(57)【要約】この発明は、液体サンプルのろ過を目的としたゲルろ過特性を有し、多孔性で、特に粒子形態を持つ一般に架橋結合された有機ポリマーろ過資材(2)が少なくとも一個からなるサイズ排除ろ過デバイス  (1)に関する。当該デバイスは、ろ過資材の粒子が望ましくは極性有機溶剤または水溶性溶剤を含んだろ過資材(2)に触れることにより前に膨張しその後脱水粒子である特徴を有する。
2005509866.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一種類の一般的な網状の有機ポリマーを含んだ、ゲルろ過媒体の性質を有し、粒子状、特にビーズ状、多孔性の形状を持ち、ろ過資材
(2)の粒子ができれば有機の極性溶剤または水溶性溶剤に接触して膨張し次に脱水する特性の少なくとも一種類のろ過資材
(2)から構成されている液体サンプルのろ過を目的にした、サイズ排除によるろ過デバイス (1)。
【請求項２】
脱水状態の時に、ろ過資材 (2)の粒子がろ過するサンプルに直接接触することにより使用する準備ができているという特徴を持つ請求項1記載のデバイス (1)。
【請求項３】
ろ過資材 (2)が、できれば多孔性の２枚のサポータ (3)に挟まれる特徴を持つ請求項1或いは2に記載のデバイス。
【請求項４】
少なくともサポータ (3)のうちの一つがニトロセルロース製シートのような多孔性材料のシートから構成される特徴を有する請求項3に記載のデバイス。
【請求項５】
ろ過資材 (2)が、コラムのような管状物体の中に配置される特徴を持つ請求項1或いは2に記載のデバイス。
【請求項６】
化学、物理、物理化学、または免疫学に使用される分析デバイスのような分析デバイスに関連する請求項1〜5のいずれか一項に記載のろ過デバイス。
【請求項７】
イムノクロマトグラフィー分析デバイスの上部に配置される、少なくとも結合が指標に連結された最初のサポート(4)、少なくとも試薬に固定された最初のサポート(4)に共有することが可能な第二のサポート(5)、そして一部は重なる可能性もあるが、一列に配列され、分析ストリップを形成する他のものと組み立てられた吸湿剤(6)で構成された特徴を有する請求項1〜6のいずれか一項に記載のろ過デバイス。
【請求項８】
ろ過資材がデキストランポリマー、ファイバーが網状のデキストラン由来のポリマーから構成され、架橋結合エージェントが、望ましくはエピクロルヒドリン、或いはその派生物質のうちの一つによって構成されているゲルろ過レジンである特徴を有する請求項1〜6のいずれか一項に記載のろ過デバイス。
【請求項９】
ろ過資材が、少なくとも、アクリルアミドのポリマーまたは網状のアクリルアミド派生のポリマーから構成され、架橋結合エージェントが、望ましくはビスアクリルアミド、或いはその派生物質によって構成されているろ過資材である特徴を有する請求項1〜7のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１０】
ろ過資材が、デキストラン、及びアクリルアミドの合成混合物、或いは後者の派生物質の合成混合物から構成される特徴を有する請求項1〜7のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１１】
ミクロの粒の中にゲル化されたアガロースから構成されるろ過資材の特徴を有する請求項1〜7のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１２】
ろ過資材が少なくともビニールポリマーから構成特徴を有する請求項1〜7のいずれか一項に記載に記載のデバイス。
【請求項１３】
ゲルろ過媒体の性質を持ち多孔性のミクロ粒のような粒子形状を有し、一般に網状をした有機ポリマーを含むデバイスのろ過資材(2)、望ましくは、有機の極性溶剤または水溶性溶剤に接触して資材の粒子が膨張し、ろ過資材 (2)が脱水して直ぐ使用でできる形状のろ過資材を形成できるようなろ過資材 (2)を水和する特徴を持つ、請求項1〜12に特に適合したろ過デバイス (1)の製造プロセス。
