(57)【要約】本発明は、薬物開発のための標的として腫瘍細胞の成長に不可欠な哺乳動物遺伝子を同定するための方法および試薬を提供し、この薬物は上記の遺伝子発現を阻害し、そしてそれによって腫瘍細胞の成長を阻害する。
2005516586.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞の成長を阻害する化合物を同定するための方法であって、
（ａ）該化合物の存在環境下または非存在環境下で細胞を培養するステップと、
（ｂ）表３に示される１または複数の遺伝子の発現または活性について該細胞をアッセイするステップと、
（ｃ）表３に示される少なくとも１つの遺伝子の発現または活性が、該化合物の非存在環境下よりも該化合物の存在環境下において低い場合に該化合物を同定するステップと、
を含む方法。
【請求項２】
前記細胞が腫瘍細胞であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞がヒト腫瘍細胞であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記化合物の存在環境下における細胞成長を該化合物の非存在環境下における細胞成長と比較するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記表３の細胞性遺伝子の発現が、相補的核酸とのハイブリダイゼーションによって検出されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記表３の細胞性遺伝子の発現が、免疫学的試薬を用いて検出されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記表３の細胞性遺伝子の発現が、該細胞性遺伝子の産物の活性についてアッセイすることによって検出されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
表３における細胞性遺伝子の発現が、表３における細胞性遺伝子由来のプロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む組み換え哺乳動物細胞を用いて、そして前記化合物の非存在環境下よりも該化合物の存在環境下において該レポーター遺伝子の発現の減少を検出してアッセイされることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記化合物の存在環境下および非存在環境下における細胞成長をアッセイするステップと、細胞成長および表３において同定される遺伝子を阻害する化合物を同定するステップをさらに含むことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が腫瘍細胞であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞がヒト腫瘍細胞であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記表３の細胞性遺伝子の発現が、相補的核酸とのハイブリダイゼーションによって検出されることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記表３の細胞性遺伝子の発現が、免疫学的試薬を用いて検出されることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記表３の細胞性遺伝子の発現が、該細胞性遺伝子の産物の活性についてアッセイすることによって検出されることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１、４、８または９の方法に従って同定される腫瘍細胞の成長を阻害する化合物であって、ＲＮＡ合成またはタンパク質合成のインヒビターではない化合物。
【請求項１６】
腫瘍細胞の成長を阻害する化合物を同定するための標的遺伝子であって、表３において同定される遺伝子であり、該遺伝子発現による阻害または該遺伝子の産物の活性による阻害が腫瘍細胞の成長を阻害する標的遺伝子。
【請求項１７】
腫瘍細胞の成長を阻害するための方法であって、表３における遺伝子の発現を阻害する有効量の化合物に腫瘍細胞を接触させるステップを含む方法。
【請求項１８】
腫瘍細胞の成長を阻害するための方法であって、表３における遺伝子の発現を阻害する有効量の化合物に腫瘍細胞を接触させるステップを含み、該化合物が請求項１、４、８または９の方法に従って同定される方法。
【請求項１９】
異常な細胞増殖または腫瘍細胞の成長に関連した疾患または状態の処置の有効性を評価するための方法であって、
（ａ）請求項１５に従った化合物を用いた処置の前および後に、異常な細胞増殖または腫瘍細胞の成長に関連した疾患または状態を有する動物から細胞を含む生物学的サンプルを獲得するステップと、
（ｂ）請求項１５に従った化合物を用いた処置後の表３における少なくとも１つの遺伝子の発現を請求項１５に従った化合物を用いた処置前の該遺伝子の発現と比較するステップと、
（ｃ）表３における少なくとも１つの遺伝子の発現が、処置前よりも処置後で低い場合に、該請求項１５に従った化合物を用いた処置が、異常な細胞増殖または腫瘍細胞の成長に関連した疾患または状態の処置に対する有効性を有することを決定するステップと、
を含む方法。
【請求項２０】
異常な細胞増殖または腫瘍細胞の成長に関連した疾患または状態を処置するための方法であって、該疾患または状態を有する動物に、表３における遺伝子の発現を阻害する請求項１、４、８または９の方法に従って産生される治療有効量の化合物を投与するステップを含む方法。
【請求項２１】
哺乳動物細胞において表３で同定される遺伝子の発現または活性を阻害する化合物であって、請求項１、４、８または９の方法に従って同定され、ＲＮＡ合成またはタンパク質合成のインヒビターではない化合物。
【請求項２２】
配列番号２２９〜配列番号３１４によって同定される配列のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項２３】
請求項２２に従ったペプチドのペプチド模倣物、有機模倣物または化学模倣物であって、模倣物である対象のペプチドと実質的に同じ腫瘍細胞の成長阻害活性を有する模倣物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(発明の詳細な説明)
（発明の背景）
本出願は、２００１年７月２０日に出願された、米国仮出願の出願番号６０／３０６，７３０に対する優先権を主張する。
【０００２】
本出願は、国立衛生研究所からの助成金番号Ｒ０１  ＣＡ６２０９９によって援助された。政府は、本発明において特定の権利を有し得る。
【０００３】
（１．発明の分野）
本発明は、腫瘍細胞の成長を阻害するための方法および試薬に関する。具体的には本発明は、薬物開発のための標的として腫瘍細胞の成長に不可欠な遺伝子を同定して、このような遺伝子を阻害し、それによって腫瘍成長を阻害する。本発明は、化合物をスクリーニングして上記の遺伝子のインヒビターを同定するための方法を提供し、そして上記のインヒビターを用いて腫瘍細胞の成長を阻害するための方法を提供する。本発明はまた、本発明の遺伝子抑制因子によってコードされるペプチド、ならびに腫瘍細胞の成長を阻害するためのその模倣物およびアナログを提供する。また本発明によって、１または複数の腫瘍細胞型の腫瘍細胞から調製される均一化されたランダムフラグメントのｃＤＮＡライブラリが提供され、このｃＤＮＡフラグメントは、生理学的に中性な刺激因子でのレシピエント細胞の処理によって誘導され得る。
【０００４】
（２．関連分野の概要）
ヒトゲノムのドラフト配列の完了は、当該分野で公知のヒト遺伝子および推定のヒト遺伝子の部分的リストを与え、この総数は、３０，０００と４５，０００との間であると見積もられる（Ｖｅｎｔｅｒら、２００１、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９１：１３０４〜１３５１；Ｌａｎｄｅｒら、２００１、Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：８６０〜９２１）。これらの遺伝子は、薬物に対する多くの潜在的な標的を提供し、これらのうちのいくつかは、癌の成長の妨げに有用であり得る。しかし臨床的に有用なジーンターゲティング抗癌薬の開発は、このヒト遺伝子のリストを癌の主要な特徴、すなわち制御不能な腫瘍成長に関与するものに絞る能力によって非常に容易になり得る。腫瘍細胞の成長に不可欠な遺伝子を同定し、そしてどの遺伝子が腫瘍特異的役割を果たし、そして正常な細胞成長に必要とされないかを決定することは特に有用である。これらの遺伝子は、腫瘍特異的な抗癌剤の開発に対する特に興味深い標的である。
【０００５】
先行技術における腫瘍特異的薬物ターゲティングの努力の大半は、癌遺伝子に集中しており、この機能は、異なる形態の癌に関連している（ＰｅｒｋｉｎｓおよびＳｔｅｒｎ、１９９７、ＣＡＮＣＥＲ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ  ＯＦ  ＯＮＣＯＬＯＧＹ、ＤｅＶｉｔａら編（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ）７９〜１０２頁）。癌遺伝子標的は、現在の化学療法レジメンにおいて使用される薬物によって標的される「正常な」細胞性酵素よりも「腫瘍特異的」であると当該分野において考えられている。この癌遺伝子の腫瘍特異性は、癌遺伝子に関連した遺伝子変化（例えば新生物形成細胞に特異的な突然変異またはリアレンジ）の存在によって主に示唆されていた。癌遺伝子は、突然変異されるかまたはリアレンジされる場合があるが、遺伝子産物の構造変化を伴わずに単に上昇したレベルまたは細胞周期の不適当な段階で発現される場合もある（ＰｅｒｋｉｎｓおよびＳｔｅｒｎ、１９９７、同書）。突然変異される場合でさえも、癌遺伝子によってコードされるタンパク質は、「正常な」癌原遺伝子産物に比べて質的に新規な機能を滅多に獲得しない。それ故突然変異された癌遺伝子、リアレンジされた癌遺伝子または過剰発現された癌遺伝子の産物は、その活性化された癌遺伝子産物の機能が異常に調節されることを除いて一般にはその正常な細胞相対物と同じ生化学的機能を果たす。
【０００６】
当該分野で公知のどの「古典的な」癌遺伝子も、伝統的なメカニズム依存性のスクリーニング手順によって発見される臨床的に有用な抗癌薬物に対する標的として同定されていないことは注目に値する。むしろ既知の化学療法薬物の細胞標的（例えばジヒドロ葉酸還元酵素（メトトレキサートおよび他の葉酸代謝拮抗薬によって阻害される）、トポイソメラーゼＩＩ（エピポドフィロトキシン、アントラサイクリンまたはアクリジン薬物によって「毒される」）、あるいは紡錘体を形成する微小管（ビンカアルカロイド類およびタキサンの標的））は、正常細胞および新生物形成細胞の両方の成長および増殖に不可欠である。抗癌薬物の腫瘍選択性は、それらの標的は主に増殖中の細胞において機能するという事実に単に基づくわけではなく、むしろ抗癌薬物標的の阻害に対する腫瘍特異的反応に基づくようである。例えばＳｃｏｌｎｉｃｋおよびＨａｌａｚｏｎｅｔｉｓ（２０００、Ｎａｔｕｒｅ  ４０６  ４３０〜４３５）は、高い画分の腫瘍細胞系統がＣＨＦＲと称される遺伝子において欠損されることを開示した。微小管阻害薬の存在環境下において、ＣＨＦＲは前期において細胞周期を阻止するようである。しかしＣＨＦＲ欠損腫瘍細胞は、薬物に衝撃を与えられた異常な前期に進行し（ＳｃｏｌｎｉｃｋおよびＨａｌａｚｏｎｅｔｉｓ、２０００、同書）、ここでこの細胞は、有糸分裂の終局またはアポトーシスを通じて死ぬ（ＴｏｒｒｅｓおよびＨｏｒｗｉｔｚ、１９９８、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：３６２０〜３６２６）。ＣＨＦＲに加えて、腫瘍細胞は、種々の細胞周期チェックポイント制御をしばしば欠損し、そしてこれらの欠損の利用は、実験治療における主要な傾向である（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ、１９９７、Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｒｖ．２９：１５１〜１８２；ＰｉｈａｎおよびＤｏｘｓｅｙ、１９９９、Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．９：２８９〜３０２）。しかし大半の場合において、抗癌薬物標的の阻害が腫瘍細胞において細胞死または恒久的な成長阻止を選択的に誘導する理由は未知である。従って、当該分野において腫瘍細胞におけるさらなる分子標的を同定する必要性が存在し、この阻害は、腫瘍細胞の成長を阻止する。
【０００７】
未知の遺伝子または既知の遺伝子の未知の機能を同定するための当該分野で公知の１つの方法は、本発明者らのうちの幾人かによって開発された遺伝子抑制因子テクノロジーである（米国特許第５，２１７，８８９号、同第５，６６５，５５０号、同第５，７５３，４３２号、同第５，８１１，２３４号、同第５，８６６，３２８号、同第５，９４２，３８９号、同第６，０４３，３４０号、同第６，０６０，１３４号、同第６，０８３，７４５号、同第６，０８３，７４６号、同第６，１９７，５２１号、同第６，２６８，１３４号、同第６，２８１，０１１号および同第６，３２６，４８８号（これらの各々は、その全体において参考として援用される））。遺伝子抑制因子（ＧＳＥ）は、それが由来する遺伝子の機能を妨げる生物学的に活性なｃＤＮＡフラグメントである。ＧＳＥは、遺伝子発現を阻害するアンチセンスＲＮＡ分子または機能的タンパク質ドメインに対応するペプチドをコードし得、これらは優性インヒビターとしてタンパク質機能を妨げる。生物学的に活性なＧＳＥの単離に対する一般的戦略は、標的遺伝子（単数または複数）のランダムに断片化されたＤＮＡを含む発現ライブラリの調製を含む。次いでこのライブラリは、レシピエント細胞に導入され、その後所望の表現型について選択され、そしてその選択された細胞から生物学的に活性なＧＳＥが回収される。ＧＳＥ選択に対する出発物質として１つのｃＤＮＡを用いることによって、標的遺伝子の特異的インヒビターを作製し得、そして標的タンパク質における機能的ドメインをマッピングし得る。出発物質として複数の遺伝子の混合物またはゲノム全体を用いることによって、ＧＳＥ選択により特定の細胞機能を担う遺伝子を同定し得る。なぜならこのような遺伝子は、この機能を阻害するＧＳＥを生じさせるからである。このアプローチの変形において、ライブラリ調製について使用されるベクターは、そのベクター中にクローニングされたｃＤＮＡフラグメントの調節発現を可能にする配列を含む。
【０００８】
この方法を使用して、細胞をネガティブな成長選択に供することによって腫瘍細胞の成長に必要とされる遺伝子を同定し得る。この型の選択の一例は、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）自殺選択として当該分野で公知であり、これは条件致死突然変異株（Ｓｔｅｔｔｅｎら、１９７７、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１０８：４４７〜４５２）および成長阻害ＤＮＡ配列（Ｐａｄｍａｎａｂｈａｎら、１９８７、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７：１８９４〜１８９９）を選択するために長い間使用されている。ＢｒｄＵ自殺選択の基本原理は、ＢｒｄＵの存在環境下でそのＤＮＡを複製する細胞の破壊である。ＢｒｄＵは、ＤＮＡに取り込む光活性ヌクレオチドであり、そしてヘキスト３３３４２の存在環境下において白色光を用いた照射下で致死的なＤＮＡ架橋を引き起こす。この選択を生き残る唯一の細胞は、ＢｒｄＵが存在する間にＤＮＡを複製しない細胞（例えば成長阻害遺伝子またはＧＳＥを発現する細胞）である。この方法の１つの利点は、生存細胞の極めて低いバックグラウンドである。誘導性ベクターの制御下でＧＳＥライブラリとともに使用した場合、この選択方法は、誘導性因子の存在環境または非存在環境に対するその表現型の無感受性によって、自発的に生じるＢｒｄＵ耐性変異体を排除する。この技術の別の主要な利点は、弱い成長阻害ＧＳＥに対する感受性である。少ない画分のＧＳＥ含有細胞のみが、ＧＳＥ誘導によって成長阻害される場合でさえも、このような細胞はＢｒｄＵ自殺を生き残り、そしてクローンの回収を誘発する。
【０００９】
成長阻害ＧＳＥの単離に対するこのアプローチの適用性は、ＰｅｓｔｏｖおよびＬａｕによって第一に実証された（１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１２５４９〜１２５５３）。この研究者らは、ＩＰＴＧ誘導性のプラスミド発現ベクターを用いて、Ｇ０／Ｇ１移行に関連した１９のマウス遺伝子由来のｃＤＮＡフラグメントの混合物から細胞分裂抑制性のＧＳＥを単離した。この研究において、この混合物中の遺伝子のうちの３つは、成長阻害ＧＳＥを生じさせた（ＰｅｓｔｏｖおよびＬａｕ、１９９４、同書）。引き続く研究において、Ｐｅｓｔｏｖら（１９９８、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １７：１３１８７〜３１９７）は、同じアプローチを用いて、名目上全長のマウスｃＤＮＡの４０，０００クローンのライブラリから、成長阻害活性を有する１つの全長ｃＤＮＡクローンおよび１つの短縮型ｃＤＮＡクローンを単離した。しかし、当該分野で開示される方法は、哺乳動物細胞（例えば腫瘍細胞）由来のｍＲＮＡ集団全体を表すランダムフラグメントのライブラリの形質導入について効率よく使用されることができない。なぜならこの方法は、ライブラリ構築についてプラスミド発現ベクターに頼り、そして限られた数の細胞のみが、このようなライブラリによって安定にトランスフェクトされ得るからである。
