(57)【要約】本発明は、医療的活性化合物、例えば、癌の処置に使用される細胞毒性化合物の効力を強化し得る新規化合物に関する。この新規化合物は、通常のパクリタキセル製剤の薬理活性を増加し、新しいパクリタキセルを製造することを可能にする。このものは、実施例に示すように、溶解性の改善、保存効果の改善、医療効力の増加を発揮する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記 (I‐VI) から選択される構造式を有する化合物：
【化１】
2005508287.tif 000017
(N-(all-trans-レチノイル)-L-システイン酸)
【化２】
2005508287.tif 000018
(N-(13-cis-レチノイル)-L-システイン酸)
【化３】
2005508287.tif 000019
(N-(all-trans-レチノイル)-L-ホモシステイン酸)
【化４】
2005508287.tif 000020
(N-(13-cis-レチノイル)-L-ホモシステイン酸)
【化５】
2005508287.tif 000021
(N-(all-trans-レチノイル)-L-システインスルフィン酸)
【化６】
2005508287.tif 000022
(N-(13-cis-レチノイル)-L-システインスルフィン酸)。
【請求項２】
請求項１の化合物の薬学的に許容される塩。
【請求項３】
請求項１の化合物の薬学的に許容されるナトリウム塩。
【請求項４】
医薬の製造における請求項１の化合物またはその誘導体の使用。
【請求項５】
癌の処置のための医薬の製造における請求項１の化合物またはその誘導体の使用。
【請求項６】
活性物質を医療作用量で含む医薬組成物であって、請求項１の化合物およびその誘導体をさらに含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項７】
活性物質が細胞毒性または細胞増殖抑制化合物であることを特徴とする、請求項６の医薬組成物。
【請求項８】
活性物質がパクリタキセルであることを特徴とする、請求項６の医薬組成物。
【請求項９】
活性物質が Taxol（登録商標） の形態で存在するパクリタキセルであることを特徴とする、請求項６の医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１の化合物がナトリウム塩の形態で存在することを特徴とする、請求項６の医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１の化合物が酸の形態で存在することを特徴とする、請求項６の医薬組成物。
【請求項１２】
医薬活性物質の効力を強化する方法であって、該物質をミセル形態中に請求項１の化合物とともに調製することを特徴とする方法。
【請求項１３】
医薬活性物質の溶解性を増加する方法であって、該物質をミセル形態中に請求項１の化合物とともに調製することを特徴とする方法。
【請求項１４】
医薬活性物質のバイオアベイラビリティを改善する方法であって、該物質をミセル形態中に請求項１の化合物とともに調製することを特徴とする方法。
【請求項１５】
医薬活性物質の保存作用を改善する方法であって、該物質をミセル形態中に請求項１の化合物とともに調製することを特徴とする方法。
【請求項１６】
癌を処置する方法であって、細胞毒性物質を請求項１の化合物と混合し、患者に送達することを特徴とする方法。
【請求項１７】
細胞毒性物質がパクリタキセルであることを特徴とする、請求項１６の方法。
【請求項１８】
細胞毒性物質が Taxol（登録商標） の形態で存在するパクリタキセルであることを特徴とする、請求項１６の方法。
【請求項１９】
請求項１の化合物がナトリウム塩の形態で存在することを特徴とする、請求項１６の方法。
【請求項２０】
請求項１の化合物が酸の形態で存在することを特徴とする、請求項１６の方法。
【請求項２１】
パクリタキセルの水溶性製剤を調製する方法であって、パクリタキセル を第１溶媒に溶解し、請求項１の化合物を第２溶媒に溶解し、得られたパクリタキセルと該化合物の溶液のアリコートを所望の分子比率に混合し、得られた混合物を蒸発乾固する工程を含む方法。
【請求項２２】
Taxol（登録商標） の水溶性改善製剤を調製する方法であって、請求項１の化合物を溶媒に溶解し、得られた溶液の所望のアリコートを蒸発乾固し、残渣を Taxol（登録商標）に溶解する工程を含む方法。
【請求項２３】
パクリタキセルの安定な保存製剤を調製する方法であって、パクリタキセル を第１溶媒に溶解し、請求項１の化合物を第２溶媒に溶解し、得られたパクリタキセルと該化合物の溶液のアリコートを所望の分子比率に混合する工程を含む方法。
【請求項２４】
患者に投与するためのパクリタキセル製剤を調製する方法であって、パクリタキセルを第１溶媒に溶解し、請求項１の化合物を第２溶媒に溶解し、得られたパクリタキセルと該化合物の溶液のアリコートを所望の分子比率に混合し、得られた混合物を蒸発乾固し、該残渣を水溶液に溶解し、形成された溶液を凍結乾燥し、ついで凍結乾燥産物を患者への投与に適したビヒクルによって再構築する工程を含む方法。
【請求項２５】
該第１および第２溶媒が少なくとも１つの脂肪族アルコールであることを特徴とする、請求項２１−２４のいずれかの方法。
【請求項２６】
該第１および第２溶媒がエタノール、メタノール、2-プロパノール、ブタノールから選択される溶媒であることを特徴とする、請求項２１−２４のいずれかの方法。
【請求項２７】
該第１および第２溶媒がメタノールであることを特徴とする、請求項２１−２４のいずれかの方法。
【請求項２８】
パクリタキセルを Taxol（登録商標） の形態で使用することを特徴とする、請求項２１−２４のいずれかの方法。
【請求項２９】
請求項１の化合物のナトリウム塩またはその類似体を合成するための方法であって、下記の連続的工程:
- アミノ基の水-有機媒体における Na2CO3 の存在下での直接的アシル化、
- 不溶性夾雑物の分離、
- ナトリウム塩の分離
を含む方法。
【請求項３０】
水-有機媒体がテトラヒドロフラン-アセトニトリル-水の混合物であることを特徴とする、請求項２９の方法。
【請求項３１】
分離を 2-プロパノール-水混合物の水-有機媒体への添加により行うことを特徴とする、請求項２９の方法。
【請求項３２】
分離を 2-プロパノール-メタノール混合物の、化合物のナトリウム塩の 2-プロパノール-水濃縮溶液への添加により行うことを特徴とする、請求項２９の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自体で医療作用を有し、かつ他の医療活性化合物、例えば、癌の処置に使用される細胞毒性化合物の効力を強化し得る新規化合物に関する。この新規化合物は、細胞成長阻害作用を有し、それに加えて、通常のパクリタキセル製剤の薬理活性を増加し、改善された溶解性および医療効力を発揮して新しいパクリタキセル製剤をつくるのを可能にする。
【背景技術】
【０００２】
用語「化学療法」は、もともと化学物質による種々の疾患の処置を含む非常に広い意味を持っていたが、今日では特定の意味を有している。現在では、用語 「化学療法」 は癌細胞を破壊する化学物質の使用を通常意味する。抗癌剤として現在使用されている化学物質において、多くの機能は、癌細胞の複製能を、細胞分裂に関連する DNA および RNA の活性に干渉して、障害することにある。
【０００３】
パクリタキセルは、ジテルペノイド化合物 {(2R,3S)-3-ベンツアミド-3-フェニル-2-ヒドロキシプロピオン酸-[(2aR, 4S, 4aS, 6R, 9S, 11S, 12S, 12aR, 12bS)-6,12b-ジアセトキシ-12-ベンゾイルオキシ-2a, 3, 4, 4a, 5, 6, 9, 10, 11, 12, 12a, 12b-ドデカヒドロ-4,11-ジヒドロキシ-4a, 8, 13, 13-テトラメチル-7, 11-メタノ-5-オキソ-1H-シクロデカ[3,4]ベンツ[1,2-b]オキセト-9-イル]エステル、Taxol（登録商標）, Bristol-Myers Squibb の活性成分} であって、最初は西洋イチイ、Taxus 属の球果を持つ常緑樹から分離された。パクリタキセル は現在使用されている主要な化学療法剤すなわち抗癌剤の１例である。この物は固形腫瘍：主に乳癌および卵巣、腸、非小細胞肺の癌種に対して広いスペクトルの活性を有す。これはツブリンのβ-サブユニットに結合し、安定な非機能的微小管束を形成し、有糸分裂に干渉する。この薬剤はまた、アポトーシスを誘発し、抗脈管形成性を持つ。
【０００４】
パクリタキセルは、高度にタンパク質結合性であり、多量の分布を有するが、中枢神経系にあまり侵入できない。この化合物は、主に肝代謝により体から排泄されるので、重い肝機能不全の場合には一般的に使用されない。
【０００５】
最近、この薬剤に関連する溶解性および毒性の問題に取り組むために、静脈投与に適したパクリタキセルの新しい製剤の開発に非常に重点が置かれている。例えば、エマルションなどの分散系、リポソーム、混合ミセルがあり、胆汁塩およびホスホリピド(Alkan-Onyuksel H, et al. Pharm. Res. vol 2. pp. 206-212, 1994) を用いる共沈降、シクロデキストリン、ミクロスフェアーにより調製される。抗腫瘍作用の期待される水溶性のプロドラッグ、例えば、ポリエチレングリコール-およびポリグルタミン酸-パクリタキセル も開発されている。
【０００６】
市販製品、Taxol（登録商標） (注入溶液の調製用のパクリタキセル濃縮物、Bristol-Myers Squibb Co., New York, NY, USA 発売) は、ポリオキシエチル化カスター油 (Cremophor（登録商標） EL) およびエタノールの混合物、比率約 1:1 (v/v) で含有するビヒクル中に製剤されている。しかし、親油性化合物について通常使用される界面活性剤である Cremophor（登録商標） EL は、気管支けいれんや降圧などの有害副作用、および特に急速な投与後の過敏性発現などに関連する。従って、これらの有害作用を減じるために、長い注入時間、エタノール: Cremophor（登録商標） EL 溶液の大きい希釈、前薬物処置 (例えば、コルチコステロイド、抗ヒスタミン剤、H2-ブロッカーの使用)を要する。
【０００７】
さらに、通常使用される製剤には、多くの難しい技術的問題がある。例えば、稀釈に際しての薬物沈降の可能性を含む安定性、ろ過の必要性、PVC-含有容器および投与セットに関する制限である。従って、市販の製品よりも効力があり毒性が少なく、副作用を改善し、この薬物の調製および投与に関連する現有の問題を除き得るような新しいパクリタキセル製剤について、必要性がある。
【０００８】
さらに、有効濃度と毒性濃度の小さい差異がパクリタキセルの臨床上の使用を制限する。医療効力は、適当なミクロ担体系でもって薬物を分布せしめることで改善し得るかも知れない。この系は薬物の時間的および空間的バイオ分布を変化せしめ得る。この方法は、高い毒性でほとんど溶けないアンホテリシン B に提案され、うまく硫酸コレステリルのディスク状ミセルに組み込まれた (Lasic D.D. Nature. Vol. 355, 16 Jan., pp.279-280, 1992)。数年間、非常な努力が、両親媒性ジブロック・コポリマーを用いるポリマーミセル性パクリタキセル製剤の開発に払われた (K. Kataoka et al., JMS-Pure Appl. Chem. A31 (11), pp. 1759-1769, 1994)。
【０００９】
ひとつの研究で、ヒト癌細胞系を用いて、バイオ分解性両親媒性ジブロック・コポリマー、モノメトキシポリ(エチレングリコール)‐ブロック‐ポリ(D,L ‐ ラクチド) (m PEG-PDLLA)およびパクリタキセル(Genexol（登録商標） -PM) および Taxol（登録商標） は、同じ濃度でインビトロ細胞毒性が匹敵していた。パクリタキセル のポリマー性ミセル製剤は Taxol（登録商標） に比して、インビボ i.p. 投与で最大耐容量(MTD) が増加した。この製剤は、低毒性レベルおよびパクリタキセル用量の増加（2 から 3 倍高いレベル）において市販の Taxol（登録商標） 注射用製剤よりも利点があるとされた (Kim S. C. et al., J. Controlled Release, v.72, pp. 191-202, 2001)。
【００１０】
上記著者の言う利点はミセルからのパクリタキセルの緩やかな放出についてであり、パクリタキセルと高分子量 m PEG-PDLLA との強い疎水性結合による。同時に、著者によると、通常でない高用量でパクリタキセルを含むポリマー性ミセル製剤についての追加の研究が、毒性の本質および特にこの種の処置の遠縁的影響を完全に特徴解明するのに必要である。
【００１１】
本発明者は、本質的に異なる方法を採用した。それには、自然界に存在する物質の残基のみを含む新規化合物を利用する。これらの化合物は、番号 I から VI であって、それ自体毒性が低い。ラットでの単用量 i.p. 毒性試験を Good Laboratory Practice の OECD 則に合わせて行った。化合物 I - VI は、用量レベル 100mg / kg 体重で死亡を認めなかった。従って、これらの化合物(I-VI)についての最小致死量は 100 mg / kg 体重以上である。
【００１２】
最も広い意味での 「化学療法」、すなわち医学的症状の予防、治療、軽減のために化学物質を投与することを考慮すると、多くの類似の問題がある。効力、例えば、化合物の取り込みおよび標的特殊性、その体内での分布およびクレアランスを最適にすること、および同時に起こり得る副作用や医療スタッフに対する危険を最小にすることが重要である。また、製造費用、調製の容易性、投与様式、保存中の安定性を考慮しなければならない。特に、効力を増加し、副作用を軽減しながら、低溶性医薬の溶性およびバイオアベイラビリティを増加することが望ましい。
【００１３】
より特殊な意味での 「化学療法」 すなわち癌細胞を破壊するための化学物質の使用を考慮すると、新しい物質および製剤を利用可能にする緊急の要請がある。それは、少なくとも効力の改善および低い副作用、好ましくはさらに溶性、安全性、安定性などについての特性の改善を示すものである。
【００１４】
現存の製剤に比して、安全性の改善、効力の改善、低い副作用を示すようなパクリタキセルの新しい製剤を利用可能にすることが望まれる。さらなる問題および対応の革新的解決は、下記の説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【００１５】
先行技術
DE 40 32 187 (Hermes Fabrik pharmazeutischer Praeparate Franz Gradinger GmbH & Co., DE) が、種々の N-レチノイル-L-アミノメルカプト化合物およびその生理的に許容される塩を開示する。この化合物は、粘膜疾患の全身的および局所的処置における使用が示唆されている。構造についての綿密な研究によると、本発明の化合物 (I ‐ VI) の中心的な構造エレメントが DE 40 32 187 では存在しないか、相違する。とりわけ、DE 40 32 187 の化合物は酸化状態‐2 および‐1 で硫黄を含有する。この硫黄含有化合物の生理的機能ならびに物理的および化学的作用が酸化状態で調べられている。この化合物がパクリタキセルなどの水不溶性または微溶性の物質の性質に影響を及ぼすとの記述はない。
【００１６】
Kalemkerian et al., 小細胞肺癌細胞系におけるフェンレチニドおよび化学療法剤, Cancer Chemother Pharmacol, (1999) 43:145-150 は、癌細胞でのアポトーシスの強力な誘発剤であり、かつ他の細胞毒性剤の活性を高める能力を有する合成レチノイドを記述する。各個々の物質および両物質の濃度範囲について、予備的実験で同定された各物質単独の IC50 値の比率に対応する固定の比率で、全体的な総合研究がなされた。著者によると、相互に排他的または相互に非排他的に実験対象物質が相互作用するかは、この研究で明らかにならなかった。パクリタキセルなどの水不溶性または微溶性の物質の溶解および保存の問題は論じられていない。
【００１７】
Zhang et al., ポリマー性ミセルパクリタキセルの抗腫瘍活性およびバイオ分布、Cancer Chemother Pharmacol, (1997) 40:81-86 において、通常の Cremophorパクリタキセル製剤を i.p. 注射されたポリマー性ミセルパクリタキセルと比較している。バイオ分解性両親媒性ジブロック・コポリマー、モノメトオキシポリ(エチレングリコール) ブロック-ポリ(D,L-ラクチド) [mPEG-PDLLA] を使用している。このミセル製剤は非常に有望な結果を示した。しかし、記載されている利点はミセルからのパクリタキセルの緩やかな放出に関し、パクリタキセルと高分子量 mPEG-PDLLA との強力な疎水性結合による。さらに、毒性および投与の緩和な放出様式の長時間作用について調べる必要がある。
【００１８】
発明の要旨
本発明者は、医療活性化合物を、所望の医療活性または所望の活性と相互作用し得るかあるいは所望の活性を強化する活性をそれ自体で発揮する化合物のミセル中に溶解できること、およびどの化合物の毒性が低いかを見出した。本発明は、１群の新規化合物、N-(all-trans-レチノイル)-L-システイン酸 (I)、N-(13-cis-レチノイル)-L-システイン酸 (II)、N-(all-trans-レチノイル)-L-ホモシステイン酸 (III)、N-(13-cis-レチノイル)-L-ホモシステイン酸 (IV)、N-(all-trans-レチノイル)-L-システインスルフィン酸 (V)、N-(13-cis-レチノイル)-L-システインスルフィン酸 (VI) を使用可能にする。これらの化合物は、それ自体で医療作用を有し、および既知の医薬との組合せで相乗作用を発揮する。細胞毒性または細胞増殖抑制性の医薬との組合せで、該新規化合物は癌を攻撃する可能性を改善する。さらに、本発明は、パクリタキセル などの水不溶性または微溶性の医薬の水溶性製剤を、薬理活性の向上ならびに保存性および取扱い性の改善により、つくり得ることを開示する。
