(57)【要約】本発明は、カプソイドを得るための還元剤を含有する溶液においてカプソイドを形成するサブユニットを集積させるための方法に関する。最初に、還元剤を不活性化するか、溶液から除去し、続いて、溶液に少なくとも１つの塩を添加することによって、サブユニットがカプソイドに集積される程度まで、溶液のイオン強度を増大させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
カプソイドを供給するため、還元剤を含む溶液中、カプソイド形成サブユニットを集積する方法であって、
還元剤は最初に不活性化されているか、または溶液から除去されており、次いで、該溶液に少なくとも１つの塩を加えることによって、少なくとも前記サブユニットが集積し前記カプソイドを供給する範囲で、該溶液のイオン強度を増大させる、前記方法。
【請求項２】
還元剤が、サイズ排除クロマトグラフィーもしくは透析によって除去されるか、または実質的に前記還元剤だけを酸化する酸化剤によって不活性化される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
イオン強度が、好ましくは５つの等大のステップであるステップにおいて増大される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ間に約１０分間の時間間隔がある、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
イオン強度Ｉが、１．５ｍｏｌ／ｌ以下、特に、１ｍｏｌ／ｌ以下、好ましくは、０．７５ｍｏｌ／ｌ以下の値まで増大される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
カプソイドおよびサブユニットによる全蛋白質濃度が、１５μｇ／ｍｌ、特に、１５０μｇ／ｍｌ、好ましくは、２２５μｇ／ｍｌを割らない、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
サブユニットが、組換え的に産生した蛋白質またはペプチドからなる、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
サブユニットが、ポリオーマウイルスのウイルス蛋白質「ＶＰ１」、パピローマウイルスのウイルス蛋白質「Ｌ１」、フラビウイルスの「膜蛋白質」および「エンベロープ蛋白質」と共に「コア蛋白質」、Ｂ型肝炎ウイルスまたはＣ型肝炎ウイルスの「コア蛋白質」、ＳＶ４０ウイルスのウイルス蛋白質「ＶＰ１」、ＨＩウイルスのウイルス蛋白質「ｇａｇ」、単純ヘルペスウイルスのウイルス蛋白質「ＶＰ５」、レオウイルスのウイルス蛋白質「ｌａｍｂｄａ１」、「ｌａｍｂｄａ２」もしくは「ｌａｍｂｄａ３」またはノーウォークウイルスの「カプシド蛋白質」を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
サブユニットに存在するＳＨ基が、カプソイドを供給するための集積の後に酸化される、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
ＳＨ基が、酸化剤、特に、システイン、シスタミン、ジ（２−ヒドロキシエチル）ジスルフィドまたは酸化グルタチオンを添加することにより酸化される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
イオン強度が増大された場合、溶液が活性化合物を含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
活性化合物が、還元剤が除去または不活性化された後にだけ、溶液に添加される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
活性化合物が、細胞内部、特に核酸、蛋白質、抗体、ペプチド、酵素、転写因子、チオリン酸誘導化オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ、ＰＮＡおよびＤＮＡのキメラ、ＤＮＡ−ペプチド複合体または低分子量活性化合物を活性化する物質である、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
