(57)【要約】健康な組織中にポリヌクレオチドを導入し、侵襲的電極を介して該組織中でパルス電場を生成する方法であって、該電極から放出される金属夾雑物に起因する、エレクトロポレーションされた組織に対する局所的な副作用及びエレクトロポレーションされた生物に対する全身的な副作用を最小化しながら、該組織の細胞への該ポリヌクレオチドの増強された送達をもたらす、前記方法が提供される。一実施形態において、本発明の方法は、エレクトロポレーションされた組織への毒性量の金属の導入を最小化する金、金合金又は他の金属の電極を使用する。他の実施形態においては、本発明の方法を、好適な標的組織の細胞にDNAを投与することによる遺伝子治療のため、及びDNAワクチンを投与することによる免疫応答の誘導のために用いる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エレクトロポレーションによる処置を受けている組織中、又は培地に懸濁された細胞中に挿入された金属製電極から生じる毒性金属夾雑物を低減させる方法であって、該エレクトロポレーションは、該組織又は該培地中の電極を用いて行うものであり、
a) 該組織又は培地と、金電極、金めっき電極、及び金合金電極からなる群より選択される電極とを接触させること、並びに
b) 該組織又は細胞をエレクトロポレーションすることができる電気パルスを用いて該電極を帯電させること、
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記電極が前記組織に侵入するのに十分な針をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記パルスが方形波パルス、双極性パルス、及び矩形パルスから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記パルスの公称電場強度が10〜1500 V/cmである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記パルスの持続期間が1〜100 msである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
複数パルスを印加する際の周波数が0.1〜1000 Hzである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
被験体の組織中にポリヌクレオチドをエレクトロポレーションし、かつ該組織中に挿入された金属製電極から生じる毒性金属夾雑物を低減させる方法であって、該エレクトロポレーションが、
a) 該組織と、金電極、金めっき電極、及び金合金電極からなる群より選択される電極とを接触させること、並びに
b) 該組織の細胞中に該ポリヌクレオチドをエレクトロポレーションすることができ、10〜1500 V/cmの公称電場強度を有する電気パルスを用いて、該電極を帯電させること、
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、全体的には、細胞の浸透性を増加させるための電気パルスの使用、より具体的には、細胞ポレーション治療(CPT)としても知られる、エレクトロポレーション治療(EPT)により、該治療手順中に被験体に有意な量の毒性物質を誘導しない材料から作製された電極を用いて、細胞への遺伝子などの核酸のin vivoでの送達のための制御された電場を印加するための方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
1970年代に、電場を用いて、永久的な損傷を引き起こさずに細胞に孔を形成することができることが発見された。この発見により、細胞の細胞質に小分子および大分子を挿入することが可能になった。結果として、遺伝子をコードするポリヌクレオチドを包含するポリヌクレオチド及び薬理化合物などの他の分子を、エレクトロポレーションとして知られるようになった前記方法を通じて生細胞に組み入れることができることが知られている。エレクトロポレーションをin vitroで適用する場合、該遺伝子又は他の分子をバッファー培地中で生細胞と混合し、強い電場の短いパルスを印加する。細胞膜は一過的に多孔になり、ポリヌクレオチド又は他の分子が細胞に進入することができる。
【０００３】