【請求項１４】
ろ過資材  (2) を溶剤の蒸発によって脱水する特徴を持つ請求項13に記載の製造プロセス。
【請求項１５】
ろ過資材 (2) の望ましくは多孔性の極性有機または水溶性溶剤と接触する前、或いは後に、ろ過資材を望ましくは多孔性の2
枚のサポート (3) の間に配置し、ろ過資材が直ぐ使用できるように脱水形状にできる特徴を持つ請求項12又は13に記載の製造プロセス。
【請求項１６】
ろ過資材の形成合成物と望ましくは多孔性のサポートが脱水形状になる前に生計物の穴の中に配置される特徴を持つ請求項15に記載の製造プロセス。
【請求項１７】
ろ過資材が請求項 1~12のものに適合する特徴を持つ請求項12〜16のいずれか一項に記載の製造プロセス。
【請求項１８】
脱水形状の資材に直接サンプルを接触させることによってろ過する特徴を有する請求項 1〜12のものに適合するろ過デバイスを使用して液体サンプルのサイズによる排除によってろ過するプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、液体サンプルのろ過を目的としたサイズ排除ろ過デバイス、当該タイプのデバイスを機能させるサイズ排除ろ過プロセス並びにそのデバイスの製造プロセスに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
今日では、サンプルの分子を分離するための方法が多数ある。これらの粒子分離方法のうちの1つは浸透クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー、ゲル又は分子連鎖のゲルろ過、或いは、ろ過と呼ばれている。このような分離方法の利用を可能にするために、多数のメーカーは、ゲルろ過マトリックスと呼ばれるゲルろ過のマトリックスを開発している。
【０００３】
ゲルろ過は、サイズ、正確にはストーク半径によって分子を分離する。ゲルろ過マトリックスはレジンから構成されている。当該ゲルのレジンは粒子、特に多孔性の高いミクロの粒から構成されている。当該レジンの孔の直径は事前定義した範囲の内において可変である。その結果、液体のサンプルが当該レジンに接すると、ある分子は大き過ぎ、任意の粒に浸透せず、粒の周りの液体中に拡散する。
【０００４】
これらの分子はゲルから溶出するのにほとんど時間がかからない。これに反して、他の分子には外部空間の他、全粒子の内部に拡散するのに十分なほど小さいものがある。この場合、ゲルから拡散するのに時間がかかる。中間サイズの分子は、粒の気孔によって中に浸透することができる。これらの分子は外部空間、及び、ある割合数の粒子の中を循環することになる。サイズ小さければ小さいほどその割合が大きくなる。その後、これらの分子は任意の時間をかけて、ゲルから拡散される。この時間は、ストーク半径に比例し、サイズ、従って重量に間接的に比例する。
【０００５】
ゲルは、特定の分留(重量を表わす分子用語)フィールドを有する。内部で、分子は大きさに比例をして、つまり重量に比例をして時間をかけ、ゲルから拡散する。このフィールドの内部で、互いを分離することができる。分留の高限、つまり排除制限より大きい分子は、他とともに速く拡散される。低限より小さな分子は、かなり遅くまで拡散しない。これらの2つのケースでは、重量によって分子を分離することは、明らかに不可能である。これらの2つの範囲間の重量を持つ分子は、お互いに分離することがでいる。この範囲を分留フィールドと呼ぶ。
【０００６】
今日市場には、安定性、圧力抵抗並びに流動抵抗の異なるゲルろ過資材が存在する。今日最も知られるのは、特にSephadexまたはSepharoseの商標を有するPHARMACIA 株式会社の製品、Biogelの商標を有するBIO-RAD株式会社の製品、あるいはFractogelの商標を有するPIERCE株式会社の製品がある。
【０００７】
