(57)【要約】  本発明は、トウモロコシから単離されたプロモーター及びそれらの機能的同等物に関する。本発明のプロモーターは、本発明の所定のプロモーターに、増大した農業的、園芸的及び／又は殺虫特性を付与する異種遺伝子の根-特異的発現を駆動する上で、並びに1種又は複数の異種遺伝子に作用可能に連結された本発明のプロモーターを含むDNA分子を含む形質転換された植物組織、及びそれらの種子において特に利用性がある。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物における根-特異的転写を指示することが可能なプロモーターをコードしている単離された核酸分子であり、ここで該プロモーターのヌクレオチド配列は：
a. 配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、又は配列番号:4のヌクレオチド配列；
b. a)のヌクレオチド配列に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；及び
c. a)のヌクレオチド配列の機能を維持しているa)の配列の断片を含むヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項２】
前記プロモーターが、配列番号:1に示されたヌクレオチド配列を含む、請求項1記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
前記断片が、配列番号:1のヌクレオチド番号603-1392を含む、請求項1記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
前記プロモーターが、配列番号:2に示されたヌクレオチド配列を含む、請求項1記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
前記断片が、配列番号:2のヌクレオチド番号921-2869を含む、請求項1記載の単離された核酸分子。
【請求項６】
前記断片が、配列番号:2のヌクレオチド番号1913-2869を含む、請求項1記載の単離された核酸分子。
【請求項７】
前記プロモーターが、配列番号:3に示されたヌクレオチド配列を含む、請求項1記載の単離された核酸分子。
【請求項８】
前記プロモーターが、配列番号:4に示されたヌクレオチド配列を含む、請求項1記載の単離された核酸分子。
【請求項９】
前記核酸分子が、標的植物種の根組織から単離されている、請求項1記載の単離された核酸分子。
【請求項１０】
前記標的植物種がトウモロコシである、請求項9記載の単離された核酸分子。
【請求項１１】
順に、請求項1記載の核酸分子、当該分子と作用可能に連結した異種コード配列、当該配列と作用可能に連結した、ポリアデニル化シグナルを含む3'側非翻訳領域、を含む、発現カセット。
【請求項１２】
前記異種コード配列が、殺虫コード配列、殺線虫コード配列、除草剤耐性コード配列、抗微生物コード配列、抗真菌コード配列、抗ウイルスコード配列、非生物ストレス耐性コード配列、栄養品質コード配列、可視マーカーコード配列及び選択マーカーコード配列からなる群より選択される、請求項11記載の発現カセット。
【請求項１３】
前記殺虫コード配列が、鞘翅類害虫に対し活性のある毒素をコードしている、請求項12記載の発現カセット。
【請求項１４】
前記鞘翅類害虫が、Diabrotica属の種である、請求項13記載の発現カセット。
【請求項１５】
前記可視マーカーが、β-グルクロニダーゼである、請求項12記載の発現カセット。
【請求項１６】
請求項11記載の発現カセットを含む、組換えベクター。
【請求項１７】
前記ベクターがプラスミドである、請求項16記載の組換えベクター。
【請求項１８】
請求項11記載の発現カセットを含む、トランスジェニック非-ヒト宿主細胞。
【請求項１９】
植物細胞である、請求項18記載のトランスジェニック宿主細胞。
【請求項２０】
請求項19記載のトランスジェニック植物細胞を含む、トランスジェニック植物。
【請求項２１】
前記植物が、モロコシ、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科作物、メンカ、コメ、ダイズ、テンサイ、サトウキビ、タバコ、バーレー、油料種子ナタネ、及びトウモロコシからなる群より選択される、請求項20記載のトランスジェニック植物。
【請求項２２】
前記植物が、コメ植物である、請求項21記載のトランスジェニック植物。
【請求項２３】
前記植物が、トウモロコシ植物である、請求項21記載のトランスジェニック植物。
【請求項２４】
請求項21記載のトランスジェニック植物由来のトランスジェニック種子。
【請求項２５】
請求項22記載のコメ植物由来のトランスジェニック種子。
【請求項２６】
請求項23記載のトウモロコシ植物由来のトランスジェニック種子。
【請求項２７】
トランスジェニック植物根において異種コード配列を特異的に発現する方法であり：
(a)植物細胞を、請求項11記載の発現カセットを含むベクターで形質転換する工程；
(b)該発現カセットを含むトランスジェニック植物細胞を生育する工程；及び
(c)異種コード配列が、該核酸分子の制御下で植物根において特異的に発現されるような、該形質転換された植物細胞からトランスジェニック植物を作成する工程を含む、方法。
【請求項２８】
トランスジェニック植物根が、トウモロコシ根又はコメ根である、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
前記異種コード配列が、殺虫コード配列、殺線虫コード配列、除草剤耐性コード配列、抗微生物コード配列、抗真菌コード配列、抗ウイルスコード配列、非生物ストレス耐性コード配列、栄養品質コード配列、可視マーカーコード配列及び選択マーカーコード配列からなる群より選択される、請求項27記載の方法。
【請求項３０】
請求項27記載の方法に従い作成されたトランスジェニック植物。
【請求項３１】
前記植物が、トウモロコシ植物又はコメ植物である、請求項30記載のトランスジェニック植物。
【請求項３２】
植物における根-特異的発現を指示することが可能なプロモーターを単離する方法であり：
(a)配列番号:1-4のいずれかひとつに由来する核酸プローブを調製する工程；
(b)該核酸プローブを、植物から調製されたcDNA又はゲノムDNAのいずれかとハイブリダイズする工程；及び
(c)該核酸プローブと少なくとも70％の同一性を伴う該cDNA又は該ゲノムDNAに由来したハイブリダイズ配列を単離する工程を含む、方法。
【請求項３３】
植物における根-特異的発現を指示することが可能なプロモーターの断片を同定する方法であり：
(a)請求項1記載の単離された核酸分子を提供する工程；
(b)工程(a)の核酸分子に含まれたプロモーター配列の断片を作成する工程；
(c)異種コード配列に作用可能に連結された工程(b)の断片で植物を形質転換する工程；及び
(d)根-特異的方法で異種コード配列の発現により、トランスジェニック植物におけるプロモーター活性を有する工程(b)の断片を同定する工程を含む、方法。
【請求項３４】
配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、及び配列番号:4からなる群より選択されるヌクレオチド配列の少なくとも16個の隣接ヌクレオチドを含むプライマー。
【請求項３５】
配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、及び配列番号:4からなる群より選択されるヌクレオチド配列の少なくとも50個の隣接ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は概して、植物分子生物学の分野、及び植物における遺伝子発現の調節に関する。より詳細に述べると、本発明は、植物根における遺伝子発現の調節に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
表現型特性(生産力又は品質など)を変更及び／又は改善するための作物の操作は、植物組織における異種遺伝子の発現を必要としている。このような遺伝子操作は、下記のふたつの発見により可能になってきている：異種遺伝物質で植物細胞を形質転換する能力、及び異種遺伝物質の発現を駆動することができるプロモーターの存在により。
【０００３】
トランスジェニック植物において望ましい作用(複数)を生じるために、様々な異なるプロモーターを選択することは利点である。適当なプロモーターは、特定の遺伝子、コンストラクト、細胞、組織、植物又は環境について選択することができる。植物導入遺伝子発現のために有用であるプロモーターは、誘導性、ウイルス性、合成、構成性(Odellら、Nature、313:810-812 (1985)；Granger及びCyr、Plant Cell Repo.、20:227-234 (2001))、時間的に調節された、空間的に調節された、組織-特異的、及び空間的に-時間的に調節された(Kuhlemeierら、Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.、38:221-257 (1987))プロモーターを含む。細菌、真菌、ウイルス及び植物由来のプロモーターは、植物細胞における遺伝子発現を制御するために使用される。
【０００４】
プロモーターは、プロモーターの完全な機能に必要であるいくつかの領域からなる。これらの領域の一部は、モジュラー(modular)であり、別の表現をするとこれらは、プロモーター活性を付与するために分離して使用することができるか、又はこれらは新規プロモーターを構築するために他のエレメントと集成することができる。これらのプロモーター領域の第一のものは、コード配列のすぐ上流に位置し、及び通常コード配列の20〜70塩基対すぐ上流にあるコンセンサス配列を含む「コアプロモーター領域」を形成している。コアプロモーター領域は、TATAボックス、及び時には開始部位に加え開始エレメントを含む。コアプロモーター領域の正確な長さは、固定されてはいないが、しかし通常よく知ることができる。このような領域は、ほとんどのプロモーターにおいて、通常いくつかの変形を伴い存在する。様々な良く特徴付けられたエレメントの間に位置する塩基配列は、余り重要でないように見える。コアプロモーター領域は、時には最小プロモーター領域と称されることがあり、その理由はこれはそれ自身に転写の基本レベルを促進するように機能するからである。
【０００５】
コアプロモーター領域の存在は、プロモーターであるような配列を定義し：この領域が存在しない場合は、そのプロモーターは機能しない。コア領域は転写開始のためのプロモーターに一般的転写機構を誘引するように作用する。しかし、コアプロモーター領域は、完全なプロモーター活性を提供するには十分ではない。一連の調節配列が、このコアの上流にあることが多く、これらがプロモーターの残余を構成している。この調節配列は、発現レベル、空間的及び時間的発現パターン、プロモーターのサブセットに関する誘導的条件下での発現(光、温度、化学物質及びホルモンなどの外部因子による調節)を決定する。調節配列は、転写因子のようなトランス-作用因子のための結合部位を規定する6〜100塩基対のDNA配列の短い領域であってもよい。調節配列は、コアプロモーター領域から離れて、時にはコア領域から数キロベース以上も離れて作用することができるDNA配列のより長い領域である、エンハンサーであることもできる。調節配列活性は、一般的転写機構、転写因子及びクロマチンアッセンブリ因子を含む、トランス-作用因子により影響を受ける。
【０００６】
植物において注目の遺伝子の組織-特異的発現が望ましいことは頻繁である。組織-特異的プロモーターは、植物全体の発現を伴わずに、専ら組織のひとつのセットにおける発現を促進し；組織-優先性(plant-preffered)プロモーターは、組織のあるサブセットにおいてより高いレベルの発現を、植物のその他の組織における有意に少ない発現と共に促進する。例えば、トウモロコシ種子においてのみ付加価値のある産物を発現するが、その植物の残りの部分においては発現しないことが望ましいことがある。別の例は、組織-特異的切除による雄性不稔の作出である。この場合、植物毒性産物が、特定の組織を切除するために植物の雄性組織においてのみ発現される一方で、花の他の組織に加え植物の残りの部分は、無傷であり続ける。多くの農業バイオテクノロジーの局面は、組織-特異的発現を使用しかつ必要としている。
【０００７】
プロモーターの必要性のひとつの重要な例は、植物根における選択された遺伝子の発現のためである。植物根は、表皮、根冠、コルメラ、皮層、内鞘、維管束及び毛根形成する原根毛などの、多くの細胞型からなり、例えば、根端、根表皮、分裂ゾーン、一次根、側根、毛根、及び維管束組織のような、根の組織又は領域へ組織化される。根-特異的又は根-優先性のものとして単離されたプロモーターは、これらの細胞型の1種又は数種における発現の促進に偏らせることができる。この細胞-特異的活性は、分裂細胞ゾーンのみにおける分裂活性の調節又は線虫有害生物に接触された細胞型のみにおける殺線虫遺伝子の発現のような、特定の用途に有用であることができる。別の場合には、根組織全体に注目の遺伝子を発現するために、より広範な細胞型特異性が望ましいことがある。これは、例えばトウモロコシ根の蠕虫(Diabrotica種)のような、植物根を摂食する害虫の防除のために、殺虫遺伝子の発現において有用である。より広範な細胞型の根特異性は、広い細胞型特異性を持つ単独の根-特異的プロモーターにより、又は発現に関して異なる細胞型特異性の2種又はそれよりも多い根-特異的もしくは根-優先的プロモーターを使用することにより、達成することができる。根-優先性及び根-特異的プロモーターの少数の例が説明されている。これらは、ニコチアナ・タバカム(Nicotiana tabacum)由来のRB7プロモーター(米国特許第5,459,282号及び第5,750,386号)；アラビドプシス・サリアナ(Arabidopsis thaliana)由来のARSK1プロモーター(Hwang及びGoodman、Plant J、8:37-43 (1995))、ゼア・マイス(Zea mays)由来のMR7プロモーター(米国特許第5,837,848号)、ゼア・マイス(Zea mays)由来のZRP2プロモーター(米国特許第5,633,363号)、及びゼア・マイス(Zea mays)由来のMTLプロモーター(米国特許第5,466,785号及び第6,018,099号)がある。多くのこれらの例は、少数の根組織に拘束された発現パターンを伴うプロモーターを明らかにしている。その他は、選択された遺伝子の発現に必要な根-特異性を提供することに失敗している。従って、新規根プロモーターを単離及び特徴決定するために、根-特異的及び根-優先性発現、特に根-特異的発現に関して、細胞型の発現の異なる幅(breadth)、発現レベル及び特異性を持つものを得ることが、当該技術分野において必要とされている。
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
本発明において、トランスジェニック植物において根-特異的発現を指示する組成物及び方法が提供されている。特に、植物において根-特異的方法で異種遺伝子の発現を駆動するゼア・マイス(Zea mays)から単離された新規核酸分子が提供される。本発明は更に、異種コード配列に作用可能に連結された本発明の新規核酸分子を含む発現カセット及びベクターを描いている。本発明は更に、本発明の発現カセットを含むトランスジェニック植物を描いている。本発明は更に、トランスジェニック植物根において異種コード配列を特異的に発現する方法、根-特異的cDNAを単離する方法、根-特異的発現を指示するのに有用な核酸分子を単離する方法、及び根-特異的プロモーターを単離する方法も提供する。本発明は更に、根-特異的又は根-優先性の転写を指示する他の植物ゲノム由来の関連したヌクレオチド配列を同定するための、プライマー及び核酸プローブを提供する。
【０００９】
ひとつの局面に従い、本発明は、植物における根-特異的転写を指示することが可能なプロモーターをコードしている単離された核酸分子を提供し、ここでこのプロモーターのヌクレオチド配列は、(a)配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、又は配列番号:4のヌクレオチド配列；(b)(a)のヌクレオチド配列と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；並びに、(c)(a)のヌクレオチド配列の機能を維持している(a)の配列の断片を含むヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００１０】
