(57)【要約】本発明は（ｉ）ＤＮＡ配列、（ｉｉ）本発明のＤＮＡ配列を含んで成る発現ベクター、（ｉｖ）本発明の発現ベクターを有する宿主細胞、（ｖ）本発明の配列がコードする遺伝子産物、（ｖｉ）本発明の配列に関し変更されたトランスジェニック動物、（ｖｉｉ）本発明の遺伝子産物に対する抗体、（ｖｉｉｉ）本発明の遺伝子産物を発現する、および／または単離する方法、（ｉｘ）本発明のＤＮＡ配列および／または遺伝子産物の薬物としての使用、（ｘ）医薬活性化合物およびそれらの調製方法、およびそのような本発明の化合物の使用、ならびに（ｘｉ）本発明のＤＮＡ配列および／または遺伝子産物の治療目的以外の使用、に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能的に相同な誘導体、断片または対立遺伝子、またはそれにハイブリダイゼーションするＤＮＡ配列を包含して、少なくとも２０アミノ酸長の、図１３、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６または１８のポリペプチドのいずれかの部分配列を有するポリペプチドをコードする配列領域を含んで成るＤＮＡ配列であって、前記図面が当該請求の範囲の一部であることを特徴とする、ＤＮＡ配列。
【請求項２】
機能的に相同な誘導体、断片または対立遺伝子、あるいはそれにハイブリダイゼーションするＤＮＡ配列を包含して、図１３、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６および１８のいずれかのポリペプチドをコードする配列領域を含み成ることを特徴とする、請求項１に記載のＤＮＡ配列。
【請求項３】
機能的に相同な誘導体、断片または対立遺伝子、あるいはそれにハイブリダイゼーションするＤＮＡ配列を包含して、図１３、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６および１８のいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることを特徴とする、請求項１または２に記載のＤＮＡ配列。
【請求項４】
図９Ａ、１０、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１２または１７に示す（ｃ）ＤＮＡ配列の少なくとも６０ヌクレオチド長の部分配列、特に図９Ａ、１０、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１２または１７に示す翻訳領域（大文字）のいずれかの配列を含み成ることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載のＤＮＡ配列。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載のＤＮＡ配列を含んで成ることを特徴とする、発現ベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の発現ベクターで形質転換されることを特徴とする、宿主細胞。
【請求項７】
哺乳動物細胞、特にヒト細胞であることを特徴とする、請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項８】
請求項１から４のいずれかに記載のＤＮＡ配列によってコードされることを特徴とする、精製遺伝子産物。
【請求項９】
ポリペプチドであることを特徴とする、請求項８に記載の精製遺伝子産物。
【請求項１０】
機能的相同対立遺伝子、断片または誘導体を包含して、図１３、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６または１８に示すアミノ酸配列のいずれかを含み成ることを特徴とする、請求項８または９に記載の精製遺伝子産物。
【請求項１１】
請求項９もしくは１０に記載の少なくとも１つのアミノ酸配列、特に図１３、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６および１８のいずれかのアミノ酸配列の量が正常動物に比べ変化するか、またはその配列が未変性のｅｅ３配列（特に図１３、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６または１８のもの）に比べて特異的に変化するように遺伝的に修飾されるか、あるいは少なくとも１つの未変性ｅｅ３アミノ酸配列の変更された形、特に請求項９に記載もしくは図１３、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６および１８のいずれかに記載の未変性ｅｅ３アミノ酸配列の変更された形またはその一部を欠くかまたは含むよう遺伝的に修飾されることを特徴とする、トランスジェニック動物。
【請求項１２】
請求項８から１０のいずれかに記載の遺伝子産物上のエピトープを認識することを特徴とする抗体。
【請求項１３】
モノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項１２に記載の抗体。
【請求項１４】
細胞外ドメインの配列部分をエピトープとする様に作製されたことを特徴とする、請求項１２および１３に記載の抗体。
【請求項１５】
宿主細胞を請求項５に記載の発現ベクターで形質転換することを特徴とする、請求項８から１０のいずれかに記載の遺伝子産物を発現する方法。
【請求項１６】
請求項６または７に記載の宿主細胞を好適な発現促進条件下に培養し、続いて培養体より遺伝子産物を精製することを特徴とする、請求項８から１０のいずれかに記載の遺伝子産物を単離する方法。
【請求項１７】
薬物としての、請求項１から４のいずれかに記載のＤＮＡ配列または請求項８から１０のいずれかに記載の遺伝子産物。
【請求項１８】
請求項１から４のいずれかに記載のＤＮＡ配列、または請求項８から１０のいずれかに記載の遺伝子産物の、腫瘍症、慢性もしくは急性の低酸素症状態、心臓血管疾患、（神経）変性疾患、特に自己免疫疾患である免疫系の疾患、特に脳卒中、多発性硬化症、パーキンソン病、筋萎縮性側索症、遺伝性運動失調症、ハンチントン病神経障害およびてんかんである神経疾患の治療（および／または治療薬調製）への利用。
【請求項１９】
ｅｅ３タンパク質の細胞内および／または細胞内機能、例えばｅｅ３タンパク質の細胞質構造に対する内部抗体を変調、特には阻害することを特徴とする化合物。
【請求項２０】
好ましくは３０００未満の分子量を持つ有機化合物であることを特徴とする、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２１】
拡散または膜輸送タンパク質により細胞膜を通過することを特徴とする、請求項１９および２０のいずれかに記載の化合物。
【請求項２２】
（ａ）  好適宿主細胞系を請求項５に記載の発現ベクター、特には図１３、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６または１８に記載のタンパク質をコードする発現ベクターと、適当であれば少なくとも１個のレポーター遺伝子をコードする少なくとも１種類の発現ベクターとをトランスフェクションすること、ならびに
（ｂ）  請求項８から１０のいずれかに記載の発明の遺伝子産物を介する機能を観察するのに、特にはアポトーシス、細胞成長、細胞増殖および／または細胞適応を観察するのに好適なパラメータを、（ａ）により得た宿主細胞について、試験化合物添加後に好適アッセイ系内で測定し、試験化合物を添加しないコントロールと比較すること、
を特徴とする、請求項１９から２１のいずれかに記載の医薬活性化合物を同定する方法。
【請求項２３】
好適な生化学または構造生物学的方法によって発明のタンパク質上の医薬活性化合物結合部位を決定する段階（ｃ）を更に含んで成ることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
細胞内Ｃａ放出がアッセイ計画の（ｂ）の測定パラメータであることを特徴とする、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
慢性もしくは急性の低酸素状態が起こり得るかまたは関係する疾患、例えば心筋梗塞、心不全、心筋症、心筋炎、心膜炎、筋周囲心炎、冠動脈性心疾患、中隔壁欠損を伴う先天性心臓欠損、ファロー４徴候症／５徴候症、アイゼンメンガー症候群、ショック、四肢低潅流症、動脈閉鎖症（ＡＯＤ）、末梢ＡＯＤ（ｐＡＯＤ）、頸動脈狭窄、腎動脈狭窄、小血管病、脳内出血、大脳静脈および洞血栓、血管奇形、クモ膜下出血、血管性痴呆、ビスワーグナー病、皮質下動脈硬化脳症、塞栓症時の多発性皮質梗塞、血管炎、糖尿病性腎症、各種原因による貧血の続発症状（例えば再生不良性貧血、異形成脊髄症候群、真性多血症、巨赤芽球性貧血、鉄欠乏貧血、腎性貧血、球状赤血球症、溶血性貧血、地中海貧血、ヘモグロビン症、グルコース６リン酸脱水素酵素欠乏、輸血事故、Ｒｈ式血液型不適合、マラリア、心臓弁交換、出血性貧血、脾臓機能亢進症候群）、肺繊維症、気腫、肺浮腫：ＡＲＤＳ、ＩＲＤＳ、再発性肺塞栓、腫瘍症（例えば結腸癌、乳癌、前立腺癌、肺癌）、免疫系疾患（例えば自己免疫疾患、特に糖尿病、乾癬、免疫不全症、多発性硬化症、リューマチ関節炎またはアトピー、喘息）ウイルス感染症（例えばＨＩＶ，Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎感染症、細菌感染（例えば連鎖球菌またはブドウ球菌乾癬）、変性疾患、特に神経変性疾患、例えば筋無力症、ＧｖＨＤ（例えば肝臓、腎臓、または心臓）、あるいは神経疾患（特に卒中、多発性硬化症、パーキンソン病、クモ膜下出血、筋萎縮性側索硬化症、遺伝変性失調症、ハンチントン病、神経症、てんかん、脳傷害、アルツハイマー病であるが、これらに限定されない）；筋弛緩剤（例えば麻酔）、内分泌疾患（例えば骨粗鬆症または甲状腺機能不全）および皮膚疾患（乾癬、神経皮膚炎）；慢性または急性疼痛状態のコントロール、遺伝性疾患、および心理学分野の疾患（例えば分裂症またはうつ病）、創傷治癒、性機能の補助、心臓血管疾患（例えば虚血性梗塞、心不全、不整脈、高血圧）、脳機能亢進、神経変性疾患、特にアルツハイマー痴呆およびパーキンソン病、筋ジストロフィー、ウイルス感染症、腫瘍症および自己免疫疾患、または脳虚血の治療への、請求項１９から２２のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項２６】
ｅｅ３タンパク質または未変性対立遺伝子、断片または誘導体の細胞間の相互作用相手を同定する方法であって、「酵母２ハイブリッド」システムを用いる方法。
【請求項２７】
ｅｅ３タンパク質が媒介するシグナル伝達に関係する別のタンパク質を同定することへの請求項１から４のいずれかに記載のＤＮＡ配列、または請求項８から１０のいずれかに記載の遺伝子産物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は（ｉ）ＤＮＡ配列、（ｉｉ）本発明のＤＮＡ配列を含んで成る発現ベクター、（ｉｖ）本発明の発現ベクターを有する宿主細胞、（ｖ）本発明の配列にコードされる遺伝子産物、（ｖｉ）本発明の配列に関し変更されたトランスジェニック動物、（ｖｉｉ）本発明の遺伝子産物に対する抗体、（ｖｉｉｉ）本発明の遺伝子産物を発現および／または単離する方法、（ｉｘ）本発明のＤＮＡ配列および／または遺伝子産物の薬物としての使用、（ｘ）薬学的活性化合物とそれらを製造する方法、および本発明のその様な化合物の使用、ならびに（ｘｉ）本発明のＤＮＡ配列および／または遺伝子産物の治療以外への使用、に関する。
【背景技術】
【０００２】
当分野では、Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）分類に属する多くのタンパク質が知られている。それらは、シグナル伝達に関係する表面分子の最大のファミリーを構成している。それらは非常に多様なリガンドおよびその他の刺激、例えば光（ロドプシン）、臭い、（臭いレセプター）、カルシウム、アミノ酸または生体アミン、ヌクレオチド、ペプチド、脂肪酸と脂肪酸誘導体、および各種ポリペプチドにより活性化される。ほ乳類ではＧＰＣＲに分類されるタンパク質が約１５００種類存在し、その内の約１２００が嗅覚、味覚または鋤骨鼻レセプターをコードすると考えられている。「オーファン（ｏｒｐｈａｎ）」ＧＰＣＲ（即ち現在までのところ何らの機能とも結びつけることができないレセプター）の総数は２００〜５００と推定されている（非特許文献１）。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ（線虫）では、ＧＣＰＲ配列はゲノムの約５％を占めており、約１０００のＧＰＣＲタンパク質をコードしている（非特許文献２）。
【０００３】
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（キイロショウジョウバエ）は約２００のＧＰＣＲ配列を持つことが知られている（非特許文献３）。このトポロジーが類似する分子の大きなグループはＧタンパク質への共役を目的として、収斂により発達したと考えられている。
【０００４】
従来技術によれば、ＧＰＣＲの分類は３または４つのファミリーに分割される。ファミリーＡは最もメンバーが多く、例えば臭いレセプターも包含する（非特許文献４）。ファミリーＢはセクレチン、ＶＩＰおよびカルシトニンを包含する。ファミリーＣは、代謝型グルタミン酸レセプター、カルシウムレセプター、ＧＡＢＡ−Ｂレセプター、味覚レセプターおよびフェロモンレセプターの様なレセプターを包含する。しかし、実質的には全ての「オーファン」ＧＰＣＲ配列は、ファミリーＡに属している。
【０００５】
ＧＰＣＲファミリーの特徴の一つは、それらがＧタンパク質を介しシグナルを伝達することである。細胞外リガンドの結合によりＧタンパク質の活性化を誘導し、これが次にシグナルを伝達する。約２００種類のＧタンパク質が存在しており、各タイプの細胞が異なるセットを持つと考えられる。Ｇタンパク質の活性型はＧＴＰ結合型であり、ＧＤＰが結合している前記Ｇタンパク質は不活性状態にある。Ｇタンパク質はＧＴＰａｓｅであることから、ＧＴＰの結合によってそれ自身不活性化される。そのために、Ｇタンパク質を介したシグナル伝達は常に一過性である。各Ｇタンパク質は３つのサブユニット、即ちアルファ、ベータおよびガンマより成る。アルファサブユニットはＧＴＰを結合することができ、それ故に下流のメッセンジャー（「第２メッセンジャー」システム）を本質的に制御できる。例えばＧタンパク質Ｇｓはアデニル酸シクラーゼを活性化（刺激）し、その結果細胞内メッセンジャーｃＡＭＰ濃度を増加する。Ｇタンパク質Ｇｉはアデニル酸シクラーゼを阻害し、そしてＧｑはホスホリパーゼＣ（第２メッセンジャー：イノシトール三リン酸およびジアシルグリセロール）を活性化する。よく利用される第２メッセンジャーシステムのその他の例としては、カルシウム、Ｋ、ｃＧＭＰ等を挙げることができる。キメラＧタンパク質も存在する。Ｇ−ベータおよび−ガンマサブユニットも、例えばＭＡＰキナーゼシグナル経路の活性化では、３量体タンパク質複合体から切り離された後に同様にシグナル伝達を誘導するだろう。Ｇタンパク質の特定ＧＰＣＲとの共役特異性は、とりわけアッセイ開発、典型的には例えばカルシウム、ｃＡＭＰまたはイノシトール三リン酸といった下流のメッセンジャーの濃度変化測定に応用するにあたって重要な薬学的特徴である。最近発表された文献の予備結果では、ＧＰＣＲシグナルを同様に伝達できるＭＡＰキナーゼシグナル経路が注目されている（非特許文献５）。
【０００６】
最終的には、Ｇタンパク質−独立シグナル伝達も原理的には可能である：即ち、例えばベータ−２−アドレナリン作動性レセプターとＮＨＥＲＦタンパク質との直接相互作用が、Ｎａ／Ｈ交換器の活性を変調する（非特許文献６）。
【０００７】
全てではないが、多くのＧＰＣＲレセプターに応用されるその他特徴は、オリゴマー化である。ここで特に興味深いものは、異種ＧＰＣＲ間のヘテロダイマー化であり、これにより薬理学的プロフィールおよびリガンド特異性が変化するだろう（非特許文献７）。即ち、例えばＧＡＢＡ−Ｂレセプターは、ＧＢＲ１とＧＢＲ２間のヘテロダイマーとしてのみ機能する（非特許文献８）。以後多くのＧＰＣＲ、例えばｍＧｌｕＲ５、デルタオピオイドレセプターおよびその他についてこの種のヘテロダイマー化が報告されている。ごく最近、子癇前症例について、ＧＰＣＲヘテロダイマーペアを構成する相手の一方の発現が増加することが病気の原因であることを示す証拠が見つかった。この場合、ブラジキンＩＩレセプターの発現増加によりブラジキンＩＩ−アンジオテンシンＩＩレセプターヘテロダイマーの形成増加が起こり、その薬理学的反応の変化により緊張亢進型の表現形を説明できるだろう（非特許文献９）。
【０００８】
最終的にはＧＰＣＲに分類されるタンパク質は、好ましい薬理学的標的分子である。１００種類の最もよく売れている医薬品の２５％以上が薬理学的にＧＰＣＲ分類のタンパク質を標的にしている（非特許文献１０）。即ち以下のレセプターグループの作用薬および拮抗薬が、特に最も薬理学的に重要なものである：アドレナリンレセプター、アンジオテンシンＩＩレセプター、セロトニンレセプター、ドーパミンレセプター、ヒスタミンレセプター、ロイコトリエン／プロスタグランジンレセプターのグループである。前記レセプターに作用する医薬品は、精神医学症状（精神分裂病、うつ病）から高血圧への作用、そして心停止向け救急医薬品を対象とする広範な疾患範囲をカバーしている。前記レセプターに作用するよく知られた医薬品の例としては、例えばアルファ−アドレナリンレセプター作用薬（ノルフェネフリン）、ベータ−アドレナリンレセプター作用薬（イソプレナリン、フェノテロール）、アルファ−アドレナリンレセプター遮断薬（パラゾシン）、ベータ−アドレナリンレセプター遮断薬（プロパノロール）、５−ＨＴ拮抗薬（シプロペタジン）、Ｈ２レセプター遮断薬（シメチジン）、Ｈ１レセプター遮断薬（テルフェナジン）、ドーパミン作用薬（ブロモクリプチン）等がある。
【０００９】
しかし精力的な研究にもかかわらず、前記レセプターにより影響を受けるシグナル伝達経路はまだ十分に解明されていない。更に、各種ＧＰＣＲシステムが相互に影響しあう複雑なネットワークやそれらが下流の細胞内プロセスに及ぼす作用、特に外部の生理学的状態に関する理解が十分ではない。
【特許文献１】米国特許第４，３７６，１１０号。
【特許文献２】キャビリーら、ＥＰ−Ａ−１２５０２３。
【特許文献３】谷口ら、ＥＰ−Ａ−１７１４９６。
【特許文献４】モリオンら、ＥＰ−Ａ−１７３４９４９。
【特許文献５】ニューベルガーら、ＷＯ８６／０１５３３。
【特許文献６】クドウら、ＥＰ−Ａ−１８４１８７。
【特許文献７】ロビンソンら、ＷＯ８７／０２６７１。
【特許文献８】米国特許第４，６９９，８８０号。
【非特許文献１】ハワード、エイディー、マカリースター  ジー、フェイナー  エス  ディー、リュー  キュー、ナルガンド  ピー  ピー、ファンデルプローグ、エルエイチ、パチェット  エイ  エイ（２００１）希少Ｇタンパク質共役レセプターと天然リガンドの発見  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ  ２２：１３２〜１４０。
【非特許文献２】バルグマン  シーアイ（１９９８）Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓゲノムの神経生物学。Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：２０２８〜２０３３とバルグマン  シーアイ、カプラン  ジェイエム（１９９８）Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ神経系のシグナル伝達。Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２１：２７９〜３０８。
【非特許文献３】ブロディー  ティー、クラビチック  エイ（２０００）キイロショウジョウバエＧタンパク質共役レセプター。Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １５０：８３〜８８。
【非特許文献４】バック  エル、アクセル  アール（１９９１）新規多重遺伝子ファミリーは臭いレセプターをコードするだろう：臭い認識の分子的基礎。Ｃｅｌｌ  ６５：１７５〜１８７。
【非特許文献５】マリニッセン  エムジェイ、グットキンド  ジェイエス（２００１）Ｇタンパク質−共役レセプターおよびシングナルネットワーク：新たな範例、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｌ  Ｓｃｉ  ２２：３６８−３７６。
【非特許文献６】ホール  アールエイ、プレモント  アールティー、チョウ  シーダブリュ、ブリッァー  エルエス、ピッチャー  ジェイエイ、クライン  エイ、ストッフェル  アールエイチ、バルク  エルエス、シェノリカー  エス、ワインマン  エイジェイ、グリンシュタイン  エス、レフコビッチ  アールジェイ（１９９８）ベータ２−アドレナリン作動性レセプターはＮａ＋／Ｈ＋交換器制御要素と相互作用してＮａ＋／Ｈ＋の交換を制御する。Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：６２６−６３０。
【非特許文献７】ブーヴェイ  エム（２００１）Ｇタンパク質−共役伝達体レセプターのオリゴマー化、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２：２７４−２８６。
【非特許文献８】クナー  アール、コール  ジー、グルンワルド  エス、アイゼンハルド  ジー、バッハ  エイ、コルナウ  エイチシー（１９９９）  ＧＡＢＡレセプター機能に於けるヘテロマー形成の役割、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３：７４−７７。
【非特許文献９】アブドラ、ロター、マシェリーおよびクイッタラー、Ｎａｔ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２００１），７，１００３−１００９。
【非特許文献１０】フラワーら、１９９９、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１４２２，２０７−２３４。
【非特許文献１１】サムブルックら、１９８９、分子クローニング：研究室マニュアル、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ。
【非特許文献１２】サムブルックら、２００１、分子クローニング：研究室マニュアル、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ。
【非特許文献１３】オーズベルら（編集）、１９８５、分子生物学の最新プロトコル、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ。
【非特許文献１４】ハームスとヒギンズ（編集）、１９８５、核酸ハイブリダイゼーション：実践的アプローチ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ。
【非特許文献１５】ブラウン（編集）１９９１、エッセンシャル分子生物学：実践的アプローチ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ。
【非特許文献１６】シュツディアら、酵素学の方法、１８５、１９９０：６０−８９およびオーズベルら（編集）１９９８、最新分子生物学プロトコル、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ。
【非特許文献１７】ポールス  ピー．エイチ．ら編集、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ−Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ−Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５，ＩＳＢＮ  ０  ４４４  ９０４０１８。
【非特許文献１８】スチンチコブら、Ｎａｔｕｒｅ，２８２：３９，（１９９７）。
【非特許文献１９】グラハムら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９（１９９７）。
【非特許文献２０】ウアラブとカシン、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．（ＵＳＡ）７７：４２１６，（１９８０）。
【非特許文献２１】Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１０，１９９０。
【非特許文献２２】ヘバート  ティーエイ、モフェッ  エス、モレーロ  ジェイピー、ロイセル  ティーピー、ビシェ  ディージー、バレット  シー、ブーヴェイ  エム（１９９６）  ベータ−２−アドレナリン作動性レセプター膜貫通ドメイン由来のペプチドはレセプターの二量体化と活性化の両方を阻害する。Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１：１６３８４−１６３９２。
【非特許文献２３】タラソヴァ  エヌアイ、ライス  ダブリュジー、ミシェイダ  シージェイ（１９９９）  膜貫通動メイン相互作用の破壊によるタンパク質共役レセプター機能の阻害。Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４：３４９１１〜３４９１５。
【非特許文献２４】オーズベルら（編集）、１９９８、分子生物学の最新プロトコル、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ。
【非特許文献２５】ハームスとヒギンズ（編集）１９９７、核酸ハイブリダイゼーション：実践的アプローチ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ。
【非特許文献２６】オーズベルら、ハロウとレーン「抗体」［抗体］：研究室マニュアル、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ，  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  （１９８８）。
【非特許文献２７】キャビリーら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５（１９８４）。
【非特許文献２８】ボウリアンら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２  ６４３−６４６  （１９８４）。
【非特許文献２９】ニューベルガーら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２６８−２７０（１９８５）。
【非特許文献３０】シャハガンら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：１０６６−１０７４（１９８６）。
【非特許文献３１】リュウら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８４：３４３９−３４４３（１９８７）。
【非特許文献３２】サンら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８４：２１４２１８（１９８７）。
【非特許文献３３】ベッターら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３（１９８８）。
【非特許文献３４】ＲＩＡ；分子生物学の研究技術と生化学、ワーク、ティーら、Ｎｏｒｔｈ  Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９７８）。
【非特許文献３５】Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏ．２９６：１７１（１９９４）。
【非特許文献３６】ヴィーズナーら、２００１、Ｊ  Ｃｅｒｅｂ  Ｂｏｌｌｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ、２１、８５７−６４）。
【非特許文献３７】ボーン、クレーベ、クビニル、１９９６、薬物デザイン［Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ］，  Ｓｐｅｋｔｒｕｍ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ。
