験した。カゼインに及ぼすＤｅｇＰ活性はＬｉｐｉｎｓｋａらにより以前に報告されている（Ｊ．Ｂａｃｅｔｒｉｏｌ．１７２：１７９１−１７９７（１９９０））。ＥｎｚＣｈｅｋ基質におけるピーク切断に次いで２つのクロマトグラフィー工程によるＤｅｇＰの溶出プロファイルが続く（データは示していない）。図４はカゼイン基質における精製されたＤｅｇＰプロテアーゼおよびトリプシンの力価測定を示す。
【００５３】
《可溶性ＰａｐＡ切断アッセイ》
ＤｅｇＰ切断活性の以前の研究により、好ましい基質は変性した、凝集したまたはフォールディングされていないタンパク質であることが示された（Ｋｉｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９５（５）：１３６３−１３７４（１９９９）；Ｋｏｌｍａｒら、Ｊ．Ｂａｃｅｔｒｉｏｌ．１７８：５９２５−５９２９（１９９６）；ＰａｌｌｅｎおよびＷｒｅｎ、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２６（２）：２０９−２２１（１９９７））。可溶性様式で切断に適した基質と共にＤｅｇＰを提供するために、ＰａｐＡ−６Ｈ４Ａを６ＭのグアニジンＨＣｌで変性し、還元し、そしてカルボキシメチル化（ＰａｐＡ−６Ｈ４Ａ−ｒｃｍ）し、そして２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ＝８．５に透析した。ＰａｐＡ−６Ｈ４Ａ−ｒｃｍをＤｅｇＰと混合し、そして４５℃で一晩インキュベートし、そして得られた反応生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離して、そしてさらに全Ｐａｐ線毛に対して調製した抗血清を用いてウェスタンブロットにより可視化した（図５）。図５Ａレーン４に認められるように、ＰａｐＡ−６Ｈ４Ａ−ｒｃｍは、２１ｋＤａ単量体に加えて、ＳＤＳにおいて安定である重合体（または凝集体）を形成する。ＰａｐＡ−６Ｈ４Ａ−ｒｃｍの双方の形態はＤｅｇＰプロテアーゼによる分解に感受性がある（図５Ａ、レーン３および５）。
【００５４】
以前の報告では、ＤｅｇＰタンパク質溶解活性をモニター観察するのに適したいくつかの異なるバッファー系が記載されている（Ｋｉｍら（１９９９）；Ｋｏｌｍａｒら（１９９６）；Ｌｉｐｉｎｓｋａら（１９９０）；Ｓｐｉｅｓｓら、Ｃｅｌｌ  ９７：３３９−３４７（１９９９））。２価カチオン（Ｍｇ2+）はいくつかの系で必要とされることが報告された（Ｋｉｍら（１９９９））。従って、我々はＭｇＣｌ2、ＭｎＣｌ2、およびＣａＣｌ2の、ＰａｐＡ−６Ｈ４Ａ−ｒｃｍのＤｅｇＰ切断に及ぼす影響を試験した（図５Ｂ、および示していないデータ）。５ｍＭのＭｇＣｌ2（図５Ｂ）、ＭｎＣｌ2、またはＣａＣｌ2（データは示していない）の添加により、ＰａｐＡ−６Ｈ４Ａ−ｒｃｍのＤｅｇＰ切断が刺激され、その結果４時間のインキュベーションで投入タンパク質の５０％近くが分解された（図５Ｂ）。さらにＥＤＴＡの切断反応物への添加により切断活性が抑制される（図６、レーン３〜５および７〜１０を比較）。
【００５５】
《カルボキシ末端ピリンサブユニットペプチドによるＤｅｇＰの活性化》
ＤｅｇＰプロテアーゼは、触媒性セリン残基の下流に位置する２つのいわゆるＰＤＺドメイン（Ｐｏｓｔ−ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ９５，Ｄｉｓｃｓ−ｌａｒｇｅ，ＺＯ−１）を有している（ＰａｌｌｅｎおよびＷｒｅｎ（１９９７））。ＰＤＺドメインは双方の基質認識および多くのタンパク質のタンパク質多量体化に関連している（Ｌｅｖｃｈｅｎｋｏら、Ｃｅｌｌ  ９１：９３９−９４７（１９９７）；Ｓａｓｓｏｏｎら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３３：５８３−５８９（１９９９）；Ｓｏｎｇｙａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：７３−７７（１９９７））。Ｌｅｖｃｈｅｎｋｏら（１９９７）は最近ＣｌｐＸシャペロンおよびＣｌｐＸプロテアーゼ機構の制御サブユニットが基質認識においてＰＤＺドメインを利用することを実証した。ＰＤＺドメインは標的タンパク質のカルボキシル末端で見出されたペプチド配列の乱れを特異的に認識する（Ｌｅｖｃｈｅｎｋｏら（１９９７）；Ｓｏｎｇｙａｎｇら（１９９７））。