(57)【要約】本発明は、炎症に伴う疾病の治療または予防を目的とする糖タンパク質を含むホスホリルコリンの使用に関する。具体的には、慢性関節リウマチ等の異常炎症に伴う自己免疫疾患の治療や予防を目的とするＥＳ−６２の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬剤として使用するためのＥＳ−６２化合物または、生理学的に活性なその誘導体。
【請求項２】
動物の炎症性疾患の治療もしくは予防に使用するためのＥＳ−６２化合物または生理学的に活性なその誘導体。
【請求項３】
動物の炎症性疾患の治療もしくは予防に使用するためのＥＳ−６２化合物または生理学的に活性なその誘導体であって、前記の炎症性疾患が、Ｉ型糖尿病、慢性関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、自己免疫性肝炎、類肉腫症、炎症性腸疾患および慢性閉塞性肺疾患などの自己免疫疾患である請求項１に記載のＥＳ−６２化合物またはその生理学的に活性なその誘導体。
【請求項４】
炎症性疾患の治療用もしくは予防用薬剤の製造に、ＥＳ−６２または生理学的に活性なその誘導体を使用すること。
【請求項５】
動物の炎症性疾患を治療もしくは予防する方法であって、炎症性疾患を持つ動物に、ＥＳ−６２またはその生理学的に活性なその誘導体を、治療上あるいは予防上有効な量で投与することからなる炎症性疾患の治療または予防法。
【請求項６】
ＥＳ−６２または生理学的に活性なその誘導体を含有する調合剤。
【請求項７】
製薬上許容される担体を、１種またはそれ以上含有する請求項６記載の調合剤。
【請求項８】
調合剤が、治療成分および／または予防成分をさらに含有する請求項６または７記載の調合剤。
【請求項９】
調合剤が、経口的、局所的（経皮、口腔、舌下を含む）、直腸または非経口的（皮下、皮下注射、筋肉内、静脈注射を含む）、および、例えば、吸入による鼻や肺への投与に適したものを含む請求項６〜８の何れかに記載の調合剤。
【請求項１０】
経口投与用の調合剤が、丸薬、カプセル、錠剤、あるいは分散可能な顆粒などの如く、単位量投与に適した調合剤であって、それぞれの調合剤が所定量の活性化合物を含有する請求項６〜９の何れかに記載の調合剤。
【請求項１１】
経口投与用の調合剤の担体が液体であり、その担体が溶液、水性懸濁液、非水性懸濁液または水中油型エマルジョンとして存在する請求項６〜１０のいずれかに記載の調合剤。
【請求項１２】
放出投薬量が制御された形態で経口投与される請求項６〜１１の何れかに記載の調合剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炎症を伴う疾病の治療または予防に糖タンパク質を使用することに関し、具体的には、慢性関節リウマチ（ＲＡ）等の異常炎症を伴う自己免疫疾患の治療や予防に、ＥＳ−６２を使用することに関する。
【背景技術】
【０００２】
フィラリア線虫は、節足動物を媒体としてヒトを含む脊椎動物に感染する寄生生物である。個々の寄生虫は5年を超えて生存するため感染は長期にわたる。このような長期の生存期間は、宿主の免疫系に抑制や変調を生じさせ、感染した個体の免疫応答に確実な障害を引き起こすことは当業者間での統一見解となっている。こうした障害は、リンパ球増殖や、シトキンと抗体の両方の生成に偏りを生じさせるといった機能障害を招く。シトキンについては、前炎症ＩＦＮ−γの生成が減少し、抗炎症ＩＬ−１０の生成が増加するという偏りが見られる。抗体については、ＩｇＧ亜綱に平衡異常が見られる。すなわち、ＩｇＧ４（補体を活性化できないか、または、高い近似性により食細胞と結合するため病原体の除去には殆ど効果のない抗体）が著しく増加し、その他のＩｇＧ亜綱は減少する。従って、全体としての免疫応答の状況は、しばしば"ＴＨ−２"（"ＴＨ"はＴリンパ球から由来し、"ヘルパー"を表す）として分類される抗炎症表現型がやや抑制されている状態を明示している。このような表現型は寄生体の生存と宿主の健康両方に伝導性があると推測され、後者は、過度に攻撃的な免疫応答から生じる病変が制限される。これと一致して、これらの寄生体を宿しているヒトの大部分は有害な病変の証を殆ど示していないことは注目に値する。
