(57)【要約】本発明は、分子量５６及び８２ｋＤａを有するEimeria maximaの主要な二つの配偶子母細胞抗原の組換えクローニングと配列決定、並びにプラスミドｐＴｒｅＨｉｓを用いたE.coli発現システム中におけるこれらの抗原の発現を提供する。本発明は、前記組換え５６ｋＤａ又は８２ｋＤａの抗原を備えた抗コクシジウム症ワクチンも提供する。本発明は、本明細書に記載されているアミノ酸配列をＮ末端に有するEimeria maxima由来の２つの３０ｋＤａタンパク質と３つの１４ｋＤａタンパク質も提供する。本発明は、組換え５６ｋＤａ又は８２ｋＤａ抗原と上記タンパク質の何れかを備えた抗コクシジウム症ワクチンも提供する。さらに、本発明は、Eimeria tenella、Eimeria maxima、Eimeria acervulina、Eimeria necatrix、Eimeria praecox、Eimeria mitis、若しくはEimeria brunetti、又は免疫学的に交叉反応する抗原を発現している微生物による感染に対して被験者を免疫する方法であって、上述のワクチンの何れかを前記被験者に投与する工程を備えた方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アイメリア・マキシマ（Eimeria maxima）の配偶子母細胞由来の５６ｋＤａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列若しくは前記ポリペプチドの相同体をコードするヌクレオチド配列を備えた単離された核酸、又は該核酸の相補物。
【請求項２】
前記ポリペプチドが配列番号３のアミノ酸配列を有する、請求項１の単離された核酸。
【請求項３】
前記ポリペプチドの前記相同体が配列番号３の配列を有する前記ポリペプチドと少なくとも５０％の同一性を有する、請求項１の単離された核酸。
【請求項４】
前記ヌクレオチド配列が、第１０３ヌクレオチドから開始し且つ第１５２９ヌクレオチドで終結する配列番号１として示されたヌクレオチド配列と少なくとも５０％の同一性を有する、請求項１の単離された核酸。
【請求項５】
前記核酸がＤＮＡ分子である、請求項１の単離された核酸。
【請求項６】
前記ＤＮＡ分子がｃＤＮＡ分子である、請求項５の単離された核酸。
【請求項７】
前記核酸が配列番号１のヌクレオチド配列を有する、請求項１の単離された核酸。
【請求項８】
前記核酸がＲＮＡ分子である、請求項１の単離された核酸。
【請求項９】
ＲＮＡ転写のプロモーターに作用可能に連結されている、請求項１の単離された核酸。
【請求項１０】
請求項１の核酸を備えたベクター。
【請求項１１】
請求項７の核酸を備えたベクター。
【請求項１２】
前記ベクターがプラスミドである、請求項１０のベクター。
【請求項１３】
前記ベクターがプラスミドである、請求項１１のベクター。
【請求項１４】
請求項１の核酸を備えたプラスミド。
【請求項１５】
豪州政府分析研究所受託番号ＮＭ０１／２２４００で寄託され、５６ＴＲＣＨｉｓｂ１プラスミドと命名された、請求項１４のプラスミド。
【請求項１６】
請求項１０のベクターを備えた宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１２のベクターを備えた宿主細胞。
【請求項１８】
前記細胞が、細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、及び哺乳類細胞からなる群から選択される、請求項１７の宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１の核酸を備えた形質転換細胞。
【請求項２０】
豪州政府分析研究所受託番号ＮＭ０１／２２４０１で寄託され、クローン５６ＴＲＣＨｉｓｂ１細菌と命名された、請求項１９の形質転換細胞。
【請求項２１】
アイメリア・マキシマ（Eimeria maxima）の配偶子母細胞由来の５６ｋＤａポリペプチド又は該ポリペプチドの相同体をさらに備える、請求項１９の形質転換細胞。
【請求項２２】
アイメリア・マキシマ（Eimeria maxima）の配偶子母細胞由来の組換え５６ｋＤａポリペプチドを作製する方法であって、請求項１９の形質転換細胞を培養することと、アイメリア・マキシマ（Eimeria maxima）の配偶子母細胞由来の組換え５６ｋＤａポリペプチドを単離することと、を備えた方法。
【請求項２３】
請求項２２の方法によって作製された組換えポリペプチド。
【請求項２４】
配列番号３５のアミノ酸配列をＮ末端に有するアイメリア・マキシマ（Eimeria maxima）の配偶子母細胞由来の３０ｋＤａタンパク質。
【請求項２５】
配列番号４２のアミノ酸配列をＮ末端に有するアイメリア・マキシマ（Eimeria maxima）の配偶子母細胞由来の３０ｋＤａタンパク質。
【請求項２６】
配列番号３７のアミノ酸配列をＮ末端に有するアイメリア・マキシマ（Eimeria maxima）の配偶子母細胞由来の１４ｋＤａタンパク質。
【請求項２７】
配列番号３９のアミノ酸配列をＮ末端に有するアイメリア・マキシマ（Eimeria maxima）の配偶子母細胞由来の１４ｋＤａタンパク質。
【請求項２８】
配列番号４１のアミノ酸配列をＮ末端に有するアイメリア・マキシマ（Eimeria maxima）の配偶子母細胞由来の１４ｋＤａタンパク質。
【請求項２９】
アイメリア・テネラ（Eimeria tenella）、アイメリア・マキシマ（Eimeria maxima）、アイメリア・アセルブリナ（Eimeria acervulina）、アイメリア・ネカトリックス（Eimeria necatrix）、アイメリア・プレコックス（Eimeria praecox）、アイメリア・ミチス（Eimeria mitis）、若しくはアイメリア・ブルネッティ（Eimeria brunetti）、又は免疫学的に交叉反応する抗原を発現している微生物に対するワクチンであって、請求項１の核酸、又は請求項１４のプラスミド、又は請求項２３の組換えポリペプチドを備えたワクチン。
【請求項３０】
第二の抗原をさらに備えた請求項２９のワクチン。
【請求項３１】
前記第二の抗原が、アイメリア・マキシマ（Eimeria maxima）由来の抗原をコードする核酸、このような核酸を備えたプラスミド、このような核酸によってコードされるポリペプチドからなる群から選択される、請求項３０のワクチン。
【請求項３２】
前記第二の抗原が配列番号４のヌクレオチド配列を有する核酸、該核酸を備えたプラスミド、又は該核酸によってコードされるポリペプチドである、請求項３１のワクチン。
【請求項３３】
前記第二の抗原が、配列番号３５若しくは配列番号４２のアミノ酸配列をＮ末端に有するアイメリア・マキシマ（Eimeria maxima）の配偶子母細胞由来の３０ｋＤａタンパク質と配列番号３７若しくは配列番号３９若しくは配列番号４１のアミノ酸配列をＮ末端に有するアイメリア・マキシマ（Eimeria maxima）の配偶子母細胞由来の１４ｋＤａタンパク質とからなる群から選択される、請求項３０のワクチン。
【請求項３４】
第三の抗原をさらに備えた請求項３２のワクチン。
【請求項３５】
前記第三の抗原が配列番号２６のヌクレオチド配列を有する核酸、該核酸を備えたプラスミド、又は該核酸によってコードされるポリペプチドである、請求項３４のワクチン。
【請求項３６】
第四の抗原をさらに備えた請求項３２のワクチン。
【請求項３７】
前記第四の抗原が、２３０ｋＤａ乃至２７０ｋＤａの分子量を有するアイメリア・マキシマ（Eimeria maxima）の配偶子母細胞由来のポリペプチド、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、又は該ヌクレオチド配列を備えたプラスミドである、請求項３６のワクチン。
【請求項３８】
前記抗原が、その５’末端に配列番号２９のアミノ酸配列又はその３’末端に配列番号３１のアミノ酸配列を有するポリペプチドを備える、請求項３７のワクチン。
【請求項３９】
アイメリア・テネラ（Eimeria tenella）、アイネリア・マキシマ（Eimeria maxima）、アイメリア・アセルブリナ（Eimeria acervulina）、アイメリア・ネカトリックス（Eimeria necatrix）、アイメリア・プレコックス（Eimeria praecox）、アイメリア・ミチス（Eimeria mitis）、若しくはアイメリア・ブルネッティ（Eimeria brunetti）、又は免疫学的に交叉反応する抗原を発現している微生物による感染に対して被験者を免疫する方法であって、請求項２９乃至３８の何れか１項のワクチンを前記被験者に投与する工程を備えた方法。
【請求項４０】
前記被験者が、ウシ、ヒツジ、ブタ、及び魚からなる群から選択される種である、請求項３９の方法。
【請求項４１】
前記被験者が鳥類種である、請求項３９の方法。
【請求項４２】
前記鳥類種が、ニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、アヒル、チャボ、ウズラ、及びハトからなる群から選択される種である、請求項４１の方法。
【請求項４３】
前記鳥類の種がニワトリである、請求項４２の方法。
【請求項４４】
前記投与工程が前記被験者の鼻孔に前記ワクチンを噴霧することを備える、請求項３９の方法。
【請求項４５】
前記投与が静脈内、筋肉内、又は腹腔内注射を備える、請求項３９の方法。
【請求項４６】
前記投与がインビボで行われる、請求項３９の方法。
【請求項４７】
前記投与が卵の気嚢に対して行われ、これにより、胚を前記ワクチンに接触させる、請求項４６の方法。
【請求項４８】
気嚢を有する鳥類種由来の受精卵であって、前記気嚢は請求項２９乃至３８の何れか１項のワクチンが接種され、孵化前又は孵化直後に、病原性型のアイメリア・テネラ（Eimeria tenella）、アイネリア・マキシマ（Eimeria maxima）、アイメリア・アセルブリナ（Eimeria acervulina）、アイメリア・ネカトリックス（Eimeria necatrix）、アイメリア・プレコックス（Eimeria praecox）、アイメリア・ミチス（Eimeria mitis）、若しくはアイメリア・ブルネッティ（Eimeria brunetti）、又は免疫学的に交叉反応する抗原を発現している微生物に対する免疫応答を前記ワクチンが胚に誘導することができる、受精卵。
【請求項４９】
前記鳥類種が、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、ガチョウ、チャボ、ウズラ、及びハトからなる群から選択される、請求項４８の受精卵。
【請求項５０】
前記鳥類種がニワトリである、請求項４９の受精卵。
【請求項５１】
アイネリア・マキシマ（Eimeria maxima）の配偶子母細胞由来の８２ｋＤａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列若しくは前記ポリペプチドの相同体をコードするヌクレオチド配列を備えた単離された核酸、又は該核酸の相補物。
【請求項５２】
前記ポリペプチドが配列番号６に示されたアミノ酸配列を有する、請求項５１の単離された核酸。
【請求項５３】
前記ポリペプチドの前記相同体が配列番号６の配列を有する前記ポリペプチドと少なくとも５０％の同一性を有する、請求項５１の単離された核酸。
【請求項５４】
前記ヌクレオチド配列が、第１００ヌクレオチドから開始し且つ第１８８６ヌクレオチドで終結する配列番号４のヌクレオチド配列と少なくとも５０％の同一性を有する、請求項５１の単離された核酸。
【請求項５５】
前記核酸がＤＮＡ分子である、請求項５１の単離された核酸。
【請求項５６】
前記ＤＮＡ分子がｃＤＮＡ分子である、請求項５５の単離された核酸。
【請求項５７】
前記核酸が配列番号４のヌクレオチド配列を有する、請求項５１の単離された核酸。
【請求項５８】
前記核酸がＲＮＡ分子である、請求項５１の単離された核酸。
【請求項５９】
ＲＮＡ転写のプロモーターに作用可能に連結されている、請求項５１の単離された核酸。
【請求項６０】
請求項５１の核酸を備えたベクター。
【請求項６１】
請求項５７の核酸を備えたベクター。
【請求項６２】
前記ベクターがプラスミドである、請求項６０のベクター。
【請求項６３】
前記ベクターがプラスミドである、請求項６１のベクター。
【請求項６４】
請求項５１の核酸を備えたプラスミド。
【請求項６５】
豪州政府分析研究所受託番号ＮＭ０１／２２３９８で寄託され、８２ＴＲＣＨｉｓｂ８プラスミドと命名された、請求項６４のプラスミド。
【請求項６６】
請求項６０のベクターを備えた宿主細胞。
【請求項６７】
請求項６１のベクターを備えた宿主細胞。
【請求項６８】
前記細胞が、細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、及び哺乳類細胞からなる群から選択される、請求項６６の宿主細胞。
【請求項６９】
請求項５１の核酸を備えた形質転換細胞。
【請求項７０】
豪州政府分析研究所受託番号ＮＭ０１／２２３９９で寄託され、クローン８２ＴＲＣＨｉｓｂ１細菌と命名された、請求項６９の形質転換細胞。
【請求項７１】
アイネリア・マキシマ（Eimeria maxima）の配偶子母細胞由来の８２ｋＤａポリペプチド又は該ポリペプチドの相同体をさらに備える、請求項６９の形質転換細胞。
【請求項７２】
アイネリア・マキシマ（Eimeria maxima）の配偶子母細胞由来の組換え８２ｋＤａポリペプチドを作製する方法であって、請求項６９の形質転換細胞を培養することと、アイネリア・マキシマ（Eimeria maxima）の配偶子母細胞由来の組換え８２ｋＤａポリペプチドを単離することと、を備えた方法。
【請求項７３】
請求項７２の方法によって作製された組換えポリペプチド。
【請求項７４】
アイメリア・テネラ（Eimeria tenella）、アイネリア・マキシマ（Eimeria maxima）、アイメリア・アセルブリナ（Eimeria acervulina）、アイメリア・ネカトリックス（Eimeria necatrix）、アイメリア・プレコックス（Eimeria praecox）、アイメリア・ミチス（Eimeria mitis）、若しくはアイメリア・ブルネッティ（Eimeria brunetti）、又は免疫学的に交叉反応する抗原を発現している微生物に対するワクチンであって、請求項５１の核酸又は請求項６４のプラスミド又は請求項７３の組換えポリペプチドを備えたワクチン。
【請求項７５】
第二の抗原をさらに備えた請求項７４のワクチン。
【請求項７６】
前記第二の抗原が、アイネリア・マキシマ（Eimeria maxima）由来の抗原をコードする核酸、このような核酸を備えたプラスミド、及びこのような核酸によってコードされるポリペプチドからなる群から選択される、請求項７５のワクチン。
【請求項７７】
前記第二の抗原が、配列番号３５若しくは配列番号４２のアミノ酸配列をＮ末端に有するアイネリア・マキシマ（Eimeria maxima）の配偶子母細胞由来の３０ｋＤａタンパク質、又は配列番号３７、配列番号３９、若しくは配列番号４１のアミノ酸配列をＮ末端に有するアイネリア・マキシマ（Eimeria maxima）の配偶子母細胞由来の１４ｋＤａタンパク質からなる群から選択される、請求項７５のワクチン。
【請求項７８】
アイメリア・テネラ（Eimeria tenella）、アイネリア・マキシマ（Eimeria maxima）、アイメリア・アセルブリナ（Eimeria acervulina）、アイメリア・ネカトリックス（Eimeria necatrix）、アイメリア・プレコックス（Eimeria praecox）、アイメリア・ミチス（Eimeria mitis）、若しくはアイメリア・ブルネッティ（Eimeria brunetti）、又は免疫学的に交叉反応する抗原を発現している微生物による感染に対して被験者を免疫する方法であって、請求項７４乃至７７の何れか１項のワクチンを前記被験者に投与する工程を備えた方法。
【請求項７９】
前記被験者が、ウシ、ヒツジ、ブタ、及び魚からなる群から選択される種である、請求項７８の方法。
【請求項８０】
前記被験者が鳥類種である、請求項７８の方法。
【請求項８１】
前記鳥類種が、ニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、アヒル、チャボ、ウズラ、及びハトからなる群から選択される、請求項８０の方法。
【請求項８２】
前記鳥類種がニワトリである、請求項８１の方法。
【請求項８３】
前記投与工程が前記被験者の鼻孔に前記ワクチンを噴霧することを備える、請求項７８の方法。
【請求項８４】
前記投与が静脈内、筋肉内、又は腹腔内注射を備える、請求項７８の方法。
【請求項８５】
前記投与がインビボで行われる、請求項８０の方法。
【請求項８６】
前記投与が卵の気嚢に対して行われ、これによって、胚を前記ワクチンに接触させる、請求項８５の方法。
【請求項８７】
