(57)【要約】第１及び第２配列を有し、第１配列にＭＨＣクラスII分子との結合能を有するポリペプチド及びノッチシグナル伝達経路の調節因子を有するポリペプチドが含まれる共役体。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１配列及び第２配列からなる複合体であって、該第１配列は輸送タンパク質又は輸送タンパク質をコードするポリヌクレオチドからなり、該第２配列はノッチシグナル伝達調節のためのポリペプチド又はポリヌクレオチドからなることを特徴とする、複合体。
【請求項２】
融合タンパク質の形態であることを特徴とする請求項１記載の複合体。
【請求項３】
第２配列が、ノッチシグナル伝達トランスダクションのためのポリペプチド又はポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項１又は２記載の複合体。
【請求項４】
第２配列が、ノッチ又はノッチのシグナル伝達トランスダクション能を保持するその断片、又はノッチのシグナル伝達トランスダクション能を有するノッチのアナログ、又はそれをコードするポリヌクレオチド配列であることを特徴とする請求項３記載の複合体。
【請求項５】
第２配列が、ノッチ細胞内ドメイン（ノッチＩＣ）又はそれをコードするポリヌクレオチド配列であることを特徴とする請求項４記載の複合体。
【請求項６】
第２配列が、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド配列であることを特徴とする請求項４記載の複合体。
【請求項７】
第２配列が、ＥＢＮＡ２、ＢＡＲＦ０若しくはＬＭＰ２Ａ、又はそれらをコードするポリヌクレオチド配列であることを特徴とする請求項６記載の複合体。
【請求項８】
第２配列が、ノッチシグナル伝達活性化のためのポリペプチド又はポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項１又は２記載の複合体。
【請求項９】
第２配列が、ノッチシグナル伝達リプレッサーのドミナントネガティブバージョン、又はノッチシグナル伝達リプレッサーのドミナントネガティブバージョンをコードするポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項８記載の複合体。
【請求項１０】
第２配列が、ノッチシグナル伝達リプレッサーの発現又は活性を阻害するポリペプチド若しくはポリヌクレオチド、又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項８記載の複合体。
【請求項１１】
第２配列が、核中で作用する作用剤又は該作用剤をコードするポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項１又は２記載の複合体。
【請求項１２】
第２配列が、ノッチシグナル伝達転写因子又はノッチシグナル伝達転写因子をコードするポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項１又は２記載の複合体。
【請求項１３】
第２配列が、ＤＮＡ結合剤又はＤＮＡ結合剤をコードするポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項１又は２記載の複合体。
【請求項１４】
第２配列が、ノッチアンキリンドメイン又はノッチアンキリンドメインをコードするポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか記載の複合体。
【請求項１５】
第２配列が、さらにＲＡＭドメイン、ＰＥＳＴ配列若しくはＯＰＡ配列、又は該配列をコードするポリヌクレオチドからなることを特徴とする請求項１４記載の複合体。
【請求項１６】
第２配列が、ノッチシグナル伝達阻害のためのポリペプチド又はポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項１又は２記載の複合体。
【請求項１７】
第２配列が、ノッチシグナル伝達の活性化因子若しくはトランスデューサーのドミナントネガティブバージョン、又はノッチシグナル伝達の活性化因子若しくはトランスデューサーのドミナントネガティブバージョンをコードするポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項１６記載の複合体。
【請求項１８】
第２配列が、ノッチシグナル伝達の活性化因子若しくはトランスデューサーの発現又は活性を阻害するポリペプチド又はポリヌクレオチド、又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項１６記載の複合体。
【請求項１９】
第２配列が、ノッチの発現又は活性をダウンレギュレートすることができるポリペプチド、ノッチシグナル伝達経路のノッチリガンド若しくは下流コンポーネント、又はそれらをコードするポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項１６記載の複合体。
【請求項２０】
第２配列が、Ｔｏｌｌ様受容体、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＢＭＰ受容体、アクチビン、並びにそれらの誘導体、断片、変異体及び相同体、又はそれらをコードするポリヌクレオチドから選択されることを特徴とする請求項１９記載の複合体。
【請求項２１】
第１配列が、核移行タンパク質であることを特徴とする請求項１〜２０のいずれか記載の複合体。
【請求項２２】
第１配列が、ヘルペスウイルスＶＰ２２タンパク質（ＶＰ２２）又はＶＰ２２輸送機能を保持する、その断片であることを特徴とする、請求項１〜２１のいずれか記載の複合体。
【請求項２３】
第１配列が、完全長ＶＰ２２配列であることを特徴とする請求項２２記載の複合体。
【請求項２４】
ＶＰ２２の断片が、完全長ＶＰ２２配列の約アミノ酸６０〜約アミノ酸３０１、又は完全長ＶＰ２２配列の約アミノ酸１５９〜約アミノ酸３０１からなることを特徴とする請求項２２記載の複合体。
【請求項２５】
第１配列が、ホメオドメイン又は輸送機能を保持する、その変異体からなることを特徴とする請求項１〜２０のいずれか記載の複合体。
【請求項２６】
ホメオドメインが、アンテナペディア、フシタラズ又はエングレイルド由来であることを特徴とする請求項２５記載の複合体。
【請求項２７】
第１配列が、ＨＩＶｔａｔタンパク質又は輸送機能を保持する、その変異体であることを特徴とする請求項１〜２０のいずれか記載の複合体。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれか記載の複合体をコードする、ポリヌクレオチド配列。
【請求項２９】
請求項２８記載のポリヌクレオチド配列からなる発現ベクター。
【請求項３０】
請求項２９記載の発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞。
【請求項３１】
複合体の発現を可能にする条件下で請求項３０記載の宿主細胞を培養することからなる、複合体の調製方法。
【請求項３２】
請求項３１記載の方法により調製された複合体。
【請求項３３】
細胞を、請求項１〜２７又は３２のいずれか記載の融合タンパク質に曝露することからなる、ノッチシグナル伝達調節のためのタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド配列を細胞内に輸送する方法。
【請求項３４】
請求項１〜２７又は３２のいずれか記載の複合体、及び医薬的に許容可能な賦形剤、希釈剤又は担体からなることを特徴とする医薬組成物。
【請求項３５】
Ｔ細胞仲介疾患の治療に用いるための、請求項３４記載の医薬組成物。
【請求項３６】
疾患又は感染の予防及び／又は治療のための薬物の調製における請求項１〜２７又は３２のいずれか記載の複合体の使用。
【請求項３７】
疾患が、Ｔ細胞仲介疾患であることを特徴とする請求項３６記載の使用。
【請求項３８】
添付図面を参照して実質的に請求項１〜３７に記載のとおりの複合体、ポリヌクレオチド配列、発現ベクター、宿主細胞、方法、医薬組成物又は使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＴ細胞シグナル伝達を調節するタンパク質を標的とすることによりＴ細胞活性を調節する分子及び方法に関し、特にノッチシグナル伝達調節に関わるタンパク質に関するが、これに限定されるものではない。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類免疫系が正常に機能するためには、自己抗原に対する免疫寛容が重要である。胸腺における自己反応性Ｔ細胞の欠失に加え、調節性Ｔ細胞を介する活性抑制が、末梢での寛容を維持する上での重要な機構として近年同定されている（ＷＯ９８／２０１４２）。多発性硬化症、関節リウマチ、糖尿病等の自己免疫疾患では寛容の正常な調節が損なわれる。自己免疫疾患においては寛容を再樹立する改良療法が望まれる。アレルギー症状や個人ドナーからの臓器又は組織移植においてもまた、かかる外来抗原や外来抗原プロフィールに寛容を誘導することが望ましい。
【０００３】
他のＴ細胞に抗原特異的寛容を伝達し得る調節性Ｔ細胞のクラスを創出できることが近年示され、この方法は感染性寛容と呼ばれる（ＷＯ９８／２０１４２）。これらの細胞の機能的活性は、その細胞表面又は抗原提示細胞表面においてノッチリガンドタンパク質を過剰発現させることにより模倣できる。具体的には、調節性Ｔ細胞はノッチリガンドタンパク質のデルタ（Delta）又はセラート（Serrate）ファミリーのメンバーを過剰発現させることにより創出できる。デルタ又はセラートに誘導され、ある抗原エピトープに特異的なＴ細胞は、同じ若しくは関連する抗原上の他のエピトープを認識するＴ細胞に寛容を伝達することもでき、この現象を「エピトープの拡散」という（Hoyne et al）。
【０００４】
さらにＷＯ００／３６０８９には、アレルゲン又は抗原に対し寛容を示すリンパ球又は抗原提示細胞（ＡＰＣ）の作製法が収載されており、この方法はヒト患者又は罹患動物から得たリンパ球又はＡＰＣを、（ｉ）リンパ球及び／又はＡＰＣにおいて内因性ノッチ又はノッチリガンドの発現をアップレギュレーションできる組成物と、或いは（ii）アレルゲン又は抗原と、共インキュベーションすることからなる方法である。
【０００５】
ノッチリガンドの発現は癌においても役割を担っている。実際、腫瘍細胞の中にはノッチリガンド発現のアップレギュレーションが認められるものがある。かような腫瘍細胞は、特異的抗原による再刺激に対しＴ細胞を不応答にすることができるが、それにより腫瘍細胞が如何にして正常Ｔ細胞の応答を阻止するかが説明できる。Ｔ細胞におけるインビボでのノッチシグナル伝達をダウンレギュレーションさせることにより、腫瘍細胞が腫瘍特異的抗原を認識するＴ細胞に免疫寛容を誘発することを回避できる可能性がある。逆に、Ｔ細胞が腫瘍細胞に免疫応答を引き起こすことが可能となる（ＷＯ００／１３５９９０）。
【０００６】
本発明者らによるＰＣＴ公開公報ＷＯ９８／２０１４２、ＷＯ００／３６０８９、ＷＯ０１３５９９０にノッチシグナル伝達経路及びそれに影響を受ける疾患に関する記載がある。ＰＣＴ／ＧＢ９７／０３０５８（ＷＯ９８／２０１４２）、ＰＣＴ／ＧＢ９９／０４２３３（ＷＯ００／３６０８９）、ＰＣＴ／ＧＢ００／０４３９１（ＷＯ０１３５９９０）のテキストを参考のため本明細書に添付する。
【０００７】
しかしながら、Ｔ細胞に介在される疾患や障害の検出、予防及び治療に有用な、さらなる診断又は治療用組成物を提供することが当技術分野で依然として要求されている。
【発明の開示】
【０００８】
本発明は、効果的なノッチシグナルをＴ細胞に直接送達することにより、上述の諸問題を検討するものである。より具体的に本発明は、ノッチリガンド等のＴ細胞シグナル伝達のモジュレーターを抗原提示細胞（ＡＰＣ）に送達するという構想に関する。本発明に開示する標的アプローチでは、例えばノッチシグナル伝達経路のモジュレーターに結合するスーパー抗原における主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスII結合モチーフを用いる。スーパー抗原は、ＭＨＣクラスII分子とＴ細胞受容体サブセットの両方に結合するので、効果的にＡＰＣｓをＴ細胞に交叉結合させて細胞をポリクローン的に活性化させる。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）とＭＨＣクラスIIを結合させる分子の分子領域は、これまでに構造的に定義され、かかる分子の異なる領域であることが示されている。ＭＨＣクラスII結合ドメインとノッチシグナル伝達経路モジュレーターを併用することにより、送達部位におけるノッチシグナル伝達経路モジュレーターのＡＰＣｓに対する活性に焦点をあてることができる。さらに上記ドメインは、Ｔ細胞を活性化するＴ細胞受容体を見つけることができないため毒性活性をもたない。
【０００９】
本発明の特徴の１つは、第１及び第２配列を有する共役体（conjugate）において、第１配列に抗原提示細胞（ＡＰＣ）との結合能を有するポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチドが含まれ、第２配列にＴ細胞シグナル伝達経路の調節能を有するポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチドが含まれることを特徴とする共役体に関する。
【００１０】
ＡＰＣへの結合能を有する配列のことを便宜上、標的配列、標的分子又は標的タンパク質と記す場合がある。
【００１１】
従って本発明は、Ｔ細胞シグナル伝達調節に関与する少なくとも一つのタンパク質に結合する少なくとも一つの標的タンパク質、又は遺伝子融合若しくは化学結合によって形成される上記Ｔ細胞のリガンドタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む分子である共役体に関する。本発明において「結合する」なる用語は、第２配列が第１配列によって標的細胞であるＡＰＣへと導入されることが可能な形で第１及び第２配列が関連していることを意味する。従って共役体には、上記タンパク質、直接合成したタンパク質、及び事前形成された配列が交叉結合作用因子によって関連している結合タンパク質をコードするＤＮＡ分子を遺伝子発現させることにより、ポリペプチドバックボーンを介して、Ｔ細胞シグナル伝達調節に関与するタンパク質に標的タンパク質が結合している融合タンパク質が含まれる。本発明において上記「結合する」なる用語はまた、Ｔ細胞シグナル伝達調節に関与するタンパク質と標的タンパク質との凝集などの会合が含まれる。第２配列に関する一実施態様によれば、例えば核酸結合ドメインなどのポリヌクレオチド配列が含まれてもよい。かかる実施態様はタンパク質／核酸複合体として示される。
本発明においてＡＰＣとは、ＭＨＣクラスII分子を発現させ、ＣＤ４+Ｔ細胞に抗原を提示することができる細胞のことである。ＡＰＣｓの例としては、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞、ランゲルハンス細胞や、ＭＨＣクラスII分子の発現能をもつ細胞型であればいずれも抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）として機能し、これらは全て本発明に含まれる。
【００１２】
第２配列は第１配列と同種由来であってよいが、本発明の共役体にあっては、自然状態のものとは異なる様態又は異種由来のものとして存在している。
【００１３】
本発明の共役体はＡＰＣｓ集団による結合や捕獲が可能であるため、ＡＰＣが提示する先であるＴ細胞内で、結合した第２ポリペプチド配列に相当するエフェクター機能が発揮される。
【００１４】
本発明の第２配列は、Ｔ細胞シグナル伝達調節に関与するタンパク質である。Ｔ細胞シグナル伝達調節には、アップストリーム及びダウンストリ−ムイベントを含むＴ細胞シグナル経路での伝達、活性化若しくは阻害が含まれる。
ここにおいて、「調節する（modulate）」なる用語は、Ｔ細胞シグナル伝達経路又はその標的シグナル伝達経路における生物活性の変化若しくは改変を意味する。「モジュレーター」なる用語は、Ｔ細胞シグナル伝達におけるアンタゴニスト又はインヒビターを意味する。すなわち、Ｔ細胞シグナル伝達経路の正常な生物活性を阻害する、少なくともある程度まで阻害する化合物を意味する。便宜上かかる化合物を本発明においてはインヒビター又はアンタゴニストと称する。或いは、「モジュレーター」は、Ｔ細胞シグナル伝達のアゴニスト、すなわち、Ｔ細胞シグナル伝達経路の正常な生物活性を少なくともある程度まで刺激又はアップレギュレーションする化合物を意味する。便宜上かかる化合物をアップレギュレーター又はアゴニストと称する。
本発明のモジュレーター、実際には標的分子は、有機化合物又は他の化学物資であってよい。一実施態様では、かかるモジュレーター又は標的配列は、２又は３以上のヒドロカルビル基をもつ有機化合物である。
【００１５】
ここにおいて「ヒドロカルビル（hydrocarbyl）基」なる用語は、少なくとも炭素原子又は水素原子を含み、また任意に他の好適置換基を１若しくは２以上含む基を意味する。かかる置換基としては、ハロ基、アルコキシ基、ニトロ基、アルキル基、環式基などが例示される。置換基が環式基である可能性に加え、置換基の組合せが環式基を形成してもよい。ヒドロカルビル基が炭素原子を２個以上有する場合、それら炭素は必ずしも互いに結合していなくてもよい。例えば、炭素のうち少なくとも２個が適切なエレメント又は基を介して結合していてもよい。従ってヒドロカルビル基にヘテロ原子が含まれていてもよい。当業者には好適なヘテロ原子は明らかであり、硫黄、窒素及び酸素が例示される。候補モジュレーターには環式基が少なくとも一つ含まれていてもよい。環式基は、非融合多環式基等の多環式基であってもよい。別のヒドロカルビル基に結合した環式基が作用因子に少なくとも一つ含まれている適用例がいくつかある。
【００１６】
好適実施態様の一つにおいて、モジュレーター及び／又は標的分子はアミノ酸配列又はその化学的誘導体、或いはそれらの組合せである。別の好適実施態様においては、モジュレーター及び／又は標的分子はヌクレオチド配列であり、かかるヌクレオチド配列はセンス配列もアンチセンス配列のいずれでもよい。モジュレーター及び／又は標的分子は抗体であってもよい。
【００１７】
「抗体」なる用語には無処理の分子と共に、エピトープ決定基との結合能を有するＦａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ及びｓｃＦｖ等、上記分子の断片が含まれる。これらの抗体断片には、その抗原又は受容体と選択的に結合する能力が保持され、以下のものが列挙できる。
（ｉ）抗体分子の一価抗原結合断片を含む断片Ｆａｂは、全抗体を酵素パパインで消化し、無処理のＬ鎖及び一本のＨ鎖の一部を得て作製できる。
（ii）抗体分子の断片Ｆａｂ'は、全抗体をペプシン処理し、次いで還元することにより、無処理のＬ鎖及びＨ鎖の一部が作出されて得られる。抗体分子１個から２個のＦａｂ'断片を得る。
（iii）Ｆ（ａｂ'）2は、全抗体を酵素ペプシンで処理し、その後還元させないで得られる抗体断片である。Ｆ（ａｂ'）2は、２個のジスルフィド結合によって保持されるＦａｂ'断片２個のダイマーである。
（iv）融合１本鎖分子としてＨ鎖及びＬ鎖の可変領域を有する遺伝子工学的に得た断片を含むｓｃＦｖ。
【００１８】
上述の断片を得る一般的な作製法については当技術分野で公知である（例えば本明細書に参考として添付したHarlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988) を参照のこと）。
【００１９】
モジュレーターは合成化合物であっても自然に単離した化合物あってもよい。
【００２０】
Ｔ細胞活性化には、Ｔ細胞受容体からのシグナルだけでなく、例えばＣＤ８０やＣＤ８６のような共刺激分子（補助分子としても知られる）がそれぞれＡＰＣｓ表面上及びＴ細胞上（例えばＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４）において相互作用することによって生じる第２シグナルも必要である。本発明では、Ｔ細胞受容体を介するシグナル伝達だけでなくＴ細胞共刺激分子を介するシグナル伝達をもＴ細胞シグナル伝達経路に含めることとする。