【０００３】
宿主の免疫系の変調はフィラリア線虫の積極的な関与を伴うもので、従って、寄生虫によって分泌された分子の生物学的な特性を特定するのにかなりの労力を費やしている。
【０００４】
グッドリッジ（Goodridge）らは、２００１年刊行の免疫学ジャーナル（Journal of Immunology）１６７号で、抗炎症及び／又はＴＨ−２表現型に対する免疫応答を励起するＥＳ−６２の免疫調節特性に寄与する前炎症性シトキンの生成の抑制を引き起こす、ＥＳ−６２によるマクロファージシトキンの生成の調節について報告している。この文献は、免疫応答に見られる変化に論理的根拠を付与しているが、特定の疾病、特に、炎症に関わる疾病の予防又は治療を行う診療でＥＳ−６２が有用かどうかの説明はない。
【０００５】
ハーネットら（Harnett and Harnett）は２０００年刊行の生化学・生物物理学雑誌（Biochemica et Biophysica Acta）１５３９号、７〜１５頁において、ＥＳ−６２及びホスホリルコリン（ＰＣ）の作用の基本的メカニズムに関する調査報告を行っている。ＰＣは、多くの免疫調節を含む様々な作用を為すと結論付けている。
【０００６】
先行技術も、ＥＳ−６２が炎症性シトキンの生成に影響するため、炎症反応を伴う疾病の媒介に何らかの役割を果たしているということを、せいぜい示唆しているに過ぎない。しかも、これらの調査はインビトロでしか実施されておらず、ＥＳ−６２が炎症に関わる疾患の治療に使用できることを示す根拠は何ら提示されていない。
【０００７】
こうした分子が臨床的使用価値を有するという証拠は、目下、立証されておらず、従って、本発明の目的は、現在の炎症に関わる疾病の治療における不備を除去又は軽減することにある。
【発明の開示】
【０００８】
発明者は、免疫調節効果を有すると考えられるＥＳ−６２分子を徹底精査した。
【０００９】
本発明の第1の態様によれば、薬剤として使用するための化合物ＥＳ−６２又はその生理学的活性誘導体が提供される。
【００１０】
ＥＳ−６２は、図１に示すアミノ酸配列からなる糖タンパク質として同定される。ＥＳ−６２のホスホリルコリン−グリカン（PC−Glycan）成分は、その構造を図２に示す。
【００１１】
ＥＳ−６２は、ＣＯ２５％、空気９５％の雰囲気に３７℃の完全ＲＰＭＩで維持され、ミクロフィラリアを除去するために０．２２μｍ膜（シグマ）の濾過装置を通過させた成体Ａヴィテア（adult A. viteae）から摂取したスペント（spent）培地から調製される。培地は、ＰＭ１０膜（イギリス、アッパーミル在、アミコン社製：Amicon, Upper Mill, UK）付きの攪拌セル内で、ｐＨ７．２のＰＢＳで洗浄され、容積１０ｍｌに濃縮された。これを更に、１００−ｋＤａ膜（ＥＳ−６２は本来、２８０ｋＤａのｍ．ｗ．を有する）付きのセントリコンチューブ（アミコン社製：Amicon）を使用して最終容積が０．５ｍｌになるよう濃縮した。こうして調製されたものを、寸法３０×１ｃｍで６カラムのスーパーローズ（Superose）（HR  １０／３０、ファーマシア製：Pharmacia）に掛け、室温にてｐＨ７．２のＰＢＳで予め均衡させた無勾配溶離ＦＰＬＣ（isocratic FPLC）システム（ファーマシア製：Pharmacia）に収めた。カラムを流量０．５ｍｌ／分で溶離させ、２８０ｎｍでの吸収をモニターした。単一のピークとして溶離したタンパク質の９５％以上が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用した分析によってＥＳ−６２と確認された。これを２ｍｇ／ｍｌに濃縮し、１０μｌのアリコート（分割量）で−２０℃で保存した（ハーネット他著、１９９３年、免疫学ジャーナル、１５１号、４８２９頁：Harnett, W. et. al., J. Immunol）。
【００１２】
