(57)【要約】本発明は、ＲＩＺヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）活性を調節する化合物を、ＨＭＴ活性を有するＲＩＺまたはＲＩＺフラグメントを、１つ以上の候補化合物と接触する工程、および該接触させたＲＩＺまたはＲＩＺフラグメントのＨＭＴ活性を決定する工程により、スクリーニングする方法を提供する。プロゲステロンレセプター（ＰＲ）活性を調節する化合物を、ＲＩＺ１調節化合物を提供する工程、およびこのＲＩＺ１調節化合物のＰＲ活性を調節する能力を決定する工程により、スクリーニングする方法もまた提供される。内分泌治療に応答する可能性の低減したエストロゲンレセプター陽性（ＥＲ＋）腫瘍をもつ個体を識別する方法もまた提供される。この方法は、腫瘍のＲＩＺ１状況を決定する工程を包含し、ここで、異常なＲＩＺ１状況が、個体を、内分泌治療に応答する可能性が低減した個体として同定する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＩＺヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を調節する化合物をスクリーニングする方法であって：
ａ）ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を有するＲＩＺまたはＲＩＺフラグメントを、１つ以上の候補化合物と接触させる工程；および
ｂ）該接触させたＲＩＺまたはＲＩＺフラグメントのヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を決定する工程、を包含し、
ここで、ＲＩＺヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を調節する化合物が同定される、方法。
【請求項２】
前記ＲＩＺがＲＩＺ１である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＲＩＺがＲＩＺ２である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＲＩＺフラグメントが、ヒトＲＩＺ１のアミノ酸残基１−２００を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＲＩＺフラグメントが、ヒトＲＩＺ１のアミノ酸残基１−３３２を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＲＩＺフラグメントが、ヒトＲＩＺ１のアミノ酸残基１５１４−１６８０を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ヒストンＨ１メチルトランスフェラーゼ活性が決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ヒストンＨ３メチルトランスフェラーゼ活性が決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ヒストンＨ４メチルトランスフェラーゼ活性が決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
プロゲステロンレセプター活性を調節する化合物をスクリーニングする方法であって：
ａ）ＲＩＺ１調節化合物を提供する工程；および
ｂ）該ＲＩＺ１調節化合物のプロゲステロンレセプター活性を調節する能力を決定する工程、を包含し、
ここで、プロゲステロンレセプター活性を調節する化合物が同定される、方法。
【請求項１１】
前記工程ａ）が：
ｉ）ＲＩＺ１を１つ以上の候補化合物と接触させること；
ｉｉ）該候補化合物がＲＩＺ１を選択的に結合する能力を決定すること；および
ｉｉｉ）工程ｉｉ）からＲＩＺ１を選択的に結合する化合物を提供すること、を包含する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記工程ａ）が：
ｉ）ＲＩＺ１を、ＲＩＺ１がＲＩＺ１結合パートナーを選択的に結合する条件下で、１つ以上の候補化合物と接触させること；
ｉｉ）該候補化合物の、ＲＩＺ１と該ＲＩＺ１結合パートナーとの間の選択的結合を調節する能力を決定すること；および
ｉｉｉ）工程ｉｉ）から該選択的結合を調節する化合物を提供すること、を包含する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記工程ａ）が：
ｉ）ＲＩＺ１を、ＲＩＺ１が機能的活性を示す条件下で、１つ以上の候補化合物と接触させること；
ｉｉ）該候補化合物の、該機能的活性を調節する能力を決定すること；および
ｉｉｉ）工程ｉｉ）から該機能的活性を調節する化合物を提供すること、を包含する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記機能的活性が、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記工程ｂ）が、前記ＲＩＺ１調節化合物の、プロゲステロンレセプター媒介転写を調節する能力を決定することを包含する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記工程ｂ）が、前記ＲＩＺ１調節化合物の、プロゲステロン依存性乳房生産を調節する能力を決定することを包含する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記工程ｂ）が、前記ＲＩＺ１調節化合物の、プロゲステロン依存性子宮発達を調節する能力を決定することを包含する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
内分泌治療に応答する可能性の低減したエストロゲンレセプター陽性（ＥＲ＋）腫瘍をもつ個体を識別する方法であって、該腫瘍のＲＩＺ１状況を決定する工程を包含し、ここで、異常なＲＩＺ１状況が、該個体を、内分泌治療に応答する可能性が低減した個体として同定する、方法。
【請求項１９】
前記異常なＲＩＺ１状況が、ＲＩＺ１プロモーターメチル化により証明される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記異常なＲＩＺ１状況が、減少したＲＩＺ１タンパク質発現により証明される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記異常なＲＩＺ１状況が、減少したＲＩＺ１ｍＲＮＡ発現により証明される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記異常なＲＩＺ１状況が、ＲＩＺ１遺伝子における変異により証明される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記異常なＲＩＺ１状況が、変化したＲＩＺ１ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性により証明される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記変化したＲＩＺ１ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性が、増加したＨ１メチル化または減少したＨ３メチル化である、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、国立衛生研究所により授与された認可番号ＣＡ７６１４６およびＣＡ６０９８８の下、合衆国政府の支援でなされた。合衆国政府は、本発明において特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、一般に、癌生物学および内分泌学の分野に関し、そしてより詳細には、ＲＩＺポリペプチドの生物学的活性に関する。
【０００３】
（背景の情報）
ヒストンタンパク質のアミノ末端テイルへのメチル基の翻訳後付加は、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）として知られるタンパク質のファミリーにより触媒される。ヒストンの部位特異的メチル化は、種々の基礎的細胞プロセスと関連し、これには、転写調節、後成的サイレンシングおよびヘテロクロマチン形成が含まれる。ＨＭＴ機能の損失は、癌に特徴的な脱分化およびゲノム不安定性に直接寄与すると期待される。
【０００４】
ＨＭＴをさらにガンに関連させるものとして、食餌メチオニンまたは葉酸の欠如が癌を引き起こすことが示されている。食餌メチオニンおよび葉酸は、次に、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）の細胞レベルを調節し、これは、メチルトランスフェラーゼによるメチル基ドナーとして用いられる。さらに、いくつかの独立したラインの調査は、メチオニン代謝経路における改変（これは、ＳＡＭの欠如および／またはメチルトランスフェラーゼインヒビターであるＳ−アデノシルホモシステイン（ＳＡＨ）の増加に至る）癌と関連していることを示した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性をもつタンパク質を同定すること、それらの基質および調節因子を決定すること、およびそれらの活性を調節する化合物を同定する必要性が存在している。特に、細胞増殖を調節することにおいて重要な役割を演じることが既に認められているタンパク質内のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を同定する必要性が存在している。このようなタンパク質のＨＭＴ活性を調節する化合物は、細胞生長を調節するための治療薬として有用であると考えられる。
【０００６】
ステロイドホルモンであるプロゲステロンは、雌性の生殖サイクルの重要な成分であり、そして妊娠を維持するために必要である。プロゲステロンの分子標的は、細胞内プロゲステロンレセプターである。プロゲステロンへの結合に際し、このプロゲステロンレセプターは、核に転座し、そこで、それは、プロゲステロン調節遺伝子群中に存在するＤＮＡ転写エレメントに転写因子として結合する。
【０００７】
プロゲステロンレセプターに対するリガンドは、雌性の生殖医薬および癌において重要な役割を演じている。例えば、プロゲステロンおよびその合成アナログは、出生コントロール処方物において、子宮内膜症の処置において、および妊娠を維持することにおいて有用である。プロゲステロンに対するアンタゴニストは、胸部、卵巣および子宮内膜（子宮の管壁）のホルモン依存性癌の特定の形態のような慢性疾患を処置することにおいて、および子宮線維症を処置することにおいて有用である。プロゲステロンアンタゴニストはまた、初期段階妊娠を終結するためのその他の薬物と組合せて有用である。
【０００８】
プロゲステロンレセプター活性を調節する化合物は、したがって、生殖適用において、および悪性疾患を処置するために有用であると期待される。しかし、このような化合物を同定するための適切な高スループットアッセイは現在不足しており、これは一部、プロゲステロンレセプターの細胞分子との生理学的に関係する相互作用の理解の欠如に起因する。したがって、プロゲステロンレセプター活性を調節する化合物のスクリーニングの改良された方法に対する必要性が存在する。
【０００９】
ステロイドホルモンエストロゲンは、エストロゲンレセプターを発現する組織の増殖を直接的および間接的に促進する。エストロゲンの増殖効果を低減する内分泌治療は、タモキシフェンのような選択的エストロゲンレセプター調節因子（ＳＥＲＭ）での治療を含み、エストロゲンレセプター陽性（ＥＲ＋）腫瘍をもつ患者における現在の第一線治療である。しかし、ＥＲ＋腫瘍をもつ患者の顕著な部分は、内分泌治療に応答しない。これらの患者では、生存の可能性を改良するために、代替の治療が召喚されている。現在、ＥＲ＋腫瘍が内分泌治療に応答すると予測される満足な方法はない。
【００１０】
したがって、どの個体が多かれ少なかれ内分泌治療に応答するかをより正確に決定するために、ＥＲ＋腫瘍におけるエストロゲン応答性の損失と関連する分子を同定する必要性が存在している。このような相関を用い、成功の改良された可能性をもつ治療の個別化された計画が選択され得る。
【００１１】
本発明は、これらの必要性を満足し、そして同様に関連する利点を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の要旨）
本発明は、ＲＩＺヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を調節する化合物をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を有するＲＩＺまたはＲＩＺフラグメントを、１つ以上の候補化合物と接触する工程、およびこの接触させたＲＩＺまたはＲＩＺフラグメントのヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を決定する工程を包含する。ＲＩＺヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を調節する化合物が同定される。
【００１３】
本発明はまた、プロゲステロンレセプター活性を調節する化合物をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、ＲＩＺ１調節化合物を提供する工程、およびこのＲＩＺ１調節化合物のプロゲステロンレセプター活性を調節する能力を決定する工程を包含する。プロゲステロンレセプター活性を調節する化合物がそれによって同定される。
【００１４】
内分泌治療に応答する可能性の低減したエストロゲンレセプター陽性（ＥＲ＋）腫瘍をもつ個体を識別する方法もまた、提供される。この方法は、腫瘍のＲＩＺ１状況を決定する工程を包含し、ここで、異常なＲＩＺ１状況が、個体を、内分泌治療に応答する可能性が低減した個体として同定する。
【００１５】
（発明の詳細な説明）
網膜芽細胞腫（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｔｏｍａ）−タンパク質−相互作用ジンクフィンガー遺伝子、すなわち「ＲＩＺ」遺伝子は、Ｒｂ腫瘍サプレッサーに結合するタンパク質についての機能的スクリーニングにおいてもともと単離された（Ｂｕｙｓｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：４４６７−４４７１（１９９５））。選択的プロモーター使用法によって、ＲＩＺ遺伝子の２つの産物が産生される。ＲＩＺ２は、これがＮ末端の２００アミノ酸（ラット）または２０１アミノ酸（ヒト）を欠くこと以外は、ＲＩＺ１と同一である（Ｌｉｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２９８４−２９９１（１９９７））。
【００１６】
ＲＩＺ１は、以下の一連の証拠によって示されるように、腫瘍サプレッサー遺伝子であるとみなされる。ＲＩＺ遺伝子は、ヒトの癌において最も一般的に欠失している領域の１つである染色体１ｐ３６へとマッピングされる。ＲＩＺ１の遺伝子サイレンシングは、乳癌、肝臓癌、結腸癌、神経芽細胞腫、黒色腫、肺癌および骨肉腫（Ｃｈａｄｗｉｃｋら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：２６６２−２６６７（２０００）；Ｈｅら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：４２３８−４２４４（１９９８）；Ｊｉａｎｇら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８３：５４１−５４７（１９９９））を含む多くの型のヒト腫瘍において通常であり、プロモーターＤＮＡメチル化と関連する（Ｄｕら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２２：８０９４−８０９９（２００１））が、ＲＩＺ２の遺伝子サイレンシングはそうではない。ＲＩＺ１ミスセンス変異（Ｓｔｅｅｌｅ−Ｐｅｒｋｉｎｓら，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５：２２５０−２２６２（２００１））およびフレームシフト変異（Ｃｈａｄｗｉｃｋら，前出（２０００）；Ｐｉａｏら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：４７０１−４７−４（２０００）；Ｓａｋｕｒａｄａら，Ｇｅｎｅｓ，Ｃｈｒｏｍｓ．Ｃａｎｃｅｒ  ３０：２０７−２１１（２００１））は、ヒトの腫瘍において通常である。ＲＩＺ１発現は、細胞周期停止、アポトーシス誘導および異種移植片腫瘍の抑制を誘導する（Ｃｈａｄｗｉｃｋら，前出、２０００；Ｈｅら，前出（１９９８）；Ｊｉａｎｇら，前出（１９９９）；ＪｉａｎｇおよびＨｕａｎｇ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：１７９６−１７９８（２００１））。最終的に、ＲＩＺ１の不活化を示し、一方で正常なＲＩＺ２を保持するマウス遺伝子ノックアウトモデルは、腫瘍感受性を引き起こす（Ｓｔｅｅｌｅ−Ｐｅｒｋｉｎｓら，前出（２００１））。これらの研究は、その腫瘍サプレッサー活性におけるＲＩＺ１のＮ末端についての重要な機能を示唆する。
【００１７】
ＲＩＺ１のＮ末端は、ＲＩＺ１のほぼ残基３０〜１６０の間に、「ＰＲ−ドメイン」と呼ばれる約１３０残基のドメインを含む。このＰＲ−ドメインは、ＲＩＺ１と転写リプレッサーＰＲＤＩ−ＢＦ１との間で相同性を示す領域として最初に同定された。このドメインは、ＳＥＴ−ドメインと構造的に関連することが後に見出され（Ｈｕａｎｇら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１５９３３−１５９４０（１９８８））、ＳＥＴ−ドメインは、近年、リジンヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）の触媒モチーフであることが示された（Ｒｅａら，Ｎａｔｕｒｅ  ４０６：５９３−５９９（２０００））。ＰＲとＳＥＴとの間の配列類似性にもかかわらず、ＰＲドメインおよびＳＥＴドメインは、明らかに異なる。第１に、ＰＲ−ドメイン間の同一性またはＳＥＴドメイン間の同一性は通常約４０％であるが、一方、ＰＲドメインとＳＥＴドメインとの間の同一性は代表的にはほんの約２０〜３０％である。第２に、ＳＥＴドメインは主に、タンパク質のカルボキシル末端に見いだされるが、一方、ＰＲ−ドメインはほとんどがアミノ末端に位置する。本開示の前には、ＰＲ−ドメインの酵素活性は記載されていない。さらに、ＲＩＺ１のＰＲ−ドメインのヒストンメチルトランスフェラーゼ活性もＲＩＺ内の他のドメインのヒストンメチルトランスフェラーゼ活性も記載されていない。
【００１８】
本明細書中に開示されるように、ＲＩＺ１タンパク質およびＲＩＺ２タンパク質は両方とも、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を有する。腫瘍抑制としてのその作用にもかかわらず、ＲＩＺ１はまた、エストロゲン応答性組織およびプロゲステロン応答性組織の正常な増殖および分化を調節することに関与する、エストロゲンレセプター（ＥＲ）およびプロゲステロンレセプターのコアクチベーターとして作用する（実施例Ｉを参照のこと）。増殖サプレッサーおよび増殖プロモーターとしてのＲＩＺの二重の役割に起因して、ＲＩＺヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を調節する化合物は、過剰増殖障害（例えば、新形成、過形成、炎症状態など）の処置および過少増殖障害（例えば、造血の種々の障害、創傷治癒など）の処置を含む、細胞増殖をポジティブまたはネガティブに調節することが望ましい適用において有用であると予想される。
【００１９】
従って、本発明は、ＲＩＺヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を調節する化合物についてスクリーニングする方法を提供する。この方法は、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を有するＲＩＺまたはＲＩＺフラグメントを、１以上の候補化合物と接触させ、そして接触したＲＩＺまたはＲＩＺフラグメントのヒストンメチルトランスフェラーゼ活性をアッセイすることによって実施される。このようにして、ＲＩＺまたはＲＩＺフラグメントのヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を調節する化合物が同定される。
【００２０】
本明細書中に開示されるように、ＨＭＴ活性は、ＲＩＺ１に特異的なＰＲ−ドメインにおいて、そしてまたＲＩＺ１およびＲＩＺ２に共通のＣ末端ＰＲ結合ドメイン（すなわちＰＢＤ）においての両方で存在する。従って、ＲＩＺ１もしくはＲＩＺ２、またはＨＭＴ活性を保持するそれらのフラグメントのいずれかを、本発明の方法において用い得る。
【００２１】
いくつかの種由来のＲＩＺ遺伝子がクローニングされて特徴付けられている（Ｂｕｙｓｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：４４６７−４４７１（１９９５）；Ｌｉｕら，前出（１９９７））。従って、任意の種由来のＲＩＺポリペプチドを、本発明のスクリーニング方法において用い得る。ヒトＲＩＺ遺伝子は、配列番号１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＣ５０８２０；ｇｉ：９９５５３７９）として示されるＲＩＺ１アミノ酸配列および配列番号２として示されるＲＩＺ２アミノ酸配列をコードする。ラットＲＩＺ遺伝子は、配列番号３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＡ７４４６８；ｇｉ：９４９９９６）に示されるＲＩＺ１アミノ酸配列および配列番号４として示されるＲＩＺ２アミノ酸配列をコードする。マウスＲＩＺ遺伝子は、部分的に配列決定されている（米国特許第５，８１１，３０４号）。