【００２１】
本発明を用いることにより調節されるＴ細胞共刺激分子としては、ノッチ、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＰＤ１、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７及びＴＲＡＮＣＥが例示されるが、公知又は今後見い出されるＴ細胞共刺激分子は全て本発明に適用してよい。かかるＴ細胞共刺激分子の対応リガンドがＴ細胞シグナル伝達経路のモジュレーターに含まれることが好ましい。このようなリガンドはＡＰＣ共刺激分子と称されることが多い。公知又は使用可能となる組合せであればどれでも本発明に用いられる。かかる組合せとしては、下記が列挙される。
【００２２】
【表１】
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本発明の好適実施態様の一つは、ノッチシグナル伝達経路の調節に関し、Ｔ細胞シグナル伝達経路のモジュレーターはノッチシグナル伝達に関与するタンパク質である。
【００２３】
ノッチシグナル伝達に関与するタンパク質というとき、本発明では、ノッチ活性化、ノッチシグナル伝達経路のダウンストリームイベント、ダウンストリーム標的遺伝子の転写調節及び他の非転写ダウンストリームイベント（例えば既存タンパク質の翻訳後修飾）を含むシグナル伝達にノッチ受容体を介して参加する分子を意味する。より具体的には第２配列は、ノッチシグナル伝達経路の標的遺伝子を活性化するドメイン、又はそれをコードするポリヌクレオチド配列である。
【００２４】
ノッチ依存性転写活性の主要標的は、スプリット複合体のエンハンサー（Enhancer of split complex；Ｅ［ｓｐｌ］）の遺伝子である。さらにこの遺伝子は、Ｓｕ（Ｈ）タンパク質による結合の直接標的であること、またノッチシグナル伝達に応答して転写が活性化されることが明らかにされている。哺乳類Ｓｕ（Ｈ）ホモログのＣＢＦ１と相互作用してＣＢＦ１を転写抑制因子から転写アクチベーターに転換させるウイルス性コアクチベータータンパク質であるＥＢＮＡ２との類似性によって、ノッチ細胞内ドメインが恐らく他のタンパク質と関連しながらＳｕ（Ｈ）と結合して、Ｓｕ（Ｈ）がＥ（ｓｐｌ）の転写を他の標的遺伝子同様に活性化させることを可能にする活性化ドメインが付与される。全てのノッチ依存性の決定にＳｕ（Ｈ）が必要ではないこともまた特記すべきであり、これは、他のＤＮＡ結合転写因子と会合することにより、又は他の機構を用いて細胞外シグナルを伝達することによって細胞運命の選択のいくつかをノッチが仲介することを示唆している。
【００２５】
本発明の特徴の一つとして、第２配列が、ノッチ、又はノッチのシグナル伝達能を有するその断片、又はノッチのシグナル伝達能を有するノッチのアナログであることが挙げられる。
【００２６】
ここにおいて用いる「ノッチのアナログ」なる用語は、ノッチのシグナル伝達能を有するその変異体も含むものとする。本発明では、ノッチシグナル伝達能をもつが、全体としてはノッチとは異なる進化起源をもつタンパク質を「アナログ」なる用語に含める。ノッチのアナログには、ＥＢＮＡ２、ＢＡＲＦ０又はＬＭＰ２Ａ等のEpstein Barr virus（ＥＢＶ）由来のタンパク質が含まれる。
【００２７】
本発明ではノッチシグナル伝達活性化に関与するタンパク質として、ノッチ、ノッチシグナル伝達経路、又はノッチシグナル伝達経路の１若しくは２以上の構成因子（component）のいずれかを活性化できる分子を意味する。
【００２８】
ある実施態様において、上記分子はノッチ又はノッチリガンドの発現を誘導若しくは亢進させる能力を有する。かかる分子はノッチ又はノッチリガンドの発現を誘導若しくは亢進させる能力を有する核酸配列であってもよい。
【００２９】
一実施態様では、分子が標的細胞においてノッチ又はノッチリガンドをコードする内因性遺伝子の発現をアップレギュレーションすることができる。かかる分子は特に、標的細胞において内因性ノッチ又はノッチリガンドの発現をアップレギュレーションすることができる免疫抑制サイトカイン、又はこのようなサイトカインをコードするポリヌクレオチドであってよい。免疫抑制サイトカインにはＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＴＧＦ−β及びＳＬＩＰ３（ＦＬＴ３）リガンドが含まれる。
【００３０】
上記分子は、Noggin、Chordin、Follistatin、Ｘｎｒ３、線維芽細胞成長因子とそれらの誘導体、断片、変異体及びホモログ、又は上記の１若しくは２以上をコードするポリヌクレオチドから選択されることが好ましい。
【００３１】
別の実施態様では、かかる分子はノッチリガンド、又はノッチリガンドをコードするポリヌクレオチドであってよい。本発明で用いるノッチリガンドには、造血幹細胞を例とする種々の哺乳類細胞の膜上に存在するノッチ受容体ポリペプチドとの結合能を一般的に有する内因性ノッチリガンドが含まれる。
【００３２】
これまでに同定されている哺乳類ノッチリガンドの具体例としては、デルタ又はデルタ様１（Genbank Accession No. AF003522-Homo sapiens）、デルタ３（Genbank Accession No. AF084576-Rattus norvegicus）及びデルタ様３（Mus musculus）（Genbank Accession No.NM_016941-Homo sapiens）、及び米国特許第６１２１０４５号（Millennium）、デルタ４（Genbank Accession Nos. AB043894 and AF253468-Homo sapiens）、及び例えばセラート１とセラート２（ＷＯ９７／０１５７１、ＷＯ９６／２７６１０、ＷＯ９２／１９７３４）のセラートファミリー、ジャグド１（Jagged-1）（Genbank Accession No.U73936-Homo sapiens）及びジャグド２（Genbank Accession No. AF029778-Homo sapiens）、及びＬＡＧ−２が挙げられる。ファミリーメンバー間における相同性は高い。ヒトデルタリガンドとヒトジャグドリガンドの配列を図１０と１１にそれぞれ示す。
好適実施態様の１つにおいてアクチベーターは、構成的に活性なノッチ受容体又はノッチ細胞内ドメイン、又はかかる受容体や細胞内ドメインをコードするポリヌクレオチドである。
【００３３】
別の実施態様でノッチシグナル伝達のアクチベーターはノッチ受容体のダウンストリームで機能している。従って、例えばノッチシグナル伝達のアクチベーターは、構成的に活性なDeltexポリペプチド又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであってよい。本発明に用いるノッチシグナル伝達経路の他のダウンストリーム構成因子には、Deltexに触媒されるＲａｓ／ＭＡＰＫカスケードに関与するポリペプチド、ノッチのタンパク質分解に関与するプレセニリン（Presenilin）等のポリペプチド、ノッチの標的遺伝子の転写調節に関与するポリペプチドが含まれるが、構成的に活性な形態であることが好ましい。
【００３４】
ノッチシグナル伝達を活性化するポリペプチドはまた、ノッチが活性化される結果として発現されるポリペプチド、かかるポリペプチドの発現に関与するポリペプチド、かかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの全てを指す。
【００３５】
ノッチシグナル伝達の活性化は、ノッチシグナル伝達経路のインヒビターを抑制することによっても達成される。その場合、ノッチシグナル伝達活性化のためのポリペプチドにはノッチシグナル伝達インヒビターを抑制できる分子が含まれる。かかる分子としては、ノッチ、ノッチリガンド又はノッチシグナル伝達経路のダウンストリーム構成因子の発現を減少させることができる化合物の産生や活性を低減又は妨害するポリペプチドや、かかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであることが好ましい。好適実施態様の１つにおいて上記分子は、トール様受容体タンパク質ファミリー、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α等のサイトカイン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）等の成長因子、ＢＭＰ受容体やアクチビン類、それらの誘導体、断片及びホモログのポリペプチドを抑制する能力をもつ分子である。
【００３６】
ノッチシグナル伝達を阻害するタンパク質、又はかかるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとは、本発明において、ノッチ、ノッチシグナル伝達経路、若しくはノッチシグナル伝達経路の１若しくは２以上の構成因子を阻害する能力を有する分子を意味する。
【００３７】
ある実施態様においてかかる分子は、ノッチ又はノッチリガンドの発現を低減又は阻止する能力を有する。このような分子は、ノッチ又はノッチリガンドの発現を低減又は阻止する能力を有する核酸配列であってもよい。
【００３８】
核酸配列が、トール様受容体タンパク質ファミリー、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α等のサイトカイン、又は骨形成タンパク質（ＢＭＰ）等の成長因子、ＢＭＰ受容体及びアクチビン類から選択されるポリペプチドをコードする核酸配列であることが好ましい。作用因子は、Noggin、Chordin、Follistatin、Ｘｎｒ３、線維芽細胞成長因子、それらの誘導体、断片、変異体及びホモログ等のノッチリガンドの発現を亢進させる能力をもつ化合物の産生を低減又は阻止するポリペプチド、かかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであることが好ましい。
【００３９】
或いはかかる核酸配列は、ノッチリガンド、又はNoggin、Chordin、Follistatin、Ｘｎｒ３、線維芽細胞成長因子、それらの誘導体、断片、変異体及びホモログ等のノッチリガンドの発現をアップレギュレーションさせる能力をもつポリペプチドから選択されるポリペプチドをコードするセンスヌクレオチド配列由来のアンチセンス構築物である。
【００４０】
別の好適実施態様ではノッチシグナル伝達のインヒビターは、ノッチ−ノッチリガンド相互作用の調節能をもつ分子である。ある分子がノッチとそのリガンドの相互作用を、好ましくは治療に奏功するに十分な程度に阻害することができるとき、かかる分子はノッチ−ノッチリガンド相互作用を調節するとみなされる。
【００４１】
この実施態様で分子は、トール様受容体タンパク質ファミリー、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α等のサイトカイン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）等の成長因子、ＢＭＰ受容体やアクチビン類から選択されるポリペプチド又はかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであってよい。Noggin、Chordin、Follistatin、Ｘｎｒ３、線維芽細胞成長因子、それらの誘導体、断片、変異体、ホモログ及びアナログ等のノッチリガンドの発現を亢進させることができる作用因子の産生を低減又は阻止するポリペプチドであることが好ましい。
【００４２】
インヒビターが、受容体又は受容体をコードする核酸配列の場合、その受容体は活性化されることが好ましい。従って例えば、作用因子が核酸配列の場合、その受容体は発現されると構成的に活性となる。
【００４３】
ノッチシグナル伝達のインヒビターには、ノッチシグナル伝達経路のダウンストリーム阻害剤、すなわちノッチ標的遺伝子の発現を回避し、又はノッチシグナル伝達経路に抑制される遺伝子の発現を誘導する化合物もまた含まれる。かかるタンパク質の例としては、NotchIC、Deltex、Dsh又はNumbのドミナントネガティブバージョンが含まれる。ノッチシグナル伝達を阻害するタンパク質には、シグナル伝達経路を伝達するよりむしろブロックするように修飾したノッチシグナル伝達経路の野生型構成因子の変異体もまた含めるものとする。かかる化合物の例としては、細胞内ドメインのタンパク質分解が最早不可能となるように修飾されたノッチ受容体が挙げられる。
本発明によれば第１配列は、ＴＣＲに提示するためにＡＰＣに対する第２配列を標的とすることができる。一好適実施態様で第１配列は、ＭＨＣクラスII分子との結合能を有するポリペプチドを含む。第１配列は、スーパー抗原であるか、そのＭＨＣクラスII分子結合ドメインを含むスーパー抗原由来であることが好ましい。第１配列には、スーパー抗原のＴＣＲ結合ドメインが含まれないことが好ましい。
【００４４】
Ｔ細胞は、適切な（すなわち自己）ＭＨＣ分子との関係においてのみ抗原を認識する。従って自己ＭＨＣは、Ｔ細胞に対する効果的な抗原提示において必要であり、活性化されてＴ細胞を助けるか若しくは細胞毒性活性をもたらす。ＣＤ４+Ｔ細胞（通常はヘルパーＴ細胞）は、ＭＨＣクラスII分子との関連においてのみ抗原を認識するように拘束されている。Ｔ細胞による抗原とＭＨＣとの「会合認識理論」に従えば、単一のＴ細胞受容体がＭＨＣと抗原特異性の両方を認識する。かかるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、抗原性ペプチド−ＭＨＣ分子複合体と結び付き、Ｔ細胞ＣＤ４分子はＭＨＣクラスII分子の保存領域と結合する。
【００４５】
従ってスーパー抗原は一般的に、抗原性ペプチド結合のための従来溝の外側でＴＣＲとＭＨＣクラスII抗原とを結合させ、複数のＴ細胞クローンの非特異的活性をもたらす数種の細菌性及びウイルス性糖タンパク質である。
【００４６】
別の実施態様では第１配列に別のＡＰＣ表面分子との結合能をもつポリペプチドが含まれる。かかるＡＰＣ分子には、ＣＤ２０５（ＤＥＣ２０５）、ＣＤ２０４（スカベンジャー受容体）、ＣＤ１４、ＣＤ２０６（マンノース受容体）、ＴＬＲｓ、Langerin（ＣＤ２０７）、ＤＣ−ＳＩＧＮ（ＣＤ２０９）、Ｆｃγ受容体１（ＣＤ６４）及びＦｃγ受容体２（ＣＤ３２）、ＣＤ６８、ＣＤ８３、ＣＤ３３、ＣＤ５４及びＢＤＣＡ−２，３，４が含まれる。これら以外に今後公知となる、又は使用可能となる表面分子もまた第１配列の標的となる。
【００４７】
従って第１配列は、ＡＰＣ表面分子に対する抗原の形態であることが適当である。一好適実施態様においてかかる抗原を、ＡＰＣ表面分子のＡＰＣ細胞外ドメイン若しくはその断片に対して作製する。抗体の作製法は、例えばKohler and Milstein (1975) Nature 256: 495-497 で説明されている。
【００４８】
ＡＰＣ表面分子に結合する分子を同定するには従来用いられているタンパク質結合アッセイを採用できる。また、ＡＰＣ表面分子に結合する配列を開発するために構造に基づいたドラッグ・デザインを適用することができる。
【００４９】
Ｔ細胞シグナル伝達経路の調節能をもつ化合物及び／又は標的分子を種々の薬剤スクリーニング法のいずれかで同定するのに、１若しくは２以上の適切な標的（アミノ酸配列及び／又はヌクレオチド配列など）を使用する。かかる試験に使用する標的は、溶液中で遊離の状態、固体支持体に固定させた状態、細胞表面に担持されている状態、又は細胞内に局在する状態のいずれであってもよい。
【００５０】
薬剤のスクリーニング法は、Geysen（欧州特許第０１３８８５５号、１９８４年９月１３日発行）に記載の方法に基づいたものでよい。概略を述べると、多数の異なる小ペプチド候補モジュレーターを、プラスチックピン又は他の物の表面などの固体基質上で合成する。これらのペプチド試験化合物を好適な標的又はその断片と反応させ、洗浄する。その後、当技術分野で公知の方法を適切に実施するなどして、結合した物質を検出する。精製した標的もまた、プレートに直接コーティングして薬剤スクリーニング法に用いることができる。ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ；高処理能力スクリーニング）に用いるプレートは、マルチウエルプレートであり、１プレートあたり９６個、３８４個、若しくは３８４個を超えるウエルがあることが好ましい。細胞は「ローン（lawns）」として播種できる。或いは、非中和抗体を使用してペプチドを捕捉し、固体支持体上に固定することができる。合成化合物のスクリーニングに用いる上述のハイスループットスクリーニングはまた、有機候補モジュレーターの同定にも用いることができる。
【００５１】
本発明はまた、標的への結合能を有する中和抗体が標的に特異的に結合する際に、かかる結合に関して試験化合物と競合するという競合的薬剤スクリーニングアッセイの使用も意図するものである。
【００５２】
かかるベクターや融合タンパク質をコードする他のポリヌクレオチドを含む哺乳類及び細菌宿主細胞、並びにそれらの作製法や使用もまた本発明に含まれる。
【００５３】
本明細書に説明する融合ポリペプチドは、融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は他のベクターを細胞集団にトランスフェクションやマイクロインジェクションなどによって導入し、コードするポリヌクレオチドを発現させて融合ポリペプチドを作製した後に上記細胞集団から離脱させて上記ＡＰＣに取り込ませることにより、ＡＰＣ標的集団の標的とすることができる。
【００５４】
或いは、本発明で説明する融合タンパク質を、融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドや他のベクターをＡＰＣ標的集団の第１部分にトランスフェクションやマイクロインジェクション等により導入し、コードするポリヌクレオチドを発現させて融合ポリペプチドを作製した後に上記標的集団の上記第１部分から離脱させて、融合タンパク質を直接産生しない細胞の標的集団の第２部分に取り込ませることによりＡＰＣの標的集団の標的とすることができる。
【００５５】
結合産物の調製物にＡＰＣを直接暴露することにより、結合産物をＡＰＣの標的集団の標的とすることができ、その結果標的ＡＰＣがそれら結合産物を取り入れることになる。
【００５６】
本発明に有用な「タンパク質」の定義範囲においては、あるタンパク質がその内因性機能が少なくとも１つ保持されるような形で特異的アミノ酸残基が修飾されてもよく、かかる修飾タンパク質を「変異体」と表すものとする。変異タンパク質は、天然型タンパク質のアミノ酸を少なくとも１つ、付加、欠失及び／又は置換することによって修飾できる。
【００５７】
通常アミノ酸は、修飾された配列が必要な標的活性やノッチシグナル伝達調節能を保持する限りにおいて、例えば１、２又は３〜１０又は２０個置換されてもよい。アミノ酸の置換には非天然型アナログを使用することも含まれる。
【００５８】
本発明で用いるタンパク質には、サイレントな変化をもたらすアミノ酸残基の欠失、挿入又は置換があってもよく、それにより、機能的に同等なタンパク質が得られる。アミノ酸の意図的な置換は、極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性における類似性を基にし、標的又は調節機能が保持される限りにおいて行われる。例えば負電荷アミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ、正電荷アミノ酸にはリシン及びアルギニンが含まれ、また同様の親水価をもつ極性ヘッド無電荷グループのアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、及びチロシンが含まれる。
【００５９】
便宜上、主要な天然型アミノ酸（及びその関連するコドン）に対する１文字コードと３文字コードを以下に記す。
【００６０】
【表２】
2005524381.tif 000004
例えば下記の表に基づき、保存的置換を行うことができる。第２カラムの同じブロック内のアミノ酸同士、及び好ましくは第３カラムの同じ行にあるアミノ酸同士は、互いに置換させてもよい。