請求項７４のワクチンが接種された気嚢を有する鳥類種由来の受精卵であって、孵化前又は孵化直後に、病原性型のアイメリア・テネラ（Eimeria tenella）、アイネリア・マキシマ（Eimeria maxima）、アイメリア・アセルブリナ（Eimeria acervulina）、アイメリア・ネカトリックス（Eimeria necatrix）、アイメリア・プレコックス（Eimeria praecox）、アイメリア・ミチス（Eimeria mitis）、若しくはアイメリア・ブルネッティ（Eimeria brunetti）、又は免疫学的に交叉反応する抗原を発現している微生物に対する免疫応答を前記ワクチンが胚に誘導することができる、受精卵。
【請求項８８】
前記鳥類種が、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、ガチョウ、チャボ、ウズラ、及びハトからなる群から選択される、請求項８７の受精卵。
【請求項８９】
前記鳥類種がニワトリである、請求項８８の受精卵。
【請求項９０】
前記アミノ酸配列が配列番号３で示される、組換えポリペプチド。
【請求項９１】
前記アミノ酸配列が配列番号６で示される、組換えポリペプチド。
【請求項９２】
アイメリア・テネラ（Eimeria tenella）、アイネリア・マキシマ（Eimeria maxima）、アイメリア・アセルブリナ（Eimeria acervulina）、アイメリア・ネカトリックス（Eimeria necatrix）、アイメリア・プレコックス（Eimeria praecox）、アイメリア・ミチス（Eimeria mitis）、若しくはアイメリア・ブルネッティ（Eimeria brunetti）、又は免疫学的に交叉反応する抗原を発現している微生物による感染に対して被験者を免疫する方法であって、請求項２４乃至２８の何れか１項のタンパク質を前記被験者に投与する工程を備えた方法。
【請求項９３】
鳥類種の新生仔被験者に対して、アイメリア・テネラ（Eimeria tenella）、アイネリア・マキシマ（Eimeria maxima）、アイメリア・アセルブリナ（Eimeria acervulina）、アイメリア・ネカトリックス（Eimeria necatrix）、アイメリア・プレコックス（Eimeria praecox）、アイメリア・ミチス（Eimeria mitis）、若しくはアイメリア・ブルネッティ（Eimeria brunetti）、又は免疫学的に交叉反応する抗原を発現している微生物による感染に対する母子免疫を付与する方法であって、受精卵の産卵に先立つ適宜の時点で請求項２９乃至３８又は請求項７４乃至７７の何れか１項に記載のワクチンを前記被験者の母親に投与することによって、母子免疫を介して、アイメリア・テネラ（Eimeria tenella）、アイネリア・マキシマ（Eimeria maxima）、アイメリア・アセルブリナ（Eimeria acervulina）、アイメリア・ネカトリックス（Eimeria necatrix）、アイメリア・プレコックス（Eimeria praecox）、アイメリア・ミチス（Eimeria mitis）、若しくはアイメリア・ブルネッティ（Eimeria brunetti）、又は免疫学的に交叉反応する抗原を発現している微生物による感染に対する保護を前記新生仔被験者に付与する工程を備えた方法。
【請求項９４】
前記鳥類種が、ニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、アヒル、チャボ、ウズラ、及びハトからなる群から選択される、請求項９３の方法。
【請求項９５】
前記投与が静脈内、筋肉内、又は腹腔内注射を備える、請求項９３の方法。
【請求項９６】
鳥類種の新生仔被験者から糞便中へのアイメリア属（Eimeria）の胞嚢体の排出を減少させる方法であって、受精卵の産卵に先立つ適宜の時点で請求項２９乃至３８又は請求項７４乃至７７のワクチンを前記被験者の母親に投与することによって、免疫反応を惹起し、前記新生仔からの胞嚢体の排出が減少するように、母子抗体を前記新生仔に伝達させる工程を備えた方法。
【請求項９７】
前記鳥類種が、ニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、アヒル、チャボ、ウズラ、及びハトからなる群から選択される種である、請求項９６の方法。
【請求項９８】
前記投与が静脈内、筋肉内、又は腹腔内注射を備える、請求項９６の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願および関連技術の参照】
【０００１】
本願は、２００１年７月６日に出願された米国仮出願第６０／３０３，６９９号の利益を主張するものであり、その内容を参照により本明細書に援用する。
【０００２】
本願を通して、括弧内に示す様々な出版物を参照する。これらの出版物の完全な引用を、本明細書の最後、特許請求の範囲の直前にアルファベット順に収載する。本発明が関連する最新技術をより完全に記載するために、これらの出版物の開示全体を参照により本明細書に援用する。
【発明の背景】
【０００３】
「コクシジウム症」として知られる疾患をニワトリに引き起こす生物は、Apicomplexa門、Sporozoa綱、Coccidia亜綱、Eucoccidia目、Eimeriorina亜目、Eimeriidae科、Eimeria属に属する。Eimeria属の中には多数の種があり、そのいくつかはニワトリの病原体である。ニワトリ産業に最も関係がある種は、アイメリア・テネラ（Eimeria tenella）、アイネリア・マキシマ（Eimeria maxima）、アイメリア・アセルブリナ（Eimeria acervulina）、アイメリア・ネカトリックス（Eimeria necatrix）及びアイネリア・ブルネッティ（Eimeria brunetti）である。
【０００４】
コクシジウム症は、主として鶏舎が過密化しかつ寄生虫の薬剤耐性が生じたために、過去数十年にわたってニワトリ産業における主要な経済問題になっている。密集した状態で敷き藁の床の上でニワトリを飼育することによって、Eimeria寄生虫の増殖及び蔓延に最適な条件が作り出されている。このような状況では、衛生管理は不可能であり、農家は、抗コクシジウム剤の効果に頼らざるを得ない。しかし、薬物を常時餌の中に入れねばならず、また、Eimeriaの薬物耐性株が出現しないようにシャトルプログラムを使用しなければならず、また、ある薬物は損害の大きい副作用を有する。また、これらの抗コクシジウム剤は、抗菌効果もあり、したがって餌内抗生物質であると考えられる。最近、欧州連合は、ニワトリ産業において抗コクシジウム剤を含むすべての餌内抗生物質の使用を禁止する決定を下した。したがって、将来的に、コクシジウム症を制御する実行可能な唯一の取り組みは、ワクチンを開発することである。
【０００５】
Eimeria寄生虫は、腸管粘膜中において複雑なライフサイクルを経る。このライフサイクルは、媒介節足動物を欠く以外は、他の住血胞子虫目寄生虫（すなわち、プラスモディウム、バベシアなど）のライフサイクルに酷似している。胞嚢体は、敷き藁床上で胞子を形成し、各々が２つの種虫（したがって、胞子虫綱に属する）を含む４つのスポロシストを生成する。胞嚢体はニワトリによって摂取され、スポロシストは砂嚢を機械的に粉砕することによって放出される。次いで、腸内のタンパク質分解酵素によってスポロシスト壁が消化されて、スポロシストから種虫が放出される。次いで、移動性である種虫は、リンパ球に侵入し、次に上皮細胞に侵入し始め、そこで無性生殖期が始まる。寄生虫は、２〜４サイクルの複製と分裂（各々の種は一定の分裂回数を有する）を経て、多数の娘虫を生成する。最終サイクルの娘虫生成後、性周期が始まり、大配偶子母細胞（雌）及び小配偶子母細胞（雄）が生成する。大配偶子母細胞は壁形成体(wall forming bodies)の生成を特徴とし、一方、小配偶子母細胞は、細胞内寄生虫の表面から芽体となって母体から分離する小配偶子の形成に関与する成分を含有する。小配偶子は鞭毛をもち、大配偶子の受精に係わる。壁形成体の融合及び核の凝集によって胞嚢体に成熟する接合子が形成される。胞嚢体は糞便中に分泌され、それによってサイクルが完結する。
【０００６】
過去数年にわたって、Eimeria maximaの有性（配偶子母細胞）世代由来の未変性抗原が産卵鶏を免疫するために使用されてきた。したがって、子孫のヒヨコは、母子免疫によってワクチン処置を受けていたことになる（防御性の母子抗体）。E.maxima配偶子母細胞において、分子量が２５０、８２及び５６ｋＤａの３つの主要な感染防御抗原がこれまでに同定されている（欧州特許第0 256 536号、米国特許第5,496,550号及び米国特許第5,932,225号）。欧州特許第0 256 536号、米国特許第5,496,550号及び米国特許第5,932,225号を、本発明が関連する最新技術をより完全に記載するために、参照により本明細書に援用する。これらの抗原は、Eimeria種の中で良好に保存されており(Wallach 1995)、ブロイラーにおいてコクシジウム症を引き起こす３つの主要な種、E.maxima、E.tenella及びE.acervulinaに対して交叉免疫可能であることが判明した。さらに最近になって、フロアーペン試験において、これらの未変性配偶子母細胞抗原を用いてワクチン処置した雌鳥からのヒヨコは、現場条件下のEimeriaに対して保護されることが判明した（Wallach 1996）。この防御は、ブロイラーの性能にいかなる有害効果も起こさないレベルにまで、胞嚢体の放出ピークを下げる働きをする。上記結果に基づいて、これらの抗原がニワトリにおけるコクシジウム症に対して有効であり、シチメンチョウ、ガチョウ、ヒツジ、ウシ、ブタ及び魚を含めた他の家畜におけるコクシジウム症に対しても使用できる可能性があることも結論付けられた。
【０００７】
これら３つの抗原は、分子レベルでも特徴が明らかにされた。これらをコードするＲＮＡ分子を同定するために無細胞の翻訳実験が実施された（Mencher等）。これらの抗原をコードするｃＤＮＡ分子が、発現ベクターラムダｚａｐにおいて作製されたｃＤＮＡライブラリの免疫スクリーニングによってクローン化された（４、米国特許第５，９３２，２２５号）。この手法によって、２５０ｋＤａ抗原をコードする遺伝子がクローン化され、配列決定された。米国特許第5,932,225号及び同5,496,550号では、クローンｐＥＭ  ２５０／１４が部分的に配列決定された。本願の図１３ａは、米国特許第5,932,225号及び同5,496,550号の図１１を再現したものであって、クローンｐＥＭ  ２５０／１４の第１の２９３ヌクレオチドのＤＮＡ配列を描いたものである。本願の図１３ｂは、米国特許第5,932,225号及び同5,496,550号の図１２を再現したものであって、クローンｐＥＭ  ２５０／１４の最後の１９６ヌクレオチドのＤＮＡ配列を示したものである。また、米国特許第5,932,225号及び同5,496,550号において、５６及び８２ｋＤａ各抗原をコードする推定遺伝子がクローン化され、配列決定された。
【０００８】
その後、Fried等は、ｐＥＭ  ２５０／１４クローン全体の配列を決定し、この抗原が、これまで考えられてきた２５０ｋＤａではなく２３０ｋＤａの分子量を有することを見出した。Fried等は、２３０ｋＤａ遺伝子が反復の多いモチーフを含み、これらの繰り返しが遺伝子全体を通して含まれることを見出した（Fried等）。このクローンは、ｐＡＴＨプラスミドベクターを用いて細菌中で発現され、E.maximaに感染してから１４日後に採取した回復期のニワトリ血清によって認識されることが判明した。最後に、この遺伝子は、大配偶子母細胞段階においてのみ発現することが判明し、大配偶子の壁形成体中に位置することが免疫蛍光によって見出された（Fried等）。
【０００９】
５６及び８２ｋＤａ各抗原をコードするｃＤＮＡクローンは、５６ｋＤａ抗原に対するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含むライブラリをスクリーニングすることによっても得られた。このモノクローナル抗体は、未処置のニワトリに受動免疫をもたらすことが以前に示された（Wallach 1990）。数個のクローンが得られ分析された。クローンの１つは、小さな１０ｋＤａの抗原をコードし、したがって所望のクローンではないことが判明した。別のクローンは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のほんのわずかな部分しか含まず、５６及び８２ｋＤａ各抗原に対するほぼ予想サイズの２つのｍＲＮＡとハイブリダイズすることがノーザンブロッティングによって判明した。したがって、これが所望のクローンであると結論付けられた。次いで、ゲノムライブラリをスクリーニングして完全長クローンを得た。しかし、このクローン中に存在する反復度が極めて高いＧＣＡモチーフのために、完全長クローンを特異的に単離することはできなかった。完全長ｃＤＮＡ分子をクローン化する試みも、これらの反復のために成功しなかった。最後に、細菌中で部分的なｃＤＮＡクローンを発現させる試みも、おそらくはそれらの異常な配列のために同様に失敗し、妥当なレベルの遺伝子発現は得られなかった。５６及び８２ｋＤａ各抗原はグリコシル化されることが以前に示された（米国特許第5,932,225号）。これは、ダイズレクチンとのそれらの高い反応性に基づいている。したがって、グリコシレーションは、これらの遺伝子の良好な発現を得るために、また、遺伝子生成物の適切な構造のために必要かも知れない。
【００１０】
５６、８２及び２３０ｋＤａ抗原に加え、胞嚢体壁の高度に精製された画分から得られる１４ｋＤａ抗原が、コクシジウム症に対して考えられるワクチン候補として提案された（Eschenbacher等）。しかし、この仮説は検討されなかった。
【００１１】
いくつかの研究室が、コクシジウム症に対するサブユニットワクチンに取り組んできた。これらの研究者の大部分は、ライフサイクルの細胞外無性世代、特に、免疫攻撃に最も脆弱と考えられる種虫及び娘虫の時期にその努力を集中させた。これまでの研究において、E.tenellaからの種虫抽出物によって、ブロイラーではこの寄生虫に対する攻撃感染に対して最高７週齢まで防御し得ることが見出された（Karkhanis等）。E.tenellaの種虫由来の抗原に対するモノクローナル抗体を用いて実施された研究によって、分子量２５，０００の抗原が同定され、クローン化され、配列決定された（欧州特許第0 164 176号、1985年12月1１日）。いくつかの他の種虫遺伝子が同定され、それらの組換え抗原又はその形質転換された細菌自体の防御免疫が試験された（Danforth等）。その結果、これらの組換え体は、Eimeriaによる攻撃感染に対して比較的低レベルの防御しかもたらすことができず、重大な傷害の出現を常に防止するとは限らないことが示された。
【００１２】
娘虫時期からの抗原を用いたワクチンも試験された（欧州特許第0 135 073号）。これらの抗原を用いて若いブロイラーを免疫して、もたらされる防御が比較的低いことが再度判明した（Danforth等）。
【００１３】
１９９３年に、Eimeria maximaの２３０ｋＤａ娘虫抗原に対する母子抗体の出現は、配偶子母細胞とは異なり、防御母子免疫との間に相関があることが見出された（Ｓｍｉｔｈ等）。この防御は、しばしば９０％を超え、（２３０ｋＤａタンパク質との反応性は依然として高いが）母子抗体濃度が比較的低いときでも起こることが判明した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから切り出された極めて少量の未変性２３０ｋＤａ娘虫抗原は、子孫のヒヨコにおけるE.maxima感染に対して、かなりのレベル（６０％）の防御母子免疫を誘導できることも見出された。また、ウェスタンブロッティングから、このタンパク質がE.maximaの娘虫及び種虫の両方において発現され、Eimeria種の間でも良好に保存されていることが示された。
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、５６及び８２ｋＤａの分子量を有するアイメリア・マクシマ（Eimeria maxima）の主要な２つの配偶子母細胞抗原をコードする核酸を提供する。
【００１５】
本発明は、配列番号３５のアミノ酸配列をＮ末端に有するEimeria maximaの配偶子母細胞由来の３０ｋＤａタンパク質も提供する。
【００１６】
本発明は、配列番号４２のアミノ酸配列をＮ末端に有するEimeria maximaの配偶子母細胞由来の３０ｋＤａタンパク質も提供する。
【００１７】
本発明は、配列番号３７のアミノ酸配列をＮ末端に有するEimeria maximaの配偶子母細胞由来の１４ｋＤａタンパク質も提供する。
【００１８】
本発明は、配列番号３９のアミノ酸配列をＮ末端に有するEimeria maximaの配偶子母細胞由来の１４ｋＤａタンパク質も提供する。
【００１９】