【００２２】
ヒトおよびラットのＲＩＺ１ポリペプチドおよびＲＩＺ２ポリペプチドは、その全長にわたって高度に相同である（例えば、米国特許第６，３２３，３３５号；同第６，０６９，２３１号；および同第５，８１１，３０４号を参照のこと）。２つの哺乳動物種をまたがってのこの高度の同一性に起因して、他の天然に存在する哺乳動物ＲＩＺポリペプチド（例えば、非ヒト霊長類種、マウス種、ウサギ種、ウシ種、ブタ種、ヒツジ種、イヌ種またはネコ種に由来するＲＩＺポリペプチド）、ならびに他の脊椎動物（魚類、鳥類、爬虫類および両生類（例えば、Ｘｅｎｏｐｕｓ）を含む）に由来する天然に存在するＲＩＺポリペプチドもまた、ヒトＲＩＺおよびラットＲＩＺとそれらの全長にわたって高度の同一性を示すことが予想される。
【００２３】
ヒトもしくはラットのＲＩＺコード核酸配列およびＲＩＺポリペプチドの知識を用いて、当業者は、従来のｃＤＮＡライブラリースクリーニング方法もしくは発現ライブラリースクリーニング方法を用いて、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、ＲＩＺコード遺伝子を他の種から容易にクローニングし得る。さらに、ヒトまたはラットのＲＩＺコード核酸配列およびＲＩＺポリペプチドの知識を用いて、当業者は、利用可能なデータベース中に存在するＥＳＴおよびゲノム配列の分析から、他の種からｃＤＮＡおよびコード配列を容易に決定し得る。これらの配列から、全長ＲＩＺ１ポリペプチドまたは全長ＲＩＺ２ポリペプチド、およびＨＭＴ活性を有するそれらのフラグメントは、本明細書中に開示されるスクリーニング方法における使用のために調製され得る。
【００２４】
本発明の方法において有用なＲＩＺポリペプチドはまた、天然に存在する配列に対して１以上の微小改変（例えば、１以上の置換、付加または欠失）を有し得る。改変されたＲＩＺポリペプチドは一般に、ネイティブなＲＩＺ配列との少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％以上の同一性を保持する。このような改変は、例えば、このポリペプチドの安定性、バイオアバイラビリティー、生物活性もしくは免疫原性を増強する際に、またはその精製を容易にするために、有利であり得る。
【００２５】
ＲＩＺアミノ酸配列に対する置換は、保存的または非保存的のいずれかであり得る。保存的アミノ酸置換としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：別の非極性アミノ酸での非極性アミノ酸の置換（例えば、イソロイシン、バリン、アラニン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニンまたはメチオニンでのロイシンの置換）；同様に荷電したアミノ酸での荷電アミノ酸の置換（例えば、アスパラギン酸でのグルタミン酸の置換、またはリジンもしくはヒスチジンでのアルギニンの置換）；別の非荷電の極性アミノ酸での非荷電の極性アミノ酸の置換（例えば、グリシン、トレオニン、チロシン、システイン、アスパラギンまたはグルタミンでのセリンの置換）；または同様のサイズおよび形状の残基での、異なる官能基を有する残基の置換（例えば、アラニンでのセリンの置換；メチオニンでのアルギニンの置換；またはフェニルアラニンでのチロシンの置換）。
【００２６】
ＲＩＺアミノ酸配列に対する付加としては、「タグ」配列（これは従来、Ｎ末端もしくはＣ末端に、シグナルペプチドの後ろに、または細胞外ループ内もしくは細胞内ループ内に付加される）の付加が挙げられるがこれに限定されない。このようなタグ配列としては、例えば、エピトープタグ、ヒスチジンタグ、グルタチオン−Ｓトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、蛍光タンパク質（例えば、増強されたグリーン蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ））などが挙げられる。このようなさらなる配列を用いて、例えば、ＲＩＺポリペプチドの発現、精製または特徴付けを容易にし得る。
【００２７】
ＲＩＺアミノ酸配列に対する欠失としては、機能に重要でない、Ｎ末端またはＣ末端の残基の欠失が挙げられるがこれらに限定されない。欠失した配列は、上記の通り、タグ配列または融合配列によって必要に応じて置換され得る。
【００２８】
ＲＩＺアミノ酸配列に対する改変は、例えば、このポリペプチドをコードする核酸分子中のヌクレオチドのランダムな挿入、欠失または置換によってランダムに作製され得る。あるいは、改変は、例えば、このポリペプチドをコードする核酸分子の部位特異的変異誘発によって指向され得る。
【００２９】
生物学的活性を保持しながらＲＩＺポリペプチドの配列を改変する際のガイダンスは、ヒトおよびラット由来のＲＩＺオルソログの配列のアラインメントによって提供され得る。進化的に保存されたアミノ酸残基が、それほど保存されていない残基よりも、生物学的活性を維持するためにより重要であるようであることは当該分野で周知である。従って、種をまたがってＲＩＺポリペプチド間で高度に保存される残基を保存されていない残基で置換することは、有害であり得、一方、種間で異なる残基で同じ置換を行うことは、生物学的活性に対して重大な影響を与えないようであることが予想される。ラットおよびヒトのＲＩＺ１アミノ酸配列のアラインメントは、米国特許第５，８１１，３０４号の図１０に提示される。
【００３０】
当該分野で周知のコンピュータプログラムはまた、ＲＩＺポリペプチドの構造的特徴または機能的特徴をなくさずにどのアミノ酸残基が改変され得るかを予測する際のガイダンスを提供し得る。
【００３１】
本明細書中に開示されるように、ＲＩＺヒストンメチルトランスフェラーゼ活性は、ＲＩＺ１に特異的なＮ末端ＰＲドメイン含有部分に存在する。従って、本発明の方法において有用な例示的なＲＩＺまたはＲＩＺフラグメントは、ＲＩＺ１のアミノ酸１〜２００（例えば、ＲＩＺ１のアミノ酸１〜３３２）を含む。本発明の方法において有用なさらなる例示的ＲＩＺまたはＲＩＺフラグメントは、ＲＩＺ１のアミノ酸１〜５２０を含む。対照的に、ヒトＲＩＺ１の残基１〜１６１からなるＲＩＺフラグメントは、ＨＭＴ活性を欠き、同様に、腫瘍中に見出される、ＰＲドメインにミスセンス変異（すなわち、Ｃ１０６Ｙ、Ｉ８８ＶおよびＡ１５９Ｖ）を含むＲＩＺ１もＨＭＴ活性を欠いていた。
【００３２】
さらに、本明細書中に開示されるように、ＲＩＺヒストンメチルトランスフェラーゼ活性もまた、ＲＩＺ１およびＲＩＺ２に共通のＣ末端ＰＲ結合ドメイン（ＰＢＤ）含有部分に存在する（Ｈｕａｎｇら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１５９３３−１５９４０（１９８８））。従って、本発明の方法において有用な例示的なＲＩＺまたはＲＩＺフラグメントは、ＲＩＺ１のアミノ酸１５１４〜１６８０（例えば、アミノ酸１５１４からＲＩＺ１のＣ末端）を含む。
【００３３】
他のＲＩＺポリペプチドおよびフラグメント（上記の通りの改変された配列を有するポリペプチドおよびフラグメントを含む）のＨＭＴ活性は、本スクリーニング方法において使用するためのヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を有するＲＩＺまたはＲＩＺフラグメントを選択するために、本明細書中に記載されるアッセイによって容易に決定され得る。
【００３４】
本明細書中に記載される場合、ＲＩＺまたはＲＩＺフラグメントに関して、用語「ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性」または「ＨＭＴ活性」とは、ＲＩＺまたはＲＩＺフラグメントが、ヒストンまたはヒストンペプチドのメチル化を適切なアッセイ条件下で触媒する能力をいう。対照的に、同じ条件下で、コントロールポリペプチド（例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ））は、ヒストンのメチル化もヒストンペプチドのメチル化も触媒できない。ＨＭＴ活性は、精製ＲＩＺもしくは部分精製ＲＩＺを用いたインビトロアッセイ、または細胞ベースのアッセイのいずれかにおいて示され得る。ＨＭＴ活性としては、任意のヒストン（例えば、ヒストンＨ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３またはＨ４）に対して示されるＨＭＴ活性が挙げられる。
【００３５】
ＨＭＴ活性アッセイにおける基質としての使用に適切なヒストンは、（例えば、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓから）市販され得るか、既知の核酸配列に基づいて組換えによって調製され得るか、または当該分野で公知の方法を用いて細胞から抽出され得る。ＨＭＴアッセイにおける基質としての使用に適切なヒストンペプチド（ネイティブ配列を有するペプチドおよびリジン残基でのアセチル化によって改変されたペプチドを含む）は、（例えば、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈから）市販され得るか、または合成によって産生され得る。適切なヒストンペプチドとしては、例えば、ｌｙｓ−９（Ｋ９）を含むＨ３のＮ末端ペプチド（例えば、Ｈ３のアミノ酸１〜２０）およびｌｙｓ−２５（Ｋ２５）を含むＨ１のＮ末端ペプチド（例えば、Ｈ１のアミノ酸１５〜３７またはアミノ酸１２〜３１）が挙げられ得る。Ｈ４におけるメチル化部位は、ｌｙｓ−２０（Ｋ２０）であると予想される。従って、適切なヒストンＨ４ペプチドは、ｌｙｓ−２０を含むＮ末端ペプチドであり得る。
【００３６】
ＨＭＴアッセイのため、望ましい任意の配列のＲＩＺまたはＲＩＺフラグメントが、組換えにより、例えば、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞におけるコード核酸分子の発現により、簡便に産生され得る。その後、発現されたポリペプチドは、抗ＲＩＺ抗体を用いて単離され得るか、または標準的生化学的分画法により精製もしくは部分精製され得る。あるいは、単離を容易にするために、そのＲＩＺポリペプチドは、タグ配列（例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６×Ｈｉｓタグまたはエピトープタグ）との融合物として発現され得る。タグ化組換えタンパク質および非タグ化組換えタンパク質を生成および単離するための方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌら（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（補遺４７）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９）を参照のこと）。
【００３７】
組換えＲＩＺまたはＲＩＺフラグメントを調製するための代替法としては、内因性ＲＩＺ１またはＲＩＺ２が、簡便な細胞供給源または組織供給源から、精製または部分精製され得る。従って、ＲＩＺフラグメントは、その内因性ＲＩＺの酵素的切断または化学的切断によって調製され得る。あるいは、ＲＩＺフラグメントは、合成方法により調製され得る。
【００３８】
ＲＩＺのＨＭＴ活性は、当該分野で公知の方法によって決定され得る。例えば、そのＲＩＺおよびヒストンまたはヒストンペプチドが、標識されたメチルドナー（例えば、Ｓ−アデノシル−［メチル−１４Ｃ］−Ｌ−メチオニンまたはＳ−アデノシル−［メチル−３Ｈ］−Ｌ−メチオニン）とともに、適切なアッセイ条件下でインキュベートされ得る。そのヒストンまたはヒストンペプチドへの放射性標識の転移が、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動および蛍光間接撮影法によって検出され得る。あるいは、その反応の後、そのヒストンまたはヒストンペプチドは、濾過によりメチルドナーから分離され得、そしてそのフィルター上に保持された放射性標識の量が、シンチレーション計数によって定量され得る。メチルドナーに結合され得る他の適切な標識（例えば、色素原性標識および蛍光標識）、ならびにヒストンおよびヒストンペプチドへのこれらの標識の転移を検出するための方法は、当該分野で公知である。
【００３９】
あるいは、ＲＩＺのＨＭＴ活性が、非標識メチルドナー（例えば、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン）と、メチル化ヒストンまたはメチル化ヒストンペプチドを選択的に認識する試薬とを使用することによって、決定され得る。例えば、そのＲＩＺと、メチルドナーと、ヒストンまたはヒストンペプチドを適切なアッセイ条件下でインキュベーションした後、メチル化ヒストンまたはメチル化ヒストンペプチドが、メチル化ヒストンエピトープに特異的な抗体を用いるイムノブロッティングまたはＥＬＩＳＡアッセイによって、検出され得る。適切な抗体は、例えば、Ｎａｋａｙａｍａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：１１０〜１１３（２００１）、Ｎｏｍａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３：１１５０〜１１５５（２００１）および公開された米国特許出願番号２００２００３９７７６に記載されるか、または当該分野で公知の方法（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）を参照のこと）に記載される。
【００４０】
抗体を使用する代わりに、メチル化ヒストンが、高親和性でメチル化ヒストンに選択的に結合する試薬を使用して検出され得る。そのような試薬は、当該分野で公知であるか、または当該分野で公知のスクリーニングアッセイによって決定され得る。例示的な結合試薬は、ヘテロクロマチンタンパク質であるＨＰ１であり、これは、リジン９でメチル化された場合ヒストンＨ３に結合する（Ｈ３−Ｋ９）。ＨＰ１またはその結合フラグメントが、標識され得、そしてメチル化Ｈ３−Ｋ９に結合したＨＰ１またはフラグメントが、検出され得る。あるいは、そのＨＰ１またはフラグメントは、標識される必要がなく、代わりに、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて抗ＨＰ１抗体を使用して検出され得る。
【００４１】
種々の低スループット酵素アッセイ形式および高スループット酵素アッセイ形式が、当該分野で公知であり、そしてＲＩＺ  ＨＭＴアッセイのために容易に適合され得る。高スループットアッセイのために、そのヒストン基質またはヒストンペプチド基質は、固体支持体（例えば、マルチウェルプレート、スライドガラスまたはチップ）上に都合良く固定され得る。この反応の後、メチル化産物が、上記の方法によってその固体支持体上で検出され得る。あるいは、そのＨＭＴ反応は、溶液中で生じ得、その後、そのヒストンまたはヒストンペプチドが、固体支持体上に固定され得、そしてメチル化産物が検出され得る。そのようなアッセイを容易にするために、その固体支持体は、ストレプトアビジンでコートされ得、そしてヒストンがビオチンで標識され得るか、またはその固体支持体が、抗ヒストン抗体でコートされ得る。当業者は、所望のスクリーニングスループット能力に依存して、適切なアッセイ形式を決定し得る。
【００４２】
本発明のスクリーニング方法は、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を有するＲＩＺまたはＲＩＺフラグメントを、１つ以上の候補化合物と接触させる工程、およびその接触されたＲＩＺまたはＲＩＺフラグメントのヒストンメチルトランスフェラーゼ活性をアッセイする工程、を包含する。本発明の方法において有用な候補化合物は、天然に存在する高分子（例えば、ペプチド、核酸、糖質、脂質、またはそれらの任意の組み合わせ）であり得る。あるいは、候補化合物は、そのような高分子の部分合成もしくは完全合成された、誘導体、アナログもしくは模倣物であり得るか、または合成低分子（例えば、コンビナトリアル化学法により調製された有機分子）であり得る。候補化合物は、望ましい場合は、特定のアッセイにおいて適切なように、検出可能に標識され得るかまたは固体支持体に付着され得る。
【００４３】
大きな化合物（単純な有機分子もしくは複雑な有機分子、金属含有化合物、糖質、ペプチド、タンパク質、ペプチド模倣物、糖タンパク質、リポタンパク質、核酸、抗体などを含む）ライブラリーを生成するための方法が、当該分野で周知であり、そして例えば、Ｈｕｓｅ，米国特許第５，２６４，５６３号；Ｆｒａｎｃｉｓら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：４２２〜４２８（１９９８）；Ｔｉｅｔｚｅら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．２：３６３〜３７１（１９９８）；Ｓｏｆｉａ，Ｍｏｌ．Ｄｉｖｅｒｓ．３：７５〜９４（１９９８）；Ｅｉｃｈｅｒら、Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．１５：４８４〜４９６（１９９５）に記載されている。多数の天然化合物および合成化合物を含むライブラリーはまた、商業的供給源から入手され得る。
【００４４】
特定のアッセイにおいてスクリーニングする異なる候補化合物の数は、当業者により決定され得、そしてこれは、２つ以上（例えば、５つ、１０個、１５個、２０個、５０個、または１００個以上）の異なる化合物であり得る。特定の適用のために、例えば、ランダムな化合物のライブラリーがスクリーニングされる場合、自動化手順のためには、１０３個以上の化合物（例えば、１０５個以上の化合物（１０７個以上の化合物を含む）をスクリーニングすることが望ましくあり得る。望ましい場合、複数の候補化合物が、プールにてアッセイされ得、そのプールは、望ましい活性を備える１つの化合物が同定されるまで、繰返し細分割され得る。候補化合物は、同時にか、並行してか、または連続して、アッセイされ得る。
【００４５】
反応において使用するために候補化合物の量は、その化合物の性質、アッセイの性質、および反応物質の濃度に基づいて、当業者により決定され得る。望ましい場合、一定範囲の候補化合物の用量が、試験され得る。
【００４６】
一般的に、その候補化合物は、ＲＩＺ、ヒストン基質またはヒストンペプチド基質、およびメチルドナーとともに、ＨＭＴ反応に含められる。必要に応じて、その候補化合物とＲＩＺとが、まず一緒にインキュベートされ得、その後、他の反応物質が、添加され得る。望ましい場合、他の成分（例えば、異なるＲＩＺポリペプチドまたはＲＩＺフラグメント）が、その反応中に含められ得、そしてそのような条件下でＲＩＺ  ＨＭＴ活性を調節することに対するその候補化合物の効果が、決定され得る。当業者は、反応物質および成分の適切な組み合わせを決定し得る。
【００４７】
細胞ベースのスクリーニングアッセイのために、ＲＩＺを発現する細胞が、候補化合物と接触され得る。単離されたヒストンのインビボメチル化が、接触後に決定され得るか、またはＲＩＺポリペプチドが単離され得、そして単離されたヒストンまたはヒストンフラグメントをメチル化する際のそのＲＩＺポリペプチドの活性が、上記のようにアッセイされ得る。望ましい場合、候補化合物が生理学的に適切な条件下でＲＩＺ活性を調節する能力が、細胞ベースのスクリーニングアッセイにおいて決定され得る。例えば、候補化合物が、エストロゲンまたはプロゲステロンの存在下で、同時発現したポリペプチドに応答してかまたは腫瘍細胞中でＲＩＺ活性を調節する能力が、決定され得る。
【００４８】
候補化合物がＲＩＺ  ＨＭＴ活性を正または負のいずれかに調節するか否かを決定するには、一般的に、コントロールに対する比較が必要とされる。コントロールは、それが候補化合物に曝露されないこと以外は、試験反応に対して同一の反応であり得る。そのコントロール反応のＨＭＴ活性は、その試験反応の前、後、または同時のいずれかで評価され得る。ＨＭＴ活性を「調節する」化合物は、コントロールと比較して、少なくとも２倍（例えば、少なくとも５倍、１０倍、またはそれ以上）ＨＭＴ活性を増加または減少する化合物である。
【００４９】
実施例Ｉに記載される結果は、ＲＩＺ１のＨ３−Ｋ９メチル化活性が増殖停止に関連しており、一方そのＨ１−Ｋ２５メチル化活性が細胞増殖と関連していることを、示唆する。従って、これらの２つの活性を差次的に調節する化合物が、同定され得、そして特定の適用に適切なように、細胞増殖を促進または阻害するために使用され得る。
【００５０】
本明細書中に開示されるように、ＲＩＺ１は、雌性ステロイドであるエストロゲン（ＥＲα）およびプロゲステロンについての核ホルモンレセプターの転写コアクチベーターとして作用するが、ＲＩＺ２はそうは作用しない。さらに、ＲＩＺ１は、エストロゲンおよびプロゲステロンに応答した、雌性標的器官（例えば、子宮、膣、および乳腺）の正常な成長および発達に必要とされる。従って、ＲＩＺ１（特に、ＲＩＺ１のＰＲドメイン）は、プロゲステロンおよびエストロゲンのレセプター活性の生理学的に重要なレギュレーターである。従って、ＲＩＺ１活性を調節する化合物はまた、プロゲステロンレセプターおよび／またはＥＲα活性を調節することができる可能性がある。そのような化合物は、雌性ステロイドレセプター活性の調節により利益を受ける状態（生殖状態を含む）および癌を予防、改善、または処置するための治療剤として使用され得る。
【００５１】
