(57)【要約】生物学的年齢関連マーカーを同定する方法を開示する。当該方法は、第一の遺伝子型を有する第一の生物および第二の遺伝子型を有する第二の生物を提供し、ここで第一および第二の生物が同一種に由来し、かつ同一の暦年齢である；第一の生物においてある生体分子に関連する特性を、第二の生物におけるその生体分子に関連する特性と比較し、前記特性について所定の値を有する生体分子を同定し、それによってその生体分子を生物学的年齢関連マーカーとして同定する；各工程を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的年齢関連マーカーを同定する方法であって：
第一の遺伝子型を有する第一の生物および第二の遺伝子型を有する第二の生物を提供し、ここで第一および第二の生物が同一種に由来し、かつ同一の暦年齢である；
前記第一の生物におけるある生体分子に関連する特性を、前記第二の生物におけるその生体分子に関連する特性と比較して、該特性について所定の値を有する生体分子を同定し、それによってその生体分子を生物学的年齢関連マーカーとして同定する；各工程を含む方法。
【請求項２】
生体分子に関連する複数の特性が比較されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記比較工程が、第一の生物に由来する第一の生物試料および第二の生物に由来する第二の生物試料を提供する工程、および各生物試料における前記生体分子の特性を評価する工程を含むことを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項４】
複数の生体分子のそれぞれの特性について比較が繰り返されることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記生体分子が核酸を含むことを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項６】
前記生体分子がタンパク質を含むことを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項７】
前記特性が量であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記特性が生体分子の化学組成であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記特性が翻訳後修飾であることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項１０】
前記特性が機能的活性であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記機能的活性が、反応性酸素種(ＲＯＳ)の存在下で評価されることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記特性が細胞亜群の分布であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記特性が、別の生体分子との物理的会合であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記比較工程が、核酸アレイへのハイブリダイゼーションを含むことを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項１５】
前記比較工程が、核酸タグ分析を含むことを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項１６】
複数のマーカーが同定され、その複数性が、前記複数の生体分子の亜集合であることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項１７】
前記比較工程が、各試料を評価して、複数のマーカー候補それぞれについて一または複数の特性に関する情報を含む試料プロファイルを与える工程、該プロファイルに関する情報を機械アクセス可能な媒体に保存する工程、対応するマーカー候補間の差の統計的有意性を評価する工程、および差が統計的に有意であるマーカー候補の亜集合を特定する情報を表示する工程、を含むことを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項１８】
前記第一および第二の生物が無脊椎動物であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１９】
前記第一および第二の生物が脊椎動物であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２０】
前記第一の遺伝子型が野生型遺伝子型であり、かつ前記第二の遺伝子型が突然変異型遺伝子型であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２１】
前記第二の突然変異型遺伝子型が、野生型遺伝子型との比較における寿命の変化によって特徴づけられることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記寿命の変化が、寿命延長であることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記寿命の変化が、寿命短縮であることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
前記第二の遺伝子型が、各々独立に寿命を変化させる同型接合の突然変異を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２５】
前記第一の遺伝子型が突然変異型遺伝子型であり、かつ第二の遺伝子型が突然変異型遺伝子型であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２６】
前記第一の遺伝子型が、同一種の野生型生物と比較して寿命延長を引き起こし、前記第二の遺伝子型が、同一種の野生型生物と比較して寿命短縮を引き起こすことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２７】
暦年齢が成年であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２８】
暦年齢が、前記第一の生物の平均寿命の５０％と７５％の間であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２９】
前記第二の生物が、前記第一の生物の平均寿命より少なくとも２０％長い平均寿命を有することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３０】
前記第二の生物が、同一種の野生型生物の平均寿命より少なくとも２５％長い平均寿命を有することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３１】
前記第二の生物が、同一種の野生型生物の平均寿命より少なくとも２５％短い平均寿命を有することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３２】
前記第二の遺伝子型が、成長ホルモンまたはインスリン様成長因子シグナル伝達成分に欠陥を引き起こすことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３３】
前記比較工程が、複数の暦年齢で繰り返されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３４】
前記生物試料が、精製タンパク質の混合物を含むことを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項３５】
第二の動物種の生体分子から、同定されたマーカーのオルソログを選択し、前記第二の種の生物においてそのオルソログの一または複数の特性を評価する、各工程をさらに含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３６】
前記評価工程が、第二の種の遺伝的同一生物におけるオルソログの特性を評価する工程を含み、該生物が異なる暦年齢であることを特徴とする請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
第三の生物試料中のマーカーの特性を評価する工程をさらに含むことを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項３８】
前記第三の生物試料が、被験化合物で処理した培養細胞から得られたものであることを特徴とする請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
前記第三の生物試料が、被験化合物で処理した動物から得られたものであることを特徴とする請求項３７記載の方法。
【請求項４０】
前記処理動物が、被験化合物でその平均寿命の２５％未満の間処理されたものであることを特徴とする請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
同定された生体分子の特性が量であり、かつ所定の値がその特性における少なくとも２倍の差に相当することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４２】
前記第一および第二の生物試料が、同一の特定組織から得られたものであることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項４３】
マーカーを選択する方法であって、
参照動物における一または複数の遺伝子の発現を、同一種の遺伝的に異なる動物における一または複数の遺伝子の発現と比較し；さらに
前記参照動物と遺伝的に異なる動物とが同一の暦年齢であり、かつ遺伝的に異なる動物が参照動物より少なくとも２０％長い平均寿命を有するという条件で、参照動物と比較して、遺伝的に異なる動物において差別的に発現される遺伝子を選択する；各工程を含む方法。
【請求項４４】
マーカーを選択する方法であって、
野生型生物における一または複数の遺伝子の発現を、同一種の遺伝的に異なる生物における一または複数の遺伝子の発現と比較し；
前記野生型生物と遺伝的に異なる生物とが同一の暦年齢であり、かつ遺伝的に異なる生物が野生型生物と比較して早期に老化するという条件で、差別的に発現される遺伝子を選択する；各工程を含む方法。
【請求項４５】
バイオマーカーを同定する方法であって、
(ａ)環境ストレスに対する応答を変化させる化合物で処理した被験体、または(ｂ)各生体分子について被験体に関連する特性を得るために前記処理した被験体から得た試料において、生体分子を評価し；
各被験体に関連する特性を、対応する対照被験体に関連する参照特性と比較して、対照被験体と比べて処理被験体で統計的に識別可能な特性を有する候補生体分子を同定し；さらに
その特性が生物の寿命の指標である一または複数のマーカー候補を同定する；各工程を含む方法。
【請求項４６】
前記化合物が酸化的ストレスを緩和することを特徴とする請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
前記同定工程が：
異なる暦年齢の遺伝的類似動物において、各候補分子のそれぞれの特性を評価する工程；および
その特性が暦年齢の指標である一または複数のマーカー候補を同定する工程；を含むことを特徴とする請求項４５記載の方法。
【請求項４８】
前記同定工程が：
第一の動物の遺伝子型が第二の動物の遺伝子型とは異なる平均寿命に関連している、同一の暦年齢の第一および第二の動物において、各候補分子のそれぞれの特性を評価する工程；および
その特性が、遺伝的に異なる動物間で異なり、かつ生物学的年齢の指標である、一または複数のマーカー候補を同定する工程；を含むことを特徴とする請求項４５記載の方法。
【請求項４９】
前記化合物が、ビタミンＥ、ビタミンＡ、ベータ−カロチンおよびＮ−アセチルシステインから成る群より選択されることを特徴とする請求項４６記載の方法。
【請求項５０】
前記化合物が、スーパーオキシドジスムターゼを活性化することを特徴とする請求項４６記載の方法。
【請求項５１】
前記化合物がマンガンであることを特徴とする請求項４６記載の方法。
【請求項５２】
核酸マーカーを選択する方法であって、
野生型動物に由来する第一の核酸集団および突然変異動物に由来する第二の核酸集団を提供し、ここで野生型動物と突然変異動物が同一の暦年齢であり、かつ前記核酸集団が、その転写物またはｃＤＮＡ複製物を含む；
ハイブリダイゼーションプローブを用いて、前記第一および第二の核酸集団を評価し；さらに
前記第一および第二の核酸集団中での量が異なる核酸を同定し、それによって核酸マーカーを同定する；各工程を含む方法。
【請求項５３】
複数の記録を含むデータベースであって、
各記録が、(ａ)生体分子の同定、(ｂ)対象生物における前記生体分子の特性、(ｃ)前記対象生物の遺伝子型、および必要に応じて、(ｄ)前記対象生物の年齢、を示す情報を含み、
(１)該データベースが、同一種の生物について、異なる予想寿命と関連付けられている少なくとも二つの遺伝子型の記録を含み、さらに
(２) 該データベースにアクセスして、異なる予想寿命に関連する遺伝子型について異なる特性を有する生体分子の記録を特定できることを特徴とする、データベース。
【請求項５４】
前記記録が、(ｅ)対象生物の被験化合物への曝露についての情報をさらに含むことを特徴とする請求項５３記載のデータベース。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
生物学における多くの過程は保存されている。たとえば、哺乳類とショウジョウバエと線虫の体制構成は視覚的類似点をほとんど持たないが、体制構成の基本的な分子的制御は高度に保存されている。たとえば、これらの生物のすべてが、体制中で細胞の特性を指定するホメオボックスタンパク質をコードする遺伝子群を有する(非特許文献１)。
【０００２】
多様な動物間の保存はまた、予想寿命における大きな格差にかかわらず、寿命 調節の分子的機構にも及ぶ。一例では、インスリン様成長因子の濃度は少なくとも線虫とマウスの両方の寿命を調節する。線虫Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）では、インスリン様成長因子受容体をコードするｄａｆ−２遺伝子の突然変異は、寿命を少なくとも５０％延長する(非特許文献２)．線虫におけるこの寿命延長表現型は、ＨＮＦ−３／フォークヘッド転写因子ｄａｆ−１６に依存する。マウスでは、インスリン様成長因子の濃度はまた寿命と相関する。延長した寿命とＰｒｏｐ−１遺伝子の同型接合の突然変異を有するＡｍｅｓマウスは、成長ホルモン産生細胞がほぼ存在しないこと、および結果として減少したインスリン様成長因子−１(ＩＧＦ−１)によって特徴づけられる(非特許文献３)。さらに、インスリン様成長因子受容体および転写因子タンパク質のようなタンパク質は、線虫と 哺乳類の間でアミノ酸配列レベルで保存されている。
