(57)【要約】本発明は、ペプチドおよび蛋白質の標的特異的折りたたみ部位を識別および決定する方法を提供し、問題とする標的に結合する既知親ポリペプチド領域にあり問題とする標的に結合する二次構造を決定する方法を含む。本発明の一つの実施例で、金属イオンへの結合に利用可能な窒素原子および硫黄原子を含有する残基または擬制体を、ペプチドおよび蛋白質の既知一次構造において単一の残基を順番に置換または隣接する二つの残基の間に挿入する。得られる配列は、金属イオンへの結合に利用可能な窒素原子および硫黄原子を含有する最小限の残基または擬制体およびそのアミノ末端側に２個の残基を含み、金属イオンと錯結合してメタロペプチドを形成する。次に得られたメタロペプチドを問題とする標的に関連する結合または機能のアッセイに使用し、結合または機能的活性を示すメタロペプチドを選択する。また本発明は、問題とする受容体または標的に結合するペプチドおよび蛋白質部分の特異的配列およびその部位の局所的な三次元構造を決定する方法、または問題とする生物活性を達成する方法、並びに問題とする受容体または標的のファルマコフォアを決定する方法を提供する。本発明は、問題とする受容体または標的の規定されたファルマコフォア、およびペプチドおよび蛋白質の標的特異的折りたたみ部位を識別および決定しかつ問題とする受容体または標的のファルマコフォアを識別および決定するように指示されたライブラリーを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）問題とする標的に結合し、一次構造が既知であり、その一次構造がｎ個の残基からなる既知親ポリペプチドを準備するステップ；
（ｂ）式Ｒ１−Ｃ−Ｒ２の第一ペプチドを構築するステップ、
ここで
Ｒ１は２からｎ個の残基を含み、この残基は親ポリペプチドの残基と同一または同族で、かつ親ポリペプチドの一次構造における残基と同一の順序にあり、
Ｃは金属イオン錯結合のためのＮおよびＳを両方提供する残基またはその擬制体であり、
Ｒ２は０からｎ−２個の残基を含み、この残基は親ポリペプチドにおける残基と同一または同族でかつ親ポリペプチドにおける一次構造の残基と同一の順序にあり、かつこのような一次構造の隣接する二つの残基に対応する隣接する二つの残基の間に挿入されるか、または親ポリペプチド一次構造の１個の残基に対応する１個の残基を置換するＣを伴ってＲ１と共に親ポリペプチドの一次構造におけると同一順序の配列を形成し；
（ｃ）式Ｒ１−Ｃ−Ｒ２の第一のペプチドを金属イオンに錯結合し、それにより第一のＲ１−Ｃ−Ｒ２メタロペプチドを形成するステップ；
（ｄ）問題とする標的への結合に対して第一のＲ１−Ｃ−Ｒ２メタロペプチドをスクリーニングするステップ；
（ｅ）必要に応じステップ（ｂ）から（ｄ）を繰返すステップ、ここで得られるＲ１−Ｃ−Ｒ２メタロペプチドは少なくともＲ１またはＲ２のいずれかにおいてそれぞれ相違する；および
（ｆ）問題とする標的への結合性を示すＲ１−Ｃ−Ｒ２メタロペプチドを選定するステップ、ここでこのようなＲ１−Ｃ−Ｒ２メタロペプチドは問題とする標的に結合する二次構造を含む；
を含む問題とする標的に結合する既知親ポリペプチドにあり、問題とする標的に結合する二次構造を決定する方法。
【請求項２】
ＣがＬ−またはＤ−３−メルカプトアミノ酸であることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項３】
Ｌ−またはＤ−３−メルカプトアミノ酸がＬ−またはＤ−システイン、Ｌ−またはＤ−ペニシラミン、３−メルカプトフェニルアラニン、または以上のいずれかの同族体であることを特徴とする請求項２の方法。
【請求項４】
金属イオンがＶ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｇａ、Ａｓ、Ｓｅ、Ｙ、Ｍｏ、Ｔｃ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｃｄ、Ｉｎ、Ｓｎ、Ｗ、Ｒｅ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ａｕ、Ｈｇ、Ｔｌ、Ｐｂ、Ｂｉ、Ｐｏ、Ａｔ、Ｓｍ、ＥｕまたはＧｄのイオンであることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項５】
問題とする標的が受容体、抗体、毒素、酵素、ホルモン、核酸、細胞内の生物関連蛋白質領域または細胞外の生物関連蛋白質領域であることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項６】
問題とする標的への結合のためのスクリーニングが問題とする標的への結合のための既知結合パートナーとＲ１−Ｃ−Ｒ２メタロペプチドとの競合を含むことを特徴とする請求項１の方法。
【請求項７】
既知結合パートナーが親ポリペプチドであることを特徴とする請求項６の方法。
【請求項８】
問題とする標的への結合のためのスクリーニングが機能アッセイを含むことを特徴とする請求項１の方法。
【請求項９】
問題とする標的が信号を伝達可能な生物学的受容体であり、かつスクリーニングがＲ１−Ｃ−Ｒ２メタロペプチドがその信号の伝達を誘起するか否かを決定することを更に含むことを特徴とする請求項１の方法。
【請求項１０】
問題とする標的が信号を伝達可能な生物学的受容体であり、かつスクリーニングは、信号の伝達を誘起することが既知の問題とする標的への結合パートナーの存在下でその信号の伝達を阻害するか否かを決定することを更に含むことを特徴とする請求項１の方法。
【請求項１１】
Ｒ１およびＲ２がそれぞれ親ポリペプチドにおける残基と同一であり、かつ親ポリペプチドの一次構造における残基と同一の順序にあることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項１２】
Ｒ１またはＲ２の任意のシステイン残基が遊離スルフヒドリル基を含有しない同族体で置換されることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項１３】
システインがグリシン、アラニン、セリン、アミノイソ酪酸、またはデヒドロアラニン残基で置換されることを特徴とする請求項１２の方法。
【請求項１４】
システインがＳ−被保護システインで置換されることを特徴とする請求項１２の方法。
【請求項１５】
システインが約１５０ＭＷ未満のアミノ酸残基の中性擬制体で置換されることを特徴とする請求項１２の方法。
【請求項１６】
式Ｒ１−Ｃ−Ｒ２のペプチドがペプチド合成の化学的方法によって構築されることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項１７】
ペプチド合成の化学的方法が固相合成であることを特徴とする請求項１６の方法。
【請求項１８】
ペプチド合成の化学的方法が溶液相合成であることを特徴とする請求項１６の方法。
【請求項１９】
Ｃがペプチド合成の化学的方法に適合する直交性Ｓ−保護基を更に含み、その直交性Ｓ−保護基は金属イオン錯結合の時点またはその前に開裂可能であることを特徴とする請求項１６の方法。
【請求項２０】
式Ｒ１−Ｃ−Ｒ２のペプチドが生物系の発現により構築されることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項２１】
生物系の発現が組換えベクターの使用を含むことを特徴とする請求項２０の方法。
【請求項２２】
Ｃのアミノ末端側に直接隣接する二つの残基中の任意のプロリン残基が置換されることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項２３】
プロリンがグリシン、アラニン、セリン、アミノイソ酪酸、またはデヒドロアラニン残基で置換されることを特徴とする請求項２２の方法。
【請求項２４】
プロリンが約１５０ＭＷ未満で金属イオン錯結合のためのＮを提供するアミノ酸残基の中性擬制体で置換されることを特徴とする請求項２２の方法。
【請求項２５】
ｎが少なくとも３であることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項２６】
Ｒ１およびＲ２を含む残基の数がｎ未満であることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項２７】
Ｒ１およびＲ２を含む残基の数がｎに等しいことを特徴とする請求項１の方法。
【請求項２８】
ｎが少なくとも１５である場合に方法が一次構造を少なくとも三つの一次構造に分断するステップを更に含み、各分断された一次構造は分断された一次構造の各隣接する一次構造と少なくとも二つの残基によって重なり合い、その後に、分断された各一次構造に関してステップ（ｂ）から（ｆ）を続けることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項２９】
Ｒ１−Ｃ−Ｒ２メタロペプチドが溶液で安定であることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項３０】
Ｒ１−Ｃ−Ｒ２メタロペプチドが溶液でない場合には安定な固体であることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項３１】
金属イオンがＲｅまたはＴｃであることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項３２】
親ポリペプチドがペプチド、ポリペプチドまたは蛋白質であることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項３３】
式Ｒ１−Ｃ−Ｒ２のペプチドがＮ末端遊離アミノ基またはアセチル基を更に含むことを特徴とする請求項１の方法。
【請求項３４】
式Ｒ１−Ｃ−Ｒ２のペプチドがＣ末端遊離カルボン酸塩またはアミド基を更に含むことを特徴とする請求項１の方法。
【請求項３５】
（ａ）問題とする標的に結合しｎ個のアミノ酸残基を含む既知一次構造の親ポリペプチドを準備するステップ；
（ｂ）少なくとも三つの要素部からなる少なくとも一つの構造体を構築するステップ、ここで一つの要素部はα−アミノ基を有するＮ１Ｓ１要素部であり、かつ提供されるであろう金属イオンへの錯結合のためのＮおよびＳの両方を提供し、そして少なくとも二つの要素部はそれぞれα−アミノ基およびα−カルボキシル基を含み、かつ提供されるであろう金属イオンへの錯結合のためのＮを提供し、この少なくとも二つの要素部は既知一次構造の親ポリペプチドにおける残基と同一または同族で同一の順序にあり、少なくとも三つの要素部はペプチド結合により連接しＮ１Ｓ１要素部が少なくとも二つの要素部のカルボキシル末端上に存在するような順序にあり、それによりＮ１Ｓ１要素部含有構造体を形成する；
（ｃ）得られたＮ１Ｓ１要素部含有構造体を金属イオンに錯結合して金属構造体を形成するステップ；
（ｄ）金属構造体を問題とする標的への結合性についてスクリーニングするステップ；
（ｅ）必要に応じステップ（ｂ）から（ｄ）を繰返す、ここで残りの少なくとも二つの要素部は既知一次構造の親ポリペプチドにおける少なくとも一つの異なる残基を含む配列と同一または同族で同一の順序である；および
（ｆ）問題とする標的に最高の結合性を示す金属構造体を選定するステップ；
を含む問題とする標的に結合する既知一次構造を有する親ポリペプチド内で、問題とする標的に結合する二次構造を決定する方法。
【請求項３６】
Ｎ１Ｓ１要素部が構造体のカルボキシル末端要素部であることを特徴とする請求項３５の方法。
【請求項３７】
Ｎ１Ｓ１要素部が構造体のカルボキシル末端要素部ではないことを特徴とする請求項３５の方法。
【請求項３８】
Ｎ１Ｓ１要素部含有構造体が少なくとも四つの要素部を含み、前記四つの要素部は一のα−アミノ基を有するＮ１Ｓ１要素部を含み、残りの少なくとも三つの要素部はそれぞれα−アミノ基およびα−カルボキシル基を含み、その残りの少なくとも三つの要素部は既知一次構造の親ポリペプチドにおける残基と同一または同族で同一順序にあり、ここでＮ１Ｓ１要素部は少なくとも三つの要素部の少なくとも二つの要素部のカルボキシル末端にあり、少なくとも四つの要素部はペプチド結合で連結していることを特徴とする請求項３５の方法。
【請求項３９】
Ｎ１Ｓ１要素部がＬ−またはＤ−３−メルカプトアミノ酸であることを特徴とする請求項３５の方法。
【請求項４０】
Ｌ−またはＤ−３−メルカプトアミノ酸がＬ−またはＤ−システイン、Ｌ−またはＤ−ペニシラミン、３−メルカプトフェニルアラニン、または以上のいずれかの同族体であることを特徴とする請求項３９の方法。
【請求項４１】
金属イオンがＶ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｇａ、Ａｓ、Ｓｅ、Ｙ、Ｍｏ、Ｔｃ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｃｄ、Ｉｎ、Ｓｎ、Ｗ、Ｒｅ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ａｕ、Ｈｇ、Ｔｌ、Ｐｂ、Ｂｉ、Ｐｏ、Ａｔ、Ｓｍ、ＥｕまたはＧｄのイオンであることを特徴とする請求項３５の方法。
【請求項４２】
金属イオンがＲｅまたはＴｃであることを特徴とする請求項３５の方法。
【請求項４３】
金属構造体が溶液で安定であることを特徴とする請求項３５の方法。
【請求項４４】
金属構造体が溶液でない場合には安定な固体であることを特徴とする請求項３５の方法。
【請求項４５】
問題とする標的が受容体、抗体、毒素、酵素、ホルモン、核酸、細胞内の生物関連蛋白質領域または細胞外の生物関連蛋白質領域であることを特徴とする請求項３５の方法。
【請求項４６】
問題とする標的への結合のためのスクリーニングが問題とする標的への結合のための既知結合パートナーと金属構造体との競合を含むことを特徴とする請求項３５の方法。
【請求項４７】
既知結合パートナーが親ポリペプチドであることを特徴とする請求項４６の方法。
【請求項４８】
問題とする標的への結合のためのスクリーニングが機能アッセイを含むことを特徴とする請求項３５の方法
【請求項４９】
問題とする標的が信号を伝達可能な生物学的受容体であり、かつスクリーニングが金属構造体はその信号の伝達を誘起するか否かを決定することを更に含むことを特徴とする請求項３５の方法。
【請求項５０】
問題とする標的が信号を伝達可能な生物学的受容体であり、かつスクリーニングが信号の伝達を誘起することが判っている問題とする標的への結合パートナーの存在下で金属構造体はその信号の伝達を阻害するか否かを決定することを更に含むことを特徴とする請求項３５の方法。
【請求項５１】
少なくとも二つの要素部がアミノ酸残基を含むことを特徴とする請求項３５の方法。
【請求項５２】
アミノ酸残基がアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、メチオニン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファンまたはチロシンを含むことを特徴とする請求項５１の方法。
【請求項５３】
アミノ酸残基がＬ−アミノ酸残基であることを特徴とする請求項５１の方法。
【請求項５４】
アミノ酸残基がＤ−アミノ酸残基であることを特徴とする請求項５１の方法。
【請求項５５】
アミノ酸残基がＬ−アミノ酸残基およびＤ−アミノ酸残基を含むことを特徴とする請求項５１の方法。
【請求項５６】
アミノ酸残基が修飾蛋白質アミノ酸残基、非蛋白質アミノ酸残基、非蛋白質アミノ酸残基の擬制体、蛋白質アミノ酸残基の擬制体、翻訳後修飾アミノ酸残基、または酵素的修飾アミノ酸残基を含むことを特徴とする請求項５１の方法。
【請求項５７】
少なくとも二つのアミノ酸残基がそれぞれ既知一次構造の親ポリペプチドにおける残基と同一であり、同一の順序にあることを特徴とする請求項３５の方法。
【請求項５８】
既知一次構造の親ポリペプチドの領域内にあり、α−アミノ基を有するＮ１Ｓ１要素部以外の要素部に同一または同族である任意のシステイン残基を遊離スルフヒドリル基のない同族体で置換することを特徴とする請求項３５の方法。
【請求項５９】
遊離スルフヒドリル基のないシステイン同族体がグリシン、アラニン、セリン、アミノイソ酪酸またはデヒドロアラニン残基であることを特徴とする請求項５８の方法。
【請求項６０】
遊離スルフヒドリル基のないシステイン同族体がＳ−被保護システインであることを特徴とする請求項５８の方法。
【請求項６１】
遊離スルフヒドリル基のないシステイン同族体が約１５０ＭＷ未満のアミノ酸の中性擬制体であることを特徴とする請求項５８の方法。
【請求項６２】
構造体がペプチド合成の化学的方法により構築されることを特徴とする請求項３５の方法。
【請求項６３】
ペプチド合成の化学的方法が固相合成であることを特徴とする請求項６２の方法。
【請求項６４】
ペプチド合成の化学的方法が溶液相合成であることを特徴とする請求項６２の方法
【請求項６５】
α−アミノ基を有するＮ１Ｓ１要素部が、Ｓに結合しかつペプチド合成の化学的方法に適合する直交性Ｓ−保護基を更に含み、その直交性Ｓ−保護基は金属イオン錯結合の時点またはその前に開裂可能であることを特徴とする請求項６２の方法。
【請求項６６】
構造体が生物系の発現により構築されることを特徴とする請求項３５の方法。
【請求項６７】
生物系の発現が組換えベクターの使用を含むことを特徴とする請求項６６の方法。
【請求項６８】
既知一次構造の親ポリペプチドの部分であって、α−アミノ基を有するＮ１Ｓ１要素部のアミノ末端に隣接する二つの要素部に同一または同族である部分の任意のプロリン残基を金属イオンへの錯結合のためのＮを提供する同族体で置換することを特徴とする請求項３５の方法。
【請求項６９】
同族体がグリシン、アラニン、セリン、アミノイソ酪酸またはデヒドロアラニン残基であることを特徴とする請求項６８の方法。
【請求項７０】
同族体が約１５０ＭＷ未満のアミノ酸の中性擬制体であることを特徴とする請求項６８の方法。
【請求項７１】
要素部の数がｎ未満であることを特徴とする請求項３５の方法。
【請求項７２】
要素部の数がｎに等しいことを特徴とする請求項３５の方法。
【請求項７３】
要素部の数がｎ＋１に等しいことを特徴とする請求項３５の方法。
【請求項７４】
親ポリペプチドがペプチド、ポリペプチドまたは蛋白質であることを特徴とする請求項３５の方法。
【請求項７５】
金属構造体がＮ末端遊離アミノ基またはアセチル基を更に含むことを特徴とする請求項３５の方法。
【請求項７６】
金属構造体がＣ末端遊離カルボン酸塩またはアミド基を更に含むことを特徴とする請求項３５の方法。
【請求項７７】
（ａ）ｎ個の残基からなる既知一次構造の既知アミノ酸配列を選定するステップ、ここでｎは少なくとも３であり、この既知アミノ酸配列は問題とする標的に結合する；
（ｂ）既知一次構造における連続する一続きの残基から少なくとも二つの連続残基を選定し、金属イオン錯結合のためのＮおよびＳを両方提供する残基を選定した少なくとも二つの連続残基の二つの残基のカルボキシル末端に挿入し、各配列はライブラリーメンバーを構成する、ことによりアミノ酸配列のライブラリーを設計するステップ、ここで各ライブラリーメンバーは金属イオン錯結合のためのＮおよびＳを両方提供する少なくとも一つの残基または残基の挿入個所により相互に異なる；
（ｃ）設計したアミノ酸配列のライブラリーを構築するステップ；
（ｄ）設計したアミノ酸配列の各ライブラリーメンバーを金属イオンに錯結合させてメタロペプチドのライブラリーを形成するステップ；
（ｅ）メタロペプチドのライブラリーを問題とする標的への結合性についてスクリーニングするステップ；および
（ｆ）問題とする標的への結合性を示すメタロペプチドを選定するステップ；
を含む問題とする標的に結合するメタロペプチドを決定する方法。
【請求項７８】
ｎ個の残基からなる既知一次構造の既知アミノ酸配列がペプチド、ポリペプチドまたは蛋白質であることを特徴とする請求項７７の方法。
【請求項７９】
設計したアミノ酸配列のライブラリーは少なくとも一つのメンバーを含み、ここで金属イオン錯結合のためのＮおよびＳを両方提供する残基がそのアミノ酸配列のカルボキシル末端残基であることを特徴とする請求項７７の方法。
【請求項８０】
設計したアミノ酸配列のライブラリーは少なくとも一つのメンバーを含み、ここで金属イオン錯結合のためのＮおよびＳを両方提供する残基がそのアミノ酸配列のカルボキシル末端残基ではないことを特徴とする請求項７７の方法。
【請求項８１】
設計したアミノ酸配列のライブラリーは少なくとも四つの残基を有する少なくとも一つのメンバーを含み、ここで金属イオン錯結合のためのＮおよびＳを両方提供する残基が既知一次構造における連続する一続きの残基から選定された二つの隣接する連続残基の間に挿入されることを特徴とする請求項７７の方法。
【請求項８２】
金属イオン錯結合のためのＮおよびＳを両方提供する残基がＬ−またはＤ−３−メルカプトアミノ酸であることを特徴とする請求項７７の方法。
【請求項８３】
Ｌ−またはＤ−３−メルカプトアミノ酸がＬ−またはＤ−システイン、Ｌ−またはＤ−ペニシラミン、３−メルカプトフェニルアラニン、または以上のいずれかの同族体であることを特徴とする請求項８２の方法。
【請求項８４】
金属イオンがＶ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｇａ、Ａｓ、Ｓｅ、Ｙ、Ｍｏ、Ｔｃ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｃｄ、Ｉｎ、Ｓｎ、Ｗ、Ｒｅ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ａｕ、Ｈｇ、Ｔｌ、Ｐｂ、Ｂｉ、Ｐｏ、Ａｔ、Ｓｍ、ＥｕまたはＧｄのイオンであることを特徴とする請求項７７の方法。
【請求項８５】
問題とする標的が受容体、抗体、毒素、酵素、ホルモン、核酸、細胞内の生物関連蛋白質領域または細胞外の生物関連蛋白質領域であることを特徴とする請求項７７の方法。
【請求項８６】
問題とする標的への結合のためのスクリーニングが問題とする標的への結合のための既知結合パートナーとメタロペプチドライブラリーのメンバーとの競合を含むことを特徴とする請求項７７の方法。
【請求項８７】
既知結合パートナーがｎ個の残基からなる既知一次構造の既知アミノ酸配列であることを特徴とする請求項８６の方法。
【請求項８８】
ｎ個の残基からなる既知一次構造の既知アミノ酸配列が蛋白質であり、既知結合パートナーがその蛋白質のペプチド断片であることを特徴とする請求項８６の方法。
【請求項８９】
問題とする標的への結合のためのスクリーニングが機能アッセイを含むことを特徴とする請求項７７の方法。
【請求項９０】
問題とする標的が信号を伝達可能な生物学的受容体であり、かつスクリーニングがメタロペプチドはその信号の伝達を誘起するか否かを決定することを更に含むことを特徴とする請求項７７の方法。
【請求項９１】
問題とする標的が信号を伝達可能な生物学的受容体であり、かつスクリーニングが信号の伝達を誘起することが判っている問題とする標的への結合パートナーの存在下でメタロペプチドはその信号の伝達を阻害するか否かを決定することを更に含むことを特徴とする請求項７７の方法。
【請求項９２】
金属イオン錯結合のためのＮおよびＳを両方提供する挿入された残基以外のアミノ酸配列ライブラリーにおける任意のシステイン残基が遊離スルフヒドリル基を含有しない同族体をもって置換されることを特徴とする請求項７７の方法。
【請求項９３】
システインがグリシン、アラニン、セリン、アミノイソ酪酸、またはデヒドロアラニン残基で置換されることを特徴とする請求項９２の方法。
【請求項９４】
システインがＳ−被保護システインで置換されることを特徴とする請求項９２の方法。
【請求項９５】
システインが約１５０ＭＷ未満のアミノ酸残基の中性擬制体で置換されることを特徴とする請求項９２の方法。
【請求項９６】
アミノ酸配列ライブラリーがペプチド合成の化学的方法によって構築されることを特徴とする請求項７７の方法。
【請求項９７】
ペプチド合成の化学的方法が固相合成であることを特徴とする請求項９６の方法。
【請求項９８】
ペプチド合成の化学的方法が溶液相合成であることを特徴とする請求項９６の方法。
【請求項９９】
金属イオン錯結合のためのＮおよびＳを両方提供する挿入された残基がペプチド合成の化学的方法に適合する直交性Ｓ−保護基を更に含み、その直交性Ｓ−保護基は金属イオン錯結合の時点またはその前に開裂可能であることを特徴とする請求項９６の方法。
【請求項１００】
アミノ酸配列ライブラリーが生物系の発現により構築されることを特徴とする請求項７７の方法。
【請求項１０１】
生物系の発現が組換えベクターの使用を含むことを特徴とする請求項１００の方法。
【請求項１０２】
任意のライブラリーメンバーにおいてＮおよびＳを両方提供する残基のアミノ末端側に直接隣接する二つの残基の中の任意のプロリン残基を金属イオン錯結合のためのＮを提供する残基で置換することを特徴とする請求項７７の方法。
【請求項１０３】
プロリンがグリシン、アラニン、セリン、アミノイソ酪酸、またはデヒドロアラニン残基で置換されることを特徴とする請求項１０２の方法。
【請求項１０４】
プロリンが約１５０ＭＷ未満で金属イオン錯結合のためのＮを提供するアミノ酸残基の中性擬制体で置換されることを特徴とする請求項１０２の方法。
【請求項１０５】
ｎが少なくとも１５である場合に方法が一次構造を少なくとも三つの分断された一次構造に分断するステップを更に含み、各分断された一次構造は分断された一次構造の各隣接する一次構造と少なくとも二つの残基によって重なり合い、その後に分断された各二次親ポリペプチドに関してステップ（ｂ）から（ｆ）を続けることを特徴とする請求項７７の方法。
【請求項１０６】
メタロペプチドライブラリーのメンバーが溶液で安定であることを特徴とする請求項７７の方法。
【請求項１０７】
メタロペプチドライブラリーのメンバーが溶液でない場合には安定な固体であることを特徴とする請求項７７の方法。
【請求項１０８】
選定された少なくとも二つの連続残基群の少なくとも一つの残基が既知一次構造における一続きの連続残基における対応する残基の同族体であることを特徴とする請求項７７の方法。
【請求項１０９】
設計された各アミノ酸配列がＮ末端遊離アミノ基またはアセチル基を更に含むことを特徴とする請求項７７の方法。
【請求項１１０】
設計された各アミノ酸配列がＣ末端遊離カルボン酸塩またはアミド基を更に含むことを特徴とする請求項７７の方法。
【請求項１１１】
（ａ）ｎ個の残基からなる既知一次構造の既知アミノ酸配列を選定するステップ、ここでｎは少なくとも４であり、この既知アミノ酸配列は問題とする標的に結合する；
（ｂ）既知一次構造の連続する一続きの残基から少なくとも三つの連続残基を選定し、金属イオン錯結合のためのＮおよびＳを両方提供する残基で選定した少なくとも三つの連続残基の連続する任意の三つの残基のカルボキシル末端残基を置換し、各配列がライブラリーメンバーを構成する、ことによりアミノ酸配列のライブラリーを設計するステップ、ここで各ライブラリーメンバーは少なくとも一つの残基により相違する；
（ｃ）設計したアミノ酸配列のライブラリーを構築するステップ；
（ｄ）設計したアミノ酸配列の各ライブラリーメンバーを金属イオンに錯結合してメタロペプチドのライブラリーを形成するステップ；
（ｅ）メタロペプチドのライブラリーを問題とする標的への結合性についてスクリーニングするステップ；および
（ｆ）問題とする標的への結合性を示すメタロペプチドを選定するステップ；
を含む問題とする標的に結合するメタロペプチドを決定する方法。
【請求項１１２】
ｎ個の残基からなる既知一次構造の既知アミノ酸配列がペプチド、ポリペプチドまたは蛋白質であることを特徴とする請求項１１１の方法。
【請求項１１３】
設計したアミノ酸配列のライブラリーは少なくとも一つのメンバーを含み、ここで金属イオン錯結合のためのＮおよびＳを両方提供する残基がそのアミノ酸配列のカルボキシル末端残基であることを特徴とする請求項１１１の方法。
【請求項１１４】
設計したアミノ酸配列のライブラリーは少なくとも一つのメンバーを含み、ここで金属イオン錯結合のためのＮおよびＳを両方提供する残基がそのアミノ酸配列のカルボキシル末端残基ではないことを特徴とする請求項１１１の方法。
【請求項１１５】
金属イオン錯結合のためのＮおよびＳを両方提供する残基がＬ−またはＤ−３−メルカプトアミノ酸であることを特徴とする請求項１１１の方法。
【請求項１１６】
Ｌ−またはＤ−３−メルカプトアミノ酸がＬ−またはＤ−システイン、Ｌ−またはＤ−ペニシラミン、３−メルカプトフェニルアラニン、または以上のいずれかの同族体であることを特徴とする請求項１１５の方法。
【請求項１１７】
金属イオンがＶ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｇａ、Ａｓ、Ｓｅ、Ｙ、Ｍｏ、Ｔｃ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｃｄ、Ｉｎ、Ｓｎ、Ｗ、Ｒｅ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ａｕ、Ｈｇ、Ｔｌ、Ｐｂ、Ｂｉ、Ｐｏ、Ａｔ、Ｓｍ、ＥｕまたはＧｄのイオンであることを特徴とする請求項１１５の方法。
【請求項１１８】
問題とする標的が受容体、抗体、毒素、酵素、ホルモン、核酸、細胞内の生物関連蛋白質領域または細胞外の生物関連蛋白質領域であることを特徴とする請求項１１１の方法。
【請求項１１９】
問題とする標的への結合のためのスクリーニングが問題とする標的への結合のための既知結合パートナーとメタロペプチドライブラリーのメンバーとの競合を含むことを特徴とする請求項１１１の方法。
【請求項１２０】
既知結合パートナーがｎ個の残基からなる既知一次構造の既知アミノ酸配列であることを特徴とする請求項１１９の方法。
【請求項１２１】
ｎ個の残基からなる既知一次構造の既知アミノ酸配列が蛋白質であり、既知結合パートナーがその蛋白質のペプチド断片であることを特徴とする請求項１１９の方法。
【請求項１２２】
問題とする標的への結合のためのスクリーニングが機能アッセイを含むことを特徴とする請求項１１１の方法。
【請求項１２３】
問題とする標的が信号を伝達可能な生物学的受容体であり、かつスクリーニングがメタロペプチドはその信号の伝達を誘起するか否かを決定することを更に含むことを特徴とする請求項１１１の方法。
【請求項１２４】
問題とする標的が信号を伝達可能な生物学的受容体であり、かつスクリーニングが信号の伝達を誘起することが判っている問題とする標的への結合パートナーの存在下でメタロペプチドはその信号の伝達を阻害するか否かを決定することを更に含むことを特徴とする請求項１１１の方法。
【請求項１２５】
金属イオン錯結合のためのＮおよびＳを両方提供する挿入された残基以外のアミノ酸配列ライブラリーにおける任意のシステイン残基が遊離スルフヒドリル基を含有しない同族体で置換されることを特徴とする請求項１１１の方法。
【請求項１２６】
システインがグリシン、アラニン、セリン、アミノイソ酪酸、またはデヒドロアラニン残基で置換されることを特徴とする請求項１２５の方法。
【請求項１２７】
システインがＳ−被保護システインで置換されることを特徴とする請求項１２５の方法。
【請求項１２８】
システインが約１５０ＭＷ未満のアミノ酸残基の中性擬制体で置換されることを特徴とする請求項１２５の方法。
【請求項１２９】
アミノ酸配列ライブラリーがペプチド合成の化学的方法によって構築されることを特徴とする請求項１１１の方法。
【請求項１３０】
ペプチド合成の化学的方法が固相合成であることを特徴とする請求項１２９の方法。
【請求項１３１】
ペプチド合成の化学的方法が溶液相合成であることを特徴とする請求項１２９の方法。
【請求項１３２】
金属イオン錯結合のためのＮおよびＳを両方提供する挿入された残基がペプチド合成の化学的方法に適合する直交性Ｓ−保護基を更に含み、その直交性Ｓ−保護基は金属イオン錯結合の時点またはその前に開裂可能であることを特徴とする請求項１２９の方法。
【請求項１３３】
アミノ酸配列ライブラリーが生物系の発現により構築されることを特徴とする請求項１１１の方法。
【請求項１３４】
生物系の発現が組換えベクターの使用を含むことを特徴とする請求項１３３の方法。
【請求項１３５】
任意のライブラリーメンバーにおいてＮおよびＳを両方提供する残基のアミノ末端側に直接隣接する二つの残基の中の任意のプロリン残基を金属イオン錯結合のためのＮを提供する残基で置換することを特徴とする請求項１１１の方法。
【請求項１３６】
プロリンがグリシン、アラニン、セリン、アミノイソ酪酸、またはデヒドロアラニン残基で置換されることを特徴とする請求項１３５の方法。
【請求項１３７】
プロリンが約１５０ＭＷ未満で金属イオン錯結合のためのＮを提供するアミノ酸残基の中性擬制体で置換されることを特徴とする請求項１３５の方法。
【請求項１３８】
ｎが少なくとも１５である場合に方法が一次構造を少なくとも三つの一次構造に分断するステップを更に含み、各分断された一次構造は分断された一次構造の隣接する各一次構造と少なくとも二つの残基によって重なり合い、その後に分断された各一次構造に関してステップ（ｂ）から（ｆ）を続けることを特徴とする請求項１１１の方法。
