(57)【要約】本発明は概して血管新生の分野に関連する。特に、本発明は血管新生促進のための方法を提供する。この方法は、血管新生が望まれる哺乳類に有効量のインテグリン結合血管新生前駆体因子またはインテグリンアンタゴニストを投与する工程を包含し、それによって上記の哺乳類の血管新生を促進する。本発明はまた、単離された血管新生タンパク質または血管新生ペプチドあるいは血管新生タンパク質または血管新生ペプチドをコードする単離された核酸を提供する。血管新生促進のための組合せおよび方法がさらに提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管新生を促進する方法であって、血管新生が望まれる哺乳類に、有効量のインテグリン結合血管新生前駆体因子を投与する工程を包含し、それによって該哺乳類の血管新生を促進する、方法。
【請求項２】
前記インテグリン結合血管新生前駆体因子がタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド性血管新生前駆体因子がβ１サブユニットを含むインテグリンに結合する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド性血管新生前駆体因子がインテグリン結合配列を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記インテグリン結合配列がＲＧＤモチーフ、ＲＧＤ関連モチーフまたは非ＲＧＤインテグリン認識モチーフを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記インテグリン結合血管新生前駆体因子が小分子の因子である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記インテグリン結合血管新生前駆体因子が抗インテグリン抗体，またはその誘導体もしくはフラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記抗インテグリン抗体がモノクローナル抗体である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記抗インテグリン抗体がβ１サブユニットを含むインテグリンに対する抗体である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗β１機能遮断抗体がＣＳＡＴ、ＡＧ８９、ＱＥ．２Ｅ５、ｍＡｂ１３およびＮａＭ１６０−１Ａ３からなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記血管新生前駆体因子がインテグリン連結を撹乱し、血管細胞接着の減少を引き起こす、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記血管新生前駆体因子がインテグリンのコンフォメーション変化を誘導し、他の潜在性のリガンド誘導性結合部位（ＬＩＢＳ）を曝露する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＬＩＢＳが潜在性コラーゲンＩ型結合部位である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記血管新生前駆体因子がインテグリンを病巣との接触点に再分配する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記血管新生前駆体因子が血管細胞の移動および／またはプロテアーゼ活性を促進する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記血管前駆体因子が神経細胞接着分子Ｌ１（ＮＣＡＭ  Ｌ１）または実質的にインテグリンに対する結合親和性を保持するその機能的誘導体もしくはフラグメント、あるいは前記のＮＣＡＭ  Ｌ１またはその機能的誘導体もしくはフラグメントをコードする核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＮＣＡＭ  Ｌ１が可溶性ＮＣＡＭ  Ｌ１または実質的にインテグリンに対する結合親和性を保持するその機能的誘導体もしくはフラグメントである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＮＣＡＭ  Ｌ１がＮＣＡＭ  Ｌ１の細胞外ドメイン全体またはインテグリンに対する結合親和性を実質的に保持するその機能的誘導体もしくはフラグメントを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＮＣＡＭ  Ｌ１がＮＣＡＭ  Ｌ１の細胞外ドメインのＩｇ様ドメイン４−６（Ｉｇ４−６）または実質的にインテグリンに対する結合親和性を保持しているその機能的誘導体もしくはフラグメントを含有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記血管新生前駆体因子が以下のアミノ酸配列：
ＰＳＩＴＷＲＧＤＧＲＤＬＱＥＬ
を有するペプチドに対して惹起された抗体に特異的に結合するタンパク質またはペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記ペプチドが以下のアミノ酸配列：
ＰＳＩＴＷＲＧＤＧＲＤＬＱＥＬ
を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記インテグリンがβ１サブユニットを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記インテグリンがα５β１またはαｖβ１を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記哺乳類がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記哺乳類が虚血性疾患または創傷治癒障害を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
ＮＣＡＭ  Ｌ１の細胞外ドメイン全体またはインテグリンに対する結合親和性を実質的に保持するその機能的誘導体もしくはフラグメント、Ｉｇ様ドメイン４−６（Ｉｇ４−６）を含むＮＣＡＭ  Ｌ１または実質的にインテグリンに対する結合親和力を保持するその機能的誘導体もしくはフラグメント、アミノ酸配列：ＰＳＩＴＷＲＧＤＧＲＤＬＱＥＬを有するペプチドに対して惹起された抗体に特異的に結合するタンパク質またはペプチド、およびアミノ酸配列：ＰＳＩＴＷＲＧＤＧＲＤＬＱＥＬを有するペプチドからなる群より選択される単離された該タンパク質またはペプチド。
【請求項２７】
請求項２６に記載の単離されたタンパク質またはペプチド、および薬学的に受容可能なキャリアもしくは賦形剤を含有する、薬学的組成物。
【請求項２８】
ＮＣＡＭ  Ｌ１の細胞外ドメイン全体またはインテグリンに対する結合親和性を実質的に保持するその機能的誘導体もしくはフラグメント、Ｉｇ様ドメイン４−６（Ｉｇ４−６）を含むＮＣＡＭ  Ｌ１または実質的にインテグリンに対する結合親和力を保持しているその機能的誘導体もしくはフラグメント、アミノ酸配列：ＰＳＩＴＷＲＧＤＧＲＤＬＱＥＬを有するペプチドに対して惹起された抗体に特異的に結合するタンパク質またはペプチド、およびアミノ酸配列：ＰＳＩＴＷＲＧＤＧＲＤＬＱＥＬを有するペプチド、からなる群より選択される、タンパク質またはペプチドをコードする、単離された核酸。
【請求項２９】
請求項２８に記載の核酸、および薬学的に受容可能なキャリアもしくは賦形剤を含有する、薬学的組成物。
【請求項３０】
以下：
ａ）有効量のインテグリン結合血管新生前駆体因子；および
ｂ）有効量の他の血管新生分子
を含む、組み合わせ。
【請求項３１】
薬学的組成物の形態である、請求項３０に記載の組合せ。
【請求項３２】
前記他の血管新生分子が、血管新生性サイトカイン、またはその血管新生活性を実質的に保持するその機能的誘導体もしくはフラグメント、あるいは血管新生性サイトカイン、またはその血管新生活性を実質的に保持しているその機能的誘導体もしくはフラグメントをコードする核酸である、請求項３０に記載の組合せ。
【請求項３３】
前記血管新生性サイトカインが、酸性繊維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）、アンジオポイエチン、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、ヘパリン結合性上皮細胞増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、細胞分散因子肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）および血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）からなる群から選択される、請求項３２に記載の組合せ。
【請求項３４】
血管新生を促進する方法であって、血管新生が望まれる哺乳類に対し、請求項３０に記載の組合せの有効量を投与する工程を包含し、それによって該哺乳類の血管新生を促進する、方法。
【請求項３５】
血管新生を促進する方法であって、血管新生が望まれる哺乳類に対し、哺乳類に対するインテグリンアンタゴニストの有効量を投与する工程を包含し、それによって該哺乳類の血管新生を促進する、方法。
【請求項３６】
前記インテグリンアンタゴニストがインテグリンアンチセンスオリゴヌクレオチド、抗インテグリン抗体、可溶性インテグリン、またはそれらの誘導体もしくはフラグメント、あるいはインテグリン産生を減少または阻害する因子からなる群より選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
以下：
ａ）有効量のインテグリンアンタゴニスト；および
ｂ）有効量の他の血管新生分子
を含む、組み合わせ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は概して血管新生の分野に関連する。特に、本発明は血管新生促進のための方法を提供する。この方法は、血管新生が望まれる哺乳類に有効量のインテグリン結合血管新生前駆体因子またはインテグリンアンタゴニストを投与する工程を包含し、それによって上記の哺乳類の血管新生を促進する。本発明はまた、単離された血管新生タンパク質または血管新生ペプチドあるいは血管新生タンパク質または血管新生ペプチドをコードする単離された核酸を提供する。血管新生促進のための組合せおよび方法がさらに提供される。
【０００２】
（技術の背景）
血管新生とは親微細血管から新しい血管が生成することである。血管新生は正常な胎盤、胚、胎児、ならびに出生後の発育および成長に必須であるが、厳密に制御された条件下ならびに卵胞、黄体および月経後の子宮内膜において周期的にみられるのを除いては、生理学的に成人ではほとんど見られない（Ｎｏｒｒｂｙ、ＡＰＭＩＳ、１０５、４１７−４３７（１９９７））。
【０００３】