【００１０】
機能に基づいて遺伝子を同定するための方法を特に使用することによって、腫瘍細胞の成長に不可欠な新規の遺伝子および既知の遺伝子の新規の機能を発見する必要性が、当該分野において残存する。また、治療薬物処置に対する標的、特に腫瘍細胞の成長の阻害に対する標的を同定する必要性、および同定される標的を阻害し、それによって腫瘍細胞の成長を阻害する化合物を開発する必要性が当該分野において存在する。
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、腫瘍細胞の成長を阻害することによって、癌の処置についての薬物開発に対する標的である遺伝子を同定する。このような遺伝子は、インビトロで腫瘍細胞の成長を阻害する遺伝子抑制因子（ＧＳＥ）の遺伝子選択を通じて、本明細書中で開示されるように同定される。この選択は、複数の遺伝子を明らかにし、このうちのあるものは、以前に細胞増殖における役割を果たすことが公知であったが、一方他のものは、本発明前に細胞増殖に関与することが公知ではなかった。この後者の遺伝子は、新規の薬物標的を構成し、そして表３に示される。
【００１２】
第一の実施態様において、本発明は、哺乳動物細胞の成長を阻害する化合物を同定する方法を提供し、この方法は、
（ａ）この化合物の存在環境下または非存在環境下で細胞を培養するステップと、
（ｂ）表３に示される１または複数の遺伝子のサンプルにおける発現または活性についてこの細胞をアッセイするステップと、
（ｃ）表３に示される少なくとも１つの遺伝子のサンプルにおける発現または活性が、この化合物の非存在環境下よりもこの化合物の存在環境下においてより低い場合にこの化合物を同定するステップを含む。
【００１３】
好ましい実施態様において、この細胞は哺乳動物細胞であり、好ましくはヒト細胞であり、そして最も好ましくはヒト腫瘍細胞である。さらなる好ましい実施態様において、遺伝子阻害は、この遺伝子に相補的な核酸とのハイブリダイゼーション、この遺伝子の活性についての生化学的アッセイ、またはこの遺伝子産物を含む抗原に特異的な抗体との免疫学的反応によって検出される。好ましい実施態様において、この細胞は、レポーター遺伝子が表３における細胞性遺伝子由来のプロモーターに作動可能に連結された組換え細胞であり、この化合物の非存在環境下よりもこの化合物の存在環境下においてレポーター遺伝子の発現の減少を検出する。さらなる好ましい実施態様において、この細胞は、この化合物の存在環境下および非存在環境下において細胞成長についてアッセイされ、細胞成長および表３において同定される遺伝子を阻害する化合物を同定する。
【００１４】
本発明はまた、本発明の方法によって同定される腫瘍細胞の成長を阻害する化合物、およびこの化合物の薬学的処方物を提供する。本発明は特に、本発明のセンス配向された遺伝子抑制因子によってコードされるペプチドを提供する。さらに本発明は、このペプチドのいずれかのすべてまたは一部分を含むペプチド模倣物、そのペプチド模倣物、有機模倣物または化学模倣物を提供する。
【００１５】
第二の実施態様において、本発明は、異常な細胞増殖または腫瘍細胞の成長に関連した疾患または状態の処置の有効性を評価するための方法を提供し、この方法は、
（ａ）表３において同定される遺伝子の発現または活性を阻害する化合物を用いた処置の前および後に、異常な細胞増殖または腫瘍細胞の成長に関連した疾患または状態を有する動物から細胞を含む生物学的サンプルを獲得するステップと、
（ｂ）この化合物を用いた処置後の表３における少なくとも１つの遺伝子の発現または活性をこの化合物を用いた処置前の遺伝子の発現または活性と比較するステップと、
（ｃ）表３における少なくとも１つの遺伝子の発現または活性が、処置前よりも処置後で低い場合に、この化合物を用いた処置が、異常な細胞増殖または新生物形成細胞の成長に関連した疾患または状態の処置に対する有効性を有することを決定するステップを含む。好ましい実施態様において、この細胞は哺乳動物細胞であり、最も好ましくはヒト細胞であり、最も好ましくは腫瘍細胞である。
【００１６】
第三の態様において、本発明は、腫瘍細胞の成長を阻害するための方法を提供し、この方法は、腫瘍細胞を表３における遺伝子の発現を阻害する有効量の化合物と接触させるステップを含む。
【００１７】
第四の態様において、本発明は、異常な細胞増殖または腫瘍細胞の成長に関連した疾患または状態を処置するための方法を提供し、この方法は、この疾患または状態を有する動物に、表３における遺伝子の発現を阻害する治療有効量の化合物を投与するステップを含む。
【００１８】
腫瘍細胞の成長を阻害し得る治療有効量の本発明のペプチドまたはペプチド模倣物、および薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む本発明の方法に従って有効な薬学的に受容可能な組成物がまた提供される。
【００１９】
本発明の特定の好ましい実施態様は、以下の特定の好ましい実施態様のより詳細な説明、および添付の特許請求の範囲から明らかになる。
【００２０】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
本発明は、細胞成長（好ましくは腫瘍細胞の成長）に関与する標的遺伝子、これらの遺伝子の発現または活性を阻害する化合物を同定するための方法、およびこれらの遺伝子の発現または活性を阻害することによって腫瘍細胞の成長を特に阻害するための方法を提供する。好ましくは、本発明の方法は、正常な細胞成長に実質的に影響を及ぼさない。
【００２１】
本発明は、腫瘍細胞の成長に必要とされる遺伝子を同定するための方法を提供する。このような遺伝子（これは、新規の抗癌薬物に対する潜在的な標的である）は、遺伝子抑制因子（ＧＳＥ）の発現選択を通じて同定される。ＧＳＥは、生物学的に活性なセンス配向またはアンチセンス配向のｃＤＮＡフラグメントであり、これは由来する遺伝子の機能を阻害する。細胞増殖に関与する遺伝子由来のＧＳＥの発現は、細胞成長を阻害することが期待される。創意に富んだ方法に従って、このようなＧＳＥは、細胞のいわゆる「自殺選択」によって単離され、この成長は、成長している細胞を特に殺傷する細胞培養条件下で阻害される。好ましい実施態様において、この自殺選択プロトコルは、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）自殺選択であり、これにおいて細胞はＢｒｄＵとともにインキュベートされ、次いで明るい光で照らされる。成長している細胞は、ＢｒｄＵを染色体ＤＮＡに取り込み、ＤＮＡを光での照射に感受性にし、この光は成長している細胞を特に殺傷する。誘導性のレトロウイルスベクターにおけるヒトｃＤＮＡフラグメントの均一化された（重複を減少された）ライブラリから始まるＧＳＥが産生される。好ましい実施態様において、このレシピエント細胞は腫瘍細胞であり、最も好ましくはヒト腫瘍細胞（例えば乳癌細胞）である。
【００２２】
本発明の目的について、「細胞（単数）」または「細胞（複数）」への言及は等価であることが意図され、そして当該分野で公知のように成長および維持される哺乳動物細胞のインビトロ培養細胞を特に包含する。
【００２３】
本発明の目的について、複数形での「細胞性遺伝子」への言及は、１つの遺伝子ならびに２つ以上の遺伝子を包含することが意図される。当業者によって、細胞性遺伝子発現の調節の効果、すなわち細胞性遺伝子由来のプロモーターの転写制御下のレポーター構造体が、第一の遺伝子において検出され得、次いでこの効果は、第二または任意の数のさらなる遺伝子、あるいはレポーター遺伝子構造体を試験することによって追試され得ることがまた理解される。あるいは、２つ以上の遺伝子またはレポーター遺伝子構造体の発現は、本発明の範囲内において同時にアッセイされ得る。
【００２４】
組換え発現構造体は、当業者によって理解されるように、適切な哺乳動物細胞に導入され得る。この構造体の好ましい実施態様は、伝達性ベクターにおいて産生され、より好ましくはウイルスベクターであり、そして最も好ましくは当該分野で公知のようなレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターおよびワクシニアウイルスベクターである。一般的には、ＭＡＭＭＡＬＩＡＮ  ＣＥＬＬ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｂｕｔｌｅｒ編）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１、５７〜８４頁を参照のこと。
【００２５】
さらに好ましい実施態様において、本発明の組換え細胞は、腫瘍細胞のｍＲＮＡ全体からのランダムなｃＤＮＡフラグメントを含む誘導性のレトロウイルスベクターをコードする構造体を含み、ここでこのフラグメントは、各々誘導性プロモーターの転写制御下にある。より好ましい実施態様において、この誘導性プロモーターは、効果が誘導因子によって調節され得るトランス作用因子に反応する。この誘導因子は、実験的に操作され得る任意の因子（温度、および最も好ましくは誘導因子の存在環境または非存在環境を含む）であり得る。好ましくは、この誘導因子は化学化合物であり、最も好ましくは、トランス作用因子に特異的な生理学的に中性の化合物である。本明細書中に開示されるような誘導性プロモーターを含む構造体の使用において、この組換え発現構造体からのランダムなｃＤＮＡフラグメントの発現は、誘導性プロモーターから転写を誘導する誘導因子と組換え細胞を接触させること、またはこのようなプロモーターから転写を阻害する因子を除去することによって媒介される。種々の誘導性プロモーターおよび同族のトランス作用因子が先行技術で公知であり、細胞培養の温度を上昇させることによって活性化され得る熱ショックプロモーター、ならびにより好ましくはプロモーター／因子対（例えばｔｅｔプロモーターおよび哺乳動物転写因子とのその融合）（米国特許第５，６５４，１６８号、同第５，８５１，７９６号および同第５，９６８，７７３号において開示されるような）、ならびにラクトースオペロンの細菌性ｌａｃプロモーターおよびその同族のｌａｃＩリプレッサータンパク質を含む。好ましい実施態様において、この組換え細胞は、ｌａｃＩリプレッサータンパク質およびランダムなｃＤＮＡフラグメントをコードする組換え発現構造体を、１または多数のｌａｃ反応性因子を含むプロモーターの制御下で発現し、ここでこのフラグメントの発現は、細胞を生理学的に中性の誘導因子であるイソプロピルチオ−β−ガラクトシドに接触させることによって誘導され得る。この好ましい実施態様において、このｌａｃＩリプレッサーは、３’ＳＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡから市販される）として同定される組換え発現構造体によってコードされる。
【００２６】
本発明はまた、成長阻害ＧＳＥの選択に適切なレシピエント細胞系統を提供する。好ましい実施態様において、この細胞系統は、トランス作用因子（例えばｌａｃリプレッサー）を含むように、そしてライブラリが構築されるレトロウイルスベクターの親和性と同族のレトロウイルスレセプターをさらに発現するように改変されたヒト乳癌細胞、ヒト肺癌細胞、ヒト結腸癌細胞およびヒト前立腺癌細胞である。好ましい実施態様において、この細胞は、細菌性のｌａｃオペロンリプレッサーであるｌａｃＩを発現するように（ＩＰＴＧ誘導性の遺伝子発現を可能にするため）、そして同種指向性のマウスレトロウイルスレセプターを発現するように（同種指向性の組換えレトロウイルスでの高効率の感染を可能にするため）改変される。別の好ましい実施態様において、この細胞は、ｌａｃＩおよびマウスの同種指向性レトロウイルスレセプターを発現するように改変されている、テロメラーゼを不死化された正常なヒト線維芽細胞、ならびに網膜色素上皮細胞および乳房上皮細胞である。
【００２７】
本発明は、腫瘍細胞の成長を制御する遺伝子を同定するための遺伝子抑制因子（ＧＳＥ）を産生する方法の改変を利用する。これらのＤＮＡフラグメントは、本明細書中で「ＧＳＥ」と称されて、細胞中で発現される場合に標的遺伝子の機能を阻害または改変し得るセンス配向およびアンチセンス配向の遺伝子フラグメントの両方を意味する。両方の型の機能的ＧＳＥは、標的遺伝子のＤＮＡのランダムな断片化によって作製され得、そして所望の細胞表現型（例えば細胞成長阻害）を与えるフラグメントの機能ベースの選択によって同定され得る。このような機能ベースのＧＳＥ選択は、選択された標的に対する遺伝子インヒビターを開発し得、タンパク質の機能的ドメインを同定し得、そして種々の複雑な表現型に関与する遺伝子を同定し得る。
【００２８】
ＧＳＥ選択の一般化概要は、図１に示される。本来モデル細菌系を用いて開発されたが（参考として援用される米国特許第５，２１７，８８９号を参照のこと）、この方法は、哺乳動物細胞における使用に適応されている。代表的なｃＤＮＡ由来のランダムフラグメントの１％未満がＧＳＥ活性を有するので、ＧＳＥ選択に必要とされる発現ライブラリのサイズは、全長ｃＤＮＡの機能ベースの選択について使用され得る対応するサイズのライブラリよりも大きい。レトロウイルスベクターが使用されて、このような大きなライブラリを哺乳動物細胞に送達する。なぜならこれは、極めて高い画分（１００％まで）のレシピエント細胞への安定な形質導入について必要とされ得るストレスのない送達系だからである。これらのレトロウイルスベースのライブラリの調製において、パッケージング細胞系統が使用され（最も好ましくはヒト２９３ベースのパッケージング細胞系統（例えばＢＯＳＣ２３）（Ｐｅａｒら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：８３９２〜８３９６））、これは、一過性のトランスフェクション後に効率的かつ均質なレトロウイルスパッケージングを提供する（ＧｕｄｋｏｖおよびＲｏｎｉｎｓｏｎ、１９９７、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ：ｃＤＮＡ  ＬＩＢＲＡＲＹ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ、ＣｏｗｅｌｌおよびＡｕｓｔｉｎ編（Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）、２２１〜２４０頁）。さらに、大規模な発現選択は、従来のレトロウイルスベクターにおける改変を必要とした。本発明の均一化された腫瘍ライブラリを産生するために使用されるレトロウイルスベクターは、１つの構成的発現プロモーターおよび１つの誘導性プロモーターを保有し、これは、非誘導性条件下でのプロモーター衝突の問題を最小限にする。本発明の改変レトロウイルスベクターの好ましい実施態様は、レトロウイルス中のＬＴＲプロモーターから細菌性ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ、哺乳動物細胞においてＧ４１８を用いて選択可能）を発現する。このベクターはまた、選択可能なマーカー遺伝子に対して３’かつ２〜４の細菌性ｌａｃオペレーター配列を含むサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のＬＴＲ由来のプロモーターを含む調節可能なプロモーターの近傍にマルチプルクローニング部位を含む。この調節可能なプロモーターは、レトロウイルスＬＴＲに対してアンチ配向にクローニングされる。これらのウイルスのうちの１つであるＬＮＸＣＯ３の機構の図は、図２に示される。別の実施態様において、このｎｅｏ遺伝子は、グリーン蛍光タンパク質をコードする遺伝子（Ｋａｎｄｅｌら、１９９７、Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．２３：３２５〜３４０）またはホタルルシフェラーゼをコードする遺伝子（Ｃｈａｎｇら、１９９９、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８：４８０８〜４８１８）に交換される。成長阻害に対するポジティブコントロールとして、ヒトｐ２１（腫瘍細胞の成長を強力に阻害することが公知のＣＤＫインヒビター）を発現するＬＮＸＣＯ３の実施態様を使用した（参考として援用される国際特許出願、公開番号ＷＯ０１／３８５３２を参照のこと）。
【００２９】
本発明は、異なる型の癌由来の１または多数のヒト細胞系統由来のポリ（Ａ）＋  ＲＮＡ調製物の混合物からの均一化されたｃＤＮＡフラグメントライブラリを提供する。この均一化されたライブラリは、ベクター、好ましくはレトロウイルスベクター、そして最も好ましくはそのベクター中にクローニングされたｃＤＮＡフラグメントの調節発現を可能にする配列を含むレトロウイルスベクターにおいて調製される。好ましい実施態様において、このベクターは、レトロウイルスベクターＬＮＸＣＯ３であり、これはイソプロピル−β−チオ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）（生理学的に中性の因子）によって誘導性のプロモーターを含む。
【００３０】
