(57)【要約】本発明はガラクトシル・イソマルト及びガラクトシル・イソマルツロースの製造方法、得られる製品並びにその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガラクトシル化水素化イソマルツロース又はガラクトシル化非水素化イソマルツロースを含む組成物の製造方法であって、少なくとも１つのガラクトシル供与体の水溶液と、少なくとも１つのβ−ガラクトシダーゼ及びガラクトシル受容体としての水素化イソマルツロース又は非水素化イソマルツロースを含む混合物の水溶液とを接触させて、ガラクトシル・イソマルト組成物（Ａ）又はガラクトシル・イソマルツロース組成物を得る上記方法。
【請求項２】
ガラクトシル供与体がラクトースである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ガラクトシル−１，６−ＧＰＳ、ガラクトシル−１，１−ＧＰＭ、ガラクトシル・ラクトース及びグルコース、ガラクトース、ラクトース及び／又はイソマルトを含むガラクトシル・イソマルト組成物（Ａ）を得る請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ガラクトシル・イソマルツロース、ガラクトシル・ラクトース及びグルコース、ガラクトース、ラクトース及び／又はイソマルツロースを含むガラクトシル・イソマルツロース組成物を得る請求項１ないし３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５】
β−ガラクトシダーゼがBacillus circulans、こうじ菌、雄牛精巣、Bacillus stearoth-ermophilus KVE39、Thermus brockianusITI360又はThermus thermophilusTH125に由来する上記請求項のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つのガラクトシル供与体と、水素化イソマルツロース又は非水素化イソマルツロースを含む混合物との重量比が１：１ないし１：５である上記請求項のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
第１段階が１ないし４８時間の反応時間にわたって行われる上記請求項のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８】
第１段階が３０℃ないし５５℃の温度で行われる上記請求項のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９】
第１段階の後に得られたガラクトシル・イソマルツロース組成物を次の第２段階で水素化し、続いてガラクトシル・イソマルト組成物（Ｂ）を得る上記請求項のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１０】
得られたガラクトシル・イソマルト組成物（Ａ、Ｂ）からガラクトシル−１，１−ＧＰＭ、ガラクトシル−１，６−ＧＰＳを後続の段階で分離する上記請求項のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１】
水素化を高温及び／又は高圧かつ水素の存在下で水素化触媒を使用して接触水素化として行う上記請求項のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１２】
ガラクトシル・イソマルツロース組成物を含む水溶液を水素化の前にｐＨ値６ないし８に整える上記請求項のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１３】
水素化を４０ないし１４０℃、とりわけ６０ないし８０℃の高い温度で行う上記請求項のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１４】
水素化を５０ないし２３０バール、とりわけ１００ないし２００バールの高圧で行う上記請求項のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１５】
水素化触媒が純ラネーメタルとラネーメタル合金の混合物からなる上記請求項のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１６】
第２段階で水素化を２ないし５時間の期間にわたって行う上記請求項のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１７】
水素化が連続的、半連続的又は不連続的に行われる上記請求項のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１８】
水素化が固定床法又は懸濁法で行われる上記請求項のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１９】
上記請求項のいずれか１つに記載の方法で製造されたガラクトシル・イソマルト組成物（Ａ、Ｂ）。
【請求項２０】
式
【化１】
2005531611.tif 000068
のβ−１，３−ガラクトシル・イソマルト又はそのソルビット・ジアステレオマー若しくはそのマンニット・ジアステレオマー。
【請求項２１】
式
【化２】
2005531611.tif 000069
のβ−１，４−ガラクトシル・イソマルト又はそのソルビット・ジアステレオマー若しくはそのマンニット・ジアステレオマー。
【請求項２２】
式
【化３】
2005531611.tif 000070
のβ−１，６−ガラクトシル・イソマルト又はそのソルビット・ジアステレオマー若しくはそのマンニット・ジアステレオマー。
【請求項２３】
ａ）１，６−ガラクトシル−１，１−ＧＰＭ及び１，６−ガラクトシル−１，６−ＧＰＳを含むβ−１，６−ガラクトシル・イソマルト４ないし３０重量％、
ｂ）１，４−ガラクトシル−１，１−ＧＰＭ及び１，４−ガラクトシル−１，６−ＧＰＳを含むβ−１，４−ガラクトシル・イソマルト６ないし６０重量％及び
ｃ）１，３−ガラクトシル−１，１−ＧＰＭ及び１，３−ガラクトシル−１，６−ＧＰＳを含むβ−１，３−ガラクトシル・イソマルト１５ないし９０重量％
を含むガラクトシル・イソマルト組成物。
【請求項２４】
さらに少なくとも１つの単糖（ＤＰ１）、少なくとも１つの二糖（ＤＰ２）、少なくとも１つの四糖（ＤＰ４）及び／又は少なくとも１つのそのアルコールを含む上記請求項のいずれか１つに記載のガラクトシル・イソマルト組成物。
【請求項２５】
混合物が２ないし３０重量％の単糖（ＤＰ１）、６０ないし９０重量％の二糖（ＤＰ２）、１ないし４５重量％、とりわけ２ないし３０重量％の式（１）、（２）及び（３）のガラクトシル・イソマルト（ＤＰ３）及び５重量％以下の四糖（ＤＰ４）を有する上記請求項に記載のガラクトシル・イソマルト組成物。
【請求項２６】
ガラクトース、グルコース、ラクトース、イソマルト及び／又はガラクトシル・ラクトースを含む上記請求項のいずれか１つに記載のガラクトシル・イソマルト組成物（Ａ）。
【請求項２７】
ガラクチット、ソルビット、ラクチット、イソマルト及び／又はガラクトシル・ラクチットを含む上記請求項のいずれか１つに記載のガラクトシル・イソマルト組成物（Ｂ）。
【請求項２８】
式
【化４】
2005531611.tif 000071
のβ−１，３−ガラクトシル・イソマルツロース。
【請求項２９】
式
【化５】
2005531611.tif 000072
のβ−１，４−ガラクトシル・イソマルツロース。
【請求項３０】
式
【化６】
2005531611.tif 000073
のβ−１，６−ガラクトシル・イソマルツロース。
【請求項３１】
ａ）４ないし３０重量％のβ−１，６−ガラクトシル・イソマルツロース、
ｂ）６ないし６０重量％のβ−１，４−ガラクトシル・イソマルツロース及び
ｃ）１５ないし９０重量％のβ−１，３−ガラクトシル・イソマルツロース
を含むガラクトシル・イソマルツロース組成物。
【請求項３２】
さらに少なくとも１つの単糖（ＤＰ１）、少なくとも１つの二糖（ＤＰ２）、少なくとも１つの四糖（ＤＰ４）及び／又は少なくとも１つのそのアルコールを含む上記請求項に記載のガラクトシル・イソマルツロース組成物。
【請求項３３】
混合物が２ないし３０重量％の単糖（ＤＰ１）、６０ないし９０重量％の二糖（ＤＰ２）、１ないし４５重量％、とりわけ２ないし３０重量％の式（４）、（５）及び（６）のガラクトシル・イソマルツロース（ＤＰ３）並びに５重量％以下の四糖（ＤＰ４）を有する上記請求項に記載のガラクトシル・イソマルツロース組成物。
【請求項３４】
ガラクトース、グルコース、ラクトース、イソマルツロース及び／又はガラクトシル・ラクトースを含む上記請求項のいずれか１つに記載のガラクトシル・イソマルツロース組成物。
【請求項３５】
上記請求項のいずれか１つに記載のガラクトシル・イソマルト組成物及び／又はガラクトシル・イソマルツロース組成物並びに少なくとも１つのプロビオティクス（Probiotikum）、特ビフィズス菌を含むシンビオティクス（Synbiotikum）。
【請求項３６】
上記請求項のいずれか１つに記載のガラクトシル・イソマルト組成物及び／又はガラクトシル・イソマルツロース組成物と、短鎖フルクトオリゴ糖、長鎖フルクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、加水分解グアルガム、ラクツロース、キシロオリゴ糖、ラクトスクロース、マルトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、ゲンチオオリゴ糖、ペクチン質、ヒドロラーゼ、糖縮合物、グルコシルスクロース、例えばハヤシバラの“Coupling Sugar”（結合糖）、グルコシルスクロース、大豆オリゴ糖、キトオリゴ糖、キトサンオリゴ糖、耐性デンプン、カラスムギ繊維、コムギ繊維、野菜繊維、果実繊維、セルロース及びテンサイ繊維からなる群から選ばれた少なくとも１つの別の不消化物とを含む不消化物組成物。
【請求項３７】
上記請求項のいずれか１つに記載のシンビオティクス、不消化物組成物、ガラクトシル・イソマルト組成物及び／又はガラクトシル・イソマルツロース組成物を含む食品、食糧、嗜好品又は動物飼料。
【請求項３８】
乳製品及びミルク製品、特にチーズ、バター、ヨーグルト、ケフィル酒、凝乳、発酵乳、脱脂乳、クリーム、コンデンスミルク、ドライミルク、乳清、乳糖、牛乳タンパク質、牛乳混合物、低脂肪乳、乳清混合物もしくは乳脂製品又は調理品；パン菓子、特にクッキー類を含むパン及び堅焼き菓子、クッキー及びワッフルを含むケーキ類；パンの塗り物；マーガリン製品及び製パン油脂；インスタント製品及びブイヨン製品；果物製品又は調理品、特に粒入りジャム、マーマレード、ゼリー、果物缶詰、果肉、果肉ピューレ、果汁、濃縮果汁、果物ネクター及び果実粉末；野菜製品又は調理品、特に野菜缶詰、野菜ジュース及び野菜ピューレ；スパイス混合物、ミュースリ、ミュースリ混合物及び調理済みミュースリを含む製品；又は非アルコール飲料、飲料原料及び飲料粉末である上記請求項に記載の食品。
【請求項３９】
低カロリー食品である上記請求項のいずれか１つに記載の食品。
【請求項４０】
上記請求項のいずれか１つに記載のシンビオティクス、不消化物組成物、ガラクトシル・イソマルト組成物及び／又はガラクトシル・イソマルツロース組成物を含む甘味品。
【請求項４１】
低カロリー甘味品である上記請求項に記載の甘味品。
【請求項４２】
チョコレート、硬質カラメル、軟質カラメル、フォンダン製品、ゼリー製品、甘味エキス、発泡砂糖製品、ココナッツフレーク、糖果、圧縮加工品、砂糖漬け果物、クロカン、ヌガー製品、アイスキャンデー、マルチパン、チューインガム、ミュースリバー及びアイスクリーム又はアルコール及び非アルコール甘味飲料である上記請求項のいずれか１つに記載の食料品又は甘味品。
【請求項４３】
上記請求項のいずれか１つに記載のシンビオティクス、不消化物組成物、ガラクトシル・イソマルト組成物及び／又はガラクトシル・イソマルツロース組成物を含む、特にグルコース不耐性、インスリン抵抗性、Ｘ症候群を持つ人の食餌のための食餌療法用特別食品。
【請求項４４】
上記請求項のいずれか１つに記載のシンビオティクス、不消化物組成物、ガラクトシル・イソマルト組成物及び／又はガラクトシル・イソマルツロース組成物を含む幼児食品。
【請求項４５】
上記請求項のいずれか１つに記載のシンビオティクス、不消化物組成物、ガラクトシル・イソマルト組成物及び／又はガラクトシル・イソマルツロース組成物を含む甘味料。
【請求項４６】
上記請求項のいずれか１つに記載のシンビオティクス、不消化物組成物、ガラクトシル・イソマルト組成物及び／又はガラクトシル・イソマルツロース組成物を含む医薬組成物。
【請求項４７】
作用物質としての上記請求項に記載の医薬組成物。
【請求項４８】
医薬用担体としての上記請求項のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【請求項４９】
食餌療法用繊維源及び／又は健全なミクロフロラのための栄養素としての上記請求項のいずれか１つに記載のガラクトシル・イソマルト組成物及び／又はガラクトシル・イソマルツロース組成物の使用。
【請求項５０】
哺乳動物の胃内の分解及び／又は哺乳動物消化管の酵素に対して耐性を持つ薬剤としての上記請求項のいずれか１つに記載のガラクトシル・イソマルト組成物及び／又はガラクトシル・イソマルツロース組成物の使用。
【請求項５１】
食品、動物飼料又は飲料、特に可溶性不消化物、とりわけプレビオティクス不消化物への添加物としての上記請求項のいずれか１つに記載のガラクトシル・イソマルト組成物及び／又はガラクトシル・イソマルツロース組成物の使用。
【請求項５２】
食品又は甘味品、特に特別食、幼児食又はグルコース／インスリン収支の障害をもつ人の食餌の血糖的性質の調節のための上記請求項のいずれか１つに記載のガラクトシル・イソマルト組成物及び／又はガラクトシル・イソマルツロース組成物の使用。
【請求項５３】
甘味料としての上記請求項のいずれか１つに記載のガラクトシル・イソマルト組成物及び／又はガラクトシル・イソマルツロース組成物の使用。
【請求項５４】
食品、食糧、嗜好品又は動物飼料の製造のための上記請求項のいずれか１つに記載のガラクトシル・イソマルト組成物及び／又はガラクトシル・イソマルツロース組成物の使用。
【請求項５５】
グルコース代謝障害、Ｉ型及びＩＩ型糖尿病、グルコース不耐性、インスリン抵抗性及び／又はＸ症候群の予防及び／又は治療のための上記請求項のいずれか１つに記載のガラクトシル・イソマルト組成物及び／又はガラクトシル・イソマルツロース組成物の使用。
【請求項５６】
グルコース代謝障害、Ｉ型及びＩＩ型糖尿病、グルコース不耐性、インスリン抵抗性及び／又はＸ症候群の予防及び／又は治療用薬剤の製造のための上記請求項のいずれか１つに記載のガラクトシル・イソマルト組成物及び／又はガラクトシル・イソマルツロース組成物の使用。
【請求項５７】
動物又はヒト消化管の栄養成分の吸収の改善のための上記請求項のいずれか１つに記載のガラクトシル・イソマルト組成物及び／又はガラクトシル・イソマルツロース組成物の使用。
【請求項５８】
動物又はヒト消化管の栄養成分の吸収を改善する薬剤の製造のための上記請求項のいずれか１つに記載のガラクトシル・イソマルト組成物及び／又はガラクトシル・イソマルツロース組成物の使用。