本発明は、配列番号４１のアミノ酸配列をＮ末端に有するEimeria maximaの配偶子母細胞由来の１４ｋＤａタンパク質も提供する。
【００２０】
本発明は、組換え５６ｋＤａ抗原のみを含む又は上述した任意のタンパク質の組合せを含む抗コクシジウム症ワクチンも提供する。
【００２１】
本発明は、組換え８２ｋＤａ抗原のみを含む又は上述した任意のタンパク質の組合せを含む抗コクシジウム症ワクチンも提供する。
【００２２】
本発明は、アイメリア・テネラ（Eimeria tenella）、アイネリア・マキシマ（Eimeria maxima）、アイメリア・アセルブリナ（Eimeria acervulina）、アイメリア・ネカトリックス（Eimeria necatrix）、アイメリア・プレコックス（Eimeria praecox）、アイメリア・ミチス（Eimeria mitis）、若しくはアイメリア・ブルネッティ（Eimeria brunetti）、又は免疫学的に交叉反応する抗原を発現している微生物による感染に対して被験者を免疫する方法であって、上記ワクチンのうち任意のワクチンを前記被験者に投与する工程を備えた方法も提供する。
【００２３】
本発明は、Eimeria maximaの配偶子母細胞由来の５６ｋＤａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列若しくは前記ポリペプチドの相同体をコードするヌクレオチド配列を備える単離された核酸、又は該核酸の相補物を提供する。
【００２４】
ある実施態様において、前記ポリペプチドは、図４に示されたアミノ酸配列（配列番号３）を有する。
【００２５】
別の実施態様では、前記ポリペプチドの相同体は、配列番号３の配列を有する前記ポリペプチドと少なくとも５０％の同一性を有する。
【００２６】
さらなる実施態様では、前記ポリペプチドの相同体は、配列番号３の配列を有する前記ポリペプチドと少なくとも６０％の同一性を有する。
【００２７】
さらなる実施態様では、前記ポリペプチドの相同体は、配列番号３の配列を有する前記ポリペプチドと少なくとも７０％の同一性を有する。
【００２８】
さらなる実施態様では、前記ポリペプチドの相同体は、配列番号３の配列を有する前記ポリペプチドと少なくとも７５％の同一性を有する。
【００２９】
さらに別の実施態様では、前記ポリペプチドの相同体は、配列番号３の配列を有する前記ポリペプチドと少なくとも８０％の同一性を有する。
【００３０】
さらなる実施態様では、前記ポリペプチドの相同体は、配列番号３の配列を有する前記ポリペプチドと少なくとも８５％の同一性を有する。
【００３１】
ある実施態様では、前記ポリペプチドの相同体は、配列番号３の配列を有する前記ポリペプチドと少なくとも９０％の同一性を有する。
【００３２】
別の実施態様では、前記ポリペプチドの相同体は、配列番号３の配列を有する前記ポリペプチドと少なくとも９３％の同一性を有する。
【００３３】
さらなる実施態様では、前記ポリペプチドの相同体は、配列番号３の配列を有する前記ポリペプチドと少なくとも９５％の同一性を有する。
【００３４】
さらなる実施態様では、前記ポリペプチドの相同体は、配列番号３の配列を有する前記ポリペプチドと少なくとも９７％の同一性を有する。
【００３５】
さらに別の実施態様では、前記ポリペプチドの相同体は、配列番号３の配列を有する前記ポリペプチドと少なくとも９９％の同一性を有する。
【００３６】
さらなる実施態様では、前記ヌクレオチド配列は、第１０３ヌクレオチドから開始し且つ第１５２９ヌクレオチドで終結する図４に示されたヌクレオチド配列（配列番号１）と少なくとも５０％の同一性を有する。
【００３７】
別の実施態様では、前記ヌクレオチド配列は、第１０３ヌクレオチドから開始し且つ第１５２９ヌクレオチドで終結する配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも６０％の同一性を有する。
【００３８】
さらなる実施態様では、前記ヌクレオチド配列は、第１０３ヌクレオチドから開始し且つ第１５２９ヌクレオチドで終結する配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有する。
【００３９】
ある実施態様では、前記ヌクレオチド配列は、第１０３ヌクレオチドから開始し且つ第１５２９ヌクレオチドで終結する配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも７５％の同一性を有する。
【００４０】
別の実施態様では、前記ヌクレオチド配列は、第１０３ヌクレオチドから開始し且つ第１５２９ヌクレオチドで終結する配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有する。
【００４１】
さらなる実施態様では、前記ヌクレオチド配列は、第１０３ヌクレオチドから開始し且つ第１５２９ヌクレオチドで終結する配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも８５％の同一性を有する。
【００４２】
ある実施態様では、前記ヌクレオチド配列は、第１０３ヌクレオチドから開始し且つ第１５２９ヌクレオチドで終結する配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する。
【００４３】
さらなる実施態様では、前記ヌクレオチド配列は、第１０３ヌクレオチドから開始し且つ第１５２９ヌクレオチドで終結する配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９３％の同一性を有する。
【００４４】
別の実施態様では、前記ヌクレオチド配列は、第１０３ヌクレオチドから開始し且つ第１５２９ヌクレオチドで終結する配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有する。
【００４５】
さらなる実施態様では、前記ヌクレオチド配列は、第１０３ヌクレオチドから開始し且つ第１５２９ヌクレオチドで終結する配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９７％の同一性を有する。
【００４６】
ある実施態様では、前記ヌクレオチド配列は、第１０３ヌクレオチドから開始し且つ第１５２９ヌクレオチドで終結する配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９９％の同一性を有する。
【００４７】
さらなる実施態様では、前記核酸はＤＮＡ分子である。
【００４８】
さらに別の実施態様では、前記ＤＮＡ分子はｃＤＮＡ分子である。
【００４９】
さらなる実施態様では、前記核酸は、第１０３ヌクレオチドから開始し且つ第１５２９ヌクレオチドで終結する図４に示されたヌクレオチド配列（配列番号１）を有する。
【００５０】
別の実施態様では、前記核酸はＲＮＡ分子である。
【００５１】
ある実施態様では、前記単離された核酸は、ＲＮＡ転写のプロモーターに作用可能に連結されている。
【００５２】
本発明には、Eimeria maximaの配偶子母細胞由来の５６ｋＤａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列若しくは前記ポリペプチドの相同体をコードするヌクレオチド配列を備える単離された核酸又は該核酸の相補物を含んだベクターも包含される。
【００５３】
ある実施態様では、前記ベクターは、第１０３ヌクレオチドから開始し且つ第１５２９ヌクレオチドで終結する図４に示されたヌクレオチド配列（配列番号１）を有する核酸を備える。
【００５４】
別の実施態様では、前記ベクターはプラスミドである。
【００５５】
さらなる実施態様では、前記プラスミドは、第１０３ヌクレオチドから開始し且つ第１５２９ヌクレオチドで終結する図４に示されたヌクレオチド配列（配列番号１）を有する核酸を備える。
【００５６】
さらなる実施態様では、前記プラスミドは、Eimeria maximaの配偶子母細胞由来の５６ｋＤａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列若しくは前記ポリペプチドの相同体をコードするヌクレオチド配列を具備する単離された核酸、又は該核酸の相補物を備える。
【００５７】
さらに別の実施態様では、前記プラスミドは、５６ＴＲＣＨｉｓｂ１プラスミドと命名されたプラスミドである（豪州政府分析研究所受託番号ＮＭ０１／２２４００）。
【００５８】
本発明は、Eimeria maximaの配偶子母細胞由来の５６ｋＤａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列若しくは前記ポリペプチドの相同体をコードするヌクレオチド配列を備える単離された核酸又は該核酸の相補物を含むベクターを備えた宿主細胞も包含する。
【００５９】
ある実施態様では、前記宿主細胞は、第１０３ヌクレオチドから開始し且つ第１５２９ヌクレオチドで終結する図４に示されたヌクレオチド配列（配列番号１）を有する核酸を備えたベクターを含む。
【００６０】
別の実施態様では、前記宿主細胞は、細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、及び哺乳類細胞からなる群から選択される。
【００６１】
本発明は、さらに、Eimeria maximaの配偶子母細胞由来の５６ｋＤａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列若しくは前記ポリペプチドの相同体をコードするヌクレオチド配列を備える単離された核酸又は該核酸の相補物を含む形質転換細胞を提供する。
【００６２】
ある実施態様では、前記形質転換細胞は、細菌中のクローン５６ＴＲＣＨｉｓｂ１と命名された形質転換細胞である（豪州政府分析研究所受託番号ＮＭ０１／２２４０１）。
【００６３】
前記５６ｋＤａの抗原をコードするプラスミドは、２００１年６月２６日に、オーストラリア、ピンブルの豪州政府分析研究所に、受託番号ＮＭ０１／２２４００で寄託した。前記５６ｋＤａの抗原で形質転換された細菌細胞は、２００１年６月２６日に、オーストラリア、ピンブルの豪州政府分析研究所に、受託番号ＮＭ０１／２２４０１で寄託した。何れの寄託も、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従って為された。
【００６４】
さらなる実施態様では、前記形質転換細胞は、Eimeria maximaの配偶子母細胞由来の５６ｋＤａポリペプチド又は該ポリペプチドの相同体をさらに備える。
【００６５】
本発明には、さらに、Eimeria maximaの配偶子母細胞由来の組換え５６ｋＤａポリペプチドを作製する方法であって、Eimeria maximaの配偶子母細胞由来の５６ｋＤａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列又は前記ポリペプチドの相同体をコードするヌクレオチド配列を備える単離された核酸又は該核酸の相補物を含む形質転換細胞を培養することと、Eimeria maximaの配偶子母細胞由来の組換え５６ｋＤａポリペプチドを単離することと、を備えた方法が含まれる。該方法によって作製された組換えポリペプチドも、本発明に包含される。
【００６６】
本発明には、Eimeria tenella、Eimeria maxima、Eimeria acervulina、Eimeria necatrix若しくはEimeria brunetti、Eimeria praecox、Eimeria mitis、又は免疫学的に交叉反応する抗原を発現している微生物に対するワクチンであって、Eimeria maximaの配偶子母細胞由来の５６ｋＤａポリペプチド若しくは該ポリペプチドの相同体をコードするヌクレオチド配列を備える単離された核酸又は該核酸の相補物を含んだワクチンも提供する。
【００６７】
該ワクチンのある実施態様では、前記単離された核酸はプラスミドである。
【００６８】
さらに、本発明は、Eimeria tenella、Eimeria maxima、Eimeria acervulina、Eimeria necatrix若しくはEimeria brunetti、Eimeria praecox、Eimeria mitis、又は免疫学的に交叉反応する抗原を発現している微生物に対するワクチンであって、Eimeria maximaの配偶子母細胞由来の５６ｋＤａポリペプチド若しくは該ポリペプチドの相同体をコードするヌクレオチド配列を備える単離された核酸又は該核酸の相補物を備えた形質転換細胞を培養し、Eimeria maximaの配偶子母細胞由来の組換え５６ｋＤａポリペプチドを単離することによって作製されたEimeria maximaの配偶子母細胞由来の組換え５６ｋＤａポリペプチドを含んだワクチンを提供する。
【００６９】
別の実施態様では、該ワクチンは、本発明の単離された核酸と本発明の組換えポリペプチドの混合物から構成される。
【００７０】
別の実施態様では、前記ワクチンは、本発明の単離された核酸と本発明の組換えポリペプチドとEimeria maximaの配偶子母細胞由来の５６ｋＤａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を備える単離された核酸を含むプラスミドとの混合物から構成される。
【００７１】
さらなる実施態様では、前記ワクチンは、さらに第二の抗原を備える。
【００７２】
ある実施態様では、前記第二の抗原は、Eimeria maxima由来の抗原をコードする核酸、このような核酸を備えたプラスミド、このような核酸によってコードされるポリペプチドからなる群から選択される。
【００７３】
別の実施態様では、前記第二の抗原は、配列番号３５若しくは配列番号４２のアミノ酸配列をＮ末端に有するEimeria maximaの配偶子母細胞由来の３０ｋＤａタンパク質、又は配列番号３７、配列番号３９、若しくは配列番号４１のアミノ酸配列をＮ末端に有するEimeria maximaの配偶子母細胞由来の１４ｋＤａタンパク質からなる群から選択される。
【００７４】
さらに別の実施態様では、前記第二の抗原は、配列番号４のヌクレオチド配列を有する核酸、該核酸を備えたプラスミド、又は該核酸によってコードされるポリペプチドである。
【００７５】
さらなる実施態様では、前記ワクチンは、さらに第三の抗原を備える。
【００７６】
本発明は、前記第三の抗原が、E.maxima由来の２３０ｋＤａの種虫／娘虫抗原であるワクチンも提供する。
【００７７】
前記２３０ｋＤａの抗原は、胞子形成した胞嚢体中に存在する精製されたE.maximaの種虫（sporozoite）から単離された（上記のライフサイクルを参照）。単離操作では、胞子形成した胞嚢体からタンパク質を抽出し、ＤＥＡＥ−ｓｅｐｈａｃｅｌ陰イオン交換カラム上で抽出した前記タンパク質を分離することを行った。これに続いて、ピーク画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロッティングによって２３０ｋＤａ抗原を同定した。さらに、精製された抗原の同一性を確認するために、ワクチン接種したメンドリと子孫の雛の両方から得た防御性母子抗血清を用いた。最後に、タンパク質配列決定とクローニングを行うために、前記２３０ｋＤａタンパク質をＰＶＤＦ膜フィルターから単離した。
【００７８】
２３０ｋＤａ抗原のアミノ末端及びトリプシンペプチド消化産物の配列を決定した。トリプシン消化物から得られた配列を用いて、縮退ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーをデザインした。該プライマーをＲＡＣＥ(rapid amplification of cDNA ends)ＰＣＲで使用して、遺伝子産物の一部を増幅した。これらの産物の配列から、遺伝子特異的なプライマーをデザインし、ｍＲＮＡの３’及び５’末端を確定するために、ＲＡＣＥ  ＰＣＲにおいて使用した。次いで、５’及び３’末端に対してデザインした遺伝子特異的プライマーを用いたＰＣＲによって、前記抗原をコードする完全長の７ｋｂ  ｃＤＮＡクローンを増幅した。このクローンを完全に配列決定すると、ネイティブタンパク質のＮ末端のアミノ酸配列と比較して、その５’末端に正しいＤＮＡ配列を含有していることが示された。このように、該核酸配列は、防御性の２３０ｋＤａ種虫／娘虫抗原をコードしており、コクシジウム症に対してニワトリにワクチン接種するための組換え抗原を与えるために使用することが可能となった。
【００７９】
前記２３０ｋＤａの抗原をコードするプラスミドは、２００１年６月２６日に、オーストラリア、ピンブルの豪州政府分析研究所に、受託番号ＮＭ０１／２２３９６で寄託した。前記２３０ｋＤａの抗原で形質転換された細菌細胞は、２００１年６月２６日に、オーストラリア、ピンブルの豪州政府分析研究所に、受託番号ＮＭ０１／２２３９７で寄託した。何れの寄託も、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従って為された。
