(57)【要約】  多数のペプチドを含有した試料から、単純化されたペプチド混合物を得るための方法および試薬が開示されている。単純化された試料は、元のペプチド試料よりも容易に分析することができながらも、元のより複雑なペプチド試料が由来する混合タンパク質試料中に存在するタンパク質のすべてまたはほぼ全てを代表するものである。本方法は、アミノ酸特異的反応基（Ｒ）を含む標識化部分の使用を伴う。標識化部分は、特定のアミノ酸位置においてペプチドまたはタンパク質を「標識」し（例えば、アミノ酸と反応して共有結合を形成するなどにより）、最終的にこれらの特定のアミノ酸を含むペプチドの単離を可能にする。他の方法は、選択されたタンパク質と共有結合的または非共有結合的のいずれかで選択的に相互作用する試薬を含む、反応性部分（ＲＰ）の使用を伴う。例えば、ＲＰは標識すべき受容体に対する天然のリガンドであってもよいし、あるいは標識すべき第２のタンパク質と相互作用するタンパク質であってもよい。ＲＰは、酵素基質であってもよいし、あるいは、抗体、ＡＴＰ，ＧＴＰ，ＮＡＤ，ＮＡＤＰ，ＮＡＤＨ，ＮＡＤＨ、ユビキチンまたはそれらの構造的類似体などの他の分子認識の要素であってもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に存在する少なくとも１つのペプチドを同定するための方法であって、
（ａ）下記の式を有する標識化部分を提供する工程と、
Ｒ−Ｌ−Ｂ
（式中、Ｒはアミノ末端セリンまたはアミノ末端スレオニンを有するペプチドと反応する反応性基であり、Ｌはリンカー基であり、Ｂは捕捉剤と選択的に結合可能である基である）
（ｂ）試料を標識化部分と反応させて、標識ペプチドを提供する工程と、
（ｃ）標識ペプチドを捕捉剤と接触させて、捕捉された標識ペプチドを提供する工程と、
（ｄ）捕捉された標識ペプチドの少なくともペプチド部分を捕捉剤から遊離させて、遊離された修飾ペプチドを提供する工程と、
（ｅ）遊離された修飾ペプチドを質量分析によって分析する工程とを含む、方法。
【請求項２】
Ｒは、−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ２を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｂは、ビオチンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｂは、ｄ−イミノビオチンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
捕捉剤は、アビジンまたはストレプトアビジンを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
遊離させる工程は、捕捉された標識ポリペプチドをビオチンに暴露することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
捕捉剤は、ビオチンに選択的な抗体を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
標識化部分は、ビオチンヒドラジドである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
試料を標識化部分に暴露する前に、試料を酸化剤に暴露する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
Ｌは、ジスルフィド基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
Ｌは、ビシナルジオール基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
Ｌは、同位体標識されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
遊離された修飾ペプチドは、質量分析による分析の前に、クロマトグラフィーによって分離される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
Ｒは、同位体標識されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
質量分析による分析は、少なくとも１つのペプチドを同定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
質量分析による分析は、少なくとも１つのペプチドを定量することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
下記式を有する標識化部分を含む試薬キット。
Ｒ−Ｌ−Ｂ
（式中、Ｒはアミノ末端セリンまたはアミノ末端スレオニンを有するペプチドと反応する反応性基であり、Ｌはリンカー基であり、Ｂは捕捉剤と選択的に結合可能である基である）
【請求項１８】
タンパク質分解酵素をさらに含む、請求項１７に記載の試薬キット。
【請求項１９】
捕捉剤をさらに含む、請求項１７に記載の試薬キット。
【請求項２０】
Ｒは、−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ２を含む、請求項１７に記載の試薬キット。
【請求項２１】
標識化部分は、ビオチンヒドラジドである、請求項１７に記載の試薬キット。
【請求項２２】
固体支持体に結合したアビジンまたはストレプトアビジンを含む捕捉剤と、Ｄビオチンとをさらに含む、請求項２１に記載の試薬キット。
【請求項２３】
酸化剤をさらに含む、請求項２２に記載の試薬キット。
【請求項２４】
酸化剤がメタ過ヨウ素酸ナトリウムであり、該キットが該酸化剤をクエンチすることができる試薬をさらに含む、請求項２３に記載の試薬キット。
【請求項２５】
ＬまたはＲが同位体標識されている、請求項１７に記載の試薬キット。
【請求項２６】
試料中に存在する少なくとも１つのペプチドを同定するための方法であって、
（ａ）下記式を有する標識化部分を提供する工程と、
Ｒ−Ｌ−Ｍ
（式中、Ｒは選択されたアミノ酸を含むポリペプチドと反応する反応性基であり、Ｌはリンカー基であり、Ｍは磁力によって引き付けられ得る磁性粒子である）
（ｂ）試料を標識化部分と反応させて、標識ポリペプチドを提供する工程と、
（ｃ）Ｍを引き付ける磁力を印加することにより、標識ポリペプチドを単離する工程と、
（ｄ）捕捉された標識ポリペプチドの少なくともポリペプチド部分をＭ基から遊離させて、遊離された修飾ポリペプチドを提供する工程と、
（ｅ）遊離された修飾ポリペプチドを質量分析によって分析する工程とを含む、方法。
【請求項２７】
Ｌは同位体標識されている、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
下記式を有する標識化部分を含む、試薬キット。
Ｒ−Ｌ−Ｍ
（式中、Ｒは選択されたアミノ酸を含むポリペプチドと反応する反応性基であり、Ｌはリンカー基であり、Ｍは磁力によって引き付けられ得る磁性粒子である）
【請求項２９】
Ｒは、
（ａ）アミン反応性部分と、
（ｂ）−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ２と、
（ｃ）チオール反応性部分と
のうちのいずれかを含む、請求項２８に記載の試薬キット。
【請求項３０】
Ｌは、同位体標識されている、請求項２８に記載の試薬キット。
【請求項３１】
Ｒは、同位体標識されている、請求項２８に記載の試薬キット。
【請求項３２】
試料中に存在する少なくとも１つのペプチドを同定するための方法であって、
（ａ）下記の成分を有する標識化部分を提供する工程と、
Ｒ，Ｌ，ＳｏｌおよびＭ
（Ｒは、選択されたアミノ酸を含むペプチドと反応する反応性基であり、Ｌはリンカー基であり、Ｓｏｌは親水性ポリマーであり、Ｍは磁力によって引き付けられ得る磁性粒子である）
（ｂ）試料を標識化部分と反応させて、標識ペプチドを提供する工程と、
（ｃ）標識ペプチドを、磁性粒子に磁気的に結合できる捕捉面と接触させて、捕捉された標識ペプチドを提供する工程と、
