(57)【要約】二量体FVIIポリペプチド。およびそれが、同時に結合するし、2つのTF分子を阻害する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式A-（LM）-Dを有する化合物であって、式中、AおよびDは、TFに結合するFVIIポリペプチドであり；およびLMは、30,000ダルトン未満の分子量を有するリンカー部分であり；並びに前記化合物は、化合物がwtFVIIai-（DPTA-dim-FFR-cmk）-wtFVIIaiまたはFVIIai（Q10E32）-（DPTA-dim-FFR-cmk）-FVIIai（Q10E32）の式を有する化合物ではないことを条件としてTF活性を阻害する化合物。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物であって、TFに対する前記化合物の結合の親和性は、TFに対するAまたはDのいずれか単独の結合の親和性よりも高い化合物。
【請求項３】
請求項1〜2のいずれか1項に記載の化合物であって、AおよびDは、ヒト組換えFVIIaである化合物。
【請求項４】
請求項1〜2のいずれか1項に記載の化合物であって、AおよびDは、ヒト組換えFVIIaiである化合物。
【請求項５】
LMがアミノ酸配列を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の化合物。
【請求項６】
LMがロイシンジッパーである、請求項1〜5のいずれか1項に記載の化合物。
【請求項７】
LMが独立して配列番号：5および配列番号：6からなる群より選択されるアミノ酸配列である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の化合物。
【請求項８】
LMがアミノ酸配列（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser）nであって、nは、1〜10の任意の整数である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の化合物。
【請求項９】
請求項1〜8のいずれか1項に記載の化合物であって、LMは、分子が直鎖または分枝のC1-50-アルキル、直鎖または分枝のC2-50-アルケニル、直鎖または分枝のC2-50-アルキニル、鎖に炭素および少なくとも１つのN、O、またはS原子を含む1〜50員の直鎖または分岐鎖、C3-8シクロアルキル、環に炭素および少なくとも１つのN、O、またはS原子を含む3〜8員の環式の環、アリール、ヘテロアリール、アミノ酸からなる群より選択され、該構造は、任意に以下の基の1つまたは複数で置換された化合物：H、ヒドロキシ、フェニル、フェノキシ、ベンジル、チエニル、オキソ、アミノ、C1-4-アルキル、CONH2、CSNH2、C1-4モノアルキルアミノ、C1-4ジアルキルアミノ、アシルアミノ、スルホニル、カルボキシ、カルボキシアミド、ハロゲノ、C1-6アルコキシ、C1-6アルキルチオ、トリフルオロアルコキシ、アルコキシカルボニル、ハロアルキル。
【請求項１０】
請求項1〜9のいずれか1項に記載の化合物であって、LMは、独立してPhe-Phe-Argクロロメチルケトン、Phe-Phe-Argクロロメチルケトン、D-Phe-Phe-Argクロロメチルケトン、D-Phe-Phe-Argクロロメチルケトン、Phe-Pro-Argクロロメチルケトン、D-Phe-Pro-Argクロロメチルケトン、Phe-Pro-Argクロロメチルケトン、D-Phe-Pro-Argクロロメチルケトン、L-Glu-Gly-Argクロロメチルケトン、およびD-Glu-Gly-Argクロロメチルケトンを含む群より選択される2つの単量体からなる二価のクロロメチルケトン阻害剤を含む化合物。
【請求項１１】
LMが2つのFVIIa阻害剤を含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の化合物。
【請求項１２】
請求項1〜11のいずれか1項に記載の化合物であって、LMは、オクタデカ二酸ビス-（{1-[1-（1-クロロアセチル-4-グアニジノ-ブチルカルバモイル）-2-フェニル-エチルカルバモイル]-2-フェニル-エチル}-アミド）、イコサン二酸ビス-（{1-[1-（1-クロロアセチル-4-グアニジノ-ブチルカルバモイル）-2-フェニル-エチルカルバモイル]-2-フェニル-エチル}-アミド）、ドコサン二酸ビス-（{1-[1-（1-クロロアセチル-4-グアニジノ-ブチルカルバモイル）-2-フェニル-エチルカルバモイル]-2-フェニル-エチル}-アミド）、10,12-ドコサジイン二酸ビス-（{1-[1-（1-クロロアセチル-4-グアニジノ-ブチルカルバモイル）-2-フェニル-エチルカルバモイル]-2-フェニル-エチル}-アミド）、およびオクタン二酸ビス-（{1-[1-（1-クロロアセチル-4-グアニジノ-ブチルカルバモイル）-2-フェニル-エチルカルバモイル]-2-フェニル-エチル}-アミド）からなる群より選択される化合物。
【請求項１３】
TF活性を減少するための方法であって、前記方法は、式A-（LM）-Dを有する化合物とTF発現細胞を接触させることを含み、式中、AおよびDは、TFに結合するFVIIポリペプチドであり；並びにLMは、30,000ダルトン未満の分子量を有するリンカー部分であり；並びに前記化合物は、化合物がwtFVIIai-（DPTA-dim-FFR-cmk）-wtFVIIaiまたはFVIIai（Q10E32）-（DPTA-dim-FFR-cmk）-FVIIai（Q10E32）の式を有する化合物ではないことを条件としてTF活性を阻害する方法。
【請求項１４】
式A-（LM）-Dを有する化合物が請求項1〜12のいずれか1項に記載されている、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
式A-（LM）-Dを有する化合物の量と薬学的に許容されるキャリアまたは賦形剤とを含む薬学的組成物であって、式中、AおよびDは、TFに結合するFVIIポリペプチドであり；並びにLMは、30,000ダルトン未満の分子量を有するリンカー部分であり；並びに前記化合物は、化合物がwtFVIIai-（DPTA-dim-FFR-cmk）-wtFVIIaiまたはFVIIai（Q10E32）-（DPTA-dim-FFR-cmk）-FVIIai（Q10E32）の式を有する化合物ではないことを条件としてTF活性を阻害する組成物。
【請求項１６】
式A-（LM）-Dを有する化合物が請求項1〜12のいずれか1項に記載されている、請求項15に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
血小板凝集阻害薬をさらに含む、請求項15〜16のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
式A-（LM）-Dを有する医薬として使用するための化合物であって、式中、AおよびDは、TFに結合するFVIIポリペプチドであり；並びにLMは、30,000ダルトン未満の分子量を有するリンカー部分であり；並びに前記化合物は、化合物がwtFVIIai-（DPTA-dim-FFR-cmk）-wtFVIIaiまたはFVIIai（Q10E32）-（DPTA-dim-FFR-cmk）-FVIIai（Q10E32）を有する化合物ではないことを条件としてTF活性を阻害する化合物。の式
【請求項１９】
式A-（LM）-Dを有する化合物が請求項1〜12のいずれか1項に記載されている、請求項18に記載の化合物。
【請求項２０】
式A-（LM）-Dを有する化合物の使用であって、式中、AおよびDは、TFに結合するFVIIポリペプチドであり；並びにLMは、30,000ダルトン未満の分子量を有するリンカー部分であり；並びに前記化合物は、化合物がwtFVIIai-（DPTA-dim-FFR-cmk）-wtFVIIaiまたはFVIIai（Q10E32）-（DPTA-dim-FFR-cmk）-FVIIai（Q10E32）の式を有する化合物ではないことを条件としてTF活性を阻害する使用。
【請求項２１】
式A-（LM）-Dを有する化合物が請求項1〜12のいずれか1項に記載されている、請求項20に記載の使用。
【請求項２２】
請求項20〜21のいずれか1項に記載の使用であって、TF関連疾患または障害は、深部静脈血栓症、動脈血栓症、手術後の血栓症、冠状動脈バイパス移植（CABG）、経皮的な経皮の冠動脈再建術（PTCA）、脳卒中、癌、腫瘍転移、血管形成、虚血／再灌流、リウマチ様関節炎を含む関節炎、血栓溶解、血管形成術後の動脈硬化および再狭窄、炎症などの急性および慢性の徴候、敗血症ショック（septic chock）、敗血症、低血圧、成人呼吸窮迫症候群（ARDS）、播種性血管内血液凝固症候群（DIC）、肺塞栓症、血小板沈着、心筋梗塞、または血栓症のリスクのあるアテローム硬化型の血管を有する哺乳類の予防的治療である使用。
【請求項２３】
哺乳類のTF関連疾患または障害の予防または治療のための方法であって、該方法は、式A-（LM）-Dを有する少なくとも１つの化合物の有効な量を哺乳類に投与することを含み、式中、AおよびDは、TFに結合するFVIIポリペプチドであり；並びにLMは、30,000ダルトン未満の分子量を有するリンカー部分であり；並びに前記化合物は、化合物がwtFVIIai-（DPTA-dim-FFR-cmk）-wtFVIIaiまたはFVIIai（Q10E32）-（DPTA-dim-FFR-cmk）-FVIIai（Q10E32）の式を有する化合物ではないことを条件としてTF活性を阻害する方法。
【請求項２４】
式A-（LM）-Dを有する化合物が請求項1〜12のいずれか1項に記載されている、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
請求項23〜24のいずれか1項に記載の方法であって、TF関連疾患または障害は、深部静脈血栓症、動脈血栓症、手術後の血栓症、冠状動脈バイパス移植（CABG）、経皮的な経皮の冠動脈再建術（PTCA）、脳卒中、癌、腫瘍転移、血管形成、虚血／再灌流、リウマチ様関節炎を含む関節炎、血栓溶解、血管形成術後の動脈硬化および再狭窄、炎症などの急性および慢性の徴候、敗血症ショック（septic chock）、敗血症、低血圧、成人呼吸窮迫症候群（ARDS）、播種性血管内血液凝固症候群（DIC）、肺塞栓症、血小板沈着、心筋梗塞、または血栓症のリスクのあるアテローム硬化型の血管を有する哺乳類の予防的治療であり、該方法は、このような治療を必要とする哺乳類に対して、請求項1〜12のいずれか1項に記載された少なくとも１つの化合物の治療的に有効な量を、薬学的許容される賦形剤および／またはキャリアと共に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、TFに結合し、かつ活性を阻害する新規化合物に関する。また、本発明は、新規化合物を含む薬学的組成物、並びに血管疾患および炎症反応を含む血栓性もしくは凝固障害関連疾患または障害の治療または予防にも関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
血液凝固は、種々の血液成分または因子の複雑な相互作用からなるプロセスであり、これは、最終的にフィブリン凝塊を引き起こす。通常、凝固「カスケード」と称されているものに参加する血液成分は、酵素前駆体または酵素前駆体、酵素的に不活性タンパク質であり、おれらは、それ自体活性化された凝固因子である活性化因子の作用によってタンパク質分解酵素に変換される。このような変換を受けた凝固因子は、一般に「活性因子」といわれ、凝固因子の名前に「a」の文字を付加することによって示される（たとえばFVIIa）。
【０００３】
フィブリン凝塊を形成し、これにより出血を止めるためには、活性化された第X因子（FXa）が必要とされる。FXaは、プロトロンビンをトロンビンに変換し、次いでフィブリン凝塊を形成する際の最終的な段階として、フィブリノーゲンをフィブリンに変換するために必要である。第X因子（FX）の活性化を促進する2つの系または経路がある。「内因性の経路」は、血漿のみに存在する因子を利用することにより、トロンビン形成を引き起こす反応をいう。一連のプロテアーゼを媒介した活性化は、I最終的にXa因子を生成し、第VII因子Iaと連動して、FXをFXaに切断する。血液凝固の「外因性の経路」において、VIIa因子（FVIIa）およびその補因子組織因子（TF）は、同一のタンパク質分解を生じる。止血の際の2つの凝固経路の相対的な寄与は不明であるが、FVIIaおよびTFは、血液凝固の開始の重要な役割を演ずることが近年見いだされた。
【０００４】
FVIIaは、2本鎖の、50キロダルトン（kDa）のビタミンK依存的な、インビボでの止血の複雑な調節に参加する血漿セリンプロテアーゼである。FVIIaは、その1本鎖の酵素前駆体のVII因子（FVII）からの単一のペプチド結合のタンパク質分解によって生じ、これは血漿中に約0.5g/mlの濃度で存在する。酵素前駆体は、触媒的に不活性である。酵素前駆体FVIIの、活性化された2本鎖状分子への変換は、内部のペプチド結合の切断によって生じる。ヒトFVIIでは、切断部位は、Arg152-Ile153である。
【０００５】
カルシウムイオンの存在下では、FVIIaは、曝露されたTF（不可欠な膜タンパク質）に高い親和性で結合する。TFは、FVIIaの補因子として作用し、その基質FVII、IX因子、およびFXのタンパク分解性の活性化を増強する。
【０００６】
TFは、219残基の細胞外ドメイン、単一の膜貫通領域、および短い細胞質ドメインから構成される263アミノ酸残基の糖タンパク質である。TFは、膜結合タンパク質であり、活性型の血漿には通常循環しない。
【０００７】
例えば腎臓潅流の間に患者の凝固カスケードを選択的に遮断もしくは阻害すること、または深部静脈血栓、敗血症、DIC、アテローム性動脈硬化症、およびその他の医学的な障害のホストを防止または治療することが望まれることが多い。典型的には、ヘパリン、クマリン、クマリン誘導体、インダンジオン（indandione）誘導体、トロンビン阻害剤、またはFXa阻害剤などの血液凝固阻止剤が使用されてきた。たとえば、治療経過の間に凝固を防止するために、潅流の際にヘパリン処理またはクエン酸イオンによる体外処理を使用してもよい。また、ヘパリンは、手術を受けている患者の深部静脈血栓を防止するためにも使用される。しかし、ヘパリンおよびその他の血液凝固阻止剤による処理は、望ましくない副作用を有するであろう。有用な血液凝固阻止剤は、一般に傷害の部位、すなわち凝固カスケードが活性である部位で特異的に作用するのではなく、体の全体にわたって作用する。たとえば、ヘパリンによって重篤な出血が生じるであろう。さらに、ヘパリンは、約80分の半減期を有し、血液から急速にクリアされ、頻繁に投与することが必要である。ヘパリンは、抗トロンビンIII（ATIII）の補因子として作用し、またATIIIは、DIC治療において急速に枯渇するので、適当なヘパリン用量を維持することは困難なことが多く、ATIIIおよびヘパリンレベルを持続的にモニタリングすることが必要である。また、ATIII枯渇が極度である場合には、ヘパリンは効果がない。さらに、ヘパリンの長引く使用は、血小板凝集を増大し、血小板数を減少する可能性もあり、骨粗鬆症の発生にも関係していた。また、インダンジオン誘導体は、有毒副作用を有するであろう。
【０００８】
その他の既知の血液凝固阻止剤は、吸血生物体に由来するトロンビンおよびFXa阻害剤を含む。抗トロンビン、ヒルジン、ヒルログ（hirulog）、およびヒルゲン（hirugen）は、リーチ（leach）ヒルド・メディシナリス（Hirudo medicinalis）に由来する組換えタンパク質またはペプチドであるが、FXa阻害剤のアンチスタチン（antistatin）および組換え誘導体rTAPは、ダニ由来のタンパク質である。モノクローナル抗体または合成ペプチドなどの血小板凝集の阻害剤は、血小板受容体GPIIb/IIIaを妨害し、血液凝固阻止としても有効である。
【０００９】
出血の合併症は、抗トロンビン、抗FXa、並びに抗血小板薬の望まれない主要な不利な点として観察される。この副作用は、TF/FVIIa活性の阻害剤によって強力に減少するか、またはなくなる。このような血液凝固阻止剤は、生理学的な阻害剤TFPI（組織因子経路の阻害剤）および不活性化FVII（FVIIai）（これは触媒的に不活性であり、したがってFXのFXaへの変換を触媒することができないが、TFに結合することができ、活性な内因性のFVIIaと競合するような方法で修飾されたFVIIaである）を含む。
【００１０】
国際特許出願の国際公開公報第92/15686号、国際公開公報第94/27631号、国際公開公報第96/12800号、国際公開公報第97/47651号は、FVIIaiおよびこれらの使用に関連する。国際特許出願の国際公開公報第90/03390号、国際公開公報第95/00541号、国際公開公報第96/18653号、および欧州特許500800号は、TF/FVIIaアンタゴニスト活性を有するFVIIaに由来するペプチドを記載する。国際公開公報第01/21661は、FVIIおよびFXaの二価の阻害剤に関する。国際公開公報第02/02764は、ビタミンK依存的なポリペプチドの高分子量の誘導体に関する。
【００１１】
HuZおよびGarenA（2001）Proc. Natl. Acad. Sci. USA97； 9221-9225；HuZおよびGarenA（1999）Proc. Natl. Acad. Sci. USA96； 8161-8166、および国際公開公報第0102439号は、ヒトIgG1免疫グロブリンのFc領域および変異体FVIIポリペプチドを含む、TFに結合するが血液凝固を開始しない免疫複合体に関する。
【００１２】
さらに、国際特許出願の国際公開公報第98/03632号は、1つまたは複数のG結合受容体に親和性を有する二価のアゴニストを記載し、Burgess, L.E.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 8348-8352 （July 1999）は、「ヒト肺トリプターゼの強力な選択的非ペプチド性の阻害剤」を記載する。
【００１３】
比較的低用量で抗凝固活性を有し、かつ望ましくない副作用を産生しない改善された組成物のための技術の要求がなおも存在する。本発明は、比較的低用量で傷害部位においてTFで開始されるプロセスに特異的に作用する血液凝固阻止剤を提供する。
【発明の開示】
【００１４】
本発明の記述
本発明は、二価であり、2つのTF分子を同時に阻害することにより、結合活性を有し、かつおそらくインビボ半減期が増大された二量体FVIIポリペプチドに関する。したがって、一価のFVIIai分子と比較して、より低濃度のTFアンタゴニストを使用することができる。本発明の1つの特定の態様において、FVIIaの2つの分子は、共に結合された2つのクロロメチルケトン部分からなる二価のクロロメチルケトン阻害剤と共に結合される。
【００１５】
不活性化された二量体のFVIIポリペプチドは、適切な結合部分（LM）によって結合された2つのFVIIポリペプチドAおよびDからなり、前記LMは、FVIIポリペプチドに化学的に結合されている。1つのTF部位のみをターゲットする阻害剤と比較して、二量体の阻害剤は、結合活性効果により、より高い結合親和性および能力に関して、さらなる効果を提供する。
【００１６】
多重結合を達成するために、TF二量体のアンタゴニストの適当なデザインは必須である。このようなアンタゴニストの機能的な親和性は、全体の濃度に依存的であるが、特にFVIIポリペプチドAおよびDの空間的な局在に依存的であり、TFに対する二価のFVIIai分子の両方のモチーフの結合に有利である。TFに対する1つのFVIIポリペプチドの結合後、これにつながれたパートナーの拡散は、2つのFVIIポリペプチドを接続するスペーサの長さにに等しい半径内に拘束される。この拘束効果により、第2のTF部位に結合するFVIIポリペプチドの局部的な濃度が増大する。