活性化合物が、少なくとも１つのサブユニットと連結または関連付けられている、請求項１１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
活性化合物が、集積の後、カプソイドの内側に局在するようにサブユニットと連結または関連付けられる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
カプソイドが凍結乾燥される、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれかに記載の方法を行うためのキットであって、
―  還元剤を含む溶液中のカプソイド形成サブユニット、および
―  実質的に前記還元剤だけを酸化する、還元剤を不活性化するのに適した酸化剤
を含む、前記キット。
【請求項１８】
酸化剤が、予め決められた量で存在し、および／または予め決められた濃度で溶解される、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
イオン強度を増大するための塩が、特に、予め決められた量で存在し、および／または予め決められた濃度で溶解される、請求項１７または１８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、カプソイド（capsoids）を供給するため、還元剤を含む溶液中、サブユニット（subunits）を集積する（assembling）方法に関する。カプソイドは、活性化合物、特に核酸を細胞内部へ輸送するためのビヒクルとして用いられ得る。
【０００２】
カプソイド形成サブユニット（カプソマーとも呼ばれる）は、一般的に、その周囲の溶液の特定のイオン強度またはカルシウムイオン濃度を超えた場合、凝集体（aggregates）を形成することができることが知られている。サブユニットは、さらに、酸化されて該サブユニット間のジスルフィド架橋を形成し、このプロセスにおいて凝集体が形成できることが知られている。しかしながら、サブユニットは、ある条件下でのみ、カプソイドに凝集する。
【０００３】
チェンら（Chen, X.S., et al.）のMolecular Cell 5 (2000)、557〜567頁には、ｐＨを下げることによって、大腸菌（E. coli）で発現したヒトパピローマウイルス１６のタンパク質Ｌ１が集積することが開示されている。タンパク質Ｌ１は、カプソマーとして五量体を形成し、その７２個がその都度組み合わさり、ｐＨ５．２でカプソイドを形成する。ここでの欠点は、形成したカプソイドが不規則であること、および組み合わさりが定量的に進行しない、即ち、フリーの五量体が残ることである。
【０００４】
ブラウンら（Braun, H., et al.）のBiotechnol. Appl. Biochem. 29 (1999)、31〜43頁には、大腸菌において組換的に産生されたサブユニットからのカプソイドの集積が開示されている。ここで、サブユニットは、ポリオーマウイルスタンパク質ＶＰ１からなる。発現後、ＶＰ１タンパク質は、低塩濃度で、還元剤を含む溶液中、大腸菌から五量体として単離され、貯蔵される。ここで還元剤は、単離と貯蔵の間、五量体間のジスルフィド架橋の形成による不規則な凝集体の形成を妨げる。五量体は、高いイオン強度の溶液においては、同様に不規則に形成された凝集体を集積するので、低塩濃度がかかる凝集体の形成を妨げる。規則的なカプソイド、即ち、７２個の五量体で構成される規則的な構造を有するカプソイドへの集積を達成するために、還元剤をゆっくり除去し、一方、イオン強度をゆっくり増大させる。両プロセスは、５〜７日間以上、透析によって同時に行われる。不都合なことに、この方法（以下、透析法という）は、極めて時間がかかる。
【０００５】
DE 199 30 676 A1には、例えば、２−メルカプトエタノールまたはシステインなどのチオール試薬を用いることによって、タンパク質の構造変化する酸化を抑制することが開示されている。これにより低減された酵素活性は、透析またはゲルろ過により２−メルカプトエタノールを除去することによって、実質的に完全に元に戻り得る。
【０００６】