【０００３】
他の過程が生理学的華麗の速度に影響を与えることが見出されている。これらの過程は、酸化的損傷への応答、遺伝子サイレンシングの調節、および代謝知覚を含む(非特許文献４)。加齢の表現型的な側面の多くもまた、異なる動物間で同様である。より高齢の動物の外見もまた典型的にはより若齢の動物とは異なる。
【特許文献１】米国特許第５，１４３，８５４号明細書
【特許文献２】米国特許第５，５１０，２７０号明細書
【特許文献３】米国特許第５，５２７，６８１号明細書
【特許文献４】米国特許第５，３８４，２６１号明細書
【特許文献５】米国特許第５，２８８，５１４号明細書
【特許文献６】国際特許出願第ＵＳ９３／０４１４５号
【特許文献７】米国特許第４，６８３，２０２号明細書
【特許文献８】米国特許第４，２７７，４３７号明細書
【特許文献９】国際公開第９９／５１７７３号パンフレット
【特許文献１０】米国特許第５，０１０，１７５号明細書
【特許文献１１】国際公開第９１／１９７３５号パンフレット
【特許文献１２】国際公開第９３／２０２４２号パンフレット
【特許文献１３】国際公開第９２／０００９１号パンフレット
【特許文献１４】米国特許第５，５３９，０８３号明細書
【特許文献１５】国際特許出願第ＵＳ９６／１０２８７号
【特許文献１６】米国特許第５，５９３，８５３号明細書
【特許文献１７】米国特許第５，５６９，５８８号明細書
【特許文献１８】米国特許第５，５４９，９７４号明細書
【特許文献１９】米国特許第５，５２５，７３５号明細書
【特許文献２０】米国特許第５，５１９，１３４号明細書
【特許文献２１】米国特許第５，５０６，３３７号明細書
【特許文献２２】米国特許第５，２８８，５１４号明細書
【特許文献２３】米国特許第５，２２３，４０９号明細書
【特許文献２４】米国特許第５４０３８３４号明細書
【特許文献２５】米国特許第５６９６１０９号明細書
【特許文献２６】米国特許第５８２７８８０号明細書
【特許文献２７】米国特許第５８３４５０９号明細書
【特許文献２８】米国特許第６０４６１８８号明細書
【非特許文献１】Ｋｅｎｙｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １９９４；１０(５)： １５９−６４
【非特許文献２】Ｋｅｎｙｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ １９９３； ３６６：４６１−４
【非特許文献３】Ｂｒｏｗｎ−Ｂｏｒｇ Ｎａｔｕｒｅ １９９６； ３８４：３３
【非特許文献４】Ｇｕａｒｅｎｔｅ ａｎｄ Ｋｅｎｙｏｎ， Ｎａｔｕｒｅ ２０００； ４０８：２５５
【非特許文献５】Ｅ． Ｂｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ３， １２７３−１２８７ (１９８９)
【非特許文献６】Ｓｐｒａｄｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２１８， ３４１−３４７ (１９Ｓ２)
【非特許文献７】Ｄｅ Ｗｉｌｄｔ ｅｔ ａｌ．， (２０００) Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １８：９８９−９９４
【非特許文献８】Ｌｕｅｌｄｎｇ ｅｔ ａｌ．， (１９９９) Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２７０：１０３−１１１
【非特許文献９】Ｇｅ， Ｈ． (２０００) Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２８：ｅ３， １−ＶＩＩ
【非特許文献１０】ＭａｃＢｅａｔｈ ａｎｄ Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ， (２０００) Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８９， １７６０−１７６３
【非特許文献１１】Ｈａａｂ ｅｔ ａｌ．， (２００１) ＧｅｎｏｍｅＢｉｏｌｏｇｙ ２(２)：ｒｅｓｅａｒｃｈ０００４．１
【非特許文献１２】Ｍｅｎｄｏｚａ， ｅｔ ａｌ． (１９９９)． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２７， ７７８−７８８
【非特許文献１３】Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ (１９７０) Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４４−４５３
【非特許文献１４】Ｅ． Ｍｅｙｅｒｓ ａｎｄ Ｗ． Ｍｉｌｌｅｒ (１９８９) ＣＡＢＩＯＳ， ４：１１−１７
【非特許文献１５】Ａｌｔｓｃｈｕｌ， ｅｔ ａｌ． (１９９０) Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−１０
【非特許文献１６】Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， (１９９７) Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５ ：３３８９−３４０２
【非特許文献１７】Ｆｕｒｋａ， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔ． Ｐｒｏｔ． Ｒｅｓ． ３７：４８７−４９３ (１ ９９１)
【非特許文献１８】Ｈｏｕｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ ， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８４−８８ (１９９１)
【非特許文献１９】Ｈｏｂｂｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：６９０９−６９１３ (１９９３)
【非特許文献２０】Ｈａｇｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ ， Ｊ． Ａｍｅｒ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １ １４：６５６８ (１９９２)
【非特許文献２１】Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍｅｒ． Ｃｈｅｍ， Ｓｏｃ． １１４：９２１７−９２１８(１９９２)
【非特許文献２２】Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍｅｒ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１６：２６６１ (１９９４)
【非特許文献２３】Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１： １３０３ (１９９３)
【非特許文献２４】Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ５９：６５８(１９９４)
【非特許文献２５】Ｖａｕｇｈｎ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １４(３)：３０９−３１４(１９９６)
【非特許文献２６】Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７４：１５２０−１５２２ (１９９６)
【非特許文献２７】Ｂａｕｍ Ｃ&ＥＮ， Ｊａｎ １８， ｐａｇｅ ３３ (１９９３)
【非特許文献２８】ＤｅＷｉｔｔ ｅｔ ａｌ (１９９３) Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９０：６９０９
【非特許文献２９】Ｅｒｂ ｅｔ ａｌ． (１９９４) Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：１１４２２
【非特許文献３０】Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． (１９９４)． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３７：２６７８
【非特許文献３１】Ｃａｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ． (１９９４) Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． ３３：２０５９
【非特許文献３２】Ｃａｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ． (１９９４) Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． ３３：２０６１
【非特許文献３３】Ｇａｌｌｏｐ ｅｔ ａｌ (１９９４) Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３７：１２３３
【非特許文献３４】Ｌａｍ (１９９７) Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．１２：１４５
【非特許文献３５】Ｈｏｕｇｈｔｅｎ (１９９２) Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３ ：４１２−４２１
【非特許文献３６】Ｌａｍ (１９９１) Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４
【非特許文献３７】Ｆｏｄｏｒ (１９９３) Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５−５５６
【非特許文献３８】Ｃｕｌｌ ｅｔ ａｌ． (１９９２) Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：１８６５−１８６９
【非特許文献３９】Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ (１９９０) Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０
【非特許文献４０】Ｄｅｖｌｉｎ (１９９０) Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４−４０６
【非特許文献４１】Ｃｗｉｒｌａ ｅｔ ａｌ． (１９９０) Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８７：６３７８−６３８２
【非特許文献４２】Ｆｅｌｉｃｉ (１９９１) Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２２：３０１−３１０
【非特許文献４３】Ｇｏｌｕｂ ｅｔ ａｌ． ((１９９９) Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６：５３１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
加齢の生物学的指標またはマーカーをよりよく同定し定量する必要がある。たとえば、そのような指標およびマーカーは、個体の生物学的加齢を評価するのに用いることができる。生物学的年齢は暦年齢と異なる可能性があり、また個体および環境間で大幅に異なりうるため、特定の生物学的年齢と相関するマーカーを用いて生物学的年齢をより正確にまた客観的に評価することができる。生物学的年齢を理解することは、ほんの数例の関連する分野を挙げると、医学、薬学、社会学、および農業等の多くの分野で重要である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、特に、生物学的年齢関連マーカーを同定する方法を提供する。
【０００６】
一つの態様では、本発明は、生物学的年齢関連マーカーを同定する方法であって、第一の遺伝子型を有する第一の生物および第二の遺伝子型を有する第二の生物を提供し、ここで第一および第二の生物が同一種に由来し、かつ同一の暦年齢である；第一の生物においてある生体分子に関連する特性を、第二の生物においてその生体分子に関連する特性と比較し、前記特性について予め選択された値を有する生体分子を同定し、それによってその生体分子を生物学的年齢関連マーカーとして同定する；各工程を含む方法に関する。典型的には、当該生物は動物である。マーカーは、たとえば、特定の種に由来する生物における寿命調節の指標を提供することができ、また個体の潜在的寿命を予測できる。典型的には、比較工程は、複数の生体分子のそれぞれの特性について繰り返される。そのような場合には、複数のマーカーが同定され、その複数性は、生体分子の亜集合である。
【０００７】
一実施形態では、生体分子に関連する複数の特性が比較される。
【０００８】
比較工程は、第一の生物に由来する第一の生物試料および第二の生物に由来する第二の生物試料を提供し、それぞれの生物試料中の当該生体分子の特性を評価することを含む。
【０００９】
生体分子の例は、核酸(たとえばＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡおよび他の非転写ＲＮＡｓ、たとえば小さい干渉ＲＮＡｓを含むＲＮＡ)、タンパク質、多糖、脂質、または代謝産物を含む。
【００１０】
一実施形態では、特性は存在または量(たとえばモル濃度)である。
【００１１】
別の実施形態では、特性は生体分子の化学組成、たとえば核酸配列、アミノ酸配列、炭化水素鎖長、または修飾状態である。たとえば、特性は、たとえばアミノ酸配列における、一または複数の部位での翻訳後修飾、たとえばリン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、硫酸化、アシル化、プレニル化、メチル化を含む。別の実施形態では、特性は機能的活性、たとえば、酵素活性または結合活性である。別の一例では、たとえば、ＲＯＳへの抵抗性または感受性を示すため、機能的活性は反応性酸素種(ＲＯＳ)の存在下で評価される。一例では、同定された生体分子の特性は量であってよく、また予め選択された値はその特性における少なくとも１、２、２、５、１０または５０倍の差に相当する。同様の予め選択された定量的関係を、他の比較において用いることができる。
