(57)【要約】本発明は、ヒトを含めた哺乳動物において特定の神経障害および精神障害を処置する方法であって、選択的ＰＤＥ１０阻害薬を投与することを含む方法を提供する。本発明は特に、気分、運動および不安障害；精神病；薬物、たとえばアルコールの嗜癖；症状として認知欠陥を伴う障害；ならびに神経変性の障害および症状の処置に関する。本発明はさらに、選択的ＰＤＥ１０阻害薬としてのパパベリンの使用を提供する。本発明は、選択的ＰＤＥ１０阻害薬としての活性をもつ化合物を同定するためのアッセイ法をも提供する。
2005524402.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物がＰＤＥ１０を選択的に阻害する活性を有するか否かを判定する方法であって、
ａ）化合物を中等大有棘ニューロン培養物に与え；そして
ｂ）培養物においてＣＲＥＢのリン酸化が増大するか否かを測定する
ことを含み、ＣＲＥＢのリン酸化の増大により、工程（ａ）で与えた化合物がＰＤＥ１０を選択的に阻害する活性を有すると判定する方法。
【請求項２】
化合物がＰＤＥ１０を選択的に阻害する活性を有するか否かを判定する方法であって、
ａ）化合物を中等大有棘ニューロン培養物に与え；そして
ｂ）培養物において中等大有棘ニューロンが産生するＧＡＢＡの量が増大するか否かを測定する
ことを含み、中等大有棘ニューロンによるＧＡＢＡ産生の増大により、工程（ａ）で与えた化合物がＰＤＥ１０を選択的に阻害する活性を有すると判定する方法。
【請求項３】
哺乳動物において、強迫性障害、トゥーレット症候群、および他のチック障害から選択される障害を処置する方法であって、哺乳動物にその障害を処置するのに有効な量の選択的ＰＤＥ１０阻害薬を投与することを含む方法。
【請求項４】
哺乳動物において神経変性性の障害または症状を処置する方法であって、哺乳動物にその障害または症状を処置するのに有効な量の選択的ＰＤＥ１０阻害薬を投与することを含む方法。
【請求項５】
神経変性性の障害または症状が、パーキンソン病；ハンチントン病；痴呆、たとえばアルツハイマー病、多発梗塞性痴呆、エイズ関連痴呆、およびフロントテンペラル痴呆；脳外傷関連の神経変性；卒中関連の神経変性、脳梗塞関連の神経変性；低血糖誘発性の神経変性；てんかん性発作関連の神経変性；神経毒中毒関連の神経変性；ならびに多系統萎縮から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
神経変性性の障害または症状が、哺乳動物における中等大有棘ニューロンの神経変性を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
神経変性性の障害または症状が、ハンチントン病である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
哺乳動物においてハンチントン病およびドーパミンアゴニスト療法に関連したジスキネジーから選択される運動障害を処置する方法であって、哺乳動物にＰＤＥ１０を阻害するのに有効な量の選択的ＰＤＥ１０阻害薬を投与することを含む方法。
【請求項９】
哺乳動物において強迫性障害、トゥーレット症候群、および他のチック障害から選択される障害を処置する方法であって、哺乳動物にＰＤＥ１０を阻害するのに有効な量の選択的ＰＤＥ１０阻害薬を投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景：
本発明は、中枢神経系の障害の処置に関する。より詳細には、本発明は神経障害および精神障害、たとえば精神病および症状として認知欠陥を含む障害の処置に関する。さらに、本発明は神経変性性の障害および症状の処置に関する。本発明はまた、ＰＤＥ１０阻害に関する。本発明はまた、選択的ＰＤＥ１０阻害薬としての活性をもつ化合物を同定するためのアッセイ法に関する。
【背景技術】
【０００２】
環状ヌクレオチドであるサイクリックアデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）およびサイクリックグアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）は、特に中枢神経系のニューロンにおいて、広範な一連の細胞内プロセスを調節する細胞内第２メッセンジャーとして機能する。ニューロンにおいて、これはｃＡＭＰおよびｃＧＭＰ依存性キナーゼの活性化、続いてシナプス伝達の短期調節ならびにニューロンの分化および生存に関与するタンパク質のリン酸化を含む。環状ヌクレオチドの信号伝達の複雑さは、ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰの合成と分解に関与する酵素の分子の多様性により示される。１０ファミリーのアデニリルシクラーゼ、２ファミリーのグアニリルシクラーゼ、１１ファミリーのホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）がある。さらに、異なるタイプのニューロンはこれらのクラスそれぞれの多数のアイソザイムを発現することが知られており、特定ニューロン内の異なるアイソザイムに対する機能のコンパーメンタリゼーションおよび特異性を示す良い証拠がある。
【０００３】
ｃＡＭＰは、膜結合酵素のファミリー、すなわち前記のアデニリルシクラーゼにより合成される。広範なセルピンファミリー受容体は、ヘテロ三量体Ｇタンパク質が仲介する結合機序によりこれらの酵素を調節する。細胞内ｃＡＭＰが増加すると、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼが活性化され、これが他の信号伝達キナーゼ、転写因子および酵素をそれらのリン酸化により調節する。ｃＡＭＰは、環状ヌクレオチド調節型イオンチャンネル、ホスホジエステラーゼまたはグアニンヌクレオチド交換因子の活性にも直接作用する可能性がある。最近の研究で、細胞内ｃＡＭＰが細胞外へ輸送された後、神経モジュレーターであるアデノシンの前駆体として機能する可能性があることも示唆されている。
【０００４】
ｃＧＭＰを合成するグアニリルシクラーゼは膜結合形と細胞質形で存在する。膜結合形はＧタンパク質共役型受容体、たとえばＡＮＰ（心房性ナトリウム利尿ペプチド）に結合するのに対し、可溶性グアニリルシクラーゼは酸化窒素により活性化される（Ｗａｎｇ，Ｘ，ａｎｄ  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６８（２）：４４３−４５６，１９９７）。ｃＡＭＰと同様に、中枢神経系におけるｃＧＭＰ信号伝達の下流メディエーターにはｃＧＭＰゲートイオンチャンネル、ｃＧＭＰ調節型ホスホジエステラーゼおよびｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼが含まれる。中枢神経系内での信号伝達における環状ヌクレオチドの重要な役割を考慮すると、環状ヌクレオチドの信号伝達調節に影響を及ぼす化合物の使用により療法上の有用性が得られる可能性がある。
【０００５】
環状ヌクレオチド信号伝達の調節に関する主な機序は、ホスホジエステラーゼが触媒する環状ヌクレオチド異化作用によるものである。２１種類の遺伝子がコードする既知の１１ファミリーのホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）がある。各遺伝子は一般に多数のスプライス変異体を生成し、これがさらにアイソザイムの多様性をもたらす。ＰＤＥファミリーは、環状ヌクレオチド基質特異性、調節機序、および阻害薬に対する感受性に基づいて、機能において区別される。さらに、ＰＤＥは中枢神経系を含めて、生体内で異なる発現をする。これらの独特の酵素活性および局在性の結果、異なるＰＤＥアイソザイムが独特の生理的機能をする可能性がある。さらに、特定のＰＤＥファミリーまたはアイソザイムを選択的に阻害することができる化合物は、格別な療法効果、より少ない副作用、または両方を提供する可能性がある。
【０００６】
ＰＤＥ１０は、一次アミノ酸配列および独特の酵素活性に基づいて、特異なファミリーとして同定される。ＥＳＴデータベースの相同性スクリーニングにより、マウスＰＤＥ１０ＡがＰＤＥ１０ファミリーのホスホジエステラーゼの最初のメンバーとして解明された（Ｆｕｊｉｓｈｉｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１８４３８−１８４４５，１９９９；Ｌｏｕｇｈｎｅｙ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ２３４：１０９−１１７，１９９９）。このマウス相同体はクローニングもされ（Ｓｏｄｅｒｉｎｇ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：７０７１−７０７６，１９９９）、ラットおよびヒト両遺伝子のＮ末端スプライス変異体が同定された（Ｋｏｔｅｒａ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２６１：５５１−５５７，１９９９；Ｆｕｊｉｓｈｉｇｅ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６６：１１１８−１１２７，１９９９）。種間で高度の相同性がある。マウスＰＤＥ１０Ａ１は７７９アミノ酸のタンパク質であり、ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰの両方をそれぞれＡＭＰおよびＧＭＰに加水分解する。ｃＡＭＰに対するＰＤＥ１０の親和性（Ｋｍ＝０．０５μＭ）はｃＧＭＰに対するもの（Ｋｍ＝３μＭ）より高い。しかし、ｃＧＭＰに対するＶｍａｘがｃＡＭＰに対するより約５倍大きいことから、ＰＤＥ１０は特異なｃＡＭＰ阻害性ｃＧＭＰａｓｅであることが示唆される（Ｆｕｊｉｓｈｉｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１８４３８−１８４４５，１９９９）。