別の局面において、本発明は、配列番号:1-4に示されたヌクレオチド配列の断片を提供し、ここでこれらの断片は、植物における根-特異的転写を指示することが可能なプロモーターをコードしている。この局面の好ましい態様において、これらの断片は、配列番号:1-4に示されたヌクレオチド配列に5'側-欠失を形成することにより作出される。より好ましくは、この断片は、配列番号:1又は配列番号:2に示されたヌクレオチド配列の5'側-欠失である。
【００１１】
本発明は更に、異種コード配列に作用可能に連結された本発明の核酸分子を含む発現カセットも提供する。ひとつの態様において、発現カセットは、殺虫コード配列、殺線虫コード配列、除草剤-耐性コード配列、抗-微生物コード配列、抗-真菌コード配列、抗-ウイルスコード配列、非生物ストレス耐性コード配列、栄養品質(nutritional quality)コード配列、可視マーカーコード配列及び選択マーカーコード配列からなる群より選択される異種コード配列を含む。好ましい態様において、発現カセットは、鞘翅類害虫に対し活性のある毒素をコードしている殺虫コード配列を含む。この態様の好ましい局面において、鞘翅類害虫は、Diabrotica属の種である。更に別の態様において、発現カセットは、乾燥ストレス、栄養ストレス、塩ストレス、水ストレス及び重金属ストレスを含むが、これらに限定されるものではない、非生物ストレス耐性コード配列を含む。更に別の態様において、発現カセットは、緑色蛍光タンパク質(GFP)、β-グルクロニダーゼ(GUS)、及びルシフェラーゼ(LUC)を含むが、これらに限定されるものではない、可視マーカーコード配列を含む。更に別の態様において、発現カセットは、ホスホマンノースイソメラーゼ(PMI)、ヒグロマイシン、カナマイシンなどのような抗生物質耐性遺伝子、ホスフィノスリシンのような除草剤耐性遺伝子並びにバーナーゼ(bar)を含むが、これらに限定されるものではない、選択マーカーコード配列を含む。
【００１２】
本発明は更に、本発明の発現カセットを含む組換えベクターも提供する。好ましい態様において、組換えベクターは、プラスミドである。
【００１３】
更に本発明は、本発明の発現カセットを含むトランスジェニック非-ヒト宿主細胞を提供する。本発明のこの局面のトランスジェニック宿主細胞は、好ましくは、植物細胞である。なお更に本発明は、そのようなトランスジェニック植物細胞を含むトランスジェニック植物を提供する。本発明のこの局面のトランスジェニック植物は、モロコシ、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科作物、綿花、コメ、ダイズ、テンサイ、サトウキビ、タバコ、オオムギ、油料種子ナタネ及びトウモロコシであることができ、好ましくはトウモロコシ又はコメである。より更に本発明は、モロコシ、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科作物、綿花、コメ、ダイズ、テンサイ、サトウキビ、タバコ、オオムギ、油料種子ナタネ及びトウモロコシからなるトランスジェニック植物群に由来したトランスジェニック種子を提供する。特に好ましい態様において、トランスジェニック種子は、トランスジェニックトウモロコシ植物又はコメ植物に由来する。
【００１４】
別の局面において、本発明は、本発明の核酸分子の転写制御下で、トランスジェニック植物根において異種コード配列を特異的に発現する方法であって：(a)植物細胞を、異種コード配列に作用可能に連結された本発明の核酸分子を含むベクターで形質転換する工程、(b)ベクターを含むトランスジェニック植物細胞を生育する工程、及び(c)異種コード配列が、本発明の核酸分子の制御下、植物根において特異的に発現されるような、形質転換された植物細胞からトランスジェニック植物を作出する工程を含む方法を提供する。この局面のひとつの態様において、トランスジェニック植物は、トウモロコシ植物又はコメ植物である。この局面の別の態様において、異種コード配列は、殺虫コード配列、殺線虫コード配列、除草剤耐性コード配列、抗-微生物コード配列、抗-真菌コード配列、抗-ウイルスコード配列、非生物ストレス耐性コード配列、栄養品質コード配列、可視マーカーコード配列及び選択マーカーコード配列からなる群より選択される。更に別の態様において、本発明は、この局面において作出されたトランスジェニック植物を提供する。好ましい態様において、トランスジェニック植物は、トウモロコシ植物又はコメ植物である。
【００１５】
更なる局面において、本発明は、植物において根-特異的発現を指示することが可能なプロモーターを単離する方法であって：(a)配列番号:1-4のいずれかひとつに由来する核酸プローブを調製する工程；(b)核酸プローブを、植物から調製したcDNA又はゲノムDNAのいずれかにハイブリダイズする工程；及び、(c)その核酸プローブと少なくとも70％の同一性を伴うcDNA又はゲノムDNAに由来したハイブリダイズ配列を単離する工程を含む方法を提供する。
【００１６】
別の局面において、本発明は、植物において根-特異的発現を指示することが可能なプロモーターの断片を同定する方法であって：(a)本発明に従い単離されたプロモーター配列を提供する工程；(b)工程(a)のプロモーター配列の断片を作成する工程；(c)異種コード配列に作用可能に連結された工程(b)の断片で植物を形質転換する工程；及び、(d)異種コード配列の発現により、トランスジェニック植物においてプロモーター活性を有する工程(b)の断片を同定する工程を含む方法を提供する。
【００１７】
同じく本発明は、配列番号:1-4のいずれかひとつの少なくとも16個の隣接ヌクレオチドを含むプライマーも提供する。更に本発明は、配列番号:1-4のいずれかひとつの少なくとも50個の隣接ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブを提供する。
【００１８】
配列表の配列の簡単な説明
配列番号:1は、MRS1プロモーターのヌクレオチド配列である。
配列番号:2は、MRS2プロモーターのヌクレオチド配列である。
配列番号:3は、MRS3プロモーターのヌクレオチド配列である。
配列番号:4は、MRS4プロモーターのヌクレオチド配列である。
配列番号:5は、22P8と称される根-特異的cDNAの配列である。
配列番号:6は、配列番号:5でコードされた推定アミノ酸配列である。
配列番号:7は、10B21と称される根-特異的cDNAの配列である。
配列番号:8は、配列番号:7でコードされた推定アミノ酸配列である。
配列番号:9は、2D14と称される根-特異的cDNAの配列である。
配列番号:10は、配列番号:9でコードされた推定アミノ酸配列である。
配列番号:11は、4H19と称される根-特異的cDNAの配列である。
配列番号:12は、配列番号:11でコードされた推定アミノ酸配列である。
配列番号:13-16は、単離されている22P8 cDNA及び関連配列において有用なプライマーである。
配列番号:17-20は、単離されている10B21 cDNA及び関連配列において有用なプライマーである。
配列番号: 21-22は、単離されている2D14 cDNA及び関連配列において有用なプライマーである。
配列番号: 23-26は、単離されている4H19 cDNA及び関連配列において有用なプライマーである。
配列番号:27は、本発明において有用なアダプタープライマーである。
配列番号:28は、22P8プロモーター及び関連配列の単離において有用なプライマーである。
配列番号:29-30は、10B21プロモーター及び関連配列の単離において有用なプライマーである。
配列番号:31-32は、2D14プロモーター及び関連配列の単離において有用なプライマーである。
配列番号:33-34は、4H19プロモーター及び関連配列の単離において有用なプライマーである。
配列番号:35は、本発明において有用なアダプタープライマーである。
配列番号:36は、22P8GSP7フォワードプライマーである。
配列番号:37は、5'側λアームプライマーである。
配列番号:38は、3'側λアームプライマーである。
配列番号:39-40は、MRS1Lプロモーターの増幅に有用なプライマーである。
配列番号:41-42は、MRS1Lプロモーターにatt部位を追加するのに有用なプライマーである。
配列番号:43-44は、本発明のプロモーターの5'及び3'末端にattB1及びattB2部位を追加するのに有用なプライマーである。
配列番号:45は、MRS1Sプロモーターを増幅するのに有用なプライマーである。
配列番号:46は、MRS1Sプロモーターにatt部位を追加するのに有用なプライマーである。
配列番号:47-50は、MRS2Sプロモーターを増幅するのに有用なプライマーである。
配列番号:51-52は、MRS2Sプロモーターにatt部位を追加するのに有用なプライマーである。
配列番号:53-54は、MRS3Sプロモーターを増幅するのに有用なプライマーである。
配列番号:55-56は、MRS3Sプロモーターにatt部位を追加するのに有用なプライマーである。
配列番号: 57-59は、MRS4Sプロモーターを増幅するのに有用なプライマーである。
配列番号:60-61は、MRS4Sプロモーターにatt部位を追加するのに有用なプライマーである。
配列番号:62-63は、本発明のバイナリーデスティネーションベクターを構築するのに有用なプライマーである。
配列番号:64-67は、MRS2M及びMRS2Sプロモーターを単離するのに有用なプライマーである。
【００１９】
定義
「アンチセンス阻害」は、内因性遺伝子又は導入遺伝子からのタンパク質発現の抑制が可能であるアンチセンスRNA転写産物の作出を意味する。
【００２０】
「キメラの」は、ベクター又は遺伝子のようなDNA配列が、天然には生じないDNA配列を結果的に生じるように組換えDNA技術により互いに融合された、個別の起源の2種又はそれよりも多いDNA配列で構成されることを示すために使用される。
【００２１】
「染色体に組込まれた」は、外来遺伝子又はDNAコンストラクトの、共有結合による宿主DNAへの組込みを意味する。遺伝子が「染色体に組込まれ」ない場合は、これらは「一過性に発現」される。遺伝子の一過性発現は、例えば、自律複製プラスミド又は発現カセットの一部として、又はウイルスのような別の生物学的システムの一部としてのいずれかで、宿主染色体に組込まれてはいないが、独立して機能する遺伝子の発現を意味する。
【００２２】
「コード配列」は、特異的アミノ酸配列についてコードしているDNA又はRNA配列を意味し、及び非-コード配列を除外する。これは、「中断されない(uninterrupted)コード配列」、すなわち、例えばcDNAにおいてイントロンを欠いているものを構成することができ、もしくは適当なスプライス接合点により結合された1個又は複数のイントロンを含むことができる。「イントロン」は、一次転写産物には含まれるが、タンパク質へ翻訳され得る成熟mRNAを作成するために、細胞内RNAの切断及び再ライゲーションにより除去されるRNA配列である。
【００２３】
「構成的プロモーター」は、植物の全て又はほぼ全ての発生段階において、植物組織の全て又はほぼ全てにおいて制御する遺伝子を発現し、これにより遺伝子の「構成的発現を」生じることができるプロモーターを意味する。
【００２４】
「同時-抑制」及び「センス抑制」は、同一又は実質的に同一である導入遺伝子又は内因性遺伝子の発現を抑制することが可能であるセンスRNA転写産物の作成を意味する(米国特許第5,231,020号)。
【００２５】
本明細書において使用される「隣接」は、互いに直ぐ前又は後ろにある核酸配列を意味する。
【００２６】
本明細書において使用される「コーンルートワーム」又は「コーンルートワーム類」は、幼虫又は成虫のいずれかの段階、好ましくは幼虫段階の、Diabrotica属の昆虫で、サザンコーンルートワーム、ノーザンコーンルートワーム、ウェスタンコーンルートワーム、及びメキシカンコーンルートワームを含むものを意味する。本発明の根-特異的プロモーターを使用し、トランスジェニック植物の根においてコーンルートワーム毒素を発現し、これによりコーンルートワーム被害からトランスジェニック植物圃場を保護する。用語「コーンルートワーム」及びDiabroticaは、本明細書において互換的に使用される。
【００２７】
「発現」は、mRNAの転写及び安定した蓄積を意味する。発現は、タンパク質の生成も意味することがある。
【００２８】
本明細書において使用される「発現カセット」は、終結シグナルに作用可能に連結された注目のヌクレオチド配列に作用可能に連結されたプロモーターを含む、適当な宿主細胞において特定のヌクレオチド配列の発現を指示することが可能であるDNA配列を意味する。これは典型的には、ヌクレオチド配列の適切な翻訳に必要な配列も含む。通常コード領域は、センス又はアンチセンス方向に、注目のタンパク質をコードしているが、例えば、アンチセンスRNA又は非翻訳RNAのような注目の機能性RNAもコードすることができる。注目のヌクレオチド配列を含む発現カセットは、キメラであることもでき、これはその構成要素の少なくとも1種が、それの他の構成要素の少なくとも1種に関して異種であることを意味する。
【００２９】
プロモーター(エンハンサーを伴う又は伴わない)の「発現パターン」は、植物のどこにおいて及び発生のどの段階において、プロモーターが転写を開始するかを示す発現レベルのパターンである。プロモーターセットの発現パターンは、一方のプロモーターの発現パターンが、他方のプロモーターの発現パターンとほとんど重複を示さない場合に相補的と称されている。
【００３０】
「遺伝子」は、調節配列を含む、mRNA、機能的RNA、又は特異的タンパク質を発現する核酸断片を意味する。用語「天然の遺伝子」は、自然界で見られるような遺伝子を意味する。用語「キメラ遺伝子」は、1)自然界で一緒には見られない、調節配列及びコード配列を含む、DNA配列、又は2)天然には相接されないタンパク質の一部をコードしている配列、又は3)天然には相接されないプロモーターの一部を含む、いずれかの遺伝子を意味する。従ってキメラ遺伝子は、異なる給源に由来した調節配列及びコード配列を含むか、又は同じ給源に由来しているが天然に認められるものとは異なる方法で配置されている調節配列及びコード配列を含むことができる。「導入遺伝子」は、形質転換によりゲノムに導入され、及び安定して維持されている遺伝子を意味する。導入遺伝子は、例えば、形質転換される特定の植物の遺伝子に対し異種又は相同のいずれかである遺伝子を含む。加えて導入遺伝子は、天然ではない生物に挿入された天然の遺伝子、又はキメラ遺伝子を含むことができる。用語「内因性遺伝子」は、生物のゲノム内のその天然の位置において天然の遺伝子を意味する。「外来」遺伝子は、宿主生物において通常は認められないが、遺伝子導入によりその生物に導入される遺伝子を意味する。
【００３１】
「遺伝子サイレンシング」は、ウイルス遺伝子、導入遺伝子、又は内因性核遺伝子の相同性に依存した抑制を意味する。遺伝子サイレンシングは、抑制が影響された遺伝子の減少した転写に起因する場合には転写性であり、もしくは抑制が影響を受けた遺伝子に相同のRNA種の増大した代謝回転(分解)に起因した場合には、転写後であることができる(Englishら、Plant Cell、8:179-1881 (1996))。遺伝子サイレンシングは、ウイルスが誘導した遺伝子サイレンシングを含む(Ruizら、Plant Cell、10:937-946 (1998))。
【００３２】
「遺伝的に安定」及び「遺伝性の」とは、植物において安定して維持され及び連続する世代を通じ後代により安定して遺伝性である染色体に組込まれた遺伝的エレメントを意味する。
【００３３】
「異種DNA配列」は、天然のDNA配列の非天然の複数のコピーを含む、それが導入される宿主細胞と天然には会合していない、DNA配列である。
【００３４】
「誘導性プロモーター」は、化学物質、光、ホルモン、ストレス、又は病原体などの外部刺激により、1種又は複数の細胞型において作動することができるようなそのような調節されたプロモーターを意味する。
【００３５】
「殺虫性」は、好ましくはそれらを殺傷することにより、昆虫を防除することが可能である毒性の生物活性として定義される。
【００３６】
「5'側非-コード配列」は、コード配列に対し5'側(上流)に位置したヌクレオチド配列を意味する。これは、開始コドンの上流の完全にプロセッシングされたmRNA内に存在し、及びmRNAへの一次転写産物、mRNA安定性又は翻訳効率に影響を及ぼすことができる(Turnerら、Molecular Biotechnology、3:225 (1995))。
【００３７】
「3'側非-コード配列」は、コード配列の3'側(下流)に位置し、並びにポリアデニル化シグナル配列及びmRNAプロセッシングもしくは遺伝子発現に影響を及ぼすことが可能である調節シグナルをコードしている他の配列を含むヌクレオチド配列を意味する。ポリアデニル化シグナルは通常、ポリアデニル酸尾部(tract)のmRNA前駆体の3'末端への付加に影響を及ぼすことにより特徴付けられる。異なる3'側非コード配列の使用は、Ingelbrechtらの論文(Plant Cell、1:671-680 (1989))により例証されている。
【００３８】
