(57)【要約】修飾膜組織（１２）上で細胞（１４）を成長させる膜組織（１２）を修飾するため、ならびに修飾組織（１２）および付着細胞（１４）を有する修飾組織（１２）を移植するための方法および装置を提供する。特に、水晶体嚢組織および内境界膜組織などの膜組織（１２）を修飾するため、虹彩色素上皮（ＩＰＥ）細胞（１４）、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、幹細胞、または他の細胞を修飾膜組織（１２）上で成長させるため、ならびに生分解性ポリマー基板（１６）上で膜組織（１２）を修飾し、細胞（１４）を成長させるための方法および装置。膜表面（１８）は、スタンプと接触させて修飾するか、膜表面（１８）の複数の部分へのアクセスを可能にする通路を有するステンシルでコーティングして修飾し得る。膜組織（１２）を修飾する方法は、スタンプなどの接触面を用いて膜組織（１２）上に生体分子の微細パターンを被着させるステップを含む。
2005503133.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜組織を修飾する方法であって、接触面に生体分子の微細パターンを付与するステップと、前記組織を、前記組織上に生体分子微細パターンの少なくとも一部を転写するのに有効な前記接触面とを接触させるステップとを含んでなる方法。
【請求項２】
膜組織を生体細胞に対して露出させるステップをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞が、虹彩色素上皮（ＩＰＥ）細胞、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、および幹細胞のうちから選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
細胞が自己細胞である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
組織がヒト組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
動物由来の膜組織を修飾する方法であって、膜組織を基板と接触させるステップと、膜組織を修飾するステップとを含んでなる方法。
【請求項７】
基板が、ガラス；プラスチック；コラーゲン；グリコサミノグリカン；キトサン；ポリ（ヒドロキシアルカノエート）；ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、およびポリラクチド−ポリグリコリド（ＰＧＡ−ＰＬＡ）混合物、アロイ、コポリマー（ＰＬＧＡ）を含むポリ（α−ヒドロキシ酸）；ポリ（ジオキサノン）；ポリ（ε−カプロラクトン）；ポリ（オルトエステル）；ポリ（無水物）；ポリ（ホスファゼン）；ポリ（アミノ酸）；ならびにこれらの化合物の他の配合物、ポリマー、コポリマー、アロイ、混合物および組合わせのうちから選択される材料を含んでなる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
基板が、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリホスファジン、ポリ乳酸グリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）、ポリエチレングリコール／ポリ乳酸コポリマー（ＰＥＧ／ＰＬＡ）、ならびにそれらのブレンドおよびコポリマーのうちから選択される材料を含んでなる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
膜組織が、水晶体嚢組織、内境界膜組織、角膜組織、ブルッフ膜組織、羊膜組織、漿膜組織、粘膜組織、および神経組織のうちから選択される膜組織を含んでなる、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
膜組織を改変するステップが膜組織のバルク修飾を含んでなり、前記バルク修飾は、機械的アブレーション、フォトアブレーション、イオンアブレーション、タンパク質分解酵素の被着、およびタンパク質分解酵素の光活性化のうちから選択される修飾を含んでなる、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記バルク修飾が膜組織の電解質に対する透過性を高めるのに有効である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記バルク修飾が膜組織の全厚を減少させるのに有効な膜組織表面のアブレーションを含んでなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記アブレーションステップが、膜組織の全厚を約２〜５μｍに減少させるのに有効である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記バルク修飾が、レーザーフォトアブレーションおよびイオンアブレーションのうちから選択される方法で膜組織に微孔またはピットを形成することを含んでなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
膜組織改変ステップが膜組織の表面修飾を含んでなる、請求項６に記載の方法。
【請求項１６】
表面修飾ステップが膜組織上に生体分子の微細パターンを被着させるステップを含んでなる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
生体分子が、タンパク質、ペプチド、有機分子、オリゴ糖、および短鎖ポリマーのうちから選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
生体分子が、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリスチレン、ポリ（メチルスチレン）、コラーゲン、ケラチン硫酸、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、オクタデシルトリクロロシラン、シランポリマー、ポリリジン、ポリ乳酸グリコール酸（ＰＬＧＡ）誘導体化ポリリジンおよびポリリジンペプチドのうちから選択される生体分子を含んでなる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
表面修飾が、細胞成長を抑制するように膜組織表面を処理するステップと、次いで、細胞を成長させるのに有効な微細パターンを膜組織表面に融除する処理、および、細胞を成長させるのに有効な生体分子の微細パターンを被着させるのに有効な接触面に膜組織表面を接触させる処理のうちから選択される処理を施すステップとを含んでなる、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
膜組織表面の複数の部分をマスキングするステップと、膜組織に、その膜組織の露出部分の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を変性させるのに有効な紫外（ＵＶ）線を照射するステップとをさらに含んでなり、前記マスキングするステップはマスクされた部分のＥＣＭ変性を減少または防止するのに有効である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
マスキングステップが、組織上にグリッドを配置するステップと、膜組織表面上に保護分子の微細パターンを適用するステップとのうちから選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
微細パターンを適用するステップが、膜組織表面を、該膜組織表面上に保護分子の微細パターンを被着させるのに有効である接触面と接触させるステップを含んでなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
動物がヒトである、請求項６に記載の方法。
【請求項２４】
修飾膜組織上で細胞を成長させる方法であって、膜組織と基板とを接触させるステップと、膜組織を修飾するステップと、修飾された膜組織に細胞を付与するステップとを含んでなる方法。
【請求項２５】
基板が、ガラス；プラスチック；コラーゲン；グリコサミノグリカン；キトサン；ポリ（ヒドロキシアルカノエート）；ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ならびにポリラクチド−ポリグリコリド（ＰＧＡ−ＰＬＡ）混合物、アロイおよびコポリマー（ＰＬＧＡ）を含むポリ（α−ヒドロキシ酸）；ポリ（ジオキサノン）；ポリ（ε−カプロラクトン）；ポリ（オルトエステル）；ポリ（無水物）；ポリ（ホスファゼン）；ポリ（アミノ酸）；ならびにこれらの化合物の他の配合物、ポリマー、コポリマー、アロイ、混合物および組合わせのうちから選択される材料を含んでなる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
基板が、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリホスファジン、ポリ乳酸グリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）、ポリエチレングリコール／ポリ乳酸コポリマー（ＰＥＧ／ＰＬＡ）、ならびにそれらのブレンドおよびコポリマーのうちから選択される生分解性ポリマーを含んでなる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
膜組織が、水晶体嚢組織、内境界膜組織、角膜組織、ブルッフ膜組織、羊膜組織、漿膜組織、粘膜組織、および神経組織のうちから選択される膜組織を含んでなる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
膜組織表面上に微細パターンを形成するステップをさらに含んでなる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
細胞が、ＩＰＥ細胞、ＲＰＥ細胞および幹細胞のうちから選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
膜組織および細胞を同一動物から得る、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
動物がヒトである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
動物由来の膜組織を修飾することによって調製される微細加工膜組織であって、前記修飾は、動物由来の膜組織を基板と接触させることと、膜組織を修飾することとを含んでなる、微細加工膜組織。
【請求項３３】
膜組織が、水晶体嚢組織、内境界膜組織、角膜組織、ブルッフ膜組織、羊膜組織、漿膜組織、粘膜組織、および神経組織のうちから選択される膜組織を含んでなる、請求項３２に記載の微細加工膜組織。
【請求項３４】
請求項２４に記載の方法で調製された、前記組織上で成長する細胞を有する微細加工膜組織。
【請求項３５】
細胞が、ＩＰＥ細胞、ＲＰＥ細胞および幹細胞のうちから選択される細胞を含んでなる、請求項３４に記載の細胞を有する微細加工組織。
【請求項３６】
移植用上皮細胞を成長させる方法であって、分解性ポリマー基板を用意するステップと、前記分解性ポリマー基板をリン酸緩衝生理食塩水に浸漬するステップと、分解性基板に上皮細胞を付与するステップとを含んでなる方法。
【請求項３７】
基板が、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリホスファジン、ポリ乳酸グリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）、ポリエチレングリコール／ポリ乳酸コポリマー（ＰＥＧ／ＰＬＡ）、ならびにそれらのブレンドおよびコポリマーのうちから選択される生分解性ポリマーを含んでなる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
微細加工膜組織であって、
少なくとも１つの表面を有する動物由来の膜組織と、
前記膜組織表面上の生体分子微細パターンと、
支持基板とを有する微細加工膜組織。
【請求項３９】
前記支持基板が、生体吸収性材料を含む、前記膜組織表面上のコーティングを含んでなる、請求項３８に記載の微細加工膜組織。
【請求項４０】
前記生体吸収性材料が、コラーゲン；グリコサミノグリカン；キトサン；ポリ（ヒドロキシアルカノエート）；ポリグリコール酸（Ｐが）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、およびポリラクチド−ポリグリコリド（ＰＧＡ−ＰＬＡ）混合物、アロイおよびコポリマー（ＰＬＧＡ）を含めむポリ（α−ヒドロキシ酸）；ポリ（ジオキサノン）；ポリ（ε−カプロラクトン）；ポリ（オルトエステル）；ポリ（無水物）；ポリ（ホスファゼン）；ポリ（アミノ酸）；ならびにこれらの化合物の他の配合物、ポリマー、コポリマー、アロイ、混合物および組合わせからなる生体吸収性材料群から選択される、請求項３９に記載の微細加工膜組織。
【請求項４１】
膜組織が、水晶体嚢組織、内境界膜組織、角膜組織、ブルッフ膜組織、羊膜組織、漿膜組織、粘膜組織、および神経組織のうちから選択される膜組織を含んでなる、請求項３８、３９および４０のいずれか１項に記載の微細加工膜組織。