【００１２】
別の実施形態では、特性は細胞亜群の分布(たとえばＥＲ、ゴルジ膜、細胞質膜、核膜、リソソーム膜、エンドソーム膜、原形質膜)または別の生体分子との物理的会合である。一実施形態では、生体分子はｍＲＮＡ転写物であり特性はエクソン構造である。
【００１３】
核酸を比較する方法は、発現配列タグ(ＥＳＴ)の分析、遺伝子発現、または転写プロファイル、または核酸タグ分析たとえば遺伝子発現連続分析(ＳＡＧＥ)、メッセンジャーＲＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡのｃＤＮＡコピーのディファレンシャルディスプレイといった減算ハイブリダイゼーション法を含んでいてよい。タンパク質を比較する方法は、抗体を用いる検定法、質量分析、酵素活性検定法、およびリガンド結合検定法を含んでいてよい。脂質および多糖を比較する方法は、質量分析、薄層クロマトグラフィー、抗体を用いる検定法、および化学的配列決定または分析を含んでいてよい。いずれの方法も、コンピュータにおける成分も含んでいてよい。
【００１４】
一実施形態では、比較工程は、特性の異種レポーターを用いて評価することを含む。一部の実施形態では、異種レポーターは、当該生体分子をコードする遺伝子の調節領域に、調節可能に結合した異種レポーター遺伝子である。異種レポーター遺伝子は、たとえば、化学発光、蛍光、抗体結合、または酵素活性を測定することによって容易に発現の検出が可能な遺伝子を含む。広く用いられているレポーター遺伝子は、たとえば、薬物耐性タンパク質(たとえば、ベータ−ラクタマーゼまたはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ)、蛍光タンパク質(たとえば、緑色蛍光タンパク質)、酵素(たとえば、ベータ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ)または標識タンパク質をコードすることができる。
【００１５】
一実施形態では、比較工程は、それぞれの試料を評価し、複数のマーカー候補のそれぞれについての特性に関する情報を含む試料プロファイルを与えることを含んでいてよい。プロファイルに関する情報は、機械アクセス可能な媒体に保存することができ、対応するマーカー候補間の差の統計的有意性を評価することができる。差が統計的に有意であるマーカー候補の亜集合を特定する情報を表示することができる。
【００１６】
第一の遺伝子型は野生型遺伝子型であってよく、第二の遺伝子型は突然変異型遺伝子型であってよい。一実施形態では、第二の遺伝子型は、寿命を変化させる天然に生じる遺伝的変異を含む。関係する別の一実施形態では、第二の遺伝子型は遺伝的損傷(たとえば点突然変異、欠失、挿入、染色体転位、トランスポゾン挿入、またはレトロウイルス挿入である損傷)。好ましい実施形態では、遺伝的損傷は寿命の変化、たとえば、寿命延長または寿命短縮を引き起こす。一実施形態では、第二のおよび／または第一の遺伝子型は、外因性の核酸、たとえば、導入遺伝子を含む。
【００１７】
第二の遺伝子型は遺伝子損傷について同型接合であってよい。あるいは、第二の遺伝子型は遺伝子損傷について異型接合であってよい。別の実施形態では、第二の遺伝子型は二つの異なる遺伝子の突然変異を含む。一実施形態では、第二の遺伝子型は二つの異なる遺伝子の突然変異を含み、それについて同型接合または異型接合である。別の実施形態では、たとえば野生型遺伝子型と比較して、第一の遺伝子型は突然変異型遺伝子型であり、第二の遺伝子型もまた突然変異型遺伝子型である。たとえば、第一の遺伝子型が同一種の野生型生物と比較して寿命延長を引き起こし、第二の遺伝子型が同一種の野生型生物と比較して寿命短縮を引き起こす。別の一例では、両方の遺伝子型が、たとえば別々の経路を乱すことによって、寿命延長を引き起こす。
【００１８】
好ましい実施形態では、暦年齢は成年、たとえば野生型生物が発達上成熟した段階にあるか、または野生型生物が生殖可能つまり妊娠可能な暦年齢である年齢である。一実施形態では、その暦年齢は、生物の大きさ(たとえば、身長)の成長が止まる年齢以降の年齢、または、生物が特定の組織において細胞分裂が低下するかまたは停止する年齢以降の年齢である。一実施形態では、生物のその暦年齢は、野生型生物が成体であるがその成体が老化による生理学的劣化の明らかな徴候を示す以前の年齢である。典型的な暦年齢は、第一の生物、野生型生物、またはその種の平均的な生物の平均寿命の、１０〜３０、３０〜５０、５０〜７５、１０〜７５、７５〜１００、８５〜１００、または４０〜６０％の間であってよい。
【００１９】
一実施形態では、第二の生物は、第一の生物の平均寿命より少なくとも５、１０、２０、４０、５０、または１００％長い平均寿命を有する。一実施形態では、第二の生物は、同一種の野生型生物の平均寿命より少なくとも５、１０、２０、４０、５０、または１００％長い平均寿命を有する。別の実施形態では、第二の生物は、同一種の野生型生物の平均寿命より少なくとも５、１０、２０、４０、または５０％短い平均寿命を有する。
【００２０】
一実施形態では、第二の遺伝子型は成長ホルモンまたはインスリン様成長因子シグナル伝達成分における欠陥、たとえば：ｄａｆ−２またはｄａｆ−２ホモログのようなインスリン／ＩＧＦ−１様ホルモン受容体、ａｇｅ−１とａｇｅ−１ホモログ、ｐｄｋ−１とｐｄｋ−１オルソログおよびホモログのようなＰＩ(３)キナーゼファミリーメンバー、ｃｅｉｎｓｕｌｉｎ−１とｃｅｉｎｓｕｌｉｎ−１オルソログおよびホモログのようなインスリン／ＩＧＦ−１様ホルモン、ｄａｆ−１６とＡＦＸ、ＦＫＨＲ、ＦＫＨＲＬ１を含むｄａｆ−１６ホモログのようなフォークヘッド転写因子、およびｄａｆ−１８とｄａｆ−１８オルソログおよびホモログのようなＰＴＥＮホスファターゼ：を経由したシグナル伝達における欠陥として明示される。別の実施形態では、第二の遺伝子型はクロマチンサイレンシングにおける欠陥を引き起こす。たとえば、その欠陥はヒストン脱アセチル化またはヒストン脱アセチル化を調節する経路における欠陥である。突然変異がヒストン脱アセチル化の調節を乱す遺伝子の例は、Ｓｉｒ２、Ｓｉｒ３、Ｓｉｒ４、Ｒｐｄ３、およびこれらの遺伝子のオルソログおよびホモログを含む。別の実施形態では、第二の遺伝子型は代謝産物感知および代謝産物輸送における欠陥を引き起こす。代謝産物感知に関与する遺伝子の例は、ＳＮＦ１キナーゼ、Ｓ１Ｐ２、ＳＮＦ−１、およびＳＮＦ４のコリプレッサーＳＮＦ１、ｃｌｋ−１、ｃｏｑ７、ＮＰＴ１のコアクチベーターおよびこれらの遺伝子のオルソログおよびホモログを含む。典型的なトランスポーターは、ジカルボン酸およびトリカルボン酸といったカルボン酸のトランスポーター、たとえば、Ｉｎｄｙトランスポーターとそのオルソログおよびホモログを含む。さらに別の実施形態では、第二の遺伝子型は酸化的ストレスに対する応答を調節する遺伝子における欠陥を引き起こす。酸化的ストレスに対する応答に関与するタンパク質の例は、ｃｔｌ−１のようなカタラーゼ、ｓｏｄ−３のようなスーパーオキシドジスムターゼ、ｍｅｖ−１のようなコハク酸デヒドロゲナーゼ、ｐ６６ｓｈｃ、ｓｐｅ−１０、ｓｐｅ−２６、およびｏｌｄ−１のようなシグナル伝達アダプター成分を含む。別の実施形態では、第二の遺伝子型は、内分泌シグナル伝達に関与する遺伝子における欠陥を引き起こす。一例では、その遺伝子は、たとえば、成長ホルモン、成長ホルモン受容体、成長ホルモン放出ホルモン、ＧＨＲＨ受容体、ｐｉｔ−１およびｐｒｏｐ１といった、成長ホルモン−ＩＧＦ−１シグナル伝達軸の構成成分をコードする。別の実施形態では、第二の遺伝子型はＧタンパク質共役受容体における欠陥によって引き起こされる。好ましい実施形態では、Ｇタンパク質共役受容体はｍｅｔｈｕｓｅｌａｈかまたはｍｅｔｈｕｓｅｌａｈのオルソログまたはホモログである。別の実施形態では、その遺伝子型はチロシンキナーゼｔｋｒ−１かまたはｔｋｒ−１のホモログにおける突然変異によって引き起こされる。ホモログは対象配列と、たとえば、典型的には機能ドメインまたは機能ドメインをコードする領域で、少なくとも５０、１００、または３００アミノ酸またはヌクレオチドの領域において、少なくとも３０、５０、７０、８Ｏ、９０、または���５％配列が同一であってよい。
【００２１】
一実施形態では、第一および第二の生物は、平均予想寿命に違いを生じさせる少なくとも一つの遺伝的差異を別にすれば、コンジェニックかまたはアイソジェニックである。一部の例では、第一および第二の生物は同胞である。
【００２２】
典型的には第一および第二の生物は同一の(または実質的に同様の)調節された条件、たとえば、実験室条件下で維持される。一部の実施形態では、その条件は加齢の側面を調節しうる環境要素を含む。たとえば、その環境要素はストレス、たとえば、紫外光、酸素ラジカル、毒素、特定の食餌、などであってよい。一実施形態では、マーカーはその所定の特性が代謝取り込みによって影響されない、たとえば、カロリー制限によって影響されない(たとえば、遺伝的に類似のまたは同一の生物を比較する場合)ように選択される。
【００２３】
一実施形態では、比較工程は複数の暦年齢で繰り返される。
【００２４】
生物試料は細胞、たとえば、固定細胞または生細胞を含んでいてよい。一実施形態では、生物試料は精製核酸、たとえば、タンパク質、脂質、および他の化合物を含まない核酸の複合試料、たとえば、ＤＮＡ調製物、ＲＮＡ調製物、またはポリアデニル化ＲＮＡ調製物を含む。別の実施形態では、生物試料は精製タンパク質、たとえば、核酸、脂質、および他の化合物を含まないタンパク質の複合試料、たとえば、複合タンパク質調製物、たとえば、クロマトグラフィー画分、沈殿物、などを含む。これらの精製タンパク質は、その未変性三次元構造を保持することができ、または変性されうる。
【００２５】
好ましい実施形態では、本方法はさらに、第二の動物種の生体分子から、同定されたマーカーのオルソログを選択し、第二の種の生物においてそのオルソログの一または複数の特性を評価する工程を含む。評価は、第二の種の遺伝的に同一の生物であり、かつ異なる暦年齢である当該生物において、オルソログの特性を評価することを含んでいてよい。その遺伝的に同一の生物は、野生型生物または遺伝的に変化した生物であってよい。
【００２６】
別の実施形態では、評価は、第二の種の第一の生物および、第二の種の第一の生物とは異なる遺伝子型を持つ第二の種の第二の生物において、オルソログの特性を評価することを含む。好ましい実施形態では、第二の種の第一および第二の生物は同一の暦年齢である。第二の種の第二の生物は、第二の種の第一の生物の平均寿命より少なくとも５、１０、２０、５０、１００％長い平均寿命を有する。一例では、第一の種は非哺乳類種であり、第二の種は哺乳類種(たとえばマウス、霊長類、ヒト、またはヒト遺伝子を含む遺伝子導入マウス)である。
【００２７】
一つの態様では、本方法はさらに第三の生物試料においてマーカーの特性を評価することを含む。一実施形態では、第三の生物試料は野生型動物から得られる。別の実施形態では、第三の生物試料はｉｎ ｖｉｔｒｏで培養された細胞から得られる。たとえば、第三の生物試料は被験化合物で処理された培養細胞から得られる。別の一例では、第三の生物試料は被験化合物で処理された動物から得られる。非常に好ましくは、その処理動物はその平均寿命の２５％、１０％、５％、１％、または０．１％より短い期間、被験化合物で処理される。その処理動物は、処理前は健常成体であってよい。
【００２８】
一実施形態では、被験化合物はたとえばインスリンシグナル伝達または酸化剤除去のような代謝過程を調節する。一実施形態では、被験化合物はインスリンシグナル伝達を調節する。別の好ましい実施形態では、被験化合物は環境ストレスの影響を調節する、たとえば被験化合物は抗酸化剤であるかまたは被験化合物はスーパーオキシドジスムターゼを活性化する。
【００２９】
一実施形態では、第一および第二の生物試料は同一の特定組織から得られる。たとえば、その特定組織は代謝過程に参加する。第二の種の野生型および突然変異生物が哺乳類(たとえばマウス)である場合、その組織は、たとえば、肝臓、膵臓、下垂体、視床下部、または脳に由来する組織であってよい。
【００３０】
別の態様では、本方法は参照動物における一または複数の遺伝子の発現を、同一種の遺伝的に異なる動物における一または複数の遺伝子の発現と比較し；さらに参照動物と遺伝的に異なる動物とが同一の暦年齢であって、遺伝的に異なる動物が参照動物より少なくとも５、１０、２０、４０、５０、８０、または１００％長い平均寿命を有するという条件で、参照動物と比較して、遺伝的に異なる動物において差別的に発現される遺伝子を選択する各工程を含む。本方法はここに記載する他の特徴を含んでいてよい。
【００３１】
別の態様では、本方法は、野生型生物における一または複数の遺伝子の発現を、同一種の遺伝的に異なる生物における一または複数の遺伝子の発現と比較し；野生型生物と遺伝的に異なる生物とが同一の暦年齢であって、遺伝的に異なる生物が野生型生物と比較して早期に老化するという条件で、差別的に発現される遺伝子を選択する各工程を含む。本方法はここに記載する他の特徴を含んでいてよい。
【００３２】
別の態様では、本発明は：(ａ)酸化的ストレスを減少させるかまたは抗酸化剤活性を提供する化合物で処理した被験体、または(ｂ)個々の生体分子について被験体に関連する特性を得るためにその被験体から得た試料において、生体分子を評価し；個々の被験体に関連する特性を対応する対照被験体に関連する参照特性と比較して、対照被験体と比べて処理被験体で統計的に識別可能な特性を有する候補生体分子を同定し；さらにその特性が生物の寿命の指標である一または複数のマーカー候補を同定する；各工程を含む方法に関する。本方法は、同定工程が、異なる暦年齢の遺伝的類似動物において、個々の候補分子のそれぞれの特性を評価する工程；およびその特性が暦年齢の指標である一または複数のマーカー候補を同定する工程；を含んでいてよい。別の一例では、本方法は、同定工程が、第一の動物の遺伝子型が第二の動物の遺伝子型とは異なる平均寿命に関連している、同一の暦年齢の第一および第二の動物において、個々の候補分子のそれぞれの特性を評価する工程；およびその特性が遺伝的に異なる動物間で異なる一または複数のマーカー候補を同定する工程；を含む。
【００３３】
抗酸化剤活性を提供する化合物は、ビタミンＥ、ビタミンＡ、ベータカロチンおよび他のカロチノイド、Ｎ−アセチルシステインおよびスーパーオキシドジスムターゼを含んでいてよい。一部の例では、当該化合物はマンガン、たとえばマンガンシクランまたはＭｎＤＯＴＡを含む。
【００３４】
一実施形態では、処理被験体は哺乳類、たとえば、マウス、ラット、霊長類、またはヒトである。一実施形態では、処理被験体および被験対照は酸化的ストレス、たとえば、反応性酸素種(ＲＯＳ)を高めるストレスに曝露される。
【００３５】