【００６１】
【表３】
2005524381.tif 000005
ここに用いる「タンパク質」なる用語には、個々の構成ポリペプチドが共有若しくは非共有手段によって結合している複数ポリペプチド複合体とともに１本鎖ポリペプチド分子も含まれる。ここに用いる「ポリペプチド」及び「ペプチド」なる用語は、モノマーがアミノ酸であり、かつペプチド結合若しくはジスルフィド結合によって結び付いているものを指す。サブユニット及びドメインなる用語もまた生物機能を有するポリペプチド及びペプチドを指す。本発明に有用なペプチドは少なくとも標的又はシグナル伝達調節能を有する。「断片」もまた変異体であり、この用語は結合アッセイにおいて目的タンパク質の選択領域のことを通常指し、断片に対する結合パートナーを見つけ、また決定する。よって「断片」とは、完全長ポリペプチドの部分であるアミノ酸配列のことであり、その長さは約８と約７４５の間であり、好ましくは約８〜約３００、より好ましくは約８〜約２００アミノ酸長であり、より一層好ましくは約１０〜約５０又は１００アミノ酸長である。「ペプチド」は、１０〜４０アミノ酸長、好ましくは１０〜３５アミノ酸長である短いアミノ酸配列のことである。
【００６２】
かかる変異体は、site-directed mutagenesis等の標準的な組換えＤＮＡ法により調製できる。挿入を行う場所に、挿入部位の片側において天然型配列に相当する５'及び３'フランキング領域と共に挿入物をコードする合成ＤＮＡを挿入する。配列が適当な酵素（１若しくは２以上）で切断され、合成ＤＮＡが切断部に結合するように、フランキング領域には天然型配列における部位に相当する便宜的な制限部位が含まれる。次にこのＤＮＡは本発明に従って発現され、コードされたタンパク質を産生する。これらの方法は、ＤＮＡ配列操作法として当技術分野で公知の無数の標準的な手法の例であり、他の公知の手法を用いることもできる。
【００６３】
ヌクレオチド配列の変異体も作製できる。かかる変異体はコドン最適化配列を有することが好ましい。コドン最適化は、ＲＮＡの安定性を、ひいては遺伝子発現を増強する手法として当技術分野で公知である。遺伝子コードの縮重とは、いくつかの異なるコドンが同じアミノ酸をコードすることを意味する。例えばロイシン、アルギニン及びセリンはそれぞれ６種類の異なるコドンによってコードされる。異なるコドンを使用する際の優先順位が異なる生物ごとにみられる。例えばＨＩＶ等のウイルスは希少コドンを数多く用いる。希少コドンが、相当し汎用されている哺乳類コドンで代替されるようにヌクレオチド配列を変化させることにより、哺乳類標的細胞における配列の発現が増強されることになる。哺乳類細胞や他の種々の生物に関するコドン使用表が当技術分野で公知となっている。
【００６４】
本発明の一実施態様において、標的細胞又はＴ細胞シグナル伝達タンパク質のいずれかをコードするヌクレオチド配列の少なくとも１つは、哺乳類細胞における発現のために最適化されたコドンである。
【００６５】
一好適実施態様では、配列はその全体にわたって最適化されている。
【００６６】
天然型配列若しくは合成配列が膜を移行する能力又はＴ細胞シグナル伝達を左右する能力は、当技術分野で公知のルーティン法によって調べられる。
ＡＰＣとの結合能を保持する公知の標的タンパク質の変異体が当技術分野で数種報告されており、使用可能となるものと同様にそれらもまた本発明の範疇である。
【００６７】
かかる能力を保持する公知のＴ細胞シグナル伝達調節タンパク質の変異体数種が当技術分野で報告されており、使用可能となるものと同様にそれらもまた本発明の範疇である。
【００６８】
非天然型タンパク質は組換え法を用いて調製することが好ましい。
【００６９】
本発明のさらなる特徴として、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。
【００７０】
「ポリヌクレオチド」とは、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかであるか、又はそのいずれかのヌクレオチド型の修飾型で、その長さが少なくとも１０塩基あり、最大で１０００塩基又はそれを超えるヌクレオチドがポリマー化したもののことである。本用語はＤＮＡの１本鎖及び２本鎖を含む。
【００７１】
これらは標準的なＤＮＡ法を用いて構築できる。核酸はＲＮＡ又はＤＮＡでよく、ＤＮＡが好ましい。ＲＮＡを使用する場合は、ｃＤＮＡ中間体を介して操作を行う。通常は第１領域をコードする核酸配列を調製し、５'及び／又は３'末端に適切な制限部位を設ける。便宜上、pBR322又はpUC19に基づくプラスミドベクターなどの標準的な実験用ベクターにおいて配列を操作する（以下参照）。好適な手法の詳細についてはMolecular Cloning by Sambrook et al. (Cold Spring Harbor, 1989)や、類似の標準的参考文献が参考となる。
【００７２】
類似のベクター系において第２領域をコードする核酸を同様に提供できる。
【００７３】
公開文献又はGenBank等のデータベースを参考にして核酸のソースを確定する。所望の第1又は第2配列をコードする核酸は学術用又は商業用のソースからの材料入手が可能であればそこから得ればよく、又は配列データのみが入手可能である場合は適した配列を合成又はクローニングして得られる。この場合は通常、対象遺伝子のクローニングに関する説明がある文献ソースを参考にして実施する。
【００７４】
或いは限られた配列データしか得られない場合、又は公知の核酸と相同若しくは関連する核酸を発現させることを望む場合、その核酸例は当技術分野で公知の核酸配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列として特徴付けられる。
【００７５】
遺伝子コードに縮重があるため、多数の異なるヌクレオチド配列が同一の標的タンパク質又は本発明に用いるＴ細胞シグナル伝達調節タンパク質をコードし得ることは当業者には理解されるところである。さらに当業者であればルーティンの手法により、本発明ヌクレオチド配列がコードする標的タンパク質又はＴ細胞シグナル伝達調節タンパク質に影響を及ぼすことなく、標的タンパク質又は本発明のノッチシグナル伝達調節タンパク質が発現される特定の宿主生物におけるコドン使用を反映してヌクレオチドの置換を行うことができると理解される。
【００７６】
一般的に本発明で用いるヌクレオチド配列との関連における「変異体」、「ホモログ」、又は「誘導体」なる用語には、結果として得られるヌクレオチド配列が標的タンパク質又はＴ細胞シグナル伝達調節タンパク質をコードするという条件下で配列中の核酸1個（若しくは2個以上）の置換、変異、修飾、置換え、欠失又は付加を含める。
【００７７】
上述したとおり、配列相同性に関しては、対象とする配列と、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、さらには少なくとも９０％の相同性があることが好ましい。少なくとも９５％、さらには少なくとも９８％の相同性を示すことが好ましい。ヌクレオチド相同性比較は上述のとおりに行われる。上述のGCG Wisconsin Bestfit programが配列比較プログラムとして好ましい。初期スコアリングマトリックスは、一致する各ヌクレオチドについて１０で、ミスマッチの各ヌクレオチドについて−１０である。初期ギャップ創出ペナルティは、各ヌクレオチドにつき−５０で初期ギャップ延長ペナルティは−３である。
【００７８】
本発明はまた、対象とする配列又はその変異体、断片、誘導体、又はそのいずれかとの相補配列との選択的ハイブリダイズ能をもつヌクレオチド配列も包含する。ヌクレオチド配列は少なくとも１５ヌクレオチド長が好ましく、少なくとも２０、３０、４０又は５０ヌクレオチド長がより好ましい。
【００７９】
ハイブリダイゼーションなる「用語」には、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いる増幅過程を意味すると同様に、「塩基ペアリングにより核酸鎖が相補鎖と結合する過程」（Coombs J (1994) Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York NY）を意味する。
【００８０】
本明細書に示すヌクレオチド配列との選択的ハイブリダイズ能をもち、本発明に有用なヌクレオチド配列、又はその相補配列は、本明細書に示す対応ヌクレオチド配列と少なくとも２０、好ましくは２５若しくは３０、例えば少なくとも４０、６０又は１００又はさらに多くの連続ヌクレオチド領域にわたって、通常少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８５若しくは９０％、より好ましくは少なくとも９５％若しくは９８％の相同性を示す。本発明のおいてはヌクレオチド配列との相同性が好ましくは少なくとも８０若しくは９０％、より好ましくは少なくとも９５％ある領域を含むヌクレオチド配列が好ましい。
【００８１】
「選択的にハイブリダイズする」なる用語は、本発明の標的ヌクレオチド配列がバックグラウンドより有意に高レベルでプローブとハイブリダイズする条件下でプローブ用ヌクレオチド配列が使用されることを意味する。例えばスクリーニングを行うｃＤＮＡやゲノムＤＮＡライブラリーに他のヌクレオチド配列が存在するために、バックグラウンドハイブリダイゼーションが生じる。かかるイベントでバックグラウンドは、プローブとライブラリーの非特異的ＤＮＡメンバーとの間で生じ、標的ＤＮＡとの間で観察される特異的相互作用の強度の１０倍未満、好ましくは１００倍未満の相互作用によるシグナルのレベルを表す。相互作用の強度は例えば32Ｐなどでプローブを放射標識することによって測定してよい。
【００８２】
ハイブリダイゼーション条件は、Berger and Kimmel の教示（1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol 152, Academic Press, San Diego CA）にあるように核酸結合複合体の融点（Ｔｍ）に基づいて、下記に説明するように定義付けられた「ストリンジェンシー」を用いる。
【００８３】
最大限のストリンジェンシーは通常、おおよそＴｍ−５℃（プローブの融点より５℃低い）で生じ、高度なストリンジェンシーは融点より約５℃〜１０℃低い温度下で生じ、中程度のストリンジェンシーは融点より約１０℃〜２０℃低い温度下で生じ、低度のストリンジェンシーは融点より約２０℃〜２５℃低い温度下で生じる。当業者には明らかであるが、最大限のストリンジェンシーでのハイブリダイゼーションは、一致するヌクレオチド配列を同定若しくは検出するために用いられ、中程度（又は低度）のストリンジェンシーでのハイブリダイゼーションは、類似の若しくは関連するヌクレオチド配列を同定若しくは検出するために用いられる。
【００８４】
好適な特徴として本発明は、ストリンジェントな条件下（例；６５℃、０．１×ＳＳＣ[１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ Ｎａ3クエン酸ｐＨ７．０]）で本発明のヌクレオチド配列とハイブリダイズできるヌクレオチド配列を包含する。本発明のヌクレオチド配列が２本鎖の場合、その２本の両方の鎖は個別であれ組合せであれ、本発明に包含される。ヌクレオチド配列が１本鎖の場合、そのヌクレオチド配列の相補配列もまた本発明の範囲に含まれる。
【００８５】
本発明の配列と１００％相同ではないが、本発明の範囲に含まれるヌクレオチド配列は、数多くの方法により得ることができる。本明細書に記載する他の変異体は、例えば種々のソースから作製したＤＮＡライブラリーをプローブすることにより得てもよい。また、他のウイルス性／細菌性、若しくは細胞性ホモログ、特に哺乳類細胞（例：ラット、マウス、ウシ及び霊長類細胞）からの細胞性ホモログを得てもよく、通常かかるホモログやその断片は、本明細書にある配列リストに示す配列と選択的にハイブリダイズすることができる。これら配列は、それが作製されたｃＤＮＡライブラリーから、又は他の動物種のゲノムＤＮＡライブラリーをプローブし、また中程度から高度なストリンジェンシー下で対象ヌクレオチド配列の全部又は一部を含むプローブでかかるライブラリーをプローブすることによって得られる。本発明に有用なアミノ酸及び／又はヌクレオチド配列の種ホモログ及び対立変異体を得る際にも同様の方法論を適用する。
【００８６】
変異体及び株／種ホモログもまた、本発明に用いる配列中の保存アミノ酸配列をコードする変異体及びホモログ内の配列を標的とするように設計されたプライマーを用いる縮重ＰＣＲにより得られる。保存配列は、例えばいくつかの変異体／ホモログにおけるアミノ酸配列を整列させることによって予測できる。配列アラインメントは当技術分野で公知のコンピューターソフトウエアを用いて実行できる。例えばGCG Wisconsin PileUp program は広く使われている。縮重ＰＣＲで用いるプライマーには１若しくは２以上の縮重位置があり、公知の配列に対する単一配列プライマーで配列をクローニングするのに用いられるストリンジェンシー条件より低い条件で使用される。
【００８７】
或いは、特徴付けられた配列にsite-directed mutagenesisを行うことにより上記ヌクレオチド配列を得てもよい。この方法は、例えばヌクレオチド配列が発現している特定宿主細胞に対するコドン優先度を最適化するためにサイレントなコドン変化が配列に要求される場合に有用である。制限酵素認識部位を導入するため、又は標的タンパク質若しくはヌクレオチド配列によってコードされるＴ細胞シグナル伝達調節タンパク質の活性を改変するために、他の配列変化が必要になる場合もある。
【００８８】
本発明に有用なＤＮＡポリヌクレオチド等のヌクレオチド配列は、組換え、合成又は当業者が実行可能ないずれの方法によって作製してもよい。標準的な手法でクローニングしてもよい。
【００８９】
一般的にプライマーは、所望の核酸配列を１ヌクレオチドずつ作出するステップワイズ手法を含む合成法で作製する。この方法で行うための自動化技術を用いる技術は当技術分野では容易に実現可能である。
【００９０】
より長いヌクレオチド配列は、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ鎖反応）クローニング法を用いる組換え法で作製するのが一般的である。この方法は、クローニングさせたい標的配列の領域をフランキング（隣接）する一対のプライマー（例；約１５〜３０ヌクレオチド）を作製し、そのプライマーを動物若しくはヒト細胞から得たｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡと接触させ、所望の領域を増幅させる条件下でポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を行い、増幅した断片を単離し（例えば反応混合物をアガロースゲル上で精製することにより）、そして増幅ＤＮＡを回収することからなる。上記プライマーは、増幅ＤＮＡが好適なクローニングベクターにクローニングされるように適切な制限酵素認識部位を有するように設計する。
【００９１】
本発明のさらなる特徴として、本発明のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター、本発明の発現ベクターで形質転換した宿主細胞、融合タンパク質を発現させる条件下で本発明の宿主細胞を培養することからなる本発明の融合タンパク質の調製法、ＡＰＣを本発明の共役体に暴露することからなるＡＰＣに対しＴ細胞シグナル伝達調節タンパク質を標的とする方法、本発明の方法により調製する共役体、本発明の共役体を含み、特にＴ細胞介在型疾患の治療に用いる医薬組成物、並びに疾患若しくは感染症、特にＴ細胞介在型疾患の予防及び／又は治療に用いる薬剤の調製における本発明の共役体の使用を提供する。
【００９２】
本発明の共役体は当技術分野で公知のいかなる方法で調製してもよい。
【００９３】
本発明はまた、本発明に有用なポリヌクレオチドを有するベクター、本発明のベクターを用いて遺伝子工学的手法で作製した宿主細胞、及び本発明に有用なポリペプチドをかかる手法により作製することに関する。
【００９４】
組換え作製法では宿主細胞に、本発明の発現系又はポリヌクレオチドを取り込むように遺伝子工学に基づく操作を施すことができる。宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入法としては、Davis et al and Sambrook et al等、多くの標準的実験室マニュアルに記載されている例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション（transvection）、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、トランスダクション、スクレープローディング（scrape loading）、弾丸導入（ballistic intruduction）、感染等の方法が有効である。これらの方法は、薬物送達系としてインビトロ又はインビボで採用することができる。
【００９５】
好適な宿主の代表的な例としては、レンサ球菌（streptococci）、ブドウ球菌（staphylococci）、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌等の細菌細胞や、酵母細胞、アスペルギルス細胞等の真菌細胞や、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞や、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＮＳＯ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ２９３、Bowesメラノーマ細胞等の動物細胞や、植物細胞が挙げられる。
【００９６】
本発明に有用なポリペプチドの作製には極めて多様な発現系が使用できる。このようなベクターとしては例えば、染色体、エピソーム及びウイルスに由来するベクター、例えば、細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、またバキュロウイルス、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス等のウイルス由来のベクター、並びにこれらの組合せに由来するベクター、例えばコスミドやファージミドのようにプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものが含まれる。この発現系構築物は発現を起こさせるだけでなく発現を調節する制御領域を含んでいてもよい。宿主内でポリヌクレオチドを保持、増殖又は発現させる、及び／又は宿主内でポリペプチドを発現させるのに適していれば通常いかなる系又はベクターでも使用してよい。例えば、Sambrook et al の方法等、十分公知のルーティンな方法に従って適切なＤＮＡ配列を発現系に挿入してよい。
【００９７】
翻訳されたタンパク質を小胞体の内腔に、ペリプラズム空間に、又は細胞外環境に分泌するためには、発現したポリペプチドに適切な分泌シグナルを導入することができる。かかるシグナルは、ポリペプチドに対し内因性でも異種シグナルでもよい。
【００９８】
本発明の共役体は、広く公知の方法を用いることにより、組換え細胞培養物から回収・精製することができる。これらの方法としては、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーなどがある。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが精製に用いられる。ポリペプチドが単離及び／又は精製の過程で変性した場合は、十分公知の方法によりタンパク質のリフォールディングを行って活性構造を再生する。
【００９９】