【請求項４２】
前記組織上で成長する細胞をさらに有する、請求項３８、３９、４０および４１のいずれか１項に記載の微細加工膜組織。
【請求項４３】
細胞が、ＩＰＥ細胞、ＲＰＥ細胞および幹細胞のうちから選択される細胞を含んでなる、請求項４２に記載の細胞を有する微細加工膜組織。
【請求項４４】
組織表面を有する微細加工膜組織であって、前記膜組織の前記組織表面に付着した通路の微細加工パターンを有するステンシルを備え、前記組織表面の複数の部分が前記ステンシルの通路を介して露出されている微細加工膜組織。
【請求項４５】
膜組織が、水晶体嚢組織、内境界膜組織、角膜組織、ブルッフ膜組織、羊膜組織、漿膜組織、粘膜組織、および神経組織のうちから選択される膜組織を含んでなる、請求項４４に記載の微細加工膜組織。
【請求項４６】
組織表面上で成長する細胞を有する微細加工膜組織であって、前記膜組織の前記組織表面に付着した通路の微細加工パターンを有するステンシルを有し、前記組織表面の複数の部分が前記ステンシルの通路を介して露出されており、前記細胞が前記露出された部分上で成長する微細加工膜組織。
【請求項４７】
細胞が、ＩＰＥ細胞、ＲＰＥ細胞および幹細胞のうちから選択される細胞を含んでなる、請求項４６に記載の細胞を有する微細加工膜組織。
【請求項４８】
組織表面を有する微細加工膜組織であって、前記膜組織の前記組織表面上に、前記組織表面と微細流動性ネットワークにより指向された溶液との接触によって形成されたパターンを有する微細加工膜組織。
【請求項４９】
膜組織が、水晶体嚢組織、内境界膜組織、角膜組織、ブルッフ膜組織、羊膜組織、漿膜組織、粘膜組織、および神経組織のうちから選択される膜組織を含んでなる、請求項４８に記載の微細加工膜組織。
【請求項５０】
組織表面を有する微細加工膜組織であって、前記組織表面上で成長する細胞を有し、前記細胞が前記組織表面と微細流動性ネットワークによって指向された溶液との接触によって形成されたパターンにおいて成長する微細加工膜組織。
【請求項５１】
細胞が、ＩＰＥ細胞、ＲＰＥ細胞および幹細胞のうちから選択される細胞を含んでなる、請求項５０に記載の細胞を有する微細加工膜組織。
【請求項５２】
修飾膜組織に細胞を付与するステップが遠心することを含んでなる、請求項２４に記載の修飾膜組織上で細胞を成長させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、眼障害、特に、加齢黄斑変性症、網膜色素変性症などの網膜障害や、他の網膜疾患の治療分野に関する。さらに、本発明は、組織を修飾するための方法および装置、ならびに細胞および組織を移植するための方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、網膜色素変性症（ＲＰ）および他の疾患などの網膜の疾患は、工業先進国における重度の視覚障害または失明の主因である。ＡＭＤの１つの顕著な特徴は、ＲＰの場合と同様に、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の変性および喪失である。ブルッフ膜も損傷を受けると考えられ、そのような損傷は、ＲＰＥ喪失の誘発刺激となり得る。ＲＰＥ細胞は、眼の中で直に光を感知する唯一の細胞である網膜光受容体の生存および適切な機能に不可欠である。ＡＭＤやＲＰなどの網膜疾患におけるＲＰＥ変性は、光受容体機能の喪失およびこれらの障害に伴う視覚障害に関連する。
【０００３】
ＲＰＥは、網膜神経層に隣接し、網膜光受容体に面して位置している。ＲＰＥ細胞は、イン・ビボでは、接触結合（ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）により連結された細胞１個分の厚さの丸石様組織を形成し、分化された頂端膜と基底膜とを有する。ＲＰＥ細胞は、イン・ビボで高密度に密集成長して、光受容体と、下に横たわるブルッフ膜、脈略膜および脈絡膜脈間構造との間の輸送を調節するバリヤーとして働く堅固な上皮を形成している。ＲＰＥの頂端部は、剥げ落ちた光受容体被着物の貪食および消化や、感光色素として再使用するためにレチナールを再循環させるというその重要な機能を果たすために、光受容体外節を取り囲んで包み込むように適合されている。ＲＰＥの基底部は、ＲＰＥおよび光受容体に必要な酸素や栄養素を供給し、網膜機能を損い得る二酸化炭素や他の廃物の被着を防止する血管に富む支持膜であるブルッフ膜に隣接している。例えば、外節代謝由来の老廃物の被着に起因し得るブルッフ膜の損傷により、酸素、成長因子および老廃物の交換が阻止される。そのような交換障害は光受容体に低酸素状態をもたらす。それに応じて、新生血管の内方成長を開始させるように生存シグナルが送り出され、湿潤型ＡＭＤに至ると考えられる。
【０００４】
ＲＰＥと同様に、胚の神経外胚葉に由来する虹彩色素上皮は、網膜と対向する眼の部分で虹彩に隣接して位置している。したがって、正常な眼の定位置では、ＩＰＥ細胞は網膜光受容体から遠く離れている。ＩＰＥ細胞の生理機構および機能については未だ多くは解明されていないが、ＲＰＥ細胞と同様に培養ＩＰＥ細胞も光受容体外節を貪食し得ることが明らかにされている。
【０００５】
ＲＰＥ細胞は人工基板上で成長され得る（ペッファー  ビー  エイ（Ｐｆｅｆｆｅｒ  Ｂ．Ａ．），“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  Ｍｏｎｋｅｙ  Ｒｅｔｉｎａｌ  Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ，”  第１０章，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｒｅｔｉｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，第１０巻，Ｅｄ．Ｏｓｂｏｒｎ，Ｎ．，ａｎｄ  Ｃｈａｄｅｒ，Ｊ．（１９９８年）；リューら（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ），Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｅｄｎ．第９巻：１１８７〜１２０５ページ（１９９９年）；およびリューら，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  第２０巻：２３５１−２３６１ページ（１９９９年））。さらに、ＲＰＥ細胞やＩＰＥ細胞を成長させるための基板として水晶体嚢組織を使用する試みもあった（ハートマンら（Ｈａｒｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ），Ｇｒａｅｆｅ’ｓ  Ａｒｃｈｉｖ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  第２３７巻：９４０−９４５ページ（１９９９年）；ニコリーニら（Ｎｉｃｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ），Ａｃｔａ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｓｃａｎｄ  第７８巻（５）：５２７〜３１ページ，２０００年１０月）。
【０００６】
退行性および進行性網膜疾患の治療には多くの方法が試行されてきた。例えば、試行されたＡＭＤ治療には、疾患を修復したり、進行を遅らせたり、または作用を補ったりするための光力学的療法、放射線療法および黄斑移転法が含まれる。しかし、そのような方法はあまり成功していない。
【０００７】
ＲＰＥ細胞の喪失は多くの網膜疾患で発生するので、ＡＭＤや他の疾患の療法および実現可能な治療法として細胞移植に大きな関心が寄せられている。喪失したＲＰＥ細胞に代わるものとしてＲＰＥ細胞を直接網膜に移植する方法が試みられた。しかし、この方法は、一つには移植した細胞が適切に機能しなかったり、また一つには移植細胞が宿主動物により拒絶されたりしたために、これまで成功していない。
【０００８】
ＲＰＥ細胞移植が網膜ジストロフィー用療法として示唆された（ヒューズ（Ｈｕｇｈｅｓ）に付与された米国特許第５，９６２，０２７号およびリュー（Ｌｉｕ）に付与された米国特許第６，０４５，７９１号）。本明細書において上記および下記に挙げられているすべての特許および刊行物はそれらの全文が本明細書に文献援用される。さらに、ＩＰＥ細胞がＲＰＥ細胞の代わりをし得るという実験に基く証明が、ＡＭＤ症状を改善させるために動物にＩＰＥ細胞を移植する最初の試みにつながった（アベら（Ａｂｅ  ｅｌ  ａｌ），Ｔｏｈｏｋｕ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．第１８９巻：２９５−３０５ページ（１９９９年）、アベら，Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  第８巻（５）：５０１〜１０ページ（１９９９年）；シュレールマイヤーら（Ｓｃｈｒａｅｒｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ），Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｔｈ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．第４０巻（７）：１５４５−５６ページ（１９９９年）；サマンら（Ｔｈｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ），Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  第６８巻（２）：１９５〜２０１ページ（１９９９年）；アベら，Ｔｏｈｏｋｕ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．第１９１巻：７〜２０ページ（２０００年）；アベら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  第２０巻（４）：２６８〜２７５ページ（２０００年）；ラパスら（Ｌａｐｐａｓ  ｅｔ  ａｌ），Ｇｒａｅｆｅｓ’ｓ  Ａｒｃｈ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  第２３８巻：６３１−６４１ページ（２０００年）；サマンら，Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．第１１８巻：１３５０〜１３５５ページ（２０００年））。
【０００９】
しかし、ＩＰＥ移植法およびＲＰＥ移植法の課題としては、（ｉ）病変したブルッフ膜の修復が困難であること、（ｉｉ）新たに移植された細胞の固定および位置決めが不可能であること、および（ｉｉｉ）色素上皮細胞の構造、機能および生存に重要な細胞外マトリックスシグナル分子の制御ができないことが挙げられる。上記および他の理由のために、抗生物質または免疫抑制物質を用いたＩＰＥおよびＲＰＥ移植法は成功を収めていない。これらの方法では有意な視力改善が実証されておらず、組織の復元という問題が残っている。したがって、この移植法は明らかに有望であるにも拘わらず、ＡＭＤや他の網膜疾患にはまだ成功した治療的介入法が存在しない。
【００１０】
したがって、当業では、移植用組織を修飾するための新規な方法および装置、ならびに網膜疾患を軽減させることを目的としたそのような組織を移植するための新規な方法および装置が求められている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、組織を修飾し、移植用細胞を成長させるための方法、装置および関連生産物に関する。特に、本発明は、ＡＭＤおよびＲＰなどの網膜疾患を治療するために、細胞および組織を網膜に移植するための方法、装置および関連生産物に関する。本明細書に開示されている新規な方法で修飾された組織は、微細加工組織と称される。本発明には、微細加工眼球膜組織、例えば、微細加工水晶体嚢組織、微細加工内境界膜組織、微細加工ブルッフ膜組織および他の組織を含む微細加工膜組織が含まれる。本発明にはさらに、移植用微細加工膜組織、膜組織の微細加工法、微細加工膜組織の利用法、微細加工膜組織上で細胞を成長させる方法、および動物の眼に微細加工組織および細胞を移植する方法が含まれる。例えば、動物はヒトであり得る。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の特徴を具体化する微細加工膜組織は、膜組織をリン酸緩衝生理食塩水に浸漬され得る生体吸収性材料を含む基板と接触させるか、または膜組織表面を生体吸収性材料でコーティングして、コーティングまたは膜組織と基板との接触の前もしくは後で膜組織を修飾することによって調製され得る。適当な生体吸収性材料としては、コラーゲン；グリコサミノグリカン；キトサン；ポリ（ヒドロキシアルカノエート）；ポリ（α−ヒドロキシ酸）；ポリグリコール酸（ＰＧＡ）；ポリ乳酸（ＰＬＡ）；ポリラクチド−ポリグリコリド（ＰＧＡ−ＰＬＡ）混合物、アロイおよびコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ジオキサノン）；ポリ（ε−カプロラクトン）；ポリ（オルトエステル）；ポリ（無水物）；ポリ（ホスファゼン）；ポリ（アミノ酸）；ならびにこれらの化合物の他の配合物、ポリマー、コポリマー、アロイ、混合物および組合わせが挙げられる。適当な膜組織には、水晶体嚢、内境界膜、ブルッフ膜、角膜組織、羊膜、漿膜組織、粘膜組織、および神経組織を含む他の組織がある。