一部の例では、バイオマーカーは亜鉛または銅を含むか、または組織または器官(たとえば、脳)中の亜鉛または銅の存在あるいは亜鉛に対する銅の濃度の比と関連している。別の例では、バイオマーカー(たとえば、転写物またはタンパク質)は亜鉛または銅の存在あるいはそれらの間の比と相関している。
【００３６】
本方法はまた、野生型動物および突然変異動物が同一の暦年齢であって核酸集団がその転写物またはｃＤＮＡ複製物を含む、野生型動物に由来する第一の核酸集団および突然変異動物に由来する第二の転写物集団を提供し；ハイブリダイゼーションプローブを用いて第一および第二の核酸集団を評価して核酸マーカーを選択し；第一および第二の核酸集団における量が異なる核酸を同定し、それによって核酸マーカーを同定する；各工程を含んでいてよい。
【００３７】
本発明の別の態様では、複数の記録を含むデータベースであって、各記録が(ａ)生体分子の同定、(ｂ)被験体生物における当該生体分子の特性、(ｃ)当該被験体生物の遺伝子型、および必要に応じて、(ｄ)当該被験体生物の年齢、を示す情報を含み、(１)データベースは同一種の生物について、異なる予想寿命と関連付けられている少なくとも二つの遺伝子型の記録を含み、さらに(２) データベースにアクセスして、異なる予想寿命に関連する遺伝子型について異なる特性を有する生体分子の記録を特定できる、データベースが開示される。一実施形態では、その記録はさらに(ｅ)被験体生物の被験化合物への曝露についての情報を含む。
【００３８】
別の態様では、本発明は：第二の生物が少なくとも一個の遺伝子の機能を標的とする条件に供されたという条件で、第一および第二の生物が同一種に由来し同一の暦年齢であって、第一の遺伝子型を有する第一の生物および第一の遺伝子型または第二の遺伝子型を有する第二の生物を提供し；第一の生物においてある生体分子に関連する特性を、第二の生物においてその生体分子に関連する特性と比較し；前記特性について予め選択された値を有する生体分子を同定し、それによってその生体分子を生物学的年齢関連マーカーとして同定する；各工程を含む方法に関する。そのマーカーは、たとえば、特定の種に由来する生物における寿命調節の指標を提供することができ、個体の潜在的な寿命を予測しできる。第二の生物は、一または複数の特定の遺伝子の機能を標的とする条件に供される。たとえば、ＲＮＡ干渉、アンチセンスＲＮＡ発現、およびリボザイムを、一または複数の特定の遺伝子を標的とするのに用いることができる。これらの遺伝子は、たとえば、ＧＨ−ＩＧＦ−１軸、ＳＩＲ経路、Ｉｎｄｙ経路、ミトコンドリア機能、代謝機能、ｓｈｅ経路、酸化的ストレス応答経路などといった特定経路における機能について選択することができる。標的とされる遺伝子は、たとえば、ここに記載する遺伝子であってよい。
【００３９】
本発明の方法はさらに、プロファイルをたとえば、非野生型または一般的でない対立遺伝子を含まない(たとえば、野生型対立遺伝子について同型接合である)生物に由来する参照試料の発現プロファイルと比較することを含んでいてよい。
【００４０】
別の態様では、本発明は、複数のデジタルコードされたデータ記録を有するコンピュータ媒体に関する。各データ記録は、試料中の特定のタンパク質またはｍＲＮＡの発現レベルを表す値、および試料の記述子を含む。試料の記述子は、試料の識別子、試料が由来した被験体(たとえば、特定の系統、個体、または寿命に障害を有する患者)、または処理(たとえば、被験化合物)であってよい。データ記録は、たとえば、リレーショナルデータベース(たとえば、ＯｒａｃｌｅまたはＳｙｂａｓｅデータベース環境のＳＱＬデータベース)といったデータベースの一部である表のような、表として構成することができる。
【００４１】
試料は、突然変異線虫、たとえば、ｄａｆ突然変異、突然変異マウス、たとえば、ｐ６６ｓｈｃ突然変異体、突然変異ハエ、たとえば、Ｉｎｄｙ突然変異体、などに由来するものであってよい。
【００４２】
また、下記の段階を行うための実行コードを有するコンピュータ媒体に関する：照会発現プロファイルを受け取る；参照発現プロファイルのデータベースにアクセスする；そしてｉ)被験体発現プロファイルと最も類似している合致する参照プロファイルを選択するかまたはｉｉ)少なくとも一個の参照プロファイルに対する被験体発現プロファイルの類似性について少なくとも一個の比較スコアを決定する。参照発現プロファイルは、野生型生物またはその試料、またはたとえば寿命が影響される突然変異体といった突然変異生物、またはその試料のプロファイルを表す。
【００４３】
別の態様では、本発明は寿命標的を同定する方法に関する。その方法は被験プロファイルを参照プロファイル(たとえば、上記の参照プロファイル)と比較することを含む。好ましい実施形態では、被験プロファイルは、たとえば、野生型と比較して延長または短縮された寿命を有する突然変異体のような、寿命が影響される突然変異体といった突然変異生物の発現プロファイルである。本方法は被験プロファイルにおいて発現低下または過剰発現されている一または複数のｍＲＮＡｓまたはタンパク質を同定することを含む。同定されたｍＲＮＡまたはタンパク質は次いで、たとえば、同定されたｍＲＮＡまたはそのｍＲＮＡにコードされるタンパク質と結合する被験化合物、あるいはそのタンパク質を同定するために、標的として用いられる。
【００４４】
別の態様では、本発明は、寿命を調節することのできる標的生体分子(たとえば、タンパク質またはＲＮＡ)を同定する方法に関する。その方法は、突然変異体系統について系統年齢の各個体として被験プロファイルを測定し、被験プロファイル中の遺伝子をクラスター化し、突然変異生物が加齢するにつれて協調して調節される生体分子(すなわち、ｍＲＮＡまたはタンパク質)を同定することを含む。同定された生体分子は寿命を調節する標的であってよい。
【００４５】
十分な数のさまざまな試料が分析される場合は、クラスター化(たとえば、階層クラスター化、ｋ−ｍｅａｎｓクラスター化、ベイジアンクラスター化など)を用いて、加齢の間に共調節される他の遺伝子を同定することができる。
【００４６】
別の態様では、本発明は被験化合物を評価する方法に関する。その方法は：被験化合物を細胞または被験体に接触させる；細胞または被験体中の生体分子の発現プロファイリングを行う；そのプロファイルを参照プロファイルと比較し、ここで参照プロファイルは寿命調節に関連する遺伝子の対立遺伝子を含む細胞または被験体のプロファイルであることを含む。
【００４７】
好ましい実施形態では、寿命調節に関連する遺伝子は、ＤＡＦ突然変異体、インスリン経路メンバー(たとえば、ＧＨ−ＩＧＦ−１経路メンバー)、ｐ６６ｓｈｃアダプター、ｓｉｒ経路メンバー(たとえば、ＳＩＲ２)、およびｓｈｅ経路メンバー、ＩＮＤＹ経路メンバー、ジカルボン酸トランスポーター、および呼吸経路および酸化経路のメンバーを含んでいてよい。
【００４８】
寿命が延長する寿命調節突然変異体の参照プロファイルとより類似するように細胞または被験体のプロファイルを変化させる被験化合物は、寿命調節の候補化合物として同定することができる。
【００４９】
好ましい実施形態では、被験化合物はＳＩＲタンパク質またはヒストンデアセチラーゼ、たとえばＳｉｒ２、インスリン経路メンバー、ジカルボン酸トランスポーター、呼吸経路および酸化経路のメンバーの作用薬または拮抗薬である。
【００５０】
ここで用いられる「暦年齢」の語は、たとえば受精、規定の発生学上のまたは胎生段階、または、より好ましくは、出生のような、予め選択された事象から経過した時間を指す。
【００５１】
対照的に、「生物学的年齢」の語は、たとえば受精、規定の発生学上のまたは胎生段階、または、より好ましくは、出生のような、予め選択された事象から経過した時間の長さとは直線的に固定されていない、表現型のまたは生理学的状態を指す。ある表現型のまたは生理学的状態が生じる暦年齢は個体によって異なりうる：哺乳類における生物学的加齢の典型的な徴候は、内分泌変化(たとえば、思春期、月経、妊孕性または生殖能力の変化、閉経、および男性型脱毛のような第二次性徴)、代謝変化(たとえば、食欲および活動性の変化)、そして免疫学的変化(たとえば、疾患への抵抗性の変化)を含む。哺乳類の外見もまた、たとえば、白髪、皮膚の皺、などのように、生物学的年齢と共に変化する。異なる分類の動物に関しては、線虫Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）もまた、たとえば生殖能力、活動性、刺激への反応性、および外見(たとえば、腸管の自己蛍光および弛緩における変化)の変化のような、生物学的加齢の徴候を有する。多くの場合で、ある個体の潜在的な余命はその生物学的年齢の関数である。
【００５２】
本発明は生物学的年齢から暦年齢を識別するマーカーを発見し妥当性評価する方法を提供する。本発明の方法は、加齢の速度を低下させ、寿命を延長し、疾患の発生を減らし、発症を遅らせ、そして高齢集団の全体の健康を改善するための新しい標的の発見と妥当性評価を含む、いくつかの分野で有用である。さらに、本発明は加齢過程に好ましい干渉を与える上記のものに基づく医薬、生物学的製剤および治療計画の発見および開発を促進する。たとえば、ここに記載の方法で同定されたマーカーを用いて、治療手順の中で標的遺伝子産物を選択し、加齢過程における標的遺伝子産物の生物学的機能を解明し、また標的遺伝子産物の活性を調節することによって加齢に伴う劣化を緩和する化合物を同定することができる。
【００５３】
本発明の一または複数の実施形態の詳細を、下に添付の図および説明に示す。本発明の他の特徴、目的、および利点は説明および図から、ならびに請求項から明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５４】
生きた生物の加齢は、時間の経過にわたって生じる複雑な発達上の変化を含む。本発明は、部分的には、分子的機構が加齢過程を調節するという観察に基づく。このように、加齢は、たとえば環境またはストレスへの曝露の結果生じうる、有害な事象のランダムなまたは付加的な蓄積に加えて、生物学的にプログラムされた変化を含む。さらに、これらのプログラムされた加齢機構の多くは、酵母とヒトほど異なる種にわたって保存されている可能性がある。現在の分子遺伝技術は、酵母、線虫、ショウジョウバエおよびマウスにおいて寿命を調節する保存された経路の発見を可能にしている。一部の場合には、単一の遺伝子における突然変異が寿命の変化を生じるであろう(総説はたとえば、非特許文献４)。
【００５５】
少なくとも一つの態様において、本発明は下記の典型的な特性の一または複数を有するであろうバイオマーカーの同定を提供する：(ａ)暦年齢を生物学的年齢から識別する、(ｂ)非侵襲的検体(たとえば、血液、尿、皮膚、唾液、など)を用いて分析できる、(ｃ)目的の年齢幅にわたって適当なダイナミックレンジを有する、そして(ｄ)異なる種の間で保存されている。一実施形態では、候補バイオマーカーは同一の暦年齢の野生型および長寿遺伝子突然変異生物の間で細胞、組織、器官および生物の全体的な遺伝子発現を比較することによって同定される。異なる暦年齢の、短い寿命と単純なゲノムを有するモデル生物(酵母、ハエ、線虫)の間で遺伝子発現を比較することもまた可能である。候補バイオマーカーは次いで、たとえば、マウスとヒトで、関連する細胞、組織および器官の転写プロファイリングまたは遺伝子発現データベースのコンピュータ内での分析によって試験することができる。少なくとも一部の例では、その過程は、たとえばヒトまたはマウスのような生物の寿命にわたって、暦年齢対生物学的年齢を、複合して信頼性高く識別し、また上に列記する一または複数の他の望ましい特性を有し、そして寿命を延長する医薬の有効性を判定するための有用な代替物となるマーカーに結びつく。
【００５６】
本発明は加齢のマーカーの同定のための方法を提供する。これらのマーカー(または「バイオマーカー」)は、成熟した生物における発達プログラムの有用な印である。本発明の一つの態様では、同一の暦年齢で異なる遺伝子型の生物が比較される。遺伝的変異は個々の生物の生物学的加齢過程に影響を及ぼしうる。従って、結果として異なる平均寿命を生じるような遺伝子型を選択することができる。「平均寿命」の語は、生物の集団の死亡の年齢の平均を指す。一部の場合には、「平均寿命」は調節された環境条件下で遺伝的に同一の生物の集団を用いて評価される。事故による死亡は切り捨てる。たとえば、線虫集団に関して、「ｂａｇｏｆｗｏｒｍｓ」表現型の結果として死亡する両性体は典型的には切り捨てる。調節された環境条件下で平均寿命を測定することができない場合(たとえば、ヒトについて)、十分大きい集団についての信頼できる統計的情報(たとえば、保険数理表から)を平均寿命として用いることができる。そのような二個の生物の間の分子的差異の特徴づけは、その生物の生理学的状態と相関するマーカーを明らかにすることができる。一部の実施形態では、特徴づけは生物が加齢の明らかな物理的性質を示す前に実施される。たとえば、生物は同一種の野生型生物の平均寿命の１０、３０、４０、５０、６０、または７０％を生きただけの成体である。
【００５７】
比較分析用に、生物が「同じ」暦年齢であるかどうかを決定するために、いろいろな判定基準を用いることができる。典型的には、必要な精度の程度は、野生型生物の平均寿命の関数である。たとえば、線虫Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）については、実験室野生型系統Ｎ２はある種の調節された条件下で平均約１６日間生きるが、同一の年齢の生物は同一の日数を生きている可能性がある。マウスについては、同一の年齢の生物は同一の週数または月数を生きている可能性がある；霊長類またはヒトについては、同一の年数(または２、３、または５年間の間)；ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）については、同一の週数；など。一般的に、同一の暦年齢の生物は、その種の野生型生物の平均寿命の１５、１０、５、３、２または１％以内の長さの時間を生きている可能性がある。好ましい実施形態では、生物は成体の生物であって、たとえばその生物は少なくとも、平均的な野生型生物が生殖することができる年齢まで成熟する長さの時間を生きている。
【００５８】
バイオマーカーを同定するためには、ある生物における候補生体分子に関連する特性を、別の生物における対応する生体分子の特性と比較する。「生体分子」は生物試料または生物の細胞中に見出される任意の分子であってよい。典型的には、そのような生体分子はその生物中に見出される分子と同一であるかまたはその誘導体である(たとえばｃＤＮＡは誘導体分子である)。「生物試料」の語は生物から単離された組織、細胞および生物学的液体(たとえば、血清、リンパ液、血液)を含む。一つの態様では、生物試料は非侵襲的検体を用いて分析することができる(たとえば血液、尿、皮膚、唾液、など)。
【００５９】