【００１９】
発明の説明
用語 「強化」 および 「強化する」 は、２以上の化合物の医療作用が、同時にまたは実質的に同時に与えられたときに、単独で与えられた該化合物の作用よりも大きくなることを定義するのに使用する。
【００２０】
用語 「同時に」 は、本明細書で最も広く解されるべきであって、すなわち、２以上の化合物が混合されて与えられる状態、および２以上の化合物が別個に、同じまたは異なる投与経路で同じ時にまたは継続的に与えられる状態である。ただし、その化合物が同じ時または実際的に同じ時に体内で医療作用を発揮するものとする。
用語 「臨界的ミセル濃度」 すなわち 「CMC」 は溶液成分濃度の尺度であって、該成分の濃度の増加がミセル形成を起こす濃度以上の臨界値を表す。
【００２１】
驚くべきことに、N-(all-trans-レチノイル)-L-システイン酸 (I)、N-(13-cis-レチノイル)-L-システイン酸 (II)、N-(all-trans-レチノイル)-L-ホモシステイン酸 (III)、N-(13-cis-レチノイル)-L-ホモシステイン酸 (IV)、N-(all-trans-レチノイル)-L-システインスルフィン酸 (V)、N-(13-cis-レチノイル)-L-システインスルフィン酸 (VI) が微溶性化合物の溶性を増加すること、およびその医療効力を強化することを見出した。本発明の新規化合物は、all-trans-レチノイン酸または 13-cis‐レチノイン酸の L-システイン酸(3-スルホ-L-アラニン)、L-ホモシステイン酸、L-システインスルフィン酸とのアミドである。これらの化合物の構造式を下記する。
【００２２】
【化１】
2005508287.tif 000002
I. N-(all-trans-レチノイル)-L-システイン酸
【化２】
2005508287.tif 000003
II. N-(13-cis-レチノイル)-L-システイン酸
【化３】
2005508287.tif 000004
III. N-(all-trans-レチノイル)-L-ホモシステイン酸
【化４】
2005508287.tif 000005
IV. N-(13-cis-レチノイル)-L-ホモシステイン酸
【化５】
2005508287.tif 000006
V. N-(all-trans-レチノイル)-L-システインスルフィン酸
【化６】
2005508287.tif 000007
VI. N-(13-cis-レチノイル)-L-システインスルフィン酸
【００２３】
これらの化合物の分子は水溶液中で親水性と疎水性の部分を同時に発現する。塩の形態において、これらの化合物はミセルを水溶液中で臨界ミセル濃度 (CMC) 以上で形成し得る。
【００２４】
本発明は、医薬の製造のために上記の化合物およびその誘導体の使用を可能にする。本発明はまた、癌処置用医薬の製造のために上記の化合物およびその誘導体の使用を可能にする。
【００２５】
さらに、本発明は、医療的有効量での活性物質および１以上の上記化合物 (化合物 I - VI) またはその誘導体を含む医薬組成物の使用を可能にする。特に、本発明は、活性物質が細胞毒性化合物であり、強化する化合物が１つの上記化合物 (化合物 I - VI) またはその誘導体の使用を可能にする。ひとつの実施態様において、該活性物質はパクリタキセルである。
【００２６】
本発明の別の実施態様は、医薬活性物質の効力を強化する方法である。そこでは、該物質を少なくとも１つの上記化合物 (化合物 I - VI) またはその誘導体とともにミセルの形態で調製する。
【００２７】
他の実施態様は、医薬活性物質の溶解性を増加する方法である。そこでは、該物質を少なくとも１つの上記化合物 (化合物 I - VI) またはその誘導体とともにミセルの形態で調製する。
【００２８】
さらに他の実施態様は、医薬活性物質のバイオアベイラビリティを改善する方法である。そこでは、該物質を少なくとも１つの上記化合物 (化合物 I - VI) またはその誘導体とともにミセルの形態で調製する。
【００２９】
本発明はまた、癌を処置する方法を使用可能にする。そこでは、細胞毒性物質を少なくとも１つの上記化合物 (化合物 I - VI) またはその誘導体と混合し、患者に分布せしめる。特に、本発明は、細胞毒性物質がパクリタキセルである方法に関する。
【００３０】
微溶性化合物パクリタキセルを N-(all-trans-レチノイル)-L-システイン酸 (I)、N-(13-cis-レチノイル)-L-システイン酸 (II)、N-(all-trans-レチノイル)-L-ホモシステイン酸 (III), N-(13-cis-レチノイル)-L-ホモシステイン酸 (IV)、N-(all-trans-レチノイル)-L-システインスルフィン酸 (V)、N-(13-cis-レチノイル)-L-システインスルフィン酸 (VI) のミセルに、混合ミセルを形成せしめて、溶解できることを見出した。この方法において、塩類溶液中で混合ミセルの形態でパクリタキセルの優れた溶解性を達成した。これらの化合物 (化合物 I - VI) の塩類溶液を広い範囲の濃度で調製し、5% ウシ胎児血清 (FBS) のMEM 中でヒト乳房腺癌の培養基 (MDA-MB-231 細胞系) に加えた。
【００３１】
発明化合物の細胞毒性を濃度 40 nM で検討した試験によると、よい結果を範囲 0,005 mg/ml 〜 5,0 mg/ml の化合物の塩類溶液 (最初の濃度) で得た。38% に近い最大細胞成長阻害を最初の濃度 1 mg/ml (塩類溶液)で、腺腫培養基 (MDA-MB-231 細胞系)に添加する前に認めた。
【００３２】
発明化合物の細胞毒性をMDA-MB-231 細胞の培養基中、濃度範囲 10-11 M 〜 10-6 M で検討した試験で、下記の従属性を認めた：発明化合物の濃度増加で細胞成長阻害が高まり、42% に近い値を濃度 10-6 M で示した。パクリタキセル/化合物 (I ‐ VI) の製剤および化合物 I から VI 単独の細胞毒性を、MDA-MB-231 細胞系の培養基でパクリタキセルおよび Taxol（登録商標） と比較した。パクリタキセル および Taxol（登録商標） の場合、細胞成長阻害 IC50 濃度に近い濃度で 46% であった。
【００３３】
特に同じパクリタキセル濃度で、パクリタキセルと化合物 I の製剤またはパクリタキセルと化合物 II の製剤は、両者とも成分の分子比率 1:5 で、驚くべき高い細胞成長阻害 70% を示した。市販の Taxol（登録商標） (ポジティブ対照) の細胞成長阻害は 45% であった。化合物 I または II 単独での細胞毒性作用はすでに濃度 40 nM で 40% に近い。パクリタキセル と化合物 I (または 化合物 II) の製剤は、細胞成長阻害の増加を分子比率の範囲 1:3 ‐ 1:5 (パクリタキセル : 化合物 I (または 化合物 II)) で示す。成分の比率を 1:10 に増加すると、細胞成長阻害の程度は実際的に変化しない。
【００３４】
N-(all-trans-レチノイル)-L-システイン酸 (I)、N-(13-cis-レチノイル)-L-システイン酸 (II)、N-(all-trans-レチノイル)-L-ホモシステイン酸 (III)、N-(13-cis-レチノイル)-L-ホモシステイン酸 (IV)、N-(all-trans-レチノイル)-L-システインスルフィン酸 (V)、N-(13-cis-レチノイル)-L-システインスルフィン酸 (VI) およびパクリタキセルの製剤を下記のように調製した:パクリタキセルと化合物 (I - VI) のいずれかのエタノール溶液(または他の脂肪族アルコール) を最初に適当な濃度で調製した。ついでこれら溶液のアリコートを混合し、所望の分子比率パクリタキセル: 化合物 (I -VI) の混合物をつくる。得られた溶液を化合物 (I -VI)の作用の変化なしに、低温で少なくとも 3 か月保存できる。さらに製剤は細胞毒性作用を長い保存中保持する。使用の前に、溶液を減圧で蒸留して、患者への静脈注入用の塩類溶液または他の市販ビヒクルに溶解するワックス状固体を得る。
【００３５】
Taxol（登録商標）(Bristol-Myers Squibb Co.) はパクリタキセル(6mg)、エタノール (396mg)、Cremophor（登録商標） EL (527mg) を含有する製剤である。本発明化合物、N-(all-trans-レチノイル)-L-システイン酸 (I)、N-(13-cis-レチノイル)-L-システイン酸 (II)、N-(all-trans-レチノイル)-L-ホモシステイン酸 (III)、N-(13-cis-レチノイル)-L-ホモシステイン酸 (IV)、N-(all-trans-レチノイル)-L-システインスルフィン酸 (V)、N-(13-cis-レチノイル)-L-システインスルフィン酸 (VI) が市販の Taxol（登録商標） 製剤において優れた溶解性を有することを明らかにする。本発明化合物を用いて通常のパクリタキセル製剤を容易に改善することが可能である。エタノール溶液を N-(all-trans-レチノイル)-L-システイン酸 (I)、N-(13-cis-レチノイル)-L-システイン酸 (II)、N-(all-trans-レチノイル)-L-ホモシステイン酸 (III)、N-(13-cis-レチノイル)-L-ホモシステイン酸 (IV)、N-(all-trans-レチノイル)-L-システインスルフィン酸 (V)、N-(13-cis-レチノイル)-L-システインスルフィン酸 (VI) のひとつから調製する。得られた溶液を減圧で蒸留すると、ワックス状の固体を得る。これに Taxol（登録商標） を加え、ワックス状の固体を溶解する。Taxol（登録商標） エムルションが化合物 (I - VI) との液体系を、パクリタキセル の化合物 (I - VI) 分子比率 1:20 以上でつくる。
【００３６】
改善されたパクリタキセル製剤 (Taxol（登録商標） および 化合物 I - VI) の細胞毒性を検討する試験を、パクリタキセル : 化合物 I (〜 化合物 VI) の分子比率 1:1 〜 1:20 で、ヒト乳房腺腫 (MDA-MB-231 細胞系) の培養基で行った。この試験の結果は、パクリタキセル および化合物 I (〜 VI) の塩類溶液で得られた結果と同じである。この改善パクリタキセル製剤 (Taxol（登録商標） および 化合物 I - VI) は、細胞成長阻害を分子比率 1:10 でほぼ 50% (Taxol単独に比して)増加した。
【００３７】
本発明は、微溶性の医療物質を溶性にしその医療効力を強化する発明思想を、下記の抗癌剤パクリタキセルを含む 12 の新規医療製剤を示して明らかにする。
1) パクリタキセルと N-(all-trans-レチノイル)-L-システイン酸、塩類溶液中、
2) パクリタキセルと N-(13-cis-レチノイル)-L-システイン酸、塩類溶液中、
3) パクリタキセルと N-(all-trans-レチノイル)-L-ホモシステイン酸、塩類溶液中、
4) パクリタキセルと N-(13-cis-レチノイル)-L-ホモシステイン酸、塩類溶液中、
5) パクリタキセルと N-(all-trans-レチノイル)-L-システインスルフィン酸、塩類溶液中、
6) パクリタキセルと N-(13-cis-レチノイル)-L-システインスルフィン酸、塩類溶液中、
7) Taxol（登録商標） と N-(all-trans-レチノイル)-L-システイン酸、
8) Taxol（登録商標） と N-(13-cis-レチノイル)-L-システイン酸、
9) Taxol（登録商標） と N-(all-trans-レチノイル)-L-ホモシステイン酸、
10) Taxol（登録商標） と N-(13-cis-レチノイル)-L-ホモシステイン酸、
11) Taxol（登録商標） と N-(all-trans-レチノイル)-L-システインスルフィン酸、
12) Taxol（登録商標） と N-(13-cis-レチノイル)-L-システインスルフィン酸。
【００３８】
これらの製剤は優れた物理的および化学的安定性を示し、稀釈時のパクリタキセルの沈澱を減じる。これはまた、通常のパクリタキセル製剤の調製および保存のための器具および容器に関する厳しい必要条件についての問題を解決する。
とりわけ、化合物 (I ‐ VI) は、毒性が低く、適当な濃度範囲で顕著な細胞成長阻害作用の増加を示す。
【００３９】
本発明で得られる結果は、化合物 (I ‐ VI)、その薬学的に有用な塩、特に Na-塩の大規模な合成についての技術を開発に導く。本発明化合物 (I-VI) の合成は、L-システイン酸、L-ホモシステインおよび L-システインスルフィン酸のアミノ基の直接的アシル化を、Na2CO3 を含有する水-有機溶媒中で混合カルボン酸−カルボン酸無水物による。化合物 (I ‐ VI) のナトリウム塩の 2-プロパノール-水の混合物中での安定性が不溶性の夾雑物(無機塩および出発のアミノ酸) を分離するのを可能にする。純粋の化合物 (I ‐ VI)を、メタノール-2-プロパノール混合物を用いて、その 2-プロパノール-水の濃縮溶液から沈澱により得る。
【００４０】
本発明で開発された上記合成法で、化合物 (I ‐ VI) のナトリウム塩を好収率でつくることができる。この方法は簡単で時間が節約できる。最終産物は純粋な形態であり、クロマトグラフィ−を必要としない。化合物 (I ‐ VI) のナトリウム塩を 2-プロパノール-水 2:1 (v/v) または エタノール-水 2:1 (v/v) の溶液で、少なくとも 6 月間低温で何らの作用変化なしに、保存できる。発明化合物 (I-VI) とパクリタキセルまたは Taxol（登録商標）との製剤をつくるために、これら化合物のナトリウム塩を容易に対応の酸形態に転換し、メタノールに溶解する。
【００４１】
発明化合物 I 〜 VI の細胞毒性をMDA-MB-231 細胞の培養基中、濃度範囲 10-11 M 〜 10-6 M で検討した試験で、下記の従属性を認めた：発明化合物の濃度増加で細胞成長阻害が高まり、化合物 I および II について 50% に近い値に、化合物 III および IV について 35% に近い値に、化合物 V および VI について 30% に近い値に達した。
【００４２】
パクリタキセル/化合物 (I-VI) 製剤をつくるために、化合物 I 〜 VI のナトリウム塩を対応の酸形態に転換し、メタノールに溶解した。同じパクリタキセル濃度で、パクリタキセル と化合物 I またはパクリタキセルと化合物 II の製剤は、70% に近い高細胞成長阻害（ポジティブ対照のパクリタキセルに比して 45%)を示した;パクリタキセルと化合物 III またはパクリタキセルと化合物 IV の製剤は、60% に近い高細胞成長阻害（ポジティブ対照のパクリタキセルに比して 30%)を示した;パクリタキセルと化合物 V またはパクリタキセルと化合物 VI の製剤は、55% に近い高細胞成長阻害（ポジティブ対照のパクリタキセルに比して 25%)を示した。パクリタキセル : 化合物 (I-VI) の分子比率は 1:7 であった。
【００４３】
Taxol（登録商標）/化合物 (I-VI) の製剤をつくるために、化合物 (I-VI) のナトリウム塩を対応の酸形態に転換し、Taxol（登録商標） 中に溶解した。Taxol（登録商標）/化合物 I または Taxol（登録商標）/化合物 II の製剤は、75% に近い細胞成長阻害(ポジティブ対照の Taxol（登録商標） 単独に比して 50% に近い)を示した； Taxol（登録商標）/化合物 III または Taxol（登録商標）/化合物 IV の製剤は、65% に近い細胞成長阻害(ポジティブ対照の Taxol（登録商標） 単独に比して 35% に近い)を示した; Taxol（登録商標）/化合物 V または Taxol（登録商標）/化合物 VI の製剤は、60% に近い細胞成長阻害(ポジティブ対照の Taxol（登録商標） 単独に比して 30% に近い)を示した。パクリタキセル : 化合物 (I-VI) の分子比率は 1:10 であった。
【００４４】
化合物 (I-VI) は、驚くべきことに、混合ミセル塩類溶液をつくって、腫瘍細胞の成長阻害能をパクリタキセル溶解力に結び付ける。さらに、これらの化合物 (I-VI) がパクリタキセルの効力を強化することを示す。また、本発明者はまた、調製方法を開発し、混合ミセル系における化合物 (I-VI)/パクリタキセルの凍結乾燥組成物をつくった。
【００４５】
化合物 (I-VI) /パクリタキセルの混合ミセル系を最適にするのに、異なる分子比率のパクリタキセル: 化合物 (I-VI) およびビヒクルを用いる。本発明の混合ミセル系は、水溶液中で稀釈 100 倍以上で薬剤の沈澱を生じない。
【００４６】
パクリタキセルと化合物 (I-VI) のメタノール溶液をパクリタキセル: 化合物 (I-VI) の異なる分子比率 1:3、1:5、1:7 で混合した。減圧で有機溶媒を蒸発し、得た乾燥フィルムを、蒸留水または 0.05 M 酢酸ナトリウム緩衝液、pH 5.6 または 10% エタノール溶液または 0.15 M NaCl 溶液または 0.05 M 酢酸ナトリウム緩衝液、pH 5.6 を 10% ナトリウム液に加えて乾燥して、化合物 (I - VI)/パクリタキセル の混合ミセル溶液を得る。これらの溶液を 0.22 μm 無菌フィルターでろ過し、4 ℃で保存する。これらの原型系のすべてが有意の抗腫瘍活性をインビトロで 3 週間示した。 沈澱などの大きい変化を保存中に認めなかった。
【００４７】
混合ミセルは溶液中であまり安定でなかった。化合物 (I-VI)/パクリタキセル の混合ミセル系の製剤を、パクリタキセル : 化合物 (I-VI) の分子比率 1:7 で凍結乾燥し(水溶液、W または 0.05 M 酢酸ナトリウム緩衝液、pH 5.6、SAB として)、粉末形態で 6 か月 4 ℃ で保存した。混合ミセル系の化合物 (I-VI)/パクリタキセル 製剤は乾燥状態で、使用に至るまでの十分な時間安定であった。活性成分の濃度変化は、少なくとも 6 か月 4 ℃の保存で認めなかった。