用語「核酸」は、糖、リン酸及びプリン又はピリミジンのいずれかである塩基を含むモノマー(ヌクレオチド)で構成された、一本鎖又は二本鎖であることができる、高分子量のポリヌクレオチドを意味する。「核酸断片」は、所定の核酸分子の画分である。より高等な植物において、デオキシリボ核酸(DNA)が遺伝物質であるのに対し、リボ核酸(RNA)はDNAに含まれた情報のタンパク質への伝達に関連している。「ゲノム」は、生物の各細胞に含まれた遺伝物質全体である。用語「ヌクレオチド配列」は、任意にDNA又はRNAポリマーに組込まれることが可能である合成、非天然又は変更されたヌクレオチド塩基を含む、一本鎖又は二本鎖であることができる、DNA又はRNAポリマーを意味する。
【００３９】
用語「オープンリーディングフレーム」又は「ORF」は、コード配列の翻訳開始コドンと停止コドンの間にコードされたアミノ酸配列を意味する。用語「開始コドン」及び「停止コドン」は、各々、タンパク質合成(mRNA翻訳)における開始及び連鎖終結を特定するコード配列における3個の隣接ヌクレオチドの単位(「コドン」)を意味する。
【００４０】
「作用可能に連結された」又は「作用可能なように連結された」は、一方の機能が他方により影響をうけるような、単独の核酸断片上の核酸配列の会合を意味する。例えばプロモーターは、そのコード配列又は機能性RNAの発現に影響を及ぼすことが可能である(すなわち、コード配列又は機能性RNAが、そのプロモーターの転写制御下にある)場合に、コード配列又は機能性RNAへ作用可能に連結されている。センス又はアンチセンス方向のコード配列は、調節配列に作用可能に連結されることができる。
【００４１】
「過剰発現」は、通常の又は形質転換されていない生物における発現レベルを超えるトランスジェニック生物における発現レベルを意味する。
【００４２】
「植物組織」は、限定しないが、根、茎、苗条、葉、花粉、種子、腫瘍組織及び細胞の様々な形、並びに単独細胞、プロトプラスト、胚、及びカルス組織などの培養物を含む、分化した又は未分化の組織又は植物を含む。植物組織は、植物内であるか、又は器官、組織、もしくは細胞培養物内であることができる。
【００４３】
「好ましい発現」は、1種又は数種の植物組織内に(空間的制限)及び／又は1種又は数種の植物の発生段階に(時間的制限)、より高いレベルで発現されることが好ましい一方、他の組織／発生段階において、比較的低レベルの発現である遺伝子産物の発現である。
【００４４】
「一次形質転換体」及び「T0世代」は、最初に形質転換された組織と同じ遺伝世代である(すなわち、形質転換による、減数分裂及び受精を通して進行していない)トランスジェニック植物を意味する。「二次形質転換体」及び「T1、T2、T3などの世代」は、1回又は複数回の減数分裂及び受精のサイクルを通じた、一次形質転換体に由来したトランスジェニック植物を意味する。これらは、一次又は二次形質転換体の自家受粉、もしくは一次又は二次形質転換体の他の形質転換された又は形質転換されない植物との交配に由来することができる。
【００４５】
用語「タンパク質」、「ペプチド」、及び「ポリペプチド」は、本明細書において互換的に使用される。
【００４６】
「プロモーター」は、RNAポリメラーゼ及び適切な転写に必要な他の因子の認識を提供することにより、コード配列の発現を制御するような、そのコード配列に対し通常上流(5'側)の、ヌクレオチド配列を意味する。「プロモーター調節配列」は、近位及びより遠位の上流エレメントからなり、後者のエレメントは、エンハンサーと称されることが多い。従って、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激することができるDNA配列であり、並びにプロモーターの生得的なエレメント又はプロモーターのレベルもしくは組織特異性を増大するために挿入された異種エレメントであることができる。両方向(通常又は反転)に作動することが可能であり、並びにプロモーターから上流又は下流のいずれかに移動した場合であっても機能することが可能である。プロモーターは、その全体が天然の遺伝子に由来することができ、又は自然界で見られる異なるプロモーターに由来した異なるエレメントで構成されるか、もしくは合成DNAセグメントで構成されることさえできる。「最小又はコアプロモーター」は、TATAボックス及び／又はイニシエーターのような、転写開始に必要な全ての基礎的エレメントのみからなるプロモーターである。
【００４７】
本明細書において使用される「参照配列」は、配列比較のための基礎として使用される配列として定義される。参照配列は、特定の配列のサブセット又は全体であることができ；例えば、完全長cDNAもしくは遺伝子配列の断片、又は完全長cDNAもしくは遺伝子配列である。
【００４８】
「調節されたプロモーター」は、構成的ではなく、時間的及び／又は空間的に調節された方法で、遺伝子発現を指示するプロモーターを意味し、並びに組織-特異性及び誘導性の両プロモーターを含む。これは天然及び合成の配列に加え、合成及び天然の配列の組合せであることができる配列も含む。様々なプロモーターが、様々な組織又は細胞型において、もしくは異なる発生段階において、又は異なる環境条件に反応して、遺伝子の発現を指示することができる。
【００４９】
「調節配列」及び「適当な調節配列」は、各々、コード配列の上流(5'側非-コード配列)、内側、又は下流(3'側非-コード配列)に位置したヌクレオチド配列を意味し、これは転写、RNAプロセシングもしくは安定性、又は会合したコード配列の翻訳に影響を及ぼす。調節配列は、エンハンサー、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、及びポリアデニル化シグナル配列を含む。これらは、天然及び合成の配列に加え、合成及び天然の配列の組合せであることができる配列である。
【００５０】
用語「RNA転写産物」は、DNA配列のRNAポリメラーゼが触媒した転写から生じる産物を意味する。RNA転写産物が、そのDNA配列の完全に相補的なコピーである場合、これは一次転写産物と称されるか、もしくは一次転写産物の転写後プロセシングに由来したRNA配列であることができ、これは成熟RNAと称される。「メッセンジャーRNA」(mRNA)は、イントロンを伴わず及び細胞によりタンパク質に翻訳され得るRNAを意味する。「cDNA」は、mRNAに相補的又はこれに由来した一本鎖又は二本鎖DNAを意味する。「機能性RNA」は、アンチセンスRNA、リボザイム、又は翻訳されない(しかしRNAとして反応又はプロセスには参加する)他のRNAを意味する。
【００５１】
「選択マーカー遺伝子」は、それの植物細胞における発現がその細胞に選択上の利点をもたらすような遺伝子を意味する。選択マーカー遺伝子により形質転換された細胞が有する選択上の利点は、形質転換されない細胞の成長の能力と比べ、抗生物質又は除草剤のような、負の選択物質の存在下でのそれらの成長する能力に起因することができる。形質転換された細胞が有する選択上の利点は、形質転換されない細胞と比べ、栄養素、増殖因子又はエネルギー給源のような追加の化合物を利用する能力の増強に起因することもある。形質転換された細胞が有する選択上の利点は、いわゆる「負の選択」において予め有する遺伝子の喪失に起因することもある。すなわち、親細胞(典型的には導入遺伝子)においては存在する特異的遺伝子(負の選択マーカー遺伝子)を喪失しなかった細胞にのみ毒性のある化合物が添加される。
【００５２】
「特異的発現」は、1種又は数種の植物組織(空間的制限)及び／又は1種又は数種の植物発生段階(時間的制限)に限定される遺伝子産物の発現である。
【００５３】
実質的に同一：ふたつの核酸又はタンパク質配列の状況において、語句「実質的に同一」は、以下の配列比較アルゴリズムのひとつを用い又は目視による検査により測定されるような、最大の一致に関して比較し及び並置する場合に、少なくとも60％、好ましくは80％、より好ましくは90、更により好ましくは95％、及び最も好ましくは少なくとも99％のヌクレオチド又はアミノ酸残基の同一性を有する、2種又はそれよりも多い配列又は部分配列を意味する。好ましくは、実質的同一性は、少なくとも約50残基長である配列の領域にわたり、より好ましくは少なくとも約100残基の領域にわたり、最も好ましくはこの配列は、少なくとも約150残基にわたり実質的に同一である。特に好ましい態様において、これらの配列は、コード領域の全長にわたり実質的に同一である。更に実質的に同一な核酸又はタンパク質配列は、実質的に同じ機能を発揮する。
【００５４】
配列比較に関して、典型的にはひとつの配列は、被験配列と比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、被験配列及び参照配列は、コンピュータに入力され、必要ならば部分配列座標が指定され、及び配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。その後配列比較アルゴリズムが、指定されたプログラムパラメータを基に、被験配列(複数)に関して参照配列と比較し配列同一性の割合(％)を計算する。当業者は、ポリヌクレオチド配列内にギャップを含むことによる参照配列との高い類似性を避けるために、典型的にはギャップペナルティーを導入し、及びマッチした数から差し引くことを理解している。
【００５５】
比較のための配列の最適アラインメントは、例えば、Smith及びWaterman、Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)のローカルホモロジーアルゴリズム、Needleman及びWunsch、J. Mol. Biol.、48:443 (1970)のホモロジーアラインメントアルゴリズム、Pearson及びLipman、Proc. Natl. Acad. Sci.、85:2444 (1988)の類似性検索法、これらのアルゴリズム(Wisconsin Genetics Software Package内の、GAP、BESTFIT、FASTA、及びTFASTA、Genetics Computer Group、575 Science Dr.、Madison、WI)のコンピュータによる実行、又は目視による検査(一般に、Ausubelら、前掲を参照のこと)により行うことができる。
【００５６】
％配列同一性及び配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの一例は、BLASTアルゴリズムであり、これはAltschulら、J. Mol. Biol.、215:403-410 (1990)に説明されている。BLAST解析を行うためのソフトウェアは、米国生物情報センター(NCBI)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)を通じて、公に入手可能である。このアルゴリズムは最初に、クエリー配列内の長さWの短いワードを同定することにより、高スコアリング配列対(high scoring sequence pairs)(HSP)を同定することが関連しており、これはデータベース配列中の同じ長さのワードと並べた場合に、いくつかの正値閾値スコアTにマッチするか又は満足するかのいずれかである。Tは、隣接ワードスコア閾値と称されている(Altschulら、1990)。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含むより長いHSPを発見するための検索を開始するための種として作用する。次にこのワードヒットは、蓄積アラインメントスコアが増大する限りは、各配列に沿って、両方向に延長される。蓄積スコアは、ヌクレオチド配列に関して、パラメータM(マッチする残基対に関するリワードスコア；常に＞0)及びN(マッチしない残基に関するペナルティスコア；常に＜0)を用いて計算される。アミノ酸配列に関して、スコアリング・マトリックスを用い蓄積スコアを計算する。各方向のワードヒットの延長は、蓄積アラインメントスコアがその最大到達値から量Xだけ小さい場合、1個又は複数の負のスコアリング残基アラインメントの蓄積のために蓄積スコアがゼロ以下になった場合、又はいずれかの配列末端に到達した場合に停止される。BLASTアルゴリズムパラメータW、T、及びXは、アラインメントの感度及び速度を決定する。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列について)は、デフォルトとして、ワード長(W)11、期待値(E)10、カットオフ値100、M=5、N=-4、及び両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に関して、BLASTPプログラムは、デフォルトとして、ワード長(W)3、期待値(E)10を、及びBLOSUM62スコアリング・マトリックスを使用する(Henikoff及びHenikoff、Proc. Natl. Acad. Sci.、89:10915 (1989)参照)。
【００５７】
BLASTアルゴリズムは、％配列同一性の計算に加え、ふたつの配列間の類似性の統計解析も行う(例えば、Karlin及びAltschul、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90: 5873-5787 (1993)参照)。BLASTアルゴリズムにより提供された類似性のひとつの測定値は、最小和尤度(P(N))であり、これはふたつのヌクレオチド配列又はアミノ酸配列間のマッチが偶然生じる尤度の指標である。例えば、被験核酸配列は、被験核酸配列の参照核酸配列との比較において最小和尤度が、約0.1未満、より好ましくは約0.01未満、及び最も好ましくは約0.001未満である場合に、参照配列と類似しているとみなされる。
【００５８】
本発明の目的のために、本明細書に明らかにされたプロモーター配列との％配列同一性を決定するためのヌクレオチド配列の比較は、好ましくは、BlastNプログラム(ver1.4.7以降)をそのデフォルトのパラメータで用い、又は同等のプログラムを用いて行われる。「同等のプログラム」は、問題のいずれかふたつの配列について、好ましいプログラムにより作成された対応するアラインメントと比較した場合に、同じヌクレオチド又はアミノ酸残基マッチ並びに同一の％配列同一性を有するアラインメントを作成するような配列比較プログラムが意図されている。
【００５９】
ふたつの核酸配列が実質的に同一である別の指標は、これらふたつの分子が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、互いにハイブリダイズすることである。語句「特異的にハイブリダイズする」とは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でその配列がDNA又はRNAの複雑な混合物(例えば、全細胞下画分)中に存在する場合に、特定のヌクレオチド配列のみへの分子の結合、二重鎖化、又はハイブリダイズすることを意味する。「実質的に結合する」とは、プローブ核酸と標的核酸の間の相補的ハイブリダイゼーションを意味し、並びに標的核酸配列の望ましい検出を達成するために、ハイブリダイゼーション培地のストリンジェンシーを低下することにより順応することができる小さいミスマッチは含んでいる。
【００６０】
サザン及びノーザンハイブリダイゼーションのような核酸ハイブリダイゼーション実験の状況において、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」及び「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列によって決まり、及び異なる環境パラメータの下では異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範囲の指針は、Tijssen、「Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes」(1993)の第I部第2章「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays」、Elsevier社、ニューヨークに記されている。一般に、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、指定されたイオン強度及びpHでの特異的配列のために融解温度(Tm)よりも約5℃低く選択される。典型的には、高ストリンジェンシー条件下で、プローブはその標的部分配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない。
【００６１】