一実施形態では、生体分子は核酸分子であり、ＤＮＡ分子(たとえばゲノムＤＮＡまたはＲＮＡから作成したｃＤＮＡ、)、またはＲＮＡ分子(たとえばｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、非転写ＲＮＡ)を含んでいてよい。核酸分子は一本鎖または二本鎖であってよい。分析前に核酸分子を単離または精製してもよい。核酸分子がバイオマーカーとして同定された場合、その後の試料を分析するためにいろいろな手法を用いることができる。これらの手法は、当該核酸分子と相補的であるプローブまたはプライマー、当該核酸分子を含むプラスミド、当該核酸分子によってコードされるタンパク質を産生することのできる宿主細胞、そして特定の試料中で対応する特性を持つ核酸分子に関連するコンピュータ記録を含む。単離されたまたは精製された核酸分子は、核酸の天然の起源中に存在する他の生体分子を実質的に含まない核酸分子を含む。たとえば、プローブは単離された核酸分子である(他の選択されたプローブと共に存在していてもよい)。
【００６０】
別の実施形態では、生体分子はタンパク質(たとえば、ポリペプチド)である。そのタンパク質と特異的に結合する抗体または他のリガンドを、そのタンパク質を検出するのに用いることができる。多くの場合、バイオマーカーとして機能する転写物は、やはりバイオマーカーであるタンパク質をコードし、また逆もそうである。さらに他の実施形態では、生体分子は多糖(たとえばグルコース、グリコサミノグリカン)、脂質(たとえばリン脂質、スフィンゴ脂質、コレステロール)、または他の分子、たとえば、代謝産物、金属イオンと結合可能なリガンド(たとえば、キレート)または他の化合物(たとえば、スーパーオキシド)である。
【００６１】
バイオマーカーを同定するためには、第一の生物において生体分子に関連する特性を、第二の生物において対応する分子に関連する特性と比較する。一実施形態では、特性は量である。生体分子の量は２値(たとえば、有りまたは無し)、半定量的(たとえば、無し、低、中、高)、または定量的であってよい。別の実施形態では、特性は化学組成である。たとえば、タンパク質生体分子に関して、この特性は翻訳後修飾状態を指すことができる。翻訳後修飾の例は、グリコシル化、リン酸化、硫酸化、ユビキチン化、アシル化、脂質化、プレニル化、タンパク質分解切断を含む。修飾はタンパク質中の特定のアミノ酸位置に特異的であろう。化学組成はまた基質−生成物変換を含む。たとえば、特定の化合物が第一の生物で見出されるが、第二の生物では修飾形(たとえば、生成物)で存在する。特性はまた酵素活性を指すことができる。酵素である生体分子については、それはある種の触媒パラメータ(たとえば、Ｋｃａｔ、Ｋｍ、基質特異性、アロステリック性)を第一の生物で、他のパラメータを第二の生物で有する可能性がある。別の実施形態では、特性は別の生体分子との物理的会合であってよい。さらに別の実施形態では、特性は生体分子の細胞内局在を指すことができる(たとえばＥＲ、ゴルジ膜、細胞質膜、核膜、リソソーム膜、エンドソーム膜、原形質膜および細胞外マトリクス)。これらの特性を評価する方法は下記に記載されているかまたは既知である。
【００６２】
一般的に、特定の生体分子の特性が第一のおよび第二の生物において評価される。それぞれの特性は、予め選択された関係を有するかどうか判定するために比較される。たとえば、定量的特性については、それらは予め選択された量と異なるであろう。予め選択された量は、その値がたとえば同一の被験体または試料の多数の比較について離散的で再現性があるという条件で、任意の値であることができ、比較の前にはわからない可能性がある。予め選択された関係が有意であるかどうか評価するために、統計的有意性もまた用いることができる。典型的な統計学的検定は、Ｓｔｕｄｅｎｔｓ Ｔ検定およびｌｏｇ−ｒａｎｋ分析を含む。ある種の統計的に有意な関係は、０．０５、または０．０２未満のＰ値を有する。
【００６３】
特性が第一および第二の生物間で定性的にまたは定量的に検出可能な程度で異なるならば、次いで加齢過程に関連する値(たとえば、定性値または定量値)が求められる。より長く生きた生物に関連する値は、その生物が長寿に有利な寿命プログラムを持っていることの指標として用いることができ、一方、生きた期間がより短い生物に関連する値は、その生物が、より長く生きた動物ほどには長寿を支持しない寿命プログラムを持っていることの指標とすることができる。
【００６４】
加齢過程のマーカーとしての機能について生体分子を評価するための典型的な方法は下記およびこの中の別の場所に記載する。
【００６５】
生物
一実施形態では、生物は短い平均寿命を有する(たとえば、５、３、または２年未満または１０、６、または１ヶ月未満)。生物は、たとえば、実験室条件下で繁殖および維持することができるよく特徴づけられた生物のような、モデル生物であってよい。さらに、モデル生物はまた、たとえば、遺伝子地図が作成され配列決定されているような、よく特徴づけられたゲノムを有していてもよい。そのような生物の例は、酵母(たとえば、Ｓ．ｃｅｒｅｍｓｉａｅ)、ハエ(たとえば、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）)、魚(たとえば、ゼブラフィッシュ)、線虫(たとえば、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓとＣ．ｂｒｉｇｇｓａｅ)、および哺乳類(たとえば、齧歯類(マウスのような))を含む。
【００６６】
上述のように、バイオマーカーはある遺伝子型の生物と別の遺伝子型の生物とによって同定することができる。ここで用いられるように、「遺伝子型」の語は個体の遺伝子組成を指す。第一および第二の遺伝子型は、二種類の異なる天然に存在する遺伝子型であってよい。別の実施形態では、第一の生物の遺伝子型は野生型で第二の生物の遺伝子型は突然変異体である。さらに別の実施形態では、両方の遺伝子型が突然変異体である。「野生型」は、ここで用いられるように、参照遺伝子型を指し、自然または実験室突然変異型と比較して生物の自然集団または実験室集団において優位である遺伝子型を含む。平均的な野生型生物の寿命表現型は必然的にその種の通常の寿命である。
【００６７】
突然変異型遺伝子型を持つ生物は、少なくとも一個の遺伝的変化を含み、典型的にはその生物の内因性遺伝子が変化する。そのような遺伝的変化はマッピングすることができる。突然変異型に関連するゲノム変化の例は、点突然変異、欠失、挿入、染色体転位、トランスポゾン挿入、およびレトロウイルス挿入を含む。一部の特定の実施形態では、当該遺伝子型は、たとえば、合成遺伝子欠失構造、組み換えによって挿入された導入遺伝子、形質転換によって挿入されたエピソーム上の外因性遺伝子、外因性に導入されたトランスポゾンまたは外因性に導入されたレトロウイルス配列のように、外因性の核酸の結果として生じる変化を含む。遺伝子変化は自発的に生じうる；それらは自然集団に低い頻度で存在しうる(たとえば、５または２％未満)；それらは実験室で生じさせることができる(たとえば、変異原または組み換え核酸への曝露によって：下記参照)。
【００６８】
表１に掲げる遺伝子に生じる一部の典型的な遺伝子変化とそのホモログ：
【表１−１】
2005524382.tif 000002
【表１−２】
2005524382.tif 000003
ＧＨ−ＩＧＦ−１軸。成長ホルモン(ＧＨ)−インスリン様成長因子１(ＩＧＦ−１)軸(ＧＨ−ＩＧＦ−１軸とも称する)の調節は、多くの生物で寿命の調節に影響しうる。たとえば、ｄａｆ−２遺伝子によってコードされたインスリン／ＩＧＦ−１様ホルモン受容体における突然変異は、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）の寿命を倍加させることができる(非特許文献２)。ＧＨ−ＩＧＦ−１軸の他の構成成分における突然変異は、同様に生物の寿命を変化させることができる。そのような構成成分の例は下記を含む：
・ｃｅｉｎｓｕｌｉｎ−１およびｃｅｉｎｓｕｌｉｎ−１ホモログのようなインスリン／ＩＧＦ−１様ホルモン、哺乳類インスリン、哺乳類ＩＧＦ−１、ソマトスタチン、成長ホルモンといったホルモン；
・細胞表面受容体(たとえばインスリン／ＩＧＦ−１様ホルモン受容体、ＧＨ放出ホルモン(ＧＨＲＨ)受容体、ＧＨ受容体、およびソマトスタチン受容体；
・ＧＨまたはＩＧＦ−１を分泌するかまたは分泌調節する細胞内タンパク質；および
・ＧＨ、ＩＧＦ−１、またはソマトスタチンへの反応のシグナル伝達を行うタンパク質(細胞内と細胞外)、たとえば、ａｇｅ−１およびａｇｅ−１ホモログ、ｐｄｋ−１およびｐｄｋ−１ホモログのようなＰＩ(３)キナーゼファミリーメンバー、ｄａｆ−１６およびｄａｆ−１６ホモログといった、ＡＦＸ、ＦＫＨＲ、ＦＫＨＲＬ１を含むフォークヘッド転写因子、そしてｄａｆ−１８およびｄａｆ−１８ホモログのようなＰＴＥＮホスファターゼ。
【００６９】
第二の生物は、たとえば、ＧＨ−ＩＧＦ−１軸の構成成分をコードする一または複数の遺伝子に影響を及ぼす一または複数の遺伝子変化を含んでいてよい。典型的な生体分子のリストには次が含まれる：ＧＨＲＦ；ＧＨＲＦ−Ｒ；ＧＨ；ＧＨ−Ｒ；ＩＧＦ−１；ＩＧＦ−１Ｒ；ＰＩ(３)Ｋ；−ｐ８５；−ｐ１１０；ＰＴＥＮ；ＰＤＫ−１；ＡＫＴ−１；ＡＫＴ−２；ＡＫＴ−３；ＰＫＣｚ；ＰＫＣ１；ＦＫＨＲ；ＡＦＸ；ＨＮＦｌａ；ＨＮＦｌｂ；ＨＮＦ４ａ；インスリン；ＩＮＳＨ；Ｉｎｓ−Ｒ；ＩＲＳ−１；ＩＲＳ−２；ＩＲＳ−３；ＩＲＳ−４；ＵＣＰ−１；ＵＣＰ−２；ＵＣＰ−３；ＵＣＰ−４；ｐ５３；ｍｃｌｋｌ；ｓｏｃｓ２；およびソマトスタチン。
【００７０】
転写調節。別の実施形態では、第二の遺伝子型は、転写調節、たとえば、クロマチンサイレンシング、転写因子(たとえばｐ５３)のような核タンパク質の調節、またはＳＩＲ２経路のようなヒストンアセチル化状態の調節、を媒介する一または複数の遺伝子に影響を及ぼす一または複数の遺伝子変化を含む。たとえば、当該遺伝子はヒストンデアセチラーゼをコードするタンパク質をコードする。突然変異がそのような過程の調節を乱す遺伝子の例は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ではＳＩＲ４、ＳＩＲＳ、およびＳＩＲ２、そしてこれらの遺伝子のホモログ、たとえば、マウスＳｉｒ２ａｌｐｈａ(ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＦ２１４６４６)、ヒトＳＩＲＴ１(ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＦ０８３１０６)、ヒトＳｉｒ２ＳＩＲＴ３ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＦ０８３１０８、ヒトＳｉｒ２ＳＩＲＴ４ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＦ０８３１０９、およびヒトＳｉｒ２ＳＩＲＴ５ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＦ０８３１１０をコードする遺伝子を含む。ヒトＳｉｒ２ホモログの基質特異性は変化し、たとえば、核基質(たとえば、ｐ５３)、および細胞質成分(たとえば、チューブリン)といったさまざまな基質を含んでいてよい。ＳＩＲ２経路は、たとえば、酵母のＲＰＤ３、および哺乳類細胞のｐ５３を含むタンパク質のネットワークを包含する。
【００７１】
代謝調節。別の実施形態では、第二の遺伝子型は代謝調節に欠陥を引き起こす。たとえば、上記のＧＨ−ＩＧＦ−１軸の調節を参照。さらなる例は、代謝産物感知または代謝産物輸送を含む。代謝産物感知に関与する遺伝子の例は、ＳＮＦ１キナーゼ、ＳＩＰ２、ＳＮＦ−１、およびＳＮＦ４のコリプレッサー、ＳＮＦ１のコアクチベーター、ｃｌｋ−１、ｃｏｑ７、ＮＰＴ１およびこれらのタンパク質のホモログをコードする遺伝子を含む。他の関連遺伝子は、代謝産物の輸送に参加する可能性のあるタンパク質、たとえば、Ｉｎｄｙトランスポーターおよび他のカルボン酸トランスポーターをコードする。そのようなタンパク質の一部はミトコンドリア膜成分であってよい。
【００７２】
代謝感知または他の感覚過程に間接的に関わる遺伝子はまた、寿命調節に影響を与えるであろう。たとえば、神経細胞運命に影響を与える遺伝子の突然変異は、さまざまな刺激の知覚を乱し、それによって寿命調節を乱す可能性がある。
【００７３】
酸化的ストレス。さらに別の実施形態では、第二の遺伝子型が、酸化的ストレスに対する応答を調節するタンパク質をコードする遺伝子における欠陥を引き起こす。酸化的ストレスに対する応答に関与するタンパク質の例は、ｃｔｌ−１のようなカタラーゼ、ｓｏｄ−３のようなスーパーオキシドジスムターゼ、ｍｅｖ−１のようなコハク酸デヒドロゲナーゼ、およびｐ６６ｓｈｃ、ｓｐｅ−１０、ｓｐｅ−２６、ｏｌｄ−１のようなシグナル伝達アダプター成分といったある種のシグナル伝達タンパク質を含む。
【００７４】
寿命調節に影響を与えうるその他の典型的な遺伝子は、たとえば、非特許文献４に記載されている。
【００７５】
別の実施形態では、第二の遺伝子型が内分泌シグナル伝達に関与する遺伝子に欠陥を引き起こす。より好ましくは、当該遺伝子は成長ホルモンおよびｐｉｔ−１／ｐｒｏｐ１を含む成長ホルモンシグナル伝達に関与する。
【００７６】
別の実施形態では、第二の遺伝子型はＧ−タンパク質共役受容体の欠陥によって引き起こされる。好ましい実施形態では、Ｇ−タンパク質共役受容体はショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のｍｅｔｈｕｓｅｌａｈまたはｍｅｔｈｕｓｅｌａｈのホモログである。別の実施形態では、当該遺伝子型はチロシンキナーゼｔｋｒ−１かまたはｔｋｒ−１のホモログの突然変異によって引き起こされる。
【００７７】
別の実施形態では、当該遺伝子型はミトコンドリア構成成分またはミトコンドリア機能のレギュレーターに欠陥を引き起こす。ミトコンドリア機能は少なくとも一部の加齢過程に関連している。
【００７８】
他の典型的な遺伝子は：Ｔｇ２５７６；Ｋｌｏｔｈｏ；ｐａｘ３；Ｌｅｐ；Ｌｅｐｒ；Ｐｉｔｌ；Ｐｒｏｐｌ；Ｓｏｄｌ；ＡｐｏＥ／Ａ４Ａｐｐ；Ｘｒｃｃ５／Ｋ．ｕ８６；Ｏｐｇ；Ｄｍｄ／Ｕｔｒｎ；Ｂｄｋｒｂ２；Ｍｐｚ異型接合／Ｇｊｂｌ同型接合；Ｓｐｏｃｋ；Ｈｄｈ；Ｇタンパク質共役受容体Ｇ２Ａ；ウテログロビン(Ｕｔｇ；Ｔｇｆｂｌ；ｍｉｔｏＳｏｄ２；ＦａｓＩ：テロメラーゼＲＮＡ成分(Ｔｅｒｃ；Ａｃｒｂ；ＸｒｃｃＳｈｏｍｏ／ｐ５３ｈｅｔｅｒｏ；ＡｐｏＥ／Ａ４Ａｐｐ；ＡｐｏＥ；Ｓａｍ８など；およびＮＯＤを含む。
【００７９】
突然変異体の世代
