(57)【要約】本発明はGENSETポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関する。かかるGENSET産物は法医学的分析用の試薬として、染色体マーカーとして、組織/細胞/細胞小器官に特異的なマーカーとして、発現ベクターの作製において使用することができる。加えて、それらは異常なGENSET発現および／または生物活性についてのスクリーニングおよび診断アッセイに、また、GENSET関連疾患の治療に用いられる化合物のスクリーニングに使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
a) いずれか１つの奇数配列番号の６〜500アミノ酸の少なくともいずれか１つの完全体をコードする、偶数配列番号のポリヌクレオチドまたは寄託クローンのヒトcDNAのポリヌクレオチド、
b) いずれか１つの奇数配列番号のシグナルペプチド配列をコードする、偶数配列番号のポリヌクレオチドまたは寄託クローンのヒトcDNAのポリヌクレオチド、
c) いずれか１つの奇数配列番号の成熟ポリペプチド配列をコードする、偶数配列番号のポリヌクレオチドまたは寄託クローンのヒトcDNAのポリヌクレオチド、
d) いずれか１つの奇数配列番号の全長ポリペプチド配列をコードする、偶数配列番号のポリヌクレオチドまたは寄託クローンのヒトcDNAのポリヌクレオチド、
e) いずれか１つの奇数配列番号の生物学的に活性な断片のポリペプチド配列をコードする、偶数配列番号のポリヌクレオチドまたは寄託クローンのヒトcDNAのポリヌクレオチド、
f) いずれか１つの奇数配列番号の、または寄託クローンのヒトcDNAによりコードされるポリペプチドの、６〜500アミノ酸からなる少なくともいずれか１つの完全体のポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド、
g) いずれか１つの奇数配列番号のシグナルペプチドの、または寄託クローンのヒトcDNAによりコードされるシグナルペプチドの、ポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド、
h) いずれか１つの奇数配列番号の成熟ポリペプチドの、または寄託クローンのヒトcDNAによりコードされる成熟ポリペプチドの、ポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド、
i) いずれか１つの奇数配列番号の全長ポリペプチドの、または寄託クローンのヒトcDNAによりコードされる全長ポリペプチドの、ポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド、
j) いずれか１つの奇数配列番号の生物学的に活性なポリペプチドの、または寄託クローンのヒトcDNAによりコードされる生物学的に活性なポリペプチドの、ポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド、
k) 発現ベクターをさらに含んでなるa)からj)のいずれか１つのポリヌクレオチド、
l) 上記a)からk)のポリヌクレオチドの組換えが起こった宿主細胞、
m) 上記k)の宿主細胞を含んでなる非ヒトトランスジェニック動物、
n) 生理学的に許容される担体をさらに含む上記a)からj)のポリヌクレオチド、
からなる群より選択される核酸配列を含んでなる、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
a) いずれか１つの奇数配列番号の、または寄託クローンのヒトcDNAによりコードされるポリペプチドの、６〜500アミノ酸のいずれか１つの完全体、
b) いずれか１つの奇数配列番号の、または寄託クローンのヒトcDNAによりコードされる、シグナルペプチド配列、
c) いずれか１つの奇数配列番号の、または寄託クローンのヒトcDNAによりコードされる、成熟ポリペプチド配列、
d) いずれか１つの奇数配列番号の、または寄託クローンのヒトcDNAによりコードされる、全長ポリペプチド配列、
e) 生理学的に許容される担体をさらに含む上記a)からd)のポリペプチド、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド。
【請求項３】
a)  請求項１に記載のポリヌクレオチドを含有する宿主細胞の集団を用意し、
b)  該宿主細胞の集団を、該宿主細胞内での請求項２に記載のポリペプチドの生産を促進する条件下で培養し、
c)  該宿主細胞の集団から該ポリペプチドを精製する、
ことを含んでなる、ポリペプチドの製造方法。
【請求項４】
a)  プロモーターに機能し得る形で連結された、請求項２に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する細胞の集団を用意し、
b)  該細胞の集団を、該細胞内での該ポリペプチドの生産を促進する条件下で培養し、
c)  該細胞の集団から該ポリペプチドを精製する、
ことを含んでなる、ポリペプチドの製造方法。
【請求項５】
請求項２に記載のポリペプチドと特異的に結合する抗体。
【請求項６】
請求項２に記載のポリペプチドを請求項５に記載の抗体と結合させる方法であって、該抗体と該ポリペプチドとを、該抗体が該ポリペプチドと特異的に結合できる条件下で接触させることを含んでなる、上記方法。
【請求項７】
GENSET遺伝子が哺乳動物の体内で発現されるかどうかを調べる方法であって、
a)  哺乳動物由来の生物学的サンプルを用意し、
b)  該生物学的サンプルを、
i)  ストリンジェントな条件下で請求項１に記載のポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチド、または
ii)  請求項２に記載のポリペプチドと特異的に結合するポリペプチド、
のいずれかと接触させ、
c)  該ポリヌクレオチドと該サンプル内のRNA種とのハイブリダイゼーションの有無、または該ポリペプチドと該サンプル内のタンパク質との結合の有無を検出する、
各ステップを含んでなり、その際、上記ハイブリダイゼーションまたは結合が検出されれば、GENSET遺伝子が該哺乳動物の体内で発現されていることを示す、上記方法。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドがプライマーであり、かつ、前記ハイブリダイゼーションがプライマーの配列を含む増幅産物の存在を検出することによって検出される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリペプチドが抗体である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
哺乳動物におけるGENSET遺伝子の発現レベルが上昇しているか低下しているかを調べる方法であって、
a)  哺乳動物由来の生物学的サンプルを用意し、
b)  該生物学的サンプル内の請求項２に記載のポリペプチドの量または該ポリペプチドをコードするRNA種の量を、対照サンプルで検出されるかまたは対照サンプルから予想されるレベルと比較する、
各ステップを含んでなり、その際、生物学的サンプル内の該ポリペプチドまたはRNA種の量が、対照サンプルで検出されたまたは対照サンプルから予想されたレベルと比較して増加していれば、該哺乳動物におけるGENSET遺伝子の発現レベルが上昇していることを示し、また、生物学的サンプル内の該ポリペプチドまたはRNA種の量が、対照サンプルで検出されたまたは対照サンプルから予想されたレベルと比較して減少していれば、該哺乳動物におけるGENSET遺伝子の発現レベルが低下していることを示す、上記方法。
【請求項１１】
GENSETポリペプチドの候補モジュレーターの同定方法であって、
a)  請求項２に記載のポリペプチドを試験化合物と接触させ、
b)  該化合物が該ポリペプチドと特異的に結合するかどうかを調べる、
ことを含んでなり、その際、該化合物が該ポリペプチドと特異的に結合することが検出されれば、該化合物がGENSETポリペプチドの候補モジュレーターであることを示す、上記方法。
【請求項１２】
前記候補モジュレーターの存在下でGENSETポリペプチドの生物活性を調べることをさらに含んでなり、その際、前記化合物の存在下でのGENSETポリペプチドの生物活性が該化合物の不在下での該活性と比較して変化していれば、該化合物がGENSETポリペプチドのモジュレーターであることを示す、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
医薬組成物の製造方法であって、
a)  請求項１１に記載の方法を用いてGENSETポリペプチドのモジュレーターを同定し、
b)  該モジュレーターを製薬上許容される担体と組み合わせる、
ことを含んでなる上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はGENSETポリペプチド、その断片、および該ポリペプチドをコードする遺伝子の5'および3'末端に位置する調節領域に向けられる。本発明はまた、GENSET遺伝子によってコードされるポリペプチドおよびその断片に関する。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含む組換えベクター、特にGENSET遺伝子調節領域またはGENSETポリペプチドをコードする配列を含む組換えベクター、および本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞、ならびにかかるベクターおよび宿主細胞の作製方法に関する。本発明はさらに、本発明のポリペプチドの生産におけるこれらの組換えベクターおよび宿主細胞の使用に関する。本発明はさらに、本発明のポリペプチドと特異的に結合する抗体、ならびにかかる抗体およびそのフラグメントの作製方法に関する。本発明はまた、サンプル中の本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの存在を検出する方法、異常なGENSETポリペプチド発現および／または生物活性を診断およびスクリーニングする方法、GENSETポリペプチドの活性または発現を調節する能力について化合物をスクリーニングする方法、ならびにかかる化合物の使用を提供する。
【背景技術】
【０００２】
分泌タンパク質またはその断片をコードするcDNAは特に価値のある治療薬の供給源に当たる。従って、分泌タンパク質およびそれらをコードする核酸を同定および特性決定する必要がある。
【０００３】
分泌タンパク質は、それら自身が治療上有用であることに加えて、そのアミノ末端に、その分泌を指令するシグナルペプチドと呼ばれる短いペプチドを含んでいる。これらのシグナルペプチドは分泌タンパク質をコードする遺伝子のコード配列の5'末端に位置するシグナル配列によってコードされている。これらのシグナルペプチドは機能的に連結されたタンパク質の細胞外分泌を指令するので、シグナル配列は、分泌が望まれるタンパク質をコードする遺伝子にシグナル配列を機能的に連結させることによって、どのようなタンパク質でも効率的な分泌を指令すべく利用することができる。さらに、膜移動配列(membrane-translocating sequence)と呼ばれるシグナルペプチドの断片を、目的のペプチドまたはタンパク質の細胞内移入を指令するために用いてもよい。これは特定の遺伝子産物をその産生細胞以外の細胞に送達することが望まれる遺伝子治療ストラテジーにおいて有用でありうる。シグナルペプチドをコードするシグナル配列はまた、タンパク質精製法を簡略化する際にも使用される。かかる用途では、所望のタンパク質の細胞外分泌により、望まないタンパク質（それらから所望のタンパク質を選択しなければならない）の数を減らすことで精製が大いに促進される。従って、シグナルペプチドをコードする分泌タンパク質の遺伝子の5'断片を同定および特性決定する必要性が存在する。
【０００４】
分泌タンパク質をコードする配列はまた、治療薬または診断薬として使用することもできる。特に、かかる配列を用いて、分泌タンパク質のコード配列の突然変異の結果として個体が疾病などの検出可能な表現型を発現する可能性があるかどうかを調べることができる。個体がかかるコード配列における突然変異の結果として疾病またはその他の望ましくない表現型を患う危険がある場合には、遺伝子治療を用いて正常なコード配列を導入することで望ましくない表現型を修正しうる。あるいはまた、望ましくない表現型がコード配列によってコードされるタンパク質の過剰発現に起因する場合には、アンチセンスまたは三重らせんに基づくストラテジーを用いて、そのタンパク質の発現を低下させることもできる。
【０００５】
コード配列によってコードされる分泌ヒトポリペプチドはまた、そのポリペプチドをコードする配列の突然変異が原因となる疾病などの症状を有する個体に直接それらを投与することによって、治療薬として使用することができる。このような場合には、個体にポリペプチドを投与することによってその症状を治癒または改善することができる。
【０００６】
さらに、分泌ヒトポリペプチドまたはその断片は、生物学的サンプルの組織型または起源種を調べるのに有用な抗体を生成するために使用することもできる。抗体を用いて、分泌ヒトポリペプチドの細胞局在または該ヒトポリペプチドに融合されたポリペプチドの細胞局在を調べることも可能である。さらに、この抗体を免疫アフィニティークロマトグラフィー技術に用いて、ヒトポリペプチドまたはヒトポリペプチドに融合された標的ポリペプチドを単離、精製または濃縮することが可能である。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
本発明は、(a)奇数配列番号1〜111の配列；(b)寄託されたクローンプールのクローンインサートの配列；(c)奇数配列番号1〜111のコード配列；(d)寄託されたクローンプールのクローンインサートのコード配列；(e)偶数配列番号2〜112のポリペプチドのうちの1つをコードする配列；(f)寄託されたクローンプールのクローンインサートによってコードされるポリペプチドのうちの1つをコードする配列；(g)GENSETポリペプチドをコードするゲノム配列；(h)GENSET遺伝子の5'転写調節領域；(i)GENSET遺伝子の3'転写調節領域；(j)(g)〜(i)の任意の組合せのヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；(k)(a)〜(j)のいずれかのポリヌクレオチドの変異ポリヌクレオチド；(l)(a)〜(k)のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド(ここで、該ポリヌクレオチドは一本鎖、二本鎖、またはある部分が一本鎖で、ある部分が二本鎖である)；(m)(l)の一本鎖ポリヌクレオチドのいずれかに相補的なヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなる(comprising)、からなる(consisting of)、または本質的にからなる(consisting essentially of)、精製または単離されたポリヌクレオチドを提供する。本発明はさらに上記(a)〜(m)の核酸およびポリペプチドの断片を提供する。
【０００８】
本発明のさらなる実施形態は、前記(a)〜(m)のヌクレオチド配列のいずれかに対して、例えば、10と最後の整数（配列表で特定された配列の最後のヌクレオチドに相当する）の間の少なくともいずれか１つの整数個の連続ヌクレオチドの領域にわたって、少なくとも70％同一の、より好ましくは少なくとも75％、さらにより好ましくは少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%同一のヌクレオチド配列を含んでなる、からなる、または本質的にからなる、精製または単離されたポリヌクレオチド、あるいはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で前記(a)〜(m)を含む本発明のポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。
【０００９】
本発明はまた、本発明の精製または単離されたポリヌクレオチドを含む組換えベクター、および本発明のポリヌクレオチドの組換えが起こった宿主細胞、ならびに前記ベクターおよび宿主細胞の作製方法に関する。本発明はさらにGENSETポリペプチドの生産におけるこれらの組換えベクターおよび組換え宿主細胞の使用に関する。本発明はさらに、プロモーター、エンハンサーなどを含めて、調節配列と機能しうる形で連結された本発明のポリヌクレオチドに関する。
【００１０】
本発明はさらに、(a)偶数配列番号2〜112の全長ポリペプチド；(b)寄託されたクローンプールのクローンインサートによってコードされる全長ポリペプチド；(c)偶数配列番号2〜112のポリペプチドのエピトープ含有断片；(d)寄託されたクローンプールに含まれるクローンインサートによってコードされるポリペプチドのエピトープ含有断片；(e)偶数配列番号2〜112のポリペプチドのドメイン；(f)寄託されたクローンプールに含まれるクローンインサートによってコードされるポリペプチドのドメイン；(g)偶数配列番号2〜112の、または寄託されたクローンプールのヒトcDNAによりコードされる、ポリペプチドのシグナルペプチド；(h)偶数配列番号2〜112の、または寄託されたクローンプールのヒトcDNAによりコードされる成熟ポリペプチド；および(i) (a)〜(h)のポリペプチドのいずれかの対立遺伝子変異ポリペプチド；からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、からなる、または本質的にからなる、精製または単離されたポリペプチドを提供する。本発明は、生物活性を有するものまたは生物学的に機能的なドメインを含んでなるものなど、前記(a)〜(i)のポリペプチドの断片をさらに提供する。
【００１１】
本発明は、(a)〜(i)に記載のポリペプチドまたはその断片に対して、例えば、6と最後の整数（配列表で特定されたポリペプチド配列の最後のアミノ酸に相当する）の間の少なくともいずれか１つの整数個のアミノ酸の領域にわたって、少なくとも70%の類似性、より好ましくは少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%の類似性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに(a)〜(i)に記載のポリペプチドまたはその断片に対して、少なくとも70%同一の、より好ましくは少なくとも75%同一の、さらにより好ましくは80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをさらに含む。本発明はさらに、本発明のポリペプチドの製造方法に関する。
【００１２】
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドについてトランスジェニックであり、かつ、本発明のポリペプチドを発現するトランスジェニック植物または動物に関する。
【００１３】
本発明はさらに、本発明のGENSETポリペプチドおよびその断片と特異的に結合する抗体、ならびにかかる抗体およびそのフラグメントの作製方法に関する。
【００１４】
本発明はまた、生物学的サンプルにおいてGEMSET遺伝子の発現および／または生物活性を検出するキット、使用および方法を提供する。かかる方法の１つは、GENSETポリヌクレオチドを増幅および検出するためのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)またはGENSETゲノムDNA、cDNAまたはmRNAを検出するためのサザンおよびノーザンブロットハイブリダイゼーションを用いて、生物学的サンプルにおけるGENSETポリヌクレオチドの発現をアッセイすることを含む。あるいは、試験サンプルにおけるGENSET遺伝子発現を検出する方法は、本発明のGENSETポリペプチドまたはGENSETポリペプチドの一部と結合する化合物を用いて達成してもよい。
【００１５】
本発明はまた、GENSET遺伝子産物レベルが上昇または低下しており、それぞれGENSET遺伝子発現を抑制または増強する治療の恩恵を受ける可能性がある個体または非ヒト動物を同定するための診断法、ならびにGENSETポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用に関し、また、GENSETポリペプチドの発現または生物活性と関連のある特定の疾病／障害に罹患する危険の高い、または現在罹患している個体または非ヒト動物の同定方法に関する。
【００１６】
本発明はまた、GENSET遺伝子調節配列と相互作用する化合物およびGENSETポリペプチドと直接または間接的に相互作用する化合物を含めて、化合物をGENSETポリペプチドの活性または発現を調節する(例えば、増加または抑制する)その能力についてスクリーニングするキット、使用および方法に関する。かかる化合物の使用もまた本発明の範囲内にある。
【００１７】
本発明はまた、本発明の活性物質、ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは抗体、および典型的には製薬上許容される担体、を含んでなる製薬上または生理学上許容される組成物に関する。
【００１８】
本発明はまた、本発明の配列のcDNAコードおよびポリペプチドコードを含むコンピュータシステム、ならびに本発明のGENSETポリペプチドまたはGENSETポリヌクレオチド配列を用いて配列を比較し、ホモロジーまたは特徴を同定するコンピュータ関連方法に関する。
【００１９】
もう1つの態様では、本発明は、上記(a)から(i)のポリペプチドを含む本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００２０】
もう1つの態様では、本発明は、前記宿主細胞を含んでなる非ヒトトランスジェニック動物を提供する。
【００２１】
もう1つの態様では、本発明は、GENSETポリペプチドの製造方法を提供し、この方法は、a)本明細書に記載のポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞の集団を用意し、次いでb)該宿主細胞の集団を、宿主細胞内での該ポリペプチドの産生を促進する条件下で培養することを含んでなる。
【００２２】
ある実施形態では、前記方法は、宿主細胞の集団から該ポリペプチドを精製することをさらに含んでなる。
【００２３】
もう1つの態様では、本発明はGENSETポリペプチドの製造方法を提供し、この方法は、a)本明細書に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる細胞の集団を用意し、b)該細胞集団を、該細胞内での該ポリペプチドの産生を促進する条件下で培養し、さらにc)該細胞集団から該ポリペプチドを精製することを含んでなる。
【００２４】
もう1つの態様では、本発明は本明細書に記載のいずれかのポリヌクレオチドによってコードされる生物学的に活性なポリペプチドを提供する。
【００２５】
ある実施形態では、前記ポリペプチドは、抗原性ポリペプチドまたはその抗原性フラグメントに対する抗体によって選択的に認識され、この抗原性ポリペプチドは偶数配列番号2〜112で示される配列のいずれか1つまたは寄託されたクローンプールのヒトcDNAによってコードされるポリペプチド配列のいずれか1つを含んでなる。
【００２６】
もう1つの態様では、本発明は本明細書に記載のいずれかのポリペプチドと特異的に結合する抗体ならびに該抗体を該ポリペプチドに結合させる方法を提供する。
【００２７】
もう1つの態様では、本発明はGENSET遺伝子が哺乳動物内で発現されるかどうかを調べる方法を提供し、この方法はa)哺乳動物由来の生物学的サンプルを用意し、b)生物学的サンプルを(i)ストリンジェントな条件下で本明細書に記載のいずれかのポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチド、または(ii)本明細書に記載のいずれかのポリペプチドと特異的に結合するポリペプチドのいずれかと接触させ、さらにc)該ポリヌクレオチドとサンプル内のRNA種とのハイブリダイゼーションの有無、または該ポリペプチドとサンプル内のタンパク質との結合の有無を検出するステップを含んでなり、その際、上記ハイブリダイゼーションまたは結合が検出されれば、GENSET遺伝子が哺乳動物内で発現されていることを示す。
【００２８】
ある実施形態では、前記ポリヌクレオチドはプライマーであり、かつ、ハイブリダイゼーションはプライマーの配列を含んでなる増幅産物の存在を検出することによって検出される。もう1つの実施形態では、前記ポリペプチドは抗体である。
【００２９】
もう1つの態様では、本発明は、哺乳動物のGENSET遺伝子の発現レベルが上昇しているか低下しているかを調べる方法を提供し、この方法はa)哺乳動物由来の生物学的サンプルを用意し、さらに、b)生物学的サンプル内の本明細書に記載のいずれかのポリペプチドの量またはポリペプチドをコードするRNA種の量を、対照サンプルで検出されるかまたは予想されるレベルと比較するステップを含んでなり、その際、対照サンプルで検出されるかまたは予想されるレベルと比較して、生物学的サンプル内のポリペプチドまたはRNA種の量が増加していれば、哺乳動物のGENSET遺伝子の発現レベルが上がっていることを示し、また、対照サンプルで検出されるかまたは予想されるレベルと比較して、生物学的サンプル内のポリペプチドまたはRNA種の量が減少していれば、哺乳動物のGENSET遺伝子の発現レベルが下がっていることを示す。
【００３０】
もう1つの態様では、本発明はGENSETポリペプチドの候補モジュレーターの同定方法を提供し、この方法はa)本明細書に記載のいずれかのポリペプチドを試験化合物と接触させ、さらに、b)該化合物が該ポリペプチドと特異的に結合するかどうかを調べることを含んでなり、その際、該化合物が該ポリペプチドと特異的に結合することが検出されれば、該化合物がGENSETポリペプチドの候補モジュレーターであることを示す。
【００３１】
表の簡単な説明
表Ｉは、配列表の各配列識別番号（配列番号：SEQ ID NO.）に対応する本出願人の内部表示番号（クローンID クローン名）を提供し、また、その配列が核酸配列（DNA）であるのか、ポリペプチド配列（PRT）であるのかを示している。さらに、対応する核酸またはポリペプチド配列の名称に関する情報、および生物学的物質の寄託に関する情報も提供される。生物学的物質はそれらの対応するクローンID、クローン名、または両方のクローンID クローン名に関連して寄託されていることを理解すべきである。
【００３２】
表IIは、本発明のポリヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（ORF）、シグナルペプチド、成熟ペプチド、ポリアデニル化シグナル、およびポリＡテイルを含む配列表の対応する配列番号のヌクレオチド位置を提供する。
【００３３】
表IIIは、実施例１に記載するような抗体の生成において有用である本発明のポリペプチドの免疫原性エピトープの位置を含む配列表の対応する配列番号のアミノ酸位置を提供する。
【００３４】
表IVは、配列表の対応する配列番号の優先的に包含されるまたは除外される断片を含むヌクレオチドの位置を提供する。
【００３５】
配列表の簡単な説明
添付の配列表に配列を示す。
【００３６】
奇数配列番号1〜111は示したオープン・リーディング・フレームを有するcDNAのヌクレオチド配列である。適宜に、潜在的なポリアデニル化部位およびポリアデニル化シグナルも示されている
偶数配列番号2〜112は奇数配列番号1〜111のcDNAによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列である。
【００３７】
配列表に関する規則に従って、配列表では以下のコードを用いてヌクレオチド配列を記載した。配列中のコード「r」は、グアニンまたはアデニンであり得るヌクレオチドを示す。配列中のコード「y」は、チミジンまたはシトシンであり得るヌクレオチドを示す。配列中のコード「m」は、アデニンまたはシトシンであり得るヌクレオチドを示す。配列中のコード「k」は、グアニンまたはチミジンであり得るヌクレオチドを示す。配列中のコード「s」は、グアニンまたはシトシンであり得るヌクレオチドを示す。配列中のコード「w」は、アデニンまたはチミジンであり得るヌクレオチドを示す。さらに、核酸配列中の記号「n」のすべての例は、そのヌクレオチドがアデニン、グアニン、シトシンまたはチミジンであり得ることを意味する。
【００３８】
いくつかの場合には、配列表中のポリペプチド配列が記号「Xaa」を含む。これらの「Xaa」記号は、(1)ヌクレオチド配列多義性のために同定できない残基、または(2) (その配列がより正確に決定された場合には)本出願人が存在すべきでないと考える、決定された配列中の停止コドン、のいずれかを示す。ある場合には、この遺伝コードによって、未知のアミノ酸のいくつかの可能性のある正体が示唆される。
【００３９】
配列番号1〜112に関して本明細書に記載されるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が配列表に示す対応配列と矛盾する場合には、配列表に示す配列が優先するものとする。配列表の配列番号1〜112のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列はその全体が参照により本明細書に組み込まれることを理解すべきである。
【００４０】
本発明および好適な実施形態の詳細な説明
定義
本発明をより詳細に説明する前に、本明細書において本発明を説明するために用いられる用語の意味および範囲を例示および規定するために以下の定義を行うこととする。
【００４１】
本明細書において「GENSET遺伝子」とは、5'および3'非翻訳領域を含むGENSETポリペプチドをコードするゲノム、mRNAおよびcDNA配列を包含する。
【００４２】
「GENSETポリペプチド生物活性」または「GENSET生物活性」とは、本発明のGENSETポリペプチドの活性と必ずしも同一ではないが、何らかの類似の活性を示すポリペプチドを表す。所定のポリペプチドのGENSETポリペプチド生物活性は、どのような好適な生物学的アッセイを用いても評価することができ、そのいくつかは当業者には公知である。対照的に、「生物活性」とは、任意のポリペプチドが持ち得る任意の活性を指す。
【００４３】
「対応するmRNA」とは、本発明のcDNAを作製するためのcDNA合成の鋳型であったか、または鋳型となり得るmRNAを指す。
【００４４】
「対応するゲノムDNA」とは、例えば、本発明のcDNAに対応する目的のmRNAをコードするゲノムDNAを指し、このゲノムDNAはゲノムDNA(またはcDNA)の配列中のチミジン残基がmRNAではウラシル残基で置換されているmRNA鎖の一方の配列を含む。
【００４５】
本明細書において「寄託されたクローンプール」とは、2000年11月27日にATCCに寄託されcDNA-11-2000と称するクローンのプール、または2000年9月15日にATCCに寄託されcDNA-8-2000と称するクローンのプールを指す。
【００４６】
本明細書において「異種」とは、本発明のGENSETポリヌクレオチドまたはGENSETポリペプチド以外のいずれかのポリヌクレオチドまたはポリペプチドをそれぞれ示すものとする。
【００４７】
生物学的サンプル、細胞集団などに関する「用意する」とは、サンプル、細胞集団などがある方法または手順において何らかの形で用いられることを示す。重要なこととして、生物学的サンプルまたは細胞集団を「用意する」ことは、サンプルまたは細胞を本発明の目的のために特別に単離または取得することを必要とせず、その代わりに、例えば、別の個体によって別の目的のために取得された生物学的サンプルを使用することを指す場合もある。
【００４８】
「増幅産物」とは、いずれかの増幅反応、例えば、PCR、RT-PCR、LCRなどの産物を指す。
【００４９】
タンパク質またはその他の化合物の「モジュレーター」とは、タンパク質との物理的結合、タンパク質発現の量または質の変化、タンパク質の測定可能または検出可能な活性、特性、または挙動の変更を含めて、タンパク質に対して機能的な影響を有するか、あるいは該タンパク質または化合物と何らかの方法で相互作用する、あらゆる物質を指す。
【００５０】
「試験化合物」とは、タンパク質またはその他の化合物を調節するその能力について評価されるどのような分子であってもよい。
【００５１】
本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドと特異的に結合する抗体またはその他の化合物は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを「選択的に認識する」とも言われる。
【００５２】
分子に関して「単離された」とは、その分子がもとの環境(例えば、天然のものである場合には天然環境)から取り出されている必要がある。例えば、生存動物中に存在する天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然の系において共存する一部または全部の物質から分離された同ポリヌクレオチドもしくはDNAまたはポリペプチドは単離されている。かかるポリヌクレオチドはベクターの一部であってもよく、かつ／またはかかるポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部であってもよく、ベクターまたは組成物は天然環境の一部ではないという点でやはり単離されたものである。例えば、生存動物中に存在する天然のポリヌクレオチドは単離されていないが、天然の系において共存する一部または全部の物質から分離された同ポリヌクレオチドは単離されている。天然の染色体(染色体の広がりなど)、in vitro核酸調製物として、またはトランスフェクト／形質転換された宿主細胞調製物(ここで、宿主細胞はin vitro異種調製物であるか、または単一コロニーの異種集団としてプレーティングされている)として存在する、人工染色体ライブラリー、ゲノムライブラリーおよびcDNAライブラリーは、「単離された」という定義から特に除外される。また、特定のポリヌクレオチドがベクター分子中の核酸インサートの数の5％未満（10％、25％、50％、または75％と指定することもできる）を構成する前記ライブラリーも特に除外される。さらに、全細胞ゲノムDNAまたは全細胞RNA調製物(機械的に剪断されたか、または酵素的に消化された全細胞調製物を含む)も特に除外される。さらに、本発明のポリヌクレオチドが電気泳動媒質中の異種ポリヌクレオチドからそれ以上分離されていない(例えば、アガロースゲルまたはナイロンブロットで異種バンド集団から単一のバンドを切り出すことによりさらに分離する)、電気泳動によって分離された異種混合物(そのブロットトランスファーを含む)またはin vitro調製物のいずれかとしての前記全細胞調製物も特に除外される。
【００５３】
「精製された」とは、完全な精製を必要とするものではなく、むしろ相対的な定義である。出発物質または天然物質の少なくとも1桁分高い精製、好ましくは2または3桁分、より好ましくは4または5桁分高い精製が特に考慮される。
【００５４】
さらに、本明細書において「精製された」は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド、炭水化物、脂質などを含むがこれらに限らない他の化合物から分離されている本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを記載するためにも用いられる。「精製された」は、本発明の単量体ポリペプチドがホモまたはヘテロ二量体、三量体などのオリゴマー形態から分離されていることを明記するために用いてもよい。「精製された」はまた、共有結合で閉環された(すなわち、環状の)ポリヌクレオチドが線状ポリヌクレオチドから分離されていることを明記するのに用いてもよい。ポリヌクレオチドはサンプルの少なくとも約50%、好ましくは60〜75%が単一のポリヌクレオチド配列およびコンホメーション(線状対共有結合閉環)を示す場合に実質的に純粋である。実質的に純粋なポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、典型的には約50%、好ましくは60〜90重量／重量%のポリペプチドまたはポリヌクレオチドサンプルをそれぞれ含んでなり、より一般的には約95%、好ましくは約99%以上の純度である。ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの純度つまり均一性は、サンプルのアガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動と、それに次いでゲルを染色した際の単一バンドの可視化など、当業者に周知のいくつかの手段によって示される。特定の目的のためには、HPLCまたは当技術分野で周知のその他の手段を用いることで、より高い分離能も提供され得る。別の実施形態として、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドの精製は、異種ポリペプチドおよびポリヌクレオチド(DNA、RNAまたは双方)に対する「少なくとも」パーセント純度として表してもよい。好ましい実施形態として、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、それぞれ異種ポリペプチドおよびポリヌクレオチドに対して少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、96%、98%、99%または100%の純度である。さらに好ましい実施形態として、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、それぞれ異種ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、任意の数字から小数点以下第3位まで、90%〜100%の範囲の純度(例えば、少なくとも99.995%の純度のポリペプチドまたはポリヌクレオチド)、または担体中に存在するもの以外のすべての化合物および分子に対する重量／重量比としての純度を有する。小数点以下第3位までのパーセント純度を表す各数字は、個々の種の純度であると言うことができる。
【００５５】
本明細書において相互交換可能に用いられる「核酸分子」、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」には、RNAもしくはDNA(一本鎖もしくは二本鎖、コーディング、相補的、またはアンチセンス)、または一本鎖もしくは二本鎖形態のいずれかの2以上のヌクレオチドからなるRNA/DNAハイブリッド配列が含まれる(しかし、上記種の各々を特に特定することができる)。本明細書において「ヌクレオチド」とは、一本鎖または二本鎖形態の任意の長さのRNA、DNAまたはRNA/DNAハイブリッド配列を含んでなる分子を記載するために形容詞として用いられる。より正確には、「ヌクレオチド配列」という表現は核酸物質それ自体を包含し、従って、特定のDNAまたはRNA分子を生化学的に特徴付ける配列情報(すなわち、4種の塩基文字から選択された文字の連続物)に限定されない。本明細書において「ヌクレオチド」はまた、個々のヌクレオチドまたは多種のヌクレオチドを指す名詞としても用いられ、プリンもしくはピリミジンと、リボースもしくはデオキシリボース糖部分と、リン酸基を含み、またはオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド内のヌクレオチドの場合にはホスホジエステル結合を含む、分子またはより大きな核酸分子中の個々の単位を意味する。本明細書において「ヌクレオチド」はまた、(a)別の結合基、(b)プリンの類似形態、(c)ピリミジンの類似形態、または(d)類似した糖などの少なくとも1つの修飾を含んでなる「修飾ヌクレオチド」を包含する。類似した結合基、プリン、ピリミジンおよび糖の例については、例えばPCT公開第WO 95/04064号（全開示内容を参照により本明細書に組み入れる）を参照されたい。本発明の好ましい修飾物としては、限定されるものではないが、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β-D-ガラクトシルケオシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルケオシン、5'-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)ワイブトキソシン(ybutoxosine)、シュードウラシル、ケオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸、5-メチル-2-チオウラシル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシル、および2,6-ジアミノプリンが挙げられる。本発明のポリヌクレオチド配列は合成、組換え、ex vivo作製またはそれらの組合せ、ならびに当技術分野で公知のいずれかの精製法の利用をはじめとするいずれかの既知の方法で調製すればよい。メチレンメチルイミノ結合オリゴヌクレオシドならびに混合バックボーン化合物は、米国特許第5,378,825号、同第5,386,023号、同第5,489,677号、同第5,602,240号および同第5,610,289号（全開示内容を参照により本明細書に組み入れる）に記載のように調製することができる。ホルムアセタールおよびチオホルムアセタール結合オリゴヌクレオシドは、米国特許第5,264,562号および同第5,264,564号（全開示内容を参照により本明細書に組み入れる）に記載のように調製することができる。エチレンオキシド結合オリゴヌクレオシドは、米国特許第5,223,618号（全開示内容を参照により本明細書に組み入れる）に記載のように調製すればよい。ホスフィネートオリゴヌクレオチドは、米国特許第5,508,270号（全開示内容を参照により本明細書に組み入れる）に記載のように調製すればよい。アルキルホスホネートオリゴヌクレオチドは、米国特許第4,469,863号（全開示内容を参照により本明細書に組み入れる）に記載のように調製すればよい。3'-デオキシ-3'-メチレンホスホネートオリゴヌクレオチドは、米国特許第5,610,289号または同第5,625,050号（全開示内容を参照により本明細書に組み入れる）に記載のように調製することができる。ホスホルアミダイトオリゴヌクレオチドは、米国特許第5,256,775号または同第5,366,878号（全開示内容を参照により本明細書に組み入れる）に記載のようにして調製することができる。アルキルホスホノチオエートオリゴヌクレオチドは、PCT公開第WO94/17093号および同第WO94/02499号（全開示内容を参照により本明細書に組み入れる）に記載のようにして調製すればよい。3'-デオキシ-3'-アミノホスホルアミデートオリゴヌクレオチドは、米国特許第5,476,925号（全開示内容を参照により本明細書に組み入れる）に記載のようにして調製することができる。ホスホトリエステルオリゴヌクレオチドは、米国特許第5,023,243号（全開示内容を参照により本明細書に組み入れる）に記載のようにして調製することができる。ボラノホスフェートオリゴヌクレオチドは、米国特許第5,130,302号および同第5,177,198号（全開示内容を参照により本明細書に組み入れる）に記載のようにして調製すればよい。
【００５６】
本明細書において「上流」とは、特定の基準点からポリヌクレオチドの5'末端の方に向かう位置を指す。
【００５７】
本明細書において「塩基対」および「ワトソン＆クリック塩基対」は、相互交換可能に用いられ、2個の水素結合によってアデニン残基と結合したチミジンまたはウラシル残基ならびに3個の水素結合によって結合したシトシンおよびグアニン残基を含む二重らせんDNAに存在するものと同様に、その配列自体によって互いに水素結合され得るヌクレオチドを指す(Stryer, 1995を参照のこと；全開示内容を参照により本明細書に組み入れる)。
【００５８】
本明細書において「相補的な」または「その相補体」とは、もう1つの特定のポリヌクレオチドと相補領域全体を通してワトソン＆クリック塩基対を形成し得るポリヌクレオチド配列を指す。本発明の目的のためには、第1のポリヌクレオチド中の各塩基がその相補的な塩基と対合する場合に、第1のポリヌクレオチドは第2のポリヌクレオチドに相補的であると認められる。相補的な塩基とは、一般にAとT(もしくはAとU)またはCとGである。本明細書において「相補体」は、「相補的ポリヌクレオチド」、「相補的核酸」および「相補的ヌクレオチド配列」からの同義語として用いられる。これらの用語は、単にその配列だけに基づくポリヌクレオチドの対に適用され、2つのポリヌクレオチドが実際に結合するであろう特定のセットの条件には適用されない。特に断らない限り、すべての相補的ポリヌクレオチドは考慮されるポリヌクレオチドの全長に対して完全に相補的である。
【００５９】
本明細書において相互交換可能に用いられる「ポリペプチド」および「タンパク質」は重合体の長さに関わらずアミノ酸の重合体を指し、従って、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質がポリペプチドの定義内に含まれる。この用語はまた、本発明のポリペプチドの化学的修飾または発現後修飾を特定したり排除したりしないが、これらのポリペプチドの化学的または発現後修飾は特定の実施形態として含めても除外してもよい。従って、例えば、グリコシル基、アセチル基、リン酸基、脂質基などの共有結合を含むポリペプチドの修飾もポリペプチドという用語に明らかに包含される。さらに、これらの修飾を含むポリペプチドは、本発明に含まれるまたは本発明から除外される個々の種として特定され得る。上記の例に挙げたものなどの天然または他の化学的修飾は、ペプチドのバックボーン、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端を含むポリペプチド中のどこに存在してもよい。同じタイプの修飾が所定のポリペプチド中のいくつかの部位に同程度または様々な程度に存在しうることが理解されよう。また、所定のポリペプチドは多くのタイプの修飾を含んでいてもよい。ポリペプチドは例えば、ユビキチン化の結果として分岐していてもよく、また、分岐したまたはしてない環状であってもよい。修飾としては、アセチル化、アシル化、ADP-リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合による結合、ヘム部分の共有結合による結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合による結合、脂質または脂質誘導体の共有結合による結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合による結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有結合による架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γカルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニン化などのタンパク質へのアミノ酸のトランスファーRNA媒介性付加、およびユビキチン化が挙げられる(例えば、Creighton (1993), Posttranslational Covalent Modification of Proteins, W.H. Freeman and Company, New York B.C. Johnson編, Academic Press, New York 1-12; Seifterら, (1990) Meth Enzymol 182: 626-646; Rattanら, (1992) Ann NY Acad Sci 663: 48-62参照)。また、1個以上のアミノ酸類似体（例えば、非天然アミノ酸、無関係の生物系においてのみ天然に存在するアミノ酸、哺乳動物系からの修飾アミノ酸など）を含むポリペプチド、置換された結合を含むポリペプチド、ならびに天然および非天然双方の当技術分野で公知の他の修飾物も定義内に含まれる。
【００６０】
本明細書において「組換えポリヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド構築物」は、相互交換可能に用いられ、その最初の天然環境では連続したヌクレオチド配列として存在しない少なくとも２つのヌクレオチド配列を含んでなる、人工的に設計された、直鎖状または環状の、精製または単離されたポリヌクレオチドを指す。特に、これらの用語は、ポリヌクレオチドまたはcDNAがその天然環境では隣接していない「バックボーン」核酸に隣接していることを意味する。さらに、cDNAが「富化される」とは、核酸バックボーン分子の集団中の核酸インサートの数が5%以上であることを表す。本発明のバックボーン分子としては、発現ベクター、自己複製核酸、ウイルス、組込み用の核酸、および目的の核酸インサートを維持または操作するために用いられるその他のベクターまたは核酸などの核酸が挙げられる。好ましくは、富化されたcDNAは組換えバックボーン分子の集団中の核酸インサート数が15%以上に相当する。富化されたcDNAは、組換えバックボーン分子の集団中の核酸インサート数が50%以上に相当することがさらに好ましい。非常に好ましい実施形態では、富化されたcDNAは、組換えバックボーン分子の集団中の核酸インサート数が90%以上(90〜100％の間の少数点以下第3位までの任意の数字を含み、例えば99.5％)に相当する。
【００６１】
本明細書において「組換えポリペプチド」とは、その最初の天然環境では連続したポリペプチド配列として存在しない少なくとも2つのポリペプチド配列を含んでなる、人工的に設計されたポリペプチドを指すか、または組換えポリヌクレオチドから発現されたポリペプチドを指す。
【００６２】
本明細書において「機能し得る形で連結された」とは、機能的な関係でのポリヌクレオチド要素の連結を指す。プロモーターなどの調節配列に「機能し得る形で連結された」配列とは、その調節エレメントが核酸との関係において正しい位置および方向にあって、RNAポリメラーゼの開始および目的の核酸の発現を制御することを意味する。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列の転写に影響を及ぼす場合にはコード配列に機能し得る形で連結されている。
【００６３】
「ドメイン」は特定の生物学的特性を有するアミノ酸断片を指す。この用語はすべての既知の構造および直鎖状の生物学的モチーフを包含する。かかるモチーフの例としては、限定されるものではないが、ロイシンジッパー、へリックス−ターン−へリックスモチーフ、グリコシル化部位、ユビキチン化部位、αへリックスおよびβシート、タンパク質の分泌を指令するシグナルペプチド、翻訳後修飾の部位、酵素の活性部位、基質結合部位および酵素切断部位が挙げられる。
【００６４】
「含んでなる」、「からなる」および「本質的にからなる」は、各々明確に区別される意味を有するが、本願を通じて相互に交換してもよい。「有する」は「含んでなる」と同じ意味であり、「からなる」または「本質的にからなる」のいずれかと置き換えることもできる。
【００６５】
特に断らない限り、本願において、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドのそれぞれヌクレオチドおよびアミノ酸は連続しており、異種配列によって中断されていない。
【００６６】
本明細書中で用いる「新生物細胞」とは、新たな異常増殖により生じる細胞を意味する。新生物細胞としては、さらに、形質転換細胞、癌細胞（血液の癌および良性または悪性の固形腫瘍を含む）が挙げられる。
【００６７】
本明細書中で用いる「腫瘍」とは、悪性であろうと良性であろうと、過度の細胞分裂から生じる細胞の異常な塊または集団、ならびに、すべての前癌状態と癌状態の細胞および組織を意味する。「腫瘍」はさらに２個以上の新生物細胞として定義される。
【００６８】
「悪性腫瘍」は、制御不能な細胞増殖に加えて、それらが周囲の組織に侵入して転移する可能性があるという点で、良性の増殖物または腫瘍と区別される。
【００６９】
「形質転換細胞」、「悪性細胞」または「癌」という用語は、相互に交換可能であり、悪性の形質転換を受けた細胞を意味するが、幼若化(blast transformation)を受けたリンパ球細胞も含まれる。悪性の形質転換は正常細胞が悪性細胞に変換されることである。形質転換細胞は、動物の体内に注入したとき腫瘍を起こさせる比較的大きな能力を有する。形質転換は増殖特性の変化、とりわけ、巨大分子増殖因子の要件の変化、により認識され、また、多くの場合は形態の変化によっても認識される。通常、形質転換細胞は培養基層への付着を必要とせずに増殖し、細胞間阻害(cell to cell inhubition)を欠いており、細胞培養で単層を形成した後でも積み重なって増殖することができる。
【００７０】
本明細書中で用いる「新生物疾患」または「腫瘍性疾患」とは、制御不能な細胞の異常増殖を特徴とする状態をさす。前記疾患には癌が含まれる。癌の例として、限定するものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が挙げられる。そのような癌のさらに特定した例としては、乳癌、前立腺癌、大腸癌、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、頸癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞癌、大腸癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓癌、外陰部の癌、甲状腺癌、肝臓癌、皮膚癌、メラノーマ、脳の癌、卵巣癌、神経芽細胞腫、骨髄腫、様々なタイプの頭部および頸部癌、急性リンパ芽球白血病、急性骨髄性白血病、ユーイング肉腫、および末梢感覚上皮腫が挙げられる。ここに挙げた可能性のある全ての癌は、個々の種として本発明に含まれるか、あるいは本発明から除外しうる。
【００７１】
本明細書中で用いる「癌腫」とは、皮膚に存在する上皮、より一般的には乳房、前立腺、肺、胃または腸などの器官の内層、から発生する新たな増殖物（腺癌）をさす。癌腫としては、膀胱癌、肝癌、胚芽細胞腫、横紋筋肉腫、卵巣癌、頸部癌、肺癌、乳癌、大腸癌、子宮癌、子宮頸癌、類内膜癌、傍神経節腫、頭部および頸部の扁平上皮癌、食道癌、甲状腺癌、星状細胞腫、神経芽細胞腫、および感覚上皮腫が挙げられる。ここに挙げた可能性のある全ての癌は、個々の種として本発明に含まれるか、あるいは本発明から除外しうる。
【００７２】
本明細書中で用いる「不死化細胞」とは、限りなく増殖する細胞をさす。かかる細胞は有限の細胞分裂サイクルの正常な増殖限界から逃れている。この用語には悪性細胞は含まれない。
【００７３】
本明細書中で用いる「正常細胞」とは、増殖に限界がある細胞、すなわち、有限の細胞分裂サイクル（ヘイフリック限界）を有する細胞をさし、それゆえ、非腫瘍形成性細胞である。正常細胞には、生存している生物から直接採取された、不死化されていない細胞または細胞系である一次細胞が含まれる。
【００７４】
本明細書中で用いる「細胞周期」とは、細胞の増殖・分裂中に生じる周期的な生化学的および構造的事象をさす。細胞周期の時期には、G0（Gap 0; 静止期）、G1（Gap 1）、S期（DNA合成期）、G2（Gap 2）、およびM期（分裂期）がある。
【００７５】
本明細書中で用いる「細胞増殖」とは、細胞集団のサイズが大きくなることをさす。
【００７６】
本明細書中で用いる「細胞分裂」とは、有糸分裂、すなわち、細胞増殖の過程をさす。
【００７７】
本明細書中で用いる「増殖」とは、細胞の生長および分裂を意味する。「活発に増殖する」とは、活発に生長し分裂している細胞を意味する。
【００７８】
本明細書中で用いる「細胞増殖を阻害する」とは、細胞の生長と分裂を遅くしかつ／または妨げることをさす。細胞はさらに、特定の細胞周期の時期、すなわち、G1（Gap 1）、S期（DNA合成期）、G2（Gap 2）またはM期（分裂期）で停止しているとして特定することができる。
【００７９】
本明細書中で用いる「細胞増殖を優先的に阻害する」とは、正常細胞と比較して、細胞の生長と分裂を遅くしかつ／または妨げることをさす。
【００８０】
「転移」という用語は、疾患が、ある器官および／または組織から直接それと関連のない別の器官および／または組織へ移ることを意味する。本明細書中で用いる場合、転移は調節されない新生物細胞の増殖および離れた組織・器官への広がりをさす。
【００８１】
「転移を阻害する」という用語は、新生物細胞の一次増殖領域から離れた部位への転移または広がりを遅らせかつ／または妨げることを意味する。
【００８２】
本明細書中で用いる「侵入」とは、癌細胞が周囲の組織へ広がることを意味する。
【００８３】
「侵入を阻害する」とは、癌細胞の周囲の組織への広がりを遅らせかつ／または妨げることを意味する。
【００８４】
本明細書中で用いる「アポトーシス」とは、細胞の寿命または健康状態が命令する場合の、正常に機能しているヒトおよび動物細胞の核により合図されるプログラムされた細胞死を意味する。「アポトーシス」は、死につつある細胞（いわゆる梯子状のパターンをゲル上に与えるDNAの断片化をしばしば特徴とする）による代謝活性を必要とする能動的なプロセスである。アポトーシスによって死滅する細胞は通常はネクローシスと関連している炎症反応を誘発しないが、その理由は不明である。しかしながら、癌性の細胞は、正常な細胞形質導入またはアポトーシスにより駆動される天然の細胞死過程を経験することができないか、あるいは、それが低減している。形態学的には、とりわけ、アポトーシスは近隣細胞との接触の低下、細胞質の凝縮、エンドヌクレアーゼ活性と関連したクロマチンの凝縮およびピクノーシス(pyknosis)、ならびに核の断片化により特徴づけられる。
【００８５】
本明細書中で用いる「ネクローシス」（壊死）とは、酵素の進行的な分解作用により引き起こされ、細胞の死を示す形態学的変化の全体をさし、細胞群または構造や器官の一部に影響を及ぼすことがある。形態学的には、ネクローシスはミトコンドリアの著しい膨張、細胞質の膨張および核の変化、これに続く細胞の破壊と自己溶解を特徴とする。これは受動的または付随的に起こる。
【００８６】
「アポトーシスを誘導する」とは、所定の細胞集団においてアポトーシスを受ける細胞の数を増加させること、または細胞がアポトーシスを受ける速度を高めることを意味する。好ましくは、かかる増加は、正常な未処理のまたは陰性の対照細胞と比べて、少なくとも1.25、1.5、2、5、10、50、100、500または1000倍の増加である。
【００８７】
「アポトーシスを阻害する」とは、未処理対照と比べて、アポトーシスを受ける細胞の数を減少させることを意味する。好ましくは、かかる減少は、正常な未処理のまたは陰性の対照細胞と比べて、少なくとも1.25、1.5、2、5、10、50、100、500または1000倍の減少である。
【００８８】
新生物細胞の「細胞増殖を阻害する」ことに関して、本明細書に開示する組成物またはそのアゴニストの「有効量」とは、ある程度まで、標的細胞の増殖を抑制することができる量のことである。この用語はさらに、標的細胞の増殖抑制、細胞静止および／または細胞傷害性効果および／またはアポトーシスおよび／またはネクローシスを誘起することができる量を含む。新生物細胞の増殖を抑制することを目的とした本発明のポリペプチドまたはそのアゴニストの「有効量」は、当技術分野で周知の方法を用いて経験的かつルーチンに決定することができる。
【００８９】
新生物疾患の治療または新生物細胞に関して、「治療に有効な量」とは、１以上の下記効果を引き出すことができる量をさす：(1)腫瘍増殖をある程度まで阻止する、例えば、(i)遅らせる、(ii)増殖を完全に停止させる；(2)腫瘍細胞の数を減少させる；(3)腫瘍の大きさを維持する；(4)腫瘍を縮小させる；(5)腫瘍細胞の周辺器官への侵潤を阻害する、例えば、(i)低減させる、(ii)遅らせる、または(iii)完全に防止する；(6)転移を阻害する、例えば、(i)低減させる、(ii)遅らせる、または(iii)完全に防止する；(7)抗腫瘍免疫応答を高め、結果的に、(i)腫瘍の大きさを維持する、(ii)腫瘍を縮小させる、(iii)腫瘍の増殖を遅らせる、(iv)侵入を低減させるか、遅らせるか、もしくは防止する、または(v)転移を低減させるか、遅らせるか、もしくは防止する；および／または(8)該疾患と関連した１以上の症状をある程度まで緩和する。腫瘍の治療を目的とした本発明のポリペプチドまたはそのアゴニストの「治療に有効な量」は、経験的にルーチンな方法で決定することができる。
【００９０】
本発明のポリペプチドまたはそのアゴニストの「増殖阻止量」とは、細胞、特に悪性腫瘍細胞（例えば、癌細胞）の増殖をin vitroまたはin vivoのいずれかで阻止することができる量のことである。新生物細胞の増殖を阻止することを目的とした本発明のポリペプチドまたはそのアゴニストの「増殖阻止量」は、当技術分野で周知の方法を用いて経験的かつルーチンに決定することができる。
【００９１】
本発明のポリペプチドまたはそのアゴニストの「細胞傷害量」とは、細胞、特に腫瘍（例えば、癌細胞）の破壊をin vitroまたはin vivoのいずれかで起こさせることができる量のことである。新生物細胞の増殖を阻止することを目的とした本発明のポリペプチドまたはそのアゴニストの「細胞傷害量」は、当技術分野で周知の方法を用いて経験的かつルーチンに決定することができる。
【００９２】
本明細書中で用いる「死滅させる」または「細胞傷害性を誘導する」とは、アポトーシスおよび／またはネクローシスによって細胞死を誘導することをさす。したがって、本発明の実施形態はアポトーシスのみ、ネクローシスのみ、およびアポトーシスとネクローシスの両方を含む。
【００９３】
本明細書中で用いる「細胞傷害剤」とは、例えば細胞周期の進行を止めることによって、細胞の機能を阻害または妨害し、かつ／または細胞死を引き起こす物質をさす。この用語には放射性同位体、化学療法剤、および毒素（例えば、細菌、真菌、植物または動物起源の酵素活性のある毒素またはその断片）を含めるものとする。
【００９４】
本明細書中で用いる「防止する」とは、疾患または症状の身体的発現を防止するために、疾患または症状の臨床徴候が現れる前に化合物を投与することをさす。あるいは、「防止する」という用語は疾患または症状と関連した臨床徴候の軽減、つまり重症度を意味するためにも使用される。
【００９５】
「抑制」は疾患が臨床的に現れる前に薬物を投与する必要がある。
【００９６】
本明細書中で用いる「治療する」とは、臨床徴候が現れた後で化合物を投与することをさす。
【００９７】
ヒトおよび動物医学においては、「防止」および「抑制」を含めるために、「治療」とは明確に区別される「予防」(prophylaxis)という語が用いられる。本明細書において「保護」には「予防」が含まれる。有効であるために保護が絶対的である必要はない。
【００９８】
本明細書中で用いる「治療を必要とする」とは、個体または動物が治療を必要とするまたは治療から利益を得るであろうという、ケア提供者（例えば、ヒトの場合は医師、看護師、介護人など；非ヒト哺乳動物を含む動物の場合は獣医師）によりなされた判断をさす。この判断は、ケア提供者の専門的知識の領分にある様々な要因（本発明の化合物によって治療可能な症状の結果として、個体または動物が病気であるか病気になるという知識を含む）に基づいて行われる。
【００９９】
「治療の必要性を認める」とは、個体が治療を望んでいるというサブクリニカルな決定をさす。その他の実施形態における「治療の必要性を認める」とは、動物の所有者が動物の治療のために行う決定をさす。
【０１００】
本明細書中で用いる「個体」または「患者」とは、哺乳動物、好ましくは、マウス、ラット、他のげっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、または霊長類を含めて、あらゆる動物をさし、最も好ましくはヒトをさす。この用語は雄または雌またはその両方を特定しても、雄または雌を排除してもよい。
【０１０１】
本明細書中で用いる「非ヒト動物」とは、昆虫、鳥類、げっ歯類、より一般的には哺乳動物を含めて、ヒト以外のあらゆる動物をさす。好ましい非ヒト動物としては霊長類、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ウシ、ウマ、ニワトリ、ウサギなどの家畜、ならびにげっ歯類、好ましくはラットまたはマウスが挙げられる。本明細書において「動物」とは、動物界のいずれかの種、好ましくは鳥類、魚類、より好ましくは哺乳類を含めた脊椎動物を指す。「動物」と「哺乳動物」の双方は、「非ヒト」という用語が先行しない限りはヒト被験者を包含する。
【０１０２】
本明細書中で用いる「生理学的に許容される」、「製薬上許容される」および「医薬用の」という用語は相互に交換可能である。
【０１０３】
核酸またはポリペプチド間の同一性
「配列同一性％」および「ホモロジー％」は本明細書において相互交換可能に用いられ、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド間の比較を指し、2つの最適にアラインメントさせた配列を比較ウィンドウにわたって比較することによって決定される。2つの配列の最適なアラインメントについて参照配列(付加または欠失を含まない)と比較した場合に、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は付加または欠失(すなわちギャップ)を含んでいてもよい。パーセントは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両配列中に存在する位置の数を求めることでマッチした位置の数を得、マッチした位置の数を比較ウィンドウ中の位置の総数で割り、その結果に100をかけて配列同一性％を得ることにより算出する。ホモロジーは当技術分野で公知の種々の配列比較アルゴリズムおよびプログラムのいずれかを用いて評価する。かかるアルゴリズムおよびプログラムとしては、限定されるものではないが、TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTA、CLUSTALW、FASTDB (PearsonおよびLipman, (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(8):2444-2448; Altschulら, (1990), J. Mol. Biol. 215(3):403-410; Thompsonら (1994), Nucleic Acids Res. 22(2):4673-4680; Higginsら, (1996), Meth. Enzymol. 266:383-402; Altschulら, (1993), Nature Genetics 3:266-272; Brutlagら (1990) Comp. App. Biosci. 6:237-24)が挙げられ、これらの全開示内容を参照により本明細書に組み入れるものとする。
【０１０４】
特に好ましい実施形態では、タンパク質および核酸配列ホモロジーは当技術分野で周知のザ・ベーシック・ローカル・アラインメント・サーチ・ツール(the Basic Local Alignment Search Tool)(「BLAST」)を用いて評価する(例えば、KarlinおよびAltschul, (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2267-2268; Altschulら, (1997), Nuc. Acids Res. 25:3389-3402参照；これらの開示内容を参照により本明細書に組み入れる)。特に、5つの特定のBLASTプログラムを用いて以下のタスクを実施する：
(1)  BLASTPおよびBLAST3はアミノ酸クエリー配列をタンパク質配列データベースに対して比較する；
(2)  BLASTNはヌクレオチドクエリー配列をヌクレオチド配列データベースに対して比較する；
(3)  BLASTXはクエリーヌクレオチド配列(両鎖)の6フレーム概念の翻訳産物をタンパク質配列データベースに対して比較する；
(4)  TBLASTNはクエリータンパク質配列をすべての6リーディング・フレームで翻訳されるヌクレオチド配列データベース(両鎖)に対して比較する；
(5)  TBLASTXはヌクレオチドクエリー配列の6フレーム翻訳をヌクレオチド配列データベースの6フレーム翻訳に対して比較する。
【０１０５】
BLASTプログラムは、クエリーアミノ酸または核酸配列と試験配列（好ましくはタンパク質または核酸配列データベースから得られる）間で、「ハイスコアリングセグメントペア」（高いスコアを与える断片対）と呼ばれる類似セグメントを同定することによって、相同配列を同定する。ハイスコアリングセグメントペアはスコアリング・マトリックスを用いて同定(すなわち、アラインメント)することが好ましく、その多くは当技術分野で公知である。好ましくは、用いるスコアリング・マトリックスはBLOSUM62マトリックスである(Gonnetら, (1992), Science 256:1443-1445; HenikoffおよびHenikoff, (1993), Proteins 17:49-61；その開示内容を参照により本明細書に組み入れる)。あまり好ましくないが、PAMまたはPAM250マトリックスも用いることができる(例えば、SchwartzおよびDayhoff編, (1978), Matrices for Detecting Distance Relationships: Atlas of Protein Sequence and Structure, Washington: National Biomedical Research Foundation参照；その開示内容を参照により本明細書に組み入れる)。BLASTプログラムは同定されたすべてのハイスコアリングセグメントペアの統計的有意性を評価し、好ましくは、ユーザーが特定したホモロジー％などの有意性のユーザー特定閾値を満たすセグメントを選択する。ハイスコアリングセグメントペアの統計的有意性は、統計的有意性に関するカーリン(Karlin)の式を用いて評価することが好ましい(例えば、KarlinおよびAltschul, 1990参照；その開示内容を参照により本明細書に組み入れる)。BLASTプログラムはデフォルトパラメーターを用いて使用してもよいし、ユーザーによって提供される改変パラメーターを用いて使用してもよい。
【０１０６】
クエリーヌクレオチド配列(本発明の配列)とサブジェクト配列間で最良の全体的なマッチを決定するためのもう1つの好ましい方法は、グローバル配列アラインメントとも呼ばれており、Brutlagら(1990) (全開示内容を参照により本明細書に組み入れる)のアルゴリズムに基づいたFASTDBコンピュータプログラムを用いて求めることができる。配列アラインメントでは、クエリーおよびサブジェクト配列は双方ともDNA配列である。RNA配列はまずUをTに変換して比較すればよい。このグローバル配列アラインメントの結果は同一性％として得られる。同一性％を算出するためにDNA配列のFASTDBアラインメントで用いるのに好ましいパラメーターは次のとおりである：マトリックス=Unitary、k-tuple=4、ミスマッチペナルティー=1、ジョイニングペナルティー=30、ランダム化グループ長=0、カットオフスコア=1、ギャップペナルティー=5、ギャップサイズペナルティー=0.05、ウィンドウサイズ=500またはサブジェクトヌクレオチド配列の長さのどちらか短い方。サブジェクト配列が、内部欠失のためではなく5'または3'欠失のためにクエリー配列よりも短い場合には、結果に手修正を施さなければならない。これはFASTDBプログラムが同一性％を計算する際にサブジェクト配列の5'および3'末端切断を計上しないからである。クエリー配列に比べて5'または3'末端が切断されているサブジェクト配列については、マッチ／アラインメントしないサブジェクト配列の5'および3'側にあるクエリー配列の塩基数を、クエリー配列の全塩基に対する％として算出することで、同一性％を修正する。ヌクレオチドがマッチ／アラインメントするかどうかはFASTDB配列アラインメントの結果によって決定される。次いで、この％値を10の特定のパラメーターを用いて前記FASTDBプログラムから算出された同一性％から差し引くことで最終的な同一性％スコアを得る。この修正されたスコアが本発明において用いられるものである。同一性％スコアを手作業で調整するために、FASTDBアラインメントによって表示されたサブジェクト配列の5'および3'ヌクレオチドの外側のヌクレオチド（クエリー配列とマッチ／アラインメントしない）のみを算出する。例えば、90ヌクレオチドのサブジェクト配列を100ヌクレオチドのクエリー配列に対してアラインメントして同一性％を求める。欠失がサブジェクト配列の5'末端に存在し、ゆえにFASTDBアラインメントは5'末端の最初の10ヌクレオチドのマッチ／アラインメントを示さない。この10個の不対合ヌクレオチドは当該配列の10％(マッチしない5'および3'末端のヌクレオチド数／クエリー配列中の全ヌクレオチド数)に相当するので、10％をFASTDBプログラムによって算出された同一性％スコアから差し引く。残りの90ヌクレオチドが完全にマッチする場合には、最終的な同一性％は90％となる。もう1つの例では、90ヌクレオチドのサブジェクト配列を100ヌクレオチドのクエリー配列と比較する。今回は、欠失が内部欠失であり、従って、クエリーとマッチ／アラインメントしないヌクレオチドはサブジェクト配列の5'または3'側にはない。この場合にはFASTDBによって算出される同一性％に手修正を施さない。ここで再び、クエリー配列とマッチ／アラインメントされないサブジェクト配列の5'および3'側のヌクレオチドのみを手修正する。本発明の目的のため��は他の手修正は加えない。
【０１０７】
クエリーアミノ酸配列(本発明の配列)とサブジェクト配列間で最良の全体的なマッチを決定するためのもう1つの好ましい方法は、グローバル配列アラインメントとも呼ばれるもので、Brutlagら(1990)のアルゴリズムに基づいたFASTDBコンピュータプログラムを用いて求めることができる。配列アラインメントでは、クエリーおよびサブジェクト配列は双方ともアミノ酸配列である。このグローバル配列アラインメントの結果は同一性％で得られる。FASTDBアミノ酸アラインメントで用いるのに好ましいパラメーターは次のとおりである：マトリックス=PAM、k-tuple=2、ミスマッチペナルティー=1、ジョイニングペナルティー=20、ランダム化グループ長=0、カットオフスコア=1、ウィンドウサイズ=配列の長さ、ギャップペナルティー=5、ギャップサイズペナルティー=0.05、ウィンドウサイズ=500またはサブジェクトアミノ酸配列の長さのどちらか短い方。内部欠失のためではなくNまたはC末端欠失のためにサブジェクト配列がクエリー配列よりも短い場合には、同一性％で表される結果を手修正しなければならない。これはFASTDBプログラムがグローバルな同一性％を計算する際にサブジェクト配列のNおよびC末端切断を計上しないからである。クエリー配列と比べてNおよびC末端が切断されているサブジェクト配列については、対応するサブジェクト残基とマッチ／アラインメントしないサブジェクト配列のNおよびC末端側にあるクエリー配列の残基数を、クエリー配列の全残基に対する％として算出することで、同一性％を修正する。残基がマッチ／アラインメントするかどうかはFASTDB配列アラインメントの結果によって決定される。次いで、この％値を、特定のパラメーターを用いて前記FASTDBプログラムによって算出した同一性％から差し引いて、最終的な同一性％スコアを得る。この最終同一性％スコアが本発明において用いられるものである。クエリー配列とマッチ／アラインメントしないサブジェクト配列のNおよびC末端側の残基のみが、同一性％スコアを手作業で調整するために考慮される。これはサブジェクト配列の最も遠いNおよびC末端残基の外側にあるクエリーアミノ酸残基のみである。例えば、90アミノ酸残基のサブジェクト配列を100残基のクエリー配列とアラインメントして同一性％を求める。欠失がサブジェクト配列のN末端に存在し、ゆえに、FASTDBアラインメントはN末端の最初の10残基とのマッチ／アラインメントを示さない。10個の不対残基はこの配列の10％(マッチしないNおよびC末端の残基数／クエリー配列の全残基数)に相当し、そのために10％をFASTDBプログラムによって算出された同一性％スコアから差し引く。残りの90残基が完全にマッチする場合には、最終同一性％は90％となる。もう1つの例では、90残基のサブジェクト配列を100残基のクエリー配列と比較する。今回は欠失が内部にあり、そのためクエリーとマッチ／アラインメントしない残基はサブジェクト配列のNまたはC末端側にはない。この場合にはFASTDBによって算出される同一性％を手修正しない。ここで再び、クエリー配列とマッチ／アラインメントしないFASTDBアラインメントで表示されたサブジェクト配列のNおよびC末端の外側の残基位置のみを手修正する。本発明の目的のためには他の手修正は加えない。
【０１０８】
「配列類似性％」とはポリペプチド配列間の比較を指し、2つの最適にアラインメントされた配列を比較ウィンドウにわたって比較することによって求める。ここで、比較ウィンドウ中のポリペプチド配列の部分は、2つの配列の最適なアラインメントのために参照配列(付加または欠失を含んでいない)に対して付加または欠失(すなわち、ギャップ)を含んでいてもよい。配列類似性％を算出するには、両配列中に同一または同等のアミノ酸残基が存在する位置の数を求めることで一致した位置の数を得、この一致した位置の数を比較ウィンドウ中の全位置数で割り、この結果に100を掛けて配列類似性％とする。類似性は本節で上記したものを含めて当技術分野で公知の種々の配列比較アルゴリズムおよびプログラムのいずれかを用いて評価する。同等なアミノ酸残基は本明細書において「変異ポリペプチド」の節で規定される。
【０１０９】
本発明のポリヌクレオチド
本発明はGENSETゲノムおよびcDNA配列に関する。本発明はGENSET遺伝子、GENSETゲノムおよびcDNA配列を含んでなるポリヌクレオチド、ならびにその断片および変異体を包含する。これらのポリヌクレオチドは単離・精製されたものでも、組換え体であってもよい。
【０１１０】
また本発明はGENSET遺伝子の対立遺伝子変異体、オルソログ、スプライス変異体および／または種相同体も包含する。当技術分野で公知の手順により、本明細書に開示される配列またはATCCに寄託されたクローンプールからの情報を用いて、奇数配列番号1〜111および寄託されたクローンプールのクローンインサートの配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対応する遺伝子およびcDNAの全長遺伝子、対立遺伝子変異体、スプライス変異体、全長コード部分、オルソログおよび／または種相同体を得ることができる。例えば、対立遺伝子変異体、オルソログおよび／または種相同体は、本明細書に示される配列から好適なプローブまたはプライマーを作製し、「類似配列を検出するために」と題される節に記載されるものを含めて当業者に公知のいずれかの技術を用いて対立遺伝子変異体および／または所望の相同体について好適な核酸源をスクリーニングすることによって、単離および同定することができる。
【０１１１】
特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは少なくとも15、30、50、100、125、500または1000個の連続するヌクレオチドである。もう1つの実施形態では、ポリヌクレオチドの長さは300kb以下、200kb、100kb、50kb、10kb、7.5kb、5kb、2.5kb、2kb、1.5kbまたは1kbである。さらなる実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは本明細書に開示されるコード配列の一部を含んでなるが、任意のイントロンの全部または一部を含まないものである。もう1つの実施形態では、コード配列を含んでなるポリヌクレオチドはゲノムフランキング遺伝子のコード配列(すなわち、ゲノム中の対象とする遺伝子の5'または3'側の配列)を含まない。その他の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは1000、500、250、100、75、50、25、20、15、10、5、4、3、2または1個より多い天然のゲノムフランキング遺伝子のコード配列を含まない。
【０１１２】
本発明の寄託されたクローンプール
GENSET遺伝子の発現はGENSET遺伝子あたり少なくとも1つのｍRNA種の産生をもたらすことが明らかにされており、そのcDNA配列は添付の配列表に奇数配列番号1〜111として示されている。これらのGENSET mRNA種に対応するcDNAをベクターpBluescriptII SK- (Stratagene) またはpPTと呼ばれるベクターのいずれかにクローニングした。クローニングされた本発明のcDNAを含む細胞はGenset,S.A. (24 Rue Royale, 75008 Paris, France)の本発明者らによって永久寄託されて維持されている。表Ｉは、各配列番号に対応するGensetの内部表示番号を提供し、また、その配列が核酸配列（DNA）であるのか、タンパク質配列（PRT）であるのかを示している。各cDNAはNotI PstI二重消化を実施することによってそれを含有するBluescriptベクターから、またはMunI HindIII二重消化を実施することによってpPTベクターから取り出して、各クローンにつき適当な断片を得ることができる。ただし、このcDNA配列はその配列内に対応する制限部位を含まないことを条件とする。あるいは、製造業者によって指示されるようにベクターのマルチクローニング部位のその他の制限酵素を用いて所望のインサートを回収してもよい。
【０１１３】
配列表に記載のGENSET遺伝子を含む細胞のプール（これらから特定のポリヌクレオチドを含有する細胞を得ることができる）はまた、American Tissue Culture Collection (ATCC) (10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, United States)に寄託されている。各cDNAクローンはこれらの複合寄託物のための個別の細菌細胞(大腸菌)にトランスフェクトされている。
【０１１４】
特定のクローンを含有する細菌細胞はこの複合寄託物から以下のようにして得ることができる：
オリゴヌクレオチドプローブまたはプローブ類はその特定のクローンについて知られている配列に対して設計すべきである。この配列は本明細書に示される配列から、またはそれらの配列の組合せから誘導することができる。好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブの設計はこれらのパラメーターに従うようにすべきである：
(a)多義性の塩基(「N」)は、存在するとしても、最少しか含まない配列の領域に対して設計すべきである；
(b)好ましくは、プローブは (AまたはT各々について2度およびGまたはC各々について4度と仮定して) 約80℃のTmをもつように設計する。しかしながら、特異性が失われないという条件で、融解温度が40℃〜80℃の間であるプローブを用いてもよい。
【０１１５】
オリゴヌクレオチドは好ましくは、オリゴヌクレオチドを標識するための慣用技法により、γ[32P]ATP(比活性6000Ci/mmole)およびT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて標識すべきである。その他の標識技法を用いてもよい。組み込まれない標識は好ましくはゲル濾過クロマトグラフィーまたはその他の確立された方法によって除去すべきである。プローブに組み込まれた放射能の量はシンチレーションカウンターでの測定によって定量すべきである。好ましくは、得られたプローブの比活性は約4x106dpm/pmoleとすべきである。
【０１１６】
全長クローンのプールを含有する細菌培養物は好ましくは、解凍した後、ストック100μｌを用いて100μg/mlのアンピシリンを含有する滅菌Lブロス25mlを入れた滅菌培地フラスコに播種する。この培養物を37℃で飽和状態になるまで増殖させ、飽和培養物は新鮮なLブロスで希釈するのが好ましい。これらの希釈物のアリコートをプレーティングして、150mmペトリ皿に100μg/mlのアンピシリンおよび1.5％の糖を含有するLブロスを含有する固体細菌学的培地で37℃にて一晩増殖させた場合に、約5000個の明確に区別される十分に分離したコロニーを生じる希釈率および容量を決定すべきである。明確に区別される十分に分離したコロニーを得るために、その他の既知の方法を用いてもよい。
【０１１７】
次いで、標準的なコロニーハイブリダイゼーション法を用いてコロニーをニトロセルロースフィルターに移し、それらを溶解し、変性させ、焼きつける。
【０１１８】
次いで、好ましくはこのフィルターを65℃で1時間、0.5%のSDS、100pg/mlの酵母RNAおよび10mMのEDTAを含有する6×SSC（20Xストックは175.3gのNaC1/リットル、88.2gのクエン酸Na/リットルをNaOHでpH7.0に調整したものである）中でゆっくりと振盪しながらインキュベートする(150mmフィルターあたり約10ml)。好ましくは、次いで、ハイブリダイゼーション混合液に1x106dpm/ml以上の濃度でプローブを加える。次いで、好ましくはこのフィルターを65℃でゆっくりと振盪しながら一晩インキュベートする。次いで、好ましくは、このフィルターを室温にて500mlの2X SSC/0.1% SDS中でゆっくりと振盪しながら15分間洗浄する。所望により、65℃にて0.1X SSC/0.5% SDS中で30分〜1時間3回目の洗浄をする。次いで、好ましくは、このフィルターを乾燥させて、X線フィルム上で陽性のものを可視化するのに十分な時間オートラジオグラフィーに付す。その他の公知のハイブリダイゼーション法を用いてもよい。
【０１１９】
陽性コロニーを選び取り、培養して増殖させ、標準的な手順を用いてプラスミドDNAを単離する。次いで、制限分析、ハイブリダイゼーション分析またはDNA配列決定によってクローンを確認する。次いで、これらの手順を用いて得られたプラスミドDNAを当業者によく知られている標準的なクローニング技術を用いて操作する。
【０１２０】
あるいは、細菌のプールからcDNAインサートを回収するために、標準的な手順およびcDNA挿入の両端で設計したプライマー（ベクターのマルチクローニング部位で設計したプライマーを含む）を用いて、単離したプラスミドDNAに対してPCRを実施することができる。目的とする特定のcDNAを回収するには、添付の配列表から得られる配列情報を用いてこのcDNAの5'末端および3'末端に特異的となるようにプライマーを設計すればよい。次いで、目的のcDNAに相当するPCR産物を当業者によく知られている標準的なクローニング技術を用いて操作する。
【０１２１】
従って、本発明の目的は、寄託されたクローンプールのcDNAインサートからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなる単離された、精製された、または組換えポリヌクレオチドである。さらに、本発明の好ましいポリヌクレオチドとしては、寄託されたクローンプールのcDNAインサートからなる群から選択されるヌクレオチド配列からなる、本質的にからなる、または含んでなる精製された、単離された、または組換えGENSET cDNAが挙げられる。
【０１２２】
本発明のcDNA配列
本発明のもう1つの目的は、添付の配列表のポリヌクレオチド配列、寄託されたクローンプールのヒトcDNAクローンインサートの配列、それに相補的な配列、およびその断片からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなる、精製された、単離された、または組換えポリヌクレオチドである。さらに、本発明の好ましいポリヌクレオチドとしては、配列表のポリヌクレオチド配列および寄託されたクローンプールのクローンインサートの配列からなる群から選択された配列からなる、本質的にからなる、または含んでなる精製された、単離された、または組換えGENSET cDNAが挙げられる。
【０１２３】
本発明のcDNAのそれぞれの構造的パラメーターは添付の配列表に示されている。従って、本発明の各cDNAのコード配列(CDS)またはオープン・リーディング・フレーム(ORF)は、開始コドンの最初のヌクレオチドで始まり、停止コドンの最後のヌクレオチドで終わるヌクレオチド配列を指す。同様に、本発明の各cDNAの5'非翻訳領域(すなわち、5'UTR)は、ヌクレオチド1で始まり、開始コドンの最初のヌクレオチドのすぐ5'側のヌクレオチドで終わるヌクレオチド配列を指す。本発明の各cDNAの3'非翻訳領域(すなわち、3'UTR)は、停止コドンの最後のヌクレオチドのすぐ3'側のヌクレオチドで始まり、cDNAの最後のヌクレオチドで終わるヌクレオチド配列を指す。
【０１２４】
非翻訳領域
さらに、本発明は、添付の配列表のポリヌクレオチド配列、寄託されたクローンプールのヒトcDNAクローンインサートの配列、それらに相補的な配列、ならびにその対立遺伝子変異体の5'UTRからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなる、精製された、単離された、および組換え核酸に関する。また、本発明は、配列表のポリヌクレオチド配列、寄託されたクローンプールのヒトcDNAクローンインサートの配列、それらに相補的な配列、ならびにその対立遺伝子変異体の3'UTRからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなる、精製された、単離された、および／または組換え核酸に関する。
【０１２５】
これらのポリヌクレオチドを用いて、当業者に周知のハイブリダイゼーションまたはRT-PCR技術のいずれかにより、生物学的サンプル中のGENSET mRNA種の存在を検出することができる。
【０１２６】
さらに、これらのポリヌクレオチドは、それらを含む任意のポリヌクレオチド(GENSETポリヌクレオチドまたは異種ポリヌクレオチドのいずれか)のプロセシングおよび成熟化、好ましくはそれらを含むそのポリヌクレオチドの局在、安定性および／または翻訳に影響を及ぼし得る調節分子として使用することができる(UTRに関しては、DeckerおよびParker, (1995) Curr. Opin. Cell. Biol. 7(3):368-92、Derrigoら (2000) Int. J. Mol. Med. 5(2):111-23を参照のこと)。特に、Makrides ((1999) Protein Expr Purif 1999 Nov; 17(2): 183-202)、米国特許第5,925,564号;同第5,807,707号および同第5,756,264号; 全開示内容を参照により本明細書に組み入れる）を含めて当業者に公知のいずれかの方法を用いて、組換えベクター中の異種mRNAの安定性を制御するために3'UTRを用いてもよい。
【０１２７】
コード配列
本発明のもう1つの目的は、添付の配列表のポリヌクレオチド配列、寄託されたクローンプールのヒトcDNAクローンインサートの配列、およびそれらの変異体からなる群から選択される配列のコード配列を含んでなる、単離された、精製された、または組換えポリヌクレオチドである。
【０１２８】
本発明のさらなる目的は、本発明のポリペプチドをコードする単離された、精製された、または組換えポリヌクレオチドである。
【０１２９】
たとえコード配列の範囲が、配列決定エラー、逆転写または増幅エラー、mRNAスプライシング、コードされたタンパク質の翻訳後修飾、コードされたタンパク質の酵素的切断、またはその他の生物学的要因の結果として添付の配列表に示されるものと異なるとしても、当業者は配列表のポリヌクレオチド配列、寄託されたクローンプールのヒトcDNAクローンインサートの配列、およびそれらの対立遺伝子変異体中のコード配列の範囲を容易に同定できることが理解されよう。従って、配列表のポリヌクレオチド配列および寄託されたクローンプールのcDNAインサートの配列のうちの1つのコード配列を含む核酸に関する請求項の範囲は、添付の配列表に記載されるコード配列から容易に同定可能な変異体またはその同等物を除外するものとして解釈されるべきでない。同等物としては、そのヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドにおいて、アミノ酸の変更をもたらさないまたは保存的アミノ酸置換（以下に定義する）をもたらすヌクレオチドコード配列の変化が含まれる。同様に、たとえポリペプチドの範囲が前記の要因のいずれかの結果として添付の配列表に示されるものと異なるとしても、添付の配列表のポリペプチド配列のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドに関する請求項の範囲は、添付の配列表に記載される配列から容易に同定可能な変異体またはその同等物を除外するものとして解釈されるべきでない。
【０１３０】
GENSET遺伝子のコード配列を含む上記ポリヌクレオチドは、このポリヌクレオチドが好適な発現シグナルの制御下に置かれた場合に、所望の宿主細胞または所望の宿主生物において発現可能である。発現シグナルは本発明のGENSET遺伝子の調節領域に含まれる発現シグナルであってもよいし、対照的に該シグナルは外来の調節ヌクレオチド配列であってもよい。好適な発現シグナル下に置かれた場合の該ポリヌクレオチドは、その発現および／または増幅用のベクターに挿入することもできる。
【０１３１】
さらに、異種アミノ酸配列のコード配列にインフレームで融合された本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明に含まれる。追加の非コード配列（限定するものではないが、5'および3'非コード配列、ベクター配列、精製、プロービング、プライミングに用いる配列を含む）と一緒の本発明のポリペプチドをコードする核酸も本発明に含まれる。例えば、異種配列としては、転写およびmRNAプロセシング（例えば、mRNAのリボソーム結合および安定性）において何らかの役割を果たし得る、転写されるが翻訳されない配列が挙げられる。あるいは、異種配列はさらなる機能性を提供する追加のコード配列を含んでいてもよい。従って、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、融合ポリペプチドの精製または検出を容易にするペプチドをコードする配列などのタグ配列に融合させることができる。本発明のこの態様の好ましい実施形態では、タグアミノ酸配列はヘキサヒスチジンペプチドであり、例えば、pQEベクター(QIAGEN)またはいくつかのさらなる市販のベクターのいずれか中に提供されるタグである。例えば、ヘキサヒスチジンは融合タンパク質の簡便な精製を提供する(Gentzら, 1989, Proc Natl Acad Sci U S A Feb; 86(3): 821-4参照; 全開示内容を参照により本明細書に組み入れる)。「HA」タグは精製に有用なもう1つのペプチドであり、これはインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに相当する(Wilsonら, 1984, Cell Jul; 37(3): 767-78参照; 全開示内容を参照により本明細書に組み入れる)。以下で述べるように、その他のかかる融合タンパク質としては、NまたはC末端でFcに融合されたGENSETポリペプチドが挙げられる。
【０１３２】
本発明の調節配列
上記のように、GENSET遺伝子のゲノム配列はこれらの遺伝子のエキソンを含むGENSETポリペプチドコード領域に隣接する非コード5'フランキング領域に、また、おそらくは非コード3'フランキング領域に調節配列を含んでいる。
【０１３３】
GENSETポリヌクレオチド5'および3'調節領域由来のポリヌクレオチドは、試験サンプル中のGENSET遺伝子のゲノムヌクレオチド配列またはその断片の少なくとも1コピーの存在を検出するのに有用である。
【０１３４】
好ましい調節配列
GENSETポリペプチドコード領域の5'末端および3'末端に位置する調節エレメントを担うポリヌクレオチドは、例えば、目的の異種ポリヌクレオチドの転写および翻訳活性を制御するために、有利に使用することができる。
【０１３５】
従って、本発明はまた、5'および3'GENSETポリヌクレオチド調節領域、それらに相補的な配列、その調節活性断片および変異体からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含んでなる、精製または単離された核酸に関する。
【０１３６】
本発明のもう1つの目的は、本明細書に定義されるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本発明のポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドを含んでなる、精製された、単離された、または組換え核酸からなる。
【０１３７】
5'および3'調節領域の好ましい断片は20〜20,000ヌクレオチドの長さを有する。
【０１３８】
本発明の目的のためには、調節ポリヌクレオチドが転写および翻訳調節情報を含むヌクレオチド配列を含み、かつそのような配列が所望のポリヌクレオチドまたは所望のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に「機能し得る形で連結」されている場合に、その核酸またはポリヌクレオチドは組換えポリペプチドまたは組換えポリヌクレオチドの発現のための「調節領域」として「機能的」である。
【０１３９】
本発明の調節ポリヌクレオチドは所望の宿主細胞または宿主生物においてコード配列を発現させるのに使用できる組換え発現ベクターの一部であってもよい。
【０１４０】
本発明の好ましい5'調節ポリヌクレオチドとしては、GENSET cDNAの5'-UTR、またはその調節活性断片もしくは変異体が挙げられる。
【０１４１】
本発明の好ましい3'調節ポリヌクレオチドとしては、GENSET cDNAの3'-UTR、またはその調節活性断片もしくは変異体が挙げられる。
【０１４２】
本発明のさらなる目的は、
a)  (i)GENSETポリヌクレオチド5'調節領域のポリヌクレオチドを含んでなるヌクレオチド配列またはそれに相補的な配列；
(ii)GENSETポリヌクレオチド5'調節領域のヌクレオチド配列に対して少なくとも95％のヌクレオチド同一性を有するポリヌクレオチドを含んでなるヌクレオチド配列またはそれに相補的な配列；
(iii)ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でGENSETポリヌクレオチド5'調節領域のヌクレオチド配列またはそれに相補的な配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドを含んでなるヌクレオチド配列；および
(iv) (i)、(ii)および(iii)のポリヌクレオチドの調節活性断片または変異体；
からなる群から選択される5'調節ヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド、
b)  (a)で定義されるポリヌクレオチドに機能し得る形で連結された、所望のポリペプチドをコードする核酸分子または目的の核酸分子、および
c)  所望により、3'調節ポリヌクレオチド、好ましくはGENSET遺伝子の3'調節ポリヌクレオチド、を含んでなるポリヌクレオチド、
を含んでなる精製または単離された核酸からなる。
【０１４３】
特定の実施形態では、先に定義した核酸にはGENSET cDNAの5'-UTR、またはその調節活性断片もしくは変異体が含まれる。
【０１４４】
3'調節領域の調節ポリヌクレオチド、またはその調節活性断片もしくは変異体は、所望のポリペプチドをコードする核酸分子または目的の核酸分子の3'末端に機能し得る形で連結されることが有利である。
【０１４５】
上記核酸によってコードされる所望のポリペプチドは種々の由来または起源のものであってよく、原核生物ウイルスまたは真核生物起源のタンパク質を包含する。GENSETポリヌクレオチド調節領域の制御下で発現されるポリペプチドの中には、細菌、真菌またはウイルスの抗原がある。真核生物のタンパク質、例えば、「ハウスキーピング」タンパク質などの細胞内タンパク質、ミトコンドリアの膜結合タンパク質および細胞表面受容体などの膜結合タンパク質、およびサイトカインなどの内在性メディエーターのような分泌タンパク質も包含される。所望のポリペプチドは異種ポリペプチドまたはGENSETポリペプチド、特に、配列表のポリペプチド配列、寄託されたクローンプールのcDNAインサートによりコードされる配列、それらの断片および変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。
【０１４６】
上記ポリヌクレオチドによってコードされる所望の核酸（通常はRNA分子）は、所望のコードポリヌクレオチド、例えば、GENSETコード配列に相補的であり、それゆえアンチセンスポリヌクレオチドとして有用であり得る。かかるポリヌクレオチドは、宿主細胞または宿主生物において所望のポリペプチドまたは所望の核酸を発現させるために、組換え発現ベクター内に含まれていてもよい。本明細書に記載されるようなポリヌクレオチドを含む好適な組換えベクターは本明細書の他の箇所に開示される。
【０１４７】
ポリヌクレオチド変異体
本発明はまた本明細書に記載のポリヌクレオチドの変異体およびその断片に関する。本明細書において使用するポリヌクレオチドの「変異体」とは、参照ポリヌクレオチドとは異なるポリヌクレオチドである。一般に、相違は参照および変異体のヌクレオチド配列が全体的に酷似しており、かつ、多くの領域で同一であるよう限定される。本発明は対立遺伝子変異体および縮重変異体の双方を包含する。
【０１４８】
対立遺伝子変異体
ポリヌクレオチドの変異体は天然の対立遺伝子変異体などの天然の変異体であってもよく、または天然に生じるとは知られていない変異体であってもよい。「対立遺伝子変異体」とは生物の染色体上の所与の遺伝子座を占めるいくつかの代替型遺伝子の1つを表す(全開示内容が参照により組み入れられる、Lewin, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9832-8935参照)。二倍体生物は対立遺伝子型についてホモ接合性またはヘテロ接合性であり得る。ポリヌクレオチドの非天然の変異体はポリヌクレオチド、細胞または生物に適用するものをはじめとする当技術分野で公知の突然変異誘発技術によって作製すればよい。例えば、本発明の関連するcDNAのセット、例えば単一遺伝子の対立遺伝子変異体を表す配列のセットを提供する表IIIを参照されたい。
【０１４９】
縮重変異体
本発明の単離されたポリヌクレオチドおよびその断片に加え、本発明はさらに前記のものとは実質的に異なるが、遺伝コードの縮重のために依然として本発明のGENSETポリペプチドをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチドを含む。これらのポリヌクレオチド変異体は本願を通じて「縮重変異体」と呼ぶ。すなわち、本発明のGENSETポリペプチドをコードするすべての可能性あるポリヌクレオチド配列が考慮される。これは当技術分野で公知の遺伝コードおよび種特異的コドン優先を含む。
【０１５０】
変異体ポリヌクレオチドに存在するヌクレオチド変更はサイレントであってもよく、これはそのポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸を変更しないことを意味する。しかしながら、ヌクレオチド変更はまた参照配列によってコードされるポリペプチド中のアミノ酸置換、付加、欠失、融合および末端切断をもたらしてもよい。置換、欠失または付加は1個以上のヌクレオチドに関するものであってもよい。変異体はコードもしくは非コード領域または両方で変更されていてもよい。コード領域における変更は保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失または付加を生じ得る。本発明の背景において、好ましい実施形態はポリヌクレオチド変異体がGENSETタンパク質と実質的に同一の生物学的特性または活性を保持するポリペプチドをコードするものである。より好ましいポリヌクレオチド変異体は保存的置換を含むものである。
【０１５１】
類似ポリヌクレオチド
本発明のその他の実施形態は、本発明のポリヌクレオチドと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%同一の、精製された、単離されたまたは組換えポリヌクレオチドを提供する。前記のポリヌクレオチドはそれらがGENSET生物活性を有するポリペプチドをコードするかどうかに関わらず含まれる。これは特定の核酸分子が活性を有するポリペプチドをコードしない場合であっても、当業者ならばその核酸分子の、例えばハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーとしての使用方法を知っているであろうからである。GENSET活性を有するポリペプチドをコードしない本発明の核酸分子の用途としては、特に、DNAライブラリーからのGENSET遺伝子またはその対立遺伝子変異体の単離、および、例えばノーザンブロットまたはPCR解析によるGENSET mRNAまたはDNAを含むと思われる生物学的サンプルにおけるGENSET mRNA発現の検出が挙げられる。
【０１５２】
本発明はさらに、ポリヌクレオチドと少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%または99%同一の配列を有するポリヌクレオチド(このポリヌクレオチドは実際にGENSET生物活性を有するポリペプチドをコードする)に向けられる。もちろん、当業者ならば、遺伝コードの縮重のために配列表のポリヌクレオチド配列および寄託されたクローンプールのヒトcDNAクローンインサートの配列からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%または99%同一の多数のポリヌクレオチドが生物活性を有するポリペプチドをコードすることが直ちに分かるであろう。本発明の参照ヌクレオチド配列と少なくとも、例えば95%「同一の」ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチド配列がGENSETポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列の各100個のヌクレオチド当たり5個までの点突然変異を含み得るという点以外は、そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であるということを表す。言い換えれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも95%同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、参照配列のヌクレオチドの5%までは欠失、挿入されていてもよく、または他のヌクレオチドで置換されていてもよい。クエリー配列は本発明のいずれかのポリヌクレオチドであってよい。
【０１５３】
ハイブリダイズするポリヌクレオチド
もう1つの態様では、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で本発明のいずれかのポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドを含んでなる、単離または精製された核酸分子を提供する。かかるハイブリダイズするポリヌクレオチドは10〜10,000ヌクレオチドの長さでありうる。
【０１５４】
もちろん、ポリA+配列(配列表に示されるいずれかのcDNAの3'末端ポリA+領域(tract)など)と、またはT(またはU)残基の5'相補的ストレッチとのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは、「ポリヌクレオチド」の定義に含まれないが、それは、かかるポリヌクレオチドがポリ(A)ストレッチまたはその相補体を含むいずれの核酸分子(例えば、実際にはオリゴdTをプライマーとして用いて作製したいずれの二本鎖cDNAクローン)ともハイブリダイズするからである。
【０１５５】
相補的ポリヌクレオチド
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドのいずれかと十分に相補的なヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子を提供する。
【０１５６】
ポリヌクレオチド断片
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドの一部または断片に向けられる。本発明のポリヌクレオチド断片の用途としてはプローブ、プライマー、分子量マーカーおよび本発明のポリペプチド断片の発現に関するものが挙げられる。断片は、a)配列表のポリヌクレオチド配列、b)ゲノムGENSET配列、c)本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、d)寄託されたクローンプールのヒトcDNAクローンインサートの配列、およびe)寄託されたクローンプールのヒトcDNAクローンインサートによってコードされるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択されるポリヌクレオチドの一部を含む。本発明は特に本発明のポリヌクレオチドの少なくとも8個の連続する塩基を含んでなる精製されたまたは単離されたポリヌクレオチドを含む。この実施形態のある態様では、ポリヌクレオチドは本発明のポリヌクレオチドの少なくとも10、12、15、18、20、25、28、30、35、40、50、75、100、150、200、300、400、500、800、1000、1500または2000個の連続するヌクレオチドを含んでなる。
【０１５７】
前記の好ましいポリヌクレオチドの長さに加え、さらに好ましいポリヌクレオチドの亜属は少なくともX個のヌクレオチドを含んでなり、ここで「X」は、8と、配列表または本明細書の他のどこかに示される最も3'側のヌクレオチド位置を表す整数と、の間のいずれかの整数と定義される。本発明の好ましいポリヌクレオチドとして、それらの5'および3'位置に関してさらに特定される前記の少なくともX個のヌクレオチドの長さのポリヌクレオチド断片がさらに含まれる。5'および3'位置は添付の配列表に示される位置番号によって表される（その際、最も5'側のヌクレオチドが１であり、最も3'側のヌクレオチドが特定の配列番号の最後のヌクレオチドである）。対立遺伝子、縮重およびその他の変異体については、位置1はORFの最も5'側のヌクレオチド、すなわち、開始コドンのヌクレオチド「A」と定義され、残りのヌクレオチドには連続して番号が付けられる。従って、少なくとも8個の連続するヌクレオチドの長さの本発明のポリヌクレオチド断片が本発明のポリヌクレオチドで占めることができる5'および3'ヌクレオチド位置のどの組合せも個別の種として本発明に含まれる。5'および3'位置で特定されるポリヌクレオチド断片はすぐに思い描くことができ、従って、本明細書を不必要に長くしないというためだけに個々には記載しない。
【０１５８】
本発明のポリヌクレオチド断片の前記の種は、式「a-b」によって代替的に記載されうることに留意されたい（ここで、「a」は、ポリヌクレオチドの最も5'側のヌクレオチド位置であり、「b」は、ポリヌクレオチドの最も3'側のヌクレオチド位置に等しく、さらに、「a」は、１と、本発明のポリヌクレオチド配列のヌクレオチド数マイナス8と、の間の整数に等しく、「b」は、９と、本発明のポリヌクレオチド配列のヌクレオチド数との間の整数に等しく、「a」は「b」よりも少なくとも8だけ小さい整数である）。
【０１５９】
本発明はまた、5'および3'位置により特定された本発明のポリヌクレオチド断片または上記のようなヌクレオチドの大きさによって特定されたポリヌクレオチドに含まれるいずれかの種の除外規定を設けるものである。除外される断片として、反復配列に対して実質的に相同であるもの、例えばAlu、L1、THEおよびMER反復配列、SSTR配列またはサテライト、マイクロサテライト、およびテロメア反復配列が挙げられる。
【０１６０】
本発明のその他の好ましい断片にはポリペプチドのドメインをコードするポリヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドがある。かかる断片を用いて、ハイブリダイゼーションまたはRT-PCR技術により類似のドメインを有するポリペプチドをコードするその他のポリヌクレオチドを得てもよい。あるいは、これらの断片を用いて特定の生物学的特性を有し得るポリペプチドドメインを発現させてもよい。
【０１６１】
本発明のもう1つの目的は、少なくとも5〜1,000個のいずれかの整数個の連続するアミノ酸の長さ、より好ましくは少なくとも5、6、8、10、12、15、20、25、30、35、40、50、60、75、100、150または200個の連続するアミノ酸の連続するスパンからなる、から本質的になる、または含んでなるポリペプチドをコードする、単離された、精製されたまたは組換えポリヌクレオチドである。
【０１６２】
本発明はさらにこの節に記載されるポリヌクレオチド断片のいずれの組合せも包含する。
【０１６３】
オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブ
本発明はまたプライマーおよびプローブとして用いられるGENSETポリヌクレオチドの断片を包含する。GENSETゲノムおよびcDNA配列由来のポリヌクレオチドは試験サンプルにおいて少なくとも1コピーのGENSETポリヌクレオチドまたはその断片、相補体もしくは変異体の存在を検出するために有用である。
【０１６４】
構造の定義
本発明のいずれのポリヌクレオチドもプライマーまたはプローブとして用いることができる。本発明の特に好ましいプローブおよびプライマーとしては、本発明のポリヌクレオチドの少なくとも12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500または1000個のヌクレオチドの連続するスパンを含んでなる、単離された、精製されたまたは組換えポリヌクレオチドが挙げられる。
【０１６５】
増幅目的には、ほぼ同じTmをもつプライマー対が好ましい。プライマーは当技術分野で公知の方法を用いて設計することができる。本発明において使用できる増幅技術としては、限定されるものではないが、EP-A-320 308、WO 9320227およびEP-A-439182に記載されるリガーゼ連鎖反応(LCR)、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR、RT-PCR)およびGuatelliら (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 35:273-286およびCompton (1991) Nature 350 (6313):91-92に記載される核酸配列に基づく増幅(NASBA)などの技術、欧州特許出願第4544610号に記載されるQ-ベータ増幅、Walkerら(1996), Clin. Chem. 42:9-13およびEP A 684 315に記載される鎖置換増幅、およびPCT国際公開WO 9322461に記載される標的媒介性増幅が挙げられる(なお、これらの全開示内容は参照により組み入れられる)。
【０１６６】
本発明のプローブは多数の目的にとって有用である。特に、それらはゲノムDNAのサザンハイブリダイゼーションに使用できる。プローブはまたPCR増幅産物を検出するためにも使用できる。また、それらを用いてその他の技術によりGENSET遺伝子またはmRNAにおけるミスマッチを検出してもよい。それらはまたin situハイブリダイゼーションに用いてもよい。
【０１６７】
本発明のポリヌクレオチド、プライマーおよびプローブのいずれも固相支持体に都合よく固定することができる。固相支持体は決定的なものではなく、当業者が選択することができる。従って、ラテックス粒子、微粒子、磁気ビーズ、非磁気ビーズ(ポリスチレンビーズを含む)、膜(ニトロセルロースストリップを含む)、プラスチック管、マイクロタイターウェルの壁、ガラス製またはシリコン製チップ、ヒツジ(またはその他の好適な動物の)赤血球細胞およびデュラサイト(duracytes)(登録商標)はすべて好適な例として挙げられる。核酸を固相に固定するための好適な方法としてはイオン性、疎水性、共有結合性相互作用などが挙げられる。本明細書において使用する固相支持体とは、不溶性であるか、またはその後の反応によって不溶性になり得るいずれかの物質を指す。固相支持体は捕捉試薬を引きつけ固定化するその固有の能力について選択すればよい。あるいは、固相は捕捉試薬を引きつけ固定化する能力を有するさらなる受容体を保持してもよい。さらなる受容体としては捕捉試薬自身または捕捉試薬と結合した荷電物質に対して反対に荷電した荷電物質が挙げられうる。さらにもう1つの別法として、受容体分子は固相支持体に固定化されており(付着しており)、かつ、特異的結合反応を介して捕捉試薬を固定化する能力を有するいずれかの特異的結合メンバーであってもよい。受容体分子はアッセイを実施する前にまたはアッセイを実施する間、捕捉試薬の固相支持体物質との間接的結合を可能にする。従って、固相はプラスチック、誘導体化プラスチック、磁性または非磁性金属、試験管のガラスまたはシリコン面、マイクロタイターウェル、シート、ビーズ、微粒子、チップ、ヒツジ(またはその他の好適な動物)赤血球、デュラサイト(登録商標)および当業者に公知のその他の形状であってもよい。本発明のポリヌクレオチドは個別に、または少なくとも2、5、8、10、12、15、20または25個の明確に区別される本発明のポリヌクレオチドのグループで固相支持体に付着または固定化することができる。さらに、本発明のもの以外のポリヌクレオチドを1つ以上の本発明のポリヌクレオチドと同じ固相支持体に付着させてもよい。
【０１６８】
オリゴヌクレオチドアレイ
本発明の複数のオリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブを含んでなる基板は、GENSET遺伝子中の標的配列の検出または増幅に用いることができ、GENSET遺伝子のコード配列または非コード配列中の突然変異の検出に用いてもよく、また、本明細書の別の箇所に記載されるように、種々の組織において、プロセス(胚発生、疾病治療)の異なる段階で、患者対健常者においてといった、様々な背景でGENSET遺伝子発現を測定するために用いてもよい。
【０１６９】
本明細書において使用する「アレイ」という用語は、遺伝子発現の特異的検出を可能にする十分な長さの核酸の一次元、二次元または多次元の配置を意味する。例えば、アレイは発現レベルを評価しようとする遺伝子由来の複数の核酸を含みうる。アレイはGENSETゲノムDNA、GENSET cDNA、それに相補的な配列またはその断片を含んでもよい。好ましくは、断片は少なくとも12、15、18、20、25、30、35、40または50個のヌクレオチド長である。より好ましくは、断片は少なくとも100個のヌクレオチド長である。さらにより好ましくは、断片は100個より多いヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、断片が500個より多いヌクレオチド長であってよい。
【０１７０】
本明細書に示されるいずれのポリヌクレオチドも固相支持体上の重複する領域にまたは無作為な位置に付着させることができる。あるいは、本発明のポリヌクレオチドは、順序づけて並べられたアレイ（各ポリヌクレオチドが他のどのポリヌクレオチドの付着部位とも重複しない固相支持体の区別される領域に付着されている）に付着させてもよい。好ましくは、ポリヌクレオチドのかかる順序づけられたアレイは「アドレス可能」であるように設計され、そこでは個別の位置が記録されて、アッセイ手順の一部として評価される。アドレス可能ポリヌクレオチドアレイは典型的には、異なる既知の位置で基板表面に結合された複数の異なるオリゴヌクレオチドプローブを含んでなる。各ポリヌクレオチド位置の正確な位置の情報により、これらの「アドレス可能」アレイはハイブリダイゼーションアッセイにおいて特に有用なものとなる。当技術分野で公知のいずれのアドレス可能アレイ技術を本発明のポリヌクレオチドと共に用いてもよい。これらのポリヌクレオチドアレイのある特定の実施形態はジーンチップ(GenechipsTM)として知られており、米国特許第5,143,854号、PCT国際出願WO 90/15070および92/10092に広く記載されている(なお、これらの全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる)。これらのアレイは一般に当技術分野で公知の方法、例えばFodorら (1991) Science 251:767-777を用いて作製することができる(なお、その全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる)。固相支持体上へのオリゴヌクレオチドのアレイの固定化は一般に、「Very Large Scale Immobilized Polymer Synthesis」(VLSIPSTM)として確認される技術の開発によって可能となったが、この技術では典型的には、プローブは高密度アレイでチップの固相表面に固定される。VLSIPS(商標)技術の例は、その全開示内容を参照により本明細書に組み入れる、米国特許第5,143,854号および同第5,412,087号およびPCT国際出願WO 90/15070、WO 92/10092およびWO 95/11995に示されている。固相支持体に固定化されたヌクレオチドのアレイを提供することを目的としたストラテジーを設計する際に、当技術分野で公知のさらなる提示ストラテジーを使用することができ、例えば、PCT国際公開WO 94/12305、同WO 94/11530、同WO 97/29212および同WO 97/31256に開示されており、それらの全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【０１７１】
従って、本発明は少なくとも1種の本発明のポリヌクレオチドを含んでなる核酸分子のアレイに関する。好ましくは、本発明は少なくとも2種の本発明のポリヌクレオチド、特に、本明細書に記載されるプローブまたはプライマーを含んでなる核酸のアレイに関する。好ましくは、本発明は少なくとも5種の本発明のポリヌクレオチド、特に、本明細書に記載されるプローブまたはプライマーを含んでなる核酸のアレイに関する。
【０１７２】
本発明のポリヌクレオチドの作製方法
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドの作製方法を含んでなる。本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載される増幅またはハイブリダイゼーションに基づく方法を含めて、当業者に周知の技術を用いて酵素的に、または化学的に合成することができる。
【０１７３】
核酸を合成するための種々の化学的な方法は当業者には公知である。これらの方法の多くでは、合成は固相支持体上で実施する。あるいは、ポリヌクレオチドは全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,049,656号に記載のように調製してもよい。いくつかの実施形態では、前記のように調製したいくつかのポリヌクレオチドを一緒に連結して、所望の配列を有するより長いポリヌクレオチドを作製する。
【０１７４】
本発明のポリペプチド
本明細書において「GENSETポリペプチド」という用語は、本発明のすべてのタンパク質およびポリペプチドを包含するように使用される。本発明は、(a)偶数配列番号2〜112の全長ポリペプチド; (b)寄託されたクローンプールのクローンインサートによってコードされる全長ポリペプチド; (c)偶数配列番号2〜112のポリペプチドのエピトープ含有断片; (d)寄託されたクローンプールに含まれるクローンインサートによってコードされるポリペプチドのエピトープ含有断片; (e)偶数配列番号2〜112のポリペプチドのドメイン; (f)寄託されたクローンプールに含まれるクローンインサートによってコードされるポリペプチドのドメイン; (g)偶数配列番号2〜112のポリペプチドの、または寄託されたクローンプールのヒトcDNAによってコードされるポリペプチドの、シグナルペプチド; (h)偶数配列番号2〜112のポリペプチドの、または寄託されたクローンプールのヒトcDNAによってコードされるポリペプチドの、成熟ポリペプチド; および(i)上記(a)〜(f)のポリペプチドのいずれかの対立遺伝子変異体; からなる組換え、単離された、または精製されたGENSETポリペプチドを含めて、GENSETポリペプチドを包含する。本発明のその他の目的は本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドならびにかかるポリペプチドを含んでなる融合ポリペプチドである。
【０１７５】
ポリペプチド変異体
本発明はさらに、対立遺伝子およびスプライス変異体、オルソログおよび／または種相同体によってコードされるGENSETポリペプチドを提供する。配列表のポリペプチドおよび寄託されたクローンプールのクローンインサートによってコードされるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの対立遺伝子変異体、スプライス変異体、オルソログおよび／または種相同体は、当技術分野で公知の手順により、本明細書に開示される配列またはATCCに寄託されたクローンからの情報を用いて取得することができる。
【０１７６】
本発明のポリペプチドとしてはまた、本発明のポリペプチドと少なくとも50%同一、より好ましくは少なくとも60%同一、さらにより好ましくは70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%または99%同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。本発明のクエリーアミノ酸配列と少なくとも、例えば95%「同一」のアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、対象のポリペプチド配列がクエリーアミノ酸配列の各100個のアミノ酸あたり5個までのアミノ酸変更を含み得るという点以外は、対象のポリペプチドのアミノ酸配列がクエリー配列と同一であるということを意味する。言い換えると、クエリーアミノ酸配列と少なくとも95%同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るには、対象の配列中に5%まで(100個のうちの5個)のアミノ酸残基が別のアミノ酸で置換、欠失(インデル)または挿入されていてもよい。
【０１７７】
参照配列のこれらの変更は参照アミノ酸配列のアミノまたはカルボキシ末端位置またはそれらの末端位置の間のいずれで生じてもよく、参照配列の残基の間で個々に、または参照配列内の1個以上の連続する群のいずれかに散在する。クエリー配列は配列表のポリペプチド配列および寄託されたクローンプールのクローンインサートによってコードされるものからなる群から選択される全アミノ酸配列であってもよいし、または本明細書に記載のように特定されるいずれかの断片であってもよい。
【０１７８】
本明細書に記載される変異体ポリペプチドはそれらがその正常な生物活性を有するかどうかに関わらず本発明に含まれる。これは特定のポリペプチド分子が生物活性を有さない場合であっても、当業者ならば、例えば、ワクチンとしてまたは抗体を作製するためのこのポリペプチドの使用法が分かるであろう。GENSET生物活性を有さない本発明のポリペプチドのその他の用途としては、特に、当業者に公知の方法を用いるエピトープマッピングにおけるエピトープタグとして、およびSDS-PAGEゲルでのまたは分子篩ゲル濾過カラムでの分子量マーカーとしての用途が挙げられる。以下に記載されるように、本発明のポリペプチドはまたGENSETタンパク質発現を検出するためのアッセイにおいて有用である、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を作製するために、またはGENSETタンパク質機能を増強または阻害し得るアゴニストおよびアンタゴニストとして用いてもよい。さらに、かかるポリペプチドは酵母ツーハイブリッド系において、これもまた本発明の候補アゴニストおよびアンタゴニストであるGENSETタンパク質結合タンパク質を「捕捉する」ために用いてもよい(例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、FieldsおよびSong, (1989), Nature, 340: 245-246参照)。
【０１７９】
本発明のポリペプチドの調製
本発明のポリペプチドは当技術分野で公知のいずれの好適な方法で調製してもよい。かかるポリペプチドとしては単離された天然ポリペプチド、組換えによって得られるポリペプチド、合成によって得られるポリペプチドまたはこれらの方法の組合せによって得られるポリペプチドが挙げられる。本発明のポリペプチドは単離された形態で提供されるのが好ましく、部分的にまたは好ましくは実質的に精製されている。従って、本発明はまた本発明のポリペプチドの調製方法を含んでなる。
【０１８０】
単離
天然の供給源から
本発明のGENSETタンパク質はヒトまたは非ヒト動物の、直接単離されたかまたは培養された細胞にかかわらず、体液、組織および細胞をはじめとする天然の供給源から単離すればよい。天然タンパク質の抽出および精製方法は当技術分野では公知であり、粒子を破壊するための界面活性剤またはカオトロピック剤の使用とそれに次ぐイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、密度による沈降およびゲル電気泳動によるポリペプチドの分別抽出および分離を含む。例えば、種々のタンパク質の精製法については、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、「Methods in Enzymology, Academic Press, 1993」参照。本発明のポリペプチドはまた、天然の供給源から、タンパク質精製の技術分野で周知の方法において本明細書に記載されるものなどの本発明のポリペプチドに向けられる抗体を用いて精製してもよい。
【０１８１】
組換え供給源から
本発明のGENSETポリペプチドは当技術分野で公知の慣例の発現法を用いて組換えによって得られるのが好ましい。所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをいずれかの便宜な宿主に好適な発現ベクター中のプロモーターに機能し得る形で連結させる。真核生物および原核生物双方の宿主系を組換えポリペプチド形成に用いる。次いで、溶解した細胞からまたは培養培地からポリペプチドを単離してその目的とする使用のために必要な程度まで精製する。
【０１８２】
本発明の任意のポリヌクレオチドを用いてGENSETポリペプチドを発現させることができる。発現されるGENSETポリペプチドをコードする核酸は、従来のクローニング技術を用いて発現ベクター中のプロモーターに機能し得る形で連結させる。発現ベクター中のGENSETインサートはGENSETタンパク質の全コード配列またはその一部を含んでなってもよい。
【０１８３】
従って、本発明のさらなる実施形態は本発明のポリペプチドの調製方法であって、この方法は、
a)i)配列表のポリヌクレオチド配列、
ii)寄託されたクローンプールのヒトcDNAのクローンインサートの配列、
iii)配列表のポリペプチドの1つをコードするポリヌクレオチド配列、および
iv)寄託されたクローンプールのクローンインサートの1つによってコードされるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列、
からなる群から選択される配列を含んでなるcDNAを取得し；
b)そのcDNAを、cDNAがプロモーターに機能し得る形で連結されるように発現ベクターに挿入し；そして
c)その発現ベクターを宿主細胞に導入し、それにより宿主細胞にそのポリペプチドを産生させる、
各ステップを含んでなる。
【０１８４】
この実施形態のある態様では、本方法はポリペプチドを単離するステップをさらに含んでなる。本発明のもう1つの実施形態は先の段落に記載される方法によって得られるポリペプチドである。
【０１８５】
発現ベクターは当技術分野で公知の哺乳類、酵母、昆虫または細菌発現系のいずれかである。市販のベクターおよび発現系はGenetics Institute(Cambridge, MA)、Stratagene(La Jolla, California)、Promega(Madison, Wisconsin)およびInvitrogen(San Diego, California)をはじめとする種々の供給業者から入手できる。所望の場合、発現を増強し、また適切なタンパク質の折りたたみを容易にするために、配列のコドン背景およびコドン対形成を、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,082,767号に説明されるように、発現ベクターが導入される特定の発現生物に対して最適化する。
【０１８６】
ある実施形態では、GENSET cDNAの全コード配列およびcDNAのポリAシグナルを介して3'UTRを発現ベクター中のプロモーターに機能し得る形で連結する。あるいは、GENSETタンパク質の一部をコードする核酸が開始部位として役立つメチオニンを欠いている場合には、従来技術を用いて開始メチオニンを核酸の第1のコドンの隣りに導入してもよい。同様に、GENSET cDNA由来のインサートがポリAシグナルを欠いている場合には、例えば、BglIおよびSalI制限エンドヌクレアーゼ酵素を用いてpSG5(Stratagene)からポリAシグナルをスプライスアウトし、それを哺乳類発現ベクターpXT1(Stratagene)に組み込むことによってこの配列を構築物に付加してもよい。pXT1はLTRおよびモロニーマウス白血病ウイルス由来のgag遺伝子の一部を含む。構築物中のLTRの位置により効率的で安定なトランスフェクションが可能となる。このベクターは単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーターおよび選択可能なネオマイシン遺伝子を含む。
【０１８７】
もう1つの実施形態では、組換えポリヌクレオチドに分泌またはリーダー配列、プロ配列、複数のヒスチジン残基などの精製に役立つ配列をコードするさらなるヌクレオチド配列、または組換え生産の際の安定性のためのさらなる配列を付加することが有利であることが多い。
【０１８８】
GENSET発現ベクターのマウスNTH3T3細胞へのトランスフェクションは、宿主細胞にポリヌクレオチドを導入する一実施形態にすぎない。ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの宿主細胞への導入はリン酸カルシウムトランスフェクション、DEAEデキストラン媒介性トランスフェクション、カチオン脂質媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染またはその他の方法によって達成することができる。かかる方法はDavisら(1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Press編, NYなどの多数の標準的な実験マニュアルに記載されている(なお、その全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる)。本発明のポリペプチドは組換えベクターを欠く宿主細胞によって実際に発現させることができ、あるいは細胞により天然で産生させることができることが特に考慮される。
【０１８９】
あるいは、発現されるGENSETポリペプチドはトランスジェニック動物の産物、すなわち、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む体細胞または生殖細胞を特徴とする、トランスジェニックウシ、ヤギ、ブタまたはヒツジのミルクの成分などであってもよい。
【０１９０】
本発明のポリペプチドは分別抽出、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーをはじめとする周知の方法によって組換え細胞培養物から回収および精製すればよい。例えば、種々のタンパク質の精製法については前記の「Methods in Enzymology」参照。精製には高性能液体クロマトグラフィー(「HPLC」)を用いるのが最も好ましい。GENSETポリペプチドの組換えにより得られるバージョンは本明細書に記載の技術または例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるSmithおよびJohnson (1988) Gene. 67(1):31-40に記載される一段階法などの別の当技術分野で公知の技術を用いて実質的に精製してもよい。本発明のポリペプチドはまた組換え供給源からタンパク質精製の技術分野で周知の方法で本明細書に記載されるものなどの本発明のポリペプチドに向けられた抗体を用いて精製してもよい。
【０１９１】
好ましくは、組換えにより発現されるGENSETポリペプチドは「イムノアフィニティークロマトグラフィー」と題される節に記載されるものなどのなどの標準的なイムノクロマトグラフィー技術を用いて精製する。かかる手順では、培養培地または細胞抽出液などの目的のタンパク質を含有する溶液を、クロマトグラフィーマトリックスにそのタンパク質に対する抗体が付着しているカラムに適用する。組換えタンパク質はイムノクロマトグラフィーカラムに結合できる。従って、カラムを洗浄して非特異的に結合したタンパク質を除去する。次いで、特異的に結合した分泌タンパク質を標準的な技術を用いてカラムから遊離させて回収する。
【０１９２】
組換え生産手順に用いる宿主によって、本発明のポリペプチドはグリコシル化されていてもよいし、またはグリコシル化されていなくてもよい。さらに、本発明のポリペプチドはまた、宿主媒介性プロセスの結果として最初の改変メチオニン残基を含む場合もある。従って、一般に、翻訳開始コドンによってコードされるN末端メチオニンはすべての真核細胞で翻訳後にいずれのタンパク質からも高効率で除去されるということは当技術分野では周知である。ほとんどの原核生物でもほとんどのタンパク質のN末端メチオニンはまた効率的に除去されるが、あるタンパク質については、N末端メチオニンが共有結合しているアミノ酸の性質次第ではこの原核生物の除去プロセスは非効率的である。従って、本発明の一つの態様として特に含まれるものは、N末端メチオニンを欠く本発明のポリペプチドである。
【０１９３】
化学合成から
さらに、本発明のポリペプチド、特に短いタンパク質断片は当技術分野で公知の技術を用いて化学合成することができる(例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Creighton (1983), Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman & Co. 2nd Ed., T.E., New York; およびHunkapillerら, (1984) Nature, 310 (5973): 105-11参照)。例えば、本発明のポリペプチド配列の断片に相当するポリペプチドはペプチドシンセサイザーを用いて合成してもよい。あるいは、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,049,656号に記載される方法を用いてもよい。
【０１９４】
さらに、所望の場合、非古典的なアミノ酸または化学アミノ酸類似体を置換または付加としてポリペプチド配列に導入してもよい。非古典的なアミノ酸としては、限定されるものではないが、通常のアミノ酸のD異性体、2,4-ジアミノ酪酸、a-アミノイソ酪酸、4-アミノ酪酸、Abu、2-アミノ酪酸、g-Abu、e-Ahx、6-アミノヘキサン酸、Aib、2-アミノイソ酪酸、3-アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、b-アラニン、フルオロアミノ酸、b-メチルアミノ酸、Ca-メチルアミノ酸、Na-メチルアミノ酸などのデザイナーアミノ酸および一般的なアミノ酸類似体が挙げられる。さらに、アミノ酸はD(右旋性)またはL(左旋性)であってもよい。
【０１９５】
修飾
本発明は翻訳の間またはその後に、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解性切断、抗体分子またはその他の細胞性リガンドへの連結などによって、異なった形で修飾されているポリペプチドを包含する。多数の化学的修飾のいずれも、限定されるものではないが、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、V8プロテアーゼ、NaBH4による特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元、ツニカマイシンの存在化での代謝合成などをはじめとする公知の技術で実施すればよい。
【０１９６】
本発明に包含されるさらなる翻訳後修飾としては、例えば、N結合型またはO結合型糖鎖、N末端またはC末端のプロセシング、アミノ酸主鎖への化学成分の付加、N結合型またはO結合型糖鎖への化学修飾および原核生物の宿主細胞発現の結果としてのN末端メチオニン残基の付加または欠失が挙げられる。ポリペプチドはまたタンパク質の検出および単離を可能にする酵素、蛍光、同位体またはアフィニティー標識などの検出可能な標識で修飾されていてもよい。
【０１９７】
