(57)【要約】本発明は、一つまたは複数の第二の薬物標的を同定する組成物および方法、ならびに特に癌または細胞複製障害の治療のために薬物または薬物候補を同定する段階におけるその利用に関する。酵母に基づく合成致死スクリーニングを用いて、細胞周期経路に欠損を有する細胞を殺すための新たな遺伝子標的を機能的に同定および確認する。これらの新たに同定された遺伝子標的を用いて、癌、良性細胞増殖、および酵母感染症を治療するための新たな治療術を開発することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異MAD2遺伝子またはその類似体もしくは相同体を有する細胞の増殖または複製を阻害する薬物を同定する方法であって、以下の段階を含む方法：
（a）変異MAD2遺伝子またはその類似体もしくは相同体を有する細胞を薬物と接触させる段階；および
（b）変異し、かつ変異MAD2遺伝子またはその類似体もしくは相同体と組み合わされて存在すると合成的に致死である（synthetically lethal）、野生型の第二の遺伝子の活性を、薬物が調節するか否かを決定する段階。
【請求項２】
細胞が腫瘍細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
段階（b）の結果を、薬物なしで増殖させた対照細胞と比較する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
対照細胞が正常細胞である、請求項3記載の方法。
【請求項５】
対照細胞が腫瘍細胞である、請求項3記載の方法。
【請求項６】
対照細胞が変異MAD2遺伝子またはその類似体もしくは相同体を有する、請求項3記載の方法。
【請求項７】
第二の遺伝子が類似体および相同体であるTUB1、CIN8、SFI1、STU1、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項８】
変異MAD2遺伝子またはその相同体もしくは類似体を有する、腫瘍細胞の治療において有用な化合物を同定する方法であって、以下の段階を含む方法：
（a）その変異型（mutant form）において、変異MAD2遺伝子またはその相同体もしくは類似体と組み合わせると合成的に致死である第二の遺伝子産物を、試験化合物と接触させる段階；および
（b）第二の遺伝子産物の活性を決定する段階。
【請求項９】
試験化合物の存在下での第二の遺伝子産物の活性を、第二の遺伝子産物の非存在下での遺伝子産物の活性と比較する段階をさらに含む、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
第二の遺伝子が類似体および相同体であるTUB1、CIN8、SFI1、STU1、ならびにその組み合わせからなる群より選択される、請求項8記載の方法。
【請求項１１】
薬物を同定するためのスクリーニングアッセイ系であり、以下を含む系：
（a）MAD2遺伝子、その類似体または相同体における欠失、およびその変異型はMAD2の欠失と組み合わさると合成的に致死である野生型の第二の遺伝子を有する、対照酵母細胞；
（b）薬物およびMAD2欠失を有する酵母とを含む試験酵母細胞系；ならびに
（c）試験細胞系の生存率の減少によって、陽性の薬物候補が同定される対照系と比較した、試験系におけるMAD2の生存率を比較するための検出器。
【請求項１２】
組織試料における良性または悪性の細胞増殖の存在をスクリーニングする方法であり、以下の段階を含む方法：
a）癌を有することが疑われる個体由来の組織試料を提供する段階；
b）組織試料の細胞におけるMAD2の発現を評価する段階；および
c）対照試料における発現と比較した試験試料におけるMAD2の異常な発現の存在が癌の存在を示す、組織試料のMAD2発現を対照試料のMAD2発現と比較する段階。
【請求項１３】
薬物が、変異もしくは欠失した第一のMAD2遺伝子または遺伝子産物を含む標的細胞において少なくとも一つの第二の遺伝子もしくは遺伝子産物と選択的に相互作用することができ、それによって標的細胞を薬物に曝露すると細胞分裂が停止されるか、または細胞が選択的に殺される、有効量の薬物、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む、薬学的組成物。
【請求項１４】
薬物が、オリゴヌクレオチド、遺伝子産物、オリゴヌクレオチドもしくは遺伝子産物の相同体もしくは類似体、低分子、またはペプチド模擬物質（mimetic）を含む、請求項13記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
MAD2変異に関連した疾患を保有する（hosting）、または保有している可能性があるヒトまたは動物を治療する方法であって、請求項13記載の薬学的組成物を提供する段階、およびヒトまたは動物を有効量の薬学的組成物を用いて治療する段階を含む方法。
【請求項１６】
疾患が、以下からなる群より選択される、請求項13記載の方法：アプドーマ、分離腫、鰓腫、悪性カルチノイド症候群、カルチノイド心疾患、癌（例えば、ウォーカー癌、基底細胞癌、基底有棘細胞癌、ブラウン-ピアース（Brown-Pearce）癌、腺管癌、エールリッヒ腫瘍、クレブス2腫瘍、メルケル細胞腫、粘液性癌腫、非小細胞肺癌、燕麦細胞癌、乳頭状癌、硬性癌、細気管支、細気管支癌、気管支原生癌、扁平上皮細胞癌、および移行上皮癌）、組織球障害、白血病（例えば、B細胞白血病、混合型白血病、ヌル細胞白血病、T細胞白血病、慢性T細胞白血病、HTLV-II関連白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、肥満細胞性白血病、および骨髄性白血病）、悪性組織球増殖症、ホジキン病、免疫増殖性小（immunoproliferative small）、非ホジキンリンパ腫、形質細胞腫、細網組織増殖症、黒色腫、軟骨芽細胞腫、軟骨腫、軟骨肉腫、線維腫、線維肉腫、巨細胞腫、組織球腫、脂肪腫、脂肪肉腫、中皮腫、粘液腫、粘液肉腫、骨腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、滑膜腫、腺線維腫、腺リンパ腫、癌肉腫、脊索腫、頭蓋咽頭腫、未分化胚細胞腫、過誤腫、間葉腫、中腎腫、筋肉腫、エナメル上皮腫、セメント質腫、歯牙腫、奇形種、胸腺腫、栄養膜腫（trophoblastic tumor）、腺癌、腺腫、胆管腫、コレステリン腫、円柱腫、嚢胞腺癌、嚢胞腺腫、顆粒膜細胞腫、男性胚細胞腫、肝癌、汗腺腫、島細胞腫（islet cell tumor）、ライディヒ細胞腫（Leydig cell tumor）、乳頭腫、セルトリ細胞腫、卵胞膜細胞腫、平滑筋腫、平滑筋肉腫、筋原細胞腫、筋腫、筋肉腫、横紋筋腫、横紋筋肉腫、脳室上皮腫、神経節細胞腫、神経膠腫、髄芽細胞腫、髄膜腫、神経鞘腫（neurilemmoma）、神経芽腫、神経上皮腫、神経線維腫、神経腫、傍神経節腫、非クロム親和性傍神経節腫（paraganglioma nonchromaffin）、被角血管腫、好酸球増多随伴性血管類リンパ組織増殖症、硬化性血管腫（angioma sclerosing）、血管腫症、グロムス血管腫、血管内皮腫、血管腫、血管外皮細胞腫、血管肉腫、リンパ管腫、リンパ管筋腫（lymphangiomyoma）、リンパ管肉腫、松果体腫、癌肉腫、軟骨肉腫、葉状嚢肉腫、線維肉腫、血管肉腫、平滑筋肉腫、白血肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、筋肉腫、粘液肉腫、卵巣癌、横紋筋肉腫、肉腫、神経線維腫症、子宮頸部異形成、線維症、良性前立腺過形成、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、糸球体硬化症、ケロイド、乾せん、黒子、角化症、線維性軟ゆう、伝染性軟属腫、性病いぼ、皮脂腺過形成（sebaceous hyperplasia）、尖圭コンジローム、血管腫、静脈湖、軟骨皮膚炎（chondrodermatitis）、化膿性肉芽腫、化膿性汗腺炎、ケロイド、角化棘細胞腫、白斑症、多発性皮脂嚢腫、睫毛乱生症、表層上皮母斑（superficial epithelial nevus）、ポリープ、接合部母斑（junctional nevus）、化膿性肉芽腫、結節性痒疹、皮膚線維腫、脂腺腫、乳頭腫、ならびにそれらの組み合わせ。
【請求項１７】
疾患が酵母感染を含む、請求項15記載の方法。
【請求項１８】
疾患が乳癌を含む、請求項15記載の方法。
【請求項１９】
薬剤（agent）が、少なくとも一つの第一の遺伝子欠損を有する細胞において見出される、少なくとも一つの第二の遺伝子または遺伝子産物と選択的に相互作用することができ、遺伝子産物がヒトのアイソザイムであるTUB1、CIN8、SFI1、STU1、およびそれらの組み合わせから選択される（または致死性遺伝子がヒトのアイソザイムであるTUB1、CIN8、SFI1、STU1をコードする）、有効量の薬剤および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む薬学的組成物を投与する段階を含む、MAD2遺伝子またはその類似体もしくは相同体の異常な蓄積を有する癌細胞を治療する方法。
【請求項２０】
第二の遺伝子の上方制御、下方制御、除去または破壊が合成致死がもたらすように、第一の遺伝子MAD2が変異している、少なくとも一つの第二の遺伝子および少なくとも一つの第一の遺伝子MAD2、またはその類似体もしくは相同体を含む、組換え真核細胞。
【請求項２１】
少なくとも一つの第二の遺伝子またはその産物が、類似体および相同体であるTUB1、CIN8、SFI1、STU1、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項20記載の組換え真核細胞。
【請求項２２】
第一の遺伝子が除去または破壊されている、請求項20記載の組換え真核細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
1.発明の分野
本発明は、細胞の生命周期（cell life cycle）において重要である組成物および真核細胞遺伝子を同定する方法に関する。より具体的には、本発明は酵母遺伝子ならびに、細胞増殖および細胞死において必須であるヒト遺伝子のような哺乳類相対物（counterparts）とに関する。悪性疾患および関連する他の疾患のような疾患および臨床状態が起こる、細胞周期関連遺伝子機能障害を同定および治療するための方法および組成物が提供される。
【０００２】
2.発明の背景
酵母ゲノムの遺伝子操作は、真核細胞の複製、増殖および死にとって必要な必須の遺伝子を同定するための便利なモデルを提供する。サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces serevisiae）株S288Cの完全なDNA配列は、1996年4月に100カ所以上の研究所による国際協力によって決定された。一般情報および遺伝子約6000個の酵母ゲノムを含むデータベースは公開されており、例えば：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Yeast；http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces/のような公開ウェブサイト上で見出されることができる。その他のデータベースも同様に存在し、これらのデータベースおよび他のウェブサイトへのリンクは、本発明の目的に関して等しく適している。例として、参照として本明細書に組み入れられる、Yeast GenBank（サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces serevisiae）に由来する全てのゲンバンク配列の集まり）；Yeast Swiss-Prot（サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces serevisiae）に由来するスイスプロットタンパク質配列の集まり）；YPD（Proteome, Inc. が管理する酵母タンパク質データベース）、およびその定期的な更新版が含まれるが、これらに限定されない。酵母を操作する方法は十分に確立されており、当業者に公知であって、適当なキーワード、例えば中でも酵母およびプロトコールというキーワードを用いることによって、公開されているウェブサイト上で見出されることができる。
【０００３】
全ての酵母遺伝子の大部分の配列は公知であって、そのそれぞれの染色体上に位置づけられているが、これらの遺伝子の多く、特に他の種に相対物が存在しない遺伝子、または公知の遺伝子との十分な配列相同性を示さない遺伝子の生物学的機能を予測することはなお困難である。言い換えれば、遺伝子の配列を決定する段階は、遺伝子に意味のある機能を帰する段階より容易である。酵母の遺伝子6000個のうちごく半数の機能が公知であるに過ぎない。さらに、公知の機能を有する遺伝子でさえも、そのような遺伝子の機能または調節が、別の遺伝子の調節機構または産物と組み合わされるとどのように改変されるかは明確でない。このように、他の遺伝子と組み合わせた場合の、ある遺伝子の公知または未知の機能を同定する問題に関しては、当技術は依然として非常に予測不可能である。
【０００４】
これまでこの作業は一件一件成し遂げられ、それによって研究者は公知の遺伝子操作技術およびスクリーニング方法を用いて、そのような方法または技術をそれぞれの関心対象の特異的遺伝子またはそれぞれの特定の遺伝子の組み合わせに応用した。操作の簡易さおよび、比較的短期間で多数の候補をスクリーニングすることが可能であることから、酵母はしばしばモデルとして選択される。酵母は調べられた生物の中で最も高い組換え率および遺伝子変換率を有し、哺乳類より数桁高い。ゲノム以降の時期では、酵母における連続的な遺伝子ノックアウト計画（四分子（tetrad）分析によって示すことができる、例えば、http://bioinformatics.weizmann.ac.il/pub/software/mac/mactetrad69.readme）によって、調べた条件では遺伝子産物6個中約1個がその細胞の生命にとって必須である（それらの遺伝子産物の欠失が致死的である）ことが確認されている。調べた遺伝子産物の道理にかなった一部（a reasonable fraction）が酵素であるが、他の遺伝子は未知の機能を有するか、またはその機能が演繹的仮定に適合しないかのいずれかである。
【０００５】
酵母の遺伝子およびそのそれぞれの機能をスクリーニングおよび同定する手段に洞察を提供する米国特許がいくつか存在する。例えば、参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5,916,752号および第5,698,686号は、テロメラーゼ組成物およびスクリーニング方法を開示する；米国特許第5,821,076号および第5,756,305号は、必須の生存遺伝子を開示する；ならびに米国特許第5,585,245号および第5,503,977号は、ユビキチンスプリットタンパク質センサーに関連する。一般的に用いられるアプローチは公知の遺伝子ノックアウトおよび相補性によるスクリーニングである。「相補性」という用語は本明細書において、本遺伝子要素が、細胞に導入された際に細胞を変異の影響から救出するように（例えば、米国特許第5,527,896号を参照）変異遺伝子要素と相同である（少なくとも40％は相同である）ことを意味すると意図される遺伝学用語である。。例えば、MEC-1 DNAは相補性過程を通じてmec-1、cdc9-8細胞におけるmec-1欠損を救出し、またはRAD9は相補性過程を通じてrad9、cdc9-8細胞におけるrad9欠損を救出し、かつそのような能力を持つMEC-1（またはRAD9）DNAは「相補的cDNA」と呼ばれる。同様に、ヒトのCDC34は酵母のCDC34と相同であり、単一の（または二重変異体）細胞、例えば酵母株cdc34の単一変異細胞における変異を相補することができる。さらなる詳細および例に関しては、参照として本明細書に組み入れられる、ハートウェル（Hartwell）らの米国特許第5,866,338号を参照されたい。酵母およびヒト遺伝子を交互参照する手段は現在達成可能であり、例えば参照として本明細書に組み入れられる、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/XREFdb/上で見出される「XREF2」プログラムを用いて行うことができる。これらの方法によって、例えば、DNAポリメラーゼαのような、酵母サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces serevisiae）由来のDNA複製付属因子（accessory factors）およびそのヒト相対物遺伝子が同定された。
【０００６】
