(57)【要約】本発明は、インスリン様増殖因子IまたはII（IGF）、およびIGFBP-1のアミノ酸39〜91、IGFBP-2のアミノ酸55〜107、IGFBP-3のアミノ酸47〜99、IGFBP-4のアミノ酸39〜91、IGFBP-5のアミノ酸40〜92、もしくはIGFBP-6のアミノ酸40〜92からなるポリペプチド、またはIGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、もしくはIGFBP-5の9〜12番目のシステイン、もしくはIGFBP-6の7〜10番目のシステインから少なくともなるそれらの断片との複合体を含む、X線回折に適した結晶；そのような結晶の原子座標の決定のための方法；IGF-Iおよび／またはIGF-IIに対する増強された結合親和性を有するIGFBP変異体、ならびに結合タンパク質からIGFを排斥する低分子を同定および最適化する方法を提供する。
2005508295.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
制限された立体配座可動性を示す複合体を形成するための、インスリン様増殖因子IまたはII（IGF）と、IGFBP-1のアミノ酸39〜91、IGFBP-2のアミノ酸55〜107、IGFBP-3のアミノ酸47〜99、IGFBP-4のアミノ酸39〜91、IGFBP-5のアミノ酸40〜92、もしくはIGFBP-6のアミノ酸40〜92からなるポリペプチド、またはIGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、もしくはIGFBP-5の9〜12番目のシステイン、もしくはIGFBP-6の7〜10番目のシステインから少なくともなるそれらの断片との複合体を含む、X線回折に適した結晶。
【請求項２】
1.5〜3.5Åの分解能で複合体の原子座標の決定のためのX線を効果的に回折する、請求項1の結晶。
【請求項３】
74.385Å×74.385Å×74.385Åという単位格子寸法を有する立方空間群P213で配列している、請求項1または2の結晶。
【請求項４】
X線回折に適した結晶を作製するための方法であって、
（a）制限された立体配座可動性を示す複合体を形成するため、IGFを、IGFBP-1のアミノ酸39〜91、IGFBP-2のアミノ酸55〜107、IGFBP-3のアミノ酸47〜99、IGFBP-4のアミノ酸39〜91、IGFBP-5のアミノ酸40〜92、もしくはIGFBP-6のアミノ酸40〜92からなるポリペプチド、またはIGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、もしくはIGFBP-5の9〜12番目のシステイン、もしくはIGFBP-6の7〜10番目のシステインから少なくともなるそれらの断片と接触させる段階、および
（b）そのようにして形成された複合体からX線回折に適した結晶を得る段階を含む方法。
【請求項５】
X線回折に適した結晶の原子座標の決定のための方法であって、
（a）制限された立体配座可動性を示す複合体を形成するため、IGFを、IGFBP-1のアミノ酸39〜91、IGFBP-2のアミノ酸55〜107、IGFBP-3のアミノ酸47〜99、IGFBP-4のアミノ酸39〜91、IGFBP-5のアミノ酸40〜92、もしくはIGFBP-6のアミノ酸40〜92からなるポリペプチド、またはIGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、もしくはIGFBP-5の9〜12番目のシステイン、もしくはIGFBP-6の7〜10番目のシステインから少なくともなるそれらの断片と接触させる段階、および
（b）そのようにして形成された複合体からX線回折に適した結晶を得る段階、
（c）該結晶の原子座標を決定す段階によって得られる方法。
【請求項６】
IGFに対する増強された結合親和性を有する、IGFBPの変異体（IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5、もしくはIGFBP-6、またはIGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、もしくはIGFBP-5の9〜12番目のシステイン、もしくはIGFBP-6の7〜10番目のシステインから少なくともなる、それらの断片の変異体）を同定するための方法であって、
（a）IGFIとIGFBPまたはそれらの断片とからなる結晶の原子座標に基づき、IGFと、IGFBP-1のアミノ酸39〜91、IGFBP-2のアミノ酸55〜107、IGFBP-3のアミノ酸47〜99、IGFBP-4のアミノ酸39〜91、IGFBP-5のアミノ酸40〜92、もしくはIGFBP-6のアミノ酸40〜92からなるポリペプチド、またはIGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、もしくはIGFBP-5の9〜12番目のシステイン、もしくはIGFBP-6の7〜10番目のシステインから少なくともなるそれらの断片との複合体の三次元構造を構築する段階；
（b）IGFと該IGFBPの変異体との間の疎水性相互作用が増強されるようIGFの疎水性アミノ酸残基から5Å未満の距離にある残基が修飾されている該IGFBPの変異体を同定するため、該三次元構造およびモデリング法を利用する段階；
（c）該変異体を作製する段階；
（d）該IGFに対する増強された結合親和性を決定するため該変異体をアッセイする段階を含む方法。
【請求項７】
IGF-Iに対する増強された結合親和性を有するIGFBP-5の変異体を同定するための方法であって、
（a）図5および6に示された原子座標により定義されたIGFとIGFBP-5との複合体の三次元構造を構築する段階；
（b）IGFとIGFBP-5との間の疎水性相互作用が増強されるよう疎水性に修飾され得る、IGFIのアミノ酸残基から5Å未満の距離にあるIGFBP-5のアミノ酸残基を同定するため、該三次元構造およびモデリング法を利用する段階；
（c）該変異体を作製する段階；
（d）該IGFに対する増強された結合親和性を決定するため該変異体をアッセイする段階を含む方法。
【請求項８】
表1〜6に示された変異のうちの1つまたはより多くを含有しているIGFBPの変異体。
【請求項９】
表1〜6によるIGFBP-5配列アラインメントに対応するアミノ酸残基49、70、および／または73の変異を1またはより多く含有しているIGFBPの変異体。
【請求項１０】
IGFBPとの結合能を有する非タンパク質性化合物を同定するための方法であって、
（a）IGF-IとIGFBPとからなる結晶の原子座標に基づき、インスリン様増殖因子IまたはIIと、インスリン様増殖因子結合タンパク質5のアミノ酸40〜92、IGFBP-1のアミノ酸39〜91、IGFBP-2のアミノ酸55〜107、IGFBP-3のアミノ酸47〜99、IGFBP-4のアミノ酸39〜91、IGFBP-5のアミノ酸40〜92、IGFBP-6のアミノ酸40〜92からなるポリペプチド、またはIGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、もしくはIGFBP-5の9〜12番目のシステイン、もしくはIGFBP-6の7〜10番目のシステインから少なくともなるそれらの断片との複合体の三次元構造を構築する段階；
（b）IGFBP-5の場合はアミノ酸49、50、70、71、および74との疎水性結合により、ならびにIGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4およびIGFBP-6の場合は表7に記載される対応するアミノ酸との疎水性結合により該IGFBPと複合体を形成する非タンパク質性化合物を同定するため、該三次元構造およびモデリング法を利用する段階；
（c）該化合物を作製する段階；
（d）化合物と該IGFBPとの間の結合を決定する段階を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、IGF結合タンパク質断片（IGFBP）のIGFとの複合体、その使用、および天然IGFBPのIGFに対する親和性より高い親和性を有する新規IGFBP変異体に関し、さらに、IGFBPとIGFとの間の複合体形成を妨害するかまたは逆転させる、IGFBPに対するアンタゴニストの作製のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
序論
インスリン様増殖因子IおよびII（以後、IGFとも呼ばれる）は、ホルモン、成長因子、およびニューロペプチドのインスリン・スーパーファミリーのメンバーであり、その生物学的作用は、細胞表面受容体と結合することによって達成される。IGFの作用は、IGFのトランスポーターとしてはたらき、それらを分解から保護し、それらの受容体との結合を制限し、そして生物学的に不活性なIGFの「貯蔵庫」を維持する、IGF結合タンパク質（IGFBP）によって制御されている（Rosenfeld,R.G.およびRoberts,C.T.編、The IGF system,Molecular Biology,Physiology,and Clinical Applications（1999）、Humana Press、Totowa、227〜255頁の Martin,J.L.およびBaxter,R.C.、IGF binding proteins as modulators of IGF actions；Jones,J.L.およびClemmons,D.R.、Endocr.Rev.12（1995）10-21；Khandwala,H.M.ら、Endocr.Rev.21（2000）215-244； Rosenfeld,R.G.およびRoberts,C.T.編、The IGF system,Molecular Biology,Physiology,and Clinical Applications（1999）、Humana Press、Totowa、315〜327頁のHwa,V.ら、The IGF binding protein superfamily）。IGFおよび成長ホルモン（GH）の軸は、胎児期および幼児期の身体の成長の制御において大きな役割を果たしており、数十年にわたる基礎研究および臨床研究によって、それが新生物の成長の維持においても重要であることが証明されている（Khandwala,H.M.ら、Endocr.Rev.21（2000）215-244）。高い循環血中IGF-I濃度は、癌罹患率の重要な決定因子にもなり得る（Hankinson,S.E.ら、Lancet 351（1998）1393-1396；Holly,J.,Lancet 351（1998）1373-1374；Wolk,A.,Lancet 356（2000）1902-1903）。腫瘍組織における応答を媒介しているIGF系の事実上全てのレベル（IGF、IGFBP、IGF受容体）が、治療アプローチのための標的となり得る（Khandwala,H.M.ら、Endocr.Rev.21（2000）215-244；Fanayan,S.ら、J.Biol.Chem.275（2000）39146-39151；Imai,Y.ら、J.Biol.Chem.275（2000）18188-18194）。IGFBP-3が、IGF非依存性の抗増殖効果およびアポトーシス促進効果を有することも、ここで言及されるべきである（Wetterau,L.A.ら、Mol.Gen.Metab.68（1999）161-181；Butt,A.J.ら、J.Biol.Chem.275（2000）39174-39181）。