【００１３】
基板で被覆されるか、基板と接触しているか、または基板上に配置された微細加工膜組織は、膜組織を基板で被覆すること、または膜組織を基板と接触させることと、前記組織は、任意でリン酸緩衝塩生理食塩水または他の生理的溶液に浸漬されていることと、膜組織を修飾することと、修飾された膜組織に細胞（例えば、ＩＰＥおよびＲＰＥ細胞）を付着させることとを含む方法によって、該組織上で成長される細胞をさらに有する。微細加工膜組織は、膜組織を部分的にステンシルで被覆し、膜組織の露出された表面上で細胞を成長させて修飾してもよい。
【００１４】
膜組織を修飾する方法としては、機械的アブレーション法、機械的接触法、およびフォトアブレーション法がある。本発明の膜組織修飾法は、眼球膜組織を含む多様な組織に適用され得る。例えば、本発明の方法には、ヒト水晶体嚢組織などの水晶体嚢組織を修飾する方法や、ヒト内境界膜組織などの内境界膜組織を修飾する方法が含まれる。
【００１５】
膜組織修飾法にはバルク修飾法（ｂｕｌｋ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）と表面修飾法がある。表面修飾法とバルク修飾法は、単独で適用してもよいし、同一膜組織に併用してもよい。膜組織の表面特性およびバルク特性を変えることにより、動物への移植に対する組織の適合性が改善される。そのような組織修飾は、組織上の細胞の付着能および成長能を高め得ると共に、栄養素、電解質および他の所望物質が、修飾された組織をより通過し易くなるように、組織の透過性を高め得る。
【００１６】
本発明の方法は、バルク修飾法であれ表面修飾法であれ、眼から水晶体嚢または内境界膜などの膜組織を除去することと、リン酸緩衝塩生理食塩水に浸漬されたカバースリップなどのガラスもしくはプラスチック基板上に膜組織を平らに広げること、または外科的移植を容易にするために膜組織を一時的分解性ポリマー上に平らに広げることとを含む。修飾組織は、細胞に適した基板を提供し、該組織に付着し、成長し得る細胞に対して露出され得る。次いで、場合により組織および／またはポリマー上に付着細胞を付与し、成長させた状態の修飾組織を、動物の体内の所望位置に移植し得る。移植後、修飾組織が分解性ポリマーと合わせて作製されている場合、このポリマーは、分解し、移植組織および細胞を適所に残して、修飾組織が移植された動物の体内に吸収されるであろう。
【００１７】
適当な分解性ポリマーとしては、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリホスファジン、ＰＬＧＡ（例えば、乳酸グリコール酸コポリマーの５０：５０混合物、９０：１０混合物または他の比率の混合物）を含むポリ乳酸グリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）、ポリ乳酸ポリマー（ＰＬＬＡ）、ポリエチレングリコール／ポリ乳酸コポリマー（ＰＥＧ／ＰＬＡ）、ならびにそれらのブレンドおよびコポリマーがある。
【００１８】
バルク修飾法は、膜組織の表面部分に限定されない膜組織の大部分を修飾する方法である。表面修飾法は、膜組織を表面または表面近くでは修飾するが、組織の他の部分は大幅に修飾しない方法である。
【００１９】
水晶体嚢組織および内境界膜組織などの眼球膜組織を含む膜組織を修飾するためのバルク修飾法としては、組織の厚さ、透過性および他の特性を修飾する方法がある。バルク修飾法には、ラビング、削り取り、切断および張力付加を含む機械的アブレーション、膜組織とスタンプなどの接触面との接触、および膜組織における微細パターン形成が含まれる。バルク修飾法の一実施形態において、膜組織を除去して平らに広げた後の処理には、レーザーまたはイオンビームを用いて組織の厚さを減少させるように膜組織表面を修飾する処理が含まれる。例えば、通常、最大約８〜１４マイクロメートル（μｍ）までの厚さであり得る水晶体嚢を、改変後の水晶体嚢の全厚がブルッフ膜の厚さ（約２〜４μｍ）のようになるように、エキシマレーザーを用いたフォトアブレーションで約２〜５μｍの厚さに融除（ａｂｌａｔｅ）し得る。
【００２０】
バルク修飾法の別の実施形態において、上記のような更なる処理としては、膜組織に微孔またはピットを形成するための、エキシマ、チタンサファイア、もしくはＹＡＧレーザーなどのレーザー処理、またはイオンビーム処理が含まれる。微孔は、直径数マイクロメートル以下のオーダーの寸法を有し得る。そのような処理によって、膜組織に微孔またはピットの微細パターンが形成される。
【００２１】
膜組織は、レーザー光照射により活性化される非活性化コラゲナーゼ酵素を含浸させることによって処理され得る。例えば、組織の直径１マイクロメートル未満のサイズの極小領域が、２フォトン共焦点レーザーシステムで照射されて活性化され得る。
【００２２】
膜組織に所望のトポロジーおよび表面付着特性を与えるのに有効な膜組織の表面および内部の生物学的エッチングに有効な酵素を膜組織上に被着させ得る。この方法のいくつかの実施形態において、被着ステップは、膜組織と、膜組織の表面または内部を生物学的にエッチングするのに有効な酵素を担持するマイクロコンタクトプリンティングスタンプなどの接触面とを接触させるステップを包含する。
【００２３】
処理には膜組織の表面修飾も含まれる。例えば、処理は、膜組織上への生体分子パターンの被着、およびレーザーまたはイオンビーム処理による微細孔またはピットパターンの形成を包含し得る。この方法のいくつかの実施形態において、パターンは数マイクロメートル以下のオーダーの寸法を有する。この方法の他の実施形態において、生体分子としては、膜組織上の選択的細胞付着部位を非活性化させるのに有効なペプチドおよび短鎖ポリマーが含まれる。
【００２４】
表面修飾法の一実施形態においては、マイクロコンタクトプリンティング法を用いて膜組織上に生体分子の化学作用微細パターンを形成する。膜表面は、表面のラビング、削り取り、および表面上に溶液を流すことを含む機械的アブレーション法によっても修飾し得る。
【００２５】
表面修飾法の別の実施形態では、膜組織表面を、全体ではなく一部を被覆するようにマスクし、次いで、組織の露出部分の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を変性させるのに有効な紫外（ＵＶ）線を照射する。膜組織表面の特定の部分のみを活性化させるために、組織表面にポリビニルアルコール（ＰＶＡ）または粘質物などの非活性化物質を塗布してもよいし、またエキシマレーザーを用いて照射マスクを介して膜組織表面上に微細パターンを融除してもよい。
【００２６】
マスキングステップは、膜組織表面上にグリッドを配置すること、またはマイクロコンタクトプリンティング法を用いて膜組織表面上に保護分子パターンを施すことにより実施することができ、マスキングステップは保護分子またはグリッドで被覆された領域におけるＥＣＭ変性を防止するのに有効である。
【００２７】
微細加工膜組織上で細胞を成長させ得る。例えば、表面にパターンを有し得る微細加工膜組織に細胞を付与し得る。さらなる実施形態では、微細加工膜組織は水晶体嚢組織または内境界膜組織であってよく、細胞はＩＰＥ細胞であってよい。本発明のさらに他の実施形態において、微細加工膜組織および細胞は同一動物から得てもよい。この場合、修飾された組織および細胞をその動物に移植することは自家移植であり、したがって、その動物の免疫系によって拒絶されることはないであろう。
【００２８】
本発明はさらに、微細加工膜組織を動物に移植するための外科的方法を含む微細加工膜組織の利用法を提供する。微細加工膜組織を動物に移植する方法には、微細加工膜組織を動物の眼に移植する外科的方法、例えば、動物の網膜近くまたは網膜内への微細加工水晶体嚢組織または微細加工内境界膜組織の移植がある。移植組織は、微細加工水晶体嚢組織または微細加工内境界膜組織上で成長させられた細胞をさらに有し得る。好ましい実施形態において、移植される微細加工膜組織は、微細加工水晶体嚢組織または微細加工内境界膜組織上で成長させたＩＰＥ細胞を有し、自己組織および細胞移植組織であり得る。
【００２９】
本発明はさらに、微細加工組織の作製および利用の際に有用な生産物を提供する。そのような生産物には、微細加工水晶体嚢および内境界膜組織を含む修飾眼球膜組織を形成するための生産物および用具、移植される組織および細胞を動物の眼に移植するための生産物および用具が含まれる。
【００３０】
本発明は、ＡＭＤ、ＲＰなどの網膜疾患および他の網膜疾患を治療するための方法および関連生産物に関する。例えば、１つのＡＭＤ療法は、病変網膜を救済するために、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、虹彩色素上皮（ＩＰＥ）細胞、幹細胞、または他の細胞の懸濁液を移植する方法である。本発明は、ＩＰＥ細胞、ＲＰＥ細胞、幹細胞および他の細胞などの移植細胞用の基板として自己ヒト組織（例えば、ヒト水晶体嚢）を精密加工する新規な組織工学技術を提供する。本発明の修飾組織および基板上で成長させた移植色素上皮細胞は、高密度に成長して、正常な網膜におけるこれらの細胞の重要な特性である分化を表す特徴を示し得る。さらに、従来の方法とは異なり、（本発明によって提供される水晶体嚢、内境界膜などの修飾された眼球膜組織および他の基板や、成長する上皮細胞を有するそのような基板を含む）修飾膜組織は、退行性網膜疾患で損なわれ得るブルッフ膜の機能の多くを補うのに有効である。したがって、色素上皮細胞を移植するための本発明の方法および装置は、高密度に成長し、かつ網膜変性疾患を有する患者に欠失している必要な生理機能を果たし得る移植細胞を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明は、移植用組織および細胞を修飾するための方法および装置を提供する。本発明の組織修飾法は、多様な臓器由来の多様な組織に適用され得る。以下の定義は本発明の説明に有用である。
【００３２】
本明細書において、用語「自己」とは、他の細胞または組織と同一の動物由来の細胞または組織を指すように用いられ、したがって、細胞が組織と同じ動物由来である場合には、その細胞はその組織に関して自己細胞であり、同様に、細胞および組織が同一動物由来である場合には、その組織は細胞に関して自己組織である。
【００３３】
本明細書において、用語「生体分子」とは、生物活性を有する分子を意味するために用いられる。したがって、生体分子は、細胞または組織に接触すると、その細胞または組織に作用するか影響を与える分子である。
【００３４】
本明細書において、用語「バルク修飾」とは、組織の大部分の特性を修飾することを意味するように用いられ、そのような修飾は組織の表面部分には制限されない。
本明細書において、用語「表面修飾」とは、組織の表面および表面近くの組織の特性を修飾することを意味するために用いられる。
【００３５】
本明細書において、用語「膜組織」とは、シートまたは鞘を形成する動物の任意の組織を意味するように用いられており、膜組織は、一般に、組織を封入するか、もしくは組織の範囲を定めるか、または臓器または組織を別個の区分に分割する。「眼球膜組織」とは、動物の眼球由来の膜組織を意味するように用いられ、水晶体嚢組織および内境界膜は、角膜、ブルッフ膜、および眼球の他の膜組織と同様に眼球膜組織の例である。
【００３６】
本明細書において、用語「アブレーション」とは、組織の改変を意味するように用いられており、必ずしも組織のサイズ縮小または除去を含むとは限らない。本明細書に用いられる限りにおいて、「機械的アブレーション」とは、機械的行為、例えば、削り取り（ｓｃｒａｐｉｎｇ）、刻み目付け（ｓｃｏｒｅｉｎｇ）、接触面（例えば、スタンプ）との接触、張力付加、または他の機械的方法による組織の改変、縮小または除去を意味する。本明細書に用いられる限りにおいて、「フォトアブレーション」とは、組織の表面または内部特性を変えるのに有効な、紫外光、レーザー光、または他の放射線、例えば、エキシマ、チタンサファイア、ＹＡＧまたは他のレーザー由来の光による照射を意味する。本明細書において、「イオンアブレーション」とは、膜組織のイオンビーム処理により行われる表面修飾またはバルク修飾を指すために用いられる。
【００３７】
「タンパク質分解酵素」または「プロテアーゼ」は、タンパク質またはペプチド分子を少なくとも部分的に消化する（分解する）のに有効なタイプの分子である。プロテアーゼおよびタンパク質分解酵素の例としては、コラゲナーゼ、トリプシン、キモトリプシン、ディスパーゼ、リベラーゼ、サーモリシン、ペプシンおよびパパインがあるが、それらには限定されない。
【００３８】
本明細書において、用語「移植」とは、動物内に細胞または組織を挿入、被着または配置することを意味するために用いられる。修飾水晶体嚢上で成長する細胞を網膜下腔内に導入することは移植の一例である。
【００３９】
本明細書において、用語「マイクロコンタクトプリンティング」とは、表面上に所望の分子を数十マイクロメートル以下のオーダーのサイズに形成されることを特徴とするパターンで被着（ｄｅｐｏｓｉｔ）させることを意味するために用いられる。
【００４０】
本明細書において、用語「微細加工」とは、表面修飾、バルク修飾、またはその両方によって修飾組織を形成することを意味するために用いられる。