抗癌剤の標的を同定する状況において、第一の欠損は、腫瘍においてしばしば調節が解除される（例えば、サイクリンの過剰発現）、酵母からヒトまで保存された遺伝子における変異であろう。第一の欠損を有する細胞を特異的に殺す変異を有する遺伝子産物は、腫瘍における不活性化により大きな治療上の利点を生じる可能性がある、推定の「第二の薬剤標的」（すなわち、第一の欠損の次の）を構成する。原則的に、単一の必須な生物学的経路に対して付加的な負の影響を及ぼす2つの変異が存在する場合、または変異が2つの異なるが機能的に重複する経路を不活性化する場合に、合成致死が起こりうる。
【０００７】
MAD2は、Bet1p、Cdc20p、およびMad1pとタンパク質-タンパク質レベルで相互作用することが公知である。MAD2は、インビボで2つのプールに存在する：1つは低分子量分画、そして2つめはより大きなMad1p含有分画に存在する。Mad1pとの会合は非常に堅固であり、細胞周期段階の影響を受けない（Chen, R. H.、Brady, D. M.、Smith, D.、Murray, A. W.、およびHardwick, K. G.、「出芽酵母の紡錘体チェックポイントはMad1タンパク質とMad2タンパク質の堅固な複合体に依存する（The Spindle Checkpoint of Budding Yeast Depends on a Tight Complex between the Mad1 and Mad2 Proteins）」、Mol Biol Cell 10、2607〜2618（1999））。さらに、Mad2pおよびMad3pは、細胞周期を通じてCdc20pに結合したままであり、Cdc20pへのMad2pの結合はMad1pを必要とする（Hwang, L. H.、Lau, L. F.、Smith, D. L.、Mistrot, C. A.、Hardwick, K. G.、Hwang, E. S.、Amon, A.およびMurray, A. W.、「出芽酵母Cdc20：紡錘体チェックポイントの標的（Budding Yeast Cdc20：A Target of the Spindle Checkpoint.）」、Science 279、1041〜4（1998））。しかし、紡錘体チェックポイントに対して抵抗性のcdc20変異体は、Mad1p、Mad2p、およびMad3pとの結合を形成せず（Hwang, L. H.、Lau, L. F.、Smith, D. L.、Mistrot, C. A.、Hardwick, K. G.、Hwang, E. S.、Amon, A.およびMurray, A. W.、「出芽酵母Cdc20：紡錘体チェックポイントの標的（Budding Yeast Cdc20：A Target of the Spindle Checkpoint.）」、Science 279、1041〜4（1998））、Mad1pの異なるリン酸化イソ型に結合する（Chen, R. H.、Brady, D. M.、Smith, D.、Murray, A. W.、およびHardwick, K. G.、「出芽酵母の紡錘体チェックポイントはMad1タンパク質とMad2タンパク質の堅固な複合体に依存する（The Spindle Checkpoint of Budding Yeast Depends on a Tight Complex between the Mad1 and Mad2 Proteins）」、Mol Biol Cell 10、2607〜2618（1999））。MAD2は、CIN8、CTF13、およびKAR3との遺伝子相互作用に関係している。MAD2の正確な機能に関して利用できる情報はほとんどないが、この遺伝子は、低濃度のノコダゾールまたはベノミルによって処理した細胞における有糸分裂時の細胞周期の遅延および生存力にとって必要であると考えられている（Wang, Y.およびBurke, D. J.、「ノコダゾールに反応して細胞分裂を遅らせるために必要なチェックポイント遺伝子は、酵母サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces serevisiae）における損傷を受けた動原体機能に反応する（Checkpoint genes required to delay cell division in response to nocodazole respond to impaired kinetochore function in the yeast Saccharomyces cerevisiae）」Mol Cell Biol. 15、6838〜44（1995）；Li, R.およびMurray, A. W.、「出芽酵母における有糸分裂のフィードバック制御（Feedback control of mitosis in budding yeast.）」、Cell 66、519〜31（1991））。Mad1p、Mad2p、Mad3p、およびCdc20pは、有糸分裂からの退去にとって必要な紡錘体チェックポイントの責任を負う複合体を形成し（Hwang, L. H.、Lau, L. F.、Smith, D. L.、Mistrot, C. A.、Hardwick, K. G.、Hwang, E. S.、Amon, A.およびMurray, A.W.、「出芽酵母Cdc20：紡錘体チェックポイントの標的（Budding Yeast Cdc20：A Target of the Spindle Checkpoint.）」、Science 279、1041〜4（1998））、かつctf13変異体における細胞周期の遅延にとっても必要である（Wang, Y.およびBurke, D. J.、「ノコダゾールに反応して細胞分裂を遅らせるために必要なチェックポイント遺伝子は、酵母サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces serevisiae）における損傷を受けた動原体機能に反応する（Checkpoint genes required to delay cell division in response to nocodazole respond to impaired kinetochore function in the yeast Saccharomyces cerevisiae）」Mol Cell Biol. 15、6838〜44（1995））。Mad1p-Mad2p複合体は、後期促進複合体（APC）の調節に関係する可能性があり、ならびにMad1pとの結合は、その紡錘体チェックポイント機能およびMad1pの過剰リン酸化（hyperphosphorylation）にとって必要である（Chen, R.H.、Brady, D. M.、Smith, D.、Murray, A. W.、およびHardwick, K. G.、「出芽酵母の紡錘体チェックポイントはMad1タンパク質とMad2タンパク質の堅固な複合体に依存する（The Spindle Checkpoint of Budding Yeast Depends on a Tight Complex between the Mad1 and Mad2 Proteins）」、Mol Biol Cell 10、2607〜2618（1999））。GALプロモーターからのBud1-5pの過剰産生は、有糸分裂の遅延を引き起こし、表現型はBUB2、BUB3、MAD1、MAD2、およびMAD3を含む他のチェックポイント遺伝子に依存し（Farr, K. A.およびHoyt, M. A.、「Bub1pキナーゼは、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces serevisiae）の紡錘体集合チェックポイントを活性化する（Bub1p kinase activates the Saccharomyces cerevisiae spindle assembly checkpoint.）」、Mol. Cell Biol. 18、2738〜2747（1998））、これらのチェックポイント遺伝子はPds1pの分解を防止する段階、およびノコダゾールによる分裂紡錘体の破壊後の染色体からのMcd1pの解離を妨害する段階において必須であるが、Clb2pの分解またはClb2p-Cdc28pの不活性化にとっては必須ではない（Alexandru, G.、Zachariae, W.、Schleiffer, A.、およびNasmyth, K、「姉妹染色分体の分離および染色体の再複製は、紡錘体の損傷に応じて異なる機構によって調節される（Sister chromatid separation and  chromosome re-duplication are regulated by different mechanisms in response to spindle damage.）」、Embo Journal 18、2707〜2721（1999））。ノコダゾールによる分裂紡錘体の破壊に対する反応は、Pds1pの分解および姉妹染色分体の分離を妨害するMad2p依存性経路、ならびにClb2pの分解およびDNAの再複製を防止するBub2p依存性経路を経て起こる可能性がある（Alexandru, G.、Zachariae, W.、Schleiffer, A.、およびNasmyth, K、「姉妹染色分体の分離および染色体の再複製は、紡錘体の損傷に応じて異なる機構によって調節される（Sister chromatid separation and  chromosome re-duplication are  regulated by different mechanisms in response to spindle damage.）」、Embo Journal 18、2707〜2721（1999））。遺伝子相互作用の分析から、Mad1p、Mad2p、Mad3pおよびBub1pが同じ調節経路において機能することが示唆される（Alexandru, G.、Zachariae, W.、Schleiffer, A.、およびNasmyth, K、「姉妹染色分体の分離および染色体の再複製は、紡錘体の損傷に応じて異なる機構によって調節される（Sister chromatid separation and  chromosome re-duplication are regulated by different mechanisms in response to spindle damage.）」、Embo Journal 18、2707〜2721（1999））。MAD2はまた、限定的な温度でsgt1-3変異体のG2遅延にとって必要であると言及されている（Kitagawa, K.、Skowyra, D.、Elledge, S. J.、Harper, J. W.、およびHieter, P.）、「SGT1は、酵母の動原体集合経路の必須成分およびSCFユビキチンリガーゼ複合体の新規サブユニットをコードする（SGT1 encodes an essential component of the kinetochore assembly pathway and a novel subunit of the SCF ubiquitin ligase complex）」、Mol Cell 4、21〜33（1999））。
【０００８】
酵母のMAD2遺伝子またはその遺伝子産物は、ヒト有糸分裂フィードバック制御タンパク質、T細胞受容体α、ヒト原形質膜カルシウムポンプ、ラットGTPアーゼRab8b、ヒトMad2様タンパク質、紡錘体集合チェックポイント成分、マウス有糸分裂チェックポイント成分Mad2、紡錘体集合チェックポイントタンパク質Mad2p、細胞周期チェックポイントタンパク質、DNAジャイレースAサブユニット、SCS2、ハンチンチン、およびRNAポリメラーゼII（DNA指向性（directed））220 kDタンパク質のような哺乳類相同体および類似体を有する。例えば、MAD2は、アフリカツメガエル（Xenopus）の相同体に対して41％の同一性を有し、ヒト相同体hsMAD2に対して40％の相同性を有する。アフリカツメガエル（Xenopus）およびヒト相同体は、分裂中期前およびノコダゾール処理細胞において非接着動原体と結合し、無処理細胞では分裂中期に動原体から消失する（Chen, R. H.、Waters, J. C.、Salmon, E. D.、およびMurray, A. W.）、「紡錘体集合チェックポイント成分XMAD2と非接着動原体との結合（Association of spindle assembly checkpoint component XMAD2 with unattached kinetochores）」、Science 274、242〜6（1996）；Li, Y.、およびBenezra, R.、「ヒト有糸分裂チェックポイント遺伝子：hsMAD2の同定（Identification of human mitotic checkpoint gene：hsMAD2）」、Science 274、246〜8（1996））。
【０００９】
変異型は公知であり、例えばMAD2-1変異は、Trp94のコドンを停止コドンに変え、Maxと特異的に相互作用してMyc-Max認識部位に結合するタンパク質である、Zervos Mxi1に変わる。（Cell 79、389（1994））。ヌル（null）対立遺伝子は、MAD2-1と同じ表現型を有し、低濃度のヒドロキシ尿素によって処理されたMAD2変異体におけるS期の伸長により、ベノミルの毒性効果が部分的に阻害される（Li, R.およびMurray, A.W.、「出芽酵母における有糸分裂のフィードバック制御（Feedback control of mitosis in budding yeast.）」、Cell 66、519〜31（1991））。さらに、ノコダゾールまたはベノミルによる分裂紡錘体の破壊は、通常は高レベルのClb2pおよびClb3pでの停止、ならびに高レベルのCdc28p-Clbキナーゼ活性による停止を引き起こすが、MAD2変異体ではClbタンパク質は安定化されない（Minshull, J.、 Straight, A.、 Rudner, A. D.、 Dernburg, A. F.、 Belmont, A.、およびMurray A. W.、「タンパク質ホスファターゼ2Aは、出芽酵母においてMPF活性および姉妹染色分体の結合を調節する（Protein phosphatase 2A regulates MPF activity and sister chromatid cohesion in budding yeast.）」、Curr. Biol. 6、1609〜20（1996）；Li, R.およびMurray, A. W.、「出芽酵母における有糸分裂のフィードバック制御（Feedback control of mitosis in budding yeast.）」、Cell 66、519〜31（1991））。ヌル変異体は、ノコダゾールによる分裂紡錘体の破壊後の姉妹染色分体の分離を防止することはできないが、細胞質分裂およびDNAの再複製を防止できることが認められている（Alexandru, G.、Zachariae, W.、Schleiffer, A.、およびNasmyth, K、「姉妹染色分体の分離および染色体の再複製は、紡錘体の損傷に応じて異なる機構によって調節される（Sister chromatid separation and  chromosome re-duplication are regulated by different mechanisms in response to spindle damage.）」、Embo Journal 18、2707〜2721（1999））。ヌル変異体細胞を分裂紡錘体破壊薬であるノコダゾールで処理すると、それらはPds1pの正常な分解および染色体からのMcd1pの正常な解離を示す（Alexandru, G.、Zachariae, W.、Schleiffer, A.、およびNasmyth, K、「姉妹染色分体の分離および染色体の再複製は、紡錘体の損傷に応じて異なる機構によって調節される（Sister chromatid separation and  chromosome re-duplication are regulated by different mechanisms in response to spindle damage.）」、Embo Journal 18、2707〜2721（1999））。一般的に、ヌル変異体は高レベルのClb2p-Cdc28p活性を維持し、ノコダゾールの存在下ではそのDNAを再複製することができない（Alexandru, G.、Zachariae, W.、Schleiffer, A.、およびNasmyth, K、「姉妹染色分体の分離および染色体の再複製は、紡錘体の損傷に応じて異なる機構によって調節される（Sister chromatid separation and  chromosome re-duplication are regulated by different mechanisms in response to spindle damage.）」、Embo Journal 18、2707〜2721（1999））。