(57)【要約】サーファクタントプロテインＤ（ＳＰ−Ｄ）は、肺の上皮細胞中で発現される膠原性レクチンドメイン含有タンパク質のコレクチンファミリーの４３ｋＤａ成員である。ＳＰ−Ｄ遺伝子は、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスを産生するために用いられる胚性幹細胞中での相同組換えにより標的化された。ＳＰ−Ｄ（−／−）欠損は、炎症、単離肺胞マクロファージによる酸化剤産生増大、異常界面活性剤構造およびレベル、ならびにＳＰ−Ａ発現低減を引き起こした。したがって気腫に関する優れたモデルとしてのＳＰ−Ｄ（−／−）マウスが開示される。マウスモデルにおける気腫療法を試験するためのモデル、気腫および肺感染のための治療、ならびに診断としてのＳＰ−Ｄタンパク質またはＤＮＡを使用する方法も含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺疾患を予防および治療する方法であって、肺疾患の症状を低減するかまたは肺疾患を予防するのに有効な量でヒトに、哺乳動物ＳＰ−Ｄタンパク質もしくは活性変異体、または哺乳動物ＳＰ−Ｄタンパク質もしくは活性変異体を発現するベクターを導入することを含む方法。
【請求項２】
肺疾患は気腫である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ＳＰ−Ｄタンパク質は気管内に投与される請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記ＳＰ−Ｄタンパク質はアデノウイルスベクターから発現される請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記アデノウイルスベクターはエアロゾル化により導入される請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記アデノウイルスベクターはアデノウイルスベクターＡｄ−ｒＳＰＤである請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記肺疾患は、嚢胞性線維症、気腫、感染性疾患、炎症性疾患および移殖拒絶からなる群から選択される疾患である請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記感染性疾患は細菌、ウイルス、真菌および原生動物からなる群から選択される請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記ウイルス性疾患は任意の肺ウイルス性疾患である請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記肺ウイルス性疾患は、Ａ型インフルエンザ、ライノウイルス、コロナウイルス、ＲＳＶ、水痘、ヒトパルボウイルスＢ１９、１〜３型パラインフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、アデノウイルス、ハンタウイルスおよび風疹からなる群から選択される請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記ヒトは免疫不全であり、未熟肺発達を有し、高齢であり、または慢性肺疾患を有する請求項１記載の方法。
【請求項１２】
ＳＰ−Ｄの前記活性変異体は、切断、塩基変化、キメラまたは欠失変異体からなる群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項１３】
肺疾患を予防および治療する方法であって、
哺乳動物ＳＰ−Ｄタンパク質もしくはＳＰ−Ｄ変異体、または哺乳動物ＳＰ−Ｄタンパク質もしくはＳＰ−Ｄ変異体を発現するベクターを、肺疾患の症状を低減しまたは肺疾患を予防するのに有効な量でヒトに導入することを含み、
肺疾患は活性酸素媒介性の疾患、化学的誘導性肺損傷、酸素ラジカルによる損傷、オゾンによる損傷、化学療法薬による損傷、炎症性および感染性疾患、再灌流傷害、溺水、移殖および拒絶からなる群から選択される方法。
【請求項１４】
哺乳動物におけるウイルス性疾患を予防および治療する方法であって、
哺乳動物ＳＰ−Ｄタンパク質、活性変異体または哺乳動物ＳＰ−Ｄタンパク質もしくは活性変異体を発現するベクターを、ウイルス性疾患のウイルスの数または症状を低減するのに有効な量でヒトに導入すること
を含む方法。
【請求項１５】
ウイルス性疾患は、アデノウイルス、ＲＳＶ、インフルエンザウイルス、水痘、第五病、サイトメガロウイルス、ライノウイルス、風疹ウイルスおよびサイトメガロウイルスからなる群から選択されるウイルスにより引き起こされる請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
感染が取り除かれた後に存続する症状を治療することをさらに含む請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
前記哺乳動物は免疫不全であり、高齢であり、未熟肺発達を有する患者であり、慢性肺疾患を有する患者からなる群から選択されるヒト患者である請求項１４記載の方法。
【請求項１８】
肺中のメタロプロテイナーゼ活性および活性酸素種を抑制する方法であって、メタロプロテイナーゼ活性および活性酸素種を抑制するのに有効な量で肺にＳＰ−Ｄを投与することを含む方法。
【請求項１９】
哺乳動物の肺または肺細胞中のＮＦ−κＢ活性を抑制する方法であって、ＮＦ−κＢ活性を抑制するのに十分な量のＳＰ−Ｄまたは活性ＳＰ−Ｄ変異体を投与することを含む方法。
【請求項２０】
ＳＮ−５０およびＩκＢからなる群から選択されるＮＦ−κＢ阻害剤を投与することをさらに含む請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
哺乳動物の肺胞マクロファージ中のメタロプロテイナーゼ活性低減または活性酸素種減少と関連した障害を治療する方法であって、
ＮＦ−κＢを全身的にまたは局所的に投与するかまたは活性化すること
を含む方法。
【請求項２２】
前記ＮＦ−κＢ活性剤は、  からなる群から選択される請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
哺乳動物における風邪、インフルエンザおよびアレルギーと関連した症状を治療する方法であって、
前記哺乳動物の肺または肺細胞に有効な量のＳＰ−Ｄまたは活性ＳＰ−Ｄ変異体を投与すること
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（本発明における政府の権利）
本明細書中に開示された本発明のいくつかの態様は、米国国立衛生研究所補助金ＨＬ  ４１３２０、ＳＣＯＲ  ＨＬ  ５６３８７、ＨＬ  ２８６２３、ＨＬ  ５８７９５およびＨＬ  ０３９０５下の合衆国政府後援で成された。合衆国政府は、本発明のこれらの態様において一定の権利を有する。
【０００２】
［発明の分野］
本発明は包括的に、生物学的に活性なタンパク質の分野に関する。特に本発明は、肺およびＳＰ−Ｄ（−／−）ヌルマウスにおける肺サーファクタント恒常性および構造、ならびに肺胞構造に関与するＳＰ−Ｄタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００３】
［発明の背景］
肺サーファクタントは、肺における正常肺力学およびガス交換に不可欠である。肺サーファクタントはＩＩ型上皮細胞により産生され、肺における表面張力を下げるサーファクタントの能力を付与するリン脂質構成成分から作られる。さらに、膠原性レクチンドメイン含有ポリペプチドであるコレクチンと呼ばれるサーファクタントに関連したタンパク質が存在する。これらのうちの２つ、すなわちサーファクタントプロテインＡ（ＳＰ−Ａ）およびサーファクタントプロテインＤ（ＳＰ−Ｄ）とよばれるものは、サーファクタントの構造および機能ならびに宿主防御に関与する傾向がある。肺サーファクタントにおける定量的および定性的欠損はともに、新生児呼吸窮迫、成人性呼吸窮迫症候群、サーファクタントプロテインＢの先天性欠損、ならびにアレルギー性喘息と関連がある。さらに、肺サーファクタントの欠損は、特に不適切なまたは損なわれた特異的免疫の設定（setting）において、微生物攻撃誘発（challenge）に対する何人かの個体の感受性増大に関与し得る。これらの障害ならびに肺炎の危険増大に関連したいくつかの障害（嚢胞性線維症、喘息、未熟、慢性気管支炎、びまん性肺胞障害）も、コレクチン機能の後天性欠陥または欠損に関連し得る。肺胞サーファクタントプールは、肺胞マクロファージによるこれらの構成成分の細胞内合成、分泌、再取込みおよび分解を含めた多レベルで調節される。サーファクタントリン脂質およびタンパク質の合成およびクリアランスはさらに、出生後の定常状態サーファクタント濃度を保持するために役立つ発生的、機械的および体液性刺激により影響を及ぼされる。
【０００４】
サーファクタントおよび正常肺機能におけるコレクチンの役割は、広範に研究されてきた。Ｃ型レクチンのコレクチンファミリーとしては、既知の宿主防御機能を有する多数の分子が挙げられる。ＳＰ−ＡおよびＳＰ−Ｄ（これらもＣ型レクチンである）は、インフルエンザウイルスおよび単純ヘルペスウイルスならびにグラム陽性およびグラム陰性細菌および種々の真菌と結合する。結合することにより、それらは、肺胞マクロファージおよび好中球による取込みを強化する。ＳＰ−ＡおよびＳＰ−Ｄに関する種々の細胞結合部位が、肺胞マクロファージ上に、あるいはＳＰ−Ａの場合には、ＩＩ型上皮細胞上に同定されている。宿主防御におけるＳＰ−Ａの重大な役割は、ＳＰ−Ａ欠損マウスが、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＢ群連鎖球菌、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、呼吸器合胞体ウイルス、アデノウイルスおよびマイコプラズマによる感染に感受性である、という観察により支持された。したがって呼吸器防御メカニズムにおけるＳＰ−Ａに関する明らかな役割と、ＳＰ−Ｄに関する見込み的な役割が存在する。コレクチンは、その他の複雑な有機物質（例えば花粉および埃ダニアレルゲン）の認識またはクリアランスにも関与し得る。しかしながら今日まで、ＳＰ−ＡまたはＳＰ−Ｄの特異的欠損に関連づけられたヒト疾患はない。
【０００５】
ＳＰ−Ｄは、肺における宿主防御に一役を果たすと提唱されてきた４３キロダルトンタンパク質である。そのｃＤＮＡおよび遺伝子は、ヒトも含めた種々の哺乳動物においてシーケンシングされている。ＳＰ−Ｄは、その他のＣ型レクチン、例えばサーファクタントプロテインＡ（ＳＰ−Ａ）、コングルチニン、ウシコレクチン−４３およびマンノース結合タンパク質とかなりの構造的相同性を共有する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験および哺乳動物Ｃａ２＋依存性レクチンファミリーとのその密接な構造的関係（特に共有構造モチーフ）は、宿主防御におけるその役割を支持する。ＳＰ−Ｄは、肺中のＩＩ型上皮細胞および非繊毛性細気管支上皮細胞により主としてそして相対的に高濃度で合成されるが、消化管、心臓、腎臓、膵臓、尿生殖路および腸間膜細胞中でも発現され得る。ＳＰ−Ｄは、結合、凝集、オプソニン化、そしていくつかの場合にはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの食細胞による殺害の活性化をもたらすそのレクチンドメイン（または糖結合ドメイン）を介して生物体の表面に結合する、ということをｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験は実証した。ＳＰ−Ｄは、リポ多糖、種々の細菌、真菌およびウイルス（例えばインフルエンザウイルス）と結合する。ＳＰ−Ｄは、肺胞マクロファージおよび多形核細胞の両方とも結合する。おそらくＳＰ−Ｄは、サーファクタントリン脂質恒常性において一役、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＩＩ型細胞によるリン脂質代謝に及ぼすＳＰ−Ａの作用を果たし得るが、しかしながらこれは論争の余地があり、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＳＰ−Ｄの明確な役割は依然として不明である。
【０００６】
サーファクタントプロテインはサーファクタント恒常性の調節に重要であり得る、という概念をｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験は支持している。疎水性サーファクタントプロテインＳＰ−ＢおよびＳＰ−Ｃはサーファクタント単一層の生成において役割を有するが、サーファクタントプロテインＡもＩＩ型上皮細胞によるサーファクタント取込みおよび／または分泌を促し得る、ということをｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験は示した。実際、ＳＰ−Ａはサーファクタント恒常性において主要な役割を有する、と広く考えられていた。しかしながらＳＰ−Ａヌルマウスについての最近の研究は、サーファクタント分泌または再取込みにおけるサーファクタントプロテインＡの主な役割を支持していない。ＳＰ−Ａの非存在は、肺の明らかな生理学的または形態学的構造異常をもたらさない。ＳＰ−Ａヌル突然変異体マウスは管状ミエリン形状を欠くが、しかし迅速に吸収し、単一層を生じる高機能的サーファクタントを生じる。サーファクタント脂質合成、分泌および再取込みは、ＳＰ−Ａヌルマウスにおいては本質的に正常であった。
【０００７】
したがってサーファクタント調節において作用する付加的サーファクタントプロテインは、依然として同定されていない。さらに正常肺機能におけるＳＰ−Ｄの明確な役割は、この点では明らかに限定されておらず、疾患または疾患感受性におけるその役割は不明である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
［発明の概要］
本発明は、気腫のモデルとして用いられ得るＳＰ−Ｄ（−／−）マウスを提供する。従来、ＳＰ−Ｄタンパク質が肺脂質恒常性に関与することは既知でなかった。ＳＰ−Ｄヌルマウスが気腫の症状を有することも既知でなかった。
【０００９】
本発明の一実施形態は、ＳＰ−Ｄ（−／−）非ヒト哺乳動物を含む、気腫のための非ヒト哺乳動物モデルである。
【００１０】
さらなる実施形態は、哺乳動物ＳＰ−Ｄタンパク質または哺乳動物ＳＰ−Ｄタンパク質を発現するベクターを、肺疾患の症状を低減しまたは肺疾患を予防するのに有効な量でヒトまたは哺乳動物に導入することにより、肺疾患を精製および治療する方法である。
【００１１】
さらなる実施形態は、ＳＰ−Ｄタンパク質と薬学的に許容可能な担体との混合物である、肺疾患を治療するのに有効な薬学的組成物である。
【００１２】
さらなる実施形態は、ＳＰ−Ｄをアップレギュレートする作用物質である、哺乳動物における肺疾患を治療するための生物学的に活性な作用物質である。
【００１３】
さらなる実施形態は、ＳＰ−Ｄタンパク質と相互作用する作用物質である、哺乳動物における肺疾患を治療するための生物学的に活性な作用物質である。
【００１４】
さらなる実施形態は、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションまたはＥＬＩＳＡにより、欠損ＳＰ−Ｄを生じるＳＰ−Ｄ遺伝子における突然変異を識別し、試験哺乳動物における突然変異を識別することによって哺乳動物における肺疾患に対する感受性を診断する方法である。
【００１５】
さらなる実施形態は、ＳＰ−Ｄヌルマウスに肺疾患を発症させ、哺乳動物に薬学的作用物質を投与し、そして肺疾患が改善した場合にその作用物質を有効であると同定することにより、肺疾患の治療に有用な薬学的作用物質を識別する方法である。
【００１６】
さらなる実施形態は、ＳＰ−Ｄタンパク質を産生しない任意のマウスからの固相肺ホモジネートを用いてＳＰ−Ｄ抗体を精製する方法である。
【００１７】
さらなる実施形態は、哺乳動物ＳＰ−Ｄタンパク質、または哺乳動物ＳＰ−Ｄタンパク質を発現するベクターを、肺疾患の症状を低減しまたは肺疾患を予防するのに有効な量でヒトに導入することにより、肺疾患を予防する方法であって、肺疾患が活性酸素媒介性の疾患、化学的誘導性肺損傷、酸素ラジカルによる損傷、オゾンによる損傷、化学療法薬による損傷、炎症性および感染性疾患、再灌流損傷、溺水、移殖および拒絶からなる群から選択される方法である。
【００１８】
本発明のさらなる実施形態は、哺乳動物ＳＰ−Ｄタンパク質、または哺乳動物ＳＰ−Ｄタンパク質を発現するベクターを、ウイルス性疾患のウイルスの数または症状を低減するのに有効な量でヒトに導入することにより、哺乳動物におけるウイルス性疾患を予防および治療する方法である。好ましくは、ウイルスはアデノウイルス、ＲＳＶおよびインフルエンザウイルスである。
【００１９】
［発明の詳細な説明］
正常肺の機能および発生におけるＳＰ−Ｄの役割を確認し、これらのマウスの肺における出生後空気間隙拡大および自発性の炎症性変化の時間的進行を実証するために、ＳＰ−Ｄ（−／−）ノックアウトマウスを本発明者らは産生した。ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスは、肺胞マクロファージによる慢性炎症および酸化剤産生増大に関連した進行性肺気腫を発症する。肺異常は、このマウスを気腫の優れたモデルにする。気腫の治療のための既存の療法は非常に少ないため、肺容積低減手術が最も一般的であり、そのモデルが緊急に必要とされる。気腫に関するマウスモデルに基づいて、気腫またはその他の形態の慢性肺損傷を治療する場合の効力に関して、マウスモデルにおけるＳＰ−Ｄタンパク質および発現ベクター、ならびに考え得る製剤を試験するための多数の方法を、本発明者らは提示した。異所性サーファクタント産生、肺線維症、サルコイドーシス、肺損傷、毒物／酸素曝露、感染、酸化剤曝露増大の種々のその他の疾患を治療するためのＳＰ−Ｄタンパク質および発現ベクターの使用も、本発明者らは提示した。最後に、気腫、肺窮迫症候群およびその他の種類の呼吸器疾患の危険に直面した患者を識別するために、ＳＰ−Ｄ  ｃＤＮＡ、ＳＰ−Ｄ抗体、ＰＣＲおよびディフェレンシャル（differential）ハイブリダイゼーション技法を用いることを、本発明者らは提示した。本明細書中に記載されたものと類似のまたは等価のその他の物質および方法が本発明の実施または試験に用いられ得るが、好ましい方法および物質を次に記載する。実施例１は、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスを産生するために必要とされる過程を記載する。
【００２０】
【表１】
2005507941.tif 000002
【実施例１】
【００２１】
ＳＰ−Ｄ（−／−）ノックアウトマウス構築
標的化遺伝子不活性化により、ＳＰ−Ｄマウスを生成した。ＳＰ−Ｄ遺伝子のエキソン
２からの配列を含有するｐＧＫｎｅｏターゲッティングベクターの組込みは、開始メチオニンおよび翻訳開始配列の除去を包含するＳＰ−Ｄ遺伝子の第二エキソンの欠失を生じた。エキソン１および２のマウスＳＰ−Ｄ遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ０４７７４１で見出され得る。ネオマイシン耐性カセットおよびチミジンキナーゼカセット間のＫｐｎＩ部位中に、イントロン２〜エキソン６をコードする５．１ｋｂ平滑末端化ＫｐｎＩ尾ＨｉｎｄＩＩＩゲノム断片を先ずサブクローニングすることにより、ｐＧＫｎｅｏを用いて、ターゲッティングベクターを設計した。その後、イントロンＩの一部を含有する１．５ｋｂゲノムＰｓｔＩ断片をＸｈｏＩリンカーで末端につないで、ネオマイシン耐性カセットからのＸｈｏＩ部位５’中にクローン化した。二重選択方法を生き延びた１０４のＥＳクローンのうちの８つを、５’および３’ＰＣＲ分析の両方により確定されるように、的確に標的化した。高度非分化および増殖性クローンであるクローン９３を展開させ、Ｃ５７／Ｂ１６胚盤胞中に注射して、キメラ雄を生成した。キメラ雄をＮＩＨ  Ｓｗｉｓｓ  Ｂｌａｃｋ雌と交配した。標的化遺伝子を保有する雌を得て、ＮＩＨ  Ｓｗｉｓｓ  Ｂｌａｃｋ雄と交配して、正常ＳＰ−Ｄ（−／−）およびＳＰ−Ｄ（＋／−）マウスを生じた。ヘテロ接合性交配はメンデル様式に従い、１１５匹の子孫のうち３０（＋／＋）、４５（＋／−）および２５％（−／−）で、これはＳＰ−Ｄ対立遺伝子に関連した生存に明らかな異常が存在しなかったことを示す。
【００２２】
ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスは、オハイオ州シンシナティの小児病院医療センター（Children’s Hospital Medical Center, Cincinnati, Ohio）の障壁封じ込め施設（barrier containment facilities）下の生態飼育場で、正常に生き残り、繁殖する。マウスは、血清学により査定した場合、無ウイルス状態であった。ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおけるウイルス感染の血清学的証拠は、剖検時に検出されなかった。
【００２３】
遺伝子型を確定するために、尾部クリップからのＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し、エキソン２およびイントロン２の一部を含有するゲノムマウスＤＮＡ由来のＰＣＲ産物を用いて、ならびにＧ４１８耐性ｃＤＮＡクローンを用いてプローブした。これは、ＳＰ−Ｄ（＋／−）およびＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおけるＧ４１８耐性をコードする配列の出現に伴うエキソン２の同時損失を実証した。
【００２４】
ＳＰ−Ｄがヌル動物において発現されなかったことを実証するために、ヌル、正常およびヘテロ接合動物からの総肺ＲＮＡを用いてＲＮＡブロット分析を実行した。結果は、ヌル動物における正常サイズのＳＰ−ＤｍＲＮＡの全体的非存在を伴うヘテロ接合動物におけるＳＰ−Ｄハイブリダイゼーション帯域の強度の約５０％減を示した。長期曝露後、正常ＳＰ−ＤｍＲＮＡより約１５０ヌクレオチド小さい拡散性のｍＲＮＡ帯域が検出された。走査濃度測定により、この帯域は、ヘテロ接合動物からの正常ＳＰ−Ｄ転写体の強度の５％未満を示す。
【００２５】
ウサギ抗ラットＳＰ−Ｄ抗血清を用いた肺ホモジネートのウエスタンブロット分析は、ＳＰ−Ｄがヘテロ接合ＳＰ−Ｄ（＋／−）マウスにおいて約５０％低減され、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいては存在しない、ということを明示した。
【００２６】
ＳＰ−Ｄ（−／−）およびＳＰ−Ｄ（＋／−）マウスはともに、周産期および出生後の期間を正常に生き延びた。選定齢で、体重、肺および心臓重量を直接測定により得た。肺および心臓容積は流体置換により得た。標準としてそれぞれウシ血清アルブミンおよびサケ精子ＤＮＡを用いて、肺タンパク質およびＤＮＡ含量を査定した。ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスの体重は離乳前はわずかに少なかったが、しかし３週齢後のＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスと有意に異ならなかった（表１）。肺容積は有意に異ならなかったが、肺容積対体重比は、３および６週齢ではＳＰ−Ｄ（−／−）マウスで増大された（表１）。心臓容積または心臓容積対体重比において、有意差は観察されなかった。成熟時（５ヶ月）、湿肺重量、総肺ＤＮＡまたはタンパク質における変化は認められなかった。
【００２７】
しかしながら異常が体重において観察されなかったが、一方、実施例２〜５は、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいて見出された別の異常または変化を記載する。
【００２８】
実施例２は、リン脂質レベルに及ぼす作用を実証する。肺胞および組織リン脂質レベル、特にホスファチジルコリンプールレベルは顕著に増大されたが、一方、総気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）タンパク質レベルは依然として変わらなかった。
【実施例２】
【００２９】
ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおけるリン脂質レベル
肺胞、組織および総飽和ホスファチジルコリン（Ｓａｔ−ＰＣ）（ｐ＜０．００１）は、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいて約３倍増大された。Ｓａｔ−ＰＣのレベルは、ＳＰ−Ｄ（＋／−）マウスにおいては変わらなかった。肺胞洗浄リン脂質組成分析のために、２〜３匹のマウスからのプール化洗浄液から成る２〜４つの試料を、相対的に多量のホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリンおよびリソビスホスファチジン酸に関して評価した。リン脂質組成は遺伝子型間では異なっていなかった。総肺Ｓａｔ−ＰＣ中への（３Ｈ）コリンの組入れは、注射の８時間後にわずかに増大され、組入れはＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいて約２０％より多かった（ｐ＜０．０５）。