本発明は、均一化されたｃＤＮＡフラグメントライブラリ（ヒト腫瘍細胞において発現される遺伝子の大半を表す）から成長阻害ＧＳＥを単離するための方法を提供する。本発明の方法とともに提供されるような均一化されたｃＤＮＡフラグメントライブラリは、５×１０７オーダーでクローンを含み（Ｇｕｄｋｏｖら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３６４４〜３７４８；Ｌｅｖｅｎｓｏｎら、１９９９、Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．２５：９〜２６）、これは１つの遺伝子当たり１，０００を超えるｃＤＮＡフラグメントに対応する。このサイズのライブラリからの個々のＧＳＥの選択は、高い感受性および低いバックグラウンドを有する手順、最も好ましくはＢｒｄＵ自殺選択を必要とする。ＢｒｄＵ自殺選択の原理は、図３に例示される。好ましい実施態様において、ＧＳＥは、成長のインヒビターがＢｒｄＵの添加前に誘導されるならば、誘導性プロモーター、最も好ましくは生理学的に中性の因子（例えばＩＰＴＧ）によって誘導され得るプロモーターの制御下で発現される。ＢｒｄＵ選択後、この誘導物質は培養細胞から洗い流され、そして成長阻害ＧＳＥで感染された細胞は増殖し始め、従って選択されたＧＳＥを有する細胞のコロニーを提供する。
【００３１】
ＢｒｄＵ自殺は、成長阻害遺伝子、すなわちＧＳＥを選択するために使用され得る唯一の技術ではない。１つの別のアプローチにおいて、細胞は、細胞膜に組み込まれ、そして各回の細胞分裂で娘細胞間に再分配される蛍光染料で標識される。結果として、標識後に最も少ない回数分裂した細胞は、最も高い蛍光を示し、そしてＦＡＣＳによって単離され得る（Ｍａｉｎｅｓら、１９９５、Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．６：６６５〜６７１）。ＤＮＡ結合性の蛍光染料での染色の変更に基づいて、浮遊する死細胞を回収するか、またはアポトーシス細胞を単離することによって、誘導物質の添加の際に死ぬ細胞を単離することがまた可能である。これらの方法が使用されて、ＭＤＲ１遺伝子（Ｚｕｈｎ、１９９６、Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ  ａｔ  Ｃｈｉｃａｇｏ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）またはＢＣＬ２（参考として援用される米国特許第５，７８９，３８９号）から調製される１遺伝子のｃＤＮＡフラグメントライブラリからＧＳＥを単離している。これらのアプローチのいずれかに理論上の問題は存在せず、そしてこれらのすべては、低い複雑性のライブラリにおいて成長阻害因子を富化するように働く。ＢｒｄＵ選択と比較した場合のこれらの代案の唯一の不都合は、極めて複雑な均一化ライブラリから選択されるべき珍しいクローンを妨げ得るより高い自発的なバックグラウンド比率を有することである。従って、ＢｒｄＵ選択は、本発明の方法の好ましい実施態様である。
【００３２】
成長阻害ＧＳＥを同定するようにＧＳＥテクノロジーを適応させるための先行技術の方法（ＰｅｓｔｏｖおよびＬａｕ、１９９４、同書）は、腫瘍細胞のｃＤＮＡ全体に適用する場合に有用性が限定された。この先行技術の方法は、哺乳動物細胞（例えば腫瘍細胞）由来のｍＲＮＡ集団全体を表すライブラリの形質導入について効果的に使用されることができない。なぜならこの方法は、ライブラリ構築についてプラスミド発現ベクターに頼り、そして限られた数の細胞のみが、このようなライブラリによって安定にトランスフェクトされ得るからである。この制約を克服するために、本発明は、細菌性ＬａｃＩリプレッサーを通じてＩＰＴＧによって調節される一組の誘導性のレトロウイルスベクターを提供する。この誘導系は、大半の感染細胞の間で遜色のないレベルの誘導を提供する。この誘導されたレベルの発現は、異なる用量のＩＰＴＧを使用することによって精密に調節され得る。
【００３３】
本発明の方法は、本明細書中においてこのＩＰＴＧ誘導性のレトロウイルス系の使用によって例示されて、ヒト乳癌細胞から均一化されたｃＤＮＡライブラリを作製する。このライブラリを使用して、乳癌細胞系統における成長阻止を誘導するＧＳＥを選択した。このアプローチを使用して、ＢｒｄＵ自殺選択によって富化された９０を超える遺伝子が同定された。これらのＧＳＥの多くは、腫瘍細胞に再導入された場合に成長阻害効果を有することを示した。創意に富んだ方法を使用して同定される遺伝子に含まれるのは、公知の癌遺伝子であり、このうちのいくつかは、乳癌、ならびに細胞増殖における公知の役割を有する他の遺伝子に特に関連している。しかしこの同定された遺伝子の多くは、公知の機能を有さないか、または細胞周期の進行における役割を果たすことが以前に公知ではなかった。従ってこの後者の遺伝子およびその産物は、癌の処置についての新規の標的を表す。さらに、乳癌細胞の増殖を阻害したＧＳＥを生じさせる遺伝子のいくつかは、正常な細胞成長に不可欠ではないようである。なぜなら、これらの遺伝子のホモ接合ノックアウトは、成熟マウスの発育を妨げないからである。
【００３４】
本発明は、ＧＳＥライブラリおよび本発明のネガティブ成長選択方法を使用して同定されるＧＳＥに対応する遺伝子発現または遺伝子産物の活性を測定するための方法を提供する。本発明の方法のこの態様の実施において、遺伝子発現または遺伝子産物の活性は、化合物の存在環境下または非存在環境下で細胞においてアッセイされて、この化合物がこのような遺伝子または遺伝子産物の発現または活性を阻害するか否かを決定する。好ましい実施態様において、遺伝子発現は、当該分野で公知の任意の技術を用いて（例えば検出可能に標識されたプローブを用いた細胞性ｍＲＮＡとのノーザンブロットハイブリダイゼーションの比較（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｔｒｏｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎ．Ｙ．に開示されるように））、あるいはインビトロ増幅方法（例えば、Ｎｏｏｎａｎら（１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：７１６０〜７１６４）によって開示されるような定量的逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイ）、またはこの遺伝子産物に特異的な抗体を用いたウエスタンブロッティング（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１、同書）によってアッセイされる。遺伝子産物の活性は、各々の遺伝子産物に特異的なアッセイ（例えばこの遺伝子産物に特異的な抗体を用いたイムノアッセイ、または遺伝子産物機能の生化学的アッセイ）を用いてアッセイされる。
【００３５】
あるいは、遺伝子発現は、ＧＳＥライブラリおよび本発明のネガティブ成長選択方法を用いて同定されるＧＳＥに対応する遺伝子由来のプロモーターを有する組換え発現構造体を用いてアッセイされ、ここでこのプロモーターは、レポーター遺伝子に作動可能に連結される。次いでこのレポーター遺伝子は、遺伝子発現に対する試験化合物の効果の敏感かつ簡便な指標として使用され、そして細胞、好ましくは腫瘍細胞の成長に必要とされる遺伝子の発現または活性を阻害する化合物が容易に同定されることを可能にする。これらの構造体に対する宿主細胞は、対応する成長促進遺伝子を発現する任意の細胞を有する。本発明のこの態様の実施に有用なレポーター遺伝子としては、ホタルルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａ（ウミシイタケ）ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、グリーン蛍光タンパク質およびアルカリホスファターゼが挙げられるがこれらに限定されない。
【００３６】
本発明は、本明細書中に開示されるＧＳＥネガティブな成長選択方法を使用して同定されている本発明のＧＳＥのいくつかによってコードされるペプチドを提供する。このようなペプチドは、表５および配列番号２２９〜３１４として配列表に示される。これらのペプチドのあるものは、細胞増殖における役割を果たすことが以前に公知であったタンパク質由来であり、そして他のものは、本発明においてこのような役割を最初に特定されたタンパク質由来である。しかし、あらゆる同定されたペプチドは、腫瘍細胞増殖の新規のインヒビターである。また、当業者の理解内での関連化合物（例えば化学模倣物、有機模倣物またはペプチド模倣物）が提供される。本明細書中で使用される場合、用語「模倣物」、「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｅｔｉｃ）」、「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）」、「有機模倣物」および「化学模倣物」は、ペプチド誘導体、ペプチドアナログ、および原子配置が、本発明のＧＳＥによってコードされるペプチドの配向と等しい３次元配向である化学化合物を包含することが意図される。本明細書中で使用されるような句「〜に等しい」は、このペプチドにおいて特定の原子または化学部分の置換を有する化合物を包含することが意図され、この部分は、模倣化合物においてこの原子および部分の同じまたは十分に類似の配置または配向を生じる結合長、結合角およびその配置を有し、本発明のＧＳＥのペプチドの生物学的機能を有することが理解される。本発明のペプチド模倣物において、化学成分の３次元配置は、ペプチド骨格およびこのペプチドにおける成分のアミノ酸側鎖の３次元配置と構造的および／または機能的に等しく、実質的な生物学的活性を有する本発明のペプチドのこのようなペプチド模倣物、有機模倣物および化学模倣物をもたらす。これらの用語は、例えば本明細書中で参考として援用されるＦａｕｃｈｅｒｅ、１９８６、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．１５：２９；ＶｅｂｅｒおよびＦｒｅｉｄｉｎｇｅｒ、１９８５、ＴＩＮＳ  ３９２頁；ならびにＥｖａｎｓら、１９８７、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９によって例示されるように、当該分野における理解に従って使用される。
【００３７】
ファーマコフォアが、本発明の各々のペプチドＧＳＥの生物学的活性について存在することが理解される。ファーマコフォアは、生物学的活性に対する構造的要件の理想化された３次元定義を含むとして当該分野で理解される。ペプチド模倣物、有機模倣物および化学模倣物は、現行のコンピュータモデリングソフトウェアを用いて各々のファーマコフォアを適合するように設計され得る（コンピュータ支援薬物設計）。このような模倣物は、本発明のペプチドＧＳＥにおける置換原子からの位置情報に基づいた構造−機能分析によって産生される。
【００３８】
本発明によって提供されるようなペプチドは、当該分野で公知の化学合成技術（特に、例えば市販の自動ペプチド合成機を用いた固相合成技術）のいずれかによって有利に合成され得る。本発明の模倣物は、ペプチド合成について簡便に使用される固相法または液相法によって合成され得る（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、１９６３、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９〜５４；Ｃａｒｐｉｎｏ、１９７３、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．６：１９１〜９８；Ｂｉｒｒ、１９７８、ＡＳＰＥＣＴ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＭＥＲＲＩＦＩＥＬＤ  ＰＥＰＴＩＤＥ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ：Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；ＴＨＥ  ＰＥＰＴＩＤＥＳ：ＡＮＡＬＹＳＩＳ、ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ、ＢＩＯＬＯＧＹ、第１、２、３、５巻（ＧｒｏｓｓおよびＭｅｉｎｈｏｆｅｒ編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７９；Ｓｔｅｗａｒｔら、１９８４、ＳＯＬＩＤ  ＰＨＡＳＥ  ＰＥＰＴＩＤＥ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ、第２版、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．：Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．；Ｋｅｎｔ、１９８８、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：９５７〜８９；ならびにＧｒｅｇｇら、１９９０、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．５５：１６１〜２１４（これらは本明細書中でその全体において参考として援用される）を参照のこと）。
【００３９】
固相法論の使用が好ましい。手短に言えば、Ｎ保護されたＣ末端アミノ酸残基が、不溶性支持体（例えばジビニルベンゼン架橋ポリスチレン、ポリアクリルアミド樹脂、キーゼルグール／ポリアミド（ｐｅｐｓｙｎ  Ｋ）、ＣＰＧ、セルロース、ポリプロピレン膜、アクリル酸コートポリエチレンロッドなど）に結合される。脱保護、中和および逐次保護されるアミノ酸誘導体の結合のサイクルが使用されて、アミノ酸配列に従ってＣ末端からアミノ酸を結合する。いくつかの合成ペプチドについて、酸感受性樹脂を使用するＦＭＯＣ戦略が使用され得る。この点で好ましい固体支持体は、ジビニルベンゼン架橋ポリスチレン樹脂であり、これは、種々の機能的形態（クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、パラアセトアミドメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン（ＢＨＡ）樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）樹脂、オキシム樹脂、４−アルコキシベンジルアルコール樹脂（Ｗａｎｇ樹脂）、４−（２’，４’−ジメトキシフェニルアミノメチル）−フェノキシメチル樹脂、２，４−ジメトキシベンズヒドリル−アミン樹脂および４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ＦＭＯＣ−アミノ−メチル）−フェノキシアセトアミドノルロイシル−ＭＢＨＡ樹脂（ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂）を含む）で市販される。さらに、酸感受性樹脂はまた、所望であればＣ末端酸を提供する。αアミノ酸について特に好ましい保護基は、塩基不安定性の９−フルオレニルメトキシ−カルボニル（ＦＭＯＣ）である。
【００４０】
ＢＯＣ（ｔ−ブチルオキシカルボニル）基およびＦＭＯＣ基と化学的に適合性のアミノ酸の側鎖官能基に適切な保護基は、当該分野で周知である。ＦＭＯＣ化学を使用する場合、以下の保護アミノ酸誘導体が好ましい：ＦＭＯＣ−Ｃｙｓ（Ｔｒｉｔ）、ＦＭＯＣ−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）、ＦＭＯＣ−Ａｓｎ（Ｔｒｉｔ）、ＦＭＯＣ−Ｌｅｕ、ＦＭＯＣ−Ｔｈｒ（Ｔｒｉｔ）、ＦＭＯＣ−Ｖａｌ、ＦＭＯＣ−Ｇｌｙ、ＦＭＯＣ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、ＦＭＯＣ−Ｇｌｎ（Ｔｒｉｔ）、ＦＭＯＣ−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）、ＦＭＯＣ−Ｈｉｓ（Ｔｒｉｔ）、ＦＭＯＣ−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）、ＦＭＯＣ−Ａｒｇ（ＰＭＣ（２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル））、ＦＭＯＣ−Ａｒｇ（ＢＯＣ）２、ＦＭＯＣ−ＰｒｏおよびＦＭＯＣ−Ｔｒｐ（ＢＯＣ）。このアミノ酸残基は、当該分野で公知の種々の結合剤および結合化学を用いることによって（例えば、ＤＩＣ（ジイソプロピル−カルボジイミド）、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）、ＢＯＰ（ベンゾトリアゾリル−Ｎ−オキシトリスジメチルアミノホスホニウムヘキサ−フルオロホスフェート）、ＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロ−ホスフェート）、ＰｙＢｒＯＰ（ブロモ−トリス−ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）との直接結合；等方性無水物の能力を介した結合；活性エステル（例えばペンタフルオロフェニルエステル）を介した結合；またはＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）活性エステルの能力を介した結合）、またはＦＭＯＣ−アミノ酸フッ化物および塩化物を用いることによって、あるいはＦＭＯＣ−アミノ酸−Ｎ−カルボキシ無水物を用いることによって結合され得る。ＨＯＢｔまたはＨＯＡｔ（７−アザヒドロキシベンゾトリアゾール）の存在環境下におけるＨＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル），１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）またはＨＡＴＵ（２−（１Ｈ−７−アザ−ベンゾトリアゾール−１−イル），１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）との活性化が好ましい。