紡錘体形成が不完全であれば、変異体細胞は有糸分裂の前で細胞周期を停止することができず、細胞死を引き起こし（Chen, R. H.、Waters, J. C.、Salmon, E. D.、およびMurray, A. W.、「紡錘体集合チェックポイント成分XMAD2と非接着動原体との結合（Association of spindle assembly checkpoint component XMAD2 with unattached kinetochores）」、Science 274、242〜6（1996）；Li, R.およびMurray, A. W.、「出芽酵母における有糸分裂のフィードバック制御（Feedback control of mitosis in budding yeast.）」、Cell 66、519〜31（1991））、変異体は微小管破壊薬剤の存在下でMad1pを過剰にリン酸化することができない（Hardwick, K. G.、およびMurray, A. W.、「出芽酵母における紡錘体集合チェックポイントのリンタンパク質成分（A phosphoprotein component of the spindle assembly checkpoint in budding yeast.）」、J Cell Biol 131、709〜20（1995））。MAD2の欠失によって、ノコダゾールによって誘導されるような分裂チェックポイント停止の損傷が引き起こされ（Fraschini, R.、 Formenti, E.、 Lucchini, G.、およびPiatti, S.、「出芽酵母のBub2は、紡錘極体に局在し、Mad2とは異なる経路によって分裂チェックポイントを活性化する（Budding yeast Bub2 is localized at spindle pole bodies and activates the mitotic checkpoint via a different pathway from Mad2）」、J Cell Biol 145、979〜991（1999））、ならびにベノミルによって処理した変異体では、分裂に続いて致死が起こる（Li, R.およびMurray, A.W.、「出芽酵母における有糸分裂のフィードバック制御（Feedback control of mitosis in budding yeast.）」、Cell 66、519〜31（1991））。ヒト相同体hsMAD2の過剰産生はcpf1ヌル変異体のチアベダゾール感受性を阻害し（Li, Y.、およびBenezra, R.、「ヒト有糸分裂チェックポイント遺伝子：hsMAD2の同定（Identification of human mitotic checkpoint gene：hsMAD2）」、Science 274、246〜8（1996））、アフリカツメガエル（Xenopus）相同体Mad2の過剰産生はMAD2変異体のベノミル感受性を阻害できない（Chen, R. H.、Waters, J. C.、Salmon, E. D.、およびMurray, A. W.）、「紡錘体集合チェックポイント成分XMAD2と非接着動原体との結合（Association of spindle assembly checkpoint component XMAD2 with unattached kinetochores）」、Science 274、242〜6（1996））。
【００１０】
MAD2の変異体は、他の変異した第二の遺伝子（二重変異体）との遺伝子相互作用に関係する。例えば、kar3、cln8、またはcbf1を有する二重変異体では、単一変異体と比較して生存率が著しく減少している（Hardwick, K. G.、Li, R.、Mistrot, C.、Chen, R. H.、Dann, P.、Rudner, A.、およびMurray, A. W.、「多くの異なる紡錘体成分における障害は、出芽酵母サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces serevisiae）における紡錘体チェックポイントを活性化する（Lesions in many different spindle components activate the spindle checkpoint in the budding yeast Saccharomyces serevisiae）」、Genetics 152、509〜518（1999））。cdc23、cdc15、またはcdc20を有する二重変異体は、任意の単一変異体より欠損していない（Hardwick, K. G.、Li, R.、Mistrot, C.、Chen, R. H.、Dann, P.、Rudner, A.、およびMurray, A. W.、「多くの異なる紡錘体成分における障害は、出芽酵母サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces serevisiae）における紡錘体チェックポイントを活性化する（Lesions in many different spindle components activate the spindle checkpoint in the budding yeast Saccharomyces serevisiae）」、Genetics 152、509〜518（1999））。しかし、MAD2 bub2二重変異体は両方の単一変異体より重度のチェックポイント欠損を有する（Fraschini, R.、 Formenti, E.、 Lucchini, G.、およびPiatti, S.、「出芽酵母のBub2は、紡錘極体に局在し、Mad2とは異なる経路によって分裂チェックポイントを活性化する（Budding yeast Bub2 is localized at spindle pole bodies and activates the mitotic checkpoint via a different pathway from Mad2）」、J Cell Biol 145、979〜991（1999））。MAD2-1変異のようなその他の二重変異体は、ctf7-203変異体の有糸分裂遅延を阻害する（Skibbens, R. V.、Corson, L. B.、Koshland, D.、およびHieter, P.、「Ctf7pは姉妹染色分体の結合にとって必須であり、有糸分裂の染色体構造をDNA複製装置と連結する（Ctf7p is essential for sister chromatid cohesion and links mitotic chromosome structure to the DNA replication machinary）」、Genes And Development 13、307〜319（1999））。ipl1-321 MAD2二重変異体は、MAD単一変異体と同様に、いずれにおいても染色体分離装置が存在しないために細胞周期において停止することができない（Biggins, S.、Severin, F. F.、Bhalla, N.、Sassoon, I.、Hyman, A. A.、およびMuray, A. W.、「保存されたタンパク質キナーゼIpl1は、出芽酵母において微小管の動原体への結合を調節する（The conserved protein kinase Ipl1 regulates microtubule binding to kinetochores in budding yeast.）」、Genes And Development 13、532〜544（1999））。Mad2、Bub2二重ヌル変異体は、ノコダゾールによる分裂紡錘体の破壊後にClb2pタンパク質およびClb3pタンパク質の分解、DNAの再複製、ならびに細胞質分裂を行うことができ（Alexandru, G.、Zachariae, W.、Schleiffer, A.、およびNasmyth, K、「姉妹染色分体の分離および染色体の再複製は、紡錘体の損傷に応じて異なる機構によって調節される（Sister chromatid separation and chromosome re-duplication are regulated by different mechanisms in response to spindle damage.）」、Embo Journal 18、2707〜2721（1999））、かつノコダゾールによって処理されたMAD2 bub2二重ヌル変異体におけるDNAの再複製は、Cdc14pに依存すると思われる（Alexandru, G.、Zachariae, W.、Schleiffer, A.、およびNasmyth, K、「姉妹染色分体の分離および染色体の再複製は、紡錘体の損傷に応じて異なる機構によって調節される（Sister chromatid separation and  chromosome re-duplication are regulated by different mechanisms in response to spindle damage.）」、Embo Journal 18、2707〜2721（1999））。glc7-10 MAD2二重変異体のようないくつかの変異体は、表現型的に、野生型のDNA含有量ならびに野生型の紡錘体伸長およびDNA分離を示す（Sassoon, I.、Severin, F. F.、Andrews, P. D.、Taba, M. R.、Kaplan, K. B.、 Ashford, A. J.、Stark, M. J. R.、Sorger, P. K.、およびHyman, A. A.、「１型ホスファターゼGlc7pによるサッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces serevisiae）動原体の調節（Regulation of Saccharomyces serevisiae kinetochores by the type 1 phosphatase Glc7p）」、Genes And Development 13、545〜555（1999））。MAD2 chl1二重変異体のようなその他の変異体は単に遅い増殖表現型を有するに過ぎない（Li, R.およびMurray, A. W.、「出芽酵母における有糸分裂のフィードバック制御（Feedback control of mitosis in budding yeast.）」、Cell 66、519〜31（1991））。ノコダゾール処理MAD2ヌル変異体細胞におけるBub2p依存的なDNA再複製の妨害が、Tem1pの過剰産生によって回避されるため、Bud2pおよびMad2pは同じ上位群にはない。
【００１１】
最後に、細胞死を引き起こす二重変異体、例えばMps1pを過剰産生する変異体、14℃で生存力を喪失するtub2-403 MAD2変異体（チューブリンが紡錘体チェックポイントを活性化することを示す）、および37℃で生存力を喪失するmps2-1 MAD2二重変異体が存在する（Hardwick, K. G.、Li, R.、Mistrot, C.、Chen, R. H.、Dann, P.、Rudner, A.、およびMurray, A. W.、「多くの異なる紡錘体成分における障害は、出芽酵母サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces serevisiae）における紡錘体チェックポイントを活性化する（Lesions in many different spindle components activate the spindle checkpoint in the budding yeast Saccharomyces serevisiae）」、Genetics 152、509〜518（1999））。
【００１２】
細胞の生命周期におけるmad1およびMAD2の役割を考慮して、癌の予防および治療の新しい経路を同定するためには、これらの遺伝子に関するさらなる情報が望ましい。
【００１３】
3.発明の概要
したがって、本発明の目的は、腫瘍細胞または様々な疾患に対応する他の調節が解除された細胞のモデルとして酵母変異体を提供することである。
【００１４】
大量のスクリーニングおよび遺伝子分析によって、腫瘍細胞を特異的に殺す化合物または薬物の標的が同定される。この文脈において、見出された致死変異体の活性を刺激する化合物の例を提供する。従って、真核生物の必須遺伝子の同定から開発される治療薬が予想される。そのような同定された遺伝子（以下「第二の遺伝子」と呼ぶ）またはその産物は、既存の薬物の機構と異なる、または類似である機構に基づいた治療術の新たな標的として役立つ。そのような化合物は、例えば、本来の変異体株において見出されるものと類似の表現型または形態を示すことによって、本明細書に開示された方法によって同定される遺伝子産物の機能を阻害する。
【００１５】
本発明の一つの局面に従って、変異体の集まりが体系的にスクリーニングされて、薬物の標的である遺伝子および／または遺伝子産物が同定される。例えば、薬物は同定された遺伝子または遺伝子産物の標的に可逆的に、または好ましくは非可逆的に結合し、かつそれによって機能を障害することによって、拮抗薬として作用しうる。遺伝子産物の標的の機能（または合成もしくは完全なプロセシング（processing））が失われると、腫瘍細胞の増殖が阻害され、好ましくは腫瘍細胞が死に至ると考えられる。この局面には、本明細書に開示される方法によって同定された第二の遺伝子の野生型配列に対応する遺伝子産物を、試験薬に曝露する段階；および遺伝子産物の機能を（好ましくは、選択的に）障害する薬剤を選択する段階を含む、抗癌剤を同定する方法が含まれる。
【００１６】
本発明の特定の態様において、第一の遺伝子欠損は、好ましくは腫瘍細胞または細胞周期の調節が解除された細胞において見出される、またはそれらに関連する欠損である。または、本発明の方法によって提供される第一の遺伝子欠損は、哺乳類もしくはヒト腫瘍細胞、または染色体異常細胞において見出される、またはそれらに関連する欠損と類似または相同である。「相同な」という用語は、特定の配列または領域がファミリーのメンバーの間で強固に保存されている遺伝子「ファミリー」における直接関係を意味する。例えば、MAD2はアフリカツメガエル（Xenopus）相同体と41％の同一性を有し、ヒト相同体hsMAD2と40％の同一性を有する。一方、「類似の」遺伝子は、同様のまたは「類似の」機能を持ちうるが、それらは直接関係しない（すなわち、類似の遺伝子の間で配列は保存されない）。この文脈内において、そのような「類似の」遺伝子は「機能的に相同」であると呼ばれ、それによって酵母細胞において哺乳類細胞における機能と類似の機能を有する遺伝子産物を意味する。例えば、アフリカツメガエル（Xenopus）およびヒトの相同体はノコダゾール処理細胞においては、分裂中期前に非接着動原体と結合し、無処理細胞においては分裂中期に動原体から消失する（Chen, R. H.、Waters, J. C.、Salmon, E. D.、およびMurray, A. W.）、「紡錘体集合チェックポイント成分XMAD2と非接着動原体との結合（Association of spindle assembly checkpoint component XMAD2 with unattached kinetochores）」、Science 274、242〜6（1996）；Li, Y.、およびBenezra, R.、「ヒト有糸分裂チェックポイント遺伝子：hsMAD2の同定（Identification of human mitotic checkpoint gene：hsMAD2）」、Science 274、246〜8（1996））。本発明の特定の態様において、MAD2の類似体および相同体には、ヒト有糸分裂フィードバック制御タンパク質、T細胞受容体α、ヒト原形質膜カルシウムポンプ、ラットGTPアーゼRab8b、ヒトMad2様タンパク質、紡錘体集合チェックポイント成分、マウス有糸分裂チェックポイント成分Mad2、紡錘体集合チェックポイントタンパク質Mad2p、細胞周期チェックポイントタンパク質、DNAジャイレースAサブユニット、SCS2、ハンチンチン、およびRNAポリメラーゼII（DNA指向性）220 kDタンパク質が含まれるがこれらに限定しない。
【００１７】
本発明の方法において、第一の遺伝子欠損の結果、機能、例えば細胞機能の変化、喪失、または阻害が起こりうる。このように、本発明の方法は、MAD1および／またはMAD2における欠損に関する。
【００１８】
一般に、影響を受ける機能は広範囲にわたって様々でありうる。影響を受ける機能には、腫瘍増殖の阻害、DNA損傷チェックポイント、DNAミスマッチ修復、ヌクレオチド切除修復、o6-メチルグアニン逆転（reversal）、二本鎖切断修復、DNAヘリカーゼ機能、シグナル伝達、細胞周期制御またはアポトーシスが含まれるが、これらに限定されない。本発明の特定の態様において、細胞の生命周期には、欠損のある有糸分裂チェックポイントを有する細胞が含まれるが、これらに限定されない。そのような欠損は、ショウジョウバエ（Drosophila）のような他の生物における第一の遺伝子欠損によって、有効にモデルとされうる。