１つの実施形態において、本発明は、プロゲステロンレセプター活性を調節する化合物についてスクリーニングする方法を提供する。その方法は、ＲＩＺ１調節化合物を提供すること、およびその化合物がプロゲステロンレセプター活性も調節する能力を決定することによって、実施される。
【００５２】
本明細書中で使用される場合、用語「ＲＩＺ１調節化合物」とは、ＲＩＺ１生物学的活性（例えば、細胞分子との結合相互作用または酵素的活性（例えば、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性）に影響する化合物を指す。従って、ＲＩＺ１調節化合物は、例えば、ＲＩＺ１に選択的に結合する化合物、ＲＩＺ１と結合パートナーとの間の相互作用を（増加するかまたは減少するかのいずれかによって）調節する化合物、ＲＩＺ１の機能的活性を調節する化合物、またはこれらの効果のうちのいくつかを有する化合物であり得る。
【００５３】
ＲＩＺ１に選択的に結合する化合物は、当該分野で公知であるか、または利用可能なスクリーニング法によって同定され得る。例えば、ＲＩＺ１に選択的に結合する化合物としては、ＲＩＺ１特異的抗体（例えば、米国特許第５，８１１，３０４号に記載される）およびＲＩＺ１結合パートナーが挙げられる。本明細書中に記載される場合、用語「ＲＩＺ１結合パートナー」とは、高親和性でＲＩＺ１に通常は結合する細胞分子（例えば、細胞タンパク質、核酸分子、酵素基質および補因子、これらの分子由来のＲＩＺ１結合ドメイン、ならびにこれらの分子のＲＩＺ１結合改変体およびＲＩＺ１結合アナログ）を指すことが意図される。
【００５４】
ＲＩＺ１結合パートナーの「改変体」は、そのネイティブ分子と実質的に同じアミノ酸配列またはヌクレオチド配列（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％、またはそれ以上の同一性）を有し、そしてそのネイティブ分子と実質的に同じ結合活性を保持する。ポリペプチドの場合、そのポリペプチドは、天然に存在する配列と比較して、１つ以上の保存的もしくは非保存的な、アミノ酸の置換、付加、もしくは欠失を有し得る。ＲＩＺ１結合パートナーの改変体を調製しそしてその改変体の結合活性をアッセイする方法は、当該分野で周知である。
【００５５】
ＲＩＺ１結合パートナーの「アナログ」は、そのネイティブ分子と実質的に同じコア化学構造を有し、そしてそのネイティブ分子と実質的に同じ結合活性を保持する。ＲＩＺ１結合パートナーのアナログを調製しそしてそのアナログの結合活性をアッセイする方法は、当該分野で周知である。
【００５６】
ＲＩＺ１に結合する例示的細胞タンパク質は、網膜芽細胞腫タンパク質（Ｒｂ）である。米国特許第５，８１１，３０４号は、全長ＲｂへのＲＩＺ１の特異的結合およびＲｂ結合ポケットを含むＲｂのＣ末端の５６ｋＤａフラグメントへのＲＩＺ１の特異的結合を記載する（Ｂｕｙｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：４４６７〜４４７１（１９９５）もまた参照のこと）。ＲＩＺ１に選択的に結合する他の細胞タンパク質としては、エストロゲンレセプター（ＥＲα）（Ａｂｂｏｎｄａｎｚａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：３１３０〜３１３５（２０００）および実施例Ｉを参照のこと）およびプロゲステロンレセプター（ＰＲ）（実施例Ｉを参照のこと）が挙げられる。さらに、ＧＡＴＡ−３（Ｓｈａｐｉｒｏら、Ｇｅｎｅ  １６３：３２９〜３３０（１９９５））、ｐ５３、ＳＲＣ１およびｐ３００が、ＲＩＺ１に選択的に結合する例示的細胞タンパク質である。
【００５７】
ＲＩＺ１に選択的に結合する核酸分子は、例えば、米国特許第５，８１１，３０４号に記載される。ＲＩＺ１が、そのジンクフィンガーＤＮＡ結合モチーフを介して選択的に結合する例示的核酸分子は、ＧＣリッチエレメントまたはＳｐ−１結合エレメントを含む。
【００５８】
ＲＩＺ１に選択的に結合する例示的酵素基質および補因子としては、ＧＴＰ（米国特許第５，８１１，３０４号）、亜鉛イオン（これは、ジンクフィンガーモチーフと会合する）、およびＳ−アデノシル−メチオニン（ＳＡＭ）が挙げられる。
【００５９】
ＳＡＭは、ＲＩＺ１メチルトランスフェラーゼ活性のための基質およびメチル基ドナーとして作用する。ＳＡＭのアナログとしては、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインまたはＳ−アデノシル−Ｄ−ホモシステイン（ＳＡＨ）、およびアデノシル−Ｌ−エチオニンが挙げられる。他の結合化合物としては、例えば、Ａ−アデノシル−γ−チオ−α−ケトブチレート、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインスルホキシド、メチルチオアデノシン（ＭＴＡ）、Ｌ−ホモシステイン、Ｌ−ホモセリン、アデノシン、アデニン、ＡＴＰ、ＣＡＭＰおよびメチオニンが挙げられ得る。
【００６０】
従って、上記の化合物またはこれらの化合物の改変体、アナログ、アゴニストおよびアンタゴニストのいずれかが、本発明の方法によりプロゲステロンレセプター活性を調節する能力についてアッセイされ得る。
【００６１】
ＲＩＺ１と結合パートナーとの間の相互作用を調節する化合物もまた、当該分野で公知であるか、または利用可能なスクリーニング方法により同定され得る。例えば、米国特許第５，８１１，３０４号は、ＲＩＺ１とＲｂとの間の相互作用に干渉する化合物として、ＳＶ４０ラージＴ抗原由来の１７アミノ酸Ｒｂ結合ペプチド（１０１〜１１８：Ｔ−ｐｅｐ）を記載する。ＲＩＺ１結合パートナーに結合する他の分子またはＲＩＺ１結合パートナー由来の結合ドメインを含む他の分子は、ＲＩＺ１と結合パートナーとの間の相互作用を調節する化合物であると予期される。ＲＩＺ１と結合パートナーとの間の相互作用を調節し得る他の化合物は、ＲＩＺ１結合ドメインを含み得、従って、その結合パートナーについて全長ＲＩＺ１と競合し得る。ＲＩＺ結合ドメインとしては、例えば、本明細書中に記載されるＬＸＸＬＬステロイドレセプター結合モチーフ、ならびにＥ１Ａ関連領域；ロイシンジッパー、保存領域１および保存領域２；共通エピトープ１；ジンクフィンガー；ＧＴＰアーゼドメイン；ＳＨ３ドメイン；ＳＨ３結合ドメイン；およびＰＭＴ（ＰＲ）ドメインが挙げられ、その各々が、米国特許第５，８１１，３０４号に記載される。
【００６２】
ＲＩＺ１に選択的に結合する他の化合物またはＲＩＺ１と結合パートナーとの間の相互作用を調節する他の化合物は、上記のように、既知の化合物のライブラリーまたは未知の化合物のライブラリーから開始する手動のスクリーニングアッセイまたは高スループットスクリーニングアッセイのいずれかによって、同定され得る。
【００６３】
結合アッセイは、検出可能に標識された候補化合物および標識されていないＲＩＺ１（および、必要に応じて標識されていない結合パートナー）を使用し得る。あるいは、結合アッセイは、標識されていない候補化合物または結合パートナーおよび標識されたＲＩＺ１を使用し得る。標識された分子と標識されていない分子との他の適切な組合わせは、アッセイ形式に依存して当業者によって決定され得る。
【００６４】
分子間の結合を測定するための種々の競合的結合アッセイ形式および非競合的結合アッセイ形式は、当該分野において公知である。これらのアッセイは、溶液ベースの方法および固相法（例えば、プレート、チップ、アフィニティカラムなどに結合された分子）の両方を含む。結合アッセイは、手動または高スループット自動化のいずれかでの化合物のスクリーニングに従う。２つの例示的な結合アッセイを、実施例ＩＩＡおよびＩＩＢに示す。
【００６５】
検出可能な標識としては、例えば、放射性同位元素、蛍光色素、強磁性物質、または蛍光物質が挙げられ得る。化合物を標識するに有用な例示的放射標識としては、１２５Ｉ、１４Ｃおよび３Ｈが挙げられる。合成中に化合物に標識されたアミノ酸を組み込むか、または合成後に化合物を誘導体化するかのいずれかによって、有機分子を検出可能に標識する方法は、当該分野において公知である。
【００６６】
ＲＩＺ１機能的活性は、本明細書中に記載されるか、または当該分野において公知である。例示的活性としては、例えば、転写活性（例えば、米国特許第５，８１１，３０４号を参照のこと）、転写抑制（例えば、Ｘｉｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：２６３６０−２６３６６（１９７７）を参照のこと）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性（実施例Ｉを参照のこと）およびホルモンレセプター同時活性化（実施例ＩおよびＩＩを参照のこと）が挙げられる。
【００６７】
ＲＩＺ１転写活性、抑制機能および同時活性化機能を調節する化合物を同定するために適切なアッセイは、当業者によって決定され得る。このようなアッセイは、一般に、細胞において、特定量の転写が生じる条件下でのＲＩＺ１と適切なプロモーター連結レポーター遺伝子との同時発現に基き、この細胞を候補化合物と接触させて転写活性の変化（すなわち、増加または減少のいずれか）が存在するか否かを決定する。転写ベースのアッセイは、当該分野において周知であり、高スループットスクリーニングアッセイに容易に従う。メチルトランスフェラーゼ活性アッセイは、上記に記載されている。
【００６８】
上記の任意の方法のいずれかによってＲＩＺ１調節化合物として同定される化合物は、次いでインビトロアッセイまたはインビボアッセイのいずれかで試験されて、プロゲステロンレセプター活性もまた調節するか否かを決定する。プロゲステロンレセプター活性を「調節する」化合物は、ＰＲ生物学的活性を増加または減少させる化合物をいうことが意図される。
【００６９】
プロゲステロンレセプターは、通常細胞質内に不活性な形態で存在する；ここで、このレセプターは、分子シャペロン、イムノフィリン、および熱ショックタンパク質と相互作用する。活性なＰＲは、プロゲステロンを結合し、そして核に移行し、核で、プロゲステロン調節遺伝子中に存在する規範的ＤＮＡ転写エレメントに転写因子として結合する。本明細書中で記載されるように、ＲＩＺ１は、ＰＲの転写活性を同時活性化する。よって、プロゲステロンレセプター（ＰＲ）活性を調節する化合物は、例えば、以下のような化合物であり得る：ＰＲと、不活性な形態では正常にホールディングする分子との間の相互作用を変更する；ＰＲとプロゲステロンとの間の相互作用を変更する；ＲＩＺ１とプロゲステロンとの間の相互作用を変更する；またはＰＲ調節遺伝子に対するＰＲの転写活性または特異性を増加または減少させる。
【００７０】
競合的結合アッセイおよび非競合的結合アッセイは、ＲＩＺ１に関して上記されており、そしてＰＲとプロゲステロン、調節分子またはＲＩＺ１との相互作用を調節する化合物の同定に適用され得る。ＰＲ転写活性を測定するアッセイをまた使用して、ＰＲ活性を調節する化合物を同定し得る。簡単には、プロゲステロン応答エレメント（ＰＲＥ）は、レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼなど）に作動可能に連結され得、そして細胞中で発現され得、そして化合物に応じたこのレポーター遺伝子の発現の増加または減少が、測定される。このようなアッセイを、実施例ＩおよびＩＩＣに記載する。あるいは、ＰＲによって天然に誘導される遺伝子（例えば、カゼイン）が、このようなアッセイにおいて使用され得、そしてｍＲＮＡ産物またはタンパク質産物が検出される。
【００７１】
転写ベースのアッセイ、レポーター遺伝子および遺伝子発現を検出するための方法、高スループットスクリーニングのためのこれらのアッセイに適合する方法は、当該分野において公知であり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（２００１）に記載される。
【００７２】
プロゲステロンレセプター活性を調節する化合物についての他のアッセイとしては、ＰＲ機能を報告するインビボアッセイ（例えば、実施例ＩおよびＩＩＤに記載される、子宮、膣および乳腺での発達についてのアッセイ）が挙げられる。特定の化合物での動物の処置に応じたこれらの器官の発生における変化は、ＰＲ活性に対する効果を有する化合物と矛盾しない。
【００７３】
一旦同定されると、プロゲステロンレセプター活性を調節する化合物は、薬学的組成物として処方され得、そして生殖系の障害および癌ならびに内分泌系の障害および癌を予防または処置するために使用され得る。このような障害としては、例えば、以下が挙げられる：不妊症、卵管疾患、排卵不全、発情周期の崩壊、月経周期の崩壊、卵巣高刺激症候群、子宮内膜腫瘍および卵巣腫瘍、自己免疫障害、異所性妊娠、奇形発生、乳癌、乳房線維嚢胞病、濫書症、精子形成の崩壊、異常精液生理機能、精巣癌、前立腺癌、良性前立腺過形成、前立腺炎、雄性の乳癌および女性化乳房。プロゲステロンレセプター活性を増加または減少させることが有利である他の状態は、当該分野において公知であるか、または当業者によって決定され得る。よって、本発明は、上記の障害および状態のいずれかを予防または改善するために、プロゲステロンレセプター活性を調節する化合物を含有する薬学的組成物の投与を提供する。
【００７４】
ＲＩＺ１  ＨＭＴ活性を調節する化合物、およびプロゲステロンレセプター活性を調節する化合物を含む、本発明の薬学的組成物は、単独でか、または少なくとも１つの他の薬剤（例えば、安定化化合物）と組合わせて投与され得、この組成物は、任意の滅菌した、生物適合性の薬学的キャリア中で投与され得る。このキャリアとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロースおよび水。この組成物は、単独でか、または他の因子、薬物またはホルモンと組合わせて投与され得る。
【００７５】
本発明において利用され得る薬学的組成物は、以下の手段が挙げられるがこれらに限定されない任意の投与経路によって投与され得る：経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、心室内、経皮的、皮下、腹腔内、鼻内、経腸的、局所、舌下、または直腸。
【００７６】
活性成分に加えて、これらの薬学的組成物は、薬学的に使用され得る調製物への活性化合物の加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む、適切な薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。処方および投与のための技術のさらなる詳細は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ）の最新版に見出され得る。
【００７７】
経口投与のための薬学的組成物は、経口投与に適切な投薬形態で、当該分野において周知の薬学的に受容可能なキャリアを使用して処方され得る。このようなキャリアは、薬学的組成物を、患者による摂取のために、錠剤、丸剤、糖剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして処方され得る。
【００７８】
経口用途のための薬学的調製物は、活性化合物を固体賦形剤と組合わせ、必要に応じて、生じた混合物を粉砕し、そして顆粒の混合物を処理し、その後適切な補助剤を添加して、所望ならば、錠剤または糖衣錠コアを得ることによって取得され得る。適切な賦形剤は、炭水化物またはタンパク質フィラー（例えば、糖（ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む）；トウモロコシ、コムギ、コメ、イモ、または他の植物からの澱粉；セルロース（例えば、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはカルボキシメチルセルロースナトリウム；ゴム（アラビアゴムおよびトラガカントガムを含む）；およびタンパク質（例えば、ゼラチンおよびコラーゲン））である。所望ならば、架橋ポリビニルピロリドン、アガー、アルギン酸またはその塩形態（例えば、アルギン酸ナトリウム）のような崩壊剤または安定剤が添加される。
【００７９】
丸剤、カプセル、錠剤などはさらに、適切なコーティング（例えば、濃縮糖溶液）を含み、これはまた、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポル（ｃａｒｂｏｐｏｌ）ゲル、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チタニウム、ラッカー溶液、ならびに適切な有機溶媒または溶媒混合物を含み得る。生成物同定のため、または活性化合物の量（すなわち、投薬量）を特徴付けるために、染料または顔料が、丸剤またはコーティングに添加され得る。
【００８０】
経口的に使用され得る薬学的調製物としては、ゼラチン製のカプセル、およびゼラチン製の柔らかな封入されたカプセル、ならびにコーティング（例えば、グリセロールまたはソルビトール）が挙げられる。プッシュフィット（ｐｕｓｈ−ｆｉｔ）カプセルは、フィラーまたは結合剤と混合された活性成分（例えば、ラクトースまたは澱粉、潤滑剤（例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウム））および必要に応じて、安定剤を含み得る。柔らかなカプセル中に、活性化合物は、安定剤を含むかまたは含まずに、適切な液体（例えば、脂肪油、液体、または液体ポリエチレングリコール）中に溶解または懸濁され得る。
【００８１】
非経口投与に適切な薬学的調製物は、生理学的に適合性の緩衝液（例えば、ハンクス液、リンガー液または生理学的緩衝化生理食塩水）水溶液中で処方され得る。水性注射懸濁液は、この懸濁液の粘度を増加させる物質（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストラン）を含み得る。さらに、活性化合物の懸濁液は、適切な油様注射懸濁液として調製され得る。適切な親油性溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油（例えば、セサミ油）または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルまたはトリグリセリド）あるいはリポソームが挙げられる。非脂質ポリカチオンアミノポリマーがまた、送達に使用され得る。必要に応じて、懸濁液はまた、適切な安定剤、または調製物の高度に濃縮された溶液を可能にする化合物の安定性を増加させる薬剤を含み得る。
【００８２】
局所投与または鼻内投与について、透過されるべき特定のバリアに適切な浸透剤が、処方物中で使用される。このような浸透剤は、一般に当該分野において公知である。
【００８３】
本発明の薬学的組成物は、当該分野において公知の様式で（例えば、混合プロセス、溶解プロセス、顆粒化プロセス、糖衣形成プロセス、研磨プロセス、乳化プロセス、カプセル化プロセス、封入プロセス、または凍結乾燥プロセスによって）製造され得る。
【００８４】
薬学的組成物は、塩として提供され得、そして、以下が挙げられるがこれらに限定されない多くの酸とともに形成され得る：硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、マレイン酸、コハク酸など。塩は、その対応する塩基形態であるよりも、水性溶媒または他のプロトン性溶媒中でより可溶性である傾向がある。他の場合では、好ましい調製物は、使用前に緩衝液と合わせられる以下のいずれかまたは全てを含み得る凍結乾燥粉末であり得る：ｐＨ範囲が４．５〜５．５での１〜５０ｍＭヒスチジン、０．１〜２％スクロース、および２〜７％マンニトール。
【００８５】
薬学的組成物が調製された後、これらは、適切な容器中に置かれ得、そして示された状況の処理についてラベルされ得る。このようなラベリングは、投与量、投与頻度、および投与法を含み得る。
【００８６】
本発明の用途に適切な薬学的組成物は、意図される目的を達成するために効果的な量で含まれる。効果的用量の決定は、十分に当業者の能力内である。
【００８７】
任意の化合物について、治療有効用量が、細胞培養アッセイまたは動物モデル（通常、マウス、ラット、ウサギ、イヌまたはブタ）のいずれかで最初推定され得る。動物モデルをまた使用して、投与の適切な濃度範囲及び経路を決定し得る。次いで、このような情報を使用して、ヒトでの投与に有用な用量及び経路を決定し得る。
【００８８】
治療有効用量は、症状及び状態を改善する活性成分の量をいう。治療効率および毒性（例えば、ＥＤ５０（集団の５０％に治療的に効果的な用量）およびＬＤ５０（集団の５０％に対する致死用量））は、細胞培養または実験動物において標準的な薬学的手順によって決定され得る。毒性効果の治療効果に対する用量比は、治療指数であり、そしてＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表され得る。高い治療指数を示す薬学的組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物研究より得られるデータが、ヒト用途に対してある範囲の投薬量を処方する際に使用される。このような組成物中に含まれる投薬量は、好ましくは、毒性をほとんど有さないかまたは全く有さない、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。投薬量は、使用される投薬形態、患者の重篤度、および投与経路に依存してこの範囲内で変化する。
【００８９】
正確な投薬量は、処置を必要とする被験体に関する要因の観点で、開業医によって決定される。投薬量および投与は、十分なレベルの活性部分を提供するかまたは所望の効果を維持するように調整される。考慮され得る要因としては、疾患状態の重篤度、被験体の一般的健康、被験体の年齢、体重、および性別、食事、投与時間及び投与頻度、薬物複合反応感受性、ならびに治療に対する寛容／応答が挙げられる。長時間作用する薬学的組成物は、特定の処方物の半減期およびクリアランス速度に依存して３〜４日毎、毎週、または２週間に１回投与され得る。