このゲルろ過の技術は、要約すると、上述のように、ろ過資材の粒子の中で最大の気孔より大きいサイズの分子、つまり、資材の分留のより高限以上の分子は、粒子の気孔の中に浸透することができず、粒子の外側の液体にあるろ過資材を通るので、まず第1に溶出される。より小さな分子は、サイズおよび形状によって粒子の気孔の中に浸透することができ、よりゆっくり時間をかけて溶出される。ゲルろ過のこれらのレジンはすべて今日、同じ原理に基づいて使用されている。これらのレジンは、粉状の状態で一般に出荷されている。使用する時は、レジンのメーカーによって一般に指示、適応された溶剤で水和しなければならない。極性溶剤または水溶性溶剤、望ましくは有機質に接すると、ろ過資材のミクロの多孔性粒子は水和され、膨張する。このようにしてサンプルのろ過を実施することができる。この文書では、水和、多孔性合成物に浸透する分子、水溶性溶剤、望ましくは有機、含水物質、水化物を含む物質について説明される。ゲルろ過のレジンの準備例は、米国A-5.976.389及びWO 97/48422の特許に提示されている。極性溶剤及び水溶性溶剤と接して粒子を膨張させるのは、分析のために数時間遅延させることができる。
【０００８】
さらに、極性溶剤、または水溶性溶剤と接触した後、ろ過資材隙間の過剰液体の一部の除去が必要になる。これは、多数のサンプル処理に使用される特別なデバイスの場合で、過剰な隙間液体を削除する遠心分離処理を必要とする。これについては、国際出願のWO 01/21311に記述されている。ろ過資材レジンを最初に使用するにあたり、ろ過資材の粒子の膨潤を目的として、極性溶剤または水溶性溶剤で資材を接触し、次に水和されたろ過資材にサンプルを接触するのに系統的な手順が必要とされる。
【０００９】
国際出願WO 99/67277によって説明されているようにゲルろ過用レジンは水成分を吸収するものとして使用することができる。この場合、レジンをサンプルに直接接触させるとレジンを構成する粒子が膨張する。次にゲルをサンプルから取り除き、サンプルを処理することができる。この場合、ゲルろ過のレジンは、ろ過資材としては使用されないが水分吸湿エレメントとしての機能を持つ。
【００１０】
要約すると、最先端技術では、極性または水溶性溶剤に接触すると吸湿物質の膨張が可能になるので、ゲルろ過レジンは常に、ろ過因子として水和して使用されるか、水分吸湿用因子として脱水状態で使用されることを示している。
【００１１】
これらのすべての技術では、ろ過資材中の湿分が分析デバイスの試薬と反応する可能性が高いので、ゲルろ過のレジンを試薬が乾燥状態で入っている分析デバイスに使用することができない。
【００１２】
しかしながら、この発明の発明者らによると、ろ過資材の粒子を膨張させるために極性または水溶性溶剤に接触し、その後、ろ過資材から水分一切なくす、あるいは、ほとんど水分をなくすために脱水すると、ゲルろ過用レジンはサイズ排除によるろ過の特性のある一定の数を維持する。材料を得るためにそのとき脱水症の段階にろ過資料の粒子の膨潤をもたらす目標がある極水の起源の溶剤に接するセッティングにさらされた時驚くべき方法で、現在まで使用されるゲルろ過のレジンがサイズ排除によってろ過の幾らかの彼らの特性を保存することに注目しました、ろ過、湿気がないか、湿気および0に近い水内容を示すことがかなりない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
この発明の目的は、よって、このろ過資材の設計により、特に前述の資材を極性溶剤または水溶剤と接触することで、ろ過資材を準備せずにろ過デバイスが直接使用できる新しいタイプのサイズ除去によるろ過デバイスを提唱することである。
【００１４】
この発明の別の目的は、この設計により、試薬が劣化したり、前述の試薬の反応が始まること無しに、乾燥した形状で分析デバイスを使用できる新タイプのサイズ排除による過デバイスを提唱することである。
【００１５】
この発明の別の目的は実施することが簡単な前述のタイプのろ過デバイスの製造工程を提唱することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