【００１９】
本発明の方法によって、特定の第二の部位変異をもたらすことができ、それが第一の遺伝子欠損を有する細胞にとって致死的となりうることが判明している。そのような第二の部位変異は、例えばTUB1、CIN8、STU1、SFI1、TUB2、およびMPS2からなる群より選択される遺伝子内で達成されうる。
【００２０】
MAD1またはMAD2および、第二の遺伝子および／またはORF（オープンリーディングフレーム）を含む二重変異体もまた、本発明の範囲に含まれる。
【００２１】
本発明はまた、変異MAD1遺伝子、変異MAD2遺伝子またはその類似体もしくは相同体を有する細胞を薬物に接触させる段階；および変異して変異MAD1遺伝子、変異MAD2遺伝子またはその類似体もしくは相同体と組み合わされて存在すると、合成的に致死となる野生型の第二の遺伝子の活性を、薬物が調節するか否かを決定する段階によって、変異MAD1遺伝子、変異MAD2遺伝子またはその類似体もしくは相同体を有する細胞の増殖または複製を阻害する薬物を同定する方法を提供する。上記の遺伝子に限定せずに、KAR3、CIN8、KIP1、CIK1、CTF19、CBF1、酵母、ヒト細胞質リンカータンパク質、ヒトレスチン、マウスシナプトネマ（synaptonemal）複合体タンパク質、マウス精巣タンパク質、ヒトデスモプラキン、マウスRho関連、ラットSCP1遺伝子産物、ヒトデスモプラキンI、ラットROK-α、ウシRho関連キナーゼ、ヒトAH抗原、ヒト非筋ミオシン重鎖、ヒトNuMAタンパク質、ヒトSP-H抗原、ヒトKIAA0378、ヒトのミオシンに対する弱い類似性、ヒトKIAA0336、ヒトのマウスCC1類似物、ラット心ミオシン重鎖5、ヒトエンドソームタンパク質およびその組み合わせからなる群より選択される、少なくとも一つの第二の遺伝子またはその産物を含む他の好ましい第二の遺伝子は、等しく適する。
【００２２】
本発明の目的には、薬物または薬物候補の同定がさらに含まれる。したがって、第二の薬物標的が解明された後、第二の薬物標的を用いて、第二の薬物標的と相互作用する可能性があり、例えばその生理活性を障害することが可能である薬物または薬物候補をスクリーニングすることができる。したがって、本発明は特定の遺伝子産物と相互作用する、結合する、または阻害する薬物または薬物候補を提供しうる。そのような遺伝子産物は、上記の例を含みうるが、それらに限定されない。薬物または薬物候補は、ヒト腫瘍または良性の新生物腫瘍の増殖を阻害または停止する能力を示すことが望ましい。好ましくはこのアッセイ法は、致死性を観察する対照系および、薬物を加えてその影響を対照系と試験系との差に基づいて評価する試験系とからなる。もし薬物が致死性を促進するか、またはこれを取り消せば、この薬物は第一の遺伝子および第二の遺伝子によって制御される生化学的経路において、特異的でありうる候補薬物であると見なされる。特異性は多くの特異性決定試験によってさらに試験され、第一の遺伝子および第二の遺伝子による遺伝子産物の酵素活性に及ぼす影響に関するインビトロ試験等において、例えば、遺伝子またはその産物を標的とする結合能は、本来認められた影響を取り消す二重変異体を導入することにより試験される。
【００２３】
このように本発明の目的は、真核細胞の望まない増殖または分化を制御する手段を提供することである。「望ましくない増殖」という用語は、それが細胞の形質転換によるものであれ、望ましくない細胞の増殖、例えば新生物または過形成の増殖、例えば創傷治癒を目的とするケロイド、再狭窄の治療、真核生物の病原体による感染、およびその他の望ましくない平滑筋増殖、美容応用、糖尿病による網膜症等に適用される。同様に、「望ましくない分化」という用語は、分化した細胞がより初期の状態に戻り、不自然なまたは「望ましくない」方法で増殖能を回復または保持するような、細胞の分化における望ましくない変化に適用される。
【００２４】
本発明は、本薬物またはその薬学的に許容される誘導体の治療上の有効量を投与することによって、過形成病変、例えば良性前立腺過形成および乳頭腫と共に、前立腺癌、黒色種、成人癌および小児癌、例えば、グリア起源の脳腫瘍、星状細胞腫、カポジ肉腫、肺の腺癌、および白血病のような悪性病態を治療する方法を提供する。
【００２５】
最も好ましくは、薬物または薬物候補の投与が、腫瘍細胞の死、新生物組織の減少および癌の治療という結果になる。癌に制限されることなく、他の臨床疾患は、本発明の化合物によって治療可能であると予想される。これらの疾患には、例えば平滑筋細胞が血管形成術後の血管において過度に増殖し、血流の制限および死に至る可能性がある、再狭窄のような心血管疾患が含まれる。
【００２６】
上記の疾患に限定されることなく、本発明はまたカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・ステラトイデア（Candida stellatoidea）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、カンジダ・パラプシローシス（Candida parapsilosis）、カンジダ・クルセイ（Candida krusei）、カンジダ・シュードトロピカリス（Candida pseudotropicalis）、カンジダ・キラーモンディ（Candida quillermondii）、カンジダ・ルゴサ（Candida rugosa）、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・フラブス（Aspergillus flavus）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、リゾプス・アリズス（Rhizopus arrhizus）、リゾプス・オリザ（Rhizopus oryzae）、アブシジア・コリムビフェラ（Absidia corymbifera）、アブシジア・ラモサ（Absidia ramosa）、およびムコール・プシルス（Mucor pusillus）、またはその組み合わせからなる群より選択される様々な真菌または酵母の病原体を治療する手段を提供する。
【００２７】
本発明はまた、MAD1タンパク質もしくはMAD2タンパク質の発現または調節遺伝子もしくはその遺伝子産物の発現を検出することによって、異常の表現型および攻撃性を評価する診断および予後のアッセイ法を具体化する。
【００２８】
本発明の目的は、薬物が少なくとも一つの第一の遺伝子欠損を含む細胞集団において、少なくとも一つの遺伝子産物の産生と選択的に相互作用し、細胞集団を薬物に曝露すると、細胞集団における細胞分裂を選択的に停止させる、薬学的に許容される担体または希釈剤中に薬物を含む、薬学的組成物をさらに含む。そのような遺伝子産物は、酵母遺伝子に類似したまたは相同なヒト遺伝子によってコードまたは調節される。
【００２９】
本発明の目的は、細胞集団を薬物に曝露すると、細胞集団において選択的に細胞分裂を停止させる、少なくとも一つの第一の遺伝子欠損を含む細胞集団における遺伝子産物による遺伝子治療の手段をさらに含む。そのような遺伝子産物は、酵母遺伝子に類似したまたは相同なヒト遺伝子によってコードまたは調節される。
【００３０】
合成致死スクリーニング方法は、関心対象の第一の遺伝子における変異、および変異型において第一の遺伝子変異と組み合わせて存在すると、細胞増殖もしくは死の調節を決定する、第二の標的遺伝子を有する酵母変異体の致死性に基づいて開示され、本発明のスクリーニングアッセイ法は、関心対象の第一の遺伝子の機能を相補する、または阻害することができる単一変異体および二重変異体を利用する。ヒトの細胞周期制御に関係する新規遺伝子を同定する、本発明を実現する実験例を提供する。これらの遺伝子には、酵母TUB1、CIN8、STU1、SFI1、TUB2、MPS2、およびその他が含まれるがこれらに限定されず、これらの遺伝子の類似体および相同体も含まれる。これらの遺伝子は、微小管および紡錘体形成の局面を含むがこれらに限定されない局面に関係するタンパク質をコードする。本発明のスクリーニングアッセイ法は、関係する第一の遺伝子（例えば、mad1またはmad2）の機能を相補するまたは阻害することができる単一変異体および二重変異体を利用する。細胞増殖に関係する新規遺伝子を同定する、本発明を実現する実験例を提供する。
【００３１】
本発明の目的には、MAD1、MAD2、またはその相同体もしくは類似体のような第一の遺伝子に少なくとも一つの欠損を含む細胞に、合成致死を誘導するために遺伝子治療を用いる手段がさらに含まれる。本発明の文脈において、合成致死を誘導する方法には、ポリヌクレオチドの作用または発現の結果、第二の遺伝子の乱れが起きて細胞が合成的に致死となる、MAD1、MAD2、またはその相同体もしくは類似体のような第一の遺伝子に少なくとも一つの欠損を含む細胞にポリヌクレオチドを導入する段階が含まれる。第二の遺伝子の乱れには、第二の遺伝子の上方制御、下方制御、除去または破壊が含まれるがこれらに限定されない。本発明における使用に適したポリヌクレオチドには、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、アンチセンスポリヌクレオチド、RNA-I（総説に関しては、その全体が参照として本明細書に組み入れられる、Nature 402：128〜129、1999を参照のこと）、および第二の遺伝子を特異的に標的とするリボザイムが含まれるがこれらに限定されない。この点において有用な第二の遺伝子には、先に述べた遺伝子、TUB1、CIN8、STU1、SFI1、TUB2、およびMPS2ならびにそのそれぞれの類似体および相同体が含まれる。
【００３２】
アンチセンスポリヌクレオチドの使用およびその応用は、例えば、その全体が参照として本明細書に組み入れられる、モル（Mol）およびバン・デ・クルル（Van der Krul）編、「アンチセンス核酸およびタンパク質の基本および応用（Antisense Nucleic Acids and Proteins Fundamentals and Applications）」、ニューヨーク、ニューヨーク州、（1992）に一般的に記載されている。適したアンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも15ヌクレオチド、および15ヌクレオチドまでであり、かつより抜きの第二の遺伝子の上流の非翻訳コード配列および関連するコード配列を含む。当業者に明らかであるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドの最適な長さは、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびmRNA上のその相補的配列との相互作用の強さ、翻訳が起こる温度およびイオン環境、アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列、mRNAおよび／またはアンチセンスオリゴヌクレオチドにおける二次構造および三次構造の存在、ならびに好ましい送達様式に依存する。例えば、可溶性のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的遺伝子の転写／翻訳を阻害するために用いられてきた（それぞれ参照として本明細書に組み入れられる、チン（Ching）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA86：10006〜10010、1989；Broderら、Ann. Int. Med. 113：604〜618（1990）；ロリュー（Loreau）ら、FEBS Letters 274：53〜56、1990；ホルセンバーグ（Holcenberg）ら、国際公開公報第91/11535号；国際公開公報第91/09865号；国際公開公報第91/04753号；国際公開公報第90/13641号；および欧州特許第386563号）。アンチセンスポリヌクレオチドにとって適した標的配列には、イントロン-エキソン接合部（適当なスプライシングを防止するため）、DNA/RNAハイブリッドが核から細胞質へのmRNAの輸送を防止する領域、開始因子結合部位、リボソーム結合部位、およびリボソームの進行を妨害する部位が含まれる。アンチセンスポリヌクレオチドにとって特に好ましい標的領域は、選択される第二の遺伝子の5'非翻訳領域である。
【００３３】
より抜きの第二の遺伝子を標的にしたアンチセンスポリヌクレオチドはまた、DNA分子が遺伝子そのものと比較して逆方向にプロモーターの下流に挿入されるような、適した発現ベクターに、標的ポリヌクレオチド配列を含むDNA分子を挿入することによって、調製されうる。次に発現ベクターを適した細胞に形質導入、形質転換、またはトランスフェクトして、アンチセンスポリヌクレオチドを発現をさせることができる。または、アンチセンスオリゴヌクレオチドを、標準的な手動のもしくは自動の合成技法を用いて合成してもよい。
【００３４】
合成されたオリゴヌクレオチドを、エレクトロポレーション（例えば、Yangら、Nucl. Acids. Res. 23：2803〜2810、1995）、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、ポリ-L-オルニチン/DMSO（Dongら、Nucle. Acids. Res. 21：771〜772、1993）を含む様々な手段によって、適した細胞に導入してもよい。適したアンチセンスオリゴヌクレオチド投与法の選択は、当業者に明らかであると考えられる。合成されたオリゴヌクレオチドに関して、アンチセンスオリゴヌクレオチド-mRNAハイブリッドの安定性は、安定化剤をオリゴヌクレオチドに添加することによって増大されうる。安定化剤には、オリゴヌクレオチドの一端または両端に共有結合するインターカレート（intercalete）剤が含まれる。オリゴヌクレオチドは、例えば、ホスホトリエステル、ホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロアミデート、またはホスホロジチオエートを導入することによってホスホジエステル骨格の改変によって、ヌクレアーゼに対して抵抗性になりうる。オリゴヌクレオチドはまた、MolおよびVan der Krul（同書）に一般的に記載されるように、デオキシリボヌクレオチドのαアノマーと共にオリゴヌクレオチドを合成することによってヌクレアーゼ抵抗性になりうる。
【００３５】
もう一つの態様において、本発明のポリヌクレオチドを基にした阻害剤には、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、標的遺伝子の転写を妨害する配列特異的DNA結合剤が含まれる。三重鎖形成オリゴヌクレオチドは一般的に、それぞれその全体が、参照として本明細書に組み入れられる、マエール（Maher）、Bioessays 14：807〜815、1992；ジー（Gee）ら、Gene 149：109〜114、1994；ヌーンバーグ（Noonberg）ら、Gene 149：123〜126、1994）；ソン（Song）ら、Ann. NY Acad. Sci. 761：97〜108、1995；ウェスティン（Westin）ら、Nuc. Acids. Res. 23：2184〜2191、1995）；ならびにワンド（Wand）およびグレイザー（Glazer）、J. Biol. Chem. 207：22595〜22901、1995）に記載されている。これらのオリゴヌクレオチドは、二本鎖DNA上において生理的条件で三重鎖ヘリックス複合体を形成し、DNA鋳型へのRNAポリメラーゼまたは転写因子の接触を物理的に妨害することによって、遺伝子の転写を選択的に阻害する。また、例えば、それぞれが参照として本明細書に組み入れられる、国際公開公報第95/25818号；国際公開公報第95/20404号；国際公開公報第94/15616号；国際公開公報第94/04550号；および国際公開公報第93/09788号を参照されたい。三重鎖形成オリゴヌクレオチドは、転写因子の結合の阻害を促進するために、ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドのテール（tail）のいずれかを含みうる。一つの例として、三重鎖形成オリゴヌクレオチドは、以下の第二の遺伝子を標的とする：TUB1、CIN8、STU1、SFI1、TUB2、およびMPS2ならびにそれぞれの類似体および相同体。
【００３６】
ポリヌクレオチドを基にした阻害剤に関して、適した配列の選択は、例えば、阻害剤の種類（すなわち、三重鎖形成オリゴヌクレオチドまたはアンチセンスポリヌクレオチド）、および処理される種によって左右されると考えられる。容易に利用可能な動物モデルにおいて用いることができるように、種の間で保存された配列を選択することが好ましいであろう。
【００３７】