血管新生は血管新生の刺激因子および阻害因子のシステムによって高度に調節されている。血管新生刺激因子の公知の例としては、特定の成長因子、サイトカイン、タンパク質、ペプチド、糖、および脂質が挙げられる（Ｎｏｒｒｂｙ、ＡＰＭＩＳ、１０５、４１７−４３７（１９９７）；Ｐｏｌｖｅｒｉｎｉ、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｒａｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、６：２３０−２４７（１９９５））。種々の内因性および外因性の血管新生阻害因子が当該分野で公知である（Ｊａｃｋｓｏｎら、ＦＡＳＥＢ、１１、４５７−４６５（１９９７）；Ｎｏｒｒｂｙ、ＡＰＭＩＳ、１０５、４１７−４３７（１９９７）；およびＯ’Ｒｅｉｌｌｙ、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇｓ、１５：５−１３（１９９７））。ある種の疾患または障害、たとえば虚血性の疾患または創傷治癒障害は血管新生の不全と関連している。
【０００４】
従って、このような血管新生が望まれる場合に血管新生を促進するための組成物および方法を提供することが本発明の目的である。血管新生の不全に関連する疾患および障害を処置するための組成物および方法を提供することもまた本研究の目的である。
【０００５】
（発明の開示）
本発明は概して血管新生の分野に関連する。一つの局面において、本発明は、血管新生促進のための方法に関する。この方法は血管新生が望まれる哺乳類に有効量のインテグリン結合血管新生前駆体因子またはインテグリンアンタゴニストを投与する工程を包含し、それによって上記の哺乳類の血管新生を促進する。典型的なインテグリン結合血管新生前駆体因子はインテグリン結合配列を持つタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドあるいは血管新生前駆体因子小分子であり得る。タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドあるいは血管新生前駆体因子小分子において、典型的なインテグリン結合配列はＲＧＤモチーフ、ＲＧＤ関連モチーフまたは非ＲＧＤインテグリン認識モチーフであり得る。
【０００６】
別の局面において、本発明は、単離された核酸に関する。この核酸は、ＮＣＡＭ  Ｌ１の細胞外ドメイン全体またはインテグリンに対する結合親和性を実質的に保持しているその機能的誘導体もしくはフラグメント、Ｉｇ様ドメイン４−６（Ｉｇ４−６）を含有するＮＣＡＭ  Ｌ１または実質的にインテグリンに対する結合親和力を保持しているその機能的誘導体もしくはフラグメント、ＰＳＩＴＷＲＧＤＧＲＤＬＱＥＬというアミノ酸配列を有するペプチドに対して惹起された抗体に特異的に結合するタンパク質またはペプチド、およびＰＳＩＴＷＲＧＤＧＲＤＬＱＥＬというアミノ酸配列を有するペプチドからなる群より選択されるタンパク質またはペプチドをコードする。
【０００７】
他の局面において、本発明は、組合せに関する。この組合せは：ａ）有効量のインテグリン結合血管新生前駆体因子；およびｂ）それ以外の有効量の血管新生分子；を含有する。
【０００８】
さらに他の局面において、本発明は、血管新生促進のための方法に関する。この方法は有効量の以下のａ）およびｂ）を含む組合せを血管新生が望まれる哺乳類に投与する工程を包含し、それによって上記の哺乳類の血管新生を促進する：
ａ）有効量のインテグリン結合血管新生前駆体因子；および
ｂ）血管新生が望まれる哺乳類に有効量の別の血管形成分子
さらに他の局面において、本発明は、血管新生促進のための方法に関する。この方法は有効量のインテグリンアンタゴニストを血管新生が望まれる哺乳類に投与する工程を包含し、それによって上記の哺乳類の血管新生を促進する。好ましくは、インテグリンアンタゴニストは、インテグリンアンチセンスオリゴヌクレオチド、抗インテグリン抗体、可溶性インテグリン、またはそれらの誘導体もしくはフラグメント、あるいはインテグリン産生を減少または阻害する因子である。
【０００９】
さらに他の局面において本発明は、組合せに関する。この組合せは：
ａ）有効量のインテグリンアンタゴニスト；および
ｂ）有効量の別の血管形成分子；を包含する。
【００１０】
（発明の実施の形態）
（Ａ．定義）
他に規定されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されているのと同じ意味を持つ。全ての特許、出願、公開された出願ならびにその他の出版物およびＧｅｎＢａｎｋおよびその他本明細書中で参照されるデータベースからの配列は、その全体において参考として援用される。
【００１１】
本明細書中で使用する場合、「インテグリン」とはα−およびβ−鎖サブユニットで構成されるヘテロダイマーである細胞膜糖タンパク質のファミリーをいう。インテグリンは細胞−細胞または細胞−基質接着、たとえば好中球と内皮細胞またはコラーゲンのような細胞外マトリックスとの結合に関与する糖タンパク質レセプターとして働く。
【００１２】
本明細書中で使用する場合「インテグリン結合血管新生前駆体因子」とは血管新生効果をインテグリンまたはインテグリンを含む複合体と結合することによって血管新生効果を発揮する物質のことをいう。
【００１３】
本明細書中で使用する場合「インテグリンのアンタゴニスト（あるいはインテグリンアンタゴニスト）」とは、インテグリンの産生および／またはインテグリンの抗血管新生機能を減少させる物質をいう。このようなアンタゴニストはインテグリン遺伝子の転写および／または翻訳の減少、インテグリン前駆体の翻訳後修飾および／または細胞性輸送の減少、あるいはインテグリンタンパク質の半減期の短縮によってインテグリンの産生を減少し得る。このようなアンタゴニストはまたインテグリンの抗血管新生活性の効力減少、または血管新生経路におけるインテグリンの天然型リガンドの感受性の減少、またはインテグリンのアンタゴニストの効力増大によってインテグリンの抗血管新生機能を減少し得る。
【００１４】
本明細書中で使用する場合「アンチセンスポリヌクレオチド」とは、ｍＲＮＡまたは二本鎖ＤＮＡのセンス鎖に対して相補的なヌクレオチド塩基の合成配列のことをいう。適当な条件下においてセンスおよびアンチセンスポリヌクレオチドを混合することにより、二つの分子が結合またはハイブリダイゼーションする。これらのポリヌクレオチドが、ｍＲＮＡと結合（ハイブリダイゼーション）する場合、タンパク質合成（翻訳）の阻害が起こる。これらのポリヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡに結合する場合、ＲＮＡ合成（転写）の阻害が起こる。結果として起こる翻訳および／または転写の阻害により、センス鎖によってコードされるタンパク質の合成が阻害される。
【００１５】
本明細書中で使用する場合「インテグリンアンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、インテグリンポリペプチドの産生または発現を抑制する任意のオリゴマーをいう。このようなオリゴマーのサイズは、この目的のために効果的な任意の長さであり得る。概して、アンチセンスオリゴマーは、翻訳開始コドンを含み、翻訳を阻止するために十分な数の相補的ヌクレオチドを有するインテグリンの転写物の一部のヌクレオチド配列に基づいて調製される。
【００１６】
本明細書中で使用する場合、「可溶性インテグリン」とは、例えば、膜貫通ドメインの欠如のために膜結合性ではないが、それにもかかわらず天然型ホモ−またはヘテロ−結合リガンドに対する結合親和性を実質的に保持している、インテグリンタンパク質の任意のフラグメントをいう。好ましくは、可溶性インテグリンはまたシグナル伝達機能に関与するインテグリンの任意の細胞内ドメインを欠失している。
【００１７】
本明細書中で使用する場合、「抗体」としては、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体、単鎖抗体および軽鎖および重鎖の可変部位から構成される他の抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント）が挙げられる。
【００１８】
本明細書で使用する場合、「ヒト化抗体」とは「ヒト」配列のアミノ酸を含むように改変されており、それによってヒトへの投与により免疫応答を誘導しない抗体のことをいう。このような抗体を作るための方法は公知である。例えば、モノクローナル抗体を発現するハイブリドーマは、組換えＤＮＡ技術によって、非可変領域のアミノ酸組成がヒト抗体に基づいている抗体を産生するように改変される。このような領域を同定するためコンピュータープログラムが設計されている。
【００１９】
本明細書中で使用する場合、「組換え手段による産生」とは、クローニングされた核酸によってコードされるタンパク質発現のための分子生物学の周知の方法に基づく組換え核酸法を使用する産生方法をいう。
【００２０】
本明細書中で使用する場合、「神経細胞接着分子Ｌ１（ＮＣＡＭ  Ｌ１）」とは、ＩｇＳＦスーパーファミリーに属する神経細胞接着分子をいう。ＮＣＡＭ  Ｌ１には実質的にそのインテグリン結合活性を変えない保存的アミノ酸置換を有する改変体も含むまれることが意図される。アミノ酸の適当な保存的置換は当該分野において公知であり、一般的に、得られる分子の生物学的活性を変えることなくなされ得る。当業者は、概して、ポリペプチドの非必須領域における単一アミノ酸の置換は生物学的活性を実質的に変えるものではないことを認識している（例えば、Ｗａｔｓｏｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ、第四版、１９８７、Ｔｈｅ  Ｂｅｊａｃｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂ．  ｃｏ．、ｐ．２２４を参照のこと）。
【００２１】
本明細書中で使用する場合、「インテグリンに対する結合親和性を実質的に保持しているＮＣＡＭ  Ｌ１の機能的誘導体またはフラグメント」とは、インテグリン結合活性および血管新生前駆体活性を実質的に保持しているＮＣＡＭ  Ｌ１の誘導体またはフラグメントのことをいう。通常は、この誘導体またはフラグメントは、インテグリンに対して少なくとも１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％の結合親和性を保持している。好ましくは、この誘導体またはフラグメントはインテグリンに対して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％および１００％の結合親和性を保持している。
【００２２】
本明細書中で使用する場合、「可溶性ＮＣＡＭ  Ｌ１」とは、例えば、膜貫通ドメインの欠如のために膜結合性ではないが、それにもかかわらずインテグリンに対する結合親和性を実質的に保持している、ＮＣＡＭ  Ｌ１タンパク質の任意のフラグメントのことをいう。好ましくは、可溶性ＮＣＡＭ  Ｌ１もまた、シグナル伝達機能に関与する任意のＮＣＡＭ  Ｌ１の細胞内ドメインを欠失している。
【００２３】