【請求項５９】
下痢疾患、特に微生物の感染によって引き起こされる下痢疾患；感染症の炎症性腸疾患；大腸発癌；骨粗しょう症；不消化炭水化物により調節することができる疾患；癌疾患；便秘；高血圧；卒中発作；病原菌により引き起こされる疾患；リウマチ性疾患；冠動脈疾患；急性心筋梗塞；心臓循環疾患；慢性炎症性疾病の予防及び／若しくは治療；消化管の健全な微生物フロラ及び／若しくは健全な腸上皮の回復及び保全並びに／又は一般感染症に対する免疫防御の強化のための作用物質としての上記請求項のいずれか１つに記載のガラクトシル・イソマルト組成物及び／又はガラクトシル・イソマルツロース組成物の使用。
【請求項６０】
下痢疾患、特に微生物の感染によって引き起こされる下痢疾患；感染症の炎症性腸疾患；大腸発癌；骨粗しょう症；不消化炭水化物により調節することができる疾患；癌疾患；便秘；高血圧；卒中発作；病原菌により引き起こされる疾患；リウマチ性疾患；冠動脈疾患；急性心筋梗塞；心臓循環疾患；慢性炎症性疾患の予防及び／若しくは治療；消化管の健全な微生物フロラ及び／若しくは健全な腸上皮の回復及び保全並びに／又は一般感染症に対する免疫防御の強化のための薬剤の製造のための上記請求項のいずれか１つに記載のガラクトシル・イソマルト組成物及び／又はガラクトシル・イソマルツロース組成物の使用。
【請求項６１】
上記請求項のいずれか１つに記載のガラクトシル・イソマルト組成物及び／又はガラクトシル・イソマルツロース組成物を、酸化的ストレスによって引き起こされる疾病又は感染症を治癒し又はこれを予防し、該疾病の進行を停止し及び／又は該疾病の症状を軽減するのに十分な用量で投与する上記請求項のいずれか１つに記載の使用。
【請求項６２】
上記請求項のいずれか１つに記載のガラクトシル・イソマルト組成物及び／又はガラクトシル・イソマルツロース組成物を医薬組成物、特に懸濁剤、シロップ、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤又は散剤として投与する上記請求項のいずれか１つに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はβ−ガラクトシル化糖又は糖アルコール、特にガラクトシル・イソマルトを含む組成物又は混合物、ガラクトシル・イソマルツロースを含む組成物及び混合物並びにその製造方法、得られる製品及び中間製品並びに食品、食糧、嗜好品及び動物飼料での使用及び薬剤のため又は薬剤としての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品、嗜好品及び飼料はまず第一にヒト及び動物消費者の栄養と健康のために使用される。これらの２つの側面のほかに、食品と嗜好品について健康促進機能がますます期待される。食糧と嗜好品は一方では健康を維持及び促進し、他方では有害な影響を防ぎ、場合によっては病気を予防する働きをしなければならない。規定によれば、このような健康促進食品及び嗜好品は主として消化管でその効果を発揮する。前部消化管では摂取された栄養物が分解され、一部は吸収される。未消化の炭水化物は大腸に到達し、そこで微生物腸内フロラに委ねられる。
【０００３】
大腸の糖分解性細菌により特に未消化の炭水化物から発酵によって短鎖脂肪酸、例えば酪酸（ブチレート）が生成される。酪酸は大腸内で上皮細胞のための有力なエネルギー源であり、細胞の増殖と分化に影響し、健全な大腸上皮の成長因子として、また大腸の粘膜防壁の維持において中心的役割を果たす。短鎖脂肪酸、例えば酪酸及びその塩（ブチレート）は大腸内の可能な突然変異誘発性代謝産物の解毒に寄与し、例えば腸のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼのような保護タンパク質の遺伝子発現又はオルニチン・デカルボキシラーゼの阻害を誘導することによって酸化的ストレスを阻止する。グルタチオン（ＧＳＨ）はシステイン含有トリペプチド及び哺乳類細胞で最も頻繁なチオール化合物である。ＧＳＨは、生体内異種化合物の解毒及び反応性酸素分子及びその他の遊離基の阻害反応を触媒する酵素、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ及びＧＳＨ−ペルオキシダーゼの基質である。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の基質として、ＧＳＨは可逆的酸化により当該の二硫化物ＧＳＳＧに移行する。グルタチオンは抗酸化剤として作用し、それによって特に細胞の酸化還元状態に対する緩衝系をなす。ＧＳＴは特に細胞分裂の第２段階でも、細胞の最も重要な解毒系の１つをなす。解毒は、例えば発癌物質の代謝の際に発生する求電子性成分にグルタチオンを転移することによって行われる。ＧＳＴが触媒する求電子性基質へのグルタチオンの求核的作用によって、細胞高分子に関する反応性が大幅に減少される。こうしてＧＳＴは一連の化学的発癌物質の効果を著しく減少することができる。従ってＧＳＴは酸化的ストレス及びそれに付随する疾患、特に癌疾患に対する防護で重要な生理的役割を果たすことができる。多環芳香族炭化水素、フェノール系抗酸化剤、反応性酸素分子、イソチオシアナート、３価ヒ素化合物、バルビツール酸塩及び合成グルココルチコイドのような化合物はＧＳＴ活性を誘導することができ、その際ＧＳＴ酵素をコードする遺伝子が活性化される（Hayes and Pulford，１９９５）。ＧＳＴ誘導は主として種々の転写機構によって行われる。ＧＳＴコーディング遺伝子の調節領域は、上記の物質を結合し、遺伝子転写を誘導することができる要素を含む。栄養成分例えば植物化学的物質もＧＳＴ活性を誘導することができ、その場合腸領域で特にπクラスのＧＳＴ形態が誘導される。従って栄養成分による腸管内のＧＳＴ誘導は腸疾患の予防機構とみなされる（Peters and Roelofs，Cancer Res．，52(1992)，1886−1890）。ＧＳＴ誘導にとって特に重要なのは、消化しにくい又は消化しない食品成分、即ちヒトの酵素による消化に耐えるが大腸内で発酵される食物繊維又は不消化物である。幾つかの炭水化物、例えばペクチン、「グアルガム」（グアル核果の粉末）や耐性デンプンがこれに属する。これらはまず腸管内で大腸の細菌フロラによって発酵され、短鎖脂肪酸特に酢酸、プロピオン酸及び酪酸となる（Bartramら、Cancer Res．，53(1993)，3238−3288）。
【０００４】
また短鎖脂肪酸、例えば酪酸は、特異的遺伝子の誘導並びに細胞サイクル調節タンパク質、抗菌ペプチド及びシグナルカスケードの修飾を調節する働きがある。大腸内、特に大腸後部領域の高い酪酸濃度は、健全な腸環境及び健全な腸上皮を促進し、大腸の潰瘍性炎症の症状を改善し、大腸発癌に防護作用があり、即ち大腸癌の危険を減少する物質とみなされる。
【０００５】
従ってヒト又は動物の健康に対して肯定的に作用する腸内細菌を助け、さらに特に大腸後部でも大量の酪酸の生産を得ることが望ましい。これは健康を促進する腸内細菌の生活条件を改善するのに適した物質及び微生物による酪酸の生成のための基質を特に大腸後部領域にも供給することによって達成される。食品又は嗜好品の成分として、特異的な健康促進性腸内細菌の成長及び／又は活性を選択的に促進する物質又は物質混合物、特にビフィズス菌及び乳酸桿菌はプレビオティクス（prebiotics）と呼ばれる。プレビオティクスは健康を助ける腸内細菌の成長及び／又は活性を促進し、通常胃腸管の酵素によって消化されない炭水化物である。
【０００６】
抗消化性かつ発酵可能な食物繊維又は不消化物の食物中の実際の割合は、多くの要因例えば食品の種類及びその調理法に左右される。たいていの食品、飼料又は嗜好品は不消化物に乏しい。これに対して野菜、ある種の果物、堅果類、種子、とりわけ未精製の穀物製品は不消化物に富んでいる。食品加工によって発生する不消化物不足又は不消化物に乏しい食餌を補償し、特に癌疾患及び感染症を食物供給によって予防する道は、理想的には不消化だがよく発酵する不消化物を食品に豊富に含ませることである。ところが従来食品の富化のために使用された不消化物の多くは一連の決定的な欠点があり、特に大腸の癌疾患及び感染症の防止及び／又は治療に関して負わされた期待を果たしていない。長期的研究、特に米国国立癌研究所及びアリゾナ大学の研究で、不消化物に富む料理、例えばミュースリ製品による多年の食餌が明らかに大腸癌の頻度に影響しないことが認められた。しかしこの研究では、大腸領域で発酵させることができない不消化物しか採用されなかったのである。
【０００７】
プレビオティクスとして知られるすべての糖類が、腸内定住微生物の有用発酵産物、特に短鎖脂肪酸例えば有益な酪酸を、とりわけブチレートとして腸後部に供給するのに役立つわけでない。大腸に到達する公知のプレビオティクス、例えばフルクトオリゴ糖はそこでかなり急速かつ完全に発酵させられる。ここで生成される短鎖脂肪酸はその発生場所で腸上皮細胞により急速に、ほぼ完全に吸収される。ところがこの発酵産物を腸後部に供給するには、腸後部領域にも十分に基質が到達して、微生物発酵に利用されるように、糖類がゆるやかに発酵されることが必要である。公知のプレビオティクスの極めて急速な発酵は、不都合なことに緩下剤効果やその他の胃腸不適合の高い危険も内包する。さらに公知のプレビオティクス、例えばイヌリン及びオリゴフルクトースは、腸内細菌により分解する時に主として他の短鎖脂肪酸、特に酢酸が生成され、有益な酪酸をごく僅かしか供給せず、従って酪酸原性が極めて低く、このため大腸後部領域での酪酸生成のための基質とならないという点でも不利である。
【０００８】
公知のプレビオティクス、例えばフルクトオリゴ糖は、食品製造での技術的加工性が一部で改善の余地があることも不利な特徴である。例えば耐性デンプンのような長鎖炭水化物の不十分な水溶性、低い酸安定性及び部分還元オリゴ糖としての反応性は、適用範囲が限られることの一因である。このことは、特に低いｐＨ値を有する製品での適用に当てはまる。
【０００９】
例えばコムギふすまも不消化物の少ない食事の添加物としてしばしば使用される。ところが大腸の腫瘍発生に関するラットでの研究が示したとことでは、コムギふすまの使用は癌予防にほとんど適さない。コムギふすまはセルロースと同様に、大腸内細菌によってほとんど発酵されない。むしろコムギふすま及び他の穀物繊維はたいてい高い割合の粘着性タンパク質、グルテン及び小腸粘膜の重い病変を招く有毒成分を有する。吸収上皮の損傷は消化酵素の損失及び極めて重い形態的機能的障害（ミネラル、ビタミン等を含むすべての栄養素の吸収障害を伴う吸収不良、腹痛）をもたらす。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
これに対してβ−ガラクトシル化オリゴ糖は理想的な不消化物に求められる上記の要求を大いに満足し、従って消化器官及び免疫系の状態に対して肯定的な効果を与える。それ故食品工業、特に健康食品及び食餌療法用食品の分野で広い応用範囲をもつと思われる。しかし実際の応用は大量のこのガラクトース含有オリゴ糖の入手可能性に大きく依存する。公知の化学的方法によるβ−ガラクトシル化オリゴ糖の合成はここ十年の間に開発されたものである。ところが公知のβ−ガラクトシル化法は、例えば保護基の導入とその後の処理段階での分解を必要とする多段法である。従ってこの方法は大きな工業的規模でのβ−ガラクトシル化オリゴ糖の製造にはほとんど適さない。こうした困難を克服するために、生物酵素が触媒として働く合成戦略が開発された。ところが例えばグリコシルトランスフェラーゼの使用を予定するこの公知の代替法も、目下のところこのトランスフェラーゼとその補因子の入手可能性が著しく限られているため、大規模に実施することはできない。またガラクトシル供与体構造としてこの方法のために必要なヌクレオシド糖もまた大量に供給することができない。
【００１１】
本発明の根底にあるのは、疾患特に大腸癌の予防に適し、先行技術で公知の不消化物の欠点がなく、この薬剤の製造のための改善された経済的な方法を提供するという技術問題である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
この課題は、ガラクトシル化水素化イソマルツロース及び／又はガラクトシル化非水素化イソマルツロースを含み、特にこれからなる組成物の製造方法において、
ａ）水溶液に溶解した少なくとも１つのガラクトシル供与体と、
ｂ）少なくとも１つのβ−ガラクトシダーゼ及び
ｃ）水素化イソマルツロース、特にイソマルト及び／又は非水素化イソマルツロースを含み、特にこれからなる混合物の水溶液
とを接触させ、ガラクトシル化水素化イソマルツロース、特にガラクトシル・イソマルトを含む混合物（以下ガラクトシル・イソマルト組成物（Ａ））及び／又はガラクトシル化非水素化イソマルツロース、即ちガラクトシル・イソマルツロース組成物を得る方法を提供することによって解決される。
【００１３】
意外なことに発明者は、グリコシル転位の性質を有するグリコシドヒドロラーゼ、即ちグリコシダーゼを立体特異性触媒として糖類及び糖アルコール、特に二糖及び二糖アルコールのグリコシル化に具合よく使用できることを発見した。このグリコシダーゼの公知の在来の機能はグリコシド結合の加水分解にある。使用する基質をより高次の末端基で誘導し、それに伴って酵素／基質結合の反応速度が変化することによって、意外にもグリコシル転位に関連して酵素反応の逆転即ちグリコシド結合の生成が起こる。その場合このグリコシダーゼが大量に利用可能であり、しかもあまり複雑でないグリコシル供与体基質、例えば二糖又は三糖の使用が可能であることが特に好都合である。
【００１４】
そこで本発明はおおむねβ−位にガラクトシル残基を含むガラクトシル糖、特にガラクトシル三糖、又はガラクトシル糖アルコール特にガラクトシル三糖アルコールの製造方法を提供する。第１段階で少なくとも１つのガラクトシル供与体と、少なくとも１つの糖及び／又は糖アルコール、特に二糖及び／又は二糖アルコール又はこれらの化合物を含む混合物であるガラクトシル受容体とを混合し、グリコシル転位酵素、即ち少なくとも１つのβ−ガラクトシダーゼの作用のもとで所定の反応時間にわたり、とりわけ水溶液中で接触させ反応させて、ガラクトシル供与体からガラクトシル受容体にガラクトシル残基を転移させる。反応生成物として少なくとも１つのガラクトシル糖、少なくとも１つのガラクトシル糖アルコール及び／又はこれらの化合物の少なくとも１つを含む混合物が生成される。得た生成物又は生成物混合物は本発明に基づきとりわけ慣用の分離法により引続き必要に応じて精製し及び／又はとりわけ接触水素化を行う。
【００１５】
本発明の別の変法は糖類又は糖アルコールとしてオリゴ糖、例えば二、三、四及び五糖並びに単糖とその混合物又はそのアルコール及びその混合物に関する。
【００１６】
本発明に基づき遊離体 (Edukt) としてａ）水素化イソマルツロース及び／又はｂ）非水素化イソマルツロースを使用し、生成物としてａ）ガラクトシル・イソマルト及び／又はｂ）ガラクトシル・イソマルツロースを含む混合物を得ることが好ましい。
【００１７】