【０００３】
IGF-IおよびIGF-IIは、それぞれ70アミノ酸および67アミノ酸の67％同一の単一ポリペプチド鎖であり、インスリンと、約40％の配列同一性を共有しており、構造的相同性を共有していると推定されている。IGFの最初の29残基は、インスリンのB鎖と相同であり（B領域、1〜29）、次に、プロインスリンのCペプチドに類似している12残基（C領域、30〜41）、およびインスリンのA鎖に相同な21残基領域（A領域、42〜62）が続いている。カルボキシ末端オクタペプチド（D領域、63〜70）に対応するものは、インスリンおよびプロインスリンには存在しない（Murray-Rust,J.ら、BioEssays 14（1992）325-331；Baxter,R.C.ら、J.Biol.Chem.267（1992）60-65）。IGFは、翻訳の後にタンパク質分解によりC領域が除去されないインスリン・スーパーファミリーの唯一のメンバーである。インスリンの3D構造は、1960年代に最初に結晶構造が決定されて以来（Adams,M.J.ら、Nature 224（1969）491-492）、精力的に研究されてきた。現在では、異なる溶媒条件で結晶化されたインスリンのための、ならびに異なる種および化学的修飾由来の多くのバリアントのための、いくつかのオリゴマー状態のインスリンの構造が存在している。これは、この報告以前には明確な構造が入手されていなかったIGF（およびプロインスリン）と全く対照的である。その代わりに、IGF-Iの三次構造は、ブタのインスリンに基づいてモデリングされた（Blundell,T.L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75（1978）180-184）。IGF-Iの2D NMR研究によって、溶液構造がモデルと一致していることが確認された（Cooke,R.M.ら、Biochemistry 30（1991）5484-5491；Sato,A.ら、Int.J.Pept.Protein Res.41（1993）433-440）。しかしながら、おそらく、IGF-Iが3未満のpH値でのみNMRに必要な濃度で可溶性であるため、IGF-IのNMR研究では、低分解能の構造しか得られていない（Cooke,R.M.,etal.,Biochemistry 30（1991）5484-5491；Sato,A.,etal.,Int.J.Pept.Protein Res.41（1993）433-440）。さらに最近、IGF-II（Terasawa,H.ら、EMBO J.13（1994）5590-5597；Torres,A.M.ら、J.Mol.Biol.248（1995）385-401）およびN末端13アミノ酸伸張を付加的に保有しているIGF-IのGlu-3からArgへのバリアント（長-[Arg3]IGF-I）（Laajoki,L.G.ら、J.Biol.Chem.275（2000）10009-10015）に関して、比較的よく定義された構造が入手された。
【０００４】
IGFBP（インスリン様増殖因子結合タンパク質1〜6）は、216〜289残基のタンパク質であり、成熟IGFBP-5は252残基からなる（Wetterau,L.A.ら、Mol.Gen.Metab.68（1999）161-181）。全てのIGFBPが、共通のドメイン構成を共有している。最も高度な保存は、N末端（残基1〜約100）およびC末端（残基170〜）のシステイン・リッチ領域に見出される。N末端ドメインには保存されたシステインが12個見出され、C末端ドメインには6個見出される。中央の弱く保存された部分（Lドメイン）は、特異的プロテアーゼのための切断部位の大部分を含有している（Chernausek,S.D.ら、J.Biol.Chem.270（1995）11377-11382）。これまでに、いくつかの異なるIGFBPの断片が記載され、生化学的に特徴決定されている（Mazerbourg,S.ら、Endocrinology 140（1999）4175-4184）。突然変異誘発研究からは、高親和性IGF結合部位がN末端ドメインに位置していること（Wetterau,L.A.ら、Mol.Gen.Metab.68（1999）161-181；Chernausek,S.D.ら、J.Biol.Chem.270（1995）11377-11382）、ならびに少なくともIGFBP-3およびIGFBP-2は、2個の結合決定因子（N末端ドメインに1個、C末端ドメインに1個）を含有していることが示唆されている（Wetterau,L.A.ら、Mol.Gen.Metab.68（1999）161-181）。最近、IGFBPより低い親和性でIGFと結合するIGFBP関連タンパク質（IGFBP-rP）の群が記載された（Rosenfeld,R.G.およびRoberts,C.T.編、The IGF system,Molecular Biology,Physiology,and Clinical Applications（1999）、Humana Press、Totowa、315〜327頁のHwa,V.ら、The IGF binding protein superfamily）。IGFBPおよびIGFBP-rPは、IGFとの結合およびインスリンとの高親和性結合を含む、いくつかの生物学的作用にとって重要であると考えられる、高度に保存されたシステイン・リッチなN末端ドメインを共有している（Hwaら、1999）。例えば血漿消化によって生成したIGFBP-3のN末端断片も、インスリンと結合し、従って生理学的にインスリン作用と関連している可能性が高い。N末端ドメイン以外には、IGFBPとIGFBP-rPとの間に配列類似性は存在しない。
【０００５】
ヒトIGFBP 1〜6の配列は、スイスプロット（SwissProt）データベース（http：//www.expasy.ch）に詳細に記載されており、以下の登録番号によって同定される。
2005508295.tif 000003
【０００６】
下記に記載されるアミノ酸の位置は、成熟型ヒトIGF結合タンパク質の配列を示す（シグナリング・ペプチドの除去後の配列は、1位のアミノ酸から開始する。表1〜6も参照のこと）。
【０００７】
インスリン様増殖因子と新形成との関連は、腫瘍におけるIGFシグナリング経路の阻害が、癌療法における優れた戦略となり得ることを示している。そのようなモジュレーションは、例えば、組換え阻害性IGFBPおよびそれらの有効断片の外因的投与によって達成され得る。さらに、腫瘍細胞IGFBP産生、阻害、または分解は、腫瘍IGFBP産生を修飾するタモキシフェンおよびICI 182,780のような薬剤によって調節され得る（Khandwala,H.M.ら、Endocr.Rev.21（2000）215-244）。結果として生じるIGFBP-3レベルの改変は、場合によっては、IGF-Iにより刺激される細胞増殖を阻害すると考えられる（Khwandalaら、2000）。IGFBP-3が、Bax：Bcl-2タンパク質比率のモジュレーションを介した、乳癌細胞のアポトーシスのp53非依存性のエフェクターである可能性も最近証明された（Butt,A.J.ら、J.Biol.Chem.275（2000）39174-39181；Wetterau,L.A.ら、Mol.Gen.Metab.68（1999）161-181）。
【０００８】
IGFBPは、インビトロでは腫瘍細胞増殖の有意な阻害を示すが、インビボでは、極めて高い用量のみが腫瘍増殖を阻害する（van den Berg,C.L.ら、Eur.J.Cancer 33（1997）1108-1113）。従って、Van den Bergは、血清中半減期を延長するポリエチレングリコールにIGFBP-1を共有結合的にカップリングさせた。しかしながら、マウスにおいて、PEG化IGFBP-1が1日1回1mgという用量で与えられた場合ですら、部分的な応答しか観察されないため、PEG化IGFBP-1の阻害効果は、ヒトにおける治療的な介在にとってまだ十分でない。これは、確立された手法によってヒトへ投与され得ず、経済的に製造され得ない、50mg/kg日という用量に相当する。
【０００９】
IGF放出ペプチドが、Loddick,S.A.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95（1998）1894-1898およびLowman,H.B.ら、Biochemistry 37（1998）8870-8878によって記載されている。結合タンパク質からIGFを排斥することができる、その記載された分子は、IGFBPと結合するがIGF-IRを刺激することはできないIGF-Iの変異体、またはファージ・ディスプレイ・ライブラリーに由来する類似した特性を有する14アミノ酸ペプチドのいずれかである。それらペプチドの生物学的活性は、脳の側脳室への注射またはミニポンプによる注入による投与によって示された。
【００１０】
IGFに関する突然変異誘発研究により、IGFのアミノ酸残基、IGF-IのGlu3、Thr4、Gln15、およびPhe16、ならびにIGF-IIのGlu6、Phe48、Arg49、およびSer50が、IGFBPとの結合にとって重要であることが示された（Baxter,R.C.ら、J.Biol.Chem.267（1992）60-65；Bach,L.A.ら、J.Biol.Chem.268（1993）9246-9254；Luethi,C.ら、Eur.J.Biochem.205（1992）483-490；Jansson,M.ら、Biochemistry 36（1997）4108-4117）。Baxterら（1992）は、IGF-Iのアミノ酸残基Glu3、Thr4、Gln15、およびPhe16が、IGFBP-3との相互作用にとって重要であり、残基Phe49、Arg50、およびSer51が第2に重要であることを示唆した。IGF-IIのPhe26が、IGFの局所構造の変化においてある役割を果たしているが、IGFBPと直接的には結合しないことも、示唆された（Terasawa,H.ら、EMBO J.13（1994）5590-5597）。
【００１１】
Kalus,W.ら、EMBOJ.17（1998）6558-6572は、ヒトIGFBP-5のタンパク質分解研究、および残基40〜92間のIGFBP-5のドメイン（mini-IGFBP-5）［このドメインは、IGF-IおよびIGF-IIと、それぞれ37nMおよび6nMのKD値で結合する］のクローニングおよび発現を記載し；さらに、、NMRによる非複合体mini-IGFBP-5の溶液構造の決定を記載している。Kalusらは、IGFBP-5の残基Val49、Tyr50、Pro62、およびLys68〜Leu75であるいくつかのIGF結合部位を同定した。
【００１２】
Imai,Y.ら、J.Biol.Chem.275（2000）18188-18194は、IGF結合部位としてKalusらによって予測されたアミノ酸位置の五重置換パターンを各々有するIGFBP-3バリアントおよびIGFBP-5バリアントを記載している。Imaiらは、68位、69位、70位、73位、および74位のアミノ酸残基を同時に実質的に改変することにより、IGF-Iに対する親和性が、野生型IGFBP-5の親和性と較べて1000倍以上低下することを見出した。
【００１３】
Conover,C.A.ら、J.Biol.Chem.270（1995）4395-4400は、IGFBP-4のプロテアーゼ抵抗性変異体を記載している。Met135-Lys136の推定切断部位の周囲の4個のIGFBP-4変異体および野生型タンパク質は、全て、同等の親和性でIGFと結合する。
【００１４】
