(57)【要約】安定で純粋な形態の３−インドリルピルビン酸エノール互変異性体並びにそれらのアルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩を合成方法によって製造する。該エノール互変異性体には、幾何異性体（Ｚ）のみが含まれ、これは適切な薬理効果を有する唯一の互変異性体型である。得られた化合物は、不安、抑鬱症、行動障害、神経変性などの病的状態において重要な生化学的及び薬理特性を示した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学的に安定で、貯蔵寿命が安定した半結晶性の固体状態で、エノールの純度が酸全体に対して９９％以上であるエノール互変異性体型３−インドリルピルビン酸及びその誘導体。
【請求項２】
エノール純度が９９．９％である請求項１に記載のエノール互変異性体型３−インドリル−ピルビン酸及びその誘導体。
【請求項３】
化学的に安定で、貯蔵寿命が安定した半結晶性の固体状態で、エノールの純度が９９％以上である、本質的に（Ｚ）型の幾何異性体から成るエノール互変異性体型３−インドリル−ピルビン酸及びその誘導体。
【請求項４】
薬剤として使用するための請求項１から３までのいずれか一項に記載のエノール互変異性体型３−インドリル−ピルビン酸及びその誘導体。
【請求項５】
中枢神経系障害の治療的処置に使用するための請求項４に記載のエノール互変異性体型３−インドリル−ピルビン酸。
【請求項６】
不安、抑鬱症、睡眠障害、食欲障害、気分障害及び情動障害、外傷後脳障害、脳低酸素症及び虚血、てんかん、高齢者認識衰退、神経変性障害、身体的及び精神的ストレス状態の処置に使用するための請求項４又は５に記載のエノール互変異性体型３−インドリル−ピルビン酸。
【請求項７】
心臓血管病的状態の処置に使用するための請求項４に記載のエノール互変異性体型３−インドリル−ピルビン酸。
【請求項８】
ニューロン細胞の発芽の治療的処置に使用するための請求項４に記載のエノール互変異性体型３−インドリル−ピルビン酸。
【請求項９】
腫瘍の治療的処置に使用するための請求項４に記載のエノール互変異性体型３−インドリル−ピルビン酸。
【請求項１０】
薬物製造用に化学的に純粋で貯蔵上安定な材料として製薬業界で使用するための請求項１から３までのいずれか一項に記載のエノール互変異性体型３−インドリル−ピルビン酸。
【請求項１１】
反応溶媒中において、錯化剤及びプロトン受容体アミン塩基の存在下で、トリプトファンと芳香族アルデヒドとを反応させ、４５℃から６５℃の温度での高温酸性加水分解段階において前記結合反応の生成物を加水分解することを含み、
プロトン受容体非求核アミン塩基としてのトリエチルアミン、
酢酸亜鉛又は硫酸亜鉛から成る群から選択された錯化剤の存在下で、
反応溶媒として、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル及びメタノールから成る群から選択された有機極性溶媒中において、
縮合反応のために、２−ピリジン−カルボキシアルデヒドを単独又はトリエチルアミンとの混合物中で前記トリプトファンのアミン官能基と反応させることを含む請求項１、２又は３に記載のエノール互変異性体型３−インドリル−ピルビン酸の製造方法。
【請求項１２】
前記錯化剤がＺｎ酢酸塩二水和物又はＺｎ硫酸塩七水和物である請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記高温酸性加水分解段階の温度が５５℃である請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記反応溶媒が無水ではない請求項１１、１２又は１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
誘導体が化学的に純粋で、貯蔵寿命が安定で、結晶状のアルカリ金属又はアルカリ土類金属との塩である、請求項１から３までのいずれか一項に記載のエノール互変異性体型３−インドリル−ピルビン酸の誘導体。
【請求項１６】
前記アルカリ金属又はｈｅａｒｔｈ金属がナトリウム、リチウム、カリウム、マグネシウム又はカルシウムである請求項１５に記載の誘導体塩。
【請求項１７】
薬剤として使用するための請求項１５又は１６に記載のエノール互変異性体型３−インドリル−ピルビン酸の誘導体塩。
【請求項１８】
中枢神経系障害の治療的処置に使用するための請求項１７に記載のエノール互変異性体型３−インドリル−ピルビン酸の誘導体塩。
【請求項１９】
前記障害が不安、抑鬱症、睡眠障害、食欲障害、気分障害及び情動障害、外傷後脳障害、脳低酸素症及び虚血、てんかん、高齢者認識衰退、神経変性障害、身体的及び精神的ストレス状態である請求項１８に記載の誘導体塩。
【請求項２０】
病的な心臓血管状態の治療的処置に使用するための請求項１７に記載のエノール互変異性体型３−インドリル−ピルビン酸の誘導体塩。
【請求項２１】
セロトニン作動活性の欠如又は興奮性アミノ酸活性の過剰の治療的処置のための活性剤として使用するための請求項１７に記載のエノール互変異性体型３−インドリル−ピルビン酸の誘導体塩。
【請求項２２】
ニューロン細胞の発芽の治療的処置のための活性剤として使用するための請求項１７に記載の誘導体塩。
【請求項２３】
腫瘍の治療的処置に活性剤として使用する請求項１７に記載の誘導体塩。
【請求項２４】
第１の非プロトン性極性溶媒において、金属活性化剤として第２のプロトン性極性溶媒と一緒に、アルカリ金属又はアルカリ土類金属で前記エノール互変異性体３−インドリル−ピルビン酸を中和する段階を特徴とする請求項１５又は１６に記載のエノール互変異性体型３−インドリル−ピルビン酸のアルカリ金属塩誘導体又はアルカリ土類金属塩誘導体の製造方法。
【請求項２５】
前記第１の非プロトン性溶媒及び前記第２のプロトン性極性溶媒が無水である請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記非プロトン性極性溶媒がジエチル−エーテル又はテトラヒドロフランである請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記中性金属がメトキシド及びエトキシドの形態で、前記プロトン性溶媒がメチルアルコール又はエチルアルコールである請求項２４から２６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記アルカリ金属又はアルカリ土類金属がナトリウム、リチウム、カリウム、マグネシウム又はカルシウムである請求項２４から２７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記誘導体が３−インドリル乳酸である請求項１から３までのいずれか一項に記載のエノール互変異性体型３−インドリル−ピルビン酸の誘導体。
【請求項３０】
前記３−インドリルピルビン酸の投与を必要とする患者の中枢神経系の治療的処置のための薬剤を製造するための、３−インドリルピルビン酸前駆体としての請求項２９に記載の３−インドリル乳酸の使用。
【請求項３１】
３−インドリルピルビン酸の投与を必要とする患者の治療的処置のための３−インドリル乳酸の前駆体として使用するための請求項１から３までのいずれか一項に記載のエノール互変異性体型３−インドリル−ピルビン酸又は請求項１５又は１６に記載のそれらのアルカリ又はアルカリ土類誘導体。
【請求項３２】
請求項１から３まで、及び１５又は１６のいずれか一項に記載のエノール互変異性体型３−インドリルピルビン酸又はそれらのアルカリ金属又はアルカリ土類金属との誘導体塩並びに薬剤として適合できる賦形剤又は担体を含む医薬品組成物。
【請求項３３】
前記担体が生理的溶液である請求項３２に記載の医薬品組成物。
【請求項３４】
中枢神経系、病的な心臓血管状態、ニューロンの発芽及び腫瘍の治療的処置に使用するための請求項３２又は３３に記載の医薬品組成物。
【請求項３５】
不安、抑鬱症、睡眠障害、食欲障害、気分障害及び情動障害、外傷後脳障害、脳低酸素症及び虚血、てんかん、高齢者認識衰退、神経変性障害、身体的及び精神的ストレス状態の処置に使用するための請求項３２又は３３に記載の医薬品組成物。
【請求項３６】
カプセル、錠剤、座剤又は注射可能なバイアルの形態の請求項３２又は３３に記載の医薬品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、製薬業界の処理段階での使用に適した、本質的にケト互変異性体を含まない形態で得られた３−インドリルピルビン酸のエノール互変異性体（簡単にＩＰＡ）並びにそれらの塩、特にアルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩に関する。
【０００２】
本発明はさらに、前記で引用した固形型、好ましくは本質的に結晶構造のエノール互変異性体及びそれらの塩の製造方法、並びに特に中枢神経系障害の処置における治療活性剤としてのそれらの活性に関する。
【背景技術】
【０００３】
ケト−エノール互変異性は良く知られた化学現象で、カルボニル基に隣接したアルファ炭素からの水素原子の完全に可逆的な移動とその後の二重結合移動として定義することができる。したがって、生じた型は、区別可能な物理化学的特性を備えており、それぞれケト及びエノール「互変異性体」として定義される。溶液中では、アルファ−ケト酸を含めたケト種は全て、平衡状態に達するまである互変異性体からもう一方の互変異性体への動力学的変換を受け、その程度は検討する化学種、溶媒、ｐＨ、温度などの要因に左右される。しかし、本来互いの変換が極めて容易な互変異性体は通常、それぞれ自体、すなわち明らかに異なった生化学反応を起こさせることができる化学種として処理されることはなく、代わりに１つの化合物であるかのように溶液中における最終効果で一般的に評価される。
【０００４】
立体異性体の場合、異性体型の互いの変換は自発的に生じることは通常不可能である。特に、１つの形態が治療的に活性のある形態であれば、その他のエナンチオマーは従来の精製方法で除去可能な不純物と考えられる。
【０００５】
反対に、互変異性体の場合、これらは緩和な条件下であっても、平衡状態に達するまで自発的に互いに変換する。実際に、互変異性体は実験条件及び保存条件に左右される連続的かつ巨視的な変更における動的体系である。したがって、１つの互変異性体型のみが治療的に活性を有すると推測することはまだ可能である一方、その他の互変異性体は除去すべき不純物として簡単に見なすことはできないが、構造バランスに自発的に関与する種として見なすことができる。この自発的な作用機構のため、治療活性種の「濃度」は常に不確実である。
【０００６】