本発明はまた、第二の遺伝子発現を阻害するための、リボザイム阻害剤の使用に関する組成物および方法を提供する。リボザイムは、所望の細胞を標的とする遺伝子治療による場合を含む、多様な様式で投与されることができる。本発明のリボザイムは、関心対象の遺伝子のRNA転写物の、配列特異的な標的である。例えば、第二の遺伝子の転写を特異的に阻害するようにリボザイムを設計しうる。それぞれのリボザイム分子は、第二の遺伝子RNAを切断することができる触媒的に活性な部分を含むように設計され、標的にされるRNAの一部と相補的なヌクレオチド配列を有する隣接配列をさらに含む。隣接配列は、部位特異的にリボザイムをRNAにアニールさせる。しかし、標的RNAと二重鎖を形成し、かつリボザイムの触媒的に活性な部分が標的部位で切断するのに十分な相補性が必要であるに過ぎないため、標的配列に対して隣接配列は絶対的に相補的である必要はない。このように、生理的条件下でリボザイムを標的RNAとハイブリダイズさせるために十分な相補性のみが必要である。本明細書において用いられるように、「リボザイム」という用語は、ヌクレオチド塩基配列特異的に、他の別個のRNA分子を切断または結び合わせる（splice）ことができる酵素活性を有する、RNA分子を意味する。触媒RNA分子または酵素RNA分子という用語は、特異的なRNA標的（例えば、TUB1、CIN8、STU1、SFI1、TUB2、またはMPS2 RNA）に対する基質結合領域において相補性を有し、かつその標的においてRNAを切断および／または結び合わせるために活性である酵素活性を有し、それによって標的分子を変化させるRNA分子を意味する。本発明の好ましい態様において、酵素RNA分子はハンマーヘッド（hammer head）モチーフにおいて形成されるが、リボザイムはまた、ヘアピンのモチーフ、δ型肝炎ウイルス、グループIイントロンまたはRNA分解酵素P RNA（RNAガイド配列に関連して）において形成されうる。ハンマーヘッドモチーフの例は、Rossiら、AIDS Res. Hum. Retrovir. 8：183、（1992）に記載されており、ヘアピンモチーフはHampelら、Biochem. 28：4929、（1989）、およびHampelら、Nucl. Acids. Res. 18：299、（1990）に記載され、δ型肝炎ウイルスモチーフは、PerrottaおよびBeen、Biochem. 31：16、（1992）において例示されており、RNA分解酵素PモチーフはGuerrier-Takadaら、Cell 35：849、（1983）に記載されており、かつグループIイントロンモチーフの例は、Cechら、米国特許第4,987,071号に記載されており、上記の開示はそれぞれ参照として本明細書に組み入れられる。これらの特異的モチーフは本発明において限定的ではなく、当業者は本発明の酵素RNA分子が一つまたは複数の標的RNA領域と相補的である、特異的な基質結合部位を有し、これが分子にRNA切断活性を付与する基質結合部位内または周辺にヌクレオチド配列を有することを認めるであろう。
【００３８】
リボザイム触媒部位の上流および下流の隣接配列は、リボザイムに対する望ましい程度の標的特異性を有効に付与する任意の長さの部分を含んでもよい。好ましくは隣接配列はヌクレオチド約4個〜約24個を含み、より好ましくはヌクレオチド約6個〜約15個、一般的にヌクレオチド約9個〜12個を含み、その結果、切断部位を含むRNA配列のすぐ上流およびすぐ下流で基質配列との塩基対形成が起こる。標的DNAまたは対応するRNAの異なる部分を標的とした、ポリヌクレオチド阻害剤、例えば、三重鎖形成オリゴヌクレオチド阻害剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤、リボザイム阻害剤等、またはそのような阻害剤の組み合わせを、標的とした細胞に広く多様な方法で送達させて、関心対象の遺伝子の阻害を促進することができる。オリゴヌクレオチドは、合成オリゴヌクレオチドとして投与するか、または発現ベクターから発現させることができる。オリゴヌクレオチドを、エキソビボで投与することができる、すなわち、個体あるいは他の細胞源から採取した標的細胞と接触させて、処理して、戻すか、またはオリゴヌクレオチドをインビボで投与することができる。エキソビボで投与する場合、特定の細胞集団に依存して、一般的に標的細胞を有糸分裂促進物質、例えば血清の有糸分裂促進物質（SCF、IL-3、EPO、TPO等）または類似物に曝露する。
【００３９】
本発明のこれらおよび他の目的は、本明細書に提供される開示から明らかであろう。
【００４０】
4.発明の詳細な説明
本発明は、癌ならびに、細胞増殖および複製の調節解除に関連する他の疾患のモデルとして、酵母変異体を提供する。酵母は、ヒト疾患を研究するために極めて有用なモデルである。例えば、1996年1月20日現在、以下のヒト疾患および臨床的に重要な病態が、ヒト遺伝子と酵母サッカロミセス・セレビジエ（S. serevisiae）遺伝子／タンパク質との間に一致があるとして同定されている：遺伝性非ポリポーシス結腸癌；嚢胞性線維症；ウィルソン病；グリセロールキナーゼ欠損症；副腎白質萎縮症；毛細血管拡張性運動失調；筋萎縮性側索硬化症；筋緊張性ジストロフィー；ローウェ症候群；1型神経線維腫症；先天性脈絡膜欠如；構造異常性異形成；脳回欠損；トムゼン病；ウィルムス腫瘍；軟骨形成不全症；メンケス症候群；多発性内分泌腺新形成2A；ウィスコット-アルドリッチ症候群；デュシェンヌ型筋ジストロフィー；無虹彩症；性腺形成異常；早期発症型乳癌および卵巣癌；慢性肉芽腫症；表皮剥離性掌しょ角皮症；ワーデンブルグ症候群；腺腫様多発結腸ポリープ；2型神経線維腫症；カルマン症候群；結節硬化症；腎嚢胞；アールスコグ-スコット症候群；マルファン症候群；ハンチントン病；脊髄小脳性運動失調；1型遺伝性QT延長症候群；脆弱X症候群；エメリー-ドライフス型筋ジストロフィー；網膜芽細胞腫；マクラウド症候群；ノリエ病；フォンヒッペル-リンダウ病；アルツハイマー病；反射亢進；X連鎖無γグロブリン血症（詳細な情報に関しては、参照として本明細書に組み入れられる、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Bassett/Yeast/およびその更新版を参照のこと）。酵母とヒト遺伝子を交互参照する手段は現在利用可能であり、例えば、参照として本明細書に組み入れられる、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/XREFdbに見出される「XREF2」プログラムを用いて行うことができる。細胞周期監視系の成分における異常は、ヒト癌および上記のような他の疾患において同定されている。これらの異常には、サイクリンの変化（腫瘍の80％〜90％）、p53の変化（腫瘍の50％〜60％）、およびDNAミスマッチ修復（結腸および膵臓のようないくつかの種類の腫瘍の10％〜20％）が含まれる。第一の遺伝子変化とは機能の喪失であることが多く、そのため、これらの欠損に重点を置いた医薬品探索プログラムは、失われた機能の回復を必要とする。もう一つのアプローチは、阻害された場合に、他のどのタンパク質（または複数）が第一の欠損を有する細胞を選択的に殺すかを同定することである。
【００４１】
一般的な情報および、酵母ゲノムを含むデータベースは公式に利用可能であり、例えば、その内容およびリンクが参照として本明細書に組み入れられる、以下のような公式ウェブサイトにおいて見出される：http://bioinformayics.weizmann.ac.il；http://ourworld.compuserve.com/homepages/C Velten/yeast.htm；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Yeast；http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces/；genome-ftp.stanford.edu（directory/yeast/genome_seq）；http://vectordb.atcg.com/vectordb/；http://www.mpimg-berlin-dahlem.mpg.de/~andy/GN/S.cerevisiae/；またはhttp://www.mips.biochem.mpg.de/proj/yeast。他のデータベースも同様に存在し、これらのデータベースおよび他のウェブサイトへのリンクも、本発明の目的にとって等しく適している。例として、その内容が参照として本明細書に組み入れられるYeast GenBank（サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces serevisiae）に由来する全てのGenBank配列の集まり）；Yeast Swiss-Prot（サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces serevisiae）に由来するSwiss-Protタンパク質配列のコレクション）；YPD（Proteome, Inc. が管理する酵母タンパク質データベース）、およびその定期的な更新版が含まれるが、これらに限定されない。酵母を操作する方法は十分に確立されており、かつ当業者に公知であり、中でも例えば、www.goshen.edu/bio/yeast、www.fhcrc.org/~gottschling、およびwww.sacs.ucsf.edu/home/HerskowitzLabのような公式ウェブサイトにおいて見出される。
【００４２】
本発明は、条件感受性致死性変異を有する変異体生物を同定する方法およびその後の遺伝子産物を特徴とする。開示された方法は、生存にとって必須である遺伝子および対応する遺伝子産物を迅速に同定するための、ゲノムライブラリーまたは変異体ライブラリーのハイスループット（high-throughput）スクリーニングのために有用である。致死性変異によって、限定的条件下（すなわち、腫瘍細胞において）では機能的でない遺伝子またはタンパク質がもたらされる。非機能的遺伝子は、プロモーター内に欠損を有する可能性があり、遺伝子発現の減少または異常をもたらす可能性がある。非機能的タンパク質は、不適切なタンパク質の折り畳みまたは異常なタンパク質分解を引き起こす構造的欠陥を有しうる。不適切なタンパク質折り畳みの結果、折り畳み、本来の基質の認識、ならびに／または基質の結合および放出は部分的または完全に失敗する。
【００４３】
本発明は、阻害された遺伝子が変異MAD1またはMAD2に不適合となるように、特定の遺伝子を阻害することができる新規化合物に関する。したがって、細胞増殖の阻害のための用途が本発明の化合物にとって好ましい。特に、本発明の化合物は、過度または異常な細胞増殖を有する被験者を治療するために有用となりうる。
【００４４】
本発明の化合物が治療的恩典を提供できる多様な病的な細胞増殖条件が存在し、一般的な戦略は異常な細胞増殖の阻害である。説明すると、病的または異常な増殖を示す細胞型には、様々な癌および白血病、乾せん、骨疾患、結合組織を巻き込むような繊維増殖障害、アテローム性動脈硬化症、およびその他の平滑筋増殖障害ならびに慢性炎症が含まれる。
【００４５】
本発明の化合物が治療利益を提供することができる多様な病的な細胞増殖条件が存在し、一般的な戦略は異常な細胞増殖の阻害である。説明すると、病的または異常な増殖を示す細胞タイプには、様々な癌、白血病、乾せん、骨疾患、結合組織を巻き込むような繊維増殖障害、アテローム性動脈硬化症、およびその他の平滑筋増殖障害と共に慢性炎症が含まれる。この意味において、MAD2、MAD1、その類似体または相同体における変異と組み合わせて致死的となる第二の変異と共に見出される合成致死を模倣する薬剤は、ヒトT細胞白血病の治療において有用でありうる（Jinら、Cell 93：81〜91、1998）。
【００４６】
増殖異常に加えて、例えば、組織の脱分化が原因で起こる分化異常の治療は、（任意に）有糸分裂への頓挫性再入を伴いうる。そのような変性性障害には、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症等、および脊髄小脳変性を含む神経系の慢性的な神経変性疾患が含まれる。他の分化異常には、例えば、軟骨細胞または骨細胞の脱分化によって起こりうるような、結合組織に関連した異常ならびに、内皮組織および平滑筋細胞の脱分化を伴う血管異常、腺細胞における変性変化を特徴とする胃潰瘍、および分化不全を特徴とする腎疾患、例えばウィルムス腫瘍が含まれる。
【００４７】
本発明はまた、以下からなる群より選択される疾患の治療にも向けられる：アプドーマ、分離腫、鰓腫、悪性カルチノイド症候群、カルチノイド心疾患、癌（例えば、ウォーカー癌、基底細胞癌、基底有棘細胞癌、ブラウン-ピアース（Brown-Pearce）癌、腺管癌、エールリッヒ腫瘍、クレブス2腫瘍、メルケル細胞腫、粘液性癌腫、非小細胞肺癌、燕麦細胞癌、乳頭状癌、硬性癌、細気管支、細気管支癌、気管支原生癌、扁平上皮細胞癌、および移行上皮癌）、組織球障害、白血病（例えば、B細胞白血病、混合型白血病、ヌル細胞白血病、T細胞白血病、慢性T細胞白血病、HTLV-II関連白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、肥満細胞性白血病、および骨髄性白血病）、悪性組織球増殖症、ホジキン病、免疫増殖性小（immunoproliferative small）、非ホジキンリンパ腫、形質細胞腫、細網組織増殖症、黒色腫、軟骨芽細胞腫、軟骨腫、軟骨肉腫、線維腫、線維肉腫、巨細胞腫、組織球腫、脂肪腫、脂肪肉腫、中皮腫、粘液腫、粘液肉腫、骨腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、滑膜腫、腺線維腫、腺リンパ腫、癌肉腫、脊索腫、頭蓋咽頭腫、未分化胚細胞腫、過誤腫、間葉腫、中腎腫、筋肉腫、エナメル上皮腫、セメント質腫、歯牙腫、奇形種、胸腺腫、栄養膜腫（trophoblastic tumor）、腺癌、腺腫、胆管腫、コレステリン腫、円柱腫、嚢胞腺癌、嚢胞腺腫、顆粒膜細胞腫、男性胚細胞腫、肝癌、汗腺腫、島細胞腫（islet cell tumor）、ライディヒ細胞腫（Leydig cell tumor）、乳頭腫、セルトリ細胞腫、卵胞膜細胞腫、平滑筋腫、平滑筋肉腫、筋原細胞腫、筋腫、筋肉腫、横紋筋腫、横紋筋肉腫、脳室上皮腫、神経節細胞腫、神経膠腫、髄芽細胞腫、髄膜腫、神経鞘腫（neurilemmoma）、神経芽腫、神経上皮腫、神経線維腫、神経腫、傍神経節腫、非クロム親和性傍神経節腫（paraganglioma nonchromaffin）、被角血管腫、好酸球増多随伴性血管類リンパ組織増殖症、硬化性血管腫（angioma sclerosing）、血管腫症、グロムス血管腫、血管内皮腫、血管腫、血管外皮細胞腫、血管肉腫、リンパ管腫、リンパ管筋腫（lymphangiomyoma）、リンパ管肉腫、松果体腫、癌肉腫、軟骨肉腫、葉状嚢肉腫、線維肉腫、血管肉腫、平滑筋肉腫、白血肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、筋肉腫、粘液肉腫、卵巣癌、横紋筋肉腫、肉腫、神経線維腫症、子宮頸部異形成、線維症、良性前立腺過形成、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、糸球体硬化症、ケロイド、乾せん、黒子、角化症、線維性軟ゆう、伝染性軟属腫、性病いぼ、皮脂腺過形成（sebaceous hyperplasia）、尖圭コンジローム、血管腫、静脈湖、軟骨皮膚炎（chondrodermatitis）、化膿性肉芽腫、化膿性汗腺炎、ケロイド、角化棘細胞腫、白斑症、多発性皮脂嚢腫、睫毛乱生症、表層上皮母斑（superficial epithelial nevus）、ポリープ、接合部母斑（junctional nevus）、化膿性肉芽腫、結節性痒疹、皮膚線維腫、脂腺腫、乳頭腫、ならびにそれらの組み合わせ。
【００４８】
治療的応用（例えば、ヒトおよび獣医学的使用の双方に関する）に加えて、例えば有糸分裂チェックポイントを制御することによって、本発明の化合物をインビトロで細胞の増殖状態および／または分化状態を制御するための細胞培養添加物として用いることができることは明らかであろう。
【００４９】
同様に、ディファレンシャル（differential）スクリーニングアッセイ法を用いて、非ヒト酵母酵素に対して特異性を有する本発明の化合物を選択することができる。したがって、真核細胞病原体に対して特異的に作用する化合物、例えば抗真菌剤、または抗寄生虫剤を、本発明の阻害剤から選択することができる。説明すると、本発明の阻害剤は、衰弱した免疫抑制患者において一般的に起こる日和見感染症であるカンジダ症の治療に用いることができる。これらの同じ阻害剤を用いて、白血病およびリンパ腫患者、免疫抑制治療を受けている人々、および真菌感染症が特に問題となる真性糖尿病またはAIDSのような素因を有する患者におけるこれらの感染症を治療することができる。