本発明の課題は、規則的なカプソイドを集積する方法および該方法を行うためのキットであって、該方法およびキットが従来技術の不利を有していないものを提供することである。特に、該方法は、透析法よりも迅速に行うことを意図される。
【０００７】
この課題は、請求項１および１７の特徴によって達成される。好適な態様は、請求項２〜１６、１８および１９の特徴から導かれる。
【０００８】
本発明は、カプソイドを供給するため、還元剤を含む溶液中、カプソイド形成サブユニットを集積する方法であって、該方法において、還元剤は最初に不活性化されているか、または溶液から除去されており、次いで、該溶液のイオン強度が、該溶液に少なくとも１つの塩を加えることによって増大する、前記方法に関する。本プロセスにおいて、イオン強度は、少なくとも、前記サブユニットが前記カプソイドを供給するように集積する程度に増大される。イオン強度が増大されなければならないレベルは、サブユニットのタイプに依存する。カプソイドが形成されるイオン強度は、既知のカプソイド形成サブユニットに対して知られている。しかしながら、カプソイドの形成はまた、光散乱の増大によって容易にモニターできるので、カプソイドの集積を誘導するために要求されるイオン強度の増大もまた、容易に決定できる。
【０００９】
本発明の目的のために、溶液はコロイド溶液または懸濁液も意味する。還元剤は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、β−メルカプトエタノール、グルタチオン、ジチオエリトリトール、システイン、ＳＨ基または２−メルカプトエタンスルホネートナトリウム塩でもよい。好適なカプソイドを得るため、還元剤は、不活性化されるか、または溶液から除去される。これは、続く立体構造的変化のため、カプソメア内（intracapsomeric）、特に五量体内（intrapentameric）の相互作用における安定化効果を有する、カプソメア内、特に五量体内のジスルフィド架橋の形成をもたらし得る。還元剤を不活性化することとは、ジスルフィド架橋を供給するため、例えば溶液に溶解している大気中の酸素などのような溶液中に存在する酸化剤によるサブユニットに存在するＳＨ基の酸化を防ぐことができないように処理することを意味する。これは、例えば、還元剤の特異的な分解または酸化によって極めて迅速に起こり得る。
【００１０】
還元剤の除去は同様に、例えば、クロマトグラフ法、特に商業的に利用可能な脱塩カラムを用いることによって、極めて迅速に起こり得る。還元剤は、例えば溶解した酸素などの溶液に存在する酸化剤によって、サブユニットに存在するＳＨ基の酸化によってジスルフィド架橋の形成が可能になる程度、除去される必要があるだけである。この目的に対して、還元剤の定量的な除去は要求されない。サブユニットを含む溶液におけるイオン強度は、還元剤を不活性化することまたは除去することが、カプソイドを産生しないほど、低い必要がある。これは、サブユニットを含む溶液におけるイオン強度が、その原因となるイオンが還元剤と共に除去される場合、初期にはより高いかもしれないことを意味する。
【００１１】
イオン強度を増大させるために溶液に添加するための塩は、固体状または溶液として添加され得る。塩を添加した後、カプソイドを形成しうる溶液をインキュベートする。インキュベーションは、好ましくは、室温で約３０分間行われる。
【００１２】
全プロセスは、１〜２時間後に終了しうる。驚くべきことに、単にイオン強度が増大したことによるその急速な形成にもかかわらず、該プロセスにおいて形成されたカプソイドは、極めて時間のかかる透析法によって得られたカプソイドと同じ規則的な構造を有している。本方法は、透析法より、例えば、イオン強度、ｐＨ、温度、蛋白質濃度などの集積が起こる条件を、より正確に予め決定し、制御することができるという利点を有している。このことは、活性化合物をカプソイド中へパッケージングすることに本発明の方法を応用することに関して、決定的に重要である。
【００１３】
事実、特定の塩濃度に達し、還元剤の濃度が特定のレベルより下に落ちるとすぐに、前述の透析法においてカプソイドが形成される。しかしながら、それは、特定の予め決められた条件、例えば、カプソイド中へ活性化合物がパッケージされるのに好適な条件で、カプソイドを形成することはできない。これに対し、本発明の方法は、サブユニットがカプソイドへ集積する限り、活性化合物を好適な条件にセットすることが可能である。