本明細書において、用語「微細加工組織」とは、微細加工法によって改変または修飾された組織を意味するために用いられる。
【００４１】
「接触面」（ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ  ｓｕｒｆａｃｅ）とは、第２の表面を接触させて、初期に接触面上に存在する分子を第２の表面上に被着させるように構成された表面である。「スタンプ」、「微細加工スタンプ」、「マイクロコンタクトプリンティングスタンプ」、「マイクロコンタクトスタンプ」、または「微細加工プリンティングスタンプ」は接触面であり、用語「スタンプ」、「微細加工スタンプ」、「マイクロコンタクトプリンティングスタンプ」、「マイクロコンタクトスタンプ」、および「微細加工プリンティングスタンプ」は、本明細書において、数十マイクロメートル以下のオーダーのサイズに形成されることを特徴とするパターンで所望分子を被着させるように適合されたデバイスを意味するために用いられる。
【００４２】
本明細書において、用語「微細パターン」とは、数十ミクロン以下のオーダーのサイズに形成されることを特徴とする規則正しい配列、デザインまたは外形などのパターンを意味するために用いられる。
【００４３】
「分解性ポリマー」（ｄｉｓｓｏｌｖａｂｌｅ  ｐｏｌｙｍｅｒ）とは、生分解性であり、動物に導入されると、少なくとも部分的に解離して、動物の体液および組織中に分散し得るポリマーを指す。
【００４４】
「レーザー」は、エキシマレーザー、チタンサファイアレーザー、イットリウム−アルミニウム−ガーネット（ＹＡＧ）、または他のレーザーであってよい。レーザーは、レーザーキャビティまたはレーザー結晶内の光増幅により生成される強力な干渉光ビームを放出し得る。
【００４５】
本明細書に用いられている限りにおいて、「エキシマレーザー」とは、約４００ナノメートル（ｎｍ）未満の波長のレーザー光を供給するレーザー光源を指す。エキシマレーザーは、キセノン、クリプトンまたはフッ素レーザーであるか、より好ましくは、フッ化アルゴンレーザーであってよい。フッ化アルゴンレーザーは、典型的には、上皮組織、結合組織および他の組織のアブレーションに適した約１９３ｎｍの波長を有する紫外レーザー光を供給する。組織アブレーションなどの組織修飾に用いる場合、レーザー光は、約１〜５０Ｈｚでパルスを出し得、各パルスは、約１〜２００ナノ秒（ｎｓ）、好ましくは、約１０〜２０ｎｓの持続時間を有する。例えばフッ化アルゴンレーザーで生成されるようなレーザービームは、典型的には、数ミリメートル〜数十ミリメートルのオーダーのサイズを有する。
【００４６】
チタンサファイア（ＴｉＳ）レーザーは、約７００〜約１１００ｎｍの範囲の波長を有する赤外レーザー光を放出し得る波長可変レーザーである。
イットリウム−アルミニウム−ガーネット（ＹＡＧ）レーザー、例えば、ネオジムＹＡＧ、ホロニウムＹＡＧ、またはエルビウムＹＡＧレーザーは、ミクロンオーダーの波長のレーザー光を放出する固相レーザーである。水分子は、ミクロン波長のエネルギーを吸収し、水は、３μｍ近くの波長のエネルギーを選択的に吸収し、エルビウムドープＹＡＧレーザーは２．９４μｍの波長を有する光を放出するが、それらの光は、細胞や組織中に存在する水を急激に局所的に蒸発させて、組織を急激に膨脹および融除させるので、フォトアブレーションに用いるのに特に適したものである。
【００４７】
イオンビームは、典型的には、高周波エネルギーにより励起されて標的に向けられるイオン化ガス分子ビームである。本発明を実施する際に用いられるイオンビーム源は任意の種類のものであってよい。イオンビーム源は、例えば、アホネン（Ａｈｏｎｅｎ）に付与された米国特許第５，２１６，３３０号に記載されている。イオンビームは材料に穿孔するために用いられ得る。ナワテ（Ｎａｗａｔｅ）に付与された米国特許第６，０９３，４４５号は、約１０ｎｍ〜約２μｍのサイズの矩形および円形の孔を穿孔するためのイオンビーム法を記載している。
【００４８】
細胞１４が付着した微細加工水晶体嚢組織１２および分解性基板１６を有する組織移植片１０が図１Ａに断面で示されている。細胞１４は微細加工水晶体嚢組織１２の上面１８に付着して成長している。微細加工水晶体嚢組織１２の下面２０は分解性基板１６に接している。細胞１４は虹彩色素上皮細胞であり、これらの細胞は、頂端膜２４と基底膜２２とを有し、基底膜２２は微細加工水晶体嚢１２の上面１８と接している。イン・ビボの色素上皮細胞に見られるような基底膜２２と頂端膜２４への適切な細胞分化の発現は、微細加工水晶体嚢上で成長する上皮細胞が適切に機能していることを示している。
【００４９】
図１Ｂは、組織移植片１０が外科的に配置された哺乳動物の眼２６を断面で示している。図１Ｃは、網膜神経層２８および組織移植片１０を含む眼２６の円内領域３３の細部である。図１Ｂと図１Ｃに示されているのは、網膜神経層２８、虹彩色素上皮（ＩＰＥ）３０、脈絡膜３６をＲＰＥの基底膜３８から隔てているブルッフ膜３４上で成長する網膜色素上皮（ＲＰＥ）３２である。ＲＰＥの頂端膜４０は、網膜神経層２８の光受容層４２にある光受容体の感光部分を包み込んで取り囲む多くの突起を有する。ＲＰＥ４０の頂端膜と光受容体４２との間の腔は網膜下腔４４である。脈絡膜３６は、網膜下腔４４に栄養素や電解質を通過させ、網膜下腔４４から老廃物を除去することにより、特に光受容層４２、全般的には網膜神経層２８の高代謝要求量をサポートし得る環境を維持する働きをする。
【００５０】
健康な眼においては、網膜下腔４４は仮想的な空間に過ぎず、光受容体４２とＲＰＥの頂端部４０との間はほとんど離れていない。しかし、網膜剥離などの多くの眼障害の場合、光受容体４２はＲＰＥ頂端膜４０から離間した状態になり得る。さらに、網膜神経層２８と色素上皮３０，３２とは、所望の場合、眼科手術中に人為的に分離され得る。図１Ｂおよび図１Ｃに示されているように、網膜下腔４４内に組織移植片１０を配置し得る。付着したＩＰＥ細胞１４を有する微細加工水晶体嚢１２が眼２６に挿入された状態で示されている。ＩＰＥ細胞３０は、光受容体４２と接触して、代謝サポートを提供し得る。分解性基板１６は、組織移植片１０が配置された後の初期には、微細加工水晶体嚢１２の下面２０と脈絡膜３６との間に示されている。しかし、分解性基板１６は、移植された微細加工水晶体嚢１２とそれに付着しているＩＰＥ細胞１４のみを網膜下腔４４内の適所に残して分解し、網膜下腔４４から消失するであろう。
【００５１】
図２は、本発明の特徴を具体化するポリ（ジメティルシロキサン）（ＰＤＭＳ）微細加工スタンプ４６の走査型電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）である。グリッド線４８は約５μｍ幅で、約５０μｍ間隔で区切られている。ＰＤＭＳスタンプの構造高さは底面から表面まで７μｍである。スタンプ４６を表面に接触配置するために、グリッド線４８を化合物、例えば、ポリ−Ｌ−リジンでコーティングしてもよい。
【００５２】
図３は、図２に示されている微細加工スタンプ４６と接触させた後の、２％ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）と０．１ｍｇ／ｍｌフルオレセインとの混合物でコーティングされた微細加工水晶体嚢組織のＳＥＭである。明るい領域はフルオレセイン溶液のマイクロプリンティングを示している。微細パターン線５０は、水晶体嚢表面と接触させることによって形成されたスタンプ４６と同じパターンおよび間隔を有する。
【００５３】
図４は、一連の円形ウエル５６で形成されたトポロジーのスタンプ表面５４を有するＰＤＭＳスタンプ５２のＳＥＭを示している。このように、スタンプ５２のスタンプ表面５４は、コーティングを受けないであろう円形凹部５６を有するする。一方、スタンプ表面５４の残りの部分は分子のコーティングを受け、次いで、その分子のコーティングは接触することになる任意の表面に転写され得る。スタンプ５２を、ＰＶＡ、粘質物などの分子または他の抑制分子でコーティングし、次いで、スタンプ５２を水晶体嚢表面などの表面に接触させると、表面の円形を除く至る所にこれらの分子パターンが形成される。そのような抑制分子の微細パターンによって、表面上で成長する細胞はこれらの円形領域上にのみ付着する。非修飾水晶体嚢表面はそれに付着した細胞を盛んに成長させるので、パターン化成長には抑制パターンが必要である。各円５６は直径約５０μｍである。
【００５４】
図５は、図３に示されているＰＤＭＳスタンプ５２からＰＶＡ抑制分子の微細パターン６０を受けたヒト水晶体嚢５８のＳＥＭである。スケールバーは２５μｍである。ＲＰＥ細胞６２がスタンプ５２を介して水晶体嚢５８上に被着した微細パターン６０により決められたパターンで成長していることは明らかである。細胞はこのパターンで２４日もの長い期間生存した。グリッド線の幅を制御して、細胞の間隔をより離したり、より近付けたりすることができる。グリッド線をより細くすると、細胞が互いに接触するように成長し、接触成長する細胞から輸送上皮層が形成される。
【００５５】
細胞の微細加工組織基板上への付着は、微細加工組織とその上で成長させる細胞とを一緒に平底遠心管内に配置することにより加速または促進し得る。例えば、約５，０００〜約１５，０００ｒｐｍなどの低速で遠心すると、細胞は微細加工組織上に迅速に被着し、微細加工組織上に被着した細胞の有向成長が支援される。
【００５６】
微細加工組織を支持マトリックス上に配置するか、または微細加工組織を支持マトリックスでコーティングすることにより、微細加工組織の処理および動物体内への移植が援助される。微細加工組織は、一方の面だけをコーティングされてもよいが、本発明の実施形態では、微細加工組織は両面をコーティングされる場合もある。微細加工水晶体嚢、微細加工内境界膜、微細加工ブルッフ膜、または他の微細加工膜組織の処理および移植は以下のようにして援助され得る。例えば、支持マトリックスは、微細加工組織をより剛直にして、より取扱い易くする。また、支持マトリックスは、組織の折れ曲がりや巻き返りの防止に有効であり、平らに拡がった組織シートの移植を可能にする。そのような広く拡がった形状により、移植細胞を成長させるための最大表面積が得られると共に、移植細胞の体液および周囲組織との接触が最大となる。本発明の特徴を具体化する生分解性支持マトリックスは、柔軟で、網膜の外形に容易に適合する。支持マトリックスは、生分解性であり、したがって、眼内に配置した後で所望期間内に宿主の身体に吸収されることが好ましい。所望期間は、約１週間〜数ヶ月、好ましくは数週間〜約２ヶ月であり、本発明の特徴を具体化する支持マトリックスは、網膜に移植された後約２週間〜約６ヶ月以内に生物分解するのがより好ましい。
【００５７】
組織の処理および眼への移植を支援するのに適した生分解性マトリックス材料としては、例えば、コラーゲン；グリコサミノグリカン；キトサン；ポリ（ヒドロキシアルカノエート）；ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリラクチド−ポリグリコリド（ＰＧＡ−ＰＬＡ）混合物、アロイおよびコポリマー（ＰＬＧＡ）を含むがこれらに限定されないポリ（α−ヒドロキシ酸）；ポリ（ジオキサノン）；ポリ（ε−カプロラクトン）；ポリ（オルトエステル）；ポリ（無水物）；ポリ（ホスファゼン）；ポリ（アミノ酸）；ならびにこれらの化合物の他の配合物、ポリマー、コポリマー、アロイ、混合物および組合わせが挙げられる。図６は、ポリラクチド／ポリグリコリド支持マトリックス上の（青く着色した）水晶体嚢を示している。スケールバーの長さは１ｍｍである。支持マトリックス基板およびコーティングは、（例えば、トリパンブルーまたはローダミンで）染色して、移植手術中の移植組織の視覚化を向上し得る。そのようなコーティングおよび基板は、水晶体嚢、内境界膜、ブルッフ膜や、角膜組織、羊膜、漿膜、粘膜および神経組織含む他の膜組織に用いられ得る。
【００５８】
図７は、ポリラクチド／ポリグリコリド支持マトリックス上のウサギ網膜のヒト水晶体嚢含有切片を示している。示されている網膜切片は、ウサギの眼の神経細胞と網膜色素上皮細胞との間の網膜下腔にヒト水晶体嚢組織を移植してから１週間後に採取した。この水晶体嚢は、移植細胞への栄養素や老廃物の流入、移植細胞からの流出を妨げるであろう折れ曲がりや巻き返りを示さない平坦形状を有する。
【００５９】
修飾すべき組織は、当業では公知の方法、例えば、切除術、生検、外科手術または病理解剖によって得られる。組織を得るための処理を行うときには、標準的な滅菌操作手順などによって膜組織の損傷および汚染を回避するように対処すべきであることが当業者には理解されよう。本発明の方法および装置は、眼球膜組織を含むがそれには限定されない任意の膜組織の修飾に適していることが理解されよう。
【００６０】
以下の説明では、最初に典型的な膜組織として水晶体嚢組織を用いて、組織を修飾するための方法および装置を説明する。これらの方法および装置は、内境界膜組織や他の組織の修飾にも適しているので、内境界膜や他の組織の修飾にも用いられ得る。本発明の方法によって達成される組織修飾は、当該組織の特性を細胞の付着や成長に適したより好ましい基板とするように変えたり、水晶体嚢組織の物理的特性や生物化学的特性を組織を介した体液や溶質の交換がより容易になるように変えるのに有効である。
【００６１】