【０００７】
またＰＤＥ１０は、他のＰＤＥファミリーと対比して哺乳動物においては特異に局在する。ＰＤＥ１０に対するｍＲＮＡは、精巣および脳にのみ高度に発現する（Ｆｕｊｉｓｈｉｇｅ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６６：１１１８−１１２７，１９９９；Ｓｏｄｅｒｌｉｎｇ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９６：７０７１−７０７６，１９９９；Ｌｏｕｇｈｎｅｙ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ２３４：１０９−１１７，１９９９）。これら初期の研究で、脳内でのＰＤＥ１０発現は線条（尾状核および被殻）、側坐核および嗅結節において最高であることが示された。より最近になって、げっ歯類の脳におけるＰＤＥ１０  ｍＲＮＡの発現パターン（Ｓｅｅｇｅｒ，Ｔ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｂｓｔ．Ｓｏｃ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２６：３４５．１０，２０００）およびＰＤＥ１０タンパク質の発現パターン（Ｍｅｎｎｉｔｉ，Ｆ．Ｓ．，Ｓｔｉｃｋ，Ｃ．Ａ．，Ｓｅｅｇｅｒ，Ｔ．Ｆ．ａｎｄ  Ｒｙａｎ，Ａ．Ｍ．，ラット脳におけるＰＤＥ１０の免疫組織学的局在性，Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｈａｒｖｅｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ’健康と疾病におけるホスホジエステラーゼ’，ポルトガル，ポルト，２００１年１２月５−７日）について詳細な分析が行われた。
【０００８】
発明の概要：
本発明は、ヒトを含めた哺乳動物において不安障害または精神障害を処置する方法であって、哺乳動物に不安障害または精神障害を処置するのに有効な量の選択的ＰＤＥ１０阻害薬を投与することを含む方法を提供する。
【０００９】
本発明は、ヒトを含めた哺乳動物において不安障害または精神障害を処置する方法であって、哺乳動物にＰＤＥ１０を阻害するのに有効な量の選択的ＰＤＥ１０阻害薬を投与することを含む方法をも提供する。
【００１０】
本発明により処置できる精神障害の例には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：統合失調症、たとえば妄想型、解体型、緊張型、鑑別不能型または残遺型のもの；分裂病様障害；分裂感情障害、たとえば妄想型または抑うつ型のもの；妄想障害；物質誘発性精神障害、たとえばアルコール、アンフェタミン、大麻、コカイン、幻覚剤、吸入剤、オピオイドまたはフェンシクリジンにより誘発される精神病；妄想性人格障害；および分裂病質性人格障害。
【００１１】
本発明により処置できる不安障害の例には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：パニック障害；広場恐怖症；特定の恐怖症；社会恐怖症；強迫性障害；心的外傷後ストレス障害；急性ストレス障害；および全般性不安障害。
【００１２】
本発明は、ヒトを含めた哺乳動物においてハンチントン病およびドーパミンアゴニスト療法に関連したジスキネジーから選択される運動障害を処置する方法であって、哺乳動物にその障害を処置するのに有効な量の選択的ＰＤＥ１０阻害薬を投与することを含む方法をも提供する。
【００１３】
本発明は、ヒトを含めた哺乳動物においてハンチントン病およびドーパミンアゴニスト療法に関連したジスキネジーから選択される運動障害を処置する方法であって、哺乳動物にＰＤＥ１０を阻害するのに有効な量の選択的ＰＤＥ１０阻害薬を投与することを含む方法をも提供する。
【００１４】
本発明はさらに、ヒトを含めた哺乳動物においてパーキンソン病、下肢静止不能症候群および本態性振戦から選択される運動障害を処置する方法であって、哺乳動物にその障害を処置するのに有効な量の選択的ＰＤＥ１０阻害薬を投与することを含む方法を提供する。
【００１５】
本発明は、ヒトを含めた哺乳動物においてパーキンソン病、下肢静止不能症候群および本態性振戦から選択される運動障害を処置する方法であって、哺乳動物にＰＤＥ１０を阻害するのに有効な量の選択的ＰＤＥ１０阻害薬を投与することを含む方法をも提供する。
【００１６】
本発明は、ヒトを含めた哺乳動物において強迫性障害、トゥーレット症候群、および他のチック障害から選択される障害を処置する方法であって、哺乳動物にその障害を処置するのに有効な量の選択的ＰＤＥ１０阻害薬を投与することを含む方法をも提供する。
【００１７】
本発明は、ヒトを含めた哺乳動物において強迫性障害、トゥーレット症候群、および他のチック障害から選択される障害を処置する方法であって、哺乳動物にＰＤＥ１０を阻害するのに有効な量の選択的ＰＤＥ１０阻害薬を投与することを含む方法をも提供する。
【００１８】
本発明はさらに、ヒトを含めた哺乳動物において薬物嗜癖、たとえばアルコール、アンフェタミン、コカインまたはオピエート嗜癖を処置する方法であって、哺乳動物に薬物嗜癖を処置するのに有効な量の選択的ＰＤＥ１０阻害薬を投与することを含む方法を提供する。
【００１９】
本発明は、ヒトを含めた哺乳動物において薬物嗜癖、たとえばアルコール、アンフェタミン、コカインまたはオピエート嗜癖を処置する方法であって、哺乳動物にＰＤＥ１０を阻害するのに有効な量の選択的ＰＤＥ１０阻害薬を投与することを含む方法をも提供する。
【００２０】
本明細書中で用いる”薬物嗜癖”は、薬物に対する異常な願望を意味し、一般に動機づけ障害、たとえば願望薬物の摂取の強迫および強い薬物欲求のエピソードを特徴とする。
本発明はさらに、ヒトを含めた哺乳動物において症状として注意および／または認知の欠陥を含む障害を処置する方法であって、哺乳動物に注意および／または認知の欠陥を処置するのに有効な量の選択的ＰＤＥ１０阻害薬を投与することを含む方法を提供する。
【００２１】
本発明は、ヒトを含めた哺乳動物において症状として注意および／または認知の欠陥を含む障害を処置する方法であって、哺乳動物にＰＤＥ１０を阻害するのに有効な量の選択的ＰＤＥ１０阻害薬を投与することを含む方法をも提供する。
【００２２】
本明細書中で”症状として注意および／または認知の欠陥を含む障害”中に用いる”注意および／または認知の欠陥”という句は、同年代集団内の他の個体と比較してある個体における１以上の認知面、たとえば記憶、知能、または学習および論理能力の正常下機能性を表わす。”注意および／または認知の欠陥”は、たとえば加齢性認知衰退に際して起きる、ある個体の１以上の認知面の機能性の低下をも表わす。
【００２３】
本発明により処置できる、症状として注意および／または認知の欠陥を含む障害の例は、下記のものである：痴呆、たとえばアルツハイマー病、多発梗塞性痴呆、アルコール痴呆もしくは他の薬物関連痴呆、頭蓋内腫瘍もしくは脳外傷に関連する痴呆、ハンチントン病もしくはパーキンソン病に関連する痴呆、またはエイズ関連痴呆；譫妄；健忘性障害；心的外傷後ストレス障害；精神遅滞；学習障害、たとえば読字障害、算数障害もしくは書字障害；注意欠陥／多動障害；および加齢性認知衰退。
【００２４】
本発明は、ヒトを含めた哺乳動物において気分障害または気分エピソードを処置する方法であって、哺乳動物にその障害またはエピソードを処置するのに有効な量の選択的ＰＤＥ１０阻害薬を投与することを含む方法をも提供する。
【００２５】
本発明は、ヒトを含めた哺乳動物において気分障害または気分エピソードを処置する方法であって、哺乳動物にＰＤＥ１０を阻害するのに有効な量の選択的ＰＤＥ１０阻害薬を投与することを含む方法をも提供する。
【００２６】
本発明により処置できる気分障害または気分エピソードの例には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：軽症、中等症または重症型の大うつ病エピソード、躁病性または混合型の気分エピソード、軽躁病性気分エピソード；非定型性のうつ病エピソード；メランコリー性うつ病エピソード；緊張病性うつ病エピソード；分娩後発症型の気分エピソード；卒中後うつ病；大うつ病性障害；気分変調性障害；小うつ病性障害；月経前不快障害；統合失調症の精神病後うつ病性障害；妄想性障害または統合失調症などの精神障害に混合した大うつ病性障害；双極性障害、たとえば双極性障害Ｉ型、双極性障害ＩＩ型；および気分循環性障害。
【００２７】
本発明はさらに、ヒトを含めた哺乳動物において神経変性性の障害または症状を処置する方法であって、哺乳動物にその障害または症状を処置するのに有効な量の選択的ＰＤＥ１０阻害薬を投与することを含む方法を提供する。