【請求項１３９】
メタロペプチドライブラリーのメンバーが溶液で安定であることを特徴とする請求項１１１の方法。
【請求項１４０】
メタロペプチドライブラリーのメンバーが溶液でない場合には安定な固体であることを特徴とする請求項１１１の方法。
【請求項１４１】
選定された少なくとも二つの連続残基群の少なくとも一つの残基が既知一次構造における一続きの連続残基における対応する残基の同族体であることを特徴とする請求項１１１の方法。
【請求項１４２】
設計された各アミノ酸配列がＮ末端遊離アミノ基またはアセチル基を更に含むことを特徴とする請求項１１１の方法。
【請求項１４３】
設計された各アミノ酸配列がＣ末端遊離カルボン酸塩またはアミド基を更に含むことを特徴とする請求項１１１の方法。
【請求項１４４】
（ａ）問題とする標的に結合し、一次構造が既知であり、この一次構造がｎ個の残基からなる既知アミノ酸配列を準備するステップ；
（ｂ）式Ｒ１−Ｃ−Ｒ２の第一ペプチドを構築するステップ、
ここで
Ｒ１は２からｎ個の残基を含み、この残基は既知アミノ酸配列の残基と同一または同族で、かつ既知アミノ酸配列の一次構造における残基と同一の順序にあり、
Ｃは金属イオン錯結合のためのＮおよびＳを両方提供する残基またはその擬制体であり、
Ｒ２は０からｎ−２個の残基を含み、この残基は既知アミノ酸配列における残基と同一または同族でかつ既知アミノ酸配列における一次構造の残基と同一の順序にあり、かつこのような一次構造の隣接する二つの残基に対応する隣接する二つの残基の間に挿入されるか、または既知アミノ酸配列一次構造の１個の残基に対応する１個の残基を置換するＣを伴ってＲ１と共に既知アミノ酸配列の一次構造におけると同一順序の配列を形成し；
（ｃ）式Ｒ１−Ｃ−Ｒ２の第一のペプチドを金属イオンに錯結合し、それにより第一のＲ１−Ｃ−Ｒ２メタロペプチドを形成するステップ；
（ｄ）問題とする標的への結合に対して第一のＲ１−Ｃ−Ｒ２メタロペプチドをスクリーニングするステップ；
（ｅ）必要に応じステップ（ｂ）から（ｄ）を繰返すステップ、ここで得られるＲ１−Ｃ−Ｒ２メタロペプチドは少なくともＲ１またはＲ２のいずれかにおいてそれぞれ相違する；
（ｆ）問題とする標的への結合性を示すＲ１−Ｃ−Ｒ２メタロペプチドを選定するステップ；および
（ｇ）金属イオンの配位幾何構造に基づいて分子模型を組み立てることにより金属イオンの配位部位におけるおよび直接隣接するアミノ酸側鎖の空間的位置を決定し、問題とする標的に対し標的特異的に結合するファルマコフォアを規定するステップ；
を含む問題とする標的に対し標的特異的に結合するファルマコフォアを決定する方法。
【請求項１４５】
金属イオンに錯結合した一以上のアミノ酸残基または金属イオンに錯結合したアミノ酸残基に隣接するアミノ酸残基のキラル性を変更することによって、問題とする標的への選定したＲ１−Ｃ−Ｒ２メタロペプチドの結合性を最適化するステップを更に含むことを特徴とする請求項１４４の方法。
【請求項１４６】
金属イオンに錯結合した少なくとも一つのアミノ酸残基または金属イオンに錯結合したアミノ酸残基に隣接する少なくとも一つのアミノ酸残基を天然または合成の同族体をもって置換することによって、問題とする標的への選定したＲ１−Ｃ−Ｒ２メタロペプチドの結合性を最適化するステップを更に含むことを特徴とする請求項１４４の方法。
【請求項１４７】
分子模型の組立てがコンピュータベースのモデル化を含むことを特徴とする請求項１４４の方法。
【請求項１４８】
ＣがＬ−またはＤ−３−メルカプトアミノ酸であることを特徴とする請求項１４４の方法。
【請求項１４９】
Ｌ−またはＤ−３−メルカプトアミノ酸がＬ−またはＤ−システイン、Ｌ−またはＤ−ペニシラミン、３−メルカプトフェニルアラニン、または以上のいずれかの同族体であることを特徴とする請求項１４４の方法。
【請求項１５０】
金属イオンがＶ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｇａ、Ａｓ、Ｓｅ、Ｙ、Ｍｏ、Ｔｃ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｃｄ、Ｉｎ、Ｓｎ、Ｗ、Ｒｅ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ａｕ、Ｈｇ、Ｔｌ、Ｐｂ、Ｂｉ、Ｐｏ、Ａｔ、Ｓｍ、ＥｕまたはＧｄのイオンであることを特徴とする請求項１４４の方法。
【請求項１５１】
問題とする標的に対する標的特異的に結合するファルマコフォアが受容体、抗体、毒素、酵素、ホルモン、核酸、細胞内の生物関連蛋白質領域または細胞外の生物関連蛋白質領域の標的特異的に結合するファルマコフォアを含むことを特徴とする請求項１４４の方法。
【請求項１５２】
問題とする標的への結合のためのスクリーニングが問題とする標的への結合のための既知結合パートナーとＲ１−Ｃ−Ｒ２メタロペプチドとの競合を含むことを特徴とする請求項１４４の方法。
【請求項１５３】
既知結合パートナーが既知アミノ酸配列であることを特徴とする請求項１５２の方法。
【請求項１５４】
Ｒ１またはＲ２のいずれかのシステイン残基が遊離スルフヒドリル基を含有しない同族体で置換されることを特徴とする請求項１４４の方法。
【請求項１５５】
システインがグリシン、アラニン、セリン、アミノイソ酪酸、またはデヒドロアラニン残基で置換されることを特徴とする請求項１５４の方法。
【請求項１５６】
システインがＳ−被保護システインで置換されることを特徴とする請求項１５４の方法。
【請求項１５７】
システインが約１５０ＭＷ未満のアミノ酸残基の中性擬制体で置換されることを特徴とする請求項１５４の方法。
【請求項１５８】
Ｃのアミノ末端側に直接隣接する二つの残基の任意のプロリン残基が置換されることを特徴とする請求項１４４の方法。
【請求項１５９】
プロリンがグリシン、アラニン、セリン、アミノイソ酪酸、またはデヒドロアラニン残基で置換されることを特徴とする請求項１５８の方法。
【請求項１６０】
プロリンが約１５０ＭＷ未満で金属イオン錯結合のためのＮを提供するアミノ酸残基の中性擬制体で置換されることを特徴とする請求項１５８の方法。
【請求項１６１】
ｎが少なくとも３であることを特徴とする請求項１４４の方法。
【請求項１６２】
ｎが少なくとも１５である場合に方法が一次構造を少なくとも三つの一次構造に分断するステップを更に含み、各分断された一次構造は分断された一次構造の各隣接する一次構造と少なくとも二つの残基によって重なり合い、その後に分断された各一次構造に関してステップ（ｂ）から（ｆ）が続けられることを特徴とする請求項１４４の方法。
【請求項１６３】
既知アミノ酸配列がペプチド、ポリペプチドまたは蛋白質であることを特徴とする請求項１４４の方法。
【請求項１６４】
ファルマコフォアであって、それは金属イオン錯結合のためのＮとＳを両方提供する残基を含み、かつそのような残基のアミノ末端側にペプチド結合によって連結しているメタロペプチドによって規定され、少なくとも二つの連続残基は問題とする標的に結合するアミノ酸残基の配列既知の一次構造における同数の連続残基と同一または同族であり、金属イオンはこれらの残基と錯結合し、ここで、金属イオン錯結合のためのＮおよびＳを両方提供する残基のアミノ末端側に直接隣接する二つの残基において任意のプロリン残基は金属イオン錯結合のためのＮを提供する残基で置換されかつ、更に金属イオン錯結合のためのＮおよびＳを両方提供する残基以外の遊離スルフヒドリル基を有する残基は遊離スルフヒドリル基を含有しない同族体で置換される場合には、このメタルペプチドは問題とする標的に結合することを特徴とする問題とする標的に対し標的特異的に結合するファルマコフォア。
【請求項１６５】
金属イオン錯結合のためのＮおよびＳを両方提供する残基がＬ−またはＤ−システイン、Ｌ−またはＤ−ペニシラミン、３−メルカプトフェニルアラニン、または以上のいずれかの同族体であることを特徴とする請求項１６４のファルマコフォア。
【請求項１６６】
プロリンが約１５０ＭＷ未満で金属イオン錯結合のためのＮを提供するアミノ酸残基の中性擬制体で置換されることを特徴とする請求項１６４のファルマコフォア。
【請求項１６７】
Ｒ１またはＲ２のいずれか一以上のシステイン残基が遊離スルフヒドリル基を含有しない同族体で置換されることを特徴とする請求項１６４のファルマコフォア。
【請求項１６８】
遊離スルフヒドリル基を有する残基がグリシン、アラニン、セリン、アミノイソ酪酸、またはデヒドロアラニン残基で置換されることを特徴とする請求項１６４のファルマコフォア。
【請求項１６９】
遊離スルフヒドリル基を有する残基がＳ−被保護システインで置換されることを特徴とする請求項１６４のファルマコフォア。
【請求項１７０】
遊離スルフヒドリル基を有する残基が約１５０ＭＷ未満のアミノ酸残基の中性擬制体で置換されることを特徴とする請求項１６４のファルマコフォア。
【請求項１７１】
金属イオンの配位幾何構造に基づく分子模型による金属イオンの配位部位におけるおよび直接隣接するアミノ酸側鎖の空間的位置によって更に規定されることを特徴とする請求項１６４のファルマコフォア。
【請求項１７２】
問題とする標的に照準を合わせたメタロペプチドライブラリーであって、ライブラリーの各構成メンバーは、
（ａ）式Ｒ１−Ｃ−Ｒ２のアミノ酸配列、
ここで、
Ｒ１は２からｎ個の残基を含み、この残基は問題とする標的に結合する既知アミノ酸配列における残基と同一または同族であり、既知アミノ酸配列は既知一次構造を有し、残基は既知アミノ酸配列一次構造における残基と同一の順序のＲ１を含み、
Ｃは金属イオン錯結合のためのＮおよびＳを両方提供する残基またはその擬制体であり、
Ｒ２は０からｎ−２個の残基を含み、この残基は親ポリペプチドにおける残基と同一または同族でかつ親ポリペプチドの一次構造における残基と同一の順序にあり、かつこのような親ポリペプチド一次構造における隣接する二つの残基に対応する隣接する二つの残基の間に挿入されるか、または親ポリペプチド一次構造における１個の残基に対応する１個の残基を置換するＣを伴ってＲ１と共に親ポリペプチドの一次構造におけると同一順序の配列を形成し、
ｎは親アミノ酸配列一次構造の残基数であり；および
（ｂ）式Ｒ１−Ｃ−Ｒ２のアミノ酸配列に錯結合した金属イオン；
を含むライブラリー。
【請求項１７３】
ＣがＬ−またはＤ−３−メルカプトアミノ酸であることを特徴とする請求項１７２のライブラリー。
【請求項１７４】
Ｌ−またはＤ−３−メルカプトアミノ酸がＬ−またはＤ−システイン、Ｌ−またはＤ−ペニシラミン、３−メルカプトフェニルアラニン、または以上のいずれかの同族体であることを特徴とする請求項１７３のライブラリー。
【請求項１７５】
金属イオンがＶ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｇａ、Ａｓ、Ｓｅ、Ｙ、Ｍｏ、Ｔｃ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｃｄ、Ｉｎ、Ｓｎ、Ｗ、Ｒｅ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ａｕ、Ｈｇ、Ｔｌ、Ｐｂ、Ｂｉ、Ｐｏ、Ａｔ、Ｓｍ、ＥｕまたはＧｄのイオンであることを特徴とする請求項１７２のライブラリー。
【請求項１７６】
問題とする標的が受容体、抗体、毒素、酵素、ホルモン、核酸、細胞内の生物関連蛋白質領域または細胞外の生物関連蛋白質領域であることを特徴とする請求項１７２のライブラリー。
【請求項１７７】
Ｒ１およびＲ２がそれぞれ親ポリペプチドにおける残基と同一であり、親ポリペプチド一次構造における残基と同一の順序にあることを特徴とする請求項１７２のライブラリー。
【請求項１７８】
Ｒ１またはＲ２の任意のシステイン残基が遊離スルフヒドリル基を含有しない同族体で置換されることを特徴とする請求項１７２のライブラリー。
【請求項１７９】
システインがグリシン、アラニン、セリン、アミノイソ酪酸、またはデヒドロアラニン残基で置換されることを特徴とする請求項１７８のライブラリー。
【請求項１８０】
システインがＳ−被保護システインで置換されることを特徴とする請求項１７８のライブラリー。
【請求項１８１】
システインが約１５０ＭＷ未満のアミノ酸残基の中性擬制体で置換されることを特徴とする請求項１７８のライブラリー。
【請求項１８２】
式Ｒ１−Ｃ−Ｒ２のアミノ酸配列がペプチド合成の化学的方法によって構築されることを特徴とする請求項１７２のライブラリー。
【請求項１８３】
ペプチド合成の化学的方法が固相合成であることを特徴とする請求項１８２のライブラリー。
【請求項１８４】
ペプチド合成の化学的方法が溶液相合成であることを特徴とする請求項１８２のライブラリー。
【請求項１８５】
Ｃがペプチド合成の化学的方法に適合する直交性Ｓ−保護基を更に含み、その直交性Ｓ−保護基が金属イオン錯結合の時点またはその前に開裂されることを特徴とする請求項１８２のライブラリー。
【請求項１８６】
Ｃのアミノ末端側に直接隣接する二つの残基の任意のプロリン残基が置換されることを特徴とする請求項１７２のライブラリー。
【請求項１８７】
プロリンがグリシン、アラニン、セリン、アミノイソ酪酸、またはデヒドロアラニン残基で置換されることを特徴とする請求項１８６のライブラリー。
【請求項１８８】
プロリンが約１５０ＭＷ未満で金属イオン錯結合のためのＮを提供するアミノ酸残基の中性擬制体で置換されることを特徴とする請求項１８６のライブラリー。
【請求項１８９】
ライブラリーの構成メンバーが溶液で安定であることを特徴とする請求項１７２のライブラリー。
【請求項１９０】
ライブラリーの各構成メンバーが溶液でない場合には安定な固体であることを特徴とする請求項１７２のライブラリー。
【請求項１９１】
親アミノ酸配列がペプチド、ポリペプチドまたは蛋白質であることを特徴とする請求項１７２のライブラリー。
【請求項１９２】
ライブラリーの各構成メンバーがＮ末端遊離アミノ基またはアセチル基を更に含むことを特徴とする請求項１７２のライブラリー。
【請求項１９３】
ライブラリーの各構成メンバーがＣ末端遊離カルボン酸塩またはアミド基を更に含むことを特徴とする請求項１７２のライブラリー。
【請求項１９４】
ｕＰＡ受容体に照準を合わせたメタロペプチドライブラリーであって、ライブラリーの各構成メンバーは、
（ａ）式Ｒ１−Ｃ−Ｒ２のアミノ酸配列、
ここで、
Ｒ１は２から１１個の残基を含み、この残基は配列Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）における残基と同一または同族であり、この残基はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基と同一の順序でＲ１を含み、
Ｃは金属イオン錯結合のためのＮおよびＳを両方提供する残基またはその擬制体であり、
Ｒ２は０から９個の残基を含み、この残基はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２における残基と同一または同族であり、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２における隣接する二つの残基に対応する隣接する二つの残基の間に挿入されるかまたはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２における１個の残基に対応する１個の残基を置換するＣを伴ってＲ１と共にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２におけると同一順序の配列を形成し；および
（ｂ）式Ｒ１−Ｃ−Ｒ２のアミノ酸配列に錯結合した金属イオン；
を含むライブラリー。
【請求項１９５】
ライブラリーの構成メンバーＡｃ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−ＮＨ２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、Ａｃ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−ＮＨ２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、Ａｃ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−ＮＨ２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、Ａｃ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−ＮＨ２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、Ａｃ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−ＮＨ２  （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）、Ａｃ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−ＮＨ２  （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）、Ａｃ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−ＮＨ２  （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）、Ａｃ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−ＮＨ２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）、Ａｃ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−ＮＨ２  （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、または、Ａｃ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−ＮＨ２−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）を含む請求項１９４のライブラリー。
【請求項１９６】
メラノコルチン受容体に照準を合わせたメタロペプチドライブラリーであって、ライブラリーの各構成メンバーは、
（ａ）式Ｒ１−Ｃ−Ｒ２のアミノ酸配列、
ここで、
Ｒ１は２から６個の残基を含有し、この残基は配列Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐにおける残基と同一または同族であり、この残基はＮｌｅ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐの残基と同一の順序でＲ１を含み；
Ｃは金属イオン錯結合のためのＮおよびＳを両方提供する残基またはその擬制体であり、
Ｒ２は０から４個の残基を含み、この残基はＮｌｅ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐにおける残基と同一または同族であり、かつＮｌｅ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐにおける隣接する二つの残基に対応する隣接する二つの残基の間に挿入されるかまたはＮｌｅ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐにおける１個の残基に対応する１個の残基を置換するＣを伴ってＲ１と共にＮｌｅ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐにおけると同一順序の配列を形成し；および
（ｂ）式Ｒ１−Ｃ−Ｒ２のアミノ酸配列に錯結合した金属イオン；
を含むライブラリー。
【請求項１９７】
ライブラリーの構成メンバーＡｃ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＮＨ２， Ａｃ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＮＨ２， Ａｃ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＮＨ２， Ａｃ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−ＮＨ２ または Ａｃ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−ＮＨ２を含む請求項１９６のライブラリー。
【請求項１９８】
アルツハイマー疾患の治療用アミロイドベータ蛋白質関連ペプチドのライブラリーであって、ライブラリーの各構成メンバーは、
（ａ）式Ｒ１−Ｃ−Ｒ２のアミノ酸配列、
ここで、
Ｒ１は２から１１個の残基を含み、この残基は配列Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）における残基と同一または同族であり、この残基はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３の残基と同一の順序でＲ１を含み、
Ｃは金属イオン錯結合のためのＮおよびＳを両方提供する残基またはその擬制体であり、
Ｒ２は０から９個の残基を含み、この残基はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３における残基と同一または同族であり、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３における隣接する二つの残基に対応する隣接する二つの残基の間に挿入されるかまたはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３における１個の残基に対応する１個の残基を置換するＣを伴ってＲ１と共にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３におけると同一順序の配列を形成し；および
（ｂ）式Ｒ１−Ｃ−Ｒ２のアミノ酸配列に錯結合した金属イオン；
を含むライブラリー。
【請求項１９９】
アルツハイマー疾患の治療用アミロイドベータ蛋白質関連ペプチドのライブラリーであって、ライブラリーの各構成メンバーは、
（ａ）式Ｒ１−Ｃ−Ｒ２のアミノ酸配列、
ここで、
Ｒ１は２から５個の残基を含み、この残基は配列Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）における残基と同一または同族であり、この残基はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４の残基と同一の順序でＲ１を含み、
Ｃは金属イオン錯結合のためのＮおよびＳを両方提供する残基またはその擬制体であり、
Ｒ２は０から３個の残基を含み、この残基はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４における残基と同一または同族であり、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４における隣接する二つの残基に対応する隣接する二つの残基の間に挿入されるかまたはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４における１個の残基に対応する１個の残基を置換するＣを伴ってＲ１と共にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４におけると同一順序の配列を形成し；および
（ｂ）式Ｒ１−Ｃ−Ｒ２のアミノ酸配列に錯結合した金属イオン；、
を含むライブラリー。
【請求項２００】
アルツハイマー疾患の治療用アミロイドベータ蛋白質関連ペプチドのライブラリーであって、ライブラリーの各構成メンバーは、
（ａ）式Ｒ１−Ｃ−Ｒ２のアミノ酸配列、
ここで、
Ｒ１は２から５個の残基をみ、この残基は配列Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）における残基と同一または同族であり、この残基はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５の残基と同一の順序でＲ１を含み、
Ｃは金属イオン錯結合のためのＮおよびＳを両方提供する残基またはその擬制体であり、
Ｒ２は０から３個の残基を含み、この残基はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５における残基と同一または同族であり、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５における隣接する二つの残基に対応する隣接する二つの残基の間に挿入されるかまたはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５における１個の残基に対応する１個の残基を置換するＣを伴ってＲ１と共にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５におけると同一順序の配列を形成し；および
（ｂ）式Ｒ１−Ｃ−Ｒ２のアミノ酸配列に錯結合した金属イオン；
を含むライブラリー。
【請求項２０１】
プリオン疾患の治療用ペプチドのライブラリーであって、ライブラリーの各構成メンバーは、
（ａ）式Ｒ１−Ｃ−Ｒ２のアミノ酸配列、
ここで、
Ｒ１は２から１３個の残基を含み、この残基は配列Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６）における残基と同一または同族であり、この残基はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６６の残基と同一の順序でＲ１を含み、
Ｃは金属イオン錯結合のためのＮおよびＳを両方提供する残基またはその擬制体であり、
Ｒ２は０から１１個の残基を含み、この残基はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６６における残基と同一または同族であり、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６６における隣接する二つの残基に対応する隣接する二つの残基の間に挿入されるかまたはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６６における１個の残基に対応する１個の残基を置換するＣを伴ってＲ１と共にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６６におけると同一順序の配列を形成し；および
（ｂ）式Ｒ１−Ｃ−Ｒ２のアミノ酸配列に錯結合した金属イオン；
を含むライブラリー。
【請求項２０２】
バソプレシン受容体を標的するペプチドのライブラリーであって、ライブラリーの各構成メンバーは、
（ａ）式Ｒ１−Ｃ−Ｒ２のアミノ酸配列、
ここで、
Ｒ１は２から８個の残基を含み、この残基は配列ｄ（ＣＨ２）５−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｄａｐ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｏｒｎにおける残基と同一または同族であり、この残基はｄ（ＣＨ２）５−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｄａｐ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｏｒｎの残基と同一の順序でＲ１を含み、
Ｃは金属イオン錯結合のためのＮおよびＳを両方提供する残基またはその擬制体であり、
Ｒ２は０から６個の残基を含み、この残基はｄ（ＣＨ２）５−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｄａｐ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｏｒｎにおける残基と同一または同族であり、かつｄ（ＣＨ２）５−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｄａｐ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｏｒｎにおける隣接する二つの残基に対応する隣接する二つの残基の間に挿入されるかまたはｄ（ＣＨ２）５−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｄａｐ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｏｒｎにおける１個の残基に対応する１個の残基を置換するＣを伴ってＲ１と共にｄ（ＣＨ２）５−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｄａｐ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｏｒｎにおけると同一順序の配列を形成し；および
（ｂ）式Ｒ１−Ｃ−Ｒ２のアミノ酸配列に錯結合した金属イオン；
を含むライブラリー。
【請求項２０３】
ライブラリーの構成メンバーＣａｃａ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｄａｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｏｒｎ−Ｃｙｓ−ＮＨ２， Ｃａｃａ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｄａｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｏｒｎ−ＮＨ２， Ｃａｃａ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｄａｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｏｒｎ−ＮＨ２， Ｃａｃａ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｄａｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｏｒｎ−ＮＨ２， Ｃａｃａ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｄａｐ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｏｒｎ−ＮＨ２， Ｃａｃａ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｄａｐ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｏｒｎ−ＮＨ２， Ｃａｃａ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｄａｐ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｏｒｎ−ＮＨ２， Ｐｍｐ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｄａｐ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｏｒｎ−ＮＨ２， Ｃｈｇ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｄａｐ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｏｒｎ−ＮＨ２または Ｄ−Ｃｈｇ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｄａｐ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｏｒｎ−ＮＨ２を含む請求項２０２のライブラリー。
【請求項２０４】
オキシトシン受容体を標的するペプチドのライブラリーであって、ライブラリーの各構成メンバーは、
（ａ）式Ｒ１−Ｃ−Ｒ２のアミノ酸配列、
ここで、
Ｒ１は２から９個の残基を含み、この残基は配列Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４８）における残基と同一または同族であり、この残基はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４２の残基と同一の順序でＲ１を含み、
Ｃは金属イオン錯結合のためのＮおよびＳを両方提供する残基またはその擬制体であり、