【非特許文献３８】コルビカ  ビーケイ、コルビカ  ティーエス、ダニエル  ケイ、レーガン  ジェイダブリュ、キャロン  エムジー、レフコビッチ  アールジェイ（１９９８）キメラアルファ２−、ベータ２−アドレナリン作動性レセプター：エフェクタ共役およびリガンド結合特性に関係するドメイン。Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１３１０−１３１６。
【非特許文献３９】シェアー  エイ、コスタ  ティー、ファネリ  エフ、ベネデッチ  ピージー、マホウティー−コジャ  エス、オービン  エル、ネニガー−トサト  エム、コテッチャ  エス（２０００）アルファ（１ｂ）−アドレナリン作動性レセプターのＧｌｕ／Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｙｒモチーフ内にある高い保存性を示すアルギニンに関する突然変異分析：レセプターイソマー化および活性化に対する影響。  Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ５７：２１９−２３１。
【非特許文献４０】バレステロス  ジェイ、キタノビクック  エス、ガルニャーリ  エフ、デイビス  ピー、フローメ  ビージェイ、コンヴィッチャ  ケイ、キ  エル、ミラー  アールピー、デビッドソン  ジェイエス、ワインシュタイン  エイチ、シールフォン  エスシー（１９９８）Ｇタンパク質共役レセプターの機能的マクロドメイン。性腺刺激ホルモン放出ホルモンレセプター内の保存的アルギニンケージモチーフ。  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３：１０４４５−１０４５３。
【非特許文献４１】２０００、Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ，４８，１５５３−６４。
【非特許文献４２】２０００、Ｂｉｏｔｅｃｎｉｑｕｅｓ  ２９、１７０−５。
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【非特許文献８６】ソアレスら、（２００２）、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、１６、５９３〜６０６。
【非特許文献８７】パタニックら、（２０００）、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２０、６７８９〜９６。
【非特許文献８８】メイスナー、ハーバーカンプ、ワッセル、フーラー、タールハマー、ロッフ、ビツナー、ラスマン、ウィチおよびプロスト（２０００）、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１５１、１１６９〜７８。
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【非特許文献９０】ジンら、（２００１）、Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９８、４７１０〜５。
【非特許文献９１】ジャンら、（２００１）Ｓｔｒｏｋｅ、３２、１２０１〜７。
【非特許文献９２】キーら（２００１）、Ｅｘｐ．Ｂｒａｉｎ．Ｒｅｓ．、１３６、３１３〜２０。
【非特許文献９３】ペリフィリエアら、（２００１）、Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．、２１１〜７。
【非特許文献９４】エリクソンら、（１９９８）、Ｎａｔ  Ｍｅｄ、４、１３１３〜７。
【非特許文献９５】ヴァンプラーグら、（２００２）、Ｎａｔｕｒｅ、４１５、１０３０〜４。
【非特許文献９６】ゲージら、（１９９８）、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ、３６、２４９〜６６。
【非特許文献９７】アレナス（２００２）、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ、５７、７９５〜８０８。
【非特許文献９８】べーカー（２００２）、Ｍｏｖ．Ｄｉｓｏｒｄ．ｍ１７、２３３〜４１。
【非特許文献９９】マフムードら（２００１）、Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ、４９、１１９６〜２０３；考察１２０３〜４。
【非特許文献１００】リューら、（２００１）、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ、１８、８１３〜９。
【非特許文献１０１】リューら、（２００２）、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、５９、５１４〜２３。
【非特許文献１０２】メイキシナーら、（２０００）、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１５１、１１６９〜７８。
【非特許文献１０３】ケーラーとミルスタイン、Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−３９７，（１９７５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、ＧＰＣＲタンパク質分類に属する更なるメンバーおよびそれらの基本となるヌクレオチド配列を見いだすことである。本発明の別の目的は、特定したタンパク質に基づいて、例えば生理学的な発現例でも出現するが、その発現の制御異常および／または非機能性変種の発現により起こる病的生理状態に治療的に介入できる治療効果物質の開発を可能にする方法を提供することである。従って、これに適う物質を提供することも本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
我々は、この目的が請求項１、５、６、８、１１、１２、１５、１６、１７、２０、２３、２６および２７の主題により達成されることを見いだした。好適実施態様は、関連する従属請求項に記載している。
【００１２】
本発明の主題の一つは、機能的に相同な誘導体、断片または対立遺伝子も包含して、ＡＡ１０からＡＡ４５（図１３の配列５で、いずれの場合もＮ末端からＣ末端に向け表されている）、より好ましくはＡＡ１０から６５；ＡＡ１０からＡＡ４５（図１４の配列６）、より好ましくはＡＡ１０からＡＡ７５；ＡＡ１０からＡＡ４５（図１５Ａの配列７Ａ）、より好ましくはＡＡ１０から６０；ＡＡ１０からＡＡ４５（図１５Ｂの配列７Ｂ）、より好ましくはＡＡ１０からＡＡ６０、より更に好ましくはＡＡ１０からＡＡ１００；ＡＡ１０からＡＡ４５（図１５Ｃの配列７Ｃ）、好ましくはＡＡ１０から６０、より更に好ましくはＡＡ１０からＡＡ１００；ＡＡ１０からＡＡ４５（図１５Ｂの配列７Ｂ）、より好ましくはＡＡ１０から６０、より更に好ましくはＡＡ１０からＡＡ７０；ＡＡ１０からＡＡ４５（図１６の配列８）、より好ましくはＡＡ１０から６０、より更に好ましくはＡＡ１０からＡＡ１００；またはＡＡ１０からＡＡ４５（図１８の配列１１）、より好ましくはＡＡ１０から６０、より更に好ましくはＡＡ１０からＡＡ１００までのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列領域を含んで成る核酸配列、特にはＤＮＡ配列に関する。より好ましくは、ｅｅ３ファミリーのタンパク質のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列領域を含んで成り、特に本発明のタンパク質のＣ末端（細胞内）部分もしくはその断片（好ましくは少なくとも２５ＡＡ長の）を含むものである核酸配列、特にはＤＮＡ配列である。開示はまた、各例の二本鎖中で相補的である配列も含めて、特に本発明の配列とハイブリダイズするいずれの核酸配列も包含する。
【００１３】
別の好適実施態様は、その遺伝子産物がそれぞれ配列番号５、６、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、８および１１に関する図１３、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６および１８のいずれかに示されているポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列を、その種のＤＮＡ配列の機能的な相同的誘導体、対立遺伝子または断片、および例えばアポトーシスシングナルカスケードといった生理学的機能を阻害できる非機能的な誘導体、対立遺伝子または類似体断片（例えばＤＮ変種）も含めて開示する。本明細書では、更に本発明の前記ＤＮＡ配列とハイブリダイズするＤＮＡ配列（相補的ＤＮＡ鎖の配列も包含する）も開示する。番号５から８の本発明のＡＡ配列を持つ誘導体、対立遺伝子、断片もしくは類似体、またはｅｅ３ファミリーのその他天然のメンバーは、少なくとも一つの生物学的特性を保持することが好ましい。この種の誘導体、類似体、断片または対立遺伝子は、標準的な方法（非特許文献１１および１２）により調達される。そのために、ｅｅ３ファミリーに属する本発明のＤＮＡ配列中、例えば図９、１０、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃまたは１２の配列中に１またはそれ以上のコドンを挿入、削除または置換して、翻訳および転写によって対応する未変性のｅｅ３タンパク質とは少なくとも１個のアミノ酸について異なっているポリペプチド、具体的には図１３、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６または１８に例示する配列を持つポリペプチドを得る。
【００１４】
本発明はまた、本発明の未変性ｅｅ３配列の部分ＤＮＡ配列、具体的には図９、１０、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃまたは１２に例示された配列にも関する。これら部分配列は、一般には図９、１０、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃまたは１２に示すヌクレオチド配列の断片を含んで成り、この断片は少なくとも６０、より好ましくは少なくとも１５０、およびより更に好ましくは少なくとも２５０のヌクレオチドを含んで成る。特に好適な部分配列は、ＡＡ２０（配列５）、ＡＡ２０（配列６）、ＡＡ２０（配列７Ａ）、ＡＡ２０（配列７Ｂ）、ＡＡ２０（配列７Ｃ）およびＡＡ２０（配列８）よりそれぞれＣ末端方向に少なくとも２０ＡＡ、好ましくは少なくとも４０、より好ましくは少なくとも６０、そして最も好ましくはＣ末端まで伸びているポリペプチドをコードする（番号はそれぞれ図１３、１４、５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６および１８による）。一方、少なくとも２０ＡＡをコードする部分配列は、また上記の点よりより近位または遠位に位置するコドンから出発してもよい。上記開示の部分配列の誘導体、類似体または対立遺伝子も開示される。本発明の前記部分ＤＮＡ配列より得られるＡＡ配列もまたそれ自体、またはより大型の組換え体タンパク質中の一部として開示される。本開示は、特に本発明の配列について想定される、または天然に起こるスプライス変種も包含している。
【００１５】
その配列が、本配列番号５、６、７および８の配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８０％、およびより更に好ましくは少なくとも９５％が同一であるタンパク質をコードする核酸配列、特にはＤＮＡ配列が更に好ましい。単離および配列決定により、例えば図９、１０、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃまたは１２の本発明のヌクレオチド配列、または例えば対立遺伝子変種もしくはアイソフォーム等の機能的もしくは非機能的なその等価物を得ることができる。本発明では、対立遺伝子変種とは、アミノ酸レベルで６０％から１００％、好ましくは７０から１００％、特に好ましくは９０から１００％相同である変種を意味する。対立遺伝子変種は、未変性ｅｅ３配列、例えば図９、１０、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃもしくは１２に記載の配列のヌクレオチドから、その不可欠な生物学的特性の少なくとも１つを保持したままヌクレオチドを欠失、挿入または置換することにより得られる機能的または非機能的変種を包含する。
【００１６】
相同体または配列関連ＤＮＡ配列は、本発明の核酸配列のサンプルまたはその一部とのハイブリダイゼーションを用いた相同性スクリーニングによる一般的方法に従って、ヒトを含むいずれかの哺乳動物種またはその他の種より単離できるだろう。機能的等価物はまた未変性ｅｅ３配列、例えば図９、１０、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃまたは１２に記載の配列の相同物、例えば他の哺乳動物由来の相同物、端断配列、コーディングおよび非コーディングＤＮＡ配列の単鎖ＤＮＡまたはＲＮＡも意味する。この種の機能的等価物は、例えば哺乳動物の様なその他脊椎動物由来の図９、１０、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃもしくは１２に記載のＤＮＡ配列、または前記配列の一部から開始して、例えば一般的なハイブリダイゼーション法またはＰＣＲにより単離できる。本発明によれば、この等価物は本発明のｅｅ３配列と、特に図９、１０、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃまたは１２に記載の配列とハイブリダイゼーションするいずれの配列をも包含する。これらＤＮＡ配列は、標準的な条件の下に本発明の配列とハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションには、当業者に既知の方法で決定できる保存領域の短いオリゴヌクレオチドが好都合に用いられる。しかし、本発明の核酸のより長い断片または完全長の配列を、ハイブリダイゼーションに用いることもできる。
【００１７】
前記標準的条件は、ハイブリダイゼーションに用いる核酸配列（オリゴヌクレオチド、より長い断片または完全長配列）および／または核酸のタイプ（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）によって異なる。従って、例えばＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの融解点は同じ長さのＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの融解点に比べ約１０℃低い。核酸に応じて、標準的条件は、例えば０．１から５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）の間の濃度の緩衝水溶液中あるいはさらに５０％ホルムアミド存在には４２から５８℃の間を意味し、例えば５×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド中では４２℃である。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのハイブリダイゼーション条件は０．１×ＳＳＣおよび約２０℃から４５℃の間の温度であり、好ましくは約３０℃から４５℃の間の温度が好都合である。ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドでは、ハイブリダイゼーション条件は０．１×ＳＳＣおよび約３０℃から５５℃の間の温度、好ましくは約４５℃から５５℃の間の温度が好都合である。これらの温度は、ハイブリダイゼーションに関し、例えば約１００ヌクレオチド長およびＧ＋Ｃ含有量５０％の核酸について、ホルムアミドが存在しない場合に計算された融解点を表す。ＤＮＡハイブリダイゼーションの実験条件は、例えばサムブルックら（非特許文献１１）の様な専門書に記載されており、そして例えば核酸長、ハイブリッドのタイプまたはＧ＋Ｃ含有量の関数のような当業者既知の式に従い計算できる。当業者は、次の教本中にハイブリダイゼーションに関する更なる情報を見いだすことができる：非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５。
【００１８】
本発明の核酸配列の等価物としては、具体的には図９、１０、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃまたは１２に記載の配列の誘導体、例えばプロモーター変種も包含される。表示のヌクレオチド配列の上流に、一緒に、または分離して配置されたプロモーターは、１またはそれ以上のヌクレオチドを置換、挿入および／または欠失により変更してもよく、前記プロモーターの機能性または有効性を保持、または必要に応じて変更することができる。即ち前記プロモーターの配列を変更するか、またはそれらを他の種の生物に由来する場合もあるより効果的なプロモーターと完全に交換することにより、それらの効率を上げることができる。
【００１９】
本発明によれば、誘導体は開始コドンの上流１から−１０００の領域内にあるそのヌクレオチド配列が、遺伝子発現および／またはタンパク質発現が変更する、好ましくは増加するように変更されている変種も意味する。
【００２０】
更に誘導体は、その３’末端が好ましく修飾されている変種も意味する。文献中に見られるこの様な「タグ」の例はヘキサ−ヒスチジンアンカーまたは各種抗体の抗原として認識できるエピトープ（例えばフラッグタグ）（非特許文献１６）、および／または翻訳されたタンパク質を、例えば特定の細胞内器官内もしくは細胞外空間内に輸送するための少なくとも１個のシグナル配列である。
【００２１】
更に本発明の核酸構築体または、例えば図９、１０、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃもしくは１２の本発明の核酸、あるいはその誘導体、変種、相同体または、特にその断片を治療または診断に好適な形状で発現してもよい。組換え体タンパク質は、特定のヌクレオチド配列により伸ばされた核酸配列または核酸構築体を有し、それにより例えば容易な精製に好適な修飾ポリペプチドをコードする、本明細書では具体的には上記タグ配列により伸長している、ベクターシステムまたはオリゴヌクレオチドを用いて製造してもよい。
【００２２】
更に本発明のゲノムＤＮＡ配列の（ｃ）ＤＮＡ配列を含む、またはこれに対応するＤＮＡ配列も好ましい。
【００２３】
本発明は、配列番号５、６、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、８および１１の配列を有する本発明のタンパク質のアミノ酸配列に本質的に対応するタンパク質をコードするＤＮＡ配列も好適物として開示する。これらＤＮＡ配列は上記図面中に示す配列に比べて修飾はごく少数であり、例えばアイソフォームであってもよい。配列の修飾の数は、一般的には１０未満である。この種のＤＮＡ配列は、配列番号５、６、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、８および／または１１のタンパク質をコードするＤＮＡ配列に本質的に対応する様な配列、および生物学的に活性なタンパク質を同様にコードする様な配列は、既知の突然変異誘導法により得られるであろうし、また突然変異体によりコードされるタンパク質の生物活性は、例えば結合試験または例えば神経プロセスもしくはアポトーシスに関連する生物機能の発現能力をスクリーニングする方法により同定されるだろう。この様な突然変異誘導法としては、少なくとも１塩基が修飾されたプライマーを自動合成することを含む「部位指定」突然変異誘導法が挙げられる。重合反応後、ヘテロ二本鎖ベクターを好適細胞システム（例えば大腸菌）に移し、適切に形質転換したクローンを単離する。
【００２４】
本発明の配列の機能性は、特に本発明のタンパク質により開始されるシグナルカスケードのより遠位側の要素の同定と直接的に結びついている。この目的を達成するために、本発明では本発明のレセプターがＭＡＰキナーゼを刺激することを見いだした。前記ＭＡＰキナーゼを同定するには適当なレポーターアッセイ（例示の実施態様参照）を利用する以外に、これら目的に適った完成されたキットを利用することも可能である（例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ社のマーキュリーインビボキナーゼアッセイキット）。これはリン酸化の標的のトランスアクチベータドメイン（転写因子、例えばｊｕｎ）に融合したｔｅｔリプレッサーの発現を包含する。ｔｅｔ−レプレッサーエレメント制御下のルシフェラーゼ構築体の活性化は、トランスアクチベータドメインがキナーゼにより特異的にリン酸化された場合にのみ起こる。これにより、本発明によれば、ｅｅ３ファミリーの本発明のレセプターまたは本発明の変異体の活性を細胞のシグナル伝達経路に割り当てることができる。
【００２５】
本発明の配列の同定は、ＥＰＯの発現上昇を伴う動物モデルで本発明のマウスｅｅ３＿１＿ｍがアップレギュレーションされていることから、細胞の生き残りやこの状態への細胞の適応に影響するプロセスに前記レセプターが、病理生理学的に関係していることが示唆されたという機能上の発見に特に基づいている。従って本発明のレセプターは酸素供給の低下に伴う病気、特に脳への酸素供給低下に関係する病気にとって特に薬学的に重要である。
【００２６】
更に本発明のＤＮＡ配列の調製、修飾および／または検出に関し当業者に一般的であるいずれの方法も好適であり、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施することができる（ＰＣＲ（イニスら、ＰＣＲプロトコル：方法およびアプリケーションの手引き）または化学合成）。適当なＰＣＲプライマーにより、例えば本発明のＤＮＡ配列内に新規の機能、例えば制限的切断部位、停止コドン等を導入することができる。これにより本発明の配列をクローニングベクター内移行に合わせてデザインできる。
【００２７】
本発明はさらに上記の様な本発明の核酸配列、典型的にはＤＮＡ配列を含んで成る発現ベクターまたは組換え体核酸構築体に関する。この場合、本発明の核酸配列は、例えば転写および翻訳シグナルの様な遺伝制御エレメントの少なくとも一つと機能的に連結していると好都合である。望まれる応用方法によって、この連結は本来の速度での発現、または本来の遺伝子発現を増加または低下させるだろう。次に、この様にして調製された発現ベクターを用いて宿主生物または宿主細胞、例えば哺乳動物細胞の細胞培養体を形質転換する。
【００２８】
本発明の発現ベクターでは、本来ある制御エレメント、即ち、例えばｅｅ３ファミリーの本発明のタンパク質、例えば哺乳動物に由来する本発明のタンパク質、特に配列番号５、６、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、８または１１を持ったタンパク質の遺伝子のプロモーターおよび／またはエンハンサー、特には対応するヒト制御配列が一般に用いられる。これら上記の未変性制御配列は、必要であれば遺伝的に修飾して発現の強さを変えてもよい。上記の未変性制御配列に加えて、または前記未変性制御配列に代わって他の遺伝子に未変性制御エレメントを、本発明のＤＮＡの上流および／または下流に持たせ（５’または３’制御配列）、これらもまた必要に応じて遺伝的に修飾して、上記未変性制御配列の制御下にある天然の制御の機能を止め、それにより前記遺伝子の発現を希望に応じて増加または減少させることもできる。
【００２９】
本発明の方法に好都合な制御配列は、例えばｃｏｓ、ｔａｃ、ｔｒｐ、ｔｅｔ、ｔｒｐ−ｔｅｔ、ｌｐｐ、ｌａｃ、ｌｐｐ−ｌａｃ、ｌａｃＩｑ、Ｔ７、Ｔ５、Ｔ３、ｇａｌ、ｔｒｃ、ａｒａ、ＳＰ６、１−ＰＲまたは１−ＰＬプロモーター内に存在しており、これらのプロモーターはグラム陰性細菌に都合よく利用されている。より都合のよい制御配列は、例えばａｍｙおよびＳＰＯ２の様なグラム陽性プロモーター、ＡＤＣ１、ＭＦａ、ＡＣ、Ｐ−６０、ＣＹＣ１、ＧＡＰＤＨの様な酵母プロモーター、またはＣａＭ、キナーゼＩＩ、ＣＭＶ、ネスチン、Ｌ７、ＢＤＮＦ、ＮＦ、ＭＢＰ、ＮＳＥ、ベータ−グロビン、ＧＦＡＰ、ＧＡＰ４３、チロシンヒドロキシラーゼ、キネート−レセプターサブユニット１、グルタミン酸−レセプターサブユニットＢの様な哺乳動物プロモーター内に存在している。原理的には、これら上記の制御配列を持つ天然プロモーターは、本発明の発現ベクターに使用することができるだろう。
【００３０】
更に合成プロモーターも利用可能であり、そして好都合である。これら制御配列は、本発明の核酸配列に狙いを定め発現させることを可能にするものである。このことは、宿主生物に応じて、例えば導入後にのみ遺伝子が発現するか、または過剰発現すること、あるいは即時的に発現および／または過剰発現することを意味する。制御配列またはファクターは、発現に対し有利な影響を持ち、それにより発現を増加することが望ましい。即ち制御エレメントはプロモーターおよび／またはエンハンサーといった強力な転写シグナルを用いて転写レベルで有利に高められるだろう。しかし、例えばｍＲＮＡの安定性を向上することで、翻訳を高めることもできる。
【００３１】
制御配列は、本発明の配列の発現に転写および／または翻訳レベルで影響を及ぼすことが可能である、当業者に一般的ないずれかの要素を意味する。プロモーター配列以外に、ＲＮＡポリメラーゼとＤＮＡとの相互作用の改善を通し発現を増加することができる「エンハンサー」配列についても、説明する必要がある。例として挙げることのできるその他の制御配列としては、「遺伝子座制御領域」、「サイレンサー」またはその特定部分配列がある。これら配列は組織特異的な発現に有利に利用できるだろう。本発明の発現ベクターは、本発明に拠るところの用語「制御配列」の中に含まれる「ターミネーター配列」を含むと都合がよいだろう。
【００３２】
本発明の好適実施態様は、本発明の核酸配列とプロモーターとの連結であり、前記プロモーターは一般的には本発明のＤＮＡ配列の５’上流に配置される。例えば３’ターミネーター、ポリアデニル化シグナルまたはエンハンサーといったその他の制御シグナルが発現ベクター内に機能的に存在してもよい。更に、本発明の遺伝子構築体内には、１またはそれ以上のコピー数の本発明の核酸配列が、具体的には図９、１０、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃまたは１２あるいは対応するタンパク質について存在してもよく、場合によっては別の遺伝子構築体上に存在してもよい。
【００３３】
用語「発現ベクター」は、前記の様な組換え体核酸構築体または遺伝子構築体、および一般的に本発明のＤＮＡ配列に加えて、その他エレメントおよび可能な制御配列をも含む完全なベクター構築体の両方を包含する。これらベクター構築体またはベクターは、好適な宿主生物での発現に使用する。少なくとも１つの本発明のＤＮＡ配列、例えばｅｅ３ファミリーのヒト遺伝子、具体的にはｅｅ３＿１またはｅｅ３＿２、あるいはこの種の遺伝子の部分配列を、選択した宿主内で遺伝子を最適に発現することができる宿主特異的ベクター内に挿入するのが有利である。ベクターは当業者に周知であり、例えば「クローニングベクター」（非特許文献１７）に見つけることができる。ベクターは、プラスミドに加え、例えばファージ、ＳＶ４０、ＣＭＶ、バキュロウイルス、アデノウイルス、シンドビスウイルス等のウイルス、トランスポゾン、ＩＳエレメント、ファスミド、ファージミド、コスミド、直鎖もしくは環状ＤＮＡといった当業者既知のその他ベクターをも意味する。前記ベクターは、宿主生物内において自立的に増幅できるか、染色体依存的に増幅できる。哺乳動物内への組み込みでは、一般には直鎖ＤＮＡを使用する。
【００３４】
本発明の核酸配列の発現は、遺伝子コピー数の増加および／または遺伝子発現に有利な影響を持つ制御ファクターを高めることにより好都合に増やすことができる。即ちプロモーターおよびエンハンサーといったより強力な転写シグナルを利用することで、転写レベルで制御エレメントを好ましく高めることができる。しかしこれ以外にも、例えばｍＲＮＡの安定性を高め、またはリボゾーム上での前記ｍＲＮＡの読取り効率を挙げることでも翻訳を促進できる。遺伝子のコピー数は、例えば核酸配列または相同遺伝子を、特定の遺伝子に割り当てられた制御遺伝子、または同様の様式で作用するプロモーター活性を好ましく含む核酸断片またはベクター内に取り込むことでも増やすことができる。遺伝子発現を高める制御配列が、特に用いられる。
【００３５】