ＲＰＭＩ−１６４０媒体に保持された成人ＡヴィテアのＥＳの生化学的特徴を、還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析すると、このものは６２０００の相対分子量を有することから、ＥＳ−６２と呼ばれる単一の分子によって支配されていることが判明した。放出されたタンパク質全体の９５％を超えるものが、ＥＳ−６２によるものだと推定される。寄生されたスナネズミの血流の検出結果から明らかなように、ＥＳ−６２は、インビボのＡヴィテアでも積極的に分泌される。ＥＳ−６２は、近頃特徴付けされたマレー糸状虫(B. Malayi)の配列とかなりのホモロジーを持ち、しかも、目下の調査で全てのヒトフィラリア線虫のＥＳで発見されている分子、ホスホリルコリンを含んでいるという理由から、ヒトフィラリア症と密接に関連する。
【００１３】
ＰＣのＥＳ−６２への結合メカニズムを調査した結果、Ｎ型グリカンを経由することが判明した（ハーネット他、１９９３年刊行、検証寄生虫学、７７号、４９８頁：Harnett et al, Experimental Parasitology；ハーストン及びハーネット、１９９６年刊行、パラシトロジー、８２号、３２０頁：Houston & Harnett, Journal of Parasitology）。ＥＳ−６２のＰＣ−グリカンを構造解析したところ、１つのグリカンにつき、少なくとも１〜２個のＰＣグループが存在することが判明した。ＥＳ−６２の配列を分析した結果、成熟タンパク質には、３つの潜在的なＮ結合のグリコシル化サイトが存在することが判明している（ハーネット他、１９９９年刊行、分子・生化学的寄生虫学、１０４（１１）号：Harnett et al. Molecular and Biochemical Parasitology）。従って、ＥＳ−６２の各分子は、２個の高ロイシン反復領域を有する。すなわち、こうしたモチーフの特性の１つは、タンパク質の２量化を促進することであり、ＦＰＬＣによるＥＳ−６２の分子量は、約２８００００と推定される。従って、天然分子は4量体の形態で存在すると考えられる。
【００１４】
薬剤は、動物の炎症性疾患の治療または予防にインピボで使用できる。治療または予防を必要とする動物は、通常、ヒト又はヒト以外のほ乳類である。
【００１５】
本発明の第２の様態によれば、動物の炎症性疾患の治療または予防に使用されるＥＳ−６２化合物またはこの化合物の生理学的に活性な誘導体が提供される。
【００１６】
治療または予防を必要とする動物は、通常、ヒト又はヒト以外のほ乳類である。  
【００１７】
炎症を伴う多くの疾患、特に本発明に従う治療または予防で対象となる炎症性疾患は、Ｉ型糖尿病、慢性関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、自己免疫性肝炎、類肉腫症、炎症性腸疾患および慢性閉塞性肺疾患などの自己免疫疾患である。
【００１８】
本発明は、慢性関節リウマチの治療や予防に、独特の効果を有する。
【００１９】
本発明の第３の実施態様によれば、炎症性疾患の治療用または予防用薬剤の製造に、ＥＳ−６２が使用される。
【００２０】
本発明の第４の態様では、ＥＳ−６２あるいは生理学的機能を有するその誘導体を、治療上または予防上有効な量で炎症性疾患のある動物に投与することからなる治療方法または予防方法が提供される。
【００２１】
好ましくは、ＥＳ−６２は炎症性疾患の治療に使用される。
【００２２】
本発明の発明者たちは、Ｎ型グリカンへのホスホリルコリン結合の特異な翻訳後修飾を伴う糖タンパク質であるところの、ＥＳ−６２分子を特に注目した。その結果、この分子は、"抗炎症"に分類できる免疫調節活性が過多であることを見出した。従って、ＥＳ−６２は、抗原に応答してリンパ球（Ｂ型およびＴ型の両方）が繁殖する能力を減少させ、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６などの前炎症性シトキンを生成する大食細胞の能力を阻害し、ＴＨ−２様の反応を優先的に引き出す樹状細胞の成熟を調節し、脾臓細胞が抗炎症性シトキンを生成するように誘導し、抗体反応をＴＨ−２／抗炎症の方向へと付勢する。
【００２３】
炎症は多くの疾病に共通の特徴であるが、始原型炎症性疾患は自己免疫疾患であり、これには、Ｉ型糖尿病、慢性関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、自己免疫性肝炎、類肉腫症、炎症性腸疾患が含まれる。こうした慢性疾患は、特徴的に再発と回復を繰り返し、実際、現在の治療では不十分である。