ポリペプチドの可溶性、安定性および循環時間の増大または免疫原性の低下などのさらなる利点を提供し得る、本発明のポリペプチドの化学的に修飾された誘導体も本発明によって提供される。米国特許第4,179,337号参照。誘導体化のための化学成分は米国特許第4,179,337号を参照して選択すればよく、その全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる。誘導体化のための化学成分はポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコール共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなどといった水溶性ポリマーから選択することができる。ポリペプチドは分子内のランダムな位置で、または分子内の所定の位置で修飾されていてもよく、1、2、3またはそれより多くの結合された化学成分を含んでもよい。
【０１９８】
ポリマーはいずれの分子量のものであってもよく、分枝していてもまたは分枝していなくともよい。ポリエチレングリコールについては、取り扱いおよび製造の容易さのために、好ましい分子量は約1 kDaと約100 kDaの間である(「約」という用語はポリエチレングリコールの調製においては、規定の分子量よりも重い分子もあり、軽い分子もあるであろうということを指す)。所望の治療プロファイルによっては(例えば、所望の徐放期間、あるとすれば生物活性に対する作用、取り扱いの容易さ、抗原性の程度またはその欠如、およびポリエチレングリコールの治療タンパク質または類似体へのその他の既知の作用)、その他の大きさを用いてもよい。
【０１９９】
ポリエチレングリコール分子(またはその他の化学成分)はタンパク質の機能性または抗原性ドメインに対する作用を考慮してタンパク質に結合されるべきである。当業者が利用できる多数の結合法があり、例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、EP0 401 384,(G-CSFへPEGを結合させる)およびMalikら(1992), Exp. Hematol. 20:1028-1035 (塩化トレシルを用いるGM-CSFのペグ化(pegylation)を報告している)がある。例えば、ポリエチレングリコールは遊離アミノまたはカルボキシル基などの反応基を介してアミノ酸残基によって共有結合され得る。反応基とは、それに活性化されたポリエチレングリコール分子が結合され得るものである。遊離アミノ基を有するアミノ酸残基としてはリジン残基およびN末端アミノ酸残基が挙げられ、遊離カルボキシル基を有するのものとしてはアスパラギン酸残基、グルタミン酸残基およびC末端アミノ酸残基が挙げられる。スルフヒドリル基をポリエチレングリコール分子を結合させるための反応基として用いてもよい。治療目的に好ましいのは、N末端またはリジン基での結合などのアミノ基での結合である。
【０２００】
N末端で化学修飾されたタンパク質が特に所望されることがある。本組成物の例示としてポリエチレングリコールを用いるならば、種々のポリエチレングリコール分子から(分子量、分枝などによって)、反応混合物中のポリエチレングリコール分子とタンパク質(ポリペプチド)との割合、実施しようとするペグ化反応のタイプ、および選択されたN末端ペグ化タンパク質の取得方法を選択することができる。N末端ペグ化調製物を取得する(すなわち、必要に応じて他のモノペグ化成分からこの成分を分離する)方法は、ペグ化タンパク質分子の集団からN末端ペグ化物質を精製することによるものであってよい。N末端修飾で化学修飾された選択的タンパク質は、特定のタンパク質の誘導体化に利用できる異なるタイプの一級アミノ基(リジン対N末端)の異なった反応性を利用する還元的アルキル化によって達成され得る。適当な反応条件下で、カルボニル基含有ポリマーによるN末端でのタンパク質の実質的に選択的な誘導体化が達成される。
【０２０１】
多量体化
本発明のポリペプチドは単量体または多量体(すなわち、二量体、三量体、四量体およびより高次の多量体)であってもよい。従って、本発明は本発明のポリペプチドの単量体および多量体、その調製およびそれを含有する組成物に関する。特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは単量体、二量体、三量体または四量体である。さらなる実施形態では、本発明の多量体は少なくとも二量体、少なくとも三量体または少なくとも四量体である。
【０２０２】
本発明に包含される多量体はホモマーであってもヘテロマーであってもよい。本明細書において使用する「ホモマー」という用語は、配列表のアミノ酸配列、または寄託されたクローンプールのヒトcDNAクローンインサートによってコードされるアミノ酸配列に相当するポリペプチドのみ(本明細書に記載されるこれらのポリペプチドに相当する断片、変異体、スプライス変異体および融合タンパク質を含む)を含む多量体を指す。これらのホモマーは同一または異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み得る。特定の実施形態では、本発明のホモマーは同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドのみを含む多量体である。もう1つの特定の実施形態では、本発明のホモマーは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む多量体である。特定の実施形態では、本発明の多量体はホモ二量体(例えば、同一のまたは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む)またはホモ三量体(例えば、同一のおよび／または異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む)である。さらなる実施形態では、本発明のホモマーの多量体は少なくともホモ二量体、少なくともホモ三量体または少なくともホモ四量体である。
【０２０３】
本明細書において使用する「ヘテロマー」という用語は本発明のポリペプチドに加え、1種以上の異種ポリペプチド(すなわち、異なるタンパク質のポリペプチド)を含む多量体を指す。特定の実施形態では、本発明の多量体はヘテロ二量体、ヘテロ三量体またはヘテロ四量体である。さらなる実施形態では、本発明のヘテロマーの多量体は少なくともヘテロ二量体、少なくともヘテロ三量体または少なくともヘテロ四量体である。
【０２０４】
本発明の多量体は疎水性、親水性、イオン性および／または共有結合性の会合の結果であってもよく、および／または、例えば、リポソーム形成によって間接的に連結していてもよい。従って、ある実施形態では、例えば、ホモ二量体またはホモ三量体などの本発明の多量体は、溶液中で本発明のポリペプチドを互いに接触させる際に形成される。もう1つの実施形態では、例えば、ヘテロ三量体またはヘテロ四量体などの本発明のヘテロ多量体は、溶液中で本発明のポリペプチドを本発明のポリペプチドに対する抗体(本発明の融合タンパク質中の異種ポリペプチド配列に対する抗体を含む)と接触させる際に形成される。その他の実施形態では、本発明の多量体は本発明のポリペプチドとの、および／または本発明のポリペプチド間の、共有結合性の会合によって形成される。かかる共有結合性の会合にはポリペプチド配列中に含まれる(例えば、配列表に列挙される、または寄託されたクローンによってコードされるポリペプチドに含まれる)1個以上のアミノ酸残基が関与し得る。ある例では、共有結合性の会合はポリペプチド配列内に位置するシステイン残基間の架橋であり、システイン残基は天然の(すなわり、自然界に存在する)ポリペプチドにおいても相互作用する。もう1つの例では、共有結合性の会合は化学的または組換え操作の結果である。あるいは、かかる共有結合性の会合には本発明の融合タンパク質中の異種ポリペプチド配列に含まれる1個以上のアミノ酸残基が関与し得る。
【０２０５】
ある例では、共有結合性の会合は本発明の融合タンパク質に含まれる異種配列間にある(例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,478,925号参照)。特定例では、共有結合性の会合は(本明細書に記載される)本発明のFc融合タンパク質に含まれる異種配列間である。もう1つの特定例では、本発明の融合タンパク質の共有結合性の会合は、共有結合で会合した多量体を形成し得る別のタンパク質（例えば、オステオプロテグリン）由来の異種ポリペプチド配列間である(例えば、その全内容を参照により本明細書に組み入れる国際公開WO98/49305参照)。もう1つの実施形態では、2個以上の本発明のポリペプチドをペプチドリンカーによって結合する。例としては、米国特許第5,073,627号(参照することにより本明細書に組み入れる)に記載されるペプチドリンカーが挙げられる。ペプチドリンカーによって分離された複数の本発明のポリペプチドを含んでなるタンパク質は、慣用の組換えDNA技術を用いて作製することができる。
【０２０６】
本発明の多量体ポリペプチドのもう1つの調製方法はロイシンジッパーまたはイソロイシンジッパーポリペプチド配列と融合した本発明のポリペプチドの使用を含む。ロイシンジッパーおよびイソロイシンジッパードメインはそれらが見出されるタンパク質の多量体化を容易にするポリペプチドである。ロイシンジッパーは最初にいくつかのDNA結合タンパク質で同定され、その後種々の異なるタンパク質でも認められてきた[Landschulzら, (1988), Science, 240:1759]。既知のロイシンジッパーの中には二量体化または三量体化する天然のペプチドおよびその誘導体がある。本発明の可溶性多量体タンパク質を得るのに好適なロイシンジッパードメインの例としては、参照により本明細書に組み入れるPCT国際出願WO94/10308に記載されるものがある。溶液中で二量体化または三量体化するポリペプチド配列と融合した本発明のポリペプチドを含んでなる組換え融合タンパク質を好適な宿主細胞において発現させ、得られる可溶性多量体融合タンパク質を当技術分野で公知の技術を用いて培養上清から回収する。
【０２０７】
本発明の三量体ポリペプチドは生物活性の増強という利点を提供し得る。好ましいロイシンジッパー部分およびイソロイシン部分は三量体を優先的に形成するものである。ある例としては、Hoppeら(1994), FEBS Letters, 344:191および米国特許出願第08/446,922号に記載される、肺表面活性タンパク質D(SPD)由来のロイシンジッパーがある(なお、その全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる)。天然の三量体タンパク質由来のその他のペプチドを本発明の三量体ポリペプチドの調製に用いてもよい。もう1つの例では、本発明のタンパク質は、フラッグ(Flag; 登録商標)ポリペプチド配列を含有する本発明の融合タンパク質に含まれるフラッグポリペプチド配列間の相互作用によって会合される。さらなる実施形態では、本発明の会合タンパク質は本発明のフラッグ融合タンパク質に含まれる異種ポリペプチド配列と抗フラッグ抗体間の相互作用によって会合される。
【０２０８】
本発明の多量体は当技術分野で公知の化学技術を用いて作製してもよい。例えば、本発明の多量体中に含めることが望まれるポリペプチドを、当技術分野で公知のリンカー分子およびリンカー分子長最適化技術を用いて、化学的に架橋することができる(例えば、その全体を参照により本明細書に組み入れる米国特許第5,478,925号参照)。さらに、本発明の多量体は、多量体中に含めることが望まれるポリペプチドの配列内に位置するシステイン残基間に1個以上の分子間架橋を形成するための当技術分野で公知の技術を用いて作製してもよい(例えば、その全体を参照により本明細書に組み入れる米国特許第5,478,925号参照)。さらに、本発明のポリペプチドはポリペプチドのC末端またはN末端へのシステインまたはビオチンの付加によって慣例的に修飾してもよく、さらに当技術分野で公知の技術を適用して1個以上のこれらの修飾ポリペプチドを含む多量体を作製してもよい(例えば、その全体を参照により本明細書に組み入れる米国特許第5,478,925号参照)。さらに、当技術分野で公知のその他の技術を適用して本発明の多量体に含めることが望まれるポリペプチド成分を含有するリポソームを作製してもよい(例えば、その全体を参照により本明細書に組み入れる米国特許第5,478,925号参照)。
【０２０９】
あるいは、本発明の多量体は当技術分野で公知の遺伝子操作技術を用いて作製してもよい。ある実施形態では、本発明の多量体に含まれるポリペプチドは本明細書に記載されるかあるいは当技術分野で公知の融合タンパク質技術を用いて組換えによって得られる(例えば、その全体を参照により本明細書に組み入れる米国特許第5,478,925号参照)。特定の実施形態では、本発明のホモ二量体をコードするポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、リンカーポリペプチドをコードする配列に、次いでさらに該ポリペプチドの翻訳産物を本来のC末端からN末端まで逆向きにコードする合成ポリヌクレオチド(リーダー配列を欠いている)に連結することによって作製される(例えば、その全体を参照により本明細書に組み入れる米国特許第5,478,925号参照)。もう1つの実施形態では、本明細書に記載されるか、あるいは当技術分野で公知の組換え技術を適用して、膜貫通ドメイン(または疎水性もしくはシグナルペプチド)を含み、膜再構成技術によってリポソームに組み込まれ得る本発明の組換えポリペプチドを作製する(例えば、その全体を参照により本明細書に組み入れる米国特許第5,478,925号参照)。
【０２１０】
突然変異ポリペプチド
本発明のGENSETポリペプチドの特性を改良または変更するために、タンパク質工学を用いてもよい。当業者に公知の組換えDNA技術を用いて単一または複数のアミノ酸置換、欠失、付加を含む新規な突然変異タンパク質すなわちムテインまたは融合タンパク質を創出してもよい。かかる改変ポリペプチドは、例えば、生物活性の増加／低下または安定性の増加／低下を示し得る。さらに、それらは少なくとも特定の精製および貯蔵条件下では、相当する天然ポリペプチドよりも高収率で精製されることがあり、また、より高い溶解性を示すことがある。さらに、本発明のポリペプチドは二量体、三量体および四量体を含めて多量体として得てもよい。多量体化はリンカーによって、または組換え的にはFc領域などの異種ポリペプチドを介して、容易に行うことができる。
【０２１１】
NおよびC末端欠失
生物学的機能の実質的な低下を伴わずに1個以上のアミノ酸がN末端またはC末端から欠失し得るということは当技術分野では公知である[例えば、Ronら(1993), Biol. Chem., 268:2984-2988]。従って、本発明はアミノ末端から1個以上の残基が欠失しているポリペプチドを提供する。同様に、生物学的に機能的なC末端欠失突然変異体の多数の例も知られている（例えば、Dobeliら1988参照)。従って、本発明はカルボキシ末端から1個以上の残基が欠失しているポリペプチドを提供する。本発明はまた以下に記載されるようにアミノおよびカルボキシル末端の双方から1個以上のアミノ酸が欠失しているポリペプチドも提供する。
【０２１２】
その他の突然変異
前記で論じられたタンパク質のNおよびC末端欠失型に加え、その他の突然変異体も本発明に含まれる。従って、本発明はさらに実質的なGENSETポリペプチド活性を示すGENSETポリペプチドの変異体を含む。かかる突然変異体としては、活性にほとんど影響を及ぼさないよう当技術分野で公知の通則に従って選択される欠失、挿入、逆位、反復および置換が挙げられる。
【０２１３】
アミノ酸配列の変更に対する許容度を研究するためには2つの主なアプローチがある(その全開示内容を参照により本明細書に組み入れる、Bowieら(1994), Science 247:1306-1310参照)。第1の方法は進化のプロセスに依存するものであり、ここでは突然変異は自然選択によって受け入れられるか、または拒絶される。第2のアプローチは、クローニングされた遺伝子の特定位置にアミノ酸変更を導入するための遺伝子操作と、機能を維持する配列を同定するための選択またはスクリーニングとを用いる。これらの研究によりタンパク質はアミノ酸置換に驚くほど許容性があるということが示されている。
【０２１４】
保存的置換として典型的に認められるものには脂肪族アミノ酸、Ala、Val、LeuおよびPheの中での互いの置換;ヒドロキシル残基SerおよびThrの交換、酸性残基AspおよびGluの交換、アミド残基AsnおよびGln間の置換、塩基性残基LysおよびArgの交換、および芳香族残基Phe、Tyr間の置換がある。従って、本発明のポリペプチドは、例えば、(i)1個以上のアミノ酸残基が、保存または非保存アミノ酸残基(好ましくは保存アミノ酸残基)で置換されているものであって、かかる置換されたアミノ酸残基は遺伝コードによってコードされるものであっても、またはそうでなくともよい:または(ii)1個以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの:または(iii)GENSETポリペプチドがそのポリペプチドの半減期を増加する化合物(例えば、ポリエチレングリコール)などの別の化合物と融合しているもの:または(iv)IgG Fc融合領域ペプチドまたはリーダーもしくは分泌配列または前記の形態のポリペプチドの精製に用いられる配列またはプロタンパク質配列などの、さらなるアミノ酸が前記の形態のポリペプチドと融合しているものであってもよい。
【０２１５】
従って、本発明のGENSETポリペプチドは天然突然変異またはヒトによる操作のいずれかに由来する1個以上のアミノ酸の置換、欠失または付加を含み得る。示したように、変更はタンパク質の折りたたみまたは活性に対して大きく影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換などの小さな性質のものであるのが好ましい。一般に、以下の群のアミノ酸は同等な変更に相当する:(1)Ala、Pro、Gly、Glu、Asp、Gln、Asn、Ser、Thr;(2)Cys、Ser、Tyr、Thr;(3)Val、Ile、Leu、Met、Ala、Phe;(4)Lys、Arg、His;(5)Phe、Tyr、Trp、His。
【０２１６】
さらに、本発明のGENSETポリペプチドは修飾されたアミノ酸を模倣する１個以上のアミノ酸置換を含んでいてもよい。このタイプの置換の例として、リン酸化され得るアミノ酸（例えば、セリン、トレオニン、またはチロシン）を、リン酸化アミノ酸の負電荷に似ている負に荷電したアミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）で置換することが含まれる。また、疎水性基により修飾され得るアミノ酸（例えば、アルギニン）を、大きな疎水性側鎖をもつアミノ酸（トリプトファンまたはフェニルアラニンなど）で置換することも含まれる。従って、本発明の特定の実施形態は、修飾され得るアミノ酸が通常存在する位置に、修飾アミノ酸を模倣する１個以上のアミノ酸置換を有するGENSETポリペプチドを含むものである。さらに、修飾可能なアミノ酸の任意のサブセットが置換されているGENSETポリペプチドも含まれる。例えば、３個のセリン残基を含むGENSETポリペプチドは、該セリンのいずれか１個、いずれか２個、または３個すべてで置換され得る。さらに、修飾可能なGENSETポリペプチドアミノ酸が、修飾を模倣するアミノ酸による置換から除外されてもよい。
【０２１７】
本発明の目的の改変GENSETペプチド分子の特定の実施形態としては、限定されるものではないが、タンパク質分解に抵抗し、-CONH-ペプチド結合が改変されており、(CH2NH)還元型結合、(NHCO)レトロインベルソ結合、(CH2-O)メチレン-オキシ結合、(CH2-S)チオメチレン結合、(CH2CH2)カルバ結合、(CO-CH2)セトメチレン結合、(CHOH-CH2)ヒドロキシエチレン結合、(N-N)結合、E-アルセン結合または-CH=CH-結合で置換されているペプチドである、ペプチド分子が挙げられる。本発明はまた、少なくとも1つのペプチド結合が前記のように改変されているヒトGENSETポリペプチドまたはその断片もしくは変異体を包含する。
【０２１８】
本発明のGENSETタンパク質中の機能に必須であるアミノ酸は部位特異的突然変異誘発またはアラニンスキャンニング突然変異誘発(例えば、全開示内容を参照により本明細書に組み入れられる、Cunninghamら(1989), Science 244:1081-1085参照)などの当技術分野で公知の方法によって同定することができる。特に注目されるのは、荷電アミノ酸のその他の荷電または中性アミノ酸による置換であり、これによりあまり凝集しないなどの極めて望ましい改良された特性を有するタンパク質が得られる。医薬製剤を製造する場合には、凝集は活性を低下させるだけでなく、凝集物が免疫原性であり得るために問題となる場合がある(例えば、Pinckardら, (1967), Clin. Exp. Immunol 2:331-340; Robbinsら, (1987), Diabetes 36:838-845; およびClelandら, (1993), Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10:307-377参照)。
【０２１９】
本発明のさらなる実施形態は、少なくとも1〜50のいずれか１つの整数個の保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有するGENSETポリペプチドのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドに関する。さらに、40以下の保存的アミノ酸置換、30以下の保存的アミノ酸置換、または20以下の保存的アミノ酸置換を含むポリペプチドも含まれる。また、少なくとも1個であるが10個以下、9、8、7、6、5、4、3、2または1個の保存的アミノ酸置換を有するGENSETポリペプチドのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドも提供する。さらに、いずれかの適当な位置または適当な位置の組合せでの保存的アミノ酸置換も提供し、これにより全ての可能な種が本発明の実施形態として含まれる。それぞれの保存的置換または置換の組合せを除外してもよい。
【０２２０】
ポリペプチド断片
構造の定義
本発明はさらに本発明のポリペプチドの断片に向けられる。より詳しくは、本発明は少なくとも6〜1000（またはポリペプチドの長さが1000より小さい場合は、そのポリペプチドアミノ酸残基マイナス１の長さ）のいずれか１つの整数個の保存的アミノ酸残基を含む精製された、単離された、または組換えポリペプチドを具体化する。好ましくは、その断片は本発明のポリペプチドの少なくとも6個、好ましくは8〜10個、より好ましくは12、15、20、25、30、35、40、50、60、75、100、125、150、175、200、225、250、275または300個の連続するアミノ酸である。
【０２２１】
前記のポリペプチド断片に加え、さらに好ましいポリペプチドの亜属は少なくともX個のアミノ酸を含んでなり、ここで、「X」は、6と、以下の配列表のポリペプチド配列を含む本発明のポリペプチドのC末端アミノ酸を表す整数と、の間の任意の整数と定義される。N末端およびC末端位置に関してさらに特定される、前記のような少なくとも6アミノ酸の長さのポリペプチド断片種もさらに含まれる。本発明には前記のような少なくとも6アミノ酸の長さのすべてのポリペプチド断片が個々の種として含まれるが、特にN末端およびC末端位置によって特定され得る。すなわち、配列表のまたは本発明のいずれかの所定のアミノ酸配列上の、少なくとも6個の連続するアミノ酸残基の長さの断片が占め得るN末端およびC末端位置のどの組合せも本発明に含まれる。
【０２２２】
配列表の偶数配列番号の配列のアミノ酸を含んでなるさらに好適なポリペプチド断片、ならびにそれをコードするポリヌクレオチドは、以下の連続的に番号を付けたアミノ酸からなる群より選択される：
1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10, 1-11, 1-12, 1-13, 1-14, 1-15, 1-16, 1-17, 1-18, 1-19, 1-20, 1-21, 1-22, 1-23, 1-24, 1-25, 1-26, 1-27, 1-28, 1-29, 1-30, 1-31, 1-32, 1-33, 1-34, 1-35, 1-36, 1-37, 1-38, 1-39, 1-40, 1-41, 1-42, 1-43, 1-44, 1-45, 1-46, 1-47, 1-48, 1-49, 1-50, 1-51, 1-52, 1-53, 1-54, 1-55, 1-56, 1-57, 1-58, 1-59, 1-60, 1-61, 1-62, 1-63, 1-64, 1-65, 1-66, 1-67, 1-68, 1-69, 1-70, 1-71, 1-72, 1-73, 1-74, 1-75, 1-76, 1-77, 1-78, 1-79, 1-80, 1-81, 1-82, 1-83, 1-84, 1-85, 1-86, 1-87, 1-88, 1-89, 1-90, 1-91, 1-92, 1-93, 1-94, 1-95, 1-96, 1-97, 1-98, 1-99, 1-100, 1-101, 1-102, 1-103, 1-104, 1-105, 1-106, 1-107, 1-108, 1-109, 1-110, 1-111, 1-112, 1-113, 1-114, 1-115, 1-116, 1-117, 1-118, 1-119, 1-120, 1-121, 1-122, 1-123, 1-124, 1-125, 1-126, 1-127, 1-128, 1-129, 1-130, 1-131, 1-132, 1-133, 1-134, 1-135, 1-136, 1-137, 1-138, 1-139, 1-140, 1-141, 1-142, 1-143, 1-144, 1-145, 1-146, 1-147, 1-148, 1-149, 1-150, 1-151, 1-152, 1-153, 1-154, 1-155, 1-156, 1-157, 1-158, 1-159, 1-160, 1-161, 1-162, 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312-476, 313-475, 314-474, 315-473, 316-472, 317-471, 318-470, 319-469, 320-468, 321-467, 322-466, 323-465, 324-464, 325-463, 326-462, 327-461, 328-460, 329-459, 330-458, 331-457, 332-456, 333-455, 334-454, 335-453, 336-452, 337-451, 338-450, 339-449, 340-448, 341-447, 342-446, 343-445, 344-444, 345-443, 346-442, 347-441, 348-440, 349-439, 350-438, 351-437, 352-436, 353-435, 354-434, 355-433, 356-432, 357-431, 358-430, 359-429, 360-428, 361-427, 362-426, 363-425, 364-424, 365-423, 366-422, 367-421, 368-420, 369-419, 370-418, 371-417, 372-416, 373-415, 374-414, 375-413, 376-412, 377-411, 378-410, 379-409, 380-408, 381-407, 382-406, 383-405, 384-404, 385-403, 386-402, 387-401, 388-400, 389-399, 390-398, および391-397（ここで、いずれか１つの断片を構成するアミノ酸の番号付けは、配列表のいずれか１つの偶数配列番号のポリペプチド配列と一致する）。
【０２２３】
配列表の偶数配列番号のさらに好ましいポリペプチド断片、ならびにそれをコードするポリヌクレオチドは、以下のいずれかの50個の連続するアミノ酸を含んでなる断片からなる群より選択される：
1-50, 2-51, 3-52, 4-53, 5-54, 6-55, 7-56, 8-57, 9-58, 10-59, 11-60, 12-61, 13-62, 14-63, 15-64, 16-65, 17-66, 18-67, 19-68, 20-69, 21-70, 22-71, 23-72, 24-73, 25-74, 26-75, 27-76, 28-77, 29-78, 30-79, 31-80, 32-81, 33-82, 34-83, 35-84, 36-85, 37-86, 38-87, 39-88, 40-89, 41-90, 42-91, 43-92, 44-93, 45-94, 46-95, 47-96, 48-97, 49-98, 50-99, 51-100, 52-101, 53-102, 54-103, 55-104, 56-105, 57-106, 58-107, 59-108, 60-109, 61-110, 62-111, 63-112, 64-113, 65-114, 66-115, 67-116, 68-117, 69-118, 70-119, 71-120, 72-121, 73-122, 74-123, 75-124, 76-125, 77-126, 78-127, 79-128, 80-129, 81-130, 82-131, 83-132, 84-133, 85-134, 86-135, 87-136, 88-137, 89-138, 90-139, 91-140, 92-141, 93-142, 94-143, 95-144, 96-145, 97-146, 98-147, 99-148, 100-149, 101-150, 102-151, 103-152, 104-153, 105-154, 106-155, 107-156, 108-157, 109-158, 110-159, 111-160, 112-161, 113-162, 114-163, 115-164, 116-165, 117-166, 118-167, 119-168, 120-169, 121-170, 122-171, 123-172, 124-173, 125-174, 126-175, 127-176, 128-177, 129-178, 130-179, 131-180, 132-181, 133-182, 134-183, 135-184, 136-185, 137-186, 138-187, 139-188, 140-189, 141-190, 142-191, 143-192, 144-193, 145-194, 146-195, 147-196, 148-197, 149-198, 150-199, 151-200, 152-201, 153-202, 154-203, 155-204, 156-205, 157-206, 158-207, 159-208, 160-209, 161-210, 162-211, 163-212, 164-213, 165-214, 166-215, 167-216, 168-217, 169-218, 170-219, 171-220, 172-221, 173-222, 174-223, 175-224, 176-225, 177-226, 178-227, 179-228, 180-229, 181-230, 182-231, 183-232, 184-233, 185-234, 186-235, 187-236, 188-237, 189-238, 190-239, 191-240, 192-241, 193-242, 194-243, 195-244, 196-245, 197-246, 198-247, 199-248, 200-249, 201-250, 202-251, 203-252, 204-253, 205-254, 206-255, 207-256, 208-257, 209-258, 210-259, 211-260, 212-261, 213-262, 214-263, 215-264, 216-265, 217-266, 218-267, 219-268, 220-269, 221-270, 222-271, 223-272, 224-273, 225-274, 226-275, 227-276, 228-277, 229-278, 230-279, 231-280, 232-281, 233-282, 234-283, 235-284, 236-285, 237-286, 238-287, 239-288, 240-289, 241-290, 242-291, 243-292, 244-293, 245-294, 246-295, 247-296, 248-297, 249-298, 250-299, 251-300, 252-301, 253-302, 254-303, 255-304, 256-305, 257-306, 258-307, 259-308, 260-309, 261-310, 262-311, 263-312, 264-313, 265-314, 266-315, 267-316, 268-317, 269-318, 270-319, 271-320, 272-321, 273-322, 274-323, 275-324, 276-325, 277-326, 278-327, 279-328, 280-329, 281-330, 282-331, 283-332, 284-333, 285-334, 286-335, 287-336, 288-337, 289-338, 290-339, 291-340, 292-341, 293-342, 294-343, 295-344, 296-345, 297-346, 298-347, 299-348, 300-349, 301-350, 302-351, 303-352, 304-353, 305-354, 306-355, 307-356, 308-357, 309-358, 310-359, 311-360, 312-361, 313-362, 314-363, 315-364, 316-365, 317-366, 318-367, 319-368, 320-369, 321-370, 322-371, 323-372, 324-373, 325-374, 326-375, 327-376, 328-377, 329-378, 330-379, 331-380, 332-381, 333-382, 334-383, 335-384, 336-385, 337-386, 338-387, 339-388, 340-389, 341-390, 342-391, 343-392, 344-393, 345-394, 346-395, 347-396, 348-397, 349-398, 350-399, 351-400, 352-401, 353-402, 354-403, 355-404, 356-405, 357-406, 358-407, 359-408, 360-409, 361-410, 362-411, 363-412, 364-413, 365-414, 366-415, 367-416, 368-417, 369-418, 370-419, 371-420, 372-421, 373-422, 374-423, 375-424, 376-425, 377-426, 378-427, 379-428, 380-429, 381-430, 382-431, 383-432, 384-433, 385-434, 386-435, 387-436, 388-437, 389-438, 390-439, 391-440, 392-441, 393-442, 394-443, 395-444, 396-445, 397-446, 398-447, 399-448, 400-449, 401-450, 402-451, 403-452, 404-453, 405-454, 406-455, 407-456, 408-457, 409-458, 410-459, 411-460, 412-461, 413-462, 414-463, 415-464, 416-465, 417-466, 418-467, 419-468, 420-469, 421-470, 422-471, 423-472, 424-473, 425-474, 426-475, 427-476, 428-477, 429-478, 430-479, 431-480, 432-481, 433-482, 434-483, 435-484, 436-485, 437-486, 438-487, 439-488, 440-489, 441-490, 442-491, 443-492, 444-493, 445-494, 446-495, 447-496, 448-497, 449-498, 450-499, 451-500, 452-501, 453-502, 454-503, 455-504, 456-505, 457-506, 458-507, 459-508, 460-509, 461-510, 462-511, 463-512, 464-513, 465-514, 466-515, 467-516, 468-517, 469-518, 470-519, 471-520, 472-521, 473-522, 474-523, 475-524, 476-525, 477-526, 478-527, 479-528, 480-529, 481-530, 482-531, 483-532, 484-533, 485-534, 486-535, 487-536, 488-537, 489-538, 490-539, 491-540, 492-541, 493-542, 494-543, 495-544, 496-545, 497-546, 498-547, 499-548, 500-549, 501-550, 502-551, 503-552, 504-553, 505-554, 506-555, 507-556, 508-557, 509-558, 510-559, 511-560, 512-561, 513-562, 514-563, 515-564, 516-565, 517-566, 518-567, 519-568, 520-569, 521-570, 522-571, 523-572, 524-573, 525-574, 526-575, 527-576, 528-577, 529-578, 530-579, 531-580, 532-581, 533-582, 534-583, 535-584, 536-585, 537-586, 538-587, 539-588, 540-589, 541-590, 542-591, 543-592, 544-593, 545-594, 546-595, 547-596, 548-597, 549-598, 550-599, 551-600, 552-601, 553-602, 554-603, 555-604, 556-605, 557-606, 558-607, 559-608, 560-609, 561-610, 562-611, 563-612, 564-613, 565-614, 566-615, 567-616, 568-617, 569-618, 570-619, 571-620, 572-621, 573-622, 574-623, 575-624, 576-625, 577-626, 578-627, 579-628, 580-629, 581-630, 582-631, 583-632, 584-633, 585-634, 586-635, 587-636, 588-637, 589-638, 590-639, 591-640, 592-641, 593-642, 594-643, 595-644, 596-645, 597-646, 598-647, 599-648, 600-649, 601-650, 602-651, 603-652, 604-653, 605-654, 606-655, 607-656, 608-657, 609-658, 610-659, 611-660, 612-661, 613-662, 614-663, 615-664, 616-665, 617-666, 618-667, 619-668, 620-669, 621-670, 622-671, 623-672, 624-673, 625-674, 626-675, 627-676, 628-677, 629-678, 630-679, 631-680, 632-681, 633-682, 634-683, 635-684, 636-685, 637-686, 638-687, 639-688, 640-689, 641-690, 642-691, 643-692, 644-693, 645-694, 646-695, 647-696, 648-697, 649-698, 650-699, 651-700, 652-701, 653-702, 654-703, 655-704, 656-705, 657-706, 658-707, 659-708, 660-709, 661-710, 662-711, 663-712, 664-713, 665-714, 666-715, 667-716, 668-717, 669-718, 670-719, 671-720, 672-721, 673-722, 674-723, 675-724, 676-725, 677-726, 678-727, 679-728, 680-729, 681-730, 682-731, 683-732, 684-733, 685-734, 686-735, 687-736, 688-737, 689-738, 690-739, 691-740, 692-741, 693-742, 694-743, 695-744, 696-745, 697-746, 698-747, 699-748, 700-749, 701-750, 702-751, 703-752, 704-753, 705-754, 706-755, 707-756, 708-757, 709-758, 710-759, 711-760, 712-761, 713-762, 714-763, 715-764, 716-765, 717-766, 718-767, 719-768, 720-769, 721-770, 722-771, 723-772, 724-773, 725-774, 726-775, 727-776, 728-777, 729-778, 730-779, 731-780, 732-781, 733-782, 734-783, 735-784, 736-785, 737-786, および738-787（ここで、いずれか１つの断片を構成するアミノ酸の番号付けは、配列表のいずれか１つの偶数配列番号のポリペプチド配列と一致する）。
【０２２４】
配列表の偶数配列番号のさらに好ましいポリペプチド断片、ならびにそれをコードするポリヌクレオチドは、以下のいずれかの100個の連続するアミノ酸を含んでなる断片からなる群より選択される：
1-100, 2-101, 3-102, 4-103, 5-104, 6-105, 7-106, 8-107, 9-108, 10-109, 11-110, 12-111, 13-112, 14-113, 15-114, 16-115, 17-116, 18-117, 19-118, 20-119, 21-120, 22-121, 23-122, 24-123, 25-124, 26-125, 27-126, 28-127, 29-128, 30-129, 31-130, 32-131, 33-132, 34-133, 35-134, 36-135, 37-136, 38-137, 39-138, 40-139, 41-140, 42-141, 43-142, 44-143, 45-144, 46-145, 47-146, 48-147, 49-148, 50-149, 51-150, 52-151, 53-152, 54-153, 55-154, 56-155, 57-156, 58-157, 59-158, 60-159, 61-160, 62-161, 63-162, 64-163, 65-164, 66-165, 67-166, 68-167, 69-168, 70-169, 71-170, 72-171, 73-172, 74-173, 75-174, 76-175, 77-176, 78-177, 79-178, 80-179, 81-180, 82-181, 83-182, 84-183, 85-184, 86-185, 87-186, 88-187, 89-188, 90-189, 91-190, 92-191, 93-192, 94-193, 95-194, 96-195, 97-196, 98-197, 99-198, 100-199, 101-200, 102-201, 103-202, 104-203, 105-204, 106-205, 107-206, 108-207, 109-208, 110-209, 111-210, 112-211, 113-212, 114-213, 115-214, 116-215, 117-216, 118-217, 119-218, 120-219, 121-220, 122-221, 123-222, 124-223, 125-224, 126-225, 127-226, 128-227, 129-228, 130-229, 131-230, 132-231, 133-232, 134-233, 135-234, 136-235, 137-236, 138-237, 139-238, 140-239, 141-240, 142-241, 143-242, 144-243, 145-244, 146-245, 147-246, 148-247, 149-248, 150-249, 151-250, 152-251, 153-252, 154-253, 155-254, 156-255, 157-256, 158-257, 159-258, 160-259, 161-260, 162-261, 163-262, 164-263, 165-264, 166-265, 167-266, 168-267, 169-268, 170-269, 171-270, 172-271, 173-272, 174-273, 175-274, 176-275, 177-276, 178-277, 179-278, 180-279, 181-280, 182-281, 183-282, 184-283, 185-284, 186-285, 187-286, 188-287, 189-288, 190-289, 191-290, 192-291, 193-292, 194-293, 195-294, 196-295, 197-296, 198-297, 199-298, 200-299, 201-300, 202-301, 203-302, 204-303, 205-304, 206-305, 207-306, 208-307, 209-308, 210-309, 211-310, 212-311, 213-312, 214-313, 215-314, 216-315, 217-316, 218-317, 219-318, 220-319, 221-320, 222-321, 223-322, 224-323, 225-324, 226-325, 227-326, 228-327, 229-328, 230-329, 231-330, 232-331, 233-332, 234-333, 235-334, 236-335, 237-336, 238-337, 239-338, 240-339, 241-340, 242-341, 243-342, 244-343, 245-344, 246-345, 247-346, 248-347, 249-348, 250-349, 251-350, 252-351, 253-352, 254-353, 255-354, 256-355, 257-356, 258-357, 259-358, 260-359, 261-360, 262-361, 263-362, 264-363, 265-364, 266-365, 267-366, 268-367, 269-368, 270-369, 271-370, 272-371, 273-372, 274-373, 275-374, 276-375, 277-376, 278-377, 279-378, 280-379, 281-380, 282-381, 283-382, 284-383, 285-384, 286-385, 287-386, 288-387, 289-388, 290-389, 291-390, 292-391, 293-392, 294-393, 295-394, 296-395, 297-396, 298-397, 299-398, 300-399, 301-400, 302-401, 303-402, 304-403, 305-404, 306-405, 307-406, 308-407, 309-408, 310-409, 311-410, 312-411, 313-412, 314-413, 315-414, 316-415, 317-416, 318-417, 319-418, 320-419, 321-420, 322-421, 323-422, 324-423, 325-424, 326-425, 327-426, 328-427, 329-428, 330-429, 331-430, 332-431, 333-432, 334-433, 335-434, 336-435, 337-436, 338-437, 339-438, 340-439, 341-440, 342-441, 343-442, 344-443, 345-444, 346-445, 347-446, 348-447, 349-448, 350-449, 351-450, 352-451, 353-452, 354-453, 355-454, 356-455, 357-456, 358-457, 359-458, 360-459, 361-460, 362-461, 363-462, 364-463, 365-464, 366-465, 367-466, 368-467, 369-468, 370-469, 371-470, 372-471, 373-472, 374-473, 375-474, 376-475, 377-476, 378-477, 379-478, 380-479, 381-480, 382-481, 383-482, 384-483, 385-484, 386-485, 387-486, 388-487, 389-488, 390-489, 391-490, 392-491, 393-492, 394-493, 395-494, 396-495, 397-496, 398-497, 399-498, 400-499, 401-500, 402-501, 403-502, 404-503, 405-504, 406-505, 407-506, 408-507, 409-508, 410-509, 411-510, 412-511, 413-512, 414-513, 415-514, 416-515, 417-516, 418-517, 419-518, 420-519, 421-520, 422-521, 423-522, 424-523, 425-524, 426-525, 427-526, 428-527, 429-528, 430-529, 431-530, 432-531, 433-532, 434-533, 435-534, 436-535, 437-536, 438-537, 439-538, 440-539, 441-540, 442-541, 443-542, 444-543, 445-544, 446-545, 447-546, 448-547, 449-548, 450-549, 451-550, 452-551, 453-552, 454-553, 455-554, 456-555, 457-556, 458-557, 459-558, 460-559, 461-560, 462-561, 463-562, 464-563, 465-564, 466-565, 467-566, 468-567, 469-568, 470-569, 471-570, 472-571, 473-572, 474-573, 475-574, 476-575, 477-576, 478-577, 479-578, 480-579, 481-580, 482-581, 483-582, 484-583, 485-584, 486-585, 487-586, 488-587, 489-588, 490-589, 491-590, 492-591, 493-592, 494-593, 495-594, 496-595, 497-596, 498-597, 499-598, 500-599, 501-600, 502-601, 503-602, 504-603, 505-604, 506-605, 507-606, 508-607, 509-608, 510-609, 511-610, 512-611, 513-612, 514-613, 515-614, 516-615, 517-616, 518-617, 519-618, 520-619, 521-620, 522-621, 523-622, 524-623, 525-624, 526-625, 527-626, 528-627, 529-628, 530-629, 531-630, 532-631, 533-632, 534-633, 535-634, 536-635, 537-636, 538-637, 539-638, 540-639, 541-640, 542-641, 543-642, 544-643, 545-644, 546-645, 547-646, 548-647, 549-648, 550-649, 551-650, 552-651, 553-652, 554-653, 555-654, 556-655, 557-656, 558-657, 559-658, 560-659, 561-660, 562-661, 563-662, 564-663, 565-664, 566-665, 567-666, 568-667, 569-668, 570-669, 571-670, 572-671, 573-672, 574-673, 575-674, 576-675, 577-676, 578-677, 579-678, 580-679, 581-680, 582-681, 583-682, 584-683, 585-684, 586-685, 587-686, 588-687, 589-688, 590-689, 591-690, 592-691, 593-692, 594-693, 595-694, 596-695, 597-696, 598-697, 599-698, 600-699, 601-700, 602-701, 603-702, 604-703, 605-704, 606-705, 607-706, 608-707, 609-708, 610-709, 611-710, 612-711, 613-712, 614-713, 615-714, 616-715, 617-716, 618-717, 619-718, 620-719, 621-720, 622-721, 623-722, 624-723, 625-724, 626-725, 627-726, 628-727, 629-728, 630-729, 631-730, 632-731, 633-732, 634-733, 635-734, 636-735, 637-736, 638-737, 639-738, 640-739, 641-740, 642-741, 643-742, 644-743, 645-744, 646-745, 647-746, 648-747, 649-748, 650-749, 651-750, 652-751, 653-752, 654-753, 655-754, 656-755, 657-756, 658-757, 659-758, 660-759, 661-760, 662-761, 663-762, 664-763, 665-764, 666-765, 667-766, 668-767, 669-768, 670-769, 671-770, 672-771, 673-772, 674-773, 675-774, 676-775, 677-776, 678-777, 679-778, 680-779, 681-780, 682-781, 683-782, 684-783, 685-784, 686-785, 687-786, および688-787（ここで、いずれか１つの断片を構成するアミノ酸の番号付けは、配列表のいずれか１つの偶数配列番号のポリペプチド配列と一致する）。
【０２２５】
本明細書に記載するこれらの特定の実施形態、ならびに他のポリペプチドおよびポリヌクレオチド断片の実施形態は、「少なくとも 」、「 に等しい」、「 に等しいかまたは より小さい」、「 より小さい」、「少なくとも であるが より大きくない」、もしくは「 から まで」、あるいは、特定された大きさ、または特定されたN末端および／またはC末端位置である、として修飾することができる。本発明の実施形態を説明するために用いた範囲はすべて、特に断らないかぎり、始めと終わりの数字を含めたものであることに留意されたい。
【０２２６】
本発明はまた、前記のようにアミノ酸残基の大きさによって特定されたいずれかの断片のN末端およびC末端位置によって特定されるどのような個々の断片の除外をも提供する。加えて、前記のようにN末端およびC末端位置またはアミノ酸残基の大きさによって特定されるどのような数の断片も個々の種として除外され得る。さらに、前記のようにN末端およびC末端位置またはアミノ酸残基の大きさによって特定される任意の数の断片が任意の組合せで１つのポリペプチド断片を構成してもよく、場合により、非GENSETおよびGENSET関連ポリペプチド配列を含んでいてもよい。
【０２２７】
本発明の前記ポリペプチド断片は先の記載を用いてすぐに想定することができ、従って、単に明細書を不必要に長くしないために個々には列記しない。さらに、GENSET生物活性を有するポリペプチドが本発明の好ましい実施形態であるが、前記の断片はこれらの活性を持つ必要はない。なんとなれば、それらは例えば、イムノアッセイにおいて、エピトープマッピング、エピトープタギングにおいて、ワクチンとして、および分子量マーカーとして有用であるためである。前記の断片はポリペプチドの特定の部分に対する抗体を作製するために用いてもよい。次いで、これらの抗体を当技術分野で周知のイムノアッセイに用いてヒトとヒト以外の細胞および組織を区別したり、または生物学的サンプル中の細胞または組織が本発明のポリペプチドを発現する同一タイプのものであるかどうかを調べたりすることができる。
【０２２８】
また、本発明の前記ポリペプチド断片種は、式「a-b」(ここで、「a」は、ポリヌクレオチドの最もN末端のアミノ酸位置に等しく、「b」は、ポリヌクレオチドの最もC末端のアミノ酸位置に等しく、さらに、「a」は、1と、本発明のポリペプチド配列のアミノ酸数マイナス6と、の間の整数に等しく、かつ、「b」は、7と、本発明のポリペプチオド配列のアミノ酸数の間の整数に等しく、かつ、「a」は「b」より少なくとも6だけ小さい整数である)で表すこともできることに留意すべきである。
【０２２９】
本発明はまた、前記のように5'および3'位によって特定される本発明のポリペプチド断片のいずれかの種、またはアミノ酸の大きさによって特定されるポリペプチドの亜属の除外を提供する。前記のように5'および3'位によってまたはアミノ酸の大きさによって特定されるどのような数の断片も除外され得る。
【０２３０】
機能の定義
ドメイン
本発明の好ましいポリヌクレオチド断片は本発明のポリペプチドのドメインを構成する。かかるドメインは、限定されるものではないが、ロイシンジッパー、へリックス・ターン・へリックスモチーフ、グリコシル化部位などの翻訳後修飾部位、ユビキチン化部位、αへリックスおよびβシート、コードされたタンパク質の分泌を指令するシグナルペプチドをコードするシグナル配列、ホメオボックスなどの転写調節に関係する配列、酸性ストレッチ、酵素の活性部位、基質結合部位、および酵素切断部位を含めて、直線状または構造モチーフおよび特徴を含んでなり得る。かかるドメインは、DNAまたはRNA結合、タンパク質の分泌、転写調節、酵素活性、基質結合活性等といった特定の生物活性を示し得る。
【０２３１】
好ましい実施形態では、ドメインは6〜1000の間のいずれかの整数である多数のアミノ酸を含んでなる。ドメインは本明細書に開示されるものを含めて当業者に公知のいずれかの方法を用いて合成することができる。特定の生物活性を有するドメインを構成するアミノ酸を決定する方法としては、突然変異誘発研究および試験すべき生物活性を測定するアッセイが挙げられる。
【０２３２】
あるいは、本発明のポリペプチドは当業者に公知のいずれかのコンピュータによる方法を用いてデータベース中のモチーフ、ドメインおよび／または特徴についてスキャンすることができる。検索可能なデータベースとしては下記のものが含まれる：Prosite [Hofmannら, (1999) Nucl. Acids Res. 27:215-219; BucherおよびBairoch (1994) Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altmanら編, pp53-61, AAAIPress, Menlo Park]、Pfam [Sonnhammerら, (1997) Proteins. 28(3):405-20; Henikoffら, (2000) Electrophoresis 21(9):1700-6; Batemanら, (2000) Nucleic Acids Res. 28(1):263-6]、Blocks [Henikoffら, (2000) Nucleic Acids Res. 28(1):228-30]、Print [Attwoodら, (1996) Nucleic Acids Res. 24(1):182-8]、Prodom [SonnhammerおよびKahn, (1994) Protein Sci. 3(3):482-92; Corpetら (2000) Nucleic Acids Res. 28(1):267-9]、Sbase [Pongorら (1993) Protein Eng. 6(4):391-5; Murvaiら, (2000) Nucleic Acids Res. 28(1):260-2]、Smart [Schultzら (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95, 5857-5864]、Dali/FSSP [HolmおよびSander (1996) Nucleic Acids Res. 24(1):206-9, HolmおよびSander (1997) Nucleic Acids Res. 25(1):231-4、ならびにHolmおよびSander (1999) Nucleic Acids Res. 27(1):244-7]、HSSP [SanderおよびSchneider (1991) Proteins. 9(1):56-68.]、CATH [Orengoら, (1997) Structure. 5(8):1093-108; Pearlら, (2000) Biochem Soc Trans. 28(2):269-75]、SCOP [Murzinら, (1995) J Mol Biol. 247(4):536-40; Lo Conteら (2000) Nucleic Acids Res. 28(1):257-9]、COG [Tatusovら (1997), Science, 278, 631:637 およびTatusovら (2000), Nucleic Acids Res. 28(1):33-6]、これらの特定のファミリーのデータベースおよび誘導体[Nevill-Manningら, (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 5865-5871; Yonaら, (1999), Proteins. 37(3):360-78; Attwoodら, (2000) Nucleic Acids Res. 28(1):225-7]（これらの全開示内容は各々参照により本明細書に組み入れられる）。利用可能なデータベースの概説については、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Nucleic Acid Research(2000)の28巻1号を参照されたい。
【０２３３】
エピトープおよび抗体融合物:
本発明の好ましい実施形態はエピトープ担持ポリペプチドおよびエピトープ担持ポリペプチド断片に向けられる。これらのエピトープは「抗原性エピトープ」であってもよいし、または「抗原性エピトープ」および「免疫原性エピトープ」の双方であってもよい。「免疫原性エピトープ」とは、ポリペプチドが免疫原である場合にin vivoで抗体応答を誘発するタンパク質の一部と定義される。他方、抗体が結合するポリペプチドの領域は「抗原決定基」または「抗原性エピトープ」と定義される。一般に、タンパク質の免疫原性エピトープ数は抗原性エピトープ数よりも少ない(例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Geysenら,(1984), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002参照)。特定のエピトープは免疫原性ではない場合があるが、それにもかかわらず、それは抗体が免疫原性および抗原性エピトープの双方に対して作製できるので有用であるということに特に留意すべきである。抗原がポリペプチドである場合は、エピトープを線状（すなわち、ポリペプチド鎖に沿って繰り返されたアミノ酸の連続配列から構成される）または非線状（すなわち、ポリペプチド鎖の折りたたみの結果として接近することとなったアミノ酸から構成される）と分類することが一般的である。非線状エピトープは、それらがポリペプチド鎖の折りたたみによって特定の立体配座（すなわち、独特な三次元構造）をとるので、「立体配座エピトープ」とも呼ばれている。
【０２３４】
エピトープは、エピトープに特有の空間的立体配座において、わずか3個のアミノ酸を含んでなる場合もある。一般に、エピトープは少なくとも6個のアミノ酸からなり、少なくとも8〜10個のアミノ酸からなることのほうが多い。好ましい実施形態では、抗原性エピトープは3〜50のいずれかの整数である多数のアミノ酸を含んでなる。エピトープとして機能する断片はいずれかの従来の手段(例えば、Houghten, (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5131-5135参照)、またさらに、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第4,631,21号に記載される手段によって作製することができる。エピトープを構成するアミノ酸を決定する方法としては、X線結晶解析、二次元核磁気共鳴およびエピトープマッピング、例えばGeysenら(1984);PCT国際公開WO84/03564;およびPCT国際公開WO84/03506によって記載されるPepscan法が挙げられる(なお、それらの全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる)。非線状エピトープはタンパク質フットプリンティングのような方法により決定される（全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,691,448号）。もう1つの例としてはJamesonおよびWolf,(1988), Comp. Appl. Biosci. 4:181-186に記載のアルゴリズムがある(なお、この参考文献は参照によりその全体が組み入れられる)。Jameson-Wolf抗原性解析は、例えば、コンピュータプログラムPROTEANを用い、デフォルトパラメーター(バージョン4.0 Windows, DNASTAR, Inc., 1228 South Park Street Madison, WI)を用いて実施すればよい。
【０２３５】
本発明のポリペプチドの全ての断片（長さが少なくとも6アミノ酸残基）は抗原性の線状エピトープとして有用であるので本発明に含まれる。他の免疫原性エピトープを含むアミノ酸残基はJameson-Wolf解析により、他の同様のアルゴリズムにより、または本明細書に記載の方法もしくは当技術分野で公知の方法を用いて抗原応答をin vivoで試験することにより決定することができる。アルゴリズム解析により推定された免疫原性エピトープは、最も高い免疫原性をもつと推定される線状エピトープを含むアミノ酸残基のみを記載する。免疫原性であると特に記載されていない本発明のポリペプチドは、in vivoでは抗原性である可能性があるので、非抗原性とはみなされない。あるいはまた、ファージディスプレイのような方法を用いると、ポリペプチドはin vitroで大概は抗原性がある。
【０２３６】
好ましくは、エピトープ含有ポリペプチドは、本発明のポリペプチドの少なくとも6アミノ酸、好ましくは少なくとも8〜10、より好ましくは12、15、20、25、30、35、40、50、60、75、100、125、150、175、200、225、250、275または300アミノ酸の連続スパンからなる。
【０２３７】
非線状エピトープは２以上の連続していないポリペプチド配列（それぞれが１個以上のアミノ酸からなる）を含む。そのようなエピトープは二次、三次または四次構造の特徴によって接近することとなった不連続なポリペプチドから得られる。従って、本発明は非線状エピトープを含む単離された、精製された、または組換えポリペプチドおよびその断片を包含する。非線状エピトープを与える好ましいポリペプチドは天然で折りたたまれたタンパク質の連続した表面により形成され、かくして、長さが本発明のポリペプチドの少なくとも10アミノ酸であり、さらに好ましくは12、15、20、25、30、35、40、50、60、75、100、125、150、175、200、225、250、275または300アミノ酸である（これらの長さの連続スパンは前記の選ばれた配列の長さと一致する）。さらに好ましいポリペプチドは配列表のポリペプチド配列からなる群より選択される全長ポリペプチド配列を含んでなる。加えて、非線状エピトープは天然の立体配座のタンパク質上に通常提示される抗原部位または連続表面を模倣する合成ペプチドによって形成することもできる。従って、非線状エピトープを与える好ましいポリペプチドは少なくとも5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、50、60、75、100、125、150、175、200、225、250、275または300アミノ酸の組合せを含む合成タンパク質によりって形成することも可能である。
【０２３８】
本発明のエピトープ担持断片は本発明のポリペプチドの6〜50アミノ酸(すなわち、6から50までの間のいずれかの整数)を含んでなることが好ましい。また、整数6と、配列表の全長GENSET配列と、の間の抗原性断片も本発明に含まれる。整数6とGENSETポリペプチドの全長配列との間の配列のすべての組合せが含まれる。エピトープ担持断片は、本発明のポリペプチド断片について上記したように、連続するアミノ酸残基の数によって(亜属として)または特定のN末端およびC末端位置によって(種として)のいずれかによって特定され得る。同様に、本発明のエピトープ担持断片はいくつでも除外され得る。
【０２３９】
抗原性エピトープは、例えば、エピトープと特異的に結合するモノクローナル抗体を含めて、抗体を作製するために有用である(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Wilsonら,1984およびSutcliffeら,(1983), Science, 219:660-666参照)。次いで、抗体は本明細書に記載されるような診断および組織／細胞同定技術などの種々の技法に、また、イムノアフィニティークロマトグラフィーなどの精製方法に用いられる。
【０２４０】
同様に、免疫原性エピトープは当技術分野で周知の方法に従って抗体を誘導するために用いてもよい(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Sutcliffeら,前掲;Wilsonら,前掲;Chowら(1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:910-914;およびBittleら,(1985), Virol. 66:2347-2354参照)。好ましい免疫原性エピトープとしては天然GENSETタンパク質が挙げられる。免疫原性エピトープはアルブミンなどの担体タンパク質とともに動物系(ウサギまたはマウスなど)に提供してもよいし、またはそれが十分に長ければ(少なくとも約25アミノ酸)担体なしでもよい。しかしながら、わずか8〜10アミノ酸からなる免疫原性エピトープが、少なくとも、変性したポリペプチドの線状エピトープと(例えば、ウェスタンブロッティングにおいて)結合し得る抗体を生起させるのに十分であることがわかっている。
【０２４１】
本発明のエピトープ担持ポリペプチドは、限定されるものではないが、in vivo免疫化、in vitro免疫化およびファージディスプレイ法をはじめとする当技術分野で周知の方法に従って抗体を誘導するために用いる(例えば、Sutcliffeら,前掲;Wilsonら,前掲およびBittleら,前掲参照)。in vivo免疫化を用いる場合には、動物を遊離ペプチドで免疫してもよいが、ペプチドをキーホールリンペット・ヘモシアニン(KLH)または破傷風トキソイドなどの巨大分子担体と結合させることで抗ペプチド抗体力価を増強してもよい。例えば、システイン残基を含むペプチドは、-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)などのリンカーを用いて担体と結合させることができる一方、他のペプチドはグルタルアルデヒドなどのより一般的な架橋剤を用いて担体と結合させる。ウサギ、ラットおよびマウスなどの動物は遊離または担体結合型ペプチドのいずれかで免疫するが、例えば、約100μgのペプチドまたは担体タンパク質とフロイントアジュバントを含有するエマルションの腹腔内および／または皮内注射によって免疫する。例えば、固相表面に吸着させた遊離ペプチドを用いるELISAアッセイによって検出され得る、有用な力価の抗ペプチド抗体を用意するには、例えば、約2週間の間隔で数回のブースター注射が必要であり得る。免疫された動物由来の血清中の抗ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体を選択することによって、例えば、当技術分野で周知の方法に従って固相支持体上のペプチドに吸着させ、選択された抗体を溶出することにより、高めてもよい。
【０２４２】
当業者ならば分かるであろうし、前記でも論じたが、免疫原性または抗原性エピトープを含んでなる本発明のポリペプチドは異種ポリペプチド配列と融合させてもよい。例えば、本発明のポリペプチドを免疫グロブリン(IgA、IgE、IgG、IgM)の定常ドメインまたはその一部(CH1、CH2、CH3、そのいずれかの組合せ(全ドメインおよびその一部の双方を含む))と融合してキメラポリペプチドを得てもよい。これらの融合タンパク質により精製が容易になり、またin vivoでの半減期の増大を示す。このことは例えば、ヒトCD4ポリペプチドの最初の2つのドメインおよび哺乳動物免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質について示されている(例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、EPA0,394,827;およびTrauneckerら, (1988), Nature, 331:84-86参照)。IgG部分のためにジスルフィド結合した二量体構造を有する融合タンパク質は、他の分子と結合して中和することにおいて単量体のポリペプチドまたはその断片単独よりも効率的であり得る(例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Fountoulakisら, (1995) Biochem, 270:3958-3964参照)。前記のエピトープをコードする核酸はまた、発現されたポリペプチドの検出および精製に役立つようエピトープタグとして目的の遺伝子と再結合させてもよい。
【０２４３】
本発明のさらなる融合タンパク質は遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エキソンシャッフリングまたはコドンシャッフリング(総称して「DNAシャッフリング」と呼ぶ)という技術によって作製してもよい。DNAシャッフリングは本発明のポリペプチドの活性をモジュレートし、それによってポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストを効率的に作製するために用いてもよい。例えば、米国特許第5,605,793号;同第5,811,238号;同第5,834,252号;同第5,837,458号;およびPattenら, (1997) Curr Opinion Biotechnol. 8:724-733; Harayama, (1998), Trends Biotechnol. 16(2): 76-82; Hanssonら(1999), J. Mol. Biol. 287:265-276;ならびにLorenzoおよびBlasco, (1998), Biotechniques. 24(2):308-313参照(これらの文書の各々は参照により本明細書に組み入れる)。ある実施形態では、本発明のコードポリヌクレオチドの、1以上の構成要素、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、断片など、またはそれによってコードされるポリペプチドを1以上の異種分子の1以上の構成要素、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、断片などと再結合させてもよい。
【０２４４】
本発明はさらに、このセクションに列挙されるポリペプチド断片の任意の組合せも包含する。
【０２４５】
抗体
定義
本発明はさらに、ポリペプチドと、より詳しくは、本発明のポリペプチドのエピトープと特異的に結合する抗体およびT細胞抗原受容体(TCR)に関する。本発明の抗体としてはIgG(IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4を含む)、IgA(IgA1およびIgA2を含む)、IgD、IgE、またはIgMおよびIgYが挙げられる。「抗体」(Ab)とは少なくとも1つの結合ドメインから構成されるポリペプチドまたはポリペプチド群を指し、ここで、該結合ドメインは抗原の抗原決定基の特徴に相補的な内面形状および電荷分布を有する三次元結合空間を形成するために抗体分子の可変ドメインの折りたたみから形成され、これにより抗原との免疫学的反応が可能となる。本明細書において「抗体」とは、一本鎖全抗体をはじめとする全抗体およびその抗原結合性フラグメントを含む。好ましい実施形態では、抗体は本発明のヒト抗原結合性抗体フラグメントであり、限定されるものではないが、Fab、Fab' F(ab)2およびF(ab')2、Fd、一本鎖Fvs(scFv)、一本鎖抗体、ジスルフィド結合したFvs(sdFv)、およびVLまたはVHドメインのいずれかを含むフラグメントが挙げられる。抗体は鳥類および哺乳類をはじめとする動物起源であってよい。好ましくは、抗体はヒト、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマまたはニワトリ由来である。
【０２４６】
一本鎖抗体をはじめとする抗原結合性抗体フラグメントは可変領域を単独で、または以下のヒンジ領域、CH1、CH2およびCH3ドメインの全体または一部と組み合わせて含んでもよい。また、可変領域と、ヒンジ領域、CH1、CH2およびCH3ドメインとのいずれの組合せも本発明に含まれる。本発明はさらに本発明のポリペプチドと特異的に結合するキメラ、ヒト化ならびにヒトモノクローナルおよびポリクローナル抗体を含む。本発明はさらに本発明の抗体に対して抗イディオタイプである抗体を含む。
【０２４７】
本発明の抗体は単一特異性、二重特異性および三重特異性であってもよいし、またはそれ以上に多特異性を有していてもよい。多特異性抗体は本発明のポリペプチドの種々のエピトープに特異的であってもよいし、または本発明のポリペプチドのみならず異種ポリペプチドまたは固相支持体材料などの異種組成物の双方に特異的であってもよい。例えば、WO93/17715、WO92/08802、WO91/00360、WO92/05793、Tuttら(1991) J. Immunol. 147:60-69、米国特許第5,573,920号、同第4,474,893号、同第5,601,819号、同第4,714,681号、同第4,925,648号、Kostelnyら(1992) J. Immunol. 148:1547-1553参照(なお、これらの全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる)。
【０２４８】
本発明の抗体は、抗体によって認識されるまたは特異的に結合される、本発明のポリペプチドのエピトープまたはエピトープ含有部分によって記載または特定することが可能である。抗体は本発明の核酸によってコードされる完全なタンパク質またはその断片と特異的に結合し得る。従って、エピトープまたはエピトープ含有ポリペプチド部分は、例えば、N末端およびC末端位置によって、連続するアミノ酸残基の長さによって、または本明細書に記載されるその他の形式(配列表を含む)によって、特定され得る。本発明のエピトープまたはポリペプチドと特異的に結合する抗体はまた、個々の種として除外され得る。従って、本発明は本発明の特定のポリペプチドと特異的に結合する抗体を含み、かつ、その除外も意図する。
【０２４９】
従って、本発明のもう1つの実施形態は本発明のポリペプチドと特異的に結合し得る精製または単離された抗体である。この実施形態のある態様では、抗体は本発明のポリペプチドの少なくとも6個の連続するアミノ酸、好ましくは少なくとも8〜10個の連続するアミノ酸、より好ましくは少なくとも12、15、20、25、30、40、50または100個の連続するアミノ酸を含んでなる線状のエピトープ含有ポリペプチドと結合し得る。この実施形態の別の態様において、抗体は本発明のポリペプチドの10アミノ酸長、さらに好ましくは12、15、20、25、30、40、50または100アミノ酸を含んでなる非線状のエピトープ含有ポリペプチド、さらに好ましくは天然の立体配座の連続する表面と結合し得る。加えて、抗体はGENSETポリペプチドからなる群より選択される配列のポリペプチドの天然立体配座の連続表面を模倣するように設計された合成ペプチドにより提示される非線状エピトープと結合し得る。線状エピトープと結合する抗体は、例えば、適正なタンパク質折りたたみを検出するアッセイにおいて、非線状エピトープと結合する抗体と組合せて使用してもよい。
【０２５０】
本発明の抗体はまた、その交差反応性により記載または特定することができる。本発明のポリペプチドのその他の類似体、オルソログまたは相同体のいずれとも特異的に結合しない抗体も含まれる。本発明のポリペプチドに対して95％未満、90％未満、85％未満、80％未満、75％未満、70％未満、65％未満、60％未満、55％未満および50％未満の同一性(当技術分野で公知であり、かつ、本明細書に記載される方法を用いて、例えば、本明細書に示されるFASTDBおよびパラメーターセットを用いて算出される)を有するポリペプチドと結合しない抗体も本発明に含まれる。さらに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件(本明細書に記載されるような)下で本発明のポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドとのみ結合する抗体も本発明に含まれる。本発明の抗体はまた、その結合親和性により記載または特定することもできる。好ましい結合親和性としては解離定数すなわちKdが、5X10-6M、10-6M、5X10-7M、10-7M、5X10-8M、10-8M、5X10-9M、10-9M、5X10-10M、10-10M、5X10-11M、10-11M、5X10-12M、10-12M、5X10-13M、10-13M、5X10-14M、10-14M、5X10-15Mおよび10-15M未満のものが挙げられる。
【０２５１】
本発明はまた突然変異GENSETタンパク質または突然変異GENSETタンパク質のエピトープを含んでなるその断片もしくは変異体と特異的に結合し得る精製または単離された抗体に関する。
【０２５２】
抗体の調製
本発明の抗体は当技術分野で公知のいずれかの好適な方法によって調製することができる。これらの方法のいくつかは「実施例1: GENSETタンパク質に対する抗体組成物の調製」と題される実施例に詳しく記載されている。例えば、「ポリクローナル抗体」を含有する血清の産生を誘導するために本発明のポリペプチドまたはその抗原性断片を動物に投与する。本明細書において「モノクローナル抗体」とは、ハイブリドーマ技術によって産生される抗体に限定されるものではなく、むしろ真核細胞クローン、原核細胞クローンまたはファージクローンをはじめとする単一のクローン由来の抗体を指すのであって、それが産生される方法を指すのではない。モノクローナル抗体はハイブリドーマ、組換え体およびファージディスプレイ技術の使用を含めて当技術分野で公知の様々な技術を用いて調製することができる。
【０２５３】
ハイブリドーマ技術としては当技術分野で公知のものが挙げられる(例えば、HarlowおよびLane,(1988) Antobodies A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, pp. 53-242; Hammerling (1981), Monoconal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y. 563-681参照;これらの文献はその全体を参照により組み入れる)。FavおよびF(ab')2フラグメントは、例えば、ハイブリドーマによって産生された抗体から、パパイン(Fabフラグメントを生成するために)またはペプシン(F(ab')2フラグメントを生成するために)などの酵素を用いてタンパク質分解切断によって調製される。
【０２５４】
あるいは、本発明の抗体は組換えDNA技術の適用によって、または当技術分野で公知の方法を用いる合成化学によって製造してもよい。例えば、本発明の抗体は当技術分野で公知の種々のファージディスプレイ法を用いて調製してもよい。ファージディスプレイ法では、機能的抗体ドメインが、それをコードするポリヌクレオチド配列を保持するファージ粒子表面に提示される。所望の結合特性を有するファージを、抗原、典型的には固相表面もしくはビーズに結合または捕捉された抗原を用いて直接的に選択することにより、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー(例えば、ヒトまたはマウス)から選択する。これらの方法に用いるファージは、典型的には、Fab、Fvまたはジスルフィド安定化Fv抗体ドメインがファージ遺伝子IIIまたは遺伝子VIIIタンパク質のいずれかに組換えによって融合されている、fdおよびM13などの繊維状ファージである。本発明の抗体作製に使用できるファージディスプレイ法の例としては、Brinkmanら(1995) J. Immunol Methods, 182:41-50; ;Amesら(1995) J. Immunol. Meth., 184:177-186; Kettleboroughら(1994), Eur. L Immunol., 24:952-958; Persicら(1997) Gene, 1879-81; Burtonら(1994) Adv. Immunol., 57:191-280;PCT/GB91/01134;WO90/02809;WO91/10737;WO92/01047;WO92/18619;WO93/11236;WO95/15982;WO95/20401および米国特許第5,698,426号、同第5,223,409号、同第5,403,484号、同第5,580,717号、同第5,427,908号、同第5,750,753号、同第5,821,047号、同第5,571,698号、同第5,427,908号、同第5,516,637号、同第5,780,225号、同第5,658,727号および同第5,733,743号に開示されるものが挙げられる(これらの文献はその全体が参照により組み入れられる)。
【０２５５】
前記の参照文献に記載されるように、ファージ選択後、ファージから抗体コード領域を単離し、それを、ヒト抗体などの全抗体またはその他の所望の抗原結合性フラグメントを生成するために用いて、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌をはじめとする任意の所望の宿主において発現させる。例えば、WO92/22324; Mullinaxら(1992) BioTechniques. 12(6):864-869;およびSawaiら(1995) AJRI 34:26-34;およびBetterら(1988) Science 240:1041-1043(これらの文献はその全体が参照により組み入れられる)に開示されるものなどの当技術分野で公知の方法を用いて、Fab、Fab’ F(ab)2およびF(ab')2フラグメントを組換えにより産生する技術も用いることができる。
【０２５６】
一本鎖Fvおよび抗体を製造するために使用できる技術の例としては、米国特許第4,946,778号および同第5,258,498号;Hustonら(1991) Meth. Enymol. 203:46-88; Shuら(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7995-7999;およびSkerra(1988) Science 240:1038-1040（これらの全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる）に記載されるものが挙げられる。ヒトにおける抗体のin vivoでの使用およびin vitro検出アッセイをはじめとするいくつかの使用のためには、キメラ、ヒト化またはヒト抗体を用いることが好ましい場合もある。キメラ抗体を作製する方法は当技術分野では公知である。例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Morrison(1985);Oiら(1986) BioTechniques 4:214; Gilliesら(1989) J. Immunol Methods 125:191-202;および米国特許第5,807,715号参照。抗体は、CDRグラフティング(EP0 239 400;WO91/09967;米国特許第5,530,101号および同第5,585,089号)、ベニアーリング法(veneering)またはリサーフェシング法(resurfacing)[EP0 592 106;EP0 519 596; Padlan (1991) Molec. Immunol. 28(4/5):489-498; Studnickaら(1994) Protein Engineering 7(6):805-814; Roguskaら(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969-973]およびチェーン・シャッフリング法(chain shuffling)(米国特許第5,565,332号)をはじめとする種々の技術を用いてヒト化してもよい(なお、これらの全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる)。ヒト抗体は前記のファージディスプレイ法をはじめとする当技術分野で公知の種々の方法によって作製することができる。米国特許第4,444,887号、同第4,716,111号、同第5,545,806号および同第5,814,318号;WO98/46645;WO98/50433;WO98/24893;WO96/34096;WO96/33735およびWO91/10741も参照(これらの文献はその全体が参照により組み入れられる)。
【０２５７】
本発明のポリペプチドと組換えにより融合した、または化学的にコンジュゲートした(共有および非共有結合の双方を含む)抗体も本発明にさらに含まれる。この抗体は本発明のポリペプチド以外の抗原に特異的であってもよい。例えば、本発明の抗体は、異種ポリペプチド、薬剤または毒素などの検出アッセイにおいて標識として有用な分子およびエフェクター分子と、組換えにより融合してもよいしまたは結合してもよい。例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、WO92/08495; WO91/14438; WO89/12624;米国特許第5,314,995号およびEP 0 396 387参照。融合抗体はまた、本発明のポリペプチドを特定の細胞表面受容体に特異的な抗体と融合または結合することによって、in vitroまたはin vivoのいずれかで本発明のポリペプチドを特定の細胞型へと標的化するために用いてもよい。本発明のポリペプチドと融合または結合された抗体はまた当技術分野で公知の方法を用いるin vitro免疫アッセイおよび精製法に用いてもよい(例えば、Harborら,前記;WO93/21232;EP0 439 095;Naramura, M.ら(1994) Immunol. Lett. 39:91-99; 米国特許第5,474,981号; Gilliesら(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1428-1432; Fellら(1991) J. Immunol. 146:2446-2452参照; これらの文献はその全体が参照により組み入れられる)。
【０２５８】
本発明は可変領域以外の抗体ドメインと融合または結合した本発明のポリペプチドを含んでなる組成物をさらに含む。例えば、本発明のポリペプチドは抗体Fc領域またはその一部と融合または結合させてもよい。本発明のポリペプチドと融合される抗体部分はヒンジ領域、CH1ドメイン、CH2ドメインおよびCH3ドメイン、または全ドメインもしくはその一部のいずれかの組合せを含んでもよい。本発明のポリペプチドはポリペプチドのin vivo半減期を延長するために、または免疫検定に用いるために、当技術分野で公知の方法を用いて前記の抗体部分と融合または結合してもよい。本ポリペプチドはまた多量体を形成するために前記の抗体部分と融合または結合してもよい。例えば、本発明のポリペプチドに融合されたFc部分はFc部分間のジスルフィド結合を介して二量体を形成し得る。ポリペプチドをIgAおよびIgMの一部分と融合することでより高度の多量体型を作製してもよい。本発明のポリペプチドを抗体の一部分と融合または結合する方法は当技術分野では公知である。例えば、米国特許第5,336,603号、同第5,622,929号、同第5,359,046号、同第5,349,053号、同第5,447,851号、同第5,112,946号;EP0 307 434、EP0 367 166;WO96/04388、WO91/06570;Ashkenaziら(1991)  Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-10539; Zheng, X.X.ら(1995) J. Immunol. 154:5590-5600;およびVilら(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337-11341 参照; これらの文献はその全体が参照により組み入れられる)。
【０２５９】
野生型であろうとトランスジェニックであろうと、抗体結合が望まれるものとは異なる種のGENSETを発現する非ヒト動物または哺乳類、およびGENSETを発現しない動物(すなわち、本明細書に記載されるGENSETノックアウト動物)は抗体を製造するのに特に有用である。GENSETノックアウト動物はGENSETタンパク質の露出された領域の全部またはほとんどを外来抗原として認識し、従って、より広範なアレイのGENSETエピトープを用いて抗体を産生する。さらに、10〜30個のアミノ酸のみを含むより小さなポリペプチドもGENSETタンパク質のいずれか1種に対する特異的結合を得るのに有用であり得る。さらに、抗原性配列と類似するGENSET種を産生する動物の体液性免疫系は、好ましいことに、動物の天然のGENSET種とその抗原配列間の差異を認識して、抗原配列中のそれらのユニーク部位に対する抗体を産生するだろう。かかる技術はGENSETタンパク質のいずれか1種と特異的に結合する抗体を得るのに特に有用である。
【０２６０】
本発明の好ましい実施形態は、抗体または抗体フラグメントをGENSETポリペプチドと特異的に結合させる方法である。この方法は、GENSETポリペプチド特異的抗体または抗体フラグメントを、抗体結合条件下で、GENSETポリペプチドに接触させるステップを含んでなる。さらに、抗体または抗体フラグメントをGENSETポリペプチドのエピトープ、ドメインまたは断片と特異的に結合させる方法が含まれる。この方法は、例えば、本明細書に記載するGENSETポリペプチドの活性を検出、精製または改変するために使用することができる。
【０２６１】
本発明の抗体を用いて、当技術分野で公知の方法により試験サンプルまたは生物学的サンプル中のタンパク質レベルをアッセイすることができる。タンパク質を検出するのに有用な抗体に基づいた方法として、イムノアッセイ、例えば酵素結合イムノソルベントアッセイ(ELISA)およびラジオイムノアッセイ(RIA)が挙げられる。適当な抗体アッセイ用の標識は当技術分野で公知であり、酵素標識、例えばグルコースオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど；放射性同位体、例えばヨウ素（125I, 121I）、炭素（14C）、硫黄（35S）、トリチウム（3H）、インジウム（121In）、テクネチウム（99Tc）；発光標識、例えばルミノール、イソルミノ、theromaticアクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、シュウ酸エステル、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、およびエクオリン；および蛍光標識、例えばフルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、O-フタルアルデヒド、フルオレスカミンが含まれる。
【０２６２】
ポリヌクレオチドの使用
試薬としてのポリヌクレオチドの使用
本発明のポリヌクレオチドは、単離方法、診断アッセイ、および法医学的方法における試薬として使用することができる。例えば、本発明のGENSETポリヌクレオチド由来の配列を、検出可能なように標識し、プローブとして使用してそれらとのハイブリダイズが可能なその他の配列を単離することができる。さらに、本発明のGENSETポリヌクレオチド由来の配列を使用して単離、診断、または法医学的方法において用いるPCRプライマーを設計することもできる。
【０２６３】
対応するゲノムDNA配列の探索
また、本発明のGENSET cDNAを使用して、対応するゲノムDNAにおいて本発明のcDNAの上流に位置する配列をクローニングすることができる。かかる上流配列は遺伝子発現を調節することが可能であり、プロモーター配列、エンハンサー配列、および転写または翻訳レベルに影響を及ぼすその他の上流配列が含まれる。ひと度、同定してクローニングすれば、これらの上流調節配列は挿入された遺伝子の発現を所望の空間的、時間的、発生的、または定量的様式で指令するよう設計される発現ベクター中で使用することができる。
【０２６４】
ゲノムDNAから上流配列をクローニングするためのcDNAまたはその断片の使用
本発明のポリヌクレオチドから得られる配列は染色体ウォーキング法を用いた対応する遺伝子のプロモーターの単離に用いることができる。ある染色体ウォーキング法では、Clontechから入手可能なGenomeWalker(商標)キットが製造業者の説明書に従って使用される。
【０２６５】
クローニングした上流配列内にあるプロモーターの同定
ひと度、前記のように上流ゲノム配列をクローニングし、配列決定したら、上流配列内の推定プロモーターおよび転写開始部位が、本発明のポリヌクレオチドの上流にある配列を、既知の転写開始部位、転写因子結合部位、またはプロモーター配列を含むデータベースと比較することによって同定され得る。
【０２６６】
さらに、上流配列内にあるプロモーターは、プロモーターリポーターベクターを用いて以下のようにして同定することができる。GENSET遺伝子の第1のエキソンの上流に位置するGENSETプロモーター領域の調節活性をもつポリヌクレオチド断片または変異体の制御下におかれている場合には、リポーター遺伝子の発現が検出される。GENSETプロモーター配列をクローニングするのに好適なプロモーターリポーターベクターとしては、Clontechから入手可能なpSEAP-Basic、pSEAP-Enhancer、pβgal-Basic、pβgal-Enhancer、またはpEGFP-1プロモーターリポーターベクター、またはPromegaのpGL2-basicまたはpGL3-basicプロモーターレスルシフェラーゼリポーター遺伝子ベクターが挙げられる。簡潔に説明すると、これらのプロモーターリポーターベクターは各々、分泌されるアルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、または緑色蛍光タンパク質などの容易にアッセイできるタンパク質をコードするリポーター遺伝子の上流に位置するマルチクローニング部位を含む。GENSETコード領域の上流の配列はリポーター遺伝子の上流にあるクローニング部位に両方の方向性で挿入され、さらに好適な宿主細胞に導入される。リポータータンパク質のレベルをアッセイし、さらにクローニング部位にインサートを含まないベクターから得られたレベルと比較する。対照ベクターに対して、インサートを含むベクターに発現レベルの上昇が認められれば、インサート内にプロモーターが存在することが示される。必要であれば、上流配列を、弱いプロモーター配列からの転写レベルを高めるためのエンハンサーを含むベクター中にクローニングすることができる。インサートを含まないベクターで前記の発現が高レベルで観察されることにより、挿入した上流配列内にプロモーター配列が存在することが示される。上流ゲノムDNA内のプロモーター配列は部位特異的突然変異誘発法、リンカースキャニング解析、または当業者に一般的なその他の技術によってさらに特徴付けることができる。
【０２６７】
各GENSET遺伝子のプロモーターの強度および特異性は、異なるタイプの細胞および組織におけるGENSETプロモーターに機能し得る形で連結された検出可能なポリヌクレオチドの発現レベルによって評価することができる。検出可能なポリヌクレオチドは、所定のオリゴヌクレオチドプローブと特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド、または検出可能なタンパク質（GENSETポリペプチドまたはその断片もしくは変異体を含む）をコードするポリヌクレオチドのいずれかであり得る。この種のアッセイは当業者には周知のものであり、米国特許第5,502,176号; および同第5,266,488号（これらの全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる）に記載されている。これらの方法のいくつかは本願の他の箇所でより詳細に説明している。
【０２６８】
本発明のポリヌクレオチドの上流に位置するプロモーターおよびその他の調節配列は、挿入された遺伝子の発現を所望の空間的、時間的、発生的、または定量的様式で指令し得る発現ベクターを設計するのに使用することができる。所望の空間的、時間的、発生的、および定量的パターンを指令し得るプロモーターは本明細書に記載の発現解析の結果を用いて選択することができる。例えば、筋肉内で高レベルの発現を与えるプロモーターが望ましい場合、筋肉内で高レベルに発現されるmRNAから誘導した本発明のポリヌクレオチドの上流にあるプロモーター配列を発現ベクターに使用することができる。
【０２６９】
類似配列の探索
本発明のポリヌクレオチドを使用して、それに類似した核酸を、本節で記載するハイブリダイゼーションまたは増幅に基づく技術をはじめとする当業者に周知のいずれかの方法を用いて単離および／または精製することができる。これらの方法を用いて、GENSET cDNAが誘導されるmRNAをコードするゲノムDNA、GENSET cDNAに対応するmRNA、またはGENSET cDNAもしくはその断片と相同である核酸（変異体、種相同体またはオルソログなど）が得られる。
【０２７０】
ハイブリダイゼーションに基づく方法
所定のプローブ配列とハイブリダイズするcDNAライブラリー中のcDNAクローンを同定するための技術については、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Sambrookら, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York)ならびにHamesおよびHiggins (1985) Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (HamesおよびHiggins編, IRL Press, Oxford)に開示されている。その技術を用いてゲノムDNAを単離することができる。
【０２７１】
GENSET cDNAまたはその断片由来の少なくとも10個連続したヌクレオチドを含むプローブは放射性同位元素または蛍光分子などの検出可能な標識で標識される。
【０２７２】
プローブを標識するための技術は周知であり、ポリヌクレオチドキナーゼによるリン酸化、ニックトランスレーション法、in vitro転写、および非放射性技術が挙げられる。ライブラリー中のcDNAまたはゲノムDNAをニトロセルロースまたはナイロンフィルターに転写して変性させる。フィルターを、非特異的部位をブロッキングした後、標識したプローブとともに、そのプローブとそれにハイブリダイズし得る配列を含むcDNAまたはゲノムDNAとが結合するのに十分な長さの時間にわたり、インキュベートする。
【０２７３】
検出可能なプローブとハイブリダイズするcDNAまたはゲノムDNAの同定に使用するハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを変えることによって、そのプローブと様々なレベルの同一性を有するcDNAまたはゲノムDNAを以下のように同定し、単離することができる。
【０２７４】
ストリンジェントな条件
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、あるプローブとの高レベルの同一性を有する核酸だけが前記のプローブとハイブリダイズできる条件として定義される。これらの条件は以下のようにして算出することができる。
【０２７５】
14〜70ヌクレオチド長のプローブについては、融解温度(Tm)は、以下の式:
Tm=81.5+16.6(log(Na+))+0.41(G+Cの割合)-(600/N)
(式中、Nはプローブの長さである)
を用いて算出される。
【０２７６】
ハイブリダイゼーションをホルムアミド含有溶液中で実施する場合、融解温度は以下の式:
Tm=81.5+16.6(log(Na+))+0.41(G+Cの割合)-(0.63%ホルムアミド)-(600/N)
(式中、Nはプローブの長さである)
を用いて算出することができる。
【０２７７】
プレハイブリダイゼーションは6X SSC、5X デンハルト試薬、0.5%SDS、100μg変性断片化サケ精子DNAまたは6X SSC、5X デンハルト試薬、0.5%SDS、100μg変性断片化サケ精子DNA、50%ホルムアミド中で実施することができる。SSCおよびデンハルト溶液の調製法についてはSambrookら, 1986に記載されている。
【０２７８】
ハイブリダイゼーションは前掲のプレハイブリダイゼーション溶液に、検出可能なプローブを添加して実施する。プローブが二本鎖DNAを含む場合、ハイブリダイゼーション溶液に添加する前にプローブを変性させる。フィルターを、プローブがそれと相補的なまたはそれと相同な配列を含む核酸とハイブリダイズするのに十分な時間にわたり、ハイブリダイゼーション溶液と接触させる。200ヌクレオチドを超える長さのプローブについては、ハイブリダイゼーションをTmより15〜25℃低い温度で実施することができる。オリゴヌクレオチドプローブなどの比較的短いプローブについては、ハイブリダイゼーションをTmより15〜25℃低い温度で実施することができる。好ましくは、6X SSC中でのハイブリダイゼーションでは、ハイブリダイゼーションを約68℃で実施する。好ましくは、50%ホルムアミド含有溶液中でのハイブリダイゼーションでは、ハイブリダイゼーションを約42℃で実施する。
【０２７９】
ハイブリダイゼーション後に、フィルターを室温で15分間、2X SSC、0.1%SDS中で洗浄する。次いで、このフィルターを室温で30分〜1時間、0.1X SSC、0.5%SDSにより洗浄する。その後、溶液をハイブリダイゼーション温度で、0.1X SSC、0.5%SDS中で洗浄する。室温で、0.1X SSC中で最終洗浄を行う。
【０２８０】
プローブとハイブリダイズした核酸は、オートラジオグラフィーまたはその他の従来の技術により同定する。
【０２８１】
低度および中度の条件
ハイブリダイゼーションおよびシグナル検出のストリンジェンシーの変更は主としてホルムアミド濃度(ホルムアミドのパーセンテージが低いほど低ストリンジェンシーとなる); 塩条件、または温度を操作することによって果たされる。そのため、前記の手順を改変してプローブ配列との同一性レベルが順次低下した核酸を同定することができる。例えば、約1Mのナトリウム濃度を有するハイブリダイゼーションバッファー中でハイブリダイゼーション温度を68℃から42℃まで5℃刻みで下げてもよい。ハイブリダイゼーション後、フィルターをハイブリダイゼーション温度で2X SSC、0.5%SDSにより洗浄してもよい。これらの条件は50℃を超えると「中度」の条件、50℃より低いと「低度」の条件としてみなされる。あるいは、ハイブリダイゼーションをホルムアミドを含有する6X SSCなどのバッファー中、42℃の温度で実施してもよい。この場合、ハイブリダイゼーションバッファー中のホルムアミド濃度を50%から0%まで5%刻みで下げてプローブとの同一性レベルが順次低下したクローンを同定することができる。ハイブリダイゼーション後、フィルターを50℃で6X SSC、0.5%SDSにより洗浄してもよい。これらの条件は、ホルムアミドが25％を上回れば「中度」の条件、ホルムアミドが25％を下回れば「低度」の条件とみなされる。プローブとハイブリダイズしたcDNAまたはゲノムDNAは、オートラジオグラフィーまたはその他の従来の技術により同定する。
【０２８２】
前記の条件の変更は、ハイブリダイゼーション試験においてバックグラウンドの抑制に使用する代替ブロッキング試薬の含有および／または置換によって達成し得ることに留意すべきである。典型的なブロッキング試薬としては、デンハルト試薬、BLOTTO、ヘパリン、変性サケ精子DNA、および商業的に入手可能な専売製品が挙げられる。特定のブロッキング試薬を含めるには、適合性の問題により前記のハイブリダイゼーション条件の改変が必要となる。
【０２８３】
よって、本発明は、本発明のポリヌクレオチドに類似した核酸を単離する方法を包含し、該方法は、
a)cDNAまたはゲノムDNA分子のコレクションと、本発明のポリヌクレオチドの少なくとも12、15、18、20、23、25、28、30、35、40または50個連続したヌクレオチドを含んでなる検出可能なプローブとを、そのプローブが前記コレクション中の少なくとも1つのcDNAまたはゲノムDNA分子とハイブリダイズし得る中度または低度のストリンジェントな条件下で接触させ、
b)前記の検出可能なプローブとハイブリダイズした前記cDNAまたはゲノムDNA分子を同定し、さらに
c)前記のプローブとハイブリダイズした前記cDNAまたはゲノムDNA分子を単離する、
ステップを含んでなる。
【０２８４】
PCRに基づく方法
前記の方法に加えて、本発明のGENSET cDNAまたはその断片を用いて相同なcDNAを取得するためのその他のプロトコールが利用可能であり、以下のパラグラフで概略を示す。
【０２８５】
cDNAはポリA選択法または当業者に公知のその他の技術を利用したmRNA調製法を用いて目的の組織、細胞、または生物体からmRNAを得ることにより作製することができる。mRNAのポリAテイルとハイブリダイズし得る第1のプライマーがmRNAとハイブリダイズし、逆転写反応が行われて第1のcDNA鎖が生成する。
【０２８６】
「mRNAのポリAテイルとハイブリダイズし得る」とは、チミジン残基のストレッチを含む全てのプライマー、すなわち、真核生物のポリ(A)+ mRNAの3'末端とハイブリダイズして第1のcDNA鎖の合成をプライミングするオリゴ(dT)プライマーを指し、それらを包含する。オリゴ(dT)プライマーを作製し、さらにそれらをmRNAとハイブリダイズさせて、続いて第1のcDNA鎖を作製するために前記のハイブリダイズしたmRNAの逆転写をプライミングするための技術は当業者には周知のものであり、Current Protocols in Molecular Biology, John WileyおよびSons, Inc. 1997ならびにSambrookら, 1989に記載されている。好ましくは、前記のオリゴ(dT)プライマーを大過剰に存在させて全てのmRNA 3'末端を少なくとも1つのオリゴ(dT)分子とハイブリダイゼーションさせる。プライミングおよび逆転写ステップは好ましくは使用する逆転写酵素のタイプに応じて37℃〜55℃間で行う。mRNAの逆転写をプライミングするための好ましいオリゴ(dT)プライマーはmRNAのポリAテイルと特異的にハイブリダイズするのに十分な長さ、好ましくは12〜18個のチミジン残基長のチミジン残基のストレッチを含むオリゴヌクレオチドである。より好ましくは、かかるオリゴ(T)プライマーはポリ(dT)ストレッチの上流にさらなる配列を含み、それによりcDNAのその後の操作を容易にするために使用することができる所定の配列を、全ての第1cDNA鎖の5'末端へ付加することができる。好ましくは、この付加配列は8〜60残基長である。例えば、cDNAの5'に制限部位を付加することにより、得られたcDNAのサブクローニングが容易になる。あるいは、付加されたそのような5'末端を使用して、目的のcDNAクローンを特異的に増幅するためのPCRのプライマーを設計してもよい。
【０２８７】
次いで、第1のcDNA鎖を第2のプライマーとハイブリダイズさせる。本発明のどのような適切なポリヌクレオチド断片も使用することができる。この第2のプライマーは本発明のポリヌクレオチドの少なくとも10個連続したヌクレオチドを含有する。好ましくは、前記プライマーが本発明のポリヌクレオチドの少なくとも10、12、15、17、18、20、23、25、または28個連続したヌクレオチドを含んでなる。いくつかの実施形態では、前記プライマーが本発明のポリヌクレオチドの30個を超えるヌクレオチドを含んでなる。真の翻訳開始部位を含む完全タンパク質コード配列を含むcDNAを取得したい場合、使用する第2のプライマーは翻訳開始部位の上流の位置に配列を含む。第2のプライマーを伸長させて第1のcDNA鎖に相補的な第2のcDNA鎖を作製する。あるいは、取得しようとするcDNAの両方の末端由来のプライマーを用いて前記のようにRT-PCRを実施してもよい。
【０２８８】
前記の方法を用いて作製された二本鎖cDNAを単離し、クローニングする。cDNAは好適な宿主細胞内で複製し得るプラスミドまたはウイルスベクターなどのベクター中にクローニングすることができる。例えば、宿主細胞は細菌細胞、哺乳類細胞、鳥類細胞、または昆虫細胞でありうる。
【０２８９】
mRNAを単離し、mRNAとハイブリダイズしたプライマーを逆転写して第1のcDNA鎖を作製し、プライマーを伸長させて第1のcDNA鎖と相補的な第2のcDNA鎖を作製し、二本鎖cDNAを単離し、さらに二本鎖cDNAをクローニングする技術は、当業者には周知のものであり、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. 1997ならびにSambrookら, 1989に記載されている。
【０２９０】
よって、本発明はcDNAを作製する方法を包含する。第1の実施形態では、cDNAを作製する方法は、
a)ヒト細胞由来のmRNA分子のコレクションと、配列表のポリヌクレオチド配列と相補的なポリヌクレオチド配列および寄託されたクローンのヒトcDNAクローンインサートと相補的なポリヌクレオチド配列からなる群から選択される配列の少なくとも12、15、18、20、23、25、28、30、35、40、または50個連続したヌクレオチドを含んでなるプライマーとを接触させ、
b)前記のプライマーを前記のコレクション中のmRNAとハイブリダイズさせ、
c)前記のハイブリダイズしたプライマーを逆転写して前記のmRNAから第1のcDNA鎖を作製し、
d)前記の第1のcDNA鎖と相補的な第2のcDNA鎖を作製し、さらに
e)前記の第1のcDNA鎖と前記の第2のcDNA鎖を含んでなる得られたcDNAを単離する、
ステップを含んでなる。
【０２９１】
本発明のもう1つの実施形態は前のパラグラフの方法によって得られる精製cDNAである。この実施形態のある態様では、cDNAがヒトポリペプチドの少なくとも一部をコードする。
【０２９２】
第2の実施形態では、cDNAを作製する方法が、
a)ヒト細胞由来のmRNA分子のコレクションと、前記mRNAのポリAテイルとハイブリダイズし得る第1のプライマーとを接触させ、
b)前記の第1のプライマーを前記のポリAテイルとハイブリダイズさせ、
c)前記のmRNAを逆転写して第1のcDNA鎖を作製し、
d)配列表のポリヌクレオチド配列および寄託されたクローンプールのヒトcDNAクローンインサートのポリヌクレオチド配列からなる群から選択される配列の少なくとも12、15、18、20、23、25、28、30、35、40、または50個連続したヌクレオチドを含んでなる、少なくとも1つのプライマーを用いて、前記の第1のcDNA鎖と相補的な第2のcDNA鎖を作製し、さらに
e)前記の第1のcDNA鎖と前記の第2のcDNA鎖を含んでなる得られたcDNAを単離する、
ステップを含んでなる。
【０２９３】
この方法のもう1つの態様では、第2のcDNA鎖を、
a)前記の第1のcDNA鎖と、配列表のポリヌクレオチド配列および寄託されたクローンプールのヒトcDNAクローンインサートのポリヌクレオチド配列からなる群から選択される配列の少なくとも12、15、18、20、23、25、28、30、35、40、または50個連続したヌクレオチドを含んでなる第2のプライマー、および前記の第1のプライマーの配列内に完全に含まれる配列からなる第3のプライマーとを接触させ、
b)前記の第2および第3のプライマーを用いて第1のポリメラーゼ連鎖反応を行って第1のPCR産物を作製し、
a)前記の第1のPCR産物と、配列表のポリヌクレオチド配列および寄託されたクローンプールのヒトcDNAクローンインサートのポリヌクレオチド配列からなる群から選択される前記配列の少なくとも12、15、18、20、23、25、28、30、35、40、または50個連続したヌクレオチドを含んでなる第4のプライマー、および前記の第3のプライマーの配列内に完全に含まれる配列からなる第5のプライマーとを接触させ、その際、その第4および第5のプライマーが前記の第1のPCR産物内の配列とハイブリダイズし、さらに
d)第2のポリメラーゼ連鎖反応を行うことによって第2のPCR産物を作製する、
ことによって作製する。
【０２９４】
あるいは、前記の第1のcDNA鎖と、配列表および寄託されたクローンプールのヒトcDNAクローンインサートのポリヌクレオチド配列からなる群から選択される配列の少なくとも12、15、18、20、23、25、28、30、35、40、または50個連続したヌクレオチドを含んでなる第2のプライマー、および前記の第1のプライマーの配列内に完全に含まれる配列からなる第3のプライマーとを接触させ、さらに前記の第2および第3のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行って前記の第2のcDNA鎖を作製することによって、第2のcDNA鎖を作製してもよい。
【０２９５】
あるいは、第2のcDNA鎖を、
a)前記の第1のcDNA鎖と、配列表および寄託されたクローンプールのヒトcDNAクローンインサートのポリヌクレオチド配列からなる群から選択される配列の少なくとも12、15、18、20、23、25、28、30、35、40、または50個連続したヌクレオチドを含んでなる第2のプライマーとを接触させ、
b)前記の第2のプライマーを前記の第1のcDNA鎖とハイブリダイズさせ、さらに
c)ハイブリダイズした前記の第2のプライマーを伸長させて前記の第2のcDNA鎖を作製する、
ことによって作製してもよい。
【０２９６】
本発明のもう1つの実施形態は本発明のcDNAの作製方法によって得られる精製cDNAである。この実施形態のある態様では、前記のcDNAがヒトポリペプチドの少なくとも一部をコードする。
【０２９７】
その他のプロトコール
また、相同cDNAを取得するためにその他の手順を用いてもよい。あるアプローチでは、cDNAをmRNAから作製し、以下のように二本鎖ファージミドにクローニングする。次いで、二本鎖ファージミドのcDNAライブラリーを、ファージF1のGene II産物などのエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼでの処理により一本鎖にする(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Changら, (1993) Gene 127:95-8)。既知のGENSET cDNA、ゲノムDNAまたはその断片を含む断片の配列を含んでなるビオチン化オリゴヌクレオチドを一本鎖ファージミドとハイブリダイズさせる。好ましくは、断片が本発明のポリヌクレオチドの少なくとも10、12、15、17、18、20、23、25、または28個連続したヌクレオチドを含んでなる。
【０２９８】
ビオチン化オリゴヌクレオチドとファージミドとのハイブリッドを、ハイブリッドをストレプトアビジンコーティング常磁性ビーズとともにインキュベートし、マグネットでビーズを回収することにより単離する(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Fryら, (1992) Biotechniques 13:124-131)。その後、得られたファージミドをビーズから解離させ、ビオチン化オリゴヌクレオチドの設計に使用するGENSET cDNAまたは断片に特異的なプライマーを用いて二本鎖DNAに変換する。あるいは、Gene Trapper キット(Gibco BRL)などのプロトコール(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる)を使用してもよい。得られた二本鎖DNAを細菌中に形質転換する。GENSET cDNAまたはその断片配列と相同なcDNAを、コロニーPCRまたはコロニーハイブリダイゼーションにより同定する。
【０２９９】
染色体マーカーとして
GENSETポリヌクレオチドは、以下で記述する放射線ハイブリッド(RH)マッピング、PCRに基づくマッピングおよび蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)マッピングをはじめとする当業者に公知の任意の方法または技術を用いて、それらの染色体上の位置にマッピングすることができる。
【０３００】
放射線ハイブリッドマッピング
放射線ハイブリッド(RH)マッピングはヒトゲノムの高解像度マッピングに使用できる体細胞遺伝的アプローチである[全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Benhamら (1989) Genomics 4:509-517およびCoxら, (1990) Science 250:245-250; ならびにSchulerら, (1996) Science 274:540-546参照]。
【０３０１】
PCR技術を用いたcDNAのヒト染色体へのマッピング
PCRに基づく手法を用いてGENSET cDNAおよびゲノムDNAをヒト染色体に割り当てることができる。かかるアプローチでは、イントロンを挟んだ増幅の機会が最小限となるよう、cDNA配列からオリゴヌクレオチドプライマー対を設計する。好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマーは18〜23bpの長さであり、PCR増幅用に設計される。既知の配列からのPCRプライマーの作製については当業者には周知である。PCR技術の概説については、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるErlich (1992)を参照。
【０３０２】
PCRを使用して、所定のヒト染色体セットを含む一連の体細胞ハイブリッド細胞系を、所定のcDNAまたはゲノムDNAの存在についてスクリーニングする。DNAを体細胞ハイブリッドから単離し、GENSET cDNAまたはゲノムDNA由来のプライマー対を用いるPCR反応の開始鋳型として使用する。GENSET cDNAまたはゲノムDNAに対応するヒト遺伝子を含む染色体との体細胞ハイブリッドによってのみ、増幅された断片が得られる。GENSET cDNAまたはゲノムDNAは体細胞ハイブリッドDNA鋳型からのPCR産物の分離パターンの解析により染色体に割り当てられる。増幅断片をもたらす全ての細胞ハイブリッドに存在する単独のヒト染色体が、そのGENSET cDNAまたはゲノムDNAを含む染色体である。体細胞遺伝子マッピング試験の技術およびその結果の解析の概説については、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるLedbetterら, (1990) Genomics 6:475-481を参照。
【０３０３】
蛍光in situハイブリダイゼーションを用いたcDNAの染色体へのマッピング
蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)により、GENSET cDNAまたはゲノムDNAを所定の染色体上の特定の位置にマッピングすることができる。蛍光in situハイブリダイゼーション技術に用いる染色体は、細胞培養物、組織、または全血をはじめとする種々の供給源から取得することができる。
【０３０４】
好ましい実施形態では、GENSET cDNAまたはゲノムDNAの染色体上の局在が、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるCherifら(1990) "Simultaneous Localization of Cosmids and Chromosome R-Banding by Fluorescence Microscopy: Application to Regional Mapping of Human Chromosome 11", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6639-6643に記載のFISHにより決定される。染色体上の位置決定のため、蛍光Rバンドを先に記載されているようにして(Cherifら, 1990, 前掲)取得する。
【０３０５】
染色体マップを構築または拡充するためcDNAの使用
ひと度、当業者に公知のいずれかの技術、特に本明細書に記載のものを用いてGENSET cDNAまたはゲノムDNAを特定の染色体に割り当てたら、それらを利用してそれらが位置付けられる染色体の高解像度マップを構築するまたはサンプル中の染色体を同定することができる。
【０３０６】
染色体マッピングは、前記のように所定の固有の配列を特定の染色体に割り当てることを含む。ひと度、固有の配列を所定の染色体にマッピングすれば、それは同じ染色体上に位置する他の固有の配列と比較して順序付けされる。染色体マッピングへの１つのアプローチでは、GENSET cDNAまたはゲノムDNAを得る起源となる生物の染色体から誘導された数千の長さのインサートを有する一連の酵母人工染色体(YAC)を利用する。このアプローチについては、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるNagarajaら(1997) "X chromosome map at 75-kb STS resolution, revealing extremes of recombination and GC content", Genome Res. 1997 Mar; 7(3):210-22に記載されている。
【０３０７】
遺伝性疾患または薬剤応答性と関連のある遺伝子の同定
この例ではGENSET cDNAまたはゲノムDNAの特定の表現型の特徴との関連付けに有用なアプローチを示す。この例では、特定のGENSET cDNAまたはゲノムDNAを試験プローブとして使用してそのGENSET cDNAまたはゲノムDNAを特定の表現型の特徴と関連付ける。
【０３０８】
GENSET cDNAまたはゲノムDNAを本明細書に記載のものなどの技術または当技術分野で公知のその他の技術を用いてヒト染色体上の特定の位置にマッピングする。「ヒトにおけるメンデル遺伝(Mendelian Inheritance in Man)」(V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man; Johns Hopkins大学Welch医学図書館によってオンラインで提供されている)の検索によりいくつかの既知の遺伝子を含む極めて遺伝子の多い領域とされるGENSET cDNAまたはゲノムDNAを含むヒト染色体の領域や、関連する遺伝子がまだ同定されていないいくつかの疾病または表現型が示される。このように、このGENSET cDNAまたはゲノムDNAに対応する遺伝子はこれらの各遺伝性疾患の当面の候補となる。
【０３０９】
これらの疾病または表現型を有する患者の細胞を単離し、培養により増殖させる。GENSET cDNAまたはゲノムDNA由来のPCRプライマーを使用して患者から得たゲノムDNA、mRNAまたはcDNAをスクリーニングする。患者において増幅されないGENSET cDNAまたはゲノムDNAをさらなる解析により特定の疾病と正に関連付けることができる。また、サンプルが健康な個体由来のものではなく、サンプルが疾患と関連のある表現型を有する個体由来のものである場合、PCR解析によって異なる長さの断片を得ることにより、そのcDNAを含む遺伝子が遺伝性疾患の原因であることが示される。
【０３１０】
組換えベクターにおけるポリヌクレオチドの使用
本発明はまた、本発明の単離されたポリヌクレオチドを含む組換えベクター、および前記ベクターなどの本発明のポリヌクレオチドについて組換えられた宿主細胞、ならびにかかるベクターおよび宿主細胞の作製方法、さらに組換え技術によるGENSETポリペプチドの生産におけるこれらの使用に関する。
【０３１１】
組換えベクター
本明細書において「ベクター」は、二本鎖または一本鎖のいずれかであり、さらに宿主細胞または単細胞もしくは多細胞宿主生物に導入しようとする少なくとも1つの目的ポリヌクレオチドを含んでなる環状もしくは直鎖DNAまたはRNA分子のいずれかを称するのに使用される。本発明はGENSETゲノム配列またはcDNA配列のいずれかから誘導される調節ポリヌクレオチドおよび／またはコーディングポリヌクレオチドを含む組換えベクターのファミリーを包含する。一般に、本発明の組換えベクターは調節配列、コード配列およびポリヌクレオチド構築物をはじめとする本明細書に記載のいずれかのポリヌクレオチド、ならびに本明細書で定義したいずれかのGENSETプライマーまたはプローブを含んでなり得る。
【０３１２】
第1の好ましい実施形態では、本発明の組換えベクターを使用して、GENSETゲノム配列またはGENSET cDNA、例えば、配列表のポリヌクレオチド配列、寄託されたクローンプールのヒトcDNAクローンインサートの配列、その変異体および断片からなる群から選択されるいずれかのcDNAから誘導された、挿入されたポリヌクレオチドを、好適な宿主細胞で増幅させる。このポリヌクレオチドは組換えベクターの複製が起こるたびに増幅される。
【０３１３】
本発明の組換えベクターの第2の好ましい実施形態は本発明の調節ポリヌクレオチドまたはコーディング核酸のいずれか、もしくはその両方を含む発現ベクターを含んでなる。特定の実施形態では、発現ベクターを使用してGENSETポリペプチドを発現させるが、次いでそれを精製して、例えば、リガンドスクリーニングアッセイにまたはGENSETタンパク質に対する特異的抗体を産生させる免疫原として使用することができる。その他の実施形態では、発現ベクターがトランスジェニック動物の構築に、さらには遺伝子治療にも使用される。発現には目的の遺伝子の宿主細胞内での発現を駆動するウイルスおよび哺乳類両起源由来のエンハンサー／プロモーターなどの種々の調節エレメントを含む好適なシグナルがベクター中に提供されることが必要である。産物を発現させる永続的な安定した細胞クローンを確立するための優性薬剤選択マーカーが、それらは薬剤選択マーカーの発現をポリペプチドの発現と結びつけるエレメントであることから、一般に本発明の発現ベクターに含められる。
【０３１４】
より詳しくは、本発明はGENSETタンパク質、好ましくは配列表のポリペプチド配列、寄託されたクローンプールのヒトcDNAクローンインサートによってコードされるポリペプチド配列、その変異体および断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するGENSETタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターに関する。本発明のポリヌクレオチドを使用して宿主生物内でコードされるタンパク質を発現させ、有益な効果をもたらすことができる。かかる方法では、コードされるタンパク質が宿主生物内で一時的に発現されるか、または宿主生物内で安定して発現され得る。コードされるタンパク質は本明細書に記載の活性のいずれかを有し得る。コードされるタンパク質は宿主生物がもたないタンパク質であるか、あるいはコードされるタンパク質が宿主生物内でのそのタンパク質の存在レベルを高めるものであると考えられる。
【０３１５】
本発明のベクター中に存在させることができるいくつかのエレメントについては以下の節でさらに詳細に記載する。
【０３１６】
本発明の発現ベクターの一般的特徴
本発明の組換えベクターとしては、限定されるものではないが、YAC(酵母人工染色体)、BAC(細菌人工染色体)、ファージ、ファージミド、コスミド、プラスミドまたは染色体、非染色体、半合成および合成DNAを含む直鎖DNA分子が挙げられる。かかる組換えベクターは以下の構成要素を含んでなる転写単位を含み得る:
(1)遺伝子発現において調節的役割を有する１以上の遺伝的エレメント、例えば、プロモーターまたはエンハンサー。エンハンサーは、一般に、約10〜300bpの長さであり、プロモーターに作用して転写を増強する、DNAのシス作用性エレメントである。
(2)mRNAに転写されて最終的にポリペプチドに翻訳される、(1)に記載の調節エレメントに機能し得る形で連結された構造配列またはコード配列; ならびに
(3)好適な転写開始配列および終結配列。酵母または真核生物発現系にて使用することが意図される構造単位は、宿主細胞により翻訳されたタンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含む。また、組換えタンパク質がリーダーまたは輸送配列がなくとも発現される場合には、それがN末端残基を含んでいてもよい。後に、発現された組換えタンパク質からこの残基が切除されてもまたはされなくても最終産物は得られる。
【０３１７】
一般に、組換え発現ベクターは、複製起点、宿主細胞の形質転換をもたらす選択マーカー、および下流にある構造配列の転写を指令する高発現遺伝子から誘導されたプロモーターを含む。異種構造配列は好適な時期に、翻訳開始配列および終結配列、ならびに好ましくは翻訳されたタンパク質の細胞膜周辺腔または細胞外媒質への分泌を指令し得るリーダー配列とともに、構築される。哺乳類宿主細胞内での所望の配列のトランスフェクトおよび発現用にベクターを適合させる特定の実施形態では、好ましいベクターは、所望の宿主における複製起点、好適なプロモーターおよびエンハンサー、さらにいずれかの必須リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、スプライスドナーおよびアセプター部位、転写終結配列、ならびに5'-フランキング非転写配列を含むであろう。SV40ウイルスゲノム由来のDNA配列、例えば、SV40起点、初期プロモーター、エンハンサー、スプライスシグナルおよびポリアデニル化シグナルを使用して必要な非転写遺伝的エレメントを提供してもよい。
【０３１８】
本発明のGENSETポリペプチドのin vivo発現は、GENSETポリペプチド発現のレベルを高めることにより治療または予防できる疾病または疾病状態の治療または予防のための宿主生物内での生来の遺伝子の発現に関連するか、または生物学的に不活性なGENSETタンパク質の生産に関連する遺伝的欠損を是正するのに、有用と考えられる。よって、本発明はまた、治療しようとする生物または患者中に好適な遺伝物質を導入することによって本発明のGENSETポリペプチドをin vivo生産するよう主として設計された組換え発現ベクターを含む。この遺伝物質は予め生物から抽出したものであり、それを細胞にin vitroにおいて導入し、その改変された細胞を続いて前記の生物へと、好適な組織へとin vivoにおいて直接再導入することができる。
【０３１９】
調節エレメント
本発明の発現ベクターに使用する好適なプロモーター領域は、その内部で異種遺伝子を発現すべき宿主細胞を考慮して選択される。
【０３２０】
好適なプロモーターは、それがその発現を制御する核酸に対して異種性であってもよいし、あるいは発現させるべきコード配列を含む天然ポリヌクレオチドに対して内在性であってもよい。さらに、プロモーターは、構築プロモーター／コード配列が挿入される組換えベクター配列に対して一般的には異種性である。プロモーター領域は、例えば、CAT(クロラムフェニコールトランスフェラーゼ)ベクター、より好ましくはpKK232-8およびpCM7ベクターを用いて、任意の所望の遺伝子から選択できる。
好ましい細菌プロモーターとしては、LacI、LacZ、T3もしくはT7バクテリオファージRNAポリメラーゼプロモーター、gpt、ラムダPR、PLおよびtrpプロモーター(EP 0036776)、ポリヘドリンプロモーター、またはバキュロウイルス由来のp10タンパク質プロモーター(Kit Novagen)、[全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Smithら, (1983) Mol. Cell. Biol. 3:2156-2165; O’Reillyら, (1992) "Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual", W.H. Freeman and Co., New York]、ラムダPRプロモーター、または、さらにtrcプロモーターがある。
【０３２１】
真核生物プロモーターとしては、CMV前初期、HSVチミジンキナーゼ、初期および後期SV40、レトロウイルス由来のLTR、およびマウスメタロチオネイン-Lが挙げられる。好適なベクターおよびプロモーターの選択は当技術分野の技量レベルの範囲内に十分に入る。プロモーターの選択は遺伝子操作分野の専門家の技量の範囲内に十分に入る。
【０３２２】
その他の調節エレメント
cDNAインサートを使用する場合、典型的には、遺伝子転写物の正確なポリアデニル化をもたらすポリアデニル化シグナルを含めることが望ましい。発現カセットのエレメントとしてターミネーターもまた含める。これらのエレメントはメッセージレベルを高め、さらに当該カセットからその他の配列内への読み通し(read through)を最小限にするのに有用であり得る。
【０３２３】
選択マーカー
選択マーカーは細胞に識別可能な変化を与え、それにより発現構築物を含む細胞の同定を容易にする。形質転換された宿主細胞の選択のための選択マーカー遺伝子は、好ましくは、真核細胞培養物についてはジヒドロ葉酸レダクターゼ耐性もしくはネオマイシン耐性、S.セレビシエ(S. cerevisiae)についてはTRP1、または大腸菌(E. coli)についてはテトラサイクリン、リファンピシンもしくはアンピシリン耐性、あるいはマイコバクテリアについてはレバンサッカラーゼである。この後者のマーカーは負の選択マーカーである。
【０３２４】
好ましいベクター
細菌ベクター
限定されるものではないが、典型的な例として、細菌での使用に有用な発現ベクターは、選択マーカーとpBR322(ATCC 37017)の遺伝的エレメントを含んでなる商業的に入手可能なプラスミドから誘導された細菌複製起点を含み得る。かかる市販のベクターとしては、例えば、pKK223-3(Pharmacia, Uppsala, Sweden)、およびpGEM1(Promega Biotec, Madison, WI, USA)が挙げられる。当業者であればその他の多くの好適なベクターを知っており、以下の細菌ベクター: pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pbs、pD10、phagescript、psiX174、pbluescript SK、pbsks、pNH8A、pNH16A、pNH18A、pNH46A(Stratagene); ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia); pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene); pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia); pQE-30(QIAexpress)などが商業的に入手可能である。