【００１７】
「TFアンタゴニスト」または「TFアンタゴニスト類」の用語は、本明細書に使用されるものとして、FXa生成アッセイ法において、TFに直接結合して、FXからFXaへの変換を阻害する任意の化合物を意味することが企図される。TFアンタゴニストの１つの例は、FVIIaiである。
【００１８】
「TF二量体のアンタゴニスト」または「TF二量体のアンタゴニスト」の用語は、本明細書に使用されるものとして、TFのための2つの結合部位を含む任意のTFアンタゴニストを意味することが企図される。
【００１９】
二価のTF阻害剤は、優先的に抑制する特徴を達成するために調節ことができる以下の3つの異なったモチーフを含む：2つのFVIIポリペプチド、および2つのFVIIポリペプチドを接続するリンカー部分（LM）。LMは、2つのFVIIポリペプチドを接続するスペーサのみであるとみなされるべきではない。最高の親和性を得るために、二価のTF阻害剤の溶解度、生物学的利用能、および結合特性をを最適化するためにLMを利用することができる。
【００２０】
本発明の目的は、TFアンタゴニストとしての薬理活性を有する化合物を提供することにより、TFを媒介した凝固活性を阻害するための方法を提供することである。
【００２１】
「TFを媒介した凝固活性」の用語は、TF/FVIIa複合体の形成並びにそれぞれFIXおよびX因子からFIXaおよびFXaへのその活性化を介してTFによって開始される凝固を意味する。
【００２２】
化合物は、血管疾患および炎症反応を含むTF関連疾患もしくは障害の予防または治療のために有用である。
【００２３】
明細書の全体にわたって使用される略語は以下のものを含む：
TF                            組織因子
FVIIa                        活性化された第VII因子
FXa因子Xa                  活性化された第X因子
FVII                        酵素前駆体（単鎖の、非活性型）の第VII因子
FX                          酵素前駆体（単鎖の、非活性型）が、第X因子
TF/FVIIa                    TFとFVIIa間の複合体
TF/FVIIa/FXa                FVIIa、TF、およびFXaによって形成される複合体
Pt                          プロトロンビン時間
APTT                        活性化された部分トロンボプラスチン時間
SP                          セリンプロテアーゼ
FFR                        Phe-Phe-ArgまたはD-Phe-Phe-Arg
D-FFR                      D-Phe-Phe-Arg
dim-FFR                    結合部分によって共に結合されたFFR、2つのFFRsの二量体形態
dim-FFR-FVIIa              好ましくは活性部位において、第VIIa因子に結合したdim-FFR
dim-FFR-cmk                結合部分によって共に結合されたFFR-cmk、2つのFFR-cmkの二量体の形態
FFR-cmk、FFR-CMK            Phe-Phe-ArgクロロメチルケトンまたはD-Phe-Phe-Argクロロメチルケトン
D-FFR-cmk                    D-Phe-Phe-Argクロロメチルケトン
D-FFR-CMK
DPTA-dim-FFR-cmk            ジエチレントリアミンペンタ酢酸無水物-dimFFR-cmk
EGR                        Glu-Gly-ArgまたはD-Glu-Gly-Arg
D-EGR                      D-Glu-Gly-Arg
EGR-cmk、EGR-CMK            Glu-Gly-ArgクロロメチルケトンまたはD-Glu-Gly-Argクロロメチルケトン
KI                          解離定数、酵素阻害剤複合体の阻害定数
名称「D」が上記記載の通りアミノ酸の文字の直前にある（abreviation）ときは、アミノ酸は、非天然のd-エナンチオマーであることが理解されるはずである。
【００２４】
「活性部位」などの用語は、FVIIaに関して本明細書に使用される場合、その用語がSchecter, I.およびBerger, A., （1967） Biochem. Biophys. Res. Commun. 7：157-162によって定義されたとおりのFVIIaの「S1」部位を含む触媒および酵素前駆体の基質結合部位をいう。
【００２５】
TF/FVIIa媒介もしくは関連のプロセスまたはイベント、またはTF媒介凝固活性と関連したプロセスもしくはイベントは、TF/FVIIaの存在が必要な任意のイベントである。
【００２６】
このようなプロセスまたはイベントは、血栓形成に至るフィブリンの形成、；血小板沈着；血小板沈着および血栓形成、走化性因子および分裂促進因子の放出、並びに動脈部分の内膜への血管平滑筋細胞の遊走および増殖を含む生物学的プロセスの複雑な相互作用によって生じると考えられる、例えば内膜の過形成または再狭窄などの血管壁の平滑筋細胞（SMC）の増殖；並びに例えば冠状血栓溶解を受けている急性心筋梗塞症患者などにおける、虚血後の再灌流に関係する有害なイベントを含むが、これらに限定されない。
【００２７】
無血流再開現象、すなわち以前に虚血した組織の微小血管系に対する均一な灌流の欠如は、Krugら（Circ. Res. 1966； 19：57-62）によって初めて記載された。
【００２８】
血餅形成の一般的な機構は、Ganongにより、Medical Physiology, 13th ed., Lange, Los Altos Calif., pp 411-414 （1987）の総説に概説されている。凝固には、血小板凝集を誘導するトロンビンの産生および血小板栓を安定化するフィブリンの形成という2つのプロセスが出会うことが必要である。本プロセスは、いくつかの工程を含み、それぞれ別々の酵素前駆体および前駆体因子の存在を必要とする。本プロセスは、フィブリンの架橋および血栓形成で終わる。フィブリノーゲンは、トロンビンの作用によってフィブリンに変換される。トロンビンは、次に、プロトロンビンのタンパク分解による切断によって形成される。このタンパク質分解は、活性化された血小板の表面に結合するFXaによって行われ、FVaおよびカルシウムの存在下においてプロトロンビンを切断する。TF/FVIIaは、外因性の凝固経路によるFXのタンパク質分解活性に必要とされる。したがって、TF/FVIIaによって媒介されるか、もしくは関係するプロセス、またはTFを媒介した凝固活性は、TF/FVIIa複合体の形成からフィブリン血小板血餅の形成までの凝固カスケードの任意の工程を含み、これには初めにTF/FVIIaが存在することが必要である。たとえば、TF/FVIIa複合体は、FXaのFVIIaへの、FIXのFIXaへの、およびさらにFXのFVIIへの活性化による外因性の経路を開始する。TF/FVIIaを媒介するか、もしく関連したプロセス、またはTFを媒介した凝固活性は、TF/FVIIaおよびその他の必要な試薬の存在下でFXのFXaへの転換のための、Roy, S., (1991) J. Biol. Chem. 266:4665-4668,およびO’Brien, D.ら(1988) J. Clin. Invest. 82:206-212に記載されているものなどの標準的なアッセイ法を使用して便利に測定することができる。
【００２９】
「TFに関連した疾患または障害」の用語は、本明細書に使用されるものとして、TFが関与する任意の疾患または障害を意味する。これには、深部静脈血栓症、動脈血栓症、手術後の血栓症、冠状動脈バイパス移植（CABG）、経皮的な経皮の冠動脈再建術（PTCA）、脳卒中、癌、腫瘍転移、血管形成、虚血／再灌流、リウマチ様関節炎を含む関節炎、血栓溶解、血管形成術後の動脈硬化および再狭窄、炎症などの急性および慢性の徴候、敗血症ショック（septic chock）、敗血症、低血圧、成人呼吸窮迫症候群（ARDS）、播種性血管内血液凝固症候群（DIC）、肺塞栓症、血小板沈着、心筋梗塞、または血栓症のリスクのあるアテローム硬化型の血管を有する哺乳類の予防的治療などの、TFを媒介した凝固活性に関連した疾患または障害、血栓性もしくは凝固障害性の関連した疾患または障害、または炎症性の反応などの疾患、および急性および慢性の徴候を含むフィブリン形成に関連した慢性血栓塞栓性の疾患または障害、およびその他の疾患を含むが、これらに限定されない。TFに関連した疾患または障害は、上記名づけられたものなどのインビボの凝固障害性の障害に限定されず、透析手順、血液濾過、または手術の間の血液迂回路などのプロセスにおいて患者からインラインで除去された血液を含む血液の体外循環によって生じるであろう凝固などの、生体外のTF/FVIIa関連したプロセスを含む。
【００３０】
「治療」は、任意の症状もしくは疾病状態の発症を防止する目的で、またはすでに発症したこのような症状または疾病状態を治癒または軽くする目的で、本発明の治療的に活性な化合物の有効な量を投与投与することを意味する。したがって、「治療」の用語は、予防的治療を含むことを意味する。
【００３１】
第１の側面において、本発明は、式A-（LM）-Dを有する化合物であって、式中、AおよびDは、TFに結合するFVIIポリペプチドであり；およびLMは、30,000ダルトン未満の分子量を有するリンカー部分であり；並びに前記化合物は、化合物がwtFVIIai-（DPTA-dim-FFR-cmk）-wtFVIIaiまたはFVIIai（Q10E32）-（DPTA-dim-FFR-cmk）-FVIIai（Q10E32）の式を有する化合物ではないことを条件としてTF活性を阻害する化合物に関する。
【００３２】
部分Aは、LMに化学的に結合され、また、部分Dに化学的に結合されていることが理解されるべきである。AおよびDは、LM部分によって共に結合された同一のFVIIポリペプチドであってもよく、またはAおよびDは、異なるFVIIポリペプチドであってもよい。
【００３３】
「FVIIポリペプチド」または「FVIIポリペプチド」の用語は、本明細書に使用されるものとして、第VII因子並びに第VII因子の相当物を意味するが、これらに限定されない。第VII因子相当物は、ヒト第VII因子と比較して化学的に修飾されたか、および／またはヒト第VII因子（すなわち第VII因子変異体）と比較して1つまたは複数のアミノ酸配列が変化を含むか、および／またはヒト第VII因子（すなわち第VII因子断片）と比較してアミノ酸配列の切断を含む第VII因子ポリペプチドを含むが、これに限定されない。このような相当物は、ヒト第VII因子と比較して、安定度、リン脂質結合、変化した比活性などを含む異なる性質を示してもよい。
【００３４】
「第VII因子」の用語は、これらの未切断（酵素前駆体）の形態の第VII因子ポリペプチド、並びに第VIIa因子と称されるであろうこれらのそれぞれの生理活性形態を得るためにタンパク質加水分解でプロセスされたものを含むことが企図される。典型的には、第VII因子は、残基152および153の間で切断されて第VIIa因子を生じる。また、「第VII因子」の用語は、野生型ヒト第VII因子（米国特許第4,784,950号に開示されたもの）、並びにたとえばウシ、ブタ、イヌ、マウス、およびサケ第VII因子などのその他の種に由来する野生型VII因子のアミノ酸配列1〜406を有するポリペプチドを含むことが企図されるが、限定されない。これには、1つの個体から別の個体に存在し、および生じるであろう、第VII因子の天然の対立形質の変異をさらに含む。また、糖鎖形成またはその他の翻訳後修飾の程度および部位は、選択した宿主細胞および宿主細胞の環境の性質に依存して異ななるであろう。
【００３５】
本明細書に使用されるものとして、「第VII因子相当物」は、野生型のヒト第VII因子と比較して、実質的に同等または改善された生物活性を示すポリペプチド、並びに野生型ヒト第VIIa因子の活性と比較して、第VIIa因子生物活性が実質的に修飾され、または減少したポリペプチドを含むが、限定されない。これらのポリペプチドは、化学的に修飾された第VII因子または第VIIa因子、および特定のアミノ酸配列の変化が導入されて、ポリペプチドの生理活性が修飾されまたは崩壊された第VII因子変異体を含むが、これらに限定されない。
【００３６】
「組織因子活性」または「TF活性」の用語は、本明細書に使用されるものとして、FXa生成アッセイ法において測定されるTFの活性を意味する。
【００３７】
「FXa生成アッセイ法」の用語は、本明細書に使用されるものとして、FXの活性がTF、FVIIa、FX、カルシウムおよびリン脂質を含む試料において測定される任意のアッセイ法を意味することが企図される。FXa生成アッセイ法の例は、アッセイ法2に記載されている。
【００３８】
第2の側面において、本発明は、TF活性を減少するための方法であって、前記方法は、式A-（LM）-Dを有する化合物とTF発現細胞を接触させることを含み、式中、AおよびDは、TFに結合するFVIIポリペプチドであり；並びにLMは、30,000ダルトン未満の分子量を有するリンカー部分であり；並びに前記化合物は、化合物がwtFVIIai-（DPTA-dim-FFR-cmk）-wtFVIIaiまたはFVIIai（Q10E32）-（DPTA-dim-FFR-cmk）-FVIIai（Q10E32）の式を有する化合物ではないことを条件としてTF活性を阻害する方法に関する。
【００３９】
第3の側面において、本発明は、式A-（LM）-Dを有する化合物の量と薬学的に許容されるキャリアまたは賦形剤とを含む薬学的組成物であって、式中、AおよびDは、TFに結合するFVIIポリペプチドであり；並びにLMは、30,000ダルトン未満の分子量を有するリンカー部分であり；並びに前記化合物は、化合物がwtFVIIai-（DPTA-dim-FFR-cmk）-wtFVIIaiまたはFVIIai（Q10E32）-（DPTA-dim-FFR-cmk）-FVIIai（Q10E32）の式を有する化合物ではないことを条件としてTF活性を阻害する組成物に関する。
【００４０】
さらなる側面において、本発明は、式A-（LM）-Dを有する医薬として使用するための化合物であって、式中、AおよびDは、TFに結合するFVIIポリペプチドであり；並びにLMは、30,000ダルトン未満の分子量を有するリンカー部分であり；並びに前記化合物は、化合物がwtFVIIai-（DPTA-dim-FFR-cmk）-wtFVIIaiまたはFVIIai（Q10E32）-（DPTA-dim-FFR-cmk）-FVIIai（Q10E32）の式を有する化合物ではないことを条件としてTF活性を阻害する化合物に関する。
【００４１】
さらなる側面において、本発明は、式A-（LM）-Dを有する化合物の使用であって、式中、AおよびDは、TFに結合するFVIIポリペプチドであり；並びにLMは、30,000ダルトン未満の分子量を有するリンカー部分であり；並びに前記化合物は、化合物がwtFVIIai-（DPTA-dim-FFR-cmk）-wtFVIIaiまたはFVIIai（Q10E32）-（DPTA-dim-FFR-cmk）-FVIIai（Q10E32）の式を有する化合物ではないことを条件としてTF活性を阻害する使用に関する。
【００４２】
さらなる側面において、本発明は、哺乳類のTF関連疾患または障害の予防または治療のための方法であって、該方法は、式A-（LM）-Dを有する少なくとも１つの化合物の有効な量を哺乳類に投与することを含み、式中、AおよびDは、TFに結合するFVIIポリペプチドであり；並びにLMは、30,000ダルトン未満の分子量を有するリンカー部分であり；並びに前記化合物は、化合物がwtFVIIai-（DPTA-dim-FFR-cmk）-wtFVIIaiまたはFVIIai（Q10E32）-（DPTA-dim-FFR-cmk）-FVIIai（Q10E32）の式を有する化合物ではないことを条件としてTF活性を阻害する方法に関する。
【００４３】
さらなる側面において、本発明は、式A-（LM）-Dを有する化合物であって、式中、AおよびDは、TFに結合するFVIIポリペプチドであり；およびLMは、30,000ダルトン未満の分子量を有するリンカー部分であり；並びに前記化合物は、TF活性を阻害する化合物に関する。
【００４４】
さらなる側面において、本発明は、TF活性を減少するための方法であって、前記方法は、式A-（LM）-Dを有する化合物とTF発現細胞を接触させることを含み、式中、AおよびDは、TFに結合するFVIIポリペプチドであり；並びにLMは、30,000ダルトン未満の分子量を有するリンカー部分であり；並びに前記化合物は、TF活性を阻害する方に関する。
【００４５】
さらなる側面において、本発明は、式A-（LM）-Dを有する化合物の量と薬学的に許容されるキャリアまたは賦形剤とを含む薬学的組成物であって、式中、AおよびDは、TFに結合するFVIIポリペプチドであり；並びにLMは、30,000ダルトン未満の分子量を有するリンカー部分であり；並びに前記化合物は、TF活性を阻害する組成物に関する。
【００４６】
さらなる側面において、本発明は、式A-（LM）-Dを有する医薬として使用するための化合物であって、式中、AおよびDは、TFに結合するFVIIポリペプチドであり；並びにLMは、30,000ダルトン未満の分子量を有するリンカー部分であり；並びに前記化合物は、TF活性を阻害する化合物に関する。
【００４７】
さらなる側面において、本発明は、式A-（LM）-Dを有する化合物の使用であって、式中、AおよびDは、TFに結合するFVIIポリペプチドであり；並びにLMは、30,000ダルトン未満の分子量を有するリンカー部分であり；並びに前記化合物は、TF活性を阻害する使用に関する。
【００４８】
さらなる側面において、本発明は、哺乳類のTF関連疾患または障害の予防または治療のための方法であって、該方法は、式A-（LM）-Dを有する少なくとも１つの化合物の有効な量を哺乳類に投与することを含み、式中、AおよびDは、TFに結合するFVIIポリペプチドであり；並びにLMは、30,000ダルトン未満の分子量を有するリンカー部分であり；並びに前記化合物は、TF活性を阻害する方法に関する。
【００４９】
式A-（LM）-Dを有する化合物の1つの態様において、TFに対する前記化合物の結合の親和性は、AまたはD単独のいずれかのTFに対する結合の親和性よりも高い。特定の態様において、TFに対する前記化合物の結合の親和性、AまたはD単独のいずれかのTFに対する結合の親和性よりも2倍高い。特定の態様において、TFに対する前記化合物の結合の親和性、AまたはD単独のいずれかのTFに対する結合の親和性よりも3倍高い。特定の態様において、TFに対する前記化合物の結合の親和性、AまたはD単独のいずれかのTFに対する結合の親和性よりも5倍高い。特定の態様において、TFに対する前記化合物の結合の親和性、AまたはD単独のいずれかのTFに対する結合の親和性よりも10倍高い。
【００５０】
本発明のさらなる態様において、式A-（LM）-Dを有する化合物のAおよびDは、ヒト組換えFVIIaである。
【００５１】
本発明のさらなる態様において、式A-（LM）-Dを有する化合物のAおよびDは、ヒト組換えFVIIaiである。
【００５２】
本発明のさらなる態様において、式A-（LM）-Dを有する化合物のLMは、20,000ダルトン未満の分子量を有するリンカー部分である。
【００５３】