公知の化学結合法により、個別のタンパク質配列から化学的に結合した配列を調製できる。かかる共役体は常法である溶液相又は固体相ペプチド合成法を用いて会合させることができ、末端アミノ基だけが脱保護反応型である完全に保護された前駆体が得られる。次にこの機能を、Ｔ細胞シグナル伝達調節タンパク質又はその好適反応融合体と直接反応させることができる。或いは、上記アミノ基をカーゴ成分（cargo moiety）又はリンカーとの反応に適した別の官能基に転換させてもよい。従って例えば、アミノ基を無水コハク酸と反応させることにより、選択的に指定可能（addressable）なカルボキシル基が得られるが、システイン誘導体でペプチド鎖をさらに延長すると選択的に指定可能なチオール基が得られる。送達ベクター前駆体において適切に選択された指定可能官能基が一旦得られると、例えばアミド、エステル、又はジスルフィド結合形成によってＴ細胞シグナル伝達調節タンパク質又はその誘導体が結合する。使用可能な交叉結合試薬については例えば、Neans, G. E. and Feeney, R. E., Chemical Modification of Proteins, Holden-Day, 1974, pp.39-43に記載がある。
【０１００】
上述したように、標的タンパク質及びＴ細胞シグナル伝達調節タンパク質は開裂可能なリンカー成分を介して直接若しくは間接的に結合する。直接結合は、Ｔ細胞シグナル伝達調節タンパク質における好都合な官能基、例えばヒドロキシ基、カルボキシ基、アミノ基等を介して生じる。好ましいのは間接結合であるが、これはリンキング成分を介して生じる。好適なリンキング成分には、二機能及び多機能のアルキル、アリール、アラルキル若しくはペプチド成分、アルキル、アリール若しくはアラルキルのアルデヒド酸エステル及び無水物、マレイミド安息香酸誘導体、マレイミドプロプリオン酸誘導体及びスクシンイミド誘導体等若しくはシアヌル酸ブロミドや塩化物由来のスルフィドリル又はカルボキシル基、又は、カルボニルジイミダゾール、スクシンイミジルエステル若しくはスルホン酸ハリドなどが含まれる。一方でリンカーとＴ細胞シグナル伝達調節タンパク質との間に、他方でリンカーと標的タンパク質との間に共有結合を形成するのに用いるリンカー成分における官能基の例としては、アミノ、ヒドラジノ、ヒドロキシル、チオール、マレイミド、カルボニル、カルボキシルの各基などの２若しくは３以上が挙げられる。リンカー成分には、それを介してリンカー成分が標的タンパク質に結合するところのシステイン残基を任意に有する１〜４アミノ酸残基長の短配列を含んでいてよい。
【０１０１】
本発明では、各標的タンパク質が少なくとも１つのＴ細胞シグナル伝達調節タンパク質に結合している。さらなる実施態様においては標的タンパク質と、Ｔ細胞シグナル伝達調節タンパク質の少なくとも１つとの結合を促進するために標的タンパク質を調製するが、Ｔ細胞シグナル伝達調節タンパク質は各々同じ又は異なる。例えば、標的タンパク質は、天然型アミノ酸の誘導体や多価合成アミノ酸の誘導体などのＴ細胞シグナル伝達調節タンパク質を２個以上結合させることを促進する成分を含んでいてもよく、または標的タンパク質が、結合基として標的タンパク質に結合する分枝鎖状リシン残基のネットワークにより、特異的に適応してもよく、各リシン残基はその後Ｔ細胞シグナル伝達調節タンパク質に結合してもよい。この方法で単一の標的タンパク質は、Ｔ細胞シグナル伝達調節タンパク質を最大３２個まで、好ましくは２〜１０、より好ましくは４〜５個のＴ細胞シグナル伝達調節タンパク質を担持していてよい。かかる実施態様では、Ｔ細胞シグナル伝達調節タンパク質のそれぞれが直接又は間接に担体成分に結合している。２以上の異なるタイプのＴ細胞シグナル伝達調節タンパク質が結合する場合、それぞれの薬剤の比率や投与量を調整して特異的タンパク質の組合せの投与を容易にすることができる。
【０１０２】
粒子サイズが例えば０．１から５ミクロンの範囲にある安定な凝集体を、Ｔ細胞シグナル伝達調節タンパク質と標的タンパク質とを混合して形成することができる。標的タンパク質とＴ細胞シグナル伝達調節タンパク質の割合を２：１〜１：１とすることが好ましい。
【０１０３】
さらなる実施態様において共役体はさらに標的成分を含んでいてもよい。標的成分は、Ｔ細胞シグナル伝達調節タンパク質が機能するのに好ましい特異的細胞型へと標的タンパク質を導くことができる。従って、かかる標的成分が体内における自然な薬剤分布を偏らせる指定系として、又は特定細胞型に対する共役体として機能する。標的成分は、Ｔ細胞シグナル伝達調節タンパク質に、又はより好ましくは標的タンパク質に結合させて共役体を所望部位に導いてもよく、かかる部位に共役体が到達すると標的成分が、Ｔ細胞シグナル伝達調節タンパク質の細胞内在化を促進する。安定な標的成分としては、細胞特異的抗体、又はファージディスプレイＳｃＦｖや、E Ruoslahti et al. （米国特許第５６２２６９９号）、Pasqualini, R, Ruoslahti E、Ruoslahti E、Arap, W, Pasqualini, R, Ruoslahti, Eが同定したペプチド配列等の抗体断片が例示できる。
【０１０４】
共役体の安定性や摂取効率を亢進する安定剤を共役体と併用して任意に細胞と接触させることもできる。例えばｔａｔタンパク質と結合し、その安定性や摂取効率を亢進する金属イオンを上記目的に用いることができる。
【０１０５】
本発明のさらなる実施態様において、細胞による摂取を増強するために共役体と併用して細胞外でリソゾーム栄養性因子を作用させる。リソゾーム栄養性因子は単独又は安定剤との併用のいずれでも用いることができる。例えば数種の細胞におけるｔａｔタンパク質の摂取を数百倍亢進することが知られるクロロキーネ、モネンシン、アマンタジン及びメチルアミン等のリソゾーム栄養性因子をこの目的に用いることもできる。
【０１０６】
別の実施態様では、ｔａｔ３８−５８又はプロタミン等の塩基性ペプチドを共役体の摂取を増強するために細胞外で共役体と併用する。かかる塩基性ペプチドは単独、又は安定剤やリソゾーム栄養性因子と組み合わせて使用することもできる。
本発明の共役体はまた、例えば共役体そのもの若しくはその構成因子の局在化を観察する常法による診断及び観察用の特異的結合アッセイに使用可能な抗体を惹起させることに用いることができる。
【０１０７】
さらに別の本発明実施態様において、本発明の共役体を特異的に認識し、結合する抗体を提供する。しかし、より好ましいのは抗体が共役体の第２配列に特異性を示すことである。共役体の第２配列が自然状態で抗体によって認識されることが好都合である。従って、第２配列がＴ細胞シグナル伝達調節タンパク質の単離断片又はドメインである場合、かかる断片又はドメインは全体又はより大きなタンパク質との関連において本発明の抗体に認識される。
【０１０８】
本発明はさらに、
ａ）本発明の共役体で動物を免疫し；また
ｂ）上記動物の血清から上記共役体の領域に特異的な免疫グロブリンを回収する工程からなる免疫グロブリンの調製法を提供する。
【０１０９】
抗体（又は免疫グロブリン）は、共役体に対するアフィニティークロマトグラフィーにより粗製調製物（すなわち抗血清）として単離してよい。或いは当技術分野での標準的な手法を用い、モノクローナル抗体を調製して精製してもよい。
【０１１０】
共役体を投与して得られる治療効果は、無処理の共役体によって、又は単独若しくはリンカーやリンカーの一部や標的タンパク質の一部と結合させた解離Ｔ細胞シグナル伝達調節タンパク質のいずれによって生じてもよい。
【０１１１】
好適実施態様では、ノッチシグナル伝達タンパク質によって治療効果が得られる。ノッチシグナル伝達経路及びそれにより影響を受ける疾患については、本発明者らのＷＯ９８／２０１４２、ＷＯ００／３６０８９及びＰＣＴ／ＧＢ００／０４３９１に詳細に記載がある。
【０１１２】
Ｔ細胞介在型として示される疾患又は感染症としては、喘息、アレルギー、移植片拒絶反応、自己免疫症、腫瘍を原因とするＴ細胞系の異常、並びにマラリヤ病原虫(Plasmodium sp.)、ミクロフィラリア、蠕虫、マイコバクテリア、ＨＩＶ、サイトメガロウイルス、シュードモナス、トキソプラズマ、エキノコックス、Ｂ型インフルエンザ、麻疹、Ｃ型肝炎、トキソカラの１若しくは２以上が含まれるが、これらに限定されない。Ｔ細胞が介在する疾患のうち、治療若しくは予防が可能であると思われるものには、多発性硬化症、関節リウマチ、又は糖尿病が含まれる。本発明は臓器移植又は骨髄移植にも用いられる。
【０１１３】
上述したとおり、本発明は自己免疫疾患又は異種移植片移植等の移植拒絶反応等の免疫障害を治療する上で有用である。
治療が可能と考えられる疾患例には一般的に自己免疫疾患と呼ばれるグループが含まれる。自己免疫疾患の範囲には臓器特異的疾患（甲状腺炎、膵島炎、多発性硬化症、虹彩毛様体炎、ブドウ膜炎、精巣炎、肝炎、アジソン病、重症筋無力症など）から関節リウマチやエリテマトーデス等の全身性疾患に及ぶ。他の疾患には、アレルギー反応等の免疫性過敏症が含まれる。
【０１１４】
より詳細には臓器特異的自己免疫疾患には、多発性硬化症、インシュリン依存性糖尿病、数タイプの貧血（再生不良性、溶血性）、自己免疫性肝炎、甲状腺炎、膵島炎、虹彩毛様体炎、強膜炎、ブドウ膜炎、精巣炎、重症筋無力症、特発性血小板減少性紫斑病、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎）が含まれる。
【０１１５】
全身性自己免疫疾患には、関節リウマチ、若年性関節炎、強皮症及び全身性硬化症、シェーグレン症候群、未分化結合織症候群、抗リン脂質抗体症候群、各種形態の脈管炎（結節性多発動脈炎、アレルギー性肉芽腫性血管炎、ウェゲネル肉芽腫症、川崎病、過敏性脈管炎、シェーンライン・ヘノッホ紫斑病（Henoch-Schoenlein purpura）、ベーチェット症候群、高安動脈炎、巨細胞性動脈炎、閉塞性血栓血管炎）、エリテマトーデス、リウマチ性多発筋痛症、本態性（混合）クリオグロブリン血症、尋常性乾癬、及び乾癬性関節炎、好酸球性若しくは非好酸球性の広汎性筋膜炎、多発性筋炎及び他の特発性炎症性筋疾患、再発性脂肪組織炎、再発性多発性軟骨炎、リンパ腫様肉芽腫、結節性紅斑、強直性脊髄炎、ライター症候群（Reiter's syndrome）、種々の病型の炎症性皮膚炎が含まれる。
【０１１６】
障害をさらに詳細に以下列挙する。関節炎（関節リウマチを含む）を含む望ましくない免疫反応及び炎症、過敏症を伴う炎症、アレルギー反応、喘息、全身性エリテマトーデス、コラーゲン疾患や他の自己免疫疾患、アテローム性動脈硬化症を伴う炎症、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化性心疾患、再潅流障害、心停止、心筋梗塞、血管性炎症疾患、呼吸窮迫症候群又は他の心肺疾患、消化器潰瘍を伴う炎症、潰瘍性大腸炎や他の消化管疾患、肝硬変や他の肝疾患、甲状腺炎や他の腺疾患、糸球体腎炎や他の腎臓及び泌尿器疾患、耳炎や他の耳鼻咽喉疾患、皮膚炎や他の皮膚疾患、歯周病や他の歯疾患、精巣炎又は副睾丸炎（精巣上体炎）、不妊症、睾丸外傷並びに他の免疫性精巣疾患、胎盤機能障害、胎盤機能不全、習慣性流産、子癇、子癇前症並びに他の免疫及び／又は炎症性婦人科疾患、後部ブドウ膜炎、中間部ブドウ膜炎、前部ブドウ膜炎、結膜炎、網脈絡膜炎、ブドウ膜炎（uveoretinitis）、視神経炎、眼内炎（例；網膜炎又は嚢胞様黄斑腫）、交感性眼炎、強膜炎、網膜色素変性症、変性眼圧疾患の免疫及び炎症構成要素、眼外傷の炎症構成要素、感染性眼炎症、増殖性硝子網膜症、急性虚血性視神経障害、過剰形成瘢痕（例；緑内障濾過手術後の）、眼組織移植に対する免疫及び／又は炎症反応、並びに他の免疫関連眼疾患、中枢神経系（ＣＮＳ）又は他の臓器の両方において免疫及び／又は炎症を抑制することが有効である自己免疫疾患若しくは症状若しくは障害に伴う炎症、パーキンソン病、パーキンソン病治療による合併症及び／又は副作用、ＡＩＤＳ痴呆症候群、ＨＩＶ脳症、デビック病（Devic's disease）、シデナム舞踏病（Sydenham's chorea）、アルツハイマー病並びに他の変性疾患、中枢神経系の疾患又は障害、脳卒中による炎症構成要素、ポリオ後症候群、精神疾患の免疫及び炎症構成要素、脊髄炎、脳炎、亜急性硬化性全脳炎、脳脊髄炎、急性神経障害、亜急性神経障害、慢性神経障害、Guillaim-Barre症候群、シデナム舞踏病、重症筋無力症、偽脳腫瘍、ダウン症候群、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側策硬化症、中枢神経系圧迫又は中枢神経系外傷又は中枢神経系感染による炎症構成要素、筋萎縮症又は筋ジストロフィーによる炎症構成要素、さらに中枢及び末梢神経系における免疫及び炎症疾患又は症状又は障害、外傷後炎症、敗血症性ショック、感染症、手術又は臓器移植後の炎症性合併症又は副作用、遺伝子療法による炎症性及び／又は免疫性合併症及び副作用（例；ウイルス担体による感染のため）、或いはＡＩＤＳに伴う炎症、液性及び／又は細胞性免疫反応の抑制又は阻害、単球又はリンパ球を減少させることにより単球又は白血球増殖性疾患（例；白血病）を治療若しくは軽減すること、天然若しくは人工の細胞や、角膜、骨髄、臓器、水晶体、ペースメーカー、天然若しくは人工の皮膚組織等の組織や臓器を移植する場合の移植片拒絶反応の予防及び／又は治療。
【０１１７】
本発明は癌治療にも有用である。本発明は特に小細胞肺癌、及び腎臓癌、子宮癌、前立腺癌、膀胱癌、卵巣癌、結腸癌、乳癌等の腺癌について有用である。
【０１１８】
本発明はまた、細胞におけるノッチ経路の機能を変化させることにより、細胞、組織又は臓器型の運命を変化させる方法において有用である。従って本出願は悪性かつ前腫瘍性疾患の治療に適用できる。
【０１１９】
本発明は特に小細胞肺癌、及び腎臓癌、子宮癌、前立腺癌、膀胱癌、卵巣癌、結腸癌、乳癌等の腺癌について有用である。例えば本発明によって治療可能となる悪性疾患には、急性及び慢性白血病、リンパ腫、骨髄腫や、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、リンパ血管内皮肉腫（lymphangioendotheliosarcom）、血管肉腫、内皮肉腫（endotheliosarcoma）、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、リンパ管肉腫、滑膜腫、胸膜中皮腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、乳癌、鱗細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、甲状腺髄様癌、気管支原性癌、絨毛癌、腎細胞癌、肝臓癌、胆管癌精上皮腫、胎生期癌、子宮頸癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫（グリオーマ）、星細胞腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫瘍、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、乏突起膠細胞腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、網膜芽腫等の肉腫が含まれる。
【０１２０】
本発明はまた、神経系疾患の治療に適用される。本発明によって治療する神経系疾患には、外科手術による外傷損傷を含む神経損傷、虚血性損傷、悪性損傷、ＨＩＶ、帯状疱疹や単純ヘルペスウイルス、ライム病、結核や梅毒によって引き起こされる感染性損傷、神経変性損傷や疾患及び脱髄損傷が含まれる。
【０１２１】
本発明は例えば糖尿病（糖尿病性神経障害、Bell's麻痺を含む）、全身性エリテマトーデス、サルコイドーシス、多発性硬化症、ＨＩＶ関連脊髄障害、脊髄横断障害又は種々の病因、進行性多巣性白質脳症、橋中心髄鞘壊死、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側策硬化症、脳梗塞若しくは虚血、脊髄梗塞若しくは虚血、進行性脊髄筋肉萎縮、進行性球麻痺、原発性側索硬化症、小児及び若年型筋萎縮症、小児期の進行性球麻痺（Fazio-Londe症候群）、ポリオ及びポリオ後症候群、並びに遺伝性運動感覚神経障害（Charcot-Marie-Tooth Disease）の治療に用いられる。
【０１２２】
本発明はさらに組織再生及び修復の促進に有用である。従って本発明は、肝硬変、肥厚性瘢痕形成及び乾癬等の欠損組織修復及び再生を伴う疾患治療に用いられる。本発明はまた好中球減少症又は貧血の治療及び臓器再生や再生医工学の技術にとっても有用である。
【０１２３】
本発明者らは本発明の共役体を用いることにより、上述の疾患の予防及び／又は後退促進が図れることを見い出した。
【０１２４】
本発明は、インビトロ又はインビボでＴ細胞シグナル伝達調節タンパク質を細胞、特に細胞核に送達することに用いることが可能である。インビトロで適用する場合は共役体を標的細胞の培養培地に加えてよい。共役体はまた、患者から得た細胞試料にＴ細胞シグナル伝達調節タンパク質を導入するために、かかる試料と併用することもできる。この方法による治療後、試料は患者に戻すことができる。共役体はインビボで投与することもできる。例えば共役体を合成する細胞を作製し、患者にインプラントすることも可能である。さらなる実施態様では、従来の治療剤とほぼ同様に用いることができ、医薬組成物の成分とすることもできる。
【０１２５】
例えば好適条件下において、共役体を合成する細胞を作製することにより、又は患者から得た試料（例；血液、骨髄）を共役体と併用することにより、共役体を培養細胞に加えてインビトロで送達することもできる。従って標的細胞としてはインビトロ細胞、すなわち培養動物細胞やヒト細胞や微生物、が可能である。診断、予防又は治療目的で共役体を適用する患者に共役体をインビボで送達することが可能である。標的細胞としてはインビボ細胞、すなわち生きた動物やヒトや生きた動物やヒトに存在する微生物の臓器や組織を構成する細胞が可能である。
【０１２６】
共役体は、ウイルス法又は非ウイルス法による送達が可能である。ウイルス送達系としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。非ウイルス送達系には、脂質媒介トランスフェクション、リポソーム、免疫リポソーム、リポフェクチン、カチオン性界面両親媒性物質（ＣＦＡ）、及びこれらを組合せた方法が含まれる。このような送達系の経路には、粘膜、鼻腔、経口、非経口、胃腸内、局所又は舌下経路が含まれるが、それらに限定されない。本発明の共役体は、ＤＮＡワクチン等の従来のＤＮＡ送達技術によって投与してよい。或いは注入してもよく、また送達するＤＮＡを塗布した金等の粒子を用いる弾丸送達により表皮に若しくは粘膜表面等の部位に、針を使用しない系で送達してもよい。
【０１２７】
本発明の共役体は、薬学上許容される担体又は希釈剤と共に医薬組成物に処方して患者に投与することが一般的である。処方は同定した化合物の性質や投与経路によって異なるが、局所、非経口、筋肉内、静脈内、腹腔内、鼻腔吸入、肺吸入、皮内、又は関節内に投与する処方が一般的である。共役体は注入可能な剤型で用いてもよい。従って、注入可能処方とするため、全身性の投与でもよいが好ましくは治療部位に直接注入するため、薬学上許容される媒体を化合物と混合してもよい。
【０１２８】
薬学上許容される担体若しくは希釈剤は、例えば、無菌の等張生理食塩水若しくはリン酸緩衝生理食塩水のような他の等張溶液でよい。本発明共役体は、好適な結合剤（１又は複数）、潤滑剤（１又は複数）、懸濁剤（１又は複数）、コーティング剤（１又は複数）、可溶化剤（１又は複数）と混合してもよい。化合物を経口で活性な剤型に処方することも好ましい。
【０１２９】
一般的に、本発明共役体を経口又は静脈内投与する場合の治療上有効な１日用量は、治療対象者の体重換算で０．０１〜５０ｍｇ／ｋｇであり、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇが好ましい。共役体を０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ／ｈｒの範囲の投与量で静脈内投与してもよい。
【０１３０】
共役体の錠剤又はカプセル剤は、必要に応じて同時に１個若しくは２個若しくは３個以上投与してよい。また、共役体を徐放性の処方として投与することも可能である。
【０１３１】
通常医師は、個々の患者にとって最適な実際の投与量を決めるが、それは個別の患者の年齢、体重、反応性によって異なる。上述の投与量は、平均的なケースを挙げたものである。個々の症例に応じて当然平均より高量投与若しくは低量投与が奏功する場合もあり、それらもまた本発明の範囲に該当する。