本発明の核酸配列は、相互作用するまたは相互作用する可能性のあるタンパク質をコードする配列と一緒に単一のベクター内にクローニングし、続いて宿主細胞中にｉｎ  ｖｉｔｒｏ、または宿主生物中でｉｎ  ｖｉｖｏに発現してもよい。あるいは、相互作用する可能性のある核酸配列および本発明のｅｅ３ファミリーのコーディング配列をそれぞれ単独ベクターに導入し、例えば形質転換、トランスフェクション、形質導入、エレクトロポレーションまたはパーティクルガンといった一般的方法を用いて前記ベクターを別々に特定生物内に持ち込むこともできる。
【００３６】
別の好適実施態様では、少なくとも１種類のマーカー遺伝子（例えば抗生物質耐性遺伝子および／または蛍光タンパク質、具体的にはＧＦＰをコードする遺伝子）が、本発明の発現ベクター、具体的には完全ベクター構築体内に存在してもよい。
【００３７】
本発明はさらに本発明のＤＮＡ配列および／または発現ベクターにより、具体的にはベクター構築体により形質転換した宿主細胞に関する。好適宿主細胞は原則的には本発明のＤＮＡ配列（結果として例えば誘導体としてそれらの対立遺伝子または機能的等価物を含む）を単独またはその他の配列、特に制御配列と結合して発現することができるいずれかの細胞である。好適宿主細胞は全ての前核−または真核細胞、例えば細菌、真菌、酵母、植物または動物細胞である。好ましい宿主細胞は大腸菌、放線菌、枯草菌またはシュードモナスの様な細菌、アスペルギルスあるいはサッカロミセス−セレビシエもしくは一般のパン酵母の様な真核微生物である（非特許文献１８）。本発明のタンパク質を比較的大量に調製する場合には、メタノール資化性酵母、特にＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓが好ましく、また有利である。そのためには、レセプターを例えば精製に有用なタグ配列を含む融合タンパク質として発現することができる好適発現ベクター内にクローニングする。最後に、酵母にエレクトロポレーションした後、安定したクローンを選択する。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社が、この方法の詳しい説明書およびそれに必要な全ての手段を提供している。その後発現産物を機能的に特徴付け、適当な場合には本発明のスクリーニング法に用いる。
【００３８】
しかしながら好ましい実施態様では、本発明のＤＮＡ配列の発現には多細胞生物由来の細胞が選ばれる。これは、コードされたタンパク質がグリコシル化（Ｎ−および／またはＯ−結合）する必要がある可能性に配慮したものである。前核細胞に対し、より高等な真核細胞は、この機能を適切な様式で遂行できる。原則的には高等真核細胞の培養体は宿主細胞として利用可能であるが、なかでも哺乳動物細胞、例えばサル、ラット、ハムスターまたはヒトが特に好ましい。多くの樹立細胞株が、当業者に知られている。次に、細胞株の例を挙げるが、これらが全てではない：２９３Ｔ（胚腎臓細胞株）、（非特許文献１９）、ＢＨＫ（子ハムスター腎臓細胞）、ＣＨＯ（ハムスター卵巣細胞）、（非特許文献２０）、ＨｅＬａ（ヒト子宮頸癌細胞）およびその他細胞株であり、特には研究使用に適した樹立株、例えばＣＨＬ、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、Ｓｆ９またはＣＯＳ細胞である。特に好ましいのはヒト細胞、特に免疫系または成人幹細胞、例えばＨｅｍａｔｏｐｏｅｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍ（骨髄由来）である。本発明のヒト形質転換細胞、特に患者の自己細胞は、本発明のＤＮＡ配列または本発明の発現ベクターにより形質転換された後（特にｅｘ  ｖｉｖｏで）のものは、例えば遺伝子治療を目的とする薬物、即ち細胞を取り出した後、適当にｅｘ  ｖｉｖｏで増殖し、形質転換、選択し、最後に移植し戻す薬物として非常に好適である。
【００３９】
特に本発明の有利な点は、昆虫細胞でｅｅ３ファミリーの本発明タンパク質を異種生産して本発明の機能特性を分析し、スクリーニングに応用することであろう。例えばＧｉタンパク質がウエスタンブロットでは検出できないことから分かるように、昆虫細胞では内因性Ｇタンパク質の濃度は比較的低く、かつ昆虫細胞は研究対象となるレセプターを一般には発現しないことから、本発明のｅｅ３ファミリーレセプターのシグナル伝達経路をｉｎ  ｖｉｖｏで再構築することに関し前記細胞は特に好適である。この場合、ｅｅ３ファミリーのレセプターはバキュロウイルス発現システムを用い、各種昆虫細胞株、例えばＳｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｎ３６８またはＴｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ、またはＭＢ細胞で発現する。この目的を達成するために、組換え体バキュロウイルスを、例えばＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄキットを用い調製し、上記昆虫細胞株に感染させる。本発明に従いＧタンパク質との共役を研究するためには同時感染を行う。そのためには、細胞をレセプターウイルスで感染し、さらに３種類のＧタンパク質サブユニットを発現するウイルスでも感染し、対応するアッセイ、例えばｃＡＭＰアッセイを実行する。従って、レセプターの活性に対する種々のタンパク質の影響を、調べることができる。レセプターまたはそれらの膜を発現する昆虫細胞も、スクリーニングアッセイに同様に利用できるだろう。昆虫細胞はファーメンタまたはシェイカーフラスコ内で簡単に大量に継代できるため、スクリーニング法およびレセプター精製を目的とする組換え体細胞または膜材料の提供に好適な出発材料である。
【００４０】
宿主細胞およびプラスミド、ウイルスまたはファージといった宿主細胞に好適な本発明の発現ベクター、例えばＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター系を含むプラスミド、ファージ１、ミューもしくはその他テンプレートファージ、またはトランスポゾン、ならびに／あるいはその他有利な制御配列との組合せにより、本発明の宿主細胞を生成すれば、これら細胞は発現系として機能するだろう。本発明の宿主細胞に基づく本発明の発現系の好適例は、例えばＣＨＯ細胞といった哺乳動物細胞と例えばｐｃＤＮＡ３ｎｅｏベクターといったベクターとの組合せ、あるいは例えばＨＥＫ２９３細胞と哺乳動物細胞に特に好適であるＣＭＶベクターとの組合せである。
【００４１】
本発明の別の局面は、本発明のＤＮＡ配列の遺伝子産物に関する。本発明では、遺伝子産物とは一次転写物、即ちＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡ、ならびにタンパク質および／またはポリペプチド、特に精製されたものの両方を意味する。これらタンパク質は、特にアポトーシスまたは壊死のシグナル、適当であれば炎症性のシグナル、または細胞増殖もしくは細胞適応性に関係するシグナルを制御し、または伝達する。前記遺伝子産物がこの配列の機能的な相同体もしくは機能−阻害（非機能的）対立遺伝子、断片、類似体または誘導体を含んで成るか、またはこの様なアミノ酸配列から典型的に構成されているのであれば、その精製遺伝子産物は好ましいものである。本発明によれば、機能的相同体はその配列が５、６、７ａ（７ｂおよび７ｃを含む）、８および１１に記載されている図１３から１６まで、および／または１８に記載のタンパク質が持つ本質的機能特性の少なくとも一つを保持する様に定義される。典型的には、本発明の機能的相同タンパク質は、具体的および特徴的には、本発明のタンパク質の生物学的機能部分に対し、例えばタンパク質相互作用ドメインに対し、例えば少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８０％同一である配列であろう。本発明によれば、具体的には実施態様６に開示される、第３、５、８およびＸ染色体上にある相同配列、およびそれらの変種も開示に含まれる。
【００４２】
ここで言う誘導体は、特にそれらの側鎖の修飾、例えば本発明のＡＡ配列への抗体、酵素またはレセプターの結合により変更が加えられたＡＡ配列も包含する。しかし誘導体は、糖（Ｎ−またはＯ−グリコシド結合による）または脂肪（酸）残基（例えばミリスチン酸）、１またはそれ以上のリン酸基との共役体、および／または側鎖、具体的には遊離ＯＨ基またはＮＨ２基上あるいは本発明のオリゴ−またはポリペプチドのＮもしくはＣ末端上の修飾体でもよい。さらに用語「誘導体」は、融合タンパク質、即ち本発明のアミノ酸配列にいずれかのオリゴ−またはポリペプチドが結合しているタンパク質も包含する。
【００４３】
「類似体」とは元の配列と比較した時に、少なくとも１個のＡＡの修飾（挿入、置換）により区別される配列を意味する。本発明の目的に照らした場合、置換後のＡＡ（極性ＡＡ、脂肪長鎖、脂肪短鎖、負または正帯電性ＡＡ、芳香基を持つＡＡ）が物理化学的特性（容積、塩基性、疎水性等）を保持している保存的置換が好ましい。置換により生物学的に機能的な、部分的に機能的な、または生物学的に非機能的な配列が生成されるだろう。例えばリジン残基はアルギニン残基の代わりに、イソロイシン残基はバリン残基の代わりに、またはグルタミン酸残基はアスパラギン酸残基の代わりになるだろう。しかし、１もしくはそれ以上のアミノ酸を付加または除去、またはその順番を変更すること、あるいはこれら操作を複数組み合わせることもできる。この様にして変更したタンパク質は、本来のｅｅ３タンパク質、具体的には図１３、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６または１８と比較した場合、アルトシュールら（非特許文献２１）のアルゴリズムに従い計算して、一般には上記図内の配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、そして特に好ましくは少なくとも９０％同一である配列を有する。単離されたタンパク質およびその機能変種は、ヒト、ドブネズミまたはハツカネズミのような哺乳動物の脳から都合よく単離できる。機能変種とは、その他哺乳動物由来の相同体も意味する。
【００４４】
本発明によれば、類似体であっても本来の配列に見られる二次構造を保持する限りにおいては、好ましいものである。本発明によれば、保存的な置換に加えて、保存性の低いＡＡ変種を本来の配列内に導入することもできる。一般的にこれら変種は、それらの持つここでの生物機能、具体的にはアポトーシスまたは壊死シグナルの伝達体としての機能、または細胞増殖、細胞適応もしくは細胞成長に関するシグナルの伝達体としての機能を保持している。置換または欠失の影響は、適当な試験方法、例えば結合アッセイまたは細胞傷害性アッセイにより容易に試験できる。
【００４５】
しかしながら、本発明はさらに、「優性阻害型」の作用を及ぼすことができる配列、即ちそれらの持つ変更された一次配列により、細胞外リガンドとの結合活性を保持しつつ、下流、即ち細胞内にシグナルを伝達できない配列も包含する。本明細書に開示する例は、そのＣ末端が切断されているｅｅ３＿１配列、例えば図１１Ｂまたは１１Ｃの２種類のスプライス変種、即ちそれぞれ１５Ｂまたは１５Ｃである。従ってこの種の類似体は、生物的機能の阻害剤、具体的にはアポトーシスの阻害剤として機能する。この種の類似体は遺伝子工学的に構築され、一般的には本発明のタンパク質をコードしているＤＮＡ配列の「部位指定」突然変異誘導法により構築される（典型的には配列番号５、６、７（ｂ、ｃ）、８および１１のもの）。これにより、類似体の基本となり、最終的に組換え細胞培養体の中でタンパク質を発現できるＤＮＡ配列が生成される（非翻訳文献１１）。上記類似体ならびに上記ＡＡ配列の基となるＤＮＡ配列の誘導体も、開示する。
【００４６】
本発明はさらに、本発明の本来のＡＡ配列の断片も包含する。断片は欠失（Ｎ−またはＣ−末端あるいは配列内欠失）により識別される。断片は、優性阻害的または優性作用的な効果を持つだろう。
【００４７】
しかし、本発明の遺伝子産物（タンパク質）には、本発明に従い図内に示したＤＮＡ配列のＤＮＡ誘導体、ＤＮＡ断片またはＤＮＡ対立遺伝子より、転写および翻訳後に誘導される全てのこれら遺伝子産物（タンパク質）も包含される。
【００４８】
さらに、本発明のタンパク質は、化学的に修飾してもよい。即ち、例えば保護基をＮ末端に存在させてもよい。グリコシル基をヒドロキシルまたはアミノ基に結合し、脂質を本発明のタンパク質に共有結合して、同様にリン酸またはアセチル基等を結合してもよい。いずれかの合成経路を介していずれかの化学物質、化合物または基を本発明のタンパク質に結合してもよい。また、例えば独立したアミノ酸またはペプチド、またはタンパク質ドメイン等の形をした付加アミノ酸が、本発明のタンパク質のＮ−および／またはＣ−末端にあってもよい。
【００４９】
本発明では、本発明のタンパク質のアミノ酸配列のＮ−末端に「シグナル」または「リーダー」配列を与えることが特に好ましく、これらはペプチドを翻訳と同時または翻訳後に特定の細胞器官または細胞外空間（あるいは培地）内に導く。本発明のアミノ酸配列の抗体との結合を可能にするアミノ酸配列、例えば抗原が、ＮまたはＣ末端に存在してもよい。この場合、その配列を一文字アミノ酸コードで表した時にＤＹＫＤＤＤＤＫであるフラグペプチドが、特に注目される。または少なくとも３個、好ましくは少なくとも６個のヒスチジン残基を有するＨｉｓタグも、注目される。これら配列は、強い抗原特性を有しており、組換え体タンパク質の迅速試験および簡便な精製を可能にする。フラグペプチドに結合するモノクローナル抗体はＥｓｔａｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏ．，  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，  Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，  Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔより入手できる。
【００５０】
本発明はさらに本来のｅｅ３配列の一区分、具体的には図１３、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６または１８に開示される配列に関し、これら区分は少なくとも２０、より好ましくは少なくとも３０、よりさらに好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸を含んで成る。この種の部分配列は、当業者既知の方法により化学的に合成してもよく、例えば抗体の産生を目的とする抗原として好ましく用いることができるだろう。好ましくは、これら区分および／またはその誘導体、対立遺伝子もしくは断片は、本発明の本来のｅｅ３配列、具体的には図１３、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６の配列中にあり、タンパク質の３次元モデルに於いてタンパク質表面を少なくとも部分的に構成する領域を形成する配列である。少なくとも２０ＡＡ長を持つ好適部分配列は、少なくとも部分的に、本発明のタンパク質の細胞質区分を含んで成り、特に好ましくは、本発明の区分は位置６００から位置７５２の間（図８による）にある、図８の本発明の配列中にある少なくとも２０ＡＡ長のペプチド、例えばペプチドＷＷＦＧＩＲＫＤＦＣＱＦＬＬＥＩＦＰＦＬＲＥ（位置６０９から６３０、２１ＡＡ長）を持つだろう。
【００５１】
本発明のＡＡ配列、例えばヒトタンパク質ｅｅ３＿１またはｅｅ３＿２の配列は、他のＧＰＣＲ分類例に同様の形状で見いだすことができる特異的配列モチーフをさらに持っている。即ち、例えばＧＰＣＲ分類タンパク質内の第３膜貫通ドメインの下流には、典型的なシグネチャートリプレット配列がある（配列ＤＲＹを含む配列（一文字コードで表したＡＡ））。
【００５２】
本発明のｅｅ３＿１では、配列ＤＲＩ（位置１０３〜１０５）はＴＭ３（８３〜１０２）の下流に見いだすことができる（図１５Ａによる）。先行技術で既知であるＧＰＣＲ分類例では（ガラニン−２レセプター、Ｃ５ａレセプター（ラット）、ＢＫ−２（ヒト）またはＣＸＣＲ−５（ヒト））、配列ＤＲＹまたはＤＲＦを対応する位置に見いだすことができる。
【００５３】
従って、上記の少なくとも２０ＡＡ長の本発明のペプチドは、ＡＡトリプレットＤＲＩを含んで成るものが特に好ましい。本明細書に記載されるこの種の本発明のペプチド例は、配列ＶＬＶＣＤＲＩＥＲＧＳＨＦＷＬＬＶＦＭＰを有するペプチドである。この種の本発明のペプチドは、レセプターの生理学的機能を変調するために特に使用されるだろう。この様なペプチド配列の細胞内取り込み、または一般的な利用では、細胞内シグナル伝達プロセスの拮抗薬依存的な活性化、Ｇタンパク質と本発明のレセプターとの相互作用の活性化、および場合によってはレセプターの内在化が影響を受けるだろう。適当である場合には、特定の本発明のオリゴ−またはポリペプチドを使って下流のシグナル伝達経路を構成的に活性化することもできる。従って本発明のオリゴ−またはポリペプチドは、薬物としての使用または調製に特に好適である。
【００５４】
さらに少なくとも２０ＡＡ長を持つ本発明のオリゴ−またはポリペプチド、例えばｅｅ３＿１（図８参照）の前方２つの細胞外ループは、ＧＰＣＲタンパク質分類の典型的特徴である２個の保存的システイン（図１５Ａでは、ｅｅ３＿１内の位置７８と１４５）も含み成ることが好ましいだろう（第１細胞外ループの末端にある配列ＧＥＴＣＶ、第２細胞外ループの中央部にある配列ＥＬＥＩＬＣＳＶＮＩＬ）。従って本発明のオリゴペプチドの配列は、例えば上記２配列を含む。
【００５５】
最後にＴＭ領域に由来する、ｅｅ３ファミリータンパク質の配列由来の少なくとも２０ＡＡ長を持つペプチド、例えばペプチドＬＤＧＨＮＡＦＳＣＩＰＩＦＶＰＬＷＬＳＬＩＴを含み成る（部分的にＣ末端ＴＭドメインを含みなる）ものも、特に好ましい。この種の本発明のペプチドは、ｅｅ３タンパク質のレセプター活動の変調、特に阻害に好ましく用いられ、以下記載の本発明の適用にこの種のペプチドを応用する治療的側面に好ましく用いられる。ＴＭ構造を阻害するペプチドは、レセプターとの正常な結合を破壊することによりレセプターの機能を変化し、特にその機能を消失させる。この関係では、例えばベータ−２−アドレナリン作動性レセプターの第６ＴＭドメインへのその種のアプローチを、例として挙げられる（非特許文献２２）。さらに本発明は、同様に薬物としての利用または調製に適した、ｅｅ３ファミリーのタンパク質の配列に由来する少なくとも２０ＡＡ長を持つリガンド結合ペプチド断片を提供するが、これら断片は結合部位を巡って本来のリガンド（細胞外または細胞内リガンド）と競合でき、そのようにして本来のｅｅ３リガンドの結合を阻止できる。この種の本発明のペプチドは「デコイレセプター」とも称され、本明細書に記載される全ての適用例に治療的側面を提供する。
【００５６】
更に、例えば本発明の阻害ペプチドを同定する方法も開示される。本発明によれば、この目的に好適なものは、特にはタラソヴァらが別の分野で記載した方法であり（非特許文献２３）、それはその全てが方法論の観点から本開示の中に取り込まれる。これら本発明の阻害ペプチドは、例えば様々なＴＭドメインの分子間相互作用、ｅｅ３ファミリーの本発明のタンパク質の機能にとって重要な前提条件を変調する、例えば阻害することができる。この種の本発明のペプチドは薬剤または薬剤の調製にも適している。
【００５７】
上記のタイプの本発明のペプチドはペプチド類似体（ペプチドミメティクス）の形で存在してもよい。この場合、主鎖内のアミド様結合は構造的に同等であり、ヒトが生来持つ酵素によって選択的に切断されることのない別の結合に置換することが好ましい。本例では、例えばオリゴカルバミン酸エステルが好適である。単量体Ｎ−保護アミノアルキルカルボン酸エステルは、例えば対応するアミノアルコールから容易に調製でき、そして塩基不安定Ｆｍｏｃ基を用いて活性化エステルに変更した後に固相合成に導入できる。この種の類似体は、対応するペプチドに比べてより疎水性であるため、血液−脳関門の通過、即ち神経学的使用を目的とする薬物として特に好適である。
【００５８】
本発明は更に、トランスジェニック動物にも関する。本発明のトランスジェニック動物は、少なくとも１種類の組織について正常動物に比較し異なる量の本発明の遺伝子産物（例えば本発明の遺伝子のプロモーター領域の修飾による）、あるいは修飾された遺伝子産物（例えばｅｅ３ファミリータンパク質の本発明の誘導体、例えば断片）を発現するかまたは含む様に遺伝的に変更された動物である。本発明によれば、これには（ａ）もはや遺伝子レベルに於いて一部分または完全長の未変性の本発明のＤＮＡ配列を持っていない動物、または（ｂ）遺伝子レベルでは本発明の配列を保持しているが、前記配列が転写および／または翻訳できず、結果として遺伝子産物をもはや有していない動物が含まれる。さらにトランスジェニック動物内の本発明の本来の配列、即ちｅｅ３タンパク質ファミリー配列、例えば配列番号５、６、７（７ｂおよび７ｃを含む）、８および１１（存在するか否かにかかわらず）は、少なくとも１つの本発明のＤＮＡ配列によって拡張され、および／または少なくとも一つの本発明のＤＮＡ配列により置換されてもよい。この置換および／または挿入配列は、具体的には変性された本発明の配列であってもよい。
【００５９】
本発明の配列に関しトランスジェニックである動物および／または「ノックアウト」動物の作製、特にマウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）またはグッピーでの調製は、当業者に一般的な方法で実施される。この目的を達成するためには、本発明のｃＤＮＡ配列、または例えば未変性もしくは変性変種をトランスジェニックマウスに於いて、例えばＮＳＥプロモーターの下に神経細胞内、ＭＢＰプロモーターの下に乏突起神経膠細胞内等で発現する。次に遺伝的修飾が加えられた動物は、様々な疾患モデル（例えば実験的に誘導された卒中、ＭＣＡＯ）の研究に用いられるだろう。ノックアウト動物の作製は、更に生体全体に対する阻害剤の影響について情報を提供すると思われるが、これはこれに関して「ノックアウトモデル」が本発明の未変性配列の阻害に相当するからである。この点に関して、この種の方法は、本発明の阻害物質、例えば本発明のペプチド、ペプチド類似体またはその他の小型有機化合物の前臨床試験に使用できるだろう。
【００６０】
本発明に従えば、全ての多細胞生物は具体的には哺乳動物、例えばマウス、ラット、ヒツジ、ウシまたはブタはトランスジェニック的にデザインできるだろう。トランスジェニック植物も原理的には考え得る。トランスジェニック生物はまた、「ノックアウト」動物でもよい。この場合、トランスジェニック動物は、本発明の機能的もしくは非機能的核酸配列、あるいは機能的もしくは非機能的な核酸構築体を単独で、または本発明のタンパク質をコードする機能的もしくは非機能的配列と組合せて含んでもよい。
【００６１】
上記トランスジェニック動物の更なる本発明の態様は、その生殖細胞またはその体細胞の全てもしくは一部、あるいはその生殖細胞またはその体細胞の全てまたは一部の未変性の本発明ヌクレオチド配列ｅｅ３ファミリー、具体的には番号１から４の配列が遺伝的方法により変更されているか、またはＤＮＡエレメントの挿入により中断されているトランスジェニック動物である。本発明のヌクレオチド配列またはその一部について考え得る別の利用は、トランスジェニックもしくはノックアウト動物、または条件的もしくは領域特異的ノックアウト動物、または遺伝的に修飾された動物内への特異的突然変異の生成である（非特許文献２４、非特許文献２５）。さらにトランスジェニック動物内に、例えば構成的に活性なｅｅ３タンパク質を生成するために（「ノック−イン」動物）、特定の突然変異を誘導すること、例えばプロモーターの修飾またはエンハンサーの挿入を行うことも可能である。この種の動物は、例えば前臨床用のｅｅ３タンパク質機能に関する作用薬候補向けの類推モデルを提供することを目的として、本発明に従い使用してもよい。
【００６２】
トランスジェニック過剰発現、または胚幹細胞での相同的組み換えによる遺伝的突然変異（ヌル突然変異または特異的欠失、挿入または修飾）という手法を用いることで、本発明の配列の（病的）生理学について価値ある情報を更に提供する動物モデルを作ることができる。この様にして作製された動物モデルは、本発明のタンパク質の生物機能、特に配列５から８のいずれかを有するタンパク質の神経、免疫、増殖またはその他プロセスに関し影響を及ぼす新規治療薬の評価にとって必須の試験システムであろう。
【００６３】
本発明はさらに、本発明のｅｅ３遺伝子産物、特には図１３、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ１６、または１８あるいはその誘導体、断片またはアイソフォームまたは対立遺伝子上にあるエピトープを認識するが、同時に例えば本発明のｍＲＮＡに対するものであってもよい抗体に関する。本発明によれば、用語「抗体」はポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方、キメラ抗体、抗イディオタイプ抗体（本発明の抗体に対するもの）、結合型または溶解型で存在するもの全て、および該当する場合にはラベル標識されたもの、ならびに前記抗体の断片を包含する。単離された本発明の抗体の断片に加え、本発明の抗体は他の（タンパク質）成分との融合タンパク質の様な組換え体形状であってもよい。この種の断片または融合タンパク質の一部としての本発明の抗体の断片は、一般に当業者に一般的である酵素開裂、タンパク質合成または組換え体技術により調製される。即ち、本発明によれば、ポリクローナル、モノクローナル、ヒトまたはヒト型、あるいは組換え体抗体またはそれらの断片、単鎖型抗体、あるいは合成抗体を抗体と呼ぶ。
【００６４】
ポリクローナル抗体は抗体分子の不均質な混合物であり、それらは抗原で免疫された動物の血清から調製する。しかし本発明は、抗体を精製（例えば特異的エピトープのペプチドを充填したカラムによる）して得たポリクローナルな単特異的抗体も包含する。モノクローナル抗体は、抗原に対し特異的であり、実質同一のエピトープ結合部位を有する抗体の本質的に均質な集団を含んで構成される。モノクローナル抗体は、当分野既知の方法（例えば非特許文献１０３、特許文献１、非特許文献２６、非特許文献２４）を用いて得られるだろう。上記引用文献にある記載は、上記の引用により本発明の一部として本発明の開示の中に取り込まれている。
【００６５】
遺伝的に構築された本発明の抗体は、上記明細書に記載の方法によっても調製できる。簡単に述べると、前記調製には抗体産生細胞を増殖すること、および前記細胞が適当な光学密度に達した後にグアニジンチオシアネートを用いて細胞を融解し、酢酸ナトリウムで酸性化し、フェノール、クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出し、イソプロパノールで沈殿し、そしてエタノールで洗浄するという既知の方法により、前記細胞からｍＲＮＡを単離することが含まれる。その後前記ｍＲＮＡから、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成する。次に合成したｃＤＮＡを直接、または例えば部位指定突然変異導入法、挿入、逆位、欠失または塩基置換の導入により遺伝的に操作した後、好適な動物、真菌、細菌またはウイルスベクターに挿入し、相応しい宿主生物内で発現させる。大腸菌といった細菌またはサッカロミセス−セレビシエといった酵母での遺伝子のクローニングおよび発現には、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８／１９、ｐＡＣＹＣ１８４、ラムダまたは酵母ミューベクターといった細菌または酵母ベクターが好ましい。本発明のタンパク質に対し特異的な抗体は、ｅｅ３ファミリーのタンパク質が病理生理学的に重要な病気の診断試薬または治療薬として有用であろう。
【００６６】
本発明の抗体は、以下いずれかのクラスの免疫グロブリンに属するだろう：ＩｇＧ、ＩｄＤ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＧＩＬＤおよび該当する場合にはＩｇＧのサブクラスまたはその混合物を意味する前記分類のサブクラス。好ましいものは、ＩｇＧおよび例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３またはＩｇＧＭといったそのサブクラスである。特に好ましいものは、ＩｇＧサブタイプのＩｇＧ１／ｋまたはＩｇＧ２ｂ／ｋである。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞クローンは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕまたはｉｎ  ｖｉｖｏで培養されるだろう。高力価のモノクローナル抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｓｉｔｕで産生するのが望ましい。
