(57)【要約】ＤＮＡ結合タンパク質の検出および測定のための組成物および方法が提供される。組成物および方法は、マルチプレックスまたはアレイ方式において複数のＤＮＡ結合タンパク質の同時またはほぼ同時検出を可能にし、タンパク質、特に転写因子によるＤＮＡ結合活性のプロファイルを作出するために用いることができる。単一試料中の複数のタンパク質ＤＮＡ結合事象は、ハイスループット方式において検出および定量され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質の検出方法であって、
（ａ）  検出デュプレックス（duplex）と、少なくとも一つの配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質を含むと思われる試料とを、該デュプレックスと該ＤＮＡ結合タンパク質との間の配列特異的結合をさせるに十分な時間接触させ、
（ｂ）  工程（ａ）からの混合物と、検出デュプレックスを切断できる切断試薬とを接触させ、ここで検出デュプレックスの切断は該ＤＮＡ結合タンパク質の該デュプレックスへの結合によって阻害され、かつ
（ｃ）  該ＤＮＡ結合タンパク質による該切断の阻害を検出する
ことを含んでなる、方法。
【請求項２】
切断試薬が、配列特異的切断試薬である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
配列特異的切断試薬が、制限エンドヌクレアーゼであり、かつ、検出デュプレックスが、制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
制限エンドヌクレアーゼが、タイプII制限エンドヌクレアーゼであり、かつ、制限エンドヌクレアーゼ認識部位が、タイプII制限エンドヌクレアーゼ認識部位である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
制限エンドヌクレアーゼが、タイプIIs制限エンドヌクレアーゼであり、かつ、制限エンドヌクレアーゼ認識部位が、タイプIIs制限エンドヌクレアーゼ認識部位である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
該ヌクレアーゼが有意なエンドヌクレアーゼ活性を欠くエキソヌクレアーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
検出デュプレックスが、
（ｉ）タグ配列を含む第一のオリゴヌクレオチドと、
（ii）第一のオリゴヌクレオチドと相補的であって、検出可能な標識を含んでなる第二のオリゴヌクレオチドと
を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
検出デュプレックスが、捕捉タグをさらに含んでなる、請求項７に記載の検出法。
【請求項９】
検出デュプレックスが、試料と接触させる前に捕捉タグを介して固体支持体上に固定化される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
検出デュプレックスが、捕捉タグを介して固体支持体上に固定化される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
複数の検出デュプレックスを用い、各検出デュプレックスが固体表面の予め決められた位置でのデュプレックスの捕捉を可能にする捕捉タグを有している、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質の検出方法であって、
（ａ）  少なくとも一つの配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質を含むと思われる試料と、検出デュプレックスとを、該デュプレックスと該結合タンパク質との間の配列特異的結合をさせるに十分な時間接触させ、かつ
（ｂ）  該デュプレックスと該結合タンパク質との間の結合を検出する
ことを含んでなる、方法。
【請求項１３】
工程（ａ）または（ｂ）の前または後で、検出デュプレックスを固体支持体上に固定化する工程をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
固定化がデュプレックス上の捕捉タグを介してなされる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
検出が、検出デュプレックスとの接触前に、該タンパク質試料を検出可能な標識で標識することにより行われる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
検出が、該結合タンパク質を特異的に結合する検出試薬により行われる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
検出試薬が抗体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
該検出デュプレックスが標識され、該固定化工程が結合タンパク質の表面への捕捉により行われる、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質の検出方法であって、
（ａ）  捕捉表面と、少なくとも一つの配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質を含むと思われる試料とを、捕捉表面で該配列特異的結合タンパク質を捕捉させるに十分な時間接触させ、
（ｂ）  該捕捉表面と検出デュプレックスとを接触させ、かつ
（ｃ）  該デュプレックスと該結合タンパク質との間の結合を検出する
ことを含んでなる、方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、転写因子活性をプロファイル解析するための組成物および方法を提供する。特に、本発明は、タンパク質結合部位を含む核酸構成物、ならびにタンパク質そして特に転写因子のこれら構成物中の結合部位への結合を検出および測定するための方法を提供する。
【０００２】
背景および関連技術
真核生物は、組織および器官に組織される特殊化された細胞型で構成されている。細胞型および機能に関係なく、個々の真核生物内の全ての細胞はゲノムと称される同一組の遺伝子を含む。細胞間の差異は、遺伝子の特異的発現から生じる。個々の遺伝子の発現は、プロモーターおよびレプレッサーなどのゲノム中のＤＮＡの調節配列へのタンパク質の結合によって制御される。そのような制御配列へのタンパク質結合は、遺伝子の転写速度の増加または減少を引き起こすことができる。転写因子と呼ばれるこれらＤＮＡ結合タンパク質は、遺伝子転写を調節し、それによって、細胞の再生、発達および分化、環境的刺激への応答、ならびに正常および病的状態における組織ホメオスタシスを含む細胞の必須特性の全てを制御する。転写因子は、転写の開始および持続において酵素ＲＮＡポリメラーゼを促進あるいは阻害することによって遺伝子発現を調節する数百の特殊化されたタンパク質からなる。
【０００３】
調節転写因子の活性化または阻害は、細胞の酸化状態の変化などの混乱またはその細胞表面受容体へのリガンドの結合によって始まるシグナル伝達カスケードにおける下流事象として起きる。細胞表面受容体の場合、リガンド結合事象は、生物学的応答に寄与する複数遺伝子を調節するために広がるシグナル伝達カスケードを誘起することができる。シグナル伝達系間のクロストークもまたよくあり、これは同一のタンパク質キナーゼ、フォスファターゼおよびセカンドメッセンジャー系の多くを利用する異種の刺激による。したがって、生物学的応答の高精巧な調節は、定性的および／または定量的に異なる組の転写因子活性化となる各刺激によって誘起されるキナーゼ、フォスファターゼおよびセカンドメッセンジャーの関わる相互作用するシグナル伝達系網として起きる。ヒトゲノム中には、約４０，０００個の遺伝子のそれぞれ独立した発現を調節する特異性に寄与する転写因子が約１０００個存在すると推測されている。したがって、遺伝子発現の変化によって特徴付けられる生物学的応答は、転写因子活性化の明確な標示と定義され得る。それゆえに、転写因子は遺伝子発現における特異的な個々のまたは総括的変化に影響する標的として重要である。
【０００４】
細胞表面受容体は、薬学研究の主要な焦点であって、治療ターゲットの大部分を構成する。これら受容体をターゲットとする方法は、疾患の治療および延命において成功したが、これら治療の多くは特異性の欠如に問題がある。ほとんどの場合、細胞表面受容体は多機能性である。例えば、一定の受容体は異なる細胞型に存在して、複雑なシグナル伝達カスケード網を活性化して複数の生物学的反応を調節し得る。受容体の多機能的性質のよく特徴付けされた例は、インシュリン受容体である。インシュリン受容体は、多様な組織に広く分布されていて、複数のセカンドメッセンジャー系を活性化して、グルコースホメオスタシスから脂肪分解までに及ぶ代謝的応答、血小板凝集、より最近ではメモリー形成に直接影響する（１−３）。
【０００５】
個々の受容体に関する多機能的役割の結果、今日市場にある多くの薬物は社会および製薬産業に膨大なコストを強いる有害な副作用を有する。可能性のある治療剤への生物学的応答をより明確にして、可能性のある治療ターゲットの性質をより完全に理解する必要性は、比較遺伝子解析のためのＤＮＡマイクロアレイの開発および適用において大いなる関心を駆り立てた。
【０００６】
その関心の結果は、遺伝子チップ技術を用いた多くの進歩および成功をもたらした。ＤＮＡマイクロアレイ上で何万もの遺伝子をスクリーニングすることによって、数百に及ぶ遺伝子からなる遺伝子発現のパターンまたはプロファイルが特定疾患の診断および分類に用いられた（５）。それでもなお、疾患プロセスの理解を深める遺伝子発現のプロファイルを得ることは、疾患の複雑性のために多くの場合で困難であることが証明された。
【０００７】
これらの状況下で、転写因子活性をプロファイリングは、疾患の診断および分類のための代替手段を提供し得る。ｍＲＮＡの遺伝子発現プロファイリングから得られた結果に対して、転写因子活性化における有意な定性的および定量的差異は、感染症、自己免疫病、炎症性疾患、神経系疾患、循環系疾患（１４）、心臓血管系疾患（１５、１７）、肥満（１８）および癌（１５、１６、１９）の発症および進行に関与する疾患関連遺伝子の発現と関連してそれを制御し得ることを示す報告がある。転写因子は、診断的（５）および予後的（６）適用を有することが示され、癌および炎症性疾患（４）への治療的介入のためのターゲットとみなされてきた。残念ながら、転写因子をターゲットとした療法ならびに転写因子に基づく診断的および予後的適用における進歩は、複数転写因子のための多数試料のスクリーニングが障害となってその速度が遅かった。現在、複数転写因子の活性の迅速な包括的プロファイリングに用い得る技術はない。
【０００８】
転写因子のようなＤＮＡ結合タンパク質を検出および測定する従来の方法には、電気泳動シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）（２４）、スーパーシフトＥＭＳＡ（２５）、およびＥＬＩＳＡに基づく技法などがある。ＥＭＳＡすならちゲルシフトアッセイは、転写因子などのＤＮＡ結合タンパク質を検出するための簡単で迅速な方法を提供し、広く用いられてきた。アッセイは、タンパク質とＤＮＡとの複合体は、非変性ポリアクリルアミドゲル中を遊離のＤＮＡ断片または二本鎖オリゴヌクレオチドよりもより遅く移動するという観察に基づく。ＥＭＳＡは、精製したタンパク質またはタンパク質の複合混合物（例えば、核または全細胞の抽出調製物）を想定されるタンパク質結合部位を含む標識されたＤＮＡ断片とともにインキュベートすることによって行なわれる。次いで、反応産生物を非変性ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動することによって分析する。想定される結合部位に関するＤＮＡ結合タンパク質の特異性は、目的タンパク質の結合部位を含むＤＮＡ断片もしくはオリゴヌクレオチドまたは他の非関連ＤＮＡ配列を用いる競合実験によって確立される。ゲルシフトアッセイでは放射性標識したＤＮＡプローブを一般に用いるが、ビオチンまたは蛍光染料などの非放射性標識もまた使用できる。しかしながら、この方法は、同時に多数の試料または複数の転写因子を迅速にスクリーニングするには適さない。