【００２４】
本発明を利用すると、糖タンパク質ＥＳ−６２を好ましくは含有する調合剤が提供され、その調合剤は、好ましく１種もしくは２種以上の薬学的に許容される担体と、任意に、その他の治療成分および／または予防成分と共に、ＥＳ−６２または生理学的機能を備えたその誘導体を含有する。使用される担体は、調合剤のその他の成分と適合性を備え、しかも、その受容者に有害でないものでなければならない。
【００２５】
本発明の調合剤は、経口的、局所的（経皮、口腔、舌下を含む）、直腸または非経口的（皮下、皮下注射、筋肉内、静脈注射を含む）、および、例えば、吸入による鼻や肺への投与に適した調合剤を包含する。調剤は、それが適当な場合は、便宜的に個別の服用量単位で提供され、また、調剤学で公知の方法の何れかで調製される。全ての方法は、活性化合物を液状担体または微細に分割された固形担体、もしくは、その両方と結合させ、必要な場合は、生成物を望ましい製剤に形成するステップを含む。
【００２６】
担体が固体の場合、経口投与に適した調合剤は、１個当たりが、各々、予め設定された量の活性化合物を含む丸薬、カプセル、または錠剤などのように服用単位量の製剤として提供されるのが最も好ましい。錠剤は、任意で１個または複数の副成分を加え、圧縮や鋳型で成形される。圧縮錠剤は、粉末または顆粒のようなフリーフロー性を持つ形態の活性化合物に、任意的に結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、界面活性剤、分散剤などを混合し、これを適当な機械内で圧縮することで調製される。
鋳型錠剤は、不活性液状希釈剤と一緒に活性化合物を成型することで調製される。錠剤は任意でコーティングすることができ、コーティングしない場合は、任意で刻み目を入れることができる。カプセル剤は、活性化合物を単独、もしくは、１種または２種以上の副成分を混合してカプセルのシェルに詰め、通常の方法で密閉することで調製される。カシェ剤はカプセル剤と類似し、ライスペーパーの包みに活性化合物と副成分とを密閉する。活性化合物はまた、例えば、投与前に水に懸濁させることができ、あるいは、食物に振り掛けることができる顆粒として調合することもできる。顆粒は、例えば小さな袋で包装することが可能である。担体が液体であって、経口投与が相応しい調合剤は、溶液、水性懸濁液、非水性懸濁液もしくは水中油型エマルジョンとして提供される。
【００２７】
経口投与の調合剤は、放出量が調節される投与剤形態を包含し、そうした形態は、例えば、活性化合物を適当な徐放性マトリックスに調合するか、または、適当な徐放性フィルムに内包することで実現可能である。こうした調合剤は、予防的用途の場合に特に好都合である。
【００２８】
担体が固体で直腸投与に相応しい調合剤は、単位投与量の座薬として提供されるのが好ましい。適当な担体はココアバターや、当該分野で一般的に使用されるその他の素材を含む。座薬は、便宜上、活性化合物を軟化、または、溶解させた担体と混合し、これを冷却し、鋳型で成型することで形成される。
【００２９】
非経口投与に相応しい調合剤は、水性溶剤または油性溶剤に活性化合物を溶解または懸濁させた無菌の溶液または懸濁液を含む。
【００３０】
注入可能な調合剤は、ボーラス注入や、連続注入に使用される。こうした調剤は、便宜上、使用するまで密閉された状態を保つ服用量単位または複数服用量を詰めた容器で提供される。あるいは、粉状に調製され、使用時に無菌で、発熱因子を含まない水などの適当な溶剤と共に用いる。
【００３１】
活性化合物は、長時間作用型デポー調剤としても調製され、例えば、皮下、または筋肉内への筋肉注射あるいは注入によって投与される。デポー調剤は、例えば、適当な高分子素材または疎水性素材、あるいはイオン交換樹脂を含む。こうした長時間作用型の調合剤は、特に、予防を用途とした場合に好都合である。
【００３２】
口腔を介しての肺投与に適した調合剤は、活性化合物を含み、望ましくは、直径が０．５〜７ミクロンの範囲で、受容体の気管支樹へ送られる粒子として提供される。
【００３３】