【００６７】
本発明のキメラ抗体は、様々な動物種に由来する様々な部分を含んで成る分子である（例えば、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域とヒト免疫グロブリンの定常領域とを有する抗体）。キメラ抗体は、一方では応用中の免疫原性を低下する場合に好ましく用いられ、その一方で産生収率を上げるためにも好ましく用いられる；例えばマウスモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞株より高率に産生されるが、同時にヒトに対しより高い免疫原性をしめすことから、ヒト／マウスキメラ抗体の使用が望ましい。キメラ抗体およびその調製方法は、当分野既知である（非特許文献、非特許文献２７、非特許文献２８、特許文献２、非特許文献２９、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、非特許文献３０、特許文献７、非特許文献３１、非特許文献３２、非特許文献３３および非特許文献２６）。これら参考文献は、本発明の中に開示の一部として取り込まれる。
【００６８】
この種の本発明の抗体は、本発明のｅｅ３タンパク質、具体的には図１３、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６または１８によるタンパク質上に細胞外区分の形で存在するエピトープに対し特に好ましく作製される。本発明の抗体は、これまでに開示された全ての変種に関して、例えば実験研究を目的としたｉｎ  ｖｉｔｒｏでのｅｅ３ファミリーの本発明タンパク質の阻害に、例えば標識を目的とするｉｎ  ｓｉｔｕで、あるいはそれらを例えば静脈内、皮下、動脈内または筋肉内に注射することによる治療利用に於いてｉｎ  ｖｉｖｏで使用できるだろう。
【００６９】
本発明の抗イディオタイプ抗体は、本発明の抗体の抗原結合部位に一般的に関連している決定基を認識する抗体である。抗イディオタイプ抗体は、本発明の抗イディオタイプ抗体がその対象とするモノクローナル抗体を得た出発材料と同種の動物および同一の遺伝的なタイプ（例えばあるマウス系統）を免疫することで調製されるだろう。免疫した動物は、前記イディオタイプ決定基に対する抗体（即ち本発明の抗イディオタイプ抗体）を産生することにより、免疫抗体のイディオタイプ決定基を認識するであろう（特許文献８）。本発明の抗イディオタイプ抗体はまた別の動物に免疫反応を誘起し、「抗−抗イディオタイプ抗体」を産生させるための抗原として使用してもよい。前記抗−抗イディオタイプ抗体は、そのエピトープ構造に関して、抗イディオタイプ反応を起こす元のモノクローナル抗体と同一であってもよいが、同一でなくてもよい。この様にして、モノクローナル抗体のイディオタイプ決定基に対する抗体を用いて、同一の特異性を持つ抗体を発現している別のクローンが同定できる。
【００７０】
本発明のタンパク質、本発明の前記タンパク質の誘導体の断片類似体、に対するモノクローナル抗体を用いて、例えばＢＡＬＢ／ｃマウスといった対応する動物に抗イディオタイプ抗体の結合を誘導してもよい。この様に免疫したマウスの脾臓由来の細胞を用いて、抗イディオタイプモノクローナル抗体を分泌する抗イディオタイプハイブリドーマ細胞株を樹立してもよい。抗イディオタイプモノクローナル抗体は、更に支持体（ＫＬＨ、カサガイヘモシアニン）に結合してからＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫に使用してもよい。これにより、これらマウスの血清は、元のモノクローナル抗体の結合特性を持ち、かつ本発明のタンパク質のエピトープまたはその断片もしくは誘導体に対し特異的である抗−抗イディオタイプ抗体を含む様になる。この様にして抗イディオタイプモノクローナル抗体は、それ自体のイディオタイプエピトープまたは研究対象となるエピトープに構造的に類似する「イディオトープ」を持つ。
【００７１】
用語「抗体」は、未変性の分子およびその断片の両方を包含するものである。上記断片は１または２個の抗原相補的な結合部位、例えば前記抗体に対応する結合部位、およびＦｖ、ＦａｂもしくはＦ（ａｂ’）2断片の様な軽鎖および重鎖から成るかまたは単鎖断片である、断端型または変更型の抗体断片である。好ましくはＦｖ、ＦａｂもしくはＦ（ａｂ’）2の様な端断型の二本鎖断片である。例えば未変性抗体には、Ｆｃ断片を欠くＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2が存在しており、その結果それらは未変性の抗体に比べると血流中により早く運び込むことでき、組織への非特異的結合が比較的小さい。本発明の抗体のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2断片、ならびにそれら抗体そのものを用いて、本発明のタンパク質を検出（定性的）および定量化してもよく（該当する場合には、本発明のタンパク質のタンパク質活性検出（例えば、特異的リン酸化）に用いてもよい）、その結果、本発明のタンパク質のタンパク質活性の定性および定量的決定および／または定量化の方法もまた本発明の主題であることが強調される。
【００７２】
この種の断片は、一般には例えばパパイン（Ｆａｂ断片調製時）もしくはペプシン（Ｆ（ａｂ’）2断片調製時）の様な酵素と用いたタンパク質分解開裂により調製されるか、あるいは前記断片は化学的酸化あるいは抗体遺伝子の遺伝子操作により得る。
【００７３】
本発明はまた、本発明の目的に適う抗体混合物にも関する。前記抗体以外にも、本発明に従い記載された方法または使用に適した抗体混合物を使用することもできる。モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の混合物の精製分画は、脳虚血（例えば脳卒中）、変性疾患、特に神経変性疾患、および例えばてんかんの様な神経病の治療を目的とする薬物として使用され、そして薬物の調製に利用される。
【００７４】
サンプル中あるいはその他にあるそれら抗体の断片および／またはその混合物を含めた本発明の抗体は、本発明のｅｅ３遺伝子産物、特に図１３、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６または１８のタンパク質、またはその断片もしくは誘導体の定量または定性的検出、あるいは本発明のタンパク質を発現している細胞、および該当する場合にはそれを分泌している細胞の検出に使用されるだろう。この観点では、本発明の抗体の診断試薬としての使用を開示する。即ち、例えば本発明の抗体を利用して本発明の遺伝子産物、例えば図１３、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６または１８のタンパク質の量、およびおそらくはその活性（例えば特異的リン酸化）を決定できる。検出は蛍光標識抗体と光学顕微鏡とを組合せ、フローサイトメトリーまたは蛍光測定法により実施される免疫蛍光法を実行できる。
【００７５】
本発明による本発明の抗体（前記抗体の断片または抗体のその他混合物を含む）は、本発明のタンパク質のｉｎ  ｓｉｔｕ検出を目的とした例えば免疫電子顕微鏡による免疫蛍光学的組織研究に好適である。ｉｎ  ｓｉｔｕ検出は患者より組織サンプルを得て、これらサンプルに本発明の標識抗体を加えることで実施されるだろう。抗体（またはこの抗体の断片）は、標識形態で生物サンプルに適用される。この様にすることで、サンプル中の本発明タンパク質の存在だけでなく、研究対象の組織内に於ける前記本発明のタンパク質の分布も決定できる。生物サンプルは生物体液、組織抽出物、例えば免疫細胞もしくは心筋細胞または肝細胞の様な採集細胞、あるいは組織培養でインキュベーションされた一般的な細胞でもよい。標識抗体の検出は、標識のタイプに応じて（例えば蛍光法）当分野既知の方法を用い実施されるだろう。しかし、生物サンプルは、例えばニトロセルロースの様な固体支持体またはその他支持体材料に適用してもよく、それにより細胞、細胞の一部、または可溶性タンパク質を固定する。次に支持体を１回または数回、好適な緩衝液で洗浄し、続いて検出可能な本発明の標識抗体で処理する。次に固体支持体を緩衝液で再度洗浄し、未結合の抗体を除く。次に固体固相に結合した標識体の量を、通常の方法で決定する。
【００７６】
好適な支持体は、具体的にはガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロンアミラーゼ、天然もしくは変性セルロース、ポリアクリルアミドおよび磁鉄鉱である。支持体は、本発明の条件に合致するために溶解度を制限しても、または不溶性であってもよい。支持体材料はいずれの形状でもよく、例えばビーズ形状、円柱状、または球状にしてもよいが、好ましい支持体はポリスチレンビーズである。
【００７７】
検出可能な抗体標識は、様々な方法で実行できるだろう。例えば、抗体を免疫アッセイ（ＥＩＡ）のなかで最終的に使用する酵素に結合してもよい。その後、前記酵素を対応する基質と反応させて検出対象となる化合物を生成させ、該当する場合には当業者に一般的である方法、例えば分光測光法、フルオロメトリーまたはその他工学的方法により定量化する。酵素は、マレイン酸脱水素酵素、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコール脱水素酵素、アルファ−グリセロリン酸脱水素酵素、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコース酸化酵素、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース６リン酸脱水素酵素、グルコアミラーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼでよい。次に、標識に用いた酵素に特異的な発色基質を使って検出することができ、この検出は例えば究極的には酵素反応で変換された基質をコントロールの標準物質と視覚的に比較することで実施されるだろう。
【００７８】
さらに検出は、他の免疫アッセイ、例えば抗体または抗体断片の放射ラベル（即ち放射免疫アッセイ（非特許文献３４））を用いて確実にしてもよい。放射性同位元素はシンチレーションカウンターまたはオートラジオグラフィーを用いて検出および定量できるだろう。
【００７９】
蛍光化合物、例えばフルオロセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒドおよびフルオレスカミンの様な化合物も同様に標識に使用できるだろう。蛍光発光金属、例えば152Ｅまたはランタニド属のその他金属もまた、用いられるだろう。これら金属は、例えばジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＥＴＰＡ）またはＥＤＴＡの様なキレート群を介して、抗体に結合する。本発明の抗体はさらに、化学発光を利用する化合物と結合してもよい。化学発光標識抗体の存在は、化学反応の進行中に生ずる発光により検出される。この様な化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩またはシュウ酸エステルである。生物発光化合物を利用することも、同様に可能である。生物発光は化学発光の一分類であり、生物系の中に見いだされ、触媒性タンパク質が化学発光反応の効率を高めている。生物発光タンパク質もまた発光を介して検出でき、好適な生物発光化合物の例はルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエコーリンである。
【００８０】
本発明の抗体はまた、「ツーサイト（ｔｗｏ−ｓｉｔｅ）」または「サンドイッチ」アッセイとしても知られる免疫的計測アッセイでも使用できる。典型的な免疫計測アッセイ系としては本発明の抗体を固相系に結合すること、およびその形で抗体を研究対象のサンプルと接触させることを特徴とする「前進」アッセイが挙げられる。この様にすることで、サンプルより抗体−抗原複合体より成る２成分固相を形成して抗原をサンプルから分離する。好適インキュベーション期間の後、固体支持体を洗浄して未結合の抗原を含むと思われる液体サンプル残留物を除き、続いて未知量の標識検出抗体を含む溶液に接触させる。この時標識抗体は「レポーター分子」として機能する。標識抗体を固相に結合した抗原と結合させる二回目のインキュベーション期間が終了した後、固相支持体を再度洗浄して未反応の標識抗体を除く。
【００８１】
別のアッセイ形態として「サンドイッチ」アッセイを利用してもよい。この方法では、固相結合抗体と標識抗体をアッセイ対象サンプルに同時に加えるのであれば、インキュベーションは１回で十分であろう。インキュベーション終了後、固相支持体を洗浄して残留液体サンプルと未結合の標識抗体を除く。固相支持体上の標識抗体の存在は、一般的な「前進」サンドイッチアッセイと同様にして決定する。「リバース」アッセイでは、最初に標識抗体溶液を液体サンプルに段階的に加える段階と、続いて溶液インキュベーション期間後に固相支持体に結合した未標識抗体を混合する段階を含む。２回目のインキュベーション段階の後、固相支持体を一般的方法で洗浄して、固相支持体から残留サンプルおよび未反応の標識抗体を取り除く。次に固相支持体と反応した標識抗体を、上記同様に決定する。
【００８２】
本発明はさらに本発明のｅｅ３遺伝子産物、即ち具体的にはその誘導体、類似体および断片も含めた図１３、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６または１８のポリペプチドを発現する方法、これらに関し本発明の発現ベクターを使って宿主細胞を形質転換する方法も開示する。本発明のＤＮＡ配列に基づく遺伝子産物を発現するこの方法は、該当する遺伝子産物を濃縮および精製するものではなく、むしろ該当する遺伝子産物の発現を介して本発明のＤＮＡ配列を導入することで細胞代謝に影響を及ぼすものである。具体的には、ここでは発現ベクターを利用して形質転換した宿主細胞を、特に例えば腫瘍症、神経疾患、神経変性疾患（例えば多発性硬化症、パーキンソン病）、脳虚血症（例えば脳卒中）といった病気の治療を目的とする薬剤として使用、または薬剤の調製に使用する。本発明の宿主細胞は、一般にはアポトーシス、壊死、細胞増殖、細胞分裂、細胞分化または細胞適応の脱制御を原因とする病気に対し用いられる。この様にしてｅｘ  ｖｉｖｏに形質転換された本発明の自己または同種宿主細胞を、患者体内に移植してもよい。
【００８３】
本発明の別の局面は、本発明のアミノ酸配列、具体的には番号５、６、７（７ｂおよび７ｃを含む）、８および１１と相同な少なくとも部分配列、少なくとも２０以上、好ましくは少なくとも３０ＡＡ以上の少なくとも部分配列を有する遺伝子産物を単離する方法であって、前記方法が宿主細胞を本発明の発現ベクターにより形質転換される段階、前記遺伝子産物を培養体から最終的に精製することができるような好適な発現促進条件下で前記細胞を培養する段階を含む方法を含んで構成される。ここでは用いた発現系に従って、本発明のＤＮＡ配列の本発明遺伝子産物は、培地または細胞抽出物から単離されるだろう。具体的な単離方法および本発明のＤＮＡによりコードされた組換え体タンパク質を精製する方法が、宿主細胞のタイプ、またはタンパク質が培地に分泌されるか否かという点に強く依存していることは当業者にとって自明である。例えば組換え体タンパク質を宿主細胞から分泌するように、発現系を利用することができる。この場合、培地を市販のタンパク質濃縮用フィルター、例えばアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）またはミリポアペリコン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｉｃｏｎ）を使って濃縮しなければならない。この濃縮段階に続いて精製段階、例えばゲル濾過段階またはカラムクロマトグラフィー法を用いた精製が行われるだろう。しかし、代替法として、ＤＥＡＥマトリックスを有するアニオン交換体を使うことも可能である。
【００８４】
使用するマトリックスは、タンパク質精製に関し知られているいずれの材料でもよく、例えばアクリルアミドまたはアガロース、またはデキストラン等である。しかし通常カルボキシメチル基を含むカチオン交換体も利用できる。本発明のＤＮＡがコードするポリペプチドは、１またはそれ以上のＨＰＬＣ段階を利用して更に精製してもよい。逆相法が特に用いられている。前記段階は、本発明のＤＮＡ配列の実質均質な組換え体タンパク質を得るのに使用する。
【００８５】
遺伝子産物はまた、細菌細胞培養体だけでなく形質転換酵母細胞を用いても単離されるだろう。この場合、翻訳されたタンパク質は分泌させることができ、それによりタンパク質精製を簡便化できる。分泌された組換え体タンパク質は、本発明の開示の一部であるウラダールら（非特許文献３５）に開示されている方法により酵母宿主細胞から得られるだろう。
【００８６】
本発明の核酸配列、具体的には本発明のＤＮＡ配列、および／または本発明の遺伝子産物は薬物として、または薬物の調製に使用してもよい。前記薬物はそれのみで投与しても（例えば口腔内、静脈内、経口、非腸管的、鼻、皮下）または他の活性化合物、賦形剤または薬剤に一般的な添加物と組み合わせて投与してもよい。本発明の核酸は、裸の核酸として特には静脈内に注射しても、またはベクターを使って患者に投与してもよい。その様なベクターは、その種または別のウイルスベクターの様なプラスミド、具体的にはレトロウイルスまたはアデノウイルスベクター、または本発明の裸のＤＮＡを持つリポソーム、もしくは本発明のＤＮＡを含んで成るプラスミドである。
【００８７】
従って本発明の配列、特にヌクレオチドまたはアミノ酸配列１から８あるいはその変種、および本発明のタンパク質ヘテロマー、ならびにそれらに由来する本発明の試薬（オリゴヌクレオチド、抗体、ペプチド）は、治療を目的とする、即ち病気の治療を目的とする薬物の調製に好適に使用できる。特に好ましい利用は、ここでは細胞死および増殖に関する恒常性の脱制御を原因とする疾患または病的生理状態の治療、またはその治療を目的とする薬物の調製への利用である。
【００８８】
この観点に於いては、その作用により細胞の転写活動を変化させることができるＥＰＯが本発明のレセプター、例えばｅｅ３＿１の転写アップレギュレーションを誘導するという本発明の発見も直接的または間接的に特に重要である。即ち本発明のレセプターは、ＥＰＯの作用を伝達するものであり、それ故にそれに関連する病気にとって非常に重要である。このことはとりわけ本発明のレセプターがＥＰＯの特定の作用、例えば神経保護作用、例えば転写因子のＮＦ−カッパＢの作用がＥＰＯの神経保護作用に於ける重要段階である（例えば神経変性疾患）または脳機能の亢進（例えば痴呆）に選択的に影響できることを意味している。対応する動物実験に基づいた研究によって、本発明の主題を脳虚血、実験誘導した脳脊髄炎、あるいはクモ膜下出血といった神経疾患のモデルで機能的に考えることが可能になる。
【００８９】
ＥＰＯの投与により、神経保護作用に加えてヘマトクリット値の上昇を誘導するが、マウスにおいてエリスロポイエチンの過剰発現により示されたように（非特許文献３６）、ＥＰＯ投与により血液のレオロジー特性が劣化して微小循環に悪い影響が出ることから、この上昇は恐らく前記の保護作用と部分的に矛盾するため、部分的な前記作用が望ましい。
【００９０】
即ち、本発明の主題、例えば本発明のヌクレオチド配列、オリゴ−もしくはポリペプチド、発現ベクター、宿主細胞、あるいは本発明のレセプターのいずれかの場所に結合できる、制御と直接関係する代用リガンドの利用は、特に神経疾患、具体的には神経変性疾患の治療を目的とする薬物の調製に好適である。
【００９１】
本発明の使用は、ｅｅ３ファミリーの本発明タンパク質またはその未変性変種を発現している細胞、具体的には神経細胞での細胞死のプロセス、例えばアポトーシスに至るカスケード、または壊死に至るプロセスにも、例えば細胞間相互作用、特にＧタンパク質共役タンパク質が関係する相互作用を変化させることにより影響する。
【００９２】
本発明によれば、本発明の未変性タンパク質、特に配列５から８を有するタンパク質は、レセプターとして細胞内シグナル伝達経路の一部であり、典型的にはシグナルカスケードの出発点であることから、その脱制御は多くの病気の原因になる。この観点に於いて本発明の上記タンパク質は、以下の細胞プロセスの構成成分であり、同時に以下の細胞機能を有すると考えることができる：細胞分化への作用、細胞分裂、成長、適応、再生、細胞分化、増殖または細胞死に対する作用を伴う一般的なシグナル伝達。従って、本発明のタンパク質、例えばｅｅ３＿１またはｅｅ３＿２の機能不全、またはその発現機能不全または過剰発現は、一般に例えば細胞分化、細胞成長、細胞適応または細胞再生の脱制御を伴う病理生理学的状態を引き起こす。他方別のメカニズムでも病理生理学的状態、例えば本発明のｅｅ３レセプターの未変性リガンドの機能不全または機能過剰が起こることがある。治療方法としては、病理生理学的疾患の分子メカニズムに応じて本発明の機能的タンパク質を投与するか、または少なくとも前記タンパク質の発現をより高くするか、または細胞で過剰発現しているタンパク質、もしくは発現している機能不全タンパク質を阻害することが望ましい。特に好ましくは、神経細胞の死、興奮および神経新生に於けるそれらの機能と関係より、本発明の配列、特に番号１から１１の配列を利用することが好ましい。本発明のこれら発見から、本発明の配列（ヌクレオチドおよびアミノ酸配列）およびそれに対応する誘導体（例えばペプチド、オリゴヌクレオチドまたは抗体）を腫瘍および神経疾患、具体的には虚血性疾患（脳卒中）、多発性硬化症、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、遺伝変性性失調症、神経障害、ハンチントン病、てんかんおよびアルツハイマー病の様な神経変性疾患の治療を目的とする薬物の調製に利用できる。さらに、エリスロポイエチン発現が増加する例でのアップレギュレーションを根拠として、本発明の主題の利用は、ＥＰＯが（保護的）役割を持つ病理的プロセス（例えば脳卒中ならびにいずれかの形の急性および慢性の低酸素症）に好適である。
【００９３】
本発明によれば、酵素補充により測定する、機能的レセプター活性向けの細胞をベースとしたＨＴＳアッセイが、分子間の関係の基礎について更なる指標を得るうえで好適であることが証明されている。本アッセイはＧＰＣＲの一般的制御メカニズムに基づいており、活性化されたレセプターとベータ−アレスチン間の相互作用を測定する。この目的のために、相互に補完し合う不活性型ベータ−ガラクトシダーゼ断片を前記レセプターとベータ−アレスチンのＣ末端に融合する。前記レセプターの活性化により、ベータ−アレスチンが補充される。その結果２つあるベータ−ガラクトシダーゼの半体が一つになり、対応する基質を変換して測定可能なシグナルに変換できる機能的なベータガラクトシダーゼ酵素になる（ＩＣＡＳＴシステム）。原理的には前記アッセイは、互いに補い合う２つの半体の融合タンパク質として発現することが可能であり、そして一般的な測定方法で読取ることができる基質反応を実行するいずれかの酵素であれば、実施できる。
【００９４】
本発明はまた本発明の配列の治療応用、即ち本発明の核酸配列またはタンパク質配列、特にはヌクレオチド配列またはアミノ酸配列番号１から４または５から８、あるいは上記に規定のその変種、特には断片の、哺乳動物、例えばヒトの遺伝子治療への利用、または他のこの種の遺伝子治療法に関する。ここでいう遺伝子治療には、請求項１から４のいずれかに記載の本発明の配列を体内またはその一部、例えば個々の組織に導入するか、あるいは本発明の配列の発現に影響を及ぼすいずれかの形態の治療を包含する。この目的のために、当業者に一般的である修飾、例えばいずれかの修飾を有し、かつ本発明の配列を含むオリゴヌクレオチド、例えばアンチセンスまたはハイブリッドＲＮＡ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドを一連の遺伝子治療に用いてもよい。同様に、本発明の配列を含んで成るウイルス構築体も利用できる（これにはその種の断片、アイソフォーム、対立遺伝子、誘導体といった変種が含まれる）。対応する本発明の裸のＤＮＡ配列もまた、遺伝子治療にとって有用である。同様に酵素活性を持つ核酸片（即ちリボザイム）も、遺伝子治療の目的に利用できる。
【００９５】
治療応用以外に、本発明の核酸またはポリペプチド、本発明のタンパク質ヘテロマーおよびそれらに（オリゴヌクレオチド、抗体、ペプチド）由来する本発明の試薬の診断にも好適に利用でき、例えばヒトの病気または遺伝的素因の診断に、また一連の妊娠試験での利用も好適である。前記疾患または素因は、具体的には治療応用に関連する上記の疾患であり、特に神経または免疫疾患または腫瘍症である。これら診断法はｉｎ  ｖｉｖｏの方法としてデザインしてもよいが、一般にはｅｘ  ｖｉｖｏの方法である。本発明の診断法の典型的なｅｘ  ｖｉｖｏ応用は、生物サンプル中に存在する本発明の核酸の定性および／または定量検出に有用であろう。この種の方法は、以下の段階を含んで成ることが好ましい：（ａ）生物サンプルを既知量の本発明の核酸または本発明の前記核酸の増幅用プライマーとして好適である既知量のオリゴヌクレオチドと一緒にインキュベーションする段階、（ｂ）特異的ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ増幅により本発明の前記核酸を検出する段階、（ｃ）ハイブリダイゼーションした核酸またはＰＣＲ増幅により得た核酸の量を定量的標準体と比較する段階。
【００９６】
更に本発明は生物サンプル中に存在する本発明のタンパク質ヘテロマーまたは本発明のタンパク質の定性的および／または定量的検出方法であって、以下の段階を含んで成る方法に関する：（ａ）生物サンプルを本発明の前記タンパク質ヘテロマーに対する、または本発明のタンパク質／ポリペプチドに対する特異的な抗体とインキュベーションする段階、（ｂ）抗体／抗原複合体を検出する段階、（ｃ）抗体／抗原複合体量を定量的標準体と比較する段階。標準体は、一般的には健康生物より得た生物サンプルである。この場合、特に診断目的では、本発明の遺伝子、例えばｅｅ３＿１遺伝子のもつ特性、特徴的な病理生理学的刺激（脳卒中、心停止、腫瘍等）を受けた後に、本発明の配列のｍＲＮＡの細胞内量が変化すること、例えば増加するという特性を利用できる。この様にすると、本発明によれば、本発明のタンパク質の発現率の変化を伴う病気（例えば脳卒中）を予防すること、治療を上手くおこなうこと、または病気を分類することができる。最後に、本発明の方法は、上記疾患の治療のモニタリングに利用してもよい。
【００９７】
本発明の配列は、例えばヒトでの前記配列の多形を決定する方法に使用してもよい。この様に決定された本発明の配列の多形は、本発明の開示の主題であるだけでなく、本発明の配列の機能不全発現、本発明の機能不全配列の発現、および／またはその過剰発現を原因とする疾患に関する素因診断向けの診断、あるいは診断マーカーとしても利用できる。さらに本発明の配列を利用して、ヒトの遺伝性疾患、単一遺伝子性および多遺伝子性両方の疾患を研究することもできる。
【００９８】
ヒトおよび／または獣医医学分野での治療および／または診断利用目的に加えて、科学的利用を目的とした本発明の核酸またはポリペプチドの使用も考えられる。特に本発明の配列により、当業者既知の方法、例えばｃＤＮＡライブラリーを用いて単細胞または多細胞生物中にある関連配列を同定すること、または関連配列のヒトゲノム中での配置を知ることができる。従って、本発明のヌクレオチド配列、特に番号１から４の配列（その変種を含む）は、一般的方法を用いた相同性スクリーニングによって、前記核酸またはその機能等価物、相同体、または誘導体をコードするｍＲＮＡに関係するヒトの遺伝性疾患遺伝子、例えばマウスまたはその他動物のゲノムおよびヒトゲノムのマーカーを単離、マッピングおよび関係付けするのに使用してもよい。この作業によって、例えばヒトｅｅ３ファミリー配列の染色体上の座（第２染色体（２ｑ１４．２）；Ｘ染色体（Ｘｑ２８、遺伝子座ＩＤ：８４５４８）；第５染色体、第８染色体；第３染色体；第７染色体）と表現形が判明している特定の遺伝性疾患、特に腫瘍症（例えば肝細胞癌）とを合理的に関連付けることができるようになり、その結果前記疾患の診断が極めて容易となり、新た内治療法を可能にする。同様のことが本発明のタンパク質にも当てはまる。
【００９９】
この様に本発明の核酸を利用することで、単一遺伝子および多遺伝子性疾患いずれでも、ヒトの特定遺伝性疾患の診断が可能であり、そしてその結果前記核酸はマーカーとして利用され、遺伝性疾患に関する本発明の診断法を提供する。
【０１００】