【００３０】
この結果は、従来の研究が肺リン脂質恒常性におけるＳＰ−Ａに関する明確な役割およびＳＰ−Ｄに関する限定的役割を示唆する場合、完全に予測されなかった。サーファクタント恒常性に関連した従来の疾患は、サーファクタントプロテインおよび脂質の両方の蓄積を包含し、したがってＳＰ−Ｄ（−／−）ヌルマウスは、ＳＰ−Ｄがサーファクタント脂質恒常性において重要な役割を果たすものであり、そしてサーファクタント中の総タンパク質濃度は変わらなかったため、サーファクタント脂質およびタンパク質恒常性はｉｎ  ｖｉｖｏで引き離され得る、ということをはじめて実証する。しかしながら、実施例３で説明されるように、ＳＰ−Ａの総濃度の控えめな低減が認められた。
【実施例３】
【００３１】
ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおけるＳＰ−Ａレベルの低減
ＳＰ−ＢおよびＳＰ−ＣｍＲＮＡまたはタンパク質における差異は、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスでは観察されなかった。これに対比して、ＳＰ−Ｄ（＋／＋）、ＳＰ−Ｄ（＋／−）およびＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからの総肺ＲＮＡのノーザンブロットハイブリダイゼーション、ならびにＳＰ−Ａプローブとのハイブリダイゼーションは、ＳＰ−ＡｍＲＮＡがＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいて低減されたことを示した。ＳＰ−ＡｍＲＮＡにおける低減と一致して、ＢＡＬ  ＳＰ−Ａタンパク質は、３匹のマウスからの肺胞洗浄のウエスタンブロット分析により査定した場合、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいて外見上約２５％低減された。
【００３２】
したがってＳＰ−Ｄは、ＳＰ−Ａ産生の調節において一役を有する。ＳＰ−Ａは肺における宿主防御に関与するため、ＳＰ−Ｄは２つの方法で宿主防御に影響を及ぼし得る。すなわち、ＳＰ−Ａ産生のアップレギュレーションにより、そして免疫と微生物細胞との直接相互作用による。
【００３３】
ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスのＢＡＬから単離される富リン脂質物質の微細構造を、実施例４に説明されるように評価した。
【実施例４】
【００３４】
ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおけるサーファクタント構造の変化
ＳＰ−Ｄ（−／−）およびＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスのプール化肺胞洗浄液から洗浄凝集体サーファクタントを単離し、下記に概説する技法を用いてＥＭにより検査した。ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおける脂質凝集体は拡張され、電子密度リン脂質アレイに体系化され、そしてＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスと比較して低管状ミエリンを含有した。微細構造は、顕著に異常であることを立証し、低減量の管状ミエリンを含有し、独特の高密度パック脂質構造を形成した。したがってＳＰ−Ｄは、肺胞脂質の構造的構成において一役を有する。
【００３５】
凝集体は肺胞洗浄液から生じる
肺胞中のサーファクタントは、遠心分離により大型凝集体（重、高密度）および小凝集体（軽、小胞性）分画に分離され得る。肺胞洗浄液を、４０，０００ｘｇで０．８Ｍスクロースクッション上で１５分間遠心分離した。次に大型凝集体サーファクタントを界面から収集し、通常生理食塩溶液で希釈し、４０，０００ｘｇで１５分間遠心分離した。小凝集体サーファクタントを含有する最初の４０，０００ｘｇ遠心分離からの上清を、３００，０００分子量保持フィルター（ミニタン（Minitan）, Milipore Corp., Bedford, MA）または遠心濃縮機（Amicon Corp., Danvers, MA）を用いて、限外濾過により４℃で濃縮する。小凝集体サーファクタントを５０ｍｌ通常生理食塩溶液で希釈し、３回限外濾過して、可溶性タンパク質を除去する。
【００３６】
最後に、肺の構造を分析した。ＳＰ−Ｄ（＋／−）マウスでは正常であるが、大型の泡沫状肺胞マクロファージ数の増大および肺胞拡張がＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいて観察された。実施例５では、肺異常を識別するための方法および結果を略記する。
【実施例５】
【００３７】
ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおける肺異常
ＳＰ−Ｄ発現の非存在が構造異常をもたらすか否かを確定するために、ヌル、正常およびヘテロ接合型マウスからの肺を膨張固定して、光学顕微鏡により切片で形態学的および組織化学的分析を実行した。光学顕微鏡レベルでの気道上皮細胞における感染の証拠および明らかな変化は認められなかった。しかしながら肺胞拡張を伴う肺実質における異質性異常が、ＳＰ−Ｄ（−／−）においては一貫して観察されたが、ＳＰ−Ｄ（＋／−）またはＳＰ−Ｄ（＋／＋）対照においては観察されなかった。
【００３８】
形態学的および組織化学的方法
ＳＰ−Ｄ（＋／＋）およびＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからの肺組織を２週、３週および６週間で屠殺試料とした（sacrificed）。動物を計量し、ケタミン、アセプロマジンおよびキシラジンの４：１：１混合物で麻酔して、下大静脈および下行大動脈を切断することにより採血した。気管にカニューレを挿入し、横隔膜を穿孔することにより肺を虚脱した。リン酸塩緩衝化生理食塩溶液（ＰＢＳ）中の４％パラホルムアルデヒドを用いて２５ｃｍの水圧で１分間、肺を膨張固定した。膨張肺中に固定液を保持するためにカニューレを除去するときに、気管を縛った。切除した肺および心臓を、それらが容器の底に沈むまで、冷固定液中で平衡させた。次に流体置換により、肺および心臓容積を確定した。各葉をその最長軸に沿って測定し、長軸と垂直に二分して、パラフィンブロック中に加工処理した。５ミクロン切片を、各葉の長さを通して連続して切断し、ポリシン被覆スライド上に載せて、ヘマトキシリンおよびエオシン、コラーゲンのためのマッソントリクローム染色、またはエラスチンのためのオセインを用いて染色した。
【００３９】
肺形態学
さらに詳細に、生後最初の２週間以内の検査は肺形態学における検出可能な異常を実証しなかったが、しかし正常出現肺胞マクロファージ数増大が、１４日齢のＳＰ−Ｄ（−／−）マウスの肺胞に認められた。これに対比して、空気間隙拡張、ならびに非定型泡沫状肺胞マクロファージからなる肺組織学の異常は、３および６週齢のＳＰ−Ｄ（−／−）マウスで観察された。肥厚性泡沫状肺胞マクロファージおよび血管周囲／細気管支周囲単球浸潤物の蓄積に関連した空気間隙拡張が６〜７月齢までに観察されたが、しかし個々のＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおける空気間隙拡張の程度は、この齢群においては中等度から重度まで種々であった。
【００４０】
７月齢ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスでは、コラーゲンに対して強度に染色された胸膜下線維性病変が観察された。エラスチン沈着の異常も、この時点でのＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからの肺の実質中で観察された。これらは、短く厚みのある、そしてより高度にらせん状に巻かれた弾性線維を伴う肺実質の領域、ならびにエラスチン染色が隣接肺胞中隔（マクロファージ蓄積および線維症に隣接する）において低減される炎症の領域から成る。
【００４１】
気管支関連リンパ球組織（ＢＡＬＴ）増大が、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスで認められた。ＩＩ型細胞中のＳＰ−Ｂ免疫染色の強度は、３つの遺伝子型間で同様であった。ＩＩ型細胞を、下記に概説するように精製した。しかしながら大量の細胞質小胞を含有する肺胞マクロファージであると思われる大型の泡沫状肺胞内細胞数の増大の局所的領域（focal area）が存在した。これらの細胞は、細胞質小胞の数および容積増大の結果として、サイズが増大した。小胞はナイルレッドに染まり、ナイルブルーでの染色後に５２０〜５５０ｎｍグリーン光で励起した場合に蛍光を発し、したがって脂質またはリン脂質を含有した。これらのマクロファージは、ＳＰ−Ｂ抗血清によっても染色された。肺胞洗浄において、正常マウス（０．３６×１０６／マウス）と比較してＳＰ−Ｄ（−／−）では約４倍より多いマクロファージ（１．２×１０６／マウス）が観察されたが、しかし相対的好中球またはリンパ球数に変化は認められなかった。マクロファージサイズは、１５００ｘｇで２分間ガラススライド上に沈殿させたサイトスピン調製物からの固定および染色マクロファージの直径から概算した。（＋／＋）からのマクロファージの平均直径は、１１．７５±１．７５μｍであり、これに比して（−／−）マウスは１８．７５±７．２５μｍであった。正常の２倍の直径を有するものと定義される異常に大きいマクロファージは、（＋／＋）マウスからの１８±１．０％と比較して、（−／−）マウスマウスからのマクロファージの２２．４±０．６％を構成した。肺胞マクロファージの数および形態は、ＳＰ−Ｄ（＋／−）マウスにおいては異ならなかった。ＩＩ型細胞の微細構造特徴は、ＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスと比較して、ＳＰ−Ｄ（−／−）においては同様であった。肺胞マクロファージの形態は、炎症に関連することが既知である活性化「泡沫」細胞のものと一致する。
【００４２】
ネズミＩＩ型細胞の単離
ＩＩ型細胞は、以下の方法を用いて本実験室においてルーチンに単離される。腹腔内注射およびペントバルビタール（５０ｍｇ／ｍｌ、３．２５ｍｌ／体重１ｋｇ）により、マウスを麻酔する。腹腔を開口後、下大静脈を切断することにより採血した。気管を露呈し、２０ゲージルアースタッブアダプターを用いてカニューレ挿入し、縫合により固定した。胸板を取り外し、血液が視覚的に見えなくなるまで、肺動脈を介して肺を１０〜２０ｍｌの滅菌生理食塩溶液で灌流した。ディスパーゼ（Collaborative Research, Inc., Bedford, MA）を気管カテーテルを介して肺中に滴注し、その後、１％低融点アガロースを滴注し、４５℃に暖めた。肺を直ちに氷で覆って、２分間インキュベートして、アガロースを固化した。肺を摘出し、さらに１ｍｌのディスパーゼを含有する培養管中に入れて、室温で４５分間インキュベートした。次に、７ｍｌのＤＭＥＭ（Gibco, BRL, Gaithersburg, MD）中の１００Ｕ／ｍｌのＤＮＡアーゼ１（Sigma, St. Louis, MO）を含入する６０ｍｍ培養皿に肺を移す。気道から組織をそっと削ぎとって、５分間回転させる。次に濾過されるまで、細胞を氷上に置く。１００μｍおよび４０μｍ細胞濾過器を通して、次に２５μｍナイロンゲージ（Tetko, Briarcliff Manor, NY）を通して、細胞懸濁液を連続濾過した。細胞を４℃で１３０ｘｇで７分間ペレット化し、１０％ＦＢＳ（Intergen Co., Purchase, NY）を含有する１０ｍｌのＤＭＥＭ中に再懸濁する。粗製細胞懸濁液を、ＣＤ−４５およびＣＤ−３２抗体（Pharmigen, San Diego, CA）で予め被覆された１００ｍｍ培養皿に付加し、５％ＣＯ２の存在下で３７℃で１０２時間インキュベートする。プレートをインキュベーターから取り出して、静かに遊離定着ＩＩ型細胞に「パニング」する。細胞懸濁液を４℃で１３０ｘｇで遠心分離して、１０％ＦＢＳ（Intergen Co., Purchase, NY）を含有する１０ｍｌのＤＭＥＭ中に再懸濁する。粗製細胞懸濁液を、ＣＤ−４５およびＣＤ−３２抗体（Pharmigen, San Diego, CA）で予め被覆された１００ｍｍ培養皿に付加し、５％ＣＯ２の存在下で３７℃で１０２時間インキュベートする。プレートをインキュベーターから取り出して、静かに遊離定着ＩＩ型細胞に「パニング」する。細胞懸濁液を１３０ｘｇで７分間遠心分離して、細胞を、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中に再懸濁する。
【００４３】
空気間隙および呼吸実質
５日齢（０．５週齢）、１４日齢（２週齢）および１７日齢（２．５週齢）、３および６週齢、ならびに６〜７月齢のマウスで、形態計測学的測定を実施した。点計数法を用いて、呼吸実質および空気間隙の全体的割合（分画面積％）を確定した。左、右上または右下葉全体で間を置いて採取した切片で、測定を実施した。２０倍対物レンズを用いてスライドを観察し、メタモルフ（MetaMorph）画像形成ソフトウエア（Universal Imaging Corp., West Chester, PA）を用いて、画像（視野）をビデオカメラでコンピュータースクリーンに移した。コンピューター生成１２１ポイント格子グリッドを各視野上に重ね合わせて、呼吸実質（肺胞および肺胞導管）または空気間隙上に位置する交差（点）の数を計数した。細気管支、大型血管および小型細動脈および細静脈上に位置する点は、試験から除外した。各区画に関する点の数（ｎ）を視野内に含入される点の総数（Ｎ）で割って、その後に１００をかけることにより、分画面積（Ｆ×面積％）を算定した：
Ｆ×面積％＝ｎ／Ｎ×１００
【００４４】
１０視野／切片を分析して、データを集めた。測定された各視野に関するｘおよびｙ座標を、無作為数生成器を用いて選択した。
【００４５】
図１に示したように、空気間隙（ａ）および呼吸実質（ｂ）の相対的割合（分画面積％）における差異は５日齢（０．５週齢）、１４日齢（２週齢）または１７日齢（２．５週齢）では観察されなかったが、一方、空気間隙の分画面積％は、３週齢までのＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいて有意に（ｐ＝０．０１３）増大された。特に空気間隙（ａ）および実質（ｂ）の両方に充てられる分画面積は、３週齢（＊ｐ＝０．０１３）、６週齢（＊ｐ＝０．０００７）および２８週齢（＊ｐ＝０．００４）での２つの異なる遺伝子型間で有意に発散した。同様に、呼吸実質の分画面積％は、齢対応ＳＰ−Ｄ（＋／＋）対照と比較して、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいて低減された（４２．５％実質／５７．５空気間隙と比較してそれぞれ３４％実質／６６％空気間隙）（図１）。空気間隙と呼吸実質の相対的割合はその後の時点で対照から有意に発散し続け、７月齢のＳＰ−Ｄ（−／−）マウス（ｎ＝５）においては、分画面積％は、２７％実質／７３％空気間隙〜３７％実質／６３％空気間隙の範囲であった。齢対応ＳＰ−Ｄ（＋／＋）対照は、より低い可変性を示し、この時点では（ｎ＝４）、４５％実質／５５％空気間隙〜４７％実質／５３％空気間隙の範囲であった。ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおける７月齢での実質の全体的低減％は対照値の３２％であったが、一方、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおける空気間隙の増大％は対照値の２７％であった。
【００４６】
細胞増殖
細胞増殖の変化を査定するために、屠殺の４時間前にＢｒｄＵを動物に予備注射した。市販キット（Zymed Laboratories, Inc., San Francisco, CA）を用いて、取込まれたＢｒｄＵの免疫組織化学的検出を実施した。各動物からの小腸の切片を、ＢｒｄＵ取込みに関する陽性対照としての肺切片と平行して免疫染色した。
【００４７】
ＢｒｄＵ標識指数は相対的に低く、対照と比較して、呼吸実質細胞または肺胞マクロファージのＢｒｄＵ標識における変化は、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからの肺においては観察されなかった。
【００４８】
肺容積
圧−容積曲線を用いた肺容積の確定を、以下に示す：１２週齢マウスにペントバルビタールナトリウムを注射し、１００％酸素を含入する小室に入れて、酸素吸収による肺胞の完全虚脱を保証した。放血によりマウスを殺害し、気管にカニューレ挿入して、３方向コネクターを介して圧力センサーに連結された注射器に接続させた（マウス肺試験系、TSS Incorporated, Cincinnati, OH）。横隔膜開口後、肺を１０秒ごとに７５μｌ増分で水２８ｃｍの最大圧に膨張させて、次に収縮させた。各動物に関して圧力−容積曲線を作成して、収縮曲線中に水１０、５および０ｃｍで（体重で割って）肺容積を確定した。図２において、１２週齢のマウス５〜６匹で、圧力−容積曲線を作成した。圧力−容積曲線の収縮枝に関連した肺容積は、１０ｃｍＨ２Ｏで、最大圧２８ｃｍＨ２Ｏでの齢対応ＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスと比較して、１２週齢ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスに関して有意に大きかった（＊ｐ＜０．０５）。
【００４９】
分画面積および圧力−容積曲線に関する分散の分析とその後のスチューデント−ニューマン−ケウルス手法、または体重、肺および心臓容積、容積：体重比、総タンパク質およびＤＮＡ含量に関するスチューデントＴ検定を用いて、統計学的有意差を確定した。ｐ＜０．０５の差は、有意であるとみなされた。値は平均±ＳＥとして示される。
【００５０】
肺容積増大は、１２週齢のＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいて容易に明らかで、気腫を実証する組織学的および形態測定試験と一致した（図２参照）。
【００５１】
肺胞
ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいては、肺胞拡張が一貫して観察された。したがってＳＰ−Ｄは、肺における肺胞リモデリングの調節に関与する傾向が非常に高い。異常および空気間隙リモデリングが気腫の明確な特徴であるため、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスは気腫の理想的モデルである。
【実施例６】
【００５２】
サイトカイン、過酸化水素産生およびメタロプロテイナーゼ活性
方法
サイトカイン測定
６〜９週齢マウスからの肺ホモジネートを２０００ＲＰＭで遠心分離し、−２０℃で保存した。製造業者の指示に従って、ネズミサンドイッチＥＬＩＳＡキット（R & D Systems,Minneapolis, MN）を用いて、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、インターロイキン（ＩＬ）−１β、ＩＬ−６およびマクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ）−２を定量した。プレートは全て、微小プレート読取機（Molecular Devices, Menlo Park, CA）で読み取り、コンピューター支援分析プログラム（ソフトマックス；Molecular Devices）を用いて分析した。算定回帰線値＞０．９５を示す標準曲線を有するアッセイのみが、分析のために許容可能であった。
【００５３】
過酸化水素産生
無染料ＲＰＭＩ培地（Gibco, Grand Island, NY）１ｍｌを用いた３回の気管支肺胞洗浄により、肺胞マクロファージを収集した。８〜１０匹のマウスからの気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）をプールして、分析のために十分な数のマクロファージを提供した。洗浄液を１２００ＲＰＭで１０分間遠心分離して、１００万個のマクロファージをＰＢＳ中に再懸濁した。酸性条件下での過酸化水素による第二鉄イオン（Ｆｅ３＋）への第一鉄イオン（Ｆｅ２＋）の酸化に基づいた市販アッセイ（ビオキシテックＨ２Ｏ２〜５６０アッセイ、OXIS International, Portland, OR）を用いて、マクロファージによる過酸化水素産生を測定した。方法は、製造業者の推奨に従った。１００ｎｇ／ｍｌのミリスチン酸酢酸ホルボール（ＰＭＡ）による活性化後、または刺激を用いずに、過酸化水素産生を確定した。
【００５４】
メタロプロテイナーゼ活性
マウス洗浄液試料をＳＷ−２８ローター（Beckman, Palo Alto, CA）中で遠心分離した（１００，０００ｘｇ、１時間）。セントリコン−３０濾過ユニット（Centricon-30 filtration units）（Amicon Inc., Beverly, MA）を用いて、上清を濃縮した。非還元条件下（laemmli）で１０％ザイモグラム、ゼラチンおよびカゼインゲル（Novex, San Diego, CA）中で試料（２００μｇタンパク質）を電気泳動処理した。電気泳動後、ゲルを２．５％トライトンＸ−１００（３７℃、１５分）で２回洗浄し、４０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭのＣａＣｌ２、１ｕＭのＺｎＣｌ２とともに１６時間インキュベートした。５０％メタノール、１０％酢酸中の０．５％（ｗ／ｖ）クーマシーブルーで１時間、ゲルを染色し、その後、脱染色した。青色バックグラウンドに対する明瞭な帯域として、メタロプロテイナーゼを検出した。［３２Ｐ］標識化ｃＤＮＡプローブ（Chemicon International, Inc., Temecula, CA）を用いて、野生型およびＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからの総肺ｍＲＮＡのノーザンブロット分析により、メタロプロテイナーゼ２および９ｍＲＮＡを定量した。
【００５５】
結果
６〜９週齢で、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからの肺ホモジネートは炎症レベルの前炎症性サイトカインＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６またはＭＩＰ−２を含有しなかったが、基本レベルのＩＬ−１βは有意に増大された（図３）。これに対比して、酸化剤産生は、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスから単離された肺胞マクロファージによる過酸化水素産生を測定することにより査定した場合、１０倍増大した（図４）。過酸化水素およびスーパーオキシド産生は、マクロファージ活性化の、特に殺微生物剤活性化の測定値である。酸化剤産生は多数のメタロプロテイナーゼの活性化に、そしてヒトおよび動物試験の両方において気腫に関連付けられてきたため、ＳＰ−Ｄ（−／−）およびＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスから単離されたＢＡＬＦ上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゼラチン基質の分解により、メタロプロテイナーゼ活性を概算した。メタロプロテイナーゼ−２および−９と一致する活性の帯域は両遺伝子型で容易に検出されたが、しかしＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからの肺組織においては変わらなかった。同様に、メタロプロテイナーゼ−２および−９ｍＲＮＡの存在度は、ノーザンブロット分析により査定した場合、ＳＰ−Ｄ（−／−）およびＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスからの全肺ＲＮＡ試料において同様であった。しかしながらＳＰ−Ｄ（−／−）マウスから単離された肺胞マクロファージによるＭＭＰ−２および９の産生は、顕著に増大された。同様に、ＭＭＥ（マクロファージメタロエラスターゼ）およびＭＭＰ−９に対する免疫染色は、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスの肺において増大された。
【００５６】
実施例１〜６の結果は、全く予測されなかった。ＳＰ−Ｄヌルマウスが気腫のモデルであることを示唆するものは文献中にない。
【００５７】