【００４８】
蒸留水または 0.05 M 酢酸ナトリウム緩衝液、pH 5.6 または 10% エタノールまたは 0.15 M NaCl 溶液または 0.05 M 酢酸ナトリウム緩衝液、pH 5.6、10% エタノール中での再構築で、澄明な溶液を直ちに得た。
【００４９】
乾燥の化合物 (I-VI)/パクリタキセルの混合ミセル系 (OF) における製剤は、0.05 M 酢酸ナトリウム緩衝液 (W/SAB) で再構築されたものまたは 0.05 M 酢酸ナトリウム緩衝液の溶液として凍結乾燥され水 (SAB/W) で再構築されたものであって、MDA-MB-231 細胞系に対して最上の細胞毒性作用を発揮する。その細胞毒性作用は化合物 (I-VI)/パクリタキセル塩類溶液製剤の作用に類似した (表 1)。
【００５０】
表 1. 本発明で調製された製剤の細胞毒性作用
【表１】
2005508287.tif 000008
【００５１】
本発明製剤は都合よく Taxol（登録商標） に匹敵し、Cremophor（登録商標） EL に関連する有害作用を除去または改善する。インビトロでの試験は顕著な結果を示し、患者における薬理活性が通常のパクリタキセル製剤に比して改善されると考えられる実質的な根拠がある。
【００５２】
従って、本発明は、パクリタキセル の水溶性製剤を調製する方法を使用可能にする。これは、第１溶媒にパクリタキセルを溶解する工程、第２溶媒に化合物 (I-VI) を溶解する工程、得られたパクリタキセルおよび該化合物の溶液のアリコートを所望の分子比率で混合する工程、得られた混合物を蒸発乾固する工程を含む。
【００５３】
さらに、本発明は、Taxol（登録商標） の水溶性改善製剤を調製する方法を使用可能にする。これは、溶媒に化合物 (I-VI) を溶解する工程、得られた溶液の所望のアリコートを蒸発乾固する工程、Taxol（登録商標）における残渣を溶解する工程を含む。
【００５４】
さらに、本発明は、パクリタキセルの安定な保存製剤を調製する方法を使用可能にする。これは、第１溶媒にパクリタキセルを溶解する工程、第２溶媒に化合物 (I-VI) を溶解する工程、得られたパクリタキセル溶液および該化合物のアリコートを所望の比率で混合する工程を含む。
【００５５】
さらに、本発明は、患者に投与用のパクリタキセルの製剤を調製する方法を使用可能にする。これは、第１溶媒にパクリタキセルを溶解する工程、第２溶媒に化合物 (I-VI) を溶解する工程、得られたパクリタキセル溶液および該化合物のアリコートを所望の比率で混合する工程、得られた溶液の所望のアリコートを蒸発乾固してパクリタキセルおよび該化合物の残渣をつくる工程、形成された溶液を凍結乾燥する工程、患者への投与に適したビヒクルを用いて凍結乾燥産物を再構築する工程を含む。
本発明を下記の非限定的な実施例で詳細に説明する。
【００５６】
（実施例）
材料および方法
all-trans-レチノイン酸、13-cis-レチノイン酸、L-システイン酸、L-ホモシステイン酸、L-システインスルフィン酸を Sigma Chemical Co, St. Louis, MO, USA から購入した。他のすべての化学試薬および溶媒を Aldrich Chemical Co から購入した。
【００５７】
1H-NMR スペクトルを 400 MHz で Varian Unity-400 分光計により測定した。スペクトルを化合物の酸形態で測定した。なお、L-ホモシステイン酸 III および IV をナトリウム塩の形態で用い、DMSO-d6 を溶媒として用いた。
【００５８】
Merck シリカゲル 60 プレコート・プレートを薄層クロマトグラフィ− (TLC) に用い、クロロホルム：メタノール：酢酸：水 (65:25:5:5, v/v/v/v) の溶媒系で展開した。TLC プレート上の化合物の検出を、10% H2SO4 メタノール液を噴霧し、150oC まで加熱し、、または 0,3 % ニンヒドリンの 1-ブタノール-酢酸 100:3 (v/v)溶液を用いて行った。合成化合物の濃度の測定を UV-スペクトル (Shimadzu UV-mini-1240 分光計、λ÷250-500 nm, λmax 346 nm, ε45000, MeOH)で all-trans-レチノイン酸の誘導体について、および重量で 13-cis-レチノイン酸の誘導体について行った。UV-スペクトルで決定された濃度はサンプルの重量に等しい。
【００５９】
合成された化合物 (酸形態) は、クロロホルム、THF、エタノール、メタノール、70% aq エタノールに溶性である。L-システイン酸および L-システインスルフィン酸の誘導体 (I, II, V, VI)のナトリウム塩は、水を含有する混合物 (例えば、メタノール-水、エタノール-水、THF-水など) にのみ溶性である。L-ホモシステイン酸の誘導体 (III, IV) のナトリウム塩は、メタノールおよび少しのメタノール含有の混合物 (例えば、クロロホルム-メタノール、THF-メタノールなど)にも溶性である。
合成の全工程を乾燥窒素気中で行った。
【００６０】
パクリタキセルは Sigma (St. Louis, MO, USA) から、Taxol（登録商標） は Bristol-Myers Squibb Co. から購入した。ヒト乳房腺腫 MDA-MB-231 細胞系は American Type Culture Collection (ATCC-HTB-26, Lot 1227150) から購入した。細胞系を、Nunclon 25cm2 フラスコ (Nunc A/S, Denmark) 中で、抗生物質を含有し、10% (v/v) ウシ胎児血清 (FBS) (Sigma, St.Louis, MO, USA) 補充の Minimum Essential Medium Eagle (MEM) において培養して、増殖せしめた。培養基を成長培地中、37℃湿気中、95% 空気および 5% CO2 で保持した。
【００６１】
腫瘍細胞 (60 × 103 細胞/mL) の懸濁液を、5% FBS および抗生物質を有する MEM 中で調製した。細胞懸濁液 (200 μL) を Nunclon 96-ミクロウエルプレート (Nunc A/S, Denmark) のウエルに密度12 × 103 細胞/ウエルで播いた。試験する薬物の溶液を培養基に 0 日または 1 日に用量 2 μL で加えた。すべての場合、細胞を 3 日間インキュベートした。
インキュベーションの終りに、固着細胞をトリプシン処理により剥がし、生細胞数をトリプシンブルー排除試験および血球計で数えた。
【００６２】
すべての実験を少なくとも２回行い、細胞計数を各薬物濃度につき３回行った。各対照および試験群は 6-8 培養基からなる。結果を平均細胞数 ± SD で表し、対照と試験群の相違を Student's t-検定で調べた。各試験薬物の細胞毒性を細胞成長阻害の程度で評価した。細胞成長阻害を下記のように評価した:
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【実施例１】
【００６３】
N-(all-trans-レチノイル)-L-システイン酸の合成
all-trans-レチノイン酸 (150 mg, 0.5mmol) およびトリエチルアミン (71 μl, 0.51 mmol)を 1 ml の無水テトラヒドロフラン（無水アセトニトリル (2ml) を添加）に溶解した。混合物を‐20oC まで冷やし、66 μl (0.51 mmol) のクロロホルム酸ブチルを加えた。30 分後に、沈澱トリエチルアミン塩酸塩のない混合物をピペットで L-システイン酸１水和物 (140 mg, 0.75 mmol) の溶液、3 ml の 1M Na2CO3 および 1.5 ml の H2O に入れた。得られた混合物を約 5 時間 20-25oC で攪拌し、1M KHSO4 で pH 3-4 の酸性とし、ろ過した。溶液をクロロホルム-2-プロパノール-メタノール (2:1:1, v/v/v, 15 ml) で抽出し、減圧で濃縮した。メタノール-水 (1:1, v/v, 15 ml) の混合物を残渣に加えた。得られた懸濁液をエーテル (2x10 ml) で洗い、減圧で蒸留し、10 ml のメタノールに溶解し、ろ過した。減圧蒸留後、残渣を 7 ml の無水テトラヒドロフランに溶解し、‐20oC まで冷やし、遠心分離した (3000 rpm, -20oC, 20 分)。澄明な上澄み液を減圧蒸留して、黄色ワックス状固体を得た。収率: 40%。
【００６４】
Rf 0.30-0.35. 1H-NMR (CD3SOCD3, 400 MHz) δ 1.00 [6H, s, C(CH3)2], 1.42 and 1.55 [2H+2H, 2m, CH2CH2C(CH3)2], 1.66 [3H, s, CH3C=CC(CH3)2], 1.94 [3H, s, CH3C=(CH)3C(CH3)=CHCO], 2.00 (2H, m, CH2C=), 2.25 (3H, s, CH3C=CHCO), 2.79-2.90 (2H, m, SCH2), 4.40 (1H, m, NCH), 5.84 (1H, s, =CHCO), 6.10-6.35 [4H, m, CH=CHC(CH3)=CHCH=CH], 6.91 (1H, dd, J 15.2, 11.5 Hz, CHCH=CH), 8.08 (1H, d, J 6.4 Hz, NH), 〜12.4 (1H, br s, CO2H)。
【実施例２】
【００６５】
ヒト乳房腺腫 MDA-MB-231 細胞系の培養基における化合物 I の細胞毒性の評価、稀釈のために培地に加える前の化合物 I 塩類溶液の最初の濃度に関連
化合物 I の最初の溶液を濃度 0.005 〜 5.0 mg/ml に、乾燥物質を塩類溶液に稀釈して調製した。調製された化合物 I の塩類溶液は下記の濃度を有する: 0.005、0.05、0.5、1.0、5.0 mg/ml。これらの溶液から、培養基に加えるため 5% FBS を持つ MEM 作業溶液を濃度 4 mM で調製した。
【００６６】
MDA-MB-231 細胞系の培養基を１日目の細胞播種後に化合物 I 溶液で処理した。作業溶液のアリコート (2 μL) を 200 μL 培養基に最終濃度 40 nM で加えた。対照培養基において、5% FBS を持つ 2 μL の培地を溶媒対照として加えた。連続２日間の培養後に培養基中の生細胞を計数し、化合物 I の細胞毒性を評価するために、MDA-MB-231 細胞系の成長阻害の程度を計算した。
培養の３日後に対照培養基は (49.9 ± 3.85) × 103 細胞を含有した。
【００６７】
化合物 I の溶液で処理した培養基は下記の生細胞数を有した:
0.005 mg/mL:    (33.3 ± 2.55) × 103, 細胞成長阻害 33.3% (p < 0.01);
0.05 mg/mL:     (33.9 ± 2.78) × 103, 細胞成長阻害 32.1% (p < 0.01);
0.5 mg/mL:      (34.2 ± 5.09) × 103, 細胞成長阻害 31.5% (p < 0.05);
1.0 mg/mL:      (30.8 ± 3.53) × 103, 細胞成長阻害 38.3% (p < 0.01);
5.0 mg/mL:      (36.1 ± 4.10) × 103, 細胞成長阻害 27.7% (p < 0.05)。
【００６８】
このように、化合物 I (濃度 40 nM) が有意の細胞毒性作用をヒト乳房腺腫 (MDA-MB-231 細胞系)の培養基で発揮する。さらに大きい細胞毒性作用を化合物 I の塩類溶液から調製された溶液が濃度 1 mg/mL で示す。この場合、細胞成長阻害の程度は 38.3% (p < 0.01)であった。
【実施例３】
【００６９】
ヒト乳房腺腫 MDA-MB-231 細胞系の培養基における化合物 I の細胞毒性の評価、培養基中の化合物 I の最終の濃度に関連
化合物 I (1 mg/ml) の最初の保存塩類溶液を、乾燥物質を塩類溶液に溶解して調製した。この溶液から、5% FBS を有する MEM 中の化合物の作業溶液を培養基に加えるための異なる濃度に連続的稀釈で調製した。
【００７０】
MDA-MB-231 細胞の培養基を、１日目の播種後に 5% FBS を含む MEM 中の薬物溶液で処理した。異なる濃度の化合物 I を有する作業溶液のアリコート (2 μL) を 200 μL 培養基に化合物 I の最終濃度 10-11 〜 10-6 mol/L で加えた。対照培養基において、5% FBS を有する 2 μL の培地に溶媒対照として加えた。連続２日の培養後に培養基中の生細胞を計数し、化合物 I 試験溶液の細胞毒性を評価するために、MDA-MB-231 細胞の成長阻害の程度を計算した。
培養３日後で対照培養基は(49.9 ± 3.85) × 103 細胞を含有した。
【００７１】
化合物 I の溶液で処理した培養基は下記の生細胞数を有した:
10-11 mol/L:       (36.3 ± 3.82) × 103, 細胞成長阻害 27.3% (p < 0.05);
10-10 mol/L:       (40.6 ± 1.69) × 103, 細胞成長阻害 18.6% (p  < 0.05);
10-9 mol/L:        (40.0 ± 2.31) × 103, 細胞成長阻害 19.8% (p < 0.05);
10-8 mol/L:        (35.0 ± 4.38) × 103, 細胞成長阻害 29.9% (p < 0.05);
4 × 10-8 mol/L:    (30.9 ± 1.62) × 103, 細胞成長阻害 38.1% (p < 0.001);
10-7 mol/L:        (30.4 ± 1.83) × 103, 細胞成長阻害 39.1% (p < 0.001);
10-6 mol/L:        (28.9 ± 2.68) × 103, 細胞成長阻害 42.1% (p < 0.001)。
【００７２】
このように、化合物 I が有意の細胞毒性作用をヒト乳房腺腫細胞に対して発揮する。化合物 I の濃度の増加により細胞成長阻害の程度が 42.1% (p < 0.001) に増加する。
【実施例４】
【００７３】
細胞毒性のヒト乳房腺腫 (MDA-MB-231 細胞系)培養基における パクリタキセル、Taxol（登録商標）、パクリタキセル化合物 I の製剤、化合物 I 単独の比較
パクリタキセルの保存溶液をエタノールで調製した。Taxol（登録商標） の溶液、パクリタキセル化合物 I 製剤、化合物 I を塩類溶液において調製した。5% FBS を有する MEM 中の各薬物の作業溶液は培養基に加えるため下記濃度で調製した:
製剤:          8 × 10-7 mol/Lのパクリタキセルおよび 4 × 10-6 mol/L の化合物 I
化合物 I:      4 × 10-6 mol/L
パクリタキセル:8 × 10-7 mol/L
Taxol（登録商標）:8 × 10-7 mol/L のパクリタキセル
【００７４】
MDA-MB-231 細胞の培養基を、０日目の播種後に 5% FBS を含む MEM 中の薬物溶液で処理した。作業溶液のアリコート (2 μL) を 200 μL 培養基に薬物の最終濃度まで加えた：
製剤:          8 × 10-9 mol/L のパクリタキセルおよび 4 × 10-8 mol/L の化合物 I
化合物 I:      4 × 10-8 mol/L
パクリタキセル:8 × 10-9 mol/L
Taxol（登録商標）:8 × 10-9 mol/L のパクリタキセル
【００７５】
対照培養基において、5% FBS を有する 2 μL の培地に溶媒対照として加えた。連続３日の培養後に培養基中の生細胞を計数し、各試験薬物の細胞毒性を評価するために、MDA-MB-231 細胞の成長阻害の程度を計算した。
対照培養基は(27.0 ± 3.79) × 103 細胞を含有した。
【００７６】
薬物で処理された培養基は下記の数の生細胞を含有した:
製剤:              (8.1 ± 0.65) × 103, 細胞阻害 70% (p<0.001)
化合物 I:          (16.3 ± 2.50) × 103, 細胞阻害 39.6% (p<0.05)
パクリタキセル:    (15.5 ± 1.63) × 103, 細胞阻害 42.6% (p<0.02)
Taxol（登録商標）: (14.7 ± 2.33) × 103, 細胞阻害 45.6% (p<0.02)
【００７７】
このように、パクリタキセルと化合物 I の製剤が Taxol（登録商標） (ポジティブ対照) およびパクリタキセル単独を越えて、ヒト乳房腺腫細胞に対する有意の細胞毒性作用を発揮する。MDA-MB-231 細胞の成長阻害は、Taxol（登録商標） について 45% (p < 0,02) であった。化合物 I 単独の細胞毒性作用は 39.6 % (p < 0.05) であった。
【実施例５】
【００７８】
ヒト乳房腺腫 MDA-MB-231 細胞系の培養基における製剤 パクリタキセル化合物 I の細胞毒性の評価、パクリタキセル : 化合物 I の分子比率に関連
塩類溶液中の製剤の最初の溶液を パクリタキセル/化合物 I の分子比率 1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:10 で調製した。これらの溶液から、培養基に加えるため 5% FBS を有する MEM 中で作業溶液を調製した。パクリタキセルの濃度は 10-6 M に等しい。
【００７９】
MDA-MB-231 細胞系の培養基を、１日目の播種後に 5% FBS を含有する MEM 中の薬物溶液で処理した。アリコートの作業溶液 (2 μL) を 200 μL 培養基に 10-8 M に等しい培養基中のパクリタキセルの最終濃度で加えた。対照培養基において、5% FBS を持つ 2 μL の培地を溶媒対照として加えた。連続２日間の培養後に培養基中の生細胞を計数し、製剤の試験溶液の細胞毒性を評価した。
【００８０】