【００８０】
E.maximaの種虫／娘虫由来の抗原は２３０ｋＤａ抗原だと以前は考えられていた。しかし、本発明者らのその後の研究によって、前記抗原は、実際には、E.maximaの種虫／娘虫の２５０ｋＤａ抗原であることが明らかとなった。
【００８１】
さらなる実施態様では、前記第三の抗原は、図１２に示されているヌクレオチド配列（配列番号２６）を有する核酸、該核酸を備えたプラスミド、該核酸によってコードされるポリペプチドである。
【００８２】
さらに別の実施態様では、前記ワクチンは、さらに第四の抗原を備える。
【００８３】
ある実施態様では、前記第四の抗原は、２３０ｋＤａ乃至２７０ｋＤａの分子量を有するEimeria maximaの配偶子母細胞由来のポリペプチド、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、又は該ヌクレオチド配列を備えたポリペプチドである。
【００８４】
さらなる実施態様では、前記抗原は、図１３ａに示されているアミノ酸配列（配列番号２９）を有するポリペプチドをその５’末端に備え、又は図１３ｂに示されているアミノ酸配列（配列番号３１）をその３’末端に備える。
【００８５】
本発明は、Eimeria tenella、Eimeria maxima、Eimeria acervulina、Eimeria necatrix、Eimeria praecox、Eimeria mitis、若しくはEimeria brunetti、又は免疫学的に交叉反応する抗原を発現している微生物による感染に対して被験者を免疫する方法であって、本発明のワクチンを前記被験者に投与する工程を備えた方法も提供する。
【００８６】
ある実施態様では、前記被験者は、ウシ、ヒツジ、ブタ、及び魚からなる群から選択される種である。
【００８７】
別の実施態様では、前記被験者は、鳥類種である。
【００８８】
さらなる実施態様では、前記鳥類種は、ニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、アヒル、チャボ、ウズラ、及びハトからなる群から選択される。
【００８９】
さらなる実施態様では、前記鳥類種はニワトリである。
【００９０】
ある実施態様では、前記投与工程は、前記被験者の鼻孔に前記ワクチンを噴霧することを備える。
【００９１】
さらなる実施態様では、前記投与は、静脈内、筋肉内、又は腹腔内注射を備える。
【００９２】
別の実施態様では、前記投与はインビボで行われる。
【００９３】
さらなる実施態様では、前記投与は卵の気嚢(air sac)に対して行われ、これにより、胚を前記ワクチンに接触させる。
【００９４】
本発明は、本発明のワクチンが接種された気嚢を有する鳥類種由来の受精卵であって、孵化前又は孵化直後に、病原性型のEimeria tenella、Eimeria maxima、Eimeria acervulina、Eimeria necatrix、Eimeria praecox、Eimeria mitis、若しくはEimeria brunetti、又は免疫学的に交叉反応する抗原を発現している微生物に対する免疫応答を前記ワクチンが胚に誘導することができる、受精卵も包含する。
【００９５】
ある実施態様では、前記鳥類種は、ニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、アヒル（ｄｕｃｋ）、チャボ、ウズラ、及びハトからなる群から選択される。
【００９６】
別の実施態様では、前記鳥類種はニワトリである。
【００９７】
本発明は、さらに、Eimeria maximaの配偶子母細胞由来の８２ｋＤａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列若しくは前記ポリペプチドの相同体をコードするヌクレオチド配列を備える単離された核酸、又は該核酸の相補物を提供する。
【００９８】
ある実施態様において、前記ポリペプチドは、図５に示されたアミノ酸配列（配列番号６）を有する。
【００９９】
別の実施態様では、前記ポリペプチドの相同体は、配列番号６の配列を有する前記ポリペプチドと少なくとも５０％の同一性を有する。
【０１００】
さらなる実施態様では、前記ポリペプチドの相同体は、配列番号６の配列を有する前記ポリペプチドと少なくとも６０％の同一性を有する。
【０１０１】
さらなる実施態様では、前記ポリペプチドの相同体は、配列番号６の配列を有する前記ポリペプチドと少なくとも７０％の同一性を有する。
【０１０２】
別の実施態様では、前記ポリペプチドの相同体は、配列番号６の配列を有する前記ポリペプチドと少なくとも７５％の同一性を有する。
【０１０３】
さらに別の実施態様では、前記ポリペプチドの相同体は、配列番号６の配列を有する前記ポリペプチドと少なくとも８０％の同一性を有する。
【０１０４】
さらなる実施態様では、前記ポリペプチドの相同体は、配列番号６の配列を有する前記ポリペプチドと少なくとも８５％の同一性を有する。
【０１０５】
ある実施態様では、前記ポリペプチドの相同体は、配列番号６の配列を有する前記ポリペプチドと少なくとも９０％の同一性を有する。
【０１０６】
さらなる実施態様では、前記ポリペプチドの相同体は、配列番号６の配列を有する前記ポリペプチドと少なくとも９３％の同一性を有する。
【０１０７】
さらに別の実施態様では、前記ポリペプチドの相同体は、配列番号６の配列を有する前記ポリペプチドと少なくとも９５％の同一性を有する。
【０１０８】
ある実施態様では、前記ポリペプチドの相同体は、配列番号６の配列を有する前記ポリペプチドと少なくとも９７％の同一性を有する。
【０１０９】
さらなる実施態様では、前記ポリペプチドの相同体は、配列番号６の配列を有する前記ポリペプチドと少なくとも９９％の同一性を有する。
【０１１０】
さらなる実施態様では、前記ヌクレオチド配列は、第１００ヌクレオチドから開始し且つ第１８８６ヌクレオチドで終結する図５に示されたヌクレオチド配列（配列番号４）と５０％を超える同一性を有する。
【０１１１】
別の実施態様では、前記ヌクレオチド配列は、第１００ヌクレオチドから開始し且つ第１８８６ヌクレオチドで終結する配列番号４のヌクレオチド配列と６０％を超える同一性を有する。
【０１１２】
さらなる実施態様では、前記ヌクレオチド配列は、第１００ヌクレオチドから開始し且つ第１８８６ヌクレオチドで終結する配列番号４のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有する。
【０１１３】
さらなる実施態様では、前記ヌクレオチド配列は、第１００ヌクレオチドから開始し且つ第１８８６ヌクレオチドで終結する配列番号４のヌクレオチド配列と少なくとも７５％の同一性を有する。
【０１１４】
別の実施態様では、前記ヌクレオチド配列は、第１００ヌクレオチドから開始し且つ第１８８６ヌクレオチドで終結する配列番号４のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有する。
【０１１５】
さらに別の実施態様では、前記ヌクレオチド配列は、第１００ヌクレオチドから開始し且つ第１８８６ヌクレオチドで終結する配列番号４のヌクレオチド配列と少なくとも８５％の同一性を有する。
【０１１６】
ある実施態様では、前記ヌクレオチド配列は、第１００ヌクレオチドから開始し且つ第１８８６ヌクレオチドで終結する配列番号４のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する。
【０１１７】
さらなる実施態様では、前記ヌクレオチド配列は、第１００ヌクレオチドから開始し且つ第１８８６ヌクレオチドで終結する配列番号４のヌクレオチド配列と少なくとも９３％の同一性を有する。
【０１１８】
別の実施態様では、前記ヌクレオチド配列は、第１００ヌクレオチドから開始し且つ第１８８６ヌクレオチドで終結する配列番号４のヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有する。
【０１１９】
さらなる実施態様では、前記ヌクレオチド配列は、第１００ヌクレオチドから開始し且つ第１８８６ヌクレオチドで終結する配列番号４のヌクレオチド配列と少なくとも９７％の同一性を有する。
【０１２０】
ある実施態様では、前記ヌクレオチド配列は、第１００ヌクレオチドから開始し且つ第１８８６ヌクレオチドで終結する配列番号４のヌクレオチド配列と少なくとも９９％の同一性を有する。
【０１２１】
さらなる実施態様では、前記核酸はＤＮＡ分子である。
【０１２２】
さらに別の実施態様では、前記ＤＮＡ分子はｃＤＮＡ分子である。
【０１２３】
さらなる実施態様では、前記核酸は、第１００ヌクレオチドから開始し且つ第１８８６ヌクレオチドで終結する配列番号４のヌクレオチド配列を有する。
【０１２４】
別の実施態様では、前記核酸はＲＮＡ分子である。
【０１２５】
ある実施態様では、前記単離された核酸は、ＲＮＡ転写のプロモーターに作用可能に連結されている。
【０１２６】
本発明には、Eimeria maximaの配偶子母細胞由来の８２ｋＤａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列若しくは前記ポリペプチドの相同体をコードするヌクレオチド配列を備える単離された核酸又は該核酸の相補物を含んだベクターも包含される。
【０１２７】
ある実施態様では、前記ベクターは、第１００ヌクレオチドから開始し且つ第１８８６ヌクレオチドで終結する図５に示されたヌクレオチド配列（配列番号４）を有する核酸を備える。
【０１２８】
別の実施態様では、前記ベクターはプラスミドである。
【０１２９】
さらなる実施態様では、前記プラスミドは、第１００ヌクレオチドから開始し且つ第１８８６ヌクレオチドで終結する図５に示されたヌクレオチド配列（配列番号４）を有する核酸を備える。
【０１３０】
さらなる実施態様では、前記プラスミドは、Eimeria maximaの配偶子母細胞由来の８２ｋＤａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列若しくは前記ポリペプチドの相同体をコードするヌクレオチド配列を具備する単離された核酸、又は該核酸の相補物を備える。
【０１３１】
さらに別の実施態様では、前記プラスミドは、８２ＴＲＣＨｉｓｂ８プラスミドと命名されたプラスミド（豪州政府分析研究所受託番号ＮＭ０１／２２３９８）である。
【０１３２】
本発明には、Eimeria maximaの配偶子母細胞由来の８２ｋＤａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列若しくは前記ポリペプチドの相同体をコードするヌクレオチド配列を備える単離された核酸又は該核酸の相補物を含んだベクターを含む宿主細胞も包含される。
【０１３３】
ある実施態様では、前記宿主細胞は、第１００ヌクレオチドから開始し且つ第１８８６ヌクレオチドで終結する図５に示されたヌクレオチド配列（配列番号４）を有する核酸を備えたベクターを含む。
【０１３４】
別の実施態様では、前記宿主細胞は、細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、及び哺乳類細胞からなる群から選択される。
【０１３５】
本発明は、Eimeria maximaの配偶子母細胞由来の８２ｋＤａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列若しくは前記ポリペプチドの相同体をコードするヌクレオチド配列を備える単離された核酸又は該核酸の相補物を含む形質転換細胞も提供する。
【０１３６】
ある実施態様では、前記形質転換細胞は、クローン８２ＴＲＣＨｉｓｂ８と命名された細菌中の形質転換細胞（豪州政府分析研究所受託番号ＮＭ０１／２２３９９）。
【０１３７】
前記８２ｋＤａの抗原をコードするプラスミドは、２００１年６月２６日に、オーストラリア、ピンブルの豪州政府分析研究所に、受託番号ＮＭ０１／２２３９８で寄託した。前記８２ｋＤａの抗原で形質転換された細菌細胞は、２００１年６月２６日に、オーストラリア、ピンブルの豪州政府分析研究所に、受託番号ＮＭ０１／２２３９９で寄託した。何れの寄託も、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従って為された。
【０１３８】
さらなる実施態様では、前記形質転換細胞は、Eimeria maximaの配偶子母細胞由来の８２ｋＤａポリペプチド又は該ポリペプチドの相同体をさらに備える。
【０１３９】
本発明には、さらに、Eimeria maximaの配偶子母細胞由来の組換え８２ｋＤａポリペプチドを作製する方法であって、Eimeria maximaの配偶子母細胞由来の組換え８２ｋＤａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列又は前記ポリペプチドの相同体をコードするヌクレオチド配列を備える単離された核酸又は該核酸の相補物を含む形質転換細胞を培養することと、Eimeria maximaの配偶子母細胞由来の組換え８２ｋＤａポリペプチドを単離することと、を備えた方法が含まれる。該方法によって作製された組換えポリペプチドも、本発明に包含される。
【０１４０】
本発明は、Eimeria tenella、Eimeria maxima、Eimeria acervulina、Eimeria necatrix、Eimeria praecox、Eimeria mitis、若しくはEimeria brunetti、又は免疫学的に交叉反応する抗原を発現している微生物に対するワクチンであって、Eimeria maximaの配偶子母細胞由来の８２ｋＤａポリペプチド若しくは該ポリペプチドの相同体をコードするヌクレオチド配列を備える単離された核酸又は該核酸の相補物を含んだワクチンも提供する。
【０１４１】
該ワクチンのある実施態様では、前記単離された核酸はプラスミドである。
【０１４２】
さらに、本発明は、Eimeria tenella、Eimeria maxima、Eimeria acervulina、Eimeria necatrix、Eimeria praecox、Eimeria mitis、若しくはEimeria brunetti、又は免疫学的に交叉反応する抗原を発現している微生物に対するワクチンであって、Eimeria maximaの配偶子母細胞由来の８２ｋＤａポリペプチド若しくは該ポリペプチドの相同体をコードするヌクレオチド配列を備える単離された核酸又は該核酸の相補物を備えた形質転換細胞を培養することと、Eimeria maximaの配偶子母細胞由来の組換え８２ｋＤａポリペプチドを単離することとによって作製されたEimeria maximaの配偶子母細胞由来の組換え８２ｋＤａポリペプチドを含んだワクチンを提供する。
【０１４３】
別の実施態様では、該ワクチンは、本発明の単離された核酸と本発明の組換えポリペプチドの混合物から構成される。
【０１４４】
別の実施態様では、前記ワクチンは、本発明の単離された核酸と本発明の組換えポリペプチドとEimeria maximaの配偶子母細胞由来の８２ｋＤａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を備える単離された核酸を含むプラスミドとの混合物から構成される。
【０１４５】
さらなる実施態様では、前記ワクチンは、さらに第二の抗原を備える。
【０１４６】
ある実施態様では、前記第二の抗原は、Eimeria maxima由来の抗原をコードする核酸、このような核酸を備えたプラスミド、このような核酸によってコードされるポリペプチドからなる群から選択される。
【０１４７】
別の実施態様では、前記第二の抗原は、配列番号３５若しくは配列番号４２のアミノ酸配列をＮ末端に有するEimeria maximaの配偶子母細胞由来の３０ｋＤａタンパク質、又は配列番号３７、配列番号３９、若しくは配列番号４１のアミノ酸配列をＮ末端に有するEimeria maximaの配偶子母細胞由来の１４ｋＤａタンパク質からなる群から選択される。
【０１４８】
本発明は、Eimeria tenella、Eimeria maxima、Eimeria acervulina、Eimeria necatrix、Eimeria praecox、Eimeria mitis、若しくはEimeria brunetti、又は免疫学的に交叉反応する抗原を発現している微生物による感染に対して被験者を免疫する方法であって、本発明のワクチンを前記被験者に投与する工程を備えた方法も提供する。
【０１４９】
ある実施態様では、前記被験者は、ウシ、ヒツジ、ブタ、及び魚からなる群から選択される種である。
【０１５０】
別の実施態様では、前記被験者は、鳥類種である。
【０１５１】
さらなる実施態様では、前記鳥類種は、ニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、アヒル、チャボ、ウズラ、及びハトからなる群から選択される。
【０１５２】
さらなる実施態様では、前記鳥類種はニワトリである。
