(57)【要約】本発明は、血液細胞から分析物を取り除く方法の発見に基づき、血球の調製物において、細胞集団中に残留する分析物のレベルが、有意に減少されるという結果を生じる。本方法は、大容量の血球懸濁物で実行され得、そしてこの様式で調製された細胞は、延長した保存後も生存能力が維持され、かつ治療的使用（例えば、輸液用途）において適切である。好ましい血球調製物は、赤血球（ＲＢＣ）集団を含む集団である。また、本発明は、血球懸濁物中の細胞外液（例えば、血漿）の量を低減させるための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血球懸濁物において分析物の濃度を低減させる方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）５０ｍＬよりも多い量で最初の血球懸濁物を提供する工程であって、該血球懸濁物が血球および細胞外液を含む、工程；ならびに
（ｉｉ）該最初の血球懸濁物中の該分析物の濃度と比べて、該分析物の濃度を少なくとも１０３倍低くするのに十分な条件下で、洗浄溶液を用いて該最初の血球懸濁物を洗浄する工程であって、ここで、該血球懸濁物の該血球が、保存溶液において、４℃で２１日より長い保存期間後に、生存能力を保持する、工程
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記洗浄する工程が、以下：
（ｉ）前記最初の血球組成物を遠心分離して、ペレット細胞画分および上清を形成させる工程：
（ｉｉ）該ペレット細胞画分から該上清を取り除く工程；
（ｉｉｉ）該ペレット細胞画分に洗浄溶液を添加する工程；
（ｉｖ）該ペレット細胞画分を該洗浄溶液中に再懸濁し、再懸濁した細胞懸濁物を形成させる工程；
（ｖ）工程（ｉ）〜（ｉｖ）を必要に応じて繰り返す工程；ならびに
（ｖｉ）保存溶液中に該ペレット細胞画分を再懸濁する工程
を包含する、方法。
【請求項３】
前記分析物が低分子である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記低分子が、エチレンイミンオリゴマー、フェノチアジン誘導体、アクリジン誘導体、ソラレン誘導体またはリボフラビンである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記低分子が治療剤である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記分析物がタンパク質である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記タンパク質がプリオンタンパク質である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記プリオンタンパク質が病原性タンパク質である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記分析物が細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が白血球である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記最初の血球懸濁物を抗病原性薬剤で処理する工程をさらに包含する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗病原性薬剤が、エチレンイミンオリゴマー、フェノチアジン誘導体、アクリジン誘導体、ソラレン誘導体またはリボフラビンである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
血球懸濁物中の細胞外液の濃度を低減させる方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）５０ｍＬよりも多い量で最初の血球懸濁物を提供する工程であって、該血球懸濁物が、血球および細胞外液を含む、工程；ならびに
（ｉｉ）該最初の血球懸濁物中の該細胞懸濁物の量と比べて、該細胞懸濁物中の細胞外液の濃度を少なくとも１０３倍低くするのに十分な条件下で、洗浄溶液を用いて該最初の血球懸濁物を洗浄する工程であって、ここで、該血球組成物の該血球が、保存溶液において、４℃で少なくとも２８日の保存期間後に、生存能力を保持する、工程
を包含する、方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、ここで、前記洗浄する工程が、以下：
（ｉ）前記最初の血球組成物を遠心分離して、ペレット細胞画分および上清を形成させる工程：
（ｉｉ）該ペレット細胞画分から該上清を取り除く工程；
（ｉｉｉ）該ペレット細胞画分に洗浄溶液を添加する工程；
（ｉｖ）該ペレット細胞画分を該洗浄溶液中に再懸濁し、再懸濁した細胞懸濁物を形成させる工程；
（ｖ）工程（ｉ）〜（ｉｖ）を必要に応じて繰り返す工程；ならびに
（ｖｉ）保存溶液中に該ペレット細胞画分を再懸濁する工程
を包含する、方法。
【請求項１５】
前記血球組成物の前記血球が、保存溶液において、４℃で少なくとも３５日の保存期間後に、生存能力を保持する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の方法であって、前記血球懸濁物の細胞外液が、前記分析物を含み、そして前記洗浄する工程は、該最初の血球懸濁物中の該分析物の濃度と比べて、該分析物の濃度を低減させる、方法。
【請求項１７】
前記分析物の濃度が、前記最初の血球懸濁物中の前記分析物の濃度と比べて、少なくとも１０４倍低減される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記血球懸濁物が、主に哺乳動物の赤血球を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記分析物が低分子である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記低分子が抗病原性薬剤である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗病原性薬剤の濃度が、哺乳動物の血球レシピエントに対して毒性ではない濃度まで低減される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗病原性薬剤が、エチレンイミンオリゴマー、フェノチアジン誘導体、アクリジン誘導体、ソラレン誘導体またはリボフラビンである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記低分子が治療用薬物である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗病原性薬剤が、エチレンアミンイミンオリゴマーまたはその誘導体である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記哺乳動物の赤血球懸濁物を、血液適合性フィルターを透過させる工程をさらに包含する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
前記血液適合性フィルターが白血球除去フィルターである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記分析物がタンパク質である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２８】
前記タンパク質がプリオンタンパク質である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記プリオンタンパク質が病原性プリオンタンパク質である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
病原性プリオンタンパク質の減少を検出する工程をさらに包含する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
病原性プリオンタンパク質の減少を検出する工程をさらに包含する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
液体エマルジョンを前記洗浄溶液に添加する工程をさらに包含する、請求項１８に記載の方法。
【請求項３３】
病原性プリオンタンパク質の減少を検出する工程をさらに包含する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
液体エマルジョンを前記洗浄溶液に添加する工程をさらに包含する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３５】
病原性プリオンタンパク質の減少を検出する工程をさらに包含する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
エチレンイミンオリゴマーを用いて前記血球懸濁物を処理する工程を包含する、請求項１８に記載の方法。
【請求項３７】
減少された前記分析物が細胞である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞が白血球である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
プリオンタンパク質の減少を検出する工程を包含する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
病原性プリオンタンパク質の減少を検出する工程を包含する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記洗浄溶液が、リン酸緩衝化生理食塩水溶液である、請求項１８に記載の方法。
【請求項４２】
前記赤血球が、生理食塩水または生理食塩水デキストロース洗浄溶液中で洗浄した該赤血球と比べて、より高いＡＴＰレベルを保持する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記洗浄する工程が、閉鎖系において実行される、請求項１８に記載の方法。
【請求項４４】
前記洗浄する工程が自動化されている、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
請求項１３に記載の方法によって産生される、血球組成物。
【請求項４６】
前記血球組成物が、治療学的に有用な血液産物である、請求項４５に記載の血球組成物。
【請求項４７】
輸液方法であって、請求項４６に記載の血球産物をレシピエントに輸液する工程を包含する、輸液方法。
【請求項４８】
血球組成物中の病原性プリオンタンパク質の濃度を低減させる方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）赤血球および細胞外液を含む哺乳動物の最初の血球懸濁物を提供する工程、ならびに
（ｉｉ）該哺乳動物の最初の血球懸濁物中の該病原性プリオンタンパク質の濃度と比べて、該病原性プリオンタンパク質の濃度を低減させるのに十分な条件下で、該血球懸濁物を洗浄溶液を用いて洗浄する工程
を包含する、方法。
【請求項４９】
病原性プリオンタンパク質の存在下または非存在について、前記血球懸濁物をアッセイする工程をさらに包含する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
請求項４９に記載の方法であって、該方法は、第一の哺乳動物の血球懸濁物の病原性プリオン濃度と比べて、病原性プリオンタンパク質濃度の、少なくとも１ケタの減少を検出する工程をさらに包含する、方法。
【請求項５１】
プリオンタンパク質の存在または非存在について、前記血球組成物をアッセイする工程をさらに包含する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
少なくとも約１００ログのプリオンタンパク質の減少を検出する工程をさらに包含する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
液体エマルジョンを前記洗浄溶液に添加する工程をさらに包含する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５４】
前記血球懸濁物を、血液適合性フィルターを透過させる工程をさらに包含する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５５】
前記第一の血球懸濁物を、抗病原性薬剤で処理する工程をさらに包含する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５６】
前記抗病原性薬剤が、エチレンイミンオリゴマーである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
請求項５０に従って得られた、赤血球懸濁物。
【請求項５８】
前記赤血球組成物が、治療学的に有用な血液産物である、請求項５７に記載の赤血球懸濁物。
【請求項５９】
請求項５８に記載の血球産物を、レシピエントに輸液する工程を包含する、輸液方法。
【請求項６０】
血球産物によって伝染可能な海綿状脳障害の伝染の危険性を減少させる方法であって、該血液産物中の検出可能な細胞外タンパク質のレベルを、実質的に減少させる工程を包含する、方法。
【請求項６１】
前記細胞外タンパク質が、該血球懸濁物中の血球を洗浄する工程によって減少される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
請求項６１に記載の方法であって、ここで、前記洗浄する工程が、以下：
（ｉ）血球および細胞外液を含む血球懸濁物を提供する工程；
（ｉｉ）前記最初の血球組成物を遠心分離して、ペレット細胞画分および上清を形成させる工程：
（ｉｉ）該ペレット細胞画分から該上清を取り除く工程；
（ｉｉｉ）該ペレット細胞画分に洗浄溶液を添加する工程；ならびに
（ｉｖ）該ペレット細胞画分を該洗浄溶液中に再懸濁し、再懸濁した細胞懸濁物を形成させる工程、および工程（ｉｉ）〜（ｉｖ）を必要に応じて繰り返す工程；
を包含する、方法。
【請求項６３】
前記減少された細胞外タンパク質がプリオンタンパク質である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記減少されたプリオンタンパク質が、病原性プリオンタンパク質である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
細胞外タンパク質の濃度の低減を検出する工程をさらに包含する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】
前記細胞外タンパク質が、血清アルブミン、ＩｇＧ、サイトカインおよびプリオンタンパク質からなる群より選択される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記細胞外タンパク質が病原性プリオンタンパク質である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記最初の血液細胞懸濁物をエチレンイミンオリゴマーで処理する工程をさらに包含する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６９】
前記血球産物が赤血球濃縮物である、請求項６２に記載の方法。
【請求項７０】
前記血球産物がヒト赤血球濃縮物である、請求項６２に記載の方法。
【請求項７１】
血球産物によって伝染可能な海綿状脳障害の発症を遅らせる方法であって、該血液産物中の検出可能な細胞外タンパク質のレベルを、実質的に減少させる工程を包含する、方法。
【請求項７２】
前記細胞外タンパク質が、血球懸濁物における前記血球を洗浄する工程によって減少される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
請求項７１に記載の方法であって、ここで、前記洗浄する工程が以下：
（ｉ）血球および細胞外液を含む血球懸濁物を提供する工程；
（ｉｉ）前記最初の血球組成物を遠心分離して、ペレット細胞画分および上清を形成させる工程：
（ｉｉ）該ペレット細胞画分から該上清を取り除く工程；
（ｉｉｉ）該ペレット細胞画分に洗浄溶液を添加する工程；ならびに
（ｉｖ）該ペレット細胞画分を該洗浄溶液中に再懸濁し、再懸濁した細胞懸濁物を形成させる工程、および工程（ｉｉ）〜（ｉｖ）を必要に応じて繰り返す工程；
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、生物学的組成（例えば、血液）から分析物（例えば、プリオンタンパク質）を除去するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