培養の３日後に対照培養基は (54.8 ± 3.53)  × 103 細胞を含有した。
パクリタキセルで濃度 10 nM で処理した培養基は (37.6 ± 2.12) × 103 細胞を含有し、細胞成長阻害が 31.4% (p < 0.001)であった。
【００８１】
製剤の溶液で、5% FBS を含有する MEM 中の製剤溶液、パクリタキセル/化合物 I の分子比率 1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:10 で処理した培養基は下記の生細胞数を有した：
1:3:    (25.7 ± 1.46) × 103, 細胞成長阻害が 53.1% (p < 0.001)で、細胞成長阻害がパクリタキセルに比して、増加 31.6% (p < 0.001);
1:4:    (28.0 ± 1.78) × 103, 細胞成長阻害が 48.9% (p < 0.001)で、細胞成長阻害がパクリタキセルに比して、増加 25.5% (p < 0.01);
1:5:    (22.8 ± 2.13) × 103, 細胞成長阻害が 58.4% (p < 0.001) で、細胞成長阻害がパクリタキセルに比して、増加 39.4% (p < 0.001);
1:6:    (21.7 ± 1.52) × 103, 細胞成長阻害が 60.4% (p < 0.001) で、細胞成長阻害がパクリタキセルに比して、増加 42.3% (p < 0.001);
1:7:    (21.6 ± 1.81) × 103, 細胞成長阻害が 60.6% (p < 0.001) で、細胞成長阻害がパクリタキセルに比して、増加 42.6% (p < 0.001);
1:10:  (20.3 ± 1.21) × 103, 細胞成長阻害が 63.0% (p < 0.001) で、細胞成長阻害がパクリタキセルに比して、増加 46.0% (p < 0.001)
【実施例６】
【００８２】
ヒト乳房腺腫 MDA-MB-231 細胞系の培養基における Taxol（登録商標） および改善以前製剤 (Taxol（登録商標） ＋ 化合物 I) の細胞毒性の評価、パクリタキセル : 化合物 I の分子比率に関連
発明製剤の最初の溶液をパクリタキセル/化合物Ｉの分子比率 1:1、1:3、1:6、1:10、1:15、1:20 で調製した。これらの溶液から、培養基に加えるため 5% FBS を有する MEM 中で作業溶液を調製した。パクリタキセルの濃度は 10-6 M に等しい。
【００８３】
MDA-MB-231 細胞系の培養基を、１日目の播種後に 5% FBS を含有する MEM 中の薬物溶液で処理した。作業溶液のアリコート (2 μL) を 200 μL 培養基に 10-8 M に等しい培養基中のパクリタキセルの最終濃度で加えた。対照培養基において、5% FBS を持つ 2 μL の培地を溶媒対照として加えた。連続２日間の培養後に培養基中の生細胞を、製剤の細胞毒性を評価するために計数した。
培養の３日後に対照培養基は (52.3 ± 2.78) × 103 細胞を含有した。
濃度 10nMパクリタキセルTaxol（登録商標） で処理した培養基は、(32.5 ± 2.04) × 103 細胞を含有し、細胞成長阻害が 37.9% (p < 0.001)であった。
【００８４】
発明製剤 (Taxol（登録商標） ＋ 化合物 I) の溶液で、5% FBS を含有する MEM 中 パクリタキセル/化合物 I の分子比率 1:1、1:3、1:6、1:10、1:15、1:20 1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:10 で処理した培養基は下記の生細胞数を有した：
1:1:   (26.9 ± 1.60) × 103, 細胞成長阻害が 48.6% (p < 0.001) で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して、増加 17.2% (p < 0.05);
1:3:   (22.2 ± 1.79) × 103, 細胞成長阻害が 57.6% (p < 0.001) で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して、増加 31.7% (p < 0.002);
1:6:   (17.5 ± 1.34) × 103, 細胞成長阻害が 66.5% (p < 0.001) で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して、増加 46.2% (p < 0.001);
1:10:  (15.8 ± 1.38) × 103, 細胞成長阻害が 69.8% (p < 0.001) で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して、増加 51.4% (p < 0.001);
1:15:  (15.1 ± 1.47) × 103, 細胞成長阻害が 71.1% (p < 0.001) で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して、増加 53.5% (p < 0.001);
1:20:  (14.4 ± 1.16) × 103, 細胞成長阻害が 72.5% (p < 0.001) で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して、増加d 55.7% (p < 0.001)。
【実施例７】
【００８５】
N-(13-cis-レチノイル)-L-システイン酸の合成
13-cis-レチノイン酸 (150 mg, 0.5mmol) およびトリエチルアミン (71 μl, 0.51 mmol)を 1 ml の無水テトラヒドロフランに溶解し、それに無水アセトニトリル (2 ml) を加え、混合物を ‐20 oC まで冷やし、66 μl (0.51 mmol) のクロロホルム酸ブチルを加えた。30 分後に、沈澱したトリエチルアミン塩酸塩のない混合物をピペットで L-システイン酸１水和物 (140 mg, 0.75 mmol) の 3 ml の 1M Na2CO3 および 1.5 ml の H2O 溶液に入れた。得られる混合物を約 5 時間 20 - 25oC で攪拌し、1M KHSO4 で pH 3-4 にし、ろ過した。溶液をクロロホルム-2-プロパノール-メタノール (2:1:1, v/v/v, 15 ml) で抽出し、減圧で濃縮した。メタノール-水 (1:1, v/v, 15 ml)の混合物を残渣に加えた。得られる懸濁液をエーテル (2x10 ml) で洗い、減圧蒸留し、10 ml のメタノールに溶解し、ろ過した。減圧蒸留後、残渣を 7 ml の無水テトラヒドロフランに溶解し、‐20oC まで冷やし、遠心分離した (3000 rpm, -20oC, 20 分間)。澄明の上澄み液を減圧蒸留して、黄色ワックス状固体を得た。収率: 30%。
【００８６】
Rf 0.30-0.35.1H-NMR (CD3SOCD3, 400 MHz) δ 1.00 [6H, s, C(CH3)2], 1.42 and 1.57 [2H+2H, 2m, CH2CH2C(CH3)2], 1.67 [3H, s, CH3C=CC(CH3)2], 1.95 and 1.97 (3H+3H, 2s, CH3C=(CH)3C(CH3)=CHCO], 1.99 (2H, m, CH2C=), 2.83 (2H, m, SCH2), 4.38 (1H, m, NCH), 5.68 (1H, s, =CHCO), 6.12-6.26 [3H, m, CH=CHC(CH3)=CHCH=CH], 6.87 (1H, dd, J 15.4, 11.4 Hz, CHCH=CH), 7.85 [1H, d, J 15.4 Hz, CH=CHC(CH3)=CHCH=CH], 8.03 (1H, d, J 6.4 Hz, NH), 〜12.4 (1H, br s, CO2H)。
【実施例８】
【００８７】
ヒト乳房腺腫 MDA-MB-231 細胞系の培養基における化合物 II の細胞毒性の評価、稀釈のために培地に加える前の化合物 II 塩類溶液の最初の濃度に関連
化合物 II の最初の溶液を濃度 0.005 〜 5.0 mg/ml で乾燥物質を塩類溶液に稀釈して調製した。調製された化合物 II の塩類溶液は下記の濃度を有する: 0.005、0.05、0.5、1.0、5.0 mg/ml。これらの溶液から、培養基に加えるため 5% FBS を持つ MEM 中の作業溶液を濃度 4 mM で調製した。
【００８８】
MDA-MB-231 細胞系の培養基を１日目の播種後に化合物 II 溶液で処理した。作業溶液のアリコート (2 μL) を 200 μL 培養基に最終濃度 40 nM で加えた。対照培養基において、5% FBS を持つ 2 μL の培地を溶媒対照として加えた。連続２日間の培養後に培養基中の生細胞を計数し、化合物 II の試験溶液の細胞毒性を評価するために、MDA-MB-231 細胞系の細胞成長阻害の程度を計算した。
培養の３日後に対照培養基は (51.6 ± 3.46) × 103 細胞を含有した。
【００８９】
化合物 II の溶液で処理した培養基は下記の生細胞数を有した:
0.005 mg/ml:  (34.8 ± 3.27) × 103, 細胞成長阻害 32.6% (p < 0.01);
0.05 mg/ml:   (33.4 ± 2.91) × 103, 細胞成長阻害 35.3% (p < 0.002);
0.5 mg/ml:    (33.1 ± 3.01) × 103, 細胞成長阻害 35.9% (p < 0.002);
1.0 mg/ml:    (32.2 ± 2.14) × 103, 細胞成長阻害 37.6% (p < 0.001);
5.0 mg/ml:    (36.5 ± 3.88) × 103, 細胞成長阻害 29.3% (p < 0.02)。
【００９０】
このように、化合物 II が濃度 40 nM で有意の細胞毒性作用をヒト乳房腺腫 MDA-MB-231 細胞系の培養基で発揮する。さらに大きい細胞毒性作用を化合物 II の最初の塩類溶液から調製された溶液が濃度 1 mg/mL で示す。この場合、細胞成長阻害の程度は 37.6% (p < 0.001)であった。
【実施例９】
【００９１】
ヒト乳房腺腫 MDA-MB-231 細胞系の培養基における化合物 II の細胞毒性の評価、培養基中の化合物 II の最終濃度に関連
化合物 II (1 mg/ml)の最初の保存塩類溶液を、乾燥物質を塩類溶液に溶解して調製した。この溶液から、 5% FBS を有する MEM 中の作業溶液を培養基に加えるため異なる濃度に連続的稀釈で調製した。
【００９２】
MDA-MB-231 細胞の培養基を、１日目の播種後に 5% FBS を含む MEM 中の薬物溶液で処理した。異なる濃度の化合物 II を有する作業溶液のアリコート (2 μL) を 200 μL 培養基に化合物 II に最終濃度 10-11 〜 10-6 mol/L で加えた。対照培養基において、5% FBS を有する 2 μL の培地に溶媒対照として加えた。連続２日の培養後に培養基中の生細胞を計数し、化合物 II 試験溶液の細胞毒性を評価するために、MDA-MB-231 細胞の成長阻害の程度を計算した。
培養３日後で対照培養基は(51.6 ± 3.46) × 103 細胞を含有した。
【００９３】
化合物 II の溶液で処理した培養基は下記の生細胞数を有した:
10-11 mol/L:       (36.7 ± 3.65) × 103, 細胞成長阻害 28.9% (p < 0.02);
10-10 mol/L:       (42.4 ± 1.93) × 103, 細胞成長阻害 17.8% (p < 0.05);
10-9 mol/L:        (40.5 ± 2.11) × 103, 細胞成長阻害 21.5% (p < 0.02);
10-8 mol/L:        (37.4 ± 3.86) × 103, 細胞成長阻害 27.5% (p < 0.02);
4 × 10-8 mol/L:    (32.6 ± 2.52) × 103, 細胞成長阻害 36.8% (p < 0.001);
10-7 mol/L:        (31.8 ± 2.05) × 103, 細胞成長阻害 38.4% (p < 0.001);
10-6 mol/L:        (30.0 ± 2.14) × 103, 細胞成長阻害 41.9% (p < 0.001)。
このように、化合物 II は有意の細胞毒性作用をヒト乳房腺腫細胞に対して発揮する。細胞成長阻害の程度は化合物 II の濃度増加とともに 41.9% (p < 0.001)に増加する。
【実施例１０】
【００９４】
ヒト乳房腺腫 MDA-MB-231 細胞系の培養基における パクリタキセル、Taxol（登録商標）、パクリタキセル化合物 II の製剤、化合物 II 単独の細胞毒性の比較
パクリタキセルの保存溶液をエタノールで調製した。Taxol（登録商標） 、パクリタキセル化合物 II 製剤、化合物 II の溶液を塩類溶液において調製した。5% FBS を有する MEM 中の各薬物の作業溶液は培養基に加えるため下記濃度で調製した:
製剤:            8 × 10-7 mol/L のパクリタキセルおよび 4 × 10-6 mol/L の化合物 II
化合物 II:       4 × 10-6 mol/L
パクリタキセル:      8 × 10-7 mol/L
Taxol（登録商標）:          8 × 10-7 mol/L の パクリタキセル
MDA-MB-231 細胞の培養基を、０日目の播種後に 5% FBS を含む MEM 中の薬物溶液で処理した。作業溶液のアリコート (2 μL) を 200 μL 培養基に薬物の最終濃度まで加えた：
製剤:           8 × 10-9 mol/L のパクリタキセルおよび 4 × 10-8 mol/L の化合物 II
化合物 II:      4 × 10-8 mol/L
パクリタキセル:     8 × 10-9 mol/L
Taxol（登録商標）:         8 × 10-9 mol/L の パクリタキセル
対照培養基において、5% FBS を有する 2 μL の培地に溶媒対照として加えた。連続３日の培養後に培養基中の生細胞を計数し、各試験薬物の細胞毒性を評価するために、MDA-MB-231 細胞の成長阻害の程度を計算した。
対照培養基は(46.2 ± 4.14) × 103 細胞を含有した。
【００９５】
薬物で処理された培養基は下記の数の生細胞を含有した:
製剤:            (14.7 ± 2.61) × 103, 細胞成長阻害 68.2% (p < 0.001);
化合物  II:      (29.9 ± 2.38) × 103, 細胞成長阻害 35.3% (p < 0.01);
パクリタキセル:      (26.3 ± 1.96) × 103, 細胞成長阻害 43.1% (p < 0.002)
Taxol（登録商標）:          (25.5 ± 2.15) × 103, 細胞成長阻害 44.8% (p < 0.001)。
【００９６】
これによると、製剤 パクリタキセル化合物 II は有意の細胞毒性作用をヒト乳房腺腫細胞に対して発揮し、Taxol（登録商標） (ポジティブ対照) およびパクリタキセルの作用を越えている。MDA-MB-231 細胞の成長阻害作用を Taxol（登録商標） と比較すると、42.4% (p < 0,01) 増加した。化合物 II 単独の細胞毒性作用は 35.3 % (p < 0.01) であった。
【実施例１１】
【００９７】
ヒト乳房腺腫 MDA-MB-231 細胞系の培養基における パクリタキセル化合物 II 細胞毒性、パクリタキセル/化合物 IIの分子比率に関連
塩類溶液中の製剤の最初の溶液を パクリタキセル/化合物 II の分子比率 1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:10 で調製した。これらの溶液から、培養基に加えるため 5% FBS を有する MEM 中で作業溶液を調製した。パクリタキセル の濃度は 10-6 M に等しい。
【００９８】
MDA-MB-231 細胞系の培養基を、１日目の播種後に 5% FBS を含有する MEM 中の薬物溶液で処理した。作業溶液のアリコート (2 μL) を 200 μL 培養基に 10-8 M に等しい培養基中のパクリタキセルの最終濃度で加えた。対照培養基において、5% FBS を持つ 2 μL の培地を溶媒対照として加えた。連続２日間の培養後に培養基中の生細胞を計数し、製剤の試験溶液の細胞毒性を評価した。
【００９９】
培養の３日後に対照培養基は (53.2 ± 2.84) × 103 細胞を含有した。
パクリタキセルで濃度 10 nM で処理した培養基は (32.1 ± 1.29) × 103 細胞を含有し、細胞成長阻害が 39.7% (p < 0.001)であった。
【０１００】
製剤の溶液で、5% FBS を含有する MEM 中の製剤溶液、パクリタキセル/化合物 I の分子比率 1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:10 で処理した培養基は下記の生細胞数を有した：
1:3:      (22.4 ± 2.75) × 103、 細胞成長阻害が 57.9% (p < 0.001)で、細胞成長阻害がパクリタキセルに比して、増加 30.2% (p < 0.01);
1:4:      (21.3 ± 2.46) × 103、 細胞成長阻害が 60.0% (p < 0.001)で、細胞成長阻害がパクリタキセルに比して、増加 33.6% (p < 0.01);
1:5:      (19.8 ± 2.37) × 103、細胞成長阻害が 62.8% (p < 0.001)で、細胞成長阻害がパクリタキセルに比して、増加 38.3% (p < 0.001);