【０００９】
スーパーシフトＥＭＳＡはゲルシフトアッセイを補完するもので、特異的抗体を用いてＤＮＡ結合タンパク質の特異的確認を可能にする。スーパーシフトＥＭＳＡは、精製したタンパク質またはタンパク質の複合混合物（例えば、核または全細胞の抽出調製物）を、想定されるタンパク質結合部位含む標識または非標識のＤＮＡ断片および想定されるタンパク質に対する抗体とともにインキュベートすることによって行なわれる。次いで、反応産生物を非変性ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動によって分析し、ＤＮＡ−タンパク質−抗体複合体を、ＤＮＡ上の標識を検出することによってまたはＤＮＡ−タンパク質−抗体複合体中の抗体を検出ための抗体を用いることによって検出することができる。ここでも、想定される結合部位に関するＤＮＡ結合タンパク質の特異性は、目的タンパク質の結合部位を含むＤＮＡ断片またはオリゴヌクレオチドあるいは他の非関連ＤＮＡ配列を用いる競合実験によって確立される。非変性ゲルで電気泳動に供したときに、ＤＮＡ−タンパク質−抗体の「スーパー複合体」はＤＮＡ−タンパク質複合体よりも移動性が有意に低下する。ゲルシフトおよびスーパーシフトアッセイは基礎研究には有用であるが、行なうべき処理が多量であるために低感度でスループットが極めて低い。加えて、ゲルシフトおよびスーパーシフトアッセイは定量的ではなく、特定のＤＮＡ結合タンパク質の有無が検出できるのみである。
【００１０】
最近、ＥＬＩＳＡ技術が既知のＤＮＡ結合タンパク質の検出に利用できるようになった（２２）。これらＥＬＩＳＡアッセイでは、想定されるタンパク質結合部位を含むＤＮＡ断片を、９６穴ポリスチレンプレートのウェル底などの固相に結合させる。精製したタンパク質またはタンパク質の複合混合物（例えば、核または全細胞の抽出調製物）を含む試料を、想定されるタンパク質結合部位を含む固定化ＤＮＡ断片を含むウェル中でインキュベートする。次いで、ウェルを洗浄して試料の非結合成分を全て除去して、想定される結合タンパク質に特異的な抗体を加える。抗体の結合を、比色、蛍光または化学発光検出を用いる標準ＥＬＩＳＡ技術を用いて達成する。
【００１１】
ＥＬＩＳＡアッセイはゲルシフトアッセイよりも感度が約１０倍高く、ハイスル−プット解析に適用することができる。しかしながら、標的タンパク質結合配列が既知でなくてはならず、結合したタンパク質の検出に抗体が入手されねばならないという重大な不都合を有する。したがって、その使用は既によく特徴づけされた系の研究に限定される。さらに、これらのアッセイは多重化（マルチプレックス）することができず、したがって、ＤＮＡ結合マーカーのパネルを得るに要する試料量は、ＤＮＡタンパク質結合プロファイルを作出するためのこの技術の広範な使用を妨げている。
【００１２】
ゲルシフトとＤＮＡチップ技術との組合せに基づくマルチプレックス転写因子アッセイもまた最近記述されている（２３）。このアッセイでは、核抽出物をビオチン標識した二本鎖オリゴヌクレオチドのプールとともにインキュベートする。タンパク質結合したオリゴヌクレオチドを電気泳動して、ゲルシフトした部分をゲルから切り出してから溶出する。次いで、オリゴヌクレオチドの配列を膜アレイへのハイブリダイゼーションによって決定する。この技術は多重化されて転写因子プロファイルを提供できるが、これには複数のステップが関与し、手で行なうべき多くの操作を要求し、したがって、中または高スループット解析には不適である。
【００１３】
したがって、複数のＤＮＡ結合タンパク質の同時検出をマルチプレックスまたはアレイ方式で可能にし、タンパク質、とくに転写因子によるＤＮＡ結合活性のプロファイルを提供する組成物および方法が切望されることは明らかである。特に、単一試料中の複数タンパク質ＤＮＡ結合事象の検出および測定を可能にするアッセイを開発することが切望される。
【００１４】
したがって本発明は、ＤＮＡ結合タンパク質の特異的検出を可能にする新規の組成物およびアッセイ方法を提供する。特に、本発明は、従来の技術に優る本質的な改善を意味し、それは特異的抗体またはタンパク質結合試薬を必要としない定量的アウトプットを提供する。本発明はさらに、可溶性シグナル伝達分子の放出をもたらさないのでＤＮＡ結合タンパク質の検出を固体または液体アレイ方式において行うことができ、それによって、可溶性シグナルが生じる場合に用い得ないシグナル増幅技術の使用を容易にする。
【発明の概要】
【００１５】
したがって、本発明は、配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質を検出する方法および組成物を提供することを目的とする。  
本発明のさらなる目的は、転写因子などの配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質の複数を同時検出するための方法を提供することである。
【００１６】
本発明のこの目的に従って、配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質の検出方法であって、（ａ）検出デュプレックスと、少なくとも一つの配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質を含むと思われる試料とを、該デュプレックスと該結合タンパク質との間の結合を可能にするに十分な時間接触させ、（ｂ）工程（ａ）からの混合物と検出デュプレックスを切断できる切断試薬とを接触させ、ここで検出デュプレックスの切断が該ＤＮＡ結合タンパク質のデュプレックスへの結合によって阻害され、かつ、（ｃ）ＤＮＡ結合タンパク質による切断阻害を検出することを含んでなる方法が提供される。切断試薬は制限エンドヌクレアーゼなどの配列特異的切断試薬であることができ、検出デュプレックスは制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含んでなることができる。制限エンドヌクレアーゼはタイプIIまたはタイプIIs制限エンドヌクレアーゼであることができ、制限エンドヌクレアーゼ認識部位はそれぞれタイプIIまたはタイプIIs制限エンドヌクレアーゼ認識部位であることができる。切断試薬はまた、有意なエンドヌクレアーゼ活性を欠くエキソヌクレアーゼでもよい。
【００１７】
これらの方法において、検出デュプレックスは、（ｉ）タグ配列を含んでなる第一オリゴヌクレオチドと、（ｉｉ）第一のオリゴヌクレオチドと相補的であって、検出可能な標識を含んでなる、第二のオリゴヌクレオチドとを含んでなることができる。検出デュプレックスは、捕捉タグをさらに含んでもよい。検出デュプレックスは、試料との接触前に捕捉タグを介して固体支持体上に固定化されてもよい。複数の検出デュプレックスを用いることができ、ここで各検出デュプレックスは固体表面の予め決められた位置でのデュプレックスの捕捉を可能にする捕捉タグを備えている。
【００１８】
本発明の他の目的に従って配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質を検出する方法が提供される。この方法は（ａ）少なくとも一つの配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質を含むと思われる試料と検出デュプレックスとを、該デュプレックスと結合タンパク質との間の配列特異的結合を可能にするに十分な時間接触させ、かつ、（ｂ）デュプレックスと結合タンパク質との間の結合を検出することを含んでなる。デュプレックスは、工程（ａ）または（ｂ）の前または後に、固体支持体上に固定化されてもよい。固定化は、デュプレックス上の捕捉タグを介してなされてもよい。検出は、検出デュプレックスに接触させる前にタンパク質試料を検出可能な標識で標識することによって達成できる。検出は、該結合タンパク質に特異的に結合する抗体のような検出試薬を介して達成してもよい。この方法では、検出デュプレックスは標識されてもよく、固定化ステップは結合タンパク質の表面への捕捉を介して達成することができる。
【００１９】
本発明の他の態様によれば、配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質を検出する方法であって、（ａ）捕捉表面と、少なくとも一つの配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質を含むと思われる試料とを、該配列特異的結合タンパク質の捕捉表面での捕捉を可能にするに十分な時間接触させ、（ｂ）捕捉表面と検出デュプレックスとを接触させ、かつ、（ｃ）デュプレックスと結合タンパク質との間の結合を検出することを含んでなる方法が提供される。
【００２０】
ここに記述する発明は、転写因子活性をプロファイルするためのハイスループットマルチプレックスアッセイに関する満足されないニーズを課題とする。本発明は、転写因子活性をプロファイルするための今日用い得る技術をしのぐ有利な技術を提供する。  
本発明のさらなる目的、特徴、局面、使用および利点は、後述する好ましい実施例の詳細な説明から明らかになるであろう。
【発明の具体的説明】
【００２１】
本発明は、試料中の配列特異的核酸結合タンパク質の検出および同定のための方法および組成物を提供する。試料は、そのような結合タンパク質を含むと思われる細胞または組織抽出物などのいかなる試料でもよい。本発明の方法および組成物は、配列特異的様式で核酸に結合しているタンパク質を検出するために使用できる。そのようなタンパク質の例としては真核生物転写因子が含まれるが、これには限定されない。本発明の方法は、迅速で高感度の核酸結合タンパク質のマルチプレックス検出に適している。
【００２２】
方法には、切断ベースのメカニズムまたはタンパク質認識要素ベースのメカニズムのいずれかが関与する。切断ベースのメカニズムにおいて、標識した検出デュプレックスを、デュプレックス内の配列に結合する配列特異的核酸結合タンパク質を含むと思われる試料と接触させる。全ての場合において、検出デュプレックスもまた固体支持体または表面へのデュプレックスの捕捉を可能にする部分を含んでもよい。デュプレックスの捕捉は、試料との混合の前または後で起き得る。この捕捉部の使用によって、試料中の複数結合タンパク質の検出のためのアレイが作出が可能になる。すなわち、これによって方法の「マルチプレックス（多重）化」が可能になる。
【００２３】
試料中のデュプレックスとタンパク質との間の結合に十分な時間の経過後、デュプレックスを切断試薬で処理する。タンパク質がデュプレックスに結合する場合は、切断試薬によるデュプレックスの切断は阻害される。逆に、タンパク質が結合しない場合は、切断が進行し得る。デュプレックスは、初めにデュプレックス上に存在する標識部からのシグナルの変化によって切断の有無が確認できるように標識される。次いで、このシグナルの変化はデュプレックスへのタンパク質結合の有無を示すだけではなく、シグナルの大きさの変化はタンパク質結合量の定量的測定法を提供する。方法は、既知試料を用いて目盛り測定され、結果はまた対照反応と比較することができる。