ピリンサブユニットのカルボキシル末端は線毛の究極的な構造における近隣サブユニットとの相互作用に重要な高度に保存されたモチーフ、およびペリプラズムシャペロンの認識モチーフである（Ｂｕｌｌｉｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１２８９０−１２８９５（１９９６）；Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５（５４３０）：１０６１−１０６６（１９９９）；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ：Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｃ．Ｎｉｅｈａｒｄｔ編、ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ、２７３０−２７５６頁（１９９６）のＨｕｌｔｇｒｅｎら、「Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｄｈｅｓｉｎｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ」；Ｓａｕｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５（５４３０）：１０５８−１０６１（１９９９））。カルボキシル末端モチーフは、報告されたところによると、ＰＤＺドメインにより認識されたモチーフに対していくらかの相同性を有する（Ｌｅｖｃｈｅｎｋｏら（１９９７）；Ｓｏｎｇｙａｎｇら（１９９７））。我々は、ＰａｐＧ付着タンパク質（ＳＰＣＪ−１−ＫＳＭＣＭＫＬＳＦＳ）（配列番号１３）からのカルボキシル末端ペプチドのＤｅｇＰ切断反応での力価測定はＰＤＺドメインでの基質結合部位に関する競合によりＰａｐＡ−６Ｈ４Ａ−ｒｃｍタンパク質の切断を抑制すると仮定した。大変興味深いことに、ＳＰＣＪ−１の切断反応への添加によりＰａｐＡ−６Ｈ４Ａ−ｒｃｍの分解が増強された（図６）。ＳＰＣＪ−１の不在下では、ＰａｐＡタンパク質の５０％切断には４５℃で４時間の消化が必要とされ（図５Ｂおよび示されていないデータ）、一方４倍少ない酵素および２倍ほどの基質を含有する反応において、活性化ペプチドの添加により６０分で５０％  切断に至り、そして４時間で９０％近くの切断に至る（図６、レーン２〜５）。予想されるように、１０ｍＭ  ＥＤＴＡの存在下、ＰａｐＡ−６Ｈ４Ａ−ｒｃｍの切断は抑制された（１時間で７％切断）（図６、レーン７〜１０）。
【００５６】
《ペプチドスキャニングによるＰａｐＡ内でのＤｅｇＰ認識部位の同定》
ＳＰＯＴ合成技術（Ｊｅｒｉｎｉ  ＡＧ、Ｂｅｒｌｉｎ、ドイツ）を利用して、完全ＰａｐＡアミノ酸配列の２つの重複ペプチドスキャニングライブラリーを構築し、そして検定して、ＤｅｇＰタンパク質溶解に適した基質である７ｍｅｒおよび１２ｍｅｒペプチドを同定した（図７）。ペプチドはアミノ末端でアミノ安息香酸（Ａｂｚ）蛍光タグを担持し、そしてセルロース膜に連結されたものを合成した。７ｍｅｒおよび１２ｍｅｒＰｒｏｔｅａｓｅＳｐｏｔ（商標）スキャンの双方で、ＰａｐＡの３領域は、セルロース結合ペプチドからの蛍光カウントの放出により表されるように、ＤｅｇＰにより切断可能な配列を有しているとして同定された。興味深いことに、この分析により同定された切断領域は全てβ鎖内またはそれに対して近位に存在し、そしてピリンサブユニットタンパク質の高度に保存された領域にある（ＳｏｔｏおよびＨｕｌｔｇｒｅｎ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１：１０５９−１０７１（１９９９）の図４参照）。
【００５７】
《ペプチド切断アッセイ》
ＤｅｇＰプロテアーゼ活性をモニター観察するための可溶性ペプチド切断アッセイを確立するために、配列−ＨＹＴＡＶＶＫＫＳＳＡＶ（配列番号３）により表される最も効率のよい切断領域をモデル基質として使用し、そしてペプチドＳＰＣＪ−１２を蛍光クエンチ検出アッセイにおいて使用するために調製した。アミノ末端で蛍光部分であるアミノ安息香酸（Ａｂｚ）基、およびカルボキシル末端でクエンチ部分であるジアミノプロピオンアミドジニトロフェニル（ＤＡＰ（Ｄｎｐ）−ＮＨ2）基を用いてＳＰＣＪ−１２を調製した。図８Ａで示すように、ＤｅｇＰは時間依存的様式でＳＰＣＪ−１２を切断した。さらに認識配列を狭め、そして切断の決定因子を定義するために、２つのさらなるペプチド試薬、ＳＰＣＪ−１３およびＳＰＣＪ−１４を調製した。ＳＰＣＪ−１３はＨＹＴＡＶＶＫ（配列番号４）（ＳＰＣＪ−１２の最初の７つの残基）を有し、一方ＳＰＣＪ−１４はＨＹＴＡＳＳＫ（配列番号１７）を有する。２重セリン置換を利用してＳＰＣＪ−１３における疎水性残基対の不可欠性を試験した。図８Ｂに示すように、ＤｅｇＰは時間依存的様式でＳＰＣＪ−１３を切断したが、ＳＰＣＪ−１４は切断しなかった。ＤｅｇＰの２重セリン置換ペプチドの切断の失敗を洞察するために、ＳＰＣＪ−１４がＳＰＣＪ−１３の切断を遮断し得るかどうかを調べるために抑制アッセイを設定した。このような結果は、ＤｅｇＰが依然ＳＰＣＪ−１４を認識するが、ペプチドを切断できないことを示唆した。図８Ｃに示すように、１０倍過剰のモル濃度で添加した場合、ＳＰＣＪ−１４はＳＰＣＪ−１３の切断を遮断した。最後に、切断不能ペプチドＳＰＣＪ−１のペプチド切断アッセイへの添加によりＳＰＣＪ−１３の切断が増強された（図８Ｄ）。