要するに、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスは最終的に、サーファクタント恒常性の調節、肺における肺胞サーファクタントの構造、ＳＰ−Ａ発現の調節における顕著でかつ意外な役割を実証し、あるいは肺において酸化剤である過酸化水素の産生における重大な抑制的役割を果たす。したがって、そのレベルは、進行中の酸化剤産生および損傷の抑制、ならびに肺胞リモデリングの調節および気腫を引き起こすプロテアーゼの抑制にとって重要である。これが、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスを気腫のための優れたモデルにする。実施例７は、気腫のマウスモデルに関する結果を要約する。
【実施例７】
【００５８】
気腫に関するモデルとしてのＳＰ−Ｄ（−／−）マウス
ＳＰ−Ｄ欠損は、遺伝子不活性化ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおける炎症、単離肺胞マクロファージによる酸化剤産生増大、気腫および局在化線維症を引き起こした。これらの肺異常の時機および進行性は、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおける肺胞拡張が、肺胞発生中に起こる発生異常に関連するというよりむしろ、慢性炎症に関連した肺胞リモデリングにより引き起こされる、という結論を支持する。本発明の知見は、肺炎症および酸化剤産生の調整におけるＳＰ−Ｄの重要かつ予期せぬ役割と一致し、そして調節または機能ＳＰ−Ｄにおける変化が病理過程において一役を果たし、慢性肺損傷後の気腫をもたらし得る、ということを示唆する。
【００５９】
ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからの肺の組織学的および形態測定分析は、マウスにおける肺胞発生が完了された１週間後である出生後３週齢まで、肺構造における異常を明示しなかった。これは、呼吸実質と空気間隙の相対的割合が出生後５〜１７日目のＳＰ−Ｄ（−／−）およびＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスの両方において同様である、という観察と一致する。２週齢後、実質−空気間隙比増大がＳＰ−Ｄ（−／−）マウスで観察されたが、これは実質および肺胞間隙の進行中のリモデリングと一致する。拡張空気間隙は一般に、大型の泡沫状肺胞マクロファージの局所的蓄積と関連したが、しかし高齢マウスにおける炎症性浸潤物およびリモデリングの局在化および程度の両方においていくつかの不均質性が認められた。ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスの肺における肺胞マクロファージの局所的蓄積は２週齢という早期に観察されたが、しかしマクロファージ形態はこの時点で依然として正常であった。拡張泡沫状細胞からなる異常肺胞マクロファージ形態は３週齢までに認められ、その後の肺胞構造の拡張と同時に起こった。従来の試験は、８週齢までのＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおける拡張肺胞マクロファージ数増大を実証した。したがってＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおける気腫の発症は、活性化マクロファージの時間的および空間的蓄積、ならびにプロテアーゼＭＭＰ−２、９およびＭＭＥの産生増大と一致し、このことは、リモデリング過程におけるそれらの役割を示唆する。本発明の知見は、正常長期形態形成ならびにマウスにおいて出生後約２週齢までに一般に完了される過程である肺胞発生におけるＳＰ−Ｄに関する役割を支持しない。
【００６０】
本発明の知見は、プロテアーゼ活性化、気腫および線維症をもたらす肺胞マクロファージ活性化および酸化剤産生の調整におけるＳＰ−Ｄに関する重要な役割を支持する。ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおけるマクロファージ浸潤および肺リモデリングは、単離肺胞マクロファージによる過酸化水素産生の顕著な増大というよりむしろ、種々の前炎症媒介物質、例えばＩＬ−１β、ＭＩＰ−２の炎症レベルにおける控えめではあるが有意の差異に関連づけられたが、しかしＴＮＦ−αおよびＩＬ−６に関しては関連づけられなかった。基礎レベルのＩＬ−１βはＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいて有意に増大されたが、しかしＩＬ−１βは、重度の炎症において典型的に検出されるレベルまでには増大されなかった。ＩＬ−１βおよび過酸化水素産生増大はＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいて観察されたが、一方、これらのマウスにおいて観察された肺異常がサイトカインまたは酸化剤誘導性損傷により直接媒介されたか否かは依然として不明である。ＳＰ−Ｄは宿主防御において重要な役割を果たすことが提唱されているが、しかしＳＰ−Ｄ（−／−）コロニーにおける感染の組織学的または血清学的証拠は認められなかった。
【００６１】
ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスの肺に見出された過酸化水素産生強化および肺胞マクロファージ数増大は、ＳＰ−Ｄが肺における重大な抗炎症的役割を果たし、そしてｉｎ  ｖｉｖｏでの肺胞マクロファージによる過酸化水素産生を調節する、という概念を支持する。酸化剤損傷と気腫および肺線維症の発症との間の関係は、多数の動物および遺伝子モデルで十分に確立されている。例えば高酸素状態への新生児曝露は、新生仔マウスにおける肺胞リモデリングおよび線維症を引き起こした。メタロプロテイナーゼの活性化は酸化剤損傷および気腫に関連づけられているため、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからのＢＡＬＦ中でメタロプロテイナーゼ活性を査定した。メタロプロテイナーゼ−２および−９と一致するプロテアーゼ活性は肺ホモジネート中でザイモグラフィーにより容易に検出されたが、しかし、これらのプロテイナーゼまたはそれらのｍＲＮＡの活性における一貫した変化は、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいては検出されなかった。しかしながらＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９の産生の顕著な増大がｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからの単離肺胞マクロファージにおいて実証され、そしてＭＭＥおよびＭＭＰ−２に関する免疫染色は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＳＰ−Ｄ（−／−）マウスの肺において増大された。したがってメタロプロテイナーゼの濃度の局在性増大および／またはその他のプロテアーゼまたは抗プロテアーゼにおける変化は、ＳＰ−Ｄ欠損と関連する。抗プロテアーゼの欠損、ならびに喫煙および酸化毒物（例えばブレオマイシンまたはパラクアット）からの酸化剤損傷は全て、ヒト肺における気腫または肺線維症と関連付けられた。
【００６２】
サーファクタントリン脂質含量はＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいて増大され、大型の泡沫状肺胞マクロファージ数の増大と関連づけられたが、一方、リン脂質含量単独の増大は、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいて観察された肺胞リモデリングを引き起こすのに十分であるとは考えられない。実際、サーファクタントリン脂質の全体的作用は、抗炎症性であり、食作用、酸化剤産生およびサイトカイン放出を変え、そしてリンパ球増殖、免疫グロブリン産生および接着分子の発現を抑制すると思われる。他方、ＧＭ−ＣＳＦが呼吸上皮中で過剰発現されたトランスジェニックマウスは、正常に見える肺胞マクロファージの数を顕著に増大したが、しかし肺胞タンパク症／類脂症、気腫または線維症を発症しなかった。これに対比して、サーファクタントリン脂質およびタンパク質は、肺胞マクロファージ蓄積および血管周囲／細気管支周囲単球浸潤物と関連して、ＧＭ−ＣＳＦ（−／−）およびＧＭ−受容体共通βサブユニット（βｃ）欠損マウスの両方からの肺において、顕著に増大された。しかしながら肺胞タンパク症／類脂症のモデルは、気腫または線維症と関連しなかった。同様に、肺においてＩＬ−４を過剰発現するトランスジェニックマウスも、サーファクタントプロテインおよび脂質の量の増大、ならびに炎症細胞の数の増大を示したが、しかし気腫を発症しなかった。
【００６３】
肺中のＳＰ−Ｄの濃度は発達中に変化し、年齢が進むにつれて増大するが、しかしＳＰ−Ｄレベルも種々の臨床条件により影響を及ぼされる。嚢胞性線維症（ＣＦ）を有する患者から得られたＢＡＬＦ中のＳＰ−Ｄ濃度の顕著な低減を最近の研究は実証したが、これはＣＦ肺疾患に関連する慢性炎症の病因におけるＳＰ−Ｄに関して考え得る役割を支持する。ＳＰ−Ｄレベルは喫煙者のＢＡＬＦ中でも低減されたが、これはＳＰ−Ｄのレベル低減が、これらの患者における慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）および気腫のその後の発症に関与し得ることを示唆する。ＢＡＬＦ中のＳＰ−Ｄの濃度は肺胞タンパク症（ＰＡＰ）を有する患者において増大されたが、しかし特発性肺線維症（ＩＰＦ）およびコラーゲン血管性疾患に関連した間質性肺炎（ＩＰＣＤ）を有する患者はＳＰ−ＤのＢＡＬＦレベルを低減した。他方、ＳＰ−Ｄの血清濃度はＰＡＰ、ＩＰＦおよびＩＰＣＤを有する患者において増大された。しかしＳＰ−ＡおよびＳＰ−Ｄの両方の血清レベルは、ＩＰＦの重症度に伴って、そして抗炎症療法の経過中に変化した。ＳＰ−Ｄが正常肺構築の維持および酸化剤産生の抑制のために必要とされるということを実証するこれらの臨床知見ならびに本発明の試験は、ＳＰ−Ｄ濃度の変化が種々の臨床症状（例えば酸化剤損傷、肺膿瘍、続発症、嚢胞性線維症、間質性肺線維症（ＩＰＦ）および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、種々の肺感染、呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）、気管支肺異形成症（ＢＰＤ）、化学療法誘導性肺損傷、原発性膿瘍に派生する肺線維症（すなわちサルコイド）および喘息）に関連した肺損傷の病因に関与し得る、という概念を支持する。
【００６４】
本発明者らの従来の研究では、肺胞マクロファージまたは肺形態学における異常はヘテロ接合性ＳＰ−Ｄ（＋／−）マウスにおいては観察されず、このことは、ＢＡＬＦ中のＳＰ−Ｄ濃度の５０％低減が肺異常を引き起こすには十分でないことを実証する。酸化剤誘導性損傷および肺リモデリングの抑制に必要とされるＳＰ−Ｄの的確な濃度は、目下不明である。ＳＰ−Ｄ（＋／−）またはＳＰ−Ｄ（−／−）マウスの肺に対するさらなる損傷または酸化剤ストレスがこの動物モデルにおける気腫および線維症を悪化させるか否かは、未だ確定されていない。
【００６５】
ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスに見出される肺ＳＰ−Ａ濃度の控えめな低減は、ＳＰ−Ａ（＋／−）マウスもＳＰ−Ａ（−／−）マウスも気腫を発症しないため、これらのマウスで観察される肺形態学の変化に関与するとは思われない。さらにＳＰ−Ａ欠損マウスの肺形態は正常であり、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスに対比して、ＳＰ−Ａ欠損は単離肺胞マクロファージによる過酸化水素産生低減に関連した。
【００６６】
ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスは、重症かつ進行性（progressive）の気腫を発症した。肺胞リモデリングおよびマクロファージ異常は３週齢という早期に明らかになったが、一方、軽症の局所性肺線維症は６〜７月齢で観察され、このことは、炎症および肺胞リモデリングの調節におけるＳＰ−Ｄに関する役割を実証する。本発明の試験も、ｉｎ  ｖｉｖｏでの肺胞マクロファージによる過酸化水素産生およびメタロプロテイナーゼ産生の調節におけるＳＰ−Ｄに関する予期せぬ役割を実証したが、これはＳＰ−Ｄ（−／−）マウスの肺における気腫の発症に関与し得る。ＳＰ−Ｄ欠損が進行中の炎症に、または種々のヒト慢性肺疾患、例えば喫煙およびその他の酸化剤により引き起こされるものに見出される気腫および線維症の発症に関与するか否かは、依然として確定されていない。
【００６７】
マウスモデルにおける療法の試験
気腫の治療のための薬学的療法の欠如のために、考え得る療法を試験するためのモデルが絶対に必要である。ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスはそのモデルを提供する。したがって実施例６は、気腫の治療のための製剤、タンパク質調製物または遺伝子操作を試験するための試料の骨組みを提供する。
【実施例８】
【００６８】
適切な緩衝液中に希釈された多数の用量または濃度のタンパク質または製剤を、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスに気管内投与する。適切な場合、ｉｎ  ｖｉｖｏ使用のためにタンパク質および製剤を精製する。組換えアデノウイルスまたは当該遺伝子を含有するその他の遺伝子ベクターを、以下のように投与する。ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスを免疫抑制して、Ｔ細胞媒介性免疫応答を特異的に遮断し、形質導入細胞中で当該遺伝子を発現するよう設計されたアデノウイルス構築物で処置する。アデノウイルス構築物投与の３日前に、マウスにＨ５７抗体を腹腔内注射する。Ｈ５７はＴ細胞受容体での免疫認識を変え、脾臓および肺ＴおよびＢリンパ球を低減する。一用量を気管内滴注し、別の群には、Ｈ５７を用いて腹腔内処置し、その後ビヒクル単独を気管内投与する。当該タンパク質レベルを投与の１週間後に測定して、ベクターの取込みおよび発現を検出する。４匹のマウスを試験し、非処置ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスを対照として用いる。気管内接種はイソフルオランで麻酔することを含み、前正中線切開は気管を露呈するために成される。ツベルクリン注射器に取り付けた３０ゲージ針を気管に挿入し、タンパク質または製剤の１００μｌ接種物を肺中に分散させる。一滴のネキサバンド（Nexaband）で切開を閉鎖する。非化膿性ＰＢＳを、対照として気管内注射する。
【００６９】
気腫の作用を減少させるに際してのタンパク質、製剤または遺伝子操作の効力に関して試験するために、多数の試験を実施する。
【００７０】
肺構造に及ぼすタンパク質または製剤の作用を確定するために、肺を膨張固定し、電子顕微鏡で切片を評価した。処置および非処置マウスからの肺を、４％パラホルムアルデヒドを用いて２０ｃｍの圧力で気管カニューレを介して膨張させ、胸部から一塊で取り出す。肺を脱水し、パラフィン中に包埋する。組織切片（５μｍ）をヘマトキシリンおよびエオシンで染色する。
【００７１】
マクロファージの数および形態学を試験するために：ナイルレッドによる染色は小胞を検出し、そしてナイルブルーによる染色および５２０〜５５０ｍｍグリーン光での励起は脂質またはリン脂質を検出するための付加的方法である。抗ＭＡＣ−１またはその他のマクロファージ特異的抗血清を用いた染色により、マクロファージ数を確定する。マクロファージサイズは、１５００ｘｇで２分間、ガラススライド上に沈殿させたサイトスピン調製物からの固定および染色マクロファージの直径から概算する。
【００７２】
サーファクタント組成および微細構造を、以下のように分析する：ＳＰ−Ｄ（−／−）処置および非処置マウスのプール化肺胞洗浄液から大型凝集体を単離することにより、サーファクタントの構造を分析し、ＥＭにより検査する（以下のプロトコール参照）。肺胞洗浄液リン脂質組成分析のために、２〜３匹のマウスからのプール化洗浄液から成る２〜４の試料を、相対的に大量のホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリンおよびリソ−ビス−ホスファチジン酸に関して評価する。総肺Ｓａｔ−ＰＣ中への（３Ｈ）コリンの取込みを評価して、総リン脂質濃度を確定する。
【００７３】
凝集体は肺胞洗浄液から生じる
遠心分離により、肺胞中のサーファクタントを大型凝集体（重、高密度）および小型凝集体（軽、小胞状）分画に分離し得た。肺胞洗浄液を４０，０００ｘｇで０．８Ｍスクロースクッション上で１５分間遠心分離した。次に大型凝集体サーファクタントを界面から収集し、通常生理食塩溶液で希釈し、４０，０００ｘｇで１５分間再び遠心分離した。小凝集体サーファクタントを含有する最初の４０，０００ｘｇ遠心分離からの上清を、３００，０００分子量保持フィルター（ミニタン（Minitan）, Miliore Corp., Bedford, MA）または遠心濃縮機（Amicon Corp., Danvers, MA）を用いて、限外濾過により４℃で濃縮する。小凝集体サーファクタントを５０ｍｌ通常生理食塩溶液で希釈し、３回限外濾過して、可溶性タンパク質を除去する。
【００７４】
肺疾患のための治療としてのＳＰ−Ｄ
ＳＰ−Ｄの欠失は気腫のためのマウスモデルを生じたため、ＳＰ−Ｄは気腫の治療または予防としての明らかな選択肢である。それは、他の種類の肺疾患の多くが異所性サーファクタント産生を特徴とするため、これらの疾患のための明白な治療でもある。さらにＳＰ−Ａに及ぼすその作用および宿主防御におけるその重要な役割がそれを肺における免疫機能を増大するための有用な道具にする。呼吸上皮への遺伝子移入の実現可能性は、種々の肺疾患の治療として非常に有望である。種々のウイルスおよび非ウイルスベースのベクター、例えば組換えアデノウイルスベクターが、気道の細胞に遺伝子を移入するために開発されてきた。これらのベクターは、エアロゾル化される能力を有するため、呼吸器治療に用いるために特に有望である。したがって実施例９は、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおける気腫の治療のための精製マウスＳＰ−Ｄタンパク質を用いた実験である。実施例１０は、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおける気腫の治療のためのラットＳＰ−Ｄを発現するアデノウイルスを用いた実験である。実施例１１は、これらの疾患の予防および治療のための、ＳＰ−Ｄペプチドの使用のための試料骨組み、あるいはＳＰ−Ｄを発現するベクターを提供する。一例示的肺疾患として、気腫を用いる。アデノウイルスは、一例示的ベクターとして用いる。
【実施例９】
【００７５】
精製ＳＰ−Ｄによる治療
以下に略記するように精製された精製マウスＳＰ−Ｄを用いて、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスを処置した。肺胞洗浄液および総肺洗浄液で、飽和ＰＣレベルを分析した。２４時間間隔での気管内反復投与は、３〜７回投与後に脂質蓄積の部分的矯正を生じた（図１２参照）。
【００７６】
気道中のＳＰ−Ｄの半減期を、マウスにおいて１３時間と確定した（図１３参照）（本技法は、以下に略記）。したがってＳＰ−Ｄ欠損は、エアロゾルまたは微粒子吸入体またはサーファクタント混合物により、合理的間隔でのＳＰ−Ｄタンパク質の置換により治療し得る。
【００７７】
マウスＳＰ−Ｄの精製
ＧＭＣＳＦおよびＳＰ−Ａ二重ヌル突然変異体マウスからのマウス気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液を収集し、凍結して、ＳＰ−Ｄのその後の精製のためにプールした。マルトシル−アガロース（Sigma）を重力流動カラム（１０×８０ｍｍ）中に充填し、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１０ｍＭの塩化カルシウム、０．０２％（Ｗ／Ｖ）アジ化ナトリウムを含有する緩衝液（ＴＣＢ）で平衡させた。ＢＡＬを、トリス−ＨＣｌに関して２０ｍＭとし、ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４に関して１０ｍＭとして、室温で１時間撹拌した。混濁溶液を４℃で４０分間、１０，０００ｘｇで遠心分離した。上清を塩化カルシウムに関して２０ｍＭとして、ｐＨ７．４に再調整した後、マルトシル−アガロースカラムに投入した。カラムをＴＣＢでバックグラウンド吸光度（background absorbence）に洗浄し、その後、１．０Ｍの塩化ナトリウムを含有するＴＣＢで洗浄した。マルトースとの結合に際してカルシウムに対する特異的要件を有するＳＰ−Ｄを、５０ｍＭの塩化マンガン、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、０．０２％（Ｗ／Ｖ）アジ化ナトリウム、ｐＨ７．４で溶離した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により、または直接ＥＬＩＳＡにより、ＳＰ−Ｄを含有する分画を確定し、プールして、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１００ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４の３つの変化に対して透析した。このプロトコールは、Strong, Peter; Kishore, Uday; Morgan, Cliff; Bernal, Andres Lopez; Singh, Mamta;ならびにReid, Kenneth B.M.; Journal of Immunological Methods 220 (1998) 139-149から改訂した。
【００７８】
サーファクタント構成成分によるマウスの治療
問題を伴わずに、７日目までの間毎日ＳＰ−Ｄを用いてマウスを反復処置するために、イソフルランによる麻酔下でマウスに２６ｇ供給管を用いる経口盲目挿管のための技法を、本発明者らは首尾よく用いてきた。このアプローチは外科手術を回避し、ＳＰ−Ｄ置換のために提唱される種類の実験および突然変異体ＳＰ−Ｄタンパク質による治療を可能にする。
【００７９】
最初にＳＰ−Ｄ（−／−）マウスを、気管滴注により精製マウスＳＰ−Ｄで処置した。２４時間間隔で投与される３またはそれ以上の投与回数の２．９μｇＳＰ−Ｄは、肺胞および飽和ＰＣプールをともに低減した（図１４参照）。投与されたＳＰ−Ｄのこの用量は、ほぼ、ＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスにおける内因性プール中に存在する量である。肺関連およびクリアランス動態を仮定すると、これは低用量である。したがってＳＰ−Ｄの外因性投与はサーファクタント脂質代謝に直接影響を及ぼし、ｉｎ  ｖｉｖｏで修飾化ＳＰ−Ｄ分子の機能を本発明者らが試験し得る実験モデルを提供する。
【００８０】
生物学的半減期プロトコール
ＳＰ−Ｄを用いた治療のための実験を設計するために、マウスにおけるＳＰ−Ｄの生物学的半減期を本発明者らは測定した。ＳＰ−Ａおよびその他のサーファクタントプロテインに関して前に実行したように、ボルトン−ハンター試薬を用いて１２５Ｉで精製マウスＳＰ−Ｄを本発明者らはヨウ化した。ＳＰ−Ｄ（＋／＋）およびＳＰ−Ｄ（−／−）マウスの肺胞洗浄液からのＳＰ−Ｄのクリアランスは同様で、約１３時間の半減期を有した（図１３参照）。ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスの肺におけるＳＰ−Ｄに関する１７時間というｔ1/2は、ＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスに関する１３時間というｔ1/2より多少長かった。
【００８１】
ＧＭ−ＣＳＦ欠損はＳＰ−Ｄの４８倍増を引き起こし、ＧＭ−ＣＳＦ（−／−）×ＳＰ−Ａ（−／−）交雑は、ＳＰ−Ｄを同様に増大したが、しかしＳＰ−Ａを増大しなかった。Ｃａ２＋の存在下でマンノース−セファロース６Ｂのアフィニティーカラムを用いて、Perssonらが記載した方法により、高純度で大量に、ＧＭ−ＣＳＦ（−／−）×ＳＰ−Ａ（−／−）マウスからの肺胞洗浄液から、ＳＰ−Ｄを本発明者らは単離した。
【実施例１０】
【００８２】
アデノウイルスから発現されるＳＰ−Ｄによる治療
ラットＳＰ−Ｄを発現する新規のアデノウイルスを、本発明者らは作製した。本ウイルスは、正常またはＳＰ−Ｄ欠損マウスの細胞中および肺中でＳＰ−Ｄを産生する。２９３個の細胞およびマウスにおいて産生されるラットＳＰ−Ｄのウエスタンブロットを本発明者らは有する。
【００８３】
Ａｄ−ｒＳＰＤアデノウイルスの構築（図１４参照）