本発明のさらなる態様において、式A-（LM）-Dを有する化合物のLMは、10,000ダルトン未満の分子量を有するリンカー部分である。
【００５４】
本発明のさらなる態様において、式A-（LM）-Dを有する化合物のLMは、5,000ダルトン未満の分子量を有するリンカー部分である。
【００５５】
本発明のさらなる態様において、式A-（LM）-Dを有する化合物のLMは、1,380ダルトンより高い分子量を有するリンカー部分である。
【００５６】
本発明のさらなる態様において、式A-（LM）-Dを有する化合物のLMは、1,400ダルトンより高い分子量を有するリンカー部分である。
【００５７】
本発明のさらなる態様において、式A-（LM）-Dを有する化合物のLMは、1,600ダルトンより高い分子量を有するリンカー部分である。
【００５８】
本発明のさらなる態様において、式A-（LM）-Dを有する化合物のLMは、1,800ダルトンより高い分子量を有するリンカー部分である。
【００５９】
本発明のさらなる態様において、式A-（LM）-Dを有する化合物のLMは、2,000ダルトンより高い分子量を有するリンカー部分である。
【００６０】
本発明のさらなる態様において、式A-（LM）-Dを有する化合物のLMは、3,000ダルトンより高い分子量を有するリンカー部分である。
【００６１】
本発明のさらなる態様において、式A-（LM）-Dを有する化合物のLMは、4,000ダルトンより高い分子量を有するリンカー部分である。
【００６２】
本発明のさらなる態様において、式A-（LM）-Dを有する化合物のLMは、5,000ダルトンより高い分子量を有するリンカー部分である。
【００６３】
本発明のさらなる態様において、式A-（LM）-Dを有する化合物のLMは、アミノ酸配列を含む。特定の態様において、式A-（LM）-Dを有する化合物は、アミノ酸配列を含むだけである。
【００６４】
本発明のさらなる態様において、式A-（LM）-Dを有する化合物のLMは、ロイシンジッパーである。
【００６５】
「ロイシンジッパー」または「LZ」の用語は、本明細書に使用されるものとして、パターン（H1・P・P・H2・P・P・P）nのアミノ酸配列であって、式中Hは、Leu、Ile、Val、またはAsnから選択される残基であり、Pは、Ser、Thr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、およびTyrから選択される残基であり、かつn≧2であるいずれかのアミノ酸配列をいう。
【００６６】
本発明のさらなる態様において、式A-（LM）-Dを有する化合物のLMは、ロイシンジッパーを含む。
【００６７】
本発明のさらなる態様において、式A-（LM）-Dを有する化合物のLMは、アミノ酸配列（H1・P・P・H2・P・P・P）nであって、式中Hは、Leu、Ile、Val、またはAsnから選択される残基であり、Pは、Ser、Thr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、およびTyrから選択される残基であり、かつn≧2であるいずれかのアミノ酸配列を含む。
【００６８】
本発明のさらなる態様において、式A-（LM）-Dを有する化合物のLMは、アミノ酸配列（H1・P・P・H2・P・P・P）nであって、式中Hは、Leu、Ile、Valから選択される残基であり、PはSer、Thr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、Hisから選択される残基であり、かつn≧4であるアミノ酸配列を含む。
【００６９】
本発明のさらなる態様において、式A-（LM）-Dを有する化合物のLMは、アミノ酸配列（H1・P・P・H2・P・P・P）nであって、式中Hは、Leu残基であり、Pは、Ser、Thr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、Hisから選択される残基であり、かつn≧4であるアミノ酸配列を含む。
【００７０】
本発明のさらなる態様において、式A-（LM）-Dを有する化合物のLMは、独立して配列番号：5および配列番号：6からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００７１】
本発明のさらなる態様において、式A-（LM）-Dを有する化合物のLMは、アミノ酸配列（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)nであって、式中nは、1〜10の任意の整数であるアミノ酸配列を含む。1つの態様において、nは1〜5である。さらなる態様において、nは3である。
【００７２】
本発明のさらなる態様において、式A-（LM）-Dを有する化合物は、免疫複合体ではない。本発明の化合物は、好ましくは免疫系の細胞溶解性の反応を媒介しないべきであることが理解されるはずである。
【００７３】
本発明のさらなる態様において、式A-（LM）-Dを有する化合物のLMは、直鎖または分枝のC1-50-アルキル、直鎖または分枝のC2-50-アルケニル、直鎖または分枝のC2-50-アルキニル、鎖に炭素および少なくとも１つのN、O、またはS原子を含む1〜50員の直鎖または分岐鎖、C3-8シクロアルキル、環に炭素および少なくとも１つのN、O、またはS原子を含む3〜8員の環式の環、アリール、ヘテロアリール、アミノ酸からなる群より選択され、該構造は、任意に以下の基の1つまたは複数で置換される分子を含む：H、ヒドロキシ、フェニル、フェノキシ、ベンジル、チエニル、オキソ、アミノ、C1-4-アルキル、CONH2、CSNH2、C1-4モノアルキルアミノ、C1-4ジアルキルアミノ、アシルアミノ、スルホニル、カルボキシ、カルボキシアミド、ハロゲノ、C1-6アルコキシ、C1-6アルキルチオ、トリフルオロアルコキシ、アルコキシカルボニル、ハロアルキル。LMは、直鎖または分枝してつながれていてもよく、1つもしくは複数の二重結合または三重結合を含んでいてもよい。LMは、1つまたは複数のヘテロ原子様のN、O、またはSを含んでいてもよい。LMは、上記した群の複数のクラスを含むことができること、並びにクラス内の複数のメンバーを含むことができることが理解されるはずである。LMが群の複数のクラスを含む場合、このようなLMは、好ましくはこれらの官能基を介して異なるユニットを接続することによって得られる。このような結合を形成するための方法には、標準的な有機合成を含み、当該技術分野において当業者に周知である。
【００７４】
本発明のさらなる態様において、式A-（LM）-Dを有する化合物のLMは、独立してPhe-Phe-Argクロロメチルケトン、Phe-Phe-Argクロロメチルケトン、D-Phe-Phe-Argクロロメチルケトン、D-Phe-Phe-Argクロロメチルケトン、Phe-Pro-Argクロロメチルケトン、D-Phe-Pro-Argクロロメチルケトン、Phe-Pro-Argクロロメチルケトン、D-Phe-Pro-Argクロロメチルケトン、L-Glu-Gly-Argクロロメチルケトン、およびD-Glu-Gly-Argクロロメチルケトンを含む群より選択される2つの単量体からなる二価のクロロメチルケトン阻害剤を含む。
【００７５】
本発明のさらなる態様において、式A-（LM）-Dを有する化合物のLMは、二価のFVIIa阻害剤である。
【００７６】
本発明のさらなる態様において、式A-（LM）-Dを有する化合物のLMは、1つのFVIIa阻害剤を含む。
【００７７】
本発明のさらなる態様において、式A-（LM）-Dを有する化合物のLMは、2つのFVIIa阻害剤を含む。
【００７８】
本発明のさらなる態様において、式A-（LM）-Dを有する化合物のLMは、オクタン二酸ビス-（{1-[1-（1-クロロアセチル-4-グアニジノ-ブチルカルバモイル）-2-フェニル-エチルカルバモイル]-2-フェニル-エチル}-アミドである。
【００７９】
本発明のさらなる態様において、式A-（LM）-Dを有する化合物のLMは、10,12-ドコサジイン二酸ビス-（{1-[1-（1-クロロアセチル-4-グアニジノ-ブチルカルバモイル）-2-フェニル-エチルカルバモイル]-2-フェニル-エチル}-アミド）である。
【００８０】
本発明のさらなる態様において、式A-（LM）-Dを有する化合物のLMは、ドコサン二酸ビス-（{1-[1-（1-クロロアセチル-4-グアニジノ-ブチルカルバモイル）-2-フェニル-エチルカルバモイル]-2-フェニル-エチル}-アミド）である。
【００８１】
本発明のさらなる態様において、式A-（LM）-Dを有する化合物のLMは、イコサン二酸ビス-（{1-[1-（1-クロロアセチル-4-グアニジノ-ブチルカルバモイル）-2-フェニル-エチルカルバモイル]-2-フェニル-エチル}-アミド）である。
【００８２】
本発明のさらなる態様において、式A-（LM）-Dを有する化合物のLMは、オクタデカ二酸ビス-（{1-[1-（1-クロロアセチル-4-グアニジノ-ブチルカルバモイル）-2-フェニル-エチルカルバモイル]-2-フェニル-エチル}-アミド）である。
【００８３】
本発明のさらなる態様において、式A-（LM）-Dを有する化合物のLMは、4,7,10,13-テトラオキサヘキサデカン二酸ビス-（{1-[1-（1-クロロアセチル-4-グアニジノ-ブチルカルバモイル）-2-フェニル-エチルカルバモイル]-2-フェニル-エチル}-アミド）である。
【００８４】
本発明のさらなる態様において、式A-（LM）-Dを有する化合物のLMは、エチレングリコール-ビスコハク酸ビス-（{1-[1-（1-クロロアセチル-4-グアニジノ-ブチルカルバモイル）-2-フェニル-エチルカルバモイル]-2-フェニル-エチル}-アミド）である。
【００８５】
本発明のさらなる態様において、式A-（LM）-Dを有する化合物のLMは、N-[3-（4-{3-[3-（1-{1-[1-（2-クロロアセチル）-4-グアニジノブチルカルバモイル]-2-フェニルエチルカルバモイル}-2-フェニルエチルカルバモイル）プロピオニルアミノ]プロピル}ピペラジン-1-イル）-プロピル]-コハク酸-1-[1-（1-クロロアセチル-4-グアニジノ-ブチルカルバモイル）-2-フェニル-エチルカルバモイル]-2-フェニル-エチル｝-アミドである。
【００８６】
本発明のさらなる態様において、式A-（LM）-Dを有する化合物のLMは、エイコサン二酸ビス-[（1-{1-[1-（2-クロロ-アセチル）-4-グアニジノ-ブチルカルバモイル]-2-フェニル-エチルカルバモイル}-2-フェニル-エチル）-アミド]である。
【００８７】
本発明のさらなる態様において、式A-（LM）-Dを有する化合物のLMは、ペンタン二酸ビス-[（1-{1-[1-（2-クロロ-アセチル）-4-グアニジノ-ブチルカルバモイル]-2-フェニル-エチルカルバモイル}-2-フェニル-エチル）-アミド]である。
【００８８】
本発明のさらなる態様において、式A-（LM）-Dを有する化合物のLMは、N,N’-ビス-（1-{1-[1-（2-クロロ-アセチル）-4-グアニジノ-ブチルカルバモイル]-2-フェニル-エチルカルバモイル}-2-フェニルエチル）-オキサルアミド）である。
【００８９】
更なる態様において、式A-（LM）-Dを有する化合物の量を含む薬学的組成物であって、式中、AおよびDは、TFに結合するFVIIポリペプチドであり；および30,000ダルトン未満の分子量を有するリンカー部分である薬学的組成物は、さらに血小板凝集阻害薬を包含する。
【００９０】
本発明のさらなる態様において、式A-（LM）-Dを有する化合物のLMは、20,000ダルトン未満の分子量を有するリンカー部分である。
【００９１】
本発明のさらなる態様において、式A-（LM）-Dを有する化合物のLMは、10,000ダルトン未満の分子量を有するリンカー部分である。
【００９２】
本発明のさらなる態様において、式A-（LM）-Dを有する化合物のLMは、5,000ダルトン未満の分子量を有するリンカー部分である。
【００９３】
本発明のさらなる態様において、式A-（LM）-Dを有する化合物のLMは、2000ダルトン未満の分子量を有するリンカー部分である。
【００９４】
本発明のさらなる態様において、式A-（LM）-Dを有する化合物のLMは、1000ダルトン未満の分子量を有するリンカー部分である。
【００９５】
さらなる態様において、LMは、[ビス-（2-カルボキシメチル-[（1-{1-[1-（2-クロロ-アセチル）-4-グアニジノ-ブチルカルバモイル]-2-フェニル-エチルカルバモイル}-2-フェニル-エチルカルバモイル）-メチル]-アミノ}-エチル）-アミノ]酢酸ではない。
【００９６】
さらなる態様において、LMは、
【化１】
2005538936.tif 000002
ではない。
【００９７】
さらなる態様において、LMは
【化２】
2005538936.tif 000003
ではない。
【００９８】
本発明のさらなる態様において、TFに関連した疾患または障害は、深部静脈血栓症、動脈血栓症、手術後の血栓症、冠状動脈バイパス移植（CABG）、経皮的な経皮の冠動脈再建術（PTCA）、脳卒中、癌、腫瘍転移、血管形成、虚血／再灌流、リウマチ様関節炎を含む関節炎、血栓溶解、血管形成術後の動脈硬化および再狭窄、炎症などの急性および慢性の徴候、敗血症ショック（septic chock）、敗血症、低血圧、成人呼吸窮迫症候群（ARDS）、播種性血管内血液凝固症候群（DIC）、肺塞栓症、血小板沈着、心筋梗塞、または血栓症のリスクのあるアテローム硬化型の血管を有する哺乳類の予防的治療である。
【００９９】
TF二量体アンタゴニストのFVIIポリペプチドは、分子リンカー部分に化学的に結合される。LMは、2つのFVIIポリペプチドを同時にTF部位に結合することができる。これを達成するために、バックボーンは、TF部位間の距離に及ぶように十分長くなければならないが、これが第2のTF部位に十分に結合できるように柔軟なければならない。換言すれば、適切なLMは、安定な、延長された二次構造配置であるが、柔軟かつ水または生理学的な系に十分に可溶性のままであると想定することができる。
【０１００】
「リンカー部分」（LM）または「バックボーン」は、2つのFVIIポリペプチドを結合するための手段として機能する任意の生体適合性の分子を意味する。それぞれのFVIIポリペプチド、またはFVIIポリペプチドのその相当物は、化学結合を経て、たとえばLMのアミノ基とカルボキシル基の間のアミドまたはペプチド結合を経て分子LMに結合され、またはその逆も同じである。LMは、共有結合性および非共有結合性の化学結合またはこれらの混合を含んでもよいことは、理解されるはずである。「柔軟」は、2つのFVIIポリペプチドを、LMが2つのTF部位を結合するために適した距離によって分離することができるように、これらの軸について自由回転を有する複数の炭素-炭素結合を意味する。
【０１０１】
適切なLMまたはバックボーンは、ペプチド；ポリヌクレオチド；単糖、二糖、およびオリゴ糖、並びにシクロデキストリンおよびデキストランを含む糖；ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、炭化水素、ポリアクリラート、およびアミノ-、ヒドロキシ-、チオ-、またはカルボキシ-官能性をもたせたシリコーン、その他の生体適合材料ユニットを含む重合体；並びにこれらの組み合わせなどの基を含むが、これらに限定されない。上記したものなどのLM材料は、広く商業的に入手可能であるか、または当業者に一般に既知の合成的有機方法を経て入手できる。
【０１０２】
LMは、たとえば、以下の構造：直鎖または分枝のC1-50-アルキル、直鎖または分枝のC2-50-アルケニル、直鎖または分枝のC2-50-アルキニル、鎖に炭素および少なくとも１つのN、O、またはS原子を含む1〜50員の直鎖または分岐鎖、C3-8シクロアルキル、環に炭素および少なくとも１つのN、O、またはS原子を含む3〜8員の環式の環、アリール、ヘテロアリール、アミノ酸の中から選択され、該構造は、任意に以下の基の1つまたは複数で置換されてもよい：H、ヒドロキシ、フェニル、フェノキシ、ベンジル、チエニル、オキソ、アミノ、C1-4-アルキル、CONH2、CSNH2、C1-4モノアルキルアミノ、C1-4ジアルキルアミノ、アシルアミノ、スルホニル、カルボキシ、カルボキシアミド、ハロゲノ、C1-6アルコキシ、C1-6アルキルチオ、トリフルオロアルコキシ、アルコキシカルボニル、ハロアルキル。LMは、直鎖または分枝してつながれていてもよく、1つもしくは複数の二重結合または三重結合を含んでいてもよい。LMは、1つまたは複数のヘテロ原子様のN、O、またはSを含んでいてもよい。LMは、上記した群の複数のクラスを含むことができること、並びにクラス内の複数のメンバーを含むことができることが理解されるはずである。LMが群の複数のクラスを含む場合、このようなLMは、好ましくはこれらの官能基を介して異なるユニットを接続することによって得られる。このような結合を形成するための方法は、標準的な有機合成を含み、当該技術分野において当業者に周知である。
【０１０３】
ペプチド、タンパク質、およびアミノ酸は、本明細書に使用されるものとして、「天然」、すなわち天然に存在するアミノ酸、並びに「非古典的な」D-アミノ酸を含むか、またはこれらをいい、一般のアミノ酸のD-アイソマー、α-イソ酪酸、4-アミノ酪酸、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β-アラニン、β-メチルアミノ酸、Cα-メチルアミノ酸、Nα-メチルアミノ酸などのデザイナー・アミノ酸、および一般のアミノ酸類似体を含むが、これらに限定されない。加えて、アミノ酸は、Abu、2-アミノ酪酸；γ-Abu、4-アミノ酪酸；ε-Ahx、6アミノヘキサン酸；Aib、2-アミノイソ酪酸；β-Ala、3‐アミノプロピオン酸；Orn、オルニチン；Hyp、トランス・ヒドロキシプロリン；Nle、ノルロイシン；Nva、ノルバリンを含むことができる。
【０１０４】
3文字表示「GLA」は、本明細書に使用されるものとして、4-カルボキシグルタミン酸（場γ-カルボキシグルタミン酸）を意味する。
【０１０５】
「これらの組み合わせ」は、LMが上記した基の複数のクラスを含むことができ、並びにクラス内で複数のメンバーを含むことが可能であることが意味される。LMが基の複数のクラスを含む場合、このようなLMは、好ましくはこれらの官能基を経て異なるユニットを接続することによって得られる。このような結合を形成するための方法は、標準的な有機合成を含み、当該技術分野において当業者に周知である。
【０１０６】
適切なリンカー部分を選択するために、FVIIポリペプチドを異なるLMに結合し、TF活性アッセイ法においてスクリーニングする。
【０１０７】
LMは、例えばヒドロキシ、オキソ、アミノ、C1-4モノアルキルアミノ、アシルアミノ、スルホニル、カルボキシ、カルボキシアミド、ハロゲノ、C1-6アルコキシ、C1-6アルキルチオ、トリフルオロアルコキシ、アルコキシカルボニル、またはハロアルキル基などの官能基を含むことができる。また、LMは、例えばアンモニウム基またはカルボキシレート基などの電荷を持つ官能基を含むことができる。
【０１０８】
電荷を持つ官能基は、TF二量体アンタゴニストに水または生理学的な系に十分な溶解度を提供することができ、その他の種とのイオン結合形成のための反応部位を提供し、TF/FVIIa/FXa複合体のその他のメンバーに対するこれらの結合活性を増強する。TF二量体アンタゴニストに最適な溶解度および結合活性特性を与えるために、特定の酸およびこれらの濃度を選択することは、当業者の認識範囲内である。好ましくは、電荷を持つ官能基の総量は、TF部位に対するTF二量体アンタゴニストの特異性を最大にするが、有意に溶解度が減少しないように、最小にされる。
【０１０９】