Tmは、標的配列の50％が完全にマッチしたプローブとハイブリダイズする温度(指定されたイオン強度及びpH下で)である。非常に高いストリンジェンシー条件が、特定のプローブについてTmに等しくなるように選択される。サザン又はノーザンブロットにおけるフィルター上の100よりも多くの相補的残基を有する相補的核酸のハイブリダイゼーションに関する、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の例は、1mgヘパリン含有50％ホルムアミドで42℃であり、ハイブリダイゼーションは一晩実行される。非常に高いストリンジェンシー洗浄条件の例は、0.15M NaCl、72℃で、約15分間である。高ストリンジェンシー洗浄条件の例は、0.2x SSC洗浄、65℃で15分間である(SSC緩衝液の説明に関してはSambrook、前掲を参照のこと)。バックグラウンドプローブシグナルを除去するために、高ストリンジェンシー洗浄の前に、低ストリンジェンシー洗浄が行われることが多い。例えば100ヌクレオチドよりも多い二重鎖の中等度のストリンジェンシー洗浄の例は、1x SSC、45℃、15分間である。例えば100ヌクレオチドよりも多い二重鎖の低ストリンジェンシー洗浄の例は、4〜6x SSC、40℃、15分間である。短いプローブ(例えば、約10〜50ヌクレオチド)に関しては、高ストリンジェンシー条件は、典型的には約1.0M未満のNaイオンの塩濃度、典型的にはpH7.0〜8.3で、約0.01〜1.0M Naイオン濃度(又は他の塩)に関連し、及び温度は典型的には低くとも約30℃である。高ストリンジェンシー条件は、ホルムアミドのような脱安定化剤の添加によっても達成することができる。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて無関係のプローブについて観察されたものよりも2倍(又はそれよりも高い)シグナル対ノイズ比は、特異的ハイブリダイゼーションの検出を示している。高ストリンジェンシー条件下では互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードしているタンパク質が実質的に同一である場合には、依然実質的に同一である。これは例えば、核酸コピーが、遺伝暗号によりもたらされた最大コドン縮重を用いて作成される場合に生じる。
【００６２】
低ストリンジェンシー条件は、30〜35％ホルムアミド、1M NaCl、1％SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)の緩衝液による、37℃でのハイブリダイゼーション、並びに1x〜2x SSC (20x SSC＝3.0M NaCl／0.3Mクエン酸三ナトリウム)による、50〜55℃での洗浄を含む。中等度のストリンジェンシー条件の例は、40〜45％ホルムアミド、1.0M NaCl、1％SDS、37℃でのハイブリダイゼーション、及び0.5x〜1x SSC中での55〜60℃での洗浄を含む。高ストリンジェンシー条件の例は、0％ホルムアミド、1M NaCl、1％SDS、37℃でのハイブリダイゼーション、及び0.1x SSC、60〜65℃での洗浄を含む。
【００６３】
以下は、本発明の参照ヌクレオチド配列と実質的に同一である相同ヌクレオチド配列をクローニングするために使用することができる、ハイブリダイゼーション／洗浄条件のセットの例である：参照ヌクレオチド配列は、好ましくは参照ヌクレオチド配列に、7％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中、50℃でハイブリダイズされ、2x SSC、0.1％SDS、50℃で洗浄され；より望ましくは、7％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中、50℃でハイブリダイズされ、1x SSC、0.1％SDS、50℃で洗浄され；更により望ましくは7％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中、50℃でハイブリダイズされ、0.5x SSC、0.1％SDS、50℃で洗浄され；好ましくは、7％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中、50℃でハイブリダイズされ、0.1x SSC、0.1％SDS、50℃で洗浄され；更に好ましくは、7％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中、50℃でハイブリダイズされ、0.1x SSC、0.1％SDS、65℃で洗浄される。
【００６４】
特異性は、典型的にはハイブリダイゼーション後の洗浄の機能であり、重要な因子は、最終洗浄液のイオン強度及び温度である。DNA-DNAのハイブリダイズに関して、Tmは、Meinkoth−Wahl式から最適化される(Anal. Biochem.、138:267-284 (1984))；TM 81.5℃＋16.6 (logM)＋0.41(％GC)−0.61(％ホルム)−500/L；ここで、Mは一価カチオンのモル濃度であり、％GCは、DNA中のグアノシン及びシトシンヌクレオチドの割合であり、％ホルムは、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの％であり、及びLは、塩基対におけるハイブリッドの長さである。TMは、相補的標的配列の50％が、完全にマッチしたプローブとハイブリダイズする温度(指定されたイオン強度及びpH下)である。各1％のミスマッチにより、Tは約1℃下がる；従って、Tm、ハイブリダイゼーション条件、及び／又は洗浄条件は、望ましい同一性の配列とハイブリダイズするように調節することができる。例えば、＞90％の同一性を有する配列が求められる場合、Tmは10℃低下することができる。一般に高ストリンジェンシー条件は、指定されたイオン強度及びpHで、特異的配列及びその相補体の融解温度(Tm)よりも約19℃低いように選択される。しかし非常に高いストリンジェンシー条件を、融解温度(Tm)よりも1、2、3又は4℃低い、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄に利用することができ；中等度のストリンジェンシー条件は、融解温度(Tm)よりも6、7、8、9又は10℃低い、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を利用することができ；低ストリンジェンシー条件は、融解温度(Tm)よりも11、12、13、14、15、又は20℃低い、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を利用することができる。この式、ハイブリダイゼーション及び洗浄組成物、並びに望ましいTを用い、当業者は、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄溶液のストリンジェンシーの変動は固有に説明されることを理解するであろう。望ましい程度のミスマッチが45℃(水溶液)又は32℃(ホルムアミド溶液)未満のTを生じるならば、SSC濃度を増加し、より高い温度を使用することができるようにすることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範な指針は、Tijssen、「Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes」(1993)の第I部第2章、Elsevier社、ニューヨーク；並びに、Ausubelら編集、「Current Protocols in Molecular Biology」、(1995)、第2章(Greens Publishing and Wiley Interscience社、ニューヨーク)に記されている。Sambrookら、「Molecular Cloning: A Laborator Manual」(1989)(第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press社, Plainview, NY)を参照のこと。
【００６５】
ふたつの核酸配列又はタンパク質が実質的に同一であることの更なる同定は、第一の核酸によりコードされたタンパク質が、第二の核酸によりコードされたタンパク質と免疫学的に交差反応性であるか、又はこれと特異的に結合することである。従ってタンパク質は、例えば、これらふたつのタンパク質が保存的置換によってのみ異なる場合には、典型的には第二のタンパク質と実質的に同一である。
【００６６】
「組織-特異的プロモーター」は、全ての植物細胞において発現されないが、特定の器官(例えば葉、根又は種子)、特定の組織(例えば胚又は子葉)、又は特定の細胞型(例えば葉の柔細胞(parenchyma)又は種子貯蔵細胞)の1種又は複数の細胞においてのみ発現されるように調節されたプロモーターを意味する。これらは、初期又は後期胚形成中、種子もしくは果実の発生時の果実熟成期間、又は完全に分化した葉、もしくは老化開始時などに、時間的に調節されたプロモーターも含む。
【００６７】
「トランス活性化遺伝子」は、トランス活性化タンパク質をコードしている遺伝子を意味する。これは転写因子をコードしていることがある。これは例えば、植物の調節配列が他の生物由来の転写因子のオープンリーディングフレームに作用可能に連結された場合の、天然の遺伝子、例えば、植物転写アクチベーター、又はキメラ遺伝子であることができる。「トランス活性化遺伝子」は、染色体に組込まれても、又は一過性に発現されてもよい。「トランス活性化」は、トランスの状態の別の(調節)遺伝子の発現による遺伝子の交換を意味する。
【００６８】
「転写カセット」は、転写の5'-3'方向に、植物において機能する転写及び翻訳開始領域、注目のDNA配列、並びに転写及び翻訳停止領域を含むであろう。停止領域は、転写開始領域と共に固有(native)であり、注目のDNA配列と共に固有であることができ、又は他の給源に由来することができる。
【００６９】
「転写開始部位」は、転写された配列の一部である最初のヌクレオチドの周囲の位置であり、これは位置+1とも定義される。この部位に関して、その遺伝子の他の配列全て及びその制御領域に番号が付けられる。下流の配列(すなわち、更なる3'方向のタンパク質コード配列)は、正値で呼称され、他方上流配列(5'方向の制御領域のほとんど)は負値で呼称される。
【００７０】
用語「形質転換」は、核酸断片の宿主細胞ゲノムへの導入を意味し、これは遺伝的に安定した継承(inheritance)を生じる。「一過性に形質転換された」は、導入遺伝子及び外来DNAが導入されている(例えば、アグロバクテリウム(Agrobacterium)-媒介型形質転換又は遺伝子銃のような方法により)が、安定した維持に関して選択されない細胞を意味する。「安定して形質転換された」は、形質転換後選択培地上で選択され及び再生された細胞を意味する。
【００７１】
「形質転換された／トランスジェニック／組換え」は、異種核酸分子が導入されている細菌又は植物のような宿主生物を意味する。核酸分子は、宿主ゲノムに安定して組込むことができるか、もしくは核酸分子は、染色体外分子として存在することもできる。このような染色体外分子は、自律複製することができる。形質転換された細胞、組織、又は植物は、形質転換過程の最終産物のみではなく、それらのトランスジェニック後代も包含することが理解される。「形質転換されない」、「トランスジェニックされない」又は「非組換え」宿主は、野生型生物、例えば異種核酸分子を含まない細菌又は植物を意味する。
【００７２】
「一過性発現」は、ウイルス又は導入遺伝子がウイルス感染により、又はアグロバクテリウム(Agrobacterium)-媒介型形質転換、電気穿孔もしくは遺伝子銃のような方法により導入されているが、その安定した維持について選択されない細胞における発現を意味する。
【００７３】
用語「翻訳リーダー配列」は、プロモーターとRNAに転写されるコード配列の間の遺伝子のDNA配列部分を意味し、及び翻訳開始コドンの上流(5'側)の完全にプロセシングされたmRNA中に存在する。翻訳リーダー配列は、一次転写産物のmRNAへのプロセシング、mRNA安定性又は翻訳効率に影響を及ぼし得る。
【００７４】
「ベクター」は、自己伝達可能又は移動可能であるか又はそうではなく、並びに細胞ゲノムの組込みにより原核又は真核宿主を形質転換するかもしくは染色体外に存在する(例えば、複製起点を伴う自律複製プラスミド)ことができる、二本鎖又は一本鎖の線状又は環状の形である、特に、あらゆるプラスミド、コスミド、ファージ又はアグロバクテリウム(Agrobacterium)バイナリーベクターを含むように定義される。具体的には、天然に又はデザインにより、2種の異なる宿主生物における複製が可能であるDNAビヒクルを意味するシャトルベクターを含み、これは放線菌及び関連種、細菌及び真核生物(例えばより高等な植物、哺乳類、酵母又は真菌細胞)により選択されるものが含まれる。
【００７５】
「可視マーカー」は、その発現が、形質転換された細胞に利点を付与することはないが、検出可能又は可視可能とすることができる遺伝子を意味する。可視マーカーの例は、β-グルクロニダーゼ(GUS)、ルシフェラーゼ(LUC)及び緑色蛍光タンパク質(GFP)を含むが、これらに限定されるものではない。
【００７６】
「野生型」は、既知の突然変異を伴わずに天然に認められる通常の遺伝子、ウイルス又は生物を意味する。
【００７７】
発明の詳細な説明
根-特異的遺伝子、プロモーター及び相同体の同定
多くの場合において、植物根組織のみにおいて発現されるように、導入遺伝子の発現を空間的に調節することが望ましい。特異的又は優先的方法で発現を指示することが可能なプロモーターは、この空間的調節を最も手早く達成することができる。
【００７８】
本発明は、植物における根-特異的転写を指示するヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子を提供する。根-特異的プロモーターは、標的植物の根組織において特異的に発現された遺伝子を同定し、引き続きこれらの遺伝子の調節配列を単離することにより、単離される。下記実施例において更に説明されるひとつの方法において、PCR-サブトラクション法が使用される。メッセンジャーRNA(mRNA)は、トウモロコシ根-組織に加え、トウモロコシ非-根組織、例えば葉、茎、及び生殖組織などの組合せから単離される。相補的DNA(cDNA)は、各mRNA集団から作成され、引き続き各cDNA集団は、制限酵素により消化される。短いDNA配列であるアダプタープライマーは、根-特異的cDNAの5'及び3'末端にライゲーションされる。次に根-特異的及び非-根cDNA断片集団はハイブリダイズされ、及びPCRを使用し、非-根cDNA集団には存在せず、その結果非-根cDNA断片集団とはハイブリダイズしないような根-特異的cDNA断片を選択的に増幅する。増幅されたcDNA断片は、根-特異的遺伝子の断片を表わしている。この方法を用い、根-特異的断片が得られる。これらの遺伝子の比較的長い配列である、完全長又はほぼ完全長のcDNAクローンは、PCR技術又はハイブリダイゼーションにより得ることができる。RACE(rapid amplification of cDNA ends)のような当該技術分野において公知の技術を用い、遺伝子-特異的プライマーを、各根-特異的断片の既知の配列の5'領域に作成し、そしてPCRが、ライブラリーの各cDNAの5'末端が短いヌクレオチドアダプター配列に連結されている根-特異的cDNAライブラリーについて行われる。PCRを用い、遺伝子-特異的プライマーとアダプター配列の間の領域を増幅する。本明細書において配列番号:5、7、9及び11に例示された根-特異的cDNAクローンは、一般にこの技術を用いて得られる。
【００７９】
プロモーター配列は、根-特異的cDNA配列に相同であるゲノム配列のクローニングにより得られる。ゲノム配列は、ハイブリダイゼーション法又は既知配列から5'又は3'のいずれかの方向に配列を延長するPCR法(「ゲノムウォーキング」と称されることもある)の使用により得ることができる。例えば、cDNAの既知の配列に対し5'側のゲノム配列を得るためには、プライマーは、cDNAの5'末端の近傍の配列に対し作成される。ゲノムライブラリーは、短いオリゴヌクレオチドアダプターにライゲーションされた各ゲノムDNA配列の5'末端を用いて構築される。アダプター配列にハイブリダイズするプライマー及び根-特異的cDNA配列の5'プライマーによるPCRは、根-特異的配列の相同配列の 5'側に存在するゲノム配列の増幅を可能にする。ゲノムウォーキングにより得られたDNA配列は、配列決定され、及び追加の5'領域が望ましいならば、このプロセスが、今度は、最長の得られたクローンの5'末端で、プライマーにより繰り返される。根-特異的cDNA配列に相同なゲノム配列は、高ストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションにより得ることもできる。高ストリンジェンシー条件は、根-特異的cDNA配列から作成されたプローブのハイブリダイゼーションを選択し、ゲノムDNA中のその相同配列にハイブリダイズする。このゲノムDNAは、λファージベクター中の5〜20kbトウモロコシゲノムDNA配列のゲノムDNAライブラリーに含まれる。根-特異的cDNAにハイブリダイズするゲノムクローンは、単離され及び配列決定される。