本明細書中で使用する場合、「有効量のインテグリン結合血管新生前駆体因子」とは、血管新生性であるが、抗血管新生性となるほど多くない量の因子のことをいう。このような量は、使用される因子、標的とするインテグリンおよび投薬経路の見地から決定されるべきである。もし必要であるなら、この量は例えば、当該分野で公知の種々のインビトロ、インビボ、または臨床的モデルによる血管新生アッセイによって実験的に決定され得る。この因子が血管新生の促進による疾患または障害の処置に使われる場合、この量は疾患に関連する症状を改善させるのに十分な量であるか、またはいくつかの場合、軽減する量をいう。このような量は、単回投与量としてかまたはレジメンに基づいて投与され得、それによって効果を発揮する。この量は疾患を治癒し得るが、典型的には、疾患の症状を改善させるために投与され得る。反復的な投与は症状の望ましい改善を達成する場合に要求され得る。
【００２４】
本明細書中で使用する場合、「インテグリンアンタゴニストの有効量」とは血管新生であるが、抗血管新生性となるほど多くないアンタゴニストの量をいう。このような量は、使用されるアンタゴニスト、標的とするインテグリンおよび投薬経路の見地から決定されるべきである。必要な場合、この量は、例えば、当該分野で公知の種々のインビトロ、インビボ、または臨床的モデルによる血管新生アッセイによって実験的に決定され得る。インテグリンアンタゴニストが血管新生の促進による疾患または障害の処置に使われる場合、この量は疾患に関連する症状を改善するのに十分な量であるか、またはいくつかの場合、軽減する量をいう。このような量は、単回投与量としてかまたはレジメンに基づいて投与され得、それによって効果を発揮する。この量は疾患を治癒し得るが、典型的には、疾患の症状を改善するために投与される。反復的な投与は、症状の望ましい改善を達成する場合に要求され得る。
【００２５】
本明細書中で使用する場合：不一致の百分率を決定する上でのハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは以下の通りである：
１）高いストリンジェンシー：０．１  ｘ  ＳＳＰＥ、０．１％  ＳＤＳ、６５℃
２）中程度のストリンジェンシー：０．２  ｘ  ＳＳＰＥ、０．１％  ＳＤＳ、５０℃
３）低いストリンジェンシー：１．０  ｘ  ＳＳＰＥ、０．１％  ＳＤＳ、５０℃
等価なストリンジェンシーは緩衝液、塩、および温度を用いて達成され得るとことが理解されている。
【００２６】
本明細書中で使用する場合、「虚血性の疾患」とは、血管の収縮もしくは閉塞によって引き起こされる身体器官、組織、または部分に対する血液供給の減少によって特徴付けられる疾患または障害のことをいう。
【００２７】
本明細書中で使用する場合、「組合せ」とは、二つまたはそれ以上の項目の任意の結び付きのことをいう。
【００２８】
本明細書中で使用する場合、「組成物」とは、二つまたはそれ以上の生成物もしくは化合物の任意の混合物のことをいう。組成物は、溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト状、含水物、非含水物、またはこれらの任意の組合せであり得る。
【００２９】
開示の明瞭さのためであり、制限のためではなく、発明の詳細な説明は、後述するようにサブセクションに分割されている。
【００３０】
（Ｂ．血管新生促進の方法）
一つの局面において、本発明は、血管新生促進のための方法に関する。この方法は、血管新生が望まれる哺乳類に、有効量のインテグリン結合血管新生前駆体因子またはインテグリンアンタゴニストを投与する工程を包含し、それによって上記の哺乳類の血管新生を促進する。
【００３１】
一つの特定の実施形態において、インテグリン結合血管新生前駆体因子は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドである。好ましくは、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド血管新生前駆体因子は、β１サブユニットを含むインテグリンに結合する。また好ましくは、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド血管新生前駆体因子は、インテグリン結合配列を含む。さらに好ましくは、このインテグリン結合配列は、ＲＧＤモチーフ、ＲＧＤ関連モチーフ、または非ＲＧＤインテグリン認識モチーフを含む。典型的なＲＧＤモチーフは、ＰＳＩＴＷＲＧＤＧＲＤＬＱＥＬを含む。典型的な非ＲＧＤインテグリン認識モチーフとして、ＲＲＥＴＡＷＡ（Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１２４：３７３−３８０（１９９４））およびＧＳＱＲＫＨＳＫＲおよびＱＶＫＧＨＬＲ（Ｓｉｌｌｅｔｔｉら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ、１４９：１１４８５−１５０１（２０００））が挙げられる。
【００３２】
別の特定の実施形態において、インテグリン結合性血管新生前駆体因子は小分子の因子である。
【００３３】
任意のインテグリンは、望ましい血管新生を促進するための標的として使用され得る。例えば、β１、β２、β３、β４、β５、β６、β７、またはβ８サブユニットを含有するインテグリンが、標的として使用され得る。好ましくは、β１サブユニットを含有するインテグリンが、標的として使用され得る。また好ましくは、α５β１またはαｖβ１サブユニットを含有するインテグリンが、標的として使用され得る。特定の実施形態において、下記のβサブユニットを含有するインテグリンが標的として使用され得る：ＡＦ２２４３３７（Ｉｃｔａｌｕｒｕｓ  ｐｕｎｃｔａｔｕｓ  β−１  インテグリン  ｍＲＮＡ）；ＡＦ０６０２０３（Ｂｉｏｍｐｈａｌａｒｉａ  ｇｌａｂｒａｔａ  βインテグリン）；ＡＦ１１５３７６（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  インテグリン  β−６）；ＡＦ０２２１１０（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  インテグリン  β−５）；ＲＮＵ６００９６（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  座骨神経インテグリン  β−４）；Ｌ１３３０５（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  インテグリンβ）；ＡＦ０７８８０２（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ  ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓ  インテグリン  β  Ｌ）；ＦＣＵ２７３５１（Ｆｅｌｉｓ  ｃａｔｕｓ  β−１  インテグリン）；ＡＦ０５９６０７（Ｌｙｔｅｃｈｉｎｕｓ  ｖａｒｉｅｇａｔｕｓ  β−Ｃ）；ＳＰＵ７７５８４（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ  ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓ  インテグリン  β  Ｇ）；ＲＮＵ１２３０９（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  インテグリン  β−１）；ＣＥＵ１９７４４（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ  インテグリン  β  ｐａｔ−３）；Ｍ６２８８０（ヒトインテグリン  β−７）；Ｍ６８８９２（ヒトインテグリン  β−７  サブユニット）；Ｊ０５６３３（ヒトインテグリン  β−５）；Ｍ３５０１１（ヒトインテグリン  β−５）；Ｍ２０１８０またはＪ０３７３６（Ｘ．ｌａｅｖｉｓ  インテグリン  β−１）；Ｍ２０１４０またはＪ０３７３６（Ｘ．ｌａｅｖｉｓ  インテグリン  β−１）；Ｍ９５６３３（マウスインテグリン  β−７）；Ｍ９５６３２（マウスインテグリン  β−７）；Ｍ７３７８０（ヒトインテグリン  β−８）；Ｍ７３７８１（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ  インテグリン  β−８）；Ｌ１３５９１（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ  インテグリン  β−３）；およびＭ６８９０３（マウスインテグリン  β−７）。
【００３４】
任意のインテグリンアンタゴニストが、本方法において使用され得る。たとえば、インテグリンアンタゴニストは、インテグリンアンチセンスオリゴヌクレオチド、抗インテグリン抗体、可溶性インテグリン、またはそれらの誘導体もしくはフラグメント、あるいはインテグリンの産生および／または抗血管新生機能を減少または阻害する因子であり得る。特定の実施形態において、インテグリンアンチセンスオリゴヌクレオチド、抗インテグリン抗体、および可溶性インテグリン、または上述のインテグリン核酸もしくはコードされたタンパク質に由来するかもしくはそれらに対して惹起されたそれらの誘導体もしくはフラグメントが使用され得る。
【００３５】
抗インテグリン抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。好ましくは、抗インテグリン抗体は、ＣＳＡＴ、ＡＧ８９（Ｔａｋａｇｉら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）、１２１（５）：９１４−９２１（１９９７）、ＱＥ．２Ｅ５（Ｆａｕｌｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１（４１）：２５０９９−１０６（１９９６））、ｍＡｂ  １３（Ｍｏｕｌｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１（３４）：２０３６５−７４（１９９６））、またはＮａＭ１６０−１Ａ３（Ｒｉｃｈａｒｄら、Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、５（１）：７５−８３（１９９８））である。
【００３６】
任意のインテグリン結合血管新生前駆体因子が、本方法において使用され得る。例えば、血管細胞接着の減少を引き起こすインテグリンの連結を撹乱させる因子が使用され得る。他の例としては、インテグリンのコンフォメーション変化を誘導し、他の潜在性リガンド誘導性結合部位（ＬＩＢＳ）、例えば潜在性コラーゲンＩ型結合部位を曝露する因子が使用され得る。また他の例としては、インテグリンを病巣との接触点の中に再分配する因子が使用され得る。さらに他の例として、血管細胞の移動および／またはプロテアーゼの活性を増進する血管新生前駆体因子が使用され得る。
【００３７】
特定の実施形態において、インテグリン結合血管新生前駆体因子は、神経細胞接着分子Ｌ１（ＮＣＡＭ  Ｌ１）、またはインテグリンに対する結合親和性を実質的に保持しているその機能的誘導体もしくはフラグメント、あるいは上記のＮＣＡＭ  Ｌ１またはその機能的誘導体もしくはフラグメントをコードしている核酸である。
【００３８】