エレクトロポレーションは、癌の化学療法の増強を含め、治療法において用いられてきた。細胞内で作用する化学療法剤を用いた特定の型の癌の治療においては、癌細胞を殺傷するのに十分に高い細胞内薬剤濃度を達成するために、十分に高い全身用量の薬剤を用いる必要がある。これは、許容できないほど多数の正常細胞を殺傷せずには不可能であることが多い。化学療法剤を癌細胞に優先的に送達して、低い全身濃度で高い細胞内濃度を達成することができれば、許容できないほど正常細胞に害を与えることなく癌細胞を殺傷するという目的を達成することができる。潜在的に最も強力な抗癌剤のいくつか、例えば、ブレオマイシンは、細胞膜を効率的に通過することができない。しかしながら、腫瘍のエレクトロポレーションによってその細胞膜を一時的に透過性にすることにより、エレクトロポレーションされた細胞中に優先的にブレオマイシンを送達することが可能となる。
【０００４】
典型的には、抗癌剤を腫瘍に直接注入し、少なくとも一対の電極間で該腫瘍に電場を印加することにより、癌(腫瘍)のエレクトロポレーション治療処置を行う。この電極の配置及び電場強度を、腫瘍細胞のエレクトロポレーションが周囲の正常細胞に顕著な影響を及ぼすことなく行われるように設計しなければならない。体表面に近い腫瘍、例えば、皮膚腫瘍については、非侵襲性のプレート電極を、正常組織の該電極間の電場への曝露を最小限に維持しながら該電極間の電場が該腫瘍を包み込むように、腫瘍の両側に用いることによって、そのエレクトロポレーションを実行することができる。プレート電極間の電場はかなり均一である。電極間の距離を測定することができ、次いで、式E=V/dに従う所望の電場強度を生じる好適な電圧を該電極に印加することができる(E=電場強度(V/cm)；V=電圧(ボルト)；及びd=距離(cm))。非侵襲性の電極を用いるin vivoエレクトロポレーションは、一般的には非侵襲性の電極を置くことができる体表面、例えば、生物の皮膚に近い小さい腫瘍に限定される。プレート電極を用いた大きいかもしくは深部(内部)に位置する腫瘍の治療は、外科的手段により該腫瘍への接近を試みた場合でさえ困難であることが多く、又は時には不可能である。さらに、約1 cmを超える電極間距離では、所望の電場強度を達成するために印加しなければならない電圧が高くなり、許容できない副作用を引き起こすため、実用的に適用できない。米国特許第5,439,440号及びその関連特許は、侵襲性電極を腫瘍に挿入するin vivoエレクトロポレーションのための電極系を開示している。そのような侵襲性電極により、深部の腫瘍に接近すること及び大きな腫瘍体積に所望の電場強度を印加することが可能になる。関連する米国特許第5,273,525号において、エレクトロポレーションのための、巨大分子を包含する分子を注入するための改変されたシリンジでは、電極としても機能する注射針を用いている。この構成は、電極を表層下に配置すること、及び、針電極に近接し、針電極間に挟まれた組織中に位置する細胞をエレクトロポレーションするためにそれらを使用することを可能にする。本発明の説明においては、用語「針電極」は任意の侵襲性電極を指すものとする。
【０００５】
健康な組織中に置かれる金属製針電極の使用を、種々の型の遺伝子治療を達成するために利用することができる。本出願においては、製剤化された、又は製剤化されていない(「裸の」)DNAを正常な組織に注入した後、注入部位の組織をエレクトロポレーションにかける。しかしながら、細胞にDNAを送達するための最適なエレクトロポレーション条件は、比較的低分子量の治療剤を送達するための最適な条件とは異なる。一般的には、低分子量薬剤の送達のための比較的短いパルス(ミリ秒)及びより強い公称電場強度(1000〜1500 V/cm)と比べてより弱い公称電場強度(100〜400 V/cm)での比較的長いパルス(ミリ秒)が、DNA送達にとって最適である(Dev, S.B.ら、IEEE Transactions on Plasma Science 28(1): 206-223 (2000))。典型的なDNA送達パルスにより、薬剤送達パルスと比較してより多い累積量の電流をもたらす。より多量の累積電流(Amp・秒＝クーロン, C)は、電極を構成する特定の金属の溶解、及び電極からの固体金属破片の剥離などの電極に対する電気化学影響を増大させ得る。
