(57)【要約】  本発明は、交配因子誘導遺伝子のプロモーターの制御下で発現されるエクオリンをコードする配列を含む改変酵母細胞に関する。その上、本発明は、異種細胞表面タンパク質が介在するエクオリン発現を調節する化合物を同定する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
交配因子誘導遺伝子のプロモーターの制御下で発現するエクオリンをコードする配列を含む改変酵母細胞。
【請求項２】
（ａ）交配因子誘導遺伝子のプロモーターの制御下でエクオリンをコードする配列を含む改変酵母細胞、
（ｂ）該改変酵母細胞を化合物と共にインキュベートすること、および、
（ｃ）エクオリン発現量を測定すること、
を含む、異種細胞表面タンパク質が仲介するエクオリン発現を調節する化合物を同定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シグナル伝達経路の活性を検出するためのレポーター遺伝子としてエクオリンを含む改変酵母細胞、および、このような改変酵母細胞を用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エクオリンは、発光クラゲＡｅｑｕｏｒｉａ  ｖｉｃｔｏｒｉａから単離された発光タンパク質である。
【０００３】
アポエクオリンは、セレンテラジンに結合すると、Ｃａ2+存在下でフォトンを放出するプロトタンパク質（ｐｒｏｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）である。エクオリン複合体は、２２,５
１４ＭＷのアポエクオリンタンパク質、分子状酸素、および、発光原子団のセレンテラジンを含む（Ｉｎｏｕｙｅ等、１９８９年；ＪｏｈｎｓｏｎおよびＳｈｉｍｏｍｕｒａ、１９７８年；ＳｈｉｍｏｍｕｒａおよびＪｏｈｎｓｏｎ、１９７８年）。この複合体に３個のＣａ2+イオンが結合すると、セレンテラジンはセレンテラミドに酸化され、その際に二酸化炭素と青い光とを放出する（最大放出量は〜４６６ｎｍ）（図７）。
【０００４】
このＣａ2+依存性の発光のために、エクオリン複合体は、細胞内Ｃａ2+のインジケーターとして広く用いられてきた。
エクオリンは、細胞の機能または胚の発生を妨害しないといわれている（Ｍｉｌｌｅｒ等、１９９４年）。
【０００５】
この発光タンパク質は、哺乳動物細胞で容易に発現可能である，これは、サイトゾルの遊離カルシウム濃度をモニターするのに用いることができる（ＴｈｏｍａｓおよびＤｅｌａｖｉｌｌｅ、１９９１年）（Ｓｈｅｕ等、１９９３年）（Ｓｔａｂｌｅｓ等、２０００年）。
【０００６】
エクオリンはまた、ミトコンドリアのような特定の細胞器官を容易に標的にすることができ（Ｂｒｉｎｉ等、１９９９年）（Ｒｉｚｚｕｔｏ等、１９９２年）、カルシウム恒常性の様々な観点をモニターすることができる。
【０００７】
エクオリンの様々な特性が医薬産業で大いに利用されており、特にハイスループットスクリーニングにおいて利用されている（Ｄｅｔｈｅｕｘ、２０００年）。小胞体からカルシウムが即座に放出されるため、発光タンパク質であるエクオリンの存在下でホスホリパーゼＣ変換経路に結合した受容体の活性化を容易に検出することができる。Ｄｅｔｈｅｕｘ等のＷＯ０００２０４５（ＥＵＲＯＳＣＲＥＥＮ  Ｓ．Ａ．）は、カルシウム結合受容体のアゴニストおよび／またはアンタゴニストのハイスループットスクリーニング診断および／または投与方法（哺乳動物細胞における）を説明しており、ここでエクオリンは受容体が刺激された場合の細胞内のカルシウム変化に関するマーカーとして用いられる。
【０００８】
これまでに、エクオリンを酵母で機能的に発現させて検出できることがわかっている。
Ｎａｋａｊｉｍａ−Ｓｈｉｍａｄａ等（Ｎａｋａｊｉｍａ−Ｓｈｉｍａｄａ等、１９９１ｂ）は、アポエクオリンｃＤＮＡ発現系を用いたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでの細胞内カルシウムのモニタリングを説明している。ここで、エクオリンは、培地中のストレスまたはグルコース変動に関する細胞内のカルシウムのマーカーとして再度使用された。
【０００９】
哺乳動物のシグナル変換とは異なり、酵母細胞においては、Ｇタンパク質共役受容体（