【００２８】
本発明はさらに、ヒトを含めた哺乳動物において神経変性性の障害または症状を処置する方法であって、哺乳動物にＰＤＥ１０を阻害するのに有効な量の選択的ＰＤＥ１０阻害薬を投与することを含む方法を提供する。
【００２９】
本明細書中で用いる”神経変性性の障害または症状”は、別途指示しない限り、中枢神経系のニューロンの機能不全および／または死により起きる障害または症状を表わす。これらの障害および症状の処置は、これらの障害または症状のリスクをもつニューロンの機能不全もしくは死を予防する薬剤、および／またはリスクをもつニューロンの機能不全もしくは死により起きる機能損失を補償するように、損傷を受けたニューロンもしくは健全なニューロンの機能を高める薬剤の投与によって促進できる。本明細書中で用いる用語”神経栄養薬”は、これらの特性の一部または全部を備えた物質または薬剤を表わす。
【００３０】
本発明により処置できる神経変性性の障害および症状の例には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：パーキンソン病；ハンチントン病；痴呆、たとえばアルツハイマー病、多発梗塞性痴呆、エイズ関連痴呆、およびフロントテンペラル（Ｆｒｏｎｔｏ  ｔｅｍｐｅｒａｌ）痴呆；脳外傷関連の神経変性；卒中関連の神経変性、脳梗塞関連の神経変性；低血糖誘発性の神経変性；てんかん性発作関連の神経変性；神経毒中毒関連の神経変性；ならびに多系統萎縮。
【００３１】
本発明の１態様において、神経変性性の障害または症状には、ヒトを含めた哺乳動物における線条の中等大有棘ニューロン（ｍｅｄｉｕｍ  ｓｐｉｎｙ  ｎｅｕｒｏｎ）の神経変性が含まれる。
【００３２】
本発明の１態様において、神経変性性の障害または症状はハンチントン病である。
”神経毒中毒”は、神経毒により起きる中毒を表わす。神経毒は神経死をもたらすことにより神経損傷を引き起こす可能性のあるいずれかの薬品または物質である。神経毒の一例はアルコールであり、これを妊婦が乱用すると、新生児の胎児性アルコール症候群として知られるアルコール中毒および神経損傷が生じる可能性がある。神経毒の他の例には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：カイニン酸、ドーモイ酸、およびアクロメリン酸（ａｃｒｏｍｅｌｉｃ  ａｃｉｄ）；ある農薬、たとえばＤＤＴ；ある殺虫剤、たとえば有機リン酸剤；揮発性有機溶剤、たとえばヘキサカーボン類（たとえばトルエン）；重金属（たとえば鉛、ヒ素、およびリン）；アルミニウム；兵器として用いられるある化学物質、たとえばオレンジ剤および神経ガス；ならびに神経毒性抗新生物薬。
【００３３】
本明細書中で用いる”選択的ＰＤＥ１０阻害薬”は、ＰＤＥ１〜９ファミリーまたはＰＤＥ１１ファミリーの酵素よりＰＤＥ１０ファミリーの酵素をより大幅に選択的に阻害する物質、たとえば有機分子を表わす。１態様において選択的ＰＤＥ１０阻害薬は、他のいずれかのＰＤＥ酵素の阻害に対してその物質がもつＫｉの約１／１０以下のＫｉをＰＤＥ１０の阻害に対してもつ物質、たとえば有機分子である。すなわちその物質は、他のいずれかのＰＤＥ酵素に必要な濃度の約１／１０以下の濃度で同程度にＰＤＥ１０活性を阻害する。
【００３４】
一般に物質は、約１０μＭ以下、好ましくは約０．１μＭ以下のＫｉをもつ場合、ＰＤＥ１０活性を効果的に阻害するとみなされる。
本明細書に記載する発明の療法の１態様において、選択的ＰＤＥ１０阻害薬はパパベリンである。
【００３５】
”選択的ＰＤＥ１０阻害薬”は、たとえばある物質がＰＤＥ１０活性を阻害する能力をその物質が他のＰＤＥファミリーのＰＤＥ酵素を阻害する能力と比較することにより同定できる。たとえばある物質がＰＤＥ１０活性、ならびにＰＤＥ１、ＰＤＥ２、ＰＤＥ３、ＰＤＥ４、ＰＤＥ５、ＰＤＥ６、ＰＤＥ７、ＰＤＥ８、ＰＤＥ９、およびＰＤＥ１１活性を阻害する能力をアッセイする。
【００３６】
上記本発明の療法の１態様において、選択的ＰＤＥ１０阻害薬はパパベリンである。
本発明は、ヒトを含めた哺乳動物においてＰＤＥ１０を選択的に阻害する方法であって、哺乳動物にＰＤＥ１０を阻害するのに有効な量のパパベリンを投与することを含む方法をも提供する。
【００３７】
”障害を処置する方法”における用語”処置する”は、その用語を適用した障害またはその障害の１以上の症状を回復、軽減、または進行抑制することを表わす。本明細書中で用いるこの用語は患者の状態に応じてその障害を予防することをも含み、これにはその障害またはそれに関連するいずれかの症状の発症を予防すること、およびその障害またはそれのいずれかの症状の程度を発症前に軽減することが含まれる。本明細書中で用いる”処置”は、障害の再発を予防することをも表わす。
【００３８】
たとえば本明細書中で用いる”統合失調症または分裂病様障害もしくは分裂感情障害の処置”には、その障害の１以上の症状（陽性、陰性、および他の関連特徴）の処置、たとえばそれに関連する妄想および／または幻覚の処置も含まれる。統合失調症ならびに分裂病様障害および分裂感情障害の他の例には、解体性言語、感情平坦化、アロギー（会話不能）、性的快感消失症、不相応な情動、不快気分（たとえば抑うつ、不安または怒りの形の）、および何らかの認知機能不全の指標が含まれる。
【００３９】
本明細書中で用いる用語”哺乳動物”は、”哺乳”類のいずれかのメンバーを表わし、ヒト、イヌおよびネコが含まれるが、これらに限定されない。
本発明は、選択的ＰＤＥ１０阻害薬である化合物の同定に用いる化合物スクリーニングのための新規なアッセイ法をも提供する。
【００４０】
たとえば本発明は、化合物がＰＤＥ１０を選択的に阻害する活性を有するかを判定する方法であって、ａ）化合物を中等大有棘ニューロン培養物に付与し；そしてｂ）培養物においてＣＲＥＢのリン酸化が増大するかを測定することを含み；ＣＲＥＢのリン酸化の増大により、工程（ａ）で付与した化合物がＰＤＥ１０を選択的に阻害する活性を有すると判定する方法をも提供する。
【００４１】
他の例として本発明は、化合物がＰＤＥ１０を選択的に阻害する活性を有するかを判定する方法であって、ａ）化合物を中等大有棘ニューロン培養物に付与し；そしてｂ）培養物において中等大有棘ニューロンが産生するＧＡＢＡの量が増大するかを測定することを含み；中等大有棘ニューロンによるＧＡＢＡ産生の増大により、工程（ａ）で付与した化合物がＰＤＥ１０を選択的に阻害する活性を有すると判定する方法を提供する。
【００４２】
中等大有棘ニューロン培養物は、当業者が既知の方法で、たとえば本明細書において後記に詳述する方法で調製できるが、これらに限定されない。
既知方法を用いる前記のいずれのアッセイ法においても、化合物を中等大有棘ニューロン培養物に付与する。化合物の付与は自動的または手作業のいずれであってもよい。さらに、一連の化合物をいずれのアッセイ法においてもハイスループットスクリーニングによりスクリーニングできる。所望により、１より多い中等大有棘ニューロン培養物および／または単一の中等大有棘ニューロン培養物を用いて、異なる化合物がＰＤＥ１０を選択的に阻害する活性を同時および／または逐次アッセイできる。これらのアッセイ法はいずれも、１以上の自動化、たとえばコンピューター化された工程を含むことができる。
【００４３】
中等大有棘ニューロン培養物におけるＣＲＥＢのリン酸化は、当業者に既知の方法で測定できる。ＣＲＥＢのリン酸化は、たとえば処理した中等大有棘ニューロン培養物をホモジナイズし、それにより得られたタンパク質混合物をＣＲＥＢに特異的な抗体を用いてウェスタンブロッティングすることにより測定できる。抗体−ＣＲＥＢ複合体は、１以上の多数の既知方法に従って、たとえば第２の蛍光標識もしくは放射性標識した抗体または酵素もしくは酵素−基質で標識した抗体を用いて測定できる。
【００４４】
中等大有棘ニューロン培養物中のＧＡＢＡは、当業者に既知の方法で測定できる。たとえば、まず幾つかの既知の核染料のいずれかおよびチューブリンを用いて中等大有棘ニューロン培養物中のニューロンを検出し、突起をもつ細胞を同定する。次いでＧＡＢＡに対して特異的な蛍光標識抗体を用いて、ＧＡＢＡ発現ニューロンを検出する。自動システムまたは視覚により、ＧＡＢＡ発現ニューロンの個数を計数する。蛍光以外のイメージ処理システムを採用でき、これには放射性標識ＧＡＢＡ特異的抗体が含まれるが、これに限定されない。他の手段として、処理した中等大有棘ニューロン培養物をホモジナイズし、それに含まれるＧＡＢＡを多数の既知方法のいずれかにより定量でき、これにはＨＰＬＣ、ＥＬＩＳＡまたは酵素反応が含まれるが、これらに限定されない。
【００４５】
発明の詳細な説明：