（ｄ）捕捉された標識ペプチドの少なくともペプチド部分を捕捉面から遊離させて、遊離された修飾ペプチドを提供する工程と、
（ｅ）遊離された修飾ペプチドを質量分析によって分析する工程とを含む、方法。
【請求項３３】
式Ｒ−Ｌ−Ｓｏｌ−Ｍ，Ｒ−Ｌ−Ｓｏｌ−Ｌ−Ｍ、およびＲ−Ｓｏｌ−Ｌ−Ｍのうちのいずれかを有する標識化部分を含む部分を含む試薬キット。
（式中、Ｒは選択されたアミノ酸を含むペプチドと反応する反応性基であり、Ｌはリンカー基であり、Ｓｏｌは親水性ポリマーであり、Ｍは磁力によって引き付けられ得る磁性粒子である）
【請求項３４】
Ｒは、
（ａ）アミン反応性部分、
（ｂ）チオール反応性部分、
（ｃ）−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ２、および、
（ｄ）酵素基質、またはＡＴＰ，ＧＴＰ，ＮＡＤ，ＮＡＤＰ，ＮＡＤＨ，ＮＡＤＨ、ユビキチンおよびそれらの構造的類似体などの他の分子認識の非共有結合要素のいずれかを含む、請求項３３に記載の試薬キット。
【請求項３５】
ＲおよびＬのいずれかは同位体標識されている、請求項３３に記載のキット。
【請求項３６】
試料中に存在する少なくとも１つのペプチドを同定するための方法であって、
（ａ）下記の成分を有する標識化部分を提供する工程と、
Ｒ，Ｌ，ＳｏｌおよびＢ
（Ｒは、選択されたアミノ酸を含むペプチドと反応する反応性基であり、Ｌはリンカー基であり、Ｓｏｌは親水性ポリマーであり、Ｂは捕捉剤に選択的に結合可能である基である）
（ｂ）試料を標識化部分と反応させて、標識ペプチドを提供する工程と、
（ｃ）標識ペプチドを、磁性粒子に磁気的に結合できる捕捉面と接触させて、捕捉された標識ペプチドを提供する工程と、
（ｄ）捕捉された標識ペプチドの少なくともペプチド部分を捕捉面から遊離させて、遊離された修飾ペプチドを提供する工程と、
（ｅ）遊離された修飾ペプチドを質量分析によって分析して、試料中に存在する少なくとも１つのペプチドを同定する工程とを含む、方法。
【請求項３７】
式Ｒ−Ｌ−Ｓｏｌ−ＢまたはＲ−Ｓｏｌ−Ｌ−Ｍを有する標識化部分を含む部分を含む試薬キット。
（式中、Ｒは選択されたアミノ酸を含むペプチドと反応する反応性基であり、Ｌはリンカー基であり、Ｓｏｌは親水性ポリマーであり、Ｂは捕捉剤に選択的に結合できる基である）
【請求項３８】
Ｒは、
（ａ）アミン反応性部分、
（ｂ）チオール反応性部分、
（ｃ）−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ２、および、
（ｄ）酵素基質、またはＡＴＰ，ＧＴＰ，ＮＡＤ，ＮＡＤＰ，ＮＡＤＨ，ＮＡＤＨ、ユビキチンおよびそれらの構造的類似体などの他の分子認識の非共有結合要素のいずれかを含む、請求項３７に記載の試薬キット。
【請求項３９】
ＲおよびＬのいずれかは同位体標識されている、請求項３７に記載の試薬キット。
【請求項４０】
式Ｒ−Ｌ−Ｓｏｌを有する標識化部分を含む部分を含む試薬キット。
（式中、Ｒは選択されたアミノ酸を含むペプチドと反応する反応性基であり、Ｌはリンカー基であり、Ｓｏｌは親水性ポリマーである）
【請求項４１】
Ｒは、
（ａ）アミン反応性部分、
（ｂ）チオール反応性部分、
（ｃ）−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ２、あるいは
（ｄ）酵素基質、またはＡＴＰ，ＧＴＰ，ＮＡＤ，ＮＡＤＰ，ＮＡＤＨ，ＮＡＤＨ、ユビキチンまたはそれらの構造的類似体などの他の分子認識の非共有結合要素を含む、請求項４０に記載の試薬キット。
【請求項４２】
ＲおよびＬのいずれかは同位体標識されている、請求項３７に記載のキット。
【請求項４３】
試料中に存在するポリペプチドの一部を分析するための方法であって、
（ａ）下記式を有する標識化部分を提供する工程と、
Ｒ−Ｌ−Ｍ
（式中、Ｒは選択されたアミノ酸を含むペプチドと反応する反応性基であり、Ｌはリンカー基であり、Ｍは磁力によって引き付けられ得る磁性粒子である）
（ｂ）試料を標識化部分と反応させて、標識ポリペプチドを提供する工程と、
（ｃ）Ｍを引き付ける磁力を印加することにより、標識ポリペプチドを単離して、単離された標識ポリペプチドを提供する工程と、
（ｄ）単離された標識ポリペプチドを酵素的に消化して、単離された標識ポリペプチド断片を提供する工程と、
（ｅ）単離された標識ポリペプチド断片の少なくともポリペプチド断片部分をＭ基から遊離させて、遊離された修飾ポリペプチド断片を提供する工程と、
（ｆ）遊離された修飾ポリペプチド断片を質量分析によって分析する工程とを含む、方法。
【請求項４４】
試料中に存在するポリペプチドの一部を分析するための方法であって、
（ａ）下記式を有する標識化部分を提供する工程と、
Ｒ−Ｌ−Ｍ
（式中、Ｒは選択されたアミノ酸を含むポリペプチドと反応する反応性基であり、Ｌはリンカー基であり、Ｍは磁力によって引き付けられ得る磁性粒子である）
（ｂ）試料を標識化部分と反応させて、標識ポリペプチドを提供する工程と、
（ｃ）標識ポリペプチドを消化して、標識ポリペプチド断片を提供する工程と、
（ｄ）Ｍを引き付ける磁力を印加することにより、標識ポリペプチド断片を単離して、単離された標識ポリペプチド断片を提供する工程と、
（ｅ）単離された標識ポリペプチド断片の少なくともポリペプチド断片部分をＭ基から
遊離させて、遊離された修飾ポリペプチド断片を提供する工程と、
（ｆ）遊離された修飾ポリペプチド断片を質量分析によって分析する工程とを含む、方法。
【請求項４５】
試料中に存在するポリペプチドの一部を分析するための方法であって、
（ａ）下記式を有する標識化部分を提供する工程と、
Ｒ−Ｌ−Ｂ
（式中、Ｒは選択されたアミノ酸を含むポリペプチドと反応する反応性基であり、Ｌはリンカー基であり、Ｂは捕捉剤に選択的に結合可能である基である）
（ｂ）試料を標識化部分と反応させて、標識ポリペプチドを提供する工程と、
（ｃ）標識ポリペプチド断片を捕捉剤に接触させて、捕捉された標識ポリペプチドを提供する工程と、
（ｄ）捕捉された標識ポリペプチドを消化して、捕捉された標識ポリペプチド断片を提供する工程と、
（ｅ）捕捉された標識ポリペプチド断片の少なくともポリペプチド部分をＢ基から遊離させて、遊離された修飾ポリペプチド断片を提供する工程と、
（ｆ）遊離された修飾ポリペプチド断片を質量分析によって分析する工程とを含む、方法。
【請求項４６】
試料中に存在するポリペプチドの一部を分析するための方法であって、
（ａ）下記式を有する標識化部分を提供する工程と、
Ｒ−Ｌ−Ｂ
（式中、Ｒは選択されたアミノ酸を含むポリペプチドと反応する反応性基であり、Ｌはリンカー基であり、Ｂは捕捉剤に選択的に結合可能である基である）
（ｂ）試料を標識化部分と反応させて、標識ポリペプチドを提供する工程と、
（ｃ）標識ポリペプチドを消化して、標識ポリペプチド断片を提供する工程と、
（ｄ）標識ポリペプチド断片を捕捉剤に接触させて、捕捉された標識ポリペプチド断片を提供する工程と、
（ｅ）捕捉された標識ポリペプチド断片の少なくともポリペプチド断片部分をＢ基から遊離させて、遊離された修飾ポリペプチド断片を提供する工程と、
（ｆ）遊離された修飾ポリペプチド断片を質量分析によって分析する工程とを含む、方法。
【請求項４７】
Ｌは、同位体標識されている、請求項４３乃至４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
Ｒは、同位体標識されている、請求項４３乃至４６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複合ペプチド混合物の単純化方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテオミクス技術によって細胞中のタンパク質の同定、定量および位置確認が可能になり、細胞の機能および発生についての理解がこれまでゲノミクス技術によって達成されてきた以上に進むことであろう。例えば、最新の質量分析技術では複合タンパク質混合物、例えば多タンパク質複合体、細胞画分および全細胞抽出物を分析することができ、これにより、強力な高スループット診断およびスクリーニング方法を提供することが約束される。