細胞性血液産物（例えば、赤血球細胞（「ＲＢＣ」）および血小板）は、患者内に輸液される前に、徹底的な精製手順および貯蔵手順に供され得る。精製手順は、夾雑する病原体（例えば、ウイルス、細菌、原生動物）の不活化および／または除去、ならびに所望されないタンパク質および核酸の除去を含み得る。赤血球（ｒｅｄ  ｃｅｌｌ）の精製が、貯蔵された血液産物の半減期に影響し得、そして輸液の際、体内の血球の生存にもまた影響し得るということは、認識される。
【０００３】
貯蔵の間に、血液組成（例えば、赤血球）は、形態学的変化および生物学的変化を被り、そして融解（これは、溶血と呼ばれる）し得る。形態学的変化および生物学的変化は、赤血球の細胞膜の流動性、およびまた、組織に酸素を送達するこれらの細胞中のヘモグロビンの能力に影響し得る。貯蔵の間に生じる形態学的変化は、最終的には、細胞上のスピクラの発達を導く（エキノサイトーシス）。これらのスピクラは、小胞のように発芽し得、細胞の表面対体積比および狭いチャネルを介する通過の際に変形する能力を根本的に変化し得る。このような異常な細胞および損傷したの細胞は、典型的には、血流から除去される。従って、細胞の最小数（代表的には、赤血球の少なくとも７５％）が輸液後２４時間循環する場合にのみ、細胞は、輸液に適切であるとみなされる。
【０００４】
特定の状況において、血球が貯蔵され得る期間を延ばすことが望ましくあり得る。例えば、自己血液産物（すなわち、外科的手順の前にドナーから除去され、そして手術の間かもしくは手術の後にドナーに再導入される血液産物）は、手術が行われ得る前に死に得る。感染性因子（それ自体は、ドナーの感染数週間後には現れていない）によって生じる疾患の証拠についてドナーを再試験し得る数ヶ月にわたって、血液産物が貯蔵されることもまた、提唱されている。これらの疾患としては、例えば、ＡＩＤＳまたは肝炎疾患が挙げられ得る。
【発明の開示】
【発明の効果】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、血球から分析物を取り出すための方法の発見に一部基づき、この方法は、血球の調製物を生じ、ここで、細胞集団中の残りの分析物のレベルが顕著に低減される。本方法は、大容量の血球懸濁物において実施され得、そしてこの様式で調製された細胞は、延長した貯蔵後に生存し続け、そして治療用途（例えば、輸液適用）に適切である。好ましい血球調製物は、赤血球（ＲＢＣ）集団を含むものである。
【０００６】
１つの局面において、本発明は、血球懸濁物中の細胞外液（例えば、血漿）の量を低減させるための方法を提供する。本方法は、血球および細胞外液を含む大容量の血球懸濁物を提供する工程、ならびに血球懸濁物中の細胞外液の量を、最初の懸濁物中の細胞外液の量と比べて少なくとも１０３倍に低減させるに十分な条件下で、洗浄溶液を用いて血球懸濁物を洗浄する工程を包含する。また、本発明の洗浄工程によって生成される血球組成物が、提供される。また、本発明の洗浄工程によって生成される血球組成物をレシピエントに輸液する方法が、提供される。
【０００７】
好ましい実施形態において、洗浄されるべき血球懸濁物は、４０ｍＬ、５０ｍＬ、７５ｍＬ、１００ｍＬ、２００ｍＬ、３００ｍｌ、４００ｍｌまたはまさに１Ｌより多い容量で提供される。
【０００８】
好ましい実施形態において、洗浄された血球は、適切な貯蔵溶液中にて、４℃での延長した貯蔵後に生存し続ける。例えば、好ましい実施形態において、洗浄された血球は、１〜６℃、好ましくは、４℃での貯蔵の２４時間後に生存し続ける。好ましい実施形態において、洗浄された血球は、１〜６℃、好ましくは、４℃での貯蔵の２４時間、２日、７日、１４日、２１日、２８日、３５日、４０日、４２日以上後に生存し続ける。
【０００９】
本発明の洗浄方法を使用して、血球懸濁物中の残りの任意の分析物の濃度を、最初の血球懸濁物中の分析物の濃度に比べて、顕著に低減させ得る。いくつかの実施形態において、１つより多い分析物の濃度が、低減され得る。いくつかの実施形態において、分析物は、細胞の形質膜（例えば、形質膜の細胞外表面）と結合される。いくつかの実施形態において、分析物は、血球懸濁物の細胞外液中に存在する。
【００１０】
いくつかの実施形態において、分析物は、低分子である。本発明の好ましい実施形態において、方法は、レシピエントに対して潜在的に有害であり得る、ドナー血球懸濁物中の所望されない低分子（例えば、薬物、抗病原性薬剤または細胞保存剤）の濃度を実質的に低減させるために提供される。本明細書中で使用される場合、「低分子」は、約１０００ダルトン未満の質量を有する分子である。本発明の方法によって除去し得る低分子の例は、グリセロール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エチレンイミンオリゴマーおよびその誘導体、フェノチアジン誘導体、ソラレン、アクリジン誘導体、リボフラビンまたは薬物（例えば、抗凝固薬もしくは抗生物質）である。分析物が低分子である場合のいくつかの実施形態において、本発明の洗浄方法は、最初の血球懸濁物中の分析物の濃度と比べて少なくとも１００倍、好ましくは、少なくとも１０００倍の因子によって、残りの任意の分析物の濃度を低減させる。従って、好ましい実施形態において、本発明の方法は、ドナー血球懸濁物中の所望されない低分子の濃度を実質的に低減させ、それにより、レシピエントにおいて所望されない薬理学的、免疫学的もしくは毒物学的影響、または所望されない薬理学的、免疫学的もしくは毒物学的影響の危険性を低減させるが、輸液前の延長した貯蔵後でさえ、血球懸濁物の治療適合性を維持する（血小板について３日より長く、赤血球について１４日より長い）。
【００１１】
他の実施形態において、分析物は、１０００ダルトンより大きい分子である。例えば、分析物は、高分子（例えば、核酸またはタンパク質）であり得る。本発明の好ましい実施形態において、方法は、レシピエントに対して潜在的に有害であり得る、ドナー血球懸濁物中の所望されない高分子（例えば：神経学的障害を生じさせ得るプリオンタンパク質；レシピエントにおいて炎症反応および熱反応を産生し得る酵素、抗体およびサイトカイン；またはアレルギー性反応を生じさせ得る血漿タンパク質）の濃度を実質的に低減させるために提供される。血球懸濁物中のレベルが本発明の方法に従って低減されるタンパク質分析物の例は、プリオンタンパク質、サイトカイン（例えば、インターロイキン１β、腫瘍壊死因子α、インターロイキン６、インターロイキン８、インターロイキン１０）、炎症性酵素（好中球エラスターゼ、カテプシン、セリンプロテイナーゼ）、アナフィラトキシン（例えば、Ｃ３ａ、Ｃ５ａ、ブラジキニン）；免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡ）である。従って、好ましい実施形態において、本発明の方法は、ドナー血球懸濁物中の所望されない高分子の濃度を実質的に低減させ、これによりレシピエント中の所望されない反応または所望されない反応の危険性を低減させるが、延長した貯蔵の後でさえ、血球懸濁物の治療適合性を維持する。
【００１２】
他の実施形態において、除去および／または低減させるべき分析物は、細胞（例えば細菌、原生動物、またはウイルス粒子（特に、細胞外ウイルス粒子））である。特に好ましい実施形態において、本発明の方法によって除去および／または低減されるべき細胞は、白血球（白血球膜フラグメントを含む）である。従って、好ましい実施形態において、本発明の方法は、ドナー血球懸濁物中の所望されない細胞、細胞フラグメントの濃度を実質的に低減させ、これによりレシピエント中の所望されない反応を低減させるが、延長した貯蔵の後でさえ、血球懸濁物の治療適合性を維持する。
【００１３】
従って、本発明の方法は、ドナー血液より調製された血球懸濁物中の潜在的に有害な分析物の濃度を低減させることによって、レシピエント中の所望されない反応の発生またはレシピエント中の所望されない反応の危険性を低減させるために提供される。好ましい実施形態において、本方法は、血球懸濁物の最初の濃度と比べて、所望されない分析物の濃度を少なくとも１０倍、１００倍、１０３倍、１０４倍、１０５倍または１０６倍低減させる工程を包含する。所望されない分析物は、低分子または高分子（ｌａｒｇｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）であり得る。「低分子」によって、１０００ダルトン未満の分子量を有する分子が意味される。前述の例としては、グリセロール、ＤＭＳＯ、エチレンイミンオリゴマー、ソラレン、フェノチアジンに基づく薬剤、アクリジンに基づく薬剤、リボフラビンまたは薬物（寄付の資格がないとしてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  ＢａｎｋｓまたはＦＤＡまたは米軍によって認められている任意の薬物を含み得る）が挙げられ得る。
【００１４】
あるいはまたはさらに、分析物は、１０００ダルトンより大きい分子であり得る。例えば、分析物は、高分子（例えば、核酸またはタンパク質）であり得る。血球懸濁物中のレベルが本発明の方法に従って低減されるタンパク質分析物の例は、プリオンタンパク質（特に、病原性プリオンタンパク質）である。本発明の方法によって除去される分析物の他の例としては、細胞（例えば、白血球、微生物病原体（例えば、細菌、真菌もしくは原生動物生物）または感染性ウイルス因子）が挙げられ得る。
【００１５】
好ましい実施形態において、洗浄は、血球懸濁物を遠心分離して、パックされた細胞画分および細胞外液を含む上清を形成させる工程、このパックされた細胞画分から上清を除去する工程、このパックされた細胞画分に洗浄溶液を添加する工程、ならびにこのパックされた細胞画分を洗浄溶液中に再懸濁して、再懸濁された細胞懸濁物を形成する工程を包含する。所望される場合、遠心分離工程および再懸濁する工程は、反復（例えば、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回以上）され得る。遠心分離工程および再懸濁する工程が反復される回数は、細胞外液および／または分析物の所望の減少倍数（ｆｏｌｄ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）ならびに各洗浄工程で使用される洗浄溶液対細胞外液の比に依存する。洗浄溶液対細胞外液の比が大きければ、細胞外液の所望の減少倍数に達するために必要とされる洗浄サイクルの数は少なくなる。例えば、５０％ヘマトクリットでの３００ｍｌの赤血球濃縮物は、１５０ｍｌのＲＢＣおよび１５０ｍｌの細胞外液を含む。８０％ヘマトクリットの赤血球ペレットに達するように血液が遠心分離され、残りの細胞外液が除される場合、濃縮されたＲＢＣ中の残りの細胞外液は３０ｍｌである。２７０ｍｌの添加によって血液が再懸濁される場合、次いで１／１０の希釈が達成される。このプロセスは、数サイクルより多く反復され得る。第１サイクル、第２サイクルおよび第３サイクルは、それぞれ１０倍、１００倍および１０００倍の細胞外希釈効果を達成する。
【００１６】
最初の血球懸濁物または本発明の方法によって洗浄された残りの血球懸濁物は、例えば、分析物および／または生存能力に特異的な検出方法による分析物の所望の減少倍数について、当該分野において公知の方法によって評価され得る。
【００１７】
いくつかの実施形態において、本発明の洗浄溶液は、リン酸緩衝化生理食塩水である。いくつかの実施形態において、本発明の洗浄溶液は、５０ｍＭ以下のリン酸（例えば、約１２〜３０ｍＭリン酸）を含む。本発明のこの実施形態において、リン酸緩衝化洗浄溶液で血球懸濁物を洗浄することによって、リン酸を含まない溶液で洗浄された細胞懸濁物と比べて、分析物（例えば、エチレンイミンオリゴマーまたは誘導体）の低減が増加するという発見の一部に基づく。さらに、リン酸緩衝化溶液で洗浄された本発明の細胞懸濁物は、緩衝化されていない生理食塩水溶液にて洗浄された細胞懸濁物と比べて、より低い溶血レベルを含み、より高いＡＴＰ濃度を維持する。
【００１８】
好ましい実施形態において、血液細胞懸濁物は、哺乳動物血液細胞を含む。好ましくは、血液細胞は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、乳牛、ヤギ、ヒツジまたはブタから得られる。好ましい実施形態において、血液細胞懸濁物は、赤血球および／または血小板および／または白血球および／または骨髄細胞が挙げられる。特に好ましい実施形態において、本発明の方法は、哺乳動物（例えば、ヒト）赤血球濃縮物または血小板濃縮物または白血球濃縮物を含む血液細胞懸濁物中の細胞外液または細胞外液および分析物を除去および／または低減するために使用され得る。好ましい実施形態において、血液細胞懸濁物は、哺乳動物無核細胞濃縮物を含む。特に好ましい実施形態において、本発明の方法は、哺乳動物（例えば、ヒト）赤血球濃縮物における細胞外液または細胞外液および分析物を除去および／または低減するために使用され得る。
【００１９】
好ましい実施形態において、洗浄は、最初の細胞懸濁物に存在する量と比較して、残存する細胞外液の量を、少なくとも１０４倍、１０５倍または１０６倍低下させる。より好ましい実施形態において、洗浄は、最初の細胞懸濁物に存在する量と比較して、残存する細胞外液の量を、少なくとも１０７倍、１０８倍、１０９倍、１０１０倍または１０１１倍低下させる。さらにより好ましい実施形態において、洗浄は、最初の細胞懸濁物に存在する量と比較して、残存する細胞外液の量を、少なくとも１０１２倍、１０１３倍、１０１４倍、１０１５倍、１０１６倍、１０１７倍、または１０１８倍低下させる。
【００２０】
好ましい実施形態において、洗浄は、最初の血液細胞懸濁物中の濃縮物と比較して、細胞懸濁物において少なくとも１０２倍、１０３倍または１０４倍、分析物の濃度を低下させる。好ましい実施形態において、洗浄は、最初の血液細胞懸濁物中の濃縮物と比較して、細胞懸濁物において少なくとも１０５倍または１０６倍、分析物の濃度を低下させる。さらに好ましい実施形態において、洗浄は、最初の血液細胞懸濁物中の濃縮物と比較して、細胞懸濁物において少なくとも１０７倍、１０８倍、１０９倍、１０１０倍または１０１１倍、分析物の濃度を低下させる。さらに好ましい実施形態において、洗浄は、最初の血液細胞懸濁物中の濃縮物と比較して、細胞懸濁物において少なくとも１０１２倍、１０１３倍、１０１４倍、１０１５倍、１０１６倍、１０１７倍または１０１８倍、分析物の濃度を低下させる。
【００２１】
低減されるべき分析物が低分子である好ましい実施形態において、本発明の方法は、薬理学的に、免疫学的に、または毒物学的に不活性なレベルまで、分析物の濃度を低減するために使用される。低減されるべき分析物が抗病原性因子（例えば、エチレンイミンオリゴマー、フェノチアジン誘導体、ソラレン、アクリジン誘導体、リボフラビン）である好ましい実施形態において、本発明の方法が、身体上で作用するレベル未満であるレベルにまで抗病原性因子の濃度を低減するために使用されることが望まれる。
【００２２】
いくつかの好ましい実施形態において、抗病原性因子の低減された最終濃度は、約１ｇ／ｍｌ未満であり、好ましくは、約１ｍｇ／ｍｌ未満である。さらに好ましい実施形態において、低減された抗病理学因子の最終濃度は、約１０−４ｇ／ｍｌ未満、約１０−５ｇ／ｍｌ未満、約１０−６ｇ／ｍｌ未満、約１０−７ｇ／ｍｌ未満、約１０−８ｇ／ｍｌ未満、約１０−９ｇ／ｍｌ未満、約１０−１０ｇ／ｍｌ未満、約１０−１１ｇ／ｍｌ未満、または約１０−１２ｇ／ｍｌ未満である。
【００２３】
いくつかの実施形態において、洗浄手順は、自動化される。いくつかの実施形態において、洗浄は、環境微生物の導入を回避するために、閉鎖系において実施される。
【００２４】
いくつかの実施形態において、この洗浄手順は、エチレンイミンオリゴマーまたはその誘導体のような病原体不活性化化合物による、血液細胞懸濁物の前処理の後に、続く。
【００２５】
いくつかの実施形態において、血液細胞懸濁物は、洗浄の前または後に、生体適合性フィルター、好ましくは、白血球除去フィルターに通される。
【００２６】
低減される分析物が細胞（例えば、白血球）である好ましい実施形態において、血液細胞懸濁物は、エチレンイミンオリゴマー（例えば、ダイマー、トリマー、もしくはテトラマー、またはその誘導体）で処理され、続いて、本発明の洗浄手順が行われる。この細胞分析物は、最初の細胞懸濁物中の細胞分析物濃度に対して、この細胞懸濁物において少なくとも１００倍、１０３倍、１０４倍、または１０５倍低減される。より好ましい実施形態において、細胞分析物濃度は、この細胞懸濁物において、少なくとも１０６倍、１０７倍、１０８倍、１０９倍、１０１０倍または１０１１倍低減される。低減されるべき細胞分析物が白血球である場合、本発明の上記実施形態は、赤血球懸濁物のエチレンイミンオリゴマーによる処理および本発明の方法に従う洗浄の組み合わせが、白血球が実質的に除去される赤血球懸濁物を生じるという発見に一部基づいている。
【００２７】