Byun,D.ら、J.Endocrinology 169（2001）135-143は、IGFBP-4によるIGF結合に関与しているいくつかの領域を推察している。セグメントLeu72〜Ser91またはLeu72〜His74の欠失により、IGF結合は消失する。ある種のシステイン残基の変異によっても、IGFの結合は有意に低下する。
【００１５】
従って、これらの記載された変異型インスリン様増殖因子結合タンパク質は、低下しているかまたは同等のIGF-Iおよび／またはIGF-IIに対する結合親和性を有する。有意に高い親和性を有し、従って改良された有効性を有するIGFBPの変異体は、従来知られておらず、そのような分子、およびIGFBPアンタゴニストを同定するための方法が必要とされている。
【発明の開示】
【００１６】
発明の概要
本発明は、インスリン様増殖因子IまたはIIと、IGFBP-1のアミノ酸39〜91、IGFBP-2のアミノ酸55〜107、IGFBP-3のアミノ酸47〜99、IGFBP-4のアミノ酸39〜91、IGFBP-5のアミノ酸40〜92、もしくはIGFBP-6のアミノ酸40〜92からなるポリペプチド、またはIGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、もしくはIGFBP-5の9〜12番目のシステイン、もしくはIGFBP-6の7〜10番目のシステインから少なくともなるそれらの断片との複合体を含む、X線回折に適した結晶を提供する（そのようなポリペプチドおよび断片を、以後、「mini-IGFBP」とも呼ぶ）。
【００１７】
そのような結晶は、IGF-I、IGF-II、およびIGFBPの結合部位の原子座標の決定に適しており、従って、IGF-IまたはIGF-IIとIGFBPとの間の相互作用を同定し、その安定性を向上させるためのこれらの分子の最適化を可能にする。好ましくは、その結晶は、1.5〜3.5Åの分解能でその複合体の原子座標の決定のためのX線を効果的に回折する。その結晶は、74.385Å×74.385Å×74.385Åという単位格子寸法を有する立方空間群P213で配列している。
【００１８】
本発明は、さらに、
（a）制限された立体配座可動性を示す複合体を形成するため、IGF-IまたはIGF-IIを、IGFBP-1のアミノ酸39〜91、IGFBP-2のアミノ酸55〜107、IGFBP-3のアミノ酸47〜99、IGFBP-4のアミノ酸39〜91、IGFBP-5のアミノ酸40〜92、もしくはIGFBP-6のアミノ酸40〜92からなるポリペプチド、またはIGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、もしくはIGFBP-5の9〜12番目のシステイン、もしくはIGFBP-6の7〜10番目のシステインから少なくともなるそれらの断片と接触させる段階、および
（b）そのようにして形成された複合体からX線回折に適した結晶を得る段階を含む、X線回折に適した結晶を作製するための方法を提供する。
【００１９】
この結晶を使用して、複合体の原子座標を決定することができる。
【００２０】
本発明はさらに、IGF-Iおよび／またはIGF-IIに対する増強された結合親和性を有する、IGFBPの変異体またはIGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、もしくはIGFBP-5の9〜12番目のシステイン、もしくはIGFBP-6の7〜10番目のシステインから少なくともなるそれらの断片の変異体を同定するための方法を含み、
（a）IGF-IまたはIGF-IIおよび以下のポリペプチドからなる結晶の原子座標に基づき、IGF-IまたはIGF-IIと、IGFBP-1のアミノ酸39〜91、IGFBP-2のアミノ酸55〜107、IGFBP-3のアミノ酸47〜99、IGFBP-4のアミノ酸39〜91、IGFBP-5のアミノ酸40〜92、もしくはIGFBP-6のアミノ酸40〜92からなるポリペプチド、またはIGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、もしくはIGFBP-5の9〜12番目のシステイン、もしくはIGFBP-6の7〜10番目のシステインから少なくともなるそれらの断片との複合体の三次元構造を構築する段階；
（b）IGF-IまたはIGF-IIと以下のIGFBPの変異体との間の疎水性相互作用が増強されるようIGF-IまたはIGF-IIの疎水性アミノ酸残基から5Å未満の距離にあるアミノ酸残基が修飾されている変異体を同定するため、該三次元構造およびモデリング法を利用する段階；
（c）上記の変異体を作製する段階；
（d）上記のIGFに対する増強された結合親和性を決定するため上記の変異体をアッセイする段階を含む。
【００２１】
本発明は、さらに、
（a）図5および6に示された原子座標により定義されたIGFとIGFBP-5との複合体の三次元構造を構築する段階；
（b）IGFとIGFBP-5との間の疎水性相互作用が増強されるよう疎水性に修飾され得る、IGF-Iのアミノ酸残基から5Å以下の距離にあるIGFBP-5のアミノ酸残基を同定するため、上記三次元構造およびモデリング法を利用する段階；
（c）上記の変異体を作製する段階；
（d）上記のIGFに対する増強された結合親和性を決定するため該変異体をアッセイすることを含む、IGF-Iに対する増強された結合親和性を有するIGFBP-5の変異体を同定するための方法を含む。
【００２２】
IGFBPが修飾されるアミノ酸は、好ましくは、IGFBP-1のアミノ酸39〜91、IGFBP-2のアミノ酸55〜107、IGFBP-3のアミノ酸47〜99、IGFBP-4のアミノ酸39〜91、IGFBP-5のアミノ酸40〜92、またはIGFBP-6のアミノ酸40〜92より選択される。
【００２３】
特に好ましいIGFBP変異体は、表7に記載されるIGFBP-5配列アラインメントに対応するアミノ酸残基49、70、および／または73において修飾されている。
【００２４】
従って、本発明は、IGF（「IGF」とは、本明細書において使用されるように、IGF-Iおよび／またはIGF-IIを意味する）に対する増強された親和性（好ましくは、対応する野生型IGFBPと較べて約3〜10倍増加した親和性）、インビトロおよびインビボでの改良されたIGF活性阻害効力を有し、従って改良された治療的有効性を有する変異型IGFBP（「IGFBP」とは、本明細書において使用されるように、IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5、および／またはIGFBP-6を意味する）を提供する。
【００２５】
本発明は、さらに、
（a）IGF-IおよびIGFBPからなる結晶の原子座標に基づき、IGF-IまたはIGF-IIと、IGFBP-1のアミノ酸39〜91、IGFBP-2のアミノ酸55〜107、IGFBP-3のアミノ酸47〜99、IGFBP-4のアミノ酸39〜91、IGFBP-5のアミノ酸40〜92、IGFBP-6のアミノ酸40〜92からなるポリペプチド、またはIGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、もしくはIGFBP-5の9〜12番目のシステイン、もしくはIGFBP-6の7〜10番目のシステインから少なくともなるそれらの断片との複合体の三次元構造を構築する段階；
（b）IGFBP-5の場合、アミノ酸49、50、70、71、および74、IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、およびIGFBP-6の場合、表7による対応するアミノ酸との疎水性結合により該IGFBPとの複合体を形成する化合物を同定するため、該三次元構造およびモデリング法を利用する段階；
（c）上記の化合物を作製すること；
（d）化合物とIGFBPとの間の結合を決定する段階を含む、IGFBPとの結合能を有する化合物を同定するための方法を提供する。
【００２６】
本発明は、さらに、有効量の前記IGFBP変異体を対象へ投与することを含む、対象、好ましくはヒト対象におけるIGFとIGFBPとの結合を阻害する方法を提供する。
【００２７】
発明の詳細な説明
本発明は、IGF-IまたはIGF-IIを、IGFBP、好ましくはIGFBP-5の短縮型N末端断片（mini-IGF）と共に共結晶化するための方法を提供する。ここで、その結晶は、原子座標を含む複合体の三次元構造の決定を可能にするために十分に高い分解能でX線を回折する。（例えば、コンピューターで読み取り可能な媒体で提供されるような）三次元構造は、IGF-IまたはIGF-IIに対する修飾された親和性、好ましくは改良された親和性を有するIGFBP変異体の合理的薬物設計にとって有用である。IGFBP-1〜IGFBP-5の9〜12番目のシステインまたはIGFBP-6の7〜10番目のシステインの間のアミノ酸によって形成され、さらにこの断片のN末端に最大7個のアミノ酸を含み、この断片のC末端に最大5〜20個のアミノ酸を含んでいる、IGFBPの単離された折り畳まれたドメインからなるポリペプチド（mini-IGFBP）と共に、IGF-Iを共結晶化するための方法が、特に提供される。BP-1のアミノ酸39〜91、IGFBP-2のアミノ酸55〜107、IGFBP-3のアミノ酸47〜99、IGFBP-4のアミノ酸39〜91、IGFBP-5のアミノ酸40〜92、もしくはIGFBP-6のアミノ酸40〜92、またはそれらの断片は、制限された立体配座可動性を示し、X線回折に高度に適したIGF-IまたはIGF-IIとの複合体を形成するのに特に適している。
【００２８】
そのような複合体は、X線回折による原子座標の決定にとって十分な方式で共結晶化される。その結晶は、1.5Å、または少なくとも3.5Åより良好な（短い）分解能で、複合体の原子座標の決定のためのX線を効果的に回折する。IGFBP断片は足場が2個のシステイン架橋の内部パッキングによって固定されており、三本鎖βシートによってさらに安定化されている、コンパクトな球状の構造を形成することができる。折り畳まれた断片は、依然として、高い結合親和性でIGF-IおよびIGF-IIと結合することができる。全長IGFBP、IGFBPの単離されたC末端ドメイン、またはN末端短縮を含まない断片のようなその他の型のIGFBPは、高い分解能のX線に基づく構造決定に適した方式ではIGFと共結晶化しない。
【００２９】
結晶構造を知ることにより、改良されたIGFとの相互作用を展開し、従ってIGFに対する増強された親和性を示し、結果として、改良されたIGFアンタゴニストとしての治療的効力を有する特定のIGFBP変異体の作製が可能となる。増加したIGFに対する親和性を有するそのようなIGFBP変異体は、インビトロおよびインビボで、天然に存在するIGFとIGF-I受容体（IGF-IR）との間の複合体の形成を防止し、それにより生物学的活性を有する遊離IGFの濃度を減少させることができる。従って、そのような合理的に設計されたIGFアンタゴニストは、天然IGFBPより効率的に、腫瘍増殖を阻害し、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導することができる。その結果、天然に存在するIGFBPに匹敵する効果を達成するための、親和性が増強された最適に設計されたIGFBP変異体の必要量はより低い用量でよい。
【００３０】