ＧＰＣＲ）を活性化しても小胞体からの相当するＣａ2+の放出はみられない。細胞へα因子が追加されることにより（すなわちＧＰＣＲのＳｔｅ２の刺激）、細胞中で［Ｃａ2+］ｉが基底レベルの約１００ｎＭから数百ナノモル濃度に上昇し、同時にＣａ2+流入が誘導される。Ｃａ２（＋）欠乏媒体で細胞をα因子と共にインキュベートすると、Ｃａ2+流入がかなり減少するが、［Ｃａ2+］ｉの上昇は検出されない（Ｉｉｄａ等、１９９０年）。このわずかな変異（ｓｌｉｄｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）は、我々の実験においては、経路の活性の検出に干渉しない。
【００１０】
酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでは限られた数のレポーター遺伝子しか用いることができず、常に適切とは限らない。スクリーニング目的では、レポーター産物は簡単に検出されなければならず、その理由において便利なレポーター分析が必要である。最も一般的に用いられているレポーター遺伝子はＬａｃＺであり、これは、極めて大きく安定な酵素β−ガラクトシダーゼをコードする。
【００１１】
エクオリンは、発光タンパク質であり、化学発光分析においてβ−ガラクトシダーゼと同様にして検出される。エクオリン（２２５１４ＭＷ）はβ−ガラクトシダーゼ（１１６３５１ＭＷ）より５倍小さいため、より大量に蓄積することが可能で、分析に対してより高い感受性を示し、より優れた経路のアップレギュレートおよびダウンレギュレート（試験された化合物の効果を活性化または阻害すること）をレポートする。
【００１２】
加えて、酵母分析では細菌汚染が起こる場合があり、汚染菌のほとんどは生理的にβ−ガラクトシダーゼを発現する。汚染された培養物は、β−ガラクトシダーゼ基質の存在下で極めて強いシグナルを発生させる可能性がある。エクオリンの使用を使用すれば、汚染による誤った陽性の危険が排除される。
【００１３】
すなわち、エクオリンは、β−ガラクトシダーゼより適切である。エクオリンは、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで機能的に発現可能である（Ｎａｋａｊｉｍａ−Ｓｈｉｍａｄａ等、１９９１ａ）。エクオリンは、発光分析でセレンテラジンおよびＣａ2+の存在下で容易に検出される。
【００１４】
これまで、エクオリンは、経路の活性のレポーター遺伝子としては用いられていなかった（このようなレポーター遺伝子は、酵母のフェロモン経路に結合した哺乳動物のＧタンパク質共役受容体では、ＬａｃＺおよびＨＩＳ３が報告されている（Ｋｉｎｇ等、１９９０年；ＨａｄｃｏｃｋおよびＰａｕｓｃｈ、１９９９年）。
【００１５】
１９９０年に最初に報告されたのは、哺乳動物の受容体（β２−アドレナリン性）による酵母の交配のシグナル伝達の制御であった（Ｋｉｎｇ等、１９９０年）。米国特許第５,８７６,９５１号（Ａ）では、フェロモンシステムのタンパク質代替物を生産するように加工された酵母細胞、および、それらの使用（ｐＦＵＳ１−ｌａｃＺ−およびｐＦＵＳ１−ルシフェラーゼ）が特許請求されている。
【００１６】
エクオリンは、伝達経路依存性レポーターとして用いられており、従って、エクオリンレポーター遺伝子は、対象の伝達経路が活性化された場合にのみ発現される。例えば、フェロモン応答経路の活性を測定するためには、レポーター遺伝子であるエクオリン発現はいくつかのフェロモン応答要素を含むプロモーターにより制御される。ＦＵＳ１プロモーターが、最も一般的に使用されている。一倍体のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞において、ＧＰＣＲは、交配プロセスを調節する。受容体Ｓｔｅ２により、反対の交配型の細胞の存在が検出され（ペプチド交配フェロモンの結合を介して）、細胞内ヘテロ三重体Ｇタンパク質が活性化され、それにより、交配プロセスが開始される。Ｇｐａ１（αサブユニット）がβγ（Ｓｔｅ４−Ｓｔｅ１８）複合体から解離し、フェロモン応答経路の下流の要素（例えば、よく特徴付けられたマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰキナーゼ）カスケードなど）を活性化する。次に、活性化された転写因子Ｓｔｅ１２は、数種の交配因子誘導遺伝子（例えばＦＵＳ１）の転写を開始させることができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
フェロモン依存性遺伝子プロモーターにより制御されると、酵母のフェロモン伝達経路の活性化に比例してエクオリンが発現する。エクオリンの検出シグナルは、経路の活性を定量化する。