【００９０】
通常の投薬量は、総用量約１ｇまでで、投与経路に依存して０．１μｇ〜１００ｍｇまで変動し得る。特定の投薬量および送達方法の手引きは、文献中に提供され、そして一般に当該分野において外科医に利用可能である。
【００９１】
本明細書中に開示されるように、ＲＩＺ１は、エストロゲンレセプターコアクチベーターである。ＲＩＺ１サイレンシングは、ＥＲポジティブ乳癌と比較してＥＲネガティブ乳癌において有意により一般的であり、そしてエストロゲン耐性の獲得に関与するようである。なぜなら、試験したＥＲ＋癌組織のほぼ半分が、ＲＩＺ１発現ネガティブにあると決定されたからである。
【００９２】
エストロゲンの作用は、特異的レセプター（ＥＲ）との相互作用を介して媒介され、一連の下流の事象を開始し、ホルモン応答遺伝子の調節および細胞増殖を導く。内分泌治療（エストロゲン作用を減少するための外科的治療および内科的治療の両方を含む）は、ＥＲ＋癌を有する患者における、好ましい第一線の治療である。
【００９３】
しかし、ＥＲ陽性腫瘍を有する大部分の患者は、内分泌治療に応答しない。ＲＩＺ１の不活性化が、乳癌細胞における減少したエストロゲン応答性に高度に関連することを決定することにより、ＲＩＺ１状態は、ＥＲ＋腫瘍を有する個体が内分泌治療に対して応答する可能性があるか否かを予測するために使用されることを可能にする。
【００９４】
ＲＩＺ１状態に関する情報に基づき、臨床医は、潜在的な副作用を有する不必要な処置に個体を曝すのを回避しつつ、無疾患状態で生存する期間を延長し、そして／または死亡率を低下させる上で有効である可能性がより高い、特定の個体に適切な処置を決定し得る。本発明の方法によって、内分泌治療に応答する通常の見込みを有すると決定される個体については、内分泌治療が適切である。しかし、本発明の方法によって、内分泌治療に応答する減少した見込みを有すると決定される個体については、代替の処置が、利用可能な処置の選択肢の中から選択され得る。あるいは、このような個体については、内分泌治療は、さらなる処置と組み合わされ得る。
【００９５】
このような個体に対する代替の処置またはさらなる処置の性質は、腫瘍の型および段階、転移の程度、個体の全体的な健康状態、ならびに他の併用する処置に基づき、臨床医により選択され得る。例えば、内分泌治療に応答する減少した見込みを有すると決定される個体において、化学治療、外科手術、または放射線照射が、内分泌治療と組み合わせられ得るか、または内分泌治療の代わりとして使用され得る。
【００９６】
従って、本発明は、内分泌治療に応答する減少した見込みを有するエストロゲンレセプター陽性（ＥＲ＋）腫瘍を有する個体を同定する方法を提供する。この方法は、この腫瘍のＲＩＺ１状態を決定することにより実施され得る。この方法において、異常なＲＩＺ１状態は、その個体を、内分泌治療に応答する減少した見込みを有する個体として識別する。正常なＲＩＺ１状態は、その個体を、内分泌治療に応答する通常の見込みを有する個体として識別する。
【００９７】
本明細書中で使用する場合、用語「内分泌治療」は、エストロゲンの増殖能を減少させる治療をいう。内分泌治療は、外科的または内科的のいずれかであり得、そしてエストロゲン作用の任意の局面（エストロゲン生成およびエストロゲンレセプターのシグナル伝達を含む）に影響を及ぼす。
【００９８】
エストロゲン生成を除去する方法としては、閉経前女性におけるエストロゲンの主要な供給源である、卵巣の外科的切除または放射線照射が挙げられる。エストロゲン生成の除去はまた、黄体形成ホルモン放出ホルモンアゴニストまたは性腺刺激ホルモン放出ホルモンアゴニストを用いることによって、薬理学的に達成され得る。
【００９９】
選択的エストロゲンレセプターモジュレーター（ＳＥＲＭ）は、試験系において同時に投与される場合に、エストロゲンアゴニスト（例えば、１７β−エストラジオール）の効果を鈍化またはブロックする化合物をいう。癌治療において使用されるＳＥＭＳ（一般的に、「抗エストロゲン」としても知られている）は、一般的に、抗エストロゲン効果およびエストロゲン効果の組み合わせを示す。最も広く使用されているＳＥＲＭであるタモキシフェンのアンタゴニスト効果は、細胞増殖のためのＥ２−ＥＲ−開始シグナルの伝達をブロックする結果である。他のＳＥＲＭとしては、４−ヒドロキシタモキシフェンおよび関連するトリフェニレン抗エストロゲン；クロミフェン；ならびに非子宮栄養性抗エストロゲン（ｎｏｎ−ｕｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ａｎｔｉｅｓｅｓｔｒｏｇｅｎ）（例えば、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、イドキシフィン（ｉｄｏｘｉｆｉｎｅ）、ナホキシジン（ｎａｆｏｘｉｄｉｎｅ）、トレミフェン、ＴＡＴ−５９、レボメロキシフェン、ＬＹ−３５３３８１、ＣＰ−３３６１５６、ＭＤＬ−１０３３２３、ＥＭ−８００、ＥＲＡ−９２３、ＩＣＩ−１８２、７８０、など）が挙げられる。他のＳＥＲＭは、当該分野で公知であるか、または決定され得る。
【０１００】
アロマターゼインヒビターもまた、閉経後女性におけるＥＲ＋癌の内分泌治療において使用される。アロマターゼは、アンドロゲンからのエストロゲン（エストロンおよびエストラジオール）の合成における最終工程を触媒し、従って、アロマターゼのインヒビターは、エストロゲン生成を減少する。代表的なアロマターゼインヒビターとしては、アミノグルテチミド、メゲストロールアセテート、アナストロゾール、レトロゾール、およびエキセメスタンが挙げられる。
【０１０１】
本明細書中で使用する場合、用語「エストロゲンレセプター陽性（ＥＲ＋）腫瘍」は、当該分野で認識されている閾値レベルを超えるエストロゲンレセプターを発現する腫瘍をいう。腫瘍をＥＲ＋またはＥＲ−と分類するために、多くのアッセイが、当該分野で慣用的に使用されている。このようなアッセイとしては、例えば、リガンド結合アッセイ（ＬＢＡ）および免疫組織化学（ＩＨＣ）が挙げられる。好適には、免疫組織化学が、本明細書中に記載されるように、腫瘍のＥＲ状態およびＲＩＺ１状態の同時決定を可能にし得る。一般的に、３ｆｍｏｌ／ｍｇ細胞質タンパク質より大きいＥＲレベル（ＬＢＡによる）がＥＲ＋とみなされるのに対し、１％より高い陽性細胞（ＩＨＣアッセイによる）がＥＲ＋とみなされる（Ｈａｒｖｅｙら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１７：１４７４−１４８１（１９９９）；Ｅｌｌｅｄｇｅら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（Ｐｒｅｄ．Ｏｎｃｏｌ．）８９：１１１−１１７（２０００））。１０％陽性細胞のカットオフを、実施例Ｉに記載される免疫組織化学アッセイにおいてＥＲ＋とみなした。しかし、結果は、１％カットオフを用いても大きく変化しない。
【０１０２】
本明細書中で使用する場合、用語「腫瘍」は、悪性新生物をいう。腫瘍は、原発性病巣または転移性病巣のいずれかであり得る。エストロゲンレセプターを発現することが示されている腫瘍としては、乳癌腫、子宮内膜癌腫、前立腺癌、卵巣癌腫、腫腎臓癌腫、黒色腫、結腸直腸腫瘍、類腱腫、膵臓癌腫、および下垂体腫瘍が挙げられる。本発明の方法は、これらの型の任意のＥＲ＋腫瘍、およびＥＲ＋であると決定された他の腫瘍に適用可能である。本発明の方法は、任意の臨床段階のＥＲ＋癌（局在化した癌、局所的に伝播した癌、および遠くに伝播した癌）に適用可能である。
【０１０３】
さらに、この方法は、生検において、悪性でないと決定される組織（正常または前癌であると決定される組織を含む）を有する個体に対して実施され得る。このようなＥＲ＋組織における異常なＲＩＺ１状態は、その組織において腫瘍が発生した個体の増大した見込みの予測となる。特に、低量の循環エストロゲンを有する女性（閉経後女性および卵巣が切除された女性を含む）において、ＥＲ＋組織における異常なＲＩＺ１状態は、その組織において腫瘍が発生した個体の増大した見込みの予測となる。このような患者については、内分泌処置以外の予防的処置が、妥当であり得る。適切な予防的処置（生活様式の変更（例えば、食事および運動）および薬物処置を含む）は、当業者により決定され得る。
【０１０４】
本明細書中で使用する場合、ＲＩＺ１に関する用語「状態」は、腫瘍におけるＲＩＺ１ポリペプチドの機能に関連する測定可能な特性をいう。決定される測定可能な特性は、ＲＩＺ１ポリペプチドの特性またはコードＲＩＺ１遺伝子もしくはコードＲＩＺ１ｍＲＮＡの特性であり得る。
【０１０５】
腫瘍におけるＲＩＺ１ポリペプチド機能に関連する例示的な測定可能な特性は、腫瘍におけるＲＩＺ１遺伝子、ＲＩＺ１  ｍＲＮＡ、またはＲＩＺ１ポリペプチドの量である。従って、この場合の「異常なＲＩＺ１状態」は、腫瘍サンプルにおける、ＲＩＺ１遺伝子、ＲＩＺ１  ｍＲＮＡ、またはＲＩＺ１ポリペプチドの減少した量であり得る。一般的に、腫瘍におけるＲＩＺ１遺伝子、ＲＩＺ１  ｍＲＮＡ、またはＲＩＺ１ポリペプチドの減少した量とは、コントロールサンプルにおける量に対する、腫瘍サンプルにおけるＲＩＺ１遺伝子、ＲＩＺ１  ｍＲＮＡ、またはＲＩＺ１ポリペプチドの量の少なくとも８０％の減少（例えば、９０％の減少）をいう。当業者は、特定のアッセイに適切なコントロール（例えば、同じ個体由来の近接する正常な組織、または正常な量のＲＩＺ１遺伝子、ＲＩＺ１  ｍＲＮＡ、またはＲＩＺ１ポリペプチドを有することが以前に同定されている腫瘍サンプル）を決定し得る。
【０１０６】
腫瘍におけるＲＩＺ１ポリペプチド機能に関連するさらなる例示的な測定可能な特性は、ＲＩＺ１遺伝子の構造的完全性である。従って、この場合の「異常なＲＩＺ１状態」は、腫瘍サンプルにおけるＲＩＺ１遺伝子の正常なヌクレオチド配列における変異であり得る。このような変異は、ＲＩＺ１遺伝子またはＲＩＺ１  ｍＲＮＡの全てまたは選択された部分を配列決定することによって直接決定され得る。ＲＩＺ１遺伝子配列における変異はまた、間接的に（例えば、ＲＩＺ１  ｍＲＮＡの正常な大きさまたは量における変化、ＲＩＺ２／ＲＩＺ１の正常な比における変化を検出することによって、あるいはＲＩＺ１ポリペプチド産物の正常な大きさ、安定性、もしくは局在性における変化を検出することによって）推定され得る。ＲＩＺ１ポリペプチドが正常に発現されるかまたは機能する能力に影響を及ぼし得る変異としては、例えば、ゲノム欠失、フレームシフト変異（Ｃｈａｄｗｉｃｋら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：２６６２−２６６７（２０００）；Ｐｉａｏら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：４７０１−４７０４（２０００）；Ｓａｋｕｒａｄａら，Ｇｅｎｅｓ，Ｃｈｒｏｍｓ．Ｃａｎｃｅｒ  ３０：２０７−２１１（２００１））、ミスセンス変異、非センス変異、および調節領域における変異（米国特許第５，８１１，３０４）が挙げられる。
【０１０７】
サンプル中の特定の遺伝子、ｍＲＮＡ、またはポリペプチドの量または構造的完全性を決定する方法は、当該分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌら（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（捕遺４７），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９））に記載される。所定の適用に対する特定の方法は、当業者により選択され得る。代表的な方法としては、例えば、ＤＮＡ配列決定、ＳＳＣＰ、サザンブロッティング、ＰＣＲ、ノザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡｓｅ保護、インサイチュハイブリダイゼーション、免疫組織化学、イムノブロッティング、および免疫沈降が挙げられる。これらの方法においてＲＩＺ１核酸分子を検出するのに適した試薬（例えば、ハイブリダイゼーションプローブおよびＰＣＲプライマー）は、当該分野で公知であり、例えば、Ｈｅら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４２３８−４２４４（１９９８）および本明細書の実施例に記載される。これらの方法においてＲＩＺ１ポリペプチドを検出するのに適した試薬（例えば、ＫＧ７．１Ｓおよび２Ｄ７抗体）もまた当該分野で公知であり、例えば、Ｂｕｙｓｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：４４６７−４４７１（１９９５）に記載される。
【０１０８】
腫瘍におけるＲＩＺ１ポリペプチド機能と関連する別の例示的な測定可能な特性は、ＲＩＺ１遺伝子プロモーターのメチル化の程度である。Ｄｕら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：８０９４−８０９９（２００１）に記載されるように、ＲＩＺ１プロモーターにおける３５ＣｐＧｓの部分的または完全なメチル化は、減少したＲＩＺ１  ｍＲＮＡ発現と強く関連し、減少したＲＩＺ１ポリペプチド量をもたらす。従って、この場合の「異常なＲＩＺ１状態」は、部分的または完全なＲＩＺ１プロモーターＣｐＧのメチル化であり得る。
【０１０９】
ＲＩＺ１プロモーターのメチル化は、例えば、Ｄｕら，前出（２００１）に記載される方法によって決定され得る。簡単にいうと、１つの方法は、サンプル由来のゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてＲＩＺ１プロモーターＤＮＡを増幅する工程、その後、増幅産物をクローニングおよび配列決定する工程を包含する。亜硫酸水素塩処理により、非メチル化シトシンがウリジンに変換されるが、メチル化シトシンは変換に対して耐性である。本発明によるＲＩＺ１プロモーターの増幅に適した例示的なプライマーセットは、５’−ＧＧＴＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＡＴＴＧＧＧ−３’（配列番号５）および５’−ＣＡＡＡＡＡＣＣＧＣＣＣＴＧＣＧＣＣＡＣＴＣＣＴＴＡＣＣ−３’（配列番号６）である。代替の方法は、サンプル由来のゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程、およびＲＩＺ１特異的プライマーを用い、メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＭＳＰ）を用いてこのＤＮＡを増幅する工程を包含する。メチル化ＲＩＺ１プロモーターＤＮＡを選択的に増幅するための例示的なプライマーセットは、５’−ＧＴＧＧＴＧＧＴＴＡＴＴＧＧＧＣＧＡＣＧＧＣ−３’（配列番号７）および５’−ＧＣＴＡＴＴＴＣＧＣＣＧＡＣＣＣＣＧＡＣＧ−３’（配列番号８）であるのに対し、非メチル化ＲＩＺ１プロモーターＤＮＡを選択的に増幅するための例示的なプライマーセットは、５’−ＴＧＧＴＧＧＴＴＡＴＴＧＧＧＴＧＡＴＧＧＴ−３’（配列番号９）および５’−ＡＣＴＡＴＴＴＣＡＣＣＡＡＣＣＣＣＡＡＧＡ−３’（配列番号１０）である。
【０１１０】
腫瘍におけるＲＩＺ１ポリペプチド機能と関連する別の例示的な測定可能な特性は、ＲＩＺ１ポリペプチドのヒストンメチルトランスフェラーゼ活性である。従って、この場合の「異常なＲＩＺ１状態」は、変更されたＨ１−Ｋ２５メチル化活性、変更されたＨ３−Ｋ９メチル化活性、または別の同定されたヒストンメチル化部位に対する正常なＲＩＺ活性の変化であり得る。このような変化は、正常なコントロールに対して増大したＨＭＴ活性または減少したＨＭＴ活性のいずれかであり得る。ヒストンメチルトランスフェラーゼアッセイは、前に記載されており、そして腫瘍サンプルにおけるＲＩＺ１ポリペプチドのヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を決定するための当業者により適合され得る。
【０１１１】
当業者は、腫瘍におけるＲＩＺ１ポリペプチド機能と関連する他の測定可能な特性を決定し得、これは、ＲＩＺ１状態を決定するために本発明において使用され得る。これらの基準のいずれかによって、ＲＩＺ１ポリペプチドが、変化した量、構造、または活性から、腫瘍において正常に機能していない可能性があると決定される場合、その腫瘍は、「異常なＲＩＺ１状態」を有すると表され、そしてその個体は、「内分泌治療に対して応答する減少した見込み」を有すると同定される。従って、内分泌治療の代替治療、または他の治療と組み合わせた内分泌治療の使用は、このような個体において、無疾患の生存および完全な生存の機会を改善するために妥当であり得る。
【０１１２】
以下の実施例は、本発明を例示することを意図しており、限定することを意図しない。
【実施例】
【０１１３】
（実施例Ｉ）
この実施例は、腫瘍抑制遺伝子ＲＩＺ１（ＰＲＤＭ２）がヒストンメチルトランスフェラーゼスーパーファミリーのメンバーであり、そして雌性ホルモンレセプターのコアクチベーターであることを示す。この実施例はまた、ＲＩＺ１がインビボで雌性ホルモン作用を媒介すること、およびＲＩＺ１の機能の欠損が、乳癌のホルモン抵抗性およびホルモン非依存性の増殖への移行に関与することを示す。
【０１１４】
（材料および方法）
（プラスミドおよび一過性トランスフェクション）
使用されたヒトＲＩＺ１発現ベクターおよびヒトＲＩＺ２発現ベクターならびにＲＩＺ１変異体ベクターは、Ｓｔｅｅｌｅ−Ｐｅｒｋｉｎｓら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５：２２５０−２２６２（２００１）に記載される。全長野生型ヒトＲＩＺ１  ｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングすることにより、哺乳動物ＲＩＺ１発現ベクターｐ３ＲＩＺ１ＲＨ４．１を構築した。ミスセンス変異（ロイシンからアラニン）を含むベクターｐ３ＲＩＺ１ＲＨ４．１−Ｌ９６５Ａを、Ｑｕｉｃｋ−Ｃｈａｎｇｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により構築し、そしてＤＮＡ配列決定により確認した。ＲＩＺタンパク質の発現ベクターおよび全長哺乳動物ＥＲα、全長哺乳動物ＰＲ、全長哺乳動物ＲＡＲα、全長哺乳動物ＲＸＲα、全長哺乳動物ＶＤＲ、全長哺乳動物ＡＲ、全長哺乳動物ＴＲおよび全長哺乳動物ＧＲを含む発現ベクターを、ｔｋ−ＣＡＴレポーターに連結された合成ホルモン応答エレメントを含む適切なレポーター構築物とともにＣＶ−１細胞にトランスフェクションした。ＲＡＲ、ＲＸＲ、およびＴＲに対する合成応答エレメントを含むレポーターＴＲＥｐａｌ−ｔｋ−ＣＡＴ（Ｚｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５５：４４１−４４６（１９９２））を使用して、ＲＡＲα、ＲＸＲα、およびＴＲの効果を評価し、ＧＲおよびＡＲについてはＧＲＥ−ｔｋ−ＣＡＴ（Ｚｈａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：８２４８−８２５４（１９９１））を、ＥＲαについてはＥＲＥ−ｔｋ−ＣＡＴ（Ｌｅｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：４１９４−４２０７（１９９５））を、ＰＲについてはＰＲＥ−ｔｋ−ｃａｔ（ＭｃｋａｙおよびＣｉｄｌｏｗｓｋｉ、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１２：４５−５６（１９９８））を、ならびにＶＤＲについてはＶＤＲＥ−ｔｋ−ＣＡＴ（Ａｇａｄｉｒら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２０：５７７−５８２（１９９９））を使用した。
【０１１５】
リン酸カルシウム沈殿手順を、以前に記載されたように一過性のトランスフェクションのために使用した（Ｌｅｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：４１９４−４２０７（１９９５））。簡潔には、０．５〜１．０×１０５細胞／ウェルを、２４ウェルプレートに播種し、そして５０〜４００ｎｇのＲＩＺプラスミド、１００ｎｇのＮＨＲについての発現ベクター、１００ｎｇのレポータープラスミドおよび１００ｎｇのβ−ｇａｌ発現ベクターを、１μｇの全ＤＮＡ／ウェルになるようにキャリアＤＮＡと混合した。ＭＣＦ−７細胞（６ウェルプレートにおいて２×１０５細胞／ウェル）のトランスフェクションには、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を、製造業者の指示書に従って使用した。細胞を、示したホルモン（エストラジオール（Ｅ２）について５０ｎＭ、ならびにＲ５０２０（合成Ｐアゴニスト）、オール−トランスレチノイン酸（オール−トランス−ＲＡ）、９−シスレチノイン酸（９−シス−ＲＡ）  １，２５ジヒドロキシビタミンＤ３（ＶＤ３）、ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）、トリヨードサイロニン（Ｔ３）、およびデキサメタゾン（ＤＥＸ）について１００ｎＭ；Ｒ５０２０以外はすべてＳｉｇｍａから、Ｒ５０２０をＮＥＮから）の有りまたは無しで、２４時間処理し、そしてＣＡＴ活性を、記載されるように測定した（Ｌｅｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：４１９４−４２０７（１９９５））。ＣＡＴの値を、対応するβ−ｇａｌ活性によってトランスフェクション効率に対して標準化した。
【０１１６】