Ｒ２は０から７個の残基を含み、この残基はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４２における残基と同一または同族であり、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４２における隣接する二つの残基に対応する隣接する二つの残基の間に挿入されるかまたはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４２における１個の残基に対応する１個の残基を置換するＣを伴ってＲ１と共にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４２におけると同一順序の配列を形成し；および
（ｂ）式Ｒ１−Ｃ−Ｒ２のアミノ酸配列に錯結合した金属イオン；
を含むライブラリー。
【請求項２０５】
ライブラリーの構成メンバーＡｌａ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＮＨ２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４９）、Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＮＨ２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５０）、Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−ＮＨ２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５１）、Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５２）、Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５３）、Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５４）、Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５５）、Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５６）、Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５７）またはＡｌａ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５８）を包む請求項２０４のライブラリー。
【請求項２０６】
アンギオテンシン受容体を標的するペプチドのライブラリーであって、ライブラリーの各構成メンバーは、
（ａ）式Ｒ１−Ｃ−Ｒ２のアミノ酸配列、
ここで、
Ｒ１は２から８個の残基を含み、この残基は配列Ｓａｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５９）における残基と同一または同族であり、この残基はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５９の残基と同一の順序でＲ１を含み、
Ｃは金属イオン錯結合のためのＮおよびＳを両方提供する残基またはその擬制体であり、
Ｒ２は０から６個の残基を含み、この残基はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５９における残基と同一または同族であり、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５９における隣接する二つの残基に対応する隣接する二つの残基の間に挿入されるかまたはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５９における１個の残基に対応する１個の残基を置換するＣを伴ってＲ１と共にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５９におけると同一順序の配列を形成し；および
（ｂ）式Ｒ１−Ｃ−Ｒ２のアミノ酸配列に錯結合した金属イオン；
を含むライブラリー。
【請求項２０７】
ライブラリーの構成メンバーＳａｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６０）、Ｓａｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６１）、Ｓａｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６２）、Ｓａｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６３）、Ｓａｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６４）、Ｓａｒ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６５）またはＳａｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６６）を含む請求項２０６のライブラリー。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ペプチドおよび蛋白質の標的特異的折りたたみ部位の識別および決定の方法；ペプチドおよび蛋白質において、問題とする受容体または標的に結合しあるいは生化学的活性を招来する部分の特異的な配列および局所的な三次元構造の決定方法；問題とする受容体または標的のファルマコフォアの決定方法；およびペプチドおよび蛋白質における標的特異的折りたたみ部位を識別および決定するように、および問題とする受容体または標的のファルマコフォアを識別および決定するように指向されたライブラリーに関する。
【０００２】
関連出願の引用
本出願は、米国仮特許出願番号６０／２５６，８４２、発明の名称「ペプチドにおける標的特異的折りたたみ部位の反復デコンボリューション」出願日２０００年１２月１９日；米国仮特許出願番号６０／３０４，８３５、発明の名称「アルツハイマー症およびプリオン症の治療のためのメタロペプチド」出願日２００１年２月１３日；および米国仮特許出願番号６０／３２７，８３５、発明の名称「ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体に特異的なメタロペプチド」出願日２００１年１０月４日の優先権利益を請求しており、また、引用により上記各出願の明細書をここに取り込む。
【０００３】
【従来技術】
留意すべきこととして、以下の説明では本発明者らの多数の公開文献および公開年度が引用されるが、中に、公開日がごく最近であるために本発明に対する従来技術と考えてはならない公開文献がある。このような公開文献を本明細書で取り上げているのは技術背景を一層完全に提示するためであって、この公開文献は特許性判断のための従来技術として容認されるとは解釈すべきでない。
【０００４】
「ペプチドおよび蛋白質の折りたたみ」
ペプチドと蛋白質の生物学的な関連構造は、官能基による三次元構造として特徴化することができるが、これの決定は生物学、生化学、薬理学における困難な課題である。任意の各種の方法を使用して、関連するペプチドまたは蛋白質の一次構造は確認できると思われる。すなわち、ペプチドまたは蛋白質を構成するアミノ酸残基の配列は知られており、そのペプチドまたは蛋白質が望ましい生物学的効果、例えば問題の標的分子や受容体と結合するとか、生物学的な活性を招来するとかが判る。しかし、そのペプチドまたは蛋白質においてリガンドを形成し望ましい生物学的効果を招来する部分の三次元構造と配列は判っていない。
【０００５】
ペプチドおよび蛋白質は非常に柔軟性がある。その理由の大部分は個々のアミノ酸残基のアミノ基とカルボン酸基の結合の回転自由度が高いためである。更に、個々のアミノ酸残基では側鎖の結合にも回転自由度を有するものがある。アミノ酸残基間の結合にまで至らない立体的相互作用により、ペプチドまたは蛋白質はその自由度に応じて自由エネルギーが最小となる安定な配置をとる。ペプチドおよび蛋白質では「二次構造」としても知られる局所構造を普通にとる。これらの構造には、α−ヘリックス、β−ベンド、シート、延長鎖、ループ等があり、ペプチドおよび蛋白質の結合または受容体特異性に最も頻繁に寄与する。
【０００６】
α−ヘリックスにはいくつかのタイプが知られており、それらは実際に曲折しているアミノ酸残基内の捩じれ角度および分子内および分子間水素結合のパターンが異なっている。また、多数の異なるβ−ベンドが知られており、それらは二面角の捩じれ角度ψ（Ｃα−Ｃ結合）またはφ（Ｃα−Ｎ結合）またはその両方が異なっている。
【０００７】
蛋白質の二次構造およびペプチドの二次および三次構造を予測するための数学的、コンピュータ的等各種のモデルが開発されているが、どのモデルも極めて限定的な条件下でしか満足な応答が得られない。それらは、例えば、ソフトウエアによるモデル化プログラム（例えば、トリポス社、ファルマコペイア社等が配布しているもの）は、各種のアルゴリズム、統計ツール、グループ間の仮想関係を根拠にしているが、与えられたペプチドまたは蛋白質に対し恐らくどれもあるいは全部有効ではない。従来技術には多数の方法が記載されている。例えば、キセノコア社の国際公開番号ＷＯ ００／２３５６４、ストラクチュラル・バイオインフォーマチックス社の国際公開番号ＷＯ ００／５７３０９および０１／３５３１６、ストラクチュラル・バイオインフォーマチックス・アドバンスドテクノロジースＡ／Ｓの国際公開番号ＷＯ ０１／５０３５５、キセノコア社に帰属する国際公開番号ＷＯ ０１／５９０６６、Ｐａｒｅｋｈらの米国特許番号６，２７８，７９４およびＦｒｅｉｒｅとＬｕｑｕｅに帰属する米国特許出願番号２００１／００００８０７に開示されている方法である。
【０００８】
従来技術では、Ｘ線結晶解析やＮＭＲのような実験方法を利用し、任意に例えば類似モデルのような蛋白質構造決定法を加味した、構造を基礎にしたファルマコフォアの誕生が知られている。しかし、このアプローチを採用するためには、ファルマコフォアを決定する受容体に特異的な立体配置に係わるリガンドから適切なデータが入手可能でなければならない。大部分ではないにせよ、多くの場合にこれは実行不可能である。
【０００９】
約５残基ないし約５０残基以上の長さであれば、ある特定のペプチドまたは蛋白質の配列が特定の受容体に結合すると決めてもよい。しかし、実際に結合に参加する特定の残基およびこれら残基を含有する局部の二次構造配列は知られていない。これが判っていないと体系的合理的アプローチを工夫してペプチドベースの薬物、ペプチド擬制薬物、あるいは小分子薬物を造ることはできない。この特定の残基および局部の二次構造が判れば、受容体のファルマコフォアを特定することができる。この特定には、例えば三次元構造における水素結合のドナーとアクセプター、正および負の電荷中心、芳香環中心、疎水性中心等の位置を提示すること、好ましくはそのファルマコフォアにおける原子間距離をもってこれを記述することが含まれる。
【００１０】
Ｗｅｌｌｓらの米国特許番号５，８３４，２５０では、ポリペプチドの構造と機能を体系的に分析する方法が提供されており、特に親ポリペプチドの活性領域と思われる領域内のアミノ酸残基の一つを「走査用アミノ酸」に置換して活性領域を識別している。この残基置換ポリペプチドを次に「標的物質」を使用してアッセイする。実際には、ポリペプチドの各種残基をアラニン等の「走査用アミノ酸」に置換し、置換ポリペプチドと親ポリペプチドの標的物質への結合を対比する。しかし、この方法では、活性領域の二次構造に関する直接の情報が得られないし、標的物質のファルマコフォアに関する情報も得られない。ＥｖａｎｓとＫｉｎｉの米国特許番号６，０８４，０６６にも同様に、「立体構造拘束性部分」が「相互作用部位」の側面に存在している天然由来ポリペプチドの同族体、類縁体が開示されている。しかし、この方法ではその「相互作用部位」ないしそのアミノ酸配列が判っていなければならない。「相互作用部位」配列の両端には側面としてプロリン残基があり、これが相互作用部位を安定化すると言われている。この方法でも「相互作用部位」の二次構造に関する直接の情報が得られないし、標的物質のファルマコフォアに関する情報も得られない。
【００１１】
したがって、問題とする受容体への結合に関与するペプチドの特定残基を識別し、かつ結合に関与する残基群の特定二次構造を識別する方法を開発する必要が極めて大きい。
【００１２】
「メタロペプチド」
直鎖ペプチドは回転自由度が高いので、たとえ一次構造が既知の小さなペプチドでもその理論的に可能な二次および三次構造の数は数百万個に及ぶであろうと判っている。一般に環状ペプチドはもっと拘束を受けているので、少なくとも小さな環状ペプチドでは、理論的に可能な二次および三次構造は遙かに少なくなる。しかし、環状ペプチドでさえ、そのペプチドに存在する実際の二次構造を精密に予測することはしばしば不可能である。これらとは対照的に、メタロペプチドは、金属イオン錯結合に関与する残基によって金属イオンの周囲に屈折構造を形成する、明確かつ限定された二次構造を持つ。金属イオンの配位球面の一部を形成する原子は、金属イオンの配位幾何構造によって固定される。この構造が残基間ペプチド結合および側鎖結合と重なり合うと、少なくとも金属イオン錯結合に関与した残基に関して、立体構造的に固定しかつ予測可能な二次構造が誕生する。米国特許番号５，８９１，４１８、名称「ペプチド−金属イオンの薬物構造体と応用」、米国特許番号６，０２７，７１１、名称「構造決定された金属構造体と応用」、および国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９９／２９７４３、名称「メタロペプチドのコンビナトリアル・ライブラリーと応用」はそれぞれ、メタロペプチドとその擬制体の製造と利用を教示しており、それぞれを引用により本明細書に取り込む。これらの特許および出願には、受容体特異的メタロペプチドおよびペプチドを製造しおよびペプチドを各種金属イオンに錯化する方法が開示されている。
【００１３】
金属への配位特性によりペプチドをスクリーニングする方法があり、例えばインペリアル・アンド・ウオークアップの米国特許番号６，０８３，７５８に開示されている。しかし、これらの方法では蛍光をモニターして金属配位を探知しているので、金属が配位したペプチドが問題とする受容体または標的に結合することに関する情報がなにも得られない。
【００１４】
【発明が解決する課題及び課題を解決するための手段】
発明の概要（発明の開示）
本発明の一態様によれば、問題とする標的に結合する既知の親ポリペプチド内に存在し、問題とする標的に結合する二次構造を決定する方法が提供される。親ポリペプチドはペプチドでも、ポリペプチドでも、蛋白質でもよい。この方法には、（ａ）既知の一次構造をもって問題とする標的に結合し、その一次構造がｎ個の残基からなる既知の親ポリペプチドの提供；（ｂ）式Ｒ１−Ｃ−Ｒ２の第一のペプチドの構築；（ｃ）式Ｒ１−Ｃ−Ｒ２のこの第一のペプチドを金属イオンに錯結合させ、それによる第一のＲ１−Ｃ−Ｒ２メタロペプチドの形成；（ｄ）この第一のＲ１−Ｃ−Ｒ２メタロペプチドの、問題とする標的への結合についてのスクリーニング；（ｅ）必要に応じステップ（ｂ）から（ｄ）を繰返すが、ここで得られるＲ１−Ｃ−Ｒ２メタロペプチドは少なくともＲ１かＲ２において他と異なる；および（ｆ）問題とする標的への結合を示すＲ１−Ｃ−Ｒ２メタロペプチドの選定、ここでこのＲ１−Ｃ−Ｒ２メタロペプチドは、問題とする標的に結合する二次構造を含む、ステップが含まれる。Ｒ１−Ｃ−Ｒ２において、Ｒ１は２からｎ個の残基を含み、これら残基は親ポリペプチドの残基と同一または同族であり、また親ポリペプチドの一次構造の残基と順序が同一である。Ｃは金属イオン錯結合のためのＮおよびＳを提供する残基またはその擬制体である。Ｒ２は０ないしｎ−２個の残基を含み、それらの残基は親ポリペプチドの残基と同一または同族であり、また親ポリペプチドの一次構造の残基と順序が同一である。Ｒ１とＲ２は一体となって親ポリペプチドの一次構造におけると同一の順序の配列を形成し、Ｃは一次構造の隣接する二つの残基に対応する二つの隣接残基の間に挿入されるか、または一次構造の１個の残基に対応する１個の残基を置換している。ＣはＬ−またはＤ−３−メルカプトアミノ酸であってよく、Ｌ−またはＤ−システイン、Ｌ−またはＤ−ペニシラミン、３−メルカプトフェニルアラニン、もしくはこれらのいずれかの同族体が含まれる。好ましい実施例ではｎは少なくとも３である。
【００１５】
Ｒ１とＲ２全体に含まれる残基の数は、ｎ未満、ｎに等しい、またはｎを超えることが可能である。ｎが少なくとも１５のポリペプチドでは、この方法に、一次構造を少なくとも３個の分断された一次構造に分断し、各分断一次構造が各隣接の分断一次構造の一次構造に少なくとも二つの残基により重なり、次にステップ（ｂ）から（ｆ）をこの各分断一次構造に関して行う、というステップを更に含ませることができる。式Ｒ１−Ｃ−Ｒ２のペプチドはＮ末端に遊離アミノ基またはアセチル基を含むことができ、またそれとは別にＣ末端に遊離カルボン酸塩またはアミド基を含むことができる。
【００１６】
本発明の本および他の方法と構造において、金属イオンはＶ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｇａ、Ａｓ、Ｓｅ、Ｙ、Ｍｏ、Ｔｃ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｃｄ、Ｉｎ、Ｓｎ、Ｗ、Ｒｅ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ａｕ、Ｈｇ、Ｔｌ、Ｐｂ、Ｂｉ、Ｐｏ、Ａｔ、Ｓｍ、Ｅｕ、またはＧｄのイオンであってよい。得られるＲ１−Ｃ−Ｒ２メタロペプチド、および本発明の他のメタロペプチドは、溶液中で安定である。ある金属イオンでは、Ｒ１−Ｃ−Ｒ２メタロペプチド、および本発明の他のメタロペプチドは、溶液中にない場合は安定な固体を形成する。Ｒｅは特に好ましいイオンであり、溶液中にない場合は安定な固体メタルペプチドを形成する。
【００１７】
本方法および本発明の他の方法において問題とする標的は、受容体、抗体、毒素、酵素、ホルモン、核酸、生物的な関連を有する細胞内蛋白質領域、または生物的な関連を有する細胞外蛋白質領域であってよい。
【００１８】
問題とする標的への結合のスクリーニング方法は、どのような方法を採用してもよい。一つの実施例での結合スクリーニング方法には、例えば競合阻害アッセイのように、問題とする標的に結合する既知の結合パートナーをＲ１−Ｃ−Ｒ２メタロペプチドと競合させることが含まれる。このようなアッセイでは、既知の結合パートナーとして親ポリペプチドを利用してよい。あるいは、親ポリペプチドから誘導したペプチドであって、問題とする標的に結合する誘導ペプチドを利用してよい。問題とする標的への結合をスクリーニングする方法には、機能アッセイも含まれる。問題とする標的が信号を伝達できる生物学的受容体である場合には、一実施例では、スクリーニング方法として、Ｒ１−Ｃ−Ｒ２メタロペプチドがその信号の伝達を誘起するか否か、したがってアゴニストであるか否かを決定することが含まれる。関連する実施例でのスクリーニング方法では、問題とする標的への結合パートナーが信号の伝達を誘起することが既に判っている場合に、その結合パートナーの存在下でＲ１−Ｃ−Ｒ２メタロペプチドがその信号の伝達を阻害するか否か、したがってアンタゴニストであるか否かを決定することが含まれている。
【００１９】
この方法でＲ１とＲ２はそれぞれ親ポリペプチドでの残基と同一でかつ親ポリペプチドの一次構造での残基と同一の順序にある残基を含有することができる。別の実施例では一以上の残基を同族体で置換している。すなわち、Ｒ１またはＲ２中の任意のシステイン残基を、遊離スルフヒドリル基を含まない同族体で置換することができる。システインを置換できる適切な同族体には、グリシン、アラニン、セリン、アミノイソ酪酸またはデヒドロアラニンの残基が挙げられる。あるいは、システインをＳ保護システインで置換することによって、システインの硫黄原子が金属イオンと錯体を形成しないようにすることができる。一般にシステインは分子量約１５０未満のアミノ酸残基の中性擬制体で置換することができる。Ｃのアミノ末端側に直接隣接する二つの残基中の任意のプロリン残基を置換するのが好ましく、グリシン、アラニン、セリン、アミノイソ酪酸またはデヒドロアラニンの残基で置換してよい。一般に、任意のプロリン残基は金属イオン錯結合のためのＮを提供する、分子量約１５０未満のアミノ酸の中性擬制体で置換することができる。
【００２０】
式Ｒ１−Ｃ−Ｒ２のペプチドはペプチド合成の化学的方法で構築するのが好ましい。その方法には固相合成と溶液相合成がある。有利な一実施例では、Ｃの中にペプチド合成の化学的方法に適応する直交性Ｓ−保護基を含有させることができ、この直交性Ｓ−保護基は金属イオン錯結合の時点でまたは前に離脱可能という特徴がある。また別の実施例では、式Ｒ１−Ｃ−Ｒ２のペプチドを生物系での発現により構築し、その実施例の方法では組換えベクトルの使用が含まれる。
【００２１】
本発明の他の一態様によれば、問題とする標的に結合する既知の親ポリペプチド内において問題とするその標的に結合する二次構造を決定する、関連するしかし異なる方法が提供される。この方法では、問題とするｎ個のアミノ酸残基を含む標的に結合する既知の一次構造を有する親ポリペプチドが提供され、ｎは少なくとも３である。次に少なくとも一つの構造体を造るが、この構造体には少なくとも三つの要素部がある。一つの要素部は、α−アミノ基を有するＮ１Ｓ１要素部であり、金属イオンへの錯結合のためにＮとＳを両方提供する。残りの少なくとも二つの要素部は、いずれも、α−アミノ基とα−カルボキシル基を含み、金属イオンへの錯結合のためにＮを提供する。これら少なくとも二つの要素部は、親ポリペプチドの残基と同一または同族であり、また一次構造が既知の親ポリペプチドの残基と順序が同一である。この少なくとも三つの要素部をペプチド結合で接合し、Ｎ１Ｓ１要素部が少なくとも二つの要素部のカルボキシル末端に存在するような順序にてＮ１Ｓ１要素部含有構造体を形成する。次に得られたＮ１Ｓ１要素部含有構造体を金属イオンに錯結合させて金属構造体を形成する。この金属構造体を問題とする標的への結合についてスクリーニングする。必要なだけ以上のステップを繰り返し、各場合に残りの少なくとも二つの要素部には既知一次構造の親ポリペプチドにおける少なくとも一つの別の残基が含有されるようにする。次に問題とする標的に最高の結合性を示す金属構造体を選択する。この方法でＮ１Ｓ１要素部は、随意に、この構造体のカルボキシル末端要素部となることができる。一つの実施例では、Ｎ１Ｓ１要素部含有構造体に少なくとも四つの要素部が含まれ、この四つの要素部はα−アミノ基を有するＮ１Ｓ１要素部、およびα−アミノ基とα−カルボキシル基を含有する残りの少なくとも三つの要素部からなり、残りの少なくとも三つの要素部は、既知一次構造の親ポリペプチドの残基と同一または同族であり、また順序が同一である。この実施例で、Ｎ１Ｓ１要素部は少なくとも三つの要素部のいずれか二つのカルボキシル末端に存在し、この少なくとも四つの要素部はペプチド結合で連結される。この方法の更に別の実施例では、少なくとも二つの要素部がアミノ酸残基であり、そのアミノ酸残基は随意にアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、メチオニン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン、またはチロシンである。アミノ酸残基はＬ−アミノ酸残基、Ｄ−アミノ酸残基、Ｌ−アミノ酸残基とＤ−アミノ酸残基の組合せ、または任意の修飾された蛋白質のアミノ酸残基、非蛋白質のアミノ酸残基、非蛋白質のアミノ酸残基の擬制体、蛋白質のアミノ酸残基の擬制体、翻訳修飾後のアミノ酸残基、または酵素的修飾したアミノ酸残基であってよい。この方法での構造体の要素部数は、ｎ未満、ｎ、またはｎ＋１以上であってよい。
【００２２】
本発明の他の態様によれば、問題とする標的に結合するメタロペプチドを決定する方法が提供される。この方法では、ｎが少なくとも３であるｎ個の残基からなる既知一次構造を有する既知アミノ酸配列であって、問題とする標的に結合するものが選定される。次に、この既知一次構造中の一続きの連続残基から少なくとも二つの連続残基を選択し、この少なくとも二つの選択連続残基の中で二つの残基のカルボキシル末端に金属イオン錯結合のためのＮとＳを両方提供する残基を挿入してアミノ酸配列ライブラリーを設計する。このように設計した各配列はライブラリーのメンバーを構成する。ライブラリーの各メンバーは、少なくとも一つの残基または金属イオン錯結合のためのＮとＳを両方提供する残基の挿入位置によって互いに異なる。次に、いずれかのペプチド合成法を使用して設計したアミノ酸配列からなるライブラリーを構築する。設計したアミノ酸配列の各ライブラリーメンバーを金属イオンに錯結合させ、メタロペプチドのライブラリーを形成する。次にメタロペプチドライブラリーの各メンバーを、問題とする標的への結合性についてスクリーニングし、問題とする標的への結合性を示すメタロペプチドを選択する。関連する実施例では、選択した少なくとも二つの連続残基の少なくとも一つの残基は、既知一次構造における一続きの連続残基の対応する残基の同族体となる。
【００２３】
本発明の別な態様によれば、問題とする標的に結合するメタロペプチドを決定する別方法が提供される。この方法では、ｎが少なくとも４であるｎ個の残基からなる既知一次構造を有する既知アミノ酸配列であって、問題とする標的に結合するものが選択される。次に、この既知一次構造中の一続きの連続残基から少なくとも三つの連続残基を選択し、この少なくとも三つの選択連続残基の中の三つの連続残基のカルボキシル末端残基を金属イオン錯結合のためのＮとＳを両方提供する残基で置換してアミノ酸配列ライブラリーを設計する。もし選択されたそれら少なくとも三つの連続残基が三つ以上の残基であれば、金属イオン錯結合のためのＮとＳの両方を提供する残基は、その残基がその残基がどの三つの連続残基中でもカルボキシル末端残基と置換されているかぎり、得られるアミノ酸配列のカルボキシル末端残基である必要はない。それぞれの配列は一つのライブラリーメンバーを構成する。それぞれのライブラリーのメンバーは、一つのライブラリーメンバーからの少なくとも一つの残基によって異なる。続いてライブラリーは構築され、ライブラリーメンバーは金属イオンに錯結合され、メタロペプチドのライブラリーを形成する。続いてライブラリーのそれぞれのメンバーを問題とする標的への結合性につてスクリーニングし、問題とする標的への結合性を示すメタロペプチドを選択する。関連する実施例では、選択した少なくとも二つの連続残基の少なくとも一つの残基は、既知一次構造における一続きの連続残基の対応する残基の同族体となる。
【００２４】
本発明の更に他の態様によれば、問題とする標的に標的特異的に結合するファルマコフォアを決定する方法が提供される。この方法では、問題とする標的に結合するメタロペプチドを前記のいずれかの方法で選択する。選択したメタロペプチドを使用し、金属イオンの配位幾何構造に基づく分子模型を組み立てることにより、金属イオンの配位部位におけるおよび直接隣接するアミノ酸側鎖の空間的位置が決定される。このようにして問題とする標的に標的特異的に結合するファルマコフォアが特定される。更にこの方法には、随意に、金属イオンに錯結合した一以上のアミノ酸残基または金属イオンに錯結合したアミノ酸残基に隣接するアミノ酸残基のキラル性を変更することによって、選択したメタロペプチドの問題とする標的への結合性を最適化することが含まれ得る。またこの方法には、随意に、金属イオンに錯結合した少なくとも一つのアミノ酸残基または金属イオンに錯結合したアミノ酸残基に隣接する少なくとも一つのアミノ酸残基を天然または合成の同族アミノ酸残基で置換することによって、選択したメタロペプチドの問題とする標的への結合性を最適化することが更に含まれ得る。このような最適化の後、この最適化メタロペプチドにより問題とする標的への結合性が向上した場合には、この最適化メタロペプチドを利用してその金属イオンの配位幾何構造に基づく分子模型を組み立てる。この方法ではコンピュータベースのモデル化を採用して分子模型を組み立てることができる。この分子模型、したがってファルマコフォアには、三次元構造における水素結合のドナーとアクセプター、正および負の電荷中心、芳香環中心、疎水性中心等の位置が含まれていてよい。好ましい実施例では、得られたファルマコフォアがそのファルマコフォア中での原子の空間的位置およびそのファルマコフォア中での原子間距離をもって記述されている。
【００２５】
本発明の更に他の実施例によれば、問題とする標的に標的特異的に結合するファルマコフォアが提供される。このファルマコフォアはメタロペプチドによって特定されるが、そのメタロペプチドは問題とする標的に結合するように選択される。このメタロペプチドには、金属イオン錯結合のためのＮとＳを両方提供する残基および、この残基のアミノ末端側にペプチド結合によって連結している少なくとも二つの連続残基が含有されているが、この少なくとも二つの連続残基は、問題とする標的に結合するアミノ酸残基の配列既知の一次構造における同数の連続残基と同一または同族である。金属イオンはこれらの残基と錯結合する。金属イオン錯結合のためのＮとＳを両方提供する残基のアミノ末端側に直接隣接する二つの残基中のいずれのプロリン残基も、金属イオン錯結合のためのＮを提供する残基で置換される。遊離スルフヒドリル基を有し、金属イオン錯結合のためのＮとＳを両方提供する残基以外のいずれの残基も、遊離スルフヒドリル基を有さない同族体で置換される。したがって、かくのごとく提供されたファルマコフォアは、金属イオンの配位幾何構造に基づく分子模型を使用する等して、金属イオン配位部位におけるおよび直接隣接するアミノ酸側鎖の空間的位置によって更に特定してもよい。
【００２６】
本発明の更に他の実施例によれば、問題とする標的に照準を合わせたメタロペプチドのライブラリーが提供される。ライブラリーの各構成メンバーには、前に定義した式Ｒ１−Ｃ−Ｒ２のアミノ酸配列が含まれており、金属イオンが各ライブラリーメンバーに錯結合している。本明細書の実施例で提示される代表的なライブラリーには、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体、メタノコルチン受容体、バソプレシン受容体、オキシトシン受容体またはアンギオテンシン受容体に照準を合わせたメタロペプチドのライブラリー、あるいはアルツハイマー症治療用アミロイドベータ蛋白質関連ペプチドまたはプリオン治療用ペプチドを構成するライブラリーが挙げられる。
【００２７】
本発明の第一の目的は、天然起源の構造モチーフ、例えば天然起源のペプチドおよび蛋白質に通常見られるモチーフで、例えば逆ターン構造、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ型ベータターン、ガンマターン、逆ガンマターン、およびショートヘリカル、シート、および延長鎖構造等に対する代用としての、立体配置的に拘束を受けたメタロペプチドの提供である。二次の構造モチーフは立体配置的に拘束を受けたメタロペプチドによって必然的に特定され、これの二次構造は天然起源の構造的モチーフに見られるトポロジーを模倣し、または模倣するようにすることができる。メタロペプチドにおいて金属イオン錯結合の結果として形成される二次の構造モチーフは、一般に弱い相互作用、例えばファンデルワールスの相互作用および水素結合のみによって安定化されている天然起源の二次構造モチーフよりも安定である。
【００２８】
本発明の他の目的は、金属イオンがＮ１Ｓ１残基を含むアミノ酸配列に錯結合することによって形成される屈曲背骨構造の提供であり、この構造により蛋白質の古典的なターン構造に位相的にほぼ類似した二次の構造モチーフが形成される。金属イオンによって誘起されるターンに関連するアミノ酸側鎖を、これが古典的なターン構造での対応する側鎖と同じ化学的空間を占めるように地形的に配置できる。
【００２９】
本発明の他の目的は、問題とする標的または受容体に結合性を示す既知アミノ酸配列に基づくメタロペプチドのライブラリーの提供であり、ここでこのペプチドには金属イオンと錯結合する領域が存在し、金属錯結合の結果、二次構造モチーフを与える特異的な立体配置構造が得られる。
【００３０】
本発明の他の目的は、メタロペプチド配列の提供であり、ここでそのメタロペプチドには金属イオンと錯結合する領域が存在し、金属錯結合の結果特異的な立体配置の二次構造モチーフが得られる。
【００３１】
本発明の他の目的は、メタロペプチド配列の提供であり、ここでそのメタロペプチドには金属イオンと錯結合する領域がその配列内の明確かつ既知の場所に存在し、ここでそのメタロペプチドをある物質に曝露すると一以上のメタロペプチドがその物質への特異性と親和性を呈する可能性がある。
【００３２】
本発明の他の目的は、問題とする既知標的への結合に関与する既知ペプチド内の特異的残基を識別する方法の提供である。
【００３３】
本発明の他の目的は、ペプチドの合成方法の提供であり、ここでこのペプチドには金属イオン錯結合領域の一部を形成する１個の反応性ＳＨ基が含まれ、その反応性ＳＨ基は合成中は保護され、そのペプチドを金属イオンと錯結合する時だけ脱保護される。