【００１４】
透析法に比べて本発明の方法の他の利点は、還元剤に敏感な活性化合物のカプソイドへのパッケージングも、還元剤を除去または不活性化した後にだけ活性化合物を添加することによって可能であることである。
【００１５】
さらにまた、本方法は、溶液およびそこに存在してもしなくてもよい活性化合物と透析膜との接触を避けることが可能であるという利点を有する。そうでなければ、非特異的結合が透析膜で起こり得る。このことが、活性化合物およびサブユニットの損失をもたらしていた。さらにまた本方法は、透析法における透析膜を通過する小さな活性化合物分子をカプソイド中へパッケージすることができる。かかる活性化合物が還元剤と共に除去されることを避けるために、好ましくは、前記還元剤を除去した後にだけ溶液が添加される。
【００１６】
本発明の方法の他の利点は、単独で扱う液量の少なさにより、透析法におけるよりも容易に滅菌条件を維持できることである。
【００１７】
本方法の好ましい態様において、還元剤は、サイズ排除クロマトグラフィーもしくは透析により除去されるか、または実質的に還元剤だけを酸化する酸化剤による不活性化される。さらに具体的には、酸化剤は、その酸化還元能力がサブユニットのＳＨ基を酸化するには十分でないものが選ばれる。酸化および還元剤の以下の組合せが、ここでは特に有利に提供される：酸化グルタチオン−還元グルタチオン、シスチン−システイン、シスタミン−システアミン、ジ（２−ヒドロキシエチル）ジスルフィド−β−メルカプトエタノール。
【００１８】
サイズ排除クロマトグラフィーは、極めて迅速に行うことができるという利点を有する。他の利点は、本方法は小規模の実験プロセスからカプソイドの比較的大量な産生のためのプロセスへ極めて効率的に移行可能であることである。本発明の方法は、一般的に低分子量の除去すべき還元剤を必要とするだけであるため、このプロセスは透析でさえも迅速に行うことができる。
【００１９】
イオン強度は、徐々に増大させ得る。これにより、カプソイドの同質性をさらに高め得る。イオン強度を５つの等大のステップで増大させることが有利である。ステップ間の時間間隔は、好ましくは、約１０分間である。最後のステップの後、およそ１０分間の室温でのインキュベーションが有利である。
【００２０】
イオン強度Iは、１．５ｍｏｌ／ｌ以下、特に、１ｍｏｌ／ｌ以下、好ましくは、０．７５ｍｏｌ／ｌ以下の値まで増大され得る。ここで、
【数１】
2005531591.tif 000002
であり、式中、ｃiは濃度であり、ｚiは溶液におけるイオンiの電荷である。
【００２１】
好ましくは、全蛋白質濃度がカプソイドおよびサブユニットによって、１５μｇ／ｍｌ、特に、１５０μｇ／ｍｌ、好ましくは、２２５μｇ／ｍｌを割らない。これにより、集積の間に達成されるカプソイドの、より高い収率および規則性が可能になる。溶液中のサブユニットの濃度が高いほど、より迅速な集積が起こる。
【００２２】
本方法の有利な態様において、サブユニットは組換え的に産生された蛋白質またはペプチドからなる。これは特に、大量のカプソイドが調製されるべき場合に有利である。なんら天然の、通常カプシド形状の、そして感染性のある、集積の前に最初に分解しなくてはならない出発材料を用いる必要はない。サブユニットは好ましくは、ポリオーマウイルスのウイルス蛋白質「ＶＰ１」、パピローマウイルスのウイルス蛋白質「Ｌ１」、フラビウイルスの「膜蛋白質」および「エンベロープ蛋白質」と共に「コア蛋白質」、Ｂ型肝炎ウイルスまたはＣ型肝炎ウイルスの「コア蛋白質」、ＳＶ４０ウイルスのウイルス蛋白質「ＶＰ１」、ＨＩウイルスのウイルス蛋白質「ｇａｇ」、単純ヘルペスウイルスのウイルス蛋白質「ＶＰ５」、レオウイルスのウイルス蛋白質「ｌａｍｂｄａ１」、「ｌａｍｂｄａ２」もしくは「ｌａｍｂｄａ３」またはノーウォークウイルスの「カプシド蛋白質」である。これらのウイルス蛋白質は、活性化合物をパッケージングするためのカプソイドの調製に特に適している。
【００２３】