３−インドリルピルビン酸（３−インドリルプロピオニック−α−オキソ酸）は、植物界及び動物界では一般的なアルファケト酸である。これは、数種の動物の食餌において必須で、ほとんどの蛋白質に見いだされる天然種のアミノ酸、トリプトファンのアミノ基転移生成物で、細胞全てに必ず存在するが、定量的な測定には常にいくつかの技術的問題が伴う。
【０００７】
たとえば、ここ数十年の間、植物の成長因子として作用する３−インドール酢酸は３−インドリルピルビン酸から直接得られ、次にトリプトファンからアミノ基転移によって得られることが知られてきた。しかし、これらの変換の範囲を定量化するために行われた研究では重大な問題が生じた。第１に、３−インドリルピルビン酸の合成に使用した様々な方法では、多色化合物が生じ、その物理化学特性が一定せず、使用した特定の合成方法に左右されることが明らかになった。第２に、ケト−エノール互変異性が存在するため、トリプトファンアミノ酸転移で生じる化学種の明確な同定が妨害された。数十年前に、３−インドリルピルビン酸のケト−エノール互変異性の特性を理解しようと、多くの基礎研究が実施され、極めて興味深い結果が得られたが、特に当時使用できた器具の限界と見なされた。
【０００８】
たとえば、Ｊ．Ａ．Ｂｅｎｔｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊ．６４、４４〜４９、１９５６）は、新たに合成した３−インドリルピルビン酸がペーパークロマトグラフィーで溶出液として使用した系に応じて、全く異なった挙動を示すことを示唆した。イソプロパノール、アンモニア及び水から成る溶液はアルファケト酸を完全に分解し、一方酢酸と水の混合物では、２つの異なるブロットを得ることができた。Ｓｃｈｗａｒｚ及びＢｉｔａｎｃｏｕｒｔ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊ．７５、１８２〜７、１９６０）は、常にペーパークロマトグラフィーを使用して、３−インドリルピルビン酸は、完全に分解されてしまうか、又は使用した溶媒では分解産物から分離することができないために、クロマトグラフィーで適切に選別できない極めて不安定な物質であることを示し、適切な注意を払い、２元クロマトグラフィーを用いて、ケト及びエノール互変異性体と見なされる２つの異なる生成物及びその他数個の未確認の分解産物を得ることができた。同研究では、おそらくケト酸はｐＨ８．０の溶液中においても主にエノール型で沈殿し、大部分は２０分でケト型に変換することが報告された。Ｓｃｈｗａｒｚ（Ａｒｃｈｉｖｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．９２、１６８〜７５、１９６１）は、ペーパークロマトグラフィーによって３−インドリルピルビン酸の２種類の互変異性体を分離し、その後ＵＶスペクトルで同定したことを記載している。エノール互変異性体の一般的なスペクトルは、２時間かけて徐々にケト互変異性体のスペクトルに変換され、一方ケト型のスペクトルは、ホウ酸及び互変異性酵素（２種類の型の間の相互変換を促進する酵素）の存在下では、迅速にエノール型のスペクトルに変換された。２つの正確な研究において、Ｊ．Ｍ．Ｋａｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．はペーパークロマトグラフィー（Ａｒｃｈｉｖｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１０３、４６９〜７４、１９６３）及びＵＶスペクトル（Ａｒｃｈｉｖｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１０３、４７５〜８７、１９６３）によって実施した３−インドリルピルビン酸に関する実験を報告した。アンモニア環境で３−インドリルピルビン酸のペーパークロマトグラフィーを行うと、ほんの数個しか同定されていないインドール特性を備えた少なくとも７個の生成物への分解が迅速に導かれることが報告された。この研究によって、使用した条件下ではエノール型からケト型に迅速に変換することが明らかであることが結論づけられた。しかし、この反応はその後生成物の分解へと進行し、酸素、光、アンモニア、又は溶媒の汚染によってもさらに促進された。分光測光法による研究に関して、固形型の３−インドリルピルビン酸はほとんどエノール型で見いだされるが、溶解すると常にケト型を好む平衡状態にあると考えられる。さらに、酸性領域（ｐＨ２．９〜６．０）ではエノール型がかなり安定であるが、塩基性領域（ｐＨ７．７〜９．５）ではケト型のスペクトルが速やかに優勢になるので、ｐＨはケト−エノール平衡に大きな影響を及ぼすようである。最後に、Ｎａｚａｒｉｏ及びＳｃｈｗａｒｚ（Ａｒｃｈｉｖｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１２３、４５７〜６１、１９６８）は���ＩＲ分光法を使用して３−インドリルピルビン酸のケト−エノール平衡に関する研究を実施した。固形型で、酸性環境において、非プロトン性溶媒又はメタノール中では、エノール型のケト酸が優勢であるが、非酸性水性溶媒中で、プロトン受容溶媒の存在下ではケト型が優勢であることを報告している。
【０００９】
したがって、結局、５０年代及び６０年代に報告された研究からは、３−インドリルピルビン酸は非常に不安定で、主にエノール型で沈殿する特徴がある化合物であるという結論が導かれた。しかし、この固形物を水性溶液に溶解すると、平衡は即座にケト互変異性体に傾き、生理学的溶液中、「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」では、エノール互変異性体の特異的パターンは数分後に消失する。実際に、中性又は塩基性ｐＨの水性溶液では、ＩＰＡは迅速に平衡に達し、ケト型が著しく優勢である。したがって、ケト酸互変異性体は植物及び動物に対する生理病理学的効果では区別できないと考えられ、細胞環境においては温度及びｐＨ条件は固定されているため、溶液中において３−インドリルピルビン酸の互変異性体の間で到達した平衡は常にケト型が著しく優勢であることが特徴で、これによってこのケト酸の代謝による結末が確定する。
【００１０】
したがって、従来技術の教示によれば、エノール互変異性体の比率の高低に関係なく、「ｉｎ  ｖｉｖｏ」ではケト互変異性体のみが存在することが予想された。
【００１１】
（本発明の技術的問題）
３−インドリルピルビン酸に関する文献では、５０年代及び６０年代から既に、有機溶媒中における様々な合成方法によって得られたケト酸は主にエノール互変異性体型で沈殿することが報告されている。しかし、（ケト互変異性体及び合成方法で第２生成物として得られたその他の化合物の両方から構成される）不純物の存在は得られた粉末の物理化学的特性並びに溶液中における分子種の代謝による結末を決定する重要な要素であることが認められ、したがって理論的に到達可能な最高純度でエノール型を得るには並はずれた注意を払わなければならない。
【００１２】
さらに、本発明及びそれらの生成物で実施した薬理試験の結果として、驚いたことに、エノール型の３−インドリルピルビン酸のみが、したがってケト型を除去すると、３−インドリルピルビン酸の治療上の使用に関係した好ましい薬理学的結果に寄与できることが見いだされた。したがって、エノール型の安定化は、３−インドリルピルビン酸の薬剤使用における重要な要素となる。
【００１３】
さらに、本発明に基づいて、
ａ）「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」で起こることとは対照的に、エノール互変異性体型で処理したヒト及び動物の生体液では、（おそらく互変異性酵素の作用によって）長時間エノール互変異性体が安定であることを示すこと、
ｂ）ケト互変異性体型は実際に薬剤としての活性を失っているが、エノール型は治療に有用な様々な活性様式を示すこと、
ｃ）経口的に投与することができなくても、エノール型を塩にすることによって注射経路による投与によってもエノール化合物を使用することが可能となること、
ｄ）ＩＰＡの実際的に純粋なエノール型（エノール純度９９．９％）に関して、本発明の方法で得られたようなエノール型自体は、驚くべきことに、２種類の可能な幾何異性体型（Ｅ）及び（Ｚ）の混合物の代わりに、専ら（Ｚ）幾何異性体型のエノール互変異性体から成ることが発見された。
【００１４】
したがって、最高純度の状態でエノール型で（Ｚ）型の異性体のＩＰＡのエノール互変異性体を得ることによって、最初からケト互変異性体も存在する場合とは対照的に、予測可能で信頼できる治療効果を達成することができる。
【００１５】
したがって、本発明の目的は、薬剤製造段階において信頼できる薬剤として使用でき、前記薬剤を治療上信頼して使用できるようにする物理的状態でエノール形態の３−インドリルピルビン酸を得ることである。したがって、本質的にケト型の３−インドリルピルビン酸を含まない、半結晶状の固体状態で、事実上純粋な状態のエノール互変異性体型を得ることが目的である。これは、このような事実上純粋な状態は３−インドリルピルビン酸のケト−エノール互変異性に関してエノール型の理論的分割と同等であることを意味する。
【００１６】
従来技術では３−インドリルピルビン酸を得るためのいくつかの方法が報告されている。明らかに、いくつかの方法（米国特許第４５５１４７１号及び米国特許第５００２９６３号に記載された方法）は３−インドリルピルビン酸のエノール互変異性体を単独で得るには有用でなく、ケト型の３−インドリルピルビン酸もまた大量に得られ、そのことから現在では高純度の対応するエノール型を得ることは不可能である。
【００１７】
その他の記載された方法（ｅｓ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒｓ  ｚ．１０９、２５９、１９２０；Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．６４、４４、１９５６；Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１０３、４６９、１９６３；Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４４、４７、１９５７；米国特許第５２１０２１５号）では、９０％を上回るエノール型を得ることが可能であるが、これらの化合物であってもインドール性を有するその他の物質の残渣、特に化学的特徴付けが事実上不可能で、遊離ラジカル捕捉現象及びその後の重合化現象から得られた着色物質によって汚染されていることが多い。
【００１８】