【０１５３】
さらなる実施態様では、前記投与は、静脈内、筋肉内、又は腹腔内注射を備える。
【０１５４】
ある実施態様では、前記投与工程は、前記被験者の鼻孔に前記ワクチンを噴霧することを備える。
【０１５５】
別の実施態様では、前記投与はインビボで行われる。
【０１５６】
さらなる実施態様では、前記投与は卵の気嚢に対して行われ、これにより、胚を前記ワクチンに接触させる。
【０１５７】
本発明は、本発明のワクチンが接種された気嚢を有する鳥類種由来の受精卵であって、孵化前又は孵化直後に、病原性（virulent）型のEimeria tenella、Eimeria maxima、Eimeria acervulina、Eimeria necatrix、Eimeria praecox、Eimeria mitis、若しくはEimeria brunetti、又は免疫学的に交叉反応する抗原を発現している微生物に対する免疫応答を前記ワクチンが胚に誘導することができる、受精卵も包含する。
【０１５８】
ある実施態様では、前記鳥類種は、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、ガチョウ、チャボ、ウズラ、及びハトからなる群から選択される。
【０１５９】
別の実施態様では、前記鳥類種はニワトリである。
【０１６０】
本発明は、前記アミノ酸配列が配列番号３で示される、組換えポリペプチドも提供する。
【０１６１】
本発明は、前記アミノ酸配列が配列番号６で示される、組換えポリペプチドも提供する。
【０１６２】
本発明は、配列番号３５のアミノ酸配列をＮ末端に有するEimeria maximaの配偶子母細胞由来の３０ｋＤａタンパク質も提供する。
【０１６３】
本発明は、配列番号４２のアミノ酸配列をＮ末端に有するEimeria maximaの配偶子母細胞由来の３０ｋＤａタンパク質も提供する。
【０１６４】
本発明は、配列番号３７のアミノ酸配列をＮ末端に有するEimeria maximaの配偶子母細胞由来の１４ｋＤａタンパク質も提供する。
【０１６５】
本発明は、配列番号３９のアミノ酸配列をＮ末端に有するEimeria maximaの配偶子母細胞由来の１４ｋＤａタンパク質も提供する。
【０１６６】
本発明は、配列番号４１のアミノ酸配列をＮ末端に有するEimeria maximaの配偶子母細胞由来の１４ｋＤａタンパク質も提供する。
【０１６７】
上記タンパク質及びそれらの対応するヌクレオチド配列は、前記５６ｋＤａ及び８２ｋＤａのタンパク質に関して上記したのと同様に使用することができ、被験者を免疫すること、及び前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有するプラスミドを宿主細胞中に取り込ませるために使用することが含まれる。
【０１６８】
本発明は、鳥類種の新生仔被験者に対して、Eimeria tenella、Eimeria maxima、Eimeria acervulina、Eimeria necatrix、Eimeria praecox、Eimeria mitis、若しくはEimeria brunetti、又は免疫学的に交叉反応する抗原を発現している微生物による感染に対する母子免疫（抗体）を付与する方法であって、受精卵の産卵に先立つ適宜の時点で本発明のワクチンを前記被験者の母親に投与することによって、母子免疫(maternal immunity)を介して、Eimeria tenella、Eimeria maxima、Eimeria acervulina、Eimeria necatrix、Eimeria praecox、Eimeria mitis、若しくはEimeria brunetti、又は免疫学的に交叉反応する抗原を発現している微生物による感染に対する保護を前記新生仔被験者に付与する工程を備えた方法を提供する。
【０１６９】
さらなる実施態様では、前記鳥類種は、ニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、アヒル、チャボ、ウズラ、及びハトからなる群から選択される。
【０１７０】
さらなる実施態様では、前記投与は、静脈内、筋肉内、又は腹腔内注射を備える。
【０１７１】
本発明は、鳥類種の新生仔被験者から糞便中へのEimeriaの胞嚢体(oocyst)の排出を減少させる方法であって、受精卵の産卵に先立つ適宜の時点で本発明のワクチンを前記被験者の母親に投与することによって、免疫反応を惹起し、前記新生仔からの胞嚢体の排出が減少するように、母子抗体(maternal antibody)を前記新生仔に伝達させる工程を備えた方法を提供する。
【０１７２】
さらなる実施態様では、前記鳥類種は、ニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、アヒル、チャボ、ウズラ、及びハトからなる群から選択される。
【０１７３】
さらなる実施態様では、前記投与は、静脈内、筋肉内、又は腹腔内注射を備える。
【０１７４】
本発明は、Eimeria tenella、Eimeria maxima、Eimeria acervulina、Eimeria necatrix、Eimeria praecox、Eimeria mitis、若しくはEimeria brunetti、又は免疫学的に交叉反応する抗原を発現している微生物による感染に対して被験者を免疫する方法であって、Eimeria maximaの配偶子母細胞から５６ｋＤａ又は８２ｋＤａのポリペプチドを発現するする生きた非病原性微生物又は生ウイルスを含む生ワクチンを前記被験者に投与する工程を備えた方法も提供する。
【０１７５】
ある実施態様では、前記生ウイルスはポックスウイルスである。
【０１７６】
ある実施態様では、前記被験者は、ウシ、ヒツジ、ブタ、及び魚からなる群から選択される種である。
【０１７７】
別の実施態様では、前記被験者は、鳥類種である。
【０１７８】
さらなる実施態様では、前記鳥類種は、ニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、アヒル、チャボ、ウズラ、及びハトからなる群から選択される。
【０１７９】
さらなる実施態様では、前記投与は、静脈内、筋肉内、又は腹腔内注射を備える。
【０１８０】
本発明は、Eimeria tenella、Eimeria maxima、Eimeria acervulina、Eimeria necatrix、Eimeria praecox、Eimeria mitis、若しくはEimeria brunetti、又は免疫学的に交叉反応する抗原を発現している微生物による感染に対して被験者を免疫する方法であって、Eimeria maximaの配偶子母細胞由来の５６ｋＤａ又は８２ｋＤａのポリペプチドを発現する細胞を有する植物を前記被験者に節食させる工程を備えた方法も提供する。
【０１８１】
ある実施態様では、前記植物は麦である。
【０１８２】
別の実施態様では、前記植物はトウモロコシである。
【０１８３】
ある実施態様では、前記被験者は、ウシ、ヒツジ、ブタ、及び魚からなる群から選択される種である。
【０１８４】
別の実施態様では、前記被験者は、鳥類種である。
【０１８５】
さらなる実施態様では、前記鳥類種は、ニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、アヒル、チャボ、ウズラ、及びハトからなる群から選択される。
【０１８６】
本発明には、Eimeria tenella、Eimeria maxima、Eimeria acervulina、Eimeria necatrix、Eimeria praecox、Eimeria mitis、若しくはEimeria brunetti、又は免疫学的に交叉反応する抗原を発現している微生物による感染に対して被験者を免疫する方法であって、Eimeria maximaの配偶子母細胞由来の５６ｋＤａ若しくは８２ｋＤａポリペプチド若しくは該ポリペプチドの相同体をコードするヌクレオチド配列を備える単離された核酸又は該核酸の相補物を含むプラスミドを前記被験者に投与する工程を備えた方法も提供する。
【０１８７】
ある実施態様では、前記被験者は、ウシ、ヒツジ、ブタ、及び魚からなる群から選択される種である。
【０１８８】
別の実施態様では、前記被験者は、鳥類種である。
【０１８９】
さらなる実施態様では、前記鳥類種は、ニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、アヒル、チャボ、ウズラ、及びハトからなる群から選択される。
【０１９０】
さらなる実施態様では、前記投与は、静脈内、筋肉内、又は腹腔内注射を備える。
【０１９１】
本発明の核酸の相同体は、該核酸によってコードされるポリペプチドと実質的に同じ生物活性を有するポリペプチドをコードする核酸である。本明細書で使用する「相同」という用語は、相補性の程度を指す。部分的に相同な場合と、完全に相同な（すなわち、同一の）場合がある。部分的な相補配列は、同一配列が標的核酸にハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害する配列であり、「実質的に相同の」という機能的な用語が用いられる。標的配列に対する完全な相補配列のハイブリダイゼーションが阻害されるかどうかは、低ストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションアッセイ（サザン又はノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど）を用いて検討することができる。実質的に相同な配列又はプローブは、低ストリンジェンシー条件下での標的配列への完全に相同な配列又はプローブの結合（すなわち、ハイブリダイゼーション）と競合し、それを阻害する。低ストリンジェンシー条件とは、非特異的結合が許容されるような条件であることは言うまでもない。すなわち、低ストリンジェンシー条件では、２つの配列の相互の結合が特異的（すなわち、選択的）相互作用であることが必要である。非特異的結合の欠如は、部分的な相補性（例えば、約３０％未満の同一性）をも欠く第２の標的配列を使用することによって試験することができる。すなわち、非特異的結合の非存在下では、プローブは、第２の非相補標的配列にハイブリダイズしないはずである。
【０１９２】
当分野で知られているように、多数の等価な条件を使用して、低又は高ストリンジェンシー条件を構成することができる。配列の長さ及び性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成）などの要因、標的の性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成、溶液中での有無、又は固定化など）、並びに塩及び他の成分の濃度（例えば、ホルムアミド、デキストラン硫酸及び／又はポリエチレングリコールの有無）を考慮し、ハイブリダイゼーション溶液を変えて上記の条件とは異なるが等価である低又は高ストリンジェンシー条件を作成することができる。
【０１９３】
本発明の一目的は、Eimeria maximaの配偶子母細胞からの５６及び８２ｋＤａ各抗原をコードするヌクレオチド配列、及びそのために誘導されるアミノ酸配列を提供することである。特に例示的なコード配列を、誘導されるアミノ酸配列とともに図４及び５に示す。例示的なアミノ酸配列と同義であるすべてのコード配列は、本発明の範囲内にある。
【０１９４】
本発明の別の目的は、他のEimeria種からの等価な配列を含めて、機能的に等価なコード配列及びタンパク質配列を提供することである。Eimeria maximaの配偶子母細胞由来の５６及び８２ｋＤａ各抗原の機能的に等価なコード配列は、特異的に同定されたコード配列に望ましくは約５０％〜約８０％のヌクレオチド配列が相同（同一）であり、特に例示的なコード配列に約８０％〜約９５％、望ましくは約９５％〜約１００％のコード配列が同一である。
【０１９５】
特定のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件によって、別な種に由来するコード配列の相同体の同定、及び変異体配列の同定が可能になり、これらの相同体及び／又は変異体配列は、少なくとも５０〜８５％（５０％を含む）、８５〜１００％（８５％を含む）ヌクレオチド配列同一性、９０〜１００％（９０％を含む）又は９５〜１００％（９５％を含む）ヌクレオチド配列同一性を有する。各構成要素及び各指定範囲の各サブセットは、本明細書の範囲内にある。
【０１９６】
本発明のコード配列及び方法は、Eimeria maxima以外の種における相同なコード配列を含む。本明細書に開示された配列及び当分野で周知の実験技術を用いた本発明の方法において有用なEimeria tenella、Eimeria acervulina、Eimeria necatrix、Eimeria praecox、Eimeria mitis及びEimeria brunettiなどの他の種を含めて、ただしこれらだけに限定されない他の生物から、（例えば、ｃＤＮＡからの）対応するコード配列を単離する方法を使用することができる。
【０１９７】
ストリンジェント条件下で開示された配列にハイブリダイズする、本明細書に例示されたもの以外の種に由来する配列は、特に本発明に含まれる。ストリンジェント条件とは、所与のプローブ長さ及びヌクレオチド組成に対して当分野で了解されている条件を意味し、ストリンジェント条件下でハイブリダイズ可能であるということは、無関係な配列のアニーリングには不利な傾向にある標準条件（すなわち、高温及び／又は低塩含量）下での対象ヌクレオチド配列又はその相補鎖へのアニーリングを意味する。
【０１９８】
「高ストリンジェンシー条件」は、６５℃〜６８℃、０．１ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの（約９５〜１００％ヌクレオチド配列同一性／類似性を示す）ハイブリダイゼーション及び洗浄条件を意味する。ハイブリダイゼーションアッセイ及び条件は、Sambrook等(1989) Molecular Cloning、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory、Plainview、N.Y.にさらに詳しく記載されている。本明細書で使用する適度な（中程度の）ストリンジェンシー条件は、５０〜６５℃、１ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの（ポジティブなハイブリダイゼーション結果が約８０〜９５％のヌクレオチド配列同一性を反映する）ハイブリダイゼーション及び洗浄条件である。低ストリンジェンシー条件は、通常、４０〜５０℃、６ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの（約５０〜８０％のヌクレオチド配列同一性を反映する）ハイブリダイゼーション及び洗浄条件である。
【０１９９】
本発明のポリペプチドの相同体は、該ポリペプチドと実質的に同じアミノ酸配列及び生物活性を有するポリペプチドである。したがって、相同体は、本発明のポリペプチドとは、得られるポリペプチドが該ポリペプチドの生物活性を保持する限り、１つ又は複数の非必須アミノ酸残基の付加、欠失又は置換によって異なることができる。当業者は、どのアミノ酸残基が付加、欠失又は置換（どのアミノ酸とそのような置換が成され得るかを含めて）されたかを、例えば、対象ポリペプチドのポリペプチド相同体の細菌発現をコードするＤＮＡ配列の設計及び製造、部位特異的突然変異誘発技術によるｃＤＮＡ及びゲノム配列の改変、組換えポリペプチド及び発現ベクターの構築、ポリペプチドの細菌発現、及び従来の生化学アッセイによるポリペプチドの生化学活性測定のための従来法を含めて、確立された周知の操作を用いて、容易に決定することができる。
【０２００】
相同体の例は、対象ポリペプチドにおいて指定された残基のすべてに満たない残基を含有する欠失相同体、指定された１つ又は複数の残基が他の残基によって置換された置換相同体、及び１つ又は複数のアミノ酸残基がポリペプチドに付加した付加相同体である。このような相同体はすべて、本発明のポリペプチドの生物活性を共有する。
【０２０１】
「実質的に同一のポリペプチド」は、本明細書では、ポリペプチドのアミノ酸配列のＮ末端における４未満のアミノ酸の欠失、付加又は置換を包含すると定義される。また、ポリペプチドの生物活性を消失させない、配列の欠失、付加又は置換もあり得る。このような改変は、当業者には既知である。例えば、置換は、例えば、Lehninger、Biochemistry、第2版.Worth Pub.、New York(1975);Creighton、Protein Structure、a Practical Approach、IRL Press at Oxford Univ.Press、Oxford、England(1989);及びDayhoff、Atlas of Protein Sequence and Structure 1972、National Biomedical Research Foundation、Maryland(1972)に記載された相同又は等価な基と一致する最大１０個の残基を包含することができる。