【００８０】
ゲノムクローンは、mRNA又はcDNAクローンにおいては認められないイントロン配列を含むことができる。ゲノム配列は、追加的に、5'側非翻訳配列、3'側非翻訳配列、並びに5'及び3'側調節配列も含むことができる。プロモーター配列は、cDNA配列に対し、5'側のゲノム配列内に認められる。根-特異的cDNA配列と相同であるゲノム配列が、クローニングされる。cDNA配列に相同な配列の5'側である配列は、本明細書においてプロモーター領域を含む5'側フランキング領域と称される。
【００８１】
プロモーター及び他の調節配列は、ゲノム配列の相同な根-特異的cDNA配列との比較により、更にはTATAボックス及び公知の植物転写因子の結合部位のようなその他の調節エレメントを配置する配列ホモロジー比較を用い、マッピングされる(Guifoyle, TJ、Genetic Engineering、19:15-47 (1997)；Meisel及びLam、Genetic Engineering、19:183-199 (1997))。本明細書において例証されるプロモーターは、配列番号:1-4に示されている。
【００８２】
本発明のひとつの態様において、根-発現に必要な配列、更には発現の全般的レベルに影響を及ぼすそれらの調節配列を更に描写するために、根-特異的プロモーター領域の欠失を作成する。欠失は、各根-特異的クローンの5'側フランキング領域に作出される。ほとんどのプロモーターにおいて、5'側フランキング配列の500〜1000塩基対(bp)は、組織-特異的活性を含むプロモーター活性にとって十分である。5'側フランキング領域の欠失は、およそ50bp、100bp、250bp、500bp、750bp及び1000bp又はそれよりも多くがプロモーター領域において生じることができる。これらのプロモーター欠失配列は、2倍の目的を果たす。これらの欠失は、各根-特異的ゲノムクローンの5'側フランキング配列内の調節配列の更なるマッピングを可能にする。加えてこれらの欠失は、それらの発現レベル及び発現パターンを変動し、その結果適当な遺伝子調節のためのプロモーター配列選択における追加の柔軟性を提供するプロモーター配列及び調節配列の道具箱を提供する。MRS1(配列番号:1)と称されるプロモーター及びMRS2(配列番号:2)と称されるプロモーターの完全に機能性のより短い断片が、本明細書において例証されている。MRS1の完全に機能性のより短い断片は、配列番号:1のヌクレオチド603-1392を含み、及びMRS1Sと称される。MRS2のひとつの完全に機能性のより短い断片は、配列番号:2のヌクレオチド921-2869を含み、及びMRS2-Mと称される。別のMRS2の完全に機能性のより短い断片は、配列番号:2のヌクレオチド1913-2869を含み、MRS2-Sと称される。
【００８３】
当業者には、当該技術分野において公知の方法を用い、1個又は複数のヌクレオチドの変異、挿入、欠失及び／又は置換を、配列番号:1-4のヌクレオチド配列に導入することができることも明らかである。加えて、本発明の配列をシャッフルすることは、新規及び変動したヌクレオチド配列を提供することができる。
【００８４】
配列番号:1-4の欠失断片のような、本発明の変種DNA配列の機能を試験するために、注目の配列が、選択又は可視マーカー遺伝子に作用可能に連結され、並びにこのマーカー遺伝子の発現が、単離された根組織又は細胞による一過性発現アッセイにおいて、又は植物への安定した形質転換により、試験される。当業者は、会合したコード配列の発現を駆動することが可能であるDNA配列は、モジュラー法(modular way)で作出されることを知っている。従って、より短いDNA断片からの発現レベルは、最長断片からのものとは異なることがあり、そして互いに異なることがある。例えば、ダウン-レギュレーションする上流エレメントの欠失は、会合したコード配列の発現レベルの増加につながるのに対し、アップ-レギュレーションするエレメントの欠失は、会合したコード配列の発現レベルの減少につながるであろう。当業者は、発生-特異的又は組織-特異的エレメントの欠失は、会合したコード配列の発現プロファイルの時間的及び空間的変更につながることも知っている。
【００８５】
別の本発明の態様において、配列番号:1-4又は配列番号:5、7、9及び11に相同なDNA及びゲノムDNA配列は、当該技術分野において周知のハイブリダイゼーション又はPCR技術のいずれかを用い、他のトウモロコシの生殖質から単離することができる。この単離された配列は、配列番号:1-4又は配列番号:5、7、9及び11と同一であることができ、もしくはこれらは、配列番号:1-4又は配列番号:5、7、9及び11と実質的に同一であることができる。他のトウモロコシ生殖質から得られた配列が、本明細書に明らかにされた配列と機能的に同一であるように同じヌクレオチド配列を含む必要はない。一部のヌクレオチド欠失、付加、及び交換は、遺伝子発現に対し、影響を有さないか又はわずかな影響のみを有する。本発明の好ましい単離された核酸分子は、配列番号:1-4に示されたヌクレオチド配列のいずれかひとつと少なくとも70％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。より好ましい単離された核酸分子は、配列番号:1-4に示されたヌクレオチド配列のいずれかひとつと少なくとも80％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。更により好ましい単離された核酸分子は、配列番号:1-4に示されたヌクレオチド配列のいずれかひとつと少なくとも90％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。なお更に好ましい単離された核酸分子は、配列番号:1-4に示されたヌクレオチド配列のいずれかひとつと少なくとも95％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。また更に好ましい単離された核酸分子は、配列番号:1-4に示されたヌクレオチド配列のいずれかひとつと少なくとも99％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。最も好ましい単離された核酸分子は、配列番号:1-4に示されたヌクレオチド配列のいずれかひとつを含む。
【００８６】
別の本発明の態様において、cDNA及びゲノムDNA配列は、根-特異的トウモロコシ遺伝子及びプロモーターの相同体を表わしている他の植物からクローニングすることができる。これらの相同体は、根における複数の遺伝子の調節に有用な追加の根-特異的プロモーターを得ることができるものである。トウモロコシcDNA及びゲノム配列又はその一部を使用するハイブリダイゼーションは、他の植物ゲノム中の相同な及び実質的に同一な配列のスクリーニングに使用する。これらの配列は、配列番号:1-4のヌクレオチドのサブセットのみを含むことができる。相同性の好ましい長さは、20塩基対(bp)長であり、より好ましくは50bp長、及び最も好ましくは少なくとも100bp長である。本発明のひとつの態様において、ハイブリダイゼーションプローブは、配列番号:1-4もしくはそれらの一部又は配列番号:5、7、9又は11もしくはそれらの一部のいずれかひとつから調製される。このような配列のハイブリダイゼーションは、高ストリンジェンシー条件下で実行することができる。あるいは、低又は中等度のストリンジェンシー条件を用い、配列中にいくつかのミスマッチを生じ、その結果低い程度の類似性を検出することができる(異種プロービング)。一般に、プローブは、約1000ヌクレオチド長未満であり、好ましくは500ヌクレオチド長未満である。
【００８７】
本発明の別の態様において、cDNA及びゲノム配列は、配列番号:1-4のいずれかひとつの配列を含む又は配列番号:5、7、9又は11からのプライマー配列を含むプライマーの調製により、単離される。これらのプライマーは、配列番号:1-4のいずれかひとつと相同配列又は実質的に同じ配列を得るために、植物からのcDNA又はゲノムDNAとのPCR反応において使用することができる。
【００８８】
発現カセットの構築
根-特異的ゲノムクローンの5'側フランキング配列を含む発現カセットが、構築される。ひとつの本発明の態様において、各発現カセットにおいて利用されるプロモーター領域は、翻訳開始部位を含む部位まで5'側フランキング領域を含む。翻訳開始部位は、cDNA及び相同ゲノム配列中に認められたオープンリーディングフレーム(ORF)の最初のATGにより示される。従って、プロモーター領域は、5'側非翻訳リーダー配列に加え、転写開始部位、コアプロモーター及び追加の調節エレメントを含むことができる。別の本発明の態様において、転写開始部位を含む部位まで根-特異的ゲノムクローンの5'側フランキング配列を含む発現カセットが、構築される。転写開始部位は、得られた最長cDNAクローンの最初のヌクレオチドにより定義することができる。加えて、転写開始部位は更に、RACE PCR、RNase保護マッピング及びプライマー伸長分析を含む、当該技術分野において周知の技術を用い、定義することができる。
【００８９】
更に発現カセットは、プロモーターの下流(3'側)に転写ターミネーターを含むことができる。発現カセットにおいて使用するための様々な転写ターミネーターが、利用可能である。転写ターミネーターは、導入遺伝子を超えた転写の終結及びmRNA転写産物のmRNAポリアデニル化の補正に寄与している。適当な転写ターミネーターは、植物における機能が分かっているものであり、CaMV 35Sターミネーター、tmlターミネーター、ノパリンシンターゼターミネーター及びマメrbcS E9ターミネーターを含む。これらは、単子葉植物及び双子葉植物の両方で使用することができる。加えて、遺伝子の未変性の転写ターミネーターを使用することができる。例えば、根-特異的cDNAクローンに相同な領域の3'側にゲノム配列を含む3'側フランキング配列を使用することができる。
【００９０】
本発明の好ましい態様において、異種コード配列、例えば殺虫コード配列、可視マーカーコード配列、又は選択マーカーコード配列などを、本発明のプロモーターと転写ターミネーターの間にクローニングし、これによりこの異種コード配列は、プロモーターに機能可能に連結され、及び転写ターミネーターが異種コード配列に機能可能に連結されている。本発明において有用な可視マーカーの例は、β-グルクロニダーゼ(GUS)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、ルシフェラーゼ(LUC)及び蛍光特性を持つタンパク質、例えばAequora victoria由来の緑色蛍光タンパク質(GFP)を含むが、これらに限定されるものではない。原理的には、タンパク質が本質的植物機能を妨害しない限りは、非常に多くのタンパク質が、この目的に適している。本発明に有用な異種コード配列の更なる例は、抗生物質耐性、ウイルス抵抗性、昆虫抵抗性、疾患抵抗性、又は他の有害生物抵抗性、除草剤耐性、改善された栄養価、工業プロセスにおける改善された性能又は変更された生産能を含むが、これらに限定されるものではない。本発明の好ましい態様において、植物の根を摂食する昆虫に対する抵抗性をコードしている遺伝子は、プロモーターとターミネーターの間にクローニングされる。別の本発明の態様において、アンチセンスRNA、センス抑制に関するセンスRNA、又は二本鎖RNAのような、機能的RNAをコードしている配列は、プロモーターと転写ターミネーターの間にクローニングすることができる。
【００９１】
多くの配列が、転写単位内で遺伝子発現を増強することがわかっており、及びこれらの配列は、トランスジェニック植物においてそれらの発現を増加するために、本発明のプロモーターと一緒に使用することができる。様々なイントロン配列は、特に単子葉植物細胞において、発現を増強することが示されている。例えば、トウモロコシのイントロンAdhI遺伝子は、トウモロコシ細胞に導入された場合に、野生型遺伝子の発現をそのコグネイトプロモーターの下で有意に増強することがわかっている。イントロン1は、特に効果があることが認められ、及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を伴う融合コンストラクト内における発現を増強した(Callisら、Genes Develop.、1:1183-1200 (1987))。同じ実験システムにおいて、トウモロコシ由来のイントロンbronze1遺伝子は、発現の増強において同様の作用を有した。イントロン配列は、植物形質転換ベクターに、典型的には非翻訳リーダー内に日常的に組込まれている。ウイルス由来の多くの非翻訳リーダー配列は、発現を増強し、及びこれらは特に双子葉植物細胞において効果があることもわかっている。具体的には、タバコモザイクウイルス(TMV、"W配列")、Maize Chlorotic Mottle Virus (MCMV)、及びアルファルファモザイクウイルス(AMV)由来のリーダー配列は、発現の増強において効果があることが示されている(例えば、Gallieら、Nucl. Acids Res.、15:8693-8711 (1987)；Skuzeskiら、Plant Molec. Biol.、15:65-79 (1990))。他の当該技術分野において公知のリーダー配列は、ピコナウイルスリーダー、例えば、EMCVリーダー(脳心筋炎ウイルス5'側非コード領域)(Elroy-Stein, O.、Fuerst, T. R.及びMoss, B.、PNAS USA、86:6126-6130 (1989))；ポチウイルスリーダー、例えば、TEVリーダー(Tobacco Etch Virus)(Allisonら、1986)；MDMVリーダー(Maize Dwarf Mosaic Virus) (Virology、154:9-20 (1986))；ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質(BiP)リーダー、(Macejak, D. G.及びSarnow, P.、Nature、353: 90-94 (1991)；アルファルファモザイクウイルスの外殻タンパク質mRNA由来の非翻訳リーダー(AMV RNA 4)(Jobling, S. A.及びGehrke, L.、Nature、325:622-625 (1987)；タバコモザイクウイルスリーダー(TMV)(Gallie, D. R.ら、Molecular Biology of RNA、237-256 (1989))；並びに、Maize Chlorotic Mottle Virusリーダー(MCMV)(Lommel, S. A.ら、Virology、81:382-385 (1991))を含むが、これらに限定されるものではない。同じく、Della-Cioppaらの論文(Plant Physiology、84:965-968 (1987))も参照のこと。
【００９２】
本発明に有用な植物形質転換法
植物の形質転換に利用可能な多くの形質転換ベクターが、植物形質転換の技術分野の業者に公知であり、及び本発明の核酸分子は、このようなベクターと一緒に使用することができる。ベクターの選択は、好ましい形質転換技術及び形質転換のための標的植物種によって決まるであろう。ある標的種に関して、異なる抗生物質及び除草剤選択マーカーが好ましいことがある。形質転換において日常的に使用される選択マーカーは、カナマイシン及び関連抗生物質に対する抵抗性を付与するnptII遺伝子(Messing及びVierra、Gene、19:259-268 (1982)；Bevanら、Nature、304:184-187 (l 983))、除草剤ホスフィノスリシンに対する抵抗性を付与するbar遺伝子(Whiteら、Nucl. Acids Res、18:1062 (1990)、Spencerら、Theor. Appl. Genet、79:625-631 (1990))、抗生物質ヒグロマイシンに対する抵抗性を付与するhph遺伝子(Blochinger及びDiggelmann、Mol Cell Biol、4:2929-2931)、及びメタトレキセートに対する抵抗性を付与するdhfr遺伝子(Bourouisら、EMBO J.、2(7):1099-1104 (1983))、グリホセートに対する抵抗性を付与するEPSPS遺伝子(米国特許第4,940,935号及び第5,188,642号)、並びにマンノース代謝能を提供するマンノース-6-リン酸イソメラーゼ遺伝子(米国特許第5,767,378号及び第5,994,629号)を含む。
【００９３】
アグロバクテリウム(Agrobacterium)形質転換に適したベクター
多くのベクターが、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)を用いる形質転換に利用可能である。典型的には、これらは、少なくとも1種のT-DNAボーダー配列を有し、及びpBIN19などのベクターを含む(Bevan、Nucl. Acids Res.、(1984))。以下に、アグロバクテリウム(Agrobacterium)形質転換に適したふたつの典型的ベクターの構築を説明する。