任意のＮＣＡＭ  Ｌ１、またはインテグリン結合性血管新生前駆体因子として機能し得る任意のＮＣＡＭ  Ｌ１の機能的誘導体もしくはフラグメント、およびこのようなＮＣＡＭ  Ｌ１、またはその機能的誘導体もしくはフラグメントをコードしている任意の核酸が、本方法において使用され得る。
【００３９】
例えば、下記のＧｅｎＢａｎｋ登録番号のＮＣＡＭ  Ｌ１タンパク質が使用され得る：Ｔ３０５３２（Ｆｕｇｕ  ｒｕｂｒｉｐｅｓ）；Ｔ３０５８１（ゼブラフィッシュ）；Ｓ３６１２６（ラット）；Ａ４３４２５（ニワトリ）；Ｓ０５４７９（マウス）；Ａ４１０６０（ヒト）；ＮＰ＿０３２５０４（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）；ＮＰ＿００６６０５（Ｌ１サピエンスに類似したホモログ）ＮＰ＿０００４１６（ホモ  サピエンス）；ＡＡＦ２２１５３（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）；ＣＡＢ５７３０１（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）；Ｐ３２００４（ヒト）；Ｑ０５６９５（ラット）；Ｐ１１６２７（マウス）；ＡＡＤ２８６１０（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ａｅｔｈｉｏｐｓ）；ＣＡＢ３７８３１（ホモ  サピエンス）；ＡＡＣ５１７４６（ホモ  サピエンス）；ＡＡＣ１５５８０（Ｆｕｇｕ  ｒｕｂｒｉｐｅｓ）；ＡＡＣ１４３５２（ホモ  サピエンス）；ＣＡＡ９６４６９（Ｆｕｇｕ  ｒｕｂｒｉｐｅｓ）；ＣＡＡ８２５６４（ホモ  サピエンス）；ＣＡＡ４１５７６（ホモサピエンス）；１４１１３０１Ａ；ＣＡＡ４２５０８（ホモ  サピエンス）；ＣＡＡ４１８６０（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）；ＡＡＡ９９１５９（Ｃａｒａｓｓｉｕｓ  ａｕｒａｔｕｓ）；ＣＡＡ６１４９１（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）；ＣＡＡ６１４９０（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）；ＡＡＡ５９４７６（ホモ  サピエンス）；ＡＡＡ３６３５３（ホモ  サピエンス）。加えて、前述のＮＣＡＭ  Ｌ１タンパク質に由来するもしくはその一部であり、インテグリン拮抗性および／または結合活性を実質的に保持している任意のタンパク質が使用され得る。好ましくは、このようなＮＣＡＭ  Ｌ１誘導体またはフラグメントは、誘導体またはフラグメントの由来となるＮＣＡＭ  Ｌ１タンパク質から特異的に認識する抗体によって認識され得る。
【００４０】
同様に、下記のＧｅｎＢａｎｋ登録番号のＮＣＡＭ  Ｌ１タンパク質をコードする核酸が使用され得る：ＡＣ００５７７５（ホモ  サピエンス）；ＡＣ００４６９０（ホモ  サピエンス）；Ｍ２８２３１（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  神経膠細胞前駆体）；ＡＨ００６３２６（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  神経膠細胞（ｎｒｇ）、選択的スプライシング生産物）；ＡＦ０５００８５（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ神経膠細胞（ｎｒｇ）遺伝子）；ＡＦ１７２２７７（ホモ  サピエンス）；ＡＦ１３３０９３（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）；ＡＪ２３９３２５（ホモ  サピエンス）；ＡＬ０２１９４０（ホモ  サピエンス）；ＡＦ１２９１６７（Ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ  ａｅｔｈｉｏｐｓ）；ＡＪ０１１９３０（ホモ  サピエンス）；Ｕ５２１１２（ホモ  サピエンス）；Ｍ９７１６１（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）；ＡＣ００５６２６（ホモ  サピエンス）；ＡＦ０２６１９８（Ｆｕｇｕ  ｒｕｂｒｉｐｅｓ）；Ｍ７７６４０（ホモ  サピエンス）；Ｕ５５２１１（Ｃａｒａｓｓｉｕｓ  ａｕｒａｔｕｓ）；Ｍ７４３８７（ヒト）。加えて、前述のＮＣＡＭ  Ｌ１をコードしている核酸に由来するまたはその一部分で、インテグリン拮抗活性および／または結合活性を実質的に保持している任意の核酸が使用され得る。好ましくは、このようなＮＣＡＭ  Ｌ１の核酸誘導体またはフラグメントは、この誘導体またはフラグメントの由来となったＮＣＡＭ  Ｌ１核酸と、低い、中程度、あるいは高いストリンジェンシーでハイブリダイズし得る。
【００４１】
好ましくは、ＮＣＡＭ  Ｌ１は、可溶性ＮＣＡＭ  Ｌ１、またはインテグリンに対する結合親和性を実質的に保持するその機能的誘導体もしくはフラグメントである。また好ましくは、ＮＣＡＭ  Ｌ１は、ＮＣＡＭ  Ｌ１またはインテグリンに対する結合親和性を実質的に保持するその機能的誘導体もしくはフラグメントの細胞外ドメインの、Ｉｇ様ドメイン４〜６（Ｉｇ４〜６）を含む。
【００４２】
別の特定の実施形態において、インテグリン結合血管新生前駆体因子（ｐｒｏ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ａｇｅｎｔ）は、以下のアミノ酸配列：ＰＳＩＴＷＲＧＤＧＲＤＬＱＥＬを有するペプチドに対して惹起された抗体に特異的に結合する、タンパク質またはペプチドである。好ましくは、このペプチドは、以下のアミノ酸配列：ＰＳＩＴＷＲＧＤＧＲＤＬＱＥＬを有する。抗体は、ポリクローナル抗体であれモノクローナル抗体であれ、当該分野で公知の任意の方法によって、所望のペプチドに対して惹起され得る（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｄｅｌｖｅｓ，Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９７；Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ、ＨｏｗａｒｄおよびＢｅｔｈｅｌｌ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、１９９９；ならびにＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｓｃｈｏｏｋ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、１９８７を参照のこと）。
【００４３】
本発明の方法は、欠損した血管新生に関連する疾患または障害を有する哺乳動物を、予防的または治療的にかのいずれかで処置するために使用され得る。このような疾患または障害の例としては、虚血疾患または創傷治癒障害が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
虚血疾患または創傷治癒障害を有する、任意の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、雌ウシ、雄ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、サルおよび他の非ヒト霊長類）は、本発明の方法を用いて処置され得る。好ましくは、虚血疾患または創傷治癒障害を有するヒトが、本発明の方法を用いて処置される。
【００４５】
（Ｃ．血管新生を増強するための、組成物、組み合わせおよび併用方法）
別の局面において、本発明は、単離されたタンパク質またはペプチドに関し、このタンパク質またはペプチドは、ＮＣＡＭ  Ｌ１またはインテグリンに対する結合親和性を実質的に保持するその機能的誘導体もしくはフラグメントの全細胞外ドメイン、ＮＣＡＭ  Ｌ１またはインテグリンに対する結合親和性を実質的に保持するその機能的誘導体もしくはフラグメントの細胞外ドメインのＩｇ様ドメイン１〜３（Ｉｇ１〜３）、Ｉｇ様ドメイン４〜６（Ｉｇ４〜６）もしくはＩｇ様ドメイン１〜６（Ｉｇ１〜６）を含むＮＣＡＭ  Ｌ１、以下のアミノ酸配列：ＰＳＩＴＷＲＧＤＧＲＤＬＱＥＬを有するペプチドに対して惹起された抗体に特異的に結合するタンパク質またはペプチド、および以下のアミノ酸配列：ＰＳＩＴＷＲＧＤＧＲＤＬＱＥＬを有するペプチドである。好ましくは、このような単離されたタンパク質またはペプチドは、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤と共に、薬学的組成物として処方される。
【００４６】
なお別の局面において、本発明は、単離された核酸に関し、この核酸は、ＮＣＡＭ  Ｌ１またはインテグリンに対する結合親和性を実質的に保持するその機能的誘導体もしくはフラグメントの全細胞外ドメイン、ＮＣＡＭ  Ｌ１またはインテグリンに対する結合親和性を実質的に保持するその機能的誘導体もしくはフラグメントの細胞外ドメインのＩｇ様ドメイン１〜３（Ｉｇ１〜３）、Ｉｇ様ドメイン４〜６（Ｉｇ４〜６）もしくはＩｇ様ドメイン１〜６（Ｉｇ１〜６）を含むＮＣＡＭ  Ｌ１、以下のアミノ酸配列：ＰＳＩＴＷＲＧＤＧＲＤＬＱＥＬを有するペプチドに対して惹起された抗体に特異的に結合するタンパク質またはペプチド、および以下のアミノ酸配列：ＰＳＩＴＷＲＧＤＧＲＤＬＱＥＬを有するペプチドをコードする。好ましくは、このような単離された核酸は、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤と共に、薬学的組成物として処方される。
【００４７】
なお別の局面において、本発明は、組み合わせに関し、この組み合わせは、以下を含む：ａ）有効量のインテグリン結合血管新生前駆体因子またはインテグリンアンタゴニスト；およびｂ）有効量の別の血管新生分子。好ましくは、このような組み合わせは、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤と共に、薬学的組成物として処方される。
【００４８】
任意のインテグリン結合血管新生前駆体因子またはインテグリンアンタゴニスト（上記の節Ｂにおいて記載されたものを含む）は、この組み合わせにおいて使用され得る。インテグリンアンタゴニスト以外の任意の血管新生分子は、この組み合わせの第二の成分として使用され得る。例えば、他の血管新生分子は、血管新生サイトカインまたは血管新生活性を実質的に保持するその機能的誘導体もしくはフラグメントであり得るか、あるいは、血管新生サイトカインまたは血管新生活性を実質的に保持するその機能的誘導体もしくはフラグメントをコードする核酸であり得る。好ましくは、この血管新生サイトカインは、酸性繊維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、アンギオポイエチン（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、ヘパリン結合上皮増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、散乱因子肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、および血管上皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、または血管新生活性を実質的に保持するその機能的誘導体もしくはフラグメント、あるいは血管新生サイトカインまたは血管新生活性を実質的に保持するその機能的誘導体もしくはフラグメントをコードする核酸である。