或いは本発明共役体を吸入により、又は座剤やペッサリーの剤型で、又はローション、液剤、クリーム、軟膏、又は粉剤の剤型で局所的に塗布することにより投与してもよい。経皮投与の別の方法としては、スキンパッチを用いる方法がある。例えば、ポリエチレングリコール水性乳剤又は液体パラフィンからなるクリームに化合物を含有させることができる。また、白ワックス又は白色軟パラフィン基剤からなる軟膏に共役体を重量濃度１〜１０％の範囲で、必要に応じて安定剤や保存料と共に含有させることもできる。
【０１３２】
適用例によっては共役体を、澱粉又はラクトース等の賦形剤を含む錠剤の剤型で、カプセル剤若しくは胚珠（ovule）剤を単独で又は賦形剤と混合して、或いは香料又は色素を含有するエリキシル剤、液剤又は懸濁剤の剤型で、経口投与することが好ましい。
【０１３３】
共役体は非経口に注入することも可能であり、陰茎海綿体内、静脈内、筋肉内、又は皮下への注入が例示できる。注入する場合、共役体には適切な担体又は希釈剤を含める。
【０１３４】
非経口投与の場合は、組成物を無菌水性溶液の剤型で使用することが最適であり、かかる溶液を血液と等張とするために例えば十分量の塩又は単糖類など、他の物質を含んでいてもよい。
【０１３５】
口腔内又は舌下に投与する場合、常法により処方可能な錠剤又はトローチ剤の剤型で組成物を投与してよい。
【０１３６】
対象（患者など）に経口、非経口、口腔内又は舌下投与する場合、本発明共役体、その薬学上許容される塩及び溶媒和物の１日用量は、通常１０〜５００ｍｇ（１回又は複数回に分けて）である。従って錠剤やカプセル剤には、例えば一度に１、２又は３錠以上を適宜に投与するため、活性化合物を５〜１００ｍｇ含有させてよい。上述したように、医師は個々の患者にとって最適な実際の投与量を決めるが、それは個々の患者の年齢、体重、反応性によって異なる。上記の投与量は平均的なケースであり、個々の症例に応じて当然平均より高量投与若しくは低量投与が奏功する場合もあり、そのような投与量の範囲もまた本発明の範囲に該当することに留意されたい。
【０１３７】
専門家であれば個々の患者にとって、例えば年齢、体重及び症状に応じて最適な投与経路や投与量を容易に決めることができるので、これまでに説明した投与経路及び投与量は単に指針としてのものである。
【０１３８】
ここに用いる治療や療法という用語は、診断及び予防を含意するものと理解される。
【０１３９】
本発明の治療には、ヒトと動物の両方への適用が含まれる。
【０１４０】
公知の送達系に対し、本発明共役体にはいくつかの長所がある。これらの長所としては、従来の治療に比した効率の向上、治療薬剤の細胞摂取率の向上、水に対する可溶性の向上、副作用及び細胞生体利用率の低減化、及び薬剤耐性発生の減少などが挙げられる。
【０１４１】
非限定的実施例及び添付の図面を参照しながら、本発明の種々の好ましい特徴や実施態様をより詳細に以下に述べる。
【０１４２】
別途特記しない限り本発明の実施には、当技術分野の専門家であれば実施可能な化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ及び免疫学における常法を採用する。かかる技術は文献に収載されている。J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N. Y.); B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak and James O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principles and Practice; Oxford University Press; M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press; and, D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press. を参照のこと。一般的なこれらの教本を参考文献として添付する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１４３】
ＭＨＣクラスII分子と結合可能なポリペプチド
好適実施態様において本発明共役体はＭＨＣクラスII分子によって認識される構造によりスーパー抗原として特徴付けられる。
【０１４４】
より詳細には、単一のペプチド抗原が、少数のＴ細胞クローンによって認識され、又は少数のＴ細胞クローンに対して免疫原性を示す一方、スーパー抗原として知られる抗原の特別な種類が複数細胞のＴ細胞クローンを刺激する能力を有している。細菌性及びウイルス性糖タンパク質としてこれまでに同定されているスーパー抗原は、ペプチド提示溝の外側でＭＨＣクラスII分子に対すると同様に多数のＴ細胞受容体Ｖβ配列との結合能を有することから、Ｔ細胞に対する超刺激因子である。図６に示すように、ＭＨＣ及びＴＣＲ分子の相対的に非多型性領域にスーパー抗原が結合することにより、ＴＣＲの抗原特異性とは無関係にＴ細胞の抗原提示細胞に対する接着が促進される。このようなＴＣＲとＭＨＣ分子との交叉結合によりＣＤ４+細胞の複数クローンが活性化される。
【０１４５】
スーパー抗原は、より低いストリンジェンシー下でＴＣＲ−ＭＨＣ複合体に結合して多数のＴ細胞を活性化する能力をもつ細菌及びウイルス由来の特殊なクラスの抗原であり、食中毒及び毒性ショック症候群等の重篤な疾患を引き起こす。
【０１４６】
ＭＨＣ分子の2本のへリックスの間に挿入することによって最も抗原性のあるペプチドがＴＣＲに対して提示されても、スーパー抗原はＭＨＣIIの側表面に結合する。さらにスーパー抗原は、抗原結合部位（ＣＤＲ３）の一部ではないＶβ遺伝子がコードするＴＣＲの部分に直接結合する。ＴＣＲαβへのスーパー抗原の結合はα鎖、及びＣＤＲ３をコードするセグメントであるＶβ鎖ＤＪセグメントに非依存であることを特記する。
【０１４７】
従って、スーパー抗原はＭＨＣ非拘束性にＴ細胞に対して提示され、特異的可変β遺伝子産物を有するＴ細胞受容体を発現するＴ細胞に対してのみ提示される。従って多くのＴ細胞は抗原非特異的かつＭＨＣ非拘束的に活性化される。
【０１４８】
好適なスーパー抗原は、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ、ＳＥＤ、ＳＥＥ及びＳＥＨ等のブドウ球菌外毒素（ＳＥｓ）、トキソイド、並びにそれらの活性断片からなるグループから選択される。かかるスーパー抗原にはウイルス性と並んで細菌性等の微生物産物、例えば毒性ショック症候群毒素（ＴＳＳＴ−１）等の連鎖球株由来産物など、また例えば発熱エキソトキシン（ＳＰＥ）等の連鎖球菌株由来産物などが含まれる。
【０１４９】
本発明に特に好ましい実施態様としては、ＴＳＳＴ−１を用いる。ＴＳＳＴ−１の結合ドメインについてWahlstein and Ramakrishnan (1998)が検討しており、ＴＳＳＴ−１は構造的に２つの異なるドメインで構成され、ＭＨＣII接触残基をＴＳＳＴ−１のＮ末端β−barrel内にＮ末端１〜８７残基に対応して局在化させることを確認している。ＴＳＳＴ−１のアミノ酸配列を図６に示す。Kum 2000は、ＴＳＳＴ−１の残基Ｇ３１／Ｓ３２がＭＨＣクラスII結合に重要であると報告しているが、ベータ１／ベータ２及びベータ３／ベータ４ループ内の領域からなる不連続エピトープなどの結合領域が他にも存在する。Rubinchik and Chow (2000) は、ＴＳＳＴ−１の４７〜６４残基がＭＨＣクラスII結合ドメインとして有用であると開示している。実施態様の１つにおいて用いた配列は、最初の約９０アミノ酸か、ＴＳＳＴ−１か、かかる配列と少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列類似性を有する配列、好ましくは同一の配列を有している。
【０１５０】
Papageorgiou et al (1999) は、ＳｐｅＡ ＭＨＣクラスII結合ドメインについて検討している。Roussel et al (1997) は、ＳｐｅＡにおける部位と類似の亜鉛結合部位を介してＳｐｅＣ ＭＨＣクラスII結合が生じると報告している。Sundstrom et al (1996) は、ＭＨＣクラスII分子との高親和性相互作用に関与するＺｎ2+ホモダイマーにＳＥＤが依存していることを報告している。
【０１５１】
ヘルペスウイルスsaimiri（ＨＶＳ）等のウイルスタンパク質由来のＭＨＣクラスII結合ドメインを使用してもよい。ＭＨＣクラスII分子を結合させる能力をもつＨＶＳタンパク質が米国特許第５７１６６２３号に開示されている。米国特許第５９２５７３４号にはＭＨＣクラスII分子に結合するEpstein Barr virus（ＥＢＶ）由来のウイルスタンパク質を開示している。
【０１５２】
向上したＭＨＣクラスII結合能を有する合成スーパー抗原を開発するために、構造に基づくドラッグデザインを用いることができる。
【０１５３】
上述のＭＨＣクラスII結合ドメイン又は今後使用可能になるＭＨＣクラスII結合ドメインはいずれも本発明で用いられる。
ノッチシグナル伝達調節タンパク質
ａ．ノッチシグナル伝達に関与するポリペプチド及びポリヌクレオチド
ノッチシグナル伝達のためのタンパク質とは、ノッチの活性化、ノッチシグナル伝達経路のダウンストリームイベント、標的遺伝子のダウンストリームにおける転写調節、及び他の非転写ダウンストリームイベント（例；既存タンパク質の翻訳後修飾）を含むノッチ受容体を介したシグナル伝達に関与する分子のことである。より具体的にノッチシグナル伝達のためのタンパク質とは、ノッチシグナル伝達経路の標的遺伝子を活性化するドメイン、又はそれをコードするポリヌクレオチド配列のことである。
【０１５４】
ノッチシグナル伝達経路における非常に重要な構成因子はノッチ受容体／ノッチリガンドの相互作用である。従ってノッチシグナル伝達は、ノッチリガンド又は受容体又はそれらの分解産物の発現、性質、活性量の変化に関係している。またノッチシグナル伝達は、ノッチシグナル伝達経路膜タンパク質、Ｇタンパク質、プロテアーゼやキナーゼ（例；セリン／トレオニンキナーゼ）、フォスファターゼ、リガーゼ（例；ユビキチンリガーゼ）、グリコシルトランスフェラーゼの発現、性質、活性量の変化に関係している。或いはノッチシグナル伝達は、転写因子等のＤＮＡ結合エレメントの発現、性質、活性量の変化に関係している。
【０１５５】
本発明においてノッチシグナル伝達は特異的シグナル伝達を意味し、これは検出されたシグナルが、サイトカインシグナル伝達などのように有意の妨害若しくは競合要因からよりも、実質的に若しくは少なくともプレドミナントにノッチシグナル伝達経路から、好ましくはノッチ／ノッチリガンド相互作用からもたらされることを意味する。実施態様の１つにおいて「ノッチシグナル伝達」なる用語はサイトカインのシグナル伝達は意味しない。ノッチシグナル伝達経路については以下に詳述する。
【０１５６】
タンパク質やポリペプチドは「成熟」タンパク質の形態でも、又は融合タンパク質や前駆体等の大きなタンパク質でもよい。例えば、分泌配列又はリーダー配列又はプロ配列（ＨＩＳオリゴマー、免疫グロブリンＦｃ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ＦＬＡＧ等）を含む付加アミノ酸配列を有することが精製をする上で好都合である。同様にかかる付加配列は、組換えによる作製過程において安定性を増すために望ましい場合がある。かかる場合、最終産物を得るために付加配列が開裂（例えば化学的に又は酵素により）してもよい。しかし場合によっては、付加配列が所望の薬理学的プロフィールをも付与するものであってもよく（ＩｇＦｃ融合タンパク質の場合のように）、その場合、投与する際の最終産物に付加配列が存在するように除去されないことが好ましい。
【０１５７】
一実施態様においてノッチを活性化するノッチリガンドは細胞上又は細胞膜上（細胞由来が好適）で発現されてもよい。
【０１５８】
ノッチシグナル伝達経路は胚における二細胞期の運命決定を指示する。ノッチはショウジョウバエにおいて2種の異なるリガンドであるデルタとセラートの受容体として機能する膜透過タンパク質として初めて見い出された。脊椎動物は複数のノッチ受容体及びリガンドを発現する（後述する）。これまでに少なくとも4種類のノッチ受容体（Notch-1、Notch-2、Notch-3、Notch-4）がヒト細胞で同定されている。
【０１５９】
ノッチタンパク質は、Furin様転換酵素により分解する単一のポリペプチド前駆体として合成される。Furin様転換酵素は2本のポリペプチド鎖をもたらし、かかるポリペプチド鎖は成熟受容体を形成すべくさらにプロセシングされる。細胞膜に存在するノッチ受容体には、2つのノッチタンパク質分解産物であるヘテロダイマーが含まれ、その1つには細胞外ドメイン、膜透過ドメイン及び細胞内ドメインの一部からなるＮ末端断片が含まれ、他方には細胞ドメインの大部分が含まれる。受容体を活性化するノッチのタンパク質分解過程は、ゴルジ装置で生じ、Furin様転換酵素に促進される。
【０１６０】
ノッチ受容体は、３６個までの上皮成長因子（ＥＧＦ）様反復［Notch１／２＝３６、Notch３＝３４、Notch４＝２９］を有する細胞外ドメインと細胞膜ドメインとを有する膜透過サブユニットからなるジスルフィド様ヘテロダイマー分子として膜に挿入する。ノッチの細胞質ドメインは、6個のアンキリン（ankyrin）様反復、ポリグルタミンのストレッチ（ＯＰＡ）及びＰＥＳＴ配列を有する。ＲＡＭ２３と名付けられたさらなるドメインがアンキリン反復の近傍に位置し、ショウジョウバエのHairless［Ｓｕ（Ｈ）］及び脊椎動物のＣＢＦ１（Tamura）のサプレッサーとして知られる転写因子との結合に関与している。ノッチリガンドはその細胞外ドメインにおいて、全てのノッチリガンドの特徴であるシステインリッチＤＳＬ（Delta-Serrate Lag2）ドメインと共に複数のＥＧＦ様反復も示す。ノッチ及びノッチ細胞内ドメインの概略図を図２及び図３に示す。
【０１６１】
ノッチ受容体は、デルタ、セラート、スカブロウ（Scabrous）等の細胞外リガンドが、ノッチの細胞外ドメインにおけるＥＧＦ様反復に結合することによって活性化される。デルタが活性化するためには分解が必要である。デルタはＡＤＡＭ ディスインテグリンメタロプロテアーゼ（disintegrin metalloprotease） Kuzbanianによって細胞表面で分解し、この分解現象により可溶性及び活性型のデルタが放出される。ＴＡＮ−１としても知られ、細胞外ドメインが切断されているヒトノッチ1タンパク質の発癌性変異体は構造的に活性であり、Ｔ細胞リンパ性白血病に関与していることが明らかになっている。
【０１６２】
ｃｄｃ１０／アンキリン細胞内ドメイン反復は、細胞内シグナル伝達タンパク質との物理的相互作用を促進する。最も顕著には、ｃｄｃ１０／アンキリン反復は、Hairless［Ｓｕ（Ｈ）］の抑制因子と相互作用を行う。Ｓｕ（Ｈ）は、Ｂ細胞のEpstein-Barr virusに誘導される不死化に関与する哺乳類ＤＮＡ結合タンパク質であるＣプロモーター結合因子−１［ＣＢＦ−１］のショウジョウバエにおけるホモログである。少なくとも培養細胞においてＳｕ（Ｈ）は、細胞質でｃｄｃ１０／アンキリン反復と会合し、ノッチ受容体がそのリガンドであるデルタと隣接細胞上で相互作用するのを受け、核内へと移行することが示されている。Ｓｕ（Ｈ）は、数種の遺伝子のプロモーター内でみられる応答エレメントを有し、ノッチシグナル伝達経路における重要なダウンストリームタンパク質であることがわかっている。Ｓｕ（Ｈ）の転写への関与はHairlessによって調節されると考えられている。
【０１６３】
ノッチ（NotchIC）の細胞内ドメインもまた直接的な核機能を有している（Lieber）。近年の研究により、ノッチの活性化には、ノッチの細胞内ドメインにおける６個のｃｄｃ１０／アンキリン反復が核に到達して転写活性に参加することが必要であることが実際に示されている。ノッチの細胞内尾部におけるタンパク質開裂部位はｇｌｙ１７４３及びｖａｌ１７４４（部位３又はＳ３と呼ばれる）の間で同定されている（Schroeter）。核への進入のためにｃｄｃ１０／アンキリン反復を放出するタンパク質開裂過程はプレセニリン（Presenilin）活性に依存する。
【０１６４】
細胞内ドメインは核内で蓄積して、核内においてＣＳＬファミリータンパク質ＣＢＦ１（Hairless、ショウジョウバエのＳｕ（Ｈ）、線虫のＬａｇ−２）と転写活性複合体を形成することが示されている（Schroeter; Struhl）。NotchIC−ＣＢＦ１複合体は次に、ｂＨＬＨタンパク質ＨＥＳ（split様のhairyエンハンサー）１及び５等の標的遺伝子を活性化する（Weinmaster）。かかるノッチの機能は哺乳類ノッチホモログについても報告されている（Lu）。
【０１６５】
ノッチリガンドのデルタ又はセラート／ジャグド（Jagged）との結合に応答した場合にのみＳ３プロセシングが生じる。ゴルジ（Munro; Ju）における発生期ノッチ受容体における翻訳後修飾は、２種類のリガンドのどちらが細胞表面で発現されるかを少なくとも部分的に制御しているようである。ノッチ受容体は、Notch／Linモチーフに結合するグリコシルトランスフェラーゼ酵素であるフリンジ（Fringe）により、その細胞外ドメインにおいて修飾される。フリンジは、ＥＧＦ様反復にＯ結合フコース基を付加することによってノッチを修飾する（Moloney; Bruckner）。フリンジによる修飾はリガンド結合を回避するものではないが、リガンドに誘導されるノッチの構造変化に影響する可能性がある。また、フリンジの作用はノッチを修飾してノッチがセラート／ジャグドリガンドと機能的に相互作用を行うことを妨げるが、優先的にデルタと結合させることが近年の研究から示唆されている（Panin; Hicks）。ショウジョウバエは単一のフリンジ遺伝子をもつが、脊椎動物は複数の遺伝子を発現することが知られている（Radical, Manic and Lunatic Fringes）（Irvine）。
【０１６６】
ノッチ受容体からのシグナル伝達は２種類の異なる経路を介してもたらされる（図４）。よりよく定義された経路には、ノッチの細胞内ドメイン（NotchIC）のタンパク質開裂が含まれ、かかるドメインは核まで移動してＣＳＬファミリータンパク質のＣＢＦ１（ショウジョウバエのHairless、Ｓｕ（Ｈ）、線虫のＬａｇ−２の抑制因子）と転写活性複合体を形成する。NotchIC−ＣＢＦ１複合体は次にｂＨＬＨタンパク質ＨＥＳ（split様のhairyエンハンサー）１及び５等の標的遺伝子を活性化する。ノッチはまた、細胞質亜鉛フィンガーを有するタンパク質Deltexを伴うＣＢＦ１非依存型様式でシグナルを送ることもできる。ＣＢＦ１とは異なりDeltexはノッチ活性化を受けて核に移行することはなく、その代わりにＧｒｂ２と相互作用してＲａｓ−ＪＮＫシグナル伝達経路を調節する。
【０１６７】
従ってノッチ受容体からのシグナル伝達は２種類の異なる経路を介して生じる。それらの経路を図４及び５に図示する。ノッチシグナル伝達経路の標的遺伝子にはDeltex、Ｈｅｓファミリー遺伝子（特にＨｅｓ−１）、Splitのエンハンサー［Ｅ（ｓｐｌ）］複合体遺伝子、ＩＬ−１０、ＣＤ−２３、ＣＤ−４及びＤｌｌ−１が含まれる。
【０１６８】
細胞内結合タンパク質のDeltexは図３に示すように、その相互作用部位を離れる際にＳｕ（Ｈ）をノッチの細胞内尾部と置き換える。Deltexは亜鉛フィンガーをもつ細胞質タンパク質である（Artavanis-Tsakonas; Osborne）。Deltexはノッチの細胞内ドメインにおけるアンキリン反復と相互作用を行う。DeltexがＧｒｂ２との相互作用によりＲａｓ−ＪＮＫシグナル伝達経路を調節し、ノッチ経路活性化を促進することが研究の結果示されている（Matsuno）。DeltexはまたＳｕ（Ｈ）がノッチ細胞内尾部と結合することを阻止する結合タンパク質としても作用する。従ってＳｕ（Ｈ）は核内へと放出され、核内において転写モジュレーターとして作用する。脊椎動物のＢ細胞系においてＳｕ（Ｈ）ホモログのＣＢＦ１よりむしろDeltexの方がＥ４７機能を阻止することに関与していることが近年の研究結果から示唆されている（Ordentlich）。ポジティブフィードバックループにおいてノッチが活性化される結果、Deltexの発現がアップレギュレートされる。ヒトDeltex（ＤＴＸ１）ｍＲＮＡの配列は、GenBank Accession No. ＡＦ０５３７００に登録されている。