遺伝子変化を持つ生物の世代(たとえば遺伝子導入、ノックアウト)は当該分野でよく知られている。たとえば、ハエ、線虫、およびマウスは変異原を用いて突然変異を生じさせ、交配し、突然変異子孫についてスクリーニングすることができる。既存の動物における突然変異はまた、他の遺伝的背景へ交配することができ、たとえば、二重突然変異体を作成することができる。さらに、分子遺伝的方法を用いて、遺伝子変化を生じさせ、回復させ、特徴づけることができる。たとえば、目的の遺伝子がいったん明らかになれば、そのような分子遺伝的方法によって、またたとえば飽和突然変異誘発のような古典的方法によっても、標的とすることができる。
【００８０】
ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）については、Ｐ因子挿入を用いることができ(非特許文献５；非特許文献６)、望ましい性質についてスクリーニングすることができる。たとえば、親系統より長命であるハエを、寿命の変化を持つ突然変異体についてのスクリーニングで選択することができる。Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）については、遺伝子変化を作成するために、Ｔｅｌ転位、エチルメタンスルホン酸またはソラレンのような物質を用いた化学突然変異誘発、またはＵＶを用いることができる。
【００８１】
マウスについては、ゲノム中の特定位置が破壊され遺伝子導入マウスを作成する一つの方法は下記の通りである。要約すると、ゲノム中の内因性核酸配列についての相同組み換えによって組み込まれるように設計されたターゲッティング構造が、胚性幹細胞(ＥＳ)に導入される。ＥＳ細胞は次いで、相同組み換え(すなわち、ターゲッティング構造の組み換え核酸配列と宿主染色体のゲノム核酸配列の)が生じるような条件下で培養される。組み換え対立遺伝子を含むと同定されたＥＳ細胞は、当該分野でよく知られた標準技術を用いて胚段階の動物に導入される(たとえば、胚盤胞へのマイクロインジェクションによって)。結果として得られるキメラ胚盤胞を次いで偽妊娠状態の代理母の子宮に入れ、生存可能な仔へ発生させる。結果として得られる仔は、体細胞組織および生殖細胞系列組織が遺伝子操作したＥＳ細胞とレシピエント胚盤胞に由来する細胞の混合物を含みうる、潜在的にキメラである創始者動物を含む。遺伝的に改変された幹細胞が、結果として得られるキメラ動物の生殖細胞系列に寄与していれば、破壊された標的ゲノム遺伝子座を含む変化したＥＳ細胞ゲノムをこれらの創始者動物の子孫に伝達することができ、それによって遺伝的に改変された動物の生産が容易になる。
【００８２】
遺伝子機能を低下させるための他の技術を用いることもまた可能である。これらは、アンチセンス、ＲＮＡ干渉、およびリボソーム媒介切断を含む。そのような実施形態では、第二の生物で遺伝子型を変化させることなく遺伝子機能が低下している。
【００８３】
生体分子マーカーを同定する方法
加齢または寿命調節に関連する生体分子マーカーを同定するためには色々な方法を用いることができる。典型的には、複数の生体分子を第一および第二の生物について評価する。個々の生体分子の特性はそれぞれの生物において同定される。検出可能に異なる特性は、その特定の生体分子をマーカー、または少なくともバイオマーカー候補として特定する。
【００８４】
核酸マーカー
多くの実施形態では、転写物は二つの生物から分析される。転写物を比較する一つの方法は、複数のアドレスを含み各アドレスが特定の転写物に特異的なプローブを有する核酸マイクロアレイを用いる。そのようなアレイは少なくとも１００、または１０００、または５０００個の異なるプローブを含んでいてよいため、相当な部分、たとえば、ある生物中の遺伝子の少なくとも１０、２５、５０、または７５％が評価される。ｍＲＮＡは、生物の試料または生物全体から単離することができる。ｍＲＮＡは、逆転写して標識ＣＤＮＡとしてもよい。標識ｃＤＮＡｓは核酸マイクロアレイとハイブリダイズされる。アレイは各プローブとハイブリダイズしたＣＤＮＡの量を定量するために検出が行われ、それによって各店社物の濃度について情報を提供する。
【００８５】
核酸マイクロアレイを作成および使用する方法はよく知られている。たとえば、核酸アレイはｃａｎｂｅｆａｂｒｉｃａｔｅｄｂｙいろいろな方法、たとえば、フォトリソグラフィー法(たとえば、特許文献１；特許文献２；特許文献３を参照)、機械的方法(たとえば、特許文献４に記載のｄｉｒｅｃｔｅｄ−ｆｌｏｗ法)、ピンを使用する方法(たとえば、特許文献５の記載)、およびビーズを使用する技術(たとえば、特許文献６の記載)。捕捉プローブは一本鎖核酸、二本鎖核酸(たとえば、ハイブリダイゼーションの前または間に変性される)、または一本鎖領域と二本鎖領域を持つ核酸であってよい。好ましくは、捕捉プローブは一本鎖である。捕捉プローブはいろいろな判定基準によって選択することができ、好ましくは最適化パラメータを用いてコンピュータプログラムによって設計される。捕捉プローブは、核酸の配列に富む(たとえば、非ホモポリマー)領域とハイブリダイズするように選択することができる。捕捉プローブのＴｍは相補領域と長さの慎重な選択によって最適化することができる。理想的には、アレイ上のすべての捕捉プローブのＴｍは同様であり、たとえば、互いの２０、１０、５、３、または２℃以内である。ある種について利用可能な配列情報のデータベース検索を用いて、クロスハイブリダイゼーションと特異性の問題の可能性を判定することができる。
【００８６】
比較のために試料から単離されたｍＲＮＡは、たとえばｒｔＰＣＲによって、たとえば(特許文献７)に記載されたように、逆転写してまた随意的に増幅することができる。核酸は、たとえば標識ヌクレオチドの組み込みによって、増幅中に標識することができる。好ましい標識の例は、たとえば赤色蛍光色素Ｃｙ５(Ａｍｅｒｓｈａｍ)または緑色蛍光色素Ｃｙ３(Ａｍｅｒｓｈａｍ)のような蛍光標識、たとえば特許文献８に記載されたような化学発光標識を含む。あるいは、核酸はビオチンで標識し、ハイブリダイゼーション後に標識ストレプトアビジン、たとえば、ストレプトアビジンフィコエリトリン(ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ)を用いて検出することができる。
【００８７】
標識核酸はアレイに接触させることができる。さらに、対照核酸または参照核酸を同一のアレイに接触させることができる。対照核酸または参照核酸は、試料核酸とは別の、たとえば異なる放射最大波長を持つ標識で標識することができる。標識核酸はハイブリダイゼーション条件下でアレイに接触させることができる。アレイを洗浄し、次いでアレイの各アドレスの蛍光を検出するために画像処理することができる。
【００８８】
プロファイルを作成し評価する一般的な手順は下記を含んでいてよい。あるアドレスでのハイブリダイゼーションの程度は数値で表され、たとえば、ベクトル、一次行列、または一次元配列で保存される。ベクトルｘはアレイの各アドレスの値を有する。たとえば、第一のアドレスでのハイブリダイゼーションの程度の数値は変数ｘａで保存される。数値は、たとえば、部分的バックグランドレベル、試料量、および他の変動について補正することができる。核酸はまた参照試料から調製され、たとえば複数のアドレスを有するアレイとハイブリダイズされる(たとえば、同一のまたは異なるアレイ)。ベクトルｙがベクトルｘと同様に作成される。試料発現プロファイルおよび参照プロファイルを、たとえば、二つのベクトルの関数である数式を用いて比較することができる。比較はスカラー量として、たとえば、二つのプロファイルの類似性を表すスコアとして、評価することができる。ベクトルのどちらかまたは両方は、そのアレイで検出された別の核酸への重み値を加えるために行列に変換することができる。
【００８９】
発現データはデータベース、たとえば、ＳＱＬデータベース(たとえば、ＯｒａｃｌｅまたはＳｙｂａｓｅデータベース環境)のようなリレーショナルデータベースに保管することができる。データベースは複数の表を持つことができる。たとえば、発現生データを各列が分析した核酸、たとえばアドレスまたはアレイに対応し、各行が試料に対応する一つの表に保存することができる。別の表は試料情報の識別子、たとえば、使用アレイのバッチ番号、日付、他の品質管理情報を保存することができる。
【００９０】
核酸種を定量する他の方法は：定量的ＲＴ−ＰＣＲを含む。さらに、たとえば減算ハイブリダイゼーションまたはディファレンシャルディスプレイを用いて、二つの核酸集団を分子レベルで比較することができる。
【００９１】
さらに、核酸転写物の組が加齢または寿命調節に関連しているといったん同定されると、そのようなマーカーについて試料を評価することのできるプローブまたはプライマーの組を開発することも可能である。たとえば、同定されたマーカーのそれぞれについてのプローブを含む核酸アレイを合成することができる。
【００９２】
タンパク質分析
たとえばアレイ形式を用いて、たとえば各々がタンパク質種の一つに特異的な抗体のアレイを用いて、複数のタンパク質種の量を並行して測定することができる。他のリガンドもまた用いることができる。ポリペプチドに特異的な抗体は既知の方法で作製することができる。
【００９３】
ポリペプチドアレイを作製する方法は、たとえば、非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；および特許文献９に記載されている。タンパク質がニトロセルロース膜にスポットされる低密度(９６ウェル形式)タンパク質アレイが開発されている非特許文献９)。抗体スクリーニングに用いられる高密度タンパク質アレイ(２２２Ｘ２２２ｍｍ中に１００、０００試料)は、タンパク質を二フッ化ビニリデン(ＰＶＤＦ)膜上にスポットして作製された(非特許文献８)。ポリペプチドは、疎水性テフロン（登録商標）被覆を封入することで形成したウェルを有する平らなガラス板上にプリントすることができる(非特許文献１２)。また、ポリペプチドは高密度アレイ中に、化学的に誘導体化した平板スライドガラスに共有結合によって結合させることができる(１平方センチメートル当たり１６００スポット)(非特許文献１０)。ＤｅＷｉｌｄｔらは、抗体−抗原相互作用をスクリーニングするために、各々が異なる一本鎖抗体を発現している１８、３４２細菌クローンの高密度アレイを記載している(非特許文献７)。これらの既知の技術その他を用いて、試料中のポリペプチドの量を検出するための抗体のアレイを作製することができる。試料は標識することができ、たとえば、後で蛍光標識と結合したストレプトアビジンを用いて検出するために、ビオチン化することができる。アレイは次いで、核酸アレイと同様に、各アドレスへの結合を測定し分析するためにスキャンすることができる。
【００９４】
質量分析。質量分析も独立にまたはタンパク質アレイか２Ｄゲル電気泳動と組み合わせて用いることができる。２Ｄゲル分析については、第一および第二の生物に由来する精製タンパク質試料２Ｄゲル上で分離する(等電点および分子量によって)。ゲル画像は染色またはタンパク質成分の検出後に比較することができる。次いで個々の「スポット」をタンパク質分解し(たとえば、トリプシン、キモトリプシン、またはエラスターゼのようなエンドプロテアーゼといった基質特異的プロテアーゼを用いて)その後ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析に供する。各々のアドレスで観察されるペプチドフラグメントの組み合わせを、同一のアドレスに沈着した核酸の配列に基づく非修飾タンパク質について予測されるフラグメントと比較することができる。たとえばトリプシン断片を予測するためのコンピュータプログラムの使用(たとえば、ＰＡＷＳ)はこの分野で定式化されている。このように、ゲル上のスポットの各アドレスまたはタンパク質アレイ上の各アドレスは、ＭＡＬＤＩによって分析することができる。この分析からのデータは、元の試料中のタンパク質生体分子の存在、量、そしてしばしば修飾状態を決定するのに用いることができる。タンパク質への修飾の大部分は、分子量に予測可能な変化を生じさせる。
【００９５】
他の方法。他の方法もまた、複数のタンパク質生体分子の特性をプロファイリングするのに用いることができる。これらはＥＬＩＳＡとウェスタンブロットを含む。これらの方法の多くは、クロマトグラフィー法およびｉｎ ｓｉｔｕ検出法(たとえば、細胞内局在を検出するための)と組み合わせて用いることができる。
【００９６】
他の生体分子
他の生体分子(たとえば、タンパク質と核酸以外の)は：ＥＬＩＳＡ、抗体結合、質量分析、酵素検定法、化学的検出法、など、を含むいろいろな方法で検出することができる。
【００９７】
マーカーオルソログ
特定の生体分子が、たとえばそれに関連する特性の少なくとも一つのために、有用なバイオマーカーであると同定された場合、他の種、たとえば、マウス、ラット、イヌ、ウシ、ブタ、霊長類、ヒトのような哺乳類種においてそのオルソログを同定することもまた可能である。典型的には「オルソログ」は、特定の種において目的の生体分子に最も近いホモログであり、オルソログは目的の生体分子が有する機能の少なくとも一つを共有する。その生物について完全なまたは部分的に完全なゲノム配列が利用可能である場合、オルソログはより容易に同定されるが、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、およびＥＳＴ分析法で代替可能である。
【００９８】
ホモロジーはいくつかの定型的方法によって決定することができる。たとえば、配列の比較および二つの配列間のパーセント同一性の決定は数学アルゴリズムを用いて達成することができる。好ましい実施形態では、二つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎａｎｄＷｕｎｓｃｈ(非特許文献１３)アルゴリズムを用いて決定され、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスのいずれか、および、１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重み、１、２、３、４、５、または６の長さ重みを用いる。さらに別の好ましい実施形態では、二つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムを用いて決定され、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリクスおよび４０、５０、６０、７０、または８０のギャップ重み、１、２、３、４、５、または６の長さ重みを用いる。特に好ましいパラメータの組(別に指定の無い限り使用するもの)はＢｌｏｓｓｕｍ６２スコアリングマトリクスとギャップペナルティ１２、ギャップ延長ペナルティ４、フレームシフトギャップペナルティ５である。
【００９９】
二つのアミノ酸またはヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム(バージョン２．０)に組み込まれているＥ．ＭｅｙｅｒｓａｎｄＷ．Ｍｉｌｌｅｒ(非特許文献１４)のアルゴリズムを用いて決定することができ、ＰＡＭ１２０重み残数表、ギャップ長ペナルティ１２、ギャップペナルティ４を用いる。