本方法の有利な態様において、サブユニットに存在するＳＨ基は、カプソイドを供給するための集積の後に酸化される。これにより、カプソメア内、特に五量体内のジスルフィド架橋の形成をもたらし、それにより誘導されるコンフォーメーションの変化によって、カプソイドの安定化をもたらす。ここで条件は、カプソメア間、特に五量体間のジスルフィド架橋の形成が妨げられるように有利に選択される。特に有利には、ＳＨ基は、酸化剤、特に、シスチン、シスタミン、ジ（２−ヒドロキシエチル）ジスルフィドまたは酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）を添加することによって酸化される。室温約３０分間で約７ｍｍｏｌ／ｌ酸化グルタチオンとのインキュベーションによって、利点が証明された。酸化剤は続いて、例えば透析またはクロマトグラフ法により除去されるか、または還元剤を添加することにより、不活性化されてもよい。
【００２４】
溶液は、イオン強度が増大した場合、活性化合物を含み得る。該プロセスにおいて、前記活性化合物を細胞へ導入するためのビヒクルとして用いられ得る、前記活性化合物を含有するカプソイドが形成され得る。還元剤を除去したか不活性化した後にだけ、活性化合物を溶液へ添加することもできる。活性化合物が還元剤に敏感である場合、これは特に有利である。活性化合物は、細胞内部、特に核酸、蛋白質、抗体、ペプチド、酵素、転写因子、チオリン酸誘導化オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ、ＰＮＡおよびＤＮＡのキメラ、ＤＮＡ−ペプチド複合体または低分子量活性化合物を活性化する物質であり得る。活性物質は、少なくとも１つのサブユニットと連結（coupled）または関連付け（associated）られていてもよい。これは活性化合物が、真核細胞内の予め定めた領域へ特異的に運搬されることを可能にする。連結または関連付ける方法は、ＷＯ 00/00224に記載されている。好ましくは、活性化合物が、集積の後、カプソイドの内側に局在するようにサブユニットと連結または関連付けられる。活性化合物のカプソイド中への封入によって、活性化合物の細胞への改善された吸収をもたらす。
【００２５】
本方法の一態様において、集積したカプソイドは凍結乾燥される。これは、カプソイドが、その溶解された形状において、時間により劣化し得るかまたはさもなければその有効性を失う場合に、特に有利である。カプソイドへのパッケージングは、透析法よりもずいぶん迅速に行われもするので、本発明により産生されたカプソイドの凍結乾燥はまた、より早い活性化合物の有効性の低下または損失を妨げ得、従来の方法を用いて産生されたカプソイドの場合よりも良好である。
【００２６】
さらに本発明は、本発明の方法を行うためのキットであって、
―  還元剤を含む溶液中のカプソイド形成サブユニット、および
―  実質的に前記還元剤だけを酸化する、還元剤を不活性化するのに適した酸化剤
を含む、前記キットに関する。
【００２７】
キットはまた、イオン強度を増大させる塩を含み得る。酸化剤および塩は、予め決められた量および／または予め決められた濃度で溶解して存在してもよい。
本発明の典型的な態様を図面に示し、以下の記載においてより詳細に説明する。
【００２８】
ポリオーマウイルスのエンベロープ蛋白質ＶＰ１は、組換え的にホモ五量体（homopentamer）として大腸菌（E. coli）から得られ、クロマトグラフィーにより精製される。精製後、還元条件下、「Ｌ１緩衝液」（５０ｍｍｏｌ／ｌ  リン酸ナトリウム、１５０ｍｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ、２ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ、５％グリセロール、６ｍｍｏｌ／ｌ  ＤＴＴ、ｐＨ７．０）中に存在する。図１は、このように行う本発明の方法の流れを図表で示している。本発明の方法によって安定したＶＰ１カプソイドを得るために（続くコンフォーメーションの変化によって、五量体間の相互作用において安定化効果を有する五量体内のジスルフィド架橋を形成する）、ＶＰ１−五量体溶液から還元剤ＤＴＴを前もって除去する必要がある。