同じ出願人による米国特許第４８０８７２８号ではまた、３−インドリルピルビン酸の製造方法を教示している。この生成物は、高純度で得られるが、このような方法であっても本発明によって向上させた結果を提供するには及ばなかった。さらに、得られた生成物は、半結晶構造の代わりに毛房状の構造を有しており、したがって製薬工程には全く適さず、安定性は不確実である。
【００１９】
米国特許第４８０８７２８号は、インドリルピルビン酸（簡単にＩＰＡ）を調製する合成方法について記載している。これらの互変異性は、該特許開示には明記されていない。回収された酸は、純度が高く（重合生成物、インドール構造をしたその他の物質が含まれておらず、無色である）、許容される化学的回収率が約５０％で、アモルファス構造の固形沈殿生成物である。
【００２０】
前記で記載した方法は、本発明の方法に役立つ開始点であった。しかし、本発明では、米国特許第４８０８７２８号の合成方法に多数の改変を行った。（Ｚ）−エノール互変異性体型のＩＰＡの回収において（８０％を上回る）著しい収率の増加が得られ、エノール純度は９９．９％より高く、回収された半結晶構造の固形沈殿物は産業上有用な貯蔵寿命を備えていた。
【００２１】
さらに、驚くべきことに、エノール互変異性体型ＩＰＡの２つの可能な幾何異性体、幾何異性体Ｅ及びＺが存在し得るが、本発明の合成では幾何異性体Ｚが専ら形成することが発見された。
【００２２】
この結果は、この説明の後の方で示す、生成物の１−Ｈ及び１３−Ｃ  ＮＭＲのデータによって証明されよう。
【００２３】
本発明で得られた結果は、以下のようにまとめて示すことができる。
ａ）２つの互変異性構造の１つのみ（エノール型）が化学変換によって高収率で形成される。
ｂ）得られたエノール型は、専ら幾何異性体ＺのＩＰＡから成る。
ｃ）このＺ型は、化学純度が最高の沈殿物である。
ｄ）この沈殿物の物理的状態は、半結晶構造で、構造及び色の均一性が高く、加工及び回収が容易である。
ｅ）この固形沈殿物は、医薬品原材料の通常保存条件下で維持したとき、貯蔵寿命が長く、構造的に安定である（両者が欠けると分解産物を形成することなく１互変異性体が他方に自発的に変換する）。
【００２４】
前記と関連して、エノール性ＩＰＡ構造に生じるように、一般的に二重結合の存在による幾何異性体（Ｅ）及び（Ｚ）は、通常極めて異なる物理化学特性を有することができる。一例として、フマル酸（幾何異性体（Ｅ））とマレイン酸（幾何異性体（Ｚ））との間の極端な違いの場合を考えることが可能である。
【００２５】
したがって、従来技術、米国特許第４４０８７２８号からは、ＩＰＡの製造方法において、ケトとエノール互変異性体型の間には自発的な互変異性の平衡が生じるという教示が得られた。次に、エノール型では、２つの幾何異性体（Ｅ）及び（Ｚ）それぞれの割合の間の平衡は前もって予知できないことが見いだされた。
【００２６】
幾何異性体の物理化学特性の可能な違いの結果として、それらの薬理特性が異なることが予想される。
【００２７】
前記のことを考慮すると、従来技術によって製造されたＩＰＡは、様々な割合の２つの互変異性体型及び２つの幾何異性体の混合物を含んでいた。このため、ＩＰＡの薬理学的特性は明らかでなく、薬理試験では不確かな結果が生じた。
【００２８】
本発明では、従来技術では安定した純粋な状態で個々に分離することができなかった単独の互変異性体型から成るＩＰＡを提供する。さらに、得られたエノール型は、従来技術では純粋で安定した、個々に分割されたエナンチオマーとして認識されなかった、正確に同定された単独の幾何異性体型から成る。この生成物は、最高の化学的純度で得られ、さらに、通常の医薬品原料に匹敵した予想外の貯蔵寿命特性を有する。これによって、今では、薬業界で初めて明瞭かつ信頼できる結果が期待できるＩＰＡに関する試験を実施することが可能となった。
【００２９】
本発明によれば、確実な製品安定性が備わった生化学的試験及び薬理学的試験をその後実施するための、実質的に純粋なエノール型（純度≧９９％、ケト型及び重合生成物を含まない）３−インドリルピルビン酸が得られる。
【００３０】
本発明の他の目的は、いずれにせよ製薬業界で使用するために、カプセル、錠剤、注射アンプルの調製に最適な、ほとんど完全な針状結晶型の生成物を提供する方法である。
【００３１】
前記の米国特許第４８０８７２８号（実施例４）では、可能な限り反応環境を無水に維持するために多大な注意が払われた。実際に、トリプトファンのＩＰＡへの変換の重要点は、芳香族アルデヒドとアミン官能基との縮合反応、付加物からの基本水除去及びアルド−アミノからケト−アミノへの再編成であった。
【００３２】
前記の予備的仮定では、これを使用することによって、「強力な」反応物、たとえば、脱水した非求核塩基としての１，８−ジアイザビシクロ（５．４．０）−ウンデカ−７−エン（簡単にＤＢＵ）及び錯化剤としての無水ＺｎＣｌ２並びに温度制御下における操作及び「十分な」反応時間が免除される。
【００３３】
したがって、引用した従来技術の方法は、「強制的な」条件及び反応物で実施される。このため、比較的狭い操作条件範囲の結果がもたらされる。
【００３４】
反対に、本発明の方法はより調節可能な「穏和な」取り組みに基づく異なる原理から出発しており、引用した米国特許第４８０８７２８号と比較しながら以後に開示する。この考察では、本発明では遙かに優れた結果がもたらされるという特に際だった特性が指摘される。
【００３５】
Ａ）ＤＢＵの代わりとしてのトリエチルアミン（ＴＥＡ）の使用
利点：温度を下げられること、温度及び反応時間をより良く制御できること、無水溶媒を使用する必要がないこと、より弱い塩基を使用し、それによって副反応が減少すること、費用が安いこと、毒性が低いこと、溶解性の高い中間生成物塩であること。
【００３６】
ＤＢＵ及びＴＥＡは、３級脂肪族非求核性塩基である。しかし、これらの塩基性特性は著しく異なっており（ＤＢＵの方が高い）、揮発性もまた著しく異なっている（ＴＥＡの方が高い）。この点を考えると、合成方法の開発には通常、ＤＢＵの方がＴＥＡよりも好ましく、その逆はない。本発明では、ＴＥＡはＤＢＵの役割を果たすことができ、副反応が起こる機会も少ないという利点が発見された。
【００３７】
さらに、ＴＥＡによって容易かつ正確な温度の制御が可能となる。実際に、この方法段階で反応混合物の温度を過度にしたり、制御しなかったりすると、ＩＰＡ収率が減少し、品質が悪くなることが発見された。
【００３８】
Ｂ）無水ＺｎＣｌ２の代わりとしてのＺｎ酢酸塩二水和物の使用
従来技術の方法では、錯化剤として、部分的に脱水剤として無水ＺｎＣｌ２を使用することは、反応機構を「推進する」方針と合致しており、これには無水で、制御された反応環境の使用が必要である。
【００３９】
その特性を考えると、無水ＺｎＣｌ２は特に、反応機構の望ましい促進に適していると考えられた。しかしまた、操作上管理及び処理が困難なために、本発明の「穏和な」原理によるＩＰＡ合成の規模拡大に適合しないことが示された。
【００４０】
Ｚｎ酢酸塩二水和物を使用すると操作性、収率及び品質の実質的な改善がもたらされる。この改善は、酢酸塩の水和物及び無水型のいずれによっても示される。これによって、使用する溶媒は最小限の水分含量であれば必ずしも無水である必要はなくなる。
【００４１】
さらに、酢酸亜鉛二水和物は、反応の化学量論的制御をよりし易くする添加可能な非潮解性結晶型で市場に見いだすことができる。実際にメタノール中における可溶化熱は示されておらず、このことはまた、反応制御に有利である。
【００４２】
本発明の驚異的かつ明瞭な成果は、水和塩の使用が可能になると中間体生成物が可溶性になることで、従来技術の教示ではこの塩はこの方法が成功するためには無水であるべきであると考えられていた。さらに、これは脱水塩基の化学量論を変更したり、「より弱い」塩基（ＴＥＡ）に置換したりすることもなく得られることに注意されたい。
【００４３】
Ｃ）イソニコチンアルデヒド（ＩＳＮＡ）の代わりとしてのピコニルアルデヒド（ＰＣＡ）の使用
利点：期限までの安定性の改善、純度の上昇（ＰＣＡ＞９９％、ＩＳＮＡでは最大９７％）、反応の増大及び時間的調節、ＩＰＡ回収率がかなり高くなること、ＩＰＡ品質がかなり良くなること
【００４４】
前記で引用した米国特許第４８０８７２８号では、トリプトファンのアミン官能基の反応、Ｓｈｉｆｆ塩基形成、アルドイミンからケトイミンへのそれらの再編成のためにＩＳＮＡを使用する。これは、１，４−（又はパラ）位にカルボニル−ピリジン窒素置換基を有するＩＳＮＡによって可能になった。
【００４５】
ＰＣＡは、オルト位（又は２位）がアルデヒド型のカルボニル基で置換されたピリジンである。
【００４６】
ＩＳＮＡの代わりにＰＣＡを使用することによって、理論に基づいて、より「推進された」反応条件及びより不安定な反応中間生成物が予想される。実際に、キノイド−１，２型の構造の形成を引き起こす芳香族構造の再編成過程は、自然には達成されないし、容易でもない。一見しただけでは、ＰＣＡはＩＳＮＡの良い置換物とは思われない。この考えはまた、ＰＣＡと比較してＩＳＮＡがより不安定であり、したがってＩＳＮＡはＰＣＡよりも反応性に富むようであることによって裏付けられる。
【００４７】
前記とは反対に、本発明によれば、ＰＣＡは様々な反応中間体の安定性及びそれらの相対的安定性に関してＩＳＮＡより優れた結果をもたらす。実際に、Ｚｎ錯体（特に、塩素よりも効果的であることが分かったＺｎ酢酸塩との）の形成によって安定化させると、より効率的で、ＩＳＮＡとは全く異なる形成機構で構成された（エネルギー的に有利な）過程中間体が生じた。
【００４８】
簡単にいうと、本発明のこの態様によって、障害となる生成物を最小限に抑え、したがって最高収率を獲得し、ＩＰＡの品質を明確に高めることによって、反応の進行を制御することが可能となる。
【００４９】
Ｄ）非無水溶媒の使用
利点：費用節約、反応制御の改善（無水条件を維持する必要がない）、簡素な手順。
【００５０】
米国特許第４８０８７２８号で開示された方法では無水溶媒の使用は必須であるが、本発明の非無水溶媒の使用は前述した論理の結果である。これは、引用した従来技術の文献で記載された方法とは対照的に、本発明に基づく「穏和な」方針をさらに確認するものである。
【００５１】