【０００３】
質量分析を用いて、混合物中の１つのタンパク質または多数のタンパク質を同定することができる。さらに、質量分析を用いて、デノボでのペプチド配列決定を行うこともできる。例えば、複合タンパク質混合物（例えば、細胞抽出物）のタンパク質分解消化によって生じたペプチドのタンデム質量分析により、元の混合物中に存在するタンパク質を同定および定量することができる。これは、シングルｍ／ｚ値を選択して、イオンを衝突誘起解離（ＣＩＤ）に供することができるタンデム質量分析計を用いて、ペプチドの配列決定と同定を行うことが可能であるという理由によるものである。ペプチドのＣＩＤによって生成された情報を用いて、タンパク質およびヌクレオチド配列データベースを検索し、そのスペクトルによって表されるアミノ酸配列を同定することにより、当該ペプチドが由来するタンパク質を同定することができる。
【０００４】
タンパク質消化物に由来するペプチド複合混合物中のペプチドを同定するために用いられるタンデム質量分析では、３つのタイプの情報を利用する。まず最初にペプチドの質量が得られる。この情報だけでも、特にタンパク質が配列特異的プロテアーゼによって消化された場合には、可能性のあるペプチド配列の数を大幅に減らすことができる。第２のタイプの情報は、ペプチドイオンのＣＩＤによって提供されるフラグメントイオンのパターンである。フラグメントイオンパターンを、配列データベースからコンピュータによって生成した理論的フラグメントイオンパターンと比較する分析方法を用いて、ペプチド配列を同定することができる。このような方法により、最もよく一致するペプチドを同定するとともに、どのペプチド配列がより正しいかを統計的に決定することができる。多次元のＭＳ分析を用いて、デノボにてペプチドのタンパク質配列を得ることにより、予測の精度を高めることができる。この直接的シーケンス情報を用いて、フラグメントイオンパターンに基づく予測の精度をさらに高めることができる。ペプチドが同定されると、配列データベースを検索することにより該ペプチドの生成元であるタンパク質を容易に決定することができる。
【０００５】
複合混合物、例えば細胞抽出物中のタンパク質は、酵素的タンパク質分解、液体クロマトグラフィー分離、タンデム質量分析、ペプチド質量スペクトルを配列データベースに基づいて理論的に予測されたペプチド質量スペクトルと相関させるコンピュータアルゴリズム、およびデノボシーケンシングの組み合わせによって、同定され得る。エレクトロスプレーイオン化法を用いることで、質量分析計への導入前に複合混合物を一時的に分離できるように、液体クロマトグラフィーをタンデム質量分析計に直接連結することが可能になる。完全なゲノム配列を入手できる生物の数が増加すれば、複合混合物の分析に対するこの手法の価値も大いに高まるであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、複数のペプチドを含む試料、例えば、タンパク質の混合物、例えば生物試料から得たタンパク質の混合物をタンパク質分解消化して作成した試料から、単純化されたペプチド混合物を得るための方法および試薬を特徴とする。本発明の方法および試薬は、より少数のペプチドしか含まない単純化ペプチド試料を得るために、合理的かつ管理された計画に従って、試料中のペプチド（またはタンパク質）の数を減少させるために用いられ得る。例えば、混合タンパク質試料をタンパク質分解消化して作成したペプチド試料から出発して、混合タンパク質試料中の各タンパク質をタンパク質分解消化することにより作成された、１つのみまたは少数のペプチドしか含まない単純化ペプチド試料を得ることができる。この単純化試料は、元のペプチド試料よりも簡単に分析を行うことが可能であるが、元のより複雑なペプチド試料が由来する混合タンパク質試料中に存在する全てもしくは殆ど全てのタンパク質を代表している。したがって、この単純化ペプチド混合物を用いて、元の混合タンパク質試料中の全てまたは殆ど全てのタンパク質を同定および定量することができる。混合タンパク質試料中のすべてのタンパク質を同定または定量する必要はないので、単純化混合物は、該混合物が混合タンパク質試料中のそれぞれのタンパク質に由来する少なくとも１つのペプチドを含んでいない場合にも有用である。
【０００７】
本発明の方法および組成物は、複合タンパク質混合物（例えば、細胞抽出物）の酵素的消化によって生じたペプチドを分析するために有用である。本発明の方法および組成物は、管理された特異的な方法でペプチド混合物の複雑性を減少させることが望まれるあらゆる設定において有用であり、とりわけ、質量分析による分析のためのペプチド試料の調製に応用できる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の方法は、アミノ酸特異的反応基（Ｒ）を含む標識化部分の使用を伴う。標識化部分は、特定のアミノ酸位置においてペプチドまたはタンパク質を（例えば、アミノ酸と反応して共有結合を形成することにより）「標識」し、最終的にこれらの特定のアミノ酸を含むペプチドの単離を可能にする。所与の標識化部分によって標識されるアミノ酸は、当該部分上に存在するＲ基の正体に依存する。あるＲ基（ＲＳ／Ｔ）は、アミノ末端に存在するセリン（ｓｅｒ）およびスレオニン（ｔｈｒ）を標識する。別のＲ基（Ｒｃ）は、ペプチド内の任意の場所にあるシステイン（ｃｙｓ）をそのチオール基において標識する。また別のＲ基（ＲＬ）は、ペプチド内の任意の場所にあるリジン（ｌｙｓ）をその第一アミンにおいて標識する。
【０００９】
本発明は、選択されたタンパク質と、選択的に、かつ共有結合的または非共有結合的に相互作用する試薬を含む、反応性部分（ＲＰ）も特徴とする。例えば、ＲＰは標識されるべき受容体に対する天然のリガンド、あるいは、標識されるべき第２のタンパク質と相互作用するタンパク質などであり得る。酵素基質または他の分子認識の要素、たとえば、抗体、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ユビキチン、またはそれらの構造的類似体などであってもよい。ＲＰはＲの特殊なケースであり、タンパク質分解に先だって、混合されたタンパク質試料中に出現するタンパク質の数を選択的に減少させることにより、ペプチド試料を単純化する目的で使用される。
【００１０】
標識化部分の反応性基は、標識されたペプチド（以下、「標識ペプチド」とする）の単離を容易にする他の基と直接的または間接的に結合する。したがって、標識化部分は、標識ペプチドの捕捉を容易にする基（ＢまたはＭ）にＲ基を接続することができるリンカー基（Ｌ）を含んでいてもよい。Ｂ基は、例えばストレプトアビジン(strepavidin) などの捕捉剤に選択的に結合できる、例えばビオチンなどの基である。Ｍ基は、磁力によって引きつけられ得る磁性粒子である。
【００１１】
単離されたペプチドは、質量分析または他の任意の所望の方法によって分析することができる。例えば、質量分析を用いて、単純化された混合物中の１つ以上のペプチドを同定および／または定量することができる。
【００１２】
したがって、本発明は、試料中に存在するペプチドの数を減少させるための方法を特徴とし、該方法は、
（ａ）３つの共有結合した下記部分を含む標識化部分を提供する工程であって、
Ｒ−Ｌ−Ｂ
上記式中、Ｒはペプチドまたはタンパク質と反応する反応性基（例：ＲＳ／Ｔ，ＲＣ，ＲＬ，またはＲＰ）を示し、Ｌは直鎖または分枝鎖中にゼロまたはそれ以上の原子と、随意の選択的切断部位とを含むリンカー基であり、Ｂは捕捉剤に選択的に結合できる基である、工程と、
（ｂ）試料を標識化部分と反応させて、標識ペプチドまたはタンパク質を提供する工程と、
（ｃ）標識ペプチドまたはタンパク質を捕捉剤と接触させて、捕捉された標識ペプチドまたはタンパク質を提供し、捕捉された標識ペプチドまたはタンパク質を試料中の他の材料（例えば、非標識ペプチドまたはタンパク質）から単離する工程と、