これは、分析用の「ＰＤ１０」、調整反応混合物用の「ＨｉＰｒｅｐ  ２６／１０  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ」（双方ともＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓより入手可能である）などの商業的に利用可能な脱塩カラムの助けを借りて行う。用いた移動層は、５０ｍｍｏｌ／ｌ  リン酸ナトリウム、１５０ｍｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ、２ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ、５％グリセロール、ｐＨ６．８（以下、ＫＢ１緩衝液という）である。カラム材の低い細孔径のため、蛋白質が貫流し、一方、還元剤は、そのより小さなサイズにより遅れてカラムから流出する。蛋白質は、この手順によってすぐに希釈される。ＶＰ１濃度は、２５０μｇ／ｍｌを下回らないべきである。記載の方法に代わるものとして、還元剤はまた、ＫＢ１緩衝液に対する透析によって除去し得る。
【００２９】
ＶＰ１五量体の集積は、高塩緩衝液（high-salt buffer）の添加によって誘導される。このため、集積のための正確なイオン強度をセットすることを可能にするため、用いたＶＰ１溶液の容積を知るべきである。集積緩衝液ＫＢ２（１０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、１５０ｍｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ、５％グリセロール、３ｍｏｌ／ｌ  硫酸アンモニウム、ｐＨ８．０）を次いで、蛋白質溶液に１：１２の割合（ＫＢ２を１部、蛋白質溶液を１１部）で添加し、混合することによって希釈する。このステップの後、硫酸アンモニウムの終濃度は、２５０ｍｍｏｌ／ｌである。これは７５０ｍｍｏｌ／ｌのイオン強度に対応している。この後、カプソイド形成が完了する間、室温で３０分間のインキュベーション相が続く。さらにカプソイドの均質化を増大させるため、集積ステップは、数回のステップで高塩緩衝液を蛋白質溶液に添加するように改変してもよい。１０分間の時間間隔で５つの等大のステップによって、徐々に２５０ｍｍｏｌ／ｌまで硫酸アンモニウム濃度を増大させる。次いで、室温で１０分間のインキュベーションによって、この手順を完了する。
【００３０】
得られたＶＰ１カプソイドを酸化グルタチオンによる安定化のための酸化条件にする。これにより、五量体内のジスルフィド架橋の形成がもたらされる。この目的のため、蛋白質溶液をＫＢ３緩衝液（１０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、１５０ｍｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ、５％グリセロール、３ｍｏｌ／ｌ  硫酸アンモニウム、４００ｍｍｏｌ／ｌ  ＧＳＳＧ、ｐＨ８．０）と１：５６の割合（ＫＢ３を１部、蛋白質溶液を５５部、ＧＳＳＧ終濃度７．１ｍｍｏｌ／ｌ）で混和し、次いで、室温で３０分間インキュベートする。
【００３１】
最後のステップにおいて、形成したカプソイドを、０．７ｍｍｏｌ／ｌ  ＣａＣｌ２を含有するＰＢＳ緩衝液（ＰＢＳ  Ｄｕｂｌｅｃｃｏ、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）（ＫＢ４）に対し、透析する。これにより酸化剤を除去する。蛋白質は、透析ろ過（diafiltration）または沈降を介して所望の濃度まで濃縮され得る。
【００３２】
図２ａおよび２ｂは、それぞれＶＰ１カプソイドの電子顕微鏡像を示す。図２ａに示したカプソイドは、本発明の方法で産生した。図２ｂに示したカプソイドは、還元剤を同時除去した透析によりイオン強度を増大する従来の方法により形成した。図２ａおよび２ｂは、本発明の方法により産生したカプソイドが、従来法で産生したカプソイドと同じ品質を有することを示している。それらは、規則的な形状を有し、直径は約４０ｎｍである。
【００３３】