野生型ラットＳＰＤｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ消化によりプラスミドＷＴ−ｒＳＰＤ／ｐＧ３Ｚから遊離し、その３’末端をクレノウで充填した。１．３ｋＢのｒＳＰＤｃＤＮＡをプラスミドｐＡｖＳ６ａのＥｃｏＲＶ部位に挿入して、プラスミドｐＡｖＳ６ａ−ｒＳＰＤを作製した。プラスミドｐＡｖＳ６ａ−ｒＳＰＤは、ＲＳＶプロモーター、ｒＳＰＣｃＤＮＡ、ＳＶ４０ポリＡシグナルおよびＡｄ５配列（９．２４〜１７．３４ｍｕ）を有する。ＮｏｔＩ線状化ｐＡｖＳ６ａ−ｒＳＰＤを、欠失されたＥ３領域（７８．５〜８４．７ｍｕ）を有するアデノウイルスＤＮＡ  Ａｄ  ｄｌ３２７のＣｌａＩ消化大型断片とともに２９３個の細胞中に同時トランスフェクトした。相同組換え後、個々のプラークをウエスタンブロットアッセイにより分析して、ｒＳＰＤタンパク質発現を確定した。一ｒＳＰＤ陽性クローンに１回のプラーク精製を施した。Ａｄ−ｒＳＰＤアデノウイルスはＥ１およびＥ３領域において欠失を有し、複製欠陥性である。２９３個の細胞中での増幅後、２回のＣｓＣｌ勾配超遠心分離により、精製Ａｄ−ｒＳＰＤアデノウイルスを産生した。アデノウイルスはＳＰ−Ｄを発現し、したがって気管内投与により肺異常を回復させるために用いられ得た。したがってこれは、気腫および多数のその他のＳＰ−Ｄ欠損病、ならびに種々のその他の形態の肺損傷および欠陥の治療のための非常に肯定的な可能性を存続させる。
【実施例１１】
【００８４】
その他のベクターから発現されるＳＰ−Ｄ、タンパク質または製剤による治療
リン脂質恒常性の回復におけるＳＰ−Ｄに関する時間的、空間的および化学量論的要件を、実施例９で確定した。ＳＰ−Ｄのクリアランスの動態を確定するための最初の試験は、気管内投与される１２５Ｉ標識化ＳＰ−Ｄを用いて実施した。半減期を算定し、その情報をＳＰ−Ｄ置換実験の設計に用いた。投与後のＳＰ−Ｄの正常生理学濃度を達成するために必要とされるＳＰ−Ｄの用量を明らかにした。
【００８５】
実施例９において、精製ＳＰ−Ｄタンパク質の投与を用いて、種々の肺疾患を治療した。しかしながら肺疾患の生理学的異常は、肺におけるＳＰ−Ｄの長期矯正を要し得る。したがって哺乳動物ＳＰ−Ｄ遺伝子を含有する組換えアデノウイルスまたはその他の遺伝子ベクターを用いる（実施例１０および１１参照）。組換えアデノウイルスベクターまたはクララ細胞分泌タンパク質（ＣＣＳＰ）およびＳＰ−Ｃプロモーターを用いて、細気管支（クララ細胞）および肺胞（ＩＩ型細胞）区画中でＳＰ−Ｄを選択的に発現し得る（実施例１０参照）。アデノウイルスベクターによる処置の３日前に、２００ｕｇのモノクローナル抗Ｔ細胞受容体抗体Ｈ５７を用いた腹腔内注射により、マウスを免疫抑制する。５×１０８ＰＦＵのウイルスの気管内注射により、アデノウイルスを投与した。ＳＰ−Ｄタンパク質のレベルを投与１週間後に測定して、ベクターの取込みおよび発現を検出した。４匹のマウスを試験し、処置を施していないＳＰ−Ｄ（−／−）マウスを対照として用いた。気腫の作用の減少時のＳＰ−Ｄの効力に関して試験するために、多数の試験を以下のように実施する。
【００８６】
肺構造に及ぼすタンパク質または製剤の作用を確定するために（実施例１１）、肺を膨張固定し、切片を電子顕微鏡で評価した。肺を、４％パラホルムアルデヒドを用いて２０ｃｍの圧力で気管カニューレを介して膨張させ、胸部から一塊で取り出す。肺を脱水し、パラフィン中に包埋する。組織切片（５μｍ）をヘマトキシリンおよびエオシンで染色する。
【００８７】
マクロファージの数および形態学を分析する。ナイルレッドによる染色は小胞を検出し、そしてナイルブルーによる染色および５２０〜５５０ｍｍグリーン光での励起は脂質またはリン脂質を検出するための付加的方法である。直接計数またはマクロファージ細胞表面マーカーにより、マクロファージ数を確定する。マクロファージサイズは、１５００ｘｇで２分間、ガラススライド上に沈殿させたサイトスピン調製物からの固定および染色マクロファージの直径から概算する。
【００８８】
サーファクタント組成および微細構造を、以下のように分析する：ＳＰ−Ｄ（−／−）処置および非処置マウスのプール化肺胞洗浄液から大型凝集体を単離することにより、サーファクタントの構造を分析し、ＥＭにより検査する。肺胞洗浄液リン脂質組成分析のために、２〜３匹のマウスからのプール化洗浄液から成る２〜４の試料を、相対的に大量のホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリンおよびリソ−ビス−ホスファチジン酸に関して評価する。総肺Ｓａｔ−ＰＣ中への（３Ｈ）コリンの取込みを評価して、総リン脂質濃度を確定する。
【００８９】
処置の効力がいったん確定されれば、他の適切な哺乳動物で処置を試験することができる。
【００９０】
肺感染におけるＳＰ−Ｄの関与
肺での宿主防御におけるＳＰ−ＤおよびＳＰ−Ａの役割は、繰り返し実証されてきた。ＳＰ−ＡおよびＳＰ−Ｄはｉｎ  ｖｉｔｒｏで種々の微生物との特異的相互作用を有し、サイトカインおよびフリーラジカル産生を変更することによりｉｎ  ｖｉｔｒｏで肺炎症を軽減する。ＳＰ−Ｄ欠損のマウスモデルを用いて、肺の細菌クリアランスおよび炎症応答におけるＳＰ−Ｄの役割をｉｎ  ｖｉｖｏで評価した。ＳＰ−Ａ欠損マウスは、感染に対してより感受性であることが既知である。多数のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験が、ＳＰ−Ａをアップレギュレートするその役割のほかに、宿主防御においてＳＰ−Ｄに関して考え得る役割を示した。実施例８〜１１は、細菌または真菌感染ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおける、ならびにＳＰ−Ａ（−／−）マウスにおける一療法としてのＳＰ−Ｄを試験するための試料プロトコールを略記する。実施例１２〜１４は、細菌、真菌およびウイルス感染に対する応答におけるＳＰ−Ｄの役割を示す実験である。実施例１３は、呼吸器合胞体ウイルスによるＳＰ−Ｄ（−／−）マウス感染の作用を示す実験である。
【実施例１２】
【００９１】
ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからの細菌性作因のクリアランス
ＳＰ−Ｄ欠損マウス（ＳＰ−Ｄ（−／−））をＢ群連鎖球菌（ＧＢＳ）またはインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）（H. flu）に気管内感染させて、野生型マウスと比較した場合のクリアランスを査定した。Ｂ群連鎖球菌を１０４ＣＦＵで投与した。総細胞に関するＢＡＬ液の分析（図５、６および７）、肺ホモジネート中のサイトカインレベル（図８）、肺胞マクロファージによる活性酸素産生（図１１）、ならびにＢＡＬ中の亜硝酸塩レベル（図９）によっても、肺膨張を査定した。
【００９２】
ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスは、野生型マウスと同様に細菌を除去した（図５および６参照）。ＧＢＳおよびＨｆｌｕの感染は、野生型マウスと比較して、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスのＢＡＬ液中の有意に多い総細胞を生じた（図７）。サイトカインレベルの選択的変化が、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスで検出された。腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）およびインターロイキン（ＩＬ）−６レベルは、ＧＢＳまたはＨｆｌｕによる感染後早期にＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからの肺ホモジネート中でより高かった（図８）。好中球化学誘引物質であるマクロファージ炎症タンパク質−２（ＭＩＰ−２）は、Ｈｆｌｕ感染後のＳＰ−Ａ（−／−）マウスからの肺ホモジネート中で有意に高かったが、しかしＧＢＳ感染後は高くなかった（図８）。ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからのマクロファージは，野生型マウスと比較して、有意に高いスーパーオキシドおよび過酸化水素を生じた（図１１）。
【００９３】
ＢＡＬ亜硝酸塩レベルは、野生型マウスと比較して、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいて増大された。一酸化窒素産生は、ＢＡＬＦ中の亜硝酸塩として測定された。一酸化窒素は、細菌殺害に寄与することにより、宿主防御に一役を果たす。一酸化窒素はスーパーオキシドと反応して、潜在的殺細菌剤である過酸化亜硝酸を生成する。
【００９４】
図１０では、光学顕微鏡およびフローサイトメトリーを用いて、食作用を評価した。ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスは、野生型と比較して、有意に低減された食作用を示した。
【００９５】
したがってＳＰ−Ｄの非存在下では、ＧＢＳまたはＨｆｌｕによる肺の細菌感染後に、炎症応答増大が観察された。肺胞マクロファージによる活性酸素種の産生は、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいて強化された。これらの結果は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細菌感染に対する肺免疫および炎症応答におけるＳＰ−Ｄの重大かつ明瞭な役割を支持する。
【００９６】
実施例１３では、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスを呼吸器合胞体ウイルスに感染させた。
【００９７】
宿主防御メカニズムは、微生物病原体の肺クリア、例えば細菌およびウイルスクリアランスの先天性媒介物質および後天性免疫応答を保持するために進化してきた。
【実施例１３】
【００９８】
ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからのウイルスのクリアランス
小児における一般的呼吸器病原体である呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）をＳＰ−Ｄ（−／−）マウスに気管内感染させた。ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスおよび野生型マウスで、ウイルス力価および肺炎症を査定した。肺ホモジネート中のＲＳＶ力価は、投与後３日および５日目に、野生型マウスと比較して、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいて有意に増大した。しかしながら炎症細胞数の有意の増大は、ＲＳＶ感染後３日および５日目に、野生型マウスと比較して、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからのＢＡＬ液中に見出され、ＰＭＮのパーセンテージがより高かった。さらにＲＳＶ感染後５日目に、組織学的に査定した肺炎症は、野生型マウスと比較して、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいてより多かった。前炎症性サイトカイン、例えばＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＭＩＰ−２は、ＲＳＶ感染後３日および５日目のＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからの肺ホモジネート中でより多かった。ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスは、野生型マウスより、肺からの低効率的ウイルスクリアランスを示し、ＲＳＶ感染後により大きい炎症性応答を実証した。これらの知見は、ＳＰ−Ｄがｉｎ  ｖｉｖｏでのＲＳＶ感染後の肺における炎症の先天性防御および調節において重要な役割を果たすことを実証する。同様の知見が、インフルエンザおよびアデノウイルスが肺に感染した後に観察された。
【実施例１４】
【００９９】
ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからの真菌のクリアランス
マウスを以下のように感染させる：真菌病原体の適切な原型を用いる。感染性作因を適宜精製し、適切な緩衝液中に懸濁して、ＳＰ−ＤとともにまたはＳＰ−Ｄを伴わずに、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスに気管内投与する（実施例１２および１３と同様）。真菌原型を適切な用量で投与する。ＳＰ−Ｄ（−／−）およびＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスを用いて、感染に対するマウスの感受性に及ぼすＳＰ−Ｄの作用を試験する。ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスを、ＳＰ−Ｄタンパク質とともにまたはＳＰ−Ｄタンパク質を伴わずに用いて、感染に対する療法としてのＳＰ−Ｄを試験する。実施例１２および１３と同様に、そして以下のように、感染のクリアランスを評価する。
【０１００】
感染性作因または感染性作因をＳＰ−Ｄと共に用いて動物に接種してから６、２４および４８時間後に肺および脾臓ホモジネートを精製することにより、真菌クリアランスを確定する。肺からの細菌クリアランスを、適切にＳＰ−Ｄ濃度を変更後に確定する。ＳＰ−Ｄの５０％低減が細菌またはウイルスクリアランスのための十分な内因性ＳＰ−Ｄを提供するか否かを確定するために、ＳＰ−Ｄ（＋／−）マウスに関しても、定量的培養を確定する。
【０１０１】
肺感染の治療のためには、他の哺乳動物においては、適切な濃度の哺乳動物ＳＰ−Ｄを用いる。
【０１０２】
ＳＰ−Ｄレベルを調節する製剤
肺の正常機能および発生におけるＳＰ−Ｄの重要性は、ＳＰ−Ｄ（−／−）ヌルマウスにより明白に実証される。したがってＳＰ−Ｄの産生、発現または作用を調節する作用物質は、重要な将来的製剤であり、そしてさらなるこのような製剤を同定するための実験助剤である。このような作用物質を同定するための多数の技法は、それら自体を当業者に示唆する。実施例１５および１６は、これらの技法のうちの２つに関する試料プロトコールを略記する。実施例１７は、ＩＬ−４がｉｎ  ｖｉｖｏでＳＰ−Ｄレベルを顕著に増大し、したがってＳＰ−Ｄの付加を伴ってまたは伴わずに、種々の肺疾患を治療するために用いられ得ることを示す。
【実施例１５】
【０１０３】
ＳＰ−Ｄプロモーターと相互作用するタンパク質
ＳＰ−Ｄプロモーターを用いて一ハイブリッド技法を設定して、ＳＰ−Ｄの発現をアップレギュレートするタンパク質を特定する。次に、気腫ならびに実施例８と同様のその他の肺疾患および感染を治療するに際しての効力に関して、これらのタンパク質をＳＰ−Ｄ（−／−）マウスで試験する。
【実施例１６】
【０１０４】
ＳＰ−Ｄタンパク質と直接相互作用するタンパク質
ＳＰ−Ｄタンパク質を用いて二ハイブリッド技法を設定して、ＳＰ−Ｄタンパク質と直接相互作用するタンパク質を同定する。次に、気腫ならびに実施例８と同様のその他の肺疾患および感染を治療するに際しての効力に関して、これらのタンパク質をＳＰ−Ｄ（−／−）マウスで試験する。
【実施例１７】
【０１０５】
ＩＬ−４はｉｎ  ｖｉｖｏでのＳＰ−Ｄレベルを増大する
クララ細胞中でＩＬ−４を発現する（ＣＣＳＰ−ＩＬ−４）マウスは、慢性気道炎症および肺胞タンパク症様症候群を発症する。サーファクタント恒常性におけるＩＬ−４の役割を同定するために、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＣＳＰ−ＩＬ−４マウスの肺における脂質およびタンパク質代謝を、本発明者らは測定した。ＩＬ−４トランスジェニックマウスでは、肺胞飽和ホスファチジルコリン（ＳａｔＰＣ）プールは６．５倍増大し、そして肺組織ＳａｔＰＣプールは４．８倍増大した（図１５参照）。ＳＰ−Ｄは、野生型マウスと比較して、ＩＬ−４マウスにおいて約９０倍増大し、そしてＳＰ−ＤｍＲＮＡの２．８倍増と関連した（図１５参照）。ＳａｔＰＣへのパルミチン酸塩およびコリンの取込みは、ＣＣＳＰ−ＩＬ−４マウスでは約２倍増大した。ＣＣＳＰ−ＩＬ−４マウスの肺からのＳａｔＰＣの正味クリアランスは、野生型マウス（１０．３μｍｏｌ／ｋｇ）の場合より、ＩＬ−４マウスにおいては６倍高かった（６０μｍｏｌ／ｋｇ）。クララ細胞中のＩＬ−４の発現は、サーファクタント脂質合成およびクリアランスを増大し、サーファクタントプール増大を伴う新規の平衡、ならびにＳＰ−Ｄタンパク質の選択的増大に関連した肺胞タンパク症を確立し、肺サーファクタント恒常性およびＩＬ−４によるＳＰ−Ｄレベルの調節におけるＩＬ−４の従来予期されなかった作用を実証した。
【０１０６】
ＳＰ−Ｄタンパク質または配列を用いる診断
ＳＰ−Ｄは、正常肺機能および発達において重要である。ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスは、気腫に関するモデルである。これはその場合、ＳＰ−Ｄに関する遺伝子またはその遺伝子の対立遺伝子における突然変異が肺疾患感受性に及ぼす顕著な作用を有することを示唆する。したがって突然変異または対立遺伝子、ならびに突然変異体タンパク質を同定するための方法は、気腫、肺感染および多数のその他の呼吸器疾患の危険に直面している個体を識別する。実施例１８および１９は、これらの診断技法に関する試料プロトコールである。
【実施例１８】
【０１０７】
ＳＰ−Ｄ遺伝子における突然変異を有する患者の診断
ＳＰ−Ｄ遺伝子における突然変異は、気腫の症状および病因に関与する傾向がある。したがって、統計学的有意数の患者の配列分析により、突然変異を識別する。これらの突然変異を用いて、診断試験を実施する。ＳＰ−Ｄ遺伝子中の突然変異を、以下の方法で検出する：適切なプライマーを用いたＳＰ−Ｄ遺伝子のＰＣＲ分析を実施する。その結果生じたＰＣＲ断片をＳＳＣＰにより分析し、シーケンシングして、突然変異または対立遺伝子を確定する。あるいはゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのディフェレンシャルハイブリダイゼーションを用いて、突然変異を検出する。
【実施例１９】
【０１０８】
突然変異体ＳＰ−Ｄタンパク質による患者の診断
気腫またはその他の肺疾患と関連する突然変異体ＳＰ−Ｄタンパク質またはＳＰ−Ｄの対立遺伝子を特異的に認識するモノクローナルまたはポリクローナル抗体を産生する。次にこれらの抗体を用いて、これらの肺疾患に対する感受性に関する酵素結合イムノアッセイまたはウエスタンブロットアッセイを設定する。実施例２０の抗体は、このアッセイのために用い得る。
【０１０９】
実施例２０は、トランスジェニック技法を用いたポリクローナル抗体の精製またはモノクローナル抗体のさらなる精製に関するプロトコールを示す。
【実施例２０】
【０１１０】
ＳＰ−Ｄ特異的モノクローナルおよびポリクローナル抗体の精製
高反応性を有する特異的ポリクローナル抗体の産生は、当該抗原の広範な精製を要する。当該抗原に関して高力価を有し、不純物とも反応性である抗体を生じた注射用部分的精製抗原を用いて、いくつかのポリクローナル抗体を、本発明者らは開発した。トランスジェニックマウスからの固相組織を用いて、これらの抗血清から非特異的抗体を除去した。マンガン溶離を伴うマルトースカラムを用いて、サーファクタントプロテイン−Ｄ（ＳＰ−Ｄ）を精製した。精製ＳＰ−Ｄを、不完全フロイントアジュバント中でニュージーランドラビットに注射した。その結果生じた抗血清を、ウエスタンブロット上で全肺洗浄液に対して試験し、ＳＰ−Ｄとのならびにその他のタンパク質との結合を明示した。この抗血清を、いかなるＳＰ−Ｄタンパク質も産生しないヌル突然変異体マウスからの固相化肺ホモジネートと一晩反応させた。抗血清を、ＳＰ−Ｄに対してのみ反応性を示す吸収後に、全肺洗浄液に対して反応させた。この抗血清を免疫組織化学実験においても評価したが、これはＳＰ−Ｄヌル突然変異体マウスからの肺切片に対する非常に低い反応性と、正常対照マウスにおける非常に特異的なＩＩ型細胞反応性を実証した。この技法は、高力価を有する高特異的抗体を調製する能力を大いに増強し、吸収抗体を用いる場合、遮断剤を使用する必要性をなくす。
【０１１１】
これらの抗体は、ＳＰ−Ｄタンパク質の診断、精製およびさらなる研究のために用いられ得る。
【実施例２１】
【０１１２】
ＳＰ−Ｄはウイルス感染を抑制する
前の結果（実施例１３）は、ＳＰ−Ｄがマウスの肺からのＲＳＶのクリアランスにおいて一役を有することを示した。したがって、その他のウイルスのクリアランスにおいてＳＰ−Ｄが同様の役割を有するか否かを調べることは興味深いことであった。
【０１１３】
ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスを、Ａ型インフルエンザウイルスに、そして別個にアデノウイルスに気管内感染させた。ウイルス力価および肺炎症を、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスおよび野生型マウスで査定した。肺ホモジネート中のＡ型インフルエンザ力価は、投与後３日および５日目に野生型マウスと比較して、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいて有意に増大した。炎症細胞数の有意の増大は、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからのＢＡＬ液中で見出され、Ａ型インフルエンザ感染後、野生型マウスと比較してより高いＰＭＮパーセンテージを示した。
【０１１４】
したがってＳＰ−Ｄ欠損マウスはｉｎ  ｖｉｖｏでＡ型インフルエンザウイルス感染に感受性で、ウイルスに対する肺炎症応答の顕著な増大を発症し、そしてＳＰ−Ｄはｉｎ  ｖｉｔｒｏでアデノウイルスと結合し、同様にｉｎ  ｖｉｖｏでのアデノウイルスのクリアランスに一役を果たすと思われる。
【実施例２２】
【０１１５】
ＳＰ−Ｄは反応性脂質種を抑制する
ＳＰ−Ｄ欠損サーファクタントは、酸素−脂質中間体（毒性脂質反応体）を増大した。したがってＳＰ−Ｄは空気間隙中の反応性脂質種を抑制し、そして活性酸素媒介性の疾患、化学的誘導性肺損傷、酸素、オゾン、化学療法薬および炎症性疾患、再灌流損傷、溺水、移殖および拒絶の改善のための考え得る利点を有し得る。
【０１１６】
脂質ヒドロペルオキシド（ＬＰＯ）アッセイキット（Caymen chemicals、カタログ番号７０５００２）により、活性酸素種を測定した。肺洗浄によりＳＰ−Ｄノックアウトマウスおよび野生型マウスからサーファクタントを単離し、第一鉄イオンとの酸化還元反応を用いて脂質過酸化産物を測定した。脂質過酸化物は野生型マウス（ｎ＝４）からのサーファクタント中には検出されなかったが、しかしＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからの洗浄液中では容易に検出された（脂質過酸化産物０．８９６±０．３０５ｎｇ／リン脂質１ｍｇ）（ｎ＝４）。
【０１１７】
肺からのウイルスのクリアランスを強化するための方法およびＳＰ−Ｄを含有する組成物
種々の細菌、真菌およびウイルス病原体に対する先天性宿主防御にＳＰ−Ｄが関与する、という証拠が漸増している。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、ＳＰ−Ｄは細菌、真菌およびウイルスと相互作用する。ＳＰ−Ｄは肺胞マクロファージとも結合し、大腸菌(Escherichia Coli)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、ヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)およびカリニ肺炎菌(Pneumocystis carinii)とのマクロファージ会合を増大する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、マンノース結合タンパク質、コングルチニン，ＳＰ−ＡおよびＳＰ−ＤがＡ型インフルエンザウイルス（ＩＡＶ）を中和し、ＩＡＶとの好中球の会合を増強する。
【０１１８】
多数のウイルスが、上および下気道における呼吸器疾患と関連がある。これらの例としては、ＲＳＶ、インフルエンザ、水痘、第五病（ヒトパルボウイルスＢ１９）、１〜３型パラインフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、ライノウイルス、アデノウイルス、ハンタウイルスおよび風疹が挙げられる。Ａ型インフルエンザウイルス感染は風媒性であり、主に上気道の感染である。しかしながら感染中は、ウイルスは下気道に広がり、ウイルス肺炎を引き起こし得るし、あるいは患者が二次細菌感染に罹りやすくする。インフルエンザ感染は小児および若年成人においてもっとも高頻度であり、さらに死亡は幼児（＜１歳）、高齢者ならびに潜在的心臓または肺疾患を有する全年齢者において最も高頻度である。気管支肺異形成はＳＰ−Ｄの分泌低減に関連づけられており、嚢胞性線維症は、ＩＡＶのような呼吸器ウイルスによる感染に対する感受性を増大し得る条件である肺洗浄液中のＳＰ−Ｄ濃度低減に関連した。
【０１１９】