フェロモン応答要素は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＵＳ１遺伝子の基礎的かつフェロモン誘導性の転写に必要であり十分である（Ｈａｇｅｎ等、１９９１年）。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、交配因子誘導遺伝子プロモーター、ＦＵＳ１プロモーターまたはそれらの部分（例えば４ＰＲＥ）の制御下でのエクオリンをコードする配列を含む改変酵母細胞に関する。本発明の特定の実施形態において、エクオリンをコードする配列は、配列番号１である。本発明のその他の特定の実施形態において、改変酵母細胞は、その他の異種タンパク質、好ましくは調査しようとする異種タンパク質を発現する。このようなその他の異種タンパク質の例は、細胞表面タンパク質、例えばＧタンパク質共役受容体またはキナーゼである。改変可能な酵母細胞は、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、および、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓである。
【００１９】
本発明はまた、例えば化合物をスクリーニングするための上記改変酵母細胞の使用に関する。
【００２０】
本発明は、異種細胞表面タンパク質が仲介するエクオリン発現を調節する化合物を同定する方法に関し、該方法は、
（ａ）交配因子誘導遺伝子のプロモーターの制御下でエクオリンをコードする配列を含む改変酵母細胞、
（ｂ）該改変酵母細胞を化合物と共にインキュベートすること、
（ｃ）エクオリン発現量を測定すること、
を含む。
【００２１】
我々の研究結果によれば、伝達経路依存性のレポーター分析において、エクオリンが、β−ガラクトシダーゼよりも優れていることが示されている。
【００２２】
実施例１：材料および方法
酵母株として、Ｗ３０３ＭＡＴａ、ｆａｒ：：ｈｉｓＧ、ｓｓｔ２：：ＵＲＡ３FOA，
ｆｕｓ１：：ＨＩＳ３を用いた。
酢酸リチウム法（Ｉｔｏ等、１９８３年）により酵母株を様々なプラスミドで形質転換した）。
【００２３】
実施例２：エクオリン発現ベクターの構築
完全長ｃＤＮＡエクオリン遺伝子をＰＣＲで増幅し、この際、テンプレートとしてキメラのミトコンドリアのエクオリンｍｔＡＥＱ（この場合、短縮化したＮ末端はヒトチトクロームＣターゲティングシグナルに融合される（Ｒｉｚｚｕｔｏ等、１９９２年））を用いた。５’ＰＣＲプライマーは、エクオリンの野生型配列の初めの５０個のヌクレオチド
と、ＥｃｏＲＩ（以下、太字で示す）クローニング部位とを含む。３’プライマーは、クローニング部位を全く含まない。
【００２４】
【化１】
2005508635.tif 000002
【００２５】
次に、完全長野生型エクオリンのコーディング配列（図１）を、フェロモン経路の活性依存性の発現ベクターｐ７８−４ＰＲＥ（ＴＲＰ１、２μ）（図３）にクローニングした。
【００２６】
ＦＵＳ１プロモーターの最小かつ十分な部分（Ｈａｇｅｎ等、１９９１年）を４ＰＲＥと称し、これは、ＦＵＳ１オープンリーディングフレーム上流のプロモーター領域の最後の２６１ｂｐからなる。このプロモーターは、２つの以下のプライマーを用いて野生型酵母のゲノムＤＮＡから増幅した：
【００２７】
【化２】
2005508635.tif 000003
【００２８】
実施例３：β−ガラクトシダーゼ発現ベクターの構築
比較するために、ＬａｃＺを、エクオリンと同じ方法で同じ発現ベクターにサブクローニングしたが、この際、いかなる内因性遺伝子の５’配列とも融合させなかった（発現レベルを高めるために行われることがある（Ｋｉｎｇ等、１９９０年））。
完全長Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子配列を、フェロモン経路の活性依存性の発現ベクターｐ７８−４ＰＲＥ（ＴＲＰ１、２μ）（図４）にクローニングした。
【００２９】
実施例４：エクオリンの検出
細胞を分配するか、および／または、白色の９６−ウェルプレートで１００μｌ量で培養した。
測定時間の３０分前に、５μＭセレンテラジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）溶液１０μｌを各ウェルに分配し（最終濃度０.５μＭになった）、細胞をローディング
した。