本発明のさらなる態様は、IGFBPのIGF結合部位と結合し、IGFとIGFBPとの間の阻害性複合体の形成を防止し、従って、IGFのタンパク質同化作用を活性化する非タンパク質性化合物の同定および最適化である。そのような「IGF放出化合物」は、FlexX（Kramer,B.ら、Proteins：Structure,Functions and Genetics 37（1999）228-241）のようなタンパク質−リガンド・ドッキング・プログラムを使用して、結晶データに基づき、本発明によって同定され得る。
【００３１】
本発明のX線回折パターンは、IGF放出化合物の三次元モデリングにとって有用な十分に高い分解能を有する。好ましくは、分解能は、1.5〜3.5Å、好ましくは1.5〜3.0Åの範囲にある。三次元モデリングは、これらのX線回折パターンから回析座標を使用して実施される。当技術分野において既知の分子モデリングのための1つまたはより多くのコンピュータ・プログラムに座標が記入される。そのような分子モデリングにおいては、少なくとも1個のIGF放出化合物の三次元構造に相当する原子座標を生成させるため、既知のX線回折分子モデリング・アルゴリズムまたは分子モデリング・ソフトウェアが利用され得る。
【００３２】
そのような化合物は、天然に存在するIGFの立体化学的相補性に基づきIGFBPに対する親和性を示す。本発明によるそのような立体化学的相補性は、図5および6に示された座標によって算出されるようなIGFBPの輪郭を形成する部位内表面残基とマッチする分子によって特徴付けられる。輪郭を定義する残基は、図5および6に示されている。本発明によるマッチングとは、同定された原子または原子団が、例えば水素結合を介してまたはエンタルピー低下（enthalpy-reduced）ファン・デル・ワールス相互作用によってIGFBP表面残基と相互作用し、それが、IGFBPとIGFとの間の相互作用を防止するか低下させ、それによって結合部位からの生物学的活性を有する化合物の放出を促進することを意味する。一般に、IGFBPの輪郭との立体化学的相補性を保有している分子の設計は、分子と標的受容体との間の適合性を化学的または幾何学的に最適化する技術によって達成されうる。この種類の既知の技術は、Sheridan,R.P.およびVenktaraghavan,R.、Acc.Chem.Res.20（1987）322；Goodford,P.J.、J.Med.Chem.27（1984）557；Verlinde,C.およびHol,W.,Structure 2（1994）577；ならびにBlundell,T.L.ら、Nature 326（1987）347によって概説されている。本発明に基づく最適化されたIGFBPリガンドの設計は、好ましくは、様々な官能基特徴を有するプローブ間の推定相互作用部位を決定するプログラムであるGRID（Goodford,P.J.、J.Med.Chem.28（1985）849-857）のようなソフトウェアの使用によって行われ、そして、タンパク質表面が、類似した阻害性のタンパク質または化合物の構造を決定するために表面部位を分析するために使用される。
【００３３】
プログラムDOCK（Kuntz,I.D.ら、J.Mol.Biol.161（1982）269-288）も、活性部位またはリガンド結合部位を分析し、相補的立体特性を有するリガンドを示唆するために使用され得る。ファルマコフォア仮説を検証し、スクリーニングのための化合物を選択するため、三次元データベースを探索するためのいくつかの方法論が、利用可能である。これらには、活性部位に既に位置している任意の数の化学的断片を接続するスペーサーとして機能し得る環式化合物のデータベースを使用するプログラムCAVEAT（Baconら、J.Mol.Biol.225（1992）849-858）が含まれる。プログラムLUDI（Bohm,H.J.ら、J.Comput.Aided Mol.Des.6（1992）61-78および593-606）は、水素結合性断片および疎水性断片の両方が適合する相互作用部位を定義する。
【００３４】
所望のファルマコフォアを保持している非タンパク質性分子も同定するための三次元データベース探索に適したプログラムには、MACCS-3DおよびISIS/3D（Molecular Design Ltd.,San Leandro,CA）、ChemDBS-3D（Chemical Design Ltd.,Oxford,U.K.）、およびSybyl/3DB Unity（Tripos Associates,St.Louis,MO）が含まれる。
【００３５】
ファルマコフォアの選択および設計に適したプログラムには、DISCO（Abbott Laboratories,Abbott Park,IL）、Catalyst（Bio-CAD Corp.,Mountain View,CA）、およびChemDBS-3D（Chemical Design Ltd.,Oxford,U.K.）が含まれる。
【００３６】
化学構造のデータベースは、ケンブリッジ結晶学データセンター（Cambridge Crystallographic Data Centre）（Cambridge,U.K.）およびケミカル・アブストラクツ・サービス（Chemical Abstracts Service）（Columbus,OH）を含む多数の供給元より入手可能である。
【００３７】
新規設計プログラムには、Ludi（Biosyrn Technologies Inc.,San Diego,CA）、Sybyl（Tripos Associates）、およびAladdin（Daylight Chemical Information Systems,Irvine,CA）が含まれる。
【００３８】
当業者であれば、そのような化合物の設計が、本発明の方法を使用して設計または同定された化学構造のわずかな構造的な改変または調整を必要としうることを認識するであろう。
【００３９】
増加したIGFに対する結合親和性を有する非タンパク質性化合物およびIGFBP変異体は、その化合物または変異体をIGF-I/IGFBP-5複合体と共にインキュベートし、放出されたIGF-IのIGF-I受容体発現細胞との結合を測定することにより同定され得る。IGF-Iとその細胞結合受容体との結合によって、受容体は活性化され自己リン酸化される。あるいは放射標識されたIGF-Iを使用し、複合体からの放出後の、それとその受容体との結合を決定してもよい。
【００４０】
IGF-I mini-IGFBP-5複合体の形成は、合計約550Å2の結合表面を覆い隠す。IGFから5Å未満にある11個のIGFBP-5アミノ酸残基のうち、6個が疎水性であり、そのうちの3個が、表面に露出したロイシンおよびバリンであり、IGFとの疎水的相互作用にとって最も重要である（図1〜4）。IGFの側では、mini-IBFBP-5から5Å未満にある11個のアミノ酸残基のうち、4個が疎水性である（図1〜4）。
【００４１】
IGFBPは、IGFの結合表面と相補的な結合表面を提示することにより、IGF-IおよびIGF-11と結合する。IGF結合表面は、比較的平らな疎水性表面、小さな疎水性のくぼみ、2個の疎水性の突起、および周囲の極性残基からなる。IGF結合表面自体（図3）の同定は、一般的結合パートナーの設計および既知の結合パートナーの最適化を特に可能にする。一般的結合パートナーは、以下の特色1〜4のうちの少なくとも二つを有するであろう。
【００４２】
1．少なくとも20平方オングストロームのほぼ平面的な疎水性の分子表面を提示するよう、IGF残基Glu9、Glu3、Leu54、Phe16、およびBP5原子Tyr50 OHによって定義された、図3に図示された周辺内で、Leu74 CD1およびCD2、VAL49 CG1およびCG2、Leu70 CB、およびTyr50 CBによって定義された平面にほぼ存在する無極性原子。
【００４３】
2．複合体構造に見られるようなIGFのくぼみを充填しているIGFに対してLeu70 CG、CD1の位置の近傍の無極性原子。
【００４４】
3．少なくとも20平方オングストロームの複合体内の正味の覆い隠された表面積によって定義されるようなIGFのPhe16、Val17、および／またはLeu54の側鎖との疎水性および／または芳香族性の相互作用。
【００４５】
4．以下のIGF原子：Asp12 OD1、2；Glu9 OE1、2；Glu3 OE1、2；Glu58 OE1、2；Thr4 O、OG1；Cys52 O；Ser51 OG；Asp53 OD1、2；Arg55 NH1、2、NE；Arg21 NH1、2、NE；Val17 O；Cys18 O；Asp20 OD1、2、N；Gln15 O、OD1、ND2のうちの1つまたはより多くとの、直接的な、または架橋溶媒分子を介した、極性（水素結合性および／または電荷相補的）相互作用。
【００４６】
略語：（International Union of Physicists and Chemists（IUPAC命名法）による）標準的なアミノ酸原子命名法に対応する文字。
CG：炭素 Cγ
CB：炭素 Cβ
OE：酸素 Oε
OH：酸素 Oη
OD：酸素 Oδ
O：骨格酸素
NH：窒素 Nη
NE：窒素 Nε
N：骨格窒素
ND：窒素 Nδ
【００４７】
IGF-I mini-IGFBP-5相互作用の例で示される主要なIGF/IGFBP相互作用は、織り交ぜられた、IGF-Iの突出している側鎖と、mini-IGFBP-5の溶媒へと露出されている疎水性側鎖とからなる疎水性サンドイッチである（図1〜4）。IGF-I Phe16、Leu54、およびGlu3の側鎖は、mini-IGFBP-5上の間隙へ深く挿入されている（図1〜4）。この間隙は、残基Cys60およびLeu61によって形成された基盤と共に、分子の溶媒へと露出されている側面のArg53、Arg59の側鎖、および反対の内側のVal49、Leu70、Leu74によって形成されている。Phe16は、mini-IGFBP-5のVal49の骨格および側鎖、ならびにCys60と直接接触している。疎水性クラスターは、IGF-IのGlu3およびGlu9、ならびにmini-IGFBP-5のHis71およびTyr50の側鎖により溶媒側面で閉じている。これらの残基は、水素結合のネットワークを形成しており；さらに、mini-IGFBP-5のArg59はGlu58と水素結合している（図2〜4）。
【００４８】
mini-IGFBP-5のArg53およびArg59は、C末端近傍の溶媒から疎水性サンドイッチを隔離している。全長IGFBP-5において、mini-IGFBP-5のC末端に相当するセグメントの後には、9個の親水性残基、次いで少なくとも30個の混合型の残基が続いている。従って、mini-IGFBP-5のC末端近傍の複合体の構造で見られた立体配座は、IGF-Iと全長IGFBP-5との複合体において保存されている可能性が高い。mini-IGFBP-5ドメインは、好ましくは、全長IGFBP-5の残基40から開始する。
【００４９】
IGFBP-5の疎水性残基Val49、Leu70、およびLeu73は、IGFとの結合にとって重要である。これらの残基は、全てのIGFBPにおいて高度に保存されているため、これらの疎水的相互作用は、全てのIGFBPのIGF結合特性を支配する。
【００５０】
変異型IGFBPおよびそれらの断片の増加した阻害効力は、野生型タンパク質および対応する断片に関して観察されるより有意に低い濃度での、（Kalus,W.ら、EMBO J.17（1998）6558-6572によって記載されたような）IGF-IRとの結合およびIGF-IRの自己リン酸化の阻害をもたらす。変異型IGFBPのより高い効力は、さらに、インビトロおよびインビボにおける腫瘍細胞の増殖の阻害によって示され得る。いくつかの腫瘍細胞系の増殖が、IGFBPによって有意に低下することが既知である。IGFBP-1は、例えばインビトロのMCF-7細胞およびMDA-MB-435A細胞の増殖、ならびにマウスにおけるインビボの腫瘍により形成されたMDA-MB-231細胞の増殖を阻害する（van den Berg,C.L.ら、Eur.J.Cancer 33（1997）1108-1113）。増加した親和性を有するIGFBP変異体は、野生型タンパク質より低い濃度でこれらの腫瘍細胞の増殖を阻害する。