低減されるべき分析物が白血球である別の好ましい実施形態において、赤血球懸濁物は、エチレンイミンオリゴマーで処理され、濾過によって白血球が低減され、そして、本発明の手順に従って洗浄される。この白血球は、本発明の上記方法によって、細胞懸濁物において、少なくとも１０３倍、１０４倍、または１０５倍低減される。より好ましい実施形態において、この白血球濃縮物は、細胞懸濁物において、少なくとも１０６倍、１０７倍、１０８倍、１０９倍、１０１０倍または１０１１倍低減される。
【００２８】
血液細胞懸濁物において低減される分析物がプリオンタンパク質である好ましい実施形態において、プリオンタンパク質の量は、本発明の方法により、最初の血液細胞懸濁物におけるプリオンタンパク質の量と比較して、少なくとも１０倍、好ましくは１０２倍低減される。好ましくは、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）は、最初の血液細胞懸濁物におけるプリオンタンパク質の量と比較して、少なくとも１０３倍、１０４倍または１０５倍低減される。より好ましくは、洗浄は、最初の血液細胞懸濁物におけるプリオンタンパク質の量と比較して、少なくとも１０６倍、１０７倍または１０８倍、プリオンタンパク質の量を十分に低減する。より好ましくは、プリオンタンパク質は、最初の血液細胞懸濁物におけるプリオンタンパク質の量と比較して、少なくとも１０９倍または１０１０倍低減される。
【００２９】
本発明の１実施形態において、プリオンタンパク質は、本発明の洗浄手順によって、血液細胞懸濁物において低減される。別の実施形態において、プリオンタンパク質は、洗浄溶液が親油性懸濁物を含む本発明の洗浄手順によって、血液細胞懸濁物において低減される。本発明の別の実施形態において、プリオンタンパク質は、血液適合性フィルター（好ましくは、白血球除去フィルター）に血液細胞懸濁物を通すことと組み合わせた、本発明の洗浄手順によって、血液細胞懸濁物において、低減される。別の好ましい実施形態において、プリオンタンパク質は、洗浄溶液が親油性懸濁物を含み、血液細胞懸濁物が血液適合性フィルターに通される本発明の洗浄手順によって、血液細胞懸濁物において、低減される。
【００３０】
好ましい実施形態において、本発明の上記方法によって除去および／または低減されたプリオンタンパク質は、病原性プリオンタンパク質である。理論によって束縛されることを望まないが、血液および／または血液産物は、いくつかの場合において、プリオン病原性因子を感染し得ると考えられる。特に好ましい実施形態において、本発明の上記方法によって除去および／または低減されるプリオンタンパク質は、内因性血液由来プリオンタンパク質である。特に好ましい実施形態において、本発明の方法によって除去および／または低減されるプリオンタンパク質は、病原性血液由来プリオンタンパク質である。特に好ましい実施形態において、病原性血液由来プリオンタンパク質は、哺乳動物赤血球懸濁物、特に哺乳動物（例えば、ヒト）全血または赤血球濃縮物から除去される。
【００３１】
血球懸濁物において低減および／または除去されるべきプリオンタンパク質が可溶性プリオンタンパク質を含む好ましい実施形態では、可溶性プリオンタンパク質は、本発明の洗浄手順によって低減され得る。血球懸濁物において低減および／または除去されるべきプリオンタンパク質が膜結合プリオンタンパク質を含む好ましい実施形態では、脂肪親和性エマルジョンが本発明の洗浄緩衝液に添加され得、そして／または血球懸濁物は、血液適合性フィルターを通して泳動され得る。血球懸濁物から低減および／または除去されるべきプリオンタンパク質が不溶性プリオンタンパク質を含む好ましい実施形態では、脂肪親和性エマルジョンが本発明の洗浄緩衝液に添加され得、そして／または血球懸濁物は、血液適合性フィルターを通して泳動され得る。血球懸濁物から低減および／または除去されるべきプリオンタンパク質がプリオンタンパク質の複数の物理的形態を含む好ましい実施形態では、洗浄、濾過および／または脂肪親和性エマルジョンの組み合わせを使用して、上記の対数的な低減を達成し得る。
【００３２】
好ましい実施形態では、血球懸濁物は、本発明の洗浄手順または洗浄／濾過の組み合わせの前および／または後で、プリオンタンパク質の存在または非存在についてアッセイされる。特に好ましい実施形態では、赤血球懸濁物が、本発明の洗浄または洗浄／濾過の組み合わせの後で、病原性プリオンタンパク質および／または凝集体の存在または非存在についてアッセイされる。残存したプリオンタンパク質の検出は、存在するならば、本発明の洗浄手順または洗浄／濾過の組み合わせの後で赤血球組成物に付随して残存しているプリオンタンパク質を濃縮するための任意の濃縮工程に従い得る。
【００３３】
特に好ましい実施形態では、血液産物によるプリオン媒介性疾患（特に、伝染性海綿状脳障害）の伝染または危険が低減される。別の特に好ましい実施形態では、プリオン媒介性疾患（特に、伝染性海綿状脳障害）の発症は、血液産物を通した潜在的曝露の時点から顕著に遅延される。好ましい実施形態では、プリオン媒介性疾患（特に、伝染性海綿状脳障害）の伝染の危険性の低減またはプリオン媒介性疾患（特に、伝染性海綿状脳障害）の発症における遅延は、以下の本発明の方法によって提供される。本発明の方法に従って血球懸濁物を洗浄、または洗浄および濾過することによって、細胞外タンパク質（特に、プリオンタンパク質（特に、病原性プリオンタンパク質））の濃度を低減する。洗浄された血球懸濁物が、レシピエントに輸液される。特に好ましい実施形態では、レシピエントは、ヒトレシピエントであり、そして洗浄された血球懸濁物は、ヒト血球濃縮物（例えば、ＲＢＣＣ）である。
【００３４】
本発明の方法は、必要に応じて、細胞外タンパク質の濃度の低減を検出する工程を包含する。細胞外タンパク質の低減の検出は、細胞外ＩｇＧ、血清アルブミン、プリオンタンパク質および／または病原性プリオンタンパク質の濃度における低減の検出を含み得る。
【００３５】
好ましい実施形態では、レシピエントに輸液される洗浄された血球懸濁物は、第２の洗浄された血球ユニットの濃度と相関する細胞外タンパク質濃度を含み、ここでこの第２の洗浄された血球ユニットは、バイオアッセイにおいて感染性プリオンタンパク質について試験されている。特に好ましい実施形態では、この第２の洗浄された血球ユニットは、動物バイオアッセイにおいて、洗浄されていないコントロールについて観察される発生率と比較してプリオン媒介性疾患（特に、伝染性海綿状脳障害）のより低い発症発生率を生じさせる。別の好ましい実施形態では、この第２の洗浄された血球ユニットは、動物バイオアッセイにおいて、洗浄されていないコントロールについてのバイオアッセイにおいて観察される発症と比較してプリオン媒介性疾患（特に、伝染性海綿状脳障害）の発症遅延を生じさせる。特に好ましい実施形態では、輸液される洗浄された血球懸濁物は、血球ユニットの濃度と相関した、細胞外ＩｇＧ、血清アルブミン、プリオンタンパク質および／または病原性プリオンタンパク質の濃度を含み、この血球ユニットは、バイオアッセイにおいて、プリオン媒介性疾患（特に、伝染性海綿状脳障害）の発症を生じさせないか、またはバイオアッセイにおいて、プリオン媒介性疾患（特に、伝染性海綿状脳障害）の発症遅延を生じさせる。
【００３６】
他に規定されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本発明が属する当該分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似または等価である方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書中で言及されたすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、それらの全体において参考として援用される。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先する。さらに、これらの材料、方法および実施例は例示のみであり、制限であるとは意図されない。
【００３７】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。
【００３８】
（発明の詳細な説明）
本発明は一部、大量の赤血球が、生理食塩水溶液（特に、リン酸緩衝化生理食塩水溶液）中での大規模な洗浄後に、構造特性、代謝特性および機能特性を保持するという予想外の発見に基づく。洗浄された血球は、長期間の保存の後に、その特性を保持する。本発明の洗浄された血球は、輸液のために適切である。
【００３９】
本発明の方法は、一般的に生物学的組成物から分析物を除去および／または低減するために使用され得る。「生物学的組成物」とは、細胞を含む組成物、もしくは１つ以上の生物学的分子を含む組成物、または細胞と１つ以上の生物学的分子との両方を含む組成物を意味する。細胞を含有する組成物としては、例えば、血液、赤血球濃縮物、血小板濃縮物、白血球濃縮物、血漿、血小板を富化した血漿、臍帯血、精液、骨髄、胎盤抽出物、哺乳動物細胞の培養物または培養培地、発酵産物、および腹水が挙げられる。生物学的組成物はまた、無細胞であり得、そして少なくとも１つの生物学的分子を含み得る。
【００４０】
「生物学的分子」とは、生物において通常見出される任意のクラスの有機分子を意味し、例えば、核酸、ポリペプチド、翻訳後修飾されたタンパク質（例えば、糖タンパク質）、多糖類および脂質のような高分子が挙げられる。生物学的分子を含有する生物学的組成物としては、例えば、血清、血球タンパク質、血漿濃縮物、血漿タンパク質画分、精製もしくは部分精製された血液タンパク質もしくは他の成分、血漿の任意の画分に由来する上清もしくは沈降物、精製もしくは部分精製された血液成分（例えば、タンパク質または脂質）、乳汁、尿、唾液、細胞溶解産物、寒冷沈降物、寒冷上清、またはそれらの部分もしくは誘導体、および普通の細胞または形質転換された細胞により細胞培養物において産生される産物を含有する組成物が挙げられる。
【００４１】
生物学的組成物は、所望される任意の動物由来であり得る。例えば、この方法は、哺乳動物血球（ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、または齧歯類の血球を含む）を含む細胞懸濁物と共に使用され得る。好ましい哺乳動物血球は、赤血球または血小板である。
【００４２】
「血液産物」は、本明細書中では、治療的に有用である（例えば、レシピエントへの輸液のために）、洗浄された生物学的組成物をいう。
【００４３】
「プリオン媒介性疾患」は、本明細書中で規定される場合、異常なプリオンタンパク質の発見と関連付けられる疾患をいい、そして伝染性海綿状脳障害（例えば、スクラピー、ウシ海綿状脳障害、クロイツフェルト−ヤーコプ病（ＣＪＤ）、および異型クロイツフェルト−ヤーコプ病）が挙げられる。
【００４４】
一般的に、洗浄される細胞型と浸透圧的に適合性でありかつ非毒性である任意の洗浄溶液が使用され得る。血球のために、好ましい洗浄溶液としては、生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム）、リン酸緩衝化生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム、１３ｍＭリン酸ナトリウム、または０．９％塩化ナトリウム、３０ｍＭリン酸ナトリウム）、およびブドウ糖生理食塩水（０．２％ブドウ糖、０．９％塩化ナトリウム）が挙げられる。
【００４５】
赤血球が、本発明の方法に従って洗浄される場合、洗浄は、好ましくは、洗浄プロセス完了後の洗浄された赤血球のヘマトクリットが、５０％と７０％との間となるように実行される。好ましくは、２０％未満の赤血球が、洗浄プロセスの結果として損失される。
【００４６】
上記で考察したように、分析物は低分子を含み得る。「低分子」とは、１０００ダルトン未満の分子量を有する分子を意味する。この低分子の例としては、グリセロール、ＤＭＳＯ、エチレンイミンオリゴマー、ソラレン、フェノチアジンに基づく薬剤、アクリジンに基づく薬剤、リボフラビン、または、薬物（これは、米国血液銀行協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋｓ）もしくはＦＤＡもしくは米軍によって、臓器提供（ｄｏｎａｔｉｎｇ）には不適格であるとして認識されている任意の薬物を含み得る）が挙げられ得る。
【００４７】
上記で考察したように、分析物はまた、１０００ダルトンより大きな分子を含み得る。例えば、分析物は、核酸またはタンパク質のような高分子であり得る。血球懸濁物中におけるレベルが本発明の方法に従って低減されるタンパク質分析物の例は、プリオンタンパク質、特に、病原性プリオンタンパク質である。本発明の方法によって除去される分析物の他の例としては、細胞（例えば、白血球）、微生物病原体（例えば、細菌、真菌、または原生動物生物）、または感染性ウイルス因子が挙げられ得る。
【００４８】
プリオンという用語は、伝染性海綿状脳障害（例えば、ヒト異型ＣＪＤ、ウシＢＳＥ、およびヒツジにおけるスクラピー）の原因となる感染性因子の別名である。本発明の方法を使用して、生物学的組成物（特に、血球懸濁物）中における任意の形態のプリオンタンパク質の量を除去および／または低減し得る。プリオンタンパク質（ＰｒＰ）という用語は、本明細書中で使用される場合、天然に存在する非感染性形態（一般に、ＰｒＰＣとして公知）、病原性形態（一般に、ＰｒＰＳｃとして公知）、βフォールド形態、組換えＤＮＡ技術によって細菌細胞または真核生物細胞において産生されるこれらのＰｒＰ（一般に、組換えＰｒＰまたはｒｅｃＰｒＰとして公知）、および主に∝−ヘリックス（∝−ｒｅｃＰｒＰ）またはβ−（β−ｒｅｃＰｒＰ）二次構造を有する形態にインビトロでリフォールドされる形態、またはこれらの形態の１つまたは組み合わせの超分子凝集体（凝集体化ＰｒＰまたはＰｒＰＡＧ）を含む。プリオンタンパク質という用語は、本明細書中で使用される場合、ＰｒＰの任意の物理的形態（例えば、可溶性、不溶性、プロテアーゼ感受性、プロテアーゼ非感受性、膜結合性、非膜結合性、凝集性または非凝集性によって分類されるＰｒＰ）を含む。病原性タンパク質は、本明細書中で使用される場合、感染性タンパク質および／または疾患の単純生成物に関して広い意味で使用される。従って、本発明の病原性プリオンタンパク質は、感染性である前述の任意のタンパク質および／または疾患の生成物である前述の任意のタンパク質を含む。
【００４９】
病原性プリオンタンパク質を含み、さらに血液伝搬性の病原性プリオンタンパク質を含むプリオンタンパク質は、以下の方法の１つ以上の使用を含む、種々の方法によって検出され得る：抗体の使用、例えば、米国特許第５，８４６，５３３号を参照のこと；ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）アッセイ、Ｈｅｍｍｉｌａ、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．、４８：３８９−３９９、１９８８、およびＭａｃＧｒｅｇｏｒら、Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ．、７７：８８−９６、１９９９を参照のこと；核酸分子、例えばＷＯ９７／１５６８５を参照のこと；動物バイオアッセイの使用、例えば、Ｃｒｏｚｅｔ，Ｃ．、Ｆｌａｍａｎｔ，Ｆ．、Ｂｅｎｃｓｉｋ，Ａ．、Ａｕｂｅｒｔ，Ｄ．、Ｓａｍａｒｕｔ，Ｊ．、およびＢａｒｏｎ，Ｔ．（２００１）。Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｓｈｅｅｐ  ｓｃｒａｐｉｅ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｏｖｉｎｅ  ｐｒｐ  ｇｅｎｅ。Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７５、５３２８−３４。；Ｍａｎｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．、Ｂａｒｒｏｎ，Ｒ．、Ｊａｍｉｅｓｏｎ，Ｅ．、Ｂａｙｂｕｔｔ，Ｈ．、Ｔｕｚｉ，Ｎ．、ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ，Ｉ．、Ｍｅｌｏｎ，Ｄ．、Ｈｏｐｅ，Ｊ．、およびＢｏｓｔｏｃｋ，Ｃ．（２０００）。Ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ＰｒＰ  ｄｒａｍａｔｉｃａｌｌｙ  ａｌｔｅｒｓ  ＴＳＥ  ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ。Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ  補遺  ９５−１０２。；Ｓｃｏｔｔ，Ｍ．Ｒ．、Ｗｉｌｌ，Ｒ．、Ｉｒｏｎｓｉｄｅ，Ｊ．、Ｎｇｕｙｅｎ，Ｈ．Ｏ．、Ｔｒｅｍｂｌａｙ，Ｐ．、ＤｅＡｒｍｏｎｄ，Ｓ．Ｊ．、およびＰｒｕｓｉｎｅｒ，Ｓ．Ｂ．（１９９９）。Ｃｏｍｐｅｌｌｉｎｇ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ  ｐｒｉｏｎｓ  ｔｏ  ｈｕｍａｎｓ。Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６、１５１３７−４２。Ｍｏｏｒｅ，Ｒ．Ｃ．およびＭｅｌｔｏｎ，Ｄ．Ｗ．（１９９７）。Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｉｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅｓ。Ｍｏｌ  Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  ３、５２９−４４。Ｒａｃｅ，Ｒ．Ｅ．、Ｐｒｉｏｌａ，Ｓ．Ａ．、Ｂｅｓｓｅｎ，Ｒ．Ａ．、Ｅｒｎｓｔ，Ｄ．、Ｄｏｃｋｔｅｒ，Ｊ．、Ｒａｌｌ，Ｇ．Ｆ．、Ｍｕｃｋｅ，Ｌ．、Ｃｈｅｓｅｂｒｏ，Ｂ．、およびＯｌｄｓｔｏｎｅ，Ｍ．Ｂ．（１９９５）。Ｎｅｕｒｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｐｒｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｉｎｉｇｅｎｅ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｓｃｒａｐｉｅ  ａｇｅｎｔ。Ｎｅｕｒｏｎ  １５、１１８３−９１；Ｔｅｌｌｉｎｇ，Ｇ．Ｃ．、Ｓｃｏｔｔ，Ｍ．、Ｈｓｉａｏ，Ｋ．Ｋ．、Ｆｏｓｔｅｒ，Ｄ．、Ｙａｎｇ，Ｓ．Ｌ．、Ｔｏｒｃｈｉａ，Ｍ．、Ｓｉｄｌｅ，Ｋ．Ｃ．、Ｃｏｌｌｉｎｇｅ，Ｊ．、ＤｅＡｒｍｏｎｄ，Ｓ．Ｊ．、およびＰｒｕｓｉｎｅｒ，Ｓ．Ｂ．（１９９４）。Ｔｒａｎｓ���ｉｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ−Ｊａｋｏｂ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎｓ  ｔｏ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｈｕｍａｎ−ｍｏｕｓｅ  ｐｒｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ。Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１、９９３６−４０。；７．Ｗｅｓｔａｗａｙ，Ｄ．、Ｍｉｒｅｎｄａ，Ｃ．Ａ．、Ｆｏｓｔｅｒ，Ｄ．、Ｚｅｂａｒｊａｄｉａｎ，Ｙ．、Ｓｃｏｔｔ，Ｍ．、Ｔｏｒｃｈｉａ，Ｍ．、Ｙａｎｇ，Ｓ．Ｌ．、Ｓｅｒｂａｎ，Ｈ．、ＤｅＡｒｍｏｎｄ，Ｓ．Ｊ．、Ｅｂｅｌｉｎｇ，Ｃ．ら（１９９１）。Ｐａｒａｄｏｘｉｃａｌ  ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ｓｃｒａｐｉｅ  ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅｓ  ｂｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｌｏｎｇ  ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ  ｐｅｒｉｏｄ  ｍｉｃｅ。Ｎｅｕｒｏｎ  ７、５９−６８。；Ｐｒｕｓｉｎｅｒ，Ｓ．Ｂ．、Ｓｃｏｔｔ，Ｍ．、Ｆｏｓｔｅｒ，Ｄ．、Ｐａｎ，Ｋ．Ｍ．、Ｇｒｏｔｈ，Ｄ．、Ｍｉｒｅｎｄａ，Ｃ．、Ｔｏｒｃｈｉａ，Ｍ．、Ｙａｎｇ，Ｓ．Ｌ．、Ｓｅｒｂａｎ，Ｄ．、Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｇ．Ａ．ら（１９９０）。Ｔｒａｎｓｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｍｐｌｉｃａｔｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ＰｒＰ  ｉｓｏｆｏｒｍｓ  ｉｎ  ｓｃｒａｐｉｅ  ｐｒｉｏｎ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ。Ｃｅｌｌ  ６３、６７３−８６。を参照のこと、細胞に基づくバイオアッセイの使用、例えばＢｉｒｋｅｔｔ，Ｃ．Ｒ．、Ｈｅｎｎｉｏｎ，Ｒ．Ｍ．、Ｂｅｍｂｒｉｄｇｅ，Ｄ．Ａ．、Ｃｌａｒｋｅ，Ｍ．Ｃ．、Ｃｈｒｅｅ，Ａ．、Ｂｒｕｃｅ，Ｍ．Ｅ．、およびＢｏｓｔｏｃｋ，Ｃ．Ｊ．（２００１）。Ｓｃｒａｐｉｅ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｍａｉｎｔａｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｏｎ  ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ。ＥＭＢＯ  Ｊ  ２０、３３５１−８。；Ｖｉｌｅｔｔｅ，Ｄ．、Ａｎｄｒｅｏｌｅｔｔｉ，Ｏ．、Ａｒｃｈｅｒ，Ｆ．、Ｍａｄｅｌａｉｎｅ，Ｍ．Ｆ．、Ｖｉｌｏｔｔｅ，Ｊ．Ｌ．、Ｌｅｈｍａｎｎ，Ｓ．、およびＬａｕｄｅ，Ｈ．（２００１）。Ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｓｈｅｅｐ  ｓｃｒａｐｉｅ  ａｇｅｎｔ  ｉｎ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｏｖｉｎｅ  ｐｒｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ。Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８、４０５５−９）を参照のこと；および、本明細書中に記載の実施例への追随。
【００５０】
感染性海綿状脳症を含むプリオン媒介性疾患の発症は、動物のバイオアッセイにおいて、疾患の臨床的な徴候について動物を観察することにより検出され得る。例えば、ヒツジの感染性海綿状脳症の臨床的な徴候は、可変であるが、全身性の神経の機能不全、行動の変化、神経質、運動失調、そう痒症（ｐｕｒｉｔｉｓ）および条件付けの欠陥（ｐｏｏｒ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ）を含み得る。これらの徴候は、数時間、数日間または数週間の期間にわたって発達し得、そして実験動物は、日々行う定期的な世話を必要とする。たとえ以前に臨床徴候が観測されていないかったとしても、こけて倒れる家畜（ｆａｌｌｅｎ  ｓｔｏｃｋ）は、疾患の潜在的な犠牲動物とみなされるべきである。疑わしい場合は、ＴＳＥ病変の特有症候の（ｐａｔｈｏｇｏｎｏｍｉｃ）３兆候−神経網の空胞形成、グリア細胞の肥大および過形成、ならびにニューロンの損失−について脳病理学の検死によって確認され得る。いくつかの場合において、アミロイドの目に見える沈着はまた、蛍光顕微鏡の下でも観察され得る。異常なプリオンタンパク質の存在について、いくつかの別個の脳の切片および末梢のリンパ組織の切片を免疫組織化学的にスクリーニングすることおよびウエスタンブロットスクリーニングすることが、ＴＳＥ疾患を確認するために推奨される。
【００５１】
いかなる特定の理論にも束縛されないが、汚染された血球調製物中の感染粒子は、高次の原繊維の凝集物から異常に折り畳まれた単量体タンパク質までの大きさにわたり得ると仮定される。従って、プリオンは、ｉ）周囲の流体中に存在し得るか、ｉｉ）イオン性相互作用または疎水性相互作用により赤血球表面へ非共有結合的に付着し得るか、または、ｉｉｉ）そのＧＰＩ膜アンカーを介して、ＲＢＣＣ膜中に部分的に組み込まれる。従って、本発明に基づく徹底的な洗浄（これによって、周囲のＰｒＰＳｃの継続的な減少が、会合の平衡を変え、ＲＢＣＣの表面から離れさせる）によりプリオンの減少が、達成され得ることが仮定される。
【００５２】
本発明の一つの利点は、洗浄された血球が、対応する洗浄されていない細胞懸濁物と比較して有意に低いレベルの分析物を含むことである。
【００５３】
本発明の別の利点は、大量の生物学的懸濁物（例えば、血球）の洗浄を可能とすることである。従って、いくつかの実施形態において、血球を、少なくとも５０ミリリットルの容量を有する懸濁物として提供する。他の実施形態において、この懸濁物は、少なくとも１００ｍＬ、１２５ｍＬ、２５０ｍＬ、４００ｍＬ、またはさらに、１Ｌもしくはそれ以上の容量で提供する。
【００５４】
本発明の方法において使用される血球懸濁物は、有核細胞または無核細胞を含み得る。「無核細胞」とは、成熟した場合に、核を欠く細胞を意味する。無核細胞の例は、血小板および赤血球である。輸液は、代表的に無核細胞の移入を包含するので、これらの細胞を白血球（例えば、リンパ球、好中球、および単球）および生物学的分子（例えば、アルブミン、免疫グロブリン、凝固因子および補体）のような他の血液成分から分離することが望まれ得る。例えば、輸液の前に、全血は、赤血球部分（少量の白血球を含む）と血漿（これもまた、少量の白血球を含む）とに分離され得る。フィコール勾配またはパーコール勾配のような標準的な方法が、密度の違いに基づいて全血の異なる成分への分離を達成するために使用され得る。無核細胞の分離を達成するための多数のシステムが、市販されており、そしてＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．（Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ、ＭＡ）のＭＣＳ（登録商標）＋Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ  システムが挙げられる。上記に記載される血球懸濁物は、本発明の方法に従って、洗浄され得る。
【００５５】
好ましい実施形態において、分析物は、遠心分離を使用して生物学的組成物から取り除かれ、および／または生物学的組成物において低減される。例えば、この方法は、集められた細胞画分と、細胞外流体とを含む上清を形成するために、血球を遠心分離する工程を包含し得る。次いで、上清は、集められた細胞画分から取り除かれる。次いで、洗浄溶液が、集められた細胞画分に加えられ、そして集められた細胞画分は、再懸濁された細胞懸濁物を形成するために、その洗浄溶液中で再懸濁される。再懸濁された細胞は、再遠心分離および再懸濁され得る。いくつかの実施形態において、細胞は、本明細書中に記載されるように、２回、３回、４回、または５回、あるいはそれより多くの回数、遠心分離されそして再懸濁される。本発明は、特定の回数の洗浄に限定されず、実施される遠心分離工程および再懸濁工程の回数は、所望の細胞外流体の減少倍率（ｆｏｌｄ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）、または細胞外流体／分析物の減少倍率ならびに細胞外流体に対する洗浄溶液の比率に依存する。本発明に使用され得る遠心分離システムおよび遠心分離システムでの使用のための使い捨て可能なセットを含む材料が、市販されており、Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ  Ｖ２１５  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ、ＭＡ．）、Ｂａｘｔｅｒ（Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）のＣＳ−３００００およびＡｍｉｃｕｓ、Ｇａｍｂｒｏ（Ａｒｖａｄａ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ）のＳｐｅｃｔｒａ、Ｇａｍｂｒｏ（Ａｒｖａｄａ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ）のＣｏｂｅ  ２９９１  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒが挙げられ得る。
【００５６】
本発明の洗浄方法は、１℃〜４０℃の間の温度で起こり得、好ましくは、２０〜３０℃の間、またはより好ましくは、室温で起こり得る。遠心速度は、５，０００〜１１，０００ｒｐｍであり得、好ましくは、６，０００〜１０，０００ｒｐｍであり得る。
【００５７】
洗浄工程は、滅菌条件下で実施される手動の洗浄または滅菌条件下で行われる自動化された洗浄のどちらかであり得る。例えば、ＲＢＣは、ビニール袋のような、滅菌容器内であり得る。次いで、この袋は、機械に取り付けられ、この機械は、滅菌条件下で、細胞をこの袋の中から汲み上げ得、必要に応じて洗浄溶液を用いてこの袋をリンスし得、洗浄溶液を用いてＲＢＣを希釈し得、溶液を所望の時間にわたって所望の温度で穏やかに混合し得、遠心分離によって赤血球を回収し得、使用した洗浄溶液（例えば、生理食塩水、ブドウ糖−生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水）を廃棄し得る。次いで、新しい洗浄溶液が、添加され、洗浄工程および遠心分離工程が、所望の回数繰り返される。最終回の洗浄の後、細胞は、保存溶液中に再懸濁され得、そしてはじめの容器に戻され得る。次いで、細胞は、所望のように、すぐに使用され得るか、保存され得るか、または凍結され得る。
【００５８】
細胞が、７日間まで保存される場合、保存溶液は、例えば、ブドウ糖−生理食塩水、生理食塩水、またはリン酸緩衝化生理食塩水であり得る。細胞が７日間より長く約４℃で保存される場合、保存溶液は、グルコースおよびホスフェートを含む、Ｐａｌｌ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＮＵＴＲＩＣＥＬ（登録商標）［ＡＳ−３］；Ｂａｘｔｅｒ  （Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ）のＡＳ−１、ＴｅｒｕｍｏのＡＳ−５、Ｐａｌｌ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＣＰＤＡ−１、ＣＰＤ、ＣＰ２Ｄのような栄養保存溶液である。細胞が、凍結保存される場合、保存溶液は、グリセロールまたはＤＭＳＯを含む。
【００５９】
本発明の洗浄方法が、自動化される場合、血球懸濁物は、遠心分離のために適切なチュービング中に汲み上げられ得る。汲み上げ速度およびチュービングの大きさは、汲み上げ効率を最大化する一方で、細胞の損傷および総洗浄時間を最小化するように選択される。しかし、汲み上げ速度は、浸透圧（ｏｓｍｏｌａｒｉｔｙ）ショックの危険を回避するために、好ましくは動的には調節されない。従って、本発明の汲み上げ速度は、５０〜２００ｍＬ／分の間を含み得る。廃棄可能な血液チュービングセットは、代表的には、医療用品質の塩化ポリビニルから製造され、そして複数の商業的な供給源（例えば、Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ、Ｎ．Ｙ．、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ、Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ、Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ、ＭＡおよびＣｏｂｅ、Ａｒｖａｄａ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ）から購入され得る。
【００６０】
血球懸濁物は、血液適合性フィルター、好ましくは白血球減少性（ｌｅｕｋｏｒｅｄｕｃｉｎｇ）フィルターを通され得る。白血球のレベルを、９９．９％より大きく（対数で３より大きい減少）減らすことができる、赤血球および全血のための市販の血液白血球減少フィルターは、以下の会社から入手可能である：Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ、ＮＹ；Ｈｅｍａｓｕｒｅ、Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ；およびＢａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ。
【００６１】
脂肪親和性のエマルジョンは、特に、血球懸濁物において取り除かれるおよび／または減らされる分析物がプリオンタンパク質または脂質被覆されたウイルスの場合に、本発明の洗浄溶液に加えられ得る。このような脂肪親和性のエマルジョンは、栄養目的の静脈内注射のために使用されるのと同一の成分から構成され得（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｌｉｐｉｄ  ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ．  Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ  ＹＡ、Ｄｕｐｏｎｔ  ＩＥ、Ｄｅｌｏｙｅｒｓ  Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｄｅｃ．２４、２０００（１２）：１４９３−７に概説される）、これらは、１０％〜２０％の長鎖トリグリセリド（ＬＣＴ）エマルジョンの組成物として通常処方される。安定なエマルジョン中の中鎖トリグリセリドはまた、血液から脂質の可溶性産物の洗い流しを増強するために適切であり得る。脂質エマルジョンは、非溶血性溶媒として作用する血液からの脂質エマルジョンによる脂肪親和性の可溶性因子の除去を促進する。血液から有害な脂肪親和性の物質の除去を促進するための洗浄溶液中の脂質エマルジョンの好ましい濃度は、０．１％〜２０％にわたる。