これら間の距離が、FVIIポリペプチドを2つのTF分子に結合させるために十分であるように、FVIIポリペプチドは、LM上に位置する。TF二量体アンタゴニストのLMは柔軟であるので、FVIIポリペプチドは、FVIIポリペプチドが2つのTF分子に結合することができる高次構造を呈することができる。FVIIポリペプチド間のこのような距離は、当該技術分野において既知の任意の方法、たとえば分子モデリングによって測定することができ、または理論的に予測することができる。使用することができる分子モデリングプログラムは、当該技術分野において共通に既知であり、かつ利用できる。
【０１１０】
TF二量体アンタゴニストの2つのFVIIポリペプチドは、同じであることができ、または異なることができることが理解されるはずである。
【０１１１】
LMは、FVIIa阻害剤をさらに含むことができる。
【０１１２】
「FVIIa阻害剤」は、FVIIaに結合し、FXaによって触媒されるFXのFVIIaへの変換を減少またはた防止する物質を意味する。FVIIa阻害剤は、Perssonら（Perssonら、J. Biol. Chem. 272: 19919-19924,1997）によって記載されたFVIIaアミド分解性（amidolytic）アッセイ法において、400μMの物質Aの濃度で少なくとも50%までアミド分解活性を減らす物質Aとして同定されてもよい。300Mの物質Aの濃度で少なくとも50%までアミド分解活性を減らする物質が好ましく；200Mの物質Aの濃度で少なくとも50%までアミド分解活性を減らする物質がより好ましい。
【０１１３】
「FVIIa阻害剤」は、FVIIa定方向阻害剤のいくつかの群のいずれか1つから選択してもよい。このような阻害剤は、本発明の目的のために広く分類されている：i）可逆的にFVIIaに結合し、FVIIaによって切断可能である阻害剤、ii）可逆的にFVIIaに結合するが、切断することができない阻害剤、およびiii）不可逆的にFVIIaに結合する阻害剤。セリンプロテアーゼの阻害剤の総説については、プロテイナーゼ阻害剤（Research Monographs in cell and Tissue Physiology; v. 12) Elsevier Science Publishing Co., Inc., New York (1990)を参照されたい。
【０１１４】
また、FVIIa阻害剤部分は、不可逆的FVIIaセリンプロテアーゼ阻害剤であってもよい。このような不可逆的な活性部位阻害剤は、一般にプロテアーゼ活性部位と共有結合を形成する。このような不可逆的阻害剤は、ペプチドクロロメチルケト（（Williamsら、J. Biol. Chem. 264:7536-7540 (1989)を参照されたい）またはペプチジルクロロメタンなどの一般的なセリンプロテアーゼ阻害剤；アザペプチド（azapeptides）；種々のグアニジノべンゾアート誘導体および3-アルコキシ-4-クロロイソクマリンなどのアシル化剤；フェニルメチルスルホニルフルオライド（PMSF）などのフッ化スルホニル；ジイソプロピルフルオロリン酸（DFP）；トシルプロピルクロロメチルケトン（TPCK）；トシルリシルクロロメチルケトン（TLCK）；ニトロフェニルスルホナートおよび関連した化合物；イソクマリンおよびクマリンなどの複素環式プロテアーゼ阻害剤を含むが、これらに限定されない。
【０１１５】
ペプチド性の不可逆的FVIIa阻害剤の例は、Phe-Phe-Argクロロメチルケトン、Phe-Phe-Argクロロメチルケトン、D-Phe-Phe-Argクロロメチルケトン、D-Phe-Phe-Argクロロメチルケトン、Phe-Pro-Argクロロメチルケトン、D-Phe-Pro-Argクロロメチルケトン、Phe-Pro-Argクロロメチルケトン、D-Phe-Pro-Argクロロメチルケトン、L-Glu-Gly-Argクロロメチルケトン、およびD-Glu-Gly-Argクロロメチルケトンを含むが、これらに限定されない。
【０１１６】
また、FVIIa阻害剤の例は、PCT/DK99/00138に記載されたものなどのベンゾオキサジノンまたはこれらの複素環式類似体を含む。
【０１１７】
その他のFVIIa阻害剤の例は、例えばPhe-Phe-Arg、D-Phe-Phe-Arg、Phe-Phe-Arg、D-Phe-Phe-Arg、Phe-Pro-Arg、D-Phe-Pro-Arg、Phe-Pro-Arg、D-Phe-Pro-Arg、L-およびD-Glu-Gly-Argなどの小さなペプチド；ペプチド擬態；ベンズアミジン系；1つまたは複数のアミジノ基によって置換された複素環式構造；1つまたは複数のC（=NH）NHR基であって、式中RはH、C1-3アルキル、OH、またはインビボで容易に分裂される基であるものによって置換された芳香族または複素芳香族系を含むが、これらに限定されない
本明細書に使用される「C1-50-アルキル」または「C1-50-アルカンジイル」の用語は、1〜50の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝の、飽和したまたは不飽和の炭化水素鎖をいう。
【０１１８】
「C2-50-アルケニル」または「C2-50-アルケンジイル」の用語は、本明細書に使用されるものとして、2〜50の炭素原子および少なくとも１つの二重結合を有する、不飽和の分枝または直鎖の炭化水素鎖をいう。
【０１１９】
「C2-50-アルキニル」または「C2-50-アルキンジイル」の用語は、本明細書に使用されるものとして、2〜50の炭素原子および少なくとも１つの三重結合を有する、不飽和の分枝または直鎖炭化水素鎖をいう。C1-50-アルキル残基は、脂肪族の炭化水素残基、不飽和の脂肪族の炭化水素残基、脂環式の炭化水素残基を含む。この定義内のC1-50-アルキルの例は、デカニル、ヘキサデカニル、オクタデカニル、ノナデカニル、イコサニル、ドコサニル、テトラコサニル、トリアコタニル、デカンジイル、ヘキサデカンジイル、オクタデカンジイル、ノナデカンジイル、イコサンジイル、ドコサンジイル、テトラコサンジイル、トリアコタンジイルを含むが、これらに限定されない。
【０１２０】
C3-8-シクロアルキルの用語は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどの3〜8の炭素原子を有する飽和した脂環式の炭化水素残基を含む脂環式の炭化水素残基；および1-シクロペンテニル、2-シクロペンテニル、3-シクロペンテニル、1-シクロヘキセニル、2-シクロヘキセニル、3-シクロヘキセニルなどの5〜6の炭素原子を有するC5-6の不飽和の脂環式の炭化水素残基を意味する。
【０１２１】
「C1-6-アルコキシ」の用語は、本明細書に使用されるものとして、単独でまたは組み合わせて、エーテル酸素を介して結合され、該エーテル酸素に由来するその自由原子価結合を有し、かつ1〜6炭素原子を有するC1-6-アルキル基、たとえばメトオキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、ペントキシを含む、直鎖または分枝の一価の置換基をいう。
【０１２２】
「C1-6-アルキルチオ」の用語は、本明細書に使用されるものとして、単独でまたは組み合わせて、チオエーテル硫黄原子を介して結合され、該チオエーテル硫黄からのその自由原子価結合を有し、かつ1〜6炭素原子を有するC1-6-アルキル基を含む直鎖または分枝の一価の置換基をいう。
【０１２３】
「アリール」および「ヘテロアリール」の用語は、本明細書に使用されるものとして、任意に置換することができるアリールまたは任意に置換することができ、以下のものを含む：ヘテロアリールをいい、フェニル、ビフェニル、インデン、フルオレン、ナフチル（1-ナフチル、2-ナフチル）、アントラセン（1-アントラセニル、2-アントラセニル、3-アントラセニル）、チオフェン（2-チエニル、3-チエニル）、フリル（2-フリル、3-フリル）、インドリル、オキサジアゾリル、イソオキサゾリル、キナゾリン、フルオレニル、キサンテニル、イソインダニル、ベンズヒドリル、アクリジニル、チアゾリル、ピロリル（2-ピロリル）、ピラゾリル（3-ピラゾリル）、イミダゾリル（1-イミダゾリル、2-イミダゾリル、4-イミダゾリル、5-イミダゾリル）、トリアゾイル（1,2,3-トリアゾル-1-イル、1,2,3-トリアゾル-2-イル1,2,3-トリアゾル-4-イル、1,2,4-トリアゾル-3-イル）、オキサゾリル（2-オキサゾリル、4-オキサゾリル、5-オキサゾリル）、チアゾリル（2-チアゾリル、4-チアゾリル、5-チアゾリル）、ピリジル（2-ピリジル、3-ピリジル、4-ピリジル）、ピリミジニル（2-ピリミジニル、4-ピリミジニル、5-ピリミジニル、6-ピリミジニル）、ピラジニル、ピリダジニル（3-ピリダジニル、4-ピリダジニル、5-ピリダジニル）、キノリル（2-キノリル、3-キノリル、4-キノリル、5-キノリル、6-キノリル、7-キノリル、8-キノリル）、イソキノリル（1-イソキノリル、3-イソキノリル、4-イソキノリル、5-イソキノリル、6-イソキノリル、7-イソキノリル、8-イソキノリル）、ベンゾ[b]フラニル（2-ベンゾ[b]フラニル、3-ベンゾ[b]フラニル、4-ベンゾ[b]フラニル、5-ベンゾ[b]フラニル、6-ベンゾ[b]フラニル、7-ベンゾ[b]フラニル）、2,3-ジヒドロベンゾ[b]フラニル（2-（2,3-ジヒドロ-ベンゾ[b]フラニル）、3-（2,3-ジヒドロ-ベンゾ[b]フラニル）、4-（2,3-ジヒドロ-ベンゾ[b]フラニル）、5-（2,3-ジヒドロ-ベンゾ[b]フラニル）、6-（2,3-ジヒドロ-ベンゾ[b]フラニル）、7-（2,3-ジヒドロ-ベンゾ[b]フラニル）、ベンゾ[b]チオフェニル（2-ベンゾ[b]チオフェニル、3-ベンゾ[b]チオフェニル、4-ベンゾ[b]チオフェニル、5-ベンゾ[b]チオフェニル、6-ベンゾ[b]チオフェニル、7-ベンゾ[b]チオフェニル）、2,3-ジヒドロベンゾ[b]チオフェニル（2-（2,3-ジヒドロ-ベンゾ[b]チオフェニル）、3-（2,3-ジヒドロ-ベンゾ[b]チオフェニル）、4-（2,3-ジヒドロ-ベンゾ[b]チオフェニル）、5-（2,3-ジヒドロ-ベンゾ[b]チオフェニル）、6-（2,3-ジヒドロ-ベンゾ[b]チオフェニル）、7-（2,3-ジヒドロ-ベンゾ[b]チオフェニル））、インドリル（1-インドリル、2-インドリル、3-インドリル、4-インドリル、5-インドリル、6-インドリル、7-インドリル）、インダゾール（indazole）（1-インダゾリル、3-インダゾリル、4-インダゾリル、5-インダゾリル、6-インダゾリル、7-インダゾリル）、ベンズイミダゾリル（1-ベンズイミダゾリル、2-ベンズイミダゾリル、4-ベンズイミダゾリル、5-ベンズイミダゾリル、6-ベンズイミダゾリル、7-ベンズイミダゾリル、8-ベンズイミダゾリル）、ベンゾオキサゾリル（1-ベンゾオキサゾリル、2-ベンゾオキサゾリル）、ベンゾチアゾリル（1-ベンゾチアゾリル、2-ベンゾチアゾリル、4-ベンゾチアゾリル、5-ベンゾチアゾリル、6-ベンゾチアゾリル、7-ベンゾチアゾリル）、カルバゾリル（1-カルバゾリル、2-カルバゾリル、3-カルバゾリル、4-カルバゾリル）、5H-ジベンズ[b,f]アゼピン（5H-ジベンズ[b,f]アゼピン-1-イル、5H-ジベンズ[b,f]アゼピン-2-イル、5H-ジベンズ[b,f]アゼピン-3-イル、5H-ジベンズ[b,f]アゼピン-4-イル、5H-ジベンズ[b,f]アゼピン-5-イル）、10,11-ジヒドロ-5H-ジベンズ[b,f]アゼピン（10,11-ジヒドロ-5H-ジベンズ[b,f]アゼピン-1-イル、10,11-ジヒドロ-5H-ジベンズ[b,f]アゼピン-2-イル、10,11-ジヒドロ-5H-ジベンズ[b,f]アゼピン-3-イル、10,11-ジヒドロ-5H-ジベンズ[b,f]アゼピン-4-イル、10,11-ジヒドロ-5H-ジベンズ[b,f]アゼピン-5-イル）。
【０１２４】
本発明は、前述の環構造の部分的または完全に飽和した類似体にも関する。
【０１２５】
「C1-4モノアルキルアミノ」および「C1-4ジアルキルアミノ」の用語は、メチルアミノ、ジメチルアミノ、N-エチル-N-メチルアミノ、エチルアミノ、ジエチルアミノ、プロピルアミノ、ジプロピルアミノ、N-（n-ブチル）-N-メチルアミノ、n-ブチルアミノ、ジ（n-ブチル）アミノ、sec-ブチルアミノ、t-ブチルアミノなどの、その水素の一方または両方が、1〜4炭素原子を有するアルキル基であって、アルキルが上記定義されたものによって、独立して置換されたものを有するアミノ基をいう。
【０１２６】
「アシル」または「カルボキシ」の用語は、たとえばアセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、ピバロイル、バレリルなどの、カルボニル基を介して結合されたC1-6-アルキル基を含む一価の置換基をいう。
【０１２７】
「アシルアミノ」の用語は、C1-nC（=O）NH-基をいう。
【０１２８】
「カルボキシアミド」の用語は、-C（=O）NHC1-n基をいう。
【０１２９】
「トリフルオロアルコキシ」の用語は、（CF3）O-、（CF3）CH2O-などの、炭素原子の1つまたは複数に結合されたその水素原子の3つがフッ素原子で置換されたものを有する、上記定義された通りのC1-6アルコキシ基をいう。
【０１３０】
「アルコキシカルボニル」の用語は、Rが上記記載の通りのC1-6アルコキシ基である、-C（=O）（R）基をいう。
【０１３１】
「C1-6-アルコキシカルボニル」の用語は、本明細書に使用されるものとして、たとえばカルボメトキシル、カルボエトキシ、プロポキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、n-ブトキシカルボニル、sec-ブトキシカルボニル、tert-ブトキシカルボニル、3-メチルブトキシカルボニル、n-ヘキソキシカルボニルなど；カルボニル基を介して結合されたC1-6-アルコキシ基を含む一価の置換基をいう。
【０１３２】
「脱離基」の用語は、本明細書に使用されるものとして、ハロゲン、スルホナート、またはアシル基を含むが、これらに限定されない。適切な脱離基は、当業者に既知である。
【０１３３】
「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素をいう。
【０１３４】
「ハロ」は、フルオロ、クロル、ブロム、およびヨードをいう。
【０１３５】
「任意の」または、「任意に」は、その後に記載されているイベントまたは状況が、起こってもよく、または起こらなくてもよいこと、並びに該記述が、前記イベントまたは状況が起こる場合、および起こらない場合を含むことを意味する。たとえば「…任意に置換されたアリール」は、アリールが置換されていてもよく、またはされていなくてもよいこと、並びに該記述が置換されていないアリールおよび置換があるアリールの両方を含むことを意味する。
【０１３６】
TF二量体アンタゴニストの調製に使用するためのFVIIa阻害剤を含むLMは、以下の方法によって調製されてもよい。以下の方法において、FVIIa阻害剤は、文字Fnと称され、nが1または2である場合、LMは、2つの異なるFVIIa阻害剤を含んでもよいことを示す。
【０１３７】
方法1
FVIIa阻害剤を含むLMは、F1-B-Xであって、式中Xは、Yが官能基である構造F2-Yと反応することができる官能基であるF1-B-Xを、当業者によって既知のカップリング試薬を使用する通常のカップリング反応の方法によって反応することによって調製される。
【０１３８】
方法2
FVIIa阻害剤を含むLMは、式中Zが脱離基であるF1-B-ZとWが求核剤（nucleofiles）であるF2Wの間の反応によって調製されてもよい。脱離基の例は、ハロゲン、スルホナート、ホスホナートである。求核剤（nucleofiles）の例は、ヒドロキシ、アミノ、N置換されたアミノ、およびカルボアニオンである。
【０１３９】
方法3
FVIIa阻害剤を含むLMは、式中Zが脱離基であるF2-B-Zと式中Wが求核剤（nucleofiles）であるF1-Wの間の反応によって調製されてもよい。脱離基の例は、ハロゲン、スルホナート、ホスホナートである。求核剤（nucleofiles）の例は、ヒドロキシ、アミノ、N置換されたアミノ、およびカルボアニオンである。
【０１４０】
方法4
リンカーBは、当該技術分野において周知方法を使用して固相表面に結合された構造F1およびF2と反応させることができる。構造F1およびF2が同一であるときは、このアプローチは特に価値があり、本方法により、本明細書では、固相に結合された試薬とリンカー大きさの間の最適な距離により、収率の著しい増大を生じる。
【０１４１】
方法5
FVIIa阻害剤を含むLMは、まずF1またはF2を、それぞれF1-B、F2-B部分を形成する活性化したリンカー部分と反応させ、その後に形成された産物をそれぞれF2、F1部分と反応させることによる反応の順番によって調製されてもよい。実際の結合形成は、方法1〜3に記載されたように、官能基また、誘導体または脱離基/求核剤（nucleofiles）に対する反応解して生じる。
【０１４２】
反応は、当業者によって既知の手順を使用して溶液相で、または固相支持体上で行うことができる。
【０１４３】
DNA技術によるFVII二量体の形成  
活性部位に向けられた試薬の使用は、TF二量体アンタゴニストを作製するための1つのアプローチを示すが、、これはまた、しっかりとした非共有結合性の相互作用を介して2つ以上のFVIIポリペプチドを特異的に結合する能力を有するFVIIポリペプチドにペプチドタグを付加することによって達成することができる。おそらく、これを達成するための大部分の適切なタグは、しっかりとしたタンパク質-タンパク相互作用を媒介することができる天然に存在するエレメントであるロイシンジッパー（LZ）ドメインを介する。
【０１４４】
以下のものなどの、LZは、多くの遺伝子調節タンパク質に存在する：CCATT-boxおよびエンハンサー結合タンパク質（C/EBP）、cAMP反応エレメント（CRE）結合タンパク質（CREB、CRE-BP1、ATFs）、転写制御因子のJun/AP1ファミリー、酵母の一般的な制御タンパク質GCN4、fos発癌遺伝子およびfos関連タンパク質fra-1およびfosB、C-myc、L-myc、およびN-myc発癌遺伝子、八量体結合転写因子2（Oct-2/OTF-2）。
【０１４５】
構造的に、LZは、典型的にはパターン（H1・P・P・H2・P・P・P）nであって、式中Hは、Leu、Ile、Val、またはAsnから選択され、かつn≧2、典型的にはn≧4であるパターンに従った8ヘリックスのターンをカバーする距離にわたって7位毎にロイシンまたはその他の疎水性の残基の周期的な反復から成る。ロイシン残基のこれらの周期的なアレイを含むセグメントが、両親媒性のαヘリックスの高次構造に存在する。1つのFVIIポリペプチド上にタグを付けた1つのαヘリックスから延長するロイシン側鎖は、第2のFVIIポリペプチド上にタグを付けた同様のαヘリックスからのものと相互作用し、二量体化を容易にし；これらの2つの領域の協力によって形成された構造は、コイルドコイルを形成する。LZについて利用できる構造上のデータは、平行した高次構造に存在する二量体の形態、すなわち両ヘリックスのN末端は、二量体の同じ末端にあることを示す。TF結合ドメインは、両方とも結合を容易にする向きである二量体化されたFVIIポリペプチドの提示を提供しているかもしれないので、これは重要である。LZモチーフのさらなる特徴は、ペプチドの2つの疎水性の位置における特異的な変異により、使用者が、標的タンパク質の二量体、三量体、または四量体の高次構造の間でスイッチできることである。LZのより複雑なオリゴマーの形態では、個々の結合パートナーの組成物に応じて異なる向きの個々エレメントを提供する（Harbury, P.B.ら、Science（1993）262：1401-1407）。
【表１】
2005538936.tif 000004