水晶体嚢組織や内境界膜などの膜組織は、ドナーの眼から、または以下の白内障手術用の水晶体摘出術などの当業では公知の技術によって患者（自己組織）から得ることができる。例えば、水晶体嚢組織は、白内障切開術（強膜切開術または角膜切開術）を行った後の眼から得られる。この方法では、その後で、切開実施後の前眼房に粘弾性物質を注入する。粘弾性物質は、通常、Ｈｅａｌｏｎ（登録商標）（ファルマシア社、米国ミシガン州カラマズー所在（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｋａｌａｍａｚｏｏ，ＭＩ））またはＶｉｓｃｏａｔ（登録商標）（アルコン社、米国テキサス州フォートワース所在（Ａｌｃｏｎ，Ｆｏｒｔ  Ｗｏｒｔｈ，ＴＸ））である。次いで、水晶体切開刀を用いて嚢切開を行う。この切開刀は、前嚢の中心を穿刺して、嚢皮弁を形成するのに用いられる。次いで、嚢切開刀を用いてこの皮弁を持ち上げる。Ｕｔｒａｔａ鉗子を用いて嚢皮弁を把持し、輪状に引っ張る。嚢を３６０°にわたって制御された方式で引っ張ると、丸い持続的な水晶体嚢切断が生じ、白内障が露出される。次いで、水晶体と水晶体嚢を除去し得る。
【００６２】
膜組織（例えば、水晶体嚢、内境界膜、または他の眼組織）を一旦除去したならば、その膜組織をイン・ビトロに保持するか、またはイン・ビボ移植のための準備をする。次いで、膜組織を、ガラス、プラスチックまたはポリマー基板上に載せる。ガラス基板は、例えば、ガラスカバースリップであってよい。プラスチック基板は、例えば、組織培養皿であってよい。ポリマー基板は、例えば、生分解性ポリマーであってよい。生分解性ポリマーフィルムは、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ＰＬＧＡ（乳酸とグリコール酸の５０：５０コポリマー）を含むポリ乳酸グリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）、ポリ乳酸ポリマー（ＰＬＬＡ）またはポリエチレングリコール／ポリ乳酸コポリマー（ＰＥＧ／ＰＬＡ）、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリホスファジン、およびそれらのブレンドおよびコポリマーを包含し得る。生分解性ポリマーフィルムの利用法は、例えば、ミコスら（Ｍｉｋｏｓ  ｅｔ  ａｌ）に付与された米国特許第５，５１２，６００号に見出されるであろう。
【００６３】
例えば、米国特許第５，５１２，６００号およびジョルダーノら（Ｇｉｏｒｄａｎｏ  ｅｔ  ａｌ）によるＪ．Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，第３４巻：８７〜９３ページ（１９９７年）に記載されている方法を用いて、健康な水晶体嚢、内境界膜、または他の膜組織をイン・ビトロおよびイン・ビボで維持し得る。ポリ乳酸ポリマー（ＰＬＬＡ）、ポリグリコール酸ポリマー、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリホスファジン、ＰＬＧＡ（例えば、乳酸とグリコール酸の５０：５０コポリマー）を含むポリ乳酸グリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）、およびポリエチレングリコール／ポリ乳酸コポリマー（ＰＥＧ／ＰＬＡ）フィルムを包含する生分解性（例えば、動物内に配置された後に分解する）ポリマーフィルムをプラスチックシャーレの底に配置し得る。次いで、水晶体嚢または他の膜組織をその表面に載せ、ピペットを用いて膜組織を伸ばす。膜組織とポリマーフィルムを一緒に移植する。ポリマーフィルムは、膜組織を残してイン・ビボで分解する。ポリマーフィルムによって膜組織の取扱いが非常に容易になる。例えば、ポリマーフィルムは、従来法で観察される問題である水晶体嚢の巻き返りを防止する。さらに、これらのステップ後に膜組織の更なる処理を適用してもよい。
【００６４】
水晶体嚢組織（または他の膜組織）は、組織培養インキュベーターまたは環境チャンバーなどの細胞成長に適した環境内に配置され得る。一実施形態において、水晶体嚢組織をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に浸漬し、３７℃で９５％Ｏ２−５％ＣＯ２雰囲気下に維持する。インキュベーション後、ＰＢＳを滅菌ピペットで除去し、水晶体嚢を滅菌シャーレの底に平らに置く。次いで、水晶体嚢をトリプシン−ＥＤＴＡに１時間浸して水晶体上皮細胞を除去した後、ペニシリン／ストレプトマイシンで３０分間滅菌する。次いで、水晶体嚢をＰＢＳで３回、その後、蒸留水で３回リンスする。リンスはそれぞれ滅菌ピペットを用いて慎重に行う。最後に、水晶体嚢とその水晶体嚢を入れたシャーレをＵＶ光下で少なくとも３時間滅菌する。
【００６５】
別の実施形態では、インターフェースチャンバーを用い、水晶体嚢組織（または他の膜組織）を、リン酸緩衝生理食塩水を充填した皿を覆う湿潤ろ紙の上に載せ、３７℃で９５％Ｏ２−５％ＣＯ２雰囲気下に維持する。ＰＢＳの代わりに重炭酸イオン緩衝生理食塩水または他の生理食塩水などの当業では公知の種々の生理食塩水を用い得ることが理解されよう。あるいは、この方法において、培地（例えば、ＲＰＭＩ、ＤＭＥＭまたはハムＦ１２（ラフテクノロジース社、米国メリーランド州所在（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＭＤ））など）を生理食塩水に追加するか、または生理食塩水と置き換えてもよく、成長因子、抗生物質、血清および他の物質を水晶体嚢組織の維持に用いられる生理食塩水または培地に添加してもよい。
【００６６】
組織修飾法にはバルク修飾法と表面修飾法がある。バルク修飾法には、組織の表面部分に限定されない組織の大部分を修飾する方法が含まれる。表面修飾法には、組織をその表面および表面近くで修飾するが、組織の他の部分は大きく修飾しない方法が含まれる。
【００６７】
水晶体嚢組織に適用される本発明の方法は、バルク修飾法であれ表面修飾法であれ、眼から水晶体嚢を取り出すことと、リン酸緩衝生理食塩水または他の適当な溶液に浸漬された滅菌ガラスまたはプラスチック基板、例えば、培養皿、顕微鏡スライドまたはガラスカバースリップ上に水晶体嚢を平らに広げることとを含み、その後、水晶体嚢の更なる処理が後続する。類似の処理を、内境界膜組織、ブルッフ膜、羊膜、または他の組織にも適用し得ることが理解されよう。
【００６８】
培養皿などのプラスチック基板や顕微鏡スライドなどのガラス基板は、紫外線照射、酸浸漬、その後の滅菌蒸留水中での反復洗浄などの標準手順、または当業では公知の他の手順によって滅菌し得る。さらに、プラスチックまたはガラス基板は、表面コーティングするか、または表面コーティングせずに使用し得る。表面コーティングは、コラーゲン、コラーゲンゲル、フィブロネクチン、ラミニン、ポリメチルシランなどのシランコーティング、ポリ−Ｌ−リジンなどのポリマーコーティング、または当業では公知の他のコーティングを包含し得る。
【００６９】
本発明の実施形態において、基板は膜組織に合わせて準備する。例えば、組織培養プラスチックは、７０％エタノール溶液でリンスして埃や油を取り除き、風乾する。風乾ステップ後、組織培養プラスチックを、所望の細胞外マトリックス分子を含有する溶液（例えば、ＰＢＳ中４ｍｇ／ｍｌのＩ型ラット尾コラーゲン、ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌのヒト胎盤由来ラミニン、またはＰＢＳ中２５μｇ／ｍｌのヒト血漿由来フィブロネクチン）（コラーゲンおよびフィブロネクチンは、シグマ社、米国ミズーリ州セントルイス所在（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し得る）で被覆し得る。１時間後、上記プラスチックを滅菌蒸留水で２回リンスし、ＵＶ下で一晩乾燥する。水晶体嚢基板は、直ちにスタンプされない場合には４℃で貯蔵される。
【００７０】
水晶体嚢組織などの膜組織を修飾するためのバルク修飾法には、水晶体嚢組織の厚さ、透過性および他の特性を修飾する方法が含まれる。バルク修飾法の一実施形態において、そのような追加処理には、エキシマレーザーを用いて、水晶体嚢表面の全厚を減少させるように嚢表面を融除する処理が含まれる。例えば、水晶体嚢は、全厚がブルッフ膜の厚さに似たものになるように、レーザーもしくはイオンビーム、または機械的方法で融除され得る。
【００７１】
水晶体嚢表面のアブレーションに有効なレーザー光パルスを得るに、エキシマレーザー（例えば、フッ化アルゴンレーザー（ラムダフィジック社（Ｌａｍｂｄａ  Ｐｈｙｓｉｋ），Ｍｏｄｅｌ  ２０１Ｅ））などのレーザーを用い得る。例えば、約１〜５０Ｈｚの周波数、１平方センチメートル当たり約３００〜５００ミリジュール（ｍｊ／ｃｍ２）のパルスエネルギー密度で放出される持続時間約１０〜２０ｎｓのパルスは、水晶体嚢表面を所望のように融除するのに有効である。各パルスは、組織を約５〜５０ミクロンの深さまで融除するのに有効である。したがって、反復パルスは水晶体嚢組織の厚さを所望の全厚まで減少させるのに有効である。角膜に適用されているような方法をその後に用いるか、適合させてもよく、それらの方法は水晶体嚢組織のフォトアブレーションに適している。そのような角膜フォトアブレーション法は、例えば、レスペランス（Ｌ’Ｅｓｐｅｒａｎｃｅ）に付与された米国特許第４，６６５，９１３号、ホーラ（Ｈｏｈｌａ）に付与された米国特許第５，６３４，９２０号およびトロケル（Ｔｒｏｋｅｌ）に付与された米国特許第５，７３５，８４３号に開示されている。
【００７２】
バルク修飾法の別の実施形態において、ガラス基板上に組織を配置した後の上記追加処理には、例えば、ＹＡＧレーザーなどのレーザーを用いて水晶体嚢に微孔を形成する処理が含まれる。そのような微孔形成によるバルク修飾により、水晶体嚢組織は細胞付着のためにより好ましい基板となるように変化され、かつ水晶体嚢組織の生物化学的特性は組織を介した体液および溶質の交換をより容易にし得るように変化される。本発明の実施形態において、微孔は、直径が数十ナノメートル（ｎｍ）以下のオーダーのサイズである。したがって、バルク修飾法によって形成される微孔は、サイズが、約０．０１〜約１０ミクロン、好ましくは、約０．１〜約１ミクロンの範囲であり得る。エルビウムＹＡＧレーザーを用いて、本発明の方法に従って水晶体嚢組織に孔を融除するのに有効な、持続時間が約１０〜５０ｎｓ、エネルギーレベルが約１〜５０ｍｊ、好ましくは約１〜約２０ｍｊのパルスを得ることができる。
【００７３】
バルク修飾法の別の実施形態において、ガラス基板上に膜組織を配置した後の上記追加処理には、水晶体嚢を細胞付着のためにより好ましい基板とするように、また、水晶体嚢組織を介した体液および溶質の交換をより容易にし得るように、イオンビームを用いて水晶体嚢に微孔を形成する処理が含まれる。例えば、ゴプラーニら（Ｇｏｐｌａｎｉ  ｅｔ  ａｌ），Ｊ  Ｍｅｍｂｒ．Ｓｃｉ．第１７８巻：９３〜９８ページ（２０００年）、スーら（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ），Ｍａｔｅｒｉａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  第５４０巻，“Ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ｉｎ  Ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ”，２５５〜２６０ページ（１９９９年）、およびオオミチら（Ｏｈｍｉｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ），Ｊ．Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  第２４８巻：３５４〜３５９ページ（１９９９７年）参照されたい。本発明の実施形態において、微孔は、直径が数十ｎｍ〜数Ｔｍのオーダーのサイズである。
【００７４】
膜組織はイオンビームに暴露するためにフリーズドライされ得る。これに代わって、膜組織を全体を完全に乾燥させ、次いで、微孔形成後に再水和してもよい。組織の照射には、イオンビーム、例えば、Ｓｉ２８イオンの１２０ＭｅＶビームを用い得る。イオンビームに暴露した後、膜組織を再水和し得る。より大きな微孔が望ましい場合には、以下に説明するようなコラゲナーゼおよび他のプロテアーゼまたはタンパク質分解酵素を用いる生物学的エッチングを用いて微孔を拡大させ得る。
【００７５】
バルク修飾法の別の実施形態において、膜組織の処理には、膜組織の表面および内部を生物学的にエッチングして組織に所望のトポロジーおよび表面付着性を与えるのに有効なタンパク質分解酵素を膜組織上に被着させる処理が含まれる。この方法のいくつかの実施形態において、被着ステップには、水晶体嚢または他の膜組織を、組織の表面または内部を生物学的にエッチングするのに有効な酵素を担持するマイクロコンタクトプリンティングスタンプと接触させるステップが含まれる。組織上に酵素をスタンプした後、所与の時間後にアルブミンまたは酵素阻害剤を用いて反応を停止させ得る。例えば、コラゲナーゼとのインキュベーションは、最大２６時間までの種々の時間、恒温水浴中２０℃で実施し、ＥＤＴＡを５０ｍＭの最終濃度まで添加してコラゲナーゼ反応を停止するのが好ましい。トリプシン（例えば、カルシウムまたはマグネシウムを含まない平衡塩溶液中０．２５％のトリプシン）とのインキュベーションは、約０〜５℃で約６〜約１８時間にわたって実施され得る。このトリプシンとのインキュベーション後、トリプシン溶液を除去し、膜組織を３７℃で２０〜３０分インキュベートしてから、約１〜約５ｍＭの量の（カルシウムおよびマグネシウムなどの）２価カチオンを含有する（場合により、ダイズトリプシンインヒビターなどのトリプシンイン阻害剤を含有する）洗浄液で洗浄し得る。あるいは、膜組織を、実質的に２価カチオンを含まない平衡塩溶液中３７℃で最大数時間、ディスパーゼ（約０．５〜約３Ｕ／ｍｌ）または他のタンパク質分解酵素と共にインキュベートしてから、溶液を除去し、約１〜約５ｍＭの２価カチオンを含有する平衡塩溶液で膜組織を洗浄し得る。