【０００６】
遺伝子治療及びDNAワクチン接種のための正常な組織へのエレクトロポレーションにより増強された遺伝子送達のための最適条件としては、100〜400 V/cmの公称電場強度での10〜80 msのパルスが挙げられる。しかしながら、DNA送達を、より広い範囲の条件、例えば、1〜100 ms及び50〜2000 V/cm内で行うこともある。一般的に用いられる200Vでの60 msのDNA送達パルスと、一般的に用いられる約500Vでの100μsのブレオマイシン送達パルスとの比較により、DNA送達パルスについて240倍以上の電荷転移(クーロン)が得られる。かくして、他の電気的及び組織条件が全て実質的に同じである限り、これらの条件下で組織中に可溶化する電極金属の量は、エレクトロポレーションを用いて遺伝子治療又はDNAワクチン接種のために正常な組織に遺伝子を送達する場合、エレクトロポレーションを用いて腫瘍組織に薬剤を送達する場合と比べ、潜在的には240倍多い。長いパルス条件下で種々の金属組成の特定の金属針電極の使用から得られる毒性金属の量は、組織及び生物に対して毒性のレベルにあることが多い。さらに、金属片が、エレクトロポレーションパルスにより電極において誘導される腐食などの電気化学的プロセスの結果として、電極から剥離する可能性もある。かくして、溶解した金属イオン及び電極から剥離した金属粒子は、健康な組織中に沈着し、そこでそれらは局部的な毒性効果を引き起こし得る。例えば、健康な組織へのエレクトロポレーションにより増強された遺伝子の送達のためにステンレススチール針を用いた場合に、本発明者らは、おそらく金属の夾雑に起因する、針の挿入及び穿通部位(針跡に沿った)のちょうどその部位、及びその近接部位での組織の変色を観察した。本発明者らはまた、針自体の酸化、腐食及び金属破片(剥離、はがれ)の証拠を観察した。金属夾雑物はリンパ系及び血流に進入し、そこでそれらは全身毒性を引き起こし得る。抗癌剤(例えば、ブレオマイシン)及びエレクトロポレーションを用いた腫瘍の治療においては、金属夾雑物は、放出される金属の量が少なくとも二桁のオーダーで少なく、腫瘍に対する毒性副作用は健康な組織に対する副作用とは反対に、健康上のリスクとして考えられないため、遺伝子治療及びDNAワクチン接種においてよりも懸念がかなり低い。
【０００７】
平らなステンレススチール製電極からの第一鉄イオンの放出は、比較的強い電場強度(1.2〜3.0 kV/cm)及び短いパルス(50〜500μs)の条件下で測定されてきた(T. Tomov及びI. Tsoneva, Bioelectrochemistry 51: 207-209 (2000))。放出される第一鉄イオンの量はパルス期間及び電場強度の2乗に比例することがわかった。ステンレススチール電極の他の成分、特に細胞毒性の点で鉄よりも懸念が大きいクロム及びニッケルの可溶化に関する記述は為されていない。また、電極からもたらされる潜在的な毒性を防止できる方法に関する示唆も為されていない。
【０００８】
従って、針電極を健康な組織中に配置する、ポリヌクレオチドのエレクトロポレーションにより増強された送達を実施するためのより良い方法が当業界で必要とされている。本発明は、組織中の電極から放出される毒性金属の毒性副作用を最小化しながら、健康な組織もしくは正常な組織の細胞にポリヌクレオチドを導入するための方法を提供することにより、当業界におけるこれらの問題及び他の問題を解決する。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
本発明の第一の態様においては、予め選択した組織と、少なくとも2つの針電極とを接触させることを含み、該組織と接触する針電極の一部もしくはその針電極の表面は、金、又は金合金、又はポリヌクレオチドを細胞に送達する目的で前記細胞をエレクトロポレーションするのに好適な条件下で用いた場合に低い毒性を示す金属から構成される、エレクトロポレーション法を提供する。前記金属及び合金は全て、以後単に「金」と呼ぶことにする。
【００１０】