（ｄ）標識ペプチドまたはタンパク質の少なくともペプチド部分またはタンパク質部分を、捕捉剤から遊離させて、遊離された修飾ペプチドまたはタンパク質を提供する工程と、（ｅ）遊離された修飾ペプチドまたはタンパク質、あるいはその断片を質量分析によって分析し、試料中に存在する少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を同定する工程とを含む。遊離された修飾ペプチドまたはタンパク質は、Ｒの全部または一部、およびＬの全部または一部を含むでいてもよいし、Ｌを全く含まなくてもよい。
【００１３】
さらに、本発明は随意でＲ−Ｌ＊−Ｂ（式中、Ｌ＊はＬを同位体標識したもの）を特徴とする。このような同位体標識された標識化部分は、それぞれ互いに異なって標識された後、質量分析の前に混合された２つ以上の試料を定量するための手段を提供する。同位体標識は、２Ｈ、１３Ｃ，１５Ｎ，１８Ｏ，３４Ｓ、または他の任意の適切な同位体標識とすることができる。また本発明は随意で、Ｒ＊−Ｌ−ＢおよびＲ−Ｌ−Ｂ＊（式中、Ｒ＊はＲを同位体標識したもの、Ｂ＊はＢを同位体標識したもの）も特徴とする。上記部分は、異なって同位体標識されたペプチドまたはタンパク質を得るための手段を提供することもできる。
【００１４】
本特許出願において、「ペプチド」は、タンパク質または「修飾ペプチドまたはタンパク質」も含むものとする。
他の実施形態において、タンパク質またはペプチドは、質量分析による分析のために、３つの共有結合された下記部分を含む標識化部分を用いることにより捕捉され得る。
【００１５】
Ｍ−Ｌ−Ｒ
上記式中、Ｍは磁性粒子を示し、ＬはＭに共有結合されたリンカーであって、直鎖または分枝鎖のゼロまたはそれ以上の原子と、随意で選択的切断部位とを含む。Ｒは、ペプチドまたはタンパク質と反応する上記で定義した反応性基（ＲＳ，ＲＣ，ＲＬ，またはＲＰ）の１つを含む特異的反応性基を示す。本実施形態において、標識ペプチドまたはタンパク質は、Ｂ部分の選択的試薬捕捉によってではなく、Ｍ部分上に選択的に磁力を印加することによって非標識ペプチドまたはタンパク質から単離され得る。
【００１６】
ペプチドは、酵素的に消化されたタンパク質または他の生物学的または合成手段で処理することによって得ることができる。タンパク質は、例えば、患者の細胞試料、患者の血清試料、または患者の組織試料から単離することができる。タンパク質は、例えば、培養細胞、対象とする化合物（例えば、治療用化合物または潜在的治療用化合物）で処理した
培養細胞、または植物細胞、微生物細胞、ウィルス、または遺伝子工学的に修飾された細胞から得ることができる。
【００１７】
様々な実施形態において、ＲＣはチオール特異的反応性基（例えば、マレイミド基またはピリジルジチオ基）を含み、ＲＬはアミン特異的反応性基（例えば、スクシンイミド基）を含み、ＲＳ／ＴはＴｈｒ／Ｓｅｒ特異的反応性基（例えば、ヒドラジド基）を含む。ＲＰは、ＲＳ／Ｔ，ＲＣ，ＲＬ、あるいは酵素基質または他の分子認識の要素、たとえば、抗体、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ユビキチン、またはそれらの構造的類似体から構成され得る。
【００１８】
Ｌは、生体または非生体のオリゴマー構造で構成されてもよい単一または多価リンカーである。例えば、Ｌは、任意の配列のポリペプチド鎖、同一のアミノ酸の鎖（例えば、ポリグリシン、またはポリアラニン）、交互になったアミノ酸の鎖、または様々なアミノ酸の鎖を含み得る。Ｌとしては、例えば、Ｏ，Ｓ，ＮＨ，ＣＯ，ＣＯＯ，ＣＯＳ，Ｓ−Ｓ，ＣＨ２、アルキル基、アルケニル基、およびアルキニル基、アルコキシ基、またはアリール基などが挙げられる。Ｌは、修飾ペプチドまたはタンパク質がＭから遊離できるようにするための化学的または酵素的切断部位を含み得る。Ｌは、安定な、または放射性の同位体原子で異なるように標識されていてもよいし、標識されていなくてもよい。
【００１９】
一実施形態において、Ｌは切断可能であり、ジスルフィド基またはビシナルジオール基、またはオルト−ニトロベンジルエーテルを含む。一実施形態において、Ｌが同位体標識されており、かつ／またはＲが同位体標識されている。
【００２０】
化学的または酵素的あるいはその双方の様々な切断部位を、Ｌ内に含めることができる。例えば、化学的切断は、適当な還元剤を用いて切断され得るジスルフィド結合であり得る。グリコールまたはジオール結合は、酸化によって切断され得る。ジアゾ結合は亜ジチオン酸(dithionite)を用いて切断され得る。エステルは、ヒドロキシアミン、酸または塩基を用いて切断され得る。スルホンは、適当な塩基を用いて切断され得る。Ｌがポリペプチドを含む場合には、該ポリペプチドはプロテアーゼを用いて切断され得る。グリセロールエステルは、リパーゼを用いて切断され得る。リン酸エステルは、ホスファターゼを用いて切断され得る。ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼを用いて切断され得る。
【００２１】
種々の実施形態において、遊離させる工程は、捕捉された標識されたポリペプチド（以下、「標識ポリペプチド」とする）を還元剤または他の切断試薬に暴露することを含む。遊離された修飾ペプチドは、質量分析法による分析の前に、クロマトグラフィーによって分離される。他の実施形態において、まず捕捉された標識ペプチドを処理して捕捉剤からＢを遊離させて（あるいは、磁場からの捕捉からＭを遊離させる）、次にＢおよびＬの全部または一部から（あるいはＭおよびＬの全部または一部から）修飾ペプチドまたはタンパク質部分を遊離させるように処理する。
【００２２】
Ｍ，ＬおよびＲ部分は、様々な方法で合成的に連結され得る。例えば、Ｍ−Ｌ−ＮＨ２の構造を有する市販の磁性粒子を購入することも可能である。同様に、Ｂ−Ｌ−ＮＨ２の構造を有する市販の捕捉基を購入してもよい。このアミノ基は、Ｌを介してＭまたはＢのいずれかに連結された様々なＲ基を生み出すように、様々な二官能性の架橋剤と反応させることができる。
【００２３】
Ｒが磁性粒子に連結されている標識化部分は、いくつかの利点を有している。まず第一に、上記標識化部分を用いて、一工程でペプチドを捕捉することができる。これにより、まず最初にアフィニティラベルを含む試薬でペプチドを標識し、続いて該アフィニティー
ラベルを、アフィニティラベルに結合する捕捉剤でコーティングした、例えばビーズまたは固体粒子などの固体支持体上に捕捉する方法と比較して、より高い効率を得ることができ、試料も扱いやすくなる。Ｒが磁性粒子または固相材料に共有結合されている標識化部分を用いることにより、捕捉されたペプチドを固体支持体に連結するために２つの結合工程を実施する必要がなくなる。さらに、固体支持体、例えばＭ−Ｌ−Ｒ構造を用いることにより、試料のクリーンアップと非誘導体化（non-derivitized ）ペプチドの除去を１つの工程で完遂することができる。それ故、より迅速かつ効率的に捕捉を行うことができる。さらに、標識ペプチドは、磁性粒子を引きつける磁力を用いて単離されるので、捕捉工程が、反応混合物中に存在する、例えばタンパク質や不純物などの成分による干渉を受けるようなものではなく、また、バッファ条件や温度などの因子によっても影響されない。さらに、磁性粒子は試料の取扱いを容易にする上での多くの利点を提供する。Ｍ−Ｌ−Ｒの形に対する適切な標識化部分は、以下のようにして調製することができる。共有結合した第一級アミノ基、ダイナルＡ／Ｓ（Ｄｙｎａｌ  Ａ／Ｓ）（ノルウェー、オスロ）を有する磁性粒子（Ｍ部分）は、ピアス  ケミカル  カンパニー（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）より市販されているヘテロ二官能性架橋剤であるＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）と反応させることによって活性化することができる。この試薬は、チオール含有ペプチドのチオールによって置換され得るピリジンチオール基を提供する。