おそらく、最も研究されたLZは、酵母の一般的な制御タンパク質GCN4のものであるが、免疫原性が懸念されうるので、ヒト化産物またはヒト相当物のうちの1つを使用してもよい。したがって、好ましい態様において、ヒトATF7またはATF4由来のLZおよびこれらの誘導体が使用される。実際の融合タンパク質は、PCRまたはプライマ-二量体カセットを含む、当業者に基地の従来の分子生物学的方法を使用して作製してもよい。タグは、FVIIポリペプチドのコード配列に対してC末端に導入され、ある程度の高次構造上の柔軟性を提供するために役立つ短いスペーサ部分（グリシン-セリン-アラニン）の後にあり、したがって、所望のオリゴマーの形成を支持する（その他のリンカー部分を想像することもでき、実際により長いスペーサが、オリゴマー形成による構造上の衝突を避けるために必要にされるであろう）。したがって、本発明にしたがったTF二量体アンタゴニストの１つの例は、天然に形成されたFVII-Gly-Ser-Ala-LZ構築物の二量体であることができる。FVII-LZ融合タンパク質は、その他のFVIIポリペプチドについて記載されているように産生される。
【０１４６】
本願明細書において、アミノ酸は、IUPAC-IUBのBiochemical Nomenclature委員会（CBN）によって承認された表1に示す略語を使用して表される。名前または以下の略語によって表されるアミノ酸および異性体を有するものなどは、特に明記しない限り天然のL型である。さらに、ペプチドのアミノ酸配列の左右の末端は、特に明記しない限りそれぞれ、NおよびC末端である。
【０１４７】
表1：アミノ酸のための略語：
アミノ酸        3文字コード  １文字コード
グリシン          Gly          G  
プロリン          Pro          P  
アラニン          Ala          A  
バリン            Val          V  
ロイシン          Leu          L  
イソロイシン      Ile          I  
メチオニン        Met          M  
シスチン          Cys          C  
フェニルアラニン  Phe          F  
チロシン          Tyr          Y  
トリプトファン    Trp          W  
ヒスチジン        His          H  
リジン            Lys          K  
アルギニン        Arg          R  
グルタミン        Gln          Q  
アスパラギン      Asn          N  
グルタミン酸      Glu          E  
アスパラギン酸    Asp          D  
セリン            Ser          S  
スレオニン        Thr          T  
本発明は、上記した通りのヒトFVIIポリペプチドを調製する方法にも関する。適切なヒトFVIIポリペプチドは、望ましくは組換えDNA技術によって産生される。このために、ヒトFVIIをコードするDNA配列は、ゲノムのまたはcDNAライブラリを調製すること、および標準的な技術に従って合成オリゴヌクレオチドプローブを使用するハイブリダイゼーションによってタンパク質の全部または一部をコードするDNA配列についてスクリーニングすることによって単離されるであろう（Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989を参照されたい）。本目的のために、タンパク質をコードするDNA配列は、ヒト起源、すなわちヒト・ゲノムDNAまたはcDNAライブラリに由来するのものが好ましい。
【０１４８】
また、ヒトFVIIポリペプチドをコードするDNA配列は、確立された標準的な方法、たとえば、Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859 - 1869によって記載されているホスホアミダイト（phosphoamidite）法、または（Matthesら、EMBO Journal 3 (1984), 801 - 805に記載されている方法によって合成的に調製されてもよい。ホスホアミダイト（phosphoamidite）法によれば、オリゴヌクレオチドは、自動DNA合成装置で合成し、精製し、アニールし、結合させ、適切なベクターにクローン化する。
【０１４９】
また、DNA配列は、たとえば米国特許第4,683,202号、Saikiら、Science 239 (1988), 487 - 491または上記Sambrookらに記載されているとおり、特異的なプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応法によって調製してもよい。
【０１５０】
ヒトFVIIポリペプチドをコードするDNA配列は、通常任意のベクターであろう組換えベクター（これは、便利に組換えDNA手順に供されるであろう）に挿入され、またベクターの選択は、それが導入されるであろう宿主細胞に依存することが多い。したがって、ベクターは、独立して複製するベクター、すなわちその複製が染色体の複製とは独立した、染色体外の実体として存在するベクター、たとえばプラスミドであってもよい。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入されるときに宿主細胞ゲノムに組み込まれるものであってもよく、これが組み込まれた染色体と共に複製されてもよい。
【０１５１】
ベクターは、好ましくはヒトFVIIポリペプチドをコードするDNA配列が、操作可能な状態でDNAの転写のために必要とされるさらなるセグメントに結合された発現ベクターである。一般に、発現ベクターは、プラスミドもしくはウィルスDNAに由来するか、または両エレメントを含んでもよい。「操作可能な状態で結合された」の用語は、セグメントがこれらの企図された目的のために強調して機能するように、たとえば転写がプロモーターで開始して、ポリペプチドをコードするDNA配列を介して進行するように配置されることを示す。
【０１５２】
プロモーターは、選択の宿主細胞の中で転写活性を示す任意のDNA配列であってもよく、宿主細胞に対して相同または異種のタンパク質をコードする遺伝子に由来してもよい。
【０１５３】
哺乳類細胞のヒトFVIIポリペプチドをコードするDNAの転写を指示するための適切なプロモーターの例は、SV40プロモーター（Subramaniら、Mol. Cell Biol. 1 (1981), 854-864）、MT-1（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター（Palmiterら、Science 222 (1983), 809 - 814）、CMVプロモータ（Boshartら、Cell 41:521-530, 1985）、またはアデノウイルス2主要後期プロモーター（Kaufman and Sharp, Mol. Cell. Biol, 2:1304-1319, 1982）である。
【０１５４】
昆虫細胞に使用される適切なプロモーターの例は、ポリヘドリン・プロモーター（米国特許第4,745,051号；Vasuvedanら、FEBS Lett. 311, (1992) 7 - 11）、P10プロモーター（J.M. Vlakら、J. Gen. Virology 69, 1988, pp. 765-776）、キンウワバ科（Autographa californica）多核体病ウイルス塩基性タンパク質プロモーター（EP397485）、バキュロウイルス前初期遺伝子1プロモーター（米国特許第5,155,037号；米国特許第5,162,222号）、またはバキュロウイルス39K遅延型早期（delayed-early）遺伝子プロモーター（米国特許第5,155,037号；米国特許第5,162,222号）である。
【０１５５】
酵母宿主細胞に使用される適切なプロモーターの例は、酵母解糖遺伝子由来のプロモーター（Hitzemanら、J. Biol. Chem. 255 (1980), 12073 - 12080; Alber and Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982), 419 - 434）またはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（Youngら、in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (Hollaenderらeds.), Plenum Press, New York, 1982ら）またはTPI1（US4,599,311）またはADH2-4c（Russellら、Nature 304 (1983), 652 - 654）プロモーターを含む。
【０１５６】
糸状菌宿主細胞に使用される適切なプロモーターの例は、たとえば、ADH3プロモーター（McKnightら、The EMBO J. 4 (1985), 2093 - 2099）またはtpiAプロモーターである。その他の有用なプロモーターの例は、A.オリザエ（oryzae） TAKAアミラーゼ、リゾムコル・ミーヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロテイナーゼ、A.ニジェール（niger）中性αアミラーゼ、A.ニジェール（niger）酸安定アミラーゼ、A.ニジェール（niger）またはA.アワモリ（awamori）グルコアミラーゼ（gluA）、リゾムコル・ミーヘイ（Rhizomucor miehei）リパーゼ、A.オリザエ（oryzae）アルカリプロテアーゼ、A.オリザエ（oryzae）トリオースリン酸イソメラーゼ、またはA.ニジュランス（nidulans）アセトアミダーゼをコードする遺伝子に由来するものである。このましくは、TAKA-アミラーゼおよびgluAプロモーターである。適切なプロモーターは、たとえばEP238023およびEP383779で言及されている。
【０１５７】
また、ヒトFVIIポリペプチドをコードするDNA配列は、必要に応じて、ヒト成長ホルモン・ターミネーター（Palmiterら、Science 222, 1983, pp. 809-814）またはTPI1に操作可能な状態で、接続していてもよい（Alber and Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1, 1982, pp. 419-434）またはADH3（McKnightら、The EMBO J. 4, 1985, pp. 2093-2099）ターミネーターなどの適切なターミネーターに任意に結合されていてもよい。また、ベクターは、プロモーターの下流にまたはFVII配列自体のための挿入部位から上流に位置する一組のRNAスプライス部位を含んでもよい。好ましいRNAスプライス部位は、アデノウイルスおよび／または免疫グロブリン遺伝子から得てもよい。また、挿入部位の下流に位置するポリアデニル化シグナルも、発現ベクターに含まれる。特に好ましいポリアデニル化シグナルは、SV40由来の初期のまたは後遺ポリアデニル化シグナル（Kaufman and Sharp、同書）、アデノウイルス5Elb領域由来のポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン遺伝子ターミネーター（DeNotoら、Nuc. Acids Res. 9:3719-3730, 1981）、またはヒトFVII遺伝子またはウシFVII遺伝子由来のポリアデニル化シグナルを含む。また、発現ベクターは、プロモーターとRNAスプライス部位の間に位置するアデノウイルス2の3部からなる（tripartite）リーダーなどの非翻訳ウイルスリーダー配列；およびSV40エンハンサーなどのエンハンサー配列を含む。
【０１５８】
組換えベクターは、ベクターが問題の宿主細胞において複製することを可能にするDNA配列をさらに含んでもよい。このような配列の例は（宿主細胞が哺乳類細胞であるときに）、SV40複製開始点である。
【０１５９】
宿主細胞が酵母細胞であるときに、ベクターが複製することを可能にする適切な配列は、酵母プラスミド2μ複製遺伝子REP1-3および複製開始点である。
【０１６０】
また、ベクターは、選択可能なマーカー、たとえば宿主細胞の欠損を補足する産物の遺伝子などの、ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）をコードする遺伝子もしくは分裂酵母ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）TPI遺伝子（P.R. Russell, Gene 40, 1985, pp. 125-130に記載されたもの）、または薬物、たとえばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ハイグロマイシン、またはメトトレキセートに耐性を与えるものを含んでいてもよい。糸状菌のためには、選択可能なマーカーは、amdS、pyrG、argB、niaD、またはsCを含む。
【０１６１】
本発明のヒトFVIIポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に向けるために、分泌シグナル配列（別名リーダー配列、プレプロ配列、またはプレ配列）を組換えベクターに提供してもよい。分泌シグナル配列は、適切な読み枠にヒトFVIIポリペプチドをコードするDNA配列に結合される。分泌性シグナル配列は、一般にペプチドをコードするDNA配列に対して5’に配置される。分泌シグナル配列は、通常タンパク質とされていてもよく、または別の分泌タンパク質をコードする遺伝子に由来してもよい。
【０１６２】
酵母細胞から分泌させるためには、分泌シグナル配列は、細胞の分泌経路に発現されたヒトFVIIポリペプチドの効率的な方向づけを確実にする任意のシグナルペプチドをコードしてもよい。シグナルペプチドは。天然に存在するシグナルペプチドもしくはこれらの機能部分であってもよく、またはこれは合成ペプチドであってもよい。適切なシグナルペプチドは、α因子シグナルペプチド（米国特許第4,870,008号を参照されたい）、マウス・プチアリンのシグナルペプチド（O. Hagenbuchleら、Nature 289, 1981, pp. 643-646を参照されたい）、修飾されたカルボキシペプチダーゼ・シグナルペプチド（L.A. Vallsら、Cell 48, 1987, pp. 887-897を参照されたい）、酵母BAR1シグナルペプチド（国際公開公報第87/02670号を参照されたい）、または酵母アスパラギン酸プロテアーゼ3（YAP3）シグナルペプチド（M. Egel-Mitaniら、Yeast 6, 1990, pp. 127-137を参照されたい）であることがわかっている。
【０１６３】
酵母における効率的な分泌のためには、リーダーペプチドをコードする配列を、シグナル配列の下流で、かつヒトFVIIポリペプチドをコードするDNA配列の上流に挿入してもよい。リーダーペプチドの機能により、発現されたペプチドを小胞体からゴルジ体に、およびさらに培地への分泌のための分泌小胞に向けることができる（すなわち、細胞壁を超えた、または少なくとも酵母細胞の細胞膜周辺腔へ細胞膜を通ったヒトFVIIポリペプチドの輸出）。リーダーペプチドは、酵母α因子リーダー（たとえば、米国特許第4,546,082号、米国特許第4,870,008号、欧州特許第16201号、欧州特許第123294号、欧州特許第123544号、および欧州特許第163529号に記載されている使用）であってもよい。あるいは、リーダーペプチドは、合成リーダーペプチドであってもよく、すなわち、リーダーペプチドは天然に見いだされない。合成リーダーペプチドは、たとえば国際公開公報第89/02463号または国際公開公報第92/11378号に記載されたとおりに構築されてもよい。
【０１６４】
糸状菌に使用するためには、シグナルペプチドは、便利にコウジカビsp.（Aspergillus sp.）アミラーゼもしくはグルコアミラーゼをコードする遺伝子、リゾムコル・ミーヘイ（Rhizomucor miehei）リパーゼもしくはプロテアーゼをコードする遺伝子、またはヒューミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）リパーゼに由来してもよい。シグナルペプチドは、好ましくはA.オリザエ（oryzae）TAKAアミラーゼ、A.ニジェール（niger）中性αアミラーゼ、A.ニジェール（niger）酸安定アミラーゼ、またはA.ニジェール（niger）グルコアミラーゼをコードする遺伝子に由来する。適切なシグナルペプチドは、例えば欧州特許第238023およびEP215594に開示されている。
【０１６５】
昆虫細胞に使用するためには、シグナルペプチドは、鱗翅類タバコスズメガ（Manduca sexta）脂肪動態ホルモン前駆体シグナルペプチド（米国特許第5,023,328号を参照されたい）などの昆虫遺伝子（国際公開公報第90/05783を参照されたい）便利に由来してもよい。
【０１６６】
ヒトFVIIポリペプチド、プロモーター、および任意にターミネーターおよび／または分泌シグナル配列をコードするDNA配列をそれぞれ結合するために、および複製のために必要な情報を含む適切なベクターにこれらを挿入するために使用される手順は、当業者に周知である（Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989）。
【０１６７】
哺乳類細胞をトランスフェクトし、細胞に導入されるDNA配列を発現させる方法は、たとえばKaufman and Sharp, J. Mol. Biol. 159 (1982), 601 - 621; Southern and Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), 327 - 341; Loyterら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982), 422 - 426; Wiglerら、Cell 14 (1978), 725; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7 (1981), 603, Graham and van der Eb, Virology 52 (1973), 456; and Neumannら、EMBO J. 1 (1982), 841 - 845に記載されている。
【０１６８】
選択可能なマーカーは、別々のプラスミドで関心対象の遺伝子と同時に細胞に導入されてもよく、またはこれらは同じプラスミドで導入されてもよい。同じプラスミドの場合、選択可能なマーカーおよび関心対象の遺伝子は、異なるプロモーターまたは同じプロモーターの制御下であってもよく、後者の配置ではジシストロニック（dicistronic）なメッセージを生じる。このタイプの構築物は、当該技術分野において既知である（例えば、LevinsonおよびSimonsen、米国特許第4,713,339号）。「キャリアDNA」として既知のさらなるDNAを、細胞に導入される混合物に対して付加することも、有利であろう。
【０１６９】