こうした調合剤の１つの可能性として、粉末状に微細に粉砕した形態で、便宜上、例えば、吸入器で使用されるゼラチン製の開孔可能なカプセル、あるいは、活性化合物と、適当な液状またはガス状の推進剤と、任意で、界面活性剤および／または固形希釈剤などのその他の成分を含む自己推進形式で提供される。適当な液状推進剤は、プロパン、クロロフルオロカーボン、および炭酸ガスを含む適当なガス状推進剤を含む。活性化合物が溶液または懸濁液の小滴として投与される場合は、自己推進形式が採用される。
【００３４】
こうした自己推進型調剤は、当該分野で公知のものと類似し、すでに確立された手法で調製される。望ましい噴射特性を有する手動式または自動式バルブを備えた容器にて適切に提供され、一回の操作ごとに、例えば、２５〜１００マイクロリットルの一定量を放出する調量型のバルブが好都合である。
【００３５】
さらなる可能性として、活性化合物は、アトマイザーや噴霧器に使用される溶液または懸濁液の形態とし、吸入用の細かい飛沫ミストを生成するために加速気流または超音波攪拌が採用される。
【００３６】
鼻から投与するのに相応しい調合剤の調製は、通常、上記した肺投与式と似たものを含む。投与する場合、こうした調剤は、鼻腔に停留できるように望ましくは１０〜２００ミクロンの粒径を有し、これは、粒子の大きさが適当な粉末を使用するか、あるいは、適切なバルブを選択することによって達成される。その他の適当な調剤には、鼻の近くに保持された容器から鼻腔を介して急速吸入で投与するために、２０〜５００ミクロンの範囲の粒径を有する粗い粉末と、水性または油性の溶液、あるいは懸濁液に、０．２〜５％ｗ／ｖの活性化合物を含有する点鼻液とが含まれる。
【００３７】
上記調合薬は、上述した担体成分に加えて、希釈剤、緩衝剤、フレーバー剤、結合剤、界面活性剤、増粘剤、潤滑剤、添加剤（抗酸化剤を含む）など、適切な１個または複数の付加的担体成分や、対象とする受容体の血液に等張性を付与する目的で添加する物質を含むことは理解されよう。
【００３８】
薬学的に許容される担体は当業者に周知で、かつ０．１Ｍ、好ましくは、０．０５Ｍのリン酸緩衝液、もしくは０．８％の生理食塩水を含むが、これに限定されるものではない。さらに、こうした薬学的担体は、水性または非水性溶液、懸濁液、乳濁液であっても構わない。非水性の溶媒としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、および油酸エチルなどの注射可能な有機エステルなどが挙げられる。水性の担体としては、生理食塩水や緩衝培地を含む、水、アルコール性／水性の溶液、乳濁液または懸濁液が挙げられる。非経口性溶剤は、塩化ナトリウム溶液、リンゲルブドウ糖、塩化デキストロース、塩化ナトリウム、乳酸化リンゲル液、不揮発性油を含む。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤、不活性ガスなどの防腐剤や添加剤を含んでも構わない。
【００３９】
家畜用の治療用調合薬は、便宜上、粉末または濃縮液の形態であっても構わない。標準的な家畜用調合の慣例によれば、乳糖またはショ糖などの一般的な水溶性賦形剤が物性を改良するために粉末に混入される。従って、本発明による特に適切な粉末は、５０〜１００％ｗ／ｗ、好ましくは６０〜８０ｗ／ｗの活性成分と、０〜５０％ｗ／ｗ、好ましくは２０〜４０％ｗ／ｗの従来の家畜用賦形剤とから成る。これらの粉末は、例えば、中間混合飼料の形で動物の飼料に添加しても良いし、動物の飲み水で薄めても構わない。
【００４０】
本発明の濃縮液は、好都合にＥＳ−６２またはその塩類を含み、任意で、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、グリセリンホルマール、または３０％ｖ／ｖまでエタノールを混合した溶剤などの家畜用に許容される水溶性溶剤を含む。濃縮液は動物の飲み水に投与される。
【００４１】
詳細な説明
図を参照しながら本発明を詳しく説明する。図１は、ＥＳ−６２のアミノ酸配列を示す。潜在性Ｎ連鎖グリコシレーション・サイトには下線を施す。目下の段階では、これらのうち、どれがどれだけ利用できるか、また、ホスホリルコリン含有グリカンとどれだけ多くの連鎖を有しているのか分かっていない。
【００４２】