本発明においては、選択的ＰＤＥ１０阻害薬を同定する。本発明者らは、この阻害薬および同様に選択的なＰＤＥ１０阻害薬を用い、ＰＤＥ１０を高濃度に発現するニューロン集団、すなわち線条中等大有棘ニューロンにおいて、ＰＤＥ１０阻害薬が環状ヌクレオチドの代謝に対し特徴的かつ特異な作用をもつと判定した。これらの阻害薬はこれらのニューロンにおいて、転写調節物質であるｃＡＭＰ応答配列結合タンパク質（ＣＲＥＢ）のリン酸化をも高める。ＣＲＥＢのリン酸化は、多様な遺伝子の転写の変化を伴う。したがって、これは機能上の結果をもたらす。これにはニューロンの生存および分化、ならびに長期活性化の増強に反映されるシナプスのオーガニゼーションの変化が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に、ＰＤＥ１０阻害薬が中等大有棘ニューロンにおいてそのような作用をもつこと、すなわちこれらのニューロンからＧＡＢＡ表現型への分化を促進することを開示する。さらに、ＰＤＥ１０阻害薬が無傷の哺乳動物において中枢神経系の機能に対する作用をもつことを開示する。具体的には、ラットに投与したＰＤＥ１０阻害薬はドーパミンＤ２受容体アンタゴニストであるハロペリドールにより誘発されたカタレプシーを増強するが、同量を単独で投与した場合にはカタレプシーを引き起こさないことを開示する。ＰＤＥ１０阻害薬は、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストであるフェンシクリジンにより誘発された歩行活動亢進も阻害する。これらの所見は、ＰＤＥ１０阻害薬が中枢神経系に作用し、特許請求の範囲に示した中枢神経系の障害を処置する療法に有用となりうるという請求を支持する。
【００４６】
ヒトＰＤＥを含めたＰＤＥ２、３および５アイソザイムは、たとえば海綿体から調製できる；ヒトＰＤＥを含めたＰＤＥ１アイソザイムは、心室から調製できる；ヒトＰＤＥを含めたＰＤＥ４アイソザイムは、骨格筋から調製できる。ＰＤＥ６は、たとえばイヌの網膜から調製できる。天然組織からの酵素の調製についての記載は、たとえばＢｏｏｌｅｌｌ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｍｐｏｔｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ８：７−５２，１９９６に記載されており、これを本明細書に援用する。
【００４７】
ＰＤＥ７〜１１も同様に天然組織から調製できる。あるいはＰＤＥ７〜９および１１ファミリーのアイソザイムは、たとえばＳＦ９細胞内へトランスフェクションした全長ヒト組換えクローンから産生できる；それぞれＦｉｓｈｅｒ，Ｄ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２４６，５７０−５７７，１９９８；Ｓｏｄｅｒｉｎｇ，Ｓ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９６：７０７１−７０７６，１９９９；Ｆｉｓｈｅｒ，Ｄ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，１５５５９−１５５６４，１９９８ｂ；およびＦａｗｃｅｔｔ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９７：３７０２−３７０７，２０００に記載。ＰＤＥ１０も、ＳＦ９細胞内へトランスフェクションしたラット組換えクローンから産生できる（Ｆｕｊｉｓｈｉｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６６，１１１８−１１２７（１９９９））。次いでＰＤＥ６について記載されるように、細胞溶解物の可溶性画分からこれらの酵素をＦＰＬＣにより調製できる。上記の参考文献の全体を本明細書に援用する。
【００４８】
あるアッセイ法においては、ＰＤＥ１０および他の遺伝子ファミリー由来のＰＤＥによる環状ヌクレオチドの加水分解の阻害について、物質をスクリーニングする。個々のＰＤＥそれぞれのアッセイに用いる環状ヌクレオチド基質濃度は、Ｋｍ濃度の１／３であり、これにより異なる酵素間のＩＣ５０値を比較できる。先に記載されているように、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）ベースの方法によりＰＤＥ活性を測定する（Ｆａｗｃｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。一定量の酵素（ＰＤＥ１〜１１）を、種々の濃度の物質、およびＩＣ５０がほぼＫｉとなるような低濃度の基質（比率３：１の非標識：［３Ｈ］標識ｃＡＭＰまたはｃＧＭＰ；Ｋｍの１／３の濃度）の存在下でアッセイすることにより、ＰＤＥ阻害薬の作用を測定する。アッセイ緩衝液［２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，５ｍＭのＭｇＣｌ２，１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン］により最終アッセイ体積を１００μｌにする。酵素により反応を開始し、３０℃で３０〜６０分間インキュベートして＜３０％の基質を代謝回転させ、５０μｌのケイ酸イットリウムＳＰＡビーズ（アマシャム）により反応を停止する（ＰＤＥ９および１１については非標識環状ヌクレオチドをそれぞれ３ｍＭ含有する）。プレートを再シールし、２０分間振とうした後、ビーズを暗所で３０分間沈降させ、次いでＴｏｐＣｏｕｎｔプレートリーダー（パッカード、コネチカット州メリデン）で計数する。放射能単位を非阻害対照（１００％）に対する活性％に換算し、阻害薬濃度に対してプロットし、’Ｆｉｔ  Ｃｕｒｖｅ’マイクロソフト、エクセルエクステンションを用いて阻害薬のＩＣ５０値を求めることができる。
【００４９】
選択的ＰＤＥ１０阻害薬の一例は、パパベリン（１−［（３，４−ジメトキシフェニル）メチル］−６，７−ジメトキシイソキノリン）である。パパベリンは、脳血管および冠動脈の痙攣ならびに勃起機能不全の処置に用いられる既知の有効な平滑筋弛緩薬である。これらの療法活性の根拠は十分には分かっていないが、それらは一般にはパパベリンの非選択的ホスホジエステラーゼ阻害薬としての活性に起因するとされている（Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ；第６版；Ａ．Ｇ．Ｇｉｌｍａｎ，Ｌ．Ｓ．Ｇｏｏｄｍａｎ，Ａ．Ｇｉｌｍａｎ（編），Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，ニューヨーク，１９８０，ｐ．８３０）。パパベリンは自然界に存在する植物アルカロイドであるが、それの全生合成がたとえばＢｒｏｃｈｍａｎｎ−Ｈａｎｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６０：１６７２，１９７１に記載されており、それを本明細書に援用する。
【００５０】
選択的ＰＤＥ１０阻害薬は、本発明に従って単独で、または医薬的に許容できるキャリヤーと組み合わせて、１回または多数回で投与できる。医薬的に許容できる適切なキャリヤーには、不活性固体希釈剤または充填剤、無菌水溶液および種々の有機溶剤が含まれる。次いでこうして調製した医薬組成物を、錠剤、散剤、トローチ剤、シロップ剤、注射液など多様な剤形で容易に投与できる。これらの医薬組成物は、所望により追加成分、たとえば矯味矯臭剤、結合剤、賦形剤などを含有してもよい。たとえば経口投与のためには、種々の賦形剤、たとえばクエン酸ナトリウム、炭酸カルシウムおよびリン酸カルシウムを、種々の崩壊剤、たとえばデンプン、メチルセルロース、アルギン酸およびある種の複合ケイ酸塩、ならびに結合剤、たとえばポリビニルピロリドン、ショ糖、ゼラチンおよびアラビアゴムと共に含有する錠剤を使用できる。さらに、滑沢剤、たとえばステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルクが錠剤製造のためにしばしば用いられる。同様なタイプの固体組成物を、充填した軟および硬ゼラチンカプセル剤の充填物としても使用できる。これに好ましい材料には、乳糖（ｌａｃｔｏｓｅ，ｍｉｌｋ  ｓｕｇａｒ）および高分子量ポリエチレングリコールが含まれる。経口投与のために水性懸濁剤またはエリキシル剤が望ましい場合、その必須有効成分を種々の甘味剤もしくは矯味矯臭剤、着色剤もしくは色素、および所望により乳化剤もしくは沈殿防止剤、ならびに希釈剤、たとえば水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリンおよびその組合わせと混和してもよい。
【００５１】
非経口投与のためには、選択的ＰＤＥ１０阻害薬をゴマ油もしくはラッカセイ油、プロピレングリコール水溶液、または無菌水溶液中に含有する液剤を使用できる。そのような水性液剤は必要ならば適切に緩衝化すべきであり、液体希釈剤は十分な塩類溶液またはブドウ糖でまず等張にすべきである。これら個々の水性液剤は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に適切である。用いる無菌水性媒質はすべて、当業者に既知の標準法で容易に入手できる。
【００５２】
選択的ＰＤＥ１０阻害薬は、本発明の療法において経口、経皮（たとえばパッチの使用による）、非経口（たとえば静脈内）、直腸または局所投与できる。一般に本明細書に記載の方法により障害または症状を処置するためのＰＤＥ１０阻害薬の１日量は、一般に約０．０１〜約１００ｍｇ／ｋｇ（処置される患者の体重）であろう。一例として、選択的ＰＤＥ１０阻害薬をたとえば精神障害またはハンチントン病の治療のために、平均体重（約７０ｋｇ）の成人に１日約１〜約７０００ｍｇ、好ましくは１日約１〜約１０００ｍｇの量で、１回または分割（すなわち多数回）量として投与できる。担当医は、上記の用量範囲に基づき、処置される者の体重、年齢および状態、疾患の重症度、ならびに選択した個々の投与経路など既知の事項を考慮した変更を行うことができる。