1:6:      (18.7 ± 2.03) × 103、細胞成長阻害が 64.8% (p < 0.001)で、細胞成長阻害がパクリタキセルに比して、増加 41.7 (p < 0.001);
1:7:      (18.1 ± 1.89) × 103、細胞成長阻害が 66.0% (p < 0.001)で、細胞成長阻害がパクリタキセルに比して、増加 43.6% (p < 0.001);
1:10:     (17.5 ± 1.24) × 103、細胞成長阻害が 67.1% (p < 0.001)で、細胞成長阻害がパクリタキセルに比して、増加 45.5% (p < 0.001)。
【実施例１２】
【０１０１】
ヒト乳房腺腫 MDA-MB-231 細胞系の培養基における Taxol（登録商標） および発明製剤 (Taxol（登録商標） + 化合物 II) の細胞毒性の比較、パクリタキセルと化合物 II の分子比率に関連
発明製剤の最初の溶液を パクリタキセル/化合物 II の分子比率 1:1、1:3、1:6、1:10、1:15、1:20 で調製した。これらの溶液から、培養基に加えるため 5% FBS を有する MEM 中で作業溶液を調製した。パクリタキセルの濃度は 10-6 M に等しい。
【０１０２】
MDA-MB-231 細胞系の培養基を、１日目の播種後に 5% FBS を含有する MEM 中の薬物溶液で処理した。作業溶液のアリコート (2 μL) を 200 μL 培養基に 10-8 M に等しい培養基中のパクリタキセルの最終濃度で加えた。対照培養基において、5% FBS を持つ 2 μL の培地を溶媒対照として加えた。連続２日間の培養後に培養基中の生細胞を計数し、製剤の試験溶液の細胞毒性を評価した。
【０１０３】
培養の３日後に対照培養基は (48.7 ± 3.12)  × 103 細胞を含有した。
濃度 10 nMパクリタキセルの Taxol（登録商標） で処理した培養基は (29.5 ± 2.68) × 103 細胞を含有し、細胞成長阻害が 39.4% (p < 0.001)であった。
【０１０４】
発明製剤（Taxol（登録商標） ＋化合物 II）の溶液で、5% FBS を含有する培地での パクリタキセル/化合物 II の分子比率  1:1、1:3、1:6、1:10、1:15、1:20 で処理した培養基は下記の生細胞数を有した：
1:1:      (19.4 ± 2.37) × 103、細胞成長阻害が 60.2% (p < 0.001)で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して、増加 34.2% (p < 0.02);
1:3:      (18.2 ± 2.28) × 103、細胞成長阻害が 62.6% (p < 0.001)で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して、増加 38.3% (p < 0.01);
1:6:      (16.0 ± 2.03) × 103、細胞成長阻害が 67.1% (p < 0.001)で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して、増加 45.8% (p < 0.002);
1:10:     (14.9 ± 1.81) × 103、細胞成長阻害が 69.4% (p < 0.001)で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して、増加 49.5% (p < 0.001);
1:15:     (14.2 ± 1.85) × 103、細胞成長阻害が 70.8% (p < 0.001)で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して、増加 51.9% (p < 0.001);
1:20:     (13.6 ± 1.59) × 103、細胞成長阻害が 72.1% (p < 0.001)で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して、増加 53.9% (p < 0.001)。
【実施例１３】
【０１０５】
N-(all-trans-レチノイル)-L-システイン酸 (ナトリウム塩) (I) の合成
all-trans-レチノイン酸 (150 mg, 0.5mmol) およびトリエチルアミン (71 μl, 0.51 mmol)を 1 ml の無水テトラヒドロフラン（無水アセトニトリル (2ml) を添加）に溶解した。混合物を‐20oC まで冷やし、66 μl (0.51 mmol) のクロロホルム酸イソブチルを加えた。30 分後に、沈澱トリエチルアミン塩酸塩のない混合物をピペットで L-システイン酸１水和物 (94 mg, 0.5 mmol) の溶液、3 ml の 1M Na2CO3 および 1.5 ml の H2O に入れた。得られた混合物を約 5 時間 20-25oC で攪拌し、15 ml の 2-プロパノール-水 2:1 (v/v) で稀釈し、ろ過し、減圧で濃縮して、約 5 ml とした。20 ml の 2-プロパノール-水 5:1 (v/v) を加え、溶液を数分間攪拌すると、白い沈澱が形成した。得られた懸濁液をろ過し、上記のように濃縮し、20 ml の 2-プロパノール-メタノール 1:1 (v/v) で稀釈した。所望の産物の黄色沈澱を分離し、15 ml の 2-プロパノール-水 2:1 (v/v) で稀釈し、不純物の少量を除去するために -18℃で一夜保存した。不溶性の物質を除去した後、純産物の澄明溶液を得た。この溶液を化合物 I の保存に使用した。収率: 40%。
【０１０６】
Rf 0.30-0.35. 1H-NMR (CD3SOCD3, 400 MHz) δ 1.00 [6H, s, C(CH3)2], 1.43 and 1.56 [2H+2H, 2m, CH2CH2C(CH3)2], 1.67 [3H, s, CH3C=CC(CH3)2], 1.95  [3H, s, CH3C=(CH)3C(CH3)=CHCO], 1.99 (2H, m, CH2C=), 2.25 (3H, s, CH3C=CHCO), 2.78-2.89 (2H, m, SCH2), 4.40 (1H, m, NCH), 5.84 (1H, s, =CHCO), 6.11-6.36 [4H, m, CH=CHC(CH3)=CHCH=CH], 6.91 [1H, dd, J 15.2, 11.5 Hz,  CH=CHC(CH3)=CHCH=CH], 8.07 (1H, d, J 6.4 Hz, NH), 〜 12.4 (1H, br s, CO2H)。
【０１０７】
化合物 I の酸性形態を得るために、化合物 (2-プロパノール-水 2:1, v/v) の溶液を 減圧蒸留し、水に稀釈し、注意深く 0.1M HCl で pH 3.5 の酸性とし、クロロホルム-2-プロパノール-メタノール (2:1:1, v/v/v) で抽出した。有機溶媒を減圧で蒸留し、残渣を乾燥メタノール (約 5 mg/mL) に溶解し、一夜 ‐18oC で保存し、ろ過し、ただちに使用した。
【実施例１４】
【０１０８】
N-(13-cis-レチノイル)-L-システイン酸 (ナトリウム塩) (II) の合成
本化合物をI について上記したように、150 mg (0.5 mmol) の 13-cis-レチノイン酸および 94 mg (0.5 mmol) の L-システイン酸１水和物を用いて、合成した。収率: 35%。
【０１０９】
Rf 0.30-0.35. 1H-NMR (CD3SOCD3, 400 MHz) δ 1.00 [6H, s, C(CH3)2], 1.43 and 1.57 [2H+2H, 2m, CH2CH2C(CH3)2], 1.67 [3H, s, CH3C=CC(CH3)2], 1.95 and 1.98 (3H+3H, 2s, CH3C=(CH)3C(CH3)=CHCO], 1.99 (2H, m, CH2C=), 2.82 (2H, m, SCH2), 4.37 (1H, m, NCH), 5.68 (1H, s, =CHCO), 6.13-6.26 [3H, m, CH=CHC(CH3)=CHCH=CH], 6.87 [1H, dd, J 15.4, 11.4 Hz, CH=CHC(CH3)=CHCH=CH], 7.85 [1H, d, J 15.4 Hz, CH=CHC(CH3)=CHCH=CH], 8.04 (1H, d, J 6.4 Hz, NH), 〜12.4 (1H, br s, CO2H).
【実施例１５】
【０１１０】
N-(all-trans-レチノイル)-L-ホモシステイン酸 (ナトリウム塩) (III) の合成
本化合物をI について上記したように、150 mg (0.5 mmol) の all-trans-レチノイン酸および 92 mg (0.5 mmol) の L-ホモシステイン酸を用いて、合成した。収率: 31%。
【０１１１】
Rf 0.30-0.35. 1H-NMR (CD3SOCD3, 400 MHz) δ 1.00 [6H, s, C(CH3)2], 1.43 and 1.56 [2H+2H, 2m, CH2CH2C(CH3)2], 1.67 [3H, s, CH3C=CC(CH3)2], 1.87 (2H, m,  SCH2CH2), 1.94 [3H, s, CH3C=(CH)3C(CH3)=CHCO], 1.99 (2H, m, CH2C=), 2.25 (3H, s, CH3C=CHCO), 2.41 (2H, m, SCH2), 3.94 (1H, m, NCH), 5.98 (1H, s, =CHCO), 6.11-6.32 [4H, m, CH=CHC(CH3)=CHCH=CH], 6.86 (1H, dd, J 15.0, 11.5 Hz, =CHCH=CH), 7.43 (1H, d, J 7.1 Hz, NH).
【実施例１６】
【０１１２】
N-(13-cis-レチノイル)-L-ホモシステイン酸 (ナトリウム塩) (IV) の合成
本化合物をI について上記したように、150 mg (0.5 mmol) の 13-cis-レチノイン酸および 92 mg (0.5 mmol) の L-ホモシステイン酸１水和物を用いて、合成した。収率: 31%。
【０１１３】
Rf 0.30-0.35. 1H-NMR (CD3SOCD3, 400 MHz) δ 1.00 [6H, s, C(CH3)2], 1.42 and 1.56 [2H+2H, 2m, CH2CH2C(CH3)2], 1.68 [3H, s, CH3C=CC(CH3)2], 1.87 (2H, m, SCH2CH-2), 1.93 and 1.94 [3H+3H, 2s, CH3C=(CH)3C(CH3)=CHCO], 1.99 (2H, m, CH2C=), 2.41 (2H, m, SCH2), 3.95 (1H, m, NCH), 5.83 (1H, s, =CHCO), 6.18 [3H, m, CH=CHC(CH3)=CHCH=CH], 6.81 [1H, dd, J 15.4, 11.4 Hz, CH=CHC(CH3)=CHCH=CH], 7.42 (1H, d, J 7.3 Hz, NH), 7.93 [1H, d, J 15.4 Hz, CH=CHC(CH3)=CHCH=CH].
【実施例１７】
【０１１４】
N-(all-trans-レチノイル)-L-システインスルフィン酸 (ナトリウム塩) (V) の合成
本化合物をI について上記したように、150 mg (0.5 mmol) の all-trans-レチノイン酸および 77 mg (0.5 mmol) の L-システインスルフィン酸を用いて、合成した。収率: 28%。
【０１１５】
Rf 0.30-0.35. 1H-NMR (CD3SOCD3, 400 MHz) δ 1.00 [6H, s, C(CH3)2], 1.43 and 1.56 [2H+2H, 2m, CH2CH2C(CH3)2], 1.67 [3H, s, CH3C=CC(CH3)2], 1.96 [3H, s, CH3C=(CH)3C(CH3)=CHCO],  2.00 (2H, m, CH2C=), 2.26 (3H, s, CH3C=CHCO), 2.88-3.00 (2H, m, SCH2), 4.51 (1H, m, NCH), 5.84 (1H, s, =CHCO), 6.11-6.36 [4H, m, CH=CHC(CH3)=CHCH=CH], 6.94 [1H, dd, J 15.0, 11.4 Hz,  CH=CHC(CH3)=CHCH=CH], 8.47 (1H, d, J 7.9 Hz, NH), 〜12.6 (1H, br s, CO2H)。
【実施例１８】
【０１１６】
N-(13-cis-レチノイル)-L-システインスルフィン酸 (ナトリウム塩) (V) の合成
本化合物をI について上記したように、150 mg (0.5 mmol) の 13-cis-レチノイン酸および 77 mg (0.5 mmol) の L-システインスルフィン酸を用いて、合成した。収率: 23%。
【０１１７】
Rf 0.30-0.35. 1H-NMR (CD3SOCD3, 400 MHz) δ 1.00 [6H, s, C(CH3)2], 1.42 and 1.56 [2H+2H, 2m, CH2CH2C(CH3)2], 1.67 [3H, s, CH3C=CC(CH3)2], 1.95 and 1.97 [3H+3H, 2s,  CH3C=(CH)3C(CH3)=CHCO], 1.99 (2H, m, CH2C=), 2.51 (1H, dd, J 13.2, 2.9 Hz, SCHaHb), 2.65 (1H, dd, J 13.2, 8.2 Hz, SCHaHb), 4.77 (1H, m, NCH), 5.72 (1H, s, =CHCO), 6.20 [3H, m, CH=CHC(CH3)=CHCH=CH], 6.87 [1H, dd, J 15.6, 11.5 Hz, CH=CHC(CH3)=CHCH=CH], 7.88 [1H, d, J 15.6 Hz, CH=CHC(CH3)=CHCH=CH], 8.21 (1H, d, J 7.9 Hz, NH)。
【実施例１９】
【０１１８】
ヒト乳房腺腫 MDA-MB-231 細胞系の培養基における化合物 I の細胞毒性の評価、培養基中の化合物 I の最終の濃度に関連
化合物 I のナトリウム塩を塩類溶液に溶解した(1 mg/ml)。この溶液から、5% FBS を有する MEM 中の化合物の作業溶液を、培養基に加えるための異なる濃度に連続的稀釈で調製した。
【０１１９】
MDA-MB-231 細胞の培養基を、１日目の播種後に 5% FBS を含む MEM 中の薬物溶液で処理した。異なる濃度の化合物 I を有する作業溶液のアリコート (2 μL) を 200 μL 培養基に化合物 I の最終濃度 10-11 〜 10-6 mol/L で加えた。対照培養基において、5% FBS を有する 2 μL の培地に溶媒対照として加えた。連続２日の培養後に培養基中の生細胞を計数し、化合物 I 試験溶液の細胞毒性を評価するために、MDA-MB-231 細胞の成長阻害の程度を計算した。
培養３日後で対照培養基は (58.7 ± 2.24) × 103 細胞を含有した。
【０１２０】
化合物 I の溶液で処理した培養基は下記の生細胞数を有した:
10-11 mol/L:     (41.9 ± 2.17) × 103、細胞成長阻害 28.6% (p < 0.001);
10-10 mol/L:     (37.3 ± 2.84) × 103、細胞成長阻害 36.5% (p < 0.001);
10-9  mol/L:     (35.4 ± 2.23) × 103、細胞成長阻害 39.7% (p < 0.001);
10-8  mol/L:     (31.6 ± 1.69) × 103、細胞成長阻害 46.2% (p < 0.001);
4 ×10-8 mol/L:   (31.2 ± 1.72) × 103、細胞成長阻害 46.8% (p < 0.001);
10-7  mol/L:    (30.5 ± 0.89) × 103、細胞成長阻害 48.0% (p < 0.001);
10-6  mol/L:    (29.5 ± 1.36) × 103、細胞成長阻害 49.7% (p < 0.001)。
このように、化合物 I が有意の細胞毒性作用をヒト乳房腺腫細胞に対して発揮した。細胞成長阻害の程度は、化合物 I の濃度の増加により 49.7% (p < 0.001) 増加した。
【実施例２０】
【０１２１】
ヒト乳房腺腫 MDA-MB-231 細胞系の培養基における製剤パクリタキセル/化合物 I の細胞毒性の評価、パクリタキセル：化合物 I の分子比率に関連
化合物 I のナトリウム塩を化合物 I の酸性形態に転換し、メタノールに溶解した。パクリタキセル のメタノール溶解および化合物 I のメタノール溶液を混合した。攪拌後に有機溶媒を蒸留した。得られた乾燥フィルムを塩類溶液に溶解した。
【０１２２】
製剤の最初の塩類溶液をパクリタキセル: 化合物 I の分子比率 1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:10 に調製した。これらの溶液から 5% FBS を有する MEM 中の作業溶液は培養基に加えるため調製した。パクリタキセルの濃度は 10-6 M に等しい。
【０１２３】
MDA-MB-231 細胞の培養基を、１日目の播種後に 5% FBS を含む MEM 中の薬物溶液で処理した。作業溶液のアリコート (2 μL) を 200 μL 培養基にパクリタキセルの最終濃度 10-6 M で加えた。対照培養基において、5% FBS を有する 2 μL の培地に溶媒対照として加えた。連続２日の培養後に培養基中の生細胞を計数し、製剤の試験溶液の細胞毒性を評価するために、MDA-MB-231 細胞の成長阻害の程度を計算した。
培養３日後で対照培養基は(54.4 ± 2.51) × 103 細胞を含有した。
パクリタキセルで濃度 10 nM で処理した培養基は(29.3 ± 1.13) × 103 細胞を含有し、細胞成長阻害が 46.1% (p < 0.001)であった。.