別の実施形態においては、前記方法は、筋肉内、皮内、皮下及び粘膜内又は任意の他の組織を通じた経路からなる群より選択される経路により、有効量の少なくとも1種のポリヌクレオチドを、被験体の標的組織に導入すること、及び少なくとも2つの針電極によりパルス電場を生成することを含み、その際、該標的組織での電場は、例えば、当業界で公知であるような、DNAワクチンなどの任意の遺伝子治療適応のために、該ポリヌクレオチドの標的組織の細胞への進入を増強するのに十分に強力なものである。パルス電場を、前記ポリヌクレオチドの導入と実質的に同時に、又は本明細書に記載のようにポリヌクレオチドの導入の後に生成することができる。
【００１１】
別の実施形態においては、健康な組織と接触する前記針電極の一部が金から構成されるか、又は非金卑金属の柄よりも上部では少なくとも金コーティングもしくは金めっきがされている。本明細書の内容における用語「金」は、本明細書に記載の適用の範囲内で適用の際及び適用後に許容できない毒性を引き起こさない金合金を含む。例えば、金コーティング又は金めっきは、10μmの平均厚さを有してもよい。必要に応じて、本発明の方法において用いる針電極の少なくとも一方は、前記ポリヌクレオチドが中空の針電極を通じて導入されるように、中空であってもよい。本発明を金針の使用に関して説明するが、当業者であれば、任意の金属もしくは金と類似した導電性などの材料特性を有する物質を含む金属から作られるか又はそれによってコーティングされ、かつ、毒性条件をもたらすことなく又は組織の変色を引き起こすことなく組織中に導入することができる針を、金針の代わりに針電極として用いることができることが理解できるであろう。
【００１２】
別の実施形態においては、パルス電場のパルス長は約100マイクロ秒〜約100 ミリ秒の範囲にある。好ましくは、金を含む針を通じて与えられる公称電場強度は、エレクトロポレーションを使用しない場合よりも大きい程度までポリヌクレオチドの標的組織の細胞への進入をもたらすのに十分な強度であり、また該ポリヌクレオチドの導入と実質的に同時に送達される。例えば、公称電場強度は約50 V/cm〜5000 V/cm、好ましくは約200 V/cm〜約400 V/cmの範囲であってよい。
【００１３】
さらに別の実施形態においては、本発明の方法は、筋肉又は皮膚への前記ポリヌクレオチドの導入に特に有効である。金を含む針を用いる本発明の方法の使用により、前記針電極は、該針電極からの金属の放出による組織の実質的な変色を引き起こさない。
【００１４】
さらに別の実施形態においては、組織中に毒性金属又は毒性量の金属を導入することなく健康な組織にポリヌクレオチドを導入するための本発明の方法を用いて、免疫原として有効量の、抗原をコードする少なくとも1種のポリヌクレオチドを、筋肉もしくは皮膚などの標的組織に送達して、該ポリヌクレオチドによりコードされた抗原に対する接種された被験体中での免疫応答の生成をもたらすように、該ポリヌクレオチドを、そこでの発現のために該標的組織の細胞に進入させる。健康な組織を、該組織と接触する針電極の一部が金でめっきされているか又は金からなるような少なくとも2つの針電極と接触させて、そこでの発現のために標的組織の細胞への該ポリヌクレオチドの進入をもたらし、また該ポリヌクレオチドによりコードされた抗原に対する接種された被験体中での免疫応答の生成をもたらすような、十分な強度のパルス電場を該標的組織で形成させる。
【００１５】
必要に応じて、ポリヌクレオチドの導入及び電場の形成の前に、それと同時に、又はその数日以内に標的組織にアジュバントとして有効な薬剤を導入することにより、抗原をコードするポリヌクレオチドを投与することを含む免疫化の他の様式から得られる免疫応答と比較して、前記抗原をコードするポリヌクレオチドの免疫原性を増強することができる。本発明の方法においては、前記ポリヌクレオチド及びアジュバントとして有効な薬剤はその導入の前に互いに実質的に化学結合していても、していなくてもよく、実質的に化学結合していない場合には、互いに完全に独立に投与することができる。関連する実施形態においては、本発明の方法におけるそのような組合せの使用は、免疫化プロトコルを施す被験体の健康な組織中で針電極から放出される毒性量の金属もしくは金属イオンを導入することなく、種々の抗原の免疫原性を増強するための安全かつ有効な手法を提供する。
【００１６】