図２において、番号（例えば、２、３、４、および６）はＣ−連鎖の位置を表す。図２は、ホスホリルコリンのグリカンに対する結合を示し、タンパク質に対してではない。＋と−の表記は、単に、単位が任意であることを示す。
【００４３】
材料、方法、および結果
生後８〜１０週のマウス（ＤＢＡ／１株）に対し、５０マイクロリットルの燐酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に２マイクログラムの精製ＥＳ−６２を含む液体を、−２日目、０日目、２１日目に、皮下投与した（ＥＳ−６２グループ）。２番目のグループにはこれに加えて、ＥＳ−６２を２２、２３、２４日目と、その後実験が終了するまで３日毎に投与した（マルチＥＳ−６２グループ）。対照群のマウスには単にＰＢＳを投与した（ＰＢＳグループ）。１００マイクロリットルのフロイント完全アジュバントに２００マイクログラムのコラーゲン（ボビン、ＩＩ型、シグマ社、プール、ドーセット：Bovine, type II; Sigma, Poole, Dorset）を混合し、全てのマウスに０日目に皮内投与し、２１日目にはＰＢＳに混合したコラーゲンを腹膜内投与した。実験プロトコルの概要を図３に示す。本実験の終了後に行った別の治療実験では、ＥＳ−６２（２ｍｇ）を疾病が定着した翌日まで投与せず、その後、１４日間連続投与した。
【００４４】
関節炎の発生と発病度について、５０日目まで毎日測定を行った。発病度のスコアは以下の基準による：０＝正常、１＝紅斑、２＝紅斑と腫れ、３＝増大／機能低下、総合スコア＝四肢の総計。治療的研究については、ＥＳ−６２が投与された１４日間、測定された。
【００４５】
リンパ節細胞が３３日目と５０日目（治験的研究のためのＥＳ−６２投与を終了した翌日）に発見され、コラーゲンの激増とシトキンの応答が測定された。すなわち、細胞を９６時間まで、培地（ＲＰＭＩ：ギブコ社／ＢＲＬ、ペーズリー、グラスゴウ、イギリス）にて２×１０６細胞／ｍｌで培養し、３７℃の５％ＣＯ２中に、２ｍＭのＬグルタミン、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝剤、１０％のＦＳＣ（以上、全てギブコ社／ＢＲＬ）を添加した。細胞を段階的な濃度のコラーゲンで刺激した。Ｕ底９６ウェルのプレート（ナンク社、ロズキル、デンマーク：Nunc, Roskile, Denmark）を用いて上述したように（レングＢ．Ｐ．他、２０００年刊行、免疫ジャーナル、１６４号、６４９５頁：Leung, B.P. et al., J. Immunol）、増殖反応測定を３回同じ方法で実施した。３個の同時進行する培養から上澄みを採取し、ＥＬＩＳＡによるシトキン濃度の評価まで、−７０℃で保存した。すなわち、対抗体を用いて、製造者の指示に従って、ＥＬＩＳＡによりマウスのＴＮＦα、ＩＦＮγ（Ｒ&Ｄ  システム）、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２（ｐ４０＋ｐ７０）（ファーミゲン、サンディエゴ、カルフォルニア：PharMingen, San Diego, CA）が分析された。検出の下限値は以下の通りである：ＩＬ−６，ＩＬ−１２，およびＴＮＦαは全て１０ｐｇ／ｍｌ；ＩＬ−１０とＩＦＮγは８０ｐｇ／ｍｌ。
【００４６】
血清標本が５０日目（治験的研究のためのＥＳ−６２投与を終了した翌日）に発見され、コラーゲンに対する抗体反応を上述した方法（レングＢ．Ｐ．他、２０００年刊行、免疫ジャーナル、１６４号、６４９５頁：Leung, B.P. et al., J. Immunol）で、ＥＬＩＳＡにより測定した。すなわち、９６ウェルのプレートに夜通し４℃でコラーゲン（０．１ＭのＮａＨ２ＣＯ３中、２ｍｇ／ｍｌ）を塗布し、ブロックし、階段希釈した血清を添加した。結合ＩｇＧ１／２ａが、それぞれ、抗マウスＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａ（ファーミンゲン社：PharMingen）のビオチン結合の助けを得て検出された。
【００４７】