【００６２】
洗浄は、好ましくは閉鎖系（例えば、機能的に閉鎖された系）で実施される。閉鎖系における洗浄は、環境的な汚染（例えば、微生物汚染）を導入する危険性を伴わずに、洗浄後より長い期間（例えば、１日、７日、１４日、２１日、２８日、３５日、４０日、４２日、またはさらに５０日より長く）の細胞の保存を可能にする。
【００６３】
洗浄は、３０分〜５時間で完了し得、そして４リットルより多くの洗浄溶液を必要とし得る。好ましい実施形態において、洗浄は、４時間未満で完了し、そして１０リットル未満の洗浄溶液を使用する。特に好ましい実施形態において、洗浄は、３０〜６０分間で完了され、そして３リットルより多いが６リットル以下である洗浄溶液を使用する。特に好ましい実施形態において、４０％〜９８％のヘマトクリットを有する、１４０ｍＬから２６０ｍＬ、好ましくは２００〜２２０ｍＬの赤血球が、５〜５．５リットルの洗浄溶液中で、１７０〜１９５分間洗浄される。
【００６４】
１つの実施形態において、全血は、緩衝化されていない滅菌生理食塩水（すなわち、０．９％ＮａＣｌ）を用いて希釈され、そして血球は、ＲＢＣ成分を単離するために遠心分離によって濃縮され得る。次いで、ＲＢＣ成分は、滅菌生理食塩水中で再懸濁され、そして１０分間２２℃で混合される(穏やかな機械的な攪拌の下で)。洗浄手順および再懸濁手順は、分析物の所望の対数的な除去が達成されるまで繰り返される。同様の手順は、単離された血小板の洗浄のために使用される。
【００６５】
細胞の洗浄のためのさらなる方法は、中空繊維透析工程を包含し、ここで赤血球からの可溶性物質の分離は、赤血球を中空繊維（赤血球を保持するために十分に小さいが巨大分子を通すために十分に大きい細孔（０．２〜１ミクロンの細孔）を有する）を通して再循環することによって達成される。中空繊維の壁を横切って拡散する細胞外の可溶性物質を置換しそして除去するために役立つ、特別なキャピラリーチャンバーに、洗浄流体が連続的に流される。これらの機材および材料は、例えば、Ｍｉｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）、Ｂａｘｔｅｒ（Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ）、Ｇａｍｂｒｏ（Ｌｕｎｄ、Ｓｗｅｄｅｎ）およびＡｓａｈｉ（Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）から入手され得る。
【００６６】
あるいは、スピン膜が使用される。細胞外可溶性物質の赤血球（ｒｅｄ  ｃｅｌｌ）濃縮物からの分離は、赤血球を保持するに十分小さいが、可溶性分子が出て行くことができるのに十分大きい（０．２〜１μｍ）孔を有する多孔性膜を用いることによって達成される。この膜を、シリンダが回転する間に赤血球が導入される中空シリンダとして収容される。この回転膜によって、赤血球細胞外液を膜を通って通過させることによって取り除くことが可能になる。市販する会社としては、Ｎｅｘｅｌｌ（Ｓａｎｔａ  Ａｎａ、ＣＡ）が挙げられ、そしてＢａｘｔｅｒ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＦｅｎｗａｌ部門は、プラスマフェレシスデバイス（Ａｕｔｏ  Ｃ  Ｓｙｓｔｅｍ）を提供する。このデバイスは、スピン膜アプローチにもとづく。
【００６７】
所望の場合、血球の安定性を増強するかそれら自体が感染因子を不活化または取り除く因子を洗浄手段において用いることができる。そのような因子の例は、抗微生物因子および抗ウイルス因子である。例としては、エチレンイミンオリゴマー（たとえば、ダイマー、トリマーおよびテトラマー）およびその誘導体が挙げられる。好ましくは、エチレンイミンオリゴマー不活化因子が脱核化血球（たとえば、赤血球または血小板）を洗浄する前に使用される。エチレンイミンオリゴマーは、本発明の洗浄手順とともに、前にまたはその間に使用される場合、洗浄溶液はクエンチ因子を含まないことが好ましい。エチレンイミンオリゴマーおよびそれらを生物学的組成物において使用する方法は、ＷＯ００／１８９６９およびＷＯ９８／５１６６０に記載されている。
【００６８】
本発明の方法に従って洗浄された赤血球が、インビトロまたはインビボあるいはその両方において延長された生存を示したことが、予想外に見出された。たとえば、いくつかの実施形態において、赤血球は、洗浄の後体内でのそのインビボ生存性を維持し、必要に応じて延長された保存を維持し、その結果洗浄された細胞の７５％を超える細胞がその移入の後２４時間で循環器中に維持される。生存性は、当該分野において公知の方法（たとえば、５１Ｃｒ放射標識法を用いる）を用いてそして以下の実施例に記載されるように測定され得る。本発明の方法に従って洗浄された赤血球は、延長されたインビトロ安定性を示す。たとえば、いくつかの実施形態において、本発明に従って洗浄された血球調製物中の細胞は少なくとも７日の貯蔵寿命を達成した。いくつかの実施形態において、洗浄された血球は、１４日、２１日、２８日、４０日または４２日、あるいはそれを超える貯蔵寿命を有する。好ましくは、本発明に従って洗浄されそして延長された期間貯蔵された血球の平均溶血レベルは、たとえば、５％未満、２．５％未満、１％未満、または０．５％未満でさえある。好ましくは、ＡＴＰレベルは、１．５μｇ／ｍｏｌを超えて維持される。
【００６９】
本発明は、以下の非限定的な実施例においてさらに例示される。
【実施例】
【００７０】
（実施例１：赤血球懸濁物からの分析物の取り出し）
１Ａ．５０００ｍＬ赤血球洗浄手順
白血球除去されていてもよい赤血球懸濁物を、滅菌条件下で閉鎖系で自動化されたシステムによって洗浄する。この洗浄手順は、室温で行う。この手順は、Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ  Ｖ２１５（Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ，Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ，ＭＡ）において行う。遠心分離ボウルのサイズは、２７５ｍＬまたは３２５ｍＬである。ＲＢＣＣ洗浄周期は、約５０００ｍＬの生理食塩水を使用し、そして完了するのに約１９０分かかる。
【００７１】
ヘマトクリットが５０〜７０の２８０〜４００ｍＬの容量を含む抗凝固化された赤血球濃縮物を、インキュベーションバッグに入れ、そしてＶ２１５に無菌的に接続する。まず、３００ｍＬの洗浄液（例えば、０．２％デキストロースおよび０．９％生理食塩水）をこのインキュベーションバッグに加え、そして４５秒にわたり平衡化させた。次いで、そのインキュベーションバッグの中身を遠心分離ボウルへとポンプにより押し出し、これを８０００ｒｐｍの速度でスピンした。ポンプ速度は５０ｍＬ／分と２００ｍＬ／分との間である。このインキュベーションバッグを８０ｍＬの洗浄溶液でリンスし、そしてこのリンス液をそのボウルに移す。次に、このボウルを５０ｍＬの洗浄液でリンスする。ボウルの中身をそのインキュベーションバッグに戻し、３００ｍＬの洗浄液で希釈し、そして４５秒間にわたり平衡化させる。このインキュベーションバッグの中身をそのボウルに戻す。次に、８０ｍＬの洗浄液での第二のインキュベーションバッグフラッシュを行う。第二のフラッシュをそのボウルに加える。このボウルを５０ｍＬの洗浄液の第二のボウルリンス液でリンスする。このボウルの中身をそのインキュベーションバッグへと戻し、そして３００ｍＬの洗浄液の第三の希釈液を加え、そして４５秒にわたり平衡化する。このバッグおよびボウルを上記のようにリンスする。上記の手順（希釈、フラッシュ、リンス、戻し）をあと１０回反復する。１２回の間、希釈工程は上記のとおりであるが、ボウルへ移した後、そのボウルを止め、そして９５ｍＬの洗浄サイクルを開始する。
【００７２】
３０ｍＬのボウルの中身をインキュベーションバッグに移し、そして１０秒の遅れの後、遠心分離を再開し、そしてそのインキュベーションバッグからの３０ｍＬの懸濁物をそのボウルに戻す。そのボウルを８０００ｒｐｍで３０秒間スピンし、そして９５ｍＬの洗浄溶液をそのボウルへと戻す。遠心分離ボウルを再び止め、そして再び３０ｍＬのボウル中身をそのインキュベーションバッグに移し、そして１０秒間の遅れの後、遠心分離を再開し、そしてそのインキュベーションバッグからの３０ｍＬの懸濁物をそのボウルへと戻す。そのボウルを８０００ｒｐｍで３０秒間スピンする。この手順を３〜５回さらに反復する。７回洗浄した後、２４０ｍＬの貯蔵溶液を赤血球を有する遠心分離ボウルに加え、そしてそのボウルの中身を最終製品バッグへと移す。最終製品バッグを取り外し、そして封入する。
【００７３】
従って、洗浄手順は、１２回の３００ｍＬでの希釈および７回の洗浄からなり、これは、合計で約５Ｌの洗浄溶液および１９０分の洗浄を必要とする。
【００７４】
（１Ｂ．５５００ｍＬの赤血球洗浄手順）
赤血球懸濁物を滅菌条件下で閉鎖系で自動化システムによって洗浄する。洗浄手順を室温で行う。この手順をＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ  Ｖ２１５（Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ，Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ，ＭＡ）中で行う。遠心分離ボウルの大きさは２７５ｍＬまたは３２５ｍＬである。ＲＢＣＣ洗浄サイクルは、約５５００ｍＬの生理食塩水を用い、そして完了するのに約１９０分かかる。
【００７５】
代表的にヘマトクリットが５０〜７０の２５０ｍＬ〜４５０ｍＬの容量を含む抗凝固化された赤血球濃縮物をインキュベーションバッグに入れ、そしてＶ２１５に無菌的に接続する。手順をはじめるために、最終製品バッグへのラインを１００ｍＬの洗浄溶液で初回刺激（ｐｒｉｍｅ）する。この洗浄溶液は、このプロセスの間、入口ライン、最終製品バッグへのラインおよび血液ポンプへのラインによって共有されるチューブＴ接続部を５ｍＬの洗浄溶液で周期的にフラッシュするために使用される。このＴ接続部フラッシュは、分析物が最終製品バッグへのラインを汚染することを防止する働きをする。予備希釈のシーケンスを開始するためにそのインキュベーションバッグの中身を遠心分離ボウルへとポンプして押し出す。これを、８０００ｒｐｍの速度でスピンする。ポンプ速度は、５０ｍＬ／分と２００ｍＬ／分との間である。いったんインキュベーションバッグが空になると、そのポンプは反転し、そして１５０ｍＬの洗浄溶液をフラッシュ容量としてインキュベーションバッグへと送達する。フラッシュ容量の送達の間、真の水平から５．５°傾斜したシェーカーテーブルによってそのインキュベーションバッグを揺らす（１８０Ｈｚ、１．５インチのピーク間振幅）。いったん１５０ｍＬがそのインキュベーションバッグに送達されると、そのシェーカーは約４５秒間にわたりとどまり、次いで停止する。次いで、このフラッシュ容量をそのインキュベーションバッグから空にし、そして遠心分離ボウルへとポンプして押し出す。次いで、Ｔ接続部を５ｍＬの洗浄溶液でフラッシュ（Ｔフラッシュ）し、最終製品バッグラインからおよび遠心分離ボウルへとポンプして押し出す。Ｔフラッシュの後、ドナー圧力モニタ（ＤＰＭ）へのラインについて、以前の工程の間にこのラインに移動した流体をパージする。これは、ＤＰＭに対して内部のパージ弁を開放することおよびＤＰＭラインの抗細菌フィルタを通じて約８ｍＬの空気を押し出す（ポンプして押し出す）ことによりＤＰＭライン中に残る流体をボウルへと押しだすことによって達成される。このＤＰＭラインのパージは、そのプロセスの間周期的に行い、ＤＰＭが処理の後の段階で処理流体を汚染し得るＤＰＭへのラインにおいて分析物が捕捉されることを防止する。ＤＰＭラインがパージされた後、遠心分離機にブレーキをかけて停止させる。いったん遠心分離ボウルがスピンしなくなると、約３０ｍＬのボウルの中身をポンプによりインキュベーションバッグへと戻す。次いで、このボウルの中身を３０秒にわたり平衡化して、その後遠心分離を再開し、そして８０００ｒｐｍへと加速する。そのインキュベーションバッグ中の３０ｍＬを遠心分離ボウルへ５０〜１００ｍＬ／分で戻す。次いで、このポンプを、遠心分離がなおスピンしている間に停止する。１５秒後、そのインキュベーションバッグシェーカーを始動し、そしてそのポンプが１５０ｍＬの洗浄溶液のフラッシュ容量をそのインキュベーションバッグへと送達する。そのシェーカーを約４５秒にわたりオンのままにし、次いで停止させる。次いで、このフラッシュ容量を、そのインキュベーションバッグからポンプして押し出し、そしてスピンしている遠心分離ボウルへとポンプして押���出す。ＴフラッシュおよびＤＰＭラインのパージを（上記のように）反復する。次いで、そのボウルの中身を約１３０ｍＬの洗浄溶液を用いて、約５０ｍＬ／分の速度でそのボウルへと洗浄溶液をポンプして押し出すことによってリンスする。次いで、この遠心分離を停止し、そしてそのボウルの中身をインキュベーションバッグへと戻す。これにより、そのプロセスの前希釈シーケンスが完了する。希釈シーケンスを次に行う。
【００７６】
希釈シーケンスを始めるために、そのシェーカーを始動させ、そして３００ｍＬの洗浄溶液（例えば、０．２％デキストロースおよび０．９％生理食塩水）をそのインキュベーションバッグに加え、そのインキュベーションバッグの中身を希釈する。そのシェーカーは１０秒後に停止させ、そしてインキュベーションバッグの中身を４５秒間にわたり平衡化させる。次いで、そのインキュベーションバッグの中身を遠心分離ボウルへとポンプして押し出す。これを８０００ｒｐｍの速度でスピンする。ポンプ速度は、５０ｍＬ／分と２００ｍＬ／分との間である。ＴフラッシュおよびＤＰＭラインのパージを反復する。そのインキュベーションバッグを８０ｍＬの洗浄溶液でフラッシュし、シェーカーテーブル上で３０秒〜４５秒にわたり揺らし、次いでフラッシュ容量をそのボウルへと移す。次にそのボウルを５０ｍＬの洗浄溶液を用いて、５０ｍＬ／分〜１００ｍＬ／分のポンプ速度でリンスする。このボウルの中身をそのインキュベーションバッグへと戻す。いったんそのボウルが空になると、システム圧力モニタ（そのボウルからの排出ラインから離れて配置される）へのラインの中身をボウルへとパージする。これは、以前の工程の間にこのラインへ移動した流体のシステム圧力モニタ（ＳＰＭ）ラインをパージするために行う。これは、ＳＰＭに対して内部のパージ弁を開き、そして約８ｍＬの空気をＳＰＭラインの抗細菌フィルターを通じて押し出し（ポンプして押し出し）てＳＰＭラインに存在する流体がそのボウルへと押し出されることを可能にすることによって達成される。このＳＰＭラインのパージは、処理の後の段階においてその生成品の汚染が生じ得るＳＰＭへのライン中における分析物が捕捉されることを防止するために処理の間周期的に行う。ＳＰＭパージ容量を、そのボウルからそのインキュベーションバッグへと空にする。
【００７７】
次いで、このインキュベーションバッグの中身をシェーカーにより揺らし、３００ｍＬの洗浄溶液の第二の希釈容量で希釈し、そして４５秒間静止させて平衡化させる。ついで、そのインキュベーションバッグの中身をボウルへと戻す。そのＴフラッシュおよびＤＰＭラインのパージを反復する。次に、８０ｍＬの洗浄溶液での第二のインキュベーションバッグフラッシュを行う。この第二のフラッシュをそのボウルに加える。このボウルを、５０ｍＬの洗浄溶液の第二のボウルリンスでリンスする。このボウルの中身をそのインキュベーションバッグへと戻す。ＳＰＭラインのパージを反復する。３００ｍＬの洗浄溶液の第三の希釈物を加え、そして４５秒にわたり平衡化する。このインキュベーションバッグの中身をそのボウルへと戻す。ＴフラッシュおよびＤＰＭラインのパージを反復する。このバッグおよびボウルを上記のようにリンスする。ＳＰＭラインをパージする。上記の手順（希釈、Ｔフラッシュ、ＤＰＭラインパージ、バッグフラッシュ、ボウルリンス、戻し、ＳＰＭラインパージ）を、さらに１０回反復する。ＤＰＭおよびＳＰＭのラインのパージを、最初の１０回の希釈のみの間で行う。１２回の希釈における最後のＴフラッシュは、製品バッグラインにおいて、初回刺激に用いた洗浄溶液を完全に空にする。１２回の間、希釈工程は上記のとおりであるが、ボウルへ移した後およびＴフラッシュの後、９５ｍＬの洗浄サイクルのシーケンスを開始する。
【００７８】