細胞がDNAを取り込んだ後、これらを適切な細胞増殖培養液中で、典型的には1〜2日培養して、関心対象の遺伝子を発現を開始させる。本明細書に使用されるものとして、「適切な細胞増殖培養液」の用語は、細胞の増殖および関心対象のヒトFVIIポリペプチドの発現のために必要とされる栄養分およびその他の成分を含む培地を意味する。培地は、一般に炭素源、窒素源、必須アミノ酸、必須糖、ビタミン、塩、リン脂質、タンパク質、および成長因子を含む。ガンマ・カルボキシル化されたタンパク質の産生のためには、培地は、好ましくは約5g/mlにつき約0.1g/mlの濃度でビタミンKを含む。次いで、適切な様式で選択可能なマーカーを発現する細胞増殖の選択に、薬物選択を適用する。増幅できる選択可能なマーカーによってトランスフェクトされた細胞について、薬物濃度を増大させてクローン配列のコピー数が増大されることにより、発現レベルが増大されたものを選択してもよい。次いで、安定にトランスフェクトされた細胞のクローンでは、関心対象のヒトFVIIポリペプチドの発現についてスクリーニングする。
【０１７０】
ヒトFVIIポリペプチドをコードするDNA配列が導入された宿主細胞は、翻訳後修飾されたヒトFVIIポリペプチドを産生することができ、酵母、真菌、およびより高等な真核細胞を含む任意の細胞であってもよい。
【０１７１】
本発明に使用される哺乳類株化細胞の例は、COS-1（ATCCCRL1650）、ベビー・ハムスター腎臓（BHK）、および293である（ATCCCRL1573；Grahamら、J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977）株化細胞。好ましいBHK株化細胞は、tk-ts13BHK株化細胞（Waechter and Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1106-1110, 1982、参照として本明細書に組み入れられる）であり、以下にBHK570細胞と称する。BHK570株化細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション12301 Parklawn Dr.、ロックビル、メリーランド20852によって、ATCCアクセッション番号CRL10314の下に寄託されている。また、tk-ts13BHK株化細胞は、アクセッション番号CRL1632下でATCCから入手可能である。加えて、RatHepI（ラット肝細胞腫；ATCCCRL1600）、ラットHepII（ラット肝細胞腫；ATCCCRL1548）、TCMK（ATCCCCL139）、ヒト肺（ATCCHB8065）、NCTC1469（ATCCCCL9.1）、CHO（ATCCCCL61）、およびDUKX細胞（Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980）を含む多くのその他の株化細胞は、本発明の範囲内で使用されてもよい。
【０１７２】
適切な酵母細胞の例は、酵母菌spp.（Saccaromyces spp.）または分裂酵母spp.（Schizosavvaromyces spp.）、特にサッカロマイセス・セレビジエ（Saccaromyces cerevisiae）またはサッカロマイセス・クルイベリ（Saccaromyces kluyveri）株の細胞を含む。異種のDNAで酵母細胞を形質転換するための方法および異種のポリペプチドをこれから産生するための方法は、たとえば米国特許第4,599,311号、米国特許第4,931,373号、米国特許第4,870,008号、第5,037,743号、および米国特許第4,845,075号（これらは、参照として本明細書に組み入れられる）に記載されている。形質転換細胞は、選択可能なマーカーによって決定される表現型、共通に薬剤抵抗性、または特定の栄養分（たとえばロイシン）の非存在下で成長する能力によって選択される。酵母に使用される好ましいベクターは、米国特許第4,931,373号に開示されるPOT1ベクターである。ヒトFVIIポリペプチドをコードするDNA配列は、たとえば上記の通りに、シグナル配列および任意にリーダー配列の後にあってもよい。適切な酵母細胞のさらなる例は、K.ラクティス（K.lactis）、ハンセヌラ（Hansenula）などのクルイベロマイセス（Kluyveromyces）、たとえばH.ポリモルファ（H.polymorpha）、またはピチア（Pichia）、たとえばP.パストリス（P.pastoris）株である（Gleesonら、J. Gen. Microbiol. 132, 1986, pp. 3459-3465を参照されたい）。
【０１７３】
その他の真菌の細胞の例は、糸状菌、たとえばコウジカビspp.（Aspergillus spp.）、パンカビspp.（Neurospora spp.）、フザリウムspp.（Fusarium spp. ）、またはトリコデルマspp.（Trichoderma spp.）、特にA.オリザエ（oryzae）、A.ニジュランス（nidulans）もしくはA.ニジェール（niger）株の細胞である。タンパク質の発現のためのコウジカビspp.の使用は、たとえば、欧州特許第272 277号、欧州特許第238 023号、欧州特許第184 438号に記載されている。F.オキシスプラム（oxysporum）のトランスフォーメーションは、たとえば、Malardierら、1989, Gene 78: 147-156によって記載されているようには行ってもよい。トリコデルマspp.のトランスフォーメーションは、たとえば欧州特許第244 234号に記載されたとおりに行ってもよい。
【０１７４】
糸状菌を宿主細胞として使用するときは、都合の良いことに組換え宿主細胞を得るために、宿主染色体にDNA構築物を組み込むことによって、本発明のDNA構築物で形質転換してもよい。この組込みは、DNA配列が細胞内に安定に維持される可能性がより高くするのに有利であると一般にみなされる。宿主染色体へのDNA構築物の組込みは、従来法に従って、たとえば相同的組換えまたは異種組換えによって行ってもよい。昆虫細胞のトランスフォーメーションおよびその中での異種ポリペプチドの産生は、米国特許第4,745,051号；米国特許第4,879,236号；米国特許第5,155,037号；米国特許第5,162,222号；欧州特許第397,485号（これら全ては、参照として本明細書に組み入れられる）に記載されたとおりに行ってもよい。宿主として使用される昆虫株化細胞は、最適にはスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞またはキンウワバ（Trichoplusia ni）細胞（米国特許第5,077,214号参照）などの鱗翅目（Lapidoptera）株化細胞であってもよい。培養条件は、最適にはたとえば国際公開公報第89/01029号または国際公開公報第89/01028号または上述した参照のいずれかに記載されたとおりであってもよい。
【０１７５】
次いで、上記した形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を適切な栄養培地において、ヒトFVIIポリペプチドの発現に培養を可能にする条件下で培養し、その後に生じるペプチドの全部または一部を培養から回収してもよい。細胞を培養するために使用される培地は、適切な補充を含む最小培地または複合培地などの、宿主細胞を培養するために適切な任意の従来の培地であってもよい。適切な培地は、商業的な供給元から入手可能であり、または発行された処方書（たとえば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログのもの）にしたがって調製してもよい。次いで、細胞によって産生されるヒトFVIIポリペプチドは、問題のポリペプチドのタイプに応じて、遠心分離または濾過によって宿主細胞を培地から分離すること、上清のタンパク質水溶性成分を沈殿すること、または塩、たとえば硫酸アンモニウムの手順による濾過、種々のクロマトグラフィー手順、たとえばイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等による精製を含む従来の手順によって培地から回収してもよい存的な。
【０１７６】
組換えヒトFVIIポリペプチドの調製のためには、クローン化された野生型FVII DNA配列を使用する。この配列は、所望のFVII変異体をコードするように修飾してもよい。ヒトFVIIの完全ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、既知である。組換えヒトFVIIのクローニングおよび発現が記載されている米国特許第4,784,950号を参照されたい（これは参照として本明細書に組み入れられる）。ウシFVII配列は、Takeyaら、J. Biol. Chem, 263:14868-14872 (1988)に記載されており、これは本明細書に参照として組み入れられる。
【０１７７】
アミノ酸配列の変化は、種々の技術によって達成されてもよい。DNA配列の修飾は、部位特異的突然変異によるものであってもよい。部位特異的突然変異のための技術は、当該技術分野において周知であり、たとえば、ZollerおよびSmith (DNA 3:479-488, 1984)に記載されている。したがって、FVIIのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を使用して、選択の変化を導入してもよい。
【０１７８】
本発明に使用するDNA配列は、典型的には適当な翻訳後プロセッシング（たとえば、グルタミン酸残基のガンマ-カルボキシル化）および宿主細胞から分泌を得られるように、FVIIタンパク質のアミノ末端にプレ−プロペプチドをコードする。プレ−プロペプチドは、FVIIのもの、または第IX因子、第X因子、プロトロンビン、プロテインC、もしくはタンパク質SなどのビタミンK依存的な別の血漿タンパク質のものであってもよい。当業者ならば周知のように、これらの修飾によりタンパク質が凝固因子として作用する能力を有意に損なわない場合には、FVIIのアミノ酸配列にさらなる修飾を作製することができる。たとえば、一般に、米国特許第5,288,629号（参照として本明細書に組み入れられる）に記載されているように、触媒三連構造のFVIIは、酵素前駆体FVIIのその活性化の2本鎖形態への変換を阻害するために、活性化切断部位に修飾することもできる。
【０１７９】
本発明の範囲内で、ヒトFVIIポリペプチドを産生するために、トランスジェニック動物技術を使用してもよい。宿主雌哺乳類の乳腺内にタンパク質を産生することが好ましい。関心対象のタンパク質の乳腺内での発現および次の乳汁への分泌は、その他の供与源からタンパク質を単離する際に遭遇する多くの問題を克服する。乳汁は、容易に回収され、大量に利用でき、生化学的によく特徴づけられる。さらに、主要な乳タンパク質は、高濃度で乳汁に存在する（典型的には、約1〜15グラム/リットル）。商業的な観点から、明らかに大量の乳汁収率を有する種を宿主として使用することが好ましい。小動物、たとえばマウス及びラットを使用することができるが、家畜哺乳類、たとえばブタ、ヤギ、ヒツジ、およびウシを用いることが好ましい。ヒツジは、この種の導入遺伝子の以前の歴史、乳汁収率、費用、およびヒツジ乳汁を回収するための設備が容易に利用できることなどの要因により、特に好ましい。宿主種の選択に影響する因子の比較のためには、WIPO刊行物国際公開公報第88/00239号を参照されたい。一般に種類の、イースト・フリースランド・ヒツジなどの酪農使用のために飼育された宿主動物を選択すること、または後日遺伝子組換え系の育種によって乳株を導入することは、望ましい。
【０１８０】
いずれにしても、既知の良好な健康状態の動物が使用されるべきである。乳腺内での発現を得るために、乳タンパク質遺伝子に由来する転写プロモーターが使用される。乳タンパク質遺伝子は、カゼイン（米国特許第5,304,489号（参照として本明細書に組み入れられる）を参照されたい）、βラクトグロブリン、αラクトアルブミン、およびホエー酸性タンパク質をコードする遺伝子を含む。βラクトグロブリン（BLG）プロモーターが好ましい。ヒツジのβラクトグロブリン遺伝子の場合、遺伝子の5’隣接配列の近くの少なくとも406塩基対の領域が一般に使用されるが、5’隣接プロモーターおよびβラクトグロブリン遺伝子の非コード部分を含む約4.25kbpのDNA部分などの、約5kbpまでの5’フランキングの大部分の配列が好ましい。Whitelawら、Biochem J. 286: 31-39 (1992）を参照されたい。その他の種に由来する同様のプロモーターDNAの断片も適している。
【０１８１】
また、βラクトグロブリン遺伝子のその他の領域を構築物に組み込んでもよく、発現される遺伝子のゲノムの領域であってもよい。たとえば、イントロンを欠いている構築物は、このようなDNA配列を含むものと比較して十分に発現しないことは、当該技術分野において一般に受け入れられる（Brinsterら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 836-840 (1988); Palmiterら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 478-482 (1991); Whitelaw ら、Transgenic Res. 1: 3-13 (1991)、国際公開公報第89/01343号；および国際公開公報第91/02318（それぞれは、参照として本明細書に組み入れられる）。この点に関しては、可能であれば、関心対象のタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子の天然のイントロンの全てまたは一部を含むゲノム配列を使用し、したがって、たとえばβラクトグロブリン遺伝子に由来する少なくとも一部のイントロンをさらなる含有するすることが一般に好ましい。一つのこのような領域は、ヒツジのβラクトグロブリン遺伝子の3’非コード領域に由来する、イントロンスプライシングおよびRNAポリアデニル化を提供するDNA部分である。天然の遺伝子の3’非コード配列と置換されたときに、このヒツジのβラクトグロブリン部分は、関心対象のタンパク質またはポリペプチドの発現レベルを増強し、かつ安定化することができる。その他の態様の範囲内において、ヒトFVIIポリペプチドをコードする配列の開始ATGを囲む領域は、乳汁特異的なタンパク質遺伝子に由来する対応配列と置換される。このような置換は、発現を増強するために推定上の組織特異的な開始環境を提供する。ヒトFVIIポリペプチドの全てのプレ−プロ配列および5’非コード配列を、たとえばBLG遺伝子のものと置換することは便利であるが、より狭い領域を置換してもよい。
【０１８２】
トランスジェニック動物内のヒトFVIIポリペプチドの発現のためには、ヒトFVIIポリペプチドをコードするDNAセグメントを、その発現に必要とされるさらなるDNAセグメントに操作可能な状態で結合して、発現ユニットを作製する。このようなさらなるセグメントは、上述のプロモーター、並びに転写終結およびmRNAのポリアデニル化を提供する配列を含む。発現ユニットは、ヒトFVIIポリペプチドををコードするセグメントに操作可能な状態で結合された分泌シグナル配列をコードするDNAセグメントをさらに含む。分泌シグナル配列は、ヒトFVIIポリペプチドの天然の分泌シグナル配列であってもよく、または乳タンパク質などの別のタンパク質のものであってもよい。たとえば、von Heinje, Nuc. Acids Res. 14: 4683-4690 (1986); およびMeadeら、米国特許第4,873,316号を参照され、これらは、参照として本明細書に組み入れられる。
【０１８３】
トランスジェニック動物に使用される発現ユニットの構築は、プラスミドへのヒトFVIIポリペプチドまたはさらなるDNAセグメントを含むファージベクターをコードする配列を挿入することによって便利に行われるが、発現ユニットは、本質的に任意のライゲーション配列によって構築されてもよい。乳タンパク質をコードするDNAセグメントを含むベクターを提供すること、およびヒトFVIIポリペプチドのものと乳タンパク質をコード配列を置換することは、特に便利であり、これにより乳タンパク質遺伝子の発現制御配列を含む遺伝子融合物を作製する。いずれにしても、プラスミドまたはその他のベクター内の発現ユニットのクローニングは、ヒトFVIIポリペプチドの増幅を容易にする。増幅は、細菌（たとえば大腸菌）宿主細胞において便利に行われ、したがってベクターは、典型的には複製開始点および細菌宿主細胞において機能的な選択可能なマーカーを含む。
【０１８４】
次いで、発現ユニットを選択した宿主種の受精卵（初期胎児を含む）に導入する。異種DNAの導入は、微量注入（たとえば米国特許第4,873,191号）、レトロウイルスの感染（Jaenisch, Science 240: 1468-1474 (1988)）、または胚幹性（ES）細胞を使用する部位特異的な組込み（Bradleyら、Bio/Technology 10: 534-539 (1992)を含むいくつかの経路のうちの1つによって達成することができる。次いで、卵子を偽妊娠の雌の卵管または子宮に移植し、発生させることができる。これらの生殖系列に導入されたDNAを有する子孫は、正常に、メンデル傾向でこれらの子孫にDNAを渡すことができ、トランスジェニック群を発生させることができる。
【０１８５】
トランスジェニック動物を作製するための一般的な手順は、当該技術分野において既知である。たとえば、Hoganら、Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1986; Simonsら、Bio/Technology 6: 179-183 (1988); Wallら、Biol. Reprod. 32: 645-651 (1985); Buhlerら、Bio/Technology 8: 140-143 (1990); Ebertら、Bio/Technology 9: 835-838 (1991); Krimpenfortら、Bio/Technology 9: 844-847 (1991); Wallら、J. Cell. Biochem. 49: 113-120 (1992)、米国特許番号4,873,191号および第4,873,316号；WIPO刊行物国際公開公報第88/00239号、国際公開公報第90/05188号、国際公開公報第92/11757号；並びにGB87/00458号を参照され、これらは参照として本明細書に組み入れられる。外来DNA配列を哺乳類およびこれらの胚細胞に導入するための技術は、当初マウスにおいて開発された。たとえば、Gordonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7380-7384 (1980); Gordon and Ruddle, Science 214: 1244-1246 (1981); Palmiter and Brinster, Cell 41: 343-345 (1985); and Brinsterら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4438-4442 (1985)を参照されたい。これらの技術は、その後家畜類種を含むより大きな動物の用途に適用された（たとえば、WIPO刊行物国際公開公報第88/00239号、国際公開公報第90/05188号、および国際公開公報第92/11757号；Simonsら、Bio/Technology 6: 179-183 (1988)を参照されたい）。要約すると、遺伝子組換えマウスまたは家畜類の作製において、現在まで使用される最も効率的な経路では、関心対象のDNAの数百の線状分子を確立された技術にしたがって受精卵の前核の1つに注入する。また、接合体の細胞質へのDNAの注射を使用することもできる。また、遺伝子組換え植物の作製を使用してもよい。発現は、一般化しても、または塊茎などの特定の器官に向けられてもよい。Hiatt, Nature 344:469-479 (1990); Edelbaumら、J. Interferon Res. 12:449-453 (1992); Sijmonsら、Bio/Technology 8:217-221 (1990)、および欧州特許庁出版物欧州特許第255,378号を参照されたい。本発明に従って作製されたFVIIは、抗FVII抗体カラムに対するアフィニティークロマトグラフィーによって精製してもよい。免疫吸着カラムは、高い特異性のモノクローナル抗体を含むことが好ましい。Wakabayashiら、J. Biol. Chem, 261:11097-11108, (1986)およびThimら、Biochem. 27: 7785-7793, (1988)に記載されたような（本明細書に参照によって組み込まれる）、カルシウム依存性のモノクローナル抗体を使用することが特に好ましい。高速液体クロマトグラフィーなどの従来の化学的精製手段によるさらなる生成を行ってもよい。クエン酸バリウム沈澱を含むその他の精製方法は、当該技術分野において既知であり、本明細書に記載されたFVIIの精製に適用してもよい（一般的には、Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y., 1982を参照されたい）。医薬品用途のためには、少なくとも約90〜95%均一な実質的に純粋なFVIIが好ましく、98〜99%以上均一であることが最も好ましい。いったん部分的にまたは要求された通りに均一に精製したら、次いで、FVIIを治療に使用してもよい。