本発明に関連して「イソマルツロース」又は「非水素化イソマルツロース」の概念は、一方では６−O−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−β−Ｄ−フルクトフラノース（以下６−O−α−Ｄ−グルコピラノシルフルクトースとも称する）、他方ではおおむね６−O−α−Ｄ−グルコピラノシルフルクトースを含む混合物を意味する。イソマルツロースはサッカロースから酵素反応によって得ることが好ましい。本発明の好ましい実施形態では、この遊離体混合物がさらに別の物質、例えば糖アルコール又は糖、特にオリゴ糖及び／又は二糖、例えばトレハルロース又はイソマルトース及び／又は単糖例えばフルクトースを含むものとする。６−O−α−Ｄ−グルコピラノシルフルクトースからなり、又はおおむねこれを含み、特に７０、８０、８５、９０、９５又は９７重量％を超える量含む遊離体混合物が好ましい。
【００１８】
このようにして本発明はとりわけβ−ガラクトシダーゼの作用下で６−O−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−フルクトース又は６−O−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−フルクトースを含む混合物から反応生成物β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−Ｄ−フルクトース、β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−Ｄ−フルクトース及び／又はβ−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−Ｄ−フルクトース（以下β−１，３−ガラクトシル・イソマルツロース、β−１，４−ガラクトシル・イソマルツロース、β−１，６−ガラクトシル・イソマルツロースと称する）又はこれらのガラクトシル・イソマルツロースの少なくとも１つを含む混合物を得るものである。ガラクトシル残基と６−O−α−D−グルコピラノシルフルクトースの結合に応じて生成物、即ちガラクトシル・イソマルツロースはβ−１，３−ガラクトシル・イソマルツロース、β−１，４−ガラクトシル・イソマルツロース及び／又はβ−１，６−ガラクトシル・イソマルツロースを含む。特にガラクトシル・イソマルツロースはこれらのβ−１，３−、β−１，４−及びβ−１，６−結合ガラクトシル・イソマルツロースの組成物である。本発明の好ましい実施形態では、得られる生成物又は生成物混合物はさらに別のガラクトシル化及び／又は非ガラクトシル化物質、例えば糖アルコール又は糖、特にオリゴ糖、二糖又は単糖又はそのアルコールを含む。β−１，３−、β−１，４−及びβ−１，６−結合ガラクトシル・イソマルツロースからなり、又はおおむねこれらを含み、特に７０、８０、８５、９０、９５又は９７重量％を超える量含む生成物混合物が好ましい。
【００１９】
本発明に基づき遊離体として使用される水素化イソマルツロースは、とりわけイソマルツロースの水素化により製出することができるイソマルト又はイソマルト含有混合物であることが好ましい。本発明に関連して「イソマルト」の概念は、６−O−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−Ｄ−ソルビット（６−O−α−D−グルコピラノシル−（１→６）−Ｄ−ソルビット）（以下１，６−ＧＰＳ）及び１−O−α−D−グルコピラノシル−（１→１）−Ｄ−マンニット、特に二水化１−O−α−D−グルコピラノシル−（１→１）−Ｄ−マンニット（以下１，１−ＧＰＭ）、特にこれら２つの糖アルコールのほぼ等モルの混合物を意味し、その場合ほぼ等モルの混合物中の１，６−ＧＰＳの割合は約４４重量％ないし約５６重量％、１，１−ＧＰＭの割合はそれに対応して約５６重量％ないし４４重量％である。もちろん発明はイソマルトの変種、即ち２つの糖アルコールのほぼ等モル比と異なる１，６−ＧＰＳ対１，１−ＧＰＭの比率、例えば１重量％１，６−ＧＰＳ対９９重量％１，１−ＧＰＭないし９９重量％１，６−ＧＰＳ対１重量％１，１−ＧＰＭ、特にＤＥ１９５３２３９６Ｃ２に開示されているように、５７重量％１，６−ＧＰＳ対４３重量％１，１−ＧＰＭないし９９重量％１，６−ＧＰＳ対１重量％１，１−ＧＰＭの比率の１，６−ＧＰＳ高含有混合物又は１重量％１，６−ＧＰＳ対９９重量％１，１−ＧＰＭないし４３重量％対５７重量％１，１−ＧＰＭの比率の１，１−ＧＰＭ高含有混合物も包含する。好ましい実施形態ではこれらの遊離体混合物がさらに別の物質、例えば糖アルコール又は糖、例えば１−O−α−D−グルコピラノシル−Ｄ−ソルビット、即ち１，１−ＧＰＳ、マンニット、ソルビット又は／及びその他の単糖、二糖又はオリゴ糖を含むことはもちろんである。その場合１，６−ＧＰＳ及び／又は１，１−ＧＰＭからなり、又はおおむねこれら含み、特に７０、８０、８５、９０、９５又は９７重量％を超える量含む遊離体混合物が好ましい。
【００２０】
本発明によれば二量体糖アルコール１，６−ＧＰＳ及び／又は１，１−ＧＰＭが三糖アルコール（ＤＰ３）即ちガラクトシル化１，６−ＧＰＳ及び／又はガラクトシル化１，１−ＧＰＳ又はガラクトシル化１，６−ＧＰＳ及び／又はガラクトシル化１，１−ＧＰＳを含む混合物（以下ガラクトシル・イソマルト組成物（Ａ）と称する）に転化される。ガラクトシル残基と１，６−ＧＰＳ及び／又は１，１−ＧＰＭの結合に応じて、生成物即ちガラクトシル・イソマルト組成物はβ−Ｄ−ガラクトシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコシル−（１→６）−Ｄ−ソルビット（β−１，３−ガラクトシル−１，６−ＧＰＳ）及び／又はβ−Ｄ−ガラクトシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコシル−（１→１）−Ｄ−マンニット（β−１，３−ガラクトシル−１，１−ＧＰＭ）、β−Ｄ−ガラクトシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコシル−（１→６）−Ｄ−ソルビット（β−１，４−ガラクトシル−１，６−ＧＰＳ）及び／又はβ−Ｄ−ガラクトシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコシル−（１→１）−Ｄ−マンニット（β−１，４−ガラクトシル−１，１−ＧＰＭ）及び／又はβ−Ｄ−ガラクトシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコシル−（１→６）−Ｄ−ソルビット（β−１，６−ガラクトシル−１，６−ＧＰＳ）及び／又はβ−Ｄ−ガラクトシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコシル−（１→１）−Ｄ−マンニット（β−１，６−ガラクトシル−１，１−ＧＰＭ）を含む。反応生成物はその他の成分としてとりわけガラクトシル・ラクトース、グルコース、イソマルト、ラクトース、ガラクトース及び／又は四糖を有する。
【００２１】
水素化イソマルツロース、特にイソマルトの本発明に基づく好ましいガラクトシル化で得られるガラクトシル・イソマルト組成物としては、
ａ）β−Ｄ−１，３−ガラクトシル・イソマルト即ち式（１）のようなβ−Ｄ−ガラクトシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコシル−（１→６）−Ｄ−ソルビット（β−１，３−ガラクトシル−１，６−ＧＰＳ）及びβ−Ｄ−ガラクトシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコシル−（１→１）−Ｄ−マンニット（β−１，３−ガラクトシル−１，１−ＧＰＭ）
【化１】
2005531611.tif 000002
【００２２】
ｂ）β−Ｄ−１，４−ガラクトシル・イソマルト即ち式（２）のようなβ−Ｄ−ガラクトシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコシル−（１→６）−Ｄ−ソルビット（β−１，４−ガラクトシル−１，６−ＧＰＳ）及びβ−Ｄ−ガラクトシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコシル−（１→１）−Ｄ−マンニット（β−１，４−ガラクトシル−１，１−ＧＰＭ）
【化２】
2005531611.tif 000003
【００２３】
ｃ）β−Ｄ−１，６−ガラクトシル・イソマルト即ち式（３）のようなβ−Ｄ−ガラクトシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコシル−（１→６）−Ｄ−ソルビット（β−１，６−ガラクトシル−１，６−ＧＰＳ）及びβ−Ｄ−ガラクトシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコシル−（１→１）−Ｄ−マンニット（β−１，６−ガラクトシル−１，１−ＧＰＭ）
【化３】
2005531611.tif 000004
【００２４】
が挙げられる。
【００２５】
上記の式（１）ないし（３）はそれぞれ、ソルビット及びマンニットの両方について関連するβ−ガラクトシル・イソマルト異性体のエピマー又はジアステレオマーを示す。それらもまた本発明の対象である。そこで本発明は単離した形のガラクトシル・イソマルトの２つのジアステレオマー（マンニット／ソルビット）のそれぞれと、単離した形の２つのジアステレオマーの混合物及び３つの結合生成物のすべてのソルビット及びマンニットエピマーの混合物を包含する。
【００２６】
非水素化イソマルツロースの本発明に基づく好ましいガラクトシル化で得られるガラクトシル・イソマルツロース組成物としては、
ａ）式（４）のようなβ−１，３−ガラクトシル・イソマルツロース（β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−Ｄ−フルクトース）
【化４】
2005531611.tif 000005
【００２７】
ｂ）式（５）のようなβ−１，４−ガラクトシル・イソマルツロース（β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−Ｄ−フルクトース）
【化５】
2005531611.tif 000006
【００２８】
ｃ）式（６）のようなβ−１，６−ガラクトシル・イソマルツロース（β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−Ｄ−フルクトース）
【化６】
2005531611.tif 000007
【００２９】
が挙げられる。
【００３０】
また本発明は上記の化合物（４）、（５）及び／又は（６）の２つ又は３つの混合物及び単離形態の化合物に関する。
【００３１】
好ましい実施形態ではガラクトシル供与体とガラクトシル受容体の比は、重量％基準でガラクトシル供与体１部に対してガラクトシル受容体１部（１：１）ないしガラクトシル供与体１部に対してガラクトシル受容体５部（１：５）である。発明の特に好ましい実施形態ではラクトースがガラクトシル供与体である。
【００３２】
発明の別の好ましい実施形態は、少なくとも１つの酵素、即ちβ−ガラクトシダーゼが遊離とりわけ溶解した形及び／又は固定化された形態で存在するものとする。酵素は完全又は部分的に精製した形で、もしくは粗抽出物として存在するものとする。また酵素は天然起源又は合成物であり、本発明に基づきとりわけ組換え法又はその他の周知の方法により調製される。最後に酵素は天然酵素の変異型、突然変異体、突然変異タンパク質、修飾型又は誘導体である。
【００３３】
本発明によれば、−特に有利な点として−試験条件の選択により、特に具体的に使用されるβ−ガラクトシダーゼの選択に応じて、本発明に基づき得られるガラクトシル糖含有又はガラクトシル糖アルコール含有混合物の組成を予定どおりに調節することが可能になる。本発明に基づく方法はβ−１，３−位、β−１，４−位及び／又はβ−１，６−位で結合されたガラクトシル三糖又はガラクトシル三糖アルコールを調整可能な組成で含むガラクトシル化生成物の製造を可能にする。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態では雄牛精巣のβ−ガラクトシダーゼが使用される。雄牛精巣のβ−ガラクトシダーゼを使用すれば、高い割合のβ−（１，３）−結合ガラクトシル生成物、特にβ−（１，３）−ガラクトシル−１，６−ＧＰＳ及び／又はβ−（１，３）−ガラクトシル−１，１−ＧＰＭ及び／又はβ−（１，３）−ガラクトシル・イソマルツロース、特に５０重量％を超えるβ−１，３−ガラクトシル生成物（ＤＰ３生成物に関して）を有するガラクトシル化生成物が生じる。
【００３５】
別の好ましい実施形態ではBacillus stearothermophiles KVE39の酵素BgaB、 Thermus brockianus ITI360の酵素BgaT及びThermus thermophiles TH125の酵素BgITの形のβ−ガラクトシダーゼが使用され、その場合もまた特に高い割合の上記のβ−（１，３）−ガラクトシル生成物、特に５０重量％を超えるβ−１，３−ガラクトシル生成物（ＤＰ３生成物に関して）が得られる（３つのすべての微生物及びそれに含まれるβ−ガラクトシダーゼはO.Fridjonsson, H.Watzlawick, R.Mattes(2000), The structure of the alpha galactosidase gene loci in Thermus brockianus ITI360and Thermus thermophilus TH125. Extremophiles 4:23-33及びC.Ganter, A.Boeck, P.Buckel, R.Mattes(1988), Production of a thermostable, recombinant alpha galact-osidase suitable for raffinose elimination from suger beet syrup. J. Biotechnol. 8:301-310に記載されている）。
【００３６】
別の好ましい実施形態ではガラクトシル化のためにBacillus circulansのβ−ガラクトシダーゼを使用して、高い割合のβ−（１，４）−ガラクトシル生成物、特にβ−（１，４）−ガラクトシル−１，６−ＧＰＳ及び／又はβ−（１，４）−ガラクトシル−１，１−ＧＰＭ及び／又はβ−（１，４）−ガラクトシル・イソマルツロースを有する生成物が得られる。特にβ−（１，４）−ガラクトシル生成物の割合は５０重量％を超える（ＤＰ３生成物に関して）。
【００３７】
最後に、別の好ましい実施形態ではガラクトシル化のためにこうじ菌のβ−ガラクトシダーゼを使用して、高い割合のβ−（１，６）−ガラクトシル生成物、特にβ−（１，６）−ガラクトシル−１，６−ＧＰＳ及び／又はβ−（１，６）−ガラクトシル−１，１−ＧＰＭ及び／又はβ−（１，６）−ガラクトシル・イソマルツロースを有する生成物が得られる。特にβ−（１，６）−ガラクトシル生成物の割合は５０重量％を超える（ＤＰ３生成物に関して）。
【００３８】
本発明に基づく特に好ましい変法では、上記の細菌生物に由来するβ−ガラクトシダーゼ・コーディング遺伝子を発現ベクターに組込み、自身はβ−ガラクトシダーゼを生産しない宿主株、とりわけ大腸菌に挿入して、所望のβ−ガラクトシダーゼを産生する生産株を得る。生成される酵素はとりわけ熱安定性の生物に由来するから、とりわけ大腸菌の粗抽出物から宿主タンパク質の熱沈降によって精製される。得た粗抽出物は産生された酵素の特に６０ないし９０重量％を有する。