【００４１】
固相法は手動で行われ得るが、市販のペプチド合成機（例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３１Ａなど；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）での自動合成が好ましい。代表的な合成において、第一の（Ｃ末端の）アミノ酸が、クロロトリチル樹脂上にセットされる。ＡＢＩ  ＦａｓｔＭｏｃプロトコル（ＡＢＩユーザー広報３２および３３、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従った逐次の脱保護（２０％  ピペリジン／ＮＭＰ（Ｎ−メチルピロリドンを用いて））および結合サイクルが使用されて、ペプチド配列全体を確立する。無水酢酸によるキャッピングを用いた二重結合および三重結合がまた使用され得る。
【００４２】
合成の模倣ペプチドは、樹脂から開裂され、そして適切なスカベンジャーを含むＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）での処理によって脱保護される。多くのこのような開裂試薬（例えばＲｅａｇｅｎｔ  Ｋ（０．７５ｇ  結晶性フェノール、０．２５ｍＬ  エタンジチオール、０．５ｍＬ  チオアニソール、０．５ｍＬ  脱イオン水、１０ｍＬ  ＴＦＡ）および他の試薬が使用され得る。ペプチドは、濾過によって樹脂から分離され、そしてエーテル沈殿によって単離される。さらなる精製は、従来方法（例えばゲル濾過および逆相ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー））によって達成され得る。本発明に従った合成カルシトニン模倣物は、薬学的に受容可能な塩（特に有機塩基および無機塩基の塩を有する塩基付加塩）の形態にあり得る。酸性アミノ酸残基の塩基付加塩は、当業者に周知の手順に従って適切な塩基または無機塩基とのペプチドの処理によって調製されるか、あるいはこの所望の塩は、適切な塩基からの凍結乾燥によって直接得られ得る。
【００４３】
一般に当業者は、本明細書中に記載されるようなペプチドは、種々の化学技術によって改変されて、未改変ペプチドと本質的に同じ活性を有する化合物および必要に応じて他の所望の性質を有する化合物を産生し得ることを認識する。例えば、ペプチドのカルボン酸基は、薬学的に受容可能な陽イオンの塩の形態で提供され得る。ペプチド内のアミノ基は、薬学的に受容可能な酸付加塩（例えばＨＣｌ塩、ＨＢｒ塩、酢酸塩、安息香酸塩、トルエンスルホン酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩および他の有機塩）の形態であり得るか、またはアミドに転換され得る。チオールは、多くの十分に認識された保護基のうちのいずれか１つ（例えばアセトアミド基）で保護され得る。当業者はまた、環状構造を本発明のペプチドに導入するための方法を認識し、その結果、ネイティブの結合構成がより近づけられる。例えば、カルボキシル末端またはアミノ末端のシステイン残基がペプチドに付加され得、その結果、酸化される場合にこのペプチドはジスルフィド結合を含み、それによって環状ペプチドを作製する。他のペプチド環化方法は、チオエーテル、ならびにカルボキシル末端およびアミノ末端のアミドおよびエステルの形成を有する。
【００４４】
特に、種々の技術が、対応するペプチド化合物と同じまたは類似の所望の生物学的活性を有するペプチド誘導体およびアナログの構築に利用されるが、溶解度、安定性ならびに加水分解およびタンパク質分解に対する感受性に関してこのペプチドよりも有利な活性を有するペプチド誘導体およびアナログの構築に利用される。このような誘導体およびアナログは、Ｎ末端アミノ基、Ｃ末端カルボキシル基で改変されたペプチドおよび／またはこのペプチド内の１以上のアミド結合を非アミド結合に変化させるペプチドを有する。２つ以上のこのような改変が、１つのペプチド模倣物構造において連結され得ることが理解される（例えばＣ末端カルボキシル基での改変、およびこのペプチド内の２つのアミノ酸間への−ＣＨ２−カルバメート結合の包含）。
【００４５】
アミノ末端改変は、アルキル化、アセチル化、カルボベンゾイル基の付加およびスクシンイミド基の形成を有する。具体的には、次いでＮ末端アミノ基が、式ＲＣ（Ｏ）ＮＨ――（ここでＲはアルキル、好ましくは低級アルキルである）のアミド基を形成するように反応され得、そして酸ハロゲン化物、ＲＣ（Ｏ）Ｃｌまたは酸無水物との反応によって付加される。代表的には、この反応は、およそ等モルまたは過剰量（例えばおよそ５当量）の酸ハロゲン化物を、好ましくは過剰（例えばおよそ１０当量）の第三級アミン（例えばジイソプロピルエチルアミン）を含む不活性希釈剤（例えばジクロロメタン）におけるペプチドと接触させて、反応中に生成された酸を捕獲することによって行われ得る。反応条件は、他の点では従来通りである（例えば室温で３０分間）。低級アルキルのＮ置換を提供するための末端アミノのアルキル化、その後の上記のような酸ハロゲン化物との反応は、式ＲＣ（Ｏ）ＮＲ−のＮ−アルキルアミド基を提供する。あるいは、このアミノ末端は、無水コハク酸との反応によってスクシンイミド基に共有結合され得る。およそ等モル量または過剰の無水コハク酸（例えばおよそ５当量）が使用され、そして末端のアミノ基は、Ｗｏｌｌｅｎｂｅｒｇら、米国特許第４，６１２，１３２号（本明細書中でその全体において参考として援用される）に記載されるように、適切な不活性溶媒（例えばジクロロメタン）における過剰（例えば１０当量）の第三級アミン（例えばジイソプロピルエチルアミン）の使用を含む当該分野で周知の方法によってスクシンイミドに転換される。コハク酸基が、例えばＣ２〜Ｃ６−アルキル置換基または――ＳＲ置換基で置換され得、これらは、従来様式で調製されて、このペプチドのＮ末端で置換スクシンイミドを提供することがまた理解される。このようなアルキル置換基は、Ｗｏｌｌｅｎｂｅｒｇら（上記）によって記載される様式において、低級オレフィン（Ｃ２〜Ｃ６−アルキル）を無水マレイン酸と反応させることによって調製され、そして――ＳＲ置換基は、ＲＳＨを無水マレイン酸と反応させることによって調製される（ここでＲは上記で規定される通りである）。別の有利な実施態様において、このアミノ末端は、ベンジルオキシカルボニル−ＮＨ−基または置換ベンジルオキシカルボニル−ＮＨ――基を形成するように誘導体化される。この誘導体は、好ましくは第三級アミンを含む適切な不活性希釈剤（例えばジクロロメタン）におけるおよそ等量または過剰のベンジルオキシカルボニルクロリド（ＣＢＺ−Ｃｌ）または置換ＣＢＺ−Ｃｌと反応させて、反応中に生成された酸を捕獲することによって産生される。なお別の誘導体において、このＮ末端は、適切な不活性希釈剤（ジクロロメタン）における等量または過剰（例えば５当量）のＲ――Ｓ（Ｏ）２Ｃｌとの反応によってスルホンアミド基を含み、末端のアミンをスルホンアミドに転換する（ここでＲはアルキルおよび好ましくは低級アルキルである）。好ましくは、この不活性希釈剤は、過剰（例えば１０当量）の第三級アミン（例えばジイソプロピルエチルアミン）を含み、反応中に産生された酸を捕獲する。反応条件は、他の点では従来通りである（例えば室温で３０分間）。カルバメート基は、適切な不活性希釈剤（例えばジクロロメタン）における等量または過剰（例えば５当量）のＲ――ＯＣ（Ｏ）ＣｌまたはＲ――ＯＣ（Ｏ）ＯＣ６Ｈ４――ｐ――ＮＯ２との反応によってアミノ末端で産生されて、末端のアミンをカルバメートに転換する（ここでＲはアルキル、好ましくは低級アルキルである）。好ましくは、この不活性希釈剤は、過剰（例えばおよそ１０当量）の第三級アミン（例えばジイソプロピルエチルアミン）を含み、反応中に産生された任意の酸を捕獲する。反応条件は、他の点では従来通りである（例えば室温で３０分間）。尿素基は、適切な不活性希釈剤（例えばジクロロメタン）における等量または過剰（例えば５当量）のＲ――Ｎ＝Ｃ＝Ｏとの反応によってアミノ末端で形成されて、末端のアミンを尿素（すなわちＲＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ――）基に転換する（ここでＲは上記で規定される通りである）。好ましくは、この不活性希釈剤は、過剰（例えばおよそ１０当量）の第三級アミン（例えばジイソプロピルエチルアミン）を含む。反応条件は、他の点では従来通りである（例えば室温でおよそ３０分間）。
【００４６】
Ｃ末端のカルボキシル基がエステル（例えば――Ｃ（Ｏ）ＯＲ（ここでＲはアルキルおよび好ましくは低級アルキルである））によって置換される場合のペプチド模倣物の調製において、ペプチド酸を調製するように使用される樹脂が利用され、そして側鎖保護ペプチドが、塩基および適切なアルコール（例えばメタノール）を用いて開裂される。次いで側鎖保護基は、フッ化水素での処理による慣例方法において除去され、所望のエステルを獲得する。Ｃ末端のカルボキシル基がアミド、――Ｃ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ４によって置換される場合のペプチド模倣物の調製において、ベンズヒドリルアミン樹脂が、ペプチド合成についての固体支持体として使用される。合成の完了の際に、この支持体からペプチドを解放するためのフッ化水素処理は、遊離のペプチドアミド（すなわちＣ末端が――Ｃ（Ｏ）ＮＨ２である）を直接生じる。あるいは、側鎖保護ペプチドを支持体から開裂するためのアンモニアを用いた反応と連結されたペプチド合成の間のクロロメチル化樹脂の使用は、遊離のペプチドアミドを生じ、そしてアルキルアミンまたはジアルキルアミンを用いた反応は、側鎖保護アルキルアミドまたはジアルキルアミド（すなわちＣ末端が――Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ１である（ここでＲおよびＲ１はアルキルおよび好ましくは低級アルキルである））を生じる。次いで側鎖保護物が、フッ化水素での処理による慣例方法において除去されて、遊離のアミド、アルキルアミドまたはジアルキルアミドを与える。
【００４７】
別の実施態様において、Ｃ末端のカルボキシル基またはＣ末端のエステルは、Ｎ末端アミノ基でのそれぞれカルボキシル基またはエステルの――ＯＨまたはエステル（――ＯＲ）の置換によって環化されるように誘導され得、環状ペプチドを形成する。例えば、ペプチド酸を与えるための合成および開裂後、遊離酸は、例えば塩化メチレン（ＣＨ２Ｃｌ２）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）またはそれらの混合物における適切なカルボキシル基活性化物質（例えばジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ））によって、溶液中で活性化エステルに転換される。次いでこの環状ペプチドは、Ｎ末端アミンでの活性化エステルの置換によって形成される。環化、どちらかといえば重合は、当該分野で周知の方法に従って、極めて希薄な溶液の使用によって増大され得る。
【００４８】
当該分野で理解され、そして本発明によって提供されるようなペプチド模倣物は、本発明のセンス配向のＧＳＥの各々によってコードされる代表的なペプチドに構造的に類似するが、当該分野で公知の方法および以下の参考文献（Ｓｐａｔｏｌａ、１９８３、ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＡＮＤ  ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＯＦ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ，ＰＥＰＴＩＤＥＳ，ＡＮＤ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ，（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編）、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２６７頁；Ｓｐａｔｏｌａ、１９８３、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  １：３；Ｍｏｒｌｅｙ、１９８０、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．４６３〜４６８頁；Ｈｕｄｓｏｎら、１９７９、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．１４：１７７〜１８５；Ｓｐａｔｏｌａら、１９８６、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．３８：１２４３〜１２４９；Ｈａｎｎ、１９８２、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．Ｉ  ３０７〜３１４；Ａｌｍｑｕｉｓｔら、１９８０、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３：１３９２〜１３９８；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅら、１９８２、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２３：２５３３；Ｓｚｅｌｋｅら、１９８２、欧州特許出願、公開番号ＥＰ０４５６６５Ａ；Ｈｏｌｌａｄａｙら、１９８３、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２４：４４０１〜４４０４；およびＨｒｕｂｙ、１９８２、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．３１：１８９〜１９９（これらの各々は、本明細書中において参考として援用される））においてさらに記載される方法によって、以下からなる基より選択される結合によって必要に応じて置換される１以上のペプチド結合を有する：――ＣＨ２ＮＨ――、――ＣＨ２Ｓ――、――ＣＨ２ＣＨ２――、――ＣＨ＝ＣＨ――（シス配座およびトランス配座の両方において）、――ＣＯＣＨ２――、――ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２――および――ＣＨ２ＳＯ――。このようなペプチド模倣物は、ポリペプチド実施態様を超える有利な利点を有し得、この利点は、例えば作製がより経済的であること、より大きな化学安定性または増大された薬理学的性質（半減期、吸収、効力、効能などのような）、減少された抗原性および他の性質を有することを含む。
【００４９】
本発明の腫瘍阻害ペプチドの模倣アナログはまた、従来の薬物設計または合理的な薬物設計の原理を使用して獲得され得る（Ａｎｄｒｅｗｓら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ａｌｆｒｅｄ  Ｂｅｎｚｏｎ  Ｓｙｍｐ．２８：１４５〜１６５；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ、１９９０、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８９：１〜２４；Ｈｏｌら、１９８９ａ、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＲＥＣＯＧＮＩＴＩＯＮ：ＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＡＮＤ  ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＰＲＯＢＬＥＭＳ、（Ｒｏｂｅｒｔｓ編）；Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：８４〜９３頁；Ｈｏｌ、１９８９ｂ、Ａｒｚｎｅｉｍ−Ｆｏｒｓｃｈ．３９：１０１６〜１０１８；Ｈｏｌ、１９８６、Ａｇｎｅｗ  Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２５：７６７〜７７８（これらの開示は、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
【００５０】