前記ペプチドはまた、異なるＲ基を連結可能である第一級アミノ基を含む合成ペプチドであってもよい。このように、チオール含有ペプチドがＬ基の一部を構成する。チオール含有ペプチドは、例えば、１３Ｃまたは重水素で標識することができる。このような場合、Ｍ−Ｌ−Ｒ部分は、Ｍ−Ｌ＊−Ｒと表記する。同位体標識を行うことにより、互いに混合され、質量分析によって同時に分析される、異なる試料中のペプチドまたはタンパク質を相対的に定量することが可能になる。チオール含有ペプチドは好ましくは、捕捉されたペプチドの遊離を可能にする切断部位を含んでいる。切断部位の例としては、化学的切断が可能なジスルフィド基を有するもの、あるいは、例えばトリプシンなどによる酵素的切断が可能な基が挙げられる。ペプチドは望ましいＬ基であるが、その理由の１つとして、ペプチドは合成が容易かつ比較的単純であることが挙げられる。ペプチドは実質的に親水性に、実質的に疎水性に、あるいは、そのいずれでもないように設計することができるため、様々な溶液条件に適応させることができる。さらに、ペプチドは構造的および立体的柔軟性を有している。ペプチドは、化学的切断部位、酵素的切断部位またはその双方のタイプの切断部位を含むように容易に設計され得る。
【００２４】
上述のように、チオール含有ペプチドの第一級アミノ基は、様々な部分と反応して、Ｍ−Ｌ−Ｒ（またはＢ−Ｌ−Ｒ）構造に対して様々なＲ部分を生成することができる。例えば、第一級アミノ基は、ヒドラジド基を含む部分と反応することができる。この場合、Ｒ部分は、アミノ末端にスレオニンまたはセリンを有するペプチドに対して選択的となる。あるいは、第一級アミノ基は、マレイミド基を含む部分と反応することもできる。この場合、Ｒ部分はシステイン含有ペプチドと選択的に反応する。システイン含有ペプチドとの反応に適した他の求電子Ｒ基としては、例えば、エポキシド、α−ハロアシル、ニトリル、スルホン化アルキルチオール、およびスルホン化アリールチオールが挙げられる。Ｒ部分は、アミノ基との反応のためのスクシンイミド基を含んでいてもよい（例えば、リジン）。
【００２５】
Ｍ−Ｌ−ＲまたはＢ−Ｌ−Ｒ部分は、（１）タンパク質の酵素的消化によって生じるものを含むペプチド、（２）天然型のタンパク質、（３）変性型のタンパク質、および（４）天然の膜内在型のタンパク質との反応に用いることができる。
【００２６】
天然型のタンパク質（および二次構造をとるのに十分な大きさを有する、ある種のペプチド）の場合、分子の外側部分上に表出している（すなわち、立体的に利用可能な）特異
的なアミノ酸のみが、Ｍ−Ｌ−ＲまたはＢ−Ｌ−Ｒ部分と反応する。したがって、結合によって、タンパク質の「表出」部分の特異的ターゲティングを行うことができる。変性タンパク質の場合、タンパク質の全ての部分に潜在的に近づき易い。その後、タンパク質はペプチド成分に消化され得る。Ｍ−Ｌ−Ｒ部分を用いて、天然型または変性型のタンパク質を捕捉する。その後、タンパク質は、化学的または酵素的に消化され得る。Ｍ−Ｌ−Ｒ部分（結合したペプチドを有する）を洗浄すると、非結合ペプチド（および他の不要な材料）を除去することができる。その後、修飾ペプチドを遊離させる。場合によっては、洗浄工程を複数回行うことが望ましいこともある。例えば、標識ペプチドまたは標識ポリペプチドを捕捉の前または後あるいは前後に洗浄することもできる。
【００２７】
酵素的または化学的消化の前にポリペプチドまたはタンパク質を標識する場合には、いくつかの手法が可能である。例えば、試料中に存在するポリペプチドの一部は、（ａ）式Ｒ−Ｌ−Ｍを有する標識化部分を提供することと（式中、Ｒは選択されたアミノ酸を含むポリペプチドと反応する反応性基であり、Ｌはリンカー基であり、Ｍは磁力によって引き付けられ得る磁性粒子である）、（ｂ）試料を標識化部分と反応させて、標識ポリペプチドを提供することと、（ｃ）Ｍを引き付ける磁力を印加することにより、標識ポリペプチドを単離して、単離された標識ポリペプチドを提供することと、（ｄ）単離された標識ポリペプチドを酵素的または化学的に消化して、単離された標識ポリペプチド断片を提供することと、（ｅ）単離された標識ポリペプチド断片の少なくともポリペプチド断片部分をＭ基から遊離させて、遊離された修飾ポリペプチド断片を提供することと、（ｆ）遊離された修飾ポリペプチド断片を質量分析によって分析することとにより、捕捉され、分析され得る。この方法において、消化工程は、標識ポリペプチドが単離された後に行われる。標識ポリペプチドの単離の前に消化を行うように、工程の順序を変えることもできる。この手法において、該方法は、（ａ）式Ｒ−Ｌ−Ｍを有する標識化部分を提供する工程と（式中、Ｒは選択されたアミノ酸を含むポリペプチドと反応する反応性基であり、Ｌはリンカー基であり、Ｍは磁力によって引き付けられ得る磁性粒子である）、（ｂ）試料を標識化部分と反応させて、標識ポリペプチドを提供する工程と、（ｃ）標識ポリペプチドを消化して、標識ポリペプチド断片を提供する工程と、（ｄ）Ｍを引き付ける磁力を印加することにより、標識ポリペプチド断片を単離して、単離された標識ポリペプチド断片を提供する工程と、（ｅ）単離された標識ポリペプチド断片の少なくともポリペプチド断片部分をＭ基から遊離させて、遊離された修飾ポリペプチド断片を提供する工程と、（ｆ）遊離された修飾ポリペプチド断片を質量分析によって分析する工程とを含んでいる。
【００２８】
インタクトのタンパク質またはポリペプチドも、Ｒ−Ｌ−Ｂ標識化部分を用いて標識することができる。したがって、本発明には、（ａ）式Ｒ−Ｌ−Ｂを有する標識化部分を提供する工程（式中、Ｒは選択されたアミノ酸を含むポリペプチドと反応する反応性基であり、Ｌはリンカー基であり、Ｂは捕捉剤に選択的に結合可能である基である）と、（ｂ）試料を標識化部分と反応させて、標識ポリペプチドを提供する工程と、（ｃ）標識ポリペプチド断片を捕捉剤に接触させて、捕捉された標識ポリペプチドを提供する工程と、（ｄ）捕捉された標識ポリペプチドを消化して、捕捉された標識ポリペプチド断片を提供する工程と、（ｅ）捕捉された標識ポリペプチド断片の少なくともポリペプチド部分をＢ基から遊離させて、遊離された修飾ポリペプチド断片を提供する工程と、（ｆ）遊離された修飾ポリペプチド断片を質量分析によって分析する工程とを含む方法も含まれる。また本発明には、（ａ）式Ｒ−Ｌ−Ｂを有する標識化部分を提供する工程（式中、Ｒは選択されたアミノ酸を含むポリペプチドと反応する反応性基であり、Ｌはリンカー基であり、Ｂは捕捉剤に選択的に結合可能である基である）と、（ｂ）試料を標識化部分と反応させて、標識ポリペプチドを提供する工程と、（ｃ）標識ポリペプチドを消化して、標識ポリペプチド断片を提供する工程と、（ｄ）標識ポリペプチド断片を捕捉剤に接触させて、捕捉された標識ポリペプチド断片を提供する工程と、（ｅ）捕捉された標識ポリペプチド断片の少なくともポリペプチド断片部分をＢ基から遊離させて、遊離された修飾ポリペプチド断片
を提供する工程と、（ｆ）遊離された修飾ポリペプチド断片を質量分析によって分析する工程とを含む方法も含まれる。
【００２９】
ポリペプチドまたはタンパク質を、本発明の標識化部分のいずれか１つを用いて標識化する場合、該ポリペプチドまたはタンパク質は必ずしもインタクトの天然に存在するポリペプチドまたはタンパク質でなくてもよい（そうであってもよい）ことを理解すべきである。場合によっては、天然に存在するポリペプチドに対して、標識する前にサイズを小さくする前処理を実施することもできる。
【００３０】
特に膜内在型および／または不溶性タンパク質に対処するための別の実施形態において、質量分析による分析のためのタンパク質およびペプチド混合物を単純化するために、Ｍ，Ｌ，ＳｏｌおよびＲの構造基を含む標識化部分を用いることもできる。この標識化部分において、Ｍは磁性粒子であり、Ｌはリンカー基であり、Ｓｏｌは膜不透過性可溶化基であり、Ｒは特定のアミノ酸に選択的に結合可能な化学的反応性基または上述のような修飾アミノ酸である。可溶化基は、Ｒ基に連結されたタンパク質の溶解性を高める、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはメトキシル化ポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ）などの高分子種であり得る。この手法は、タンパク質そのものが一旦その膜から除去されると水溶液への十分な溶解性を有さない場合に特に有用である。下記式、すなわち、