【００３９】
本発明に基づき本方法は酸性ｐＨ値、特に４．０ないし６．５のｐＨ値で、とりわけ緩衝溶液中で行うことが好ましい。ガラクトシル化反応はとりわけ３０℃ないし５５℃の温度でとりわけ１ないし５０時間の期間に行うこととし、特に雄牛精巣のβ−ガラクトシダーゼを使用するときは温度３３℃ないし４０℃で４０ないし５０時間の期間、Bacillus c-irculansのβ−ガラクトシダーゼを使用するときは温度５０℃ないし６０℃で１ないし３時間の期間、こうじ菌のβ−ガラクトシダーゼを使用するときは温度２５℃ないし３５℃で１ないし３時間の期間とする。
【００４０】
本発明に基づき上記のすべての反応生成物の分離と単離のために、所望の重合度の反応生成物の分離を可能にする物理的及び／又は化学的分離法を使用することが好ましい。本発明に基づき選ばれた反応生成物をクロマトグラフィー法により周知のように精製又は濃縮することが好ましい。本発明に関連して「クロマトグラフィー分離法」とは、固定相と移動相に分配することによって物質の分離が行われ、分離機構としてとりわけ吸着、イオン相互作用、極性又は無極性相互作用、サイズ排除、錯形成に基づくすべての物理的方法を意味する。発明の好ましい実施形態では、排除クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー又はゲル濾過法とも呼ばれるゲル浸透法を使用して反応生成物の分離が行われる。「ゲル浸透」とは、多孔構造のゲルマトリックスを通って分子が移動することにより、ふるい効果に基づき分子サイズに従って分配が行われる過程を意味する。一変法では選ばれた反応生成物の分離のために、ポリデキストラン、ポリアクリルアミド、アガロース等の物質がゲルマトリックスとして使用される。特に好ましい変法では随伴物質の分離のために特にカルシウムイオン（Ｃａ２＋）をもつ陽イオン交換体を使用する。
【００４１】
別の特に好ましい実施形態では本発明に基づく第１の処理段階で糖及び／又は糖含有混合物、特にイソマルツロース又はイソマルツロース含有混合物を本発明に基づき変化させて得たガラクトシル糖組成物、特にガラクトシル・イソマルツロース組成物を、別の後続の第２の処理段階で化学的水素化、とりわけ水素化触媒を使用した接触水素化により水素（Ｈ２）の存在でおおむねガラクトシル糖アルコール含有混合物、特にガラクトシル・イソマルト含有混合物（以下ガラクトシル・イソマルト組成物（Ｂ）と称する）に転化する。
【００４２】
本発明に基づき第１段階で上記の方法の１つによるガラクトシル化で生成物として得られ、本発明に基づく好ましい水素化のための遊離体とされるガラクトシル・イソマルツロース組成物の個々の成分を、水素化の前にクロマトグラフィー分離法によって濃縮又は減少させることが好ましい。
【００４３】
本発明に基づき混合物又は個別物質を水性媒質、とりわけ水に２０重量％ないし４０重量％、とりわけ３０重量％の濃度で溶解することによって、上記の方法で得たガラクトシル糖組成物を水素化することが好ましい。本発明に基づき適当な薬品を使用して、特に緩衝溶液で水溶液のｐＨ値を６ないし８のｐＨ値に調整することが好ましい。発明の好ましい実施形態では苛性ソーダ溶液を加えることによって、水素化する化合物の溶液のｐＨ値を７．８に調整する。本発明に基づき水素化は４０℃ないし１４０℃、特に６０℃ないし８０℃、とりわけ７０℃の温度で行うものとする。また本発明に基づき水素化を水素の存在下で行い、本発明の方法の好ましい実施形態では使用する水素は５０ないし２３０バール、特に１００ないし２００バール、とりわけ約１５０バールの高い圧力を有する。水素化の際に連続的に攪拌することが好ましい。本発明に基づき特に水素化は少なくとも２時間ないし５時間、とりわけ少なくとも４時間の期間にわたって行うものとする。本発明に基づき水素化は連続的に行う。一変法では水素化を半連続的又は不連続的に行う。本発明に基づく水素化を固定床法及び／又は懸濁法で行うことが好ましい。
【００４４】
本発明に基づく水素化は、触媒を使用して接触水素化として行うことが特に好ましい。発明の好ましい実施形態では触媒として純ラネーメタルとラネーメタル合金の混合物を使用し、その場合ラネーメタルはとりわけニッケル、銅、コバルト又は鉄である。ラネーメタル合金は少なくとも１つの特に浸出可能な成分、例えばアルミニウム、スズ又はケイ素を含むニッケル、銅、コバルト及び／又は鉄の合金であることが好ましい。発明の別の好ましい実施形態では、水素化のために使用される触媒は、不活性担体上の周期表第８族の単数又は複数の金属を活性成分として含む。活性成分として白金、ルテニウム、パラジウム、ロジウム及び／又はその混合物を使用することが好ましい。不活性触媒担体はとりわけ炭素（活性炭）、酸化アルミニウム、酸化ジルコニウム、酸化ケイ素、二酸化チタン及び／又はその混合物からなる。
【００４５】
本発明に基づきガラクトシル・イソマルツロース組成物は水素化でおおむねガラクトシル化１，６−ＧＰＳ及びガラクトシル化１，１−ＧＰＭ又はこれらの化合物を含む混合物（以下ガラクトシル・イソマルト組成物（Ｂ）と称する）に転化されることが好ましい。ガラクトシル残基と１，６−ＧＰＳ及び／又は１，１−ＧＰＭの結合に応じて、水素化生成物、ガラクトシル・イソマルト組成物（Ｂ）はβ−１，３−ガラクトシル−１，６−ＧＰＳ及び／又はβ−１，３−ガラクトシル−１，１−ＧＰＭ及び／又はβ−１，４−ガラクトシル−１，６−ＧＰＳ及び／又はβ−１，４−ガラクトシル−１，１−ＧＰＭ及び／又はβ−１，６−ガラクトシル−１，６−ＧＰＳ及び／又はβ−１，６−ガラクトシル−１，１−ＧＰＭとなる。ガラクトシル・イソマルト組成物（Ｂ）の別の成分として、とりわけ糖アルコール、ガラクトシル・イソマルト、ガラクトシル・ラクチット、ガラクトシル・ソルビット及びソルビット、イソマルト、ラクチット及び／又はガラクチットが生じる。
【００４６】
好ましい変法では、特にガラクトシル・ラクチット及び／又はガラクトシル・イソマルト濃縮生成物、特に精製又は単離されたガラクトシル・ラクチット及び／又はガラクトシル・イソマルトを得るために、本発明に基づく水素化生成物、即ちガラクトシル・イソマルト組成物（Ｂ）をさらに精製又は濃縮する。
【００４７】
また発明は本発明に基づき調製され又は得られた反応生成物及び中間生成物、特にガラクトシル・イソマルト組成物（Ａ）及びガラクトシル・イソマルト組成物（Ｂ）及び／又はガラクトシル・イソマルト含有混合物、例えばガラクトシル・イソマルツロース組成物に関する。
【００４８】
本発明の主題は、イソマルツロースを含む遊離体混合物のガラクトシル化によって調製された、とりわけ４ないし３０重量％、特に５ないし１５重量％のβ−１，６−ガラクトシル・イソマルツロース（６）、とりわけ６ないし６０重量％、特に１０ないし４０重量％のβ−１，４−ガラクトシル・イソマルツロース（５）及びとりわけ１５ないし９０重量％、特に２５ないし６０重量％のβ−１，３−ガラクトシル・イソマルツロース（４）を含み、特にこれからなるガラクトシル・イソマルツロース組成物である。本発明によればＤＰ３生成物に関して５０重量％を超えるβ−１，３−ガラクトシル・イソマルツロースを含む、β−１，３−ガラクトシル生成物が濃厚なガラクトシル・イソマルツロース組成物が好ましい。
【００４９】
また本発明の主題は、水素化イソマルツロース、特にイソマルトを含む遊離体混合物のガラクトシル化によって調製されたガラクトシル・イソマルト組成物（Ａ）、ガラクトシル化イソマルツロースを含む遊離体混合物の水素化によって調製されたガラクトシル・イソマルト組成物（Ｂ）、とりわけ４ないし３０重量％、特に５ないし１５重量％のβ−１，６−ガラクトシル・イソマルト、とりわけ６ないし６０重量%、特に１０ないし４０重量％のβ−１，４−ガラクトシル・イソマルト及びとりわけ１５ないし９０重量％、特に２５ないし６０重量％のβ−１，３−ガラクトシル・イソマルトを含み、特にこれからなる上記のガラクトシル・イソマルツロース組成物である。重量％のデータはそれぞれ反応生成物、即ちガラクトシル・イソマルトのＤＰ３生成物の乾燥物総含量に関するものである。本発明によればＤＰ３生成物に関して５０重量％を超えるβ−１，３−ガラクトシル・イソマルトを含む、β−１，３−ガラクトシル生成物が濃厚なガラクトシル・イソマルト組成物が好ましい。
【００５０】
また発明は少なくとも１つの別の糖及び／又は糖アルコール、例えば単糖（ＤＰ１）又はそのアルコール、二糖（ＤＰ２）又はそのアルコール及び四糖（ＤＰ４）又はそのアルコールを含む上記の生成物に関する。
【００５１】
好ましい実施形態ではガラクトシル・イソマルツロース組成物が１ないし４５重量％、特に２ないし３０重量％ガラクトシル・イソマルツロース、さらにはガラクトース、グルコース、ラクトース、イソマルツロース及び／又はガラクトシル・ラクトースを含む。
【００５２】
別の好ましい実施形態ではイソマルト含有混合物のガラクトシル化によって得たガラクトシル・イソマルト組成物（Ａ）は、１ないし４５重量％、特に２ないし３０重量％のガラクトシル・イソマルトのほかにガラクトース、グルコース、ラクトース、イソマルト及び／又はガラクトシル・ラクトースも含む。一変法ではガラクトシル・イソマルト組成物（Ａ）がガラクトシル化１，１−ＧＰＳも含む。発明の別の主題は、とりわけガラクトシル・イソマルト組成物（Ａ）及び／又はガラクトシル・イソマルツロース組成物から分離して得た単離成分、特にガラクトシル・ラクトースである。
【００５３】
別の好ましい実施形態ではガラクトシル・イソマルツロース含有混合物の水素化によって得たガラクトシル・イソマルト組成物（Ｂ）が１ないし４５重量％、特に２ないし３０重量％のガラクトシル・イソマルト及びガラクチット、ソルビット、ラクチット、イソマルト、ガラクトシル・ソルビット及び／又はガラクトシル・ラクチットを含む。また発明の別の主題は、とりわけガラクトシル・イソマルト組成物（Ｂ）から分離して得た単離成分、特にガラクトシル・イソマルト、ガラクトシル・ラクチット及びガラクトシル・ソルビットである。一変法ではガラクトシル・イソマルト組成物（Ｂ）はガラクトシル化１，１−ＧＰＳも含む。
【００５４】
本発明に基づく上記の個別物質、混合物及び組成物はとりわけ完全又は部分的に精製された形をなすものであり、この形で使用することが好ましい。代替実施形態では、本発明に基づく混合物及び組成物は反応副生物を分離せずにそのまま使用される。本発明に基づく混合物及び組成物は例えば乾燥した形で又は懸濁液として又は水溶液で使用することが好ましい。
【００５５】
本発明に基づく混合物及び組成物では重合度１（ＤＰ１）の成分の割合がとりわけ２ないし３０重量％、重合度２（ＤＰ２）の生成物の割合がとりわけ３０ないし９０重量％及び重合度４（ＤＰ４）の生成物の割合がとりわけ０ないし５重量％である。その場合本発明に基づき個々の反応生成物、特にＤＰ３生成物、ガラクトシル・イソマルト又はガラクトシル・イソマルツロース及び／又はガラクトシル・ラクトース又はガラクトシル・ラクチット及び／又はガラクトシル・ソルビットがクロマトグラフィー分離法によって濃縮される。
【００５６】
また発明はβ−１，３−ガラクトシル・イソマルト、β−１，４−ガラクトシル・イソマルト及びβ−１，６−ガラクトシル・イソマルトからなり、又はおおむねこれらを例えば ＞８０、 ＞９０、 ＞９５重量％乾燥物の量で含む単離及び精製された混合物に関する。同様に発明は単離されたβ−１，３−ガラクトシル・イソマルトに関する。また発明は単離されたβ−１，４−ガラクトシル・イソマルトに関する。さらに発明は単離されたβ−１，６−ガラクトシル・イソマルトに関する。
【００５７】
本発明に基づく化合物の単離はとりわけ分取クロマトグラフィーシステムによって得られる。とりわけゲル浸透クロマトグラフィー（下記の実施例４を参照）で得られるＤＰ３領域は、好ましい実施形態では分取ＨＰＡＥＣ（高速陰イオン交換クロマトグラフィー）により例えば下記の条件で所望の個別成分に展開することができる。
【００５８】
分離カラム：２×Carbopac PA1、各々２２ｍｍ×２５０ｍｍ、陰イオン交換体、Dionex社、
流速：３０ｍＬ／ｍｉｎ
給入容積：０．６ｍＬ
検出：パルス電流測定検出器（金電極）、溶出液のアリコート、溶離液、溶離時間、電位及びパルス時間、実施例５を参照
各出発溶液を繰返し給入して、ＮＭＲ（核磁気共鳴）試験に必要な物質量に達した。適当にまとめた画分を回転蒸発装置で濃縮し、精密濾過し、凍結乾燥した。
【００５９】
そこで発明はとりわけ単離形態の個々の立体異性体、３つのいわゆるガラクトシル・イソマルト即ちβ−１，３−、β−１，４−及びβ−１，６−ガラクトシル・イソマルトのマンニット又はソルビット立体異性体に関する。
【００６０】
また発明は上記の方法を使用して互いに分離された形の３つのガラクトシル・イソマルトを調製するための方法において、続いて所望の具体的なガラクトシル・イソマルトをそれぞれ精製し、他の２つの形態から分離及び単離し、単離形態又は混合物におおむね例えば ＞８０、 ＞９０、 ＞９５重量％乾燥物の量で含む具体的なガラクトシル・イソマルトを得る方法に関する。
【００６１】
また発明は上記の方法を使用してとりわけ単離した形の３つのガラクトシル・イソマルトの個々の立体異性体、即ちβ−１，３−、β−１，４−及びβ−１，６−ガラクトシル・イソマルトのマンニット又はソルビット立体異性体を調製するための方法において、所望の具体的なガラクトシル・イソマルト立体異性体を精製し、他の形態から分離及び単離し、単離形態又は混合物におおむね例えば ＞８０、 ＞９０、 ＞９５重量％乾燥物の量で含む具体的なガラクトシル・イソマルトを得る方法に関する。
【００６２】
さらに発明はβ−１，３−ガラクトシル・イソマルツロース、β−１，４−ガラクトシル・イソマルツロース及びβ−１，６−ガラクトシル・イソマルツロースからなり又はおおむねこれを例えば ＞８０、 ＞９０、 ＞９５重量％乾燥物の量で含む単離及び精製されたガラクトシル・イソマルツロース混合物に関する。発明は同じく単離したβ−１，３−ガラクトシル・イソマルツロースに関する。また発明は単離したβ−１，４−ガラクトシル・イソマルツロースに関する。さらに発明は単離したβ−１，６−ガラクトシル・イソマルツロースに関する。
【００６３】
また発明は上記の方法を使用して、互いに分離した形の３つのガラクトシル・イソマルツロースを調製するための方法において、続いて所望の具体的なガラクトシル・イソマルツロースを精製し、他の２つの形態から分離及び単離し、単離形態又は混合物におおむね例えば＞８０、＞９０、＞９５重量％乾燥物の量で含む具体的なガラクトシル・イソマルトを得る方法に関する。
【００６４】
発明の別の実施形態は、本発明に基づく上記のガラクトシル・イソマルト組成物（Ａ）又は／及びガラクトシル・イソマルト組成物（Ｂ）又は／及びガラクトシル・イソマルツロース組成物及び／又は本発明に基づく混合物に含まれる純粋物質（以下本発明生成物と称する）、主としてβ−１，３−ガラクトシル・イソマルト、β−１，４−ガラクトシル・イソマルト、β−１，６−ガラクトシル・イソマルト、β−１，３−ガラクトシル・イソマルツロース、β−１，４−ガラクトシル・イソマルツロース、β−１，６−ガラクトシル・イソマルツロース、ガラクトシル・ラクトース、ガラクトシル・ラクチット及び／又はガラクトシル・ソルビット並びにこれらの物質の少なくとも２つの混合物の、特に健康促進、治療及び／又は予防効果をもつ食品、食糧、嗜好品及び／又は動物飼料としての使用に関する。また発明は食品、食糧、嗜好品及び／又は動物飼料並びに薬剤の製造のための上記の本発明生成物の使用に関する。