【００２４】
切断試薬は、一末端からデュプレックスの一方または両方の鎖を切断できるエキソヌクレアーゼなどの非特異性的なものでもよく、あるいはデュプレックスの特異的部位に結合してその部位で切断する（すなわち、タイプII制限エンドヌクレアーゼ）かまたは特異的部位からいくらか離れた一定部位で切断する（すなわち、タイプIIs制限エンドヌクレアーゼ）ような制限エンドヌクレアーゼなどの配列特異的なものでもよい。いずれの場合も、デュプレックスに結合した転写因子などの結合タンパク質の存在は、原子空間的にデュプレックスの切断を阻害する。タンパク質結合の不在は切断を可能にして、この切断によって標識がデュプレックスから遊離される。
【００２５】
タンパク質認識要素ベースのメカニズムを用いる方法では、タンパク質結合タンパク質を含むと思われる試料中のタンパク質は検出デュプレックスとの接触に先立って標識してもよく、その場合は検出デュプレックスへの結合前または後に、結合タンパク質自体は認識要素として機能するか、または結合タンパク質は抗体や他の特異的認識要素などの試薬に特異的に結合する。結合タンパク質が検出デュプレックスとの混合の前に試薬と結合する場合は、結合の検出を促進するためにデュプレックス自体を直接に標識してもよい。標識の検出は、直接観察によってもよく、または二次検出によって促進してもよい。例えば、二次検出は、標識を放出する切断試薬を用いて処理することによって達成され得る。切断は検出デュプレックスが存在する場合にのみ起き得て、それ自体はデュプレックスが特異的結合タンパク質に結合する場合にのみ起き得る。
【００２６】
定義
タンパク質またはＤＮＡ結合タンパク質
ここでいう「タンパク質」および「ＤＮＡ結合タンパク質」とは、一定の核酸配列に特異的に結合し得るペプチド、ポリペプチド、ペプチド含有物質または複合体を意味する。ＤＮＡ結合タンパク質は、二つまたはそれ以上の個々の分子の複合体であってもよい。そのようは複合体は通常、「ホモダイマー」、「ヘテロダイマー」、「ホモ型複合体」および「ヘテロ型複合体」と称される。そのような複合体は共有結合または非共有相互作用によって合体したいくつかの個々の構成要素を含んでなる。ＤＮＡ結合タンパク質は、天然物でも合成物でもよく、特定の形状である必要はない。よく知られたＤＮＡ結合タンパク質の例としては、ＡＰ−１、Ｊｕｍ、Ｆｏｓ、ＣＲＥＢ、ＡＴＦ−１、Ｍｙｃ、Ｍａｘ、ＮＦ−カッパＢ、ＰＰＡＲγおよびＵｂｘが挙げられる。ポリメラーゼ、テロメラーゼ複合体のタンパク質、ジャイレース、およびスプライシングタンパク質などのあらゆる種類の核酸結合タンパク質もまたこの定義に含まれる。
【００２７】
試料
ここでいう「試料」とは、ＤＮＡ結合タンパク質を含むと思われるあらゆる材料、例えば、ヒトおよび動物組織、培養細胞、培養または天然の微生物、体液、血液、血清などを指すが、これらには限定されない。試料は生物学的材料のみを含む必要はない。試料はまた、身体マトリックス上またはその中のＤＮＡ結合タンパク質含有材料から成ってもよい。
【００２８】
検出デュプレックス
ここでいう「検出デュプレックス」（ditection duplex（検出二本鎖ＤＮＡ分子））とは、タンパク質結合部位を含んでなる二本鎖領域を含むＤＮＡ分子を指す。検出デュプレックスは、一部は一本鎖で一部は二本鎖でもよく、ギャップおよびニックを含むことができる。検出デュプレックスは一つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドで構成することができ、ヘアピンループを形成する一つまたはそれ以上の自己ハイブリダイズされた領域を含んでもよい。検出デュプレックスは天然および非天然ヌクレオチドのいかなる組合せを含んでもよく、ヌクレオチド間に非天然結合を含んでもよい。検出デュプレックスは一つまたはそれ以上の検出可能な標識を含むことができる。検出デュプレックスは一つまたはそれ以上の結合部を含んでもよい。検出デュプレックスは、一本鎖または二本鎖ＤＮＡの安定化に影響する一つまたはそれ以上の修飾を含んでもよい。そのような修飾には、逆向き「Ｔ」残基、チオール化残基、ペプチド核酸結合、キメラまたはＲＮＡおよびＤＮＡなどが含まれ得る。検出デュプレックスは支持体上に固定化されてもよく、結合部を介してまたは支持体上の相補的配列への検出デュプレックスの一本鎖部分のハイブリダイゼーションを介して固定化が可能であってもよい。検出デュプレックスはまた、意図的または非意図的ミスマッチを含んでもよい。検出デュプレックスの例を図１に示す。当業者は、本発明において広範囲の適切な検出デュプレックスが使用でき、図１に示された例は本発明の限定を意図するものではないことを認識するであろう。
【００２９】
捕捉タグ
ここでいう「捕捉タグ」（capture tag）とは、デュプレックスを支持体上に捕捉するために用い得る検出デュプレックス内の配列を意味する。
【００３０】
結合部
ここでいう「結合部」とは、ＤＮＡまたはタンパク質などの物質を固体支持体に付するために用い得る化学または生化学的部分を意味する。結合部は、物質と固体支持体との間で非共有結合、可逆的共有結合、または非可逆的共有結合を形成することができる。化学的結合部の例としては、当業者に十分公知の技術を用いて物質を固体支持体に化学的に結合し得るアルデヒド部（ＣＨＯ）およびアミノ部（−ＮＨ２）があげられる。当業者は、他の適切な結合部は当業者に公知であって、本発明に使用し得ることを認識するであろう。生化学的結合部の例としては、ビオチン、ＩｇＧおよびＤＮＡがあげられる。ビオチンで標識された物質は、アビジン被覆した固体支持体と強力な非共有結合を形成する。ＩｇＧはプロテインＧで被覆した固体支持体に結合し、ＤＮＡは相補的ＲＮＡまたはＤＮＡ配列で被覆した固体支持体に結合する。本発明での使用に適する他のそのような結合相互作用は、当業者に公知である。
【００３１】
検出試薬
ここでいう「検出試薬」とは、二次物質に結合して直接または間接的に二次物質の検出を可能にする検出可能な物質を意味する。検出試薬は、標識を含むまたは含まない核酸、タンパク質、ペプチドまたは他の生物分子であることができる。検出試薬の例としては、ペプチド、オリゴヌクレオチド、モノおよびポリクローナル抗体、抗体断片、レクチン、着色料、染料など、およびこれら物質のキメラ型があげられる。直接検出ができない検出試薬は標識を含むか、標識を含む二次検出試薬によって検出することができる。例えば、抗体は標識されたプロテインＧを用いて検出できる。
【００３２】
標識
ここでいう「標識」とは、検出可能なシグナル部分またはレポーターである。本発明では多様な標識またはレポーターが使用できるが、これには放射性同位元素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識および酵素標識などが含まれる。標識は直接または間接的に結合させることができる。標識はまた、抗体やペプチドなどの二次試薬、直接的化学的相互作用および当業者に十分公知の他の方法によって認識され得るハプテンでもよい。標識はまた、当業者に十分公知の方法によるハイブリダイゼーション、重合化、ライゲーションおよび／または増幅によって検出できるオリゴヌクレオチドまたは核酸でもよい。標識を用いてシグナル読み出しの増加または減少を生じさせてもよい。標識はまた、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）と称される現象を利用するために近接して結合する二つの発色団を含んでもよい。適当な波長の光で照射されると、一つに発色団がフォトンを吸収して、励起状態で存在する。発色団と受容体が空間的に相互近接している場合には、励起された発色団からのエネルギーは受容体分子に移動する。このエネルギー移動によって、励起された発色団の光フィトンの形でのエネルギー放出が妨げられ、その結果として発色団の蛍光が抑制される。受容体分子が空間的に十分近接していない場合は、エネルギー移動は起きず、したがって、励起された発色団は蛍光を発し得る。適当な相互作用シグナル部の対は当業者に十分公知である。ルミネッセンス共鳴エネルギー移動（ＬＲＥＴ）と称される同様の現象は、感作されたランタニド金属と受容体染料との間で起き、本発明で使用し得る。さらに、ナノクリスタルのミクロまたはナノトランスポンダーも標識として使用し得る。さらに、検出を促進するために使用し得る他の標識には、化学発光標識、ｃ−ｍｙｃのような免疫親和性タグ、セルロース結合ドメインのような親和性タグ、ストレプトアビジン、ビオチン、ストレプトアビジンまたはマッチングフィットを有する全部または部分マクロ分子、発色、発光、蛍光または他の追跡能を有するレポーター酵素などが含まれる。
【００３３】
支持体
ここでいう「支持体」は、タンパク質、ペプチド、核酸などを付するに適する多孔性または非多孔性の材料またはマトリックスであることができる。タンパク質、ペプチド、核酸などは、当業者に十分公知の技術または技術の組合せによって支持体に共有または非共有結合することができる。本発明の支持体は、ナイロン、ニトロセルロース、ジアゾニトロセルロース、ガラス、シリコン、ポリスチレン、塩化ポリビニール、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、セファロース、寒天、澱粉、または生物分子の固定化が可能な他のいかなる材料から成ってもよい。材料は、フィルター、膜、平坦面、管、導管、ウェル、シート、粒子、ビーズ、マイクロスフェア（微粒子）、カラム、ファイバー（例えば、光ファイバー）などに形成することができる。支持体はまた、１２−ウェル、２４−ウェル、４８−ウェル、９６−ウェル、３８４−ウェル、および１５３７−ウェルプレートのような複数ウェル方式（例えば、マイクロタイタープレート）で構成されてもよい。粒子またはビーズは、ガラス、ラテックス、磁性材料（磁性、常磁性、または超磁性ビーズ）または他の適切な材料で作ることができる。本発明に使い得る支持体の一例は、例えばLuminex Corporation（テキサス州、オースチン）によって製造販売されている色コードされた一組のマイクロスフェアがある。
【００３４】
アレイ
ここで用いる用語「アレイ」とは、支持体上の一定の分子または物質の整然配列を意味し、これには支持体に配列または固定化されたＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質などの生物分子または化学物質が含まれるが、これらには限定されない。オリゴヌクレオチド、プローブ、受容体、抗体などの生物分子または標的と反応する物質のアレイは、バイオテクノロジー産業および関連分野においてますます重要なツールとなってきた。多数の生物分子からなるアレイは、薬物スクリーニング、核酸配列決定、突然変異解析、ゲノムおよびプロテオーム適用などを含む多様な適用での使用が可能である。そのようなアレイは、マイクロプレート、ガラススライド、ビーズ、マイクロスフェア、マイクロ流体デバイスまたは標準ブロッティング用膜上に形成することができ、「アレイ」、マイクロアレイまたはチップと称される。捕捉分子を、共有または非共有的相互作用を介して支持体に結合させてもよい。平らな表面に結合される場合、捕捉分子は、特定の捕捉分子のいずれもがアレイ上のその位置によって確認され得るように整然と結合される。
【００３５】