この発明は、粒子状、特にビーズ状、多孔性の形状を持った少なくとも一種類の一般的な網状の有機ポリマーを含んだ、ゲルろ過媒体の性質を有し、ろ過資材の望ましくは有機の極性溶剤または水溶性溶剤に接触して膨張し次に脱水する特性の液体サンプルのろ過を目的にした、サイズ排除によるろ過デバイスである。
【００１７】
脱水した形状のろ過資材によって、前述の多大なろ過準備を必要とせずに直接ろ過として使用することができる。
【００１８】
この発明は上述のタイプのろ過デバイスの製造プロセス、ゲルろ過媒体の特性を持ち、有機極性または水溶性溶剤に接触すると資材の粒子が膨張し、またそのまま直ぐに使用できる乾燥した特長を持つ、ろ過資材多孔性のミクロのビーズのような粒子の形状をした一般的な網状有機ポリマーを含んだデバイスのろ過資材も目的にしている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
前述のように、発明の目的であるろ過デバイス1はサイズ排除の原理をとる。それは特別なビーズである多孔性の粒子の形状をして存在し、ゲルのろ過媒体の特性を持ち、少なくても一つの一般的に網目状をした有機ポリマーを含むろ過資材  (2) の目的にする。発明の原理は、乾燥した形状中で水性の媒体の中で通常使用されることを構成する。この目的のために、ろ過資材(2)の粒子は事前に、望ましくは有機の極性または水溶性溶剤に触れることにより膨張させておき、その後脱水状態にっている。上述のように、このようなろ過資材は大きな分子を通過させ、サンプルの小さなサイズの粒子を保持する能力がある。望ましくは有機の極性または水溶性溶剤に接触させた後ろ過のデバイス  (1) に使用される基本的なろ過資材  (2) は、架橋結合エージェントが、望ましくはエピクロルヒドリン、或いはその派生物質から構成される繊維が網目状になっているデキストランまたはデキストラン派生のポリマーから構成される。望ましくは有機の極性または水溶性溶剤に接触させる意図を有するこのような基礎資材は、例えば、商標Sephadexを有するPHARMACIA株式会社によって市場化されている。ろ過資材の特性、特に分留フィールドによって、様々なリファランスが提案される。
【００２０】
この基礎ろ過資材(2)は、少なくとも、アクリルアミドのポリマーまたは網状のアクリルアミド派生のポリマーから構成され、架橋結合エージェントが、望ましくはビスアクリルアミド、或いはその派生物質によって構成されているろ過資材である特徴を有する。そのような製品は、特にBiogelの商標でBIO-RAD株式会社によって販売されている。最後に、このようなろ過資材はPIERCE株式会社によって販売される製品fractogene
TSK(商標)のように、少なくともビニルポリマーから構成することができる。ゲルろ過媒体の特性を持つ他のタイプのろ過資材はは、この発明の範囲内に等価な方法として使用することができる。
【００２１】
上述タイプのゲルろ過レジンから構成されたろ過資材 (2) は、前述のレジンに含まれる粒子の膨潤を引き起こすために最初は、水和される。この水和は、極性または水溶性有機溶剤にろ過資材を接触させることによって一般に実施される。一般に、ゲルろ過用レジンメーカーは、極性または水溶性の有機的溶剤の使用を規定している。以下に溶剤の例をあげる。
【００２２】
溶剤
Tris EDTA :
Tris-HCl pH=8,0    10 mM
EDTA pH=8          0,1 mM
または、
溶剤
Tris acetate EDTA :
Tris                                 40 mM
Sodium Acetate                      5 mM
EDTA                                  1 mM
または
溶剤
(Tris EDTA NaCl)
Tris-HCl pH=8,0                    40 mM
NaCl                                  5 mM
EDTA                                  1 mM
または