【００５１】
IGFBPの以下の変異が、IGFに対する結合親和性の増強にとって好ましい（図1において整列させられたようなIGF-BP5による番号付け）（標準的なアミノ酸の一文字表記を使用）。
【００５２】
（表１）IGFBP-1
2005508295.tif 000004
【００５３】
（表２）IGFBP-2
2005508295.tif 000005
【００５４】
（表３）IGFBP-3
2005508295.tif 000006
【００５５】
（表４）IGFBP-4
2005508295.tif 000007
【００５６】
（表５）IGFBP-5
2005508295.tif 000008
【００５７】
（表６）IGFBP-6
2005508295.tif 000009
1）アミノ酸は、標準的な一文字アミノ酸記号で与えられており、代替的なアミノ酸交換（または）として理解されるべきである。例えば、表6の最後の行は、ロイシン（L）であるIGFBP-6のアミノ酸残基75が、好ましくはヒスチジン（H）またはアスパラギン酸（D）のいずれかへと修飾され得ることを意味する。表6は、さらに、アミノ酸49、50、53、61、68、70、73、74、および／または75が親和性を改良するために交換されうるものと解釈されたい。特に好ましいのは、単一の点変異を有するIGFBP変異体である。最も好ましいのは、太字残基からの単一の点変異を有するIGFBP変異体である。これは、その他の表にも相応じて当てはまる。
【００５８】
（表７）IGFBP-1〜6の対応するアミノ酸を示す配列アラインメント
2005508295.tif 000010
【００５９】
提示された構造は、「遊離」生理活性IGFを放出する能力を有する小さなIGFBPリガンド阻害剤に関するコンピューターによる（in silico）スクリーニングを可能にする。結合タンパク質からのIGFの置換は、低身長、腎不全、I型およびII型糖尿病、発作、ならびにその他の神経変性性疾患を含む多様な可能性のある適応症の治療において治療的に有用である。
【００６０】
本発明の化合物およびIGFBP変異体は、当業者に既知の、組成物、好ましくは薬学的組成物の調製のための方法によって製剤化され得る。好ましくは、そのような化合物およびIGFBP変異体は、薬学的に許容される担体との混合物として組み合わせられる。そのような許容される担体は、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences、第18版、1990、Mack Publishing Company、Osloら編（例えば、1435〜1712頁）に記載されている。典型的な組成物は、適当な量の担体と共に、有効量、例えば約1〜10mg/mlの本発明に係る非タンパク質性化合物またはIGFBP変異体を含有している。化合物およびIGFBP変異体は、好ましくは非経口的に投与され得る。
【００６１】
本発明は、さらに、本発明に係る非タンパク質性化合物またはIGFBP変異体を含有している薬学的組成物を提供する。そのような薬学的組成物は、薬学的に許容される希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、佐剤、および／または担体と共に、有効量の本発明の化合物およびIGFBP変異体を含有している。そのような組成物には、様々な緩衝能（buffer contents）（例えば、酢酸、リン酸、リン酸緩衝食塩水）、pH、およびイオン強度の希釈剤；界面活性剤および可溶化剤（例えば、Tween（登録商標）80、ポリソルベート、Pluronic（登録商標）F68）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存剤（例えば、Timersol（登録商標）、ベンジルアルコール）、ならびに賦形物質（例えば、ショ糖、マンニトール）のような添加剤が含まれる。
【００６２】
本発明に係る組成物および薬学的組成物は、純粋な凍結乾燥形態の物質が、中性pH値のPBSまたは生理的塩化ナトリウム溶液に最大1〜20mg/lの濃度で溶解させられるよう製造される。より良好な可溶性のため、界面活性剤を添加することが好ましい。
【００６３】
典型的には、標準的な癌治療計画において、患者は、1日当たり体重1kg当たり0.5〜10mgの物質という範囲の投薬量により治療される。
【００６４】
以下の実施例、参照、配列表、および図面は、本発明の理解を補助するために提供され、本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載される。本発明の本旨を逸脱することなく、その記載された手法に修飾を施し得ることが理解される。
【００６５】
配列表
配列番号：1  プライマーFBP5LY
配列番号：2  プライマーRBP5LY
配列番号：3  プライマーFBP5LM
配列番号：4  プライマーRBP5LM
配列番号：5  プライマーIBP4NdeI
配列番号：6  プライマーIBP4BamHI
配列番号：7  ペプチドGSALA
配列番号：8  ペプチドGSHMDEAIH
【００６６】
実施例1
結晶化、データ収集、および誘導体化
mini-IGFBP-5は、Kalus,W.ら、EMBO J.17（1998）6558-6572および実施例6に記載されたようにして作製し、IGF-IはOvoPepi（Australia）より入手した。10％ Jeffamine M-600、0.1Mクエン酸ナトリウム、0.01M塩化第二鉄、pH5.6により、結晶化に成功した。結晶は、4℃で11日以内に出現し、約0.3×0.2×0.2mm3という最終サイズへと成長した。それらは、立方空間群P213に属し、単位格子寸法a、b、c＝74.385Åを有し、非対称単位中に1個の複合体分子を含んでいた。重原子化合物を含む沈殿緩衝液への浸漬によって、解釈可能な誘導体K2PtCl4（2.7mM、3d）を得た。全ての回析データを、グラファイトで単色化したCuKα線により、Rigaku（Tokyo,Japan）RU300回転対陰極型X線発生装置に取り付けられた300mm MARリサーチ（Research）（Hamburg,Germany）イメージング・プレート検出器を使用して収集した。全てのイメージング・プレート・データを、MOSFLM（Moras,D.,Podjarny,A.D.およびThierry,J.C.編、Crystallographic Computing 5（1991）、Oxford University Press、Oxford、UK、50〜61頁のLeslie,A.G.W.、Molecular Data in Processing）およびCCP4プログラム（Collaborative Computational Project、Number 4、1994年）により処理した。
【００６７】
実施例2
位相計算、モデル構築、および精密化
IGF/mini-IGFBP-5複合体の構造を、前記の1個の重原子誘導体を使用した単一同形置換（s.i.r.）法により解明した。まず、同形差パターソン図を使用し、SHELX-97（Moras,D.、Podjarny,A.D.、およびThierry,J.C.編、Crystallographic Computing 5（1991）、Oxford University Press、Oxford、UK、145〜157頁のSheldrick,G.、Tutorial on automated Patterson interpretation to find heavy atoms）で実行されたパターソン・ベクトル重ね合わせ法を利用することにより、誘導体データをネイティブ・データ・セットと共に分析した。2個のヘビー・サイト（heavy sites）の位置を、CCP4プログラムを使用して、適切な初期シングル・サイト（single site）s.i.r位相を用いて、差フーリエ法によって確認した。重原子パラメーターの精密化およびs.i.r位相の計算は、SHARP（de la Fortelle,E.およびde Bricogne,G.、Methods Enzymol.276（1997）472-494）を用いて行った。最終パラメーターを、表8に示す。初期s.i.r位相を、45％の溶媒画分を使用して、SOLOMON（Abrahams,J.P.およびLeslie,A.G.W.、Acta.Cryst.D52（1996）30-42）により精密化し、解釈可能な2.1Å電子密度図を得た。精密化は、CNS1.0（Brunger,A.T.ら、Acta Crystallogr.D54（1998）905-921）において実行されるような共役勾配プロトコルおよび焼きなましプロトコルによって実施した。全てのプロトコルが、個々の等方性B因子の精密化および振幅に基づく最尤ターゲット関数（maximum likelihood target function）の使用を含んでいた。47個の水分子を含む最終モデルに関して、R因子は、21.8％にまで低下した（Rフリー＝26.2％、分解能範囲16.2〜2.1Å）。水モデルは、ARPを使用して計算し、視覚的検討によって確証した。最終精密化統計を表8に示す。
【００６８】
（表８）結晶解析からの統計
2005508295.tif 000011
2005508295.tif 000012
RCullis-iso＝r.m.s.ラック・オブ・クロージャー（lack of closure）/r.m.s同形差（isomorphous difference）
2005508295.tif 000013
平均FOM＝平均フィギュア・オブ・メリット（figure of merit）
Rcryst＝精密化において使用された反射に関する結晶学的R因子
Rfree＝精密化において使用されなかった反射に関する結晶学的R因子
r.m.s.＝二乗平均
【００６９】
実施例3
IGFBP変異体の結合親和性の決定