【００４９】
なお別の局面において、本発明は、血管新生を増強するための方法に関し、この方法は、血管新生が所望される哺乳動物に、上記の組み合わせの有効量を投与し、それによってこの哺乳動物において血管新生を増強する工程を包含する。
【００５０】
（好ましくは薬学的組成物の形態での）上記の組成物、組み合わせの処方物、投薬量および投与経路は、当該分野で公知の方法に従って決定され得る（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（編者）Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ａｐｒｉｌ  １９９７；Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂａｎｇａ、１９９９；ならびにＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、ＨｏｖｇａａｒｄおよびＦｒｋｊｒ（編）、Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｉｎｃ．、２０００；Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ、ＬａｓｉｃおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ（編）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８；Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｊａｉｎ，Ｈｏｇｒｅｆｅ＆Ｈｕｂｅｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９８；Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ：Ｂａｓｉｃ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｔｏ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、第１５巻、Ｓｅｔｈ，Ｌａｎｄｅｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１９９９；Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｗｕ−ＰｏｎｇおよびＲｏｊａｎａｓａｋｕｌ（編）、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、１９９９；Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ：Ｆｒｏｍ  Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｃｌｉｎｉｃ、第２８巻、Ｄｏｌｅら（編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９９を参照のこと）。組成物、組み合わせまたは薬学的組成物は、経口投与、直腸投与、局所投与、吸入投与、頬（例えば、舌下）投与、非経口（例えば、皮下、筋内、皮内、または静脈内）投与、経皮投与または任意の他の適切な投与経路のために処方され得る。任意の所定の場合において最も適切な経路は、処置される状態の性質および感受性、ならびに使用される特定の組成物、組み合わせまたは薬学的組成物の性質に依存する。例えば、虚血の処置において、動脈遺伝子移入が使用され得る（ＩｓｎｅｒおよびＡｓａｈａｒａ、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、３：ｅ４９−６９（１９９８）。
【００５１】
上記の組成物、組み合わせまたは薬学的組成物の効力および／または毒性はまた、当該分野で公知の方法によって評価され得る（一般には、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇｓ、１５：５−１３（１９９７）を参照のこと）。例えば、標的化合物が、内皮細胞のインビトロの増殖、移動および管形成を阻害する能力に基づく、インビトロの血管新生アッセイが使用され得る。あるいは、インビボの血管新生アッセイ（例えば、ニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）アッセイおよび円板（ｄｉｓｃ）血管新生アッセイ）が使用され得る。好ましくは、インビボの血管新生インヒビターの評価のための確立された臨床前モデル（例えば、角膜血管新生アッセイ、眼血管新生の霊長類モデル、転移モデル、霊長類腫瘍増殖モデルおよび腫瘍増殖のトランスジェニックマウスモデル）が使用され得る。
【００５２】
以下の実施例は、例示目的のみのために含まれ、本発明の範囲を限定する意図はない。
【００５３】
（Ｄ．実施例）
新生血管形成または血管新生は、発生および創傷治癒から炎症および腫瘍形成までの多くの正常なプロセスまたは病原性プロセスの、非常に重要な構成要素である。新血管の発生は、複雑な多段階のプロセスであり、タンパク質分解、移動、増殖から、管腔形成および分化までの、一時的に調節される異なる要素を含む。このカスケードのほぼ全ての要素は、血管細胞の微小環境を構成する細胞外マトリックスによって大きく制御される。
【００５４】
ＥＣＭによって提供される情報信号の一次媒介因子として、血管インテグリンは、最も重要である。実際、インテグリンは、タンパク質分解の調節因子ならびに血管細胞増殖および生存から、運動性および細管形成（ｔｕｂｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）の媒介因子までの、血管新生プロセスの全ての局面に関与している１〜８。インテグリンの中心的役割を考慮すると、インテグリン機能のアンタゴニストが、血管発生を破壊することが直感される。実際、β１−インテグリンおよびビトロネクチンレセプターαｖβ３に対する抗体は、血管新生（ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）および血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）をそれぞれ破壊することが示されている９、１０。しかし、多くのインビトロ研究から、インテグリンアンタゴニストがまた、タンパク質分解１、１１、および細管形成１２を含む血管新生プロセスの要素を増強し得ることもまた明らかである。
【００５５】
血管新生におけるインテグリンスーパーファミリーの重要性は、十分確立されているが、免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）の役割は、あまり明らかではない。実際、ＩｇＳＦメンバーの体液過剰症は、血管細胞において記載されているが、これらの細胞接着分子（ＣＡＭ）の機能的重要性は、主に血管外遊出の相乗作用に関連する。しかし、細胞−細胞接着の媒介因子として、管腔または血管の形成および維持に必要な細胞間相互作用におけるＩｇＳＦメンバーの役割を予測し得る。これに関して、最近の知見は、ホモタイプの上皮細胞相互作用におけるＰＥＣＡＭ−１（ＣＤ３１）の役割を支持しない１３。可溶性ＩｇＳＦメンバーであるＶＣＡＭ−１が実際に血管新生応答を誘導し、そしてこの前血管新生活性が血管α４β１の連結におそらく関連するという最近の知見が、この研究と直接関連する１４、１５。
【００５６】
可溶性ＶＣＡＭ−１が、血管インテグリンとの相互作用を介して新生血管形成を誘導し得るという観察は、いくつかの興味ある問題（これが、このＣＡＭの独自の特性であるか、または他のＩｇＳＦメンバーもまた血管新生前駆性であるか、そして他の血管インテグリンが、このような応答の誘導のための標的リガンドとして働き得るかを含む）を示す。これに関して、本発明者らおよび他者は、最近、神経ＣＡＭ  Ｌ１が、インテグリンと相互作用し得るＩｇＳＦメンバーの別の例であることを報告した１６〜１８。
【００５７】
Ｌ１は、６個の免疫グロブリン様（Ｉｇ様）ドメインと、その後に続く５つのＩＩＩ型フィブロネクチン様（ＦＮ様）反復からなる、マルチドメインの糖タンパク質である１９、２０。１個の膜貫通領域は、この細胞外ドメインを高度に保存された短い細胞質テイルと連結させる１９。重要なことに、ヒトＬ１は、６番目のＩｇ様ドメイン内の１個のＲＧＤインテグリン認識モチーフ２１、および翻訳後の切断を促進するいくつかの推定プロテアーゼ切断部位２２、２３を含む。Ｌ１は、神経起源の細胞（中枢神経系および末梢神経系の有糸分裂後のニューロンを含む）との関連に基づいて、神経細胞接着分子として記載されている２４、２５。しかし、Ｌ１はまた、異なる組織学的起源の広範な種々の腫瘍上２６〜２８、およびリンパ系列または骨髄性単球系列の細胞について記載されてきた。
【００５８】
Ｌ１が、血管インテグリンと相互作用し得１８、そして多くの神経外胚葉腫瘍によって発現および減少される２６という知見に基づいて、本発明者らは、Ｌ１が、血管新生応答を誘導し得るＩｇＳＦメンバーの例であるか否かを決定することを選択した。ニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）モデルを利用して、本発明者らは、Ｌ１の規定された可溶性フラグメントが有意な血管新生応答を誘導し得ることを実証した。この血管新生前駆性フラグメントは、インテグリンαｖβ３およびαｖβ１によって認識されるＲＧＤモチーフを含む１８。重要なことに、本発明者らは、ＲＧＤモチーフを含む短いＬ１ペプチドもまた血管新生応答を誘導することを実証することによって、このモチーフの重要性を確認できる。ＲＧＤモチーフのみが、血管新生応答の誘導に十分であるので、本発明者らは、インテグリン結合の混乱に基づいて、血管新生の誘導についての新規機構を提案する。この概念の支持に加えて、本発明者らはまた、ｂ１−インテグリンサブユニットに対する機能遮断抗体もまた、血管新生を促進し得ることを示した。
【００５９】
（結果）
（可溶性Ｌ１−フラグメントによる血管新生の誘導）
可溶性Ｌ１ポリペプチドが血管新生を誘導できるかどうかを決定するため、本発明者らは全体としてＬ１の細胞外ドメイン全体にわたる３つのＬ１  ＧＳＴ融合タンパク質を試験した。これらの融合タンパク質は、Ｉｇ様ドメイン１−３（Ｉｇ１−３）、Ｉｇ様ドメイン４−６（Ｉｇ４−６）およびフィブロネクチン様ドメイン（ＦＮ１−５）全体からなる（図１ａ）。これらの融合タンパク質の産生および特徴付けは他で詳細に記載されている３０。これらの融合タンパク質の血管新生誘導能力は、方法の節に示したようにニワトリ絨毛尿膜モデルを用いて評価した。
【００６０】