【００５３】
以下の実施例により本発明を説明する。ただし本発明は、本明細書に十分に記載し、特許請求の範囲に示したように、以下の実施例の詳細事項により限定されるものではない。
【実施例】
【００５４】
実施例１．選択的ＰＤＥ１０阻害薬：パパベリン：
ＰＤＥ１０および他の遺伝子ファミリーに由来する一連のＰＤＥによる環状ヌクレオチド加水分解の阻害について、パパベリンをスクリーニングした。個々のＰＤＥそれぞれに用いた環状ヌクレオチド基質濃度は、Ｋｍ濃度の１／３であった。これにより異なる酵素間のＩＣ５０値を比較できる。
【００５５】
前記の詳細な説明のセクションに記載したケイ酸イットリウムＳＰＡビーズによるアッセイ法を用いてＰＤＥ活性を測定した。放射能単位を非阻害対照（１００％）に対する活性％に換算し、阻害薬濃度に対してプロットし、’Ｆｉｔ  Ｃｕｒｖｅ’マイクロソフト、エクセルエクステンションを用いて阻害薬のＩＣ５０値を求めた。
【００５６】
パパベリンはＰＤＥ１０の格別有効な競合阻害薬であることが認められた：ＩＣ５０値１８ｎＭ（表１）。パパベリンは試験した他のすべてのＰＤＥに対して効力がかなり低かった。ＰＤＥ１０に次いで、パパベリンで最も強く阻害された酵素はＰＤＥ４Ｄであった：ＩＣ５０値３２０ｎＭ、すなわちＰＤＥ１０に対するものより１９倍低い値。したがって、これらのデータから、パパベリンが選択的ＰＤＥ１０阻害薬であること、およびこの化合物をこの酵素の生理学的試験に使用できることが、初めて明らかになった。
【００５７】
【表１】
2005524402.tif 000003
【００５８】
実施例２．選択的ＰＤＥ１０阻害薬が中等大有棘ニューロンの環状ヌクレオチド代謝に及ぼす作用：
実施例１で判定した選択的ＰＤＥ１０阻害薬パパベリンが環状ヌクレオチド代謝に及ぼす作用を、ラットの中等大有棘ニューロン初代培養物において調べた。
【００５９】
ＢＤＮＦの存在下で培養したＥ１７ラット胎仔線条由来のニューロンは、先に記載されたもの（Ｖｅｎｔｉｍｉｇｌｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７（１９９５）２１３−２２２）にきわめて類似する表現型を示した。これらのニューロンのうち約５０％がＧＡＢＡ免疫反応性について陽性染色され、この培養物中に中等大有棘ニューロンが存在することが確認された。４−６ＤＩＶのこれらの培養物中におけるＰＤＥ１０メッセージの発現をＲＮＡａｓｅ保護アッセイにより確認した。
【００６０】
線条培養物を先の記載に従って調製した（Ｖｅｎｔｉｍｉｇｌｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：２１３−２２２，１９９５）。要約すると、線条（尾状核および被殻）をＥ１７ラットから切り取り、解離させて単一細胞懸濁液を調製し、ポリ−Ｌ−オルニチン／ラミニンで被覆したマルチウェルプレートに５×１０４ニューロン／ウェルの密度で接種した。細胞は、Ｂ２７補充物質およびＢＤＮＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）を含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中に接種された。実験は一般に４日後、インビトロで実施された。中等大有棘ニューロンは、これらの培養物中の大部分の細胞を構成する（５０〜６０％；ＧＡＢＡ免疫反応性により確認）。
【００６１】
ＲＮＡａｓｅ保護アッセイのために、これらのラット中等大有棘ニューロン初代培養物から、先の記載に従って５．７Ｍ塩化セシウム勾配を通した１５０，０００×ｇ、２０℃、２１時間の遠心分離によりＲＮＡを調製した（Ｉｒｅｄａｌｅ，ＰＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５０：１１０３−１１１０，１９９６）。ＲＮＡペレットを０．３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）に再懸濁し、エタノール中で沈殿させ、分光測光法により濃度を測定した。マウスｃＤＮＡ（ｂｐ３８０〜ｂｐ１２９４に相当する）から単離した９１４ｂｐフラグメントのＰＣＲ増幅により、ＰＤＥ１０リボプローブを調製した。次いでこのフラグメントをｐＧＥＭ３Ｚｆ中へクローニングした。このベクターを線状化し、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いて［３２Ｐ］標識アンチセンスリボプローブを合成した。ＲＰＡＩＩキット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてＲＮＡ保護アッセイを実施した。要約すると、５μｇの全細胞ＲＮＡと［３２Ｐ］標識ＰＤＥ１０リボプローブ（試料当たり約１０５ｃｐｍ）を４２℃で一夜ハイブリダイズさせた。翌日、試料をＲＮＡａｓｅＡおよびＴ１と共に３７℃で３０分間インキュベートし、保護された二本鎖ＲＮＡフラグメントを次いで沈殿させ、尿素を含有する６％ポリアクリルアミドゲル上を泳動させた。
【００６２】
パパベリンが環状ヌクレオチドに及ぼす作用を分析するために、線条細胞培養物をインビトロで４日後に、Ｃａ２＋／Ｍｇ＋を含まないリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄し、Ｃａ２＋／Ｍｇ＋を含まないリン酸緩衝化生理食塩水、３０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍｇ／ｍＬのデキストロースおよび５ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する緩衝液中で、１時間プレインキュベートした。線条細胞をホスホジエステラーゼ阻害薬に暴露し、３７℃で２０分間インキュベートした。ｃＧＭＰの測定に際しては、化合物と共に２０分間インキュベートした後、ニューロンを酸化窒素源ナトリウムニトロプルシドで２分間刺激した。ｃＡＭＰの測定に際しては、化合物との２０分間のインキュベーション期間中、ニューロンをアデニル酸シクラーゼ活性化薬フォルスコリンで２分間刺激した。９：１の組合わせのｃＡＭＰ  ＳＰＡ直接スクリーニングアッセイ緩衝液（０．０１％のナトリウムアジドを含む０．０５Ｍアセテート）と緩衝液Ａ（１３３ｍｇ／ｍＬのドデシルトリメチルアンモニウムブロミド）を用いて細胞を溶解し、溶解物をドライアイスで凍結した。ｃＡＭＰ［ｌ１２５］またはｃＧＭＰ［ｌ１２５］シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）系（アマシャム、それぞれコードＲＰＡ５４０およびＲＰＡ５５９）を用いて、細胞溶解物中における環状ヌクレオチドそれぞれの濃度を検出した。
【００６３】
パパベリン単独では、線条培養物中のｃＡＭＰまたはｃＧＭＰのいずれの基礎濃度にも測定可能な変化を生じなかった。したがって、それぞれフォルスコリンまたはＮＯ供与体ナトリウムニトロプルシド（ＳＮＰ）でｃＡＭＰまたはｃＧＭＰの合成を刺激した条件下で、化合物の作用を調べた。培養物をフォルスコリン（０．１〜１０μＭ）で２０分間刺激すると、濃度依存性でｃＡＭＰ濃度が上昇した。同様に培養物をＳＮＰ（３〜１０００μＭ）に２分間、短時間暴露すると、濃度依存性でｃＧＭＰ濃度が上昇した。フォルスコリン単独（１０μＭ）でｃＧＭＰ濃度は変化せず、ＳＮＰ（３００μＭ）もｃＡＭＰ濃度を上昇させなかった。パパベリンがｃＡＭＰおよびｃＧＭＰの代謝に及ぼす作用を判定するために、線条培養物を種々の濃度のこの化合物と共にインキュベートし、次いで最大下有効濃度のフォルスコリン（１μＭ）またはＳＮＰ（１００μＭ）で刺激した。これらの濃度のフォルスコリンまたはＳＮＰは、それぞれｃＡＭＰおよびｃＧＭＰを基礎濃度より２〜３倍上昇させた。パパベリンは、ＳＮＰ誘発によるｃＧＭＰ蓄積を濃度依存性で増加させた：ＥＣ２００（２倍上昇を生じる阻害薬濃度）値１１．７μＭ（表２）。最大効果は１００μＭでみられ、その際ｃＧＭＰ濃度はＳＮＰ単独で刺激した培養物の場合より５倍上昇した。パパベリンはフォルスコリン刺激した培養物中のｃＡＭＰ蓄積も増加させた。しかしこの化合物は、ｃＡＭＰ増加の増強においてはｃＧＭＰの場合より有効性が３．３倍低かった。線条培養物におけるパパベリンの作用を、選択性の異なる他のＰＤＥ阻害薬と比較した（表２）。非選択的阻害薬ＩＢＭＸは、ＳＮＰまたはフォルスコリンで刺激した培養物中のｃＧＭＰおよびｃＡＭＰの蓄積を両方とも濃度依存性で（３〜１００μＭ）増加させた：それぞれＥＣ２００値１９および３０μＭ。選択的ＰＤＥ４阻害薬ロリプラム（ｒｏｌｉｐｒａｍ）は、フォルスコリン刺激によるｃＡＭＰ蓄積をＥＣ２００値２．５μＭで増加させ、ｃＧＭＰ蓄積率を２倍にするためには１０倍高い濃度を必要とした。ｃＧＭＰ指向性ＰＤＥ阻害薬ザプリナスト（ｚａｐｒｉｎａｓｔ）は、これらのニューロンのｃＡＭＰ濃度を９８μＭの濃度で２倍にした。しかし、１００μＭのこの化合物がｃＧＭＰレベルを２倍にすることは全くなかった。これらのデータから、パパベリンは中等大有棘ニューロンにおける環状ヌクレオチド調節に対する特異な作用をもつこと、およびこの作用はＰＤＥ１０に対する選択性によるものであることが、初めて明らかになった。
【００６４】
【表２】