野生型断片および変異体断片ならびに全長IGFBPのIGF結合特性を、ビアコア（BIAcore）バイオセンサー測定によって定量的に分析した。ビアコア2000、センサー・チップSA、およびHBSを、BIAcore AB（Uppsala,Sweden）より入手した。全ての実験を25℃で実施し、HBS（20mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、pH7.5）を、ランニング・バッファーとして、そしてリガンドおよびアナライトの希釈のため使用した。ビオチン化IGF-Iを、40および110レゾナンス・ユニット（RU）のシグナルが生じるよう、ストレプトアビジンでコーティングされたセンサー・チップへ、5μl/分の流速で、HBS中5nMおよび10nMの濃度で固定化した。ビオチン化IGF-IIは、20RUのシグナルが生じるようHBS中5nMの濃度で固定化した。空のフロー・セルを、非特異的結合および容積効果に関する対照として使用した。物質輸送制限（mass transport limitations）および再結合を制限するため、低いリガンド濃度が必要であった。同じ理由で、100μl/分という可能な限り高い流速で、全ての動力学的実験を実施した。各タンパク質（野生型および変異型のIGFBPまたはこれらのタンパク質の断片）を、4つの濃度（250 nM、50 nM、10 nM、および2nM）で注入した。各試料を、2分間注入した後、4分間バッファー流中で解離させた。解離過程の後、5μl/分の流速で10μlの100mM HClを注入することによって、センサー・チップを再生させた。動力学的パラメーターは、BIAevaluation 3.0ソフトウェア （BIAcore AB）を使用して計算した。ブランク・センサーグラムの差し引きの後、「物質輸送による1：1結合（1：1 binding with mass transfer）」と呼ばれる方法を使用して、全ての濃度の1個のアナライトのセンサーグラムのオーバーレイの一般的な適合から、動力学的速度定数を計算した。IGF-IおよびIGF-IIは、ビオチン・プロテイン・ラベリング・キット（Biotin Protein Labelling Kit）（Roche Diagnostics GmbH,DE）の試薬および取り扱い説明書を使用して、5倍モル過剰のD-ビオチニル-ε-アミノカプロン酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルによりビオチン化した。リジンによるブロッキングの後、反応物を、50mMリン酸Na、50mM NaCl、pH7.5に対して透析した。
【００７０】
実施例4
IGF-Iにより誘導されるIGF-IRリン酸化のIGFBP変異体による阻害
3.5cmディッシュ内のヒトIGF-IRを安定的に発現しているNIH3T3細胞のコンフルエント単層を、0.5％透析済みウシ胎仔血清を含有しているDMEM中で飢餓状態にした。48時間後、細胞を、ホルモンの非存在下で、または5×10-9M IGF-Iまたは1×10-8M IGF-IIと共にインキュベートし；各試料を、増加する濃度の異なるIGF結合タンパク質またはそれらの断片と共に室温で1時間プレインキュベートした。37℃で10分間刺激した後、培地を除去し、氷上で10分間、250μl溶解緩衝液（20mMヘペス（Hepes）、pH7.5、150 mM NaCl、10％グリセロール、1％ノニデット（Nonidet）P40、1.5mM MgCl2、1mM EGTA（エチレングリコール-ビス（2-アミノエチル）-N,N,N',N'-四酢酸、Aldrich, USA）、10mMオルトバナジン酸ナトリウム、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル・コンプリート（Complete）（Roche Diagnostics GmbH,DE）により細胞を溶解させた。続いて、細胞をプレートから剥離し、不溶性材料を4℃で20分の遠心分離によって分離した。上清のタンパク質濃度を、ピアース（Pierce）（Rockford, USA）のBCAキットを使用して製造業者の指示に従い決定した。等しいタンパク質濃度を、SDS試料緩衝液（63mMトリス（Tris）-HCl、pH 6.8、3％SDS、10％グリセロール、0.05％ブロモフェノール・ブルー、100mM DTT）と共にインキュベートし、5分間煮沸し、7.5％SDSポリアクリルアミド・ゲルに載せた。電気泳動の後、タンパク質をニトロセルロース膜に移し、それを、まず、3％BSA含有PBST（リン酸緩衝生理食塩水−Tween（登録商標））で1時間ブロッキングし、次いで、1μg/mlモノクローナル抗ホスホチロシン抗体3-365-10（Roche Diagnostics GmbH,DE）を含む3％BSA含有PBSTと共に一夜インキュベートした。未結合抗体を、徹底的な洗浄によって除去した。次いで、ブロットを1：10000希釈の西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ結合抗マウスIgG特異的抗体（Roche Diagnostics GmbH,DE）と共にインキュベートした。そのイムノブロットを、アマシャム（Amersham）のECLキットを使用して可視化し、IGF-I受容体リン酸化の50％の阻害をもたらすIGFBPの濃度を決定した。
【００７１】
実施例5
IGFBP変異体による腫瘍細胞増殖の阻害の決定
（ATCC、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）,Rockville,Maryland,U.S.A.,HTB22からの）MCF-7細胞を、腫瘍細胞に対するIGFBP変異体の阻害効果を調査するために使用した。1ウェル当たり1000個のMCF-7細胞を、2.5％FBS（ウシ胎仔血清）を含有している培地に入れて播いた。その細胞を、48時間、様々な濃度のIGFBPの存在下で培養した。生存細胞の割合（％）を、MTT（3-［4,5-ジメチルチアゾール-2イル］-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド）アッセイ法によって決定し、細胞生存率を50％低下させる結合タンパク質の濃度を決定した。
【００７２】
実施例6
mini-IGFBP-5の突然変異誘発、発現、および精製、ならびにIGFBP-4のPet-28a（+）へのサブクローニング
6.1  緩衝液および培地
細胞増殖培地：
LB培地  1リットル当たり：ペプトン10g、酵母抽出物5g、NaCl 10g、pH 7に調整。
LBアガー  1リットル当たり：ペプトン10g、酵母抽出物5g、NaCl 10g、バクトアガー15g、pH 7に調整。
最少培地  1リットル当たり： NaCl 0.5g、クエン酸一水化物1g、クエン酸第一鉄36mg（濃HClに予め溶解）、KH2PO4  4.02g、K2HP04  7.82g、15N-NH4Cl 1g、微量元素溶液（ストック溶液1リットル当たり：2.5g H3BO3、2.0g CoCl2、1.13g CuCl2、9.8g MnCl2、2.0g Na2MoO4）1.3ml、Zn-EDTA溶液（ストック溶液1ml当たり：5mg EDTA、8.4mg 酢酸亜鉛）1ml、pH 7に調整、オートクレーブ処理。後に添加：オートクレーブ処理済み20％（w/v）グルコース25ml、滅菌ろ過済み1％（w/v）チアミン560μl、1M MgS04 2ml。
【００７３】
抗生物質ストック：
アンピシリン  蒸留水中50mg/ml、0.22μm濾過、−20℃で保管。
カナマイシン  蒸留水中25mg/ml、0.22μm濾過、−20℃で保管。
クロラムフェニコール  96％エタノール中35mg/ml、−20℃で保管。
【００７４】
アガロース・ゲル電気泳動：
TAE緩衝液（50×）  2M Tris-HCl（pH 8.0）、2M氷酢酸、および50mM EDTA。
ローディング緩衝液（3×）  0.13％ブロモフェノール・ブルー、0.13％キシレンシアノール、30％グリセロール。
Et-Br溶液  ddH20中の10mg/ml臭化エチジウム。
【００７５】
SDS-PAGE：
試料緩衝液（5×）  125mMトリス-HCl（pH 6.8）、10％SDS、760mM 2-メルカプトエタノール、0.13％ブロモフェノール・ブルー、50％グリセロール、および2mM EDTA。
染色溶液  500ml 96％エタノールおよび500ml 10％酢酸中の0.125％CBB-R250。
脱染溶液  4：3：3比の96％エタノール、10％酢酸、および蒸留H20。
【００７６】
トリシン・ゲル：
陰極（上部）ランニング緩衝液（10×）  1Mトリス-HCl（pH8.25）、1Mトリシン、および1％SDS。
陽極（下部）ランニング緩衝液（10×）  2Mトリス-HCl（pH8.9）。
分離緩衝液  3Mトリス-HCl（pH8.9）および0.3％SDS。
濃縮緩衝液  1Mトリス-HCl（pH6.8）および0.3％SDS。
分離アクリルアミド  48％（w/v）アクリルアミド、1.5％（w/v）N,N'-メチレン-ビス-アクリルアミド。
濃縮アクリルアミド  30％（w/v）アクリルアミド、0.8％（w/v）N,N'-メチレン-ビス-アクリルアミド。
APS ddH2O中の10％過硫酸アンモニウム。
分離ゲル（主要）  2個の70×80×0.75mmミニ・ゲル用： H2O 1.675ml、分離緩衝液2.5ml、分離アクリルアミド2.5ml、グリセロール0.8ml、APS 25μl、およびTEMED 2.5μl。
分離ゲル（中間）  H2O 1.725ml、分離緩衝液1.25ml、分離アクリルアミドO.75ml、APS 12.5μl、およびTEMED 1.25μl。
濃縮ゲル  H20 2.575ml、濃縮緩衝液0.475ml、濃縮アクリルアミド0.625ml、0.5M EDTA（pH8.0）12.5μl、APS 37.5μl、およびTEMED 1.9μl。
【００７７】
タンパク質精製：
緩衝液A  6Mグアニジウム-HCl、100mM NaH2PO4、10mMトリス、および10mM 2-メルカプトエタノール、pH8.0。
緩衝液B  6Mグアニジウム-HCl、100mM NaH2PO4、10mMトリス、および10mM 2-メルカプトエタノール、pH6.5
緩衝液C  6Mグアニジウム-HCl、100mM酢酸Na、および10mM 2-メルカプトエタノール、pH4.0。
緩衝液D  6Mグアニジウム-HCl、pH3.0。
緩衝液E  200mMアルギニン、1mM EDTA、100mMトリス-HCl、2mM還元型グルタチオン、2mM酸化型グルタチオン、pH8.4。
PB（0）  10mM Na2HP04、1.8mM KH2PO4、および0.05％NaN3、pH7.2。
PB（1000） 10mM Na2HP04、1.8mM KH2PO4、0.05％NaN3、および1M NaCl、pH7.2。
PBS  140mM NaCl、27mM KCl、10mM Na2HP04、1.8mM KH2PO4、および0.05％NaN3。
トロンビン切断緩衝液  60mM NaCl、60mM KCl、2.5mM CaCl2、50mMトリス、pH8.0。
【００７８】
6.2  mini-IGFBP-5のクローニング
mini-IGFBP-5（IGFBP-5の残基40〜92）を、IGFBP-5の完全配列を含有しているベクターからpQE30ベクター（Qiagen,Hilden,Germany）のBamHIおよびPstI制限部位へサブクローニングした。制限部位、終止コドン、およびN末端トロンビン切断部位をコードする21塩基を、PCR（Kalus,W.ら、EMBO J.17（1998）6558-6572）によって導入した。
【００７９】
6.3  ミニIGFBP-5の突然変異誘発
TyrによるLeu61の置換、およびMetによるLeu74の置換をもたらす変異の導入のため、インビトロ突然変異誘発を、クイックチェンジ（QuickChange）（商標）部位特異的突然変異誘発キット（Stratagene,La Jolla,Canada）を使用して実施した。以下の2セットの突然変異誘発オリゴヌクレオチド・プライマーを、プラスミドDNAの増幅および所望の点変異の導入のため設計した。
2005508295.tif 000014
変化させたコドン（L61Y変異体におけるCTC→TAC、およびL74M変異体におけるCTG→ATG）は、太字で示されている。変更した（degenerated）塩基には下線が施されている。
【００８０】