【０３２５】
バクテリオファージベクター
P1バクテリオファージベクターは約80〜約100kbに及ぶ大きなインサートを含めることができる。p158またはp158/neo8などのP1バクテリオファージベクターの構築については特に、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるSternberg (1992) Trends Genet. 8:1-16、およびSternberg (1994) Mamm. Genome. 5:397-404に記載されている。GENSETヌクレオチド配列を含んでなる組換えP1クローンは、40kbを超える大きなポリヌクレオチドの挿入を目的として設計され得る[Lintonら, (1993) J. Clin. Invest. 92:3029-3037を参照; その全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる]。トランスジェニック試験用のP1 DNAを作製するために好ましいプロトコールは、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるMcCormickら(1994) Genet. Anal. Tech. Appl. 11:158-164に記載のプロトコールである。簡潔に説明すると、P1プラスミドを保持する大腸菌(好ましくはNS3529株)を25μg/mlのカナマイシンを含有する好適なブロス培地で一晩増殖させる。Qiagen Plasmid Maxiキット(Qiagen, Chatsworth, CA, USA)を用いて製造業者の説明書に従ってP1 DNAを大腸菌からアルカリ溶解により調製する。キットに含まれる洗浄および溶出バッファーを用いて2本のQiagen-tip 500カラムで細菌溶解液からP1 DNAを精製する。次いで、フェノール／クロロホルム抽出を行い、その後、70%エタノールを用いてDNAを沈降させる。TE(10mM Tris-HCl、pH7.4、1mM EDTA)中にDNAを溶解した後、DNA濃度を分光測光法により評価する。
【０３２６】
トランスジェニック動物、典型的にはトランスジェニックマウスにおいてGENSETポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるP1クローンを発現させることを目的とする場合は、例えば、P1 DNAをP1ポリリンカー内のレアカット部位(SfiI、NotIまたはSalI)で切断することにより、P1 DNA断片からベクター配列を除去することが望ましい。次いで、YACからのDNAの単離に関して最初に報告されたもの[例えば、Schedlら, (1993a) Nature, 362:258-261; Petersonら, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:7593-7597を参照; 全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる]と同様の方法を用いてパルスフィールドアガロースゲル上でベクター配列からP1インサートを精製する。この段階において、必要であれば、得られた精製インサートDNAを、Milliporeウルトラフリー-MCフィルターユニット(Millipore, Bedford, MA, USA-30,000分子量限界)で濃縮した後に、100mM NaCl、30μMスペルミン、70μMスペルミジンを含有するマイクロインジェクションバッファー(10mM Tris-HCl、pH7.4; 250μM EDTA)に対して微小透析膜(タイプ VS、0.025μM Millipore製)により透析することができる。精製されたP1 DNAインサートの完全性を1%アガロース(Sea Kem GTG; FMC Bio-products)パルスフィールドゲルでの電気泳動および臭化エチジウム染色により評価する。
【０３２７】
ウイルスベクター
ある特定の実施形態では、ベクターをアデノウイルスから誘導する。本発明の好ましいアデノウイルスベクターは、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、FeldmanおよびSteg (1996) Medecine/Scirnces, 12:47-55、またはOhnoら, (1994) Science, 265:781-784に記載のものである。本発明のこの特定の実施形態のもう1つの好ましい組換えアデノウイルスは、ヒトアデノウイルス2型または5型(Ad 2もしくはAd 5)あるいは動物起源のアデノウイルス(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる仏国特許出願第FR-93.05954号)である。さらに、アデノ随伴ウイルスベクターも本発明に含まれる。
【０３２８】
レトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターは一般に、外因性ポリヌクレオチドの、特にヒトをはじめとする哺乳類へのin vivo導入用に選択される組換え遺伝子送達系であると考えられている。これらのベクターによって細胞への効率的な遺伝子送達がもたらされ、導入された核酸は宿主の染色体DNAに安定して組み込まれる。本発明のレトロウイルス系in vitroまたはin vitro遺伝子送達運搬体の作製または構築用に特に好ましいレトロウイルスとしては、ミンク細胞フォーカス誘導ウイルス、マウス肉腫ウイルス、細網内皮症ウイルスおよびラウス肉腫ウイルスからなる群から選択されるレトロウイルスが挙げられる。特に好ましいマウス白血病ウイルスとしては、4070Aおよび1504Aウイルス、Abelson(ATCC番号VR-999)、Friend (ATCC番号VR-245)、Gross(ATCC番号VR-590)、Rauscher(ATCC番号VR-998)ならびにモロニーマウス白血病ウイルス(ATCC番号VR-190; PCT出願番号WO94/24298)が挙げられる。特に好ましいラウス肉腫ウイルスとしては、Bryan high titer(ATCC番号VR-334、VR-657、VR-726、VR-659およびVR-728)が挙げられる。その他の好ましいレトロウイルスベクターには、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Rothら(1996) Nature Medicine, 2(9):985-991、PCT出願番号WO93/25234、同WO94/06920、Rouxら, (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:9079-9083、Julanら, (1992), J. Gen. Virol. 73:3251-3255、ならびにNedaら, (1991), J. Biol. CHem. 266:14143-14146に記載のものがある。
【０３２９】
BACベクター
ゲノムDNAの大きな断片(100〜300kb)を大腸菌内に安定して維持するために、細菌人工染色体(BAC)クローニング系[Shizuyaら, (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:8794-8797; 全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる]を作製した。好ましいBACベクターには、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるKimら(1996), Genomics 34:213-218に記載されたpBeloBAC11ベクターが含まれる。このベクターを使用し、ベクター内のBamHIまたはHindIII部位のいずれかへの連結を可能にする酵素を用いて部分的に消化したサイズ選別ゲノムDNAを用いてBACライブラリーを作製する。これらのクローニング部位には、RNA転写またはPCR法のいずれかによって末端プローブを作製するのに使用できるT7およびSP6 RNAポリメラーゼ転写開始部位がフランキングする。大腸菌におけるBACライブラリーを構築した後、BAC DNAをスーパーコイル環状DNAとして宿主細胞から精製する。サイズ決定およびBACのレシピエント細胞への導入はいずれもこれらの環状分子を直鎖形態へと変換した後に行う。クローニング部位には2つのNotI部位がフランキングしており、クローニングしたセグメントをNotI消化によってベクターから切り出すことができる。また、pBeloBAC11ベクター内に含まれるDNAインサートは、唯一のcosN部位での切断を誘導する商業的に入手可能な酵素λ-ターミナーゼによってBACベクターを処理することにより直鎖状にしてもよいが、この切断法では結果としてインサートDNAおよびBAC配列の両方を含む全長BACクローンが生じる。
【０３３０】
バキュロウイルス
もう1つの特定の好適な宿主ベクター系はスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)から誘導されるSF9細胞系(ATCC番号CRL 1711)をトランスフェクトするのに使用するpVL1392/1393バキュロウイルス導入ベクター(Pharmingen)である。本発明のGENSETポリペプチドをバキュロウイルス発現系において発現させるためのその他の好適なベクターとしては、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Chaiら, (1993), Biotechnol. Appl. Biochem. 18:259-273、Vlasakら, (1983), Eur. J. Biochem. 135:123-126、およびLenhardら, (1996), Gene. 169:187-190に記載のものが挙げられる。
【０３３１】
組換えベクターの送達
本発明のポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド構築物の発現を達成するためには構築物を細胞内に送達させる必要がある。この送達は、細胞系を形質転換するための実験手順などにおけるin vitroで、または特定の病状の治療などにおけるin vivoもしくはex vivoで達成されうる。
【０３３２】
1つのメカニズムは、発現構築物が感染性ウイルス粒子内に封入されるウイルス感染である。発現構築物、好ましくは本明細書に記載の組換えウイルスベクターを、エレクトロポレーション、リポソーム、CaPO4沈降などの当技術分野で公知の手段によりパッケージング細胞に形質導入する。このパッケージング細胞が本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む感染性ウイルス粒子を生成する。次に、そのようなウイルス粒子を用いて、in vitro、ex vivoまたはin vivoで真核細胞に形質導入する。形質導入された真核細胞は本発明のポリペプチドを発現するだろう。好ましくは、本発明で用いるウイルスを１個以上の次の遺伝子の全部または一部を欠失させることで複製欠損にする：E1a、E1b、E3、E4、E2a、またはL1〜L5（全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,228,844号）。ウイルスの送達は本明細書中で詳述される（全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,968,821号も参照されたい）。
【０３３３】
レトロウイルスベクターとアデノ随伴ウイルスベクターは、外因性遺伝子をin vivoで、特にヒトに導入するのに好適な組換え遺伝子送達系である、と一般に理解されている。これらのベクターは細胞への効率のよい遺伝子送達を提供し、導入された核酸が宿主の染色体DNAに安定して組み込まれる。レトロウイルスの使用に伴う主な必要条件は、その使用上の安全性（特に、細胞集団中の野生型ウイルスの広がりの可能性に関して）を確保することである。複製欠損レトロウイルスのみを産生する特殊化された細胞系（「パッケージング細胞」と呼ばれる）の開発により、遺伝子治療でのレトロウイルスの有用性が増しており、欠損レトロウイルスは遺伝子治療を目的とした遺伝子導入での使用のために十分に特徴づけられている(Miller, A.D. (1990) Blood 76:271参照)。こうして、レトロウイルスのコード配列(gag、pol、env)がCCRタンパク質の一つをコードする核酸（レトロウイルスを複製欠損にする）で置換されている組換えレトロウイルスを構築することができる。その後、複製欠損レトロウイルスはビリオンへとパッケージングされ、このようなビリオンを用いると、ヘルパーウイルスの使用により標準的な技法で標的細胞に感染させることができる。
【０３３４】
組換えレトロウイルスを作製し、そのようなウイルスをin vitroまたはin vivoで細胞に感染させるためのプロトコルは、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M.ら(編) Greene Publishing Associates, (1989), Sections 9.10-9.14 および他の標準的な実験室マニュアルに見出せる。適当なレトロウイルスの例としては、pLJ、pZIP、pWEおよびpEMが挙げられるが、これらは当業者に公知である。同種指向性および両種指向性の両レトロウイルス系を作製するのに好適なパッケージングウイルス系統の例としては、ψCrip、ψCre、ψ2およびψAmが挙げられる。レトロウイルスは多種多様な細胞型（例えば、神経細胞、上皮細胞、内皮細胞、リンパ球、筋芽細胞、肝細胞、骨髄細胞など）に種々の遺伝子をin vitroおよび／またはin vivoで導入するために使用されている (例えば、Eglitisら (1985) Science 230:1395-1398; DanosおよびMulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6460-6464; Wilsonら (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3014-3018; Armentanoら (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6141-6145; Huberら (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8039-8043; Ferryら (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8377-8381; Chowdhuryら (1991) Science 254:1802-1805; van Beusechemら (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7640-7644; Kayら (1992) Human Gene Therapy 3:641-647; Daiら (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10892-10895; Hwuら (1993) J. Immunol. 150:4104-4115; 米国特許第4,868,116号; 同第4,980,286号; PCT出願WO 89/07136; PCT出願WO 89/02468; PCT出願WO 89/05345; およびPCT出願WO 92/07573を参照されたい)。
【０３３５】
さらに、ウイルス粒子の表面上のウイルスパッケージングタンパク質を改変することによって、レトロウイルス、ひいてはレトロウイルス系ベクターの感染スペクトルを制限することが可能である、こともわかっている(例えば、PCT公開WO93/25234、WO94/06920、およびWO94/11524を参照されたい)。例えば、レトロウイルスベクターの感染スペクトルを改変するためのストラテジーは、細胞表面抗原に特異的な抗体をウイルスenvタンパク質に結合させること(Rouxら (1989) PNAS 86:9079-9083; Julanら (1992) J. Gen Virol 73:3251-3255; およびGoudら (1983) Virology 163:251-254); または、細胞表面リガンドをウイルスenvタンパク質に結合させること(Nedaら (1991) J Biol Chem 266:14143-14146)を含む。上記結合はタンパク質または他の変種（例えば、envタンパク質をアシアロ糖タンパク質に変換するラクトース）との化学的架橋の形態をとってもよいし、融合タンパク質（例えば、一本鎖抗体／env融合タンパク質）を生成させることによるものであってもよい。この技法は、感染を特定の組織型に制限したり他の方法で指令するために有用であるが、同種指向性ベクターを両種指向性ベクターに変換するにも使用することができる。
【０３３６】
さらに、レトロウイルス遺伝子送達の使用は、目的遺伝子の発現を制御する組織または細胞特異的な転写調節配列を使用することで、さらに高めることができる。
【０３３７】
本発明において有用な別のウイルス遺伝子送達系は、アデノウイルス由来のベクターを利用するものである。アデノウイルスのゲノムを操作して、それが目的の遺伝子産物をコードするが、通常の溶解ウイルス生活環におけるその複製能に関して不活性化されるようにすることができる(例えば、Berknerら (1988) BioTechniques 6:616; Rosenfeldら (1991) Science 252:431-434; およびRosenfeldら (1992) Cell 68:143-155を参照されたい)。アデノウイルス株Ad 5型 dl324または他のアデノウイルス株（例えば、Ad2、Ad3、Ad7など）から誘導される適当なアデノウイルスベクターは当業者に周知である。組換えアデノウイルスは、分裂していない細胞には感染しないという点で特定の状況において有利なことがあり、気道上皮(Rosenfeldら (1992) 前掲)、内皮細胞(Lemarchandら(1992) Proc. Natl. Sci. USA 89:6482-6486)、肝細胞(HerzおよびGerard (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2812-2816)、ならびに筋細胞(Quantinら (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2581-2584)を含めて、さまざまな細胞型に感染させるために使用することができる。さらに、ウイルス粒子は比較的安定していて、精製や濃縮が容易であり、上記のように感染スペクトルに影響を及ぼすように改変することが可能である。加えて、導入されたアデノウイルスのポリヌクレオチド（およびそこに含まれる外来ポリヌクレオチド）は宿主細胞のゲノムに組み込まれないで、エピソームのままであり、これにより、導入されたDNAが宿主ゲノムに組み込まれる場合（例えば、レトロウイルスDNAの場合）に挿入突然変異誘発の結果として起こり得る問題が回避される。さらに、アデノウイルスゲノムが外来DNAを保持できる能力は、他の遺伝子送達ベクターと比べて大きい（最大8キロベースまで）(Haj-AhmandおよびGraham (1986) J. Virol. 57:267)。現在使用されており、したがって本発明において有利に使用される大部分の複製欠損アデノウイルスベクターは、ウイルスのE1およびE3遺伝子の全部または一部を欠失させてあるが、アデノウイルスの遺伝物質を80％も保持している(例えば、Jonesら (1979) Cell 16:683; Berknerら, 前掲; およびGrahamら, Methods in Molecular Biology, E.J. Murray編 (Humana, Clifton, N.J., 1991) vol. 7. pp.109-127を参照されたい)。所望のポリヌクレオチドの発現は、例えば、E1Aプロモーター、主要後期プロモーター(MLP)および関連するリーダー配列、E3プロモーター、または外因的に付加されたプロモーター配列の制御下であり得る。
【０３３８】
ポリヌクレオチドの送達に有用なさらに別のウイルスベクター系は、アデノ随伴ウイルス(AAV)である。アデノ随伴ウイルスは天然に存在する欠損ウイルスであり、効率のよい複製および増殖性の生活環のためには、ヘルパーウイルスとしてアデノウイルスやヘルペスウイルスのような別のウイルスを必要とする (Muzyczkaら, Curr. Topics in Micro. and Immunol. (1992) 158:97-129を参照されたい)。このウイルスはまた、その核酸を非分裂細胞に組み込むことができる少数のウイルスのうちの一つであり、高頻度の安定した組み込みを示す (例えば、Flotteら, (1992) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 7:349-356; Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349-356; Samulskiら (1989) J. Virol. 63:3822-3828; およびMcLaughlinら (1989) J. Virol. 62:1963-1973を参照されたい)。300塩基対ほどの小さいAAVを含むベクターはパッケージングと組み込みが可能である。外因性DNAのためのスペースは約4.5 kbに限られる。Tratschinら (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260に記載されるようなAAVベクターを用いてDNAを細胞に導入することができる。AAVベクターを用いて、さまざまな核酸がいろいろな細胞型に導入されている (例えば、Hermonatら (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470; Tratschinら (1985) Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081; Wondisfordら (1988) Mol. Endocrinol. 2:32-39; Tratschinら (1984) J. Virol. 51:611-619; およびFlotteら (1993) J. Biol. Chem. 268:3781-3790を参照されたい)。
【０３３９】
遺伝子治療に応用できるその他のウイルスベクターは、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、および数種のRNAウイルスから誘導されている。特に、ヘルペスウイルスベクターは、中枢神経系および眼組織の細胞に挿入された遺伝子の発現を持続させるための独特なストラテジーを提供しうる (Peposeら (1994) Invest Ophthalmol Vis Sci 35:2662-2666)。
【０３４０】
ポリヌクレオチドを哺乳類培養細胞内へ導入するためのいくつかの非ウイルス的な方法もまた本発明に含まれ、限定されるものではないが、リン酸カルシウム沈降[Grahamら,  (1973) Virol. 52:456-457; Chenら (1987) Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752]; DEAE-デキストラン[Gopal (1985) Mol. Cell. Biol., 5:1188-1190]; エレクトロポレーション[Tur-Kaspaoら (1986) Mol. Cell. Biol. 6:716-718; Potterら, (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81(22):7161-7165];直接マイクロインジェクション(Harlandら, (1985) J. Cell. Biol. 101:1094-1095);DNAローディングリポソーム[Nicolauら, (1982) Biochim. Biophys. Acta. 721:185-190; Fraleyら, (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76:3348-3352];および受容体媒介性トランスフェクション[Wu & Wu (1987), J. Biol. Chem. 262:4429-4432; およびWu & Wu (1988), Biochemistry 27:887-892](なお、それらの全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる)が挙げられる。これらの技術のいくつかは、本明細書で述べるようにin vivoまたはex vivo使用にうまく適合すると考えられる。
【０３４１】
ひと度、発現ポリヌクレオチドを細胞に送達させれば、それはレシピエント細胞のゲノム内に安定して組み込まれ得る。この組み込みは、相同組換えによって対応する(cognate)位置および方向でなされ得る(遺伝子置換)か、またはランダムな、特定されない位置に組み込まれ得る(遺伝子増強)。さらなる実施形態では、核酸がDNAの独立したエピソームセグメントとして細胞内に安定して維持され得る。かかる核酸セグメントまたは「エピソーム」は宿主細胞周期とは無関係に、またはそれと同期して維持および複製させるのに十分な配列をコードする。
【０３４２】
タンパク質またはペプチドをin vivoにおいて脊椎動物の細胞内部に送達させる方法に関するある特定の実施形態は、生理学上許容される担体および目的のポリペプチドを機能し得る形でコードする裸のポリヌクレオチドを含んでなる調製物を、細胞を含む組織の間質空間に導入するステップを含んでなり、それによって裸のポリヌクレオチドが細胞内部に取り込まれて生理学的作用を示すこととなる。これはin vitro導入に特に好適であるが、in vivoにおいても適合するであろう。
【０３４３】
in vitroおよびin vivoにおいて使用する「裸の」ポリヌクレオチドを含んでなる組成物は、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるPCT出願WO90/11092(Vical Inc.)、さらにPCT出願WO95/11307(Institut Pasteur, INSERM, Universite d’Ottawa)、ならびにTasconら(1996), Nature Medicine, 2(8):888-892およびHuygenら(1996), Nature Medicine, 2(8):893-898の論文に記載されている。
【０３４４】
本発明のさらにもう1つの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド構築物を含む本発明の裸のポリヌクレオチドの細胞内への導入を、例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるKleinら(1987) Nature 327:70-73に記載のように、粒子衝撃法(遺伝子銃)によって達成してもよく、ここでその粒子は高速度に加速されるDNAコーティングした微小弾(microprojectile)であり、これらは細胞膜を貫通して、細胞を死滅させることなく細胞に侵入することができる。本発明で用いるリポソーム調製物には、カチオン性（正に荷電）、アニオン性（負に荷電）および中性調製物が含まれる。しかしながら、カチオン性リポソームは、そのカチオン性リポソームとポリアニオン性核酸との間で密着した電荷複合体が形成されるので、特に好ましいものである。カチオン性リポソームは、機能的な形でのプラスミドDNA (Felgnerら, Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1987) 84:7413-7416, 全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる); mRNA (Maloneら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86:6077-6081, 全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる); および精製された転写因子 (Debsら, J. Biol. Chem. (1990) 265:10189-10192, 全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる)の細胞内送達を媒介することが示されている。
【０３４５】
カチオン性リポソームは容易に入手することができる。例えば、N[1-2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリエチルアンモニウム(DOTMA)リポソームは特に有用であり、GIBCO BRL (Grand Island, N.Y.)からリポフェクチン(Lipofectin)という商標名で入手可能である（さらに、Feignerら, Proc. Nad Acad. Sci. USA (1987) 84:7413-7416を参照されたい)。その他の市販リポソームとしては、transfectace (DDAB/DOPE)およびDOTAP/DOPE (Boehringer)がある。
【０３４６】
同様に、アニオン性および中性リポソームも、例えば、AvantiPolar Lipids (Birmingham, Ala.)から容易に入手することができ、また、簡単に手に入る材料から容易に調製することができる。そのような材料として、とりわけ、ホスファチジルコリン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)、ジオレオイルホスファチジルグリセロール(DOPG)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)が挙げられる。これらの材料は適切な比率でDOTMAおよびDOTAP出発材料と混合してもよい。これらの材料を用いてリポソームを製造する方法は当技術分野で周知である。
【０３４７】
例えば、市販のジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)、ジオレオイルホスファチジルグリセロール(DOPG)、およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)をいろいろな組合せで用いて慣用のリポソーム（コレステロールの添加あり、または添加なし）を製造することができる。リポソームには多重膜リポソーム(MLV)、小さな単膜リポソーム(SUV)、または大きな単膜リポソーム(LUV)が含まれるが、そのうちSUVが好適である。種々のリポソーム-核酸複合体は当技術分野で公知の方法を使って(Straubingerら, Methods of Immunology (1983), 101:512-527, 全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる)製造される。例えば、核酸を含むMLVを製造するには、ガラスチューブの壁面にリン脂質の薄膜を付着させ、続いて、封入すべき物質の溶液で水和させる(米国特許第5,965,421号、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる)。一般的には、DNAとリポソームの比を約10：1から約1：10の範囲とする。好ましくは、この比は約5：1から約1：5の範囲である。より好ましくは、この比は約3：1から約1：3の範囲である。より一層好ましくは、この比は約1：1である。さらに、リポソームは、その脂質外皮にターゲッティング成分（例えば、受容体-受容体リガンド対のメンバー）を埋め込むことにより、特定の細胞型に標的化することができる。有用なターゲッティング成分は細胞表面リガンド（例えば、CD48またはマスト細胞上のSCF受容体）と特異的に結合するものである。こうして、マスト細胞への有用なターゲッティング成分の例としては、抗CD48抗体またはSCFリガンドがある(米国特許第6177433号、米国特許第6110490号、およびP.C.T番号WO9704748、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる)。
【０３４８】
さらなる実施形態において、本発明のポリヌクレオチドはリポソーム内に捕捉され得る[全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、GhoshおよびBacchawat, (1991), Targeting of liposomes to hepatocytes, IN: Liver Diseases, Targeted diagnosis and therapy using specific rceptors and ligands. Eds., Marcel Dekeker, New York, pp. 87-104; Wongら (1980), Gene. 10:87-94; Nicolauら (1987), Meth. Enzymol., 149:157-76]。
【０３４９】
ある特定の実施形態では、本発明は本明細書に記載のGENSETポリペプチドをin vivo生産するための組成物を提供する。それは、該ポリペプチドを機能し得る形でコードする裸のポリヌクレオチドを、生理学上許容される担体中に溶解状態で含み、組織の細胞に前記タンパク質またはポリペプチドの発現を引き起こさせるために組織内へ導入する上で好適である。
【０３５０】
所望の宿主生物に注入すべきベクターの量は注入部位によって異なる。指標となる量としては、動物、好ましくは哺乳動物、例えばマウスの体内に0.1〜100μgのベクターを注入する。
【０３５１】
本発明のベクターのもう1つの実施形態では、それを、宿主細胞、好ましくは治療すべき動物から予め採取した宿主細胞、より好ましくは筋肉細胞などの体細胞にin vitro導入してもよい。後続のステップにおいて、所望のGENSETポリペプチドまたはその所望の断片をコードするベクターで形質転換した細胞を動物の体内に再導入して、組換えタンパク質を局所的にまたは全身的に送達させる。
【０３５２】
分泌ベクター
また、本発明のGENSET cDNAまたはゲノムDNAの一部は、ベクターに挿入された遺伝子によってコードされるタンパク質の分泌を指令し得る分泌ベクターを構築するために使用することができる。かかる分泌ベクターは、所望のタンパク質を精製または濃縮する際に取り除く必要のあるバックグラウンドタンパク質の数を減少させることによって、そこに挿入された遺伝子によりコードされるタンパク質の精製または濃縮を容易にし得る。典型的な分泌ベクターを以下に記載する。
【０３５３】
本発明の分泌ベクターは目的の宿主細胞、組織、または生物体内での遺伝子発現を指令し得るプロモーターを含む。かかるプロモーターとしては、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、SV40プロモーター、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター、および当業者に一般的なその他のプロモーターが挙げられる。
【０３５４】
本発明のポリヌクレオチドからのシグナル配列ならびに寄託されたクローンプールのクローンインサートのシグナル配列は、プロモーターから転写されたmRNAがそのシグナルペプチドの翻訳を指令するようにそのプロモーターに機能し得る形で連結される。宿主細胞、組織または生物体は、GENSET cDNAまたはゲノムDNA中のシグナル配列によってコードされるシグナルペプチドを認識するどのような細胞、組織、または生物体であってもよい。好適な宿主としては、哺乳類の細胞、組織もしくは生物体、鳥類の細胞、組織もしくは生物体、昆虫の細胞、組織もしくは生物体、または酵母が挙げられる。
【０３５５】
さらに、分泌ベクターは分泌されるであろうタンパク質をコードする遺伝子を挿入するためのクローニング部位を含んでいる。このクローニング部位によって、シグナルペプチドと挿入された遺伝子によってコードされるタンパク質とが融合された融合タンパク質がプロモーターから転写されたmRNAから発現されるように、シグナル配列とインフレームのインサート遺伝子のクローニングが容易になる。シグナルペプチドは融合タンパク質の細胞外分泌を指令する。
【０３５６】
分泌ベクターはDNAまたはRNAであってよく、宿主の染色体に組み込まれるか、宿主内で染色体外レプリコンとして安定して維持されるか、人工染色体であるか、または宿主内に一時的に存在するものであってよい。好ましくは、分泌ベクターは各宿主細胞内で複数コピーとして維持される。本明細書において用いられる、複数コピーとは、細胞当たり少なくとも2、5、10、20、25、50または50を超えるコピー数を意味する。いくつかの実施形態では、複数コピーが染色体外で維持される。その他の実施形態では、複数コピーは染色体配列の増幅によってもたらされる。
【０３５７】
レトロウイルスベクター、SV40ベクター、ウシ乳頭腫ウイルスベクター、酵母組込みプラスミド、酵母エピソームプラスミド、酵母人工染色体、ヒト人工染色体、Pエレメントベクター、バキュロウイルスベクター、または宿主内に一時的に導入できる細菌プラスミドをはじめとする、分泌ベクターとしての使用に好適な数多くの核酸バックボーンは当業者に周知である。
【０３５８】
分泌ベクターはポリA シグナルをさらに含んでいてもよく、ポリA シグナルが分泌ベクターに挿入された遺伝子の下流に配置されるようにする。
【０３５９】
分泌が望まれるタンパク質をコードする遺伝子を分泌ベクターに挿入した後に、その分泌ベクターを、リン酸カルシウム沈降、DEAE-デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム媒介性トランスフェクション、ウイルス粒子を利用して、または裸のDNAとして、宿主細胞、組織、または生物体に導入する。次いで、挿入された遺伝子によってコードされるタンパク質を、硫酸アンモニウム沈殿、免疫沈降、免疫クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、およびhplcなどの従来の技術を用いて上清から精製または濃縮する。また、分泌されたタンパク質は、宿主の上清または増殖培地においてさらなる濃縮を行うことなくその意図された目的に使用できる程度に十分に濃縮されたまたは精製された状態にあると考えられる。
【０３６０】
また、シグナル配列を遺伝子治療に向けて設計されたベクター中に挿入してもよい。かかるベクターでは、シグナル配列は、プロモーターから転写されたmRNAがシグナルペプチドをコードするようにプロモーターに機能し得る形で連結されている。クローニング部位は、分泌が望まれるタンパク質をコードする遺伝子が容易にベクター中に挿入されて、シグナル配列と融合させうるように、シグナル配列の下流に位置している。ベクターは好適な宿主細胞内に導入される。プロモーターより発現されたタンパク質は細胞外に分泌され、それによって、治療効果がもたらされる。
【０３６１】
宿主細胞
本発明のもう1つの目的は本明細書に記載のポリヌクレオチドの1つ、特にGENSETポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの調節配列またはGENSETポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのいずれかを含んでなるポリヌクレオチドによって形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を含む。また、上記したような組換えベクターで形質転換(原核細胞)、トランスフェクト(真核細胞)、または形質導入された宿主細胞も含まれる。しかしながら、本発明の宿主細胞は本発明のポリヌクレオチドの任意のものを含んでいてよい。本発明の発現ベクターに対するレシピエントとして使用される好ましい宿主細胞には以下のものがある:
a)原核宿主細胞: 大腸菌株(I.E.DH5-α株)、枯草菌(Bacillus subtilis)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、ならびにシュードモナス属(Pseudomonas)、ストレプトミセス属(Streptomyces)およびブドウ球菌属(Staphylococcus)などの種の株。
【０３６２】
b)真核宿主細胞: HeLa細胞(ATCC番号CCL2; 同CCL2.1; 同CCL2.2)、Cv 1細胞(ATCC番号CCL70)、COS細胞(ATCC番号CRL1650; 同CRL1651)、Sf-9細胞(ATCC番号CRL1711)、C127細胞(ATCC番号CRL-1804)、3T3(ATCC番号CRL-6361)、CHO(ATCC番号CCL-61)、ヒト腎臓 293.(ATCC番号45504; 同CRL-1573)およびBHK(ECACC番号84100501; 同84111301)。
【０３６３】
本発明はまた、a)外因性(異種)ポリヌクレオチドを標的遺伝子の内因性染色体DNAに挿入する、b)内因性染色体DNAを欠失させる、および／またはc)内因性染色体DNAを外因性ポリヌクレオチドで置換する、べく操作した脊椎動物起源、好ましくは哺乳動物起源、特にヒト起源の一次、二次、および不死化された相同組換え宿主細胞も含む。ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失、および／または置換は、標的遺伝子のコード配列に対して行っても、かつ／または標的遺伝子と機能し得る形で結合されたプロモーターおよびエンハンサー配列などの調節領域に対して行ってもよい。
【０３６４】
本明細書に記載のベクター構築物を含む宿主細胞を包含することに加えて、本発明はまた、内因性遺伝物質(例えば、コード配列)を欠失もしくは置換するように、かつ／または本発明のポリヌクレオチドと機能し得る形で結合されており、内因性ポリヌクレオチドを活性化、改変、および／もしくは増幅する遺伝物質(例えば、異種ポリヌクレオチド配列)を含めるように操作された脊椎動物起源、特に哺乳動物起源の一次、二次、および不死化宿主細胞も含む。例えば、当技術分野で公知の技術を用いて異種制御領域(例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー)と内因性ポリヌクレオチド配列を相同組換えによって機能し得る形で結合してもよい、例えば、1997年6月24日発行の米国特許第5,641,670号; 1996年9月26日公開の国際公開番号WO96/29411; 1994年8月4日公開の国際公開番号WO94/12650; Kollerら, (1989); およびZijlstraら(1989)(なお、それらの全開示内容は各々参照により本明細書に組み入れられる)を参照されたい。
【０３６５】
本発明はさらに、細胞内で正常に発現されない標的遺伝子の発現を改変するin vitroまたはin vivoでの相同組換え宿主細胞の作製方法に関する。好ましくは、その改変によって正常な増殖条件下または標的遺伝子によってコードされるポリペプチドの生産に好適な条件下で標的遺伝子の発現が起こる。この方法は、(a)in vitroまたはin vivoにおいて、(i)ターゲッティング配列; (ii)調節配列および／またはコード配列; ならびに(iii)必要に応じて、不対のスプライス供与部位; を含んでなるポリヌクレオチド構築物で細胞をトランスフェクトし、それによってトランスフェクト細胞を作製し、さらに(b)in vitroまたはin vivoにおいてトランスフェクト細胞を相同組換えに好適な条件下で維持するステップを含んでなる。
【０３６６】
本発明はさらに、細胞内で正常に発現されない標的遺伝子の細胞内での発現をin vitroまたはin vivoにおいて改変する方法であって、(a)in vitroまたはin vivoにおいて、(i)ターゲッティング配列; (ii)調節配列および／またはコード配列; ならびに(iii)必要に応じて、不対のスプライス供与部位; を含んでなるポリヌクレオチド構築物で細胞をトランスフェクトし、それによってトランスフェクト細胞を作製し、次いで(b)in vitroまたはin vivoにおいてトランスフェクト細胞を相同組換えに好適な条件下で維持し、それによって、相同組換え細胞を作製し、さらに(c)in vitroまたはin vivoにおいて相同組換え細胞を遺伝子の発現に好適な条件下で維持するステップを含んでなる方法に関する。
【０３６７】
本発明はさらに、細胞内で正常に発現されない標的内因性遺伝子の細胞内での発現をin vitroまたはin vivoにおいて改変することにより本発明のポリペプチドを製造する方法であって、(a)in vitroにおいて、(i)ターゲッティング配列; (ii)調節配列および／またはコード配列; ならびに(iii)必要に応じて、不対のスプライス供与部位; を含んでなるポリヌクレオチド構築物で細胞をトランスフェクトし、それによってトランスフェクト細胞を作製し、(b)in vitroまたはin vivoにおいてトランスフェクト細胞を相同組換えに好適な条件下で維持し、それによって、相同組換え細胞を作製し、さらに(c)in vitroまたはin vivoにおいて相同組換え細胞を遺伝子の発現に好適な条件下で維持し、それによってポリペプチドを製造するステップを含んでなる方法に関する。
【０３６８】
本発明はさらに、標的遺伝子が正常に発現されない細胞型内での該遺伝子の発現を改変するポリヌクレオチド構築物に関する。これは、(a)ターゲッティング配列; (b)調節配列および／またはコード配列; ならびに(c)必要であれば、不対のスプライス供与部位、を含んでなるポリヌクレオチド構築物が標的細胞の染色体DNAに挿入される場合に起こる。さらに、染色体DNAとの相同組換え後に標的内因性遺伝子と同じフレーム内にある、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、上記のようなポリヌクレオチド構築物も含まれる。
【０３６９】
米国特許第6,054,288号;同第6,048,729号;同第6,048,724号;同第6,048,524号;同第5,994,127号;同第5,968,502号;同第5,965,125号;同第5,869,239号;同第5,817,789号;同第5,783,385号;同第5,733,761号;同第5,641,670号;同第5,580,734号;国際公開番号:WO96/29411、WO94/12650;およびKollerらによって記載(1994)された科学論文に記載のものなどの当技術分野で公知の技術によって組成物を作製し、さらに方法を実施してもよい(なお、それらの全開示内容は各々参照により本明細書に組み入れられる)。
【０３７０】
哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞におけるGENSET遺伝子発現は欠損させたり、あるいは動物細胞のゲノム内の内因性GENSETポリペプチドをコードする遺伝子を、本発明のGENSETポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで置換することによって改変したりすることができる。これらの遺伝的改変は、これまでに記載された特定のポリヌクレオチド構築物を用いる相同組換えによって生じさせることができる。
【０３７１】
マウス接合子などの哺乳動物接合子を細胞宿主として使用してもよい。例えば、マウス接合子に目的の精製DNA分子のマイクロインジェクションを行ってもよい。
【０３７２】
本明細書に記載のポリヌクレオチド構築物をはじめとする本発明のポリヌクレオチドのいずれか1つを胚性幹(ES)細胞系、好ましくはマウスES細胞系に導入してもよい。ES細胞系は着床前胚盤胞の内部細胞塊の多能性分化未決定細胞から誘導される。好ましいES細胞系には以下のものがある: ES-E14TG2a(ATCC番号CRL-1821)、ES-D3(ATCC番号CRL1934およびCRL-11632)、YS001(ATCC番号CRL-11776)、36.5(ATCC番号CRL-11116)。ES細胞は、増殖を抑制された支持細胞（この胚性表現型を維持する好適なシグナルを提供し、さらにES細胞付着のためのマトリックスとしての機能を果たす）の存在下で培養することにより、分化未決定状態で維持される。好ましい支持細胞は、実質上すべてのマウス系統の13〜14日目の胚の組織から樹立された一次胚性繊維芽細胞であり、該細胞は、例えば、Abbondanzoら(1993), Meth. Enzymol., Academic Press, New York, pp 803-823に記載されたように培養下で維持され、さらに、Robertson (1987), Embryo-derived stem cell lines; In: E.J. Robertoson編, Teratocarcinomas and embrionic stem cells: a practical approach. IRL Press, Oxfoed, pp.71に記載されたように放射線照射により、またはPeaseおよびWilliams (1990), Exp. Cell. Res. 190: 209-211に記載されたように阻止濃度のLIFの存在により、増殖を抑制される(なお、それらの全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる)。
【０３７３】
宿主細胞内の構築物は、組換え配列によってコードされる遺伝子産物を産生させるために従来の方法で使用することができる。
【０３７４】
トランスジェニック動物
本明細書中で用いる「トランスジェニック動物」または「宿主動物」とは、それらのゲノムが本発明の核酸の1つを含むように遺伝的かつ人為的に操作された動物を指す。好ましい動物は非ヒト哺乳動物であり、本発明の核酸の挿入によってそれらのゲノムが人為的かつ遺伝的に改変されたMus(例えば、マウス)、Rattus(例えば、ラット)およびOryctogalus(例えば、ウサギ)から選択される属に属するものが含まれる。ある実施形態では、本発明は、本発明の組換えベクターまたはノックアウトベクターとの相同組換えによって破壊されたGENSET遺伝子を含んでなる非ヒト宿主哺乳動物を含む。
【０３７５】
本発明のトランスジェニック動物の全てが、それらの複数の細胞内にクローニングされた組換えまたは合成DNA配列、より詳しくは、例えば、本明細書に記載されるようなGENSETポリペプチドコード配列、GENSETポリヌクレオチド調節配列、ポリヌクレオチド構築物、またはアンチセンスポリヌクレオチドをコードするDNA配列を含んでなる精製または単離された核酸の1つを含んでいる。
【０３７６】
一般に、本発明のトランスジェニック動物は本発明において記載するポリヌクレオチド、組換えベクターおよび宿主細胞のいすせれかを含んでなる。第1の好ましい実施形態では、これらのトランスジェニック動物は所定のGENSET遺伝子の発現の調節不全と関連した多岐にわたる病因を研究するための優れた実験モデルであり、特にトランスジェニック動物はそれらのゲノム内に天然GENSETポリペプチドまたはGENSETポリペプチドの変異体をコードする挿入ポリヌクレオチドを1コピーまたは数コピーで含む。
【０３７７】
第2の好ましい実施形態では、これらのトランスジェニック動物はGENSET遺伝子の調節ポリヌクレオチドの制御下で目的とする所望のポリペプチドを発現し、それによってこの目的のタンパク質の合成が高収率で起こり、さらに最終的には目的のタンパク質の組織特異的発現がもたらされ得る。
【０３７８】
本発明のトランスジェニック動物の設計は当業者に周知の従来技術に従って行うことができる。トランスジェニック動物、特にトランスジェニックマウスの作製に関するより詳細な内容については、1989年10月10日発行の米国特許第4,873,191号; 1995年11月7日発行の同第5,464,764号; および1998年8月4日発行の第5,789,215号を参照されたい(なお、トランスジェニックマウスの作製方法を開示するこれらの文書が参照により本明細書に組み入れられる)。
【０３７９】
本発明のトランスジェニック動物は、結果として外因性遺伝物質を組み込んだゲノムを有する動物が得られる手順を適用することによって作製される。この手順には、例えば、本明細書に記載されるようにGENSETポリペプチドコード配列、GENSETポリヌクレオチド調節配列、またはGENSETポリヌクレオチドアンチセンス配列をコードするDNA配列、もしくはその一部のいずれかをコードする遺伝物質を得ることが含まれる。本発明の組換えポリヌクレオチドは胚性またはES幹細胞系に挿入される[例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるThomasら(1987) Cell. 51:503-512を参照されたい]。本発明に従って使用し得る陽性-陰性選択法の例は、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるMansourら(1988) Nature. 336:348-352に記載されている。
【０３８０】
次いで、例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるBradley (1987)[Production and analysis of chimaeric mice In: E.J. Robertson(編), Teratocarcinomas and embrionic stem cells: a practical approach. IRL Press, Oxfoed, pp. 113]に記載されるように、陽性細胞を単離し、クローニングし、さらにマウスの3.5日齢の胚盤胞に注入する。その後、胚盤胞を雌宿主動物に挿入し、出産日まで生育させる。あるいは、例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Woodら(1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:4582-4585、またはNagyら(1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 8424-8428に記載されたように、陽性ES細胞を2.5日齢の8〜16細胞期の胚(桑実胚)に接触させ、ES細胞を内部に取り込ませ、生殖細胞系を生じる細胞を含む胚盤胞を十分にコロニー形成させる。
【０３８１】
雌宿主の子孫を試験して動物がトランスジェニックであるかどうか、例えば、挿入された外因性DNA配列を含んでいるかどうか、あるいは野生型であるかどうかを調べる。
【０３８２】
よって、本発明はまた、本発明の核酸、組換え発現ベクターまたは組換え宿主細胞を含むトランスジェニック動物に関する。
【０３８３】
もう1つの実施形態では、トランスジェニック動物をポリヌクレオチドのマイクロインジェクション(受精卵母細胞にマイクロインジェクトされる)によって作製する。受精卵母細胞を着床前段階まで培養する方法については、例えば、Gordonら((1984) Methods in Enzymology, 101, 414); Hoganら((1986) in Manipulating the mouse embryo. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y)(マウス胚に関する); Hammerら((1985) Nature, 315, 680)(ウサギおよびブタ胚に関する); Gandolfiら((1987) J. Reprod. Fert. 81, 23-28); Rexroadら((1988) J. Anim. Sci. 66, 947-953)(ヒツジ胚に関する); ならびにEyestoneら((1989) J. Reprod. Fert. 85, 715-720); Camousら((1984) J. Reprod. Fert. 72, 779-785); さらにHeymanら((1987) Theriogenology 27, 5968)(ウシ胚に関する)(なお、それらの全開示内容は各々参照により本明細書に組み入れられる)に記載されている。次いで、着床前胚を標準方法により好適な雌に移し、トランスジーンを導入する発生段階に応じてトランスジェニックまたはキメラ動物を誕生させる。
【０３８４】
当技術分野で公知の多くの方法のうちいずれを用いても着床前胚におけるトランスジーンの存在を検出することができる。
【０３８５】
本発明の特に好ましい実施形態では、組換えGENSETポリペプチドをそれらの乳汁に分泌するトランスジェニック哺乳動物を作製する。乳腺はタンパク質生産性の高い器官であるため、かかる方法を使用してグラム/リットル範囲(しばしば、もっと有意に高い)のタンパク質濃度を生み出すことができる。好ましくは、乳腺での発現はGENSETポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを乳腺特異的プロモーターと、所望により、その他の調節エレメントに機能し得る形で連結することにより達成される。好適なプロモーターおよびその他のエレメントとしては、限定されるものではないが、哺乳動物ショートおよびロングWAP、α、β、およびκ、カゼイン、αおよびβラクトグロブリン、β-CN 5’遺伝子由来のもの、ならびにマウス乳癌ウイルス(MMTV)プロモーターが挙げられる。かかるプロモーターおよびその他のエレメントは、限定されるものではないが、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウサギ、およびモルモットをはじめとする哺乳動物由来のものであってよい。プロモーターおよびその他の調節配列、ベクター、ならびにその他の関連した教示は、例えば、Clark (1998) J Mammary Gland Biol Neoplasia 3:337-50; Jostら(1999) Nat. Biotechnol 17:160-4;米国特許第5,994,616号;同第6,140,552号;同第6,013,857号; Sohnら(1999) DNA Cell Biol. 18:845-52; Kimら(1999) J. Biochem. (Japan) 126:320-5; Soulierら(1999) Euro. J. Biochem. 260:533-9; Zhangら(1997) Chin. J. Biotech. 13:271-6; Rijnkelsら(1998) Transgen. Res. 7:5-14; Korhonenら(1997) Euro. J. Biochem. 245:482-9; Uusi-Oukariら(1997) Transgen. Res. 6:75-84; Hitchinら(1996) Prot. Expr. Purif. 7:247-52; Platenburgら(1994) Transgen. Res. 3:99-108; Heng-Cherlら(1993) Animal Biotech. 4:89-107; およびChristaら(2000) Euro. J. Biochem. 267:1665-71(なお、それらの全開示内容は各々参照により本明細書に組み入れられる)により示されている。
【０３８６】
もう1つの実施形態では、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをin vivoにおいて乳腺の体細胞、例えば、乳腺分泌上皮細胞に導入することによりポリペプチドを乳汁に分泌させることができる。例えば、プラスミドDNAは乳頭管から、例えば、DEAE-デキストランを介して(例えば、Hensら(2000) Biochim. Biophys. Acta 1523:161-171を参照)、構築物の受容体媒介エンドサイトーシスを導き得るリガンドを介して(例えば、Sobolevら(1998) 273:7928-33を参照)、またはレトロウイルスベクター、例えば、テナガザル白血病ウイルスなどのウイルスベクターで(例えば、Archerら(1994) PNAS 91:6840-6844を参照)注入することができる。これらの実施形態のいずれにおいても、ポリヌクレオチドが前記のように乳腺特異的プロモーター、あるいはCMVまたはMoMLV LTRなどのいずれかの強力な発現プロモーターに機能し得る形で連結されていてもよい。
【０３８７】
ベクター、プロモーター、調節エレメントなどの本発明での使用についての適合性は乳腺上皮細胞、例えば、MacT細胞(ウシ乳腺上皮細胞)またはGME細胞(ヤギ乳腺上皮細胞)などの細胞をin vitroにおいてトランスフェクトし、さらにトランスフェクションおよび細胞内でのトランスジーンの発現の効率を調べることによって事前に評価することができる。
【０３８８】
好ましい実施形態では、Archerら((1994) PNAS 91:6840-6844)に記載されたようにテナガザル白血病ウイルスベクターなどのレトロウイルスベクターを使用する。レトロウイルス感染は典型的には細胞分裂を必要とするため、ベクターの投与と同時に、例えば、安息香酸エストラジオール、プロゲステロン、レセルピン、またはデキサメタゾンなどの因子を用いて乳腺における細胞分裂を刺激することができる。さらに、ポリブレンなどの補助的化合物を用いてレトロウイルスやその他の感染方法を促進することができる。あるいはまた、本明細書で述べるように非分裂細胞に感染させるためにアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスベクターを使用してもよい。
【０３８９】
乳汁からGENSETポリペプチドを得るための本明細書に記載のいずれの方法においても、得られる乳汁量、その結果としてのGENSETポリペプチドの生産量を、例えば、ヘキセストロール、エストロゲン、および／またはプロゲステロンを用いたいずれかの標準的乳汁分泌誘発方法を用いて高めることができる。
【０３９０】
かかる実施形態で使用するポリヌクレオチドは全長GENSETタンパク質またはGENSET断片のいずれかをコードすることができる。典型的には、コードされるポリペプチドはタンパク質の乳汁への分泌を確実にするシグナル配列を含むだろう。
【０３９１】
本発明のトランスジェニック動物から誘導される組換え細胞系:
本発明のさらなる目的は本明細書に記載のトランスジェニック動物から得られる組換え宿主細胞を含む。ある実施形態では、本発明は本発明の組換えベクターまたはノックアウトベクターとの相同組換えによって破壊されたGENSET遺伝子を含んでなる非ヒト宿主哺乳動物に由来する細胞を含む。
【０３９２】
組換え細胞系は、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Chou (1989), Mol. Endocrinol. 3:1511-1514、およびShayら(1991), Biochem. Biophys. Acta, 1072: 1-7に記載されたように、本発明のトランスジェニック動物のいずれかの組織から得られた細胞から、例えば、SV40ラージT抗原などのonc-遺伝子を発現するベクターでの一次細胞培養物のトランスフェクションによって、in vitroにおいて樹立することができる。
【０３９３】
本発明のポリペプチドの用途
配列番号24のタンパク質(内部表示クローン47-14-1-C3-CL0_5)
クローン47-14-1-C3-CL0_5のcDNA(配列番号23)はアミノ酸配列:
MVPFIYLQAHFTLCSGWSSTYRDLRKGVYVPYTQGKWEGELGTDLVSIPHGPNVTVRANIAAITESDKFFINGSNWEGILGLAYAEIARPDDSPEPFFDSLVKQTHVPNLFSLQLCGAGFPLNQSEVLASVGGSMIIGGIDHSLYTGSLWYTPIRREWYYEVIIVRVEINGQDLKMDCKEYNYDKSIVDSGTTNLRLPKKVFEAAVKSIKAASSTEKFPDGFWLGEQLVCWQAGTTPWNIFPVISLYLMGEVTNQSFRITILPQQYLRPVEDVATSQDDCYKFAISQSSTGTVMGAVIMEGFYVVFDRARKRIGFAVSACHVHDEFRTAAVEGPFVTLDMEDCGYNIPQTDESTLMTIAYVMAAICALFMLPLCLMVCQWRCLRCLRQQHDDFADDISLLKを含んでなる配列番号24のタンパク質をコードする。よって、本願を通じて記載される配列番号24のポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン47-14-1-C3-CL0_5に含まれる核酸によってコードされるポリペプチドについても当てはまることが理解されよう。さらに、本願を通じて記載される配列番号23のポリヌクレオチドの全ての特徴および用途はクローン47-14-1-C3-CL0_5に含まれる核酸についても当てはまることが理解されよう。本発明のある好ましい実施形態は配列番号23、配列番号24およびクローン47-14-1-C3-CL0_5の組成物に向けられる。また、本明細書に記載されるような生物活性を有するポリペプチド断片およびそれらの断片をコードするポリヌクレオチドも好ましい。
【０３９４】
アミノ酸配列: SPEPFFDSLVKQTHVPNLFSLQLCGAGFPLNQSEVLASVGGSMIIGGIDHSLYTGSLWYTPIRREWYYEVIIVRVEINGQDLKMDCKEYNYDKSIVDSGTTNLRLPKKVFEAAVKSIKAASSTEKFPDGFWLGEQLVCWQAGTTPWNIFPVISLYLMGEVTNQSFRITILPQQYLRPVEDVATSQDDCYKFAISQSSTGTVMGAVIMEGFYVVFDRARKRIGFAVSACHVHDEFRTAAVEGPFVTLDMEDCGYNIPQTDESTLMTIAY;
DLKMDCKEYNYDKSIVDSGTTNLRLPKKVFEAAVKSIKAASSTEKFPDGFWLGEQLVCWQ、および
AITESDKFFINGSNWEGILGLAYAEIARPDDSPEPFFDSLVKQTHVPNLFSLQLCGAGFPLNQSEVLASVGGSMIIGGIDHSLYTGSLWYTPIRREWYYEVIIVRVEINGQDLKMDCKEYNYDKSIVDSGTTNLRLPKKVFEAAVKSIKAASSTEKFPDGFWLGEQLVCWQAGTTPWNIFPVISLYLMGEVTNQSFRITILPQQYLRPVEDVATSQDDCYKFAISQSSTGTVMGAVIMEGFYVVFDRARKRIGFAVSACHを含んでなる組成物もさらに好ましい。また、本明細書に記載されるような生物活性を有するポリペプチド断片およびそれらの断片をコードするポリヌクレオチドも好ましい。
【０３９５】
配列番号24のタンパク質はアミロイドプロセシングインヒビタータンパク質(APIP)をコードする。APIPは哺乳類組織、特に神経細胞で発現し、基質と結合できるが触媒活性を欠く不完全なアスパルチルプロテアーゼである。APIPと相互作用する化合物の例としては、限定されるものではないが、アミロイドβ前駆体タンパク質、アミロイド前駆体様タンパク質-1、アミロイド前駆体様タンパク質-2、プロテアーゼネキシン-2、抗トリプシンタンパク質、Kunitzプロテアーゼ阻害剤およびアミロイド様タンパク質が挙げられる。
【０３９６】
アミロイドβ前駆体タンパク質(APP)は数種のプロテアーゼによってプロセシングされて可溶性または不溶性の断片を生じ得る(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるNunanおよびSmall, FEBS Lett (2000) 483(1):6-10)。βセクレターゼおよびγセクレターゼによるAPPの一連の切断は、細胞外アミロイドプラークの主成分であるβアミロイドとして知られる分泌型の不溶性原繊維アミロイドタンパク質を生じる。βアミロイドタンパク質の沈着は神経内の神経原繊維のもつれを生じさせる。アミロイドプラークおよび血管アミロイド沈着はアルツハイマー病および高齢ダウン症候群の双方に特徴的である。APPのプロセシングにおける欠陥は脳出血に至ることがある。配列番号24のポリペプチドおよびその断片はAPPおよびその他のアミロイド様タンパク質と結合し、これらのタンパク質のプロセシングの速度を引き下げる。
【０３９７】
いくつかの実施形態では、APIPを、生物学的サンプル中のいくつかの基質のいずれかと結合させ、かつ／または基質を阻害するために用いる。例えば、1つの好ましい実施形態はAPIPを含んでなる組成物をAPPと接触させる方法に向けられる。さらに、APIPを含んでなる組成物をアミロイド前駆体様タンパク質-1(APLP1)と接触させる方法も好ましい。さらにまた、APIPを含んでなる組成物をアミロイド前駆体様タンパク質-2(APLP2)と接触させる方法も好ましい。このような方法は、例えば、APP、APLP1またはAPLP2などの基質の活性を阻害するため、あるいは例えばAPIPを標識し、特異的に結合させて、その基質またはその基質を発現する細胞もしくは組織を可視化することにより、基質を標識するために有用である。
【０３９８】
もう1つの実施形態は、哺乳類細胞をAPIPと接触させることを含んでなる、細胞外分泌アミロイドβ前駆体タンパク質(APP)の異化作用を低下させる方法に向けられる。該哺乳類細胞はAPPを産生することが好ましい。哺乳類細胞は好ましくは神経細胞である。哺乳類は好ましくは齧歯類、イヌまたは霊長類である。
【０３９９】
もう1つの実施形態は、哺乳類細胞をAPIPと接触させることを含んでなる、細胞外分泌APLP1の異化作用を低下させる方法に向けられる。 該哺乳類細胞はAPLP1を産生することが好ましい。哺乳類細胞は好ましくは神経細胞である。哺乳類は好ましくは齧歯類、イヌまたは霊長類である。
【０４００】
もう1つの実施形態は、哺乳類細胞をAPIPと接触させることを含んでなる、細胞外分泌APLP2の異化作用を低下させる方法に向けられる。該哺乳類細胞はAPLP2を産生することが好ましい。哺乳類細胞は好ましくは神経細胞である。哺乳類は好ましくは齧歯類、イヌまたは霊長類である。
【０４０１】
脳内のアミロイドプラークは神経伝達の妨害の一因となり、行動、知覚、記憶および気分に障害をもたらす。本発明のもう1つの好ましい実施形態は、APIPを含んでなる組成物を神経細胞と接触させることにより気分障害を予防または緩和する方法に向けられる。さらに、APIPを含んでなる組成物を神経細胞と接触させることにより精神分裂病を予防または緩和する方法も好ましい。さらにまた、APIPを含んでなる組成物を神経細胞と接触させることによりアルツハイマー病を予防または緩和する方法も好ましい。
【０４０２】
また膵臓ではアミロイドーシスも起こり、これはグルコース不耐症、インスリン機能不全症または糖尿病の一因となり得る。ある好ましい実施形態は、APIPを含んでなる組成物を膵細胞と接触させることによりグルコース不耐症を予防または緩和する方法に向けられる。さらに、APIPを含んでなる組成物を膵細胞と接触させることによりインスリン機能不全症を予防または緩和する方法も好ましい。さらにまた、APIPを含んでなる組成物を膵細胞と接触させることにより糖尿病を予防または緩和する方法も好ましい。
【０４０３】
配列番号23のクローン47-14-1-C3-CL0_5に関して記載した本発明の方法において用いられる本発明の組成物は、配列番号24のポリペプチド(APIP)およびその断片、ならびに配列番号24のポリペプチドおよびその断片を含んでなる組成物を含むことを理解すべきである。
【０４０４】
配列番号28のタンパク質(内部表示クローン117401_106-006-4-0-B11-F)
クローン117401_106-006-4-0-B11-FのcDNA(配列番号27)は配列番号28のタンパク質をコードする。よって、本願を通じて記載される配列番号28のポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン117401_106-006-4-0-B11-Fに含まれる核酸によりコードされるポリペプチドについても当てはまることが理解されよう。さらに、本願を通じて記載される配列番号27のポリヌクレオチドの全ての特徴および用途はクローン117401_106-006-4-0-B11-Fに含まれる核酸についても当てはまることが理解されよう。本明細書に記載されるような生物活性を有するポリペプチド断片およびそれらの断片をコードするポリヌクレオチドも好ましい。配列番号28のタンパク質の遺伝子は第8染色体上に位置する。
【０４０５】
配列番号28のタンパク質は本明細書ではフランジオポゲン(Frangiopogen)と呼ぶ。フランジオポゲンはヒト胎児肝臓および肺での発現が高い。これは肝臓再生を刺激し、細胞分裂活性を有し、胚発達に積極的に関与する。フランジオポゲンは細胞増殖および血管形成をはじめとする複雑な調節プロセスに関与する。
【０４０６】
本発明のさらなる実施形態では、フランジオポゲンは、好ましくは虚血などの傷害後、または一般の手術、耳、鼻および喉の手術、組織移植、皮膚もしくは歯もしくは人工関節移植、または形成手術をはじめとする手術後、創傷治癒を促進する組織治療用組成物において用いる。さらに、組織再生用の組織治療用組成物におけるフランジオポゲンの使用も好ましい。
【０４０７】
本発明の好ましい組織治療用組成物としては、配列番号28のタンパク質を含んでなる生理学上許容される製剤が挙げられる。さらに、配列番号28のタンパク質を、フィブリン、フィブリノーゲン、トロンビン、XIII因子、塩化カルシウム、プラスミノーゲンアクチベーター、プラスミンインヒビター(アプロチンなど)、増殖因子、およびヒアルロン酸などの多糖からなる群から選択される付加的化合物と組み合わせて含んでなる生理学上許容される製剤も好ましい。さらにまた、例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,083,902号および同第5,631,011号に記載されるように配列番号28のタンパク質を単独でまたは組成物中に含んでなる製剤も好ましい。
【０４０８】
さらなる実施形態では、本発明の組織治療用組成物は、創傷または傷害組織を、治癒または再生に有効な量(本発明の組成物で処置しない同じ創傷または傷害組織に比べて治癒または再生の速度または進行を高める量)のフランジオポゲンポリペプチドと接触させる工程を含んでなる傷害治療方法において用いられる。さらなる実施形態としては、傷害組織を、治癒または再生に有効な量のフランジオポゲンポリペプチドと接触させる工程を含んでなる、事故後または術後の損傷部位(例えば、真皮が露出するように外皮が損なわれた部位と定義)への局所適用のための本発明の組織治療用組成物の使用が挙げられる。なおさらなる実施形態では、本発明の組織治療用組成物は単独で、または胚性軟骨細胞などの軟骨細胞と組み合わせて、関節軟骨の治療および骨欠損の修復のための方法において用いられる。
【０４０９】
本発明は、内皮細胞を、増殖に有効な量の本発明のフランジオポゲンポリペプチドと接触させる工程を含んでなる、内皮細胞の増殖の刺激方法を提供する。好ましくはこの内皮細胞は血管内皮細胞、動脈または静脈内皮細胞である。さらに好ましくは、この方法は新しい毛細血管の発達を含む血管形成すなわち組織の血管新生のプロセスをもたらす。好ましくは血管形成は哺乳類で起こり、より好ましくは哺乳類はイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタまたはヒトである。
【０４１０】
さらに、本発明は本発明のフランジオポゲンポリペプチドと特異的に結合する抗体を提供する。抗体はモノクローナルであってもポリクローナルであってもよい。本発明はまた、内皮細胞を含んでなる生物学的サンプルを、増殖阻害に有効な量の抗フランジオポゲン抗体と接触させる工程を含んでなる、内皮細胞の増殖の阻害方法も提供する。好ましくは、内皮細胞は血管内皮細胞、動脈または静脈内皮細胞である。さらに好ましくは、これらの方法は血管形成または血管成長の阻害をもたらす。さらに好ましくは、この血管形成の阻害は哺乳類で起こり、より好ましくは哺乳類はイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタまたはヒトである。
【０４１１】
あるいは、本発明は、当技術分野で周知の細胞傷害剤および方法を用いて細胞傷害剤がフランジオポゲンポリペプチドに共有結合もしくは非共有結合で、組換え的もしくは非組換え的に結合されたフランジオポゲンポリペプチド-細胞傷害剤コンジュゲートを提供する。本発明はまた、内皮細胞を含んでなる生物学的サンプルまたは個体を、増殖阻害または内皮細胞死滅に有効な量のフランジオポゲン-細胞傷害剤コンジュゲートと接触させる工程を含んでなる、内皮細胞の増殖の阻害方法も提供する。好ましくは、内皮細胞は血管内皮細胞である。さらに好ましくは、これらの方法は血管形成または血管成長の阻害をもたらす。さらに好ましくは、この血管形成の阻害は哺乳類で起こり、より好ましくは哺乳類はイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタまたはヒトである。特定の抗フランジオポゲン抗体またはフランジオポゲン-細胞傷害剤コンジュゲートが血管成長または血管形成を妨害するのに有用であるかどうかを調べるには、当技術分野で周知のモデル、例えばニワトリ漿尿膜アッセイを用いればよい。
【０４１２】
本発明の方法で用いるために好ましいポリペプチドとしては、
アミノ酸配列: MRLRAQVRLLETRVKQQQVKIKQLLQENEVQFLDKGDENTVVDLGSKRQYADCSEIFNDGYKLSGFYKIKPLQSPAEFSVYCDMSDGGGWTVIQRRSDGSENFNRGWKDYENGFGXFVQKHGEYWLGNKNLHFLTTQEDYTLKIDLADFEKNSRYAQYKNFKVGDEKNFYELNIGEYSGTAGDSLAGNFHPEVQWWASHQRMKFSTWDRDHDNYEGNCAEEDQSGWWFNRCHXANLNGVYYSGPYTAKTDNGIVWYTWHGWWYSLKSVVMKIRPNDFIPNVIを含んでなる配列番号28のポリペプチド;
アミノ酸配列: MAKVFSFILVTTALIMGREISALEDCAQEQMRLRAQVRLLETRVKQQQVKIKQLLQENEVQFLDKGDEDTVVDLGSKRQYADCSEIFNDGYKLSGFYKIKPLQSPAEFSVYCDMSDGGGWTVIQRRSDGSENFNRGWKDYENGFGNFVQKHGEYWLGNKNLHFLTTQEDYTLKIDLADFEKNSRYAQYKNFKVGDEKNFYELNIGEYSGTAGDSLAGNFHPEVQWWASHQRMKFSTWDRDHDNYEGNCAEEDQSGWWFNRCHSANLNGVYYSGPYTAKTDNGIVWYTWHGWWYSLKSVVMKIRPNDFIPNVIを含んでなるポリペプチド;
アミノ酸配列: SPISNCEITITDPGKFYNSNSVFSRGNMAKVFSFILVTTALXMGREISALEDCAQEQMRLRAQVRLLETRVKQQQVKIKQLLQENEVQFLDKGDENTVVDLGSKRQYADCSEIFNDGYKLSGFYKIKPLQSPAEFSVYCDMSDGGGWTVIQRRSDGSENFNRGWDYENGFGNFVQKHGEYWLGNKNLHFLTTQEDYTLKIDLADFEKNSRYAQYKNFKVGDEKNFYELNIGEYSGTAGDSLAGNFHPEVQWWASHQRMK FSTWDRDHDNYEGNCAEEDQSGWWFNRCHSANLNGVYYSGPYTAKTDNGIVWYTWHGWWY SLKSVVMKIR PNDFIPNVIを含んでなるポリペプチド;
アミノ酸配列: MAKVFSFILVTTALIMGREISALEDCAQEQMRLRAQVRLLETRVKQQQVKIKQLLQENEVQFLDKGDENTVVDLGSKRQYADCSEIFNDGYKLSGFYKIKPLQSPAEFSVYCDMSDGGGWTVIQRRSDGSENFNRGWKDYENGFGNFVQKHGEYWLGNKNLHFLTTQEDYTLKIDLADFEKNSRYAQYKNFKVGDEKNFYELNIGEYSGTAGDSLAGNFHPEVQWWASHQRMKFSTWDRDHDNYEGNCAEEDQSGWWFNRCHSANLNGVYYSGPYTAKTDNGIVWYTWHGWWYSLKSVVMKIRPNDFIPNVIを含んでなるポリペプチド;および
アミノ酸配列: MKLANWYWLSSAVLATYGFLVVANNETEEIKDERAKDVCPVRLESRGKCEEAGECPYQVSLPPLTIQLPKQFSRIEEVFKEVQNLKEIVNSLKKSCQDCKLQADDNGDPGRNGLLLPSTGAPGEVGDNRVRELESEVNKLSSELKNAKEEINVLHGRLEKLNLVNMNNIENYVDSKVANLTFVVNSLDGKCSKCPSQEQIQSRPVQHLIYKDCSDYYAIGKRSSETYRVTPDPKNSSFEVYCDMETMGGGWTVLQARLDGSTNFTRTWQDYKAGFGNLRREFWLGNDKIHLLTKSKEMILRIDLEDFNGVELYALYDQFYVANEFLKYRLHVGNYNGTAGDALRFNKHYNHDLKFFTTPDKDNDRYPSGNCGLYYSSGWWFDACLSANLNGKYYHQKYRGVRNGIFWGTWPGVSEAHPGGYKSSFKEAKMMIRPKHFKPを含んでなるポリペプチドが挙げられる。また、本明細書に記載されるような生物活性を有するポリペプチド断片およびそれらの断片をコードするポリヌクレオチドも好ましい。
【０４１３】
配列番号10(内部表示クローン147103_106-024-1-0-H6-F)、配列番号12(内部表示クローン224168_116-096-3-0-G11-F)、配列番号16(内部表示クローン225432_116-083-3-0-C6-F)、および配列番号14(内部表示クローン243303_116-118-4-0-A3-F)のタンパク質
配列番号9、11、13および15のポリペプチド、ならびに配列番号10、12、14および16のポリヌクレオチドはそれぞれ可溶性低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質-10(sLRP10)MSASCCLSWCPAKAKSKCGPTFFPCASGIHCIIGRFRCNGFEDCPDGSDEENCTANPLLCSTARYHCKNGLCIDKSFICDGQNNCQDNSDEESCESSQAIFPQITVSをコードする。本発明の好ましいポリヌクレオチドおよびポリペプチドは配列番号9、11、13および15の核酸配列、ならびに配列番号10、12、14および16のアミノ酸配列を含んでなる。本願を通じて記載される配列番号9、11、13および15のポリヌクレオチド、ならびに配列番号10、12、14および16のポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン147103_106-024-1-0-H6-F、224168_116-096-3-0-G11-F、243303_116-118-4-0-A3-Fおよび225432_116-083-3-0-C6-FのヒトcDNA、ならびにそれらによりコードされるポリペプチドについても当てはまることが理解されよう。本発明の好ましい組成物は、クローン147103_106-024-1-0-H6-F、224168_116-096-3-0-G11-F、243303_116-118-4-0-A3-F、および225432_116-083-3-0-C6-F;配列番号9、11、13および15;配列番号10、12、14および16のポリヌクレオチドおよびポリペプチドが挙げられる。また、本明細書に記載されるような生物活性を有するポリペプチド断片およびそれらの断片をコードするポリヌクレオチドも好ましい。
【０４１４】
sLRP10は低密度リポタンパク質受容体(LDLR)ファミリーの非膜型可溶性メンバーである。このファミリーはいくつかの保存されたシステインリッチLDLRドメインの存在を特徴とする。このドメインは折りたたまれて所定のリガンド結合構造を形成する。LDLRファミリーの大部分のメンバーはクラスリンにより媒介される種々のリガンドのエンドサイトーシスにおいて機能する膜貫通タンパク質である。これらのリガンドは通常は次にリソソーム分解によって破壊される。しかし、より短い分泌型のファミリーメンバーも記載されている(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,496,926号およびQuinn, K.ら, Exp. Cell Res. 251: 433-41(1999))。LDLRファミリーのタンパク質は種々のタンパク質およびリポタンパク質リガンドと結合することができる。さらに、特定のウイルスはLDLRドメインをターゲッティングしてLDLRファミリーメンバーを発現する細胞へ侵入する。LDLRタンパク質は肝細胞、ニューロン、繊維芽細胞、上皮、脂肪、筋肉および膵細胞をはじめとする種々の細胞型で発現する。
【０４１５】
高レベルの低密度リポタンパク質(LDL)、超低密度リポタンパク質(VLDL)、キロミクロン、およびアポリポタンパク質E(ApoE)はアテローム性動脈硬化症およびその他のコレステロール関連疾患に関連する。これらの分子は医学分野で重視されている研究の課題である。ある好ましい実施形態としては、LDL、VLDL、キロミクロンおよびApoEと結合させるためにsLRP10を用いる。LDLRおよびα-2-マクログロブリン受容体などのLDLRファミリーの多くのメンバーは極めて大きな(>400kD)膜貫通タンパク質であるが、sLRP10は比較的小さく、膜結合型ではない。従って、sLRP10はLDLRドメインリガンドと結合させるために使用できる容易に精製できるポリペプチドである。この実施形態の一部として、sLRP10ポリペプチドを当技術分野で周知の技術を用いて固相マトリックスに共有結合または非共有結合させ、液相のLDL、VLDL、キロミクロンまたはApoEと結合させる。結合すればこれらのタンパク質は以下の工程:i)混入物を除去するための固相マトリックスの洗浄、ii)より高いストリンジェント条件（例えば、塩濃度を上昇させる）を用いた目的タンパク質の溶出、を用いて精製することができる。
【０４１６】
この実施形態のさらなる態様には、LDL、VLDL、キロミクロンまたはApoEを含有すると思われる生物学的サンプルを取得し；該サンプルと、本発明のLDL、VLDL、キロミクロンまたはApoE結合sLRP10ポリペプチドとを、sLRP10とLDL、VLDLまたはApoEとの結合に好適な条件下で接触させ；LDL、VLDLまたはApoEと結合したsLRP10の有無を検出することによりLDL、VLDLまたはApoEの有無を検出する工程を含んでなる、当技術分野で一般的な技術(例えば、ウエスタンブロット法、ELISAまたは標識二次検出法の使用)を用いてsLRP10に結合したLDL、VLDLまたはApoEを検出および定量する方法が含まれる。この実施形態は例えば、これらのタンパク質の血漿レベルを検出するための診断ツールとして有用である。
【０４１７】
本発明のもう1つの実施形態では、sLRP10ポリペプチドは、in vivoでLDL、VLDL、キロミクロンおよびApoEと結合させて血流からこれらの分子を除去するために用いられる。この実施形態では、さらに、sLRP10ポリペプチドは身体からの分泌を特定するポリペプチドシグナルとの融合タンパク質として発現させてもよい。本発明は、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,652,224号に記載のものをはじめ、i)これらの疾患に関するその個体の家系的疾病素因を判定し、ii)その個体から生物学的サンプルを得、さらに、iii)そのサンプルに対してリポタンパク質含量に関するアッセイを行う工程を含んでなる一般的な医学技術によって判定されるようなアテローム性動脈硬化症またはLDL、VLDL、キロミクロンまたはApoEの動脈リポタンパク質沈着のリスクがある個体に送達される。送達としては、診断された個体の血流に適量のsLRP10ポリペプチドを、例えば注射により、投与することを含む。
【０４１８】
ApoEはまた糖尿病の病因とも関連している。異常に高レベルのApoEはアミロイドプラークおよび膵臓P細胞の破壊に関連する。また、ApoEは抗酸化活性を有し(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Miyata and Smith, Nature Genet. 14: 55-61 (1996))、1型糖尿病では酸化的傷害がP細胞を破壊する(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Bach J., Endocrin. Rev. 15: 516-542 (1994)およびPCT出願WO9846743)。本発明のこの実施形態はさらに、膵臓ApoEのレベルを引き下げるために糖尿病に罹患した、または糖尿病のリスクがある患者に送達することができる。この実施形態では、sLRP10ポリペプチドはさらに身体からの分泌を特定するポリペプチドシグナルとの融合タンパク質として発現させてもよい。適当な用量のsLRP10は、例えば注射により血流中に、あるいは全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,652,224号に記載のものをはじめ当技術分野で公知の方法を用いて膵細胞へ特異的に送達することができる。これらには、i)本発明のヌクレオチド配列およびその発現を指令する調節配列と機能し得る形で連結されたアデノウイルスのゲノムの一部(この部分は膵細胞に感染することができる)のDNAを含んでなる、またはそれに対応する組換えウイルスベクターの構築;ii)有効量のこの組換えアデノウイルスベクターの糖尿病リスクのある個体への送達を含んでなる工程が含まれる。
【０４１９】
本発明のポリペプチドsLRP10はApoEともアミロイド前駆体タンパク質(APP)とも結合することができ、これら両者はアルツハイマー病の病因に関連している(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Kounnas, M.Z.ら Cell 82:331-40 (1995))。本発明のさらなる実施形態としては、アルツハイマー病の病因の研究を可能にするために、sLRP10ポリペプチドを用いて、神経細胞集団中のこれらのタンパク質と結合させる。特に、本発明はApoE活性の遮断およびアミロイドプラーク形成の研究のためにニューロン集団へ直接加えられる。
【０４２０】
sLRP10はまた、プロトオンコジーンWnt-1とも結合することができる(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Tamai, K.ら, Nature 407:530-35 (2000))。Wnt-1は通常、Frizzled受容体と結合する可溶性増殖因子として働くが、Wnt-1は細胞の形質転換とも関連づけられている(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、van Ooyen, A., Cell 39:233-40 (1984))。さらに、Wnt-1は精神分裂病とも関連づけられており(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Shackleford, G.ら, Neuron 11:865-75 (1993))、このタンパク質は生物医学界で特に注目されるものとなっている。本発明のsLRP10ポリペプチドのもう1つの実施形態は、当技術分野で一般的な技術を用いてWnt-1およびその作用を研究する方法を提供する。この実施形態は、i)sLRP10を固相マトリックスに結合させ；ii)Wnt-1を含有する溶液をアプライし；iii)Wnt-1とsLRP10を結合させ；iv)洗浄して、Wnt-1を溶出させることを含んでなる工程を用い、体液からWnt-1タンパク質を精製する方法を提供する。Wnt-1の精製は、例えば精製したWnt-1を増殖因子として用いて細胞へ送達するため、Wnt-1に対する抗体を作製するため、その他の多くの用途において有用である。さらに、sLRP10ポリペプチドのこの実施形態は液相のWnt-1と結合させ、Frizzled受容体とのその会合を妨げ、それにより細胞成長、増殖および／または形質転換に導く分子シグナル伝達事象を妨げるために用いられる。
【０４２１】
sLRP10は、ラウス肉腫ウイルス、フラビウイルス(C型肝炎ウイルスを含む)およびライノウイルス(「普通の風邪」の一因となるものを含む)科を含むウイルスと結合する(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Bates, P.ら Cell 93:1043-51 (1993), Agnello, V.ら, PNAS 96:12766-71 (1999), Hofer, F.ら, PNAS 91:1839-42 (1994))。本発明のある好ましい実施形態では、sLRP10ポリペプチドを液相中のウイルスと結合させるために用いる。この実施形態は、ラウス肉腫、フラビウイルスまたはライノウイルス科の少なくとも1つに由来するウイルスを含有すると思われる生物学的サンプルを得;そのサンプルを、標識したまたは他の方法で検出可能なsLRP10ポリペプチドと接触させ;さらに、標識されたsLRP10を可視化することによりウイルスを検出および定量する工程を含んでなる当技術分野で一般的な技術(例えば、sLRP10の蛍光標識)により、ウイルスを検出および定量するために用いることができる。
【０４２２】
膜貫通LDLRファミリーメンバーは、細胞侵入のためにラウス肉腫ウイルス、フラビウイルス、およびライノウイルス科のウイルスによりターゲッティングされる。しかし、sLRP10は細胞膜と結合していないので、LDLR受容体を発現する細胞上のLDLRタンパク質へのウイルスの結合を遮断し、それによりこれらの細胞への感染を妨げる働きをする。本発明のある好ましい実施形態としては、sLRP10タンパク質は、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,496,926号をはじめ当技術分野で公知の方法を用いて、ウイルスと結合させ、LDLRファミリーを発現する細胞への感染を妨げるために用いられる。この実施形態は、i)sLPR10ポリペプチドを細胞（例えば、ウイルスサンプルに曝露される可能性のあるLDLRファミリー受容体を発現する細胞）に直接加え、ii)ラウス肉腫ウイルス、フラビウイルスおよびライノウイルス科のウイルスによるこれら細胞の感染を妨げることを含んでなる工程によって行うことができる。
【０４２３】
配列番号20のタンパク質(内部表示クローン158523_106-030-2-0-A3-F)
クローン158523_106-030-2-0-A3-FのcDNA(配列番号19)はアミノ酸配列：
MRAWIFFLLCLAGRALAAPQQEALPDETEVVEETVAEVTEVSVGANPVQVEVGEFDDGAEETEEEVVAENPCQNHHCKHGKVCELDENNTPMCVCQDPTSCPAPIGEFEKVCSNDNKTFDSSCHFFATKCTLEGTKKGHKLHLDYIGPCKYIPPCLDSELTEFPLRMRDWLKNVLVTLYERDEDNNLLTEKQKLRVKKIHENEKRLEAGDHPVELLARDCQAVSARKAKIKSEM(配列番号20)を含んでなるOsteoAngioRemodeling(OAR)タンパク質をコードする。よって、本願を通じて記載される配列番号20のポリペプチドの全ての特徴および用途は、クローン158523_106-030-2-0-A3-Fに含まれる核酸によってコードされるポリペプチドについても当てはまることが理解されよう。さらに、本願を通じて記載される配列番号19のポリヌクレオチドの全ての特徴および用途は、クローン158523_106-030-2-0-A3-Fに含まれる核酸についても当てはまることが理解されよう。本発明の好ましい実施形態は配列番号19、配列番号20またはクローン158523_106-030-2-0-A3-Fを含んでなる組成物に向けられる。また、本明細書に記載されるような生物活性を有するポリペプチド断片およびそれらの断片をコードするポリヌクレオチドも好ましい。本発明のもう1つの好ましい実施形態は、本明細書に記載の生物活性を有するものをはじめ、配列番号20:LLARDCQAVSARK内の少なくとも6個のアミノ酸のポリペプチド断片を含んでなる組成物およびそれに対応するポリヌクレオチドに向けられる。本発明の好ましいポリペプチドとしては、KKIHENEKRLEAGDHPVELLARDCQAVSARKAKIKSEMを含んでなる配列番号20のポリペプチド断片およびそれに対応するポリヌクレオチドが挙げられる。本発明のさらなる好ましいポリペプチドとしては、DYIGPCKYIPPCLDSELTEFPLRMRDWLKNVLVTLYERDEDNNLLTEKQKLRVKKIHENEKRLEAGDHPVELLARDCQAVSARKAKIKSEMを含んでなる配列番号20のポリペプチド断片およびそれに対応するポリヌクレオチドが挙げられる。本明細書に記載されるような生物活性を有する配列番号20のポリペプチド断片およびそれをコードするポリヌクレオチドも本発明に含まれる。生物活性としては、骨芽細胞と接触させたときの骨密度の増加、組織リモデリング（再構築）および創傷治癒が挙げられる。
【０４２４】
配列番号20のOsteoAngioRemodeling(OAR)タンパク質のポリペプチドはヒトオステオネクチン(SPARC/ BM-40ともいう)タンパク質のカルボキシ末端変異体をコードする。OARは 配列番号19のポリヌクレオチドによりコードされ、全長オステオネクチンcDNAの選択的スプライス変異体に相当する。このスプライス変異体は303アミノ酸のオステオネクチンタンパク質の219番の残基で始まる選択的なカルボキシ末端15アミノ酸の存在を特徴とする。
【０４２５】
OARは、オステオネクチン同様、非コラーゲン性の細胞外マトリックス会合型タンパク質である。発現は骨芽細胞、血小板および血管上皮をはじめとする多くの細胞型で見られ、増殖および細胞外マトリックス(ECM)リモデリングの部位でアップレギュレートされる。OARは、そのドメイン面が構造およびタンパク質-タンパク質相互作用を媒介するモジュール型タンパク質である。OARは2つのEFハンドモチーフのうち1つを含む全長オステオネクチンのドメインIVを欠く。OARはコラーゲン、PDGFおよびFGFなどの分子と結合する。コラーゲン型結合特異性は一部にはアミノ酸71および99の異なったN-グリコシル化により決定される。この調節レベルは組織特異的であり、従って、骨由来のOARはコラーゲンI、IIIおよびVに結合し、卵黄嚢由来のOARはIIIおよびVにしか結合せず、血小板由来OARはコラーゲンには全く結合しない。さらに、低pH条件では結合が低下する。OARは細胞の移動性、増殖、骨および組織のリモデリング、ならびにメタロプロテイナーゼ産生を調節するうえである役割を果たす。OARは骨粗鬆症、骨関節炎、アテローム性動脈硬化症、血管形成、肥満症および転移性腫瘍に関与する。
【０４２６】
OARは骨の密度および再構築の増強に関連する。OARはまた、骨の再構築に重要なメタロプロテイナーゼ産生に関連する。ある好ましい実施形態としては、本発明のOARポリペプチドは、例えば、骨芽細胞を刺激する量のOARを骨芽細胞培養系に加えて骨の生産を高めることによるなど、当技術分野で一般的な方法を用いて骨芽細胞の活性を高めるために用いられる。この実施形態は研究または置換療法を含む目的に向けて骨芽細胞の生産性を高めるために適用される。さらなる実施形態として、OARは、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるGerber, H.,ら (1999) Nat. Med. 5:623-8に記載されるものなどの骨再構築方法において用いられる。例えば、OARは、OARを培養骨芽細胞と接触させることでメタロプロテイナーゼまたはオステオカルシン産生を誘導することにより骨芽細胞の分化および骨再構築を促進する方法において用いられる。さらにまたOARは、OARを、例えば骨折部位である場合が多い大腿骨の増殖板または股関節部などの潜在的骨増殖域と接触させ、in vivoにおいて骨芽細胞分化を促進させる方法において用いられる。有効量のOARを注射およびその他当技術分野で一般的な方法によってこの部位に送達し、有効性はX線または全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるはDelany, A.ら (2000) J. Clin. Invest. 105: 915-23に記載の方法などのいずれかの好適な方法を用いて判定する。
【０４２７】
特定の組織に由来する細胞は特定のコラーゲンに接着している。OARは例えば上皮および骨組織で見られるI、IIIおよびV型コラーゲンと結合する。これにより、ECM中のコラーゲンと細胞表面接着分子との通常の相互作用を阻害することにより、OARを抗接着因子として働かせることができる。この活性は細胞の移動および分化に関連する。さらにまたOARは、ECMの分解と組織リモデリングをもたらすメタロプロテイナーゼ発現の増強とも関連する。よって、本発明の好ましい実施形態は、OARを骨芽細胞と接触させてコラーゲンと細胞との結合を阻害し、組織のリモデリングを可能とする、組織リモデリングにおけるOARの使用方法に向けられる。さらに、創傷治癒(例えば、外科的損傷または糖尿病性潰瘍などの慢性症状からの治癒)、組織移植、OARと結合するI、IIIおよびV型コラーゲンを含むECM環境における壊死または低酸素組織においてOARを用いる方法も好ましい。これらの症状を治療する方法としては、i)修復の必要な組織のECMを、当技術分野で一般的な方法を用いてOARと結合するものとして特定し(例えば、蛍光標識OARをECRサンプルに適用して、顕微鏡により可視化する)、ii)直接または注射により創傷領域に有効量のOARを局在させ、iii)OARが細胞接着を阻害することからECMの再構築を生じさせることを含んでなる工程を含む。
【０４２８】
オステオネクチンは血管の形成を調節するVEGFに結合する。この相互作用はVEGFのその受容体への結合を妨げる。このOARポリペプチドはVEGF結合ドメインを欠くが、ECMと結合して再構築に影響を及ぼす能力は保持している(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Kupprion, C.ら (1998) J. Biol. Chem. 273:29635-40)。本発明のある好ましい実施形態では、OARポリペプチドは、創傷治癒および組織リモデリングを媒介するECMの相互作用の他、VEGF活性を必要とする症状においてオステオネクチンを代替するために用いられる。これは、少なくともVEGFおよびVEGF応答性細胞を含む培養下の細胞または組織サンプルを得、ii)この培養物にECM結合に有効な量のOARを加え、iii)血管形成および組織治癒を目的にOARをECM再構築ならびにVEGFシグナル伝達可能とさせることを含んでなる工程で達成される。さらに、オステオネクチンの発現は、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるNakamura, S.ら (1996) Arthritis Rheum. 39:539-51に記載のようにして、IL-1を罹患領域に導入することにより阻害することができる。さらなる実施形態として、本発明は壊死または低酸素組織、組織移植片および骨関連組織の成長および治癒に適用される。OARポリペプチドは、注射または目的組織に特異的なターゲッティング分子と融合させたOARポリペプチドの使用など、当技術分野で一般的な方法を用いてこれらの組織へ送達される。
【０４２９】
極端な場合、ECMから細胞表面までの「接触阻害」が低下すれば、腫瘍形成および転移につながる。OARは細胞とECM中の特定のコラーゲン型との接触を阻害するので、OARは乳癌および前立腺癌をはじめとするいくつかの腫瘍細胞型の転移に関与している。本発明のある好ましい実施形態では、OARポリペプチドは、ECM浸潤を防ぐためにそのコラーゲン結合活性の阻害剤を開発する目的で用いられる。この浸潤は慢性関節リウマチ、ならびに乳癌および前立腺癌をはじめとする癌で見られるような、不適切な組織への細胞の増殖を含む。OARの阻害剤はOARポリペプチドのカルボキシ末端の15アミノ酸に対して作製された抗体およびOARコラーゲン結合活性を妨げる小分子を含む。ECM環境に対するOARの結合は、蛍光標識OARを組織サンプルに適用して顕微鏡により可視化するなど、当技術分野で一般的な方法を用いて判定される。OAR阻害剤の有効性は、上述の方法を用いるか、または全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるKato, Y.ら (1998-99) Invasion Metastasis 18:105-147に記載されているようにECMの細胞浸潤を観測することで判定される。この実施形態の使用例としては、i)当技術分野で一般的な方法(例えば、アフィニティークロマトグラフィー)を用いて抗体などのOAR阻害剤を精製し、ii)組織イメージング、X線または触診などの当技術分野で一般的な方法を用いて不適切なECM浸潤の部位を判定し、iii)その部位に有効量のOAR阻害剤を局在させて、細胞表面-コラーゲン相互作用を可能となし、ECM浸潤を防ぐ工程を含んでなる方法が挙げられる。OAR阻害剤の局在化は注射などの当技術分野で一般的な方法を用いて行う。さらに、目的の組織に特異的なターゲッティング分子と融合させたOARポリペプチドを送達するための方法も本発明に含まれる。
【０４３０】
OARはPDGFをはじめとする増殖因子と結合し、細胞の移動および増殖を誘導することができ、特定の条件下で増殖因子とその受容体との結合を阻害する。本発明のある好ましい実施形態として、OARポリペプチドは、PDGF受容体などの増殖因子受容体を介するシグナル伝達を阻害するために用いられる。この実施形態は、皮膚の繊維芽細胞(例えば、過形成性瘢痕の場合)および血小板(例えば、悪性リンパ腫の場合)などのPDGF応答性細胞の不適切な増殖を防ぐ上で有用である。この実施形態は例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるNedelec, B.ら (2000) J. Burn Care Rehabil. 21:205-12に記載の方法を用いて過剰な瘢痕組織を有する領域を特定し;有効量のOARを直接または注射により瘢痕へ投与し;上述の方法または当技術分野で一般的な他の方法を用いてその瘢痕をモニタリングすることにより、過形成瘢痕の体積を減じるために行われる。
【０４３１】
配列番号30のタンパク質(内部表示クローン133431_105-092-4-0-G11-F)
クローン133431_105-092-4-0-G11-FのcDNA(配列番号29)はアミノ酸配列:
MGRTREAGCVAAGVVIGAGACYCVYRLAWGRDENEKIWDEDEESTDTSXIGVETVKGAKTNAGAGSGAKLQGDSEVKPEVSLGLEDCPGVKEKAHSGSHSGGGLEAKAKALFNTLKEQASAKAGKGARVGTISGNRTLAPSLPCPGGRGGGCHPTRSGSRAGGRASGKSKGKARSKSTRAPATTWPVRRGKFNFPYKIDDILSAPDLQKVLNILERTNDPFIQEVALVTLGNNAAYSFNQNAIRELGGVPIIAKKKKK(配列番号30)を有するALEX-1タンパク質の変異体をコードする。本願を通じて記載される配列番号30のポリペプチドの全ての特徴および用途は、クローン133431_105-092-4-0-G11-Fに含まれる核酸によりコードされるポリペプチドについても当てはまることが理解されよう。さらに、本願を通じて記載される配列番号29のポリヌクレオチドの全ての特徴および用途は、クローン133431_105-092-4-0-G11-Fに含まれる核酸についても当てはまることが理解されよう。本発明のある好ましい実施形態は配列番号29、配列番号30およびクローン133431_105-092-4-0-G11-Fの組成物に向けられる。また、本明細書に記載のような生物活性を有するポリペプチド断片およびそれらの断片をコードするポリヌクレオチドも好ましい。配列番号29の遺伝子はX染色体上に位置する。それはデスエフェクター(death effector)ドメインを有する新規なアルマジロリピートタンパク質をコードし、細胞間接着、細胞シグナル伝達およびアポトーシスプロセスに関与し、本明細書ではアルマポプチン(Armapoptin)と呼ばれる。
【０４３２】
アルマポプチンは胚発達中の細胞の増殖と分化を促進する。これは細胞間接着、アクチン細胞骨格と隣接細胞との固着、細胞接着に応答して細胞の極性および上皮の形成を開始させるシグナル、を媒介するマルチタンパク質複合体の一部である。アルマポプチン複合体はE-カドヘリン、およびβ-カテニンをはじめとする種々のカドヘリン結合タンパク質を含み、腺腫性大腸ポリープ症(Adenomatous Polyposis Coli: APC)などの遺伝性大腸癌では突然変異している腫瘍抑制タンパク質とも会合することができる。正常な分化プロセスおよび悪性増殖での細胞間接着は、マルチタンパク質複合体の構築のための足場として働くアルマジロドメインにより媒介される。
【０４３３】
アルマポプチンのN末端領域は残基RLAWGRDENEKIWDEDEESを含んでなるデスエフェクタードメイン(DED)を含む。デスエフェクタードメインはカスパーゼ依存性のアポトーシスプロセスに関与する。アルマポプチンは大部分の組織で発現するが、患者の乳癌生検、ならびに卵巣癌、子宮頸癌細胞、肺癌をはじめとする上皮に基づく腫瘍細胞系およびt-HUE2などの不死化内皮細胞系では発現しないか、著しく発現が低い。
【０４３４】
ある実施形態では、アルマポプチンポリヌクレオチドは、好ましくは乳癌、卵巣癌、肺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)および頭頸部扁平細胞癌(SCCHN)をはじめとする上皮細胞に基づく腫瘍において、カスパーゼ依存性アポトーシスを促進するための、また、細胞間接着を回復させるための、遺伝子治療法に用いられる。遺伝子治療法において用いる好ましいアルマポプチンの組成物は、「アルマポプチンの遺伝子治療用組成物」とも称され、配列：
aatcctagtcttcgtttggtccggttgcactcttcctatagcccagagggcgagagggcctgtggcctgggggaaggaggacgaggttctgcctggatcccagcaggacgctgtgccatttgggaacaaaggaatagtctgcctggaatccctgcagatcttggggccggaggccagtccaacccttggagcaggaagaaacgcaaagttgtcaagaaccaagtcgagctgcctcagagccggcccgcagtagctgcagactccgcccgcgacgtgtgcgcgcttctctgggccagagcgagcctgttttgtgctcgggttaagagatttgtcccagctataccgcgtggccgctggtgtggttatcggggctggtgcctgctactgtgtatacagactggcttggggaagagacgagaacgagaaaatctgggacgaagacgaggagtctacggacacctcakagattggggttgagactgtgaaaggagctaaaactaacgctggggcagggtctggggccaaacttcagggtgattcagaggtcaagcctgaggtgagtttgggactcgaggattgtccgggtgtaaaagagaaggcccattcaggatcccacagcggaggtggcctagaggccaaggccaaggcccttttcaacacgctgaaggaacaggcaagtgcaaaggcaggcaaaggggctagggtgggtaccatctctgggaacaggacccttgcaccgagtttaccctgcccaggaggcaggggtggaggctgccaccccaccaggagtggatctagggccgggggcagggcaagtggaaaatccaagggaaaggcccgaagtaagagcaccagggctccagctacaacatggcctgtccggagaggcaagttcaactttccttataaaattgatgatattctgagtgctcccgacctccaaaaggtcctcaacatcctggagcgaacaaatgatccttttattcaagaagtagccttggtcactctgggtaacaatgcagcatattcatttaaccagaatgccatacgtgaattgggtggtgtcccaattattgcaaaaaaaaaaaaaaaa、または
tctgagtacc agctccccac tgccctgagg gcgggccggc ctgcggcgga gggaaaaaggaagaggagaa ggaaattgtc ccgaatccct gcagtgggtc caagcctctc ccgggtggccagtctttctg taggttgcgg cacaacgcca ggcaaaagaa gaggaaggaa tttaatcctaatcggtggag gtcgatttga gggtctgctg tagcaggtgg ctccgcttga agcgagggaggaagtttcct ccgatcagta gagattggaa agattgttgg gagtggcacaccactagggaaaagaagaag gggcgaactg cttgtcttga ggaggtcaac ccccacaatc agctcttgtggccttgaagt ggctgaagac gatcaccctc cacaggcttg agcccagtcc cacagccttcctcccccagc ctgagtgact actctattcc ttggtccctg ctattgtcgg ggacgattgcatgggctacg ccaggaaagt aggctgggtg accgcaggcc tggtgattgg ggctggcgcctgctattgca tttatagact gactagggga agaaaacaga acaaggaaaa aatggctgagggtggatctg gggatgtgga tgatgctggg gactgttctg gggccaggta taatgactggtctgatgatg atgatgacag caatgagagc aagagtatag tatggtaccc accttgggctcggattggga ctgaagctgg aaccagagct agggccaggg caagggccag ggctacccgggcacgtcggg ctgtccagaa acgggcttcc cccaattcag atgataccgt tttgtcccctcaagagctac aaaaggttct ttgcttggtt gagatgtctg aaaagcctta tattcttgaagcagctttaa ttgctctggg taacaatgct gcttatgcat ttaacagaga tattattcgtgatctgggtg gtctcccaat tgtcgcaaag attctcaata ctcgggatcc catagttaaggaaaaggctt taattgtcct gaataacttg agtgtgaatg ctgaaaatca gcgcaggcttaaagtataca tgaatcaagt gtgtgatgac acaatcactt ctcgcttgaa ctcatctgtgcagcttgctg gactgagatt gcttacaaat atgactgtta ctaatgagta tcagcacatgcttgctaatt ccatttctga cttttttcgt ttattttcag cgggaaatga agaaaccaaacttcaggttc tgaaactcct tttgaatttg gctgaaaatc cagccatgac tagggaactgctcagggccc aagtaccatc ttcactgggc tccctcttta ataagaaaga gaacaaagaagttattctta aacttctggt catatttgag aacataaatg ataatttcaa atgggaagaaaatgaaccta ctcagaatca attcggtgaa ggttcacttt ttttcttttt aaaagaatttcaagtgtgtg ctgataaggt tctgggaata gaaagtcacc atgatttttt ggtgaaagtaaaagttggaa aattcatggc caaacttgct gaacatatgt tcccaaagag ccaggaataacaccttgatt ttgtaattta gaagcaacac acattgtaaa ctattcattt tctccaccttgtttatatgg taaaggaatc ctttcagctg ccagttttga ataatgaata tcatattgtatcatcaatgc tgatatttaa ctgagttggt ctttaggttt aagatggata aatgaatatcactacttgtt ctgaaaacat gtttgttgct ttttatctcg ctgcctagat tgaaatattttgctatttct tctgcataag tgacagtgaa ccaattcatc atgagtaagc tcccttctgtcattttcatt gatttaattt gtgtatcatc aataaaattg tatgttaatg ctggaagggaaaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa
を含めて、ポリペプチドもしくはその断片をコードする全長DNA配列番号29もしくはその断片を含む組成物である。
【０４３５】
さらに、pCMVbまたはpSVbなどのプラスミドベクター、MUC1プロモーター（上皮細胞特異的発現を可能とし、かつ、悪性状態でアップレギュレートされる）、および全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Patel, 米国特許第6,225,090号, 2001, Thierry, 米国特許第6,110,490号, 2000; Wolff,ら, 米国特許第6,228,844号, 2001, Graham,ら, Int.J.Cancer 92:382-387, 2001, Zhouら, Cancer Res. 61:2328-2334, 2001に記載の方法によりリポソーム送達系を用いる乳癌のためのP450aromプロモーターIIなど、組織特異的プロモーター含有プラスミドへの、アルマポプチンの遺伝子治療用組成物のPCRに基づくサブクローニングからなる組成物も好ましい。さらに、アデノウイルスベクター(Beach,ら, 米国特許第5,968,821号, 1999,および同第6,211,334号, 2001; Mehtali,ら, 米国特許第6,204,060, 2001)、および全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるHolt,ら, 米国特許第6,177,410号, 2001に記載の方法に従って、分裂細胞、すなわち腫瘍組織に遺伝子送達するためのMoMLVに基づくレトロウイルスベクターにクローニングされた本発明のポリヌクレオチドを含んでなる組成物も好ましい。
【０４３６】
アルマポプチンポリヌクレオチドおよびその断片の好ましい組成物を送達するための方法は、本発明の好ましい組成物の腫瘍組織または周辺の血管への局所注射、またはex vivo療法を含む。さらなる方法としては、抗体または腫瘍特異的受容体を認識する他のリガンドを介してプラスミド内のアルマポプチンポリヌクレオチドまたはその断片の腫瘍組織特異的ターゲッティングを含んでなる。これらのリガンドはポリ-L-リジンなどのポリカチオンまたはリポソームと共有結合させ、アルマポプチンの好ましい遺伝子治療用組成物と複合体を形成させる。遺伝子治療法に用いる好ましい腫瘍細胞型としては、齧歯類およびヒトをはじめとする哺乳類に由来する乳癌、子宮頸癌、卵巣癌、肺癌および頭頸部扁平細胞癌が挙げられる。治療効力の評価としては、腫瘍周縁の測定によってモニタリングされるようなアルマポプチンの好ましい遺伝子治療用組成物を送達した後の腫瘍退縮を含む。アポトーシスは細胞質の凝縮、細胞の球形化および解離をはじめとする形態学的評価により、また、生存能、細胞死およびカスパーゼ活性に関するミトコンドリアの機能を測定するMTTアッセイにより、また、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるNoteborn,ら 米国特許第5,981,502, 1999; Boone,ら, J.Biol.Chem. 275:37596-37603, 2000; Shibata,ら, Cancer Gene Therapy. 8:23-35, 2001; Lacour,ら, Cancer Research 61:1645-1651, 2001)により記載されるようなDNA断片化アッセイにより測定する。
【０４３７】
さらなる実施形態としては、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるEberstadt,ら, Nature.392:941-945, 1998およびHackam,ら, J.Biol.Chem.275:41299-41308, 2000に記載されているようなRLAWGRDENEKIWDEDEESおよびFADD DED関連ドメインを、コンセンサス配列SSYRVLLLLISEELDSEELEVLLFLCNDDIPKRKLEIKTALDLFSALEEQGLLSEDNLSLLAELLYRLRRLDLLRRLFGとともに含む好ましい配列のポリペプチドを含んでなる組成物を癌細胞とインキュベートすることを含む、カスパーゼ依存性細胞死における治療上の使用のための推定デスエフェクタードメインを含む。
【０４３８】
さらに、これらのDEDドメインをコードする配列を発現ベクターにサブクローニングし、上記のように細胞のトランスフェクションおよびアポトーシス研究に用いる。
【０４３９】
もう1つの実施形態では、アルマポプチンポリペプチドまたはその断片は、細胞特異的(例えば腫瘍細胞特異的)抗体と、あるいは腫瘍細胞特異的受容体により認識されてインターナライズされるリガンドと、共有結合または非共有結合させることで免疫治療薬として用いられる。本発明で用いられる、腫瘍細胞では豊富に発現するがインタクトな休止組織では発現しない受容体としては、H11[(C抗原); Dan,ら, 米国特許第6,207,153号, 2001]、erbB-2(HER-2-neu)をはじめとするチロシン増殖因子受容体(Suzukiら, Biochim Biophys Acta.1525:191-196, 2001; Kumarら, Semin Oncol.27:84-91, 2000; Langoら, Current Opin Oncol.13:168-175, 2001)、葉酸受容体(Ward, Current Opin Mol Ther.2:182-187, 2000)、ヒト上皮増殖因子受容体(Schlessingerら, 米国特許第6,217,866号, 2001)、および腫瘍血管のターゲティングのための内皮細胞上のエンドグリン(Seon, 米国特許第6,200,566号, 2001)が挙げられ、これらの全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【０４４０】
デスエフェクタードメインは、健康な個体の野生型ハンチンチン(huntingtin)とは対照的に疾病を引き起こす変異型グルタミンリッチタンパク質と強く会合することによってハンチントン舞踏病において神経細胞死を引き起こす(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるHackamら, J.Biol.Chem. 275:41299-41308, 2000)。もう1つの実施形態では、野生型ハンチンチンと病因変異体の競合結合研究のために、アルマポプチンおよびALEX-1、デスエフェクタードメインRLAWGRDENEKIWDEDEESを含むその部分配列、およびコンセンサスペプチドSSYRVLLLLISEELDSEELEVLLFLCNDDIPKRKLEIKTALDLFSALEEQGLLSEDNLSLLAELLYRLRRLDLLRRLFGを有する関連配列の中で保存されているハンチンチン相互作用タンパク質(HIP-1)のデスエフェクタードメインを用いる。本発明のポリペプチドを野生型および変異型(グルタミンリッチ)ハンチンチンと接触させることにより、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるScalleyら, Biochemistry. 38:15927-15935, 1999; Chaillan-Huntingtonら, J Biol Chem. 275:5874-5879, 2000; Lohnerら, Biochim Biophys Acta.1462:141-156, 1999; Eberstadtら, Nature 392:941-945, 1998に記載されているように以下の工程を用い、ペプチド-タンパク質相互作用が生物物理学的方法により分析される。
【０４４１】
変性状態における構造遷移、蛍光エネルギー移動、ならびに相対的Kd値および相互作用の強度を求めるための円二色性等温滴定熱量計、蛍光結合アッセイおよび示差走査熱量計を用いたペプチドのコンフォメーションおよび構造特性の決定。
【０４４２】
NMRおよびX線結晶学によるポリペプチド/ハンチンチン複合体の構造決定。293T細胞のような細胞系とタンパク質-ペプチド複合体との同時インキュベーション、および細胞傷害性アッセイのための野生型および変異型ハンチンチンをコードするプラスミドおよびクローン化オリゴヌクレオチドによる細胞の同時トランスフェクションは当技術分野で周知である。
【０４４３】
もう1つの実施形態としては、癌または細胞間接着の回復が望まれるその他の疾病または疾患の治療または予防における、細胞間接着の回復のための、単一リピートとしてのNFPYKIDDILSAPDLQKVLNILERTNDPFIQEVALVTLGNNAAおよびYSFNQNAIRELGGVPIIAKLIKTKDPIIREKTYNALNNLSV、ならびに天然に存在するタンデムアレイリピートNFPYKIDDILSAPDLQKVLNILERTNDPFIQEVALVTLGNNAAYSFNQNAIRELGGVPIIAKLIKTKDPIIREKTYNALNNLSVをはじめとするアルマポプチンのアルマジロリピートを用いる方法を含み、この方法は、細胞間接着を必要とする細胞を、細胞間接着回復量の本発明のアルマポプチンポリペプチドの単量体、あるいは二量体、三量体またはより長いリピートなど組換え的または非組換え的いずれかのコンカテマー化形態と接触させることを含む。
【０４４４】
配列番号26のタンパク質(内部表示クローン545542_182-1-2-0-D12-F)
クローン545542_182-1-2-0-D12-FのcDNA(配列番号25)はアミノ酸配列:
MLGARLRLWVCALCSVCSMSVLRAYPNASPLLGSSWGGLIHLYTATARNSYHLQIHKNGHVDGAPHQTIYSALMIRSEDAGFVVITGVMSRRYLCMDFRGNIFGSHYFDPENCRFQHQTLENGYDVYHSPQYHFLVSLGRAKRAFLPGMNPPPYSQFLSRRNEIPLIHFNTPIPRRHTRSAEDDSERDPLNVLKPRARMTPAPASCSQELPSAEDNSPMASDPLGVVRGGRVNTHAGGTGPEGCRPFAKFI(配列番号26)を含んでなる、251アミノ酸のヒト繊維芽細胞増殖因子-22タンパク質(FGF-22)をコードする。よって、本願を通じて記載される配列番号26のポリペプチドの全ての特徴および用途は、クローン545542_182-1-2-0-D12-Fに含まれる核酸によりコードされるポリペプチドについても当てはまることが理解されよう。さらに、本願を通じて記載される配列番号25のポリヌクレオチドの全ての特徴および用途は、クローン545542_182-1-2-0-D12-Fに含まれる核酸についても当てはまることが理解されよう。本発明のある好ましい実施形態は配列番号25、配列番号26およびクローン545542_182-1-2-0-D12-Fの組成物に向けられる。また、本明細書に記載されるような生物活性を有するポリペプチド断片およびそれらの断片をコードするポリヌクレオチドも好ましい。
【０４４５】
FGFは繊維芽細胞増殖因子受容体1(FGFR-1)、繊維芽細胞増殖因子受容体2(FGFR-2)、繊維芽細胞増殖因子受容体3(FGFR-3)および繊維芽細胞増殖因子受容体4(FGFR-4)と呼ばれる固有のキナーゼ活性を有する同族の1回膜貫通型ヘパリン結合性繊維芽細胞増殖因子受容体(FGFR)との相互作用を通じてそれらの生物学的作用を及ぼす。生理学的には、FGFはコアタンパク質と共有結合した硫酸化グリコサミノグリカンであるヘパリン硫酸プロテオグリカンと結合する。ヘパリン様部分と結合する能力には、ペプチド増殖因子のより包括的なヘパリン結合増殖因子(HBGF)スーパーファミリーに属するFGFが含まれる。さらに、FGFは、その他のFGFRに対して相互に排他的な様式で、内在性の1回膜貫通タンパク質であるシステインリッチFGF-R(CFR)と結合する。
【０４４６】
FGF-22は胚および成体生物において時間的および空間的発現のパターンを示すが、視床腹外側核および視床をはじめとする脳での発現が最も強い。FGF-22は、配列番号25のG527AおよびC535T各々の位置でのFGF-22ヌクレオチドの転移によって起こる、配列番号26のFGF-22ポリペプチド残基ARG176GLNおよびARG179TRP各々におけるミスセンス変異によって表される遺伝性疾患の常染色体優性遺伝性低リン血症性くる病(ADHR)と直接関連している。
【０４４７】
本発明のある実施形態としては、腎組織または細胞を、in vitroまたはin vivoにおいて、有効量のFGF-22ポリペプチドと接触させる工程を含んでなる、血清リン酸レベルを生理学上許容される濃度内に高める方法が含まれる。本発明のポリペプチドは、投与のための生理学上許容される組成物を得るために好適な生理学上許容される担体と組み合わせて使用してもよい。このような組成物は治療に有効な量のFGF-22ポリペプチドおよび生理学上許容される担体または賦形剤を含んでなる。このような担体としては、限定されるものではないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組合せが挙げられる。製剤は投与様式に適したものとすべきである。好ましくは、腎細胞はネフロン尿細管ならびに尿細管再吸収および／または遠位もしくは集合尿細管を変化させ得る関連血管構成要素(これらをまとめて糸球体嚢と呼ぶ)である。好ましくは、FGF-22ポリペプチドを個体に投与することによって腎組織または細胞に接触させる。本明細書において使用する「個体」とは、限定されるものではないが、ヒトをはじめとする動物界のメンバーを包含する。好ましくは、FGF-22ポリペプチドは非経口的に、より好ましくは腹腔内に投与される。
【０４４８】
さらに骨組織(骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞)を骨軟化症の予防に有効な量のFGF-22ポリペプチドと接触させることを含んでなる、骨軟化症または腫瘍性骨軟化症を改善する方法も本発明に含まれる。本発明のポリペプチドは投与のための生理学上許容される組成物を得るために好適な生理学上許容される担体と組み合わせて使用してもよい。このような組成物は治療に有効な量のFGF-22ポリペプチドおよび生理学上許容される担体または賦形剤を含んでなる。このような担体としては、限定されるものではないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組合せが挙げられる。製剤は投与様式に適したものとすべきである。好ましくは、FGF-22ポリペプチドを個体に投与することによって骨組織または細胞に接触させる。好ましくは、FGF-22ポリペプチドは非経口的に、より好ましくは腹腔内に投与される。
【０４４９】
本発明のもう1つの実施形態では、骨組織(骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞)を骨減少症の予防に有効な量のFGF-22ポリペプチドと接触させることを含んでなる、骨減少症を改善する方法である。本発明のポリペプチドは投与のための生理学上許容される組成物を得るために好適な生理学上許容される担体と組み合わせて使用してもよい。このような組成物は治療に有効な量のFGF-22ポリペプチドおよび生理学上許容される担体または賦形剤を含んでなる。このような担体としては、限定されるものではないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組合せが挙げられる。製剤は投与様式に適したものとすべきである。好ましくは、FGF-22ポリペプチドを個体に投与することによって骨組織に接触させる。好ましくは、FGF-22ポリペプチドは非経口的に、より好ましくは腹腔内に投与される。
【０４５０】
本発明のもう1つの実施形態では、骨組織(骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞)を、類骨沈着または類骨石灰化の刺激に有効な量のFGF-22ポリペプチドと接触させることを含んでなる、先天性奇形、骨形成不全症(タイプI-IV)、骨粗鬆症(タイプIおよび／またタイプII)、くる病、骨折部位の再構築、外科的修復および再生に関連した、ならびに類骨石灰化または沈着障害に関連した欠陥をはじめとする骨基質沈着を弱める方法である。本発明のポリペプチドは投与のための生理学上許容される組成物を得るために好適な生理学上許容される担体と組み合わせて使用してもよい。このような組成物は治療に有効な量のFGF-22ポリペプチドおよび生理学上許容される担体または賦形剤を含んでなる。このような担体としては、限定されるものではないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組合せが挙げられる。製剤は投与様式に適したものとすべきである。好ましくは、FGF-22ポリペプチドを個体に投与することによって骨組織に接触させる。好ましくは、FGF-22ポリペプチドは非経口的に、より好ましくは腹腔内に投与される。
【０４５１】
本発明のもう1つの実施形態では、下顎または上顎の、好ましくは、歯肉溝領域に隣接してある口腔骨組織(骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞)を有効量のFGF-22ポリペプチドと接触させることを含んでなる、歯の腫瘍(歯根尖端周囲もしくは歯周)形成もしくは進行、先天性もしくは誘導性無歯状態、または必然的ないし選択的抜歯に関連した顎変形(jaw atropy)または骨吸収を改善する方法である。本発明のポリペプチドは投与のための生理学上許容される組成物を得るために好適な生理学上許容される担体と組み合わせて使用してもよい。このような組成物は治療に有効な量のFGF-22ポリペプチドおよび生理学上許容される担体または賦形剤を含んでなる。このような担体としては、限定されるものではないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組合せが挙げられる。製剤は投与様式に適したものとすべきである。好ましくは、FGF-22ポリペプチドを個体に投与することによって骨組織に接触させる。好ましくは、FGF-22ポリペプチドは非経口的に、いずれかの便宜な様式により、典型的にはシリンジまたはカテーテルにより目的とする骨接合箇所に投与される。
【０４５２】
本発明のさらなる実施形態では、上顎および／もしくは下顎の口腔骨組織(骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞)、ならびに骨組織、すなわち、自己もしくは同種骨移植片、または歯科治療用生体材料マトリックス、すなわち、歯科インプラントデバイス内に組み入れられたサンゴもしくはヒドロキシアパタイト、あるいはインプラント周囲領域の生体吸収性セメントを、有効量のFGF-22ポリペプチドと接触させることを含んでなる、歯科インプラント補綴物の骨形成を促進する方法である。抜歯後、インプラント骨切り術の準備をし、生体吸収性セメント中に含めたFGF-22ポリペプチドを骨切り術範囲内の周囲に置いた。FGF-22歯科用セメントを含む準備された部位にインプラント補綴物を配置した(Merawら,(J Periodontol 71: 8-13, 2000))。好ましくは、FGF-22ポリペプチドを個体に投与することによって骨組織に接触させる。本発明のポリペプチドは投与のための生理学上許容される組成物を得るために好適な生理学上許容される担体と組み合わせて使用してもよい。このような組成物は治療上有効な量のFGF-22ポリペプチドおよび生理学上許容される担体または賦形剤を含んでなる。このような担体としては、限定されるものではないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組合せが挙げられる。製剤は投与様式に適したものとすべきである。好ましくは、FGF-22ポリペプチドは非経口的に、いずれかの便宜な様式により、典型的にはシリンジまたはカテーテルにより目的とする骨接合箇所に投与される。FGF-22ポリペプチドは選択的にあるいは追加的に、Illi(米国特許第6,214,008号/PCT WO98/46289)、GayerおよびComfort(米国特許第6,214,049号)の方法を用いて歯科インプラントの生物分解性マトリックスと結合させて、および／または全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Merawら(J Periodontol 71: 8-13, 2000)の方法を用いて生物吸収性セメントと結合させて直接投与される。
【０４５３】
本発明のさらなる実施形態は、股関節、好ましくは、寛骨臼領域および／または大腿骨頭の、インプラントが局在する骨組織(骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞)を、刺激に有効な量のFGF-22ポリペプチドと接触させることを含んでなる、股関節形成を目的とした股関節インプラント補綴術の整形外科的骨結合に先立って大腿骨頭の寛骨臼侵食または骨壊死を軽減するための骨接合を促進する方法である。本発明のポリペプチドは投与のための生理学上許容される組成物を得るために好適な生理学上許容される担体と組み合わせて使用してもよい。このような組成物は治療上有効な量のFGF-22ポリペプチドおよび生理学上許容される担体または賦形剤を含んでなる。このような担体としては、限定されるものではないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組合せが挙げられる。製剤は投与様式に適したものとすべきである。好ましくは、FGF-22ポリペプチドを個体に投与することによって骨組織に接触させる。好ましくは、FGF-22ポリペプチドは非経口的に、好ましくは腹腔内、またはいずれかの便宜な様式により、またはシリンジもしくはカテーテルにより目的とする骨接合箇所に投与される。FGF-22ポリペプチドは人工関節インプラントの生物分解性マトリックスとの混和により追加的に投与される。
【０４５４】
本発明のさらなる実施形態は、インプラントが局在する膝関節の骨組織(骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞)を、刺激に有効な量のFGF-22ポリペプチドと接触させることを含んでなる、膝関節形成を目的とした膝関節インプラント補綴術の整形外科的骨結合、または骨軟骨の骨折部位の修復、または整形外科用ピンもしくはネジの配置に先立って大腿骨および／または脛骨および／または膝蓋骨の関節面侵食または骨壊死を軽減するための骨接合を促進する方法である。本発明のポリペプチドは投与のための生理学上許容される組成物を得るために好適な生理学上許容される担体と組み合わせて使用してもよい。このような組成物は治療上有効な量のFGF-22ポリペプチドおよび生理学上許容される担体または賦形剤を含んでなる。このような担体としては、限定されるものではないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組合せが挙げられる。製剤は投与様式に適したものとすべきである。好ましくは、FGF-22ポリペプチドを個体に投与することによって骨組織に接触させる。好ましくは、FGF-22ポリペプチドは非経口的に、好ましくは腹腔内、またはいずれかの便宜な様式により、典型的にはシリンジもしくはカテーテルにより目的とする骨接合箇所に投与される。FGF-22ポリペプチドは人工関節インプラントの生物分解性マトリックスとの混和により追加的に投与される。FGF-22は上皮細胞増殖の強力な誘導物質である。よって、本発明のもう1つの実施形態は、上皮細胞を、in vitroまたはin vivoにおいて、増殖刺激または生存能力増進に有効な量のFGF-22ポリペプチドと接触させることにより、上皮細胞増殖を刺激するまたは上皮細胞の生存能力を高める方法である。さらに具体的に言えば、上皮細胞または組織を、in vitroまたはin vivoにおいて、増殖刺激または生存能力増進に有効な量のFGF-22ポリペプチドと接触させることにより、上皮細胞増殖を刺激するまたは上皮細胞の生存能力を高めることによって、火傷、潰瘍(例えば、糖尿病患者の静脈潰瘍)、老化、術後損傷、疾病、またはその他の傷害の結果などの創傷修復または組織治癒を促進する方法である。本発明のポリペプチドは投与のための生理学上許容される組成物を得るために好適な生理学上許容される担体と組み合わせて使用してもよい。このような組成物は治療上有効な量のFGF-22ポリペプチドおよび生理学上許容される担体または賦形剤を含んでなる。このような担体としては、限定されるものではないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組合せが挙げられる。製剤は投与様式に適したものとすべきである。好ましくは、FGF-22ポリペプチドを個体に投与することによって上皮組織に接触させる。好ましくは、FGF-22ポリペプチドは非経口的に、好ましくは腹腔内、またはいずれかの便宜な様式により、典型的にはシリンジもしくはカテーテルにより直接目的とする上皮増殖箇所に投与される。