そのようなアレイは、ガラスまたはプラスチックの顕微鏡スライドのような平らな物体上に構成してもよい。アレイはまた、管またはマイクロプレートウェルの内側表面上に構成することができ、またはマイクロ流体デバイスの導管の内側に構成してもよい。一般に、捕捉分子が結合する個々の部位が認識できる限り、アレイの方式には何ら限定はない。支持体がビーズまたはマイクロスフェアの一組である場合、異なる捕捉分子にカップリングされたビーズまたはマイクロスフェアの一組は、何らかの方法で区別可能でなければならない。一つの態様において、Liminex Corporation（テキサス州オースチン）からのビーズは、１０の異なる濃度の二つの異なる染料を添加することによって、１００の異なる色ビーズで色コード区別されている。捕捉分子は、特定の色ビーズに結合でき、各ビーズの色はフローサイトメトリーで確認される。ビーズアレイは、特定の捕捉分子を特定の色のビーズ組に結合させ、次いで異なる組の色ビーズを混合してアレイを作出することによって調製される。別の態様では、各粒子が固有無線周波数タグを含むPharmaseq（ニュージャージー州プリンストン）からのマイクロ粒子を用いて、特定のマイクロ粒子を確認することができる。
【００３６】
他の方法を用いて、核酸およびペプチドタグのように確認のために個々のビーズをタグ付けをすることができる。アレイは、おおよそ２ないし１００，０００個のエレメント、好ましくは３ないし５０００個のエレメントを含むことができる。一つの態様において、本発明は市販されて入手可能なLuminex LabMAPTM Technologyのようなビーズアレイ方式を用いるが、事実上いかなる型またはアレイベースまたは方式に適用できる。本発明は、単一の反応容器、ウェルまたは管において１００，０００に及ぶ異なる調節タンパク質の活性を定量的および定性的にプロファイルする能力を有するアッセイ系を含んでなる。
【００３７】
捕捉試薬
本発明において「捕捉試薬」とは、一つまたはそれ以上の生物分子を含む溶液からＤＮＡ結合タンパク質または検出デュプレックスを特異的に捕捉するような分子を意味する。捕捉試薬の例としては、ポリおよびモノクローナル抗体ならびに抗体断片があげられる。捕捉試薬は、ハプテンまたは結合部に結合する分子でもよい。特異的ＤＮＡ結合タンパク質への天然親和性を有するタンパク質およびＤＮＡ結合タンパク質に特異的に結合するように作出されたタンパク質もまた、この定義に含まれる。捕捉分子はまた、ＤＮＡ結合タンパク質に結合する他の分子に結合する分子でもよい。例えば、抗ウサギＩｇＧを使ってウサギ抗体−タンパク質複合体を捕捉してもよい。同様に、プロテインＧを使ってヤギ抗体−タンパク質複合体を捕捉してもよい。捕捉試薬および対応する結合部の例を、表１に示す。
【００３８】
【表１】
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【００３９】
捕捉試薬はまた、ＤＮＡ、タンパク質またはＤＮＡ−タンパク質複合体に結合し得る化学物質または染料を含んでもよい。捕捉試薬はまた、生物分子の特異的構造を認識するか特定の修飾を認識できるような試薬を含んでもよい。例えば、フォスフォセリンに対して反応する抗体を捕捉試薬として使用して、露出したフォスフォセリン残基を含むタンパク質を捕捉することができる。さらに、ＳＨ２ドメインを用いて、フォスフォチロシンを含む特定の４アミノ酸モチーフを含むタンパク質を捕捉することができる。
【００４０】
プロファイル
ここでいう「プロファイル」は、生物学的、生化学的または化学的系の二つまたはそれ以上の性質の測定の組合せである。測定は、同時または順に行なわれる。例えば、プロファイルは、試料中の二つまたはそれ以上のタンパク質の濃度で構成されてもよい。プロファイルの他の例は、試料中の二つまたはそれ以上のタンパク質のリン酸化状態である。プロファイルは、定量的または定量的測定から構成されてもよく、客観的データとともに主観的データを含んでもよい。
【００４１】
配列特異的切断試薬
ここでいう「配列特異的切断試薬」（sequence-specific cleavage reagernt）は、特異的ＤＮＡ配列の認識に基づいて特異的部位でＤＮＡを切断することができる試薬である。配列特異的切断試薬の例としては、ＥｃｏＲ１、ＨｉｎｄIIIおよびＢａｍＨＩなどのタイプII制限エンドヌクレアーゼがあげられる。配列特異的切断試薬にはまた、特異的ＤＮＡ配列に結合して酵素結合部位から一定距離のところでＤＮＡを切断するようなタイプIIs（または「ホーミング」）制限エンドヌクレアーゼの種類も含まれる。
【００４２】
外部切断試薬
ここでいう「外部切断試薬」（external cleavage reagent）とは、核酸の一つまたはそれ以上の鎖の消化すなわち切断を核酸の一つまたはそれ以上の末端またはその近傍で開始する試薬を意味する。消化すなわち切断は、開始部位から単一方向に進行する。外部切断試薬には、エキソヌクレアーゼとして通常公知の酵素が含まれる。外部切断試薬の例およびそれらの性質を図２に示す。
【００４３】
プローブ捕捉配列
ここでいう「プローブ捕捉配列」とは、標識または非標識オリゴヌクレオチドまたは核酸プローブを捕捉するのに用い得るＤＮＡの配列を意味する。配列は、一本鎖でも二本鎖でもよい。プローブ捕捉配列は、検出デュプレックスまたはＤＮＡ−タンパク質複合体を捕捉するのに用い得る。
【００４４】
シグナル増幅法
ここでいう「シグナル増幅法」とは、「一標識」検出法を用いて達成され得るシグナルを超えて生物学的分析のシグナルを増強させるために用いられる方法を意味する。シグナル増幅法は、チラミドシグナル増幅法のような酵素触媒されたレポーター付着に基づいてもよく、酵素増幅法に基づいてもよい。代わりに、標識の数を増加させる方法を用いてもよい。そのような方法には、二次検出試薬のための複数の結合部位を含むデンドリマー、分枝ポリマーおよび長直鎖ポリマーの結合が含まれる。これら方法の例としては、オリゴヌクレオチドデンドリマー、分枝ＤＮＡ、およびハイブリド捕捉があげられるが、これらには限定されない。他の増幅法は当業者に公知であって、本発明の状況で使用できる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応のような核酸増幅法およびローリングサークル型増幅法もまた、得られたシグナルの増幅に使用できる。これら方法の多くは核酸検出の感度を上げるために当初は設計されたが、抗体、ペプチド、アビジンまたはストレプトアビジンなどの検出試薬に適当な核酸分子を単に付することによって他の分子の検出にも容易に適用することができる。本発明では、アッセイによって生じたシグナルを増強するためにシグナル増幅法のいずれを用いてもよい。
【００４５】
したがって本発明は、ＤＮＡ結合タンパク質の検出および測定のための組成物および方法を提供する。加えて、本発明は、マルチプレックスまたはアレイ方式における複数のＤＮＡ結合タンパク質の同時またはほぼ同時検出のための組成物および方法を提供し、さらに、タンパク質、特に転写因子によるＤＮＡ結合活性のプロファイルを作出するための組成物および方法を提供する。より具体的には、本発明は、ハイスループット方式において単一試料中の複数のタンパク質ＤＮＡ結合事象を検出および測定するための組成物および方法を提供する。
【００４６】
一つの態様において、本発明は検出デュプレックスへのタンパク質結合を検出する方法を提供するが、ここでは検出デュプレックスへのタンパク質結合は部位特異的切断試薬によるデュプレックスの切断を阻害し、それによってシグナルを増強または消失させる。
【００４７】
本発明のこの態様では、検出デュプレックスは、タンパク質結合部位にタンパク質が結合していなかった場合に部位特異的切断試薬が検出デュプレックスを切断するように、部位特異的切断試薬によって認識されるＤＮＡ配列を含んでなる。しかしながら、タンパク質が検出デュプレックスのタンパク質結合部位に結合していた場合は検出デュプレックスの切断が阻害され、それによってシグナルが増減する。タイプII制限酵素は、検出デュプレックス中のタンパク質結合部位がタイプII制限酵素のための公知の部位を含んでなる場合、またはそれが制限酵素部位に空間的に十分に近くにあって特異的結合タンパク質のタンパク質結合部位への結合が酵素認識部位への制限酵素結合を阻害または防御する場合に、本発明のこの態様において用い得る。例えば、結合部、標識、および結合部と標識との間のタンパク質結合部位を含んでなり、そのタンパク質結合部位が制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含むような検出デュプレックスを用いることができる。検出デュプレックスを試料と接触させて、ＤＮＡ結合タンパク質が存在すれば、それは検出デュプレックスに結合する。タイプII制限エンドヌクレアーゼなどの部位特異的切断試薬を加える。タンパク質がタンパク質結合部位に結合していれば、検出デュプレックスはそのままで残る。タンパク質が検出デュプレックスに結合していなければ、検出デュプレックスは切断されて、その結果、標識から結合部が分離され、標識の検出が妨げられる。本発明のこの態様の例を、図３に示す。
【００４８】
他のタイプの部位特異的切断試薬を本発明のこの態様に用いてもよい。タイプIIs制限エンドヌクレアーゼは特異的ＤＮＡ配列を認識してそれに結合するが、酵素結合部位から離れた一定領域でＤＮＡを切断する。これらの酵素を利用するアッセイは、タンパク質結合部位が部位特異的切断試薬のための認識配列を含む必要がない故に、有利である。むしろ、部位特異的切断試薬のための結合部位を検出デュプレックス内に設計することができる。この例では、部位特異的切断試薬が検出デュプレックスに結合した場合にタンパク質結合部位内またはその近傍でデュプレックスを切断するように、検出デュプレックスは結合部、標識、タンパク質結合部位および部位特異的切断試薬のための結合部位を含んでなる。検出デュプレックスを試料に接触させて、ＤＮＡ−結合タンパク質が存在すれば、それは検出デュプレックスに結合する。タイプII制限エンドヌクレアーゼなどの部位特異的切断試薬を加える。タンパク質がタンパク質結合部位に結合していれば、検出デュプレックスはそのままで残る。タンパク質が検出デュプレックスに結合していなければ、検出デュプレックスは切断されて、その結果として結合部が標識から分離され、標識の検出が妨げられる。本発明のこの態様の例を、図４に示す。標識の検出を促進するために、デュプレックスは支持体上に捕捉されていてもよい。
【００４９】
他の態様において、本発明は検出デュプレックスへのタンパク質結合を検出する方法を提供するが、ここでは、検出デュプレックスへのタンパク質結合は外部切断試薬によるデュプレックスの切断を阻害して、それによってシグナルが増強または低減される。外部切断試薬は、デュプレックス中のＤＮＡ鎖の一つまたはそれ以上の末端で始めて検出デュプレックスの一方または両方の鎖を切断することができる。この態様の一つの型において、検出デュプレックスを支持体上に最初に固定化する。試料を支持体上の検出デュプレックスに接触させて、タンパク質を検出デュプレックスに結合させる。次に、外部切断試薬を支持体上の検出デュプレックスと接触させる。タンパク質が検出デュプレックスに結合していれば、検出デュプレックスはそのタンパク質の存在で防御されているため、外部切断試薬で十分消化され得ない。タンパク質が検出デュプレックスに結合していなければ、外部切断試薬は検出デュプレックスの一方または両方の鎖を消化して、標識は媒体中に放出され、そこで洗い出され得る。タンパク質が検出デュプレックスに結合していれば、標識は支持体に結合したままで残り、検出される。本発明のこの態様の例を、図５に示す。
【００５０】
この態様の他の例を、図６および７に示す。この例では、固定化された検出デュプレックスは、プローブ捕捉配列およびタンパク質結合配列、および固定化されたまたは固定化され得る鎖の５’末端のリン酸基部を含んでなる。検出デュプレックスは、支持体上に固定化されてもよく、有利であれば他のステップで支持体上に捕捉されてもよい。捕捉配列およびタンパク質結合配列は、同一でも異なっていてもよい。アレイ方式では、同一検出試薬を多くの異なる検出デュプレックスとともに使用できるためにプローブ捕捉配列とタンパク質結合配列とが異なることが有利であろう。