2005524402.tif 000004
【００６５】
実施例３．基底核機能の動物モデルにおける選択的ＰＤＥ１０阻害薬の作用：
ヒトおよびヒト以外の哺乳動物における研究により、基底核が広範な運動ならびに認知および情動／欲求行動を調節することが示されている（Ｇｒａｙｂｉｅｌ，Ａ．Ｍ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０（１４）：Ｒ５０９−１１，２０００）。化合物が基底核に及ぼす作用を評価するために使用できるげっ歯類の実験モデルが開発された。本発明者らは、パパベリンがそのような２モデルにおいて予想外の特異な行動作用プロフィールをもつことを見いだした。
【００６６】
雄ＣＤラットにおいてカタレプシーを引き起こす能力について、パパベリン単独およびハロペリドールと組み合わせた作用を調べた。この動物モデルを用いて、化合物が基底核の出力に及ぼす作用を分析する。パパベリン（１．０、３．２、１０または３２ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルを皮下投与した。ある実験については、この直後にハロペリドールを投与した。薬物投与の３０分後、動物の前足を高い（１０ｃｍ）棒（直径１ｃｍ）に乗せ、両前足を棒からはずす潜伏期間を３０秒の潜伏期間カットオフで測定することにより、カタレプシーの程度を定量した。クルスカル−ワラス（Ｋｒｕｓｋａｌｌ−Ｗａｌｌａｃｅ）の分散分析法による比較のために、各処置群内で潜伏期間をランク付けした。事後分析（ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を、マン・ホイットニー（Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ）のＵ検定により行った。
【００６７】
抗精神病薬ハロペリドールは、先に記載されているようにこのモデルにおいて強いカタレプシーを生じる（Ｃｈａｒｔｏｆｆ，Ｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２９１：５３１−５３７，１９９９）。ハロペリドールの最大有効量は１ｍｇ／ｋｇ（皮下）であることが認められた。これに対しパパベリンは、単独で投与した場合、最高３２ｍｇ／ｋｇ（皮下）の用量でカタレプシーを誘発しなかった（ｐ＝０．８６）。しかし図１に示すように、パパベリンは最大下量のハロペリドール（０．３２ｍｇ／ｋｇ、皮下、０．３％酒石酸中）のカタレプシー作用を増強した（ｐ＜０．００１）。ハロペリドール誘発カタレプシーの増強に対するパパベリンの最小有効量は３．２ｍｇ／ｋｇ（皮下）である。この実験により、パパベリンが基底核の出力を抗精神病活性と一致した方向に変化させる可能性があることが証明された。
【００６８】
実施例４．精神病の動物モデルにおける選択的ＰＤＥ１０阻害薬の作用：
次に、シャトルボックス内でのラットの歩行活動にパパベリンが及ぼす作用を調べた。げっ歯類におけるＰＣＰ刺激歩行活動の低下は、新規な抗精神病薬を探索する際の一次スクリーニングとして受け入れられている。最近の異型抗精神病薬は一般に、アンフェタミン刺激歩行活動と対比して優先的にＰＣＰ刺激歩行活動の阻害を示す。雄成体Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２５０〜３００ｇ）をチャールズ・リバー（マサチュセッツ州ウィルミントン）から入手した。市販のシャトルボックス（Ｃｏｕｌｂｏｕｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ペンシルベニア州アレンタウン）内における横切り行動を利用して、歩行活動を評価した。薬物投与後、５分間隔で１時間、データを収集した。動物にビヒクル（５％ＤＭＳＯ、５％Ｅｍｕｌｐｈｏｒ、９０％生理食塩水）、フェンシクリジン（ＰＣＰ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．）または硫酸アンフェタミン（ＲＢＩ）、続いて直ちにビヒクルまたは被験化合物を投与した。スチューデントのｔ検定により統計分析を行った。
【００６９】
精神刺激薬アンフェタミンおよびフェンシクリジン（ＰＣＰ）は両方とも、このモデルにおいて強い歩行活動亢進を生じる。パパベリンは単独で（３２ｍｇ／ｋｇ、皮下）歩行活動をわずかに低下させ、これはある試験においては統計的に有意であった（図２）。しかし、これと同一量のパパベリンが、３．２ｍｇ／ｋｇ（皮下）のフェンシクリジンにより刺激した歩行活動を有意に低下させ、行動的に同等量のアンフェタミン（１ｍｇ／ｋｇ、皮下）が生じた歩行活動には作用しなかった。
【００７０】
このような歩行活動動物スクリーニング法を用いた他の実験では、パパベリンをアンフェタミン（１ｍｇ／ｋｇ、皮下）またはＰＣＰ（３．２ｍｇ／ｋｇ、皮下）と共投与し、歩行活動を３０分間測定した。この実験では、パパベリンはアンフェタミンおよびＰＣＰ刺激による歩行活動を両方とも効果的に阻害した。
【００７１】
前記の両方の実験の結果は、パパベリンが歩行活動に対して抗精神病プロフィールと一致した行動作用をもつことを示す。
以下の実施例５〜７においては、選択的ＰＤＥ１０阻害薬および選択的ＰＤＥ１Ｂ阻害薬を発明の詳細な説明に記載したアッセイ法に従って判定した（表３にＰＤＥ１、２、３、４、５、７、８、９、１０および１１に対する選択的ＰＤＥ１０阻害薬のＩＣ５０（μＭを示す）。
【００７２】
【表３】
2005524402.tif 000005
【００７３】
実施例５．ＰＤＥ阻害薬が中等大有棘ニューロンにおけるｃＡＭＰおよびｃＧＭＰ蓄積に及ぼす作用：
中等大有棘ニューロン培養物を、実施例２の記載に従ってＥ１７またはＥ１８ラット胎仔の線条から調製した。線条をトリプシンで消化し、解離した細胞を、ポリ−Ｌ−オルニチン／ラミニン被覆プレート上、Ｂ２７補充物質を含有するＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中に接種した。環状ヌクレオチド形成およびＣＲＥＢリン酸化のアッセイのために、ニューロンに５０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦをも補充し、６ＤＩＶにおいて使用した。この時点で約９０％の細胞がニューロンの形態をもち、５０％がＧＡＢＡに関して陽性染色される。
【００７４】
中等大有棘ニューロン培養物において、本発明者らはＰＤＥ１０およびＰＤＥ１Ｂに対する選択的阻害薬ならびにロリプラム（ＰＤＥ４に対する選択的阻害薬）が、それぞれフォルスコリンまたはＳＮＡＰ刺激によるｃＡＭＰ（図３）またはｃＧＭＰ（図４）の蓄積増加を増強することを見いだした。しかし、刺激物質の不存在下でこれらの化合物を添加した場合、ｃＡＭＰまたはｃＧＭＰ濃度に検出可能な変化はなかった。
【００７５】
ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰの増大を増強する力価によりＰＤＥ阻害薬を分類した（表４）。表４には、ＥＣ２００、すなわちそれぞれフォルスコリンまたはＳＮＡＰ誘発によるｃＡＭＰまたはｃＧＭＰ増加を２００％上昇させるＰＤＥ阻害薬濃度として力価を表示する。
【００７６】
【表４】
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【００７７】
実施例６．ＰＤＥ阻害薬が中等大有棘ニューロンにおけるＣＲＥＢのリン酸化に及ぼす作用：
ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰは、それぞれプロテインキナーゼＰＫＡおよびＰＫＧを活性化する。両キナーゼとも転写調節物質ＣＲＥＢをリン酸化することができる。表３の選択的ＰＤＥ阻害薬が環状ヌクレオチド信号伝達カスケードにおける下流事象としてのＣＲＥＢのリン酸化に及ぼす作用を調べた。
【００７８】
フォルスコリンによる刺激は、ウェスタンブロッティングで測定したＣＲＥＢのリン酸化を著しく増大させた。選択的ＰＤＥ１０阻害薬およびロリプラムも、ウェスタンブロッティングにより測定したＣＲＥＢのリン酸化を増大させた。選択的ＰＤＥ１０阻害薬とロリプラムの作用の比較を図５に示す。ＣＲＥＢのリン酸化増大における効力のランク順位は、フォルスコリン＞選択的ＰＤＥ１０阻害薬＞ロリプラムと判定された。選択的ＰＤＥ１Ｂ阻害薬は、ＣＲＥＢのリン酸化において無効であった。
【００７９】
実施例７．ＰＤＥ阻害薬が中等大有棘ニューロンの分化に及ぼす作用：
ＣＲＥＢのリン酸化により活性化された転写事象は、ニューロンの生存および分化に関与する。表３のＰＤＥ阻害薬が中等大有棘ニューロンの生存および分化に作用を及ぼすかを調べた。これらの実験はＶｅｎｔｉｍｉｇｌｉａらによるプロトコル（参照：Ｖｅｎｔｉｍｉｇｌｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，前掲）を用いて実施され、ＢＤＮＦが中等大有棘ニューロンにおいてこれらのプロセスに及ぼす作用をアッセイした。詳細には、接種時にＰＤＥ阻害薬を中等大有棘ニューロン培地に添加し、次いで６ＤＩＶにおいて、ニューロンの生存および分化に関連する種々のパラメーターをＣｅｌｌｏｍｉｃｓ，ＩｎｃのＡｒｒａｙ  Ｓｃａｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（米国ペンシルベニア州ピッツバーグ）により定量した。