【０４５５】
FGF-22は胎児間葉細胞、疎性、膠質性および弾性結合組織の繊維芽細胞、軟骨の軟骨細胞および骨の骨細胞をはじめとする結合組織増殖の強力な調節物質である。よって、本発明のもう1つの実施形態は、繊維芽細胞を、in vitroまたはin vivoにおいて、増殖刺激または生存能力増進に有効な量のFGF-22ポリペプチドと接触させることにより繊維芽細胞増殖を刺激するまたは繊維芽細胞の生存能力を高める方法である。本発明のさらに具体的な実施形態は、結合組織細胞を、in vitroまたはin vivoにおいて、増殖刺激または生存能力増進に有効な量のFGF-22ポリペプチドと接触させることにより結合組織細胞増殖を刺激するまたは結合組織細胞生存能力を高めることによって、火傷、潰瘍、老化、腱および靭帯修復などの術後損傷(Chanら, Acta Orthop Scand 71: 513-518, 2000; Kurodaら, Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc 8: 120-126, 2000)、疾病、またはその他の傷害の結果などの創傷修復または組織治癒をin vitroおよびin vivoにおいて促進する方法である。本発明のポリペプチドは投与のための生理学上許容される組成物を得るために好適な生理学上許容される担体と組み合わせて使用してもよい。このような組成物は治療上有効な量のFGF-22ポリペプチドおよび生理学上許容される担体または賦形剤を含んでなる。このような担体としては、限定されるものではないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組合せが挙げられる。製剤は投与様式に適したものとすべきである。好ましくは、これらの細胞は腱、靭帯、および滑膜に存在する。さらに具体的には、これらの細胞は腱および／または靭帯および／または滑膜内の滑膜細胞の疎性、密性、膠質性および弾性結合組織に存在する繊維芽細胞であり、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Chanら(Acta Orthop Scand 71: 513-518, 2000)およびKurodaら(Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc 8: 120-126, 2000)の方法を用いて接触させる。より好ましくは、繊維芽細胞が、密性結合組織および／またはコラーゲンを活発に合成するように誘導される。好ましくは、FGF-22ポリペプチドを個体に投与することによって結合組織に接触させる。好ましくは、FGF-22ポリペプチドは非経口的に、より好ましくは腹腔内に投与される。
【０４５６】
本発明のさらに具体的な実施形態は、軟骨組織細胞を、in vitroまたはin vivoにおいて、増殖刺激または生存能力増進に有効な量のFGF-22ポリペプチドと接触させることにより軟骨組織細胞増殖を刺激するまたは軟骨組織細胞の生存能力を高めることによって、老化、術後損傷、疾病、またはその他の傷害の結果などの軟骨(硝子軟骨、線維軟骨、弾性軟骨)創傷修復または組織治癒をin vitroおよびin vivoにおいて促進する方法である。本発明のポリペプチドは投与のための生理学上許容される組成物を得るために好適な生理学上許容される担体と組み合わせて使用してもよい。このような組成物は治療上有効な量のFGF-22ポリペプチドおよび生理学上許容される担体または賦形剤を含んでなる。このような担体としては、限定されるものではないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組合せが挙げられる。製剤は投与様式に適したものとすべきである。好ましくは、細胞は間質／内因的成長および／または付加／外生的成長に関連する関節内部および／または関節表面、長骨の先端部(関節軟骨)、肋骨の先端部(肋軟骨)、椎間板、恥骨、膝関節間軟骨、鼻中隔、喉頭、咽頭、気管、気管支、喉頭蓋、胸骨、エウスタキオ管の、さらに外(耳介)、中および内耳の結合線にある。さらに具体的には、細胞が軟骨性結合組織に存在する細胞間質(膠質性または弾性繊維、グリコサミノグリカン、コンドロイチン硫酸マトリックス)再構築細胞(軟骨細胞、軟骨芽細胞、軟骨吸収細胞)であり、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Toolanら(J Biomed Mater Res 31: 273-280, 1996)、Shidaら(J Orthop Res 14: 265-272, 1996)、および／またはChanら(Clin Orthop 342: 239-247, 1997)の方法を用いて接触させる。より好ましくは、軟骨細胞(軟骨細胞、軟骨芽細胞)は細胞間質を活発に合成するように誘導される。好ましくは、FGF-22ポリペプチドを個体に投与することによって結合組織に接触させる。好ましくは、FGF-22ポリペプチドは非経口的に、好ましくは腹腔内、またはいずれかの便宜な様式により、またはシリンジもしくはカテーテルにより目的とする軟骨結合組織生合成箇所に投与される(Chan etalclin Orthop 342: 239-247, 1997)。
【０４５７】
本発明のさらに具体的な実施形態は、骨結合組織細胞を、in vitroまたはin vivoにおいて、増殖刺激または生存能力増進に有効な量のFGF-22ポリペプチドと接触させることにより骨結合組織細胞(骨芽細胞前駆間質幹細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞)増殖を刺激するまたは骨結合組織細胞の生存能力を高めることによって、老化、術後損傷、疾病、またはその他の傷害の結果などの骨(緻密骨、海綿骨)創傷修復または組織治癒をin vitroおよびin vivoにおいて促進する方法である。本発明のポリペプチドは投与のための生理学上許容される組成物を得るために好適な生理学上許容される担体と組み合わせて使用してもよい。このような組成物は治療上有効な量のFGF-22ポリペプチドおよび生理学上許容される担体または賦形剤を含んでなる。このような担体としては、限定されるものではないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組合せが挙げられる。製剤は投与様式に適したものとすべきである。好ましくは、細胞(骨芽細胞前駆体間質幹細胞、骨細胞、骨芽細胞)はリン酸カルシウムや炭酸カルシウムなどの無機塩を含有する間質マトリックス物質ならびにコラーゲン性繊維を活発に合成するように誘導される。骨組織細胞にはMathijssenら(J Craniofac Genet Dev Biol 20: 127-136, 2000)、Reiffら(J Trauma 50: 433-438, 2001)および／またはMackenzieら(Plast Reconstr Surg 107: 989-996, 2001)の方法を用いて接触させる。FGF-22処理の結果を受けて、放射線形態計測学的(異常の放射線不透過率)および組織形態計測学的(新生骨形成の平方ミリメートル)方法を用いて定量的結果のデータが得られる。好ましくは、FGF-22ポリペプチドを個体に投与することによって骨結合組織に接触させる。好ましくは、FGF-22ポリペプチドは非経口的に、好ましくは腹腔内、またはいずれかの便宜な様式により、またはシリンジもしくはカテーテルにより目的とする骨接合箇所に(Radomsky, etalclin Orthop 355 Suppl: S283-S293, 1998)、または(Nakamuraら, J Orthop Res 15: 307-313, 1996; Nakamuraら, Int Orthop 22: 49-54, 1998)の方法を用いた直接骨内注射により投与される。
【０４５８】
FGF-22はCNSの視床腹外側核、振戦麻痺、またはパーキンソン病と関連した領域で発現される。パーキンソン病に対する視床破壊術を用いた外科的介入には腹外側視床に損傷を導入して震えを抑え、さらに硬直を改善することが含まれる。よって、本発明のさらなる実施形態は、視床腹外側組織細胞を、有効量のFGF-22ポリペプチドと接触させる工程を含んでなる、視床腹外側組織を接触させることによってパーキンソン病関連振戦、または関係のない良性本態性振戦を改善する方法である。本発明のもう1つの態様は、in vitroまたは哺乳類の中枢神経系におけるニューロンの形成および／または生存を増進するおよび／または刺激するおよび／または維持するおよび／または再生する方法であって、例えば、in vitroでまたは哺乳類に投与することによって、有効量のFGF-22を中枢神経系のニューロン数の増加をもたらすおよび／またはそれを維持するのに十分な条件下で十分な時間にわたりニューロンまたは神経前駆細胞に接触させることを含んでなる方法に関する。好ましくは、細胞および／または組織がCNSの視床領域内にある。より好ましくは、細胞および／または組織が視床腹側核にある。本発明のポリペプチドは投与のための生理学上許容される組成物を得るために好適な生理学上許容される担体と組み合わせて使用してもよい。このような組成物は治療上有効な量のFGF-22ポリペプチドおよび生理学上許容される担体または賦形剤を含んでなる。このような担体としては、限定されるものではないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組合せが挙げられる。製剤は投与様式に適したものとすべきである。好ましくは、FGF-22ポリペプチドを個体に投与することによってCNS組織に接触させる。好ましくは、FGF-22ポリペプチドは非経口的に、腹腔内、筋肉内投与経路で、または静脈注射により、または遺伝子治療を用いて投与されるが、注入、点滴、脳内注射(Mufsonら, Prog Neurobiol 57: 451-484, 1999)および／またはインプラント(Shultsら, Brain Res 883: 192-204, 2000; Tornqvistら, Exp Neurol 164: 130-138, 2000)および
それらの全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,179,826号に記載されたものなどのさらなる経路が可能である。また、FGF-22は脳に直接投与してもよい。本発明のさらなる実施形態では、FGF-22を使用して神経成長を刺激したり、さらに卒中と関連したまたはアルツハイマー病やAIDS関連症候群などの特定の神経疾患または神経変性疾患で起こる神経損傷を治療および予防したりすることもできる。
【０４５９】
アデノ随伴ウイルス(AAV)は、細胞表面で遍在的に発現されるヘパラン硫酸プロテオグリカンのみならず、哺乳類細胞への感染のための共受容体としてヒトFGFR-1を利用する(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Qingら, Nat Med 5: 71-77, 1999)。同様に、アデノウイルスベクターは、FGFファミリーポリペプチドがそれらのコグネイトFGFRと高親和性で結合する能力を用いて、全身性および局部性疾患を治療するための有効な標的とされる(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Sosnowski, etalcurr Opin Mol Ther 1: 573-579, 1999)。本発明のさらなる実施形態としては、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Hogansonら,(Mol Ther 3: 105-112, 2001)およびQingら(Nat Med 5: 71-77, 1999)の方法を用いて、アデノウイルスまたはAAV送達系の一部としてコードされるFGF-22ポリペプチドまたはキメラポリペプチドを、コグネイトFGFR複合体を発現する細胞に再ターゲッティングさせる方法である。好ましくは、FGF-22ポリペプチドは、Goldmanら(Cancer Res 57:1447-51, 1997)およびDoukasら(FASEB J 13:1459-66, 1999)の方法を用いて、FGF-22に連結された阻止抗アデノウイルスknob Fabフラグメントからなる二官能性コンジュゲートとしてウイルス送達系により、部分的または全体的に、発現される。好ましくは、FGFR複合体はFGFR-1ポリペプチドまたはFGFR-1ポリペプチドリガンド結合部分である。
【０４６０】
配列番号18のタンパク質(内部表示クローン229633_253-2-5-2-A11-F)
クローン229633_253-2-5-2-A11-FのcDNA(配列番号17)はアミノ酸配列:
MDRALQVLQSIDPTDSKPDSQDLLDLEDICQQMGPMIDEKLEEIDRKHSELSELNVKVLEALELYNKLVNEAPVYSVYSKLHPPAHYPPASSGVPMQTYPVQSHGGNYMGQSIHQVTVAQSYSLGPDQIGPLRSLPPNVNSSVTAQPAQTSYLSTGQDTVSNPTYMNQNSNLQSATGTTAYTQQMGMSVDMSSYQNTTSNLPQLAGFPVTVPAHPVAQQHTNYHQQPLL(配列番号18)を含んでなるSTAM-SAPper(STAMSAP)タンパク質をコードする。よって、本願を通じて記載される配列番号18のポリペプチドの全ての特徴および用途は、クローン229633_253-2-5-2-A11-Fに含まれる核酸によりコードされるポリペプチドについても当てはまることが理解されよう。さらに、本願を通じて記載される配列番号17のポリヌクレオチドの全ての特徴および用途は、クローン229633_253-2-5-2-A11-Fに含まれる核酸についても当てはまることが理解されよう。本発明のある好ましい実施形態は配列番号17、配列番号18およびクローン229633_253-2-5-2-A11-Fを含んでなる組成物に向けられる。本発明のもう1つの好ましい実施形態は、gagcaagacgtggtgatgccaattggtggaaaggagaaaatcacから選択される少なくとも18個連続するヌクレオチドの断片、好ましくは本明細書に記載される生物活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる組成物に向けられる。本発明のさらなる好ましいポリヌクレオチドとしては、gaagcggmgsggtctagggagccgcggccgcgggtcacccggcgggtagcagttgctgagtgtcagctagacagcagcgactagggctcgggcgccggcgagatgcctttgttcaccgccaaccccttcgagcaagacgtggtgatgccaattggtggaaaggagaaaatcacを含んでなる核酸、好ましくは本明細書に記載される生物活性を有するポリペプチドをコードするものが挙げられる。本発明のさらなる好ましいポリヌクレオチドとしては、gaagcggmgsggtctagggagccgcggccgcgggtcacccggcgggtagcagttgctgagtgtcagctagacagcagcgactagggctcgggcgccggcgagatgcctttgttcaccgccaaccccttcgagcaagacgtggtgatgccaattggtggaaaggagaaaatcacagaggaataggacttttcccatccaattttgtaacaactaatttaaacatagagactgaggcagcggctgtggacaaattgaatgtaattgatgatgatgtggaggaaattaagaaatcagagcctgagcctgtttatatagatgaggataagatggatagagccctgcaggtacttcagagtatagatccaacagattcaaaaccagactcccaagaccttttggatttagaagatatctgccaacaを含んでなる配列番号17の核酸、好ましくは本明細書に記載される生物活性を有するポリペプチドをコードするものが挙げられる。本明細書に記載のものおよびそれをコードするポリヌクレオチドのx％の生物活性を有する本発明のポリペプチド(ここで、xは1〜100間のいずれかの整数である)も本発明に含まれる。生物活性を有する本発明のポリペプチドはJanusキナーゼ(Jak)などのチロシンキナーゼによりリン酸化され得るポリペプチドと定義される。
【０４６１】
STAMSAPタンパク質はシグナル伝達アダプター分子(STAM)-2転写物内でのスプライス事象の結果として生じる。このスプライス変異体はSTAM-2のヌクレオチド152をヌクレオチド817と接触させるか、またはそれと再結合させる。得られたSTAMSAPスプライス変異体は525アミノ酸のSTAM-2タンパク質のカルボキシ末端228アミノ酸をコードする。STAM-2は十分に特徴付けられた3つのドメインを含む。第1のものはSTAMSAPと共有しないアミノ酸212-266にわたるSH3ドメインである。このSH3ドメインはSTAM-2の下流エフェクターAMSHと結合し、AMSHはc-mycおよびAP-1を含むプロトオンコジーン転写因子を活性化する、その結果として細胞増殖を含む応答を引き起こす(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Tanaka, N.ら (1999) J. Biol. Chem. 274:19129-35)。STAM-2のアミノ酸359-387にわたる免疫受容体チロシンに基づく活性化モチーフ(ITAM)およびカルボキシ末端チロシンリッチドメインはSTAMSAPと共有している(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Endo, K.ら (2000) FEBS Let. 477:55-61およびPandey, A.ら (2000) J. Biol. Chem. 275:38633-9)。
【０４６２】
STAMSAPは、Jak2およびJak3を含むJak分子により、ITAMおよびカルボキシ末端ドメイン内のチロシン残基でリン酸化される。Jak2およびJak3は、IL-2R、IL-3R、IL-4R、IL-7R、血小板由来増殖因子受容体(PDGFR)、上皮増殖因子受容体(EGFR)、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体(GM-CSFR)を含む細胞表面受容体のリガンド結合に応答して、STAMSAPをリン酸化する。Jak活性化とその後に続いて起こる遺伝子発現は、増殖ならびに乳癌および大腸癌さらにB細胞リンパ腫を含む癌と関連する(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Yamauchi, T.ら (2000) J. Biol. Chem. 275:33937-44; Kaulsay, K., (2000) Endocrinology 141:1571-84; 米国特許第6177433号)。Jakは、上流受容体またはそれらのリガンドが癌細胞において異常に高発現であるために過剰に活性化されることが多い。例えば、正常レベルよりも高いPDGFは進行した段階の乳癌であることを示している(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Seymour, L.ら (1993) Breast Cancer Res. Treat. 26:247-52)。EGFRは子宮頸癌をはじめとする種々の腫瘍で過剰発現される(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Mathur, R.ら (2000) Am. J. Reprod. Immunol. 44:114-20)。さらに、Jak3は刺激された肥満細胞において活性化され、脱顆粒とその後にアレルギー反応を引き起こす(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6177433号)。
【０４６３】
STAMSAPは下流エフェクターをもたないため、Jakシグナル伝達のドミナントネガティブ阻害剤として作用する。本発明のある好ましい実施形態では、STAMSAPポリペプチドはJakシグナル伝達の下流で細胞増殖、細胞生存、またはウイルス複製を阻害するために使用される。この実施形態は、STAMSAPを、活性化Jakに応答する細胞、例えば、IL-2Rを発現するMOLT-4細胞(ATCC受託番号CRL-1582)に送達する工程を含んでなる方法により達成される。STAMSAPをJak応答性細胞に送達する方法は、次のパラグラフで記述するような当技術分野で一般的な方法により、該細胞をSTAMSAPポリヌクレオチドまたはポリペプチドと接触させることを含む。さらに、この実施形態には、プロモーターなどの発現制御エレメントに機能し得る形で連結された生物活性を有するSTAMSAPポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドも含まれる。該ポリヌクレオチドは裸のポリヌクレオチドのエレクトロポレーションまたはトランスフェクションなどの当技術分野で一般的な方法によりJak応答性細胞に送達される。さらに、Jakシグナル伝達により活性化された遺伝子は当技術分野で一般的な方法、例えば、ルシフェラーゼまたはβ-ガラクトシダーゼなどのリポーター遺伝子アッセイを用いてモニターまたはアッセイすることができる。この実施形態は、例えば、in vitroでJak依存性細胞応答を阻害する際に適用される。
【０４６４】
本発明のもう1つの好ましい実施形態は、STAMSAPを用いてJak誘導性細胞増殖を阻害する方法に向けられる。特に、この実施形態は、増殖因子などのJakのいずれかの上流エフェクターの活性化によって起こる細胞増殖の阻害に向けられる。好ましい上流エフェクター分子としては、限定されるものではないが、PDGFR、EGFR、IL-2R、IL-3R、IL-4R、IL-7R、およびGM-CSFRが挙げられる。STAMSAPは、STAMSAPポリペプチドまたは発現制御エレメントに機能し得る形で連結された該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドを、JakまたはJakの上流エフェクターのいずれかにより活性化される細胞(例えば、EGFにより刺激された子宮頸癌細胞)に導入する工程を含んでなる方法において用いられる。好ましい制御エレメントは、本発明が送達される細胞の増殖を阻害するのに有効な量のSTAMSAPを発現する。別の好ましい制御エレメントは、細胞または組織特異的エンハンサーエレメント、例えば、B細胞の場合のlynエンハンサー、または増殖細胞の場合のc-mycもしくはAP-1部位を含んでなる。前記ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは以下のリスト: 全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5616565号、同第6110490号、同第6204060号、またはWO9704748のいずれか1つに記載されるような、脂質小胞またはウイルス形質導入などの当技術分野で一般的な方法を用いて、前記細胞に導入される。例えば、ポリヌクレオチドは、i)ポリヌクレオチド発現ユニット、好ましくは生物学的に活性なSTAMSAPポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ユニットを、以下のリスト: ウイルスエンベロープ、リポソーム、ミセル、およびこれらの改変型のいずれかから得られた脂質小胞に、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6110490号またはP.C.T.904748に記載されるようにして圧縮し、ii)所望により、例えば、受容体-受容体リガンド対のメンバー(例えば、B細胞をターゲッティングするCD40リガンド)を脂質エンベロープに埋め込むことにより、脂質小胞を特定の細胞にターゲッティングさせ、iii)注入または吸入などの当技術分野で一般的な方法により、ターゲッティングされた脂質小胞を特定の細胞と接触させることにより該細胞に送達される(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6110490号、P.C.T 9704748、および米国特許第6034062号)。ポリペプチドを該細胞に送達する方法の一例は、i)生物学的に活性なSTAMSAPポリペプチドを脂質小胞にパッケージングし、ii)例えば、受容体-受容体リガンド対のメンバーを脂質エンベロープに含めることにより、脂質小胞を特定の細胞にターゲッティングし、iii)ペプチドなどの融合成分を脂質エンベロープに埋め込んで、カプセル封入されたポリペプチドの標的細胞への送達を促進し、さらにiv)注入または吸入により、ターゲッティングされた脂質小胞を特定の細胞と接触させる工程を含んでなる(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、P.C.T. 9704748および米国特許第6034062号)。
【０４６５】
もう1つの好ましい実施形態では、STAMSAPは肥満細胞、好酸球、T細胞、およびB細胞などの炎症反応を誘発する細胞においてJak3を阻害するために用いられる。この実施形態は、生物学的に活性なSTAMSAPポリペプチドまたは発現制御エレメントに機能し得る形で連結された該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドを、炎症反応(例えば、アレルギー性鼻炎(花粉症)、アレルギー性蕁麻疹(発疹)、血管浮腫、アレルギー性喘息、または過敏症)の作用を呈している個体に送達する方法を含む。好ましい送達方法としては、限定されるものではないが、i)全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6110490号、同第5616565号、およびP.C.T. 9704748に記載されるように該ポリヌクレオチドを脂質小胞にパッケージングし、さらにii)該脂質小胞を肥満細胞などのアレルギー反応を誘導する細胞に送達して、STAMSAPポリペプチドを関連細胞内部位と接触させる工程を含んでなる方法が挙げられる。好ましい制御エレメントは炎症反応を阻害するのに有効な量のSTAMSAPの発現を指令する。この実施形態での使用にさらに好ましい制御エレメントは、肥満細胞におけるCD48などの細胞特異的遺伝子のプロモーターを含む。脂質小胞は以下のリスト: ウイルスエンベロープ、リポソーム、ミセル、およびこれらの改変型のいずれかから得られる。脂質小胞の特定の細胞型へのターゲッティングは、工程(ii)で記載されるように、受容体-受容体リガンド対のメンバーなどのターゲッティング成分を脂質小胞の脂質エンベロープに埋め込むことによって達成される。有用なターゲッティング成分は肥満細胞のSCF受容体またはCD48などの細胞表面リガンドと特異的に結合するものである。よって、抗CD48抗体またはSCFリガンドが有用な肥満細胞ターゲッティング成分の例となる。さらに、抗体B43およびTXUは各々、BおよびT細胞に対して有用である。ベクターおよびターゲッティングは、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6177433号、同第6110490号、およびP.C.T. 9704748にさらに記載されている。本発明は、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6177433号および同第6034062号に記載されるように注入または吸入などの当技術分野で一般的な方法により、好適な部位に送達される。
【０４６６】
配列番号22のタンパク質(内部表示クローン589198_184-11-1-0-E4-F)
クローン589198_184-11-1-0-E4-FのcDNA(配列番号21)はアミノ酸配列:
MKTLQSTLLLLLLVPLIKPAPPTQQDSRIIYDYGTDNFEESIFSQDYEDKYLDGKNIKEKETVIIPNEKSLQLQKDEAITPLPPKKENDEMPTCLLCVCLSGSVYCEEVDIDAVPPLPKESAYLYARFNKIKKLTAKDFADIPNLRRLDFTGNLIEDIEDGTFSKLSLLEELSLAENXLLKLPVLPPKLTLFNAKYNKIKSRGIKANAFKKLNNLTFLYLDHNALESVPLNLPESLRVIHLQFNNIASITDDTFCKANDTSYIRDRIEEIXLEGNPIVLGKHPNSFICLKRLPIGSYF(配列番号22)を含んでなるCorneal Osteo-Vascular Inducing(COVI)タンパク質をコードする。よって、本願を通じて記載される配列番号22のポリペプチドの全ての特徴および用途は、クローン589198_184-11-1-0-E4-Fに含まれる核酸によりコードされるポリペプチドについても当てはまることが理解されよう。さらに、本願を通じて記載される配列番号21のポリヌクレオチドの全ての特徴および用途は、クローン589198_184-11-1-0-E4-Fに含まれる核酸についても当てはまることが理解されよう。本発明のある好ましい実施形態は配列番号21、配列番号22およびクローン589198_184-11-1-0-E4-Fの組成物に向けられる。本発明にはさらに、本明細書に記載の生物活性を有する、配列番号22の少なくとも7アミノ酸長のポリペプチド断片、ならびにそれをコードするポリヌクレオチドも含まれる。生物活性としては、限定されるものではないが、骨形成細胞と接触した際の骨密度の増加および血管組織の再構築が挙げられる。
【０４６７】
COVIポリペプチドはmimecan(オステオグリシンおよび骨誘導因子とも呼ばれる)遺伝子のユニークなスプライス変異体である(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Kukita, A.ら (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:3023-6, Funderburgh, J.ら (1997) J. Biol. Chem. 272:28089-95,およびTasheva, E.ら (1999) J. Biol. Chem. 274:18693-701)。1997塩基対のCOVI転写物は全長mimecanのエキソン3から始まり、298アミノ酸からなるタンパク質をコードする。
【０４６８】
COVIポリペプチドは骨の増殖および再構築を促進する細胞外マトリックス(ECM)と会合した分泌タンパク質である。本発明の好ましい実施形態では、COVIポリペプチドが、骨増殖を刺激するのに有効な量のCOVIポリペプチドを細胞に接触させることによって骨増殖を促進する方法において用いられる。好ましい細胞は、限定されるものではないが、骨芽細胞、骨細胞、およびそれらの前駆体をはじめとする、通常骨組織を形成する細胞である。この方法は、限定されるものではないが、骨量減少、萎縮、あるいは、損傷、先天性もしくは慢性症状、外科手術、または疾病による奇形などの症例において骨増殖を促進するのに有用である。例としては、限定されるものではないが、骨減少症、骨粗鬆症、くる病、悪性黒色腫誘発性骨分解、および損傷、待機手術(例えば、形成手術)、再建外科、および歯科治療または手術による骨亀裂または骨折が挙げられる。COVIポリペプチドは生理学上許容される溶液、例えば、pH緩衝生理食塩水、グリセロールまたはデキストロースなどの粘稠液に、または骨増殖を補助するその他の成分を含む溶液に含めて送達される。好ましい骨増殖成分は骨片、骨粉末、および硫酸カルシウム、ヒドロキシアパタイト、超高分子量ポリエチレン(UHMWPE)、およびコラーゲンなどのタンパク質をはじめとするマトリックス材料を含んでなる。生理学上許容される溶液に含めたCOVIポリペプチドは、限定されるものではないが、注入、カテーテル送達、または直接埋め込みをはじめとする方法により局部にまたは全身に送達される(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,034,062号)。
【０４６９】
本発明のさらなる実施形態は、例えば、歯科インプラント、整形外科補綴術、またはその他の外科的処置の場合の骨移植を目的として、骨増殖刺激量のCOVIポリペプチドを細胞に接触させて骨組み込みを促進する方法である。好ましい細胞は、限定されるものではないが、骨芽細胞、骨細胞、およびそれらの前駆体をはじめとする骨組織に存在するものである。COVIポリペプチドは生理学上許容される溶液、例えば、pH緩衝生理食塩水、グリセロールまたはデキストロースなどの粘稠液に、または骨増殖を補助するその他の成分を含む溶液に含めて送達される。好ましい骨増殖成分は骨片、骨粉末、および硫酸カルシウム、ヒドロキシアパタイト、UHMWPE、およびコラーゲンなどのタンパク質をはじめとするマトリックス材料を含んでなる。生理学上許容される溶液に含めたCOVIポリペプチドは、注入または組み込まれる組織への直接添加を含んでなる方法により、所望の骨組み込み部位に送達される(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6034062号)。
【０４７０】
本発明のさらなる実施形態は、例えば、移植を目的として増殖刺激量のCOVIポリペプチドを細胞に接触させて骨増殖を促進する方法である。好ましい細胞としては、骨細胞を含む。さらなる好ましい細胞としては、限定されるものではないが、ヒト骨芽細胞、例えば、細胞系MG63もしくはC2C12あるいは骨から直接精製された骨芽細胞、または骨髄間質または間葉性幹細胞から精製されたものなどのそれらの前駆細胞が挙げられる。好ましい培養条件については、当技術分野で一般的であり、限定されるものではないが、骨形成を促進するその他の要素、例えば、形成を誘導する骨または複合マトリックス、アスコルビン酸、β-グリセロリン酸、デキサメタゾン、カルシウム塩、およびコラーゲンが挙げられる[全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Dean, D.ら (2001) J. Orthop. Res. 19:179-86およびButtery, L.ら (2001) Tissue Eng. 7:89-99]。ある好ましい方法は、COVIポリペプチドを培養細胞と直接接触させ、石灰化した骨構成体を回収し、さらに新たに形成された骨を所望の場所に外科的に埋め込む工程を含んでなる(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第4950296号、同第5385566号、および同第6200324号)。もう1つの好ましい方法は、ポリヌクレオチドを培養細胞に送達し、細胞を所望の骨増殖部位(例えば、骨折部位または骨量減少状態にある骨)に送達する工程を含んでなる。好ましいポリヌクレオチドは、骨増殖刺激量のCOVI発現(例えば、CMVプロモーターからの高い構成的発現、またはテトラサイクリン抑制性プロモーターからの調節された発現(なお、これらはいずれも商業的に容易に入手可能である))を送達する発現制御ユニット(例えば、プロモーター)に機能し得る形で連結されたCOVIポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる。該ポリヌクレオチドはエレクトロポレーション、リン酸カルシウムトランスフェクション、またはアデノウイルス形質導入などの当技術分野で一般的な方法によりin vitroまたはin situにおいて細胞に送達される[全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Maniatis, T.ら Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)およびCheng, S.ら (2001) Calcif. Tissue Int. 68:87-94]。細胞は注入、カテーテルによる導入、または、例えば、骨量減少状態にある骨への細胞含有ステントの外科的埋め込みを含んでなる方法によりin vitro、in situ、またはin vivoにおいて所望の骨増殖部位に導入される(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6034062号および同第6206914号)。
【０４７１】
COVIはECMの血管平滑筋細胞(VSMC)に会合している。COVIスプライス変異体は血管マトリックス再構築、すなわち、新たな血管の形成(例えば、発生または組織増殖)、および外傷、切り傷、火傷、疾病、心筋梗塞、潰瘍、糖尿病性潰瘍、およびアテローム性動脈硬化症などの慢性症状から起こるものなどの損傷した血管の治癒、を促進する能力を高めてある。本発明の好ましい実施形態は、血管再構築刺激量のCOVIポリペプチドを細胞に接触させることによって血管再構築を促進する方法である。好ましい細胞としては、限定されるものではないが、VSMC、血管上皮細胞、および繊維芽細胞が挙げられる。さらに好ましい細胞としては、限定されるものではないが、無傷の組織における(すなわち、コラーゲンなどのECMタンパク質のある環境での)ヒトVSMC、血管上皮細胞、および繊維芽細胞が挙げられる。COVIポリペプチドは生理学上許容される溶液、例えば、pH緩衝生理食塩水、またはグリセロールまたはデキストロースなどの粘稠液に含めて細胞に送達される。該溶液は潰瘍、損傷、外傷、糖尿病性潰瘍、火傷、外傷、鬱血性潰瘍、歯周病、裂傷、およびその他の症状の治療において創傷組織表面に局部的に用いてもよい。さらに、侵襲的手術によってもたらされたものなどの腹腔内創傷組織を、血管再構築を増進するCOVIポリペプチドを含んでなる生理学上許容される溶液で治療してもよい。例えば、手術部位を縫合する前に手術面を該溶液でコーティングして内部毛細血管潅流および治癒を促進してもよい。さらに、局部的に起こる治癒の速度を注入などの当技術分野で一般的な方法による該溶液の皮下投与によって加速させてもよい(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,096,709号)。
【０４７２】
時宜に即した血管再構築は、臓器拡大を予防するために心筋梗塞の場合における緊急要素である。本発明のさらなる好ましい実施形態は、血管再構築刺激量のCOVIポリペプチドを細胞に接触させる方法である。この方法はCOVIポリペプチド放出ステントの、例えば、外科的またはカテーテルを介した埋め込みによって、COVIポリペプチドを細胞に接触させる工程を含んでなる(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,500,013号および同第5,449,382号)。好ましい細胞としては、限定されるものではないが、梗塞の結果として損傷を受けた心組織に存在するもの、または、アテローム性動脈硬化症、狭窄症もしくは動脈瘤などの種々の疾患を治療することにより崩壊している、部分的に閉塞した、または弱くなった部分を補強するために血管内に存在するものが挙げられる。
【０４７３】
本発明のさらなる好ましい実施形態は、COVIポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを細胞に送達することにより血管再構築を促進する方法である。この方法はCOVIポリペプチドを発現する細胞の移植などの目的に向けられる。好ましい細胞としては、限定されるものではないが、VSMC、血管上皮細胞、および繊維芽細胞が挙げられる。さらなる好ましい細胞としては、限定されるものではないが、好ましくは無傷の組織における(すなわち、コラーゲンなどのECMタンパク質のある環境での)ヒトVSMC、血管上皮細胞、および繊維芽細胞が挙げられる。好ましいポリヌクレオチドは血管再構築刺激量のCOVI発現(例えば、CMVプロモーターからの高い構成的発現またはテトラサイクリン抑制性プロモーターからの調節された発現(なお、これらはいずれも商業的に容易に入手可能である))を送達する発現制御ユニット(例えば、プロモーター)に機能し得る形で連結されたCOVIポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる。該ポリヌクレオチドはエレクトロポレーション、リン酸カルシウムトランスフェクション、またはアデノウイルス形質導入などの当技術分野で一般的な方法によりin vitroまたはin situにおいて細胞に送達される[全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Maniatis, T.ら Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)およびCheng, S.ら (2001) Calcif. Tissue Int. 68:87-94]。さらに細胞懸濁物の注入もしくはカテーテル送達または無傷組織の内視鏡もしくは侵襲法による外科的埋め込みなどの当技術分野で一般的な方法により、該細胞を所望の血管再構築部位(限定されるものではないが、創傷、切り傷、外傷、潰瘍、および疾病によるまたはそうでない血管欠乏病巣など)に送達する工程も方法に含まれる(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,669,925号および同第5,683,345号)。
【０４７４】
COVIポリペプチドは高度に修飾されたケラタン硫酸プロテオグリカン(KSPG)として角膜内にも存在している。KSPGは角膜内のECMタンパク質と会合し、角膜の形状および不透明性を維持する働きをする。本発明のさらなる実施形態では、角膜維持に有効な量のCOVIポリペプチドは所望の形状(例えば、レーザー外科療法または非侵襲的角膜矯正療法による)または角膜組織の不透明性(例えば、水晶体形成の開始時)を維持する方法において用いられる。この方法はCOVIポリペプチドを生理学上許容される溶液中の角膜ECMと接触させる工程を含んでなる。好ましい生理学上許容される溶液としては、pH緩衝生理食塩水が挙げられる。好ましい接触方法は点眼手段によるものである(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、P.C.T. 00119386)。
【０４７５】
配列番号4のタンパク質(内部表示クローン1000848582_181-40-4-0-A11-F)
クローン1000848582_181-40-4-0-A11-FのcDNA(配列番号3)はアミノ酸配列：
MELALRRSPVPRWLLLLPLLLGLNAGAVIDWPTEEGKEVWDYVTVRKDAYMFWWLYYATNSCKNFSELPLVMWLQGGPGGSSTGFGNFEEIGPLDSDLKPRKTTWLQAASLLFVDNPVGTGFSYVNGSGAYAKDLAMVASDMMVLLKTFFSCHKEFQTVPFYIFSESYGGKMAAGIGLELYKAIQRGTIKCNFAGVALGDSWISPVDSVLSWGPYLYSMSLLEDKGLAEVSKVAEQVLNAVNKGLYREATELWGKAEMIIEQVKRGNTQRLACLAFSGGYRAHGWCCQTWSLHを含んでなる配列番号4のタンパク質をコードする。よって、本願を通じて記載される配列番号4のポリペプチドの全ての特徴および用途は、クローン1000848582_181-40-4-0-A11-Fに含まれる核酸によりコードされるポリペプチドについても当てはまることが理解されよう。さらに、本願を通じて記載される配列番号3のポリヌクレオチドの全ての特徴および用途は、クローン1000848582_181-40-4-0-A11-Fに含まれる核酸についても当てはまることが理解されよう。本発明のある好ましい実施形態は配列番号3、配列番号4およびクローン1000848582_181-40-4-0-A11-Fの組成物に向けられる。また、本明細書に記載される生物活性を有するポリペプチド断片およびそれらの断片をコードするポリヌクレオチドも好ましい。
【０４７６】
配列番号4のタンパク質は、本明細書でセリンカルボキシペプチダーゼhx(SCPhx)と呼ばれる新規なセリンカルボキシペプチダーゼをコードする。SCPhxはKRGNTQRLACLAFSGGYRAHGWCLQTWSLHを含んでなる31アミノ酸のユニークなC末端配列を有する。SCPhx内のこのユニーク配列は触媒三つ組のヒスチジンに寄与している。SCPhxはそのタンパク質またはペプチド基質の最後から2番目とC末端アミノ酸残基との間のペプチド結合を切断し、こうすることで、この基質の生物学的機能を活性化または不活性化することができる。
【０４７７】
本発明の好ましい実施形態は、配列番号4(SCPhx)のアミノ酸配列またはその断片を含んでなる組成物に向けられる。
【０４７８】
さらに、SCPhxポリペプチドを含んでなる組成物のセリンカルボキシペプチダーゼ活性を生合成法に用いる方法も好ましい。さらに、保護的であるが不活性化するC末端アミノ酸で操作された組換えポリペプチドがSCPhxによるこのアミノ酸の除去によって活性化されるような、前記方法の適用も好ましい。
【０４７９】
さらに、SCPhxポリペプチドを含んでなる組成物のセリンカルボキシペプチダーゼ活性を分析法に用いる方法も好ましい。さらに、任意のタンパク質の機能に対してC末端アミノ酸が必要かどうかがSCPhxによるこのアミノ酸の除去によって決定されるような、前記方法の適用も好ましい。
【０４８０】
SCPhxのセリンカルボキシペプチダーゼ活性はSCPhxに抗繊維素溶解活性を付与する。さらなる実施形態では、SCPhxを含んでなる本発明の組成物はSCPhxの抗繊維素溶解活性を創傷治癒の促進に使用する方法に用いられる。さらなる好ましい実施形態では、この組成物は、創傷または損傷組織を、再生に有効な量の本発明の組成物と接触させることにより、血管構造に裂け目のある部位において血塊を安定化させる方法に用いられる。
【０４８１】
本発明のさらなる実施形態では、SCPhxは抗体指令酵素プロドラッグ療法(antibody-directed enzyme prodrug therapy：ADEPT)の方法に用いられる。前記方法では、SCPhxセリンカルボキシペプチダーゼ活性のin vivo局在がSCPhxの特異的抗体へのコンジュゲーションを通して行われる。SCPhx-抗体コンジュゲートをプロドラッグ(薬物-α-ペプチド)(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Shi, P.T.ら, Yao Xue Bao 32:106-9 (1997))と共に注射すると、この薬物の局部的活性化が起こる。
【０４８２】
ADEPTのための前記方法では、本発明の好ましい実施形態は、腫瘍反応性抗体にコンジュゲートされたSCPhxを含んでなる組成物に向けられる[全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Napier, M.P.,ら, Clin. Cancer Res. 6:765-72 (2000)]。さらなる好ましい実施形態では、SCPhxは癌胎児性抗原(CEA)に反応する抗体とコンジュゲートされ、直腸結腸癌の治療のためにメトトレキセートプロドラッグとともに用いられる。
【０４８３】
さらなる好ましい実施形態では、本発明はSCPhxセリンカルボキシペプチダーゼ活性の中和を伴うまたは伴わないSCPhxと結合する抗体を提供する。この抗体はモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であってよい。好ましい組成物はSCPhx抗体を含む。
【０４８４】
乳癌細胞により発現されるSCPhxセリンカルボキシペプチダーゼ活性は、その腫瘍細胞により同時に発現される自己分泌神経ペプチド増殖因子を活性化し得る。本発明のさらなる実施形態では、中和抗SCPhx抗体は、腫瘍により構成的に発現されるSCPhxによる自己分泌増殖因子の活性化を遮断することにより腫瘍増殖を抑制するために、静注によって用いられる。さらなる好ましい実施形態では、前記方法は乳癌の治療に用いられる。さらなる好ましい実施形態では、前記方法は唾液腺癌の治療に用いられる。
【０４８５】
SCPhxセリンカルボキシペプチダーゼ活性はβ-アミロイド前駆体タンパク質をプロセシングしてβ-アミロイドを生成することができる。本発明のさらなる実施形態では、中和抗SCPhx抗体は、β-アミロイド前駆体タンパク質のプロセシングおよびβ-アミロイドの生成を阻止するために、アルツハイマー病において注射により用いられる。
【０４８６】
高脂肪／スクロース食を消費しているマウスに極めて低用量のポリペプチドgAcrp30を毎日投与すると、食物摂取に影響を及ぼさずに顕著かつ持続可能な体重減少が起こる(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Fruebis, J.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:2005-10 (2001))。gAcrp30の前記活性はSCPhxセリンカルボキシペプチダーゼ活性により排除される。本発明の好ましい実施形態では、中和SCPhx抗体を含んでなる組成物は、SCPhxセリンカルボキシペプチダーゼ活性によるin vivoでのポリペプチド機能の不活化を阻止する方法に用いられる。さらなる好ましい実施形態では、中和SCPhx抗体を含んでなる組成物は、ヒトgAcrp30との同時静注によってヒトにおける肥満症を治療する方法に用いられる。さらなる好ましい実施形態では、中和SCPhx抗体を含んでなる組成物は哺乳動物またはヒトgAcrp30との同時静注によってその他の哺乳類における肥満症を治療する方法に用いられる。
【０４８７】
さらに本発明は、SCPhxポリペプチドを試験化合物と接触させ、試験化合物がSCPhxポリペプチドと結合したかどうかを検出または測定する工程を含んでなる、上記SCPhxセリンカルボキシペプチダーゼ活性と結合し、かつ／またはそれを阻害する試験化合物のスクリーニング法に関する。あるいは、この方法は試験化合物の存在下でSCPhxポリペプチドをSCPhxポリペプチド基質と接触させ、SCPhx基質からのC末端アミノ酸の放出を検出または測定する工程を含み、ここで、試験化合物の不在下での放出量と比較した放出量の差異が、SCPhxのセリンカルボキシペプチダーゼ活性をモジュレートする（好ましくは、阻害する）。
【０４８８】
配列番号8のタンパク質(内部表示クローン1000770704_208-27-3-0-G6-F)
クローン1000770704_208-27-3-0-G6-FのcDNA(配列番号7)はアミノ酸配列：
MRLPAQLLGLLMLWVSGSSGDIVMTQSPLFLPVTPGEPASISCRSSQSLLHVQGSNYLDWYHQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPFTFGPGTRVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECを含んでなる配列番号8のタンパク質をコードする。よって、本願を通じて記載される配列番号8のポリペプチドの全ての特徴および用途は、クローン1000770704_208-27-3-0-G6-Fに含まれる核酸によりコードされるポリペプチドについても当てはまることが理解されよう。さらに、本願を通じて記載される配列番号7のポリヌクレオチドの全ての特徴および用途は、クローン1000770704_208-27-3-0-G6-Fに含まれる核酸についても当てはまることが理解されよう。本発明の好ましい実施形態は配列番号7、配列番号8およびクローン1000770704_208-27-3-0-G6-Fの組成物に向けられる。また、本明細書に記載される生物活性を有するポリペプチド断片およびそれらの断片をコードするポリヌクレオチドも好ましい。
【０４８９】
配列番号8のタンパク質は、骨代謝に関与するホルモンである副甲状腺ホルモン関連タンパク質(PTHrP)と結合するポリペプチドCalXをコードする。
【０４９０】
PTHrPは、もともと、体液性悪性高カルシウム血症(HHM)を引き起こす腫瘍由来の全身性因子として発見された。今ではPTHrPはHHMで主要な役割を果たすことが知られている。これは、以前には骨格転移性の関与を通して高カルシウム血症を引き起こすと考えられていた腫瘍における主な原因物質であると同定されていた。高カルシウム血症は新生物形成疾患に関連した、最も一般的な生命を脅かす代謝性疾患であり、全癌患者の推定10%〜20%に発症する。PTHrPが単なる部外者ではなく高カルシウム血症の主因であることは、ヒト腫瘍の異種移植により発症した高カルシウム血症の動物において、PTHrPに対する中和抗体の注入が高カルシウム血症を逆転させるという知見により示される。
【０４９１】
CalXはPTHrpと結合して、HHMの誘発をはじめとするPTHrpの活性を中和する。本発明の好ましい実施形態は配列番号8(CalX)のアミノ酸配列を含んでなるものに向けられる。さらに、本明細書に記載される生物活性を有する全長CalXの断片ならびにこれらの断片をコードするポリヌクレオチドも本発明に含まれる。
【０４９２】
好ましい実施形態では、本発明の組成物は、CalXを含んでなる組成物をPTHrPに接触させ、それによりPTHrP活性を遮断するというPTHrPの中和方法に用いられる。さらなる実施形態はHHMを抑制するためのCalX組成物の使用方法に向けられる。さらなる好ましい実施形態では、CalXは乳癌、膵臓腺癌、前立腺癌、肺の扁平上皮細胞癌、腎細胞癌、卵巣癌、およびT細胞白血病／リンパ腫に関連するHHMの抑制に用いられる。
【０４９３】
PTHrPは骨関節炎に関係した病理生理学において何らかの役割を果たすと考えられている。さらなる好ましい実施形態では、CalXは、罹患した関節内（好ましくは、関節包の滑膜内）の骨吸収を抑制する方法に用いられる。前記方法はCalX組成物を関節包の滑液と接触させることを含む。CalXの好ましい送達としては、関節部位での注射または経皮接触が挙げられる。
【０４９４】
PTHrPは慢性関節リウマチに関係した病理生理学においてある役割を果たすと考えられている。さらなる好ましい実施形態では、CalXは罹患した関節内（好ましくは、関節包の滑膜内）の炎症を軽減する方法に用いられる。さらなる好ましい実施形態では、CalXは罹患関節内（好ましくは、関節包の滑膜内）の骨吸収を減少させる方法に用いられる。前記方法はCalX組成物を関節包の滑液と接触させることを含む。CalXの好ましい送達としては関節部位での注射または経皮接触が挙げられる。
【０４９５】
配列番号6のタンパク質(内部表示クローン1000839315_220-26-1-0-F3-F)
クローン1000839315_220-26-1-0-F3-FのcDNA(配列番号5)はアミノ酸配列:
MKFFVFALVLALMISMISADSHEKRHHGYRRKFHEKHHSYHITLLPLFEESSKSNANEKHYNLLYTLCFRILAFSIVTを含んでなる配列番号6のタンパク質をコードする。よって、本願を通じて記載される配列番号6のポリペプチドの全ての特徴および用途は、クローン1000839315_220-26-1-0-F3-Fに含まれる核酸によりコードされるポリペプチドについても当てはまることが理解されよう。さらに、本願を通じて記載される配列番号5のポリヌクレオチドの全ての特徴および用途は、クローン1000839315_220-26-1-0-F3-Fに含まれる核酸についても当てはまることが理解されよう。本発明の好ましい実施形態は、配列番号5、配列番号6およびクローン1000839315_220-26-1-0-F3-Fの組成物に向けられる。また、本明細書に記載のような生物活性を有するポリペプチド断片およびそれらの断片をコードするポリヌクレオチドも好ましい。
【０４９６】
配列番号6のタンパク質は、連鎖性スタテリン(statherin)遺伝子由来のエキソンへと下流でスプライシングされたヒスタチン1遺伝子由来のエキソンによりコードされるキメラポリペプチドであるキメリン(Chimerin)をコードする。詳細には、ヒスタチン1とキメリン両者のN末端アミノ酸(MKFFVFALVLALMISMISADSHEKRHHGYRRKFHEKHHS)をコードするエキソンは、スタテリンmRNAの全3'非翻訳ヌクレオチド配列と区別して、キメリンの新規なC末端アミノ酸(YHITLLPLFEESSKSNANEKHYNLLYTLCFRILAFSIVT)をコードするスタテリン由来エキソンへとスプライシングされる。
【０４９７】
キメリンは低分子量のヒスチジンリッチな唾液ポリペプチドである。キメリンは口腔で非免疫性宿主防護系の一部として働く。
【０４９８】
キメリンは正常な宿主細胞に対して最小限の細胞傷害性で、病原性酵母Candida alibcansに対するものをはじめとする広域の抗真菌活性を有し、新規な抗真菌治療薬としての高い可能性が示唆される。キメリンはまた、Streptococcus mutans株および歯周病原性Porphyromonas gingivalisに対するものをはじめとする抗菌活性も有する。キメリンの大きな利点はこれまでに耐性真菌株が示されていない上に、キメリンは消化管内で自然に加水分解され得ることである。従って、キメリンは長期の使用に適用可能で、抗生物質の使用を中断できる。
【０４９９】
本発明のある好ましい実施形態は配列番号6(キメリン)のアミノ酸配列：
MKFFVFALVLALMISMISADSHEKRHHGYRRKFHEKHHSYHITLLPLFEESSKSNANEKHYNLLYTLCFRILAFSIVTを含んでなる組成物に向けられる。
【０５００】
本発明にはさらに、本明細書に記載される生物活性を有する全長キメリンポリペプチドならびにこれらの断片をコードするポリヌクレオチドも含まれる。生物活性を有する好ましい断片としては、DSHEKRHHGYRRKFHEKHHSYHITLLPLFEESSKSNANEKHYNLLYTLCFRILAFSIVTまたはDSHEKRHHGYRRまたはKFHEKHHSYHITLLPLFEESSKSNANEKHYNLLYTLCFRILAFSIVTを含んでなるアミノ酸配列が挙げられる。
【０５０１】
さらに、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第4,725,576号("Fungicidal polypeptide compositions containing L-histidine and methods for use therefore")にさらに記載されるような、生理学上適合する溶液中にキメリンを含んでなる製剤を用いる方法も好ましく、限定されるものではないが、口中洗浄剤へのキメリンの配合が挙げられる。
【０５０２】
さらに、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,912,230号("Anti-fungal and anti-bacterial histatin-based peptides")にさらに記載されるような、真菌または細菌感染を治療する薬剤としてキメリンを含んでなる組成物を用いる方法も好ましい。前記方法は、真菌または細菌に、有効量の本発明のキメリンポリペプチドを接触させることからなる。この真菌または細菌感染の治療方法は、真菌または細菌感染が、(a)口腔の感染;(b)膣の感染;(c)子宮の感染;(d)耳の感染;(e)皮膚の感染;(f)呼吸器感染;(g)粘膜感染;(h)眼の感染;および(i)全身感染からなる群から選択される場合に適用できる。
【０５０３】
さらに、限定されるものではないが、エイズ患者;糖尿病患者;ならびにシェーグレン症候群および放射線療法の結果として唾液腺の機能が損なわれた患者をはじめとする口内乾燥症患者からなる群からのものを含む患者で再発性真菌または細菌感染を予防する薬剤としてキメリンを含んでなる組成物を用いる方法も好ましい。
【０５０４】
さらに、真菌または細菌が以下の群から選択される場合の真菌または細菌感染を治療するためにキメリンを含んでなる組成物を用いる方法も好ましい：(a)Candida albicans;(b)Actinomyces actinomycetemcomitans;(c)Actinomyces viscosus;(d)Bacteroides forsythus;(e)Bacteriodes fragilis;(f)Bacteriodes gracilis;(g)Bacteriodes ureolyticus;(h)Campylobacter concisus;(i)Campylobacter rectus;(j)Campylobacter showae;(k)Campylobacter sputorum;(l)Capnocytophaga gingivalis;(m)Capnocytophaga ochracea;(n)Capnocytophaga sputigena;(o)Clostridium histolyticum;(p)Eikenella corrodens;(q)Eubacterium nodatum;(r)Fusobacterium nucleatum;(s)Fusobacterium periodonticum;(t)Peptostreptococcus micros;(u)Porphyromonas endodontalis;(v)Porphyromonas gingivalis;(w)Prevotella intermedia;(x)Prevotella nigrescens;(y)Propionibacterium acnes;(z)緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa);(aa)Selenomonas noxia;(bb)黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus);(cc)Streptococcus constellatus;(dd)Streptococcus gordonii;(ee)Streptococcus intermedius;(ff)Streptococcus mutans;(gg)Streptococcus oralis;(hh)肺炎球菌(Streptococcus pneumonia);(ii)Streptococcus sanguis;(kk)Treponema denticola;(ll)Treponema pectinovorum;(mm)Treponema socranskii;(nn)Veillonella parvula;および(oo)Wolinella succinogenes。
【０５０５】
上記で述べた真菌または細菌感染の治療のための組成物および方法はヒトに限定されるものではなく、同様に獣医学的用途にも利用できる。
【０５０６】
さらなる好ましい実施形態では、本発明はキメリンと特異的に結合する抗体を提供する。本発明はさらに、キメリンの独特なC末端の39アミノ酸(YHITLLPLFEESSKSNANEKHYNLLYTLCFRILAFSIVT)と試験抗体を接触させ、試験抗体がキメリンポリペプチドと結合するかどうかを検出または測定する工程を含んでなる、キメリンと特異的に結合する抗体をスクリーニングする方法に関する。さらに、唾液をはじめとする体液中のキメリン濃度を測定するため、診断アッセイにおいてこの抗体を含んでなる組成物を用いる方法も好ましい。
【０５０７】
さらに、配列番号5(キメリン)のヌクレオチド配列またはその断片を含んでなる組成物を用い、唾液をはじめとする体液から、または組換え源からキメリンを特異的に精製するために、この抗体を含んでなる組成物を用いる方法も好ましい。
【０５０８】
配列番号2のタンパク質(内部表示クローン223583_114-044-2-0-E11-F)
クローン223583_114-044-2-0-E11-FのcDNA(配列番号1)はアミノ酸配列:
MAACQLLLEITTFLRETFSCLPRPRTEPLVASTDHTKMPSQMEHAMETMMFTFHKFAGDKGYLTKEDLRVLMEKEFPGFLENQKDPLAVDKIMKDLDQCRDGKVGFQSFFSLIAGLTIACNDYFVVHMKQKGKKを含んでなる配列番号2のタンパク質をコードする。よって、本願を通じて記載される配列番号2のポリペプチドの全ての特徴および用途は、またクローン223583_114-044-2-0-E11-Fに含まれる核酸によりコードされるポリペプチドに関係することが理解されるだろう。さらに、本願を通じて記載される配列番号1のポリヌクレオチドの全ての特徴および用途は、またクローン223583_114-044-2-0-E11-Fに含まれる核酸に関係することが理解されるだろう。本発明のある好ましい実施形態は、配列番号1、配列番号2およびクローン223583_114-044-2-0-E11-Fの組成物に向けられる。また、本明細書に記載のような生物活性を有するポリペプチド断片およびそれらの断片をコードするポリヌクレオチドも好ましい。
【０５０９】
配列番号2のタンパク質はS-100Aのスプライス変異体であるS-100A10関連タンパク質(S-100A10rP)をコードする。詳しくは、配列番号2のタンパク質はMAACQLLLEITTFLRETFSCLPRPRTEP LVASTDHTKを含んでなるアミノ末端の独特な37アミノ酸配列により先行されるS-100A10ポリペプチドをコードする。
【０５１０】
二量体S-100A10は二量体アネキシンIIと会合してヘテロ四量体を形成し得る。このヘテロ四量体の構成要素として、S-100A10は細胞表面の多数の活性を媒介し得る(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Kassam G.,ら, Biochemistry 37:16958-66 (1998), Mai, J.ら, J. Biol. Chem. 275:12806-12 (2000))。S-100A10rPはこれらの活性に拮抗する。
【０５１１】
ヘテロ四量体アネキシンIIは細胞表面でプラスミノーゲンおよび組織プラスミノーゲン活性化因子の双方と会合することにより広範な基質特異性を持つセリンプロテアーゼであるプラスミンの生成を促進する。アネキシンIIによるプラスミン生成の促進は、(i)止血および凝固の制御、(ii)マクロファージの移動およびマトリックスの再構築、(iii)神経細胞の分化、(iv)腫瘍細胞の浸潤および転移、ならびに(v) 心血管形成および血管形成で役割を果たす。
本発明のある好ましい実施形態は配列番号2(S-100ArP)のアミノ酸配列を含んでなる組成物に向けられる。本発明のさらなる好ましい実施形態は単量体または二量体S-100A10rPのいずれかを含んでなる組成物に向けられる。本発明にはさらに、本明細書に記載される生物活性を有する全長S-100A10rPポリペプチドの断片ならびにこれらの断片をコードするポリヌクレオチドも含まれる。
【０５１２】
さらに、S-100ArPを含んでなる組成物を用いてプラスミン生成を抑制し、それにより慢性炎症部位、好ましくは関節包の滑膜内での炎症を軽減する方法も好ましい。該方法はS-100A10rP組成物を関節包の滑液に接触させることを含む。好ましいS-100A10rPの送達としては関節部位における注射または経皮接触が挙げられる。
【０５１３】
S-100ArPを含んでなる組成物を用いて腫瘍細胞の転移を抑制する方法も好ましい。さらに、S-100A10rPの組成物を用いて、システインプロテアーゼカテプシンBの細胞表面ヘテロ四量体アネキシンIIとの結合によって促進される腫瘍細胞の転移を抑制することに向けられる方法の実施形態も好ましい。該方法は注射によって該腫瘍細胞を有効量のS-100A10rPと接触させることを含む。さらに、S-100A10rPを用いて乳癌の転移を抑制することに向けられる方法の実施形態も好ましい。さらに、S-100A10rPを用いて神経膠腫の転移を抑制することに向けられる方法の実施形態も好ましい。
【０５１４】
S-100ArPを含んでなる組成物を用いて創傷治癒に関連する炎症を抑制する方法が好ましい。さらに、創傷部位での注射または経皮接触によって創傷または損傷組織に改善上有効な量を接触させることからなる治療法におけるS-100ArPからなる組成物の使用も好ましい。
【０５１５】
急性前骨髄球性白血病(APL)はヘテロ四量体アネキシンIIの促進するプラスミン生成および結果として起こる播種性血管内凝固による線溶亢進を特徴とする。本発明の好ましい実施形態では、S-100A10rPを用いてこの線溶亢進を抑制する。該方法は注射によってAPL細胞を有効量のS-100A10rPと接触させることからなる。
【０５１６】
本発明のある好ましい実施形態はS-100A10rPを含んでなる組成物を固形腫瘍の増殖に関連する血管形成を抑制する方法に使用することである。さらに、S-100A10rPを含んでなる組成物を用いて乳癌、前立腺癌、膵腺癌、結腸直腸癌、腎細胞癌、肺の扁平上皮癌およびT細胞リンパ腫に関連する血管形成を抑制する方法も好ましい。好ましい送達としては静脈注射によって腫瘍を有効量のS-100A10rPと接触させることが挙げられる。
【０５１７】
本発明の好ましい実施形態は、S-100A10rPを含んでなる組成物を慢性炎症に関連する血管形成を抑制する方法に用いることである。さらに、S-100A10rPを含んでなる組成物を用いて慢性関節リウマチに関連する血管形成を抑制し、その結果、好ましくは関節包の滑膜内で炎症を軽減させる方法も好ましい。該方法はS-100A10rP組成物を関節包の滑液と接触させることを含む。
【０５１８】
さらなる好ましい実施形態では、本発明はS-100A10rP機能を中和する方法で本発明のS-100A10rPポリペプチドと特異的に結合し、それにより細胞外ヘテロ四量体アネキシンIIの機能的活性をアップレギュレートする抗体を提供する。さらに、この抗体を含んでなる組成物を用いて虚血性心組織で血管形成を促進する方法も好ましい。好ましい送達としては静脈注射によって心組織を有効量の抗S-100A10rP抗体と接触させることが挙げられる。さらに、抗S-100A10rP抗体を含んでなる組成物を用いて虚血性脳組織で神経突起形成(neuritogenesis)を促進する方法も好ましい。好ましい送達としては局所注射または経皮接触によって神経組織を有効量の抗S-100A10rP抗体と接触させることが挙げられる。
【０５１９】
配列番号32のタンパク質(内部表示クローン477709_174-8-2-0-C10-F)
クローン477709_174-8-2-0-C10-FのcDNA(配列番号31)はアミノ酸配列:
MAWRGWAQRGWGCGQAWGASVGGRSCEELTAVLTPPQLLGRRFNFFIQQKCGFRKAPRKVEPRRSDPGTSGEAYKRSALIPPVEETVFYPSPYPIRSLIKPLFFTVGFTGCAFGSAAIWQYESLKSRVQSYFDGIKADWLDSIRPQKEGDFRKEINKWWNNLSDGQRTVTGIIAANVLVFCLWRVPSLQRTMIRYFTSNPASKVLCSPMLLSTFSHFSLFHMAANMYVLWSFSSSIVNILGQEQFMAVYLSAGVISNFVSYVGKVATGRYGPSLGAALKAIIAMDTAGMILGWKFFDHAAHLGGALFGIWYVTYGHELIWKNREPLVKIWHEIRTNGPKKGGGSKを含んでなる配列番号32のタンパク質をコードする。よって、本願を通じて記載される配列番号32のポリペプチドの全ての特徴および用途は、またクローン477709_174-8-2-0-C10-Fに含まれる核酸によりコードされるポリペプチドに関係することが理解されるだろう。さらに、本願を通じて記載される配列番号31のポリヌクレオチドの全ての特徴および用途は、またクローン477709_174-8-2-0-C10-Fに含まれる核酸に関係することが理解されるだろう。本発明のある好ましい実施形態は、配列番号31、配列番号32およびクローン477709_174-8-2-0-C10-Fの組成物に向けられる。また、本明細書に記載のような生物活性を有するポリペプチド断片およびそれらの断片をコードするポリヌクレオチドも好ましい。
【０５２０】
配列番号32のタンパク質はEMBL登録Q9H300タンパク質のスプライス変異体であるプレタクチリン(Pretactilin)をコードする。第3染色体に位置する対応する遺伝子座はEMBL登録AAH03653およびQ9H300に記載の少なくとも2つの既知の変異体を有する。ヌクレオチドおよびアミノ酸レベルの双方で最も近い既知配列はQ9H300である。Q9H300は10エキソンに分かれ、そのうち本発明のタンパク質はエキソン8を欠失し、一方AAH03653はエキソン6を欠失している。
【０５２１】
プレタクチリンはプレセニリン1およびプレセニリン2のカルボキシル末端と相互作用するポリペプチドである。プレタクチリンは6の推定膜貫通ドメインを担持し、細菌、植物、無脊椎動物からヒトへと及ぶ種々の生物体から単離された膜貫通rhomboid様タンパク質のファミリーに属する。このファミリーで最初に単離されたメンバーのキイロショウジョウバエRhomboidタンパク質は、哺乳動物では増殖および発生の多くの態様を制御する上皮増殖因子受容体(EGFR)のシグナル伝達に関与するとされている7回膜貫通ドメインタンパク質である。遺伝的証拠が、Rhomboidが隣接細胞の表面に存在するTGFα様分子である膜貫通EGFRリガンドSpitzのタンパク質分解によって活性化を制御し、このリガンドの拡散可能な活性形態を生じることを示している。
【０５２２】
このプレタクチリンのrhomboidドメインはアミノ酸位置186から323までにわたり、予測された膜貫通ドメイン領域を含む。近年、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Pellegriniら, 2001, J. Alzheimers Dis. 3 (2)によって、Rhomboidスーパーファミリーのメンバーが金属依存性プロテアーゼ活性を有することが示唆されている。
【０５２３】
家族性アルツハイマー病遺伝子産物であるプレセニリン1およびプレセニリン2は、それらのカルボキシル末端の大きい親水性ループ内で内部タンパク質分解プロセシングを受ける6〜8の膜貫通領域からなる複数回膜貫通型タンパク質(multipass membrane protein)である。免疫学的局在決定研究により、偏在的に発現した、主に小胞体およびゴルジ装置に位置するこれらの分子は核膜および原形質膜上にも見られることが証明されている。このプレセニリンタンパク質はアミロイド前駆体タンパク質のプロセシング、notch受容体のシグナル伝達、およびプログラムされた細胞死またはアポトーシスに機能的に関与することが報告されている。
【０５２４】
アルツハイマー病(AD)は、脳内細胞外老人斑での4kDaのβアミロイドペプチド(Aβ)の分泌および堆積の増加に関連する進行性の記憶および認識障害が特徴の破壊的な神経変性疾患である。健常者においてもAD患者においても、AβはAPPセクレターゼと呼ばれる種々のプロテイナーゼによるタンパク質分解で切断された一回膜貫通型アミロイド前駆体タンパク質(APP)に由来する。αセクレターゼがアミロイド配列内のAPPを切断するのに対し、βおよびγセクレターゼと呼ばれるその他のプロテアーゼはそれぞれNおよびC末端上で切断する。膜貫通型アスパルチルプロテアーゼであるBACEがβセクレターゼとして同定され、いくつかのプロテアーゼがα-セクレターゼ(ADAM-10、TACE、PC7)である可能性があるが、その一方でγセクレターゼの性質はなお未解明である。近年、多くの研究がAβ産生の増加を伴う最も悪性の家族性ADを引き起こすミスセンス突然変異であるプレセニリン自体が長い間捜し求められていたAβを放出するγ-セクレターゼでありうると示唆している。
【０５２５】
またタンパク質のプレセニリンファミリーはNotchとの安定した複合体を形成することによってNotchシグナル伝達経路と相互作用することが明らかになっており、細胞表面でのその適切な切断に必要である。Notchは脊椎動物および無脊椎動物の双方での発生の間中に多くの細胞の運命決定を媒介する一回膜貫通ドメイン細胞表面受容体である。Notchはゴルジを横切るネットワークルーメンで切断される大きい前駆体として合成され、細胞表面でヘテロ二量体受容体を形成する2つの断片を生じる。リガンド受容体結合の後、NotchのC末端膜貫通型細胞内断片が未だ確認されていないプロテアーゼによってその膜貫通ドメイン内で切断される。このリガンド活性化切断は膜からNotchの細胞内ドメインを放出し、そのCSLファミリーメンバーを含むタンパク質との相互作用を通じて標的遺伝子の転写活性に作用する核への転位を可能にする。
【０５２６】
APPプロセシングおよびNotch受容体シグナル伝達における役割に加え、プレセニリンがプログラムされた細胞死にも関与していることを多数の証拠が示している。プレセニリン2の過剰発現は多くのアポトーシス刺激により誘発されるアポトーシスを増加させるが、家族性アルツハイマー病の場合に見られるプレセニリン遺伝子での突然変異は構造性のプロアポトーシス活性を有する分子を生成する。相補的な研究が、アンチセンスRNAによるPS2タンパク質レベルの枯渇は多数の細胞死を誘発するアポトーシス刺激によって誘発されるアポトーシスから細胞を保護することを証明している。分子レベルでは、近年、プレセニリン1およびプレセニリン2のカルボキシル末端がBcl-2ファミリーの抗アポトーシスメンバーであるBcl-XLタンパク質と相互作用して、これらのタンパク質とこのアポトーシスの経路との間にさらなるつながりをもたらすことが観察されている。
【０５２７】
それが膜貫通プロテアーゼまたは膜貫通プロテアーゼ補因子のどちらかであるために、プレタクチリンは物理的にプレセニリンと相互作用してAPP代謝、Notchシグナル伝達および特定のタンパク質プロセシングを経由するプログラムされた細胞死に関与する膜で活性複合体を形成する。具体的には、プレタクチリンはAPPおよびNotchをはじめとする多くのタンパク質基質のタンパク質分解プロセシングに寄与する。
【０５２８】
本発明のある実施形態では、プレタクチリンはタンパク質、好ましくは生物学的サンプル由来の膜貫通タンパク質を消化するためにプロテアーゼ混合物に使用できる。プロテアーゼ混合物の使用は、粗細胞抽出物由来DNAを迅速に精製するためにも、またはタンパク質の再構成およびin vitro機能的アッセイに有用なタンパク質非含有膜小胞を調製するために、単離された膜調製物中の膜貫通および膜会合タンパク質を除去するためにも特に注目され得る。ある好ましい実施形態では、プレタクチリンは1以上のプレセニリンタンパク質と組み合わせてプロテアーゼ混合物に加えられる。
【０５２９】
もう1つの実施形態では、プレタクチリンを生物学的サンプルまたはin vitroで増殖した細胞由来の膜貫通タンパク質の回収をモニタリングするためのタンパク質精製法の間で有用でありうる膜貫通マーカーとして使用できる。このような方法では、このタンパク質は多数の手段のうちのいずれかで検出できる。例えば、プレタクチリンを精製工程の前に標識してサンプルまたは細胞に加えることができる。あるいは、プレタクチリンは精製工程の前に組換え技術によってGFPなどの検出可能なタンパク質と融合させることができ、サンプルを採取した生物体または細胞で発現させることができる。さらに、精製工程全体にわたり、プレタクチリンを特異的に認識するモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いてプレタクチリンを検出することができる。
【０５３０】
本発明はまた野生型および突然変異体プレセニリンタンパク質、好ましくはヒトプレセニリンを精製する新規の方法を提供し、これはプレタクチリンまたはその断片を用いて細胞抽出物由来のプレセニリンを同時免疫精製することにある。複数のタンパク質を同時に免疫精製する方法は当業者に周知のものである。例えば、プレセニリンはアフィニティーカラムクロマトグラフィーによって、またはプレタクチリンと特異的に結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体とセファロースビーズ上に固定化することによって同時に免疫精製することができる。次いでこのような精製した野生型および突然変異体プレセニリンはアルツハイマー病の治療に用い得るプレセニリン抗体を生成する点で特に注目されうる。さらに、精製したプレセニリンポリペプチドはその後、以下に記載するようなアルツハイマー病の診断に用い得る。
【０５３１】
さらなる実施形態では、本発明は以下の工程:
(a)複数のプレセニリンを生物学的サンプル由来のプレタクチリンと同時免疫精製し、
(b)再構成したプレセニリン基質、好ましくはNotchタンパク質、ならびに所望により、再構成したプレタクチリンを含む膜小胞へ対応する精製ポリペプチドを加え、
(c)タンパク質分解された断片の検出および定量によって、これら膜小胞のプロテアーゼ活性を、再構成した陽性および陰性対照(例えば、野生型および突然変異体プレセニリンがそれぞれ組み込まれている同一の膜小胞)と比較して定量すること、
を含んでなる個体におけるアルツハイマー病の検出のための診断法に用いられる。
【０５３２】
もう1つの実施形態では、本発明はプレセニリンおよび／またはプレタクチリンと物理的に相互作用するその他のタンパク質を同定するための新規な方法を提供する。好ましい方法では、プレタクチリンを用いて細胞抽出物由来、好ましくは脳細胞抽出物由来のプレセニリン複合体を同時免疫精製し、次いでその成分を放出し、関連タンパク質を同定するために例えばマイクロシーケンシングによって、続いて遺伝子のクローニングおよび特性付けによって、単離された複合体を分裂させる。あるいは、プレタクチリンを、相互作用するポリペプチドのスクリーニングのための酵母ツーハイブリッド実験にベイト(bait)として用いることもできる。このような相互作用タンパク質はAβペプチド産生のモジュレーションにも関与している可能性があるため、その特性は必ずやその突然変異体がアルツハイマー病を引き起こす、またはアルツハイマー病にかかりやすくする新規の遺伝子の同定をもたらすであろう。これらはまたこの疾病の遺伝子療法および薬物療法に有用な新規の標的も提供することになろう。
【０５３３】
さらなる実施形態では、プレタクチリンは単離した細胞サンプルを標識したプレタクチリンと接触させ、それらの細胞での標識化を検出する工程を含んでなる、細胞、好ましくは神経細胞の細胞小器官コンパートメントでプレセニリンの位置を捜し当てる方法に使用できる。タンパク質の標識に使用する方法は当技術分野で周知であり、そのいずれもが本発明で使用できる。
【０５３４】
プレタクチリンは、この細胞での本タンパク質のレベルまたは活性を低下させることによりAβペプチドのレベル増加をもたらす突然変異体細胞において通常のAPPプロセシングを回復する方法も提供する。これは当技術分野で周知の技術、例えば抗体、アンチセンス分子、リボザイムを用いて、または該突然変異体細胞へのプレタクチリンの細胞小分子阻害剤の投与によって達成できる。
【０５３５】
本発明はまた、in vitroでの培養細胞、好ましくは脳細胞、より好ましくは神経細胞を、これらの細胞でのプレタクチリンの高レベル発現を達成するため、強力な構成プロモーター配列の制御下に置かれたプレタクチリンをコードするヌクレオチド配列でトランスフェクトし、この細胞へ試験物質を適用し、これらの細胞により産生したAβペプチドの量を対照のトランスフェクト細胞と比較して測定することにある、アルツハイマー病の予防または治療のいずれににおいても特に注目されうるAβ産生阻害剤のスクリーニングに有用なin vitro系を提供する。
【０５３６】
もう1つの実施形態では、プレタクチリンを細胞のアポトーシスのモジュレーションに使用できる。例えば、プレタクチリンのレベルは細胞、好ましくは腫瘍細胞においてin vitroまたはin vivoで増加させ、それによりアポトーシスを誘導することができる。プレタクチリンのレベルまたは活性は、精製したプレタクチリンを細胞へ投与すること、細胞をプレタクチリンをコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトすること、または細胞へプレタクチリンの活性または発現の増加をもたらす化合物を投与することによることをはじめとする多数の方法のいずれによっても増強することができる。あるいは、アポトーシスは、例えば抗体、アンチセンス分子、リボザイム、またはプレタクチリンの小分子阻害剤を用いて、細胞でのプレタクチリンのレベルまたは活性を低下させることによって阻害することもできる。ある好ましい実施形態では、プレタクチリンを用いて神経変性疾患、好ましくは、アルツハイマー病を患う患者の神経細胞のアポトーシスを阻害する。
【０５３７】
もう1つの実施形態では、本発明はプレタクチリンの過剰産生のため高レベルのAβペプチドを産生するトランスジェニック非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくは齧歯類を提供する。このようなトランスジェニック動物はアルツハイマー病の徴候を研究するため、より詳しくはAβペプチド堆積がこの疾病の病因に果たす役割を調査するために有用なin vivoモデルを提供するであろう。これもAβペプチドの分泌または蓄積を阻害する化合物のスクリーニングにとって相当に注目されるであろう。このようなトランスジェニック動物は、例えばマウスでは受精卵へのDNAマイクロインジェクションまたは胚幹細胞のトランスフェクションを用いる、当業者に周知のトランスジェニック動物の作出に用いられるいずれの現行法によっても得ることができる。プレタクチリンの高度の過剰発現は、強力なプロモーター配列の制御下にプレタクチリンをコードするヌクレオチド配列を配置することによって達成できる。このプロモーター配列は動物で広範に発現する遺伝子に由来するものであっても、またはその発現が脳に限定される遺伝子に由来するものであってもよい。好ましくは、調節可能なプロモーター配列を一度動物へ導入された導入遺伝子の発現を一時的に制御するために使用する。
【０５３８】
もう1つの実施形態では、プレタクチリンのレベルまたは活性をモジュレートしてアルツハイマー病患者の治療を提供することができる。実際にアルツハイマー病ではAβペプチドの堆積は初期に必ず起こる事象であるので、Aβ産生に影響する治療がこの疾病の治療に有効であると考えられている。よって、突然変異体細胞でのプレタクチリンのレベルまたは活性を低下させると、それによってAβ産生が減少するだろう。これはin vivoでの治療に用いられる周知のストラテジーのいずれによっても、例えばアンチセンス分子、抗体またはプレタクチリンの小分子阻害剤を用いても達成できる。
【０５３９】
配列番号34のタンパク質(内部表示145606_106-023-2-0-B3-F)
クローンのcDNA(配列番号33)は配列:
MDSSTAHSPVFLVFPPEITASEYESTELSATTFSTQSPLQKLFARKMKILGTIQILFGIMTFSFGVIFLFTLLKPYPRFPFIFLSGYPFWGSVLFINSGAFLIAVKRKTTETLIILSRIMNFLSALGAIAGIILLTFGFILDQNYICGYSHQNSQCKAVTVLFLGILITLMTFSIIELFISLPFSILGCHSEDCDCEQCCを含んでなるヒトMS4A5タンパク質(配列番号34)をコードする。よって、本願を通じて記載される配列番号34のポリペプチドの全ての特徴および用途は、またクローン145606_106-023-2-0-B3-Fに含まれる核酸によりコードされるポリペプチドに関係することが理解されるだろう。さらに、本願を通じて記載される配列番号33のポリヌクレオチドの全ての特徴および用途は、またクローン145606_106-023-2-0-B3-Fに含まれる核酸に関係することが理解されるだろう。本発明のある好ましい実施形態は、配列番号33、配列番号34およびクローン145606_106-023-2-0-B3-Fの組成物に向けられる。また、本明細書に記載のような生物活性を有するポリペプチド断片およびそれらの断片をコードするポリヌクレオチドも好ましい。
【０５４０】
5エキソンを含んでなる配列番号33のcDNAはMS4Aタンパク質ファミリー(4つの膜貫通ドメイン、Aサブファミリー)に属する200アミノ酸MS4A5タンパク質(STR Q9H3V2)をコードする。ヒト(MS4A4-7)およびマウス(MS4A8-11)で4つのMS4Aファミリーメンバーがすでに記載されている(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Ishibashi K.ら, Gene (2001), 264, 87-93)。CD20/Fc(σ)RI(β)/HTm4スーパーファミリーのその他のメンバーと同様、全てのMS4Aタンパク質が疎水性が高く4つの膜貫通ドメインを有する(同様に4つの膜貫通ドメインを有する4回膜貫通ファミリーメンバーとは異なる)。配列番号34のタンパク質をコードする配列番号33のcDNAは開始メチオニンの周囲の保存配列(ATC ATG G)および第2および第3の膜貫通ドメイン間の細胞内ループのコンセンサスタンパク質キナーゼA(PKA)リン酸化部位(KRKTT)を有する。主にリンパ系組織で発現するMS4Aファミリーのその他のメンバーと対照的に、MS4A5は精巣、膵臓で発現し、心臓および脳で低いレベルで発現する。MS4A5遺伝子はCD20、Fc(σ)RI(β)およびHTm4遺伝子と同じ染色体であるヒト第11染色体、特に11q12の位置にある。MS4A5は単独またはその他のタンパク質と共同してイオンチャネル、例えばリガンド依存性カルシウムチャネルとして働く新規な膜貫通タンパク質である。MS4A5は非リンパ系細胞での多数の細胞機能、例えば細胞内シグナル伝達、細胞内カルシウム濃度の調節、外分泌機能、および内分泌機能に関与している。
ある実施形態では、本発明のタンパク質またはその断片は、例えばフローサイトメトリー技術または当技術分野で周知の古典的なin situでの検出技術を用いて本タンパク質を特異的に発現する細胞を検出する方法を提供する。このような方法は、例えば本タンパク質は精巣、膵臓、心臓、または脳の細胞型で発現が高いので、これらの細胞型の特異的検出に有用である。このような方法は本タンパク質を過剰発現するまたは発現不十分な細胞の検出にも有用であり、従ってこのタンパク質の発現または活性の増加または減少の結果として生じるまたはそれに関連する疾病または症状の診断に有用である。この方法はこの疾病または症状に罹患しているおそれのある、またはこの疾病または症状が発生する危険のある個体から得た生物学的サンプルを、本タンパク質または核酸、例えば本タンパク質に対する抗体またはこのcDNAに対するポリヌクレオチドプローブと選択的に結合可能な化合物と接触させる工程を含む。この結合工程の後、この方法はサンプル内でのこの化合物と細胞またはタンパク質の間の選択的結合の存在または不在の検出をさらに含む。好ましい実施形態では、この化合物を標識し、サンプルには精巣、膵臓、心臓または脳に由来する細胞を含む。
【０５４１】
もう1つの実施形態では、本発明のタンパク質またはその断片を用いて細胞の増殖をモジュレートすることができる。例えば、本タンパク質のレベルまたは活性を細胞内で増強させて細胞の増殖の速度または程度を増加させることができる。このようなある実施形態では、生物学的サンプル中の細胞の増殖は、サンプル内の1以上の細胞の増殖の速度または程度を増加させるに十分な量の本タンパク質と、またはサンプルの1以上の細胞内の本タンパク質の活性または発現を増加させる化合物と生物学的サンプルを接触させることによって増強させる。このような方法はin vitroまたはin vivoのどちらでも行うことができ、好ましくは、この細胞には膵臓、精巣、心臓または脳の細胞を含む。細胞内の本タンパク質のレベルは、精製したタンパク質を細胞へ投与すること、このタンパク質をコードするポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクトすること、またはこのタンパク質の活性または発現を増加させる化合物を細胞へ投与することをはじめとする多くの手段の中のいずれでも増強することができる。あるいは、例えばアンチセンス分子を用いて、細胞内の本タンパク質のレベルを低下させることによって細胞の増殖を阻害することもできるし、あるいは直接または間接に本タンパク質に対する阻害分子または拮抗抗体を用いてより特異的に本タンパク質の活性を阻害することもできる。
【０５４２】
さらなる実施形態では、本発明のタンパク質またはその断片を用いて細胞のカルシウム濃度をモジュレートし、それによりカルシウム依存性シグナル伝達をモジュレートすることができる。カルシウム輸送は、例えば、サンプル内の1以上の細胞のカルシウム輸送を増加させるに十分な量の本タンパク質と、またはサンプルの1以上の細胞内の本タンパク質の活性または発現を増加させる化合物と生物学的サンプルを接触させることによりモジュレートすることができる。このような方法はin vitroまたはin vivoのどちらでも使用可能で、好ましくは、限定されるものではないが、この方法は膵臓、精巣、心臓または脳の細胞を含む細胞で行われる。細胞での本タンパク質のレベルは、精製したタンパク質を細胞へ投与すること、このタンパク質をコードするポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクトすること、またはこのタンパク質の活性または発現を増加させる化合物を細胞へ投与することをはじめとする多くの手段のうちのいずれでも増強することができる。あるいは、例えばアンチセンス分子を用いて細胞内の本タンパク質レベルを低下させることにより、本タンパク質の直接または間接阻害分子または拮抗抗体を用いることにより、あるいはドミナント・ネガティブ様式で働く不活性型のタンパク質を細胞内で発現させ、MS4Aファミリーのその他のメンバーにより行われる細胞での通常のカルシウムシグナル伝達を阻害することにより、このタンパク質の活性を阻害できる。
【０５４３】
本発明はまた、動物の1以上の組織で本タンパク質の発現または活性をモジュレートして作出した動物モデルを提供する。このような動物は異常なカルシウムのホメオスタシスおよび／または細胞増殖または本タンパク質の活性に特異的に関与するいずれかの機能に関連する疾病の種々の病態生理学的態様の治療に有用である可能性のある候補分子を試験するためのin vivoアッセイ法を示す。これらの動物は本タンパク質の発現を増加または低下させるいずれの方法でも作出できる。
【０５４４】
もう1つの実施形態では、カルシウムは遺伝子転写、細胞増殖、またより具体的には筋収縮、シナプス機能、膵臓ランゲルハンス島でのインスリン分泌、その他多数などの多様な範囲の細胞プロセスを制御する一般的な細胞内メッセンジャーであるので、本タンパク質またはその断片は、多くの器官(脳、腎臓、副甲状腺、膵臓、骨、腸)でのカルシウムホメオスタシスの不安定化に起因するまたは関連する異なる病態を治療する方法を提供する。さらに、本タンパク質が細胞または患者細胞において通常レベルである場合であっても、細胞または患者において細胞中のタンパク質の通常レベルの低下または上昇を引き起こすことによって、これらのプロセスのいずれもが増強または阻害可能である。本明細書に記載の方法のいずれに関しても、本タンパク質の活性は多数の手段のいずれか、例えばポリクローナルまたはモノクローナル抗体、または本タンパク質と特異的に結合して本タンパク質に関する機能に刺激効果または阻害効果を及ぼす全長抗体と質的な生物活性を共有するその他いずれかの化合物を用いるなどして、向上または阻害することができる。
【０５４５】
本タンパク質と相互作用し、それによりその活性を促進または干渉する化合物も上記のいずれかの病状の治療法として使用できる。このような化合物は、例えば、限定されるものではないが、同時免疫沈降、ツーハイブリッド法などの相互作用スクリーニングアプローチを用いて同定できる。さらに、本タンパク質を発現する細胞を提供することにより、または本タンパク質で再構成した脂質二重層を提供することにより、また、化合物の細胞または二重層で本タンパク質の活性をモジュレートする能力を検出することによって、本タンパク質の活性をモジュレートする能力について化合物をスクリーニングすることができる。このような活性は、限定されるものではないが、細胞または膜でのカルシウム流量またはカルシウムシグナル伝達の検出(例えば、シグナル伝達経路の下流メンバーの活性で明白)をはじめとする多数の手段のいずれでも検出できる。本発明はまた、本タンパク質を試験化合物と接触させ、化合物のタンパク質との結合能またはタンパク質活性をモジュレートする能力を検出する工程を含んでなる、本タンパク質の一部または全ての活性を促進または阻害可能ないずれの化合物を同定するin vitro法を提供する。この実施形態ではまた、本タンパク質または上記疾患の治療に有用なこの調査方法によって同定された有効ないずれかの化合物は、他の薬剤または化合物と組み合わせて使用できる。
【０５４６】
染色体11q13上の複数の遺伝子座がアトピー性喘息に関連することが既に示されているように(Adra CN.ら, Clin. Genet. (1999) June; 55(6):431-437)、本発明はまたこの症状に対する新規の候補遺伝子を提供する。よって、本発明はこの症状を有するおそれのある、またはこの症状を発症するリスクのある個体の1以上の細胞中のこの核酸の1以上のヌクレオチドの正体を突き止め、この細胞または細胞がこの症状を示す、またはこの症状を発症するリスクが高いことを示すこの核酸配列内にヌクレオチドを含むかを決定することを含んでなる、アトピー性喘息の診断法を提供する。このようなヌクレオチドの正体は多数の手段のいずれか、例えばその多くが当技術分野で周知である標準シーケンシングまたはゲノタイピング法を用いて決定することができる。
【０５４７】
配列番号36のタンパク質(内部表示クローン1000769575_208-22-1-0-B2-F)
クローン1000769575_208-22-1-0-B2-FのcDNA(配列番号35)はアミノ酸配列：
MGMSSLKLLKYVLFFFNLLFWICGCCILGFGIYLLIHNNFGVLFHNLPSLTLGNVFVIVGSIIMVVAFLGCMGSIKENKCLLMSFFILLLIILLAEVTLAILLFVAKGLTDSIHRYHSDNSTKAAWDSIQSFLQCCGINGTSDWTSGPPASCPSDRKVEGCYAKARLWFHSNFFIRGPYを含んでなる配列番号36のタンパク質をコードする。よって、本願を通じて記載される配列番号36のポリペプチドの全ての特徴および用途は、またクローン1000769575_208-22-1-0-B2-Fに含まれる核酸によりコードされるポリペプチドに関係することが理解されるだろう。さらに、本願を通じて記載される配列番号35のポリヌクレオチドの全ての特徴および用途は、またクローン1000769575_208-22-1-0-B2-Fに含まれる核酸に関係することが理解されるだろう。本発明のある好ましい実施形態は、配列番号35、配列番号36およびクローン1000769575_208-22-1-0-B2-Fの組成物に向けられる。また、本明細書に記載のような生物活性を有するポリペプチド断片およびそれらの断片をコードするポリヌクレオチドも好ましい。
【０５４８】
配列番号36のタンパク質は新規な機能を有するCD53の複雑なスプライス変異体であるアンタギニン(Antaginin)をコードする。アンタギニンにおいては、エキソン4のエキソン5へのスプライシングによって、9つのアミノ酸の欠失(エキソン4から4つ、エキソン5から5つ)と対応する独特な連結配列が生じる。さらに、エキソン7の、エキソン8内の通常の3'非翻訳ヌクレオチド配列へのスプライシングによって、エキソン7からの14のアミノ酸の欠失、ならびにCD53のカルボキシ末端の23のアミノ酸の欠失およびアンタギニンの独特な6つのアミノ酸カルボキシ末端配列での置換が生じる。
【０５４９】
CD53は発現が白血球に限定され、テトラスパニニン（tetraspaninin）スーパーファミリーのメンバーである。CD53は、短い細胞内アミノテールとカルボキシルテールを有する小および大細胞外ループ(それぞれEC1およびEC2)を形成する4つの膜貫通ドメイン(TM1〜TM4)を特徴とする完全な膜タンパク質である。CD53のEC1およびEC2はそれぞれアミノ酸配列37〜54および107〜181(CD53の最初のメチオニンから数えて)を含んでなる。CD53のTM1〜TM4はそれぞれアミノ酸配列11〜36、55〜69、81〜106および182〜206(CD53の最初のメチオニンから数えて)を含んでなる(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Rost, B.ら, Prot. Sci. 5:1704-18, (1996))。
【０５５０】
CD53は細胞表面においてモジュール型シグナル伝達複合体の構築を促進する。特にCD53は細胞外リガンド結合ドメイン(β1インテグリンのものなど)を、シグナル伝達に関与する細胞内ドメイン(タンパク質キナーゼCのものなど)と機能的に連結するアダプターとして働く(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Zhang, XAら, J. Biol. Chem. (2001))。β1インテグリンはEC2を介してCD53と会合することが示されている。さらに、他のテトラスパニニンとの相互作用を介し、CD53は細胞表面に存在するより高次のテトラスパニニンウェブに組み込まれる。CD53は細胞接着、運動性、活性化(CD3/T細胞受容体により媒介されるT細胞の活性化に対する共刺激シグナルの送達を含む)、および増殖におけるその生理学上の重要性を示す多くの特性を示す(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Boucheix, C.ら Expert Reviews in Molecular Medicine (2001))。
【０５５１】
アンタギニンは摂動の高いEC2ループと発散性の高いTM4膜貫通ドメインを特徴とする。アンタギニンのEC2/TM4領域はアミノ酸107〜179(アンタギニンの開始メチオニンから数えて)を含んでなる。さらに、アンタギニンはエキソン4と5の連結部(アミノ酸124/125、アンタギニンの開始メチオニンから数えて)におけるアミノ酸配列の細胞外摂動を特徴とする(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Rost, B.ら, Prot. Sci. 5:1704-18, (1996))。アンタギニンはCD53により促進される細胞表面において機能的モジュール型シグナル伝達複合体の構築に拮抗作用を示す。
【０５５２】
ある好ましい実施形態では、本発明は本発明のアンタギニンと特異的に結合する抗体を提供する。さらに、マウスがアンタギニンでトランスフェクトされた同系細胞系で免疫化される、抗体を作製する方法も好ましい。このようなマウス由来のモノクローナル抗体はアンタギニンでトランスフェクトされた細胞系と結合するが、ヒトCD53でトランスフェクトされた同じ細胞系とは結合しないようにスクリーニングする。抗体の特異性は免疫沈降材料のアミノ酸配列解析によってさらに確認する。さらに、アンタギニンのEC1またはカルボキシル末端配列(EC2/TM-4領域)と結合するような抗体を作製する方法も好ましい。アンタギニンのEC1およびEC2/TM4領域はそれぞれアミノ酸配列37〜54および107〜179(アンタギニンの開始メチオニンから数えて)を含んでなる。さらに、アンタギニンのEC2/TM4領域と結合するような抗体を作製する方法も好ましい。該モノクローナル抗体を作製する方法およびその特異性を確認する方法は当業者に周知のものである。
【０５５３】
ある好ましい実施形態では、本発明は該抗体をアンタギニンと接触させ特異的に結合させる方法を提供する。さらに、免疫応答障害の基礎を調べるために該抗体を診断的に用いる方法も好ましい。さらに、病理学的観点から白血球によるアンタギニン発現のフローサイトメトリー分析において該抗体を診断的に用いる方法も好ましい。さらに、ウイルス感染に関して白血球によるアンタギニン発現のフローサイトメトリー分析において該抗体を診断的に用いる方法も好ましく、ここではウイルスとしては、限定されるものではないが、(a)サイトメガロウイルス;(b)ヒト免疫不全ウイルス;(c)ヒトヘルペスウイルス6(HHV6);(d)C型肝炎ウイルス;および(e)D型肝炎ウイルスからなる群から選択される。
【０５５４】
さらに、抗腫瘍免疫応答障害の基礎を調べるため、白血病患者の正常な白血球によるアンタギニン発現のフローサイトメトリー分析において該抗体を診断的に用いる方法も好ましく、ここで白血病としては、限定されるものではないが、(a)B細胞急性リンパ芽球性白血病(B-ALL);(b)慢性リンパ性白血病(CLL);(c)T細胞急性リンパ芽球性白血病(T-ALL);(d)多発性骨髄腫;および(e)急性骨髄性白血病(AML)からなる群から選択される。
【０５５５】
さらに、抗腫瘍免疫応答障害の基礎を調べるため、癌患者の正常な白血球によるアンタギニン発現のフローサイトメトリー分析において該抗体を診断的に用いる方法も好ましく、ここで癌としては、限定されるものではないが、(a)黒色腫;(b)乳癌;(c)肺癌;(d)結腸癌;(e)ホジキンリンパ腫;(f)非ホジキンリンパ腫;(g)前立腺癌;(h)膵臓癌;(i)子宮癌;(j)卵巣癌;(k)精巣癌;(l)直腸癌;(m)肝臓癌;および(n)肺非小細胞癌からなる群から選択される。
【０５５６】
白血球の活性化の閾値はサイトカインによって調節され得る。さらなる実施形態では、本発明は白血球によるアンタギニン発現のサイトカイン調節のin vitro分析における該アンタギニン抗体の使用を提供する。さらに、サイトカインによる該調節のフローサイトメトリー分析において該抗体を用いる方法も好ましく、ここでサイトカインとしては、限定されるものではないが、(a)インターフェロンγ;(b)インターロイキン17;(c)インターロイキン4;(d)インターロイキン10;(e)インターロイキン13;(f)インターロイキン15;(g)インターロイキン1;(h)インターロイキン6;(i)単球走化性タンパク質1(MCP-1);(j)インターロイキン8;および(k)腫瘍壊死因子αからなる群から選択される。
【０５５７】
さらに、該抗体をアンタギニンと接触させて、それにより細胞表面においてCD53により促進される機能的モジュール型シグナル伝達複合体の構築に拮抗するアンタギニンの能力を立体化学的に阻害する方法も好ましい。このようにすると、アンタギニン抗体はCD53により媒介される白血球の活性化をアップレギュレートする。好ましい組成物は、アンタギニン抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体を含んでなる。好ましい投与経路は静注である。
【０５５８】
本発明のさらなる実施形態では、該アンタギニン抗体は誘発された免疫応答をアップレギュレートする方法においてワクチン調製物中のアジュバントして配合する。該方法では、該アンタギニン抗体は特異的免疫の確立に寄与するCD53により媒介される白血球の活性化を促進する。該アンタギニン抗体は細胞表面においてCD53により促進される機能的モジュール型シグナル伝達複合体の構築に拮抗するアンタギニンの能力を立体化学的に阻害することにより、CD53により媒介される白血球の活性化をアップレギュレートする。さらに、ウイルス感染をターゲッティングするワクチンにおいて該抗体を用いる方法も好ましく、ここでウイルスとしては、限定されるものではないが、(a)ヒト免疫不全ウイルス;(b)ヒトヘルペスウイルス6(HHV6);(c)C型肝炎ウイルス;(d)D型肝炎ウイルス;(e)E型肝炎ウイルス;(f)サイトメガロウイルス;(g)呼吸器合胞体ウイルス;(h)I型単純ヘルペスウイルス;(i)II型単純ヘルペスウイルス;(j)インフルエンザウイルス;(k)パルボウイルス;(l)コクサッキーウイルス;(m)エコーウイルス;(n)エプスタイン・バーウイルス;(o)デングウイルス;(p)ラッサ熱ウイルス;および(q)エボラウイルスからなる群から選択される。
【０５５９】
さらに、原生動物感染をターゲッティングするワクチンにおいて該アンタギニン抗体を用いる方法も好ましく、ここで原生動物としては、限定されるものではないが、(a)赤痢アメーバ(Entamoeba histolytica);(b)クリプトスポリジウム・パルブム(Cryptosporidium parvum);(c)熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum);(d)トリパノソーマ属(Trypanosoma);(e)リーシュマニア属(Leishmania);(f)膣トリコモナス(Trichomonas vaginalis);および(g)アカンスアメーバ属(Acanthamoeba)からなる群から選択される。
【０５６０】
ウイルスは免疫の監視を回避する手段として免疫応答を抑制することができる。本発明のさらなる実施形態では、該アンタギニン抗体は進行中のウイルス感染に対する免疫応答をアップレギュレートする方法において用いられる。該方法では、該アンタギニン抗体は抗ウイルス免疫応答に寄与するCD53により媒介される白血球の活性化を促進する。該アンタギニン抗体は細胞表面においてCD53により促進される機能的モジュール型シグナル伝達複合体の構築に拮抗するアンタギニンの能力を立体化学的に阻害することにより、CD53により媒介される白血球の活性化をアップレギュレートする。さらに、進行中のウイルス感染に対する免疫応答をアップレギュレートする方法も好ましく、ここでウイルスとしては、限定されるものではないが、(a)ヒト免疫不全ウイルス;(b)ヒトヘルペスウイルス6(HHV6);(c)B型肝炎ウイルス;(d)C型肝炎ウイルス;(e)D型肝炎ウイルス;(f)サイトメガロウイルス;(g)呼吸器合胞体ウイルス;(h)インフルエンザウイルス;(i)I型単純ヘルペスウイルス;(j)II型単純ヘルペスウイルス;(k)エプスタイン・バーウイルス;(l)水痘帯状疱疹ウイルス;(m)モルビリウイルス;(n)パラミクソウイルス;(o)パピローマウイルス;(p)アデノウイルス;(q)デングウイルス;(r)ラッサ熱ウイルス;(s)コクサッキーウイルス;(t)エコーウイルス;および(u)エボラウイルスからなる群から選択される。
【０５６１】
細菌は免疫の監視を回避する手段として免疫応答を抑制することができる。本発明のさらなる実施形態では、該アンタギニン抗体は進行中の細菌感染に対する免疫応答をアップレギュレートする方法において用いられる。該方法では、該アンタギニン抗体は抗細菌免疫応答に寄与するCD53により媒介される白血球の活性化を促進する。該アンタギニン抗体は細胞表面においてCD53により促進される機能的モジュール型シグナル伝達複合体の構築に拮抗するアンタギニンの能力を立体化学的に阻害することにより、CD53により媒介される白血球の活性化をアップレギュレートする。さらに、進行中の細菌感染に対する免疫応答をアップレギュレートする方法も好ましく、ここで細菌としては、限定されるものではないが、(a)トリ結核菌群(Mycobacterium avium complex);(b)ニューモシスティス・カリニ(Pneumocystis carinii);(c)アクネ・ブルガリス(Acne vulgaris);(d)レジオネラ・ニューモフィラ菌(Legionella pneumophilia);(e)ペスト菌(Yersinia pestis);(f)ウレアプラズマ・ウレアリチカム(Ureaplasma urealyticum);(g)肺炎クラミジア(Chlamydia pneumoniae);(h)ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori);(i)梅毒トレポネーマ(Treponema pallidum);(j)淋菌(Neisseria gonorrhoeae);(k)ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium);(l)コレラ菌(Vibrio cholera);(m)クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile);(n)バシラリー・ディセンタリー(Bacillary dysentery);(o)ペニシリン耐性肺炎球菌(Pencillin resistant Pneumococcus);(p)鼻疽菌(Burkholderia mallei);(q)らい菌(Mycobacterium leprae);(r)マイコバクテリウム・ハエモフィルム(Mycobacterium haemophilum);(s)マイコバクテリウム・カンサシイ(Mycobacterium kansasii);(t)インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae;および(u)炭疽菌(Bacillus anthracis)からなる群から選択される。
【０５６２】
原生動物は免疫の監視を回避する手段として免疫応答を抑制することができる。本発明のさらなる実施形態では、該アンタギニン抗体は進行中の原生動物感染に対する免疫応答をアップレギュレートする方法において用いられる。該方法では、該アンタギニン抗体は抗原生動物免疫応答に寄与するCD53により媒介される白血球の活性化を促進する。該アンタギニン抗体は細胞表面においてCD53により促進される機能的モジュール型シグナル伝達複合体の構築に拮抗するアンタギニンの能力を立体化学的に阻害することにより、CD53により媒介される白血球の活性化をアップレギュレートする。さらに、進行中の原生動物感染に対する免疫応答をアップレギュレートする方法も好ましく、ここで原生動物としては、限定されるものではないが、(a)赤痢アメーバ(Entamoeba histolytica);(b)クリプトスポリジウム・パルブム(Cryptosporidium parvum);(c)ランブル鞭毛虫(Giardia lamblia);(d)トキソプラスマ(Toxoplasma gondii);(e)イソスポラ・ベリイ(Isospora belli);(f)エンセファリトゾーン・カニキュリ(Encephalitozoon cuniculi);(g)エンテロサイトゾーン・ビエニューシ(Enterocytozoon bieneusi);(h)熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum);(i)トリパノソーマ属(Trypanosoma);(j)リーシュマニア属(Leishmania);(k)膣トリコモナス(Trichomonas vaginalis);および(l)アカンスアメーバ属(Acanthamoeba)からなる群から選択される。
【０５６３】
本発明のさらなる実施形態では、該アンタギニン抗体は進行中の真菌感染に対する免疫応答をアップレギュレートする方法において用いられ、ここで真菌としては、限定されるものではないが、(a)クリプトコッカス・メニンジチス(Cryptococcal meningitis);(b)ヒストプラスマ・カプスラーツム(Histoplasma capstulatum);(c)コクシジオデス・イミチス(Coccidiodes immitis);および(d)カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)からなる群から選択される。
【０５６４】
腫瘍は免疫の監視を回避する手段として免疫応答を抑制することができる。本発明のさらなる実施形態では、該アンタギニン抗体は腫瘍に対する免疫応答をアップレギュレートする方法において用いられる。該方法では、該アンタギニン抗体は抗腫瘍免疫応答に寄与するCD53により媒介される白血球の活性化を促進する。該アンタギニン抗体は細胞表面においてCD53により促進される機能的モジュール型シグナル伝達複合体の構築に拮抗するアンタギニンの能力を立体化学的に阻害することにより、CD53により媒介される白血球の活性化をアップレギュレートする。さらに、腫瘍に対する免疫応答をアップレギュレートする方法も好ましく、ここで腫瘍としては、限定されるものではないが、(a)黒色腫;(b)乳癌;(c)肺癌;(d)結腸癌;(e)ホジキンリンパ腫;(f)非ホジキンリンパ腫;(g)前立腺癌;(h)膵臓癌;(i)子宮癌;(j)卵巣癌;(k)精巣癌;(l)直腸癌;(m)肝臓癌;および(n)肺非小細胞癌からなる群から選択される。
【０５６５】
本発明のさらなる実施形態において、該アンタギニン抗体は、治療的抗腫瘍ワクチン中のアジュバントとして組み込まれ、ここで腫瘍としては、限定されるものではないが、(a)黒色腫;(b)乳癌;(c)肺癌;(d)結腸癌;(e)ホジキンリンパ腫;(f)非ホジキンリンパ腫;(g)前立腺癌;(h)膵臓癌;(i)子宮癌;(j)卵巣癌;(k)精巣癌;(l)直腸癌;(m)肝臓癌;および(n)肺非小細胞癌からなる群から選択される。
【０５６６】
細胞内(マクロファージ)病原体は、マクロファージの活性化か、または細胞傷害性Tリンパ球による感染マクロファージの溶解のいずれかによって除去することができる(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Chunら, J. Exp. Med. 193:1213 (2001))。本発明のさらなる実施形態では、該アンタギニン抗体はマクロファージの活性化または細胞傷害性Tリンパ球の生成を促進することにより細胞内の病原体を除去する方法において用いられ、ここで病原体としては、限定されるものではないが、(a)ヒストプラスマ・カプスラーツム(Histoplasma capsulatum);(b)結核菌(Mycobacterium tuberculosis);(c)ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium);(d)トラコーマクラミジア(Chlamydia trachomatis);および(e)ニューモシスティス・カリニ(Pneumocystis carinii)からなる細胞内(マクロファージ)病原体群から選択される。
【０５６７】
ウイルスの生活環に役割を果たす数例のテトラスパニンが存在している。抗テトラスパニン抗体はシンシチウムの形成および／またはウイルスの産生を阻害する。これはヒトTリンパ球親和性ウイルス1ではテトラスパニンCD81およびCD82、また、ネコ免疫不全ウイルスおよびイヌジステンパーウイルスではテトラスパニンCD9に関して観察された。また、テトラスパニンCD81はC型肝炎ウイルスの病因(aetiopathogenesis)にも役割を果たすと考えられている(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるBoucheix, C.ら (2001))。本発明のさらなる実施形態では、該アンタギニン抗体は、アンタギニンがウイルス受容体として用いられる場合にウイルス感染を遮断する方法において用いられる。さらに、アンタギニンがウイルス受容体として用いられ、限定されるものではないが、(a)Tリンパ球;(b)Bリンパ球;(c)NKリンパ球;(d)単球;(e)マクロファージ;(f)好中球;および(g)樹状細胞からなる白血球型の群から選択される白血球型により発現される場合の該ウイルス感染を遮断する方法における該アンタギニン抗体の使用も好ましい。
【０５６８】
さらなる好ましい実施形態では、本発明はアンタギニンと結合し、アンタギニンのCD53機能を妨げる能力を阻害または促進する能力に関して試験化合物をスクリーニングする方法を提供する。さらに、それはβ1インテグリンを介してそのシグナル伝達の促進に関連することから、アンタギニンと結合してアンタギニンのCD53機能を妨げる能力を阻害または促進する能力に関して試験化合物をスクリーニングする方法も好ましい(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるZhang, XAら, J. Biol. Chem. (2001))。さらに、アンタギニンと結合してCD53により促進されるタンパク質キナーゼCのβ1インテグリンとの会合を妨げる能力を阻害または促進する能力に関して試験化合物をスクリーニングする方法も好ましい。さらにまた、CD53およびアンタギニンでトランスフェクトされたβ1(α3β1、α4β1またはα6β1)発現細胞系においてはアンタギニンと結合してタンパク質キナーゼCとβ1インテグリンとの会合を阻害または促進する能力があるが、CD53単独でトランスフェクトされた同じ細胞系においてはそうではない試験化合物をスクリーニングする方法も好ましい。このような試験化合物をスクリーニングする方法およびCD53により促進されるタンパク質キナーゼCとβ1インテグリンと会合に関するそれらの作用を特徴づける方法は当業者に周知のものである。
【０５６９】
該化合物の好ましい製剤としては、限定されるものではないが、(a)経口;(b)経皮;(c)注射;(d)口内;および(d)エアゾールの群から選択される送達経路と適合する製剤から選択されるものである。
【０５７０】
アンタギニンと結合してアンタギニンのCD53機能を妨げる能力を阻害し、それによりCD53活性を効果的にアップレギュレートすることが見出された化合物はアンタギニン抗体に関して上記したものと同様の方法で用いられる。
【０５７１】
アンタギニンと結合してアンタギニンのCD53機能を妨げる能力を促進し、それによりCD53活性を効果的にダウンレギュレートすることが見出された化合物。このような化合物は慢性炎症性自己免疫疾患およびその他の免疫調節障害に用途を持つ。このような化合物は細胞表面においてCD53により促進される機能的モジュール型シグナル伝達複合体の構築に拮抗するアンタギニンの能力を促進することによりCD53により媒介される白血球の活性化をダウンレギュレートする。本発明のさらなる実施形態では、該化合物はアンタギニンを接触させて調節不全(dysregulated)免疫応答をダウンレギュレートし、それにより関連の免疫疾患を治療する方法において用いられ、ここで免疫疾患としては、限定されるものではないが、(a)慢性関節リウマチ;(b)炎症性腸疾患;(c)インスリン依存性糖尿病(1型糖尿病);(d)多発性硬化症;(e)全身性紅斑性狼瘡;(f)乾癬;(g)アレルギー性喘息;(h)アレルギー性鼻炎(花粉症);および(i)移植片対宿主病の群から選択される。本発明のさらなる実施形態では、急性炎症を抑制する方法においてアンタギニンのCD53機能を妨げる能力を促進することができるこのような試験化合物が用いられる。このような試験化合物は細胞表面においてCD53により促進される機能的モジュール型シグナル伝達複合体の構築に拮抗するアンタギニンの能力を促進することによりCD53により媒介される白血球の活性化をダウンレギュレートする。さらに、創傷治癒に関連する炎症を抑制するためにこのような試験化合物を用いる方法も好ましい。さらにまた、創傷または損傷組織をその創傷部位に注射または経皮接触によって改善上有効な量と接触させる方法において、このような試験化合物からなる組成物を用いることも好ましい。
【０５７２】
配列番号38のタンパク質(内部表示クローン146994_106-023-4-0-C9-F)
クローン146994_106-023-4-0-C9-FのcDNA(配列番号37)はアミノ酸配列: MSPGQPMTFPPEALWVTVGLSVCLIALLVALAFVCWRKIKQSCEEENAGAEDQDGEGEGSKTALQPLKHSDSKEDDGQEIAを含んでなる配列番号38のタンパク質をコードする。よって、本願を通じて記載される配列番号38のポリペプチドの全ての特徴および用途は、またクローン146994_106-023-4-0-C9-Fに含まれる核酸によりコードされるポリペプチドに関係することが理解されるだろう。さらに、本願を通じて記載される配列番号37のポリヌクレオチドの全ての特徴および用途は、またクローン146994_106-023-4-0-C9-Fに含まれる核酸に関係することが理解されるだろう。本発明のある好ましい実施形態は、配列番号37、配列番号38およびクローン146994_106-023-4-0-C9-Fの組成物に向けられる。また、本明細書に記載のような生物活性を有するポリペプチド断片およびそれらの断片をコードするポリヌクレオチドも好ましい。
【０５７３】
配列番号38のタンパク質はベフェリン(Beferin)をコードする。ベフェリンは最近記載された、Bリンパ球活性化抗原B7(BLAA)ファミリーの2つのメンバーB7-H3およびBlaaの新規なスプライス変異体である。ベフェリンは以下に記載するような新規な機能を有する。
【０５７４】
B7-H3はTリンパ球共刺激活性を有するヒトB7様分子として同定された(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Chapoval, AIら, Nature Immunology 2:269-74 (2001))。B7-H3は構造:[シグナルペプチド]-[IgV様ドメイン1]-[IgC様ドメイン2]-[膜貫通領域]-[細胞質テール]を有する。
【０５７５】
Blaa(NCBI受託番号AX097550)は、全体が参照により組み入れられる特許出願WO00118204A1(「ヒトBリンパ球活性化抗原B7ファミリーのメンバーをコードするポリヌクレオチドおよびそれによってコードされたポリペプチド(Polynucleotides encoding members of the human B lymphocyte activation antigen B7 family and polypeptides encoded thereby)」)に記載されているように、ヒトB7様分子として同定された。Blaaは構造: [シグナルペプチド]-[IgV様ドメイン1]-[IgC様ドメイン1]-[IgV様ドメイン2]-[IgC様ドメイン2]-[膜貫通領域]-[細胞質テール]を有する。
【０５７６】
Blaa(NCBI受託番号AX047070)は、全体が参照により組み入れられる特許出願WO00068266A1(「アミロイド前駆体タンパク質プロテアーゼおよび関連核酸組成物(Amyloid precursor protein protease and related nucleic acid compositions)」)に記載されているように、β-セクレターゼ(β-アミロイド変換酵素)活性を有するタンパク質として独立に同定された。AX947070のアミノ酸配列はAX097550と同じである。
【０５７７】
IgV様ドメイン1はIgV様ドメイン2のアミノ酸配列と同一ではないが極めて類似している。IgC様ドメイン1はIgC様ドメイン2のアミノ酸配列と同一ではないが極めて類似している。
【０５７８】
ベフェリンの場合、新規な5'エキソンは膜貫通領域および細胞質テールをコードするエキソンへと直接スプライシングされる。この結果、IgV様およびIgC様細胞外ドメインの欠失が起こる。ベフェリンの短い細胞外テールは新規な5'エキソン(下線)によりコードされる3つの新規な(B7-H3でもBlaaでも見られない)N末端アミノ酸で始まるB7-H3およびBlaaと共通のおよそ7つのアミノ酸からなる: MSPGQPMTFP。
【０５７９】
共刺激は、T細胞受容体の結合の他、T細胞の最適な活性化に必要とされる。最も包括的に研究されている共刺激分子はBリンパ球活性化抗原B7ファミリーのメンバーであり、これまでのところ5つある。B7ファミリーの各メンバーはT細胞上の1以上のカウンター受容体(counter-receptor)と結合するが、これまでのところこれには4つがある。B7-H3は心臓、肝臓、胎盤、前立腺、精巣、子宮、膵臓、小腸および大腸をはじめ多くのヒト組織で発現が高い。また、脳、骨格筋、腎臓および肺でもB7-H3の低発現が見られた。B7-H3は末梢血単核細胞では検出できないが、炎症性サイトカインにより樹状細胞および単球上に誘導され得る。また、黒色腫、子宮頚腺癌、慢性骨髄性白血病、肺癌および結腸直腸腺癌由来のものをはじめとするいくつかの腫瘍系統でもB7-H3が発現する。B7-H3はCD4+およびCD8+T細胞の両者の増殖を共刺激し、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)の誘導を増強し、T細胞受容体シグナル伝達の存在下で炎症性サイトカインインターフェロンγ(IFNγ)の産生を選択的に刺激する。B7-H3は抗原提示細胞上に非共有結合オリゴマーとして存在し、これはT細胞共刺激因子としてのその役割においてB7-H3とそのカウンター受容体との高結合活性に重要である。
【０５８０】
非神経組織では、Blaaはそのβ-セクレターゼ活性により細胞表面において751アミノ酸のアイソフォームのアミロイドβタンパク質前駆体(APP751)を切断してセリンプロテアーゼ阻害剤プロテアーゼネキシン2(PN2)と同じ可溶性断片を生じる。PN2とそのKunitzプロテアーゼ阻害ドメインは第VIIa凝固因子(FVIIa)の阻害剤および外因性凝固カスケードの第VIIa因子-組織因子複合体(FVIIa-TF)(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Mahdi, Fら, Thromb. Res. 99:267-76 (2000))イニシエーターであることが示されている。卵巣癌細胞によるTF発現およびその外因性凝固経路の連動(engagement)は癌の転移に役割を果たすことが示されている(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Fischer, EGら, J. Clin. Invest. 104:1213-21 (1999) )。FVIIa-TFによって生成される第Xa因子(FXa)はそのプロテアーゼ活性化受容体2(PAR2)の切断によって血管内皮細胞の炎症活性化をもたらすことが示されている(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Camerer, Eら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:5255-60 (2000))。FXaはまた、プロテアーゼ活性化受容体1(PAR1)の切断により炎症性細胞応答を誘起することができる(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Kravchenko, RM Blood 97:3109-16 (2001))。
【０５８１】
ベフェリンは細胞表面においてB7-H3オリゴマーへのその非生産的組み込みを介してTリンパ球のB7-H3共刺激を妨げる。従ってベフェリンの1つの機能はTリンパ球共刺激に負の調節を行うことである。病理学的観点からは、ベフェリンのアップレギュレーションは病原体および腫瘍細胞による免疫の監視の回避を助長する。
【０５８２】
ベフェリンはAPP751とのその非生産的相互作用を介してPN2のBlaa生成を妨げる。従ってベフェリン発現の第2の機能的結果は、FXaの生成をはじめ、外因的凝固経路の連動のアップレギュレートにある。病理学的観点からは、ベフェリンのアップレギュレーションは凝固亢進および癌の転移を助長する。
【０５８３】
ある好ましい実施形態では、本発明は本発明のベフェリンと特異的に結合する抗体を提供する。さらに、ベフェリンでトランスフェクトされた同系細胞系でマウスを免疫化する、このような抗体の作製方法も好ましい。該マウスに由来するモノクローナル抗体を、ベフェリンでトランスフェクトされた細胞系とは結合するが、ヒトB7-H3またはBlaaでトランスフェクトされた同じ細胞系とは結合しないものに関してスクリーニングする。抗体の特異性はさらに免疫沈降材料のアミノ酸配列解析によって確認する。さらに、抗体がベフェリンの細胞外アミノ末端の全体または一部と結合する抗体を作製する方法も好ましい。このベフェリンの細胞外アミノ末端はアミノ酸配列1〜10(ベフェリンの開始メチオニンから数えて)を含んでなる。このようなモノクローナル抗体を作製する方法およびその特異性を確認する方法は当業者に周知のものである。
【０５８４】
ある好ましい実施形態では、本発明は該抗体を接触させ、それをベフェリンと特異的に結合させる方法を提供する。さらに、免疫応答障害または凝固亢進の基礎を調べるために該抗体を診断的に用いる方法も好ましい。さらに、病理学的観点から白血球によるベフェリン発現のフローサイトメトリー分析において該抗体を診断的に用いる方法も好ましい。さらに、病理学的観点から組織によるベフェリン発現の免疫組織化学的分析において該抗体を診断的に用いる方法も好ましい。免疫組織化学的分析またはフローサイトメトリー分析を行う方法は当業者に周知のものである。
【０５８５】
さらに、抗腫瘍免疫応答障害または凝固亢進のいずれかの基礎を調べるため、白血病患者の正常な白血球および白血病細胞によるベフェリン発現のフローサイトメトリー分析において該抗体を診断的に用いる方法も好ましく、ここで白血病としては、限定されるものではないが、(a)B細胞急性リンパ芽球性白血病(B-ALL);(b)慢性リンパ性白血病(CLL);(c)T細胞急性リンパ芽球性白血病(T-ALL);(d)多発性骨髄腫;および(f)急性骨髄性白血病(AML)からなる群から選択される。
【０５８６】
さらに、抗ウイルス免疫応答障害または凝固亢進のいずれかの基礎を調べるため、ウイルス感染患者の白血球によるベフェリン発現のフローサイトメトリー分析において該抗体を診断的に用いる方法も好ましく、ここでウイルスとしては、限定されるものではないが、(a)サイトメガロウイルス;(b)ヒトヘルペスウイルス6(HHV6);(c)ヒト免疫不全ウイルス;(d)C型肝炎ウイルス;および(e)D型肝炎ウイルスからなる群から選択される。
【０５８７】
さらに、凝固亢進の基礎を調べるため、組織によるベフェリン発現の免疫組織化学的分析において該抗体を診断的に用いる方法も好ましく、ここで組織としては、限定されるものではないが、(a)心臓;(b)肝臓;(c)胎盤;(d)前立腺;(e)精巣;(f)子宮;(g)膵臓;(h)小腸;(i)大腸;(j)腎臓;および(k)肺からなる群から選択される。
【０５８８】
さらに、抗腫瘍免疫応答または凝固亢進のいずれかの基礎を調べるため、腫瘍細胞によるベフェリン発現の免疫組織化学的分析において該抗体を診断的に用いる方法も好ましく、ここで腫瘍細胞としては、限定されるものではないが、(a)黒色腫;(b)乳癌;(c)肺癌;(d)結腸癌;(e)ホジキンリンパ腫;(f)非ホジキンリンパ腫;(g)前立腺癌;(h)膵臓癌;(i)子宮癌;(j)卵巣癌;(k)精巣癌;(l)直腸癌;(m)肝臓癌;および(n)肺非小細胞癌からなる群から選択される。
【０５８９】
Tリンパ球共刺激の効力ならびに凝固性の状態はサイトカインにより調節することができる。さらなる実施形態では、本発明は正常な白血球によるベフェリン発現のサイトカイン調節のin vitro分析における該ベフェリン抗体の使用を提供する。さらに、サイトカインによる該調節のフローサイトメトリー分析において該抗体を用いる方法も好ましく、ここでサイトカインとしては、限定されるものではないが、(a)インターフェロンγ;(b)インターロイキン17;(c)インターロイキン4;(d)インターロイキン10;(e)インターロイキン13;(f)インターロイキン15;(g)インターロイキン1;(h)インターロイキン6;(i)単球走化性タンパク質1(MCP-1);(j)血管内皮増殖因子(VEGF);(k)トランスフォーミング増殖因子β;(l)インターロイキン8;および(m)腫瘍壊死因子αからなる群から選択される。
【０５９０】
さらなる実施形態では、本発明は非白血球細胞系によるベフェリン発現のサイトカイン調節のin vitro分析における該ベフェリン抗体の使用を提供する。さらに、サイトカインによる該調節のフローサイトメトリー分析において該抗体を用いる方法も好ましく、ここでサイトカインとしては、限定されるものではないが、(a)インターフェロンγ;(b)インターロイキン17;(c)インターロイキン4;(d)インターロイキン10;(e)インターロイキン13;(f)インターロイキン15;(g)インターロイキン1;(h)インターロイキン6;(i)単球走化性タンパク質1(MCP-1);(j)血管内皮増殖因子(VEGF);(k)トランスフォーミング増殖因子β;(l)インターロイキン8;および(m)腫瘍壊死因子αからなる群から選択される。
【０５９１】
さらに、該抗体をベフェリンと接触させて特異的に結合させ、それにより細胞表面においてベフェリンのB7-H3オリゴマーへの非生産的組み込みを立体化学的に阻害する方法も好ましい。このようにすると、該ベフェリン抗体はB7-H3により媒介されるTリンパ球の共刺激をアップレギュレートする。さらに、該抗体をベフェリンと接触させて特異的に結合させ、ベフェリンとAPP751との非生産的相互作用を立体化学的に阻害し、それによりBlaaにより媒介されるAPP751のβセクレターゼ切断をアップレギュレートしてPN2を生じさせる方法も好ましい。PN2はFVIIa-TFのレベルで外因性凝固経路の阻害剤であるので、これは次に凝固性の状態をダウンレギュレートする。好ましい組成物はベフェリン抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体を含んでなる。好ましい投与経路は静注である。
【０５９２】
本発明のさらなる実施形態では、該ベフェリン抗体は誘起された免疫応答をアップレギュレートする方法においてワクチン調製物中のアジュバントとして配合される。該方法では、該ベフェリン抗体はB7-H3により媒介されるTリンパ球共刺激を促進して特異的免疫の確立に寄与する。該ベフェリン抗体は、細胞表面においてベフェリンのB7-H3オリゴマーへの非生産的組み込みを立体化学的に阻害することにより、B7-H3により媒介されるTリンパ球共刺激をアップレギュレートする。さらに、ウイルス感染をターゲッティングするワクチンにおいて該抗体を用いる方法も好ましく、ここでウイルスとしては、限定されるものではないが、(a)ヒト免疫不全ウイルス;(b)ヒトヘルペスウイルス6(HHV6);(c)C型肝炎ウイルス;(d)D型肝炎ウイルス;(e)E型肝炎ウイルス;(f)サイトメガロウイルス;(g)呼吸器合胞体ウイルス;(h)I型単純ヘルペスウイルス;(i)II型単純ヘルペスウイルス;(j)インフルエンザウイルス;(k)パルボウイルス;(m)コクサッキーウイルス;(n)エコーウイルス;(o)エプスタイン・バーウイルス;(p)デングウイルス;(q)ラッサ熱ウイルス;および(r)エボラウイルスからなる群から選択される。
【０５９３】
さらに、原生動物感染をターゲッティングするワクチンにおいて該ベフェリン抗体を用いる方法も好ましく、ここで原生動物としては、限定されるものではないが、(a)赤痢アメーバ(Entamoeba histolytica);(b)クリプトスポリジウム・パルブム(Cryptosporidium parvum);(c)熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum);(d)トリパノソーマ属(Trypanosoma);(e)リーシュマニア属(Leishmania);(f)膣トリコモナス(Trichomonas vaginalis);および(g)アカンスアメーバ属(Acanthamoeba)からなる群から選択される。
【０５９４】
ウイルスは免疫の監視を回避する手段として免疫応答を抑制することができる。本発明のさらなる実施形態では、該ベフェリン抗体は進行中のウイルス感染に対する免疫応答をアップレギュレートする方法において用いられる。該方法では、該ベフェリン抗体は抗ウイルス免疫応答に寄与するB7-H3により媒介されるTリンパ球共刺激を促進する。該ベフェリン抗体は細胞表面においてベフェリンのB7-H3オリゴマーへの非生産的組み込みを立体化学的に阻害することにより、B7-H3により媒介されるTリンパ球共刺激をアップレギュレートする。さらに、進行中のウイルス感染に対する免疫応答をアップレギュレートする方法も好ましく、ここでウイルスとしては、限定されるものではないが、(a)ヒト免疫不全ウイルス;(b)ヒトヘルペスウイルス6(HHV6);(c)B型肝炎ウイルス;(d)C型肝炎ウイルス;(e)D型肝炎ウイルス;(f)サイトメガロウイルス;(g)呼吸器合胞体ウイルス;(h)インフルエンザウイルス;(i)I型単純ヘルペスウイルス;(j)II型単純ヘルペスウイルス;(k)エプスタイン・バーウイルス;(l)水痘帯状疱疹ウイルス;(m)モルビリウイルス;(n)パラミクソウイルス;(o)パピローマウイルス;(p)アデノウイルス;(q)デングウイルス;(r)ラッサ熱ウイルス;(s)コクサッキーウイルス;(t)エコーウイルス;および(u)エボラウイルスからなる群から選択される。
【０５９５】
細菌は免疫の監視を回避する手段として免疫応答を抑制することができる。本発明のさらなる実施形態では、該ベフェリン抗体は進行中の細菌感染に対する免疫応答をアップレギュレートする方法において用いられる。該方法では、該ベフェリン抗体は抗細菌免疫応答に寄与するB7-H3により媒介されるTリンパ球共刺激を促進する。該ベフェリン抗体は細胞表面においてベフェリンのB7-H3オリゴマーへの非生産的組み込みを立体化学的に阻害することにより、B7-H3により媒介されるTリンパ球共刺激をアップレギュレートする。さらに、進行中の細菌感染に対する免疫応答をアップレギュレートする方法も好ましく、ここで細菌としては、限定されるものではないが、(a)トリ結核菌群(Mycobacterium avium complex);(b)ニューモシスティス・カリニ(Pneumocystis carinii);(c)アクネ・ブルガリス(Acne vulgaris);(d)レジオネラ・ニューモフィラ菌(Legionella pneumophilia);(e)ペスト菌(Yersinia pestis);(f)ウレアプラズマ・ウレアリチカム(Ureaplasma urealyticum);(g)肺炎クラミジア(Chlamydia pneumoniae);(h)ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori);(i)梅毒トレポネーマ(Treponema pallidum);(j)淋菌(Neisseria gonorrhoeae);(k)ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium);(l)コレラ菌(Vibrio cholera);(m)クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile);(n)バシラリー・ディセンタリー(Bacillary dysentery);(o)ペニシリン耐性肺炎球菌(Pencillin resistant Pneumococcus);(p)鼻疽菌(Burkholderia mallei);(q)らい菌(Mycobacterium leprae);(r)マイコバクテリウム・ハエモフィルム(Mycobacterium haemophilum);(s)マイコバクテリウム・カンサシイ(Mycobacterium kansasii);(t)インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae);および(u)炭疽菌(Bacillus anthracis)からなる群から選択される。