【０１６９】
Ｈｅｓ−１（Split-1のHumpエンハンサー）（Takebayashi）は基本的なへリックス−ループ−へリックス構造を有する転写因子である。Ｈｅｓ−１はＣＤ４サイレンサーにおける重要な機能部位に結合し、ＣＤ４遺伝子発現を抑制する。従ってＨｅｓ−１はＴ細胞の運命決定に深く関与している。Ｈｅｓファミリーの他の遺伝子には、Ｈｅｓ−５（Splitホモログの哺乳類エンハンサー）とＨｅｓ−３が含まれ、Ｈｅｓ−５の発現もまたノッチ活性化によりアップレギュレーションされる。Ｈｅｓ−１の発現はノッチが活性化されることによりアップレギュレートされる。Mus musculus Ｈｅｓ−１の配列はGenBankに登録番号Ｄ１６４６４として登録されている。
【０１７０】
Ｅ（ｓｐｌ）遺伝子複合体［Ｅ（ｓｐｌ）−Ｃ］（Leimeister）には７種の遺伝子が含まれるが、そのうちＥ（ｓｐｌ）とGrouchoだけが変異体となったときに目に見える表現型を示す。Ｅ（ｓｐｌ）は、そのSplit変異を増強する能力から命名され、Splitはノッチの別名である。実際Ｅ（ｓｐｌ）−Ｃ遺伝子は、achaete−scute複合遺伝子発現を調節することによりデルタを抑制する。Ｅ（ｓｐｌ）の発現は、ノッチが活性化する結果としてアップレギュレーションされる。
【０１７１】
ＩＬ−１０（インターロイキン−１０）は、Ｔｈ２ヘルパーＴ細胞が産生する因子である。ＩＬ−１０はマスト細胞増殖におけるコレギュレーターであり、Epstein-Barr bcrfi 遺伝子と非常に高い相同性を示す。ＩＬ−１０はノッチシグナル伝達経路にとって直接のダウンストリーム標的であることは判明していないが、その発現はノッチの活性化に伴い顕著にアップレギュレートされることが見い出されている。ＩＬ−１０のｍＲＮＡ配列は、GenBankにＧＩ１０４１８１２として登録されている。
【０１７２】
ＣＤ２３は、ヒト白血球分化抗原ＣＤ２３（ＦＣＥ２）のことであり、Ｂ細胞の活性化及び増殖にとって肝要な分子である。ＣＤ２３はＩｇＥに対し、低親和性受容体である。また、切断化分子が分泌されて潜在的な分裂成長因子として機能する。ＣＤ２３はノッチシグナル伝達経路のダウンストリームにおける直接標的とは考えられていないが、その発現はノッチの活性化に伴い顕著にアップレギュレートされることが見い出されている。ＣＤ２３の配列は、GenBankにＧＩ１７８３３４４として登録されている。
【０１７３】
Ｄｌｘ−１（distalless−１）（McGuiness）の発現はノッチ活性化に伴いダウンレギュレートされる。Ｄｌｘ遺伝子の配列は、GenBankにＵ５１０００−３として登録されている。
【０１７４】
ＣＤ４の発現はノッチ活性化に伴いダウンレギュレートされる。ＣＤ４抗原の配列は、GenBankにＸＭ００６９６６として登録されている。
【０１７５】
ノッチシグナル伝達経路に関与する上述以外の遺伝子（例えばNumb、Mastermind、Ｄｓｈ）、及びその発現がノッチ活性化により調節される全ての遺伝子は本発明の範囲に含まれる。
【０１７６】
ｂ．ノッチシグナル伝達活性化のためのポリペプチド及びポリヌクレオチド
現在までに同定されている哺乳類ノッチリガンドの例としては、デルタ１（Genbank Accession No. AF003522 _ Homo sapiens）、デルタ３（Genbank Accession No. AF084576 _ Rattus norvegicus）、デルタ様３（Mus musculus）、等のデルタファミリー、セラート１やセラート２（ＷＯ９７／０１５７１、ＷＯ９６／２７６１０、ＷＯ９２／１９７３４）等のセラートファミリー、ジャグド１やジャグド２（Genbank Accession No. AF029778 _ Homo sapiens）、及びＬＡＧ−２が挙げられる。これらのファミリーメンバー間における相同性は著しい。例えば、ヒトジャグド２は、セラートに対し、４０．６％の相同性と５８．７％の類似性を示す。
【０１７７】
標準的手法を用いて既知の哺乳類ノッチリガンドのさらなるホモログを同定してもよい。「ホモログ」なる用語は、例えば上述したもののように既知のノッチリガンドのいずれかとの配列ホモロジー（アミノ酸若しくは核酸配列のホモロジーのどちらか）を示す遺伝子産物を意味する。通常、既知ノッチリガンドのホモログは、相当する既知ノッチリガンドにアミノ酸レベルで少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％一致する。２若しくは３以上のアミノ酸若しくは核酸配列間の配列ホモロジーを計算する方法又はソフトウエアは当技術分野で公知である（http:  HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov" www.ncbi.nlm.nih.gov. 及び Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons, Inc.を参照）。
【０１７８】
これまでに同定されているノッチリガンドには、該タンパク質のアミノ末端に、また細胞外表面の３〜８ＥＧＦ様反復間に２０〜２２アミノ酸を有する診断用ＤＳＬドメイン（D. Delta, S. Serate, L. Lag2）がある。従って、ノッチリガンドのホモログには、Ｎ末端に、また細胞外表面の３〜８ＥＧＦ様反復間にＤＳＬドメインも有する。
【０１７９】
タンパク質又はポリペプチドが、ＥＧＦドメイン又はその断片、誘導体、ホモログ、アナログ若しくは対立変異体の少なくとも１つにおいてノッチリガンドＤＳＬが含まれていることが好ましい。
【０１８０】
ノッチリガンドＤＳＬドメイン及び少なくとも１〜２０、好適には少なくとも３〜１５、例えば少なくとも３〜８個のノッチリガンドＥＧＦ反復モチーフがノッチを活性化するタンパク質に含まれることが好ましい。ＤＳＬ及びＥＧＦ配列が哺乳類配列であるか、哺乳類配列に相当することが好適である。好適配列にはヒト配列が含まれる。
ノッチリガンドドメイン
上述したとおり、ノッチリガンドは多数の異なるドメインを有する。種々の天然型ヒトノッチリガンドにおける予測／潜在的ドメイン位置（前駆タンパク質のアミノ酸番号に基づく）をいくつか以下に示す。
【０１８１】
【表４】
2005524381.tif 000006
【０１８２】
【表５】
2005524381.tif 000007
【０１８３】
【表６】
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【０１８４】
【表７】
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【０１８５】
【表８】
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ＤＳＬドメイン
通常のＤＳＬドメインには、以下のコンセンサスアミノ酸配列の殆ど又は全てが含まれていてもよい。
【０１８６】
【表９】
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ＤＳＬドメインには、以下のコンセンサスアミノ酸配列の殆ど又は全てが含まれていることが好ましい。
【０１８７】
【表１０】
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【０１８８】
【表１１】
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種々のソース由来のノッチリガンドにおけるＤＳＬアラインメントを図９に示す。
【０１８９】
使用するＤＳＬドメインは、例えばショウジョウバエ、アフリカツメガエル、ラット、マウス、ヒトなど、いかなる好適種に由来するものであってもよい。ＤＳＬは脊椎動物、好ましくは哺乳類、好ましくはヒトノッチリガンド配列に由来することが好ましい。
【０１９０】
例えば、本発明に使用するＤＳＬドメインは、ヒトジャグド１のＤＳＬドメインに対し、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有することが好適である。
【０１９１】
或いは、本発明に使用するＤＳＬドメインは、ヒトジャグド２のＤＳＬドメインに対し、例えば少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有していてもよい。
【０１９２】
或いは、本発明に使用するＤＳＬドメインは、ヒトデルタ１のＤＳＬドメインに対し、例えば少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有していてもよい。
或いは、本発明に使用するＤＳＬドメインは、ヒトデルタ３のＤＳＬドメインに対し、例えば少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有していてもよい。
【０１９３】
或いは、本発明に使用するＤＳＬドメインは、ヒトデルタ４のＤＳＬドメインに対し、例えば少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有していてもよい。
ＥＧＦドメイン
ＥＧＦやノッチやノッチリガンドと同様に、ＥＧＦ様モチーフも種々のタンパク質で見い出されており、その中には血液凝固カスケードに関与するものも含まれる（Furie and Furie, 1988, Cell 53: 505-518）。例えばこのモチーフは、血液凝固因子IX及びＸ（Rees et al., 1988, EMBO J. 7: 2053-2061; Furie and Furie, 1988, Cell 53: 505-518）等の細胞外タンパク質、他のショウジョウバエ遺伝子（Knust et al., 1987 EMBO J. 761-766; Rothberg et al., 1988, Cell 55: 1047-1059）、及びトロンボモジュリン等いくつかの細胞表面受容体タンパク質（Suzuki et al., 1987, EMBO J. 6: 1891-1897）、及びＬＤＬ受容体（Sudhof et al., 1985, Science 228: 815-822）で観察されている。トロンボモジュリンやウロキナーゼのＥＧＦ反復ドメインにタンパク質結合部位がマッピングされている（Kurosawa et al., 1988, J. Biol. Chem 263: 5993-5996; Appella et al., 1987, J. Biol. Chem. 262: 4437-4440）。
【０１９４】
PROSITEで報告されているようにＥＧＦドメインには、ジスルフィド結合に関与することがわかっている（ＥＧＦにおいて）6個のシステイン残基が通常含まれる。2本鎖βシートからループでＣ末端における2本鎖短シートに続く主要構造が提唱されているが、それは必要条件ではない。以下のＥＧＦ様ドメインの概略図に示すように保存されたシステイン間のサブドメインは、それぞれ長さが大きく異なっている。
【０１９５】
【表１２】
2005524381.tif 000014
５番目と６番目のシステインの間の領域には2個の保存されたグリシンが含まれ、少なくともそのいずれか1個は殆どのＥＧＦ様ドメインに普通存在している。
【０１９６】
用いるＥＧＦ様ドメインは、好適な種からであれば何に由来していてもよく、ショウジョウバエ、アフリカツメガエル、ラット、マウス又はヒト等が列挙できる。ＥＧＦ様ドメインは脊椎動物、好ましくは哺乳類、好ましくはヒトノッチリガンド配列に由来することが好ましい。
【０１９７】
例えば、本発明に用いるＥＧＦ様ドメインは、ヒトジャグド１のＥＧＦ様ドメインに対し、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を示す。
【０１９８】
或いは、本発明に用いるＥＧＦ様ドメインは、ヒトジャグド２のＥＧＦ様ドメインに対し、例えば少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を示す。
【０１９９】
或いは、本発明に用いるＥＧＦ様ドメインは、ヒトデルタ１のＥＧＦ様ドメインに対し、例えば少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を示す。
【０２００】
或いは、本発明に用いるＥＧＦ様ドメインは、ヒトデルタ３のＥＧＦ様ドメインに対し、例えば少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を示す。
【０２０１】
或いは、本発明に用いるＥＧＦ様ドメインは、ヒトデルタ４のＥＧＦ様ドメインに対し、例えば少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を示す。
【０２０２】
ノッチリガンド、ホモログ、ノッチリガンドドメインの組合せのいずれかが活性であるか否かは、以下の実施例２に記載するアッセイなどにより測定できる。
【０２０３】
さらにノッチリガンドの好適ホモログは、ノッチ受容体への結合能を有する。インビトロ結合アッセイ等の当技術分野で公知の種々の方法により結合を調べることができる。
【０２０４】
ノッチリガンドのホモログは多数の方法で同定することができ、例えば中程度から高度なストリンジェンシー下（例えば、約５０℃〜約６０℃にて０．０３Ｍの塩化ナトリウム及び０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム）において、ノッチリガンドをコードする核酸の全部又は一部を含むプローブを用いてゲノムライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーをプローブする方法が挙げられる。或いは、保存アミノ酸配列をコードする変異体やホモログ内の配列を標的とするように設計したプライマーを一般に用いる変性ＰＣＲを用いてホモログを得てもよい。かかるプライマーには１若しくは２以上の変性部分が含まれ、既知配列に対する単一配列プライマーを用いて配列をクローニングする際の条件より緩やかなストリンジェンシー条件で使用する。
【０２０５】
ノッチシグナル伝達経路を活性化することができる物質としては他に、骨形成タンパク質（ＢＭＰｓ）に結合してその活性を低減若しくは中和するポリペプチドなどの、ノッチリガンド発現をアップレギュレートする能力を有する化合物が含まれる。細胞外ＢＭＰｓ（Wilson and Hemmati-Brivanlou, Hemmati-Brivanlou and Melton）がその受容体に結合するとachaete／scute複合体の転写因子の発現が阻害されてデルタの転写がダウンレギュレートされる。この複合体は直接デルタの発現調節に関与していると考えられている。従って、ＢＭＰ発現を阻害する及び／又は受容体へのＢＭＰｓの結合を阻害する物質であれば、デルタ及び／又はセラート等のノッチリガンドの発現を亢進する能力がある可能性がある。かかるインヒビターの具体例としては、Noggin（Valenzuela）、Chordin（Sasai）、Follistatin（Iemura）、Ｘｎｒ３、及びそれらの誘導体及び変異体が挙げられる。Noggin及びChordinはＢＭＰｓに結合することにより、そのシグナル伝達カスケードの活性化を阻止し、その結果デルタの転写を減少させる。結果的に、Noggin及びChordinのレベルが増加することにより、ノッチリガンド、特にデルタ、の発現が亢進する。
【０２０６】
さらに、achaete／scute複合体転写因子の発現をアップレギュレートする物質のいずれもまたノッチリガンドの発現をアップレギュレートする。
【０２０７】
ノッチリガンド発現のアップレギュレーションに用いられる好適物質としては他にも、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーのメンバーなどの線維芽細胞成長因子が挙げられる。ＦＧＦファミリーは、哺乳類塩基性ＦＧＦ、酸性ＦＧＦや、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７等のＦＧＦファミリーの他のメンバーでよい。ＦＧＦが酸性ＦＧＦ（ＦＧＦ−１；Zhao）ではないことが好ましい。最も好ましいのは、ＦＧＦが、ＡＰＣｓ上でセラートポリペプチド発現のアップレギュレーションを刺激することにより作用するＦＧＦファミリーのメンバーであることである。本発明者らは、ＦＧＦファミリーメンバーがＡＰＣｓにおいてセラート−１遺伝子発現をアップレギュレートできることを明らかにした。
【０２０８】
免疫抑制サイトカインもまたノッチリガンド発現のアップレギュレーションに用いてよい。かかるサイトカインとしては、ＴＧＦ−β−１及びＴＧＦ−β−２等のＴＧＦ−βファミリーメンバーや、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３等のインターロイキンや、ＦＬＴ３リガンドが例示される。ＴＧＦ−βファミリーはノッチの、特にノッチ１の発現をアップレギュレートでき、ＩＬ−１０はセラートの、特にセラート１の発現をアップレギュレートでき、ＩＬ−１０はノッチ、デルタ及びセラートの、特にノッチ２、ノッチ４、デルタ１、セラート１の発現をアップレギュレートできる。またＩＬ−１０は、セラートの、とくにセラート１の発現をアップレギュレートできる。
【０２０９】
ノッチ又はノッチリガンドの発現をアップレギュレーションできる物質は、合成化合物及び天然化合物を含むポリペプチド及びその断片、線状ペプチド、環状ペプチドから選択してよい。ノッチリガンドの発現をアップレギュレートできる物質は、細胞外マトリックスの構成要素などの生物材料に由来していてもよい。目などの免疫学的寛容部位由来の細胞外マトリックス構成要素が好ましい。例えば水性体液又はその構成要素が用いられる。
【０２１０】
Noggin、ＦＧＦｓ及びＴＧＦ−β等のポリペプチド物質は、適当な宿主細胞で組換え発現させて得た哺乳類細胞、又は市販の哺乳類細胞から精製してよい。或いは、ポリペプチドをコードする核酸構築物を導入してもよい。さらなる実施例として、セラートやデルタ遺伝子等の内因性遺伝子を活性化できる核酸構築物を導入することにより、ノッチ又はデルタやセラート等のノッチリガンドを過剰発現させてもよい。特に、標的細胞のゲノムにおいてセラートやデルタプロモーター等の天然型プロモーターの場所に異種プロモーターを挿入する異種組換えを行うことにより遺伝子を活性化させることができる。
【０２１１】
本発明の活性化分子は、別の実施態様においてノッチタンパク質の発現若しくは細胞膜上での提示、又はシグナル伝達経路を調節する能力をもつ。標的細胞表面において完全に機能的なノッチタンパク質の提示を強化する薬剤には、ショウジョウバエのKuzbanian遺伝子産物及び他のADAMALYSIN遺伝子ファミリーメンバー等のマトリックスメタロプロテイナーゼが含まれる。
【０２１２】
ノッチシグナル伝達経路のアクチベーターとしては、上述の活性化剤に対する抗体も含まれる。
【０２１３】
ｃ．ノッチシグナル伝達を阻害するポリペプチド及びポリヌクレオチド
ノッチリガンドの発現を阻害するために用いる物質には、ノッチリガンドをコードする遺伝子の発現に影響するポリペプチドをコードする核酸配列が含まれる。例えばデルタの発現に関しては、細胞外ＢＭＰｓ（骨形成タンパク質、Wilson and Hemmati-Brivanlou; Hemmati-Brivanlou and Melton）がその受容体に結合することにより、achaete／scute複合体転写因子の発現が阻害されてデルタの転写がダウンレギュレートされる。この複合体はデルタ発現の調節に直接関与していると考えられている。従って、ＢＭＰ発現をアップレギュレートし、及び／又はＢＭＰとその受容体との結合を刺激するポリペプチドであれば、デルタ及び／又はセラートなどのノッチリガンドの発現を減少させることができる。ＢＭＰ自身をコードする核酸が例として挙げられる。さらに、achaete／scute複合体転写因子の発現を阻害する物質であればやはりノッチリガンドの発現をダウンレギュレートする可能性がある。