まず、９５ｍＬの洗浄溶液を、７５ｍＬ／分の速度でそのボウルへとポンプして押し出す。次いで、遠心分離を停止し、３０ｍＬのボウルの中身をそのインキュベーションバッグに移し、そして４５秒間の遅れの後、遠心分離を再開する。このボウルを８０００ｒｐｍで３０秒にわたりスピンし、次いでインキュベーションバッグからの３０ｍＬの懸濁物をそのボウルへと戻す。次いで、第２の９５ｍＬの洗浄溶液をそのボウルへと移す。遠心分離ボウルを再び停止させ、そして再び３０ｍＬのボウルの中身をそのインキュベーションバッグへと移し、そして４５秒の遅れの後、遠心分離を再開する。このボウルを８０００ｒｐｍで３０秒間にわたりスピンし、次いでそのインキュベーションバッグから３０ｍＬの懸濁物をそのボウルへと戻す。この手順をさらに５回反復する。７回目の洗浄の後、遠心分離を停止し、そして３０ｍＬのボウルの中身を空にして製品バッグへと移す。遠心分離を８０００ｒｐｍで再開し、そして４５秒間にわたりスピンする。次いで、２５０ｍＬの貯蔵溶液を、７５ｍＬ／分の速度で、赤血球を有するその遠心分離ボウルへと加える。遠心分離を停止し、そしてそのボウルの中身を最終製品バッグへと移す。その最終製品バッグを取り外し、そして封入する。
【００７９】
従って、その洗浄手順は、前希釈シーケンス、１２回の３００ｍＬ希釈、および７回の９５ｍＬ洗浄からなり、合計で約５．５Ｌの洗浄溶液および１９０分の時間を必要とする。
【００８０】
（実施例２．インビトロでの生物化学的特徴付けおよびインビボでの洗浄された赤血球の生存能力）
ＣＰ２Ｄにおいて、コントロールの血液ユニットを健康なヒト被験体から収集し、そして室温でＰａｌｌ  ＷＢＦ２白血球除去（ｌｅｕｋｏｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）フィルターを介して白血球を除去（ｌｅｕｋｏｒｅｄｕｃｅ）する。収集４時間後、この細胞を強いスピン（２０℃で５，０００ｇ×５分間）を通してＡＳ−３  Ｒｅｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ（Ｍｅｄｓｅｐ、Ｃｏｖｉｎａ、ＣＡ）に転換する。実験的なユニットをＣＰＤに収集し、そしてＳｅｐａｃｅｌｌ  ＲＳ２０００白血球除去フィルター（Ｂａｘｔｅｒ、Ｒｏｕｎｄ  Ｌａｋｅ、ＩＬ）を介して白血球を除去する。室温で４時間置いた後、これらを１，６１５ｇで２０℃にて４分間の遠心分離によって充填細胞に転換し、７５〜８０％のヘマトクリットに達する。次いで、エチレンイミンオリゴマーを０．１％（ｖ／ｖ）でそのユニットに無菌的に加え、約９２０μｇ／ｍＬの濃度にする。次いで、ユニットを、実施例１Ａに記載される手順に従って、約２７０ｍＬのボウル容積を有する閉鎖系デバイス（Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ  ２１５，Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ，ＭＡ）中で６Ｌの５％ブドウ糖／０．９％ＮａＣｌで洗浄する。チオ硫酸ナトリウムの生理食塩水を加え、０．２ｍＭの最終濃度を得、そして１００ｍＬのＡＳ−３をユニットに加えた。
【００８１】
ユニットを４２日間、１〜６℃のモニターされる冷蔵庫に入れる。アリコートを、処理の前と後、ならびに貯蔵２１日後、２８日後、３５日後および４２日後に、滅菌した連結デバイス（ＳＣＤ３１２、Ｔｅｒｕｍｏ、Ｅｌｋｔｏｎ、ＭＤ）を介してサンプリングのために取りだす。ユニットの質量を、計算された特定の比重：（１４１２×質量）／（スピンさせたヘマトクリット＋１４３６）を使用して体積に換算する。例えば、Ｈａｌｌｉｎｇら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ３１：２１Ｓ、１９９１を参照のこと。
【００８２】
２８日間の貯蔵後、アリコートを標準の技術を使用して５１Ｃｒで放射標識するために取り出す。例えば、Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ：Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｒａｄｉｏｉｓｏｔｏｐｅ  ｒｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｂｌｏｏｄ；３８：３７８−８６、１９７１；およびＭｏｒｏｆｆら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ、２４：１０９−１１４、１９８４を参照のこと。
【００８３】
同じ日のモニタリングにおいて、新鮮なサンプルを、ヒト被験体から９９ｍＴｃ放射標識を同時に使用して赤血球の体積を決定するためにヘパリン中に収集する。Ｂａｎｄｙら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．、１６：４３５−４３７、１９７５を参照のこと。続けて、２つの放射標識の同時注射を、複数回の静脈サンプリングをしながら３０分まで（９９ｍＴｃを介して赤血球の体積を測定するため）、そして２４時間（５１Ｃｒを介して収集を測定するため）に行う。エチレンイミンオリゴマーの濃度を、洗浄工程後、そして貯蔵の２１日後および２８日後の、インキュベーション期間の終わりに、化学物質を添加した後に取り出した上清を加えた溶解した細胞のサンプル上で、０．０３μｇ／ｍＬの感度を有するＨＰＬＣを使用して決定する。
【００８４】
細胞カウントを、白血球除去（これは、Ｎａｇｅｏｔｔｅチャンバを介して実施される）の後、白血球の計数を除いて自動カウンター（Ａｄｖｉａ１２０、Ｂａｙｅｒ、Ｎｏｒｗｏｏｄ、ＭＡ）によって実施する。Ｄｚｉｋら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ３３：２７２−２７３、１９９３を参照のこと。
【００８５】
ユニットからの上清を、３６００ｒｐｍ（ＭＰ４Ｒ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｅｄｈａｍ  Ｈｅｉｇｈｔ、ＭＡ）で１０分間、２度スピンし、次いでＣＯＢＡＳ  ＦＡＲＡ（Ｒｏｃｈｅ、Ｎｕｔｌｅｙ、ＮＪ）上で、自動化されたＤｒａｂｋｉｎ試薬法（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用して濁った収集物とともにヘモグロビンについて分析する。上清電解質濃度をイオン特異性電極（Ｈｉｔａｃｈｉ  ９１７、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐｏｒｒａｔｉｏｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）によって決定する。グルコースをグルコースオキシダーゼ（Ｈｉｔａｃｈｉ  ９１７）で決定する。乳酸を乳酸オキシダーゼ／ペルオキシダーゼ終点反応（Ｈｉｔａｃｈｉ  ９１７）によって決定する。ｐＨを血液ガス分析機（Ｍｏｄｅｌ  ８５５、Ｂａｙｅｒ）で測定し、３７℃で読む。赤血球過塩素酸抽出物を、３ＭのＫ２ＣＯ３で中性化し、そしてＣｏｂａｓ−ＦＡＲＡにおいて適応する試薬キット（Ｓｉｇｍａ）を使用して、ＡＴＰ（ホスホグリセリン酸ホスホキナーゼによるＡＴＰの使用に続く、リン酸グリセルアルデヒドデヒドロゲナーゼによるＮＡＤＨ酸化の測定による）およびＤＰＧ（ＮＡＤＨ酸化の測定による）に対して分析する。処理した試料の７０〜８０℃における４ヶ月までの貯蔵後、上清のアッセイをバッチで行う。生物化学アッセイを、結果の平均を有する複製物およびまちまちの値をとる複製物の反復において実施する。
【００８６】
ユニットを貯蔵期間の終わりにＡＢＯとＲｈに分類する。このとき、これらをまた、標準の技術を使用して抗グロブリン相で、被験体の血漿に対してクロスマッチする。例えば、Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｍａｎｕａｌ、第１３版。Ｂｅｔｈｅｓｄａ：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋｓ、１９９９を参照のこと。
【００８７】
被験体は、医療センターの臨床研究室の標準の方法を使用して、研究に入るときならびに各再注入の前および後に一連の試験を実施する。これらの分析としては、以下が挙げられる：完全な血液カウント、尿検査、血清電解質、リン酸塩、尿酸、ＢＵＮ、クレアチニン、アスパラギン酸およびアラニンアミノトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、総ビリルビン、グルコース、アルカリホスファターゼ、総タンパク質、アルブミン、トリグリセリド、およびコレステロール。
【００８８】
統計分析を、無意味な仮説を拒絶するための判定基準として選択した０．０５の確率で両すそを取り除いた（ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ）両側ｔ試験によって行う。全てのデータを、平均±１の標準偏差として示す。
【００８９】
エチルイミンオリゴマーの添加によって、添加後すぐに予想される濃度（９２０μｇ／ｍＬ）に達した。洗浄工程の後および貯蔵の２１日後、２８日貯蔵後すぐに取りだしたサンプルは、４  ｌｏｇ１０より大きな濃度減少が生じることを示す分析システムの検出限界未満である。
【００９０】
コントロールと実験ユニットの操作性の差は、この実験系の特定の特徴の影響を同定するための手段としてよりもむしろ、これらの被験体における赤血球の貯蔵に関して異常な結果のないことの保証を提供すると思われるコントロールユニットの定義のために生じる。結果として、このユニットのスピンされたヘマトクリットは、貯蔵期間の始めにおいて、コントロールと実験ユニットとの間で異なり（６４．９±１．３対５０．８±３．４％）（ｐ＜０．０５）、このｐＨは、コントロールグループにおいてわずかに高く（６．７６±０．０２対６．５２±０．０５）（０日目）、そして貯蔵のための総時間は、実験グループ（１５〜１６時間）に対してコントロールグループ（５〜６時間）がより短かい。さらに、洗浄後、実験ユニットにはほとんど血漿が残っていないが、このコントロールユニットは、約１０〜１５％の血漿を保持したままである。全てのユニットを、塩化ポリビニルバッグに貯蔵するが、洗浄された実験ユニットをＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓから入手されるバッグに入れるのに対し、このコントロールユニットをＭｅｄｓｅｐから入手されるバッグに入れる。全てのユニットは、１×１０６より少ない白血球を有する。
【００９１】
処理され、洗浄された細胞に対して、ヘマトクリットを、Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ２１５から誘導される「充填された（ｐａｃｋｅｄ）赤血球ユニット」の固いスピン生成物を通して作成されるものと同様のレベルから下げる。このプロセスを通しての赤血球の回収率は、約８０％であり、これは機械のボウル（総容量２７５ｍＬ）の容量によって制限される。溶血は、視覚的には見られなかった。電解質、ｐＨ、およびグルコースの変化は、洗浄溶液の含有量に匹敵する。ＡＴＰは、維持される。ＤＰＧは、その開始濃度の約半分に下がる。
【００９２】
貯蔵の間に、グルコース濃度は下がり、そして乳酸濃度は上昇する。グルコース消費の速度（コントロール：０．３７±０．０９対０．２６±０．０９ｍｍｏｌ／１０６赤血球）は接近していたが、統計的な有意性には達せず、それにもかかわらず乳酸生成（コントロール：０．９１±０．１２対０．４２±０．０９ｍｍｏｌ／１０６赤血球）は、コントロールユニットより高い。上清のカリウムレベルは、実験ユニットにおいてより低い。洗浄の０日目後におけるｐＨの違いは、貯蔵期間をとおして続き、そして４２日目において有意に異なった。
【００９３】
溶血は、貯蔵期間をとおして全てのユニットにおいて１％未満を維持する。実験ユニットにおいて、溶血の増加の傾向があり、このことは、より長い貯蔵でより明白である（４２日目において、コントロール：０．２３±０．１１  対  実験：０．７０±０．２４％；ｐ＞０．０５）。ＡＴＰレベルは、貯蔵期間をとおしてグループ間で有意差はなく（４２日目において、コントロール：２．８９±０．６５  対  実験：１．７９±０．５０μｍｏｌｅ／ｇ  Ｈｂ；ｐ＞０．０５）。
【００９４】
赤血球を、貯蔵の２８日後、被験体に再注入する。２重標識技術を使用する２４時間の回収は、表１に示すようにコントロールグループと実験グループとの間で差はない。
【００９５】
表１．赤血球の回収および残存
2005503331.tif 000002
（実施例３  白血球の減少）
１０ユニットの抗凝血化された全血ユニットを収集し、４℃で、Ｐａｌｌ  ＢＰＦ４Ｂ白血球除去フィルターを介して白血球を除去する。９個のユニットを実施例１Ａの手順に従って洗浄する。１１ユニットの血液を０．１％（ｖ／ｖ）のエチレンイミンオリゴマーで処理し、２３℃で２４時間で約９２０μｇ／ｍＬの濃度にし、そして実施例１Ａの手段に従って洗浄する。
【００９６】
白血球濾過、洗浄または洗浄に続くエチレンイミンオリゴマー処理の前に、血液のユニットは、血液のユニットあたり２．４×１０９〜４．７×１０９個の白血球を有する。白血球濾過のみでは、血液のユニットあたり０．４×１０６〜５６×１０６個の白血球含有量が減少する。洗浄のみでは、血液のユニットあたり１１×１０６〜１１００×１０６個の白血球含有量が減少する。エチレンイミンオリゴマー処理および洗浄（白血球濾過は行わない）では、血液のユニットあたり１．３×１０６〜４．１×１０６個の白血球含有量が減少する。
【００９７】
（実施例４  リン酸緩衝化洗浄溶液と非緩衝洗浄化溶液との比較）
（４Ａ．洗浄後および貯蔵の４２日後の生物化学パラメータ）
抗凝血し、白血球濾過したヒトＲＢＣＣユニットの標準的な１２個の同じペアを、０．１％（ｖ／ｖ）［９２０μｇ／ｍＬ］エチレンイミンオリゴマーで、２３℃で２４時間処理する。このエチレンイミンオリゴマーを、０．２５Ｍの濾過−滅菌したＮａＨ２ＰＯ４中の２％（ｖ／ｖ）のストック溶液としてＲＢＣＣユニットに加える。各ペアからの処理した１つのユニットを、実施例１Ａの手順に従って、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）洗浄緩衝液（０．９％のＮａＣｌ、１２．５ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．７）および別の標準的な非緩衝化生理食塩水（０．９％のＮａＣｌ、０．２％のＤｅｘｔｒｏｓｅ、Ｂａｘｔｅｒ）で洗浄する。全てのユニットを１〜６℃で４２日間、ＡＳ−３溶液に貯蔵する。４２日後、生物化学パラメータを決定した。貯蔵の４２日後に、ＰＢＳおよび生理食塩水で洗浄したユニットの平均値は、以下のとおりである：それぞれ、溶血０．５５±０．２１％および０．７４±０．３４％；ＡＴＰレベル３．２８±０．６１μｍｏｌｅ／ｇＨｇｂおよび２．３３±０．４４μｍｏｌｅ／ｇＨｇｂ；細胞外Ｋ＋４３．０±７．４ｍｅ／Ｌおよび４０±２．８ｍｅ／Ｌ。
【００９８】
（４Ｂ．分析物減少）
抗凝血し、白血球濾過したヒトＲＢＣＣユニットの標準的な同じ７個のセットを、１％（ｖ／ｖ）、９２０μｇ／ｍＬのエチレンイミンオリゴマーで２３℃で２４時間処理する。このエチレンイミンオリゴマーを、０．２５Ｍの濾過滅菌したＮａＨ２ＰＯ４中の２％（ｖ／ｖ）のストック溶液としてＲＢＣＣユニットに加える。この処理したユニット、実施例１Ａまたは１Ｂの手順に従って生理食塩水洗浄溶液（０．９％の塩化ナトリウム、０．２％のＤｅｘｔｒｏｓｅ）、またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（０．９％の塩化ナトリウム、１２．５ｍＭのリン酸ナトリウム（ＰＢＳ）、０．９％の塩化ナトリウム、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ＰＢＳ−５０）または０．９％の塩化ナトリウム、７５ｍＭのリン酸ナトリウム（ＰＢＳ−７５）の３種類の組成物のうち１種類を有する）で洗浄する。洗浄に続き、エチレンイミンオリゴマー濃度を、３０ｎｇ／ｍＬ以上の感度を持つＨＰＬＣによって決定する。典型的には、使用した実験条件下において、生理食塩水洗浄したＲＢＣＣ中で７２ｎｇ／ｍＬの残留エチレンイミンオリゴマーが検出されたのに対し、１２．５ｍＭのリン酸緩衝化溶液で洗浄したＲＢＣＣ中では、５４ｎｇ／ｍＬの残留エチレンイミンオリゴマーが検出され、５０ｍＭのリン酸緩衝溶液で洗浄したＲＢＣＣ中では、３６ｎｇ／ｍＬの残留エチレンイミンオリゴマーが検出され、そして７５ｍＭのリン酸緩衝化溶液で洗浄したＲＢＣＣ中では、１５ｎｇ／ｍＬの残留エチレンイミンオリゴマーが検出される。全ての処理および洗浄したユニットを、４２日間、１〜６℃で貯蔵する。貯蔵の４２日間後、生理食塩水、ＰＢＳ、ＰＢＳ−５０およびＰＢＳ−７５で洗浄したユニットの平均値は以下のとおりである：それぞれ、溶血０．８±０．２８％、０．４２＋０．０６％、０．４３±０．１３％、および０．６８±０．０１７％；ＡＴＰレベル２．０５±０．０６μｍｏｌ／ｇＨｇｂ、３．４２±０．１８μｍｏｌ／ｇＨｇｂ、３．６７±０．３３μｍｏｌ／ｇＨｇｂ、および４．２５±０．４１μｍｏｌ／ｇＨｇｂ；細胞外Ｋ＋３８．５±５．１ｍＥｑ／Ｌ、３６．６±４．３ｍＥｑ／Ｌ、３５．７±３．１ｍＥｑ／Ｌ、および３６．３±３．２ｍＥｑ／Ｌ。