【００７６】
バルク修飾法の実施形態において、例えば、コラゲナーゼ、キモトリプシン、ディスパーゼ、リベラーゼ、サーモリシン、ペプシン、パパインおよび他のプロテアーゼなどの作用物質は、蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水または他の緩衝溶液中約０．０１〜約１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約１〜約２０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度の溶液としてマイクロコンタクトプリンティングスタンプの表面に塗布され得る。水晶体嚢組織などの組織の表面は、空中または生理食塩水に浸漬された状態で接触させ得る。トリプシンの場合のようにプロテアーゼがカルシウムの不在下に活性である場合、溶液にはＥＤＴＡおよびＥＧＴＡなどのキレート剤が約１〜約１０ｍＭの濃度で含まれ得る。そのような場合、所望のときにカルシウムおよび／またはマグネシウムを溶液に添加して酵素作用を停止させ得る。いずれの場合にも、酵素作用は、過剰な酵素無添加溶液で希釈するか、または適切な酵素阻害剤を添加することにより停止され得る（例えば、トリプシンは、ダイズトリプシンインヒビター（Ｔ−９００３、シグマケミカルカンパニー、米国ミズーリ州セントルイス所在（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））などのトリプシン阻害剤によって阻害され得る）。
【００７７】
バルク修飾法の別の実施形態において、内境界膜または水晶体嚢組織の処理には、レーザー光照射で活性化される不活性化された酵素、例えば、不活性化コラゲナーゼ酵素を組織に含浸させる処理が含まれる。例えば、一実施形態では、組織の直径１ミクロン未満のサイズの極めて小さい領域を２フォトン共焦点レーザーシステムで照射して活性化させる。このようにして活性化された酵素は、活性化が生じた小領域の組織を分解または変化させるのに有効であるが、共焦点レーザーシステムで活性化されていない隣接領域は不変に保たれる。活性化酵素は、水によって、流し出されるか、または不活性化され得る。本発明の実施に適した酵素としては、コラゲナーゼ、トリプシン、キモトリプシン、ディスパーゼ、リベラーゼ、パパイン、ペプシン、サーモリシンおよび他のプロテアーゼがあるが、それらには限定されない。
【００７８】
表面修飾法の一実施形態では、マイクロコンタクトプリンティング法を用いて、組織上に生体分子の化学的微細パターンを形成する。例えば、水晶体嚢組織の表面修飾は、水晶体嚢組織上に生体分子のパターンを被着させることを含み得る。そのようなパターンは、幾何学的または線形パターンの繰返し反復、または、小さいパターンユニットから構成されているのではなく、数個のパターン、もしくは一個のパターンを包含し得る。したがって、表面修飾パターンは、組織表面上に被着した生体分子の線形配列もしくは生体分子の曲線配列、生体分子のリングもしくはドットなどの一連の円形パターン、または生体分子の単一パターン内の複数形状を含む一連の他の形状を包含し得る。あるいは、そのようなパターンは、被着した生体分子で実質的に覆われた広範囲領域、または被着した生体分子を実質的に欠く広範囲領域を含み得る。これらの方法には、線、形物、または被着した生体分子を有する領域間に位置する被着分子を欠く領域を含む被着分子領域を含む任意の適当なパターンが含まれることが理解されよう。そのような微細パターンは、一般には、修飾膜表面上の細胞の付着および成長を増進させ得る。しかしながら、本発明の実施形態においては、微細パターンは、修飾膜組織の複数の領域が細胞の付着および成長にあまり適していないか不適とされる場所に形成される。このように、細胞の付着および成長は、膜組織のそのような処理が施されていない領域に指向され、その領域に限定される。
【００７９】
マイクロコンタクトプリンティングスタンプは、標的組織上に被着させるべき全パターンを有するか、所望パターンの一部を有し得る。スタンプが所望パターンの一部を有する場合には、組織表面にマイクロコンタクトプリンティングスタンプを複数回当てることが組織表面上に所望パターンの生体分子を被着させるのに有効である。スタンプが全パターンを有する場合、マイクロコンタクトプリンティングスタンプ自体上に生体分子が所望パターンで被着され得る。
【００８０】
マイクロコンタクトプリンティングスタンプ上の生体分子パターンは、スタンプ上に生体分子を有向配置することによって決定されるか、またはスタンプの表面構造によって決定され得る。生体分子パターンがスタンプの表面構造で決定される場合、その構造パターンは局所的に隆起した突条を有する。スタンプと生体分子源とを接触させることは、そのような生体分子を隆起した表面上に被着させるために有効であり、他の隆起していない表面部分には生体分子は実質的にまったく被着しない。そのようなマイクロコンタクトスタンプの場合、組織上に被着させる生体分子パターンは隆起した表面のパターンに従うであろう。あるいは、パターンは、表面に形成された引っ掻き傷のような、凹部、溝または割れ目を有し、スタンプと生体分子源とを接触させることは、そのような生体分子を表面の主要部分上に被着させるのに有効であり、表面の凹んだ部分には生体分子は実質的にまったく被着しない。そのような凹部を有するマイクロコンタクトスタンプの場合、生体分子は、組織の大部分に被着し、被着した生体分子を実質的に有さない領域は凹部表面のパターンに従うであろう。
【００８１】
この方法のいくつかの実施形態において、パターンは数ミクロン以下のオーダーのサイズである。したがって、本発明の表面修飾法の実施形態では、パターン全体を構成する個々のパターンは、約０．１〜約２０ミクロン、好ましくは、約０．５〜約５ミクロンの範囲のサイズであろう。
【００８２】
組織表面上に被着させるのに適した生体分子としては、コラーゲン、ヒアルロン酸、ケラチン硫酸（ｋｅｒａｔｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）、グリコサミノグリカン、メチルアクリレート、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリスチレン、ポリ（メチルスチレン）、ポリリジン、ポリ乳酸グリコール酸（ＰＬＧＡ）誘導体化ポリリジン、ポリリジン、ポリリジンペプチド、およびオクタデシルトリクロロシラン（ＯＴＳ）などのシランポリマーを含むがそれらには限定されない、タンパク質、ペプチド、有機分子、オリゴ糖および短鎖ポリマーがある。生体分子の被着を含む表面修飾は、組織の生物特性、例えば、微細加工組織上に配置された細胞の付着能または付着し易さを変更するのに有効である。例えば、疎水性分子の被着は、水晶体嚢組織上の選択的細胞付着部位を不活性化するのに有効である。
【００８３】
マイクロコンタクトプリンティングスタンプは、適当なパターンを保持し得る任意の材料、例えば、ガラス、セラミック、金属、プラスチック、ポリマーまたは他の材料で形成され得る。この方法の好ましい実施形態において、マイクロコンタクトプリンティングスタンプには、市販されているポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）（例えば、ダウコーニング社、米国ミシガン州４８６４０，ミッドランド所在（Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＭＩｄｌａｎｄ  ＭＩ  ４８６４０）製のＳｙｌｇａｒｄ（登録商標）１８４）が含まれる。マイクロコンタクトプリンティングスタンプは、例えば、グリッド線パターンなどの所望パターンを有するマスターからＰＤＭＳで成型され得る。あるいは、形成すべきパターンが組織上への生体分子の被着パターンによって決定される場合、スタンプは、生体分子の保持に適した単純な表面、例えば平坦表面を有し得る。そのようなスタンプは、例えば、ピン、スロットピン、バーまたはロッドを備え、円形、三角形、正方形、矩形、他の多角形または異形外周を有し得る。
【００８４】
表面修飾法の実施形態において、水晶体嚢組織の表面の全体ではなく一部を被覆するようにマスクし、次いで、組織の露出部分の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を変性させるのに有効な紫外（ＵＶ）線を照射する。これにより細胞付着に特異的な分子が不活性化されて、露出領域では細胞の付着または成長が阻害または阻止されるが、被覆領域では細胞の付着または成長は阻害または阻止されない。したがって、本発明の方法のこの実施形態においては、基板の複数の部分が細胞の付着および成長に不適とされる。このように、成長する細胞を非所望領域を避けて所望領域に指向させることができる。
【００８５】
本発明の実施形態において、基板表面全体を細胞の付着または成長を阻止するように不活性化し、次いで、特異的領域を再活性化してもよい。細胞付着に特異的なタンパク質を不活性化することにより、細胞の成長を限定領域に制限し得る。不活性化物質は、成長細胞の付着もしくは広がり、または付着と広がりの両方を防止する物質である。例えば、０．２％ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）溶液および粘質物（ｍｕｃｉｌａｇｅ）は有効な不活性化物質である。
【００８６】
不活性化物質を塗布して表面を不活性化し、その表面の一部を再活性化し得る。例えば、水晶体嚢表面に塗布された０．２％ＰＶＡは水晶体嚢表面の不活性化に有効である。不活性化水晶体嚢表面をエキシマレーザーからの光の微細パターンに暴露することは、水晶体嚢表面上に微細パターンを融除するのに有効である。例えば、照射マスクを介して水晶体嚢表面を照射して水晶体嚢表面に微細パターンを形成し得る。融除された微細パターンは、不活性化物質を除去するか、または変性させて細胞の成長および融除領域への広がりを可能にする基板部分を再活性化することによって、細胞成長を所望のパターンに従うように指向させる。
【００８７】
マスキングステップは組織上にグリッドを配置するステップを包含し得、グリッドは、ＵＶ線などの放射線源による表面照射を防止するのに有効な材料を含む。グリッドは、金属、ガラス、プラスチック、セラミック、ポリマー、タンパク質、またはＵＶ線の吸収または反射に有効な他の材料を含む材料から形成され得る。
【００８８】
マスキング法の代替実施形態において、マスキングステップは、マイクロコンタクトプリンティング法を用いて、水晶体嚢組織表面上に、保護分子で被覆された領域のＥＣＭ変性を防止する保護分子パターンを被着させるステップを包含する。したがって、マスキングステップのグリッドは、表面を照射から遮蔽するために有効な表面コーティングを有し得る。そのようなコーティングは、タンパク質、好ましくは、紫外光を吸収するチロシンおよびアミノ酸残基に富むもの、紫外光の吸収に有効なポリマー、または、例えば、パラアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）などの紫外光の遮蔽に有効な小分子を含み得る。
【００８９】
表面修飾法およびバルク修飾法をそれぞれ単一組織に適用し得ることが当業者には理解されよう。したがって、例えば、同一の水晶体嚢組織を、微細加工水晶体嚢組織を得るのに有効である表面修飾法とバルク修飾法とで処理してもよい。
【００９０】
微細加工組織は細胞成長に適した基板である。微細加工組織上で細胞を成長させる方法は、上述の方法の１つで作製された微細加工組織を得るステップと、微細加工組織に細胞を付与するステップを含む。例えば、微細加工組織は、その表面上に、コラーゲンパターンなどのパターンを有する微細加工水晶体嚢を包含し、細胞は、ＩＰＥ細胞、ＲＰＥ細胞、幹細胞、または他の細胞を包含し得る。自己組織および細胞を有する本発明の好ましい実施形態において、微細加工組織と細胞は同一動物から得られる。
【００９１】
本発明はさらに、微細加工組織の利用法を提供し、この方法は、動物に微細加工組織を移植する外科的方法を含む。好ましい実施形態において、動物に微細加工組織を移植する方法には、動物の眼に微細加工組織を移植する外科的方法が含まれる。最も好ましい方法において、動物の眼への微細加工組織の移植は、微細加工水晶体嚢組織を動物の網膜内またはその近くに移植することを含む。いくつかの実施形態において、移植組織は、微細加工水晶体嚢組織上で成長させた細胞をさらに有する。他の実施形態では、移植組織は、微細加工水晶体嚢組織上で成長させたＲＰＥ細胞、ＩＰＥ細胞、幹細胞または他の細胞を有する。これに代わって、移植用細胞を成長させるために分解性ポリマー基板を用いてもよい。さらなる実施形態において、移植組織は、微細加工膜組織または分解性ポリマー基板上で成長させたＲＰＥ細胞、ＩＥＰ細胞、幹細胞または他の細胞を有し、細胞と組織は、それらが移植される動物と同一の動物から採取される（自己組織）。