従来の薬物設計方法に従って、所望の模倣分子は、構造が「ネイティブの」ペプチドの構造と同様の特性を有するランダムに試験される分子によって獲得される。結合分子の特定の基の変化から生じる量的寄与は、ペプチドの腫瘍阻害活性と比べて推定模倣物の生物学的活性を測定することによって決定され得る。合理的な薬物設計の好ましい実施態様において、模倣物は、ペプチドの最も安定な３次元コンホメーションの特性を共有するように設計される。従って、例えば模倣物は、本明細書中で開示されるように、本発明の腫瘍阻害ペプチドによって示されるものと類似のイオン相互作用、疎水性相互作用またはファンデルワールス相互作用を引き起こすに十分な様式で配向される化学基を有するように設計され得る。
【００５１】
合理的な模倣物設計を行うための好ましい方法は、例えばＨｏｌ、１９８９ａ、同書；Ｈｏｌ、１９８９ｂ、同書；およびＨｏｌ、１９８６、同書によって例示されるようなペプチドの３次元構造の表示を形成し得るコンピュータシステムを利用する。本発明のペプチドのペプチド模倣物、有機模倣物および化学模倣物の分子構造は、当該分野で市販されるコンピュータ支援設計プログラムを用いて当業者に従って作製される。このようなプログラムの例としては、ＳＹＢＹＬ  ６．５（登録商標）、ＨＱＳＡＲＴＭおよびＡＬＣＨＥＭＹ  ２０００ＴＭ（Ｔｒｉｐｏｓ）；ＧＡＬＡＸＹＴＭおよびＡＭ２０００ＴＭ（ＡＭ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ，ＴＸ）；ＣＡＴＡＬＹＳＴＴＭおよびＣＥＲＩＵＳＴＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）；ＣＡＣＨＥ  ＰＲＯＤＵＣＴＳＴＭ、ＴＳＡＲＴＭ、ＡＭＢＥＲＴＭおよびＣＨＥＭ−ＸＴＭ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＣＡ）ならびにＣＨＥＭＢＵＩＬＤＥＲ３ＤＴＭ（Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）が挙げられる。
【００５２】
例えば当該分野で認識される分子モデリングプログラムをを使用して、本明細書中で開示されるペプチドを用いて産生されるペプチド模倣物、有機模倣物および化学模倣物は、従来の化学合成技術、最も好ましくは、コンビナトリアル・ケミストリー方法を含むハイスループットスクリーニングを供給するように設計される技術を用いて産生される。本発明のペプチド模倣物、有機模倣物および化学模倣物の産生に有用なコンビナトリアル方法は、例えばＳＩＤＤＣＯ，Ｔｕｓｃｏｎ，Ａｒｉｚｏｎａ；Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ／Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｓｙｍｙｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ；Ｍｅｄｉｃｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｌｅｍｏｎｔ，ＩＬ；Ｐｈａｒｍ−Ｅｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ，ＰＡ；またはＮ．Ｖ．Ｏｒｇａｎｏｎ，Ｏｓｓ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓによって提供されるようなファージディスプレイアレイ、固相合成およびコンビナトリアル・ケミストリーアレイを有する。本発明のペプチド模倣物、有機模倣物および化学模倣物のコンビナトリアル・ケミストリー産生は、当該分野で公知の方法に従って産生され、これは、以下において開示される技術を含むがこれらに限定されない：Ｔｅｒｒｅｔｔ、１９９８、ＣＯＭＢＩＮＡＴＯＲＩＡＬ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ；Ｇａｌｌｏｐら、１９９４、「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｔｏ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．１．Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３〜５１；Ｇｏｒｄｏｎら、１９９４、「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｔｏ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．２．Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｌｉｂｒａｒｙ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ」、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１３８５〜１４０１；Ｌｏｏｋら、１９９６、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．６：７０７〜１２；Ｒｕｈｌａｎｄら、１９９６、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８：２５３〜４；Ｇｏｒｄｏｎら、１９９６、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２９：１４４〜５４；ＴｈｏｍｐｓｏｎおよびＥｌｌｍａｎ、１９９６、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９６：５５５〜６００；ＦｒｕｃｈｔｅｌおよびＪｕｎｇ、１９９６、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３５：１７〜４２；Ｐａｖｉａ、１９９５、「Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ」、Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ、ｗｗｗ．ｎｅｔｓｃｉ．ｏｒｇ；Ａｄｎａｎら、１９９５、「Ｓｏｌｉｄ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｎ  Ｌｅａｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ＳＡＲ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ」、同書、ＤａｖｉｅｓおよびＢｒｉａｎｔ、１９９５、「Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｕｓｉｎｇ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ」、同書、Ｐａｖｉａ、１９９６、「Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：Ｐｒｅｓｅｎｔ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ」、同書；ならびにＨｏｒｌｂｅｃｋに対する米国特許第５，８８０，９７２号；Ａｇｒａｆｉｏｔｉｓらに対する同第５，４６３，５６４号；Ｂａｌａｊｉらに対する同第５，３３１，５７３号；およびＬｅｒｎｅｒらに対する同第５，５７３，９０５号。
【００５３】
本発明はまた、本明細書中で同定される遺伝子（特に表３に示される遺伝子）を使用して、この遺伝子の発現または活性のインヒビターを同定するために化合物をスクリーニングするための方法を提供する。本発明の方法のこの態様の実施において、細胞成長に必要とされる遺伝子（特に表３において同定される遺伝子）を発現する細胞は、試験化合物の存在環境下および非存在環境下においてアッセイされ、そしてそれによってこの遺伝子または遺伝子産物の発現または活性を減少する試験化合物が同定される。さらに、このアッセイは、自殺選択条件下で行われ得、ここでこの遺伝子の発現または活性を阻害することによって細胞成長を阻害する化合物が、細胞の生存について選択する。別の実施態様において、本発明のレポーター遺伝子構造体が使用され、ここでこのレポーター遺伝子の発現は、試験化合物の存在環境下で減少されるが、この試験化合物の非存在環境下では減少されない。
【００５４】
本発明の方法は、腫瘍細胞、最も好ましくはヒト腫瘍細胞の成長を阻害する化合物の同定に有用である。本発明はまた、同定される化合物を提供し、そしてこの同定される化合物を用いて腫瘍細胞、最も好ましくはヒト腫瘍細胞の成長を阻害するための方法を提供する。例示的な化合物としては、遺伝子産物の活性を妨げる中和抗体；本発明の方法に従ったＧＳＥとして開発されるかまたは当該分野で公知の他の方法によって同定されるかのいずれかのアンチセンスオリゴヌクレオチド；リボザイム；３重らせん構造のオリゴヌクレオチド；および遺伝子発現または活性の「低分子」インヒビター（好ましくは、表３における遺伝子の発現の媒介を担う遺伝子産物または調節因子に特異的に結合する低分子）が挙げられる。
【００５５】
本発明はまた、薬学的組成物として、本明細書中において開示される方法によって同定される化合物の実施態様を提供する。本発明の薬学的組成物は、それ自身公知の様式において（例えば、従来の混合プロセス、溶解プロセス、粒状化プロセス、糖剤作製プロセス、湿式粉砕プロセス、乳化プロセス、カプセル化プロセス、捕捉プロセスまたは凍結乾燥プロセスの手段によって）製造され得る。
【００５６】
従って本発明に従った使用についての薬学的組成物は、薬学的に使用され得る調製物への活性化合物のプロセシングを容易にする賦形剤および補助剤を含む１以上の生理学的に受容可能なキャリアを用いた従来様式で処方され得る。適切な処方物は、選択される投与経路に依存する。
【００５７】
無毒性の薬学的塩は、酸（例えば塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸、スルフィン酸、ギ酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、硝酸、安息香酸、クエン酸、酒石酸、マレイン酸、ヨウ化水素酸、酢酸のようなアルカン酸（ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３（ここでｎは０〜４である））など）の塩を有する。無毒性の薬学的な塩基付加塩は、塩基（例えばナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウムなど）の塩を有する。当業者は、広範な種々の無毒性の薬学的に受容可能な付加塩を認識する。
【００５８】
注入について、本発明の方法に従って同定される腫瘍細胞の成長阻害化合物は、適切な水溶液（例えばハンクス溶液、リンガー溶液または生理的塩類溶液の緩衝液のような生理学的に適合性の緩衝液）において処方され得る。経粘膜投与および経皮投与について、透過されるべき障壁に適切な浸透剤がこの処方物において使用される。このような浸透剤は、一般的に当該分野で公知である。
【００５９】
経口投与について、化合物は、当該分野で周知の薬学的に受容可能なキャリアと活性化合物を結合することによって容易に処方され得る。このようなキャリアは、本発明の化合物が、処置されるべき患者による経口摂取について、錠剤、丸剤、糖剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして処方されることを可能にする。経口用途についての薬学的調製物は、固体賦形剤とともに得られ得、所望であれば適切な補助剤を添加した後に、得られる混合物を必要に応じて粉砕し、そしてこの顆粒の混合物を処理して、錠剤または糖剤のコアを獲得する。適切な賦形剤は、特に糖（ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む）のようなフィラー；例えばトウモロコシデンプン、コムギデンプン、イネデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）のようなセルロース調製物である。所望であれば、崩壊剤（例えば架橋されたポリビニルピロリドン、寒天またはアルギン酸もしくはその塩（例えばアルギン酸ナトリウム））が添加され得る。
【００６０】
糖剤のコアは、適切なコーティングとともに提供される。この目的について、濃縮された糖溶液が使用され得、これは、必要に応じてアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チタン、ラッカー溶液、ならびに適切な有機溶媒または溶媒混合物を含み得る。染料または顔料は、識別のため、または活性化合物用量の異なる組み合わせを特徴付けるために錠剤または糖剤のコーティングに添加され得る。
【００６１】
経口で使用され得る薬学的調製物としては、ゼラチンから作られるプッシュフィットカプセル、ならびにゼラチンから作られるソフトシールカプセル、および可塑剤（例えばグリセロールまたはソルビトール）が挙げられる。このプッシュフィットカプセルは、フィラー（例えばラクトース）、結合剤（例えばデンプン）および／または潤滑剤（例えばタルクもしくはステアリン酸マグネシウム）ならびに必要に応じて安定剤と混合して活性成分を含み得る。ソフトカプセルにおいて、活性化合物は、適切な液体（例えば脂肪油、液体パラフィンまたは液体ポリエチレングリコール）に溶解または懸濁され得る。さらに、安定剤が添加され得る。経口投与についてのすべての処方物は、このような投与に適切な投薬量であるべきである。口腔投与について、組成物は、従来様式において処方される錠剤またはロゼンジの形態をとり得る。
【００６２】
吸入による投与について、本発明に従った使用についての化合物は、適切な推進剤（例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切な気体）の使用とともに、加圧パックまたは噴霧器からのエーロゾルスプレー提示の形態で簡便に送達される。加圧エーロゾルの場合において、投薬単位は、計量された量を送達するための弁を提供することによって決定され得る。化合物および適切な粉末ベース（例えばラクトースまたはデンプン）の粉末混合物を含む吸入器または注入器における使用についての例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジが処方され得る。
【００６３】
注入（例えばボーラス注入または連続的注入）による非経口投与についての化合物が処方され得る。注入についての処方物は、添加された防腐剤とともに、単位投薬形態（例えばアンプルまたは複数用量の容器）において与えられ得る。この組成物は、油性または水性のビヒクルにおける懸濁液、溶液またはエマルジョンのような形態をとり得、そして調合剤（例えば懸濁剤、安定剤および／または分散剤）を含み得る。
【００６４】
非経口投与についての薬学的処方物は、水溶性形態における活性化合物の水溶液を含む。さらに、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注入懸濁液として調製され得る。適切な親油性溶媒またはビヒクルは、脂肪油（例えばゴマ油）または合成脂肪酸エステル（例えばオレイン酸エチルもしくはトリグリセリド）あるいはリポソームを含む。水性注入懸濁液は、この懸濁液の粘性を増大する物質（例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストラン）を含み得る。必要に応じてこの懸濁液はまた、適切な安定剤またはこの化合物の溶解度を増大する因子を含み、高度に濃縮された溶液の調製を可能にし得る。あるいはこの活性成分は、使用前に適切なビヒクル（例えば滅菌された発熱物質を含まない水）と構成するために粉末形態であり得る。この化合物はまた、直腸組成物（例えば坐剤または停留浣腸（例えばカカオ脂もしくは他のグリセリドのような従来の坐剤ベースを含む））において処方され得る。
【００６５】
上記の処方物に加えて、この化合物はまた、デポー調製物として処方され得る。このような持続性作用のある処方物は、移植（例えば皮下移植もしくは筋肉内移植）または筋肉内注入によって投与され得る。従って例えばこの化合物は、適切な高分子材料もしくは疎水性材料（例えば受容可能な油におけるエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂とともに、あるいは微溶性誘導体（例えば微溶性塩）として処方され得る。
【００６６】
本発明の疎水性化合物についての薬学的キャリアは、ベンジルアルコール、非極性界面活性剤、水混和性有機ポリマーおよび水相を含む共溶媒系である。この共溶媒系は、ＶＰＤ共溶媒系であり得る。ＶＰＤは、３％  ｗ／ｖ  ベンジルアルコール、８％  ｗ／ｖの非極性界面活性剤、ポリソルベート８０および６５％  ｗ／ｖ  ポリエチレングリコール３００（残りの量は無水エタノールで補填する）の溶液である。このＶＰＤ共溶媒系（ＶＰＤ：５Ｗ）は、水溶液中の５％  デキストロースで１：１希釈されたＶＰＤからなる。この共溶媒系は、疎水性化合物を良好に溶解し、そしてそれ自身全身性投与の際に低毒性を生じる。当然共溶媒系の比率は、その溶解度および毒性の特質を破壊することなく相当に変化され得る。さらにこの共溶媒成分の同一性は変化され得（例えば、他の低毒性の非極性界面活性剤が、ポリソルベート８０の代わりに使用され得）、ポリエチレングリコールの画分サイズは変化され得（他の生体適合性ポリマー（例えばポリビニルピロリドン）がポリエチレングリコールを置換し得）、そして他の糖または多糖類がデキストロースの代わりとなり得る。