従って、一実施形態においては、抗原をコードするポリヌクレオチドを、筋肉内注入により被験体の標的組織に導入する。健康な組織と、該組織と接触する針電極の一部が金であるような少なくとも2つの針電極とを接触させることにより、該標的組織でパルス電場を形成させる。パルス電場は、そこでの発現のために標的組織の細胞に前記ポリヌクレオチドを進入させ、該ポリヌクレオチドによりコードされた抗原に対する被験体の免疫応答を生成させるのに十分な強度及び持続期間のものであり、該ポリヌクレオチドの導入と実質的に同時に与えられる。この際、アジュバントとして有効な量の粒子を、該ポリヌクレオチドの導入及び電場の形成と本質的に同時に又はその数日以内に標的組織に導入するが、ここで該ポリヌクレオチド及び該粒子はその導入前に互いに実質的に化学結合していないものである。本発明の方法から得られる免疫応答は、前記抗原をコードするそのようなポリヌクレオチドの投与を含む他の様式の免疫化から得られる免疫応答と比較して増強される。
【００１７】
本発明のこれらの実施形態及び他の実施形態は本明細書の開示を考慮して当業者にとっては容易に思いつくことができるであろう。本明細書に引用される全ての刊行物、特許及び特許出願はその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【００１８】
本発明の実施は、特に指摘しない限り、当業界の技術の範囲内に含まれる化学、生化学、分子生物学、免疫学及び薬理学の慣用法を用いる。そのような技術は文献で十分に説明されている。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版(Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1990); Methods In Enzymology (S. Colowick及びN. Kaplan,(編), Academic Press, Inc.); 及びHandbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir及びC. C. Blackwell, (編), 1986, Blackwell Scientific Publications); 並びにSambrook及びRussell., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第3版, 2000)を参照されたい。
【００１９】
発明の詳細な説明
本発明の説明においては、次の用語を、以下に示すように使用しまた定義するものとする。
【００２０】
「不活性」とは、体内に導入された場合、感知され得るいかなる様式でもそれ自身は生体と化学的に反応しない安定な組成物を意味する。
【００２１】
「ポリヌクレオチド」とは、線状、弛緩した環状、スーパーコイル状もしくは凝縮したものであっても、一本鎖もしくは二本鎖であってもよい、DNA、cDNA、mRNA及びRNAなどの核酸ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドは天然の成分と比較して化学的に改変されている1つ以上の成分を含んでもよい。このポリヌクレオチドを、送達ビヒクル中に配置することなく(すなわち、「裸の」ポリヌクレオチドとして)、又は当業界で公知のものなどの好適なビヒクル中に配置して、提供することができる。特に、本明細書の目的のための用語「ポリヌクレオチド」がオリゴヌクレオチドをも包含することも、本発明の範囲内にあると意図される。「裸の」形態で投与されるポリヌクレオチドに加えて、前記ポリヌクレオチドを製剤化された形態又は改変された形態で投与することもできる。例えば、このポリヌクレオチドを、保護用、双方向性、非凝縮性(PINC)のポリマーと混合することにより製剤化することができ(Fewell, J.G.ら、Gene therapy for the treatment of hemophilia B using PINC-formulated plasmid delivered to muscle with electroporation(エレクトロポレーションにより筋肉に送達されたPINC製剤化されたプラスミドを用いたB型血友病の治療のための遺伝子治療) Molecular Therapy, 3:574-583 (2000))、又はこのポリヌクレオチドを、ペプチドもしくはマーカー分子などの他の化学物質を該ポリヌクレオチドと結合させることにより改変することができる(Zelphati, O.ら、PNA-dependent gene chemistry: stable coupling of peptides and oligonucleotides to plasmid DNA(PNA依存性遺伝子化学：ペプチド及びオリゴヌクレオチドとプラスミドDNAとの安定なカップリング), Biotechniques 28:304-310; 312-314; 316 (2000))。