【００６５】
本発明に基づき意外なことに本発明生成物は胃内の条件下で、かつ小腸酵素によって加水分解されないことが判明した。プロビオティクス（Probiotikum）例えばヒト・ビフィズス菌による本発明生成物の発酵は、公知のプレビオティクス物質の場合より著しく緩慢に行われることが特に好都合である。それによって本発明生成物が大腸前部だけでなく、その全長にわたって、即ち後部でも肯定的な効果を発揮するようになることが特に好都合である。好んで使用されるガラクトース受容体分子、イソマルト及びイソマルツロースと異なり、本発明生成物は大腸に到達し、不消化炭水化物として生理的に可溶性不消化物の働きをし、特に腸の健康を促進する。しかし本発明生成物は低分子オリゴ糖として、他の可溶性不消化物又は不消化炭水化物の応用技術的欠点がない。
【００６６】
本発明生成物は大腸内で発酵可能であり、そこで大腸微生物によって有用な発酵産物、特に有益な酪酸又はブチレートの生成をもたらす。ブチレートは大腸上皮細胞の好ましいエネルギー源であり、従って健全な大腸機能にとって決定的に重要である。ブチレートは健全な上皮の成長と分化及び（前）新生物細胞のプログラム細胞死を促す。それは他の短鎖脂肪酸とともに大腸腔内の突然変異誘発物質及びその他の有毒物質を減少し、例えば腸グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼのような保護タンパク質の遺伝子発現を誘導し、それに基づきグルタチオンの形の解毒作用性の細胞還元当量を増加することによって、生体の還元力即ち防衛力を高める。こうして酸化的ストレスが減少される。さらにブチレートを含む短鎖脂肪酸は腔内ｐＨを減少し、こうして有害な細菌代謝活性、例えばβ−グルコシダーゼ、アゾ還元酵素又はニトロ還元酵素を阻害する。また低い大腸ｐＨは有害な腸内細菌を抑制し、有益な微生物の成長条件を改善する。
【００６７】
本発明生成物のこの発酵産物のその他の効果は、腸壁の機能強化のための基質としての機能、有毒な腔内物質の減少、抗酸化剤グルタチオン及びグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの細胞内合成に対する誘導効果、癌細胞に対する抗増殖作用、抗腫瘍作用及び細胞分化の増強能力にある。従って本発明生成物は疾病の治療及び／又は予防、特に酸化的ストレスに関連する疾病、とりわけ大腸領域の癌疾患及び炎症性腸疾患の治療及び／又は予防のための薬剤として優れている。また本発明生成物は特に病原菌の表面構造との相互作用によって病原菌を阻害し、その感染を抑制する性質がある。
【００６８】
本発明に基づき調製される生成物は先行技術の欠点と問題を克服し、本発明の意味で健康促進、多数の疾患の予防及び治療に適した薬剤である。本発明生成物は体内で本発明に基づきとりわけ作用物質として細胞高分子に直接作用し、それに基づき一連の機能変化を誘導し、生物学的効果を引き起こす。また本発明によれば本発明生成物の分解又は発酵産物は体内で作用物質として機能する。そこで発明は不消化炭水化物により影響を与えることができる疾病の治療及び／又は予防のための薬剤又は作用物質としての本発明生成物の使用に関する。
【００６９】
本発明に関連して「疾病」又は「疾患」とは、主観的に感じられ及び／又は客観的に確認し得る身体的異変を付随する生体の生活過程の障害及び／又は欠乏状態を意味する。本発明に基づき「疾病」とは、とりわけ不消化炭水化物により影響を与えることができる疾患及び感染症、特に大腸領域の癌疾患例えば大腸発癌、便秘、高血圧、卒中発作、病原菌によって引き起こされる疾病、リウマチ性疾患、骨粗しょう症、冠動脈疾患、急性心不全その他の心臓循環疾患、特に腸領域の慢性炎症性疾病及び炎症性腸疾患を意味する。
【００７０】
本発明に基づき「疾病」は、とりわけおおむね「酸化的ストレス」に原因する疾患も意味する。「酸化的ストレス」とは、人体又は特定の臓器又は組織にフリーラジカルの生成と分解の不均衡が成立する状態である。なお「フリーラジカル」とは、単独の不対電子を特徴とし、従って極めて反応性の高い分子又はその断片及び原子である。
【００７１】
別の好ましい実施形態は便秘の治療及び／又は予防のための薬剤又は作用物質、健全な微生物フロラの回復及び保全のための作用物質、特に動物又はヒト消化管の栄養成分、特にミネラル、例えばカルシウムの吸収を改善し、特に栄養不足症状を防止及び／又は減少するための作用物質及び腸の多くの微生物感染症（＝細菌性又はウイルス性腸炎）で起こる下痢疾患、例えば毒素原性大腸菌株並びにその他の腸病原性細菌、ウイルス、菌類及び寄生虫によって引き起こされる急性下痢、さらにはアミーバ赤痢の防止及び／又は治療のための作用物質としての本発明生成物の使用に関する。最後に、特に好ましい実施形態は一般感染症に対する免疫防御の強化のための作用物質、感染症の予防、腸疾患の予防、便秘の予防、大腸発癌の予防、炎症性疾患の予防及び／又は骨粗しょう症の予防のための作用物質としての本発明生成物の使用に関する。
発明の別の好ましい実施形態は医薬組成物の医薬用担体としての本発明生成物の使用に関する。
【００７２】
もちろん本発明は上記の疾病の治療及び／又は予防のための医薬組成物及び／又は薬剤の製造のための本発明組成物の使用にも関する。本発明に関連して「医薬組成物」又は「薬剤」とは、少なくとも１つの天然の又は合成的に作られ、治療効果を誘起する作用物質を含み、診断、治療及び／又は予防目的のために使用される、即ちヒト又は動物の身体の健康を促進又は回復する固体、液体、溶解又は懸濁状の製品又は物質混合物を意味する。医薬組成物は固体及び液体混合物である。例えば作用物質を含む医薬組成物は、単数又は複数の製薬上適合する賦形剤を含むことができる。さらに医薬組成物は通常専門分野で使用される添加物、例えば安定化剤、仕上剤、離型剤、増量剤、潤滑剤、着色料、香料、調味料、乳化剤又は製薬組成物の製造に慣用されるその他の物質を含むことができる。
【００７３】
本発明に基づき本発明生成物は例えば酸化的ストレスに原因する疾病の状態又は感染症の状態を予防し、このような疾病の進行を停止し、症状を軽減し、及び／又は特に疾病を治癒するのに十分な用量で投与するものとする。本発明組成物は胃腸管を経て大腸に到達することができるように、経口的に投与することが好ましい。その場合本発明生成物の用量の決定はとりわけ投薬形態、罹患している生体、特に罹患している人又は治療を受ける動物の年齢、性別及び体重、疾病の危険度及び疾患の重度に関係する。発明の好ましい実施形態では、例えば疾病又は感染を治療及び／又は予防するために、本発明生成物を医薬組成物の形で投与する。特に本発明生成物を含む医薬組成物は経口投与される医薬組成物の形、特に懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤の形又は同様に適当な投薬形態を有するものとする。本発明に基づき使用される本発明生成物は胃酸に対して不感であるが、胃液に耐える被覆を有する薬剤形態の中に本発明生成物を収容することができる。このような薬剤形態で医薬組成物に含まれる作用物質は胃を支障なく通過することができ、とりわけ腸上部又は中間部で初めて放出される。胃液耐性被覆の組成とこのような胃液耐性被覆の調製は専門分野で周知である。発明の特に好ましい実施形態では、疾病の長期的治療を可能にするために、緩慢な作用物質放出機構を有する薬剤形態が使用される。作用物質放出を遅らせたこのような薬剤形態の構造と組成は、同じく専門分野で周知である。
【００７４】
発明の特に好ましい実施形態では、本発明生成物を含む医薬組成物が疾病の治療、特に予防のための複合治療の枠内で使用される。即ち本発明に基づき作用物質としての本発明生成物のほかに、同時に少なくとも１つの作用物質又は少なくとも１つの別の薬剤が同じ適応症のために投与される。本発明生成物と少なくとも１つの追加の作用物質又は薬剤の併用は治療又は予防効果の強化を目指すことができるが、身体の種々の生物学的系に作用して全体的効果を強化することもできる。本発明生成物と少なくとも１つの追加の薬剤を、別個に又は固定的組合せとして投与することができる。追加の薬剤又は作用物質の選択は主として具体的に治療される疾病及びその重度に関係する。疾患が例えば酸化的ストレスに関連する疾患、例えば顕性大腸癌であれば、場合によって医師の指示に基づき例えば５−フルオロウラシルを使用する基礎化学療法を、本発明生成物の同時投与によって支援することができる。疾患が顕性糖尿病であれば、例えば血小板凝集阻止剤を使用する糖尿病患者の大血管症の薬物治療を、本発明生成物の同時投与によって支援することができる。
【００７５】
発明の別の好ましい実施形態では本発明生成物を飼料又は飲料水の添加剤として投与することによって、本発明生成物を特に単胃型の動物、例えば家畜及び有用動物の疾病の予防及び／又は治療のために使用する。本発明生成物は摂取した食物とともに動物の消化管に到達し、大腸領域で腸内細菌により発酵が起こる。本発明に基づき使用される生成物の食物による供給は、特に疾病予防の適している。本発明生成物を含む動物飼料を規則的に給餌すれば、長期的な疾病予防が可能である。本発明に関連して「飼料」又は「動物飼料」とは、無変化又は調理又は処理又は加工状態で動物に給餌するための物質又は物質混合物を意味する。動物飼料は固体状であることも液体状であることも可能である。従って「飼料」及び「動物飼料」の概念は、動物のための調整又は補助剤入り飲料水も包含する。飼料は単一飼料又は混合飼料である。本発明に基づく作用物質は溶解した形でも、固体状でも動物飼料に混入することができる。有用動物例えばブタへの投与のために、本発明作用物質を粉末、シロップ、顆粒の形で、動物の食餌のために使用される動物飼料又は添加剤混合物に混入することができる。本発明に基づき使用される生成物は、本発明に基づき同じく動物の飲料水に加えることもできる。本発明に基づき使用される物質がとりわけ急速に溶解し得るように、本発明生成物を例えば粉末、シロップ又は顆粒の形で飲料水と混合することによって、本発明作用物質の飲料水への添加を使用の直前に行うことが好ましい。
【００７６】
発明の別の好ましい実施形態では本発明生成物を食品、食餌療法用食品として、食品、食餌療法用食品及び飲料の添加剤として、また人の消費のための飲料水に使用することによって、上記の疾病の予防及び／又は治療のための本発明生成物の使用が行われる。こうして本発明生成物は摂取された食物又は液体とともにヒトの消化管に到達し、大腸領域で腸定住微生物によって発酵が起こる。本発明に基づき使用される生成物の食物による供給は、例えば感染症の疾病予防に特に適している。本発明生成物を含む食品又は飲物を規則的に消費すれば、長期的な予防と健康保持が可能である。
【００７７】
本発明に関連して「食品」の概念は、主としてヒトの食餌のために使用され、主として無変化又は調理又は加工状態でヒトが消費するための固体、液体、溶解又は懸濁状の製品又は物質混合物を意味する。食品は天然成分のほかに、天然又は合成起源の別の成分を含むことができる。食品は固体状でも液体状でも存在する。従って「食品」の概念はヒトが消費するための飲料水を含むあらゆる種類の飲物も包含する。本発明に基づき使用される生成物は溶解した形でも固形状態でも食品に混入することができる。「嗜好品」とは、主として飲食したときに起こるヒト又は動物の身体の快楽に役立つ固体、液体、溶解又は懸濁状の物質又は物質混合物を意味する。
【００７８】
本発明に関連して「食餌療法用食品」とは、特定の栄養素又はその他の栄養生理学的効果物質を所定の数量比又は所定の性状で供給するという所定の栄養目的に供するための食品を意味する。食餌療法用食品はその組成と性質が、比較可能な種類の食品と決定的に相違する。食餌療法用食品は疾病、機能障害もしくは個々の食品又はその内容物質に対するアレルギー反応に基づき所定の栄養要件を満たさなければならない場合に使用することができる。また食餌療法用食品は固体状でも液体状でも提供することができる。
【００７９】
発明の好ましい実施形態では、本発明生成物が食品中の不消化物、特に可溶性不消化物又は不消化炭水化物として使用される。本発明に関連して「不消化物」とはヒト又は動物の酵素にとって不消化の食物成分、特に食物の不消化炭水化物分を意味する。しかし不消化物は大腸細菌によって少なくとも部分的に発酵させることができ、こうして少量がヒト又は動物の身体のためにエネルギーとして利用可能である。「可溶性不消化物」は溶液、特に水溶液に溶解可能である。不消化物として使用した場合、本発明生成物は主栄養素分から生じるエネルギー密度を調節するとともに、小腸内の移行時間と吸収に関連する消化過程を調節する。本発明生成物は水に大変よく溶けるので大腸領域に溶解した形で存在し、このため腸内フロラによって完全又はほぼ完全に発酵されるから、特に可溶性不消化物として適している。しばしば使用される他の不消化物、例えばコムギ又はオートムギふすまと比較して、本発明生成物は不消化物として使用した場合に望ましくない副作用をもたらす物質を含まないという利点がある。
【００８０】
発明の別の実施形態は本発明生成物のプレビオティクス的不消化物、特にプレビオティクスとしての使用に関する。本発明に関連して「プレビオティクス」とは、ヒト又は動物の消化管内の特殊な細菌、特にビフィズス菌及び／又はラクトバチルスの成長及び／又は活性を健康促進効果が期待されるように選択的に刺激する食品、嗜好品、飼料又は薬剤成分を意味する。プレビオティクスは通常全く消化されないか又は極めて消化しにくい。本発明生成物の発酵により多量の短鎖脂肪酸、特にブチレートが生じるから、本発明生成物を使用すれば大腸領域でｐＨ値が酸性領域へ明らかに低下する利点がある。大腸領域のｐＨ値の低下により、病原性腸内微生物にとって生活条件が悪化し、同時に親酸性及び糖分解性微生物のための生活条件が改善される。
【００８１】
別の好ましい実施形態では本発明生成物は他の可溶性又は不溶性の発酵可能又は発酵不能な不消化物と併用される。この実施形態の好ましい変法では本発明生成物は、可溶性不消化物、例えば短鎖フルクトオリゴ糖、長鎖フルクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、加水分解グアルガム、例えば“Sunfibre”又は“Benefibre”、ラクツロース、キシロオリゴ糖、ラクトスクロース、マルトオリゴ糖、例えばMatsutaniの“Fibersol-2”、イソマルトオリゴ糖、ゲンチオオリゴ糖、ヒドロラーゼを含むペクチン物質、糖縮合物、グルコシル・スクロース、例えばHayashibaraの“Coupling Sugar ”、大豆オリゴ糖、キトオリゴ糖、キトサンオリゴ糖並びに不溶性不消化物、例えば耐性デンプン、カラスムギ繊維、コムギ繊維、野菜繊維、例えばエンドウマメ、トマトの繊維、果実繊維、例えばリンゴ、ブドウ及びイナゴマメの繊維、例えばNutrinovaの“Caromax”、セルロース及びテンサイ繊維、例えばDaniscoの“Fibrex”からなる不消化物又は不消化炭水化物のグループから選ばれた少なくとも１つの別の不消化物と組み合わせて使用される。そこで発明の別の主題はガラクトシル・イソマルツロース組成物及び／又はガラクトシル・イソマルツロース組成物並びに上記の不消化物のグループから選ばれた少なくとも１つの不消化物を含む不消化物組成物である。