【０１２４】
5% FBS を含有する培養基中の製剤の溶液、パクリタキセル : 化合物 I の分子比率 1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:10 で処理した培養基は下記の生細胞数を有した:
1:3:   (20.1 ± 1.53) × 103, 細胞成長阻害 63.1% (p < 0.001)、細胞成長阻害がパクリタキセルに比して、増加 31.4% (p <0.002);
1:4:   (18.9 ± 0.92) × 103, 細胞成長阻害 65.3% (p < 0.001)、細胞成長阻害がパクリタキセルに比して、増加 35.5% (p <0.001);
1:5:   (17.4 ± 1.18) × 103, 細胞成長阻害 68.0% (p < 0.001)、細胞成長阻害がパクリタキセルに比して、増加 40.6% (p <0.001);
1:6:   (16.9 ± 1.08) × 103, 細胞成長阻害 68.9% (p < 0.001)、細胞成長阻害がパクリタキセルに比して、増加 42.3% (p <0.001);
1:7:   (15.8 ± 1.34) × 103, 細胞成長阻害 71.0% (p < 0.001)、細胞成長阻害がパクリタキセルに比して、増加 46.1% (p <0.001);
1:10:  (15.2 ± 0.72) × 103, 細胞成長阻害 72.1% (p < 0.001)、細胞成長阻害がパクリタキセルに比して、増加 48.1% (p <0.001)。
【実施例２１】
【０１２５】
ヒト乳房腺腫 MDA-MB-231 細胞系の培養基における Taxol（登録商標） と発明製剤 (Taxol（登録商標） + 化合物 I) の細胞毒性の比較、パクリタキセル：化合物 I の分子比率に関連
化合物 I のナトリウム塩を化合物 I の酸性形態に転換し、メタノールに溶解した。有機溶媒を蒸留した。得られた乾燥フィルムを塩類溶液に溶解した。
【０１２６】
製剤の最初の塩類溶液をパクリタキセル: 化合物 I の分子比率 1:1、1:3、1:6、1:7、1:10、1:15、1:20 に調製した。これらの溶液から 5% FBS を有する MEM 中の作業溶液は培養基に加えるため調製した。パクリタキセルの濃度は 10-6 M に等しい。
【０１２７】
MDA-MB-231 細胞の培養基を、１日目の播種後に 5% FBS を含む MEM 中の薬物溶液で処理した。作業溶液のアリコート (2 μL) を 200 μL 培養基にパクリタキセルの最終濃度 10-6 M で加えた。対照培養基において、5% FBS を有する 2 μL の培地に溶媒対照として加えた。連続２日の培養後に培養基中の生細胞を計数し、試験溶液の細胞毒性を評価するために、MDA-MB-231 細胞の成長阻害の程度を計算した。
培養３日後で対照培養基は(54.4 ± 2.51) × 103 細胞を含有した。
パクリタキセル濃度 10 nM の Taxol（登録商標） で処理した培養基は (29.0 ± 0.91) × 103 細胞を含有した。細胞成長阻害は 46.3% (p < 0.001) であった。
【０１２８】
5% FBS を含有する培養基中の発明製剤 (Taxol（登録商標） + 化合物 I) の溶液、パクリタキセル : 化合物 I の分子比率  1:1、1:3、1:6、1:7、1:10、1:15、1:20 で処理した培養基は下記の生細胞数を有した:
1:1:   (21.5 ± 2.18) × 103, 細胞成長阻害 60.2% (p < 0.001)で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して、増加 25.9% (p < 0.01);
1:3:   (18.5 ± 1.08) × 103, 細胞成長阻害 65.7% (p < 0.001)で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して、増加 36.2% (p <0.001);
1:6:   (14.2 ± 0.75) × 103, 細胞成長阻害 73.7% (p < 0.001)で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して、増加 51.0% (p <0.001);
1:10:  (13.8 ± 0.63) × 103, 細胞成長阻害 74.4% (p < 0.001)で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して、増加 52.4% (p <0.001);
1:15:  (13.4 ± 1.22) × 103, 細胞成長阻害 75.2% (p < 0.001)で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して、増加 53.8% (p <0.001);
1:20:  (13.5 ± 1.14) × 103, 細胞成長阻害 75.0% (p < 0.001)で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して、増加 53.4% (p <0.001)。
【実施例２２】
【０１２９】
ヒト乳房腺腫 MDA-MB-231 細胞系の培養基における化合物 II の細胞毒性の評価、培養基中の化合物 II の最終濃度に関連
化合物 II のナトリウム塩を塩類溶液に溶解した(1 mg/ml)。この溶液から、5% FBS を有する MEM 中の作業溶液を、培養基に加えるため異なる濃度に連続的稀釈で調製した。
【０１３０】
MDA-MB-231 細胞の培養基を、１日目の播種後に 5% FBS を含む MEM 中の薬物溶液で処理した。異なる濃度の化合物 II を有する作業溶液のアリコート (2 μL) を 200 μL 培養基に化合物 II に最終濃度 10-11 〜 10-6 mol/L で加えた。対照培養基において、5% FBS を有する 2 μL の培地に溶媒対照として加えた。連続２日の培養後に培養基中の生細胞を計数し、化合物 II 試験溶液の細胞毒性を評価するために、MDA-MB-231 細胞の成長阻害の程度を計算した。
培養３日後で対照培養基は(58.7± 2.24) × 103 細胞を含有した。
【０１３１】
化合物 II の溶液で処理した培養基は下記の生細胞数を有した:
10-11 mol/L:     (42.3 ± 2.32) × 103, 細胞成長阻害 27.9% (p < 0.001);
10-10 mol/L:     (38.1 ± 1.18) × 103, 細胞成長阻害 35.1% (p < 0.001);
10-9 mol/L:      (34.5 ± 1.94) × 103, 細胞成長阻害 41.2% (p < 0.001);
10-8 mol/L:      (31.4 ± 1.62) × 103, 細胞成長阻害 46.5% (p < 0.001);
4 × 10-8 mol/L:  (31.2 ± 2.33) × 103, 細胞成長阻害 46.8% (p < 0.001);
10-7 mol/L:      (31.7 ± 1.54) × 103, 細胞成長阻害 46.0% (p < 0.001);
10-6 mol/L:      (28.4 ± 1.02) × 103, 細胞成長阻害ion 51.6% (p < 0.001)。
このように、化合物 II が有意の細胞毒性作用をヒト乳房腺腫細胞に対して発揮した。細胞成長阻害の程度は、化合物 II の濃度の増加により 51.6%  (p < 0.001) 増加した。
【実施例２３】
【０１３２】
ヒト乳房腺腫 MDA-MB-231 細胞系の培養基における製剤 パクリタキセル/化合物 II の細胞毒性の評価、パクリタキセル：化合物 II の分子比率に関連
化合物 II のナトリウム塩を化合物 II の酸性形態に転換し、メタノールに溶解した。パクリタキセル のメタノール溶液および化合物 II のメタノール溶液を混合した。攪拌後に有機溶媒を蒸留した。得られた乾燥フィルムを塩類溶液に溶解した。
【０１３３】
製剤の最初の塩類溶液をパクリタキセル: 化合物 II の分子比率 1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:10 に調製した。これらの溶液から 5% FBS を有する MEM 中の作業溶液は培養基に加えるため調製した。パクリタキセル の濃度は 10-6 M に等しい。
【０１３４】
MDA-MB-231 細胞の培養基を、１日目の播種後に 5% FBS を含む MEM 中の薬物溶液で処理した。作業溶液のアリコート (2 μL) を 200 μL 培養基にパクリタキセルの最終濃度 10-8 M で加えた。対照培養基において、5% FBS を有する 2 μL の培地に溶媒対照として加えた。連続２日の培養後に培養基中の生細胞を計数し、製剤の試験溶液の細胞毒性を評価するために、MDA-MB-231 細胞の成長阻害の程度を計算した。
培養３日後で対照培養基は(54.4 ± 2.51) × 103 細胞を含有した。
パクリタキセルで濃度 10 nM で処理した培養基は(29.3 ± 1.13) × 103 細胞を含有し、細胞成長阻害が 46.1% (p < 0.001)であった。.
【０１３５】
5% FBS を含有する培養基中の製剤の溶液、パクリタキセル : 化合物 II の分子比率 1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:10 で処理した培養基は下記の生細胞数を有した:
1:3:   (20.9 ± 1.52) × 103, 細胞成長阻害が 61.6% (p < 0.002)で、細胞成長阻害がパクリタキセルに比して、増加 28.7% (p < 0.01);
1:4:   (18.6 ± 1.27) × 103, 細胞成長阻害が 65.8% (p < 0.001)で、細胞成長阻害がパクリタキセルに比して、増加 36.5% (p <0.001);
1:5:   (17.3 ± 1.16) × 103, 細胞成長阻害が 68.2% (p < 0.001)で、細胞成長阻害がパクリタキセルに比して、増加 41.0% (p <0.001);
1:6:   (16.8 ± 0.75) × 103, 細胞成長阻害が 69.1% (p < 0.001)で、細胞成長阻害がパクリタキセルに比して、増加 42.7% (p <0.001);
1:7:   (16.3 ± 1.20) × 103, 細胞成長阻害が 70.0% (p < 0.001)で、細胞成長阻害がパクリタキセルに比して、増加 44.4% (p <0.001);
1:10:  (15.9 ± 0.86) × 103, 細胞成長阻害 70.8% (p < 0.001)で、細胞成長阻害パクリタキセルに比して、増加 45.7% (p <0.001)。
【実施例２４】
【０１３６】
ヒト乳房腺腫 MDA-MB-231 細胞系の培養基における Taxol（登録商標） と発明製剤 (Taxol（登録商標） + 化合物 I) の細胞毒性の比較、パクリタキセル：化合物 II の分子比率に関連
化合物 II のナトリウム塩を化合物 II の酸性形態に転換し、メタノールに溶解した。有機溶媒を蒸留した。得られた乾燥フィルムを Taxol（登録商標） に溶解した。
【０１３７】
発明製剤の最初の溶液をパクリタキセル: 化合物 II の分子比率 1:1、1:3、1:6、1:10、1:15、1:20 に調製した。これらの溶液から 5% FBS を有する MEM 中の作業溶液は培養基に加えるため調製した。パクリタキセルの濃度は 10-6 M に等しい。
【０１３８】
MDA-MB-231 細胞の培養基を、１日目の播種後に 5% FBS を含む MEM 中の薬物溶液で処理した。作業溶液のアリコート (2 μL) を 200 μL 培養基にパクリタキセルの最終濃度 10-8 M で加えた。対照培養基において、5% FBS を有する 2 μL の培地に溶媒対照として加えた。連続２日の培養後に培養基中の生細胞を計数し、試験溶液の細胞毒性を評価するために、MDA-MB-231 細胞の成長阻害の程度を計算した。
培養３日後で対照培養基は(54.0 ± 1.60) × 103 細胞を含有した。
パクリタキセル濃度 10 nM の Taxol（登録商標） で処理した培養基は(29.0 ± 0.91) × 103 細胞を含有し、細胞成長阻害が 46.3% (p < 0.001)であった。
【０１３９】
5% FBS を含有する培養基中の発明製剤 (Taxol（登録商標） + 化合物 II)の溶液、パクリタキセル : 化合物 II の分子比率  1:1、1:3、1:6、1:10、1:15、1:20 で処理した培養基は下記の生細胞数を有した:
1:1:   (21.1 ± 1.76) × 103, 細胞成長阻害が 60.9% (p < 0.001)で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して、増加 27.2% (p < 0.01);
1:3:   (19.8 ± 1.81) × 103, 細胞成長阻害が 63.3% (p < 0.001)で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して、増加 31.7% (p <0.001);
1:6:   (14.7 ± 1.46) × 103, 細胞成長阻害が 72.8% (p < 0.001)で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して、増加 49.3% (p <0.001);
1:10:  (14.2 ± 1.15) × 103, 細胞成長阻害が 73.7% (p < 0.001)で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して、増加 51.0% (p <0.001);
1:15:  (13.9 ± 1.02) × 103, 細胞成長阻害が 74.3% (p < 0.001)で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して、増加 52.1% (p <0.001);
1:20:  (13.3 ± 1.27) × 103, 細胞成長阻害が 75.4% (p < 0.001)で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して増加 54.1% (p <0.001)。
【実施例２５】
【０１４０】
ヒト乳房腺腫 MDA-MB-231 細胞系の培養基における化合物 III の細胞毒性の評価、培養基中の化合物 III の最終濃度に関連
化合物 III のナトリウム塩を塩類溶液に溶解した(1 mg/ml)。この溶液から、5% FBS を有する MEM 中の化合物 III 作業溶液を、培養基に加えるための異なる濃度に連続的稀釈で調製した。
【０１４１】
MDA-MB-231 細胞の培養基を、１日目の播種後に 5% FBS を含む MEM 中の薬物溶液で処理した。異なる濃度の化合物 III を有する作業溶液のアリコート (2 μL) を 200 μL 培養基に化合物 III に最終濃度 10-11 〜 10-6 mol/L で加えた。対照培養基において、5% FBS を有する 2 μL の培地に溶媒対照として加えた。連続２日の培養後に培養基中の生細胞を計数し、化合物 II 試験溶液の細胞毒性を評価するために、MDA-MB-231 細胞の成長阻害の程度を計算した。
培養３日後で対照培養基は(54.3 ± 2.12) × 103 細胞を含有した。
【０１４２】
化合物 III の溶液で処理した培養基は下記の生細胞数を有した:
10-11 mol/L:      (45.1 ± 3.51) × 103, 細胞成長阻害 16.9% (p < 0.05);
10-10 mol/L:      (45.9 ± 2.84) × 103, 細胞成長阻害 15.5% (p < 0.05);
10-9 mol/L:       (43.6 ± 2.57) × 103, 細胞成長阻害 19.7% (p < 0.01);
10-8 mol/L:       (40.3 ± 3.36) × 103, 細胞成長阻害 25.8% (p < 0.01);
4 × 10-8 mol/L:   (36.5 ± 2.08) × 103, 細胞成長阻害 32.8% (p < 0.001);
10-7 mol/L:       (35.6 ± 1.68) × 103, 細胞成長阻害 34.4% (p < 0.001);
10-6 mol/L:       (34.7 ± 1.52) × 103, 細胞成長阻害ion 36.1% (p < 0.001).
このように、化合物 III が有意の細胞毒性作用をヒト乳房腺腫細胞に対して発揮した。細胞成長阻害の程度は、化合物 III の濃度の増加により 36.1%  (p < 0.001) 増加した。
【実施例２６】
【０１４３】
ヒト乳房腺腫 MDA-MB-231 細胞系の培養基における製剤パクリタキセル/化合物 III の細胞毒性の評価、パクリタキセル：化合物 III の分子比率に関連
化合物 III のナトリウム塩を化合物 III の酸性形態に転換し、メタノールに溶解した。パクリタキセル のメタノール溶液および化合物 III のメタノール溶液を混合した。攪拌後に有機溶媒を蒸留した。得られた乾燥フィルムを塩類溶液に溶解した。
【０１４４】
製剤の最初の塩類溶液をパクリタキセル: 化合物 III の分子比率 1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:10 に調製した。これらの溶液から 5% FBS を有する MEM 中の作業溶液は培養基に加えるため調製した。パクリタキセルの濃度は 10-6 M に等しい。
【０１４５】
MDA-MB-231 細胞の培養基を、１日目の播種後に 5% FBS を含む MEM 中の薬物溶液で処理した。作業溶液のアリコート (2 μL) を 200 μL 培養基にパクリタキセルの最終濃度 10-8 M で加えた。対照培養基において、5% FBS を有する 2 μL の培地に溶媒対照として加えた。連続２日の培養後に培養基中の生細胞を計数し、製剤の試験溶液の細胞毒性を評価するために、MDA-MB-231 細胞の成長阻害の程度を計算した。
培養３日後で対照培養基は(53.7 ± 1.96) × 103 細胞を含有した。
パクリタキセルで濃度 10 nM で処理した培養基は(31.8 ± 1.85) × 103 細胞を含有し、細胞成長阻害が 40.8% (p < 0.001)であった。.