Ｍ−Ｌ−Ｓｏｌ−Ｒと、
Ｍ−Ｓｏｌ−Ｌ−Ｒと、
Ｍ−Ｌ−Ｓｏｌ−Ｌ−Ｒと、
Ｍ−Ｌ−Ｒ−Ｓｏｌと、
Ｍ−Ｌ−Ｒ−Ｌ−Ｓｏｌと、
Ｍ−Ｌ−Ｒ
｜
Ｓｏｌ
とを含む様々な構成のこれらの成分を用いることができる。
【００３１】
Ｍ基、Ｓｏｌ基またはＲ基の間に１つ以上の化学的切断部位（例えば、上述のような）を設けてもよいが、最も好ましい実施形態において、Ｌ基は、磁性粒子の近傍に切断部位を含み、切断後、Ｒ，ＬおよびＳｏｌに連結されたタンパク質に対するペプチドを産出する。切断部位は、ジスルフィドまたは酵素によって切断可能なオリゴペプチドを含んでいてもよい。切断後、Ｓｏｌ基は結合したタンパク質の水溶性を高める。水溶性の向上は、エレクトロスプレーなどの流体イオン化技術を用いた質量分析による分析の前にタンパク質に対して実施すべき処理に有益であり得る。第２の切断部位を用いて、Ｒの全部または一部に連結され、かつＬの全部または一部に連結されているか、またはＬには連結されていない、ペプチドまたはタンパク質から脱離するＳｏｌ基を遊離させることができる。
【００３２】
随意で、Ｌ，ＲおよびＳｏｌのうちの１つ以上を同位体標識してもよい。
上述のように、Ｂ基をＭ基の代わりに用いることができる。したがって、ビオチンまたは他の何らかの親和性基を磁性粒子の代わりに用いることができる。このような状況下において、標識ペプチドを、例えば、ストレプトアビジンでコーティングした磁性粒子を用いて捕捉することができる。この場合、Ｒ，Ｌ，ＳｏｌおよびＢで構成される可溶化剤もまた、アミノ酸特異的試薬（Ｒ）が脂質膜を通過することを防止する機能を果たすことができる。したがって、この試薬は、脂質膜の外側に性状を表す特定の膜内タンパク質を選択するために有効であるとともに、ＬＣＭＳ分析よりも上流のタンパク質分解および他の試料調製工程において上記タンパク質を可溶化する。
【００３３】
Ｒ，ＬおよびＳｏｌで構成される汎用可溶化剤には、膜結合タンパク質をほぼ可溶化するための用途もある。固相捕捉は必ずしも必要でない。例えば、膜由来成分を単離するた
めに、様々な液体クロマトグラフィー手段を用いることができる。
【００３４】
本発明は、下記式を有する標識化部分を含む試薬キットも特徴とする。
Ｒ−Ｌ−Ｂ
Ｒ−Ｌ−Ｍ
Ｒ，Ｌ，ＳｏｌおよびＭ、
Ｒ，Ｌ，ＳｏｌおよびＢ、ならびに、
Ｒ，ＬおよびＳｏｌ
式中、Ｒは先に詳述したように、上記４つの反応性基（ＲＳ／Ｔ，ＲＣ，ＲＬまたはＲＰ）のいずれか１つを含み、Ｌは上述のようなリンカー基であり、Ｂは上述のように捕捉剤に選択的に結合可能である基であり、随意でタンパク質分解酵素である。様々な実施形態において、ＬまたはＲは同位体標識されており（Ｌ＊またはＲ＊と表す）、ＲＳは式−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ２の構造を含み、標識化部分全体はビオチンヒドラジドである。
【００３５】
他の実施形態において、試薬キットは、ラテックス粒子または磁性粒子などの固体支持体に結合されたアビジンまたはストレプトアビジンを含む捕捉剤と、Ｄ−ビオチンと、酸化剤（例えば、過ヨウ素酸ナトリウム）および酸化剤をクエンチすることができる試薬と、関与する反応および分離を最適化するように特別に調製されたバッファとをさらに含む。
【００３６】
他の実施形態において、質量分析による分析は、少なくとも１つの遊離された修飾ペプチドの分子量および／または少なくとも１つの遊離された修飾ペプチドの少なくとも一部のアミノ酸配列を決定することを含み、ペプチドは標識化部分との反応の前に化学的に処理される。
【００３７】
本発明の方法は、１つには、複合ペプチド混合物の分析が非常に困難で時間を要することがあるという理由から有用である。全細胞抽出物、オルガネラ、タンパク質複合体または組織試料から酵素的消化または他の手段によって生成されたペプチド混合物は、膨大な数のペプチドを含んでいると考えられる。例えば、全哺乳動物細胞溶解物のトリプシン消化物は、１，０００，０００以上のペプチドを含んでいることもある。そのような混合物中のそれぞれのペプチドの量、ましてや正体を分析することは、気の遠くなるような作業である。それらのペプチドが由来するタンパク質を同定しようとすると、分析はさらに複雑になる。しかしながら、当業者であれば理解できるであろうが、混合物中の所与のタンパク質は、該タンパク質の消化によって生成されたペプチドのうちの１つまたは少数に基づいて同定および定量することができる。そのタンパク質に対する特異的な抗体の結合を利用して、たとえその抗体がタンパク質の全構造のうちの小さな画分だけしか認識して結合しないとしても、該タンパク質の存在を確認することは、生物学において広く受け入れられている方法である。言い換えると、タンパク質は、該タンパク質の消化によって生じる全てのペプチドよりも少数のペプチドを検出することで同定できるのである。したがって、混合物中に存在するペプチドのサブセットを単離することにより、制御可能かつ予測可能な手法で、ペプチド混合物の複雑性を減じる方法によって、上記ペプチド混合物の由来するタンパク質の同定および／または定量を著しく容易にすることができる。
【００３８】
混合物中に存在するペプチド（およびそれらの由来するタンパク質）を同定するためのデータベース検索に要する時間と費用が大きく削減されるため、分析が容易になる。本発明の方法によって達成される分析の速度、簡便性、および信頼性の向上は、せいぜい情報が僅かに損失する程度で実現することができる。この情報の損失は、例えば、タンパク質の何らかの小さな画分が、何らかの条件下において、所与のＲ基で標識化可能なペプチドを生成できないことために生じ得る。したがって、状況によっては、少数のタンパク質が検出されないこともある。しかしながら、さらなる分析を実施することでこの問題はかな
り克服することができる。例えば、異なるＲ基を有する標識化部分を用いてさらなる分析を行うこともできる。ＲＳ／Ｔを用いた標識化部分の場合、最初の消化条件ではアミノ末端ｓｅｒペプチドおよび／またはアミノ末端ｔｈｒペプチドを生成しないタンパク質から、アミノ末端ｓｅｒペプチドおよび／またはアミノ末端ｔｈｒペプチドを生成する別の方法によって、元の混合タンパク質試料中のタンパク質を消化することができる。このことは上述の方法の強みの１つ、すなわち上記方法がタンパク質中に存在する配列情報に依存しているということを浮き彫りにしている。このことは、異なる特異性の酵素でタンパク質を切断すると、元のセットとほぼ直交（orthogonal）しうるペプチドのセットが得られることを意味している。第２の分析の結果を、第１の分析の結果と組み合わせることにより、元の試料中に存在するタンパク質の分析は完璧なものとなる。
【００３９】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および請求項から明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