ＢＭＰファミリーのメンバーには、ＢＭＰ１〜ＢＭＰ６、ＯＰ１とも呼ばれるＢＭＰ７、ＯＰ２（ＢＭＰ８）などが含まれる。ＢＭＰｓは形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーに属し、このスーパーファミリーにはＴＧＦ−β以外にもアクチビン／インヒビン（例；α−インヒビン）、mullerian阻害物質、グリア細胞株由来神経栄養因子などが属している。
【０２１４】
デルタ及び／又はセラートの発現を阻害するポリペプチドの例としては他にも、トール様受容体（Medzhitov）又は先天免疫系（例；ＣＤ１４、補体受容体、スカベンジャー受容体、ディフェンシン（defensin）タンパク質）に結合する他の受容体、また、Noggin（Valenzuela）、Chordin（Sasai）、Follistatin（Iemura）、Ｘｎｒ３又はそれらの誘導体若しくは変異体の産生を低減若しくは抑止する上記以外のポリペプチドが挙げられる。Noggin及びChordinはＢＭＰｓに結合するので、デルタの転写を減少させるＢＭＰｓのシグナル伝達カスケードの活性化を阻止する。その結果、Noggin及びChordinのレベルを減少させることにより、ノッチリガンド、特にデルタの発現が減少する。
より詳細には、ショウジョウバエではトール膜透過型受容体が、非特異的先天免疫応答を優先的に制御するシグナル伝達経路において主要な役割を担っている。かかるトール介在型免疫応答は、広汎な生物にわたりホモログな構成要素をもつ始原的保存シグナル伝達系を反映するものである。トール様受容体（ＴＬＲ）遺伝子及びトール／インターロイキン−１受容体様（ＴＩＬ）遺伝子の中で、ヒトトールホモログが同定されており、それらは、細胞外ロイシンリッチ反復ドメイン及び細胞質インターロイキン−１受容体様領域というトールモチーフの特徴を有している。トール様受容体遺伝子（ＴＩＬ遺伝子を含む）には現在、ＴＬＲ４、ＴＩＬ３、ＴＩＬ４、及びこれら以外に同定されているＴＬＲ遺伝子４種類が含まれる。
【０２１５】
ノッチリガンドの発現をダウンレギュレートすることに用いる好適配列としては他にも、免疫共刺激分子（例；ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＯＳ、ＳＬＡＭ）や免疫増強作用と関連する他の補助分子（例；ＣＤ２、ＬＦＡ−１）をコードする配列が含まれる。
ノッチリガンドの発現をダウンレギュレートすることに用いる好適配列としては他にも、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーのメンバーなどの形質転換成長因子の効果を阻害する核酸が含まれる。かかるＴＧＦは、哺乳類塩基性ＦＧＦ、酸性ＦＧＦ、又はＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７等のＦＧＦファミリーの他のメンバーであってよい。ＦＧＦは酸性ＦＧＦ（ＦＧＦ−１；Zhao et al., 1995）でないことが好ましい。ＦＧＦが、ＡＰＣｓ上でセラートポリペプチドの発現をアップレギュレートさせるように刺激することにより作用するＦＧＦファミリーのメンバーであることが最も好ましい。本発明者らはＦＧＦファミリーのメンバーがＡＰＣｓ上におけるセラート−１遺伝子発現をアップレギュレートできることを示した。
好適核酸配列には、例えばノッチリガンド発現のアップレギュレーション因子の発現を減少させ若しくは阻害するように設計したアンチセンス構築物と並び、アンチセンスノッチリガンド構築物をコードする核酸配列などのアンチセンス構築物が含まれる（上記を参照）。アンチセンス核酸は合成１本鎖ＤＮＡ等のオリゴヌクレオチドでもよい。しかしアンチセンスが、遺伝的ベクターの導入により患者自身の細胞で産生されるアンチセンスＲＮＡであることがより好ましい。かかるベクターは、宿主細胞へのベクター導入後に所望の特異性をもつアンチセンスＲＮＡの産生に関与している。
【０２１６】
好ましくは本発明に用いる核酸配列はセラート及びデルタ、好ましくは樹状細胞等のＡＰＣｓにおいてデルタ１及びデルタ３の発現と共にセラート１及びセラート２の発現を阻害する能力をもつ。特にかかる核酸配列はＡＰＣｓにおいてセラートの発現阻害能を有しても、デルタ発現に対する阻害能はもたない。或いは本発明に用いる核酸配列は、ＣＤ４+ヘルパーＴ細胞等のＴ細胞又はデルタを発現する他の免疫系細胞（例えば細胞表面受容体による刺激に応答して）におけるデルタ発現に対する阻害能を有する。特にＴ細胞において核酸配列はデルタ発現を阻害する能力を有してもよいが、セラート発現を阻害することはできない。特に好適な実施態様では核酸配列が、Ｔ細胞とＡＰＣの両方においてノッチリガンド発現を、例えばＡＰＣｓでセラート発現を、Ｔ細胞においてデルタ発現を阻害できる。
【０２１７】
ノッチリガンドの発現をダウンレギュレートするのに用いられる好適物質としては成長因子やサイトカインが例示できる。より好ましくは、ノッチ又はノッチリガンドの発現を阻害するのに可溶性タンパク質成長因子を用いる。例えばＢＭＰｓやアクチビン（ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバー）を加えることによりノッチリガンドの発現が減少又は阻害される。さらに、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１８、ＴＮＦ−αを含む炎症型サイトカインを単独又はＢＭＰｓと組み合わせた存在下において、Ｔ細胞、ＡＰＣｓ又は腫瘍細胞を培養することもできる。
ノッチシグナル伝達を阻害する分子にも、細胞膜上やシグナル伝達経路におけるノッチタンパク質の発現又は提示を調節する能力をもつポリペプチド又はかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれる。完全に機能的な細胞膜タンパク質としての提示を低減又は阻止する分子には、ヒドロキシム酸に基づくインヒビター等のＭＭＰ阻害剤が含まれる。
【０２１８】
ノッチとノッチリガンドとの間の相互作用を低減させるのに用いる物質としては他にも内因性ノッチ若しくはノッチリガンド又はそれらの機能的誘導体がある。このようなノッチリガンド誘導体は、細胞外表面においてＮ末端及びＥＧＦ様反復の３〜８番目の間にＤＳＬドメインを有することが好ましい。ｈジャグド１のデルタ／セラート／ＬＡＧ−２ドメインに相当するペプチド、及びｈジャグド１の細胞外部分の可溶形態を発現するＣＯＳ細胞から得た上清は、ノッチ１の阻害においてジャグド１の効果を模倣することが判明している（Li）。
【０２１９】
他のノッチシグナル伝達経路アンタゴニストには、ノッチシグナル伝達経路の構成因子間の相互作用を阻害する抗体、例えばノッチリガンドに対する抗体が含まれる。
ある物質が、ノッチ−ノッチリガンド発現の調節に用いることができるかどうかについては適当なスクリーニングアッセイにより調べられる。
ノッチシグナル伝達はプロテインアッセイ又は核酸アッセイにより観察できる。ノッチ受容体の活性化により、その細胞質ドメインにタンパク質開裂が生じ、細胞核へと移入する。ここにおける「検出可能なシグナル」とは、ノッチの開裂した細胞内ドメインの存在に起因する検出可能な発現のことである。従ってノッチシグナル伝達の亢進は、開裂したノッチドメインの細胞内濃度を測定することによりタンパク質レベルでの検定が可能である。ノッチ受容体の活性化もまた一連のダウンストリームでの反応を触媒し、よく定義された遺伝子の発現レベルの変化をもたらす。従って、ノッチシグナル伝達の亢進は、例えば特異的ｍＲＮＡの細胞内濃度を測定することにより、核酸レベルで検定することができる。本発明の一好適実施態様ではこのようなアッセイは核酸アッセイである。
核酸アッセイを採用する利点は、このアッセイが高感度であり、小試料の分析も可能だという点にある。
【０２２０】
所定の時間に測定する特定ｍＲＮＡの細胞内濃度は、その時間における相当遺伝子の発現レベルを反映するものである。従って、ノッチシグナル伝達経路のダウンストリーム標的遺伝子のｍＲＮＡレベルは、免疫系Ｔ細胞の間接的アッセイを行うことによって測定できる。特に、Deltex、ＨＥＳ−１及び／又はＩＬ−１０のｍＲＮＡは例えばアレルギーの誘導を示し、Ｄｌｌ−１又はＩＦＮ−γｍＲＮＡ、又はＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−１３等のサイトカインをコードするｍＲＮＡのレベルは応答性の向上を示す。
種々の核酸アッセイもまた知られている。公知の、又は後に開示されている常法であればどれを採用してもよい。好適な核酸アッセイとしては以下に説明する増幅法、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅプロテクション法、ブロット法、分光分析、レポーター遺伝子アッセイ、遺伝子チップアレイ法、またこれら以外のハイブリダイゼーション法などが列挙される。
【０２２１】
標的遺伝子の存在、増幅、及び／又は発現は、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来式サザンブロッティング、標的ｍＲＮＡの転写量を測定するノーザンブロッティング、ドットブロッティング（ＤＮＡ又はＲＮＡ分析）、又はインサイチューハイブリダイゼーションにより試料から直接測定される。当技術分野の専門家であれば、所望する場合、これらの方法に如何なる変更を加えればよいかを容易に構想できる。
ＰＣＲは元々、不純試料からＤＮＡを増幅する手段として開発された。この技術は反応液を繰り返し熱したり冷却したりの温度サイクルを基礎とし、それによりプライマーを標的配列にアニーリングさせ、これらプライマーを伸張することにより、娘鎖の複製を形成するものである。ＲＴ−ＰＣＲは、逆転写酵素を用いて第１鎖ｃＤＮＡを作製する際にＲＮＡ鋳型を使用する。次にこのｃＤＮＡを標準的なＰＣＲプロトコールに則って増幅する。合成と変性のサイクルを反復して行うことにより、作製する標的ＤＮＡの複製数が指数関数的に増加する。しかし反応成分が限られてくるに従って増幅速度が低下し、やがて停滞期に達し、ＰＣＲ産物における純増加は殆ど或いは全く認められなくなる。反応開始時点における核酸標的の複製数が多いほど、かかる「終点」に早く到達する。
【０２２２】
リアルタイムＰＣＲは、蛍光タグ又は蛍光染色で標識したプローブを使用し、サイクルを規定回数行った後の産物蓄積量の測定というよりむしろ蓄積していくＰＣＲ産物の検出に用いられるという点で、定量アッセイに用いる終点ＰＣＲとは異なる。蛍光の有意な増加に基づいて標的配列の増幅が最初に検出されるのがサイクル中のどの時点であるかによって反応が特徴付けられる。
【０２２３】
リボ核酸プロテクション（ＲＮａｓｅプロテクション）アッセイは、溶液中の特異的ＲＮＡの定量法として非常に高感度な方法である。リボ核酸プロテクションアッセイは、標的としての全細胞ＲＮＡ又はポリ（Ａ）選択性ｍＲＮＡで行うことができる。リボ核酸プロテクションアッセイの感度は、高度に特異的な活性に対して放射標識された相補的インビトロ転写プローブを使用することに基づいている。かかるプローブと標的ＲＮＡを溶液中でハイブリダイズさせた後、この混合物をリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）で希釈し、処理し、残存する１本鎖ＲＮＡを全て分解する。プローブのハイブリダイズした部分は分解から保護され、上記混合物を、変性ポリアクリルアミドゲル上における電気泳動後さらにオートラジオグラフィーにかけることにより、ハイブリダイズした部分を視覚化できる。保護された断片は高分解能ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析されるので、リボ核酸プロテクションアッセイはｍＲＮＡの特性を正確にマッピングするために採用できる。標的ＲＮＡに対して過剰なモル下でプローブがハイブリダイズされる場合、得られるシグナルは試料中の相補ＲＮＡ量と正比例する。
【０２２４】
遺伝子発現はレポーター系を使用して検出してもよい。かかるレポーター系には、発現系（例えば観察を行っている遺伝子の発現系）の制御下にあって容易に同定できるマーカーが含まれる。ＦＡＣＳによる検出及びソーティングが可能な蛍光マーカーが好ましい。特に好ましいのはＧＦＰとルシフェラーゼである。好ましいレポーターとしては他にも細胞表面マーカー、すなわち細胞表面で発現するので容易に同定できるタンパク質がある。
【０２２５】
一般的に、レポーター遺伝子を発現させてヘッジホッグシグナル伝達を測定する上で有用なレポーター構築物は、Sambrook et al (1989) の一般的教示に従って構築してよい。本発明における構築物は通常、目的とする遺伝子の（すなわち内因性標的遺伝子の）プロモーター、並びにＧＦＰやルシフェラーゼなどの所望のレポーター構築物をコードするコーディング配列を有している。ＧＦＰ及びルシフェラーゼをコードするベクターは当技術分野では公知であり市販もされている。
【０２２６】
標的遺伝子の発現を検出することによる細胞ソーティングは、当技術分野で公知の上記いずれの手法で実施してもよい。例えば細胞をフローサイトメトリーすなわちＦＡＣＳでソーティングしてもよい。全般的な内容に関しては、Flow Cytometry and Cell Sorting: A Laboratory Manual (1992) A. Radbruch (Ed.), Springer Laboratory, New York を参照のこと。
【０２２７】
フローサイトメトリーは、細胞の研究及び精製において強力な手法である。フローサイトメトリーは広範に、特に免疫学や細胞生物学の分野において利用されているが、ＦＡＣＳの能力は、生物学の他の多くの分野において利用できる。頭文字のＦ．Ａ．Ｃ．Ｓ．は、Fluorescence Activated Cell Sorting を表し、「フローサイトメトリー」と互換性のある用語である。ＦＡＣＳの原理は、液体の細い流れに保持された個別の細胞を１若しくは２以上のレーザービームに通すことにより光を散乱させ、種々の頻度で蛍光染色を発光させるというものである。光電子増倍管（ＰＭＴ）は光を電子シグナルに転換し、この電子シグナルをソフトウエアで解析して細胞のデータを作成する。定義付けされた特徴を有する細胞サブ集団が同定され、極めて高純度（〜１００％）にて懸濁液から自動的にソーティングされる。
【０２２８】
ＦＡＣＳは、ポリペプチドをコードする組換えＤＮＡをトランスフェクトした細胞における標的遺伝子の発現を測定するのに用いられる。これは、かかるタンパク質産物を標識することにより直接、或いは構築物中のレポーター遺伝子を使用して間接的に行うことができる。レポーター遺伝子としては、β−ガラクトシダーゼやグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が例示される。β−ガラクトシダーゼの活性は、フルオレセインジガラクトシド（ＦＤＧ）等の蛍光基質を用いるＦＡＣＳによる検出が可能である。ＦＤＧは、低張性ショックを与えることによって細胞内に導入され、酵素によって開裂して蛍光産物を作り出す。この蛍光産物は細胞内に留め置かれる。従って１種の酵素で大量の蛍光産物を産出できるのである。ＧＦＰ構築物を発現する細胞は、基質を加えることなく蛍光発色する。励起頻度が異なっても同一チャネルで蛍光発色するＧＦＰ変異体は利用可能である。Two-laserＦＡＣＳ機器では、異なるレーザー光線によって励起される細胞の識別が可能であり、よってトランスフェクション２種類のアッセイを同時に行うことができる。
【０２２９】
別のセルソーティング法を利用してもよい。例えば、本発明には、ｍＲＮＡに相補的な核酸プローブの使用も含まれる。かかるプローブは、別々にポリペプチドを発現する細胞を同定することに用いられ、それらの細胞はその後マニュアルソーティング法又はＦＡＣＳソーティング法によりソーティングされる。ｍＲＮＡに相補的な核酸プローブは、Sambrook et al (1989) の一般的なプロトコールを用いる上述の教示に従って調製する。
【０２３０】
好適実施態様において本発明には、ＦＡＣＳセルソーティング法で用いる蛍光体に結合させ、標的ｍＲＮＡに相補的なアンチセンス核酸分子の使用も含まれる。
【０２３１】
所謂遺伝子チップアレイや高密度ＤＮＡアレイを使用して、遺伝子の発現や同一性に関する情報を得る各種方法についての記載もある（Chee）。これらの高密度アレイは、診断及び予防の目的で特に有用である。In Vivo Expression Technology（ＩＶＥＴ）（Camilli）も使用してもよい。ＩＶＥＴでは、例えば治療や疾患の過程において実験培養の場合と比較してアップレギュレートされた標的遺伝子を同定する。
【０２３２】
プロテインアッセイ（タンパク質測定法）を使用することの利点は、ノッチの活性を直接測定できることである。ポリペプチドレベルを測定するために利用可能なアッセイ技術は、当技術分野の専門家には十分公知である。そのようなアッセイ法には、放射免疫測定法、競合結合測定法、タンパク質ゲル測定法、ウエスタンブロット分析、抗体サンドイッチアッセイ、抗体検出法、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡが含まれる。
初回免疫したＡＰＣｓ及びリンパ球の調製
本発明の特徴の１つによれば、免疫細胞を使用して抗原又はアレルゲンを提示し、及び／又は免疫細胞を処理してノッチ、ノッチリガンド若しくはノッチシグナル伝達経路の発現や相互作用を調節する。従って例えば抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）をＤＭＥＭや他の定義された培地等の好適な培養培地において、任意にウシ胎児血清等の血清存在下で培養する。サイトカインの最適濃度は滴定によって決定できる。一般的には次に、ノッチシグナル伝達経路をアップレギュレート又はダウンレギュレートすることが可能な１若しくは２以上の物質を目的抗原と共に培養培地に加える。この抗原は物質（１若しくは複数）添加の前、後、若しくは実質的に同時に加えてよい。通常、上記物質（１若しくは複数）及び抗原の共存下で細胞を少なくとも１時間、好ましくは少なくとも３時間、必要に応じて少なくとも１２時間以上３７℃でインキュベーションする。必要に応じ、上述のとおりに少量の細胞を検定して標的遺伝子の調節された発現を調べてもよい。或いはＷＯ９８／２０１４２に記載があるように、表面マーカー、サイトカインの分泌や増殖を観察してＴ細胞活性化の阻害を調べることにより細胞活性を測定してもよい。セラートなどの発現を指示する核酸構築物でトランスフェクトしたＡＰＣｓを対照としてもよい。
【０２３３】
上述したとおり、ポリペプチドをコードする核酸構築物／ウイルスベクターを、ＡＰＣにおける該ポリペプチド発現が可能な条件下で細胞に導入することによって該ポリペプチド物質を上記ＡＰＣに投与してもよい。同様に、抗原をコードする核酸構築物をトランスフェクション、ウイルス感染、又はウイルス形質導入によってＡＰＣｓに導入してもよい。その結果得られるノッチシグナル伝達のレベルが上昇したＡＰＣｓは直ちに使用に供すことができる。
【０２３４】
後述する技術はＴ細胞との関連で説明するが、Ｂ細胞にも同じように適用できる。用いる技術は、Ｔ細胞を通常ＡＰＣｓと共培養する以外は基本的にＡＰＣｓ単独に対するものと同じである。しかし、まず初回免疫（初回抗原投与）したＡＰＣｓを調製し、次にそれらのＡＰＣｓをＴ細胞共存下でインキュベートすることが好ましい。例えば、初回免疫したＡＰＣｓを一旦調製した後、新鮮培養培地に再懸濁する前にかかるＡＰＣｓをペレット状にしてＰＢＳで洗浄してよい。この方法は、例えばＡＰＣに用いるものとは異なる、プレセニリンを調節できる物質（１若しくは複数）でＴ細胞を処理することが望まれる場合に利点があり、その場合Ｔ細胞は、ＡＰＣに用いた異なる物質（１若しくは複数）と接触することはない。或いは、プレセニリン若しくはプレセニリン依存性γ−セクレターゼ（secretase）及び任意にノッチシグナル伝達を調節するためにＴ細胞を第１物質（又は物質のセット）とコインキュベートし、洗浄し、再懸濁して、ＡＰＣ調節に用いる物質（１若しくは複数）及びＴ細胞調節に用いる物質（１若しくは複数）の両方の不在下かつ初回免疫したＡＰＣ共存下にてインキュベーションする。或いはＴ細胞をＡＰＣｓ不在下で、抗ＴＣＲ抗体（例；抗ＣＤ３抗体）等のＡＰＣ代替物を用いて、共刺激分子（例；抗ＣＤ２８抗体）に対する抗体の存在下又は不在下で培養し、初回免疫する。又はＭＨＣ−ペプチド複合体（例；テトラマー）を用いてＴ細胞を活性化する。