【０１００】
ここで記載する核酸およびタンパク質配列は、たとえば他のファミリーメンバーまたは関係する配列を同定する目的で公開データベースに対する検索を行うための「照会配列」として用いることができる。そのような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ、ｅｔ ａｌ．非特許文献１５のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム(バージョン２．０)を用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索はＮＢＬＡＳＴプログラムを用いて、ｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２で行い、目的の核酸生体分子と相同であるヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索はＸＢＬＡＳＴプログラムを用いて、ｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３で行い、目的のタンパク質生体分子と相同であるアミノ酸配列を得ることができる。比較の目的でギャップ配列を得るには、非特許文献１６に記載されるようにＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴプログラムを利用する際は、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ(たとえば、ＸＢＬＡＳＴとＮＢＬＡＳＴ)を用いることができる。
【０１０１】
データベースとプロファイル
試料を評価し試料のプロファイルを決定する方法もまた扱い、ここでプロファイルは生体分子の濃度または生体分子に関連する他の特性を表す値を含む。一実施形態では、遺伝子の非野生型または非優位対立遺伝子を含む生物からの試料のプロファイルを含んでいてよい。より好ましい実施形態では、その対立遺伝子は生物が延長または短縮した寿命を持つ原因となる。ここで用いられるように、「プロファイル」は値または定性的記述子、個々の値または記述子、特定の遺伝子の発現レベル(タンパク質またはｍＲＮＡ)を表す個々の値または記述子を指す。生物は後生動物、たとえば哺乳類(たとえばマウス、ラット、イヌ、またはヒト)、または無脊椎動物たとえばハエであってよい。
【０１０２】
一部の実施形態では、プロファイルは試料または試料から抽出あるいは増幅した分子を核酸アレイに接触させることによって測定する。別の実施形態では、プロファイルは試料または試料から抽出した分子をタンパク質アレイに接触させることによって測定する。さらに別の実施形態では、プロファイルは質量分析によって測定する。本方法はさらに、値またはプロファイル(すなわち複数の値)を参照値または参照プロファイルと比較することに関係することができる。試料のプロファイルは、ここに記載の任意の方法によって得ることができる(たとえば、試料由来の核酸を与え、その核酸をアレイに接触させることによって)。本方法は、たとえば被験化合物または承認された治療薬で処理された被験体のように、処理を監視するのに用いることができる。たとえば、被験化合物を用いた処理を受ける被験体からの試料について遺伝子発現プロファイルを測定することができる。好ましい実施形態では、本方法はさらに、プロファイルを遺伝子の非野生型または非優位対立遺伝子を含まない(たとえば、野生型対立遺伝子について同型接合である)生物に由来する参照試料の発現プロファイルと比較することを含む。
【０１０３】
一つの態様では、本発明は複数のデジタル式にコードされたデータ記録を持つコンピュータ媒体を提供する。たとえば、個々のデータ記録は試料中の生体分子の発現レベルを表す値、および試料の記述子を含む。試料の記述子は、試料の識別子、試料が由来した被験体(たとえば、マウスといった生物)、処理(たとえば、被験化合物を用いた処理)であってよい。好ましい実施形態では、データ記録はさらに、追加の生体分子(たとえば、加齢に関連する他の遺伝子またはタンパク質、またはアレイ上の他の遺伝子)の発現レベルを表す数値を含む。データ記録はたとえば、リレーショナルデータベース(たとえば、ＯｒａｃｌｅまたはＳｙｂａｓｅデータベース環境のＳＱＬデータベース)といったデータベースの一部である表のような、表として構成することができる。
【０１０４】
試料は、たとえば、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）のｄａｆ突然変異体といった突然変異線虫、たとえば、ｐ６６ｓｈｃ突然変異体、ＡｍｅｓまたはＳｎｅｌｌマウスといった突然変異マウス、たとえば、Ｉｎｄｙ突然変異体といった突然変異ハエ、など、通常と比較して寿命調節に変化を生じさせる遺伝子型を持つ動物に由来することができる。
【０１０５】
下記の段階を行うための実行コードを有するコンピュータ媒体もまた扱われている；照会発現プロファイルを受け取る；参照発現プロファイルのデータベースにアクセスする；そしてｉ)被験体発現プロファイルと最も類似している合致する参照プロファイルを選択するかまたはｉｉ)少なくとも一個の参照プロファイルに対する被験体発現プロファイルの類似性について少なくとも一個の比較スコアを決定する。参照発現プロファイルは、野生型生物またはその試料、またはたとえば寿命が影響される突然変異体といった突然変異生物、またはその試料のプロファイルを表すことができる。
【０１０６】
ここに記載するコンピュータを使用する技術は、いかなる特定のハードウェアまたはソフトウェア構成にも限定されない；その技術は任意の計算または処理環境で適用される。本技術はハードウェア、ソフトウェア、またはその二つの組み合わせで実施することができる。たとえば、本技術は内蔵回路を用いて実施することができる。コンピュータを使用する技術は、携帯型または据置型コンピュータ、手持ち型機器、生物試料処理または検知器具、およびそれぞれがプロセッサ、当該プロセッサで読み取り可能な保存媒体(揮発性および不揮発性メモリおよび／または記憶素子を含む)、少なくとも一個のポートまたはビデオ入力装置、および一または複数の出力装置(たとえば、ビデオ保存および／または配布用)を含む同様の装置のような、プログラム可能な装置上で実行されるプログラム内で実施することができる。
【０１０７】
記載のビデオエンコード法に適当である、プログラム可能なシステムの例は、プロセッサ、ランダムアクセスメモリ(ＲＡＭ)、プログラムメモリ(たとえば、フラッシュＲＯＭのような書き込み可読み出し専用メモリ(ＲＯＭ))、ハードドライブコントローラ、およびプロセッサ（ＣＰＵ）バスと連結した入力／出力(Ｉ／Ｏ)コントローラを含む。そのシステムはたとえばＲＯＭに予めプログラムすることができ、または他のソースから(たとえば、フロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、または別のコンピュータから)プログラムをロードすることによってプログラムする(および再プログラムする)ことができる。ハードドライブコントローラは、実行コンピュータプログラムおよび／またはエンコードされたビデオデータを保存するのに適当なハードディスクと連結されている。Ｉ／ＯコントローラはＩ／Ｏインターフェイスと連結されている。Ｉ／Ｏインターフェイスは、たとえばローカルエリアネットワーク、バーチャルプライベートネットワーク、またはインターネットへの通信リンクを介してアナログまたはデジタル形式のデータを送受信する。
【０１０８】
プログラムは機器システムと通信するため高度な手続き型またはオブジェクト指向型プログラム言語で実施される。しかし、必要に応じてプログラムはアセンブリまたはマシン言語で実施することができる。いずれの場合でも、言語はコンパイラ型言語またはインタープリタ型言語であってよい。そのようなプログラムのそれぞれは、本書面に記載の手順を実施するために、保存媒体または装置がコンピュータによって読み取られる時、装置を設定し操作するために一般用または特殊目的プログラム可装置によって読み出しが可能である、たとえば、コンパクトディスク読み出し専用メモリ(ＣＤ−ＲＯＭ)、ハードディスク、磁気ディスク、または同様の媒体または装置といった、保存媒体または装置に保存することができる。本システムはまた、機械が予め定められた方法で動作するよう保存媒体が設定されている、プログラムと共に設定された機械可読保存媒体として実施することができる。
【０１０９】
標的同定と妥当性評価
標的同定と妥当性評価の多くの方法が、酵母、ハエ、線虫、およびマウスを含むモデル生物における分子遺伝学(正遺伝学および逆遺伝学)および生化学(たとえば、ＲＮＡｉ、アンチセンス、標的特異的抗体、他の標的結合リガンド)手法を利用し、混乱させられた時に寿命を延長する遺伝子を同定する。ヒト集団遺伝学の利用を通じて、モデル生物において同定された候補遺伝子を、たとえば、関連分析によって妥当性評価することができる。さらに、寿命延長に関連する新規ヒト遺伝子を、関連分析を介して同定することができる(たとえば、ポジショナルクローニング)。
【０１１０】
使用できる方法は以下を含む：
１．ＥＳＴ、遺伝子発現、タンパク質−タンパク質相互作用、生化学−代謝経路、構造−機能のコンピュータ内での分析および他の遺伝子−機能データベースを用いて下記の一または複数を達成することができる：(１)モデル生物で同定された長寿遺伝子のヒトオルソログ候補を同定する、(２)候補遺伝子について組織および発生発現情報を得る、(３)ヒト長寿表現型に関連する可能性のある候補遺伝子に関連する可能な多型を同定する、(４)コードされたタンパク質を経路へ割り当てる、(５)これらの経路中の他の関与分子を同定する、(６))コードされたタンパク質について構造モデルを作製する、(６)機能および作用機序を確立する、(７)当該経路のメンバーと相互作用することが知られている化合物を同定し、それらの化合物について薬理的、構造的、および他の情報を得る、そして(８)経路のメンバーと特定の疾患とを関連付ける。
【０１１１】
２．細胞、組織、器官、および生物における遺伝子発現の転写プロファイリングを用いて、下記の一または複数を達成することができる：(１)初期発生、成熟および加齢を通じて、モデル生物およびヒトにおける全体的遺伝子発現に及ぼす長寿遺伝子の遺伝的および／または生化学的混乱の影響を評価する、(２)長寿遺伝子、長寿経路のメンバー、および長寿遺伝子を混乱させることによって影響される遺伝子の、組織および発生上の発現を測定する、(３)潜在的な長寿遺伝子を同定するための、短い寿命と単純なゲノムを持つモデル生物(たとえば、酵母、線虫、ハエ)における遺伝子発現の、異なる暦年齢を比較した全体的比較、(４)作用機序、潜在的毒性を決定し、長寿スクリーニングから得られた化合物の標的を同定する、(５)薬学的介入のための潜在的標的および経路を同定するための、異なる暦年齢および生物学的年齢の生物間の遺伝子発現の全体的評価。
【０１１２】
３．候補長寿遺伝子、たとえば、ミトコンドリア機能またはエネルギー代謝(たとえばトランスポーター分子)、熱ショック応答、インスリンシグナル伝達に関与する遺伝子、または、および／または候補長寿遺伝子の設計された突然変異体が組み込まれた遺伝子導入動物モデルを作製し、その生物において制御された発現(たとえば、定量的ならびに発生上、組織、などの調節)を達成する。
【０１１３】
使用することのできる分析法は、生体分子の発現レベルを評価するため、および異なる遺伝子型の生物においてそのような分子の間の差異を同定するための方法を含む。そのような分析法の詳細な例をここに提供する。
【０１１４】
被験化合物の評価
実施形態は、寿命延長について化合物一次スクリーニングを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分子的または細胞系検定法を用いておよび／またはｉｎ ｖｉｖｏで単純なモデル生物を用いて、自動化、高処理量、高容量スクリーニングで実施することを含む。代替の寿命マーカー(上記参照)は、ｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングの検定終点として死亡を測定することに代替が可能で、従ってこれらのスクリーニングを加速する。これらの一次スクリーニングでの陽性は、次いで動物、たとえば、ハエ、線虫、またはマウス、で検定することができ、この段階でより少数の化合物のうちの一つで処理した動物について実際の寿命を測定することができるが、ここでもまた、その生物について信頼できる寿命代替マーカーを同様に用いることができる。転写プロファイリングを用いて、我々のスクリーニングから出現した寿命延長化合物候補の有効性、作用機序、潜在的毒性および薬理遺伝学的性質を評価することができる。上述の通り(『標的同定と妥当性評価』を参照)、転写プロファイリングはまた、細胞系およびｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングから得られたそれらの化合物のための潜在的標的を同定することができる。被験化合物は動物モデル、特にマウスを用いて評価することができ、ここでは、上記の通り、より単純なモデル生物から収集した情報にしばしば基づいて、我々は以前に寿命延長有効性についてのマーカーを同定している。
【０１１５】
一つの態様では、本発明は、年齢に関係する過程に及ぼす被験化合物の効果を評価するために、被験化合物について、またはより典型的には被験化合物のライブラリについてスクリーニングを行うための検定法を提供する。その方法は、細胞または生物のような系を被験化合物と接触させ、寿命調節または加齢過程に関連するマーカーの特性を評価することを含む。特性は、たとえば、被験化合物がその系を混乱させるかどうかを、被験化合物に曝露されておらずまた典型的にはその他は同一の条件下で維持されている対照系と比較して見るために、対照系と比較することができる。バイオマーカーの特性に変化を生じさせ、その特性が長寿に関連する遺伝子型を持つ被験体の特徴に向かって変化するかまたはその特徴を持つようになる被験化合物を、寿命を伸ばすことのできる化合物と同定できる。被験化合物はまた、さらに修飾され最適化されるリード化合物と考えることができる。修飾型は同様に分析することができる。別の一例では、バイオマーカーの特性に変化を生じさせ、その特性が寿命短縮に関連する遺伝子型を持つ被験体の特徴に向かって変化するかまたはその特徴を持つようになる被験化合物は、その被験化合物を寿命調節を変化させ寿命を短縮する化合物と同定できる。そのような被験化合物は、寿命調節の好ましい調節のために修飾または再設計することができる。たとえば、再設計はある種の作用薬を拮抗薬に変えることができ、また逆もそうである。さらにそのような被験化合物は、他のレギュレーターに目標にされている標的分子を同定するための導入点として使用することができる。