【００５８】
ＳＰＣＪ−１２およびＳＰＣＪ−１３の正確な切断部位をマッピングするために、切断反応の反応生成物をＣ１８  Ｓｅｐｈａｓｉｌカラムを用いる逆相ＨＰＬＣで分離した（図９Ａ）。未処置ＳＰＣＪ−１３は５３．０６ｍｌの保持容量を有する（データは示していない）が、切断後、４５．７２ｍｌの保持容量を有する１本の新たなピークが認められ、そして５３．０６ｍｌピークが大きく減少した（図９Ａ）。新たなピークにおける材料の質量をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器分析により決定した。新たなピークは、ペプチドのバリン残基対の間の切断に合致する質量（４８０．５９＝ＶＫ−ＤＡＰ（Ｄｎｐ）−ＮＨ2；７０８．９９＝ＡＢＺ−ＨＹＴＡＶ）を有する２つの種を含有した（図９Ｂ）。確認のために、ＳＰＣＪ−１２の切断部位もまたＭＡＬＤＩ  ＭＳによりマッピングし、そして再度ＤｅｇＰがバリン残基対の間で切断したことを実証した（データは示していない）。
【００５９】
［論考］
細胞質およびペリプラズムのミスフォールディングおよび／または誤集合タンパク質の分解および清掃は、細菌の盛んな増殖に必須である（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．３０：４６５−５０６（１９９６）；Ｌａｓｋｏｗｓｋａら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２２：５５５−５７１（１９９６）；ＰａｌｌｅｎおよびＷｒｅｎ（１９９７））。大腸菌およびたいていのグラム陰性生物のペリプラズムでは、この仕事はＤｅｇＰプロテアーゼにかかっている（ＰａｌｌｅｎおよびＷｒｅｎ（１９９７））。ＤｅｇＰの機能的な複製の欠如により細菌は高温での増殖に失敗する（Ｌｉｐｉｎｓｋａら（１９９０）；ＰａｌｌｅｎおよびＷｒｅｎ（１９９７））。さらに最近のデータでは、ｄｅｇＰヌル変異体は、高温での増殖が危ういのに加えて、酸化ストレスに対してさらに鋭敏であり、そして無毒性である（Ｂｏｕｃｈｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：５１１−５２３（１９９６）；Ｅｌｚｅｒら、Ｒｅｓ．Ｖｅｔ．Ｓｃｉ．６０：４８−５０（１９９６ａ）；Ｅｌｚｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔ．＆  Ｉｍｍｕｎ．６４：４８３８−４８４１（１９９６ｂ）；Ｌｉら、Ｉｎｆｅｃｔ．＆  Ｉｍｍｕｎ．６４：２０８８−２０９４（１９９６）；ＰａｌｌｅｎおよびＷｒｅｎ（１９９７）；Ｐｅｄｅｒｓｏｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．＆  Ｉｍｍｕｎ．６９（４）：２５６９−２５７９（２００１）；Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、Ｒｅｓ．Ｖｅｔ．Ｓｃｉ．６３：１６５−１６７（１９９７）；Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｉｎｆｅｃｔ．＆  Ｉｍｍｕｎ．６８（１０）：６０４１−６０４３（２０００）；Ｔａｃｋｅｔら、Ｉｎｆｅｃｔ．＆  Ｉｍｍｕｎ．６５：４５２−４５６（１９９７）；Ｔａｃｋｅｔら、Ｉｎｆｅｃｔ．＆  Ｉｍｍｕｎ．６８（３）：１１９６−１２０１（２０００））。現在のモデルは、病原体の侵入に対する宿主の酸化応答の結果、ペリプラズムのタンパク質の酸化的変性に至る。いくつかの最近記載された感染の動物モデルでは、ｄｅｇＰ変異株の変性タンパク質を清掃またはリフォールディングすることができないと、病原体に十分な負担を負わせ、毒性の低下に至る（Ｂｏｕｃｈｅｒら（１９９６）；Ｅｌｚｅｒら（１９９６ａ）；Ｅｌｚｅｒら（１９９６ｂ）；Ｌｉら（１９９６）；ＰａｌｌｅｎおよびＷｒｅｎ（１９９７）；Ｐｅｄｅｒｓｏｎら（２００１）；Ｐｈｉｌｌｉｐｓら（１９９７）；Ｒｏｂｅｒｔｓら（２０００）；Ｔａｃｋｅｔら（１９９７）；Ｔａｃｋｅｔら（２０００））。
【００６０】