【０２３５】
インキュベーションは通常少なくとも１時間、好ましくは少なくとも３若しくは６時間、３７℃下で好適培地にて行う。次いでＴ細胞を抗原で追加免疫し、ＡＰＣｓに暴露しなかった対照細胞との比較においてＩＬ−２産生量を測定することにより、免疫寛容が誘導されたかどうかを調べる。
【０２３６】
上記の方法で初回免疫したＴ細胞又はＢ細胞を本発明に従って用いることにより、他のＴ細胞又はＢ細胞に免疫寛容を誘導する。
【０２３７】
実施例１
ＴＳＳＴ１のＮ末端９０アミノ酸とヒトジャグド１のＮ末端断片の間で、ジャグド１断片が融合タンパク質のＮ末端に、ＴＳＳＴ１断片がＣ末端に位置するようにして融合タンパク質を作製した。
【０２３８】
幼若タンパク質配列の第１アミノ酸（すなわち転写を開始するＭｅｔ（Ｍ）残基）から第２９６アミノ酸（Ａｓｐ（Ｄ））にかけてコードするヒトジャグド１（hJag１）ｃＤＮＡ（GenBank登録番号Ｕ６１２７６）の断片をｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター（Invitrogen社製、Carlsbad, CA, USA 及びPaisley社製、UK）において調製した。上記ジャグド１ｃＤＮＡ断片の核酸配列は以下のとおりである。
【０２３９】
【表１３】
2005524381.tif 000015
【０２４０】
２９６アミノ酸は制限部位BglIIの認識配列（ＡＧＡＴＣＴ）の一部を自然に形成するので、BglII／EcoRI片としてBglII部位を用い、ＴＳＳＴ−１断片部位をインフレームでhJagged１ベクターにクローニングし、以下をコードするオープンリーディングフレームを作製した。
ｈＪａｇ１の１〜２９６アミノ酸；（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）5人工リンカー；ＴＳＳＴ−1 Ｎ末端配列の１〜９０アミノ酸
得られた融合タンパク質におけるｈＪａｇ１の２９６アミノ酸断片は以下のアミノ酸配列を有していた。
【０２４１】
【表１４】
2005524381.tif 000016
得られた融合タンパク質におけるＴＳＳＴ−１のＮ末端９０アミノ酸断片は以下のアミノ酸配列を有していた
【０２４２】
【表１５】
2005524381.tif 000017
得られた融合タンパク質における（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）5人工リンカー配列のアミノ酸配列は、GSGSGSGSGSだった。
【０２４３】
融合タンパク質におけるＴＳＳＴ／リンカー部分を得るために、ＴＳＳＴ−１Ｎ末端配列の１〜９０アミノ酸及び５'（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）5リンカーをコードするポリヌクレオチドを下記の核酸配列を用いて作製した。
【０２４４】
【表１６】
2005524381.tif 000018
【０２４５】
このポリヌクレオチドは、遺伝子アセンブリー（オリゴヌクレオチドプライマーを使用し、続いてBglIIとEcoRI部位をそれぞれ導入するのと同時に５'及び３'末端から増幅するように設計したオリゴヌクレオチドプライマーを使用してＰＣＲ増幅を行う）により、またオーバーラップしている「上鎖」及び「下鎖」プライマー（上鎖及び下鎖が互いに約１２〜１５塩基対重複するように選択された）を下記のようにアニーリングすることにより作製した。
【０２４６】
上鎖プライマー：Ｇｍ４０、４２、４６及び４８：
【表１７】
2005524381.tif 000019
【０２４７】
下鎖プライマー：Ｇｍ４１、４３、４５、４７及び５０：
【表１８】
2005524381.tif 000020
【０２４８】
アニーリング及びＰＣＲは以下のように行った。
１．全ての上鎖プライマーを等量ずつ混合した。全ての下鎖プライマーを等量ずつ混合した。
２．上：下プライマーを２：１の割合とした混合物１ｕｌを標的とし、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを用いて以下のサイクル条件にてMJ TetradTM PCR機器を使用し、一次ＰＣＲ反応を行った。
４０℃で２分、７２℃で３０秒、次に９４℃で３０秒、４５℃で３０秒、７２℃で３０秒のサイクルを３０回行い、続いて１６℃でソーク（soak）した。
この反応により産物の混合物が得られるが、この産物の大部分は予想サイズ３３０ｂｐである。
３．上記３３０ｂｐ産物をQiaquickTM Gel Extraction kit を用いてゲル精製し、プライマーＧｍ４９（ata aga atc aga tct cgg ctc）及びＧｍ５０（上述のとおり）を用いる二次ＰＣＲにおいて標的とした。MJ TetradTM PCR機器を用い、以下のサイクル条件下でＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを使用した。
９４℃で1分、次に９４℃で３０秒、４９℃で３０秒、７２℃で１分のサイクルを３０回行い、続いて７２℃で１０分、その後１６℃でソークした。
上記により、３３０ｂｐの単一産物（ｇｍ４９及びｇｍ５０はそれぞれBglII及びEcoRI部位を有し、それにより最終断片をクローニングした）を作製した。
４．上記産物を上述のとおりにゲル精製し、BglII及びEcoRIで消化し、その後、hJag１配列の５'末端を既に有する発現ベクターにクローニングした。
次にＣ２Ｃ１２細胞を、上記の結果得られるpcDNA3.1発現ベクターＤＮＡ０．４μｇで一時的にトランスフェクトし（EffecteneTM transfection reagent; Qiagen, Valencia, CA, US and Crawley, UKを用いる）、トランスフェクトした細胞を培養して最終的な融合タンパク質を発現させた。
【０２４９】
参考実施例２：ＣＨＯ−Ｎ２（Ｎ２７）ルシフェラーゼレポーターアッセイ
Ａ）ルシフェラーゼレポータープラスミド10xCBF1-Luc（pLOR91）
BglII及びHindIII凝集性末端をもつアデノウイルス主要後期プロモーターTATA-boxモチーフを以下のようにして作製した。
【０２５０】
【表１９】
2005524381.tif 000021
【０２５１】
これをプラスミドpGL3-Basic（Promega社製）にBglIIとHindIII部位との間にクローニングしてプラスミドpGL3-AdTATAを作製した。
BamH1及びBglII凝集性末端を有するＡＴＰ１プロモーター配列（ＴＰ１；ＣＢＦ１の２回反復に相当）を以下のようにして作製した。
【０２５２】
【表２０】
2005524381.tif 000022
【０２５３】
BglII部位に繰り返し挿入することにより上記配列をペンタマー（５量体）とし、得られたＴＰ１ペンタマー（ＣＢＦ１の１０回反復に相当）をBglII部位においてpGL3-AdTATAに挿入してプラスミドpLOR91を作製した。
【０２５４】
Ｂ）完全長ノッチ2を発現する安定なＣＨＯ細胞レポーター細胞株及び10xCBF1-Lucレポーターカセットの作成
ヒトノッチ2遺伝子（例としてGenBank 登録番号ＡＦ３１５３５６を参照）の完全コーディング配列を網羅するｃＤＮＡクローンを以下のようにして構築した。細胞内ドメインの全体及び細胞外ドメインの一部をコードする３'ｃＤＮＡ断片をヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー（OriGene Technologies Ltd., USA）からＰＣＲベーススクリーニング法（PCR-based screening strategy）により単離した。残存５'コーディング配列をＲＡＣＥ（Rapid Amplification of cDNA Ends；ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）法により単離し、両方の断片に共通の独特な制限部位（ClaＩ）を用いて既存３'断片と結合させた。その結果得られた完全長ｃＤＮＡを次に哺乳類発現ベクターpcDNA3.1−V5−HisA（Invitrogen）にストップコドンなしでクローニングし、プラスミドpLOR92を作製した。従って、pLOR92は哺乳類細胞で発現されると、その細胞内ドメインの３'末端にＶ５及びＨｉｓタグを有する完全長ヒトノッチ2タンパク質を発現する。
【０２５５】
Lipfectamine2000TM（Invitrogen社製）を用いて野生型ＣＨＯ−Ｋ１細胞（例としてＡＴＣＣ ＮｏＣＣＬ６１）にpLOR92（pcDNA3.1−FLNotch２−V5-His）をトランスフェクトし、完全長ヒトノッチ2（Ｎ２）を発現する安定なＣＨＯ細胞クローンを作製した。トランスフェクトしたクローンは、限界希釈を用いる９６ウエルプレートにおいて、１０％熱不活化ウシ胎児血清（（ＨＩ）ＦＣＳ）とグルタミンとペニシリン−ストレプトマイシン（Ｐ／Ｃ）と１ｍｇ／ｍｌＧ４１８（GeneticinTM、Invitrogen社製）を添加したダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ；Dulbecco's Modified Eagle Medium）から選択した。個々のコロニーを、１０％（ＨＩ）ＦＣＳとグルタミンとＰ／Ｓと０．５ｍｇ／ｍｌＧ４１８を添加したＤＭＥＭで増殖させた。抗Ｖ５モノクローナル抗体（Invitrogen社製）を用いるウエスタンブロッティングに細胞溶解物を供してＮ２の発現を調べた。陽性クローンをレポーターベクターpLOR91（１０ｘＣＢＦ１−Ｌｕｃ）で一時的にトランスフェクションし、完全長ヒトデルタ様リガンド１（ＤＬＬ１；例としてGenBank登録番号ＡＦ１９６５７１号を参照）を発現する安定ＣＨＯ細胞クローン（ＣＨＯ−デルタ）と共培養することにより試験した。（ＣＨＯノッチ２クローンと同様にしてＣＨＯ−デルタを調製したが、ノッチ２の代わりにヒトＤＬＬ１を使用した。抗Ｖ５モノクローナル抗体を使用し、細胞溶解物をウエスタンブロッティングにかけて著しく陽性を示したクローンを選択した。）
【０２５６】
ＣＨＯ−Ｎ２安定クローンの１つであるＮ２７にpLOR91（１０ｘＣＢＦ１−Ｌｕｃ）を一時的トランスフェクションし、完全長ヒトＤＬＬ１を発現する安定ＣＨＯ細胞クローン（ＣＨＯ−デルタ）と共培養したところ、高レベルな誘導を示したことが明らかになった。BamH1とSal１を用いてヒグロマイシン遺伝子カセット（pcDNA3.1／hygro、Invitrogen社製）をpLOR91（１０ｘＣＢＦ１−Ｌｕｃ）に挿入し、このベクター（１０ｘＣＢＦ１−Ｌｕｃ−hygro）をLipfectamine2000（Invitrogen社製）を用いてCHO-N２安定クローン（Ｎ２７）にトランスフェクトした。トランスフェクトしたクローンを、限界希釈を用いる９６ウエルプレートにおいて、１０％（ＨＩ）ＦＣＳとグルタミンとＰ／Ｃと０．４ｍｇ／ｍｌヒグロマイシンＢ（Invitrogen社製）と０．５ｍｇ／ｍｌＧ４１８（Invitrogen社製）を添加したＤＭＥＭから選択した。１０％（ＨＩ）ＦＣＳとグルタミンとＰ／Ｓと０．２ｍｇ／ｍｌヒグロマイシンＢ（Invitrogen社製）と０．５ｍｇ／ｍｌＧ４１８（Invitrogen社製）を添加したＤＭＥＭにおいて個々のクローンを増殖させた。
【０２５７】
ＦＬヒトＤＬＬ１を発現する安定ＣＨＯ細胞クローンと共培養することによりクローンを試験した。Ｎ２７＃１１、Ｎ２７＃１７、Ｎ２７＃３６の３種類の安定レポーター細胞株を作製した。ノッチシグナル伝達不在下におけるバックグラウンドシグナルが低く、そのためシグナル伝達が開始されると誘導が高倍率で生じることから、Ｎ２７＃１１を選択した。１０％（ＨＩ）ＦＣＳとグルタミンとＰ／Ｓを添加したＤＭＥＭを１ウエルあたり１００μｌ入れた９６ウエルプレートにおいて、ウエル毎に２×１０4のＮ２７＃１１細胞を播いてアッセイを行った。
【０２５８】
Ｃ）ＣＨＯ-Ｎ２細胞に対する１０ｘＣＢＦ１−Ｌｕｃの一時的トランスフェクション
また、一時的トランスフェクションを行うために、１０％（ＨＩ）ＦＣＳとグルタミンとＰ／Ｓと０．５ｍｇ／ｍｌＧ１８を添加したＤＭＥＭでＣＨＯ−Ｎ２（クローンＮ２７）細胞を維持し、ＣＨＯ−Ｎ２細胞のＴ80フラスコに対し、以下のようにしてトランスフェクションを行った。細胞上の培地を、１０％（ＨＩ）ＦＣＳとグルタミンとＰ／Ｓを添加したＤＭＥＭ新鮮培地８ｍｌと交換した。pLOR91（１０ｘＣＢＦ１−Ｌｕｃ）が入った無菌小容器（bijou）に、１０μｇのOptiMem（Invitrogen社製）を最終容量が１ｍｌとなるように加え、混合した。２個目の無菌小容器に、２０μｌのLipofectamine2000試薬をOptiMem９８０μｌに加えて混合した。
【０２５９】
各小容器の内容物を混合し、室温で２０分間放置した。トランスフェクション混合物２ｍｌを培地８ｍｌが入った細胞入りのフラスコに加え、得られた混合物を一晩ＣＯ2インキュベーターに放置した後、トランスフェクト細胞を取り出して不動化ノッチリガンドタンパク質の入った９６ウエルプレートに加えた。
その翌日に０．０２％ＥＤＴＡ溶液（Sigma社製）を用いてトランスフェクトＣＨＯ−Ｎ２細胞を取り出し、遠心分離して１０％（ＨＩ）ＦＣＳとグルタミンとＰ／Ｓを添加したＤＭＥＭ１０ｍｌに再懸濁した。１０μｌ中の細胞数を数え、１０％（ＨＩ）ＦＣＳとグルタミンとＰ／Ｓを添加した新鮮ＤＭＥＭにおける細胞密度を２．０×１０5細胞／ｍｌに調整した。マルチチャネルピペットを用いて９６ウエル組織培養プレート（平底）の各ウエルに１００μｌを加え、すなわち１ウエルあたり２．０×１０4個のトランスフェクト細胞とし、このプレートを一晩インキュベーションした。
【０２６０】
Ｄ）９６ウエル組織培養プレートへ直接ノッチリガンドタンパク質を固定する
精製ノッチリガンドタンパク質１０μｇを無菌エッペンドルフ型（Eppendorf）管中の無菌ＰＢＳに加え、最終容量を１ｍｌとした。このうち５００μｌを５００μｌの無菌ＰＢＳが入った無菌エッペンドルフ型管に加え、連続して１：２で希釈液を作り、１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、１．２５μｇ／ｍｌ、０．６２５μｇ／ｍｌ、０μｇ／ｍｌの各希釈液を作製した。
上記プレートの蓋をパラフィルムで密封し、プレートを４℃下で一晩又は３７℃下で２時間放置した。その後タンパク質を除去し、プレートをＰＢＳ２００μｌで洗浄した。
【０２６１】
Ｅ）Ａ２０−デルタ細胞
ＩＶＳ、ＩＲＥＳ、Ｎｅｏ及びｐＡの各エレメントをプラスミドpIRESneo2（Clontech社製、USA）から取り出し、pUCクローニングベクター内のニワトリβ−アクチンプロモーター（例としてGenBank登録番号Ｅ０２１９９を参照）のダウンストリームに挿入した。マウスデルタ１（例としてGenBank登録番号ＮＭ_００７８６５を参照）をアクチンプロモーターとＩＶＳエレメントとの間に挿入し、３つのリーディングフレームの全てに複数のストップコドンが含まれる配列をデルタとＩＶＳエレメントとの間に挿入した。
その結果得られた構築物をエレクトロポレーションとＧ４１８を用いてＡ２０細胞にトランスフェクトし、マウスデルタ１をその表面に発現するＡ２０細胞を得た（Ａ２０−デルタ）。
【０２６２】
Ｆ）ＣＨＯ及びＣＨＯ−hデルタ1−Ｖ５−Ｈｉｓアッセイ対照
１０％（ＨＩ）ＦＣＳとグルタミンとＰ／Ｓを添加したＤＭＥＭにおいてＣＨＯ細胞を維持し、１０％（ＨＩ）ＦＣＳとグルタミンとＰ／Ｓと０．５ｍｇ／ｍｌＧ４１８を添加したＤＭＥＭにおいてＣＨＯ−hデルタ1−Ｖ５−Ｈｉｓ（クローン＃１０）細胞を維持した。
【０２６３】
０．０２％ＥＤＴＡ溶液（Sigma社製）を用いて細胞を取り出し、遠心分離にかけ、１０％（ＨＩ）ＦＣＳとグルタミンとＰ／Ｓを添加したＤＭＥＭ１０ｍｌに再懸濁した。１０μｌ中の細胞数を数え、１０％（ＨＩ）ＦＣＳとグルタミンとＰ／Ｓを添加した新鮮ＤＭＥＭにおける細胞密度を５．０×１０5細胞／ｍｌに調整した。５．０×１０5細胞／ｍｌと調整した各細胞株の３００μｌを９６ウエルの組織培養プレートのウエル２個ずつに加えた。１０％（ＨＩ）ＦＣＳとグルタミンとＰ／Ｓを添加したＤＭＥＭ１５０μｌを各ウエルの下のウエル５個（縦列に５個）に加えた。細胞１５０μｌを次のウエル４個に連続希釈していき、それぞれ５．０×１０5細胞／ｍｌ、２．５×１０5細胞／ｍｌ、１．２５×１０5細胞／ｍｌ、０．６２５×１０5細胞／ｍｌ、０．３１２５×１０5細胞／ｍｌ、０細胞／ｍｌの細胞密度の希釈液を得た。
【０２６４】
１０ｘＣＢＦ１−ＬｕｃにトランスフェクトさせたＣＨＯ−Ｎ２細胞（２．０×１０4トランスフェクトＣＨＯ−Ｎ２細胞／ウエル）１００μｌを含有する９６ウエルプレートに、上記各ウエルから１００μｌを添加し、このプレートを一晩インキュベーターに静置した。
【０２６５】
Ｇ）細胞共培養
５×１０4ＣＨＯ−Ｎ２細胞を９６ウエルプレート上に播いた。ＣＨＯ−デルタ細胞又はＡ２０−デルタ細胞を必要に応じて滴定した（ＣＨＯ−Ｎ２：ＣＨＯ−デルタの最大比率は１：１で、ＣＨＯ−Ｎ２：Ａ２０−デルタの最大比率は１：２）。上記混合物を一晩インキュベーションした後にルシフェラーゼアッセイを行った。
【０２６６】
Ｈ）ルシフェラーゼアッセイ
全ウエルから上清を除去した。ＰＢＳ１００μｌとSteadyGloTMルシフェラーゼアッセイ試薬（Promega社製）１００μｌを加え、細胞を５分間室温に放置した。この混合物をピペットで上下に２回操作して取り出し、各ウエルからの細胞溶解物と内容物が白色９６ウエルOptiPlate TM（Packard社製）に確実に移した。化学発光（ルミネセンス）はTopCount TM係数器（Packard社製）で測定した。
【０２６７】
上述の明細書で言及した文献は全て参考文献として本明細書に添付している。当技術分野の専門家にとっては、本発明の範囲や精神から逸脱することなく本発明で記載した方法やシステムに種々の修正や変更を加えることは自明である。本発明は具体的に好適な実施態様との関連で記載しているが、ここにクレームする本発明は、かかる具体的実施態様に不当に限定されるべきではない。実際、本発明を実施するためにここに記載した方法に加える、生化学及びバイオテクノロジー又はそれらの関連分野における専門家にとっては自明の種々の修正は以下に記載する特許請求の範囲に含まれることを意図する。
【図面の簡単な説明】
【０２６８】
【図１】本発明の実施態様を示す代表的な概略図である。第１配列がＡＰＣ表面分子を標的とし、第２配列がＴ細胞共刺激分子のモジュレーターである。
【図２】ノッチを示す概略図である。
【図３】ノッチＩＣを示す概略図である。
【図４】ノッチシグナル伝達経路を示す概略図である。
【図５】ノッチシグナル伝達経路を示す概略図である。
【図６】ＭＨＣ及びＴＣＲをスーパー抗原が認識する様子を示す概略図である。
【図７】ＴＳＳＴ−１のアミノ酸配列を示す図である。
【図８】ノッチリガンドであるジャグド及びデルタを示す概略図である。
【図９】種々のショウジョウバエ及び哺乳類のノッチリガンドにおけるＤＳＬドメインを整列させたアミノ酸配列各種を示す図である。
【図１０】ヒトデルタ１、デルタ３及びデルタ４を示す図である。
【図１１】ヒトジャグド１及びジャグド２のアミノ酸配列を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2005524381.tif 000029
【図８】
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【図９】
2005524381.tif 000031
【図１０】
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【図１１】
2005524381.tif 000033
【国際調査報告】
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2005524381.tif 000036
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