【０５９６】
原生動物は免疫の監視を回避する手段として免疫応答を抑制することができる。本発明のさらなる実施形態では、該ベフェリン抗体は進行中の原生動物感染に対する免疫応答をアップレギュレートする方法において用いられる。該方法では、該ベフェリン抗体は抗原生動物免疫応答に寄与するB7-H3により媒介されるTリンパ球共刺激を促進する。該ベフェリン抗体は細胞表面においてベフェリンのB7-H3オリゴマーへの非生産的組み込みを立体化学的に阻害することにより、B7-H3により媒介されるTリンパ球共刺激をアップレギュレートする。さらに、進行中の原生動物感染に対する免疫応答をアップレギュレートする方法も好ましく、ここで原生動物としては、限定されるものではないが、(a)赤痢アメーバ(Entamoeba histolytica);(b)クリプトスポリジウム・パルブム(Cryptosporidium parvum);(c)ランブル鞭毛虫(Giardia lamblia);(d)トキソプラスマ(Toxoplasma gondii);(e)イソスポラ・ベリイ(Isospora belli);(f)エンセファリトゾーン・カニキュリ(Encephalitozoon cuniculi);(g)エンテロサイトゾーン・ビエニューシ(Enterocytozoon bieneusi);(h)熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum);(i)トリパノソーマ属(Trypanosoma);(j)リーシュマニア属(Leishmania);(k)膣トリコモナス(Trichomonas vaginalis);および(l)アカンスアメーバ属(Acanthamoeba)からなる群から選択される。
【０５９７】
本発明のさらなる実施形態では、該ベフェリン抗体は進行中の真菌感染に対する免疫応答をアップレギュレートする方法において用いられ、ここで真菌としては、限定されるものではないが、(a)クリプトコッカス・メニンジチス(Cryptococcal meningitis);(b)ヒストプラスマ・カプスラーツム(Histoplasma capstulatum);(c)コクシジオデス・イミチス(Coccidiodes immitis);および(d)カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)からなる群から選択される。
【０５９８】
腫瘍は免疫の監視を回避する手段として免疫応答を抑制することができる。本発明のさらなる実施形態では、該ベフェリン抗体は腫瘍に対する免疫応答をアップレギュレートする方法において用いられる。該方法では、該ベフェリン抗体は抗腫瘍免疫応答に寄与するB7-H3により媒介されるTリンパ球共刺激を促進する。該ベフェリン抗体は細胞表面においてベフェリンのB7-H3オリゴマーへの非生産的組み込みを立体化学的に阻害することにより、B7-H3により媒介されるTリンパ球共刺激をアップレギュレートする。さらに、腫瘍に対する免疫応答をアップレギュレートする方法も好ましく、ここで腫瘍としては、限定されるものではないが、(a)黒色腫;(b)乳癌;(c)肺癌;(d)結腸癌;(e)前立腺癌;(f)ホジキンリンパ腫;(g)非ホジキンリンパ腫;(h)膵臓癌;(i)子宮癌;(j)卵巣癌;(k)精巣癌;(l)直腸癌;(m)肝臓癌;および(n)肺非小細胞癌からなる群から選択される。
【０５９９】
本発明のさらなる実施形態では、該ベフェリン抗体は治療用抗腫瘍ワクチン中のアジュバントとして配合され、ここで腫瘍としては、限定されるものではないが、(a)黒色腫;(b)乳癌;(c)肺癌;(d)結腸癌;(e)前立腺癌;(f)膵臓癌;(g)子宮癌;(h)卵巣癌;(i)精巣癌;(j)直腸癌;(k)肝臓癌;および(l)肺非小細胞癌からなる群から選択される。
【０６００】
細胞内(マクロファージ)病原体は、マクロファージの活性化か、または細胞傷害性Tリンパ球による感染マクロファージの溶解のいずれかによって除去することができる(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Chunら, J. Exp. Med. 193:1213 (2001))。マクロファージ上で発現したB7ファミリーのメンバーの結合はマクロファージの活性化をもたらし得る[全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Hirokawa, M Immunol. Lett. 50:95-8 (1996)]。本発明のさらなる実施形態では、該ベフェリン抗体はマクロファージの活性化または細胞傷害性Tリンパ球の生成を促進することにより細胞内の病原体を除去する方法において用いられ、ここで病原体としては、限定されるものではないが、(a)ヒストプラスマ・カプスラーツム(Histoplasma capsulatum);(b)結核菌(Mycobacterium tuberculosis);(c)ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium);(d)トラコーマクラミジア(Chlamydia trachomatis);および(e)ニューモシスティス・カリニ(Pneumocystis carinii)からなる細胞内(マクロファージ)病原体群から選択される。
【０６０１】
腫瘍は転移を助長する手段としてTF発現によって外因性凝固経路を連動させうる。本発明のさらなる実施形態では、該ベフェリン抗体は外因性凝固経路の腫瘍連結をダウンレギュレートする方法において用いられる。該方法では、該ベフェリン抗体はBlaaにより媒介される、APP751のβセクレターゼ切断を促進して、FVIIa-TFレベルにおける外因性凝固経路の阻害剤であるPN2を生成する。該ベフェリン抗体はベフェリンとAPP751との非生産的相互作用を立体化学的に阻害することによりBlaaにより媒介されるPN2の生成を促進する。さらに、外因性凝固経路の腫瘍連動をダウンレギュレートする方法も好ましく、ここで腫瘍としては、限定されるものではないが、(a)黒色腫;(b)乳癌;(c)肺癌;(d)結腸癌;(e)前立腺癌;(f)ホジキンリンパ腫;(g)非ホジキンリンパ腫;(h)膵臓癌;(i)子宮癌;(j)卵巣癌;(k)精巣癌;(l)直腸癌;(m)肝臓癌;および(n)肺非小細胞癌からなる群から選択される。
【０６０２】
さらなる好ましい実施形態では、本発明はベフェリンと結合し、ベフェリンのB7-H3機能を妨げる能力を阻害または促進する能力に関して試験化合物をスクリーニングする方法を提供する。さらに、ベフェリンと結合し、ベフェリンのB7-H3により媒介されるTリンパ球共刺激を妨げる能力を阻害または促進する能力に関して試験化合物をスクリーニングする方法も好ましい。さらに、ベフェリンと結合し、ベフェリンのB7-H3により媒介されるTリンパ球共刺激を妨げる能力を阻害または促進する能力に関して試験化合物をスクリーニングする方法も好ましい。さらに、抗原提示細胞がB7-H3およびベフェリンでトランスフェクトされている場合にはベフェリンと結合し、B7-H3により媒介されるTリンパ球共刺激を阻害または促進するが、同じ細胞をB7-H3単独でトランスフェクトした場合にはそうではない能力に関して試験化合物をスクリーニングする方法も好ましい。該試験化合物をスクリーニングする方法およびB7-H3により媒介されるTリンパ球共刺激に対するそれらの作用を特徴付ける方法は当業者に周知のものである。
【０６０３】
該化合物の好ましい製剤としては、限定されるものではないが、(a)経口;(b)経皮;(c)注射;(d)口内;および(e)エアゾールの群から選択される送達経路と適合する製剤から選択されるものである。
【０６０４】
ベフェリンと結合してベフェリンのB7-H3機能を妨げる能力を阻害し、それによりB7−H3活性を効果的にアップレギュレートすることが見出された化合物はベフェリン抗体に関して上記したものと同様の方法で用いられる。
【０６０５】
ベフェリンと結合して、ベフェリンのB7-H3により媒介されるTリンパ球共刺激を妨げる能力を促進することが見出された化合物はB7-H3活性を効果的にダウンレギュレートする。このような化合物は慢性炎症性自己免疫疾患およびその他の免疫調節障害に用途を持つ。このような化合物は細胞表面においてベフェリンのB7-H3オリゴマーへの非生産的組み込みを促進することによりB7-H3により媒介されるTリンパ球共刺激をダウンレギュレートする。本発明のさらなる実施形態では、該化合物はベフェリンを接触させて調節不全免疫応答をダウンレギュレートし、それにより関連の免疫疾患を治療する方法において用いられ、ここで免疫疾患としては、限定されるものではないが、(a)慢性関節リウマチ;(b)炎症性腸疾患;(c)インスリン依存性糖尿病(1型糖尿病);(d)多発性硬化症;(e)全身性紅斑性狼瘡;(f)乾癬;(g)アレルギー性喘息;(h)アレルギー性鼻炎(花粉症);および(i)移植片対宿主病の群から選択される。
【０６０６】
さらなる好ましい実施形態では、本発明はベフェリンと結合してベフェリンのBlaa機能を妨げる能力を阻害する能力に関して試験化合物をスクリーニングする方法を提供する。さらに、ベフェリンと結合して、APP751の切断を介してBlaaにより媒介されるPN2の生成をアップレギュレートし、それにより該経路の阻害剤であるPN2により外因性凝固経路の連動をダウンレギュレートする能力に関して該試験化合物をスクリーニングする方法も好ましい。さらに、ベフェリンと結合し、ベフェリンとAPP751との非生産的相互作用を妨げることによりBlaaにより媒介されるPN2の生成をアップレギュレートする能力に関して該試験化合物をスクリーニングする方法も好ましい。さらに、ベフェリンと結合し、APP751を発現する、ベフェリンおよびBlaaでトランスフェクトされた細胞からのPN2放出はアップレギュレートするが、Blaa単独でトランスフェクトした同じ細胞系からPN2放出はアップレギュレートしない能力に関して該試験化合物をスクリーニングする方法も好ましい。該試験化合物をスクリーニングする方法および培地中に放出されたPN2量を測定する方法は当業者に周知のものである。
【０６０７】
ベフェリンと結合してこのような外因性凝固経路のダウンレギュレーションに作用することが見出された化合物はベフェリン抗体に関して上記したものと同様の方法で用いられる。
【０６０８】
配列番号40のタンパク質(内部表示クローン1000838788_228-28-4-0-F7-F)
クローン1000838788_228-28-4-0-F7-FのcDNA(配列番号39)はレダクターゼタンパク質(RP):
MVSGRFYLSCLLLGSLGSMCILFTIYWMQYWRGGFAWNGSIYMFNWHPVLMVAGMVVFYGGASLVYRLPQSWVGPKLPWKLLHAALHLMAFVLTVVGLVAVFTFHNHGRTANLYSLHSWLGITTVFLFGCQWFLGFAVFLLPWASMWLRSLLKPIHVFFGAAILSLSIASVISGINEKLFFSLKNTTRPYHSLPSEAVFANSTGMLVVAFGLLVLYILLASSWKRPEPGILTDRQLLLQLRPGSRPFPVTYVSVTGRQPYKSW(配列番号40)をコードする。よって、本願を通じて記載される配列番号40のポリペプチドの全ての特徴および用途は、またクローン1000838788_228-28-4-0-F7-Fに含まれる核酸によりコードされるポリペプチドに関係することが理解されるだろう。さらに、本願を通じて記載される配列番号39のポリヌクレオチドの全ての特徴および用途は、またクローン1000838788_228-28-4-0-F7-Fに含まれる核酸に関係することが理解されるだろう。本発明のある好ましい実施形態は、配列番号39、配列番号40およびクローン1000838788_228-28-4-0-F7-Fの組成物に向けられる。また、本明細書に記載される生物活性を有するポリペプチド断片およびそれらの断片をコードするポリヌクレオチドも好ましい。
【０６０９】
RPは膜貫通電子伝達タンパク質シトクロムb561ファミリーの新規メンバーである。RPは供与体から電子受容体への膜を横切る電子伝達を触媒することにより還元型の等価物を供給する。このプロセスはタンパク質内のヒスチジン残基と遷移金属(通常、鉄)との相互作用に依存している。また、電子供与体および受容体として作用する補因子も必要である。電子供与体の例としては、限定されるものではないが、アスコルビン酸、NADH、NADPH、フラビン、および還元性ポリペプチドが挙げられる。電子受容体としては、限定されるものではないが、セミデヒドロアスコルビン酸、NAD+、NADP+、酸化型フラビン種、および電子受容性ポリペプチド複合体が挙げられる。よって、RPは活性に膜結合、遷移金属補因子、および電子供与体／受容体補因子を必要とする。以下、これらの「RP活性の必須成分」は、そのようなものを意味するだろう。
【０６１０】
本発明の好ましい実施形態としては、(1)配列番号40のRPポリペプチド配列を含んでなる組成物; (2)生物活性を有するRPポリペプチド断片を含んでなる組成物; (3)RPポリペプチドをコードする配列番号39のポリヌクレオチド配列を含んでなる組成物; (4)生物活性を有するRPポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる組成物が挙げられる。
【０６１１】
酸化種の鉄を還元する方法はRPポリペプチドまたはRPポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド構築物を鉄および細胞と接触させる工程を含んでなる。好ましくは、第二鉄が第一鉄へと還元される。好ましくは、細胞が鉄摂取に関与する。さらに好ましくは、細胞が十二指腸または小腸上皮由来である。さらに好ましくは、細胞が刷子縁腸細胞である。
【０６１２】
モノオキシゲナーゼを還元する方法としては、RPポリペプチドまたはRPポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド構築物をモノオキシゲナーゼ酵素および細胞と接触させる工程を含んでなる。好ましくは、モノオキシゲナーゼがペプチジルグリシンα-アミド化モノオキシゲナーゼ(PAM)である。また、モノオキシゲナーゼドーパミンβ-ヒドロキシラーゼ(DBH)も好ましい。好ましくは、細胞が内分泌細胞である。さらに好ましくは、細胞が神経内分泌細胞である。
【０６１３】
RPポリペプチドと結合し、かつ／またはRPポリペプチドの電子伝達能力を阻害する分子についてスクリーニングする方法としては、(1)RPポリペプチドを試験分子と接触させ、(2)該RPポリペプチドと結合している試験分子を検出し、さらに(3)RPポリペプチドの生物活性を阻害する試験分子を検出する工程を含んでなる。好ましくは、試験分子が半固体マトリックスに固定化される。
【０６１４】
また、固体マトリックスに固定化された試験分子も好ましい。好ましくは、RPポリペプチドと結合している試験分子が蛍光標識したRP抗体を用いて検出される。好ましくは、RPの生物活性が一般的な酸化還元アッセイを用いて検出される。さらに好ましくは、RPの生物活性がMTT還元アッセイを用いて検出される。また、RPの生物活性がNBT還元アッセイを用いて検出されることもさらに好ましい。
【０６１５】
RPポリペプチド依存的電子伝達を阻害する方法としては、RPポリペプチドをRPポリペプチド阻害剤と接触させる工程を含んでなる。
【０６１６】
RPポリペプチドは電子を鉄種へと伝達することができ、例えば、第二鉄(III)を第一鉄(II)へと還元することができる。ヘム非結合型Fe(III)は体内では難溶性であるが、還元されたFe(II)はよりすばやく吸収される。よって、Fe(III)をFe(II)へと還元する方法が溶血性疾患(例えば、鎌状赤血球貧血)、異常血色素症、鉄吸収不良(low iron absorption)、慢性関節リウマチ、低酸素症、妊娠、末期腎不全、癌化学療法、およびAIDS(特に、ジドブジン(AZT)で治療中の被験体)に伴う貧血、ならびに慢性貧血などの疾患に対して非常に望まれる治療である。さらに、鉄摂取の増加によって家畜類で望まれる短期間での体重増加が可能になる。本発明のある好ましい実施形態では、鉄還元上有効な量のRPポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド構築物は酸化種の鉄を還元する方法において用いられる。この方法はRPポリペプチドまたはポリヌクレオチド構築物をRP活性の必須成分、鉄、および細胞と接触させる工程を含んでなる。好ましい細胞は鉄摂取に関与するものである。さらに好ましい細胞は十二指腸および刷子縁腸細胞などの小腸上皮のものである[概説については、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Siddiqi, S.,ら(2001) Curr. Opin. Gastroenterol. 17:110-7を参照]。
【０６１７】
RPは神経内分泌組織で発現される(この際、RPは分泌小胞に局在する)。RPは還元能力(すなわち、電子)を、カテコールアミン(例えば、ドーパミンおよびノルエピネフリン)およびペプチドホルモン(例えば、神経ペプチド、ゴナドトロピン、ソマトトロピン、甲状腺刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、およびバソプレシン、オキシトシン、およびインスリンなどのラクトトロピン)の生合成およびプロセシングに役割を果たすモノオキシゲナーゼ酵素に供給する。本発明のある好ましい実施形態では、還元上有効な量のRPポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはモノオキシゲナーゼを還元することによってこれらの酵素の活性を高める方法において用いられる。この方法はRPポリペプチドまたはポリヌクレオチド構築物をRP活性の必須成分、モノオキシゲナーゼ酵素、および細胞と接触させる工程を含んでなる。好ましいモノオキシゲナーゼ酵素としては、限定されるものではないが、ペプチジルグリシンα-アミド化モノオキシゲナーゼ(PAM)およびドーパミンβ-ヒドロキシラーゼ(DBH)が挙げられる。好ましい細胞は副腎髄質、下垂体、ならびにその他の神経および内分泌組織の細胞などの内因性モノオキシゲナーゼを発現するものである。
【０６１８】
RPポリペプチドまたはRPポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド構築物の細胞への送達はトランスフェクション、エレクトロポレーション、またはマイクロインジェクションなどの当技術分野で一般的な方法により達成される。該ポリヌクレオチド構築物を細胞と接触させるさらなる方法としては、限定されるものではないが、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,110,490号、同第5,019,369号、およびP.C.T.9704748に記載されるような脂質小胞送達(ミセル、ウイルスエンベロープコンポーネント、リポソーム、およびこれらの改変型など); 全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,204,060号に記載されるようなウイルス形質導入(弱毒化レンチウイルスおよびアデノウイルス系を含む); および全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,225,290号に記載されるような裸のポリヌクレオチドの送達(好ましくは、胃腸管の細胞への送達)が挙げられる。
【０６１９】
送達方法の一例としては、i)全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,180,603号、同第6,110,490号またはP.C.T. 9704748に記載されるように、好ましくは発現制御エレメント(例えば、構成的発現を指令するCMVプロモーター)に機能し得る形で連結されたRPポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド構築物を以下のリスト: ウイルスエンベロープ、リポソーム、ミセル、ガングリオシドおよびこれらの改変型、好ましくはガングリオシドGM-1およびホスファチジルセリンのいずれかから得られた脂質小胞に圧縮し、ii)例えば、ターゲッティングする部分を脂質エンベロープに埋め込むことにより(例えば下垂体局所用の成長ホルモン分泌促進薬)脂質小胞を特定の細胞にターゲッティングし、iii)注入または吸入などの当技術分野で一般的な方法によりターゲッティングされた小胞を特定の細胞と接触させる(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,110,490号、P.C.T. 9704748、および米国特許第6,180,603号)工程を含んでなる。
【０６２０】
送達のさらなる例では、発現制御エレメント(例えば、構成的発現を指令するCMVプロモーターまたはスクラーゼプロモーターなどの刷子縁特異的プロモーター)に機能し得る形で連結されたRPポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド構築物が(例えば、生理学上許容される液体、スラリー剤、シロップ剤、ペースト剤、散剤、丸薬、またはカプセル剤の形態で)経口的に送達されて十二指腸の刷子縁腸細胞による鉄吸収が高められる。該裸のポリヌクレオチド構築物は腸の特定の細胞を特異的にターゲッティングすべく、例えば、刷子縁細胞レクチンに特異的なオリゴ糖修飾(例えば、小麦胚凝集素)を付加することによって修飾してもよい。該裸のポリヌクレオチド構築物は標的腸細胞のゲノムへの部位特異的組込みをさらに提供し得る。例えば、該構築物はプロモーターに機能し得る形で連結されたRPポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)Ty3の位置特異的組込みマーカーがフランキングするように改変することができる(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,292,662号)。さらに、RPの阻害剤を用いて上述のRP活性を阻害する方法も本発明に含まれる。よって、本発明の好ましい実施形態は、RPポリペプチドをRPポリペプチド阻害剤と接触させることによりRPポリペプチド依存的電子伝達(第二鉄の第一鉄への還元およびモノオキシゲナーゼ酵素の還元を含む)を阻害する方法である。本発明のさらなる実施形態は、RPポリペプチドと結合し、かつ／またはRPポリペプチドの電子伝達能力を阻害する化合物についてスクリーニングする方法である。この方法はi)RPポリペプチドを試験化合物と接触させ、さらにii)該試験化合物がRPポリペプチドと結合し、かつ／またはRPポリペプチド還元活性を阻害するかどうかを検出する工程を含んでなる。RPポリペプチド結合の検出は当技術分野で一般的な方法により(例えば、該試験化合物を固体または半固体マトリックスに固定化し、さらに蛍光標識したRP抗体によりRPポリペプチドを検出することにより)達成される。RPポリペプチド還元活性の阻害はMTT還元法(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Chakrabarti, R.,ら(2000) J. Cell Biochem. 18:133-8)またはNBT還元法[全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Meerhof, L.およびRoos, D.(1986) J. Leukoc. Biol. 39:699-711]などの酸化還元および電子伝達活性を検出するための一般的なアッセイを用いて測定される。
【０６２１】
配列番号42のタンパク質(内部表示クローン1000943975_160-213-2-0-A5-F)
クローン1000943975_160-213-2-0-A5-FのcDNA(配列番号41)はアミノ酸配列:
MPACRLGPLAAALLLSLLLFGFTLVSGTGAEKTGVCPELQADQNCTQECVSDSECADNLKCCSAGCATFCSLPNDKEGSCPQVNINFPQLGLCRDQCQVDSQCPGQMKCCRNGCGKVSCVTPNF(配列番号42)を含んでなる分泌型小セリンプロテアーゼ阻害剤(SSSPI)をコードする。よって、本願を通じて記載される配列番号42のポリペプチドの全ての特徴および用途は、またクローン1000943975_160-213-2-0-A5-Fに含まれる核酸によりコードされるポリペプチドに関係することが理解されるだろう。さらに、本願を通じて記載される配列番号41のポリヌクレオチドの全ての特徴および用途は、またクローン1000943975_160-213-2-0-A5-Fに含まれる核酸に関係することが理解されるだろう。本発明のある好ましい実施形態は、配列番号41、配列番号42およびクローン1000943975_160-213-2-0-A5-Fに向けられる。また、本明細書に記載のような生物活性を有するポリペプチド断片およびそれらの断片をコードするポリヌクレオチドも好ましい。
【０６２２】
分泌型小セリンプロテアーゼ阻害剤(SSSPI)はセリンプロテアーゼ阻害剤で一般的に見られる2つのWAP(乳清酸性タンパク質)/4-ジスルフィドコアドメインを含む。SSSPIは多数の分子内ジスルフィド結合の存在により非常に安定している。SSSPIの生物活性は、例えば、当技術分野で一般的な方法により(例えば、クーマシーブルー染色)タンパク質分解を追跡することにより決定されるセリンプロテアーゼによるタンパク質分解を阻害することにある。さらに、SSSPI活性は平滑筋、結腸、卵巣、および乳房組織を含む組織での増殖の抑制に関連する。
【０６２３】
本発明のある好ましい実施形態では、SSSPIポリペプチドまたはその断片はSSSPIポリペプチドと調べようとする薬剤との結合複合体の形成について化合物のライブラリーをスクリーニングするために使用される。このようなスクリーニングに使用される断片は、溶液中に遊離させても、固体支持体に付着させても、細胞表面上に担持させても、または細胞内に位置してもよい。結合複合体の形成は当技術分野で公知の方法により(例えば、試験薬剤、SSSPIポリペプチド、またはいずれかに対する抗体の蛍光標識または緑色蛍光タンパク質タグ付け)測定される。ある好ましいスクリーニング方法は、SSSPIポリペプチドに対する好適な結合親和性を有する化合物のハイスループットスクリーニングを提供する。例えば、この方法はi)多数の異なる試験小化合物をプラスチックピンなどの固体基板上で合成し、ii)試験化合物をSSSPIポリペプチドと反応させて洗浄し、iii)結合したSSSPIポリペプチドを当技術分野で公知の方法により検出する工程を含んでなる。あるいは、SSSPIポリペプチドをプレート上に直接コーティングするか、または非中和抗体を用いて固定化して上述のスクリーニング技術に使用される。この方法は、例えば、試験溶液におけるプロテアーゼレベルを検出する、または以下の実施形態で記載されるようにSSSPIと相互作用する分子についてスクリーニングするために適用される。本発明のもう1つの実施形態では、SSSPIポリペプチドと上述の試験薬剤との結合複合体はSSSPIポリペプチドのセリンプロテアーゼ基質との相互作用を阻害する化合物についてスクリーニングする方法において用いられる。この方法はi)SSSPIポリペプチド-試験薬剤結合複合体を形成させ、ii)SSSPI基質(エラスターゼなど)を添加し、iii)基質と直接または間接的に結合しているSSSPIを当技術分野で一般的な方法により(例えば、基質分子または該基質に対する抗体の蛍光標識)測定する工程を含んでなる。この方法は、例えば、SSSPI生物活性を阻害する分子についてのスクリーニングに適用される。
【０６２４】
本発明のある好ましい実施形態では、生物学的に活性なSSSPIポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド構築物を用いてタンパク質分解を阻害する方法が提供される。この方法はタンパク質分解阻害上有効な量のSSSPIポリペプチドをSSSPI生物活性を可能にする適切なpHおよび塩濃度の溶液(例えば、緩衝生理食塩水)に含めたタンパク質と接触させる工程を含んでなる。さらなる実施形態では、SSSPIポリペプチドはその他のプロテアーゼ阻害剤と組み合わせてタンパク質分解を阻害する方法において用いられる。この方法はタンパク質分解阻害上有効な量のSSSPIポリペプチドをプロテアーゼ阻害剤カクテルを作製するのに有効な量のその他のプロテアーゼ阻害剤と合わせ、さらに該カクテルをSSSPI生物活性を可能にする適切なpHおよび塩濃度の溶液においてタンパク質と接触させる工程を含んでなる。好ましいプロテアーゼ阻害剤はSSSPIとは異なる特異性を有し、Kunitz-、トリプシン阻害剤様シスチンリッチドメイン(TIL)-、チログロブリン-、Kazal-、およびネトリン(NTR)- 型プロテアーゼ阻害剤などのカクテルのプロテアーゼ阻害効果を最大にするものである。
【０６２５】
また、SSSPIポリペプチドの生物学上許容される塩は本発明の範囲に入る。本明細書において使用する「生物学上許容される塩」とは、塩酸塩、硫酸塩、およびリン酸塩などの無機酸付加塩、または酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、およびクエン酸塩などの有機酸付加塩を意味する。生物学上許容される金属塩の例としては、ナトリウム塩およびカリウム塩などのアルカリ金属塩、マグネシウム塩およびカルシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、ならびに亜鉛塩がある。生物学上許容される有機アミン付加塩の例は、モルホリンおよびピペリジンに関する塩である。生物学上許容されるアミノ酸付加塩の例は、リジン、グリシン、およびフェニルアラニンに関する塩である。
【０６２６】
本明細書で提供される化合物は生理学上許容される非毒性賦形剤および担体との混合によって「生理学上許容される組成物」に製剤化することができる。このような組成物は非経口投与(特に、液体溶液または懸濁液形態)、経口投与(特に、錠剤またはカプセル剤形態)、経鼻(特に、散剤、点鼻剤、またはエアゾール剤形態)、経皮(例えば、経皮パッチにより)用に調製しもよいし、または当業者ならば分かるように、これらおよびその他の投与形態に好適なその他の様式で調製してもよい。
【０６２７】
一般的な賦形剤としては、例えば、滅菌水または生理食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物起源の油類、および水素化ナフタレンが挙げられる。さらなる賦形剤としては、限定されるものではないが、ラクトース、ポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテル、グリココール酸塩、デオキシコール酸塩、サリチル酸塩、クエン酸、油性またはゲル様溶液および親油性エマルションが挙げられる。これらの活性化合物に対して潜在的に有用性のある非経口送達系としては、エチレン-酢酸ビニル共重合体粒子、オスモティックポンプ、埋込型注入系、およびリポソームが挙げられる。本発明は単独の活性剤として使用できる、またはセリンプロテアーゼの阻害を促進できるその他の有効成分と組み合わせて使用できる。
【０６２８】
プロテアーゼ活性は増殖因子(例えば、インスリン様増殖因子、繊維芽細胞増殖因子(FGF)、上皮増殖因子(EGF)、ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子、腫瘍壊死因子(TNF)-α、およびトランスフォーミング増殖因子(TGF)-β)のタンパク質分解プロセシングを含む機構による腫瘍形成に関連する。実際には、SSSPIはインスリン様増殖因子IIおよびFGF各々のタンパク質分解プロセシングを妨げることによって前立腺癌細胞および肺動脈平滑筋の増殖を阻害することが可能である。本発明のある好ましい実施形態では、タンパク質分解阻害上有効な量のSSSPIポリペプチドを細胞と接触させてタンパク質のタンパク質分解プロセシングおよび分解を阻害する。好ましい細胞は増殖の促進にタンパク質分解プロセシングを必要とする、上記で挙げたものなどの増殖因子を発現するものである。好ましい細胞の例としては、肺、胃腸管、肝臓、皮膚、乳腺、膵臓、卵巣、前立腺、ならびに血管平滑筋および上皮由来のものが挙げられる。この方法はSSSPIポリペプチドの生理学上許容される組成物を細胞と接触させる工程を含んでなる。該組成物の細胞への送達は当業者によって適当であると判断されるように、上述のように達成される。
【０６２９】
本発明のさらなる実施形態は、SSSPIポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド構築物を細胞に導入してタンパク質のタンパク質分解プロセシングおよび分解を阻害する方法を提供する。好ましい細胞は増殖の促進にタンパク質分解プロセシングを必要とする増殖因子(例えば、インスリン様増殖因子、FGF、EGF、ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子、TNF-α、およびTGF-β)を発現するものまたは該細胞を接触させる細胞である。好ましい細胞の例としては、肺、胃腸管、肝臓、皮膚、乳腺、膵臓、卵巣、前立腺、ならびに血管平滑筋および上皮由来のものが挙げられる。好ましいポリヌクレオチド構築物はプロモーターなどの発現制御エレメントに機能し得る形で連結されたSSSPIポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる。好ましい発現制御エレメントはタンパク質分解を阻害するのに有効な量のSSSPIポリペプチドの発現を指令する。例としては、構成的発現用のCMVプロモーターまたはアンドロゲン受容体-陽性前立腺癌細胞における発現用のヒト腺カリクレイン-2 プロモーターなどの組織特異的プロモーターが挙げられる。ポリヌクレオチド構築物を含んでなる生理学上許容される組成物はエレクトロポレーションまたはトランスフェクションなどの当技術分野で一般的な方法を用いて細胞に導入される。該生理学上許容される組成物を送達するさらなる方法としては、限定されるものではないが、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6110490号、同第5019369号、およびP.C.T. 9704748に記載されるような脂質小胞送達(ミセル、ウイルスエンベロープコンポーネント、リポソーム、およびこれらの改変型を含む); 全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6204060号に記載されるようなウイルス形質導入(弱毒化レンチウイルスおよびアデノウイルス系を含む); および全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6225290号に記載されるような裸のポリヌクレオチドを含んでなる生理学上許容される組成物の送達(例えば、胃腸管の細胞への送達)が挙げられる。
【０６３０】
SSSPIは、限定されるものではないが、トロンビン、ヒト白血球エラスターゼ、膵エラスターゼ、トリプシン、チマーゼ、およびカテプシンGをはじめとする変性疾患に関与するセリンプロテアーゼを阻害することが可能である。トロンビンは血液凝固カスケード内で産生され、血栓静脈炎、血栓症、その他の出血性疾患、および喘息などの疾患に関与する。ヒト白血球エラスターゼは慢性関節リウマチ、変形性関節症、アテローム性動脈硬化症、気管支炎、嚢胞性繊維症、および気腫などの組織変性疾患に関与する。膵エラスターゼおよびトリプシンは、特に膵炎の場合の軟組織分解に関与する。アンギオテンシン合成において重要な酵素であるチマーゼは、高血圧、心筋梗塞、および冠状動脈性心臓疾患などの疾患に関与する。カテプシンGは、特に肺での異常な結合組織分解に関与する。極端な場合には、限定されるものではないが、上述のもの、カリクレイン、および前立腺特異的抗原(PSA)をはじめとするセリンプロテアーゼは、細胞外マトリックス(ECM)タンパク質のタンパク質分解再構築を通じて腫瘍形成に関与する。このタンパク質分解再構築によって組織上皮ライニング(lining)および基底膜の完全性の崩壊が引き起こされ、さらに転移が起こり得る。本発明のある好ましい実施形態では、タンパク質分解阻害上有効な量のSSSPIポリペプチドはタンパク質分解および得られた組織またはECMの変性を阻害するために細胞に適用される。この方法はSSSPIポリペプチドを含んでなる生理学上許容される組成物を細胞と接触させる工程を含んでなる。好ましい細胞としては、肺、胃腸管、肝臓、皮膚、乳腺、膵臓、卵巣、前立腺、骨および軟骨、ならびに血管平滑筋および上皮由来のものなどのセリンプロテアーゼ活性を受けて変性疾患と診断されるまたはその危険性があるものが挙げられる。さらに好ましい細胞としては、上皮ライニング、基底膜、およびECMの形成に関与するもの(例えば、上皮細胞および繊維芽細胞)などのセリンプロテアーゼ活性を受けて腫瘍浸潤と診断されるまたはその危険性があるものが挙げられる。該組成物の細胞への送達は当業者によって適当であると判断される上述のように達成される。
【０６３１】
本発明のさらなる実施形態では、SSSPIポリペプチドまたはその断片はセリンプロテアーゼを検出する方法において用いられる。この方法は上述の疾患および疾病の診断に向けられる。この方法のある例は、SSSPIポリペプチドをセリンプロテアーゼを含有していると考えられる体液(例えば、細胞培養培地、血液、血清、細胞懸濁物またはサンプル)と接触させ、洗浄し、さらにセリンプロテアーゼ-SSSPI複合体を検出する工程を含んでなる。該複合体の検出は蛍光標識した中和抗体との競合などの当技術分野で一般的な方法により達成される。
【０６３２】
配列番号44のタンパク質(内部表示クローン147441_106-025-2-0-C11-F)
クローン147441_106-025-2-0-C11-FのcDNA(配列番号43)はカルボキシペプチダーゼ阻害剤-1(CPI-1):
MQGTPGGGTRPGPSPVDRRTLLVFSFILAAALGQMNFTGDQVLRVLAKDEKQLSLLGDLEGLKPQKVDFWRGPARPSLPVDMRVPFSELKD(配列番号44)をコードする。よって、本願を通じて記載される配列番号44のポリペプチドの全ての特徴および用途は、またクローン147441_106-025-2-0-C11-Fに含まれる核酸によりコードされるポリペプチドに関係することが理解されるだろう。さらに、本願を通じて記載される配列番号43のポリヌクレオチドの全ての特徴および用途は、またクローン147441_106-025-2-0-C11-Fに含まれる核酸に関係することが理解されるだろう。本発明のある好ましい実施形態は、配列番号43、配列番号44およびクローン147441_106-025-2-0-C11-Fの組成物に向けられる。また、本明細書に記載のような生物活性を有するポリペプチド断片およびそれらの断片をコードするポリヌクレオチドも好ましい。
【０６３３】
CPI-1はプレプロカルボキシペプチダーゼのアミノ末端「プレプロ」領域に極めて相同な91アミノ酸のタンパク質である。「プレ」領域はシグナルペプチドに相当し、「プロ」領域はタンパク質分解的に除去される前に酵素の活性部位に結合することによりカルボキシペプチダーゼの酵素活性を阻害する。プロカルボキシペプチダーゼのタンパク質分解切断により成熟した活性なカルボキシペプチダーゼが生じる。プロカルボキシペプチダーゼのタンパク質分解プロセシング(例えばトリプシンによる)は「プロ」領域のカルボキシ末端によるものであり、これはCPI-1には存在しない。従ってCPI-1はカルボキシペプチダーゼ特異的プロテアーゼにより認識されないカルボキシペプチダーゼ活性の小型の独立した阻害剤として働く。カルボキシペプチダーゼは多くの生理学的プロセスで機能するタンパク質ファミリーを含んでなる。これらのタンパク質は広範なカルボキシル末端アミノ酸を除去し、そうすることで酵素およびペプチドホルモン活性を活性化、不活性化およびモジュレートするとともに、ペプチド分解およびアミノ酸吸収に寄与することができる。活性型の哺乳類カルボキシペプチダーゼは分泌するか、またはリポソームに存在し、そこで細胞内タンパク質のプロセシング、分解およびターンオーバーを調節する。CPI-1ポリペプチドの「生物活性」はカルボキシペプチダーゼ活性を阻害する能力として定義される。カルボキシペプチダーゼ活性は試験サンプルを放射性標識Bolton-Hunter試薬を結合させたペプチド基質とともにインキュベートするなど(Normant, E.ら (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92:12225-9)、当技術分野で一般的な方法によって測定すればよい。「カルボキシペプチダーゼ」は本明細書ではカルボキシペプチダーゼファミリーのいずれのメンバーもさすものとして用いられる。
【０６３４】
本発明の好ましい実施形態としては、(1)配列番号44のCPI-1ポリペプチド配列を含んでなる組成物;(2)カルボキシペプチダーゼを阻害する生物活性を有するCPI-1ポリペプチド断片を含んでなる組成物;(3)CPI-1ポリペプチドをコードする配列番号43のポリヌクレオチド配列を含んでなる組成物;(4)カルボキシペプチダーゼを阻害する生物学的に活性なCPI-1ポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる組成物が挙げられる。
【０６３５】
カルボキシペプチダーゼにより媒介される抗繊維素溶解活性を阻害する方法としては、有効量のCPI-1ポリペプチドまたは生物学的に活性なその断片を個体の血流中のカルボキシペプチダーゼと接触させる工程を含んでなる。さらに好ましくは、CPI-1ポリペプチドはヒトへ送達される。
【０６３６】
カルボキシペプチダーゼにより媒介される膵炎を予防またはその進行を抑制する方法としては、CPI-1ポリペプチドまたは生物学的に活性なその断片を膵細胞と接触させる工程を含んでなる。
【０６３７】
カルボキシペプチダーゼにより媒介される膵臓癌を予防またはその進行を抑制する方法としては、CPI-1ポリペプチドまたは生物学的に活性なその断片を膵細胞と接触させる工程を含んでなる。
【０６３８】
カルボキシペプチダーゼにより媒介される肺癌を予防またはその進行を抑制する方法としては、CPI-1ポリペプチドまたは生物学的に活性なその断片を肺細胞と接触させる工程を含んでなる。
【０６３９】
カルボキシペプチダーゼにより媒介される卵巣癌を予防またはその進行を抑制する方法としては、CPI-1ポリペプチドまたは生物学的に活性なその断片を卵巣細胞と接触させる工程を含んでなる。
【０６４０】
カルボキシペプチダーゼにより媒介される喉頭癌を予防またはその進行を抑制する方法としては、CPI-1ポリペプチドまたは生物学的に活性なその断片を喉頭細胞と接触させる工程を含んでなる。
【０６４１】
カルボキシペプチダーゼにより媒介される子宮癌を予防またはその進行を抑制する方法としては、CPI-1ポリペプチドまたは生物学的に活性なその断片を子宮細胞と接触させる工程を含んでなる。
【０６４２】
カルボキシペプチダーゼにより媒介される肝臓癌を予防またはその進行を抑制する方法としては、CPI-1ポリペプチドまたは生物学的に活性なその断片を肝細胞と接触させる工程を含んでなる。
【０６４３】
抗体または抗体フラグメントをCPI-1ポリペプチドと結合させる方法としては、その抗体または抗体フラグメントを生物学的サンプルと接触させる工程を含んでなる。
【０６４４】
検出アッセイにおいてCPI-1ポリペプチドまたはその断片と特異的に結合する抗体または抗体フラグメントを使用する方法は、該抗体または抗体フラグメントを生物学的サンプルと接触させ、該サンプルとの抗体または抗体フラグメントとの結合を検出する工程を含んでなる。
【０６４５】
さらなる好ましい方法としては、CPI-1ポリペプチドまたはその断片と結合しない第2の抗体、または抗体フラグメントを該生物学的サンプルと接触させるさらなる工程を含んでなる。
【０６４６】
さらに好ましくは、この第1および／または第2の抗体または抗体フラグメントは検出可能な分子タグで修飾する。
【０６４７】
さらに好ましくは、この生物学的サンプルは血液サンプルまたは組織サンプルである。
【０６４８】
さらに好ましくは、この検出アッセイは診断目的で用いる。
【０６４９】
CPI-1の生物活性を阻害し、かつ、カルボキシペプチダーゼ活性を促進するため、CPI-1ポリペプチドまたはその断片と結合する抗体または抗体フラグメントを用いる方法としては、該抗体または抗体フラグメントをCPI-1ポリペプチドまたは生物学的に活性なその断片と接触させる工程を含んでなる。
【０６５０】
凝固経路と繊維素溶解経路は適切な時点でそれぞれ血液凝固および血塊分解をもたらすためにバランスを保つ。カルボキシペプチダーゼ活性は抗繊維素溶解性であり、すなわち、カルボキシペプチダーゼは、最も可能性のあるものとしてはプラスミノーゲンの活性化を阻害することにより血塊分解を排除する。本発明のある好ましい実施形態では、カルボキシペプチダーゼにより媒介される血塊の形成および保持を阻害するためにカルボキシペプチダーゼを阻害する有効量のCPI-1ポリペプチド、その断片または該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いる。この方法は運動抑制(immobilization)、栓友病、遺伝性栓友病、卒中、心筋梗塞、冠状動脈疾患、悪性症状などの症例で、また、外科術中および外科術後に、また、投薬に付随して血塊が高リスクである場合に望まれるような抗凝固剤活性の促進に向けられうる。好ましくはこの方法はヒトにおけるこれらの症状の治療に向けられる。この方法はCPI-1ポリペプチドを個体に投与することによりCPI-1ポリペプチドまたは生物学的に活性なその断片をカルボキシペプチダーゼと接触させる工程を含んでなる。CPI-1ポリペプチドまたは生物学的に活性なその断片を個体に送達する好ましい方法としては、生理学上許容される溶液(例えば、pH緩衝等張生理食塩水、グリセロールなどの粘稠な要素の添加により改質したpH緩衝等張生理食塩水、)中の該ポリペプチドまたは断片の直接の静注が挙げられる。
【０６５１】
CPI-1ポリペプチドまたは断片を個体に送達するさらなる好ましい方法としては、CPI-1ポリペプチドまたは生物学的に活性なその断片をコードするポリヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド構築物を細胞へ導入する工程を含んでなる。好ましい細胞としては血管内皮細胞、血管平滑筋細胞および繊維芽細胞など、血流を裏打ちするものである。さらなる好ましい細胞としては、造血細胞およびそれらの前駆体、リンパ球、マクロファージ、好酸球、好中球および赤血球細胞など、血流を通じて移動するものである。好ましいポリヌクレオチド構築物としては、CPI-1ポリペプチドまたは生物学的に活性なその断片をコードするポリヌクレオチドと機能し得る形で連結された発現制御エレメントを含んでなる。市販の発現制御ユニットの例としては、限定されるものではないが、構成的発現用のCMVプロモーターまたは調節発現用のテトラサイクリン抑制性プロモーターが挙げられる。該ポリヌクレオチド構築物はその細胞型に適切な所定の方法によって細胞に送達される。血流を通じて移動する細胞への送達はトランスフェクションまたはエレクトロポレーションなどの当技術分野で一般的な方法によって達成し得る。このポリヌクレオチド構築物を有する細胞を次に、例えば注射により血流へ導入するする。血流を裏打ちする細胞への送達は、限定されるものではないが、以下のリスト:米国特許第5616565号、同第6110490号、同第6204060号およびP.C.T. 9704748(なお、これらの全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる)のいずれかに記載のように、脂質小胞またはウイルス形質転換をはじめとする方法によって達成し得る。脂質小胞は限定されるものではないが、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6110490号またはP.C.T. 9704748に記載のようなウイルスエンベロープ、リポソーム、ミセルおよびこれらの改変型をはじめとするエレメントに由来するものであってよい。脂質小胞またはウイルスはさらに、例えば受容体-受容体リガンド対のメンバーを脂質エンベロープへ包埋することにより特定の細胞へターゲッティングしてもよい(例えば、血管内皮細胞をターゲッティングするVEGF/VEGFR)。
【０６５２】
カルボキシペプチダーゼ活性は膵臓におけ通常のタンパク質プロセシングに必要であるが、通常レベルよりも高い活性は膵炎、または膵臓の破壊および炎症に至らせる。膵炎は膵臓癌に至る場合が多い。カルボキシペプチダーゼは膵臓の細胞外空間ならびにリソソームなどの血管コンパートメントで活性を有する。本発明のある好ましい実施形態では、膵炎または膵臓癌を予防する、またはその進行を阻害するためにカルボキシペプチダーゼを阻害する有効量のCPI-1ポリペプチド、生物学的に活性なその断片、または該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが用いられる。この方法はCPI-1ポリペプチドまたは生物学的に活性なその断片を含んでなる生理学上許容される溶液を膵細胞に接触させる工程を含んでなる。該ポリペプチドは例えば外科的にまたはカテーテルを通じてCPI-1ポリペプチドを放出するステントを埋め込むことにより送達し得る(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,500,013号および同第5,449,382号)。さらにポリペプチドは膵臓器官に直接注射(カテーテルまたはシリンジ)によって送達してもよい。CPI-1ポリペプチドまたは生物学的に活性なその断片を送達するさらなる好ましい方法としては、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド構築物を膵細胞へ導入することを含む。この方法には、CPI-1ポリペプチドをカルボキシペプチダーゼ活性の細胞内コンパートメントと接触させるという利点がある。該ポリヌクレオチド構築物はさらにCPI-1ポリペプチドまたは生物学的に活性なその断片をコードするポリヌクレオチドと機能し得る形で連結された発現制御エレメントを含んでもよい。該ポリヌクレオチド構築物は、限定されるものではないが、以下のリスト: 米国特許第5,616,565号、同第6,110,490号、同第6,204,060号およびP.C.T. 9704748(なお、これらの全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる)のいずれかに記載のように、脂質小胞またはウイルス形質転換をはじめとする方法によって膵細胞へ送達すればよい。脂質小胞は限定されるものではないが、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6110490号またはP.C.T. 9704748に記載のように、以下のリスト:ウイルスエンベロープ、リポソーム、ミセルおよびこれらの改変型をはじめとするエレメントに由来するものであってよい。脂質小胞またはウイルスはさらに、例えば受容体-受容体リガンド対のメンバーを脂質エンベロープへ包埋することにより特定の細胞へターゲッティングしてもよい。
【０６５３】
膵臓癌の他、肺癌、卵巣癌、喉頭癌、子宮癌、肝臓癌、胃癌および乳癌をはじめとする癌で通常レベルより高いカルボキシペプチダーゼ活性が見られる。カルボキシペプチダーゼ活性は腫瘍壊死因子(TNF)-αなどの炎症性サイトカインの上昇をもたらす。従って、カルボキシペプチダーゼにより媒介される腫瘍形成は多数の組織型における炎症および破壊によるものである。本発明のある好ましい実施形態としては、癌を予防する、またはその進行を阻害するためにカルボキシペプチダーゼを阻害する有効量のCPI-1ポリペプチド、生物学的に活性なその断片または該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが用いられる。好ましい癌としては上記に列挙したものが挙げられる。この方法はCPI-1ポリペプチドまたは生物学的に活性なその断片を含んでなる生理学上許容される溶液を細胞と接触させる工程を含んでなる。好ましい細胞としては、肺、卵巣、喉頭、子宮、肝臓、胃および乳房のものが挙げられる。さらなる好ましい細胞としては、当業者により一般に判定されるような癌もしくは前癌病理のリスクがあるかまたは癌もしくは前癌病理を示すものがある(例えば、接触阻害の欠如、細胞サイズまたは形状の異常)。CPI-1ポリペプチド、生物学的に活性なその断片または該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは本明細書で述べられるものなど、当技術分野で一般的な方法により特定の細胞へ送達される。
【０６５４】
本発明のさらなる実施形態では、CPI-1ポリペプチドまたはその断片と特異的に結合し(「検出抗体」としてのdetAbs)、かつ／またはCPI-1ポリペプチドまたはその断片の生物活性を阻害する(「阻害抗体」としてのinhAbs)抗体(または抗体フラグメント)を作製するためにCPI-1ポリペプチドまたはその断片が用いられる。抗体はポリクローナルであってもモノクローナルであってもよく、当業者に公知のいずれの方法によって作製してもよい。
【０６５５】
本発明のある好ましい実施形態では、カルボキシペプチダーゼ活性を促進するために、CPI-1と特異的に結合してその生物活性を阻害する抗体または抗体フラグメント(inhAbs)が用いられる。この方法は例えば、出血性疾患を予防または治療するため、カルボキシペプチダーゼにより媒介される抗繊維素溶解活性の増強に向けられ得る。あるいは、この方法は、例えば高血圧またはアテローム性動脈硬化症を予防または治療するためにマクロファージによる低密度リポタンパク質(LDL)粒子のカルボキシペプチダーゼにより媒介される取り込みの増強に向けられ得る。この方法はinhAbsをCPI-1と接触させる工程を含んでなる。好ましい接触方法としては、inhAbsを含んでなる生理学上許容される溶液を、出血性疾患または高LDLレベルのリスクのある、またはそれに罹患している個体の血流へ注射することを含む。
【０６５６】
本発明のさらなる好ましい実施形態では、CPI-1ポリペプチドまたはその断片と結合する抗体または抗体フラグメント(detAbs)が、CPI-1ポリペプチドまたはその断片と結合し、かつ／または検出するためのアッセイにおいて用いられる。この方法は創薬のためのCPI-1またはカルボキシペプチダーゼポリペプチドの精製などのin vitro使用に向けられ得る。この方法の例としては、固体または半固体マトリックス(例えばセファロース)上にdetAbを固定化し、その固定化detAbをタンパク質、好ましくはCPI-1ポリペプチドまたはその断片を含んでなる生物学的溶液に曝す工程を含んでなる。この方法はさらに膵炎、膵臓癌、LDLにより媒介される疾患、および血友病、栓友病、遺伝性栓友病、卒中、心筋梗塞、冠状動脈疾患、悪性症状および血塊などの凝固疾患の診断に向けられ得る。この方法はdetAb、好ましくは検出可能なように標識されたdetAb(例えば蛍光タグとコンジュゲートされたもの)を生物学的サンプル、好ましくは組織または血液サンプルと接触させ、該サンプルに対するdetAbの結合を検出する工程を含んでなる。第1の抗体または抗体フラグメントにより検出されるタンパク質の特性を決定するために、CPI-1ポリペプチドまたはその断片と結合しない第2の抗体または抗体フラグメントを接触させるさらなる工程を加えてもよい。この第2の抗体または抗体フラグメントは好ましくは蛍光分子などの検出可能な分子タグで標識する。さらに好ましくは、第1の抗体または抗体フラグメントにより用いたものとは異なる分子タグを第2の抗体または抗体フラグメントとともに用いる。
【０６５７】
配列番号46のタンパク質(内部表示 クローン124610_113-003-3-0-H5-F)
配列番号46のポリペプチドはクローン124610_113-003-3-0-H5-Fの配列番号45のポリヌクレオチドによりコードされる。本願を通じて記載される配列番号45のポリヌクレオチドおよび配列番号46のポリペプチドの全ての特徴および用途は、クローン124610_113-003-3-0-H5-FのヒトcDNAおよびそれによりコードされるポリペプチドについても当てはまることが理解されよう。配列番号45の遺伝子は第17染色体上に位置し、増殖停止および分化のヒトレチノイン酸誘導レギュレーターをコードし、ここではポリペプチド
MTPSEGARAGTGRELEMLDSLLALGGLVLLRDSXXWEGXSLLKALVKKSALCGEQVHILGCEVSEEEFREGFDSDINNRLVYHDFFRDPLNWSKTEEAFPGGPLGALRAMCKRTDPVPVTIALDSLSWLLLRLPCTTLCQVLHAVSHQDSCPGDSSSVGKVSVLGLLHEELHGPGPVGALSSLAQTEVTLGGTMGQASAHILCRRPRQRPTDQTQWFSILPDFSLDLQEGPSVESQPYSDPHIPPVSKNAKARTRKCSLVSGHGRENKSCRGWGWGQGFを含んでなるRET-A-MODULINと呼ばれる。本発明のある好ましい実施形態は、配列番号45、配列番号46およびクローン124610_113-003-3-0-H5-Fの組成物に向けられる。また、本明細書に記載のような生物活性を有するポリペプチド断片およびそれらの断片をコードするポリヌクレオチドも好ましい。
【０６５８】
本発明のある好ましい実施形態は新生物細胞増殖を阻害し、新生物細胞を死滅させ、そして癌を治療する方法におけるRET-A-MODULINを含んでなる組成物およびその他の好ましい組成物の使用に向けられる。より詳しくは、本発明は、新生物細胞の細胞増殖を阻害し、新生物細胞において細胞傷害性を誘導し、さらに新生物細胞(例えば、癌腫、黒色腫および急性骨髄性白血病(AML)などのリンパ腫)を死滅させる方法および組成物に関し、該方法は細胞を、増殖を阻害する量の本発明のRET-A-MODULINまたはその他の配列と接触させることを含んでなる。新生物細胞の増殖を抑制する方法としては、(a)細胞増殖(growth or proliferation)の阻害;(b)該新生物細胞の死滅;(c)該新生物細胞におけるアポトーシスの誘導;(d)該新生物細胞におけるネクローシスの誘導;(e)新生物細胞浸潤の防止または阻害;および(f)新生物細胞の転移の防止または阻害、からなる群から選択される作用を含んでなる。ある好ましい実施形態では、新生物は癌性のものであるか、腫瘍由来である。本発明のもう1つの態様では、該新生物細胞は膀胱癌、肝細胞癌、肝芽細胞腫、横紋筋肉腫、卵巣癌、子宮頚癌、肺癌、乳癌、頭頸部の扁平細胞癌、食道癌、甲状腺癌、星状細胞腫、神経節芽細胞腫、神経芽細胞腫、リンパ腫、骨髄腫、肉腫および神経上皮腫からなる群から選択される。本発明のさらにもう1つの態様では、該新生物細胞は悪性または良性である。本発明にはさらに、以下のタンパク質配列:
MLDSLLALGGLVLLRDSVEWEGRSLLKALVKKSALCGEQVHILGCEVSEEEFREGFDSDINNRLVYHDFFRDPLNWSKTEEAFPGGPLGALRAMCKRTDPVPVTIALDSLSWLLLRLPCTTLCQVLHAVSHQDSCPGDSSSVGKVSVLGLLHEELHGPGPVGALSSLAQTEVTLGGTMGQASAHILCRRPRQRPTDQTQWFSILPDFSLDLQEGPSVESQPYSDPHIPPVDPTTHLTFNLHLSKKEREARDSLILPFQFSSEKQQALLRPRPGQATSHIFYEPDAYYDLDQEDPDDDLDI、
MLDSLLAIGGLVLLRDSVEWEGRSLLKALIKKSALRGEQVHVLGCEVSEEEFREGFDSDVNSRLVYHDLFRDPLNWSKPGEAVPEGPLKALRSMCKRTDHGSVTIALDSLSWLLCHIPCVTLCQALHALSQQNGDPGDNSLVEQVHVLGLLHEELHGPGSMGALNTLAHTEVTLSGKVDQTSASILCRRPQQRATYQTWWFSVLPDFSLTLHEGLPLRSELHPDHHTTQVDPTAHLTFNLHLSKKEREARDSLTLPFQFSSEKQKALLHPVPSRTTGRIFYEPDAFDDVDQEDPDDDLDI、
SLLKALIKKSALRGEQVHVLGCEVSEEEFREGFDSDVNSRLVYHDLFRDPLNWSKPGEAVPEGPLKALRSMCKRTDHGSVTIALDSLSWLLCHIPCVTLCQALHALSQQNGDPGDNSLVEQVRVLGLLHEELHGPGSMGALNTLAHTEVTLSGKVDQTSASILCRRPQQRATYQTWWFSVLPDFSLTLHEGLPLRSELHPDHHTTQVDPTAHLTFNLHLSKKEREARDSLTLPFQFSSEKQKALLHPVPSRTTGHIFYEPDAFDDVDPEDPDDDLDI、
MLDSLLAIGGLVLLRDSVEWEGRSLLKALIKKSALRGEQVHVLGCEVSEEEFREGFDSDVNSRLVYHDLFRDPLNWSKPGEAVPEGPLKALRSMCKRTDHGSVTIALDSLSWLLCHIPCVTLCQALHALSQQNGDPGDNSLVEQVHVLGLLHEELHGPGSMGALNTLAHTEVTLSGKVDQTSASILCRRPQQRATYQTWWFSVLPDFSLTLHEGLPLRSELHPDHHTTQVDPTAHLTFNLHLSKKEREARDSLTLPFQFSSEKQKALLHPVPSRTTGRIFYEPDAFDDVDQEDPDDDLDI、および
MGTPGEGLGRCSHALIRGVPESLASGEGAGAGLPALDLAKAQREHGVLGGKLRQRLGLQLLELPPEESLPLGPLLGDTAVIQGDTALITRPWSPARRPEVDGVRKALQDLGLRIVEMGDENATLDGTDVLFTGREFFVGLSKWTNHRGAEIVADTFRDFAVSTVPVSGSSHLRGLCGMGGPRTVVAGSSEAAQKAVRAMAALTDHPYASLTLPDDAASDCLFLRPGLPGATPFLLHRGGSAEAL、
も含まれる。
【０６５９】
これらの実施形態はまた、RET-A-MODULINのデスエフェクタードメインおよびペプチドLVKKSALCGEQVHIL、LVKRHRLATMPPMV、LGWLCLLLLPIPLI、LHSDSGISVDSQSL、LPAGDRLTGIPSHI、LLLPLVLRALLVDV、LQPGPQLYDVMDAV、LDCVRLLLQYDAEI、LDCVRLLLQYNAEI、LLEQNDLEPGHTEL、LLEQNDLERGHTGL、MDGPRLLLLLLLGV、MDRLRLLLLLILGV、LKPENILVDNDFHI、LKPENILVDRDFHI、LLLPLVLLELLVGI、LLLSLVLLALLMGI、LLLSLVLLALLMGI、LWALLILLIPIVLI、LWLLTILVLLIPLV、LLPLPVRAQLCAHL、WTELARELDFTEEQIH、WRRLARQLKVSDTKID、WKRLARELKVSEAKMD、WHQLHGKKEAYDTLIK、WRQLAGELGYKEDLID、WEPMVLSLGLSQTDIY、WAELARELQFSVEDIN、WAELARELQFSVEDIN、WRHLAGELGYQPEHID、WRHLAGELGYQPEHID、WKNCARKLGFTQSQID、WKNCARKLGFTESQID、WKEFVRRLGLSDHEID、WKEFMRFMGLSEHEIE、WKEFVRRLGLSEHEIE、WKEFMRLLGLSEHEIE、WKEFVRTLGLREAEIE、VKEFVRKNGMEEAKID、CWYQSHGKSDAYQDLIK、WQQLATAVKLYPDQVEをはじめとするその他のデスエフェクタードメインも含んでなる。
【０６６０】
本発明のある好ましい実施形態は、患者における新生物細胞の増殖を特徴とする癌(前立腺癌、皮膚癌／黒色腫、膵臓癌、結腸癌、黒色腫、卵巣癌、肝臓癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、子宮頚癌、乳癌、膀胱癌、脳腫瘍、神経芽細胞腫／神経膠芽細胞腫、白血病、リンパ腫、頭頸部癌、腎臓癌、骨髄腫および卵巣癌など)を治療するための生理学上許容される組成物、およびそのための方法であって(a)このような新生物細胞においてアポトーシスおよび／またはネクローシスを選択的に誘導し、それによりそれらの増殖を阻害する;(b)新生物細胞の増殖を阻害する;(c)新生物細胞の浸潤を阻害する;(d)新生物細胞の転移を阻害する;(e)新生物細胞を死滅させる;(f)新生物細胞の増殖を優先的に阻害する;および、(g)新生物細胞を優先的に死滅させるのに有効な量の本発明のポリペプチドを患者に投与することを含んでなる方法、を含んでなる。本発明のRET-A-MODULINまたはその他のタンパク質またはその断片は、癌の化学療法剤として知られる種々の抗癌剤および／または放射線療法を1以上組み合わせて用いることができる。このように、優れた抗癌作用をもたらし得る本発明の有効成分である化合物は、組み合わせて用いたその他の抗癌剤の作用を著しく増進して相乗作用をもたらし得る。従って、対となる抗癌剤を通常の用量よりもずっと少ない用量で用いる場合でも十分な抗癌作用を得ることができ、それにより対となる抗癌剤の副作用を最小限にすることができる。化学療法剤それ自体としては、限定されるものではないが例えば、5-フルオロウラシル(5-FU; Kyowa Hakko Kogyo)、マイトマイシンC(Kyowa Hakko Kogyo)、フトラフル(FT-207; Taiho Pharmaceutical)、エンドキサン(Shionogi & Co.)およびトヨマイシン(Takeda Chemical Industries)が挙げられる。さらに、本発明のアポトーシス調節組成物を、その細胞傷害特性をさらに増強するためにビタミンD誘導体とともに投与してもよい(米国特許第6,087,350号)。本発明の抗癌剤は、タモキシフェンなどの抗エストロゲン化合物またはオナプリストロン(欧州特許EP616812参照)などの抗プロゲステロンをこのような分子に関して知られている用量で組み合わせてもよい。
【０６６１】
本発明において用いられる製薬上および生理学上許容される組成物は、限定されるものではないが、非経口、皮下、頭蓋内、眼内、関節包内、髄腔内、槽内、肺内 (吸入)、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、鞘内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻内、腸内、局所、舌下または直腸手段をはじめとする多数の経路によって投与し得る。これらの有効成分の他、これらの製薬上および生理学上許容される組成物は、これらの有効化合物を製薬上使用できる製剤へと加工する助けとなる賦形剤および補助剤を含む好適な生理学上許容される担体を含んでもよい。製剤および投与の技術に関してさらに詳しくは最新版のRemington's Pharmaceutical Sciences (Maack PublishingCo. Easton, Pa)に見出すことができる。経口投与のための製薬上および生理学上許容される組成物は当技術分野で周知の生理学上許容される担体を用い、経口投与に好適な用量で製剤化することができる。このような担体によって製薬上および生理学上許容される組成物は患者の服用のための錠剤、丸剤、糖衣丸、カプセル剤、水剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁剤などとして製剤化することが可能になる。経口用医薬製剤は有効化合物と固形賦形剤との組合せによって得ることができ、所望であれば錠剤または糖衣丸核を得るためには好適な補助剤を加えた後に得られた混合物を所望により摩砕し、顆粒混合物を加工する。好適な賦形剤としては、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールをはじめとする糖類;トウモロコシ、小麦、米、ジャガイモまたはその他の植物からのデンプン;メチルセルロース、ヒドロキシルプロピルメチルセルロースまたはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース;アラビアガムおよびトラガカントガムをはじめとするガム;ならびにゼラチンおよびコラーゲンなどのタンパク質といった炭水化物またはタンパク質増量剤がある。所望により、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはアルギン酸ナトリウムなどのその塩など、崩壊剤または可溶化剤を加えてもよい。
【０６６２】
糖衣丸核は、アラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含んでもよい濃縮糖溶液などの好適な被覆剤と組み合わせて用いてもよい。製品の識別のためまたは有効化合物の量、すなわち用量の特定のため、錠剤または糖衣丸の被覆剤に着色剤または色素を加えてもよい。
【０６６３】
経口使用可能な医薬製剤としては、ゼラチン製のプッシュフィット(push-fit)カプセル、ならびにゼラチン製のソフトシール(soft sealed)カプセルおよびグリセロールまたはソルビトールなどの被覆剤を含む。プッシュフィットカプセルはラクトースまたはデンプンなどの増量剤または結合剤;タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤および所望により安定剤と混合した有効成分を含み得る。ソフトカプセルでは、有効化合物を脂肪油、液体、液体ポリエチレングリコールなどの好適な液体中に、安定剤を加えてまたは加えずに溶解または懸濁させればよい。非経口投与に好適な医薬製剤は水溶液、好ましくはハンク溶液、リンゲル溶液、または生理学的に緩衝させた食塩水などの生理学上適合するバッファー中に製剤化すればよい。水性注射懸濁剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランなど、懸濁剤の粘度を高める物質を含んでもよい。さらに有効化合物の懸濁剤は好適な油性注射懸濁剤として調製してもよい。好適な脂質親和性溶媒またはビヒクルとしては、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、あるいはリポソームが挙げられる。所望によりこの懸濁剤はさらに好適な安定剤または高濃度溶液の調製を意図して化合物の溶解度を高める薬剤を含んでもよい。局所または鼻内投与に関しては、浸透させる特定のバリアに適切な浸透剤を製剤に用いる。このような浸透剤は一般に当技術分野で公知である。本発明の製薬上および生理学上許容される組成物は、例えば通常の混合、溶解、造粒、糖衣丸製造、レビゲーティング、乳化、カプセル化、捕捉、または凍結乾燥加工の手段により、当技術分野で公知の方法で製造され得る。
【０６６４】
この医薬組成物は塩として提供してもよく、限定されるものではないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などをはじめとする多くの酸によって形成し得る。水性またはその他のプロトン酸溶媒中では塩の方がその対応する遊離塩基形態よりも溶解度が高い傾向にある。他の場合では、好ましい製剤は、4.5〜5.5のpH範囲の1〜50mMヒスチジン、0.1%〜2%スクロースおよび2〜7%マンニトールのいずれかまたは全てを含み、使用前にバッファーと混合され得る凍結乾燥粉末であってもよい。製薬上および生理学上許容される組成物を調製した後、それらを適当な容器に入れ、所定の疾病状態の治療についてラベル表示してもよい。RET-A-MODULINの投与については、このようなラベル表示は量、頻度および投与方法を含む。本発明で用いるために適した製薬上および生理学上許容される組成物としては、意図した目的を達成するために有効な量で有効成分を含有する組成物が挙げられる。有効用量の決定は十分に当業者の能力の範囲内である。いずれの化合物でも、治療上の有効用量はまず、例えば新生物細胞の細胞培養アッセイ、または動物モデル、通常はマウス、ウサギ、イヌもしくはブタで評価することができる。適当な濃度範囲および投与経路を決定するためにも動物モデルを用いればよい。次にこのような情報を用いてヒトにおける投与に有用な用量および経路を決定することができる。当業者ならばあるモデル(in vitroまたはin vivoモデルであり得る)からの推定が十分可能である。治療上有効な用量とは、症状または病状を緩和する有効成分、例えばRET-A-MODULINポリペプチドまたは本発明のその他のタンパク質もしくはその断片の量をさす。治療効力および毒性は細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的方法、例えばED50(集団の50%に治療上有効な量)およびLD50(集団の50%に致死的な量)により、判定すればよい。治療効果と毒性効果の用量比が治療指数であり、LD50/ED50比率として表すことができる。高い治療指数を示す製薬上および生理学上許容される組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータはヒト用の用量範囲での製剤化に用いられる。このような組成物に含まれる用量は好ましくは毒性がほとんどまたは全くないED50を含む循環濃度の範囲内である。その用量は用いる剤形、患者の感受性および投与経路に応じたその範囲内でさまざまである。医師は治療を必要とする被験者に関連する因子に照らして適正な用量を決定する。用量および投与は、有効成分を十分なレベルで提供すべく、または所望の効果を維持すべく調節する。考慮されうる因子としては、疾病状態の重篤度、被験者の全身の健康状態、被験者の年齢、体重および性別、食事、投与時間および頻度、薬物の組合せ、反応感受性、ならびに治療に対する耐性／応答が挙げられる。持続型の製薬上および生理学上許容される組成物ならば、特定の製剤の半減期およびクリアランス速度に応じて3〜4日ごと、毎週、または2週間に一度投与すればよい。通常の用量は投与経路に応じて0.1〜100,000マイクログラム、最大で総用量約1gまでさまざまである。具体的な用量および送達方法に関する指針は文献で示され、当業者は一般に利用できる。当業者ならばヌクレオチドではタンパク質またはその阻害剤とは異なる製剤を用いるであろう。同様にポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は特定の細胞、条件、場所などに特異的である。疾病の予防または治療に関して、本明細書において抗腫瘍剤の適当な用量は、上記に定義したような治療する疾病のタイプ、疾病の重篤度および経過、その薬剤が予防目的で投与されるか治療目的で投与されるか、過去の治療、患者の臨床歴およびその薬剤に対する応答、ならびに主治医の判断によって異なる。薬剤は1回で、または一連の治療にわたって患者に好適に投与する。動物試験はヒトの治療のための有効用量の決定に信頼できる指針を与える。有効用量の種間の倍率掛けはMordenti, J. and Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" in Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobiら, eds., Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96により記載されている原理に従って行うことができる。例えば、疾病のタイプおよび重篤度により、例えば1回以上の単独投与によるものであれ連続注入によるものであれ、抗腫瘍剤約1g/kg〜15mg/kg(例えば、0.1〜20mg/kg)が患者に投与する最初の候補用量となる。典型的な日用量は、上記の因子に応じて約1g/kg〜100g/kgまたはそれ以上の範囲であり得る。疾病状態に応じて数日以上にわたる反復投与では、疾病の症状の望ましい抑制が見られるまで治療を持続する。しかし、他の用量計画も有用である。この治療の経過は従来の技術およびアッセイにより容易にモニタリングされる。特定の用量および送達法に関する指針は文献に示されている(例えば、米国特許第4,657,760号;同第5,206,344号;または同第5,225,212号)。異なる治療化合物および異なる疾患には異なる製剤が有効であり、例えばある器官または組織をターゲッティングする投与ならば別の器官または組織に対するものとは異なる様式での送達が必要となると考えられる。療法はRET-A-MODULIN細胞傷害性を利用すべくデザインしてもよい。特にRET-A-MODULIN発現を増強する療法または該ポリペプチドの投与は癌細胞の阻害または死滅の促進に有用である。細胞傷害性試薬としては、限定されるものではないが、全長または断片RET-A-MODULINポリペプチド、mRNA、またはRET-A-MODULINの生物活性を増強する任意の化合物が挙げられる。
【０６６５】
本発明に含まれる別の治療手法は、直接的に所望の標的細胞または組織の部位への(例えば注射による)、またはそこで治療組成物が標的細胞または組織へさらに方向付けられる部位への、あるいは全身的な(例えば、従来の組換えタンパク質投与技術による)、RET-A-MODULIN治療組成物(ポリヌクレオチド、抗体、小分子アゴニストまたは組換えRET-A-MODULINポリペプチド)の投与を含む。RET-A-MODULINの用量は個々の患者の大きさおよび健康状態をはじめとするさまざまな因子によって決まるが、一般に一日当たり0.1mgから100mgまでの間で生理学上許容される任意の製剤として成人に投与する。
【０６６６】
もう1つの実施形態では、RET-A-MODULINポリペプチドおよび核酸配列は、異常なレベルのアポトーシスをともなう疾病状態を検出またはモニタリングする上での診断用途を有する。例えば、ヒトにおいてRET-A-MODULINの発現の低減はアポトーシスの低下と相関している可能性がある。従って、RET-A-MODULINの産生レベルの低下または上昇は有害な状態の兆候となり得る。RET-A-MODULINの発現レベルは生検試料におけるノーザンブロット解析およびRT-PCRなどの任意の標準的な技術によってアッセイできる。
【０６６７】
これらの実施形態はRET-A-MODULINまたは本発明のその他のタンパク質またはその断片のin vitro活性試験、さらなる細胞増殖アッセイおよび細胞アポトーシス/ネクローシスアッセイをはじめとする、RET-A-MODULINにより媒介される増殖阻害およびアポトーシスの検出のための方法を含んでなる。アポトーシスアッセイの具体例は以下の参照文献にも示されている。リンパ球におけるアポトーシスに対するアッセイは、Notebornら, 米国特許第5,981,502号, 1999, Liら, "Induction of apoptosis in uninfected lymphocytes by HIV-1 Tat protein", Science 268: 429-431, 1995; Gibelliniら, "Tat-expressing Jurkat cells show an increased resistance to different apoptosis stimuli, including acute human immunodeficiency virus-type 1 (HIV-1) infection", Br. J. Haematol. 89: 24-33, 1995; Martinら, "HIV-1 infection of human CD4+T cells in vitro. Differential induction of apoptosis in these cells." J. Immunol. 152:330-342, 1994; Teraiら, "Apoptosis as a mechanism of cell death in cultured T lymphoblasts acutely infected with HIV-1", J. Clin Invest. 87: 1710-1715, 199 1; Dheinら, "Autocrine T-cell suicide mediated by APO-1/(Fas/CD95)", Nature 373: 438-441, 1995; Katsikisら, "Fas antigen stimulation induces marked apoptosisi of T lymphocytes in human immunodeficiency virus-infected individuals", J. Exp. Med. 1815:2029-2036, 1995; Westendorpら, "Sensitization of T cells to CD95-mediated apoptosis by HIV-1 Tat and gp120", Nature 375:497, 1995; DeRossiら, Virology 198:234-244, 1994に開示されている。繊維芽細胞のアポトーシスに対するアッセイは、Vossbeckら, "Direct transforming activity of TGF-beta on rat fibroblasts", Int. J. Cancer 61:92-97, 1995; Goruppiら, "Dissection of c-myc domains involved in S phase induction of NIH3T3 fibroblasts", Oncogene 9:1537-44, 1994; Fernandezら, "Differential sensitivity of normal and Ha-ras transformed C3H mouse embryo fibroblasts to tumor necrosis factor: induction of bcl-2, c-myc, and manganese superoxide dismutase in resistant cells", Oncogene 9:2009-2017, 1994; Harringtonら, "c-Myc-induced apoptosis in fibroblasts is inhibited by specific cytokines", EMBO J. 13:3286-3295, 1994; Itohら, "A novel protein domain required for apoptosis.  Mutational analysis of human Fas antigen", J. Biol. Chem. 268:10932-10937, 1993に開示されている。In vitro細胞増殖アッセイは、Jurkat、HepG2、K562またはHeLaなどの培養細胞を含み、これを例えば0.5〜25μg/mLの濃度範囲のRET-A-MODULINまたはその断片で処理し、処理の24、48および72時間後に細胞増殖の低下%を測定する。細胞アポトーシスはVYBRANT(商標)アポトーシスアッセイキット#3(Molecular Probes)などのアポトーシスアッセイキットを用いて測定する。回収および洗浄した後、細胞をFITC標識抗RET-A-MODULIN抗体で染色し、製造業者の説明書に従ってFACSにより分析する。細胞をP1またはDAP1で染色してアポトーシス核を検出する。DNAフラグメンテーション解析は、細胞DNAの抽出および約1μgのDNAを用いたサザンブロット解析により行い、RET-A-MODULINで処理していない前記細胞に由来するランダムプライム32P標識染色体DNAとハイブリダイズさせる。
【０６６８】
これらの実施形態はまた、トランスフェクションアッセイのためにpCMV-neoなどの発現ベクターへ前記ヌクレオチドをサブクローニングすることによる、RET-A-MODULINもしくは本発明のその他のタンパク質またはその断片の産生、ウエスタンブロット解析によるタンパク質発現の測定、および間接的免疫蛍光解析およびDNAフラグメンテーション解析によるRET-A-MODULIN誘導型アポトーシスの検出、を含んでなる。また本発明には、当技術分野で記載されている方法に従う、RET-A-MODULINもしくは本発明のその他のタンパク質またはその断片に対して特異的な抗体の作製も含まれるが、ここで該抗体はポリクローナルであってもモノクローナルであってもよい。
【０６６９】
RET-A-MODULINはまた、細胞性免疫機能の抑制された患者においておよび出生前感染において合併症を引き起こす病原性ヘルペスウイルスであるヒトサイトメガロウイルスの2つのリン酸化マトリックスタンパク質と相同性を有する(Rugerら, J Virology 61:446-453, 1987, Koretzら, N.Engl.J.Med.314:801-805, 1986, Bowdenら, N.Engl.J.Med.314:1006-1010, 1986)。ある好ましい実施形態は、ヘルペスウイルス感染に対するワクチン接種、ならびにヒトサイトメガロウイルス(HCMV)およびカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス／ヒトヘルペスウイルス8などのヘルペスウイルスに対するワクチン製剤(この製剤は本発明のRET-A-MODULINタンパク質またはタンパク質部分と、場合によりサブユニットワクチンに好適な1以上の担体およびアジュバントとを含んでなる)のための、RET-A-MODULIN、および、GPGPVGALSSLAQTEVTLG、EGPSVESQPYSD、EVSEEEFREGFDSDINN、TTLCQVLHAVSHQDSCPGDSSSVGKVSVLGLLHEELHGPGPVGALS、GPSVESQPYSD、CQVLHAVSH、GKVSVLGLLHEELHGPGPVをはじめとするその断片の使用を含んでなる。
【０６７０】
RET-A-MODULIN特異的ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を製造する方法における上記で定義したようなRET-A-MODULINタンパク質またはタンパク質部分の使用もまた本発明の範囲内にある。ワクチン接種および免疫化とは一般に、個体の免疫系が免疫応答を開始し得る対象となる非毒性因子を導入することをさし、これは次に病原体による攻撃に対する防護に役立つであろう。免疫系は、主としてその個体には通常存在しないタンパク質その他の大分子を識別することで、侵入した「外来」の組成物および因子を識別する。この外来タンパク質はそれに対して免疫応答が起こる標的に相当する。さらなる例としては、ヘルペスウイルス感染に対する受動免疫のための本発明のRET-A-MODULIN特異的抗体の使用、ならびにヘルペスウイルス感染に対する受動免疫のための免疫製剤(この製剤は本発明のRET-A-MODULIN特異的抗体と場合により受動免疫製剤に好適な1以上の担体およびアジュバントとを含む)である。
【０６７１】
予備的な適用としては、一例として、RET-A-MODULINを単離および／または精製する方法における本発明のRET-A-MODULIN特異的抗体の使用がある。投与経路としては、限定されるものではないが、筋肉内、腹腔内、皮内、皮下、静脈内、動脈内、眼内、および経口、ならびに経皮、または吸入もしくは坐剤によるものが挙げられる。好ましい投与経路としては、Pachukら, 米国特許第6,235,888号(2001)に記載されているような、筋肉内、腹腔内、皮内および皮下注射が挙げられる。また、Notebornら, 米国特許第6,238,669号(2001), Patelら, Diagnostic Molecular Pathology 10:95-99 (2001)、およびAoki and Tosato, Leuk Lymphoma, 41:229-237 (2001)も参照。なおこれらの全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【０６７２】
配列番号48のタンパク質(内部表示 クローン1000855165_205-99-1-0-A5-F)および配列番号52のタンパク質(内部表示 クローン500721700_204-43-4-0-H10-F)
クローン1000855165_205-99-1-0-A5-FのcDNA(配列番号47)はアミノ酸配列: MIYTMKKVHALWASVCLLLNLAPAPLNADSEEDEEHTIITDTELPPLKLMHSFCAFKADDGPCKAIMKRFFFNIFTRQCEEFIYGGCEGNQNRFESLEECKKMCTREKPDFCFLEEDPGICRGYITRYFYNNQTKQCERFKYGGCLGNMNNFETLEECKNICEDGPNGXQVDNYGTQLNAVNNSLTPQSTKVPSLFEFHGPSWCLTPADRGLCRANENRFYYNSVIGKCRPFKYSGCGGNENNFTSKQECLRACKKGFIQRISKGGLIKTKRKRKKQRVKIAYEEIFVKNM を含んでなる配列番号48のタンパク質をコードする。よって、本願を通じて記載される配列番号48のポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン1000855165_205-99-1-0-A5-Fに含まれる核酸によりコードされるポリペプチドについても当てはまることが理解されよう。さらに、本願を通じて記載される配列番号47のポリヌクレオチドの全ての特徴および用途はクローン1000855165_205-99-1-0-A5-Fに含まれる核酸についても当てはまることが理解されよう。本発明のある好ましい実施形態は、配列番号47、配列番号48およびクローン1000855165_205-99-1-0-A5-Fの組成物に向けられる。また、本明細書に記載のような生物活性を有するポリペプチド断片およびそれらの断片をコードするポリヌクレオチドも好ましい。
【０６７３】
クローン500721700_204-43-4-0-H10-FのcDNA(配列番号51)はアミノ酸配列: MIYTMKKVHALWASVCLLLNLAPAPLNADSEEDEEHTIITDTELPPLKLMHSFCAFKSDDGPCKAIMKRFFFNIFTRQCEEFIYGGCEGNQNRFESLEECKKMCTREKPDFCFLEEDPGICRGYITRYFYNNQTKQCERFKYGGCLGNMNNFETLEECKNICEDGPNGXQVDNYGTQLNAVNNSLTPQSTKVPSLFEFHGPSWCLTPADRGLCRANENRFYYNSVIGKCRPFKYSGCGGNENNFTSKQECLRACKKGFIQRISKGGLIKTKRKRKKQRVKIAYEEIFVKNM を含んでなる配列番号52のタンパク質をコードする。よって、本願を通じて記載される配列番号52のポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン500721700_204-43-4-0-H10-Fに含まれる核酸によりコードされるポリペプチドについても当てはまることが理解されよう。さらに、本願を通じて記載される配列番号51のポリヌクレオチドの全ての特徴および用途はクローン500721700_204-43-4-0-H10-Fに含まれる核酸についても当てはまることが理解されよう。本発明のある好ましい実施形態は、配列番号51、配列番号52およびクローン500721700_204-43-4-0-H10-Fの組成物に向けられる。また、本明細書に記載のような生物活性を有するポリペプチド断片およびそれらの断片をコードするポリヌクレオチドも好ましい。
【０６７４】
配列番号48のタンパク質はチファピニックス(Tifapinix)をコードする。配列番号52のタンパク質はチファピニックス-A58Sをコードする。チファピニックス-A58Sは、58位(チファピニックスの開始メチオニンから数えて)にアラニンではなくセリンを有する(A58S)点でチファピニックスと異なる。本明細書においてチファピニックスに向けられた詳細説明、組成物および実施形態は同様にチファピニックス-A58Sに対しても向けられるように提供されるものとみなされる。さらにまた、チファピニックスの任意のポリペプチド(該ポリペプチドは58位にアラニンを含む)に向けられた詳細説明、組成物および実施形態において、対応するチファピニックスのポリペプチドにも同様に向けられるように提供される詳細説明、組成物および実施形態は、58位のアミノ酸のセリンを含むと考えられる。
【０６７５】
チファピニックスは組織因子経路阻害剤(TFPI-1)の新規なスプライス変異体である。組織因子(TF)は外因性凝固経路を開始させる(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,849,875号;同第5,106,833号;同第6,103,499号;同第5,773,251号;同第5,994,125号, 1999)。TFPI-1はまたリポタンパク質結合凝固阻害剤(LACI)としても知られ、血漿リポタンパク質に対するその親和性のためにそう呼ばれる。
【０６７６】
チファピニックスは以下に記載されるような新規な機能を有する。
【０６７７】
TFPI-1は、活性化因子VII(FVIIa)およびTFの触媒複合体を活性化因子X(FXa)によってフィードバック阻害することにより凝固の開始を負に調節する、分泌型の三価Kunitz型血漿プロテイナーゼ阻害剤である。TFPI-1の第2のKunitzドメインはFXaと結合してこれを阻害するが、第1のKunitzドメインはTF-FVIIa複合体におけるFVIIaの阻害の原因となる。TFPI-1のKunitzドメイン1と2の間のリンカー領域は20アミノ酸:TRDNANRIIKTTLQQEKPDFを含んでなる(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,849,875号)。第3のKunitzドメインの機能はまだ知られていないが、それがヘパリン結合部位を含むことの証拠はある。また、第3のKunitzドメインではヘパリン結合部位がカルボキシル末端にマッピングされている。
【０６７８】
TFPI-1はFXaを直接阻害し、FXa依存的様式でTF-FVIIa触媒複合体のフィードバック阻害をもたらす。TFPI-1はTF-FVIIa複合体のプロテアーゼ活性の主要な阻害剤である。Kunitzドメイン2に結合しているFXaに対する、Kunitzドメイン1によるTF-FVIIa結合のアロステリックな増強はおそらく、少なくとも部分的にはKunitzドメイン1と2の間のリンカー領域によって行われる。TF-VIIa複合体の阻害にはFXaと結合するKunitzドメイン2が必要であるという知見から、TFPI-1が四価のTF-FVIIa-FXa-TFPI-1複合体を形成することによりTF-FVIIaを阻害するという考えが導かれた。この四価複合体の形成は、まずTFPI-1とFXaが結合し、次にTF-VIIa複合体と結合するか、あるいはまた、あらかじめ形成されていたTF-FVIIa-FXa複合体にTFPI-1が直接結合することによって生じ得る。四価の複合体の形成の結果として、TFは凝固の開始にもはや参加できなくなる。
【０６７９】
凝固におけるその役割の他、FXaは炎症においても役割を果たす。TF-FVIIaにより生成されたFXaはそのプロテアーゼ活性化受容体2(PAR2)の切断を介して血管内皮細胞の前炎症性活性化をもたらすことが示されている(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Camerer, Eら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:5255-60 (2000))。FXaはまたプロテアーゼ活性化受容体1(PAR1)の切断により前炎症性細胞応答を誘発することもできる(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Kravchenko, RM Blood 97:3109-16 (2001))。リウマチ様滑膜におけるTFのHLA-DR拘束性マクロファージ発現は一部にはFXaの生成を介して疾病の病原性に関与すると考えられている(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Dialynas DPら, Arthritis and Rheumatism 41:1515-6 (1998))。
【０６８０】
TFは癌において繊維素沈着と血管形成の双方を誘導し得る二機能性分子である。癌患者は静脈血栓塞栓症を起こしやすく、この凝固亢進は腫瘍増殖および転移を促進する。ヒト肺癌、黒色腫および乳癌では、TFおよび血管内皮増殖因子(VEGF)は腫瘍細胞に同時局在し、腫瘍細胞系におけるTFおよびVEGF合成と重症性複合型免疫不全マウスモデルにおけるin vivo血管形成との間には密接な相関が存在する(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Rickles, FRら, Int. J. Hematol. 73:145-50 (2001); Wojtukiewicz MZら, Thromb. Haemost. 82:1659-62 (1999); Abdulkadir SAら, Hum. Pathol. 31:443-7 (2000); Koomagi Rら, Int. J. Cancer 79:19-22 (1998))。
【０６８１】
TFは転移を助ける(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Mueller BMら, J. Clin. Invest. 101:1372-8 (1998); Fischer EGら, J. Clin. Invest. 104:1213-21 (1999))。このプロセスに等しく重要なものとして、(a)移動促進性アクチン結合タンパク質280と結合するTF細胞質ドメインの相互作用、および(b)腫瘍細胞表面でのタンパク質分解により活性をもつTF-FVIIa複合体の形成がある。原発性膀胱癌細胞では、この複合体は、TFPI-1に対して強く染まる腫瘍浸潤血管の近傍にある浸潤縁部に位置する。腫瘍細胞の接着および移動はin vitroではTF-FVIIaと、TFPI-1により固定化されたヘパリンとの相互作用により補助されていることが示されている。
【０６８２】
TF抗原は動脈硬化性プラークを含む全ての細胞エレメントで検出されている。TFの最も豊富な供給源は脂質豊富な壊死核を取り巻くキャップに存在するマクロファージおよび血管内膜平滑筋細胞であると思われる。またTF抗原はプラークの上をおおう内側細胞および内皮細胞にも存在する。血管細胞との関連に加えて、TF抗原はまた血管内膜の細胞外マトリックスおよび壊死核でも見られる。このTFはプラークが破裂すると循環血液と接触するようになり、すなわち急性動脈血栓症の最も重要な沈殿剤である(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Taubman MBら, Thrombosis and Haemostasis 82:801-5 (1999))。
【０６８３】
最近、TFPI-1は塩基性繊維芽細胞増殖因子により刺激された内皮細胞の増殖を阻害することが示された。最初の2つのKunitz型プロテイナーゼ阻害剤ドメインのみを含む末端切断型のTFPI-1は、極めて低い抗増殖活性を示すが、このことはTFPI-1のカルボキシル末端領域がこの活性に寄与することを示唆している(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Hembrough, TAら, J. Biol. Chem. 276:12241-8 (2001))。この活により、TFPI-1は血管形成阻害剤である。異常な血管形成は癌、増殖性糖尿病性網膜症および慢性関節リウマチをはじめとするさまざまな病変において重要な役割を果たす(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Folkman, J, Forum (Geneva) 9(3 Suppl 3):59-62 (1999); Danis, RPら, Expert Opin. Pharmacother 2:395-407 (2001); Stupack, DGら, Braz J. Med. Biol. Res. 32:573-81 (1999))。
【０６８４】
チファピニックスの場合、選択的スプライシングの結果、Kunitzドメイン1と2の間のリンカー領域に由来する13アミノ酸を含んでなるエキソン5の内部欠失が生じる(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Girard, TJら, J. Biol. Chem. 266:5036-41 (1991))。チファピニックスから、そして標準的なTFPI-1アミノ酸配列(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるNCBI登録番号P10646)から、チファピニックス-A58Sを区別するA58Sアミノ酸置換は、チファピニックスで示されるTFPI-1の選択的スプライシングがTFPI-1の２以上の対立遺伝子に対して起こりうることを明らかにするものであり、それによりチファピニックスで示される選択的スプライシングはTFPI-1の生物学において重要かつ独特な役割を果たすという説が支持される。
【０６８５】
得られた、短縮されたKunitzドメイン1と2の間のリンカー領域は、7アミノ酸: TREKPDFを含んでなる。またこの欠失により、その欠失を囲んでいる2つのアミノ酸(前記で下線を引いたRE)周辺に新たなアミノ酸の近隣関係が生じる。ファピニックスはFXaと結合する能力(Kunitzドメイン2)は保持しているが、FXaの結合に応答して、Kunitzドメイン1のTF-FVIIaへの結合をアロステリックに促進する能力は失っている。従って、チファピニックスはFXaを阻害する能力を保持していることから、チファピニックスは依然として抗凝固性かつ抗炎症性である。チファピニックスのカルボキシル末端は完全なままであることから、チファピニックスは血管形成を阻害する能力を保持している。
【０６８６】
しかし重要なことに、TFPI-1とは対照的に、Kunitzドメイン1によるTF-FVIIa結合をアロステリックに促進する能力を失っているせいで、チファピニックスは腫瘍細胞転移を促進する目的でTF-FVIIaにより集められる能力を失っている(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Mueller BMら, J. Clin. Invest. 101:1372-8 (1998); Fischer EGら, J. Clin. Invest. 104:1213-21 (1999))。
【０６８７】
ある好ましい実施形態では、本発明は本発明のチファピニックスと特異的に結合する抗体を提供する。さらに、該抗体がチファピニックスの非コンホメーションエピトープまたはコンホメーションエピトープを認識するものである該抗体の作製方法も好ましい。
【０６８８】
さらに、マウスがチファピニックスで免疫化されることを特徴とする該抗体の作製方法も好ましい。さらに、該マウスに由来するモノクローナル抗体をチファピニックスとは結合するが、TFPI-1とは結合しないことについてスクリーニングするような方法も好ましい。さらに、チファピニックスの開始メチオニンから数えて105〜111番のアミノ酸を含んでなるチファピニックスの新規なリンカー領域配列またはその任意の断片に対するものである該抗体の作製方法も好ましい。さらに、該マウスに由来するモノクローナル抗体を、チファピニックスとは結合するがTFPI-1とは結合しないものに関してサンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)により、スクリーニングする方法も好ましい。該モノクローナル抗体を作製する方法およびサンドイッチELISAを含む方法によりその特異性を確認する方法は当業者に周知のものである。
【０６８９】
ある好ましい実施形態では、本発明は該抗体をチファピニックスと接触させ、それに特異的に結合させる方法を提供する。さらに、免疫不全または炎症性病態のいずれかに対する病因を調べるために該抗体を診断的に用いる方法も好ましい。炎症性病態の場合(以下の病態が代表的なものである)、チファピニックスの発現レベルは抑制されていると予測される。非炎症性免疫調節不全の場合、チファピニックスの状態は演繹的に予測するのがより難しい。どちらの場合でも、チファピニックスの状態は診断を助け、さらには病態の階層化を助けるものと思われる。さらにまたチファピニックスの状態は予後についての価値も有し得る。さらに、病理学的背景において、血漿中、または、限定されるものではないが滑液および脳脊髄液をはじめとするその他の体液中のチファピニックスを定量するため、サンドイッチELISA方式において該抗体を診断的に用いる方法も好ましい。さらに、免疫機能調節不全または炎症性病態のいずれかを有する患者の血漿またはその他の体液中のチファピニックスのレベルを決定するために該診断アッセイを用いる方法も好ましく、ここで免疫不全または炎症性病態としては、限定されるものではないが、(a)慢性関節リウマチ;(b)アテローム性動脈硬化症;(c)炎症性腸疾患;(d)インスリン依存性糖尿病(1型糖尿病);(e)全身性紅斑性狼瘡;(f)多発性硬化症;(g)乾癬;(h)アレルギー性喘息;(i)再潅流傷害;および(j)卒中からなる群から選択される。
【０６９０】
さらなる好ましい実施形態では、本発明は免疫不全または炎症性病態を有する患者を治療するためにチファピニックスを用いる方法を提供する。好ましい組成物はチファピニックスを含んでなる。さらなる好ましい組成物は、チファピニックスを含んでなる。該組成物の好ましい製剤は、送達経路に適合する製剤であり、その送達経路は限定されるものではないが、(a)経口;(b)経皮;(c)注射(なお注射は、限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、皮下、滑膜内および腫瘍内からなる群から選択される);(d)バッカル;および(e)エアゾールの群から選択される。
【０６９１】
新血管形成は、限定されるものではないが慢性関節リウマチをはじめとするさまざまな疾病の病原性に関与する[全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Danis RPら, Expert Opin. Pharmacother. 2:395-407 (2001)]。
【０６９２】
本発明のさらなる実施形態では、チファピニックスを含んでなる前記組成物は免疫不全または炎症性病態を有する患者を治療する方法において用いられる。さらに、該免疫不全または炎症性病態に関連する症状または病状を緩和する方法として該患者を治療する方法も好ましい。さらに、外因性凝固経路の病原性の関与またはTFによる血管形成の促進に関連する症状または病状を緩和する方法として該患者を治療する方法も好ましい。さらに、該患者に前記送達経路により緩和上有効量のチファピニックスを送達する方法において用いられるチファピニックスを含んでなる組成物も好ましい。さらに、免疫不全または炎症性病態を有する患者に前記投与経路によりチファピニックスを含んでなる該組成物を送達する方法であって、その免疫不全または炎症性病態が、限定されるものではないが、(a)慢性関節リウマチ;(b)アテローム性動脈硬化症;(c)炎症性腸疾患;(d)インスリン依存性糖尿病(1型糖尿病);(e)全身性紅斑性狼瘡;(f)乾癬;(g)多発性硬化症;(h)アレルギー性喘息;(i)再潅流傷害;および(j)卒中からなる群から選択される前記方法も、好ましい。
【０６９３】
急性心筋梗塞(AMI)においては、単球のTF凝固促進活性が増強され、それにより再発またはその他の血栓性事象のリスクの一因となることがある[全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Ott Iら, Blood 97:3721-6 (2001)]。本発明のさらなる実施形態では、チファピニックスを含んでなる該組成物はAMI患者を治療する方法において用いられる。さらに、AMI患者を治療する方法において緩和上有効量のチファピニックスを静注により送達する方法も好ましい。
【０６９４】
研究によれば血管損傷後の平滑筋の増殖および新生内膜の肥厚における、TFにより媒介される凝固の重要な役割が確認されている[全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Han Xら, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 19:2563-7 (1999); Taubman MBら, Thrombosis and Haemostasis 82:801-5 (1999)]。本発明のさらなる実施形態では、チファピニックスを含んでなる該組成物は、限定されるものではないがバルーンによって引き起こされた血管損傷の結果として起こるものをはじめとする、血管損傷後の新生内膜の肥厚を有する患者を治療する方法において用いられる。さらに、血管損傷後の内膜の肥厚を有する患者を治療する方法において緩和上有効量のチファピニックスを静注により送達する方法も好ましい。
【０６９５】
研究によれば血管病状における外因性凝固経路のTF関与の重要な役割が確認されている。本発明のさらなる実施形態では、チファピニックスを含んでなる該組成物は、前記TFに関連した血管病態を有する患者を治療する方法において用いられる。さらに、該血管病態を有する患者を治療する方法において緩和上有効量のチファピニックスを静注により送達する方法も好ましい。さらに、該血管病態を有する患者を治療する方法において緩和上有効量のチファピニックスを静注による送達する方法であって、該病状が、限定されるものではないが、(a)播種性血管内凝固(DIC);(b)凝固亢進;および(c)敗血性ショックからなる群から選択される前記方法も好ましい。
【０６９６】
増殖性糖尿病性網膜症(PDR)は依然として先進国における後天的盲目の主因の1つである。PDRの特徴は異常な血管形成である新血管形成であり、これは最終的にはガラス体腔の重度の出血および／または網膜剥離を起こすことがある。本発明のさらなる実施形態では、チファピニックスを含んでなる該組成物はPDR患者を治療する方法において用いられる。
【０６９７】
本発明のさらなる実施形態では、チファピニックスを含んでなる該組成物は、癌患者を治療するための抗血管形成または抗転移の方法において用いられる。さらに、該癌に関連する症状または病状を緩和する方法において該患者を治療する方法も好ましい。さらに、前記送達経路により該患者に緩和上有効量のチファピニックスを送達する方法において用いられるチファピニックスを含んでなる組成物も好ましい。さらに、癌患者に前記送達経路によりチファピニックスを送達する方法であって、該癌が、限定されるものではないが、(a)黒色腫;(b)乳癌;(c)肺癌;(d)結腸癌;(e)前立腺癌;(f)ホジキンリンパ腫;(g)非ホジキンリンパ腫;(h)膵臓癌;(i)子宮癌;(j)卵巣癌;(k)精巣癌;(l)腎癌;(m)肝臓癌;および(n)肺非小細胞癌からなる群から選択される前記方法も好ましい。
【０６９８】
チファピニックスは、Kunitzドメイン2に結合している最初のFXaと、Kunitzドメイン1に結合している次のTF-FVIIaとの間のアロステリックな関係の分子的基礎に取り組むために用いる独特の有用性を持つ試薬である。というのも、チファピニックスは小型であり、かつKunitzドメイン1と2の間のリンカー領域からの13個連続したアミノ酸の欠失により明確に定義されているからである。特にリンカー長とリンカーのアミノ酸組成が比較的重要であることが容易に突き止められる。従って、さらなる好ましい実施形態では、本発明は該アロステリック機構の重要な分子パラメーターを同定するための、チファピニックスをコードするポリヌクレオチドの組換えDNA操作方法が提供される。限定されるものではないが、部位指定突然変異誘発および組換えタンパク質の発現をはじめとする核酸配列操作法は当業者に周知のものである。
【０６９９】
チファピニックスのFXaのセリンプロテアーゼ活性を特異的に阻害する能力により、チファピニックスは、FXaセリンプロテアーゼ活性の役割、またはより一般にはさまざまな活性におけるFXaの活性部位の役割のいずれかを評価するのに極めて有用な試薬となる。これらの活性としては、必ずしも以下に限定されるものではないが、次の群：
凝固アッセイで読みとれるような外因性凝固の増強(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Dialynas DPら Cellular Immunology 177:671-9  (1997);
特異的基質のセリンタンパク質分解切断;および
血管内皮細胞および平滑筋細胞で発現するその受容体であるEPR-1との結合(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Nicholson ACら, J. Biol. Chem. 271:28407-13 (1996))、
が挙げられる。
【０７００】
(a)と(b)はFXaの活性部位を必要とするが、(c)は必要としない。従ってチファピニックスは多様な活性におけるFXa活性部位の関与を評価するために用いられる識別試薬となる。例えば、チファピニックスは(a)と(b)を阻止するが、(c)は阻止しない、さらなる好ましい実施形態では、本発明は、試験サンプルによって明示される活性におけるFXa活性部位に対する要求性を推定上のFXaによって調べるためにチファピニックスを用いる方法を提供する。
【０７０１】
さらなる好ましい実施形態では、チファピニックスはプラスミンの結合および阻害のために用いられる。本発明の化合物を試験するためにはいずれの好適な方法を用いてもよい(米国特許第6,103,499号, 2000)。Scatchard (Ann N.Y. Acad Sci (1949) 51:660-669)はタンパク質結合に適用できる結合の測定および分析のための従来法を記載している。この方法は、比較的純粋なタンパク質と、結合タンパク質と非結合タンパク質とを識別可能であることとを必要とする。KDを測定するもう1つの適当な方法としては酵素に対する阻害活性を測定するものがある。測定されるKDが1nM〜1mμMの範囲であれば、この方法は発色基質または蛍光基質、および数十マイクログラム〜数十ミリグラムの比較的純粋な阻害剤を必要とする。本発明のタンパク質は5nM〜50pMの範囲のKDを有するので、数ng〜数mgの阻害剤で十分である。本方法を用いる場合、阻害剤と酵素基質の間の競合が真のKiよりも高いKi測定値を与え得る。ここで報告する測定値はこうした補正をしていないが、これは補正が極めて小さく、また、いずれの補正もKi を引き下げるからである。発明者らはここではKi測定値をKDの直接の測定値として用いる。チファピニックスのプラスミンに対するKDはせいぜい約5nM、より好ましくはせいぜい約300pM、最も好ましくはせいぜい100pM以下である。この結合はKiがKDと同じになるような阻害を示すことが好ましい。プラスミンに対するQS4のKiは約2nMである。プラスミンに対するSPI11のKiは約88pMである。
【０７０２】
もう1つの好ましい実施形態では、チファピニックスは製薬法および製剤のために用いられる。本発明の好ましい被験体は哺乳類である。本発明は特にヒトの治療に有用であるが、獣医学的適用にも適している。本明細書では「防護(protection)」とは「回避(prevention)」、「抑制(suppression)」、および「治療(treatment)」を含む。「回避」は疾病の誘発前の薬物投与を伴う。「抑制」は疾病の臨床発現前の薬物投与を伴う。「治療」は疾病の発現後の薬物投与を伴う。ヒト医学および獣医学においては、誘発事象が未知であったり潜伏性であったり、あるいは誘発事象の発症後まで患者が確定されなかったりするので、「回避」と「抑制」の識別はできないことがある。発明者らは「治療」と区別するものとして「回避」および「抑制」を含めて「予防(prophylaxis)」という用語を用いる。本発明では「防護」とは「予防」を含む。防護は絶対的に有用でなくともよい。疾病または有害な状態から患者を防護するため、チファピニックスまたはその断片を全身または局所的に任意の手段によって投与すればよい。例えばこのような組成物の投与は非経口経路のいずれか、ボーラス注射、または緩やかな灌流によるものであってもよい。あるいはまたはそれと同時に、投与は経口経路によるのでもよい。好適な投与計画としては、単回用量、または一定の時間、日数、月数もしくは年数にわたる複数回用量として投与する有効量のタンパク質の投与を含んでなる。本発明のタンパク質の好適な用量はレシピエントの年齢、性別、健康状態および体重、もしあれば同時に行う治療の種類、処置頻度、および所望の効果によって異なる。しかし、最も好ましい用量は個々の患者に合わせることができ、そのことは、当業者であれば当技術分野で公知の方法で用量を調節することにより過度な試験をすることなく理解し決定することができる。タンパク質をはじめとする薬物の前臨床試験および臨床試験の方法に関しては、例えば、Berkowら編, The Merck Manual, 第15版, Merck and Co., Rahway, N.J., 1987; Goodmanら編, Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 第8版, Pergamon Press, Inc., Elmsford, N.Y., (1990); Avery's Drug Treatment:  Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, 第3版, ADIS Press, LTD., Williams and Wilkins, Baltimore, Md. (1987), Ebadi, Pharmacology, Little, Brown and Co., Boston, (1985)（なお、これらの全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる)を参照。チファピニックスの他、医薬組成物が、製薬上許容される担体、賦形剤または補助剤を含んでもよい。例えば、Berker, 上記, Goodman, 上記, Avery, 上記およびEbadi, 上記を参照。
【０７０３】
なおもう1つの好ましい実施形態では、チファピニックスまたはその断片はin vitro診断法および試薬に用いられる。チファピニックスおよび関連の配列は、存在するプラスミンを測定するため、プラスミンを含み得る任意の好適なサンプルに対してin vitroで適用することができる。このアッセイは存在するプラスミンの量に依存する検出可能なシグナルを提供するシグナル生成系(SPS)を含んでいなければならない。このシグナルは視覚的に検出されるものでも装置により検出されるものでもよい。可能性のあるシグナルとしては、発色、蛍光または発光生成物の生成、アッセイ成分または生成物による放射線の吸収または放出特性の変化、および成分または生成物の沈降または凝集が挙げられる。診断試薬と非常に緊密に関連づけられるSPSの成分は「標識」と呼ばれる。標識は例えば放射性同位元素、蛍光団、酵素、補酵素、酵素基質、電子密度化合物または凝集性粒子であり得る。放射性同位元素は例えばガンマーカウンタまたはシンチレーションカウンターの使用によりまたはオートラジオグラフィーにより検出することができる。特に有用な同位元素としては、3H、125I、131I、35S、14C、好ましくは125Iが挙げられる。また化合物を蛍光化合物で標識することもできる。蛍光標識化合物を適切な波長の光に曝すとその存在が検出される。最もよく用いられる蛍光標識化合物としてはフルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ο-フタルデヒドおよびフルオレスカミンがある。あるいは125Euまたはその他のアンタニドなどの蛍光放出金属を、ジエチレントリアミン五酢酸またはエチレンジアミン四酢酸などの金属キレート基を用いて結合タンパク質に結合させてもよい。これらのタンパク質はまた、ルミノール、イソルミノ、セロマチックアクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルなどの化学発光化合物に結合させることにより検出可能なように標識することもできる。同様に、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンなどの生物発光化合物を用いて結合タンパク質を標識してもよい。生物発光タンパク質の存在は発光の存在を検出することで判定される。ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼおよびアルカリ性ホスファターゼなどの酵素標識が好ましい。不均一および均一の２つの基本的なアッセイ型がある。不均一アッセイでは、親和性分子とアナライトの結合は標識に影響を及ぼさないので、アナライトの量を測定するためには結合した標識を遊離標識から分離しなければならない。均一アッセイでは、相互作用が標識の活性に影響を及ぼすので、アナライトは分離せずに測定することができる。チファピニックスをプラスミン結合タンパク質として、抗プラスミン抗体を用いる同様の方法において診断的に用いてもよい。このようにアッセイ方式に応じて、それを用いて、プラスミンをアッセイしたり、またはプラスミンと結合する他の物質を競合阻害によりアッセイすることができる。サンプルは一般に、血液、尿、精液、乳汁もしくは脳脊髄液またはそれらの派生物などの体液、あるいは組織切片またはホモジネートなどの生体組織である。サンプルが体液または生体組織である場合、それはヒトまたはそ���他の哺乳類、脊椎動物または動物、あるいは植物から採取したものであり得る。好ましいサンプルは血液、またはその画分もしくは派生物である。関連の実施形態では、チファピニックスまたはその断片を固定化し、サンプル中のプラスミンを既知量の標識したまたは特異的に標識可能なプラスミン類似体と競合させる。「プラスミン類似体」とはチファピニックスまたはその断片との結合に関してプラスミンと競合し得る分子である。これは予め標識しておいてもよいし、あるいは後でプラスミン類似体がプラスミンと異なっている部分に標識を特異的に結合させることにより標識してもよい。層を分離し、１つの層の標識プラスミン類似体を定量する。「サンドイッチアッセイ」では、不溶化プラスミン結合剤(PBA)と標識PBAの両者を用いる。プラスミンアナライトは不溶化PBAにより捕捉され、標識PBAによりタグ付けされて三価の複合体を形成する。これらの試薬はいずれの順序でサンプルに加えてもよい。このPBAは同一であっても異なっていてもよく、一方のPBAだけは本発明のチファピニックスまたはその断片を含む必要がある(他方は例えば抗体であり得る)。この三価の複合体における標識PBAの量はサンプル中のプラスミン量と正比例する。上記の2つの実施形態はいずれも不均一アッセイである。均一アッセイではチファピニックスまたはその断片とプラスミンとの結合によって標識が影響を受けることのみを必要とする。チファピニックスまたはその断片を診断試薬として用いる場合、プラスミンアナライトはその固有の標識として働き得る。診断試薬を製造するために、標識をプラスミン結合タンパク質と直接または間接的に(例えば標識した抗チファピニックス抗体を介する)、共有結合的に(例えばSPDPを用いる)または非共有結合的にコンジュゲートさせてもよい。同様に、プラスミン結合タンパク質を固相支持体へコンジュゲートして固相（「キャプチャー」）診断試薬を生成してもよい。好適な支持体としてはガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼおよび磁鉄鉱が挙げられる。この担体は本発明の目的の上ではある程度可溶であってもよいし不溶であってもよい。この支持体材料はそれに結合した分子がプラスミンと結合可能な限りいかなる構造をとってもよい。
【０７０４】
さらにもう1つの好ましい実施形態では、チファピニックスまたはその断片はin vivo診断用としても用いられる。チファピニックスまたはその断片、すなわちプラスミンと極めて強固に結合するKunitzドメインは、in vivoイメージングに使用することができる。放射性標識したチファピニックスは、好適な放射性検出装置を用いて次に行う動的および／または静的イメージングを可能とするに十分な量で、典型的には注射、例えば静脈内または動脈内、また皮下、筋肉内などのその他の投与手段によりヒトまたは動物被験体へ投与すればよい。用量は診断上有効な画像を得ることができる最少量とし、指標として既知の放射性イメージング剤を用い、当技術分野における常法により測定すればよい。典型的にはこのイメージングは被験体の体全体で行うか、あるいは検査において症状または疾病に関連する身体の一部または器官に対して行う。放射性標識した結合タンパク質は蓄積される。次に、当該標的器官において所定の時点で蓄積した放射性標識結合タンパク質の量を定量する。特に好適な放射性検出装置としては、ガンマーカメラなどのシンチレーションカメラがある。カメラ内の検出装置が放射活性の減衰を感知し、それを記録する（さらに場合によりデジタル化する）。デジタル化情報は好適な任意の方法で解析することができ、その多くは当技術分野で公知である。例えば、時間-活性分析により、経時的に標的器官による放射性標識結合タンパク質のクリアランスによる取り込みを示すことができる。用いる放射性同位元素は好ましくは薬理学的に不活性であるべきであり、投与する量は実質的に生理作用を示してはならない。この結合タンパク質はヨウ素の種々の同位元素、例えば123I、125Iまたは131Iで放射性標識してもよい(例えば、米国特許第4,609,725号参照)。標識量は好適にモニタリングしなければならない。
【０７０５】
ヒト被験者に対する適用では、身体の総被爆線量を少なくし、標識分子の検出能を至適化するため、標識に125I以外の放射性同位元素を用いるのが望ましい場合がある。ヒトでの使用に即時に臨床利用できることを考えると、好ましい放射性標識としては99mTc、67Ga、68Ga、90Y、111In、113mIn、123I、186Re、188Reまたは211Atが挙げられる。放射性標識タンパク質は種々の方法により調製し得る。これらにはクロラミン-Tによる放射性ハロゲン化、またはラクトペルオキシダーゼ法とその後の高速液体クロマトグラフィーによる精製が挙げられる(例えば、Gutkowskaら, "Endocrinology and Metabolism Clinics of America 16 (1):183, 1987参照)。IODOBEADS.TM.など他の放射性標識法も使用できる。チファピニックスまたはその断片はまた体液、例えば血液からプラスミンを精製するために用いてもよい。この目的ではそれを不溶性支持体に固定化することが好ましい。このような支持体としては、固相診断試薬を製造するのに有用なものが挙げられる。タンパク質はタンパク質の分離または精製における参照のための分子量マーカーとしても使用できる。
【０７０６】
これらの実施形態はまた抗体の単離、精製および産生にも関し、その場合に、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,171,587号 B1, 2000に記載のように該抗体はポリクローナルであってもモノクローナルであってもよい。
【０７０７】
もう1つの好ましい実施形態はカリクレイン活性の阻害のためのチファピニックスおよびそのKunitzドメインの使用に関する。カリクレインは組織および血漿の双方に見られるセリンプロテアーゼである(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,994,125号, 1999, 同第6,057,287号, 2000参照)。血漿カリクレインは、接触により活性化される凝固や、因子XII(凝固)、プロウロキナーゼ/プラスミノーゲン(繊維素溶解)およびキニノーゲン(低血圧および炎症)の活性により媒介される繊維素溶解、低血圧、および炎症に関与する。キニノーゲンのカリクレイン切断の結果、極めて強力な生物活性ペプチド(キニン)が産生され、これは高い血管浸透性、血管拡張、気管支痙攣および痛みの誘導をもたらす。このようにキニンは菌血症(敗血症)または外傷に関連する生命を脅かす血管性ショックおよび浮腫、喘息ならびに組織傷害に関連する炎症性および神経性の痛み、ならびにC1阻害剤欠損疾患における浮腫(遺伝性血管浮腫)を媒介する。プロテアーゼ阻害剤としてのチファピニックスおよびその断片、該Kunitzドメインはカリクレインの切断を妨げ、従って該キニンの放出を防ぐ。
【０７０８】
チファピニックスは上記目的のいずれかのために使用できる。真核生物および原核生物発現系を用いる作製方法はこれまでに報告されており、当技術分野で公知である(米国特許第6,103,500号, 2000; PCT WO 95/18830)。例えば、チファピニックスまたはその断片(なお、好ましい断片としては該Kunitzドメイン、好ましくはKunitzドメイン3を含んでなる)は、(i)成分アミノ酸の連続的結合による非生物学的合成、(ii)細菌、昆虫または哺乳類細胞などの好適な宿主細胞における組換えDNA技術による生産、(iii)望ましくないLACI由来の配列の除去と合成置換配列の結合を含む任意の従来技術によって作製することができる(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,994,125, 1999)。
【０７０９】
配列番号50のタンパク質(内部表示 クローン588098_184-11-4-0-H4-F)
クローン588098_184-11-4-0-H4-FのcDNA(配列番号49)はアミノ酸配列
MPSSVSWGILLLAGLCCLVPVSLGTKADTHDEILEGLNFNLTEIPEAQIHEGFQELLRTLNQPDSQLQLTTGNGLFLSEGLKLVDKFLEDVKKLYHSEAFTVNFGDTEEAKKQINDYVEKGTQGKIVDLVKELDRDTVFALVNYIFFKGKWERPFEVKDTEEEDFHVDQVTTVKVPMMKRLGMFNIQHCKKLSSWVLLMKYLGNATAIFFLPDEGKLQHLENELTHDIITKFLENEDRRSASLHLPKLSITGTYDLKSVLGQLGITKVFSNGADLSGVTEEAPLKLSKAVHKAVLTIDEKGTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVKFNKPFVFLMIDXNTKSPLFMGKVVNPTQKを含んでなる配列番号50のタンパク質をコードする。よって、本願を通じて記載される配列番号50のポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン588098_184-11-4-0-H4-Fに含まれる核酸によりコードされるポリペプチドについても当てはまることが理解されよう。さらに、本願を通じて記載される配列番号49のポリヌクレオチドの全ての特徴および用途はクローン588098_184-11-4-0-H4-Fに含まれる核酸についても当てはまることが理解されよう。本発明のある好ましい実施形態は、配列番号49、配列番号50およびクローン588098_184-11-4-0-H4-Fの組成物に向けられる。また、本明細書に記載のような生物活性を有するポリペプチド断片およびそれらの断片をコードするポリヌクレオチドも好ましい。
【０７１０】
配列番号50のタンパク質は新規な機能を有するα-1-アンチトリプシン(アンチトリプシン)のスプライス変異体CrypAATをコードする。CrypAATではエキソン2内での内部スプライシングはシグナル配列をそのままにしながら、この成熟タンパク質から67アミノ酸のN末端欠失を生じる。この欠失は影響を受けたN末端からヘリックスAを経てヘリックスBにまで及ぶ(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Stein, PEら, Nature Structural Biology 2:96-113 (1995))。C末端付近のMet-Ser活性部位は完全なままである。
【０７１１】
アンチトリプシンは主として肝細胞により合成され、ヒト血漿中に最も豊富なプロテイナーゼ阻害剤である。それはあらゆる器官に拡散して多くのプロテアーゼを阻害するが、その主たる機能は肺実質において発揮され、そこでそれは、炎症応答の過程で放出されるセリンプロテアーゼである好中球エラスターゼによる損傷から肺胞組織を保護する。エラスターゼは組織に弾力性を与えるマトリックスタンパク質であるエラスチンを切断する能力により定義される。もし制御されないままであれば、好中球エラスターゼは過剰な炎症と進行性の肺気腫をもたらす。アンチトリプシン欠損を有する個体は肺気腫を発症するリスクが少なくとも20倍高まる。
【０７１２】
アンチトリプシンは、セルピン(serpin; serine protease inhibitor)スーパー遺伝子ファミリーのメンバーである。ほとんどのセルピンの主要機能は生理学的および病理学的条件下の双方でのタンパク質分解酵素の調節である。高い配列類似性に基づき、既知の阻害活性を持たないいくつかのタンパク質がセルピンとして分類されている。例えば、チロキシン結合グロブリン(TBG)およびコルチコステロイド結合グロブリン(CBG)は脂溶性ホルモンの輸送体として働くが、アンギオテンシノーゲンはペプチドホルモン前駆体である(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Janciauskiene, S, Biochimica et Biophysica Acta.1535:221-35 (2001))。
【０７１３】
セルピンはセリンプロテアーゼの競合的、不可逆的阻害剤である。セルピンは5本のストランドからなるβシートAとそれから生じる反応性ループに基づく共通分子デザインを有し、それがペプチド配列を標的プロテイナーゼに対して呈示する。アンチトリプシンのプロテイナーゼ阻害剤としての機能は、それが好中球エラスターゼに結合した際に受けるコンホメーション変化に依存する。この変化は切断された反応性ループをそのβ-シートAの第4ストランドとして挿入することを含み、アンチトリプシン分子をその上下を反転するように揺れ動かすことにより好中球エラスターゼを失活させる(ネズミ捕り作用として記載されている)(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Parmar, JSら, Journal of the Royal College of Physicians of London 34:295-300 (2000))。複合体「シャッター」ドメインは通常の閉じられた状態のβ-シートAの維持に寄与する(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Stein, PEら, Nature Structural Biology 2:96-113 (1995); Gils, Aら Thromb. Haemost. 80:531-41 (1998))。
【０７１４】
新規なスプライシング事象によりタンパク質に負荷されるコンホメーション摂動のため、CrypAATはプロテイナーゼ阻害作用を持たない。しかしながら、CrypAATは好中球エラスターゼによる切断に対して感受性を保持している。それはまたゼラチナーゼB(MMP-9)などのいくつかの非標的プロテイナーゼによる切断に対する感受性も保持している。従ってアンチトリプシンとは異なり、CrypAATはプロテイナーゼ基質として機能する。好中球エラスターゼおよび非標的プロテイナーゼによるCrypAATの切断は4kDaの36残基からなるC末端断片を生じるが、その断片は切断されても切断されたCrypAATにそのまま非共有結合する。
【０７１５】
CrypAATはプロテイナーゼ基質としてのさまざまな異なる生理学的役割を果たす(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Janciauskiene, S, Biochimica et Biophysica Acta 1535:221-35 (2001))。切断されたCrypAATは多形核白血球の浸潤の後期に寄与し、単球の強力な化学誘因物質である。CrypAATの単離されたC末端断片はコラーゲンおよび／またはラミニン-1などの細胞外マトリックスタンパク質と結合でき、そうすることで不適切な酵素消化からこれらのタンパク質を保護する役割を果たす。このCrypAATのC末端断片はまた、最近では、脂質代謝および前炎症性タンパク質に対する遺伝子を調節するとされている転写因子であるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体(PPAR)を活性化することにより、細胞の脂質異化および前炎症性活性化に重要な影響をもたらす。
【０７１６】
CrypAATはまた、いくつかの病態、すなわちアテローム性動脈硬化症および癌に関係があるとされている。CrypAATのC末端切断断片は動脈硬化性プラークの成分であり、壊死核近傍の繊維性キャップに特異的に存在する。CrypAATはアテローム性動脈硬化症においてプロテアーゼ基質としておよび生理活性ペプチドの分解産物の貯蔵庫としての役割を果たす。結腸および肺のCrypAAT陽性の腺癌はCrypAAT陰性のものより予後が悪い。最近の研究では、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)により生成されたC末端断片がin vivoにおける腫瘍増殖および浸潤性を高めることの十分な実験的証拠が示されている。
【０７１７】
これまでの定説とは対照的に、脳細胞はサイトカインやケモカインを産生することができ、in situで炎症性反応が可能である接着分子を発現し得ることは今や十分確認されている。脳虚血および外傷は著しい炎症を誘発する。脳の損傷後すぐの好中球の蓄積が脳組織の損失程度に関与すると考えられている。
【０７１８】
ある好ましい実施形態では、本発明は本発明のCrypAATと特異的に結合する抗体を提供する。さらに、CrypAATの非コンホメーションエピトープまたはコンホメーションエピトープを認識するような抗体を作製するための方法も好ましい。
【０７１９】
さらに、マウスがCrypAATで免疫化されることを特徴とする該抗体の作製方法も好ましい。さらに、該マウスに由来するモノクローナル抗体を、CrypAATとは結合するがアンチトリプシンとは結合しないことについてスクリーニングするような方法も好ましい。さらに、該マウスに由来するモノクローナル抗体を、CrypAATとは結合するがアンチトリプシンとは結合しないことについて酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によりスクリーニングするような方法も好ましい。さらに、該抗体を、CrypAATのプロテアーゼ感受性を立体的またはアロステリックに排除する能力に関してスクリーニングするような方法も好ましい。さらに、CrypAATの好中球エラスターゼまたはゼラチナーゼ感受性を立体的またはアロステリックに排除する能力に関してスクリーニングするような方法も好ましい。該モノクローナル抗体を作製する方法およびELISAをはじめとする方法によりその特異性を確認する方法は当業者に周知のものである。該抗体をCrypAATのプロテアーゼ感受性を排除する能力に関してスクリーニングする方法も当業者に周知のものであり、限定されるものではないが、抗体をCrypAATと接触させ、抗体-CrypAAT複合体を好中球エラスターゼまたはゼラチナーゼとともにインキュベートし、さらに4kDaのカルボキシル断片のタンパク質分解的生成を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により追跡することを含む。
【０７２０】
ある好ましい実施形態では、本発明は該抗体を接触させてそれを特異的にCrypAATと結合させる方法を提供する。さらに、免疫不全または炎症性病態のいずれかに対する病因を調べるために該抗体を診断的に用いる方法も好ましい。さらに、病理学的背景において、血漿中、または限定されるものではないが滑液および脳脊髄液をはじめとするその他の体液中のCrypAATを定量するため、サンドイッチELISA方式において該抗体を診断的に用いる方法も好ましい。さらに、免疫機能調節不全または炎症性病態のいずれかを有する患者の血漿またはその他の体液中のCrypAATレベルを測定するために該診断アッセイを用いる方法であって、該免疫不全または炎症性病態が、限定されるものではないが、(a)慢性関節リウマチ;(b)アテローム性動脈硬化症;(c)炎症性腸疾患;(d)インスリン依存性糖尿病(1型糖尿病);(e)全身性紅斑性狼瘡;(f)多発性硬化症;(g)乾癬;(h)アレルギー性喘息;(i)急性心筋梗塞;(j)敗血性ショック;(k)再潅流傷害;および(l)卒中からなる群から選択される前記方法が好ましい。
【０７２１】
さらなる好ましい実施形態では、本発明は、CrypAATがもつ、限定されるものではないが好中球エラスターゼおよびゼラチナーゼなどによるタンパク質分解への感受性を排除する能力を有する該抗体をCrypAATと接触させ、それに特異的に結合させる方法を提供する。さらに、免疫不全または炎症性病態のいずれかを有する患者のための治療薬としてCrypAATと接触させて該抗体を用いる方法も好ましい。好ましい組成物は、該CrypAAT抗体またはその断片もしくは誘導体を含んでなる。該組成物の好ましい製剤は、限定されるものではないが、(a)経口;(b)経皮;(c)注射;(d)バッカル;および(e)エアゾールの群から選択される送達経路に適合するものである。
【０７２２】