【００５０】
第一の遺伝子MAD1、MAD2、またはその相同体もしくは類似体における変異と組み合わせて合成的に致死となる遺伝子が同定されれば、第二の変異を模倣できる薬剤のスクリーニング法を開発することができる。そのような薬剤は、異常な増殖に関連した疾患を治療するために、本発明の意味において有用な治療薬である。本発明の第二の遺伝子は、例えば、疾患がMAD1、MAD2、またはその類似体もしくは相同体における変異のように、第一の遺伝子における変異を特徴とする、癌のような増殖性疾患を治療するための治療薬剤を同定するアッセイ法において用いられる。本発明のこれらの局面において、そのような調節の結果、第二の遺伝子産物の活性の阻害もしくは減少、上記の第二の遺伝子の上方制御、下方制御、消失または破壊が起こる、第二の遺伝子または第二の遺伝子産物またはその類似体もしくは相同体の活性を調節する候補薬物を含む薬剤を同定するスクリーニングアッセイ法を行ってもよい。この意味においてアッセイ法は、標的遺伝子を発現する細胞全体、標的遺伝子産物を含む細胞溶解物を用いてもよく、または精製された標的遺伝子産物を用いてもよい。本発明の特定のアッセイ法において、適切な条件下で、試験薬剤が標的遺伝子産物の活性を調節するのに十分な時間、標的遺伝子発現細胞を含む反応混合物と試験薬剤をインキュベートし、対照試料を試験薬剤の非存在下で同一の条件下でインキュベートする。本明細書において用いられるように、標的遺伝子産物の活性の調節には、例えば、遺伝子産物との直接結合による標的遺伝子産物の活性の増加または減少、および標的遺伝子産物の転写または翻訳を上方制御または下方制御することによって標的遺伝子産物の活性を増加または減少させることが含まれるが、これらに限定されない。本発明の局面には、標的遺伝子産物の調節物質を同定するように設計された、ハイスループットスクリーニングアッセイ法が含まれる。
【００５１】
本発明の一つのアッセイ法において、候補薬物は以下の方法によって同定される：a）MAD1、MAD2のような第一の遺伝子において欠失または変異を有する細胞を含む試験細胞系を候補薬物に曝露する段階；b）試験細胞系において対照細胞系より低い生存率を引き起こす候補薬物が治療薬の候補薬物である、MAD1、MAD2、またはその類似体もしくは相同体のような第一の遺伝子、ならびに、その変異型がMAD1、MAD2またはその類似体もしくは相同体のような、第一の遺伝子変異と組み合わせると合成的に致死となる第二の遺伝子、において欠失または変異を有する細胞を含む対照細胞系の生存率と試験細胞系の生存率とを比較する段階。本発明の文脈において、生存率は細胞が自身を再生する能力として測定され、非生存細胞は分裂しない、または分裂できない細胞、細胞周期の任意の期において停止しない細胞、アポトーシスを受ける、またはアポトーシス経路に従って進行する細胞、および死細胞である。生存および非生存細胞の有無を決定する手段は、当業者に明らかであり、生体色素染色、染色体濃縮の測定等が含まれる。
【００５２】
もう一つの態様は、以下の段階を含む、MAD1遺伝子、MAD2遺伝子またはその類似体もしくは相同体における変異を特徴とする癌のような増殖疾患の治療において有用な化合物を同定する方法である：1）その変異型において、変異体MAD1遺伝子、変異MAD2遺伝子またはその類似体もしくは相同体と組み合わせると合成的に致死となる第二の遺伝子の野生型遺伝子産物を、試験化合物が遺伝子産物に影響を及ぼすために十分な条件下および期間、試験化合物と接触させる段階；2）試験化合物の存在下での遺伝子産物の活性を、試験化合物の非存在下での遺伝子産物の活性と比較する段階。この例示的アッセイ法において、第二の遺伝子産物またはその類似体もしくは相同体の活性を減少させることができる化合物は、MAD1遺伝子、MAD2遺伝子、またはその類似体もしくは相同体における変異を特徴とする癌または他の増殖性疾患の治療にとって有用であると同定される。本発明のもう一つの態様において、野生型の第二の遺伝子またはその類似体もしくは相同体を有する細胞を試験化合物と接触させ、tol遺伝子産物またはその類似体もしくは相同体の発現および／または活性を評価して、試験化合物に曝露されていない細胞における野生型の第二の遺伝子産物の発現および／または活性と比較する、細胞全体のアッセイ法を実施する。この局面において、遺伝子産物の発現または活性を減少させる化合物は、MAD1遺伝子、MAD2遺伝子、またはその類似体もしくは相同体における変異を特徴とする癌またはその他の増殖性疾患の治療にとって有用である。
【００５３】
本明細書に記載したアッセイ法の目的のため、第二の遺伝子の遺伝子産物の調節のためのアッセイ法は当業者に公知である。当業者には明らかであるように、第二の遺伝子標的は、当業者が遺伝子およびそのそれぞれの変異を特徴付けるのに用いられるアッセイ法を決定するように、タンパク質活性の調節を測定するための適当なアッセイ法を決定すると考えられる。例えば、テランダー（Thelander）ら（J. Biol. Chem. 255：7426〜7432、1980）、およびエングストロム（Engstrom）ら（Biochemistry 18：2941〜2948、1979）の方法を用いた、リボヌクレオチドのデオキシリボヌクレオチドへの直接還元による、リボヌクレオチドレダクターゼ（RNR1およびRNR2の遺伝子産物）の酵素活性の増加または減少、チミジル酸キナーゼ（CDC8の遺伝子産物）活性の測定を、ヌクレアーゼおよびポリメラーゼ活性の後に、例えば、ヨン（Yong）およびキャンベル（Campbell）により記載される（J. Biol. Chem. 259：14394〜14398、1984）、リン酸化またはデオキシチミジン一リン酸、ならびにRAD27タンパク質のエンドおよび5'エキソヌクレアーゼ活性、ならびにPOL1に関連したポリメラーゼ活性を測定することによって、そのようなアッセイ法を用いて決定することができる。タンパク質の活性はまた、例えば、抗体染色を用いた可視化または免疫沈降によって、遺伝子産物のそのリガンドまたは基質への結合の増加または減少を測定することによって決定することができる。一方、チューブリン（TUB1およびTUB2の遺伝子産物）のような構造タンパク質を、細胞によって作製されたチューブリンの質および量を測定することによって測定することができる。
【００５４】
説明のために、本明細書に記載したアッセイ法を用いて、カンジダ症、アスペルギルス症、ムコール菌症、分芽菌症、ゲオトリクム症、クリプトコッカス症、色素酵母菌症、コクシジウム症、分生胞子症（conidiosporosis）、ヒストプラスマ症、マズラミコーシス、リノスポリジウム症、ノカルディア症、パラアクチノミセス症、ペニシリウム症、モニリア症、またはスポロトリクム症のような真菌症に関係する少なくとも一種の真菌を阻害するために最終的に有用でありうる薬剤をスクリーニングすることができる。
【００５５】
表1は、第二の標的を同定するための合成致死スクリーニング戦略を示す。下記の表は、表示された第一の遺伝子欠損と組み合わせて致死性であることが見出された第二の部位変異のいくつかを示す（ヒト相同体も示す）。第二の標的がモデル系において同定されると、いくつかの条件を一致させてから、これらの遺伝子産物の哺乳類相同体の阻害剤に関するハイスループットスクリーニングを開始することが妥当である。第一のおよび第二の標的が不活化される哺乳類細胞（一致した細胞株対および腫瘍細胞株の双方）において合成致死も同様に起こることを最初に確認する必要がある。これは、リボザイム、アンチセンス分子、またはドミナント-ネガティブ戦略のような哺乳類の誘導型遺伝子破壊技術の使用を必要とする。低分子による阻害を最も受けやすい第二の遺伝子標的（例えば、十分に定義された基質を有する酵素）は詳しい分析のための明白な最初の選択であるため、それぞれの推定の薬物標的の薬理学的実現可能性を同時に決定しなければならない。これらの試験が終了した後に限って、これらの哺乳類の確認された第二の遺伝子標的の阻害剤の標準的なハイスループットスクリーニングを開始することができる。
【００５６】
【表１】酵母株：MAD2
2005509447.tif 000002
【００５７】
そのような治療的利用の他に、そのような示差スクリーニングアッセイ法によって開発された抗真菌剤を、例えば食料品における保存剤、家畜の体重増加を促進するための飼料添加剤、または非生物材料の処理、例えば病院機器および病室の汚染除去のための消毒製剤として用いることができる。
【００５８】
同様にして、哺乳類遺伝子およびショウジョウバエ（Drosophila）のような昆虫遺伝子の阻害を並べて比較すると、本発明の誘導体の中からヒト／哺乳類の酵素および昆虫酵素とを識別する阻害剤を選択することが可能となると考えられる。したがって、本発明は、ショウジョウバエ（Drosophila）のような昆虫の管理のために用いられるように、殺虫剤における本発明の用途および製剤を広く意図する。
【００５９】
さらにもう一つの態様において、本発明の阻害剤化合物のいくつかを、哺乳類の相対物と比較して植物遺伝子に対する阻害特異性に基づいて選択することができる。例えば、植物酵素を阻害するための最大の選択性を有する化合物を選択するために、一つまたは複数のヒト酵素によるディファレンシャルスクリーニングにおいて、植物遺伝子を配置することができる。したがって、本発明は枯葉剤等の形態など農業的応用のための本発明の阻害剤の製剤を特に意図している。
【００６０】
もう一つの局面において、本発明は、一つまたは複数の薬学的に許容されうる担体（添加剤）および／または希釈剤と共に製剤化した、一つまたは複数の治療的有効量の上記の化合物を含む、薬学的に許容されうる組成物を提供する。以下に詳細に説明するように、本発明の薬学的組成物を、以下に関して適合させたものを含む、固体状または液体状での投与のため特に製剤化してもよい：（1）経口投与、例えば飲薬（水溶液もしくは非水溶液、または懸濁液）、錠剤、巨丸剤、粉剤、顆粒、舌に適用するためのペースト；（2）非経口投与としては、例えば滅菌溶液または懸濁液としての皮下注射、筋肉内注射、または静脈内注射；（3）局所適用、例えば、皮膚に適用されるクリーム、軟膏、もしくはスプレーとして；または（4）膣内もしくは直腸内、例えば、ペッサリー、クリーム、もしくはフォームとして。
【００６１】
本明細書において用いられる「治療的有効量」という用語は、第一の遺伝子（MAD1、MAD2、またはその類似体もしくは相同体）に変異を含む動物における細胞の少なくとも一つの亜集団において標的の第二の遺伝子の発現活性を調節し、それによる処理細胞における該タンパク質活性の生物学的帰結を、任意の医学的処置に応用可能な妥当な恩典／リスク比で、妨害することによって、何らかの所望の治療効果を得るために有効である本発明の化合物を含む、化合物、材料、または組成物の量を意味する。
【００６２】
「薬学的に許容される」という用語は、本明細書において、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、またはその他の問題もしくは合併症がなく、妥当な利益／リスク比に比例して、ヒトおよび動物の組織と接触して用いることに適している化合物、材料、組成物および／または剤形を意味するために用いられる。
【００６３】
本明細書において用いられる「薬学的に許容される担体」という用語は、一つの臓器、または体内の一部分から体内の他の臓器または他の部分に対象の薬剤を運ぶまたは輸送することに関係する、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒または封入材料のような、薬学的に許容される材料、組成物、または媒体を意味する。それぞれの担体は、製剤の他の成分と適合性があり、患者に対して有害でないという意味において「許容され」なければならない。薬学的に許容される担体として役立ちうる材料のいくつかの例には：（1）乳糖、ブドウ糖、およびショ糖のような糖；（2）コーンスターチおよびジャガイモデンプンのようなデンプン；（3）セルロースおよび、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロースのようなその誘導体；（4）粉末トラガカント；（5）麦芽；（6）ゼラチン；（7）タルク；（8）カカオバターおよび坐剤ロウのような賦形剤；（9）ピーナッツ油、綿実油、ひまわり油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、および大豆油のような油脂；（10）プロピレングリコールのようなグリコール；（11）グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールのようなポリオール；（12）オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルのようなエステル；（13）寒天；（14）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムのような緩衝剤；（15）アルギン酸；（16）発熱物質不含水；（17）等張生理食塩水；（18）リンゲル液；（19）エチルアルコール；（20）リン酸緩衝液；ならびに（21）薬学的製剤において用いられる他の非毒性適合性物質が含まれる。
【００６４】
上記のように、本発明のチェックポイントタンパク質ならびに上記および下記の他のタンパク質の特定の態様は、アミノ基またはアルキルアミノ基のような塩基性官能基を含んでもよく、したがって、薬学的に許容される酸によって薬学的に許容される塩を形成することができる。この点において、「薬学的に許容される塩」という用語は、本発明の化合物の比較的非毒性の無機酸付加塩および有機酸付加塩を意味する。これらの塩を、本発明の化合物の最終的な単離および精製の際にインサイチューで、または遊離状態の本発明の精製化合物を適切な有機酸または無機酸と個々に反応させ、形成された塩を単離することによって、調製することができる。代表的な塩には、臭化水素塩、塩化水素塩、硫酸塩、亜硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシラート、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩、メシレート、グルコヘプト酸塩、ラクトビオネート、およびラウリルスルホン酸塩等が含まれる。
【００６５】
他の例において、本発明の化合物は、一つまたは複数の酸性官能基を含んでもよく、したがって、薬学的に許容される塩基によって薬学的に許容される塩を形成することができる。これらの例において「薬学的に許容される塩」という用語は、本発明の化合物の比較的非毒性の無機塩基付加塩および有機塩基付加塩を意味する。これらの塩はさらに、化合物の最終的な単離および精製の際にインサイチューで調製することができ、または酸解離状態の精製化合物を、薬学的に許容される金属陽イオンの水酸化物、炭酸塩または炭酸水素塩のような適した塩基と、アンモニアと、または薬学的に許容される有機一級アミン、二級アミン、もしくは三級アミンと個々に反応させることによって、調製することができる。代表的なアルカリ塩類またはアルカリ土類塩には、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、およびアルミニウム塩等が含まれる。塩基付加塩の形成にとって有用な代表的な有機アミンには、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジン等が含まれる。
【００６６】
ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムのような湿潤剤、乳化剤、および潤滑剤、ならびに着色剤、放出剤、コート剤、甘味料、香料、保存剤および抗酸化剤も同様に組成物中に存在しうる。
【００６７】
薬学的に許容される抗酸化剤の例にはいかが含まれる：（1）アスコルビン酸、水酸化システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等のような水溶性抗酸化剤；（2）アスコルビン酸・パルミテート、ブチルヒドロキシアニソール（BHA）、ブチルヒドロキシトルエン（BHT）、レシチン、没食子酸プロピル、α-トコフェロール等のような脂溶性抗酸化剤；および（3）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等のような金属キレート剤が含まれる。
【００６８】
本発明の製剤には、経口投与、鼻腔内投与、局所投与（頬および舌下を含む）、直腸投与、膣投与、および／または非経口投与に適した製剤が含まれる。製剤は、便宜上単位剤形で存在してもよく、薬学の技術分野において公知の任意の方法によって調製されうる。単一の剤形を生成するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、治療される宿主、特定の投与様式に応じて変化すると考えられる。単一の剤形を作製するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、一般的に治療効果を生じる化合物の量であると考えられる。一般的に、100％のうち、この量は活性成分の約1％〜約99％、好ましくは約5％〜約70％、最も好ましくは約10％〜約30％の範囲内であろう。