本発明は特に、本発明のアミノ酸および／またはヌクレオチド配列に基づく、科学的応用を目的とするアッセイシステムを開示する。この関係では、本発明の核酸配列のｃＤＮＡ、ゲノミックＤＮＡ、制御エレメントおよびそのポリペプチド、ならびに組換え体または非組換え体断片がアッセイシステムの開発に使用されるだろう。かかる本発明のアッセイシステムは、試験物質中に存在するプロモーターまたはタンパク質の活性測定に特に好適である。前記アッセイシステムは、複数の試験物質を迅速に測定できる単純な測定方法（発色法、発光法、蛍光をベースとした方法、または放射活性法）を含みなることが好ましい（非特許文献３７）。記載のアッセイシステムは、本発明のタンパク質に作用する物質、特に配列５から８（例えばその誘導体または断片）を阻害的または活性化する物質に関する化学ライブラリーのスクリーニングを可能にする。この様な物質を同定することは、ｅｅ３が関係するシグナル伝達に特異的に作用する新規薬物を見つけ出す作業の第一段階である。具体的にはＧタンパク質共役タンパク質の既知の特性を利用するアッセイシステム、例えば以下記載のアッセイシステムを提供することが、この段階に含まれる。
【０１０１】
本発明のタンパク質、具体的には図１３、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６または１８のタンパク質の生物活性、典型的にはアポトーシス、増殖、再生、細胞成長に関係する生物活性を、例えば脳卒中、敗血症ショック、ＧｖＨＤ（移植片対宿主病）、変性疾患、特に神経変性疾患、急性肝炎またはその他ここに開示された適用疾患について、それが望まれる場合には阻害することもできるが、その場合典型的には少なくとも１０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであって、配列番号５、６、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、８および１１をそれぞれ有するタンパク質の未変性配列に対するアンチセンス鎖のオリゴヌクレオチドが、当業者に一般的な方法を用いて問題の細胞内に導入される。その結果、適切に形質転換された細胞内ではｅｅ３ファミリー、例えばｅｅ３＿１またはｅｅ３＿２の本発明タンパク質の未変性ｍＲＮＡの翻訳が阻止され、トランスフェクションした細胞の生存率が上がるか、または細胞成長、細胞適応、細胞増殖に対する変調効果が生ずる。この場合には、上記方法を組換え体ウイルスをつかって行ってもよい。
【０１０２】
本発明の配列の機能不全を原因とする病気（例えば上記適応症）での、病的に亢進したと思われる細胞アポトーシス、細胞増殖を、リボザイム法を用いて治療することも可能である。この目的には、標的ｍＲＮＡを切断できるリボザイムを使用する。この場合、本発明は未変性のｅｅ３ｍＲＮＡ、例えばｅｅ３＿１またはｅｅ３＿２のｍＲＮＡを開裂できるリボザイムを開示し、またこれらに関する。本発明のリボザイムは、本発明の標的ｍＲＮＡと、例えば対合により相互作用し、続いて前記ｍＲＮＡを開裂して例えばｅｅ３＿１またはｅｅ３＿２の翻訳を阻止できるものでなければならない。本発明のリボザイムは、好適ベクターを（具体的にはプラスミド、修飾動物ウイルス、特にはレトロウイルス）使って標的細胞内に導入されるが、前記ベクターはその他配列に加えて、適当であれば本発明のリボザイムのｃＤＮＡ配列を有する。
【０１０３】
上記の可能性に加えて、本発明の他の主題を利用することで、本発明の遺伝子産物、特に図１３、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６または１８の遺伝子産物の生物機能、典型的には本発明の遺伝子産物のアポトーシスもしくは壊死、増殖もしくは成長を指示するシグナル伝達に関する機能を変調することも可能である。本発明の化合物は、例えばＤＮＡ（例えばプロモーター領域）に結合すること、または本発明の遺伝子を制御するいずれかの転写因子に結合することによって、本発明の基礎となるＤＮＡ配列のレベルでｅｅ３ファミリーの本発明のタンパク質の特に細胞内機能を変調、典型的には阻害または活性化、あるいは生物機能に影響するだろう。本発明の化合物は、一般的には本発明のタンパク質、特にアミノ酸配列１から４のいずれかを有するタンパク質、または本発明の核酸配列、特に配列参照番号５から８のいずれかを有する核酸配列に特異的に結合し、それにより薬理学的、特に神経保護または免疫変調作用あるいは免疫変調または抗アポトーシス若しくは抗増殖作用を発揮する。
【０１０４】
故に本発明は、分子量５０００未満の、好ましくは３０００未満、特には１５００未満の化合物、好ましくは有機化合物であって、一般的に生理学的によく受け入れられ、そして血液−脳関門をよく通過できる化合物を開示する。適当であれば、前記化合物は少なくとも１種類の別の活性化合物を含み、さらに補助剤および／または添加物を含むことが好ましい組成物の一部であり、そして薬物として利用できるだろう。特に好ましいものは、本発明のタンパク質への結合、特に本発明のタンパク質のＣ末端、細胞質ドメインまたは細胞外ドメインへの結合に関する結合定数が少なくとも１０7／モルであるものである有機分子である。本発明の化合物は細胞膜を拡散または（内）膜輸送タンパク質を介して、場合によっては例えばＡＡ配列の添加のような適当な修飾が施された後に、通過できるよう設計されるのが好ましいだろう。さらにｅｅ３ファミリーの本発明タンパク質とその結合相手との相互作用、特にアポトーシスもしくは壊死、増殖もしくは成長を指示するシグナルまたは再生シグナルを阻害または促進する化合物も望ましい。この種の化合物は、本発明のタンパク質の表面上にある特定の場所を占領するか、または本発明のタンパク質に局所的な立体構造変化をもたらすことで、本発明のタンパク質に本来の結合相手が結合することを阻止する。
【０１０５】
本発明のタンパク質の構造解析より、特定の結合親和性を持つ本発明の化合物を特異的に見いだすことができる（非特許文献３７）。ここではいずれかの本発明のタンパク質、特に配列５から８を持ついずれかのタンパク質の構造、部分構造、誘導体、対立遺伝子、アイソフォームまたはそれらの一部を、ＮＭＲまたはＸ線結晶学（例えば「懸滴」法を用いて適当に結晶化した後）の方法で決定するか、あるいは高解像度構造を必要としない場合には、構造予測アルゴリズムと既にその構造が解明されている相同タンパク質（例えばロドプシン）を用いて本発明のタンパク質の構造モデルを作製し、そして分子モデル化プログラムの助けをかりながら前記構造または構造モデルを利用して、作用薬または拮抗薬として機能する可能性があり、本発明のタンパク質に対し高い親和性を持つと推測できる化合物を同定する。適当であれば、上記の方法に、別の構造推測法を組み合わせることもできる。適当な力の場を用いて、本発明のタンパク質の中にある問題の亜構造、例えば活性部位、結合空間もしくはヒンジ領域に対し親和性を持つ可能性のある化合物の親和性をシミュレーションする。次にこれら物質を合成し、それらの結合能およびそれらの治療上の活用性について好適な試験方法を用いて試験する。本発明のｅｅ３タンパク質への結合を介して作用を発揮する潜在的活性化合物を同定するためのコンピューターを用いたこの様な方法もまた、本発明の主題の一つである。
【０１０６】
本発明の別の好適実際態様では、本発明の化合物は抗体、好ましくはｅｅ３ファミリータンパク質、例えばｅｅ３＿１、ｅｅ３＿２もしくはｅｅ３＿５に対する抗体、またはその基礎となるｍＲＮＡに対する抗体であり、これら抗体はｅｘ  ｖｉｖｏに再移植する宿主細胞内に導入されるか、またはｉｎ  ｖｉｖｏ的な遺伝子治療の方法により宿主細胞内に導入され、それらは「内部抗体」であるためにそこに分泌はされないが、細胞内でその機能を発揮できる。この種の本発明の内部抗体は、誤読によるアポトーシス反応、例えば本発明のタンパク質の過剰発現によるアポトーシスから細胞を守る。この様な方法は、患者体内で病理生理学的に過剰なアポトーシスの挙動を示している組織の細胞、即ち例えば脾臓細胞、ケラチノサイト、結合組織細胞、免疫細胞、神経または筋肉細胞に特に好適であろう。抗体または内部抗体に加えて、本発明の内部抗体を使って上記のように遺伝的に修飾された細胞もまた、本発明の一部である。
【０１０７】
本発明の未変性ｅｅ３タンパク質、例えば配列番号５、６、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、８および１１のタンパク質、または対応する未変性対立遺伝子または未変性スプライス変種の生物機能、例えばアポトーシス機能を阻止する、また適当な場合には活性化する機能を持つ本発明の化合物は、薬物として使用してもよい。これに包含される化合物は、上記のいずれかの変種、即ち、例えば有機化合物、抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムである。本発明の化合物は、病気の治療、特に神経学、免疫学または増殖性の疾患の治療（および薬物の調製）に特に好適である。従って本発明の未変性タンパク質、特に配列５から８を有するタンパク質またはその未変性変種の細胞機能、即ち、例えばアポトーシス反応に関する本発明の阻害剤（例えば阻害作用を持つ抗体（特に内部抗体）、リボザイム、アンチセンスＲＮＡ、優性阻害型突然変異体または上記のいずれかの適当な阻害性の有機化合物、好ましくは上記方法のいずれかにより得られる高親和性化合物）を薬物として使用することが可能であり、特に以下の疾患の治療または以下の疾患の治療に用いる薬物の調製に使用できる：慢性もしくは急性の低酸素状態が起こり得る、または関係する疾患、例えば心筋梗塞、心不全、心筋症、心筋炎、心膜炎、筋周囲心炎、冠動脈性心疾患、中隔壁欠損を伴う先天性心臓欠損、ファロー４徴候症／５徴候症、アイゼンメンガー症候群、ショック、四肢低潅流症、動脈閉鎖症（ＡＯＤ）、末梢ＡＯＤ（ｐＡＯＤ）、頸動脈狭窄、腎動脈狭窄、小血管病、脳内出血、大脳静脈および洞血栓、血管奇形、クモ膜下出血、血管性痴呆、ビスワーグナー病、皮質下動脈硬化脳症、塞栓症時の多発性皮質梗塞、血管炎、糖尿病性腎症、各種原因による貧血の続発症状（例えば再生不良性貧血、異形成脊髄症候群、真性多血症、巨赤芽球性貧血、鉄欠乏貧血、腎性貧血、球状赤血球症、溶血性貧血、地中海貧血、ヘモグロビン症、グルコース６リン酸脱水素酵素欠乏、輸血事故、Ｒｈ式血液型不適合、マラリア、心臓弁交換、出血性貧血、脾臓機能亢進症候群）、肺繊維症、気腫、肺浮腫：ＡＲＤＳ、ＩＲＤＳ、再発性肺塞栓。
【０１０８】
腫瘍症（例えば結腸癌、乳癌、前立腺癌、肺癌）、免疫系疾患（例えば自己免疫疾患、特に糖尿病、乾癬、免疫不全症、多発性硬化症、リューマチ関節炎またはアトピー、喘息）、ウイルス感染症（例えばＨＩＶ，Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎感染症、細菌感染（例えば連鎖球菌またはブドウ球菌乾癬）、変性疾患、特に神経変性疾患、例えば筋無力症、ＧｖＨＤ（例えば肝臓、腎臓、または心臓）、あるいは神経疾患（特に卒中、多発性硬化症、パーキンソン病、クモ膜下出血、筋萎縮性側索硬化症、遺伝変性失調症、ハンチントン病、神経症、てんかん、脳傷害、アルツハイマー病であるが、これらに限定されない）；筋弛緩剤（例えば麻酔）、内分泌疾患（例えば骨粗鬆症または甲状腺機能不全）および皮膚疾患（乾癬、神経皮膚炎）；慢性または急性疼痛状態のコントロール、遺伝性疾患、および心理学分野の疾患（例えば分裂症またはうつ病）、創傷治癒、性機能の補助、心臓血管疾患（例えば虚血性梗塞、心不全、不整脈、高血圧）、脳機能亢進。
【０１０９】
上記適応分野は、本発明の遺伝子産物または本発明のＤＮＡ配列の薬剤調製の適用分野でもある。
【０１１０】
本発明の上記物質はまた、治療を目的とする投与に関し組成物を安定化する、またはその生物利用度および／もしくは薬力学を改善することを目的として薬学的キャリア、賦形剤および／または添加物を更に含む医薬組成物の一部でもある。
【０１１１】
本発明はまた、薬学的に活性な化合物、特に本発明の配列により誘導される生理学的反応と関連したシグナルを発する、または伝達することに関し阻害的な特性を有する化合物を同定する方法（スクリーニング方法）に関する。この種の薬学的に活性な物質は、本発明のレセプターを、その細胞外末端、ＴＭドメイン（この場合は、例えばその二量体化または多量体化を障害する）および細胞内のシグナル伝達レベルで遮断し、例えばｅｅ３タンパク質と細胞内シグナルタンパク質の相互作用を遮断または活性化し、特に細胞内タンパク質ｒａｎｂｐｍおよび／またはＭＡＰ１ａ／ＭＡＰ１ｂとの相互作用に影響（活性化または阻害）する。
【０１１２】
本発明の方法では（ａ）請求項５に記載の発現ベクター、特に本発明のポリペプチド、例えば配列番号５、６、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、８または１１を有するポリペプチドをコードする発現ベクターにより、適当であれば少なくとも１種類のレポーター遺伝子をコードする少なくとも１種類の発現ベクターによりトランスフェクションされた細胞、ならびに（ｂ）本発明のタンパク質が介在する機能を観察することに好適なパラメータ、例えば再生もしくは増殖プロセスに関するシグナル伝達、特に好適な前記パラメータはカスパーゼ−３の活性化を、（ａ）により得た宿主細胞系について試験化合物添加後に測定し、試験化合物を添加しないコントロールと比較する。この目的を達成するためには、前記試験物質の薬学活性の場合、例えばアポトーシス阻害作用の例では、前記試験物質のＩＤ50を決定できるようにするために、前記試験物質の濃度を上昇する複数の実験を本発明の方法に従って同時に準備することが好ましい。
【０１１３】
ｅｅ３タンパク質の一次配列の知識を利用して、当分野既知である既に特性分析されたＧＰＣＲの特性を利用した組換え体構築体を準備してもよい。この様にすることで、例えば本発明のｅｅ３タンパク質の特定配列領域を既知の、特性がよく分かっているＧＰＣＲの特定配列領域と交換することができる。こうして得た構築体は、既知のリガンドまたは作用薬を使って、Ｇタンパク質の共役および利用されている第２メッセンジャーシステムを特定すること、あるいは既知のＧタンパク質共役を用いてリガンド、作用薬または拮抗薬を見いだすことに用いられるだろう。本発明のキメラレポーターは、例えば上記の利用に関して、例えばコビルカらの方法（および本発明に包含される方法）（非特許文献３８）に従って調製してもよい。
【０１１４】
本発明によれば、本発明のｅｅ３ファミリーの構造的活性的レセプター突然変異を用いて、これら変種がシグナル伝達経路に及ぼす作用の特徴を解析すること、およびリガンドをスクリーニングすることができる。７ＴＭ−タンパク質分類を代表するものとして本発明のレセプターに、特に前記レセプターの生理学的および薬理学的挙動に変化を惹起するような形で突然変異を誘導してもよい。この方法は、例えば天然リガンドまたは作用薬が未知の場合に、細胞内のシグナル経路を特定するのに使用できるだろう。この様な変化を起こす上で特に好適な方法は、ｅｅ３タンパク質のＤＲＩコンセンサス配列内への突然変異誘導である；例えばＤＲＹ配列内のＲの（非特許文献３９）、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｌａ、ＡｓｎおよびＩｌｅへの突然変異であり、Ｌｙｓへの突然変異は構成的活性化を強力に高める。ＨｉｓまたはＡｓｐへの突然変異による構成的活性化の上昇は、より小さい。興味深いことに、Ａｒｇへの突然変異は、作用薬の親和性を高めたことから、これら突然変異はＨＴＳスクリーニングに関しても興味深い。
【０１１５】
同様に第３ＴＭドメイン内の保存的Ａｒｇは、突然変異が可能な部位である（非特許文献４０）。
【０１１６】
あるいは固定化した本発明の機能的レセプターを利用する方法を用いて、内因性または代用リガンドを同定してもよい。この場合、ｅｅ３ファミリーの本発明のレセプターは、本発明により開示された様にＧＳＴ、ＦｌａｇタグまたはＴＡＰタグとの融合タンパク質として発現する。こうして得た細胞を一般的方法により処理し膜を集めるか、または直接可溶化に使用する。例えばドデシルマルトシド、ジギトニン、コール酸または界面活性剤混合物等の好適界面活性剤を用いてレセプターを可溶化し、次にＧＳＴセファロース、抗Ｆｌａｇ  Ｍ２アガロースまたはＩｇＧセファロース等の適当な親和性マトリックスに結合する。前記マトリックスを洗浄してから組織抽出物または細胞上清とインキュベーションし、再度洗浄する。抽出物が活性リガンド、例えばペプチドを含む場合には、前記リガンドは固定化されたレセプターに結合するため、これを溶出した後、分析的方法、例えば質量分析装置等を利用して同定できる。
【０１１７】
本発明によれば「内在化アッセイ」とは、本発明のレセプター、例えばｅｅ３＿１に対する天然リガンド、または特に代用リガンドを同定できる別の方法である。この場合も、ＧＰＣＲに分類されるタンパク質が、異なる特性を持つことを利用する。例えばＧＰＣＲに分類されるタンパク質が持つ内在化特性を、利用することができる。この性質は、レセプター活性化後の制御メカニズムであると考えられている。この特性に基づくスクリーニング法には、問題のレセプターの生理学について詳細を知る必要がないという利点がある。特に共役するＧタンパク質および利用されるシグナル伝達経路に関する知識は、必要ない。
【０１１８】
この種のアッセイは、例えばレンカイら（非特許文献４１）によって記載されており、本発明のレセプターについても本発明に従い有利に使用されるだろう。本発明によりこの目的を達成するには、まず本発明のタンパク質とＥＧＦＰとのＣ末端融合構築体を調製する。続いて標準的方法により、安定したＣＨＯ細胞を調製する。ＦＡＣＳソーターを使い、ＥＧＦＰ蛍光について安定したクローンを選択する。蛍光顕微鏡を使って表面での発現を調べて、最終的な選択を行う。次に選択した細胞を組織抽出物のＨＰＬＣ分画とインキュベーションし、共焦点顕微鏡を使って内在化を調べる。評価は、細胞中心からの蛍光シグナルの距離を原理とする形態計測ソフトウエアー（ＮＩＨイメージ）を利用して行う。頻度／距離分布から、前記内在化について良好な分解能が得られた。
【０１１９】
未知のリガンドを発見するために、連続的に分画化を行い対応するペプチドを単離、純化して、続いて例えば配列解析またはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより前記ペプチドを同定した。原理的に同じ方法を別の形で応用した例がゴッシュら（非特許文献４２、非特許文献４３）に記載されており、これら応用は共にその全てが本開示に取り込まれる。
【０１２０】
しかし、リガンドの同定および／または、適当であれば、本発明のレセプターの特性解析にも、機能的Ｃａアッセイを利用することもできる。本発明によれば、この利用はＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞またはその他細胞内に産生した７ＴＭレセプター（７個の膜貫通ドメインを持つレセプター）の多重性によって、Ｇｑ分類のＧタンパク質との共役を介して、ＰＬＣの活性化と細胞内Ｃａの流動化が起こるという事実に基づいている。特定の本発明のレセプターがＧｑ分類のＧタンパク質と共役しなければ、その場合キメラＧタンパク質または比較的非特異的にレセプターと共役するＧタンパク質であるＧ１５もしくはＧ１６を共発現させることで、ＰＬＣによって前記レセプターに強制的にシグナル伝達を起こしてＣａを放出させることができる。ｅｅ３ファミリーの本発明のレセプターは、一般にはＨＥＫ２９３およびＣＨＯ細胞内に於いて単独、またはキメラＧタンパク質であるＧｑｉ５またはＧ蛋白のＧｑ１５と一緒に安定かつ一過性に発現する。次に細胞を膜透過型のＣａ結合蛍光色素、例えばＦｕｒａ−２またはＦｌｕｏ−３もしくは−４と一緒にし、細胞を洗浄した後、各種試験物質で処理すると同時にＣａ放出を、例えばモレキュラーディバイス社のＦＬＩＰＲ装置を使って測定することが好ましい。最後に陽性シグナルを示した試験物質をコントロール細胞（ベクターのみをトランスフェションした）で試験することが望ましく、もしシグナルが特異的であることが判明した場合には、薬理学的解析、即ち用量−反応曲線による解析を行う。
【０１２１】
あるいはリガンドにより惹起されたＣａ反応は、別のＣａ検出装置、例えばユーロスクリーン社のエコースクリーン（ＡｅｑｕｏＳｃｒｅｅｎ）（Ｂｒｕｓｓｅｌｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ；例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｒａｃｔｏｒｓ／ｃｏｍｐｏｕｎｄ＿ｍａｎ／ｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ／参照）を利用して測定してもよい。この方法では、タンパク質であるアポエコーリンの遺伝子を発現する細胞の使用が包含される。エコーリンは、アポエコーリンと結合するシーレントラジン（ｃｏｅｌｅｎｔｒａｚｉｎｅ）と共に細胞に加えることで生ずる。リガンドがＣａ放出を惹起すれば、前記Ｃａがエコーリンを活性化してシーレンテラジンを酸化し、これにより発光が起こる。発光の強度は細胞内のＣａ濃度の上昇に比例し、見つかったリガンドの活性の測定に用いられる（対応するコントロールを考慮する）。
【０１２２】
拮抗薬は、十分高濃度の様々なリガンドが存在する状態で既知の作用薬でレセプターを刺激することにより、本発明に従い同定される。コントロール（作用薬のみでその他リガンドが存在しない）に対しシグナルが変化した場合、例えばＣａシグナルが低下した場合はそのリガンドは競合的拮抗薬であることを示している。
【０１２３】
さらにｅｅ３ファミリーの本発明レセプターの特性分析およびリガンドの同定には、ｃＡＭＰアッセイも利用できる。ｅｅ３レセプターの薬理学的特性分析に関する本発明のこの方法の根拠および、リガンド同定（作用薬または拮抗薬）に好適であることの根拠は、ＧＰＣＲ分類のレセプターの特性、即ち例えば本発明のタンパク質がアデニレートシクラーゼに刺激的または阻害的に作用でき、通常は活性化により「Ｇｓタンパク質を刺激し」または「Ｇｉタンパク質を阻害する」という性質にある。試験物質の作用に応じてこの方法を利用することで、例えば高処理スクリーニングで細胞ｃＡＭＰレベルの変化を直接または間接的に測定し、研究できる。この方法には、レセプター遺伝子を哺乳動物細胞に於いて安定的または一過性に発現すること（実施態様２参照）が含まれる。アデニレートシクラーゼを活性化することで細胞ｃＡＭＰレベルを上げるＧＰＣＲの例では、試験物質の中の潜在的作用薬はコントロール細胞と比較した時のｃＡＭＰ濃度の上昇から同定される。試験物質の中の拮抗薬は、例えばＨＴＳ法では、それらが作用薬によるｃＡＭＰ濃度の増加を遮断することを利用し同定される。本発明のＧｉ共役ｅｅ３レセプターの場合、アッセイはフォルスコリンを使った直接的なアデニレートシクラーゼの刺激、またはＧｓ−共役レセプターの活性化を介したアデニレートシクラーゼの刺激と、それによるｃＡＭＰレベルの増加を包含する。Ｇｉ−共役レセプター作用薬は、この増加を阻害する。Ａｍｒｅｓｈａｍ社のｃＡＭＰ[3H]アッセイシステムの様な、例えば放射標識（トリチウム）されたｃＡＭＰを加えて内因性に産生したｃＡＭＰを競合的に置換する原理に基づく多くの市販キットを使って、直接ｃＡＭＰを測定してもよい。間接的ｃＡＭＰ測定は、一般にはレポーターアッセイの形で行われる。そのためには、レポーターシステム、例えばＣＲＥ−ルシフェラーゼシステムを含む細胞株でレポーターを発現する。ｃＡＭＰがルシフェラーゼの発現を活性化し、対応する基質の変換および生成物を発光測定することでその活性を測定する。レポーターアッセイは、大規模スクリーニング法として特に好適である。
【０１２４】
最後に上記のアッセイに加え、以下のアッセイも本発明の中で、本発明のレセプターに関する第２メッセンジャーシステムの特性分析および／または本発明のｅｅ３レセプターのリガンドの同定に利用することができる：ソロモンによる細胞または膜内のアデニレートシクラーゼ活性測定法（非特許文献４４）、イノシトール３−リン酸濃度測定法、またはアラキドン酸放出の変化を測定する方法。例えば、一般的な細胞株にｅｅ３＿１を過剰発現させ、組織抽出物で活性化した後に上記の第２メッセンジャーシステムの活性を測定することができる。ＧＰＣＲ分類の第２メッセンジャーシステムに適した個々のアッセイは当業者周知であり、それら技術はそれぞれ文献、例えば非特許文献４５に見いだすことができる。スクリーニングに適したその他レポーターアッセイとしては、ＭＡＰキナーゼ／ルシフェラーゼおよびＮＦＡＴルシフェラーゼシステムが挙げられる。
【０１２５】
ｅｅ３レセプターシグナル伝達がＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路を介しても起こるという本発明の発見より、例えばＮＦ−ｋＢレポーターシステムまたはルシフェラーゼシステムを介して、リガンドの探索または阻害剤の同定に適したスクリーニングアッセイの開発にも利用できる。
【０１２６】
上記の様に、第２メッセンジャーの活性化は本発明のレセプターに結合し、それによって特定の細胞プロセスに対しその作用性および／または拮抗性の作用を提示できるリガンド、作用薬または拮抗薬の同定にも貢献する。リガンド、作用薬または拮抗薬の同定には、例えばマイクロフィジオメーターを使ってもよいだろう。ｅｅ３ファミリーのレセプターにリガンドが結合し生じたシグナルは、エネルギー消費プロセスである。従ってこの種のプロセスには必ず若干の代謝的な変化、とりわけわずかなｐＨのシフトが起こる。前記変化を、例えばマイクロフィジオメーター（Ｃｙｔｏｓｅｎｓｏｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使って細胞外に記録してもよいだろう。
【０１２７】
ｅｅ３レセプターファミリーの本発明タンパク質に対する結合能を有するリガンド、作用薬または拮抗薬が同定されたら、本発明に従ってリガンド結合アッセイを行いそれらの特性をより詳しく調べてもよい。リガンド結合アッセイにより、レセプターの薬理、即ち前記レセプターに対する多くのリガンドの親和性を直接測定することができる。結合研究では、一般には上記方法により、またはその他の方法で化学的に純粋であることが同定されているリガンドを、レセプターに関する前記リガンドの活性を低下させない様式で高い比活性（３０〜２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）で放射線標識する。アッセイ条件を、前記レセプターを発現する細胞の利用および、前記細胞より調製した膜の使用について最適になるように緩衝液の組成、塩、例えばヌクレオチドの様な変調成分または例えばグリセロールの様な安定化剤について調製し、有用なシグナル対バックグランド比が測定できるようにする。これら結合アッセイに関して特異的レセプター結合とは、レセプター標本（細胞または膜）に結合した全放射活性の差、即ち１種類の特異的な放射性リガンドのみが存在した様態で測定した時の放射活性と、放射性リガンドと過剰量の非放射標識リガンドの両方が存在した状態で、測定した時の放射活性との差として定義される。この場合未標識リガンドは、放射性リガンドを競合的に置換する。可能であれば少なくとも化学的に異なる競合する２種類のリガンドを用いて、非特異的結合を測定する。最適な特異的結合は、特異結合が全結合の少なくとも５０％である結合である。結合アッセイは、濾過アッセイのような非ホモジーニアスに、またはシンチレーション近接アッセイのようはホモジーニアスに実施される。
【０１２８】
濾過アッセイでは、レセプターを含む標本（細胞または膜）を好適な緩衝溶液中にリガンドと、結合が平衡に達するまで、一般的には室温にて１時間、そして４℃で一晩インキュベーションしてから好適な濾過器、例えばワットマン社またはシュライヒャーアンドシュール社製のガラスファイバーフィルターを、適当な場合には、例えばポリエチレンイミンで前処理してから使って濾過し、結合放射性リガンドと未結合の放射性リガンドとを分離する。フィルターを洗浄してから乾燥し、または湿潤状態のまま適当なシンチレーターで処理し、必要とされるインキュベーションを行った後得られた放射活性をシンチレーションカウンターで測定する。シンチレーション近接アッセイには、好適シンチレーションビーズ、例えばＷＧＡビーズを、リガンドおよびレセプター含有膜と好適緩衝液中で結合が平衡に達するまでインキュベーションする段階を含んでおり、次に放射活性を好適シンチレーションカウンターで測定する。いずれの結合アッセイも、ＨＴＳ形式で実施してもよい。
【０１２９】
可溶化または精製レセプターは、シンチレーション近接アッセイにより、またはＰＥＧ沈殿した後の濾過アッセイ、吸着アッセイまたはゲル濾過アッセイ（非特許文献４６）といった一般的な非ホモジーニアスアッセイにより測定する。
【０１３０】