ＧＳＴタンパク質産生のために使用するプラスミドを、以下のようにＰＣＲクローニングによって構築した。ヒトＲＩＺ１タンパク質の１〜２００残基領域を発現させるために、全長ヒトＲＩＺ１  ｃＤＮＡプラスミドを、プライマーｈＲＰ１０９．２（ＡＡＡ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＡＴＣ  ＡＧＡ  ＡＣＡ  ＣＴＡ  ＣＴＧ  ＡＧ（配列番号１１））およびＲＰ２７４（ＣＣＧ  ＴＡＡ  ＧＣＴ  ＴＣＡ  ＴＧＣ  ＡＧＡ  ＧＧＴ  ＧＡＡ  ＡＴＣ  ＴＧＧ  Ｃ（配列番号１２））によるＰＣＲ（Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のための鋳型として使用した。このＰＣＲフラグメントを、ベクターｐＫＧ−ＰＢＲ（Ｈｕａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１５９３３−１５９４０（１９９８ｂ））中のＮｃｏＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングして、ｐＫＧ−ＨＮ１を作製した。ＧＳＴ−ＲＩＺ２００タンパク質を作製するために、ＢＬ−２１細胞を、ｐＫＧ−ＨＮ１によって形質転換した。ＲＩＺタンパク質の１〜１６１残基領域を発現させるために、Ｑｕｉｃｋ−Ｃｈａｎｇｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用することによって、プラスミドｐＫＧ−ＨＮ１中の残基１６２に終止コドンを導入した。使用したプライマーは、ＲＰ２９６Ｐ１（ＣＧＡ  ＧＣＣ  ＡＧＣ  ＧＣＣ  ＣＧＧ  ＡＧＣ  ＴＡＡ  ＧＣＴ  ＴＡＡ  ＧＣＧ  ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＣＣＣ（配列番号１３））およびＲＰ２９６Ｐ１の相補配列を有するＲＰ２９６Ｐ２であった。ミスセンス変異体ＧＳＴ−ＲＩＺ２００タンパク質を作製するために、ｐＫＧ−ＨＮ１プラスミド鋳型においてＱｕｉｃｋ−Ｃｈａｎｇｅによる変異誘発を、以前に記載されたようなプライマーを使用して実施した（Ｓｔｅｅｌｅ−Ｐｅｒｋｉｎｓら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５：２２５０−２２６２（２００１））。細菌中で、より長いＲＩＺ１のペプチドフラグメントを作製するために、ＰＣＲによってＮ末端５２０残基フラグメントを最初にｐＫＧ−ＰＢＲベクターのＮｃｏＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングして、プラスミドｐＫＧＨ２０５を作製した。しかし、このプラスミドは、高収量の期待のタンパク質産物を与えなかった。次に、Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ変異誘発によって、このプラスミドに終止コドンを導入して、ｐＫＧＲＩＺ３３２を作製した。ｐＫＧＲＩＺ３３２は、次いで、高収量のＲＩＺ１のＮ末端３３２残基ペプチドを産生した。変異誘発に使用したＰＣＲプライマーは、以下：ＲＰ３０７：ＧＡＴ  ＴＴＡ  ＴＴＡ  ＧＡＧ  ＧＡＡ  ｔｇＡ  ＡＡＡ  ＡＣＡ  ＡＣＴ  ＴＣＡ  ＧＡＡ  Ｇ（配列番号１４）、およびＲＰ３０８：ＣＴＴ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  ＴＴＧ  ＴＴＴ  ＴＴｃ  ａＴＴ  ＣＣＴ  ＣＴＡ  ＡＴＡ  ＡＡＴ  Ｃ（配列番号１５）である。
【０１１７】
（免疫沈降および免疫ブロット）
ＭＣＦ−７乳癌細胞およびＴ４７−Ｄ乳癌細胞を、１５ｃｍディッシュにおいて５％ＦＣＳおよび２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含むＤＭＥＭ中で増殖させた。次いで、コンフルエント前（ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）の細胞（４×１０６）を、フェノールレッドも、血清もホルモンも含まないＤＭＥＭでさらに３日間培養した。その間、培地を１日２回交換した。ホルモン（Ｅ２について５０ｎＭおよびＲ５０２０について１００ｎＭ）有りまたは無しで、細胞を２４時間インキュベートし、そしてＲＩＺ１を含むアデノウイルスベクター（ＡｄＲＩＺ１；１×１０１０ウイルス粒子／１５ｃｍディッシュの濃度で）または空ベクター（ＡｄＮｕｌｌ）を感染させた（Ｈｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：４２３８−４２４４（１９９８））。次いで、細胞を、炭処理された５％のＦＣＳ（Ｏｍｅｇａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充した、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ中でさらに４８時間増殖させた。細胞を回収し、（Ｂｕｙｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：４４６７−４４７１（１９９５）；Ｌｉｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２９８４−２９９１（１９９７））に本質的に記載されるようにして免疫沈降および免疫ブロットを続けた。使用した抗体としては、ＲＩＺモノクローナル抗体２Ｄ７（Ｂｕｙｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：４４６７−４４７１（１９９５））、ＥＲαに対するモノクローナル抗体（ｓｃ−８００５、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、プロゲステロンレセプターに対するモノクローナル抗体（１Ａ６、ＤＡＫＯ）が挙げられる。ヒストンメチル化解析のために、抗ジメチル−Ｈ３−Ｋ９抗体および抗ジメチル−Ｈ３−Ｋ４抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を、コントロールウイルスおよびＡｄＲＩＺ１ウイルスを４８時間感染させた細胞から酸抽出したヒストンの免疫ブロット解析に使用した。Ｈ１リン酸化解析のために、抗ホスホ−Ｈ１抗体および抗Ｈ１抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を、酸抽出したヒストンの免疫ブロット解析に使用した。
【０１１８】
（マウス）
ＲＩＺ１−／−マウスを、Ｓｔｅｅｌｅ−Ｐｅｒｋｉｎｓら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５：２２５０−２２６２（２００１）に記載されるように作製した。簡潔には、マウスゲノムＤＮＡを得るために、ラットＲＩＺ１  ｃＤＮＡの、ＰＲドメインをコードするｃＤＮＡフラグメントを使用して、マウス１２９Ｓｖゲノムライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をスクリーニングした。標的化構築物を、ＰＧＫ−ｎｅｏｒ−ＢｐＡカセット（Ｓｏｒｉａｎｏら、Ｃｅｌｌ  ６４：６９３−７０２（１９９１））をエキソン５中に挿入し、そして相同の領域の外側に隣接してＰＭＣ１−ＴＫ（Ｍａｎｓｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３６：３４８−３５２（１９８８））由来の単純ヘルペスウイルスＴＫカセットを位置付けるように設計した。標的化プラスミドを、ＸｈｏＩ消化により直線化し、そしてＤ３  ＥＳ細胞（Ｇｏｓｓｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：９０６５−９０６９（１９８６））にエレクトロポレーションした。このＥＳクローンを、Ｇ４１８（１５０μｇ／ｍｌ）およびガンシクロビル（２．０μＭ）を含む培地で選択した。相同組換え事象を、ＸｂａＩ消化と０．５−ｋｂ  ＸｂａＩ−ＢｇｌＩＩ５’プローブへのハイブリダイゼーションまたはＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩ消化と０．５−ｋｂ  ＳａｃＩＩ−ＮｏｔＩ３’プローブへのハイブリダイゼーションを使用したサザンブロット解析によってスクリーニングした。５つのＲＩＺ１＋／−ＥＳ細胞株を、Ｃ５７ＢＬ／６胚盤胞に微量注入した。次いで、この胚盤胞をＢａｌｂ／ｃ養母の子宮に移植した。２つのＲＩＺ１＋／−ＥＳクローンから作製された雄のキメラマウスが、ＲＩＺ変異を生殖系列に伝達された。Ｆ１動物におけるＲＩＺ１変異体対立遺伝子の存在を、動物の尾由来のゲノムＤＮＡのサザンブロット解析およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）解析によって確認した。ＲＩＺ１＋／−Ｆ１動物どうしを交配させて、ＲＩＺ１−／−マウスを作製した。
【０１１９】
生殖機能を試験するために、雌ＲＩＺ１−／−マウスを、雄ＲＩＺ１＋／−マウスと交配し、雌ＲＩＺ１＋／−マウスを、雄ＲＩＺ１−／−マウスと交配し、そしてヘテロ接合体の変異体間の交配もまた実施した。同腹仔の数を記録し、研究全体を通してルーチン的に、全てのマウスを体重測定した。
【０１２０】
（遺伝子発現の分析）
ＲＩＺ染色について、ＲＩＺウサギ抗血清ＫＧ７．１Ｓ（Ｂｕｙｓｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：４４６７−４４７１（１９９５））を１／２００の最適希釈で使用した。ＥＲα染色について、ポリクローナルウサギ抗ＥＲα抗体（ｓｃ−５４２  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を、１／２５０の希釈で使用し、そしてＰＲ染色については、ポリクローナルウサギ抗ＰＲ抗体（Ａ００９８  ＤＡＫＯ）を、１／１００の希釈で使用した（基本的には、（Ｔｉｂｂｅｔｔｓら，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５９：１１４３−１１５２（１９９８））に記載されるとおり）。組織をブワン溶液中で固定化し、そしてパラフィン中への包埋および断片化（５μｍ）の従来の方法によって処理した。ＲＩＺ染色およびＥＲ染色については、断片をトリプシン（Ｚｙｍｅｄ）で処理したが、ＰＲ染色については、断片をＴａｒｇｅｔ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＤＡＫＯ）を使用する処理に供した。これらの全ては、製造者の指示に従って実施した。次いで、断片を１次抗体と共にインキュベートし、その後ビオチン化二次抗体と共にインキュベートした。１次抗体の局在性を、褐色染色を生じるイミダゾール−ＤＡＢ反応によって可視化し、その後ヘマトキシリン対比染色および明視野顕微鏡分析（ｂｒｉｇｈｔ−ｆｉｅｌｄ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ）の慣用的処理を続けた。ネガティブコントロールは、１次抗体の欠損および免疫前ＫＧ７．１Ｓ抗血清とのインキュベーションを含んだのに対して、ＡｄＲＩＺ１に感染した直腸結腸異種移植片腫瘍をＲＩＴ発現についてのポジティブコントロールとして使用した（ＪｉａｎｇおよびＨｕａｎｇ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：１７９６−１７９８（２００１））。
【０１２１】
ＲＩＺ遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ分析のために、７週齢のＲＩＺ１＋／＋マウス由来の組織を液体窒素中で微粉砕し、そして総ＲＮＡをＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を使用して単離した。第１鎖ｃＤＮＡ合成キット（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を使用して、ｃＤＮＡを合成した。オリゴＲＰ２６０（５’−ＣＴＣ  ＡＴＴ  ＣＡＴ  ＣＴＡ  ＡＧＡ  ＡＡＧ  ＧＴＧ  Ｇ−３’；配列番号１６）＋ＲＰ２５９（５’−ＴＧＡ  ＴＴＣ  ＣＡＧ  ＧＴＣ  ＡＣＴ  ＴＣＡ  ＧＧ−３’；配列番号１７）およびＲＰ１７０（５’−ＧＡＡ  ＧＣＣ  ＡＡＡ  ＧＧＣ  ＣＴＣ  ＴＣＡ  ＴＣ−３’；配列番号１８）＋Ｋ０５（５’−ＡＧＡ  ＣＴＣ  ＴＧＧ  ＣＴＧ  ＡＧＧ  ＴＡＣ  Ｃ−３’；配列番号１９）を５９℃のアニーリング温度での３０サイクルを含む標準的なＰＣＲ条件において使用し、それぞれ、ＲＩＺ１＋２およびＲＩＺ１特異的フラグメントを増幅させた。
【０１２２】
（ホルモン処理に対する応答における標的器官の分析）
子宮の増殖および充血ならびに膣上皮の細胞組織化の変化におけるＥ２媒介性増大（Ｘｕら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９：１９２２−１９２５（１９９８））を試験するために、８週齢雌ＲＩＺ−／−マウスおよびＲＩＺ＋／＋マウスを卵巣摘出（ＯＶＸ）した。ＯＶＸ後の１５〜１７日目に、マウスをＥ２のＳ．Ｃ．注射（０．８ｎｇ／ｇ／日；Ｓｉｇｍａ）またはビヒクル（０．１ｍｌ  トウモロコシ油）のみで、３日間処理した。次いで、このマウスを、１８日目に屠殺し、子宮の湿潤重量を測定し、そして膣組織を収集した。この組織を上記のとおりに処理し、膣試料を慣習的なＨ＆Ｅでおよび子宮試料をＰＲ発現のために染色した。この膣上皮および角質化層の厚さを撮影し、Ｓｐｏｔ  ３．２．４．ソフトウエア（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して図４に記載するとおりに測定した。
【０１２３】
Ｐ媒介性脱落膜応答およびＥ２媒介性脱落膜応答を評価するために、以前に記載されたプロトコルを使用した（Ｌｙｄｏｎら，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．９：２２６６−２２７８（１９９５））；Ｘｕら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９：１９２２−１９２５（１９９８））。簡単に言うと、８週齢の雌マウスをＯＶＸし、そしてＯＶＸ後１０〜１２日目に、マウスをトウモロコシ油中のＥ２のＳ．Ｃ．注射で処置し（１００ｎｇ／日）、次いで、１６〜２３日目からＰ（１ｍｇ／日；Ｓｉｇｍａ）＋Ｅ２（６．７ｎｇ／日）で処置した。１８日目の３度目のＰ＋Ｅ２注射から６時間後、左側の子宮角（右側の角は、コントロールとして供された）を、頸部の近くにギザギザのついた針を挿入し、子宮角の全長を、子宮間膜に対して（ａｎｔｉｍｅｓｏｍｅｔｒｉａｌｌｙ）長軸方向に引っかくことによって外傷的に刺激した。このマウスを２３日目の最後のＰ＋Ｅ２注射から６時間後に屠殺し、そして左側および右側の子宮角の湿潤重量を測定した。
【０１２４】
正常な発達による乳房生成（ｍａｍｍｏｐｏｉｅｓｉｓ）、妊娠、および女性ホルモン処理に対する影響を測定するために、以下のプロトコルを使用した（Ｘｕら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７：６３７９−６３８４（２０００）；Ｘｕら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９：１９２２−１９２５（１９９８））。乳腺発達に対する正常な青春期発達の影響を測定するために、７週齢の処女雌マウスを屠殺した。さらに、最初の妊娠の１９日目に、妊娠した雌マウスを屠殺した。乳腺発達に対するＥ２＋Ｐ処置の影響を試験するために、８週齢の雌マウスをＯＶＸし、そしてＯＶＸ後１４日目に、０．１ｍｇのＥ２および１０ｍｇのＰ４を含有するＳ．Ｃ．２１日間放出ホルモンペレットまたはＳ．Ｃ．プラシーボペレット（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）で処置した。３５日目に、このマウスを屠殺し、そして子宮を湿潤状態で重さを量り、実際のホルモン放出を裏付けるために顕微鏡で分析した。全ての場合において、ホールマウントを第４乳腺から調製し、標準的な手順（Ｅｖａｎｓら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９：９８９−９９１（２０００））に従ってカルミン染色し、そして乳管と乳房脂肪パッド（ｍａｍｍａｒｙ  ｆａｔ  ｐａｄ）との間の関係、ブランチングの程度ならびにブランチの数を顕微鏡で調べた。
【０１２５】
テストステロンに対する応答を評価するために、１２週齢の雄マウスを精巣摘除（ＯＲＣ）し、精巣を湿潤状態で重量測定した（Ｘｕら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９：１９２２−１９２５（１９９８））。ＯＲＣの９日後、マウスをテストステロンのＳ．Ｃ．注射（３ｍｇ／ｋｇ／日，Ｓｉｇｍａ）またはビヒクルのみ（０．１ｍｌ  トウモロコシ油）で、９〜１５日間の間処置した。１６日目に、マウスを屠殺し、その前立腺および尿道前立腺部（技術的理由のため）を除去し、湿潤状態で重量測定した。
【０１２６】
（統計学分析）
独立スチューデントｔ−検定を、Ｐ＜０．０５を有意とみなして、統計学的評価手順として使用した。全ての結果を平均値±ＳＥＭ（平均値の標準誤差）または平均値±ＳＤ（定常時の標準偏差）として表した。フィッシャーの直接確率検定を使用して、ＥＲ陰性乳癌とＥＲ陽性乳癌との間の差異を、Ｐ＜０．０５を有意とみなして評価した。
【０１２７】
（メチル化アッセイ）
メチル化反応物（３０〜４０μｌ）は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、０．４ｍＭ  ＥＤＴＡ、親和性精製ＧＳＴ−ＲＩＺ１または免疫沈降産物、ヒト癌細胞（Ａ５４９またはＵ２ＯＳ）の酸抽出物から精製された遊離ヒストン（２０〜４０μｇ）、および３μｌ（１．６５μＣｉおよび２１ｐｍｏｌｅ）［メチル−３Ｈ］−アデノシルメチオニン（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を含有した。核抽出物を標準的な手順に従って調製し、そして免疫沈降に使用した。免疫沈降のために使用した抗血清は、抗ＫＧ７．１Ｓおよび以前に記載された免疫前血清（Ｂｕｙｓｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：４４６７−４４７１（１９９５））であった。類似のＨＭＴ活性もまた、異なる血清（データ示さず）、以前に記載された１７１５（Ｓｔｅｅｌｅ−Ｐｅｒｋｉｎｓら，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５：２２５０−２２６２（２００１））を使用する免疫沈降で観察された。様々な量のＳＡＨ（Ｓｉｇｍａ）をいくつかのメチル化反応物に加えた。
【０１２８】
Ｈ３およびＨ１におけるメチル化残基を決定するために、Ｈ３  Ｎ末端の１〜２０残基ペプチド（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、Ｋ９およびＫ１４における非アセチル化残基およびアセチル化残基、ならびにＨ１  Ｎ末端の１５〜３７および１２〜３１ペプチドを、上記のようなインビトロメチル化反応のための基質として使用した。この反応物をＴｒｉｓ−トリシン１０〜２０％ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に溶解させた後、蛍光光度分析した。３Ｈ−標識化Ｈ３またはＨ１ペプチドをＨＰＬＣによって精製し、そしてＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｍｏｄｅｌ  ４７７Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒにおいてアミノ末端から配列決定した。変換後、このサンプルをシンチレーション計数による放射活性の決定のために回収した。
【０１２９】
ノコダゾール（ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）処理した細胞由来のヒストンを５０ｎｇ／ｍｌのノコダゾールで４８時間処理したＵ２ＯＳ細胞の酸抽出によって単離した。ヒストン（２０  ｍｇ）を、λプロテインホスファターゼ（４００Ｕ）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で、緩衝液中において、３０℃で１時間処理した。コントロールのヒストンには、ホスファターゼをインキュベーション混合物から取り除くこと以外は同じ処理をした。
【０１３０】
（結果）
（ＲＩＺ１は、ＥＲおよびプロゲステロンレセプターの特異的コアクチベーターである）
ＲＩＺ１は、エストロゲンレセプター（ＥＲ）のコアクチベーターであることが示されている（Ａｂｂｏｎｄａｎｚａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：３１３０−３１３５（２０００）；Ｓｔｅｅｌｅ−Ｐｅｒｋｉｎｓら，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５：２２５０−２２６２  （２００１））。ＲＩＺ１のコアクチベーター機能をより理解するために、ＥＲに対するＲＩＺ１の効果を他のいくつかのＮＨＲに対するＲＩＺ１の効果と比較した。図１Ａに示すように、ＲＩＺ１は、リガンド依存様式および用量依存様式においてＥＲおよびプロゲステロンレセプター（ＰＲ）機能を増強した。対照的に、ＲＩＺ１は、アンドロゲンレセプター、レチノイン酸レセプターα（ＲＡＲα）、レチノイン酸Ｘレセプターα（ＲＸＲα）、甲状腺ホルモンレセプター（示さず）、糖質コルチコイドレセプター（示さず）およびビタミンＤレセプター（示さず）の活性に対してほとんど効果を有さなかった。同様のことがＥＲによっても見出され（Ｓｔｅｅｌｅ−Ｐｅｒｋｉｎｓら，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５：２２５０−２２６２（２００１））、ＲＩＺ２およびＲＩＺ１ミスセンス変異体（Ｃ１０６ＹおよびＩ１８８Ｖ）は、プロゲステロンレセプターを同時活性化できなかった（図１Ａ）。ＲＩＺのＬＸＸＬＬモチーフ中の点変異の導入はまた、プロゲステロンレセプターに対してコアクチベーターとして作用し得ないタンパク質を産生した（図１Ａ）。ＥＲおよびプロゲストロンレセプターに対するＲＩＺ１効果と一致して、ＲＩＺ１およびこれらのレセプターを含有するタンパク質複合体を、同時免疫沈降アッセイによって検出した（図１Ｂ）。従って、ＲＩＺ１は、エストロゲンレセプターおよびプロゲステロンレセプターの特異的コアクチベーターであるが、他の核ホルモンレセプターのコアクチベーターではなく、そして、ＲＩＺ１のインタクトなＰＲ／ＳＥＴ−ドメインが、その機能のために必須である。