【００５１】
この例では、検出デュプレックスをＤＮＡ結合タンパク質を含むと思われる試料と接触させる。タンパク質が存在すれば、それは検出デュプレックスのタンパク質結合部位に結合する。次いで、検出デュプレックスを、５’リン酸化ＤＮＡ鎖を５’から３’方向に消化する外部切断試薬であるラムダエキソヌクレアーゼと接触させる。タンパク質が検出デュプレックスに結合していれば、検出デュプレックスのリン酸化鎖は酵素による切断から防御される。タンパク質が結合していなければ、検出デュプレックスの５’リン酸化鎖は完全に消化される。次いで、検出デュプレックスを熱変性して洗浄して外部切断試薬を不活化して、検出デュプレックスの鎖を分離して、切断産物を除去する。検出デュプレックスがタンパク質結合によって防御された場合は、プローブ捕捉配列を含む鎖は支持体に結合したままで残る。タンパク質が検出デュプレックスに結合せずに消化が阻害されないためにデュプレックスが防御されない場合は、プローブ捕捉配列を含む鎖はもはや支持体上にない。次いで、標識されたオリゴヌクレオチドまたは核酸プローブを加えて、存在すればプローブ捕捉配列にハイブリダイズさせる。シグナルの存在は、結合したタンパク質によって検出デュプレックスが防御されたことを示す（図６）。シグナルの不在は、鎖は外部切断試薬によって消化されてタンパク質結合によって防御されなかったことを示す（図７）。
【００５２】
本発明のさらなる態様は検出デュプレックスへのタンパク質結合を検出する方法を提供するが、ここで、試料中のタンパク質は検出デュプレックスに結合させる前またはその後で標識される。洗浄後、検出デュプレックスに結合していたタンパク質を、検出デュプレックスに結合した標識の存在によって検出する。試料中のタンパク質は当分野で通常用いられる方法によって標識するが、それにはビオチンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどの活性エステル、Ｃｙ３およびＣｙ５などの蛍光染料のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルフヒドリル反応性標識および他の通常用いられる方法が含まれる。本態様の一例では、試料を、蛍光染料Ｃｙ３のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Amersham Biosciences）などのアミン反応性染料で標識する。このプロセスで、試料中のタンパク質の事実上全部あるいはほぼ全部が標識される。次いで、標識された試料を検出デュプレックスと接触させる。検出デュプレックスは支持体上に固定化されていても、溶液中にあってもよい。一定期間インキュベートしてタンパク質を検出デュプレックスのタンパク質結合部位に十分結合させる。検出デュプレックスが溶液中であれば、それは今や支持体上に捕捉されて、未結合の分子は洗い出される。検出デュプレックスに結合したタンパク質は、標識によって検出される。本発明のこの態様の例を図８に示す。
【００５３】
この態様の別の変化例では、二つまたはそれ以上の試料を異なる標識で別々に標識してから混合する。次いで、この混合試料を検出デュプレックスに接触させる。一定期間インキュベートして標識タンパク質を検出デュプレックスに十分結合させる。検出デュプレックスが溶液中であれば、それは今や支持体上に捕捉されて、未結合の分子は洗い出される。検出デュプレックスに結合したタンパク質は、標識の検出によって検出される。二つまたはそれ以上の試料が異なる標識で標識されたことから、各標識は独自に検出測定され、結果は、ＲＮＡ分子を区別標識してＤＮＡマイクロアレイで測定するのと同様にして、二試料中のＤＮＡ結合タンパク質の示差分析として表現される（２７）。
【００５４】
さらにまた別の態様は検出デュプレックスに結合したタンパク質の検出法を提供するが、ここでは、試料中のタンパク質を検出デュプレックスに結合させた後、過剰のタンパク質を洗い出して、次いで、結合したタンパク質を検出試薬で検出する。検出デュプレックスは初めに支持体に捕捉させてもよく、有利であれば他のステップの後に支持体上に捕捉させてもよい。デュプレックス、試料および検出試薬の接触はいかなる順序で行なってもよい。この態様の一つの例では、固定化された検出デュプレックスを、ＤＮＡ結合タンパク質を含むと思われる試料と接触させる。固定化された検出デュプレックスを試料とともにインキュベートして、タンパク質を検出デュプレックスに結合させる。未結合物質を洗い出して、結合したタンパク質を検出試薬で検出する。この実施例を図１０に示す。タンパク質は、単一のタンパク質のみを検出する特異的抗体で検出してもよく、タンパク質の種類または特定タンパク質モチーフを検出する抗体を用いて検出してもよい。例えば、多くのＤＮＡ結合タンパク質はリン酸化したチロシン、スレオニンまたはセリン残基を含み、タンパク質は抗フォスフォチロシン、抗フォスフォセリン、および抗フォスフォスレオニン抗体を用いて検出できる。タンパク質はまた、特定のモチーフに結合する他のタンパク質を用いて検出してもよい。例えば、ＤＮＡ結合タンパク質はＳＨ２ドメインと称されるタンパク質の種類を用いて検出してもよい。ＳＨ２ドメインはフォスフォセリンを含む四アミノ酸モチーフに結合する。結合したタンパク質はまた、化学的または生化学的着色料を用いて検出できる。
【００５５】
本発明のさらなる態様は検出デュプレックスへのタンパク質結合の検出法を提供するが、ここで、標識した検出デュプレックスにタンパク質をまず結合させた後、タンパク質−検出デュプレックス複合体を捕捉試薬を用いて支持体上に捕捉してから検出する。代わりに、捕捉試薬、タンパク質および標識した検出デュプレックスをまず接触させて、次いで支持体上に捕捉させてもよい。一般に、捕捉試薬、試料および標識した検出デュプレックスの添加ならびに支持体上への捕捉は、いかなる順序で行なってもよい。この態様の一つの例では、捕捉試薬を支持体上に固定化する。標識した検出デュプレックスを、ＤＮＡ結合タンパク質を含むと思われる試料に接触させる。試料を検出デュプレックスとともにインキュベートして、あるとすればタンパク質を検出デュプレックスに結合させる。インキュベーションの後、タンパク質−検出デュプレックス複合体を支持体上に捕捉する固定化した捕捉試薬に混合物を接触させて、検出デュプレックス上の標識を検出する。この実施例を図１１に示す。タンパク質が検出デュプレックスに結合しない場合、タンパク質はなお捕捉試薬によって捕捉され得るが、標識が検出デュプレックスに付されているために標識は検出されない。この実施例では、捕捉試薬は支持体上に固定化された特異的ＤＮＡ結合タンパク質に対する抗体でもよい。
【００５６】
図１２に示すこの態様の別の例では、標識した検出デュプレックスを、ＤＮＡ結合タンパク質を含むと思われる試料に接触させる。試料を検出デュプレックスとともにインキュベートして、あるとすればタンパク質を検出デュプレックスに結合させる。インキュベーションの後、タンパク質−検出デュプレックス複合体に結合する一次捕捉試薬と混合物とを接触させる。次いで、一次捕捉試薬−タンパク質−検出デュプレックス複合体を二次捕捉試薬を介して支持体上に捕捉させて、検出デュプレックス上の標識を検出する。この態様において、一次捕捉試薬はＤＮＡ結合タンパク質に特異的な抗体であることができ、支持体上の二次捕捉試薬は一次抗体捕捉試薬を結合できるプロテインＡまたはプロテインＧなどの分子であることができる。
【００５７】
上記した本発明の態様は、アレイ方式における使用に容易に適用可能である。特に、本発明は、支持体上に固定化された二つまたはそれ以上の検出デュプレックスを含んでなる、ＤＮＡ結合タンパク質の検出法を提供する。別の態様では、本発明は、二つまたはそれ以上の検出デュプレックスを用いて複数のＤＮＡ結合タンパク質を検出する方法を提供する。デュプレックスを試料とともに溶液中で混合して、次いでアレイ方式の支持体上に捕捉する。例えば、固有の一本鎖領域を含む検出デュプレックスを、検出デュプレックスの一本鎖領域に相補的なオリゴヌクレオチドのアレイを含んでなる支持体に結合させることができる。さらに、試料との接触前またはその後に、検出デュプレックスをアレイ方式の支持体上に結合部を介して捕捉させてもよい。アレイはまた、ＤＮＡ結合タンパク質−検出デュプレックス複合体の捕捉に用い得る抗体または他の捕捉試薬のアレイを含んでもよい。
【００５８】
ここに記述された発明は、Luminex Corporationによって開発されたＬａｂＭａｐシステムなどのマルチプレックス能を有するフローサイトメトリービーズアレイ上での適用に適している（２８）。ビーズアレイを作るために、ポリスチレンマイクロスフェアを正確な比率の分光的に区別できる二つの蛍光染料を用いて内部染色する。各蛍光色の１０の異なる濃度の一つを用いて各ビーズを染色し、結果として１００の分光的に区別できるマイクロスフェア組からなるビーズアレイが得られる。各マイクロスフェア組は、その分光的アドレス（二つの染料色の比率）によって識別することができ、それらを単一試験に組み合わせることによって、１００に及ぶ異なる分析対象を単一反応器において同時に測定することができる。タンパク質、ペプチド、核酸などの物質を、当業者に十分公知の標準化学を用いてマイクロスフェアにカップリングさせることができる。第三の蛍光染料をレポーター分子にカップリングさせ、マイクロスフェア表面で起きた生物分子相互作用を定量する。マイクロスフェアは急速流動液体流を通るときに二つの別々のレーザーによって個々に調べられる。高速ディジタルシグナルプロセシングによってマイクロスフェアはその分光的アドレスに基づいて類別され、ビーズ表面上のレポーターシグナルが定量される。未結合のレポーターを除去するための洗浄は通常不要であるので、アッセイは本質的に均質となる。一秒間に何千というマイクロスフェアが調べられ、結果として、単一反応器で二、三秒間に１００に及ぶ異なる反応の分析および報告が可能な分析システムが得られる。本発明の態様は、検出デュプレックス、オリゴヌクレオチドまたは捕捉試薬をビーズに結合させることによって、容易にビーズアレイ方式に適用することができる。検出デュプレックスはビーズ上に固定化されてもよく、試料との接触後にビーズ上に捕捉されてもよい。抗体または他の捕捉試薬をビーズ上に固定化するか、試料との接触の後に複合体をビーズ上に捕捉させてもよい。
【００５９】
本発明の方法は、検出感度を上げるために用いられるシグナル増幅法との組み合わせ使用に容易に適応できる。酵素増幅法、ローリングサークル増幅法、リガーゼ連鎖反応、および検出可能なシグナルを増幅できる他の方法は、本発明の範囲に含まれる。
【００６０】
本発明の方法は、種々の疾患、障害または生物学的試料の異常を検出、スクリーニングおよび診断するのに用い得る。本発明の方法はまた、疾患および治療の進行をモニターするためにも使用できる。本発明の方法はまた、試料中のＤＮＡ結合タンパク質の活性または量に影響または変化を及ぼすような化合物または生物学的分子のスクリーニングにも用い得る。本発明はまた、ＤＮＡ結合タンパク質の結合能に及ぼす遺伝的変異の影響を決定するためにも使用し得る。例えば、本発明は、単一または複数のＤＮＡ結合タンパク質の多数の異なるタンパク質結合配列への親和性を同時に測定するために使用できる。
【００６１】