【００９９】
（実施例５−洗浄された赤血球からのタンパク質分析物の除去についてのアッセイ）
（５Ａ．ヒト血清アルブミンの除去についてのアッセイ）
ウェスタンブロット化学ルミネセンスアッセイは、実施例１Ａの方法に従い、赤血球の濃縮物の連続的かつ繰返しの洗浄によるタンパク質の除去のレベルを測定するために用いられる。
【０１００】
存在するヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のレベルについて試験される各々のサンプルを、別々のアリコートに分割する。各々のサンプルの１つのアリコート（１ｍＬ）を、２５００で１０分間、遠心分離し、そしてその上清を取り出した。各々のセットからのＡ、Ｂ、およびＣとラベルされた３つのサンプルを、アルブミンの存在および／または非存在について分析する。サンプルＡは、処理前の血液を示す。サンプルＢは、コントロールの洗浄された血液であり、そしてサンプルＣは、室温で、０．１％（ｖ／ｖ）、９２０μｇ／ｍＬのエチレンイミンオリゴマーにより２４時間、処理され、次いで洗浄された血液である。処理前のサンプル（サンプルＡ）を、ＳＤＳゲルにロードする前に、１：１０，０００に希釈する。サンプルＢおよびサンプルＣは、希釈されていない。全てのサンプルを、２×ＳＤＳゲル還元サンプル緩衝液でさらに希釈し、そして３分間煮沸する。
【０１０１】
１０μｌの各々のサンプルを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、そしてＢｉｏ−Ｒａｄセミドライシステムを用いて、ニトロセルロース膜へと電気泳動で移す。この膜を、室温で、ブロック溶液（１×ＰＢＳ中に作製された、３％Ｄｒｙ−Ｐｏｗｄｅｒ  ｍｉｌｄ）中で１時間（あるいは、４°で一晩）、振動させることによって、非特異的結合部位をブロックする。このブロットを、ヒト血清アルブミン特異的ヒトモノクローナル抗体（クローン番号ＨＡＳ−１１、Ｓｉｇｍａ、ロット番号１２９Ｈ４８４７）と共にインキュベートする。抗体を、１×ＰＢＳ溶液中に、１：２０００希釈で希釈し、そしてこの膜と接触するように配置する。一次抗体の結合の後、この膜を、１×ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎを用いて、５分間ずつ２回洗浄し、その後、豊富な量のＤＤ水を用いて洗浄する。次いで、この膜を、プロテインＡ−ＨＲＰ結合体の１：３０，０００希釈物と共にインキュベートし、そして４５分間インキュベートする。このブロットを、１×ＰＢＳで１回、５分間すすぎ、次いで水ですすぐ。酵素標識した二次抗体の可視化を、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａの溶液キットを用いて、化学ルミネセンス検出法（ＥＣＬ）を用いて達成する。
【０１０２】
標準の調製のために、Ａｌｐｈａ  Ｂｉｏｔｅｃｈからの純粋なヒト血清アルブミン（５％）を、５ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）に緩衝液置換する。このタンパク質濃度は、３１．１ｍｇ／ｍＬである。
【０１０３】
この結果は、この検出方法を用いる場合、サンプル中の１０ｎｇ程度の低いＨＳＡを検出することが可能であることを示す。７サンプルの各々を試験し、４サンプルが、コントロールおよび処理されたサンプルの両方について、非常に類似するアルブミン除去レベルを示す。タンパク質残留のレベルは、使用したもっとも低い標準（１０ｎｇ）よりも非常に低い。
【０１０４】
正常なヒト血漿中のアルブミン濃度は、３０〜５０ｍｇ／ｍＬの間であり、従って、実施例１Ａに記載される方法に従うアルブミンの除去レベルは、少なくとも６ｌｏｇ分であるはずである。
【０１０５】
（５Ｂ．ヒト血清アルブミンおよびＩｇＧの除去についてのアッセイ）
実施例１Ａの方法に従い、ウェスタンブロット化学ルミネセンスアッセイを用いて、白血球を減少させた（ｌｅｕｋｏｒｅｄｕｃｅｄ）赤血球（ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ）の濃縮物の連続的かつ繰返しの洗浄によるタンパク質の除去のレベルを測定する。
【０１０６】
各々のサンプルを、別々のアリコートに分割する。各々のサンプルの１つのアリコート（１ｍＬ）を、５０００×ｇで５分間遠心分離し、その上清を取り出し、そして１６，０００×ｇで１０分間、再遠心分離し、そしてその上清を、そのペレットから移して出す。このサンプルを、ＨＳＡおよびＩｇＧの存在について、定量分析する。サンプルＡは、処理前の血液を示す。この処理前のサンプル（サンプルＡ）を、各々ＨＳＡ分析およびＩｇＧ分析のために、ＳＤＳゲルへのロードの前に、１：２０００または１：１０，０００に希釈する。洗浄後のサンプルは、希釈しない。全てのサンプルを、２×ＳＤＳゲル非還元サンプル緩衝液でさらに希釈し、そして３分間煮沸する。
【０１０７】
１０μｌの各々のサンプルを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、そしてニトロセルロース膜へと電気泳動で移す。この膜を、室温で、ブロッキング溶液（１×ＴＢＳＴ中に作製された、５％Ｄｒｙ−Ｐｏｗｄｅｒ  ｍｉｌｄ）中で１時間（あるいは、４℃で一晩）、振動させることによって、非特異的結合部位をブロックする。ＨＳＡの分析のために、このブロットを、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）特異的ヒトモノクローナル抗体（クローン番号ＨＳＡ−１１、Ｓｉｇｍａ、Ａ８７６３）と共にインキュベートする。抗体を、１×ブロッキング溶液中に、１：２０００希釈で希釈し、そしてこの膜と接触するように配置する。一次抗体の結合の後、この膜を、１×ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎを用いて、５分間ずつ４回洗浄する。次いで、この膜を、ヒツジ抗マウスＩＧＧ  ＨＲＰ結合体の１：１０，０００希釈物と共にインキュベートし、かつ６０分間インキュベートする。このブロットを、１×ＴＢＳＴで５分間ずつ４回すすぐ。ＩｇＧの検出については、プロテインＡ  ＨＲＰ結合体（Ｐｉｅｒｃｅ＃３２４００）の１：３０，０００希釈物のみを用いることを除いて、その手順は、同一である。酵素標識した二次抗体の可視化を、化学ルミネセンス検出法（ＥＣＬ＋、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ａｍｅｒｓｈａｍ）により達成する。定量を、Ｆｌｏｕｒ  Ｓ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｉｍａｇｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて画像を捕捉することによって行い、そしてＱｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）を用いて分析する。
【０１０８】
標準の調製のために、Ｓｉｇｍａからの本質的にイムノグロブリンを含まない、純粋なヒト血清アルブミン（Ａ８７６３）を、再懸濁し、そしてＰＢＳ緩衝液中に所望の濃度にまで希釈する。純粋なヒトＩｇＧ（Ａｌｐｈａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を、標準イムノグロブリンとして用いた。この結果は、この検出方法を用いる場合、元のサンプル中の９８ｎｇ／ｍＬ（０．４９ｎｇ）程度の低３濃度のＨＳＡおよび１８ｎｇ／ｍＬ以下のＩｇＧを検出することが可能であることを示す。洗浄後に残留するアルブミンおよびＩｇＧの濃度は、夫々、４４０ｎｇ／ｍＬおよび１４０ｎｇ／ｍＬである。
【０１０９】
最初のＲＢＣＣ上清中のこれらのアルブミンおよびＩｇＧの濃度は、２８±４ｍｇ／ｍＬおよび９．７±３．３ｍｇ／ｍＬであり、従って、実施例１Ａに記載される方法に従うアルブミンおよびＩｇＧの除去レベルは約４．８ｌｏｇあるはずである。
【０１１０】
（実施例６−プリオンタンパク質スパイキング（ｓｐｉｋｉｎｇ）物質の調製）
（スクラピーハムスターの脳のホモジネートの調製）
スクラピー（２６３Ｋ株）に感染させたハムスターの脳を、冷リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に１０％（ｗ／ｖ）の最終濃度へとホモジナイズする。このホモジネートを、超音波処理（Ｍｉｃｒｏｓｏｎｉｘ  Ｃｕｐ  Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ  設定８〜１０、３×１分間）して、スパイキングのための均一の懸濁物を作製する。
【０１１１】
（Ｂ．スクラピーハムスターの脳のミクロソームＰｒＰＳｃの調製）
スクラピー（２６３Ｋ株）に感染させたハムスターの脳を上記のようにホモジナイズし、そして超音波処理する。この調製物を、低速度（５，０００×ｇ、１０分間）で遠心分離して、粗残渣（ｃｏａｒｓｅ  ｄｅｂｒｉｓ）をペレット化する。その上清を取り出し、そしてＰｒＰＳｃを、超遠心（２００，０００×ｇ、３０分間）によって、ペレット化する。その上清およびリポスキン（ｌｉｐｏｓｋｉｎ）を、慎重に取り出し、そして廃棄した。このペレットを、ＰＢＳ中に再懸濁し、超音波処理して均質にし、そしてスパイキングのために用いる。
【０１１２】
（Ｃ．正常なウシの脳のホモジネートの調製）
正常なウシの脳を、超音波処理によってホモジナイズする。このホモジネート由来ＰｒＰＣを、２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ  １００を用いて抽出する。抽出された混合物を、ＳＰ−セファロースクロマトグラフィーおよびその後の金属キレート化クロマトグラフィーによって部分的に精製する。ＰｒＰＣを含む画分を、スパイキングのために用いる。
【０１１３】
（Ｄ．ヒト血小板由来の正常なプリオンタンパク質（ｈｕＰｌｔＰｒＰＣ））
（１．  ９８４ｎｇ／ｍＬの調製物）
１アフェレーシスユニット由来の血小板を、ＨＥＰＥＳ緩衝液で洗浄する。ＣａＣｌ２
およびＣａ＋＋イオノフォアを添加して、血小板の活性化を誘導する。この活性化血小板を、２３０，０００×ｇで、１時間超遠心して、不溶性タンパク質をペレット化して取り
出す（ｐｅｌｌｅｔ  ｏｕｔ）。この可溶性ＰｒＰＣを含む上清を、スパイキングのため
に用いる。そして、この上清は、９８４ｎｇ／ｍＬのＰｒＰＣを含む。
【０１１４】
（２．  ５４００ｎｇ／ｍＬの調製物）
６アフェレーシスユニット由来の血小板を、ＨＥＰＥＳ緩衝液で洗浄する。ＣａＣｌ２およびＣａ＋＋イオノフォアを添加して、血小板の活性化を誘導する。タンパク質分解を防ぐために、プロテアーゼインヒビターを添加する。この活性化血小板を、２３０，０００×ｇで、１時間超遠心して、細胞性の粗残渣および不溶性タンパク質をペレット化して取り出す。この可溶性ＰｒＰＣを含む上清を、１０ＫＤａの公称排除限界分子量の遠心分離濃縮器を用いて約１０倍に濃縮し、そして保持物質（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）をスパイキングに用いる。このスパイク（４５ｍＬ）は、５４００ｎｇ／ｍＬのＰｒＰＣを含む。
【０１１５】
（Ｅ．シリアンハムスター組換えＰｒＰ（Ｓｈａ  ｒＰｒＰ））
組換えα形態およびβ形態の全長プリオンタンパク質を、ＴＳＥ  Ｒｅｓｏｒｕｃｅ  Ｃｅｎｔｒｅ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｃｏｍｐｔｏｎ、Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ、ＵＫより得る。本質的に、このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、還元条件下および変性条件下で、ＩＭＡＣおよびカチオン交換クロマトグラフィーによって抽出および精製する。このタンパク質を酸化しさせ、そしてＪａｃｋｓｏｎらのＣｕＣｌ２透析法（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｇ．Ｓ．ら、（１９９９）．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｆｏｒ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １４３１，１〜１３）によってα形態に再び折りたたむ（ｒｅｆｏｌｄ）。組換えＰｒＰ  β形態を、ｒＰｒＰ  α形態から作製した（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｇ．Ｓ．ら、１９９９）。このタンパク質の組換えα形態およびβ形態の品質管理データを、ＳＤＳゲル分析、質量分析および円偏光二色性によって提供する。スパイキング実験に使用する前に、この組換えタンパク質を、１００  ０００ｇで１時間遠心分離して、保存または凍結する際に形成された不溶性タンパク質を取り出し、そしてこれらの濃度を、ＵＶ分光法によって測定する。
【０１１６】
（実施例７−自動化された洗浄手順によるプリオンタンパク質の除去）
（Ａ．スクラピー感染されたハムスターの脳のホモジネートのＲＢＣＣからの除去）
ロイコフィルター（ｌｅｕｋｏｆｉｌｔｅｒ）（例えば、ＰＡＬＬ  ＲＣＸＬ１ｌ）を用いて、１ユニットの抗凝固化ＲＢＣＣの白血球を減少させる。上記の実施例６に従い調製される、スクラピー感染させたハムスターの脳のホモジネートの１０％の調製物の５％ｖ／ｖ（約２つの脳すなわち２００μｇのＰｒＰＳＣ）を、そのＲＢＣＣに添加し、そしてこのユニットを、手動で１分間混合する。このＲＢＣＣユニットを、室温で１時間にわたり揺らしながら、インキュベートする。次いで、このＲＢＣＣユニットを、実施例１Ａに従い洗浄する。
【０１１７】
０．５ｍＬのサンプルを、洗浄されたＲＢＣＣユニットから取り出し、そして等価の１０％サルコシルを用いて溶解する。このサンプルを、室温で、１３００００×ｇで３０分間、スピンさせる。内因性ＰｒＰＣは、可溶性であり、そしてこの上清に残留する他の血液成分とともに、デカンテーションする。次いで、このペレットを、５％のサルコシルを用いて１回洗浄し、そして室温で、１３００００×ｇで３０分間再び超遠心する。このペレットを、５％のサルコシルを用いて１回洗浄して、残留するサルコシルを除去し、そして１３００００×ｇで３０分間再び超遠心する。最終的なペレットを、小容量の６ＭのグアニジンＨＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．４中に懸濁し、超音波処理して均質にし、そして１０分間煮沸する。次いでこのサンプルを、時間解像される解離増強蛍光イムノアッセイ（ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）、Ｈｅｍｍｉｌａ  Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．、４８：３８９〜３９９、１９８８、およびＭａｃＧｒｅｇｏｒら、Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ．、７７：８８〜９６、１９９９を参照のこと）によって、ＰｒＰまたはＰｒＰＳＣ（ＧｄｎＣｌ中での変性の後）について分析した。
【０１１８】
スクラピーハムスターの脳のホモジネートの濃度は、未洗浄のスパイキングされたコントロールにおけるスクラピーの脳のホモジネートの濃度と比較して１．２ｌｏｇから３．０ｌｏｇ分減少する。本明細書に記載される自動化された洗浄手順および手動の洗浄手順におけるｌｏｇ除去を、そのサンプルと標準曲線とを比較することによって決定する（この標準曲線は、スパイキングされていない同種のＷＢへの最初にスパイキングしたＷＢの限界希釈によって作成する）。あるいは、ＰｒＰＣレベルを、血小板由来ＰｒＰＣ較正物質（ｃａｌｉｂｒａｔｅｒ）から作成した標準曲線によって定量する。このＰｒＰＣ較正物質は、洗浄された血小板の界面活性剤処理、およびその後の２０００×ｇでの２０分間の遠心分離により細胞性の粗残渣を取り出すことによって得られる。この較正物質を、公知の濃度のＳＨａ  ｒＰｒＰの標準曲線に対して較正し、そして７０９ｎｇ／ｍＬであると決定する。
【０１１９】
（Ｂ．全血からのスクラピー感染ハムスター脳ホモジネートからの除去