【００３４】
本発明の他の目的は、既知親ポリペプチドの活性結合部位に対する模型としてメタロペプチドを製造する方法の提供であり、ここで各内在性システイン残基は置換され、あるいは、各内在性システイン残基がＳ−保護基を更に有し、その結果これら内在性システインが金属イオン錯結合のための領域の一部を形成することはなくなる。
【００３５】
本発明の他の目的は、ペプチドのライブラリーの提供であり、ここでライブラリーを形成する各ペプチドは金属イオンとの錯結合によりメタロペプチドを形成し、二次構造モチーフを含有する。
【００３６】
本発明の他の目的は、問題とする標的分子への特異性と親和性が高いメタロペプチドを含有するライブラリーの提供であり、この高い特異性と親和性は、金属イオン錯結合の結果としての二次構造モチーフを含有するライブラリーを形成する各メタロペプチドに由来する。
【００３７】
本発明の他の目的は、多様なペプチドのプールを、レニウム金属イオン等の金属イオンと迅速にかつ効果的に錯結合させる方法の提供である。
【００３８】
本発明の他の目的、有利かつ新規な特徴、適用の更なる範囲は、一部は添付図面との関連で以下の詳細説明に示され、一部は以下の試験により当業者に明白となり、あるいは発明の実施により判るであろう。本発明の目的と利点は添付のクレームに特別に指摘する手段と組合せによって実現され達成されるであろう。
【００３９】
【発明の実施の形態】
好ましい実施例（発明実施の最良モード）
本明細書およびクレームを通じて使用する用語の定義は以下のごとくである。
【００４０】
本明細書およびクレームを通じて使用する「結合する」「結合性」「標識する」「標識性」「錯結合する」「錯結合性」の語は、物理的および化学的な結合、反応、錯結合、誘引、キレート化等の全ての形式を包含する意味である。
【００４１】
本発明の「ポリペプチド」および「ペプチド」は、（ａ）天然起源、（ｂ）化学合成により生産、（ｃ）組換えＤＮＡ技術により生産、（ｄ）より大きな分子を生化学的または酵素的に断片化して生産、（ｅ）上記ａからｄまでの方法の組合せでの方法により生産、または（ｆ）ポリペプチドまたはペプチドを生産する任意の他の手段により生産、であってよい。
【００４２】
本明細書およびクレームを通して使用する「ポリペプチド」の語は、アミノ酸残基の化学的な修飾体および誘導体を含む、二以上のアミノ酸残基から構成される構造全てを含む意味である。したがって、「ポリペプチド」の語は、２から約２０個のアミノ酸残基を包含する通常の「ペプチド」、約２０から約５０個のアミノ酸残基を有する通常の「ポリペプチド」、および最小約５０個のアミノ酸残基を有する通常の「蛋白質」を含む。多くの場合に、本発明により製造され、メタロペプチドとして利用されるポリペプチドが含むアミノ酸残基は１００未満であり、好ましくは６０未満であり、最も好ましくは約３から２０の範囲である。ポリペプチドの全部または一部を形成するアミノ酸残基は、天然起源アミノ酸残基、そのアミノ酸残基の立体異性体および修飾体、非蛋白質性アミノ酸残基、翻訳後修飾したアミノ酸残基、酵素的に修飾したアミノ酸残基、アミノ酸残基を擬制するように設計された構築体または構造体、等であり、したがって「ポリペプチド」の語は、非ペプチド性背骨を有する構造体を含み、擬ペプチドおよびペプチド擬制体を含む。「製造された」ペプチドまたはポリペプチドには、化学合成、組換えＤＮＡ技術、より大きな分子の生化学的または酵素的断片化、以上の組合せによって製造された、または、一般的に、他の任意の方法で製造されたペプチドまたはポリペプチドが含まれる。
【００４３】
本発明で使用する「アミノ酸残基」、および本明細書およびクレームで使用するこの語には、既知天然起源のコード化された蛋白質のアミノ酸残基が含まれ、これらは常用の三文字標記および一文字標記で言及される。参照Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ， ＧＡ Ｇｒａｎｔ， ｅｄｉｔｏｒ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９２、これの教示を、１１頁から２４頁に記載の文および表を含めて、引用により本明細書に取り込む。また上記のごとく「アミノ酸残基」の語には、天然起源アミノ酸残基の立体異性体および修飾体、非蛋白質性アミノ酸残基、翻訳後修飾したアミノ酸残基、酵素的に合成されたアミノ酸残基、誘導化されたアミノ酸残基、アミノ酸残基を擬制するように設計された構築体または構造体、等が含まれる。修飾された普遍的でないアミノ酸残基は、上記Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ；Ｈｒｕｂｙ ＶＪ，Ａｌ−ｏｂｅｉｄｉ Ｆ ａｎｄ Ｋａｚｍｉｅｒｓｋｉ Ｗ； Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２６８：２４９−２６２，１９９０； およびＴｏｎｉｏｌｏ Ｃ： Ｉｎｔ Ｊ ＰｅｐｔｉｄｅＰｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ ３５：２８７−３００， １９９０、に概略的に記載されており、これら全ての教示を、引用により本明細書に取り込む。単一のアミノ酸残基またはその誘導体は「残基」または「アミノ酸」として本明細書に引用することがある。
【００４４】
本発明の構造体には金属イオンも含まれ、これは任意の金属状元素のイオン状であればよく、金属および半金属を含むがこれらに限定されない。金属イオンは放射活性、常磁性または超常磁性であってよいが、その必須ではない。金属イオンは任意の金属の任意の酸化状態であることも可能であり、例えば、バナジウム（Ｖ）、マンガン（Ｍｎ）、鉄（Ｆｅ）、コバルト（Ｃｏ）、ニッケル（Ｎｉ）、銅（Ｃｕ）、亜鉛（Ｚｎ）、ガリウム（Ｇａ）、砒素（Ａｓ）、セレニウム（Ｓｅ）、イットリウム（Ｙ）、モリブデン（Ｍｏ）、テクネチウム（Ｔｃ）、ルテニウム（Ｒｕ）、ロジウム（Ｒｈ）、パラジウム（Ｐｄ）、銀（Ａｇ）、カドミウム（Ｃｄ）、インジウム（Ｉｎ）、錫（Ｓｎ）、タングステン（Ｗ）、レニウム（Ｒｅ）、オスミウム（Ｏｓ）、イリジウム（Ｉｒ）、白金（Ｐｔ）、金（Ａｕ）、水銀（Ｈｇ）、タリウム（Ｔｌ）、鉛（Ｐｂ）、ビスマス（Ｂｉ）、ポロニウム（Ｐｏ）、アスタチン（Ａｔ）、サマリウム（Ｓｍ）、ユーロピウム（Ｅｕ）、およびガドリニウム（Ｇｄ）の各種酸化状態が挙げられる。また、金属イオンは、Ｉｎ、Ａｕ、Ａｇ、Ｈｇ、Ｔｃ、Ｒｅ、Ｓｎ、Ａｔ、Ｙ、およびＣｕを含み、上記の放射性核種であることも可能である。四座配位子の球面を有する好ましい金属イオンはＲｅである。スクリーニングやアッセイ系で放射性同位元素が望ましい適用例では、アルファ−、ガンマ−またはベータ−放射性核種を採用してもよい。
【００４５】
一つの実施例では、親ポリペプチドを体系的に分析し、親ポリペプチドと標的物質との相互作用、例えば結合に関与する少なくとも一つの活性な配列または領域を親ポリペプチド中に決定する本発明の方法が提供される。本明細書で使用する「親ポリペプチド」とは、標的物質に相互作用、例えば結合、を示すアミノ酸残基の全ての配列を言い、したがって、それがペプチド、ポリペプチドまたは蛋白質を構成していてもよい。本明細書では、親ポリペプチドは一般に約３から約１００個のアミノ酸残基を有するポリペプチドと定義されるが、親ポリペプチドの語には、大きなポリペプチドまたは蛋白質であると当分野では一般に考えられているもっと大きな構造体も含むことができる。本発明の方法を使用するためには、親ポリペプチドの少なくとも一部、好ましくは全部の一次構造、すなわち配列が判っていなければならない。しかし、本発明の方法を実施するためには、親ポリペプチドの二次または三次構造に関するなんらかの情報を持っている必要はない。
【００４６】
親ポリペプチドは、細胞、組織、臓器、または他の生物学材料等に存在する受容体に結合を示す配列であればいずれでもよい。親ポリペプチドの例には、限定なしに、生物学的活性ペプチド、ホルモン、神経伝達体、酵素、抗体等が挙げられる。このような親ポリペプチドは、受容体への結合の結果として信号を直接的または間接的に伝達することができ、したがって親ポリペプチドはアゴニスト、アンタゴニスト、あるいはアゴニスト−アンタゴニスト混合体であってよい。本発明の適切な親ポリペプチドの例には、メラノコルチン受容体特異的ペプチド、ウロキナーゼ型組織プラスミノーゲン活性化因子蛋白質、アミロイドベータ蛋白質関連ペプチド、プリオン症関連ペプチド、バソプレシンペプチド、オキシトシンペプチド、アンギオテンシンペプチド、カルシトニン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、オピオイドペプチド、ヒト成長ホルモン、ヒトプロラクチン受容体リガンド、アルファインターフェロン等の各種インターフェロン、上皮成長因子、腫瘍ネクローシス因子、各種血圧低下性ペプチド、フィブリン溶解性ペプチド、化学走性ペプチド、成長促進ペプチド、マイトージェン、免疫調節剤、等が挙げられる。
【００４７】
一般に、本発明を採用するためには、本発明の構造体が問題とする受容体に結合することを決定する、および好ましくは親ポリペプチドが問題とする受容体に結合することを決定する少なくとも一つのアッセイまたはテスト方法が判っていなくてはならない。本発明の好ましい実施例では、競合阻害法または同様なアッセイを使用しているので、本発明の構造体の結合性または機能活性を親ポリペプチドと直接に対比して、相対的な結合性または機能活性を決定することができる。他の実施例では他のアッセイまたはテスト方法を使用してよい。これらアッセイは機能アッセイであってよいが、必須ではない。アッセイの例には、各種の競合阻害アッセイ、直接結合アッセイ、機能アッセイ等があげられる。例えば、本発明の構造体がアゴニストか、アンタゴニストかまたはアゴニスト−アンタゴニスト混合体かを決定するアッセイを使用すること、および更に結合と機能を別々に測定できる場合には、受容体への親和性と特異性並びに機能活性の両方を別々に測定することが予期される。そのようなアッセイおよびテスト方法の例は当分野では周知であり、資料も十分であり、一般に、どのような親ポリペプチドにも一以上のそのようなアッセイまたはテスト方法が知られている。
【００４８】
本発明の方法では、やがて金属イオンに錯結合する一以上の、好ましくは一連のペプチドを製造するための原型として親ポリペプチドを使用する。製造したペプチドは、必ずではないが一般に親ポリペプチドよりも長さが短い。しかし、一次構造の長さが親ポリペプチドと同じまたは長い製造ペプチドは可能であり、それが予期される。長さにかかわらず、製造ペプチドを金属イオンに錯結合してメタロペプチドを形成する。次にそのメタロペプチドを使用して任意の既知のまたは新しいアッセイまたはテスト方法を実施し、結合または機能、または両方についてメタロペプチドを親ポリペプチドと対比する。
【００４９】
一般に各種通常の金属イオンの配位子球面は四座配位ないし六座配位である。本発明の一実施例では、残基は、ペプチドが金属と錯結合する基を所望の数（多くの場合に４ないし６）だけ含有するように製造ペプチドに含まれる。したがって、金属と錯結合すると、得られるメタロペプチドは金属錯結合があった部位周辺に二次構造のモチーフを形成する。配位子数４、５または６の金属がそれぞれアミノ酸残基と錯結合して四座、五座または六座のリガンドを形成すると、そのリガンドは折りたたまれかつ歪む。リガンドを形成するアミノ酸またはアミノ酸擬制体の配列を、ペプチドまたはペプチド擬制体の金属イオン錯結合領域（「ＭＣＤ」）と定義する。すなわち、ペプチドのように柔軟性の高い分子は折りたたまれ、金属イオンと錯結合した際に二次構造のモチーフを形成する。このようにして得られたモチーフは、立体配置的な意味で歪みの高い構造である。
【００５０】
メタロペプチドの結合領域（「ＢＤ」）は、本明細書およびクレームでは、生物学的に活性な配列を構成し、細胞、組織、臓器、および他の生物学材料等に存在する受容体に結合性を示し、それにより特異的結合対の一員としてのメタロペプチドを構築する二以上のアミノ酸残基の配列である、と定義する。本発明の好ましい実施例では、本発明のメタロペプチドのＢＤは少なくともＭＣＤの一部を含み、必須ではないが、ＭＣＤと同一領域であってもよい。したがって、本発明の好ましい実施例では、ＢＤを構築するアミノ酸残基の配列も、金属イオンと共に二次構造モチーフを構築するアミノ酸残基の配列の全部または一部となっている。また、ＢＤが含有する配列は、連続するアミノ酸残基または擬制体（ｓｙｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ）あるいは非連続のアミノ酸残基または擬制体（ｒｈｅｇｎｙｌｏｇｉｃａｌ）であってよく、その配列によってリガンドが形成され、そのリガンドによってアクセプターないしレセプターとの特異的な相互作用が形成可能となる。「受容体」の語はアクセプターおよびレセプターの両方を包含する意である。受容体は生物学的受容体であってよい。配列またはＢＤは、結合後に、細胞、組織、または他の生物学的受容体関連材料に信号を伝達できるが、これは必須ではない。ＢＤの例には、ホルモン受容体、神経伝達受容体、細胞表面受容体、酵素受容体、および抗体−抗原系に特異的なＢＤが挙げられるが、これらに限定されない。ＢＤはアゴニストでも、アンタゴニストでも、アゴニスト−アンタゴニスト混合体であってもよい。ＢＤには、部位特異的ＲＮＡまたはＤＮＡ結合に対する任意のリガンドが含まれてもよく、例えば転写および他の遺伝子制御用蛋白質の擬制体として使用してもよい配列も挙げられる。またＢＤには、一以上のアミノ酸残基または擬制体の任意の配列、または他の拘束された分子領域であって他のペプチド、酵素、抗体または他の組成物、例えば蛋白性組成物に存在する生物学的受容体への結合を示すものが含有されてもよく、これら自体がもう一つ別の生物学的受容体に結合性を示してもよい。このようなＢＤをもって金属イオンと錯結合したペプチドまたはペプチド擬制体は、「特異的な結合対」の一員を構成していることになるが、この特異的な結合対は少なくとも二つの異なる分子からなり、一方の分子がその表面または空洞に、他方の分子の特定の空間的および極性的組織に特異的に結合する領域を有する。しばしば、特異的な結合対の構成員は、リガンドおよび受容体またはアンチリガンドと言われる。特異的な結合対の例には、抗体−抗原対、ホルモン−受容体対、ペプチド−受容体対、酵素−受容体対、炭水化物−蛋白質対（糖蛋白質）、炭水化物−脂質対（糖脂質）、レクチン−炭水化物対、等がある。
【００５１】
立体配置的な拘束は、そのペプチドや他の構造体が装う三次元形状の安定性および好ましい立体配置に関係する。立体配置的な拘束には、例えば、ペプチドの単一残基の立体配置的な運動性が拘束される局所的拘束；一群の残基の立体配置的な運動性が拘束される領域的拘束、その残基群はなんらかの二次構造的な単位を形成してもよい；および全ペプチド構造に関与する全体的拘束が挙げられる。概略は、上記引用のＳｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅを参照。
【００５２】
ペプチドの一次構造はそれのアミノ酸配列である。二次構造は、そのペプチドの背骨の立体配置、およびそのペプチド部分が規則的な構造、例えばα−ヘリックス、β−ベンド、ターン、延長鎖等に折れ曲がることに関する。例えば、金属に錯結合したアミノ酸配列により想定される局所的な三次元形状によって、ここでは二次構造モチーフと呼ぶ二次構造が形成される。概略は、上記引用のＳｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅの２４−３３、３９−４１、および５８−６７頁に記載の本文、図、表を参照。全体的または三次構造は、立体配置的に拘束された三次元形状を選択するにあたって最も優先されるペプチド構造である。
【００５３】
本明細書に記載の方法で得られる生産物は、医薬用途および動物薬用途の両方に使用できる。生産物は典型的にはヒトに使用するが、他の哺乳動物にも使用してよい。「患者」の語は哺乳動物個体を意味し、本明細書および本クレームを通してその意味で使用されている。本発明の主な適用はヒト患者であるが、研究所、農場、動物園、野生、ペット、スポーツまたは他の動物に適用してもよい。本発明生産物では、随意に放射性核種イオンを利用してもよく、これは診断映像目的または放射治療目的に使用してよい。
【００５４】
本発明の好ましい一実施例では、ペプチド、ポリペプチド、または蛋白質、またはアミノ酸残基またはその擬制体を包含する任意の分子または分子構造の部分であって、問題とする受容体または標的に結合する部分の領域的な二次構造は、以後に提供する方法および構造体によって特定される。関連する好ましい実施例では、問題とする受容体または標的のファルマコフォアであって、これに結合するアミノ酸残基またはその擬制体を含有しているペプチド、ポリペプチド、または蛋白質、または一般に分子または分子構造が判っているファルマコフォアは、以後に提供する方法および構造体によって特定される。
【００５５】
本発明では、メタロペプチドおよびこれに類似の金属構造体、すなわち二以上のアミノ酸残基、好ましくは３個のアミノ酸残基に金属イオンを錯結合して形成した金属構造体の特異な構造と特徴が有利に利用されている。大部分の金属イオン、例えばＲｅ、Ｔｃ、Ｃｕ、Ｎｉ、Ａｕ、Ａｇ、ＳｎおよびＨｇのイオンにとって、利用できる硫黄原子（Ｓ）を含むＭＣＤは錯結合するのに好ましい。すなわち、金属イオンは、そのイオンが錯結合に適切で望ましい酸化状態にある場合に、好ましくは錯結合用のＳがある残基を、最も好ましくは錯結合用のＳと窒素原子（Ｎ）が両方ある残基を含有するトリペプチドＭＣＤ配列に、錯結合用のＳがないトリペプチド配列に優先して錯結合する。
【００５６】
したがって、ｎが少なくとも３である長さｎの全てのアミノ酸配列において、適切かつ望ましい酸化状態にある金属イオンは、ＭＣＤを形成するトリペプチドＸ−Ｘ−Ｃｙｓに優先的に錯結合すると見てよい。ここで各Ｘは独立にＰｒｏまたはＣｙｓ以外の天然アミノ酸残基であり、また更に、唯一長さｎのアミノ酸配列に存在するＣｙｓはＸ−Ｙ−ＣｙｓにおけるＣｙｓと仮定する。すなわち、金属の錯結合反応の動力学は、得られたメタロペプチドに、トリペプチド配列Ｘ−Ｙ−Ｃｙｓから形成されるＮ３Ｓ１リガンドが存在することが、四座配位の金属イオンにとって好ましい。二以上のＣｙｓ残基、またはＮとＳを両方提供するＣｙｓの擬制体または変異体について、得られるメタロペプチド構造を予測することは困難であり、また金属イオンとの錯結合からは多種類のメタロペプチドが生じている可能性がある。例えば、二つのＣｙｓ残基を含む長さｎのアミノ酸配列では、架橋、二量化、重合化、内部のジスルフィド架橋の形成化、等の可能性がある。金属錯結合に対し、配列の一次構造に応じて二つの異なるＭＣＤが存在する可能性があり、その結果、金属イオンが第一のＭＣＤに結合した分子があり、第二のＭＣＤに結合した分子があり、更に両方のＭＣＤに結合した分子があるであろう。したがって、得られたメタロペプチドの構造を予測することはできず、経験的に決めなければならない。同様に、再び配列の一次構造に応じて、配列中の一以上のＭＣＤはＮ３Ｓ１リガンドを、他方少なくとも一つの他のＭＣＤはＮ２Ｓ２リガンドを提供しているという可能性もある。この場合にも、得られるメタロペプチドの構造を予測することはできず、経験的に決めなければならない。
【００５７】
本発明には、ペプチド、ポリペプチド、または蛋白質、または一般的にアミノ酸残基またはその擬制体を含む任意の分子または分子構造の領域であって、問題とする任意の受容体または標的に結合する領域の二次構造を特定する方法が包含されている。これは、Ｃｙｓ残基、または金属イオンの配位球面に錯結合用のＮとＳを両方提供する他の残基、擬制基、または同族基（「Ｎ１Ｓ１残基」）を、その分子に沿った各種位置にて置換または挿入し、金属イオンをそれに錯結合させてメタロペプチドを形成し、そして得られたメタロペプチドを問題とする受容体または標的への結合性についてテストする、ことによって達成される。本発明の一実施例では、親ポリペプチド、例えば問題とする受容体または標的に結合するペプチド、ポリペプチドまたは蛋白質の一次構造が判っている。このような親ポリペプチドは「ｎ」残基と呼ばれる特定数の残基からなる。式Ｒ１−Ｃ−Ｒ２の一連のペプチドが作られるが、ここでＲ１は２からｎ個の残基であり、親ポリペプチドの残基と同一または同族で、順序は親ポリペプチドの順序と同一である。Ｃは任意のＮ１Ｓ１残基であり、例えばＬ−Ｃｙｓ， Ｄ−Ｃｙｓ， Ｌ−Ｐｅｎ， Ｄ−Ｐｅｎ または ３−メルカプトフェニルアラニンであるか、これらに限定されない。Ｒ２は０からｎ−２個の異なる残基であり、順序が親ポリペプチドの順序と同一の既知一次構造の残基と同一または同族である。更にＲ１とＲ２は一緒に少なくとも二つの残基を構築し、一体となって順序が親配列の順序と同一の配列を形成し、ここでのＣは隣接する二つの残基の間に挿入されているかまたは１個の残基を置換している。Ｒ１またはＲ２における任意のＣｙｓは、Ｇｌｙ、ＡｌａまたはＳｅｒ（天然起源のコード化された蛋白質アミノ酸残基の仲間）で、好ましくはＧｌｙまたはＡｌａでその位置を保存するように置換されてもよい。あるいは、Ｓ−保護基を有するＣｙｓ（以後このように記載する）を使用してもよい。更なる実施例では、合成または非天然の比較的に小さな中性アミノ酸、例えばアミノイソ酪酸（Ａｉｂ）またはデヒドロアラニン（ΔＡｌａ）を使用してもよい。Ｃのアミノ末端側に直接隣接する二つの残基のうち、任意のＰｒｏは推定上のＭＣＤの一部を形成する位置に配置されており、同様にその位置を保存するように置換される。このような置換が必要となる理由は、Ｐｒｏには金属イオンの配位球面に錯結合するＮが存在せず、したがってＰｒｏはＭＣＤの一部を形成することができないからである。したがってそのようなＰｒｏはＧｌｙ、ＡｌａまたはＳｅｒ（天然起源のコード化された蛋白質アミノ酸残基の仲間）で、好ましくＧｌｙまたはＡｌａで置換されてもよい。更なる実施例では、合成または非天然の比較的に小さな中性アミノ酸、例えばＡｉｂまたはΔＡｌａを使用してもよい。
【００５８】
本明細書および本クレームで「同族体」の語は、上記置換されるべきＣｙｓの場合で言えば、Ｇｌｙ、ＡｌａまたはＳｅｒで、好ましくはＧｌｙまたはＡｌａでの位置保存的な置換体を含む。「同族体」の語は更にＳ−保護基を有するＣｙｓを含み、ここでこのＳ−保護基によりＣｙｓ残基中の硫黄はもはや金属イオンへの結合用としては利用できない。「同族体」の語は更に、上記置換されるべきＣｙｓの場合で言えば、合成または非天然の比較的に小さな中性アミノ酸、例えばＡｉｂまたはΔＡｌａを含む。上記置換されるべきＰｒｏの場合で言えば、「同族体」の語は更に、Ｇｌｙ、ＡｌａまたはＳｅｒで、好ましくはＧｌｙまたは Ａｌａでの位置保存的な置換体を含む。「同族体」の語は更に、上記置換されるべきＰｒｏの場合で言えば、合成または非天然の比較的に小さな中性アミノ酸、例えばＡｉｂまたはΔＡｌａを含む。Ｒ１またはＲ２のいずれかにあり、Ｃのアミノ末端側に直接隣接する二つの残基におけるＰｒｏ、またはＣｙｓを除く残基の場合で言えば、そのような残基の「同族体」には例えば以下が挙げられる。（ａ）Ｌ−アミノ酸残基を置換するＤ−アミノ酸残基、（ｂ）翻訳後に修飾された残基、（ｃ）そのような残基を基礎とする非蛋白質アミノ酸残基または他の修飾アミノ酸残基、例えばフェニルアラニン残基に対するフェニルグリシン、ホモフェニルアラニン、環置換ハロゲン化、およびアルキル化またはアリール化フェニルアラニン、アルギニン残基に対するジアミノプロピオン酸、ジアミノ酪酸、オルニチン、リジンおよびホモアルギニン、等、および（ｄ）アミノ酸残基を擬制しており、コード化またはコード化されていないアミノ酸残基あるいは構成または構造体であって、側鎖の電荷（中性、陽性または陰性）が同様で、好ましくは疎水性または親水性が同様で、好ましくは側鎖が飽和脂肪族性、官能化した脂肪族性、芳香族性、または複素環性の点で同じのもの。
【００５９】
例えば、特定の既知受容体に結合する６個のアミノ酸残基からなる親ポリペプチドを想定してみる。この親ポリペプチドは次のように記述してよい。
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６
前記式Ｒ１−Ｃ−Ｒ２を採用し、例えば第一の場合としてＣｙｓをＣに対して使用し、Ｘ４とＸ５の位置の間に挿入すると仮定すると、Ｘ４とＸ５位置の間へのＣｙｓ挿入に関して以下のペプチド群が本発明により想定されるのが解る。
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｃｙｓ−Ｘ５−Ｘ６
Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｃｙｓ−Ｘ５−Ｘ６
Ｘ３−Ｘ４−Ｃｙｓ−Ｘ５−Ｘ６
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｃｙｓ−Ｘ５
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｃｙｓ
Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｃｙｓ−Ｘ５
Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｃｙｓ
Ｘ３−Ｘ４−Ｃｙｓ−Ｘ５
Ｘ３−Ｘ４−Ｃｙｓ
【００６０】
Ｘ２とＸ３の位置の間、Ｘ３とＸ４の位置の間、Ｘ５とＸ６の位置の間、またはＸ６の位置の後にＣｙｓの挿入を仮定すると、ペプチドの同様なシリーズを創造できる。例えば、Ｘ２とＸ３の位置の間にＣｙｓの挿入を仮定すると、以下のペプチド群になる。
Ｘ１−Ｘ２−Ｃｙｓ−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６
Ｘ１−Ｘ２−Ｃｙｓ−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５
Ｘ１−Ｘ２−Ｃｙｓ−Ｘ３−Ｘ４
Ｘ１−Ｘ２−Ｃｙｓ−Ｘ３
Ｘ１−Ｘ２−Ｃｙｓ
【００６１】
Ｘ６の位置の後にＣｙｓの挿入を仮定すると、以下のペプチド群になる。
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｃｙｓ
Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｃｙｓ
Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｃｙｓ
Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｃｙｓ
Ｘ５−Ｘ６−Ｃｙｓ
【００６２】
本発明の実施では、Ｃｙｓは、隣接する二つの残基の間に挿入するのではなく、親ポリペプチドの残基を置換することに使用するが可能であり、予期される。再度、６個のアミノ酸残基または残基からなる特定の既知受容体に結合する親ポリペプチドを次のように想定してみる。
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６
【００６３】
式Ｒ１−Ｃ−Ｒ２を採用し、例えばＣがＣｙｓであり、第一の場合としてＸ４残基を置換すると仮定すると、ＣｙｓによるＸ４の置換に関して以下のペプチド群が本発明により想定されるのが解る。
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｃｙｓ−Ｘ５−Ｘ６
Ｘ２−Ｘ３−Ｃｙｓ−Ｘ５−Ｘ６
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｃｙｓ−Ｘ５
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｃｙｓ
Ｘ２−Ｘ３−Ｃｙｓ−Ｘ５
Ｘ２−Ｘ３−Ｃｙｓ
【００６４】
ＣｙｓによりＸ３残基、Ｘ５残基、またはＸ６残基を置換したと仮定すると、ペプチドの同様なシリーズが誕生する。例えば、ＣｙｓによりＸ３残基を置換したと仮定すると、以下のペプチド群になる。
Ｘ１−Ｘ２−Ｃｙｓ−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６
Ｘ１−Ｘ２−Ｃｙｓ−Ｘ４−Ｘ５
Ｘ１−Ｘ２−Ｃｙｓ−Ｘ４
Ｘ１−Ｘ２−Ｃｙｓ
【００６５】
ＣｙｓによりＸ６残基を置換したと仮定すると、以下のペプチド群になる。
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｃｙｓ
Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｃｙｓ
Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｃｙｓ
Ｘ４−Ｘ５−Ｃｙｓ
【００６６】
もちろん、上の例示において親ポリペプチドＸ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６のいずれかの残基がＣｙｓである場合にＧｌｙ、ＡｌａまたはＳｅｒで、好ましくはＧｌｙまたはＡｌａでの位置保存的な置換を採用してもよい。あるいは、後に記載するように、Ｓ−保護基を有するＣｙｓを使用してもよい。更なる実施例において、任意の合成または非天然の比較的に小さな中性アミノ酸をＣｙｓの代わりに使用してもよい。例えば、親ポリペプチドを次のように記述すると想定する。
Ｘ１−Ｘ２−Ｃｙｓ−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６
【００６７】
前記式Ｒ１−Ｃ−Ｒ２を採用し、例えば第一の場合としてＣがＸ４とＸ５の位置の間に挿入されたＣｙｓであり、かつＡｌａを使用して親ポリペプチドのＸ３位置にある内在性のＣｙｓを置換したと仮定すると、以下のペプチド群が本発明により想定されるのが解る。
Ｘ１−Ｘ２−Ａｌａ−Ｘ４−Ｃｙｓ−Ｘ５−Ｘ６
Ｘ２−Ａｌａ−Ｘ４−Ｃｙｓ−Ｘ５−Ｘ６
Ａｌａ−Ｘ４−Ｃｙｓ−Ｘ５−Ｘ６
Ｘ１−Ｘ２−Ａｌａ−Ｘ４−Ｃｙｓ−Ｘ５
Ｘ１−Ｘ２−Ａｌａ−Ｘ４−Ｃｙｓ
Ｘ２−Ａｌａ−Ｘ４−Ｃｙｓ−Ｘ５
Ｘ２−Ａｌａ−Ｘ４−Ｃｙｓ
Ａｌａ−Ｘ４−Ｃｙｓ−Ｘ５
Ａｌａ−Ｘ４−Ｃｙｓ
式Ｒ１−Ｃ−Ｒ２のＣが挿入ではなくて置換により使用される場合には同様な置換が行われる。
【００６８】
同様に、上のいずれかの例示において親ポリペプチドにＰｒｏが存在し、そのＰｒｏがＭＣＤの一部を形成する配列（すなわち、式Ｒ１−Ｃ−Ｒ２のＣおよびＣのアミノ末端に直接隣接し少なくともＲ１の一部を含む二つの残基）の中に位置している場合には、Ｐｒｏの代わりにＧｌｙ、ＡｌａまたはＳｅｒで、好ましくはＧｌｙまたはＡｌａでの位置保存的な置換を採用してもよい。あるいは、合成または非天然の比較的に小さな中性アミノ酸または擬制体（必須ではないが、好ましくは、また疎水性）を、金属イオンとの錯結合用Ｎが存在するという条件で、Ｐｒｏの代わりに使用してもよい。例えば、親ポリペプチドを次のように記述すると想定する。
Ｘ１−Ｘ２−Ｐｒｏ−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６
【００６９】
式Ｒ１−Ｃ−Ｒ２を採用し、例えば第一の場合としてＣがＣｙｓであり、そのＣｙｓがＸ４とＸ５の位置の間に挿入され、かつＧｌｙを使用して親ポリペプチドのＸ３位置にある内在性のＰｒｏを置換したと仮定すると、以下のペプチド群が本発明により想定されるのが解る。
Ｘ１−Ｘ２−Ｇｌｙ−Ｘ４−Ｃｙｓ−Ｘ５−Ｘ６
Ｘ２−Ｇｌｙ−Ｘ４−Ｃｙｓ−Ｘ５−Ｘ６
Ｇｌｙ−Ｘ４−Ｃｙｓ−Ｘ５−Ｘ６
Ｘ１−Ｘ２−Ｇｌｙ−Ｘ４−Ｃｙｓ−Ｘ５
Ｘ１−Ｘ２−Ｇｌｙ−Ｘ４−Ｃｙｓ
Ｘ２−Ｇｌｙ−Ｘ４−Ｃｙｓ−Ｘ５
Ｘ２−Ｇｌｙ−Ｘ４−Ｃｙｓ
Ｇｌｙ−Ｘ４−Ｃｙｓ−Ｘ５
Ｇｌｙ−Ｘ４−Ｃｙｓ
【００７０】
しかし、親ポリペプチドＸ１−Ｘ２−Ｐｒｏ−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６において、ＣｙｓがＸ６の後ろの位置に挿入されたと仮定すると、Ｐｒｏの置換は必要がないので、以下のペプチド群になる。
Ｘ１−Ｘ２−Ｐｒｏ−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｃｙｓ
Ｘ２−Ｐｒｏ−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｃｙｓ
Ｐｒｏ−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｃｙｓ
Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｃｙｓ
Ｘ５−Ｘ６−Ｃｙｓ
【００７１】
式Ｒ１−Ｃ−Ｒ２のＣが挿入ではなくて置換により使用される場合には同様な置換が行われる。
【００７２】
更に別の実施例では、親ポリペプチドを１個の単位として処理してもよい。１５個のアミノ酸残基または残基からなるペプチドが特定の既知受容体に結合すると想定する。このペプチドは次のように記述される。