ここ数年の間では、３−インドリルピルビン酸は、動物の実験研究及びヒトの治療における潜在的用途を明らかにするための、いくつかの薬理学的研究及び臨床研究、並びにいくつかの発明特許の課題であった。たとえば、米国特許第４５５１４７１号では、トリプトファンアミノ基転移反応による３−インドリルピルビン酸の生合成の方法、ケト酸をラットに投与したときの、脳内のセロトニン濃度の増加とそれに伴う明らかな薬理効果について記載している。米国特許第５００２９６３号は、トリプトファンに対するＬ−アミノ酸オキシダーゼの使用に基づいた３−インドリルピルビン酸の新規生合成法、並びにケト酸をキヌレン酸に直接変換し、したがって興奮性アミノ酸による毒性及び変性効果を拮抗することによって示される著しい能力について記載している。米国特許第５０７５３２９号は、３−インドリルピルビン酸の強力な抗ラジカル特性、並びに心臓病、炎症、動脈硬化などにおける潜在的な薬理学的適用について例示している。米国特許第５０９１１７２号は、３−インドリルピルビン酸の抗酸化特性及び抗変異原生特性、並びに酸素、日光及び加齢から皮膚を防御するための化粧品での潜在的使用について記載している。米国特許第５２１０２１５号は、開始化合物としてベンゼン又はベンゼン環が置換されたインドールを使用することをベースとした、変性疾患で有用な３−インドリルピルビン酸及びその誘導体の新規化学合成法について例示している。米国特許第５４４７９５１号は、ストレス除去剤として作用して、ラットにおけるコルチコステロン濃度を減少させる３−インドリルピルビン酸の能力について記載している。
【００５２】
薬理学的研究に関連して、Ｂａｃｃｉｏｔｔｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９、８０３〜１７、１９８７）は、３−インドリルピルビン酸がラット脳内でのセロトニン代謝を増大させ、鎮静鎮痛活性を有することを報告した。Ｒｕｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３８、２４０５〜９、１９８９）は、３−インドリルピルビン酸投与後ラットの全組織内においてキヌレン酸が著しく増大することを示し、興奮性アミノ酸の重要な阻害剤を形成する新規代謝経路を提唱した。Ｓｑｕａｄｒｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１５、１０２〜８、１９９０）は、セロトニン脳内濃度の増加に関連させて、様々な高血圧ラットモデルにおける３−インドリルピルビン酸の抗高血圧効果について報告した。Ｍｅｒｌｏ  Ｐｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｃｔａ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．１３９、５８３〜９、１９９０）は、ラットの睡眠及び食餌摂取に対するケト酸の影響について報告し、２、３日の投与後には食欲不振効果は消失するが、睡眠増強効果は長期投与で維持されることを示した。Ｆｅｒｒｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１８７、３４５〜５６、１９９０）は、ラット松果体における３−インドリルピルビン酸のメラトニン産生刺激剤としての効果を報告した。Ｂｒｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．８、１３７〜４６、１９９１）は、３−インドリルピルビン酸及びその誘導体がカイニン酸受容体及びＮＭＤＡ受容体の両方に対して拮抗薬として作用でき、小脳神経培養物におけるカルシウム取り込みの誘発を弱めることを報告している。Ｓｑｕａｄｒｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｅｕｒｏｓｅｉ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．９、２７〜３６、１９９１）は、遺伝的肥満ラット（Ｚｕｃｋｅｒ）による食餌摂取に対する３−インドリルピルビン酸の抑制効果について報告している。Ｂｉａｇｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ３３、７１２〜９、１９９３）は、ラットに一連のストレス要因を負荷したときの、コルチコステロン血漿濃度及びグルココルチコイド海馬回受容体に対する効果を分析した。Ｚｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．２３、１３９〜４８、１９９３）は、ラットの実験的虚血モデルにおける３−インドリルピルビン酸の効果を報告した。Ｌａｐｉｎ及びＰｏｌｉｔｉは、マウスにおける抗不安薬（Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．２８、１２９〜３４、１９９３）及びエタノール毒性効果の阻害剤（Ａｌｃｏｈｏｌ  ＆  ａｌｃｏｈｏｌｉｓｍ  ２９、２６５〜８、１９９４）としての３−インドリルピルビン酸の活性を報告した。
【００５３】
臨床試験に関して、Ｓｉｌｖｅｓｔｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｉｎｔｌ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．１９、４０３〜９、１９９１）は健常人志願者６人に用量１００ｍｇから２００ｍｇの範囲の用量の３−インドリルピルビン酸を数晩投与したところ、トリプトファン又はメラトニンで認められたのと同様の睡眠の改善が示されたことを報告した。Ｓｈａｍｓｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｈｕｍａｎ  Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．１１、２３５〜９、１９９６）は、睡眠に問題を抱える若年のボランティア１０人に対する３−インドリルピルビン酸の３種類の用量（１００、２００及び３００ｍｇ）の効果を調査し、ケト酸は睡眠に刺激作用を与えず、おそらくストレス減少に対する著しい関与が反映されているのだろうと報告した。
【００５４】
５０年代及び６０年代に報告された研究では、１チームによって得られた結果がその他のチームによって確かめられたことはほとんどなかったので、３−インドリルピルビン酸に関心を持った研究者等はいくつかの対立及び議論よって分かれたらしいことを強調することは重要である。これは特に、ケト酸を合成するために異なる方法を使用したことによるもので、不純物は少量であっても物質の迅速な劣化を導き、溶液中における性質に基本的な差異を引き起こし得るからである。関与した研究者は全て、３−インドリルピルビン酸を水性溶液に溶解したとき、互変異性体の存在に気が付いていたが、文献で報告された研究ではいずれも、ケト酸可溶化で採用すべき特定の事前対策については全く触れていなかったことを強調することは重要である。これは、おそらく容易に互換するので、２種類の互変異性体はしばらくすると平衡に達し、最後には生理学的及び薬理学的最終効果が確定するという事実のためである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００５５】
本発明の目的は、化学的及び貯蔵寿命が安定な状態であり、半結晶性の固体状態で、エノール純度が全酸の９９％以上であるエノール互変異性体型の３−インドリルピルビン酸及びその誘導体である。
【００５６】
本発明の他の目的は、二重結合の周囲に形成された（Ｚ）型幾何異性体によってさらに優先的に構成されるエノール型ＩＰＡである。
【００５７】
本発明の他の目的は、中枢試験系、心臓血管病理並びにニューロン細胞及び腫瘍の処理のレベルで治療に使用するための、前記で説明した型のＩＰＡの使用である。
【００５８】
本発明の他の目的は、錯化剤及びプロトン受容体アミン塩基の存在下で、反応溶媒中でトリプトファンと芳香族アルデヒドを反応させること、及び温度４５°から６５°の高温酸性加水分解で前記反応生成物を加水分解することを含み、プロトン受容体非求核アミン塩基としてのトリエチルアミン、酢酸亜鉛又は硫酸亜鉛から成る群から選択された錯化剤の存在下で、反応溶媒としてテトラヒドロフラン、ジメチル−ホルムアミド、アセトニトリル及びメタノールから成る群から選択された有機極性溶媒中において、縮合反応のために、２−ピリジン−カルボキシアルデヒドを単独で、又はトリエチルアミン含む混合物中で前記トリプトファンのアミン官能基と反応させることを含むエノール互変異性体型３−インドリルピルビン酸の製造方法である。
【００５９】
本発明の目的はまた、ＩＰＡのエノール互変異性体のアルカリ塩又はアルカリ土類塩型の誘導体、実質的にエノールＩＰＡと同様のそれらの治療的使用及び第１の非プロトン性溶媒中で、金属活性化剤としての第２のプロトン性極性溶媒と一緒に、３−インドリ−ピルビン酸の前記エノール互変異性体を中性の前記アルカリ金属又はアルカリ土類金属の１つで中和する段階を含むそれらの製造方法である。
【００６０】
本発明の他の目的は、前述の医薬品業界用化合物の使用であって、この化合物は初めて、信頼できる組成、管理可能な半結晶構造及び貯蔵寿命安定性に関して産業で使用することができる形態である。
【００６１】
エノール性ＩＰＡ誘導体はまた本発明の目的で、インドリル乳酸は主張したエノール性ＩＰＡ化合物と相互平衡状態にあるので、したがってＩＰＡ乳酸の前駆体として作用することができ、又はその逆も可能である。
【００６２】
前述した化合物を含む医薬組成物はまた、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００６３】
本発明のエノール互変異性体で実施した薬理学的試験から考えると、本発明の他の態様に従って、
１）３−インドリルピルビン酸の２種類の互変異性体の間の変換は部分的にのみ可逆的で、水性溶液中でエノール型から生じるケト型は主に、自発的にエノール型とは独立した代謝経路に従うこと、
２）該エノール互変異性体型は、３−インドリルピルビン酸を使用したとき文献で報告されたように、関係のある生化学的特性及び薬理学的特性に主に関与することができる型であること、
３）エノール互変異性体型は、ケト型への変換を妨害する特異的酵素（互変異性酵素）の存在のために生物組織において特に安定であることが今では分かってきた。
【００６４】
したがって、本発明のさらに他の目的は、治療に使用するために本質的にケト互変異性体を含まないエノール型を適用すること、互変異性体混合物で既に述べられたが、生理学的環境におけるエノール及びその塩の易溶解性を利用すること、動物組織及び血漿中におけるエノール互変異性体濃度、最終的には、互変異性体又はその塩を実験動物又はヒト細胞培養物に投与したときに達成される生化学的及び薬理学的効果を測定することである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６５】
１．  ３−インドリルピルビン酸のエノール互変異性体及びその塩の合成