特異的ならびに非特異的免疫メカニズムは、インフルエンザウイルスに対する宿主応答に加わる。Ａ型インフルエンザウイルス感染は溶解性感染であり、感染初期に血液−組織バリアの破壊を生じて、肺中へのマクロファージ、好中球およびナチュラルキラー細胞の流入を引き起こす。ＩＡＶに対する特異的免疫応答は、ウイルス特異的Ｔリンパ球の流入および抗体産生により開始され、細胞傷害性Ｔリンパ球はウイルス感染細胞の直接的細胞溶解によりウイルスクリアランスに関与すると考えられる。好中球も、肺からのウイルスクリアランスに重要な役割を果たす。末梢多形核白血球の数を低減するよう照射されたマウスは、肺におけるインフルエンザ感染後、ウイルス力価を増大した。好中球および単球走化性、酸化性および細菌殺害機能の欠陥が、ＩＡＶ感染において実証された。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、ＩＡＶ曝露に起因する好中球機能不全は、ウイルスをＳＰ−Ｄとともに予備インキュベートすると、減少される。他方、ＳＰ−Ｄは、肺胞マクロファージによるＩＡＶ取り込みに及ぼす作用を有さないことが報告されている。
【０１２０】
ＳＰ−Ｄがｉｎ  ｖｉｔｒｏでウイルスに対する宿主防御を強化するという説得力のある証拠が存在するが、しかしｉｎ  ｖｉｖｏでのウイルス病原体のクリアランスにおけるその役割は実証されていない。したがってウイルスクリアランスにおけるＳＰ−Ｄの役割を実施例２３〜２９で明らかにしたが、この場合、ＳＰ−Ｄ欠損マウスをＡ型インフルエンザウイルスのＳＰ−Ｄ感受性および耐性株に気管内感染させた。高精製組換えＳＰ−Ｄを用いて、救済実験を実施した。ＩＡＶクリアランス、肺炎症、サイトカイン産生およびマクロファージによるウイルス取込みならびに好中球活性を、ｉｎ  ｖｉｖｏでＳＰ−Ｄ（−／−）およびＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスで比較した。実験は、肺からのウイルスのクリアランスならびに炎症特性の低減におけるＳＰ−Ｄに関する役割を示す。したがってＳＰ−Ｄは、ウイルス感染およびその結果生じる肺の炎症の治療に、特に幼児、高齢者、免疫無防備状態の者そしてあらゆる種類の肺欠損症を有する者における感染の治療のために用いられ得る。
【０１２１】
したがって実施形態は、ＳＰ−Ｄまたは活性ＳＰ−Ｄ変異体を用いて患者におけるウイルス感染を治療するための方法を包含する。ＳＰ−Ｄは、実施例９の場合と同様に、タンパク質として投与され得る。あるいはＳＰ−Ｄは、実施例１０および１１の場合と同様に、アデノウイルスまたはその他のベクターから発現され得る。あるいは活性ＳＰ−Ｄ遺伝子は、ＳＰ−Ｄ転写活性剤を用いてアップレギュレートされ得る。
【０１２２】
ＳＰ−Ｄを用いて治療可能なウイルス感染としては、（原発性であれ、二次性であれ）任意の肺ウイルス感染、例えばＡ型インフルエンザ、普通の風邪または風邪関連症状を引き起こすライノウイルスおよびその他のウイルス、ＲＳＶ、水痘、第五病（ヒトパルボウイルスＢ１９）、１〜３型パラインフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、ライノウイルス、アデノウイルス、ハンタウイルスおよび風疹が挙げられる。
【０１２３】
あるいはウイルス感染に関連した炎症および症状は、ＳＰ−Ｄで治療され得る。例えば風邪およびインフルエンザはしばしば、ウイルスが除去された後でさえ、炎症を引き起こす。この炎症応答または同様な応答は、ＳＰ−Ｄで治療され得る。
【０１２４】
ＳＰ−Ｄ治療が用いられ得る患者としては、肺ウイルス感染を有する全ての患者が挙げられる。しかしながら特にＳＰ−Ｄまたは不活性ＳＰ−Ｄのレベル低減を示す患者である。このような患者としては、喘息、気腫、嚢胞性線維症を有する患者、免疫無防備状態の患者、極若年患者、特に免疫系発達中の患者、ならびに極高齢患者が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２５】
以下の実施例では、肺のウイルス感染においてＳＰ−Ｄが果たす役割を同定するために、Ａ型インフルエンザウイルス（ＩＡＶ）をＳＰ−Ｄ（−／−）およびＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスに投与した。Ａ型インフルエンザウイルスを、原型的肺ウイルスとして用いた。実施例２４〜２９では、ウイルスクリアランス、好中球ＭＰＯ活性、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞増殖、サーファクタントプロテインＤ濃度、ならびにサイトカインレベルに及ぼす作用を評価した。肺ウイルス力価、総細胞数、サイトカイン、ＭＰＯ活性およびＳＰ−Ｄレベルを、分散分析法（ＡＮＯＶＡ）およびスチューデントｔ検定を用いて比較した。知見は、確率レベル＜０．０５で統計学的に有意であるとみなされた。
【０１２６】
実施例２４〜２９では、Ａ型インフルエンザウイルスの鼻腔内投与Ｐｈｉｌ／８２株の肺クリアランスが、ＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスと比較して、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいて低減された。しかしながらｉｎ  ｖｉｔｒｏでＳＰ−Ｄに対して相対的に耐性である低グリコシル化株Ｍｅｍ／７１は、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスの肺から効率的に除去された。さらに組換えＳＰ−Ｄの同時投与は、ウイルスクリアランスを正規化した。したがってＩＡＶの障害性クリアランスは、ＳＰ−Ｄヌル表現型の他の態様またはより包括的な宿主防御欠損に原因があるというよりむしろ、ＳＰ−Ｄにおける欠損に直接原因があり得る。この点で、ＳＰ−ＤヌルマウスはＢ群連鎖球菌およびインフルエンザ菌のクリアランスの障害を示さない、ということを前の結果は実証した。肺炎症は、ＩＡＶ感染後の肺における総細胞数および前炎症性サイトカイン増大により示した場合、野生型対照と比較して、ＳＰ−Ｄ欠損マウスにおいて増大した。好中球ミエロペルオキシダーゼ活性はＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいて低減されたが、これは、ＩＡＶの好中球クリアランスが減損され得ることを示唆する。肺ＩＡＶ感染は、野生型マウスにおけるＳＰ−Ｄ濃度を増大した。これらの知見は、ＳＰ−Ｄが、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＩＡＶおよびその他の肺ウイルスのある種の株に対する初期肺宿主防御において重要な役割を果たす、ということを実証する。
【０１２７】
ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスの肺からのＩＡＶのクリアランス減損は、宿主防御におけるＳＰ−Ｄの重要性を支持する。ＳＰ−Ｄは、マンノース結合タンパク質、コングルチニンおよびＳＰ−Ａを含むポリペプチドのＣ型レクチンファミリーの一成員である。Ｃ型レクチンは、膠原性アミノ末端および「球状」カルボキシ末端ドメインを含めた構造的特徴を共有し、後者はオプソニン化において機能する炭水化物認識ドメインとして役立つ。カルシウムの存在下で、ＳＰ−Ｄは種々の複合糖類、例えば二糖類および単糖類、例えばマルトース、グルコースおよびマンノースと結合する。インフルエンザウイルスは、２つの膜糖タンパク質、すなわちヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）を有する。コレクチンはインフルエンザウイルス糖タンパク質上でオリゴ糖と結合し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでウイルス感染性を中和し、ウイルスのより重度にグリコシル化された株がもっとも感受性である。ＳＰ−Ｄは、ＩＡＶの炭水化物側鎖と結合し、受容体結合部位への細胞表面受容体のアクセスを遮断し、したがって宿主細胞によるウイルスインターナライゼーションを妨げることにより、ウイルスクリアランスを強化し得る。さらにＳＰ−Ｄは、ＩＡＶを結合し、凝集させて、これが部分的に、粘膜毛様体による肺からのウイルス除去および食作用性クリアランスを強化し得る。しかしながら肺胞マクロファージによるウイルスの取込みは低減されないという知見は、ＳＰ−Ｄ結合、凝集および肺胞マクロファージによる取込みがＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいて認められたウイルス殺害低減の重大な決定因子ではないことを示唆する。
【０１２８】
ＳＰ−Ｄの非存在下では、肺からのＩＡＶウイルスクリアランスは減損された。さらに肺炎症はＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいてより重症であり、これはＳＰ−Ｄがウイルス感染中のサイトカイン産生および炎症性応答を調整するのに一役を果たすことを示唆する。ＳＰ−Ｄは、粘膜毛様体クリアランス、ならびに多形核白血球の動員および活性化の強化により肺からのＩＡＶ除去も強化し得るＩＡＶとの結合およびその凝集によって、さらなる役割を有する。気道は、インフルエンザウイルスおよびその他の呼吸器病原体に関する通常の進入口であるため、ＳＰ−Ｄの局所的産生も、吸入ウイルスに対する先天性防御応答に関与し得る。
【実施例２３】
【０１２９】
ＩＡＶ投与後のＳＰ−Ｄ（−／−）マウスの肺病態
実施例１に示したように標的化遺伝子不活性化により、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスを産生した。ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスの肺は、検出可能なＳＰ−Ｄを含有しない。元の１２９／ＮＩＨスイスブラックへテロ接合型マウスをＮＩＨスイスブラックマウスと交配し、ＳＰ−Ｄ（−／−）およびＳＰ−Ｄ（＋／＋）コロニーを保持した。マウスを障壁封じ込めに収容し、血清学的に査定する場合、無ウイルス状態を存続させた。試験は、Institutional Animal Care and Use Committee of the Children’s Hospital Research Foundation, Cincinnatiにより再検討され、認可された。約２０〜２５ｇ（３５〜４２日齢）の雌雄マウスを用いた。
【０１３０】
ＳＰ−Ｄ（−／−）およびＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスへの投与のために用いられるＩＡＶを、以下のように調製した：ＩＡＶ株Ｈ３Ｎ２Ａ／Phillipines／８２（Ｐｈｉｌ／８２）およびＨ３Ｎ１  Ｍｅｍ７１Ｈ−ＢｅｌＮ（Ｍｅｍ７１）は、E.M. AndersからK. Hartshorn(University of Melbourne, Melbourne, Australia)に厚意により進呈されたものであり、１０日齢孵化鶏卵の漿尿膜液中で増殖させた。尿嚢液を４８時間インキュベーション後に採取し、１，０００ｇで４０分の遠心分離により清澄化し、その後１３５，０００ｇでの遠心分離によりウイルスを沈殿させた。ウイルス含有ペレットを再懸濁し、前に記載されたように不連続スクロース密度勾配上で精製した（Hartshorn, et al. 2000. Enhanced anti-influenza activity of a surfactant protein D and serum conglutinin fusion protein. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 278: L90-L98）。ウイルスストックを、リン酸塩緩衝化生理食塩溶液（ＰＢＳ）に対して透析し、アリコートに分けて、使用するまで−７０℃で保存した。ＰＢＳ中でウイルス試料を滴定し、その後、徹底的に洗浄したヒトＯ型赤血球を付加することにより、ヘマグルチニン（ＨＡ）力価を確定した。−７０℃での凍結貯蔵から試料を解凍した後、ＨＡおよびタンパク質アッセイにより各ウイルスストックの効力を測定した。以下の手法を用いて、ウイルスをＦＩＴＣで標識した。
【０１３１】
蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）ストックを、１ｍｏｌ／Ｌ炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６中に１ｍｇ／ｍｌで調製した。濃縮ウイルスストックをＦＩＴＣとともに（ＰＢＳ中のウイルスとＦＩＴＣストックの１０：１（容積で）混合物）1時間インキュベートし、その後、ＰＢＳに対して１８時間混合物を透析することにより、ＦＩＴＣ標識化ウイルス（Ｐｈｉｌ／８２）を調製した。ＦＩＴＣ標識化ＩＡＶの接種。
【０１３２】
マウスをイソフルランで軽く麻酔して、５０μｌのＰＢＳ中のＩＡＶの１０５蛍光病巣（ｆｆ）を鼻腔内接種した。ＩＡＶを動物に接種後３日および５日目に、肺ホモジネートの定量的ＩＡＶ培養を実施した。全肺を摘出し、２ｍｌの滅菌ＰＢＳ中で均質化して、急速冷凍し、計量して、−８０℃で保存した。記載された様にウイルス病巣アッセイのために、９６ウエルプレート中にマディン−ダービーイヌ腎単一層を調製した（Hartshorn, et al. 2000. Enhanced anti-influenza activity of a surfactant protein D and serum conglutinin fusion protein. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 278: L90-L98）。その層を、２ｍＭのカルシウムを含有するＰＢＳ中に希釈した肺ホモジネートと一緒に、３７℃で４５分間インキュベートし、１％ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有する無ウイルスＤＭＥＭ中で単一層を３回洗浄した。単一層をＤＭＥＭ中で３７℃で７時間インキュベートし、繰り返し洗浄して、８０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）アセトンを用いて−２０℃で１０分間、細胞を固定した。次に単一層を、ＩＡＶ核タンパク質に対して向けられるモノクローナル抗体（モノクローナル抗体Ａ−３）とともに、次にローダミン標識化ヤギ抗マウスＩｇＧとともにインキュベートした。蛍光顕微鏡により直接的に、蛍光病巣を計数した。その結果生じた力価を肺重量で割って、蛍光病巣（ｆｆ）／肺１ｇとして報告した。
【０１３３】
ＩＡＶ（１０５ｆｆ）の鼻腔内投与は十分に耐容され、全動物が試験期間を生き延びた。ＩＡＶに感染したマウスは感染後４日の間に体重を損失した。体重損失パーセンテージは、ＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスに関する１．５±１．０％と比較して、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスに関してはより大きく１４．４±１．４％＊であった（平均±ＳＥＭ、ｎ＝６匹マウス、＊ｐ＜０．０５（ＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスとの比較））。ＢＡＬＦ中の総細胞数増大が、ＩＡＶ感染後３日および５日目にＳＰ−Ｄ（−／−）マウスで観察された（図１９参照）。ＰＢＳを接種された対照からのＢＡＬ液中のベースライン総細胞数は、ＳＰ−Ｄ（＋／＋）およびＳＰ−Ｄ（−／−）マウスに関して有意に異ならなかった（図１９参照）。ＰＭＮの有意に大きいパーセンテージが、感染後３日および５日目にＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスと比較したＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからのＢＡＬ液中で検出された（図１９参照）。肺浸潤物は、滅菌ＰＢＳを接種された野生型マウス（ｎ＝５）においては観察されなかった。
【０１３４】
実施例２４では、ＩＡＶのクリアランスをＳＰ−Ｄ（−／−）および野生型マウスにおいて定量した。
【実施例２４】
【０１３５】
ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおけるウイルスクリアランス
ＩＡＶの異なる株を動物に接種後３日および５日目に、肺ホモジネートの定量的ＩＡＶ培養を実施した。インフルエンザウイルスの株は、表面糖タンパク質のグリコシル化の程度が異なる。グリコシル化における株依存性変化がＳＰ−Ｄ依存性クリアランスに影響を及ぼすか否かを調べるために、Ｍｅｍ７１Ｈ−ＢｅｌＮ（Ｈ３Ｎ１）（Ｍｅｍ／７１）による感染をＰｈｉｌ／８２と比較した。前の試験は、Ｐｈｉｌ／８２より少ないグリコシル化ヘマグルチニンを有するＭｅｍ／７１が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＳＰ−Ｄの作用に対して相対的に耐性であることを示した。Ｍｅｍ／７１は、ＳＰ−Ｄ感受性株と比較して、低ＳＰ−Ｄ依存性ウイルス凝集および赤血球凝集抑制、好中球取込みおよび活性化の増強低減、ならびに感染性の抑制低減を示す。Ｍｅｍ／７１の肺中力価はＳＰ−Ｄ（−／−）マウス（６．８×１０３±１．９×１０３ｆｆ／肺１ｇ）およびＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウス（５．９×１０３±１．４×１０３）（平均±ＳＥＭ、８匹／群）に関して同様であったことは有意である。
【０１３６】
しかしながらＩＡＶ（Ｐｈｉｌ／８２）のウイルス力価増大は、ＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスと比較して、感染後３日および５日目のＳＰ−Ｄ（−／−）マウスの肺で観察された（図２０参照）。
【０１３７】
次にヒトＳＰ−ＤをＩＡＶ感染マウスに投与して、作用を分析した。ヒトＳＰ−Ｄ（ｈＳＰ−Ｄ）を、記載された様に単離した（Hartshorn, et al. 1996. “Interactions of recombinant human pulmonary surfactant protein D and SP-D multimers with influenza A”, Am. J. Physiol. 271: L753-L762）。要するに、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）を、ｐＥＥ１４哺乳動物発現ベクター中で全長ヒトｃＤＮＡを用いてトランスフェクトした。分泌ＳＰ−Ｄをマルトシル−アガロースアフィニティークロマトグラフィーにより単離し、非変性条件下でのゲル濾過クロマトグラフィーによりＳＰ−Ｄ十二量体を大型多量体および三量体から分離した。マルトシル−アガロース上での再クロマトグラフィーにより、タンパク質を濃縮した。１０ｍＭのＥＤＴＡを含有するＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩溶液中で結合タンパク質を溶離し、−８０℃で保存した。標準としてウシ血清アルブミンを用いた染料結合アッセイを用いて、タンパク質濃度を概算した。標準として大腸菌０１１１：Ｂ４内毒素を用いた終点色素産生性微小プレートアッセイ（Chromogenix, Sweden）を用いて、内毒素汚染のレベルを定量した。これらの実験のために用いられる精製組換えタンパク質の内毒素含量は、ストック溶液に関しては＜２ｎｇ／ｍｌであった。ＩＡＶをマウスに鼻腔内接種し、その後、ＰＢＳまたはＳＰ−Ｄ（５μｇ）を気管内接種後３日目に、肺ホモジネートの定量的ＩＡＶ培養を実施した。
【０１３８】
組換えＳＰ−Ｄ（５μｇ）の気管内同時投与は、感染後３日目の非処置ＳＰ−Ｄ（−／−）（１．６×１０４±４．０×１０４）マウスと比較して、ＳＰ−Ｄ（−／−）（７．５×１０４±１．４×１０４＊ｆｆ／肺１ｇ）の肺からのＡ／Phillipines／８２（Ｈ３Ｎ２）（Ｐｈｉｌ／８２）ウイルスのクリアランスを強化した（平均±ＳＥＭ、ｎ＝８匹／群、＊ｐ＜０．０５）。
【０１３９】
これは、ＳＰ−Ｄが肺からのウイルスのクリアランスに一役を有し、そして欠損動物へのＳＰ−Ｄの投与がウイルス取り込みを強化して、肺ウイルス感染の治療方法を提供する、ということを示唆する。
【０１４０】
実施例２５では、ＩＡＶ感染ＳＰ−Ｄ（−／−）およびＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスにおいて、サイトカインレベルを分析した。
【実施例２５】
【０１４１】
肺ホモジネート中のサイトカインレベル
ＳＰ−Ｄ（−／−）およびＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスのＩＡＶ感染後３日および５日目に、サイトカインレベルを分析した。肺ホモジネートを２０００ＲＰＭで遠心分離し、上清を−２０℃で保存した。製造業者の指示に従って、ネズミサンドイッチＥＬＩＳＡキット（R & D Systems,Minneapolis, MN）を用いて、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、インターロイキン（ＩＬ）−１β、ＩＬ−６およびマクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ）−２を定量した。プレートは全て、マイクロプレート読取機（Molecular Devices, Menlo Park, CA）で読み取り、コンピューター補助分析プログラム（ソフトマックス；Molecular Devices）を用いて分析した。算定回帰線値＞０．９５を示す標準曲線を有するアッセイのみが、分析のために許容可能であった。
【０１４２】
結果は、ＩＡＶ感染後３日および５日目に、前炎症性サイトカインＴＮＦ−α、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６は、ＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスと比較して、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからの肺ホモジネート中で有意に増大された（図２１）。ＩＦＮ−γは、ＩＡＶ感染後、ＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスと比較して、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスの肺で増大された。ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからの肺は、ＩＡＶ感染後５日目に、ＩＦＮ−γの最大濃度を有し、ＳＰ−Ｄ（＋／＋）およびＳＰ−Ｄ（−／−）マウスに関してはそれぞれ９１±２０および２３９８±１７６ｐｇ／ｍｌであった（平均±ＳＥＭ、＊ｐ＜０．０５）。好中球化学誘引物質であるＭＩＰ−２は、ウイルス感染後のＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからの肺ホモジネート中で有意に多かった（図２１参照）。ＳＰ−Ｄによる気管内処置は、それぞれ非処置ＳＰ−Ｄ（−／−）および処置ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスに関して肺中のＴＮＦ−α（６７．２±８．９から１９．０±７．０ｐｇ／ｍｌに）およびＩＬ−６（４８１±７３から２９５±２９＊ｐｇ／ｍｌに）レベルを有意に低減した（平均±ＳＥＭ、＊ｐ＜０．０５）。滅菌ＰＢＳを接種された対照マウスの肺中の基礎サイトカインレベルは低いかまたは存在せず、ＳＰ−Ｄ（−／−）およびＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスにおいて異ならなかった。
【０１４３】
ＩＡＶ感染後、炎症のマーカー、例えば炎症細胞およびサイトカインは、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスの肺中で増大され、外因性組換えＳＰ−ＤはＩＡＶ誘導性サイトカイン産生を低減した。ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスは、ＩＡＶ感染に対する免疫応答を増大し得た。しかしながら応答は、野生型対照と比較して大いに増大された。サイトカイン産生増大は、ウイルス感染後のＢＡＬ液中の細胞増大を反映し得た。非感染ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスは肺中の肺胞マクロファージの数を控えめに増大したが、しかしながら前炎症性サイトカイン濃度は実質的に増大しなかった。サイトカイン、すなわちＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＦＮ−γの増大は、肺におけるリンパ球および単核球浸潤物と関連したＩＡＶ感染のマウスモデルで実証された。ＩＡＶに対するサイトカイン応答は、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいて同様で、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＦＮ−γ増大を伴ったが、しかしながらＩＡＶに対する肺サイトカイン応答は、野生型マウスよりも、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスのほうが有意に大きかった。炎症応答増大は、細菌攻撃誘発後にも観察された。これらの知見は、ＳＰ−Ｄがｉｎ  ｖｉｖｏで重要な抗炎症的役割を果たすという一般的仮説と一致した。これらの作用が、取込みまたはクリアランスを強化しながら、肺組織に対する付随する損傷を最小限にするために役立った、ということもあり得る。