本発明の方法を用いて、特定のアミノ酸を含むペプチド（例えば、アミノ末端セリン（「アミノ末端ｓｅｒペプチド」）またはアミノ末端スレオニン（「アミノ末端ｔｈｒペプチド」）を有するペプチド）を単離することにより、複合ペプチド混合物を単純化することができる。ペプチドは、該ペプチドを、所望のペプチドと反応してそのペプチドを捕捉剤によって捕捉されるように標識する標識化部分と反応させることにより、単離され得る。標識化部分は、反応性基（Ｒ）と、リンカー基（Ｌ）と、捕捉剤に選択的に結合できる基（Ｂ）と、あるいはＢの代わりに、磁力に応答する磁性基（Ｍ）とを含む。標識されたペプチドは、標識化部分がＢ基を含む場合には前記ペプチドを捕捉剤（例えば、固体支持体に結合された捕捉剤）と接触させることによって捕捉、単離され、あるいは、標識化部分がＭ基を含む場合には磁力印加によって標識ペプチドを引き付けることによって捕捉、単離される。使用するＲ基のタイプに応じて、システイン含有ペプチド、リジン含有ペプチド、またはアミノ末端セリンもしくはアミノ末端スレオニンのいずれかを有するペプチドを、混合物中に存在する他の材料（例えば他のペプチド）から単離することができる。単離後、捕捉されたペプチドを捕捉剤から遊離させて、質量分析によって分析する。ペプチドは、標識化部分内のリンカー基を選択的に切断するか、あるいは捕捉剤と該捕捉剤に選択的に結合する基との間の相互作用を崩壊させることによって遊離され得る。多くの場合、遊離されたペプチドは修飾ペプチドであり、標識化部分に由来する成分、例えば、リンカー基（Ｌ）の全部または一部、および／または、反応性基（Ｒ）の全部または一部を含んでいてもよい。場合によっては、本質的に非修飾形態のペプチドが遊離されることもある。
【００４１】
捕捉剤を、アビジンまたはストレプトアビジンまたは修飾アビジンまたは修飾ストレプトアビジンとして、標識化部分をビオチンまたは修飾ビオチンを含むようにしてもよい。あるいは、捕捉剤をビオチンまたは修飾ビオチンとして、標識化部分がアビジンまたはストレプトアビジンまたは修飾アビジンまたは修飾ストレプトアビジンを含むようにしてもよい。他の成分からの標識ペプチドの単離を容易にするために、捕捉剤は、好ましくは共有結合的に、ガラス粒子、ミクロタイタープレートのウェル、磁性粒子などの固体支持体に結合させることができる。したがって、標識ペプチドは、アビジンまたはストレプトアビジンでコーティングした磁性粒子を用いて捕捉することができる。
【００４２】
上記のペプチド、例えば、アミノ末端ｓｅｒおよびアミノ末端ｔｈｒペプチドは、タンパク質またはタンパク質の混合物の切断によって生成され得る。切断は酵素的に行うことができる。例えば、ペプチドは、タンパク質またはタンパク質の混合物を標準的な技術を用いてトリプシンで消化することによって生成され得る。
【００４３】
質量分析による分析のためのアミノ末端ｓｅｒおよびアミノ末端ｔｈｒペプチドは、以下のようにして調製することができる。タンパク質の混合物を含む試料を変性条件に供する。変性したタンパク質をトリプシンで消化する。アミノ末端ｓｅｒペプチドおよびアミノ末端ｔｈｒペプチド上に存在するβ−アミノアルコール部分は、ｐＨ７のリン酸バッファに溶解されたペプチド混合液に、溶液濃度が過ヨウ素酸中４０ｍＭとなるようにメタ過ヨウ素酸ナトリウムを加えることにより、選択的に酸化される。室温にて暗中５分間インキュベートした後、過剰の酸化剤をエチレングリコールを添加することによりクエンチする。次に反応混合液にビオチンヒドラジドを直接添加して３０分間インキュベートすることにより、修飾ペプチドをビオチニル化する。次に、選択的にビオチニル化されたペプチドを単量体ストレプトアビジンでコーティングした粒子上に捕捉させる。非修飾ペプチドを洗浄除去し、ＨＰＬＣ開始バッファで洗浄した後、遊離Ｄ−ビオチンで交換することにより、ペプチドを粒子から溶出する。これに代わって、ビオチニル化工程のために切断可能なリンカーを含む、特殊化されたビオチン−ヒドラジドを用い、結合したペプチドを粒子から遊離させるために選択的切断試薬を加えるようにしてもよい。リンカーに組み込むことのできる切断可能な基としては、例えば、ジスルフィド基（ＴＣＥＰによって切断）またはビシナルジオール基（過ヨウ素酸ナトリウムによって切断）が挙げられる。単離されたペプチドが粒子から遊離されたところで、試料を液体クロマトグラフィー−質量分析装置（ＬＣ／ＭＣ）に直接注入することにより、これらのペプチドを分析することができる。
【００４４】
ペプチド混合物の単純化を達成するための前述の方法は、システインを含むペプチドを単離するために、システイン（ｃｙｓ）の反応性スルフヒドリル基を用いている。アミノ末端ｓｅｒまたはアミノ末端ｔｈｒを有するペプチドを単離することにより、本発明の方法は、見逃されるタンパク質の数を殆ど若しくは全く増加させることなく、さらなる単純化を実現することができる。一般に、単純化と部分配列情報の知識が増大すると、より制約されたデータベース検索を行うことができるようになり、少ないデータベース内でより迅速に検索を行うことになり、処理容量とメモリの集中使用が少なくて済む。さらに、本発明の方法において、分析される各ペプチドの一部が既知である（たとえば、アミノ末端ｓｅｒまたはｔｈｒがあることが既知である、またはｃｙｓが存在することが既知である、あるいはｌｙｓが存在することが既知である）。このことにより、データベース検索を制約して行うことができ、ＭＳ／ＭＳ断片化パターンの解釈が容易になる。さらに、アミノ末端において修飾されたペプチドの分析は、内部で修飾されたペプチドの分析よりも容易であることがある。本発明の方法は、同時溶出ピークの発生が減少するはずであるから、ピークパーキング（peak parking）の必要を低減し、したがって試料の出力が増加することになる。
【００４５】
本発明によって達成される単純化は、複合ゲノムから得たプロテオームを調べることによって説明することができる。図１〜３は、全Ｃ．Ｅｌｅｇａｎｓプロテオームのトリプシン消化物のバイオインフォマティクス分析の結果を示している。図１は、全プロテオームのトリプシン消化によって生じたペプチド／タンパク質の分布を示している。図２は、全プロテオームのトリプシン消化によって生じたｃｙｓ含有ペプチド／タンパク質の分布を示している。図３は、全プロテオームのトリプシン消化によって生じたアミノ末端ｓｅｒおよびアミノ末端ｔｈｒペプチド／タンパク質の分布を示している。これらの計算の結果は、アミノ末端ｓｅｒペプチドおよびアミノ末端ｔｈｒペプチドを選択した場合の方が、ｃｙｓ含有ペプチドを選択した場合よりも大きな単純化を達成することができることを示唆している。これらの計算は、プロテオームの約５％が各手法によって検出されないことを示唆している（ペプチド／タンパク質を保有しないタンパク質の画分）。これらの計算では、酵素的切断の結果として３つ以下のアミノ酸しか含まないペプチドを除外している。
【００４６】
図４は、ビオチンヒドラジドの構造を描いたものである。この化合物は、Ｂ−Ｌ−ＲＳ／Ｔ標識化部分の一例である。この化合物は、ビオチンからなるＢ基２と、Ｌ基４と、ヒドラジド基からなるＲＳ／Ｔ基６とを含んでいる。
【００４７】
図５Ａ〜５Ｃは、Ｍ，ＬおよびＲ（すなわち、Ｍ−Ｌ−Ｒ標識化部分）の組み合わせ例を示したものである。図５Ａは、アミノ末端ＳｅｒまたはＴｈｒを有するペプチドの捕捉に適した標識化部分を示している。この標識化部分は、磁性粒子８と、ジスルフィド結合切断部位１２を含むＬ基１０と、ヒドラジド基を含む反応性基１４とを含んでいる。図５Ｂは、Ｃｙｓを有するペプチドの捕捉に適した標識化部分を示したものである。この標識化部分は、磁性粒子１６と、ジスルフィド結合切断部位２０を含むＬ基１８と、マレイミド基を含む反応性部分２２とを含んでいる。図５Ｃは、Ｌｙｓを有するペプチドの捕捉に適した標識化部分を示したものである。この標識化部分は、磁性粒子２４と、ジスルフィド結合切断部位２８を含むＬ基２６と、スクシンイミド基を含む反応性部分３０とを含んでいる。
【００４８】
標識化部分は、例えばリンカー基または反応性部分内の１つまたはそれ以上の原子を、該原子の安定な同位体で置換することにより同位体標識することができ、例えば、１つ以上の水素を重水素で置換することもできるし、あるいは１つ以上の１２Ｃを１３Ｃで置換することもできるし、あるいは１４Ｎを１５Ｎで標識することもできるし、あるいはこれらを組み合わせてもよい。同位体標識された標識化部分を用いる場合、遊離された修飾ペプチドは同位体標識されていることになる。２つのペプチド試料を、異なるように同位体標識されているが化学的に同一である標識化部分と反応させた場合、２つの試料中のペプチドの相対量を容易に定量できるようになる。これは、一方は「軽い」型の標識で修飾され、他方は「重い」型の標識で修飾された２つのペプチド試料の混合物は、２つの化学的に同一物の軽い型と重い型を含むことになるためである。したがって、この手法は、ｃｙｓ含有ペプチドを定量するために用いられてきており（ギジ（Ｇｙｇｉ）ら、（１９９９年）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．第１７号、９９４頁、およびＰＣＴ公報第ＷＯ００／１１２０８号）、同様の手法をアミノ末端ｓｅｒペプチドおよびアミノ末端ｔｈｒペプチド、ならびにｌｙｓ含有ペプチドを定量するために用いることもできる。