【００９４】
pCIB200及びpCIB2001；
バイナリーベクターpCIB200及びpCIB2001は、アグロバクテリウム(Agrobacterium)と共に使用するための組換えベクターの構築に使用され、及び以下の方法で構築される。pTJS75kanを、pTJS75のNarI消化により作成し(Schmidhauser及びHelinski、J. Bacteriol.、164:446-455 (1985))、テトラサイクリン-抵抗性遺伝子を切出し、その後NPTIIを有するpUC4KからのAccI断片を挿入した(Messing及びVierra、Gene、19:259-268 (1982)；Bevanら、Nature、304:184-187 (1983)；McBrideら、Plant Molecular Biology、14:266-276 (1990))。XhoIリンカーは、左側及び右側のT-DNAボーダー、植物選択性nos/nptIIキメラ遺伝子及びpUCポリリンカーを含むPCIB7のEcoRV断片に連結し(Rothsteinら、Gene、53:153-161 (1987))、並びにXhoI消化した断片を、SalI消化したpTJS75kanにクローニングし、pCIB200を作成した(欧州特許第0 332 104号、実施例19も参照のこと)。pCIB200は、下記の独自のポリリンカー制限部位を含む；EcoRI、SstI、KpnI、BglII、XbaI、及びSalI。pCIB2001は、追加の制限部位のポリリンカーへの挿入により作成されたpCIB200の誘導体である。pCIB2001のポリリンカーの独自の制限部位は、EcoRI、SstI、KpnI、BglII、XbaI、SalI、MluI、BclI、AvrII、ApaI、HpaI、及びStuIである。pC1B2001は、これらの独自の制限部位を含むことに加え、植物及び細菌のカナマイシン選択、アグロバクテリウム(Agrobacterium)-媒介型形質転換のための左側及び右側のT-DNAボーダー、大腸菌及び他の宿主の間の移動に関するRK2-由来のtrfA機能、並びに同じくRK2由来のOriT及びOriV機能も有す。pCIB2001ポリリンカーは、それら自身の調節シグナルを含む植物発現カセットのクローニングに適している。
【００９５】
pCIB10及びそれらのヒグロマイシン選択性誘導体
バイナリーベクターpCIB10(Rothsteinら、Gene、53:153-161 (1987))は、植物における選択のためのカナマイシン抵抗性をコードしている遺伝子、並びにT-DNA右側及び左側ボーダー配列を含み、並びに大腸菌及びアグロバクテリウム(Agrobacterium)の両方においてその複製を可能にする広範な宿主-範囲のプラスミドpRK252から配列を組込んでいる。ヒグロマイシンBホスホトランスフェラーゼのための遺伝子を組込むpCIB10の様々な誘導体は、Gritzらの論文に説明されている(Gene、25:179-188 (1983))。これらの誘導体は、トランスジェニック植物細胞のヒグロマイシン単独(pCIB743)、又はヒグロマイシン及びカナマイシン(pCIB715, pCIB717)の選択を可能にしている。
【００９６】
非-アグロバクテリウム(Agrobacterium)形質転換に適したベクター
アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)を使用しない形質転換は、選択された形質転換ベクターにおけるT-DNA配列の必要性がなく、その結果これらの配列を欠損しているベクターは、T-DNA配列を含むような先に説明されたものなどのベクターに加えて利用することができる。アグロバクテリウム(Agrobacterium)に頼らない形質転換技術は、微粒子銃、プロトプラスト取込み(例えば、PEG及び電気穿孔)及びマイクロインジェクションを介した形質転換を含む。ベクターの選択は、形質転換される種の好ましい選択により大きく左右される。以下に、典型的な非-アグロバクテリウム(Agrobacterium)形質転換に適したベクターの構築を説明する。
【００９７】
pCIB30G4:
pCIB3064は、除草剤Basta(又はホスフィノスリシン)による選択と組合わせた、直接の遺伝子導入技術に適したpUC-由来のベクターである。プラスミドpCIB246は、大腸菌GUS遺伝子への機能的融合において、CaMV35Sプロモーター及びCaMV35S転写ターミネーターを含み、これはPCT公開された国際公開公報第93/07278号に開示されている。このベクターの35Sプロモーターは、開始部位の5'側にふたつのATG配列を含む。これらの部位は、ATGを除去するような方法により、標準のPCR技術を用い突然変異し、並びに制限部位SspI及びPvuIIが作成される。新たな規制限部位は、独自のSalI部位から96及び37bpであり、並びに実際の開始部位から101及び42bpである。得られたpCIB246誘導体は、消化されたpCIB3025である。次にGUS遺伝子は、SalI及びSacIによる消化により、pCIB3025から切出され、平滑末端とされ、再ライゲーションされ、プラスミドpCIB3060を作成する。プラスミドpJIT82は、John Innes Centre(Norwich)から入手されるが、これからストレプトマイセス・ビリドクロモジュネス(Streptomyces viridochromogenes)由来のbar遺伝子を含む400bp SmaI断片が切出され、pCIB3060のHpaI部位に挿入される(Thompsonら、EMBO J、6:2519-2523 (1987))。このことは、除草剤選択のためにCaMV 35Sプロモーター及びターミネーターの制御下のbar遺伝子、アンピシリン抵抗性遺伝子(大腸菌における選択のため)並びに独自の部位SphI、PstI、HindIII及びBamHIを伴うポリリンカーを含むpCIB3064を作成する。このベクターは、それら自身の調節シグナルを含む植物発現カセットのクローニングに適している。
【００９８】
pSOG19及びpSOG35:
pSOG35は、メトトレキセートに対する抵抗性を付与する選択マーカーとして大腸菌遺伝子ジヒドロ葉酸還元酵素(DFR)を利用する形質転換ベクターである。PCRを用い、35Sプロモーター(-800bp)、トウモロコシAdh1遺伝子由来のイントロン6(-550bp)及びpSOG10由来の18bpのGUS非翻訳リーダー配列を増幅する。大腸菌ジヒドロ葉酸還元酵素II型遺伝子をコードしている250bp断片もPCRにより増幅し、これらのふたつのPCR断片を、pUC19ベクター骨格及びノパリンシンターゼターミネーターを含むpB1221 (Clontech社)のSacI-PstI断片と集成した。これらの断片の集成は、イントロン6配列、GUSリーダー、DHFR遺伝子及びノパリンシンターゼターミネーターと共に、融合物中に35Sプロモーターを含むpSOG19を作成する。pSOG19中のGUSリーダーをMaize Chlorotic Mottle Virus (MCMV)由来のリーダー配列と交換し、ベクターpSOG35を作成する。pSOG19及びpSOG35は、アンピシリン抵抗性のためのpUC遺伝子を保持し、並びに外来物質のクローニングに利用可能なHindIII、SphI、PstI及びEcoRI部位を有する。
【００９９】
本発明に有用な形質転換法
一旦本発明の核酸分子が発現カセットにクローニングされたならば、これは植物細胞へ形質転換される。本発明の受容体及び標的発現カセットは、多くの当該技術分野において認められた方法で、植物細胞へ導入することができる。植物の再生法は、当該技術分野において周知である。例えば、Tiプラスミドベクターが、外来DNAの送達、更には直接DNA取込み、リポソーム、電気穿孔、マイクロインジェクション、及び微粒子銃に利用される。加えて、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属の細菌を用い、植物細胞を形質転換することができる。以下は、双子葉及び単子葉の両植物の代表的形質転換技術、加えて代表的プラスチド形質転換技術の説明である。
【０１００】
本発明に従い形質転換される植物は、単子葉植物又は双子葉植物であることができ、並びにトウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、サツマイモ、インゲン、エンドウマメ、チコリ、レタス、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、カブ、ダイコン、ホウレンソウ、アスパラガス、タマネギ、ニンニク、コショウ、セロリ、スクワッシュ、カボチャ、アサ、ズッキーニ、リンゴ、ナシ、マルメロ、メロン、プラム、サクランボ、モモ、ネクタリン、アプリコット、イチゴ、ブドウ、ラズベリー、ブラックベリー、パイナップル、アボガド、パパイヤ、マンゴ、バナナ、ダイズ、トマト、モロコシ、サトウキビ、テンサイ、ヒマワリ、ナタネ、クローバー、タバコ、ニンジン、メンカ、アルファルファ、コメ、ジャガイモ、ナス、キュウリ、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、並びに針葉樹及び落葉樹のような樹木植物などを含むが、これらに限定されるものではなく、特にトウモロコシ、コムギ又はテンサイである。
【０１０１】
一旦発現カセットが特定の植物種に形質転換されたならば、この発現カセットは、その種において増殖され、及び従来の育種技術を用い、同じ種の他の品種、特に商業的な品種へ移される。
【０１０２】
双子葉植物の形質転換
双子葉植物の形質転換技術は、当該技術分野において周知であり、並びにアグロバクテリウム(Agrobacterium)-ベース及び非-アグロバクテリウム(Agrobacterium)ベースの両方の技術を含む。非-アグロバクテリウム(Agrobacterium)技術は、プロトプラスト又は細胞による直接的外来遺伝物質の取込みに関連している。これは、微粒子銃が媒介した送達、マイクロインジェクション、又はPEGもしくは電気穿孔が媒介した取込みにより実現される。これらの技術の例は、Paszkowskiら、EMBO J、3:2717-2722 (1984)、Potrykusら、Mol. Gen. Genet.、199:169-177 (1985)、Reichら、Biotechnology、4:1001-1004 (1986)、及びKleinら、Nature、327:70-73 (1987)に説明されている。各々の場合、形質転換された細胞は、当該技術分野において公知の標準技術を用い、植物全体に再生される。
【０１０３】
アグロバクテリウム(Agrobacterium)媒介型形質転換は、その高い形質転換効率及び多くの多様な種での広範な利用性のために、双子葉植物の形質転換にとって好ましい技術である。Agrobacterirum形質転換は、典型的には、注目の外来DNAを保持するバイナリーベクター(例えば、pCIB200又はpCIB2001)の、Tiプラスミドの同時存在(co-resident)又は染色体的のいずれかにおいて、宿主アグロバクテリウム(Agrobacterium)種(例えば、pCIB200及びpCIB2001のためのCIB542株(Uknesら、Plant Cell、5:159-169 (1993)))により保持されたvir遺伝子の相補性により左右され得る適当なアグロバクテリウム(Agrobacterium)種への導入が関連している。組換えバイナリーベクターのアグロバクテリウム(Agrobacterium)への導入は、この組換えバイナリーベクターを保持する大腸菌、pRK2013のようなプラスミドを保持し及び組換えバイナリーベクターの標的アグロバクテリウム(Agrobacterium)株への移動が可能であるヘルパー大腸菌株を使用する三親交配法(tri-parental mating procedure)により実現される。あるいは、この組換えバイナリーベクターは、DNA形質転換により、アグロバクテリウム(Agrobacterium)へ導入することができる(Hofgen及びWillmitzer、Nucl. Acids Res.、16:9877 (1988))。
【０１０４】
組換えアグロバクテリウム(Agrobacterium)による標的植物種の形質転換は、アグロバクテリウム(Agrobacterium)の、その植物由来の外植片との共生培養に関連し、及びこれは当該技術分野において周知のプロトコールに従う。形質転換された組織は、バイナリープラスミドT-DNAボーダーの間に存在する抗生物質又は除草剤抵抗性マーカーを保持する選択培地において再生される。
【０１０５】
別の植物細胞を遺伝子で形質転換する方法は、植物組織及び細胞での不活性又は生物学的に活性のある粒子の噴射に関連している。この技術は、全てSanfordらの米国特許第4,945,050号、第5,036,006号及び第5,100,792号に開示されている。一般にこの手法は、細胞の外側表面の浸透に効果があり及びその内部への組込みをもたらすような条件下の細胞での、不活性又は生物学的活性粒子の噴射に関連している。不活性粒子が利用される場合、これらの粒子を所望の遺伝子を含むベクターで被覆することにより、ベクターを細胞へ導入することができる。あるいは、このベクターは、標的細胞を取り囲むことができ、その結果ベクターは、この粒子の通り跡(wake)により、細胞の中に保持される。生物学的活性粒子(例えば、各々導入されるべき求められるDNAを含む、乾燥酵母細胞、乾燥細菌又はバクテリオファージ)も、植物細胞組織へ噴射することができる。
【０１０６】
単子葉植物の形質転換
ほとんどの単子葉植物種の形質転換も、現在日常的になってきている。好ましい技術は、PEG又は電気穿孔技術を用いるプロトプラストへの、及び微粒子銃粒子を用いるカルス組織への直接の遺伝子導入を含む。形質転換は、単独のDNA種又は複数のDNA種(すなわち、同時形質転換)により行われ、並びにこれらの技術は両方とも本発明での使用に適している。同時形質転換は、完全なベクター構築を避けること及び注目の遺伝子及び選択マーカーについて連結されていない遺伝子座を伴うトランスジェニック植物を作成することの利点を有し、このことは次世代で選択マーカーを除去することを可能にし、これは望ましいものとみなされている。しかし同時形質転換使用の欠点は、個別のDNA種がゲノムに組込まれる頻度が 100％未満であることである(Schocherら、Biotechnology、4:1093-1096 (1986))。
【０１０７】
欧州特許出願第EP 0 292 435号、第EP 0 392 225号、及び国際公開公報第93/07278号は、トウモロコシの優良種近交系からのカルス及びプロトプラストの調製、PEG又は電気穿孔を用いるプロトプラストの形質転換、及び形質転換されたプロトプラストからのトウモロコシ植物の再生の技術を開示している。Gordon-Kammら(Plant Cell、2:603-618 (1990))及びFrommら(Biotechnology、8:833-839 (1990))は、A188-由来のトウモロコシ系統の形質転換に関する微粒子銃を使用する技術を公開している。更に国際公開公報第93/07278号及びKozielら(Biotechnology、11:194-200 (1993))は、粒子銃による、トウモロコシの優良種近交系の形質転換に関する技術を開示している。この技術は、受粉の14〜15日後のトウモロコシ穂から切出した長さ1.5〜2.5mmの未熟なトウモロコシ胚及び投射のためにPDS-1000He Biolistics装置を使用する。
【０１０８】
コメの形質転換は、プロトプラスト又は微粒子銃を利用する直接遺伝子導入技術によっても行うことができる。プロトプラスト媒介型形質転換は、ジャポニカ米型及びインディカ米型について説明されている(Zhangら、Plant Cell Rep、7:379-384 (1988)；Shimamotoら、Nature、338:274-277 (1989)；Dattaら、Biotechnology、8:736-740 (1990))。両型とも、微粒子銃を用い、日常的に形質転換されている(Christouら、Biotechnology、9:957-962 (1991))。更に国際公開公報第93/21335号は、コメの電気穿孔による形質転換技術を開示している。
【０１０９】