放射性リガンドではなく蛍光リガンド、例えばＢＯＤＩＰＹの様な蛍光色素と共有結合したリガンドも利用できる。レセプターへの蛍光リガンドの結合は、蛍光偏光法により測定する。この方法は、ＨＴＳ形式での一次スクリーニングおよび二次アッセイに好適である。
【０１３１】
本発明はまた、好適実施態様に於いてリガンド（作用薬または拮抗薬）、特に本発明のｅｅ３配列の阻害剤を同定するための高処理スクリーニングアッセイ（ＨＴＳ）を開示する。この場合、阻害剤同定に関する、特に小有機化合物の同定に関する本発明の方法の範囲内にあるＭＡＰシグナル伝達経路の（全ての既知）成分を用いることが特に好ましい。望ましいシステムは、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、ＭＡＰキナーゼＳＰＡ（非特許文献４７）参照）を含むシステムである。前記アプリケーションは、その全体が本発明の開示の中に取り込まれている。ここではＭＡＰカスケードがｉｎ  ｖｉｔｒｏで再構築され、個々の成分を用いＧＳＴ融合タンパク質が調製される（大腸菌発現）か、またはｃＲＡＦ１の場合にはバキュロウイルスシステムを使って調製される。この場合、阻害剤を高い信頼度でアッセイするためには、カスケードの第１エレメント（ＭＡＰ−ＫＫＫ）は永久的かつ均一に活性化されなければならない。このことは、バキュロウイルスシステムによりｓｒｃを同時発現することで一般には達成される。これにより、ｃＲａｆが確実にｒａｓ−様に活性化される。本発明のヌクレオチド配列をトランスフェクションするとカスケードが変調するが、アッセイ対象となる物質を添加して前記変調に対する影響をＨＴＳで測定するためにこの変調を利用する。
【０１３２】
上記の本発明の方法によって高い親和性を持つ選択物質を同定した後、てんかん、脳卒中およびその他神経学的、免疫学的または増殖性疾患（腫瘍症）といった疾患の医薬品として使用できるか前記物質をアッセイする。さらに、本発明のｅｅ３遺伝子産物、特に番号５、６、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、８または１１の配列を持つ産物に対し同定された薬理学的活性物質の結合部位を、酵母−２ハイブリッドシステムまたはその他アッセイを用いて、即ち相互作用、例えば未変性タンパク質間の相互作用に関係するアミノ酸の範囲を狭めていって決定することもできる。次の段階では、本特許の明細書に記載のスクリーニング法を用いて、未変性の相互作用相手との結合に関与することが既に分かっているアミノ酸（構造領域）を特に持つ高親和性物質（代用リガンド）を同定することができる。この様にすると、本発明のポリペプチドと想定される本来の細胞内相互作用相手との間の相互作用に影響を及ぼすことができる、特に阻害することができる物質を見いだすこともできる。これは、本発明のタンパク質に対し特異的結合親和性を持つ物質を発見する本発明による方法を開示する。この観点に関しては、クラインら（非特許文献４８）が記載した方法が特に好ましい例である。Ｇタンパク質共役レセプターの分類に属する本発明のタンパク質について知られている特質（Ｇタンパク質との共役、シグナル伝達）を更に用いて、本発明による阻害剤を同定してもよいだろう。
【０１３３】
ｅｅ３ファミリー、特にｅｅ３＿１およびｅｅ３＿２の配列に関する本発明の遺伝子および本発明の遺伝子産物、および／またはその未変性変種は多様な疾患、例えば神経変性、増殖性疾患、即ち具体的には新生物の疾患（腫瘍症、例えば固形癌（肉腫（皮膚の肉腫（カポシ肉腫）、芽腫、肝癌、小腸癌、膵臓癌、胃ガン、肺癌）または造血組織の腫瘍、特にはリンパ腫または白血病）、または低アポトーシス若しくは抗アポトーシス性疾患において薬理学的に重要であることから、本発明の方法により同定された医薬活性物質は広い応用範囲を持つ。一またはそれ以上の他分子、例えばシグナル伝達経路中の下流にあるタンパク質キナーゼまたはアダプターとの相互作用を阻害することに加えて、特に細胞内にある本発明のタンパク質の転写または転写量に影響を及ぼし、医薬活性を発揮することも可能である。記載すべき例は、病的プロセスを本発明の化合物により抑制した後に、本発明のＤＮＡ配列の転写が迅速にアップレギュレーションされる例であり、特に転写活性によりそれが迅速に制御される例でのアップレギュレーションである。故に医薬活性化合物にとって好ましい標的は転写制御であり、例えば前記物質の本発明の遺伝子産物に関する制御領域（例えばプロモーターまたはエンハンサー配列）への特異的結合による、本発明の遺伝子産物に関する１またはそれ以上の転写因子への結合による（結果として前記転写因子の活性化または阻害が起こる）、またはそのような転写因子自体の発現（転写または翻訳）を制御することによる制御である。
【０１３４】
転写制御以外、即ち細胞内での本発明の遺伝子のｍＲＮＡ量制御以外に、本発明の医薬活性化合物は、例えば本発明のタンパク質の発現速度（例えば翻訳、スプライスプロセス、例えばリン酸化のような本発明の遺伝子産物の未変性誘導化、または本発明の遺伝子産物の分解制御といった、その他細胞制御プロセスにも介入するだろう。
【０１３５】
本発明はまたｅｅ３ファミリー由来の本発明のポリペプチド、即ち具体的にはｅｅ３＿１、ｅｅ３＿２またはｅｅ３＿５タンパク質および／またはそれらの未変性変種（アイソフォーム、対立遺伝子、スプライス型、断片）の細胞相互作用相手の同定方法にも関する。この様にして、本発明のタンパク質に対し特異的結合親和性を持つ相互作用相手となるタンパク質を同定すること、または本発明のタンパク質に対し特異的結合親和性を有するタンパク質をコードしている核酸を同定することができる。本発明のｅｅ３タンパク質に分類されるタンパク質の細胞相互作用相手の例は、他のＧＰＣＲまたはイオンチャンネルでもよい。
【０１３６】
この種の本発明の方法、かかる方法を実行することを目的とした本発明のポリペプチドの使用、本発明の核酸配列および／または本発明の核酸構築体の使用は、酵母２−ハイブリッドスクリーニング（ｙ２ｈスクリーニング）を単独、または他の生化学的方法と組合せ実施するのが好ましい（非特許文献４９）。この種のスクリーニングは、ヴァンエルストら（非特許文献５０）およびボジェテックら（非特許文献５１）の報告にも見ることができる。一般には本発明の方法の実施に関しては、例えばルオら（非特許文献５２）が記載した様に酵母システム以外にも哺乳動物システムも利用できる。上記の実験アプローチは、ＧＰＣＲ分類のタンパク質が持つ典型的な特徴、例えば細胞内相互作用の相手としても知られるＧタンパク質を介した例えばシグナル伝達を利用する。
【０１３７】
ｙ２ｈスクリーニングでは本発明の配列、特に番号１から４または未変性変種の配列のオープンリーディングフレーム、特に好ましくは本発明の配列の細胞内領域、例えばｅｅ３−１またはｅｅ３−２の領域を、例えば「バイトベクター（ｂａｉｔ  ｖｅｃｔｏｒ）」の中に、ＧＡＬ４結合ドメイン（例えばクローンテック社のｐＧＢＴ１０またはｐＧＢＫＴ７）と一緒のフレームで挿入する。これを利用して、一般的なプロトコルに従って酵母株内の「プレイ（ｐｒｅｙ）ライブラリー」を相互作用タンパク質についてスクリーニングすることができる。さらに、ｙ２ｈシステムはまた、特異的相互作用ドメインを同定するための「マッピング実験」の実施にも利用できる。
【０１３８】
他の融合相手またはその他細胞システムを利用した２ハイブリッドシステム、例えばストラタジーン社のバクテリオマッチシステムもしくはストラタジーン社のサイトトラップシステムも、同様に好適である。ｙ２ｈ法の代替法として、哺乳動物を用いた同等のシステム、例えば本発明の開示の一部であるルオら（非特許文献５２）のシステムを、本発明に従い用いることもできる。
【０１３９】
本発明によれば、本発明の発現ベクターをトランスフェクションした細胞から共免疫沈殿により相互作用の相手を単離し、それらに結合するタンパク質を精製し、タンパク質配列決定法（例えばＭＬＡＤＩ−ＴＯＦ、ＥＳＩ−タンデム−ＭＡＬＤＩ）により対応する遺伝子を同定することもできる。
【０１４０】
従って本発明は、本発明のｅｅ３タンパク質および／またはその未変性変種の相互作用ドメインを同定することへの酵母２ハイブリッドシステムの利用または当分野既知のそれに対応する方法の利用、または他の生化学方法に利用、ならびに薬物治療介入への前記相互作用ドメイン（未変性配列の断片）の利用に関する。
【０１４１】
内因性リガンドまたは代理リガンド、即ちｅｅ３ファミリーの本発明レセプターへの結合特性を持つ非天然化合物を同定する本発明の別の方法を、以下の出発材料を含むアッセイを用い実施してもよい：（ａ）エリスロポイエチンの様な物質によっても前処理された、極めて広範囲の組織の抽出物および様々な種類の同処理を受けた細胞の細胞培養上清が、用いられるだろう。次に、抽出物は分画化され、さらに個々の分画をリガンドが単離されるまでアッセイに用いる。（ｂ）市販の物質バンク、例えばシグマ社のＬＯＰＡＣを用いるが、これはオーファンレセプターに対する潜在的リガンド、特に（神経）伝達物質、生物活性ペプチド、ホルモン、ケモカインおよび７ＴＭレセプターに結合できる先行技術のその他天然物質を含んでおり、従ってｅｅ３ファミリーの本発明のレセプターとの結合能力も有しているだろう。（ｃ）コンビナトリアルペプチドライブラリーを用いる。または（ｄ）：その構成成分が大きく異なっていると思われる、市販の物質ライブラリーを用いる。
【０１４２】
例えばＥＰＯによるｅｅ３＿１のアップレギュレーションは、例えばｅｅ３＿１が生存細胞と関係することを示すが、これはＥＰＯが神経保護作用を有しているからである。従って本発明のポリペプチドは、特にその生物活性が研究対象である未変性型またはその他非未変性の人工的に生成した変種は、アポトーシスアッセイまたは細胞死シグナルまたはその他の細胞生理学プロセスを誘導、伝達または阻害に於ける本発明のポリペプチドの機能および／または有効性を研究する方法に、本発明に従い用いてもよい。ｅｅ３ファミリーの本発明のタンパク質または上記本発明の変種の、例えばアポトーシスカスケードへの関与は、本発明のｅｅ３配列、具体的には番号１から４の配列、またはその変種を含む発現構築体を真核細胞（この種の研究へのその使用も開示する結果として）にトランスフェクションすることで研究し、それに続いてアポトーシス誘導の研究も可能である。この作業は、例えばアネキシン（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）染色、活性型カスパーゼ−３認識抗体（ニューイングランドバイオラブス）またはＤＮＡ−ヒストン断片を認識するＥＬＩＳＡ（ｃｅｌｌ−ｄｅａｔｈ  ｅｌｉｓａ、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）によって行ってもよい。前記のアポトーシス誘導は、場合によっては細胞型特異的であり、その結果本発明では複数の細胞株および初代細胞を研究することが望ましい。アポトーシス誘導はまた、刺激特異的であることもある。それ故に本発明の方法では、基本的には、例えば熱ショック、低酸素条件、サイトカイン処理（例えばＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ−アルファ）またはＨ2Ｏ2処理等複数のストレス条件を採用するのが望ましい。本発明のかかる方法に好適な細胞のタイプは、例えばＣｏｓ細胞、ＨＥＫ細胞、ＰＣ１２細胞、ＴＨＰ−１細胞、または例えば神経、星状細胞といった初代細胞、ならびに必要であればその他不死化された初代細胞株等の、通常の細胞株である。
【０１４３】
本発明はまた増殖アッセイへの本発明の核酸、本発明の核酸構築体の使用、または本発明の遺伝子産物の使用および／または本発明の上記主題を利用したその種の方法に関する。上記アポトーシスアッセイと同様に、細胞成長、細胞周期進行または腫瘍形成形質転換へのｅｅ３配列、特にｅｅ３＿１またはｅｅ３＿２およびその未変性または変性変種の関与は、本発明のｅｅ３ポリヌクレオチド、例えばｅｅ３＿１またはｅｅ３＿２もしくは対応するその変種を含む発現構築体を真核細胞内にトランスフェクションし、続いて例えば軟寒天培地アッセイ（非特許文献５３）を用いて、例えば腫瘍形成の誘導を調べることで研究することができる。好適な細胞タイプは、通常の細胞株、例えばＣｏｓ細胞、ＨＥＫ細胞、ＰＣ１２細胞、ＴＨＰ−１細胞、または例えば神経、星状細胞の様な初代細胞、ならびに必要な場合には、その他不死化した初代細胞株である。特に本発明のこの種の方法を用いることで、本発明の遺伝子産物がｒａｓシグナル伝達経路で果たす機能、および本発明の遺伝子産物とｒａｓシグナル伝達経路のその他構成要素との間の相互作用で果たす役割を、特に増殖プロセスに関し研究することができる。
【０１４４】
本発明はさらに、宿主細胞のｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏ形質転換に於ける、請求項１から４のいずれかに記載のＤＮＡ配列、または請求項８から１０のいずれかに記載の遺伝子産物の自殺遺伝子／自殺タンパク質としての利用に関する。これにより宿主細胞の中で、特にアポトーシスおよび／または壊死シグナルのシングナル伝達に於ける本発明のタンパク質の生物機能に関して、細胞死を特異的に起こすことができる。この場合、本発明のＤＮＡ配列および／または本発明のタンパク質の利用を、自殺遺伝子がプロモーターに作動可能に連結し、転写を抑制して必要時にだけ活性化されるようにデザインすることが望ましい。具体的には、患者細胞を移植した後、遺伝子治療の流れの中でトランスフェクション細胞をｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで特異的にスイッチオフできる。
【０１４５】
要約すると、本発明により哺乳動物系に於いて膜結合Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）の新規ファミリーが同定され、それらは当分野既知のファミリーと明瞭に区別されるものであると結論できる。本発明により、新規のタンパク質分類およびその基礎となるＤＮＡ配列が同定され、その中枢神経系における制御の違いに基づいて様々な生理学的および病理生理学的プロセスを解明し、そして特徴付けることができた。
【０１４６】
同定は、本発明のタンパク質ｅｅ３＿１のＥＰＯ誘導転写アップレギュレーションによる（直接または間接的）介入により行われた。これは例えばｅｅ３＿１の作用薬および拮抗薬がＥＰＯの作用を促進または代理するか、あるいは望ましくない作用を拮抗できることを意味している。このＥＰＯの作用は、おそらく、例えば神経保護作用（例えば神経変性疾患での）または脳機能の亢進（例えば痴呆での）といったものに選択的に影響するだろう。
【０１４７】
本明細書に示した遺伝子は、マウスおよびヒトの新規の７回膜貫通タンパク質であり、それは主に脳内に発現している。これはＧタンパク質共役レセプターである。
【０１４８】
ＥＭＢＬ配列データベースの相同性スクリーニングからは、ＧＰＣＲのＡファミリー、特にペプチドレセプターに類似の距離を得た。
【０１４９】
さらにｅｅ３＿１は、以下の神経疾患モデルに於いては、実際限定的な形でのみ制御されている；ラットでのてんかん発作（海馬、発作段階５、発作後２時間）、皮質発作（皮質、２．５時間閉塞、ならびに２および６時間の再潅流）、全体虚血（脳全体、虚血後３および６時間）。このことは、ＥＰＯによる制御の高い特異性が、例えば初期遺伝子に比べて高いことを示している。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１５０】
以下実施態様により本発明をより詳細に説明する。
【０１５１】
（実施態様１）
ｅｅ３＿１＿ｍおよび相同体の同定および分子クローニング
【０１５２】
（ａ）ｅｅ３＿１＿ｍの同定
エリスロポイエチンを過剰発現しているトランスジェニックマウスの脳を、経頭蓋潅流により麻酔して取り出し、液体窒素で瞬間凍結した。ＲＮＡをチモジンスキーとサッチの方法（非特許文献５４）に従い得た。２匹のトランスジェニックマウスと２匹の同腹子コントロールについて、マウスｃＤＮＡアレイ（チップ）を用いインサイト社の方法（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｃｙｔｅ．ｃｏｍ／ｒｅａｇｅｎｔｓ／ｌｉｆｅａｒｒａｙ／ｌｉｆｅａｒｒａｙ  ｓｅｒｖｉｃｅ．ｓ  ｈｔｍｌ参照）に従いハイブリダイゼーション実験した。実験には、２種類の標識サンプル（ＣｙｔおよびＣｙ３で標識された）を使った競合的ハイブリダイゼーションが、含まれている。ハイブリダイゼーション実験により、多くのアップレギュレートされた配列が、生成した。具体的には、ＥＳＴクローンＡＡ１８５４３２が同定されたが、これは繰り返し行った実験に於いてもＥｐｏトランスジェニックマウスで同様にアップレギュレーションされた。トランスジェニックでない同腹子と比較した場合の相対誘導係数は、＋３．９±０．１であった（図１）。前記アップレギュレーションは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒシステムを使った定量的ＰＣＲにより確認された（図２、フォワードプライマー：５’−ＧＧＴＧＴＧＧＧＡＧＡＡＡＴＧＧＣＴＴＡ−３’、リバースプライマー：５’ＡＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＧＣＣＴＧＧＡＧＡ−３’）。
【０１５３】
（ｂ）ｅｅ３配列のクローニング
同定したＥＳＴ配列を、ＥＳＴデータベース内のＢＬＡＳＴＮクエリ機能を使って拡張検索した。この様にして別の相同的マウス配列、ｅｅ３＿２＿ｍを同定した。適当なプログラム（ＢＬＡＳＴ、ＴＢＬＡＳＴＮ）を用いた相同性スクリーニングを利用することで、ＥＳＴおよびゲノムデータベース（ｅｎｓｅｍｂｌ）内のヒト相同体を同定することができた。
【０１５４】
得られた配列を、シェパードのＰＣＲクローニング法（非特許文献５５）を使ってマウスおよびヒト配列データベース内をスクリーニングして確認した。上記文献およびここに引用した先行技術は、本発明の開示の中にその全てが取り込まれる。前記方法は、プラスミドライブラリーに由来するｃＤＮＡ分子をビオチン結合オリゴヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションし、続いてストレプトアビジン結合磁性ビーズを使って前記プラスミドを抽出し、診断的ＰＣＲ法を用いてその結果を調べ、選択したプラスミドを再度形質転換した後に、単一のクローンが得られるまで前記段階を２回繰り返した。次のプライマーの組合せを用いた：
（１）完全長遺伝子区分のクローニングに用いたオリゴヌクレオチド：
ｅｅ３＿１−ｈ：
【０１５５】
【数１】
2005516591.tif 000002
ｅｅ３＿１−ｍ：
【０１５６】
【数２】
2005516591.tif 000003
ｅｅ３＿２＿ｈ：
【０１５７】
【数３】
2005516591.tif 000004
ｅｅ３＿２−ｍ：
【０１５８】
【数４】
2005516591.tif 000005
ｅｅ３＿ｃ３−ｈ：
【０１５９】
【数５】
2005516591.tif 000006
ｅｅ３＿ｃ５−ｈ：
【０１６０】
【数６】
2005516591.tif 000007
ｅｅ３＿ｃ８−ｈ：
【０１６１】
【数７】
2005516591.tif 000008
（２）さらに機能分析を行うために、ｅｅ３配列のコーディング領域をＧＡＴＥＷＡＹ（ｔｍ）−適合ベクターにクローニングした。この作業には、次のオリゴヌクレオチドを用いた：
ｅｅ３＿１−ｈ：
【０１６２】
【数８】
2005516591.tif 000009
ｅｅ３＿２−ｈ：
【０１６３】
【数９】
2005516591.tif 000010
ｅｅ３＿２−ｍ：
【０１６４】
【数１０】
2005516591.tif 000011
【０１６５】
（ｃ）ヒトｃＤＮＡライブラリーの調製
２μｇのヒト胎児脳ｍＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）および５μｇの成体マウスの脳由来ｍＲＮＡを材料として、対応するｃＤＮＡライブラリーをＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）のｃＤＮＡ合成キットを用いて調製した。作業は、製造元の指示書に実質従って行った。第一鎖ｃＤＮＡ合成はオリゴｄＴプライマーを用い、製造元指示書に従って行った。クローニングに適した（ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ）二本鎖ｃＤＮＡ断片を大きさ（製造元の指示書／ストラタジーン社による）に基づき選択し、プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に連結した。エレクトロポレーションを用いて大腸菌（ＤＨ１０Ｂ、Ｇｉｂｃｏ）内に結体を形質転換し、ＬＢ−アンピシリン寒天プレート上で増幅した。プラスミドＤＮＡをアルカリ融解法およびイオン交換クロマトグラフィー（Ｑｉａｇｅｎ製ＱＩＡｆｉｌｔｅｒキット、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、単離した。
【０１６６】
ヒト胎児脳ｃＤＮＡバンクの個別クローン数は、４００万である。各ｃＤＮＡバンクから２４個の単一クローンを挿入サイズに基づき無作為に分析したところ、サイズ分布は８００ｂｐから最大４．５ｋＢであり、ヒトバンクに関するｃＤＮＡ挿入体の平均長は約１．２ｋＢであることが示された。
【０１６７】
（実施態様２）
エリスロポイエチン（ＥＰＯ）によるｅｅ３＿１の制御
【０１６８】
ｅｅ３＿１は、Ｅｐｏ−トランスジェニックマウス（マウス系統ｔｇ６およびｔｇ２１）の脳ではアップレギュレーションを受けた遺伝子産物として同定された。
【０１６９】
本発明の実験に用いたマウスは、それらの構成に関しこれまで何度か特徴付けが行われている（非特許文献５６、非特許文献５７、非特許文献５８）。マウスはトランスジェニック構築体を用い、ヘルガーズベルグ記載の方法（非特許文献５９）に従って調製した。この構築体は、ＰＤＧＦプロモーターおよびエリスロポイエチンをコードする配列を構成要素として含んでいる。複数のトランスジェニック系統を作製し、その中のｔｇ６およびｔｇ２１を今回調べた。ｔｇ６のみが全身性にＥＰＯ発現を増加したが、このことはルスチツカらの方法（非特許文献５６）による血清学的研究により確認された。系統ｔｇ２１は、全身のＥＰＯレベルは増加しなかった。ササハラらの結果（非特許文献６０）との類似より、使用したＰＤＧＦ−プロモーター断片はトランスジェニックＥＰＯの発現を、特に神経細胞で誘導したと想定される。
【０１７０】
ｔｇ６系統のマウスでは、ＥＰＯの全身の発現増加により赤血球新生が顕著に高まり、最高ヘマトクリット０．８の赤血球増加症および明瞭な血液容積の増加（最大４．０ｍＬ）を引き起こした（非特許文献５７）。これに対し、ｔｇ２１系統は表現形的に顕著なことはなかった。
【０１７１】
ＲＮＡ産物、例えばええ３＿１遺伝子のＲＮＡ産物は、エリスロポイエチンをトランスジェニック的に過剰発現しているマウス（系統ｔｇ６およびｔｇ２１（非特許文献５６、非特許文献５７、非特許文献５８）の脳に於で高く発現しており、ＤＮＡアレイ実験により同定されている。ＥＰＯの過剰発現による転写レベルのＥＥ３＿１制御が生理学的および病理生理学的に重要であることは、マイクロアレイを用いた転写分析により両トランスジェニック系統で同様に制御されていることが分かっている別の制御遺伝子産物、即ちアルファ−グロビンが見いだされたことで確認された。このことは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒシステムを用いて確認された（図２）。特に、海馬領域で増加が認められた（ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）。
【０１７２】
（実施態様３）
哺乳動物細胞内における本発明の配列の発現および安定細胞株の調製
【０１７３】
ｅｅ３ファミリーの遺伝子のオープンリーディングフレームを、クローンテック製のｐｃＤＮＡシリーズの一般的真核発現ベクターにクローニングした（ハイデルベルグ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。この様にして作製した発現プラスミドを用い、具体的にはヒト胚腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）の場合はリン酸カルシウム法で、ＣＨＯ細胞およびＣＨＯ−ｄｈｆｒ-細胞の場合はリポフェクタミンで、またはＣＯＳ細胞の場合はＤＥＡＥ−デキストランビーズを利用してトランスフェクションし、４００〜５００ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を用いて選択した。選択３週後、個々のクローンを拾い上げ、拡大して以後の分析に用いた。約３０個のクローンを、ノーザンブロットおよびウエスタンブロット法で解析した。選択マーカーとしてジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む真核発現ベクターにｅｅ３ファミリーの遺伝子のオープンリーディングフレームをクローニングし、得られた発現プラスミドをトランスフェクションに用いて、ヌクレオチドを含まない培地中でトランスフェクションしたＣＨＯ−ｄｈｆｒ-細胞を選別した。この様にしてトランスフェクションしたＣＨＯ−ｄｈｆｒ-細胞を、濃度を上げながらメトトレキセートで処理し、この様に処理した細胞からジヒドロ葉酸還元酵素発現量が増加している細胞、およびレセプター量も増加している細胞を選択したが、トランスフェクションしたその他の細胞でも同様な選択ができる。
【０１７４】
（実施態様４）
ｅｅ３＿１のカルボキシ末端部分を用いた酵母２−ハイブリッド実験
【０１７５】
酵母２−ハイブリッドシステムの中から潜在的な相互作用相手を特定するために、本発明のｅｅ３＿１のカルボキシル末端部分をバイトベクターｐＧＢＫＴ７（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）にクローニングした。
使用したタンパク質配列：
【０１７６】
【数１１】
2005516591.tif 000012
対応する核酸配列：
【０１７７】
【数１２】
2005516591.tif 000013
相互作用相手のスクリーニングは、ヒト脳ライブラリーを用い、当業者に一般的な標準的方法に従い実施した（かけ合わせ法、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）。その結果、重複配列を含む２つのクローン（クローン１１および３６）を得た。
【０１７８】
同定されたクローン１１の配列は、次の通りであった：
【０１７９】
【数１３】
2005516591.tif 000014
相互作用遺伝子産物は、ＲＡＮＢＰＭまたはＲＡＮＢＰ９（非特許文献６１）と同定された。同様に２種類のその他相互作用タンパク質、即ちＭａｐｌａおよびＭａｐｌｂが、同定された。興味深いことに、両タンパク質のカルボキシ末端部分は、相互作用部分と同一であり、両タンパク質の前記の部分が相同的領域を含んでいることが判明した。この領域のＭａｐｌａおよびＭａｐｌｂのアラインメントを示すが、上の配列がＭａｐｌａであり、下の配列がＭａｐｌｂである：
【０１８０】
【数１４】
2005516591.tif 000015
【０１８１】
（実施態様５）
ｅｅ３＿１／ｅｅ＿２のヒト相同的配列
【０１８２】
（ａ）染色体５ｑ３３．１上
Ｔｂｌａｓｔｎを用い、別の相同配列がコンティグＡＣ１１４０６．０００１５上にあることが突き止められた：
【０１８３】
【数１５】
2005516591.tif 000016
対応するｃＤＮＡを得ることもできたが、翻訳からはｅｅ３タンパク質に相同的なカルボキシル末端断片のみが生成された。
ｅｅ３＿１＿ｍとの配列比較は以下の通りであった：
【０１８４】
【数１６】
2005516591.tif 000017
得られたｃＤＮＡ配列は全体としてゲノムデータに一致し、ＡＴＧの上流のフレーム内に停止コドンが存在することが示されていることから（配列参照）、１種類のＧＰＣＲ断片だけが生成されることは確実であった：
【０１８５】
【数１７】
2005516591.tif 000018
【数１８】
2005516591.tif 000019
【０１８６】
（ｂ）染色体８ｑ１１．２２上
別の相同配列が、ＥｎｓｅｂｌコンティグＡｃ０３４１７４上に見いだされた。
相同なヌクレオチド部分のタンパク質配列は、次の通りであった：
【０１８７】
【数１９】
2005516591.tif 000020
【０１８８】
（ｃ）染色体３ｐ２５．３上
第３染色体上に相同配列が、見いだされた：
【０１８９】
【数２０】
2005516591.tif 000021
【０１９０】
（ｄ）染色体Ｘｐ２１．１上
【０１９１】
【数２１】
2005516591.tif 000022