【００６７】
あるいは、疎水性の薬学的化合物についての他の送達系が利用され得る。リポソームおよびエマルジョンは、疎水性薬物についての送達ビヒクルまたはキャリアの周知の例である。特定の有機溶媒（例えばジメチルスルホキシド）がまた利用され得るが、より大きな毒性の犠牲を通常払う。さらにこの化合物は、徐放性システム（例えば、治療因子を含む固体の疎水性ポリマーの半透性マトリックス）を用いて送達され得る。種々の徐放性材料が確立されており、そして当業者によって周知である。徐放性カプセルは、その化学性質に依存して、１００日超まで数週間化合物を放出し得る。この治療試薬の化学性質および生物学的安定性に依存して、タンパク質および核酸の安定化についてのさらなる戦略が利用され得る。
【００６８】
薬学的組成物はまた、適切な固相またはゲル相のキャリアまたは賦形剤を含み得る。このようなキャリアまたは賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチンおよびポリマー（例えばポリエチレングリコール）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６９】
本発明の化合物は、薬学的に適合性の対イオンを有する塩として提供され得る。薬学的に適合性の塩は、多くの酸（塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、リン酸、臭化水素酸、スルフィン酸、ギ酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、硝酸（ｎｉｔｉｃ）、安息香酸、クエン酸、酒石酸、マレイン酸、ヨウ化水素酸、酢酸のようなアルカン酸、ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３（ここでｎは０〜４である）などを含むがこれらに限定されない）とともに形成され得る。塩は、対応する遊離塩基形態である水性溶媒または他のプロトン性溶媒においてより可溶性である傾向がある。無毒性の薬学的な塩基付加塩は、塩基（例えばナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウムなど）の塩を有する。当業者は、広範な種々の無毒性の薬学的に受容可能な付加塩を認識する。
【００７０】
本発明の化合物の薬学的組成物は、種々の手段（全身性投与、限局性投与または局所投与を含む）を通じて処方および投与され得る。処方および投与についての技術は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡに見出され得る。投与の様式は、体における所望の標的部位への送達を最大にするように選択され得る。適切な投与経路は、例えば経口投与、直腸投与、経粘膜投与、経皮投与または腸管投与；非経口送達（筋肉内注入、皮下注入、骨髄内注入、ならびに鞘内注入、直接心室内注入、静脈内注入、腹腔内注入、鼻内注入または眼内注入を含む）を含み得る。
【００７１】
あるいは、しばしばデポー処方物または徐放性処方物において、例えば特定の組織への直接的な化合物の注入を介して全身性様式よりもむしろ局所に化合物を投与し得る。
【００７２】
本発明における使用に適切な薬学的組成物は、活性成分が、その意図された目的を達成するに有効な量で含まれる組成物を有する。より具体的には、治療有効量は、処置されている被験体の発達を妨げるに有効な量、またはこの被験体の現在の症状を緩和するに有効な量を意味する。有効量の決定は、特に本明細書中で提供される詳細な開示に鑑みて、当業者の能力の範囲で申し分ない。
【００７３】
本発明の方法において使用される任意の化合物について、治療有効用量は、本明細書中に開示されるように、最初は細胞培養アッセイから見積もられ得る。例えば、用量は動物モデルにおいて処方されて、細胞培養において決定されるようなＥＣ５０（５０％の増大に有効な用量）、すなわち、細菌の細胞成長の最大の半分の阻害を達成する試験化合物の濃度を有する循環濃度範囲を達成し得る。このような情報が使用されて、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定し得る。
【００７４】
しかし、任意の特定の患者についての特定の用量レベルが、種々の因子（利用される特定の化合物の活性、年齢、体重、一般的健康状態、性別、食餌、投与時間、投与経路ならびに排出速度、薬物の組み合わせ、治療を受けている特定の疾患の重篤度および処方医師の判断を含む）に依存することが理解される。
【００７５】
本発明の好ましい化合物は、特定の薬理学的性質を有する。このような性質は、経口バイオアベイラビリティー、低毒性、低い血清タンパク質結合、ならびに望ましいインビトロ半減期およびインビボ半減期を含むがこれらに限定されない。アッセイが使用されて、これらの望ましい薬理学的性質を予測し得る。バイオアベイラビリティーを予測するために使用されるアッセイは、ヒトの腸管細胞の単層（Ｃａｃｏ−２細胞の単層を含む）を横切る輸送を含む。血清タンパク質結合は、アルブミン結合アッセイから予測され得る。このようなアッセイは、Ｏｒａｖｃｏｖａら（１９９６、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔ．Ｂ  ６７７：１〜２７）による概説において記載される。化合物の半減期は、化合物の投薬の頻度に反比例する。化合物のインビトロ半減期は、ＫｕｈｎｚおよびＧｉｅｓｃｈｅｎ（１９９８、ＤＲＵＧ  ＭＥＴＡＢＯＬＩＳＭ  ＡＮＤ  ＤＩＳＰＯＳＩＴＩＯＮ、第２６巻、１１２０〜１１２７頁）によって記載されるようなミクロソーム半減期のアッセイから予測され得る。
【００７６】
このような化合物の毒性および治療効能は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順（例えばＬＤ５０（集団の５０％に対する致死量）およびＥＤ５０（集団の５０％における治療有効量）の決定について）によって決定され得る。毒性効果と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、そしてこれは、ＬＤ５０とＥＤ５０との間の比として表され得る。高い治療指数を示す化合物が好ましい。これらの細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒトにおける使用についての投薬範囲の処方に使用され得る。このような化合物の投薬量は、好ましくは、わずかな毒性を有するかまたは毒性を有さないＥＤ５０を有する循環濃度の範囲内にある。投薬量は、利用される投薬形態および利用される投与経路に依存してこの範囲内で変化し得る。正確な処方、投与経路および投薬量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択され得る（例えば、Ｆｉｎｇｌら、１９７５、「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、第１章、１頁を参照のこと）。
【００７７】
投薬量および投薬間隔は、個々に調整されて、腫瘍細胞の成長阻害効果を維持するに十分な活性成分の血漿レベルを提供し得る。全身性投与についての通常の患者の投薬量は、１日当たり１００〜２０００ｍｇに及ぶ。患者の体表面積の点で言うと、通常の投薬量は、１日当たり５０〜９１０ｍｇ／ｍ２に及ぶ。通常の平均血漿レベルは、０．１〜１０００μＭ内に維持されるべきである。局所投与または選択的取り込みの場合において、化合物の有効な局所濃度は、血漿濃度に関連されることはできない。
【００７８】
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい実施態様をさらに例示することが意図され、まったく限定されない。
【実施例】
【００７９】
（１．     ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞からの均一化腫瘍ライブラリの産生）
均一化ｃＤＮＡフラグメントライブラリを、ＭＣＦ−７乳癌細胞系統（エストロゲンレセプターポジティブのｐ５３に対する野生型；ＡＴＣＣ受託番号ＨＴＢ２２、米国菌培養収集所、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から作製した。ＭＣＦ−７細胞からのポリ（Ａ）＋ＲＮＡを使用して、ＧｕｄｋｏｖおよびＲｏｎｉｎｓｏｎ（１９９７）に記載される手順の改変を通じて、均一化されたｃＤＮＡフラグメントの集団を調製した。手短に言えば、ＲＮＡを、１００℃で９分間の加熱によって断片化した。二重鎖ｃＤＮＡを、逆転写プライマー（５’−ＧＧＡＴＣＣＴＣＡＣＴＣＡＣＴＣＡＮＮＮＮＮＮＮＮ−３’；配列番号１）を用いてＧｉｂｃｏ  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔキットを使用してこの熱断片化ＲＮＡから作製した。このプライマーは、ランダムプライミングについてその３’末端にランダムオクタマー配列を含み、そしてこれは、ＢａｍＨＩ制限部位とともに、すべての３つのオープンリーディングフレームにおいてＴＧＡ停止コドンを提供するタグ（その二重鎖形態において「停止アダプター」と称される）を保有する。ＰＣＲアッセイを使用して、このｃＤＮＡ調製物におけるβ２−ミクログロブリン、β−アクチンおよびエストロゲンレセプターのｍＲＮＡ配列の存在を確立した。二重鎖ｃＤＮＡフラグメントを、以下のアダプターと連結した：
５’ＧＴＡＣＣＴＧＡＧＴＴＡＴＡＧＧＡＴＣＣＣＴＧＣＣＡＴＧＣＣＡＴＧＣＣＡＴＧ３’（配列番号２）
３’ＣＣＴＡＧＧＧＡＣＧＧＴＡＣＧＧＴＡＣＧＧＴＡＣ５’（配列番号３）
後者のアダプター（「開始アダプター」）は、ＢａｍＨＩ部位とともにすべての３つのフレームにおいて翻訳開始部位を含んだ。二重鎖ｃＤＮＡを、開始アダプターおよび停止アダプターにアニーリングするプライマーを用いたＰＣＲによって増幅した。この開始アダプターは、ｃＤＮＡフラグメントの両方の末端で最初に連結されるが、このＰＣＲ産物は、２つの異なるプライマーによって支配的に作製され、そして開始アダプターを３’末端ではなく５’末端にのみ含んだ。この望ましい結果は、逆方向反復によって隣接される配列の再生の際に形成されるフライパンの柄のような構造によるＰＣＲ阻害に起因した「ＰＣＲ抑制効果」によって説明された（Ｓｉｅｂｅｒｔら、１９９５、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：１０８７〜１０８８）。さらに、３’末端での任意の残りの開始アダプターを、クローニングの前にＢａｍＨＩ消化によって引き続いて除去した。増幅されたｃＤＮＡフラグメント集団を、β２−ミクログロブリン、β−アクチンおよびエストロゲンレセプターの配列の存在について再び試験した。この手順は、ランダムに開始し、そして終結する二重鎖ｃＤＮＡフラグメント（１００〜４００ｂｐサイズ）の集団を産生し、これは、元のｍＲＮＡの５’方向および３’方向に対応する末端で異なるアダプターによってタグ化された。この５’アダプターは、３つのオープンリーディングフレームにおいて翻訳開始コドンを含み、そしてこの３’アダプターは、すべての３つのリーディングフレームにおいて停止コドンを含んだ。このようなフラグメントは、センス配向でクローニングされる場合に、親タンパク質に由来するペプチドの合成を指向するか、またはアンチセンス配向でクローニングされる場合に、アンチセンスＲＮＡ分子を生じさせた。
【００８０】
このｃＤＮＡフラグメントの混合物を、Ｃ０ｔ分別に基づいたＰａｔａｎｊａｌｉら（１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１９４３〜１９４７）の手順の改変を通じて均一化に供した。均一化を、２４時間、４８時間、７２時間または９６時間の間、変性ｃＤＮＡ部分を再アニーリングすることによって達成した。一本鎖産物を、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによって、再アニーリングされた二重鎖ＤＮＡから分離した。ｃＤＮＡフラグメントの均一化を、ＭＣＦ−７細胞における異なるレベルに対して発現され、そして各々の一本鎖画分で行われる遺伝子に対応するプローブとのサザンハイブリダイゼーションによって試験した。この分析は、β−アクチン（豊富なｍＲＮＡ種）の含量が、均一化時間にわたって減少し、最も低い含量は、９６時間の時点で見出されたことを示した。逆に、わずかに豊富なｃＤＮＡ配列（ｃ−ＭＹＣ）および豊富ではないｃＤＮＡ配列（ＭＤＲ１）（これは、均一化の前にＭＣＦ−７  ｃＤＮＡにおいて検出不可能であった）は、９６時間までにβ−アクチンと匹敵するレベルに増大し、これは、９６時間の画分が最良に均一化されたことを示唆した。９６時間の画分の均一化を確認するために、このＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し（小規模で）、プラスミドベクターに連結し、そしてエレクトロポレーションによってＥ．ｃｏｌｉ（Ｔｏｐ１０）に形質転換した。コロニーハイブリダイゼーション分析を、異なる遺伝子について放射能標識されたプローブを用いて、１０，０００個のコロニーがプレーティングされたニトロセルロースフィルターに対して行った。１フィルター当たり以下のシグナル数を得た：β−アクチンは３つのシグナル；ＭＤＲ１は３つのシグナル；Ｃ−ＭＹＣは２つのシグナル；Ｃ−ＦＯＳは２つのシグナル。これらの結果は、試験された遺伝子由来の配列は、平均してこのライブラリの３，０００〜５，０００クローンのうちの１つにおいて見出されることを示し、そしてまた、９６時間の画分が均一化されたことを確認した。
【００８１】
この均一化ｃＤＮＡ画分を、ＰＣＲによって増幅し、そしてＩＰＴＧ誘導性のレトロウイルスベクター、ＬＮＸＣＯ３（ＣｈａｎｇおよびＲｏｎｉｎｓｏｎ、１９９６、Ｇｅｎｅ  １８３：１３７〜１４２）に連結した。この連結反応は、およそ５０００万個のクローンのライブラリを産生した。このライブラリにおけるパーセント組換えを、ＬＮＸＣＯ３の挿入部位に隣接するプライマーを用いて、細菌性コロニー由来のＤＮＡのＰＣＲによって評価した。インサートを含むクローン数は、１３１／１５０、すなわち８７％であった。大半のインサートは、１００ｂｐ〜３００ｂｐのサイズに及んだ。ライブラリのさらなる特徴付けについて、このインサートの画分を、ｐｃＤＮＡ３ベクターに再クローニングした。ｐｃＤＮＡ３における６９のランダムに選ばれたクローンのインサート配列を、ハイスループットＤＮＡシーケンサーを用いて決定し、そしてパブリックドメインのデータベースにおける公知の遺伝子配列との相同性について分析した。インサートのうちの５２が公知の遺伝子に照合されず、１６が異なるヒト遺伝子に対応し、そして１つの配列が細菌起源であることが見出された。この均一化されたＭＣＦ−７  ｃＤＮＡフラグメントライブラリを使用して、乳癌細胞における成長阻害ＧＳＥを選択した。
【００８２】
（２．     乳癌レシピエント細胞の産生）
実施例１に記載される均一化腫瘍ライブラリを、ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞から調製した。ＧＳＥ選択についてのレシピエント細胞として、異なる乳癌細胞系統、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ受託番号ＨＴＢ２６）を選択した。この系統は、ＭＣＦ−７に比べて乳癌のより悪性なクラスを代表し、これはエストロゲンレセプターネガティブであり、そしてｐ５３欠損であった。ＲＮＡ供給源およびレシピエントとしての異なる細胞系統の選択は、異なる型の乳癌に対してより有効であるような成長阻害ＧＳＥの単離に向けられた。
【００８３】
ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞を、第一に同種指向性レトロウイルスでの感染に感受性にし、このウイルスは、簡便なパッケージング細胞系統を用いて高い力価で容易に作製され得、そしてヒトまたは未改変のヒト細胞に感染性ではなかった。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、レトロウイルスベクターＬＸＩＨｉｓ（Ｌｅｖｅｎｓｏｎら、１９９８、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：１２３３〜１２３６）においてマウス同種指向性レセプターに対する遺伝子を保有する両種指向性組換えウイルスで感染させ、そしてこの感染した細胞集団を、ヒスチジノールで選択した。同種指向性レトロウイルスでの感染に対するこの選択細胞の感受性を、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に対する遺伝子を保有する同種指向性レトロウイルスＬＸＳＥ（Ｋａｎｄｅｌら、１９９７、同書）でこのような細胞を感染させることによって決定した。８６％を超えるＬＸＳＥ感染細胞が、ＧＦＰ蛍光に対してポジティブであり（フローサイトメトリーによって決定されるように）、それに対応して高い感染率であることを示した。次にこれらの細胞を、ＬａｃＩリプレッサー（Ｆｉｅｃｋら、１９９２、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：１７８５〜１７９１）およびハイグロマイシン耐性マーカーを保有する３’ＳＳプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で感染し、そして安定なトランスフェクタントをハイグロマイシンで選択した。この選択されたトランスフェクタントをサブクローニングし、そして３３の単細胞クローンを、ＬａｃＩ阻害性プロモーターのＩＰＴＧ調節発現について個々に試験した。この試験を、ＬａｃＩ調節性ＣＭＶプロモーターからルシフェラーゼを発現するｐＣＭＶＩ３ｌｕｃプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）での細胞クローンの一過性トランスフェクションによって行った。ポジティブコントロールとして、同じアッセイを、以前に特徴付けられた良好に調節される線維肉腫細胞系統ＨＴ１０８０  ３’ＳＳ６（ＣｈａｎｇおよびＲｏｎｉｎｓｏｎ、１９９６、同書；Ｃｈａｎｇら、１９９９、同書）に対して行った。試験されたクローンのうちの３つが、ＨＴ１０８０  ３’ＳＳ６と類似のレベルでＩＰＴＧの存在環境下においてルシフェラーゼ発現の誘導を示した。