【００９２】
眼からＲＰＥ細胞を分離または取り出す方法は、フェファー  ビー  エイ（Ｐｆｅｆｆｅｒ，Ｂ．Ａ．），第１０章，“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  Ｍｏｎｋｅｙ  Ｒｅｔｉｎａｌ  Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ，”Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｒｅｔｉｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，第１０巻，Ｅｄ．Ｏｓｂｏｒｎ，Ｎ．およびＣｈａｄｅｒ（１９９１年）に見出され得る。これらの方法はＩＰＥ細胞にも適用され得る。細胞は、ドナーの眼から、または、最終的に細胞を有する微細加工組織移植片を受容するであろう眼を含む患者の正常な眼から取り出され得る。自家移植手順に関して、生検で得られた細胞を収穫する方法は、レーン  シーら（Ｌａｎｅ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ）  Ｅｙｅ  第３巻：２７〜３２ページ（１９８９年）で見出されるであろう。さらなるＲＰＥおよびＩＰＥ調達法は、例えば、アベら（Ａｂｅ  ｅｔ  ａｌ），１９９９年；サマンら（Ｔｈｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ），１９９９年；ラパスら（Ｌａｐｐａｓ  ｅｔ  ａｌ），２０００年；およびサーマンら（Ｔｈｕｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ），２０００年に見出されるであろう。
【００９３】
ＩＰＥ細胞、ＲＰＥ細胞、幹細胞または他の細胞は、リン酸緩衝生理食塩水などの生理食塩水中に、約１０４〜約１０７細胞／ｍｌの密度で分散され得る。単離されたＲＰＥ細胞、ＩＰＥ細胞、幹細胞または他の細胞は、それらのＩＰＥ細胞、ＲＰＥ細胞、幹細胞または他の細胞を含有する溶液をＰＢＳに浸漬した微細加工組織上にゆっくりピペットで加えることによって、微細加工組織、例えば微細加工水晶体嚢組織に付与され、次いで、細胞と組織を３７℃で滅菌９５％Ｏ２−５％ＣＯ２雰囲気下に１２時間維持され得る。滅菌ピペットでＰＢＳを除去し、水晶体嚢を滅菌シャーレまたは他の容器の底に平らに置く。次いで、水晶体嚢をトリプシン−ＥＤＴＡ中に１時間浸漬して水晶体上皮細胞を除去した後、ペニシリン／ストレプトマイシンで３０分間殺菌し得る。この後、水晶体嚢をＰＢＳ中で３回、次いで蒸留水中で３回リンスし得る。各リンスは滅菌ピペットを用いて慎重に行う必要がある。最後に、水晶体嚢とその基板をＵＶ光下で少なくとも３時間滅菌する。
【００９４】
水晶体嚢、内境界膜、ブルッフ膜および他の膜などの微細加工組織は、細胞を付与する前に、上述のように修飾して微細加工され得る。そのような修飾や微細加工に代えて、またはそれらに加えて、修飾すべき膜表面上に微細流路または微細流路パターンを形成して、膜表面に細胞または分子の懸濁液を送出してもよい。例えば、膜を修飾するために、本明細書に全文が文献援用されるデラマルシュら（Ｄｅｌａｍａｒｃｈｅ  ｅｌ  ａｌ）（Ｓｃｉｅｎｃｅ  第２７６巻：７７９〜７８１ページ（１９９７年））により記載されているような微細流路を膜表面に形成し得る。そのような手順において、ＰＤＭＳまたは他の生体適合性材料に１つの溝または一連の溝を形成し得る。その溝は、膜表面上にＰＤＭＳを配置すると導管を形成するように構成されており、膜表面は導管壁としての働きをする。細胞もしくは生体分子を含有する溶液、または細胞および生体分子を共に含有する溶液を導管に流すことによって、細胞または生体分子を膜表面に接触させ得る。このように、細胞および生体分子は、導管の壁を構成する膜の露出表面上に被着するか、または同露出表面を修飾し得る。
【００９５】
単離されたＲＰＥ細胞、ＩＰＥ細胞または他の細胞は、ステンシルで部分的に被覆された膜組織にも付与され得る。本発明の実施に適したステンシルは、その表面を貫通する孔または通路パターンを有するように構成されている。そのようなステンシルが膜組織に貼り付けられると、該ステンシルは下にある膜組織を被覆するが、孔または通路パターンは、下にある膜組織部分を露出させたままにするのに有効である。組織微細加工用ステンシルは、機械的強度を得やすくするために、ステンシルの体積より厚いリムを有し得る。そのような孔または通路パターンを有するステンシルは、微細加工すべき膜組織の表面に貼り付けられて、膜組織上での細胞成長を指向させたり、または外部作用物質および処理に対する膜組織の露出量を調節したりするのに有効であり得る。この方法のいくつかの実施形態において、孔または通路パターンは、２、３ミクロン以下のオーダー、または５、６ミクロンのオーダーのサイズであり得、したがって、パターンは、約０．１〜約１００ミクロン、好ましくは約１〜約７５ミクロン、より好ましくは約５〜約５０ミクロンの範囲のサイズであろう。ステンシルは、例えば、ＰＤＭＳまたはＰＬＧＡ／ＰＥＧコポリマーなどの任意の適当な生体適合性材料から形成され得る。適当なステンシル材料は、固体またはゲル状であってよく、柔軟であることが好ましい。ステンシル材料は、生分解性（例えば、ＰＬＧＡ／ＰＥＧコポリマー）であってもよい。動物の眼に移植するための膜組織に用いるのに適したステンシルは、例えば、本明細書にその全文が文献援用されるフォルチら（Ｆｏｌｃｈ  ｅｔ  ａｌ）  Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．第５２巻：３４６−３５３ページ（２０００年）に記載されているものと類似の方法で形成され得る。
【００９６】
微細加工水晶体嚢組織の網膜下腔への移植は、網膜下腔へのアクセスを提供する任意の手段によって実施され得る。網膜下腔へのアクセスは、例えば、目の側部の強膜切開によるか、それより前部の切開により硝子体液を介して行う。網膜下腔を含む網膜へのアクセスまたは網膜への移植手順が記載されている。例えば、アベら（Ａｂｅ  ｅｔ  ａｌ），Ｔｏｈｏｋｕ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．第１８９巻：２９５〜３０５ページ（１９９９年）、アベら，Ｔｏｈｏｋｕ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．第１９１巻：７〜２０ページ（２０００年）、ラパスら（Ｌａｐｐｓ  ｅｔ  ａｌ），Ｇｒａｅｆｅｓ’ｓ  Ａｒｃｈ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．第２３８巻：６３１〜６４１ページ（２０００年）、サマンら（Ｔｈｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ），Ａｒｃｈ，Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．第１１８巻：１３５０〜１３５５（２０００年）、ヒューズ（Ｈｕｇｈｅｓ）に付与された米国特許第５，９６２，０２７号およびリュー（Ｌｉｕ）に付与された米国特許第６，０４５，７９１号参照されたい。
【００９７】
代替例として、マイクロコンタクトプリンティングスタンプまたはステンシルは、イン・ビボで眼球膜に適用され得る。例えば、正常な生体眼のブルッフ膜へのアクセスは、眼の網膜下腔に、ガス、生理食塩水、鉱油、または他の生体適合性液体を注入してブレブ（ｂｌｅｂ）を生成させ、ブルッフ膜上にマイクロコンタクトプリンティングスタンプまたはステンシルを配置することを含む標準的な外科的手順により得られる。そのようなマイクロコンタクトプリンティングスタンプまたはステンシルの適用は、湿式、すなわち、正常な体液、ＰＢＳもしくは他の人工生理溶液、鉱油、または他の生体適合性液体の存在下で実施され得る。これに代わって、そのようなマイクロコンタクトプリンティングスタンプまたはステンシルの適用を、乾式、すなわち、正常な体液または人工生理溶液の不在下で、例えば、網膜下腔を窒素またはアルゴンなどの不活性ガスで満たして実施してもよい。
【００９８】
スタンプまたはステンシルを適用する前にブルッフ膜をすくい取るかまたは創面切除してＲＰＥ細胞を取り出すことによって、正常なブルッフ膜をイン・シトゥで微細加工するために準備され得る。次いで、スタンプまたはステンシルを用いて、ブルッフ膜表面上に所望のパターンを形成し得る。例えば、通路パターンを有するＰＤＭＳステンシルをブルッフ膜の表面に貼り付ける。細胞は、通路によって露出された膜表面上に付着して成長することができる。同様に、膜表面に触れた溶液中の生体分子は、通路によって露出された膜表面に接触して、膜表面を修飾するか、膜表面に付着することができる。通路パターンは、生体分子の被着、および付加細胞、例えば、ＲＰＥ細胞、ＩＰＥ細胞、幹細胞、もしくは他の付加細胞の成長、または眼の他領域由来の内生細胞の再生を指向させるのに適したパターンを提供するのに有効である。あるいは、またはそれに加えて、ラミニン、フィブロネクチン、または他の所望コーティング物質を担持するマイクロコンタクトプリンティングスタンプを眼球膜表面に当ててもよい。本発明の特徴を具体化するさらなる代替法において、眼球内膜は、例えば、強膜穿刺、強膜切開、強膜窓の形成、または他の方法などによって、強膜を介してアクセスされ得る。強膜アクセスを利用する方法においては、治療のために眼球膜にアクセスすることを目的として硝子体液を横切る必要がないであろう。
【実施例】
【００９９】
（実施例１）
マイクロコンタクトプリンティングを用いて、水晶体嚢組織上にミクロンサイズの生体分子パターンを被着させた。５０ミクロン間隔のグリッド線トポロジーパターンを有するマスターからポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）スタンプを成型した。ＰＤＭＳスタンプはシリコンウエーハを微細加工したマスターから形成した。ＰＤＭＳスタンプを用いて、水晶体嚢組織上にパターンを微細加工した。図１に示されているのは、ヒト水晶体嚢組織片上に微細パターンを被着させるのに用いたＰＤＭＳスタンプの走査型電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）である。
【０１００】
図２に示されているＰＤＭＳスタンプは、５μｍ幅の線の六角形配列によって形成された表面トポロジーを有する。各線は約５０μｍ間隔である。図３は、図１に示されているＰＤＭＳスタンプを当てたヒト水晶体嚢を示している。ＰＤＭＳスタンプを用いて、水晶体嚢上にＰＶＡとフルオレセインの溶液（２％ＰＶＡおよび０．１ｍｇ／ｍｌフルオレセイン）の六角形パターンを被着させた。この実施例は、ＰＤＭＳスタンプがそのパターンに対応するパターンを表面に形成するために有効であることを示している。
【０１０１】
（実施例２）
図４には組織の微細パターン化に用いる円形パターンを有するＰＤＭＳスタンプのＳＥＭが示されている。示されているように、このスタンプは、直径約５０μｍの円形ウエル配列によって形成された表面トポロジーを有する。この隆起パターンをＰＶＡまたは粘質物などの抑制分子でコーティングし、水晶体嚢に当てると、抑制分子は示されているパターンで水晶体嚢に転写される。図５は、図２に示されているようなパターンとその上で成長したＲＰＥ細胞を有するＰＤＭＳスタンプでパターン化された水晶体嚢表面を示している。この実施例は、ＰＤＭＳスタンプが、そのパターンに対応するパターンを水晶体嚢表面上に被着させ、スタンプのパターンに従って細胞成長をパターン化するのに有効であることを示している。
【０１０２】
したがって、本発明のスタンプを当てることによって、パターン化基板上で成長する細胞の成長を指向させ得るパターンで抑制分子を被着させることができる。水晶体嚢は成長を活発にさせるので、ＰＶＡなどの抑制分子パターンはパターン化成長に好ましい。成長を抑制するように処理された基板上でスタンプを使用するには、基板上での成長をパターン化する活性化分子を用いる必要があろう。
【０１０３】
（実施例３）
水晶体嚢組織表面をマスキングし、次いでマスクされていない露出表面をＵＶ線で照射するステップは、水晶体嚢組織表面上にＳＥＭグリッドを配置することによって達成される。５０ミクロン間隔のＳＥＭグリッドを、リン酸緩衝生理食塩水に浸漬したガラスカバースリップ上に置かれた切除水晶体嚢組織の露出表面上に配置する。水晶体嚢組織表面とＳＥＭグリッドはリン酸緩衝生理食塩水には浸漬されず、リン酸緩衝生理食塩水の水位より上方に出ている。ＵＶ光をＳＥＭグリッド材料の真下に位置していない水晶体嚢組織を照射するのに有効な水晶体嚢組織の露出表面上に向ける。照射後、ＳＥＭグリッドを除去する。水晶体嚢表面は、照射された組織からなる領域を取り囲む照射されていない組織（ＳＥＭグリッド材料下の領域）からなる線の微細パターンを有する。
【０１０４】
（実施例４）