本発明は、細胞ネットワークおよび細胞シグナル伝達経路の解明および理解に用い得る方法を提供する。本発明の方法および組成物によって作出されるＤＮＡ結合タンパク質のプロファイルは、作出されたデータおよびプロファイルを解析するソフトウェアと組み合わせることができる。そのようなソフトウェアは、新生物マーカーの発見、病気の診断および段階判断を促進したり、可能性のある新薬物の効果を予見することができるような、パターン認識およびパターン発見アルゴリズム、教示なしまたは教示付き階層的クラスタリングなどの特性を含む。本発明の方法はまた、タンパク質およびタンパク質結合配列をそれらの機能的および生物学的特性と関連付けるソフトウェアと組み合わせて用いてもよい。そのような特性には、検出されたタンパク質の構造、調節または酵素的機能、タンパク質が寄与する生物学的「目標」、検出されたタンパク質の一つまたはそれ以上の他のタンパク質または遺伝子との機能的関連、タンパク質結合配列の他のタンパク質または核酸配列との機能的関連、検出されたタンパク質の主要な生物学的プロセスおよび生化学的機能との関連などが含まれ得る。
【００６２】
本発明において記述された方法とコンピュータソフトウェアならびにコンピュータおよび実験室ハードウェアとの組み合わせは、本発明に包含される。
【実施例】
【００６３】
例１：  ビーズカップリング
オリゴヌクレオチドを、標準ＥＤＣカルボキシラートカップリングケミストリーを用いてビーズにカップリングさせた。概述すれば、ビーズをＭＥＳ緩衝液ｐＨ４．７中に懸濁させて、オリゴヌクレオチドを最終濃度２μＭになるように加える。新鮮なＥＤＣを加えて最終濃度を１〜２ｍｇ／ｍｌにして、暗所で回転させながらビーズ懸濁液と３０分間反応させる。同様の濃度の新鮮ＥＤＣをビーズ懸濁液に再度加えて、さらに２時間暗所で回転させながら反応させる。カップリングさせたビーズを５０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％ツイーン２０で１回、０．２％ＳＤＳのＰＢＳ溶液で１回、０．０２％ツイーン２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．５）で２回、ＰＢＳ（ｐＨ７．５）で１回洗浄し、ｐＨ  ７．５のＰＢＳに再懸濁させて最終濃度を１０００〜２０００ビーズ／マイクロリットルにする。
【００６４】
例２：  捕捉タグを用いた、検出試薬による検出デュプレックスへのタンパク質結合の検出
オリゴヌクレオチドアニーリング
検出デュプレックスを、タグ配列、ＮＦ−ｋＢ結合部位および５’リン酸基を有するオリゴヌクレオチドＰＯ４Ｋｂｆｏｒ（P04-AGTTGAGGGGATCCCCAGGAGCGGCTTATCGGTCTATTCAACTCCCCTAGGGG）ならびにタグ配列を欠く相補的オリゴヌクレオチドＫＢｒｅｖ（TCCTGGGGATCCCCTCAACT）から組み立てた。
ＰＯ４ＫｂｆｏｒおよびＫＢｒｅｖを、まず１００μＭのオリゴヌクレオチドストックをアニーリング緩衝液（４０ｍＭトリスｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に希釈して２０ｎＭ  ＰＯ４Ｋｂｆｏｒ：１μＭ  ＫＢｒｅｖの比にして、アニーリングした。次いで、１００μｌのオリゴヌクレオチド混合物を９５℃まで１分間加熱して、４５分間かけて直線的に室温まで冷却した。一本鎖タグ配列を示す検出デュプレックスを含むアニーリングした混合物１μｌを、２５０ｎｇのポリｄＩ−ｄＣおよび０．５％ウシ血清アルブミン（フラクションＶ）を含む転写因子結合用緩衝液（１０ｍＭトリスｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２）１９μｌに加えて、種々の量のＮＦ−ｋＢ  Ｐ５０タンパク質とともに室温で１５分間インキュベートした。０．３５％ＢＳＡを含む転写因子結合用緩衝液２５μｌに懸濁させた１８００個のビーズを適切な反応物に加えて、室温で３０分間インキュベートした。ＤＮＡ結合タンパク質−検出デュプレックス複合体のビーズ表面へのハイブリダイゼーションに続いて、０．１μｇのＮＦ−ｋＢ  Ｐ５０特異的一次抗体（Santa Cruz Biotechnolgy、カタログ番号ＳＣ−１１４）を含む転写因子結合用緩衝液２５μｌを検出デュプレックス−試料−ビーズ混合物に加えて、暗所で攪拌しながら室温で２０分間インキュベートした。フィルタープレート（Millipore MABV1250）および真空多岐管を用いて、０．３５％ＢＳＡを含む転写因子結合用緩衝液１００μｌでビーズを１回洗浄した。５０μｌの１：５００希釈のフィコエリスリン標識した抗ウサギ二次抗体（シグマ、カタログ番号Ｐ９５３７）を各分析物に加えた後、暗所で攪拌しながら室温で３０分間インキュベートした。各分析物２５μｌを、Ｌｕｍｉｎｅｘ  １００機器を用いて解析した。この実験からのデータを図１２に示すが、得られたシグナルは検出デュプレックスに加えたＤＮＡ結合タンパク質の量への濃度依存的応答を示す。
【００６５】
例３：  捕捉試薬を用いた、ＤＮＡへのタンパク質結合の検出
２μｇの捕捉試薬（Santa Cruz Biotechnologies、NFKb P65抗体、カタログ番号ＳＣ−３７２）を、組換えプロテインＧ（Upstate Biotechnology）に共有カップリングさせたビーズ支持体とともにインキュベートする。このインキュベーションは暗所で攪拌しながら室温で２時間行なう。次いで、ビーズを３×２００μｌ量の転写因子用緩衝液で洗浄して、プロテインＧビーズ表面に結合しなかった抗体を除去する。２００ｆｍｏｌｅのビオチン−ＨＰＮＦＫＢ６５ヘアピン検出デュプレックス：
【化１】
2005521411.tif 000003
を、対照およびＴＮＦアルファ刺激されたＨｅＬａ細胞から得られた核抽出物２μｇとともに、１μｇポリｄＩ−ｄＣおよび０．５％ウシ血清アルブミン（フラクションＶ）を含む２０μｌの転写因子結合用緩衝液（１０ｍＭトリスｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中で室温で１０分間インキュベートする。試料を検出デュプレックスとともにインキュベートした後、捕捉試薬に結合した１０００個のプロテインＧビーズを含む転写因子結合用緩衝液２５μｌを各分析物に加えてから室温で３０分間インキュベートする。次いで、ビーズを２×２００μｌ量の転写因子用緩衝液で洗浄して、ビーズ表面に捕捉されなかったヘアピンオリゴヌクレオチドを除去する。次いで、各分析物を１００μｌのストレプトアビジン−フィコエリスリン（ＳＡ−ＰＥ）抱合体に再懸濁（転写因子結合用緩衝液中に２μｇ／ｍｌ）させて、室温で１０分間インキュベートしてから、Ｌｕｍｉｎｅｘ  １００機器を用いて分析する。
【００６６】
ＴＮＦ刺激された抽出物は、検出に用いるヘアピンオリゴヌクレオチドと複合体を形成する活性ＮＦ−ｋＢ  Ｐ６５タンパク質を含む。ＮＦ−ｋＢ  Ｐ６５−ヘアピンオリゴヌクレオチドはビーズ表面に固定化された抗Ｐ６５抗体によって捕捉され、ビーズ表面に結合したＮＦ−ｋＢ  Ｐ６５−ビオチン化ＤＮＡ複合体はＳＡ−ＰＥを用いて検出される。
【００６７】
例４：  部位特異的切断の阻害を用いた、ＤＮＡへのタンパク質結合の検出
本実施例では、クラスII制限エンドヌクレアーゼを、ビーズにカップリングしたヘアピンオリゴヌクレオチドを含んでなる検出デュプレックスとともに用いる。クラスII制限酵素は、ＤＮＡを認識してそれに結合する同一部位で二本鎖ＤＮＡを切断する。
【００６８】
重複する転写因子（ＮＦ−ｋＢ）および制限酵素（ＥｃｏＲＩ）結合部位を表すヘアピンオリゴヌクレオチド（KBREHPビオチン−TCCAAGGGGATTCCCCAGTG−アミノC-6-TACTGGGGAATCCCCTTGGA）を、既述したように標準ＥＤＣケミストリーを用いてアミノ−Ｃ６を介してビーズ表面にカップリングさせる。約１０００個のカップリングされたビーズを、２５μｌの分析物当たりに用いる。ＫＢＲＥＨＰカップリングしたビーズを、２μｇの核抽出物（対照およびＴＮＦ処理されたＨｅＬａ細胞から得られる）とともに、１００ｎｇのポリｄＩ−ｄＣおよび０．３５％ウシ血清アルブミン（フラクションＶ）を含む２５μｌ量の転写因子結合用緩衝液（１０ｍＭトリスｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中で室温で１０分間インキュベートする。結合の後、反応物を転写因子結合用緩衝液で５０μｌにして、１Ｍ  ＭｇＣｌ２を加えて最終濃度１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２にした。次いで、試料を１０μの制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩとともに３７℃で１０分間インキュベートする。５０μｌの２μｇ／ｍｌのストレプトアビジン−フィコエリスリン（ＳＡ−ＰＥ）を各反応物に加えて、Ｌｕｍｉｎｅｘ  １００機器を用いての分析の前に室温で１０分間インキュベートする。活性ＮＦ−ｋＢ  Ｐ５０はＤＮＡに結合し、ＥｃｏＲＩエンドヌクレアーゼによる消化が妨げられる。ＮＦ−ｋＢは、ビーズ表面に保持されたシグナル測定値として定量される。
【００６９】
例５：  クラスIIs制限エンドヌクレアーゼによる部位特異的切断の阻害を用いた、ＤＮＡへのタンパク質結合の検出
検出デュプレックスを、ＮＦ−ｋＢ結合部位、Ｆｏｋ１結合部位およびタグ配列を含んでなるＦＯＲと称されるオリゴヌクレオチド（ビオチン−AAGGATGAGCGGGGGATCCCAATAGGCGGCTGCTTATCGGTCTAT）をＦＯＲオリゴヌクレオチドに相補的であるが相補的タグ配列を欠くｂＲＥＢと称されるオリゴヌクレオチド（CTATTGGGATCCCCGCTCATCCTT）にハイブリダイズさせることによって組み立てた。
オリゴヌクレオチド対のハイブリダイゼーションは次のようにして行なった。ｂＲＥＶおよびＦＯＲを、４０ｍＭトリスｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む緩衝液中でそれぞれ１μＭおよび４０ｎＭに希釈した。次いで、オリゴヌクレオチドを９５℃で１分間加熱して、４５分間かけて室温まで冷却した。
【００７０】
転写因子の結合は、１μｌのハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを組換えＮＦ−ｋＢ  Ｐ５０転写因子（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号）とともに、１００ｎｇのポリｄＩ−ｄＣおよび０．３５％ウシ血清アルブミン（フラクションＶ）を含む全量１５μｌの結合用緩衝液（１０ｍＭトリスｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中でインキュベートすることによって行なった。室温で１０分間インキュベートした後、各分析物をＦｏＫＩ（４ユニット）１μｌまたはＦｏｋＩ保存用緩衝液１μｌを含む２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２に増補した結合用緩衝液１５μｌと混合して、３７℃でさらに１０分間インキュベートした。一本鎖捕捉オリゴヌクレオチド（ATAGACCGATAAGCAGCCGC）をカップリングしたＬｕｍｉｎｅｘビーズ（１０００ビーズ）を含む転写因子結合用緩衝液３０μｌを各分析物に加えて、消化されたおよび消化されない検出デュプレックスをビーズ表面に固定化するために３０分間インキュベートした。ビーズ表面に結合したビオチン化オリゴヌクレオチドを可視化するために、Ｌｕｍｉｎｅｘ  １００機器を用いる解析の１０分前に６０μｌの２μｇ／ｍｌのストレプトアビジン−フィコエリスリン（ＳＡ−ＰＥ）を各反応に加えた。活性ＮＦ−ｋＢ  Ｐ５０はＤＮＡに結合し、ＦｏｋＩタイプIIs制限エンドヌクレアーゼによる消化を妨げる。ＮＦ−ｋＢは、保持されたシグナルの測定値として定量される。