【０２０２】
本明細書で使用する「生物学的に活性」という用語は、天然分子の構造的機能、調節機能又は生化学機能を有するポリペプチドを指す。同様に、「免疫学的に活性」とは、天然、組換え又は合成ポリペプチド、あるいはそれらの任意のオリゴペプチド部分が、動物又は細胞において特異的免疫応答を誘発し、特異的抗体と結合する能力を指す。
【０２０３】
「実質的に同一の生物活性」とは、天然の分子と同じ生物活性を指し、当業者が依然として同一の生物活性であると認める程度又はレベルでわずかに異なり得る。
【０２０４】
（「所与のポリペプチドの一部」のように）ポリペプチドに関連して本明細書で使用する「部分」という用語は、該ポリペプチドの断片を指す。この断片は、４アミノ酸残基から、全アミノ酸配列−１アミノ酸までのサイズとすることができる。（「所与の核酸の一部」のように）核酸に関連して本明細書で使用する「部分」という用語は、該核酸の断片を指す。この断片は、１２ヌクレオチド残基から、全核酸配列−１ヌクレオチドまでのサイズとすることができる。
【０２０５】
本明細書で使用する「欠失」とは、それぞれ１つ又は複数のアミノ酸又はヌクレオチド残基が欠けているアミノ酸又はヌクレオチド配列の変化を指す。
【０２０６】
本明細書で使用する「挿入」又は「付加」とは、天然の分子と比較して、それぞれ１つ又は複数のアミノ酸又はヌクレオチド残基が付加した結果となるアミノ酸又はヌクレオチド配列の変化を指す。
【０２０７】
本明細書で使用する「置換」とは、それぞれ異なるアミノ酸又はヌクレオチドによる１つ又は複数のアミノ酸又はヌクレオチドの置換を意味する。
【０２０８】
本発明は、主要なEimeria maxima配偶子母細胞抗原のうち、５６及び８２ｋＤａの各分子量を有する２つの抗原の組換えクローニング及びシーケンシングを提供する。
【０２０９】
本発明は、Ｅ．cｏｌｉ発現系におけるプラスミドｐＴｒｃＨｉｓを用いたこれらの組換え抗原の発現も提供する。
【０２１０】
本発明は、組換え５６ｋＤａ抗原を含む、コクシジウム症に対するワクチンも提供する。また、本発明は、組換え８２ｋＤａ抗原を含む、コクシジウム症に対するワクチンも提供する。
【０２１１】
本発明は、主要なEimeria maxima配偶子母細胞抗原のうち、５６及び８２ｋＤａの各分子量を有する２つの抗原のクローニング及びシーケンシングを提供する。
【０２１２】
５６及び８２ｋＤａ各糖タンパク質自体のアミノ酸配列決定を行うのに十分な配偶子母細胞抗原（すなわち、ミリグラム量の特異的抗原）を単離するために配偶子母細胞の生成をスケールアップした。このスケールアップ生成は、それ自体極めて困難な課題であり、配列解析を実施するのに十分な材料を用意するために数千のニワトリを感染させる必要があった。この目標を達成した後に、大規模スケールで２つの糖タンパク質の単離を開始するのに十分な親和性精製配偶子母細胞抗原（ＡＰＧＡ）を生成することができた。
【０２１３】
精製した配偶子母細胞抗原糖タンパク質を２次元ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって分離した。染色による２次元ゲルの分析後、ＰＶＤＦメンブレンフィルターに移し、ＡＰＧＡに対する抗血清を用いて免疫検出することによって５６及び８２ｋＤａ各抗原の位置を決定した。５６及び８２ｋＤａ各抗原を同定し、フィルターから除去した後、それらのＮ末端配列、並びにトリプシンペプチドから得られる内部タンパク質配列のアミノ酸配列決定を実施した。どの小さな特異的オリゴヌクレオチドプローブが合成されるかに基づいて、ＤＮＡ配列を予測するために、これらのペプチド配列を用いた。
【０２１４】
特異的オリゴヌクレオチドプローブをＲＡＣＥ  ＰＣＲ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅(rapid amplification of cDNA ends)）に用いて、５６及び８２ｋＤａ各抗原をコードする配偶子母細胞ＲＮＡからｃＤＮＡ分子を調製した。この方法によって、所望のペプチドをコードするＲＮＡ配列をその中に含有するｍＲＮＡ分子から、特異的に増幅された完全長ｃＤＮＡ分子を生成させることが可能になった。次いで、このｃＤＮＡ生成物の完全な配列を決定し、上で配列決定した様々なペプチドの有無を確認した。驚くべきことに、本発明者らが得たｃＤＮＡクローンは、Wallach他、米国特許第5,932,225号に記載されたものとは無関係であることを本発明者らは見出した。したがって、Wallach他において、単離された５６及び８２ｋＤａ各抗原をコードすると考えられた抗体及びクローンを用いてｃＤＮＡライブラリをスクリーニングしたときに発生する人為産物は、実際にはこれらの抗原をコードしないと考えられる。
【０２１５】
最後に、２つの新しいｃＤＮＡクローンをサザン及びノーザンブロッティング実験におけるプローブとして用いて、５６及び８２ｋＤａ各抗原をコードする特異的遺伝子及びｍＲＮＡ分子を同定した。以前にはブロットによって明確なバンドパターンが得られなかった（米国特許第５，９３２，２２５号）のに対し、２つの抗原をコードする遺伝子断片及びｍＲＮＡ転写物の数及びサイズが明確に確認された。
【０２１６】
本発明は、（組換え抗原の精製に役立つ）ポリｈｉｓタグを含有する細菌発現ベクターｐＴｒｃＨｉｓに、５６及び８２ｋＤａ各抗原をクローニングするための方法もさらに提供する。次いで、特異的誘導分子（イソプロピル−α−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を添加し、その後組換え５６及び８２ｋＤａ各抗原タンパク質をウェスタンブロッティングによって同定することによって、Ｅ．cｏｌｉ中でこの２つの遺伝子を発現させた。これらのブロットの結果、５６及び８２ｋＤａ各組換え抗原が、質量分析法による測定に基づく正確なサイズを有し、ｈｉｓタグに対する抗体、並びに未変性５６及び８２ｋＤａ各配偶子母細胞抗原に対して産生された防御抗血清によって認識されることが示された。これらの結果から、クローンの同一性が確認され、これらの組換え抗原を用いて、ニワトリのコクシジウム症に対する母性ベースのワクチン中の未変性抗原を置換できることが示された。
【０２１７】
本発明は、５６ｋＤａ配偶子母細胞抗原と３０ｋＤａ胞嚢体タンパク質の関係についても述べる。この胞嚢体タンパク質は、免疫ブロットによって、５６及び８２ｋＤａ各配偶子母細胞抗原に対する抗血清と強く反応することが示された。３０ｋＤａ胞嚢体タンパク質のアミノ末端配列を決定することによって、本発明者らは５６ｋＤａ抗原のアミノ末端と正確に一致することを見出した。したがって、５６ｋＤａ抗原は、配偶子母細胞から胞嚢体が発達する間に３０ｋＤａタンパク質に処理されると結論された。
【０２１８】
本発明を、以下の実施例によってさらに説明するが、これらをさらに本発明を限定するものと決して解釈すべきではない。当業者は、考察した特定の方法及び結果が単に本発明を説明するためのものであり、その後の特許請求の範囲に、より完全に記載されていることを容易に理解できるはずである。
【実験の詳細】
【０２１９】
［実施例１］
Eimeria maxima配偶子母細胞の大規模スケールでの精製
極めて多量の配偶子母細胞を産生するために、４，０００匹の重種ニワトリを１０，０００個の胞子形成したE.maximaの胞嚢体に感染させ、次いで、感染から６日（約１３４時間）後に屠殺した。ニワトリの腸を取り出し、ＰＢＳで洗浄し、長軸方向に切開した。次いで、１ｃｍ長の小片に切断し、０．５ｍｇ／ｍＬヒアルロニダーゼ（Ｔｙｐｅ  ＩＩＩ、Ｓｉｇｍａ、７００単位／ｍｇ）を含有するＳＡＣ緩衝溶液（１７０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７、１０ｍＭグルコース、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１％粉乳）に入れた。腸の小片を３７℃で２０分間インキュベートし、その後ガーゼフィルターの上に置いた。この小片を多量のＳＡＣ緩衝液ですすぎ、得られたろ液を回収した。次いで、このろ液を１７ミクロンのポリモン（ｐｏｌｙｍｏｎ）フィルター(Swiss Silk Bolting Cloth Mfg.Co.Ltd.、Zurich、Switzerland)を通してろ過し、次いで得られたろ液を１０ミクロンフィルターを通してろ過した。配偶子母細胞を１０ミクロンフィルター上から回収し、検査し、顕微鏡によって数え、遠心分離瓶に入れ、８００Ｇで１０分間回転させた。次いで、配偶子母細胞をＳＡＣ緩衝液で２回洗浄し、−７０℃で凍結させた。
【０２２０】
［実施例２］
５６、８２及び２３０ｋＤａ各配偶子母細胞抗原の精製
凍結配偶子母細胞を室温で解凍し、既報（Wallach  1995）のようにしてタンパク質を抽出した。５６及び８２ｋＤａ各配偶子母細胞抗原を、５６ｋＤａ抗原に対して産生されたモノクローナル抗体１Ｅ１１−１１を含有するセファロース４Ｂカラムにかけてタンパク質抽出物から単離した。配偶子母細胞抗原の複合物を、樹脂に付着したモノクローナル抗体と結合させ、非特異的材料を緩衝液を用いて洗い流し、親和性精製された配偶子母細胞抗原（ＡＰＧＡ）をカラムから溶出させた。この精製ＡＰＧＡを凍結乾燥させた。少量のＡＰＧＡ試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析すると、５６及び８２ｋＤａの各未変性抗原が明瞭に可視化された（図１）。
【０２２１】
［実施例３］
ＡＰＧＡの２次元ゲル電気泳動及び主要な５６及び８２ｋＤａ各抗原の単離
５６及び８２ｋＤａ各配偶子母細胞抗原をＡＰＧＡから単離した。凍結乾燥ＡＰＧＡを実施例２に記載したように調製し、水に溶解させた。次いで、このタンパク質を２次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し（図２）、５６及び８２ｋＤａの両方のタンパク質を認識するポリクローナルニワトリ抗ＡＰＧＡ抗体を用いた免疫ブロットによって同定した。このタンパク質を同定し、２次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でのその位置を確定した後、ＰＶＤＦメンブレンフィルターに移し、クーマシーブルーを用いて染色した（図３）。同時に免疫ブロットを実施し、２つのブロットを比較して５６及び８２ｋＤａの各タンパク質を明確に同定した。５６及び８２ｋＤａの各配偶子母細胞抗原に対応するスポットをメンブレンから切り出し、各抗原のアミノ末端の配列を決定した。
【０２２２】
［実施例４］
５６及び８２ｋＤａ各抗原のアミノ末端及び内部トリプシンペプチドのアミノ酸配列決定
５６及び８２ｋＤａ各タンパク質のアミノ末端配列を以下のように決定した。
５６ｋＤａタンパク質のアミノ末端：ＶＰＳＴＴＰＶＥＮＱＶＨＰＹ−ＥＭ  （配列番号７）
８２ｋＤａタンパク質のアミノ末端：−ＰＴＶＬＤＴＴＴＧ−ＱＶＥＤＴ  （配列番号８）
【０２２３】
５６及び８２ｋＤａ各タンパク質の内部トリプシン消化断片のタンパク質配列を決定するために、ＡＰＧＡ調製物を１次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってまず分離し、クーマシーブルーにより染色した。次いで、このタンパク質をゲルから切り出し、トリプシン消化してその配列を決定した。
【０２２４】
いくつかのトリプシンペプチド配列が両方のタンパク質から得られた。結果を表１に要約する。
【０２２５】
表１  ５６及び８２ｋＤａ各抗原から単離されたトリプシンペプチドのアミノ酸配列
【表１】
2005501533.tif 000002
【０２２６】
得られたアミノ酸配列は、いかなる他の既知のタンパク質ともなんら相同性を示さなかった。
【０２２７】
［実施例５］
５６及び８２ｋＤａ各抗原をコードする各遺伝子のＲＡＣＥ  ＰＣＲクローニング及び配列決定
５６及び８２ｋＤａ各タンパク質の遺伝子を、SMART RACE PCR技術(Clonetech)を用いて配偶子母細胞ｃＤＮＡから増幅した。E.maxima配偶子母細胞からＲＮＡを単離し、Dynalヒ゛ース゛(Dynal)を用いてｍＲＮＡを精製した。逆転写酵素Powerscript(Clonetech)を用いて製造者の指示による手順に従って、SMART ready cDNAを合成した。SMART RACE PCRマニュアルに記載された手順、ＤＮＡポリメラーゼ、Advantage Taq(Clonetech)、高忠実度酵素混合物を用いて、５’及び３’両末端の増幅を実施した。
【０２２８】
実施例１に示したように、配偶子母細胞をニワトリの腸から単離し、数回ろ過し、完全に洗浄した。ニワトリ腸の残留物がこの調製物中にまだ残っている懸念があった。すなわち、５６及び８２ｋＤａ各遺伝子のアミノ末端用に設計された縮重プライマー及び内部トリプシンペプチド断片用に設計された縮重プライマーを用いて実施したＰＣＲによって、精製配偶子母細胞及び未感染ニワトリ細胞から調製された両方のｃＤＮＡ試料におけるバンドが生じた。この状況において、臭化エチジウムを用いてアガロースゲル上で強く染色されたＰＣＲバンドを精製し、pGEMT-Easy(Promega)中にクローン化し、その配列を決定した(SUPAMAC sequencing service、Sydney、Australia)。いくつかの例において、再配列が認められるとき、又はクローン断片の配列決定が困難なときは、直接ＰＣＲ産物から配列を得た。ＰＣＲ産物からのＤＮＡ配列データがトリプシンペプチドのアミノ酸配列のいずれかに翻訳される場合、ＰＣＲ産物は寄生虫起源であり、配列決定を続けた。
【０２２９】
５６及び８２ｋＤａ各タンパク質の完全長配列を、それぞれ図４及び５に示す。２３０ｋＤａタンパク質の完全長配列を図１２に示す。
【０２３０】
５６配偶子母細胞抗原のトリプシンペプチド及びＮ末端のアミノ酸配列は、対応するクローンＤＮＡから生じる誘導アミノ酸配列に一致した。
【０２３１】
５６ｋＤａタンパク質の場合、９つのトリプシンペプチドの配列が決定された（表１）。ｓｂ５６ｉを除くすべてのペプチドを、５６ｋＤａタンパク質に対応するクローン遺伝子に位置づけることができた（図４）。このトリプシン断片は、試料中に存在する混入バンドに対応し得る。詳細には、以下のとおりである。
−トリプシンペプチドｓｂ５６ａ、ｓｂ５６ｂ、ｓｂ５６ｃ、ｓｂ５６ｄ、ｓｂ５６ｆ及びｓｂ５６ｈは、クローンＤＮＡによって予想される誘導アミノ酸配列に正確に一致した。
−トリプシンペプチドｓｂ５６ｇは、クローンＤＮＡによって予想される誘導アミノ酸配列に正確には一致しなかった。トリプシン断片の配列を再分析すると、新しい配列はクローンＤＮＡから誘導される予測配列により近いものであった。
【０２３２】
トリプシン消化断片ｓｂ５６ｇオリジナル配列：ＲＱ−−ＴＡＡＷＭＤＲ−ＴＡ［Ｌ／Ｉ］ＥＱＥＥＴＴ  （配列番号２３）
再分析ｓｂ５６ｇ配列：ＲＧＶＱＴＡＡＷＭＤＧＶＴＡ  Ｉ  ＥＫＥＥＴＴ  （配列番号２４）
ＤＮＡから誘導されたａａ配列：ＲＧＶＱＴＡＡＷＭＮＧＶＴＡ  Ｉ  ＥＫＥＥＴＴ  （配列番号２５）
【０２３３】
このペプチドのアミノ酸１０における不一致は依然残っており、タンパク質配列はＤを示し、ＤＮＡ配列はＮを予想する。このＤＮＡセグメントは４回配列決定され、毎回Ｎが予想された。
【０２３４】
トリプシンペプチドのアミノ酸及び８２配偶子母細胞抗原のＮ末端の配列は、対応するクローンＤＮＡから生じる誘導アミノ酸配列に一致する。
【０２３５】
８２ｋＤａタンパク質の場合、７個のトリプシンペプチドの配列が決定された（表１）。ｓｂ８２ｄ及びｓｂ８２ｅの２つを除くすべてのペプチドを、８２ｋＤａタンパク質に対応するクローン遺伝子に位置づけることができた。このトリプシン消化断片は、試料中に存在する汚染バンドに対応している可能性がある。詳細は以下のとおりである。
−トリプシンペプチドｓｂ８２ａ、ｓｂ８２ｂ、ｓｂ８２ｃ、ｓｂ５６ｄ及びｓｂ８２ｆは、クローンＤＮＡによって予想される誘導アミノ酸配列に正確に一致した。
−トリプシンペプチドｓｂ８２ｄ及びｓｂ８２ｅは、クローンＤＮＡによって予想される誘導アミノ酸配列に一致しなかった。
【０２３６】
上述の配列情報に加えて、
１）８２ｋＤａタンパク質の成熟形をコードするＯＲＦの予想サイズは、質量分析法によって決定して６４，２７５Ｄａであり、未変性タンパク質の真のサイズである６２，２３６Ｄａに対応する。
２）５６ｋＤａタンパク質の成熟形をコードするＯＲＦの予想サイズは、質量分析法によって決定して５１，４０７Ｄａであり、未変性タンパク質の真のサイズである５２，４５０Ｄａに対応する。
【０２３７】
最後に、２つのタンパク質とＤＮＡの配列は、他のあらゆる既知の遺伝子又はタンパク質となんら相同性を示さなかった。
【０２３８】
［実施例６］