【００７３】
ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−ＣＯＯＨ
この親ペプチドにおいて、Ｘはどのような残基でもよく、その残基はどのような順序または配列においても多数回繰り返えされてよい。したがって、位置Ｘ１の残基は位置Ｘ２の残基と異なっても同一であってもよく、これは位置Ｘ１またはＸ３の残基と異なっても同一であってもよく、以下同様である。ここでもまたＣｙｓが親ポリペプチド中に存在する場合には置換が行われてもよい。同様に、推定ＭＣＤの一部を含む配列にＰｒｏが存在する場合、例えば後で提供されるＮ１Ｓ１残基のアミノ末端側に直接隣接するＲ１の二つの残基内にＰｒｏがある場合に、置換が行われてもよい。
【００７４】
本発明の実施では、金属イオンへの錯結合用ＮとＳを両方提供するＮ１Ｓ１残基、例えばＬ−またはＤ−システイン、他の天然、非天然または合成アミノ酸または金属イオンへの錯結合用ＮとＳを両方提供する擬制体が使用される。以下の例示には「Ｃｙｓ」が使用され、任意のＮ１Ｓ１残基を同様に使用できるが、本例示およびそれに続く例示ではＮ１Ｓ１残基はＣｙｓに限定されない。標準的なペプチド合成技術を使用してペプチドを構築したが、そのペプチドではシステインが２番位置（Ｘ２）の後ろから１６番（ｎ＋１）位置（Ｘ１５の後ろ）まで挿入され、その結果以下のペプチド群となる。
ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｃｙｓ−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｃｙｓ−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｃｙｓ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｃｙｓ−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｃｙｓ−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｃｙｓ−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｃｙｓ−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｃｙｓ−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｃｙｓ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｃｙｓ−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｃｙｓ−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｃｙｓ−Ｘ１４−Ｘ１５−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｃｙｓ−Ｘ１５−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｃｙｓ−ＣＯＯＨ
以上の要領にて親ポリペプチドに沿う各可能性のある挿入点を「走査」することにより、挿入点毎に金属イオンにより安定化した二次構造モチーフが生成し、その結果としてメタロペプチドの生物活性が特定されるか否か、および好ましくは生物活性が親ポリペプチドの生物活性に少なくとも同等またはほぼ同等か否かを決定する。
【００７５】
合成過程で式Ｒ１−Ｃ−Ｒ２のＣの−ＳＨ基を下記する直交性保護剤で保護してよい。次に得られた直交方向に保護されたＣｙｓ含有ペプチドを脱保護し、続いてレニウムイオン等の金属イオンと錯結合してメタロペプチドを形成するが、レニウムイオンの場合には予め作って置いた適当な金属オキソ転移剤、例えばＲｅ（Ｏ）Ｃｌ３（ＰＰｈ３）２を使用する。得られた各メタロペプチドの結合性を、競合阻害アッセイ等の適当なアッセイまたはテスト方法によって親ポリペプチドと対比する。そして結合性を強化または増加したメタロペプチドは、そのメタロペプチドのＢＤの全部または一部を形成している金属イオン錯体の周辺に逆ターン構造が含まれていると識別される。
【００７６】
関連するやり方では、規定された長さだが親ポリペプチドの長さに及ばない配列を合成する。これら配列は、例えば上記した１５残基からなる、仮想既知親ポリペプチドを基礎にしている。一つの実施例でＣｙｓをその規定長さの配列に挿入する。すると４個のアミノ酸残基からなる配列のシリーズが合成され上記のごとくスクリーニングされることが可能であり予期される。４個のアミノ酸残基の構成は、Ｃｙｓのカルボキシル末端側に１個の残基があり、Ｃｙｓのアミノ末端側に２個の残基があって、以下のごとくである。
ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｃｙｓ−Ｘ３−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−Ｘ２−Ｘ３−Ｃｙｓ−Ｘ４−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｃｙｓ−Ｘ５−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−Ｘ４−Ｘ５−Ｃｙｓ−Ｘ６−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−Ｘ５−Ｘ６−Ｃｙｓ−Ｘ７−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−Ｘ６−Ｘ７−Ｃｙｓ−Ｘ８−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−Ｘ７−Ｘ８−Ｃｙｓ−Ｘ９−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−Ｘ８−Ｘ９−Ｃｙｓ−Ｘ１０−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−Ｘ９−Ｘ１０−Ｃｙｓ−Ｘ１１−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｃｙｓ−Ｘ１２−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｃｙｓ−Ｘ１３−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｃｙｓ−Ｘ１４−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｃｙｓ−Ｘ１５−ＣＯＯＨ
【００７７】
更に別の手法では、規定された長さながら親ポリペプチドの長さに及ばない配列を合成するが、親ポリペプチドの或るアミノ酸残基の置換体としてＣｙｓが使用される。すると４個のアミノ酸残基からなる配列が合成され上記のごとくスクリーニングされることが可能であり予期される。４個のアミノ酸残基の構成は、親ポリペプチドの残基をＣｙｓが置換しており、Ｃｙｓのカルボキシル末端側に１個の残基があり、Ｃｙｓのアミノ末端側に２個の残基があって、以下のごとくである。
ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｃｙｓ−Ｘ４−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−Ｘ２−Ｘ３−Ｃｙｓ−Ｘ５−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｃｙｓ−Ｘ６−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−Ｘ４−Ｘ５−Ｃｙｓ−Ｘ７−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−Ｘ５−Ｘ６−Ｃｙｓ−Ｘ８−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−Ｘ６−Ｘ７−Ｃｙｓ−Ｘ９−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−Ｘ７−Ｘ８−Ｃｙｓ−Ｘ１０−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−Ｘ８−Ｘ９−Ｃｙｓ−Ｘ１１−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−Ｘ９−Ｘ１０−Ｃｙｓ−Ｘ１２−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｃｙｓ−Ｘ１３−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｃｙｓ−Ｘ１４−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｃｙｓ−Ｘ１５−ＣＯＯＨ
【００７８】
更に別の関連する手法では、規定の長さながら親ポリペプチドの長さに及ばない別の配列群を合成する。すると４個のアミノ酸残基からなる更に別の配列が合成され上記のごとくスクリーニングされることが可能であり想定される。４個のアミノ酸残基には、親ポリペプチドからの順序による３個の残基があるテトラペプチド配列のカルボキシル末端残基としてＣｙｓがあり、以下のごとくになる。
ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｃｙｓ−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｃｙｓ−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｃｙｓ−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｃｙｓ−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｃｙｓ−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｃｙｓ−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｃｙｓ−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｃｙｓ−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｃｙｓ−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｃｙｓ−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｃｙｓ−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｃｙｓ−ＣＯＯＨ
ＮＨ２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｃｙｓ−ＣＯＯＨ
【００７９】
上記各例ではテトラペプチド配列を採用し、その残基の一つはＣｙｓである。しかし、配列は、トリペプチド（例えばＸ−Ｘ−Ｃｙｓ）から長さｎ＋１のペプチドまで、どのような長さでもよいということを理解しなければならない。ここでｎは親ポリペプチドの長さである。別の実施例では、他の残基、擬制基、末端基を追加して、配列の長さをｎ＋１より大きくすることが可能である。同様にＣｙｓは、Ｎ１Ｓ１残基を含む限り天然または非天然、あるいはその擬制基あるいは別の構造基であってもよいことを理解しなければならない。そのような各場合、得られるＣｙｓ含有ペプチドはレニウムイオン等の金属イオンと錯結合しメタロペプチドを形成する。この場合に例えば予め作って置いた適当な金属オキソ転移剤、例えば Ｒｅ（Ｏ）Ｃｌ３（ＰＰｈ３）２を使用する。
【００８０】
更に別の実施例で、親ポリペプチドを重なり合う配列に分断し、次にこのような各配列を独立の親ポリペプチドとして考え、本発明の方法および構成に従って処理するということが予期され、理解される。例えば、ｎが３０である長さｎの親ポリペプチドを想定する。このような親ポリペプチドは二以上の分離しているＢＤを含有しているかも知れない。したがって、一実施例では、一次配列を構造体、例えば三つの構造体に分断する。例えば第一の構造体は１から１５までの位置の残基からなり、第二は７から２１までの残基、そして第三は１６から３０までの残基からなる。この要領で、可能性のある内在性の隣接ＢＤを全て、三つの構造体の少なくとも一つに含ませる。その後に各構造体を独立の親ポリペプチドとして、本発明の方法に従って処理する。好ましい実施例で、ｎが１５である長さｎの親ポリペプチドにこの方法を採用し、三つの分断された構造体を使用し、各分断構造体は隣接の分断構造体と少なくとも二つの残基で重なり合う。
【００８１】
適切なスクリーニングアッセイ、例えば競合阻害アッセイを使用して、得られる各メタロペプチドの結合性を親ポリペプチドと対比し、結合性の強化または増大しているメタロペプチドには、そのＢＤの少なくとも一部を形成している金属イオン錯体の周辺に二次構造モチーフが含まれていると識別される。いったん結合性の強化または増大しているメタロペプチドが一以上識別されると、アミノ末端またはカルボキシル末端にアミノ酸残基を追加、削除等をして側鎖を修飾し、かつ同様な変更を加えて、最適の結合性または他の希望する特徴、例えばアゴニスト活性、アンタゴニスト活性またはアゴニスト／アンタゴニスト混合活性を有するメタロペプチドを得る。
【００８２】
親ポリペプチドが一以上の内在性Ｃｙｓ残基を含む場合に、元来存在していたＣｙｓ残基は非直交性のＳＨ保護剤で保護し、導入されたＮ１Ｓ１残基は直交性のＳＨ保護剤で保護し、その後に直交性のＳＨ保護剤を選択的に脱保護し、次に脱保護されたＮ１Ｓ１残基を金属イオンと錯結合し、その後に非直交性のＳＨ保護剤を有するＣｙｓを脱保護するということは可能である。非直交性のＳＨ保護基の例には、トリチル、ベンジル、ｐ−メトキシベンジルおよびｔＢｕがあるが、これらに限定されない。
【００８３】
以上から更に理解されるように、本発明の他の実施例では、問題とする受容体または標的のファルマコフォアを規定してもよい。既知の親ポリペプチド（ペプチド、ポリペプチドあるいは蛋白質でもよい）がファルマコフォアの規定が望まれている受容体に結合すると想定する。親ポリペプチドの一次構造は判っているが、受容体への結合に関与する特異的残基、および受容体へのそのような結合に関与する二次構造が判っていない。親ポリペプチドの一次構造に関する情報だけからではファルマコフォアの規定を誘導することはできない。そのファルマコフォアに関する知識があれば、例えば、受容体に結合し、随意にアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する、ペプチド擬制体および非ペプチド小分子を含む広汎な各種小分子の設計と構築が可能となると思われる。既知親ポリペプチドの一次構造に基づいて、既述のようにメタロペプチドのシリーズを構築する。受容体と親ポリペプチドに関し、最適結合性および他の希望する特徴を有するメタロペプチドを選択する。選択したメタロペプチドは、例えば結合を可能とする最少数の残基を決定することによって、式Ｒ１−Ｃｙｓ−Ｒ２におけるＲ１とＲ２が一体となって３個以下の、好ましくは２個だけの残基を構成するように最適化してもよい。同様に、得られるメタロペプチドが希望する水素結合ドナーおよびアクセプター、電荷中心、芳香環中心、疎水性中心等を有し、それにより受容体への最適結合性を備えるように、選択したメタロペプチドを最適化する修飾を、側鎖に関し随意に行ってもよい。
【００８４】
本発明の方法に定められたように、所望の受容体に対する最適結合性を提供するメタロペプチドを親ポリペプチドとの対比で選択し、ついでその選択したメタロペプチドをモデル化してもよい。代表的なペプチド（すなわち親ポリペプチド）には多種類の捩じれ角度が存在するので、それらによって決定するペプチドの確率的な二次および三次構造は多様である。したがって、代表的なペプチドについて、その一次構造に関する知識から、経験的な証拠なしに二次または三次構造を決定できるとは必ずしも言えない。しかし、本発明のメタロペプチドでは式Ｒ１−Ｃｙｓ−Ｒ２を採用しているので、金属イオンおよびメタロペプチドＭＣＤは立体配置的に拘束を受け、固定され決定された二次構造を伴う。ＭＣＤの残基内および残基間の捩じれ角度は、金属イオン錯結合のために固定されるので、使用する金属イオンの、酸化状態、配位幾何構造等を含む型に基づいて決定できる。
【００８５】
結果的には、どのようなメタロペプチドでも、メタロペプチドのＭＣＤ部分およびＭＣＤに隣接する残基の或る程度までを特異的に含んでいれば、これをモデル化して二次構造を決定してもよい。この手段で、メタロペプチドへの補助としてファルマコフォアをモデル化できる。例えば、三次元構造における水素結合ドナーおよびアクセプター、正負の電荷中心、芳香環中心、疎水性中心等の位置を（ファルマコフォアの一部を構成する原子間の距離の決定を含めて）決定することができる。このモデル化のためには、多数のソフトウエアプログラムのいずれも、例えばＳＹＢＹＬ（トリポス社）、Ａｌｃｈｅｍｙ（トリポス社）、Ａｌｉｇｎ／Ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ（アクセリル社）、Ｃａｔａｌｙｓｔ（アクセリル社）、ＭａｃｒｏＭｏｄｅｌ（シュレーディンガー社）、ＰＣ−Ｍｏｄｅｌ（セレナソフトウエア）、ＣＳ  ＣｈｅｍＯｆｆｉｃｅ（ケンブリッジソフト社）および当分野で既知の他のプログラム等のプログラムを、使用できる。ファルマコフォア・モデル化の技術は多数の論文と教科書に教示されており、例えば、Ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ Ｐｅｒｃｅｐｔｉｏｎ， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｕｓｅ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ， Ｏｓｍａｎ Ｆ． Ｇｕｎｅｒ， Ｅｄ．， Ｉｎｔ’ ｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｌｉｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ， ２０００； および Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ ｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ， Ｎ． Ｃｌａｕｄｅ Ｃｏｈｅｎ， Ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， １９９６．がある。
【００８６】
本発明の方法と構造体を使用してメタロペプチドのライブラリーを設計して製造することができ、ここで、構成シリーズの各メンバーには、金属との錯結合のための配位部位を提供するのに必要なＭＣＤ配列が含まれていることが、更に判るであろう。これらのライブラリーは、特に液相および固相合成法を含む方法を使用して製作可能である。
【００８７】
ＭＣＤを金属と錯結合すると、二次構造のモチーフを形成する特異な構造をもたらす。この錯体の特異な立体化学的特徴は、錯結合性金属イオンの配位球面の立体化学に由来する。金属の配位球面の好ましい幾何構造は立体配置的制約の性質と程度を決定づけ、規定する。一般に、本発明で有用と判った金属の大部分は配位子数が４ないし６（時には、しかし稀に、８まで高い）である。これは、推定ＭＣＤは、与えられた幾何構造および配位球面を有する金属イオンとの結合を達成する立体適合性の様式で位置決めされた反応基を伴う残基で作られているに違いない、ということをほのめかしている。ペプチド鎖の配位基には、アミン、アミド、イミダゾールまたはグアニジノ機能性の窒素原子、チオールまたはジスルフィドの硫黄原子、およびヒドロキシ、フェノール、カルボニルまたはカルボキシル機能性の酸素原子が含まれる。更に、ペプチド鎖または個々のアミノ酸残基は、これを化学的に変更して配位基、例えばオキシム、ヒドラジノ、スルフヒドリル、フォスフェート、シアノ、ピリジノ、ピペリジノ、またはモルフォリノ基を含くませることができる。配位子数４の金属に対して好ましいＭＣＤは３個のアミノ酸の配列であり、その１個のアミノ酸残基の側鎖には硫黄を基礎とする配位基（例えばＣｙｓ）があり、そのような残基はＮ１Ｓ１リガンドを構成する。したがって、３個のアミノ酸の配列からＮ３Ｓ、Ｎ２ＳＯ、あるいは同様なリガンドが得られ、これらから窒素、硫黄、および随意に酸素原子を利用する金属イオンの四座配位が得られる。
【００８８】
どの金属を選択するかによって、得られるターン構造の構造が部分的に決定される。例えば、Ｒｅイオンを使用すると正方ミラミッド配位の幾何構造になる。Ｔｃ（これもほぼ同様な配位要件と化学特性を有し、一般的に本明細書の全ての例示においてＲｅを代置してよい）も同様に正方ミラミッド配位の幾何構造になる。Ｃｕ、ＮｉまたはＺｎ等の他の金属イオンを使用すると、正方平面配位の幾何構造になる。したがって、原子半径はＲｅでは１．３７オングストロームの次元、Ｃｕではより小さく１．２８オングストロームの次元であるが、金属配位基の得られる次元は大部分が配位の幾何構造によって決定され、単に金属イオンの原子半径にはよらない。正方平面配位の四座幾何構造をとるＣｕ、ＮｉまたはＺｎ等の金属イオンの場合、その金属イオンと四つの配位原子の各々（Ｓ、ＮまたはＯ等）は同一平面上にある。しかし、（正方ミラミッド配位の四座幾何構造になる）ＲｅまたはＴｃ等の金属イオンを使用した場合には、四つの配位原子（Ｓ、ＮまたはＯ等）は同一平面上にあるが、Ｒｅの場合には、金属イオンは配位基の平面から約０．６５オングストローム離れている。
【００８９】
本発明において、各種金属イオンはいずれも使用可能であるが、ＲｅおよびＴｃは特に好ましい。両金属はＣｙｓ含有ペプチドと類似の錯体を形成し、類似の正方ミラミッド錯体が得られる。しかし、Ｒｅと錯結合したペプチドは、対応するＴｃ含有ペプチドよりも化学的に安定である。ＺｎおよびＣｕの正方平面錯体は、金属イオンとペプチドの四つの配位原子は全て一平面にあるので、金属イオンの原子半径の違いにも拘わらず、ＴｃまたはＲｅで得られる錯体幾何構造、すなわち金属イオンがペプチドの四つの配位原子の平面から上方に突き出ている構造にほぼ同一の理想的な錯化幾何構造になる。例えばＲｅ、Ｔｃ、ＺｎまたはＣｕが使用されたか否かに関係なく、正味の結果はそれぞれ地形的な同一性があるメタロペプチドである。しかし、Ｒｅと錯結合したメタロペプチドは、特別なまたは外来の薬剤あるいは保護剤を必要とせずに、空気および湿気に安定であるという点で特異である。Ｒｅ錯体は日常的に固体化合物として単離でき、固体としておよび広いｐＨ範囲にわたって溶液中で安定であり、したがって分析による特徴づけおよび、より重要なことに、広い条件範囲にわたってｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの生物学実験での使用が容易である。他の金属タイプ、例えばＺｎ錯体およびＣｕ錯体は溶液形態での実験に利用される。しかし、Ｚｎ錯体およびＣｕ錯体は形成が極めて容易であり、基本的には適当な緩衝液中で１マイクロモルないし１ミリモル濃度の金属イオンの存在下で形成される。
【００９０】
ＲｅおよびＴｃの錯体は金属オキソ化合物であり、一般に、かつ好ましい実施例では酸化状態［Ｖ］にある。メタロペプチドの金属オキソ中心核Ｍ＝Ｏによってコア構造に異性化現象が生ずる。金属オキソ基はキラルなアミノ酸側鎖に関してシンまたはアンチとなる。オキソ基の配向はアミノ酸側鎖が形成する組織分布的な表面を変化させないので、この異性化現象はメタロペプチドの生物活性には影響しない。図１Ａ、１Ｃ、２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、５および６からよく理解できることであるが、金属イオンのオキソ基が立体配置的に拘束されたアミノ酸側鎖の表出を立体的に妨害することはない。事実、金属イオンの空間的な所在位置は、水素結合によってターンが天然のターン構造に安定化された場合の所在位置とほぼ同じである。ということは、オキソ基は、天然のターン構造においては関与できない空間にいることになる。メタロペプチドのシンおよびアンチ異性体を個別にコンピュータで模型化すると、これら二つの構造は唯一オキソ基の配向が異なり、アミノ酸の配置に関しては全く識別不可能であることを示している。
【００９１】
本発明の実施例の有用性は、これにより天然起源のペプチドおよび蛋白質構造の位相を擬制する構造が得られるので、本発明の図面を参照して読み取ってもよい。蛋白質構造は、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｃａｒｌ Ｂｒａｎｄｅｎ ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｔｏｏｚｅ， １９９１， Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ａｎｄ Ｌｏｎｄｏｎにおいて広範囲に検討され説明されている。そこでの検討を引用してここに取り込む。図１Ｂは古典的なベータＩＩ’ターンの骨格構造を示す。図１Ａは、Ｒｅ金属に配位したＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のペンタペプチドの構造を示し、Ｌ−Ｃｙｓが使用されている。図１Ｃは、図１Ｂの上に図１Ａを、３個の連続するＮ末端アミノ酸残基（Ｃ１−α、Ｃ２−αおよびＣ３−α原子）のそれぞれＣ−α炭素原子で重ね合わせた図である。図１Ｃを検討して理解されることであるが、これら３個の炭素原子には、ＲＭＳＤ＜０．０５オングストロームの優れた重なりがあり、図１Ａのターン構造により図１Ｂの古典的なベータＩＩ’ターンの近似擬制体が形成されている。したがって、例えば図１Ａと図１Ｂのこれらアミノ酸残基の側鎖は、その位相および相対的な関係において極めて類似しているであろう。留意すべきことは、図１Ａに使用している配列、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ａｌａ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）はモデルとしてのみ使用したのであって、Ｃｙｓが４位置、他の残基はＣｙｓまたはＰｒｏ以外の残基であるペンタペプチドは全て同じ骨格図になり、Ｃ１−α、Ｃ２−αおよびＣ３−α原子の重なりも同じになる。
【００９２】
図２Ａは、Ｒｅ金属に配位したＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｄ−Ｃｙｓ−Ａｌａペンタペプチドの構造を、同様な骨格図により示す。図２Ｂは、３個の連続するＮ末端アミノ酸残基（Ｃ１−α、Ｃ２−αおよびＣ３−α原子）のそれぞれＣ−α炭素原子で重ね合わせた図２Ａの図である。図１Ｃを検討して理解されることであるが、これら３個の炭素原子にも、同様にＲＭＳＤ＜０．０５オングストロームの優れた重なりがあり、図２Ａのターン構造も図１Ｂの古典的なベータＩＩ’ターンの近似擬制体を形成することを実証している。したがって、例えば図２Ａと図１Ｂのこれらアミノ酸残基の側鎖は、その位相および相対的な関係において極めて類似しているであろう。ここでもまた、４位置にＤ−Ｃｙｓ、残りの位置にＣｙｓまたはＰｒｏ以外の任意の残基が使用されている任意のペンタペプチド配列は、Ｃ１−α、Ｃ２−αおよびＣ３−α原子の重なりが同じである同様な骨格図となるであろう。図１Ａと図２ＡのＲｅ−ペプチド構造を比較すると明らかなように、Ｃ末端５番目のアミノ酸がこれら原型において延伸しているので、特定受容体への接触を達成するための追加のかつ明瞭な化学的空間が有効に許容され、それによりこの構造における多様性の強化に拍車をかけた。
【００９３】
図３Ａは、延伸した鎖状ペプチド構造の上に重ね合わせられた、レニウム金属イオンに錯結合したペプチド配列Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｄ−Ｃｙｓ−Ａｌａの骨格図である。この図示では、延伸した鎖状構造の連続する二つのアミノ酸残基のＣ−α原子がメタロペプチド配列のＣ１−α、およびＣ２−α原子に重なっている。図を重ね合わせて見ると、これら二つのアミノ酸残基はそれらのＣ−ベータ炭素原子に沿ってほぼ類似な化学的に平行した位置にあるのが示唆される。同様に図３Ｂは、配列Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｄ−Ｃｙｓ−ＡｌａのＣ２−αおよびＣ３−α原子に重ねられた延伸鎖状構造の連続する二つのアミノ酸残基のＣ−α原子を示している。図を重ね合わせて見ると、Ｃ２−αおよびＣ３−α原子およびＣ３−β炭素原子の正確な位置取りが示唆されると同時に、別の化学的空間へのアクセスがＣ２−β炭素原子の位置で可能であることが示唆される。
【００９４】
図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃは、β−シートのペプチド構造に重ね合わせた、レニウムが錯結合したペプチド配列Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｄ−Ｃｙｓ−Ａｌａを示す。三つの別々の重ね合わせが示されている。すなわち、メタロペプチド配列のＣ１−αおよびＣ２−α原子に重ねられた、β−シート構造の連続する二つのアミノ酸残基のＣ−α原子を伴う図４Ａの重ね合わせ；メタロペプチド配列のＣ２−αおよびＣ３−α原子に重ねられた、β−シート構造の連続する二つのアミノ酸残基のＣ−α原子を伴う図４Ｂの重ね合わせ；および、メタロペプチド配列のＣ２−αおよびＣ３−α原子に図４Ｂで示したのとは異なる配向で重ねられたβ−シート構造の連続する二つのアミノ酸残基のＣ−α原子を伴う図４Ｃの重ね合わせ、である。それぞれ、例えば図４Ｂの場合にはＣ２−βおよびＣ３−β炭素原子の位置で、あるいは図４Ｃの場合にはＣ２−β原子の位置で、メタロペプチドの追加のまたは異なる化学的空間へのアクセスを許容しながら、Ｃ−α炭素原子の類似のまたは正確な位置取りを図解している。
【００９５】
図５は、メタロペプチドの側鎖の位相を、ヘリックス等の天然ターン構造の位相と同様に、組織化し、選択ができることを図解している。メタロペプチドにはアミノ酸残基１および５に関して機能的ヘリックス性が存在しているので、メタロペプチド上のｉからｉ＋５の残基ピッチをα−ヘリックスにおけるｉおよびｉ＋４残基の化学的空間に組織分布的に合わせることができる。同様に天然Ｃｙｓを利用して図６に示すような類似の位相が得られる。
【００９６】
図８のラマチャンドラン・プロットは、図７Ａおよび７ＢのメタロペプチドのＭ−１、Ｍ−２、Ｍ−３−Ｌ、およびＭ−３−Ｄの配位、したがって対応する構造的性癖を示す。したがって、Ｌ−Ｃｙｓを有するメタロペプチドは短い右手ターンのヘリックス擬制体を形成し、Ｄ−Ｃｙｓを有するメタロペプチドは短い左手ターンのヘリックス擬制体を形成することが理解できる。天然ヘリックスのターンは右手だけであるのは周知である。したがって、メタロペプチド手法により、右手と左手の両構造が構築できるという利点が得られる。これらの構造は、Ｌ−Ｃｙｓ含有メタロペプチドにおけるｉおよびｉ＋５残基の側鎖を、右手ヘリックスになっているｉおよびｉ＋４残基の側鎖に対する化学的空間と同一の化学的空間に組織分布的に位置付けることに利用できる。あるいは、Ｄ−Ｃｙｓ含有メタロペプチドによって、推定的な非天然左ヘリックスのｉおよびｉ＋４残基に対する組織分布的な擬制体を造ることが可能となる。
【００９７】
また、評価すべきことであるが、天然の線状ペプチドおよび同族体は、或るアミノ酸残基の特定二次構造への包含を先導する、シュー−ファスマン型の規則の制約を受けるのに対し（Ｐ．Ｙ． Ｃｈｏｕ ａｎｄ Ｇ．Ｄ． Ｆａｓｍａｎ： Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３：２２２−２４５， １９７４）、本発明の方法および構造体はこれらの規則から完全に独立している。本発明によって、シュー−ファスマン規則の制約を受けずに、また事実上他の制約も受けずに、どのような天然または合成のアミノ酸残基でも構造中に編入することができる。
【００９８】