【００８４】
これらのクローンを、以下のアッセイによってさらに試験した。第一のアッセイは、ＬＸＳＥ同種指向性レトロウイルスでの感染、その後のＧＦＰ蛍光のＦＡＣＳ分析であり、同種指向性感染に対する感受性を決定した。第二のアッセイは、ＩＰＴＧ調節性レトロウイルス、ＬＮＬｕｃＣＯ３（ＣｈａｎｇおよびＲｏｎｉｎｓｏｎ、１９９６）での同種指向性レトロウイルスの形質導入、その後のＧ４１８選択およびルシフェラーゼ発現のＩＰＴＧ誘導性についての試験であった。第三のアッセイは、ＩＰＴＧ調節性同種指向性レトロウイルス、ＬＮｐ２１ＣＯ３（Ｃｈａｎｇら、１９９９、同書）（これは、細胞周期インヒビター、ｐ２１（ＩＰＴＧ誘導性の遺伝子インヒビターについてのポジティブコントロール）を保有する）での感染、その後のＩＰＴＧの存在環境下および非存在環境下でのＢｒｄＵ自殺選択（以下に記載される）であった。これらのアッセイの結果に基づいて、ＭＤＡ−ＭＢ２３１  ３’ＳＳ３１と呼ばれる細胞系統を、成長阻害ＧＳＥ選択についての最適条件として選択した。この細胞系統は、同種指向性レトロウイルスでのおよそ８０％の感染能力、ＩＰＴＧによるおよそ１０倍の誘導能力（これは、ＨＴ１０８０  ３’ＳＳ６について同時に決定された値よりも高い）、およびＬＮｐ２１ＣＯ３での感染の際のＢｒｄＵ自殺のクローン原性生存の２０倍を超える増大を示した。
【００８５】
（３．     腫瘍細胞の成長を阻害する遺伝子抑制因子の単離）
ＬＮＸＣＯ３ベクターにおけるＭＣＦ−７由来の均一化腫瘍ライブラリを、Ｒｏｎｉｎｓｏｎら（１９９８、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２９２：２２５〜２４８）に記載されるように、ＢＯＳＣ２３パッケージング細胞系統（Ｐｅａｒら、１９９３、同書）を用いて、同種指向性レトロウイルスの形質導入によってＭＤＡ−ＭＢ２３１  ３’ＳＳ３１細胞系統に形質導入した。２億（２×１０８）のレシピエント細胞を感染し、そしてＧ４１８で選択した。この感染率（Ｇ４１８耐性コロニーの頻度によって決定されるように）は３６％であった。８千万（８×１０７）のＧ４１８選択されたインフェクタントを、以下のようなＢｒｄＵ自殺に対するＩＰＴＧ依存性の耐性についての選択に供した。細胞を、Ｐ１５０当たり１０６細胞でプレーティングし、そして５０μＭ  ＩＰＴＧで３６時間処理し、次いで５０μＭ  ＩＰＴＧおよび５０μＭ  ＢｒｄＵで４８時間処理した。細胞をその後１０μＭ  ヘキスト３３３４２とともに３時間インキュベートし、そしてライトボックス上で１５分間蛍光白色光で照らして、ＩＰＴＧの存在環境下で成長しそしてＢｒｄＵを取り込んだ細胞を破壊した。次いで細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水で２回洗浄し、そして７〜１０日間ＩＰＴＧまたはＢｒｄＵを含まないＧ４１８含有培地において回収した。次いでこの生存細胞を、同じ条件下でＢｒｄＵ選択の第二ステップに供した。コントロールプレートを、ＩＰＴＧの非存在環境下で選択し、そして代表的なプレートを染色して、コロニーを計数した（これらの結果を図４に示す）。ＩＰＴＧの存在環境下における第二ステップの選択後の生存コロニー数は、ＩＰＴＧの非存在環境下における対応する数よりもおよそ３倍多かった。対照的に、インサートを含まないＬＮＸＣＯ３ベクターで感染されたコントロール細胞は、ＩＰＴＧの存在環境下または非存在環境下においてＢｒｄＵ自殺における差異は見られなかった。ポジティブコントロールとして、細胞をｐ２１発現性ＬＮｐ２１ＣＯ３で感染したが、ＩＰＴＧの存在環境下における生存細胞数は多すぎて計数できなかった。これらの結果は、ＩＰＴＧ誘導性の成長阻害ＧＳＥの首尾良い選択と一致して、ＢｒｄＵ自殺選択を生き残るライブラリ感染細胞の頻度は、ＩＰＴＧ依存性様式で増大したことを実証した。
【００８６】
ゲノムＤＮＡを、２段階選択されたライブラリ形質導入細胞から単離し、そしてプライマーとしてインサートに隣接するベクター由来配列を用いて、ＰＣＲについての鋳型として使用した。選択細胞由来のインサートのＰＣＲ増幅混合物を、ＬＮＸＣＯ３ベクターに再クローニングし、そして選択フラグメントのライブラリからほぼ３，０００のランダムに選ばれたプラスミドクローンを、ＰＰＤ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡによるハイスループットＤＮＡ配列決定によって配列決定した。ヒトｃＤＮＡフラグメントを含む１４８２のクローンを、ＮＣＢＩデータベースを用いたＢＬＡＳＴ相同性検索によってこれらの配列の間で同定し、そして分析して、選択されたｃＤＮＡフラグメントを生じさせる遺伝子を同定した。９３の遺伝子が、２つ以上の配列決定されたクローンを生じさせることを見出し、これは選択されたライブラリにおけるこのような遺伝子の富化を示し、６７の遺伝子が、３つ以上のクローンによって表された。富化された遺伝子のうちの４９個は、２つ以上の同一ではない配列によって表された。この富化クローンの配列は、表４および配列表に提供された。これらのクローンの多くは、対応する遺伝子産物由来のペプチドをコードした。これらの成長阻害ペプチドの配列は、表５および配列番号２２９〜３１４として配列表において提供された。対応する受託番号、ならびに選択されたクローン数および各々の遺伝子由来の異なる配列数を有する富化遺伝子を、表１に列挙した。表２は、細胞増殖に関与することが以前に公知であった富化遺伝子を列挙し、そして表３は、細胞増殖に関与することが以前には公知でなかった富化遺伝子を列挙した。
【００８７】
以下の規準を、遺伝子の表２または表３への割り当てについて使用した。各々の遺伝子の機能を、ＮＣＢＩのＬｏｃｕｓＬｉｎｋデータベースにおいて対応するエントリーに従って第一に確認した。この情報に基づいて、基本的な細胞機能（例えば全般的な転写または翻訳）に不可欠な遺伝子、および細胞周期進行または発癌における役割を果たすことが公知の遺伝子を表３から除外し、そして表２に割り当てた。次いで他の遺伝子の機能を、検索のキーワードとしてＬｏｃｕｓＬｉｎｋに列挙される遺伝子のすべての一般的名称を使用して、当該分野のデータベース検索を通じて調査した。この分析を通じて、さらなる遺伝子を、以下の規準によって表２に割り当てた：（ｉ）遺伝子の過剰発現（単独または組み合わせて）が、新生物形成の形質転換または細胞の不死化を促進することが示された場合；（ｉｉ）遺伝子機能または遺伝子発現の阻害が、細胞成長の阻害または細胞死を生じることが示された場合；（ｉｉｉ）遺伝子のホモ接合体ノックアウトが、哺乳動物における胚致死であることが示された場合；または（ｉｖ）遺伝子が、任意の型の癌の相当多量の画分において、遺伝子変化（例えば遺伝子の増幅、リアレンジまたは点突然変異）を通じて活性化されることが見出された場合。次いで上記の規準のいずれも満たさなかった遺伝子を、表３に割り当てた。
【００８８】
（４．     腫瘍細胞の成長を阻害する遺伝子抑制因子の分析）
富化遺伝子を代表する個々に選択されたクローンを、ＧＳＥ活性についての機能的試験によって分析した。これらのアッセイの結果を、表１に要約した。第一のアッセイは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−３’ＳＳ３１細胞への個々の推定ＧＳＥクローン（ＬＮＸＣＯ３ベクターにおける）の形質導入、その後の感染集団（ＬＮＸＣＯ３のｎｅｏ遺伝子についての）のＧ４１８選択、およびＢｒｄＵ自殺のＩＰＴＧ依存性生存についての形質導入集団の試験を含んだ。後者のアッセイは、以下の通りに行われた。感染細胞（Ｐ１００当たり２００，０００、三部で）を、５０μＭ  ＩＰＴＧで７２時間処理し、次いで５０μＭ  ＩＰＴＧおよび５０μＭ  ＢｒｄＵで４８時間処理した。平行した一組の細胞を、同じ様式（ただしＩＰＴＧを含まず三部で）で処理した。次いで細胞を、白色光で照射し、そしてＢｒｄＵおよびＩＰＴＧの非存在環境下において１２〜１４日間回収した。結果を、Ｐ１００当たりの平均のコロニー数として、標準偏差で表した。各々の組のアッセイにおいて、インサートを含まないＬＮＸＣＯ３ベクターを、ネガティブコントロールとして使用した。ポジティブコントロールとして、ＣＤＫインヒビターｐ２１を発現するＬＮＸＣＯ３ベクターを使用したが、このコントロールは、過剰にポジティブな値の生存コロニーを矛盾なく与えた。別のポジティブコントロールは、増殖関連の転写因子Ｓｔａｔ３由来のＧＳＥを含み、これは、複数のアッセイにおいて、中位であるが再現可能にポジティブな結果を生じた。表１は、ＩＰＴＧの存在環境下および非存在環境下において生存するコロニー数の差異のｔ試験分析が、Ｐ＜０．０５という有意性値を提供する場合に、ポジティブであるとして（機能的アッセイの行において「Ａ」）このアッセイ（ＢｒｄＵ自殺のＩＰＴＧ依存性生存）の結果を列挙した。ポジティブＧＳＥの亜集団に対するこの分析の結果を、図５に示した。
【００８９】
ＢｒｄＵ自殺のＩＰＴＧ依存性生存についてのアッセイを、ポジティブな結果を有する３８の遺伝子由来のＧＳＥについて行った。このアッセイにおいてポジティブと与えられたいくつかの感染細胞集団をまた、ＩＰＴＧによる直接的な成長阻害についてのより厳密なアッセイによって試験した。しかしどの試験集団も、ＩＰＴＧによって顕著な成長阻害を示さなかった。類似の結果（ＢｒｄＵ選択においてはポジティブであるが、成長阻害アッセイにおいてはポジティブではない）が、ユビキチン結合酵素をコードする弱い成長阻害ｃＤＮＡクローンについて、Ｐｅｓｔｏｖら（１９９８、同書）によって報告された。このような細胞集団におけるＢｒｄＵ自殺の増大が、感染細胞間のＧＳＥ発現および機能の異質性を反映するか否かを決定するために、複数（１０以上）のクローン細胞系統を、感染集団の亜集団から作製し、そしてＩＰＴＧによって成長阻害される能力について試験した。このプロセスを通じて、１９の富化遺伝子由来のＧＳＥを含むＩＰＴＧ阻害性細胞系統を産生した。このアッセイによってポジティブと与えられた遺伝子を、表１に示した（機能的アッセイの行において「Ｂ」）。これらのＧＳＥ含有細胞系統と対照的に、インサートを含まないＬＮＸＣＯ３ベクターで形質転換された細胞は、ＩＰＴＧの存在環境下において成長阻害を示さなかった。ポジティブな細胞系統を用いたＩＰＴＧ成長阻害アッセイの結果を、図６に示した。
【００９０】
７つの試験遺伝子からの推定ＧＳＥは、コントロールのＬＮＸＣＯ３ウイルスまたは他の試験クローンで感染された細胞に比べて、Ｇ４１８耐性インフェクタントの収量を非常に減少した。これらのクローンで感染されたＧ４１８耐性細胞の得られる小集団が拡張し、そしてＢｒｄＵ自殺のＩＰＴＧ依存性生存について試験された場合、これらの集団のほとんどすべてが、ネガティブな結果を生じた。際立って、このカテゴリー（表１の機能的アッセイの行において「Ｃ］）における大半の遺伝子は、細胞成長の重要なポジティブレギュレーターであることが公知であり（ＪＵＮ  Ｂ、ＩＮＴ−２、ＭＣＭ−３複製タンパク質、プロテインキナーゼＣのδおよびηアイソフォーム）、従って、成長阻害ＧＳＥを生じさせることが期待された。ＬＮＸＣＯ３ベクターは、ＩＰＴＧの非存在環境下において十分な基礎的発現を提供することが公知であるので（ＣｈａｎｇおよびＲｏｎｉｎｓｏｎ、１９９６）、この群は、最も強い機能的ＧＳＥを有し得るようであり、このＧＳＥは、ＩＰＴＧの非存在環境下でさえも細胞成長を阻害した。概して言えば、５１の遺伝子全体からのＧＳＥが、機能的アッセイ（ＢｒｄＵ自殺のＩＰＴＧ依存性生存またはＩＰＴＧ依存性の成長阻害）、あるいは推定のポジティブな規準（明白な感染率の減少）によって今までのところ確認されていた。
【００９１】
表２に示される遺伝子は、細胞成長または新生物形成の形質転換のポジティブレギュレーターであることが公知であった。これらは、細胞周期進行（例えばＣＣＮ  Ｄ１およびＣＤＫ２）またはＤＮＡ複製（例えばＰＣＮＡ、ＲＰＡ３またはＭＣＭ−３）、成長因子（例えばＩＮＴ−２／ＦＧＦ−３およびＴＤＧＦ１）および成長因子レセプター（例えばＦＧＦＲ１、Ｃ−ＫＩＴ）、細胞増殖のポジティブレギュレーターであることが公知の転写因子（例えばＳＴＡＴ３、ｃ−ＦＯＳ、ＮＦκＢ−１）、いくつかの増殖関連シグナル伝達タンパク質（例えばＰＫＣ（発癌プロモーターの主な標的）の３つのアイソフォーム）および３つのインテグリンタンパク質、ならびにタンパク質合成に必要とされるいくつかのリボソーム成分に直接関与する遺伝子を有した。富化遺伝子は、多くの公知の癌原遺伝子（例えばＪｕｎＢおよびｃ−ＦＯＳ（これらは、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞における１９遺伝子のライブラリからＰｅｓｔｏｖおよびＬａｕ（１９９４、同書）によって単離された３つの成長阻害ＧＳＥのうちの２つを生じさせた）、ＦＯＳ関連遺伝子、ＩＮＴ−２、ｃ−ＫＩＴ、ＬＹＮ  Ｂ（ＹＥＳ癌原遺伝子）、ＭＥＴ、ＲＡＮ（ＲＡＳファミリーのメンバー）、癌において増幅されることが公知のいくつかの成長促進遺伝子（ＣＣＮ  Ｄ１、ＣＤＫ２、ＦＧＦＲ１）、ならびに癌において過剰発現されることが報告されたいくつかの遺伝子）を有した。富化遺伝子のいくつかは、乳癌との特異的関連を有し、これは、乳房癌遺伝子として本来同定されたＩＮＴ−２（Ｐｅｔｅｒｓら、１９８４、Ｎａｔｕｒｅ  ３０９：２７３〜２７５）、乳癌の実質的少数において増幅されることが見出されたＣＣＮ  Ｄ１およびＦＧＦＲ１（ＢａｒｎｅｓおよびＧｉｌｌｅｔｔ、１９９８、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ．５２：１〜１５；Ｊａｃｑｕｅｍｉｅｒら、１９９４、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５９：３７３〜３７８）ならびにＨＳＰＣＡ（これは、非悪性の乳房組織より高いレベルで、試験された乳癌のすべて（全部で１４３）において発現されることが示された）（Ｊａｍｅｅｌら、１９９２、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５０：４０９〜４１５）を有した。選択配列間の多量のこのような遺伝子は、乳癌細胞におけるポジティブな成長レギュレーターの解明に対して、このアプローチの強力な批准を提供した。
【００９２】
表３の遺伝子は、成長調節における公知の機能を有さなかった。これらの遺伝子は、いくつかの転写因子、シグナル伝達または細胞接着に関与するタンパク質、ＲＮＡ輸送またはタンパク質輸送およびタンパク質プロセシングに関与する多くのタンパク質、細胞成長に関連しない多種多様の他の機能を有する遺伝子群、ならびに機能が現在未知である１０の遺伝子をコードする。
【００９３】
特に見所として挙げられるのは、表３の遺伝子のうち少なくとも３つが、正常な細胞の成長に不可欠ではないらしいことであった。なぜなら、マウスにおけるこれらの遺伝子のホモ接合体ノックアウトは、成熟動物の発生を妨げないからである（いくつかの限定された発生異常を除く）。これらの遺伝子は、Ｌ１ＣＡＭ（Ｄａｈｍｅら、１９９７、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１７  ３４６〜３４９）、ＩＣＡＭ２（Ｇｅｒｗｉｎら、１９９９、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １０：９〜１９）およびフォンウィルブランド因子（Ｄｅｎｉｓら、１９９８、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５：９５２４〜９５２９）を有した。乳癌細胞に対するこれらの遺伝子由来のＧＳＥの効果は、このような「不可欠ではない」遺伝子の阻害は、望ましい腫瘍特異的な抗増殖効果または組織特異的な抗増殖効果を有し得ることを示唆した。
【００９４】