１０％のハムスタースクラピー脳ホモジネート（２６３Ｋ系統）を上記の実施例６に記載されるように調製する。１ユニットの全血（ＷＢ）を、５％容量の１０％ＳＢＨ（約３個の脳または３００μｇのＰｒＰＳｃ）を用いてスパイクして、そして１時間２２℃でインキュベートする。次いでこのユニットをＲＢＣＣ成分に分画して（１３００×ｇ、４分）、ＡＳ−３溶液に再懸濁して、そしてＰａｌｌ  ＲＣＸＬ１  白血球除去（ｌｅｕｋｏｒｅｄｕｃｅ）フィルターを通して白血球除去させる。この白血球除去したユニットを上記の実施例１Ａに従って洗浄する。サンプルを白血球除去前、白血球除去後および洗浄手順後に分析に掛ける。内在性ＰｒＰＣを除去して、そしてＰｒＰＳｃを、超遠心手順によりサンプルから回収してそして上記の実施例７Ａに記載されるように検出する。
【０１２０】
ＰｒＰＳｃを≧１〜２．９ｌｏｇまで低減させる。０．１〜０．８ｌｏｇのクリアランスは白血球除去によるものであり、そして１．６〜２．１ｌｏｇのクリアランスは記載の洗浄手順によるものである。
【０１２１】
（Ｃ．内在性ヒトＰｒＰＣの除去）
１ユニットの全血を、標準の血液勾配技術（１３００×ｇ、４分）を使用してＲＢＣＣに分画する。このＲＢＣＣを、ＰＡＬＬ  ＲＣＸＬ１  白血球除去フィルターを通して白血球濾取（ｌｅｕｋｏｆｉｌｔｅｒ）する。このＬＲ−ＲＢＣＣユニットを上記の実施例１Ａの手順に従って洗浄する。
【０１２２】
ＲＢＣＣに付随する残留ＰｒＰＣを、上記の実施例７Ａに記載される、時間分解型の解離増強性蛍光免疫アッセイ（ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｆｌｕｏｒｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）を使用して定量する。内在性ヒトＰｒＰＣの濃度を、このアッセイの検出レベルまで低減させる。内在性ヒトＰｒＰＣの濃度を、無洗浄コントロール中の内在性ヒトＰｒＰＣの濃度と比較して、約２ｌｏｇ（≧１．８〜２．０ｌｏｇ）に低減させる。
【０１２３】
（Ｄ．内在性ヒトＰｒＰＣおよびスパイクしたヒト血小板由来ＰｒＰＣの除去）
２つの適合可能なユニットの全血を、標準の血液勾配技術（１３００×ｇ、４分）を使用してＲＢＣＣに分画する。このユニットを混ぜ合わせて、そして等ユニットに分配する。上記の実施例６Ｄ２に記載されたように調製されたヒト血小板由来ＰｒＰＣ（２４０μｇ）を、ＲＢＣＣユニットのうちの１ユニット中にスパイクして、そして１時間インキュベートする。２つ目のユニットを等容量のＨＥＰＥＳ緩衝液と混合する。このＲＢＣＣユニットを、ＰＡＬＬ  ＲＣＸＬ１  白血球除去フィルターを通して白血球濾取する。このＬＲ−ＲＢＣＣユニットを、実施例１Ａの手順に従って洗浄する（ｎ＝５）。内在性ＰｒＰ濃度およびスパイクされたＰｒＰ濃度を、上記の実施例７Ａに記載された、時間分解型の解離増強性蛍光免疫アッセイを使用して、細胞画分および細胞除去した画分において、決定する。血小板由来ＰｒＰＣ標準物質から作成される標準曲線から、細胞除去したサンプル中のＰｒＰ濃度を決定する。細胞画分の低減は、スパイクされない洗浄した血液への、スパイクされた開始物質の系列的な希釈に基づく。
【０１２４】
細胞画分の分析は、洗浄工程のみにより、ｈｕＰｌｔＰｒＰＣの≧３．０ｌｏｇの低減を証明する。さらに、内在性のＰｒＰｃおよびｈｕＰｌｔＰｒＰＣのレベルは、無細胞成分を分析すると、白血球除去前でそれぞれ３２．４ｎｇ／ｍＬおよび１１４０ｎｇ／ｍＬであり、洗浄前でそれぞれ１６．３ｎｇ／ｍＬおよび８５０ｎｇ／ｍＬであり、そして洗浄後で≦０．１４ｎｇ／ｍＬである。その０．３ｌｏｇの内在性ＰｒＰＣを白血球濾取にかけることにより除去して、そして洗浄がさらに内在性ＰｒＰＣレベルを≧２ｌｏｇ低下させ、≧２．３５ｌｏｇの内在性ＰｒＰＣの総合的な低減が達成される。同様にして、０．１３ｌｏｇのｈｕＰｌｔＰｒＰＣが白血球濾取により除去されて、そして洗浄がさらに内在性ＰｒＰＣレベルを≧３．７ｌｏｇ低減させ、≧３．９ｌｏｇのｈｕＰｌｔＰｒＰＣの総合的な低減を達成する。
【０１２５】
（Ｅ．シリアンハムスターの組換えＰｒｐの除去）
２つの適合可能なユニットの全血を、標準の血液勾配技術（１３００×ｇ、４分）を使用してＲＢＣＣに分画する。このユニットを混ぜ合わせて、等ユニットに分配する。このＲＢＣＣユニットをＰＡＬＬ  ＲＣＸＬ１白血球除去フィルターの通して白血球濾取する。Ｅ．ｃｏｌｉ由来の組換えシリアンハムスターｒＰｒＰ（４００μｇ）を、上記の実施例６Ｅに記載されるように調製して、ＲＢＣＣユニットのうちの１ユニットにスパイクして、そして１時間インキュベートする。その２つ目のユニットを等容量のＨＥＰＥＳ緩衝液と混合する。このＬＲ−ＲＢＣＣユニットを実施例１Ａの手順に従って洗浄する。上記実施例７Ａに記載した、時間解離型の解離増強性蛍光免疫アッセイにより、細胞画分および細胞除去した画分中のスパイクされた細胞除去サンプル中のＰｒＰの濃度を決定する。ＰｒＰ濃度を、血小板由来のＰｒＰＣ標準物質から作成される標準曲線と比較することにより決定する。細胞画分の低減は、スパイクされない非洗浄の血液への、スパイクされた開始物質の系列的な希釈に基づく。
【０１２６】
細胞除去した懸濁物中のα型Ｓｈａ  ｒＰｒＰのレベルは、洗浄前で１４０５ｎｇ／ｍＬであり、そして洗浄後で≦０．１２ｎｇ／ｍＬであり、洗浄の結果≧４ｌｏｇの低減のＰｒＰを生じる。細胞画分の分析は、≧３．０ｌｏｇの低減を証明する。
【０１２７】
（実施例８  手動の洗浄手順によるプリオンタンパク質の除去）
１ユニットの抗凝固されたＲＢＣＣを、白血球フィルター、例えばＰＡＬＬ  ＲＣＸＬ１を使用して白血球除去する。スパイクを有する２５ｍＬのサンプルまたはスパイクを有さない２５ｍＬのサンプルを５０ｍＬ円錐管に移す。等容量の生理食塩水／デキストロース溶液をその管に添加して、２分間混合する。この物質を遠心分離して、赤血球を沈殿させる（２０００×ｇ、４分間）。この上清を、赤血球の層を乱さないように慎重にデカントする。生理食塩水／デキストロース溶液を添加して管の内容物を元の容量（２５ｍＬ）まで戻す。この工程を総計１１回の洗浄まで繰り返す。この最終的なＲＢＣＣ沈殿物をＡＳ−３保存培地中に再懸濁する。
【０１２８】
このＲＢＣＣがスパイクを全く含まない場合、上記の実施例７Ａに記載した、時間分解型の解離増強性蛍光免疫アッセイを、内在性ＰｒＰＣを検出するために使用する。内在性ヒトＰｒＰＣの濃度は、無洗浄のコントロール中の内在性ヒトＰｒＰＣの濃度と比較して、洗浄サンプルにおいて少なくとも２ｌｏｇに低減する。
【０１２９】
上記の実施例６に記載されたように調製された、ウシＰｒＰＣまたはｈｕＰｌｔＰｒＰＣが、１０％  容積／容積で２５ｍＬのＲＢＣＣ中にスパイクされる場合、上記の実施例７Ａに記載された時間分解型の解離増強性蛍光免疫アッセイを使用して、ＰｒＰＣを検出した。無洗浄コントロール中のウシＰｒＰＣまたはｈｕＰｌｔＰｒＰＣの濃度と比較して、洗浄サンプル中のウシＰｒＰＣまたはｈｕＰｌｔＰｒＰＣの濃度は低減する。
【０１３０】
実施例６で上に示されたように調製された、スクラピーハムスターの脳ホモジネートＰｒＰＳｃまたはスクラピーハムスター脳ミクロソームのＰｒＰＳｃを、２５ｍＬのＲＢＣＣサンプル中に１０％（容量／容量）でスパイクして、遠心分離のサンプル調製工程および上記の実施例７Ａに記載された、時間分解型の解離増強性蛍光免疫アッセイを使用して、ＰｒＰＳｃを検出する。スクラピーハムスター脳ホモジネートのＰｒＰＳｃの濃度またはスクラピーハムスターミクロソームのＰｒＰＳｃの濃度は、無洗浄のコントロール中の濃度と比べて低減する。
【０１３１】
（実施例９  ＰｒＰ除去とのＨＳＡおよびＩｇＧの除去の比較）
ＲＢＣＣのユニットを、上記の実施例７Ｄおよび実施例Ｅに記載されるように、ｈｕＰｌｔ  ＰｒＰＣまたはαＳＨａ  ｒＰｒＰを用いてスパイクして、そして実施例１Ａの方法に従って洗浄する。サンプルを各々の洗浄の繰り返し後に除去して、そして細胞の除去された画分を、実施例５Ｂの方法を使用してＨＳＡおよびＩｇＧの存在について定量的に分析して、そしてＰｒＰを実施例７Ａに記載されるように定量する。平均の開始レベルのＨＳＡ（ｎ＝５）、ＩｇＧ（ｎ＝５）、ｈｕＰｌｔ  ＰｒＰＣ（ｎ＝５）およびｒＰｒＰ（ｎ＝２）は、それぞれ２７．９ｍｇ／ｍＬ、９．６７ｍｇ／ｍＬ、８５０ｎｇ／ｍＬおよび１４０５ｎｇ／ｍＬである。ＰｒＰの除去の割合は、最初の４回洗浄サイクルの間のＨＳＡおよびＩｇＧの除去の割合と対応し、洗浄後にＰｒＰのレベルはＤＥＬＦＩＡアッセイの感度レベルよりも下に低減する。最初の洗浄サイクルの完了までで、ＨＳＡ、ＩｇＧ、ｈｕＰｌｔ  ＰｒＰｃおよびｒＰｒＰｃの全体のｌｏｇ低減は、それぞれ、１．６２ｌｏｇ、１．５８ｌｏｇ、１．６０ｌｏｇ、１．５２ｌｏｇである；２回目の洗浄サイクルの完了までで、それぞれ、２．７８ｌｏｇ、２．６９ｌｏｇ、２．７６ｌｏｇ、２．７１ｌｏｇである；３回目の洗浄サイクルの完了までで、それぞれ、３．６０ｌｏｇ、３．３９ｌｏｇ、３．６１ｌｏｇ、３．１３ｌｏｇである；４回目の洗浄サイクルの完了までで、それぞれ、４．１７ｌｏｇ、３．８８ｌｏｇ、３．８８ｌｏｇ、３．６２ｌｏｇである。ＨＳＡおよびＩｇＧを、最終の洗浄サンプル中に０．４４μｇ／ｍＬおよび０．１４μｇ／ｍＬのレベルまでさらに除去すると、さらにそれぞれ４．８０ｌｏｇおよび４．８３ｌｏｇの全体的な削除を示す。このアッセイの感度のレベル（０．１４ｎｇ／ｍＬ）未満に低減するレベルが原因となり、４回目の洗浄後のＰｒＰの定量は不可能である。
【０１３２】
（実施例１０  海綿状脳障害の血液媒介性伝播の低減についてのアッセイ）
（１０Ａ．伝播性海綿状脳障害の血液媒介性伝播の低減についてのヒツジのバイオアッセイ）
５匹のＶＲＱ／ＶＲＱ北イングランドチェビオットヒツジのうちの１匹を、例えば、Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｆ；Ｆｏｓｔｅｒ、Ｊ．Ｄ．；Ｃｈｏｎｇ，Ａ．；Ｈｕｎｔｅｒ，Ｎ．およびＢｏｓｔｏｃｋ，Ｃ．Ｊ．「Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＢＳＥ  ｂｙ  ｂｌｏｏｄ  ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ｉｎ  ｓｈｅｅｐ．」Ｌａｎｃｅｔ．２０００年９月１６日号；３５６（９２３４）：９９９−１０００により記載されるように、複数用量のＢＳＥ感染ウシ脳ホモジネートを摂食させる。好ましくは、１〜２ｇの用量を、最初の３ヶ月間は１ヶ月の間隔で摂食させる。１０日目、６ヶ月目、１２ヶ月目、１８ヶ月目および屠殺日に、２ユニット以上の血液を各々のヒツジから採集する。各々の時点で、１ユニットの採集された血液を、実施例１Ａおよび実施例１Ｂの手順に従って洗浄し、一方で残りのユニットをコントロールとして周囲の温度で維持する。実施例１Ａまたは実施例１Ｂの手順を経た細胞外タンパク質の低減、例えばＩｇＧおよび／または血清アルブミンおよび／または細胞内プリオンタンパク質および／または感染性プリオンタンパク質を、上記の実施例５、実施例７および実施例９のいずれかに記載されるように、モニターする。
【０１３３】
ＮＺチェビオット（ＡＲＱ／ＡＲＱ）レシピエントヒツジを洗浄したＲＢＣＣユニットを用いて少なくとも１時点から輸液して（グループＡレシピエントヒツジ）、そして２つ目のレシピエントを、無洗浄の全血コントロールまたは無洗浄のコントロール由来の赤血球画分を除去した粗精製血漿を用いて、同じ時点に輸液する（グループＢレシピエントヒツジ）。
【０１３４】
これらレシピエントヒツジを、上記の本発明の詳細な説明において記載されるように、伝播性の海綿状脳障害の徴候について５年間観察して、そして／または疾患の生化学的な指標について評価する。例えば、輸液されたレシピエントへのＢＳＥの伝播についての確実な証拠を、ＰｒＰ糖分類（Ｈｏｐｅ，Ｊ．，Ｗｏｏｄ，Ｓ．Ｃ．，Ｂｉｒｋｅｔｔ，Ｃ．Ｒ．，Ｃｈｏｎｇ，Ａ．，Ｂｒｕｃｅ，Ｍ．Ｅ．，Ｃａｉｒｎｓ，Ｄ．，Ｇｏｌｄｍａｎｎ，Ｗ．，Ｈｕｎｔｅｒ，Ｎ．およびＢｏｓｔｏｃｋ，Ｃ．Ｊ．（１９９９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｏｖｉｎｅ  ｐｒｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ＢＳＥ  ａｎｄ  ａｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｉｓｏｌａｔｅ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｓｃｒａｐｉｅ，ＣＨ１６４１．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８０（Ｐｔ１），１−４）または、純系の研究室マウスの集団への二次的伝播へと続く方法論を分類する、伝統的な病変の性質系統により、獲得し得る。
【０１３５】
グループＢレシピエントと比較したグループＡレシピエントにおいて、有意に低頻度の疾患発生率または疾患の生化学的指標を、輸液を経由した伝播性の海綿状脳障害の伝播の危険性の低下にポジティブとして記録する。グループＢレシピエントと比較したグループＡレシピエントにおいて、有意な遅滞性の疾患発症または疾患の生化学的指標を、輸液を経由した潜在的な曝露から疾患発症に必要とされるポジティブな延長時間として記録する。
【０１３６】
（１０Ｂ．伝播性の海綿状脳障害の血液媒介性伝播の低下についてのマウスバイオアッセイ）
２０μＬの潜在的に感染したＲＢＣＣを脳内に接種したレシピエントマウス（レシピエントグループＡ）、および２０μＬの対応する無洗浄の全血または粗精製の血小板が除去された赤血球画分コントロールを用いた２つ目のグループのレシピエントマウス（レシピエントグループＢ）を、実施例１Ａまたは実施例１Ｂに従って洗浄する。この潜在的に感染性の洗浄したＲＢＣＣユニットおよび無洗浄のコントロールを、上記の実施例５、実施例７または実施例９に記載されるように、細胞外タンパク質（例えは、ＩｇＧまたは血清アルブミン）、細胞内プリオンタンパク質および／または病原性プリオンタンパク質の濃度について評価する。そのレシピエントマウスは、公知の系列のＴｇ１０１Ｌ、またはＴｇＨｕ１０１Ｌ、またはＴｇＢｏＰｒＰ、または従来のＲＩＩＩマウスもしくはＣ５７Ｂ１マウス（Ｂｒｕｃｅ，Ｍ．Ｅ．，Ｗｉｌｌ，Ｒ．Ｇ．，Ｉｒｏｎｓｉｄｅ，Ｊ．Ｗ．，ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ，Ｉ．，Ｄｒｕｍｍｏｎｄ，Ｄ．，Ｓｕｔｔｉｅ，Ａ．，ＭｃＣａｒｄｌｅ，Ｌ．，Ｃｈｒｅｅ，Ａ．，Ｈｏｐｅ，Ｊ．，Ｂｉｒｋｅｔｔ，Ｃ．，Ｃｏｕｓｅｎｓ，Ｓ．，Ｆｒａｓｅｒ，Ｈ．およびＢｏｓｔｏｃｋ，Ｃ．Ｊ．（１９９７）．「Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｓ  ｔｏ  ｍｉｃｅ  ｉｎｄｉｃａｔｅ  ｔｈａｔ  ’ｎｅｗ  ｖａｒｉａｎｔ’ＣＪＤ  ｉｓ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ＢＳＥ  ａｇｅｎｔ」．Ｎａｔｕｒｅ  ３８９，４９８−５０１；Ｂｒｕｃｅ，Ｍ．Ｅ．（１９９３）．Ｓｃｒａｐｉｅ  ｓｔｒａｉｎ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎ．Ｂｒ  Ｍｅｄ  Ｂｕｌｌ４９，８２２−３８）のような、感受性のトランスジェニック系列であり得る。
【０１３７】
グループＢレシピエントと比較したグループＡレシピエントにおいて、有意に低度な疾患発生率または疾患の生化学的指標を、輸液を経由した伝播性の海綿状脳障害の伝播の危険性の低下にポジティブとして記録する。グループＢレシピエントと比較したグループＡレシピエントにおいて、有意な遅滞性の疾患発症または疾患の生化学的指標を、輸液を経由した潜在的な曝露から疾患発症に必要とされるポジティブな延長時間として記録する。
【０１３８】
（実施例１１  輸液を経由した伝播性の海綿状脳障害の伝播の低下）
ヒトＲＢＣＣユニットを、上記の実施例１Ａおよび実施例１Ｂに従って洗浄する。このヒトＲＢＣＣを、上記の実施例５、実施例７または実施例９に記載されるように、細胞外タンパク質（例えは、ＩｇＧまたは血清アルブミン）、細胞内プリオンタンパク質および／または病原性プリオンタンパク質の濃度について評価する。上記の実施例１０においてポジティブを記録したＲＢＣＣユニット中のタンパク質濃度と相関のある細胞外タンパク質濃度を含むＲＢＣＣを、レシピエントに輸液する。
【０１３９】
（他の実施形態）
上記の記載から、当業者は本発明の本質的な特徴を容易に確認し得る。本発明の精神および範囲から逸脱すること無く、当業者は、種々の用途および条件に適合するよう本発明の様々な変更および改変を成し得る。他の実施形態もまた、本特許請求の範囲内である。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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