【００８２】
本発明生成物と上記の不消化物の少なくとも１つとの混合物のほかに、本発明に基づき単独の又は上記不消化物の少なくとも１つと組合わせた本発明生成物と「プロビオティクス」との混合物も、いわゆる「シンビオティクス」（Synbiotikum）として使用することが好ましい。とりわけ添加されるプロビオティクス・ビフィズス菌、乳酸桿菌及び／又は腸内細菌の培養物は、使用と投薬形態に応じて生培養物及び／又は乾燥培養物又は持続培養物として調製される。本発明に関連して「シンビオティクス」とは、特に微生物の成長及び／又は代謝活性を選択的に刺激して、胃腸管内の健康増進性の生きた微生物の生存率を改善し、個数を増加することによりヒト又は動物消費者の健康を促進する、少なくとも１つのプロビオティクスと少なくとも１つのプレビオティクスの混合物を意味する。ガラクトシル・イソマルト組成物及び／又はガラクトシル・イソマルツロース組成物と少なくとも１つのプロビオティクス、特にビフィズス菌を含むシンビオティクスも発明の主題である。
【００８３】
本発明に関連して「プロビオティクス」とは、ヒト又は動物消費者の消化管内の微生物組成の安定化又は改善によってその健康を促進する食品、嗜好品、飼料又は薬剤の生きた微生物成分を意味する。食品、嗜好品又は飼料に使用することができるこのようなプロビオティクス微生物は、例えばビフィズス菌例えばB.adolescentis, B.animals, B.bifidu-m, B.longum, B.thermophilun株；腸球菌；乳酸桿菌例えばLb.acidophilus, Lb.Brevis, Lb.casei, Lb.cellobiosus, Lb.crispatus, Lb.delbrueckii subsp. Bulgaricus, Lb.fermen-tum, Lb.GG, Lb.johnsonii, Lb.lactis, Lb.plantarum,  Lb.reuteri, Lb.rhamnosum, Lb.salivarius株；Bacillus cereus toyoi；Bacillus cereus；Leuconostoc；Prediococcus a-cidilactici；プロピオン酸菌；連鎖球菌例えばS.cremoris, S.infantarius, S.intermedius, S.lactis, S.salivarius subsp.thermophilus株である（J.Fuller, J.Appl. Bacteriol.(1989)を参照）。好ましいプレビオティクスは乳酸桿菌属及びビフィズス菌属である。
【００８４】
本発明生成物は単独で又はシンビオティクスとして、本発明に基づき食餌療法用繊維源として及び／又は健全なミクロフロラのための栄養素として、便秘の治療及び／又は予防、消化管内の健全な微生物フロラの回復及び保全、動物又は人の消化管内の栄養成分例えばミネラルの利用可能度と吸収の改善 、一般に特に回復期の健康の増進と回復のために利用され、前述のように大腸腫瘍及び炎症性腸疾患の発生を防止する。本発明に基づき本発明生成物を動物及び人の身体の免疫系の調節及び支援のために利用することが好ましい。
【００８５】
発明の別の好ましい実施形態は食品又は甘味品の血糖的性質の調節、特に特別食、幼児食又はグルコース／インスリン収支の障害及びそれに起因する血糖的反応をもつ人の食餌のための本発明生成物の使用に関する。血糖的反応とは、消化しやすい炭水化物を摂取した後の血糖レベルの変化を意味する。経口的摂取の後に唾液、膵臓又は小腸酵素によって急速にグルコースが放出され、吸収される炭水化物は、極めて強い血糖的反応を引き起こす。健全な身体では血糖の上昇はインスリン分泌をもたらし、その際インスリンは末梢組織、例えば骨格筋によるグルコース摂取を刺激するから、血液値は再び基準値に低下する。そこで本発明生成物は糖尿病及び類縁の代謝疾患、例えばＸ症候群、インスリン抵抗性又はグルコース不耐性の予防及び／又は治療のために、とりわけ食餌療法用食品及び嗜好品の成分として使用することができる。発明のもう一つの主題は糖代謝障害、１型及び２型糖尿病、グルコース不耐性、インスリン抵抗性及び／又はＸ症候群の予防及び／又は治療のための本発明生成物の使用である。
【００８６】
発明の別の好ましい実施形態では、甘味料としての本発明生成物の使用が予定される。本発明生成物は改善された甘味づけ性又は甘味度を有する。従ってそれに伴う上記の肯定的性質を備えた可溶性不消化物としてだけでなく、特に食餌療法用製品の糖代用品及び／又は甘味料としても使用することができる。本発明生成物は人間の口腔内フロラによって分解されないから、優れた非う蝕原性を有する。従って本発明生成物を含む甘味料は非う蝕原性を特徴とする利点がある。そこで本発明生成物を含む甘味料も発明の主題である。
【００８７】
発明の別の好ましい実施形態では食品、甘味品及び動物飼料の製造のための本発明生成物の使用が予定されている。特にｐＨ値２ないし５、特に２ないし４の酸性食品の製造のための本発明生成物の使用が予定されている。このような酸性食品によって本発明生成物のプレビオティクス的効果が増進される。特に本発明生成物を果汁又は果汁調理品の製造に使用することが好ましい。
【００８８】
また本発明は本発明生成物を単独で又は少なくとも１つの別の不消化物及び／又はプロビオティクスとの組合せとして含む食品、食糧及び嗜好品に関する。そこで発明の別の主題は、シンビオティクス、不消化物組成物、ガラクトシル・イソマルト組成物及び／又はガラクトシル・イソマルツロース組成物を含む食品、食糧、嗜好品又は動物飼料である。
【００８９】
本発明に基づき少なくとも１つの別の不消化物は上記の可溶性、不溶性不消化物又は不消化炭水化物のグループから選ばれる。本発明生成物は胃のｐＨ条件下で、かつ小腸粘膜の酵素によって事実上分解されないから、有効量の本発明生成物を含む本発明の食品、食糧及び嗜好品は低カロリー食品、食糧又は嗜好品であるという利点がある。発明の好ましい実施形態では本発明の食品は乳製品又はミルク製品、例えばチーズ、バター、ヨーグルト、ケフィル酒、凝乳、発酵乳、脱脂乳、クリーム、コンデンスミルク、ドライミルク、乳清、ミルク混合物、低脂肪乳、乳清混合物、乳糖、乳タンパク質及び乳脂製品である。発明の別の好ましい実施形態では本発明に基づく食品はパン菓子、特にビスケットを含むパン及び堅焼きパン菓子を含むケーキ類である。発明の別の実施形態では本発明に基づく食品はパンの塗りもの、マーガリン製品及び製パン油脂並びにインスタント製品及びブイヨン製品である。発明の別の好ましい実施形態では本発明に基づく食品は果物製品特に粒入りジャム、マーマレード、ゼリー、果物缶詰、果肉、果肉ピューレ、果汁、濃縮果汁、果実ネクター及び果実粉末である。本発明生成物を含む食品は本発明に基づき野菜製品、特に野菜缶詰、野菜ジュース及び野菜ピューレである。発明の別の実施態様では本発明生成物を含む食品は非アルコール飲料即ちスポーツ飲料、飲料原料及び飲料粉末である。
【００９０】
本発明の別の好ましい実施形態は本発明生成物を含む甘味品に関する。本発明生成物は砂糖代用品及び／又は甘味料としても甘味品、特に食餌療法用製品に使用される。従って本発明に基づく甘味品は非う蝕原性を特徴とする利点がある。本発明に基づく甘味品は特にチョコレート製品、硬質カラメル、軟質カラメル、フォンダン製品、ゼリー製品、甘草エキス、発泡糖製品、ココナッツフレーク、ボンボン、圧縮製品、砂糖漬け果物、クロカン、ヌガー製品、アイスキャンデー、マルチパン、チューインガム、ミュースリバー及びアイスクリームもしくはアルコール又は非アルコール甘味飲料である。
【００９１】
発明のその他の有利な実施態様は従属請求項で明らかである。
【００９２】
下記の実施例に基づき発明を詳述する。
【実施例１】
【００９３】
β−１，３−ガラクトシル・イソマルト高濃度化混合物の調製
ｐＨ４．３のMcllvain緩衝液中で供与体としてのラクトース１．１７mol／lを雄牛精巣のβ−ガラクトシダーゼ（酵素量：０．７５単位）及び受容体としてのイソマルト（Palatinit（登録商標））１．０mol／lと３７℃で４８時間反応させる。ＤＰ−３成分に関してβ−１，３−ガラクトシル・イソマルト（式（１））が高濃度化されたガラクトシル・イソマルト混合物が得られる。
【実施例２】
【００９４】
β−１，４−ガラクトシル・イソマルト高濃度化混合物の調製
ａ）β−１，４−ガラクトシル・イソマルト高濃度化混合物の調製
ｐＨ５．０の酢酸ナトリウム緩衝液中で０．２mol／lのラクトースをBacillus circlansのβ−ガラクトシダーゼ（酵素量：１．２単位、Ｅ．Ｃ．３．２．１．２３型、“Biolacta N5”、製造元：Daiwa Kasei Co.Ltd．，大阪）及び１．０mol／lのイソマルトと５５℃で２時間反応させる。９０℃に１０分間加熱して反応を終了する。ＤＰ−３成分に関してβ−１，４−ガラクトシル・イソマルト（式（２））が高濃度化されたガラクトシル・イソマルトが得られる。
【００９５】
反応生成物の分析：
そのために３６０．３mgのイソマルト（一水化物）（１mmol又は１０当量に相当）と３６．０mgのラクトース（０．１mmolに相当）を前述のように反応させる。収量は２９．８mg（０．０５９ｍｍｏｌ）（５９％に相当）である。白色の無定形固形物、Ｃ１８Ｈ３４Ｏ１６、ＭＷ＝５０６．４５、［α］２０Ｄ＋６１（ｃ＝０．８，Ｈ２Ｏ）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦm/z５２９．６７［Ｍ＋Ｎａ］＋、５４５．６３［Ｍ＋Ｋ］＋が得られる。
【表１】
2005531611.tif 000008
【表２】
2005531611.tif 000009
【００９６】
ｂ）β−ガラクトシル・イソマルツロース高濃度化混合物の調製
ｐＨ５．０の酢酸ナトリウム緩衝液５０mol／l中で０．２mol／lのラクトースをBacill-us circlansのβ−ガラクトシダーゼ及び１．０mol／lのイソマルツロースと５５℃で２時間反応させる。９０℃に１０分間加熱して反応を終了する。ＤＰ−３成分に関してβ−１，４−ガラクトシル・イソマルツロース（式（５））が高濃度化されたガラクトシル・イソマルトが得られる。
【００９７】
反応生成物の分析：
そのために３４２．３mgのイソマルツロース（１mmol又は１０当量に相当）と３６．０mgのラクトース（０．１mmolに相当）を前述のように反応させる。収量は２９．７mg（０．０５９ｍｍｏｌ）（５９％に相当）である。白色の無定形固形物、Ｃ１８Ｈ３２Ｏ１６、ＭＷ＝５０４．４４、［α］２０Ｄ＋７４（ｃ＝０．５，Ｈ２Ｏ）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦm/z５２６．８３７［Ｍ＋Ｎａ］＋が得られる。
【表３】
2005531611.tif 000010
【表４】
2005531611.tif 000011
【実施例３】
【００９８】
β−１，６−ガラクトシル・イソマルト高濃度化混合物の調製
ｐＨ４．５（緩衝液なし）で０．２mol／lのラクトースをこうじ菌のβ−ガラクトシダーゼ（酵素量：５０単位、Ｇ５１６０型、製造元：SIGMA Aldrich）及び１．０mol／lのイソマルトと３０℃で２時間反応させる。ＤＰ−３成分に関してβ−１，６−ガラクトシル・イソマルト（式（３））が高濃度化されたガラクトシル・イソマルト含有混合物が得られる。
【００９９】
実施例４の表は得たガラクトシル・イソマルト含有混合物の生成物組成（ＤＰ分布）を示す。
【実施例４】
【０１００】
ガラクトシル・イソマルト混合物（実施例１ないし３を参照）のクロマトグラフィー展開
実施例１ないし３の反応生成物のＤＰ分布を５０℃でFractogel（登録商標）HW40Ｓ及び溶離液として完全脱塩水によりゲル浸透クロマトグラフィーで確かめた。その際Raftilose（登録商標）STを対照物質として使用した。
【表５】
2005531611.tif 000012
【０１０１】
選んだインキュベート条件のもとですべての場合にオリゴ糖（ＤＰ３、ＤＰ４）が生成された。
【実施例５】
【０１０２】
ガラクトシル・イソマルトＤＰ３／ＤＰ４の加水分解
実施例１ないし３から得たＤＰ３及びＤＰ４領域の成分の加水分解を０．５％溶液、１mol／ｌＨＣｌで９５℃で３時間行った。下記の条件でＨＰＡＥＣにより分析を行った。
【０１０３】
分離カラム：２×Carbopac PA1、各４ｍｍ×２５０ｍｍ、前置カラムPA１、４ｍｍ×５０ｍｍ、陰イオン交換体、Dionex社
溶離液：０．１６mol／l ＮａＯＨ及び０．５mol／l 酢酸ナトリウム、勾配１ないし５４％
溶離時間：３０分
流速：１ml／min
検出：パルス電流測定検出器（金電極）
電位Ｅ及びパルス時間ｔ：Ｅ１＝０．０５Ｖ及びｔ１＝４００ｍｓ、Ｅ２＝０．６Ｖ及びｔ２＝３００ｍｓ、Ｅ３＝０．６０Ｖ及びｔ３＝２４０ｍｓ
【表６】
2005531611.tif 000013
【０１０４】
単離したＤＰ３／ＤＰ４生成物の加水分解は、単糖ではソルビット、マンニット、グルコースと、そのほかに僅かな割合の分解生成物１，６−ＧＰＳ及び１，１−ＧＰＭを生じる。ソルビット及びマンニットとグルコース及びガラクトースとの比は、主としてガラクトシル・イソマルトが生成されることを示す。
【実施例６】
【０１０５】
好熱性β−ガラクトシダーゼによる反応
３つの好熱性微生物
Bacillus stearothermopilus KVE39 (BgaB)
Thermus brockianus ITI360       (BgaT) 
Thermus thermophilus TH125     (BglT)
から誘導されたβ−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子を発現ベクターで大腸菌宿主株（β−ガラクトシダーゼ陰性）にクローニングし、続いて増殖した。細胞の分解の後に得た大腸菌粗抽出物を熱沈降によって部分的に精製し、その後のインキュベーションに使用した。
【０１０６】
調合物：１．５mol／lのラクトース溶液に、またラクトース０．２部と０．０２％アジ化ナトリウム（ＮａＮ３）を含むリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）５０mmol／l中のイソマルツロース、１，６−ＧＰＳ又は１，１−ＧＰＭそれぞれ０．８部からなる１．５mol／lの溶液に、調合物０．５mlにつき１単位のβ−ガラクトシダーゼを加え、３７℃で振とうしつつ１６時間インキュベートする。反応停止：９５℃、１５分。ＨＰＡＥＣ分析：実施例４を参照。
【表７】
2005531611.tif 000014
【表８】
2005531611.tif 000015
【表９】
2005531611.tif 000016
【０１０７】
β−ガラクトシダーゼＢｇａＴ及びＢｇＩＴは供与体分子として２つのイソマルト成分１，６−ＧＰＳ／１，１−ＧＰＭ及びラクトースの存在下でオリゴ糖を生成する。１，６−ＧＰＳも１，１−ＧＰＭも受容体として機能することが明らかである。使用したβ−ガラクトシダーゼでイソマルツロース及びラクトースとの反応はすべての場合に三糖及び部分的に四糖も生じる。β−ガラクトシダーゼＢｇａＢ（野生種）の場合は三糖又は四糖（ＤＰ３、ＤＰ４）の生成は起こらない。
【実施例７】
【０１０８】
Bacillus stearothermophilus KVE39(BgaB)の突然変異体の好熱性β−ガラクトシダーゼによる反応