【０１４４】
実施例２６では、食作用に及ぼすＳＰ−Ｄの作用を査定した。
【実施例２６】
【０１４５】
マクロファージによるＩＡＶの食作用
肺胞マクロファージによるＦＩＴＣ標識化ＩＡＶの食作用を、フローサイトメトリーにより査定した。ウイルスの取込みは、ＩＡＶ感染後２時間目のＳＰ−Ｄ（＋／＋）およびＳＰ−Ｄ（−／−）マウスで同様であった（それぞれ１１．１±１．９％および９．４±１．９％の食作用（平均±ＳＥＭ）。これらの結果は、ＩＡＶのマクロファージ食作用がｉｎ  ｖｉｖｏでＳＰ−Ｄの非存在下で観察されたＩＡＶのクリアランス低減に対する主要誘因でない、ということを示唆した。
【０１４６】
ＦＩＴＣ標識化ＩＡＶをマウスに鼻腔内感染させて、その後フローサイトメトリーにより細胞関連蛍光を評価することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏでのマクロファージによるＩＡＶの食作用を測定した。感染２時間後、ＢＡＬ液からのマクロファージをフィコエリテリン（ＰＥ）接合ネズミＣＤ１６／ＣＤ３２抗体（Pharmingen, San Diego, CA）とともに氷上で１時間、緩衝液（ＰＢＳ、０．２％ＢＳＡ分画Ｖ、０．０２％アジ化ナトリウム）中でインキュベートし、新鮮な緩衝液中で２回洗浄した。トリパンブルー（０．２ｍｇ／ｍｌ）を付加して、細胞外ＦＩＴＣの蛍光を消光した。ＣＥＬＬＱｕｅｓｔソフトウエア（Becton Dickinson, San Jose, CA）を用いて、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターで細胞関連蛍光を測定した。マクロファージの各試料に関して、２０，０００細胞を二重反復試験で計数し、その結果をマクロファージ食作用のパーセンテージとして表した。
【０１４７】
肺胞マクロファージによるＩＡＶの食作用は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＳＰ−Ｄ（−／−）および野生型マウスに関してと同様であった。マクロファージ食作用は初期非特異的免疫応答の一部であるため、初期時点を選択してマクロファージ食作用を査定したが、しかしながらマクロファージによるウイルス食作用を査定するための最適時点は、未知である。さらに、マクロファージ蛍光を検出するためには、大量の摂食済みＦＩＴＣ標識化ウイルスが必要である。序論で示したように、ＳＰ−Ｄはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの肺胞マクロファージによるＩＡＶのいくつかの株の取込みを強化しない、ということを前の研究は示唆している。ＳＰ−Ｄの非存在下では、ＩＡＶのマクロファージ食作用は野生型マウスと同様であり、このことは、ＳＰ−Ｄがｉｎ  ｖｉｖｏでのＩＡＶのマクロファージクリアランスに関する重大な決定因子ではないことを示唆している。
【実施例２７】
【０１４８】
ＢＡＬＦ中のＣＤ４およびＣＤ８リンパ球
ＩＡＶ感染後３日目に、ＣＤ４（ヘルパーＴリンパ球）およびＣＤ８（細胞傷害性Ｔリンパ球）細胞をＢＡＬＦ中で測定した。ＳＰ−Ｄ（−／−）およびＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウス間にＢＡＬＦ中のＣＤ４およびＣＤ８Ｔリンパ球のパーセンテージにおける差異は認められなかった（図２２）。ＢＡＬＦ中のＣＤ４およびＣＤ８Ｔリンパ球の分画は、非感染ＳＰ−Ｄ（＋／＋）およびＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいて同様であった（図２２参照）。
【０１４９】
気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）により、肺細胞を回収した。ウイルスクリアランスに関して記載したように動物を屠殺し、１ｍｌの滅菌ＰＢＳで肺を３回洗浄した。その液を２０００ＲＰＭで１０分間遠心分離し、６００μｌのＰＢＳ中に再懸濁して、総細胞をトリパンブルーで染色し、光学顕微鏡下で計数した。Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ（Scientific Products, McGaw Park, IN）で染色したサイトスピン調製物で、鑑別（differencial）細胞計数を実施した。
【０１５０】
鼻腔内ＩＡＶ感染後、蛍光抗体でＢＡＬＦ中の細胞を染色し、その後、フローサイトメトリーにより細胞関連蛍光を評価して、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔリンパ球を測定した。感染３日後、ＢＡＬ液からの細胞を、ラット抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２抗体（Ｆｃブロック）、ＦＩＴＣ接合マウスＣＤ４およびフィコエリテリン（ＰＥ）接合マウスＣＤ８抗体（Pharmingen, San Diego, CA）とともに緩衝液（ＰＢＳ、０．２％ＢＳＡ分画Ｖ、０．０２％アジ化ナトリウム）中で氷上で１時間インキュベートし、新鮮な緩衝液で２回洗浄した。ＣＥＬＬＱｕｅｓｔソフトウエア（Becton Dickinson, San Jose, CA）を用いて、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターで細胞関連蛍光を測定した。各試料に関して、２０，０００細胞を計数し、その結果をＢＡＬＦ中のＣＤ４およびＣＤ８Ｔリンパ球パーセンテージとして表した。
【０１５１】
細胞傷害性Ｔ細胞は、ウイルス感染細胞の直接的細胞溶解による肺からのＩＡＶクリアランスにおいて重要な役割を果たす。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、ＳＰ−Ｄは、ＩＬ−２依存性有糸分裂刺激性Ｔリンパ球増殖を抑制する。しかしながら結果は、ＳＰ−Ｄの非存在下ではＢＡＬＦ中のＣＤ４およびＣＤ８Ｔリンパ球のパーセンテージはＩＡＶ感染後の野生型マウスの場合と同様であることを示した。最近の研究はＩＡＶ感染後のＢＡＬ液中に存在するＴリンパ球の数を調べたが、しかしＴリンパ球の機能および活性化状態は調べなかった。
【０１５２】
実施例２８では、好中球中のミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性に及ぼすＳＰ−Ｄの作用を調べた。
【実施例２８】
【０１５３】
ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおける好中球ＭＰＯ活性低減
ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）は、好中球の特定の顆粒中に蓄えられる。好中球機能の一測定値として、肺洗浄液中に回収される好中球に関連したＭＰＯのレベルを確定した。ＩＡＶ感染後、単離ＢＡＬ好中球からのＭＰＯ活性は、ＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスと比較して、ＳＰ−Ｄ（−／−）において有意に低減された（図２３）。非感染ＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスの血液から単離された対照好中球は、ＩＡＶ感染ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからのＢＡＬ好中球と比較して有意に大きいＭＰＯ活性を、そしてＩＡＶ感染ＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスからのＢＡＬ好中球と比較して有意に低いＭＰＯ活性を有した（図２４参照）。
【０１５４】
１０６ｆｆの濃度のＩＡＶによる鼻腔内感染後３日目のＢＡＬ好中球で、ミエロペルオキシダーゼ活性を測定した。より高いウイルス濃度を用いて、試験のために適切な好中球を提供した。３匹の野生型マウスからのＢＡＬＦをプールして、十分な好中球を提供する一方、１匹のＳＰ−Ｄ（−／−）マウスを用いた。非感染ＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスから採取した血液を好中球単離培地（ＮＩＭ−１、Cardinal Associates, Santa Fe, NM）の勾配上で分離して、血中好中球を単離した。最終容積５０μｌ中の９６ウエル微小滴定プレート中のホモジネート緩衝液（１００ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０；２０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸「ＥＤＴＡ」ｐＨ７．０；１％臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム「ＨＥＴＡＢ」）に好中球を付加した。好中球混合物を３７℃で１時間インキュベートして、好中球を溶解し、顆粒からＭＰＯを放出させた。１ｍＭのＨ２Ｏ２、１％ＨＥＴＡＢ、３．２ｍＭの３，３’５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を含有するアッセイ用緩衝液（１００μｌ）を各ウエルに添加して、４分間、ＴＨＥＲＭＯＭＡＸ微小プレート読取機を用いて６５０ｎｍで読取りをした。読み取りは少なくとも３つの個々のウエルの平均であり、ＭＰＯ活性は最大ＭＰＯ活性／４分／１０３好中球として報告された。
【０１５５】
ＩＡＶ感染後、肺好中球蓄積は、野生型マウスの場合より、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスのほうが多かった。しかしながら細胞あたりで正規化された好中球ミエロペルオキシダーゼ活性は、ＳＰ−Ｄ欠損マウスにおいてはＩＡＶ感染後低減された。そのレベルは血中好中球中では正常であったため、ＳＰ−Ｄの非存在下では動員細胞ウイルス攻撃誘発に応答してより大きい程度の脱顆粒を受けたと思われる。好中球走化性、酸化的および細菌殺害機能における欠損は、ＩＡＶ感染において立証されている。さらに、これらの細胞の機能の減損と細菌重複感染に対する疾病素質との間の相関が認められることが動物モデルにおいて示された。ＳＰ−Ｄは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのインターナライズ化ウイルスに対する取込みおよび特異的酸化応答を強化する。さらにＳＰ−Ｄは、好中球呼吸バースト応答に及ぼすＩＡＶの抑制作用を低減する。好中球脱顆粒およびＭＰＯ活性に及ぼすＳＰ−ＤおよびＩＡＶの作用はｉｎ  ｖｉｔｒｏでは未だ特性化されていないが、しかし知見は、ＩＡＶに対する初期宿主応答に関する好中球の潜在的重要性を強調し、ＳＰ−Ｄがインターナライズ化ウイルスに対する好中球応答を変え得ることを示唆する。
【実施例２９】
【０１５６】
ＩＡＶ感染は肺におけるＳＰ−Ｄ蓄積を強化する
肺ホモジネート中のＳＰ−Ｄの濃度は、ＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスにおいてはＩＡＶ感染後３日目に約２倍増大された（図２４参照）。ＩＡＶ後５日目に、感染ＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスの肺中のＳＰ−Ｄ濃度は、非感染ＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスと同様の濃度に低減した。
【０１５７】
酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）により、肺ホモジネート中のＳＰ−Ｄの濃度を確定した。ＩＡＶによる感染後３日および５日目に、感染および非感染野生型マウスから肺を摘出して、２ｍｌのＰＢＳ中で均質化した。ウサギおよびモルモット抗ＳＰ−Ｄ血清を用いて二重抗体ＥＬＩＳＡにおいて、サーファクタントプロテインＤ濃度を測定した。各アッセイプレートは、精製マウスＳＰ−Ｄを用いて生成された標準曲線を包含した。全試料を二重反復試験で実行して、吸光度対標準濃度をグラフにして、試料の濃度を算定した。
【０１５８】
ＳＰ−Ｄは酸化剤感受性経路により肺胞マクロファージにおけるＮｆ−κＢおよびマトリックスメタロプロテイナーゼ産生を調節する
マウスにおけるＳＰ−Ｄ遺伝子の標的化遺伝子不活性化は、サーファクタントリン脂質の蓄積、気腫、ならびに脂質を持った泡沫状肺胞マクロファージ数の増大を生じた。ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおける気腫は、肺感染後の、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）−２、９、１２の産生増大、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、ならびに前炎症性サイトカイン産生増大に関連した。サイトカイン、ＭＭＰおよびＨ２Ｏ２の局所的産生はＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおける気腫の発症に一役を果たし得るが、一方、これらの分子の生成を媒介するメカニズムは同定されなかった。
【０１５９】
活性酸素種（ＲＯＳ）、例えばスーパーオキシド陰イオン（Ｏ２−）、ヒドロキシラジカル（ＯＨ・）および過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）は、酸化的ストレスに関連したいくつかの肺疾患、例えば気腫、成人性呼吸窮迫症候群、喘息および肺線維症の発病に結びつけられてきた。ＲＯＳは宿主防御において重大な役割を果たすが、しかし急性および慢性炎症中に生成されるＲＯＳ増大は細胞傷害性であり、種々の高分子、脂質過酸化、タンパク質架橋、タンパク質断片化、ＤＮＡ損傷および鎖破壊に対する酸化的損傷を引き起こし得る。酸化的ストレスは、感染および損傷に対する細胞応答を媒介する転写経路の活性化に関連づけられてきた。例えば核因子κＢ（ＮＦ−κＢ）およびアクチベータープロテイン−１（ＡＰ−１）の活性は、酸化的ストレスにより刺激された。ＮＦ−κＢおよびＡＰ−１に関する結合部位を、前炎症性サイトカインを含めた多数の遺伝子のプロモーター中で同定した。同様に、ＮＦ−κＢおよび／またはＡＰ−１を結合するシス作用素子が、ＭＭＰ−２、９および１２遺伝子のプロモーター領域に存在した。したがって本明細書中では、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいてＡＭにより生成される活性酸素種は、酸化還元感受性転写因子を活性化して、ＭＭＰの発現増大を生じ得る、と仮定された。本発明の試験では、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスの肺でＲＯＳ増大を実証した。酸化剤感受性経路、例えばＮＦ−κＢ活性化により、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからの肺胞マクロファージによるＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９産生を刺激した。
【０１６０】
以後の実施例では、肺胞マクロファージ中のメタロプロテイナーゼ産生に及ぼすＳＰ−Ｄの作用を査定した。ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスを気腫のモデルとして用いて、ＳＰ−Ｄ（＋／＋）を比較した。結果を、平均±標準誤差（ＳＥ）で表す。スチューデントｔ検定により比較を行なった。ＳｔａｔｖｉｅｗＩＩ統計パッケージ（Abacus Concepts, Berkeley, CA）を用いて統計学的算定を実施した。Ｐ＜０．０５の値を有意とみなした。
【０１６１】
実施例に用いたＳＰ−Ｄ（−／−）マウスは、実施例１と同様に標的化遺伝子不活性化により生成した。
【０１６２】
リン酸塩緩衝化生理食塩溶液（ＰＢＳ）の１ｍｌアリコートを１０回滴注することにより、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）からの肺胞マクロファージ（ＡＭ）の単離を実施した。いくつかの動物からのＢＡＬ液をプールして、各分析のための十分数のマクロファージを提供した。洗浄液を１２００ｒｐｍで７分間遠心分離して、ペレット化細胞を、１％Ｎｕｔｒｉｏｄｏｍａ（Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN）を含有する無血清ＲＰＭＩ培地中に再懸濁し、血球計で計数した。ＷＴおよびＳＰ−Ｄ（−／−）マウスの両方において、９０％より多いＢＡＬ細胞がＡＭであった。いくつかの実験に関しては、３７℃での組織培養フラスコへの鑑別付着により、肺胞マクロファージ（ＡＭ）を単離した。次に非接着細胞を除去し、新鮮な無血清培地を付加した。実験終了まで、接着ＡＭを５％ＣＯ２および９５％空気を含有する加湿大気中に保持した。
【０１６３】
実施例３０〜３２の実験は、肺中の肺胞マクロファージによる酸化剤産生または活性酸素種（ＲＯＳ）のクリアランスの調節のためにＳＰ−Ｄシグナル伝達が必要とされること、ならびにシグナル伝達がＮＦ−κＢ経路を介して起こることを示す。特に、ＳＰ−Ｄは、ＮＦ−κＢの作用を抑制することにより作用する。
【０１６４】
したがって、阻害剤としてＳＰ−Ｄを用いるＮＦ−κＢの過活性化に関連した肺疾患の治療方法が提供される。ＳＰ−Ｄは、本明細書中で前に用いた、そして実施例９〜１２に略記した方法のいずれかで投与され得る。
【実施例３０】
【０１６５】
ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスの肺における酸化剤ストレス増大
酸化剤ストレスがＳＰ−Ｄ（−／−）マウスの肺において増大されたか否かを確定するために、脂質過酸化物（ＬＰＯ）濃度を査定した。ＬＰＯ−５８６アッセイキット（OXIS International, Inc., Portland, OR）を用いて、ＳＰ−Ｄ（−／−）および野生型マウスからの全肺において、脂質ヒドロペルオキシド（ＬＰＯ）濃度を測定した。肺を単離し、５ｍＭのブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）を含有するＰＢＳを用いて均質化して、４℃で１５分間、１５０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を収集し、マロンアルデヒドおよび４−ヒドロキシアルケナールの含量を、製造業者の手法を用いて比色定量的に測定した。肺ホモジネートのＬＰＯ含量は、野生型マウスと比較して、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスの肺において有意に増大された（図２５参照）。
【０１６６】
脂質過酸化由来カルボニルの組織化学的検出を、以下のように実施した：凍結組織検体から得た肺切片（１０μｍ厚）を、５％酢酸を含有する５０％エタノール中の０．１％３−ＯＨ−２−ナフトエ酸ヒドラジン（ＯＨＮＡＨ）溶液に、６０℃で１時間曝露した。反応後、切片を５０％エタノール中で十分に洗浄し、等容積の１００ｍＭリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．４と９５％エタノールを混合することにより調製したアルコール緩衝液中の０．１％ファストブルー(fast blue)Ｂ溶液で５〜１０分染色した。ＯＨＮＡＨとの反応により、カルボニルをナフトエ酸ヒドラゾンに転化した。次にジアゾニウム塩とのカップリングは、バイオレットアゾ染料を生じた。ＯＨＮＡＨテトラゾリウムによる組織化学的染色は、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからの肺切片における染色増大を実証した。ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおけるＯＨＮＡＨ染色の強度は均一ではなく、泡沫状マクロファージ浸潤の部位でもっとも顕著であった（図２６参照）。
【０１６７】
細胞内過酸化物、例えばＨ２Ｏ２および脂質過酸化物の指示薬であるＣＤＣＦＨを用いて、ＡＭにおける細胞内活性酸素種（ＲＯＳ）を確定した。ＣＤＣＦＨ、二酢酸６−カルボキシ−２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセイン（Molecular Probes, Inc., Eugene, OR）は、蛍光プローブである。染色させるために、ＡＭを１０μＭのＣＤＣＦＨとともに３０分間インキュベートし、ＰＢＳですすいで、４％パラホルムアルデヒドで固定した。それぞれ４８５および５３０の励起および発光波長を用いて、蛍光顕微鏡により蛍光を観察した。ＣＤＣＦＨ蛍光増大は、対照マウスからのＡＭと比較して、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからのＡＭにおいて観察された（図２７）。前の知見と一緒に考えあわせると、これは、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからのＡＭによる過酸化水素産生増大を実証し、本データは、酸化的ストレスがＳＰ−Ｄの非存在下での肺組織中で増大されるという概念を支持する。
【実施例３１】
【０１６８】
ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおけるＮＦ−κＢの活性化
ＲＯＳは、酸化還元感受性転写因子、例えばＮＦ−κＢおよびＡＰ−１を活性化する。したがってＳＰ−Ｄの存在がこれらの転写因子のいずれかの産生と相関するか否かを確定することは興味深いことであった。ＮＦ−κＢｐ６５に関する免疫染色を、以下のように実施した：ＢＡＬ細胞を野生型およびＳＰ−Ｄ（−／−）マウスから単離し、細胞回転して、冷メタノールで１０分間固定し、ＰＢＳ中で洗浄した。次にスライドをウサギ抗ｐ６５抗体（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）とともに４℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、スライドをＰＢＳ中で洗浄し、二次抗体としてのフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−接合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Santa Cruz Biotechnology）とともにインキュベートして、一次抗体を用いずに同様に調製した試料と比較した。
【０１６９】
抗ＮＦ−κＢ  ｐ６５抗体を用いた免疫蛍光染色分析は、ＮＦ−κＢのｐ６５サブユニットが野生型およびＳＰ−Ｄ（−／−）マウスの両方からのＡＭの細胞質中に存在することを実証した（図２８Ａ）。しかしながらＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからのＡＭでは、ＮＦ−κＢｐ６５に関する染色増大が観察された。さらに核染色はＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからのＡＭにおいて顕著に増大し、ＷＴマウスからのＡＭではほとんど検出されなかった。ＥＭＳＡにおけるコンセンサスＮＦ−κＢオリゴヌクレオチドとの結合を査定することにより、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからの核抽出物で、ＮＦ−κＢ活性を確定した（図２８Ｂ）。ＮＦ−κＢ結合増大は、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスのＡＭからの核抽出物で観察された。ＮＦ−κＢ部位との核抽出物の結合は、非標識化ＮＦ−κＢオリゴヌクレオチドを用いた同時インキュベーションにより抑制されたが、これは、ＥＭＳＡの特異性を支持する。同様に、ＡＰ−１結合活性は、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスのＡＭからの核抽出物で増大された。ＮＦ−κＢに関するスーパーシフトアッセイは、タンパク質／ＤＮＡ複合体がＮＦ−κＢｐ５０およびｐ６５の両構成成分を含有するが、ｃ−Ｒｅｌを含有しないことを示した（図２８Ｃ）。
【０１７０】
したがってＳＰ−Ｄ欠損は、ＮＦ−κＢ活性の酸化還元感受性増強に関連した肺組織中での酸化的ストレス増大、ならびにＡＭによるメタロプロテイナーゼ産生増大を引き起こした。ＮＦ−κＢは炎症中の転写応答の重大な媒介物質であるため、ＳＰ−ＤがＡＭによる酸化剤産生および炎症応答の両方の適切な調節のために必要である、という概念をこれらの知見は支持する。ＳＰ−Ｄは、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスに特徴的な気腫に関与し得る定常状態ＮＦ−κＢ活性化およびメタロプロテイナーゼ発現の抑制のために必要である。ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからのＡＭ中に観察されるＮＦ−κＢの核転位および活性増大は、肺感染中のこれらのマウスからのＡＭの増大化炎症応答に影響を及ぼし得る。