【００２２】
「〜と化学結合した」とは、化学的にそれと複合体化されたか、化学的にそれに付加されたか、それによってコーティングされたか、その上にコーティングされたか、それに吸着されたか、あるいはそれ以外で化学的に結合したことを意味する。例えば、粒子上でコーティングされたか又は粒子に吸着された核酸は、該粒子と化学結合している。結合は共有結合又は非共有結合を意味してもよい。
【００２３】
「皮膚組織」は、角質層の下にある表皮及び真皮を意味する。
【００２４】
「皮内」及び「皮内的に」は、皮膚の表面上ではなく、その皮層中への投与を意味する。例えば、皮内経路としては、限定されるものではないが、真皮細胞の腫瘍が挙げられる。
【００２５】
「筋肉内投与」及び「筋肉内に」は、筋肉実質中、すなわち、筋肉床中への投与を意味する。
【００２６】
「粘膜内投与」及び「粘膜内に」は、粘膜、又は、限定されるものではないが気道-消化管及び泌尿器管などの種々の管状構造を裏打ちする粘膜組織中への投与を意味する。
【００２７】
「皮下投与」及び「皮下的に」は、皮膚の下にある組織中への投与を意味する。
【００２８】
「免疫化」は、個体を免疫し、免疫応答を生起させるプロセスを意味する。
【００２９】
「抗体」は、抗原によりヒトなどの動物中で惹起される免疫又は防御タンパク質を意味し、該免疫タンパク質と該抗原との特異的反応を特徴とする。
【００３０】
ポリヌクレオチドとパルス電場の共投与のタイミングに関する「実質的に同時に」は、同時に、又は互いの投与の数分〜数時間以内であることを意味する。
【００３１】
「抗原」は、該抗原が提示された場合に、宿主の免疫系を刺激して、体液性抗体応答又は細胞性抗原特異的免疫応答を誘導する1個以上のエピトープを含む分子を意味する。通常、エピトープは約3〜15個、一般的には5〜15個のアミノ酸を含む。本発明の目的のために、抗原をいくつかの公知のウイルス、細菌、寄生虫及び菌類のいずれかから得ることができる。この用語はまた、種々の腫瘍抗原のいずれかを包含することも意図される。さらに、本発明の目的のために、「抗原」は、タンパク質、ポリペプチド又は多糖が免疫学的応答を誘導する能力を維持する限り、天然の配列に対して、欠失、付加及び置換(一般的には、特性保存的なもの)などの改変を有するものを含む。これらの改変は、部位特異的突然変異誘発などの意図的なものであってもよく、又は前記抗原を産生する宿主の突然変異によるものなどの偶発的なものであってもよい。
【００３２】
抗原又は組成物に対する「免疫応答」は、目的の組成物中に存在する分子に対する体液性及び／又は細胞性免疫応答の被験体中での生起である。本発明の目的のために、「体液性免疫応答」は抗体分子により媒介される免疫応答を指すが、「細胞性免疫応答」はTリンパ球及び／又は他の白血球細胞により媒介されるものである。細胞性免疫の1つの重要な態様は、細胞溶解性T細胞(「CTL」)による抗原特異的応答を含む。CTLは、主要組織適合複合体(MHC)によりコードされ、細胞の表面上で発現されるタンパク質と結合して提示されるペプチド抗原に対して、特異性を有する。CTLは細胞内微生物の細胞内破壊、又はそのような微生物に感染した細胞の溶解を誘導及び促進するのを助ける。細胞性免疫の別の態様は、ヘルパーT細胞による抗原特異的応答を含む。ヘルパーT細胞は、その表面上でMHC分子と結合したペプチド抗原を提示する細胞に対する非特異的エフェクター細胞の機能を刺激し、その活性をそれに集中させるのを助けるように働く。「細胞性免疫応答」はまた、CD4+及びCD8+ T細胞から誘導されるものなどの、活性化T細胞及び／又は他の白血球細胞により産生されるサイトカイン、ケモカイン及び他のそのような分子の産生をも指す。
【００３３】