【０１４６】
5% FBS を含有する培養基中の製剤の溶液、パクリタキセル : 化合物 III の分子比率 1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:10 で処理した培養基は下記の生細胞数を有した:
1:3:    (24.7 ± 2.17) × 103, 細胞成長阻害が 54.0% (p < 0.001)で、細胞成長阻害がパクリタキセルに比して、増加 22.3% (p < 0.05);
1:4:   (24.0 ± 2.23) × 103, 細胞成長阻害が 55.3% (p < 0.001)で、細胞成長阻害がパクリタキセルに比して、増加 24.5% (p <0.05);
1:5:   (22.5 ± 1.91) × 103, 細胞成長阻害が 58.1% (p < 0.001)で、細胞成長阻害がパクリタキセルに比して、増加 29.2% (p <0.01);
1:6:   (22.3 ± 1.88) × 103, 細胞成長阻害が 58.5% (p < 0.001)で、細胞成長阻害がパクリタキセルに比して、増加 29.9% (p <0.01);
1:7:   (21.9 ± 1.90) × 103, 細胞成長阻害が 59.2% (p < 0.001)で、細胞成長阻害がパクリタキセルに比して、増加 31.1% (p <0.001);
1:10:  (21.7 ± 1.56) × 103, 細胞成長阻害が 59.6% (p < 0.001)で、細胞成長阻害がパクリタキセルに比して、増加 31.8% (p <0.002)。
【実施例２７】
【０１４７】
ヒト乳房腺腫 MDA-MB-231 細胞系の培養基における Taxol（登録商標） と発明製剤 (Taxol（登録商標） + 化合物 III) の細胞毒性の比較、パクリタキセル：化合物 III の分子比率に関連
化合物 III のナトリウム塩を化合物 III の酸性形態に転換し、メタノールに溶解した。有機溶媒を蒸留した。得られた乾燥フィルムを Taxol（登録商標） に溶解した。
【０１４８】
発明製剤の最初の溶液をパクリタキセル: 化合物 III の分子比率 1:1、1:3、1:6、1:10、1:15、1:20 に調製した。これらの溶液から 5% FBS を有する MEM 中の作業溶液は培養基に加えるため調製した。パクリタキセルの濃度は 10-6 M に等しい。
【０１４９】
MDA-MB-231 細胞の培養基を、１日目の播種後に 5% FBS を含む MEM 中の薬物溶液で処理した。作業溶液のアリコート (2 μL) を 200 μL 培養基にパクリタキセルの最終濃度 10-8 M で加えた。対照培養基において、5% FBS を有する 2 μL の培地に溶媒対照として加えた。連続２日の培養後に培養基中の生細胞を計数し、試験溶液の細胞毒性を評価した。
培養３日後で対照培養基は(55.8 ± 1.78) × 103 細胞を含有した。
パクリタキセル濃度 10 nM の Taxol（登録商標） で処理した培養基は(31.4 ± 1.61) × 103 細胞を含有し、細胞成長阻害が 43.7% (p < 0.001)であった。
【０１５０】
5% FBS を含有する培養基中の発明製剤 (Taxol（登録商標） + 化合物 III)の溶液、パクリタキセル : 化合物 III の分子比率  1:1、1:3、1:6、1:10、1:15、1:20 で処理した培養基は下記の生細胞数を有した:
1:1:   (27.4 ± 1.56)  × 103, 細胞成長阻害が 50.9% (p < 0.001)で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して、増加 12.7% (p > 0.05);
1:3:   (23.7 ± 1.42) × 103, 細胞成長阻害が 57.5% (p < 0.001)で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して、増加 24.5% (p <0.01);
1:6:   (20.5 ± 1.17) × 103, 細胞成長阻害が 63.3% (p < 0.001)で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して、増加 34.7% (p <0.001);
1:10:  (19.6 ± 1.23) × 103, 細胞成長阻害が 64.9% (p < 0.001)で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して、増加 37.6% (p <0.001);
1:15:  (19.8 ± 1.64) × 103, 細胞成長阻害が 64.5% (p < 0.001)で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して、増加 36.9% (p <0.001);
1:20:  (19.5 ± 1.49) × 103, 細胞成長阻害が 65.1% (p < 0.001)で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して、増加 37.9% (p <0.001)。
【実施例２８】
【０１５１】
ヒト乳房腺腫 MDA-MB-231 細胞系の培養基における化合物 IV の細胞毒性の評価、培養基中の化合物 IV の最終濃度に関連
化合物 IV のナトリウム塩を塩類溶液に溶解した(1 mg/ml)。この溶液から、5% FBS を有する MEM 中の化合物 IV 作業溶液を、培養基に加えるため異なる濃度に連続的稀釈で調製した。
【０１５２】
MDA-MB-231 細胞の培養基を、１日目の播種後に 5% FBS を含む MEM 中の薬物溶液で処理した。異なる濃度の化合物 IV を有する作業溶液のアリコート (2 μL) を 200 μL 培養基に化合物 IV に最終濃度 10-11 〜 10-6 mol/L で加えた。対照培養基において、5% FBS を有する 2 μL の培地に溶媒対照として加えた。連続２日の培養後に培養基中の生細胞を計数し、化合物 IV 試験溶液の細胞毒性を評価するために、MDA-MB-231 細胞の成長阻害の程度を計算した。
培養３日後で対照培養基は(52.7 ± 1.85) × 103 細胞を含有した。
【０１５３】
化合物 IV の溶液で処理した培養基は下記の生細胞数を有した:
10-11 mol/L:     (44.9 ± 3.02) × 103, 細胞成長阻害 14.8% (p < 0.05);
10-10 mol/L:     (44.2 ± 3.35) × 103, 細胞成長阻害 16.1% (p < 0.05);
10-9  mol/L:     (43.6 ± 3.21) × 103, 細胞成長阻害 17.3% (p < 0.05);
10-8  mol/L:     (39.6 ± 2.74) × 103, 細胞成長阻害 24.9% (p < 0.01);
4×10-8 mol/L:    (37.1 ± 2.56) × 103, 細胞成長阻害 29.6% (p < 0.001);
10-7  mol/L:     (36.3 ± 2.08) × 103, 細胞成長阻害 31.1% (p < 0.001);
10-6  mol/L:     (35.9 ± 2.29) × 103, 細胞成長阻害 31.9% (p < 0.001)。
このように、化合物 IV が有意の細胞毒性作用をヒト乳房腺腫細胞に対して発揮した。細胞成長阻害の程度は、化合物 IV の濃度の増加により 31.9%  (p < 0.001) 増加した。
【実施例２９】
【０１５４】
ヒト乳房腺腫 MDA-MB-231 細胞系の培養基における製剤パクリタキセル/化合物 IV の細胞毒性の評価、パクリタキセル：化合物 IV の分子比率に関連
化合物 IV のナトリウム塩を化合物 IV の酸性形態に転換し、メタノールに溶解した。パクリタキセル のメタノール溶液および化合物 IV のメタノール溶液を混合した。攪拌後に有機溶媒を蒸留した。得られた乾燥フィルムを塩類溶液に溶解した。
【０１５５】
製剤の最初の塩類溶液をパクリタキセル: 化合物 IV の分子比率 1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:10 に調製した。これらの溶液から 5% FBS を有する MEM 中の作業溶液は培養基に加えるため調製した。パクリタキセルの濃度は 10-6 M に等しい。
【０１５６】
MDA-MB-231 細胞の培養基を、１日目の播種後に 5% FBS を含む MEM 中の薬物溶液で処理した。作業溶液のアリコート (2 μL) を 200 μL 培養基にパクリタキセルの最終濃度 10-8 M で加えた。対照培養基において、5% FBS を有する 2 μL の培地に溶媒対照として加えた。連続２日の培養後に培養基中の生細胞を計数し、製剤の試験溶液の細胞毒性を評価するために、MDA-MB-231 細胞の成長阻害の程度を計算した。
培養３日後で対照培養基は(55.1 ± 2.38) × 103 細胞を含有した。
パクリタキセルで濃度 10 nM で処理した培養基は(30.7 ± 2.15) × 103 細胞を含有し、細胞成長阻害が 44.3% (p < 0.001)であった。.
【０１５７】
5% FBS を含有する培養基中の製剤の溶液、パクリタキセル : 化合物 IV の分子比率 1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:10 で処理した培養基は下記の生細胞数を有した:
1:3:    (24.3 ± 1.74) × 103, 細胞成長阻害が 55.9% (p < 0.001)で、細胞成長阻害がパクリタキセルに比して、増加 20.8% (p < 0.05);
1:4:   (23.7 ± 2.03) × 103, 細胞成長阻害が 57.0% (p < 0.001)で、細胞成長阻害がパクリタキセルに比して、増加 22.8% (p <0.05);
1:5:   (22.1 ± 1.52) × 103, 細胞成長阻害が 59.9% (p < 0.001)で、細胞成長阻害がパクリタキセルに比して、増加 28.0% (p <0.01);
1:6:   (21.9 ± 1.16) × 103, 細胞成長阻害が 60.3% (p < 0.001)で、細胞成長阻害がパクリタキセルに比して、増加 28.7% (p <0.01);
1:7:   (21.8 ± 1.98) × 103, 細胞成長阻害が 60.4% (p < 0.001)で、細胞成長阻害がパクリタキセルに比して、増加 29.0% (p <0.02);
1:10:  (21.6 ± 1.45) × 103, 細胞成長阻害が 60.8% (p < 0.001)で、細胞成長阻害パクリタキセルに比して、増加 29.6% (p <0.002)。
【実施例３０】
【０１５８】
ヒト乳房腺腫 MDA-MB-231 細胞系の培養基における Taxol（登録商標） と発明製剤 (Taxol（登録商標） + 化合物 IV) の細胞毒性の比較、パクリタキセル：化合物 IV の分子比率に関連
化合物 IV のナトリウム塩を化合物 IV の酸性形態に転換し、メタノールに溶解した。有機溶媒を蒸留した。得られた乾燥フィルムを Taxol（登録商標） に溶解した。
【０１５９】
発明製剤の最初の溶液をパクリタキセル: 化合物 IV の分子比率 1:1、1:3、1:6、1:10、1:15、1:20 に調製した。これらの溶液から 5% FBS を有する MEM 中の作業溶液は培養基に加えるため調製した。パクリタキセルの濃度は 10-6 M に等しい。
【０１６０】
MDA-MB-231 細胞の培養基を、１日目の播種後に 5% FBS を含む MEM 中の薬物溶液で処理した。作業溶液のアリコート (2 μL) を 200 μL 培養基にパクリタキセルの最終濃度 10-8 M で加えた。対照培養基において、5% FBS を有する 2 μL の培地に溶媒対照として加えた。連続２日の培養後に培養基中の生細胞を計数し、試験溶液の細胞毒性を評価した。
培養３日後で対照培養基は(50.4 ± 2.45) × 103 細胞を含有した。
パクリタキセル濃度 10 nM の Taxol（登録商標） で処理した培養基は(29.5 ± 1.32) × 103 細胞を含有し、細胞成長阻害が 41.5% (p < 0.001)であった。
【０１６１】
5% FBS を含有する培養基中の発明製剤 (Taxol（登録商標） + 化合物 IV)の溶液、パクリタキセル : 化合物 IV の分子比率  1:1、1:3、1:6、1:10、1:15、1:20 で処理した培養基は下記の生細胞数を有した:
1:1:   (26.2 ± 1.15)  × 103, 細胞成長阻害が 48.0% (p < 0.001)で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して、増加 11.2% (p < 0.05);
1:3:   (23.3 ± 1.68) × 103, 細胞成長阻害が 53.8% (p < 0.001)で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して、増加 21.0% (p <0.02);
1:6:   (19.8 ± 1.26) × 103, 細胞成長阻害が 60.7% (p < 0.001)で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して、増加 32.9% (p <0.001);
1:10:  (19.1 ± 1.04) × 103, 細胞成長阻害が 62.1% (p < 0.001)で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して、増加 35.3% (p <0.001);
1:15:  (18.9 ± 1.73) × 103, 細胞成長阻害が 62.5% (p < 0.001)で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して、増加 35.9% (p <0.001);
1:20:  (19.3 ± 1.42) × 103, 細胞成長阻害が 61.7% (p < 0.001)で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して、増加 34.6% (p <0.001)。
【実施例３１】
【０１６２】
ヒト乳房腺腫 MDA-MB-231 細胞系の培養基における化合物 V の細胞毒性の評価、培養基中の化合物 V の最終濃度に関連
化合物 V のナトリウム塩を塩類溶液に溶解した(1 mg/ml)。この溶液から、5% FBS を有する MEM 中の化合物 V 作業溶液を、培養基に加えるため異なる濃度に連続的稀釈で調製した。
【０１６３】
MDA-MB-231 細胞の培養基を、１日目の播種後に 5% FBS を含む MEM 中の薬物溶液で処理した。異なる濃度の化合物 V を有する作業溶液のアリコート (2 μL) を 200 μL 培養基に化合物 V に最終濃度 10-11 〜 10-6 mol/L で加えた。対照培養基において、5% FBS を有する 2 μL の培地に溶媒対照として加えた。連続２日の培養後に培養基中の生細胞を計数し、化合物 V 試験溶液の細胞毒性を評価するために、MDA-MB-231 細胞の成長阻害の程度を計算した。
培養３日後で対照培養基は(54.3 ± 2.12) × 103 細胞を含有した。
【０１６４】
化合物 V の溶液で処理した培養基は下記の生細胞数を有した:
10-11 mol/L:   (47.1 ± 2.41) × 103, 細胞成長阻害 13.3% (p < 0.05);
10-10 mol/L:   (46.3 ± 2.49) × 103, 細胞成長阻害 14.7% (p < 0.05);
10-9  mol/L:   (45.5 ± 2.80) × 103, 細胞成長阻害 16.2% (p < 0.05);
10-8  mol/L:   (41.1 ± 2.34) × 103, 細胞成長阻害 24.3% (p < 0.002);
4×10-8 mol/L   (39.6 ± 1.75) × 103, 細胞成長阻害 27.1% (p < 0.001);
10-7  mol/L:   (39.3 ± 1.22) × 103, 細胞成長阻害 27.6% (p < 0.001);
10-6  mol/L:   (38.1 ± 1.86) × 103, 細胞成長阻害 29.8% (p < 0.001)。
このように、化合物 V が有意の細胞毒性作用をヒト乳房腺腫細胞に対して発揮した。細胞成長阻害の程度は、化合物 V の濃度の増加により 29.8%  (p < 0.001) 増加した。
【実施例３２】
【０１６５】
ヒト乳房腺腫 MDA-MB-231 細胞系の培養基における製剤 パクリタキセル/化合物 V の細胞毒性の評価、パクリタキセル：化合物 V の分子比率に関連
化合物 V のナトリウム塩を化合物 V の酸性形態に転換し、メタノールに溶解した。パクリタキセル のメタノール溶液および化合物 V のメタノール溶液を混合した。攪拌後に有機溶媒を蒸留した。得られた乾燥フィルムを塩類溶液に溶解した。
【０１６６】
製剤の最初の塩類溶液をパクリタキセル: 化合物 V の分子比率 1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:10 に調製した。これらの溶液から 5% FBS を有する MEM 中の作業溶液は培養基に加えるため調製した。パクリタキセル の濃度は 10-6 M に等しい。
【０１６７】
MDA-MB-231 細胞の培養基を、１日目の播種後に 5% FBS を含む MEM 中の薬物溶液で処理した。作業溶液のアリコート (2 μL) を 200 μL 培養基にパクリタキセルの最終濃度 10-8 M で加えた。対照培養基において、5% FBS を有する 2 μL の培地に溶媒対照として加えた。連続２日の培養後に培養基中の生細胞を計数し、製剤の試験溶液の細胞毒性を評価するために、MDA-MB-231 細胞の成長阻害の程度を計算した。
培養３日後で対照培養基は(53.7 ± 1.96) × 103 細胞を含有した。
パクリタキセルで濃度 10 nM で処理した培養基は(31.8 ± 1.85) × 103 細胞を含有し、細胞成長阻害が 40.8% (p < 0.001)であった。.