反応は、突然変異誘発キット・マニュアルに見出される指示に従って準備した。PCR混合物（50μl）は、およそ50ngの鋳型（ミニ・プレップ・スピン・カラム・キット（mini prep spin columns kit）,Qiagenによって調製されたpQE30（mini-IGFBP-5））および各125ngの2個のオリゴヌクレオチド・プライマーを含有していた。反応のためのサイクリング・パラメーターは、以下の通りであった： 95℃30秒の後、95℃30秒、55℃1分、および68℃7.5分を13サイクル。DpnI消化およびXL1-Blueスーパーコンピテント（supercompetent）細胞の形質転換は、供給元の指針に厳密に従い実施した。
【００８１】
各変異体の2個のクローンを、自動二本鎖配列決定による確証に供したところ、4つの場合全てにおいて、期待される置換が存在することが立証された。
【００８２】
6.4  変異型mini-IGFBP-5の発現
エレクトロコンピテント（Electrocompetent）細胞BL21を、変異を保持している構築物により形質転換した。新鮮なプレートから、37℃で1ml当たり300μgのアンピシリンの存在下で3mlのLB培養を開始し、翌日まで（6〜7時間）増殖させた。この培養物から、50μlを20mlのMMに接種するために使用した。この培養物を、一夜（9〜11時間）増殖させた。1lの培養物を1：50比で接種した。OD600≡0.8で、IPTG（1mM最終濃度）の添加によりタンパク質の発現を誘導した。3時間後に細胞を採集した（6000×G、20分、4℃）。
【００８３】
6.5  mini-IGFBP-5の精製
採集された細胞を、緩衝液Aに再懸濁し（1lの培養物から細胞を再懸濁させるために緩衝液30mlを使用した）、1時間〜一夜、激しく振とう（280RMP）しながら室温でインキュベートした。超音波処理によって細胞を破壊した（マクロチップ（macrotip）、50％デューティ・サイクル（duty cycle）、出力コントロール（output control）70、2×4分）。次いで、細胞片をペレット化するため、細胞抽出物を遠心分離した（65 000×G、1時間、室温）。上清のpHを、およそ8.0の値に調整した。次いで、上清を、緩衝液Aで予め平衡化されたNi-NTAスーパーフロー（Superflow）マトリックス（Qiagen）と混合し、1時間〜一夜撹拌しながらインキュベートし、次いで空のカラム（培養物1lにつき3mlのベッド容量）に載せた。UV吸収基底線が安定するまで、緩衝液A、続いて緩衝液Bでカラムを洗浄した。結合タンパク質を、緩衝液BおよびCの100mlのpH勾配により分画した。収集された画分を、トリシン・ゲル電気泳動により分析した（電気泳動の前に、タンパク質を5％（w/v）TCAにより沈殿させた）。mini-IGFBP-5を含有している画分をプールし、アミコン（Amicon）YM3で2〜4mlに濃縮し、2lの緩衝液Dに対して一夜透析した（透析の前に、100μl過剰の2-メルカプトエタノールを試料に添加した）。
【００８４】
再折り畳みを促進するため、透析された試料を、激しく撹拌しながら、新鮮に調製された氷冷緩衝液Eへ（緩衝液E 50ml当たり試料1mlの割合で）100μlずつ希釈し、撹拌しながら2〜3日間4℃で放置した。
【００８５】
試料をアミコン（Amicon）YM3で15〜25mlに濃縮し、沈殿した材料を取り除くため遠心分離し、30mM NaClを含有している緩衝液PB 4lに対して一夜透析した。
【００８６】
続いて、溶液を、緩衝液PB（0）で予め平衡化されたモノ（Mono）S 5/5 HR陽イオン交換体カラム（およそ1ml）（Amersham Pharmacia,Uppsala,Sweden）へ1ml/分の流速で載せた。カラムを緩衝液PB（0）で洗浄した。0〜70％NaClの45mlの直線勾配によりタンパク質を溶出させ、1ml画分を収集した。
【００８７】
（トリシン・ゲル電気泳動に基づき決定されたような）mini-IGFBP-5を含有している画分をプールし、2〜3mlに濃縮し、PBSで予め平衡化されたスーパーデックス（Superdex）75ハイロード（HiLoad）26/60（およそ320ml）ゲルろ過カラム（Pharmacia）に0.6ml/分の流速で載せた。mini-IGFBP-5は、左右対称の単一ピークとして溶出した。タンパク質を含有している画分をプールし、セントリコンYM3で濃縮した。
【００８８】
6.6  pET-28a（+）へのサブクローニング
pQE30からのタンパク質の全体的に低い発現の理由は、このベクターが大腸菌における発現にとって良好に最適化されていないという事実である可能性がある。例えば、ベクターによりコードされた配列は、開始コドンAUGの直ぐ下流に3個の稀少コドンのクラスター（すなわち、それぞれArg、Gly、およびSerをコードするAGA、GGA、およびTCG）を含有している。多数の研究が、標的遺伝子における過度の稀少コドンの使用頻度が、低レベル発現の原因となり得ることを示している。その影響は、複数の稀少コドンがアミノ末端近傍に存在する場合、および連続的に出現する場合に、最も重篤であると考えられている。特に、ArgコドンAGGおよびAGAの存在は、タンパク質産生のレベルに重篤な効果を及ぼし得る。その系は、また、良好に抑制されていないと考えられ（Lacリプレッサーをコードする遺伝子の追加コピーが存在しない）、そして漏出発現（leaky expression）が、観察されたプラスミド不安定性を引き起こしている可能性がある。そのベクターは、不安定なプラスミドを欠く細胞による、ある種の段階における培養物の迅速な過剰増殖を可能にする、さほど効率的でない選択マーカー、AmpR遺伝子（bla）を保持している。次いで、pQE30の代わりに、ベクターpET-28a（+）（Novagen）を選択した。このプラスミドは、大腸菌における遺伝子の発現にとって良好に最適化されており、強力な選択マーカー（KanR）を保持しており、IPTGの非存在下での標的遺伝子発現の高レベルの抑制のため安定している（非DE3溶原性株においては、誘導因子の存在下ですら安定している）。
【００８９】
pQE30からpET-28aへmini-IGFBP-5野生型、L61Y、およびL74Mをサブクローニングするため、BamHIおよびHindIII（pQE30において、HindIII切断部位は、PstI部位より下流に存在する）により、ベクターから適切な断片を切り出した。切り出しは、二重消化として実施した。消化されたpETベクターを5'脱リン酸した。反応混合物を電気泳動にかけ、pQE30（mini-IGFBP-5 野生型、L61Y、およびL74M）から切り出された約200bpの断片、ならびにpET-28aの約5000bpの断片に対応するバンドを、1％アガロース・ゲルから切り取り、精製した（ゲル抽出キット（gel extraction kit）、Qiagen）。断片をライゲートさせ（ライゲーション・キット（Ligation kit）、Fermentas）、XL-1 Blueスーパーコンピテント細胞をライゲーション混合物で形質転換した。
【００９０】
単離されたプラスミドDNAに対して続いて実施された制限アッセイ法は、予想サイズの断片の存在を明らかにした（制限酵素NcoIおよびPstIを使用し、二重消化を実施した。PstI制限部位は、mini-IGFBP-5をコードする断片と共にpETベクターへ導入された）。
【００９１】
試験的規模の発現および精製の実験により、pQE30ベクターを使用した場合、目的のタンパク質（この場合、mini-IGFBP-5 L61Y）の発現が、野生型タンパク質の発現より高いことが示された。
【００９２】
タンパク質は二重融合体として発現され：それらは、Hisタグ、続いてT7タグを保持している。いずれのタグも、トロンビン切断によって除去することが可能である。トロンビンによる切断後のmini-IGFBP-5は、以下のN末端アミノ酸配列を含む：GSALA（配列番号： 7）（トロンビン切断部位によるクローニングからの2個の付加的なaaを含むaa40より開始するmini-IGFBP-5のN末端）。ベクターに由来するアミノ酸には、下線が施されている。
【００９３】
6.7  pKK177-3HBからpET-28a（+）へのIGFBP4のサブクローニング
pET-28aベクターのNdeIおよびBamHI制限部位へ、Hisタグに対してインフレームでIGFBP4-2をサブクローニングするため、以下のオリゴヌクレオチドを、PCRによるDNAの増幅のために設計した：
2005508295.tif 000015
NdeIおよびBamHIにより認識される制限部位は、太字で示されている。変更した塩基には下線が施されている。
【００９４】
PCR混合物（50μl）は、124ngのpKK177-3HBおよびPfdx500リプレッサー・プラスミドの混合物、各130ngのプライマー、1μlのdNTP混合物、ならびに2.5UのPfu Turbo DNAポリメラーゼ（Strategene）を含有していた。95℃30秒の初期工程の後、95℃30秒、55℃1分、および68℃2分の反応を30サイクル行った。PCR産物を精製し（PCR精製キット、Qiagen）、二重消化し、電気泳動にかけた。切断されたpET-28aおよびPCR産物に対応するバンドを、ゲルから切り出し精製した。
【００９５】
XL-1 Blueスーパーコンピテント細胞をライゲーション混合物により形質転換した。
【００９６】
IGFBP4-2は、N末端Hisタグ融合タンパク質として発現される。トロンビン切断の後、タンパク質は、以下のアミノ酸配列を含む：GSHMDEAIH...（配列番号：8）。ベクターに由来するアミノ酸には、下線が施されている。
【００９７】
mini-IGFBP-5の場合と同じ精製ルーチンが、Hisタグ化IGFBP-4に関しても使用されるであると考えられる。
【００９８】
実施例7
両分子の複合体の結晶構造の座標を使用することによる、IGFBP-5またはIGF-Iと結合する化学的非タンパク質性化合物の同定
550ダルトン未満の分子量を有し、原子｛N、O、F、またはS｝のうちの少なくとも一つを含有している化合物を選択して、ACD（Available Chemicals Directory；ACD-3D 2000）の約90,000個の化合物の物質ライブラリーをスクリーニングするために、FlexXバージョン1.9.0を使用した。IGFBP-5界面の両分子表面においてドッキング探索を実施した。FlexX標準スコア関数により判定されるようなスコアの高いヒット、および結合部位タンパク質原子との近接を選択し、活性に関して試験した。
【００９９】
IGFBP-5からのIGF-Iの放出のため、これらの基準により選択されたスコアの高い化合物は、以下の通りであった。
化合物1：N1-(3,4-ジクロロフェニル）-2-[2-[5-（3,5-ジクロロフェニル）-2H-1,2,3,-テトラゾール-2イル]A（MF：C16H11Cl4N7OS；MW：491,1890Da）
化合物2：F-MOC-Tyr（PO3H2）-OH（C24H22NO8P；MW：483.4110）
化合物2A：Nα-FMOC-O-tert-ブチル-L-チロシン
化合物2B：Nα-FMOC-L-フェニルアラニン
化合物2C：Nα-FMOC-N-BOC-L-トリプトファン
化合物2D：Nα-FMOC-L-ロイシン
化合物3：4-（2,5-ジクロロフェニルアゾ）-4-フルオロスルホニル-1-ヒドロキシ-2-ナフトアニリド（MF：C23H14Cl2FN3O4S；MW：518.3510）
化合物4B：5-アミノ-2[（4-アミノ-2-カルボキシフェニル）チオ]安息香酸（C14H12N2O4S ； MW 304.3250）
化合物4C：5-アミノ-2[（2-カルボキシフェニル）チオ]安息香酸（C14H11NO4S；MW 289.3100）