溶剤 (Tris Borate EDTA)
Tris                                    89 mM
Boric acid                            89 mM
EDTA                                  2,5 mM
【００２３】
極性または水溶性の有機的溶剤に接触させた後、ろ過資材を脱水させる。脱水は溶剤の蒸発による。脱水工程が終了すると、脱水状態のろ過資材 (2) の粒子は準備が完了し、ろ過するサンプルに直接使用できる。
【００２４】
ろ過デバイスの好ましい実施モードにおいて、ろ過資材(2)は、2枚の望ましくは多孔性のサポート
(3) の間に挟む。少なくともサポート (3)の一枚はニトロセルロース・シートのような多孔性物質でできたシートから構成する。したがって、望ましくは有機の、極性、或いは水溶性溶剤にろ過資材を接触させる前或いは、後に、ろ過資材を望ましくは多孔性の2枚のサポート板の間に配置し、この合成物質の全体を脱水化し、ろ過デバイスの準備を完了させる。望ましくは、ろ過資材と多孔性が望ましいサポートから構成されるこの合成物質は脱水化の前に成型物の穴の中に配置されたい。
【００２５】
当該ろ過デバイスの製造は以下のように実施される。サプライヤーの表示に従って適切な量のバファーで水和されたSephadex (商標)の合成物質とセルローズのような恐らく様々な異なる製品を含んだ混合物は、シートと同じ寸法を有する容器の底に置かれた、シート
(3) の上に配置し、次に、第2のシート(3) は水和された合成物の上に置く。ユニットは、完全な脱水に十分必要な時間をかけて37°Cの温度の乾燥し、換気の良い環境に置く。脱水が完了したら、ろ過デバイスを成型物から取り出し、必要な分と、将来に必要な分を考慮してカットする。
【００２６】
これによって得られた、ろ過デバイスは単独、あるいは化学、物理、物理化学、免疫学の分析デバイスのような分析装置と併用して使用できる。図2は、分析のイムノクロマトグラフィーのデバイスにこのろ過デバイスを上部に配置して使用する例を示す。イムノクロマトグラフィーの分析のデバイスは、少なくともインディケータに連結された分子が置かれた最初のサポート
(4)から構成され、また、少なくとも一つの試薬を固定した最初のサポート (4) に共通の 第二のサポート(5) から構成され、また、直線に配置され分析ストリップを形成する他の物質と部分的に重なって組み合わされる吸湿剤
(6) 、ろ過  {1} 、サポート (4)、(5)、および吸湿剤 (6) から構成される。このアセンブリは図 2 の(7) として示される接着剤を使用して取得できる。
【００２７】
このような非制限的に、薄膜になり得るサポートに固定した試薬の存在を特徴とするデバイスは、酵素用の親和反応の有る無しにかかわらず、いかなる分析および表示試薬にも適用される。表示試薬は、色の付く粒子、反応によって色が付いたり、色の欠如で結果が示される酵素のような反応分子を含む。そのような分析デバイスによって探求されるエレメントは生物学的性質、抗体、抗原、化学または生化学的性質になり得る。
【００２８】
さらに、探求する要素が1つあるいはいくつかの病理学に特定の1つあるいはいくつかの抗原である場合、そのようなデバイスの適用が可能である。さらに、分析デバイスは、治療後のフォローアップの枠内で適用可能となる。例として、ろ過デバイスは、ニトロセルロース薄膜(例:
サポート5) に、フルオレスセインの親和性を示す抗体が固定され、膠質の金に連結したstreptavidinが自由な形で存在する(例: サポート4)、イムノクロマトグラフィーの分析デバイスに関連させることができる。1つは、DNAを含んでいるサンプルに基づいて、フルオレスセインのラベルが付いたけられた最初のプライマーと、ビオチンのラベルが付いた第二のプライマーの使用によってPCRに進む。増幅の終わりに、プライマーがamplicon(増幅製品)に組み入れられていない場合、ビオチンのラベルが付いたプライマーは膠質の金と連結したstreptavidinを捕らえるが、固定された抗フルオレスセイン抗体には捕らえられない。フルオレスセインとラベルが付いたプライマーだけが捕らえられ、有色の表示を示すことができない。この表示がないことで、明白に増幅の陰性としての結果を示すことになる。陽性の増幅の場合には、プライマーがampliconsに組み込まれている。ラベルは、このように、フルオレセイン、およびビオチンのラベルが付けられたプライマーがそれぞれつけられる。