５６及び８２ｋＤａ  ｃＤＮＡクローンプローブを用いたサザン及びノーザンブロッティング。
最初に様々な制限酵素を用いてＤＮＡを切断し、得られたＤＮＡ断片をアガロースゲル上で分離することによって、E.maxima及びニワトリＤＮＡを用いたサザンブロッティングを実施した。その後、ＤＮＡをニトロセルロース紙に移し、Ｐ３２標識ｃＤＮＡプローブを用いて５６（図６）又は８２（図７）ｋＤａ抗原を探索し、オートラジオグラフィを実施した。その結果、５６及び８２ｋＤａの両方の抗原に対して、２つのタンパク質をコードする２つの異なる単一コピー遺伝子が存在すると考えられた。
【０２３９】
ＲＮＡ分子をアガロースゲル上で分離し、それをニトロセルロースフィルターに移し、Ｐ３２標識５６及び８２各ｃＤＮＡクローンを用いて探索することによって、E.maxima及びニワトリＲＮＡを用いたノーザンブロッティングを実施した。その結果、５６ｋＤａ  ｍＲＮＡが約１．９ＫＢの分子量を有し、８２ｋＤａ  ｍＲＮＡが約２．４ＫＢの分子量を有することが示された（図８）。これらのサイズは、ＤＮＡ配列から予測されるサイズに極めて類似している。
【０２４０】
［実施例７］
ｐＴｒｃＨｉｓベクターを用いたＥ．ｃｏｌｉ中での組換え５６及び８２ｋＤａ抗原の発現及び未変性ＡＰＧＡに対する血清を用いたそれらの分析
８２ｋＤａタンパク質をコードする完全長遺伝子を、末端制限酵素切断部位を有する遺伝子特異的プライマーを用いてE.maxima配偶子母細胞ｃＤＮＡから増幅して、発現ベクターｐＴＲＣＨｉｓｂ(Invitrogen)中への一定方向のクローニングを促進させた。完全長遺伝子は、成熟タンパク質のアミノ末端コード領域及び停止コドン（５７５  ａａ）までの（ただし、停止コドンを含まない）配列を含んでいた。５６ｋＤａタンパク質をコードする遺伝子の部分的断片を、末端制限酵素切断部位を有する遺伝子特異的プライマーを用いてE.maxima配偶子母細胞ｃＤＮＡから増幅した。これは、タンパク質のアミノ末端、さらに配列の３２３アミノ酸、完全長成熟タンパク質よりも短い１３３アミノ酸を含んでいた。両方の遺伝子を市販のベクターｐＴｒｃＨｉｓｂ(Invitrogen)にクローン化した。
【０２４１】
１）ｐＴｒｃＨｉｓ  Ｂにおける５６ｋＤａ遺伝子の発現
形質転換された細菌を１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて誘導し、細菌溶解物を１Ｄ−ＳＤＳ  ＰＡＧＥ及び免疫ブロットによって分析した（図９）。組換えタンパク質のＨｉｓ融合タグに対する市販の抗Ｈｉｓ抗体は、誘発条件下で４０ｋＤａの予想サイズのバンドを認識した（このクローンは、１３３アミノ酸に対するコード領域を欠いている）。非誘発条件下でも、このバンドと低レベルの反応性があり、遺伝子発現の漏出がある程度存在することを示している。次いで、組換え５６ｋＤａタンパク質を認識できるかどうかを、ニワトリポリクローナル抗ＡＰＧＡ抗体を用いた免疫ブロットによって評価した。免疫ブロットから、抗ＡＰＧＡ抗体は、１次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって未変性タンパク質及び組換えタンパク質を認識することが示され、クローン遺伝産物が実際に５６ｋＤａタンパク質をコードすることが明確に実証された。
【０２４２】
２）ｐＴｒｃＨｉｓ  Ｂにおける８２ｋＤａ遺伝子の発現
形質転換された細菌を１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて誘導し、細菌溶解物を１次元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ及び免疫ブロットによって分析した（図１０）。組換えタンパク質のＨｉｓ融合タグに対する市販の抗Ｈｉｓ抗体は、誘発条件下でも非誘発条件下でも８２ｋＤａの予想サイズのバンドを認識した。次いで、組換え８２ｋＤａタンパク質を認識できるかどうかを、ニワトリポリクローナル抗ＡＰＧＡ抗体を用いた免疫ブロットによって評価した。精製配偶子母細胞から単離された未変性ＡＰＧＡを用いてニワトリを免疫することによってこの抗体を産生した。免疫ブロットから、抗ＡＰＧＡ抗体は、１次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって未変性タンパク質及び組換えタンパク質を認識することが１Ｄ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって示され、クローン遺伝産物が実際に８２ｋＤａタンパク質をコードすることが明確に実証された。
【０２４３】
上記結果、並びに実施例５に記載した配列分析に基づいて、本発明者らは、上述の２つのｃＤＮＡクローンが５６及び８２ｋＤａ各抗原をコードする真正な遺伝子であると結論した。また、未変性抗原に対して産生された抗血清との強い反応性から、これらの組換えタンパク質を用いてＡＰＧＡを置換し、コクシジウム症に対してニワトリを免疫化できることが示された。
【０２４４】
［実施例８］
E.maxima胞嚢体由来の５６ｋＤａ抗原と３０ｋＤａ抗原の相同性
ＡＰＧＡに対する抗体を用いて、胞嚢体抗原の２次元ブロット上で相同なタンパク質を検出した。本発明者らは、３０ｋＤａのタンパク質と極めて強い反応性があることを見出した（図１１）。このスポットをメンブレンフィルターから切り出し、このタンパク質のＮ末端配列を決定した。得られたアミノ酸配列は、配偶子母細胞５６ｋＤａ抗原のＮ末端配列に正確に対応した。この知見に基づいて、本発明者らは、配偶子母細胞５６ｋＤａ抗原が処理されて、発達の胞嚢体時期の３０ｋＤａタンパク質になると結論した。
【０２４５】
［実施例９］
Eimeria maxima由来の５６ｋＤａ配偶子母細胞抗原ｇａｍ  ５６の発現
未変性タンパク質：Ｍｒ  ５６，０００（分子サイジング（ＭＳ、ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｉｚｉｎｇ）によって決定されたサイズ：５２，４５０Ｄａ）
源：寄生虫：Eimeria maxima
ライフサイクル時期：大配偶子母細胞
遺伝子：５ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）断片にわたって存在する１，７５４塩基対配列。コード領域の約４００ｂｐを含む遺伝子の最後の約６００ｂｐを除いて、これらすべてをｐＧＥＭＴ−Ｅａｓｙにクローン化する。
５’ＵＴＲ  （１〜１０２ｂｐ）
ＯＲＦ  （１０３〜１，５３３ｂｐ）
３’ＵＴＲ  （１，５３４〜１，７３１ｂｐ）
ポリＡ配列（１，７３２〜１，７５４ｂｐ）
ｐＩ：配列から予想される４．８（２Ｄ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、タンパク質はゲルの酸性末端方向に移動する）
【０２４６】
発現構築物
使用発現ベクター：ｐＴＲＣＨｉｓｂ、ｐＥＴ２５ｂ
発現構築物：任意  ｐ５６ＴＲＣＨｉｓｂｌ
発現ベクター中にクローン化された遺伝子断片：以下のプライマー対、すなわちＴＲＣＨｉｓｂのＢａｍＨＩ／ＥｃｏｒＩ部位への一定方向クローニング用ＳＢ７４／ＳＢ７５（１７２〜１１３７ｂｐ）を用いてｃＤＮＡからｇａｍ  ５６を増幅した。増幅された領域は、イニシエータメチオニン及びリーダー配列を除いて、成熟タンパク質のアミノ末端をコードする配列を含む。これは、チロシン−セリンリッチ領域を含み、プロリン−メチオニンリッチ領域を含まない。
【０２４７】
クローン化ｇａｍ  ５６断片のアミノ酸組成：２システインが存在
ｐＴＲＣＨｉｓｂ中にクローン化された遺伝子断片のアミノ酸組成：
Ｓ（12.7％）  Ｙ（11.5％）  Ａ（ 8.7％）  Ｔ（ 8.4％）  Ｐ（ 7.2％）
Ｒ（ 6.6％）  Ｅ（ 6.0％）  Ｍ（ 5.5％）  Ｌ（ 5.5％）  Ｖ（ 4.6％）
Ｑ（ 4.3％）  Ｎ（ 4.3％）  Ｇ（ 3.8％）  Ｄ（ 3.5％）  Ｗ（ 1.7％）
Ｆ（ 1.4％）  Ｋ（ 1.4％）  Ｉ（ 1.4％）  Ｈ（ 0.9％）  Ｃ（ 0.6％）
【０２４８】
予想タンパク質サイズ：４１ｋＤａ
【０２４９】
収率：０．９〜１．４μｇ／ｍＬ（ニッケルアガロース精製タンパク質／ｍＬ培地）  クーマシーブルー染色ゲル上で未精製細菌溶解物中の誘導タンパク質を見ることは困難である。
【０２５０】
発現条件：プロモーターは漏出性があり、したがって本発明者らはＩＰＴＧの非存在下で発現を得ることができる。
１ｍＭ  ＩＰＴＧ、０．０１Ｍ  Ｍｇ２＋ＳＯＢ（ＬＢよりもＳＯＢが良い）中の０．１ｍｇ／ｍＬアンピシリンを含むバッフル付きフラスコを３７℃、４時間誘導で使用した。
【０２５１】
通常、１本の優勢な約４２ｋＤａのバンドが、精製及び銀染色検出後に得られる。主要な約４２ｋＤａバンドと同様に、いくつかの凝集体であり得る高分子量バンドが精製後に得られることが多い。このタンパク質は、−２０℃及び４℃で凝集すると考えられ、精製後、本発明者らは脱塩し安定剤（３％乳糖、１％グルタミン酸一ナトリウム）を添加した。
【０２５２】
［実施例１０］
ニワトリにおける組換え５６ｋＤａ（ｒ５６）及び８２ｋＤａ（ｒ８２）各配偶子母細胞抗原及び２５０ｋＤａ（ｒ２５０）無性世代抗原の免疫化及び攻撃誘発試験
免疫化
動物
2005501533.tif 000003
【０２５３】
抗原
ｐＴＲＣＨｉｓｂ発現系における組換えタンパク質を０．０１Ｍ  Ｍｇ２＋ＳＯＢ中の０．１ｍｇ／ｍＬアンピシリン中３７℃で増殖させ、１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて４時間誘導した。このタンパク質をＮｉ−アガロースカラム上で精製し、濃縮し、脱塩し、安定剤（３％乳糖、１％グルタミン酸一ナトリウム）を加えて凍結乾燥させた。すべての抗原に対して用いたタンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイにより測定した。Ｍ．Wallachによって提供された親和性精製配偶子母細胞抗原（ＡＰＧＡ）調製物を試験の正の対照として用いた。
【０２５４】
グループ及び投与量
−  １グループ当たり９匹のニワトリを使用；合計９グループ；合計８１匹のニワトリを使用。
−  ニワトリを、１匹当たり０．５ｍｌ抗原／フロイド不完全抗原（ＦＩＡ）カクテル（０．２５ｍｌ抗原／０．２５ｍｌ  ＦＩＡ）で、筋肉内、ニワトリの片方のみに、以下の抗原を用いて免疫した：
グループ１  ＰＢＳのみ
グループ２  アジュバント（ＦＩＡ）／ＰＢＳ
グループ３  ＡＰＧＡ（２．５ｇ）
グループ４  ｒ２５０タンパク質（１．０ｇ）
グループ５  ｒ２５０タンパク質（１０．０ｇ）
グループ６  ｒ５６タンパク質（０．５ｇ）
グループ７  ｒ５６タンパク質（５．０ｇ）
グループ８  ｒ８２タンパク質（０．５ｇ）
グループ９  ｒ８２タンパク質（５．０ｇ）
【０２５５】
免疫化スケジュール
免疫化１：  第１週
免疫化２：  第３週
出血：      第６週
出血：      第８週
出血／屠殺：第９週
【０２５６】
分析
−  採血（約１．５〜２ｍｌ／トリ）し、血清を分離し、ＥＬＩＳＡ及び免疫ブロットにより試験した
【０２５７】
結果
出血の結果を図１４に示す。
【０２５８】
攻撃誘発
動物及び寄生虫
−  出血１のＥＬＩＳＡによる結果に基づいて、各グループから抗体力価の最も高い５匹のニワトリ（１４８日齢；約４．５月）を使用した。ＰＢＳ及びＦＩＡ対照の場合、抗体力価の最も低いニワトリを使用した
−  E.maxima（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ菌株）；
−  攻撃誘発の１週前に餌からロベニデンを除いた
【０２５９】
グループ
以下のグループ及びニワトリを上記の免疫化試験から採用し、攻撃誘発実験に使用した
2005501533.tif 000004
【０２６０】
攻撃誘発スケジュール
ロベニンデンを除去した
トリ１匹当たり１００個の胞子形成胞嚢体を用いて攻撃誘発した    第６日
【０２６１】
胞嚢体の回収及び計測スケジュール
第０日  感染後
第１日  感染後
第２日  感染後
第３日  感染後
第４日  感染後
【０２６２】
胞嚢体の結果に別の種が混入していないかどうかを検討した
プラスチックシートを交換して収集を開始した
【０２６３】
第５日  感染後  糞便を回収し、胞嚢体を数えた
第６日  感染後  糞便を回収し、胞嚢体を数えた
第７日  感染後  糞便を回収し、胞嚢体を数えた
第８日  感染後  糞便を回収し、胞嚢体を数えた
第９日  感染後  糞便を回収し、胞嚢体を数えた
第１０日  感染後  糞便を回収し、胞嚢体を数えた
【０２６４】
【表２】
2005501533.tif 000005
【０２６５】
［実施例１１］
２５０ｋＤａ無性世代タンパク質の組換え断片の発現
予想された膜貫通領域／サイトゾル尾部及び上流の親水性領域をコードする２５０ｋＤａタンパク質領域を発現試験用に選択した（図１５）。この区域は、以下のいくつかの理由によって選択された：１）類似した３’親水性末端領域がいくつかのアピコンプレックス門ミクロネームタンパク質において同定され、このタンパク質ファミリーに固有と考えられる；２）このような領域は、免疫優性の主としてEimeria tenellaミクロネームタンパク質１（ＥｔＭＩＣ１）及び表面抗原５４０１（ＥｔＭＩＣ４）としても認識される他のミクロネームタンパク質においても同定された；３）類似の領域はE.tenella  ５４０１抗原（ＥｔＭＩＣ４）からも発現され、E.tenellaによる攻撃誘発に対して有意な防御をもたらすことが見出された（Ｄａｎｆｏｒｔｈ等、１９８８）；４）他のタンパク質領域は、主としてＥＧＦ様及びＴＳＰ−１様ドメインからなる。これらのドメインタイプは、真核生物中に高度に保存されていることが見出され、したがって、それらの誘導自己免疫の可能性を考えなければならない。また、このようなドメインタイプが蔓延していることから、これらが強い免疫応答を誘導する原因であるとは考え難い。
【０２６６】
２５０ｋＤａタンパク質をコードするｃＤＮＡクローンから、選択したＤＮＡ領域を増幅するように、ＰＣＲプライマーＥＰ００６（５’−ＴＴＧＧＡＴＣＣＣＧＡＡＴＴＧＣＡＣＣＣＣＡ  ＴＴＣＣ−３’）及びＥＰ００７（５’−ＴＴＧＡＡＴＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＧＣＣＧＣＴＧＴＣＧ−３’）を設計した。これらのプライマーには、ＢａｍＨＩ（ＥＰ００６）及びＥｃｏＲＩ（ＥＰ００７）制限酵素切断部位が組み込まれており、選択した発現ベクターへのクローニングが容易になる。このプライマーを用いてその後生成されるＰＣＲ産物をゲル精製し、その同一性を配列決定によって確認した。
【０２６７】
細菌発現ベクターｐＴｒｃＨｉｓＢ(Invitrogen)を発現試験用に選択した。プラスミドベクターＤＮＡ及びゲル精製されたｃＤＮＡ挿入断片を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、消化されたＤＮＡ断片をゲル精製し連結した。この連結混合物を、平板培養しインキュベーションした後にＥ．ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５−ａ中に形質転換し、得られたコロニーを選択し、培養し、プラスミド調製に用いた。選択された組換え体の同一性をＤＮＡ配列を決定することによって確認した。
【０２６８】
発現に備えて、発現構築物を含有するプラスミドＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主発現菌株ＴＯＰ１０中に形質転換した。平板培養及びインキュベーション後、単一の細菌コロニーを選択し、それを用いてＬＢ培地においてＯ／Ｎ培養物(O/N culture)を樹立した。ベクターのみの負の対照培養物を樹立した。次いで、一定量の各培養物を新鮮なＬＢ培地に移し、細胞が対数期の中間部に到達するまでインキュベートし、そこで１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加して発現を誘発させた。発現培養及び負の対照培養からの各試料を誘導から０、１、２、５及び２４時間後に採取し、遠心して細菌細胞のペレットにした。続いて、すべてのペレットをＴＥ緩衝液に再懸濁し、超音波処理し、遠心分離して、水溶性画分（上清）を不溶画分（ペレット）から分離させた。すべての画分を還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析し、続いてクーマシーブルーで染色した。負の対照試料と比較すると、４５ｋＤａマーカーのすぐ下に移動する過剰発現タンパク質が可溶画分中に検出された。ｐＴｒｃＨｉｓ発現産物の６×ヒスチジンタグと反応する抗体を用いた可溶画分のウェスタン分析によって、同じ見掛け分子量のタンパク質バンドが検出された。発現タンパク質の予想サイズは約３０ｋＤａであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで観測されたサイズよりもやや小さかった。このサイズの相違は、見掛け分子量の高いタンパク質を移動させることが知られ発現タンパク質中に高頻度で出現するプロリン残基によっておそらく説明することができる。