Ａ）極性有機溶媒中における錯化剤及びアミノ塩基としてのトリエチルアミンの存在下でのトリプトファンと２−ピリジンカルボキシアルデヒドの反応並びに該反応生成物の熱加水分解による３−インドリルピルビン酸のエノールの生成方法。
【００６６】
Ｂ）Ａ）で説明した合成方法によって生じた３−インドリルピルビン酸のエノールの直接的又は間接的中和によって調製されたアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩の調製。
【００６７】
本発明では、その後Ａ）で確認した合成の定量的データを説明する。
【００６８】
トリプトファンに関して過剰な条件下、又はわずかに欠乏した条件下で、芳香族アルデヒドとして、ピコリンアルデヒド又はＰＣＡとも呼ばれる好ましくは２−ピリジンカルボキシアルデヒドを使用して、３級アミン塩基量の不足を補う。特に、第２の組み合わせでは、ＰＣＡはあまり可溶化熱を生じないという事実によって反応温度の制御が改善されることによっても、３−インドリルピルビン酸のエノールの回収率の実質的な増加がもたらされる。
【００６９】
錯化剤として様々な有機及び無機亜鉛塩（水和物並びに無水物）を、同様に有機溶媒に溶解して場合によっては使用したが、同種の結合反応は必要なかった。選択例としては、無水テトラヒドロフランに溶かした硫酸亜鉛、酢酸亜鉛（無水並びに水和物）及び塩化亜鉛がある。特に、予め水酸化カリウム（ＫＯＨ）などの乾燥剤で真空保存した酢酸亜鉛水和物を使用すると最高の収率が達成される。さらに、酢酸亜鉛水和物は保存されていたので、結合反応中間体と共に、その他の塩よりも溶解性の高い複合体を形成する。
【００７０】
プロトン受容体及び脱水３級アミン塩基として好ましく使用されるのはトリエチルアミンで、ＤＢＵ又はその他のトリアルキル脂環式塩基（ＤＩＥＡなど）のような、同様の特性を有するその他の公知の塩基の対応物に対して、より溶解しやすい中間塩を形成する。さらに、指定した塩基に関して、トリエチルアミンはあまり溶解熱を発生しないので、特に脱水したり、必然的に結合中間体の構造が再編成したりする重要段階において、反応温度の経過をうまく制御することが可能である。
【００７１】
反応中間体の溶解性及び溶媒化が高められ、高温酸加水分解の最終段階での溶解性が最大になるので、反応溶媒として極性溶媒（無水である必要はない）たとえば、ＤＭＦ、アセトニトリル、ＴＨＦ又は短い脂肪鎖を有するアルコール性溶媒を使用する。特に、メタノールを使用すると最高の成果が得られる。
【００７２】
この反応は、室温又は好ましくは低温で実施することが可能で、使用した反応物の特定の組み合わせによって最高の結果が得られる。３−インドリルピルビン酸のエノール沈殿の品質を高めるために、酸加水分解方法を４５℃から６０℃、好ましくは５５℃の高温条件下で実施すべきである。このような酸性環境は、無機酸、好ましくは、適切な量の蒸留水で希釈した１Ｎ塩化水素酸であるべきである。
【００７３】
全体的に見て、前記で引用した特許に記載された３−インドリルピルビン酸の調製に関しては、本発明の目的である３−インドリルピルビン酸エノールの調製方法では、最終回収率（＞８０％）の実質的増加、エノール型（＞９９．９％）の純度上昇、沈殿物の品質特性の改善（淡黄色、結晶に近い一貫性）及び該固形物の医薬品としての加工性の必然的改善がもたらされた。さらに、これらの特性によって、該沈殿物は本発明で説明した、その後のアルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩の調製に特に適するようになる。後者は、２つの目的、生理食塩水にすぐに溶解するエノール型３−インドリルピルビン酸を形成するため、及び潜在的な塩特異的薬理活性を検出するために調製された。
【００７４】
本発明では以後、Ｂ）で合成し同定したデータの確認について説明する。
【００７５】
３−インドリルピルビン酸のエノールの塩の調製には、アルカリ金属及びアルカリ土類金属塩、特にナトリウム、リチウム、カリウム、マグネシウム及びカルシウムの塩が必要である。
【００７６】
これらの塩は、インドールアルファ−ケト酸を完全に可溶化したり、生じた塩を完全に沈殿化したりするためなどの量の適切な無水非プロトン性溶媒、特にジエチルエーテル又はテトラヒドロフラン中で、３−インドリルピルビン酸のエノール及び本発明で説明した適切な化学型のアルカリ金属及びアルカリ土類金属を中和することによって調製した。
【００７７】
特に、中性金属としてアルカリ金属及びアルカリ土類金属を、（可能であるならば）金属活性剤として一定量の無水プロトン極性溶媒、特にメチルアルコール又はエチルアルコールと共に使用した。
【００７８】
特に、可能であるならば、アルコキシドにおいて力価が公知のアルコール性溶液を使用し、生じた塩を確実に定量沈殿化するためなど非プロトン性溶媒の量によって３−インドリルピルビン酸のエノールを確実に中和するために必要な適量のアルコール性溶液を計算して、アルカリ金属及びアルカリ土類金属を対応するメトキシド又はエトキシドの化学型で使用した。
【００７９】
ＮＭＲ分光法によって実施したインドリル３−ピルビン酸（ＩＰＡ）の構造分析の報告
ＩＰＡ構造は、重水素化テトラヒドロフラン（ＴＨＦ−ｄ８）におけるプロトン（１−Ｈ：２００ＭＨｚ）及び炭素１３（１３−Ｃ：５０，３ＭＨｚ）スペクトルを実施することによって、ＮＭＲ分光法によって決定した。
【００８０】
該分子の９個の水素原子及び１１個の炭素原子に関連したＮＭＲシグナル全てを検出して、ＴＦＨ−ｄ８（並びに重水素化メタノール）中で特有の（Ｚ）配置の１００％エノール型互変異性体として存在するＩＰＡ分子の特異的位置に割り当てた。
【化１】
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【００８１】
１）第１組のスペクトル
一連のプロトンスペクトルをＴＨＦ−ｄ８中で０．５ｍｇ／ｍｌ濃度で実施した。これらの条件では、該分子の９個の水素（プロトン）に関連したシグナルは全て、明瞭に認められた。
【００８２】
特に、以下のように割り当てることができた。
ＣＯＯＨ    １１．２５ｐｐｍ
ＮＨ        １０．４５ｐｐｍ
ＯＨ        ７．７５ｐｐｍ(Ｈ１０、ＯＨによる２重線、Ｊ＝１．８Ｈｚカップリング)
Ｈ１０        ６．８５ｐｐｍ(Ｈ１０、ＯＨによる２重線、Ｊ＝１．８Ｈｚカップリング)
Ｈ２  ７．９３ｐｐｍ(Ｈ２、ＮＨによる２重線、Ｊ＝２．７Ｈｚカップリング)
Ｈ４  ７．６４ｐｐｍ(１個のみのオルトカップリング)
Ｈ７  ７．３２ｐｐｍ(１個のみのオルトカップリング)
Ｈ６  ７．１２ｐｐｍ(２個のオルトカップリング)
Ｈ５  ７．０２ｐｐｍ(２個のオルトカップリング)
【００８３】
Ｈ４及びＨ７のシグナルの組及びＨ５及びＨ６のシグナルの組に関連した位置の割り当ては、インドール自身のスペクトルの類似に基づいている（Ｐ．Ｊ．Ｂｌｏｃｋ、Ｍ．Ｌ．Ｈｅｆｆｅｒｎａｎ、Ａｕｓｔｒ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．（１９６５）、１８、３５３）。結合定数Ｈ１０、ＯＨが高いことは、Ｈ１０はＯＨに対してトランスであることを示唆している（Ｚ配置）。他のスペクトルの証拠はこの報告の７項に示す。全体的に、このスペクトルは純度１００％のエノール互変異性体のみと一致する。
【００８４】
２）第２組のスペクトル
第１組の溶液に、前記ＤＯ２（重水）を添加した。同位体置換によってＣＯＯＨ及びＯＨプロトンシグナルが消失すると同時に、Ｈ２Ｏシグナルの出現が認められる。さらに、Ｈ１０、ＯＨ定数の消失によって前述の割り当てが裏付けられる。ＮＨプロトンシグナルの移動は少ないので、重水交換によって迅速には消失しなかった。
【００８５】
３）第３組のスペクトル
第２組と同様の試料を使用するが、数日後に記録した。ＮＨプロトンシグナルの消失もまた確認され、Ｈ２、ＮＨカップリングの消失も生じた。さらに、プロトンＨ５、Ｈ６、Ｈ７に割り当てられたシグナルは第２組に関しては変化しなかったが、Ｈ４に割り当てられたシグナルはより狭くなり、したがってインドールに存在することが知られている小さなカップリング定数（約０．８Ｈｚ）は消失することが示された。
【００８６】
４）第４組のスペクトル
濃縮ＩＰＡ溶液のＴＨＦ−ｄ８におけるプロトンスペクトル
これらは、濃度が異なるためいくらかシフト移動（特にＣＯＯＨ基）が伴うが、実質的に第１組と同様である。ちょうどこれによって、ＯＨ移動プロトンは互いに、及びＣＯＯＨの移動プロトンとより迅速に交換し、対応するシグナルの拡大及び結合定数Ｈ１０、ＯＨの消失が再び引き起こされる。
【００８７】
５）第５組のスペクトル
第４組のために調製した溶液の１３−Ｃスペクトル
１１個の炭素原子に対応する１１個のシグナルを観察した。強度の低いシグナル（５個のシグナル）は４級炭素に関連しており、そのように割り当てることができる。
ＣＯＯＨ：１６９．０ｐｐｍ
Ｃ８        １３８．５ｐｐｍ
Ｃ９        １２９．５ｐｐｍ
Ｃ３        １１２．９ｐｐｍ
【００８８】
Ｃ３、Ｃ８及びＣ９に割り当てられたシグナルは、インドールのスペクトルとの類似性によって同定した（Ｃ．Ｌｅｖｙ、Ｒ．Ｌｉｃｈｔｅｒ、Ｇ．Ｌ．Ｎｅｌｓｏｎ「ＮＭＲ分光法（ＮＭＲ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）」第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８０）、１２１３ページ）。１４０ｐｐｍへのＣ１１の割り当ては、５個の４級炭素原子全ての割り当てを実施した排除した結果である。
【００８９】
再度、インドールスペクトルとの類似によって、以下のＣＨのシグナルを割り当てることができる。
Ｃ４、Ｃ５及びＣ６：１２３．３〜１２１．６〜１２０．２ｐｐｍの範囲
Ｃ７：１１３．４ｐｐｍ
【００９０】
４個の炭素原子Ｃ４、Ｃ５及びＣ６のシグナルは、インドール及びＩＰＡ自体いずれにおいても、個々の割り当てを可能にするには近接しすぎている。さらに、ＩＰＡの３位に置換が存在することによって、傾向を変更し、インドールと比較していくつかの割り当てを逆転させることができる。信頼できる割り当てを行うために、以下の組みで説明したスペクトルを実施した。
【００９１】
６）第６組のスペクトル
第５組で採用したのと同様の解法を使用して、炭素−水素直接結合因子によってプロトンスペクトルを１３−Ｃスペクトル（ＨＥＴＣＯＲスペクトル）に関連付ける２次元スペクトルを記録した。
【００９２】
したがって、プロトンスペクトルが分かれば、以下のようにＣＨ割り当てを遂行することが可能であった。
１０５．７ｐｐｍ        Ｃ１０  （６．９ｐｐｍでＨ１０に関連する）
１２９．８ｐｐｍ        Ｃ２        （７．９ｐｐｍでＨ２に関連する）