【００６９】
これらの製剤または組成物を調製する方法には、本発明の化合物を担体と、および任意で一つまたは複数の付属成分と結合させる段階が含まれる。一般的に、本発明の化合物を液体担体、または細粒固体担体またはその双方と均一に完全に結合させ、次に必要であれば産物を成形することによって、製剤が調製される。
【００７０】
経口投与に適した本発明の製剤は、活性成分として本発明の化合物の規定量をそれぞれ含む、カプセル剤、カシェ剤、丸剤、錠剤、（香料基剤、通常、ショ糖およびアカシアゴムまたはトラガカントを用いる）ロゼンジ、粉剤、顆粒剤の形状で、または水溶液もしくは非水溶液中での溶液もしくは懸濁液として、または水中油型もしくは油中水型の乳剤として、またはエリキシル剤もしくはシロップ剤として、または（ゼラチンおよびグリセリン、またはショ糖およびアカシアゴムなどの不活性基材を用いる）トローチとしておよび／またはマウスウオッシュ等としての形状であってもよい。本発明の化合物はまた、ボーラス、舐剤、またはペーストとして投与されうる。
【００７１】
経口投与のための本発明の固体剤形（カプセル剤、錠剤、丸剤、糖衣丸、粉剤、顆粒等）において、活性成分を、クエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウム、および／または以下のいずれかのような、一つまたは複数の薬学的に許容される担体と混合する：（1）デンプン、乳糖、ショ糖、ブドウ糖、マンニトール、および／またはケイ酸のような充填剤または増量剤；（2）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ショ糖および／またはアカシアゴムのような結合剤；（3）グリセロールのような湿潤剤；（4）寒天-寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩、および炭酸ナトリウムのような崩壊剤；（5）パラフィンのような溶液遅延剤；（6）四級アンモニウム化合物のような吸収加速剤；（7）例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロールのような湿潤剤；（8）カオリンおよびベントナイト粘土のような吸収剤；（9）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびその混合物などの潤滑剤；ならびに（10）着色剤。カプセル、錠剤、および丸剤の場合、薬学的組成物はまた緩衝剤を含んでもよい。類似のタイプの固体組成物も同様に、乳糖または牛乳の糖と共に、高分子量ポリエチレングリコール等のような賦形剤を用いて軟および硬充填ゼラチンカプセルにおいて充填剤として用いられうる。
【００７２】
錠剤を、任意に一つまたは複数の補助成分と共に、圧縮または成型によって作製してもよい。圧縮錠剤を、結合剤（例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、潤滑剤、不活性希釈剤、保存剤、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウムもしくは架橋したカルボキシメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤または分散剤を用いて調製してもよい。成型錠剤を、適切な機械において不活性液体希釈剤によって湿らせた粉末化合物の混合物を成型することによって作製してもよい。
【００７３】
本発明の薬学的組成物の錠剤、ならびに糖衣丸、カプセル剤、丸剤および顆粒のようなその他の固体剤形を、任意に、腸溶コーティングおよび製薬技術分野で公知の他のコーティングのようなコーティングおよび外被と共に得ることができる、または調製することができる。それらをまた、例えば、所望の放出プロフィールを提供するための様々な比率のヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリクス、リポソームおよび／またはミクロスフェアを用いることによって、その中の活性成分の遅いまたは制御された放出を提供するように製剤化してもよい。それらを例えば、細菌残留フィルターによる濾過によって、または使用直前に滅菌水または他の滅菌注射可能媒体に溶解することができる滅菌固体組成物の形で滅菌物質を組み入れることによって、滅菌してもよい。これらの組成物はまた、任意に不透明化物質を含んでもよく、そして胃腸管の特定の部位に限って、またはそれらの部位に選択的に、ゆっくりと活性成分を放出する組成物であってもよい。用いることができる包埋組成物の例には、ポリマー物質およびロウが含まれる。活性成分はまた、適当であれば、上記の賦形剤の一つまたは複数を有する、微小封入体の形状でありうる。
【００７４】
本発明の化合物を経口投与するための液体剤形には、薬学的に許容される乳剤、微小乳剤、溶液、懸濁液、シロップ剤、およびエリキシル剤が含まれる。活性成分の他に、液体剤形は、例えば水および他の溶媒のような当技術分野で一般的に用いられる不活性希釈剤、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、ベンジル安息香酸、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、油脂（特に綿実油、落花生油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにそれらの混合物のような可溶化剤および乳化剤を含んでもよい。
【００７５】
不活性希釈剤の他に、経口組成物はまた、湿潤剤、乳化剤、および懸濁化剤、甘味料、着香料、着色料、香料ならびに保存剤のようなアジュバント（adjuvant）を含みうる。
【００７６】
懸濁剤は、活性化合物の他に、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール、およびソルビタンエステル、微結晶性（microcrystalline）セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天-寒天およびトラガカント、ならびにそれらの混合物などの、懸濁化剤を含んでもよい。
【００７７】
直腸投与または経膣投与のための本発明の薬学的組成物の製剤は、坐剤として示されうり、これは例えば、室温では固体であるが、体温では液体であり、したがって直腸または膣腔内で融解して活性化合物を放出するカカオバター、ポリエチレングリコール、坐剤用ロウ、またはサリチル酸塩を含む一つまたは複数の適切な非刺激性の賦形剤または担体と、本発明の一つまたは複数の化合物を混合することによって調製されうる。
【００７８】
経膣投与に適した本発明の製剤にはまた、当技術分野において適当であることが知られているような担体を含む、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム、またはスプレー製剤が含まれる。
【００７９】
本発明の化合物の局所投与または経皮投与のための剤形には、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ、および吸入剤質が含まれる。活性化合物を、滅菌条件下で、薬学的に許容される担体および必要でありうる任意の保存剤、緩衝剤、または噴射剤と共に混合してもよい。
【００８０】
軟膏、ペースト、クリームおよびゲルは、本発明の活性化合物に加えて、動物性脂肪および植物性脂肪、油脂、ロウ、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、ケイ酸、タルク、および酸化亜鉛、またはそれらの混合物のような賦形剤を含んでもよい。
【００８１】
粉剤およびスプレーは、本発明の化合物の他に、乳糖、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、およびポリアミド粉末、またはそれらの物質の混合物のような賦形剤を含みうる。スプレーは、クロロフルオロヒドロカーボン、ならびにブタンおよびプロパンのような揮発性の非置換炭化水素のような通常の噴射剤をさらに含みうる。
【００８２】
経皮パッチは、本発明の化合物の体内への制御された送達を提供する、さらなる長所を有する。そのような剤形は、適当な媒体に化合物を溶解または分散させることによって作製することができる。化合物の皮膚を介した流入を増加させるために吸収促進剤も同様に用いることができる。そのような流入の速度を、速度調節膜を提供することによって、またはポリマーマトリクスまたはゲル中に化合物を分散させることによって、制御することができる。
【００８３】
眼科用製剤、眼軟膏、点眼液、粉剤、移植片等も同様に、本発明の範囲内であることが意図されている。
【００８４】
非経口投与に適した本発明の薬学的組成物は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、意図されたレシピエントの血液と等張な製剤にする溶質、懸濁剤もしくは濃化剤を含んでもよい、一つもしくは複数の薬学的に許容される滅菌等張水溶液もしくは非水溶液、分散液、懸濁液、もしくは乳液、または使用直前に滅菌注射可能溶液または分散剤に戻してもよい滅菌粉末と組み合わせた、本発明の一つもしくは複数の化合物を含む。
【００８５】
本発明の薬学的組成物において用いられうる適切な水溶性担体または非水溶性担体の例には、水、エタノール、（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のような）ポリオール、およびそれらの適切な混合物、オリーブ油のような植物油、およびオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルが含まれる。適当な流動性を、例えば、レシチンのようなコーティング材料を用いることによって、分散剤の場合には必要な粒子径を維持することによって、および界面活性剤を用いることによって、維持することができる。
【００８６】
これらの組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤のようなアジュバントを含んでもよい。微生物の作用の阻害は、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸等のような様々な抗菌剤および抗真菌剤を含めることによって、確保されうる。同様に、糖、塩化ナトリウム等のような等張剤が組成物に望ましく含まれうる。さらに、注射可能な薬学的形態の持続的な吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅らせる物質を含めることによってもたらされうる。
【００８７】
場合によっては、薬物の効果を持続させるために、皮下注射または筋肉内注射からの薬物の吸収を遅らせることが望ましい。これは、水溶性が低い結晶またはアモルファス材料の液体懸濁液を用いることによって達成されうる。薬物の吸収速度はその溶解速度に依存し、その結果、結晶の大きさおよび結晶形に依存しうる。または、非経口投与剤形の吸収の遅延は、油性媒体に薬物を溶解または懸濁することによって行われる。
【００８８】
注射可能デポー剤形は、本発明の化合物の微小封入マトリクスを、ポリラクチド-ポリグリコリドのような生体分解性のポリマーにおいて形成することによって作製される。ポリマーに対する薬物の比、および用いる特定のポリマーの特性に応じて、薬物の放出速度を制御することができる。その他の生体分解性ポリマーの例には、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が含まれる。デポー注射可能製剤はまた、生体組織と適合性であるリポソームまたは微小乳液中に薬物を捕獲することによって調製される。
【００８９】
本発明の化合物を医薬品としてヒトおよび動物に投与する場合、それ自体を投与するか、または例えば0.1％〜99.5％（より好ましくは0.5％〜90％）の活性成分を薬学的に許容される担体と組み合わせて含む、薬学的組成物として投与することができる。
【００９０】
本発明の調製物を、経口投与、非経口投与、局所投与、または直腸内投与してもよい。それらは当然、それぞれの投与経路に適した形状で投与される。例えば、それらは、錠剤、またはカプセル剤、注射剤、吸入剤、眼科用ローション、軟膏、坐剤等、注射、注入、または吸入投与；ローションまたは軟膏による局所投与；および坐剤による直腸内投与によって投与される。経口投与が好ましい。
【００９１】
本明細書において用いられる「非経口投与」および「非経口的に投与する」という用語は、腸内および局所投与以外の投与様式、通常注射による投与を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、および槽内の注射および注入が含まれるがこれらに限定されない。
【００９２】
本明細書において用いられる「全身投与」、「全身に投与する」、「末梢投与」、および「末梢に投与する」という用語は、本明細書において、これが患者の神経系に入って、したがって代謝および他の類似の過程に供されるように、中枢神経系に直接投与する以外の化合物、薬物、または他の材料を投与すること、例えば皮下投与を意味する。
【００９３】
これらのペプチドおよび化合物を、例えばスプレーによる経口投与、鼻腔内投与、直腸内投与、膣内投与、非経口投与、槽内投与、および粉末、軟膏、または点眼液のような、経頬投与および舌下投与を含む局所的投与を含む、任意の適切な経路によって治療するために、ヒトおよびその他の動物に投与してもよい。
【００９４】
選択した投与経路にかかわらず、適切な水和型で用いられうる本発明の化合物および／または本発明の薬学的組成物は、当業者に公知である従来の方法によって薬学的に許容される投与剤形に製剤化される。
【００９５】
本発明の薬学的組成物における活性成分の実際の投与レベルを、患者に対して毒性を示さずに、特定の患者、組成物および投与様式に対して所望の治療反応を得るために有効な活性成分の量を得るために変更してもよい。
【００９６】
選択した用量レベルは、用いる本発明の特定の化合物、もしくはそのエステル、塩、もしくはアミドの活性、投与経路、投与時期、用いられる特定の化合物の排泄速度、治療期間、他の薬物、用いられる特定の化合物と組み合わせて用いられる化合物および／もしくは材料、治療すべき患者の年齢、性別、体重、状態、全身健康、および既往、ならびに医学の技術分野において公知の類似の要因を含む、様々な要因に依存すると考えられる。
【００９７】
当技術分野において通常の技術を有する医師または獣医師は、必要とされる薬学的組成物の有効量を容易に決定して処方することができる。例えば、医師または獣医師は薬学的組成物において用いられる本発明の化合物の用量を、所望の効果を得るために必要な用量より低いレベルで開始して、所望の効果が得られるまで用量を徐々に増加させることができる。
【００９８】
一般的に、本発明の化合物の適切な一日量は、治療効果を生じるために有効な最低用量である化合物の量であると考えられる。そのような有効量は、一般的に上記の要因に依存すると考えられる。一般的に、示された鎮痛効果のために用いる場合、本発明の化合物の患者への静脈内投与量、脳室内投与量および皮下投与量は、1日あたり体重1キログラムあたり約0.0001mg〜約100mgの範囲であると考えられる。
【００９９】
望ましいならば、活性化合物の有効な一日量を、1日を通じて適当な間隔で個別に2回、3回、4回、5回、6回またはそれ以上に分けて、任意に単位剤形で投与してもよい。
【０１００】
本発明の化合物を単独で投与することができるが、薬学的製剤（組成物）として化合物を投与することが好ましい。
【０１０１】
有糸分裂チェックポイントに欠損が起こると、染色体の喪失、細胞周期の乱れ、および多倍数体をもたらす。これらの欠損は腫瘍発生において役割を果たしうる。Mad1およびMAD2は、有糸分裂チェックポイントの制御を補助する遺伝子である。したがって、MAD1またはMAD2に変異を有する細胞をターゲティングすることは、癌の予防において実行可能な戦略である。
【０１０２】
MAD1および／またはMAD2における変異と不適合な変異を有する遺伝子は、有糸分裂チェックポイントの欠損を有する細胞を特異的に根絶して、機能的有糸分裂チェックポイントを有する細胞を残すことができる化合物に対する潜在的な薬物標的を提供する。そのような遺伝子における変異は、MAD1および／またはMAD2によって合成的に致死性である。
【０１０３】
本発明を全般的に記述したが、これは本発明の特定の局面および態様を説明する目的のために単に含まれるのであって本発明を制限することを意図していない、以下の実施例を参考にしてより容易に理解されるであろう。
【０１０４】
実施例1．MAD1変異によって合成的に致死性である遺伝子
以下の株を試験した：