ＢｇａＢ突然変異体ｐＧＰ１７及びｐＧＰ２３のβ−ガラクトシダーゼを実施例５と同様に調製し、試験した。
【表１０】
2005531611.tif 000017
【表１１】
2005531611.tif 000018
【０１０９】
ＢｇａＢのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の突然変異は、野生種と異なりガラクトシル・イソマルト又はガラクトシル・イソマルツロースを合成することができる酵素をもたらすことが明らかである。
【実施例８】
【０１１０】
胃及び小腸内のガラクトシル・イソマルトの安定性
ａ）胃内の安定性
胃通路での物質の安定性はｐＨ２．０での加水分解率を測定することによってシミュレートすることができる。対照としてサッカロース及び１−ケストースを使用する。
【０１１１】
実施例４の三糖（ＤＰ３）の１％溶液をそれぞれ１０mmol／lの塩酸（ｐＨ２．０）とともに３７℃で３時間インキュベートする。それぞれ６０分、１２０分及び１８０分後に反応調合物から試料を採取し、これを塩基性陰イオン交換体クロマトグラフィー、ＨＰＡＥＣにより分析する。
【表１２】
2005531611.tif 000019
【０１１２】
β−１，３−、β−１，４−及びβ−１，６−高濃度化ガラクトシル・イソマルト含有混合物から単離した三糖（ＤＰ３）又は単離したガラクトシル・イソマルツロース含有混合物（ＢｇｌＴ）は、胃通路と比較可能な条件のもとで、分解率８％のサッカロース及び分解率３６％の１−ケト−スと比較して加水分解されない。
【０１１３】
ｂ）膵臓酵素に対する安定性
膵臓分泌物は大量のヒドロラーゼ、とりわけ炭水化物分解酵素、例えばα−アミラーゼを含む。α−アミラーゼはα−１，４−グルカン（デンプン、グリコーゲン）をとりわけマルトースおよびマルトオリゴ糖に分解する。膵臓酵素に対する糖類の安定性試験は次のように行う。
【０１１４】
調合物ごとに各々３．０mlの炭水化物溶液（溶液２ないし溶液６）にそれぞれ０．１mlの酵素溶液（溶液７）を混合する。
【０１１５】
溶液１：２０mmol／lのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）及び６mmol／lのＮａＣｌ
溶液２：実施例２及び実施例４により調製した本発明のβ−１，４−ガラクトシル・イソマルト混合物の、溶液１に溶解した１％溶液
溶液３：実施例１及び実施例４により調製した本発明のβ−１，３−ガラクトシル・イソマルト混合物の、溶液１に溶解した１％溶液
溶液４：実施例３及び実施例４により調製した本発明のβ−１，６−ガラクトシル・イソマルト混合物の、溶液１に溶解した１％溶液
溶液５：実施例６（ＢｇＩＴ）により調製し、実施例４と同様に三糖を単離した本発明のガラクトシル・イソマルツロース含有混合物の、溶液１に溶解した１％溶液
溶液６：溶液１中の１％デンプン溶液（Zulkowskiによる可溶性デンプン）
溶液７：溶液１に溶解した０．２％膵臓酵素（Sigma）
３７℃でサーモミキサ（間欠的に振とう）で２１０分間インキュベートした後、９５℃で１５分間加熱して反応を終了し、試料をＨＰＡＥＣで分析する。デンプン含有試料（溶液６＋溶液７）はＨＰＡＥＣ分析の前に１mol／lの塩酸中で９５℃に３時間加熱して完全に加水分解し、試料のデンプン含量を算定するために、こうして生じたグルコースを測定する。
【表１３】
2005531611.tif 000020
【０１１６】
β−１，３−、β−１，４−及びβ−１，６−高濃度化ガラクトシル・イソマルト含有混合物から単離された三糖（ＤＰ３）及び三糖のガラクトシル・イソマルツロースは、使用した膵臓酵素によって分解されない。
【０１１７】
ｃ）小腸αグルコシダーゼに対する安定性
小腸内に存在する粘膜耐性酵素複合体サッカラーゼ／イソマルターゼ及びグルコアミラーゼ／マルターゼは生体内で、小腸に到達した二糖例えばマルトース及びサッカロース、部分的にマルトオリゴ糖も単糖に分解させ、そのまま腸壁を通って血液循環に吸収されるようにする。これらの酵素に対するガラクトシル・イソマルト（ＤＰ３）及びガラクトシル・イソマルツロースの安定性の試験を次のように行った。
【０１１８】
酵素複合体サッカラーゼ／イソマルターゼ（ＳＩ複合体）及びグルコアミラーゼ／マルターゼ（ＧＭ複合体）をH.Heymannの方法（ハノーファー大学学位請求論文、１９９１年）によりブタ小腸から単離した。
【０１１９】
溶液１：  ０．１mol／lのトリエタノールアミン（ＴＥＡ）緩衝液、ｐＨ７．０
溶液２：  実施例４により調製したβ−１，４−ガラクトシル・イソマルト混合物のＤＰ３領域の、溶液１に溶解した１％溶液
溶液３：  実施例４によるβ−１，３−ガラクトシル・イソマルト混合物のＤＰ３領域の、溶液１に溶解した１％溶液
溶液４：  実施例４により調製したβ−１．６−ガラクトシル・イソマルト混合物のＤＰ３領域の、溶液１に溶解した１％溶液
溶液５：  実施例６（ＢｇＩＴ）により調製し、実施例４と同様に三糖を単離したガラクトシル・イソマルト混合物のＤＰ３領域の、溶液１に溶解した１％溶液
溶液６：  溶液１中のマルトースの１％溶液
溶液７：  溶液１中のサッカロースの１％溶液
溶液８：  溶液１中のイソマルトの１％溶液
溶液９：  溶液１中のイソマルツロースの１％溶液
溶液１０：溶液１中のサッカラーゼ／イソマルターゼ酵素複合体
溶液１１：溶液１中のグルコアミラーゼ／マルターゼ酵素複合体
ｉ）３７℃に温度調整した炭水化物溶液（溶液２ないし溶液８）１．０mlにそれぞれ０．７単位の酵素複合体サッカラーゼ／イソマルターゼ（溶液１０）又はグルコアミラーゼ／マルターゼ（溶液１１）を加え、混合し、３７℃でインキュベートした。
【０１２０】
ｉｉ）より激しい条件でのインキュベートのために１６単位の酵素複合体サッカラーゼ／イソマルターゼ又は１３単位の酵素複合体グルコアミラーゼ／マルターゼを使用した。２時間後に９５℃に１５分加熱して反応を停止した。その際生成された単糖と各調合物の未分解の糖類をＨＰＡＥＣにより定量的に決定した。
【表１４】
2005531611.tif 000021
【０１２１】
選んだ標準条件のもとでサッカロースとマルトースはサッカラーゼ／イソマルターゼ酵素複合体により、マルトースはグルコアミラーゼ／マルターゼ酵素複合体により、ほぼ完全に加水分解される。イソマルトはこの条件で部分的に分解される。β−１，６−ガラクトシル・イソマルト（６．９％）以外のガラクトシル・イソマルトは全く分解されない。
【０１２２】
イソマルトの場合、激しい条件でサッカラーゼ／イソマルターゼに対して５２％、グルコアミラーゼ／マルターゼに対して１２，８％の著しい分解が起こる。ガラクトシル・イソマルトとガラクトシル・イソマルツロースはこの条件でほとんど分解されない。
【０１２３】
ｄ）ラクターゼに対する安定性
小腸内に存在する粘膜耐性酵素ラクターゼは生体内で、小腸に到達したラクトースを分解させ、生じる単糖が腸壁を通って血液循環に吸収されるようにする。
【０１２４】
この酵素に対するガラクトシル・イソマルト（ＤＰ３）及びガラクトシル・イソマルツロースの安定性の試験を次のように行う。
【０１２５】
酵素ラクターゼをK.Wallenfels及びJ.Fischerの改良法（Z.Physiologische Chemie 321(1960)223）により単離する。
【０１２６】
溶液１−５：    実施例８ｃ）を参照
溶液６：    溶液１中のラクトースの１％溶液
溶液７：    溶液１中のイソマルトの１％溶液
溶液８：    溶液１中のラクターゼ
３７℃に温度調整した炭水化物溶液（溶液２ないし７）１．０mlにそれぞれ０．９単位の酵素ラクターゼを加え、混合し、３７℃でインキュベートする。６時間後に９５℃に１５分熱して反応を停止する。その際生成された単糖及び各調合物の未分解の糖類をＨＰＡＥＣにより定量的に決定する。
【表１５】
2005531611.tif 000022
【０１２７】
選んだ条件でラクトースのほぼ完全な加水分解が起こる。ラクトースと比較して、ガラクトシル・イソマル及びガラクトシル・イソマルツロースは僅かしか分解されない。
【実施例９】
【０１２８】
β−ガラクトシダーゼの調製
本発明の方法に特に適しているのが細菌のβ−ガラクトシダーゼである。これは雄牛精巣のβ−ガラクトシダーゼの活性に類似する。次表は使用した酵素の主要な性質とその起源を示す。  
活性はそれぞれ６５℃でｐＮｐ−β−Ｇａｌで決定した。一般にリン酸カリウム緩衝液（ｐH６．５）が測定に使用され、酵素調製物はこの緩衝液中にある。４℃で安定的な貯蔵が行われる。
【表１６】
2005531611.tif 000023
【０１２９】
Thermus ssp.の２つの酵素の最適温度は著しく高い（〜９０℃）。
【０１３０】
酵素の様々な基質と領域選択性を調べた。その場合酵素ごとに鮮明な相違が明らかになった。
【０１３１】
６５℃で種々のパラニトロフェニルグリコシドを使用した（この場合基質は十分に安定である）。次表にｐＮｐ−β−Ｇａｌについて活性（％）を示す。
【表１７】
2005531611.tif 000024
【０１３２】
上記の細菌酵素、その発現ベクター及び酵素をコードする遺伝子並びに遺伝子又は発現ベクターを有する細胞も本発明の主題である。
【０１３３】
β−ガラクトシダーゼ調製物
Ａ）Bacillus stearothermopilusのＢｇａＢ
大腸菌株：      大腸菌ＪＭ１０９のｐＨＷＧ５０９
濃縮：          熱沈降
活性：          ｐＮｐ−βＧａｌ（６５℃）：４８単位／ｍｌ
タンパク質：    １．１５ｍｇ／ｍｌ
Ｂ）Thermus brockianusのＢｇａＴ  
大腸菌株：      大腸菌ＪＭ１０９のｐＯＦ３８２３
濃縮：          熱沈降
活性：          ｐＮｐ−βＧａｌ（６５℃）：１７単位／ｍｌ
タンパク質：    １．９ｍｇ／ｍｌ
Ｃ）Thermus thermophiles ＴＨ１２５のＢｇｌＴ
大腸菌株：      大腸菌ＪＭ１０９のｐＨＷＧ４７５
濃縮：          熱沈降
活性：          ｐＮｐ−βＧａｌ（６５℃）：１９単位／ｍｌ
タンパク質：    ０．９ｍｇ／ｍｌ
β−ガラクトシダーゼ調製物を４℃で０．１ｍｏｌ／ｌの燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）中に保存する。
【実施例１０】
【０１３４】
ＢｇａＢ野生種（ｐＨＷＧ５０９）及びＢｇａＢ突然変異体（ｐＧＰ１７及び２３）の酵素粗抽出物の調製及び特性
すべての抽出物は１００ｍｌの終夜培養物（アンピシリン、ラムノース０．２％）から調製した。まず４℃、６０００rev／minで１０分間遠心分離し、得たペレットを１０mmol／lの燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で洗浄した。続いて４℃、６０００rev／minで１０分間遠心分離する。ペレットをリン酸カリウム緩衝液１０mmol／ｌ（ｐＨ６．５）に溶解し、細胞をフレンチプレスで分解し、室温で１３０００rev／minで３０分間遠心分離する。上澄み液（粗抽出物）を６０℃で１５分間変性させ、室温で３０分間遠心分離し、０．０２重量％のアジ化ナトリウムとともに保存する。次に酵素の特性を示す。
【０１３５】
活性の決定のために２μlの粗抽出物を３９８μlのリン酸カリウム緩衝液（０.１mol／l、ｐＨ６．５）と混合する。３７℃で３５分間プレインキュベートし、リン酸カリウム緩衝液（０．１mol／l、ｐＨ６．５）中の１００μlのｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（４mg／ml）を加える。活性を２分間測定する。１mlのホウ酸ナトリウム（０．４mol／l、ｐH４．０）で反応を停止し、４０５ｎｍでｐＮＰの品質を測定する。
【表１８】
2005531611.tif 000025
【表１９】
2005531611.tif 000026
【表２０】
2005531611.tif 000027
【０１３６】
調製された突然変異遺伝子、それによってコードされたβ−ガラクトシダーゼ及びこれを含むベクター並びに宿主細胞も発明の主題である。
【実施例１１】
【０１３７】
ヒトの糞便中のβ−ガラクトシル・イソマルトの発酵
炭水化物をヒトの糞便とともにインキュベートすれば、細菌集団による代謝速度及び短鎖脂肪酸、酪酸の生成について記述が可能である。
【０１３８】
1n vitro発酵実験での発酵性の研究のために、β−ガラクトシル・イソマルトのほかに比較のために似た構造及び重合度の炭水化物としてRaftilose（登録商標）Ｐ９５（フルクトオリゴ糖、ＤＰ４−５）、ガラクトシル・ラクトース（オリゴマーＤＰ３）及びラクトスクロースも使用する。
【０１３９】
in vitro発酵実験のために下記の組成の嫌気性培地を使用する。
【０１４０】
培地１：
トリプトン                          １．５ｇ
酵母抽出物                          １．５ｇ
ＫＨ２ＰＯ４                          ０．２４グラム
Ｎａ２ＨＰＯ４                        ０．２４ｇ
（ＮＨ４）２ＳＯ４                    １．２４ｇ  
ＮａＣｌ                            ０．４８ｇ
ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ                  ０．１０ｇ
ＣａＣｌ×２Ｈ２Ｏ   ０．０６ｇ
ＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ                  ２．０ｍｇ
レゾアズリン                        １．０ｍｇ
システイン／ＨＣｌ                  ０．５ｇ
ビタミン溶液（ＤＳＭ１４１による）  ０．５ｇ
微量元素溶液（ＤＳＭ１４１による）  ９．０ｍｌ
ＮａＨＣＯ３                          ２．０ｇ
Ｈ２Ｏ蒸留水  １０００ｍｌ、ｐＨ０．７
供試オリゴ糖での腸内細菌の培養
９ｍｌの前述の嫌気性培地１を０．５％（Ｗ／Ｖ）供試ガラクトシル・イソマルト（実施例１−３により調製）並びに適当な対照、ラクトース及びガラクトシル・ラクトースと混合し、続いてあらかじめ還元剤として０．５ｇ／Ｌのシステイン／ＨＣｌを加えた嫌気性５０mmol／lリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中の１０％糞便懸濁液（２人の被験者の混合糞便）１mlを接種する。
【０１４１】
続いて“Hungate”試験管を３７℃で振とうしつつ最大２８時間インキュベートする。様々な時期にそれから試料を取り出し、これを残留オリゴ糖、短鎖脂肪酸、乳酸及びｐＨ値について検査する。
【０１４２】
結果：
フルクトオリゴ糖（Raftilose（登録商標）Ｐ９５）、ガラクトシル・ラクトース及びラクトスクロースはすでに７時間後にほぼ完全に代謝されている。これに対して実施例１ないし３により調製した３つの異なるβ−ガラクトシル・イソマルトは著しく緩慢に発酵されるから、この物質は大腸に入った後、遠い区域において引続き肯定的な効果を引き起こす。