評価すべきことであるが、図１〜７に示されている構造の骨格は天然の蛋白質構造のものとは非常に違っているのに対し、本発明は、類似点を利用して各種アミノ酸残基のＣ−α炭素原子、および或る場合にはＣ−β炭素原子を、対応する原蛋白質構造におけると同じ化学的空間に位置付け、更にこれらの位置を誘導化して天然の生物活性のある構造モチーフにおけると類似の化学的な位相または平面を達成することを目的としている。したがって、これらメタロペプチド構造を利用すれば、ペプチドまたは蛋白質等の親ポリペプチドにおける折りたたみまたは立体配置的な拘束の部位を表示し特定する生物学的に活性な分子を識別することができる。構造と機能の関係が判っていないポリペプチドに対しては、その情報は、親ポリペプチドの一部または全部の位置でＣｙｓ残基を挿入または置換する設計を行った親ポリペプチドに対応する全てのメタロペプチドの組合せを合成することによって、得られる。そのシリーズの生物学的に活性なメタロペプチドの構造により、そのポリペプチドにおける折りたたみ部位が明らかになる。またこのメタロペプチドにより、鍵となる拘束されたアミノ酸残基に関する情報、例えば空間的関係等の、相互関係およびキラル性の情報が得られるがこれに限定されない。次にこの情報を利用して分子模型、例えばコンピュータ・ベースの分子模型を造り、それによって更なる最適化のための最小構造のファルマコフォアモデルを特定する。本発明の実施では、かくして識別された構造モチーフを利用し、規定された位相の更なる修飾を行うこと、例えば親ポリペプチドの天然起源側鎖を同族のアミノ酸側鎖に置換することによって所望の生物学的効果を顕著にすることは可能である。同族の側鎖の例には、Ｌ−アミノ酸置換用のＤ−アミノ酸、あるいはアミノ酸同族体の利用、例えばフェニルアラニン残基に対するフェニルグリシン、ホモフェニルアラニン、環置換ハロゲン化およびアルキル化またはアリール化フェニルアラニンのシリーズ、アルギニン残基に対するジアミノプロピオン酸、ジアミノ酪酸、オルニチン、リジンおよびホモアルギニン、等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９９】
本発明の実施では、残基の遊離チオール基またはスルフヒドリル基（−ＳＨ）は金属イオンの錯結合に利用されているのが理解される。しかし、遊離−ＳＨ基があるペプチドおよび他の有機化合物は空気中および溶液中で容易に酸化されて、しばしばジスルフィドで連結した二量体を形成する。分子中に二以上の−ＳＨ基が存在する場合には酸化により複雑な重合体が生ずる可能性がある。更に、金属イオンがペプチドに錯結合する時に二以上の遊離−ＳＨがあると、金属イオンはペプチドの二以上のＭＣＤにおいて錯結合する可能性がある。この結果メタロペプチドの混合種が生じ、問題とする標的に結合する特定メタロペプチドの決定並びに関連する二次構造の決定が複雑になる。同様に、遊離−ＳＨ基を有する異なるペプチドまたは有機化合物が混合している場合には、一般に、酸化により組成の判らない重合体の複雑な混合物となる。これは、一以上の−ＳＨ基の金属錯結合への使用が意図されているメタロペプチドまたは他の有機化合物のライブラリーを用意する場合に深刻な問題である。
【０１００】
−ＳＨ基を編入している本発明のメタロペプチドを構築するためには、最も具体的にはライブラリーを構築するためには、Ｓが保護された誘導体を利用するのが望ましい。Ｓ−保護基は、（ａ）液相および固相ペプチド合成法によりＳ−保護基のあるペプチドを合成して支障はなく、Ｓ−保護基は合成過程中安定である、そして（ｂ）Ｓ−保護基は、金属錯結合のステップ過程で、固相合成の場合には樹脂から開裂することなく、そのままで脱保護することができる、により選択される。上記の指標を充足するＳ−保護基を本明細書では直交性Ｓ−保護基（ＯＳＰＧ）と定義する。多数の従来法は上記二つの指標のせいぜい一つを充足するに過ぎないので、本明細書で定義するＯＳＰＧを構成しない。
【０１０１】
被直交性Ｓ−保護チオール基を使用すれば、単一の容器の中で金属化合物を合成することができる。それぞれＯＳＰＧを含有する化合物群の混合物を金属イオンとの錯結合に使用する、そしてＳ被保護基が脱保護されるのは金属イオン錯結合の過程中のみであり、したがって重合化および架橋化は回避される。この方法でメタロペプチドの均質なライブラリーが得られる。
【０１０２】
上に特定した指標を充足する、そして本発明において有利に使用できるＯＳＰＧの一つでは、ＳｔＢｕ（Ｓ−チオブチルまたはＳ−ｔ−ブチル）基が−ＳＨ基を保護するために使用されている。ＳｔＢｕ基は、ペプチド合成で代表的に採用される酸性および塩基性両条件下で安定である。更に、ＳｔＢｕ基は適当なフォスフィン試薬を使用する還元によって開裂され、その還元ステップは金属イオンをペプチドに錯結合する直前でもあるいは同時でもよい。このようなＯＳＰＧの開裂を行ってもペプチドが樹脂から開裂することはなく、あるいはペプチドの構造は変化しない。
【０１０３】
上に特定した指標を充足し本発明に適する他のＯＳＰＧでは、Ｓ−Ａｃｍ（Ｓ−アセトアミドメチル）基が−ＳＨ基を保護するために使用されている。Ｓ−Ａｃｍ基もペプチド合成中に通常採用される酸性および塩基性条件下で安定である。Ｓ−Ａｃｍ基は、Ｓ−Ａｃｍ基で保護されたペプチドまたはペプチド樹脂を酢酸水銀（ＩＩ）またはテトラフルオロホウ酸銀（Ｉ）で処理することにより離脱させることができ、この結果チオールペプチドは水銀イオンまたは銀イオンと錯結合した状態で遊離する。水銀イオンまたは銀イオンのメタロペプチドが所望される場合には、得られたメタロペプチドを溶液中に保存し、本明細書に記載のアッセイに使用すればよい。あるいは、遊離チオール含有ペプチドは、水銀イオンまたは銀イオンとチオールとの錯結合塩を過剰のチオール含有試薬、例えばベータメルカプトエタノールまたはジチオスレイトールで処理することにより、回収できる。次に得られたペプチドを使用してＲｅまたはＴｃ等の金属に金属錯結合する。あるいは、水銀イオンまたは銀イオンとチオールとが錯結合したペプチドは、金属イオン錯結合試薬、例えばＲｅ錯結合試薬で直接に処理して、所望のメタロペプチド、例えばＲｅメタロペプチドを形成してもよい。
【０１０４】
他のメタロペプチド用ＯＳＰＧの例には、４−メトキシトリチル（Ｍｍｔ）、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル（Ｎｐｙｓ）、およびＳ−スルフォネート（ＳＯ３Ｈ）が挙げられる。Ｍｍｔは１％ＴＦＡジクロロメタン液で処理すると選択的に除去される。ＮｐｙｓおよびＳ−スルフォネートは、チオール含有試薬、例えばベータメルカプトエタノールまたはジチオスレイトール、あるいはフォスフィン試薬、例えばトリブチルフォスフィンで処理すると選択的に除去される。Ｎｐｙｓ基（Ｒ．Ｇ． Ｓｉｍｍｏｎｄｓ ＲＧ ｅｔ ａｌ： Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ， ４３：３６３，１９９４）はペプチド合成用Ｂｏｃの化学と両立する、またＳ−スルフォネート（Ｍａｕｇｒａｓ Ｉ ｅｔ ａｌ： Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ， ４５：１５２， １９９５）はＦｍｏｃおよびＢｏｃの両方の化学と両立する。Ｓ−アルキル、またはＳ−アリール、またはＳ−アラルキルの同族シリーズから誘導される類似のＯＳＰＧも、本発明に使用してよい。ＯＳＰＧの主な特徴は、それを使用することによって、チオール含有アミノ酸と保護基のそれぞれから１個づつ硫黄原子が利用されて、ジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合が形成されることである。更に、得られたジスルフィド結合は各種ジスルフィド開裂試薬、例えば限定はされないがフォスフィン含有試薬およびチオール含有試薬を使用して開裂可能である。
【０１０５】
ＳｔＢｕで保護された−ＳＨ基あるいは他のＯＳＰＧを使用する方法を固相または可溶性のライブラリーを製造するのに採用してもよい。固相ライブラリーには、通常のＦｍｏｃ化学を利用してペプチドを合成してよい。通常のＦｍｏｃ化学の場合には、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｃｙｓ−（ＳｔＢｕ）を、一以上のアミノ酸残基を中間に介して適当な樹脂に結合し、次に追加のアミノ酸残基をＬ−Ｃｙｓ−（ＳｔＢｕ）残基に結合する。ＳｔＢｕは、Ｌ−またはＤ−Ｃｙｓのいずれか、および金属イオン錯結合用−ＳＨ基が存在することを特徴とする他の各種アミノ酸残基、合成ないし非天然型アミノ酸残基とそれらの擬制体、例えば限定はされないが３−メルカプトフェニルアラニンおよび他の関連する３−メルカプトアミノ酸残基、例えば３−メルカプトバリン（ペニシラミン）、Ｎ１Ｓ１残基を構築する上記の全てと共に、使用してよい。これらの全ての場合に、Ｓは、上記のごとく、Ｓ−Ｂｕｔ、Ｓ−Ａｃｍ、Ｍｍｔ、Ｎｐｙｓ、Ｓ−スルフォネートおよび関連基によって保護することができる。
【０１０６】
ペプチド、例えばライブラリー中のペプチドへの、特にペプチドのＭＣＤへの金属イオンの錯結合は、ペプチドを金属イオンと混合することによって達成される。これは従来から溶液中で、適切な緩衝剤を含有する溶液と共に行われる。一つの手法では、ペプチドまたはペプチド擬制構成体と混合する場合に、金属イオンは既にＭＣＤへの錯結合に最も好ましい酸化状態にある。最も安定な酸化状態で錯結合する金属イオンがあり、例えばカルシウム（ＩＩ）、カリウム（Ｉ）、インジウム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、亜鉛（ＩＩ）等の金属である。他の場合には、金属は、ＭＣＤへの錯結合のために酸化の低い状態に還元しなければならない。これは、第一鉄、第二鉄、第一錫、第二錫、テクネリウムオキソ（Ｖ）、パーテクネテート、レニウムオキソ（Ｖ）、パーレネートおよび他の同様な金属イオンについて成立する。還元は配列との混合前、配列との混合と同時、あるいは配列との混合後に行ってよい。金属イオンを所望の酸化状態に還元するには当分野で公知のどのような手段でも採用してよい。
【０１０７】
ＲｅおよびＴｃは、特に得られるメタロペプチドが精製され、例えば凍結乾燥によって溶液から取りだされ、安定であるという点で、使用するのに好ましい金属イオンである。他のメタロペプチド、例えばＺｎ、Ｃｕ、Ｎｉ、Ｃｏ、ＦｅおよびＭｎが使用されているメタロペプチドは溶液で安定であるが、溶液から取りだされると酸化および金属イオンの損失を受け易い。したがって、これらのメタロペプチドは、常に、例えばアッセイおよび他のテストの実行中は、溶液中で、かつ好ましくは適切なｐＨで適切な緩衝剤と共に、保存する必要がある。これにより、これら金属イオンの使用には多少の制限が加えられる。しかし、本明細書で述べているように、ＲｅまたはＴｃ以外の金属イオンが使用されているメタロペプチドを使用してもよい。
【０１０８】
金属イオンとの四座配位に対しては、レニウムまたはテクネチウムは好ましいイオンである。入手が容易であり、配位錯体が安定であるために、Ｒｅは特に好ましい金属イオンである。固相樹脂に結合したペプチドまたはペプチド擬制体の配列は、塩基、例えば１，８−ジアザビシクロ［５，４，０］ウンデセ−７−エン（ＤＢＵ）の存在下に、レニウム伝達剤Ｒｅ（Ｏ）Ｃｌ３（ＰＰｈ３）２で処理することにより、レニウムイオンで標識化してもよい。次に配列を樹脂から開裂させればよい。溶液中のペプチドまたはペプチド擬制体の配列は、塩基、例えばトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ−メチルモルフォリンまたはＤＢＵの存在下にＲｅ（Ｏ）Ｃｌ３（ＰＰｈ３）２で処理することにより、同様に標識化してもよい。塩基としてのＤＢＵの存在下で行うと、金属錯結合は室温で完成するので便利である。
【０１０９】
金属錯結合の別の方法では、緩和な塩基、例えば酢酸ナトリウムを使用することができる。この場合には、チオール含有配列を、溶液とするかまたは固相に結合して適当な溶媒、例えばジメチルフォルムアミド（ＤＭＦ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、メタノール（ＭｅＯＨ）またはこれらの混合液に取り、レニウム伝達剤Ｒｅ（Ｏ）Ｃｌ３（ＰＰｈ３）２と共に、酢酸ナトリウムの存在下に１５分間６０〜７０℃に加熱する。同様にトリエチルアミン、水酸化アンモニウム等他の塩基を使用してもよい。本発明によれば、溶液中のＳ−脱被保護ペプチドをレニウム錯結合する場合には、ＭｅＯＨが好ましい選択溶媒である。固相に結合したままのＳ−脱被保護ペプチドに対する溶媒は、主に固相の溶媒和（膨潤）性の優劣を考慮して選択される。ＤＭＦおよびＮＭＰを使用してもよい。ＭｅＯＨおよびＤＣＭ、ＣＨＣｌ３等と組合せたこれら溶媒の混合液も錯結合成果を最適化するために使用してよい。
【０１１０】
本発明の一実施例では、ＳｔＢｕで保護されたペプチドをそのままレニウム伝達剤と共にＤＢＵおよびトリブチルフォスフィンの存在下で処理することにより、Ｓ−脱保護とレニウム錯結合とを一つの容器で達成している。あるいは、レニウムパーレネートの存在下に、ＳｔＢｕで保護されたペプチドにレニウムを錯結合するのは、塩化第二錫での処理で完成してもよい。この試薬は、Ｓ−脱保護並びにＲｅＯ４状態のＲｅＯ状態へのその場での転換に有効なので、Ｓ−脱保護ペプチドへのレニウムの錯結合が達成される。本発明の好ましい手順は、Ｓ−Ｂｕｔで保護されたペプチドを使用し、トリブチルフォスフィンで処理してＳ−脱保護し、得られたペプチドをＤＢＵの存在下に室温でＲｅ（Ｏ）Ｃｌ３（ＰＰｈ３）２により金属錯結合することである。
【０１１１】
本発明のペプチドのライブラリーを作成し、次に得られたペプチドをレニウム等の金属イオンに錯結合してメタロペプチドを得ることは可能であり、予期される。このようなライブラリーは固相ライブラリーでもよく、あるいは液相ライブラリーでもよい。
【０１１２】
上記したごとく、先ず親ポリペプチドに基づいて、周知のペプチド合成法によりペプチドライブラリーを組み立てる。このやり方で固相ライブラリーも可溶性ライブラリーも得ることができる。次に全ライブラリーを適当な金属錯結合剤と反応させ、予め決定した構造の類似クラスを含んでいる、対応する金属配位ライブラリーを得る。例えば、ペプチドライブラリーをレニウムオキソ金属イオンと錯結合するために、ペプチドライブラリーを酢酸ナトリウムの存在下にＲｅ（Ｏ）Ｃｌ３（ＰＰｈ３）２と共に処理することができる。この手順の結果、ＲｅＯがペプチドと定量的に錯結合する。Ｚｎ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｍｎ、ＦｅまたはＣｕイオンを錯結合するために、ペプチドライブラリーをこれら金属イオンの塩化物または他の適当な塩と処理すると、対応する金属イオンのライブラリーが得られる。基本的には、各種金属イオンを使用して異なるメタロペプチドライブラリーを構築できる。適切な金属イオンの選定における一つの制限要因は特定の金属−ペプチド錯体の相対的な安定性であって、これは大部分が金属−ペプチド錯体の結合定数に関連する。当分野で周知であるが、特定範囲内のｐＨまたは他の特別な条件下でのみ安定である、あるいは空気中で容易に酸化される、金属−ペプチド構造体がある。他のペプチド−金属イオン錯体、例えばＲｅＯとの錯体は純粋形態で安定であり、単離が可能であり、通常の保存条件で長期間保存可能である。
【０１１３】
好ましい実施例で、メタロペプチドの合成に固相法が採用されており、ペプチドが固相上に存在する間に金属イオン錯結合も達成される。Ｆｍｏｃの化学を利用して、ＳｔＢｕで保護されたＣｙｓ誘導体を使用してリング状アミド樹脂の上に線状ペプチドを完全に組み立てる。ペプチド合成に続き、Ｂｕ３ＰのＤＭＦ溶液で処理してＳｔＢｕ基を除去する。得られた遊離−ＳＨ含有ペプチド−樹脂を、塩基としてのＤＢＵの存在下でレニウム伝達剤Ｒｅ（Ｏ）［Ｖ］Ｃｌ３（ＰＰｈ３）２と共に処理する。完全な金属イオン錯結合が室温で２時間以内に達成される。得られたメタロペプチド樹脂を洗浄し、乾燥し、次にＴＦＡで処理してメタロペプチドを樹脂から開裂させ、側鎖保護基を全て除去する。メタロペプチドをＨＰＬＣで精製し、質量スペクトル法およびアミノ酸分析により特徴化する。
【０１１４】
以下の非制限的実施例によって本発明を更に説明する。
【０１１５】
実施例１
ウロキナーゼ型組織プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）のアミノ末端断片の（ＡＴＦ）でｕＰＡ受容体への結合は十分である。特に、その結合能は、Ｃｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド架橋に収納されているＡＴＦの２１−３０番アミノ酸配列からなるオメガループ領域に存在することが証明されている。このオメガループに対応するＮおよびＣ末端がキャップされた１１アミノ酸ペプチドを選択して、Ｒｅ錯結合メタロペプチドのシリーズを作成し、この配列に存在し生物学的な関連を有する逆ターン構造の構造と位置を決定した。配列Ａｃ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−ＮＨ２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を有する親ポリペプチド、ここでは親ペプチドに対して、位置２の後ろから位置ｎ＋１までにＣｙｓを系統的に挿入した。ここでｎは親ペプチドの残基数である。一連の１０個のペプチドを固相ペプチド合成の標準的な方法で合成した。Ｃｙｓの−ＳＨ基は直交性のＳ−ｔＢｕ基で保護した。各個別のペプチドを樹脂上に完全に組立てた後に、Ｓ−ｔＢｕ基をトリブチルフォスフィンで処理して除去し、次にペプチド樹脂をＤＢＵの存在下にＲｅオキソ伝達剤Ｒｅ（Ｏ）Ｃｌ３（ＰＰｈ３）２で処理してメタロペプチドを形成した。次にペプチド樹脂をＴＦＡで処理し、樹脂から得られたメタロペプチドを開裂させた。メタロペプチドを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製し、Ｕ９３７細胞と競合的受容体結合リガンドとしてＡＴＦを使用する受容体結合アッセイ法でアッセイした。表１に示すデータから、レニウムイオンに結合してメタロペプチドを形成したペプチドＡｃ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−ＮＨ２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）がこれら全ての分子の中で最も有力であり、ＢＤの位置はこのペプチドのＩｌｅ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ断片周辺にあると示唆していることが判る。表の他の化合物から、ファルマコフォアには関連しないターン構造は、ｕＰＡ受容体結合に係わることが示された。したがって、このペプチド断片におけるターン構造の位置を示すには、系統的に合成された１０個の分子からなるこのシリーズで十分である。表１Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の帰属は図１１の原型に示されている。
【表１】
2005501220.tif 000002
【０１１６】
実施例２
Ａｃ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＮＨ２はメラノトロピン受容体に対する既知の受容体結合配列である。ＭＣＲ−１および−４への結合を示すＫ１値は、それぞれ０．１μＭおよび２μＭと測定された。この配列に基づく一連のメタロペプチドは、実施例１で記載したと同様に、位置２の後ろから位置ｎ＋１までにＣｙｓ残基を順番に挿入し、得られたＣｙｓ含有ペプチドをＲｅオキソ金属イオンと錯結合して合成した。得られたメタロペプチドを、ＭＣＲ−１に対するＢ−１６マウスのメラノーマ細胞およびクローン化したヒトＭＣＲ−２，−３および−４受容体で形質転換した２９３細胞を使用し、１２５Ｉ−ＮＤＰ−ＮＤＰ−ａｌｐｈａ−ＭＳＨ放射性リガンドの結合に対する阻害につき、スクリーニングした。
【０１１７】
１ ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ ｍＭ ＣａＣｌ２ および ５ ｍＭ ＫＣｌ をｐＨ ７．２で含有する５０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ 緩衝液中の、０．４ ｎＭ １２５Ｉ−ＮＤＰ−ａｌｐｈａ−ＭＳＨ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ， Ｂｏｓｔｏｎ， ＭＡ， ＵＳＡ）を使用し、ｈＭＣ３−Ｒ、ｈＭＣ４−Ｒ、ｈＭＣ５−Ｒ、および Ｂ−１６ マウスメラノーマ細胞 （ＭＣ１−Ｒを含有）から調製した膜を使用して競合阻害結合アッセイを行った。アッセイ用チューブに、既述のようにレニウムイオンに錯結合させた、濃度を選択した本発明のテスト用ペプチドを入れ、受容体に対する１２５Ｉ−ＮＤＰ−ａｌｐｈａ−ＭＳＨの結合を阻害する効力を測定した。非特異的結合は、１ μＭ ａｌｐｈａ−ＭＳＨの存在により１２５Ｉ−ＮＤＰ−ａｌｐｈａ−ＭＳＨの結合を完全に阻害してアッセイすることにより測定した。インキュベーションは室温で９０分間行い、その後アッセイ用混合物を濾過し、膜を氷冷緩衝液で３回洗浄した。フィルターを乾燥し、ガンマ計数管でカウントし、膜に結合した残存放射活性を求めた。１ μＭ ａｌｐｈａ−ＭＳＨの存在しない場合と存在する場合における細胞膜に結合した放射活性（ｃｐｍ）の差をもって１００％特異結合率を定義した。テスト用化合物の存在下で得られたｃｐｍを１００％特異結合率に関して規格化し、１２５Ｉ−ＮＤＰ−ａｌｐｈａ−ＭＳＨ結合への阻害率を決定した。各アッセイを３回行い、実際の平均値を表２に示す。
【０１１８】
データを表２に示す。Ａｃ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−ＮＨ２のメタロペプチドは、レニウムオキソ金属イオンの錯結合により生じた立体配置的に拘束された構造を呈しており、この構造は、ＭＣＲ−１受容体にはＢＤ特異的であるが、ＭＣＲ−４受容体には特異的でなかった。この構造モチーフの座位はＤ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ配列に含まれていた。したがって、このターンのモチーフからＭＣＲ−１に特異的な強力リガンドが開発された。Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ配列の座位を有する拘束された構造モチーフＡｃ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−ＮＨ２からＭＣＲ−１およびＭＣＲ−４受容体の両方に結合するファルマコフォアが提供された。表２のＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の帰属は図１１の原型に示されている。
【表２】
2005501220.tif 000003
【０１１９】
実施例３
アルツハイマーおよびプリオン疾患
アルツハイマーおよびプリオン疾患、例えばクロイツフェルトヤコブ病およびプリオンにより駆動される疾患は、蛋白質構造の疾病である。これらは神経衰退疾患であり、痴呆に至る。多くの場合に、疾患原因はそれぞれの疾患に関連した蛋白質、すなわちアルツハイマー疾患ではアミロイド−ベータ、プリオン疾患では糖蛋白質ＰｒＰｓｃの一組の立体配置の変化であり、結果的にはベータシート構造モチーフのレベルが高くなっている。各蛋白質の特異配列に関連してベータシート構造の形成を不安定化する能力を付加的に有するペプチドであって、かつ疾患状態に寄与している蛋白質部分に結合可能なペプチドば、疾患の進展を止める有用な治療剤であろうし、疾患の逆転さえもたらすかもしれない、ということが示されている。他の研究者が開発している一連の線状ペプチドは疾患状態の蛋白質に特異的な結合を示し、治療力の見込みがあることを示している。例えば、Ｓｏｔｏ Ｃ： Ｐｌａｑｕｅ ｂｕｓｔｅｒｓ： Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｔｏ ｉｎｈｉｂｉｔ ａｍｙｌｏｉｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ． Ｍｏｌ． Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｔｏｄａｙ， ５： ３４３−３５０ （１９９９）； Ｓｏｔｏ Ｃ． ｅｔ ａｌ．： Ｂｅｔａ−ｓｈｅｅｔ ｂｒｅａｋｅｒ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎｈｉｂｉｔ ｆｉｂｒｉｌｌｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ａ ｒａｔ ｂｒａｉｎ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ： Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ４： ８２２−８２６ （１９９８）； Ｓｏｔｏ Ｃ： Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ａｎｄ ｐｒｉｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ ａｓ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ：  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｍｅｄ．， ７７： ４１２−４１８ （１９９９）； および Ｓｏｔｏ Ｃ ｅｔ ａｌ．： Ｒｅｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｐｒｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｂｙ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂｅｔａ−ｓｈｅｅｔ ｂｒｅａｋｅｒ ｐｅｐｔｉｄｅｓ． Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ， ３５５： １９２−１９７ （２０００）を参照。
【０１２０】
本発明のメタロペプチドを使用して、少なくとも一部のアミノ酸配列にＲｅ金属イオンが配位することに基づいて、親ポリペプチドの一部に立体配置的な制約を加えることができる。得られるメタロペプチドはタンパク分解性に安定であり、概して対応する親ペプチドよりも疎水性である。基礎となるメタロポリペプチドの原形も、適切な側鎖機能性で装飾して、例えば、アルツハイマーやプリオン疾患に関連するペプチドのような天然ペプチドの生物活性組織分布を模倣する組織分布を生み出すかもしれない。
【０１２１】
「本発明の代表的アルツハイマー疾患ペプチド」
１７〜２０の疎水性領域のペプチド（ＬＶＦＦ）は、特異的なベータシート・ブレイカーペプチドを開発する原型としてある程度役立つ。表３の線状ペプチド配列は、レニウム等の金属イオンに結合してメタロペプチドを形成するペプチド配列を合理的に設計するための最初の原型として使用される。
【表３】
ＡＤ処理用のアミロイドベータ蛋白質関連ペプチド
Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）
Ａｃ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−ＮＨ２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）
Ａｃ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−ＮＨ２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）
表３に記載の親ポリペプチドまたはペプチドは、本発明の方法および構成体を使用してＬ−ＣｙｓかＤ−Ｃｙｓを有する一連のメタロペプチドを合成するための原型として使用できる。本発明の実施ではＮ１Ｓ１残基、例えばシステインを使用するが、システインはＬ−Ｃｙｓ でもＤ−Ｃｙｓでもよい。標準的なペプチド合成技法を使用してペプチドを構築するが、その中の選択点にシステインを挿入する。Ｃｙｓの−ＳＨ基は上記した直交性の保護基を使用して保護してよい。次に得られたＣｙｓ含有ペプチドを脱保護し、続いて、予め調製しておいた適切な金属オキソ伝達剤、例えばＲｅ（Ｏ）Ｃｌ３（ＰＰｈ３）２を使用し、レニウムイオンと錯結合させてメタロペプチドを形成する。競合阻害結合アッセイを使用して、得られた各メタロペプチドの結合性を親ペプチドと対比し、結合性が強化または増加しているメタロペプチドを識別する。
【０１２２】
この手法を使用して、一連の最初のおよび前駆体のメタロペプチドを表４に記載のごとく規定してある。
【表４】
ＡＤ用の前駆体メタロペプチド
Ｒ１−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａａａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｒ２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）
Ｒ１−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａａａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｒ２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）
Ｒ１−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａａａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｒ２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）
Ｒ１−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａａａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｒ２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）
Ｒ１−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａａａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｒ２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）
Ｒ１−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｂｂｂ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｒ２  （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）
Ｒ１−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｂｂｂ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｒ２  （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）
Ｒ１−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｂｂｂ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｒ２  （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）
Ｒ１−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ａａａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｒ２  （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）
Ｒ１−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ａａａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｒ２  （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）
Ｒ１−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａａａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｒ２  （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）ここで、
Ｒ１ は Ｈ （Ｎ−末端が遊離アミノ基） または Ａｃ （Ｎ−末端にアセチル基）；
Ｒ２ は ＯＨ （Ｃ−末端にカルボキシル基） または ＮＨ２ （Ｃ−末端がアミド基）；