このモデルとの一致において、ＤｅｇＰの好ましい基質は全体的にまたは一過的に変性しているタンパク質であると考えられ、これはインビボでの役割がペリプラズムからミスフォールディングまたは変性したタンパク質を除去することであるという仮説を支持している（Ｋｏｌｍａｒら（１９９６））。Ｋｏｌｍａｒら（Ｋｏｌｍａｒら（１９９６））は、ＤｅｇＰがλレプレッサーおよびＡｒｃレプレッサーのフォールディング遅延変異体を切断し、そして切断部位Ｐ１残基は疎水性残基であり、たいていはバリンであることを実証した。疎水性切断部位は変性した標的においてのみ利用可能であるので、これらのデータは仮説を支持する。従って、タンパク質が「オフ経路」を進んだか、または環境侵襲のために変性した場合、ＤｅｇＰ基質の認識部位が暴露される。魅力的なモデルではあるが、用いられたタンパク質がいずれもペリプラズムタンパク質でないという事実によりこの研究は妨害された。しかしながら、この知見を支持して、Ｌａｓｋｏｗｓｋａら（Ｌａｓｋｏｗｓｋａら（１９９６））はインビトロで、精製されたＤｅｇＰタンパク質が、大腸菌抽出物から分別された熱凝集タンパク質を分解することを実証した。さらに、彼らはＤｎａＪシャペロンがＤｅｇＰ分解を拮抗する；すなわちタンパク質がＤｅｇＰによる分解の標的ではないように、シャペロンがタンパク質のリフォールディングを助けることを示した。
【００６１】
我々は、腎盂腎炎随伴線毛（Ｐａｐ）由来のＰａｐＡピリンがインビトロでＤｅｇＰの標的であることを明白に実証した。変性金属アフィニティークロマトグラフィーに結合したアミノ末端ポリヒスチジンアフィニティータグを用いて、可溶性切断アッセイを実施するために、十分なＰａｐＡ−６Ｈ４Ａをペリプラズムシャペロン、ＰａｐＤから精製することができる（図１）。標準的なクロマトグラフィー手段によりＤｅｇＰプロテアーゼを精製し（図３）、そしてカゼイン基質および変性し、還元し、そしてカルボキシメチル化したＰａｐＡ−６Ｈ４Ａの双方でタンパク質溶解活性を示した（図４および５）。還元し、そしてカルボキシメチル化していないＰａｐＡ−６Ｈ４ＡにおけるＤｅｇＰ切断活性を、ＰａｐＡ−６Ｈ４Ａ−ｒｃｍにおけるその活性と比較することにより最小にした（データは示していない）。しかしながら、ＰａｐＤとの複合体形成または線毛への集合がない場合のＰａｐＡの正確な「フォールディング状態」を定義することは難しい提案である。最近の同時結晶化研究により、元来のフォールディングにおけるβシートを完了するのに必要な第７番目のカルボキシル末端鎖の不在のために、ピリンサブユニットが不完全な免疫グロブリンフォールディングを有することが示された（Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙら（１９９９）；Ｓａｕｅｒら（１９９９））。線毛生合成の間に、この鎖欠損がペリプラズムシャペロンまたは近隣のピリンサブユニットのいずれかにより、各々供与鎖補完または供与鎖交換を介して提供される（Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙら（１９９９）；Ｓａｕｅｒら（１９９９））。
【００６２】
切断されたＰａｐＡのアミノ末端切除断片（ｔｒｕｎｃａｔｅ）をアフィニティー樹脂上の、または可溶性切断アッセイの変性基質を用いて同定して、切断がタンパク質の中央近くで生じることが示唆された（図１Ｄおよび６）。ＤｅｇＰ切断の特異性をさらに定義し、そしてＰａｐＡ内で切断部位をマッピングするために、重複ペプチドスキャンを利用した（ＰｒｏｔｅａｓｅＳｐｏｔ（商標）、Ｊｅｒｉｎｉ  ＡＧ、Ｂｅｒｌｉｎ、ドイツ）（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ２０００：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ２６ｔｈ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ、Ｊ．ＭａｒｔｉｎｅｚおよびＪ．Ａ．Ｆｅｈｒｅｎｅｔｚ編、（２０００）のＲｅｉｎｅｋｅら、「Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ」）。双方のスキャニングライブラリー（７ｍｅｒおよび１２ｍｅｒ、図７）は固相アッセイにおいてＤｅｇＰによる切断を増強しているＰａｐＡの３領域を同定した。蛍光クエンチアッセイ系を利用する可溶性切断アッセイにおいて、スキャニングの結果をカルボキシル末端の最大のペプチド配列であるＳＰＣＪ−１２（ＨＹＴＡＶＶＫＫＳＳＡＶ）（配列番号３）およびより短い形であるＳＰＣＪ−１３（ＨＹＴＡＶＶＫ）（配列番号４）に関して確認した（図８）。