マッキントッシュのミニタブソフトウェアを用いて統計学的分析を実施した。客観的スコアは、ノンパラメトリックのマン＝ホイットニＵ検定法を用いて分析された。一定の時点での累積発生率の相違は、カイ２乗式コンティンジェンシー分析法(chi-square contingency analysis)を用いて分析された。シトキンおよびコラーゲンに特異なＩｇＧレベルは、スチューデントのｔ検定(Student's t-test)を用いて比較された。
【００４８】
治験の研究を完了した段階で、マウスの後肢を切除し、切片を調製して、ヘマトキシリンとエオシンで染色した。
【００４９】
Ｂａｌｂ／ｃまたはＣ５７／Ｂ６のマウス（５匹のグループ）に１００マイクロリットルのＰＢＳで精製したＥＳ−６２を、−２日目、０日目、２１日目に、２マイクログラムずつ皮下投与した（ＥＳ−６２グループ、トライアルＩ）。２番目のグループであるＣ５７／Ｂ６のマウスには、これに加えて、ＥＳ−６２を４日目と６日目に皮下投与した（ＥＳ−６２グループ、トライアルＩＩ）。対照群マウスには単にＰＢＳを投与した（ＰＢＳグループ）。５×１０６のリーシュマニア属主要寄生生物を５０μｌのＰＢＳに混入し、全てのマウスの肢に皮下投与した。寄生生物による負荷は、上述した手法（ピエドラフィタ  Ｄ．他、１９９９年刊行、免疫ジャーナル、１６３号、１４６７頁：Piedrafita D. et al. J. Immunol）で、感染した肢を感染していない対の肢と比較し、そのサイズ（ｍｍ）の増大により判定した。
【００５０】
図４に示すように（上のグラフ）、３回量ＥＳ−６２を投与されたプロトコル（ＥＳ−６２グループ）は関節炎の発病度が効果的に減少した（統計的に有意）。最初の実験は、多数のＥＳ−６２の治療（マルチＥＳ−６２グループ）が、ＥＳ−６２の３回量投与プロトコル（ＥＳ−６２グループ）より効果が高いことを示唆している。
【００５１】
図５に示すように、発病度の改善は、３３日目の半ビボでのリンパ節培地における抗原誘発性細胞増殖の抑制と調和した。この効果は全く特殊なもので、非特異型分裂促進因子であるコンカナバリンＡへの細胞増殖反応は損なわれなかった。
【００５２】
図５に示すように、発病度の改善は、３３日目の半ビボでのリンパ節培地における前炎症性シトキンであるＩＬ−６、ＴＮＦα、ＩＦＮγの生成抑制と調和した。
【００５３】
図５に示すように、抗炎症性シトキンであるＩＬ−１０の生成は、逆に増加している。
【００５４】
図６に示すように、複数のＥＳ−６２治療は、細胞増殖および炎症性シトキン生成の両方で抑制を維持するのに効果があった（５０日目）。
【００５５】
図７に示すように、ＴＨ−１抗体であるＩｇＧ２ａの生成が多数の治療で減少した（５０日目）。
【００５６】
図８に示すように、発病後のＥＳ−６２による治療では、マウスのコラーゲン・モデルにおいて定着した関節炎の進行抑制に効果があった。
【００５７】
図９に示すように、疾患の更なる進行の抑制は、ＥＳ−６２を１４日間毎日投与した翌日に調製したリンパ節培地における半ビボでの抗原誘発性細胞増殖の抑制と調和した。
【００５８】
図９に示すように、疾患の更なる進行の抑制は、ＥＳ−６２を１４日間毎日投与した翌日に調製したリンパ節培地における半ビボでの前炎症性シトキンであるＩＬ−６、ＴＮＦα、ＩＦＮγの生成抑制とも調和した。
【００５９】
図１０に示すように、ＴＨ−１抗体であるＩｇＧ２ａの生成は、ＥＳ−６２を１４日間毎日投与した翌日に検知されたように、ＥＳ−６２の連続投与によって減少した。
【００６０】
図１１に示すように、治験におけるＥＳ−６２を用いた治療では、単にＰＢＳだけを投与されたマウスに観察された全面的な軟骨性表面侵食と炎症が抑制された。
【００６１】
図１２に示すように、治験におけるＥＳ−６２を用いた治療では、単にＰＢＳを投与されたマウスに観察された軟骨性表面侵食と炎症が全面的に抑制された。
【００６２】
滑液組織によるＴＮＦの生成は、インビボにおける前病原性経路にとって重要な代理の役割を果たす。図１３は、インビトロでＥＳ−６２がヒト組織のＴＮＦα生成を阻止することを示す。ＴＮＦαのインビトロ放出を最適化するために、ＲＡ滑膜または滑液から調製された２個の単一細胞懸濁（すなわち、ＡとＢ）をＥＳ−６２で前処置し、その後、ＬＰＳ（１０００ｎｇ／ｍｌまたは１００ｎｇ／ｍｌ）で２４時間刺激した。培養の上澄みへ放出されたＴＮＦαをＥＬＩＳＡで測定した。データは、３つの培養の平均値±ＳＥＭで、３つの類似実験を表す。