Ｉｇ様ドメイン４〜６（Ｉｇ４−６）を含むフラグメントによる有意な血管新生応答の誘導が最も顕著である（図１ｂおよびｃ）。このような応答は等モル量のＬ１のフィブロネクチン様ドメイン（ＦＮ１−５）では観測されず、免疫グロブリン様ドメイン１〜３（Ｉｇ１−３）は限定的な応答のみを誘導した（図１ｂ）。Ｉｇ４−６によって誘導された応答は、血管新生応答の誘導のために最適な濃度で使用されたｂＦＧＦによって誘導される応答と遜色ない（図１ｂおよびｃ）。Ｉｇ１−３またはＦＮ１−５に対してではなく、Ｉｇ４−６に対する有意な血管新生応答は、融合タンパク質調製物中のＧＳＴまたは微量の内毒素の役割ではないと考えられる。この点に関しては、全ての融合タンパク質は同様の実験条件で産生され、ＣＡＭに用いられる場合、同程度に微量の内毒素を含んでいた（ＦＮ１−５＝０．５４ＥＵ／ｍｌ；Ｉｇ１−３＝０．１２ＥＵ／ｍｌ；Ｉｇ４−６＝０．１５２ＥＵ／ｍｌ）。
【００６１】
（可溶性１５マーＬ１−ＲＧＤペプチドは血管新生の誘導のために十分である）
血管新生誘導性Ｌ１融合タンパク質Ｉｇ４−６の重要な性質は、一つのＲＧＤインテグリン認識モチーフの存在である。本発明者らは、以前にこのモチーフを含むＬ１−フラグメント（Ｉｇ４−６およびＩｇ６）が有意のインテグリン依存性の接着および移動を支持し得ることを示した１６、１８。さらに、本発明者らは、内皮細胞がαｖβ３またはαｖβ１を用いてこのＲＧＤモチーフを認識し得る１６、１８ことを示した。Ｌ１  ＲＧＤモチーフの重要性を評価するために、本発明者らは、Ｌ１配列  ＰＳＩＴＷＲＧＤＧＲＤＬＱＥＬ  に基づいて１５マーのＲＧＤを合成した。
【００６２】
このＬ１−ＲＧＤペプチドもまた、規定された濃度範囲において血管新生誘導性であることが見出されたことが注目される（図２ａおよびｃ）。このＬ１−ＲＧＤペプチドは、高濃度では効果的でないことに注目することは重要である（図２ａ）。ＲＧＤからＲＡＤへの変異を持つさらなる１５マーＬ１ペプチド（例えば、ＰＳＩＴＷＲＡＤＧＲＤＬＱＥＬ）は、等濃度の野生型ペプチドと比べると、有意に低い血管新生誘導性であった（図２ａ）。興味深いことに、この変異体ペプチドは、多少の血管新生活性をなおも示したが、多少のインテグリン結合活性を保持していることが分かった（データは表示していない）。Ｌ１  ＲＧＤペプチドに応答して形成された血管は、ｂＦＧＦに応答して形成された血管に比べて、繊細に形成され、より目立たず、または発達していないことが注目される（図２ｃ）。
【００６３】
可溶性Ｌ１−ＲＧＤペプチドが血管新生を誘導し得るという知見は、インテグリン機能の撹乱に関与する機構を示唆する。もしインテグリン連結の崩壊が原因であるならば、機能遮断抗インテグリン抗体を用いてもまた血管新生を誘導し得るであろう。本発明者らは、可能性のある標的リガンドとしてαｖβ３およびαｖβ１を同定したので、本発明者らは、ニワトリαｖβ３（ＬＭ６０９）またはニワトリβ１−インテグリン（ＣＳＡＴ）に対して反応性の二種の機能遮断抗体を試験した。ニワトリαｖβ１に特異的な抗体は、現時点で存在しない。注目すべきは、αｖβ３−特異抗体に対する応答は観察されなかったが、抗β１抗体は、実際に有意な血管新生応答を誘導したことである（図２ｂおよびｃ）。重大なことには、この抗β１抗体は、高濃度の抗体が効果的でなく、抑制的であるという、Ｌ１−ＲＧＤペプチドと類似した用量応答プロフィールを与えた（図２ｂ）。これらのデータは可溶性Ｌ１−ＲＧＤペプチドまたはＬ１−ＲＧＤフラグメントとβ１−インテグリンの間の相互作用に関連する機構を示唆している。この点に関連して、本発明者らは血管新生前駆体Ｌ１−Ｉｇ４−６フラグメントおよびＬ１−ＲＧＤペプチドの両方が、内皮細胞によって発現されるαｖβ１によって認識されることを観察した１８。これらの知見は血管新生の誘導のための新しい機構を示し、タンパク質分解された細胞外マトリックスに由来するポリペプチドを含む他のインテグリン反応性ポリペプチドによる血管新生の増強を広範に企図する。
【００６４】
（Ｌ１切断産物による血管新生の誘導）
可溶性Ｌ１切断産物は、インビボについて記載されており３１、３２、これは翻訳後のタンパク質分解の結果である可能性が高い２２、２３。インビトロの研究は、トリプシンがインビボで見出されているものとサイズおよび分子の由来が同等であるＬ１フラグメントを産生し得ることを示した２２、２３。これらの発見に基づいて、本発明者らはＬ１の細胞外ドメイン全体（Ｌ１−ＥＣＤ−Ｈｉｓ）からなるＬ１−構築物が穏やかなトリプシン処理の後で、血管新生を誘導し得るかどうかを決定した。Ｌ１−ＥＣＤ−Ｈｉｓ融合タンパク質は、真核細胞においてグリコシル化タンパク質として産生され、細胞培地から１９０ｋＤａの全長産物およびそれより短い１４０ｋＤａのＬ１切断産物（Ｌ１  １４０）として精製された（図３ａ）。穏やかなトリプシン処理の後、Ｌ１−ＥＣＤ−Ｈｉｓ融合タンパク質は、一連の大きなフラグメントに分解された（Ｌ１−１４０、Ｌ１−９５、およびＬ１−５０）（図３ａ）。アミノ末端配列決定により、これらの産物は、第３ＦＮ様ドメインの中央部位（Ｌ１−１４０、Ｌ１−５０）、およびＩｇ様ドメイン６とＦＮ様ドメイン１（Ｌ１−９５）の間の部位における切断の結果であることを確認した（図３ｂ）。重要なことに、インビボにおいて切断産物はＬ１−１４０およびＬ１−５０と等価であることが記載されている３１−３３。３０分間の消化により生じたＬ１−分解産物（Ｆｉｇ．３ａ）を、ＣＡＭモデルにおいて試験し、Ｌ１  Ｉｇ−４−６フラグメントによる本発明者らの観察に基づき、血管新生前駆体であることを見出した（図３ｃ）。最適な活性は１〜０．１ｍｇ／ディスクの範囲内で検出された（図３ｃ）。
（神経外胚葉の腫瘍は可溶性Ｌ１フラグメントの重要な供給源である）
Ｌ１放出の生理学的な背景は血管新生の誘導における潜在的な役割を理解するために重要である。かねてから、種々の黒色腫の細胞株および神経芽細胞腫の細胞株を含む多くの神経外胚葉の腫瘍は、Ｌ１を発現することが報告されてきた２７。このような細胞株がＬ１を分泌するかどうかを決定し、産生された可溶性Ｌ１の量を定量するために、本発明者らはモノクローナル抗体（５Ｇ３）およびアフィニティ−精製された抗Ｌ１ポリクローナル抗体を用いた二抗体ＥＬＩＳＡを構築した。黒色腫細胞株（Ｍ２１）および神経芽細胞腫細胞株（ＳＫ−Ｎ−ＡＳ）の両方による可溶性Ｌ１の産生を、無血清培地において７２時間後に評価した（図４ａ）。５ｘ１０３  Ｍ２１またはＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞はそれぞれ、およそ２０ｎｇおよび５ｎｇの可溶性Ｌ１を産生した（図４ａ）。１〜０．１ｍｇの切断されたＬ１（図３ｃ）の使用はニワトリ絨毛尿膜における応答を誘導するために十分であるので、小腫瘍（＞  ５ｘ１０６細胞）のＬ１−産生は理論上、血管新生応答を促進するために十分であるはずである。
【００６５】
病態生理学的な関連性のさらなる確立のため、本発明者らは血清のＬ１レベルが神経芽細胞腫の患者（Ｉ−ＩＶ段階）において上昇しているかどうかを決定した。有意な可溶性Ｌ１の局所的産生と一致して、本発明者らは大部分のこれらの患者において、顕著な血清Ｌ１レベルの上昇を見出した（図４ｂ）。重要なことには、Ｌ１レベルが７ｎｇ／ｍｌ以上の全ての患者は、第ＩＶ段階の疾患まで進行していた。
【００６６】
（考察）
これまでのところ、神経細胞接着分子Ｌ１に起因する機能は、小脳細胞移動および神経突起束形成のような神経発達過程の増強を含む２４、３４。本研究において本発明者らは、血管新生の増強におけるＬ１の拡大された新規の役割の証拠を示す。これによって、αｖβ３およびαｖβ１の両方と相互作用する可溶性Ｌ１フラグメントが、ニワトリ絨毛尿膜において有意な血管新生応答を誘導することを示した。さらに、ＲＧＤモチーフおよび適当な隣接アミノ酸を含む１５マーＬ１ペプチドもまた有意な血管新生応答を誘導することを実証することによって、本発明者らはこのフラグメントの中の単一のＲＧＤモチーフの重要性を確認し得た。重要なことには、本発明者らは有意の量のＬ１ポリペプチドが神経外胚葉性腫瘍によって産生されることのさらなる証拠を提出する。
【００６７】
血管新生誘導における標的リガンドとしてのαｖβ３またはαｖβ１の役割に関しては重要な機構的な問題点が残っている。αｖβ３の潜在的な役割を考慮すると、このインテグリンは１０日齢のニワトリ胚の休止状態の血管において最小限に発現されているかまたは欠失しているかのいずれかであり、そして新たに形成された新生血管において有意に発現されるのみであることを知る必要がある１０。インテグリンαｖβ１は微細血管内皮細胞において報告されており３５、それゆえより適切な標的であり得る。ニワトリβ１−インテグリンに対して機能遮断するがαｖβ３には作用しない抗体はＬ１−ＲＧＤペプチドと同様の用量応答プロフィールで血管新生を誘導し得るという本発明者らの発見は、αｖβ１の機能的重要性にいくらかの裏付けを追加するものである。
【００６８】
ＲＧＤペプチドが血管新生応答を誘導し得るという新しい発見は、腫瘍またはサイトカインにより誘導される血管新生が、αｖβ３と相互作用する環状ＲＧＤペプチドによって阻害され得る４、１０という知見と折り合いをつける必要がある。本明細書に示したデータに基づいて、Ｌ１  ＲＧＤペプチドは、示される濃度範囲においてのみ血管新生を誘導し、高濃度では効果がないことは明らかである。高濃度のＬ１−ＲＧＤペプチドが、環状ＲＧＤ−ペプチドを用いた先の研究４、１０に記述されるように、阻害的または抗血管新生的になるならば、この用量応答は説明され得る。それゆえ、投与の濃度と頻度に依存して、与えられたＲＧＤ−ペプチドは、アンタゴニストおよびアゴニストの両方として機能し得る。Ｌ１−ＲＧＤペプチドによる血管新生の誘導は、既存の休止血管との初期の相互作用に関与する可能性があるが、高濃度のＲＧＤペプチドの継続的な存在は、血管の発達（内皮細胞の移動を含む）に必要なその後の現象を抑止し得る。
【００６９】
ＲＧＤペプチドの拮抗性効果は直感的に理解されるが、Ｌ１−ＲＧＤペプチドまたはＬ１−ＲＧＤポリペプチドが新生血管形成を誘導する機構は規定される必要がある。おそらく、最も明瞭な説明は、インテグリン連結の撹乱の結果として起こる血管細胞接着力の低下であろう。この点に関しては、ＩｎｇｂｅｒおよびＦｏｌｋｍａｎ３６が、高いレベルでも低いレベルでもない、中間的レベルの接着力が内皮細胞の管形成（ｔｕｂｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）を大いに増強し得る証拠を提出した。この現象はまた、抗インテグリン抗体を用いても示された。このため、Ｇａｍｂｌｅらは１２、抗α２β１および抗αｖβ３抗体がそれぞれコラーゲンおよびフィブリンゲルにおける内皮細胞の管形成を増強し得ることを実証した。これらの筆者らは、この現象が、細胞とマトリックスの間の接着力または機構的な共役の減少、好都合なより運動能力のある表現型の発現、および細胞形態および／もしくはアクチン組織化の変化の次の細胞内シグナル伝達現象の発生、を原因とし得ることを示唆した。抗インテグリン抗体のインビトロの管形成を促進する能力は、抗β１抗体が血管新生を誘導し得る、という本発明者らの発見を考えると特に興味深い。これらの発見もまた、中間的なレベルの接着力を促進するための、完全ではないが、限定的な接着の阻害が血管新生を増強し得る、という概念に裏付けを追加する。