【０１００】
実施例8
IGF-IのIGF-IR発現細胞との結合により測定された、選択された化合物によるIGFBP-5との複合体からのIGF-Iの放出
Kalus, W.ら、EMBO J. 17 （1998） 6558-6572は、阻害性複合体の形成による、IGF-IとIGF-IR発現NIH 3T3細胞との結合の阻害を記載している。このアッセイを、IGFBP-5との阻害性複合体からのIGF-Iの放出を調査するために使用した。
【０１０１】
ヒトIGF-IRを安定的に発現しているNIH 3T3細胞を、10％ウシ胎仔血清を含有しているダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で培養皿で増殖させた。細胞を、PBSにより注意深く洗浄し、50mM EDTA 5mlを含むPBSと共に45分間インキュベートした。細胞をプレートから除去し、PBSで一回、結合緩衝液（100mMヘペス pH 7.6、120mM NaCl、5mM KCl、1.2mM MgSO4、1mM EDTA、10mMグルコース、15mM酢酸ナトリウム、1％透析済みBSA）で一回洗浄し、細胞数を決定するために結合緩衝液へ再懸濁させた。5pM 125I-IGF-I（Amersham）を、単独の、または33μMの異なる化合物1、2、3、4B、および4Cと組み合わされた、10nMまたは100nMいずれかのIGFBP-5と共に、1時間4℃でインキュベートした。次いで、2×105細胞に相当する細胞懸濁液400μlを、全容量が500μlとなるよう添加した。4℃での12時間のインキュベーションの後、細胞を（4℃で）結合緩衝液で洗浄した。遠心分離および結合緩衝液への再懸濁を繰り返すことによって、遊離ホルモンを除去した。細胞と結合した125I放射能を、ガンマ・カウンターで決定した。
【０１０２】
図7に示されるように、標識されたIGF-Iは、IGFBP-5の非存在下でNIH 3T3細胞と結合し、細胞結合はIGFBP-5の添加により阻害される。IGFBP-5とIGF-Iとの複合体を選択された化合物と共にプレインキュベートすると、化合物3により複合体からIGF-Iが放出され、従ってIGF-IがIGF-IR発現細胞と結合する。
【０１０３】
実施例9
IGF-IR活性化により測定された、選択された化合物によるIGFBP-5との複合体からのIGF-Iの放出
Kalus,W.ら、EMBO J. 17（1998）6558-6572は、IGFBP-5の存在下におけるIGF-IによるIGF-IRの活性化および自己リン酸化の阻害を記載している。このアッセイ法を、化合物3によるIGFBP-5との阻害性複合体からのIGF-Iの放出をさらに調査するために使用した。化合物3とIGFBP-5との結合、および結合タンパク質とIGF-Iとの複合体の解離は、IGFBP-5の存在下におけるIGF-IRの活性化および自己リン酸化をもたらすはずである。
【０１０４】
3.5cmディッシュ内のヒトIGF-IRを安定的に発現しているNIH 3T3細胞のコンフルエント単層を、0.5％透析済みウシ胎仔血清を含有しているDMEM中で飢餓状態にした。48時間後、細胞を、ホルモンの非存在下で、または10nM IGF-1と共にインキュベートした。試料を、100nM IGFBP-5、および0〜50μMの増加する濃度の化合物3と共に室温で1時間プレインキュベートした。37℃で10分間刺激した後、培地を除去し、氷上で10分間、250μlの溶解緩衝液（20mMヘペス pH 7.5、150mM NaCl、10％グリセロール、1％NP-40、1.5mM MgCl2、1mM EGTA）、10mMオルトバナジン酸ナトリウム、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル・コンプリート（Complete）（Roche Molecular Biochemicals）で細胞を溶解させた。続いて、細胞をプレートから剥離し、不溶性材料を4℃で20分間の遠心分離によって分離した。上清のタンパク質濃度を、ピアース（Pierce）からのBCAキットを使用して製造業者の指示に従って決定した。等しいタンパク質濃度を、SDS試料緩衝液（63mMトリス-HCl pH6.8、3％SDS、10％グリセロール、0.05％ブロモフェノールブルー、100mM DTT）と共にインキュベートし、5分間煮沸し、7.5％SDSポリアクリルアミド・ゲルに載せた。電気泳動の後、タンパク質をニトロセルロース膜に移し、それを、まず、3％BSA含有リン酸緩衝生理食塩水-トゥイーン（PBST）で1時間ブロッキングし、次いで1mg/mlモノクローナル抗ホスホチロシン抗体4G10（Upstate Biotechnology）、ポリクローナル抗ホスホAKT抗体（New England Biolabs）、またはポリクローナル抗IGF-IR（C-20,Santa Cruz Biotechnology）を含む3％BSA含有PBSTと共に一夜インキュベートした。未結合抗体を、徹底的な洗浄により除去した。次いで、ブロットを、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した1：10000希釈抗マウスIgG特異的抗体または1：5000希釈抗ウサギ特異的抗体（いずれもRoche Molecular Biochemicals）と共にインキュベートした。そのイムノブロットを、アマシャム（Amersham）のECLキットを使用して可視化した。
【０１０５】
図8に示されるように、IGF-IによるIGF-IRの自己リン酸化は、IGFBP-5の存在下で阻害される。IGFBP-5とIGF-Iとの不活性複合体へ化合物3を添加することにより、50uMの化合物3で、受容体の自己リン酸化は増加する。
【０１０６】
実施例10
リガンド結合の検出
リガンド結合は、15N-HSQCスペクトルの取得により検出した。全てのNMRスペクトルを、ブルカー（Bruker）DRX600分光光度計で300Kで取得した。NMR分光法のための試料は、濃縮され、PBS緩衝液に対して透析された。典型的には、試料濃度は、0.3〜1.0mMの範囲であった。測定前に、凝集物およびその他の巨視的粒子を沈降させるため、試料を遠心分離した。タンパク質溶液450μlを、D20（5〜10％）50μlと混合し、NMRサンプル・チューブに移した。化合物のストック溶液は、100mMを含む水または重水素化（perdeuterated）DMSOのいずれかであった。滴定の間中、pHは一定に維持した。その結合は、15N-HSQCスペクトルの変化の観察によりモニタリングした。解離定数は、リガンド濃度の関数として、いくつかのアミノ酸残基（表9）の骨格アミドの化学シフト変化をモニタリングすることにより入手した。データのフィッティングは、単一結合部位モデルを使用して行った。同様にして、化合物2の誘導体に関する解離定数が推計される（表10）。
【０１０７】
（表９）別個のアミノ酸残基からのデータを使用した、化合物2またはDMSOとIGFBP-5との結合に関する解離定数計算
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【０１０８】
（表１０）残基L81に関する化学シフトの変化を使用した、化合物2およびその誘導体とIGFBP-5との結合に関して計算された解離定数
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【０１０９】
参照のリスト
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【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１Ａ】IGF-IおよびIGF-IIの配列アラインメント。IGF-Iの太字の下線付きの残基は、mini-IGFPBと接触する。IGF-I受容体（IGF-IR）との結合を担う残基には、配列の上にアステリスクが付けられている。
【図１Ｂ】ヒトIGF-BP 1〜6のN末端ドメインの多重配列アラインメント。BP5の番号付けにより番号付けられたmini-BP構築物は、整列させた残基の上に「m」が付けられており、クローニング・ベクター由来の付加的な残基を示すGSを含んでいる。（81位の後、mini-BP5のX線構造は乱れていた；これはイタリック体で示されている。）IGF-Iと相互作用するBP5残基は、下線付き、太字で示されている。残基の保存の程度は、厳密な保存については「＊」、残基型の厳密な保存については「：」、比較的高い保存については「.」がアラインメントの下に付けられている。コンセンサス配列は、厳密な保存のレベルを示すために以下の記号を使用している：「o」アルコール、「l」脂肪族、「a」芳香族、「c」荷電、「h」疎水性、「-」負、「p」極性、「+」正、「s」比較的小（small）、「u」小（tiny）、t ターンライク（turnlike）。
【図２】IGF-I（チューブ・モデル）mini-IGFBP5（分子表面）複合体の全体構造。プロットされた側鎖は、BP5と接触しているIGF残基を示す。特に重要であるのは、BP5表面上の疎水性のくぼみを充填しているように見えるPhe16である。
【図３】図2と同様であるが、IGFが分子表面で示され、BP5がチューブ・モデルとして示されている。IGFとの結合を担うBP5の側鎖も示されている。界面に寄与する比較的平らな疎水性IGF表面と同様に、IGF Phe16の表面が顕著である。
【図４】図4Aおよび図4BはIGF-BP5とIGF-Iとの接触の概要を示す。結合親和性に寄与する相互作用は、疎水的相互作用（a）（特に、BP5の残基ロイシン70、73、および74、ならびにIGF-IのPhe16を含む）、および極性相互作用（b）からなる。BP-IGF結合の増強は、特に、これらもしくは付加的な残基を含む分子間接触面の増加、またはさらなる極性接触の導入のいずれかによる、疎水的相互作用の増強に依存する。（A）IGFBP-5とIGF-1との間のパッキング接触。接触は、最も近い距離によって表され、従って最も密接な接触には極性相互作用が含まれる。（B）IGFBP-5とIGF-1との間の極性接触。略語は、水素結合（HB）、CH-O水素結合（CHB）、塩架橋（SB）、および側鎖（SC）または主鎖（MC）の相互作用を表す。
【図５】mini-IGFBP-5との複合体内のIGF-Iの原子座標。
【図６】IGF-1との複合体内のmini-IGFBP-5の原子座標。
【図７】IGFBP-5、およびIGF-IとIGFBP-5との間の複合体形成に干渉する可能性のある化合物の非存在下および存在下における、放射性I-125 IGF-IとIGF-IR発現NIH 3T3細胞との結合。
【図８】IGFBP-5、およびIGF-IとIGFBP-5との間の複合体形成に干渉する可能性のある化合物の非存在下および存在下における、NIH 3T3細胞によって発現されたIGF-IRのIGF-Iにより誘導される自己リン酸化。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図５−７】
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【図５−８】
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【図５−９】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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