【００６３】
図１３は、ＥＳ−６２がヒト滑膜または滑液の前炎症性シトキンの生成を抑制することを示す。
【００６４】
結論および含意
得られたデータは、３服用量のＥＳ−６２プロトコルが、マウスのコラーゲン誘発性関節炎の発病度を有意に減じることを明確に示している。この軽減は、コラーゲンへの標準的な前炎症反応の喪失および抗炎症表現型の発達と関連していた。こうした変化は、ＴＨ−１からＴＨ−２へのＴ細胞の極性の反転（増殖とシトキン生成の変化で裏付けられる）によって引き起こされた。さらに興味深いことには、疾患の発病度および半ビボでの前炎症性シトキン生成に対する効果が、３日毎に更にＥＳ−６２を投与することで維持された。これは、ＥＳ−６２が進行中の関節炎を抑制する機能を有することを強く示唆している。治療研究用の最終実験の結果は、この所見と完全に一致している。この実験では、コラーゲン誘発性関節炎に関わる疾患を発病した後にＥＳ−６２で治療したマウスにおいて、ＥＳ−６２が疾患の更なる進行を抑制した。従って、ＥＳ−６２はヒトの関節性疾患の治療に役立つ。ヒト滑膜培養におけるＥＳ−６２のＴＮＦα生成に関する効果を示すデータは、この所見と一致している。
【００６５】
最後に、ＥＳ−６２は、Ｔヘルパー表現型の極性化を伴う全ての疾患を調節するとは考えられないため、選択的な抗炎症剤であるといえる。例えば、マウスにおけるリーシュマニア属の鞭毛虫による感染への感受性は、ＴＨ２表現型（Ｂａｌｂ／ｃ）と関連し、一方、寄生生物の抵抗と浄化値はＴＨ１表現型と関連している。実際、ＩＬ−１２やＴＮＦαなどの前炎症性シトキンに欠陥のあるマウスでは、疾患が悪化する。従って、もし、ＥＳ−６２が、単に"抗炎症性"またはＴＨ１の極性を逆転させることで、その効果をもたらしたのであれば、Ｂａｌｂ／ｃ（ＴＨ２）マウスの病状の悪化とＣ５７／Ｂ６（ＴＨ１）マウスの感染への感受性の影響が予想された。実際には、ＥＳ−６２を使用した治療ではどちらの株菌のマウスにも影響がなかった。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】ＥＳ−６２のアミノ酸配列を示し、潜在性Ｎ連鎖グリコシレーション・サイトには下線を施す。
【図２】ＥＳ−６２のホスホリルコリン−グリカンの成分構成を示す（ハスラム他、１９９７年刊行、分子および生化学的寄生虫学、８５号、５３頁：Haslam et al., Molecular and Biochemical Parasitology）。
【図３】コラーゲン誘発関節炎の実験プロトコルの概略図。
【図４】時間の経過と共に関節炎が進行する状況を示すグラフ。
【図５】３３日目のリンパ節培養における、抗原誘発性細胞の増殖と前炎症性シトキン生成の両方の抑制を示す。
【図６】ＥＳ−６２治療により、細胞増殖と炎症性シトキン生成の両方の抑制が共に維持されることを示す。
【図７】ＥＳ−６２治療により、ＴＨ−１に関わる抗体であるＩｇＧ２ａの生成が減少していることを示す。
【図８】ＥＳ−６２治療が定着した関節炎の進行を防ぐのに有効であることを示す。
【図９】ＥＳ−６２の投与により、半ビボでのリンパ節培養における抗原誘発性細胞の増殖が阻害され、前炎症性シトキンの生成も抑制されることを示す。
【図１０】ＥＳ−６２の投与により、ＴＨ−１抗体であるＩｇＧ２ａの生成が減少することを示す。
【図１１】ＥＳ−６２で治療されたマウスの軟骨組織表面の侵食と炎症が防止されたことを示す、ヘマトキシリンとエオシンで染色された関節炎を伴うマウスの後肢の切片。
【図１２】マウスのリーシュマニア株で観察された後肢の増大にＥＳ−６２の治療効果がないことを示す。
【図１３】ＥＳ−６２がヒト滑膜と滑液細胞からの前炎症性シトキンの生成を阻害することを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年6月29日(2004.6.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【国際調査報告】
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