この配列の切断の特異性を対象ペプチドであるＳＰＣＪ−１４（ＨＹＴＡＳＳＫ）（配列番号１７）を用いてさらに定義し、これはバリン残基対が不在の場合のペプチドを切断するようにプロテアーゼを誘発した。ＳＰＣＪ−１４の切断の欠如は、モデルＤｅｇＰ基質のＰ１残基がたいていバリン残基であることを示したＳａｕｅｒ研究所からの以前に報告された研究と合致する（Ｋｏｌｍａｒら（１９９６））。ペプチドスキャニングにより同定されたその他の配列のうち、ＬＤＩＥＬＶＮＣＤＩＴＡ（配列番号５）、ＥＬＶＮＣＤＩ（配列番号６）、ＫＬＡＦＴＧＰＩＶＮＧＨ（配列番号７）、ＦＴＧＰＩＶＮＧＨＳＤＥ（配列番号８）、ＴＬＫＤＧＥＮＶＬＨＹＴ（配列番号９）、ＤＧＥＮＶＬＨ（配列番号１０）、およびＮＶＬＨＹＴＡ（配列番号１１）もまた疎水性残基対を有したが、ＮＧＨＳＤＥＬ配列はこのパターンに従わない。明らかに、配列に加えてペプチド構造は、配列を共有する「近隣の」ペプチドが固相アッセイにおいて同等に切断されなかったいくつかの実例で認めることができるように、ＤｅｇＰによる認識において果たす役割を有している（図７）。
【００６３】
最初の固相切断アッセイにおいて同定されたＰａｐＤ切断フラグメント（〜１２ｋＤａ）（図１Ｄ）はアミノ末端シークエンシングによりＰａｐＡのアミノ末端フラグメントとして同定された。このフラグメントは再び固相アッセイで（図６）、アミノ末端シークエンシングにより決定された切断生成物の同定に至る。この切断生成物は上流部位、（ＬＤＩＥＬＶＮＣＤＩＴＡ）（配列番号５）、（ＦＴＧＰＩＶＮＧＨＳＤＥ）（配列番号８）の１つでの切断の可能性が非常に高い。
【００６４】
基質認識に関しては、Ｓｏｎｙａｎｇら（Ｓｏｎｙａｎｇら（１９９７））は最近ＰＤＺドメインにより認識された標的タンパク質におけるカルボキシル末端モチーフを同定した。この知見を考慮して、細菌プロテアーゼのＰＤＺドメインは、プロテアーゼ切断部位とは異なるタンパク質のミスフォールディング状態をシグナル化する配列を認識することができる。Ｓｏｎｙａｎｇらにより同定されたモチーフの最も特筆すべき特徴は−３位置（同定された配列の＞６０％）での保存的残基（スレオニン、セリン、またはチロシン）および高度に保存された（＞８０％）疎水性カルボキシル末端残基（バリン、イソロイシン、またはロイシン）である。興味深いことに、４４ピリンサブユニットのカルボキシル末端のアラインメントにより、−３位置がしばしばセリン、スレオニンまたはチロシンであることが示された（〜５０％）（ＳｏｔｏおよびＨｕｌｔｇｒｅｎ（１９９９））。シャペロン先導物質集合体経路（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ−ｕｓｈｅｒ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｐａｔｈｗａｙ）により集合した細菌線毛、例えばＰａｐ線毛が構造および配列特性に基づいて２つのファミリー：いわゆるＦＧＳおよびＦＧＬサブファミリーに最近分けられた（Ｈｕｎｇら（１９９６））。ＦＧＬサブファミリーでは、−３位置での保存（セリロン、スレオニンまたはチロシン）は８０％以上である。ＰａｐＧのカルボキシル末端の１０個の残基を確認するための、ＳＰＣＪ−１（ＫＳＭＣＭＫＬＳＦＳ）（配列番号１３）を用いた我々の最初の結果は、ＤｅｇＰのＰＤＺドメインがカルボキシル末端配列との相互作用を介して基質認識において役割を果たすことを示している。ＳＰＣＪ−１を添加し、そして不適切なペプチドを添加しない（データは示していない）ことによりプロテアーゼの切断活性が増強された（図５、６および８Ｄ）。２つの最近の文献で詳細に記載されており（Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙら（１９９９）；Ｓａｕｅｒら（１９９９））、そして先の遺伝子データにより支持されているように（Ｂｕｌｌｉｔｔら（１９９６）；Ｈｕｌｔｇｒｅｎら（１９９６）；Ｋｕｅｈｎら（１９９３）；Ｓｌｏｎｉｍら（１９９２）；ＳｏｔｏおよびＨｕｌｔｇｒｅｎ（１９９９）；Ｘｕら（１９９５））、ピリンサブユニットのカルボキシル末端はシャペロン−サブユニット複合体形成のための認識部位の不可欠な成分である。前記で簡単に論じたように、免疫グロブリンフォールディングのカルボキシル末端第７鎖の欠如の結果、疎水性コアに暴露するピリンの表面で深い溝ができる。この溝の一方の縁はピリンのカルボキシル末端β鎖により線になる（Ｆ鎖）（完全な論考に関しては（Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙら（１９９９）；Ｓａｕｅｒら（１９９９）参照）。