さらなる好ましい実施形態では、本発明は、CrypAATがもつ、限定されるものではないが好中球エラスターゼおよびゼラチナーゼなどによるタンパク質分解への感受性を排除する能力を有する該抗体をCrypAATと接触させ、それに特異的に結合させる方法を提供する。さらに、免疫不全または炎症性病態を有する患者を治療するために該CrypAAT抗体を用いる方法も好ましい。さらに、免疫不全または炎症性病態に関連する症状または病状を緩和する方法において該患者を該CrypAAT抗体で治療する方法も好ましい。該CrypAAT抗体は、限定されるものではないが4kDaカルボキシル断片をはじめとするCrypAATの生物活性断片のタンパク質分解による生成を抑制することにより、免疫不全または炎症性病態に関連する症状または病状を緩和する。さらに、緩和上有効量の該CrypAAT抗体を該患者に送達する方法も好ましい。さらに、緩和上有効量の該CrypAAT抗体を注射により該患者に送達する方法も好ましい。さらに、緩和上有効量の該CrypAAT抗体を免疫不全または炎症性病態を有する該患者に送達する方法であって、該免疫不全または炎症性病態が、限定されるものではないが、(a)慢性関節リウマチ;(b)アテローム性動脈硬化症;(c)炎症性腸疾患;(d)インスリン依存性糖尿病(1型糖尿病);(e)全身性紅斑性狼瘡;(f)乾癬;(g)多発性硬化症;(h)アレルギー性喘息;(i)急性心筋梗塞;(j)敗血性ショック;(k)再潅流傷害;および(l)卒中の群から選択される前記方法も好ましい。
【０７２３】
さらに、乾癬の症状または病状を緩和するための経皮接触法において該抗体をCrypAATと接触させて特異的に結合させる方法も好ましい。さらに、病変部位における注射または経皮接触により緩和上有効量の該CrypAAT抗体を乾癬病変と接触させる方法において用いる該CrypAAT抗体を含んでなる組成物も好ましい。
【０７２４】
さらに、アレルギー性喘息の症状または病状を緩和するための方法において該抗体をCrypAATと接触させて特異的に結合させる方法も好ましい。好ましい送達経路はエアゾールである。さらに、喘息組織に緩和上有効量の該CrypAAT抗体をエアゾールにより接触させる方法において用いる該CrypAAT抗体を含んでなる組成物も好ましい。
【０７２５】
さらに、アレルギー性鼻炎(花粉症)の症状または病状を緩和するための方法において該抗体をCrypAATと接触させて特異的に結合させる方法も好ましい。好ましい送達経路はエアゾールである。さらに、炎症を起こしている鼻組織に緩和上有効量の該CrypAAT抗体をエアゾールにより接触させる方法において用いる該CrypAAT抗体を含んでなる組成物も好ましい。
【０７２６】
さらなる実施形態では、本発明は急性炎症を抑制する方法において用いるべき該CrypAAT抗体を提供する。さらに、創傷治癒に関連する炎症を抑制するために該CrypAAT抗体を用いる方法も好ましい。さらに、創傷部位における注射または経皮接触により、創傷または外傷組織に緩和上有効量を接触させる方法において用いる該抗体を含んでなる組成物も好ましい。
【０７２７】
さらなる好ましい実施形態では、本発明は、CrypAATがもつ、限定されるものではないが好中球エラスターゼおよびゼラチナーゼなどによるタンパク質分解への感受性を排除する能力を有する該抗体CrypAATと接触させ、それに特異的に結合させる方法を提供する。さらに、癌に関連する症状または病状を緩和する方法において、癌患者を該CrypAAT抗体で治療する方法も好ましい。該CrypAAT抗体は、限定されるものではないが4kDaカルボキシル断片をはじめとするCrypAATの生物活性断片のタンパク質分解による生成を抑制することにより、癌に関連する症状または病状(限定されるものではないが、転移および浸潤性を含む)を緩和する。さらに、前記送達経路により緩和上有効量の該CrypAAT抗体を該患者に送達する方法も好ましい。好ましい送達経路は静注または腫瘍内注射である。さらに、該癌患者に緩和上有効量の該CrypAAT抗体を送達する方法であって、該癌が、限定されるものではないが、(a)黒色腫;(b)乳癌;(c)肺癌;(d)結腸癌;(e)ホジキンリンパ腫;(f)非ホジキンリンパ腫;(g)前立腺癌;(h)膵臓癌;(i)子宮癌;(j)卵巣癌;(k)精巣癌;(l)腎癌;(m)肝臓癌;および(n)肺非小細胞癌の群から選択される前記方法も好ましい。
【０７２８】
さらなる実施形態では、本発明は、限定されるものではないが免疫不全、炎症性病態および癌をはじめとする疾病の動物モデルにおける前臨床薬理学の手法において用いられる該CrypAAT抗体を提供する。
【０７２９】
さらに、該CrypAAT抗体の治療効力を至適化するため、ヒト免疫不全または炎症性病態の齧歯類または霊長類モデルにおいて該CrypAAT抗体を用いる方法も好ましい。さらに、ヒト免疫不全または炎症性病態の齧歯類または霊長類モデルにおいて該CrypAAT抗体を用いる方法であって、該免疫不全または炎症性病態が、限定されるものではないが、(a)慢性関節リウマチ;アテローム性動脈硬化症;炎症性腸疾患;インスリン依存性糖尿病(1型糖尿病);全身性紅斑性狼瘡;乾癬;多発性硬化症;アレルギー性喘息;急性心筋梗塞;敗血性ショック;再潅流傷害;および卒中の群から選択される前記方法も好ましい。
【０７３０】
さらに、該CrypAAT抗体の治療効力を至適化するため、ヒト癌のマウスモデルにおいて該CrypAAT抗体を用いる方法も好ましい。さらに、ヒト白血病の異種マウスモデルにおいて該CrypAAT抗体を用いる方法も好ましい。CrypAAT抗体を含んでなる該組成物の好ましい送達経路としては、限定されるものではないが、静注およびインプラントポンプが挙げられる。さらに、患者から得られた原発性白血病細胞を移植したヒト白血病の異種マウスモデルにおいて該CrypAAT抗体を用いる方法(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Dialynas, DPら, Blood 97:3218-25 (2001))であって、該白血病が、限定されるものではないが、(a)小児Tリンパ球急性リンパ芽球性白血病(小児T-ALL);(b)成人Tリンパ球急性リンパ芽球性白血病(成人T-ALL);(c)Bリンパ球急性リンパ芽球性白血病(B-ALL);(d)急性骨髄性白血病(AML);(e)慢性リンパ性白血病(CLL);および(f)多発性骨髄腫の群から選択される前記方法も好ましい。
【０７３１】
さらなる実施形態では、本発明は、ヒト血清を用いてin vitro細胞培養系においてCrypAATの4kDaの生物活性断片のタンパク質分解による生成を排除する方法における該CrypAAT抗体の使用を提供する。さらに、ヒト血清により、培養系に導入されたCrypAATからの4kDaの生物活性カルボキシル断片のin situタンパク質分解生成を阻止するため、該CrypAAT抗体を培養系のCrypAATと接触させて特異的に結合させる方法も好ましい。さらに、免疫アフィニティークロマトグラフィーによりヒト血清サンプルからCrypAATを枯渇させるため、樹脂上に固定化した該CrypAAT抗体をCrypAATと接触させて特異的に結合させる方法も好ましい。
【０７３２】
さらなる実施形態では、本発明は、CrypAATと特異的に結合して、それにより、限定されるものではないが好中球エラスターゼおよびゼラチナーゼをはじめとするプロテアーゼによる4kDaカルボキシル断片のタンパク質分解による生成を阻止する能力に関する、試験化合物のスクリーニングを提供する。さらに、CrypAAT上の非コンホメーション部位またはコンホメーション部位のいずれかと特異的に結合する試験化合物も好ましい。さらに、該CrypAATのタンパク質分解切断を立体的またはアロステリックに阻止する試験化合物も好ましい。さらに、好中球エラスターゼまたは非標的プロテイナーゼによるCrypAATの活性部位内での切断を阻止し、それにより、4kDaカルボキシル断片を生成する能力に関して、該試験化合物をスクリーニングする方法も好ましい。CrypAATのプロテアーゼ感受性を排除する能力に関して該試験化合物をスクリーニングする方法は当業者に周知のものであり、限定されるものではないが、試験化合物をCrypAATと接触させ、試験化合物-CrypAAT複合体を好中球エラスターゼまたはゼラチナーゼとともにインキュベートし、さらに、4kDaカルボキシル断片のタンパク質分解生成を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により追跡することを含む。
【０７３３】
該化合物の好ましい製剤としては、限定されるものではないが、(a)経口;(b)経皮;(c)注射;(d)バッカル;および(e)エアゾールの群から選択される送達経路に合った製剤から選択されるものである。
【０７３４】
エラスターゼまたは非標的プロテイナーゼによりその活性部位内でのCrypAATの切断を阻止することが分かった化合物はCrypAAT抗体に関して上記したものと類似のin vivoおよびin vitro法で用いられる。
【０７３５】
配列番号54のタンパク質(内部表示クローン789749_182-14-3-0-C12-F)
クローン789749_182-14-3-0-C12-FのcDNA(配列番号53)はアミノ酸配列:
MHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNNを含んでなる配列番号54のタンパク質をコードする。よって、本願を通じて記載される配列番号54のポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン789749_182-14-3-0-C12-Fに含まれる核酸によりコードされるポリペプチドについても当てはまることが理解されよう。さらに、本願を通じて記載される配列番号53のポリヌクレオチドの全ての特徴および用途はクローン789749_182-14-3-0-C12-Fに含まれる核酸についても当てはまることが理解されよう。また、本明細書に記載のような生物活性を有する断片およびそれらの断片をコードするポリヌクレオチドも好ましい。
【０７３６】
配列番号54のタンパク質はプラスミノーゲン遺伝子内のオルタナティブな転写開始によって生ずるプラスミンの変異体であるプラスミヌート(Plasminute)をコードする。プラスミヌートは以下に記載されるような新規な機能を有する。
【０７３７】
ヒト繊維素溶解系の活性化において最後に起こることは種々の機能的特性を有するセリンプロテアーゼである酵素プラスミンの生成であり、その最も着目される特性は繊維素沈着物のタンパク質分解によるクリアランスである。プラスミンは、唯一のペプチド結合の切断の結果として、そのチモーゲンであるプラスミノーゲンが活性化される際に生じる。この後者の事象はプラスミノーゲンアクチベーターと呼ばれる、特異性の狭いセリンプロテアーゼによって触媒される。ウロキナーゼ型のプラスミノーゲンアクチベーターおよび組織型のプラスミノーゲンアクチベーターは直接作用し、ストレプトキナーゼは間接的に作用する。セリンプロテアーゼとしてのその能力において、プラスミンはフィブリンクロットを溶解させる働きをする。これらの各プラスミノーゲンアクチベーターは商業的に入手可能であり、心筋梗塞、卒中、肺塞栓症、深部静脈血栓症、末梢動脈閉塞およびその他の静脈血栓症ななどの急性血管疾患の治療に必要とされる(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,753,486; "Human tissue plasminogen activator;")。これらの疾病はひとまとめにして主要健康ハザードおよびリスクに数えられている。
【０７３８】
セリンプロテアーゼとしてのその能力において、プラスミンはまた組織再構築における細胞移動を伴う通常のプロセスにおいて役割を果たす。これに関してプラスミンは、炎症、血管形成におけるマクロファージの浸潤および創傷治癒後のケラチノサイトの蓄積など、細胞の移動が不可欠なプロセスにおいて機能するものと考えられている。さらにまたプラスミンは、腫瘍細胞の増殖(プラスミンは増殖因子を活性化することができる)および周辺組織への浸潤そしておそらくは転移、に関与する細胞移動の病理学的プロセスにおいて重要なメディエーターとして強く関連づけられている。これらのプロセスにおけるプラスミンの関与は、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ラミニンおよびIV型コラーゲンなどの細胞外マトリックスタンパク質を直接分解するプラスミンの能力、かつ／またはストロモリシンおよびプロコラゲナーゼなどのメタロプロテアーゼチモーゲンの活性化を通じてマトリックスタンパク質の分解に間接的に寄与するプラスミンの能力により、支持される。細胞外マトリックスの分解の結果、周辺領域への細胞の移動が容易になる(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Castellino, FJ in Molecular Basis of Thrombosis and Hemostasis, High, KA & Roberts, HR, editors, New York, pp 495-515 (1995))。
【０７３９】
プラスミノーゲンは内皮細胞により810残基の一本鎖糖タンパク質として合成され、分泌の際にそれから19残基のシグナルペプチドが切り出される。プラスミノーゲンは、Arg561-Val562ペプチド結合(分泌型プラスミノーゲンのアミノ末端グルタミン酸残基から数えて)の、アクチベーターにより触媒される切断の結果、プラスミンへと変換される。この結果生じたプラスミンは、軽鎖に二重ジスルフィド結合した、 プラスミノーゲンのアミノ末端に起源を有する重鎖を含む。この軽鎖領域はプラスミノーゲンのカルボキシ末端を含み、トリプシンおよびエラスターゼなどのセリンプロテアーゼと相同である。プラスミンの重鎖は、プラスミンと阻害剤との相互作用に部分的に寄与するkringleと呼ばれる約80アミノ酸残基長の５回反復した三重ジスルフィド結合ペプチド領域からなる(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Castellino, FJら, Ciba Found. Symp. 212:46-60 (1997))。
【０７４０】
ヒトプラスミノーゲン遺伝子は約52.5キロベースのDNAにわたり、18のイントロンによって分断された19のエキソンからなる(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Petersen, TEら, J. Biol. Chem. 265:6104-11 (1990))。
【０７４１】
プラスミノーゲンはレーザー光散乱実験およびNMRにより測定したところによれば、液相でおよそ3つの異なる形態で存在する。3つの末端切断型プラスミノーゲンが記載されている。アミノ酸末端ドメインが除去されれば、親(Glu-プラスミノーゲン)よりも効率的に活性化されるより短鎖のプロ酵素(Lys-プラスミノーゲン)となる。酵素エラスターゼを用いてさらに切断するとアミノ末端ドメインと4つのkringleドメインが除去され、ミニプラスミノーゲンが残る。ミニプラスミノーゲンはウロキナーゼにより活性化されてプラスミンと同等の繊維素溶解活性を有する酵素ミニプラスミンとなりうる。ミニプラスミンの最も著しい機能的な違いは主要なプラスミン阻害剤であるα-2-アンチプラスミンによる阻害に対して比較的耐性であることであり、おそらくこれはプラスミンと阻害剤の主要な相互作用を促進すると考えられているkringleドメイン1が存在しないことを反映するものである(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Moroz, LA, Blood, 58:97-104 (1981))。
【０７４２】
kringle構造を持たない機能的に活性なヒトミクロプラスミノーゲンはアルカリpHでプラスミノーゲンをウロキナーゼ不含プラスミンとともにインキュベートすることにより生成された。ミクロプラスミノーゲンはウロキナーゼおよびストレプトキナーゼにより活性化されて触媒的に活性なミクロプラスミンとなる。ミクロプラスミンはジスルフィド結合により連結された2つのポリペプチド鎖からなり、その一方は完全なままの軽鎖であり、他方は重鎖のカルボキシル末端部分に由来する31残基のペプチドである(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Shi, G-Yら, J. Biol. Chem. 263:17071-5 (1988))。
【０７４３】
ミニプラスミノーゲン様分子などのプラスミノーゲン断片の形成がいくつかの病態生理学的状態で認められていることは重要である。特に注目すべきは、急性炎症性関節炎(慢性関節リウマチを含む)における滑液は急性非炎症性関節炎(骨関節炎を含む)の滑液とは異なり、ミニプラスミノーゲンの特性を有するプラスミノーゲンの低分子量断片を含むことである(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Moroz, LAら, Thrombosis Research 43:417-24 (1986))。それらの生成に好中球エラスターゼが関与するにしてもその他の機構が関与するにしても、ミニプラスミノーゲンの特性を有する分子が炎症性関節に存在するということは、リウマチ様滑膜におけるプロコラゲナーゼからコラゲナーゼへの活性化の場合のようにプラスミン活性が関連するとされている炎症現象におけるそれらの関与の可能性を示すものであるが、ここでα-2-アンチプラスミンの阻害活性が、このような見解に対して障害になるものとして思い起こされる。しかし、ミニプラスミンなどの分子がもつこのような阻害を回避する能力は、ミニプラスミンの生成がプロコラゲナーゼの活性化、または関節の構造タンパク質の直接的破壊をもたらし得る可能性を示唆するものである。
【０７４４】
プラスミヌートはプラスミノーゲン遺伝子内のオルタナティブな転写開始の産物である。転写はイントロンN内(エキソンXVの少なくとも1036ヌクレオチド上流)で始まり、プラスミノーゲン遺伝子の残りの部分に沿って進行する(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Petersen, TEら, J. Biol. Chem. 265:6104-11 (1990); NCBI登録番号AL109933.25)。スプライシングは通常、転写されたエキソンXVとXIXの間で起こる。翻訳はエキソンXV内で始まり、プラスミノーゲンのオープンリーディングフレーム内で行われる。プラスミヌートはアミノ酸585〜790(分泌型プラスミノーゲンのアミノ末端グルタミン酸残基から数えて)に相当するプラスミノーゲンのカルボキシル末端断片である。
【０７４５】
重要なことには、プラスミヌートはそのプロテアーゼ活性が規制を逃れるという新規な方式であることによって区別される、プラスミンの変異体である。プラスミヌートはプラスミンの触媒性トライアド(分泌型プラスミノーゲンのアミノ末端グルタミン酸残基から数えてHis603、Asp646、Ser741)を保持する。プラスミヌートは、プラスミノーゲンからプラスミンへの変換に関与する切断部位(分泌型プラスミノーゲンのアミノ酸561〜562、アミノ末端グルタミン酸残基から数えて)の下流でその翻訳が開始されるため、タンパク質分解による活性化に対する要求性を回避する、構成的プロテアーゼ活性を示す。さらに、プラスミヌートのプロテアーゼ活性は、プラスミノーゲンkringleドメインの下流でその翻訳が開始されるために、主要なプラスミン阻害剤であるα-2-アンチプラスミンによる阻害に対して比較的耐性がある。
【０７４６】
ある好ましい実施形態では、本発明は急性血管疾患を有する患者においてプラスミヌートを血塊と接触させる方法を提供する。プラスミノーゲンアクチベーターと比較したプラスミヌートの有利な点は二倍であり、すなわち、1)患者内でプラスミンを生成させる必要がなくなることから、より直接的かつ制御可能となっていること、さらに2)外から投与したアクチベーターにより生じるプラスミンの大部分の場合のように過剰なα-2-アンチプラスミンによりすぐに中和されることがない(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,753,486号; "Human tissue plasminogen activator;")。好ましい組成物はプラスミヌートを含んでなる。好ましい投与経路は静注である。
【０７４７】
さらなる好ましい実施形態では、本発明は、血塊、すなわち血栓または血栓塞栓による血管の部分的閉塞または重症の場合には全面的な閉塞を指し示す病因学的基礎を示す疾病を有する患者においてプラスミヌートを血塊と接触させる方法を提供する。さらに、該血塊を溶解させる目的でプラスミヌートを該患者内の血塊と接触させる方法も好ましい。さらに、急性血管疾患を有する患者において血塊を緩和上有効量と接触させる方法において用いられるプラスミヌートを含んでなる組成物であって、該急性血管疾患が、限定されるものではないが、(a)心筋梗塞;(b)卒中;(c)肺塞栓症;(d)深部静脈血栓症;(e)末梢動脈閉塞;および(f)その他の静脈血栓症からなる群から選択される前記方法も好ましい。
【０７４８】
プラスミンは心筋梗塞、皮膚創傷および動脈新生内膜形成からの回復をはじめとする創傷治癒に重要な役割を果たす。心筋梗塞の経過においては、心筋細胞が死滅し、例えば皮膚創傷における創傷治癒に類似し、かつ、プラスミンを必要とするプロセスが起こる(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Creemers Eら, Am. J. Pathol. 156:1865-73 (2000))。皮膚創傷に関しては特に、創傷の閉鎖に必要な有効なケラチノサイト移動にプラスミンが必要とされる(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Romer Jら, Nat. Med. 2:287-92 (1996))。動脈新生内膜形成については、引き起こされた動脈壁の損傷の壊死中心への平滑筋細胞の移動にプラスミンが必要とされる(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Carmeliet, Pら, J. Clin. Invest. 99:200-8 (1997))。
【０７４９】
さらなる実施形態では、本発明は創傷治癒を促進する方法において用いられるプラスミヌートを含んでなる組成物を提供する。さらに、該創傷を緩和上有効量と接触させる方法において用いられるプラスミヌートを含んでなる組成物であって、該創傷が、限定されるものではないが、(a)心筋梗塞;(b)皮膚創傷;および(c)動脈壁損傷からなる群から選択される前記組成物も好ましい。
【０７５０】
上述の急性血管疾患の治療および創傷治癒のための組成物および方法は、限定されるものではないがヒトに用いられるが、同様に獣医学的適用も有する。
【０７５１】
プラスミンによるタンパク質の部分消化は該タンパク質のin vitro生化学分析にしばしば用いられる(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Bewley, TA, Biochemistry 16:209-15 (1977); Nawratil, Pら, J. Biol. Chem. 271:31735-41 (1996); Kost, Cら, Eur. J. Biochem. 236:682-8 (1996); Angelloz-Nicoud, Pら, Growth Hormone and IGF Research 8:71-75 (1998); Itoh, Yら, J. Biochem. 128:1017-24 (2000))。例えばプラスミンによる部分消化は特定のタンパク質ドメインについて機能を特定する上で、また、タンパク質上に抗原エピトープをマッピングする上で有用であり得る。プラスミヌートは該生化学分析に関して、1)プラスミヌートの生成はプラスミノーゲンのタンパク質分解による活性化を必要としない点および2)より小さいサイズであるプラスミヌートは操作がより容易である点でプラスミンに優る有用性を有する。
【０７５２】
さらに、限定されるものではないが、タンパク質機能および抗原性の分析をはじめとするタンパク質のin vitro生化学分析の方法において用いられるプラスミヌートを含んでなる組成物も好ましい。さらに、限定されるものではないが、タンパク質機能および抗原性の分析をはじめとするタンパク質のin vitro生化学分析の方法においてキットのパーツとして用いられるプラスミヌートを含んでなる組成物も好ましい。
【０７５３】
ある好ましい実施形態では、本発明は、本発明のプラスミヌートと特異的に結合する抗体を提供する。さらに、プラスミヌートの非コンホメーションエピトープまたはコンホメーションエピトープを認識する該抗体を作製する方法も好ましい。さらに、プラスミヌートのセリンプロテアーゼ活性を中和する、または組織からのプラスミヌートの除去を促進する該抗体を作製する方法も好ましい。
【０７５４】
さらに、マウスをプラスミヌートで免疫化することを特徴とする方法も好ましい。さらに、該マウスに由来するモノクローナル抗体を、プラスミヌートとは結合するがプラスミンまたはプラスミノーゲンとは結合しないことについてスクリーニングするような方法も好ましい。さらに、該マウスに由来するモノクローナル抗体を、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)により、プラスミヌートとは結合するがプラスミンまたはプラスミノーゲンとは結合しないことについてスクリーニングするような方法も好ましい。さらに、該マウスに由来するモノクローナル抗体を、プラスミヌートとは結合するが、プラスミン、プラスミノーゲン、ミニプラスミン、ミニプラスミノーゲン、ミクロプラスミンまたはミクロプラスミノーゲンと結合しないことについてスクリーニングするような方法も好ましい。さらに、該マウスに由来するモノクローナル抗体を、ELISAにより、プラスミヌートとは結合するが、プラスミン、プラスミノーゲン、ミニプラスミン、ミニプラスミノーゲン、ミクロプラスミンまたはミクロプラスミノーゲンとは結合しないことについてスクリーニングするような方法も好ましい。さらに、該抗体を、プラスミヌートのセリンプロテアーゼ活性を立体的またはアロステリックに中和する能力に関してスクリーニングするような方法も好ましい。さらに、前記モノクローナル抗体をヒト化する方法も好ましい。該モノクローナル抗体を作製する方法およびELISAをはじめとする方法により特異性を確認する方法は当業者に周知のものである。プラスミヌートのセリンプロテアーゼ活性を中和する該抗体をスクリーニングする方法は当業者に周知のものであり、それは、限定されるものではないが、該抗体をプラスミヌートと接触させ、抗体-プラスミヌート複合体をプラスミヌートの基質とともにインキュベートし、さらにプラスミヌート基質のタンパク質分解による活性化を追跡することを含む。該モノクローナル抗体をヒト化する方法は当業者に周知のものである。
【０７５５】
プラスミヌートの機能は前炎症性である。急性炎症性関節炎の滑液には少なくともミニプラスミノーゲン程度には小さなプラスミノーゲンの機能的断片がみとめられるが、急性非炎症性関節炎の滑液にはみとめられていない(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Moroz, LAら, Thrombosis Research 43:417-24 (1986))。
【０７５６】
ある好ましい実施形態では、本発明は該抗体を接触させて、それとプラスミヌートを特異的に結合させる方法を提供する。さらに、炎症性病態の基礎を調べるために該抗体を診断的に用いる方法も好ましい。さらに、病理学的背景において、血漿中、または限定されるものではないが滑液および脳脊髄液をはじめとするその他の体液中のプラスミヌートレベルを測定するため、サンドイッチELISA方式において該抗体を診断的に用いる方法も好ましい。さらに、プラスミヌートの基底レベルを確認する目的で、正常な被験者由来の血漿中、または限定されるものではないが滑液および脳脊髄液をはじめとするその他の体液中のプラスミヌートレベルを測定するため、サンドイッチELISA方式において該抗体を用いる方法も好ましい。さらに、炎症性病態を有する患者の血漿中またはその他の体液中のプラスミヌートレベルを測定するために該診断アッセイを用いる方法であって、該炎症性病態が、限定されるものではないが、(a)アテローム性動脈硬化症;(b)炎症性腸疾患;(c)インスリン依存性糖尿病(1型糖尿病);(d)全身性紅斑性狼瘡;(e)多発性硬化症;乾癬;(f)アレルギー性喘息;(g)敗血性ショック;および(h)再潅流傷害からなる群から選択される前記方法も好ましい。
【０７５７】
ある好ましい実施形態では、本発明は該抗体を接触させて、それとプラスミヌートを特異的に結合させる方法を提供する。さらに、炎症性関節炎の基礎を調べるために該抗体を診断的に用いる方法も好ましい。さらに、急性炎症性関節炎(以下のa〜d)または急性非炎症性関節炎(以下のe〜f)を有する患者の滑液中のプラスミヌートレベルを測定するために該診断アッセイを用いる方法も好ましい。プラスミヌートレベルはさらに、前者のものと後者のものを識別するのにも有用であり得る(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Moroz, LAら, Thrombosis Research 43:417-24 (1986))。
【０７５８】
ある好ましい実施形態では、本発明は該抗体を接触させて、それとプラスミヌートを特異的に結合させる方法を提供する。さらに、急性炎症性関節炎または急性非炎症性関節炎を有する患者の滑液中のプラスミヌートレベルを測定するため、前記サンドイッチELISA方式において該診断アッセイを用いる方法も好ましい。さらに、急性炎症性関節炎または急性非炎症性関節炎を有する患者の滑液中のプラスミヌートレベルを測定するために該診断アッセイを用いる方法であって、該関節炎が、限定されるものではないが、(a)慢性関節リウマチ;(b)痛風;(c)肺血性関節炎;(d)ライター症候群;(e)骨関節炎;および(f)外傷からなる群から選択される前記方法も好ましい。
【０７５９】
ある好ましい実施形態では、本発明は該抗体を接触させて、それとプラスミヌートを特異的に結合させる方法を提供する。さらに、炎症性病態を呈する患者における罹患組織中のプラスミヌートレベルを測定するため、免疫組織化学的方式において該抗体を診断的に用いる方法も好ましい。さらに、炎症性病態が限定されるものではないが(a)炎症性関節炎;(b)アテローム性動脈硬化症;(c)炎症性腸疾患;(d)インスリン依存性糖尿病(1型糖尿病);(e)全身性紅斑性狼瘡;(f)多発性硬化症;(g)乾癬;(h)アレルギー性喘息;(i)敗血性ショック;および(j)再潅流傷害からなる群から選択される場合の該炎症性病態を呈する患者における罹患組織中のプラスミヌートレベルを測定するため、免疫組織化学的方式において該抗体を診断的に用いる方法も好ましい。
【０７６０】
プラスミノーゲンからプラスミンへの変換に関与するウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター系の構成要素は正常組織または良性腫瘍におけるよりも悪性腫瘍で有意に多い量で存在し、このような発現の上昇は乳癌、前立腺癌、肺癌または結腸癌をはじめとする腫瘍を有すると診断された種々の患者の予後の悪さと関連している(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Andreasen, PAら, Cell. Mol. Life Sci. 57:25-40 (2000))(以下にさらに詳しく述べる)。乳癌に関しては、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーターレベルと患者の予後とを相関させた最大のデータセットが利用できる。西洋諸国では、約10人に1人の女性が乳癌を発症する。これらの患者のうちのかなりの人数では、彼女らの乳癌が診断される時点までに転移細胞がリンパ節およびその他の組織に拡散してしまっているであろう。よって、外科手術後これらの患者は通常、二次的な癌を発症するリスクを軽減する目的で数種の付加的療法を受ける。
【０７６１】
リンパ節に腫瘍細胞が存在しない(節が陰性)患者であっても、 二次的な腫瘍を発症するリスクが高いか低いかを知ることはやはり重要である。ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター系の構成要素のレベルを測定すればこのリスクを評価することができ、高いレベルであれば転移が起こるリスクが高いことを示し、患者が付加的な療法で処置されなけれならないことが示唆される。ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター系の関与に加えてプラスミンの生成が増大していればまさに転移のリスクが高いことを示し、腫瘍細胞によるプラスミヌートの発現が高ければ転移のリスクが高いことを示す。ある好ましい実施形態では、本発明は該抗体を接触させて、それとプラスミヌートを特異的に結合させる方法を提供する。さらに、癌を呈する患者における罹患組織中のプラスミヌートレベルを測定するため、免疫組織化学的方式において該抗体を診断的に用いる方法も好ましい。さらに、癌を呈する患者において腫瘍細胞により発現されたプラスミヌートのレベルを測定するため、免疫組織化学的方式において該抗体を診断的に用いる方法であって、該癌が、限定されるものではないが、(a)黒色腫;(b)皮膚の扁平細胞腫;(c)乳癌;(d)小細胞肺癌;(e)結腸癌;(f)ホジキンリンパ腫;(g)非ホジキンリンパ腫;(h)前立腺癌;(i)膵臓癌;(j)骨肉腫;(k)子宮癌;(l)卵巣癌;(m)軟骨肉腫;(n)子宮内膜癌;(o)精巣癌;(p)腎癌;(q)肝臓癌;(r)肺非小細胞癌;(s)Tリンパ球急性リンパ芽球性白血病(T-ALL);(t)Bリンパ球急性リンパ芽球性白血病(B-ALL);(u)急性骨髄性白血病(AML);(v)慢性リンパ性白血病(CLL);および(w)多発性骨髄腫からなる群から選択される前記方法も好ましい。
【０７６２】
ウイルス性出血熱は、フィロウイルス、アレナウイルス、フラビウイルスおよびブンヤウイルスの4つの異なる科のウイルスにより引き起こされる一群の疾病である。ウイルスにより駆動される宿主のプラスミヌート発現およびその結果としての腺溶亢進は少なくともいくつかのウイルス病態の原因でありうる。さらに、プラスミヌートレベルを測定することがこの群のウイルス同士を識別する上で診断的価値を有する可能性があり、あるいはこの群に属するウイルスをこの群に属さないウイルスと識別する上で診断的価値を有する可能性がある。
【０７６３】
ある好ましい実施形態では、本発明は該抗体を接触させて、それとプラスミヌートを特異的に結合させる方法を提供する。さらに、ウイルス性出血熱を罹患しているおそれのある患者における血漿中またはその他の体液中のプラスミヌートレベルを測定するため、サンドイッチELISA方式において該診断アッセイを用いる方法も好ましい。さらに、その他のウイルス感染におけるプラスミヌートレベルの基底レベルを確認することを目的に、ウイルス性出血熱を引き起こす群には属さないウイルスに感染した患者におけるプラスミヌートレベルを測定するために該診断アッセイを用いる方法も好ましい。さらに、ウイルス性出血熱を罹患しているおそれのある患者における血漿中またはその他の体液中のプラスミヌートレベルを測定するために該診断アッセイを用いる方法であって、該ウイルスが、限定されるものではないが、(a)エボラウイルス;(b)オムスク出血熱ウイルス;(c)フニンウイルス;(d)マールブルグウイルス;(e)クリミア-コンゴ出血熱ウイルス;および(f)デング熱ウイルスからなる群から選択される前記方法も好ましい。
【０７６４】
プラスミヌートのセリンプロテアーゼ活性は、その翻訳がプラスミノーゲンkringleドメインの下流で開始されるため、主要なプラスミン阻害剤α-2-アンチプラスミンによる阻害に比較的耐性がある。臨床サンプルのin vitro分析では、プラスミンまたはその誘導体によるものをはじめ、ex vivoサンプルの人為的タンパク質分解を防ぐことが重要である。サンプルがプラスミヌートを含有している場合、α-2-アンチプラスミンを用いる現行技術でこのようなタンパク質分解を阻止することは適切ではない。この点で、プラスミヌートに対する、プラスミヌートのセリンプロテアーゼ活性を中和するこのような抗体はα-2-アンチプラスミンに優る有用性を有する。ある好ましい実施形態では、本発明は該抗体を接触させて、それとプラスミヌートを特異的に結合させる方法を提供する。さらに、臨床サンプル内のプラスミヌートによるex vivoタンパク質分解を阻止するために抗プラスミヌート中和抗体を用いる方法も好ましい。
【０７６５】
同じ遺伝子に由来し、サイトカインにより相互に調節される機能的に異なるタンパク質イソ型をコードする、選択的にスプライシングされた2つの転写物の発現に関する先例がある。これは例えばTリンパ球共刺激分子CD86の単球での発現の事例である。インターフェロンγは、CD86の末端切断された阻害型をコードする選択的スプライシング転写物の単球発現をダウンレギュレートし、全長CD86をコードするスプライシング転写物をアップレギュレートする(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Magistrelli, Gら, Biochem. Biophys. Res. Commun. 280:1211-5 (2001))。従って、本発明の場合のように機能的に異なるタンパク質イソ型をコードするオルタナティブな転写物をもたらす遺伝子内に転写開始のサイトカイン調節が存在することを期待するというのは合理的ではない。遺伝子内にオルタナティブな転写開始のサイトカイン調節を同定することは、治療的価値を有し、病態のよりよい理解につながるものと予想される。
【０７６６】
ある好ましい実施形態では、本発明は該抗体を接触させて、それとプラスミヌートを特異的に結合させる方法を提供する。 さらに、内皮細胞によるプラスミヌート発現のサイトカイン調節を特徴付けるために該抗体を用いる方法も好ましい。さらに、内皮細胞によるプラスミヌート発現のサイトカイン調節を特徴付けるため、サンドイッチELISAにおいて該抗体を用いる方法も好ましい。さらに、内皮細胞によるプラスミヌート発現のサイトカイン調節を同定するため、サンドイッチELISAにおいて該抗体を用いる方法であって、該サイトカインが、限定されるものではないが、(a)インターフェロンγ;(b)インターロイキン17;(c)インターロイキン4;(d)インターロイキン10;(e)インターロイキン13;(f)インターロイキン15;(g)インターロイキン12;(h)インターロイキン18;(i)インターロイキン20;(j)インターロイキン21;(k)インターロイキン1β;(l)インターロイキン6;(m)単球化学走化性タンパク質1(MCP-1);(n)RANTES;(o)IP-10;(p)血管内皮増殖因子(VEGF);(q)トランスフォーミング増殖因子β;(r)インターロイキン8;および(s)腫瘍壊死因子αからなる群から選択される前記方法も好ましい。
【０７６７】
内皮細胞によるプラスミヌート発現のサイトカイン調節を特徴付ける方法は当業者に周知のものであり、それは、限定されるものではないが、内皮細胞をサイトカインを加えてまたは加えずに24〜48時間インキュベートし、培養上清を回収し、さらにその培養上清中のプラスミヌートタンパク質をサンドイッチELISAにより測定することを含む。
【０７６８】
プラスミヌートをコードする転写物はプラスミノーゲンをコードするものおよびその誘導体から容易に区別することができる。従ってさらに、内皮細胞によるプラスミヌートmRNA発現のサイトカイン調節を直接特徴付ける方法も好ましい。さらに、内皮細胞のプラスミヌートmRNAのレベルを測定するためにプラスミヌートを含んでなるポリヌクレオチドを用いる方法も好ましい。さらに、サイトカインの存在下または不在下で0、2、4、6、8、12または24時間インキュベートした内皮細胞のプラスミヌートmRNAのレベルを測定するためにプラスミヌートを含んでなるポリヌクレオチドを用いる方法も好ましい。さらに、該プラスミヌートmRNAレベルのノーザンブロット解析においてイントロンNに由来する5'非翻訳配列をコードするプラスミヌートcDNA断片を特異的プローブとして用いる方法も好ましい。さらに、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)により該プラスミヌートmRNAを特異的に測定するため、イントロンNに由来するプラスミヌート5'非翻訳配列中に指定されるプライマーをプラスミヌート3'非翻訳配列中に指定されるプライマーとともに用いる方法も好ましい。全RNAまたはポリ(A)+RNAに対してノーザンブロット解析またはRT-PCRを行う方法は当業者に周知のものである。
【０７６９】
プラスミヌートの機能は前炎症性である。この点で、急性炎症性関節炎の滑液には少なくともミニプラスミノーゲン程度には小さなプラスミノーゲンの機能的断片がみとめられるが、急性非炎症性関節炎の滑液ではみとめられていないことは重要である(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Moroz, LAら, Thrombosis Research 43:417-24 (1986))。抗プラスミヌート抗体の中和はプラスミヌートが役割を果たす炎症病態において治療的価値を有すると予想される。
【０７７０】
セリンプロテアーゼとしてのその能力において、プラスミンは組織の再構築において細胞移動を伴う通常のプロセスにおいて役割を果たす。この点でプラスミンは炎症および血管形成におけるマクロファージの浸潤など、細胞の移動が不可欠なプロセスにおいて機能すると考えられている。これらのプロセスにおけるプラスミンの関与は、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ラミニンおよびIV型コラーゲンなどの細胞外マトリックスタンパク質を直接分解するプラスミンの能力、かつ／またはストロモリシンおよびプロコラゲナーゼなどのメタロプロテアーゼチモーゲンの活性化を通じてマトリックスタンパク質の分解に間接的に寄与するプラスミンの能力により支持される。細胞外マトリックスの分解の結果、周辺領域への細胞の移動が容易になる(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Castellino, FJ in Molecular Basis of Thrombosis and Hemostasis, High, KA & Roberts, HR, editors, New York, pp 495-515 (1995))。
【０７７１】
新血管形成は、限定されるものではないが慢性関節リウマチをはじめとする多くの疾病で役割を果たす(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Danis, RPら, Expert Opin. Pharmacother. 2:395-407 (2001))。
【０７７２】
さらなる好ましい実施形態では、本発明は、プラスミヌートのセリンプロテアーゼ活性を中和するかまたは組織からのプラスミヌートの排除を促進する能力を有する該抗体を接触させてプラスミヌートと特異的に結合させる方法を提供する。さらに、炎症性病態を有する患者の治療薬としてプラスミヌートと接触させるように該抗体を用いる方法も好ましい。好ましい組成物は、該プラスミヌート抗体もしくはその断片または誘導体を含んでなる。該組成物の好ましい製剤は、限定されるものではないが(a)経口;(b)経皮;(c)注射;(d)バッカル;および(e)エアゾールからなる群から選択される送達経路に適合するものである。
【０７７３】
さらなる好ましい実施形態では、本発明は、プラスミヌートのセリンプロテアーゼ活性を中和するかまたは組織からのプラスミヌートの排除を促進する能力を有する該抗体を接触させてプラスミヌートと特異的に結合させる方法を提供する。さらに、炎症性病態を有する患者を治療するために該プラスミヌート抗体を用いる方法も好ましい。さらに、該炎症性病態と関連する症状または病状を緩和するために該プラスミヌート抗体を含んでなる組成物を用いる方法も好ましい。該プラスミヌート抗体は、プラスミヌートにより直接的または間接的に媒介され、かつ、この病状に関連するマクロファージの浸潤または血管形成をはじめとする炎症プロセスを促進するマトリックスのタンパク質分解による再構築を阻止することにより該炎症性病態に関連する症状または病状を緩和する。さらに、該炎症性病態を有する患者に緩和上有効量の該プラスミヌート抗体を送達する方法であって、該該炎症性病態が、限定されるものではないが、(a)慢性関節リウマチ;(b)アテローム性動脈硬化症;(c)炎症性腸疾患;(d)インスリン依存性糖尿病(1型糖尿病);(e)全身性紅斑性狼瘡;(f)多発性硬化症;(g)乾癬;(h)アレルギー性喘息;(i)敗血性ショック;および(j)再潅流傷害からなる群から選択される前記方法も好ましい。
【０７７４】
増殖性糖尿病性網膜症(PDR)は依然として先進国における後天的盲目の主因の1つである。PDRの特徴は異常な血管形成である新血管形成であり、これは最終的にはガラス体腔の重度の出血および／または網膜剥離を起こすことがある。本発明のさらなる実施形態では、抗プラスミヌート中和抗体を含んでなる該組成物はPDR患者を治療する方法において用いられる。
【０７７５】
セリンプロテアーゼとしてのその能力において、プラスミンは腫瘍細胞の増殖および周辺組織への浸潤、およびおそらくは転移に関与する細胞移動の病理学的プロセスにおいて役割を果たす[全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Andreasen, PAら,細胞. Mol. Life Sci. 57:25-40 (2000)]。これらのプロセスにおけるプラスミンの関与は、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ラミニンおよびIV型コラーゲンなどの細胞外マトリックスタンパク質を直接分解するプラスミヌートの能力、かつ／またはストロモリシンおよびプロコラゲナーゼなどのメタロプロテアーゼチモーゲンの活性化を通じてマトリックスタンパク質の分解に間接的に寄与するプラスミンの能力により支持される。細胞外マトリックスの分解の結果、周辺領域への細胞の移動が容易になる(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Castellino, FJ in Molecular Basis of Thrombosis and Hemostasis, High, KA & Roberts, HR, editors, New York, pp 495-515 (1995))。
【０７７６】
ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター系は、またプラスミンの関与により腫瘍の浸潤および転移のリスクの高さと関連している[開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Konno, Hら, Jpn. J. Cancer Res. 92:516-23 (2001); Fisher, JLら, Clin. Cancer Res. 7:1654-60 (2001); Vazquez-Rivera, Fら, Proceedings of the 11th NCI-EORTC-AACR Symposium, Abstract 294 (2000); Ellrieder, Vら, Annals of Oncology 10, suppl.4, 41-45 (1999); Smolarz, Bら, Med. Sci. Monit. 5:833-7 (1999); Romer, Jら, J. Invest. Dermatol. 116:353-8 (2001); Abe, Jら, Cancer 86:2602-11 (1999); Morii, Tら, Anticancer Res. 20(5A):3031-6 (2000); Tecimer, Cら, Gynecol. Oncol. 80:48-55 (2001); Zheng, Qら, J. Cancer Res. Clin. Oncol. 126:641-6 (2000); Swiercz, Rら Oncol. Rep. 8:463-70 (2001); Borgfeldt, Cら Int. J. Cancer 92:497-502 (2001); He, Cら, J. Cancer Res. Clin. Oncol. 127:180-6 (2001)]。
【０７７７】
さらなる好ましい実施形態では、本発明は、プラスミヌートのセリンプロテアーゼ活性を中和するかまたは組織からのプラスミヌートの排除を促進する能力を有する該抗体を接触させてプラスミヌートと特異的に結合させる方法を提供する。さらに、癌患者を治療するために該プラスミヌート抗体を用いる方法も好ましい。さらに、該癌に関連する症状または病状を緩和するために該プラスミヌート抗体を含んでなる組成物を用いる方法も好ましい。該プラスミヌート抗体は、プラスミヌートにより直接的または間接的に媒介され、かつ、この病状に関連する浸潤および転移プロセスまたは血管形成を促進するマトリックスのタンパク質分解による再構築を阻止することにより該癌に関連する症状または病状を緩和する。さらに、該プラスミヌート抗体を含んでなる組成物を静注により送達する方法も好ましい。さらに、緩和上有効量の該プラスミヌート抗体を該癌患者に送達する方法であって、該癌が、限定されるものではないが、(a)黒色腫;(b)皮膚の扁平細胞腫;(c)乳癌;(d)小細胞肺癌;(e)結腸癌;(f)ホジキンリンパ腫;(g)非ホジキンリンパ腫;(h)前立腺癌;(i)膵臓癌;(j)骨肉腫;(k)子宮癌;(m)卵巣癌;(n)軟骨肉腫;(o)子宮内膜癌;(p)精巣癌;(q)腎癌;(r)肝臓癌;(s)肺非小細胞癌;(t)Tリンパ球急性リンパ芽球性白血病(T-ALL);(u)Bリンパ球急性リンパ芽球性白血病(B-ALL);(v)急性骨髄性白血病(AML);(w)慢性リンパ性白血病(CLL);および(x)多発性骨髄腫からなる群から選択される前記方法も好ましい。
【０７７８】
さらなる好ましい実施形態では、本発明は試験化合物を、プラスミヌートと結合してプラスミヌートのセリンプロテアーゼ活性を特異的に中和する能力に関してスクリーニングする方法を提供する。さらに、プラスミヌートの非コンホメーション部位またはコンホメーション部位のいずれかに結合する該試験化合物も好ましい。さらに、プラスミヌートのセリンプロテアーゼ活性を立体的またはアロステリックに中和する試験化合物も好ましい。さらに、プラスミヌートの該セリンプロテアーゼ活性を中和する能力に関して該試験化合物をスクリーニングする方法も好ましい。プラスミヌートの該セリンプロテアーゼ活性を中和する能力に関して該試験化合物をスクリーニングする方法は当業者に周知のものであり、それは、限定されるものではないが、試験化合物をプラスミヌートと接触させ、試験化合物-プラスミヌート複合体をプラスミヌートの基質とともにインキュベートし、さらにプラスミヌート基質のタンパク質分解による活性化を追跡することを含む。
【０７７９】
該化合物の好ましい製剤は、限定されるものではないが、(a)経口;(b)経皮;(c)注射;(d)バッカル;および(e)エアゾールからなる群から選択されるものである。
【０７８０】
プラスミヌートと結合してそのセリンプロテアーゼ活性を特異的に中和することが分かった化合物は、抗プラスミヌート抗体の中和に関して上記したものと類似の方法において用いられる。
【０７８１】
配列番号56のタンパク質(内部表示クローン519757_184-4-2-0-F7-F)
クローン519757_184-4-2-0-F7-FのcDNA(配列番号55)はアミノ酸配列:
MLEVSDALGGPGRVPGATAGMNGVDTSLLCDLLQALTFLTRNEILCIHDTFLKLCPPGKYYKEATLTMDQVSSLPALRVNPFRDRICRVFSHKGMFSFEDVLGMASVFSEQACPSLKIEYAFRIYDFNENGFIDEEDLQRIILRLLNSDDMSEDLLMDLTNHVLSESDLDNDNMLSFSEFEHAMAKSPDFMNSFRIHFWGCを含んでなるヒト細胞内シグナル伝達タンパク質をコードし、カルシウムとインテグリンとの結合性(CIB)およびDNA依存性キナーゼ相互作用性(KIP)を有するタンパク質としての特徴を有する。本願明細書中に記載される配列番号55のポリヌクレオチドおよび配列番号56のポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン519757_184-4-2-0-F7-FのヒトcDNAおよびそれによりコードされるポリペプチド断片についても当てはまることが理解されよう。本明細書に記載される生物学的活性を有するポリペプチド断片およびそれをコードするポリヌクレオチドも本発明に含まれる。本発明に含まれる関連のポリペプチド配列としては、MGQCLRYQMH WEDLEEYQALTFLTRNEILCIHDTFLKLCPPGKYYKEATLTMDQVSSLPALRVNPFRDRI CRVFSHKGMFSFEDVLGMASVFSEQACPSLKIEYAFRIYDFNENGFIDEEDLQRIILRLL NSDDMSEDLLMDLTNHVLSESDLDNDNMLSFSEFEHAMAKSPDFMYSFRIRFWGCがある。
【０７８２】
配列番号55の遺伝子は第2染色体上に位置し、普遍的に発現し、2つのEF-ハンド・カルシウム結合および亜鉛結合ドメインを有し、神経伝達、筋肉グリコーゲン代謝、およびリンパ球活性化などのCa2+依存性脱リン酸化プロセスを制御し、本明細書ではCALSIGNと呼ぶ。CALSIGNは血小板凝集および血栓形成を誘導するシグナル伝達プロセスを刺激する。これはインテグリンの細胞質ドメインと結合し、血小板で発現されることによって、フィブリノゲン、フィブロネクチン、フォン・ヴィルブランド因子、ビトロネクチン、およびトロンボスポンディンと結合するインテグリンを活性化するフィブリノゲン受容体(インテグリンα11bβ3)を介して生理学的プロセスにおけるインテグリンの働きを制御する。さらに、これはインターフェロン1-受容体とも結合して、強い細胞間接着、血小板凝集、および血栓形成を誘導する血小板におけるシグナル伝達に貢献している。また、CALSIGNはウイルスおよび細菌感染ならびに内因性因子に応答して、表面抗原の発現回復およびT細胞活性化によって、免疫応答をも促進する。CALSIGNのさらなる特徴はB細胞成熟におけるVDJ-組換えおよび成熟B細胞での表面抗原発現を含んでなる[全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Naikら, J.Biol.Chem.272:4651-4654, 1997; PCT WO 98/14471, 1998; WuおよびLieber, Mutat.Res.385:13-20, 1997; PCT WO 98/31796, 1998; Hynes, Cell 69:11-25, 1992; Smythら, Blood 81:2827-2843, 1993; 米国特許第6,093,565号, 2000]。
【０７８３】
ある好ましい実施形態では、本発明のCALSIGNまたはその他のポリペプチドは外傷受傷後の組織再生および創傷治癒のための方法において用いられる。創傷、特に、第二度および第三度熱傷、鬱血性潰瘍、褥瘡性潰瘍などの栄養障害、重い切り傷ならびに擦り傷のような皮膚に起こるものは、一般的に自然治癒プロセスを受けにくく、本発明に含まれるCALSIGNまたはその他のポリペプチド、もしくはその断片を含んでなる組成物を血小板由来増殖因子(PDGF)または結合組織増殖因子(CTGF)などの増殖因子を含み得る製剤、または銀被覆繊維などの無菌性を有する創傷被覆材として用いて治療し得る(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,149,916号, 2000; 同第6,187,743号, 2001; 同第6,087,549号, 2000)。
【０７８４】
創傷治癒プロセスは、損傷組織が修復され、再生され、さらに新しい組織が瘢痕へと再構成される3つの段階からなる。これらの3つの段階は、a)0日〜3日に始まる炎症期、b)3日〜12日の細胞増殖期、およびc)3日〜約6ヶ月の再構築期に分かれる。3つの段階の全てにおいて、酸化防止剤が治癒プロセスに極めて重要な役割をする。炎症期では、炎症性細胞、主として好中球が創傷部位に浸潤し、続いてリンパ球、単球、さらに後にマクロファージとなる。刺激された好中球は、周囲組織および侵入してくる微生物の両方に有害となり得るプロテアーゼおよび活性酸素種を周囲環境に放出し始める。好中球によって放出されることが知られている酸素種は原形質膜と結合したNADPHオキシダーゼの作用によるスーパーオキシド(O2-)、O2-の不均化反応によって形成される過酸化水素(H2O2)、およびH2O2を有するミエロペルオキシダーゼの作用によって生成されるHOClである。
【０７８５】
増殖期は損傷部位における新たな肉芽組織の形成、および新たな血管形成からなる。繊維芽細胞、内皮細胞、および上皮細胞は創傷部位内へ移動する。これらの繊維芽細胞は創傷修復に必要なコラーゲンを産生する。アスコルビン酸はコラーゲンの形成において非常に重要である。アスコルビン酸によって、老化皮膚繊維芽細胞増殖能低下の克服が可能であること、ならびに、コラーゲン合成の基礎レベルは年齢依存的であるが、老化細胞における新生細胞の場合と同程度までのコラーゲン合成の増加が可能であることを示す研究がなされている。受傷領域のアスコルビン酸が減少すると創傷治癒速度が減速すると考えられる。上皮再形成の際、上皮細胞は創傷全域の組織の辺縁から移動する。この事象は後に創傷の周辺での上皮細胞の増殖へと引き継がれる。また、上皮再形成が防湿層を保持する閉鎖創傷被覆材の存在によって増強されるということも研究によって示された。創傷治癒の最終段階が再構築期であり、この期では肉芽組織のコラーゲンおよびエラスチン繊維での置き換えおよび肉芽組織の脈管遮断の両方が生じる。酸化防止剤、特にα-トコフェロールの局所適用によって、治療期間を通じて瘢痕形成が抑制され、さらに血液凝固が正常化されることが最近の研究によって示された。
【０７８６】
創傷ならびに火傷、潰瘍および損傷などの皮膚欠損のための特に有効な治癒治療は、必須成分としてデキストロース当量が約35未満のデンプン加水分解物を含有する包帯の適用である。このような創傷治療では、デンプン加水分解物は下層の肉芽組織と密着して気体および液体に対して半透性である被膜を形成して体液および血漿喪失ならびに病原菌による浸潤を抑制する理想的な保護カバーを提供する。さらに、デンプン加水分解物は局所的または特定部分の高栄養状態、すなわち、正常な血流栄養から相対的に孤立している損傷組織および発生期の組織の栄養摂取において特に有効であるグルコースの漸進的放出を提供する局所的栄養を提供するものと考えられる。このような虚血性損傷による血流の停止は、褥瘡性潰瘍および鬱血性潰瘍の場合のように緩慢かつ漸進的な様式で進行する場合もあり、また、熱放射および化学火傷の場合のようにもっと急に起こる場合もある。栄養不在下では、栄養物の液体送達割合が低下し、細胞および組織の生存における進行性障害が生じる。これにより最終的には壊死として知られる状況において組織および細胞の変性および死がもたらされる。壊死は一般に細菌、真菌および／またはウイルス汚染を伴う。上述の特許においてさらに示されるように、滲出性皮膚創傷をデンプン加水分解物被覆材で治療することにより細菌感染した傷の細菌数が激減して細菌感染していない傷の感染が予防される。さらに、創傷または潰瘍にデンプン加水分解物を塗布することにより水腫液の通過が許容される被膜または半透膜が形成されるが、タンパク性物質は体内に保持されるため、比較的汚染されていない状況での滲出液の量の減少が可能になる。
【０７８７】
創傷治癒プロセスを増強および促進する組成物はCALSIGNの懸濁物、該繊維性タンパク質、コラーゲン、および繊維芽細胞または内皮細胞に対して走化性を示すグリコサミノグリカンなどの多糖類を含んでなる。好ましいグリコサミノグリカンは、ヘパリン、へパラン硫酸、またはアルギン酸塩であるとされている。I型コラーゲン、アスコルビン酸(ビタミンC)およびα-トコフェロール(ビタミンE)などのビタミン類、ならびに粒状デンプン加水分解物は正常な肉芽組織の形成および増殖を促進するために創傷に塗布される。創傷治癒プロセスは、細胞増殖を促進しかつ抗菌性、抗真菌性、および鎮痛性を有する銀または銀被覆繊維と非金属繊維が交互に重なった層を含んでなる多層ラミネート「創傷被覆材」によってかなり向上すると思われる(米国特許第6,087,549号, 2000)。軽度の裂傷(breaches)または断裂(ruptures)の修復プロセスでさえも時間および日単位から週単位の時間を要する。さらに、潰瘍形成の場合のように、裂傷または断裂が長期間、すなわち、月単位または年単位の時間すら存続し得る場合もある。短時間であっても長時間であっても、新しい組織が形成されて裂傷または断裂が完全に閉塞するまでは常に病原生物または異物が侵入する可能性が存続する。感染の危険性から、創傷の通常の管理として、病原物質を導入する可能性のある汚れ、織物片、またはその他の残渣などのあらゆる汚染物質を除去するために最初に患部を十分に浄化することを含む。絶望的な損傷を受けた組織は創面切除できるため、その部位を可能な限り無菌状態にするために消毒物質が適用される。必要であれば、縫合により下層組織の面積を小さくし、それによってその後汚染物に曝される組織量を制限することもできる。治癒プロセスは、一般に数種類の群の特定の細胞およびタンパク質が関与する複合的生物学的機構によってもたらされる。好中球およびマクロファージなどの白血球は創傷部位に集まり、異物である病原体および残渣を消化する。また、このような細胞は創傷周辺に繊維芽細胞を誘導する化学シグナルを出し、最終的には新しい組織の大部分を構成する結合構造、主として、コラーゲンを産生する。内皮細胞は再構成された組織部位に伸長する新たな毛細血管を生成する。これは、新たに増殖する組織細胞に栄養物を供給し、さらに異化産物を除去するのに必要である。新生毛細血管が成長するにつれて、創傷辺縁の細胞が同時に増殖し、さらに内側に成長する。この細胞増殖から生じる繊維性組織によって最終的には創腔が、コラーゲンの繊維が絡まりあった網状組織で満たされ、やがて堅く引き締まったバンドにまとめられ、新しい永久組織を形成する。
【０７８８】
創傷治癒を促進するための該方法は、
低デキストロース当量DEのデンプン加水分解物との混合物中のウシI型コラーゲンおよびα-トコフェロールの水性懸濁液中、治療上有効な濃度の本発明に含まれるCALSIGNまたはその他のポリペプチドの組成物(なお、この組成物は繊維芽細胞および内皮細胞に対して走化性である)を創傷に塗布する工程を含んでなる。このウシコラーゲンは、異物のタンパク性物質を除去するために種々の溶解、沈降および濾過技術によって前処理して、純粋なコラーゲン産物を調製する。
【０７８９】
組成物はビタミンCおよびビタミンEなどのビタミン類の組合せ、ならびに治療上有効な濃度の精製結合組織増殖因子(CTGF)および血小板由来増殖因子(PDGF)と組み合わせてもよい。
【０７９０】
効果的に治癒プロセスを促進するためには治癒期間中、該水性懸濁液を創傷に繰り返し塗布する。
【０７９１】
該水性懸濁液は術後創傷の治療用の該多層銀被覆材と組み合わせてもよい。
【０７９２】
また、これらの実施形態は、本発明のCALSIGNおよびその他のポリペプチドに対する抗体（ポリクローナルまたはモノクローナルであってよい）の作製も含む。組換えCALSIGNの作製には、発現ベクターおよび対応する細胞系が使用されよう(なお、発現系は大腸菌などの原核生物、およびバキュロウイルス／昆虫細胞などの真核生物、または当技術分野で十分に公知の哺乳類の系であってよい)。
【０７９３】
配列番号58のタンパク質(内部表示クローン625004_188-15-4-0-H6-F)
クローンのcDNA(配列番号57)は配列:
MGPPGFKGKTGHPGLPGPKGDCGKPGPPGSTGRPGAEGEPGAMGPQGRPGPPGHVGPPGPPGQPGPAGISAVGLKGDRGATGERGLAGLPGQPGPPGPQGPPGYGKMGATGMGQQGIPGIPGPPGPMGQPGKAGHCNPSDCFGAMPMEQQYPPMKTMKGPFGを含んでなる配列番号58のタンパク質をコードする。
【０７９４】
よって、本願明細書中に記載される配列番号58のポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン625004_188-15-4-0-H6-Fに含まれる核酸によりコードされるポリペプチドについても当てはまることが理解されよう。さらに、本願明細書中に記載される配列番号57のポリヌクレオチドの全ての特徴および用途はクローン625004_188-15-4-0-H6-Fに含まれる核酸についても当てはまることが理解されよう。また、本明細書に記載されるような生物学的活性を有する断片、および該断片をコードするポリヌクレオチドも好ましい。
【０７９５】
配列番号57のcDNAは第1染色体上、特にp34-35領域に位置するヒトα-1 XVI型コラーゲン遺伝子(GB M92642.1)の新規スプライシング変異体である。配列番号57のcDNAクローンは489のヌクレオチドのオープンリーディングフレームをコードする。天然型ヒトα-1 XVI型コラーゲンは1603個のアミノ酸からなるタンパク質をコードする71のエキソンを有するが、配列番号57のcDNAは14のエキソンを含み、かつ配列番号58の163個のアミノ酸からなるタンパク質をコードする。本タンパク質は最初に記載されたvCOL16A1と呼ばれるヒトα-1 XVI型コラーゲンの変異体に相当する。本タンパク質は2つのコラーゲン三重らせん繰り返し配列ドメインを含有する(11〜70位および73〜131位)。
【０７９６】
コラーゲンは、構造的に関連のあるタンパク質の大型ファミリーを総称するものであり、該ファミリーには現在では20種を超える型のコラーゲンが含まれる。これらのタンパク質は、結合組織の主要な細胞外マトリックス成分を構成し、種々の組織の完全な構造の維持に主要な役割を果たしている。またこれらは多くのその他の重要な機能も有している。コラーゲンは原繊維形成コラーゲンと非原繊維形成コラーゲンの、2つの主要な種に分類することができ、後者の種は、3重らせん介在原繊維結合性コラーゲン(FACIT: fibril-associated collagens with interrupted triple helices)と呼ばれるサブグループを含む。ヒトα-1 XVI型コラーゲンは非原繊維形成コラーゲン種のタンパク質のほとんどの特徴を示す。
【０７９７】
ある実施形態では、本発明のタンパク質またはその断片は、コラーゲンを分解するまたは変性させる種々のプロテアーゼ（コラゲナーゼおよび他の多数のものなど）の特異的活性を調べるためのin vitroアッセイを提供する。このようなプロテアーゼの活性を評価する方法は調べようとするプロテアーゼを本タンパク質と接触させ、生じる本タンパク質のタンパク質分解量を検出する工程を含む。
【０７９８】
コラーゲン原繊維は1つ以上の型のコラーゲンを含有する不均一な構造である場合が多いが、本発明は組織または生物学的サンプル中に存在するコラーゲンの型を決定する方法を提供する。例えば、罹患組織のコラーゲン組成はタンパク質-タンパク質相互作用を混乱させない条件下で本タンパク質を単離し、さらに本タンパク質に関連するタンパク質の同一性を確認することによって決定することができる。このような関連タンパク質は、限定されるものではないが、免疫沈降および免疫アフィニティーカラムをはじめとするいずれかの標準的方法によって同定できる。
【０７９９】
また、本発明は動物の1つ以上の組織における本タンパク質の発現または活性をモジュレートすることにより作製された動物モデルも提供する。このような動物は数多くの用途(例えば、それらは本タンパク質の活性と特異的な関係にある異常なコラーゲン代謝に関連する疾患の種々の病態生理学的症状の治療に対して有用である可能性のある候補分子を調べるためのin vivoアッセイ方法を意味する)に有用である。また、このようなモデルの表現型の研究によってコラーゲンの変異によって起こるまたはそれと関係があるさらなるヒトの同じ疾患の同定も可能になる。これらの動物は本タンパク質の過剰発現または不活性化を目的とするいずれかの方法のよって作製することができる。このような実施形態では、精製した本タンパク質を動物の関節に注射するか、またはタンパク質を関節内で組換え発現させることにより、周知の関節炎モデルである、関節における「コラーゲン誘導性関節炎」を引き起こす。このようなモデルは、例えば、関節炎ならびにその他の炎症性疾患および症状の治療における候補治療法および薬剤の評価において極めて有用である。
【０８００】
その他の実施形態では、本発明のタンパク質またはその断片は、コラーゲン代謝異常に関連する疾患または疾患を診断するのに用いられる。このような疾患および障害の例としては、限定されるものではないが、進行性腎不全を引き起こすコラーゲンの集合形成の異常が原因であるアルポート型の遺伝性腎炎、骨粗鬆症を含む骨組織疾患、パジェット病、関節炎(骨関節炎および慢性関節リウマチなど)で生じる軟骨組織疾患、アテローム性動脈硬化症で顕著な心臓血管系疾患、高血圧、心筋梗塞および心肥大が挙げられる。この方法は疾患または症状に罹患した疑いのある、または疾患または症状を発症するリスクがある個体から調製した生物学的サンプルを、本タンパク質または核酸と選択的に結合し得る化合物（例えば、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体またはその免疫学的に活性な断片、核酸プローブなど）と接触させ、さらにサンプル内の本タンパク質のレベル、空間分布、またはその他の検出可能な特性を検出する工程を含み、対照サンプルと比較したサンプル内のレベル、空間分布、またはその他の特性の違いにより、疾患もしくは障害、または疾患もしくは障害の発現傾向の存在が示される。
【０８０１】
本発明のさらなる実施形態は、骨折をはじめとする創傷治療にを含む、コラーゲンマトリックス破壊に関連する疾患および症状の治療に有用な新規方法および組成物を提供することである。このような方法は治療上有効な量の本タンパク質の疾患または症状に罹患した患者への投与を含んでなる。好ましくは、タンパク質はコラーゲンマトリックス破壊部位に直接投与される。また、この方法および組成物は、例えば、外科的に誘導された創傷の回復において、または生理学的機能不全（例えば尿失禁）を調節する、すなわち、固有括約筋不全の回復のためにも用い得る。かかる方法では、本タンパク質を尿道周囲注入により投与して管腔径を狭小化することができる。これらの組成物は、本発明のタンパク質と、所望により、1種以上のその他の型のコラーゲン、コラーゲン誘導体、または対象とする他の化合物を含んでなり得る。これらの成分全ては天然源から調製してもよいし、または組換え遺伝子工学技術および／もしくは化学修飾によって作製してもよい。
【０８０２】
コラーゲンの異常分解が結合組織障害の1つの指標となるが、本発明のもう1つの実施形態はin vivoにおけるコラーゲン分解をモニタリングするためのアッセイを提供することである。よって、本発明はコラーゲンの分解、すなわち、本タンパク質の分解によって生じるコラーゲン断片を生物学的サンプル内での定量するのに有用な試験キットを含む。このキットは少なくとも1つの免疫学的結合パートナー、例えば、本タンパク質の分解によって生じるペプチドまたは完全な形態の本タンパク質に特異的であり、かつ検出可能なマーカーと結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体を含んでなる。コラーゲン分解はイムノアッセイをはじめとするいずれかの好適な方法により、血漿、血清または血液で効率的に測定することができる。その結果、被験体の症状を継続的にモニタリングすることができ、さらに病理学的サンプルで測定したコラーゲン断片の定量値を正常な個体の生物学的サンプルの該値と比較することができる。
【０８０３】
この実施形態では、このようなアッセイの適用はこれらまたはその他の症状を治療するために施される治療法の経過をモニタリングするために利用することができる。さらに、毒性物質の投与は多くの場合、組織破壊という結果を招くため、このアッセイは毒性測定として使用できる。また、新薬の臨床試験期間にこれらの薬剤のコラーゲン代謝に及ぼす影響を評価するためにも使用できる。よって、このアッセイは、症状、治療、または被験体に直接投与されるもしくは被験体が環境下で曝される物質の影響の指標としてコラーゲン組織の代謝状況が使用できる、あらゆる状況に適用し得る。
【０８０４】
また、この実施形態では、本発明は悪性腫瘍の存在を検出し、かつ／またはその転移の進行をモニターする方法も提供する。実際には、二次的部位、特に組織における腫瘍細胞のさらなる増殖を可能にする転移能は、単独でもまたコラーゲンなどの結合組織エレメントと共同しても作用する種々の細胞表面接着分子によってプラスの影響もまたマイナスの影響も受け得る。本発明は、本タンパク質または特異的に結合するいずれかのコラーゲン型に特異的であり検出可能なマーカーと結合する特定のモノクローナルまたはポリクローナル抗体と、生物学的サンプルを接触させる工程を含んでなる、生物学的サンプル中で本タンパク質または特異的に結合するいずれかの型のコラーゲンを定量するのに有用な試験キットを含む。その結果、患者の症状を継続的にモニタリングすることができ、さらに病理学的サンプルで測定したこのようなタンパク質の定量値を正常な個体の生物学的サンプルの該値またはその患者のこれまでの分析結果と比較することができる。
【０８０５】
コラーゲンの過剰産生および沈着によって繊維症が起こり、さらにそのために罹患した器官および組織の正常な機能が低下する。心臓発作後の心臓のポンプ能を低下させる瘢痕組織の形成を含む、繊維症の例が多数ある。糖尿病は腎機能の進行性喪失を引き起こす腎臓における損傷／瘢痕形成の原因となることが多い。術後においても、瘢痕組織は内部器官相互間に生じて拘縮、痛み、および時として不妊症を引き起こす。よって、本発明はコラーゲン蓄積、特に本タンパク質の蓄積を抑制することによって治癒遅延を避ける方法を提供する。本タンパク質のレベルは、アンチセンス分子またはリボザイムを用いるといった多くの方法のうち任意のものを用いて抑制するまたは低下させることができ、あるいは、本タンパク質の活性は、本タンパク質の直接もしくは間接的阻害剤分子または本タンパク質に対するアンタゴニスト抗体を用いて抑制することができる。また、本タンパク質の発現または活性の阻害は、急性繊維症(傷害をはじめとする種々の外傷、感染症、手術、火傷、放射線、化学療法による)の治療において、または、最も一般的な罹患器官(心臓、肝臓、腎臓、肺、眼および皮膚)の、例えば、ウイルス感染、糖尿病、高血圧もしくはその他の慢性症状に起因する慢性繊維症の治療においても有用である。
【０８０６】
もう1つの実施形態では、本発明は抗しわ活性を有する皮膚用クリームなどの化粧用組成物の製造に有用である。また、美容用途としては、眉アップリフト後のコラーゲン懸濁物の注入により組織サイズを拡大するための、口唇の拡大、および顔面、眉間皺線および座瘡瘢痕の矯正のための皮膚のインプラントとしての本発明の使用も含む。本タンパク質は、美容整形(抗しわ)において組織サイズを拡大するための皮膚のインプラントとして注入可能な生物材料として使用できる。本発明のタンパク質は、生物材料の早期拒絶または完全な不全を招く可能性がある異物応答を発現することなくその特定の役割を果たすのに十分に長く体内に存続するその能力によって理想的な生物材料であり続ける。これらの組成物は、精製した本タンパク質と、所望により、他の型の1種以上のコラーゲンまたはコラーゲン誘導体を含んでよい。これらの成分全ては天然源から調製してもよいし、あるいは組換え遺伝子工学技術および／または化学修飾によって作製してもよい。
【０８０７】
また、本発明は、食物材料としての種々の用途にも使用できる。ウシコラーゲンなどの汎用の様々なウシ由来製品からのウシ海綿状脳症のヒトへの伝播の危険性がいまだ解明されていないため、ウシ由来製品に代わる代替製品が必要である。そのため、本発明のもう1つの利点はそれが動物由来のコラーゲンではなくヒトコラーゲンであるという事実によって得られる。これは通常ソーセージなどの食品のケーシングを作製するために有用であるが、本発明は獣肉、魚肉、甲殻類、および、イクラなどの魚卵、チーズ、めん類をはじめとするいずれのタイプの材料にも適用可能である。さらに、結合食品(bound food)の十分な結合強度を得るのに不可欠であると当技術分野では考えられてきたカゼインの代わりの結合剤成分として本タンパク質が使用できる。よって、上記タンパク質にアレルギー性の消費者が、本発明を添加して製造した結合食品はアレルギー反応を起こすおそれなく楽しむことができる。また、本発明の使用はペットフード(例えば、イヌまたはネコ用)にも有望であり、これを動物栄養に従来使用される固形製品、例えば、肉もしくは魚肉片、ならびに／または押出成形シリアルおよび／もしくは押出成形タンパク質と組み合わせるとさらに有望であり得る。このような実施形態では、本発明は、限定されるものではないが、流動状態の混合物として、または、ゲル状態の混合物として、凍結乾燥状態、または沈降塩状態などで輸送可能である。
【０８０８】
もう1つの実施形態では、本タンパク質は、損傷した組織を再生させるまたは置換するために組織工学における生物材料として使用できる。よって、本発明は、修復するまたは再生させることができない組織または器官自体の形成のための種々の臨床的適用を提供する。これは、例えば、骨再生を促進する、腱、靭帯または軟骨を修復する、血管または心臓弁を形成する、歯科インプラントを作製するためだけでなく、火傷、慢性的に不安定な瘢痕の皮膚置換、遺伝的、外傷的または腫瘍学的理由による皮膚の欠損後、または角膜再構築においても使用できる(例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Atala,(2000) J Endourol Feb;14(1):49-57; Schwartzmann(2000) Implant Dent 9(1):63-6; Machensら(2000) Cells Tissues Organs 167(2-3):88-94を参照)。本発明はin vivoにおける移植または埋め込みなどの目的のための三次元哺乳動物組織の培養に適しており、かつ人工器官補助装置の主たる構成要素として適している。また、幹細胞、例えば多能性細胞、（これは、好適な環境、例えば本タンパク質を含む環境によって刺激されて種々の組織(筋肉、軟骨、皮膚、骨など)に分化し得る細胞である）を必要とする方法も提供される。例えば、幹細胞をin vitroにおいて増殖させ、さらにコラーゲンゲルマトリックスに懸濁して複合材料を形成することができる。得られた複合材料は、移植片として欠損部(gap defect)に埋め込まれ、これがin vivoにおける再構築後に宿主細胞とともに定着するようになって正常な機能構築を再現すると思われる。この実施形態では、これらの代替物がヒト組織の応答および治癒機構をより理解するための毒性検査用in vitroモデルとしての役目も果たし得る。
【０８０９】
配列番号60のタンパク質(内部表示クローン422353_145-11-3-0-E7-F)
配列番号59のcDNAは、配列:
MCFPKVLSDDMKKLKARMHQAIERFYDKMQNAESGRGQVMSSLAELEDDFKEGYLETVAAYYEEQHPELTPLLEKERDGLRCRGNRSPVPDVEDPATEEPGESFCDKVMRWFQAMLQRLQTWWHGVLAWVKEKVVALVHAVQALWKQFQSFCCSLSELFMSSFQSYGAPRGDKEELTPQKCSEPQSSKを含んでなる配列番号60のタンパク質をコードする。よって、本願明細書中に記載される配列番号60のポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン422353_145-11-3-0-E7-Fに含まれる核酸によりコードされるポリペプチドについても当てはまることが理解されよう。さらに、本願明細書中に記載される配列番号59の核酸の全ての特徴および用途はクローン422353_145-11-3-0-E7-Fに含まれる核酸についても当てはまることが理解されよう。本発明のある好ましい実施形態は、配列番号59、配列番号60およびクローン422353_145-11-3-0-E7-Fの組成物に関する。また、本明細書に記載のような生物学的活性を有するポリペプチド断片およびそれらの断片をコードするポリヌクレオチドも好ましい。
【０８１０】
配列番号60のタンパク質(NK5)はヒトナチュラルキラー細胞タンパク質4前駆体(NK4)(Genbank受託番号M59807)の新規スプライシング変異体である。NK5は170〜172位にRGD細胞-接着配列を示す188アミノ酸長のタンパク質である。163〜187位に位置するエピトープは、このRGDモチーフと部分的に重複する。NK5は148〜168位に推定膜貫通ドメインを有する。また、NK5はNK4とは異なり、シグナルペプチドを有していない。NK4 cDNAは6つのエキソンからなる(Bernotら, Genomics 50:147-60(1998))が、一方のNK5 cDNAは7つのエキソンからなる。NK4およびNK5についてのエキソン1および2は同一であり、さらにNK5のエキソン5、6および7はNK4のエキソン4、5および6と同一である。NK5のエキソン3はNK4のエキソン3よりも短く、さらにエキソン4はNK5独自のものである。
【０８１１】
NK4遺伝子発現は遍在的である(Bernotら, Genomics 50:147-60(1998))。それでもなお、その発現は、有糸分裂促進物質-活性化T細胞およびIL-2-活性化ナチュラルキラー細胞(Dahlら, J. Immun. 148:597-603(1992))により大幅に増大される。
【０８１２】
ナチュラルキラー(NK)細胞およびT細胞はサイトカイン産生および直接細胞傷害活性の両方によってもたらされる抗感染、抗新生物、および免疫調節作用を提供する。特に、NK細胞は、体内の癌細胞の予防および除去、多種のウイルス(ヘルペスおよび麻疹など)の除去において主要な役割を果たし、さらに、子宮内膜症を有する女性ではその存在のレベルが低いことが分かっている。さらに、これらの明らかな免疫防御作用の他に、NK細胞は様々な恒常性維持作用、特に造血調節にも関与し、さらにそれらには胎盤形成の維持および進行で果たす重要な役割があると考えられる。これらの様々な状況におけるNKおよびT細胞の挙動は正および負のシグナルを送る多数の異なる受容体によって調節される。静止状態のNKおよびT細胞が刺激されると、細胞傷害機構を活性化し得る多数の表面分子を発現する。これらのシグナルのバランスによって、NKまたはT細胞が何も行わないか、または活性化されて増殖するか、死滅するか、もしくは種々のサイトカインおよびケモカインを分泌するかどうかが決定される。さらに特に、IL-2は標準または「天然」の抗腫瘍細胞傷害性、抗体依存性細胞傷害活性(ADCC)、増殖、およびサイトカイン産生をはじめとする多くのNK細胞機能を活性化し(Trinchieri, Adv. Immunol. 47:187-376(1989))、さらにIL-2-活性化NK細胞は、ヒトおよびマウス腫瘍標的細胞に対してより広範な反応性を示す。多くのタンパク質に見られるRGDモチーフが細胞接着に関係していることが分かってきた。十分な活性化にはNK細胞の足場が必要であること(Liら, J Immunother 20:123-30(1997))、および長期活性化NK細胞が新たな接着特性を獲得することが明らかになっている。このことから免疫応答の調節におけるRGD認識に関する中心的な役割が示唆される。
【０８１３】
NK5遺伝子の発現は、IL2-活性化NK細胞および有糸分裂促進物質活性化T細胞によって非常に増大することから、リンパ球活性化において重要な役割を果たすと考えられる。特に、NK5は活性化リンパ球によって獲得される新たな接着力に関係していると思われる。NK5はシグナルペプチドを示さないため、NK5はこのプロセスではNK4とは異なる役割を果たすと考えられる。
【０８１４】
本発明のある実施形態は、活性化T細胞および／または活性化NK細胞を選択的に検出するか、および／またはこれを定量するためにNK5またはその断片をマーカーとして使用する方法に関する。NK5の存在、レベル、または活性を検出するいずれかの方法をかかる方法に用いることができる。例えば、本発明のタンパク質またはその断片は標準的方法を用いて特異的抗体を作製するために用いればよい。かかる抗体はNK細胞またはT細胞内の本タンパク質のレベルを検出するために用いることができ、細胞内での静止状態のT細胞またはNK細胞における対照レベルよりも高レベルで本タンパク質が検出されると、細胞が活性化されていることを示す。好ましくは、抗体は直接または間接的に標識されて、NK4などの関連タンパク質よりもNK5と特異的に結合する。あるいは、本発明の核酸またはその断片は、当業者に公知のいずれかの技術を用いて特定のプローブを合成するために用いればよい。次ぎに、このような抗体および／またはプローブは、例えば、体液、組織サンプルおよび哺乳類細胞培養物内の活性化T細胞および／または活性化NK細胞の検出および／または定量用のアッセイおよび診断キットにおいて用いればよい。
【０８１５】
ある好ましい実施形態では、例えば、特異的抗体および／またはプローブを用いるなどの、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドのかかる検出方法は、哺乳類細胞培養物のT細胞および／またはNK細胞活性に対する試験化合物の影響を測定するために用いることができる。もう1つの好ましい実施形態では、かかる方法は、患者のT細胞および／またはNK細胞活性を増大もしくは低下させること、または患者における移植片拒絶反応の開始を検出することを目標にした治療の効果をモニターするために用いることができる。
【０８１６】
本発明のもう1つの実施形態は、T細胞および／またはNK細胞活性化により起こる疾患および障害の治療または予防のために、患者のNK5の発現または活性を阻害するための組成物および方法に関する。T細胞および／またはNK細胞活性化の阻害および／または低下は任意の好適な方法を用いて、例えば、治療上有効な量の、NK5またはその断片を特異的に認識する抗体の患者への投与によって達成され得る。好ましくは、抗体は、RGDドメインと重複するエピトープを認識する。抗体は単独でまたは当技術分野で公知の1種以上の薬剤、例えば、その他の免疫抑制剤と組み合わせて投与することができる。抗体の投与は、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,817,311号に記載されるものをはじめとする当技術分野で公知のいずれかの方法に従って行うことができる。使用できる他のNK5発現または活性阻害剤としては、限定されるものではないが、アンチセンス分子、リボザイム、ドミナントネガティブ型のNK5、および細胞内でのNK5の活性または発現を低下させる化合物が挙げられる。このような化合物は、例えば、NK5を発現する、またはNK5を発現し得るT細胞またはナチュラルキラー細胞に対する試験薬剤をスクリーニングし、ナチュラルキラー細胞もしくはT細胞活性化を阻害する、または試験薬剤のNK5発現レベルを低下させる能力を検出することによって容易に同定することができる。T細胞および／またはNK細胞活性化によって起こる疾患および障害としては、限定されるものではないが、アレルギーおよび喘息が挙げられ、さらに、この方法は進行中の免疫応答を阻止するおよび／または抑制するための治療においても使用できる。さらに特に、このような治療は重大な移植片拒絶を予防する、もしくは抑制する、もしくは軽減するために、または移植片の移植に対する耐性を誘導するために用いられる。このような移植としては、例として、限定されるものではないが、細胞、骨髄、組織、固形臓器、骨などの移植が挙げられる。また、かかる治療は重大な移植片対宿主病および、例えば、限定されるものではないが、慢性関節リウマチ、全身性狼瘡、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、肝炎、慢性関節リウマチ、グレーブス病などが挙げられる自己免疫疾患を予防するまたは軽減するためにも用いられる。
【０８１７】
本発明のもう1つの実施形態は、例えば、NK5もしくはその断片、タンパク質をコードするポリヌクレオチド、またはNK5の発現もしくは活性を増大させる化合物を含む組成物および方法に基づくNKおよび／もしくはT細胞の活性化ならびに／または不活性化の阻害に関する。このような化合物は、例えば、NK5を発現する、またはNK5を発現し得るT細胞またはナチュラルキラー細胞に対する試験薬剤をスクリーニングし、ナチュラルキラー細胞もしくはT細胞活性化を増大させるか、またはNK5発現レベルを増加させる試験薬剤の能力を検出することによって容易に同定することができる。T細胞および／またはNK細胞活性化によって治療し得る、かつ／または重篤度を軽減し得る疾患および障害としては、限定されるものではないが、腫瘍、ウイルス感染、炎症、または免疫不全、細菌感染、肝機能異常、肝再生、造血ならびに胎盤形成の維持および進行に関連する症状が挙げられる。さらに特に、かかる治療は、増殖性疾患(白血病、リンパ腫、肉腫、黒色腫、腺腫、固形組織内の癌、低酸素腫瘍、扁平細胞腫、泌尿生殖器癌、造血器癌、頭頸部癌、および神経系癌などの種々の形態の癌、乳頭腫などの良性病変、アテローム性動脈硬化症、血管形成など)、ウイルス感染(特に、HBV、HCV、HIV、肝炎、麻疹およびヘルペスウイルス感染、ならびにその他のウイルス誘発性感染)、およびその他の種々の免疫不全症を治療するために用いられる。これらの免疫不全症は、遺伝性のもの(例えば、慢性関節リウマチおよび変形性関節症ならびに重症複合型免疫不全症(SCID))、または種々の細菌または真菌感染(例えば、マイコバクテリア、リーシュマニア種、マラリア種およびカンジダ感染)によって起こるものでもよい。もちろん、NK5は、一般に免疫系を刺激することが望まれると考えられる場合、すなわち、癌治療の際の放射線療法または化学療法においても有用である。NK5またはその断片は、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,245,563号および同第6,197,302号に記載される方法等の、単独でまたはNKおよび／もしくはT細胞を活性化し得るその他の公知の薬剤と組み合わせて投与することができる。
【０８１８】
配列番号62のタンパク質(内部表示クローン500715621_204-15-3-0-C6-F)
クローン500715621_204-15-3-0-C6-FのcDNA(配列番号61)はアミノ酸配列:
MELWGAYLLLCLFSLLTQVTTEPPTQKPKKIVNAKKDVVNTKMFEELKSRLDTLAQEVALLKEQQALQTVCLKGTKVHMKCFLAFTQTKTFHESSEDCISRGGTLSTPQTGSENDALYEYLRQSVGNEAEIWLGLNDMAAEGTWVDMTGARIAYKNWETEITAQPDGGKTENCAVLSGAANGKWFDKRCRDQLPYICQFGIVを含んでなる配列番号62の202アミノ酸長のポリペプチドをコードする。よって、本願明細書中に記載される配列番号62のポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン500715621_204-15-3-0-C6-Fに含まれる核酸によりコードされるポリペプチドについても当てはまることが理解されよう。さらに、本願明細書中に記載される配列番号61のポリヌクレオチドの全ての特徴および用途はクローン500715621_204-15-3-0-C6-Fに含まれる核酸についても当てはまることが理解されよう。本発明のある好ましい実施形態は、配列番号61、配列番号62およびクローン500715621_204-15-3-0-C6-の組成物に関する。また、本明細書に記載のような生物学的活性を有するポリペプチド断片およびそれらの断片をコードするポリヌクレオチドも好ましい。
【０８１９】
配列番号62のタンパク質はアラニン残基がセリン残基で置換される94位のアミノ酸置換を有する新規変異型ヒトテトラネクチン前駆体ポリペプチド(SwissprotエントリーP05452)に相当する。配列番号62のタンパク質は21個のアミノ酸からなるシグナルペプチドと、その後に続く本発明の成熟ポリペプチド、プラスミノーゲン担体タンパク質(PLCP)に相当する181個のアミノ酸からなる配列を含んでなる202アミノ酸長のポリペプチドである。
【０８２０】
PLCPは血漿に存在する68キロダルトンのホモ三量体プラスミノーゲン結合タンパク質である。プラスミノーゲンの他、PLCPはカルシウム、ならびにヘパリン、コンドロイチンおよびフコイダンといった多数の硫酸化多糖と結合する。また、これはアポリポタンパク質Aおよびフィブリンも結合する。
【０８２１】
一次および三次構造においては、このタンパク質は、炭水化物、脂質およびタンパク質をはじめとする広く多様な化合物に結合するタンパク質、Ca(2+)結合C型レクチンのファミリーに関連している。
【０８２２】
このタンパク質は3つの機能的ドメインに対応する3つのエキソンによってコードされる。エキソン3(配列番号61のnt367〜nt771位)はCa(2+)およびプラスミノーゲン結合に関与する糖鎖認識ドメイン(CRD)とも呼ばれる長鎖C型レクチンドメイン(配列番号62のaa77〜aa198位)をコードする。エキソン2(nt268〜nt366位)はα-ヘリックスドメインをコードし、該ドメインは三重らせんコイルドコイル構造エレメントの構築によるPLCPオリゴマーの三量体形成を支配する。最後に、エキソン1(nt13〜nt267位)によってコードされる残基はCRDに結合しないが、ヘパリンに結合することから、硫酸化糖質リガンド結合にこのドメインが果たす特別な役割が示される(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Lorentsenら 2000, Biochem. J. 347, 83-87)。
【０８２３】
PLCPはプラスミノーゲンの第4のクリングルドメインとの特異的な相互作用を通じてそのCRDを介してプラスミノーゲンに結合する。結合が組織型プラスミノーゲンアクチベーターによるプラスミノーゲンのプラスミンへのタンパク質分解的活性化を促進することは報告されている。プラスミノーゲン活性化がフィブリン溶解、細胞移動、血管形成、腫瘍細胞浸潤、炎症、創傷治癒、および組織再構築をはじめとする種々の細胞外タンパク質分解事象に関与することから、PLCPはこれらの生物学的プロセスの調節において有用である。
【０８２４】
本タンパク質はヒト血液から単離されるが、種々の組織の細胞外マトリックス内に沈着することも分かっている。特に、PLCPは乳房、結腸、および卵巣腫瘍の腫瘍周囲基質内に沈着する。また、皮膚黒色腫損傷の浸潤先端部にプラスミン／プラスミノーゲンとともに局在することが分かっているが、対応する正常組織ではPLCPはほとんどまたは全く見られない。血漿PLCPレベルは癌患者では低くなり、PLCPは特定種の癌の診断用予後マーカーとしても有用である。
【０８２５】
以下に記載の方法において用いるために好ましいPLCPポリペプチドとしては、
アミノ配列:EPPTQKPKKIVNAKKDVVNTKMFEELKSRLDTLAQEVALLKEQQALQTVCLKGTKVHMKCFLAFTQTKTFHESSEDCISRGGTLSTPQTGSENDALYEYLRQSVGNEAEIWLGLNDMAAEGTWVDMTGARIAYKNWETEITAQPDGGKTENCAVLSGAANGKWFDKRCRDQLPYICQFGIVを含んでなるポリペプチド;
アミノ酸配列:VCLKGTKVHMKCFLAFTQTKTFHESSEDCISRGGTLSTPQTGSENDALYEYLRQSVGNEAEIWLGLNDMAAEGTWVDMTGARIAYKNWETEITAQPDGGKTENCAVLSGAANGKWFDKRCRDQLPYICQFGIVを含んでなるポリペプチド;
アミノ酸配列:VHMKCFLAFTQTKTFHESSEDCISRGGTLSTPQTGSENDALYEYLRQSVGNEAEIWLGLNDMAAEGTWVDMTGARIAYKNWETEITAQPDGGKTENCAVLSGAANGKWFDKRCRDQLPYICQを含んでなるポリペプチドが挙げられる。
【０８２６】
ある実施形態では、配列番号62の94位においてアラニン残基がセリンで置換される438位にGのTへの置換を有する配列番号61のcDNAはDNA遺伝子型判定に用いられる。実際には、この遺伝子座の遺伝子型判定は父子鑑定または法医学的分析のためのDNA指紋法において興味深いものであり得る。また、これは遺伝的関連調査のために、特に凝固障害に関する病理学においても用いることもできる。
【０８２７】
もう1つの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド配列は患者の症状または疾患の治療に理想的な薬剤(例えば、凝固または抗凝固薬)、または薬剤の投与量の選択を助けるために遺伝薬理学的用途において用いられる。例えば、ある実施形態では、本発明は患者の遺伝子型判定をして配列番号62の438位のアミノ酸をコードするヌクレオチドを同定し、さらに438位にセリン残基を有するものにおいて選択的に有効である(例えば、その位置にセリンを有するイソ型のタンパク質との薬剤の選択的な結合による)ことが確立されている薬剤またはある投与量の薬剤を患者に投与する方法を提供する。もう1つの実施形態では、患者は438位のアミノ酸をコードするヌクレオチドの遺伝子型判定がなされて、例えば、438位にセリンを有する個体への薬剤の投与には副作用が伴うことが分かっていることから、薬剤は患者への投与が望ましくないと判断される。
【０８２８】
もう1つの実施形態では、本タンパク質は生物学的サンプル、好ましくは肝細胞抽出物からプラスミノーゲンを同時精製するために用いられる。これは当技術分野で公知である多くの方法のいずれかを用いて達成される。例えば、プラスミノーゲンは配列番号62のタンパク質についてのアフィニティーカラムクロマトグラフィーを用いてまたは本発明のタンパク質を特異的に結合するモノクローナルもしくはポリクローナル抗体を用いた同時免疫精製により精製される。精製プラスミノーゲンは治療用フィブリン溶解組成物の製造をはじめとする数多くの用途において有用である。
【０８２９】
さらなる実施形態では、本タンパク質は細胞抽出物から1つ以上のクリングルドメインを有するタンパク質を精製するための方法であって、無傷CRDドメインを保持する本タンパク質の断片、好ましくはCRDドメイン自体に限定される断片を用いて、例えばアフィニティークロマトグラフィーなどの方法によりクリングルドメイン含有タンパク質を精製することを含んでなる方法を提供する。好ましくは、精製されるタンパク質は、プラスミノーゲン、アンギオスタチン、トロンビン、肝細胞増殖因子、マクロファージ刺激タンパク質およびアポリポタンパク質Aからなる群から選択される。本方法を用いて精製されるタンパク質はあらゆる起源由来、例えば、無脊椎動物、酵母または細菌異種発現系を用いてin vitro発現されるタンパク質である。
【０８３０】
もう1つの実施形態では、本タンパク質はin vivoまたはex vivoにおけるプラスミノーゲンの局在性を調べるための方法を提供する。このような方法では、組織切片を標識した配列番号62のタンパク質と接触させ、その後、組織切片上の標識を検出する。また、本発明のタンパク質を用いてプラスミノーゲンを未精製の細胞または組織抽出物から直接検出することもできる。タンパク質の標識方法は当技術分野で周知のものであり、任意のものを本発明において用いてよい。
【０８３１】
もう1つの実施形態では、配列番号62のタンパク質は個体の血液中のプラスミノーゲンの循環レベルを調べるために用いられ、この方法は血液サンプルからプラスミノーゲンを同時精製する(例えばアフィニティーカラムクロマトグラフィー等による)ために本発明のタンパク質を用いて個体から血液サンプルを準備し、さらに当技術分野で周知の方法、例えば、ELISA、ウエスタンブロットまたは放射免疫検定法(RIA)を用いてサンプル内のプラスミノーゲンのレベルを測定することを含んでなる。循環血液中のプラスミノーゲンレベルの測定は、凝固能の低下またはフィブリン溶解に関連する疾患を有する患者のモニタリングにおいて特に興味深いものであり得る。
【０８３２】
もう1つの実施形態では、本タンパク質は、乳癌、卵巣癌、結腸または結腸直腸癌の診断または予後マーカーとして用いられ、この方法は患者由来の血液サンプル、好ましくは血清サンプルを本タンパク質に対する抗体と接触させ、さらに健康な患者の対照レベルと比較したサンプル内のPLCPのレベルを調べることを含んでなり、対照レベルと比較した患者サンプル内のPLCPレベルの低下が患者が疾患を有すること、疾患を発症させる危険性が高いこと、または正常なレベルのタンパク質を有する患者より予後が悪いことを示す。用いる抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれかであり、さらに免疫複合体の定量化のために当業者に周知の方法により直接または間接的に標識される。
【０８３３】
もう1つの実施形態では、本タンパク質は配列番号62のタンパク質の無発現または発現低下によるフィブリン溶解活性異常を有するトランスジェニック動物、好ましくは哺乳類、さらに好ましくは齧歯類を提供する。このようなトランスジェニック動物は、フィブリン溶解能の低下に関連する病変、特に繊維症および血栓症の研究するための有力なモデルを提供する。さらに、このような動物は候補分子を凝固または繊維症を阻害する能力についてスクリーニングするために用いられる。
【０８３４】
PLCP発現もしくは活性が低下したまたは消失したトランスジェニック動物は、例えば、マウスでの、受精卵へのDNAマイクロインジェクションまたは胚幹細胞のトランスフェクションを用いたPLCP遺伝子ノックアウトによるといった多くの方法のいずれかを用いて作出される。また、本タンパク質の低レベルな発現は、例えば、配列番号62のタンパク質をコードするヌクレオチドの逆配列を強力なプロモーター配列の制御下に置くことによるアンチセンス方法を用いて達成される。好ましくは、調節可能および遍在性プロモーター配列がひとたび動物に導入された遺伝子構築物の発現を時間制御するために用いられる。本方法における使用に好適なその他の方法としては、リボザイム、抗体、およびドミナントネガティブ型の本タンパク質の使用が挙げられる。
【０８３５】
もう1つの実施形態では、本タンパク質は、個体におけるフィブリン溶解を高めるための方法であって、該個体にプラスミノーゲン活性化を高めるのに十分な量の本タンパク質を投与することを含んでなる方法を提供する。本タンパク質は静脈注射による等の多くの方法のいずれかで投与される。このような方法は、限定されるものではないが、卒中または肺塞栓症をはじめとする心臓血管疾患の予防または治療において血栓を消滅させるために用いられる。
【０８３６】
配列番号64のタンパク質(内部表示クローン165843_116-008-4-0-G4-F)
クローン165843_116-008-4-0-G4-FのcDNA(配列番号63)はアミノ酸配列:
MTVLEITLAVILTLLGLAILAILLTRWARRKQSEMHISRYSSEQSARLLDYEDGRGSRHAYSTQSERSKRDYTPSTNSLALSRSSIALPQGSMSSIKCLQTTEELPSRTAGAMSKFFFCPLILMCFALLNCを含んでなる配列番号64の新規なカルパスタチン1(NC1)タンパク質をコードする。よって、本願明細書中に記載される配列番号64のポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン165843_116-008-4-0-G4-Fに含まれる核酸によりコードされるポリペプチドについても当てはまることが理解されよう。さらに、本願明細書中に記載される配列番号64のポリヌクレオチドの全ての特徴および用途はクローン165843_116-008-4-0-G4-Fに含まれる核酸についても当てはまることが理解されよう。本発明のある好ましい実施形態は、配列番号63、64およびクローン165843_116-008-4-0-G4-Fの組成物に関する。また、本明細書に記載の生物学的活性を有するポリペプチド断片およびそれらの断片をコードするポリヌクレオチドも好ましい。
【０８３７】
NC1はカルパインの生理学的阻害剤である。カルパインは遍在性Ca2+活性化細胞質内プロテアーゼ群であり、膜関連およびアクチン関連細胞骨格タンパク質の部位特異的調節的タンパク質分解およびアポトーシスに関連する細胞骨格再構築事象、細胞接着、形態変化、および移動性に関与するとされてきた[Beckerleら, Cell 51:569-577, 1987; Yaoら, Am. J. Physiol. 265(pt. 1):C36-46, 1993;およびShusterら, J. Cell Biol. 128:837-848, 1995; Squierら, J. Cell Physiol., 178(3): 311-319, 1999]。また、カルパインは脳および心筋虚血、血小板活性化、NF-kB活性化、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、白内障進行ならびに慢性関節リウマチの病態に関与するともされてきた。細胞接着、細胞骨格再構築事象および細胞移動性は多数の病変と関係があるため、カルパインの阻害剤には大変興味がもたれる(Wangら, Trends in Pharm. Sci. 15:412-419, 1994; Mehdi, Trends in Biochem.  Sci. 16:150-153, 1991)。さらに、カルパイン／カルパスタチン系はいくつかの細胞種の膜融合事象に関与しており、さらにカルパインは特異的抗血清を用いたウエスタンブロット法によりヒト精子および精巣抽出物で検出することができるため、tCASTはカルシウムにより媒介される受精に必要な先体反応においてカルパインを調節すると考えられる(Li Sら, Biol Reprod, 63(1):172-8, 2000)。
【０８３８】
NC1は独特のN末端ドメイン(ドメインL)および4つのプロテアーゼ-阻害剤反復ドメイン(ドメイン I-IV)を有する(Lee WJら, J Biol Chem, 267(12):8437-42, 1992)。配列番号64のタンパク質はカルパスタチンドメインTおよびIIを有する。Tドメインは細胞質内局在および膜結合を目的とするが、一方、ドメインIは核局在機能を示す。
【０８３９】
NC1は膜およびアクチン関連細胞骨格タンパク質の部位特異的調節的タンパク質分解による細胞骨格再構築事象、細胞接着、形態変化および移動性において作用する。本発明の好ましいポリペプチドは配列番号64の1〜116位のアミノ酸を含んでなるポリペプチドである。また、本明細書に記載のような生物学的活性を有する配列番号64の断片およびそれらの断片をコードするポリヌクレオチドも好ましい。
【０８４０】
本発明のある実施形態は、体液、組織サンプルまたは哺乳類細胞培養物などの生物学的サンプル内のカルパインの存在を検出するためのアッセイにおいて本発明のタンパク質またはその断片を用いる方法に関する。NC1はカルパインに結合する(Murachi, Biochemistry Int., 18(2)263-294, 1989)ため、本発明のタンパク質は当業者に公知の技術を用いてカルパインの存在を調べるためのアッセイおよび診断キットにおいて使用できる。好ましくは、本発明のタンパク質またはその断片と異種タンパク質との複合体形成を可能にする条件下で所定量の本発明のタンパク質またはその断片をサンプルに添加し、次に複合体および／または結合していない本発明のタンパク質またはその断片の存在をアッセイし、さらに対照と比較する。NC1は細胞内カルパイン活性化のマーカーとして有用であり、さらにカルパインの病理的状況との関係をモニタリングするために用いることができる(De Tullioら, FEBS letter, 475(1):17-21, 2000)。カルパインは、虚血ならびにアルツハイマー病(Wronskiら, J. Neural transm., 107(2):145-157, 2000)およびパーキンソン病(Mouatt-Prigentら, J. Comp. Neurol., 419:175-92, 2000)のような疾患の病態、脊髄損傷(SCI)ラットの神経細胞アポトーシス(Ray, Brain res., 867(1-2):80-9, 2000)、細胞可溶性(Kosowerら, Methods Mol Biol., 144:181-94, 2000)ならびにその他の病態生理学に関係する細胞骨格タンパク質分解に関連する。そのため、細胞内でのカルパインレベルの増加または減少を検出するアッセイは、これらの疾患または症状のいずれかの診断において有用である。さらに、最近の研究により、カルパイン-カルパスタチン系は、細胞骨格タンパク質およびその他の細胞調節タンパク質に対するタンパク質分解活性に加え、構造タンパク質または調節タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルにも作用し得ることが分かっている(Chenら, Am. J. Physiol. Cell Physiol, 279:C709-C716, 2000)。よって、NC1およびカルパインレベルを検出する能力はさらに多くの疾患および症状の診断においても有用である。
【０８４１】
もう1つの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、特異的抗体および核酸プローブの使用に関連するものをはじめとする当業者に公知のいずれかの技術を用いた配偶子、配偶子前駆体細胞(精子形成幹細胞など)、または配偶子内の特異的構造の検出のために使用することができる。一般には精子、または特に精子先体を可視化する能力は患者の不妊症の分析用といった多くの用途において明らかに有用性がある。
【０８４２】
本発明のもう1つの実施形態は、細胞内のカルパインを阻害する方法であって、細胞内のカルパインを阻害するのに十分な量の本タンパク質を細胞に投与することを含んでなる方法に関する。このような方法は、in vitroまたはin vivoにおいて実施することができる。カルパインの阻害は種々の疾患および症状、例えば、脳、心筋、腎虚血、血小板活性化、NF-κB活性化、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋ジストロフィー、白内障進行、癌悪液質および慢性関節リウマチの病態の治療または予防において多数の使用法がある。このような増加は、限定されるものではないが、精製した本発明のタンパク質を細胞に直接投与する、細胞をプロモーターに機能し得る形で連結されたタンパク質をコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトする、さらに本発明のタンパク質の活性または発現を増強する化合物を細胞に投与するといった多くの方法のいずれによってもたらされる。さらに、本発明のタンパク質の発現または活性化は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗体、ドミナントネガティブ型タンパク質の使用、およびタンパク質の発現または活性化を低下させる異種化合物の使用といった数多くの方法のいずれによっても阻害できる。このような化合物は、例えば、いずれかの標準的アッセイを用いて候補化合物をスクリーニングし、さらにタンパク質の発現または活性のレベルを検出することにより容易に同定することができる。また、本タンパク質と併用することができる、またはさらなるカルパスタチン阻害剤またはアクチベーターの同定において対照として使用することができるその他のカルパイン阻害剤も知られている。このような阻害剤としては、限定されるものではないが、セレブロリシン(Wronskiら, J. Neural Transm. Suppl., 59:263-272, 2000)、E-64-D(Rayら, Brain Res., 867(1-2): 80-9, 2000)、およびカルパイン活性部位阻害剤N-アセチル-ロイシル-ロイシル-ノルロイシナール(Squierら, J. Cell Physiol., 178(3): 311-319, 1999)が挙げられる。
【０８４３】
さらにもう1つの実施形態では、配列番号64のタンパク質またはその断片は細胞のアポトーシスを阻害するために用いることができる。特に、細胞内での本タンパク質のレベルまたは活性を高めるすべての方法がin vitroまたはin vivoにおける細胞のアポトーシスを阻害するために用いることができる。例えば、配列番号64のタンパク質、またはそのいずれもの断片もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドを、例えば、ベクターにより細胞に導入することができ、それによりタンパク質が細胞内で発現される。あるいは、配列番号64のタンパク質自体を、好ましくは該タンパク質の細胞内取り込みを誘導する製剤に含まれる形で細胞に投与することができる。また、細胞内でのタンパク質の発現または活性化を増強するあらゆる化合物を投与することもできる。細胞のアポトーシスの阻害は、限定されるものではないが、増殖中の培養細胞の死滅の防止、種々の疾患のいずれかの患者の該疾患に関与するアポトーシスの阻害、または化学療法などの細胞ストレスのレベルを上昇させる治療を受けている患者の細胞のアポトーシスの阻害等の多くの用途において使用できる。さらに、本発明は、限定されるものではないが、異常細胞増殖および／またはプログラム細胞死を特徴とする疾患（癌、免疫不全症候群(AIDSなど)、I型糖尿病、病原性感染、心臓血管および神経外傷、脱毛、老化、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、ジストニー、レーバー遺伝性視神経症、統合失調症などの変性疾患、ならびに「高乳酸血症および卒中様症状を伴うミトコンドリア脳筋症」(MELAS)および「赤色筋線維の損傷を伴うミオクローヌス癲癇症候群」(MERRF)などの筋変性疾患等）を診断、予防および／または治療するための、本発明のタンパク質またはその断片を用いる方法および組成物に関する。診断用途では、本発明のタンパク質の発現をノーザンブロット法、RT-PCRまたは免疫ブロット法などのいずれかの方法を用いて検出し、さらに対照個体における発現と比較することができ、対照レベルと比較した本タンパク質のレベルの増加または低下が、疾患または症状、または疾患または症状の傾向を示す。細胞増殖の低減および／もしくはアポトーシスの増加が必要な疾患の予防ならびに／または治療用途においては、例えば、精製したタンパク質を細胞に投与するか、細胞をタンパク質をコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトするか、またはタンパク質の発現または活性を増強する化合物を細胞に投与するかのいずれかの方法を用いて、本発明のタンパク質の発現を増強するとよい。細胞増殖の増大および／もしくはアポトーシスの低減が必要な疾患の予防ならびに／または治療用途では、三重らせん体およびアンチセンス法などの任意の方法を用いて本発明のタンパク質の内因性発現を阻害するとよい。
【０８４４】
もう1つの実施形態では、本発明のタンパク質の阻害は望ましくない細胞でアポトーシスを誘導するために使用できる。このような阻害は、限定されるものではないが、抗体、アンチセンス配列、ドミナントネガティブ型タンパク質、またはタンパク質の発現または活性の小分子阻害剤の使用といった多くの方法のいずれかで達成することができる。このようなアポトーシス誘導は、望ましくない細胞（例えば患者の癌細胞）、消滅させるために用いることができる。このような阻害剤は、標準的方法を用いて、特異的に患者の望ましくない細胞を標的とすることが好ましい。
【０８４５】
もう1つの好ましい実施形態では、本発明のタンパク質は不妊症の治療または診断、および避妊をはじめとする目的で受精能力を調節および／または解析するために使用できる。NC1は受精に必要な工程である先体反応に関与するため、本タンパク質の過剰もしくは低発現または活性化はこの反応を混乱させることによって受精能力を抑制するために用いることができる。例えば、避妊目的では、タンパク質の発現または活性化を、例えば、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、タンパク質自体を用いて、またはタンパク質発現もしくは活性のアクチベーターを用いてタンパク質レベルを高めることにより、あるいはアンチセンスオリゴヌクレオチド、抗体、ドミナントネガティブ型タンパク質などの阻害剤を用いて、さらにタンパク質発現または活性を阻害する異種化合物を用いてタンパク質レベルを下げることにより人為的に混乱させることができる。同様に、多くの患者の不妊症の原因を本タンパク質の発現レベルを検出することにより突き止めることができ、タンパク質の異常なレベルの活性または発現が不妊症の原因がカルパイン依存性先体反応と関係していることを示す。また、このような診断は、例えば、精子における本タンパク質の発現または活性化を増強するまたは低下させることにより不妊症を治療する方法も提示する。
【０８４６】
もう1つの実施形態では、本発明はサンプル内の配列番号64のタンパク質のレベルを基に、組織、好ましくは精巣を選択的に同定するか、または組織サンプルが由来する可能性のある2種以上の起源を識別するために本発明のタンパク質またはその断片をマーカータンパク質として用いる方法および組成物に関する。例えば、配列番号64のタンパク質またはその断片を本明細書に記載のものをはじめとする当業者に公知のいずれかの技術を用いて抗体を産生させるために使用してもよい。次いで、このような組織特異的抗体を未知の起源の組織、例えば、法医学的サンプル、体の別の部位に転移した分化した腫瘍組織を同定する、または免疫化学を用いて組織断面にある異なる組織種を識別するために用いてもよい。このような方法では、組織サンプルを、抗体結合を容易にする条件下で、検出が可能なように標識し得る抗体と接触させる。試験サンプルとの抗体結合レベルを測定し、さらに精巣または精巣以外の組織由来の対照細胞との結合レベルと比較して試験サンプルが精巣由来であるかどうかを調べる。同様の方法がタンパク質を発現する細胞を特異的に検出するか、ならびにタンパク質を発現する細胞を特異的に単離するか、またはタンパク質自体を単離するために用いることができる。例えば、配列番号64のタンパク質またはその断片に対する抗体をクロマトグラフィーマトリックスなどの固相支持体に固定化してもよい。配列番号64のタンパク質を発現する細胞を含有する調製物を抗体との結合を容易にする条件下で抗体と接触させる。支持体を洗浄後、タンパク質を抗体から解離させる薬剤に支持体を接触させることによりタンパク質を支持体から解放する。
【０８４７】
あるいは、試験サンプル内の配列番号64のタンパク質をコードするRNAのレベルを調べることにより試験サンプル内の配列番号64のタンパク質のレベルを測定してもよい。RNAレベルは核酸アレイ、またはin situハイブリダイゼーション、ノーザンブロット、ドットブロットまたは当業者には一般的なその他の技術等を用いて測定することができる。必要あれば、解析に先立ち、PCR反応などの増幅反応を核酸サンプルで実施してもよい。試験サンプル内のRNAレベルを精巣または精巣以外の組織に由来する対照細胞内のRNAレベルと比較して試験サンプルが精巣由来であるかどうかを調べる。上述の種々の疾患、特に炎症性プロセスに関する疾患では、配列番号64のポリペプチドをコードする遺伝子の発現が特定の組織の細胞種(例えば、癌および受傷組織)もしくは体液(例えば、血清、血漿、滑液、および髄液)またはこのような疾患を有する個体から採取した別の組織の細胞サンプルにおいて、標準遺伝子発現レベル、すなわち、疾患を有していない個体由来の正常な組織または体液での発現レベルと比べてかなり高いまたは低いレベルで通常検出され得る。
【０８４８】
もう1つの実施形態では、本発明は炎症性プロセス、特に、慢性関節リウマチ(RA)、慢性多発性関節炎および関節破壊を特徴とする全身性疾患の指標となる自己抗体を同定するための本発明のタンパク質または断片を用いる方法に関する(これらの場合、カルパスタチンにする自己抗体が高レベルで同定される)。よって、本タンパク質は細胞内での自己抗体の存在および／または局在性を検出するために用いることができる。ある典型的な実施形態では、配列番号64のタンパク質は、限定されるものではないが、蛍光標識、放射性原子、常磁性イオン、ビオチン、化学発光標識または二次的酵素または結合工程を通じて検出可能な標識をはじめとするいずれかの検出可能な部分で標識される。さらに、本発明は炎症性プロセス、例えば、慢性関節リウマチを診断し、さらにこのようなプロセスとその他の疾患を識別する方法を提供する。
【０８４９】
配列番号66のタンパク質(内部表示335752_157-15-4-0-B11-F)
クローン335752_157-15-4-0-B11-FのcDNA(配列番号65)はアミノ酸配列:
MTVLEITLAVILTLLGLAILAILLTRWARRKQSEMYISRYSSEQSARLLDYEDGRGSRHAYSTQSERSKRDYTPSTNSLALSRSSIALPQGSMSSIKCLQTTEEPPSRTAGAMMQFTAPIPGATGPIKLSQKTIVQTLGPIVQYPGSNGRINISQLTSEDLTGAKGRVTSGPQFPNSHHVPENLHGYMNSLSLFSPAを含んでなる配列番号66の新規なカルパスタチン2(NC2)タンパク質をコードする。よって、本願明細書中に記載される配列番号66のポリペプチドの全ての特徴および用途は、クローン335752_157-15-4-0-B11-Fに含まれる核酸によりコードされるポリペプチドについても当てはまることが理解されよう。さらに、本願明細書中に記載される配列番号66のポリヌクレオチドの全ての特徴および用途は、クローン335752_157-15-4-0-B11-Fに含まれる核酸についても当てはまることが理解されよう。本発明のある好ましい実施形態は、配列番号65、66およびクローン335752_157-15-4-0-B11-Fの組成物に関する。また、本明細書に記載のような生物学的活性を有するポリペプチド断片およびそれらの断片をコードするポリヌクレオチドも好ましい。
【０８５０】
NC2はカルパインの生理学的阻害剤である。遍在性Ca2+活性化細胞質内プロテアーゼのグループであるカルパインは、膜関連およびアクチン関連細胞骨格タンパク質の部位特異的調節的タンパク質分解およびアポトーシスに関連した細胞骨格再構築事象、細胞接着、形態変化、および移動性に関与するとされてきた[Beckerleら, Cell 51:569-577, 1987; Yaoら, Am. J. Physiol. 265(pt. 1):C36-46, 1993;およびShusterら, J. Cell Biol. 128:837-848, 1995; Squierら, J. Cell Physiol., 178(3): 311-319, 1999]。また、カルパインは脳および心筋虚血、血小板活性化、NF-kB活性化、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、白内障進行ならびに慢性関節リウマチの病態に関与するともされてきた。細胞接着、細胞骨格再構築事象および細胞移動性は多数の病変と関係があるため、カルパインの阻害剤はかなり興味深い(Wangら, Trends in Pharm. Sci. 15:412-419, 1994; Mehdi, Trends in Biochem.  Sci. 16:150-153, 1991)。さらに、カルパイン／カルパスタチン系はいくつかの細胞種の膜融合事象に関与しており、カルパインはヒト精子および精巣抽出物で検出され得る。
【０８５１】
NC2はカルパスタチンドメインTおよびIIからなる。Tドメインは細胞質内の局在化および膜会合を標的とし、他方、ドメインIは核局在化機能を示す。
【０８５２】
配列番号66のタンパク質はカルパスタチンファミリーの新規メンバーであり、従って、細胞骨格再構築事象、細胞接着、形態変化およびよび膜会合型およびアクチン会合型細胞骨格タンパク質の部位特異的調節性タンパク質分解による移動に関与している。本発明の好ましいポリペプチドには1〜116位の配列番号66のアミノ酸を含んでなるポリペプチドがある。また、本明細書に記載される生物学的活性を有する配列番号66の断片およびそれらの断片をコードするポリヌクレオチドも好ましい。
【０８５３】
本発明のある実施形態は、体液、組織サンプル、または哺乳類細胞培養物などの生物学的サンプル内のカルパインの存在を検出するためのアッセイにおいて本発明のタンパク質またはその断片を用いる方法に関する。NC2は、カルパインに結合するので、本発明のタンパク質は当業者に公知の技術を用いてカルパインの有無を調べるアッセイおよび診断キットに使用できる。好ましくは、本発明のタンパク質またはその断片と異種タンパク質との複合体形成を可能にする条件下で所定量の本発明のタンパク質またはその断片をサンプルに添加し、次ぎに複合体および／または結合していない本発明のタンパク質またはその断片の存在をアッセイし、さらに対照と比較する。NC2は細胞内カルパイン活性化のマーカーとして有用であり、さらにカルパインの病理的状況との関係をモニタリングするために用いることができる(De Tullioら, FEBS letter, 475(1):17-21, 2000)。カルパインは虚血ならびにアルツハイマー病(Wronskiら, J. Neural transm., 107(2):145-157, 2000)およびパーキンソン病(Mouatt-Prigentら, J. Comp. Neurol., 419:175-92, 2000)のような疾患の病態、脊髄損傷(SCI)ラットの神経細胞アポトーシス(Ray, Brain res., 867(1-2):80-9, 2000)、細胞可溶性(Kosowerら, Methods Mol Biol., 144:181-94, 2000)ならびにその他の病態生理学に関係する細胞骨格タンパク質分解に関する。そのため、細胞内でのカルパインレベルの増加または減少を検出するアッセイはこれらの疾患または症状のいずれかの診断において有用である。カルパイン-NC2系は、細胞骨格タンパク質およびその他の細胞調節性タンパク質に対するそれらのタンパク質分解活性に加え、構造または調節性タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルにも作用し得る。よって、NC1およびカルパインレベルを検出する能力はさらに多くの疾患および症状の診断においても有用である。
【０８５４】
もう1つの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは特異的抗体および核酸プローブの使用に関連したものをはじめとする当業者に公知のいずれかの技術を用いた配偶子、配偶子前駆体細胞(精子生成幹細胞など)、または配偶子内の特異的構造の検出のために使用することができる。一般には精子、特に精子先体を可視化できるということは、患者の不妊症の分析用等の多くの用途において明らかに有用性がある。
【０８５５】
本発明のもう1つの実施形態は、細胞内のカルパインを阻害する方法であって、細胞内のカルパインを阻害するのに十分な量の本タンパク質を細胞に投与することを含んでなる方法に関する。このような方法は、in vitroまたはin vivoにおいて実施することができる。カルパインの阻害は、種々の疾患および症状、例えば、脳、心筋、腎虚血、血小板活性化、NF-κB活性化、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋ジストロフィー、白内障進行、癌悪液質および慢性関節リウマチの病態の治療または予防において多数の用途がある。限定されるものではないが、精製した本発明のタンパク質を細胞に直接投与するか、細胞をプロモーターに機能し得る形で連結されたタンパク質をコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトするか、さらに本発明のタンパク質の活性または発現を増強する化合物を細胞に投与する等の多くの方法のいずれによっても、たらすことができる。さらに、本発明のタンパク質の発現または活性化はアンチセンスオリゴヌクレオチド、抗体、ドミナントネガティブ型タンパク質の使用、およびタンパク質の発現または活性化を低下させる異種化合物の使用等の多くの方法のいずれかにより阻害することができる。このような化合物は、例えば、いずれかの標準的アッセイを用いて候補化合物をスクリーニングし、さらにタンパク質の発現または活性のレベルを検出することにより容易に同定することができる。また、本タンパク質と併用することができる、またはさらなるカルパスタチン阻害剤またはアクチベーターの同定において対照として使用することができるその他のカルパイン阻害剤も知られている。このような阻害剤としては、限定されるものではないが、セレブロリシン(Wronskiら, J. Neural Transm. Suppl., 59:263-272, 2000)、E-64-D(Rayら, Brain Res., 867(1-2): 80-9, 2000)、およびカルパイン活性部位阻害剤N-アセチル-ロイシル-ロイシル-ノルロイシナール(Squierら, J. Cell Physiol., 178(3): 311-319, 1999)が挙げられる。
【０８５６】
もう1つの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、特異的抗体および核酸プローブの使用に関連するものをはじめとする当業者に公知のいずれかの技術を用いた配偶子、配偶子前駆体細胞(精子形成幹細胞など)、または配偶子内の特異的構造の検出のために使用することができる。一般には精子、または特に精子先体を可視化する能力は患者の不妊症の分析用といった多くの用途において明らかに有用性がある。
【０８５７】
本発明のもう1つの実施形態は、細胞内のカルパインを阻害する方法であって、細胞内のカルパインを阻害するのに十分な量の本タンパク質を細胞に投与することを含んでなる方法に関する。このような方法は、in vitroまたはin vivoにおいて実施することができる。カルパインの阻害は種々の疾患および症状、例えば、脳、心筋、腎虚血、血小板活性化、NF-κB活性化、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋ジストロフィー、白内障進行、癌悪液質および慢性関節リウマチの病態の治療または予防において多数の使用法がある。このような増加は、限定されるものではないが、精製した本発明のタンパク質を細胞に直接投与する、細胞をプロモーターに機能し得る形で連結されたタンパク質をコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトする、さらに本発明のタンパク質の活性または発現を増強する化合物を細胞に投与するといった多くの方法のいずれによってもたらされる。さらに、本発明のタンパク質の発現または活性化は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗体、ドミナントネガティブ型タンパク質の使用、およびタンパク質の発現または活性化を低下させる異種化合物の使用といった数多くの方法のいずれによっても阻害できる。このような化合物は、例えば、いずれかの標準的アッセイを用いて候補化合物をスクリーニングし、さらにタンパク質の発現または活性のレベルを検出することにより容易に同定することができる。また、本タンパク質と併用することができる、またはさらなるカルパスタチン阻害剤またはアクチベーターの同定において対照として使用することができるその他のカルパイン阻害剤も知られている。このような阻害剤としては、限定されるものではないが、セレブロリシン(Wronskiら, J. Neural Transm. Suppl., 59:263-272, 2000)、E-64-D(Rayら, Brain Res., 867(1-2): 80-9, 2000)、およびカルパイン活性部位阻害剤N-アセチル-ロイシル-ロイシル-ノルロイシナール(Squierら, J. Cell Physiol., 178(3): 311-319, 1999)が挙げられる。
【０８５８】
さらにもう1つの実施形態では、配列番号66のタンパク質またはその断片は細胞のアポトーシスを阻害するために用いることができる。特に、細胞内での本タンパク質のレベルまたは活性を高めるすべての方法がin vitroまたはin vivoにおける細胞のアポトーシスを阻害するために用いることができる。例えば、配列番号66のタンパク質、またはそのいずれもの断片もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドを、例えば、ベクターにより細胞に導入することができ、それによりタンパク質が細胞内で発現される。あるいは、配列番号66のタンパク質自体を、好ましくは該タンパク質の細胞内取り込みを誘導する製剤に含まれる形で細胞に投与することができる。また、細胞内でのタンパク質の発現または活性化を増強するあらゆる化合物を投与することもできる。細胞のアポトーシスの阻害は、限定されるものではないが、増殖中の培養細胞の死滅の防止、種々の疾患のいずれかの患者の該疾患に関与するアポトーシスの阻害、または化学療法などの細胞ストレスのレベルを上昇させる治療を受けている患者の細胞のアポトーシスの阻害等の多くの用途において使用できる。さらに、本発明は、限定されるものではないが、異常細胞増殖および／またはプログラム細胞死を特徴とする疾患（癌、免疫不全症候群(AIDSなど)、I型糖尿病、病原性感染、心臓血管および神経外傷、脱毛、老化、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、ジストニー、レーバー遺伝性視神経症、統合失調症などの変性疾患、ならびに「高乳酸血症および卒中様症状を伴うミトコンドリア脳筋症」(MELAS)および「赤色筋線維の損傷を伴うミオクローヌス癲癇症候群」(MERRF)などの筋変性疾患等）を診断、予防および／または治療するための、本発明のタンパク質またはその断片を用いる方法および組成物に関する。診断用途では、本発明のタンパク質の発現をノーザンブロット法、RT-PCRまたは免疫ブロット法などのいずれかの方法を用いて検出し、さらに対照個体における発現と比較することができ、対照レベルと比較した本タンパク質のレベルの増加または低下が、疾患または症状、または疾患または症状の傾向を示す。細胞増殖の低減および／もしくはアポトーシスの増加が必要な疾患の予防ならびに／または治療用途においては、例えば、精製したタンパク質を細胞に投与するか、細胞をタンパク質をコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトするか、またはタンパク質の発現または活性を増強する化合物を細胞に投与するかのいずれかの方法を用いて、本発明のタンパク質の発現を増強するとよい。細胞増殖の増大および／もしくはアポトーシスの低減が必要な疾患の予防ならびに／または治療用途では、三重らせん体およびアンチセンス法などの任意の方法を用いて本発明のタンパク質の内因性発現を阻害するとよい。
【０８５９】
もう1つの実施形態では、本発明のタンパク質の阻害は望ましくない細胞でアポトーシスを誘導するために使用できる。このような阻害は、限定されるものではないが、抗体、アンチセンス配列、ドミナントネガティブ型タンパク質、またはタンパク質の発現または活性の小分子阻害剤の使用といった多くの方法のいずれかで達成することができる。このようなアポトーシス誘導は、望ましくない細胞（例えば患者の癌細胞）、消滅させるために用いることができる。このような阻害剤は、標準的方法を用いて、特異的に患者の望ましくない細胞を標的とすることが好ましい。
【０８６０】
もう1つの好ましい実施形態では、本発明のタンパク質は不妊症の治療または診断、および避妊をはじめとする目的で受精能力を調節および／または解析するために使用できる。NC2は受精に必要な工程である先体反応に関与するため、本タンパク質の過剰もしくは低発現または活性化はこの反応を混乱させることによって受精能力を抑制するために用いることができる。例えば、避妊目的では、タンパク質の発現または活性化を、例えば、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、タンパク質自体を用いて、またはタンパク質発現もしくは活性のアクチベーターを用いてタンパク質レベルを高めることにより、あるいはアンチセンスオリゴヌクレオチド、抗体、ドミナントネガティブ型タンパク質などの阻害剤を用いて、さらにタンパク質発現または活性を阻害する異種化合物を用いてタンパク質レベルを下げることにより人為的に混乱させることができる。同様に、多くの患者の不妊症の原因を本タンパク質の発現レベルを検出することにより突き止めることができ、タンパク質の異常なレベルの活性または発現が不妊症の原因がカルパイン依存性先体反応と関係していることを示す。また、このような診断は、例えば、精子における本タンパク質の発現または活性化を増強するまたは低下させることにより不妊症を治療する方法も提示する。
【０８６１】
もう1つの実施形態では、本発明はサンプル内の配列番号66のタンパク質のレベルを基に、組織、好ましくは精巣を選択的に同定するか、または組織サンプルが由来する可能性のある2種以上の起源を識別するために本発明のタンパク質またはその断片をマーカータンパク質として用いる方法および組成物に関する。例えば、配列番号66のタンパク質またはその断片を本明細書に記載のものをはじめとする当業者に公知のいずれかの技術を用いて抗体を産生させるために使用してもよい。次いで、このような組織特異的抗体を未知の起源の組織、例えば、法医学的サンプル、体の別の部位に転移した分化した腫瘍組織を同定する、または免疫化学を用いて組織断面にある異なる組織種を識別するために用いてもよい。このような方法では、組織サンプルを、抗体結合を容易にする条件下で、検出が可能なように標識し得る抗体と接触させる。試験サンプルとの抗体結合レベルを測定し、さらに精巣または精巣以外の組織由来の対照細胞との結合レベルと比較して試験サンプルが精巣由来であるかどうかを調べる。同様の方法がタンパク質を発現する細胞を特異的に検出するか、ならびにタンパク質を発現する細胞を特異的に単離するか、またはタンパク質自体を単離するために用いることができる。例えば、配列番号66のタンパク質またはその断片に対する抗体をクロマトグラフィーマトリックスなどの固相支持体に固定化してもよい。配列番号66のタンパク質を発現する細胞を含有する調製物を抗体との結合を容易にする条件下で抗体と接触させる。支持体を洗浄後、タンパク質を抗体から解離させる薬剤に支持体を接触させることによりタンパク質を支持体から解放する。
【０８６２】
あるいは、試験サンプル内の配列番号66のタンパク質をコードするRNAのレベルを調べることにより試験サンプル内の配列番号66のタンパク質のレベルを測定してもよい。RNAレベルは核酸アレイ、またはin situハイブリダイゼーション、ノーザンブロット、ドットブロットまたは当業者には一般的なその他の技術等を用いて測定することができる。必要あれば、解析に先立ち、PCR反応などの増幅反応を核酸サンプルで実施してもよい。試験サンプル内のRNAレベルを精巣または精巣以外の組織に由来する対照細胞内のRNAレベルと比較して試験サンプルが精巣由来であるかどうかを調べる。上述の種々の疾患、特に炎症性プロセスに関する疾患では、配列番号66のポリペプチドをコードする遺伝子の発現が特定の組織の細胞種(例えば、癌および受傷組織)もしくは体液(例えば、血清、血漿、滑液、および髄液)またはこのような疾患を有する個体から採取した別の組織の細胞サンプルにおいて、標準遺伝子発現レベル、すなわち、疾患を有していない個体由来の正常な組織または体液での発現レベルと比べてかなり高いまたは低いレベルで通常検出され得る。
【０８６３】
もう1つの実施形態では、本発明は炎症性プロセス、特に、慢性関節リウマチ(RA)、慢性多発性関節炎および関節破壊を特徴とする全身性疾患の指標となる自己抗体を同定するための本発明のタンパク質または断片を用いる方法に関する(これらの場合、カルパスタチンにする自己抗体が高レベルで同定される)。よって、本タンパク質は細胞内での自己抗体の存在および／または局在性を検出するために用いることができる。ある典型的な実施形態では、配列番号66のタンパク質は、限定されるものではないが、蛍光標識、放射性原子、常磁性イオン、ビオチン、化学発光標識または二次的酵素または結合工程を通じて検出可能な標識をはじめとするいずれかの検出可能な部分で標識される。さらに、本発明は炎症性プロセス、例えば、慢性関節リウマチを診断し、さらにこのようなプロセスとその他の疾患を識別する方法を提供する。
【０８６４】
配列番号68のタンパク質(内部表示クローン646607_181-15-2-0-E2-F)
クローン646607_181-15-2-0-E2-FのcDNA(配列番号67)はアミノ酸配列:
MRLQGAIFVLLPHLGPILVWLFTRDHMSGWCEGPRMLSWCPFYKVLLLVQTAIYSVVGYASYLVWKDLGGGLGWPLALPLRLYAVQLTISWTVLVLFFTVHNPGLALLHLLLLYGLVVSTALIWHPINKLAALLLLPYLAWLTVTSALTYHLWRDSLCPVHQPQPTEKSDを含んでなる配列番号68のベンゾジアゼピン受容体2(BZRP-R2)タンパク質をコードする。よって、本願明細書中に記載される配列番号68のポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン646607_181-15-2-0-E2-Fに含まれる核酸によりコードされるポリペプチドについても当てはまることが理解されよう。さらに、本願明細書中に記載される配列番号68のポリヌクレオチドの全ての特徴および用途はクローン646607_181-15-2-0-E2-Fに含まれる核酸についても当てはまることが理解されよう。本発明のある好ましい実施形態は、配列番号67、68およびクローン646607_181-15-2-0-E2-Fに関する。また、本明細書に記載のような生物学的活性を有するポリペプチド断片およびそれらの断片をコードするポリヌクレオチドも好ましい。
【０８６５】
BZRP-R2はヒト、ウシおよびネズミ起源の末梢型ベンゾジアゼピン受容体／イソキノリン結合タンパク質(PBR/IBP)(それぞれGenbank受託番号M36035、M64520およびL17306)と相同である。配列番号68の170アミノ酸のタンパク質は既知の末梢型PBR/IBPベンゾジアゼピン受容体／イソキノリン結合タンパク質と大きさおよびハイドロパシーが類似している。BZRP-R2は3〜23、45〜65、82〜102、105〜125および130〜150位に5の膜貫通ドメインを有する。さらに、BZRP-R2は近年同定された推定コレステロール認識／相互作用アミノ酸コンセンサスパターン(-L/V-(X)(1-5)-Y-(X)(1-5)-R/K-)に対応する11アミノ酸配列(V144で開始してR154で終わる)を示す[Liら, Endocrinology 1998 Dec; 139 (12): 4991-7参照]。