2005509447.tif 000003
【０１０５】
したがって、4つの遺伝子における変異（TUB1、CIN8、STU1、およびSFI1）は、MAD1変異によって合成的に致死である。すなわち、これらの株は、TUB1、CIN8、SFI1、またはSTU1プラスミドによってそれぞれ形質転換されない限り、MAD1プラスミドがないと増殖できない。TUB1はαチューブリンをコードする。CIN8は、キネシン関連微小管運動タンパク質をコードする。STU1は、微小管関連タンパク質をコードする。SFI1は、新規タンパク質をコードする。
【０１０６】
実施例2．MAD2によって合成的に致死性である遺伝子のスクリーニング
プラスミドをMAD2遺伝子に関する酵母細胞変異体に導入する。このプラスミドは、Ty1と呼ばれる著しいレトロトランスポジションエレメントの発現および転移（transposition）を可能にする。ゲノムへの転移後、細胞の大部分が、ゲノムにランダムに挿入されたトランスポゾンの一つまたはいくつかのコピーを有する。細胞において、トランスポゾンのコピーが遺伝子に挿入されれば、その不活化がNAD2によって合成的に致死となり、MAD2および第二の遺伝子の双方がこの細胞内で不活化されるために、そのような細胞は分裂を停止すると考えられる。本発明者らは、数世代にわたって細胞を増殖させることによってそのような転移を見出す。そのような転移を有し、かつ分裂しない細胞は、活発に分裂する細胞の集団から急速に失われる。増殖選択機構の後、本発明者らは、選択した遺伝子におけるそのような転移の有無に関してゲノム全体を調査する。転移が無作為な過程であるため、特定の遺伝子にそのような転移が存在しなければ、この遺伝子は合成致死の候補となる。
【０１０７】
本実験は、機能的MAD2を有する細胞における平行選択によって制御される。そのような細胞では、機能的MAD2を有する細胞が増殖選択を生き残るために、（第二の）合成致死遺伝子候補において転移が起こるはずである。
【０１０８】
次に、MAD2による新規合成致死遺伝子候補を遺伝的に確認する。
【０１０９】
実施例3．微小管重合化、紡錘極体、微小管運動、および動原体の欠損は全て、紡錘体チェックポイントを活性化することによって有糸分裂中に細胞を停止させる
材料および方法：
材料および方法に関する詳細な説明に関しては、その全体が参照として本明細書に組み入れられる、ハードウィック（Hardwick）, K.G.、リ（Li）, R.、ミストロット（Mistrot）, C.、チェン（Chen）, R. H.、ダン（Dann）, P.、ラドナー（Rudner）, A.、およびミュレイ（Murray）, A. W.、「多くの異なる紡錘体成分における障害は、出芽酵母サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces serevisiae）における紡錘体チェックポイントを活性化する（Lesions in many different spindle components activate the spindle checkpoint in the budding yeast Saccharomyces serevisiae）」、Genetics 152、509〜518（1999）を参照されたい。S288Cと同系であるmps2-1およびtub2-403株ならびにそれらの誘導体を除き、用いた株は全てW303（MATa ade2-1 can1-100 ura3-1、leu2-3、112his3-11、15trp1-1）と同系である。
【０１１０】
MAD依存的チェックポイントを活性化する有糸分裂欠損の種類を調べるために、mad変異と、有糸分裂の特定の段階の実行において欠損を引き起こす変異との相互作用を調べる。これらには微小管脱重合を阻害する変異、紡錘極体複製を防止する変異、中心体結合タンパク質を除去する変異、および37℃で細胞を有糸分裂中に停止させるcdc変異が含まれる。有糸分裂変異を、2つの種類、すなわち条件的致死変異および非必須遺伝子におけるヌル変異において試験する。mad変異と、C2または有糸分裂中に停止を引き起こすcdc変異との相互作用を決定するために、mad cdc二重変異体の特性をcdc変異体単独の特性と比較する。cdc変異体の細胞周期停止点が紡錘体チェックポイントに依存していなければ、cdc mad二重変異体は、cdc変異体単独と全く同じ挙動を示す；細胞周期が非許容温度で停止し、許容温度でインキュベートすると、単一変異体および二重変異体が同じ速度で生存力を喪失する。これに対して、cdc変異体の停止が紡錘体チェックポイントに依存していれば、チェックポイントの不活性化により、たとえ紡錘体が欠損していても、mad cdc二重変異体は制限温度において有糸分裂すると考えられる。したがって、そのようなcdc変異をmad変異と組み合わせると、株を非許容温度でインキュベートした場合に、有糸分裂中に停止できず、cdc変異体単独より速く生存力を喪失する二重変異体が産生されると考えられる。
【０１１１】
実施例4．分析した遺伝子の誘導型発現に基づく合成致死スクリーニング
微小管運動が欠損している半数体をmad株と交配させることにより、実験を実施する。好ましい態様において、mad変異に関して既にヘテロ接合である株において微小管運動遺伝子を喪失させるために、遺伝子破壊を用いて、ヘテロ接合性を作製する実験を行う。この後者の方法は、kar3のような増殖の遅い株が抑制性変異を獲得する可能性を消失させるが、これはより面倒な方法である。
【０１１２】
劣性の合成致死変異を含むハイブリッドを野生型株と交配させて、胞子を形成させ、解剖し、胞子4連菌を、合成致死表現型の分離に関する適当な単一変異パターンに関してチェックする。そのような分離パターンを示す変異体を相補性によってクローニングする。酵母をスクリーニングするこの方法および他の方法の変法は公知であり（例えば、米国特許第5,912,154号；第5,908,752号；第5,876,951号；第5,869,287号；第5,866,338号；第5,789,184号；第5,674,996号；第5,578,477号；第5,527,896号；第5,352,581号；第5,175,091号；および第5,139,936号を参照のこと）、特定の目的に関してどれを選択するかを当業者は容易に理解している。
【０１１３】
実施例5．ヒトcDNAライブラリーによる酵母株の相補
本実施例において、異常なMAD1またはMAD2を有する酵母における上記の合成致死の代理になるタンパク質をコードするヒトcDNAが、それによって同定される原理を提供する。異常なMAD1またはMAD2を含む酵母株を構築する。ヒト胎児線維芽細胞から調製したmRNAを用いるcDNAライブラリーを、ヒトcDNAの発現のためのADHのような構成性酵母プロモーターを含む酵母菌（S. serevisiae）ベクターにおいて構築する（詳細に関しては、例えば米国特許第5,783,661号；第5,952,195号を参照のこと）。ライブラリーを宿主MAD1酵母株またはMAD2酵母株にトランスフェクトして、独立した形質転換体105個をレプリカ平板法によってグルコースまたはガラクトース上での増殖能に関してスクリーニングする。その結果、増殖パターンがヒトcDNAの発現によって救出されるいくつかの形質転換体が単離される。それらのいくつかは既に公知の遺伝子、例えばCDC14のヒト相同体、アベルソンマウス白血病ウイルス腫瘍遺伝子のヒト相同体ABL1、線維芽細胞増殖因子受容体bfr-2であるが、いくつかはあまり知られておらず、タンパク質キナーゼのeph/elkファミリーにおける上皮細胞受容体、カルシウムチャネルタンパク質、またはヒトWee1キナーゼのような遺伝子に関連するか、または「相同」であるように思われる。
【０１１４】
実施例6．薬学的アンタゴニストおよびアゴニストのスクリーニング
本発明において同定された細胞周期またはDNA複製障害を治療するために有用な薬物を、現在では上記の確立された酵母モデルを用いてスクリーニングすることができる。化学化合物、有機化合物および無機化合物、ペプチド、またはペプチド模倣物、アンチセンス分子、抗体等のようないくつかの種類の薬物をスクリーニングすることができる。化学ライブラリーのハイスループットスクリーニングを作製および実施する方法は十分に確立されており、当業者に公知である。細胞周期調節において得られた見通しを用いて、酵母に基づくアッセイ法において選択された候補物質をスクリーニングするため、かつ哺乳類細胞または細胞株をさらに調べることによってその治療的可能性を評価するための薬物発見プログラムを確立する。本質的に、アッセイ法は、致死性を観察する対照系および薬物が添加される試験系からなり、その効果は対照系と試験系間の差に基づいて評価される。薬物が致死性を増強するか、またはこれを逆転させれば、この薬物は第一の遺伝子および第二の遺伝子によって制御される生化学経路において特異的である可能性がある、候補薬物と見なされる。特異性は多くの特異性決定試験、例えば、標的遺伝子またはその産物との結合能によって、当初認められた効果を逆転させる二重変異体の導入によって、遺伝子産物の酵素活性に及ぼす影響に関するインビトロ試験等によって、さらに試験される。これらの薬学的薬剤は、予測可能的に細胞周期の局面を理想的に阻害して、それによって癌またはその他の細胞周期関連臨床状態における有望性の決定を可能にすると考えられた。試験した化合物のいくつかは、薬学的に許容される濃度で活性であることが判明する。これらには、トリブチレート（4-フェニル酪酸ナトリウム塩、またはナトリウムフェニルブチレート）、当技術分野で公知の手段によって調製される様々なベンゾピラン誘導体が含まれるが、これらに限定されない。例えば、米国特許第5,359,115号；第5,362,899号；第5,288,514号；第5,733,920号または国際公開公報第94/08051号；国際公開公報第92/10092号；国際公開公報第93/09668号；国際公開公報第91/07087号；国際公開公報第93/20242号を参照のこと。したがって、本発明の化合物の1000個〜100,000個以上のオーダーのディバーソマー（diversomer）の多様なライブラリーを合成することができ、PCT国際公開公報第94/09135号に記載のように、阻害剤を検出するためのハイスループットアッセイ法を用いることによって、生物活性を迅速にスクリーニングすることができる。組み合わせ（combinatorial）合成方法の概論、ならびにライブラリースクリーニングおよび脱重畳積分解析方法に関しては、例えばE. M. ゴードン（Gordon)ら、（1994）J. Med. Chem. 37：1385〜1401、およびそれらに引用された参考文献を参照されたい。
【０１１５】
実施例7．良性細胞増殖または悪性細胞増殖による臨床病態の治療
次に、酵母に基づくアッセイ法において陽性とスクリーニングされた薬物を、過度の細胞増殖によって引き起こされる疾患の治療について試験する。そのような疾患のほとんどが悪性疾患、すなわち多様な種類の癌であり、以下のような固形腫瘍および白血病であるが、これらに限定されない：アプドーマ、分離腫、鰓腫、悪性カルチノイド症候群、カルチノイド心疾患、癌（例えば、ウォーカー癌、基底細胞癌、基底有棘細胞癌、ブラウン-ピアース（Brown-Pearce）癌、腺管癌、エールリッヒ腫瘍、クレブス2腫瘍、メルケル細胞腫、粘液性癌腫、非小細胞肺癌、燕麦細胞癌、乳頭状癌、硬性癌、細気管支、細気管支癌、気管支原生癌、扁平上皮細胞癌、および移行上皮癌）、組織球障害、白血病（例えば、B細胞白血病、混合型白血病、ヌル細胞白血病、T細胞白血病、慢性T細胞白血病、HTLV-II関連白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、肥満細胞性白血病、および骨髄性白血病）、悪性組織球増殖症、ホジキン病、免疫増殖性小（immunoproliferative small）、非ホジキンリンパ腫、形質細胞腫、細網組織増殖症、黒色腫、軟骨芽細胞腫、軟骨腫、軟骨肉腫、線維腫、線維肉腫、巨細胞腫、組織球腫、脂肪腫、脂肪肉腫、中皮腫、粘液腫、粘液肉腫、骨腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、滑膜腫、腺線維腫、腺リンパ腫、癌肉腫、脊索腫、頭蓋咽頭腫、未分化胚細胞腫、過誤腫、間葉腫、中腎腫、筋肉腫、エナメル上皮腫、セメント質腫、歯牙腫、奇形種、胸腺腫、栄養膜腫（trophoblastic tumor）、腺癌、腺腫、胆管腫、コレステリン腫、円柱腫、嚢胞腺癌、嚢胞腺腫、顆粒膜細胞腫、男性胚細胞腫、肝癌、汗腺腫、島細胞腫（islet cell tumor）、ライディヒ細胞腫（Leydig cell tumor）、乳頭腫、セルトリ細胞腫、卵胞膜細胞腫、平滑筋腫、平滑筋肉腫、筋原細胞腫、筋腫、筋肉腫、横紋筋腫、横紋筋肉腫、脳室上皮腫、神経節細胞腫、神経膠腫、髄芽細胞腫、髄膜腫、神経鞘腫（neurilemmoma）、神経芽腫、神経上皮腫、神経線維腫、神経腫、傍神経節腫、非クロム親和性傍神経節腫（paraganglioma nonchromaffin）、被角血管腫、好酸球増多随伴性血管類リンパ組織増殖症、硬化性血管腫（angioma sclerosing）、血管腫症、グロムス血管腫、血管内皮腫、血管腫、血管外皮細胞腫、血管肉腫、リンパ管腫、リンパ管筋腫（lymphangiomyoma）、リンパ管肉腫、松果体腫、癌肉腫、軟骨肉腫、葉状嚢肉腫、線維肉腫、血管肉腫、平滑筋肉腫、白血肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、筋肉腫、粘液肉腫、卵巣癌、横紋筋肉腫、肉腫、新生物（例えば、骨新生物、胸部新生物、消化器系新生物、結腸直腸新生物、肝臓新生物、膵臓新生物、下垂体新生物、精巣新生物、眼窩新生物、頭頸部新生物、中枢神経新生物、耳道（acoustic）新生物、骨盤新生物、気道新生物、および尿性器新生物）、神経線維腫症、子宮頸部異形成。
【０１１６】
いくつかの疾患は、過度だが良性の細胞増殖（すなわち、非悪性）によって起こる。そのような疾患の例は、以下である：線維症、良性前立腺過形成、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、糸球体硬化症、ケロイド、乾せん、黒子、角化症、線維性軟ゆう、伝染性軟属腫、性病いぼ、皮脂腺過形成（sebaceous hyperplasia）、尖圭コンジローム、血管腫、静脈湖、軟骨皮膚炎（chondrodermatitis）、化膿性肉芽腫、化膿性汗腺炎、ケロイド、角化棘細胞腫、白斑症、多発性皮脂嚢腫、睫毛乱生症、表層上皮母斑（superficial epithelial nevus）、ポリープ、接合部母斑（junctional nevus）、化膿性肉芽腫、結節性痒疹、皮膚線維腫、脂腺腫、およびその他の皮膚疾患、ならびに例えばカポジ肉腫、乳頭腫のような非悪性新生物疾患。
【０１１７】
次に、ナトリウムフェニルブチレートまたはベンゾピラン誘導体の効果を、インビボにおけるヒト神経膠芽細胞腫細胞の腫瘍発生表現型について決定する。フィッシャー344系ラットの右脳半球の深部白質に同系9L神経膠肉腫細胞（4×104個）を接種した。その後、皮下に移植した浸透圧ミニポンプを用いて、動物をナトリウムフェニルブチレート（550 mg/kg/日、皮下投与）による2週間連続治療に供した。対照のラットにおいてはミニポンプを生理食塩水で満たした。データの統計分析には、フィッシャーの正確検定（Fisher's Exact Test）を用いた。薬物による神経膠芽腫細胞の処理によって、時間および用量依存的な増殖の停止が起こり、これに付随して同様にDNA合成も減少した。4mMフェニルブチレートによる連続的な処理を4日〜6日行うと、増殖が約50％阻害される。フェニルアセテートの中間代謝物であるフェニルブチレートは腫瘍細胞複製を阻害したが、最終代謝物であるフェニルアセチルグルタミンは不活性である。選択的な腫瘍の細胞分裂の停止に加えて、フェニルアセテートとフェニルブチレートはいずれも、無胸腺マウスにおける細胞骨格中間体フィラメントのパターンの変化、接着独立性の喪失、および腫瘍形成性の減少によって明らかになるように、細胞の成熟および非悪性表現型への変換を促進した。腫瘍の挙動におけるこれらの顕著な変化は、増殖制御、血管新生、および免疫抑制に関係するサイクリン遺伝子の発現の変化を伴う。
【０１１８】
上記に引用したインターネットの典拠、特許、出版物、およびその中に含まれる引用文献は全て、それぞれの全体を参照するために特に参照として本明細書に組み入れられる。
【０１１９】
以上のように本発明を説明したが、これが様々に変化させられうることは明らかであろう。そのような変更は、本発明の趣旨および範囲から逸脱しないと見なされ、そのような改変は全て、添付の特許請求の範囲に含まれると解釈される。
【国際調査報告】
2005509447.tif 000004
2005509447.tif 000005
2005509447.tif 000006
2005509447.tif 000007