これら相同部分に対応するヌクレオチド配列は、次の通りであった：
【０１９２】
【数２２】
2005516591.tif 000023
および
【０１９３】
【数２３】
2005516591.tif 000024
しかしコンセンサス配列ＤＲＩは、見つからなかった。
【０１９４】
（ｄ）  別スプライス産物ｅｅ３＿１ｂ＿ｈおよびｅｅ３＿１ｃ＿ｈ
【０１９５】
ヒト遺伝子産物ｅｅ＿１＿ｈの別スプライス産物、即ちｅｅ３＿１ｂ＿ｈ（図１１Ｂ、配列番号３Ｂ参照）を発見した。前記産物は、エクソン３内にあるコンセンサススプライス−ドナー部位に由来するもので、修飾カルボキシ末端とより早い位置の翻訳停止位置を持つ、修飾オープンリーディングフレームを生ずる。その結果、第４ＴＭドメイン後で切れているタンパク質（１６６アミノ酸、分子量：１９．２ｋＤ）ができる（図１５Ｂ、配列番号７Ｂ参照）。さらに第２ＴＭドメイン後に切れている、図１５Ｃに対応するタンパク質配列（配列番号７Ｃ）が示されている別のスプライス産物、即ちｅｅ３＿１ｃ＿ｈ（図１１Ｃ、配列番号３Ｃ参照）が同定された。前記スプライス産物は、シェパードらのクローニング法（実施態様１参照）を用いたクローニングおよび配列決定の過程で見出されたものである。
【０１９６】
ｅｅ３＿１ｂ＿ｈのＴＭ領域は、以下の様に推測された：
→非常に好ましいモデル：Ｎ末端外側
４個の強力な膜貫通へリックス、合計スコア：６３１５
番号      開始        終了      長さ    スコア    方向
１        １５        ３３    （１９）  ２０６６  ｏ−ｉ（ｏ：外側、ｉ：内側）
２        ４０        ５６    （１７）  １１４３  ｉ−ｏ
３        ８３      １０２    （２０）  １７６５  ｏ−ｉ
４      １１２      １３４    （２３）  １３４１  ｉ−ｏ
【０１９７】
このスプライス産物は、全長レセプター、例えば主にＶ２バソプレッシンレセプターの機能を制御する上で機能的に重要である（非特許文献６２、非特許文献６３）。ＧＰＣＲタンパク質は、ホモ−またはヘテロ二量体化することから（非特許文献６４）、この様な端断型の本発明の配列は優性阻害的な役割を果たすだろう。
【０１９８】
結果として、本発明は、特にこの様な本発明のｅｅ３タンパク質のスプライス型（例えば本発明の発現ベクターに於ける裸のＤＮＡの様な、本発明のタンパク質配列の様な）およびそのようなスプライス型の変種の、ここに開示した様な疾患治療薬調製への利用を開示する。同様に開示は、薬理学的影響を受ける本発明のｅｅ３ファミリーレセプターの研究へのそれらの利用も包含する。
【０１９９】
(実施態様６)
ｅｅ３ファミリーのタンパク質に関するタンパク質トポロジーデータ
ＴＭＰｒｅｄプログラムを用いたＴＭ（膜貫通）スクリーニングより、以下の非常に好ましいモデルを得た：
【０２００】
（ａ）ｅｅ３＿１
→非常に好ましいモデル：Ｎ末端外側
７個の強力な膜貫通へリックス、合計スコア：１１８６３
番号  開始      終了    長さ  スコア    方向
１    １５      ３３  （１９）２０６６  ｏ−ｉ  ＦLIYACLLLFSVLLALRLD
２    ４０      ５６  （１７）１１４３  ｉ−ｏ  YWAVFAPIWLWKLMVIV
３    ８３    １０２  （２０）１７６５  ｏ−ｉ  AMLIAVGIHLLLLMFEVLVC
４  １１２    １３４   (２３）１３４１  ｉ−ｏ  ＷLLVFMPLFFVSPVSVAACVWGF
５  １６８    １９１  （２４）２９７８  ｏ−ｉ  MLVVCVPLWILMSFLCLVVLYYIV
６  ２１１    ２２７  （１７）１０７０  ｉ−ｏ  ITMALSWMTIVVPLLTF
７  ２４０    ２５８  （１９）１５００  ｏ−ｉ  AFSCIPIFVPLWLSLITLM
【０２０１】
ＴＭドメイン間のセグメント距離は、１５、７、２７、１０、３４、２０、１３ＡＡであり、細胞内残基は９２ＡＡ長であった。
【０２０２】
（ｂ）ｅｅ３＿２に関する一致像：
→非常に好ましいモデル：Ｎ末端外側
７個の強力な膜貫通へリックス、合計スコア：１２３５１
番号      開始        終了      長さ    スコア    方向
１        １５        ３６    （２２）  １８１１  ｏ−ｉ
２        ３２        ５０    （１９）  １２１９  ｉ−ｏ
３        ８３      １０２    （２０）  １７３３  ｏ−ｉ
４      １１２      １３４    （２３）  １３３０  ｉ−ｏ
５      １６８      １９１    （２４）  ３０６８  ｏ−ｉ
６      ２１１      ２２７    （１７）  １２３９  ｉ−ｏ
７      ２４３      ２６０    （１８）  １９５１  ｏ−ｉ
【０２０３】
ＴＭドメイン間のセグメント距離は、１５、０、３３、１０、３４、２０、１６ＡＡであり、細胞内残基は９０ＡＡ長であった。
【０２０４】
（ｃ）比較に用いたコントロール実験は、先行技術のＣＣＲ−５レセプター（同様に７ＴＭレセプター分類に属する）のトポロジーであった：
１        ５１        ７６    （２６）  ２８９５  ｏ−ｉ
２        ８９      １０８    （２０）  １１５５  ｉ−ｏ
３      １２４      １４５    （２２）  １１６３  ｏ−ｉ
４      １６３      １８７    （２５）  １４１５  ｉ−ｏ
５      ２２０      ２３９    （２０）  ２１８３  ｏ−ｉ
６      ２６０      ２８１    （２２）  １７８２  ｉ−ｏ
７      ２９８      ３２５    （２８）  １３２５  ｏ−ｉ
【０２０５】
ＴＭドメイン間のセグメント距離は、５１、１３、１６、１８、３３、２１および１７ＡＡであり、残基は４６ＡＡ長であった。
【０２０６】
比較的関連性の低い７ＴＭレセプターであるブラジキニン−２、ＣＸＲ５、ガラニンレセプター２およびアナフィラトキシンＣ５ａの一般トポロジー（タンパク質の膜貫通以外の各構成部分、即ちＮ末端およびＣ末端、ならびにループ部分内のアミノ酸数が示される）との比較からは、本発明のｅｅ３＿１について次の様な比較結果を得た：
レセプター        Ｎ末端      １    ２    ３    ４    ５    ６    残り
Ｃ５ａ              ３９    １２  １４  ２２  ２８  １６  ２０    ４５
ＢＫ−２            ６３    １３  １４  ２０  ２７  ２６  ２４    ５６
ゲラニン−２        ２８    １０  １７  １９  ２４  ２５    １  １０５
ｃｘｃｔ−５        ５５    １１  １４  ２１  ３０  １８  ２３    ４６
ｍｗ                43.3    11.7  15.0  20.3  26.3  22.3  15.0    63.0
ｅｅ３＿１          １５      ７  ２７  １０  ３４  ２０  １３    ９２
これらタンパク質の一般トポロジーは、よく似ていることが判明した。
【０２０７】
(実施態様７)
ｅｅ３＿１内のモチーフおよびシグナル配列の決定
使用したプロサイトプログラム：
【０２０８】
【数２４】
2005516591.tif 000025
即ちＣＫ２のリン酸化部位は位置７７に、アスパラギン酸グリコシル化部位は位置２９４に、２カ所あるミリスチル化部位は位置５７および２６３（図７の連続番号による）に位置していた。カルボキシル末端には、典型的なリン酸化部位は見いだせなかった。
【０２０９】
(実施態様８)
エリスロポイエチン単回投与によるｅｅ３の誘導
【０２１０】
図１９に示す様にラットでは、ｅｅ３＿１はエリスロポイエチン（Ｅｒｙｐｏ、Ｊａｎｓｓｅｎ；５０００Ｕ／体重ｋｇ）を腹腔内に単回注射することで転写レベルに誘導される。エリスロポイエチン注射６時間後および２４時間後にＲｏｍｐｕｎ／Ｋｅｔａｎｅｓｔ注射で麻酔屠殺し、注意しながら脳を取り出した。コントロールのラットは、生理食塩水で処理した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた半定量的ＲＴ−ＰＣＲを利用して、ｅｅ３＿１メッセンジャーＲＮＡを測定した。サンプルの相対蛍光を、シクロフィリンに対する標準曲線と比較して定量化した。
【０２１１】
チモジンスキー／サッチの方法（酸性フェノール抽出）で総ＲＮＡをラット前脳（小脳および嗅球を除く）より単離してから、ＲＮｅａｓｙ抽出キットを用いて製造元（Ｑｉａｇｅｎ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒｉｔａ、ＣＡ、ＵＳＡ）指示書に従い精製した。ＲＮＡ濃度は、分光光学的に決定し、総ＲＮＡの品質はアガロースゲル電気泳動で評価した。ＲＮＡは、使用するまで−８０℃で保管した。
【０２１２】
Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）で逆転写した後反応産物を、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ技術を利用したリアルタイムオンラインＰＣＲにて相対定量した。これには、３匹の野生型マウスおよび３匹のトランスジェニックｔｇ６マウスの脳より得た総ＲＮＡサンプルを用いた。シクロピリン用の特異的オリゴヌクレオチドプライマー配列は、フォワードプライマーについては
５’ＡＣＣＣＣＡＣＣＧＴＧＴＴＣＴＴＣＧＡＣ−３’
であり、リバースプライマーについては
５’ＣＡＴＴＴＧＣＣＡＴＧＧＡＣＡＡＧＡＴＧ−３’
であり、その結合温度は６０℃であり、そしてラットｅｅ３＿１については：
フォワードプライマー：５’−ＧＧＴＧＴＧＧＧＡＧＡＡＡＴＧＧＣＴＴＡ−３’、リバースプライマー：５’−ＡＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＧＣＣＴＧＧＡＧＡ−３’であった。
【０２１３】
定量を行うために、１：３、１：９、１：２７、１：８１および１：２４３に連続希釈したｃＤＮＡを、次の計画に従い増幅した：９５℃、５分間の初期変性、９４℃変性５秒間、特異的プライマーに応じて（上記参照）５５℃または６０℃による結合１０秒間、７２℃の伸長３０秒間を含み成るサイクル５０回の増幅。各サンプルの蛍光を、各サイクル終了後１０秒間８０℃にて測定した。反応産物の特異性は、アガロースゲル電気泳動および融解曲線（データ未提示）で確認した。各ＰＣＲ反応は、正確に１種類の反応産物のみを生成した。
【０２１４】
定量には前記ＰＣＲ反応の対数期を用いた。これには、適当な曲線に漸近線を引くことも含まれる。ヘモグロビンの場合、結果は増加曲線と事実上平行しており、その結果シクロフィリンの標準曲線との比較にこれら曲線の傾斜を利用することができた。規格化したＰＣＲ産物の各ｃＤＮＡ希釈物について、平均値±標準偏差を決定した。この様にして得た定量的な差は、トランスジェニックおよび野生型動物でのＲＮＡ発現の相対的変化に一致した。全ての反応は、一つの反応産物だけを生成した。ｅｅ３の平均誘導係数は、６時間後で１．３５倍、２４時間後で１．４４倍であった。
【０２１５】
(実施態様９)
脳内のｅｅ３＿１ＲＮＡの分布
【０２１６】
マウスのｅｅ３＿１転写物の局在を、放射性標識オリゴプローブを用いたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより研究した。このために厚さ１５μｍの脳切片をクライオスタトを使って−２０℃で作製し、ポリ−Ｌ−リジンコーティングスライド上に載せ、４％パラホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）で固定した。オリゴヌクレオチドは、ターミナルトランスフェラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ）法によりａ−35Ｓ−ｄＡＴＰで放射性標識した。標識化およびそれに続くハイブリダイゼーションは、ワイスデンとモリス（非特許文献６５）のプロトコルに従い行った。
【０２１７】
使用した放射性標識プローブ（ｅｅ３＿１．３の場合はＡＡＣＧＡＡＧＧＧＣＣＡＧＴＡＧＣＡＣＡＧＡＧＡＡＣＡＧＣＡＧＣＡＧＡＣＡＧＧＣＡＴＡＧＡＴＧＡＧＧ）は、小脳（ｃｅ）、海馬（ｈｃ）、歯状回（ｄｇ）および皮質（ｃｏ）、特に内側嗅皮質（ｅｎｔ）、嗅球内（ｏｌｆ）でのｅｅ３＿１の発現を視覚化した。これに対応するセンスコントロール（ｅｅ３＿１．３ｓの場合、ＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＧＣＣＴＧＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＴＣＴＣＴＧＴＧＣＴＡＣＴＧＧＣＣＣＴＴＣＧＴＴ）は、特異的シグナルを示さなかった（図示しない）（図２０）。
【０２１８】
(実施態様１０)
マウス組織内ｅｅ３＿１分布の免疫組織化学例
【０２１９】
パラフィン包埋した組織を切片化し（２μｍ）、処理済みスライド（ＤＡＫＯ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）上に載せ、一晩風乾した後脱パラフィン処理（キシレンおよび漸次濃度を下げたアルコールのシリーズ）した。クエン酸緩衝液中で５００Ｗのマイクロ波処理を１０分間おこなった後、切片を１：５００に希釈した抗ｅｅ３＿１血清（ＡＳ４１６３）と、湿潤チャンバー内で室温で１時間インキュベーションした。免疫反応は、ＤＡＢを発色剤として使用するＡＢＣ技術を製造元指示書（ＤＡＫＯ、Ｇｌｏｓｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）に従い使用して視覚化した。陰性コントロールは、一次抗体による処理を除き上記同様に処理した切片、および一次抗体に代わって対応する免疫前の血清で処理した切片を用いた。
【０２２０】
免疫組織化学染色の結果を、図２２に示した。全体にわたり、ｅｅ３が小腸および肺の一部構造以外では実質的に神経特異的に局在することが示された。ｅｅ３は、統合機能を持つ神経細胞（第５皮質層の大型円錐細胞、嗅球の僧帽細胞、小脳のプルキンエ細胞）で頻繁に発現していた。像Ａ〜Ｃは、第５層内のｅｅ３が皮質に局在し、神経突起がよく染まることを示している。より強い免疫染色が、内側嗅皮質（Ｃ）に見ることができる。生理学的な観点より、情報は内側嗅皮質から海馬にながれ、学習および記憶に関与する。
【０２２１】
脳卒中、アルツハイマー病または頭部および脳の障害を受けた患者に、内側嗅皮質の変化が頻発する。内側嗅皮質の障害は行動変化をもたらすことがあり、その中には感覚印象の不適切な処理および学習困難が含まれる（非特許文献６６）。像Ｄ−Ｆは、海馬でのｅｅ３分布パターンを示している。ここでは、ＣＡ３セクター内での発現とＣＡ２およびＣＡ１セクターで発現が欠如している、明確な境界が明瞭に示されている。ＣＡ１領域の神経細胞、および程度は低いがＣＡ４領域の神経細胞は、特に既存の一般的な中枢神経損傷と伴う場合、壊死−および炎症−の無い生理学的な細胞死（アポトーシス）に対し特に感受性である（例えば非特許文献６７）。これに対し歯状回は、むしろ壊死による損傷を受けやすいと思われる。歯状回は、病的刺激後のｄｅ  ｎｏｖｏの神経細胞形成と関係している（非特許文献６８）（非特許文献６９）。ｅｅ３は、同様に非新皮質形成領域：小脳のプルキンエ細胞内（Ｇ，Ｈ）、プルキンエ細胞はそこでは統合新経細胞として機能しおり、そして嗅球の僧帽細胞（Ｉ、Ｊ）内にも存在している。神経節細胞や網膜の感覚細胞内（Ｋ、Ｌ）でｅｅ３の強い発現が、認められた。
【０２２２】
最近、エリスロポイエチンの網膜に於ける神経保護機能が、報告された（非特許文献７０；非特許文献７１）。これらの発見は、ＥＰＯ誘導とｅｅ３発現との間の関連性を示唆している。ＥＥ３は、運動系に属する神経細胞でも同様に強く発現している。即ち、特異的発現が、脊髄内の前角の大運動神経細胞内（図２２Ｍ）および三叉神経核（図２２Ｎ）の機能的に同等な運動神経細胞内にも見ることができる。
【０２２３】
脊髄内でのｅｅ３に関する前記分布は、筋萎縮性側索硬化症の治療および診断的介入に利用できるかもしれない。筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ；ローゲーリック病；シャルコー病）は、１００，０００人当たり年間発生率０．４から１．７６人の神経変性病である（非特許文献７２）。この病気は、全身の繊維束性痙攣、進行性の萎縮および骨格筋の衰弱、痙攣および正の錐体路徴候、構語障害、嚥下障害および呼吸困難といった症状を特徴とする最も一般的な形の運動神経障害である。その病理は主に脊髄前角内の神経細胞および下部脳幹部運動核内の神経細胞の消失であり、同時に皮質内の第一次運動神経細胞にも影響が出る。この病気の病因は殆どわかっていないが、家族性の症例ではスーパーオキサイドジスムターゼの突然変異の役割がよく調べられている。今日までにＳＯＤ１タンパク質には、９０を越えるＡＬＳ起こすと考えられる突然変異が報告されている（非特許文献７３）。神経細繊維もまた、この病気に関係していると考えられている。グルタミン酸の過剰により引き起こされるメカニズムである興奮毒症の病因は別であり、そのことはヒト患者でのリルゾールの作用により確認できる。カスパーゼとアポトーシスが同時に活性化されることが、ＡＬＳの発症の最終経路と考えられている（非特許文献７４、非特許文献７５）。ＡＬＳに罹った神経細胞でのｅｅ３タンパク質の局在から、ｅｅ３作用薬またはｅｅ３拮抗薬がこの病気に治療機能的／診断的に応用できる可能性が示唆されている。
【０２２４】
中脳黒質内のｅｅ３の局在（図２２  Ｏ、Ｐ）は、パーキンソン病の治療および診断の可能性を開く。パーキンソン病は最も一般的な運動障害で、北アメリカで約１００万人の患者がいる。６５歳以上の集団では約１％が、この病気に罹っている。主な症状は、硬直、振戦、運動不能症である（非特許文献７６）。この病気の原因は、不明である。しかし、死後組織の分析および動物モデルから、持続的にドーパミン性神経の変性を起こす黒質内での酸化ストレスの進行プロセスが、示唆されている。神経変性のプロセスを研究するために、６−ヒドロキシドーパミンおよびＭＰＴＰ（Ｎ−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン）のような神経毒により引き起こされる酸化ストレスが、動物モデルに用いられている。症状に基づく治療（例えばＬ−ドーパにデカルボキシラーゼ阻害剤を併用するもの；ブロモクリプチン、ドーパミン作用薬であるペルゴライドおよびトリヘキシフェニジル（アルタン）の様な抗コリン作動性物質）は存在するが、病的プロセスを停止できる合理的な、即ち神経保護的な治療が強く求められている。動物モデルおよびヒトでの発症には、アポトーシス機構が明らかに関与している（非特許文献７７、非特許文献７８、非特許文献７９、非特許文献８０）。
【０２２５】
神経系にｅｅ３が局在することは、このタンパク質の発現と神経細胞死、神経発生および神経適応との間の関連性に関する極めて強力な証拠である。
【０２２６】
肺では、ｅｅ３は別の構造内に見いだされる（図２２  Ｑ〜Ｖ）。ｅｅ３を発現している基底細胞が気管支末端に見いだすことができ、この細胞はおそらく神経分泌活性を持つ細胞であろう。この局在から、ｅｅ３が気管支疾患の治療に重要であることが、示唆される。細動脈の内皮細胞および平滑筋細胞でも、発現が見られる（１２  Ｕ、Ｖ）。これに対し静脈は、免疫組織化学的なｅｅ３の発現を示さない（図２２  ＱおよびＲ）。内皮細胞が特定レセプターを発現していることは、薬理学的に極めて重要であるが、それは治療薬が血中においてこの細胞層にまず接触するからである。血液循環に作用する重要な薬物は細動脈、特にその内皮細胞または平滑筋系を標的とする。従ってｅｅ３は循環器病、例えば動脈性高血圧に影響することに関し、極めて魅力的な標的タンパク質である。
【０２２７】
小腸では、ｅｅ３は基本的には腺窩（図２２  Ｗ、Ｘ）および聴神経に属すると思われる神経細胞内（図２２  Ｙ）に見いだされた。組織学的に調べられた大部分の臓器では、臓器特異的細胞が特異的に染色されることはなく、むしろ多くの場合で神経のみが顕著に染色された（例えば心筋については図２２のＡＡ、あるいは結合組織、図２２Ｚを参照）。このｅｅ３の明瞭な軸索への局在から、この分子の末梢神経疾患（神経障害）の診断および治療への応用が想定されるが、その対象としては、例えば広く見られる糖尿病性多発性神経炎が挙げられる。同様に末梢神経系の一般的遺伝性疾患、例えばＨＭＳＮグループ（遺伝性の運動感覚神経性疾患）もその恩恵を受けるだろう。
【０２２８】
最後に、運動終盤上の局在に最も一致すると思われる発現パターンが、骨格筋で見いだされた（図２２  ＢＢ）。このことは、運動終盤性疾患、例えば重症筋無力症にとって特に興味深い。
【０２２９】
(実施態様１１)
ＥＰＯ過剰発現マウスでは、ｅｅ３はタンパク質レベルでアップレギュレーションされている
【０２３０】
免疫組織化学（抗血清ＡＳ４１６３）はまた、ｅｅ３タンパク質がエリスロポイエチンにより明瞭にアップレギュレーションされていることも示した（図２３）。同時に処理したＣＮＳ切片では、ｅｅ３のシグナルが明瞭に強くなっていた。このことは、遺伝子型についてブラインド試験で染色し評価された各例３匹のマウス（野生型およびＥＰＯ過剰発現（ｔｇ６））全てについて示された。
【０２３１】
(実施態様１２)
ｅｅ３およびｍａｐ１ｂの共局在、ならびにｍａｐ１ｂ−欠失マウスに於けるｅｅ３発現の欠失
【０２３２】
ｅｅ３＿１カルボキシル末端による酵母２ハイブリッドスクリーニングにより、Ｍａｐ１ａおよびＭａｐ１ｂの軽鎖が相互作用タンパク質として同定された（前記実施態様、例えば実施態様４を参照）。図２４は、マウスでのｅｅ３＿１およびｍａｐ１ｂの二重免疫蛍光を示しており、予想外にもｅｅ３＿１とｍａｐ１ｂの発現がマウスで重複していることを示している。
【０２３３】
二重免疫蛍光染色を行うために、脱パラフィンした切片をマイクロ波処理した後（クエン酸緩衝液中、５００Ｗ、１０分）、ウサギｅｅ３＿１抗体（ＡＳ４１６３）およびｍａｐ  １ａに対するヤギ抗体（ＭＡＰ−１Ｂ（Ｃ２０）；ｓｃ−８９７１；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＵＳＡ）と湿潤チャンバー内、室温で１時間、同時にインキュベーションした。適当な洗浄を行った後、切片を二次抗体であるＦＩＴＣ抗ウサギおよびＴＲＩＴＣ抗ヤギ抗体と３０分間インキュベーションした（両抗体ともＤｉａｎｏｖａ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙより得たもので、それぞれＰＢＳで１：３０に希釈した）。切片を再度ＰＢＳで洗浄した後、標本をヒストセーフで密封し、適当な保護フィルターを使って蛍光顕微鏡（オリンパスＩＸ８１、オリンパス、Ｇｅｒｍａｎｙ）で解析した。分析ソフト（ソフトイメージングシステム、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、シグナルの重ね合わせを調製した。同時におこなった単独蛍光染色では、いずれの例でももう一方のチャンネルにシグナルがないことが実証され、例えばフィルターの不適当であり、シグナルがもう一方のチャンネルに「漏れる」ことがないことを示した。二次抗体の発色団を相互に交換して行った二重染色でも、同一の像を得た（図示せず）。
【０２３４】
図２４は、ＣＮＳでは驚くべき事に前記２種類のタンパク質が共局在していることを示している。緑；ｅｅ３＿１染色；赤：Ｍａｐ１ｂ染色；黄色：両シグナルの電子的な重ね合わせ。脊髄（ｓｃ）および小脳（ｃｂ）の例を示した。
【０２３５】
Ｍａｐ１ｂは、重要な神経タンパク質である。これは、ほ乳類の中枢神経系の発生に於いて発現する最初の微小管関連タンパク質（ｍａｐｓ）の一つである。神経の軸索形成に関与していると思われる（非特許文献８１、非特許文献８２）。神経相互作用に於いてｍａｐ１ｂが機能的に重要な役割を果たしていることが最近の研究から支持されており、これら研究はｍａｐ１ｂが最も一般的な遺伝性の精神薄弱症である脆弱Ｘ症候群の病理発生に関係していることを示している。ｍａｐ１ｂのｍＲＮＡは、脆弱ＸｍＲＮＡによる直接制御を受けているタンパク質ＦＭＲＰにより制御されている。ショウジョウバエの研究からｍａｐ１ｂ（ショウジョウバエではｆｕｔｓｃｈ）が、脆弱Ｘ類似表現形の発現に中心的な役割を果たしていることが見いだされた（非特許文献８３、非特許文献８４）。ｍａｐ１ｂはまたギガコンシンに結合するが、このタンパク質の突然変異遺伝子は劣勢の遺伝子疾患である巨大軸索神経症（ＧＡＮ）に関係している（非特許文献８５）。ｍａｐ１ｂは、末梢神経が損傷されるとミエリン化神経内を伸びる神経細胞で増加誘導され、おそらく軸索の発出と関係しているだろう（非特許文献８６）。最終的にｍａｐ１ｂが、恐らくはＧＡＢＡ−Ｃレセプターをそのシナプス位置に局在させると考えられている（非特許文献８７）。
【０２３６】
ｍａｐ１ｂ遺伝子を、マウスに於いて遺伝的に不活性化した（ノックアウト）。最も有用なノックアウトは、メイスナーらが記載したマウスである（非特許文献８８）。ｍａｐ１ｂ遺伝子をホモ接合的に不活性化したマウスについて、ｅｅ３の発現を免疫組織化学的に研究した。ｅｅ３＿１の染色性（図２５）が大きく低下していることが見いだされ、ｅｅ３＿１タンパク質の発現またはタンパク質の安定性がｍａｐ１ｂとの相互作用に依存していることが示唆された。従って、この相互作用の阻害剤は、ｅｅ３の発現を大きく低下させるだろう。
【０２３７】
(実施態様１３)
ｅｅ３＿１検出用抗血清の調製
【０２３８】
ヒトｅｅ３＿１タンパク質のタンパク質配列をＤＮＡＳｔａｒプログラムパッケージ（Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ）のＰｒｏｔｅａｎプログラムを用い解析し、二次予測および予想された高い表面確率性と高い抗原性に基づきアミノ酸２９９〜３１５に相当する、細胞内Ｃ末端に局在するエピトープＬＨＨＥＤＮＥＥＴＥＥＴＰＶＰＥＰを選択した。キャリアタンパク質であるＫＬＨ（カサガイヘモシアニン）への特異的結合をコントロールできるようにするために、Ｎ末端にシステインを付加して前記ペプチド配列を合成した（ＣＬＨＨＥＤＮＥＥＴＥＥＴＰＶＰＥＰ）。二匹のウサギを、最適化した計画に基づいてペプチド−ＫＬＨ共役体で免疫した。ペプチド合成、続くＫＬＨ結合、および二匹のウサギの免疫はＢｉｏＴｒｅｎｄ  Ｃｈｅｍｉｋａｌｅｎ  ＧｍｂＨに依頼した。一部のウサギの免疫前血清を一次免疫の前にアッセイし、モックトンランスフェクション細胞および脳抽出物のウエスタンブロット分析でその交叉反応性を調べた。バックグランドが無視できる２匹のウサギに、初回免疫３週後に一回目のブーストを、そして４週後に二回目のブーストを行った。１週後、血液２０ｍｌをウサギから採取し、一過性にトランスフェクションした細胞（ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ−ｄｈｆｒ−）を用いたウエスタンブロット分析と、免疫細胞化学染色で血清を調べた。３回または４回目のブーストを行った後、ウサギを全採血した。
【０２３９】
両方のウサギの血清が、陽性であった。特にＡＳ４１６３抗血清は、前記２つの方法のいずれについても、各種細胞の一過性発現ヒトｅｅ３＿１タンパク質を極めて特異的に認識し、最大１：１２０００の希釈でもウエスタンブロット分析に使用できた。ＡＳ４１６３抗血清はまた、ｅｅ３＿１タンパク質、およびトランスフェクションした細胞または未変性組織に由来する、前記タンパク質と相互作用するタンパク質の免疫沈降にも好適ある。ＡＳ４１６３抗血清は、特にヒト配列とは１個のアミノ酸しか異ならない、即ちＮ３０４がセリンに突然変異しているマウスｅｅ３＿１配列内にある対応するエピトープを認識する。この様な理由から、図２２〜２４に示す様に、ＡＳ４１６２３抗血清は、野生型、トランスジェニックおよびノックアウトマウスでのｅｅ３＿１タンパク質発現の免疫組織化学分析に非常に適している。
【０２４０】
(実施態様１４)
ｅｅ３＿１は神経幹細胞により発現される
【０２４１】