供与鎖補完の間に、シャペロンはそのＧ鎖を提供してピリンの免疫グロブリンフォールディングを完成する。供与されたＧ鎖は溝の両側との相互作用によりピリンの疎水性コアを完了する。双方の遺伝子データおよび分子モデル化により、ピリンサブユニットのカルボキシル末端が線毛集合体を招くピリン−ピリン接触部分の一部であるモデルが支持される（Ｂｕｌｌｉｔｔら（１９９６）；Ｈｕｌｔｇｒｅｎら（１９９６）；Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙら（１９９９）；Ｓａｕｅｒら（１９９９））。従って、このモチーフが溶媒に暴露されるのは稀である。ミスフォールディングまたは誤集合の事象におけるこのモチーフの暴露は、リフォールディングを触媒するためのシャペロンかまたはタンパク質を分解するためのプロテアーゼのいずれかの必要性をシグナル化する。
【００６５】
これらの研究は、主要なペリプラズムプロテアーゼであるＤｅｇＰがミスフォールディングされたピリンサブユニットを切断するメカニズムを説明し、そしてＤｅｇＰ基質に関する一般的なタンパク質溶解経路に関係し得る。グラム陰性およびグラム陽性病原体の双方の病原性におけるＤｅｇＰの役割は高速大量処理スクリーニングおよびこの重要な毒性標的の小型分子インヒビターの同定に適したアッセイを開発するための推進力を提供する。記載した研究によりＤｅｇＰプロテアーゼに対して開発された新規クラスの抗感染薬の開発のための道が開かれる。
【００６６】
本明細書が参考にした全ての引用した特許および出版物はその全てを参照として本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】ＰａｐＡ−６Ｈ４Ａの発現および精製  １Ａ．ペリプラズムにおけるＰａｐＡ−６Ｈ４Ａの蓄積はＰａｐＤシャペロンに依存する。ＰａｐＡ−６Ｈ４Ａ単独のＩＰＴＧ（１ｍＭ）誘導（レーン１）またはＰａｐＡ−６Ｈ４ＡおよびＰａｐＤ双方の同時誘導（レーン２）の後、ＫＳ４７４／ｐＣＬ１０１／ｐＨＪ９２０３から調製したペリプラズム分画を分析した。培養物を中期対数増殖期で６０分間誘導した。ペリプラズムをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画化し、そしてクーマシーブルーで染色した。  １Ｂ．ペリプラズムからのＰａｐＺ−６Ｈ４Ａ−ＰａｐＤ複合体の精製。二重誘導培養物からのペリプラズムをＴａｌｏｎ金属アフィニティー樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に適用した。プレＴａｌｏｎ、すなわち非結合性分画および最初の３回洗浄（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ＝８、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）を各々レーン２〜６に示す。結合性ＰａｐＤ−ＰａｐＡ−６Ｈ４Ａ複合体を含有するＴａｌｏｎ樹脂を８Ｍ  尿素で処理し、そして洗浄してＰａｐＤを除去した（レーン７〜９）。次いで結合性ＰａｐＡ−６Ｈ４Ａを０．１Ｍ  イミダゾール、８Ｍ  尿素で溶出した（レーン１０〜１２）。ＰａｐＡ−６Ｈ４Ａに夾雑する微量のＰａｐＤを除去するために（レーン１０〜１２）、３つの溶出分画の材料をプールし、透析し、そして２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ＝８、８Ｍの尿素でＴａｌｏｎ樹脂に再度適用し、続いて十分に洗浄し、ＰａｐＡ−６Ｈ４Ａを０．１Ｍのイミダゾール、８Ｍの尿素で溶出した（レーン１３）。レーン１は分子量マーカーを含有する。  １Ｃ．ＰａｐＤ−ＰａｐＡ−６Ｈ４Ａ複合体の再構築。変性ＰａｐＡ−６Ｈ４Ａ（レーン２）をＴａｌｏｎ金属アフィニティー樹脂に適用し、そして精製されたＰａｐＤシャペロンを含有する溶液に希釈した。樹脂を洗浄し、そしてシャペロンサブユニット複合体を０．１Ｍのイミダゾールで溶出した（レーン３）。レーン１は参照のために精製された元来のＰａｐＤ  ＰａｐＡ−６Ｈ４Ａ複合体を含有する。  １Ｄ．ＤｅｇＰプロテアーゼ結合およびＰａｐＡ−６Ｈ４Ａの切断。変性ＰａｐＡ−６Ｈ４Ａを金属アフィニティー樹脂に並べ、そして対照ペリプラズム（ＫＳ４７４／ｐＡＣＹＣ１８４、レーン１）またはＤｅｇＰプロテアーゼ富化したペリプラズム（ＫＳ４７４／ｐＫＳ１７、レーン２）と共に室温で６０分間インキュベートした。３回洗浄の後、結合タンパク質を０．１Ｍのイミダゾールで溶出した。ＰａｐＡ−６Ｈ４ＡをＤｅｇＰ富化ペリプラズムに暴露した後、３つの新規のバンドが明らかになる。アミノ末端配列分析により〜４８ｋＤａのバンド（レーン２）がＤｅｇＰプロテアーゼとして同定されたが、およそ１２ｋＤａのバンド（レーン２）はＰａｐＡ−６Ｈ４Ａに関して推定されるアミノ末端を有する。第３のバンドは示された１４ｋＤａ分子量マーカーを超えて移動し、さらに同定されなければならない。レーン３は分子量マーカーを含有する。Ａ〜Ｄでは、分子量マーカーの大きさが示されている。