１２０．２５ｐｐｍ      Ｃ４        （７．８ｐｐｍでＨ４に関連する）
１２１．６ｐｐｍ        Ｃ５        （７．０２ｐｐｍでＨ５に関連する）
１２３．９ｐｐｍ        Ｃ６        （７．１２ｐｐｍでＨ６に関連する）
【００９３】
さらに、Ｃ７（１１３．４ｐｐｍ）からＨ７（７．３５ｐｐｍ）への関連を確認した。
【００９４】
したがって、炭素原子全ての配列の割り当ては明確である。
【００９５】
７）第７組のスペクトル
この組では、通常の未結合スペクトル（第５組参照）と比較して、様々な水素原子と完全に結合した炭素スペクトルを示す。
【００９６】
ａ）６個の炭素は、結合定数Ｃ−Ｈ＞＝１５０Ｈｚの２重線（他の微細な構造による）になり、それらがｓｐ２ハイブリッドＣＨであることが確認された。４級炭素原子であるその他の５個の炭素原子のカップリングはほんのわずかであった。
【００９７】
ｂ）１６９ｐｐｍにおけるＣＯＯＨシグナルはＨ１０とカップリングによる２重線（Ｊ＝３．７Ｈｚ）である。置換されたエチレンにおいて、３個の結合（ＪＣＣＣＨ型要素）によって分離された炭素−水素カップリングは、もし、ｃｉｓ配置であれば３〜８Ｈｚの範囲であり、ｔｒａｎｓ配置であれば８〜１４である。陰性基が存在すれば、ＩＰＡの場合、結合要素の値は指定した範囲の低い方の限界に対応する（Ａ．Ｗ．Ｄｏｕｇｌａｓ、Ｏｒｇ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．；（１９７７）９、６９；Ｈ．Ｖｏｇａｌｉ、Ｗ．Ｖ．Ｐｈｉｌｉｐｓｂｏｒｎ、Ｏｒｇ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｎ．；（１９７５）７、６１７）。例として、ＩＰＡの場合のように二重結合に結合した酸素を有する化合物ＣＨ３（ＡｃＯ）Ｃ＝ＣＨ２では、メチル−炭素及びエチル−水素のカップリングはｃｉｓ配置では３．４Ｈｚであり、ｔｒａｓ配置では８．１Ｈｚである。ＪＣＣＣＨは３．７Ｈｚに等しいことが検出されたので、Ｈ１０とＣＯＯＨは互いにｃｉｓ配置であることが確実に確かめられた。したがって、さらに、結合定数ＪＨ１０，ＯＨは第１組のプロトンスペクトルにおいて１．８Ｈｚであることによって既に示唆されたように、ＩＰＡ配置は（Ｚ）型である。反対の配置（Ｅ）では、結合定数ＪＣＣＣＨの値は約８Ｈｚであった。
【００９８】
ｃ）１４０ｐｐｍでのシグナルは、ＩＰＡのエチレン及び芳香族４級炭素の両方でいずれも２重線（Ｊ＝２Ｈｚ）である。Ｃ１１のみが、特にＨ１０と単一のカップリングを有することができる。したがって、結果によって、第５組のスペクトルの考察において、排除によって行われた１４０ＨｚシグナルのＣ１１への割り当てが裏付けられた。
【００９９】
ｄ）残りの４級シグナル（Ｃ３、Ｃ８及びＣ９）は前記の結果と大部分が一致することが示された。
【０１００】
ｅ）１２９．８ｐｐｍのシグナルは、直接結合定数ＪＣＨが１８７．５Ｈｚを示し、１５７Ｈｚから１６０Ｈｚの範囲の値を示し一般的にｓｐ２炭素であるその他のＣＨのいずれよりもはるかに大きい。したがって、（その他のＣＨとは異なり）１２９．８ｐｐｍ炭素は、インドール窒素などの電気陰性原子と結合しているべきであり、したがって既に行ったＣ２への割り当てが裏付けられた。
【０１０１】
本発明の方法の調製の例（Ａ）を以後に報告する。
【実施例１】
【０１０２】
エノール互変異性体型３−インドリルピルビン酸の調製
トリプトファン８．０ｇ及びトリエチルアミン６．０ｍｌをメタノール５６ｍｌに迅速に添加し、氷浴温度で維持する。白色の懸濁液を撹拌して、温度を確認しながら維持する。
【０１０３】
約１０分後、ピコリルアルデヒド（ＰＣＡ、２−ピリジンカルボキシアルデヒド）を、迅速に撹拌しながら添加すると、透明な明るい黄色の溶液が得られた。氷浴温度及び撹拌をさらに３０分間維持する。
【０１０４】
次に、一晩真空下で保存した酢酸亜鉛二水和物５．１６６ｇ及びＫＯＨペレットを迅速に添加すると、数分後、非常に微細で流動性のある明るい黄色の沈殿が得られた。
【０１０５】
３０分後、トリエチルアミン１２．０ｍｌを添加し、氷浴中で維持して、黄色懸濁液を撹拌しながらさらに３０分間放置する。
【０１０６】
この懸濁液を予め５５℃に加熱した１Ｎ  ＨＣｌ８００ｍｌに約１５分間激しく撹拌しながら移し、反応フラスコをさらに１Ｎ  ＨＣｌ２０ｍｌで厳密に洗浄する。
【０１０７】
明るい黄橙色の溶液が得られ、移行開始から約５分後、時間と共にかなり微細な結晶に近い金色味のある黄色の沈殿が得られる。
【０１０８】
移行終了から約３０分間撹拌を続けた後、加熱浴を循環冷却水浴と交換する。
【０１０９】
３０分後、真空濾過によって該沈殿を回収し、冷却した酸性水３０ｍｌ（ｘ２）及び冷却した蒸留水で１回次々に洗浄する。
【０１１０】
該沈殿を真空乾燥機で一晩乾燥すると、インドール−３−ピルビン酸５．３７０ｇ（約６７．４％）が微細な半結晶性の金色味のある黄色の粉末として、純度＞９９．９％で得られる（ＨＰＬＣ、ＮＭＲ、ＩＲ及びＵＶが一致）。
【実施例２】
【０１１１】
エノール互変異性体型３−インドリルピルビン酸の調製
トリプトファン８．０ｇ及びトリエチルアミン６．０ｍｌをメタノール５６ｍｌに迅速に添加し、氷浴温度で維持する。白色の懸濁液を撹拌して、温度を確認しながら維持する。
【０１１２】
約１０分後、ピコリルアルデヒド４．４７ｍｌ（ＰＣＡ、２−ピリジンカルボキシアルデヒド）及びトリエチルアミン２．７３ｍｌを撹拌しながら次々に迅速に添加すると、透明な明るい黄色の溶液が得られた。氷浴温度及び撹拌をさらに３０分間維持する。
【０１１３】
次に、一晩真空下で保存した酢酸亜鉛二水和物５．１６６ｇ及びＫＯＨペレットを迅速に添加した。該溶液は暗いオレンジ色に変化し、数分後、非常に微細な流動性のある明るい黄色の沈殿が得られた。
【０１１４】
３０分後、トリエチルアミン１２．０ｍｌを添加し、氷浴中で維持して、黄色懸濁液を撹拌しながらさらに３０分間放置する。
【０１１５】
この懸濁液を予め５５℃に加熱した１Ｎ  ＨＣｌ８００ｍｌに約１５分間激しく撹拌しながら移し、反応フラスコをさらに１Ｎ  ＨＣｌ２０ｍｌで厳密に洗浄する。
【０１１６】
明るい黄橙色の溶液が得られ、移行開始から約５分後、時間と共にかなり微細な結晶に近い金色味のある黄色の沈殿が得られる。
【０１１７】
移行終了から３０分間撹拌を続けた後、加熱浴を循環冷却水浴と交換する。
【０１１８】
３０分後、真空濾過によって該沈殿を回収し、冷却した酸性水３０ｍｌ（ｘ２）及び冷却した蒸留水で１回逐次的に洗浄する。
【０１１９】
該沈殿物を真空乾燥機で一晩乾燥すると、インドール−３−ピルビン酸６．５００ｇ（約８１．７％）が微細な半結晶性の金色味のある黄色の粉末として、純度＞９９．９％で得られる（ＨＰＬＣ、ＮＭＲ、ＩＲ及びＵＶが一致）。
【０１２０】
本発明のＢ）による塩の調製例を以下に例示する。
【実施例３】
【０１２１】
メチルアルコール中におけるナトリウムメトキシドからのエノール互変異性体型３−インドリルピルビン酸のナトリウム塩の調製
エノール型の３−インドリルピルビン酸３００ｍｇを無水メチルアルコール１０ｍｌ中で室温で撹拌しながら溶解する。完全に溶解した後、新たに調製した無水メタノールに溶かした０．５Ｍナトリウムメトキシド溶液２．４６ｍｌ、酸全てを中和するような量を添加する。室温で１時間撹拌後、該反応混合物を真空下で約３分の１まで濃縮して、無水エチルエーテル２００ｍｌに激しく撹拌しながら滴加すると、非常に微細な黄色みを帯びた沈殿物が得られたが、一方溶液は無色になる傾向がある。約２時間後、該沈殿物を焼結ガラス濾過器（Ｇ４型）で吸引濾過によって回収する。したがって、回収された沈殿物は無水エチルエーテル１０ｍｌで洗浄し、ＫＯＨペレット上において真空下で一晩維持する。エノール型３−インドリルピルビン酸のナトリウム塩２７２ｍｇ（＞９８％収率）が回収された（ＨＰＬＣで遊離酸として純度＞９８％）。
【実施例４】
【０１２２】
エチルアルコール中でのナトリウムエトキシドからの３−インドリルピルビン酸エノール互変異性体のナトリウム塩の調製
実施例３と同様の方法で、エノール互変異性体型３−インドリルピルビン酸のナトリウム塩を無水エチルエーテル中でナトリウムエトキシドから調製した（２１％ｗ／ｗ、使用した量は酸中和量に等しい）。エノール互変異性体型３−インドリルピルビン酸の量、反応溶媒、反応収率及び純度は実施例３と同一である。
【実施例５】
【０１２３】
ナトリウムメトキシド粉末からの３−インドリルピルビン酸エノール互変異性体のナトリウム塩の調製
エノール型３−インドリルピルビン酸３００ｍｇを無水エチルエーテル７０ｍｌに懸濁し、完全に溶解するまで室温で撹拌しながら維持すると暗い黄橙色の溶液が得られる。酸全てを中和するため等の量のナトリウムメトキシド粉末７０．４５ｍｇ（純度＞９５％）及び反応開始剤として無水メチルアルコール９６３μｌを迅速にこの溶液に添加し、激しい撹拌を維持する。時間と共に微細な黄色みを帯びた沈殿がたくさん得られる。この反応混合物を室温で撹拌しながら一晩放置する。このように得られた黄色みを帯びた沈殿物を焼結ガラス濾過器（Ｇ４型）で吸引濾過によって回収する。このように回収した沈殿物を無水エチルアルコール１０ｍｌで２回洗浄して、ＫＯＨ上において真空下で一晩維持する。エノール型の３−インドリルピルビン酸のナトリウム塩２６２ｍｇ（収率＞９８％）が回収される（ＨＰＬＣで遊離酸として純度＞９８％）。
【実施例６】
【０１２４】
金属ナトリウムからの３−インドリルピルビン酸エノール互変異性体のナトリウム塩の調製
エノール型３−インドリルピルビン酸３００ｍｇを無水エチルエーテル７０ｍｌに懸濁し、完全に溶解するまで撹拌しながら室温で維持すると、暗い黄橙色の溶液が得られる。この溶液に、酸全てを中和するため等の量で迅速に計量した純粋な金属ナトリウム３４ｍｇ及び金属ナトリウム活性化剤として無水メチルアルコール５００μｌを添加した。時間と共に柔毛状の黄色沈殿物が得られた。撹拌しながら一晩放置し、該沈殿物を実施例５のように回収する。エノール型３−インドリルピルビン酸のナトリウム塩５．２５１ｍｇ（収率＞９３％）が回収される（ＨＰＬＣで遊離酸として純度＞９８％）。
【実施例７】
【０１２５】
実施例５と同様の方法で、以下を調製した。
−カリウムメトキシド粉末から開始したエノール互変異性体３−インドリルピルビン酸のカリウム塩
−リチウムメトキシド粉末から開始したエノール互変異性体３−インドリルピルビン酸のリチウム塩
【０１２６】
対応する塩の回収率及び純度は、実施例５と同様である。
【実施例８】
【０１２７】