Ａａａ は Ｖａｌ， Ｐｒｏ， Ｇｌｙ または Ａｌａ；
Ｂｂｂ は Ｖａｌ， Ｇｌｙ または Ａｌａ；
Ｃｙｓ は Ｌ−Ｃｙｓ または Ｄ−Ｃｙｓ 、および
Ｃｙｓの前３個のアミノ酸残基およびＣｙｓに直接続く１個のアミノ酸はＬアミノ酸残基かＤアミノ酸残基か、またはそれらの任意の組合せである。
【０１２３】
下記ペプチドのシリーズは、表４のペプチドのシリーズから誘導される。各シリーズにおいて、ペプチドの長さはＮ末端またはＣ末端、または両方から連続的に短くなる。以下のシリーズ（表５から表１４）において、Ｒ１、Ｒ２、Ａａａ、ＢｂｂおよびＣｙｓは定義通りであり、Ｃｙｓの前３個のアミノ酸残基およびＣｙｓに直接続く１個のアミノ酸はＬアミノ酸残基かＤアミノ酸残基か、またはそれらの任意の組合せである。
【表５】
Ｒ３−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｒ２
ここでＲ３は
Ｒ１−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａａａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）
Ｒ１−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａａａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）
Ｒ１−Ｌｅｕ−Ａａａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）
Ｒ１−Ａａａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）
Ｒ１−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）
Ｒ１−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ，
Ｒ１−Ａｌａ−Ｇｌｕ，
Ｒ１−Ｇｌｕ， または
Ｒ１．
【表６】
Ｒ４−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｒ５
ここでＲ４は
Ｒ１−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａａａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）
Ｒ１−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａａａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）
Ｒ１−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａａａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）
Ｒ１−Ｌｅｕ−Ａａａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）
Ｒ１−Ａａａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ，
Ｒ１−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ，
Ｒ１−Ｐｈｅ−Ａｌａ，
Ｒ１−Ａｌａ， または
Ｒ１；
かつＲ５ は
Ｖａｌ−Ｒ２， または
Ｒ２．
【表７】
Ｒ６−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｒ７
ここでＲ６ は
Ｒ１−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａａａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）
Ｒ１−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａａａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）
Ｒ１−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａａａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）
Ｒ１−Ｌｅｕ−Ａａａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ，
Ｒ１−Ａａａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ，
Ｒ１−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ，
Ｒ１−Ｐｈｅ， または
Ｒ１；
かつ Ｒ７ は
Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｒ２，
Ａｓｐ−Ｒ２，または
Ｒ２．
【表８】
Ｒ８−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｒ９
ここで Ｒ８ は
Ｒ１−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａａａ−Ｐｈｅ， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）
Ｒ１−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａａａ−Ｐｈｅ， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）
Ｒ１−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａａａ−Ｐｈｅ，
Ｒ１−Ｌｅｕ−Ａａａ−Ｐｈｅ，
Ｒ１−Ａａａ−Ｐｈｅ，
Ｒ１−Ｐｈｅ， または
Ｒ１；
かつ Ｒ９ は
Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｒ２，
Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｒ２，
Ｇｌｕ−Ｒ２， または
Ｒ２．
【表９】
Ｒ９−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｒ１０
ここで Ｒ９ は
Ｒ１−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａａａ， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）
Ｒ１−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａａａ，
Ｒ１−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａａａ，
Ｒ１−Ｌｅｕ−Ａａａ，
Ｒ１−Ａａａ，
Ｒ１，
Ｒ１−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｂｂｂ， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）
Ｒ１−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｂｂｂ，
Ｒ１−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｂｂｂ，
Ｒ１−Ｌｅｕ−Ｂｂｂ， または
Ｒ１−Ｂｂｂ；
かつ Ｒ１０ は
Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｒ２， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）
Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｒ２，
Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｒ２，
Ｇｌｕ−Ｒ２， または
Ｒ２．
【表１０】
Ｒ１１−Ｂｂｂ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｒ１２
ここで Ｒ１１ は
Ｒ１−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）
Ｒ１−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ，
Ｒ１−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ，
Ｒ１−Ｌｅｕ， または
Ｒ１；
かつ Ｒ１２ は
Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｒ２， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５）
Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｒ２， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）
Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｒ２，
Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｒ２，
Ｐｈｅ−Ｒ２， または
Ｒ２．
【表１１】
Ｒ１３−Ｌｅｕ−Ｂｂｂ−Ｃｙｓ−Ｒ１４
ここで Ｒ１３ は
Ｒ１−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ，
Ｒ１−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ，
Ｒ１−Ｌｙｓ， または
Ｒ１；
かつ Ｒ１４ は
Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｒ２， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７）
Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｒ２， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８）
Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｒ２， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９）
Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｒ２，
Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｒ２，
Ｐｈｅ−Ｒ２， または
Ｒ２．
【表１２】
Ｒ１５−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｒ１６
ここで Ｒ１５ は
Ｒ１−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ，
Ｒ１−Ｇｌｎ， または
Ｒ１；
かつ Ｒ１６ は
Ａａａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｒ２， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０）
Ａａａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｒ２， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１）
Ａａａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｒ２， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２）
Ａａａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｒ２，
Ａａａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｒ２，
Ａａａ−Ｐｈｅ−Ｒ２，
Ａａａ−Ｒ２，
Ｒ２，
Ｂｂｂ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｒ２， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３）
Ｂｂｂ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｒ２， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４）
Ｂｂｂ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｒ２， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５）
Ｂｂｂ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｒ２，
Ｂｂｂ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｒ２，
Ｂｂｂ−Ｐｈｅ−Ｒ２， または
Ｂｂｂ−Ｒ２．
【表１３】
Ｒ１７−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｒ１８  （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６）
ここで Ｒ１７ は
Ｒ１−Ｈｉｓ または
Ｒ１；
かつ Ｒ１８ は
Ｌｅｕ−Ａａａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｒ２， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７）
Ｌｅｕ−Ａａａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｒ２， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８）
Ｌｅｕ−Ａａａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｒ２， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９）
Ｌｅｕ−Ａａａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｒ２， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０）
Ｌｅｕ−Ａａａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｒ２，
Ｌｅｕ−Ａａａ−Ｐｈｅ−Ｒ２，
Ｌｅｕ−Ａａａ−Ｒ２，
Ｌｅｕ−Ｒ２， または
Ｒ２．
【表１４】
Ｒ１−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｒ１９
ここで Ｒ１９ は
Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａａａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｒ２， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１）
Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａａａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｒ２， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２）
Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａａａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｒ２， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３）
Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａａａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｒ２， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４）
Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａａａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｒ２， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５）
Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａａａ−Ｐｈｅ−Ｒ２，
Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａａａ−Ｒ２，
Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｒ２，
Ｌｙｓ−Ｒ２， または
Ｒ２．
【０１２４】
本発明の代表的なプリオン疾患ペプチド
本発明の他の実施例で、プリオン疾患、例えば限定はされないが、クロイツフェルトヤコブ病、変異クロイツフェルトヤコブ病、および関連するプリオン駆動性疾患の治療に使用するためのペプチドが提供されている。表１５の線状ペプチド配列は、レニウム等の金属イオンに結合してメタロペプチドを形成するペプチド配列を合理的に設計するための親ペプチドとして使用される。
【表１５】
Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６）
【０１２５】
表１５に記載の親ポリペプチドまたはペプチドは、本発明の方法および構成体を使用してＬ−ＣｙｓかＤ−Ｃｙｓを有する一連のメタロペプチドを合成するための原型として使用できる。本発明の実施ではＮ１Ｓ１残基、例えばシステインを使用するが、システインはＬ−ＣｙｓでもＤ−Ｃｙｓでもよい。標準的なペプチド合成技法を使用してペプチドを構築するが、その中の選択点にシステインを挿入する。Ｃｙｓの−ＳＨ基は上記した直交性の保護基を使用して保護してよい。次に得られたＣｙｓ含有ペプチドを脱保護し、続いて、予め調製しておいた適切な金属オキソ伝達剤、例えばＲｅ（Ｏ）Ｃｌ３（ＰＰｈ３）２を使用て、レニウムイオンと錯結合させてメタロペプチドを形成する。競合阻害結合アッセイを使用して、得られた各メタロペプチドの結合性を親ペプチドと対比し、結合性が強化または増加しているメタロペプチドを識別する。
【０１２６】
この方法を使用して、前駆体分子のシリーズを表１６に記載のごとく規定してある。
【表１６】
プリオン疾患用の前駆体メタロペプチド
2005501220.tif 000004
ここで：
Ｓ１ は Ｈ （Ｎ−末端は遊離アミノ基） または Ａｃ （Ｎ−末端にアセチル基）；
Ｓ２ は ＯＨ （Ｃ−末端に遊離カルボン酸塩） または ＮＨ２ （Ｃ−末端はアミド基）；
Ａａａ は Ｇｌｙ または Ａｌａ；
Ｂｂｂ は Ｐｒｏ， Ｇｌｙ または Ａｌａ； および
Ｃｙｓの前３個のアミノ酸残基およびＣｙｓに直接続く１個のアミノ酸はＬアミノ酸残基かＤアミノ酸残基か、またはそれらの任意の組合せである。
【０１２７】
以下のペプチドのシリーズは表１６のペプチドのシリーズから誘導される。各シリーズにおいて、ペプチドの長さはＮ末端またはＣ末端、または両方から連続的に短くなる。以下のシリーズ（表１７から表２８）において、Ｓ１、Ｓ２、Ａａａ、ＢｂｂおよびＣｙｓは定義通りであり、Ｃｙｓの前３個のアミノ酸残基およびＣｙｓに直接続く１個のアミノ酸はＬアミノ酸残基かＤアミノ酸残基か、またはそれらの任意の組合せである。
【表１７】
Ｓ３−Ａａａ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｓ２
ここで Ｓ３ は
Ｓ１−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌ， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９）
Ｓ１−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌ， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０）
Ｓ１−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌ， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１）
Ｓ１−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌ， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２）
Ｓ１−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌ， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３）
Ｓ１−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌ， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４）
Ｓ１−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌ， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５）
Ｓ１−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌ， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６）
Ｓ１−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌ，
Ｓ１−Ａｌａ−Ｖａｌ，
Ｓ１−Ｖａｌ， または
Ｓ１．
【表１８】
Ｓ４−Ｖａｌ−Ａａａ−Ｃｙｓ−Ｓ５
ここで Ｓ４ は
Ｓ１−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７）
Ｓ１−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８）
Ｓ１−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９）
Ｓ１−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０）
Ｓ１−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１）
Ｓ１−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２）
Ｓ１−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３）
Ｓ１−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ，
Ｓ１−Ｐｒｏ−Ａｌａ，
Ｓ１−Ａｌａ， または
Ｓ１；
かつ Ｓ５ は
Ｖａｌ−Ｓ２ または
Ｓ２．
【表１９】
Ｓ６−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｓ７
ここで Ｓ６ は
Ｓ１−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｂｂｂ， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４）
Ｓ１−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｂｂｂ， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５）
Ｓ１−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｂｂｂ， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６）
Ｓ１−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｂｂｂ， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７）
Ｓ１−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｂｂｂ， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８）
Ｓ１−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｂｂｂ，
Ｓ１−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｂｂｂ，
Ｓ１−Ｇｌｙ−Ｂｂｂ，
Ｓ１−Ｂｂｂ， または
Ｓ１；
かつ Ｓ７ は
Ｂｂｂ−Ｖａｌ−Ｓ２，
Ｖａｌ−Ｓ２， または
Ｓ２．
【表２０】
Ｓ８−Ａａａ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｓ９
ここで Ｓ８ は
Ｓ１−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９９）
Ｓ１−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１００）
Ｓ１−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１）
Ｓ１−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０２）
Ｓ１−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３）
Ｓ１−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ，
Ｓ１−Ａｌａ−Ｇｌｙ，
Ｓ１−Ｇｌｙ， または
Ｓ１；
かつ Ｓ９ は
Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｓ２，
Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｓ２，
Ｖａｌ−Ｓ２， または
Ｓ２．
【表２１】
Ｓ１０−Ｇｌｙ−Ａａａ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｓ１１， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４）
ここで Ｓ１０ は
Ｓ１−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５）
Ｓ１−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０６）
Ｓ１−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７）
Ｓ１−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８）
Ｓ１−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ，
Ｓ１−Ｐｒｏ−Ａｌａ，
Ｓ１−Ａｌａ， または
Ｓ１；
かつ Ｓ１１ は
Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｓ２， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９）
Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｓ２，
Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｓ２，
Ａｌａ−Ｓ２， または
Ｓ２．
【表２２】
Ｓ１２−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｂｂｂ−Ｓ１３
ここで Ｓ１２ は
Ｓ１−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｂｂｂ， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１０）
Ｓ１−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｂｂｂ， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１）
Ｓ１−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｂｂｂ，
Ｓ１−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｂｂｂ，
Ｓ１−Ａｌａ−Ｂｂｂ，
Ｓ１−Ｂｂｂ， または
Ｓ１；
かつ Ｓ１３ は
Ｂｂｂ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｓ２，
Ｂｂｂ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｓ２，
Ｂｂｂ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｓ２，
Ｂｂｂ−Ａｌａ−Ｓ２，
Ｂｂｂ−Ｓ２， または
Ｓ２．
【表２３】
Ｓ１４−Ａａａ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｓ１５
ここで Ｓ１４ は
Ｓ１−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１２）
Ｓ１−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３）
Ｓ１−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ，
Ｓ１−Ａｌａ−Ａｌａ，
Ｓ１−Ａｌａ， または
Ｓ１；
かつ Ｓ１５ は
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｓ２， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４）
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｓ２， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１５）
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｓ２， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６）
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓ２，
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓ２，
Ｇｌｙ−Ｓ２， または
Ｓ２．
【表２４】
Ｓ１６−Ａｌａ−Ａａａ−Ｃｙｓ−Ｓ１７
ここで Ｓ１６ は
Ｓ１−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７）
Ｓ１−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ，
Ｓ１−Ｐｒｏ−Ａｌａ，
Ｓ１−Ａｌａ， または
Ｓ１；
かつ Ｓ１７ は
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｓ２， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８）