【０１６８】
5% FBS を含有する培養基中の製剤の溶液、パクリタキセル : 化合物 V の分子比率 1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:10 で処理した培養基は下記の生細胞数を有した:
1:3:    (26.1 ± 2.33) × 103, 細胞成長阻害が 51.4% (p < 0.001)で、細胞成長阻害がパクリタキセルに比して、増加 17.9% (p > 0.05);
1:4:    (25.7 ± 2.14) × 103, 細胞成長阻害が 52.1% (p < 0.001)で、細胞成長阻害がパクリタキセルに比して、増加 19.2% (p > 0.05);
1:5:    (24.3 ± 2.06) × 103, 細胞成長阻害が 54.7% (p < 0.001)で、細胞成長阻害がパクリタキセルに比して、増加 23.6% (p < 0.05);
1:6:    (24.1 ± 1.87) × 103, 細胞成長阻害が 55.1% (p < 0.001)で、細胞成長阻害がパクリタキセルに比して、増加 24.2% (p < 0.02);
1:7:    (23.9 ± 2.08) × 103, 細胞成長阻害が 55.5% (p < 0.001)で、細胞成長阻害がパクリタキセルに比して、増加 24.8% (p  0.02);
1:10:   (23.7 ± 1.65) × 103, 細胞成長阻害が 55.9% (p < 0.001)で、細胞成長阻害がパクリタキセルに比して、増加 25.5% (p < 0.01)。
【実施例３３】
【０１６９】
ヒト乳房腺腫 MDA-MB-231 細胞系の培養基における Taxol（登録商標） と発明製剤 (Taxol（登録商標） + 化合物 V) の細胞毒性の比較、パクリタキセル：化合物 V の分子比率に関連
化合物 V のナトリウム塩を化合物 V の酸性形態に転換し、メタノールに溶解した。有機溶媒を蒸留した。得られた乾燥フィルムを Taxol（登録商標） に溶解した。
【０１７０】
発明製剤の最初の溶液をパクリタキセル: 化合物 V の分子比率 1:1、1:3、1:6、1:10、1:15、1:20 に調製した。これらの溶液から 5% FBS を有する MEM 中の作業溶液は培養基に加えるため調製した。パクリタキセル の濃度は 10-6 M に等しい。
【０１７１】
MDA-MB-231 細胞の培養基を、１日目の播種後に 5% FBS を含む MEM 中の薬物溶液で処理した。作業溶液のアリコート (2 μL) を 200 μL 培養基にパクリタキセルの最終濃度 10-8 M で加えた。対照培養基において、5% FBS を有する 2 μL の培地に溶媒対照として加えた。連続２日の培養後に培養基中の生細胞を計数し、試験溶液の細胞毒性を評価した。
培養３日後で対照培養基は(55.8 ± 1.78) × 103 細胞を含有した。
パクリタキセル濃度 10 nM の Taxol（登録商標） で処理した培養基は(31.4 ± 1.61) × 103 細胞を含有し、細胞成長阻害が 43.7% (p < 0.001)であった。
【０１７２】
5% FBS を含有する培養基中の発明製剤 (Taxol（登録商標） + 化合物 V)の溶液、パクリタキセル : 化合物 V の分子比率  1:1、1:3、1:6、1:10、1:15、1:20 で処理した培養基は下記の生細胞数を有した:
1:1:   (28.1 ± 2.14) × 103, 細胞成長阻害が 49.6% (p < 0.001)で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して、増加 10.5% (p > 0.05);
1:3:   (25.3 ± 1.78) × 103, 細胞成長阻害が 54.7% (p < 0.001)で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して、増加 19.4% (p < 0.05);
1:6:   (22.8 ± 1.85) × 103, 細胞成長阻害が 59.1% (p < 0.001)で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して、増加 27.4% (p < 0.01);
1:10:  (21.9 ± 1.12) × 103, 細胞成長阻害が 60.8% (p < 0.001)で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して、増加 30.3% (p < 0.001);
1:15:  (21.8 ± 1.33) × 103, 細胞成長阻害が 60.9% (p < 0.001)で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して、増加 30.6% (p < 0.001);
1:20:  (22.0 ± 1.57) × 103, 細胞成長阻害が 60.6% (p < 0.001)で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して、増加 29.9% (p < 0.002)。
【実施例３４】
【０１７３】
ヒト乳房腺腫 MDA-MB-231 細胞系の培養基における化合物 VI の細胞毒性の評価、培養基中の化合物 VI の最終濃度に関連
化合物 VI のナトリウム塩を塩類溶液に溶解した(1 mg/ml)。この溶液から、5% FBS を有する MEM 中の化合物 VI 作業溶液を、培養基に加えるための異なる濃度に連続的稀釈で調製した。
【０１７４】
MDA-MB-231 細胞の培養基を、１日目の播種後に 5% FBS を含む MEM 中の薬物溶液で処理した。異なる濃度の化合物 VI を有する作業溶液のアリコート (2 μL) を 200 μL 培養基に化合物 VI に最終濃度 10-11 〜 10-6 mol/L で加えた。対照培養基において、5% FBS を有する 2 μL の培地に溶媒対照として加えた。連続２日の培養後に培養基中の生細胞を計数し、化合物 VI 試験溶液の細胞毒性を評価するために、MDA-MB-231 細胞の成長阻害の程度を計算した。
培養３日後で対照培養基は(52.7 ± 1.85) × 103 細胞を含有した。
【０１７５】
化合物 VI の溶液で処理した培養基は下記の生細胞数を有した:
10-11 mol/L:      (46.2 ± 3.54) × 103, 細胞成長阻害 12.3% (p > 0.05);
10-10 mol/L:      (45.5 ± 2.68) × 103, 細胞成長阻害 13.7% (p < 0.05);
10-9  mol/L:      (45.3 ± 2.55) × 103, 細胞成長阻害 14.0% (p < 0.05);
10-8  mol/L:      (40.9 ± 2.88) × 103, 細胞成長阻害 22.4% (p < 0.01);
4 × 10-8  mol/L:  (39.6 ± 2.70) × 103, 細胞成長阻害 24.9% (p < 0.01);
10-7  mol/L:      (39.1 ± 2.16) × 103, 細胞成長阻害 25.8% (p < 0.001);
10-6  mol/L:      (38.3 ± 2.34) × 103, 細胞成長阻害 27.3% (p < 0.001)。
このように、化合物 VI が有意の細胞毒性作用をヒト乳房腺腫細胞に対して発揮した。細胞成長阻害の程度は、化合物 VI の濃度の増加により 27.3% (p < 0.001) 増加した。
【実施例３５】
【０１７６】
ヒト乳房腺腫 MDA-MB-231 細胞系の培養基における製剤 パクリタキセル/化合物 VI の細胞毒性の評価、パクリタキセル：化合物 VI の分子比率に関連
化合物 VI のナトリウム塩を化合物 VI の酸性形態に転換し、メタノールに溶解した。パクリタキセル のメタノール溶液および化合物 VI のメタノール溶液を混合した。攪拌後に有機溶媒を蒸留した。得られた乾燥フィルムを塩類溶液に溶解した。
【０１７７】
製剤の最初の塩類溶液をパクリタキセル: 化合物 VI の分子比率 1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:10 に調製した。これらの溶液から 5% FBS を有する MEM 中の作業溶液は培養基に加えるため調製した。パクリタキセル の濃度は 10-6 M に等しい。
【０１７８】
MDA-MB-231 細胞の培養基を、１日目の播種後に 5% FBS を含む MEM 中の薬物溶液で処理した。作業溶液のアリコート (2 μL) を 200 μL 培養基にパクリタキセルの最終濃度 10-8 M で加えた。対照培養基において、5% FBS を有する 2 μL の培地に溶媒対照として加えた。連続２日の培養後に培養基中の生細胞を計数し、製剤の試験溶液の細胞毒性を評価するために、MDA-MB-231 細胞の成長阻害の程度を計算した。
培養３日後で対照培養基は(55.1 ± 2.38) × 103 細胞を含有した。
パクリタキセルで濃度 10 nM で処理した培養基は(30.7 ± 2.15) × 103 細胞を含有し、細胞成長阻害が 44.3% (p < 0.001)であった。.
【０１７９】
5% FBS を含有する培養基中の製剤の溶液、パクリタキセル : 化合物 VI の分子比率 1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:10 で処理した培養基は下記の生細胞数を有した:
1:3:    (25.6 ± 2.42) × 103, 細胞成長阻害が 53.5% (p < 0.001)で、細胞成長阻害がパクリタキセルに比して、増加 16.6% (p > 0.05);
1:4:    (25.0 ± 2.23) × 103, 細胞成長阻害が 54.6% (p < 0.001)で、細胞成長阻害がパクリタキセルに比して、増加 18.6% (p > 0.05);
1:5:    (24.0 ± 1.84) × 103, 細胞成長阻害が 56.4% (p < 0.001)で、細胞成長阻害がパクリタキセルに比して、増加 21.8% (p < 0.05);
1:6:    (23.7 ± 1.69) × 103, 細胞成長阻害が 57.0% (p < 0.001)で、細胞成長阻害がパクリタキセルに比して、増加 22.8% (p < 0.05);
1:7:    (23.4 ± 1.36) × 103, 細胞成長阻害が 57.5% (p < 0.001)で、細胞成長阻害がパクリタキセルに比して、増加 23.8% (p < 0.02);
1:10:   (23.1 ± 1.75) × 103, 細胞成長阻害が 58.1% (p < 0.001)で、細胞成長阻害がパクリタキセルに比して、増加 24.8% (p < 0.02)。
【実施例３６】
【０１８０】
ヒト乳房腺腫 MDA-MB-231 細胞系の培養基における Taxol（登録商標） と発明製剤 (Taxol（登録商標） + 化合物 VI) の細胞毒性の比較、パクリタキセル：化合物 VI の分子比率に関連
化合物 VI のナトリウム塩を化合物 VI の酸性形態に転換し、メタノールに溶解した。有機溶媒を蒸留した。得られた乾燥フィルムを Taxol（登録商標） に溶解した。
【０１８１】
発明製剤の最初の溶液をパクリタキセル: 化合物 VI の分子比率 1:1、1:3、1:6、1:10、1:15、1:20 に調製した。これらの溶液から 5% FBS を有する MEM 中の作業溶液は培養基に加えるため調製した。パクリタキセル の濃度は 10-6 M に等しい。
【０１８２】
MDA-MB-231 細胞の培養基を、１日目の播種後に 5% FBS を含む MEM 中の薬物溶液で処理した。作業溶液のアリコート (2 μL) を 200 μL 培養基にパクリタキセルの最終濃度 10-8 M で加えた。対照培養基において、5% FBS を有する 2 μL の培地に溶媒対照として加えた。連続２日の培養後に培養基中の生細胞を計数し、試験溶液の細胞毒性を評価した。
培養３日後で対照培養基は(50.4 ± 2.45) × 103 細胞を含有した。
パクリタキセル濃度 10 nM の Taxol（登録商標） で処理した培養基は(29.5 ± 1.32) × 103 細胞を含有し、細胞成長阻害が 41.5% (p < 0.001)であった。
【０１８３】
5% FBS を含有する培養基中の発明製剤 (Taxol（登録商標） + 化合物 VI)の溶液、パクリタキセル : 化合物 VI の分子比率  1:1、1:3、1:6、1:10、1:15、1:20 で処理した培養基は下記の生細胞数を有した:
1:1:   (27.9 ± 2.08) × 103, 細胞成長阻害が 44.6% (p < 0.001)で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して、増加 5.4% (p > 0.05);
1:3:   (24.2 ± 1.66) × 103, 細胞成長阻害が 52.0% (p < 0.001)で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して、増加 18.0% (p < 0.05);
1:6:   (21.9 ± 1.54) × 103, 細胞成長阻害が 56.5% (p < 0.001)で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して、増加 25.8% (p < 0.01);
1:10:  (21.3 ± 1.27) × 103, 細胞成長阻害が 57.7% (p < 0.001)で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して、増加 27.8% (p < 0.001);
1:15:  (20.9 ± 1.40) × 103, 細胞成長阻害が 58.5% (p < 0.001)で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して、増加 29.2% (p < 0.001);
1:20:  (20.7 ± 1.72) × 103, 細胞成長阻害が 58.9% (p < 0.001)で、細胞成長阻害が Taxol（登録商標） に比して、増加 29.8% (p < 0.002)。
【実施例３７】
【０１８４】
乾燥化合物 I/パクリタキセルの混合ミセル系 (OF-1) の調製および長期間保存
パクリタキセル(5 mg) の 1 mL メタノール液および化合物 I (19.5 mg ) の 10 ml メタノール液を丸底フラスコ中で混合した。攪拌 (2 分間) および超音波浴での音波処理 (1 分間) の後、有機溶媒を回転蒸留器で減圧 40℃で蒸留した。得られた乾燥フィルムを、水 (W) の添加 25℃または 0.05 M 酢酸ナトリウム緩衝液 pH 5.6 (SAB) の添加で溶解して、化合物 I/パクリタキセル ミセル溶液を得た。得られた溶液を 0.22 μm 無菌フィルターでろ過し、凍結乾燥系で凍結乾燥して、乾燥化合物 I/パクリタキセルの混合-ミセル系 (OF-1W) または乾燥化合物 I/パクリタキセル 混合-ミセル系 (OF-1SAB) を得た。
OF-1W および OF-1SAB の調製物を粉末の形態で 1、36、64、92、127、183 日間 4℃で保存した。
【０１８５】
OF-1W 調製物を下記のもので再製した: 蒸留水 (OF-1W/W); 10% エタノール溶液 (OF-1W/E); 0.15 M NaCl 溶液 (OF-1W/S); 0.05 M 酢酸ナトリウム緩衝液、pH 5.6 (OF-1W/SAB); 0.05 M 酢酸ナトリウム緩衝液の 10% エタノール溶液、pH 5.6 (OF-1W/SAB/E)。
OF-1SAB を蒸留水から再製した(OF-1SAB/W)。
すべての場合に、澄明な溶液をすぐに得た。色の変化や沈澱などの変化を認めなかった。
【０１８６】
OF-1 の細胞毒性を MDA-MB-231 細胞系で異なる期間での保存後に試験した(結果を表２に示す)。細胞培養基におけるパクリタキセルおよび 化合物 I の最終濃度は、それぞれ1・10-8 M および 7・10-8 M であった。
【０１８７】
ヒト乳房腺腫細胞系 MDA-MB-231 における OF-1W および OF-1SAB の細胞毒性、4℃で異なる期間での保存後
【表２−１】
2005508287.tif 000010
【表２−２】
2005508287.tif 000011
【実施例３８】
【０１８８】
乾燥化合物 II/パクリタキセルの混合ミセル系 (OF-2) の調製および長期間保存
乾燥化合物II/パクリタキセルの混合-ミセル系 (OF-2W) および乾燥化合物 II/パクリタキセルの混合-ミセル系 (OF-2SAB) を、乾燥化合物 I/パクリタキセル の混合-ミセル系 (OF-1) について記載したように得た。OF-2W および OF-2SAB の調製物を粉末として 1 または 180 日間 4℃で保存した。
【０１８９】
OF-2W および OF-2SAB の調製物を 0.05 M 酢酸ナトリウム緩衝液、pH 5,6 (OF-2W/SAB) または蒸留水 (OF-2SAB/W) で再製した。溶液 OF-2W/SAB および OF-2SAB/W の細胞毒性をMDA-MB-231 細胞系で、保存後に試験した (結果を表３に示す)。細胞培養基中のパクリタキセルおよび化合物 II の最終濃度はそれぞれ 1・10-8 M および 7・10-8 M であった。
【０１９０】
ヒト乳房腺腫細胞系 MDA-MB-231 における OF-2W および OF-2SAB の細胞毒性、4℃で異なる期間での保存後
【表３】
2005508287.tif 000012
【実施例３９】
【０１９１】
乾燥化合物 III/パクリタキセルの混合ミセル系 (OF-3) の調製および長期間保存
乾燥化合物 III/パクリタキセル の混合-ミセル系 (OF-3W) および乾燥化合物 III/パクリタキセル の混合-ミセル系 (OF-3SAB) を、乾燥化合物 I/パクリタキセル の混合-ミセル系 (OF-1) について記載したように得た。OF-3W および OF-3SAB の調製物を粉末として 1 または 180 日間 4℃で保存した。
【０１９２】
OF-3W および OF-3SAB の調製物を 0.05 M 酢酸ナトリウム緩衝液、pH 5,6 (OF-3W/SAB) または蒸留水 (OF-3SAB/W) で再製した。溶液 OF-3W/SAB および OF-3SAB/W の細胞毒性をMDA-MB-231 細胞系で、保存後に試験した (結果を表３に示す)。細胞培養基中のパクリタキセルおよび 化合物 III の最終濃度はそれぞれ 1・10-8 M および 7・10-8 M であった。
【０１９３】
ヒト乳房腺腫細胞系 MDA-MB-231 における OF-3W および OF-3SAB の細胞毒性、4℃で異なる期間での保存後
【表４】
2005508287.tif 000013
【実施例４０】
【０１９４】
乾燥化合物 IV/パクリタキセルの混合ミセル系 (OF-4) の調製および長期間保存
乾燥化合物 IV/パクリタキセル の混合-ミセル系 (OF-4W) および乾燥化合物 IV/パクリタキセル の混合-ミセル系 (OF-4SAB) を、乾燥化合物 I/パクリタキセル の混合-ミセル系 (OF-1) について記載したように得た。OF-4W および OF-4SAB の調製物を粉末として 1 または 180 日間 4℃で保存した。
【０１９５】
OF-4W および OF-4SAB の調製物を 0.05 M 酢酸ナトリウム緩衝液、pH 5,6 (OF-4W/SAB) または蒸留水 (OF-4SAB/W) で再製した。溶液 OF-4W/SAB および OF-4SAB/W の細胞毒性をMDA-MB-231 細胞系で、保存後に試験した (結果を表５に示す)。細胞培養基中のパクリタキセルおよび 化合物 IV の最終濃度はそれぞれ 1・10-8 M および 7・10-8 M であった。
【０１９６】
ヒト乳房腺腫細胞系 MDA-MB-231 における OF-4W および OF-4SAB の細胞毒性、4℃で異なる期間での保存後
【表５】
2005508287.tif 000014
【実施例４１】
【０１９７】
乾燥化合物 V/パクリタキセルの混合ミセル系 (OF-5) の調製および長期間保存
乾燥化合物 V/パクリタキセルの混合-ミセル系 (OF-5W) および乾燥化合物 V/パクリタキセルの混合-ミセル系 (OF-5SAB) を、乾燥化合物 I/パクリタキセルの混合-ミセル系 (OF-1) について記載したように得た。OF-5W および OF-5SAB の調製物を粉末として 1 または 180 日間 4℃で保存した。
【０１９８】
OF-5W および OF-5SAB の調製物を 0.05 M 酢酸ナトリウム緩衝液、pH 5,6 (OF-4W/SAB) または蒸留水 (OF-5SAB/W) で再製した。溶液 OF-5W/SAB および OF-5SAB/W の細胞毒性をMDA-MB-231 細胞系で、保存後に試験した (結果を表６に示す)。細胞培養基中のパクリタキセルおよび化合物 V の最終濃度はそれぞれ 1・10-8 M および 7・10-8 M であった。
【０１９９】
ヒト乳房腺腫細胞系 MDA-MB-231 における OF-5W および OF-5SAB の細胞毒性、4℃で異なる期間での保存後
【表６】
2005508287.tif 000015
【０２００】
乾燥化合物 VI/パクリタキセルの混合ミセル系 (OF-6) の調製および長期間保存
乾燥化合物 VI/パクリタキセルの混合-ミセル系 (OF-6W) および乾燥化合物 VI/パクリタキセル の混合-ミセル系 (OF-6SAB) を、乾燥化合物 I/パクリタキセル の混合-ミセル系 (OF-1) について記載したように得た。OF-6W および OF-6SAB の調製物を粉末として 1 または 180 日間 4℃で保存した。
【０２０１】
OF-6W および OF-6SAB の調製物を 0.05 M 酢酸ナトリウム緩衝液、pH 5,6 (OF-6W/SAB) または蒸留水 (OF-6SAB/W) で再製した。溶液 OF-6W/SAB および OF-6SAB/W の細胞毒性をMDA-MB-231 細胞系で、保存後に試験した (結果を表７に示す)。細胞培養基中のパクリタキセルおよび化合物 V の最終濃度はそれぞれ 1・10-8 M および 7・10-8 M であった。
【０２０２】
ヒト乳房腺腫細胞系 MDA-MB-231 における OF-6W および OF-6SAB の細胞毒性、4℃で異なる期間での保存後
【表７】
2005508287.tif 000016
【０２０３】
本発明をその好ましい実施態様で記載した。これらは現時点で発明者が知る最良の態様であるが、当業者に明らかなように種々の改変または修飾を、請求項に規定する発明の範囲から逸脱することなしに、行い得ることを理解すべきである。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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