【０１７１】
ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスの肺における酸化的ストレス増大は、ＡＭによる活性酸素種の産生増大、酸化脂質種、反応性カルボニルおよびＣＤＣＦＨ蛍光の含量増大により支持される。しかしながらＳＰ−Ｄ（−／−）マウスの肺における酸化的ストレスの基礎を成すメカニズムは依然として不明であり、酸化剤産生増大、酸化防止活性低減または活性酸素種の除去失敗に関連し得る。本試験は、ＡＭによるＮＦ−κＢ活性化が、少なくとも一部は、アポシニンおよびＤＰＩ感受性経路により媒介される、という概念を支持し、これは、当該過程におけるＮＡＤＰＨオキシダーゼまたはその他のオキシダーゼの役割を支持する。近年、アルコール性肝損傷におけるＮＡＤＰＨオキシダーゼによるＮＦ−κＢ活性化経路も報告された。しかしながら種々のオキシダーゼに対するこれらの阻害剤の特異性は、確立されていない。実際、ＤＰＩは広範囲のフラビンタンパク質、例えばＮＡＤＰＨオキシダーゼおよびミトコンドリア電子伝達鎖内の複合体Ｉを抑制する。したがってＮＡＤＰＨオキシダーゼ以外の経路がこの過程に関与する可能性がある。Bridges等の近年の研究も、ＳＰ−ＡおよびＳＰ−Ｄがｉｎ  ｖｉｔｒｏでの不飽和リン脂質の酸化を防止することを実証したが、これは、これらのタンパク質に関する直接的抗酸化機能を支持する。この活性は、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスの肺において特に重要であり、この場合、肺胞脂質の濃度が顕著に増大され、ＳＰ−Ａの濃度が相対的に低い。ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからの大型凝集体サーファクタントは、増大化脂質過酸化物種を含有し、これはおそらくは肺による酸化剤産生増大または酸化剤クリアランス低減を反映する。
【実施例３２】
【０１７２】
酸化防止剤は、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからのＡＭによるＭＭＰ発現を抑制する
酸化剤産生増大がＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからのＡＭによるＭＭＰの発現を媒介するか否かを確定するために、ともに酸化防止剤試薬であるＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）およびピロリジンジチオカルバメート（ＰＤＴＣ）で細胞を以下のように処理した：ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからのＡＭをプールし、無血清ＲＰＭＩ培地中に５×１０５細胞／ウエルの濃度で培養中に入れた。ＡＭを２０ｍＭのＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）、２００μＭのピロリジンジチオカルバメート（ＰＤＴＣ）、１μＭの塩化ジフェニレンヨードニウム（ＤＰＩ）（Sigma, St. Louis, MO）または１ｍＭのアポシニン（Aldrich, Milwaukee, WI）で処理した。細胞をさらにまた、ＮＦ−κＢ核内移行の阻害剤である１０μＭのＳＮ−５０（Calbiochem, LaJolla, CA）とともにインキュベートした。６時間インキュベーション後、上清を除去し、細胞を洗浄して、試薬を含む新たな培地とともに２４時間インキュベートした。トリパンブルー排除またはＬＤＨ測定（Roche, Indianapolis, IN）により確定した場合、用いた濃度では、これらの作用物質はマクロファージの生育能力を変えなかった。ＲＡＷ２６４．７ネズミマクロファージ細胞株をAmerican Type Culture Collection（Rockville, MD）から入手して、１０％ＦＢＳ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５０Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中に保持した。２４ウエルプレート中の２×１０５細胞を１０μＭのメナジオン（Sigma, St. Louis, MO）とともにまたは伴わずに、２４時間インキュベートした。
【０１７３】
未処理および処理細胞の培地中のゼラチン溶解活性を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥザイモグラフィーにより分析した（図２９）。ゼラチンザイモグラフィーを以下のように実施した：マクロファージ調整培地中で、ＭＭＰ活性を測定した。ゼラチン−アガロースビーズ（Amersham Pharmacia Arlington Heights, IL）とともに４℃で２時間のインキュベーションにより、調整培地中のプロテイナーゼを濃縮した。ビーズをペレット化し、洗浄して、試料緩衝液中で３７℃で４５分間のインキュベーションにより、プロテイナーゼを溶離した。次に試料を１０％ザイモグラムゼラチンゲル（NOVEX, San Diego, CA）中で電気泳動処理した。電気泳動後、ゲルを２．５％トリトンＸ−１００（３７℃、３０分）で２回洗浄し、４０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＣａＣｌ２および１μＭのＺｎＣｌ２とともに１６時間インキュベートした。ゲルを５０％メタノールおよび１０％酢酸中の０．５％（重量／容量）クーマシーブルーで３０分間染色し、次に脱染色した。ＭＭＰを青色バックグラウンドに対する明瞭な帯域として検出した。
【０１７４】
ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからのＡＭをＮＡＣおよびＰＤＴＣで処理すると、ＭＭＰ−２および９の移動度と一致して、ゼラチン溶解活性が低減された。ＮＡＤＰＨオキシダーゼはマクロファージ中のＲＯＳの重要な供給源であるため、ＮＡＤＰＨオキシダーゼまたはその他のオキシダーゼにより生成されるＲＯＳがＳＰ−Ｄ（−／−）マウスに特徴的なＭＭＰ発現増大を媒介するか否かを査定した。ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからのＡＭを、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤、塩化ジフェニレンヨードニウム（ＤＰＩ）およびアポシニンとともにインキュベートした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ−ザイモグラフィーは、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤がともにＭＭＰ酵素活性を顕著に抑制することを示した（図３０Ａ）。同様に、アポシニンはＳＰ−Ｄ（−／−）からの培養ＡＭ中のＭＭＰ−２および９ｍＲＮＡを低減した（図３０Ｂ）。
【０１７５】
アポシアニンが核抽出物の結合に影響を及ぼすか否かを査定するために、以下のプロトコールを用いた：上記方法の変法を用いて、核抽出物を得た（Sever Chroneos, et al. Am. J. Physiol. 277: L79）。洗浄細胞を緩衝液Ａ（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１０ｍＭのＫＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２％ノニデットＰ−４０（ＮＰ−４０）、１ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのＰＭＳＦ）で溶解し、その後回転させ（vortex）て、細胞膜を剪断した。微量高速遠心機中で４℃で３分間、３０００ｒｐｍでの遠心分離により、核をペレット化した。高塩緩衝液Ｃ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２５％グリセロール、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、４２０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのＰＭＳＦ）を用いて核タンパク質を抽出し、−８０℃で保存した。ビシンコニン酸（ＢＣＡ）法により、総核タンパク質濃度を確定した。
【０１７６】
アポシニンは、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスから単離されたＡＭからの核抽出物とＮＦ−κＢオリゴヌクレオチドとの結合を低減した（図３０Ｃ）。アポシニンは、ＡＰ−１オリゴヌクレオチドとのＤＮＡ結合活性も低減した。ＡＭを、ＮＦ−κＢの核内移行を遮断する合成抑制ペプチドであるＳＮ−５０とともに培養した。ＳＮ−５０は、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからのＡＭによるＭＭＰ−２および９産生を顕著に抑制した（図３１）。
【０１７７】
ＲＯＳがＭＭＰ産生を直接刺激するか否かを査定するために、ＲＡＷ２６４．７マクロファージを、ＲＯＳ発生物質である１０μＭのメナジオンとともに２４時間インキュベートした。ＭＭＰ−９産生は、ザイモグラフィーにより査定した場合、メナジオンにより増大された。
【０１７８】
泡沫状マクロファージは、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおける肺の病態の顕著な特徴である。ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいて認められる酸化剤産生増大および泡沫状肺胞マクロファージ形成は、アテロームにおける知見を連想させるが、この場合、組織マクロファージによる酸化脂質の取込みは活性酸素種をさらに誘導し、マクロファージ活性化を増強する。肺脂質濃度はＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおいて顕著に増大されるが、一方、脂質含量増大単独は、活性化泡沫状マクロファージを生成するのに十分な刺激であるとは思われない。実際、サーファクタント脂質濃度増大および泡沫状マクロファージは、ＧＭ−ＣＳＦおよび共通β鎖受容体欠損マウスにおいても同様に観察され、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスで観察される酸化剤産生増大または肺胞マクロファージ活性化を伴わなかった。合わせて考えると、本知見は、ＳＰ−Ｄシグナル伝達が肺中のＡＭによる酸化剤産生またはＲＯＳクリアランスの調節のために必要である、という概念を支持する。ＳＰ−Ｄがその炭水化物認識ドメインを介してＣＤ１４と結合して、ＣＤ１４リポ多糖（ＬＰＳ）相互作用を抑制するという最近の知見は、肺胞マクロファージ活性がＳＰ−Ｄにより調整され得るメカニズムを示唆する。ＬＰＳ−ＣＤ１４相互作用はＮＡＤＰＨオキシダーゼおよびＮＦ−κＢにも影響を及ぼし得るため、これらの経路はＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおける肺感染中に観察される炎症応答増大を媒介し得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのマウス（５μｇ／ｍｌ）ＳＰ−Ｄの付加は、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからのＡＭによるＭＭＰ産生を低減しない、ということも本明細書中で観察された。この知見は、ＳＰ−Ｄによる直接シグナル伝達がｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからのＡＭによるＭＭＰ産生を抑制するのに十分でないことを、そしてＡＭの活性化がＳＰ−Ｄ欠損マウスの肺で生成される化学的メッセンジャーにより間接的に媒介され得る、ということを示唆する。
【０１７９】
ＳＰ−Ｄは、多数の病原体により引き起こされる肺感染の調整において重要な役割を果たす。ＳＰ−Ｄは種々の微生物およびそれらの産物と、例えばグラム陰性およびグラム陽性細菌、呼吸器ウイルス、真菌および内毒素と結合する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験は、それらの食作用および殺害を増強する病原体の結合および凝集におけるＳＰ−Ｄの役割を支持する。逆説的には、いくつかの病原体の存在下で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＡＭによる酸化剤産生および殺害はＳＰ−Ｄにより増大され、これは、ＳＰ−Ｄ欠損マウスからのＡＭ中に観察される内因性酸化剤産生の顕著な活性化と対照を成す知見である。したがってエフェクター細胞に及ぼすＳＰ−Ｄ作用は、病原体,ＳＰ−Ｄ−病原体複合体またはＳＰ−Ｄを独自に認識し得る種々の受容体の間の複雑な相互作用により媒介され得る。ＳＰ−Ｄは、炎症応答に関与する既知の二次メッセンジャーである種々の脂質構成成分、例えばホスファチジルイノシトールおよびグリコシルセラミドとも結合するため、ＳＰ−Ｄはこのような分子との相互作用による細胞シグナル伝達にも間接的に影響し得る。
【０１８０】
実施例３０〜３２に記述した研究は、ＳＰ−Ｄの非存在下で生成される余分量の活性酸素種が酸化還元感受性転写因子ＮＦ−κＢを活性化することを実証する。したがってＳＰ−Ｄは、ＡＭにおけるＮＦ−κＢ活性の調節において中心的役割を果たすと思われる。ＮＦ−κＢはＡＭにより発現される多数の前炎症性応答遺伝子、例えばＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＭＩＰ−２およびメタロプロテイナーゼ−９を調節するため、ＳＰ−Ｄ依存性経路は、感染および炎症に対するＡＭの一般的応答の重要なモジュレーターであり得る。実際近年の研究において、サイトカインＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびＩＬ−１βの産生増大が、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおける細菌病原体による肺感染後に観察されており、これは、ＳＰ−Ｄが、定常状態およびＡＭによる感染誘導性前炎症性サイトカイン産生の両方を統合するという概念を支持する。
【０１８１】
本試験において、選択的ＮＦ−κＢ阻害剤であるＳＮ−５０は、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９産生を抑制した。ＳＮ−５０は、ＮＦ−κＢの核内移行を抑制し、それによりその転写活性を抑制することが既知である。ＮＦ−κＢ素子は、ＭＭＰ−９遺伝子のプロモーター領域に存在し、これは、ＳＮ−５０がＮＦ−κＢ活性を遮断することによりＭＭＰ−９産生を抑制し得るという概念を支持する。しかしながらＮＦ−κＢ結合部位はＭＭＰ−２のプロモーター領域には検出されておらず、ＭＭＰ−２産生に及ぼすＳＮ−５０の抑制作用がＭＭＰ−２転写に及ぼす直接的作用により調節されるか、間接的作用により調節されるかは不明である。あるいはＮＦ−κＢは、ＭＭＰ−２発現を直接的にまたはタンパク質−タンパク質相互作用を介して増大し得る他の転写因子、例えばＡＰ−１およびｐ５３と結合し、その発現を増強し得る。最後に、ＳＮ−５０は、内因性ＮＦ−κＢの核内移行に関して競合する核局在化配列を共有する。ＮＦ−κＢ核内移行に対するＳＮ−５０の特異性は、他の核タンパク質がこの核内移行系を共有するため、疑問視されてきた。それにもかかわらず、本知見は、ＳＰ−ＤがＮＦ−κＢ活性に作用することによりＡＭにおけるメタロプロテイナーゼ発現の調整において中心的役割を果たすという概念を支持する。
【０１８２】
本試験は、このモデルに特徴的な気腫の病因に関与し得るＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからのＡＭによるＮＦ−κＢの酸化剤依存性活性化およびメタロプロテイナーゼ発現増強を実証する。大気汚染、喫煙および炎症細胞活性化に由来する酸化剤は、ヒト肺疾患における気腫の病因に関連づけられきた。ＳＰ−Ｄ濃度が喫煙個体および嚢胞性線維症患者からの肺洗浄液中で低減されるという知見は、酸化剤誘導性肺炎症の調節におけるＳＰ−Ｄに関する潜在的役割を支持する。
【実施例３３】
【０１８３】
ＳＰ−Ｄによる風邪およびインフルエンザならびにそれらの症状の治療
ＳＰ−Ｄは肺からのウイルスのクリアランスおよび炎症における低減の両方において一役を有するため、風邪およびインフルエンザの感染および症状の治療に用いるために十分に適している。多数の患者が、身体からのウイルスのクリアランス後でも長引く咳および不快を経験する。したがってＳＰ−Ｄの使用は、炎症の抑制、ならびにそれに関連した症状の低減を可能にする。したがってインフルエンザ患者は、症状が完全に消えるまで、１〜２週間、ＳＰ−Ｄタンパク質で処置される。
【０１８４】
ＳＰ−Ｄタンパク質構造およびドメインは多数のコレクチンを有するとして非常によく特性化されている（Hansen, et al. Immunobiology 1998 Aug; 199(2): 165-189）。タンパク質は、ジスルフィド結合により各々安定化される４つのホモ三量体からなる十二量体として合成される（Zhang, et al. J. Biol. Chem. 2001 Jun 1; 276(22): 19214-19219）。ＳＰ−Ｄは短いＮＨ２−末端ドメイン、コラーゲン様配列およびＣ末端レクチンドメインを有する４３ｋＤａポリペプチドである、ということを複数の試験が示している（Crouch et al. J. Biol. Chem. 1994 Jun 24; 269(25): 17311-17319）。炭水化物認識ドメインは、Ｎ末端およびコラーゲンドメインを有するとして、詳細にマッピングされている。炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）は、融合タンパク質としてまたは単独で発現され、さらに炭水化物を結合し得る（Kishore, et al. Biochem. J. 1996 Sep 1; 318(Pt 2): 505-511）。さらに異なるコレクチンからの種々のドメインを含有するキメラタンパク質が産生された（White, et al. J. Immunol. 2000 Aug 15; 165(4): 2108-2115）。アミノ末端領域およびコラーゲン様領域の両方を欠く変異体が生成され、分析された（Ogasawara et al. J. Biol. Chem 1995 Aug 11; 270(32): 19052-19058）。ＳＰ−Ｄタンパク質の三量体α−ヘリカル・コイルドコイルおよびレクチンドメインの結晶構造が分析されている（Hakansson, et al. Structure Fold Des. 1999 Mar 15; 7(3): 255-264）。したがって当該技術分野において記載されたＳＰ−Ｄ、キメラおよび変異体の広範な特性化に関して、当業者は、本明細書中に開示された方法において依然として活性であるＳＰ−Ｄの活性変異体を同定するためにこの情報を用いることができるであろう。活性であるかまたはより活性である変異体が望ましいが、しかし８０％またはそれ以上活性である変異体が依然として有用であることが予見される。
【実施例３４】
【０１８５】
ＳＰ−Ｄおよび活性変異体
必要とされる活性を依然として有し得るＳＰ−Ｄ変異体を産生する。活性はサーファクタント、抗炎症性、または感染性作因に対する活性と同様である。特にＳＰ−Ｄは、選定細胞、ウイルス、真菌、細菌、あるいは白血球と依然として結合することができる。特異的活性に必要なＳＰ−Ｄのドメインおよびアミノ酸配列について多くが既知である。例えばアレルゲン、リポ多糖（グラム陰性細菌の）と結合する能力、ならびにリン脂質との相互作用は、炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）に関連がある。したがってＣＲＤはタンパク質の活性において、特に細菌、真菌およびウイルスとの結合において、重要なドメインである。活性ＣＲＤを含有するＳＰ−Ｄ変異体が産生される。好ましくは変異体は、ＣＲＤ以外のＳＰ−Ｄの領域で切頭化されるかまたは突然変異化される。ＣＲＤ領域中に小アミノ酸変化を有する、特に同様のアミノ酸変化（塩基性アミノ酸から塩基性アミノ酸への）のような活性に影響を及ぼさないアミノ酸変化を有する変異体が産生され得る。さらに、他のコレクチンまたはＣ型レクチンからのドメインを組入れるキメラが意図される。
【０１８６】
ＳＰ−Ｄの首領域は、一緒に３つのＣＤＲをもたらして、多価結合を可能にし、したがって強力な結合を可能にするための二量体かまたは三量体化領域として重要であると考えられる。したがって、首領域に突然変異または欠失を含有する二価、三価および多価変異体が予見される。
【０１８７】
他のコレクチンからのドメインを含有するキメラが予見され、これは、実際、野生型ＳＰ−Ｄより活性であり得る。例えば、ヒトＳＰ−ＤのＮ末端およびコラーゲンドメイン、ならびにヒトＭＢＬの首領域およびＣＲＤを含有するヒト血清マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）およびＳＰ−Ｄのキメラを産生し、新規のコレクチンを作製した。Ａ型インフルエンザウイルス（ＩＡＶ）に結合されたキメラは、ＩＡＶ赤血球凝集活性および感染性を抑制し、ＭＢＬより大きい程度にウイルス粒子の凝集を誘導した（White et al. J. Immunol. 2000 Aug 15; 165(4): 2108-15）。ウシ血清コングルチニンおよびアミノ末端ならびにコングルチニンの首およびＣＲＤに融合されるラット肺ＳＰ−Ｄのコラーゲンドメインを含有する二次キメラも、ＩＡＶ感染を抑制する高い能力を示した。
【０１８８】
したがって活性変異体は、野生型ＳＰ−Ｄの活性の少なくとも５０％の活性を、好ましくは６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％またはそれ以上の活性を依然として保有するＳＰ−Ｄの変異体である。例としては、活性にとって需要でないタンパク質の一部が除去される切頭化、活性に必要でないタンパク質の一部が突然変異化される点突然変異が挙げられる。特に有益な突然変異としては、コードされるアミノ酸を変えない突然変異、または同様のアミノ酸から同様のアミノ酸に、例えば塩基性アミノ酸に変える突然変異が挙げられる。さらに、他のコレクチンからのドメインを用いるキメラが、特許請求される本発明に用いられ得る高活性バージョンのＳＰ−Ｄを産生することは、明らかである。
【０１８９】
患者は、実施例１２〜１４に記載したように治療されるが、この場合、ＳＰ−Ｄ変異体を発現するベクターのＳＰ−Ｄ変異体タンパク質が、病原体が身体から除去され、症状が寛解するまで、必要な場合に患者に投与される。あるいはＳＰ−Ｄ変異体は、実施例９〜１１に記載したように、気腫またはその他の形態の肺異常または病態を有する患者に投与される。
【図面の簡単な説明】
【０１９０】
【図１】ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスおよび齢対応ＳＰ−Ｄ（＋／＋）対照における週齢に伴う空気間隙（ａ）および呼吸実質（ｂ）の分画面積（Ｆ×面積％）における変化の比較。各個体遺伝子型に関する週齢に伴うこれらのパラメーターにおける変化の分析（ｃおよびｄ）。データは、分画面積％として表され、平均±ＳＥを示す。
【図２】ＳＰ−Ｄ（＋／＋）およびＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからの圧力−容積曲線の収縮枝。データはｍｌ／ｋｇとして表され、平均±ＳＥを示す。
【図３】ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからの肺ホモジネート中の前炎症性サイトカイン。ＳＰ−Ｄ（−／−）（中黒棒）およびＳＰ−Ｄ（＋／＋）（線影棒）マウスからの肺ホモジネート中で、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＭＩＰ−２の濃度を査定した。データはｐｇ／ｍｌとして表され、平均±ＳＥを示し、ｎ＝５匹／群である。＊ｐ＜０．０５（ＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスと比較）。
【図４】ＰＭＡ刺激を用いてまたは用いずにＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウス（線影棒）と比較した場合の、ＳＰ−Ｄ（−／−）（中黒棒）からの肺胞マクロファージ中の過酸化水素産生を、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）から単離された１×１０６個のマクロファージから査定した。データはＨ２Ｏ２のμＭとして表され、平均±ＳＥを示し、ｎ＝４匹マウス／群である。＊ｐ０．０５（ＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスと比較）。