実施例３と同様の方法で、３−インドリルピルビン酸エノール互変異性体のリチウム塩を無水メタノール中でリチウムメトキシドから調製した。対応するリチウム塩の回収率及び純度は実施例３と同様である。
【実施例９】
【０１２８】
実施例６と同様の方法で、３−インドリルピルビン酸エノール互変異性体のカリウム塩を無水メチルアルコールでその場で活性化した金属カリウムから調製した。対応するカリウム塩の回収率及び純度は実施例６と同様である。
【実施例１０】
【０１２９】
金属マグネシウムからの３−インドリルピルビン酸エノール互変異性体のマグネシウム塩の調製
エノール型３−インドリルピルビン酸３００ｍｇを無水エチルエーテル７０ｍｌに懸濁し、完全に溶解するまで撹拌しながら室温で維持すると、暗い黄橙色の溶液が得られる。この溶液に、酸全てを中和するため等の量で迅速に計量した純粋な金属マグネシウム１７．９ｍｇ及び金属ナトリウム活性化剤として無水メチルアルコール５００μｌを添加した。時間と共に柔毛状の黄色沈殿物が増加して得られることが確実である。撹拌しながら一晩放置し、該沈殿物を実施例５のように回収する。エノール型３−インドリルピルビン酸のマグネシウム塩５．３００ｍｇ（収率＞９５％）が回収される（ＨＰＬＣで遊離酸として純度＞９８％）。
【実施例１１】
【０１３０】
マグネシウムメトキシドからの３−インドリルピルビン酸エノール互変異性体のマグネシウム塩の調製
エノール型３−インドリルピルビン酸３００ｍｇを無水エチルエーテル７０ｍｌに懸濁し、完全に溶解するまで撹拌しながら室温で維持すると、暗い黄橙色の溶液が得られる。この溶液に、酸全てを中和するため等の量で無水メチルアルコール溶液に溶かしたマグネシウムメトキシド（６％ｗ／ｗ濃度）１．１８ｍｌを迅速に添加した。時間と共に増加する微細な黄色みを帯びた沈殿がたくさん得られた。この反応混合物を撹拌しながら室温で３時間放置する。このように得られた非常に微細な黄色みを帯びた沈殿物を濾紙（Ｗａｈｔｍａｎ４２番、無水エチルアルコールで洗浄して、重量が一定になるようにする）上で軽く吸引して濾過することによって回収する。このように濾紙上に回収した沈殿物を無水エチルアルコール１０ｍｌで２回洗浄して、ＫＯＨペレット上において真空下で一晩維持する。エノール型３−インドリルピルビン酸のマグネシウム塩２８２ｍｇ（収率＞９８％）が回収される（ＨＰＬＣで遊離酸として純度＞９８％）。
【実施例１２】
【０１３１】
カルシウムメトキシド粉末からの３−インドリルピルビン酸エノール互変異性体のカルシウム塩の調製
実施例５と同様の方法で、エノール型３−インドリルピルビン酸のカルシウム塩をカルシウムメトキシド粉末から調製した。対応するカルシウム塩の回収率及び純度は実施例１１と同様である。
【０１３２】
２．溶液中におけるエノール型３−インドリルピルビン酸の同定
実施例１及び２で前述した方法によって純度＞９９．９％で得られたエノール型３−インドリルピルビン酸は、水及びクロロホルムには全く不溶性で、エチルエーテルには少し溶解し、アセトン、メタノール及びエタノールでは非常に良く溶解するようである。メタノールによる溶液は、ＵＶ光下で３２５ｎｍに特徴的なピークを示し、ケト型と区別することが可能で、ケト酸ではこのピークが消失し、代わりに優位なインドール環の２８０ｎｍピークが優位になる。エノール型３−インドリルピルビン酸はメタノール中で極めて安定で、室温で数日間後であってもあまり損失が認められない。
【０１３３】
３−インドリルピルビン酸のエノール互変異性体が水性環境で溶解するとき、溶液温度、ｐＨ及び使用した緩衝液の種類に応じて多少速くなるが、３２５ｎｍにおけるＵＶピークの減少がすぐに認められる。報告された研究から考慮して、これによって周知のケト−エノール平衡の確立が示され、水性溶液中では、該水性溶液が中性又は塩基性ｐＨのとき、ケト互変異性体が主に好まれる。使用した実験条件では、ケト酸のエノール互変異性体がＮａＯＨ希釈溶液に溶解するとき、溶液中ではケト−エノール平衡は数秒でケト型に傾き、その後３２５ｎｍピークの迅速な消失が認められる。
【０１３４】
しかし、前記の文献で記載されたこととは反対に、極めて激しい条件、たとえば濃縮した酸溶液の添加などを使用しなければ、水性溶液中においてケト型（ＵＶの３２５ｎｍのピークで特性決定）は開始エノール型を最小限しか再構成することができず、この場合はまた、３２５ｎｍのピークは極めて不安定な様子である。したがって、ほとんど純粋なエノール互変異性体型で実施した実験は、アルカリ性又は中性の水性溶液では、実際のケト−エノール平衡は、ケトからエノールへの逆転はそれほどではなく、むしろエノール型のケト型へのやや迅速な変換が生じることを示している。
【０１３５】
高速液体クロマトグラフィー（Ｂｏｎｄａｐａｃｋ  Ｃ１８カラムによるＨＰＬＣ）で溶液を溶出し、インドールを明らかにして得られたより正確な研究によって、中性又は塩基性水性溶液においてはエノール型の多かれ少なかれ迅速な消失が生じ、それに伴って、短時間で既にケト酸ではなくゲムジオールのケト型を特徴とする新しいクロマトグラフィーピークが増加することを確かめることが可能になった。より長くインキュベートするとまた、ゲムジオール型が消失するが、ケト型の上昇は起こらない。
【０１３６】
特に、ｐＨ７．４のリン酸溶液を使用すると、エノール型は＋３０分で既に４４％まで減少し、ゲムジオール型は＋１時間で優勢（増加）になり始め（４４％対２３％）、さらに約＋２時間で安定し（４９％）、その後徐々に減少する。
【０１３７】
簡単に述べると、ほとんど純粋なエノール互変異性体型の３−インドリルピルビン酸のケト−エノール平衡に関する試験によって、エノール互変異性体は、中性又はアルカリ性水性溶液に溶解すると、もはやケト互変異性体型から適度な濃度で再構成されることはできず、ケト互変異性体は迅速にゲムジオール型に傾き、この型は不安定で、さらに化学変換が進行するという結論が導かれる。これによって３−インドリルピルビン酸は、使用した溶解条件に応じてエノール型又はゲムジオール型の特性を示すという重要な実験結果がもたらされる。さらに、平衡が一旦ゲムジオール型に傾くと、エノール型の物理化学的、生理学的及び薬理学的特性が最終的に失われてしまう。
【０１３８】
３．生理食塩中におけるエノール互変異性体型３−インドリルピルビン酸の同定
前記の実施例１及び２で説明した方法によって得られたほとんど純粋な３−インドリルピルビン酸エノール互変異性体について、トリプトファン及びその誘導体の使用を特徴とする哺乳動物細胞代謝経路への関与をはっきりさせるために、ラットの組織ホモジネートで調べた。特に、水性溶液中における実験（２）を参照のこと）によって、ケト酸のエノール型は中性又はアルカリ性ｐＨで迅速に消失することが示されたので、（実施例１及び２で説明したようにこの実験の直前に入手したケト酸を溶解して得られた）エノール型の特性を（商業的供給源から購入したケト酸を希ＮａＯＨに溶解することによって得られた）ケト型と比較しながら、哺乳動物細胞において３−インドリルピルビン酸に関与し得る２種類の主要な経路、（異なるアミノ基転移酵素によって触媒される）トリプトファンへの変換及び特定の脱水素酵素によって触媒される３−インドリル−乳酸への変換において分析した。ケト型を使用すると、トリプトファンにも３−インドリル−乳酸にも著しい変換は認められないが、エノール型によって得られた結果によって、これらの化学種が両インドール化合物への前駆体として作用し、ややアルカリ性の緩衝液環境（ｐＨ７．４）においても、生体物質を除去した単なる水溶液では認められるゲムジオール型に傾くことなく、良好な安定性が維持される並はずれた能力が強調された。既に文献で報告されているように、生物学的液体に互異的互変異性酵素が存在することによるこの現象によって、該エノール型はインドールに活性を示す特異的酵素によって生化学的変換を受けることが可能である。特に、ケト酸のエノール型をラット肝ホモジネートでインキュベートすると、３−インドリルピルビン酸のエノールがトリプトファンへ徐々に変換されるのが認められる。この変換はｐＨとは独立して、時間と共にむしろ直線的であり−少なくとも６．５÷７．５間隔であり−５時間で５０％を上回るケト酸の変換が引き起こされる。この反応で確認されたその他のインドールは３−インドールアルデヒドのみであるが、その濃度はあまり多くなく、時間による変化はない。肝ホモジネートでは３−インドール−乳酸への変換は認められなかった。
【０１３９】
反対に、３−インドールピルビン酸のエノールをラット脳ホモジネートでインキュベートすると、３−インドリル−乳酸経路への大量の変換が生じ、トリプトファンへの変換はさらにわずかな量で、３−インドールアルデヒドとして少量が見いだされ、その濃度は時間が経過しても実質的に変化がない。脳組織での変換は迅速に生じ、２時間で約５０％のケト酸が３−インドリル−乳酸として見いだされる。
【０１４０】
簡単に述べると、哺乳動物の器官のホモジネートについて３−インドリルピルビン酸の２種類の互変異性体型で実施した実験によって、生理学的ｐＨの単なる水性溶媒では不安的なエノール型は組織内では１種又は複数の互変異性酵素の介在によって安定化し、細胞のトリプトファンを導く経路及びインドリル−乳酸を導く経路の両方の基質となることを述べることができる。さらに、３−インドリル−乳酸は３−インドリルピルビン酸のエノール互変異性体をインキュベートした後の脳内の優勢な代謝物として現れることは、３−インドリル−乳酸は実際に、必要なときにインドールアルファ−ケト酸を得ることができる貯蔵所として役立ち、したがって、それによって中枢神経系で実施される薬理効果のいくつかについてケト酸の代わりに使用可能であることが示唆される。
【０１４１】
４．エノール互変異性体型３−インドリルピルビン酸の吸収
ラット器官ホモジネートでの実験で、互変異性体の介在によって十分長期間にわたって安定に維持されるエノール型３−インドリルピルビン酸の特異な能力がはっきりしたので、経口的に動物に投与した後のケト酸の濃度を測定するために研究を実施した。胃の酸性環境（エノール型の安定化に好ましいことが知られている）及び組織内の互変異性体の存在によって、エノール型ケト酸は十分吸収され、血漿濃度は＋１時間と＋２時間の間でピークを示し、数時間後もまだ明らかに確認可能であることが示された。
【０１４２】
たとえば、エノール型３−インドリルピルビン酸を実際に胃洗浄によってラットに１００ｍｇ／Ｋｇの用量で投与すると、＋１時間で７４±１４マイクログラム（ｍｃｇ）／ｍｌ血漿が見いだされ、一方同用量で慢性処理したラットの血漿濃度は１８３±７８ｍｃｇ／ｍｌに等しかった。用量を４００ｍｇ／Ｋｇまで増加させると、急性投与では１６０±１３ｍｃｇ／ｍｌの値が、慢性投与では１８９±６８ｍｃｇ／ｍｌの値が得られた。
【０１４３】