【００２９】
サンプルが上述のろ過デバイスを通ると、自由なプライマーは、アンプリコンが連結した分析デバイスに拡散する。アンプリコンは、膠質の金と連結したstreptavidinを捕らえて、次に、サポート「5」を形成する薄膜に固定された抗フルオレスセイン抗体によって捕らえられる。色が赤紫の標識は増幅が陽性であることを示す。
【００３０】
ろ過デバイスは同様にして、カラムの形状、あるいは管状のデバイスとして表わすことができる。この場合、ろ過資材は前述の管状物体の内部に配置され、ろ過うす膜によってこの物体の中で保持される。
【００３１】
上述のろ過デバイス1では、このサンプルを脱水したろ過デバイス上のろ過資材に接触することによりサンプルをろ過する液体サンプルのサイズ排除から、ろ過プロセスの実装を可能にする。これにより、分析の実施をするにあたり、顕著な時間の節減となる。上に言及されるように、このろ過する装置の適用は多数である。例として、増幅産物の検知への応用は、上述の通りである。他にも例があげることが可能である。
【００３２】
したがって、例えば、患者の血中に薬剤製品の自由な形状因子を検知することが必要になる時がある。血中に存在する移動分子に関連する時、がん細胞に有害な効果を持つ薬性の抗がん目的の全ての分子を引き出すことができる。実際、これらの分子のうちのいくつかは、自由な形状の有機体に有毒な副作用を持つことがあり得る。
【００３３】
よって、自由分子を検知するために、自由分子を結合分子から隔離する必要がでてくる。
【００３４】
これらの分子を検知するデバイスに関連したろ過デバイスは血液、血清あるいはプラズマのサンプルに接触させると、自由分子のみを検知することが可能になる。その後、分子の自由化率が毒性度の閾値より低くなると患者に薬剤を直ぐに与えることによって患者の薬剤治療が最適化される。
他の適用例では、生物学のマーカーの検知である。これは、環境または食品産業の場合に適用されるが健康分野での適用もあり得る。
【００３５】
前立腺の癌のスクリーニング、およびフォローアップを目的として、よく使用されるマーカーは、ＰＳＡ (前立腺特異抗原)  である。これまでは、生物学的診断のために、尿や血液の中のＰＳＡの総合率のみを使用したが、今日では、自由PSAの割合やキモトリプシンにリンクされたＰＳＡを判定することによって、多大な特異性や表示値と予測値を得ることができると認識されている。２つの割合のうち一つに決定するために最も使用される方法は、他の率をＰＳＡの総合率から取り除くことである。
【００３６】
ＰＳＡの合計の従来の検知システムに関連したこの発明のろ過デバイスは、自由ＰＳＡの除去によって拘束されたＰＳＡの割合を決定することが可能である。ＰＳＡの割合の合計を決定するろ過システムのない同じシステムは、減法によってPSA結合率を獲得する。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、この発明のろ過デバイスの概略図である。
【図２】図２は、分析デバイスに関連した過デバイスの実施例の概略図である。この場合は特にイムノクロマトグラフィー分析デバイスの概略図である。
【図１】
2005509866.tif 000003
【図２】
2005509866.tif 000004
【国際調査報告】
2005509866.tif 000005
2005509866.tif 000006
2005509866.tif 000007
2005509866.tif 000008
2005509866.tif 000009
2005509866.tif 000010