【００７１】
例６：  外部切断試薬の阻害による、ＤＮＡへのタンパク質結合の検出
ラムダエキソヌクレアーゼは、５’リン酸基を有する二本鎖ＤＮＡに高度に特異的で、リン酸化されていないＤＮＡ上で著しく低い活性を有する。ＤＮＡのラムダエキソヌクレアーゼ消化は５’から３’の方向で起きる。
タグ配列、ＮＦ−ｋＢ結合部位および５’リン酸基を含むオリゴヌクレオチドＰＯ４Ｋｂｆｏｒ（P04-AGTTGAGGGGATCCCCAGGAGCGGCTTATCGGTCTATTCAACTCCCCTAGGGG）を、捕捉タグ配列を欠くビオチン化した相補的オリゴヌクレオチドであるビオチンＫＢｒｅｖ（TCCTGGGGATCCCCTCAACT−ビオチン）にアニーリングさせた。
アニーリングは、まず１００μＭのオリゴヌクレオチドストックをアニーリング緩衝液（４０ｍＭトリスｐＨ  ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に希釈して、４００ｎＭ  ＰＯ４Ｋｂｆｏｒ：１０μＭビオチンＫＢｒｅｖの比にした。次いで、オリゴヌクレオチド混合物を９５℃で１分間加熱して、４５分間かけて室温まで冷却して、一本鎖タグ配列を表す二本鎖対を形成した。タグ捕捉配列にカップリングした約５０，０００個のビーズを、５０μｌのアニーリングしたオリゴヌクレオチドと室温で１時間ハイブリダイズさせた。次いで、ビーズを洗浄してハイブリダイズしなかったオリゴヌクレオチドを除去して、転写因子結合用緩衝液中に再懸濁した。
【００７２】
Ｐ５０転写因子へのＤＮＡ結合を、０．５ゲルシフトユニットの組換えＰ５０（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ３７７０）（従来のゲルシフトアッセイ−プロメガを用いて二本鎖ＮＦ−ｋＢ結合オリゴヌクレオチドの１９０ｆｍｏｌｅをシフトするに要するＰ５０の量として定義される）を１０００個のハイブリダイズされたビーズとともに、１００ｎｇのポリｄＩ−ｄＣおよび０．３５％ウシ血清アルブミン（フラクションＶ）を含む２０μｌ量の転写因子結合用緩衝液（１０ｍＭトリスｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中でインキュベートすることによって行なった。室温で１０分間インキュベートした後、２０μｌの３ユニットのラムダエキソヌクレアーゼを含む３ｍＭ  ＭｇＣｌ２に増補した転写因子結合用緩衝液または同等のラムダエキソヌクレアーゼ保存緩衝液を適当な反応物に加えて、３７℃で１５分間インキュベートした。酵素消化の後、Ｌｕｍｉｎｅｘ  １００機器を用いての解析の１０分前に４０μｌの４μｌ／ｍｌのストレプトアビジン−ＰＥ抱合体のＰＢＳ（ｐＨ＝７．５）溶液を試料に加えた。この実験の結果を図１３に示すが、これは加えたＤＮＡ結合タンパク質量を用いて得られたシグナルの用量応答を示す。
【００７３】
例７：  外部切断試薬の阻害および標識されたオリゴヌクレオチドプローブによる、ＤＮＡへのタンパク質結合の検出
転写因子結合配列およびプローブ−捕捉配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドＰＯ４Ｐ５０（5'P04AGTTGAGGGGATCCCCAAGGGCGAAGGAACTCGACGTGGAGCCGTTTTT−アミノＣ６）を、既述したようにアミノ−Ｃ６を介してビーズにカップリングさせる。オリゴヌクレオチドＰＯ４Ｐ５０ｒｅｖをＰＯ４Ｐ５０にカップリングしたビーズ（１ｐｍｏｌｅ／１０００ビーズ）を、転写因子結合用緩衝液（１０ｍＭトリスｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中で１時間ハイブリダイズさせる。次いで、ビーズを洗浄して、転写因子結合用緩衝液中に１０００ビーズ／μｌの濃度で再懸濁させる。次いで、結合反応を、０．３５％ＢＳＡおよび０．１〜２μｇのポリｄＩ−ｄＣを含む２０μｌ量の転写因子結合用緩衝液中で１０００個のビーズを試料と室温で１０分間インキュベートすることによって行なう。結合反応の後、２０μｌの３ユニットのラムダエキソヌクレアーゼを含む３ｍＭ  ＭｇＣｌ２に増補した転写因子結合用緩衝液または同等のラムダエキソヌクレアーゼ保存緩衝液を適当な反応物に加えて、３７℃で１５分間インキュベートする。次いで、１ｐｍｏｌｅのビオチン標識した一本鎖プローブＤＮＡを各反応物に加えて、９５℃で１分間加熱し、続いて室温になるまで３０分間にわたって冷却することによってビーズとハイブリダイズさせる。プローブのビーズカップリングしたＤＮＡとのハイブリダイゼーションの後、真空およびフィルタープレートを用いて２×１００μｌ量のＰＢＳ  ｐＨ７．５で分析物を洗浄する。ビーズを１００μｌの２μｇ／ｍｌのＳＡ−ＰＥのＰＢＳ（ｐＨ７．５）溶液中に再懸濁させる。室温で１０分間インキュベートした後、Ｌｕｍｉｎｅｘ  １００機器を用いて分析物を解析する。
【００７４】
例８：  タンパク質の直接標識による、ＤＮＡへのタンパク質結合の検出
対照細胞抽出物１０μｇおよび１０ゲルシフトユニットの組換えＮＦ−ｋＢＰ５０でスパイクされたＨｅＬａ細胞抽出物１０μｇを、別々に標識用緩衝液（ＰＢＳ  ｐＨ８．０）２０μｌに懸濁させる。０．５ｍｇの水溶性型Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド−ビオチン（ＮＨＳ−ビオチン）を各標識反応物に加える。ボルテックス混合し、室温で２時間インキュベートする。３０μｌの転写因子結合用緩衝液（１０ｍＭトリスｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を各標識反応物に加えて、取り込まれなかったＮＨＳ−ビオチンをＧ−２５スピンカラム上で脱塩することによって除去する。１ゲルシフトユニットの脱塩された標識された試料を、ＮＦ−ｋＢ  Ｐ５０結合部位を有するヘアピン検出分子にカップリングしたビーズとともにインキュベートする。このインキュベーションは、１００ｎｇのポリｄＩ−ｄＣおよび０．３５％ＢＳＡフラクションＶを含む転写因子結合用緩衝液の全量２０μｌ中で行なう。室温で１０分間インキュベートした後、８０μｌの２μｌ／ｍｌのストレプトアビジン−フィコエリスリンの転写因子結合用緩衝液溶液を加え、１０分間インキュベートして、Ｌｕｍｉｎｅｘ  １００機器を用いて解析する。組換えＮＦ−ｋＢ  Ｐ５０でスパイクされた標識ＨｅＬａ細胞抽出物とともにインキュベートしたビーズは、組換えＮＦ−ｋＢ  Ｐ５０でスパイクされなかった標識ＨｅＬａ細胞核抽出物に較べて、それら表面に連なる有意なフィコエリスリンシグナルを有する。
【００７５】
参考文献
【表２】
2005521411.tif 000004
【００７６】
当業者は、格別な実験法を用いることなく、ここに記載した本発明の具体的態様と同等の多くを認識し、または確認できるであろう。そのような同等態様は、以下のクレームによって包含されることを意図する。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】検出デュプレックスの例を示す。全ての検出デュプレックスはタンパク質結合配列を含む。検出デュプレックスは、完全な二本鎖でも、一部が一本鎖で一部が二本鎖でもよく、ギャップおよびニックを含んでもよい。検出デュプレックスは、一つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドで構成され、ヘアピンループを形成する一つまたはそれ以上の自己ハイブリッド領域を含んでもよい。検出デュプレックスは、天然と非天然ヌクレオチドとの組合せを含んでもよく、ヌクレオチド間に非天然連結を含んでもよい。検出デュプレックスは、一つまたはそれ以上の検出可能な標識および一つまたはそれ以上の結合部を含むことができる。検出デュプレックスは、支持体上に固定化されてもよく、あるいは結合部を介してまたは検出デュプレックスの一本鎖部分の支持体上の相補配列へのハイブリダイゼーションを介して固定化され得てもよい。検出デュプレックスはまた、意図的または非意図的ミスマッチを含んでもよい。検出デュプレックスは、ペプチド、炭水化物などの他の構成要素を含んでもよい。
【図２】外部切断試薬の性質を示す。この図は、本発明のいくつかの外部切断試薬の性質を要約する。極性は消化の方向を表す。基質は一本鎖（ＳＳ）または二本鎖（ＤＳ）ＤＮＡに関する酵素の選択を表す。構造は、各酵素と適合する特定の核酸構造を意味する。すなわち、「５’ＰＯ４」は酵素活性に５’リン酸基を要するかどうかを示し、「５’ｅｘｔ」は酵素が５’伸長を有するＤＮＡを消化するかどうかを示し、「３’ｅｘｔ」は酵素が３’伸長を有するＤＮＡを切断するかどうかを示し、「ブラント（平滑）」は酵素が平滑末端ＤＮＡ断片で活性を有するかどうかを示し、「ニック」は二本鎖ＤＮＡ中のニックを開始部として消化するかどうかを示す。
【図３】部位特異的切断試薬、特にタイプII制限エンドヌクレアーゼによる切断からの防御によるタンパク質結合の検出を説明する。この実施例において、検出デュプレックスはタンパク質結合配列中に制限エンドヌクレアーゼの切断部位を含む。ＤＮＡ結合タンパク質を含むと思われる試料をデュプレックスと混合して、ＤＮＡ結合タンパク質が存在する場合はそれはタンパク質結合配列に結合する。続いて、制限エンドヌクレアーゼを加える。タンパク質がタンパク質結合配列に結合していた場合は、制限エンドヌクレアーゼは二本鎖ＤＮＡを切断することができず、標識が検出される（図３Ａ）。タンパク質がタンパク質結合配列に結合していなかった場合は、制限エンドヌクレアーゼはＤＮＡを切断して検出可能な標識を放出し、それは洗い出されて検出されない（図３Ｂ）。
【図４】部位特異的切断試薬、特に酵素結合部位から一定距離の位置でＤＮＡを切断するタイプIIs制限エンドヌクレアーゼによる消化からの防御による、タンパク質結合の検出を説明する。この実施例において、検出デュプレックスはタンパク質結合配列の外側にホーミング制限エンドヌクレアーゼの結合部位を含む。ＤＮＡ結合タンパク質を含むと思われる試料をデュプレックスと混合して、ＤＮＡ結合タンパク質が存在する場合はそれはタンパク質結合配列に結合する。続いて、タイプIIs制限エンドヌクレアーゼを反応系に加える。タイプIIs制限エンドヌクレアーゼはデュプレックス中のその特異的結合部位に結合し、タンパク質結合配列内のＤＮＡ鎖を切断しようとする。タンパク質がタンパク質結合配列に結合していた場合は、ホーミング制限エンドヌクレアーゼは二本鎖ＤＮＡを切断することができず、標識が検出される（図４Ａ）。タンパク質がタンパク質結合配列に結合していなかった場合は、タイプIIs制限エンドヌクレアーゼはＤＮＡを切断して検出可能な標識を放出し、それは洗い出されて検出されない（図４Ｂ）。
【図５】検出デュプレックスの外部切断試薬による消化からの防御による、ＤＮＡへのタンパク質結合の検出を説明する。この実施例では、検出デュプレックスは支持体に結合している。二本鎖ＤＮＡ配列の平滑末端は、Ｔ７エキソヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼIIIなどの平滑末端特異的エキソヌクレアーゼの基質である。検出可能な標識は、検出デュプレックスの支持体とタンパク質結合配列との間に付されている。ＤＮＡ結合タンパク質を含むと思われる試料をデュプレックスと混合して、ＤＮＡ結合タンパク質が存在する場合はそれはタンパク質結合配列に結合する。続いて、平滑末端エキソヌクレアーゼを加える。タンパク質がタンパク質結合配列に結合していなかった場合は、エキソヌクレアーゼはＤＮＡを支持体方向に自由に消化することができる。この段階で、検出可能な標識は放出されて、検出されない（図５Ｂ）。タンパク質がタンパク質結合配列に結合していた場合は、エキソヌクレアーゼは結合部位を超えて検出デュプレックスを消化することができない。したがって、標識は検出デュプレックスと支持体に付されたままで、検出が可能である（図５Ａ）。