本発明の方法は、抗原をコードするポリヌクレオチドが、免疫応答の出現を早める(すなわち、免疫応答の反応速度を増強する)か、又は粒子／パルス電場アジュバント効果を用いずに等量のポリヌクレオチドにより誘導された免疫応答と比べて、免疫応答を誘導する能力が高い場合に、その抗原をコードするポリヌクレオチドの「免疫原性を増強する」ものである。かくして、免疫応答を誘導する本方法は、産生される抗原がより強い免疫原性を有するか、又は該抗原をコードするポリヌクレオチドがそれを投与する被験体中で免疫応答を達成するのに低用量で十分であるか、又は例えば、限定されるものではないが抗体力価によって示されるような効率的な免疫応答へと投与後により早く達するために、「増強された免疫原性」を示し得る。本発明においては、増強された免疫応答は、他の免疫化プロトコルと比べて免疫応答がより早く出現することによって証明されるような（これは例えば、抗体力価の上昇により証明される）、免疫応答の反応速度がより早いという利点を有するのが好ましい。そのような増強された免疫原性を、前記ポリヌクレオチド組成物及びパルス電場、又は該ポリヌクレオチド及び対照としての前記粒子を動物に投与し、そして当業界で周知のラジオイムノアッセイ及びELISAなどの標準的なアッセイを用いて本発明の方法に対する免疫応答を比較することにより、決定することができる。
【００３４】
本発明の方法において用いられるアジュバントに適用される用語「アジュバントとして有効な量」は、所望の免疫学的応答及び対応する治療効果に対するアジュバント効果をもたらすのに十分な量のアジュバントを指す。必要とされる正確な量は、被験体の生物種、年齢、及び全体的な状態、治療しようとする症状の重篤度、並びに目的の抗原をコードする特定のポリヌクレオチド、投与様式（例えば、筋肉に投与するか皮膚に投与するか）、アジュバントの種類などに応じて、被験体ごとに変わるであろう。個々の事例において適切な「有効」量は、当業者であれば日常的な実験を用いて決定することができる。
【００３５】
抗原をコードするポリヌクレオチドを含む組成物は、「免疫原として有効な量」の目的のポリヌクレオチドを含むであろう。すなわち、ある量のポリヌクレオチドは、コードされた抗原が被験体中で産生される場合に、前記粒子及びパルス電場と組み合わせて、症状を阻止、軽減又は消失させるのに十分な免疫応答を被験体で生じさせるであろう前記組成物中に、含められるであろう。好適な有効量は、当業者により容易に決定することができる。かくして、「免疫原として有効な量」は、日常的な試験を通じて決定することができる比較的広範囲で認められる。
【００３６】
本明細書で用いる「免疫応答の誘導」は、(i)伝統的なワクチンと同じように感染又は再感染の防止、(ii)症状の軽減又は消失、並びに(iii)目的の病原体の実質的な又は完全な排除のいずれをも指す。かくして、免疫応答を誘導する方法を、予防的(感染前に)又は治療的(感染後に)に行うことができる。
【００３７】
「製薬上許容し得る」又は「薬学的に許容し得る」は、生物活性ではないか又はその他で望ましくない材料を意味し、すなわち、任意の望ましくない生物学的影響を引き起こすことなく、あるいはそれが含まれる組成物の成分のいずれとも有害な様式で相互作用せずに、この材料を粒子アジュバント製剤と共に個体に投与することができる。
【００３８】
「被験体」は、限定されるものではないが、チンパンジー及び他の類人猿及びサル種などの非ヒト霊長類を含むヒト及び他の霊長類；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ及びウマなどの農業用動物；イヌ及びネコなどの家畜；マウス、ラット及びモルモットなどのげっ歯類を含む実験動物を含む任意の哺乳動物、家庭用愛玩動物、ニワトリなどの農業用動物などを意味する。この用語は特定の年齢を意味するものではない。かくして、成体個体及び新生児個体の両方が、本発明の方法に従って治療することができる被験体に含まれる。本明細書に記載の本発明の方法は、これらの動物全ての免疫系は同様に機能するため、上記哺乳動物種のいずれにおける使用をも意図される。
【００３９】
本発明の実施形態に従えば、金針を用いて健康な組織中でパルス電場を形成する場合、そのパルス長が最大100 ミリ秒長であっても、ポリヌクレオチドの導入、及び遺伝子治療において用いる他の分子やDNAワクチンとして用いる他の分子の導入にとって有利であるように、治療する組織中の前記針からの金属もしくは金属イオンの毒性を引き起こす放出がもたらされることを回避することができる。