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｓ２， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１９）
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｓ２， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２０）
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓ２， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１）
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓ２，
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓ２，
Ａｌａ−Ｓ２， または
Ｓ２．
【表２５】
Ｓ１８−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｂｂｂ−Ｓ１９
ここで Ｓ１８ は
Ｓ１−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｂｂｂ，
Ｓ１−Ａｌａ−Ｂｂｂ，
Ｓ１−Ｂｂｂ， または
Ｓ１；
かつ Ｓ１９ は
Ｂｂｂ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｓ２， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２２）
Ｂｂｂ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｓ２， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２３）
Ｂｂｂ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｓ２， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２４）
Ｂｂｂ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓ２， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５）
Ｂｂｂ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓ２，
Ｂｂｂ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓ２，
Ｂｂｂ−Ａｌａ−Ｓ２，
Ｂｂｂ−Ｓ２， または
Ｓ２．
【表２６】
Ｓ２０−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａａａ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｓ２１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２６）
ここで Ｓ２０ は
Ｓ１−Ａｓｐ−Ａｌａ，
Ｓ１−Ａｌａ， または
Ｓ１；
かつ Ｓ２１ は
Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｓ２， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２７）
Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｓ２， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２８）
Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｓ２， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２９）
Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓ２， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３０）
Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓ２， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３１）
Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓ２， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３２）
Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓ２，
Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｓ２，
Ａｌａ−Ｓ２， または
Ｓ２．
【表２７】
Ｓ２２−Ａｌａ−Ａａａ−Ｃｙｓ−Ｓ２３
ここで Ｓ２２ は
Ｓ１−Ａｓｐ または
Ｓ１；
かつ Ｓ２３ は
Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｓ２， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３３）
Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｓ２， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３４）
Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｓ２， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３５）
Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓ２， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６）
Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓ２， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３７）
Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓ２， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８）
Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓ２， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３９）
Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｓ２，
Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓ２，
Ａｌａ−Ｓ２， または
Ｓ２．
【表２８】
Ｓ１−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｂｂｂ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｓ２４ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４０）
ここで Ｓ２４ は
Ｂｂｂ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｓ２， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４１）
Ｂｂｂ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｓ２， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２）
Ｂｂｂ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｓ２， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４３）
Ｂｂｂ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓ２， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４４）
Ｂｂｂ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓ２， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４５）
Ｂｂｂ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓ２， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４６）
Ｂｂｂ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓ２， （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４７）
Ｂｂｂ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｓ２，
Ｂｂｂ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓ２，
Ｂｂｂ−Ａｌａ−Ｓ２，
Ｂｂｂ−Ｓ２， または
Ｓ２．
【０１２８】
実施例４
既知のバソプレシンリガンドＰｍｐ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｄａｐ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｏｒｎを基礎にして別のペプチドライブラリーを開発した。ここでＰｍｐはβ−メルカプト−β、β−シクロペンタメチレンプロピオニル、Ｄａｐはジアミノプロピオン酸である （Ｃｈａｎ ＷＹ ｅｔ ａｌ．： Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ ａｎｄ ｏｘｙｔｏｃｉｎ ａｇｏｎｉｓｔｓ ａｎｄ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ： ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｂｉｏａｓｓａｙｓ， Ｅｘｐ Ｐｈｙｓｉｏｌ ８５： Ｓｐｅｃ Ｎｏ：７Ｓ−１８Ｓ， ２０００）。このリガンドには１と６の残基の間にジスルフィド架橋がある。内在性のＣｙｓを、Ｃｙｓのように比較的小さな中性アミノ酸であるＡｌａで置換した。この置換により、位置６の内在性Ｃｙｓを保護する必要がなくなった。同様に、Ｎ末端のβ−メルカプト−β、β−シクロペンタメチレンプロピオニル基をシクロヘキシル酢酸で置換した。この置換により、１と６の位置にある二つの残基の内在性−ＳＨ基を保護しその後に脱保護する必要がなくなった。更に、各種の中性Ｎ末端残基、例えばシクロヘキシグリシン（Ｃｈｇ）、ＰｍｐまたはＤ−Ｃｈｇを有する分子をいくつか作製した。ペプチドは実施例１に概略記載したと同様に作製し、そこに記載のごとくレニウムと錯結合した。次に得られたメタロペプチドは、下の表２９に示してあり、活性についてスクリーニングした。
【０１２９】
ラット子宮から調製した細胞膜を使用してオキシトシン受容体に対するメタロペプチドの結合性をスクリーニングした。ミリポアのマルチスクリーンシステムをアッセイに使用し、０．５％ウシ血清アルブミン燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で新たに保護した９６穴ミリポア濾過プレート（Ｄｕｒａｐｏｒｅ， ０．４５μｍ空隙率）で行った。膜調製物（１０−５０μｇ／穴）を、０．２％ウシ血清アルブミンを含む４１２〜８００ｐＭの３ＨオキシトシンＨＥＰＥＳ緩衝液とテスト化合物（１μＭ最終アッセイ濃度）とで４℃２時間インキュベートした。テスト化合物の代わりにオキシトシン１０−６Ｍを加えて非特異性結合を測定した。インキュベート後に膜を氷冷ＰＢＳで３回濾過と洗浄を行った。膜を空気乾燥しシンチレーションバイアルの中に直接パンチした。シンチレーションカクテルを加え、バイアルに蓋をして１２時間緩く振蕩しフィルターに含まれている放射活性を溶出した。次にバイアルのトリチウムカウントをシンチレーションカウンターで読取った。３Ｈオキシトシンのみを含有する穴での放射活性から１０−６Ｍオキシトシンを含有する穴での放射活性を差引いたものを特異的結合として決定した。アッセイを３回行った。放射トレーサーの受容体に対する特異的結合を阻害する能力によって、テスト化合物の活性プロフィールを形成した。
【０１３０】
ラット肝臓から調製した細胞膜を使用してバソプレシン−１受容体に対して化合物をスクリーニングした。アッセイは、基本的にはオキシトシン受容体アッセイに対し上記したと同様に行った。このアッセイでは、２−４ｎＭの３Ｈバソプレシン−１アンタゴニスト（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｅｍｅｒ−ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手）を放射トレーサーとして使用し、Ａｒｇ８バソプレシン（１μＭアッセイ最終濃度）を使用して非特異的結合を測定した。アッセイを３回行った。放射トレーサーの受容体に対する特異的結合を阻害する能力によって、テスト化合物の活性プロフィールを形成した。
【表２９】
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上の表で、ＭＣＤはイタリック体で表記してある。「Ｃａｃａ」はシクロヘキシル酢酸である。表２９で見ることができるが、配列Ｃａｃａ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｄａｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｏｒｎ−Ｃｙｓ−ＮＨ２において、後に続く二つの配列におけると同様に、ｎ＝７位置のＰｒｏをＡｌａで置換した。その後にＰｒｏを使用した。このように行った目的は、拘束された金属ペプチド核の次にＰｒｏが存在すると立体配置に何かの摂動が起こるのか否かを調べることであった。本セットの化合物に関するデータから、化合物群はバソプレシン受容体を選別しており、これらペプチドの一つは最大の活性を有することが明瞭に示される。顕著に観察されたのは、ジスルフィド架橋により拘束されている親ペプチドと同一の領域において、このペプチドも金属錯結合により拘束されていることである。しかしこの場合、金属イオンにより誘起された拘束は、もっと特別なアミノ酸残基対、Ｄ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅを、生物活性のある配置中で構造的に組織化された主な残基として識別した。親ペプチドにおいて四つのアミノ酸残基Ｄ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｄａｐはジスルフィド拘束の領域にある。かくて、このメタロペプチドによるアプローチにより、一層精密なファルマコフォアモデルが規定された。
【０１３１】
実施例５
既知の天然オキシトシンリガンドＣｙｓ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４８）に基づいて、別のペプチドライブラリーを開発した。このリガンドには１と６の位置に内在性のＣｙｓがある。内在性のＣｙｓを両方とも、Ｃｙｓ同様比較的小さな中性アミノ酸であるＡｌａで置換した。この置換により、位置１と６の内在性Ｃｙｓを保護し続いて脱保護する必要がなくなった。ペプチドは実施例１に概略記載したと同様に作製し、そこに記載のごとくレニウムと錯結合した。次に、下の表３０に示した得られたメタロペプチドは、実施例４に記載のように活性についてスクリーニングした。
【表３０】
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ここでもＭＣＤはイタリック体で示してあり、１番と６番位置の内在性Ｃｙｓ残基はＡｌａで置換されている。本セットの化合物に関するデータから、化合物群はオキシトシン受容体を選別することが示される。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５５のメタロペプチドが最大活性を有し、直接隣接する二つのメタロペプチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５４ および ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５６も活性であった。再び顕著に観察されたのは、ジスルフィド架橋により拘束されている親オキシトシンと同一の領域において、最大活性のメタロペプチドも金属錯結合により拘束されていたことである。しかしこの場合、金属イオンにより誘起された拘束は、もっと特別なアミノ酸残基対、Ｇｌｎ−Ａｓｎを、生物活性のある配置中で構造的に組織化された主な残基として識別した。親ペプチドにおいて四つのアミノ酸残基はジスルフィド拘束の領域にある。かくて、このメタロペプチドによるアプローチにより、一層精密なファルマコフォアモデルが規定された。
【０１３２】
実施例６
既知のアンギオテンシンリガンドＳａｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５９）に基づいて別のペプチドライブラリーを開発した。ここでＳａｒはサルコシンであり、親ペプチドとして働いた （Ｔａｋｅｉ Ｙ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎ Ｃｏｍｐ Ｅｎｄｏｒｉｎｏｌ ９０：２１４， １９９３）。ペプチドは実施例１に概略記載したと同様に作製し、そこに記載のごとくレニウムと錯結合した。次に、下の表３１に示した得られたメタロペプチドは、下記のごとく活性についてスクリーニングした。
【表３１】
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ヒト神経芽細胞腫細胞（ＫＡＮ−ＴＳ）から得た細胞膜を使用して、アンギオテンシン−ＩＩ受容体に対する化合物群の結合性をスクリーニングした。受容体に結合した放射活性を測定した点を除き、概略オキシトシンに対する実施例４に記載したと同様にして、アッセイを３回行った。アンギオテンシンに対して（トリチウム化リガンドの代わりに）放射ヨード化トレーサーリガンドを使用した。この放射ヨード化トレーサーにより、ガンマカウンターを用いた結合した放射活性の直接測定が容易に行われた。最終濃度１〜３ｎＭの１２５Ｉ−Ｔｙｒ４、Ｓａｒ１、Ｉｌｅ８−アンギオテンシン−ＩＩリガンド（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｅｍｅｒ−ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手）を放射トレーサーとして使用し、アンギオテンシン−ＩＩ（１μＭ最終アッセイ濃度）を使用して非特異的結合を測定した。インキュベーション媒体を濾過し、洗浄し、フィルターを乾燥し、フィルターを試験管にパンチした後に、フィルターの放射活性をガンマカウンターで計数した。放射トレーサーの受容体に対する特異的結合を阻害する能力によって、テスト化合物の活性プロフィールを形成した。
【０１３３】
Ｐｒｏは、最後の位置の次にあったので、Ｇｌｙで置換されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６０以外では置換されなかった。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６６ではＧｌｙがＰｒｏを置換しているが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６６での阻害率は、ＧｌｙがＰｒｏを置換したことだけが違うＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６１に比べるとかなり低い。このことから、Ｐｒｏの二級アミノ基が結合に寄与しており、これを一部に使用すれば、受容体のファルマコフォアが規定される可能性がある。
【０１３４】
実施例７
表３のアミロイドベータ蛋白質に基づいて別のペプチドライブラリーを合成した。自動ペプチド合成機を使用して表３２の以下ペプチドを合成し、Ｒｅと錯結合させてメタロペプチドを形成し、次にＨＰＬＣで精製した。
【表３２】
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本発明の包括的または特定的に記載した反応物および／または操作条件をもって前記実施例の反応物および／または操作条件を置換えて再度前記実施例を実施しても、同様な成果を得ることができる。
【０１３５】
以上好ましい実施例を特に参照して本発明を詳細に説明したが、他の実施例によっても同一の結果が達成される。本発明の改変例および修飾例は当業者には自明であるが、そのような修飾例および均等例を添付のクレームに包含することを意図している。上に引用した全ての引例、出願、特許、刊行物の全開示内容を、引用により本明細書に取り込む。
【図面の簡単な説明】
添付図面は、明細書に包含されてその一部を形成し、本発明の一以上の実施例を図示し、詳細説明と一体となって本発明原理の説明に寄与する。図面は、本発明の一以上の好ましい実施例を図示することのみを目的とし、本発明を限定するものと解釈されてはならない。
【図１】図１Ａは、レニウム金属イオンに錯結合したペプチド配列Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ａｌａ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の背骨図であり、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｃｙｓ配列は金属イオン結合性領域を形成しており、これによりメタロペプチドを形成している。
図１Ｂは、古典的ベータＩＩ’ターンの背骨ペプチドの配位図である。
図１Ｃは、図１Ｂの上に重ねた図１Ａの図であり、三つの連続Ｎ末端アミノ酸残基を各Ｃ−α炭素原子において整列している。重ね合わせた構造を比較すると、三つのＣ−α炭素原子の位置に優れた重なりが示されており、計算による原子当りの二乗平均平方根偏差（ＲＭＳＤ）は＜０．０５オングストロームである。図１Ａのターン中心に位置する金属イオンは図１Ｃの天然ベータターン構造を安定化する水素結合に対応している。この図において、メタロペプチドの三つのＣ−β炭素原子は、天然ベータターン構造の方向とは別の方向に指向されており、したがってこれらは追加の化学的空間へのアクセスを提供する。更にメタロペプチドのＣ末端により新たな化学的空間へのアクセスも提供されている。
【図２】図２Ａは、レニウム金属イオンに錯結合したペプチド配列Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｄ−Ｃｙｓ−Ａｌａの背骨図であり、配列Ａｌａ−Ａｌａ−Ｄ−Ｃｙｓが金属イオン結合性領域を形成しており、これによりメタロペプチドを形成している。
図２Ｂは、図１Ｃと同様のやり方で、図１Ｂの上に重ねた図２Ａの図である。これらの構造を比較すると、三つの連続Ｎ末端アミノ酸残基における三つのＣ−α炭素原子の位置に優れた重なりが示されており、同様に重なりのＲＭＳＤは＜０．０５オングストロームである。ターン中心に位置する金属イオンは、同様に天然ベータターン構造を安定化する水素結合に対応している。この図において、メタロペプチドのＣ−β炭素原子は天然ベータターン構造の方向とは別の方向に指向されており、したがってこれらは追加の化学的空間へのアクセスを提供する。更にメタロペプチドのＣ末端により新たな化学的空間へのアクセスが提供されている。しかしこの空間は図１Ａでのメタロペプチドによるアドレス可能な空間とは異なる。
【図３】図３Ａは、延長鎖ペプチド構造の上に重ね合わせた、レニウム金属イオンに錯結合したペプチド配列Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｄ−Ｃｙｓ−Ａｌａの背骨図である。この図では、延長鎖構造における二つの連続アミノ酸残基のＣ−α原子がメタロペプチド配列のＣ１−αおよびＣ２−α原子に重なっている。重ね合わせてみると、Ｃ−β炭素原子を含めて、二つのアミノ酸残基はほぼ類似した化学的並列にて位置取りをしているのが示される。
図３Ｂは、延長鎖ペプチド構造の上に重ね合わせた、レニウム金属イオンに錯結合したペプチド配列Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｄ−Ｃｙｓ−Ａｌａの背骨図である。この図では、延長鎖構造における二つの連続アミノ酸残基のＣ−α原子がメタロペプチド配列のＣ２−αおよびＣ３−α原子に重なっている。重ね合わせてみると、別の化学的空間へのアクセスをＣ２−β炭素原子の位置で可能としながら、これら二つのアミノ酸残基のＣ−α炭素原子並びにＣ３−β炭素原子の精密な位置取りが示されている。
【図４】図４Ａは、β−シートペプチド構造の上に重ね合わせた、レニウム金属イオンに錯結合したペプチド配列Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｄ−Ｃｙｓ−Ａｌａの背骨図である。この図では、β−シート構造における二つの連続アミノ酸残基のＣ−α原子がメタロペプチド配列のＣ１−αおよびＣ２−α原子に重なっている。重ね合わせてみると、これら二つのアミノ酸残基はＣ−β炭素原子と共に類似の化学的並列にあるのが示される。
図４Ｂは、β−シートペプチド構造の上に重ね合わせた、レニウム金属イオンに錯結合したペプチド配列Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｄ−Ｃｙｓ−Ａｌａの背骨図である。この図では、β−シート構造における二つの連続アミノ酸残基のＣ−α原子がメタロペプチド配列のＣ２−αおよびＣ３−α原子に重なっている。重ね合わせてみると、別の化学的空間へのアクセスをＣ２−β炭素原子の位置で可能としながら、これら二つのアミノ酸残基のＣ−α炭素原子並びにＣ３−β炭素原子の精密な位置取りが示されている。
図４Ｃは、β−シートペプチド構造の上に重ね合わせた、レニウム金属イオンに錯結合したペプチド配列Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｄ−Ｃｙｓ−Ａｌａの背骨図である。この図では、βシート構造における二つの連続アミノ酸残基のＣ−α原子が図４Ｂとは異なる態様でメタロペプチド配列のＣ２−αおよびＣ３−α原子に重なっている。重ね合わせてみると、これら二つのアミノ酸残基はＣ３−β炭素原子と共に類似の化学的並列にて位置取りをしており、また別の化学的空間へのアクセスがＣ２−β原子の位置で可能となっていることが示唆される。
【図５】図５は、レニウム金属イオンに錯結合したペプチド配列Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｄ−Ｃｙｓ−Ａｌａを、アミノ酸残基１、２、３およびＤ−ＣｙｓのＣ−α炭素を通過する平面に沿って見た場合の背骨図である。図には、メタロペプチドにおけるアミノ酸位置１および５に関する螺旋構造が描かれている。メタロペプチドのｉ＋５ピッチに対するｉをα−螺旋におけるｉおよびｉ＋４残基の化学的空間に地形的に合わせることができる。
【図６】図６は、Ｒｅに錯結合したペプチド配列Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ａｌａ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を、アミノ酸残基１、２、３およびＣｙｓのＣ−α炭素を通過する平面に沿って見た場合の背骨図である。この図にも同様にメタロペプチドにおけるアミノ酸位置１および５に関する螺旋構造が描かれている。
【図７】図７Ａは、Ｒｅに錯結合した概念化したＬ−Ｃｙｓメタロペプチドの構造を示しており、ここでＭ−１およびＭ−２はＬ−Ｃｙｓ （Ｍ−３−Ｌ）と共に金属錯結合に関与する二つのアミノ酸残基を示す。
図７Ｂは、Ｒｅに錯結合した概念化したＤ−Ｃｙｓメタロペプチドの構造を示しており、ここでＭ−１およびＭ−２はＤ−Ｃｙｓ （Ｍ−３−Ｄ）と共に金属錯結合に関与する二つのアミノ酸残基を示す。
【図８】図８は、図７Ａおよび図７Ｂのメタロペプチドのファイ−プサイ（ラマチャンドラン）プロット図であり、Ｍ−１、Ｍ−２、Ｍ−３−Ｌ、およびＭ−３−Ｄ残基に対する配位（構造的性癖）が示されている。また、天然蛋白質の構造領域、例えば、α−ヘリックス（Ｈ）、β−シート（Ｂ）、コラーゲンヘリックス（Ｃ）、ガンマターン（Ｇ）、逆ガンマターン（Ｇ−ｉ）、タイプ−Ｉ−ベータターン（Ｉ）、タイプ−Ｉ’−ベータターン（Ｉ’）、タイプ−ＩＩ−ベータターン（ＩＩ）、タイプ−ＩＩ’−ベータターン（ＩＩ’）、タイプ−ＩＩＩ−ベータターン（ＩＩＩ）、およびタイプ−ＩＩＩ’−ベータターン（ＩＩＩ’）もプロット図に含めてある。点線はターン構造のアミノ酸対（ｉ＋１およびｉ＋２残基）を特定している。負のファイおよびプサイ値を有するＨは天然の右手ヘリックスに対応しており、正のファイおよびプサイ値を有する他のＨは左手ヘリックスを表す。Ｍ−１およびＭ−２残基は０°、１８０°または０°、−１８０°の配位にある。両位置によって、メタロペプチドにおけるこれらアミノ酸残基は天然蛋白質構造のいずれとも異なる構造を示すことが判る。Ｌ−Ｃｙｓ （Ｍ−３−Ｌ）またはＤ−Ｃｙｓ （Ｍ−３−Ｄ）におけるファイ角度はそれぞれ約−６３°および＋６３°に固定されている（二本の垂直実線）。Ｃｙｓ残基のプサイ値に基づけば、Ｍ−３−ＬおよびＭ−３−Ｄはこれら二本の垂直線上のどこかに存在する筈である。しかし、どちらかのＬ−Ｃｙｓ残基のカルボニル（ＣＯ）基は配向が制限されているので、プサイ角度はＬ−およびＤ−Ｃｙｓについてそれぞれ６０°から９０°または−６０°から−９０°の範囲になる筈である。これらの条件下で、ラマチャンドラン・プロット図から明らかなことは、Ｃｙｓでの立体配位の特徴はＬ−Ｃｙｓでは右手ヘリックス、Ｄ−Ｃｙｓでは左手ヘリックスに近いということである。この結論は図５および６の図示と合致する。
【図９】図９Ａは、脱アミノＰｈｅ−Ｄ−Ａｓｐ−Ｌ−ＨｏｍｏＳｅｒ−Ｌ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−アミド一次構造のＲｅに錯結合したＬ−Ｃｙｓメタロペプチドの構造を示す。
図９Ｂは、Ｔｈｒ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ一次構造のＲｅに錯結合したＤ−Ｃｙｓメタロペプチドの構造を示す。
【図１０】図１０Ａは、図９Ａのメタロペプチドの円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルプロット（実線で示す）であり、金属イオンと錯結合していない図９Ａの構造のペプチド（点線で示す）と比較してある。ここでＸ軸は波長（ｎｍ）、Ｙ軸は残基あたり試料の平均モル楕円率Θ×１０−３（度・ｃｍ２／デシモル）である。直鎖ペプチドのＣＤスペクトル（点線）には組織化した構造が見られない（楕円率０）のに対し、Ｒｅ錯結合ペプチドでのＣＤスペクトル（実線）には整然とした構造の特徴がある。
図１０Ｂは、図９Ｂのメタロペプチドの円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルプロット（実線で示す）であり、金属イオンと錯結合していない図９Ｂの構造のペプチド（点線で示す）と比較してある。ここでＸ軸は波長（ｎｍ）、Ｙ軸は残基あたり試料の平均モル楕円率Θ×１０−３（度・ｃｍ２／デシモル）である。直鎖ペプチドのＣＤスペクトル（点線）には組織化した構造が見られない（楕円率０）のに対し、Ｒｅ錯結合ペプチドでのＣＤスペクトル（実線）には整然とした構造の特徴がある。
【図１１】図１１は、実施例１のウロキナーゼ型組織プラスミノーゲン活性化因子メタロペプチドの原型および実施例２のメラノコルチンメタロペプチドの原型を両方の一般構造である。
【図８】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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