【０１８６】
HednerおよびKisiel (1983, J. Clin. Invest. 71: 1836-1841)によって記載されているように第XIIa因子を使用して、またはトリプシン様の特異性を有するその他のプロテアーゼによって（KisielおよびFujikawa, Behring Inst. Mitt. 73: 29-42, 1983）、単鎖FVIIの活性な2本鎖FVIIaへの変換を達成してもよい。あるいは、FVIIは、モノQ.RTM（Pharmacia Fire Chemicalss）または同様のもの（Bjoernら、1986, Research Disclosures 269:564-565）などのイオン交換クロマトグラフィーカラムに通すことによって自己活性化してもよい。本発明のFVII分子およびこれらの薬学的組成物は、特に血管内凝固を含む種々の症状を治療するためにヒトに投与するために有用である。
【０１８７】
本発明の化合物は、1つまたは複数の不斉中心を有していてもよく、分離されたものとしての立体異性体（光学異性体）、純粋なもしくは部分的に精製された立体異性体、またはラセミ混合物も本発明の範囲に含まれることが企図される。
【０１８８】
本発明の範囲内において、TF二量体アンタゴニストは、薬学的に許容される塩、特に有機酸および鉱酸の塩を含む酸付加塩の形態で調製してもよい。このような塩の例は、ギ酸、フマル酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、サリチル酸などの有機酸の塩を含む。適切な無機酸付加塩は、塩化水素酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などの塩を含む。薬学的に許容される無機または有機酸付加塩のさらなる例は、当業者に既知のJournal of Pharmaceutical Science, 66, 2 (1977)に一覧を示す薬学的に許容される塩を含む。
【０１８９】
また、本化合物を形成することができる水和物も、薬学的に許容される酸付加塩として企図される。
【０１９０】
酸付加塩は、化合物合成の直接の生成物として得られてもよい。択一的に、遊離塩基を適切な酸を含む適切な溶媒に溶解し、溶媒を蒸発させるか、またはそうでなければ塩と溶媒を分離することによって、塩を単離してもよい。
【０１９１】
本発明の化合物は、当業者に既知の方法を使用して、標準的な低分子量の溶媒と溶媒和化合物を形成してもよい。本発明のTF二量体アンタゴニストは、血管疾患および炎症反応を含む血栓性もしくは凝固障害性の関連した疾患または障害の治療または予防のための薬学的組成物を調製するために有用である。これには、深部静脈血栓症、動脈血栓症、手術後の血栓症、冠状動脈バイパス移植（CABG）、経皮的な経皮の冠動脈再建術（PTCA）、脳卒中、癌、腫瘍転移、血管形成、虚血／再灌流、リウマチ様関節炎を含む関節炎、血栓溶解、血管形成術後の動脈硬化および再狭窄、炎症などの急性および慢性の徴候、敗血症ショック（septic chock）、敗血症、低血圧、成人呼吸窮迫症候群（ARDS）、播種性血管内血液凝固症候群（DIC）、肺塞栓症、血小板沈着、心筋梗塞、または血栓症のリスクのあるアテローム硬化型の血管を有する哺乳類の予防的治療などの血管障害を含む、TFを媒介した凝固活性に関連した疾患または障害、血栓性もしくは凝固障害性の関連した疾患または障害、または炎症性の反応およびフィブリン形成に関連した慢性血栓塞栓性の疾患または障害、およびその他の疾患を含むが、これらに限定されない。TFに関連した疾患または障害は、上記名づけられたものなどのインビボの凝固障害性の障害に限定されず、透析手順、血液濾過、または手術の間の血液迂回路などのプロセスにおいて患者からインラインで除去された血液を含む、血液の体外循環によって生じるであろう凝固などの、生体外のTF/FVIIa関連したプロセスを含む。
【０１９２】
TF二量体アンタゴニストは、薬学的に許容される酸付加塩の形態で投与してもよく、または適切な場合には、アルカリ金属またはアルカリ土類金属または低級アルキルアンモニウム塩としてとして投与してもよい。このような塩形態は、遊離塩基系とほぼ同じオーダーの活性を示すと考えられている。
【０１９３】
化合物の薬学的使用とは別に、これらは、FVIIa、FXa、またはTF/FVIIa/FXa活性の阻害を調査するための有用なインビトロのツールであもあろう。
【０１９４】
薬学的組成物  
もう一つの側面において、本発明は、その範囲内に、活性成分としてTF二量体アンタゴニストを含むその範囲薬学的組成物、またはこれらの薬学的に許容される塩を、薬学的に許容されるキャリアまたは希釈液と共に含む。
【０１９５】
任意に、本発明の薬学的組成物は、抗凝固活性を示す1つまたは複数のその他の化合物、たとえば血小板凝集阻害薬と組み合わせて、TF二量体アンタゴニストを含む。
【０１９６】
本発明の化合物は、化合物および薬学的に許容されるキャリアを含む薬学的組成物または希釈液に処方してもよい。このようなキャリアは、水、生理食塩水、エタノール、ポリオール、たとえばグリセリンもしくはプロピレングリコール、または植物油を含む。また、本明細書において使用されるものとして、「薬学的に許容されるキャリア」は、溶媒、分散媒、コーテング、抗真菌薬、防腐剤、等張性の薬剤などのいずれかおよび全てを含む。任意の従来の媒体が活性成分およびその企図される使用に不適合であるものを除いて、本発明の組成物のその使用が想定される。
【０１９７】
本組成物は、従来の技術によって従来の形態に、たとえばカプセル、タブレット、溶液、または懸濁液に調製してもよい。使用される薬学的キャリアは、従来の固体または液状のキャリアであってもよい。固体キャリアの例は、ラクトース、白土、シュークロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、およびステアリン酸である。液体キャリアの例は、シロップ、落花生油、オリーブ油、および水である。同様に、キャリアまたは希釈液は、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルを単独でまたは蝋と混合したものなど、当該技術分野において既知の任意の時間遅延材料を含んでもよい。また、製剤は、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、保存剤、甘味剤、または香味剤をを含んでいてもよい。本発明の製剤は、当該技術分野において周知の手順を使用することによって患者への投与の後、活性成分の簡単な、持続性または遅延性の放出を提供するように処方してもよい。
【０１９８】
薬学的組成物は、殺菌することができ、必要に応じて、活性化合物と反応せずに有害ではない、補助的な薬剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼすための塩、緩衝液、および／または着色物質などを混合することができる。
【０１９９】
投与の経路は、経口または非経口など、たとえば直腸、経皮、皮下、鼻腔内、筋肉内、局所的、静脈内、尿道内、眼の溶液または軟膏など、適切なまたは所望の作用部位に活性化合物を効率的に輸送する任意の経路であってもよいが、経口経路が好ましい。
【０２００】
経口投与のための固体キャリアを使用する場合、標品をタブレット化し、粉末またはペレット形態の硬いゼラチンカプセルに配置することができ、またはトローチまたはロゼンジの形態にすることもできる。固体キャリアの量は、広く変化させてもよいが、通常約25mg〜約1gである。液体キャリアが使用される場合、標品は、水性もしくは非水溶液状の懸濁液または溶液などのシロップ、エマルジョン、軟らかいゼラチンカプセル、または無菌の注射用の液体の形態であってもよい。
【０２０１】
鼻噴投与のためには、標品は、エアロゾル適用のために液体キャリア、特に水性キャリアに溶解されまたは懸濁された式（I）の化合物を含んでもよい。キャリアは、たとえばパラベン、プロピレングリコール、界面活性剤などの溶解剤、レシチン（ホスファチジルコリン）またはシクロデキストリンなどの吸収促進薬、または防腐剤などの添加剤を含んでいてもよい。
【０２０２】
非経口的適用のためには、注射用の溶液または懸濁液、好ましくはポリヒドロキシル化されたひまし油に溶解された活性化合物を含む水性溶液が特に適切している。
【０２０３】
タルクおよび／または炭水化物キャリアもしくは結合剤などを有するタブレット、糖衣丸、またはカプセルは、特に経口適用のに適している。
【０２０４】
タブレット、糖衣丸、またはカプセルのための好ましいキャリアは、ラクトース、コーンスターチ、および／またはジャガイモデンプンを含む。加糖媒体を使用することができる場合は、シロップまたはエリキシルを使用することができる。
【０２０５】
典型的なタブレットは、従来のタブレット化技術によって調製してもよく、以下のものを包含する：
コア：
活性化合物（遊離の化合物またはこれらの塩として）          10mg
コロイド性の二酸化ケイ素（Areosil（登録商標））            1.5mg
セルロース、微結晶（Avicel（登録商標））                  70mg
修飾セルロースガム（Ac-Di-Sol（登録商標））                7.5mg
ステアリン酸マグネシウム
コーテング：
HPMC                                                      約9mg
*Mywacett（登録商標）9-40T                                約0.9mg
*フィルムコーティングのために可塑剤として使用されるの*アシル化されたモノグリセリド。
【０２０６】
本発明の化合物は、このような上記したとおりの種々の血栓溶解性もしくは凝固障害性の疾患または障害の、治療、予防、排除、軽減、または回復を必要とする哺乳類、特にヒトに投与してもよい。また、このような哺乳類は、野生生物などの動物、家畜、たとえば家庭ペットおよび非家畜動物を含む。
【０２０７】
通常、経口、鼻、肺、または経皮の投与のために適した財形は、約0.001mg〜約100mg、好ましくは約0.01mg〜約50mgの式Iの化合物を薬学的に許容されるキャリアまたは希釈液と混合して含む。
【０２０８】
化合物は、薬学的に許容されるキャリアまたは希釈液と並行して、同時に、または共に、経口、直腸、または非経口的（皮下を含む）経路によって投与してもよい。化合物は、しばしばおよび好ましくは、そのアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩の形態である。
【０２０９】
適切な用量範囲は、投与の正確な様式投与の形態、投与が指示される徴候、関係する被検者および関係する被検者の体重、並びに医師または獣医の選択および経験に応じて、上に示したように異なる。
【０２１０】
本発明の化合物は、興味深い薬理学的性質を有する。たとえば、この発明の化合物は、血液凝固因子またはこれらの阻害剤の欠損または機能不全によって生じる哺乳類の止血バランスの障害を調節および正常にするために使用することができる。FVIIaおよび特にTF/FVIIaの活性は、凝固カスケードの制御において重要な役割を果たし、本発明などのこのような鍵となる調節活性の修飾因子は、血管疾患および炎症反応を含む血栓性のまたは凝固障害性の関連した疾患または障害の治療および予防に使用することができる。したがって、本発明の薬学的組成物は、哺乳類の止血バランスの障害を調整し、正常化するために有用であろう。特に、薬学的組成物は、血管疾患および炎症反応を含む血栓性のまたは凝固障害性の関連した疾患または障害の治療および予防のために有用であろう。
【０２１１】
「止血バランスの障害を調整し、正常化する」とは、インビトロ・アッセイ法で測定できる凝固系および／または血栓症または出血のリスクを減弱させる動物モデルに対する効果を達成することを意味する。
【０２１２】
より詳しくは、薬学的組成物は、哺乳類の血液凝固の阻害剤として、哺乳類の凝固活性の阻害剤として、哺乳類のフィブリン沈着の阻害剤として、哺乳類の血小板沈着の阻害剤として、深部静脈血栓症、動脈血栓症、手術後の血栓症、冠状動脈バイパス移植（CABG）、経皮的な経皮の冠動脈再建術（PTCA）、脳卒中、癌、腫瘍転移、血管形成、虚血／再灌流、リウマチ様関節炎を含む関節炎、血栓溶解、血管形成術後の動脈硬化および再狭窄、炎症などの急性および慢性の徴候、敗血症ショック（septic chock）、敗血症、低血圧、成人呼吸窮迫症候群（ARDS）、播種性血管内血液凝固症候群（DIC）、肺塞栓症、血小板沈着、心筋梗塞に苦しむほ乳類の治療に、または血栓症のリスクのあるアテローム硬化型の血管を有する哺乳類の予防的治療に有用であろう。本発明の組成物は、また、血栓溶解療法の補助として使用してもよい。
【０２１３】
さらに、本発明は、哺乳類のTF惹起活性を阻害するための方法であって、このような治療を必要とする哺乳類に対し、本発明の少なくとも１つの化合物の有効な量を、薬学的に許容される賦形剤および／またはキャリアと組み合わせて投与ことを含む方法に関する。
【０２１４】
アッセイ法
二量体のTFアンタゴニストFXa生成アッセイ法によるFXのFVIIa/リン脂質に包埋されたTFで触媒される活性化の阻害（アッセイ法1）：
以下の実施例では、全ての濃度は、最終濃度である。脂質化（Lipidated）TF（10pM）、FVIIa（100pM）、および二量体TFアンタゴニストまたはFFR-rFVIIa（0〜50nM）のHBS/BSA（50mMのHepes、pH7.4、150mMのNaCl、5mMのCaCl2、1mg/mlのBSA）溶液を、FX（50nM）を添加する前に室温で60分間インキュベートする。10分後に1/2体積の停止緩衝液（50mMのHepes、pH7.4、100mMのNaCl、20mMのEDTA）の添加によって反応を停止させる。生成したFXaの量を、基質S2765（0.6mM、Chromogenix）を添加して、10分間連続的に405nmで吸光度を測定することによって決定する。FVIIa/脂質化TFを媒介したFXの活性化のTFアンタゴニスト阻害のIC50値を算出してもよい。FFR-rFVIIaのIC50値は、このアッセイ法では51+/-26pMである。
【０２１５】
二量体TFアンタゴニストによるFVIIa/細胞表面のTFで触媒されるFXの活性化の阻害（アッセイ法2）：
以下の実施例では、全ての濃度は、最終濃度である。構成的にTFを発現する、ヒト肺線維芽細胞WI-38（ATCC番号CCL-75）またはヒト膀胱カルシノーマ細胞系J82（ATCC番号HTB-1）の単層またはヒト・ケラチノサイト株化細胞CCD1102KerTr（ATCC番号CRL-2310）を、FVIIa/TFで触媒されるFXの活性化のTF供与源として使用する。96穴プレートのコンフルエントな細胞単層を緩衝液A（10mMのHepes、pH7.45、150mMのNaCl、4mMのKCl、および11mMのグルコース）で1回および緩衝液B（1mg/mlのBSAおよび5mMのCa2+を補った緩衝液A）で1回洗浄した。FVIIa（1nM）、FX（135nM）、および様々な濃度の二量体TFアンタゴニストまたはFFR-rFVIIaの緩衝液B溶液を同時に細胞に添加する。37℃で15分間FXaを形成させる。50μlの一定分量をそれぞれのウェルから除去して、停止緩衝液（10mMのEDTAおよび1mg/mlのBSAを補った緩衝液A）を50μlに添加する。生成したFXaの量を、マイクロタイタープレートウェルに50μlの上記の混合物を移し、ウェルに25μlのChromozymX（終濃度0.6mM）を添加することによって決定する。405nmの吸光度を連続的に測定し、色の発生の初速度を、FXa検量線を使用してFXa濃度に変換する。FFR-rFVIIaのIC50値は、このアッセイ法では1.5nMである。
【０２１６】
二量体TFアンタゴニストによる細胞表面TFに対する125I-FVIIaの結合の阻害（アッセイ法3）：
以下の実施例では、全ての濃度は、最終濃度である。結合研究は、全て構成的にTFを発現する、ヒト膀胱カルシノーマ細胞系J82（ATTC番号HTB-1）またはヒト・ケラチノサイト株化細胞（CCD1102KerTr ATCC番号CRL-2310）またはNHEKP166（Clonetics番号CC-2507）を使用した。5mMのEDTAを補った緩衝液A（アッセイ法8を参照）で24穴組織培養プレートのコンフルエントな単層を洗浄し、次いで緩衝液Aで1回および緩衝液B（アッセイ法8を参照）で1回洗浄した。単層を100μlの冷却緩衝液Bと共に2分間プレインキュベートする。種々の濃度のMabs（または、FFR-FVIIa）および放射標識されたFVIIa（0.5nM 125I-FVIIa）を同時に細胞（最終体積200μl）に添加する。プレートを4℃で2時間インキュベートする。インキュベーション終了後、未結合の物質を除去して、細胞を氷冷緩衝液Bで4回洗浄し、300μl溶解緩衝液（200mMのNaOH、1%のSDS、および10mMのEDTA）に溶解させる。放射活性は、ガンマ計数器（Cobra, Packard Instruments）で測定する。GraFit4を使用して、結合データを解析し、曲線に当てはめる（Erithacus Software、Ltd., (U.K.）。FFR-rFVIIaのIC50値は、は、このアッセイ法では4nMである。
【０２１７】
本発明は、以下の実施例によってさらに例示される。
【０２１８】
本発明は、実施例に開示された特定の態様によって範囲は限定されず、本発明の多くの側面の具体例であり、機能的に均等である任意の態様が、本発明の範囲内であることが企図される。当業者であれば、ルーチン試験のみを使用して、本明細書に記載した本発明の特定の態様に対する多くの均等物を知ること、または確認することが可能であろう。これらのおよび全てのその他の均等物は、請求項の範囲に含まれることが企図される。
【実施例】
【０２１９】
FVIIa阻害剤を含む以下のLMを合成した：
【化３】
2005538936.tif 000005
オクタン二酸ビス-（{1-[1-（1-クロロアセチル-4-グアニジノ-ブチルカルバモイル）-2-フェニル-エチルカルバモイル]-2-フェニル-エチル}-アミド）（実施例1）
【化４】
2005538936.tif 000006
N、N’ビス-（1-{1-[1-（2-クロロ-アセチル）-4-グアニジノ-ブチルカルバモイル]-2-フェニル-エチルカルバモイル}-2-フェニルエチル）-オキサルアミド（実施例2）
【化５】
2005538936.tif 000007