【０８６６】
BZRP-R2はベンゾジアゼピンおよびイミダゾピリジン誘導体に結合する能力があるが、GABA神経伝達物質受容体とは異なる。BZRP-R2ポリペプチドはステロイド産生細胞に最も豊富で、主にミトコンドリア外膜に見られる。BZRP-R2はミトコンドリア外／内膜接触部位に位置する34kDaの孔形成電位依存性陰イオンチャネルタンパク質に関連している。BZRP-R2のリガンドは受容体との結合時に、in vitroおよびin vivoにおいてステロイド産生細胞のステロイド合成を促す。BZRP-R2はミトコンドリア外膜から内膜へのコレステロール輸送効率を増加させることによってステロイド形成を促す。
【０８６７】
コレステロールの膜にまたがる移動を媒介する役割に加えて、BZRP-R2は細胞増殖および分化、走化性、ミトコンドリアの生理機能、ポルフィリンおよびヘム生合成、免疫応答および陰イオン輸送等の複数の他の生理的機能に関連づけられている。さらに、BZRP-R2アゴニストは有効な抗アポトーシス化合物である。
【０８６８】
BZRP-R2はストレスおよび不安障害に関連している。BZRP-R2はHPA系などの複数のストレス系、交感神経系、レニン・アンギオテンシン系、および神経内分泌系の調節に関与している。これらの系では、急性のストレスは典型的にBZRP-R2濃度の増加を引き起こすが、慢性のストレスは典型的にBZRP-R2濃度の低下を引き起こす。例えば、全般性不安障害(GAD)、パニック障害(PD)、全般性対人恐怖(GSP)、および外傷後ストレス障害(PTSD)において、BZRP-R2濃度は典型的に低下する。BZRP-R2は脳のグリア細胞に発現する。さらに、BZRP-R2の発現は神経変性疾患で、および神経毒および外傷性虚血性脳傷害の後に増加する。慢性精神分裂病患者でBZRP-R2発現は減少する、これは脳でのBZRP-R2の濃度低下が精神分裂病の病理生理学に関与している可能性があることを示唆している。しかし、BZRP-R2はPSE患者(門脈体循環性脳障害患者)由来の解剖脳組織において正常よりも高い。
【０８６９】
BZRP-R2はミトコンドリア活性を増加させアポトーシスを抑制し、従って腫瘍細胞の増殖に関与している。BZRP-R2は好ましくは肝臓癌および乳癌で発現する。さらに、BZRP-R2は癌の検出、診断、予後および治療のためのツール／マーカーとして有用である。
【０８７０】
種々の親和性を有するBZRP-R2と結合する多くのリガンドが既に記載されている。いくつかのベンゾジアゼパン、Ro 5-4864[4-クロロジアゼパン]、ジアゼパンおよび構造上関連する化合物は強力かつ選択的なPBRリガンドである。また外因性リガンドとして、2-フェニルキノリンカルボキサミド(PK11195系)、イミダゾ[1,2-a]ピリジン-3-アセトアミド(アルピデム系)、ピリダジン、およびイソキニロン(isoquinilone)誘導体が挙げられる。ポルフィリンおよびジアゼパン結合阻害剤(DBI)をはじめとするいくつかの内因性の化合物はBZRP-R2と結合する。
【０８７１】
ある実施形態では、本発明の好ましいポリペプチドは配列番号68のアミノ酸の144〜154位にあるVTSALTYHLWRを含む。さらに好ましいBZRP-R2の断片はエピトープ:ALPLRLYAVまたはその断片を含む。もう1つの実施形態では、本発明は配列番号68の配列を含んでなるポリペプチドを提供する。その他の好ましい本発明のポリペプチドとしては配列番号68の生物学的活性断片が挙げられる。タンパク質BZRP-R2の生物学的活性断片は本明細書に記載のいずれかの生物学的活性を有する。もう1つの実施形態では、本発明のポリペプチドはクローン646607 215-15-5-0-B11-Fによってコードされる。
【０８７２】
本発明のある好ましい実施形態は、BZRP-R2の発現を調節する化合物のスクリーニング法である。この方法は、i)細胞を試験化合物と接触させ、ii)試験化合物への曝露後、細胞中のBZRP-R2ポリペプチドレベルを、未処理の対照細胞のレベルと比較する工程を含む。BZRP-R2ポリペプチドレベルはノーザンブロット法またはRT-PCRなどの当技術分野で公知の方法によってBZRP-R2のmRNAを検出することにより推定すればよい。BZRP-R2ポリペプチドレベルはウエスタンブロット法または免疫蛍光法などの当技術分野で公知の、抗体に基づく方法によって検出してもよい。BZRP-R2発現を増加させる試験化合物は、本明細書に記載のとおりアゴニストとしても有用である。BZRP-R2発現を減少させる試験化合物は、本明細書に記載のとおりアンタゴニストとして有用である。
【０８７３】
BZRP-R2のアンタゴニストには配列番号68のタンパク質をコードする発現mRNAのレベルを低下させる作用因子が挙げられる。これらには、限定されるものではないが、RNAi、本発明のタンパク質を消化可能な1以上のリボザイム、またはBZRP-R2をコードするmRNAとハイブリダイズ可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドはDNA、RNA、ウイルスエンベロープ受容体タンパク質を含むプロテオリポソームに捕捉されたDNAとしてまたは標的細胞で発現可能でアンチセンスDNAまたはRNAを提供するベクターの一部として投与できる[Kanoda, Y.ら, (1989) Science 243: 375これは全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる]。特定の細胞種で発現するベクターは当技術分野で公知である。あるいは、DNAは担体とともに注射することもできる。担体はサイトカインなどのタンパク質、例えばインターロイキン2、またはポリリシン-糖タンパク質担体であり得る。担体タンパク質、ベクター、ならびにポリリシン担体系の製造および使用方法は、当技術分野で公知である。あるいは、アンチセンス分子をコードする核酸を金ビーズにコーティングし、例えば、遺伝子銃で皮膚内へ導入してもよい[Ulmer, J.B.ら, (1993) Science 259:1745これは、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる]。
【０８７４】
本発明のある好ましい実施形態はBZRP-R2ポリペプチドと結合する化合物のスクリーニング法である。このような化合物はBZRP-R2活性のアゴニストおよびアンタゴニストの開発に有用である。この方法は、i)結合が起こる条件下で、BZRP-R2ポリペプチドまたはその断片を試験化合物に接触させ、ii)該試験化合物の結合を検出する工程を含む。結合はBZRP-R2に特異的な標識抗体との競合作用など当技術分野で周知の任意の方法によるか、または各試験物質への直接標識によって検出してもよい。このような方法の一例では、BZRP-R2ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその生物学的活性断片を真核または原核宿主細胞に形質転換する。形質転換した細胞は生存能力のあるものでも固定されたものでもよい。BZRP-R2ポリペプチドに結合する候補薬剤または化合物は、当業者に周知の結合アッセイでこのような形質転換細胞についてスクリーニングする。あるいは、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Geysen H. N.,のWO84/03564（1984年9月13日公開）に教示されているものなどのアッセイを用いてBZRP-R2ポリペプチドまたはその断片の結合親和性を実証するペプチド化合物をスクリーニングできる。もう1つの実施形態は、RP-R2ポリペプチドまたはその断片との結合について試験化合物と特異的に競合す中和抗体を用いる競合的薬物スクリーニングアッセイである。試験化合物は、ジアゼパン(すなわち、バリウム)、トリアゾロベンゾジアゼピン、およびアジナゾランなどのベンゾジアゼピン系、ならびにその改変物に含まれるものが好ましい。イミダゾピリジムおよびイソキノリン系の試験化合物がさらに好ましい。
【０８７５】
種々の薬剤スクリーニング技術が利用できる。本発明のこの態様では、BZRP-R2ポリペプチドまたはその生物学的活性断片は溶液中で遊離しているか、固相支持体に付着しているか、組換え技術によって細胞表面で発現しているか、または細胞表面と化学的に結合しているか、あるいは細胞内に存在していてよい。次いでBZRP-R2ポリペプチドまたはその生物学的活性断片と試験する化合物との結合複合体の形態を本明細書に記載のとおり測定してもよい。
【０８７６】
本発明のもう1つの実施形態は、本発明のタンパク質の活性を選択的に調節する組成物および方法を提供する。BZRP-R2の調節によってBZRP-R2に関連する疾患または生化学的異常の予防、治療、または処置が可能となる。アゴニスト化合物とは、細胞中のBZRP-R2ポリペプチドの量を増加させるか、またはBZRP-R2の生物学的活性を増加させる化合物である。本発明の好ましい実施形態は、i)BZRP-R2に結合する試験物質を上記の通りスクリーングし、ii)BZRP-R2生物学的活性を検出する工程を含んでなる、BZRP-R2に結合するアゴニストのスクリーニング法である。好ましくは、この方法は、完全な細胞で行う。さらに好ましくは、この細胞は精巣または卵巣細胞などのステロイド産生細胞である。好ましくは、BZRP-R2の生物学的活性は、試験物質に曝す前または曝した後に、細胞から放出されたステロイドホルモンの濃度を測定することによって決定する。BZRP-R2のアゴニストは細胞からのステロイドホルモンの放出を増加させる。アンタゴニスト化合物とは、細胞中のBZRP-R2ポリペプチドの量を減少させるか、またはBZRP-R2の生物学的活性を低下させる化合物である。本発明のもう1つの好ましい実施形態は、i)BZRP-R2に結合する試験物質を上記の通りスクリーングし、ii)BZRP-R2生物学的活性を検出する工程を含んでなる、BZRP-R2に結合するアンタゴニストのスクリーニング法である。好ましくは、この方法は完全な細胞で行う。さらに好ましくは、この細胞は精巣または卵巣細胞などのステロイド産生細胞である。好ましくは、BZRP-R2の生物学的活性は、試験物質に曝される前と後に、細胞から放出されたステロイドホルモンの濃度を測定することによって決定する。BZRP-R2のアンタゴニストは細胞からのステロイドホルモンの放出を減少させる。
【０８７７】
本発明のタンパク質の発現または活性を減少または阻害可能なアンタアゴニストは、BZRP-R2レベルの上昇、細胞増殖の増大またはアポトーシスの低減、およびコレステロール輸送の増大に関連する疾患の治療に有用である。従って、本発明は、限定されるものではないが、癌、特に肝臓および乳癌、および門脈体循環性脳障害をはじめとする種々の疾患または疾患の治療のための方法を提供する。ステロイド産生細胞のミトコンドリアへのコレステロール輸送の増加は、プロゲステロン、テストステロン、およびエストロゲンなどのステロイドホルモンの正常より高い産生を招く。異常に高いレベルのステロイドホルモンは、副腎皮質のフィードバックメカニズムの混乱および視床下部および下垂体からの栄養ホルモンの産生低下をもたらす。BZRP-R2およびステロイド合成の阻害は、ゴナドトロピン放出ホルモンなどの栄養ホルモンのレベルを上昇させる可能性がある。
【０８７８】
あるいはまた、本発明は、BZRP-R2ポリペプチドレベルの低下およびステロイドホルモン放出量の減少に関連する疾患または疾患をそのアゴニストを用いて治療する方法を提供する。このような方法は細胞をBZRP-R2アゴニストと接触させる工程を含む。この方法は、細胞をBZRP-R2のアゴニストと接触させる工程を含む。従って、本発明は、限定されるものではないが、精神分裂病、慢性ストレス、GAD、PD、GSPおよびPTSD等の疾患を治療する方法を提供する。BZRP-R2のアゴニストによって治療し得るその他の疾患としては、細胞増殖の減少に関連する疾患、例えば成長遅延が挙げられる。さらに、BZRP-R2はコレステロールを細胞へ輸送できるため、BZRP-R2アゴニストを用いて細胞へのコレステロール輸送を増加させてもよい。コレステロール輸送不全に関連する疾患としては、リポイド副腎過形成、卵巣嚢腫、ステロイド産生細胞での異常な脂質沈着が挙げられる。ミエリンおよび髄鞘形成のためのコレステロール要件を反映する疾患としては、アルツハイマー病、多発性硬化症、脊髄損傷、および脳神経発達障害が挙げられる。BZRP-R2レベルの低下に関連する疾患の治療法は、BZRP-R2の発現または活性を促進するアゴニストの導入によって行ってもよい。
【０８７９】
さらに、ミトコンドリア活性不全に起因する疾患はBZRP-R2のアゴニストで治療できる場合がある。ミトコンドリア活性不全は、他にまたはこれに加えて、細胞および組織を損傷し得る高反応性の遊離基を生成する場合がある。これらのフリーラジカルとしては、スーパーオキシド、ペルオキシナイトライトおよびヒドロキシルラジカル、および細胞に対して有害で、アポトーシスを引き起こすその他の反応種などの反応性酸素分子種(ROS)を含んでもよい。例えば、酸素のフリーラジカルにより誘導される脂質過酸化反応は、多くの変性疾患および虚血(すなわち、卒中)で見とめられる中枢神経系(CNS)損傷における病因機構として十分確立されたものである。ミトコンドリア機能の改変およびアポトーシスに関連する疾患としては、アルツハイマー病、糖尿病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、ジストニー、レーバー遺伝性視神経症、精神分裂病、ミトコンドリア脳症、乳酸アシドーシス、および卒中が挙げられる。
【０８８０】
さらに好ましい実施形態としては培養中の細胞のアポトーシスを阻害する方法が含まれる。この方法は培養中の細胞をBZRP-R2のアゴニストと接触させる工程を含む。このような方法は初代培養の神経細胞およびリンパ球など、アポトーシスを起こすことでよく知られている培養細胞に有用である。
【０８８１】
ある実施形態では、BZRP-R2ポリペプチドまたは生物学的に活性なその断片をコードする核酸を、標的細胞種に導入することにより細胞中のBZRP-R2レベルを増加させてもよい。このような核酸の標的細胞への導入法およびこのような方法に有用なベクターは当業者に公知である。
【０８８２】
BZRP-R2の活性の低下または阻害が可能な抗体またはその他のポリペプチドは、単離されて実質的に精製された形態で提供され得る。あるいは、BZRP-R2の活性の阻害または低下が可能な抗体またはその他のポリペプチドを、遺伝子組み換技術によって標的細胞で発現させて調節作用をもたらす。さらに、BZRP-R2の活性を阻害するかまたは低下させる化合物を、薬剤送達が望ましい場所の近傍に移植する生分解性高分子に組み込んでもよい。例えば、生分解性高分子を腫瘍部位に移植してもよく、またはその代わりに、化合物を全身に徐々に放出するようにアンタゴニスト／アゴニストを含む生分解性高分子を移植してもよい。生分解性高分子およびその使用は当業者に公知である(例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Bremら, (1991) J. Neurosurg. 74:441-446参照)。
【０８８３】
もう1つの実施形態では、本発明は本発明のタンパク質をコードするmRNAの発現レベルを検出する方法および組成物を提供する。BZRP-R2のmRNAレベルの定量化は、本発明のタンパク質の発現の変化に関連する疾患の診断または予後に有用である。BZRP-R2をコードするmRNAの検出および定量アッセイは当技術分野で公知である(例えば、全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる、Maniatis, Fitsch and Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual (1982)、またはCurrent Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M.ら編, Wiley & Sons, Inc.参照)。
【０８８４】
BZRP-R2 mRNAの検出のためのポリヌクレオチドプローブまたはプライマーは、配列番号67のcDNAから設計することができる。プローブまたはプライマーのデザイン方法は当技術分野で公知である。もう1つの実施形態では、本発明は細胞内で本発明のタンパク質のmRNAを検出するための診断キットを提供する。このキットは、PCRアッセイで本発明のタンパク質を検出するためのオリゴヌクレオチドプライマーを含む1以上の容器、またはin situハイブリダイゼーションまたはノーザン分析によって本発明のタンパク質のmRNAを検出するためのポリヌクレオチドプローブを含む1以上の容器を有するパッケージを含む。所望により、キットに種々のハイブリダイゼーションアッセイで用いる種々の試薬からなる容器を含めてもよい。所望により、キットに1以上の以下の品目:重合酵素、バッファー、使用説明書、対照試料、または検出用標識を含めてもよい。また所望により、本発明に従うハイブリダイゼーションアッセイを実行するために、キットに好適な割合で混合した試薬を含む容器を含めてもよい。この試薬を含む容器は、本方法を実行する際に計量工程を省くことができるような単位量で試薬を含むことが好ましい。
【０８８５】
もう1つの実施形態では、本発明は特定の生物学的サンプル中に存在する本発明のタンパク質レベルの検出および定量のための方法および組成物に関する。これらの方法は本発明のタンパク質のレベルの変化に関連する疾患の診断または予後に有用である。本発明のタンパク質を検出する診断アッセイは、生検、器官または組織切片由来細胞のin situアッセイ、または腫瘍もしくは正常組織からの細胞の吸引を含む。さらに、アッセイは器官からの細胞抽出物、組織、細胞、尿、あるいは血清または血液あるいはその他の体液または抽出物で行ってよい。
【０８８６】
BZRP-R2ポリペプチドの定量アッセイは当技術分野で周知の方法に従って行えばよい。典型的には、これらのアッセイは、サンプルを本発明のタンパク質のリガンドあるいは本発明のタンパク質またはその断片を特異的に認識する抗体(ポリクローナルまたはモノクローナル)と接触させ、サンプル中に存在する本発明のタンパク質とリガンドまたは抗体との間に形成された複合体を検出する工程を含む。リガンドおよび抗体の断片も、これらの断片がBZRP-R2ポリペプチドと特異的に相互作用可能であるならば、結合アッセイに用いてよい。さらに、BZRP-R2と結合するリガンドおよび抗体を当技術分野で公知の方法に従って標識してよい。本発明で有用な標識としては、限定されるものではないが、酵素標識、放射性同位体標識、常磁性標識および化学発光標識が挙げられる。標準的な技術としては、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるKennedy, J. H.ら, (1976) Clin. Chim. Acta 70:1-31;およびSchurs, A. H.ら, (1977) Clin. Chim. Acta 81: 1-40に記載されている。
【０８８７】
本発明はまた転移性腫瘍塊の同定のための方法および組成物を提供する。本発明のこの態様では、BZRP-R2ポリペプチドまたはその断片と特異的に結合するポリペプチドまたは抗体は、転移性腫瘍塊の同定のためのマーカーとして用いてもよい。乳房または肝臓由来の転移性腫瘍はBZRP-R2ポリペプチドを過剰発現し得るが、新規に形成された腫瘍、またはその他の組織由来の腫瘍はBZRP-R2を発現しないと考えられる。
【０８８８】
配列番号70のタンパク質(内部表示クローン229654_114-049-1-0-F12-F (cFS))
クローン229654_114-049-1-0-F12-FのcDNA(配列番号69)はアミノ酸配列:
MFRLWLLLAGLCGLLASRPGFQNSLLQIVIPEKIQTNTNDSSEIEYEQISYIIPIDEKLYTVHLKQRYFLTDNFMIYLYNQGSMNTYSSDIQTQCYYQGNIEEYPDSMVTLSTCSGLRGILQFENVSYGIEPLESAVEFQHVLHKLKNEDNDIAIFIDRSLKEQPMDDNIFISEKSEPAVPDLFPLYLEMHIVVDKTLYDYWGSDSMIVTNKVIEIVGLANSMFTQFKVTIVLSSLELWSDENKISTVGEADELLQKFLEWKQSYLNLRPHDIAYLLIYMDYPRYLGAVFPGTMCITRYSAGVALYPKEITLEAFAVIVTQMLALSLGISYDDPKKCQCSESTCIMNPEVVQSNGVKTFSSCSLRSFQNFISNVGVKCLQNKPQMQKKSPKPVCGNGRLEGNEICDCGTEAQCGPASCCDFRTCVLKDGAKCYKGLCCKDCQILQSGVECRPKAHPECDIAENCNGSSPECGPDITLINGLSCKNNKFICYDGDCHDLDARCESVFGKGSRNAPFACYEEIQSQSDRFGNCGRDRNNKYVFCGWRNLICGRLVCTYPTRKPFHQENGDVIYAFVRDSVCITVDYKLPRTVPDPLAVKNGSQCDIGRVCVNRECVESRIIKASAHVCSQQCSGHGVCDSRNKCHCSPGYKPPNCQIRSKGFSIFPEEDMGSIMERASGKTENTWLLGFLIALPILIVTTAIVLARKQLKNWFAKEEEFPSSESKSEGSTQTYASQSSSEGSTQTYAGQTRSESSSQADTSKSKSEDSAEAYTSRSKSQDSTQTQSSSNを含んでなる配列番号70のLAPと呼ばれる787アミノ酸長のポリペプチドをコードする。よって、本願明細書中に記載される配列番号70のポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン229654_114-049-1-0-F12-Fに含まれる核酸によりコードされるポリペプチドについても当てはまることが理解されよう。さらに、本願明細書中に記載される配列番号69のポリヌクレオチドの全ての特徴および用途はクローン229654_114-049-1-0-F12-Fに含まれる核酸についても当てはまることが理解されよう。本発明のある好ましい実施形態は、配列番号69、配列番号70およびクローン229654_114-049-1-0-F12-Fの組成物に関する。また、本明細書に記載するような生物学的活性を有するポリペプチド断片およびそれらの断片をコードするポリヌクレオチドも好ましい。
【０８８９】
配列番号70のタンパク質LAPはADAM(A Disintegrin And Metalloprotease domain)ファミリーのタンパク質の新規メンバーである。クローン229654.cFSの遺伝子は第8染色体上に位置し、肝臓、脂肪および精巣をはじめとする組織で発現する。
【０８９０】
LAPはADAMファミリーメンバーとしての膜固定細胞表面タンパク質である。このファミリーのメンバーは細胞表面接着分子およびプロテアーゼの大きなグループを形成しており、その名称はこれらのタンパク質がその密接な関連があるPIII種の蛇毒メタロプロテイナーゼ(SVMP)と共通している2つのドメインを表している。ADAMプロテアーゼは亜鉛依存性メタロプロテイナーゼのアダマリシン/レプロリシンサブファミリー内のSVMPSに属す。ADAMはまたMDC(メタロプロテイナーゼ/ジスインテグリン/システインリッチ)、細胞性ジスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ-デスインテグリンとも呼ばれる。
【０８９１】
これらのタンパク質は酵母、蠕虫、ハエ、カエルおよび哺乳類にわたる広範な生物から単離されている。発現研究では、広い組織発現を示すADAMSもあれば、ある組織に限って発現を示すものもあることが示されている。
【０８９２】
ADAMタンパク質は細胞間相互作用、細胞シグナル伝達および膜固定タンパク質のエクトドメインのプロセシングにおいて働くことが示されており、精子と卵子の結合および融合、筋芽細胞の融合、サイトカインのタンパク質-エクトドメイン放出、サイトカイン受容体、接着およびその他の細胞外タンパク質ドメインをはじめとする多様な生物学的プロセスに関連づけられている。さらに、それらはショウジョウバエにおける適切な軸索誘導、神経および羽根の発達、線虫（Caenorhabditis elegans）における陰門の発達、ならびにマウスにおける上皮成熟および皮膚・羽毛の発達に必要であることが示されている。
【０８９３】
構造上、LAPはN末端シグナル配列(MFRLWLLLAGLCGLLAS)、この酵素を不活性状態で保つことが示されているプロドメイン(HLKQRYFLTDNFMIYLYNQGSMNTYSSDIQTQCYYQGNIEEYPDSMVTLSTCSGLRGILQFENVSYGIEPLESAVEFQHVLHKLKNEDNDIAIFIDRSLKEQPMDDNIFISEKS)、続いて、タンパク質分解に重要であり亜鉛結合触媒部位を含むメタロプロテアーゼドメイン(LYLEMHIVVDKTLYDYWGSDSMIVTNKVIEIVGLANSMFTQFKVTIVLSSLELWSDENKISTVGEADELLQKFLEWKQSYLNLRPHDIAYLLIYMDYPRYLGAVFPGTMCITRYSAGVALYPKEITLEAFAVIVTQMLALSLGISYDDPKKCQCSESTCIMNPEVVQSNGVKTFSSCSLRSFQNFISNVGVKCLQNKP)、インテグリンと結合することが証明されているジスインテグリン様ドメイン(KPVCGNGRLEGNEICDCGTEAQCGPASCCDFRTCVLKDGAKCYKGLCCKDCQILQSGVECPKAHPECDIAENCNGSSPEC)、接着活性も有するシステインリッチ領域(GLSCKNNKFICYDGDCHDLDARCESVFGKGSRNAPFACYEEIQSQSDRFGNCGRDRNNKYVFCGWRNLICGRLVCTYPTRKPFHQENGDVIYAFVRDSVC)、基質認識に重要なEGF様ドメイン(CDIGRVCVNRECVESRIIKASAHVCSQQCSGHGVCDSRNKCHCSPGYKPPNC)、膜貫通ドメイン(TWLLGFLIALPILIVTTAIVL)、および多くのADAMでSH3結合部位を含むことが示され、細胞のシグナル伝達に重要である可能性のある細胞質テール(ARKQLKNWFAKEEEFPSSESKSEGSTQTYASQSSSEGSTQTYAGQTRSESSSQADTSKSKSEDSAEAYTSRSKSQDSTQTQSSSN)を有する。
【０８９４】
興味深いことに、LAPタンパク質の細胞質C末端ドメインはいずれのSH3結合部位も含まないが、セリン/トレオニン残基が豊富な(セリン残基36%; SSESKSEGSTQTYASQSSSEGSTQTYAGQTRSESSSQADTSKSKSEDSAEAYTSRSKSQDST QTQSSS)69アミノ酸の領域で終わる。
【０８９５】
LAPはジスインテグリン様ドメインとメタロプロテアーゼドメインの双方を含み、細胞接着活性とプロテアーゼ活性の双方を有する。しかし、LAPはそのメタロプロテアーゼドメインの触媒部位コンセンサス配列(QMLALSLGISYD)を欠いている。LAPは別の触媒不活性プロテアーゼフェルチリンβ同様、精巣上体において精子成熟中に精子細胞表面でプロセシングされ、受精能のある精子上にジスインテグリンドメインを保持する成熟タンパク質となる。
【０８９６】
以下に記載の方法において用いるための好ましいLAPポリペプチドとしては、
アミノ配列:KPVCGNGRLEGNEICDCGTEAQCGPASCCDFRTCVLKDGAKCYKGLCCKDCQILQSGVECRPKAHPECDIAENCNGSSPECGPDITLINGLSCKNNKFICYDGDCHDLDARCESVFGKGSRNAPFACYEEIQSQSDRFGNCGRDRNNKYVFCGWRNLICGRLVCTYPTRKPFHQENGDVIYAFVRDSVCITVDYKLPRTVPDPLAVKNGSQCDIGRVCVNRECVESRIIKASAHVCSQQCSGHGVCDSRNKCHCSPGYKPPNCQIRSKGFSIFPEEDMGSIMERASGKTENTWLLGFLIALPILIVTTAIVLARKQLKNWFAKEEEFPSSESKSEGSTQTYASQSSSEGSTQTYAGQTRSESSSQADTSKSKSEDSAEAYTSRSKSQDSTQTQSSSNを含んでなるポリペプチド;
アミノ酸配列:KPVCGNGRLEGNEICDCGTEAQCGPASCCDFRTCVLKDGAKCYKGLCCKDCQILQSGVECRPKAHPECDIAENCNGSSPECGPDITLINGLSCKNNKFICYDGDCHDLDARCESVFGKGSRNAPFACYEEIQSQSDRFGNCGRDRNNKYVFCGWRNLICGRLVCTYPTRKPFHQENGDVIYAFVRDSVCITVDYKLPRTVPDPLAVKNGSQCDIGRVCVNRECVESRIIKASAHVCSQQCSGHGVCDSRNKCHCSPGYKPPNCQIRSKGFSIFPEEDMGSIMERASGKTENを含んでなるポリペプチド;
アミノ酸配列:KPVCGNGRLEGNEICDCGTEAQCGPASCCDFRTCVLKDGAKCYKGLCCKDCQILQSGVECRPKAHPECDIAENCNGSSPECGPDITLINGLSCKNNKFICYDGDCHDLDARCESVFGKGSRNAPFACYEEIQSQSDRFGNCGRDRNNKYVFCGWRNLICGRLVCTYPTRKPFHQENGDVIYAFVRDSVCを含んでなるポリペプチド;
アミノ酸配列:KPVCGNGRLEGNEICDCGTEAQCGPASCCDFRTCVLKDGAKCYKGLCCKDCQILQSGVECRPKAHPECDIAENCNGSSPECGPDを含んでなるポリペプチド;
アミノ酸配列:GLSCKNNKFICYDGDCHDLDARCESVFGKGSRNAPFACYEEIQSQSDRFGNCGRDRNNKYVFCGWRNLICGRLVCTYPTRKPFHQENGDVIYAFVRDSVCを含んでなるポリペプチド;
アミノ酸配列:PSSESKSEGSTQTYASQSSSEGSTQTYAGQTRSESSSQADTSKSKSEDSAEAYTSRSKSQDSTQTQSSSNを含んでなるポリペプチドが挙げられる。
【０８９７】
本発明の実施形態は、卵母細胞表面におけるLAPと細胞表面受容体との相互作用を遮断する分子をスクリーニングする方法であって、精子とスクリーニングする該分子を接触させ、その精子と卵母細胞を接触させ、さらに精子-卵母細胞結合を妨げる工程を含んでなる方法に関する。
【０８９８】
本発明のある好ましい実施形態は、LAPと卵母細胞細胞表面との相互作用を遮断することにより精子-卵母細胞の相互作用を阻害する方法であって、精子を、スクリーニングで同定されたLAP-卵母細胞の相互作用を阻害または遮断するブロッキング分子と接触させるステップを含んでなる方法に関する。好ましい薬剤としてはLAP-ジスインテグリンドメインに対する抗体が挙げられる。
【０８９９】
LAPは肝細胞ならびに脂肪細胞において接着および細胞シグナル伝達活性を有する原形質膜に固定されたタンパク質である。より詳しくは、成熟LAPタンパク質はその細胞外ドメインを介して、隣接する細胞の表面に存在する、まだ同定されていないインテグリンおよびその他のタンパク質を相互作用するが、その細胞質セリンリッチドメインは、該セリンリッチドメインと相互作用する細胞質または原形質膜会合タンパク質と相互作用することによりシグナル伝達事象に関与する。さらにまた、セリンおよびトレオニン残基はいずれもリン酸化可能な残基であるので、LAPタンパク質のシグナル伝達活性はこのドメイン上に存在する特定のセリンおよび／またはトレオニン残基のリン酸化/脱リン酸化事象によって調節される。
【０９００】
さらなる実施形態では、in vitroでの細胞、好ましくは肝細胞または脂肪細胞間の細胞間相互作用を低下させるかまたは阻害する方法において本発明のポリペプチドに対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体が用いられる。細胞間相互作用を低下させるかまたは阻害する好ましい方法としては、i)その細胞を、本発明のポリペプチドに対する抗体、好ましくはジスインテグリン様ドメインに対するモノクローナル抗体またはシステインリッチドメインに対するモノクローナル抗体を阻害するのに有効な量で含んでなる組成物と接触させる工程を含んでなる。
【０９０１】
さらなる実施形態はLAPとその結合パートナーの少なくとも1つとの相互作用を遮断または阻害する方法であって、i)細胞を、遮断上有効な量の、LAPの細胞外ドメインを含んでなる本発明のポリペプチド断片と接触させる工程を含んでなる方法に関する。LAPと結合パートナーの相互作用を遮断する該方法で用いる好ましい細胞外ドメインとしては、LAPのジスインテグリン様ドメインおよびLAPのシステインリッチドメインが挙げられる。該方法の組成物に用いられる好ましい合成ペプチドは、CRPKAHPECDIAENCもしくはCGNGRLEGNEICDCG、またはその組み合わせを含んでなるアミノ酸配列を有する。
【０９０２】
配列番号72のタンパク質(内部表示クローン338116_174-1-1-0-B10-F)
クローン338116_174-1-1-0-B10-FのcDNA(配列番号71)はアミノ酸配列:
MGPHLHLCLCVPDLRSLRVCVSLWSVHHRPHESLAREEALTALGKLLYLLDGMLDGQVNSGIAATPASAAAATLDVAVRRGLSHAAQRLLCVALGQLDRPPDLAHDGRSLWLNIRGKEAAALSMFHVSTPLPVMTGGFLSCILGLVLPLAYGFQPDLVLVALGPGHGLQGPHXALLAAMLRGLAGGRVLALLEENSTPQLAGILARVLNGEAPPSLGPSSVASPEDVQALMYLRGQLEPQWKMLQCHPHLVAを含んでなる配列番号72のタンパク質(本明細書ではショート・ヒストン・デアセチラーゼ(SHDAC)と呼ばれる)をコードし、cDNAクローン338116_174-1-1-0-B10-F(配列番号71)によりコードされる。配列番号72のタンパク質は新規なヒストンデアセチラーゼ(HDAC)変異体である。よって、本願明細書中に記載される配列番号72のポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン338116_174-1-1-0-B10-Fに含まれる核酸によりコードされるポリペプチドについても当てはまることが理解されよう。さらに、本願明細書中に記載される配列番号71の核酸の全ての特徴および用途はクローン338116_174-1-1-0-B10-Fに含まれる核酸についても当てはまることが理解されよう。本発明の好ましい実施形態は、配列番号71、配列番号72およびクローン338116_174-1-1-0-B10-Fを含む組成物に関する。また、本明細書に記載のような生物学的活性を有するポリペプチド断片およびそれらの断片をコードするポリヌクレオチドも好ましい。
【０９０３】
配列番号72のタンパク質は1つの可能性のある膜貫通セグメント(130〜150位)とシグナルペプチド(1位からのMGPHLHLCLCVPDLRSL)を含む。配列番号72のタンパク質は胎盤および唾液腺で発現が高い。
【０９０４】
ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)タンパク質は、ヒストンアセチル-トランスフェラーゼタンパク質に関して作用して、ヒストンのアセチル化状態の変化を介してクロマチンの構造および転写活性を調節する関連タンパク質の一ファミリーを含んでなる。HDACは加水分解によりヒストンからアセチル基を除去し[Davie, J.R. Curr. Opin. Genet. Dev. 8, 173-178 (1998)]、それにより局部的なクロマチンの凝集を引き起こし、特定のDNA領域をRNAポリメラーゼ複合体に接近しにくくする。実際、転写活性のあるクロマチンはヒストンの過剰アセチル化と相関しており[Grundstein M. Nature 389:349-352 (1997)]、ヒストンアセチルトランスフェラーゼは転写を促進し、一方、ヒストンデアセチラーゼは受容体および転写サイレンサーとして働くことが示唆されている[Doetzlhofer A.ら, Mol. Cell. Biol. 19:5504-5511(1999)]。
【０９０５】
ヒストンデアセチラーゼタンパク質は保存された380残基の触媒ドメインを有する亜鉛金属酵素のスーパーファミリーに属する[Finnin, M.S.ら, Nature 401:188-193(1999)]。ヒストンデアセチラーゼはSIN3、RbAp46/48、SAP18、SAP30のようなアダプタータンパク質、およびN-CoR、SMRTおよびSUN-CoRsなどの核コレプレッサーと会合した高分子量複合体中に見られる[Alland, L.ら, Nature 387:49-55 (1997); Heinzel, T.ら, Nature 387:43-48 (1997); Laherty, C.D.ら, Cell 89: 349-356 (1997); Nagy, L.H.ら, Cell 89:373-380 (1997); Zhang, W.ら, EMBO J. 17:3155-3167 (1997); Zhang; Y.ら, Cell 89:357-364 (1997); Knoepfker, P.S. & Eisenman, R.N. Cell 99:447-450 (1999)]。
【０９０６】
ヒストンデアセチラーゼは、マトリックス会合型デアセチラーゼ(Mad)[Sommer, A.ら, Curr. Biol. 7 :357-365 (1997)]、YY1[Yang, W.M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:12845-12850 (1996)]、ホルモン依存性核受容体[Nagy, L.H.ら, Cell 89:373-380 (1997)]、MeCP2[Jones, P.L.ら, Nat. Genet. 19:187-191 (1998)]、CBF[Kao, H.Y.P.ら, Genes Dev. 12:2269-2277 (1998)]、網膜芽細胞腫タンパク質(Rb)[Brehm, A.ら, Nature 391:597-601 (1998)]、groucho[Chen, G.ら, Genes Dev. 13:2218-2230 (1999)]、Bリンパ球誘導性成熟タンパク質[Yu, J.ら, Mol. Cell. Biol. 20:2592-2603 (2000)]、および関連するポケットタンパク質[Ferreiraら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10493-10498 (1998)]などの哺乳類転写因子により特定のプロモーターに抑制のために会合する。PZLF(前骨髄性白血病ジンクフィンガー)、PML(前骨髄性白血病)、およびETO融合タンパク質によるヒトヒストンデアセチラーゼの補充は急性前骨髄性白血病において造血前駆体細胞の分化を妨げることができる[Lin, R.J.ら, Nature 311:811-815 (1996); David, G.L.ら, Oncogene 16:25492556 (1998); Grignani, F.S.ら, Nature 391:815-818 (1998); Guidezら, Blood 91:2634-2642 (1998)]。
【０９０７】
いくつかの薬物がヒストンアセチル化に作用することが確認されている。数例として、トリコスタチンA(TSA)、アピシジン(好原生動物剤)、スペロイルアニリドヒドロキサム酸(SAHA)、環状ヒドロキサム酸含有ペプチド(CHAP)1、FR901228(強力な抗腫瘍剤)、CBHA(m-カルボキシ桂皮酸ビス-ヒドロキサミド)、トラポキシン、MS-275(抗腫瘍剤)、ピロキサミド(スベロイル-3-アミノピリジンアミドヒドロキサム)酸および酪酸フェニルがある。このような薬物は細胞の分化およびアポトーシスの誘導をはじめ、細胞の活性における主要な変化を引き起こす[Medina, V.ら, Cancer Res. 57:3697-3707 (1997); Richon, V.M.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:3003-3007 (1998); Sambucetti, L.C.ら, J. Biol. Chem. 274:34940-34947 (1999); Buter, L.M.ら, Clin. Cancer Res. 7:962-970 (2001); Coffey, D.C.ら, Cancer Res. 61:3591-3594 (2001); Colletti, S.L.ら, Bioorg. Med. Chem. Lett. 11:107-111 (2001); Furumai, R.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:87-92 . (2001); Lee, B.I.ら, Cancer Res. 63:931-934 (2001)]。
【０９０８】
配列番号72のタンパク質はヒストンデアセチラーゼの新規なスプライシングおよび多型変異体であり、それ自体、転写、染色体安定性、細胞周期の進行、遺伝子のサイレンシング、リンパ球および筋肉の分化、加齢、神経表現型の調節、DNAの複製およびDNA傷害に対する応答に関与する。特に本発明のタンパク質は基質、好ましくはアセチル化ヒストンを直接または酵素の補因子として間接的に脱アセチル化する。本発明の好ましいポリペプチドは、配列番号72の29〜252位のアミノ酸を含んでなるポリペプチドである。また、本明細書に記載されるような生物学的活性を有する配列番号72の断片およびそれらの断片をコードするポリヌクレオチドも好ましい。本発明のタンパク質またはその断片の脱アセチル化活性は当業者に公知のいくつかの方法のいずれを用いてアッセイしてもよい。
【０９０９】
本発明は、配列番号72のタンパク質またはその断片を用いて細胞の転写活性を阻害または調節し、それにより細胞の分化を調節する方法および組成物に関する。具体的には、ヒストンデアセチラーゼが分化に関連する転写の阻害に関与しているので、このタンパク質の活性または発現の増加を分化の阻害に使用できる。分化の阻害能力には、例えば、未分化の多能性細胞の培養中に、所定の細胞種が必要となるまで(例えば移植片の場合)培養細胞を未分化の状態で維持するなど、多数の用途がある。例えば、本発明のヒストンデアセチラーゼを用いて細胞周期のG1またはG2期にin vitroで増殖する非新生物細胞集団を抑制してもよい。このような同調により、例えば、細胞周期のG1またはG2期に発現した遺伝子および／または遺伝子産物の同定が可能となる。このような培養細胞の同調はまた、トランスフェクション効率が異なる上にトランスフェクトする細胞の特定の細胞周期に依存する場合の、新規のトランスフェクションプロトコールの有効性の試験に有用である。本発明のヒストンデアセチラーゼの使用は細胞集団の同調を可能にし、それによってトランスフェクション効率の向上の検出が加わる。このタンパク質の活性または発現レベルは、このタンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞へ導入することによるもの、タンパク質自体を細胞へ投与することによるもの、または細胞にタンパク質の活性または発現を増加させる化合物を投与することによるものをはじめとする、多数の手段のいずれでも増大させることができる。あるいは、本発明のタンパク質の発現または活性化は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗体、このタンパク質のドミナントネガティブ型の使用、およびこのタンパク質の発現または活性化を低下させる異種化合物の使用をはじめ、多数の手段のいずれかで阻害することができる。このような化合物は、例えばいずれかの標準的アッセイを用いる候補化合物のスクリーニングおよびこのタンパク質の発現または活性レベルの検出によって、容易に同定できる。癌細胞は比較的未分化の状態であることが多く、細胞の分化は典型的に増殖停止に伴うため、分化促進能力は癌の治療または予防をはじめ、多くの用途がある。
【０９１０】
もう1つの実施形態では、限定されるものではないが、癌、免疫不全症候群(AIDSをはじめとする)、I型糖尿病、病原菌感染、心血管および神経の損傷、脱毛症、加齢、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、ジストニー、レーバー遺伝性視神経症、精神分裂症などの変性疾患、、ならびに「ミトコンドリア脳症、乳酸アシドーシス、および卒中(MELAS)」および「赤色筋線維の損傷を伴うミオクローヌス癲癇症候群(MERRF)」などの筋萎縮性疾患をはじめとする、細胞増殖異常および／またはプログラムされた細胞死が特徴の疾患の予防および／または治療する目的で、特定の条件下で本発明のタンパク質またはその断片を発現させるために真核細胞を遺伝子操作する。例えば、配列番号72のタンパク質またはその生物学的活性断片を発現可能なベクターを、限定されるものではないが、上記に記載の疾患をはじめとする疾患の治療または予防のため被験体へ投与することができる。あるいは、このベクターは変異体または変異タンパク質の生物学的活性断片をコードしてもよい。配列番号72のいずれかの組合せをコードする多重ベクター、変異体、および／または配列番号72の生物学的活性断片および／または変異体が被験体へ投与され得る。
【０９１１】
本発明は、基質からアセチル基を取り除くため、本発明のタンパク質またはその断片を、単独または別の物質、例えば、限定されるものではないが、サイレンシング特異的標的遺伝子と組み合わせて用いる方法および組成物に関する。このような方法で用いられるアセチル化基質としては、好ましくはアセチル化ヒストンおよびアセチルトランスフェラーゼである。例えば、本発明のタンパク質またはその断片を、脱アセチル化を可能とする条件下で基質を含むサンプルに加え、基質の脱アセチル化を触媒させる。ある好ましい実施形態では、脱アセチル化は、Landryおよび共同研究者[全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Landryら, Proc. Natl. Acad. Sci. 97:5807-5811 (2000)]の記述などの標準的アッセイを用いて実施される。この方法で得られた脱アセチル化ヒストンは、精製した純粋なDNA(例えばプラスミド調製物)と混合して、クロマチン様構造をin vitroで再構築してもよい。このような構造は、転写および複製に関与する酵素様因子の研究において特に注目される。天然の転写因子は凝集したクロマチンに進入できず、その遺伝子機能は効果的にスイッチオフされる。また、クロマチン凝集構築物は雄の生殖能力の評価において、従来の精子パラメーターとは完全に独立した有用なパラメーターである[Hammadeh, M.E.ら, Arch Androl;46(2):99-104 (2001)]。
【０９１２】
本発明のもう1つの実施形態は、デアセチラーゼ活性の阻害剤およびアクチベーターをスクリーニングするための本発明のタンパク質またはその断片を用いる組成物および方法に関する。このようなデアセチラーゼ阻害剤は、癌細胞で転写調節に影響を与えアポトーシスまたは分化を誘発するそれらの能力によって新規の薬物として[Marks P.A.ら, Clin. Cancer Res. 7:759-760 (2001)]、また抗原虫薬、抗真菌剤、植物毒素および抗ウイルス薬用途に関与する抗増殖性試薬として[Meinke, P.T. & Liberator, P., Curr. Med. Chem. 8:211-235 (2001)]大いに可能性がある。このようなある実施形態では、本発明のタンパク質をin vitroで蛍光標識されたアセチル化基質ならびに試験薬と接触させ、このタンパク質の活性を検出するが、ここで、試験薬の不在下での活性と比較して、試験薬の存在下でのこのタンパク質の活性に相違があれば、この試験薬がこのタンパク質のモジュレーターであることを示す。好適な基質としては、例えば、アセチル化リジンのアミノクマリン誘導体が挙げられ、これは蛍光検出器を用いる逆相HPLCシステムを用いて定量できる[例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Hoffmannら, Nucl. Acids Res. 27:2057-2058 (1999); Hoffmannら, Pharmazie 55:601-606 (2000)参照]。
【０９１３】
もう1つの好ましい実施形態では、配列番号71のポリヌクレオチド、配列番号72のポリペプチドまたは本発明のポリペプチドに対する抗体はまた、ポリペプチドまたはmRNAレベルの異常な低下または増加を検出するためのスクリーニング法、ならびに添加した化合物が細胞での当該mRNAおよびポリペプチド産生に及ぼす影響を検出するスクリーニング法に用いてもよい。本発明のタンパク質の異常活性はコケーン症候群、運動失調末梢血管拡張症およびウェルナー症候群などの早期老化症候群ならびに年齢に関係する疾病ならびに痴呆およびパーキンソン病など老齢に関係する疾病の「早発」形態 に関係する。発現の増加または低下は、例えば、PCRおよびRT-PCRをはじめとする核酸増幅法、ならびにRNAアーゼ保護、ノーザンブロット法およびその他のハイブリダイゼーション法など、ポリヌクレオチドの定量のための当技術分野で公知の方法のいずれかを用いてRNAレベルで測定することができる。発現はまた、ELISAアッセイなど、本発明のタンパク質のレベルを測定するアッセイを用いて検出することができる。これらの方法はまた細胞または組織でポリペプチド産生を阻害または増大させる薬物を発見するために使用することもできる。有力なポリペプチド阻害剤の例としては、抗体、オリゴヌクレオチド、異種タンパク質、または本発明のタンパク質の小分子阻害剤が挙げられる。
【０９１４】
本発明のもう1つの実施形態は、本発明のタンパク質またはその断片と選択的に結合する抗体を調製する方法に関する。このような抗体は、例えば、本発明のタンパク質の結合部位を含むクロマチン断片を凝集（enrich）する共免疫沈降法で用いることができる。この方法は、本発明のタンパク質のデアセチラーゼ活性によってサイレンシングされたヒトゲノムの遺伝子または領域、およびクロマチン様RCC1(染色体凝縮レギュレーター)の緻密化した形態と相互作用するタンパク質も同定することができる[Renault, L.ら, Cell, 105:245-255 (2001)]。例えば、ある方法では、HDACと選択的に結合する抗体をプロテインＡまたはプロテインＧセファロースビーズと結合させ、免疫沈降に従う条件下で天然のクロマチン断片を含むサンプルへ加え、HDACと同時に沈殿したDNA断片を抽出してサブクローニングする。これらのDNA断片は次に配列決定してもよいしおよび／またはゲノムライブラリーのスクリーニングにプローブとして使用することもできる[全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Gouldら, Nature 348:308-312 (1990)]。
【０９１５】
もう1つの実施形態では、 本発明は、本発明のタンパク質またはその断片を、唾液腺もしくは胎盤などの組織を選択的に同定するまたはそのサンプル中の配列番号72のタンパク質レベルに基づいて2以上の可能性ある組織サンプル源を識別するマーカータンパク質として用いる方法および組成物に関する。例えば、配列番号72のタンパク質またはその断片は、当業者に公知のいずれかの技術を用いる抗体産生に使用してもよいし、この抗体を次に未知の起源の組織、例えば、法医学サンプル、異種の身体部位へ転移した分化腫瘍組織の同定に用いてもよいし、または免疫化学を用いる組織切断面で異なる組織種の識別に用いてもよい。一般的に、このような方法では抗体の結合を促進する条件下で組織サンプルを抗体(検出可能なように標識してもよい)と接触させる。ある実施形態では、試験サンプルと結合する抗体のレベルを測定し、唾液腺および胎盤に由来するまたは唾液腺および胎盤以外の組織に由来する対照細胞から予測された結合レベルと比較して、試験サンプルが唾液腺および胎盤に由来するかどうかを決定する。このような方法は細胞を同定する他の独立した方法と併せて行ってもよい。同様の方法を用いてこのタンパク質を発現している細胞の特異的検出、ならびにこのタンパク質を発現している細胞の特異的単離またはタンパク質自体の単離ができる。例えば、配列番号72のタンパク質またはその断片に対する抗体はクロマトグラフィーマトリックスなどの固相支持体へ固定化してもよい。配列番号72のタンパク質を発現している細胞を含む製剤は抗体との結合を促進する条件下で抗体と接触した状態で置く。この支持体を洗浄し、次いで抗体からタンパク質を分離させる薬物と支持体を接触させることによってこのタンパク質を支持体から遊離させる。
【０９１６】
本発明のある好ましい実施形態は、配列番号72のタンパク質またはその断片を用いて、その転写が局部的なクロマチン凝集の程度によって調節される遺伝子の発現により引き起こされた疾患を診断、治療および／または予防する組成物および方法に関する。本発明のタンパク質によって治療できる病態および症状の数はおそらく莫大で尽きることはない。好ましい疾患は、癌、ならびに、白血病、リンパ腫、前立腺肥大、腎臓病、腎不全、ウイルス感染、特にHIVおよびウイルス肝炎(すなわちウイルスタンパク質の発現)、肥満などの代謝病および、例えばインターロイキンの過剰発現による多くの炎症性疾患、をはじめとする異常な細胞の分化、増殖、または変性に関連するその他の疾患などのように遺伝子転写の調節不全と関連している。診断目的には、本発明のタンパク質の発現を任意の方法、例えばノーザンブロット法、RT-PCRまたは免疫ブロット法を用いて調査し、対照個体での発現と比較することができる。予防および／または治療目的には、遺伝子療法またはこのタンパク質の発現もしくは活性を増大または阻害する化合物の投与による方法をはじめとする多数の方法のいずれかを用いて患者の中で本発明のタンパク質の発現を増大、阻害してもよいし、あるいはまた変化させてもよい。
【０９１７】
ある実施形態では、本発明は細胞の増殖を阻害する方法を提供し、この方法は本発明のタンパク質を細胞増殖制御遺伝子に特異的に標的化する異種タンパク質ドメインと結合した本発明のタンパク質を細胞に導入することを含んでなり、そこで本発明のタンパク質に対する遺伝子ターゲッティングが局部的なクロマチンの凝集を引き起こし、この遺伝子の発現を阻害する。デアセチラーゼ活性および特異的DNA結合ドメインの双方を含む細胞融合タンパク質は当業者に周知の分子生物学の方法によって得られる。ある実施形態では、細胞を融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトしてこのような融合タンパク質を細胞内に導入し、そこでこの融合タンパク質が細胞で発現する。このようなポリヌクレオチドは、例えば発現ベクターの形態であり、従って例えば癌、代謝病、加齢および局部的なクロマチンの脱凝集に関連して遺伝子が過剰発現するいずれかの疾患の治療または予防のための遺伝子療法に使用できる。このような組換えcDNAは例えば、ウイルスまたは非ウイルスのいずれのベクターに含めて導入してもよく、ウイルスベクターは限定されるものではないが、癌の治療に既に用いられているレトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ベクターであり得る(Alemanyら, Nat. Biotechnol. 18:723-727 (2000))。もう1つの手法は治療量の配列番号72のポリペプチドを、好ましくは好適な医薬担体と組み合わせて投与することである。このような担体には、限定されるものではないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノールおよびその組合せが挙げられる。
【０９１８】
もう1つの実施形態では、配列番号71またはその断片のヌクレオチド配列を含んでなるオリゴヌクレオチドプローブのアレイを、例えば、遺伝子突然変異を効果的にスクリーニングするために構築することができる。このマイクロアレイを用いて多数の遺伝子の発現レベルを同時にモニタリングし、遺伝子の変異体、突然変異および多型を同定することができる。この情報は遺伝子機能の決定、疾患の遺伝的基礎の理解、疾患の診断、ならびに治療剤の開発およびその活性のモニタリングに使用してもよい(例えば、Chee, M.ら, Science, 274:610-614 (1996)参照)。癌細胞の従来型いくつかの特徴は不適切なヒストン脱アセチル化によって発現することが分かっている[総説としては、Wade, P.A. Hum Mol Genet;10(7):693-698 (2001)参照]。
【０９１９】
もう1つの関連する実施形態は本発明のタンパク質のアンタゴニストおよびHDAC複合体を構築するための配列番号72、その相補物、またはそのいずれかの部分の使用に関する。ヒストンデアセチラーゼのアンタゴニストまたは阻害剤は実際に遺伝子サイレンシングの抑制に使用してよい。このようなアンタゴニストおよび／または阻害剤は、アンタゴニストとして直接に用いることも、または間接的に本発明のタンパク質を発現する細胞または組織へ薬剤をもたらすためのターゲッティングまたは送達系として用いることも可能な本発明のタンパク質に特異的な抗体であってよい。本発明のタンパク質の発現を阻害するその他の方法には本明細書に記載のアンチセンス法および三重らせん法が挙げられる。その他の本発明のタンパク質のアンタゴニストまたは阻害剤は、薬剤ライブラリーをスクリーニングして本発明のタンパク質と特異的に結合するものを同定することをはじめとする、当技術分野で一般に公知の方法を用いて生成すればよい。本発明のタンパク質、またはその断片、好ましくはその機能的または免疫原性断片、またはそれに関するオリゴペプチドは、種々の薬物スクリーニング技術のいずれかで化合物ライブラリーのスクリーニングに使用することができる。このようなスクリーニングに用いる断片は溶液中で遊離状態であってもよいし、固相支持体へ結合させてもよいし、細胞表面に支持されてもよいし、または細胞内に位置していてもよい。本発明のタンパク質またはその断片またはその誘導体と、試験する物質との間の結合複合体の形成を測定してもよい。使用し得る薬物スクリーニングためのもう1つの技術としては、PCT出願WO84/03564に公開されている記載の通り、本発明のタンパク質と好適な結合親和性を持つ化合物のハイフループットスクリーニングを提供する。異常な遺伝子サイレンシングは、限定されるものではないが、Cochayne症候群、運動失調末梢血管拡張症およびウェルナー症候群などの早期老化症候群ならびに年齢に関係する疾病ならびに痴呆およびパーキンソン病など老齢に関係する疾病の「早発」形態などの疾患を引き起こす。
【０９２０】
配列番号74のタンパク質(内部表示クローン500716683_204-24-2-0-D12-F)
アミノ酸配列:
MAVLLLLLRALRRGPGPGPRPLWGPGPAWSPGFPARPGRGRPYMASRPPGDLAEAGGRALQSLQLRLLTPTFEGINGLLLKQHLVQNPVRLWQLLGGTFYFNTSRLKQKNKEKDKSKGKAPEEDEGIFIを含んでなる配列番号74のタンパク質は本明細書ではショートパラプレジン（short paraplegin）と称し、クローン500716683_204-24-2-0-D12-FのcDNA(配列番号73)によりコードされる。よって、本願を通じて記載される配列番号74のポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン500716683_204-24-2-0-D12-Fに含まれる核酸によりコードされるポリペプチドについても当てはまることが理解されよう。さらに、本願を通じて記載される配列番号73の核酸の全ての特徴および用途はクローン500716683_204-24-2-0-D12-Fに含まれる核酸についても当てはまることが理解されよう。本発明の好ましい実施形態は、配列番号73、配列番号74およびクローン500716683_204-24-2-0-D12-Fの組成物に関する。また、本明細書に記載のような生物活性を有するポリペプチド断片およびそれらの断片をコードするポリヌクレオチドも好ましい。
【０９２１】
配列番号74のタンパク質は塩基9〜395間にORFを持つ879ヌクレオチドの核酸によりコードされ、129アミノ酸のタンパク質をなす。このタンパク質はヒトプロテアーゼと、会合したプロテイン15(PPRG-15)の配列(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、PCT公開WO200009709-A2に記載)、および遺伝性痙性対麻痺に関連するタンパク質の配列(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるPCT公開 WO9958556-A2に記載)の変異体である。それはそのN末端に17アミノ酸残基にわたるシグナルペプチドを有する。配列番号74のタンパク質は脳に局在し、ミトコンドリア局在シグナルペプチドを有する。
【０９２２】
さらに、配列番号74のタンパク質は遺伝性痙性対麻痺に関連するタンパク質配列のN末端と高い相同性を示す(PCT公開WO9958556-A2に記載)。遺伝性痙性対麻痺(HSP)は皮質脊髄軸策の変性による進行性の脆弱化および下肢の痙縮が特徴である。(Harding, A.E., J. Med. Genet. 18: 436-441(1981); Fink, J.K.ら, Am. J. Hum. Genet. 56:188-192 (1997); Reid, E., J. Med. Genet. 34:499-503, (1997))。これは約10,000人に1人が罹患する神経変性疾患の遺伝的異種群である(Filla (1992); Poloら(1993))。HSPの患者は一般的に、脚のこわばりおよび歩行困難、鋭い刺激に対する認識力の低下、および下肢遠位での振動感覚の消失を示す。発症年齢および症状の重篤度共に、同じ家系の個体間であっても変動が大きい(Harding, A.E., J. Med. Genet. 18: 436-441(1981); Durrら, 1994)。現在、HSPの症状を予防、治癒、または進行を遅延させる特異的療法はない。
【０９２３】
HSPの「純粋」な形態に代表的な上記の臨床範囲に加えて、患者の中には精神発達遅滞、末梢神経障害、筋萎縮、運動失調、色素性網膜炎、視神経萎縮、難聴、および魚鱗癬などのさらなる神経学的および非神経学的症状の存在が特徴のHSPの「複合」型を示すものもいることが分かっている(Bonneau, D.ら, J. Med. Genet. 30:381-384 (1993); Gigli, G.L.ら, Am. J. Med. Genet. 45:711-716 (1993); Lizcano-Gil, L.A.ら, Am. J. Med. Genet. 68:1-6 (1997); Webb, S.ら, Epilepsia 38:495-499 (1997))。これらの型のいくつかはファミリーで分離することが分かっているにもかかわらず、HSPの複合型が別個の遺伝子の存在を表すのかまたは純粋型HSPの変異型形態を表すのかどうか未だに不明である。しかし、HSPの純粋型であったとしても(すなわち、下部に限られる臨床徴候を有する)、より広範な無症状の神経系の存在が証明されている[Tedeschi, G.ら, J. Neurol. Sci. 103:55-60 (1991); Durr, A.ら, Neurology 44:1274-1277 (1994)]。
【０９２４】
遺伝子の異質性を示すHSPの常染色体優性、常染色体劣性およびX染色体連鎖型が記載されている[Harding, A.E., J. Med. Genet. 18: 436-441(1981); Fink, J.K.ら, Am. J. Hum. Genet. 56:188-192 (1997); Reid, E., J. Med. Genet. 34:499-503, (1997)]。Casariと共同研究者らは染色体16qのテロメア領域に位置する遺伝性痙性対麻痺に関連する遺伝子、およびそれに由来するパラプレジンと称するタンパク質を同定し特性決定している[Casari, G.ら, Cell 93:973,983 (1998)]。
配列番号74のタンパク質またはその断片は遺伝性痙性対麻痺に関連するミトコンドリアタンパク質であると考えられている。本発明のタンパク質またはその断片はミトコンドリアの分解機構に役割を果たしている可能性がある。好ましい本発明のポリペプチドは1〜125番の配列番号74のアミノ酸を含んでなるポリペプチドである。その他の好ましい本発明のポリペプチドは本明細書に記載のいずれかの生物活性を有する配列番号74の断片である。
【０９２５】
本発明のもう1つの実施形態は、例えば遺伝性痙性対麻痺[Casari, G.ら, Cell 93:973,983 (1998)]、神経弛緩薬性悪性症候群(NMS)[Kuboら, Forensic Sci. Int. 115:155-158 (2001)]、レット症候群[Armstrong, Brain Dev. 14 Suppl:S89-98 (1992)]、アルパーズ病[Chow and Thorburn, Hum. Reprod. 15 Suppl 2:68-78 (2000)]またはミトコンドリア脳筋症[Handranら, Neurobiol. Dis. 3:287-298 (1997)]などのミトコンドリア関連ヒト疾患に関連するこの器官の数的な何らかの変化、トポロジーまたは形態を可視化するために本発明のタンパク質またはその断片を用いてミトコンドリアを標識する組成物および方法に関する。Casariおよび共同研究者らは免疫蛍光研究によってパラプレジンタンパク質がミトコンドリアに局在することを示している[Casari, G.ら, Cell 93:973,983 (1998)]。パラプレジンタンパク質は、本発明のタンパク質と相同性の高いN末端のらせん回転 (helical wheel)パターン(片側は塩基性残基(主にアルギニン)からなる両親媒性構造で反対側は非極性残基)を示している;さらに、初めの41アミノ酸のうちでリシンに対して高い割合のアルギニンは代表的なミトコンドリアリーダー配列の存在を示している[Casari, G.ら, Cell 93:973,983 (1998)]。例えば、このタンパク質は本発明のタンパク質をコードするcDNAを、タグ配列をコードする配列と読み取り枠を合わせて真核発現ベクターへ挿入することにより容易に検出可能とし得る。また、タグをつけた本発明のタンパク質を発現する真核細胞を、いずれかのミトコンドリアに関連する疾病または疾患を治療可能な薬物または遺伝子のin vitroスクリーニングに使用してもよい。もう1つの例として、本発明のタンパク質またはその断片を用いて、次に当業者に周知の方法によってミトコンドリアの構造を可視化できる特異的抗体を生成してもよい。
【０９２６】
もう1つの実施形態では、本発明のタンパク質を用いて異種化合物(ポリペプチドまたはポリヌクレオチド)を脳および／またはミトコンドリアへターゲッティングすることもできる。例えば、遺伝子組換えによりまたは化学的に治療上重要なタンパク質またはポリヌクレオチドと融合した本発明のタンパク質からなるキメラタンパク質によって、上記細胞／組織標的(ミトコンドリア、脳)への特異的な治療用タンパク質/ポリヌクレオチドの送達が可能となるであろう。断片は、推定ペプチドシグナルおよび／またはミトコンドリアへのターゲッティングシグナルを含む可能性のある本発明のタンパク質のその他の断片が好ましい。このような異種化合物を用いてミトコンドリア誘導アポトーシスまたは壊死の誘発および／または抑制など、ミトコンドリア活性を調節することも可能である。例えば、これらの異種化合物は、限定されるものではないが、遺伝性痙性対麻痺をはじめとするミトコンドリアの機能障害による疾患の治療および／または予防に用い得る。さらに、異種ポリヌクレオチドをミトコンドリアの遺伝子治療、すなわち不完全なミトコンドリア遺伝子の置換および／またはミトコンドリア遺伝子の有害な発現の阻害のための核酸送達に用いてもよい。
【０９２７】
配列番号74のタンパク質のアンタゴニストは当技術分野で一般に公知の方法を用いて作出し得る。ある態様では、本発明のタンパク質または断片を用いて、本明細書に記載のものをはじめとする当業者に公知のいずれかの技術を用いて特異的抗体を合成することができる。特に、精製したショートパラプレジンを抗体の産生またはショートパラプレジンと特異的に結合する薬物の同定のための医薬物ライブラリーのスクリーニングに用いてもよい。
【０９２８】
さらなる実施形態では、実質的に精製した配列番号74のタンパク質を含んでなる医薬組成物を、限定されるものではないが、上記に記載のものをはじめとするショートパラプレジンの発現または活性の変化に関連する疾患の治療または予防のために好適な医薬担体と共に被検体へ投与しうる。ショートパラプレジンと特異的に結合する抗体はアンタゴニストとして直接に用いても、ショートパラプレジンを発現する細胞または組織へ医薬物をもたらすためのターゲッティングまたは送達機構として間接的に用いてもよい。
【０９２９】
もう1つの実施形態では、配列番号74のタンパク質と特異的に結合する抗体をショートパラプレジンの発現を特徴とする疾患の診断に用いうる。末端切断型パラプレジンは遺伝性痙性対麻痺に関与している(Casari, G.ら, Cell 93:973,983 (1998))。ショートパラプレジンの診断アッセイにはヒト体液中または細胞もしくは組織抽出物中でショートパラプレジンを検出するため抗体および標識を利用する方法が挙げられる。ELISA、RIA、およびFACSをはじめとするショートパラプレジンを測定するための種々のプロトコールが当技術分野で公知であり、ショートパラプレジン発現の存在を診断する基礎を提供する。
【０９３０】
もう1つの実施形態では、配列番号73のポリヌクレオチドまたは断片は、関連疾患、例えば限定されるものではないが、遺伝性痙性対麻痺の存在を検出するアッセイで診断目的に用いてよい。用い得るポリヌクレオチドとしては、オリゴヌクレオチド配列、相補RNAおよびDNA分子、PNAが挙げられる。このポリヌクレオチドは、ショートパラプレジンの発現が疾病と相関する、生検組織での遺伝子発現の検出および定量に用いうる。ショートパラプレジンをコードするヌクレオチド配列は標準法により標識し、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件下で患者由来の体液または組織サンプルへ添加しうる。好適なインキュベーション期間の後、このサンプルを洗浄し、シグナルを定量化して標準値と比較する。患者サンプル中のシグナル量が対照サンプルと比較して有意に増加した場合には、サンプル中のショートパラプレジンをコードするヌクレオチド配列レベルの増加の存在は、関連する疾患、特に限定されるものではないが、遺伝性痙性対麻痺の存在を示す。このようなアッセイはまた臨床試験の動物試験における特定の治療処置計画の有効性の評価にまたは個別の患者の治療のモニタリングに用いることができる。
【０９３１】
ひと度疾患の存在が確立され、治療プロトコールが開始されると、ハイブリダイゼーションアッセイを定期的に繰り返して、患者における発現レベルが正常な被検体に認められる近似値で始まるかどうかを判定すればよい。連続アッセイから得られた結果を用いて経時的な治療の有効性を示すことができる。
【０９３２】
もう1つの実施形態では、配列番号73のヌクレオチド配列またはその断片を含んでなるオリゴヌクレオチドプローブのアレイを、例えば、遺伝子突然変異を効果的にスクリーニングするために構築できる。マイクロアレイを用いて多数の遺伝子の発現レベルの同時モニタリング、ならびに遺伝子の変異体、突然変異体、および多型の同定に用いてもよい。この情報は、遺伝子機能の決定、疾患の遺伝的基礎の理解、疾患の診断、ならびに治療剤の開発およびその活性のモニタリングに使用することができる[例えば、Chee, M.ら, Science, 274:610-614 (1996)参照]。例えば、遺伝子の変異体、突然変異体、および多型が遺伝性痙性対麻痺に関連することが示されている[総説としては、Casari, G., and Rugarli, E. Curr. Opin. Genetics and Development, 11:336-342 (2001)参照]。
【０９３３】
もう1つの好ましい実施形態では、本発明のタンパク質またはその断片は、特に、限定されるものではないが、自己免疫疾患および慢性関節リウマチなどの慢性炎症性疾患をはじめとする重篤な副作用に関連する薬物で治療される多数の病状の治療のための酵素／プロドラッグ戦略、および癌化学療法に使用することができる。これらの副作用は、主に使用する薬物のin vivo選択性が極めて低い(例えば、大部分の抗癌剤の腫瘍と正常細胞との間の不適切な選択性は周知であり、正常組織に対するその毒性が用量を制限する)という事実により説明される。このようなプロトコールの一例の最初の段階では、本発明のタンパク質またはその断片と組織特異的抗原に対する抗体のコンジュゲート(例えば、癌化学療法の場合の腫瘍特異的抗原)を投与する。残りの酵素コンジュゲートが血液からクリアランスされる猶予の後、比較的毒性のない化合物を患者へ投与する。この毒性のない化合物は本発明のタンパク質の基質であり、このタンパク質によって実質的に毒性のより高い化合物へ変換される。従って、本発明のタンパク質を予め標的化投与するために、毒性のない化合物を投与する場合はこの有毒化合物を融合タンパク質によってターゲッティングされる細胞の近傍に産生させるだけでよい。この2段階手法は抗体ターゲッティング酵素プロドラッグ療法(ADEPT)と呼ばれ、この手法はMeltonらが概説している[Melton R.ら, J. Natl. Cancer Inst., 88, p153-165 (1996)]。あるいは第一段階は、標的化組織由来の細胞による本発明のタンパク質またはその断片の新規合成を結果としてもたらす遺伝子治療手法に置き換え可能であり、これは遺伝子依存性酵素／プロドラッグ療法(GDEPT)と呼ばれている。これら2つの手法(ADEPTおよびGDEPT)のもう1つの利点は、単独の酵素分子が多くのプロドラッグ分子を活性化させることができるということである。
【０９３４】
配列番号76のタンパク質(内部表示クローン500760207_205-58-4-0-H6-F)
アミノ酸配列:
MMGVFVVAAKRTPFGAYGGLLKDFTATDLSEFAAKAALSAGKVSPETVDSVIMGNVLQSSSDAIYLARHVGLRVGIPKETPALTINRLCGSGFQSIVNGCQEICVKEAEVVLCGGTESMSQAPYCVRNVRFGTKLGSDIKLEDSLWVSLTDQHVQLPMAMTAENLAVKHKISREECDKYALQSQQRWKAANDAGYFNDEMAPIEVKTKKGKQTMQVDEHARPQTTLEQLQKLPPVFKKDGTVTAGNASGVADGAGAVIIASEDAVKKHNFTPLARIVGYFVSGCDPSIMGIGPVPAISGALKKAGLSLKDMDLVEVNEAFAPQYLAVERSLDLDISKTNVNGGAIALGHPLGGSGSRITAHLVHELRRRGGKYAVGSACIGGGQGIAVIIQSTAを含んでなる配列番号76のタンパク質は本明細書ではケトチオラーゼ(KT)と称し、クローン500760207_205-58-4-0-H6-FのcDNA(配列番号75)によりコードされる。よって、本願を通じて記載される配列番号76のポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン500760207_205-58-4-0-H6-FのヒトcDNAによりコードされるポリペプチドについても当てはまることが理解されよう。さらに、本願を通じて記載される配列番号75の核酸の全ての特徴および用途はクローン500760207_205-58-4-0-H6-FのヒトcDNAについても当てはまることが理解されよう。本発明の好ましい実施形態は、配列番号75、配列番号76およびクローン500760207_205-58-4-0-H6-Fの組成物に関する。また、本明細書に記載のような生物活性を有するポリペプチド断片およびそれらの断片をコードするポリヌクレオチドも好ましい。
【０９３５】
配列番号75のcDNAによってコードされる配列番号76のタンパク質は3-ケトアシルCoAチオラーゼタンパク質(GENPEPT受託番号D16294)の多型変異体である。さらに、配列番号76のアミノ酸配列を用いたBLAST検索により本発明のタンパク質はラット(Swissprot受託番号P13437)およびバシラス・ハロデュランス(Bacillus halodurans)(Genbank受託番号AP001514)の3-ケトアシルCoAチオラーゼと相同であるということが示されている。
【０９３６】
配列番号76の394個のアミノ酸のタンパク質はアミノ酸373〜393にわたる1つの候補膜貫通（membrane-spanning）セグメントを示す。従って、本発明のいくつかの実施形態は膜貫通ドメインを含んでなるポリペプチドプチドに関する。最後に、本発明のタンパク質はそれぞれ85〜103番、339〜355番および374〜387番にまたがる3つのチオラーゼ特性(PS00098、PS00737、PS00099)を示す。従って、本発明のいくつかの実施形態はチオラーゼ特性を含んでなるポリペプチドに関する。
【０９３７】
生物は内因的合成によってまたは外来の供給源からのいずれかで生じるいくつかの異なる脂肪酸およびその種々の誘導体に曝されている。これらの親水性化合物は排除される前に生物において特定の代謝的、構造的または内分泌機能を果たすことができ、CO2にまたはより極性の脂質代謝物に代謝されてその排出が可能となる。量的には、脂肪酸を代謝する主要な経路の1つはβ-酸化であり、これは3種の酵素によって触媒される4種の反応のらせんと記載されることも多い。
【０９３８】
長鎖3-ヒドロキシル-CoAデヒドロゲナーゼを含む、脂肪酸のミトコンドリアβ-酸化の3つの連続ステップステップは、三機能タンパク質:2-エノイル-CoAヒドラターゼ、3-ヒドロキシアシル-CoAデヒドロゲナーゼおよび3-ケトアシル-CoAチオラーゼによって触媒される。4つのαおよび4つのβサブユニットを含むヘテロ複合体の酵素活性の欠損は乳幼児の原因不明の突然死、ライ様症候群、心筋症または骨格筋障害を引き起こす。
【０９３９】
三機能タンパク質の欠陥は2つの群に分類される:3-ヒドロキシアシル-CoAデヒドロゲナーゼに単独の欠陥のある患者および3つの活性すべてに欠陥があり、かつ、免疫応答タンパク質がない患者(Tyni, J.ら, Acta Paeditr. 88:237-245 (1999))。第2群の患者は2-エノイル-CoAヒドラターゼおよび3-ヒドロキシアシル-CoAデヒドロゲナーゼをコードするα-サブユニットcDNAに欠失または3-ケトアシル-CoAチオラーゼをコードするβ-サブユニットに点変異のいずれかを有すると認められている[Ushikubo, S.ら, Am. J; Hum. Genet. 58: 979-988 (1996); Ori, K.F.ら, Hum. Mol Genet. 6: 1215-1224 (1997)]。
【０９４０】
配列番号76のタンパク質またはその断片は好ましくはエステル結合に作用するヒドロラーゼ、より好ましくはチオールエステルヒドロラーゼ、いっそうより好ましくは、それ自体で脂肪酸代謝において、細胞の小胞輸送および細胞構築の維持において、細胞のタンパク質分解、エンドサイトーシス、シグナル伝達、リソソーム貯蔵、細胞増殖および分化、免疫および炎症応答において役割を果たすケトアシル-CoAチオラーゼであると考えられる。この酵素の基質は好ましくはエステル結合、好ましくはチオールエステル結合、より好ましくはアシルチオエステル結合を含む化合物である。本発明の好ましいポリペプチドとしては85〜103番、339〜355番および374〜387番にわたる配列番号76のアミノ酸を含んでなるポリペプチドがある。本発明のその他の好ましいポリペプチドとしては本明細書に記載の生物活性のいずれかを有する配列番号76の断片がある。本発明のタンパク質またはその断片の加水分解活性は米国特許第5,445,942号に記載されるものをはじめとして当業者に公知のアッセイのいずれかを用いてアッセイすればよい。補因子との結合能も、例えば、米国特許第5,986,172号に記載されるNAD結合についてのアッセイをはじめ当業者に周知の技術のいずれかを用いてアッセイすればよい。
【０９４１】
本発明のもう1つの実施形態は、例えば、神経弛緩薬性悪性症候群(NMS)(Kuboら, Forensic Sci. Int. 115:155-158 (2001))、レット症候群(Armstrong, Brain Dev. 14 Suppl:S89-98 (1992))、アルパーズ病(Chow and Thorburn, Hum. Reprod. 15 Suppl 2:68-78 (2000))またはミトコンドリア脳筋症(Handranら, Neurobiol. Dis. 3:287-298 (1997))などのミトコンドリア関連ヒト疾患に関連するこの器官の数、トポロジーまたは形態の何らかの変化を可視化するためにミトコンドリア、より詳しくはミトコンドリア内膜を標識するための本発明のタンパク質またはその断片を用いる組成物および方法に関する。例えば、本発明のタンパク質をコードするcDNAを真核生物の発現ベクターにタグ配列をコードする配列と読み取り枠を合わせて挿入することでタンパク質を容易に検出できるようにしてもよい。本発明のタグをつけたタンパク質を発現する真核細胞はまたいずれかのミトコンドリア関連疾病または症状を治療できる薬剤または遺伝子のin vitroスクリーニングに用いてもよい。
【０９４２】
ある実施形態では、本発明は配列番号76のタンパク質またはその断片を組織種(特に胎盤)のマーカーとして用いる、または組織サンプルの2以上の可能性ある供給源をサンプル中の配列番号76のタンパク質のレベルに基づいて区別するための組成物および方法に関する。例えば、 配列番号76のタンパク質またはその断片を当業者に公知の技術を用いて抗体を作製するために用いてもよく、次いで、この抗体を、免疫化学を用いて、未知の起源の組織、例えば、法医学サンプル、他の体の部位に転移している分化した腫瘍組織を同定するために、または組織切片において種々の組織種を区別するために用いてもよい。典型的には、このような方法では、組織サンプルを抗体結合を容易にする条件下で検出可能に標識され得る抗体と接触させる。ある実施形態では、試験サンプルとの抗体の結合レベルを測定し、胎盤由来の対照細胞、または胎盤以外の組織から予測される結合レベルと比較して試験サンプルが胎盤由来であるかどうかを調べる。このような方法はまた、細胞同一性を調べるためのその他の独立した方法とともに実施してもよい。同様の方法を本タンパク質を発現する細胞を特異的に検出するため、ならびに、本タンパク質を発現する細胞を特異的に単離するため、または本タンパク質自体を単離するために用いてもよい。例えば、配列番号76のタンパク質またはその断片に対する抗体をクロマトグラフィーマトリックスなどの固相支持体に固定化してもよい。配列番号76のタンパク質を発現する細胞を含有する調製物を抗体との結合を容易にする条件下で抗体と接触させて置く。支持体を洗浄し、次いで、支持体を抗体からタンパク質を解離させる薬剤と接触させることでタンパク質が支持体から放出される。
【０９４３】
もう1つの実施形態では、本発明のタンパク質を胎盤および／または細胞ミトコンドリアに対する異種化合物(ポリペプチドまたはポリヌクレオチド)をターゲッティングするために用いてもよい。例えば、治療上重要なタンパク質またはポリヌクレオチドと組換えによってまたは化学的に融合した本発明のタンパク質からなるキメラタンパク質は上記の細胞／組織標的(ミトコンドリア、胎盤)への治療タンパク質／ポリヌクレオチドの特異的送達を可能にするであろう。
【０９４４】
本発明のもう1つの実施形態は、当業者に公知のいずれかの方法によってトランスジェニックモデル動物(ショウジョウバエ（D. melanogaster）、マウス（M. musculus）)を確立するための本発明のタンパク質またはその断片をコードするポリヌクレオチド配列を用いる組成物および方法に関する。薬剤または変更（modifier）遺伝子(アクチベーターまたはサプレッサー遺伝子)を用いてトランスジーンの発現をin vivoで調節することにより、筋障害または肥満症などのヒトミトコンドリア関連疾患を模倣する動物モデルを開発することができる。従って、これらの動物モデルによって疾患の治療のための可能性ある治療薬の同定が可能となる。さらに、これらのトランスジェニック動物由来の組換え細胞系をex vivoでの同様の手法に用いてもよい。
【０９４５】
もう1つの実施形態では、本発明は重要な基質のリガンドなどの本発明のタンパク質またはその断片を用いる組成物および方法に関する。好ましい実施形態では、本発明のタンパク質またはその断片を当業者に公知の任意の技術を用いて基質を同定および／または定量するために用いてもよい。基質を見出すためには、種々の薬剤スクリーニング技術のうちのいずれかにおいて本発明のタンパク質またはその断片もしくはその誘導体を用いて化合物のライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなスクリーニングに用いる断片は溶液中に遊離状態であってもよいし、固相支持体に結合されていてもよいし、細胞表面に支持されていてもよいし、または細胞内に位置していてもよい。本発明のタンパク質またはその断片もしくはその誘導体と被験薬剤の間の結合複合体の形成を測定すればよい。本発明のタンパク質のアンタゴニストまたは阻害剤は医薬のライブラリーをスクリーニングして本発明のタンパク質と特異的に結合するものを同定することをはじめとして当技術分野で公知の方法を用いて得ることができる。使用できる薬剤スクリーニングのためのもう1つの技術は、PCT国際公開WO84/03564に記載されるような、本発明のタンパク質に対して好適な結合親和性を有する化合物のハイスループットスクリーニングを提供する。
【０９４６】
もう1つの実施形態では、本発明は特定の生物学的サンプルに存在する本発明のタンパク質レベルを検出し定量するための方法および組成物に関する。これらの方法は本発明のタンパク質レベルの変更など、限定されるものではないが、ヒドロゲナーゼ活性(LCHAD活性)の欠損を伴う疾病の診断または予防にとって有用である。本発明のタンパク質を検出するための診断アッセイは、生検、器官もしくは組織切片由来の細胞または腫瘍もしくは正常組織由来の細胞の吸引液のin situアッセイを含み得る。さらに、このアッセイは器官、組織、細胞、尿または血清もしくは血液由来の細胞抽出物またはいずれかの他の体液もしくは抽出物で実施してもよい。
【０９４７】
配列番号76のKTの定量のためのアッセイは当技術分野で周知の方法に従って実施すればよい。典型的にはこれらのアッセイはサンプルを本発明のタンパク質のリガンドまたは本発明のタンパク質もしくはその断片を認識する抗体(ポリクローナルまたはモノクローナル)と接触させ、サンプル中に存在する本発明のタンパク質とリガンドまたは抗体の間で形成される複合体を検出することを含んでなる。リガンドおよび抗体の断片を結合アッセイに用いてもよい（ただし、これらの断片は本発明のKTと特異的に相互作用し得る）。さらに、本発明のKTと結合するリガンドおよび抗体を当技術分野で公知の方法に従って標識してもよい。本発明において有用な標識としては、限定されるものではないが、酵素標識、放射性同位元素標識、常磁性標識および化学発光標識が挙げられる。典型的な技術はKennedy, J. H.ら (1976) Clin. Chim. Acta 70:1-31およびSchurs, A. H.ら (1977) Clin. Chim. Acta 81: 1-40に記載されている。
【０９４８】
もう1つの実施形態では、本発明は、個体のある症状を治療するまたは回復させるための所望の生物活性を有する配列番号76のタンパク質または断片の使用を含む。例えば、この症状はヒドロゲナーゼ活性の欠損(LCHAD欠損)、低血糖症、筋緊張低下、高アンモニア血症、軽度肝機能障害、3-ヒドロキシジカルボン酸尿症、心筋症、網膜ジストロフィー、バナヤン・リレイ・ルバルカバ(Bannayan-Riley-Ruvalcaba)症候群、ヒドロゲナーゼ活性の機能の何らかの異常であり得る。このような実施形態では、配列番号76のタンパク質のいずれかの活性の増加または低下が望まれる個体に配列番号76のタンパク質またはその断片を投与する。配列番号76のタンパク質またはその断片は個体に直接投与してもよいし、あるいは、個体に配列番号76のタンパク質またはその断片をコードする核酸を投与してもよい。あるいは、配列番号76のタンパク質の活性を増加させる薬剤を個体に投与してもよい。このような薬剤は配列番号76のタンパク質または配列番号76のタンパク質を含有する細胞もしくは調製物を試験薬剤と接触させ、試験薬剤がタンパク質の活性を増加させるかどうかをアッセイすることによって同定すればよい。例えば、試験薬剤は化学化合物またはポリペプチドもしくはペプチドであり得る。あるいは、配列番号76のタンパク質の活性は個体にこのような活性を干渉する薬剤を投与することによって低下させてもよい。配列番号76のタンパク質の活性を干渉する薬剤は配列番号76のタンパク質または配列番号76のタンパク質を含有する細胞もしくは調製物を試験薬剤と接触させ、試験薬剤がタンパク質の活性を低下させるかどうかをアッセイすることによって同定すればよい。例えば、この薬剤は、化学化合物、ポリペプチドもしくはペプチド、抗体またはアンチセンス核酸もしくは三重らせん体形成性核酸などの核酸であり得る。
【０９４９】
もう1つの実施形態では、本発明はまた配列番号75のポリヌクレオチドの診断試薬としての使用に関する。機能障害と関連がある配列番号75のポリヌクレオチドを特徴とする遺伝子の変異型の検出は疾病または疾病に対する感受性の診断を捕捉または規定し得る診断ツールを提供する。これまでに、βサブユニットの変異が上記で挙げられたものなどの三機能タンパク質関連疾病を引き起こすということが示されている[Ushikibo, S.ら, Am. J. Hum. Genet. 58:979-988 (1996); Ori, K.F.ら, Hum. Mol Genet. 6:1215-1224 (1997)]。遺伝子に変異のある個体は当業者に公知の種々の技術によってDNAレベルで検出され得る。診断のための核酸は、血液、尿、唾液、組織生検または培検材料からなどの対象細胞から得ればよい。ゲノムDNAを直接検出に用いてもよいし、または解析に先立ってPCRもしくはその他の増幅技術を用いて酵素的に増幅してもよい。
【０９５０】
もう1つの実施形態では、例えば、遺伝子変異の効率的なスクリーニングを実施するために配列番号75のヌクレオチド配列またはその断片を含んでなるオリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築してもよい。多数の遺伝子の発現レベルを同時にモニタリングし、また遺伝子変異体、変異および多型を同定するためにマイクロアレイを用いてもよい。この情報は遺伝子機能を決定するために、疾患の遺伝的基礎を理解するために、疾患を診断するために、また治療薬を開発し、その活性をモニタリングするために用いることができる(例えば、Chee, M.ら, Science, 274:610-614 (1996)参照)。
【０９５１】
配列番号78のタンパク質(内部表示クローン122421_105-076-4-0-H1-F)
クローン122421_105-076-4-0-H1-FのcDNA(配列番号77)はアミノ酸配列:
MAAALFVLLGFALLGTHGASGAAGTVFTTVEDLGSKILLTCSLNDSATEVTGHRWLKGGVVLKEDALPGQKTEFKVDSDDQWGEYSCVFLPEPMGTANIQLHGPPRVKAVKSSEHINEGETAMLVCKSESVPPVTDWAWYKITDSEDKALMNGSESRFFVSSSQGLSELHIENLNMEADPGQYRCNGTSSKGSDQAIITLRVRSHLAALWPFLGIVAEVLVLVTIIFIYEKRRKPEDVLDDDDAGSAPLKSSGQHQNDKGKNVRQRNSSを含んでなる配列番号78のタンパク質をコードする。よって、本願を通じて記載される配列番号78のポリペプチドの全ての特徴および用途は、クローン122421_105-076-4-0-H1-Fに含まれる核酸によりコードされるポリペプチドについても当てはまることが理解されよう。さらに、本願を通じて記載される配列番号77の核酸の全ての特徴および用途は、クローン122421_105-076-4-0-H1-Fに含まれる核酸についても当てはまることが理解されよう。本発明の好ましい実施形態は、配列番号77、配列番号78およびクローン122421_105-076-4-0-H1-Fの組成物に関する。また、本明細書に記載のような生物活性を有するポリペプチド断片およびそれらの断片をコードするポリヌクレオチドも好ましい。
【０９５２】
配列番号78のタンパク質(BASI2)はヒトバシジンの新規な多型変異体である。BASI2はシグナルペプチド(MAAALFVLLGFALLGTHG)、および2つの免疫グロブリン(Ig)ドメイン(GSKILLTCSLNDSATEVTGHRWLKGGVVLKEDALPGQKTEFKVDSDDQWGEYSCVFおよびGETAMLVCKSESVPPVTDWAWYKITDSEDKALMNGSESRFFVSSSQGLSELHIENLNMEADGQYRCNGTSS)を示す。さらに、BASI2は3つのN-グリコシル化部位(NDSA、NGSEおよびNGTS)を示す。バシジンにおける166番のアルギニンは、BASI2ではロイシンに変化している。このようにBASI2に存在する多型的非保存変異は第２のIgドメインに位置し、タンパク質間相互作用に関与している。そのような第２のIgドメインの新規な多型変化は今まで報告されていない。バシジンの新規な多型変異体としての、BASI2はバシジンと類似の生物活性を示すが、タンパク質間相互作用の際には高い動態パラメーターを示す。
【０９５３】
BASI2は免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、T細胞受容体、神経細胞接着分子および主要組織適合複合体抗原を含む。BASI2は広範に分布し、活性化された神経膠腫、腫瘍細胞、活性化されたT細胞および網膜色素上皮および新生児の血液脳関門で特に高レベルで発現されている細胞表面膜貫通糖タンパク質である。BASI2は細胞間相互作用に関与し、多様な生物学的役割を有する。特に、BASI2は種々のマトリックス・メタロプロテイナーゼ (MMP)、細胞外マトリックスの大部分の化合物の分解に関与する酵素群の生合成を刺激する。特に、MMP生合成は腫瘍分泌および免疫応答においては重要である。BASI2は精子形成および受精、中枢神経系における神経相互作用およびHIV-1感染において役割を果たしている。
【０９５４】
本発明のある実施形態は、メタロプロテイナーゼの生合成を刺激するためにBASI2またはその断片を用いる方法に関する。ある好ましい実施形態では、このような方法によって得られたメタロプロテイナーゼを、そのタンパク質が何であるかをしらずに広範なタンパク質を消化し得るプロテアーゼの「カクテル」に用いてもよい。このようなプロテアーゼカクテルは、検査アッセイにおいてサンプル中の望ましくないタンパク質を分解するのに、例えば、DNA調製物中のタンパク質を除去するために、またはいずれかの酵素反応後に酵素を除去するために有用である。もう1つの好ましい実施形態では、このような方法によって得られたメタロプロテイナーゼをメタロプロテイナーゼ阻害剤のスクリーニングおよび／またはアッセイに用いてもよい。このようなメタロプロテイナーゼ阻害剤はメタロプロテイナーゼ活性化と関連する広範な疾病を治療および／または予防するのに極めて有用である。さらにもう1つの好ましい実施形態では、このような方法によって得られたメタロプロテイナーゼを例えば、食品産業において結合組織の分解に用いてもよい。このような方法にはメタロプロテイナーゼ生合成を刺激するいずれの方法を用いてもよい。例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるGuoら(J Biol Chem 272:24-7 (1997)に記載されるように繊維芽細胞を刺激してもよい。
【０９５５】
本発明のある実施形態は、癌、移植片拒絶および移植片対宿主病の診断にBASI2またはその断片を用いる方法に関する。このような方法では、BASI2またはその断片をBASI2および／またはバシジン発現がアップレギュレートされている、およびMMPが合成されている細胞を検出および／または定量するためのマーカーとして用いる。このような方法にはBASI2および／またはバシジンの存在、レベルまたは活性を検出するいずれの方法を用いてもよい。例えば、本発明のタンパク質またはその断片を標準的な方法を用いて特異的抗体を作製するために用いてもよい。抗体は直接または間接的にのいずれかで標識され、第2のIgドメインを認識するのが好ましい。ある好ましい実施形態では、抗体はバシジンなどの関連タンパク質よりも特異的にBASI2と結合する。このような抗体はBASI2変異体の存在を特異的に検出するために使用できる。もう1つの好ましい実施形態では、抗体はバシジンとBASI2の双方を認識する。このような抗体はバシジンおよびBASI2分子の全量を検出するために用いてもよい。あるいは、当業者に公知のいずれかの技術を用いて特異的プローブを合成するために本発明の核酸またはその断片を用いてもよい。このようなアッセイおよび診断キットでは、所定の組織または体液に由来する非悪性細胞に相当する対照と比較してより高レベルのBASI2および／またはバシジン発現の検出は、腫瘍の存在または移植片拒絶応答の開始と診断される。
【０９５６】
本発明のもう1つの実施形態はメタロプロテイナーゼ生合成の結果として引き起こされるかまたは悪化する疾患の治療または予防のために患者においてBASI2の活性または発現を阻害する組成物および方法に関する。BASI2活性または発現の阻害はいずれかの好適な方法を用いて、例えば、患者への治療上有効な量のBASI2またはその断片を認識する抗体の投与によって達成すればよい。抗体は直接または間接的にのいずれかで標識され、第2のIGドメインを認識するのが好ましい。ある好ましい実施形態では、抗体はバシジンなどの関連タンパク質よりも特異的にBASI2と結合する。このような抗体はBASI2変異体を特異的に阻害するために使用できる。もう1つの好ましい実施形態では、抗体はBASI2とバシジンの双方を認識する。このような抗体は両方のイソ型を阻害するために使用できる。抗体は単独で投与してもよいし、当技術分野で公知の1種以上の薬剤、例えば、PCT国際公開WO99/45031に記載されるABX-CBL抗体と組み合わせて投与してもよい。抗体の投与は全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるPCT国際公開WO99/45031に記載されるものをはじめとする当技術分野で公知のいずれかの方法に従って実施すればよい。使用可能なBASI2発現または活性のその他の阻害剤としては、限定されるものではないが、アンチセンス分子、リボザイム、BASI2のドミナントネガティブ型および細胞におけるBASI2の活性または発現を低下させる化合物が挙げられる。このような化合物は、例えば、BASI2を過剰発現する腫瘍細胞に対して試験薬剤をスクリーニングし、試験薬剤のメタロプロテイナーゼ生合成を減少させるかまたはBASI2発現レベルを低下させる能力を検出することによって容易に同定できる。MMP生合成の結果として引き起こされるかまたは悪化し、かつ、BASI2および／またはバシジンの阻害剤の投与によって治療され得る疾病および疾患としては、限定されるものではないが、癌、移植片拒絶および移植片対宿主病が挙げられる。
【０９５７】
さらにもう1つの実施形態は、ミクログリアの活性化の結果として引き起こされるかまたは悪化する疾患の治療または予防のために患者においてBASI2の発現または活性を阻害する組成物および方法に関する。BASI2活性または発現の阻害は上記のいずれかの方法を用いて達成すればよい。ミクログリアの活性化の結果として引き起こされるかまたは悪化する疾患としては、限定されるものではないが、脊髄挫傷、ハンチントン舞踏病、レビ小体を伴う痴呆、虚血、多発性硬化症およびアルツハイマー病が挙げられる。
【０９５８】
さらにもう1つの実施形態は、重篤なHIV感染を治療または減少させるために患者においてBASI2とサイクロフィリンA(CyPA)間の相互作用を阻害するための組成物および方法に関する。相互作用の阻害はいずれかの好適な方法を用いて、例えば、患者への治療上有効な量のBASI2またはその断片を認識する抗体の投与によって達成すればよい。抗体は直接または間接的にのいずれかで標識され、かつ、第1のIgドメインおよび／または第2のIgドメインを認識することが好ましい。抗体の投与は上記のように実施すればよい。
【０９５９】
本発明のもう1つの実施形態は、不妊、学習および記憶障害ならびに網膜血管新生などの、BASI2および／またはバシジン欠損の結果として引き起こされるかまたは悪化する疾患の治療または予防のために、患者においてBASI2および／またはバシジンの発現または活性を増強するための組成物および方法に関する。BASI2またはその断片、本タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはBASI2の発現もしくは活性を高める化合物を含む、BASI2および／またはバシジンの発現または活性を増強するためのいずれの方法または組成物を用いてもよい。このような化合物は、例えば、試験薬剤をBASI2を発現する活性化されていないグリア細胞に対してスクリーニングし、該試験薬剤がメタロプロテイナーゼ生合成を増強する、またはBASI2発現レベルを高める能力を検出することによって容易に同定できる。本発明の組成物はいずれかの好適な方法を用いて、例えば、静脈灌流によってまたは経口投与によって患者に直接投与してもよい。本発明のポリペプチドの有効用量は関連技術によって決定される。
【０９６０】
配列番号80のタンパク質(内部表示99483_105-016-1-0-D7-F)
クローン99483_105-016-1-0-D7-FのcDNA(配列番号79)はアミノ酸配列:
MLPPPRPAAALALPVLLLLLVVLTPPPTGARPSPGPDYLRRGWMRLLAEGEGCAPCRPEECAAPRGCLAGRVRDACGCCWECANLEGQLCDLDPSAHFYGHCGEQLECRLDTGGDLSRGEVPEPLCACRSQSPLCGSDGHTYSQICRLQEAARARPDANLTVAHPGPCESGPQIVSHPYDTWNVTGQDVIFGCEVFAYPMASIEWRKDGLDIQLPGDDPHISVQFRGGPQRFEVTGWLQIQAVRPSDEGTYRCLGPMPWVKWRPLLAを含んでなる配列番号80のタンパク質KSPI1をコードする。よって、本願を通じて記載される配列番号80のポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン99483_105-016-1-0-D7-Fに含まれる核酸によりコードされるポリペプチドについても当てはまることが理解されよう。さらに、本願を通じて記載される配列番号79の核酸の全ての特徴および用途はクローン99483_105-016-1-0-D7-Fに含まれる核酸についても当てはまることが理解されよう。本発明の好ましい実施形態は、配列番号79、配列番号80およびクローン99483_105-016-1-0-D7-Fの組成物に関する。また、本明細書に記載のような生物活性を有するポリペプチド断片およびそれらの断片をコードするポリヌクレオチドも好ましい。以下に記載の方法において用いるために好ましいKSPI1ポリペプチドとしては、
アミノ配列: CAPCRPEECAAPRGCLAGRVRDACGCCWECANLEGQLCDLDPSAHFYGHCGEQLECRLDTGGDLSRGEVPEPLCACRSQSPLCGSDGHTYSQICRLQEAARARPDANLTVAHPGPCを含んでなるポリペプチド;
アミノ酸配列: VPEPLCACRSQSPLCGSDGHTYSQICRLQEAARARPDANLTVAHPGPCを含んでなるポリペプチドが挙げられる。
【０９６１】
配列番号80のタンパク質(KSPI1)は267アミノ酸長のタンパク質であり、bA108L7.1遺伝子の新規な変異体(Genbank受託番号AL133215)である。この2つのタンパク質では最初の255のアミノ酸は同一であるが、KSPI1の最後の12のアミノ酸が独特なものである。KSPI1はシグナルペプチド(MLPPPRPAAALALPVLLLLLVVLTPPPTGA)、カザル（kazal）型セリンプロテアーゼ阻害剤(Ki)ドメイン(VPEPLCACRSQSPLCGSDGHTYSQICRLQEAARARPDANLTVAHPGPC)、免疫グロブリン様(Ig)ドメイン(QDVIFGCEVFAYPMASIEWRKDGLDIQLPGDDPHISVQFRGGPQRFEVTGWLQIQAVRPSDEGTYRCLG)およびインスリン様増殖因子結合ドメイン(CAPCRPEECAAPRGCLAGRVRDACGCCWECANLEGQLC)を示す。さらにまた、KSPI1は多くのインスリン様増殖因子結合タンパク質(IGFBP)の1〜255番と相同性を示し、既知のIGFBPとの最高の相同性としてはヒトMAC25で得られている。
【０９６２】
KSPI1は新規カザル型セリンプロテアーゼ阻害剤である。プロテアーゼ阻害剤はそれらの標的プロテアーゼのタンパク質分解活性を調節するための、緊急時にこれらを遮断するための、または受容体相互作用もしくはクリアランスをシグナル伝達するための重要な天然のツールである。カザル型セリンプロテアーゼ阻害剤は、トリプシン、エラスターゼ、アクロシン、およびトロンビンなどの多数のセリンプロテアーゼを阻害することが示されている。これらのプロテアーゼは、止血、炎症およびアポトーシスなどの主要な生体プロセスに関与することから、それらの阻害剤には広範囲の治療用途があると考えられる(Dahlback, Lancet, 355:1627-32 (2000); Watorekら, Adv Exp Med Biol, 240:23-31 (1988); Martinら, Cell, 82:349-52 (1995))。
【０９６３】
さらに、KSPI1は低親和性IGFBPファミリーに属する。IGFBPはインスリン様増殖因子(IGF)と結合する可溶性タンパク質である。IGFは細胞増殖および代謝の調節に関与し、さらにIGFBPの主要な役割は体液中のIGFアベラビリティを調節することである。いくつかのセリンプロテアーゼ阻害剤は増殖因子の活性化に関係していることが分かっている(Kawaguchiら, J Biol Chem 272:27558-64 (1997))。KSPI1は低親和性IGFBPファミリーに属するセリンプロテアーゼであるため、KSP1はIGFと結合し、セリンプロテアーゼを阻害することによってIGF活性化を調節する。
【０９６４】
本発明のある実施形態は、サンプル中に混入しているプロテアーゼを阻害するためにKSPI1またはその断片を用いる方法に関する。特に、KSPI1はプロテアーゼの特異性がわからなくても広範なプロテアーゼを阻害できるプロテアーゼ阻害剤の「カクテル」に用いることができる。このようなプロテアーゼ阻害剤カクテルは混入しているプロテアーゼによるタンパク質サンプルの分解を阻止するために実験アッセイで広く用いられる。
【０９６５】
もう1つの実施形態では、KSPI1またはその断片はトロンビンにより媒介されるおよびトロンビンが関連する疾患を治療するおよび／または軽減するために用いることができる。トロンビンは凝固カスケードの最終ステップを調節するセリンプロテアーゼであり、止血および血栓形成における重要な調節的役割がある。組成物および方法は、例えば、KSPI1もしくはその断片、タンパク質をコードするポリヌクレオチド、またはKSPI1の発現もしくは活性を増強する化合物を含む。このような化合物は、例えば、KSPI1を発現する細胞に対する試験薬剤をスクリーニングし、さらにKSPI1発現のレベルを高める試験薬剤の能力を検出することにより容易に同定することができる。トロンビンのタンパク質分解活性を遮断する本発明のポリペプチドの能力を調べる方法は米国特許第6,218,365号に記載されている。本発明の組成物はいずれかの好適な方法を用いて、例えば、静脈内潅流または経口投与により患者に直接投与することができる。また、本発明の組成物は、透析および手術に必要な場合には体外循環にも用いることができる。本発明のポリペプチドの有効量は関連技術によって決定される。本発明の組成物は、単独でまたは凝固カスケードのプロテアーゼを阻害するその他の公知の薬剤と組み合わせて投与してもよい。凝固カスケードが活性化される、トロンビンにより媒介されるおよびトロンビンが関連する疾患としては、限定されるものではないが、深部静脈血栓症、肺塞栓症、血栓性静脈炎、血栓症または塞栓症の動脈閉塞、血管形成または血栓溶解術中もしくは術後の動脈再閉塞、動脈損傷または侵襲的心臓学的処置後の再狭窄、術後血栓症または塞栓症、急性もしくは慢性アテローム性動脈硬化症、卒中、心筋梗塞が挙げられる。
【０９６６】
もう1つの好ましい実施形態では、KSPI1またはその断片は、好中球から放出されるプロテアーゼに関係する疾病を治療するおよび／または軽減するために用いることができる。活性化された好中球はエラスターゼまたはカテプシンGなどのセリンプロテアーゼを放出するが、これは適切に制御されなければ結合組織の異常な代謝回転および正常な組織に対する重篤な損傷を引き起こす[Watorekら, Adv Exp Med Biol, 240:23-31 (1988)]。KSPI1またはその断片は好中球から放出されるプロテアーゼを阻害し、本発明のポリペプチドの阻害効果は、強結合阻害剤で導き出した方法を用いてin vitroにおける見かけの平衡解離定数を測定することによって調べることができる[Bieth, Proteinase Inhibitors. 463-9 (1974); Williamsら, Methods Enzymol. 63:437-67 (1979)]。本発明の組成物はいずれかの好適な方法を用いて、例えば、静脈内潅流または経口投与により患者に直接投与することができる。本発明のポリペプチドの有効量は関連技術によって決定される。本発明の組成物は単独でまたは好中球から放出されるプロテアーゼを阻害するその他の公知の薬剤と組み合わせて投与してもよい。好中球から放出されるプロテアーゼが原因で起こる疾病としては、限定されるものではないが、気腫、特発性肺繊維症、成人呼吸窮迫症候群、嚢腫性繊維症、慢性関節リウマチ、臓器不全、糸球体腎炎および種々の炎症性疾患が挙げられる。
【０９６７】
本発明のもう1つの実施形態は、病原微生物によって生成されるプロテアーゼの阻害および／または軽減に関する。この実施形態は、ヒト、動物および細胞培養物における寄生生物による感染症を予防するおよび／または治療するためのKSPI1もしくはその断片、またはKSPI1の発現もしくは活性を増強する化合物の単独またはその他の公知の薬剤と組み合わせての投与に関する。プロテアーゼ阻害剤によって宿主生物におけるウイルス、原生動物、細菌または真菌の蔓延を防ぐことができることはこれまでに分かっている。医薬組成物を製造して評価するために、および組成物を投与するために種々の病原微生物由来のセリンプロテアーゼのタンパク質分解活性を遮断する本発明のポリペプチドの能力を調べる方法は、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,739,283号で記載されている。よって、本発明のポリペプチドは、例えば、コクシジウム症、ブドウ球菌感染症、インフルエンザウイルス、P.ジンギバリス（P. gingivalis）またはT.デンチコラ（T. denticola）による感染症、および侵入性肺アスペルギルス症を予防するまたは治療するために用いることができる。
【０９６８】
本発明のもう1つの実施形態は、サンプル中のセリンプロテアーゼを除去するまたは精製するためにKSPI1またはその断片を用いる方法に関する。このような方法は、サンプルから混入しているプロテアーゼを除去する、またはサンプル内のあるプロテアーゼを精製するいずれかの目的において有用であり得る。好ましいポリペプチドは、完全KSPI1、Kiドメインを有するポリペプチド、ならびにKiおよびIgドメインを有するポリペプチドである。また、KSPI1のKiおよび／またはIgを示す組換えタンパク質を用いてもよい。あるセリンプロテアーゼに対するKSPI1の結合効果はいずれかの好適な方法、例えば、免疫沈降法およびウエスタンブロット解析を用いて調べることができる。KSPI1をプロテアーゼと結合させる、およびその複合体を精製するすべての方法がこのような方法において用いることができる。ある好ましい実施形態では、KSPI1またはその断片を単独でまたはその他のプロテアーゼ阻害剤と組み合わせてクロマトグラフィー支持体に固定化してアフィニティークロマトグラフィーカラムを作製してもよい。解析すべきサンプルはその後、このアフィニティークロマトグラフィーカラムに流すことができる。
【０９６９】
本発明のもう1つの実施形態は、サンプル中のプロテアーゼ量を検出するおよび／または定量するためのKSPI1またはその断片を用いる方法、さらにサンプル、体液または細胞培養物中のプロテアーゼの定量化のためのアッセイおよび診断キットにおけるこれらの方法の使用に関する。このようなアッセイは、セリンプロテアーゼ精製収率を算出するために用いることができ、また、正常な被験体に見られるプロテアーゼ量に相当するサンプルも含めたこのような診断キットは上述のものなどのプロテアーゼ活性が原因で起こる疾病および疾患を検出するために用いることができる。好ましいポリペプチドは、完全KSPI1、Kiドメインを有するポリペプチド、ならびにKiおよびIgドメインを有するポリペプチドである。KSPI1またはその断片のプロテアーゼ阻害剤活性を検出する全ての方法がこのような方法において用いることができる。例えば、サンプルは標準プロテアーゼ基質を用いてアッセイされる。既知の濃度のKSPI1またはその断片を添加して、存在する特定のプロテアーゼと結合させる。次いで、プロテアーゼアッセイを再度実施した後、当業者に周知の技術を用いて活性の喪失とプロテアーゼ阻害剤活性との相関関係を算定する。
【０９７０】
本発明のなおもう1つの実施形態は、KSPI1のIGFとの結合を減少させることによってIGF活性を調節するための組成物および方法に関する。ヒトIGF受容体に対するものではなく、IGFとその結合タンパク質のいずれか1つとの相互作用を阻害する化合物は哺乳動物の活性IGFの血清および組織レベルを高めるために有用である。このように、KSPI1とIGFとの結合を減少させるための組成物および方法は、例えば、IGFが通常投与される全ての治療、例えば、高血糖性、肥満関連、神経、心臓、腎臓、免疫、および同化疾患の治療において用いることができる。KSPI1とIGFとの結合の阻害および／または減少はいずれかの好適な方法を用いて、例えば、治療上有効な量のKSPI1またはその断片を特異的に認識する抗体の患者への投与によって達成され得る。好ましくは、2つの抗体が別々にまたは同時に用いられ、その1つはIgドメインを認識し、さらにもう1つがKiドメインを認識する。抗体は単独でまたは当技術分野で公知の1種以上の薬剤、例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,251,865号に記載されるものと組み合わせて投与することができる。本発明の抗体の有効量は関連技術によって決定される。また、KSPI1とIGFとの結合の減少は、KSPI1発現または活性を低下させる方法および化合物を用いることによってももたらすことができる。このような方法および化合物としては、限定されるものではないが、アンチセンス分子、リボザイム、ドミナントネガティブ型のKSPI1、および細胞内でのKSPI1の活性または発現を低下させる化合物が挙げられる。
【０９７１】
本発明のもう1つの実施形態は、サンプル中のIGFを精製するためにKSPI1またはその断片を用いる方法に関する。IGFを精製するこのような方法は、上述の疾病の1つに罹患した患者に存在する種々のIGFを解析するために用いることができる。あるIGFに対するKSPI1の結合効果はいずれかの好適な方法、例えば、免疫沈降法およびウエスタンブロット解析を用いて調べることができる。KSPI1をIGFと結合させる、およびその複合体を精製するすべての方法がこのような方法において用いることができる。ある好ましい実施形態では、KSPI1またはその断片を単独でまたはその他のIGFBPと組み合わせてクロマトグラフィー支持体に固定化してアフィニティークロマトグラフィーカラムを作製してもよい。精製すべきサンプルはその後、このアフィニティークロマトグラフィーカラムに流すことができる。
【０９７２】
一連のもう1つの実施形態では、KSPI1またはその断片はサンプル中のIGFを検出するおよび／または定量するために用いることができる。このような方法は、例えば、体液または組織サンプル中のKSPI1-IGF複合体の定量化のためのアッセイおよび診断キットにおいて用いてもよい。KSPI1-IGF複合体の存在またはレベルを検出する全ての方法を用いることができる。特に、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Khosraviら [Clin Chem 43:523-32 (1997)]および米国特許第6,248,546号に記載される方法を利用しうる。ある好ましい実施形態では、正常な被験体に見られるKSPI1-IGF複合体のレベルに相当するサンプルを含めた診断キットは、IGFレベルの低下が原因で起こる疾病を検出するために、または患者のIGFレベルを高めるもしくは低下させることを目的とした治療の効果をモニタリングするために用いることができる。
【０９７３】
配列番号82のタンパク質(内部表示クローン517778_184-5-3-0-G3-F)
クローン517778_184-5-3-0-G3-FのcDNA(配列番号81)はアミノ酸配列:
MAGGVRPLRGLRALCRVLLFLSQFCILSGGESTEIPPYVMKCPSNGLCSRLPADCIDCTTNFSCTYGKPVTFDCAVKPSVTCVDQDFKSQKNFIINMTCRFCWQLPETDYECTNSTSCMTVSCPRQRYPANCTVRDHVHCLGNRTFPKMLYCNWTGGYKWSTALALSITLGGFGADRFYLGQWREGLGKLFSFGGLGIWTLIDVLLIGVGYVGPADGSLYIを含んでなるアミロイドアポトーシス受容体(AAR)タンパク質(配列番号82)をコードする。よって、本願を通じて記載される配列番号82のポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン517778_184-5-3-0-G3-Fに含まれる核酸によりコードされるポリペプチドについても当てはまることが理解されよう。さらに、本願を通じて記載される配列番号81のポリヌクレオチドの全ての特徴および用途はクローン517778_184-5-3-0-G3-Fに含まれる核酸についても当てはまることが理解されよう。本発明の好ましい実施形態は、配列番号81、配列番号82およびクローン517778_184-5-3-0-G3-Fの組成物に関する。また、本明細書に記載のような生物活性を有するポリペプチド断片およびそれらの断片をコードするポリヌクレオチドも好ましい。
【０９７４】
AARは2つの膜貫通セグメントを有する221個のアミノ酸からなる受容体である。結果として生じるタンパク質は親水性細胞内ループならびに細胞外アミノ末端およびカルボキシ末端を有する。AARの膜貫通ドメインおよび細胞内ループは７回膜貫通型Gタンパク質共役受容体の第3および第4番目の膜貫通ドメインならびに介在配列と極めて類似している。Gタンパク質結合アミノ酸配列DRFはAARの第1番目の膜貫通領域近くで見られる。AARの細胞外部分はアミロイド生成性ペプチドを含むリガンドと結合する。リガンド結合はAAR発現細胞のアポトーシスを誘導する。AARは、Gタンパク質成分およびアミロイド生成性ペプチドなどのリガンドを結合することを含んでなる生物活性を有する。
【０９７５】
本発明の好ましい実施形態としては、細胞死を防ぐ方法であって、リガンドが結合するAARのポリペプチド断片を細胞で発現されるAARとのリガンド結合を競合的に阻害するのに有効な量でリガンドと接触させる方法が挙げられる。
【０９７６】
好ましいAARのポリペプチド断片としては、限定されるものではないが、アミノ酸1〜40番からなる群から選択されるアミノ酸で開始し、アミノ酸165〜180番からなる群から選択されるアミノ酸で終結するものが挙げられる。最も好ましいポリペプチド断片はAARのアミノ酸1〜180番を含んでなる。
【０９７７】
細胞死を防ぐ好ましい方法としては、アミロイド生成性ペプチドに関連したものが挙げられる。アポトーシス細胞死を誘導する方法では、AARリガンドを細胞のアポトーシスを誘導するのに有効な量で細胞と接触させる。好ましいAARリガンドとしては、アミロイド生成性ペプチドが挙げられる。さらに好ましいAARリガンドはAARと特異的に結合してAARを発現する細胞でアポトーシスを引き起こす化合物である。さらに好ましいAARリガンドとしては、AAR特異的抗体が挙げられる。好ましいAAR特異的抗体としては、AARのアミノ末端細胞外領域内のエピトープと結合するものが挙げられる。AARリガンドと接触させるのに好ましい細胞としては、新生物細胞が挙げられる。さらに好ましい細胞としては、AARを発現する新生物細胞が挙げられる。
【０９７８】
好ましいAARリガンド溶液は送達の限局性を向上させるためのヒドロゲル形成性高分子溶液をさらに含んでなる。好ましいAARリガンド溶液は、リガンド結合を向上させるための1種以上のアルカリ塩をさらに含んでなる。好ましいAARリガンド溶液は治療効果を向上させるための1種以上の化学療法薬をさらに含んでなる。細胞と接触させる好ましい方法としては、カテーテル注射を含む。
【０９７９】
細胞と接触させる好ましい方法は、局所送達の精度を向上させるための腫瘍イメージングをさらに含む。細胞と接触させる好ましい方法は、局所送達の精度を向上させるためのコンピューターモデリングとAARリガンドの投与をさらに含む。
【０９８０】
AARのアミノ末端はアミロイド生成性ペプチド(すなわち、アルツハイマー病に関連するβ-アミロイドペプチド、アミロイド前駆体様タンパク質(APLP)1および2、免疫グロブリンL鎖、プレアルブミン、β-2-ミクログロブリン、トランスサイレチン、アミリン、インスリン、心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)、アポリポタンパク質およびグルカゴン)などのリガンドと結合できる。これらのタンパク質のアミロイド生成性断片は主としてβ-折りたたみシート構造を形成し、ある病態ではこの構造がアミロイド繊維を形成し得る。アミロイドの沈着は罹患組織において細胞死をもたらすことが多い。アミロイド関連疾患としては、特に、アルツハイマー病、糖尿病、全身性アミロイドーシス、家族性内臓アミロイドーシス、皮膚アミロイドーシス、マックル・ウェルズ症候群、ゲルストマン・ストロイスラー病、透析関連および血液透析関連アミロイドーシスが挙げられる。アミロイド沈着は罹患組織に応じてさらなる病因となり得る。例えば、血液透析関連アミロイドーシスは手根管症候群、糜爛性関節症、脊椎関節症、溶解性骨病変、および病理学的骨折を引き起こす可能性がある。軟膜および実質血管の中膜におけるβ-アミロイドペプチド沈着は、平滑筋細胞の破壊、続いて皮質出血を引き起こす。さらに、アルツハイマー病で認められる神経細胞死は、疾病の後期に伴う老衰と関係しており、さらに膵臓ランゲルハンス島細胞死は糖尿病におけるインスリン調節の乱れの原因となる要因である。アミロイド生成性ペプチドのレベルを低下させることが本明細書に記載のものなどの疾患の望ましい治療法である。
【０９８１】
本発明のある好ましい実施形態では、リガンドが結合するAARのポリペプチド断片は細胞死を防ぐために用いられる。この方法は、AARのリガンド結合断片を細胞で発現されるAARとのリガンド結合を競合的に阻害するのに有効な量でリガンドと接触させるステップを含んでなる。好ましいAARのポリペプチド断片としては、限定されるものではないが、アミノ酸1〜40番からなる群から選択されるアミノ酸で開始し、アミノ酸165〜180番からなる群から選択されるアミノ酸で終結するものが挙げられる。上述のリストに含まれるいずれかの単一AAR断片またはAAR断片の組合せは本発明のこの実施形態から排除され得る。最も好ましい断片はAARのアミノ酸1〜180番を含んでなる。膵臓ランゲルハンス島細胞死および本明細書に記載のその他のものなどの細胞死を阻止する好ましい方法としては、アミロイド生成性ペプチドに関連したものが挙げられる。AAR断片は本明細書に記載のものなどの当技術分野で一般的な方法により適用され得る。例えば、AAR断片は生理学上許容される形態で直接注射またはカテーテルにより膵臓の細胞に送達してもよい。長期にわたる治療では、AAR断片は埋め込み型ポリペプチド放出ステントから放出させてもよい(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5683345号および同第5500013号)。
【０９８２】
リガンドの不在下では、AAR発現はアポトーシス細胞死から細胞を防御する。AARは白血球ならびに心臓、脳、胎盤、卵巣、精巣、肺、肝臓、筋肉、腎臓、膵臓、大腸、腸、および前立腺の細胞といった多くの異なる細胞種で発現される。そのため、AARはリガンドの付加により細胞死の誘導に利用される可能性がある。この細胞死誘導は、多くの異なる組織における新生物細胞増殖を処置するために有用である。本発明の好ましい実施形態として、AARリガンドはアポトーシス細胞死を促進するための方法において用いられる。この方法はAARリガンドをアポトーシス細胞死を誘導するのに有効な量で細胞と接触させるステップを含んでなる。好ましいAARリガンドとしては、限定されるものではないが、本明細書に記載のもの(すなわち、アミロイド生成性ペプチド)が挙げられる。いずれかの単一のアミロイド生成性ペプチドリガンドまたはアミロイド生成性ペプチドリガンドの組合せは本発明のこの実施形態から排除され得る。さらに好ましいAARリガンドは、AAR特異的抗体などのAARと特異的に結合してAARを発現する細胞でアポトーシスを引き起こす化合物である。この方法における使用に好ましい抗体としては、AARのアミノ末端細胞外領域内のエピトープと結合するものが挙げられる。AARのエピトープと結合するいずれかの単一抗体または抗体の組合せは本発明のこの実施形態から排除され得る。AARリガンドと接触させるのに好ましい細胞としては、限定されるものではないが、新生物白血球、ならびに心臓、脳、胎盤、卵巣、精巣、肺、肝臓、筋肉、腎臓、膵臓、大腸、腸、および前立腺の新生物細胞といった新生物細胞が挙げられる。さらに好ましい細胞としては、AARを発現するものが挙げられる。
【０９８３】
AARリガンドの特定細胞への送達は本明細書に記載のものなどの当技術分野で一般的な方法により達成することができる。例えば、アポトーシス細胞死を促進するために生理学上許容される溶液中の有効量のAARリガンドはシリンジまたはカテーテルにより腫瘍塊に局所的に注入してもよい。AARリガンドは、溶液中の単独の活性剤として使用してもよいし、または治療効果を高めるその他の化学療法薬と組み合わせて使用してもよい。AARリガンドの充実性腫瘍への直接送達に伴う問題は、組織の液体の流入に対する耐性であると思われる。浸透を高めさらに／または注入口からの逆流を減らし、その結果としてより多くの物質が腫瘍に導入されて、それを腫瘍に残留させることはAARリガンドに粘稠なビヒクルを使用することで達成される。好ましい材料としては、注射または埋め込み時にあるいはその直後にハイドロゲルを形成する高分子材料の溶液または懸濁剤が挙げられる。AARリガンドのヒドロゲル溶液は、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5945100号に記載されるようにカテーテルを介して治療すべき腫瘍領域に注入される。AARリガンドの直接送達に伴うもう1つの問題は、癌性腫瘍が「嫌気的解糖」として知られる代謝プロセスにより局部の酸度を相対的に高めることである。この酸性環境はAARとのリガンド結合を妨害すると考えられる。そのため、AARリガンドの生理学上許容される溶液としては、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5681857号に記載されるように種々のアルカリ塩を含み得る。治療精度をさらに高めるために、腫瘍イメージングを単独でまたはコンピューターモデリングおよびAARリガンド溶液の投与と組み合わせて用いてもよい(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5438989号および同第5823993号)。
【０９８４】
配列番号84、86および98のタンパク質(内部表示クローン100038_105-017-4-0-E4-F、100523_105-019-1-0-F3-Fおよび100545_105-019-2-0-E3-F)
クローン100038_105-017-4-0-E4-Fおよび100523_105-019-1-0-F3-FのcDNA(それぞれ配列番号83および85)はアミノ酸配列:
MLPPLPSRLGLLLLLLLCPAHVGGLWWAVGSPLVMDPTSICRKARRLAGRQAELCQAEPEVVAELARGARLGVRECQFQFRFRRWNCSSHSKAFGRILQQGQCGEGHPARTLPPRPLGQPSRRRFQVPGPSを含んでなるWnt(SAW)-1タンパク質(配列番号84および86)の可溶性アクチベーターをコードする。クローン100545_105-019-2-0-E3-FのcDNA(配列番号 97)はアミノ酸配列:
MLPPLPSRLGLLLLLLLCPAHVGGLWWAVGSPLVMDPTSICRKARRLAGRQAELCQAEPEVVAELARGARLGVRECQFQFRFRRWNCSSHSKAFGRILQQGQCGEGAEVGLLSPCCGTRGEENWFAEVAを含んでなるSAW-2タンパク質(配列番号98)をコードする。よって、本願を通じて記載される配列番号84、86および98のポリペプチドの全ての特徴および用途はそれぞれクローン100038_105-017-4-0-E4-F、100523_105-019-1-0-F3-Fおよび100545_105-019-2-0-E3-Fに含まれる核酸によりコードされるポリペプチドについても当てはまることが理解されよう。さらに、本願を通じて記載される配列番号83、85および97のポリヌクレオチドの全ての特徴および用途はそれぞれクローン100038_105-017-4-0-E4-F、100523_105-019-1-0-F3-Fおよび100545_105-019-2-0-E3-Fに含まれる核酸についても当てはまることが理解されよう。本発明のある好ましい実施形態は、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号97、配列番号98、クローン100038_105-017-4-0-E4-F、クローン100523_105-019-1-0-F3-F、およびクローン100545_105-019-2-0-E3-Fの組成物に関する。また、本明細書に記載される生物活性を有する断片およびそれらの断片をコードするポリヌクレオチドも好ましい。配列番号84および86のポリペプチドの好ましい断片は、MLPPLPSRLGLLLLLLLCPAHVGGLWWAVGSPLVMDPTSICRKARRLAGRQAELCQAEPEVVAELARGARLGVRECQFQFRFRRWNCSSHSKAFGRILQQGQCGEGHPARTLPPを含んでなる。配列番号98のポリペプチドの好ましい断片は、MLPPLPSRLGLLLLLLLCPAHVGGLWWAVGSPLVMDPTSICRKARRLAGRQAELCQAEPEVVAELARGARLGVRECQFQFRFRRWNCSSHSKAFGRILQQGQCGEGAEVGLLSPを含んでなる。配列番号84、86および98の好ましい断片は、MLPPLPSRLGLLLLLLLCPAHVGGLWWAVGSPLVMDPTSICRKARRLAGRQAELCQAEPEVVAELARGARLGVRECQFQFRFRRWNCSSHSKAFGRILQQGQを含んでなる。
【０９８５】
本発明の好ましい実施形態の一覧は以下の通りである。
ある好ましい実施形態としては、配列番号84のSAW-1ポリペプチド配列を含んでなる組成物がある。
【０９８６】
ある好ましい実施形態としては、配列番号86のSAW-1ポリペプチド配列を含んでなる組成物がある。
【０９８７】
ある好ましい実施形態としては、生物活性を有するSAW-1ポリペプチド断片を含んでなる組成物がある。
【０９８８】
ある好ましい実施形態としては、配列番号98のSAW-2ポリペプチド配列を含んでなる組成物がある。
【０９８９】
ある好ましい実施形態としては、生物活性を有するSAW-2ポリペプチド断片を含んでなる組成物がある。
【０９９０】
ある好ましい実施形態としては、SAW-1ポリペプチドをコードする配列番号83のポリヌクレオチド配列を含んでなる組成物がある。
【０９９１】
ある好ましい実施形態としては、SAW-1ポリペプチドをコードする配列番号85のポリヌクレオチド配列を含んでなる組成物がある。
【０９９２】
ある好ましい実施形態としては、生物学的に活性なSAW-1ポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる組成物がある。
【０９９３】
ある好ましい実施形態としては、SAW-2ポリペプチドをコードする配列番号97のポリヌクレオチド配列を含んでなる組成物がある。
【０９９４】
ある好ましい実施形態としては、生物学的に活性なSAW-2ポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる組成物がある。
【０９９５】
ある好ましい実施形態としては、幹細胞の増殖を促進するためにWnt依存性シグナル伝達を増強する方法であって、SAW-1もしくはSAW-2ポリペプチドまたは生物学的に活性なその断片を幹細胞と接触させるステップを含んでなる方法がある。
【０９９６】
好ましい幹細胞としては、Wntに応答して増殖(growthまたはproliferation)し得るものが挙げられる。
【０９９７】
さらなる好ましい幹細胞としては、造血細胞となり得るものが挙げられる。
【０９９８】
さらなる好ましい幹細胞としては、神経細胞または神経膠細胞となり得るものが挙げられる。
さらなる好ましい幹細胞としては、肝細胞となり得るものが挙げられる。
【０９９９】
さらなる好ましい幹細胞としては、膵細胞となり得るものが挙げられる。
【１０００】
さらなる好ましい幹細胞としては、骨芽細胞が挙げられる。
【１００１】
さらなる好ましい幹細胞としては、軟骨芽細胞が挙げられる。
【１００２】
さらなる好ましい幹細胞としては、臍帯血で見られる細胞が挙げられる。
【１００３】
また、SAW-1またはSAW-2ポリペプチドと接触させる前、接触中、接触させた後に1以上の細胞種特異的増殖因子を幹細胞に加えることも好ましい。
【１００４】
ある好ましい実施形態としては、アポトーシスを防ぐためにWnt依存性シグナル伝達を増強させる方法であって、SAW-1もしくはSAW-2ポリペプチドまたは生物学的に活性なその断片をアポトーシスのリスクのある細胞と接触させるステップを含んでなる方法がある。
【１００５】
好ましい細胞としては、Wntに応答し得るものがある。
【１００６】
好ましくはこの方法は培養細胞のアポトーシスを防ぐために適用される。
【１００７】
好ましくはこの方法はアポトーシス関連疾患を治療するために適用される。
【１００８】
好ましくはこの方法はアポトーシス関連疾患を予防するために適用される。
【１００９】
好ましいアポトーシス関連疾患としては、神経変性疾患、I〜III型棘筋萎縮症(SMA)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、ハンチントン舞踏病、アルツハイマー病、パーキンソン病、網膜変性、色素性網膜炎、小脳変性、脊髄形成異常症、再生不良性貧血、虚血関連変性、心筋梗塞、卒中、肝変性疾患、アルコール性肝炎、B型肝炎、C型肝炎、劇症肝炎、関節変性疾患、骨関節炎および糖尿病からなる群から選択される。
【１０１０】
SAW-1およびSAW-2はWnt-6遺伝子のスプライス変異体である。SAW-1の場合、Wnt-6 cDNAに挿入された135ヌクレオチドのカセットは早期終止コドンをコードする。365個のアミノ酸からなるWnt-6タンパク質と比べ、結果として生じるSAW-1ポリペプチドは131アミノ酸長である。SAW-2の場合、236ヌクレオチドのインサートはまた早期終止コドンをコードする。SAW-2ポリペプチドは129アミノ酸長であり、SAW-1と同じ生物活性を有する。Wntタンパク質ファミリーは、細胞極性および運命の決定、胚発生における多数の組織の形成、細胞増殖、ならびに一生を通じた幹細胞集団の維持に不可欠である。細胞生存を促進する上でのWntタンパク質の役割によってヒト癌におけるWnt過剰発現の影響力が明らかとなろう。Wntタンパク質は一般には細胞外マトリックスまたは細胞表面に関連する分泌因子である。Wntタンパク質の受容体としては、7回膜貫通型受容体であるFrizzled(Fz)ファミリーならびに低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質(LRP)5および6が挙げられる。これらの受容体はシグナルを伝達して標的遺伝子発現をアップレギュレートするWnt共受容体として相助的に作用し得る。Wntシグナル伝達の阻害剤としては、ドミナントネガティブ型競合的阻害剤として作用する可溶型のFz受容体、ならびに細胞外因子CerberusおよびWnt阻害因子(WIF)が挙げられる。そのため、Wntタンパク質は複数のタンパク質間相互作用の標的である。SAW-1およびSAW-2はCerberusおよびWIFタンパク質と相互作用するWnt-6の新規末端切断型スプライス変異体である。SAW-1およびSAW-2の生物活性はこれらの相互作用によって明示される。
【１０１１】
Wntタンパク質は成人期を通じた幹細胞集団の維持に重要である。幹細胞は未分化または部分的に未分化な自己複製する集団を含んでなる。本明細書において使用する「幹細胞」とは、自己複製が可能な未分化性を有し、かつさらなる分化細胞を生み出す細胞をいう。これらの細胞はほぼ全ての種類の細胞集団、特に、上皮層、皮層、ならびに生殖および造血系の高代謝回転集団の複製に重要である。幹細胞集団の欠損または大幅な細胞消失は、遺伝性素因、外傷、疾病、または化学療法などの治療法によって引き起こされるものであろうとなかろうと、個体に著しい影響をもたらす。これらの欠損はin vivoにおいて残存する幹細胞集団の増殖を刺激することによって克服することができる。また、幹細胞(好ましくは治療を必要とする個体由来のものであるが、臍帯血などのその他の起源由来のものでもよい)のin vitro培養および移植が有効であると思われる。培養した幹細胞から誘導した成熟細胞も同様に移植することができる。Wntタンパク質は幹細胞に対して有効な増殖および生存因子であることから、これらのタンパク質はいずれの細胞置換戦略においても有用である。しかしながら、Wntタンパク質は可溶型として精製することが難しく、容易に拡散しないため、Wntに基づく治療の遂行が難しくなる。Wntシグナル伝達を増強する好ましい方法はWntのCerberusおよびWIFなどの可溶性阻害剤との相互作用を弱めることである。
【１０１２】
本発明のある好ましい実施形態では、SAW-1もしくはSAW-2ポリペプチドまたは生物学的に活性なその断片は、Wnt依存性シグナル伝達を増強して幹細胞増殖を促進するために用いられる。この方法はSAW-1もしくはSAW-2ポリペプチドまたは生物学的に活性なその断片を幹細胞と接触させるステップを含んでなる。好ましい幹細胞としては、Wntに応答して増殖(growthまたはproliferation)し得るものが挙げられる。また、SAW-1またはSAW-2ポリペプチドと組み合わせて1以上の細胞種特異的増殖因子またはサイトカインを加えることも好ましい。例としては、インターロイキン(例えば、IL-3)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、エリスロポエチン(Epo)、リンホトキシン、鉄因子(steel factor)(SLF)、腫瘍壊死因子(TNF)およびγ-インターフェロンが挙げられる。IL-3は、多能性幹細胞、ならびに顆粒球、マクロファージ、好酸球、巨核球、赤血球または肥満細胞系統に限定された前駆体に作用し、Epoはかなり成熟した赤血球前駆細胞に作用する。SAW-1もしくはSAW-2ポリペプチドまたは生物学的に活性なその断片は該ポリペプチドを含んでなる生理学上許容される溶液をWnt依存性増殖(growthまたはproliferation)を促進するのに有効な量で培養幹細胞(例えば、肝臓幹細胞、神経または神経膠幹細胞、骨芽細胞、軟骨芽細胞、膵臓幹細胞、造血幹細胞、臍帯血など)に加えることにより幹細胞培養増殖を促進するために用いることができる。SAW-1もしくはSAW-2ポリペプチドまたは生物学的に活性なその断片を含んでなる生理学上許容される溶液はin vivoにおける細胞のさらなる増殖の可能性を提供するために培養した細胞の個体への移植または再導入においてさらに加えてもよい。細胞移植および再導入方法は当業者によって決定され、その方法としては、シリンジまたはカテーテルによる単一細胞懸濁物注入および外科的移植が挙げられる(また、神経膠細胞移植については米国特許第5869463号; 骨髄移植については米国特許第6068836号; 膵細胞移植についてはNoelら, Metabolism, 31:184-7 (1982); ならびに骨移植については米国特許第4950296号、同第5385566号、および同第6200324号(なお、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる)も参照)。さらに、この方法はin vivoにおけるWnt依存性幹細胞増殖(growthおよびproliferation)を強化するために適用することができる。例えば、SAW-1もしくはSAW-2ポリペプチドまたは生物学的に活性なその断片を含んでなる生理学上許容される溶液は、目的の部位(例えば、造血幹細胞治療では骨髄)に直接または当技術分野で一般的なその他の方法により注入してもよい。