【図２】毒性アッセイ  ２Ａ．ＰａｐＤによるＰａｐＡ毒性抑制。ＫＳ４７４／ｐＣＬ１０１／ｐＨＪ９２０３（ＰａｐＤ）を０．３ｍＭのＩＰＴＧで誘導して、ＰａｐＤの存在下（黒四角）または不在下（黒三角）での成長開始時のＰａｐＡ−６Ｈ４Ａの合成を誘導した。培養物成長開始時に４％  アラビノースでＰａｐＤを誘導した。各培養物のＡ600を成長の間モニター観察した。  ２Ｂ．ＤｅｇＰによるＰａｐＡ毒性抑制。ＫＳ４７４／ｐＣＬ１０１／ｐＫＳ１７（ｄｅｇＰ）（黒四角）およびＫＳ４７４／ｐＣＬ１０１／ｐＡＣＹＣ１８４（ベクター対照）（黒三角）を成長開始時に０．３ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。各培養物のＡ600を成長の間モニター観察した。
【図３】ＤｅｇＰの精製  ３Ａ．カチオン交換分画。細胞３０ｇから調製したペリプラズムを５ｍｌのＨｉＴｒａｐ  ＳＰカラムに適用し、そして直線塩グラジエントで溶出した。出発材料および流出分画を各々レーン２および３に示す。溶出グラジエントの関連する部分をレーン４〜８に示す。ＤｅｇＰはおよそ１００ｍＭのＮａＣｌで溶出された。  ３Ｂ．ＨＩＣブチル分別。カチオン交換分別からのピーク分画をプールし、０．５Ｍの硫酸アンモニウムにし、そしてＨｉＴｒｐ  ＨＩＣブチルカラムに適用した。流出分画をレーン２に示し、そしてグラジエント溶出の部分をレーン３〜８に示す。ＤｅｇＰはおよそ０．３ＭのＮａＣｌに溶出し、そしてレーン４〜８に示す。小型の矢印はＤｅｇＰのトランケートされた形態を示し、その全てはアミノ末端シークエンシングにより同定された（データは確立されていない）。ＡおよびＢの双方で、レーン１は高分子量マーカーを含有する。
【図４】インビボプロテアーゼアッセイ  これらの３つの別個のＤｅｇＰ精製物を流したもの（Ａ、Ｂ、Ｃ）からプールしたピークＨＩＣブチル分画を市販のカゼイン基質における一般的なプロテアーゼ活性に関して検査した。ＥｎｚＣｈｅｋアッセイキットは切断まで内部でクエンチされている感受性の高い蛍光標識カゼイン基質を用いている。ＢＯＤＩＰＹ−カゼインＦＬシグナルを４８５ｎｍでの励起の後に読み、そして５３０ｎｍの発光をモニター観察する。製造者の指示書に従ってＤｅｇＰを含有するピーク分画を基質と共にインキュベートし、１時間後にプレート蛍光光度計で読んだ。トリプシンをアッセイの対照として使用した。
【図５】インビトロＤｅｇＰ切断アッセイ  ５Ａ．還元し、そしてカルボキシメチル化したＰａｐＡ−６Ｈ４Ａ（ＰａｐＡ−６Ｈ４Ａ−ｒｃｍ）を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ＝８中ＤｅｇＰと混合し、そして４５℃で一晩インキュベートした。反応物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ膜に移し、そしてＰ線毛全体に対して上昇されたポリクローナル抗体と共に発達させた。ＰａｐＡ−６Ｈ４Ａ−ｒｃｍ（レーン２および３、０．２５μｇ、レーン４および５、０．５μｇ）をおよそ５０および１００倍過剰のモル濃度のＤｅｇＰ（各々レーン３およびレーン５）の存在下（レーン３および５）および不在下（レーン２および４）でインキュベートした。大型の矢印はレーン４のＰａｐＡ凝集を示す。切断されたＰａｐＡ−６Ｈ４Ａバンドの濃度測定による定量により、ＤｅｇＰが投入タンパク質の８４％（レーン２および３と比較）および凝集バンドのほぼ１００％およびレーン５のタンパク質量体の４９％を切断したことが示された。レーン１は対照としてＤｅｇＰ単独を含有する。ＰａｐＡ抗血清とＤｅｇＰとの間の交差反応性が認められたブロットもあった。  ５Ｂ．二価カチオン、ＭｇＣｌ2の添加によりＰａｐＡのＤｅｇＰ切断が増強される。還元し、そしてカルボキシメチル化したＰａｐＡ−６Ｈ４Ａ（２０μｇ）を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ＝８、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2中ＤｅｇＰ（２０μｇ）と混合し、そして４５℃で４時間インキュベートした。ＤｅｇＰ単独（レーン１）、ＰａｐＡ−６Ｈ４Ａ−ｒｃｍ単独（レーン３）およびＤｅｇＰ＋ＰａｐＡ−６Ｈ４Ａ−ｒｃｍ（レーン２）を含有する反応物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、そしてクーマシーブリリアントブルーで染色した。投入ＰａｐＡ−６Ｈ４Ａ−ｒｃｍのほぼ５０％が４時間のインキュベーションの間に切断された。