N,N’-ビス-（1-{1-[1-（2-クロロ-アセチル）-4-グアニジノ-ブチルカルバモイル]-2-フェニル-エチルカルバモイル}-2-フェニルエチル-2,3-ジヒドロキシスクシンアミド（実施例3）
【化６】
2005538936.tif 000008
ペンタン二酸ビス-[（1-{1-[1-（2-クロロ-アセチル）-4-グアニジノ-ブチルカルバモイル]-2-フェニル-エチルカルバモイル}-2-フェニル-エチル）-アミド]（実施例4）
【化７】
2005538936.tif 000009
ドコサ-10,12ジエン二酸ビス-[（1-{1-[1-（2-クロロ-アセチル）-4-グアニジノ-ブチルカルバモイル]-2-フェニル-エチルカルバモイル}-2-フェニル-エチル）-アミド]（実施例5）
【化８】
2005538936.tif 000010
オクタデカン二酸ビス-[（1-{1-[1-（2-クロロ-アセチル）-4-グアニジノ-ブチルカルバモイル]-2-フェニル-エチルカルバモイル}-2-フェニル-エチル）-アミド]（実施例8）
【化９】
2005538936.tif 000011
エイコサン二酸ビス-[（1-{1-[1-（2-クロロ-アセチル）-4-グアニジノ-ブチルカルバモイル]-2-フェニル-エチルカルバモイル}-2-フェニル-エチル）-アミド]（実施例7）
【化１０】
2005538936.tif 000012
ドコサン二酸ビス-[（1-{1-[1-（2-クロロ-アセチル）-4-グアニジノ-ブチルカルバモイル]-2-フェニル-エチルカルバモイル}-2-フェニル-エチル）-アミド]（実施例6）
実施例1  
オクタン二酸ビス-（{1-[1-（1-クロロアセチル-4-グアニジノ-ブチルカルバモイル）-2-フェニル-エチルカルバモイル]-2-フェニル-エチル}-アミド）（1）
ジスクシンイミジルスベラート（Pierce #21555）（5.86mg）を1.5mlのFFR-CMK（25mg）のリン酸緩衝液pH7.4溶液と混合し、2滴のDMFを添加後、混合物をN2雰囲気下で1日間閉じた容器中で撹拌し、引き続く蒸発により、黄色の油生の生成物物（35mg）を得て、これを1ml/分の一定の流れでHPLC（逆相カラム（Symmetry Shield,C8、Waters、Part no. WAT200655））で精製した。溶出は、水相（0.1%のTFA水溶液）に関して有機相（0.1%のトリフルオロ酢酸（TFA）を含有するアセトニトリル）の割合を増大することによって達成した。FFR-CMKの二量体の形態が約28分で溶出される場合、35分にわたる14%から50%の有機相の直線濃度勾配を使用した。
【０２２０】
30.94分のrt（保持時間）の画分を単離した。MS（M+1）1141、収率12%、油。
【０２２１】
実施例2  
N,N’-ビス-（1-{1-[1-（2-クロロ-アセチル）-4-グアニジノ-ブチルカルバモイル]-2-フェニル-エチルカルバモイル}-2-フェニルエチル）-オキサルアミド（2）
ジスクシンイミジルスベラート（4.2mg）およびFFR-CMK（25mg）を1.5mlのリン酸緩衝液pH7.4に混合し、2滴のDMFを添加後、混合物をN2雰囲気下で1日間閉じた容器中で撹拌し、引き続く蒸発により、黄色の油生の未精製生成物（35mg）を得て、これを1ml/分の一定の流れでHPLC（逆相カラム（Symmetry Shield,C8、Waters、Part no. WAT200655））で精製した。溶出は、水相（0.1%のTFA水溶液）に関して有機相（0.1%のトリフルオロ酢酸（TFA）を含有するアセトニトリル）の割合を増大することによって達成した。FFR-CMKの二量体の形態が約28分で溶出される場合、35分にわたる14%から50%の有機相の直線濃度勾配を使用した。
【０２２２】
31.08分のrtの画分を単離した。MS（M+1）1057、収率8%、黄色の油。
【０２２３】
実施例3  
N,N’-ビス-（1-{1-[1-（2-クロロ-アセチル）-4-グアニジノ-ブチルカルバモイル]-2-フェニル-エチルカルバモイル}-2-フェニルエチル-2,3-ジヒドロキシsuccinアミド（3）
ジスクシンイミジルタルテート（Pierce #20589）（5.16mg）およびFFR-CMK（25mg）を1.5mlのリン酸緩衝液pH7.4に混合し、4滴のDMFを添加後、混合物をN2雰囲気下で一晩閉じた容器中で撹拌し、引き続く蒸発により、黄色の油生の未精製生成物（35mg）を得て、これを1ml/分の一定の流れでHPLC（逆相カラム（Symmetry Shield,C8、Waters、Part no. WAT200655））で精製した。溶出は、水相（0.1%のTFA水溶液）に関して有機相（0.1%のトリフルオロ酢酸（TFA）を含有するアセトニトリル）の割合を増大することによって達成した。FFR-CMKの二量体の形態が約28分で溶出される場合、35分にわたる14%から50%の有機相の直線濃度勾配を使用した。
【０２２４】
29.20分のrtの画分を単離した。MS（M+1）1117、収率4%、黄色の油。
【０２２５】
実施例4  
ペンタン二酸ビス-（1-{1-[1-（2-クロロ-アセチル）-4-グアニジノ-ブチルカルバモイル]-2-フェニル-エチルカルバモイル}-2-フェニル-エチル）-アミド]（4）
ジスクシンイミジルグルタラート（Pierce #20593）（4.89mg）およびFFR-CMK（25mg）を1.5mlのリン酸緩衝液pH7.4に混合し、1mlのDMFを添加後、混合物をN2雰囲気下で3日間閉じた容器中で撹拌し、引き続く蒸発により、黄色の油生の未精製生成物（35mg）を得て、これを1ml/分の一定の流れでHPLC（逆相カラム（Symmetry Shield,C8、Waters、Part no. WAT200655））で精製した。溶出は、水相（0.1%のTFA水溶液）に関して有機相（0.1%のトリフルオロ酢酸（TFA）を含有するアセトニトリル）の割合を増大することによって達成した。FFR-CMKの二量体の形態が約28分で溶出される場合、35分にわたる14%から50%の有機相の直線濃度勾配を使用した。
【０２２６】
29.20分のrtrtの画分を単離した。MS（M+1）1099、収率18%、黄色のの油。
【０２２７】
実施例5  
10,12-ドコサジイン二酸ビス-（{1-[1-（1-クロロアセチル-4-グアニジノ-ブチルカルバモイル）-2-フェニル-エチルカルバモイル]-2-フェニル-エチル}-アミド）
ドコサ-10,12-ジイン二酸ビス-（2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イル）エステル（9.4mg）をFFR-CMK（25mg）の1.0mLのリン酸緩衝液pH7.4溶液と混合し、1.0mlのDMFを添加した後、混合物をN2雰囲気下で4日間閉じた容器中で撹拌し、引き続く蒸発により、黄色の油生の生成物（35mg）を得た。
【０２２８】
実施例6  
ドコサン二酸ビス-（{1-[1-（1-クロロアセチル-4-グアニジノ-ブチルカルバモイル）-2-フェニル-エチルカルバモイル]-2-フェニル-エチル}-アミド）
ドコサン二酸ビス-（2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イル）エステル（9.5mg）をFFR-CMK（25mg）の1.0mLのリン酸緩衝液pH7.4溶液と混合し、1.0mlのDMFを添加した後、混合物をN2雰囲気下で4日間閉じた容器中で撹拌し、引き続く蒸発により、黄色の油生の未精製生成物を得た。
【０２２９】
実施例7  
イコサン二酸ビス-（{1-[1-（1-クロロアセチル-4-グアニジノ-ブチルカルバモイル）-2-フェニル-エチルカルバモイル]-2-フェニル-エチル}-アミド）
エイコサン二酸ビス-（2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イル）エステル（9.1mg）をFFR-CMK（25mg）の1.0mLのリン酸緩衝液pH7.4溶液、および1.0mlのDMFと混合し、混合物をN2雰囲気下で4日間閉じた容器中で撹拌し、引き続く蒸発により、黄色の油生の未精製生成物を得た。
【０２３０】
実施例8  
オクタデカン二酸ビス-（{1-[1-（1-クロロアセチル-4-グアニジノ-ブチルカルバモイル）-2-フェニル-エチルカルバモイル]-2-フェニル-エチル}-アミド）
オクタデカン二酸ビス-（2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イル）エステル（8.6mg）をFFR-CMK（25mg）の1.0mLのリン酸緩衝液pH7.4溶液、および1.0mlのDMFと混合し、混合物をN2雰囲気下で4日間閉じた容器中で撹拌し、引き続く蒸発により、黄色の油生の未精製生成物を得た。
【０２３１】
実施例9：  
オクタン二酸ビス-（{1-[1-（1-クロロアセチル-4-グアニジノ-ブチルカルバモイル）-2-フェニル-エチルカルバモイル]-2-フェニル-エチル}-アミドを、150mMのNaClおよび10mMの塩化カルシウムを1：2のモル比で含む10mMのグリシルグリシンpH7.5中のrFVIIaと混合し、4℃で6日間インキュベートした。試料を、20mMのトリスCl、250mMのNaCl、5mMの塩化カルシウム、pH8.0によって平衡させたHiLoad 16/60 Superdex 75（Parmacia）に充填した。画分をSDS-PAGE（Novex）によって解析し、分子量100,000のバンドを示する画分数16〜19をプールして、Centiprep10カラム（Amicon）で濃縮した。濃縮した試料を、20mMのトリスCl、250mMのNaCl、5mMの塩化カルシウム、pH8.0によって平衡させたHiLoad 16/60 Superdex 200（Parmacia）に充填し、SDS-PAGEで分子量100,000のバンドを含む画分をプールして濃縮した。
【０２３２】
オクタン二酸ビス-（{1-[1-（1-クロロアセチル-4-グアニジノ-ブチルカルバモイル）-2-フェニル-エチルカルバモイル]-2-フェニル-エチル}-アミドで反応したrFVIIaのサイズ排除クロマトグラフィー（図1a）、および画分のSDS-PAGE（図1b）。SDS-PAGEのための試料は還元しなかった。MARK 12（Invitrogen）を標準分子量として使用した（左のレーン）。16〜19ではに画分をプールし、濃縮し、Superdex200カラムに充填した。
【０２３３】
実施例10：  
FVII-LZの作製および発現。
【０２３４】
哺乳類細胞でヒトFVII融合タンパク質を発現するためのプラスミドベクターpFVII-fusは、pCI-neoプラスミドベクター（Promega, Madison, WI）に基づいて、存在するBamHI部位をBamHI消化によって欠失させ、続いてT4DNAポリメラーゼでつなぎ、pCI-neo（ΔBamHI）と呼ばれるプラスミドベクターを得て作製した。簡単には、pFVII-fusベクターは、挿入されたcDNAの転写のための強力なCMVプロモーターの制御下のプロペプチドおよび選択可能なマーカーとして使用するためのSV40初期プロモーターの制御下のネオマイシンホスホトランスフェラーゼcDNAを含むヒトFVIIをコードするcDNAヌクレオチド配列を有する。FVIIのインサートは、I.M.A.G.E.クローンID：1848877から作製されるが、Expand High Fidelity（Roche）を使用するPCRによって任意の全長FVII cDNAを使用することもできる。PCR産物は、当業者に周知の、特異的なプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応法を使用するDNA構築物を調製するための手順によって（PCR Protocols, 1990, Academic Press, San Diego, California, USAを参照されたい）、オリゴヌクレオチドプライマー1および2を使用して作製される：
プライマー1。  5’-AAATAGGCTAGCATGGTCTCCCAGGCCCTCAGG-3’（配列番号1）
プライマー2。  5’-ACGCGTGAATTCTCAGGCGGATCCGGGAAATGGGGCTCG-3’（配列番号2）
生じる産物は、C末端タグのフレーム挿入に使用されるBamHI部位を含むGly-Ser-Alaをコードするインフレーム部分に続いて完全なFVIIコード配列を含む。断片をNheIおよびEcoRIによって消化し（プライマー配列に下線を引いた）、pCI-neo（BamHI）のNheIおよびEcoRI部位に導入して、pFVII-fusと呼ばれるプラスミドベクターを得る。
【０２３５】
異なるロイシンジッパー挿入を、重複するオリゴヌクレオチド（イタリックの重複領域）を使用するプライマー二量体として作製し、これをT4またはTaqDNAポリメラーゼを使用してつないで、Gly-Ser-AlaをコードするBamHI部位の前の、終止コドンおよびEcoRI部位の後に選択のLZをコードする2本鎖DNA断片を得た。（プライマー配列に下線を引いた）。したがって、ATF4由来のLZを含む融合タンパク質を生じるデザインの例を以下の通りに示す。
【０２３６】
プライマー3（ATF4LZ forward）：
5’-ATGGGATCCGCCAAGGAGCTGGAGAAGAAGAACGAGGCCCTGAAGGAGCGCGCCGACAGCCTGGC-3’（配列番号3）
プライマ-4（ATF4LZ recerse）：
5’-CATGAATTCTCACTCCTCGATCAGGTCCTTCAGGTACTGGATCTCCTTGGCCAGGCTGTCGGCGC-3’（配列番号4）
T4ポリメラーゼによってつなぐ反応に続いて、DNAポリメラーゼを取り除き、二本鎖DNA産物をBamHIおよびEcoRIによって消化して、生じるインサートを従来法を使用して精製する。精製したインサートは、T４DNAリガーゼを使用してpFVII-fusベクターのBamHIおよびEcoRI部位に結合させ、適切なE.coli株、たとえばDH5αまたはXL1 Blueに形質転換する；所望のLZタグを含むプラスミドベクター（pFVII-LZと呼ばれる）を同定し、標準的な技術を使用して単離して、DNAシーケンシングで配列を検査する。生じる発現ベクターは、以下のタンパク質をコードする：
FVII-GSA-KELEKKNEALKERADSLAKEIQYLKDLIEE
pFVII-LZベクターをリポフェクトアミンまたは同様の技術を使用してCHO細胞にトランスフェクトし、ネオマイシン選択に続いて安定クローンを単離する。FVIIを分泌するクローンを、FVII ELISAを使用して同定し、高産生クローンをさらにサブクローニングして、10%のウシ胎児血清を有するダルベッコ修飾イーグル培地中で非常に特異的なFVII発現を有するクローンを得る。その後、クローンを商業的に入手可能なCHO培地（JRH Bioscience）を使用して、無血清懸濁培養に適応させる。次いで、生じる組換えFVII-LZ物質は、従来法（Thim, L.ら、Biochemistry (1988) 27:7785-93）を使用して、培地から精製することができる。
【０２３７】
実施例11  
FVII-LZの発現。
【０２３８】
BHK細胞は、本質的に前述したようにpFVII-LZベクターによってトランスフェクトして（Thimら、(1988) Biochemistry 27, 7785-7793; PerssonおよびNielsen (1996) FEBS Lett. 385, 241-243)）FVII-LZの発現を得る。FVII-LZタンパク質を次のように精製する：
条件培地は、5mMのEDTA、0.1%のトリトンX-100、および10mMのトリス、8.0にpHをあわせ、水を加えることによ10-11mS/cmに伝導度をあわせて添加した後、QセファロースFast Flow（Pharmacia Biotech）の25mlのカラムに充填する。
【０２３９】
タンパク質の溶出は、10mMのトリス、50mMのNaCl、0.1%のトリトンX-100、pH8.0〜10mMのトリス、50mMのNaCl、25mMの塩化カルシウム、0.1%のトリトンX-100、pH8.0の段階によって達成される。S314E/K316H-FVIIを含む画分をプールし、CNBr活性セファロース4B（Pharmacia Biotech）に結合されたモノクローナル抗体F1A2（NovoNordisk、Bagsvard、Denmark）を含む25mlのカラムに充填する。
【０２４０】
カラムを10mMのCaCl2、100mMのNaClおよび0.02%のトリトンX-100を含む50mMのHepes（pH7.5）によって平衡化する。
【０２４１】
平衡緩衝液および2MのNaClを含む平衡緩衝液で洗浄後、結合した物質を塩化カルシウムの代わりに10mMのEDTAを含む平衡緩衝液によって溶出させる。使用または貯蔵の前に、EDTA以上の過剰な塩化カルシウムを添加するか、またはFVII-LZを、Ca2+を含有する緩衝液に移す。それぞれの工程の収率は、VII因子ELISA測定によって行い、精製したタンパク質をSDS-PAGEによって分析した。その後の、たとえばFFR-CMKによるFVII-LZ分子のFVII部分の不活性化は、当業者に既知である。
【０２４２】
実施例12  
FFR-FVIIa二量体およびFFR.FVIIaは、次のように競合凝固アッセイ法で解析した：リンカーとしてのオクタン二酸ビス-（{1-[1-（1-クロロアセチル-4-グアニジノ-ブチルカルバモイル）-2-フェニル-エチルカルバモイル]-2-フェニル-エチル}-アミドを使用して調製されたFFR-FVIIa二量体またはFFR-FVIIa単量体を、20nMのFVIIa、10nM塩化カルシウム、および脂質化組換えTF（Innovin、Dade Behring）の200×希釈した50mMのイミダゾール、0.1MのNaCl、pH7.4溶液と共に示された濃度で、37℃で60分間、0.1%のBSAと共にインキュベートして、アンタゴニストを伴わずに試料中で30秒間の凝固時間を与えた。凝固時間は、0.5体積のFVII欠損血漿（Helena BioSciences）を添加した後にACL300 Research機器（Instrumentation Laboratories）で測定した。凝固時間を2倍にするために必要とされるFFR-FVIIa単量体の濃度は、0.23μg/mlあったが、凝固時間を2倍にするために必要とされるFFR-FVIIa二量体の濃度は、0.002μg/mlであった、すなわち、二量体は、凝固時間を引き延ばすのにほぼ100倍有効であった。
【図面の簡単な説明】
【０２４３】
【図１】rFVIIaのサイズ排除クロマトグラフィーは、オクタン二酸ビス-（{1-[1-（1-クロロアセチル-4-グアニジノ-ブチルカルバモイル）-2-フェニル-エチルカルバモイル]-2-フェニル-エチル}-アミドとともに反応した（画分（b）a）およびSDS-PAGE。
【図２】FFR-FVIIa活性部位二量体の効果およびTF供与源として脂質化された組換えTF（Innovin）を使用する競合凝固アッセイ法の中のFFR-FVIIa単量体。
【図３−１】本発明において使用される配列。
【図３−２】本発明において使用される配列。
【図３−３】本発明において使用される配列。
【図１】
2005538936.tif 000013
【図２】
2005538936.tif 000014
【図３−１】
2005538936.tif 000015
【図３−２】
2005538936.tif 000016
【図３−３】
2005538936.tif 000017
【配列表】
2005538936000001.app
【国際調査報告】
2005538936.tif 000018
2005538936.tif 000019
2005538936.tif 000020
2005538936.tif 000021
2005538936.tif 000022
2005538936.tif 000023