【０１１６】
寿命自体でなくマーカーを評価することの少なくとも一つの利点はスピードである。たとえば、その系は当該の生物の全寿命にわたって維持する必要が無い。典型的には、細胞または生物が被験化合物に曝露され、ある期間の後(たとえば、数時間、または数日)、細胞または生物は、たとえば、関連するバイオマーカーについて再び特徴づけが行われる。さらに、被験化合物は異なる年齢の細胞および生物と接触させ、年齢に基づく反応を評価することができる。三つめに、本検定法は特定の直接の標的を考えることなく実施することができる。
【０１１７】
「被験化合物」は任意の化学化合物、たとえば、巨大分子(たとえば、ポリペプチドタンパク質複合体、または核酸)または小分子(たとえば、アミノ酸、ヌクレオチド、有機または無機化合物)であってよい。被験化合物は、モル当たり約１０、０００グラム未満、モル当たり５、０００グラム未満、モル当たり１、０００グラム未満、またはモル当たり約５００グラム未満、の式量を持つことができる。被験化合物は天然に存在するか(たとえば、ハーブまたは天然産物)、合成か、または両方であってよい。巨大分子の例は、タンパク質、タンパク質複合体、糖タンパク質、核酸、たとえばＤＮＡ、ＲＮＡおよびＰＮＡ(ペプチド核酸)である。小分子の例は、ペプチド、ペプチドミメティック(たとえばペプトイド)、アミノ酸、アミノ酸アナログ、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドアナログ、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、有機または無機化合物たとえば、有機ヘテロまたは有機金属化合物である。被験化合物はここに記載の方法によって測定される唯一の物質であってよい。あるいは、一群の被験化合物を連続的にまたは同時に、ここに記載の方法によって測定することができる。
【０１１８】
好ましい実施形態では、高処理量スクリーニング法は、多数の潜在的治療薬化合物(潜在的なモジュレーターまたはリガンド化合物)を含む組み合わせ化学またはペプチドライブラリを提供することを含む。そのような「組み合わせ化学ライブラリ」または「リガンドライブラリ」は次いでここに記載の通り一または複数の検定法でスクリーニングし、目的の特徴的な活性を示すライブラリメンバー(特定の化学種または亜集合)を同定する。そのように同定された化合物は従来の「リード化合物」として用いることができるかまたは、それら自身が潜在的または実際の治療薬として用いることができる。
【０１１９】
組み合わせ化学ライブラリは、試薬のようないくつかの化学「ブロック」を組み合わせることによって、化学合成または生物学的合成のいずれかで作製されたさまざまな化学化合物の集合である。たとえば、化学ブロック(アミノ酸)の組を所定の化合物長（すなわち、ポリペプチド化合物中のアミノ酸の数）になるように可能なすべての方法で組み合わせることによって、ポリペプチドライブラリのような直線組み合わせ化学ライブラリが形成される。化学ブロックの何百万ものそのような組み合わせ混合を通じて、化学化合物を合成することができる。
【０１２０】
組み合わせ化学ライブラリの作製およびスクリーニングは当業者によく知られている。そのような組み合わせ化学ライブラリは、ペプチドライブラリ(たとえば、特許文献１０、非特許文献１７および非特許文献１８を参照)を含むがこれらに限定されない。化学的多様性ライブラリを作製するための他の化学もまた使用することができる。そのような化学は：ペプトイド(たとえば、特許文献１１)、コードペプチド(たとえば、特許文献１２)、ランダムバイオオリゴマー(たとえば、特許文献１３)、ベンゾジアゼピン(たとえば、特許文献５)、ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチドのようなダイバーソマー(非特許文献１９)、ビニロガスポリペプチド(非特許文献２０)、グルコース足場を有する非ペプチドのペプチドミメティック(非特許文献２１)、小化合物ライブラリのアナログ有機合成(非特許文献２２)、オリゴカルバメート(非特許文献２３)、および／またはペプチジルホスホネート(非特許文献２４)、核酸ライブラリ(Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｂｅｒｇｅｒａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ、すべて前出、を参照)、ペプチド核酸ライブラリ(たとえば、特許文献１４を参照)、抗体ライブラリ(たとえば、非特許文献２５および特許文献１５)、炭化水素ライブラリ(たとえば、非特許文献２６および特許文献１６を参照)、有機小分子ライブラリ(たとえば、ベンゾジアゼピン、非特許文献２７；イソプレノイド、特許文献１７；チアゾリジノンおよびメタチアザノン、特許文献１８；ピロリジン、特許文献１９および特許文献２０；モルホリノ化合物、特許文献２１；ベンゾジアゼピン、特許文献２２、などを参照)を含むがこれらに限定されない。分子ライブラリの合成のための方法のさらなる例は当該分野に見出され、たとえば：非特許文献２８；非特許文献２９；非特許文献３０；非特許文献２３；非特許文献３１；非特許文献３２；および非特許文献３３。
【０１２１】
組み合わせライブラリの作製のための装置は市販されている(たとえば、３５７ＭＰＳ、３９０ＭＰＳ、ＡｄｖａｎｃｅｄＣｈｅｍＴｅｃｈ、ＬｏｕｉｓｖｉｌｌｅＫＹ、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ、Ｒａｉｎｉｎ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ、４３３ＡＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、ＣＡ、９０５０Ｐｌｕｓ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡを参照)．さらに、多数の組み合わせライブラリがそれ自体市販されている(たとえば、ＣｏｍＧｅｎｅｘ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．、Ａｓｉｎｅｘ、Ｍｏｓｃｏｗ、Ｒｕ、Ｔｒｉｐｏｓ、Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＣｈｅｍＳｔａｒ、Ｌｔｄ、Ｍｏｓｃｏｗ、ＲＵ、３ＤＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｅｘｔｏｎ、ＰＡ、ＭａｒｔｅｋＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＤ、などを参照)。
【０１２２】
本発明の被験化合物はまた：生物学的ライブラリ；ペプトイドライブラリ(ペプチドの機能性を有するが、新規の、酵素分解に耐性であるが、にもかかわらず生物活性を保つ非ペプチド骨格を有する分子のライブラリ；たとえば、非特許文献３０を参照)；空間位置指定可の平行固相または溶液相ライブラリ；デコンボルーションを必要とする合成ライブラリ法；「１ビーズ１化合物」ライブラリ法；およびアフィニティクロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリ法、から得ることができる。生物学的ライブラリは核酸のライブラリとタンパク質のライブラリを含む。一部の核酸ライブラリは多様な組のタンパク質をコードする(たとえば、天然および人工タンパク質；他のものは、たとえば、核酸アプタマーまたはリボザイムといった機能性ＲＮＡおよびＤＮＡ分子を提供する。ペプトイドライブラリはペプチドライブラリと同様の構造を含むように作製することができる．(非特許文献３４も参照)。タンパク質のライブラリは発現ライブラリまたはディスプレイライブラリ(たとえば、ファージディスプレイライブラリ)によって作製することができる。
【０１２３】
化合物のライブラリは溶液中に(たとえば、非特許文献３５)、またはビーズ上(非特許文献３６)、チップ(非特許文献３７)、細菌(Ｌａｄｎｅｒ、特許文献２３)、胞子(特許文献２３)、プラスミド(非特許文献３８)またはファージ上(非特許文献３９；非特許文献４０；非特許文献４１；非特許文献４２；特許文献２３)に提示することができる。
【０１２４】
さらに別の態様では、本発明は複数のバイオマーカーを用いて被験化合物を評価する方法に関する。これは試料のプロファイリングによって行うことができる。その方法は、細胞と被験化合物を提供すること；被験化合物を細胞と接触させること；接触した細胞について被験体発現プロファイルを得ること；そして被験体発現プロファイルを一または複数の参照プロファイルと比較すること、を含む。プロファイルは、年齢に関係する過程に関与することが以前に決定された分子の発現のレベルを表す値を含む。好ましい実施形態では、被験体発現プロファイルは、標的プロファイル、たとえば、正常細胞についてまたは細胞の目的の状態についてのプロファイルと比較する。被験体発現プロファイルが、接触していない細胞から得られた発現プロファイルよりも、標的プロファイルに類似している場合、被験化合物には良い評価が与えられる。
【０１２５】
プロファイルの類似性は、ｎ次元空間におけるユークリッド距離を含む、いろいろな尺度によって測定することができ、ｎはプロファイル内の異なる値の数である。他の尺度は、たとえば、比較における重要性に従った異なる値に基づく重み係数を含む。
【０１２６】
たとえば核酸アレイまたはタンパク質アレイから得られたプロファイルのようなプロファイルは、非特許文献４３に記載された通り、いろいろな状態の試料および／または細胞ｉを比較するのに用いることができる。一実施形態では、異なる条件に由来する複数の発現プロファイル、また複製分析または同様の条件に由来する同種試料を比較して、発現レベルが試料および／または条件を予測する核酸を同定する。それぞれの候補核酸には、その核酸の相関の程度および試料の性質に従った、重みづけされた「投票」係数を与えることができる。相関は、ユークリッド距離またはピアソン相関係数を用いて測定することができる。
【０１２７】
診断および患者の治療
ここに記載の方法で同定されたバイオマーカーはまた、たとえば患者の治療において診断目的で使用することができる。たとえば、マーカーは被験者を評価する方法に用いることができる。被験者は健常または疾患を持つ被験者であることができ、たとえば、成人患者または治療中の患者である。典型的な方法は：ａ)たとえば、試料を被験者から入手する介護者といった介護者から、被験者由来の試料を入手すること；ｂ)その試料について被験者発現プロファイルを測定すること、を含む。随意的に、その方法はさらに：ｃ)被験者発現プロファイルを一または複数の参照発現プロファイルと比較すること；そしてｄ)被験者参照プロファイルと最も類似している参照プロファイルを選択すること、のいずれかまたは両方の段階を含む。被験者発現プロファイルと参照プロファイルは、加齢のマーカーとして同定された分子の発現レベルを表す値を含む。二つの参照プロファイルを比較するためには、いろいろな定型的な統計手法を用いることができる。一つの可能な尺度は、二つのプロファイルの間の差である距離ベクトルの長さである。被験者および参照プロファイルのそれぞれは多次元ベクトルとして表され、各次元はプロファイル中の値である。
【０１２８】
本方法はさらに、結果を介護者へ送ることを含む。結果は、ｃａｎｂｅｔｈｅ被験者発現プロファイル、被験者発現プロファイルと別のプロファイルとの比較結果、最も類似した参照プロファイル、または前記のうち任意のものの記述子であってよい。結果はコンピュータネットワークを通じて送ることができ、たとえば、結果はコンピュータ通信の形式、たとえば、搬送波に埋め込まれたコンピュータデータ信号であってよい。
【０１２９】
下記の段階を実施するための実行コードを有するコンピュータ媒体もまた扱われる：被験者発現プロファイルを受け取る；参照発現プロファイルのデータベースにアクセスする；そしてｉ)被験者発現プロファイルと最も類似している合致する参照プロファイルを選択するかまたはｉｉ)少なくとも一個の参照プロファイルに対する被験者発現プロファイルの類似性について少なくとも一個の比較スコアを決定する。被験者発現プロファイルと参照発現プロファイルのそれぞれが、加齢のマーカーの発現のレベルを表す値を含む。
【０１３０】
反応性酸素種
生物学的組織は、加齢および変性疾患(たとえば、筋萎縮性側索硬化症)に寄与しうる酸化的ストレスを含むいろいろなストレスによって損傷される。典型的な反応性酸素種は、酸素ラジカル(たとえば、スーパーオキシド)、および過酸化水素を含む。集合的にこれらは反応性酸素種(ＲＯＳ)と呼ばれる。多数のフリーラジカル反応は細胞成分に高度に損傷を与える；それらの反応は、タンパク質を架橋し、ＤＮＡに突然変異を生じ、脂質を過酸化することができる。
【０１３１】
一実施形態では、細胞または生物は、環境ストレスを緩和するかまたは緩和する可能性がある物質で処理される。たとえば、ＲＯＳに関しては、典型的な物質は、合成触媒スカベンジャー化合物および、スーパーオキシドジスムターゼまたはカタラーゼを活性化するかまたは活性を上昇させる物質を含む。典型的なＲＯＳ結合化合物は、ホモシステイン、クリオキノール、ジアミノジカルボン酸を含む。さらに他の化合物が、サレン−遷移金属複合体、たとえば、フリーラジカルスカベンジャーであるサレン−Ｍｎ(ＩＩＩ)複合体を記載している、特許文献２４、特許文献２５、特許文献２６、特許文献２７および特許文献２８に記載されている。
【０１３２】
細胞または生物は、当該物質の緩和効果と関連しているバイオマーカーを同定するために評価される。そのようなバイオマーカーは、たとえば、物質として同様の効果を有する天然または人工化合物を同定するのに有用である。
【０１３３】
一例では、バイオマーカーは銅または亜鉛を含む生体分子である。さらに、ＣｕおよびＺｎの脳組織における濃度を、ある動物の寿命にわたって、または同一の暦年齢で異なる遺伝子型の動物(たとえば、哺乳類)において評価することが可能である。ＣｕまたはＺｎの濃度と相関する生体分子を評価することは、ある種の疾患（たとえばアルツハイマー病）で生じるように、これらの元素の高い濃度と関連する生理学的状態を検出するのに用いることができるマーカーを同定する。
【０１３４】
本発明のいくつかの実施形態が記載されている。にもかかわらず、本発明の精神および範囲を離れることなくさまざまな修飾を行うことができることが理解される。従って、他の実施形態は下記の請求項の範囲にある。
【国際調査報告】
2005524382.tif 000004
2005524382.tif 000005