選択ライブラリにおいて富化された外見上不可欠ではない遺伝子の際立った例は（これは、乳癌処置に対する非常に有望な標的として独立して同定されている）、ＨＳＰＣＡ（表２に含まれる）によって提供された。この遺伝子（これは、シャペロンタンパク質の熱ショック応答ファミリーに属し、このタンパク質は、成熟タンパク質のリホールディングにおける役割を果たす）の基本的機能は、細胞成長に必要とされるはずであることを示さなかった。しかしＨＳＰＣＡは、腫瘍形成経路に関与するいくつかのタンパク質（Ｒａｆ、Ｍｅｔ、ステロイドレセプターおよびＨＥＲキナーゼファミリーのメンバーを含む）を安定化させる役割を果たすことが見出され、そして抗腫瘍抗生物質ゲルダナマイシン（Ｓｔｅｂｂｉｎｓら、１９９７、Ｃｅｌｌ  ８９：２３９〜２５０）の標的として役立つことが見出された。このＨＳＰＣＡを阻害するゲルダナマイシンアナログ１７−ＡＡＧは、乳癌細胞系統の成長を阻止することが示されており（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を含む；Ｍｕｎｓｔｅｒら、２００１、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：２９４５〜２９５２）、そしてこのような細胞を化学療法誘導性のアポトーシスに感受性にすることが示された（Ｍｕｎｓｔｅｒら、２００１、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７：２２２８〜２２３６）。１７−ＡＡＧは、現在臨床試験の段階にある。ＨＳＰＣＡの例は、ＧＳＥ選択によって同定された他の外見上不可欠ではない遺伝子が、癌の処置に対する類似の有望な標的を提供するようであることを示唆した。これらの潜在的な新規の標的のいくつかは、次の節により詳細に記載される。
【００９５】
（５．     潜在的な新規の薬物標的）
選択遺伝子のいくつかは、癌の薬物開発に対する潜在的な新規の標的としての考慮を保証した。非限定的な例は、以下の通りであった。
【００９６】
（Ｌ１ＣＡＭ）Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１ＣＡＭ）は、８つのセンス配向のＧＳＥおよび４つのアンチセンス配向のＧＳＥによって成長阻害ＧＳＥの組で代表された。Ｌ１ＣＡＭは、神経細胞、造血細胞および特定の上皮細胞において発現される免疫グロブリンスーパーファミリーの２００〜２２０ｋＤａのＩ型膜糖タンパク質であった。Ｌ１ＣＡＭの非ニューロン（短縮）形態は、黒色腫、神経芽細胞腫、および他の腫瘍細胞型（乳房を含む）において高度に発現された。Ｌ１ＣＡＭは、膜結合形態においてだけではなく、脳および腫瘍細胞の細胞外マトリックスにおいても見出された。可溶性のＬ１ＣＡＭは、グリオーマ細胞の移動を指向し、そして抗Ｌ１ＣＡＭ抗体のうちの１つは、この移動を阻害することが見出された（Ｉｚｕｍｏｔｏら、１９９６、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：１４４０〜１４４４）。このような抗体は、初期のプロトタイプ因子として有用であり、癌の薬物標的としてＬ１ＣＡＭを批准し得る。
【００９７】
細胞表面分子として、Ｌ１ＣＡＭは、異なる型の薬物に容易に到達可能なはずである。図７Ａおよび７Ｂは、クローンのＩＰＴＧ阻害細胞系統におけるＬ１ＣＡＭ由来のＧＳＥの形態学的効果を例示した。ＩＰＴＧでの４日間の処理は、細胞形態を激烈に変更し、この細胞は、ラメリポディアおよび外見上病巣の接着プラークを発達した（図７Ａ）。この効果は、Ｌ１ＣＡＭの標的化から予測されているように、ＩＰＴＧ誘導性ＧＳＥが細胞接着に影響を及ぼすことを示唆した。ＧＳＥ誘導は、細胞成長を阻止するだけでなく、１５〜２０％のＩＰＴＧ処理細胞において有糸分裂の終局も誘導した。有糸分裂の終局は、腫瘍細胞死の主要な形態であり（Ｃｈａｎｇら、１９９９、同書）、これは、異常な有糸分裂形状および複数の小核を有する細胞の形成によって特徴付けられた（図７Ｂ）。ＧＳＥが有糸分裂の終局を誘導する能力は、ＧＳＥ阻害性標的の潜在的な有望さについての良好な一般的徴候であった。
【００９８】
ヒトＬ１ＣＡＭ遺伝子は、重篤なＸ連鎖した神経学的症候群（ＣＲＡＳＨ：脳梁発育不全、遅滞、失語症、痙性対麻痺および水頭症）を伴う患者において変異した。Ｌ１ＣＡＭ「ノックアウト」（−／−）マウスは、成熟期に発達し、そして外見上正常に見えた（成熟マウスよりもわずかに小さい）が、このマウスは、ＣＲＡＳＨ様神経学的欠損に起因して寿命が短く、これは、神経突起成長の減少に関連し得た（Ｄａｈｍｅら、１９９７、同書）。これらの所見は、成人の癌患者におけるＬ１ＣＡＭの標的化は、神経系以外では主要な毒性を有するはずがないことを示唆し、ここで大半の薬物は、血液脳関門に起因して侵入しない。さらにこの神経学的効果は、胚発生の間のＬ１ＣＡＭの欠如にのみ由来し、そして成人におけるＬ１ＣＡＭ阻害から発達しない見込みが大いにあった。
【００９９】
（ＩＣＡＭ２）細胞間接着分子２（ＩＣＡＭ２）は、２つのセンス配向のＧＳＥおよび１つのアンチセンス配向のＧＳＥによって成長阻害ＧＳＥの組で代表された。ＩＣＡＭ２は、Ｌ１ＣＡＭと多くの類似点を有し、そしてまた、正常な細胞の成長に不可欠ではなかった（Ｇｅｒｗｉｎら、１９９９、同書）。例えば抗ＩＣＡＭ２抗体は、プロトタイプ薬物についての興味深い可能性であった。
【０１００】
（ＮＩＮ２８３）この遺伝子は、神経損傷の際にシュワン細胞において誘導されていると最近記載されており（Ａｒａｋｉら、２００１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３４１３１〜３４１４１）、そしてＮＩＮ２８３と称された。ＮＩＮ２８３の誘導は、シュワン細胞の損傷応答の一部であり、次いでこれは、損傷された神経の成長を促進するように作用した。ＮＩＮ２８３はまた、神経成長因子（ＮＧＦ）によって誘導された。Ｌ１ＣＡＭのように、ＮＩＮ２８３は、主に脳において発現した。これは、リソソームに局在化し、進化において高度に保存され（ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａおよびＣ．ｅｌｅｇａｎｓにおいて同定可能なホモログを有する）、そして１つのジンクフィンガーモチーフおよびＲＩＮＧフィンガーモチーフの独特の組み合わせを含んだ。これらの構造的特長および局在化に基づいて、Ａｒａｋｉら（２００１、同書）は、ＮＩＮ２８３は、ユビキチン媒介性のタンパク質修飾およびタンパク質分解に関与し得ることを推測した。タンパク質修飾におけるこの推定機能、ストレス誘導性および進化の保存によって、ＮＩＮ２８３は、上記で議論されるＨＳＰＣＡに対するアナログのようであった。
【０１０１】
ここで、この遺伝子は、乳癌の成長阻害アッセイにおいて最も強力な機能的に活性なＧＳＥのうちの１つを生じさせることが見出された。ＮＩＮ２８３の機能的ドメインに対して利用可能な情報は、この目的タンパク質の低分子インヒビターの構造ベースの合理的設計に有用なはずであった。
【０１０２】
（ＡＴＦ４）Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ４は、これらの選択アッセイにおいて最も高度に富化されたアンチセンスＧＳＥを生じさせた。ＡＴＦ４のホモ接合体ノックアウトは、重要ではない発生異常（眼のレンズにおいて；Ｔａｎａｋａら、１９９８、Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ３：８０１〜８１０；Ｈｅｔｔｍａｎｎら、２０００、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２２２：１１０〜１２３）にのみ帰着し、これは、この因子が、正常な細胞成長に不可欠ではないことを示した。本明細書中で開示される結果は、ＡＴＦ４を乳癌細胞の増殖に関係させ、そしてＡＴＦ４の発現および機能は、ヒレグリンβ１（乳癌細胞の成長を刺激する因子）によって増大されるという当該分野における報告によって補強された（Ｔａｌｕｋｄｅｒら、２０００、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：２７６〜２８１）。
【０１０３】
（Ｚｉｎｅｄｉｎ）Ｚｉｎｅｄｉｎは、ＷＤ反復ドメインを含む最近記載されたカルモジュリン結合タンパク質であり、これは優先的に脳において発現された（Ｃａｓｔｅｔｓら、２０００、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１９９７０〜１９９７７）。この発現パターンは、ｚｉｎｅｄｉｎ標的化薬物が、任意の正常な増殖細胞に対する影響を有さないようであることを示唆した。しかしｚｉｎｅｄｉｎ由来のアンチセンス配向のＧＳＥは、ＩＰＴＧ依存性のＢｒｄＵ自殺アッセイおよびＩＰＴＧ阻害性の細胞系統を生じさせる能力の両方によって、乳癌細胞の成長を阻害することが本明細書中では見出されなかった。ｚｉｎｅｄｉｎの構造分析は、カルモジュリンおよびカベオリンとの相互作用を媒介するような特定のドメインを示した（Ｃａｓｔｅｔｓら、同書）。これらのドメインの構造ベースの標的化、ならびにｚｉｎｅｄｉｎ−カルモジュリン相互作用の妨害に基づくスクリーニングは、ｚｉｎｅｄｉｎ標的化薬物の開発についての戦略として使用され得る。
【０１０４】
（新規の遺伝子）この選択によって同定されるいくつかの遺伝子は、公知の機能を有さないか、公知の遺伝子または同定可能な機能的ドメインとの著しい相同性を有さなかった。これらの結果は、このような遺伝子に対する第一の機能的証拠を提供した。最も高度に富化され、そして機能的に活性なＧＳＥのうちの１つは、ＧＢＣ−１（Ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  １）と称された。ＧＢＣ−１の翻訳されたタンパク質配列は、仮説に基づいた無名のタンパク質（受託番号ＸＰ＿０３１９２０）の部分的なセンス配向の配列に照合した。ＧＢＣ−１  ＧＳＥは、ヘリカルリピートペプチドをコードした。このＧＳＥの強力な成長阻害活性は、このペプチド由来の分子またはこのペプチドを模倣する分子が抗腫瘍活性を有するようであることを示唆した。本明細書中で開示されるＧＢＣ−１ペプチドは、プロトタイプ薬物とみなされ得、この構造を使用して、合成化合物の合理的設計を指向し得た。
【０１０５】
本発明において同定される他の新規の遺伝子の中で、本明細書中でＧＢＣ−３（Ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ３）およびＧＢＣ−１１（Ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  １１）と称される２つの遺伝子は、最も高度に富化され、そしてこれらのＧＳＥは、強力な機能的活性を示した。これらのＧＳＥを含み、そしてＩＰＴＧでの処理によって効率的に成長阻害される細胞系統は、ＧＢＣ−３阻害またはＧＢＣ−１１阻害の細胞性効果の特徴付けに有用であった。ＧＢＣ−３は、他の点では特徴付けられないＥＳＴ  ＡＡ４４３０２７に照合し、そして染色体３ｑ２９にマッピングし、ＧＢＣ−１１は、染色体１４にマッピングし、そして任意の公知のｃＤＮＡ配列を照合しなかった。ＧＢＣ−３は、ＮＣＢＩ  ＳＡＧＥデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＡＧＥ／ｓａｇｅｖｎ．ｃｇｉ）を用いて行われる「仮想ノーザン」分析に従って、すべての細胞型において極めて低いレベルで発現されるようであり、これは、阻害のための容易な標的であり得ることを示唆した。
【０１０６】
（６．     試験化合物のインビボ試験）
表３に示される遺伝子の発現または活性を阻害する効能は、以下のようにインビボで試験された。
【０１０７】
表３における遺伝子の発現または活性を阻害する本発明のＩＰＴＧ誘導性ＧＳＥを発現する細胞（１〜２×１０６）を、異種移植片として最も好ましくはマウスの一方の側腹においてマウスに注入し、その結果腫瘍成長は、視覚的にモニターされ得た。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌のマウス異種移植片におけるＩＰＴＧ調節性の遺伝子発現は、例えばＬｅｅら（１９９７、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３：１０６２〜１０６８）によって当該分野において実証されており、そして本明細書中で記載される実験は、Ｌｅｅらによって記載されるように実質的に行われ得たが、本発明のＧＳＥ含有腫瘍細胞を用いて行われ得た。逆に、ＧＳＥナイーブな腫瘍細胞は、各々のマウスにおいて反対の側腹に注入された。２組の注入マウスを、平行して収容および飼育し、１組のマウスは、Ｌｅｅらによって教示されるような濃度でＩＰＴＧを補充された飼料を与えられ、そして他の組のマウスは、ＩＰＴＧ補充飼料を受けなかった。発現した腫瘍を、腫瘍細胞の成長の程度が致命的または過酷になるまで、過酷な動物飼育条件下でマウスに対して観察した。生検サンプルを採取し、そして腫瘍を測定し、そして動物屠殺後に体重を量って、各々のマウスにおけるＧＳＥ発現腫瘍と非ＧＳＥ発現腫瘍との間の差異、およびＩＰＴＧ補足を受けたマウスとＩＰＴＧ補足を受けていないマウスとの間の差異を決定した。
【０１０８】
ＩＰＴＧを受けたマウスは、成長がＩＰＴＧによって影響されないナイーブな異種移植片細胞の１つの腫瘍を生じた。これらの腫瘍は、ＩＰＴＧを受けていないマウスのナイーブな異種移植片細胞およびＧＳＥ含有異種移植片細胞の腫瘍の両方のサイズに実質的に等しかった。対照的に、ＩＰＴＧを受けたマウスのＧＳＥ含有異種移植片細胞から生じた腫瘍は、他の腫瘍よりもかなり小さかった。生検は、ＩＰＴＧを受けていないマウスのナイーブな異種移植片細胞およびＧＳＥ含有異種移植片細胞の腫瘍の両方、ならびにＩＰＴＧを受けたマウス由来のナイーブな異種移植片細胞において腫瘍細胞の増殖を示し、そしてＧＳＥ含有異種移植片腫瘍における細胞の休止または死を示した。
【０１０９】
これらの結果は、表３に示される遺伝子の発現または活性の阻害が、インビボで腫瘍細胞の成長を阻害したことを実証した。
【０１１０】
上述の開示が、本発明のある特定の実施態様を強調し、そしてそれに等しいすべての改変または代案が、添付の特許請求の範囲に示されるような本発明の趣旨および範囲内にあることが理解されるべきである。
【表１】
2005516586.tif 000003
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【０１１１】
【表２】
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【０１１２】
【表３】
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【０１１３】
【表４】
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【０１１４】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】図１は、遺伝子抑制因子テクノロジーの原理を例示する概略図である。
【図２】図２は、ＬＮＣＸＣＯ３レトロウイルスベクターの構造の概略図である。
【図３】図３は、ＢｒｄＵ選択プロトコルの概略図である。
【図４】図４は、ＩＰＴＧの存在環境下または非存在環境下においてＢｒｄＵ自殺選択に供されたライブラリ形質導入細胞を含む細胞培養プレートの写真であり、これは、Ｇ４１８選択直後（上）、ＩＰＴＧ存在環境下において１回のＢｒｄＵ自殺選択後（中央）またはＩＰＴＧ存在環境下において２回のＢｒｄＵ自殺選択後（下）である。
【図５】図５は、ＢｒｄＵ自殺に対するＩＰＴＧ依存性の耐性について、個々のＧＳＥで形質導入された細胞集団の試験の結果の棒グラフであり、三部で測定され、そしてＩＰＴＧの存在環境下および非存在環境下においてＢｒｄＵ自殺選択を生き残るコロニー数の平均および標準偏差として表される。示される結果についての配列は、ＧＳＥ（配列番号）である：ＧＢＣ−１（７９）、ＧＢＣ−３（９４）、ＳＴＡＴ３（２０５）、ＳＴＡＴ５ｂ（２１１）、ＰＲＬ３１（１９２）、ＧＢＣ−１１（８５）、Ｌ１ＣＡＭ（１２５）、ＩＮＴＢ５（１１２）、ＯＫＣη（１７０）、ＶＷＦ（２２５）、ＺＩＮ（２２８）、ＨＳＰＣＡ（１０３）、ＣＤＣ２０（３７）、ＰＫＣζ（１７２）、ＣＤＫ１０（３９）、ＤＡＰ３（５９）、ＲＰＡ３（１９０）、ＮＦκＢ１（１５７）、ＨＥＳ６（９９）およびＭＢＤ１（１４２）。
【図６】図６は、個々のＧＳＥで形質導入されたクローン細胞系統を用いて実施されたＩＰＴＧ成長阻害アッセイの結果の棒グラフであり、三部で測定され、そしてＩＰＴＧの存在環境下および非存在環境下における培養７日後の細胞数の平均および標準偏差として表される。示される結果についての配列は、ＧＳＥ（配列番号）である：ＨＮＲＰＦ（１０１）、ＨＲＭＴ１Ｌ２（１０２）、ＳＴＡＴ５ｂ（２１１）、ＣＣＮＤ１（５７）、２８Ｓ  ＲＮＡ（１７）、ＲＰＬ３１（１９２）、ＣＤＫ２（４０）、ＡＨＲＧ（１８３）、ＧＢＣ−１（７９）、Ｌ１ＣＡＭ（１２５）、ＮＩＮ２８３（１５８）、ＭＹＬ６（１５５）、ＤＡＰ３（５９）、ＴＡＦ７（２１５）、ＳＴＡＴ３（２０５）、ＩＦ１（３２）、ＧＢＣ−１１（８５）、ＬＹＮ（１３８）、ｃ−ＫＩＴ（４８）、ＧＢＣ−３（９４）、ｅＩＦ−３（６２）、ＰＫＣη（１７０）、ＥＦＮＡ１（６７）、ＡＴＦ４（２７）、ＨＮＲＰＡ２Ｂ１（１０２）、ＧＢＣ−１２（８６）、ＩＮＴＢ５（１１２）、ＢＡＭ２２（３５）、ＦＯＳ（４３）、ＦＧＦＲ１（７７）およびＫＩＡＡ１２７０（１２３）。
【図７】図７Ａおよび図７Ｂは、クローンＩＰＴＧ阻害細胞系統におけるＬ１ＣＡＭ由来ＧＳＥ（配列番号１３４）の形態学的効果を例示する顕微鏡写真である。図７Ａは、ＩＰＴＧ処理４日の細胞形態に対する効果を示す。図７Ｂは、ＩＰＴＧ処理細胞における有糸分裂の終局の証拠を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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