次に、プレートを残り３０分間を３０℃でインキュベートした。
注入システムを備えたルミノメーターでエクオリンを検出した（Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ，Ｌａｂｓｙｓｔｅｍ）。各ウェルにおいて、１０ｍＭのＣａＣｌ2溶液（Ｐｉｅｒｃｅ社製のリシス緩衝液Ｙ−ＰＥＲで希釈した１ＭのＣａＣｌ2）を注入した直後に、１５秒間発光シグナルを統合した。
ローディングの中間工程を省くために、分析の最初から培地にセレンテラジンを加えてもよく、その場合、セレンテラジンは濃度０.５μＭで加えられる。
【００３０】
実施例５：β−ガラクトシダーゼの検出
細胞を分配するか、および／または、白色の９６−ウェルプレートで１００μｌ量で培養した。測定時間に、各ウェルにβ−ガラクトシダーゼ検出ミックス（Ｇａｌ−ｓｃｒｅｅｎ，Ｔｒｏｐｉｘ）１００μｌを加えた。
プレートを、１時間、２８℃でインキュベートした。
β−ガラクトシダーゼシグナルをルミノメーターで読み取った；０.５秒間発光シグナ
ルを統合した。
【００３１】
実施例６：経路の活性の典型的なレポーター
この分析において、２種のレポーター遺伝子の発現は、フェロモン交配経路の活性に依存する（Ｌｅｂｅｒｅｒ等、１９９７年）。ＦＵＳ１プロモーター領域から増幅された最小プロモーター４ＰＲＥ（Ｈａｇｅｎ等、１９９１年）は、交配シグナルの場合のみ活性化された。このシグナルは、フェロモン受容体Ｓｔｅ２がそのリガンドであるα因子で刺激されることにより惹起される。
ｐ７８−４ＰＲＥ−ＡＥＱまたはｐ７８  ４ＰＲＥ−ＬａｃＺプラスミドのいずれかで形質転換された酵母株の３個のコロニーを、適切な培地（ＳＣグルコース−Ｔｒｐ）で定常期に達するまで培養し、続いて、０；１０-7；１０-9；１０-11Ｍのα因子（Ｓｉｇｍ
ａ）を含む同培地（エクオリン株に対しては０.５μＭセレンテラジンを含む）で希釈し
た。続いて、プレートを、３０℃で、７００ｒ．ｐ．ｍ．で、３時間、６時間、および、２４時間振盪した。
【００３２】
２種のレポーター間との比較、および、様々な刺激時間での比較を行うために、測定されたエクオリン（図５）およびβ−ガラクトシダーゼ（図６）の検出数を刺激／非刺激の比率で示す。
刺激してから３時間後、検出された比率は、すでに１ｎＭまたは１００ｎＭのα因子で、β−ガラクトシダーゼよりエクオリンのほうが高かった（それぞれ、エクオリンでは８および２４の比率、β−ガラクトシダーゼでは４および７の比率）。刺激してから６時間後、β−ガラクトシダーゼの比率は、同じレベルに留まったが（いずれのα因子濃度においても７の比率であった）、エクオリン検は、より高いレベルが検出された（α因子１ｎＭでは１１の比率であり、α因子１００ｎＭでは３６の比率であった）。刺激してから２４時間後、エクオリン数は、β−ガラクトシダーゼより高いレベルを維持した。
すなわち、この実験から、エクオリンが、β−ガラクトシダーゼよりも良好に様々なリガンド濃度でのＳｔｅ２の刺激を長期間にわたり示すことがわかった。
【００３３】
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【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】エクオリンのオープンリーディングフレームである（配列番号１）。
【図２】４ＰＲＥ配列である（配列番号２）。
【図３】ｐ７８−４ＰＲＥ−Ａｅｑの制限地図である。
【図４】ｐ７８−４ＰＲＥ−ｌａｃＺの制限地図である。
【図５】経路の活性レポーター／エクオリン活性の結果である。
【図６】経路の活性レポーター／β−ガラクトシダーゼ活性の結果である。
【図７】アポエクオリン（ＡＰＯ）およびセレンテラジンを含むエクオリン複合体によるＣａ2+依存性の発光の発生である（ＯｈｍｉｙａおよびＨｉｒａｎｏ、１９９６年））。
【図１】
2005508635.tif 000004
【図２】
2005508635.tif 000005
【図３】
2005508635.tif 000006
【図４】
2005508635.tif 000007
【図５】
2005508635.tif 000008
【図６】
2005508635.tif 000009
【図７】
2005508635.tif 000010
【国際調査報告】
2005508635.tif 000011
2005508635.tif 000012
2005508635.tif 000013