【０２６９】
免疫原性試験に備えて、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースニッケル充填樹脂（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、製造者の推奨手順をわずかに変更してこの発現タンパク質を精製した。６ｘＨｉｓタグを含有する発現タンパク質は、この樹脂に結合し、溶出緩衝液中のイミダゾール濃度を増加させることによって置換される。手短に述べると、１ｍｇ／ｍＬリゾチームを含有する溶解緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）中に細胞ペレットを再懸濁させた。この懸濁液を氷上で超音波処理し、遠心分離して不溶材料をペレットにした。次いで、可溶タンパク質を含有する上清をＮｉ−ＮＴＡ樹脂と混合し、使い捨て溶出カラムに入れた。このスラリーを静置し、次いで、洗浄緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）で洗浄し、溶出緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）で溶出させた。溶出画分の純度を、還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクーマシーブルー染色によって分析した。
【０２７０】
免疫原性試験の詳細は、５６ｋＤａ及び８２ｋＤａ試験に関するものである。マウスの試験の場合、マウス１匹当たり０．５μｇ及び５μｇ用量の組換えタンパク質を用いた（６マウス／グループ）。ニワトリの試験の場合、トリ１羽当たり１μｇ及び１０μｇ用量を用いた（９ニワトリ／グループ）。マウス及びニワトリ試験から収集した血清試料に対するＥＬＩＳＡの結果をそれぞれ図１６及び１７に示す。
【０２７１】
［実施例１２］
寄生虫（大配偶子母細胞）の有性世代に見られる前駆体タンパク質からEimeriaの胞嚢体壁が誘導される。この前駆体タンパク質は、プロセシングを受け、ジチロシン架橋されて寄生虫から排出された形の強化防御バリアを形成する。
【０２７２】
５６ｋＤａ及び８２ｋＤ各無性世代大配偶子母細胞抗原をコードする遺伝子をクローン化して、その配列を決定した。両方の遺伝子とも、異常なアミノ酸組成を示し、特に、両方ともチロシンリッチ領域を有する。すなわち、５６ｋＤａタンパク質は１つのチロシンリッチ領域を有し、８２ｋＤａタンパク質は２つのチロシンリッチ領域を有する。チロシンが豊富なタンパク質は、以前からE.acervulina及びE.tenellaにおける胞嚢体壁の形成に関係付けられている（Eschenbacher等）。したがって、胞嚢体壁形成における５６ｋＤａ及び８２ｋＤ各無性世代抗原中のチロシンリッチ領域の役割を、Eimeria maximaにおいて検討した。
【０２７３】
５６ｋＤａタンパク質の組換え体に対する抗体（抗ｒ５６）及び８２ｋＤａタンパク質の組換え体に対する抗体（抗ｒ８２）は、胞子形成しない胞嚢体及び胞子形成した胞嚢体中の約３０ｋＤａタンパク質、及び精製された壁断片中の約３０ｋＤａタンパク質を認識する（図１８及び１９参照）。これらは、配偶子母細胞抽出物におけるそれらの未変性体カウンターパートも認識する。精製胞嚢体壁断片において抗ｒ８２ｋＤａ抗体によって認識される約３０ｋＤａタンパク質は、抗ｒ５６によって認識される約３０ｋＤａタンパク質とは同一でなく、わずかに小さい。抗ｒ５６抗体によって認識される約３０ｋＤａタンパク質を精製し、そのＮ末端配列を決定した。約３０ｋＤａタンパク質のＮ末端は、５６ｋＤａ配偶子母細胞抗原のＮ末端に正確に対応する（図２０ａ参照）。
【０２７４】
別の研究者は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクーマシーブルー染色によって、Eimeriaの胞嚢体壁が１４ｋＤａ及び３０ｋＤａの２つの優勢なタンパク質で構成されることを示した。より優れたＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離技術を用いて、本発明者らは、１４ｋＤａタンパク質を約１０〜１４ｋＤａの３つの成分に分解し、それらを１４．１、１４．２及び１４．３と命名した。１４．１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で最も遅く移動したタンパク質であり、１４．３は最も速く移動したタンパク質である（図１８ｃ参照）。本発明者らは、４つのタンパク質すべてのＮ末端配列を決定した。その結果を図２０に示す。要約すると、３０ｋＤａタンパク質は、ＢＬＡＳＴタンパク質探索を通して決定されたすでに特性の明らかなあらゆる他のタンパク質とはなんら類似性を示さない新規なタンパク質である（図２０ｃ参照）。タンパク質１４．３のＮ末端は８２ｋＤａタンパク質のドメイン１におけるチロシンリッチ領域の開始部に対応し（図２０ｂ参照）、タンパク質１４．２のＮ末端は８２ｋＤａタンパク質のドメイン２におけるチロシンリッチ領域の開始部に対応し（図２０ｂ参照）、タンパク質１４．１のＮ末端は５６ｋＤａタンパク質中のチロシンリッチ領域の開始部に対応する（図２０ａ参照）。
【０２７５】
まとめると、これらの結果から、Eimeriaの胞嚢体壁は、寄生虫の有性世代（大配偶子母細胞）の壁形成体中に見られる前駆体タンパク質から誘導されることがわかる。いくつかの情報伝達機構を通して、前駆体タンパク質は約３０ｋＤａ及び約１４ｋＤａのいくつかのより短いタンパク質にタンパク質分解処理される。これまでの知見に反して、本発明者らのデータは、胞嚢体壁が２つを超えるタンパク質で構成されていることを示している。本発明者らの知見から、胞嚢体壁が寄生虫において異なる濃度で存在するいくつかのタンパク質で構成されることが示唆され、そのいくつかは多量に存在してＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクーマシーブルー染色によって認識され、低濃度で存在する他のタンパク質は、より高感度な技術である免疫ブロットによってのみ検出される。クーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて見られる約３０ｋＤａタンパク質は、５６ｋＤａ及び８２ｋＤａ各配偶子母細胞抗原とは関係がないが、より小さな約１０〜１４ｋＤａタンパク質は関係がある。ジチロシンが胞嚢体において０．００３３８ｍｍｏｌ／ｍｏｌ程度の検出可能な濃度で存在するという本発明者らの最近の知見は、小さなチロシンリッチタンパク質がジチロシン架橋を含む機序を通して壁中におそらく保持されていることを示している。しかし、本発明者らは、すべてのタンパク質が壁中にこのように保持されているわけではないと考えており、現在それについて研究中である。
【参考文献】
【０２７６】
2005501533.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【０２７７】
【図１】アフィニティー精製された未変性配偶子母細胞抗原のクーマシーブルー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを表す図。矢印は５６及び８２ｋＤａ抗原を示す。分子量マーカータンパク質が示されている。
【図２】アフィニティー精製された未変性配偶子母細胞抗原を免疫ブロットし銀染色した後の２次元（２Ｄ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを表す図。分子量マーカータンパク質が示されている。
【図３】２次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから移しクーマシーブルーで染色されたＰＶＤＦフィルター、及び配列解析のために切り出されたスポットの同定。矢印は５６及び８２ｋＤａの各抗原を示す。
【図４−１】５６ｋＤａ配偶子母細胞抗原の完全長ＤＮＡ配列を表す図。アミノ末端及び内部トリプシンペプチド断片が示されている。加えて、予想されるイニシエータメチオニン及びシグナルペプチド切断部位が示されている。コード配列、その相補配列及びアミノ酸配列が示されている（配列番号１−３）。
【図４−２】図４−１に同じ。
【図４−３】図４−１に同じ。
【図５−１】８２ｋＤａ配偶子母細胞抗原の完全長ＤＮＡ配列を表す図。アミノ末端及び内部トリプシンペプチド断片が示されている。加えて、予想されるイニシエータメチオニン及びシグナルペプチド切断部位が示されている。コード配列、その相補配列及びアミノ酸配列が示されている（配列番号４−６）。
【図５−２】図５−１に同じ。
【図５−３】図５−１に同じ。
【図５−４】図５−１に同じ。
【図６】５６kＤａ抗原に対するｃＤＮＡクローンをプローブとして探索した配偶子母細胞及び対照用ニワトリＤＮＡのサザンブロットを表す図。ＤＮＡの消化に用いた制限酵素及びキロベースでのマーカーバンドサイズが示されている。
【図７】８２kＤａ抗原に対するｃＤＮＡクローンをプローブとして探索した配偶子母細胞及び対照用ニワトリＤＮＡのサザンブロットを表す図。ＤＮＡの消化に用いた制限酵素及びマーカーバンドサイズが示されている。
【図８】８２kＤａのｃＤＮＡクローンをプローブとして探索した配偶子母細胞(Ｇ)及び対照（Ｃ）用ニワトリ総ＲＮＡのノーザンブロットを表す図。キロベースでのマーカーバンドのサイズが左側に示されている。
【図９】抗Ｈｉｓ抗体及びニワトリ抗ＡＰＧＡと、ｐＴｒｃＨｉｓＢに５６kＤａ  ｃＤＮＡクローンを有しＩＰＴＧによる誘導及び非誘導（対照用）下のバクテリアにより発現されたタンパク質との反応性を示す免疫ブロットを表す図。さらなる負の対照として、未挿入のプラスミドｐＴｒｃＨｉｓＢで形質転換した細胞を試験した。最後に、未変性ＡＰＧＡを抗ＡＰＧＡ抗血清によるブロットの正の対照として用いた。タンパク質マーカーバンドのサイズが示されている。矢印は４１kＤａ組換えタンパク質並びに５６及び８２kＤａ未変性タンパク質の位置を示す。
【図１０】８２kＤａのｃＤＮＡをクローン化されたプラスミドｐＴｒｃＨｉｓＢを有するバクテリア由来のタンパク質のクーマシーブルー染色されたゲル及び免疫ブロットを表す図。免疫ブロットは、ＩＰＴＧによる誘導及び非誘導条件下で、誘導後様々な時間における、抗Ｈｉｓ抗体、ニワトリ抗ＡＰＧＡ及び未感染ニワトリ（負の対照）血清の、８２kＤａ組み換えタンパク質との反応性を示す。負の対照として、未挿入の同プラスミドで形質転換された細菌を用いた試験も実施した。正の対照として、未変性ＡＰＧＡも用いた。矢印は８２kＤａ組換えタンパク質の位置を示す。タンパク質マーカーバンドのサイズが左側に示されている。
【図１１】２次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより分離された、胞子未形成のE.maxima胞嚢体の全溶解物の免疫ブロットを表す図。ゲルをメンブレンフィルターにブロットし、抗ＡＰＧＡ抗血清をプローブにして探索した。強く反応する３０ｋＤａのスポットを矢印で示してある。これはゲルから切り取り、配列解析にかけたスポットであった。
【図１２−１】２３０ｋＤａ  ｃＤＮＡ  E.maximaクローンのＤＮＡ配列と６０％の相同性を示すＷＯ９０／００４０３号の相同ＤＮＡの配列（配列番号２６−２７）とを並列した図。
【図１２−２】図１２−１に同じ。
【図１２−３】図１２−１に同じ。
【図１２−４】図１２−１に同じ。
【図１２−５】図１２−１に同じ。
【図１２−６】図１２−１に同じ。
【図１２−７】図１２−１に同じ。
【図１２−８】図１２−１に同じ。
【図１２−９】図１２−１に同じ。
【図１２−１０】図１２−１に同じ。
【図１２−１１】図１２−１に同じ。
【図１３Ａ】クローンｐＥＭ  ２５０／１４の最初の２９３ヌクレオチドのＤＮＡ配列を表す図。コード配列とそのアミノ酸配列が示されている（配列番号２８−２９）。
【図１３Ｂ】クローンｐＥＭ  ２５０／１４の最後の１９６ヌクレオチドのＤＮＡ配列を表す図。コード配列とそのアミノ酸配列が示されている（配列番号３０−３１）。
【図１４Ａ】組換え型の５６kＤａ及び８２kＤａ配偶子母細胞抗原のニワトリ免疫原性試験に対するＥＬＩＳＡの結果。すべての血清試料は１：１０００に希釈して試験した。Ａ）コーティング抗原：抗ＡＰＧＡ血清の試験にはＡＰＧＡ；ＰＢＳ、ＦＩＡ及び２回投与のｒ５６により免疫化されたニワトリから採取した血清の試験には精製ｒ５６。Ｂ）コーティング抗原：抗ＡＰＧＡ血清の試験にはＡＰＧＡ；ＰＢＳ、ＦＩＡ及び２回投与のｒ８２により免疫化されたニワトリから採取した血清の試験には精製ｒ８２。
【図１４Ｂ】ニワトリに対する組み替え５６kＤａ及び８２kＤａ配偶子母細胞抗原のＥＬＩＳＡによる免疫原性試験の結果。すべての血清試料は１：１０００に希釈して試験した。Ａ）コーティング抗原：抗ＡＰＧＡ血清の試験にはＡＰＧＡ；ＰＢＳ、ＦＩＡ及び２回投与のｒ５６により免疫化されたニワトリから採取した血清の試験には精製ｒ５６。Ｂ）コーティング抗原：抗ＡＰＧＡ血清の試験にはＡＰＧＡ；ＰＢＳ、ＦＩＡ及び２回投与のｒ８２により免疫化されたニワトリから採取した血清の試験には精製ｒ８２。
【図１５】２５０ｋＤａ無性世代タンパク質から発現されたタンパク質断片のＤＮＡ及びコードされたアミノ酸の配列（配列番号３２−３３）。
【図１６】２５０ｋＤａ無性世代タンパク質の組み換え断片によるマウスに対する免疫原性試験。  連続３回の出血に対する各グループの平均が標準誤差バーとともに示されている。すべての血清試料は１：１０００に希釈して試験した。コーティング抗原は、正の対照用ＡＰＧＡグループから採取した血清に対しては１００ｎｇのＡＰＧＡであり、負の対照用ＰＢＳ及びＰＢＳ／ＦＩＡグループ並びに２回投与の組換えタンパク質（ｒ０．ＺＩＧ及びＲ５ＵＧ）に対しては１００ｎｇの組換えタンパク質であった。
【図１７】２５０ｋＤａ無性世代タンパク質の組換え断片によるニワトリに対する免疫原性試験。連続３回の出血に対する各グループの平均が標準誤差バーとともに示されている。すべての血清試料は１：１０００に希釈して試験した。コーティング抗原は、正の対照用ＡＰＧＡグループから採取した血清に対しては１００ｎｇのＡＰＧＡ、あるいは負の対照用ＰＢＳ及びＰＢＳ／ＦＩＡグループ並びに２回投与の組換えタンパク質（ＬＰ．Ｇ及びＲＬＯ＆ＧＴ；Ｇ）に対しては１００ｎｇの組換えタンパク質であった。
【図１８】Eimeria.maximaにおける配偶子母細胞及び壁抗原の抗ｒ５６による認識。
【図１９】Eimeria.maximaにおける配偶子母細胞及び壁抗原の抗ｒ８２による認識。
【図２０】５６ｋＤａ及び８２ｋＤａ配偶子母細胞抗原と比較した接合子嚢壁各タンパク質のＮ末端配列（配列番号３４−４２）。
【図１】
2005501533.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１２−５】
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【図１２−６】
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【図１２−７】
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【図１２−８】
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【図１２−９】
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【図１２−１０】
2005501533.tif 000032
【図１２−１１】
2005501533.tif 000033
【図１３Ａ】
2005501533.tif 000034
【図１３Ｂ】
2005501533.tif 000035
【図１４Ａ】
2005501533.tif 000036
【図１４Ｂ】
2005501533.tif 000037
【図１５】
2005501533.tif 000038
【図１６】
2005501533.tif 000039
【図１７】
2005501533.tif 000040
【図１８】
2005501533.tif 000041
【図１９】
2005501533.tif 000042
【図２０】
2005501533.tif 000043
【国際公開パンフレット】
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2005501533.tif 000045
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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