【図６】プローブ捕捉配列の防御とそれに続いての検出可能なプローブとのハイブリダイゼーションを介するプローブ捕捉配列の検出による、検出デュプレックスへのタンパク質結合の検出を説明する。この実施例では、検出デュプレックスは支持体に結合されている。ＤＮＡの第一鎖は、３’末端で支持体と共有結合しており、５’末端でリン酸基で標識されている。第二ＤＮＡ鎖は第一ＤＮＡ鎖にハイブリダイゼーションによって結合している。検出デュプレックスは、タンパク質結合配列およびプローブ捕捉配列を含み、このプローブ捕捉配列は支持体とタンパク質結合配列との間にある。プローブ捕捉配列は標識されたオリゴヌクレオチドまたは核酸プローブと相補的であるように設計されている。ＤＮＡを試料と混合して、タンパク質が存在すればタンパク質結合配列に結合する。続いて、ラムダエキソヌクレアーゼを反応系に加える。ラムダエキソヌクレアーゼは、リン酸化された５’末端からのみＤＮＡ鎖を特異的に消化する。タンパク質がタンパク質結合部位に結合していた場合は、ＤＮＡ鎖はラムダエキソヌクレアーゼ消化から防御される（図６）。次に、反応混合物を熱変性させてから洗浄する。熱変性および洗浄はラムダエキソヌクレアーゼを不活性化して除去し、タンパク質をＤＮＡ結合配列から分離し、ＤＮＡ鎖を分離し、これら全ては洗い出される。プローブ捕捉配列を含む第一ＤＮＡ鎖は、支持体に結合したままである。標識されたオリゴヌクレオチドまたは核酸はこのプローブ配列とハイブリダイズして、この鎖の存在を検出する。代わりに、タンパク質結合配列もまたプローブ捕捉配列として用い得る。しかしながら、別のプローブ捕捉配列を用いる様式は全てのタンパク質結合配列が異なってもいずれのプローブ配列も同じになるように設計できるが、そのような方式はマルチプレックス方式において各タンパク質捕捉配列に関して異なる標識オリゴヌクレオチドを要求する。  いずれのタンパク質もタンパク質結合配列に結合しなかった場合（図７）、ラムダエキソヌクレアーゼは第一ＤＮＡ鎖を支持体に至るまで消化し、第一鎖とハイブリダイズしていた第二ＤＮＡ鎖はそれとハイブリダイズする相補鎖がもはや存在しないので放出される。混合物が熱変性されて洗浄されるとき、第二ＤＮＡ鎖および消化された第一鎖はともに洗い出され、標識されたオリゴヌクレオチドまたは核酸が結合するものは何も残らない。したがって、標識は検出されない。
【図７】プローブ捕捉配列の防御とそれに続いての検出可能なプローブとのハイブリダイゼーションを介するプローブ捕捉配列の検出による、検出デュプレックスへのタンパク質結合の検出を説明する。この実施例では、検出デュプレックスは支持体に結合されている。ＤＮＡの第一鎖は、３’末端で支持体と共有結合しており、５’末端でリン酸基で標識されている。第二ＤＮＡ鎖は第一ＤＮＡ鎖にハイブリダイゼーションによって結合している。検出デュプレックスは、タンパク質結合配列およびプローブ捕捉配列を含み、このプローブ捕捉配列は支持体とタンパク質結合配列との間にある。プローブ捕捉配列は標識されたオリゴヌクレオチドまたは核酸プローブと相補的であるように設計されている。ＤＮＡを試料と混合して、タンパク質が存在すればタンパク質結合配列に結合する。続いて、ラムダエキソヌクレアーゼを反応系に加える。ラムダエキソヌクレアーゼは、リン酸化された５’末端からのみＤＮＡ鎖を特異的に消化する。タンパク質がタンパク質結合部位に結合していた場合は、ＤＮＡ鎖はラムダエキソヌクレアーゼ消化から防御される（図６）。次に、反応混合物を熱変性させてから洗浄する。熱変性および洗浄はラムダエキソヌクレアーゼを不活性化して除去し、タンパク質をＤＮＡ結合配列から分離し、ＤＮＡ鎖を分離し、これら全ては洗い出される。プローブ捕捉配列を含む第一ＤＮＡ鎖は、支持体に結合したままである。標識されたオリゴヌクレオチドまたは核酸はこのプローブ配列とハイブリダイズして、この鎖の存在を検出する。代わりに、タンパク質結合配列もまたプローブ捕捉配列として用い得る。しかしながら、別のプローブ捕捉配列を用いる様式は全てのタンパク質結合配列が異なってもいずれのプローブ配列も同じになるように設計できるが、そのような方式はマルチプレックス方式において各タンパク質捕捉配列に関して異なる標識オリゴヌクレオチドを要求する。  いずれのタンパク質もタンパク質結合配列に結合しなかった場合（図７）、ラムダエキソヌクレアーゼは第一ＤＮＡ鎖を支持体に至るまで消化し、第一鎖とハイブリダイズしていた第二ＤＮＡ鎖はそれとハイブリダイズする相補鎖がもはや存在しないので放出される。混合物が熱変性されて洗浄されるとき、第二ＤＮＡ鎖および消化された第一鎖はともに洗い出され、標識されたオリゴヌクレオチドまたは核酸が結合するものは何も残らない。したがって、標識は検出されない。
【図８】標識されたタンパク質の検出デュプレックスへの結合による、ＤＮＡへのタンパク質結合の検出を説明する。この実施例では、試料の構成成分をビオチンのＮ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体またはＣｙ３あるいはＣｙ５（Amersham Biosciences）のような蛍光染料などの反応性標識部で標識する。標識の後、標識されたタンパク質を支持体上の検出デュプレックスと接触させる。未結合物を洗い出した後、検出デュプレックス上のタンパク質結合配列に結合したタンパク質を今や支持体に結合している標識を介して検出する。代わりに、標識したタンパク質を溶液中の検出デュプレックスと接触させて、次いで検出デュプレックスを支持体上に捕捉することもできる。
【図９】検出デュプレックスに結合したタンパク質を検出する検出試薬の使用による、検出デュプレックスへのタンパク質結合の検出を説明する。この実施例では、試料を固定化された検出デュプレックスと直接反応させて、タンパク質をタンパク質結合配列に結合させる。次いで、結合したタンパク質を、例えば、特異的タンパク質に対する抗体。一般クラスのタンパク質に対する抗体、フォスフォチロシンなどの特異的生化学モチーフに対する抗体、または多数のタンパク質、クラスまたはモチーフに対する抗体の混合物などを含む検出試薬を用いて検出する。代わりに、結合したタンパク質は、ＤＮＡに結合したタンパク質に結合する、ＳＨ２ドメインとして知られるタンパク質などの他の生化学物または他の組換えもしくは合成タンパク質アミノ酸を用いて検出することもできる。あるいは、化学着色剤をＤＮＡに結合したタンパク質の検出に用いることができる。そのような着色剤は、ある型のタンパク質に結合した場合に変色したり、ある型のタンパク質への着色剤の結合が非蛍光状態から蛍光状態への変化を誘導することができる（例えば、ＰｉｅｒｃｅからのＰｈｏｓＰｈｏＱタンパク質着色剤はリン酸化されたタンパク質のみを着色する）。
【図１０】検出デュプレックスへのタンパク質結合の、捕捉試薬による検出を説明する。この実施例では、標識した検出デュプレックスを試料に加えて、タンパク質を検出デュプレックスに結合させる。次いで、タンパク質−デュプレックス複合体を、その表面に捕捉試薬を構成するように修飾した支持体上に捕捉させる。複合体が捕捉された後に、検出デュプレックス上の標識を検出する。この方式では、例えば、捕捉試薬はタンパク質に特異的な抗体でもよい。
【図１１】検出デュプレックスへのタンパク質結合の、捕捉試薬による検出を説明する。この実施例では、標識された検出デュプレックスを試料に加えて、タンパク質を検出デュプレックスに結合させる。次いで、タンパク質−デュプレックス複合体のタンパク質部分と結合する第一捕捉試薬を加える。次いでこれら第一捕捉試薬−タンパク質−デュプレックス複合体は、第二捕捉試薬を表面に構成するように修飾した支持体上に捕捉される。複合体が捕捉された後に、検出デュプレックス上の標識を検出する。この方式では、例えば、第一捕捉試薬としてはタンパク質に特異的なヤギポリクローナル抗体を用いることができ、第二捕捉試薬としてはプロテインＧのような抗体特異的試薬を用いることができる。
【図１２】検出試薬を用いた、検出デュプレックスへのタンパク質結合の検出を証明する実験結果を示す。捕捉タグを含む検出デュプレックスは、二つのオリゴヌクレオチドをアニーリングして作出した。このようにして形成した検出デュプレックスは、ＮＦ−ｋＢ  ｐ５０結合部位および捕捉タグ配列を含んだ。検出デュプレックスを一連の濃度のＮＦ−ｋＢ  ｐ５０タンパク質とともにインキュベートして、次いで捕捉タグとビーズに結合した相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによってビーズ上に捕捉した。結合したタンパク質を、ＮＦ−ｋＢ  ｐ５０タンパク質に対するウサギ抗体、続いてフィコエリスリン標識した抗ウサギ抗体を用いて検出した。ビーズ上の蛍光シグナルをＬｕｍｉｎｅｘ  １００フローサイトメターで測定した。
【図１３】クラスIIs制限酵素Ｆｏｋ  Ｉによる消化からの検出デュプレックスの防御による、ＮＦ−ｋＢ  ｐ５０  ＤＮＡ結合タンパク質の検出を示す。この実施例では、捕捉タグ、標識、タンパク質結合部位およびＦｏｋ  Ｉ結合部位を含んでなる検出デュプレックスを用いた。検出デュプレックスは、Ｆｏｋ  Ｉがｐ５０結合部位内のＤＮＡを切断するように、Ｆｏｋ  Ｉ結合部位およびＮＦ−ｋＢ  ｐ５０結合部位を含んだ。デュプレックスがＦｏｋ  Ｉによって切断された場合にビオチン標識が放出されるように、ビオチン標識を検出デュプレックス中に合成した。検出デュプレックスを、ＮＦ−ｋＢタンパク質の存在下および非存在下でインキュベートした。Ｆｏｋ  Ｉ酵素を加えて、インキュベートした。次いで、検出デュプレックスを、捕捉タグとビーズに結合した相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによってビーズ上に捕捉した。ビオチン標識をストレプトアビジン−フィコエリスリン抱合体を用いて検出した。ｐ５０タンパク質とともにインキュベートした試料は実質的シグナルを示し、ｐ５０タンパク質なしの試料はシグナルをほとんど示さなかったが、これはｐ５０タンパク質の結合がデュプレックスをＦｏｋ  Ｉ酵素による消化から防御したことを示す。
【図１４】検出デュプレックスをラムダエキソヌクレアーゼによる消化から防御することによる、ＮＦ−ｋＢ  ｐ５０タンパク質の検出を示す。この実施例では、検出デュプレックスは、タンパク質結合配列、ビオチン標識、およびポリスチレンビーズとカップリングしたＤＮＡ鎖の一つの５’末端の５’リン酸基部分を含んでなる。カップリングの後、ビーズとカップリングした検出デュプレックスを、ＮＦ−ｋＢ  ｐ５０タンパク質の存在下および非存在下でインキュベートした。続いて、ラムダエキソヌクレアーゼを加えてインキュベートして、５’リン酸基で標識したＤＮＡ鎖を十分な時間で酵素で消化した。消化に続いて、ストレプトアビジン−フィコエリスリン抱合体を加えて、ビーズとカップリングした検出デュプレックス上に残っているビオチン標識を検出した。ｐ５０タンパク質が存在しない場合は検出は完全に消化消失したが、ｐ５０が存在する場合は約３６００蛍光ユニットのシグナルが測定され、これはｐ５０が検出デュプレックス上のラムダエキソヌクレアーゼの活性を阻害するその活性によって検出できることを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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