【表２１】
2005531611.tif 000028
【０１４３】
生成されたブチレートの発酵終期の含量は対照、ラクトスクロース又はガラクトシル・ラクトースでは約６mmol／lであり、Raftiloseの発酵ではさらに少ないブチレート（２．５mmol／l）が発生する。これに対してβ−１，３−、β−１，４−又はβ−１，６− ガラクトシル・イソマルトを使用すれば、著しく高いブチレート濃度（１３．３ないし１７mmol／l）への代謝が行われる。
【実施例１２】
【０１４４】
β−ガラクトシル・イソマルトのヒト・ビフィズス菌による発酵
ガラクトシル・イソマルトのプレビオティクス的及びビフィズス原性的性質の研究のために、この物質での種々のヒト・ビフィズス菌の成長をin vitroで調べた。そのために下記の組成の嫌気性培地を使用した。
【０１４５】
培地２：
カゼインペプトン                          １０．０ｇ
肉抽出物                                    ５．０ｇ
酵母抽出物                                  ５．０ｇ
Ｎａ２ＨＰ４                                 １．４４ｇ
ＮａＨ２ＰＯ４                               ０．２４ｇ
Ｋ２ＨＰＯ４                                 ６．０ｇ
Tween８０                                  １．０ｇ
ＤＳＭ１４１による微量元素溶液              ９．０ｍｌ
ＤＳＭ１４１によるビタミン溶液              １．０ｍｌ
レゾアズリン                                １．０ｍｇ
システイン／ＨＣｌ                          ０．５ｇ
ガラクトシル・イソマルト                    １．０ｇ
Ｈ２Ｏ蒸留水  １０００ｍｌ、ｐＨ７．０
２２のヒト・ビフィズス菌株をまず“Hungate”試験管内で上記の培地１で予備培養した。但しその炭水化物源をあらかじめグルコース（１０ｇ／l）に置き換えた。続いて菌株を培地２に移して接種し、４８時間インキュベートし、次に光学密度（Ｅ578）、ｐH値、酢酸塩及び酪酸塩の生成並びにβ−１，３−ガラクトシル・イソマルト濃度の減少を測定した。
【０１４６】
結果：  
ガラクトシル・イソマルトの代謝に関して様々な分解経路が区別される。幾つかの株はβ−ガラクトシダーゼで基質からガラクトースを分解し、この単糖（＋）を代謝する。
【０１４７】
他の株はガラクトースのほかに、さらに生じたイソマルトからグルコースを分解し、２つの単糖を代謝するが、このことは生じたマンニット又はソルビットには当てはまらない（＋＋）。第３のグループはガラクトシル・イソマルトを基質として利用することができ、マンニット及びソルビットも共に代謝される（＋＋＋）。
【０１４８】
供試ビフィズス菌がガラクトシル・イソマルトを基質としてどの程度利用することができるかは、次表で明らかである。
【表２２】
2005531611.tif 000029
【実施例１３】
【０１４９】
ガラクトシル・イソマルツロース含有混合物の水素化
イソマルツロース（実施例６と同じ）とβ−ガラクトシダーゼＢｇｌＴの反応によって得たガラクトシル・イソマルツロース含有反応溶液（３０％乾燥物に希釈）５００mlを１NのＮａＯＨの添加により攪拌しつつｐＨ値７．８に調整した。水素（１５０バール）の存在下７０℃でニッケル触媒（２００ｇ湿潤物）により水素化した。
【０１５０】
０、１、２、３及び４時間後に試料を取って、そのガラクトシル・イソマルツロース含量及びガラクトシル・イソマルト含量を調べた。遊離イソマルツロースのガラクトシル・イソマルトへの定量的転化の後に水素化を終了した。
【表２３】
2005531611.tif 000030
【０１５１】
４時間の反応時間の後にガラクトシル・イソマルツロース含有反応溶液に含まれるガラクトシル・イソマルツロースが完全にガラクトシル・イソマルトに水素化された。触媒の分離の後に得た水素化混合物の溶液を、Ｈ＋をもつ陽イオン交換体及びＯＨ−をもつ陽イオン交換体でイオン交換により精製した。
【実施例１４】
【０１５２】
水素化混合物からのガラクトシル・イソマルト及びガラクトシル・ラクチットの単離
実施例１３により水素化し、２０％乾燥物に希釈した溶液２００mlをゲル浸透クロマトグラフィー（Fraktogel HW40S、分離カラム３本、各々長さ１２０cm、直径１０cm）により温度５５℃、流速６００ml／hでクトマトグラフ分析した。ＤＰ３領域の画分をまとめて濃縮し、凍結乾燥した。
【０１５３】
得た凍結乾燥物（２．９ｇ）を例えば消化性、発酵性等のin vitro分析に使用した。
【０１５４】
応用例：
下記の応用例はβ−１，３−ガラクトシル・イソマルト、β−１，４−ガラクトシル・イソマルト及びβ−１，６−ガラクトシル・イソマルトから選ばれた少なくとも１つのガラクトシル・イソマルトを含むガラクトシル・イソマルト含有組成物の食品での使用に関するものである。以下でこれらの混合物又は個別物質は総じて「ガラクトシル・イソマルト」と称する。
【０１５５】
応用例１：甘味品
【表２４】
2005531611.tif 000031
【０１５６】
ゼラチンは水で軟化又は溶解する。砂糖、グルコースシロップ及びガラクトシル・イソマルトは所定の温度に煮沸し、いくらか冷やす。ゼラチン、果実酸及びグリセリンを加える。生地を流し込み、保温室に入れ、散粉し、塗油する。
【０１５７】
アラビアゴムは一晩水に溶かし、毛編ふるいに通す。グルコースシロップとガラクトシル・イソマルトは所定の温度に煮沸し、やや冷やす。ゴム溶液、グリセリン及び果実酸を加える。生地を流し込み、保温室に入れ、散粉し、塗油する。
【表２５】
2005531611.tif 000032
【０１５８】
寒天を水で軟化し、溶解し、砂糖及びその他の添加物を加えて１０５℃に煮沸する。生地を適当な型に流し込む。
【表２６】
2005531611.tif 000033
【０１５９】
配合１：
ガラクトシル・イソマルトと水を１６０℃に煮沸し、次に真空処理（−０．９バール）する。１２０℃に冷却した後、あらかじめ溶解したＤＬ−リンゴ酸、香料及び着色料をかき混ぜる。溶融物を型押し又は注型する。
【０１６０】
配合２：
サッカロース、グルコースシロップ、ガラクトシル・イソマルト及び水を１３５℃に煮沸し、次に真空処理する。１２０℃に冷却した後、あらかじめ溶解したＤＬ−リンゴ酸、香料及び着色料をかき混ぜる。溶融物を型押し又は注型する。
【表２７】
2005531611.tif 000034
【０１６１】
ガラクトシル・イソマルト、リカシン、甘味料及び水を溶解し、１２０℃でトフィックス、レシチン及びモノムルスをかき混ぜ、１２５℃でゼラチン、炭酸カルシウム及び香料をかき混ぜ、成形する。
【０１６２】
応用例２：ドッグフード
【表２８】
2005531611.tif 000035
【０１６３】
添加物を混合し、小さな玉を成形し、２００℃で２０分焼く。          
【表２９】
2005531611.tif 000036
【０１６４】
添加物を混合し、球を成形し、２２０℃で１５分焼く。
【０１６５】
応用例３：ミュースリ
【表３０】
2005531611.tif 000037
【０１６６】
砂糖、蜂蜜、ガラクトシル・イソマルト、バター及びレモン半個分のジュースでカラメルを作る。カラスムギフレーク、コーンフレーク、ナッツ、ヒマワリの種及びすりおろしココナッツを混合して、これに加える。生地をよく混合し、べーキングプレートの上に置く。バーを切断し、乾燥貯蔵する。
【表３１】
2005531611.tif 000038
【０１６７】
フレーク、ヨーグルト及びヒッポフェアを混合し、ナッツを加える。リンゴを粗くすりおろし、その他の果実を細かくさいの目に切り、レモンジュースをリンゴに掛け、ガラクトシル・イソマルトを加える。
【表３２】
2005531611.tif 000039
【表３３】
2005531611.tif 000040
【０１６８】
小麦粉、カラスムギ粉、白及び黒麦芽、ガラクトシル・イソマルト及び塩を混合する。水の添加は押出機で行う。生地がそこで混合され、せん断され、煮沸され、可塑化され、リングダイを経て押出される。続いてリングを乾燥し、冷却する。
【０１６９】
応用例４：飲物
【表３４】
2005531611.tif 000041
【０１７０】
オレンジを絞り、小麦の麦芽とガラクトシル・イソマルトともにかき混ぜ、ヨーグルトを混入する。
【表３５】
2005531611.tif 000042
【表３６】
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【表３７】
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【表３８】
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【表３９】
2005531611.tif 000046
【０１７１】
トマト、キュウリ、ニンジン及びリンゴのジュースを絞り、クリーム、パセリ及びガラクトシル・イソマルトを加える。
【表４０】
2005531611.tif 000047
【０１７２】
トマトをピューレにし、残りの添加物とかき混ぜる。
【表４１】
2005531611.tif 000048
【表４２】
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【０１７３】
応用例５：果物調理品
【表４３】
2005531611.tif 000050
【０１７４】
デンプンをやや冷たい果汁とともに攪拌し、沸騰する果汁にかき混ぜる。５分間沸騰させる。果実、砂糖及びガラクトシル・イソマルトを加える。
【表４４】
2005531611.tif 000051
【０１７５】
ダイオウを洗い、切り、水及びレモンジュースとともに蒸して軟らかくする。温かいうちに砂糖及びガラクトシル・イソマルトをかき混ぜ、冷やし、白ワインを混入する。
【表４５】
2005531611.tif 000052
【０１７６】
添加材料をミキサーでピューレにする。
【表４６】
2005531611.tif 000053
【０１７７】
イチゴをピューレにし、ガラクトシル・イソマルトとバニラシュガーを加え、溶かしたゼラチンを加えて冷やす。クリームを固まるまで泡立て、混ぜ合わせる。
【表４７】
2005531611.tif 000054
【０１７８】
アンズ、水、砂糖、ガラクトシル・イソマルト及びバニラシュガー３０分煮る。ゼラチンをアンズの砂糖煮に溶かす。生地をピューレにして冷やす。クリームを固くなるまで泡立て、混ぜ合わせる。
【０１７９】
応用例６：ヨーグルト
【表４８】
2005531611.tif 000055
【０１８０】
添加物を混合する。
【表４９】
2005531611.tif 000056
【０１８１】
ゼラチンを軟化する。卵黄を卵白から分離する。ヨーグルト、卵黄、砂糖、ガラクトシル・イソマルト及びレモンジュースを混合する。ゼラチンを溶かして加える。卵白を泡立てて泡雪にし、混ぜ合わせる。
【０１８２】
応用例７：粒入りジャム
【表５０】
2005531611.tif 000057
【０１８３】
煮込み時間はそれぞれ４分（ＧＺｍＺを除き）、ＧＺｍＺは煮込み時間５分。  
【表５１】
2005531611.tif 000058
【０１８４】
モレロの半分をミキサーでよく粉砕する。フルーツムースを残りのモレロ、バニラスティックの髄及びゼリーシュガーと混合し、かき混ぜながら煮る。４分間沸騰させる。アマレットを加える。熱い砂糖煮を瓶に詰め、直ちに密閉する。    
【表５２】
2005531611.tif 000059
【０１８５】
ダイオウとイチゴをぶつ切りにする。果物とゼリーシュガー及びバニラシュガーを混合し、蓋をして３ないし４時間浸透させる。次にかき混ぜながら煮て、４分間沸騰させる。レモンメリッサを混ぜる。熱い砂糖煮を瓶に詰め、直ちに密閉する。
【表５３】
2005531611.tif 000060
【０１８６】
カボチャをさいの目に切り、水と共に２０ないし３０分間軟らかく煮る。ジュースを布で濾す。７５０ｍｌの冷たいジュースをゼリーシュガー及びレモンジュースと混合し、かき混ぜながら煮る。４分間沸騰させる。ハッカを混ぜる。熱いゼリーを瓶に詰め、直ちに密閉する。
【表５４】
2005531611.tif 000061
【０１８７】
イチゴを押しつぶし、ゼリーシュガー及びすりおろしたオレンジの皮を加え、すべてをよく混合する。かき混ぜながら煮て、４分間沸騰させる。グランマルニエを混ぜる。熱いうちに瓶に詰め、直ちに密閉する。
【０１８８】
応用例８：パン菓子
記載した配合では製パン膨張剤として酵母が使用される。本発明に基づくガラクトシル・イソマルトは製パン酵母によって基質として限定的にしか利用できない。従って砂糖の一部だけをガラクトシル・イソマルトに置き換える。
【表５５】
2005531611.tif 000062
【０１８９】
酵母、微温のクリーム、１つまみの塩及び１つまみの小麦粉をかき混ぜる。１０分間そのままにする。その他の添加物をこね混ぜ、２０分間そのままにする。生地をよくこね、伸ばして１５個の三角形を切取り、巻いてクロワッサンにする。短時間膨張させ、２００℃で１０分間焼く。
【表５６】
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【０１９０】
酵母と砂糖を微温の牛乳混入し、１０分間そのままにする。その他の添加物をこね混ぜ、２０分間そのままにする。パン焼き型の中で１７５℃で４５分焼く。
【表５７】
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【０１９１】
製造は白パンを参照。
【表５８】
2005531611.tif 000065
【０１９２】
すべての添加物をこね器により最低段階でざっと混ぜ合わせ、次に高い段階でよくこねる。焼く前に生地を冷やしておく。
【表５９】
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【０１９３】
すべての添加物を泡だて器でまず低い段階で、次に最高段階でかき混ぜる。こうして調製された２つのかき混ぜ生地は砂糖入りかき混ぜ生地より濃い焼け色を呈し、甘味が少ない。従って上記の２つのかき混ぜ生地に必要に応じて甘味料で甘味を加えることが望ましい。
【表６０】
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【０１９４】
卵黄、水、砂糖、ガラクトシル・イソマルト及び塩を泡だて器で泡立たせる。ごく固くなるまでかき混ぜた卵白を卵黄材料に加える。小麦粉、食用デンプン及びベーキングパウダーを混合し、ふるいに掛けて泡雪状の生地に加え、入念に混ぜ込む。  
応用例９：ガラクトシル・イソマルツロースを含む配合
応用例１ないし８に挙げたすべての配合でそれぞれ示した量の成分、ガラクトシル・イソマルトを同量の本発明に基づくガラクトシル・イソマルツロースに置き換えた。その場合も有利な食品、食糧、嗜好品又は動物飼料が得られた。
【国際調査報告】
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