【０１３１】
Ｅ２およびプロゲステロンの標的器官において、予測されるＲＩＺ発現を確認するために、ＲＩＺ発現を、免疫組織化学によって決定した。この遺伝子産物は、子宮（腺上皮および管腔上皮、ならびに間質細胞および子宮筋層細胞の両方を含む）において、ＥＲの発現と類似した、核染色を示した（図１Ｃ）。さらに、ＲＩＺを、乳房上皮および膣上皮の両方において発現させる。これらの試験のために、血清抗ＫＧ７．１Ｓ（これは、ＲＩＺ１およびＲＩＺ２の両方を認識する）を使用した（Ｂｕｙｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：４４６７−４４７１（１９９５）；Ｌｉｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２９８４−２９９１（１９９７））。この抗体からの陽性の結果は、おそらく、両方のタンパク質の発現を反映する。なぜなら、これらのタンパク質は、大部分の組織において同時発現されるからである（Ｂｕｙｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：４４６７−４４７１（１９９５）；Ｌｉｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２９８４−２９９１（１９９７））。それにもかかわらず、ＲＩＺ１とＲＩＺ２とを区別し得るプライマーセットを使用するＲＴ−ＰＣＲ分析によって、ＲＩＺ１は、実際には、女性ステロイドホルモンの種々の標的組織において発現されることが確認された（図１Ｄ）。
【０１３２】
（ＲＩＺ１欠損雌マウスの標的組織における部分的ホルモン耐性）
ＲＩＺ１変異マウスは、ＲＩＺ１を欠損しているが、ＲＩＺ２を欠損しておらず、そのため、特に、このＲＩＺ１遺伝子のすべてのＰＲドメイン関連機能を欠損している（Ｓｔｅｅｌｅ−Ｐｅｒｋｉｎｓら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５：２２５０−２２６２（２００１））。これらの動物は、生存可能でかつ妊娠可能であり、そして全体的な発生上の欠損を示さない（Ｓｔｅｅｌｅ−Ｐｅｒｋｉｎｓら、前出（２００１））。ステロイドホルモン作用におけるＲＩＺ１の生理学的役割を決定するために、Ｅ２に応答した子宮成長を、卵巣切除した（ＯＶＸｅｄ）マウス（Ｌｕｂａｈｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１１１６２−１１１６６（１９９３））において、最初に試験した。野生型またはヘテロ接合性のＲＩＺ１変異マウスは、Ｅ２処置に対して応答し、子宮の湿重量が、５．３±０．５倍増加および５．４±０．４倍増加した。ホモ接合性ＲＩＺ１変異体の子宮は、約３．７±０．４倍のより少量の増加を示した（＋／＋  対  −／−について、Ｐ＜０．００１；図２ＡおよびＢ）。機械的外傷（脱落膜刺激）に対する子宮の応答は、主に、プロゲステロンレセプター依存性プロセスである（Ｌｙｄｏｎら、Ｇｅｎｅ  Ｄｅｖ．９：２２６６−２２７８（１９９５））。ＯＶＸｅｄマウスを、高用量のプロゲステロンおよび低用量のＥ２で処置し、続いて、各動物の左子宮角を機械的に刺激した。刺激していない左子宮角は、コントロールとして役立てた。脱落膜応答は、子宮角サイズの増加を生じ、そしてこれは、野生型マウスの刺激した左子宮角において一貫して観察された。部分的な応答のみが、ＲＩＺ１ヌル変異体の子宮角において観察された（図２Ｃ）。これらの結果は、ＲＩＺ１が、インビボにおいて、Ｅ２およびプロゲステロンに対して最大の子宮応答のために必要とされることを示唆する。
【０１３３】
３日間のＥ２処置に応答した腟角化を、ＯＶＸｅｄマウスにおいて試験した。このホルモンは、膣肥厚の増加およびその上皮の角化を生じる（Ｌｕｂａｈｎら、前出（１９９３））。このことが、野生型マウスにおいて一貫して見られた（図２Ｄ、Ｅ）。しかし、ＲＩＺ１ヌル雌マウスは、このような最大応答を示さず、従って、このことは、ＲＩＺ１がインビボでＥ２に対する膣応答のために必要とされることを示唆する。
【０１３４】
次いで、子宮の上皮区画および間質区画を、プロゲステロンレセプター発現のＥ２誘導性変化について分析した。ＥＲによるこのような調節は、非常に区画特異的であり、発情周期の間の子宮における変化を模倣する（Ｔｉｂｂｅｔｔｓら、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５９：１１４３−１１５２（１９９８））。ビヒクルで処置したＯＶＸｅｄ  ＲＩＺ１  ＋／＋マウスおよびＯＶＸｅｄ  ＲＩＺ１  −／−マウスにおけるプロゲステロンレセプター染色は、明らかに類似しており、管腔上皮（ＬＥ）および腺上皮（ＧＥ）の両方のほとんど全ての細胞において、強力な免疫反応性を示したが、間質細胞および子宮筋層細胞の画分のみが、ポジティブであった（図２Ｇ、データは示さず）。予測されたように、野生型動物のＥ２処置は、プロゲステロンレセプター発現に対して二重の効果を有した。この効果は、ＬＥにおけるレベルを低下させること、ならびに間質区画および子宮筋層区画におけるレベルを増加させることである。ＧＥにおける免疫反応性は変化しなかった、このことは、Ｅ２単独ではこの区画におけるプロゲステロンレセプター発現を調節しないことを示した以前の知見と一致している（図２Ｆ、Ｇ）（Ｔｉｂｅｔｔｓら、前出（１９９８））。ＲＩＺ１欠損動物のＥ２処置の際に、ＬＥにおけるプロゲステロンレセプターレベルの低下は、野生型組織におけるプロゲステロンレセプターレベルの低下の１／８倍であり、そして間質および子宮筋層におけるレセプターレベルの増加は、正常よりもほぼ１／２倍であった。これらの知見は、ＲＩＺ１が子宮におけるプロゲステロンレセプター発現のＥ２調節において役割を担っていることを示唆する。
【０１３５】
ステロイドホルモンは、乳汁生成（ｍａｍｍｏｐｏｉｅｓｉｓ）において重要な役割を担っている（ＨｅｎｎｉｇｈａｕｓｅｎおよびＲｏｂｉｎｓｏｎ，Ｇｅｎｅ  Ｄｅｖ．１２：４４９−４５５（１９９８））。Ｅ２およびプロゲステロンの両方が、妊娠中の肺胞発生のために必須である。７週齢の野生型雌において、乳管は、乳房の脂肪パッドへと成長し始めたが、年齢の一致したＲＩＺ１ヌル変異体において、明確な差異を有さなかった（図３ＡおよびＢ）。しかし、妊娠によって刺激された場合、野生型乳腺における肺胞性構造は、高度に発達し、そして全ての管部分に現れ、管内空間を満たした。ＲＩＺ１変異乳腺において、肺胞は、その肺胞の数およびサイズの点では、全く発達せず、わずかな肺胞が、妊娠の同じ段階において管の末端にて観察された（図３Ｃ〜Ｆ）。ＲＩＺ１ヌル変異体の乳腺は、依然として乳汁を生成し得るが、これらの結果は、ＲＩＺ１が、妊娠中にインビボでの正常な乳管伸長および肺胞発生のために必要とされることを示唆する。ＯＶＸｅｄ成体マウスにおいて、Ｅ２処置およびプロゲステロン処置に応答した乳腺の発達もまた、試験した。Ｅ２およびプロゲステロンは、野生型マウスの乳腺において複雑な管の分枝および広範な肺胞形成を刺激した。これは、妊娠初期の乳汁生成の段階を模倣する。ＲＩＺ１変異マウスの乳腺においては、ホルモン処置の後に、部分的な管成長のみが観察された（図３Ｇ〜Ｊ）。従って、ＲＩＺ１は、Ｅ２およびプロゲステロンに応答した乳腺の効率的な増殖および分化のために必要とされるようである。
【０１３６】
（ＲＩＺ１欠損雄マウスにおける正常なステロイドホルモン応答）
ＲＩＺ１は雄性ステロイドホルモンの標的組織（例えば、精巣）において発現され（Ｂｕｙｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：４４６７−４４７１（１９９５））るが、アンドロゲンレセプターのためのコアクチベーターとして働くようには見えない（図１Ａ）。このことをさらに研究するために、前立腺の成長を、アンドロゲンで処置した後に精巣摘出した雄マウスにおいて測定した。雌マウスと同様に、総体重における差異は、ＲＩＺ１ヌル変異雄性動物において全く注目されなかった（表１）。
【０１３７】
【表１】
2005503131.tif 000002
精巣摘出の８日後、野生型動物および変異動物の両方の前立腺は、退行した。７日間にわたるテストステロンの注射は、野生型動物およびＲＩＺ１ヌル動物における前立腺成長を刺激した。野生型動物およびＲＩＺ１ヌル変異動物は、体重に対する前立腺および尿道の重量比が類似していた（１．１９±０．０３  対  １．１４±０．０３；＋／＋および−／−のそれぞれについて、ｎ＝１０匹および９匹（マウス）；ｐ＝０．２３）。野生型動物およびＲＩＺ１ヌル変異動物はまた、体重に対する精巣重量比が類似していた（７．７±０．４  対  ７．４±０．４；両方の遺伝子型について、ｎ＝１４；ｐ＝０．５８）。従って、テストステロンに対する組織応答は、ＲＩＺ１を欠損しているマウスにおいて、有意には影響を及ぼさず、これは、アンドロゲンレセプタートランス活性化機能に対する遺伝子の効果の欠損と一致している（図１Ａ）。
【０１３８】
（ＲＩＺ１欠損雌マウスによる、同腹仔サイズの低下）
ＲＩＺ１変異マウスの生殖能力を評価した。雌のＲＩＺ１  −／−マウスを、雄のＲＩＺ１  ＋／−マウスと交配させ、コントロールとして、雌のＲＩＺ１  ＋／−マウスを、雄のＲＩＺ１  −／−マウスと交配させた。また、ヘテロ接合性変異体の間で、交配を行った。ＲＩＺ１  −／−雌マウス×ＲＩＺ１  ＋／−雄マウスの交配からの平均同腹仔サイズは、６．６±３．２（標準偏差；ｎ＝３５匹の同腹仔）であったが、ＲＩＺ１  ＋／−雌マウス×ＲＩＺ１  −／−雄マウスの交配の同腹仔については、平均同腹仔サイズは、８．４±２．０（ｎ＝２０匹の同腹仔）であり（Ｐ＜０．０１）、そしてヘテロ接合性マウス間での交配の同腹仔については、平均同腹仔サイズは、８．０±２．２（ｎ＝５０匹の同腹仔）であった（Ｐ＜０．０２）。これらの結果は、ＲＩＺ１が欠損した雌（雄ではない）マウスに関係するわずかに弱まった生殖能力を示し、これは、雄動物（雌動物ではない）においてステロイドに対する欠損性組織応答を示した上記の結果と一致している。
【０１３９】
（ＲＩＺ１およびＲＩＺ２による、乳癌におけるＥＲ依存性転写の調節）
上記の結果は、正常組織のＥ２応答におけるＲＩＺ１の生理学的役割を示唆する。ＲＩＺ１の腫瘍サプレッサーの役割を考慮して、ＲＩＺが乳癌細胞のＥ２応答における役割もまた担うか否かという疑問を問いただした。ＲＩＺ１は、しばしば欠失しているが、ＲＩＺ２は、一様に乳癌中に存在している（Ｈｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：４２３８−４２４４（１９９８）；ＪｉａｎｇおよびＨｕａｎｇ，Ｈｉｓｔｏｌ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．１５：１０９−１１７（２０００））。ＲＩＺ２は、ＥＲのコアクチベーターとして働かず、実際には、ＲＩＺ１のコアクチベーター機能を無効にし得る（Ｓｔｅｅｌｅ−Ｐｅｒｋｉｎｓら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５：２２５０−２２６２（２００１））。従って、ＭＣＦ−７において過剰発現したＲＩＺ１およびＲＩＺ２の効力を、ＥＲおよびＲＩＺ１を発現する乳癌細胞において試験した（Ｈｅら、前出（１９９８））。ＥＲＥ−ｔｒ−ＣＡＴレセプターを用いてＭＣＦ−７細胞に同時トランスフェクトした場合、ＲＩＺ１は、エストロゲン誘導性レセプター活性を増加した（図４Ａ）。対照的に、Ｅ２誘導性レセプター遺伝子転写は、ＲＩＺ２発現によって抑制された。ＥＲを欠いたＣＶ−１細胞において、レセプター遺伝子発現は、ＲＩＺ１、ＲＩＺ２、およびＥ２によって影響を受けなかった（図４Ｂ）。このデータは、ＲＩＺ１が、Ｅ２に対して乳癌を感作し得ること、およびＲＩＺ２発現によって達成されるような、低下したＲＩＺ１活性が、乳癌のＥ２感受性を阻害し得ることを示唆する。
【０１４０】
（ホルモン耐性乳癌におけるＲＩＺ１遺伝子サイレンシング）
上記の研究によって示されるように、ＲＩＺ１がＥ２媒介性正常癌増殖およびＥ２媒介性乳癌増殖を促進するようである場合、ＲＩＺ１はまた、なぜ腫瘍サプレッサーであり、そしてしばしば乳癌においてサイレンスであるのだろうか（Ｈｅら、前出（１９９８））。公開されたデータの再分析によって、ＲＩＺ１欠失は、試験された乳癌細胞株の間の（ＥＲ状態によって表わされるような）ホルモン耐性に関連することが見出された（表２）。
【０１４１】
メチル化特異的ＰＣＲが、ＲＩＺ１プロモーターのメチル化を試験するために開発された。これは、ＤＮＡメチル化が、腫瘍細胞株および組織におけるＲＩＺ１  ｍＲＮＡ発現の損失または減少の良好な指標であることを示した（Ｄｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２２：８０９４−８０９９（２００１））。ＲＩＺ１プロモーターのメチル化は、乳癌組織において共通していることが見出された（試験した２５個の乳癌組織のうち１１個の乳癌組織において生じた）。ＢＴ２０細胞株およびＺＲ７５−１細胞株を除いて、表２のｍＲＮＡ発現データは、Ｈｅら、前出（１９９８）からのデータである。正常の１０％より低い発現レベルを、ネガティブ（−）とスコア付けした。
【０１４２】
【表２】
2005503131.tif 000003
ＲＩＺ１と乳癌組織のホルモン応答性との間の関係に取り組むために、ＥＲ発現状態を、組織切片が利用可能な、２５個のサンプルのうちの１８個について試験した。ＥＲ発現を、免役組織化学によって決定し（１０％より低い陽性を、ネガティブとみなした）、そしてこれらのサンプルのメチル化状態を認識することなく、二重盲検様式でスコア付けした。これらの結果は、ＥＲネガティブ腫瘍がＲＩＺ１ネガティブである傾向があるという、細胞株において以前に見出された傾向と同じ傾向を示した（表３）。
【０１４３】
【表３】
2005503131.tif 000004
従って、６つのＥＲネガティブ症例のうちの５つの症例は、１２のＥＲポジティブ症例のうちの５つの症例と比較して、ＲＩＺ１ネガティブであった。細胞株からのデータと一緒に、これらの結果は、ＲＩＺ１サイレンシングとＥＲネガティブ乳癌との間に有意な関連性があることを示す（１２個のＥＲネガティブサンプルのうち９個のサンプルにおいて見出されるＲＩＺ１サイレンシング  対  １６個のＥＲポジティブサンプルのうち５個のサンプルにおいて見出されるＲＩＺ１サイレンシング、ｐ＜０．０５）。これらの結果はまた、ＥＲポジティブ癌組織のほぼ半分（１２個のうち５個）が、ＲＩＺ１ネガティブであったことを示しており、これは、ＥＲポジティブ乳癌のホルモン耐性の発生におけるＲＩＺ１サイレンシングの潜在的な役割を示す。総合すると、これらの研究は、ＥＲの存在または非存在、次に、乳癌疾患の初期段階または後期段階に関連した、乳癌におけるＲＩＺ１の二重状態を示す。遺伝子の二重状態は、腫瘍サプレッサーおよびＥＲ／Ｅ２依存性腫瘍プロモーターとしての、この遺伝子の二重の役割と一致するようである（以下の議論を参照のこと）。
【０１４４】
（ＲＩＺ１のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性およびエストロゲンによる調節）
本明細書中および以前に示された動物ノックアウト研究の結果（Ｓｔｅｅｌｅ−Ｐｅｒｋｉｎｓら、前出（２００１））、ならびに上で議論した、乳癌細胞におけるＲＩＺ１の二重の役割は、ＥＲコアクチベーター／増殖プロモーターおよび腫瘍サプレッサーとしてのＲＩＺ１の生理学的役割を示唆する。これらの動物または腫瘍に欠けているのは、ＲＩＺ１のＰＲドメインのみであるので、ＲＩＺ２の正常な発現に起因して、ＲＩＺ１が、ＥＲコアクチベーター／増殖プロモーターおよび腫瘍サプレッサーとしての二重機能を説明し得る活性を有するか否を求めた。
【０１４５】
ＲＩＺ１のＮ末端ＰＲドメイン領域の組換えＧＳＴ融合タンパク質を、細菌中で調製した。この組換えタンパク質を精製し、そして基質としてヒストンを使用し、メチル基ドナーとしてＳ−アデノシル−［メチル−３Ｈ］−Ｌ−メチオニンを使用して、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性についてアッセイした。反応生成物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そして蛍光間接撮影法によって視覚化した。ヒストンＨ４の特異的標識が、ＲＩＺ１の残基１〜２００からなる、精製したＧＳＴ産物の存在下で観察された（図５Ａ）。ＧＳＴ単独または残基１〜１６１からなるタンパク質は、ＨＭＴ活性を欠如した。さらに、腫瘍において見出されるミスセンス変異（Ｃ１０６Ｙ、Ｉ１８８Ｖ、およびＡ１５９Ｖ）は、ＨＭＴ活性を無効にした。この結果は、ＲＩＺ１がＨＭＴ活性を有し、ＨＭＴ活性は、保存されたＰＲドメイン（残基３０〜１６０）およびＰＲドメインのＣ末端側にある非保存残基（残基１６２〜２００）を必要とすることを示唆する。
【０１４６】
次いで、ＰＲドメインのＨＭＴ活性が、ＲＩＺ１のさらなる配列により改変され得るか否かを、細菌内で作られるより長いＲＩＺ１のＮ末端フラグメントを試験することによって調べた。Ｎ末端３３２残基のペプチドを発現するＧＳＴ融合タンパク質は、メチル化Ｈ４におけるＮ末端２００残基のペプチドに対して同様の活性を示した（図５Ｂ）。細菌において、さらにより長いペプチド（５２０残基）を試験する試みは、タンパク質の収量が低かったために、首尾よくなかった。この結果は、残基２００〜３３２は、ＨＭＴ活性に本質的には寄与し得ないが、Ｎ末端２００残基領域のＨＭＴ活性の調節における役割を担うことからＲＩＺ１の他の領域（３３３〜１７１９）を除外し得なかったことを示唆する。
【０１４７】
ＲＩＺ１タンパク質のＣ末端（アミノ酸１５１４〜１６８０）に位置するドメインは、ＲＩＺ１のＰＲドメインに結合し得ることが以前に規定された（Ｈｕａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ.２７３：１５９３３〜１５９４０（１９９８））。次いで、ＰＢＤすなわちＰＲ−結合ドメインと称されるこのドメインが、ＰＲ  ＨＭＴ活性を調節し得るか否かを調べた。先に記載したＧＳＴ融合タンパク質（ＧＳＴ−ｈＲＩＺ１（１５１４〜１６８０））またはここでＧＳＴＲＩＺＰＢＤと称されるタンパク質を、ＧＳＴＲＩＺ３３２のＨＭＴ活性に対するその効果について調べた。予想外に、ＧＳＴＲＩＺＰＢＤタンパク質は、単独で、特にＨ４に対するＨＭＴ活性を示し、このことは、ＲＩＺ  ＰＢＤドメインがメチルトランスフェラーゼの新規の触媒モチーフを示すことを示唆する。Ｈ４の増加したメチル化およびＨ１の分子量と類似の分子量を有する新しい基質のメチル化によって示されるように、ＧＳＴＲＩＺ３２２およびＧＳＴＲＩＺＰＢＤの両方がＨＭＴ反応中に存在する場合、ＨＭＴ活性の（相加的効果よりも）相乗的促進が観察された（図５Ｃ）。この結果は、ＰＲドメインＨＭＴ活性が、ＲＩＺ１の他の領域（例えば、ＰＢＤドメイン）により調節され得ることを示唆する。
【０１４８】
次いで、哺乳動物細胞由来の全長ＲＩＺ１タンパク質の酵素活性をアッセイした。ＲＩＺ１をほとんど発現しないヒト骨肉腫Ｕ２ＯＳ細胞（Ｈｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：４２３８〜４２４４（１９９８））を、ＡｄＲＩＺ１ウイルスまたはコントロールＡｄＮｕｌｌウイルスで感染させ、そしてウイルス感染細胞由来の核抽出物を、ＲＩＺ血清抗ＫＧ７．１Ｓまたは免疫前の血清で免疫沈降させた。ＲＩＺ１を発現する抽出物由来のＲＩＺ１血清による免疫沈降生成物は、Ｈ１、Ｈ３およびＨ４のメチル化を引き起こした（図６Ａ）。同様の結果をまた、異なるＲＩＺ１抗血清１７１５を用いて得た（データは示さず）。コントロールとして、免疫前の血清の免疫沈降物について、またはＲＩＺ１ネガティブな核抽出物を免疫沈降に用いた場合、ＨＭＴ活性が検出されなかった。
【０１４９】
このデータは、哺乳動物細胞のＲＩＺ１タンパク質が、細菌から得られる短縮型なタンパク質の活性と一致するＨＭＴ活性を有することを示す（図５）。しかし、全長のタンパク質は、細菌由来の短縮型タンパク質より多くのヒストン基質を標的化するようである。なぜならおそらく、このタンパク質が、細菌が発現したタンパク質で欠失している配列もしくは改変またはこれらの両方を有するからである。この結果は、ＰＲドメインのＨＭＴ活性を調節するＲＩＺタンパク質の他の領域と一致する。
【０１５０】
腫瘍の抑制におけるＲＩＺ１の役割を考慮して、Ｓ−アデノシルホモシステイン（ＳＡＭ）、異常な蓄積が発癌性に関連するＳＡＭ−依存性メチルトランスフェラーゼのアナログインヒビターである、ＲＩＺ１酵素活性を阻害し得るか否かを決定した。免疫沈降したＲＩＺ１によるヒストンのインビトロでのメチル化に対するＳＡＨの効果を試験した。メチル化アッセイを、０μＭ、０．５μＭおよび５μＭのＳＡＨ、ならびに０．４２μＭの３Ｈ−ＳＡＭの存在下で実施した。ＲＩＺ１によるヒストンメチル化は、０．５μＭのＳＡＨにより部分的に阻害され、そして５μＭのＳＡＨにより完全に阻害された（図６Ｂ）。この結果は、ＳＡＨがＲＩＺ１メチルトランスフェラーゼのインヒビターであることを示す。