【００７０】
Ｌ１ポリペプチドまたはＬ１−ＲＧＤペプチドが、内皮細胞間、または内皮細胞および内皮下マトリックスとの間の接着力を変える程度についてはなお決定される必要がある。しかしながら、高いモル濃度（２５０ｕＭ）のＬ１−ＲＧＤペプチドは、３０〜４０％のＨＤＭＥＣまたはＥＣＶ３０４  ａｖｂ３（−）のフィブロネクチンに対する細胞接着を抑止する（データは表示していない）。低い血管新生誘導濃度においては（例えば２５ｍＭ）、Ｌ１−ＲＧＤペプチドは過度にフィブロネクチンに対する接着を妨げないが、それでもなお細胞接着の強度またはインテグリン結合のレパートリーへの影響を有し得る。これは確かにαｖβ３およびαｖβ１の両方が、フィブロネクチンをに対する細胞接着または拡散を促進し得る３７−３８、という事実と一致する。
【００７１】
Ｌ１  ＲＧＤペプチドまたはＬ１融合タンパク質による血管新生の誘導は、単一の現象に起因するものではなく、多機能的な現象に起因すると考えられる。それゆえ、血管新生を増強し得る、ＲＧＤ−ペプチドまたはポリペプチドの誘導プロセスの例が多数存在する。例えば、フィブロネクチン由来の可溶性ＲＧＤペプチド（４〜６マー）および可溶性ＲＧＤ−ポリペプチドフラグメント（１２０ｋＤ）の両方が、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ−１、２および−９）の発現を誘導することが示されてきた１１。内皮下の基質の消失は血管新生プロセスにおいて必須の初期現象であることから、これは重要である。ＲＧＤペプチドは、内皮単層または血漿タンパク質に対する血管の透過性を誘導する３９ことが示されてきたことに言及することもまた重要である。これは、血漿タンパク質に対する微小血管の透過性亢進は、血管新生誘導において重要でありそして初期の機構的な構成要素である４０ことが示唆されているため、関連し得る。
【００７２】
ＲＧＤペプチドが、インテグリンの機能を効果的に促進する「アゴニスト」として機能し得る、とする非常に多くの研究が示されている。それゆえ、何人かの研究者は、短いＲＧＤペプチドが、ある種のインテグリンにおいて、他の潜在性の基質結合部位を曝露するコンフォメーション変化を誘導し得ることを示唆している。この点に関して、Ａｇｒｅｚらは４１、四量体のＲＧＤペプチドが、別の潜在性コラーゲンＩ型結合部位を曝露するαｖ−インテグリンのコンフォメーション変化を誘導し得ることを示唆する証拠を示した。注目すべきことに、本発明者らの発見のように、ＲＧＤペプチドの拮抗効果は、より高いペプチド濃度では効果的ではないか、または抑制的であった限られた濃度範囲のみで観察された。重要なことには、この効果もまた、ビトロネクチンのようなＲＧＤ含有糖タンパク質によって生じることが報告されている４１。類似の現象が、血小板と重合化したフィブリンとの間の相互作用において記述されている。それゆえ、血小板ａＩＩｂｂ３とフィブロネクチンａ−鎖のＲＧＤ含有ペプチドの間の相互作用は、フィブリンとの血小板の相互作用を有意に強化し、凝塊張力を増加することが見出されている４２。これはさらに、ＲＧＤ含有リガンドのコンフォメーション変化を誘導し、他の潜在性のリガンド誘導性結合部位（ＬＩＢＳ）を曝露する能力を反映していると考えられている。これらＬＩＢＳの中のあるものは、そのため機能を媒介するようである４３。ＲＧＤペプチドに起因する、他の注目すべき「拮抗的」機能は、これらのインテグリンがリガンド支持接着および病巣との接触点形成物と相互作用できない４４という事実にもかかわらず、αｖβ１とαｖβ３の両方を病巣との接触点に再分配する能力である。接着プラークはシグナル伝達カスケードの重要な部位または開始点４５であるため、このような接着プラークの中へのトランスロケーションは、引き続くシグナル伝達現象のための重要な結果を持つようになることが示唆されている。
【００７３】
血管新生の誘導のためのＲＧＤモチーフの一般的な関連性は未だ確立されていないとはいえ、このモチーフが多くの強力な血管新生因子、（例えば、ウシアンジオゲニンおよびＨＩＶ  Ｔａｔタンパク質）に存在することは注目すべきである。両方の件において、これらの因子はインテグリン依存性内皮細胞接着４６またはチューブロジェネシス４７の支持作用を示した。多くの研究は、ＲＧＤを含むＥＣＭ構成要素の血管新生の調節能力、または誘導能力さえを立証した。例えば、フィブリンは動物モデルにおいて血管新生を誘導すると報告されているが４９、フィブロネクチンはコラーゲンゲルを添加すると、微細血管伸長の促進を示した４８。しかしながら、これらの構成要素が、固相のリガンドではなく、可溶性の作動薬として機能するる範囲は明らかでない。両方の研究において、著者らは初期因子としてのフィブリン分解産物の可溶性フィブロネクチンの潜在的な役割について議論している。次いでこれは、細胞外マトリックスの制御されたタンパク質分解が、ＲＧＤモチーフを含む可溶性分解産物を産生することによって、血管新生を開始できる可能性を高める。次いでこれは、タンパク質分解によって放出されたＬ１  ＲＧＤポリペプチドによる血管新生の誘導という、興味深い類似点を供給する。
【００７４】
Ｌ１放出の生理学的な背景は、血管新生の誘導におけるその潜在的な役割を理解するために不可欠である。本発明者らは、攻撃性神経外胚葉腫瘍の新生血管形成における役割を強く示唆する、有意なレベルの可溶性Ｌ１が黒色腫または神経芽細胞腫の細胞株によって放出される、という証拠を提供した。この点に関して、黒色腫細胞株Ｋ１７３５の攻撃的な転移性改変体において、有意なＬ１の発現が見られる一方で、非転移性Ｋ１７３５細胞においてはＬ１の発現は確認されなかった、というＬｉｎｎｅｍａｎｎら２８の報告は興味深い。本発明者らおよび他のグループが免疫細胞におけるＬ１について記載した最近の報告は、Ｌ１が炎症部位においても放出され得ることを示唆しているので、重要である。これは、可溶性Ｌ１が慢性関節リウマチのような炎症性の障害において、潜在的な血管新生因子として存在し得ることを示唆するため、重要な知見である。最後に、Ｌ１の発現の増加および分泌の増加は神経損傷との関連で報告され５０−５２、神経再生は毛細血管形成の増加および血管透過性の増加の両方と関連する５３点は特に興味深い。
【００７５】
結論として、本発明者らは、可溶性インテグリンアンタゴニストが、単回の低用量の投与において、血管新生応答を誘導し得ることを実証した。この知見に基づいて、本発明者らは、インテグリン結合のわずかな撹乱に基づく、血管新生の誘導ための新しい機構を提案する。本発明者らはさらに、この機構が、種々の血管インテグリンによって認識される１８可溶性Ｌ１の血管新生誘導活性を説明し得ることを提案する。神経外胚葉の腫瘍による可溶性Ｌ１の産生は、腫瘍の新生血管形成との病態生理学的な関連を示唆する。
【００７６】
（方法）
（試薬および抗体）
使用した抗インテグリン抗体として、抗ヒトおよび抗ニワトリαｖβ３  ＭＡｂ  ＬＭ６０９ならびに抗ニワトリ  β１−インテグリン  ＭＡｂ  ＣＳＡＴが挙げられる。ＬＭ６０９およびＣＳＡＴはそれぞれ、Ｄｒ  Ｄ．Ａ．  Ｃｈｅｒｅｓｈ（Ｔｈｅ  Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＣＡ）およびＤｒ  Ｃ．Ｂｕｃｋ（Ｗｉｓｔａｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＰＡ）の厚意により提供された。アフィニティ−精製された抗−ヒトＬ１ポリクローナル抗体および精製されたＬ１融合タンパク質（Ｌ１の細胞外ドメイン全体と６Ｘ  Ｈｉｓタグからなる（Ｌ１−ＥＣＤ−Ｈｉｓ））はＤｒ．  Ｗ．  Ｓｔａｌｌｃｕｐ（Ｂｕｒｎｈａｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｅ、ＣＡ）の厚意により提供された。
【００７７】
（ペプチド）
Ｌ１ペプチドは、Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ  の中で、ＡＢＩ  ４３０Ａ  ペプチド合成機を用いて合成した。ヒトＬ１のなかの一つのＲＧＤ部位を含有する１５マーのペプチド（すなわち、ＰＳＩＴＷＲＧＤＧＲＤＬＱＥＬ）を選択した。コントロールペプチドはアラニンで置換した  ＰＳＩＴＷＲＡＤＧＲＤＬＱＥＬである。固定化のために、これらのペプチドのさらなるバッチを、Ｎ末端システイン残基を用いて合成した。Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡまたはＷａｎｇ樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いてペプチドを調製した。樹脂の脱保護および回収の後、ペプチドを切断用カクテル（２．５％  エタンジチオール、５％  チオアニソール、５％  水、８７．５％  トリフルオロ酢酸）を用いて樹脂から切断し、引き続いて分離用逆相ＨＰＬＣにより精製した。ペプチドはさらに、分析用ＨＰＬＣおよび質量分析により特徴付けを行った。
【００７８】
（Ｌ１融合タンパク質の構築と発現）
本研究に用いたＬ１融合タンパク質の生成と特徴付けは詳細に記載されている３０。要約すると、Ｉｇ様ドメイン１、２および３（Ｉｇ１−３）、Ｉｇ様ドメイン４、５および６（Ｉｇ４−６）、ならびにフィブロネクチンタイプＩＩＩ様リピート（ＦＮ１−５）の５つ全部をコードする３つのｃＤＮＡフラグメントを調製し、ｐＧＥＸ−３ＸのＥｃｏ  ＲＩおよびＢａｍ  ＨＩ部位の間に挿入した。ｃＤＮＡフラグメントＩｇ１−３は、２４位から３５１位のアミノ酸をコードし、ｃＤＮＡフラグメントＩｇ４−６は、３５２位から５９５位のアミノ酸をコードし、そしてｃＤＮＡフラグメントＦＮ１−５は、５９６位から１０９４位のアミノ酸をコードする（アミノ酸番号はＨｌａｖｉｎおよびＬｅｍｍｏｎ、１９９１に基づく）。３つ全てについて、ＧＳＴを、融合タンパク質のアミノ末端に融合した。ＧＳＴ−Ｌ１融合タンパク質を産生するため、形質転換されたＥ．Ｃｏｌｉ．ＪＭ１０１株を１ｍＭイソプロピル  ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することにより誘導し、誘導した細菌は引き続いて溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液、５％グリセロール、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１Ｍ  ＤＴＴ、ｐＨ７．９）の中で再懸濁した。融合タンパク質を、封入体から単離し、記述の通り３０、可溶化およびリフォールディングを行った。すべてのＧＳＴ融合タンパク質を、引き続いてグルタチオン−セファロース４Ｂカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、ＰＢＳを用いて広範に透析した。Ｌ１  ＧＳＴ融合タンパク質Ｉｇ１−３、Ｉｇ４−６、およびＦＮ１−５を、ＺｈａｏおよびＳｉｕ３０によって記述されているようにＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【００７９】
（Ｌ１細胞外ドメインのトリプシン処理）