【図６】ＰａｐＡ−６Ｈ４Ａ基質のＤｅｇＰ切断はキレート剤により抑制され、そして切断不能ペプチド、ＳＰＣＪ−１の添加により刺激される。  ２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ＝８、５ｍＭのＭｇＣｌ2中、２００μＭのＳＰＣＪ−１の存在下、ＤｅｇＰ（５μｇ）をカルボキシメチル化したＰａｐＡ−６Ｈ４Ａ（４０μｇ）と共にインキュベートした。ＥＤＴＡ（１０ｍＭ）を反応物に添加し、レーン７〜１０に負荷した。指示された時点でアリコートを取り、そしてＳＤＳ負荷バッファーの添加および氷上でのインキュベーションにより反応を停止させた。反応物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、そしてクーマシーブリリアントブルーで染色した。先の切断アッセイ（図１Ｄ）で認められた〜１２ｋＤａ切断生成物（レーン３〜５）を矢印で示す。投入ＰａｐＡ−６Ｈ４Ａの５０％以上が６０分で、そして４時間の時点では９０％分解した。
【図７】ＰａｐＡのＤｅｇＰプロテアーゼ切断部位の同定  ＳＰＯＴ合成技術を用いて、ＰａｐＡ配列の７−および１２−アミノ酸長の２つの重複（３残基）ペプチドライブラリーを構築した。連続セルロース膜に連結され、アミノ末端で蛍光タグ、アミノ安息香酸（Ａｂｚ）を有するペプチド（ＰｒｏｔｅａｓｅＳｐｏｔｓ）を合成した。ＰｅｐＳｐｏｔｓを９６ウェル様式で２０ｍＭのＰＯ4、ｐＨ＝７．５、５ｍＭのＭｇＣｌ2中０．２８ｍｇ／ｍｌのＤｅｇＰを用いてＰｅｐＳｐｏｔｓを検定した。提示したデータは２８時間のインキュベーションの後に遊離された蛍光である（発光−３２５ｎｍ、発光−４２０ｎｍ）。データは７ｍｅｒ（図７Ａ）および１２ｍｅｒ（図７Ｂ）ライブラリーの各々のペプチドに関する切断の相対レベルを示す。
【図８】インビトロペプチド切断アッセイ  ８Ａ．ＳＰＣＪ−１２（８μＭ）を反応バッファー（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ＝８、５ｍＭ  ＣａＣｌ2）中５μｇのＤｅｇＰ（黒四角）を含むものおよび含まないもの（黒三角）で指示された時間インキュベートした。  ８Ｂ．ＳＰＣＪ−１３（黒四角、白四角）およびＳＰＣＪ−１４（黒三角、白三角）（１０μＭ）を反応バッファー中５μｇのＤｅｇＰを含むもの（黒四角、黒三角）および含まないもの（白四角、白三角）で指示された時間インキュベートした。  ８Ｃ．ＤｅｇＰ  ５μｇを１０μＭ（黒ダイヤ）または１００μＭ（黒丸）ＳＰＣＪ−１４と共に３０分間予めインキュベートし、そして次に１０μＭ  ＳＰＣＪ−１３を添加し、そして６０分間インキュベートを続けることによりＳＰＣＪ−１４の抑制活性を実証した。  ８Ｄ．ＳＰＣＪ−１３を反応バッファー中５μｇのＤｅｇＰを含むもの（黒四角、黒ダイヤ）および含まないもの（黒丸、黒三角）でインキュベートした。ＳＰＣＪ−１の刺激効果を試験するために、２００μＭのペプチド（黒四角、黒丸）をインキュベーションの始めに加えた。Ｖｉｃｔｏｒ2Ｖプレートリーダーで指示された時間にアッセイをモニター観察した（発光−３４０ｎｍ、発光−４２０ｎｍ）。
【図９】基質ペプチドにおけるＤｅｇＰ切断部位のマッピング  ９Ａ．ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて増加させた（５ｍｌ）切断反応物の生成物を分離した。２１５ｎｍ、３４０ｎｍ、および４２０ｎｍでの吸光度を示す４５．７２ｍｌでのピーク（実際には２つのピーク−挿入部分参照）を凍結乾燥して乾燥し、そしてＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ質量分析器により置換基を同定した。  ９Ｂ．単一のピークはペプチドの切断から得られた２種を含有した。第１の種はＶＫ−ＤＡＰ（Ｄｎｐ）−ＮＨ2（配列番号１）に相当する４８０．５９のｍ／ｚを有したが、その他の種はＡｂｚ−ＨＹＴＡＶ（配列番号２）に相当する７０８．９９のｍ／ｚを有した。ＳＰＣＪ−１２ペプチド（１２アミノ酸長）を用いてこの分析を繰り返し、同一の切断部位をマッピングした（データは示していない）。
【配列表】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【国際調査報告】
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