【００８０】
ＰＤＥ１０阻害薬は試験したパラメーターのうちＧＡＢＡ作動性ニューロン数を著しく増加させることが認められた。細胞を下記に従って染色した：青色−核；緑色−ニューロン；赤色−ＧＡＢＡに対して陽性のニューロンを染色。選択的ＰＤＥ１０阻害薬はＢＤＮＦと同様に有効であったが、ロリプラムおよび選択的ＰＤＥ１Ｂ阻害薬は効果がなかった（図６）。
【００８１】
考察：
線条、側坐核および嗅結節においてＰＤＥ１０  ｍＲＮＡの発現が高いことは、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを用いて既に報告されている（Ｓｅｅｇｅｒ，Ｔ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，前掲）。これに対応してこれらの脳領域のＰＤＥ１０タンパク質の濃度が高いことも、ＰＤＥ１０タンパク質に対するモノクローナル抗体を用いて認められている（Ｍｅｎｎｉｔｉ，Ｆ．Ｓ．，Ｓｔｉｃｋ，Ｃ．Ａ．，Ｓｅｅｇｅｒ，Ｔ．Ｆ．ａｎｄ  Ｒｙａｎ，Ａ．Ｍ．，ラット脳におけるＰＤＥ１０の免疫組織学的局在性，前掲）。本発明者らは、線条および側坐核内で中等大有棘ニューロンにおいてＰＤＥ１０  ｍＲＮＡが高レベルで発現することを見いだした。中等大有棘ニューロンは線条、側坐核および嗅結節の出力ニューロンであり、これらの脳領域の全ニューロンの約９５％を構成する。さらに、高濃度のＰＤＥ１０タンパク質が、線条、側坐核および嗅結節から淡蒼球および黒質を含めた他の脳領域へ突出している中等大有棘ニューロンの投射部（軸索および終末）中にみられた。これら後者の脳領域自体のＰＤＥ１０  ｍＲＮＡは濃度が低いか、または検出できない。したがって、これらの領域における高濃度のＰＤＥ１０タンパク質は、中等大有棘ニューロンの軸索および終末に由来する。さらに、ＰＤＥ１０のｍＲＮＡおよびタンパク質の発現レベルは、皮質および小脳を含めた他の脳領域のニューロンではより低い。
【００８２】
線条および側坐核におけるＰＤＥ１０発現レベルが高いことは、これらが基底核の主要な皮質入力核であること、および中脳ドーパミン作動性投射部の主要な終末領域であることを考慮すると、特に興味深い。線条およびその腹側延長部である側坐核は、グルタミン酸作動性求心物質（ｇｌｕｔａｍａｔｅｒｇｉｃ  ａｆｆｅｒｅｎｔ）を実質的に大脳皮質のあらゆる領域から受容し、広範な皮質活動の皮質下統合部位として機能する。一般に、背側線条は運動行動の調節に関与するのに対し、側坐核を含めた腹側領域は情動／欲求行動の調節機能をもつと考えられている。したがって本発明者らは、ＰＤＥ１０は多数のこれらの基礎的な生理学的プロセスを調節する信号伝達経路に関与する可能性があると考える。
【００８３】
事実、本発明者らは、中等大有棘ニューロンにおける環状ヌクレオチド代謝およびＣＲＥＢ信号伝達に際して、ＰＤＥ１０の阻害が、これらのニューロンにより発現する他の主要なＰＤＥであるＰＤＥ４またはＰＤＥ１の阻害により起きるものとは異なる作用をもつことを開示する。本発明者らは、ＰＤＥ１０阻害薬がインビボで基底核の機能に対する立証可能な作用をもつことをも開示する。
【００８４】
ＰＤＥ１０、４および１それぞれの選択的阻害薬は、それぞれＳＮＡＰまたはフォルスコリンで刺激した中等大有棘ニューロンにおいてｃＧＭＰおよび／またはｃＡＭＰの蓄積を増加させた（図３および４）。しかし、これらの阻害薬はこれら２種類の環状ヌクレオチドに作用する力価の比率が異なっていた（表３）。これらの相異は、これら２種類の環状ヌクレオチドに対するＰＤＥ１０、４および１Ｂの固有親和性、ならびに環状ヌクレオチドプールへの異なるＰＤＥの到達度の相異を反映していると思われる。これらの阻害薬は刺激の無い状態ではｃＡＭＰおよびｃＧＭＰの濃度に対して測定可能な作用をもたない点に注目すべきである。ＣＲＥＢのリン酸化は、環状ヌクレオチド信号伝達カスケードにより活性化される下流事象の１つである。本発明者らは、選択的ＰＤＥ１０阻害薬および選択的ＰＤＥ４阻害薬がＣＲＥＢのリン酸化を増大させ、選択的ＰＤＥ１０阻害薬の方がより有効かつ効率的であることを証明する。これらの作用は、これらの化合物を他の刺激なしに添加した場合に、したがって環状ヌクレオチド濃度に検出可能な変化が無い状態で起きる。本発明者らは、選択的ＰＤＥ１Ｂ阻害薬は無効であることを示した。これらの結果は、ＰＤＥ１０が中等大有棘ニューロンの環状ヌクレオチド信号伝達において特異な役割をもつことを示し、ＰＤＥ１０は特にＣＲＥＢのリン酸化の調節に関連すると思われる。
【００８５】
インビトロ系において解明されたＰＤＥ１０阻害薬の独特の作用は、インビボでの基底核の機能に対するＰＤＥ１０阻害薬の特異な作用に対応する。本発明者らは、選択的ＰＤＥ１０阻害薬パパベリンが、ドーパミンＤ２受容体アンタゴニストであるハロペリドールのカタレプシー作用を増強し、単独ではカタレプシーを生じないことを開示する。さらに、この化合物はＮＭＤＡ受容体アンタゴニストであるフェンシクリジンにより誘発された歩行活動亢進を低下させる。パパベリンのこの薬理学的プロフィールにより、この物質およびすべてのＰＤＥ１０阻害薬が後記のように基底核内の機能不全を伴う神経障害および精神障害の処置に有用であろうと推定される。
【００８６】
線条への皮質入力は、ＧＡＢＡ作動性中等大有棘ニューロンに対する一次刺激動因をもたらす。これに対し中等大有棘ニューロンのグルタミン酸作動性活性化は、中脳からの強力なドーパミン作動性入力により調節される。これら２つの求心系の拮抗性は多数の研究で証明されている。たとえば実験動物における歩行活動刺激活性は、ドーパミン受容体アゴニストまたはＮＭＤＡサブタイプのグルタミン酸受容体アンタゴニストにより生じさせることができる（Ｃａｒｌｓｓｏｎ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ  Ｃａｒｌｓｓｏｎ，Ａ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１３：２７２−２７６，１９９０）。Ｄ２ドーパミン受容体アンタゴニスト、たとえばハロペリドールのカタレプシー作用は、ハロペリドール誘発による遺伝子発現と同様に、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストにより低下する（Ｃｈａｒｔｏｆｆ，Ｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２９１：５３１−５３７，１９９９）。より最近になって、Ｄ２ドーパミン受容体を遮断するとリン酸化または活性化状態の線条ＮＭＤＡ受容体が増加することが証明された（Ｌｅｖｅｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２０（１１）：４０１１−４０２０，２０００）。
【００８７】
臨床効果のある抗精神病薬はすべて有効なＤ２アンタゴニスト活性をもつという認識から、統合失調症の症状は中央辺縁（ｍｅｓｏｌｉｍｂｉｃ）ドーパミン系の過剰活性の結果であるという独自の仮説が導かれる。化合物が直接または間接ドーパミンアゴニストの刺激性を低下させる能力は、新規な抗精神病薬を探索する際の重要な実験室試験法となった。より最近になって、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト、たとえばＰＣＰが、ヒトにおいて統合失調症の陽性、陰性および認知症状を忠実に再現する能力（Ｌｕｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９５９；Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９５９；Ｋｒｙｓｔａｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）から、統合失調症のフロンタリティー低下（ｈｙｐｏｆｒｏｎｔａｌｉｔｙ）仮説が導かれた。簡単に述べるとこの仮説は、統合失調症においてはグルタミン酸作動性（具体的にはＮＭＤＡ受容体仲介による）神経伝達が低下した結果として線条仲介による行動抑制に欠陥が生じると提唱する。この仮説は、Ｄ２ドーパミン受容体アンタゴニストが皮質から線条への入力を直接または間接的に脱抑制する能力（前記）を考慮すると、それらがもつ既知の抗精神病作用と完全に一致する。ＰＣＰがヒトにおいて統合失調症の症状を厳密に再現することから、げっ歯類におけるＰＣＰ刺激による歩行活動が新規な抗精神病薬を探索する際の一次スクリーニング法として採用された。最近の、より有効と思われる異型抗精神病薬がアンフェタミン刺激による歩行活動よりＰＣＰ刺激による歩行活動に対して優先的活性を示すという証明は、この方法を支持すると思われる（Ｇｌｅａｓｏｎ  Ｓ．Ｄ．ａｎｄ  Ｓｈａｎｎｏｎ  Ｈ．Ｅ．Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．１２９：７９−８４，１９９７）。
【００８８】