精製されたＬ１−ＥＣＤ−Ｈｉｓタグ融合タンパク質（７００ｍｌのＰＢＳ中に１ｍｇ／ｍｌ）を、ＰＢＳ中で２５０ｍｌの固定化したトリプシンと混合した。使用したトリプシンは、ウシの膵臓から単離し、そして架橋した４％アガロースビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）上に固定化した。スラリーを、Ｌ１−ＥＣＤ−Ｈｉｓタグ融合タンパク質の添加に先だって、ＰＢＳ中で繰り返し洗浄した。トリプシン化（ｔｒｙｓｉｎｉｚａｔｉｏｎ）を室温で１５−６０分間、固定化トリプシンの除去に先だって行い、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。固定化トリプシンを遠心および濾過により取り除いた。
（血管新生のアッセイ）
血管新生を、広く記載されている、ニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）モデル５４を用いて評価した。手短に言えば、受精齢１０日のＬｅｇｈｏｒｎ鶏卵を、Ｍｃ  Ｉｎｔｙｒｅ  Ｐｏｕｌｔｒｙ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡより購入した。絨毛尿膜を、偽の気嚢（ｆａｌｓｅ  ａｉｒ  ｓａｃ）を作るために殻から取り除き、取り除いた膜のすぐ上の殻に１ｃｍ２の窓を作った。Ｗｈａｔｍａｎ  １  フィルターペーパー（Ｗｈａｔｍａｎ、ＵＫ）を打ち抜いた円形のフィルターディスクを、本明細書に示される濃度のＧＳＴ融合タンパク質、ペプチドまたはｍＡｂｓを含有する、およそ１０ｕｌの繊維芽細胞基本培地（ＦＢＭ；Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で浸した。全てのサンプルについてエンドトキシンによる汚染をＬｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ  ＱＣＣ−１０００によって、製造業者（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＡ）の記載のとおりにアッセイし、有意に汚染した調製物を除外した。浸されたディスクを、高度に血管新生した領域を避けて、曝露した絨毛尿膜上に慎重に設置した。胚は、ディスクの下部および近接部の膜の収集に先だち、引き続いて３７℃、相対湿度６０％のインキュベーター中で７２時間保持した。血管新生を、ディスクのすぐ下の膜領域内の血管の分岐数を計数することにより定量した。計数はＯｌｙｍｐｕｓ  ＳＺＨ１０  研究用立体顕微鏡を用いて行った。血管分岐数は新生血管の数に比例する。動物モデルにおける固有の変動性のために、処理群は最低限６つの胚からなり、二人の異なる研究者により、実験を３回に分けて行った。
【００８０】
（酵素結合免疫吸着検査法）
可動性ファルコン９６ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｏｘｎａｒｄ、ＣＡ）のウェルを、精製された抗Ｌ１  ＭＡｂ  ５Ｇ３  またはコントロールマウスＩｇＧ２ａ抗体（ＵＰＣ１０：Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いて、一晩４℃でコートした。両方の抗体はＰＢＳ中に４ｕｇ／ｍｌとした。処理されたウェルを、０．２％のＴｗｅｅｎ−２０を含む、トリス−生理食塩水緩衝液（１０ｍＭ  トリス、１３８ｍＭ  ＮａＣｌ）で繰り返し洗浄した。非特異的結合部位を、引き続いてＰＢＳ中の５％ＢＳＡを用い、２時間、３７℃でブロックした。異なる濃度に希釈した無血清腫瘍馴化培地を５Ｇ３  ＭａｂまたはＵＰＣ１０抗体処理されたウェルに加えた。Ｍ２１黒色腫細胞またはＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞をＲＰＭＩ−１６４０中１％グルタミンのみの条件で７２時間の培養することにより、腫瘍馴化培地に産生した。細胞を遠心によって取り除き、培地１ｍｌ中の細胞数を決定した。腫瘍馴化培地のサンプルを、０．２％  Ｔｗｅｅｎ−２０および０．１％  ＢＳＡを含有するトリス−生理食塩水希釈用緩衝液（１０ｍＭ  トリス、１３８ｍＭ  ＮａＣｌ）の中に希釈し、ウェルの中に添加し、２時間、室温で保った。さらなる実験として、正常人からの血清サンプルまたは神経芽細胞腫患者（Ｉ−ＩＶ段階）の血清サンプルを、０．２％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中に１：１０に希釈し、これもまた抗体処理されたウェルに添加し、２時間、室温で保った。一連の洗浄の後で、ウェルを、０．２％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するトリス−生理食塩水緩衝液（１０ｍＭ  トリス、１３８ｍＭ  ＮａＣｌ）中に２．５ｕｇ／ｍｌに希釈された、アフィニティー精製された抗Ｌ１ウサギポリクローナル抗体と共に９０分間インキュベートした。結合したウサギ抗体を、トリス−生理食塩水希釈用緩衝液で６０００倍に希釈した、ヒト吸収型（ａｂｓｏｒｂｅｄ）ヤギ抗ウサギＩｇＧ−ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）を用いて検出した。１００ｕｌの０．４ｍｇ／ｍｌのフェニレンジアミン二塩酸塩（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）および０．０５Ｍリン酸−クエン酸（ｃｉｒａｔｅ）緩衝液、ｐＨ５、中の０．０１４％過酸化水素の添加によって色を発色した。プレートは、マイクロプレートリーダー（Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用い、４５０ｎｍで読み取った。Ｌ１の絶対量を、Ｌ１の細胞外ドメイン全体を含む精製されたＬ１−Ｈｉｓ融合タンパク質（２〜１５０ｎｇ／ｍｌ）の添加および滴定から得られた検量線を参照して決定した。
【００８１】
（参考文献）
【００８２】
【表１】
2005508831.tif 000002
2005508831.tif 000003
2005508831.tif 000004
2005508831.tif 000005
いくつかの改変が当業者に明らであり、本発明は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１はＬ１の第４、第５、および第６Ｉｇ様ドメイン（Ｉｇ４−６）を含む可溶性Ｌ１融合タンパク質による血管新生の誘導を示す。ａ．ＧＳＴ融合タンパク質はＬ１の細胞外ドメイン全体を網羅し、免疫グロブリン様ドメイン１〜３（Ｉｇ１−３）、免疫グロブリン様ドメイン４〜６（Ｉｇ４−６）、ならびにＩＩＩ型ＦＮ様ドメイン１〜５（ＦＮ１−５）からなる。ｂ．Ｌ１融合タンパク質（Ｉｇ１−３、Ｉｇ４−６またはＦＮ１−５）を血管新生応答の誘導能力について、ニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）モデルにおいて試験した。フィルターディスクはそれぞれ０．５ｍｇのＩｇ４−６融合タンパク質（１０ｍｌ／ディスク）またはこれと等モルのＩｇ１−３、あるいはＦＮ１−５融合タンパク質を有した。ネガティブコントロール群またはポジティブコントロール群には、それぞれ培地のみまたはｂＦＧＦが染み込んだフィルターディスクを与えた。血管新生を、ディスクのすぐ下の膜領域内の血管の分岐数を計数することにより定量した。培地のみを与えられたコントロール群において計算された血管分岐数を差し引いた。処理群は最低限６つの胚からなり、実験を３回行った。ｃ．Ｌ１  Ｉｇ４−６融合タンパク質による血管新生誘導を実証する絨毛尿膜の写真。ｂＦＧＦまたは培地のみを使用して得られた結果を比較のために示す。緻密で高度に分岐した新生血管は既に存在する大きな血管から区別され得ることが注目される。点線は膜の上に置かれたフィルターディスクの領域を描く。フィルターディスクの下および隣接部の切り出した膜をＯｌｙｍｐｕｓ  ＳＺＨ１０  研究用立体顕微鏡を用い１５倍で撮影した。
【図２】
図２はＬ１−ＲＧＤペプチドおよびβ１インテグリンに対する機能阻害抗体による血管新生の誘導を示す。ａ．ニワトリＣＡＭモデルにおいて、血管新生応答を誘導する能力について、Ｌ１ペプチドＰＳＩＴＷＲＧＤＧＲＤＬＱＥＬまたはその変異体ＰＳＩＴＷＲＡＤＧＲＤＬＱＥＬを試験した。ｂ．ニワトリａｖβ３（ＬＭ６０９）またはニワトリβ１−インテグリン（ＣＳＡＴ）に対する機能阻害抗体もまた試験した。フィルターディスクに、１０ｍｌの培地のみ、または異なった量（０．０１〜５ｍｇ／ディスク）のＬ１ペプチドもしくは抗インテグリン抗体（１〜１０ｍｇ／ディスク）を含む１０ｍｌの培地を染み込ませた。血管新生を、ディスクのすぐ下の膜領域内の血管の分岐数を計数することにより定量した。培地のみを与えられたコントロール群において計算された血管分岐数を差し引いた。ｃ．絨毛尿膜の写真はＬ１−ＲＧＤペプチドおよびＣＳＡＴによる血管新生の誘導を実証する。ＬＭ６０９を用いて得られた結果を比較のために示す。点線は膜の上に置かれたフィルターディスクの領域を描く。フィルターディスクの下および隣接部の切り出した膜をＯｌｙｍｐｕｓ  ＳＺＨ１０  研究用立体顕微鏡を用い１５倍で撮影した。
【図３】
図３はＬ１切断産物による血管新生の誘導を示す。ａ．Ｌ１の細胞外ドメイン全体からなる精製されたグリコシル化Ｌ１−Ｈｉｓ融合タンパク質を、固定化されたトリプシンと共に１５−６０分間インキュベートした。次いで、未処理および消化されたＬ１（トリプシンを含まない）をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（５〜１５％の勾配）によって分析した。ｂ．トリプシン切断部位をアミノ末端配列決定により決定し、これを図示する。ｃ．ＣＡＭモデルにおいて、血管新生応答を誘導する能力について、切断されたＬ１−フラグメントを試験した。ネガティブコントロール群またはポジティブコントロール群には、それぞれトリプシン処理培地のみまたはｂＦＧＦが染み込んだフィルターディスクを与えられた。血管新生を、ディスクのすぐ下の膜領域内の血管の分岐数を計数することにより定量した。
【図４】
図４は有意な量の可溶性Ｌ１を取り除いた黒色腫および神経芽腫を示す。ａ．Ｍ２１黒色腫またはＳＫ−Ｎ−ＡＳ神経芽腫によって７２時間の間に無血清腫瘍馴化培地に分泌された可溶性Ｌ１の量を、抗Ｌ１モノクローナル抗体５Ｇ３およびアフィニティー精製された抗Ｌ１ポリクローナル抗体を用いた２抗体サンドイッチイムノアッセイを用いて定量した。ｂ．正常人の血清中のＬ１のレベル（ｎ＝８）または神経芽腫を持つ患者の血清中のＬ１のレベル（Ｉ−ＩＶ段階、ｎ＝２９）もまた、抗Ｌ１モノクローナル抗体５Ｇ３およびアフィニティー精製された抗Ｌ１ポリクローナル抗体を用いた２抗体サンドイッチイムノアッセイを用いて定量した。Ｌ１の絶対量を、Ｌ１の細胞外ドメイン全体からなる精製されたＬ１から得られた検量線を参照して決定した（データは表示していない）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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