【１０１３】
幹細胞が初期段階でほぼ全ての種類の成熟機能細胞へと分化し得るならば、幹細胞治療によって種々の症状に対応することができる。例として、造血幹細胞増殖または置換は以下の典型的な症状: リンパ球減少症; リンパ漏; リンパ鬱滞; 免疫不全(例えば、HIVおよびAIDS); 感染症(例えば、日和見感染症および結核(TB)など); 狼瘡; リンパ球欠乏を特徴とする疾患、赤血球減少症; 赤血球変性疾患; 赤芽球減少症; 白赤芽球症; 赤血球崩壊; サラセミア; 貧血(例えば、後天性、自己免疫性、または微小血管症性溶血性貧血などの溶血性貧血; 形成不全性(aplastic)貧血; 先天性貧血、例えば、先天性異常造血性貧血、先天性溶血性貧血または先天性再生不良性(hypoplastic)貧血; 造血不全性貧血; ファコーニ（Faconi's） 貧血; 遺伝性貧血; 出血性貧血; 高色素性または低色素性貧血; 栄養性、低鉄性、または鉄欠乏性貧血; 再生不良性(hypoplastic)貧血; 感染性貧血; 鉛貧血; 局所的貧血; 大球性または小球性貧血; 悪性(malignantまたはpernicious)貧血; 巨赤芽球性貧血; 分子性貧血; 正球性貧血; 生理的貧血; 外傷性または出血後貧血; 難治性貧血; 放射線性貧血; 鎌状赤血球貧血; 脾性貧血; および中毒性貧血); 骨髄繊維症; 血小板減少症; 形成不全症; 播種性血管内凝固(DIC); 免疫(自己免疫)性血小板減少性紫斑病(ITP); HIV誘発性ITP; 骨髄異形成症候群; 血小板増加症(thrombocytotic disease and thrombocytosis)のうちのいずれか1つまたはそれ以上の素因があるまたはそれに罹患しているものに恩恵をもたらし得る。神経または神経膠細胞を形成する幹細胞は、限定されるものではないが、アルツハイマー病、前頭側頭型痴呆、双極性障害、ハンチントン舞踏病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、テイ・サックス病、ゴーシェ病、ならびにパーキンソン病および統合失調症などのドーパミン関連疾患をはじめとする疾患を治療するために適用され得る。膵臓幹細胞培養物は糖尿病などの代謝性疾患の治療に適用することができる。骨組織由来の幹細胞(骨芽細胞)は骨量減少、萎縮、または損傷、先天性もしくは慢性疾患による奇形、骨減少症、骨粗鬆症、くる病、悪性黒色腫誘発性骨分解、ならびに損傷、待機手術(例えば、形成手術)、再建外科、および歯科治療もしくは手術による骨亀裂または骨折を治療するために用いることができる。
【１０１４】
Wntタンパク質はアポトーシスを阻止してWnt応答細胞の生存を促進するために作用する。Wntシグナル伝達の特異的アクチベーターはin vitroにおける細胞または組織増殖にもin vivoにおけるアポトーシス関連疾患の治療にも望ましい。このような疾患の例としては、I〜III型棘筋萎縮症(SMA)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、網膜変性、色素性網膜炎および小脳変性などの神経変性疾患; 形成不全性(aplastic)貧血などの脊髄形成異常症; 心筋梗塞および卒中などの虚血性疾患; アルコール性肝炎、B型肝炎、C型肝炎、および劇症肝炎などの肝疾患; 骨関節炎などの関節疾患; ならびに糖尿病などの代謝性疾患が挙げられる。本発明のある好ましい実施形態では、SAW-1もしくはSAW-2ポリペプチドまたは生物学的に活性なその断片は、アポトーシス関連変性症を予防するために用いられる。この方法は、SAW-1もしくはSAW-2ポリペプチドまたは生物学的に活性なその断片を細胞と接触させるステップを含んでなる。好ましい細胞はWntに応答し得るものである。さらに好ましい細胞はアポトーシスのリスクのあるものである。例えば、SAW-1またはSAW-2ポリペプチドを含んでなる生理学上許容される組成物は培養細胞の生存率を高めるために海馬ニューロンの混合培養物に加えてもよい。また、SAW-1もしくはSAW-2ポリペプチドまたは生物学的に活性なその断片を含んでなる生理学上許容される組成物は当業者によって決められたようにアポトーシス関連疾患と診断されたまたはそのリスクがある個体に送達してもよい。SAW-1またはSAW-2ポリペプチドは単独でまたはWntシグナル伝達、アポトーシス、または細胞種特異的プロセスを調節する薬剤と組み合わせて使用してもよい。さらに、SAW-1またはSAW-2ポリペプチドは、該ポリペプチドの安定化および／またはターゲッティングのためにリガンド(例えば、破傷風毒素、カルシウムチャンネル遮断薬、トランスフェリン、ポリオウイルスエピトープ、神経ペプチド断片、もしくはステロイドホルモンアンドロゲン、または神経ターゲッティングに十分なその断片)と融合してもよい。例として、SAW-1またはSAW-2ポリペプチドを含んでなる生理学上許容される組成物を骨関節炎関連関節変性を予防するために個体に送達してもよい。さらなる例として、該組成物を虚血性事象が起こっているまたは起こる可能性が高い個体に投与してもよい。本明細書に記載のものなどの好適な送達方法は当業者によって事例毎に決定される。
【１０１５】
配列番号88および90のタンパク質(内部表示クローン116470_105-063-3-0-H7-Fおよびクローン122600_105-077-3-0-F9-F)
クローン116470_105-063-3-0-H7-F and クローン122600_105-077-3-0-F9-FのcDNA(それぞれ配列番号87および89)はアミノ酸配列:
MLFRLSEHSSPEEEASPHQRASGEGHHLKSKRPNPCAYTPPSLKAVQRIAESHLQSISNLNENQASEEEDELGELRELGYPREEDEEEEEDDEEEEEEEDSQAEVLKVIRQSAGQKTTCGQGLEGPWERPPPLDESERDGGSEDQVEDPALSEPGEEPQRPSPSEPGTを含んでなるドーパミンアンフェタミン阻害剤(Dampin)タンパク質(配列番号88および90)をコードする。よって、本願を通じて記載される配列番号88および90のポリペプチドの全ての特徴および用途はそれぞれクローン116470_105-063-3-0-H7-Fおよびクローン122600_105-077-3-0-F9-Fに含まれる核酸によりコードされるポリペプチドについても当てはまることが理解されよう。さらに、本願を通じて記載される配列番号87および89のポリヌクレオチドの全ての特徴および用途はそれぞれクローン116470_105-063-3-0-H7-Fおよびクローン122600_105-077-3-0-F9-Fに含まれる核酸についても当てはまることが理解されよう。本発明の好ましい実施形態は、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、クローン116470_105-063-3-0-H7-Fおよびクローン122600_105-077-3-0-F9-Fの組成物に関する。また、本明細書に記載のような生物活性を有するポリペプチド断片およびそれらの断片をコードするポリヌクレオチドも好ましい。
【１０１６】
Dampinは、ドーパミン、および、異なる翻訳開始部位を利用し、DARPP-32の最初の37アミノ酸を欠くcAMP調節リンタンパク質32(DARPP-32)のスプライス変異体である。DARPP-32は残基T34でプロテインホスファターゼ1(PP1)の阻害剤として働くプロテインキナーゼA(PKA)によるリン酸化によって調節される細胞質シグナル伝達分子である。これが下流標的へのPKAの効果を増加させる。ニューロンでは、PKAはドーパミンシグナル伝達経路に作用するドーパミンまたは向精神薬(例えば、コカインおよびアンフェタミン)に応答してDARPP-32をリン酸化する。あるいは、Cdk5によるT75のリン酸化の結果としてPKAのDARPP-32阻害を招く。スプライス変異体としてのダンピンはPKAシグナル伝達に応答してリン酸化されず、PP1の阻害剤としても働かない。しかし、DampinはCdk5リン酸化部位を持っているので、PKAシグナル伝達を阻害可能である。
【１０１７】
ドーパミン作動経路を介する異常なシグナル伝達は、パーキンソン病、トゥレット症候群、注意欠陥障害(ADD)、ハンチントン舞踏病、精神分裂症、および薬物／アルコール乱用をはじめとするいくつかの主な神経および精神障害に関与しているとされてきた。特に、コカインおよびアンフェタミンはPKAを介してドーパミン作動経路を活性化させる。さらに、常習行為はドーパミン作動性シグナル伝達およびPKA活性の増加に関連している。よって、PKA活性の減少によって常習行為ならびに薬物およびアルコールの乱用に取り組むのが望ましい。ドーパミン応答の増加によってパーキンソン病、トゥレット症候群、ADD、ハンチントン舞踏病、および精神分裂症などの疾患を治療することが望ましい。
【１０１８】
ドーパミンに類似したプロゲステロンもまたT34でのDARPP-32のリン酸化およびPP1の阻害をもたらすPKAを活性化させる。DampinはPKA活性を弱めることによりドーパミンおよびプロゲステロン双方のシグナル伝達を阻害する。プロゲステロンは排卵および子宮壁での受精卵の着床に必要とされる。さらに、プロゲステロンは、ドーパミンと組み合わせてメスの性的受容性を増加させる。よって、DARPP-32に対して高レベルのDampinはメスの避妊ならびに行動修正に有効であろう(例えば、動物訓練目的のため)。あるいは、Dampinに対して高レベルのDARPP-32はメスの受精率および性的受容性の増加に有効であろう。
【１０１９】
PP1はインスリンに応答してグリコーゲン合成酵素を活性化させる。グリコーゲン合成は血糖レベルがインスリンにより調節される一つの機構である。PP1のDARPP-32阻害は次にインスリンによって阻害される。しかし、不十分なインスリンまたはインスリン抵抗性はPP1の不適切な阻害および血糖レベルの調節不全をもたらす。このような調節不全は、非インスリン依存性糖尿病(MIDDM)、インスリン依存性糖尿病(IDDM)、黒色表皮症、妖精症、および脂肪組織萎縮症などインスリン抵抗性およびインスリン抵抗性疾患などの疾患に起因する。DampinはPP1を阻害しないので、DARPP-32に対して高レベルのDampinはグリコーゲン合成酵素活性の増加による血糖レベルの調節に効果的であろう。
【１０２０】
本発明の好ましい実施形態としては以下のものが挙げられる。
【１０２１】
配列番号88および90のDampinポリペプチド配列を含んでなる組成物；生物活性を有するDampinポリペプチド断片を含んでなる組成物；Dampinポリペプチドをコードする配列番号87および89のポリヌクレオチド配列を含んでなる組成物。生物活性を有するDampinポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる組成物。
【１０２２】
i)細胞を試験物質と接触させ、さらにii)試験物質に暴露後の細胞におけるDampin発現と非暴露対照細胞のそれとを比較するステップを含んでなる試験物質をDampin発現のモジュレーターに関してスクリーニングする方法。
【１０２３】
i)細胞を試験物質と接触させ、ii)試験物質に暴露後の細胞におけるDampin発現と非暴露対照細胞のそれとを比較し、iii)暴露後の細胞におけるDARPP-32発現と非暴露対照細胞のそれとを比較し、iv)該発現レベルを定量し、さらにv)暴露細胞および非暴露細胞におけるDampinに対するDARPP-32のレベルを決定するステップを含んでなる、Dampinに対するDARPP-32の比率を改変する試験物質をスクリーニングする方法。
【１０２４】
この試験物質は特定の細胞種においてDARPP-32に対するDampinの比率を改変するが、他の細胞においては改変しないことが好ましい。さらに好ましくは、この試験物質は細胞種特異的リガンドにコンジュゲートされている。好ましくは、この方法はDampinに対するDARPP-32の比率を低下させる試験物質をスクリーニングするものである。
【１０２５】
あるいは、この方法はDampinに対するDARPP-32の比率を上昇させる試験物質をスクリーニングする。
【１０２６】
i)DARPP-32と特異的に結合するがDampinとは結合しない第1の抗体をタンパク質サンプルと接触させ、ii)DARPP-32とDampinの両者に特異的に結合する第2の抗体とタンパク質サンプルを接触させ、さらにiii)タンパク質と結合した抗体を検出するステップを含んでなる、DampinポリペプチドをDARPP-32ポリペプチドと識別する方法。好ましくは、この第1および第2の抗体を、異なる検出可能なコンジュゲートで標識する。好ましくは、この方法は免疫組織化学プロトコールにより行う。
【１０２７】
i)細胞を試験物質と接触させ、ii)試験物質に暴露後の細胞におけるDampin発現と非暴露対照細胞のそれとを比較し、iii)暴露後の細胞におけるDARPP-32発現と非暴露対照細胞のそれとを比較し、iv)該発現レベルを定量し、v)暴露細胞と非暴露細胞におけるDampinに対するDARPP-32のレベルを決定するステップを含んでなる方法によって製造されるDampinに対するDARPP-32の比率を低下させる物質。
【１０２８】
この試験物質は特定の細胞種においてDampinに対するDARPP-32の比率を低下させるが、他の細胞種においては低下させないことが好ましい。さらに好ましくは、この物質は生理学上許容される組成物中に含まれる。
【１０２９】
i)細胞を試験物質と接触させ、ii)試験物質に暴露後の細胞におけるDampin発現と非暴露対照細胞のそれとを比較し、iii)暴露後の細胞におけるDARPP-32発現と非暴露対照細胞のそれとを比較し、iv)該発現レベルを定量し、v)暴露細胞と非暴露細胞におけるDampinに対するDARPP-32のレベルを決定するステップを含んでなる方法によって製造されるDampinに対するDARPP-32の比率を上昇させる物質。
【１０３０】
この試験物質は特定の細胞種においてDampinに対するDARPP-32の比率を上昇させるが、他の細胞種においては上昇させないことが好ましい。さらに好ましくは、この物質は生理学上許容される組成物中に含まれる。
【１０３１】
i)試験物質をDampinポリペプチドと、PKAの存在下、DampinとPKAとの結合を可能とする条件下で接触させ、さらにii)試験物質の存在下および不在下でDampinと結合したPAKの量を検出するステップを含んでなる、Dampinと特異的に結合してPKAとの結合を妨げる試験物質をスクリーニングする方法。
【１０３２】
この試験物質は特定の細胞種においてDampinのPKAとの相互作用を阻害することができるが、他の細胞種においては阻害することができないことが好ましい。さらに、細胞種特異的リガンドまたはその一部とコンジュゲートされた試験物質も好ましい。
【１０３３】
i)試験物質をDampinポリペプチドと、PKAの存在下、DampinとPKAとの結合を可能とする条件下で接触させ、さらにii)当技術分野で一般的な方法により、試験物質の存在下および不在下でDampinと結合したPKAの量を検出するステップを含んでなる方法によって製造されるDampinと特異的に結合してPKAとの結合を妨げる物質。
【１０３４】
DARPP-32に対するDampinの比率を上昇させることのできる物質とニューロンを接触させるステップを含んでなる、ニューロンでPKA活性を低下させる方法。好ましくは、この物資は血液脳関門を通過することができる。好ましくは、この方法を用いてコカインまたはアンフェタミン依存性応答を減少させる。好ましくは、この方法を用いて常習行為を減少させる。さらに、この方法を用いて飲酒癖を減少させるのが好ましい。
【１０３５】
DARPP-32に対するDampinの比率を上昇させることのできる物質と女性生殖系の細胞を接触させるステップを含んでなる、女性生殖系の細胞でPKA活性を低下させる方法。好ましい細胞としては、子宮の卵巣顆粒膜細胞および黄体細胞が挙げられる。好ましくは、この方法を用いてプロゲステロン依存性排卵および受精卵の着床を阻害する。好ましくは、この方法はメスの避妊に使用する。
【１０３６】
DARPP-32に対するDampinの比率を上昇させることのできる物質とグリコーゲン貯蔵細胞を接触させるステップを含んでなる、血糖レベルを調節する方法。好ましいグリコーゲン貯蔵細胞としては筋細胞および肝細胞が挙げられる。
【１０３７】
Dampinポリペプチドを細胞へ導入するステップを含んでなる、PKA活性を阻害する方法。好ましくは、Dampinポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを細胞へ導入することによってDampinポリペプチドを細胞へ送達する。好ましくは、このポリヌクレオチドは発現制御ユニットおよびDampinポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド構築物である。好ましい細胞としては、ニューロン、卵巣顆粒膜細胞、子宮細胞、肝細胞、および筋細胞が挙げられる。
【１０３８】
DARPP-32に対するDampinの比率を低下させることのできる物質をニューロンと接触させるステップを含んでなる、ニューロンのPKA活性を増加させる方法。好ましくは、この物質は血液脳関門を通過することができる。好ましくは、この方法を用いて神経疾患に冒されたドーパミン作動性ニューロンでPKA活性を増加させる。
【１０３９】
好ましい神経疾患としては、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、ADD、トゥレット症候群、および精神分裂症が挙げられる。好ましくは、この方法を用いてドーパミン作動性受容体およびプロゲステロン受容体の双方を発現する視床下部のニューロンでPKA活性を増加させる。好ましくは、視床下部でPKA活性を増加させることはメス個体での性的受容性を増加させることに向けられる。
【１０４０】
DARPP-32に対するDampinの比率を低下させることのできる物質をネフロンの腎臓細胞と接触させるステップを含んでなる、心房性ナトリウム利尿因子(ANF)活性を増加させる方法。好ましくは、この方法を用いて血液量を低減させる。さらに、この方法を用いて高血圧症を緩和するのが好ましい。
【１０４１】
本発明のある実施形態は試験物質をDampin発現のモジュレーターに関してスクリーニングする方法を提供する。この方法は、i)細胞を試験物質と接触させ、さらにii)試験物質に暴露後の細胞におけるDampin発現と非暴露対照細胞のそれとを比較するステップを含んでなる。Dampin発現は当技術分野で一般的な、または本明細書に含まれる方法により、Dampinポリヌクレオチドまたはポリペプチドを検出することにより測定される。この方法の一例としては、i)同等な2つの細胞サンプルを培養し、ii)これらの培養物のうち一方に試験物質を加え、他方には加えず、iii)所定の時点で両培養物を回収し、iv)各細胞サンプルからmRNAを精製し、v)各サンプル中のDampin mRNAをノーザンブロット、RTPCRまたは当技術分野で一般的な別の方法により比較するステップを含んでなる。本発明は上記で述べたような特異的ポリヌクレオチドプローブおよびプライマーの設計および使用を提供する。さらなる例としては、i)同等な2つの細胞培養物を得、ii)それらの培養物のうち一方には試験物質を加え、他方には加えず、iii)両培養物を回収し、iv)各細胞サンプルからタンパク質を精製し、v)各サンプル中のDampinポリペプチドのレベルをウエスタンブロット、免疫組織化学または当技術分野で一般的な別の方法により比較するステップを含んでなる。本発明は上記で述べたような特異的抗体および抗体フラグメントの設計および使用を提供する。
【１０４２】
本発明のある好ましい実施形態は、Dampinに対するDARPP-32の比率を改変する試験物質をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、i)細胞を試験物質と接触させ、ii)試験物質に暴露後の細胞におけるDampin発現と非暴露対照細胞のそれとを比較し、iii)試験物質に暴露後の細胞におけるDARPP-32発現と非暴露対照細胞のそれとを比較し、iv)該発現レベルを定量し、さらにv)暴露細胞(すなわち、試験細胞)と非暴露細胞(すなわち、対照細胞)のDampinに対するDARPP-32のレベルを決定するステップを含んでなる。
【１０４３】
本発明のさらなる好ましい実施形態は、特定の細胞種においてDampinに対するDARPP-32の比率を改変するが、その他の細胞種では改変しない試験物質をスクリーニングする方法を提供する。この方法には、細胞種特異的リガンドまたはその一部とコンジュゲートされた試験物質が含まれる。例えば、脳へターゲッティングするため、試験物質は親水性神経ペプチド(例えば、インターフェロンα、エンドルフィン、ソマトスタチン)とコンジュゲートさせてもよい(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第4902505号)。
【１０４４】
本発明のある好ましい実施形態は、Dampinに対するDARPP-32の比率を低下させる試験物質をスクリーニングする方法を提供する。本発明のある選択的好ましい実施形態は、Dampinに対するDARPP-32の比率を上昇させる試験物質をスクリーニングする方法を提供する。
【１０４５】
本発明のある好ましい実施形態では、Dampinに対するDARPP-32の比率を低下させる物質は、i)細胞を試験物質と接触させ、ii)試験物質に暴露後の細胞におけるDampin発現と非暴露対照細胞のそれとを比較し、iii)暴露後の細胞におけるDARPP-32発現と非暴露対照細胞のそれとを比較し、さらにiv)該発現レベルを定量し、v)暴露細胞と非暴露細胞におけるDampinに対するDARPP-32のレベルを決定するステップを含んでなる方法によって製造される。この物質は本明細書で述べた目的のため用いられる。
【１０４６】
本発明のある好ましい実施形態では、Dampinに対するDARPP-32の比率を上昇させる物質は、i)細胞を試験物質と接触させ、ii)試験物質に暴露後の細胞におけるDampin発現と非暴露対照細胞のそれとを比較し、iii)暴露後の細胞におけるDARPP-32発現と非暴露対照細胞のそれとを比較し、iv)該発現レベルを定量し、v)暴露細胞と非暴露細胞におけるDampinに対するDARPP-32のレベルを決定するステップを含んでなる方法によって製造される。DARPP-32の相対的レベルを上昇させる物質は本明細書で述べた目的のため用いられる。
【１０４７】
Dampinポリヌクレオチドおよびポリペプチドを検出する方法はDARPP-32ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを検出するために用いてもよく、本明細書ではその方法を取り入れる (例えば、mRNA検出法、抗体に基づく検出法)。DampinとDARPP-32スプライス変異体とを識別する簡便な方法が望ましい。本発明のある好ましい実施形態は、DampinポリペプチドとDARPP-32ポリペプチドとを識別する方法を提供する。この方法は、i)DARPP-32と特異的に結合するが、Dampinとは結合しない第1の抗体をタンパク質サンプルを接触させ、ii)DARPP-32とDampinの両者と特異的に結合する第2の抗体をタンパク質サンプルと接触させ、さらにiii)タンパク質と結合した抗体を検出するステップを含んでなる。好ましくは、第１および第２の抗体は、異なる検出可能なコンジュゲートで標識される。これにより単一のタンパク質サンプルを用いてこの方法を行えるようになる。好ましくは、このタンパク質サンプルは固定化された半浸透性細胞サンプルである。好ましくは、この検出法は本明細書で述べたような免疫組織化学プロトコールに従う。
【１０４８】
Dampinは競合的結合機構によりPKAを阻害する。よって、このDampinの阻害作用はDampinとPKAの相互作用を遮断する物質によって除去し得る。本発明のある好ましい実施形態は、Dampinと特異的に結合してPKAとの結合を妨げる試験物質をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、i)試験物質をDampinポリペプチドと、PKAの存在下、DampinとPKAの結合を可能とする条件下(例えば、未処理細胞)で接触させ、さらにii)試験物質の存在下および不在下でDampinと結合したPKAの量を、当技術分野で一般的な方法(例えば、共免疫沈降法およびウエスタンブロット法などの抗体に基づく方法)により検出するステップを含んでなる。この試験物質は特定の細胞種においてDampinとPKAの相互作用を阻害することができるが、他の細胞種では阻害することができないことが好ましい。この方法には、細胞種特異的リガンドまたはその一部とコンジュゲートされた試験物質が含まれる。
【１０４９】
本発明のある好ましい実施形態では、PKAに対するDampinの結合を阻害する物質は、i)試験物質をDampinポリペプチドと、PKAの存在下、DampinとPKAの結合を可能とする条件下 (例えば、生物溶液、好ましくは未処理細胞)で接触させ、さらにii)試験物質の存在下および不在下でDampinと結合したPKAの量を、当技術分野で一般的な方法(例えば、共免疫沈降法およびウエスタンブロット法などの抗体に基づく方法)により検出するステップを含んでなる方法により製造される。
【１０５０】
本発明のある好ましい実施形態では、DARPP-32に対するDampinの比率を上昇させることのできる物質をニューロンでPKA活性を低下させる方法に用いる。さらにin vivoで血液脳関門を通過できる物質が好ましい。この方法はニューロンと該物質を接触させるステップを含む。低下した活性はin situでドーパミンに応答するカルシウムチャネル機能の変化した調節によって測定できる。この低下した活性はまた、in situでドーパミンにより媒介されるナトリウム・カリウムATPアーゼ(Na、K ATPアーゼ)の阻害の損失、または線条体および皮質ニューロンの興奮性の増加として測定してもよい。この方法はまた、i)in situで測定されるようなアンフェタミンに応答するドーパミン放出を減少させる;ii)in situで測定されるようなアンフェタミンに応答するGABA(4-アミノ酪酸)放出を減少させる;iii)in situで測定されるような線条体および皮質での物質Pのレベルを増加させる;iv)in situで測定されるような線条体および皮質でのニューロテンシンのレベルを増加させる;v)コカインに応答する個体の自発運動の増加を緩和する;vi)in situで測定されるようなアンフェタミンに応答するタンパク質Fosの増加を緩和する;vii)in situで測定されるようなコカインに応答するタンパク質慢性Fos関与抗原(FRA)の増加を緩和する;viii)in situで測定されるようなドーパミンに応答する脳のナトリウム・カリウムATPアーゼの活性の阻害を減少させる;およびix)家族の病歴または臨床評価によって決定される個人のリスクのある常習行為またはそのような行為を見せることを減少させるのにも適用される。
【１０５１】
本発明のある好ましい実施形態では、DARPP-32に対するDampinの比率を上昇させることのできる物質を女性生殖系の細胞でPKA活性を低下させる方法に用いる。この方法は、女性生殖系の細胞と該物質を接触させるステップを含む。好ましい細胞としては子宮の卵巣顆粒膜細胞および黄体細胞が挙げられる。Dampinは排卵および子宮壁での受精卵の着床に必要なプロゲステロンによって媒介されるPKA活性を阻害する。この方法はメスの避妊に用いられる。
【１０５２】
本発明のある好ましい実施形態では、グリコーゲン貯蔵細胞でDARPP-32に対するDampinの比率を上昇させることのできる物質を用いて血糖レベルを調節する。この方法は、該物質とグリコーゲン貯蔵細胞を接触させるステップを含む。好ましい細胞としては肝細胞および筋細胞が挙げられる。DARPP-32はインスリンに応答するグリコーゲンシンターゼ活性に必要なPP1を阻害する。DampinはPP1を阻害しないのでグルコースプロセシングおよび血糖調節を可能にする。この方法はインスリン欠乏および糖尿病の個体でグルコースレベルを調節するのに特に有用である。
【１０５３】
DampinはDARPP-32のドミナントネガティブ阻害剤として働くため、Dampinポリペプチドを細胞で発現させてPKA活性を阻害することもできる。本発明のある好ましい実施形態では、Dampinポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを細胞でPKA活性を阻害するのに用いる。この方法は、DampinポリペプチドまたはDampinをコードするポリヌクレオチドと機能し得る形で連結した発現制御ユニットを含むポリヌクレオチド構築物を細胞へ導入するステップを含む。好ましい細胞としては、限定されるものではないが、ニューロン、卵巣顆粒膜細胞、子宮細胞、肝細胞、および筋細胞が挙げられる。ポリペプチドまたはポリヌクレオチド構築物を特定の細胞種へ送達する方法は本明細書で述べられている。例えば、ポリヌクレオチド構築物を当技術分野で広く行われているトランスフェクション、エレクトロポレーション、またはウイルス形質転換によって培養細胞へ導入してよい。さらなる例として、ポリヌクレオチド構築物を、該ポリヌクレオチド構築物をリポソームベクターにパッケージングし;肝細胞特異的リガンド(例えば、肝細胞増殖因子)を膜内に埋め込むことによってリポソームベクターを肝臓へターゲッティングし;このリポソームを生理学上許容される方法で(例えば経口でまたは注射により)個体へ導入することによって肝細胞へ導入してよい。好ましくは、この実施態様は、本明細書で述べた通り、特に飲酒癖に関する常習行為の減少;コカインまたはアンフェタミン依存性応答の減少;プロゲステロン依存性排卵および着床の減少;または対照血糖レベルまでのグリコーゲン合成の増加に用いられる。
【１０５４】
本発明のある好ましい実施形態では、DARPP-32に対するDampinの比率を低下させることのできる物質をニューロンでPKA活性を増加させる方法に使用する。さらにin vivoで血液脳関門を通過できる化合物が好ましい。この方法はニューロンと該物質を接触させるステップを含む。ドーパミン作動性のシグナル伝達(従ってPKA活性も)の欠損は、パーキンソン病、トゥレット症候群、ADD、ハンチントン舞踏病、および精神分裂症をはじめとするいくつかの主な神経および精神障害に関与しているとされてきた。DARPP-32はドーパミン作動性経路の極めて重要な下流成分であるので、好ましくはこの方法はこれらの疾患の治療に用いられる。増加した活性は、in situでドーパミンに応答するカルシウムチャネル機能の変化した調節、in situでドーパミンにより媒介されるナトリウム・カリウムATPアーゼ(Na、K ATPアーゼ)の阻害、線条体および皮質ニューロンの興奮性の増加、またはin situで測定されるようなドーパミンにより媒介される脳ナトリウム・カリウムATPアーゼ活性の阻害によって測ることができる。さらに、この方法を用いてメス個体で性的受容性を増加させてもよい。この方法での使用のための好ましいニューロンとしては、ドーパミン受容体およびプロゲステロン受容体の双方を発現する視床下部ニューロンが挙げられる。好ましい個体としては育種動物が挙げられる。さらに好ましい個体としてはヒトが挙げられる。
【１０５５】
本発明のさらなる好ましい実施形態では、DampinによるPKAの阻害をブロックする物質を、ニューロンでPKA活性を増加させる方法に用いる。さらにin vivoで血液脳関門を通過できる化合物が好ましい。この方法はニューロンと該物質を接触させるステップを含む。この方法はパーキンソン病、トゥレット症候群、ADD、ハンチントン舞踏病、および精神分裂症をはじめとする神経および精神障害の治療に用いられる。さらに、この方法を用いてメス個体で性的受容性を増加させてもよい。この方法での使用するための好ましいニューロンとしては、ドーパミン受容体およびプロゲステロン受容体の双方を発現する視床下部ニューロンが挙げられる。好ましい個体としては育種動物が挙げられる。さらに好ましい個体としてはヒトが挙げられる。
【１０５６】
DARPP-32は腎臓での適切な心房性ナトリウム利尿因子(ANF)活性のために必要である。ANFは、ネフロン全体にわたる腎基底外側上皮で唯一の活性化ナトリウム輸送体である腎ナトリウム・カリウムATPアーゼを阻害することによって血中ナトリウムレベルを調節し、血液量を減少させる。本発明のある好ましい実施形態では、DARPP-32発現に対するDampinの比率を低下させることのできる物質を細胞でANFを活性化する方法に用いる。好ましい細胞としてはネフロンの腎臓細胞がある。この方法を、in situで測定したように、ANFに応答する腎ナトリウム・カリウムATPアーゼの活性を阻害し、ANFにより媒介されるin vivoでのナトリウム排出量を増加させるのに適用する。好ましくは、この方法は血液量および高血圧症の減少に用いられる。
【１０５７】
本発明のさらなる好ましい実施形態では、DampinによるPKAの阻害をブロックする物質を、細胞でANFを活性化させる方法に用いる。好ましい細胞としてはネフロンの腎臓細胞がある。この方法を、in situで測定されるようなANFに応答する腎臓のナトリウム・カリウムATPアーゼの活性を阻害し、ANFにより媒介されるin vivoでのナトリウム排出量を増加させるのに適用する。好ましくは、この方法は血液量および高血圧症の減少に用いられる。
【１０５８】
配列番号92のタンパク質(内部表示クローン651658_181-35-2-0-C8-F)
クローン651658_181-35-2-0-C8-FのcDNA(配列番号91)はアミノ酸配列:
MPSSVSWGILLLAGLCCLVPVSLAEDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFAFSLYRQLAHQSNSTNIFFSPVSIATAFAMLSLGTKADTHDEILESLNFNLTEIPEAQIHEGFQELLRTLNQPDSQLQLTTGNGLFLSEGLKLVDKFLEDVKKLYHSEAFTVNFGDTEEAKKQINDYVEKGTQGKIVDLVKELDRDTVFALVNYIFFKGKWERPFEVKDTEEEDFHVDQATTVKVPMMKRLGMFNIQHCKKLSSWVLLMKYLGNATAIFFLPDEGKLQHLENELTHDIITKFLENEDRRSASLHLPKLSITGTYDLKSVLGQLGITKVFSNGADLSGVTEEAPLKLSKAVHKAVLTIDEKGTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVKFNKPFVFLMIEQNTKSPLFMGKVVNPTQKを含んでなる配列番号92のタンパク質をコードする。よって、本願を通じて記載される配列番号92のポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン651658_181-35-2-0-C8-Fに含まれる核酸によりコードされるポリペプチドについても当てはまることが理解されよう。さらに、本願を通じて記載される配列番号91のポリヌクレオチドの全ての特徴および用途はクローン651658_181-35-2-0-C8-Fに含まれる核酸についても当てはまることが理解されよう。本発明のある好ましい実施形態は、配列番号91および配列番号92の組成物に関する。また、本明細書に記載されるような生物活性を有するポリペプチド断片およびそれらの断片をコードするポリヌクレオチドも好ましい。
【１０５９】
配列番号91のcDNAは第14染色体、詳しくは14q32.1に位置する遺伝子によってコードされ、VAGSと呼ばれるヒトα1抗トリプシンタンパク質の新規な変異体である。配列番号91のcDNAは配列番号92の418アミノ酸のタンパク質をコードする。
【１０６０】
プロテアーゼは広範な生物学的経路の主要な成分であり、それらの触媒機構に応じて、セリン、システイン(チオール)、アスパラギン酸(カルボキシル)およびメタロプロテアーゼの4つの群に分類することができる。VAGSはセルピンモチーフを示すことからセルピンと呼ばれるセリンプロテアーゼ阻害剤タンパク質ファミリーに属する。セルピンは血液凝固、繊維素溶解、補体の活性化、血管形成、アポトーシス、炎症、新生組織形成およびウイルス病理などの多様な生理学的プロセスにおいてタンパク質分解を調節する上で中枢的な役割を有するプロテアーゼの不可逆的な自殺型阻害剤である。VAGSはその標的酵素と安定した複合体を形成するその活性部位に結合することにより細胞内で形成の未熟ないずれのトリプシンでも中和し、これはセルピン/セリンプロテアーゼ相互作用の一般的な特性である。VAGSは肝臓で合成され、炎症刺激に応答して、炎症部位で活性化された好中球から放出されるタンパク質分解酵素好中球エラスターゼを阻害する。肝細胞では、VAGSの発現はサイトカインであるインターロイキン-6(IL-6)により増強される。VAGSの合成は炎症/組織損傷部位における好中球エラスターゼとVAGSの正味のバランスにより厳格に調節される。その機能レベルに影響し得るセルピンの変化が病状をもたらす可能性がある。先天性のセルピン欠陥は抗トロンビンIII欠陥を有する血栓症などの特定の臨床症候群を引き起こす。VAGS欠陥を有する個体は肺気腫および肝疾患の早期発症を受けやすい。さらに、セリンプロテアーゼとそれらの同種阻害剤とのバランスの変化がアルツハイマー病などのいくつかの神経変性疾患に関連するものに類似する病態をもたらすこともある。
【１０６１】
ある実施形態では、VAGSまたはその断片はVAGSに対する種々のプロテアーゼの特異的感受性を試験するためのin vitroアッセイを提供する。VAGSプロテアーゼ阻害活性は、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,955,284号に開示されているものをはじめ、当業者に公知ないずれの技術を用いて評価してもよい。本発明のタンパク質の可能性のある基質としては、限定されるものではないが、エラスターゼ、トリプシン、キモトリプシン、トロンビンIII、プラスミン、ヘパリン、補体II、プラスミノーゲンアクチベーター、Cタンパク質、インターロイキン-1β変換酵素などのセリンプロテアーゼが挙げられ、トリプシン、エラスターゼおよびキモトリプシンが好ましい。このようなプロテアーゼ阻害剤の活性を評価する方法としては、試験する阻害剤を1または数種のプロテアーゼ基質と競合系で接触させ、起こった該タンパク質の阻害の量を検出する工程を含む。また、全てのプロテアーゼ基質の中で個々のVAGS親和性を調べるために競合系を用いてもよい。
【１０６２】
もう1つの実施形態では、サンプル中の挟雑プロテアーゼを除去、同定または阻害するためにVAGSまたはその断片を用いてもよい。本発明のポリペプチドを含んでなる組成物は、タンパク質サンプルの分解を防ぐため他のプロテアーゼ阻害剤との「カクテル」として生物学的サンプルに加えてもよい。プロテアーゼ阻害剤のカクテルを用いる利点は、プロテアーゼの特異性が知られていない広範なプロテアーゼを阻害することができるという点にある。また、プロテアーゼ阻害剤カクテルを用いると、多数のソースからのタンパク質サンプルに挟雑しうる将来の未知の広範なプロテアーゼからタンパク質サンプルを保護することができる。例えば本発明のタンパク質またはその断片は、挟雑プロテアーゼによるタンパク質分解が望ましくないサンプルに加えてもよい。このようなプロテアーゼ阻害剤カクテルは、アッセイを行おうとする目的タンパク質が分解を受けやすいプロテアーゼを阻害するためにアッセイにおいて広く用いられる。あるいは、アフィニティークロマトグラフィーカラムを作製するために、当業者に周知の方法を用い、本発明のタンパク質またはその断片を単独または他のプロテアーゼ阻害剤と組み合わせてクロマトグラフィー支持体に結合させてもよい。望ましくないプロテアーゼを含有するサンプルをこのカラムに通してそのプロテアーゼを除去する。あるいは、本発明のタンパク質の新たな標的プロテアーゼを同定するために同じ方法を用いてもよい。
【１０６３】
ある実施形態では、VAGSまたはその断片は生物学的サンプル中の特定のプロテアーゼの量を定量するのに有用であることから、細菌、真菌、植物、酵母、ウイルスまたは哺乳類細胞培養物の他、体液またはその他の組織サンプルにおいてプロテアーゼを定量するためのアッセイおよび診断キットにおいて用いられる。ある好ましい実施形態では、サンプルは標準プロテアーゼ基質を用いてアッセイされる。既知濃度のプロテアーゼ阻害剤を加え、存在している特定のプロテアーゼと結合させる。次に、このプロテアーゼアッセイをもう一度行い、当業者に周知の技術を用いて活性の損失をプロテアーゼ阻害剤活性と相関させる。この実施形態において好ましいプロテアーゼはセリンプロテアーゼであり、より好ましくはエラスターゼ、トリプシンおよびキモトリプシンである。
【１０６４】
もう1つの好ましい実施形態では、VAGSまたはその断片は、限定されるものではないが細菌および寄生虫感染をはじめとする多くの感染性疾患に関連する外因性プロテアーゼを阻害するのに有用な抗菌剤として用いてもよい。例えば、プロテアーゼ阻害剤は抗生物質耐性株をはじめとするストレプトコッカスA群の全ての株の増殖を阻害することができる。よって、本発明はin vitroまたはin vivoにおいて特定の微生物の増殖を遅延させるまたは阻害するのに用い得る。
【１０６５】
本発明はVAGSと特異的に結合するその他の分子を同定する方法を提供する。例えば、罹患組織のプロテアーゼ／プロテアーゼ阻害剤バランスの組成は、タンパク質-タンパク質相互作用を破壊しない条件下で本タンパク質を単離し、本タンパク質と会合したタンパク質が何であるかを判定することにより決定することができる。このような会合タンパク質は、限定されるものではないが、免疫沈降および免疫アフィニティーカラムをはじめとする標準的な方法のいずれかにより同定することができる。それはまた、セルピンの生物学に影響を及ぼすいくつかの疾病に関連づけることができる本タンパク質の適切な標的を含む新たな相互作用を同定するために酵母ツーハイブリッドトラップを用いる検討を含んでもよい。別法としては、本タンパク質と分子ライブラリーを、複合体を形成させるのに好適な条件下で合し、複合体の形成を検出することを含むことができ、ここで複合体が存在すれば、本発明のタンパク質と特異的に結合し、かつ、いくつかの疾病で蓄積し得る分子が確認される。
【１０６６】
さらなる実施形態では、VAGSはセリンプロテアーゼ活性を効果的に調節し得る組換えセルピンを作製する方法を提供する。血清由来のヒトα1抗トリプシンの利用可能性にもかかわらず、主としてヒト血清の利用が限定されていることから治療用に十分な量を得ることができていない。従って、治療用として作製される必要を満たすためα1抗トリプシンの他の供給源の必要性は大きい。ある好ましい実施形態では、乳汁中で本発明のタンパク質を産生させ、精製後に有意な量のこの特定のタンパク質を生成するため乳汁生産動物を用いることができる。この目的においては、限定されるものではないが、ヒツジ、ヤギおよびウシなど、十分な量の乳汁を産生するいずれのタイプの動物を用いてもよい。これらの動物は、乳汁中での本タンパク質の過剰発現を目標とするいずれの方法により作出してもよい。またこの実施形態では、本発明のタンパク質は本タンパク質をコードする核酸配列を含んでなる適当な発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞において産生することができる。これらの宿主細胞はこの特定のタンパク質をコードする核酸配列が発現する条件下で培養する。生成物が蓄積するのに適切な時間の後、このタンパク質を宿主細胞または細胞周囲の培地から精製する。本発明のタンパク質をコードする核酸配列を組み込んだ発現ベクターの宿主細胞への導入は、限定されるものではないが、塩化カルシウムまたは塩化リチウム処理、エレクトロポレーション、リポフェクションなどの種々の方法で行うことができる。
【１０６７】
もう1つの実施形態では、VAGSの使用は細胞においてセリンプロテアーゼ活性を効果的に調節する方法を提供する。例えば、生物学的サンプルをサンプル内の1以上の細胞の特定のセリンプロテアーゼの速度を低下させるもしくは阻害するのに十分な量の本タンパク質、またはサンプルの1以上の細胞内の本タンパク質の活性もしくは発現を増強する化合物と接触させることにより、特定のセリンプロテアーゼの速度を低下させるまたは阻害するため、細胞において本タンパク質のレベルまたは活性を増強させることができる。このような方法はin vitroまたはin vivoのいずれで行うこともできる。細胞において本タンパク質のレベルは、精製したタンパク質を細胞に投与するか、本タンパク質をコードするポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクトするか、あるいは本タンパク質の活性または発現を増強する化合物を細胞へ投与することを含むいくつかの方法のいずれで増強させてもよい。あるいは、例えばアンチセンス分子を用いて細胞における本タンパク質のレベルを低下させることにより、あるいはより詳しくは、直接的もしくは間接的阻害分子、または本タンパク質に対するアンタゴニスト抗体を用いて本タンパク質の活性を阻害することによりセリンプロテアーゼレベルを増強することもできる。
【１０６８】
本発明はまた、動物の1以上の組織において本タンパク質の発現または活性を調節することにより作出された動物モデルを提供する。このような動物はいくつかの目的で、例えばヒトα1抗トリプシン欠陥疾患の研究を助けるために有用であるが、これは本タンパク質の活性に特異的に関連する疾病における種々の病態生理学的態様の治療に有用である可能性のある候補分子を試験するin vivoアッセイ法に相当するからである。このようなモデルの表現型の研究はまた、α1抗トリプシン欠陥により引き起こされるまたはそれに関連する同等のさらなるヒト疾病の同定を可能とする。これらの動物は本タンパク質の過剰発現または不活性化を目標とするいずれの方法でも作出することができる。このようなモデルは、例えば炎症性疾患および症状の治療のための候補となる治療法および薬物の評価において極めて有用である。
【１０６９】
その他の実施形態では、VAGSまたはその断片は、本タンパク質の発現または活性の変化に関連する疾病または疾患を診断するために用いられる。特にこれは本タンパク質の量が欠損し、その結果、標的プロテアーゼの活性が制御されなくなった患者を診断するのに有用である。このような疾病および疾患の例としては、限定されるものではないが、α1抗トリプシン欠陥関連疾患、より詳しくは肝疾患、または慢性関節リウマチ、肺気腫および乾癬などの過剰なレベルのエラスターゼと関連した疾病が挙げられる。この方法は、その疾病または症状を罹患しているおそれのあるまたはその疾病または症状を発症するリスクのある個体から得た体液または組織サンプルを、本タンパク質または核酸と特異的に結合し得る化合物、例えばポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、または免疫学的に活性なそのいずれかのフラグメント、核酸プローブなどと接触させ、サンプル中の本タンパク質のレベルまたは検出可能なその他のいずれかの特性を検出する工程を含む。この場合、対照サンプルに比べてサンプルにおけるレベルまたはその他の特性が異なれば、疾病または症状の存在、あるいは疾病または症状を発症する傾向の存在を示す。この実施形態では、周知のPCRまたはRT-PCR技術を用いて、特にこのような症状の診断を容易にするリアルタイムPCR系による突然変異の同定を行った。あるいは、このような方法を用い、本発明は、本発明の特定の変異体の発現をこれまでに連関されていなかったいくつかの病状と相関させるための手段を提供する。このように本発明はこのような症状の新規な候補遺伝子を提供する。
【１０７０】
本発明のさらなる実施形態は、プロテアーゼまたはそれらの阻害剤の異常な機能に関連する疾病および症状の治療に有用な新規な方法および組成物を提供することである。VAGSまたはその断片は、限定されるものではないが、好ましくは関節炎、筋ジストロフィー、炎症、腫瘍浸潤、糸球体腎炎、寄生虫感染、アルツハイマー病、歯周病および癌転移をはじめとする組織変性を特徴とする疾病など、細胞内タンパク質分解が起こる多くの疾病に関連づけられているプロテアーゼを阻害するために用いることができる。これらの方法および組成物はまた、敗血性ショック、膵炎、凝固障害の治療にも有用であり得る。さらに好ましい実施形態では、本発明は、限定されるものではないが慢性肺気腫、肝硬変、肝疾患、嚢胞性繊維症、およびより詳しくは動脈瘤または毒物ショックなどのα1抗トリプシン欠陥関連疾患をはじめとする異常に高いレベルのトリプシン、キモトリプシンまたはエラスターゼを特徴とする疾病における本発明のタンパク質またはその断片を用いる組成物および方法に関する。この実施形態では、本発明は好ましくは慢性関節リウマチ、肺気腫および乾癬などの過剰なレベルのエラスターゼに関連する疾病の治療において適用される。実際、細胞の老化または遺伝的欠陥に起因することが多いエラスターゼの調節されていない分泌は、非特異的タンパク質分解を起こし、種々の慢性疾患に関連する破壊的プロセスを誘発しうる。このような方法としては、治療上有効量の本タンパク質を疾病または症状を患う哺乳類に投与することを含んでなり、ここで「有効量」とはセリンプロテアーゼの活性を調節し得る本タンパク質の濃度を意味する。本発明の組成物は好ましくは生理食塩水もしくはその他のバッファーなどの生理学上許容される液体、または生理学上許容される担体と組み合わせて罹患哺乳類へ送達する。皮膚炎症の治療では、本発明の組成物は生理学上許容される軟膏またはクリームと組み合わせて罹患領域に塗布すればよい。有効成分と医薬担体の比率は通常組換えセリンプロテアーゼ阻害剤の化学的性質、溶解度および安定性によって異なる。いずれかの特定の症状に対して哺乳類に投与する本発明の組成物の特定量は、患者の臨床症状および病気のタイプ、その他、患者の体重、年齢および送達経路などの因子によって異なる。このような組成物は、限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下経路をはじめとする好適ないずれかの経路により投与することができ、また皮膚の罹患部位へは局所的に、または鼻、口腔、膣、直腸などの上皮または粘膜の内膜からの吸収により投与することができる。あるいは治療目的で、本発明のタンパク質を当技術分野で公知の遺伝子治療方法のいずれかを用いて投与してもよい。これらの組成物は本発明のタンパク質および所望により1以上のその他の種のプロテアーゼ組成物、または他のいずれかの目的化合物を含み得る。実際、この実施形態では、本発明は薬物増強適用において用途を見出せる。例えば、抗生物質または抗腫瘍薬などの治療薬を、内在するプロテアーゼによるタンパク質分解により不活性化し、それにより投与された薬物の効果を小さくしたり不活性にしたりすることができる。よって、本発明のプロテアーゼ阻害剤は薬物���活性を増強または上昇させるため、治療薬とともに患者に投与してもよい。この同時投与は、プロテアーゼ阻害剤と薬物の混合物など同時の投与によるものであっても、あるいは個別または逐次の投与によるものであってもよい。これらの成分は全て、天然源から得られたものであっても、あるいは組換え遺伝子操作技術および／または化学修飾によって作製されたものであってもよい。
【１０７１】
それらの阻害剤によるセリンプロテアーゼの調節は上記疾病における組織破壊の制御に重要なものであることから、さらなる実施形態では、VAGSまたはその断片は病態の同定のためのin vivoにおいてマーカーをモニタリングするアッセイを提供する。よって本発明は生物学的サンプル中での本タンパク質量の定量に有用な試験キットを含む。これらのキットとしては、少なくとも1つの免疫結合パートナー、例えば本発明のタンパク質に特異的であり、かつ、検出可能なマーカーに結合されたモノクローナルまたはポリクローナル抗体を含んでなる。この実施形態では、このようなアッセイの適用はこれらのまたはその他の症状を治療するために投じられた療法の進行をモニタリングするために使用できる。さらに、これらのアッセイは毒性の指標として、または組織変性への影響を評価するため新規な薬剤の臨床試験の際に使用できる。このようにこれらのアッセイは、本発明が症状、治療、または被験体に直接投与された物質の効果の指標として使用できるいずれかの状況、あるいは被験体が環境中で曝されるいずれかの状況において適用することができる。よって、このマーカーは予後指標、好ましくは炎症性疾患に関する予後指標としての役割も果たし得る。例えば、慢性炎症がその多因子病態に付随する生理学的誘因であるアルツハイマー病においてこのマーカーを用いることができる。また、ある好ましい実施形態では、本発明は悪性腫瘍の転移進行の存在を検出し、かつ／またはモニタリングする方法を提供する。実際、転移能は新生物細胞と細胞外マトリックスおよび本タンパク質をはじめとするタンパク質分解酵素などのそれらの微小環境との相互作用によって影響を受け得る。よって本発明は、生物学的サンプルを、本タンパク質に特異的でありかつ検出可能なマーカーに結合された特異的モノクローナルまたはポリクローナル抗体と、接触させる工程を含んでなる、生物学的サンプル中の本タンパク質量の定量に有用な試験キットを含む。このように、患者の症状を継続的にモニタリングすることができ、病理サンプルにおいて測定されたこのようなタンパク質の量を正常個体の生物学的サンプル中で定量された量と、あるいは同じ患者の過去の分析結果とを比較することができる。この全実施形態において、このマーカーは免疫アッセイをはじめとする好適ないずれかの方法により血漿、血清または血液中で効果的に測定することができる。それは炎症部位から採取した組織および体液においても測定できることが好ましい。このように、被験体の症状を継続的にモニタリングすることができ、病理サンプル中で測定されたこの特定のタンパク質の量を正常個体の生物学的サンプルにおいて定量した量と比較することができる。
【１０７２】
配列番号93のポリヌクレオチド(内部表示クローン150011_110-006-3-0-D5-F)および配列番号95のポリヌクレオチド(内部表示クローン500737461_205-43-3-0-E3-F)
クローン150011_110-006-3-0-D5-FのcDNA(配列番号93)はヌクレオチド配列:
CTCTTTGCTCTAACAGACAGCAGCGACTTTAGGCTGGATAATAGTCAAATTCTTACCTCGCTCTTTCACTGCTAGTAAGATCAGATTGCGTTTCTTTCAGTTACTCTTCAATCGCCAGTTTCTTGATCTGCTTCTAAAAGAARAAGTAGAGAAGATAAATCCTGTCTTCAATACCTGGAAGGAAAAACAAAATAACCTCAACTCCGTTTTGAAAAAAACATTCCAAGAACTTTCATCAGAGATTTTACTTAGATGATTTACACAATGAAGAAAGTACATGCACTTTGGGCTTCTGTCCCTGCTGCTTAATCTTGCCCCTGCCCCTCTTAATGCTGATTCTGAGGAAGATGAAGAACACACAATTATCACAGATACGGAGTTGCCACCACTGAAACTTATGCATTCATTTTGTGCATTCAAGGCGGATGATAGCCCATGTAAAGCAATCATGAAAAGATTTTTCTTCAATATTTTCACTCGACAGTGCGAAGAATTTATATATGGGGGATGTGAAGGAAATCAGAATCGATTTGAAAGTCTGGAAGAGTGCAAAAAAATGTGTACAAGAGATAMTGCAAACAGGATTATAAAGACAACATTGCAACAAGAAAAGCCAGATTTCTGCTTTTTGGAAGAAGATCCTGGAATATGTCGAGGTTATATTACCAGGTATTTTTATAACAATCAGACAAAACATGTGAACGTTTCAAGTATGGTGGATGCCTGGGCAATATGAACAATTTTGAGACACTGGAAGAATGCAAGAACATTTGTGAAGATGGTCCGAATGGTTTCCAGGTGGATAATTATGGAACCCAGCTCAATGCTGTGAATAACTCCCTGACTCCGCAATCAACCAAGGTTCCCAGCCTTTTTGTTACAAAAGAAGGAACAAATGATGGTTGGAAGAATGCGGCTCATATTTACCAAGTCTTTYTGAACGCCTTCTGCATTCATGCATCCATGTTCTTTCTAGGATTGGATAGCATTTCATGCCTATGTTAATATTTGTGCTTTTGGCATTTCCTTAATATTTATATGTATACGTGATGCCTTTGATAGCATACTGCTAATAAAGTTTTAATATTTACATGCATAGGAAAAAAAAAAAAAAAを含んでなる組織因子経路阻害剤-1(TFPI-1)の対立遺伝子をコードする。よって、本願を通じて記載される配列番号94のポリペプチドおよび配列番号93のポリヌクレオチドの全ての特徴および用途はクローン150011_110-006-3-0-D5-Fに含まれる核酸についても当てはまることが理解されよう。クローン150011_110-006-3-0-D5-Fはあるいは、本発明の主題であるヌクレオチド多型に関連して本明細書ではTFPI-C16Pfsとも呼ばれる。本発明のある好ましい実施形態は、配列番号93、配列番号94およびクローン150011_110-006-3-0-D5-Fの組成物に関する。また、本明細書に記載のような生物活性を有するポリペプチド断片およびそれらの断片をコードするポリヌクレオチドも好ましい。
【１０７３】
クローン500737461_205-43-3-0-E3-FのcDNA(配列番号95)はヌクレオチド配列:
CTCTTTGCTCTAACAGACAGCAGCGACTTTAGGCTGGATAATAGTCAAATTCTTACCTCGCTCTTTCACTGCTAGTAAGATCAGATTGCGTTTCTTTCAGTTACTCTTCAATCGCCAGTTTCTTGATCTGCTTCTAAAAGAAGAAGTAGAGAAGATAAATCCTGTCTTCAATACCTGGAAGGAAAAACAGAATAACCTCAACTCCGTTTTGAAAAAAACATTCCAAGAACTTTCATCAGAGATTTTACTTAGATGATTTACACAATGAAGAAAGTACATGCACTTTGGGCTTCTGTATGCCTGCTGCTTAATCTTGCCCCTGCCCCTCTTAATGCTGATTCTGAGGAAGATGAAGAACACACAATTATCACAGATACGGAGTTGCCACCACTGAAACTTATGCATTCATTTTGTGCATTCAAGGCGGATGATGGCCCATGTAAAGCAATCATGAAAAGATTTTTCTTCAATATTTTCACTCGACAGTGCGAAGAATTTATATATGGGGGATGTGAAGGAAATCAGAATCGATTTGAAAGTCTGGAAGAGTGCAAAAAAATGTGTACAAGAGATAATGCAAACAGGATTATAAAGACAACATTGCAACAAGAAAAGCCAGATTTCTGCTTTTTGGAAGAAGATCCTGGAATATGTCGAGGTTATATTACCAGGTATTTTTATAACAATCAGACAAAACAGTGTGAACGTTTCAAGTATGGTGGATGCCTGGGCAATCAACAATTTTGAGACACTGGAACAATGCAAGAACATTTGTGAAGATGGTCCGAATGGTTTCCAGGTGGATAATTATGGAACCCAGCTCAATGCTGTGAATAACTCCCTGACTCCGCAATCAACCAAGGTTCCCAGCCTTTTTGAATTTCACGGTCCCTCATGGTGTCTCACTCCAGCAGACAGAGGATTGTGTCGTGCCAATGAGAACAGATTCTACTACAATTCAGTCATTGGGAAATGCCGCCCATTTAAGTACAGTGGATGTGGGGGAAATGAAAACAATTTTACTTCCAAACAAGAATGTCTGAGGGCATGTAAAAAAGGTTTCATCCAAAGAATATCAAAAGGAGGCCTAATTAAAACCAAAAGAAAAAGAAAGAAGCAGAGAGTGAAAATAGCATATGAAGAAATTTTTGTTAAAAATATGTGAATTTGTTATAGCAATGTAACATTAATTCTACTAAATATTTTATATGAAATGTTTCACTATGATTTTCTATTTTTCTTCTAAAATGCTTTTAATTAATATGTTCATTAAATTTTCTATGCTTATTGCAAAAAAAAAAAAAAAAを含んでなる組織因子経路阻害剤-1(TFPI-1)の対立遺伝子をコードする。よって、本願を通じて記載される配列番号95のポリヌクレオチドおよび配列番号96のポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン500737461_205-43-3-0-E3-Fに含まれる核酸についても当てはまることが理解されよう。クローン500737461_205-43-3-0-E3-Fはあるいは、本発明の主題であるヌクレオチド多型に関連して本明細書ではTFPI-M162Qfsとも呼ばれる。本発明のある好ましい実施形態は配列番号95、配列番号96およびクローン500737461_205-43-3-0-E3-Fの組成物に関する。また、本明細書に記載のような生物活性を有するポリペプチド断片およびそれらの断片をコードするポリヌクレオチドも好ましい。
【１０７４】
外因性凝固経路は組織因子(TF)が血漿に曝されることで開始される(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるMcVey JH, Bailliere's Clinical Haematology 12:361-72 (1999))。組織因子経路阻害剤-1(TFPI-1)は外因性凝固経路の負のレギュレーターである(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,849,875号)。
【１０７５】
TFPI-1は分泌型の三価のKunitz型血漿プロテイナーゼ阻害剤である。TFPI-1は活性化因子VII(FVIIa)とTFの触媒複合体の活性化因子X(FXa)フィードバック阻害の機構を通じて凝固開始を負に調節する。すなわち、TFPI-1は直接FXaを阻害し、FXaに依存する様式で、TF-FVIIa結合をアロステリックに可能とすることによりTF-FVIIa複合体のフィードバック阻害を作り出す。TFPI-1はTF-FVIIa複合体のプロテアーゼ活性の主要な阻害剤である。TFPI-1の第2のKunitzドメインはFXaと結合してそれを阻害するが、第1のKunitzドメインはTF-FVIIa複合体におけるFVIIaの阻害に寄与する。第3のKunitzドメインの機能は未知であるが、これがヘパリン結合部位を含んでいるという証拠がある。ヘパリン結合部位はまた第3のKunitzドメインのカルボキシル末端にも配置されている。
【１０７６】
凝固の組織因子経路は正常な止血作用の際に主要な役割を果たす。主として微小血管の内皮により発現されるTFPI-1は、TFにより誘導される凝固の主要な生理学的阻害剤であると思われる。TFにより開始される凝固はまた、冠状動脈血栓症、播種性血管内凝固、卒中およびアテローム性動脈硬化症をはじめとする多くの疾病の病態生理に重要な役割を果たす。いくつかの動物試験で、これらの臨床症状のいくつかにおいて組換えTFPI-1の有益な効果が認められている。
【１０７７】
TFPI-1はTF依存性の血栓形成の調節に重要な役割を果たす。組換え全長TFPI-1は頚静脈血栓症のウサギモデルにおいて血栓症の形成および溶解後の再血栓を防ぐ(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Kaiser, Bら Thromb. Haemost. 76:615-20 (1996))。播種性血管内凝固のラットモデルでは、TFPI-1は血栓形成を阻害することが分かっている(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Elsayed, YAら, Am. J. Clin. Pathol. 106:574-83 (1996))。
【１０７８】
アテローム性動脈硬化病巣、特に進行した病巣においては、高レベルのTF抗原および活性が検出される。これらのプラークが崩壊または溶出すると、細胞内および細胞外細胞外TFが循環血液に曝され、そのことが急性冠状動脈症候群につながるフィブリンに富んだ血栓形成の媒介に中枢的役割を果たす。アテローム性動脈硬化プラークにおけるTFPI-1の存在は、組織因子活性低下およびプラーク血栓形成減少に関連している(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Caplice, NMら, Circulation 98:1051-7 (1998); Badimon, JJら, Circulation 99:1780-7 (1999))。
【１０７９】
遺伝子ノックアウト技術を用いたマウスにおける最近の研究では、TFPI-1の欠損がアテローム性動脈硬化症および血栓症を誘発することが明確に確認された。この研究では、TFPI-1がアテローム性動脈硬化症から防護し、アテローム性動脈硬化症の状況下で起こる血栓症の重要なレギュレーターであることが判明した(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Westrick, RJら, Circulation, 103:3044-6 (2001))。重要なこととしては、このモデルにおいてアテローム性動脈硬化症および血栓症の誘発には、2コピーのTFPI-1遺伝子のうち1つのみを不活性化するだけで十分であることが分かった。
【１０８０】
最近、ヒトTFPI-1でいくつかのアミノ酸多型が確認された。エキソン7の1番のヌクレオチドが突然変異すると、179番(TFPI-1の開始メチオニンから数えて)においてプロリンがロイシンに置換する(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Kleesiek, Kら, Blood 10:3976-7 (1998))。この突然変異はKunitzドメイン2のすぐ下流で起こる(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,849,875号)。この突然変異は種々の血栓症に対するリスクの高さと統計学的に関連していることが分かっている(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Kleesiek, Kら, Thromb. Haemost. 82:1-5 (1999))。
【１０８１】
第2のアミノ酸多型は292番(TFPI-1の開始メチオニンから数えて)におけるバリンからメチオニンへの置換を生じる。この突然変異はTFPI-1のカルボキシ末端に極めて近いところで起こる。突然変異に関して予測されるように、Kunitzドメイン1および2の下流である限り、この突然変異と静脈血栓塞栓症との間に連鎖は見られなかった(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Arnaud, Eら, Thromb. Haemost. 82:159-60 (1999))。
【１０８２】
クローン150011のcDNAは配列番号94のタンパク質をコードする。TFPI-C16Pfsの場合、コドン16(TFPI-1の開始メチオニンから数えて)における2つのヌクレオチドの欠失の結果、システインからプロリンへの置換が起こり、シグナル配列(エキソン3)内のタンパク質の未成熟な翻訳終結をもたらすフレームシフトが導入される。特に、TFPI-1のコドン16はTGCを表すが(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,849,875号)、TFPI-C16PfsではヌクレオチドTとGが欠失している。タンパク質TFPI-C16PfsはKunitzドメイン1および2の上流で翻訳終結するので、配列番号94のタンパク質は機能を有しない。
【１０８３】
クローン500737461のcDNAは配列番号96のタンパク質をコードする。TFPI-M162Qfsの場合、コドン162(TFPI-1の開始メチオニンから数えて)における2つのヌクレオチドの欠失および残りのヌクレオチドの突然変異の結果、メチオニンからグルタミンへの置換が起こり、Kunitzドメイン2(エキソン6)内でのタンパク質の未成熟な翻訳終結をもたらすフレームシフトが導入される。特に、TFPI-1のコドン162はATGを表すが(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,849,875号)、TFPI-M162Qfsではこのヌクレオチドのうち2つが欠失し、もう1つがCに変化している。タンパク質TFPI-M162QfsはKunitzドメイン2内で終結するので、Kunitzドメイン1によるFXa結合も、その結果としてのTF-FVIIa結合の可能性も生じず、配列番号96の非機能的タンパク質となる。
【１０８４】
血栓症の遺伝的素因に関して高情報量遺伝子スクリーニングおよび診断マーカーを利用できることは大きな価値を持つ。一方でこのような情報は、患者が適切なライフスタイルの変更を行うために使用することができる。また他方において、このような情報は医師が臨床手順の経過において起こり得る血栓合併症を予想するために使用することができる。いずれの場合とも、このような情報は患者に健康上の利益をもたらし、患者ならびに一般社会が負う医療コストを低減させる。
【１０８５】
クローン150011(TFPI-C16Pfs)および500737461(TFPI-M162Qfs)について本明細書で記載され、本発明の主題でもあるヌクレオチド多型は非機能的TFPI-1をもたらす。TFPI-1遺伝子の2コピーのうち1つだけでも不活性化されたものを持てば患者はアテローム性動脈硬化症および血栓症を罹患しやすいという明らかな証拠がある。従って、非機能的TFPI-1をもたらすTFPI-1のコード領域内においてここで記載されるヌクレオチド多型は、アテローム性動脈硬化症および血栓症に対して遺伝的に罹患しやすい患者を識別する上での遺伝子スクリーニング的価値および診断的価値を有することになる。
【１０８６】
ある好ましい実施形態では、本発明はTFPI-1コドン16(TFPI-1の開始メチオニンから数えて)における2ヌクレオチドの欠失の同定によってアテローム性動脈硬化症および血栓症の遺伝的素因を診断する方法を提供する。このような2ヌクレオチドの欠失を同定する方法は当業者に周知のものであり、限定されるものではないが、PCR-SSCP(一本鎖高次構造多型分析)が含まれる(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Kleesiek, Kら, Blood 10:3976-7 (1998))。
【１０８７】
さらなる好ましい実施形態では、本発明は、好ましくはPCR-SSCP法を用い、生物学的サンプル、好ましくは血液においてTFPI-1コドン162(TFPI-1の開始メチオニンから数えて)における2ヌクレオチドの欠失を同定する工程を含んでなる、ある個体がアテローム性動脈硬化症および血栓症を発症するリスクが高いかどうかを調べる方法へと導かれる(ここで、該欠失は高いリスクを示す)。
【１０８８】
さらなる好ましい実施形態では、本発明はTFPI-1コドン162(TFPI-1の開始メチオニンから数えて)における2ヌクレオチドの欠失の同定によりアテローム性動脈硬化症および血栓症に対する遺伝的素因を診断する方法を提供する。このような2ヌクレオチドの欠失を同定する方法は当業者に周知のものであり、限定されるものではないが、PCR-SSCP(一本鎖高次構造多型分析)が含まれる(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Kleesiek, Kら, Blood 10:3976-7 (1998))。
【１０８９】
さらなる好ましい実施形態では、本発明は、好ましくはPCR-SSCP法を用い、生物学的サンプル、好ましくは血液においてTFPI-1コドン162(TFPI-1の開始メチオニンから数えて)における2ヌクレオチドの欠失を同定する工程を含んでなる、ある個体がアテローム性動脈硬化症および血栓症を発症するリスクが高いかどうかを調べる方法へと導かれる(ここで、該欠失は高いリスクを示す)。
【１０９０】
配列番号100のタンパク質(内部表示クローン479155_174-4-4-0-C8-F)
クローン479155_174-4-4-0-C8-FのcDNA(配列番号99)はアミノ酸配列：
MIVKGVASRTVVSRPFPGNWLFSSIQLTDDQGPVLMTTVAMPVFSKQNETRSKGILLGVVGTDVPVKELLKTIPKYKLGIHGYAFAITNNGYILTHPELRLLYEEGKKRRKPNYSSVDLSEVEWEDRDDVLRNAMVNRKTGKFSMEVKKTVDKGVHFSQTFLLLNLKQTTVKNを含んでなる配列番号100のタンパク質をコードする。よって、本願を通じて記載される配列番号100のポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン479155_174-4-4-0-C8-Fに含まれる核酸によりコードされるポリペプチドについても当てはまることが理解されよう。さらに、本願を通じて記載される配列番号99のポリヌクレオチドの全ての特徴および用途はクローン479155_174-4-4-0-C8-Fに含まれる核酸についても当てはまることが理解されよう。本発明のある好ましい実施形態は、配列番号99、配列番号100およびクローン479155_174-4-4-0-C8-Fの組成物に関する。また、本明細書に記載のような生物活性を有するポリペプチド断片およびそれらの断片をコードするポリヌクレオチドも好ましい。
【１０９１】
配列番号100のタンパク質は選択的スプライシングによるカルシウムチャネルα2δ3サブユニットの変異体ADEVARをコードする。ADEVARは以下に記載されるような新規な機能を有する。
【１０９２】
α2δ3サブユニットは電位ゲートCa2+チャネルの成分である。α2サブユニットはいくつかの疎水性配列を有するが、生合成研究によりこれはδサブユニットとのジスルフィド結合を介して膜に結合した細胞外外因性膜タンパク質であることが示されている。このδサブユニットはα2サブユニットと同じ遺伝子のコード配列の3'末端によりコードされ、これら2つのサブユニットの成熟型は翻訳後タンパク質分解プロセシングとジスルフィド結合により産生される(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Catterall, WA, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 16:521-55 (2000))。α2δ3サブユニットはもっぱら脳において発現される(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Klugbauer, Nら, J. Neuroscience 19:684-691 (1999))。α2δ3サブユニットは神経のCa2+電流の調節に役割を果たす(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Catteral, WA, Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 16:521-55 (2000); Stefani, Aら, Neuropharmacology 37:83-91 (1998))。α2δ3サブユニットは癲癇発作に関連づけられてる(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Gee NSら, J. Biol Chem. 271:5768-76 (1996); Bryans JSら, J. Med. Chem. 41:1838-1845 (1998))。
【１０９３】
ADEVARはアミノ末端とカルボキシル末端の双方で末端切断された可溶性タンパク質をもたらす選択的スプライシングの産物である。ADEVARはCa2+チャネル機能において負の調節の役割を果たす。ADEVAR発現が低下すると、このチャネルを通るCa2+フラックスの調節不全および神経の興奮性の低下をもたらす。
【１０９４】
ある好ましい実施形態では、本発明は、本発明のADEVARと特異的に結合する抗体を提供する。さらに、ADEVARの非コンホメーションまたはコンホメーションエピトープを認識する該抗体の作製方法も好ましい。
【１０９５】
さらに、マウスがADEVARで免疫化される方法も好ましい。さらに、ADEVARが組換えDNA法により作出される場合のADEVARによる該免疫化も好ましい。さらに、ADEVARとは結合するが全長α2δ3サブユニットとは結合しない該マウス由来のモノクローナル抗体をスクリーニングする方法も好ましい。さらに、ADEVARとは結合するが全長α2δ3サブユニットとは結合しない該マウス由来のモノクローナル抗体を酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によりスクリーニングする方法も好ましい。組換えDNA法によりタンパク質を発現させる方法は当業者に周知のものであり、該モノクローナル抗体を作製する方法およびELISAをはじめとする方法により特異性を確認する方法は当業者に周知のものである。
【１０９６】
さらなる好ましい実施形態では、本発明は、該ADEVAR抗体が体液中のADEVARを定量する方法において用いられる方法を提供する。さらに、その定量方法がサンドイッチELISA形式である、体液中のADEVARを定量する方法も好ましい。さらに、該ADEVAR抗体が脳脊髄液中のADEVAR濃度を測定するために用いられる方法も好ましい。ある好ましい実施形態では、本発明は該抗体を接触させ、それをADEVARと特異的に結合させる方法を提供する。さらに、発作を階層化し、それにより治療戦略に価値を付与するために該抗体を診断的に用いる方法も好ましい。さらに、ADEVARレベルの低下を、発作を発現する患者の部分集団における発作に対する疾病素因と関連づける診断方法も好ましい。
【１０９７】
配列番号102のタンパク質(内部表示クローン586587_181-9-2-0-C5-F)
クローン586587_181-9-2-0-C5-FのcDNA(配列番号101)はアミノ酸配列:
MACWPQLRLLLWKNLTFRRRQTCQLLLEVAWPLFIFLILISVRLSYPPYEQHECHFPNKAMPSAGTLPWVQGIICNANNPCFRYPTPGEAPGVVGNFNKSIVARLFSDARRLLLYSQKDTSMKDMRKVLRTLQQIKKSSSRGDKRHFLNWQKGLKPLPQALLを含んでなる配列番号102のhABCをコードする。よって、本願を通じて記載される配列番号102のポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン586587_181-9-2-0-C5-Fに含まれる核酸によりコードされるポリペプチドについても当てはまることが理解されよう。さらに、本願を通じて記載される配列番号101のポリヌクレオチドの全ての特徴および用途はクローン586587_181-9-2-0-C5-Fについても当てはまることが理解されよう。本発明のある好ましい実施形態は、配列番号102、配列番号101およびクローン586587_181-9-2-0-C5-Fの組成物に関する。また、本明細書に記載のような生物活性を有するポリペプチド断片およびそれらの断片をコードするポリヌクレオチドも好ましい。
【１０９８】
hABCはATP結合カセット1の新規なスプライス変異体である。スプライス変異体としてのhABCは162アミノ酸長しかないが、ABCA1は2261アミノ酸長である。hABCはその140アミノ末端残基にわたってABCA1と100%の同一性を示すが、カルボキシル末端の22アミノ酸はhABCに独特なものである。hABCはWalker AおよびBモチーフも示さず、活性のある輸送シグナルも示さない。この140の共通アミノ酸はコレステロール結合に役割を果たすABCA1の細胞質アミノ末端テールに相当する。さらにhABCは1つの膜貫通ドメイン(TCQLLLEVAWPLFIFLILISV)と、原形質膜への輸送に必要とされる「正の、疎水性、極性」シグナルペプチドを示す。さらにまた、hABCスプライス変異体は肝細胞で特異的に発現する。このように、hABCはHDL-コレステロールと結合することで血流からHDLをクリアランスするのに重要な役割を果たし、これによりHDL-コレステロールは肝細胞へ輸送され、そこで脂質が異化され、排泄される。
【１０９９】
本発明のある実施形態は、配列番号102のhABCポリペプチド配列を含んでなる組成物に関する。
【１１００】
本発明のさらなる実施形態は、生物活性を有するhABCポリペプチド断片を含んでなる組成物に関する。
【１１０１】
本発明のある実施形態は、hABCポリペプチドをコードする配列番号101のポリヌクレオチド配列を含んでなる組成物に関する。
【１１０２】
本発明のさらなる実施形態は、生物活性を有するhABCポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる組成物に関する。
【１１０３】
本発明のある実施形態は、hABCポリペプチドをコードする配列番号101の配列と相補的なRNAを生じるポリヌクレオチド配列を含んでなる組成物に関する。
【１１０４】
本発明のさらなる実施形態は、hABCポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド配列に相補的なRNAを生じるポリヌクレオチド配列を含んでなる組成物に関する。このような好ましいポリヌクレオチド配列としては、GAGGGGACAAACGCCATTTCCTCAACTGGCAGAAGGGACTGAAGCCTCTCCCTCAAGCCCTTTTAに相補的なRNAを生じるポリヌクレオチド配列がある。
【１１０５】
本発明のさらなる実施形態は、hABCポリペプチドに対する抗体または同じ生物活性を有するhABCポリペプチド断片に対する抗体を含んでなる組成物に関する。好ましくは、この抗体はhABCポリペプチドに特異的に結合するか、またはABCA1ポリペプチドとは特異的に結合しない。いっそう好ましくは、この抗体はアミノ酸配列LQQIKKSSSRGDKRHFLまたはアミノ酸配列RHFLNWQKGLKPLPを認識する。
【１１０６】
本発明の実施形態は、体液中の循環HDL-コレステロールを測定する方法に関する。循環HDL-コレステロールを検出、測定する方法としては、i)標準的な方法によりhABCポリペプチドを、定量可能なシグナルを与えるために使用できる分子で標識し、ii)ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件下で、患者から得た体液および既知量のHDL-コレステロールを含有する対照液にこのプローブを加え、iii)好適なインキュベーション期間の後に、HDL-コレステロールと複合体を形成していない全てのhABCポリペプチドを除去するためにこのサンプルを洗浄し、さらにiv)生じたシグナルを既知量のHDL-コレステロールを含有する対照サンプルと比較する工程を含んでなる。このような方法は、低循環HDL-コレステロールレベルに関連する疾病を検出するため、動物試験および臨床試験において特定の治療的処置計画の効力を評価するため、および個々の患者の治療をモニタリングするための診断キットにおいて用いることができる。hABCのHDL-コレステロールに対する結合効率は当業者に公知のいずれかの技術を用いて、例えば全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,962,322号に記載のアッセイを用いて判定することができる。
【１１０７】
本発明のある実施形態は、hABCに対する抗体またはそのフラグメントを含んでなる組成物、抗hABC抗体を用いてHDL-コレステロールに対するhABCの結合を阻害する工程を含んでなる、HDL-コレステロールの取り込みを低下させる方法に関する。好ましくはこのような組成物としては、上記の好ましい抗体を含んでなる。このような組成物は細胞、組織サンプルまたは患者に投与することができる。好ましくはこの方法は、低循環HDL-コレステロールレベルである個体を、HDL-コレステロールクリアランスを低下させることにより処置することに関する。
【１１０８】
もう1つの実施形態は、アンチセンスポリヌクレオチドを用い、ABCA1発現に影響を与えずにhABC発現を阻害する工程を含んでなるHDL-コレステロールの取り込みを低下させる方法に関する。このような方法では、hABC mRNAの配列に相補的なRNAを生じるポリペプチドを含んでなる組換え発現ベクターを、細胞、組織サンプルまたは患者に投与することができる。好ましいこのようなアンチセンスポリヌクレオチドは上記されている。好ましい発現ベクターとしては、ウイルスベクター、特にアデノウイルスおよびレンチウイルスベクターが挙げられる。好ましくは本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは肝細胞に投与される。
【１１０９】
もう1つの実施形態では、hABC mRNAの配列に相補的なRNAを生じるポリヌクレオチドを含んでなるベクターによる細胞の改変は、遺伝子治療分野において周知の1以上の技術を用いて達成すればよい。例えば全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるMulligan (Mulligan, Science, 260:926-32 (1993))に記載の方法の1つが使用できる。好ましくはこのような方法は、低循環HDL-コレステロールレベルである個体を、HDL-コレステロールクリアランスを低下させることにより処置することに関する。
【１１１０】
本発明のあるさらなる実施形態は、ABCA1発現に影響を及ぼさずにhABC発現を低下させる物質、ならびにi)細胞と試験物質を接触させ、ii)暴露後の細胞におけるhABC発現と非暴露対照細胞のそれとを比較し、iii)暴露後の細胞におけるABCA1発現と非暴露対照細胞のそれとを比較し、iv)その発現レベルを定量し、さらにv)非暴露細胞における発現レベルに対する暴露細胞におけるhABCおよびABCA1発現の比を求める工程を含んでなる、このような物質のスクリーニング方法に関する。好ましくは、hABC発現は肝細胞で検討し、ABCA1発現はマクロファージで検討する。
【１１１１】
もう1つの好ましい実施形態では、ABCA1発現に影響を及ぼさずにhABC発現を低下させる物質を含んでなる組成物を、低レベルのHDL-コレステロールを呈する患者に投与することができる。
【１１１２】
さらに、hABCに対する抗体またはABCA1発現に影響を及ぼさずにhABC発現を低下させる物質を含んでなる組成物を、患者へ投与する医薬品を製造するための従来の製薬法に従って加工処理することができる。例えば、hABCに対する抗体またはABCA1発現に影響を及ぼさずにhABC発現を低下させる物質を含んでなる医薬組成物は固体状(例えば、経口投与用顆粒、吸入用粉末)で製造してもよいし、液体状(例えば、経口投与用または注射用溶液)で製造してもよい。
【１１１３】
組成物の有効性は、本発明の組成物を投与する前および投与した後の動物モデルの血漿HDL-コレステロールレベルを測定することによりin vivoにおいて確認することができる。循環HDL-コレステロールレベルは、例えば全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,962,322号に記載のような高速液体クロマトグラフィー技術を用いて測定することができる。低循環HDL-コレステロールを呈するヒト患者を本発明の組成物で治療する投与計画は広範囲に異なるが、標準的な方法を用いて測定することができる。例えば、hABCに対する抗体またはABCA1発現に影響を及ぼさずにhABC発現を低下させる物質の量は被験体の血漿において循環低HDL-コレステロールを上昇させるのに十分な量である。
【１１１４】
本発明の組成物は単独で投与してもよいし、循環HDL-コレステロールレベルを高める他の公知の薬剤、例えばゲムフィブロジル、ナイアシンおよびSR-BI HDL-コレステロール受容体と組み合わせて投与してもよい。本発明の組成物および方法によって治療され得る低循環HDL-コレステロールレベルに関連する疾病としては、限定されるものではないが、アテローム性動脈硬化症、血管形成術、非インスリン依存性糖尿病に関連する脂質代謝異常、肥満症および種々の他の冠状動脈疾患が挙げられる。
【１１１５】
配列番号104のタンパク質(内部表示クローン620315_188-13-1-0-G12-F)
クローン620315_188-13-1-0-G12-FのcDNA(配列番号103)はアミノ酸配列: MSQKPAKEGPRLSKNQKYSEHFSIHCCPPFTFLNSKKEIVDRKYSICKSGCFYQKKEEDWICCACQKTRLKRKIRPTPKKKを含んでなる配列番号104のMOBP-81hをコードする。よって、本願を通じて記載される配列番号104のポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン620315_188-13-1-0-G12-Fに含まれる核酸によりコードされるポリペプチドについても当てはまることが理解されよう。さらに、本願を通じて記載される配列番号103のポリヌクレオチドの全ての特徴および用途はクローン620315_188-13-1-0-G12-Fに含まれる核酸についても当てはまることが理解されよう。本発明のある好ましい実施形態は、配列番号104、配列番号103およびクローン620315_188-13-1-0-G12-Fの組成物に関する。また、本明細書に記載のような生物活性を有するポリペプチド断片およびそれらの断片をコードするポリヌクレオチドも好ましい。
【１１１６】
MOBP-81hと呼ばれる本発明のタンパク質は、ミエリン会合乏突起細胞塩基性タンパク質(MOBP, Genbank受託番号BAA05659)の新規なスプライス変異体である。MOBP-81hは81アミノ酸長しかないが、MOBPは183アミノ酸長である。この2つのcDNAでは最初のエキソンが同じである。MOBP-81hはMOBPの2番目のエキソンを欠き、MOBP-81hのカルボキシル末端の12アミノ酸はこのスプライス変異体に独特なものである。MOBP-81hはヒトMOBPタンパク質に関して記載された最初のスプライス変異体である。MOBP-81hはCNS乏突起細胞で特異的に発現し、ミエリン鞘の完全性を維持する上で役割を果たす。
【１１１７】
本発明のある実施形態は、配列番号104のMOBP-81hポリペプチド配列を含んでなる組成物に関する。
【１１１８】
本発明のさらなる実施形態は、生物活性を有するMOBP-81hポリペプチド断片を含んでなる組成物に関する。
【１１１９】
本発明のさらなる実施形態は、MOBP-81hポリペプチドをコードする配列番号103のポリヌクレオチド配列を含んでなる組成物に関する。
【１１２０】
本発明のさらなる実施形態は、生物活性を有するMOBP-81hポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる組成物に関する。
【１１２１】
もう1つの実施形態では、本発明の組成物はMOBP-81hポリペプチドを含んでなる。MOBP-81hポリペプチドを産生させる方法としては、i)哺乳類宿主細胞を、本発明のポリヌクレオチドを含んでなる組換え発現ベクターでトランスフェクトし、さらにii)産生されたタンパク質を精製する工程を含んでなる。本発明の精製は当業者に周知のいずれかの技術に従って行うことができる。好ましくはMOBP-81hに対する抗体またはそのフラグメントをクロマトグラフィー支持体に結合させてアフィニティークロマトグラフィーカラムを作製してもよい。いっそう好ましくは、この抗体はMOBP-81hのカルボキシル末端の12アミノ酸を認識する。
【１１２２】
本発明のある実施形態は重症性脱髄疾患を治療または軽減するために本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを用いる方法に関する。例えばMOBP-81hポリペプチドまたはその断片、そのタンパク質をコードするポリヌクレオチド、あるいはMOBP-81hの発現または活性を増強する化合物を含むいずれかの組成物および方法が使用できる。
【１１２３】
ある実施形態では、本発明の方法は脱髄疾患患者に本発明のポリヌクレオチドの1つを含んでなる組換え発現ベクターを投与することに関する。好ましい発現ベクターとしては、ウイルスベクター、特にアデノウイルスおよびレンチウイルスベクターが挙げられる。
【１１２４】
もう1つの実施形態では、遺伝子治療分野において周知の1以上の技術を用いて本発明のポリヌクレオチドの1つを含んでなるベクターによる細胞の遺伝的改変を達成することができる。例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるMulligan (Mulligan, Science, 260:926-32 (1993))に記載の方法の1つを用いることができる。
【１１２５】
さらにもう1つの実施形態では、本発明の組成物はMOBP-81h発現を増強する物質を含んでなる。
【１１２６】
さらに、本発明の方法はMOBP-81h発現を増強する試験物質をスクリーニングする方法に関する。これらの方法としては、i)細胞を試験化合物と接触させ、さらにii)試験物質に暴露後の細胞におけるMOBP-81h発現と非暴露対照細胞のそれとを比較する工程を含んでなる。好ましくはこの試験物質は乏突起細胞におけるMOBP-81hの発現は改変するが他の細胞型では改変しないものである。
【１１２７】
本発明の組成物および方法の脱髄疾患を治療するための有効性は、免疫電子顕微鏡法により髄鞘の形態に対する本発明の組成物の影響を調べることによりin vitroで確認することができる。また、本発明の組成物および方法の脱髄疾患を治療するための有効性は、脱髄疾患の試験モデル、例えばTMEV感染マウスを用いてin vivoで確認することもできる。本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの脱髄疾患患者を治療するための有効量は関連の技術に従って決定することができる。例えば、本発明の組成物の有効量は、脱髄疾患に関連する臨床徴候(例えば、震え、緊張性発作、歩行不安定、運動失調)の重篤性を消失または軽減するのに必要かつ十分な組成物の量を測定することにより決定することができる。
【１１２８】
ある好ましい実施形態では、患者に投与するための医薬品を製造するため、MOBP-81hポリペプチドまたはMOBP-81h発現を増強する物質は従来の製薬法に従って加工処理することができる。このように、MOBP-81hもしくはその断片、またはMOBP-81h発現を増強する物質を含んでなる医薬組成物は固体状(例えば、経口投与用顆粒、吸入用粉末)で製造してもよいし、液体状(例えば、経口投与用または注射用溶液)で製造してもよい。
【１１２９】
本発明の組成物は単独で投与してもよいし、脱髄疾患を治療する他の公知の薬剤、例えばイミダゾール誘導体またはMBP分子と組み合わせて投与してもよい。MOBP-81hまたはその断片を含有する組成物により治療され得る脱髄疾患としては、限定されるものではないが、白質萎縮症(例えば、クラッベ病、異染性白質萎縮症、ALD、カナバン病、アレクサンダー病)、白質脳症、多発性硬化症およびウイルス誘発型炎症性脱髄が挙げられる。
【１１３０】
配列番号106のタンパク質(内部表示クローン646477_181-19-2-0-F4-F)
クローン646477_181-19-2-0-F4-FのcDNA(配列番号105)はアミノ酸配列:
MISPVLILFSSFLCHVAIAGRTCPKPDDLPFSTVVPLKTFYEPGEEITYSCKPGYVSRGGMRKFICPLTGLWLINTLKCTPRVCPFAGILENGAVRYTTFEYPNTISFSCNTGFYLNGADSAKCTEEGKWSPELPVCAPIICPPPSIPTFATLRVYKPSAGNNSLYRDTAVFECLPQHAMFGNDTITCTTHGNWTKLPECREVKCPFPSRPDNGFVNYPAKPTLYYKDKATFGCHDGYSLDGPEEIECTKLGNWSAMPSCKASCKVPVKKATVVYQGERVKIQEKFKNGMLHGDKVSFFCKNKEKKCSYTEDAQCIDGTIEVPKCFKEHSSLAFWKTDASDVKPCを含んでなる配列番号106の新規なアポリポタンパク質H(NAPOH)をコードする。よって、本願を通じて記載される配列番号106のポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン646477_181-19-2-0-F4-Fに含まれる核酸によりコードされるポリペプチドについても当てはまることが理解されよう。さらに、本願を通じて記載される配列番号105のポリヌクレオチドの全ての特徴および用途はクローン646477_181-19-2-0-F4-Fに含まれる核酸についても当てはまることが理解されよう。本発明のある好ましい実施形態は、配列番号105、配列番号106およびクローン646477_181-19-2-0-F4-Fの組成物に関する。また、本明細書に記載のような生物活性を有するポリペプチド断片およびそれらの断片をコードするポリヌクレオチドも好ましい。
【１１３１】
配列番号106のタンパク質はアポリポタンパク質Hまたはβ-2-糖タンパク質I前駆体の配列の多型変異体(swissprot受託番号P02749)である。アポタンパク質H同様、本発明のタンパク質は4つのSushiドメイン(PF00084)と1つのsushi様ドメイン、すなわちアミノ酸23〜79(Sushi 1)、アミノ酸84〜137(Sushi 2)、アミノ酸142〜200(Sushi 3)、アミノ酸205〜260(Sushi 4)およびアミノ酸263〜345(Sushi様)を示す。またSushiドメインは補体制御タンパク質(CCP)モジュール、すなわち短いコンセンサスリピート(SCR)としても知られ、広範な補体および接着タンパク質に存在している。また、ドメインV(sushi様ドメイン)は疎水性リガンドと特異的に相互作用することも報告されている(Hong, D.P.ら, Biochemistry 40:8092-8100 (2001))。新規なアポリポタンパク質H、すなわち配列番号106のタンパク質は肝臓で発現が高い。
【１１３２】
新規なアポリポタンパク質Hは、負電荷を持つ様々な種類の物質と結合する能力を有する血漿タンパク質である。新規なアポリポタンパク質H(NAPOH)は傷害を受けた細胞の表面のリン脂質と結合することにより内因的な血液凝固カスケードの活性化を防ぎ得る。NAPOHはB細胞体液性応答およびT細胞免疫応答を刺激する強力な自己抗原である。NAPOHはリポタンパク質の代謝、アテローム性動脈硬化症をはじめとする種々の生理学的経路、ならびに抗リン脂質自己抗体(「aPA」)の産生に関連づけられている。NAPOHはまた血小板、ミトコンドリア、ヘパリン、DNAおよび陰イオン性リン脂質とも結合し、血液凝固経路、血小板凝集、および血小板のプロトロンビナーゼ活性に関与することが示されている。NAPOHは凝固経路および血小板凝集に対して多重阻害を示す。NAPOHは全身性紅斑性狼瘡のような慢性炎症性疾患および原発性抗リン脂質症候群を有する多くの患者の血清に見られるaPAにより陰イオン性リン脂質抗原に必要な補助因子であると考えられるが、感染症に関連するaPAの反応性に必要であるとは考えられない。これらの研究では、NAPOH-リン脂質複合体が、aPAに対する抗原を形成することが示唆される。原発性抗リン脂質症候群を有する患者ではリン脂質フリーのNAPOHに対する自己抗体が存在する。抗リン脂質自己抗体は、最も一般的には狼瘡抗凝固剤および負電荷を有するリン脂質に対する抗カルジオリピン抗体をはじめとする自己抗体のヘテロな群である。抗リン脂質自己抗体の存在は再発性深静脈血栓症、ならびに肺、直腸および網膜血栓症をはじめとするその他の血栓合併症、ならびにバッド・キアリー症候群に関連している。さらにまた、抗リン脂質自己抗体は、脳、網膜、および末梢動脈をはじめとする動脈血栓に関連づけられている。習慣性流産は通常妊娠第2期および第3期に起こり、1つには胎盤血管の血栓症とそれに続く梗塞により胎盤不全が起こることによるものと思われ、最終的には流産は抗リン脂質自己抗体に関連する。
【１１３３】
本発明のある実施形態は、配列番号106の新規なアポリポタンパク質H(NAPOH)ポリペプチド配列を含んでなる組成物に関する。
【１１３４】
本発明のさらなる実施形態は、生物活性を有するNAPOHポリペプチド断片を含んでなる組成物に関する。
【１１３５】
本発明のさらなる実施形態は、NAPOHポリペプチドをコードする配列番号105のポリヌクレオチド配列を含んでなる組成物に関する。
【１１３６】
本発明のさらなる実施形態は、生物活性を有するNAPOHポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる組成物に関する。
【１１３７】
配列番号106のタンパク質またはその断片の調製および精製は、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,859,213号に記載のように行えばよい。例えばヒト血漿からNAPOHを精製する方法としては、i)血漿を加熱および冷却して沈殿および上清を得、ii)上清を分離してその上清を酸性化し、iii)その上清に沈殿剤を加えて第2の沈殿からアルブミン水溶液を分離し、iv)そのアルブミン水溶液に対してアフィニティークロマトグラフィーを行い、さらにv)粒子状支持体を溶出してNAPOHを得る工程を含んでなる。
【１１３８】
本発明のさらなる実施形態は、i)細胞を試験物質と接触させ、さらにii)試験物質に暴露後の細胞におけるNAPOH発現と非暴露対照細胞のそれとを比較する工程を含んでなる、試験物質をNAPOH発現のアクチベーターまたは阻害剤に関してスクリーニングする方法に関する。その結果、このようなNAPOHアクチベーターはそれらの凝固誘導能により新規薬物としての大きな可能性を持ち、種々の凝固障害(限定されるものではないが、血友病および播種性血管内凝固などの遺伝疾患、重篤な出血性症候群を含む)の治療に有用であり、あるいは外傷、外科術またはその他の原因による創傷を治療する上で凝固およびその他の止血作用を増強するものと思われる。あるいは、このようなNAPOH阻害剤は自己免疫疾患および血栓症の治療に有用であり得る。
【１１３９】
本発明のさらなる実施形態は、i)試験物質を抗リン脂質自己抗体の存在下でNAPOHポリペプチドと、NAPOHと抗リン脂質自己抗体の結合を可能とする条件下で接触させ、さらにii)当技術分野で一般的な方法により、試験物質の存在下または不在下でNAPOHと結合した抗リン脂質自己抗体の量を検出する工程を含んでなる、NAPOHと特異的に結合して抗リン脂質自己抗体との結合を妨げる試験物質をスクリーニングする方法に関する。好ましくはこの試験物質はNAPOHの抗リン脂質自己抗体との相互作用を阻害することができる。NAPOHの自己抗体との相互作用は抗リン脂質症候群、より詳しくは自己免疫アテローム形成と連関している。
【１１４０】
本発明のさらなる実施形態は、i)細胞を試験物質と接触させ、さらにii)試験物質に暴露後の細胞におけるNAPOH発現と非暴露対照細胞のそれとを比較する工程を含んでなるNAPOH発現のモジュレーターに関して物質をスクリーニングする方法に関する。NAPOH発現は、当技術分野で一般的なまたは本明細書に含まれる方法によりNAPOHポリヌクレオチドまたはポリペプチドを検出することによって測定することができる。この方法の一例としては、i)同等の2つの細胞サンプルを培養し、ii)その培養物の一方に試験物質を加え、他方には加えず、iii)所定の時点で両培養物を回収し、iv)各細胞サンプルからmRNAを精製し、v)ノーザンブロット、RTPCRまたは当技術分野で一般的な別の方法により各サンプルのNAPOH mRNAのレベルを比較する工程を含んでなる。本発明は本明細書に記載のように特異的ポリヌクレオチドプローブおよびプライマーのデザインおよび使用を提供する。さらなる例としては、i)同等の2つの細胞培養物を得、ii)その培養物の一方に試験物質を加え、他方には加えず、iii)両培養物を回収し、iv)各細胞サンプルからタンパク質を精製し、v)ウエスタンブロット、免疫組織化学または当技術分野で一般的な別の方法により、各サンプルのNAPOHポリペプチドのレベルを比較する工程を含んでなる。本発明は本明細書に述べるように特異的抗体および抗体フラグメントのデザインおよび使用を提供する。その結果、このようなNAPOHアクチベーターはそれらの凝固誘導能により新規薬物としての大きな可能性を持ち、また種々の凝固障害(限定されるものではないが、血友病および播種性血管内凝固などの遺伝疾患、重篤な出血性症候群を含む)の治療に有用であり、あるいは外傷、外科術またはその他の原因による創傷を治療する上で凝固およびその他の止血作用を増強するものと思われる。あるいは、このようなNAPOH阻害剤は炎症性aPAのレベルを低下させることにより自己免疫疾患および血栓症の治療に有用であり得る。もう1つの実施形態では、本発明は、自己免疫疾患および全身性紅斑性狼瘡(SLE)に関連する自己抗体を同定するために本発明のタンパク質またはその断片を用いる方法に関する。よって、本発明は、自己抗体の存在を検出するために用い得る。典型的な実施形態では、配列番号106のタンパク質は、限定されるものではないが、蛍光標識、放射性原子、常磁性イオン、ビオチン、化学発光標識または二次的な酵素による工程または結合による工程によって検出することができる標識をはじめとする検出可能な部分で標識する。本発明はさらにSLEを診断し、他の疾患からこのようなプロセスを識別する方法を提供する。
【１１４１】
配列番号106のタンパク質のアンタゴニストは当技術分野で一般的な方法を用いて作製し得る。アンタゴニストは、自己免疫疾患に関連づけられている負電荷を有するリン脂質に対するNAPOHの結合活性に影響を与える。ある態様では本発明のタンパク質またはその断片は、本明細書に記載のものをはじめ当業者に公知のいずれかの技術を用い、特異的抗体を合成するために用い得る。特に、精製NAPOHは、抗体を作製するかまたは医薬品のライブラリーをスクリーニングして、NAPOHと特異的に結合するものを同定するために用い得る。このようにNAPOHは自己免疫疾患患者においてこのタンパク質に対する抗体を同定およびアッセイするために用い得る。
【１１４２】
本発明のタンパク質またはその断片の抗リン脂質抗体に対する主要抗原として機能する能力は当業者に周知の技術を用いて評価すればよい。本発明のタンパク質またはその断片、特にSushiモチーフおよびSushi様モチーフを含む断片の抗リン脂質自己抗体と結合する能力は、本明細書に記載のものをはじめ、当業者に周知の技術を用いて評価すればよい。例えば、配列番号106のタンパク質またはその断片はクロマトグラフィーマトリックスなどの固相支持体に固定化してもよい。抗リン脂質自己抗体を含む調製物はNAPOHとの結合を促進する条件下で本発明のタンパク質と接触するように配置させる。この支持体を洗浄した後、この支持体を、抗リン脂質自己抗体をNAPOHから解離させる薬剤と接触させることにより、抗リン脂質自己抗体を支持体から遊離させる。
【１１４３】
本発明のある実施形態は、生物学的サンプル中の結合自己抗体、好ましくは抗リン脂質自己抗体を同定および／または定量するために本発明のタンパク質またはその断片、特にSushiモチーフを含むポリペプチドまたはその誘導体を用いる方法に関するものであり、従って、体液、組織サンプル、および哺乳類細胞培養物においてこのような結合タンパク質を定量するためのアッセイおよび診断キットにおいて用いられる。このようなアッセイは原発性抗リン脂質症候群に関連する疾患の検出およびモニタリングにおける診断または予後診断ツールとして特に有用であり得る。本発明のタンパク質またはその断片の結合活性は当業者に公知のいずれかの方法を用いて評価すればよい。好ましくは、規定量の本発明のタンパク質またはその断片をサンプルに、本発明のタンパク質またはその断片と同定および／または定量する結合タンパク質との間の複合体の形成を可能とする条件下で加える。次に、複合体および／または本発明の遊離タンパク質もしくはその断片の存在をアッセイし、最後に当業者に公知のいずれかの技術を用いて対照と比較する。
【１１４４】
もう1つの実施形態では、例えば遺伝子突然変異の効率的スクリーニングを行うために配列番号105のヌクレオチド配列またはその断片を含んでなるオリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築することができる。このマイクロアレイは多数の遺伝子の発現レベルを同時にモニタリングするため、また、遺伝子変異体、突然変異、および多型を同定するために使用することができる。この情報は、遺伝子の機能を決定するため、疾患の遺伝的基礎を理解するため、疾患を診断するため、また、治療薬を開発してその活性をモニタリングするために使用することができる(例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるChee, M.ら, Science, 274:610-614 (1996)参照)。例えば、遺伝子変異体、突然変異、および多型は血栓関連疾病および慢性炎症性疾患に関連することが示されている(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,203,980 B1号に記載)。
【１１４５】
さらに、NAPOHは受精プロセスにも関与する。この精製タンパク質を正常精子男性から調製した精子サンプルに加えると、精子直線地点移動速度(VSL)と精子頭部振幅値(ALH)が有意に高まる。精子の保存は商業用動物育種プログラム、ヒト精子提供プログラムおよび特定の病態の治療において幅広い重要性がある。例えば、精子サンプルは、癌または最終的に精子産生を妨げることがあるその他の疾患を有すると診断された男性のために、ならびにその他の状況または時点において用いるため精子が保存される人工授精を目的として冷凍してもよい。このような場合において用いられる手法としては、精漿または残渣など、サンプルの非精子成分から精子に富んだ画分を分離するために精子サンプルを洗浄し;さらに射精液中の死精子または白血球細胞から健常な運動性精子を単離し;後日用いるために、または種々の状況で女性に提供するために精子を冷凍または冷蔵し;診断試験で培養するため、または試験管内受精もしくは細胞質内精子注入などの治療的介入において用いるために拡張または希釈することを含む(Cohenら 12: 994-1001 (1997))。精子が洗浄および単離されれば、次にそれは様々な目的(精子分析、診断試験、人工授精)のために培地または保持液で拡張(または希釈)する。拡張または希釈された精子の各々の用途によりいくらか異なる基本培地組成を必要とするが(例えば、米国特許第6,140,121号 Ellingtonら Oct. 2000参照)、いずれの場合でも精子の生存率は女性の生殖管以外では至適に満たない。精子機能の保存性を向上させ得る希釈または保存培地の新規な付加的成分が有用である。従って、本発明のもう1つの好ましい実施形態では、配列番号106によりコードされる精製組換えタンパク質またはその断片を、精子を保護すべくデザインされた薬理学的培地の成分として加えることができる。このような保存培地を構成するために用いる方法は一般に当業者に公知である(例えば、 O liver S.A.ら 米国特許第5,897,987号 Apr.1999; Cohen J.ら,上記)。逆に、本発明のさらにもう1つの実施形態では、本発明のタンパク質を認識し、それと結合し、それを遮断するリガンド、阻害剤、中和抗体またはその他の生物薬を男性における避妊を目的としてデザインされた薬剤の成分として用いることもできる。
【１１４６】
配列番号108のタンパク質(内部表示クローン113165_105-056-3-0-G12-F)
クローン113165のcDNA(配列番号107)はアミノ酸配列:
MAAGGSGVGGKRSSKSDADSGFLGLRPTSVDPALRRRRRGPRNKKRGWRRLAQEPLGLEVDQFLEDVRLQERTSGGLLSEAPNEKLFFVDTGSKEKGLTKKRTKVQKKSLLLKKPLRVDLILENTSKVPAPKDVLAHQVPNAKKLRRKEQLWEKLAKQGELPREVRRAQARLLNPSATRAKPGPQDTVERPFYDLWASDNPLDRPLVGQDEFFLEQTKKKGVKRPARLHTKPSQAPAVEVAPAGASYNPSFEDHQTLLSAAHEVELQRQKEAEKLERQLALPATEQAATQESTFQELCEGLLEESDGEGEPGQGEGPEAGDAEVCPTPARLATTEKKTEQQRRREKAVHRLRVQQAALRAARLRHQELFRLRGIKAQVALRLAELARRQRRRQARREAEADKPRRLGRLKYQAPDIDVQLSSELTDSLRTLKPEGNILRDRFKSFQRRNMIEPRERAKFKRKYKVKLVEKRAFREIQLを含んでなる配列番号108のタンパク質をコードする。よって、本願を通じて記載される配列番号108のポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン113165_105-056-3-0-G12-Fに含まれる核酸によりコードされるポリペプチドについても当てはまることが理解されよう。さらに、本願を通じて記載される配列番号107のポリヌクレオチドの全ての特徴および用途はクローン113165_105-056-3-0-G12-Fに含まれる核酸についても当てはまることが理解されよう。本発明のある好ましい実施形態は、配列番号107、配列番号108およびクローン113165_105-056-3-0-G12-Fの組成物に関する。また、本明細書に記載のような生物活性を有するポリペプチド断片およびそれらの断片をコードするポリヌクレオチドも好ましい。
【１１４７】
配列番号107のcDNAは、マウスJNK3結合タンパク質(GSP:AAB12882)と相同な、hJNK3-BPと呼ばれる新規なヒトJNK3結合タンパク質である。配列番号107のcDNAは主として脳で発現する配列番号108の478アミノ酸長のタンパク質をコードする。
【１１４８】
c-Jun NH2末端キナーゼ(JNK)シグナル伝達経路は種々の環境ストレスに応答して、また、数種の細胞表面受容体の関与によって活性化される。哺乳類細胞においてJNKは、免疫応答、癌化およびアポトーシスに関連づけられている。JNKのこれらの作用は少なくとも1つには遺伝子発現の増強によって媒介される。3種類の哺乳類遺伝子がJNKタンパク質キナーゼをコードしている。JNK1およびJNK2は遍在的に発現するが、JNK3は主として脳で発現する(Ip YT, Davis RJ Curr Opin Cell Biol 1998 Apr;10(2):205-19)。特異的にベイト(bait)としてJNK3を用いて酵母ツーハイブリッドスクリーニングを行うことにより、Ito Mら (Ito M, Yoshioka K, Akechi M, Yamashita S, Takamatsu N, Sugiyama K, Hibi M, Nakabeppu Y, Shiba T, Yamamoto KI. Mol Cell Biol 1999 Nov;19(11):7539-48)はマウスJsap1(JNK/ストレス活性化タンパク質キナーゼ会合タンパク質1に関する)を単離し、これはJip-3(Kelkar N, Gupta S, Dickens M, Davis RJ, Mol Cell Bio 2000 20:1030-1043)としても知られている。Jip-3は、JNKシグナル伝達経路によりシグナル伝達を調節し得る足場タンパク質として働くJip-1およびJip-2などのJNK相互作用タンパク質(JIP)に相当する。本発明のタンパク質hJNK3-BPはJNK3タンパク質キナーゼと特異的に結合して、細胞のJNK3シグナル伝達経路の生物作用を調節する。hJNK3-BPはJNK3カスケードの調節に関与する新規な種の足場タンパク質の始原メンバーに相当する。
【１１４９】
本発明のある実施形態は、配列番号108のhJNK3-BPポリペプチド配列を含んでなる組成物に関する。
【１１５０】
本発明のさらなる実施形態は、生物活性を有するhJNK3-BPポリペプチド断片を含んでなる組成物に関する。
【１１５１】
本発明のさらなる実施形態は、hJNK3-BPポリペプチドをコードする配列番号107のポリヌクレオチド配列を含んでなる組成物に関する。
【１１５２】
本発明のさらなる実施形態は、生物活性を有するhJNK3-BPポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる組成物に関する。
【１１５３】
ある実施形態では、本発明はJNK活性を効果的に調節し得る組換えタンパク質を作製する方法を提供する。本発明のタンパク質は、hJNK3-BPポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる適当な発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞において産生させることができる。本発明のタンパク質をコードする核酸配列を宿主細胞に導入する発現ベクターの導入は、限定されるものではないが、塩化カルシウムもしくは塩化リチウム処理、エレクトロポレーションまたはリポフェクションをはじめとする種々の方法で行うことができる。組換えタンパク質を得るには広範な発現系のいずれを用いてもよい。好適な発現ビヒクルとしては、限定されるものではないが、プラスミド、ウイルス粒子および昆虫細胞ではバキュロウイルスが挙げられる。この発現ビヒクルは宿主細胞ゲノムに組み込むことができる。ある状況では、誘導型の発現ベクターを用いるのが望ましい。発現ビヒクルを担持する宿主細胞を、この特定のタンパク質をコードする核酸配列が発現される条件下において従来の栄養培地中で培養する。生成物が蓄積するのに適切な時間の後、このタンパク質を宿主細胞から精製する。
【１１５４】
もう1つの実施形態では、本発明は細胞においてJNK活性を効果的に調節する方法を提供する。細胞においてhJNK3-BPのレベルまたは活性を増強させて特異的JNKタンパク質キナーゼ活性を低下または阻害し、それによりJNK3関連のアポトーシスを妨げることができる。hJNK3-BPレベルは、hJNK3-BPポリヌクレオチドまたはポリペプチドを細胞に、サンプル内の1以上の細胞のJNKタンパク質キナーゼ活性を特異的に阻害するのに十分な量で導入することにより上昇させることができる。このような方法はin vitroまたはin vivoのいずれでも行うことができる。hJNK3-BPのレベルは細胞内にていくつかの方法のうちいずれでも増強させることができる。例えば、精製hJNK3-BPタンパク質はマイクロインジェクションにより、あるいはリポソームまたはミセルにより媒介される輸送により細胞に導入することができる。このようなリポソームまたはミセルによるマイクロカプセルは所望により抗体または受容体リガンドなどの細胞型特異的標的と組み合わせてもよい。あるいは、hJNK3-BPポリヌクレオチドは、トランスフェクション、エレクトロポレーションまたはウイルス形質導入など当技術分野で一般的な方法により細胞に導入してもよい。細胞にhJNK3-BPポリヌクレオチドを導入するためには、シクロデキストリン、リポソームまたはミセルにより媒介される輸送を用いてもよい。上記方法の有用な例としては、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5019369号、同第5616565号、同第6110490号、同第6204060号およびP.C.T. WO9704748に記載されている。さらに、hJNK3-BPポリペプチドの発現を増強するいずれかの化合物を用いてサンプルの1以上の細胞内でJNKタンパク質キナーゼ活性を低下させることもできる。このような化合物は、細胞を試験物質と接触させ、試験物質に暴露後の細胞におけるhJNK3-BP発現と非暴露対照細胞のそれとを比較する工程を含んでなる、hJNK3-BP発現を増強する試験物質をスクリーニングすることにより同定することができる。
【１１５５】
本発明はJNKの活性化により誘導されるアポトーシスを阻害して細胞を培養系で生存維持するin vitro法を提供する。好ましくは本発明は、hJNK3-BPポリヌクレオチドのex vivo導入の後、このような細胞をin vivoにて移植または埋植することを含む目的での細胞培養に適している。該ポリヌクレオチドは上記で挙げられたものなど当技術分野で公知の方法により目的の細胞に導入することができる。さらにまた、このような方法は培養系でアポトーシスを受けるニューロンまたはその他の細胞型とともに使用することができる。hJNK3-BPを発現する健常なニューロンをニューロンが変性している被験体に移植するとそれらの神経疾患または障害のいくつかの影響を緩和することができる。処理した細胞は、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,264,943号に開示された技術を用い、in vitroにおいて支持体マトリックス上で培養された細胞として、あるいは分散させた細胞として、特に脳に移植することができる。
【１１５６】
本発明はまた、動物の1以上の組織において本タンパク質の発現または活性を調節することにより作出される動物モデルも提供する。好ましくは、hJNK3-BPポリペプチドの発現は脳にターゲッティングされる。このトランスジーンは単一のトランスジーンとして導入することもできるし、あるいはコンカテマー、例えばヘッド-ヘッドタンデムまたはヘッド-テールタンデムとして導入することもできる。トランスジーンはまた、条件発現系を用いて特定の細胞型へ選択的に導入し、活性化させることもできる。このような動物は、hJNK3-BPポリペプチドの活性またはJNKの生物作用に対するhJNK3-BPポリペプチドの活性の結果に特異的に関連する疾病の種々の病態生理学的態様の治療に有用な可能性のある候補分子を試験するためのin vivoアッセイに相当することから多くの目的に有用である。このようなモデルの表現型の研究はまた、JNKの異常な活性に関連するさらなるヒト疾病の同定を可能とすることもできる。これらの動物はトランスジェニック動物の創始系を作出するためhJNK3-BPの過剰発現または不活性化を目標とするいずれかの方法で作製することができる。このようなモデルは例えば神経変性疾患および自己免疫または悪性症状の治療のための候補となる療法および薬物の評価において極めて有用である。
【１１５７】
その他の実施形態では、本発明のタンパク質またはその断片は、異常なhJNK3-BP活性および特にJNKの生物作用の変化に関連する疾病または疾患を診断するために用いられる。特にJNKタンパク質キナーゼの制御されない活性をもたらすhJNK3-BPの量が不足した患者を診断し、このような症状においてhJNK3-BP発現をモニタリングする上で有用である。好ましくは、本発明は、限定されるものではないが、パーキンソン病およびアルツハイマー病をはじめとするアポトーシスを特徴とする神経変性疾患、関節炎などの自己免疫疾患、または白血病などの炎症および悪性性を特徴とするその他の症状といった、アポトーシスまたは炎症応答の変化に関連する病態を診断する方法を提供する。本方法は上記疾病または症状を罹患しているおそれのある、あるいは疾病または症状を発症するリスクのある個体から得られた組織サンプルを、hJNK3-BPポリペプチドまたは核酸と特異的に結合し得る検出可能なように標識された化合物と接触させる工程を含んでなる。例えば、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、その免疫学上活性なフラグメント、または核酸プローブを用いてよい。
【１１５８】
このようにこのマーカーはまた、好ましくは炎症性疾患に関する予後指標としての役割も果たす。より好ましくは、これは炎症部位から回収した組織および体液において測定することができる。このように被験体の症状を連続的にモニタリングすることができ、病理サンプルにおいて測定されたこの特定のタンパク質の量を正常個体の生物学的サンプルにおいて定量された量と、あるいは同じ患者の過去のサンプルと比べることができる。
【１１５９】
本発明のさらなる実施形態は、異常なJNK生物作用に関連した、好ましくは異常なアポトーシスを伴う疾病および症状の治療または予防に有用な新規な方法および組成物を提供することである。本発明のタンパク質またはその断片は、パーキンソン病およびアルツハイマー病をはじめとするアポトーシスを特徴とする神経変性疾患を治療するために用いてもよい。本発明の組成物および方法を用いて治療することができるその他の症状としては、関節炎などの自己免疫疾患、炎症性関節炎および気管支喘息などの炎症、ならびに限定されるものではないが白血病などの悪性腫瘍がある。
【１１６０】
本発明のもう1つの実施形態では、異常なJNKの生物作用に依存する酸化的傷害に関連する疾病および症状の治療または予防に有用な新規な方法および組成物を提供する。本発明のタンパク質またはその断片は、肝臓および腎臓などの器官に対する酸化的傷害、および特に心臓疾患および心筋症における虚血／再潅流による傷害を治療または予防するために使用することができる。より好ましくは、このような方法および組成物はまた、移植のためのドナー器官を処理するために使用することもできる。実際、これらの器官は器官の正常な機能に影響を及ぼし得る実質的な環境ストレスに曝され、その作用はhJNK3-BPなどのJNKモジュレーターによって遮断され得る。
【１１６１】
このような方法としては、疾病または症状を有する哺乳類に治療上有効量のhJNK3-BPポリペプチドを投与することを含み、ここで「有効量」とは、JNKの生物作用を調節し得るhJNK3-BPポリペプチドの濃度を意味する。本発明の組成物は好ましくは、生理食塩水または患者への投与に好適なその他の生理学的バッファーなどの製薬上許容される担体と組み合わせて個体に送達される。いずれかの特定の症状に対して該哺乳類に投与される本発明の組成物の特定量は患者の症状、ならびに体重、年齢および送達経路などのその他の因子によって異なる。このような組成物は好適な経路により送達することができる。あるいは、治療目的のため、核酸を当技術分野で公知の標準的なベクターおよび／または遺伝子送達法のいずれかを用いて患者に投与することができる。好適な遺伝子送達系としては、限定されるものではないが、リポソーム、裸のDNAおよびウイルスベクターが挙げられる。これらの組成物は本発明のタンパク質および所望により1以上のその他の目的化合物を含み得る。実際、本実施形態では、本発明は薬物増強適用において用途が見出せる。この同時投与は同時的な投与によるものでも、あるいは個別または逐次投与によるものでもよい。これらの成分は全て天然源から得られたものであっても、あるいは組換え遺伝子操作技術および／または化学修飾により作製してもよい。
【１１６２】
配列番号110のタンパク質(内部表示クローン231462_117-065-1-0-G11-F)
クローン231462_117-065-1-0-G11-FのcDNA(配列番号109)はアミノ酸配列:
MCLLLSCPCHPSAHGQSMWIERTSFVTAYKLPGILRWFEVVHMSQTTISPLENAIETMSTANEKILMMINQYQSDETLPINPLSMLLNGIVDPAVMGGFAKYEKAFFTEEYVRDHPEDQDKLTHLKDLIAWQIPFLGAGIKIHEKRVSDNLRPFHDRMEECFKNLKMKVEKEYGVREMPDFDDRRVGRPRSMLRSYRQMSIISLASMNSDCSTPSKPTSESFDLELASPKTPRVEQEEPISPGSTLPEVKLRRSKKRTKRSSVVFADEKAAAESDLKRLSRKHEFMSDTNLSEHAAIPLKASVLSQMSFASQSMPTIPALALSVAGIPGLDEANTSPRLSQTFLQLSDGDKKTLTRKKVNQFFKTMLASKSAEEGKQIPDSLSTDLを含んでなる配列番号110の386アミノ酸長のポリペプチド、DROCK2をコードする。よって、本願を通じて記載される配列番号110のポリペプチドの全ての特徴および用途は、クローン231462 117-065-1-0-G11-Fに含まれる核酸によりコードされるポリペプチドについても当てはまることが理解されよう。さらに、本願を通じて記載される配列番号109のポリヌクレオチドの全ての特徴および用途は、クローン231462 117-065-1-0-G11-Fに含まれる核酸についても当てはまることが理解されよう。本発明のある好ましい実施形態は、配列番号109、配列番号110およびクローン231462 117-065-1-0-G11-Fの組成物に関する。また、本明細書に記載のような生物活性を有するポリペプチド断片およびそれらの断片をコードするポリヌクレオチドも好ましい。
【１１６３】
配列番号110のタンパク質DROCK2は、DOCK2の後部末端側の370アミノ酸を保持するDOCK2(EMBL entry Q92608)のスプライシング変異体であるが、最初の16アミノ酸(MCLLLSCPCHPSAHGQ)はシグナル配列に相当する特異的なDROCK2アミノ酸を表す。よって生じたイソ型はDOCK2イソ型のN末端配列を欠くが、膜会合タンパク質のPDZドメインと相互作用することによりタンパク質-タンパク質相互作用に関与することが示されている20アミノ酸からなる配列(LASKSAEEGKQIPDSLSTDL)を含んでなるDOCK2のC末端ドメインを保持している。
【１１６４】
DROCK2はDOCK2とともに、ヒトDOCK180タンパク質およびそのホモログであるCaenorhabditis elegansのCed-5タンパク質およびDrosophila melanagasterのMbcポリペプチドも含むCDMファミリーのシグナル伝達タンパク質に属する。これらのタンパク質はそれらのカルボキシル末端領域が多様であること以外はアミノ酸レベルで著しい類似性を有する。CDMタンパク質はそれらの個々の生物の細胞表面の伸張部の分極に関連づけられている。DrosophilaのMbcは筋芽細胞の融合および上皮細胞の移動に必要であり、両者とも細胞骨格の再組織化を必要とする。Ced-5もまた線虫における細胞骨格の調節に関連があることが示されており、その機能の欠損により死細胞の包み込みおよび細胞端部への移動に欠陥が起こる。最後に、当初はCrkIIアダプタータンパク質に結合している主要なタンパク質の1つとして同定されたヒトDOCK180タンパク質は、非接着細胞における膜の波打ち現象および細胞移動に関与する。それはCrkII-p130Cas複合体から細胞骨格と、低分子量Rac GTPアーゼを副次的に活性化する(byactivating)JNK経路との双方へシグナルを伝達することが示されている。
【１１６５】
DROCK2は、末梢血細胞を除く全ての組織で発現するDOCK180とは対照的に、循環血細胞、リンパ球、および器官に存在するマクロファージでのみ発現する。従ってこのタンパク質は非接着細胞によって特異的に発現される。DROCK2は血液細胞の移動およびマクロファージによるアポトーシス細胞の食作用に関与し、そこでそれはRac GTPアーゼと結合してRac GTPアーゼを活性化させる。
【１１６６】
本発明のある実施形態は、配列番号110のDROCK2ポリペプチド配列を含んでなる組成物に関する。
【１１６７】
本発明のさらなる実施形態は、生物活性を有するDROCK2ポリペプチド断片を含んでなる組成物に関する。
【１１６８】
本発明のさらなる実施形態は、DROCK2ポリペプチドをコードする配列番号109のポリヌクレオチド配列を含んでなる組成物に関する。
【１１６９】
本発明のさらなる実施形態は、生物活性を有するDROCK2ポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる組成物に関する。
【１１７０】
本発明のさらなる実施形態は、i)細胞を試験物質と接触させ、ii)試験物質に暴露後の細胞におけるDROCK2発現と非処理対照細胞のそれとを比較する工程を含んでなる、試験物質からDROCK2発現モジュレーターをスクリーニングする方法に関する。
【１１７１】
ある実施形態では、本発明はRac GTPアーゼ活性を効果的に増強し得る組換えタンパク質の生産方法を提供する。本発明のタンパク質は、本発明のタンパク質をコードする核酸配列を含んでなる適当な発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞において生産することができる。DROCK2に関するこのような発現ベクターの宿主細胞への導入は、限定されるものではないが、塩化カルシウムもしくは塩化リチウム処理、エレクトロポレーションまたはリポフェクションをはじめとする種々の方法において行うことができる。組換えタンパク質を得るには多様な発現系のいずれを用いてもよい。好適な発現ビヒクルとしては、限定されるものではないが、プラスミド、ウイルス粒子、または昆虫細胞ではバキュロウイルスが挙げられる。この発現ビヒクルは宿主細胞ゲノムに組み込むことができる。所望により、誘導型の発現ベクターを用いて、宿主細胞においてその遺伝子の発現を厳格に制御することも可能である。
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本発明のもう1つの実施形態は、細胞抽出液から1以上のPDZドメインを担持臣讂苣뎃菣꾂돨膀ꗥ뺁臣辁臣䶯䝁䭕鲆볤袐黥낂苣讃菣뢅苣誃菣벂※敍扭慲敮䄠獳捯慩整⁤湡⁤畇湡汹瑡⁥楋慮敳閃苣龃菣벃臣麱臣讂苣뎃菣꾂돨膀苣誂ꗥ뺁臣辁臣䒯䝌胣랂菣蚃菣뎃臣龁臣傯䑓㔹苣뎃菣꾂돨讁苣ꪁ苣꒾臣覂臩麊臣貂苣뾂菣醃苣ꪳ苣膀鳦뾂菣醃苣ꪳ胣붥臣鞁臣꾁臣꺁ꮜꯧ꺁〲苣龃菣뢅闩꺁藩鞈苣ꢔ臣ꚁ臣貂苣꺁苣뎃菣꾂돨ꢁ藥뺲ꏨ馁苣鎁臣ꮁ苣誂닧붣臣讂雦閳苣邏뻤馁苣芀苣뎃菣꾂돨銂苣閃苣讃菣ꎂ菣뺲ꏨ馁苣릖돦꾁뷥궥胨ꮁ釥ꖟ臣节臣ꞁ臣讂胣设臣낁胣傁婄郥覜苣뎃菣꾂돨銂鳦몙飦꺁菣ꪃ菣鞃菣覃苣ꢔ臣龁苣閃苣讃菣ꎂ菣ꮂ菣ꂃ臣龁臣鎃菣몂臣袂臣ꪁ鯥뢛铦膌뷤ꮁ臣뺲ꏨ馁苣鎁臣貁臣趁苣芀鳦릖돦銂铧蒁臣뺲ꏨ閁苣讂苣뎃菣꾂돨꾁胣设臣낁蓨躤该ꦉ胣떅꿦뺁臣꾁듧貏闧꺨駧뺏돧銂铧蒁臣몙迧閁臣龁苣뎃菣꾂돨ꪁ臣膀臣骁苣꺁뗨邺臣覂뻥ꚁ苣袂臣芀戼㹲邀볯醼볯鎼胣㲑牢ਾ鳦몙飦꺁苣蚁ꒁ臣龮雦ꊽ藦꾁胣ꊂ菣袃菣랂苣내菨꺁ꏩ鲽铧銂ꋥ랼臣讂雦閳臣ꊖ臣讂胣붥臣鞁臣꾁胣鎁臣릖돦꾁胥鎽臣뺯臣ꚁ湩瘠癩ꞁ臩ꢔ臣貂苣芀臣꺁雦閳臣膀⥩跥莐臣떂菣鞃菣銂軦随臣膀楩䐩佒䭃㈭菣ꪃ菣鞃菣覃臣龁臣鶁臣궖觧銂苣벃菣馁苣鶃菣貃苣것苣膃菣銂硥瘠癩ꮁ臣鎁苣覂臣내菨ꮁ냥ꖅ臣膀臣覂臣榫楩鎁苣覂臣蒵迦袁듧麃苣讀뷤ꮁ蛥ꢳ藥馁苣ꖷ꣧銂郥鎂臣ꪁ苣芀臣꺁苣蚁臣릖돦銂諦貙臣龁臣鞊苣ꒂ菣릂駧閳臣떽铧馁苣鎁臣꾁苣鶃菣벃苣릂駧뺁臣꾁蓦鎟듧麃臣薿胩ꪁ駩뮎臣ꊖ臣ꚁ觧ꮁ돦꺛臣貂苣芀戼㹲邀볯醼볯钼胣㲑牢ਾ鳦몙飦꺁臣讂껥붖뷥讅臣膀剄䍏ⵋ몙迧꺁菣뢂菣것菣뾂菣ꮁ雩馁苣ꚩ꣩ꦉ돨꺁苣꾂菣벃菣뎃苣릖돦銂迦鮾臣讂胣鎁臣릖돦꾁胣榁내菨銂ꧨ鎨觧ꪳ臣ꖎ꟨閁臣膀臣覂臣榫⥩ꧨ鎨觧ꪳ臣뒚鳩貾臣내菨ꮁ臣醁苣䒋佒䭃㈭駧뺏臣麝髦늜꿥ꞅ듧麃臣鶁苣ꢁ苣钯볨馁苣ꖷ꣧銂郥鎂臣ꪁ苣芀剄䍏ⵋ몙迧꾁뷥肊ꇨ蚈蟩ꞁ룤겈髧ꪁ胣뺁臣꾁鳦躘듧뢛臣ꮐ臣貂臣蒁苣릖돦ꮁ苣誂胣䒁佒䭃㈭菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃臣龁臣鶃菣骃菣膃菣銂ꓦ몇臣讂臣ꢁ臣袂苣겸껥閁苣讂胣鎁臣릖돦꺁룤设臣鞁臣꾁胣榁貐귧ꪁꒁ臣내菨떂菣鞃菣銂鿥誤臣膀楩鶁苣覂臣릟ꓩꦉ臣蚁臣肸雦ꮁꧨ鎨觧ꪳ苣ꂊ臣膀믤릖臣꾁諥袁臣膀楩⥩触骮臣芙苧ꞁ룤릟ꓩꦉ苣麛迥鞁胣榁⥶郥내菨떂菣鞃菣讁苣涉乒銂닧붣臣膀⥶郥떂菣鞃菣궸臣䒮佒䭃㈭洠乒꺁菣馃菣銂菣벃苣뎃菣궃菣袃胣劁偔剃臣龁臣鎽諦鎡裥躇臣肸���蒚臣ꖈ臣릖돦ꮁ苣誂꿦莼臣讂럥讨苣ꮐ苣ꞁ臣讂胣겜駧躘臣겜飦내鯦궸臣낿臣龁苣蚁臣릉闧蒚菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃菣궃菣隃臣袂臣鞃菣ꒂ菣벃臣螃苣ꒂ菣誁苣뎁뷤ꢔ苣邏뻤馁苣芀臣覂臣讂뻤ꢁ臣ꚁ臣膀⥩郥覭臣㊪臣꺁듧麃鿥誤觧銂뻥膀楩鶁苣覂臣릟ꓩꦉ臣蚁臣肸雦ꮁ臣ꚩ꣩ꦉ돨銂諥袁胣隻雦ꮁ臣ꂊ臣骁胣榁楩ꆸ鿥誤觧銂鯥躏臣膀癩蒐듧麃苣뎃菣ꮃ臣覂苣뎃菣꾂돨銂닧붣臣膀⥶郥떂菣鞃菣궸臣䒮佒䭃㈭菣ꪃ菣鞃菣覃臣것菣ꮃ苣Ꚃ苣릂苣뎃菣궃菣袃胣超雧蒵맧隌귥뺁臣꾁뷥肊ꇨ蚈蟩ꞁ룤겈髧ꪁ裥꺁雦閳臣袂苣钯볨馁苣ꖷ꣧銂郥鎂臣ꪁ苣芀鳦몙飦꾁鳦躘듧뢛룤ꞁ뿨릁臣袂臣ꪁ觧낕髧鞊뷤誁苣뎁諦鎽菣ꦃ苣ꆃ菣袃臣螃苣ꒂ菣誁苣뎁뷤ꢔ苣邏뻤馁苣芀듧麃ꫩ베臣趆꟦覯臣袂臣劳捡臣뮴胦隌苣鞢볥馁苣龁苣ꮁ臣䒯佒䭃㈭駧뺏苣鞢볥馁苣ꦉ돨⢪苣뒂菣릂菣⦈苣ꢔ臣貂臣袂臣芀듧麃ꫩ베臣趆꟦覯臣袂臣劳捡臣뮴胦隌苣뮘껥馁苣龁苣ꮁ臣䒯佒䭃㈭駧뺏苣躽룤閁臣讂觧ꪳꊂ菣뾂苣讃苣袃銂铧蒁苣낁苣蒁胣䒂佒䭃㈭苣뒂菣릂菣誁苣뎁苣뎃苣뒂菣릂菣銂裥ꢔ臣讂雦閳苣겜飦내鯦ꮁ郥뺁苣讂胣㲂牢ਾ胣醼볯鞼볯醀戼㹲겜駧躘臣芁苣붥臣鞁臣龮雦ꊽ藦꾁剄䍏ⵋ鶃菣骃菣膃菣ꢁ뗧袐臣讂ꧨ鎨觧ꪳ苣릂苣ꪃ菣讃菣낂臣讂雦閳苣邏뻤馁苣芀臣꺁雦閳臣膀⥩ꧨ鎨觧ꪳ苣䒒佒䭃㈭菣ꪃ菣鞃菣覃臣龁臣鶁臣궖觧ꢁ胣邵郥銂迥붃臣馁苣ꆝ믤许臣ꖎ꟨閁臣膀臣覂臣榫⥩ꧨ鎨觧ꪳ臣邵郥銂뷥肊ꇨ蚈蟩ꞁ룤겈髧ꪁ雦閳设臣낁胣놅藥ꮖ닦趙돦誁苣뎁苣ꢂ苣뾂菣隃菣莃菣閳臣ꦁ臣뚫郥鞊뷤ꮁ鿥ꖁ臣릖돦⦕臣袂苣鲤蟥馁苣ꖷ꣧銂郥鎂臣ꪁ苣芀臣꺁雦閳臣꾁胣鞊뷤膀諦鎽菣ꦃ苣ꆃ菣袃胣내菨讞觧낕髧ꪃ苣뎃菣뺁臣꾁臣꺁룤ꢃ臣뎂菣뢂菣늂菣袃臣貂臣ꚩ꣩ꦉ돨貁郥뺁苣讂胣㲂牢ਾ胣醼볯鞼볯醀戼㹲겜駧躘臣閁苣ꪁ苣붥臣鞁臣龮雦ꊽ藦꾁胣䒁佒䭃㈭臣邵郥馁苣ꚩ꣩ꦉ돨讁苣䒉佒䭃㈭듦Ꞁ臣ꊂ菣뾂苣讃苣袃苣릂苣ꪃ菣讃菣낂臣讂雦閳苣邏뻤馁苣芀臣꺁雦閳臣膀⥩듧麃苣ꚩ꣩ꦉ돨ꢁ軦ꚧ臣鮁胣閁苣ꮁ楩ꚩ꣩ꦉ돨뒚鳩貾臣䒮佒䭃㈭铧ꦉ듦Ꞁ臣麝髦늜꿥ꞅ듧麃臣鶁苣ꢁ苣钯볨馁苣ꖷ꣧銂郥鎂臣ꪁ苣芀剄䍏ⵋ꺁铧ꦉ듦Ꞁ臣鲤蟥꾁胣劁捡䜠偔苣벃苣뮴胦銂ꓦ몇臣讂臣ꢁ臣袂苣鲤蟥馁苣鎁臣貁臣趁苣芀慒뮴胦銂ꓦ몇臣讂苣莃苣ꒂ臣肸뻤ꢁ臣ꚁ臣膀慒⁣呇ꊂ菣벂苣뺔냥Ꞁ꣦颭呇ꮁ鯦鞁胣誁鯩꺁铦蒰胦馨귨ꪃ菣뢅臣辇苣鲤蟥馁苣鎁臣ꮁ苣誂諥뒰裥ꎧ蟩銂ꓦ몇臣讂럥讨苣ꮐ苣ꞁ���讂胣㲂牢ਾ胣醼볯鞼볯醀戼㹲겜駧躘臣閁苣ꪁ苣龮雦ꊽ藦꾁臣龁胣鞊苣鶃菣벃苣릂닦芙苣鞏臣龁苦薀臣誁臣ꚁ苣鶃菣벃苣릂듧麃臣꒙軥龀뫥銂뷤许臣鮁苣릖돦ꮁ雩鞁胣鎁臣袂臣ꪁ雦閳臣늩苦薀臣颍郧込菣꾂菣閃苣벃苣꺁苣뎃菣ꮃ苣随苣몇臣膀硥瘠癩ꮁ臣颍鯩내菨궸臣겜苣뎃菣꾂돨꺁駧뺏苣뮘껥뺁臣꾁뷤许臣鮁胣閁苣ꮁ臣貂苣꺁铦覤듧麃苣ꎂ胨ꮁ蛥ꢳ藥馁苣鎁臣銂郥鎂臣ꪁ苣芀듧麃臣誁臣ꚁ觧骮臣몁볤邭臣몙迧銂飩뎮臣讂雦閳臣鎽諦鎡裥躇臣ꢑ鿧꺁苣꺁臣芁苣膀뻤袁臣ꊂ菣膃苣뎃苣뺁臣꾁菣鲃苣ꒂ菣Ꚉ闧銂铧蒁苣节臣貁臣誂胣겜雦閳臣꾁臣꺁臣骁苣銂铧蒁臣节苣蒁胣芁苣蒁臣膀ꧨꎂ胨ꮁ臣醁苣ꊂ菣袃菣랂苣내菨꺁ꏩ鲽铧꺁뷤许臣膀鳦뾂菣醃苣ꪳ臣ꎭ룥ꪁ듦Ꞁ苣ꢦ臣讂臣ꢁ臣袂苣钁裦馁苣鎁臣貁臣趁苣芀臣꺁苣蚁臣릖돦ꞁ臣膀跥ꊛ臣龁跥莐苣貾菩㊨议鿥꺁苣ꮃ菣궂苣ꮜꯧꊂ菣躃藩ꮁ鯧鎽臣讂剄䍏㉋雦螉臣斧⁸楶潶菣ꦃ菣릂菣Ꞃ苣袃臣龁뻥ꮁ苦薀臣趆돦ꖅ臣讂胣鞊苣鶃菣벃苣릂雨꺁諦躸臣貐駦ꮁ苣鶃菣벃苣릂듧麃臣龣뷤ꢔ苣躽룤閁臣讂臣膀귦薻臣袂臣ꢁ臣ꚁ臣讂苣誂ꓥ辁臣내菨銂铧趁臣뺁臣궶賦馁苣ꦊ臣ꢁ臣誂胣鎾臣ꚁ諦ꊂ菣袃菣랂苣겖臣鲽铧鞁臣讂苣蚁臣ꪁ苣鎁臣讁苣膀駩骮臣貂苣节臣ꞁ臣ꪁ臣貁胣麥뗧覤胦뺖苦銂臣颁苣ꢁ臣讂闧뢸臣내菨ꊂ菣袃菣랂苣ꮁ雩ꎀ臣讂雧薗臣뮲駧릊諥銂ꋥ늀臣鮁苣龁苣ꮁ臣꺁苣蚁臣릖돦貁觧ꮁ돦꺛臣貂苣芀戼㹲邀볯醼볯颼胣㲑牢ਾ臣讂ꗥ뺁臣蒁껥붖뷥讅臣내菨ꢪꃦ꺁蛥讧꿧⢉뻤袁臣膀껧隤臩몇臣ꊖ臣ꚁ銂뿥膦臣馁苣뢵뷦Ꞁ雦龔觧銂뫤늘臣袂臣뮲駧馁苣릖돦銂迦鮾臣讂胣鎁臣릖돦꾁剄䍏ⵋ꺁駧뺏臣龁臣뮴胦꺁苣뎃苣뒂菣릂菣銂듧麃臣ꖎ꟨閁臣讂럥讨苣ꮐ苣ꞁ臣讂胣붥臣鞁臣내菨ꢁ臣ꚁ臣麝軦肝듧麃臣馌臣覂苣讂胣閁苣ꪁ苣붥臣鞁臣내菨ꢁ臣ꚁ臣膀菣뎃菣莐臣袂臣麃苣궃菣ꆂ菣뢂臣馌臣覂苣讂胣붥臣鞁臣꾁臣꺁剄䍏ⵋꊂ菣뾂苣讃苣袃臣膀뻤袁臣鎁臣ꊂ菣뾂苣讃苣袃苣내菨讞觧낕髧뾂菣늂菣蚃苣뎃苣ꢃ裥⢆뻤袁臣膀菣겂菣覃臣龁臣鞊뷤閃菣낂菣뎃菣⦈臣뎂菣뢂菣늂菣袃臣讂臣ꢁ臣袂苣릉껥꺁듧麃黥ꮁ胩钁臣貂苣芀铧蚐귥誸꣨릮臣貂苣뚺뛦궸臣䒮佒䭃㈭苣뎃苣뒂菣릂菣꾁뗧ꎏ臣龁臣麝뗧ꎏ臣ꦁ胣鎽諦鎡裥躇臣肸裨蒚臣릖돦ꮁ苣誂胩钁臣貂臣袂臣芀臣꺁雦閳臣붙ꇨ薗臣袂臣鶁臣隻臣뢵뷦Ꞁ雦龔觧꺁뫤늘臣袂臣뮲駧ꮁ鳦ꢔ臣芁苣芀戼㹲邀볯醼���馼胣㲑牢ਾ藩鞈闧랏ㄱ꺁苣뎃菣꾂돨⢪蛥ꢃꇨ몤苣궃菣뎃〵㜰㌲㠵弹〲ⴵ㐳㌭〭䜭ⴴ⥆戼㹲꾂菣벃菣㖳〰㈷㔳㤸㉟㔰㌭ⴴⴳⴰ㑇䘭臣掮乄⡁藩鞈闧랏ㄱ⤱臣ꊂ菣躃藩超裥㪗戼㹲䴊呓䙆䑓䅔䥗䱃噁呐䱖䝃噔䍆奋䭋卓兇坌坓噍䱃䝁䍌噁䱃䥌卌䙐䝗䥌䙌噓䍓䱆奍奔卌兇䱅偌䑖䭑噁噌䝔䑇䝃䝌䅈䍌奋䑌䱅䙇噔䅆噇乌久假䅇䕅剌呒千剐卌䱖䵑䥄䭔噐䥑䑋奁䭓䅖䵁兌剄䱇䅗䥖乎䝁䱖䙇呐䝄䱅䱌呍奄克䵃噁䙎䝆噔噅䭔䙔偌䱌䭒䭓則噌噎卓䝍䝇偁䕖䱒十䝙卓䅋噁䵔卆噓前䕌卌坋䥇噋十光䝐䙇呌䥎䝁協䭄䕗䱋䭅䥄䑌䱈䅐噅䕑奄元奄䱉允乒䱆䱌义䱓十䑋卆噐剌䥄䡑䥁䅌卋䙐奁呙䝐䝋奁坌䍉䅌奈偌䝉奉奄䅆剋䙈兇䭄䵐剐䱁䵒乐䭙䭋偁苣ꮐ苣ꞁ臣讂藩鞈闧랏ㄱ꺁雦辦臣ㆪ츷ⶲ菣覃菣궂苣릂菣궃苣覃菣銃菣궃苣誃菣벂讞丨䡂䑓⤲苣뎂菣覃臣讂胣袂臣ꚁ胣겜ꇩ銂胩颁臣風볨閁苣讂藩鞈闧랏ㄱ꺁菣ꪃ菣鞃菣覃臣ꢅ臣꺁觧뒾臣袂臣ꢔ胩꾁胣꾂菣벃菣㖳〰㈷㔳㤸㉟㔰㌭ⴴⴳⴰ㑇䘭臣ꮐ臣貂苣뢠藩ꮁ苣誂苣벃菣閁苣讂菣ꪃ菣鞃菣覃臣ꒁ臣ꚁ苣鎽臣꾁臣讂臣ꢁ臣蚐꟨閁苣袂臣芀臣覂臣膀鳦颡苣骀臣ꚁ꣨覼臣貂苣超裥ꪕ迥ㆷㄱ臣鶃菣貃苣것苣膃菣꺁藥ꚁ臣릉뻥誁苣뎁铧钀臣膀苣궃菣뎃〵㜰㌲㠵弹〲ⴵ㐳㌭〭䜭ⴴꮁ郥뺁苣讂ꃦ뢅臣ꒁ臣ꚁ苣鎽臣꾁臣讂臣ꢁ臣蚐꟨閁苣袂臣芀鳦몙飦꺁臣讂ꗥ뺁臣蒁껥붖뷥讅臣膀藩鞈闧랏ㄱ膀藩鞈闧랏ㄱ誁苣뎁苣궃菣뎃〵㜰㌲㠵弹〲ⴵ㐳㌭〭䜭ⴴ꺁뗧邈觧ꮁ雩馁苣芀臣龁胣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣袂臣ꪁ铧ꦉ듦Ꞁ苣覜臣讂菣ꪃ菣鞃菣覃雦螉臣袂臣鶁苣覂臣궖觧銂苣벃菣馁苣鶃菣貃苣것苣膃菣节ꗥ뺁臣蒁胣㲂牢ਾ胣醼볯颼볯醀戼㹲超裥ꪕ迥ㆷ㈱臣뾂菣醃苣ꪳ臣膀㜱닎苣릂菣ꦃ苣ꪂ菣ꮃ菣銃菣궃苣誃菣벂猨楷獳牰瑯迥鞨闧랏㍐〷㤵꺁ꓥ讞ꓥ낕뷤ꞁ臣讂胣㊂黥ㆋ츷ⶲ菣覃菣궂苣릂菣궃苣覃菣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