抗精神病療法のための現在の方法は一般に膜受容体を標的とするが、本発明者らは中等大有棘ニューロンにおけるＰＤＥ１０の細胞内操作も抗精神病効果を生じる可能性があることを本明細書において提唱する。ｃＡＭＰおよびＰＫＡ活性の増大がＮＭＤＡを含めたグルタミン酸アゴニストに対する線条ニューロンの応答を高めることは知られている（Ｃｏｌｗｅｌｌ，Ｃ．Ｓ．ａｎｄ  Ｍ．Ｓ．Ｌｅｖｉｎｅ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １５（３）１７０４−１７１３，１９９５）。ハロペリドールの神経遮断作用も、ｃＡＭＰ濃度の上昇（Ｗａｒｄ，Ｒ．Ｐ．ａｎｄ  Ｄ．Ｍ．Ｄｏｒｓａ，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ８９（３）：９２７−９３８，１９９９）およびＰＫＡ活性化（Ａｄａｍｓ，Ｍ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：１２１５７−１２１６１，１９９７）に依存する。線条のｃＧＭＰ濃度もＤ２受容体遮断後に上昇する（Ａｌｔａｒ，Ｃ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１８１：１７−２１，１９９０）；ＰＫＧはＰＫＡと同じ下流基質のあるものをリン酸化することが知られており、これには内因性のプロテインホスファターゼＩインヒビターＤＡＲＰが含まれる（Ｇｒｅｅｎｇａｒｄ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．２６：２７４−２８４，１９９８）。したがって本発明者らは、線条の中等大有棘ニューロンにおける環状ヌクレオチド濃度を選択的に高めることができる薬剤が線条の機能を補償して抗精神病作用をもたらし、ＰＤＥ１０阻害薬が精神病の処置に際して療法効果をもつであろうと期待するのは妥当であると仮定した。そのような化合物はＰＤＥ１０が触媒するｃＡＭＰおよびｃＧＭＰの代謝を阻害して、中等大有棘ニューロンにおけるこれらの環状ヌクレオチドの濃度を高めるからである。
【００８９】
基底核の異常な機能は、精神病のほか下記を含めた多様な神経精神状態に関与することが示唆されている：注意欠陥／多動障害（ＡＤＨＤ）および関連の注意障害（Ｓｅｅｍａｎ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ３：３８６−９６，１９９８）、うつ病（Ｋａｐｕｒ，Ｓ．，Ｂｉｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ３２：１−１７，１９９２；Ｗｉｌｌｎｅｒ，Ｐ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．２８７：２２５−２３６，１９８３）、トゥーレット症候群その他のチック障害を含めた強迫性障害（Ｇｒａｙｂｉｅｌ  ＡＭ，Ｒａｕｃｈ  ＳＬ，強迫性障害の神経生物学について，Ｎｅｕｒｏｎ．２８（２）：３４３−７，２０００）、ならびに物質乱用（Ｓｅｌｆ，Ｄ．Ｗ．  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｍｅｄ．３０：３７９−３８９，１９９８）。パーキンソン病、下肢静止不能症候群（Ｈｅｎｉｎｇ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｌｅｅｐ  ２２：９７０−９９９，１９９９）およびハンチントン病（Ｖｏｎｓａｔｔｅｌ  ＪＰ  ｅｔ  ａｌ．，ハンチントン病の神経病理学的分類，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．４４：５５９−５７７，１９８５）を含めた幾つかの神経障害も、基底核の機能不全に関連する。したがって本発明者らは、本明細書に記載した研究に基づいてＰＤＥ１０阻害薬はそのような障害に対して療法効果をもつと考える。
【００９０】
ＣＲＥＢのリン酸化は、ニューロンの生存および／または分化の増大を含めた多様な作用を神経機能に及ぼす可能性のある多様な遺伝子の転写を誘導する。本発明者らは、選択的ＰＤＥ１０阻害薬が中等大有棘ニューロンからＧＡＢＡ作動性表現型への分化を高めうることを開示する（図６）。ロリプラム（選択的ＰＤＥ４阻害薬）および選択的ＰＤＥ１Ｂ阻害薬はそのような活性を示さなかった（図７）。
【００９１】
ＰＤＥ１０阻害がＣＲＥＢのリン酸化に及ぼす作用は、神経変性症状、たとえばハンチントン病の処置に関して特に注目すべきである。
中等大有棘ニューロンにおけるＣＲＥＢのリン酸化および中等大有棘ニューロンからＧＡＢＡ作動性表現型への分化は、それぞれ選択的ＰＤＥ１０阻害薬としての活性をもつ有機化合物を同定するための有用な手段も提供する。
【００９２】
本明細書中のデータは、中等大有棘ニューロンの分化および／または生存におけるＰＤＥ１０の特異な役割を示す。ハンチントン病においてはこれらのニューロンが選択的に損傷を受けやすく、これはこれらのニューロンの栄養支持の損失により起きると仮定される（Ｚｕｃｃａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，ハンチントン病におけるハンチントン仲介ＢＤＮＦ遺伝子転写の損失，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３：４９３−４９８，２００１）。本発明者らは、選択的ＰＤＥ１０阻害薬が中等大有棘ニューロンに関して神経栄養活性をもつと結論する。さらに本発明者らは、ＰＤＥ１０阻害薬はＰＤＥ１０を発現するいかなるニューロンに関しても神経栄養活性をもつと思われ、したがってＰＤＥ１０阻害薬は本明細書に示した神経変性疾患（それらに限定されない）の処置に有用であると結論する。
【００９３】
ＰＤＥ１０のｍＲＮＡおよびタンパク質は海馬および皮質のニューロンにも発現する。認知プロセスは海馬および皮質の機能に依存するので、ＰＤＥ１０は認知プロセスにも役割をもち、ＰＤＥ１０阻害薬は特徴的な認知および／または注意機能欠陥の要素をもつ障害、たとえばアルツハイマー病および加齢性認知衰退（ＡＲＣＤ）の処置にも使用できると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】パパベリン用量の増加に対する動物のカタレプシーを示す棒グラフである。灰色の棒は、パパベリンとハロペリドールの組合わせを表わし、ハロペリドール誘発カタレプシーがパパベリンによって増強することを示す。黒色の棒はパパベリン単独を表わす。これらの黒色棒は、パパベリンが単独では最高３２ｍｇ／ｋｇの用量でカタレプシーを誘発しなかったことを示す。より詳細には、指示した用量のパパベリンを単独で、またはハロペリドール（０．３２ｍｇ／ｋｇ）と共に、試験の３０分前に投与した。各棒は、同様に処理した６匹の動物が、高い棒から両前足をはずす動作についての平均潜伏期間である。クルスカル−ワラス（Ｋｒｕｓｋａｌｌ−Ｗａｌｌａｃｅ）の分散分析法を用いて、ランク付けしたパパベリン単独とハロペリドール共投与を比較した。事後分析は、３．２、１０および３２ｍｇ／ｋｇのパパベリンとハロペリドールを投与した動物が、ハロペリドール単独で処理した動物より有意に（＊＊）長い潜伏期間をもつことを示す。
【図２】それぞれシャトルボックス試験において、物質投与後の最初の６０分間に動物が横切る平均＋ＳＥＭ回数を示す２つの棒グラフである。上のグラフは、パパベリンが単独で運動に及ぼす作用を、パパベリンがアンフェタミン誘発運動に及ぼす作用と比較する。下のグラフは、パパベリンが単独で運動に及ぼす作用を、パパベリンがＰＣＰ誘発運動に及ぼす作用と比較する。アンフェタミンを１ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与した。ＰＣＰを３．２ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与した。パパベリンを３２ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内にいずれかの薬剤と共投与した。データは、ラットｎ＝８／群について、薬物投与後の最初の６０分間に動物が横切る平均＋ＳＥＭ回数を表わす。＊＊はビヒクル／ビヒクル対照に対してｐ＜０．０１；＊はビヒクル／ＰＣＰ対照に対してｐ＜０．０５；スチューデントのｔ検定による。
【図３】フォルスコリン刺激した中等大有棘ニューロン培養物中のｃＡＭＰ濃度を示す。選択的ＰＤＥ１０阻害薬、選択的ＰＤＥ１Ｂ阻害薬、および選択的ＰＤＥ４阻害薬が、刺激したニューロンにおいてｃＡＭＰ濃度に及ぼす作用も示す。
【図４】ＳＮＡＰ刺激した中等大有棘ニューロン培養物中のｃＧＭＰ濃度を示す。選択的ＰＤＥ１０阻害薬、選択的ＰＤＥ１Ｂ阻害薬、および選択的ＰＤＥ４阻害薬が、刺激したニューロンにおいてｃＧＭＰ濃度に及ぼす作用も示す。
【図５】選択的ＰＤＥ１０阻害薬とロリプラム（選択的ＰＤＥ４阻害薬）が、中等大有棘ニューロン培養物においてＣＲＥＢ（サイクリックＡＭＰ応答配列結合タンパク質）のリン酸化に及ぼす相対的作用の比較を示す。リン酸化されたＣＲＥＢの量をウェスタンブロットにより測定した。
【図６】選択的ＰＤＥ１０阻害薬、選択的ＰＤＥ４阻害薬（ロリプラム）、および選択的ＰＤＥ１Ｂ阻害薬で処理したニューロンについて、ＧＡＢＡ陽性である中等大有棘ニューロンの相対数を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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