【００４９】
例えば一方を選択された化合物に暴露された細胞から得た試料とし、他方をその選択された化合物に暴露されていない細胞から得た試料とする、２つの異なるペプチド試料を、本発明の標識化部分を用いて異なるように同位体標識することができる。２つの試料から生じる、単離された異なるように同位体標識された修飾ペプチドは、一緒に混合されて質量分析によって分析することができる。
【００５０】
図６は、Ｂ−ＬＡ−Ｓｏｌ−ＬＢ−Ｒ標識化部分の一例を示したものである。この標識化部分のＲ基はビオチン３２であり、ＬＢ基３４は少なくとも１３Åの長さの鎖である。メトキシポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ）を含むＳｏｌ基３６は、一端において、アミド結合３６によってＬＢ基に連結され、他端において、アミド結合４０によって標識化部分の残りの部分に連結されている。ＭＰＥＧは、５，０００ダルトンもしくはそれ以上の質量を持つこともあり、Ｌ基およびＲ基との反応のための１つ以上の求核基または求電子基を含んでいてもよい。Ｓｏｌ基３６は、容易に切断可能なジスルフィド結合４６を含む第２のリンカー領域ＬＡ４４によって、Ｒ基４２に連結されている。Ｒ基４２は、アミノ基と選択的に反応可能なスクシンイミド基である（例えば、リジン含有ペプチド）。
【００５１】
実施例
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；シグマ  ケミカル  インコーポレイテッド（Ｓｉｇｍａ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｉｎｃ．））およびウマミオグロビン（シグマ  ケミカル  インコーポレイテッド）を標準的な手順に従って別々にトリプシン（プロメガ  インコーポレイ
テッド（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ））で消化した。消化によって得られたペプチド混合物をＮａＩＯ４で処理した。次にエチレングリコールを添加することにより、過剰の酸化剤をクエンチした。次に、ペプチド混合物をビオチンヒドラジド（ビアス  ケミカル  コーポレイション（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｃｏ．）；図４）とともに３０分間インキュベートすることにより、修飾ペプチドを選択的にビオチニル化した。このビオチニル化されたペプチドをＭＰＧストレプトアビジンでコーティングされた磁性粒子（シーピージー  インコーポレイテッド（ＣＰＧ，Ｉｎｃ））を用いて捕捉した。ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ自動磁性粒子プロセッサ（ラブ  システムズ  インコーポレイテッド（Ｌａｂ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ））によって試料プロセシングを実施した。
【００５２】
ナノスプレー源を備えたＬＣＱ  Ｄｅｃａ質量分析計（サーモフィニガン  インコーポレイテッド（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ，Ｉｎｃ））に連結された、ナノフロー動作用に構成されたＳｕｒｖｅｙｏｒＨＰＬＣ（サーモフィニガン  インコーポレイテッド）を用いて試料を解析した。ＰｉｃｏＦｒｉｔパックドチップ（ニュー  オブジェクティブ（Ｎｅｗ  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ））（内径７５ｕｍ×長さ１０ｃｍ）および１００ｎＬ／分の流速で標準的な勾配を用いて、逆相ＨＰＬＣを実施した。
【００５３】
ＢＳＡの配列に基づくと、トリプシン消化によって、６つのｔｈｒ／ｓｅｒアミノ末端ペプチドが生じるはずである。ウマミオグロビンの配列に基づくと、トリプシン消化によって１つのｔｈｒ／ｓｅｒアミノ末端ペプチドが生じるはずである。ＢＳＡに対する６つの予測されるペプチドおよびミオグロビンに対する１つの予測されるペプチドは、捕捉された画分において観察されるペプチドのみであった。
【００５４】
本願を通して引用したすべての参照文献、特許および特許出願公報は、参照によって本願に組み入れる。
他の実施形態
異なるＲ基を有する２つまたはそれ以上の標識化部分を組み合わせて用いることもできる。ｃｙｓ含有ペプチドと選択的に反応可能な標識化部分を用いて、ｃｙｓ含有ペプチドを対象試料のある画分から単離することができる。アミノ末端ｓｅｒペプチドおよびアミノ末端ｔｈｒペプチドと選択的に反応可能な標識化部分を用いて、対象試料の第２の画分からアミノ末端ｓｅｒペプチドおよびアミノ末端ｔｈｒペプチドを単離することができる。双方のタイプの標識化部分を用いて単離した修飾ペプチドを組み合わせて、質量分析によって分析することもできるし、あるいはそれらを別々に分析して、結果を組み合わせるようにしてもよい。標識化部分が同じ捕捉剤を用いて捕捉され得る場合には、標識ペプチド（ｃｙｓ含有ペプチドと、アミノ末端ｓｅｒペプチドと、アミノ末端ｔｈｒペプチドの混合物）は単一の反応において、捕捉剤によって捕捉され得る。その後、遊離された修飾ペプチドの混合物を、質量分析によって分析することができる。異なるように同位体標識された標識化部分を用いて、２つまたはそれ以上の異なる試料中のペプチドを異なるように標識することができる。遊離されたペプチドは、質量分析以外の方法によって分析することもできる。したがって、本発明の様々な標識化部分および方法を用いてペプチドを単離および精製し、任意の目的のために複合混合物を単純化することができる。
【００５５】
均等物
当業者であれば、本明細書中に記載の本発明の具体的な実施形態に対する多くの均等物を理解するか、あるいは単に常套的な実験を用いて解明することができるであろう。そのような均等物は、特許請求の範囲によって包含されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの全プロテオームのトリプシン消化のバオイオインフォマティクスモデリングによって生成されたペプチド／タンパク質分布を示す図。
【図２】Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの全プロテオームのトリプシン消化のバオイオインフォマティクスモデリングに続いて、ｃｙｓ含有ペプチドの選択を行って生成されたｃｙｓ含有ペプチド／タンパク質分布を示す図。
【図３】Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの全プロテオームのトリプシン消化のバオイオインフォマティクスモデリングに続いて、アミノ末端ｓｅｒおよびアミノ末端ｔｈｒペプチドの選択を行って生成されたアミノ末端ｓｅｒおよびアミノ末端ｔｈｒペプチド／タンパク質分布を示す図。
【図４】ビオチンヒドラジドの構造を示す図。
【図５Ａ】様々なＭ−Ｌ−Ｒ標識化部分を示す図。
【図５Ｂ】様々なＭ−Ｌ−Ｒ標識化部分を示す図。
【図５Ｃ】様々なＭ−Ｌ−Ｒ標識化部分を示す図。
【図６】Ｂ−Ｌ−Ｓｏｌ−Ｌ−Ｒ標識化部分を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【国際調査報告】
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