欧州特許出願第EP 0 332 581号は、Pooideaeプロトプラストの作出、形質転換及び再生の技術を開示している。これらの技術は、Dactylis及びコムギの形質転換を可能にしている。更にコムギの形質転換は、C型長期再生可能なカルス細胞への微粒子銃を用いる方法がVasilらの論文(Biotechnology、10:667-674 (1992))に、並びに更に未熟胚及び未熟胚由来のカルスの微粒子銃を使用する方法がVasilらの論文(Biotechnology、11:1553-1558 (1993))及びWeeksらの論文(Plant Physiol.、102:1077-1084 (1993))に開示されている。しかしコムギの形質転換の好ましい技術は、未熟胚の微粒子銃によるコムギの形質転換に関連しており、遺伝子送達前の高ショ糖又は高マルトース工程のいずれかを含む。投射前に、長さ0.75〜1mmの胚を、3％ショ糖(Murashiga及びSkoog、Physiologia Plantarum、15:473-497 (1962))、及び体細胞胚の誘導のための3mg/Lの2,4-Dを含有するMS培地上に置き、これは暗所で進行することができる。選択された投射日に、胚は、誘導培地から取り出され、浸透圧調節物質(すなわち、望ましい濃度、典型的には15％で添加されたショ糖又はマルトースを含む誘導培地)上に配置する。これらの胚は、2〜3時間原形質分離することができ、その後投射が施される。標的プレート1枚当り20個の胚が、典型であるが、これは重要ではない。標準の手法を用い、適当な遺伝子を保持するプラスミド(pCIB3064又はpSG35など)を、μmサイズの金粒子上に沈殿させる。各胚のプレートを、DuPont社Biolistics(登録商標)ヘリウム装置により、破裂圧力〜1000psi(6.9MPa)で、標準の80メッシュスクリーンを用い射撃する。投射を施した後、これらの胚は、回収のために約24時間(依然浸透圧調節物質上)、暗所に戻される。24時間後、胚を浸透圧調節物質から取り除き、及び誘導培地上に戻し、そこでこれらは再生前約1ヶ月間配置される。およそ1ヶ月後、胚形成性カルスを発生している胚の外植片を、更に適当な選択剤(pCIB3064の場合は 10mg/Lバスタ及びpSOG35の場合は2mg/Lメトトレキセート)を含有する再生培地(MS＋1mg/L NAA、5mg/L GA)に移す。およそ1月後、発生した苗条を、半分の強度のMS、2％ショ糖、及び同じ濃度の選択剤を含有する「GA7」として公知であるより大きい滅菌容器に移した。
【０１１０】
単子葉植物のアグロバクテリウム(Agrobacterium)を使用する形質転換は、国際公開公報第94/00977号及び米国特許第5,591,616号に開示されており、これらは両方とも、本明細書に参照として組入れられている。トウモロコシ形質転換の好ましい方法は、Negrottoらの論文(Plant Cell Reports、19:798-803 (2000))に説明されており、これは本明細書に参照として組入れられている。
【０１１１】
プロモーター活性の分析
いくつかの方法が、プロモーター活性を評価するために、利用可能である。発現カセットは、前述のように、可視マーカーを伴い構築される。一過性形質転換法を用い、プロモーター活性を評価する。微粒子銃、アグロバクテリウム(Agrobacterium)形質転換又はプロトプラスト形質転換などの形質転換法を用い、発現カセットを植物細胞又は組織へ送達される。β-グルクロニダーゼ活性、ルシフェラーゼ活性又はGFP蛍光のようなレポーター遺伝子活性は、当該技術分野において周知の方法を用い、形質転換後、経時的に、例えばDNA送達後2時間、5時間、8時間、16時間、24時間、36時間、48時間及び72時間にモニタリングされる。レポーター遺伝子活性は、酵素活性により、レポーター遺伝子によりコードされた酵素の基質による細胞もしくは組織の染色により、又は適当な波長光下での直接的可視化により、モニタリングすることができる。完全長プロモーター配列、プロモーター配列の欠失及び突然変異はアッセイされ、それらの発現レベルを比較することができる。更にRNAレベルを、ノーザンブロット、競合的逆転写酵素PCR及びRNAse保護アッセイなどの、当該技術分野において周知の方法を用いて測定することができる。これらのアッセイは、標準の転写されたレポーターmRNAの「安定状態」濃度を測定することにより、プロモーターの発現レベルを測定する。レポーターmRNAの濃度は、その合成速度のみではなく、mRNAが分解される速度によっても左右されるので、この測定は間接的である。従って安定状態のレベルは、合成速度及び分解速度の積である。しかし分解速度は、転写された配列が同一である場合は、一定速度で進行すると考えられ、従ってこの値は、合成速度の測定値として利用することができる。
【０１１２】
プロモーター活性の更なる確認は、前述のような、植物への、可視マーカー又は注目の遺伝子を含む発現カセット中のプロモーターの安定した形質転換により得られる。先に説明された酵素活性アッセイ、RNA解析及びタンパク質アッセイのような前述の様々な方法を用い、プロモーター活性が、発生の期間にわたり、及び追加的に一次形質転換体内の異なる組織における発現及びトランスジェニック植物の後代を通じてのモニタリングにより、モニタリングされる。
【実施例】
【０１１３】
本発明は、更に、下記の詳細な実施例を参照し説明される。これらの実施例は、例証のみを目的として提供され、特に記さない限りは限定を意図するものではない。ここで使用される標準の組換えDNA及び分子クローニング技術は、当該技術分野において周知であり、及びAusubel(編集)の「Current Protocols in Molecular Biology」、John Wiley and Sons社(1994)；J. Sambrookらの「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」第3版、コールドスプリングハーバー、NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press社(2001)；並びに、T.J. Silhavy、M.L. Berman、及びL.W. Enquistの「Experiments with Gene Fusions」、Cold Spring Harbor Laboratory社、コールドスプリングハーバー、NY(1984)に説明されている。
【０１１４】
実施例1：トウモロコシ根のフォワード及びリバースサブトラクションcDNAライブラリーの構築
トウモロコシ根-特異的cDNAクローンの同定に向かう第一の工程として、サブトラクションcDNAライブラリーを、Clontech社のPCR-Select cDNA Subtraction Kit(Clontech社カタログ番号K1804-1)を用い構築した。下記の2種の異なるサブトラクションcDNAライブラリーを構築した；1)根に特異的である示差的に発現された転写産物が豊富な、フォワード-サブトラクションライブラリー、及び2)根以外の全ての地上組織に対して特異的である示差的に発現された転写産物が豊富な、リバース-サブトラクションライブラリー。総RNAを、各器官の成熟体及びいくつかの発生段階からプールされた組織試料を用い、雄穂、絹糸、種子、茎、葉及び根を含む、トウモロコシ系統CG00526から単離した。根に関して、冠根、一次根及び側根を、発芽後2週目に始まり熟性(maturity)で終了するおおまかに5種に均等に分割された発生段階から試料採取した。ポリA mRNAを、PolyA Ttract mRNA isolation Systemsキット(Promega社カタログ番号Z3790)において概説された手法を用い、総RNA調製物の各々から単離した。cDNAは、各器官のポリA mRNAから合成し、RsaIで消化し、アダプターにライゲーションし、並びに「tester cDNA」及び「driver cDNA」集団へ分けた。フォワード-サブトラクションライブラリーに関して、「tester cDNA」は、根cDNAにより表わし、及び「driver cDNA」は、雄穂、絹糸、種子、茎、及び葉のcDNAの等量の構成とした。リバース-サブトラクションライブラリーに関して、「tester」及び「driver」cDNA集団は、フォワード-サブトラクションライブラリーにおいて使用されるものの逆であった。
【０１１５】
これらのライブラリーの各々に関するcDNAサブトラクション及びPCR増幅は、Clontech社のPCR-Select cDNA Subtraction Kitの使用説明書に説明されているように行った。根-特異的フォワード-サブトラクションライブラリーのPCR産物は、TA-クローニングベクターpCR2.1 (Invitrogen社カタログ番号K20000-01)及びpBSK- (Stratagene社カタログ番号212206)の両方へクローニングした。pBSK-にライゲーションされたcDNAは、電気穿孔により、大腸菌株DH10B細胞(Life Technologies社カタログ番号18290-015)へ形質転換した。形質転換反応は、青色／白色コロニー選択が可能である培地を含むQ-トレイ(Genetix社)上にプレーティングした。Q-トレイ上の白色コロニーは、ロボット操作(Q-bot)により、抗生物質線選択培地及び凍害防御物質を含む384-ウェルプレートへ採取した。384-ウェルプレート中のコロニーを増殖し、及び-80℃で凍結した。およそ16,000コロニーを採取した。トウモロコシ根サブトラクションライブラリーを表わすおよそ16,000の格子状に並べた細菌コロニーの各々は、Q-bot(Genetix社)を用い、複製用の23cm2ナイロン膜上にふたつ組のスポットとしてロボット操作によりアレイとした。コロニーを、選択寒天トレイ上に積層した膜上で増殖し、その後in situ細菌コロニー溶解液及びハイブリダイゼーションのための膜のプロセッシングを、Nizeticらの論文(Nucleic Acids Res.、19(1):182 (1991))に従い行った。
【０１１６】
実施例2：トウモロコシ根サブトラクションcDNAライブラリーのスクリーニング、クローンの配列決定及びノーザンブロット分析による根-特異性の確認
その発現が根特異的であるクローンを同定するために、32P-標識したプローブを伴うアレイ化したライブラリーの示差的ハイブリダイゼーションスクリーニングを行った。これは、フォワード-サブトラクションライブラリーを構築するために使用された同じサブトラクションcDNAから作成したフォワード-サブトラクションプローブで、ライブラリーの2種の複製アレイの一方をハイブリダイズし；及び、第二の複製アレイを、フィリバース-サブトラクションライブラリーを構築するために使用された同じサブトラクションcDNAを用いる、リバース-サブトラクションプローブでハイブリダイズすることにより、実現した。プローブ産生及びハイブリダイゼーションは、PCR-Select Differential Screening Kit (Clontech社カタログ番号K1808-1, D)の使用説明書に従い行った。ナイロン膜を、フィルム(Kodak社Biomax)及びホスホイメージャーの両方に曝し、並びにデンシトメトリー値を各スポットについて割当てた。
【０１１７】
オートラジオグラフ及びデンシトメトリーのデータの目視による検査を用い、300クローンを配列決定のために採取した。クローンは、下記の3種の判定基準を満足するそれらの能力を基に採取した：1)リバース-サブトラクションプローブへのハイブリダイゼーションなし、2)フォワード-サブトラクションプローブへの強力なハイブリダイゼーション、及び3)同一フィルター上のふたつ組スポット間で一定のハイブリダイゼーション強度。配列解析及びコンティグアッセンブリーのために、この300種の配列は、Phred/Phrapプログラム(Codon Code社)を用い、70種の独自のコンティグへアレンジした。配列同一性は、Blastプログラムを用いて検索し、同じblast IDを生じたクローンは除去した。次に得られた36種の独特なクローンは、ノーザンブロット分析により根-特異的発現を評価した。
【０１１８】
6種の異なる器官である雄穂、絹糸、種子、葉、茎及び根の各々に由来した総RNA(各試料のいくつかの発生段階の組織から単離されたもの)の18μgを含むゲルブロットを、各々36 cDNAから作成された32P-標識したプローブとハイブリダイズした。これらの分析は、15種のクローン(2A12、10B21、4J8、16M14、29D21、7B21、14H6、2D14、16H17、36E7、4H19、2P9、6G15、22P8、及びSM13)が根-特異的発現を有することを確認した。
【０１１９】
前記の15種のcDNAクローンに、次に逆ノーザンブロット分析を施し、先に観察された根-特異的発現が、根端に限定されるか又は顕著である発現に起因しているかどうかを評価した。15種の根-特異的cDNAクローンの5種のふたつ組のゲルブロットを調製し、及び各々は根全体、根端、根端を伴わない根、冠根端、又は先端を伴わない冠根から単離したpolyA+ RNAから調製した第一鎖の32P-標識したcDNAプローブとハイブリダイズした。オートラジオグラフィー上の32P-標識したバンドの強度は、高(+++)、中(++)、低(+)、又はナシ(-)に特徴付けた。表1に示した結果は、15種全てのクローンの発現が根端に確認されなかったこと、及び実質的発現は根全体に認められたことを示している。
【表１】
2005514920.tif 000002
【０１２０】
実施例3：選択された根特異的cDNAのための完全長cDNAクローンの獲得
前記ノーザン及び逆ノーザン発現データを用い、完全長cDNAを得るために、4種のクローン22P8、10B21、2D14、4H19を選択した。これらのクローンに関して当初のcDNAは4種全て、各々ポリA尾部を含む3'側断片を表わしている。Clontech社のMarathon cDNA Amplification Kit (カタログ番号K1802-1)を使用する5' RACE PCRを用い、部分的cDNAクローンを延長した。トウモロコシDNAの高G+C含量のために、下記RACE遺伝子-特異的プライマー(配列番号:13-26)及びアダプタープライマー(配列番号:27)を使用するRACE伸長の増分を用い、完全長cDNA産物を得た：
【表２】
2005514920.tif 000003
【０１２１】
本プロセスにおいて使用されたcDNAクローン及びプライマーのRACE伸長の結果は、表2に示した。完全長cDNA候補(配列番号:5、7、9及び11)を、4種のクローンの各々について得た。RACE PCRにより得られた完全長又はほぼ完全長のcDNAクローンは、各cDNAクローンに関する翻訳開始ATGの予想を可能にした。
【表３】
2005514920.tif 000004
【０１２２】
実施例4：根-特異的cDNAに対応するプロモーター／ゲノムクローンの単離
cDNA類22P8、10B21、2D14、4H19(各々、配列番号:5、7、9及び11)に相当するプロモーター／ゲノムクローンは、トウモロコシ「ゲノムウォーカー」又はλEMBL3ゲノムライブラリーのいずれかを鋳型として利用するPCRにより単離した。「ゲノムウォーカー」アダプター-ライゲーションしたトウモロコシゲノムライブラリーは、トウモロコシ系統CGC000526由来のDNA及びClontech社のUniversal Genome Walkerキット(Clontechカタログ番号K1807-1)を用いて構築した。5種の異なるライブラリーを構築し、それらは各々、下記の平滑末端制限酵素のひとつによる消化により作成されたゲノムDNA断片で構成された：DraI、EcoRV、HincII、SspI、又はStuI。ゲノムウォーカーライブラリーは、下記の遺伝子特異的プライマー(配列番号:28-34)及びキットで供給されたアダプタープライマー(配列番号:35)を利用し、スクリーニングした：
【表４】
2005514920.tif 000005
【０１２３】
PCR条件は、Clontech社使用説明書に示されたものである。PCR反応物は、アガロースゲル上で分画し、及び得られた生成物のバンドを切出し、Topoベクターでクローニングし、及び配列決定して、正確な産物を証明した。cDNA 22P8、10B21、2D14、4H19(各々、配列番号:5、7、9及び11)に相当するプロモータークローンは、これらのライブラリーからクローニングした。
【０１２４】
λEMBL3ライブラリーは、トウモロコシ系統CG000526由来のゲノムDNAを用い、Clontech社(Clontech社カタログ番号cs1012j)による注文生産されたものであった。cDNA 22P8(配列番号:5)に相当する1.4kbプロモータークローンを、このライブラリーからクローニングした。このライブラリーは、22P8GSP7、5'-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3'(配列番号:36)を用い、下記のClontech社により供給された5'及び3'側λアームプライマー(カタログ番号9104-1)と共に、PCRスクリーニングした：
5'-CTGCTTCTCATAGAGTCTTGCAGACAAACTGCGCAAC-3'、(配列番号:37)
5'-TGAACACTCGTCCGAGAATAACGAGTGGATCTGGGTC-3'、(配列番号:38)。
PCRは、これらのプライマーと供に提供された使用説明書に示された条件を用い行った。22P8プロモータークローンは、3'λプライマー及び22P8GSP7プライマーの産物であった。