【０１５１】
ヒストンＨ３のメチル化された４位および９位のリジン残基は、それらの生物学的な機能に関して最も特徴付けられたヒストンリジンのメチル化である。Ｈ３−Ｋ９のメチル化は、遺伝子の抑制およびヘテロクロマチン形成に関連する一方、Ｈ３−Ｋ４のメチル化は、しばしば遺伝子活性化に関連する（Ｎｏｍａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３：１１５０〜１１５５（２００１）；Ｒｅａら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０６：５９３〜５９９（２０００）；Ｓｔｒａｈｌら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１１：１〜５（２００１））。２つのリジン残基の各々は、いくつかの異なるＳＥＴドメインＨＭＴにより標的化され得、これらのドメインは、Ｋ４特異的またはＫ９特異的のいずれかであって両方に特異的ではなく、そしてしばしば非Ｈ３基質（例えばＨ１）を有する（Ｎｉｓｈｉｏｋａら、Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．１６：４７９〜４８９（２００２）；Ｒｅａら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０６：５９３〜５９９（２０００）；Ｔａｃｈｉｂａｎａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２５３０９〜２５３１７（２００１）；Ｗａｎｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．８：１２０７〜１２１７（２００１ａ））。ＲＩＺ１がＨ３−Ｋ４特異的ＨＭＴまたはＨ３−Ｋ９特異的ＨＭＴのような群に属し得るか否かを決定することは、転写においてＲＩＺ１がどのように機能するかを直ちに説明し得る。従って、ＲＩＺ１がＨ３−Ｋ４またはＨ３―Ｋ９に対する任意の活性を有し得るか否かを決定した。第一に、ＲＩＺ１が、これらの残基のメチル化を哺乳動物細胞においてインビボで変化し得るか否かを決定した。ヒストンを、ＡｄＲＩＺ１またはコントロールウイルスで感染させたＵ２０Ｓ細胞から抽出し、そしてＨ３−Ｋ９メチル化またはＨ３−Ｋ４メチル化を特異的に認識する抗体を用いるウェスタンブロット分析により分析した。この結果は、ＲＩＺ１がＨ３−Ｋ９メチル化を増加させるが、Ｈ３−Ｋ４メチル化には影響を及ぼさないことを示し（図６Ｃ）、ＲＩＺ１メチルトランスフェラーゼの潜在的な標的としてのＨ３−Ｋ９と一致するが、Ｈ３−Ｋ４とは一致しない。
【０１５２】
ＲＩＺ１がＨ３−Ｋ９を直接メチル化し得ることを示す、ペプチドメチル化および配列決定実験を実施した。Ｈ３のＮ末端の１〜２０残基を含むペプチドを、メチルドナーとしてＳ−アデノシル−［メチル−３Ｈ］−Ｌ−メチオニンを用いた免疫沈降ＲＩＺ１タンパク質により、インビトロで完全にメチル化した（図６Ｄ）。対照的に、アセチル化したＫ９およびＫ１４を含むペプチドはメチル化されず、ＲＩＺ１の標的としてのＫ９とは一致するがＫ４とは一致しない。ダブレットとしてのこのペプチドの移動はまた、他社によっても観察されており、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの不完全な分解に起因し得る。次いで、メチル化したペプチドをＨＰＬＣによって精製し、ペプチド配列決定分析に供した。精製したペプチドを、アミノ末端から配列決定し、そしてこの配列決定した残基の各々の放射活性を、シンチレーション計測によって決定した。９位のリジンで、単一の放射活性のピークを観察した（図６Ｅ）。この結果は、Ｈ３−Ｋ９（Ｈ３−Ｋ４ではない）はＲＩＺ１メチルトランスフェラーゼの標的であることを示す。
【０１５３】
次いで、Ｈ１のメチル化可能な部位を決定した。Ｈ１ペプチド（１５〜３７ａａ）を、ＲＩＺ１によってインビトロでメチル化し、次いでＨＰＬＣ精製および配列決定分析に供した。メチル化の繰り返しおよび配列分析は、２５位のリジンがＲＩＺ１によってメチル化されたことを示した（図６Ｆ）。
【０１５４】
Ｋ９特異的な様式でＨ３をメチル化する能力は、転写の抑制におけるＲＩＺ１についての役割を示唆し、このことは、ＥＲコアクチベーターとしてのＲＩＺ１の役割と矛盾するようである。この明らかな矛盾の理解を助けるために、ＲＩＺ１  ＨＭＴ活性に対するエストロジェンの効果を調べた。コントロールおよびＥ２処理したＭＣＦ−７細胞由来の核抽出物を、ＲＩＺ１血清抗ＫＧ７．１Ｓまたは免疫前の血清により免疫沈降した。期待したように、ＨＭＴ活性（Ｈ３およびＨ１を標識する）を、ＲＩＺ１血清の免疫沈降物において検出したが、免疫前の血清では検出しなかった（図７Ａ、レーン１およびレーン３）。興味深いことに、エストロジェン処理はＨ３メチル化を減少させたが、ＲＩＺ１によるＨ１メチル化は維持されたかまたは僅かに促進された（図７Ａ、レーン４）。ＲＮａｓｅ保護分析では、ＭＣＦ−７細胞のＥ２処理により変化したＲＩＺ１遺伝子発現またはＲＩＺ２遺伝子発現は示されなかった（データは示さず）。さらに、Ｅ２はまた、ＡｄＲＩＺ１ウイルス感染ＭＣＦ−７細胞における過剰発現ＲＩＺ１タンパク質のＨＭＴ活性を同様に調節した（図７Ａ、レーン５〜レーン６）；コントロールウイルスで感染させた細胞は、非感染細胞と同様の結果を示した（データは示さず）。従って、Ｅ２は、Ｈ１ではなくＨ３のメチル化を特異的に阻害する選択的方法で、ＲＩＺ１  ＨＭＴ活性を調節するようである。このデータは、Ｅ２が、おそらく転写リプレッサーおよび転写アクチベーターの二重の役割を有する、ＲＩＺ１を、Ｈ３メチル化によって表されるようなそのリプレッサー活性を選択的にオフする一方で、おそらくＨ１メチル化によって表されるその推定のアクチベーター活性を促進することにより転写アクチベーターに変化させ得ることを示唆する。
【０１５５】
特徴付けられるべきＨ１メチル化の機能は残されている一方で、本発明の結果は、ＲＩＺ１のＨ１のＲＩＺ１メチル化およびＨ３−Ｋ９メチル化の２つのメチル化活性の対照的な動態を考慮すると、少なくとも類似していないようであることを示唆する。Ｈ１リン酸化は転写の活性化に関与している（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２１：５４１７〜５４２５（２００１）；ＤｏｕおよびＧｏｒｏｖｓｋｙ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．６：２２５〜２３１（２０００））ので、次いで、Ｅ２またはＲＩＺ１が、Ｈ１リン酸化を増強し得るか否かを試験した。ヒストンを、ＡｄＲＩＺ１ウイルスまたはコントロールウイルスで感染させたＭＣＦ７細胞から抽出し、そしてリン酸化Ｈ１を特異的に認識する抗体を用いるウエスタンブロット分析により分析した。この結果は、Ｅ２およびＲＩＺ１の両方がＨ１リン酸化を増加させることを示し（図７Ｂ）、Ｅ２またはＲＩＺ１が、促進されたＨ１リン酸化を介して、部分的に転写を刺激するように機能し得ることを示唆する。ＲＩＺ１のＨ１メチル化がＨ１−リン酸化にポジティブに相関したことは、そのようなメチル化が、転写の活性化に相関することを示唆する。
【０１５６】
次いで、リン酸化Ｈ１のメチル受容能力を、非リン酸化Ｈ１または過リン酸化Ｈ１と比較した。ノコダゾール（ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）によってＧ２／Ｍ期に停止させた細胞よりヒストンを単離した。このヒストンは、リン酸化Ｈ１に富んでおり、そしてこのヒストンを、ＲＩＺ１によるインビトロでのメチル化のための基質として使用した。ノコダゾール処理細胞由来のＨ１は、コントロール細胞由来のＨ１と比較して、不十分な基質として働くようである（示さず）。この結果は、ノコダゾール処理細胞より単離されたＨ１がリン酸化およびメチル化の両方がなされていること、またはＨ１のリン酸化がそのメチル化を妨げ得ることかのいずれかであることを示唆する。このことを解明するために、ヒストンを、メチル化基質として使用する前にホスファターゼを用いて処理した。ホスファターゼ処理は、Ｈ１上のかなりの量のホスフェートを除去したが、Ｈ１がメチル化基質として働く能力には影響しなかった（示さず）。合わせると、これらの結果は、リン酸化Ｈ１が非リン酸化Ｈ１または過リン酸化Ｈ１よりも高度にメチル化されることと関連すること、およびメチル化Ｈ１が非メチル化Ｈ１または過メチル化Ｈ１よりも高度にリン酸化されることと関連することを示唆する。
【０１５７】
次いで、Ｅ２処理に対する、ＲＩＺ１メチル化活性の時間経過応答を研究した。ＲＩＺ１のＨ３メチル化活性の低下を、Ｅ２処理の４時間後に見出した。これらは、その後、低レベルのまま持続された（示さず）。Ｅ２誘導性細胞増殖が処理の少なくとも８時間前に起こることは知られていないので、これらのデータは、Ｅ２によるＲＩＺ１のＨ３メチル化活性の阻害が細胞増殖の結果ではなさそうであることを示唆する。
【０１５８】
Ｅ２（増殖因子）がＲＩＺ１によるＨ３のメチル化に対して持続性の阻害効果を有するが、Ｈ１に対しては有さないことの観察は、ＲＩＺ１のＨ３メチル化活性およびＨ１メチル化活性が細胞増殖と相対して結び付けられ得ることを示唆する。Ｈ１メチル化およびＨ３メチル化の対向性の挙動をさらに研究するために、モデル系として、Ｕ９３７骨髄白血病細胞の１２−Ｏ−テトラデカノイル−ホルボール−１３−アセテート（ＴＰＡ）処理を使用して、細胞増殖によるＲＩＺ１  ＨＭＴ活性の調節を試験した。Ｕ９３７細胞は、ＴＰＡに曝される場合、増殖停止、および単球への終末分化を行う。この細胞モデルを、研究のために選択した。なぜなら、これらの細胞において、ＲＩＺ遺伝子発現がＴＰＡによって極僅かにしか調節されないことが示されているからである。ＴＰＡ処理の３日後以降まで、ＲＩＺ１  ｍＲＮＡが僅かに増加（２倍未満）したが、ＲＩＺ２レベルが全く変化しなかったことを観察しなかった（Ｇａｚｚｅｒｒｏら、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７：５５２−５６０（２００１））。したがって、ＨＭＴ活性の有意な変化（特に減少）は、少なくとも処理の最初の３日以内では、ＲＩＺ１タンパク質量の変化のためではあり得ない。Ｕ９３７の細胞増殖および分化に対するＴＰＡの効果を、細胞数を計数することおよび細胞形態を試験することによって確認した（示さず）。ＲＩＺ遺伝子発現がＴＰＡ処理の最初の３日以内では有意には変動しないことをまた確認した。核抽出物からのＲＩＺ１免疫沈降物のＨＭＴ活性をアッセイすることによって、Ｈ３メチル化が増加したことを見出したが、Ｈ１メチル化はＴＰＡ処理の２４時間後に僅かに減少した（示さず）。同様の結果を、ＴＰＡ処理の３日後または７日後に観察したが、Ｈ３メチル化活性は処理の１日後の活性よりも低いことが注目された。２４時間未満の任意の処理期間にわたって、ＨＭＴ活性に有意な変化がないことが注目された。ＴＰＡ処理の２４時間後の変化は、任意の有意な増殖停止が起こる前に十分であった。このことは、このような変化が増殖停止の結果ではなさそうであることを示唆する。これらの結果は、ＲＩＺ１のＨ３メチル化活性が増殖停止と関連するが、ＲＩＺ１のＨ１メチル化活性は細胞増殖と関連することを示唆し、このことは、Ｅ２に応答したこれらの活性の、上記の対向性の挙動を追認する。
【０１５９】
（考察）
上記の結果は、ＲＩＺ１欠損雌マウスがＥ２およびプロゲステロンに対する不十分な応答、および低減した生殖能を提示することを示す。ＲＩＺ１は、ＥＲおよびプロゲステロンレセプターについてのコアクチベーター活性を示すが、他の試験したＮＨＲについては、全く活性を示さないかまたは弱い活性を示した。さらに、これらの結果は、コアクチベーター（ＲＩＺ１）が、初期段階の乳癌においてＥ２依存性増殖プロモーターおよびエストロゲン非依存性状態への乳癌の進行を妨げる腫瘍サプレッサーの両方として働き得ることを示唆する。乳癌細胞においてエストロゲン媒介性転写活性化は、ＲＩＺ１アンタゴニスト（ＲＩＺ２）によって抑制され、そしてホルモン耐性乳癌は、より通常、ホルモン感受性乳癌よりもサイレントなＲＩＺ１遺伝子を保有する。これらのデータは、ＲＩＺ１がＨＭＴ活性を有し、ＨＭＴ活性が、２つの独立であるが相互作用する触媒モチーフによって媒介されることを示唆する。ＰＲドメインのＨＭＴ活性は、そのＥＲコアクチベーターの機能および腫瘍抑制機能の両方と結びつく。このコアクチベーター機能を不活性化するＰＲドメイン中の癌関連変異は、ＨＭＴ活性を損なう。また、ＲＩＺ１のＨＭＴ活性は、ＥＲコアクチベーターとしてのＲＩＺ１の役割と一致した様式で、Ｅ２によって調節され得る。
【０１６０】
雌性の性ＮＨＲとの相互作用におけるＲＩＺ１の特異性は、この観点においてより乱雑的であるようである、ＳＲＣ−１／ｐ１６０ファミリーメンバーのうちのメンバーと対照的である。従って、ＳＲＣ欠損動物に対して、ＲＩＺ１欠損マウスについて、より微妙な表現型が予想され得る。実際に、これは、ＳＲＣメンバーを欠損した動物の中で最も穏やかな表現型を示す、まさにＳＲＣ−１欠損マウスと比較した場合である（Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１３５４９−１３５５４（２０００）；Ｘｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：６３７９−６３８４（２０００）；Ｘｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９：１９２２−１９２５（１９９８））。ＳＲＣ−１欠損雌動物およびＲＩＺ１欠損雌動物は、雌性性ホルモンに対して同様の低減した感受性を示すが、ＲＩＺ１とは異なりＳＲＣ−１変異はまた、処女マウスにおける思春期中の乳管の成長および雄性におけるホルモン応答に影響する。ＲＩＺ１欠損マウスおよびＳＲＣ−１欠損マウスにおいて観察される、部分的にホルモン耐性である表現型は、ＲＩＺ１関連タンパク質およびＳＲＣ−１関連タンパク質の重複する機能を反映するようであり、それら機能については、多くのものが存在する。すなわち、これはＥＲ機能に対するＲＩＺ１およびＳＲＣ−１のさらなる効果に関連し得る。低減したＨ３−Ｋ９メチル化は、ＲＩＺ１のＥ２阻害によって誘導される場合、単独でまたはひとりでに、ヘテロクロマチンタンパク質ＨＰ１がＨ３上のメチル化Ｋ９に結合することを低減することによって、転写活性化を容易にする（Ｂａｎｎｉｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ４１０：１２０−１２４（２００１）；Ｌａｃｈｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ４１０：１１６−１２０（２００１））。さらに、転写は、ＳＲＣ−１またはその関連ＨＡＴによるメチルのないＨ３−Ｋ９のアセチル化によってさらに増強される。
【０１６１】
ＲＩＺ１欠損マウスにおいてステロイドに対する組織応答の部分的低減は、標的遺伝子発現の対応する低減によって併発された。子宮の間質区画および子宮筋層区画におけるプロゲステロンレセプター遺伝子発現のＥ２誘導は、ＲＩＺ１欠損マウスにおいて低減された（図２Ｆ〜Ｇ）。この結果は、ＥＲ転写活性化機能を促進するＲＩＺ１の生理学的役割、およびこのようなコアクチベーターの機能がＥ２に対する観察された組織応答の原因であるようであることを示唆する。
【０１６２】
ステロイドに対する総合的な組織応答は、ＲＩＺ１欠損によって部分的にのみ低減されるが、このことは、ＲＩＺ１がＮＨＲ機能を促進することにおいて、独特かつ非重複性の機能を供給し得ないことを、必然的には示さない。分子レベルで、ＲＩＺ１が、特定の標的遺伝子発現を制御することに独自に関与し得ることは、可能である。実際に、エストロゲンは、ＲＩＺ１の存在下で子宮の内膜上皮細胞において、プロゲステロンレセプター遺伝子発現をほぼ１／２０に抑制することを示したが、ＲＩＺ１非存在下では１／２でしかなかった（図２Ｆ〜Ｇ）。ＥＲ／Ｅ２はコアクチベーターとして広範にＲＩＺ１を使用するようであるが、この結果はさらに、特定の状況においてコレプレッサーとしてＲＩＺ１を使用し得ることをまた示唆する。特定の細胞内容物において、ＥＲ／Ｅ２がＲＩＺ１によるＨ３−Ｋ９のメチル化を増強し得ることが可能である。
【０１６３】
ＲＩＺ１がＥ２誘導性組織増殖に必要とされるようであることは、ＲＩＺ１の腫瘍サプレッサーの役割と対照的である。この明かな矛盾を理解するのを補助するために、乳癌におけるＲＩＺ１の役割を研究した。ＲＩＺ１過剰発現は、レポーター遺伝子のＥＲ依存的転写活性化を増強するが、ＲＩＺ１アンタゴニストであるＲＩＺ２の過剰発現は、乳癌細胞において内因性ＥＲの転写活性化機能を阻害した。従って、ＲＩＺ１不活性化は、乳癌における低下したホルモン応答と関連し得る。一貫して、ＲＩＺ１のサイレンシングは、ＥＲポジティブな乳癌と比較して、Ｅ２耐性またはＥＲネガティブにおいて、より一般に有意であることが示された。ＥＲコアクチベーターの変更が乳癌のホルモン応答性表現型において役割を有し得ることを予想することは、必然的である。この理念は、いくつかの以前の研究によって追求さされ、これらはほとんどＥＲポジティブな乳癌において、ＳＲＣ３（ＡＩＢ１）およびＳＲＡの過剰発現が見出された（Ａｎｚｉｃｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：９６５−９６８（１９９７）；Ｋｕｒｅｂａｙａｓｈｉら、（Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６：５１２−５１８（２０００）；Ｍｕｒｐｈｙら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：６２６６−６２７１（２０００）；Ｔｈｅｎｏｔら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１５６：８５−９３（１９９９））。予想され得るように、乳癌組織におけるＥＲ濃度とＥ２に対する応答との間には、定量的な関係がある（Ａｌｌｅｇｒａ、Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１０：２３−２８（１９８３）；Ｏｓｂｏｒｎｅら、Ｃａｎｃｅｒ  ４６：２８８４−２８８８（１９８０））。ＥＲ量が高いほど、応答は大きくなりそうである。ＥＲはほとんど変異されず、そして用語ＥＲネガティブとは、実験的に決定されるレベル未満であるＥＲのレベルをいう。低いＥＲレベルを有するこのような細胞において、部分的なホルモン応答性は、依然として存在する。従って、コアクチベーターのうちの１つ（ＲＩＺ１）の消失は、このような細胞のホルモン応答をさらに低減し得ることが予想される。同様に、ＥＲポジティブな乳癌におけるコアクチベーターのサイレンシングは、ＲＩＺ１について本明細書で示されるように、これらの腫瘍のホルモン耐性の表現型の獲得に役割を果たし得る。
【０１６４】
ホルモン感受性初期段階乳癌について、腫瘍サプレッサーおよびＥＲコアクチベーター／増殖プロモーターとしてのＲＩＺ１の二重の役割は、無能力なＲＩＺが、腫瘍細胞増殖に有益であり得るのかまたは有益であり得ないのかという問題を生じる。ＲＩＺ１を保持することは、ＲＩＺ１欠損マウスにおけるＥ２誘導組織増殖の減少から見て、無能力なＲＩＺ１よりもより好適であり得ることが明らかである。この観点はまた、ＲＩＺ１サイレンシングが、ＥＲネガティブ乳癌に対してＥＲポジティブ乳癌において、あまり一般的でなかったという知見と一致する。
【０１６５】
ＲＩＺ１が、初期段階乳癌に対する増殖の利点を与え得るのならば、なぜＲＩＺ１が通常サイレンスである後期段階のＥＲネガティブ乳癌に対してそうでないのか？このことは、ＥＲ依存増殖プロモター機能をまた有する腫瘍サプレッサーを予測する。Ｅ２結合の際、ＲＩＺ１をデフォルト腫瘍サプレッサーからコアクチベーター／腫瘍プロモーターへと変換し得る機能的ＥＲを有する乳癌において、ＲＩＺ１は、しばしば存在し、そしてＥ２の存在下で腫瘍増殖を促進する役割を果し得る。これらの腫瘍において、ＲＩＺ１はまた、Ｅ２が存在しない場合、腫瘍増殖を抑える役割を果し得る。対照的に、コアクチベーターがもはや有用でなく、そして腫瘍サプレッサーが望ましくない、ＥＲネガティブ乳癌において、これらの腫瘍のＥ２依存増殖表現型を促進する役割を果し得るＲＩＺ１は、頻繁に失われる。
【０１６６】
なぜほとんどの他のＥＲコアクチベーターがホルモン耐性乳癌においてサイレンスではないのかという疑問が生じる（Ａｎｚｉｃｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：９６５−９６８（１９９７）；Ｋｕｒｅｂａｙａｓｈｉら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６：５１２−５１８（２０００）；Ｍｕｒｐｈｙら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：６２６６−６２７１（２０００）；Ｔｈｅｎｏｔら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１５６：８５−９３（１９９９））。これは、おそらく、これらが腫瘍サプレッサーではないという理由である。腫瘍サプレッサー機能を有するコアクチベーターのみが、ホルモン感受性から非感受性腫瘍への転移の間、好ましい標的の不活性化を表すであろう。このような転移の間、ホルモン感受性腫瘍は、ホルモン刺激またはＥＲ機能の非存在下で、増殖するための機構を開発する。生存する欠陥を生じたＥＲを有するこれらの腫瘍細胞において、コアクチベーターは、もはや有用ではなく、従って、その活性を維持するための選択圧はもはやない。一方では、ＥＲスイッチの非存在下において、コアクチべーターのデフォルト腫瘍サプレッサー機能（これは腫瘍に対して有利でない）が作用し、そしてコアクチベーターを不活性化するための選択圧が出現し得る。