カプソイドは、その五量体に比べより大きな直径によって、溶液に照射した光を五量体よりもより強く散乱する。したがって、溶液の光散乱の程度は、溶液のカプソイド内容量の尺度として用いることができ、これによってカプソイド形成の経過をモニターすることが可能である。図３は、塩添加後の本発明により産生したカプソイドによる光散乱の時間関数としてのグラフ図を示す。曲線１０、１２および１４は、ＶＰ１濃度１９４μｇ／ｍｌ、３８７μｇ／ｍｌおよび７７５μｇ／ｍｌに対応する。これは、カプソイドがＶＰ１濃度を増加させることによってより迅速に形成することが示している。したがって、前記形成は、高いＶＰ１濃度で数分後に完了し得る。
【００３４】
形成された粒子の大きさは、光子相関スペクトロスコピー（ＰＣＳ）によっても決定し得る。このことは、粒子が溶液中で大きさを増大させながら、よりゆっくりと移動しているという事実を利用してなる。図４ａおよび４ｂにおいて、曲線１６および１８はそれぞれ、粒子の総数に相対する特定の大きさの粒子の割合を示し、前記割合は任意に選択された単位でＰＣＳで決定される。曲線２０および２２はそれぞれ、曲線１６および１８の積分曲線である。図４ａは、集積の前に行われたＰＣＳ測定の結果を示す。曲線１６のピークは、約１０ｎｍの直径を有する五量体の結果である。図４ｂは、五量体の集積後のＰＣＳ測定の結果を示す。曲線１８のピークは、約４０ｎｍの直径を有する形成されたカプソイドによる。それは図４ａの曲線１６のピークに比べ、明確なシフトを示す。曲線１６および１８の比較によって、五量体がカプソイドへ完全に集積することが示される。ＰＣＳによる測定に対し、比較的狭い曲線１８のピークはカプソイドが均一の大きさを有していることをさらに示す。
【００３５】
分析的なゲルろ過を行った。溶出液の蛋白質含有量を２８０ｎｍの波長でＵＶ吸収を測定することによって決定した。図５ａはＶＰ１に対し決定した結果を示し、図５ｂはそれらから形成されたカプソイドに対し決定した結果を示し、それぞれ、吸収に対し選択された任意の単位（ｍＡＵ）を用いた。ＶＰ１五量体は１０．８２ｍｌの保持容量でピークを生む。このピークは、図５ｂではもはや見えない。このことは、ＶＰ１五量体が、カプソイドへ完全に集積したことを示唆している。図５ｂにおいて７．６６ｍｌの保持容量を見せる形成されたカプソイドによる狭いピークは、カプソイドが均一な大きさを有することを示す。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明の方法の図表示である。
【図２】ａ、ｂそれぞれは、本発明の方法による、および従来の方法による、ウイルス蛋白質ＶＰ１から産生したカプソイドの電子顕微鏡像を示す。
【図３】塩の添加後の時間関数として、本発明により産生したカプソイドによる光散乱を示すグラフである。
【図４】ａ、ｂはそれぞれ、光子相関スペクトロスコピー（ＰＣＳ）による塩の添加の前後の溶液に存在する粒子の分析の一例のグラフである。
【図５】ａ、ｂはそれぞれ、塩の添加の前後の溶液に存在する粒子のゲルろ過分析の一例のグラフである。
【図１】
2005531591.tif 000003
【図２】
2005531591.tif 000004
【図３】
2005531591.tif 000005
【図４】
2005531591.tif 000006
【図５】
2005531591.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成16年8月23日(2004.8.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれかに記載の方法を行うためのキットであって、
―  還元剤を含む溶液中のカプソイド形成サブユニット、
―  実質的に前記還元剤だけを酸化する、還元剤を不活性化するのに適した酸化剤、および
―  イオン強度を増大させるための塩
を含む、前記キット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１９】
塩が、予め決められた量で存在し、および／または予め決められた濃度で溶解される、請求項１７または１８に記載のキット。
【国際調査報告】
2005531591.tif 000008
2005531591.tif 000009
2005531591.tif 000010
2005531591.tif 000011