【０１２５】
実施例5：根-特異的発現カセットの構築
エントリーベクター
発現カセットの構築における第一の工程は、プロモーターのエントリーベクターへのクローニングであった。PCRプライマーは、各プロモーターを増幅し、並びにattB1及びattB2部位を各々5'及び3'末端に配置するようにデザインした。cDNA 22P8に対応するプロモーターは、トウモロコシ根-特異的1(Maize Root-Specific 1)又はMRS1と称した。ふたつの異なるプロモーターコンストラクトを、MRS1から作成し；配列番号:1のヌクレオチド1から1391を含む完全長MRS1は、MRS1Lと称し、及び配列番号:1のヌクレオチド601から1391を含むMRS1の第二のより短い断片は、MRS1Sと称した。MRS1Lは、ゲノムウォーカーライブラリーEcoRVから、プライマー22P8DS1、5'-TTAAGAACATGACGGATGAAGAATCACT-3' (配列番号:39)及び22P8GSP6、5'-TGATCCGCAGTTGCAGCTTGATCC-3' (配列番号:40)により、その後22P8DS1(配列番号:39)及び入れ子式プライマー22P8GSP7(配列番号:36)により、PCR増幅した。Att部位は、入れ子式反応の産物を、1/2 att並びに1/2遺伝子-特異的配列、22P8DS5、5'-ACAAAAAAGCAGGCTGAACATGACGGATGA-3' (配列番号:41)及び22P8DS9、5'-ACAAGAAAGCTGGGTCCTCGAGCTCTTTCG-3' (配列番号:42)からなるプライマーで、PCR増幅することにより、MRS1Lへ追加した。完全なattB1及びattB2部位は、プライマーattB1、5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3' (配列番号:43)及びattB2、5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3' (配列番号:44)を用いることにより、追加した。MRS1S(配列番号:1のヌクレオチド601-1391)は、ゲノムウォーカーライブラリーEcoRVから、プライマー22P8DS1(配列番号:39)及び22P8GSP6(配列番号:40)により、その後入れ子式プライマー22P8DS3、5'-GCGTAGTTGAAGCTTACAAAGTTGCAT-3' (配列番号:45)及び22P8GSP7(配列番号:36)によりPCR増幅した。Att部位は、1/2 att並びに1/2遺伝子-特異的配列、22P8DS7、5'-ACAAAAAAGCAGGCTGTAGTTGAAGCTTAC-3' (配列番号:46)及び22P8DS9 (配列番号:42)からなるプライマーによる、入れ子式反応の産物のPCR増幅により、MRS1Sに追加した。完全なattB1及びattB2部位は、プライマーattB1(配列番号:43)及びattB2(配列番号:44)を用いることにより追加した。
【０１２６】
cDNA 10B21に対応するプロモーターは、MRS2L(配列番号:2)と称した。MRS2Lは、ゲノムウォーカーライブラリーEcoRVから、プライマー10B21DS1、5'-GACGGCCCGGGCTGGTAAATTGACTT-3' (配列番号:47)及び10B21GSP1, 5'-CATGCTCGCGGCTAGCTTAGAGG-3' (配列番号:48)、その後入れ子式プライマー1OB21DS3、5'-TGGTAAATTGACTTTGCCTAGTGTTGGA-3' (配列番号:49)及び10B21GSP2、5'-ACAGTCTTGCCGCAGTGGTGCAG-3' (配列番号:50)により、PCR増幅した。Att部位は、1/2att並びに1/2遺伝子-特異的配列、10B21DS5、5'-ACAAAAAAGCAGGCTTGACTTTGCCTAGTG-3' (配列番号:51)及び10B21DS7、5'-ACAAGAAAGCTGGGTTGCTGCAGAGTACAG-3' (配列番号:52)からなるプライマーによる、入れ子式反応の産物のPCR増幅により、MRS2に追加した。完全attB1及びattB2部位は、プライマーattB1 (配列番号:43)及びattB2(配列番号:44)を用いて追加した。ふたつのより短い断片MRS2Lを作成した。配列番号:2のヌクレオチド921から2869を含む、MRS2Lのひとつの断片は、MRS2Mと称され、及び配列番号:2のヌクレオチド1913から2869を含むMRS2Lの第二の断片は、MRS2Sと称される。MRS2Lプロモーターの断片は、鋳型としてMRS2Lプロモーター(配列番号:2)及び遺伝子特異的プライマー(配列番号:64-67)を用いる、PCRにより作成した。配列CACCは、各フォワードプライマーの5'末端に追加し、pENTR-D/TOPOプラスミド(Invitrogen社)への方向のあるクローニングを可能にした。この方向のあるクローニングは、MRS2M断片又はMRS2S断片のいずれかを含むエントリーベクターを作出した。MRS2プロモーター断片を作成するために使用したMRS2-特異的プライマーは以下であった：
【表５】
2005514920.tif 000006
【０１２７】
MRS2プロモーター断片を作成するために使用したPCRプライマーの組合せは、下記であった：
【表６】
2005514920.tif 000007
【０１２８】
cDNA 2D14に対応するプロモーターは、MRS3 (配列番号:3)と称した。MRS3は、プライマー2D14DS1、5'-ATGGGTTTGCGGGTATGGGTAGTGGTA-3' (配列番号:53)及び2D14GSPS、5'-ACACCACCAGGTTCACGGCGAGGAACAG-3' (配列番号:54)でのPCRにより、ゲノムウォーカーライブラリーEcoRVから増幅した。Att部位は、1/2att並びに1/2遺伝子-特異的配列、2D14DS3、5'-ACAAAAAAGCAGGCTGCGGGTATGGGTAG-3' (配列番号:55)及び2D14DS5、5'-ACAAGAAAGCTGGGTTGCTCGATCACAACA-3' (配列番号:56)からなるプライマーによる、一次反応の精製物のPCR増幅により、MRS3へ追加した。完全なattB1及びattB2部位は、プライマーattB1(配列番号:43)及びattB2(配列番号:44)を用いることにより追加した。
【０１２９】
cDNA 4H19に対応するプロモーターは、MRS4(配列番号:4)と称されている。MRS4は、プライマー4H19GSP3、5'-TCTTTCTTGTGCACCGCCGAAGC-3' (配列番号:57)及び4H19profor、5'-ACCCGATAACGAGTTAACGATATGAACTGG-3' (配列番号:58)により、ゲノムウォーカーライブラリーDraIから増幅し、その後入れ子式プライマー4H19GSP4、5'-TGCACTCACACCGCCGATGATGG-3' (配列番号:59)及び4H19profor(配列番号:58)により増幅した。Att部位は、MRS4へ、1/2att並びに1/2遺伝子-特異的配列、4H19proforB1、5'-ACAAAAAAGCAGGCTAACGATATGAACTGG-3' (配列番号:60)及び4H19prorevB2、5'-ACAAGAAAGCTGGGTCTTCACGAGTTCGGT-3' (配列番号:61)からなるプライマーによる、一次反応の産物のPCR増幅により追加した。attB1及びattB2末端を伴う各プロモーターは、組換え酵素のBPクロナーゼ混合物(Life Technologies社カタログ番号11789-013)を用い、プラスミドpDONR 201(Life Technologies社カタログ番号11798-014)のattP組換え部位を伴うドナーベクターへ組換えた。このエントリーベクターにおいて、各プロモーターは、attL1部位に隣接したプロモーターの5'末端及びattL2部位に隣接した3'末端で方向付けてクローニングされる。個別のエントリーベクターを4種のプロモーターの各々について作成した。
【０１３０】
デスティネーションベクター
植物の形質転換に有用なバイナリーデスティネーションベクターは、下記の方法で構築した。クロラムフェニコール抵抗性遺伝子及び制御された細胞死(ecd)遺伝子にフランキングしているλバクテリオファージ付着部位-R(attR)を含む組換え断片(rf)を、Invitrogen社(カタログ番号11828-019)から得た。オリゴヌクレオチドは、rfカセットをPCR増幅するために得、フランキング5' BclI部位、rfBclI、5'-TGCCCGTATGATCAACAAGTTTGTACAAAA-3' (配列番号:62)及び3' EcoRV部位、rfEcoRV、5'-CCAGACCGATATCAACCACTTTGTACAAGA-3' (配列番号:63)を、カセットへ導入した。これらの独自の制限部位の追加は、β-グルクロニダーゼ(GUS)遺伝子及びノパリンシンターゼ(nos)ターミネーターの前の組換え断片(rf::gus::nos)の方向のあるサブクローニングを可能にし、中間体ドナーベクターを作成した。この発現カセット(rf::gus::nos)は、ドナーベクターから、KpnIを用いるエンドヌクレアーゼ消化及び〜3kb断片のゲル精製により除去した。レシピエントバイナリーベクター(Negrottoら、Plant Cell Reports、19:798-803 (2000))は、KpnIを用いるエンドヌクレアーゼ消化により、及び仔ウシの腸ホスファターゼ(CIP)を用いる脱リン酸化により、発現カセットのライゲーションのために調製した。次に発現カセットを、バイナリープラスミドの右側境界の近傍であるT-DNA領域内のKpnI部位へサブクローニングした。最終バイナリーデスティネーションベクターのT-DNA領域は、組換え発現カセット、それに続くホスホマンノースイソメラーゼを駆動するトウモロコシユビキチンプロモーター及びnosターミネーターを含む植物選択マーカー発現カセットを収容した(Negrottoら、Plant Cell Reports、19: 798-803(2000))。根-特異的プロモーターMRS1L、MRS1S、MRS2L、MRS2M、MRS2S、及びMRS3は、各々、GUSコード配列の前方の、最終バイナリー組換えベクターへクローニングした。従って6種のバイナリーベクター、MRS1 L-GUS、MRS 1 S-GUS、MRS2L-GUS、MRS2M-GUS、MRS2S-GUS、及びMRS3-GUSを作成した。
【０１３１】
実施例6：根-特異的プロモーターにより指示されたトウモロコシにおける一過性発現
トウモロコシ種子は、無菌条件下で7日間、暗所で発芽及び生育させた。根組織は、滅菌したカミソリの刃を用い1cmセグメントに切断し、及び2JMS+AG培地(JMS大量、SH少量、MS鉄、2％ショ糖、5mg/mlディカンバ、GS添加剤、10mg/ml AgNO3)により調製したアガロースプレート上に置いた。MRS1 L-GUS、MRS1 S-GUS、MRS2L-GUS、及びMRS3-GUSを含ベクター由来の5μgのDNAは、金粒子(＜1μm)金担体上に沈殿させ、説明されたように650psi(4.5MPa)での投射のためにマイクロキャリヤ上にスポットした (Wrightら、Plant Cell Reports、20:429-436 (2001))。断片DNAは、「DuPont Biolistics Manual」に説明されたように金微粒子担体(＜1μm)上に沈殿した。遺伝子は、PDS-1000He Biolistics装置を用い、標的組織細胞へ送達した。この装置のおよその設定は、以下のようであった：ラプチャーディスクとマクロキャリヤの間8mm、マクロキャリヤと停止スクリーンの間10mm、及び停止スクリーンと標的の間7cm。これらのプレートは、650psi (4.5MPa)-ラプチャーディスクを用い、DNA-被覆した粒子で2回射撃した。ヘリウム衝風の衝撃波による組織損傷を低減するために、水平及び垂直の1直交インチ当り200開口部のステンレス鋼メッシュ(McMaster-Carr社、ニューブラスウィック、NJ)を、停止スクリーンと標的組織の間に配置した。これらのプレート上で、根を48時間、25℃で暗所栽培した。GUSの発現は、100mM NaPO4、0.5mMフェリシアン化カリウム、0.5mMフェロシアン化カリウム、1.0 mM EDTA(pH8.0)、0.5mg/ml X-Gluc、0.1％Triton X-100で染色することにより、可視化した。表3は、GUSの発現を駆動する構成的トウモロコシユビキチンプロモーターを伴うコンストラクトUbiP-GUSと比較した、根-特異的プロモーターコンストラクトのGUS発現の相対レベルを示している。野生型(Wt)トウモロコシ植物を、陰性対照として使用した。GUS活性は、高(+++)、中(++)、低(+)、又はナシ(-)として特徴決定した。結果は、本発明のプロモーターは植物細胞において機能し、及び異種コード配列の発現を構成的プロモーターに対し同等のレベルで駆動することを示している。
【表７】
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【０１３２】
実施例7：根特異的プロモーターにより指示された安定して-形質転換されたトウモロコシ及びコメのGUSの発現
トウモロコシ及びコメ植物を、GUSコード配列に作用可能に連結された本発明のプロモーターを含む発現カセットで形質転換した。安定して形質転換されたトウモロコシ及びコメ組織のGUS活性を、蛍光アッセイにより測定した。植物組織は、抽出緩衝液(50mM Na2HPO4、pH7.0、5mM DTT、1mM NA2 EDTA、0.1％サルコシル、0.1％Triton-X)中に粉砕した。5部のアッセイ緩衝液(47mM 4-メチルウンベリウムフェリル-グルクロアミドを含む抽出緩衝液)に対し組織抽出液およそ1部で、反応を37℃で進行し、及び複数時点で、2％ Na2CO3で停止した。この活性は、Tecan Spectrafluor Plusにおいて、Na2CO3中に希釈した4-MU標準で、365nm励起及び455nm蛍光でキャリブレーションした。MU蛍光対時間の勾配は、GUS酵素活性を示している。タンパク質濃度は、BCAアッセイ(Pierco社カタログ番号23223及び23224)で測定し、及びGus活性を、タンパク質濃度に対して標準化した。Gus活性は、高(+++)、中(++)、低(+)、又はナシ(-)として特徴付けし、及び12〜31種の単コピートランスジェニックトウモロコシ植物又は7種の単コピートランスジェニックコメ植物を、各プロモーターコンストラクトについて平均化した。表4及び5に示された結果は、本発明のプロモーターを含む発現カセットを含むトランスジェニック植物におけるGUS活性は、根に対し特異的に制限されたしたことを明らかにしている。
【表８】
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【表９】
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【０１３３】
実施例8：根-特異的プロモーターを使用する殺虫毒素の発現
トウモロコシ植物は、修飾したCry3A毒素をコードしている異種コード配列に機能可能に連結されたMRS3プロモーターを含む発現カセットで形質転換した(米国特許出願第60/316,421号)。殺虫毒素を発現している形質転換された植物の切出した根を、ウェスタンコーンルートワームに対してバイオアッセイし、かつ殺虫性であることを認めた。MRS3-修飾されたCry3A発現カセットを含む形質転換された植物は、コーンルートワーム幼虫の摂食加害に対して抵抗性があった。
【０１３４】
当業者には、本発明のプロモーターは、コーンルートワームに対して活性のある毒素をコードしている他の異種コード配列、例えば、PS149B1タンパク質(Moellenbeckら、Nature Biotechnology、19:668-672 (2001))、修飾されたCry3Bb毒素(米国特許第6,063,597号)、米国特許第6,281,413号に開示されたDiabrotica毒素、又はVip1-Vip2毒素(米国特許第5,872,212号)に作用可能に連結され得ることが認められるであろう。
【０１３５】
本明細書において言及された全ての刊行物及び特許出願は、本発明の属する技術分野の業者の技術レベルの指標である。全ての刊行物及び特許出願は、各々個別の刊行物及び特許出願が個別に参照として組入れられていることが具体的及び個別に示されるのと同等に、本明細書に参照として組入れられている。
【０１３６】
前述の発明は、理解を明確にすることを目的として例証及び実施例に関して一部詳細に説明されているが、当業者にはある種の変更及び修飾を本発明の範囲内で実践することができることは明らかであろう。
【配列表】
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