【０１６７】
これらの結果は、ＲＩＺ１が内因性のＨＭＴ活性を有することを示唆する。ＰＲドメイン（これはＲＩＺ２に存在しない）を含むＲＩＺ１の特定の領域（１〜２００アミノ酸）は、インビトロでのヒストンＨ４のメチル化に十分である。ＰＲドメイン（残基３０〜１６０）は、必要であるが、不十分であり、そしてＨＭＴ活性ついてのＰＲドメインに対するＣ末端側のあまり保存されない領域（残基１６１〜２００）を必要とする。ＰＲドメインのすぐ隣の領域の必要性は、ＳＥＴドメインについて記載されてる領域に類似する（Ｒｅａら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０６：５９３−５９９（２０００））。ＰＲドメインの活性は、腫瘍関連点変異によって損なわれ、このことは、腫瘍抑制機能における活性の重要な役割と一致した。
【０１６８】
新しいメチルトランスフェラーゼ触媒モチーフは、ＲＩＺ１のＣ末端に位置されるＰＢＤドメインを同定した。このドメインは、インビトロでＨ４をメチル化し得、そしてＰＲドメインと物理的／機能的に協同して、より高いＨＭＴ活性を生成し得、そして基質特異性を広げ得る。ＰＢＤドメインは、データベース中の任意のタンパク質に有意に関与することはないようである。このドメインがＨＭＴ活性を有し、そしてＰＲ活性を調節し得ることは、マイクロサテライトの不安定な癌中のフレームシフト変異に起因するその欠損によって示されるように、腫瘍抑制におけるこのドメインの潜在的な役割に一致する。
【０１６９】
これらのデータは、ＲＩＺ１のＮ末端のＰＲドメイン領域からなる細菌発現させた２００残基ペプチドがヒストンＨ４をメチル化する一方、全長のタンパク質はまた、基質としてＨ１およびＨ３を使用したことを示す。この結果は、ＰＲドメイン活性を調節する際に、ＲＩＺ１の他の領域（例えば、ＰＢＤドメイン）の必要性と一致する。実際に、新規のＨ１様タンパク質のみが、ＰＲおよびＰＢＤの両方の存在下でメチル化されたが、いずれか単独ではメチル化されなかった。あるいは、免疫沈降されたＲＩＺ１は、その酵素活性を調節し得るＲＩＺ１結合タンパク質を含まなくてもよい。ＲＩＺ１は、タンパク質複合体の一部として存在し得、そしてこのような複合体のインタクトな性質は、ＨＭＴ活性によって必要とされ得る。ＨＭＴ複合体の例としては、６５０ｋＤａのＳＵＶ３９Ｈ１複合体である（Ｎｉｓｈｉｏｋａら、Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．１６：４７９−４８９（２００２））。最後に、ＲＩＺ１の哺乳動物特異的な翻訳後改変は、基質特異的メチル化活性において役割を果し得る。後者の２つの可能性は、Ｅ２およびＴＰＡによるＲＩＺ１  ＨＭＴ活性の基質特異性の調節に一致し、そしてさらなる研究のための重要なトピックとなる。
【０１７０】
この結果はまた、ヒストンＨ３のリジン９がＲＩＺ１タンパク質の主要なメチル化標的であることを示す。ＲＩＺ１タンパク質は、インビボで増強したＨ３−Ｋ９メチル化を引き起こし、そしてまたインビトロでＨ３−Ｋ９をメチル化した。Ｈ３−Ｋ９メチル化は、異質染色質形成および遺伝子サイレンシングに関連し、これらは次いで、ＲＩＺ１について同様の役割に関係する。ヒストンＨ１およびヒストンＨ４はまた、ＲＩＺ１によってメチル化されるが、遺伝子転写におけるＨ１およびＨ４メチル化の役割は、理解すべきことが残っている。ＲＩＺ１標的残基は、インビボでＨ１−Ｋ２５の公知のメチル化に一致するリジン２５としてインビトロでＨ１上で同定された（Ｏｈｅら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）１００：３５９−３６８（１９８６））。
【０１７１】
Ｅ２が、１つの基質（Ｈ１）のメチル化を維持し得るか、または増強し得るが、別（Ｈ３）のメチル化を減少することは、ＲＩＺ１活性の調節の複雑な機構を示唆する。Ｈ３およびＨ１における変化は、ＥＲトランス活性化機能のリガンド依存ＲＩＺ１活性化におそらく一緒に寄与する。このようなメチル化が遺伝子サイレンシングと関係するならば、ＲＩＺ１によるＨ３−Ｋ９のメチル化がＥ２によって阻害されることは、コアクチベーターとしてＲＩＺ１と一致する。Ｈ１メチル化における対照的な変化は、このようなメチル化の役割が、逆でない場合、Ｈ３−Ｋ９メチル化の役割と少なくとも異なるようであることを示唆する。Ｈ１リン酸化は、転写活性化において重要であること（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２１：５４１７−５４２５（２００１）；ＤｏｕおよびＧｏｒｏｖｓｋｙ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．６：２２５−２３１（２０００））が公知であるが、そのメチル化の役割は、未知のままである。ＲＩＺ１またはＥ２がＨ１のリン酸化およびメチル化の両方を誘導する本明細書中の知見は、Ｈ１リン酸化の役割に類似するＨ１メチル化の役割を示唆する。コアクチベーター機能および以前に記載された転写リプレッサー機能（Ｘｉｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２６３６０−２６３６６（１９９７））の点から見て、ＲＩＺ１が転写活性化および転写抑制の両方における二重の役割を有することが明らかである。二重の役割は、それぞれＨ３−Ｋ９およびＨ１−Ｋ２５のメチル化によって部分的に媒介され得（表４）、タンパク質および特定の環境（ｃｉｒｃｕｍｓｔａｎｃｅｓ）でのＲＩＺ１のプロモーター環境（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）に依存して、さらに１つの方向またはその他の方向に向かって変化し得る。ＲＩＺ１が転写を活性化するようなエストロゲンによって補充される場合、ＲＩＺ１のＨ３メチル化機能は、阻害され、そしてＨ１メチル化は、維持されるか増強される。この結果は、ＲＩＺ１が腫瘍サプレッサーおよびＥＲコアクチベーター／増殖プロモターの二重の役割を有し、そして同じＰＲドメインが両方に必要であるというモデルを示唆する。ＥＲ／Ｅ２は、腫瘍サプレッサーから増殖プロモターへとＲＩＺ１を変化し得るスイッチであると考えられる。ＲＩＺ１の二重の役割は、異なる基質用法によって媒介され得る。ＲＩＺ１のＨ３−Ｋ９メチル化／遺伝子抑制機能は、増殖停止に関連するが、Ｕ９３７細胞の末期の分化の間のＲＩＺ１のこれらのメチル化活性化の変化によって示されるように、Ｈ１メチル化が細胞増殖に関連すると考えられる（表４に要約される）。ＲＩＺ１の腫瘍サプレッサーの役割は、非組織特異的であるが、ＥＲコアクチベター機能は、ＥＲポジティブ組織に制限される。
【０１７２】
（表４）
【０１７３】
【表４】
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ａ  ＲＩＺ１の機能活性は、相対的に低い（＋）または高い（＋＋）として示す。
【０１７４】
Ｅ２がその増殖促進機能について腫瘍抑制遺伝子を使用することは、逆説的であるように見える。ＲＩＺ１  ＨＭＴ活性が、Ｅ２に対して感受性であることは、ＲＩＺ１が、細胞の異常なホルモン非依存性増殖を防止するためのセンサーおよびブレーカーとしての役割を有し得る可能性を生じる。乳癌の初期の段階でのＲＩＺ１の存在は、Ｅ２の非存在下において腫瘍が増殖しないことを説明し得る一方で、進行した乳癌において共通してＥ２が存在しないことは、ホルモン非依存性腫瘍増殖を説明し得る。Ｅ２は、おそらく標的遺伝子および／またはＨＭＴ活性を変化させることによって、ＲＩＺ１の腫瘍抑制遺伝子機能を止めるためのスイッチとして作用し得る。ＨＭＴ機能が、ＲＩＺ１の腫瘍抑制遺伝子機能および同時活性化因子機能の両方のために必要とされる場合、Ｅ２は、全てのＨＭＴ活性を単に止める必要はない。従って、Ｅ２が１つの基質（Ｈ３）に対するＲＩＺ１  ＨＭＴ活性を選択的に阻害し得る一方で、他の基質（Ｈ１）に対する活性を維持または増強することが、再保証される。
【０１７５】
要するに、上記される研究は、ＨＭＴ（ＲＩＺ１）がエストロゲンの標的であり、そしてインビボでの有効な雌性ホルモン作用のために必要とされることを実証する。ＲＩＺ１の欠陥を有するＨＭＴ機能は、エストロゲン耐性乳癌と関連し、そして、乳癌進行の間のホルモン耐性への変換およびホルモン非依存性増殖において重要であると判明し得る。類推によって、変更されたＨＭＴ機能は、損傷した雌性ホルモン恒常性により特徴付けられる臨床的症候群（例えば、骨粗鬆症、心臓血管疾患、およびアルツハイマー病）にもまた関与し得る。
【０１７６】
（実施例ＩＩ）
この実施例は、ＲＩＺ１調節性化合物およびプロゲステロンレセプター活性を調節する化合物を同定するために適した種々のアッセイを示す。
【０１７７】
（Ａ．プロテインメチルトランスフェラーゼ活性の共通のインヒビターに対するＲＩＺ１の結合に基づいた生化学的アッセイ）
ＰＭＴの現在最も知られている共通のインヒビターは、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインまたはＳ−アデノシル−Ｄ−ホモシステイン（ＳＡＨ、Ｋｉ＝５〜１２μＭ）である。あまり強力でないインヒビターは、アデノシル−Ｌ−エチオニン（Ｋｉ＝１７０μＭ）である。ＳＡＨは、ＰＭＴの基質であり、メチル基のドナーである、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ）の構造を模倣する。ＲＩＺ１は、そのＰＲ／ＰＭＴモチーフおよびそのＰＢＤドメインを介してＳＡＨに結合することが予想される。
【０１７８】
マルチウェルプレートをＳＡＨでコーティングし、そして各ウェルを、低分子化合物ライブラリーからの化合物と接触させる。このプレートを、ＲＩＺ１  ＰＲ／ＰＭＴモチーフ（約２００個のアミノ酸）を含み、蛍光プローブで標識された、精製された組換えタンパク質と共にインキュベートする。結合していないＲＩＺ１タンパク質を洗い流した後、このプレートを、蛍光検出器によって読み取る。
【０１７９】
（Ｂ．ＲＩＺ１のＥＲまたはＰＲに対する結合に基づいた生化学的アッセイ）
ＲＩＺ１のＥＲまたはＰＲに対する同時活性化因子機能は、物理的な複合体形成に依存する。ＲＩＺ１のＥＲまたはＰＲに対する結合は、ＲＩＺ１のＬＸＸＬＬモチーフによって媒介され、そしてホルモン依存性である。
【０１８０】
組換えＲＩＺ１タンパク質を、マルチウェルプレートにコーティングし、そして各ウェルを、エストロゲンまたはプロゲステロンと同様に、低分子化合物ライブラリーからの化合物と接触させる。このプレートを、蛍光プローブで標識された、精製された組換えＥＲタンパク質またはＰＲタンパク質と共にインキュベートする。結合していないＥＲタンパク質またはＰＲタンパク質を洗い流した後、このプレートを、蛍光検出器で読み取る。
【０１８１】
（Ｃ．ＥＲまたはＰＲのＲＩＺ１同時活性化に基づいた細胞アッセイ）
マルチウェルプレートに、ＣＶ１細胞ならびにルシフェラーゼレポーターに連結されたＥＲ応答性プロモーターを含むプラスミド、ＥＲを発現するプラスミド、およびＲＩＺ１を発現するプラスミドでトランスフェクトされた細胞を播種する。各ウェルを、低分子化合物ライブラリーからの化合物と接触させる。トランスフェクションの２日後、各ウェルのルシフェラーゼ活性をアッセイし、そして蛍光検出器によって読み取る。
【０１８２】
（Ｄ．ＲＩＺ１の調節因子のインビボでの効力を決定または検証するためのアッセイ）
一旦、標的化合物を、インビトロ生化学的ハイスループットスクリーニングまたは細胞ハイスループットスクリーニングによって得ると、これらの化合物を、ＲＩＺ１の生理学的機能を阻害／増強するインビボでの効力について試験する。ＲＩＺ１  ＰＲ／ＰＭＴ機能を欠損する雌性マウスは、エストロゲンおよびプロゲステロンに対する応答の減少を示す。従って、ＲＩＺ１  ＰＲ／ＰＭＴのインヒビターは、マウスにおけるエストロゲン応答およびプロゲステロン応答の減少が期待される一方、ＲＩＺ１の活性化因子は、応答を増強し得る。
【０１８３】
過剰切除された雌性マウスを、エストロゲンおよび標的化合物で、３日間処理する。この動物を屠殺し、そして子宮湿潤重量および膣角質化について試験する。さらに、エストロゲンおよびプロゲステロンに応じた乳腺増殖を決定する。８週齢雌性マウスを、０日目に過剰切除し、そして１４〜３４日目にＥ２（５０μｇ／日）＋Ｐ４（１μｇ／日）（または０．１ｍｇのＥ２および１０ｍｇのＰ４を含む、２１日放出ホルモンペレット；Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）で処置する。標的化合物を、ホルモンと共に適用する。３５日目に、マウスを屠殺し、そして全マウントを調製し、そしてそれを染色した。ＲＩＺ１ヌル変異型マウスを、同様に処置し、標的化合物の効果についての特異性コントロールを与える。
【０１８４】
上に提供される、全ての雑誌論文、参考文献および特許引用は（括弧内あってもそうでなくても）（前記されていようといまいと）、その全体を参考として、本明細書中に援用される。
【０１８５】
本発明は、上に提供される実施例に関して記載されてきたが、種々の改変が、本発明の精神を逸脱することなくなされ得ることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１８６】
【図１】図１Ａは、ホルモン応答性プロモーターに対するＲＩＺ１の効果を示す。示された量のＲＩＺ１および種々の核ホルモンレセプター発現ベクターを、ＣＶ−１細胞中に、適切なホルモンレセプター応答エレメントを含むレポーター構築物と同時トランスフェクトした。細胞を、示されたホルモンとともに、またなしで２４時間処理し、そしてＣＡＴ活性についてアッセイした。示されたデータは、３つの独立した実験の平均±ＳＥＭを表す。
【０１８７】
図１Ｂは、ＲＩＺ１が、ＥＲαおよびプロゲステロンレセプタータンパク質とインビボでホルモン依存性タンパク質複合体を形成することを示す。Ｔ４７−Ｄ（プロゲステロンレセプターについて）細胞およびＭＣＦ−７（ＥＲについて）細胞を、アデノウイルス発現ＲＩＺ１で感染した。ホルモンとともに、またはなしで処理した細胞の抽出物を調製し、そして、示されるように、プロゲステロンレセプター（ＰＲ）（ＰＲ−ＢおよびＰＲ−Ａの両方を検出する）またはＥＲαに対する、予備免疫された血清またはモノクローナル抗体で免疫沈降（ＩＰ）した。免疫沈降された産物を、ＲＩＺ１、プロゲステロンレセプターまたＥＲαモノクローナル抗体（それぞれ、２Ｄ７、１Ａ６、およびｓｃ−８００５）を用いて、イムノブロット分析により分析した。
【０１８８】
図１Ｃは、雌性の性ステロイドホルモンの標的器官におけるＲＩＺ発現の免疫組織化学分析を示す。７週齢の純潔な野生型のマウスからの組織を、ＲＩＺおよびＥＲαの発現について分析した。切片は、子宮（パネルａおよびｂ）、胸部（ｃおよびｄ）、および膣上皮（ｅおよびｆ）におけるＲＩＺおよびＥＲα免疫染色を示す。ａ、ｃ、およびｅにおけるスケールの棒はまた、ｂ、ｄ、およびｆにそれぞれ適用される。
【０１８９】
図１Ｄは、雌性の性ステロイドホルモンの標的器官におけるＲＩＺ１発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。マウスの示された組織から単離された総ＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲ分析に用いた。
【図２】図２は、ＲＩＺ１変異体マウスにおける雌性の性ステロイドホルモンに対する子宮および膣応答を示す。ＡおよびＢ、子宮の湿潤重量を測定し、そして示された数のマウスについて体重に対する子宮重量の比を算出し、そして平均±ＳＥＭとして表わした。Ｃ．脱落膜応答に対する子宮応答を測定した。Ｅ２およびプロゲステロンでの処理、および左子宮角の機械的刺激の後、刺激された（Ｌ）角の非刺激（コントロール；Ｒ）角に対する重量の比を示された数のマウスについて算出し、そして平均±ＳＥＭとして表わした。ＤおよびＥ．膣応答。膣組織を採集し、そしてＨ＆Ｅ染色のために固定した。全膣上皮および角質層の厚さを、各マウスにおける膣上皮の最大深さにおいて７つのランダムに選択された領域で測定し、そしてデータを、各グループ中の７匹のマウスについて平均±ＳＥＭとして表わしている。ＦおよびＧ．ＲＩＺ１変異体マウスにおけるＥ２による子宮プロゲステロンレセプター発現の損傷した調節。子宮を集め、そしてプロゲステロンレセプター発現について免疫組織化学的に分析した。エストロゲン処置された子宮をＧに示す（トップパネル：低倍率；ボトムパネル：高倍率）。ランダムに選択された領域を写真撮影し、そして各グループ中の４匹のマウスの子宮の各区画からの１０００以上の細胞を計数し、そしてデータを平均±ＳＥＭ（Ｇ）として表わした。挿入されたスケールの棒は、両方の遺伝子型について適用される。
【図３】ＲＩＺ１欠損マウスにおける乳房生産を示す。示された遺伝子型をもつマウスの第４の乳腺の全マウントを調製し、そして染色した。ＡおよびＢ．７週齢の純潔マウス。ＣおよびＤ．初めての妊娠マウス。ＥおよびＦ．妊娠マウスの乳腺の管路および肺胞構造のより高い倍率。ＧおよびＨ．方法で記載したようにＰおよびＥ２を含むホルモンペレットで処理したマウスからの乳腺．ＩおよびＪ．それぞれＧおよびＨからの乳管路および肺胞構造のより高い倍率。両方の遺伝子型に適用されるスケールの棒を挿入してある。
【図４】内因性ＥＲにより媒介されるＥ２依存性転写のＲＩＺによる調節を示す。ＭＣＦ−７細胞（Ａ）およびＣＶ−１細胞（Ｂ）を、レポーターＥＲＥ−ｔｋ−ＣＡＴと、ＲＩＺ１またはＲＩＺ２発現プラスミドのいずれかと同時トランスフェクトした。細胞を、Ｅ２とともにまたはなしで処理し、そしてＣＡＴ活性についてアッセイした。示されるデータは、３つの独立した実験の平均±ＳＥＭを表す。
【図５】図５は、ＰＲ−ドメイン、ＰＲ−結合ドメイン（ＰＢＤ）、およびこれら２つのドメインの組合せ作用によるインビトロのヒストンのメチル化を示す。ヒトＲＩＺ１の細菌で発現されたＧＳＴ融合タンパク質を、ヒストンを基質として用いるインビトロのＨＭＴ反応のために用いた。トップパネルは、精製されたタンパク質およびヒストンのＣｏｏｍａｓｓｉｅブルー染色を示す。ボトムパネルは、基質のメチル化を示す蛍光関節撮影法を示す。Ａ．示されるように、ＧＳＴタンパク質単独によるのではない、ＧＳＴ−ＲＩＺ２００（ＲＩＺ１残基１−２００からなる）による、ＧＳＴ−ＲＩＺ１６１（ＲＩＺ１残基１−１６１からなる）、および３つのＧＳＴ−ＲＩＺ２００点変異体タンパク質による、Ｈ４のメチル化。Ｂ．ＧＳＴ−ＲＩＺ３３２（ＲＩＺ１残基１−３３２からなる）によるＨ４のメチル化。Ｃ．ＧＳＴ−ＲＩＺ３２２プラスＧＳＴ−ＲＩＺＰＢＤにより与えられる増大したメチル化。
【図６】図６は、哺乳動物細胞において発現される全長ＲＩＺ１タンパク質によるヒストンのメチル化を示す。Ａ．ＡｄＲＩＺ１ウイルスまたはＡｄＮｕｌｌコントロールウイルスに感染させたＵ２０Ｓ細胞から調製した核抽出物（５００μｇ）を、免疫前血清またはＲＩＺ１血清抗ＫＧ７．１Ｓを用いて免疫沈降した。次いで、免疫沈降物を、遊離ヒストンを基質として用いてＨＭＴ活性についてアッセイした。このパネルは、ヒストンＨ１、Ｈ３およびＨ４のメチル化を示す蛍光写真を示す。Ｂ．ＲＩＺ１過剰発現による、Ｈ３上のリジン９の増強されたメチル化。ヒストンを、ＡｄＲＩＺ１ウイルスまたはコントロールウイルスに感染させたＵ２０Ｓ細胞から抽出し、そしてＨ３上のメチル化Ｋ９に対する抗体またはＨ３上のメチル化Ｋ４に対する抗体のいずれかを用いたウェスタンブロット分析によって分析した。Ｃ．ＲＩＺ１によるインビトロでのＨ３のＮ末端ペプチドのメチル化。免疫沈降したＲＩＺ１を酵素として用い、そしてＨ３およびアセチル化Ｈ３（Ｋ９／Ｋ１４  Ａｃ：Ｋ９残基およびＫ１４残基でアセチル化された）の示されたＮ末端側の１−２０残基のペプチドを基質として用いた、インビトロメチル化アッセイ。これらのメチル化ペプチドを、１６％  Ｔｒｉｓ−Ｔｒｉｃｉｎｅ  ＳＤＳゲルによって分離し、続いて蛍光写真を撮影した。Ｄ．免疫沈降によって精製された全長ＲＩＺ１によってインビトロでメチル化されたＨ３のＮ末端ペプチド（残基１〜２０）の自動化配列決定。各連続した回の微小配列決定において同定された個々のアミノ酸のトリチウム取込みを示す。
【図７】図７は、エストロゲンによるＲＩＺ１メチルトランスフェラーゼ活性の調節を示す。Ａ．ＭＣＦ７細胞中のＲＩＺ１に対するエストロゲンの影響。Ｅ２処理ＭＣＦ−７細胞もしくはコントロールＭＣＦ−７細胞由来の同じ量の核抽出物（５００μｇ）、またはＡｄＲＩＺ１感染細胞由来の同じ量の核抽出物（５００μｇ）を、免疫前血清またはＲＩＺ１血清抗ＫＧ７．１Ｓを用いて免疫沈降した。次いで、免疫沈降物を、遊離ヒストンを基質として用いてＨＭＴ活性についてアッセイした。このパネルは、ヒストンＨ１およびＨ３のメチル化を示す蛍光写真を示す。Ｂ．Ｈ１リン酸化に対するＥ２およびＲＩＺ１の影響。コントロールウイルスまたはＡｄＲＩＺ１ウイルスに感染させたＭＣＦ７細胞を、４８時間にわたってＥ２またはビヒクルで処理した。ヒストンを処理後に抽出し、そして抗ホスホ−Ｈ１（ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈ−Ｈ１）抗体（上のパネル）または抗Ｈ１抗体（下のパネル）を用いたウェスタンブロットによって分析した。
【図１】
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【図２】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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