神経幹細胞は４〜６週齢のオスＷｉｓｔａｒラットより、既報通り（非特許文献８９）に海馬より単離した。プロトコルは、ドイツ国内法を遵守するものである。動物を１％（ｖ／ｖ）イソフルラン、７０％Ｎ2Ｏ、２９％酸素で麻酔し、断頭して屠殺した。脳を取り出して、４．５ｇ／ｌのグルコースを含む氷冷ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）（ＤＰＳＧ／Ｇｌｃ）５０ｍｌで洗浄した。６匹の動物から海馬を調製し、１０ｍｌのＤＰＢＳ／Ｇｌｃで洗浄、４℃にて５分間１６００×ｇで遠心分離した。上清を除いた後、組織をハサミとメスで均質になるまで細かく切った。組織片をＤＰＢＳ／Ｇｌｃ媒体で洗い、８００ｇで５分間遠心分離し、沈殿を０．０１％（ｗ／ｖ）パパイン、０．１％（ｗ／ｖ）ジパーゼＩＩ（中性プロテアーゼ）、０．０１％（ｗ／ｖ）ＤＮａｓｅＩ、および１２．４ｍＭ硫酸マグネシウムのハンクス溶液（ＨＢＳＳ）に再懸濁した。ピペットチップを使って組織を粉砕し、室温で４０分間、時々溶液を攪拌しながら（１０分おき）インキュベーションした。次に懸濁液を８００×ｇ、４℃で５分間遠心分離し、沈殿を２ｍＭのＬ−グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリンおよび１００単位／ｍｌのストレプトマイシンを含むＤＭＥＭハムのＦ−１２媒体１０ｍｌで３回洗った。つぎに細胞をＢ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００単位／ｍｌペニシリンおよび１００単位／ｍｌストレプトマイシン、２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２、および２μｇ／ｍｌのヘパリンを含む神経基本培地１ｍｌに再懸濁した。これら細胞を無菌条件下に６ウエル型のプレートに、２５０００〜１０００００細胞／ｍｌの割合で接種した。プレートを３７℃、５％ＣＯ2でインキュベーションした。細胞培地は１週間に１回、培地の約２／３のみを交換するように替えた（非特許文献８９参照）。
【０２４２】
ＲＮＡを、３週間培養し、凍結保存したものを解凍した海馬幹細胞より標準的な方法（ＲＮｅａｓｙ  Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）に従い単離した。オリゴｄＴプライマーとＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ）を用いた標準的プロトコールに従って、ｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲを以下の反応パラメータを用いて行った：次のプライマーペアを用い、９４℃、１０分間の変性、９４℃３０秒、５５℃５０秒、７２℃６０秒のサイクル３０回、７２℃５分、４℃：ｅｅ３＿プラス５’−ＧＧＴＧＴＧＧＧＡＧＡＡＡＴＧＧＣＴＴＡ−３’およびｅｅ３＿マイナス５’−ＡＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＧＣＣＴＧＧＡＧＡ−３’。
【０２４３】
近年、神経疾患の進行に於ける神経細胞の新規形成（神経新生）の重要性が、認識されている。他の組織と異なり、成熟した脳の再生能は限定されており、細胞が高度に特殊化することが、破壊された組織機能を残った健康な組織でカバーする能力を著しく制限している。成人の脳の中にある前駆細胞からの神経細胞の発生は、原理的にはこれら機能を取り戻させる。
【０２４４】
神経新生は、成体脳（側脳室の吻側脳室下領域（ＳＶＺ）および歯状回（ＤＧ）内の顆粒細胞下帯（ＳＧＺ））の独立した領域内で起こっている。多くのグループが、神経新生が特に神経損傷により誘導されること（例えば脳虚血（非特許文献９０、非特許文献９１、非特許文献９２、非特許文献９３）を実証している。神経新生はヒトでも起こり（非特許文献９４）、そしてさらに機能的神経も誘導する（非特許文献９５）。歯状回の顆粒細胞下帯および門細胞は、成体では神経細胞の新規生成能を持っている（非特許文献９６）。ｅｅ３は、海馬の神経幹細胞に顕著に検出できる（図２５）。このことは、ｅｅ３が神経新生で大きな役割を果たしていることを暗示する。神経新生に於けるこの重要性は、ｅｅ３が神経変性疾患一般にとって有用であることを示す別の証拠である。
【０２４５】
脳内の内因性幹細胞に対する作用に対し、幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ操作に関するｅｅ３の治療介入（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化および増殖）がある。現在幹細胞は、様々な神経変性疾患、特にパーキンソン病や脳卒中においてその有用性が期待されている。例えばパーキンソン患者では、移植用の細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させ、注射によりドーパミン欠損を補完することが望まれている（補充療法）（非特許文献９７、非特許文献９８）。幹細胞を導入する別の可能性は、例えば脳卒中または脳障害例での動脈内または静脈内注射である（非特許文献９９、非特許文献１００、非特許文献１０１）。幹細胞治療に於けるｅｅ３について可能な別の利用は、ｅｅ３に関する作用薬または拮抗薬を一定に分泌する細胞調製であろう。
【０２４６】
(実施態様１５)
Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓおよびＤａｒｉｏ  ｒｅｒｉｏからのｅｅ３レセプターファミリーの追加関連遺伝子のクローニング
【０２４７】
本発明の相同性判定基準に基づいて、ｅｅ３タンパク質ファミリーの追加メンバーをクローニングできた。ＥＳＴデータベースを、ＴＢＬＡＳＴＮを利用してヒトｅｅ３＿１タンパク質のタンパク質配列でスクリーニングしたところ、Ｘ．ｌａｅｖｉｓ（アフリカツメガエル）およびＤ．ｒｅｒｉｏ（ゼブラフィッシュ）のＥＳＴを得た。前記ＥＴＳを標準的な方法で配列決定し、以下の配列を得た：
ｘｌ＿ｅｅ３の完全長配列（Ｘａｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）：
【０２４８】
【数２５】
2005516591.tif 000026
ｘ１＿ｅｅ３のオープンリーディングフレーム：
【０２４９】
【数２６】
2005516591.tif 000027
およびｘ１＿ｅｅ３のタンパク質配列：
【０２５０】
【数２７】
2005516591.tif 000028
Ｄ．ｒｅｒｉｏについての配列は、以下の通りであった（ｄｒ＿ｅｅ３）：
【０２５１】
【数２８】
2005516591.tif 000029
ｄｒ＿ｅｅ３のオープンリーディングフレーム：
【０２５２】
【数２９】
2005516591.tif 000030
およびｄｒ＿ｅｅ３のタンパク質配列：
【０２５３】
【数３０】
2005516591.tif 000031
図２７には、Ｘ．ｌａｅｖｉｓおよびＤ．ｒｅｒｉｏ由来の２種類のタンパク質を用いて再度ｅｅ３ファミリーの高い進化的保存性を示した。
【図面の簡単な説明】
【０２５４】
以下の図面は、本発明をより詳細に描写している：
【図１ａ】Ｅｐｏマウスの脳の転写分析例。グラフは、ＤＮＡアレイハイブリダイゼーション実験のデータを示している。ＥＰＯ−トランスジェニック動物中のシグナル（ｙ軸）は、野生型マウス内のシグナル（ｘ軸）の関数としてプロットされている。シグナルは（相対）蛍光シグナルである。対角線の上にある点は、ＥＰＯトランスジェニック動物の脳内で高い制御を受けている遺伝子産物を示す。対角線２より上に８個の陽性シグナル（野生型に比べトランスジェニック動物で２倍過剰発現している）が、観察できる。
【図１ｂ】マイクロアレイ実験の結果。ここではＥＰＯトランスジェニックマウス（右）脳内のマウスｅｅ３＿１（ｒｅｌ．：相対）誘導係数を野生型動物の脳内での誘導、即ち２回別々に行ったハイブリダイゼーション実験の誘導値の平均値に関連付けプロットしている。誘導係数１は、同腹のコントロール動物の脳内濃度に相当する。本発明の配列の発現は、約４倍高い。
【図２】ＥＰＯトランスジェニック動物での本発明のｅｅ３＿１の誘導が増加していること、およびＥＰＯトランスジェニック動物中で同様にアップレギュレーションされるアルファグロビン遺伝子産物の誘導が増加していることを示す、定量的ＰＣＲ（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）を使い行われたマウスでの実験の結果。データは、６個の脳（トランスジェニック（ｔｇ）または野生型（ｗｔ））より得たプールＲＮＡサンプルを示す。相対誘導度を、ｙ軸にプロットしている。コントロールの測定値に比べ（相対誘導度＝１）、本発明の配列は１１倍誘導度を上げている。
【図３】発生中（７、１１、１５および１７日齢胚）のマウスおよび各種成体組織（脳、心臓、肝臓、腎臓、胚、骨格筋、脾臓および精巣）に於ける本発明のｅｅ＿１の発現（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）。ｅｅ３転写物の相対量をｙ軸にプロットしている。結果は、ｅｅ３＿１がマウスの胚発生では全ての段階で、そして調べた全ての組織に於いて比較的普遍的に発現していることを示す。ＥＳＴデータによれば、ｅｅ３＿２はマウスでは、胚性腫瘍、腎臓、肝臓、Ｂ細胞、肺、乳腺および子宮で発現している。
【図４】ヒトの成人組織（心臓、脳、胎盤、胚、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓）に於ける本発明のヒトｅｅ３＿１、ｅｅ３＿２およびｅｅ３＿５の発現。データは、定量的ＰＣＲ実験による（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）。ｙ軸上にプロットされた数値は、図３の数値に対応しており、本発明のｅｅ３ファミリー遺伝子が調べた組織内で普遍的かつ同時に発現していることを示している。腎臓および膵臓でのｅｅ３ファミリーの発現増加が突出しており、一方脳および骨格筋内での発現は低い。ｅｅ３＿１およびｅｅ３＿２の発現は、実質的に同一であり、これら２種類の本発明のタンパク質が同様の機能を果たしていることが推測される。ヒトでは、以下の器官でｅｅ３＿１配列を示すＥＳＴを見いだすことができ、比較的広範囲に発現していることが示されている：脳、眼、生殖細胞、心臓、腎臓、肺、胎盤、前立腺、全胚、副腎、乳腺、結腸、胃、精巣。ｅｅ３＿２のＥＳＴはヒトでは脳、結腸、心臓、腎臓、肺、膵臓、甲状腺、前立腺、精巣、子宮、膀胱、乳腺、皮膚に見いだすことができる。
【図５】各種ヒト腫瘍細胞株に於ける本発明のヒトｅｅ３＿１の発現に関するノーザンブロットの結果。前記ノーザンブロットのハイブリダイゼーションには、ヒトｅｅ３＿１のＯＲＦを含んで成るマウスプローブを用いた（クローンテック）。本発明のヒトｅｅ３＿１のＲＮＡ転写体が、普遍的に発現していることが示された。
【図６】脳（ラット）の各領域でのｅｅ３＿１の発現。この場合も脳内の様々な領域に普遍的に分布していることが示されたが、小脳および脊髄で若干強かった。使用プローブ：マウスｅｅ３＿１。下方に負荷コントロールのエチジウムブロマイド染色ゲル像を示す。
【図７】膜貫通ドメイン（ＴＭドメイン）を特に考慮して予測した構造をベースにしたｅｅ３＿１＿ｍのタンパク質トポロジーモデル。前記モデルは、７個のＴＭドメイン（水平方向に並び描かれている）と短い細胞外Ｎ末端（ＴＭドメイン１の上に位置する）、細胞内Ｃ末端（ＴＭドメイン７の下に描かれている）を持つ典型的なＧＰＣＲタンパク質のトポロジーを示している。疎水性アミノ酸は、緑色で示した。
【図８】本発明のタンパク質ｅｅ３＿１（「ｈｕｍａｎ  ｐｒｏ：ヒトタンパク質」）、ｅｅ３＿２、およびｅｅ３＿５のタンパク質断片と当分野既知の各種ＧＰＣＲタンパク質（例えばｄｃ３２＿ｂｉｏ、ｃｃｒ５−ｈｕｍａｎまたはｄｏｐ２１＿ｈｕｍａｎ）ならび当分野既知のＧＰＣＲファミリーＡ、ＢおよびＣのコンセンサスモチーフ（図８ではｃｏｎｓ  ｆａｍＡ、ｃｏｎｓ  ｆａｍＢ）とのアラインメント。「Ｐｆａｍ」とはタンパク質ファミリーを意味し、タンパク質の集団より得たコンセンサスモチーフ群である。掲載のモチーフは、ｐｆａｍデータベースより得た。明らかにｅｅ３タンパク質の本発明のファミリーは、ファミリーＡのＧＰＣＲタンパク質と最も類似している。  既知ＧＰＣＲタンパク質と比較した場合、ヒトｅｅ３＿１およびｅｅ３＿２の次の配列部分は、本発明のタンパク質ファミリーに特に特徴的である（以下のＡＡ番号は図８の番号に対応している）：ＡＡ７５〜８５、ＡＡ１２９〜１３５（特に位置１２９および１３２のグリシンおよびセリン、位置１７４、ＡＡ１９３〜２００のグリシン（特に位置１９８のグリシン）、位置２６０と２６１のＡＡ、位置３０８のＡＡ（Ｃｙｓ）、ＡＡ３３４〜３４０、位置５３９のＡＡ（Ｈｉｓ）、位置６０８のＡＡ（Ｈｉｓ）、位置６１１のＡＡ（Ａｓｐ）、および位置６３７から始まるＣ末端配列部分全て（特に位置６４０から６５５の間に酸性モチーフを、６６６から６７０の間に塩基性モチーフ、および位置６８０から６８５の間に富プロリンモチーフを含み成る）。
【図９Ａ】翻訳領域を含んで成るｅｅ３＿ｃ１（ｅｅ３＿１）と称される本発明のマウスＤＮＡ配列（配列１）（提示の配列は全て次のように読む：左から右、上から下に連続的、即ちラインの最後はその直ぐ下、左のラインにつながっている）。開始コドンおよび停止コドンは太字で強調した。
【図９Ｂ】図９Ａの配列の一部領域医（３’非翻訳領域）である本発明の別の配列。
【図１０】同様に翻訳領域を含んで成るｅｅ３＿２と称される本発明のマウスＤＮＡ配列（配列２）。この配列領域の開始コドンおよび停止コドンは、太字で強調した。
【図１１Ａ】同様に翻訳領域を含んで成るｅｅ３＿１と称される本発明のヒトＤＮＡ配列（配列３）。この配列領域の開始コドンおよび停止コドンは、太字で強調した。さらにポリアデニル化シグナルと思われる場所も太字で強調し、下線を付けた。
【図１１Ｂ】Ｃ末端を端断した本発明のタンパク質をコードする別のＣ末端スプライス形態。開始および停止コドンを太字で強調し、さらにスプライス部位のコンセンサス配列も強調されている。
【図１１Ｃ】Ｃ末端を端断した本発明のタンパク質をコードする別のＣ末端スプライス形態。開始および停止コドンを、太字で強調している。
【図１２】同様に翻訳領域を含んで成るｅｅ３＿２と称される本発明のヒトＤＮＡ配列（配列４）。この配列領域の開始コドンおよび停止コドンは、太字で強調した（それぞれＡＴＧおよびＴＡＡ）。さらにポリアデニル化シグナルと思われる場所も、太字で強調した。図１２下部に示す配列は、配列の最初の部分に続く（最初と二番目の部分で重複する領域はイタリックで示した）。
【図１３】ｅｅ３＿１と称される、Ｎ末端からＣ末端に向かって連続して示された本発明のマウスＡＡ配列（配列５）（図９の基本のＤＮＡ配列も参照）。
【図１４】ｅｅ３＿２と称される、Ｎ末端からＣ末端に向かって連続して示された本発明のマウスＡＡ配列（配列６）（図１０の基本のＤＮＡ配列も参照）。
【図１５Ａ】ｅｅ３＿１と称される、Ｎ末端からＣ末端に向かって連続して示された本発明のヒトＡＡ配列（配列７）（図１１Ａの基本のＤＮＡ配列も参照）。
【図１５Ｂ】ｅｅ３＿１ｂ＿ｈと称される、Ｎ末端からＣ末端に向かって示された本発明のヒトＡＡ配列（配列７ｂ）（図１１Ｂの基本のＤＮＡ配列も参照）。図１５Ｂの配列は、図１１Ａに示すＤＮＡ配列の別のスプライス産物のＡＡ配列である。
【図１５Ｃ】ｅｅ３＿１ｃ＿ｈと称される、Ｎ末端からＣ末端に向かって連続して示された本発明のヒトＡＡ配列（配列７ｃ）（図１１Ｃの基本のＤＮＡ配列も参照）。図１５Ｃの配列は、図１１Ａに示すＤＮＡ配列の別のスプライス産物のＡＡ配列である。
【図１６】ｅｅ３＿２と称される、Ｎ末端からＣ末端に向かって示された本発明のヒトＡＡ配列（配列８）（図１２の基本のＤＮＡ配列も参照）。
【図１７】ｅｅ３＿５と称される、翻訳領域も含むヒトｃＤＮＡ配列（配列１０）。この配列領域内の開始コドンおよび停止コドン（それぞれＡＴＧおよびＴＡＡ）を、太字で強調している。
【図１８】ｅｅ３＿５と称される、Ｎ末端からＣ末端に向かって連続して示された本発明のヒトＡＡ配列（配列１１）（図１９の基本のＤＮＡ配列も参照）。
【図１９】エリスロポイエチン（ＥＰＯ）５０００U／体重ｋｇを腹腔内投与し、その後６時間または２４時間還流して調べた、マウス脳内ｅｅ３＿１の定量ＰＣＲの結果。ｓｉ−６−１、ｓｉ−２４−１：それぞれ６時間および２４時間後に生理食塩水を注射した動物。ｅｉ−６−１、ｅｉ−６−２：６時間後にＥＰＯを注射した動物；ｅｉ−２４−１、ｅｉ−２４−２：２４時間後にＥＰＯを注射した動物。ｅｅ３ＲＮＡ発現の増加が認められ、前記発現は時間と共に増加した。ＥＰＯ−処理動物のデータと生理食塩水処理動物のデータとの間には、統計有意差が認められた（ＡＮＯＶＡを行い、続いてニューマン−クールス多重比較試験を行った）。
【図２０】マウスの脳水平切片のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション像。放射線標識プローブ（ｅｅ３＿１．３ではＡＡＣＧＡＡＧＧＧＣＣＡＧＴＡＧＣＡＣＡＧＡＧＡＡＣＡＧＣＡＧＣＡＧＡＣＡＧＧＣＡＴＡＧＡＴＧＡＧＧ）を用いると、小脳（ｃｅ）、海馬（ｈｃ）、歯状回（ｄｇ）および皮質（ｃｏ）内、特に内側嗅領皮質（ｅｎｔ）、嗅球（ｏｌｆ）内のｅｅ３＿１の発現を視覚化することができた。対応するセンスコントロール（ｅｅ３−１．３ｓ、ＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＧＣＣＴＧＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＴＣＴＣＴＧＴＧＣＴＡＣＴＧＧＣＣＣＴＴＣＧＴＴ）では、特異的シグナルは得られなかった（未表示）。
【図２１】ｅｅ３＿１タンパク質に対するＣ末端ポリクローナル抗血清の調製方法。ａ：高い抗原性を持つカルボキシル末端上のペプチドエピトープの選択（ＣＬＨＨＥＤＮＥＥＴＥＥＴＰＶＰＥＰ）。ｂ：一過性にトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞でのｅｅ３＿１の特異的検出を示すイムノブロット。いずれの例でも、構築体Ｅｘｐ．ｅｅ３−１−ｈ−Ｎｔｅｒ−ｍｙｃがトランスフェクションされ、その結果Ｎ−末端にｍｙｃタグが融合したｅｅ３＿１タンパク質を産生するＨＥＫ２９３の溶解物が同一量用いられている。レーン１：ｍｙｃ特異的抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｉｏｍｏｌ  Ｆｅｉｎｃｈｅｍｉｋａｌｉｅｎ  ＧｍｂＨにより販売）を１：２０００に希釈し使用）を用いたＮ末端にｍｙｃタグが融合したｅｅ３＿１タンパク質の検出。レーン２〜８：各種希釈率のｅｅ３＿１特異的抗血清ＡＳ４１６３（１：５００〜１：１２０００）を用いたｅｅ３＿１の検出。この抗血清はｅｅ３＿１特異的なバンド（約３５ｋＤａ）を高感度に特異的に検出する。レーン９：対応する１：５００に希釈した免疫前の血清（ＰＩＳ）はいずれのバンドも検出しない。
【図２２】ＡＳ４１６３抗血清を用いた各種組織に於けるｅｅ３＿１の免疫組織学的検出。Ａ：体性感覚皮質内第５層神経細胞の特異的染色。Ｂ：Ａの拡大像。Ｃ：内側嗅領内の神経細胞。Ｄ：歯状回およびＣＡ３海馬域内のｅｅ３＿１の発現。Ｅ：ＣＡ３海馬域の拡大像。Ｆ：海馬でのＣＡ３とＣＡ２間境界域でのｅｅ３＿１の発現。Ｇ：プルキンエ細胞層および小脳核内の小脳特異的免疫組織染色。Ｈ：小脳内のプルキンエ細胞。Ｉ：嗅球。Ｊ：拡大像、大僧帽細胞の染色。Ｋ：網膜、網膜の神経節細胞および感覚細胞の染色。Ｌ：Ｋの拡大像。網膜の感覚細胞の染色。Ｍ：脊髄前角の大運動ニューロン内でのｅｅ３＿１の発現。Ｎ：三叉神経核の運動核に於けるｅｅ３＿１の発現。Ｏ：黒質、網様部の染色。Ｐ：黒質部の拡大像。Ｑ：肺ではｅｅ３＿１が神経外に発現している。気管支基底細胞の染色。細動脈は染色されるが、静脈は染色されない。Ｒ：典型的な肺気管支、動脈および静脈の例。Ｓ：細気管支の拡大像。特定の基底細胞での発現は詳しく画定されていない。Ｔ：細動脈壁（左上）および気管支壁（右下）部の拡大像。Ｕ：細動脈の縦断面。血管壁内の内皮細胞および個別平滑筋細胞の染色。Ｖ：平滑筋細胞および個別内皮細胞を免疫組織化学染色した細動脈切片。Ｗ：腺窩および絨毛構造を持つ小腸。ｅｅ３＿１に対する抗体による基底腺窩部の染色。絨毛内に独立した自律神経が染色されている。Ｘ：Ｗの拡大像。Ｙ：小腸壁内にある、小腸自律筋層間神経叢に属する神経繊維の例。Ｚ：皮下脂肪／結合組織内の末梢神経の断面。ＡＡ：特異的に染色された神経繊維を持つ心筋。ＢＢ：横紋筋（骨格筋）。画像中心にある免疫組織化学染色部分は、運動終盤とよく一致する。筋鞘内の個々の末梢神経繊維（右下）。
【図２３】野生型マウス脊髄（上の画像）と一過性にエリスロポイエチンを過剰発現させたマウスの脊髄［（ｔｇ６）下の画像］のｅｅ３＿１免疫組織化学染色の比較。同一染色条件に於いてより強いシグナルが、トランスジェニックマウスに見られる。この発見は、更に別の２匹のマウスでも確認された。
【図２４】マウスのｅｅ３＿１およびｍａｐｌｂの二重免疫蛍光。前記２種類のタンパク質は、ｙ２ｈシステムに於ける相互作用相手として検出された。これら２種類のタンパク質のＣＮＳ内局在は、驚くほど一致することが分かった。緑：ｅｅ３＿１染色；赤：Ｍａｐｌｂ染色；黄色：両シグナルを電子的に重ね合わせたもの。脊髄（ｓｃ）および小脳（ｃｂ）の例を示している。
【図２５】ｍａｐｌｂ遺伝子が突然変異したマウス（非特許文献１０２）の免疫組織化学染色像で、ｍａｐｌｂ−ホモ接合型ｋｏ動物では痕跡程度のｅｅ３＿１が依然見いだせることを示している。ａ：海馬、ｂ：皮質、ｃ：小脳。
【図２６】ラット海馬由来の成体神経幹細胞（ｎｓｃ）でのｅｅ３＿１のＰＣＲ。陰性レーン（Ｎ）では、シグナルは検出されない。ｅｅ３＿１は、これら神経幹細胞によって発現している。
【図２７】Ｘ．ｌａｅｖｉｓ（アフリカツメガエル）およびＤ．ｒｅｒｉｏ（ゼブラフィッシュ）の配列を考慮した、様々な種由来のｅｅ３タンパク質のタンパク質アラインメント。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２２−３】
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【図２２−４】
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【図２２−５】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年6月22日(2004.6.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能的相同誘導体も含んだ、図１３、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６または１８のいずれかによるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列。
【請求項２】
翻訳領域（大文字）に関する図９Ａ、１０、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１２および１７のいずれかの（ｃ）ＤＮＡ配列を含んで成る、請求項１に記載のＤＮＡ配列。
【請求項３】
請求項１に記載のＤＮＡ配列を含んで成る発現ベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の発現ベクターで形質転換される宿主細胞。
【請求項５】
哺乳動物細胞である、請求項４に記載の宿主細胞。
【請求項６】
ヒト細胞である、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項７】
請求項１に記載のＤＮＡ配列によりコードされる精製遺伝子産物。
【請求項８】
ポリペプチドである、請求項７に記載の精製遺伝子産物。
【請求項９】
図１３、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６および１８のいずれか、またはその一部の未変性ｅｅ３アミノ酸配列を少なくとも１つ欠いている、トランスジェニック動物。
【請求項１０】
請求項７に記載の遺伝子産物上のエピトープを認識する抗体。
【請求項１１】
モノクローナルである、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
細胞外ドメイン上の配列区分をエピトープとする、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１３】
請求項７に記載の遺伝子産物を発現する方法であって、宿主細胞を図１３、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６または１８のいずれかのポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含んで成る発現ベクターで形質転換する方法。
【請求項１４】
請求項７に記載の遺伝子産物を単離する方法であって、宿主細胞を図１３、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６または１８のいずれかのポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含んで成る発現ベクターで形質転換し、好適な発現促進条件下に培養し、続いて遺伝子産物を培養体から精製する方法。
【請求項１５】
薬物の成分となる請求項１に記載のＤＮＡ配列または請求項１に記載のＤＮＡ配列によりコードされる遺伝子産物。
【請求項１６】
請求項１に記載のＤＮＡ配列または請求項１に記載のＤＮＡ配列がコードする遺伝子産物を、治療または治療薬の調製、あるいは腫瘍症、慢性もしくは急性の低酸素症状態、心臓血管疾患、（神経）変性疾患、免疫系の疾患、特に自己免疫疾患、神経疾患の治療および治療薬の調製に利用する方法。
【請求項１７】
脳卒中、多発性硬化症、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、遺伝性運動失調症、ハンチントン病、神経障害およびてんかんを治療する、請求項１６に記載の利用方法。
【請求項１８】
ｅｅ３タンパク質の機能を変調する医薬活性化合物を同定する方法であって、
（ａ）  好適宿主細胞系を図１３、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６または１８のタンパク質をコードする発現ベクターと、適当であれば少なくとも１個のレポーター遺伝子をコードする少なくとも１種類の発現ベクターでトランスフェクションし、そして
（ｂ）  請求項７に記載の発明の遺伝子産物が仲介する機能の観察に好適なパラメータを、（ａ）で得た宿主細胞系について好適アッセイシステム内で試験化合物添加後に測定し、試験化合物を添加しないコントロールと比較する、
方法。
【請求項１９】
前記パラメータがアポトーシス、細胞成長、細胞増殖および細胞適応より成るグループから選択される細胞状態の観察に好適である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
好適な生化学または構造生物学的方法により発明のタンパク質上の医薬活性化合物結合部位を決定する段階（ｃ）を更に含んで成る、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
細胞内Ｃａ放出がアッセイ計画内の（ｂ）で測定するパラメータであることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
疾患の治療、疾患治療用薬物の調製、あるいは心筋梗塞、心不全、心筋症、心筋炎、心膜炎、筋周囲心炎、冠動脈性心疾患、中隔壁欠損を伴う先天性心臓欠損、ファロー４徴候症／５徴候症、アイゼンメンガー症候群、ショック、四肢低潅流症、動脈閉鎖症（ＡＯＤ）、末梢ＡＯＤ（ｐＡＯＤ）、頸動脈狭窄、腎動脈狭窄、小血管病、脳内出血、大脳静脈および洞血栓、血管奇形、クモ膜下出血、血管性痴呆、ビスワーグナー病、皮質下動脈硬化脳症、塞栓症時の多発性皮質梗塞、血管炎、糖尿病性腎症、各種原因による貧血の続発症状、肺繊維症、気腫、肺浮腫より成るグループから選択される慢性もしくは急性の低酸素状態が起こり得るかもしくは関係する疾患、：ＡＲＤＳ、ＩＲＤＳ、再発性肺塞栓、腫瘍症、免疫系疾患、ウイルス感染症、細菌感染、変性疾患、その他神経学疾患、筋弛緩剤、内分泌疾患および皮膚学疾患；疼痛、遺伝性疾患、心理学分野の疾患、創傷治癒、性機能の補助、心臓血管疾患、脳機能亢進、神経変性疾患、筋ジストロフィー、ウイルス感染症、腫瘍および自己免疫疾患の慢性もしくは急性状態のコントロール、または脳虚血である疾患の治療もしくは治療用薬物の調製を目的とする、ｅｅ３タンパク質の機能を変調する化合物の利用方法。
【請求項２３】
「酵母２ハイブリッド」システムを利用したｅｅ３タンパク質または誘導体の細胞相互作用相手を同定する方法。
【請求項２４】
ｅｅ３タンパク質が介在するシグナル伝達に関係する別のタンパク質を同定することを目的とする、請求項１に記載のＤＮＡ配列を利用する、または請求項１に記載のＤＮＡ配列によりコードされる遺伝子産物を利用する方法。
【国際調査報告】
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