【図５】ＧｐＢ連鎖球菌（ＧＢＳ）による感染後のＳＰ−Ｄ（−／−）およびＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスにおける肺コロニー数。
【図６】インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）（H. flu）による感染後のＳＰ−Ｄ（−／−）およびＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスにおける肺コロニー数。
【図７】ＧＢＳおよびH. fluによる感染後の気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液中の総細胞数。
【図８】ＧＢＳおよびH. fluによる感染後の肺ホモジネート中のサイトカインレベル。
【図９】ＧＢＳおよびH. fluによる感染後のＢＡＬ亜硝酸塩レベル。
【図１０】ＧＢＳおよびH. fluによる感染後の光学顕微鏡およびＦＡＣＳ分析により分析された食作用。
【図１１】ＧＢＳおよびH. fluによる感染後にＢＡＬから単離されたマクロファージ中の過酸化水素およびスーパーオキシドレベル。
【図１２】ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスに及ぼすＳＰ−Ｄタンパク質処置の作用。
【図１３】マウスにおけるＳＰ−Ｄタンパク質の総肺および肺胞洗浄クリアランス動態。
【図１４】ラットＳＰ−ＤｃＤＮＡを含有するアデノウイルスベクターＡｄ−ｒＳＰＤ。
【図１５】野生型およびＣＣＳＰ−ＩＬ−４マウス（ＩＬ−４マウス）からの肺胞洗浄液中のＳＰ−ＡおよびＳＰ−Ｄのイムノブロットの定量。ｐ＜０．０１。
【図１６】肺ホモジネートの定量プラークアッセイにより、ＲＳＶおよびＩＡＶ力価を確定した。ＲＳＶのウイルス力価は、野生型（線影棒）マウスと比較して、ＳＰ−Ｄ（−／−）（中白棒）において、１０７ｐｆｕ  ＲＳＶの投与後３日および５日目に有意に大きかった（グラフＡ）。ＩＡＶの肺ホモジネート力価は、感染後３日および５日目に、野生型（線影棒）マウスと比較して、ＳＰ−Ｄ（−／−）（中白棒）に関して有意に大きかった（グラフＢ）。データは平均±ＳＥＭであり、ｎ＝１５匹マウス／群（グラフＡ）およびｎ＝１０匹マウス／群（グラフＢ）である。＊ｐ＜０．０５（野生型マウスと比較）。
【図１７】気管支肺胞洗浄により肺細胞を回収して、トリパンブルーで染色し、光学顕微鏡下で計数した。ＳＰ−Ｄ（−／−）マウス（中白棒）は、野生型マウス（線影棒）と比較して、ＲＳＶ感染後３日および５日目にＢＡＬ液中の総細胞数を増大した（グラフＡ）。ＳＰ−Ｄ（−／−）マウス（中白棒）は、ＩＡＶ感染後３日および５日目にＢＡＬ液中の総細胞数を増大した（グラフＢ）。データは平均±ＳＥＭであり、ｎ＝８匹マウス／群である。＊ｐ＜０．０５（野生型マウスと比較）。
【図１８】気管支肺胞洗浄液のサイトスピン調製物をＤＩＦＦ−ＱＵＩＫで染色して、マクロファージ、リンパ球および多形核白血球を特定した。ＢＡＬ液中の好中球のパーセンテージは、野生型（線影棒）マウスと比較して、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウス（中白棒）への１０７ｐｆｕ  ＲＳＶの投与後３日および５日目に有意に大きかった（グラフＡ）。同様に、ＢＡＬ液中の好中球のパーセンテージは、野生型と比較して、ＳＰ−Ｄ（−／−）（中白棒）マウスへの１０５ｐｆｕ  ＩＡＶの投与後３日および５日目に有意に大きかった（グラフＢ）。データは平均±ＳＥＭであり、ｎ＝８匹マウス／群である。＊ｐ＜０．０５（野生型マウスと比較）。
【図１９】ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからのＢＡＬ液中の総細胞数および好中球増大を示す。気管支肺胞洗浄により肺細胞を回収して、トリパンブルーで染色し、光学顕微鏡下で計数した。気管支肺胞洗浄液のサイトスピン調製物をＤｉｆｆ−Ｑｕｉｋで染色して、マクロファージ、リンパ球および多形核白血球を特定した。ＰＢＳを接種された対照からの基準総細胞数は、ＳＰ−Ｄ（−／−）（中白棒）およびＳＰ−Ｄ（＋／＋）（線影棒）マウスにおいて有意に異ならなかった。ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスは、ＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウス（線影棒）と比較して、ＩＡＶ感染後３日および５日目にＢＡＬ液中の総細胞数を増大した（グラフＡ）。ＢＡＬ液中の好中球のパーセンテージは、ＳＰ−Ｄ（＋／＋）（線影棒）マウスと比較して、ＳＰ−Ｄ（−／−）（中白棒）への１０５ｆｆＩＡＶの投与後３日および５日目に有意に大きかった（グラフＢ）。データは平均±ＳＥＭであり、ｎ＝８匹マウス／群である。＊ｐ＜０．０５（ＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスと比較）。
【図２０】ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからの肺ホモジネート中のウイルス力価増大を示す。肺ホモジネートの定量プラークアッセイにより、ＩＡＶ力価を確定した。ＩＡＶのウイルス力価は、ＳＰ−Ｄ（＋／＋）（線影棒）マウスと比較して、ＳＰ−Ｄ（−／−）（中白棒）に対する１０５ｆｆＩＡＶの投与後３日および５日目に有意に大きかった。データは平均±ＳＥＭであり、ｎ＝１０匹マウス／群である。＊ｐ＜０．０５（ＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスと比較）。
【図２１】ＩＡＶ感染後のＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからの肺ホモジネート中の前炎症性サイトカイン増大を示す。ＳＰ−Ｄ（−／−）（中白棒）およびＳＰ−Ｄ（＋／＋）（線影棒）マウスからの肺ホモジネート中で、ＴＮＦ−、ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＭＩＰ−２の濃度を査定した。ＩＡＶ感染後３日および５日目に、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからの肺ホモジネート中に、前炎症性サイトカインＴＮＦ−、ＩＬ−６、ＩＬ−１βおよびＭＩＰ−２の濃度増大が見いだされた。データはｐｇ／ｍｌとして表され、平均±ＳＥを示し、ｎ＝１０匹／群である。＊ｐ＜０．０５（ＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスと比較）。
【図２２】ＩＡＶ感染後のＢＡＬＦ中のＣＤ４およびＣＤ８Ｔリンパ球を示す。ＩＡＶ感染後３日、蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）接合マウスＣＤ４およびフィコエリテリン（ＰＥ）接合マウスＣＤ８抗体を用いてフローサイトメトリーによりＢＡＬＦ中で、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔリンパ球サブセットを測定した。ＳＰ−Ｄ（−／−）（中白棒）およびＳＰ−Ｄ（＋／＋）（線影棒）マウス間に、ＢＡＬＦ中のＣＤ４（グラフＡ）およびＣＤ８（グラフＢ）Ｔリンパ球のパーセンテージにおける差は認められなかった。ＢＡＬＦ中のＣＤ４およびＣＤ８Ｔリンパ球は、非感染ＳＰ−Ｄ（＋／＋）およびＳＰ−Ｄ（−／−）マウスに関して同様であった。データは平均±ＳＥＭであり、ｎ＝８匹マウス／群である。＊ｐ＜０．０５（ＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスと比較）。
【図２３】好中球ミエロペルオキシダーゼ活性がＳＰ−Ｄ（−／−）マウスから低減されたことを示す。１０６ｆｆの濃度でＩＡＶを用いて鼻腔内感染後３日にＢＡＬ好中球中で、ミエロペルオキシダーゼ活性を測定した。非感染野生型マウスからの単離血中好中球を対照として用いた。好中球を溶解して顆粒からのＭＰＯの放出を可能にし、本方法に記載されたようにＭＰＯ活性を測定した。ＢＡＬ好中球からのＭＰＯ活性は、ＩＡＶ感染後３日にＳＰ−Ｄ（＋／＋）（線影棒）マウスと比較して、ＳＰ−Ｄ（−／−）（中白棒）において有意に低減された。非感染ＳＰ−Ｄ（＋／＋）（中黒棒、ＷＴ血）マウスからの血中好中球は、ＳＰ−Ｄ（−／−）ＢＡＬ好中球と比較して有意に大きいＭＰＯ活性を有し、感染後のＳＰ−Ｄ（＋／＋）ＢＡＬ好中球と比較して有意に低いＭＰＯ活性を有した。データは平均±ＳＥＭであり、ｎ＝８匹マウス／群である。＊ｐ＜０．０５（ＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスと比較）。
【図２４】ＩＡＶ感染後の肺におけるＳＰ−Ｄ濃度増大を示す。肺ホモジネート中のＳＰ−Ｄの濃度を、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）で確定した。ＩＡＶ感染後３日、ＳＰ−Ｄ（＋／＋）（線影棒）マウスの肺中のＳＰ−Ｄ濃度は、非感染ＳＰ−Ｄ（＋／＋）（中白棒）マウスと比較して有意に高かった。ＩＡＶ感染後５日、ＳＰ−Ｄ（＋／＋）（中黒棒）マウスの肺中のＳＰ−Ｄ濃度は、非感染ＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスと同様のレベルに低減した。データは平均±ＳＥＭであり、ｎ＝１０匹マウス／群である。＊ｐ＜０．０５（非感染ＳＰ−Ｄ（＋／＋）マウスと比較）。
【図２５】肺脂質ヒドロペルオキシダーゼ濃度は、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスの肺中で増大された。成体ＷＴおよびＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからの肺組織を均質化し、マロンアルデヒドおよび４−ヒドロキシアルカネルの含量を比色計で測定した。ＬＰＯは、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからの肺中で有意に増大された。示された値は、平均±ＳＥである（ｎ＝５、＊ｐ＜０．０５）。
【図２６】ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスの肺における反応性カルボニル増大。ＷＴおよびＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからの肺の凍結切片をＯＨＮＡＨとともにインキュベートし、その後ジアゾニウムとカップリングさせた。反応性カルボニルはＳＰ−Ｄ（−／−）マウスにおける泡沫状肺胞マクロファージ浸潤の部位で観察された（Ｂ）、しかし対照マウスでは観察されなかった（Ａ）。図は、３つの別個の実験を代表するものである。
【図２７】ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからの肺胞マクロファージ中の細胞内ＲＯＳ増大。野生型およびＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからのＡＭをＣＤ−ＣＦＨとともに３０分間インキュベートした。蛍光増大は、対照（Ａ）からのものと比較して、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウス（Ｂ）からのＡＭ中に観察された。データは、３つの別個の実験を代表するものである。
【図２８】ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからのＡＭにおけるＮＦ−κＢ活性化。パネル（Ａ）ＷＴおよびＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからのＡＭ中のＮＦ−κＢｐ６５に関する免疫蛍光染色。ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスおよび齢対応対照からの洗浄細胞を免疫組織化学から調製した。ＮＦ−κＢに関する強い染色が、ＷＴマウスと比較してＳＰ−Ｄ（−／−）からのＡＭの細胞質および核中で観察された。パネル（Ｂ）ＮＦ−κＢに関するＥＭＳＡ。ＷＴおよびＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからＡＭの核抽出物を得て、ＥＭＳＡによりＮＦ−κＢ活性化を査定した。ＷＴマウスからのものと比較して、ＳＰ−Ｄ（−／−）からの核抽出物中でＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性強化を検出した。余分量の非標識化ＮＦ−κＢオリゴヌクレオチドとの特異的競合は、ＮＦ−κＢ帯域を排除した。同様に、ＡＰ−１結合活性は、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからの核抽出物中で増強された。パネル（Ｃ）スーパーシフトアッセイは、ｐ５０およびｐ６５サブユニットを含有するが、しかしｃ−Ｒｅｌを含有しない帯域を実証した。
【図２９】ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからのＡＭによるＭＭＰ発現に及ぼす酸化防止剤の作用。肺胞マクロファージをＳＰ−Ｄ（−／−）マウスから単離し、２０ｍＭのＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）または２００μＭのジチオカルバミン酸ピロリジン（ＰＤＴＣ）で処理した。ＡＭからの調整培地を２４時間インキュベーション後に収集し、ＭＭＰ−２および９活性をゼラチンザイモグラフィーにより確定した。ＮＡＣ（Ａ）およびＰＤＴＣ（Ｂ）はともに、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからの調整培地中のＭＭＰ−２および９のゼラチン溶解性活性を阻害した。図は、少なくとも３つの個々の実験の代表である。処理をした場合（中黒棒）としない場合（中白棒）のゼラチン溶解活性の濃度測定分析は、ＮＡＣ（Ｃ）およびＰＤＴＣ（Ｄ）がともにＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからの調整培地中のＭＭＰ−２および９のゼラチン溶解活性を有意に阻害することを示した。値は、対応非処理対照±ＳＥに正規化した（ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５）。
【図３０】ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤は、ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからのＡＭによるＭＭＰ産生を低減する。ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからのＡＭを１μＭの塩化ヨードニウムジフェニレン（ＤＰＩ）および１ｍＭのアポシニンで処理した。（Ａ）ＡＭからの調整培地をＳＤＳ−ＰＡＧＥザイモグラフィーにより分析した。ＤＰＩおよびアポシニンは、ＭＭＰ活性を顕著に低減した。（Ｂ）以下のようにして、ＭＭＰ−２および９のｃＤＮＡ配列に関する特定のプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲによりＭＭＰ−２および９ｍＲＮＡを検出した：製造業者のプロトコルに従って、ＴＲＩｚｏｌ試薬（GIBCO, BRL, Gaithersburg, MD）によりマクロファージからの総ＲＮＡを抽出した。オリゴ（ｄＴ）およびモロニーネズミ白血病ウイルス逆転写酵素（GIBCO, BRL）を用いて、４２℃で４５分間、逆転写を実行した。以下の分子のｃＤＮＡ配列に特異的な種々のプライマーを用いて、ｃＤＮＡを増幅した：ＭＭＰ−２（５’−ＴＣＴ  ＧＣＧ  ＧＧＴ  ＴＣＴ  ＣＴＧ  ＣＧＴ  ＣＣＴ  ＧＴＧ  Ｃ−３’、５’−ＧＴＧ  ＣＣＣ  ＴＧＧ  ＡＡＧ  ＣＧＧ  ＡＡＣ  ＧＧＡ  ＡＡＣ  Ｔ−３’）（配列番号１）、ＭＭＰ−９（５’−ＴＴＣ  ＴＣＴ  ＧＧＡ  ＣＧＴ  ＣＡＡ  ＡＴＧ  ＴＧＧ−３’）（配列番号２）、５’−ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＡＧＧ  ＡＧＣ  ＣＣＴ  ＡＧＴ  ＴＣＡ  ＡＧＧ−３’（配列番号３）、β−アクチン（５’−ＧＴＧ  ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＴＣＴ  ＡＧＧ  ＣＡＣ  ＣＡＡ−３’、５’−ＣＴＣ  ＴＴＴ  ＧＡＴ  ＧＴＣ  ＡＣＧ  ＣＡＧ  ＧＡＴ  ＴＴＣ−３’）（配列番号４）。１％アガロースゲル中でＰＣＲ産物を電気泳動処理し、臭化エチジウムで染色した染色ゲルをAlpha-Imager２０００ドキュメンテーションおよび分析ソフトウエア（Alpha Innotech, San Leandro, CA）を用いて画像化した。ＭＭＰ−２および９ｍＲＮＡも、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤により低減された。（Ｃ）アポシニンの処理がＳＰ−Ｄ（−／−）マウスから単離されたＡＭ中のＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性を低減することを、ＥＭＳＡ分析は実証した。
【図３１】ＳＮ−５０はＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからのＡＭによるＭＭＰ発現を抑制する。ＳＰ−Ｄ（−／−）マウスから単離されたＡＭを、合成ＮＦ−κＢ抑制ペプチドであるＳＮ−５０で処理した。ＡＭからの調整培地を、ゼラチン基質中でザイモグラフィー処理した。ＳＮ−５０は、ＭＭＰ−２および９のゼラチン溶解活性を有意に低減した（Ａ）。ザイモグラムは、３つの別個の実験を代表するものである。処理をした場合（中黒棒）としない場合（中白棒）のゼラチン溶解活性の濃度測定分析は、ＳＮ−５０がＳＰ−Ｄ（−／−）マウスからの調整培地中のＭＭＰ−２および９のゼラチン溶解活性を阻害することを示した（Ｂ）。値は、対応非処理対照±ＳＥに正規化した（ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５）。
【図１】
2005507941.tif 000003
【図２】
2005507941.tif 000004
【図３】
2005507941.tif 000005
【図４】
2005507941.tif 000006
【図５】
2005507941.tif 000007
【図６】
2005507941.tif 000008
【図７】
2005507941.tif 000009
【図８】
2005507941.tif 000010
【図９】
2005507941.tif 000011
【図１０】
2005507941.tif 000012
【図１１】
2005507941.tif 000013
【図１２】
2005507941.tif 000014
【図１３】
2005507941.tif 000015
【図１４】
2005507941.tif 000016
【図１５】
2005507941.tif 000017
【図１６】
2005507941.tif 000018
【図１７】
2005507941.tif 000019
【図１８】
2005507941.tif 000020
【図１９】
2005507941.tif 000021
【図２０】
2005507941.tif 000022
【図２１】
2005507941.tif 000023
【図２２】
2005507941.tif 000024
【図２３】
2005507941.tif 000025
【図２４】
2005507941.tif 000026
【図２５】
2005507941.tif 000027
【図２６】
2005507941.tif 000028
【図２７】
2005507941.tif 000029
【図２８】
2005507941.tif 000030
【図２９】
2005507941.tif 000031
【図３０】
2005507941.tif 000032
【図３１】
2005507941.tif 000033
【国際公開パンフレット】
2005507941.tif 000034
2005507941.tif 000035
2005507941.tif 000036
2005507941.tif 000037
2005507941.tif 000038
2005507941.tif 000039
2005507941.tif 000040
2005507941.tif 000041
2005507941.tif 000042
2005507941.tif 000043
2005507941.tif 000044
2005507941.tif 000045
2005507941.tif 000046
2005507941.tif 000047
2005507941.tif 000048
2005507941.tif 000049
2005507941.tif 000050
2005507941.tif 000051
2005507941.tif 000052
2005507941.tif 000053
2005507941.tif 000054
2005507941.tif 000055
2005507941.tif 000056
2005507941.tif 000057
2005507941.tif 000058
2005507941.tif 000059
2005507941.tif 000060
2005507941.tif 000061
2005507941.tif 000062
2005507941.tif 000063
2005507941.tif 000064
2005507941.tif 000065
2005507941.tif 000066
2005507941.tif 000067
2005507941.tif 000068
2005507941.tif 000069
2005507941.tif 000070
2005507941.tif 000071
2005507941.tif 000072
2005507941.tif 000073
2005507941.tif 000074
2005507941.tif 000075
2005507941.tif 000076
2005507941.tif 000077
2005507941.tif 000078
2005507941.tif 000079
2005507941.tif 000080
2005507941.tif 000081
2005507941.tif 000082
2005507941.tif 000083
2005507941.tif 000084
2005507941.tif 000085
2005507941.tif 000086
2005507941.tif 000087
2005507941.tif 000088
2005507941.tif 000089
2005507941.tif 000090
2005507941.tif 000091
2005507941.tif 000092
2005507941.tif 000093
2005507941.tif 000094
2005507941.tif 000095
2005507941.tif 000096
2005507941.tif 000097
2005507941.tif 000098
2005507941.tif 000099
2005507941.tif 000100
2005507941.tif 000101
2005507941.tif 000102
2005507941.tif 000103
2005507941.tif 000104
2005507941.tif 000105
2005507941.tif 000106
2005507941.tif 000107
2005507941.tif 000108
2005507941.tif 000109
2005507941.tif 000110
2005507941.tif 000111
2005507941.tif 000112
2005507941.tif 000113
2005507941.tif 000114
2005507941.tif 000115
2005507941.tif 000116
2005507941.tif 000117
2005507941.tif 000118
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005507941.tif 000119
【国際調査報告】
2005507941.tif 000120
2005507941.tif 000121
2005507941.tif 000122
2005507941.tif 000123