イヌにおいても類似した結果が得られ、エノール型３−インドリルピルビン酸１００ｍｇ／Ｋｇを投与すると（食餌を混合したペレット）、＋１時間で、血漿濃度は急性投与で１０６±４７ｍｃｇ／ｍｌ、慢性投与で９７±１７ｍｃｇ／ｍｌであった。２８５ｍｇ／Ｋｇの用量では、＋１時間で、急性投与で１３６±１７ｍｃｇ／ｍｌ、慢性投与で１２０±８ｍｃｇ／ｍｌの濃度が生じた。
【０１４４】
したがって、これらの結果によって、エノール型３−インドリルピルビン酸は胃内濃度で十分に吸収され、数時間後でも血漿中でまだ検出可能であるように生態環境で優勢な条件下で安定化することを結論づけることができる。
【０１４５】
５．キヌレン酸形成
３−インドリルピルビン酸は、適切な代謝条件において、キヌレン酸、興奮性アミノ酸の最も重要な内因性阻害剤、の直接的前駆体として機能することは文献によって既に公知である。エノール型のケト酸はキヌレン酸の変換を促進する酸素の遊離ラジカルを捕捉するために、ケト型よりもずっと効果的であることもまた報告された（Ａｄｖａｎｃｅｓ  Ｅｘｐｔｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２９４、５１５〜１８、１９９１）。したがって、前述の実施例１及び２の方法に従って得られたエノール型３−インドリルピルビン酸、（商業的供給源から得られた３−インドリルピルビン酸の標準的調製物をＮａＯＨ０．１Ｍに溶解して得られた）ケト型と（前記標準的調製物をｐＨ７．４リン酸緩衝液に溶解して得られた）２種類の型の混合物との間で比較試験を実施した。したがって、最初に、ケト互変異性体型と反対に、エノール型３−インドリルピルビン酸は、スーパーオキシド陰イオンだけでなく細胞変性現象において最も危険と一般的に考えられている水酸イオンに対して強力な中和力を備えていることが見いだされた。さらに、エノール型はケト型よりも、分解から膜リン脂質を防御するため、及びキサンチン／キサンタンオキシダーゼ混合物によって誘導されるルミノール化学ルミネセンスを阻害するための両方において１００倍から１０００倍強力であることが見いだされている。キヌレン酸の形成に関して、同様の実験条件下で、エノール型３−インドリルピルビン酸は常にケト型又はこの２種類の型の混合物よりも２０倍から１００倍のキヌレン酸を生成した。エノール型３−インドリルピルビン酸をヒヒに静脈内注射（２００ｍｇ／Ｋｇ）したとき、エノール血漿濃度曲線は開始時の高い値から徐々に減少し、数時間で明らかに検出可能な濃度が残存した。付随して、個体間で著しい変動があるがキヌレン酸が形成され始め、エノール注射から＋９０分〜＋１８０分で血漿値がピークに達した。反応速度曲線によって、少なくとも２％から１０％のエノール型３−インドリルピルビン酸がキヌレン酸に変換されたことが示された。
【０１４６】
これらの試験結果によって、エノール型の３−インドリルピルビン酸はキヌレン酸の主要な前駆体であり、哺乳動物の生体液のｉｎ  ｖｉｖｏにおいてこの変換は一定の継続した様式で行われることが裏付けられ、したがって該エノールは実際に、数時間血液中にキヌレン酸を継続的に放出できる貯蔵体として見なすことができる。
【０１４７】
６．薬理活性
本明細書の実施例１及び２で記載した方法で得られたエノール型３−インドリルピルビン酸について、潜在的治療活性を明確にするためにいくつかの薬理試験を行い、（哺乳動物組織のホモジネートでの実験で示されたような）該エノール型がトリプトファン前駆体として作用する能力、並びに該化合物がインドリル−乳酸の脳内濃度を増加させ、興奮性アミノ酸の強力な阻害剤と見なされるキヌレン酸を継続的に適度な量で生成させることが可能であるという事実を考慮した。（商業的供給源から得られたケト型３−インドリルピルビン酸の標準的調製物をＮａＯＨ０．１Ｍに溶解して得られた）ケト型３−インドリルピルビン酸と（前記標準的調製物をｐＨ７．４リン酸緩衝液に溶解して得られた）２種類の互変異性体の混合物の両方を比較して実施した試験によって、ラットに経口的及びＩＰ注射の両方から投与した３−インドリルピルビン酸エノール互変異性体は中枢神経系（たとえば、睡眠の延長、中枢の鎮痛、ＮＭＤＡ誘導性痙攣の防御、アヘン製剤の毒性効果の減少、抗不安効果及び抗鬱薬効果、ストレスの阻害）及び心臓血管系（高血圧ラットでは血圧が減少したが、正常血圧ラットでは減少しなかった）の両方に対して明らかににいくつかの薬理学的特性を有することを確かめることができた。観察された効果は２種類の互変異性体の混合物で得られた効果より明らかに優れており、一方ケト互変異性体自体は検討した変数について明らかな影響を示さなかった。
【０１４８】
実施例３から１２で報告した方法に従って得られたエノール互変異性体型３−インドリルピルビン酸の塩に関して、それらの特異的薬理活性を決定するために、２種類のヒト細胞培養モデル、メラノーマ及び神経芽細胞種でアッセイした。
【０１４９】
得られた結果を以後報告する。
【実施例１３】
【０１５０】
メラノーマ細胞のマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）への浸潤に対する３−インドリルピルビン酸エノール互変異性体及びその塩の影響
マトリゲルは、ラミニン、エンタクチン、コラーゲンＩＶ及びプロテオグリカンなどの基底膜の主要な成分から構成される、Ｅｎｇｌｅｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍマウス肉腫から抽出された細胞外生物マトリックスである。室温で、マトリゲルは初代細胞系及び継代細胞系の増殖を促進でき、さらに腫瘍細胞系の接着、分化、移動及び浸潤の媒体（基質）として作用できるゲルを形成する。このような特性によって、マトリゲル試験は通常、腫瘍細胞及び炎症応答細胞の運動性を妨害できる物質の活性を特徴付けるために使用される。この試験は、孔径８ミクロンの膜によって分割されたウェル内で実施する。マトリゲル（１２．４マイクログラム）は膜上に均一に広がるが、マウスｈｅｍｂｒｙｏ細胞系（３Ｔ３）の上清から成る化学走性誘因物質（６００マイクロリットル）はウェルの底部に進入する。試験すべき細胞をウェルの上部に接種し、濃度勾配の形成を妨げるために、細胞の移動性を妨害できる化合物を膜の上部並びに下部に入れる。実験終了時に、膜を貫通する細胞を計数する。
【０１５１】
ヒトメラノーマ細胞（Ａ２０５８系）をＭＥＭ培地で、５％ＣＯ２で３７℃において培養した。所望する増殖濃度に達したら、（１００．０００）細胞をウェルの上部に接種した。細胞培養培地に溶解した３−インドリルピルビン酸のエノール及びその塩をウェルの上部及び下部に入れた。
【０１５２】
【表１】
2005529146.tif 000003
【０１５３】
値は３種類の異なる実験の平均に関連し、±は標準偏差である。
【０１５４】
前記表から明らかなように、３−インドリルピルビン酸のエノール互変異性体及びその塩の両方は、ヒトメラノーマ細胞のマトリゲルへの移動性に関連した阻害効果を現す。興奮性アミノ酸の拮抗物質が腫瘍の増殖を遅らせることができるという発見（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、７、１０１０〜１０１５、２００１）と関連して、この効果からエノール互変異性体及びその塩のいくつかは一層、腫瘍処理に有用に使用できることが示唆される。
【実施例１４】
【０１５５】
ニューロン細胞の発芽に対する３−インドリルピルビン酸のエノール互変異性体及びその誘導体の効果
ニューロンは、中枢神経系の複雑な相互連結の基礎となり、一般的に細胞の健全性指数と見なされる並はずれた発芽伸長能力を有する細胞で、実際に、若い個体のニューロンの特徴はいくつかの長い神経突起である一方、高齢者又は中枢神経系変性疾患に罹患した人の脳領域では、ニューロンは神経突起がほとんど有さず、長さも限られていることが知られている。神経腫瘍細胞の神経突起は一般的に成長が短くて数も少ないが、栄養要素の作用を受けると、増殖を抑え、より長くて、より多くの神経突起の成長を開始できることもまた知られている。
【０１５６】
ＬＡＮ５ヒト神経芽細胞は、胎児血清１０％及びゲンタマイシン４０マイクログラム／ｍｌを添加したＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）培地を入れた６ウェルプレートに接種した（２５．０００細胞／ウェル）。２４時間後、３−インドリルピルビン酸のエノール互変異性体及びその誘導体を最終濃度１０μＭで該培養培地に添加した。３日毎に培地交換し、試験する化合物を追加して、この処理を７日間継続した。＋７日目に、Ｌｅｉｔｚ  Ｄｉａｌｕｘ  ２０顕微鏡を使用して細胞の写真を撮った。次に、神経突起の長さを測定した。
【０１５７】
以下の表に報告した結果は、各処理のニューロンの平均長をミクロンで表しており、±は標準偏差である。
【０１５８】
【表２】
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【０１５９】
この結果は非常に興味深く、３−インドリルピルビン酸のエノール互変異性体及びその誘導体のいくつかは、一般的に分化及び成長力の徴候であるヒト腫瘍細胞系ニューロンの神経突起発芽を誘発することができる。これらの効果は、部分的には神経腫瘍の増殖を抑制する興奮性アミノ酸拮抗剤が示した能力（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、７、１０１０〜１０１５、２００１）による可能性があるが、それでも主に３−インドリルピルビン酸のエノール互変異性体によって示された著しい抗酸化効果によるものである。アッセイしたインドールの中で、インドール乳酸のみが、（おそらく、抗酸化活性を有する化合物を継続的に供給する貯蔵所として作用するので）、エノール型の効果よりも優れた神経突起長への顕著な効果を示したが、抗酸化力が非常に限定される３−インドール酢酸及び５−ヒドロキシインドール酢酸は使用した実験条件下では神経突起の長さに影響を及ぼさないことを強調したい。
【０１６０】
７．製剤
水溶液中で不安定なため、３−インドリルピルビン酸のエノール互変異性体は通常の水を使用した技術系で薬剤形態に製剤することはできず、特異的な保護系に頼るものとする。（製造並びにコーティング及び吸収遅延剤を任意の内在のために、技術的な工夫をこらした後者の場合では）許容される形態は、経口用にはカプセル剤及び錠剤であってよく、注射可能な製品では、本発明で説明した塩のいずれか１つを使用した、使用直前に可溶化する粉末であってよい。
【０１６１】
ヒトに使用することを念頭においた投与量は、用量当たり１００ｍｇから５００ｍｇの範囲である。
【国際調査報告】
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