網膜色素上皮細胞および虹彩色素上皮細胞の単層培養細胞の成長は、基板が平らであること、および眼の網膜下腔または他の領域に移植されたときに基板の巻き返りや折れ曲がりを確実に無くすことによって容易になる。生分解性マトリックスコーティングは、水晶体嚢組織の折れ曲がりや巻き返りを防止することが判明した。そのような基板の巻き返りや折れ曲がりを防止する生分解性マトリックスコーティングは、眼に移植するための網膜色素上皮細胞および虹彩色素上皮細胞の単層培養細胞を成長させるための基板として用いるのに適している。
【０１０５】
５０ｍｇのポリ（ｄｌ−ラクチド／グリコリド）９０：１０混合物（ポリサイエンシーズインコーポレイティッド社、米国ペンシルベニア州１８９７６  ウォーリントン所在（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ＰＡ  １８９７６））を種々の量のジクロロメタンに溶かして、１００ｍｇ／ｍｌ（０．５ｍｌのジクロロメタン）、１５０ｍｇ／ｍｌ（０．３３ｍｌのジクロロメタン）、および２００ｍｇ／ｍｌ（０．２５ｍｌのジクロロメタン）の溶液を作って、ポリ（ｄｌ−ラクチド／グリコリド）の生分解性ポリマーマトリックスを調製した。
【０１０６】
リン酸緩衝生理食塩水中４℃で貯蔵しておいた白内障手術時に得たヒト水晶体嚢を、紫外光下で滅菌（２５４ｎｍで３時間）し、３７℃で１０分間０／０５％トリプシン−（エチレンジアミン四酢酸）で処理して水晶体上皮細胞を除去した。処理した水晶体嚢をシャーレに入れたＰａｒａｆｉｌｍ（登録商標）（ペチネープラスチックパッケイジングインコーポレイティッド社、米国ウィスコンシン州  ５４９５６  ニーナ所在（Ｐｅｃｈｉｎｅｙ  Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｅｎａｈ，ＷＩ  ５４９５６））上に単層となる様に拡げ、５μｌ、１０μｌまたは２０μｌのポリ−ｄ−ラクチルグリコール酸（ＰＬＧＡ）溶液をピペットから水晶体嚢上に分与することによって、その片面を単一濃度のポリ−ｄ−ラクチルグリコール酸（ＰＬＧＡ）生分解性マトリックスで被覆した。ＰＬＧＡ溶液を平らにした水晶体嚢を含む直径５ｍｍの円形領域に広げた。化学フード内で溶剤を蒸発させた。
【０１０７】
体重２．５〜３．５ｋｇのニュージーランドホワイトウサギ５匹をケタミン（４０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した後、ウサギに水晶体嚢／ＰＬＧＡ複合体を移植した。左眼の結膜嚢にトロピカミド０．５％およびフェニレフリン２．５％の点眼薬を５分ごとに３滴（ｔｈｒｅｅ  ｄｏｓｅ）ずつ滴下した。標準的な３ポート扁平部硝子体切除術を実施し、４２ゲージ針を介して約０．５ｍｌの平衡塩溶液を注入して、黄斑部の網膜ブレブ（ｒｅｔｉｎａｌ  ｂｌｅｂ）を膨脹させた。直径１ｍｍの網膜切開部を形成し、網膜下鉗子を用いて網膜切開部を介して網膜下腔に水晶体嚢／ＰＬＡＧＡを挿入した。次いで、空気−流体交換により網膜を再付着させた。
【０１０８】
手術した眼を水晶体嚢／ＰＬＡＧＡ移植の１週間後に取り出し、カコジレートバッファー（ｐＨ７．４）中１．２５％グルタルアルデヒド／１％パラホルムアルデヒド中で固定した。次いで、眼を切り開き、固定し、四塩化オスミウム中で後固定し、段階的エタノール系列で脱水して、エポキシ樹脂に埋め込み、１μｍ切片に切断して、トルイジンブルーで染色した。
【０１０９】
着床後１週間で実施した組織学的研究により、水晶体嚢がブルッフ膜上で平らなままであることが実証された。これは、図７に示されている移植１週間後に採取された水晶体嚢／ＰＬＧＡ移植片を有するウサギ網膜の切片によって示されている。恐らく前にブレブで占められていたと思われる領域に、光受容層の局所的破壊およびその上の網膜の剥離があった。いずれの場合も、ＰＬＧＡはほぼ完全に分解した。５匹に対する移植によって、ＰＬＧＡでコーティングした水晶体嚢が、手術時に操作しやすく、かつ移植片を網膜下腔内で平らなままに維持するのに十分な剛性を有することが証明された。有意な炎症性反応の徴候は認められなかった。
【０１１０】
この実施例は、ＰＬＧＡによって、網膜下移植時の水晶体嚢の手術操作が大きく改善されると共に、水晶体嚢を巻き返らせることなく移植し得ることを示している。処理しなかった水晶体嚢は、移植中に丸まって多重層になったり、折り畳まれたりすることがあるのに対し、この実施例で用いたＰＬＧＡコーティングなどの生分解性マトリックスコーティングで処理した水晶体嚢は移植後に網膜下腔で比較的平らに保たれる。ＰＬＧＡは数週間内に分解するので、移植片に対する遅発型免疫反応の心配が少ない。コーティングされた微細加工水晶体嚢の改良された機械的特性を示すこの実施例は、水晶体嚢、内境界膜、ブルッフ膜および他の組織などの微細加工組織をコーティングすることによって、非処理組織の機械的弱さの限界が克服され、組織および細胞移植用の改良型基板が得られることを示している。
【０１１１】
（実施例５）
１つのＡＭＤ療法は、ＲＰＥ細胞またはＩＰＥ細胞の懸濁液を移植して病変網膜を救済する方法である。本発明は、ＩＰＥ細胞、ＲＰＥ細胞、幹細胞および他の細胞などの細胞移植用基板として自己ヒト組織を精密加工する新規な組織工学技術を提供する。適当な組織としては、膜組織、例えば、水晶体嚢（例えば、ヒト水晶体嚢）、内境界膜組織、ブルッフ膜組織、角膜組織、羊膜組織、漿膜組織、粘膜組織、および神経組織が挙げられる。
【０１１２】
適当な基板の表面上に抑制分子のマイクロジオメトリーを配置する。適当な基板には、ヒト水晶体嚢、コラーゲンゲル、コラーゲン被覆プラスチック、フィブロネクチン被覆プラスチックおよびラミニン被覆プラスチック、並びにＰＬＧＡまたはＰＬＬＡなどの分解性ポリマーが含まれる。ヒト水晶体嚢は白内障手術時に得られる。これらの微細加工表面上で実験用ＲＰＥ細胞の培養物を成長させ、走査型電子顕微鏡、原子力顕微鏡、および蛍光顕微鏡を用いて分析する。次いで、自己組織の微細加工表面と人工の表面および膜との比較を行う。
【０１１３】
これらの比較によって、個々のＲＰＥ細胞がそれぞれの生物学的表面上の微環境で成長するように指向されることが実証される。ヒト水晶体嚢を含む研究したすべての表面は微細加工の影響を受けやすいが、種々の組織工学技術を用いて、細胞間間隔や、成長因子および細胞付着分子の微環境を変え得ることが理解されよう。
【０１１４】
（実施例６）
この実施例では、単離されたＲＰＥ細胞を、ステンシルで部分的に被覆された水晶体嚢膜組織に付与し、水晶体嚢上でのＰＲＥ細胞の成長をステンシルパターンに従って指向させる。リン酸緩衝生理食塩水に浸漬したガラスカバースリップ上に載せられた摘出水晶体嚢組織上にフィブロネクチン（ヒト血漿由来、ＰＢＳ中２５μｇ／ｍｌ）をコーティングする。約１０μｍ間隔の直径約５０μｍの六角形孔の規則的パターンを有するＰＤＭＳステンシルを摘出水晶体嚢組織上に滅菌配置した。フィブロネクチンは、ステンシルの水晶体嚢への付着を促進すると共に、付与される細胞の付着をも促進する。細胞成長培地中に分散されたＲＰＥ細胞（１０７細胞／ｍｌ）をステンシルで部分的に被覆されて生理食塩水に浸漬された水晶体嚢表面上に滅菌付加する。水晶体嚢、ステンシル、ガラスカバースリップ、付加細胞および細胞成長培地を組織培養インキュベータ中の組織培養皿内に維持し、約３７℃、９５％Ｏ２−５％ＣＯ２雰囲気の適当な培養条件下に維持する。ステンシルの六角形孔パターンはその下にある膜組織部分をＲＰＥ細胞に対して露出させる。ＲＰＥ細胞は露出された水晶体嚢組織に付着し、その上でステンシルにより指向された六角形パターンで成長する。得られた、付着ＲＰＥ細胞を有する微細加工水晶体嚢組織は、動物の眼に移植するのに適している。
【０１１５】
（実施例７）
この実施例では、マイクロコンタクトプリンティングスタンプをイン・ビボで眼球膜に適用して、細胞の成長に適した微細加工膜表面を得る。そのような細胞成長に適した微細加工膜表面は、眼球膜または眼細胞の欠陥に起因する眼疾患または症状の治療を援助する。例えば、病変ＲＰＥ細胞領域、または適切に機能しないＲＰＥ細胞を有する眼の場合、欠陥のあるＲＰＥ細胞を除去し、その下のブルッフ膜を、場合により細胞を付与して、微細加工することは眼の治療に有効である。
【０１１６】
網膜下ブレブを用いて病変ＲＰＥ細胞を有する患者の眼の網膜領域にアクセスする。ブレブは、３ポート扁平部硝子体切除術および網膜神経層を貫通する小経路穿刺の後、網膜下腔に滅菌生理食塩水を注入して形成する。ブレブによって露出されたＲＰＥ細胞は、脈絡膜新生血管除去手術に用いられる技術などによりブルッフ膜をすくい取るか創面切除してブルッフ膜の一部から除去される。１０μｍ間隔の直径５０μｍの円形パターンを有するマイクロコンタクトプリンティングスタンプをＰＢＳ中２５μｍ／ｍｌのヒト血漿由来フィブロネクチンでコーティングし、チューブ状に巻き込み、針に挿入する。この針をＰＢＳが入っている注射器に接続する。マイクロコンタクトプリンティングスタンプとＰＢＳを網膜下腔内のブレブにゆっくり注入し、針と針から放出されるＰＢＳの作用によってスタンプを拡げる。マイクロコンタクトプリンティングスタンプを露出されたフルッフ膜と接触させて配置する。コーティングされたマイクロコンタクトプリンティングスタンプをそのように配置することは、露出されたブルッフ膜上にフィブロネクチンパターンを被着させ、付加細胞の成長または眼の他の領域由来の内生細胞の再生を指向させるのに適したパターンを得るのに有効な微細加工用の正常なブルッフ膜をイン・シトゥで形成するのに有効である。１５分後、網膜神経層を貫通する経路を介してブレブからマイクロコンタクトプリンティングスタンプを取り出す。代替処置においては、マイクロコンタクトプリンティングスタンプを約１分から最大約１時間までの可変時間ブルッフ膜と接触させたままにする。マイクロコンタクトプリンティングスタンプを取り出した後、ブレブにＲＰＥ細胞のＰＢＳ分散液（１０６細胞／ｍｌ）をゆっくり注入する。マイクロコンタクトプリンティングスタンプが生分解性材料製であるさらなら代替処置においては、マイクロコンタクトプリンティングスタンプを取り出さず、細胞が付加された後も適所に残してもよい。次いで、眼から器具を取り出し、切開部を閉じ、患者に標準的な術後処置を施す。ＲＰＥ細胞は増殖してブルッフ膜の露出部分を被覆し、ブルッフ膜の健康維持およびブルッフ膜上の網膜神経層の支持を支援する。
【０１１７】
（実施例８）
この実施例では、イン・ビボで眼球膜の上にステンシルを配置し、細胞の成長に適した微細加工膜表面を得る。網膜下ブレブを用いて病変ＲＰＥ細胞を有する患者の眼の網膜領域にアクセスする。ブレブは、３ポート扁平部硝子体切除術および網膜神経層を貫通する小経路の穿孔後、網膜下腔に滅菌生理食塩水を注入して形成する。ブレブによって露出されたＲＰＥ細胞は、脈絡膜新生血管除去手術に用いられる技術などによりブルッフ膜をすくい取るか創面切除してブルッフ膜の一部から除去される。ブレブにフィブロネクチン（ヒト血漿由来、ＰＢＳ中２５μｇ／ｍｌ）を放散させて露出されたブルッフ膜をコーティングし、上に載せたステンシルの付着を促進する。最大寸法が直径６０μｍで、１０μｍ間隔の六角形パターンを有するＰＤＭＳ製ステンシルをＰＢＳ中でチューブ状に巻き込み、針に挿入する。ステンシルとＰＢＳを網膜下腔内のブレブにゆっくり注入し、針と針から放出されるＰＢＳの作用によりステンシルを拡げる。ステンシルを露出されたブルッフ膜の上に配置する。そのようにステンシルをイン・シトゥでブルッフ膜の上に配置することは、付加細胞の成長または眼の他の領域由来の内生細胞の再生を指向させるのに有効なパターンを露出されたブルッフ膜上に形成するのに有効である。ステンシル配置後、ＩＰＥ細胞のＰＢＳ分散液（１０５細胞／ｍｌ）をブレブにゆっくり注入する。次いで、眼から器具を取り出し、切開部を閉じ、患者に標準的な術後処置を施す。ＩＰＥ細胞は増殖してブルッフ膜のステンシルのギャップによって露出された露出部分を被覆し、ブルッフ膜の健康維持およびその上にある網膜神経層の支持を支援する。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１Ａ】本発明の特徴を具体化する分解性基板上の微細加工膜組織の断面図。
【図１Ｂ】動物の眼の網膜下腔内に移植された分解性基板上の微細加工組織を有する動物の眼の断面図。
【図１Ｃ】図１に示されている眼の微細加工組織、網膜および網膜下腔の詳細断面図。
【図２】本発明の特徴を具体化する微細加工膜組織の作製に有用なマイクロコンタクトプリンティングスタンプの図。
【図３】本発明の特徴を具体化するマイクロコンタクトプリンティングスタンプと接触させた後の微細加工水晶体嚢組織の図。
【図４】本発明の特徴を具体化する方法に従って膜組織を微細パターン化するためのポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）スタンプの図。
【図５】図４に示されているＰＤＭＳスタンプで微細パターン化した水晶体嚢上で成長する細胞の図。
【図６】ポリラクチド／ポリグリコリド支持マトリックス上の微細加工水晶体嚢の顕微鏡写真。
【図７】移植してから１週間後のポリラクチド／ポリグリコリド支持マトリックス上の微細加工水晶体嚢を有するウサギ網膜切片の顕微鏡写真。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005503133.tif 000053
2005503133.tif 000054
【国際調査報告】
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2005503133.tif 000056