【００４０】
例えば、遺伝子治療及びDNAワクチン接種などの目的で筋肉組織中の細胞のエレクトロポレーションを引き起こすために、本発明の方法で用いるパルス電場は約50 V/cm〜約2500 V/cm、好ましくは約200 V/cm〜約400 V/cmの公称電場強度を有するであろう。筋肉に送達されるパルス電場において用いられるパルス長は、約1〜100ミリ秒(msec)、好ましくは20〜60 msecの範囲であり、約1〜6回のパルスを0.1〜1000Hzの周波数で印加する。電気パルスの波形は単極性又は双極性のものであってよい。DNAワクチン接種又は遺伝子治療のためにポリヌクレオチドを皮膚に送達する本発明の方法については、パルス電場を、0.1〜1000Hzで、各々約100ミリ秒〜100 msecで持続する、各々50 V〜200 Vの1〜約12回のパルスで発生させる。
【００４１】
遺伝子治療適用を意図したDNAワクチン又はポリヌクレオチドの導入と実質的に同時に筋肉中で電場を形成するためには、2、4、又は6個の電極を有する針電極が好ましい。金電極又は金コーティングされた電極を、対、向かい合った対、平行な列、三角形、長方形、正方形、又は任意の他の好適な幾何図形に配置されたものが意図される。
【００４２】
DNAワクチンの導入と実質的に同時に皮膚中で電場を形成するためには、種々の侵襲的電極を用いることができる。皮膚の表面に適用されるエレクトロポレーションについては、一定の深さまで角質層及び表皮及び真皮を穿通するように、長さ1ミリメートル〜数ミリメートルを下回る短い針電極が好ましい。対照的に、筋肉に適用されるエレクトロポレーションについては、より長い針電極が好ましい。
【００４３】
本発明の方法の実施においてエレクトロポレーションを実施するためのいくつかの現在好ましい条件を以下の表1に提供するが、ここでエレクトロポレーションに用いる針は、該針電極を用いる健康な組織中での電場の形成が、該組織への針電極からの相当量の毒性金属の導入をもたらさないように、金を含むものである。
【表１】
2005521496.tif 000002
【００４４】
本発明の方法を、頬粘膜及び鼻粘膜などの標的組織としての粘膜組織を用いて実施することができる。電荷の印加のためのパラメーターは、皮膚組織について本明細書で説明したものと実質的に同じである。裸の、製剤化された、又は改変された形態のポリヌクレオチドを粘膜中に注入することにより、もしくは局所適用により、ポリヌクレオチドを粘膜組織及び細胞、又は粘膜の下にある細胞に送達した後、複数の短い針電極からなる電極などの、金を含む最小限に侵襲性の針電極を用いてエレクトロポレーションすることができる(米国特許第5,810,762号；Glasspool-Malone, J.ら、Efficient nonviral cutaneous transfection(効率的な非ウイルス性皮膚トランスフェクション), Molecular Therapy 2: 140-146 (2000); Zhang, L.ら、Enhanced delivery of naked DNA to the skin by non-invasive in vivo electroporation(非侵襲性のin vivoエレクトロポレーションによる皮膚への裸のDNAの増強された送達), Biochim. Biophys. Acta 1572(1): 1-9 (2002))。当業者であれば、単純な実験を行って、特定の粘膜組織へのDNAワクチンの送達のための最適条件を決定することができるであろう。
【００４５】
本明細書に記載の方法は、種々の悪性癌を治療するための手段を提供する。例えば、本発明の方法を用いて、活性化された癌遺伝子、胎児抗原、又は活性化マーカーなどの目的の癌に特異的な特定のタンパク質に対する体液性免疫応答及び細胞媒介免疫応答の双方を増大させることができる。そのような腫瘍抗原としては、限定されるものではないが、特に、MAGE 1、2、3、4などの種々のMAGE(メラノーマ関連抗原E)のいずれか(Boon, T. Scientific American (1993年3月):82-89)；種々のチロシナーゼのいずれか；MART 1(T細胞により認識されるメラノーマ抗原)；突然変異体ras；突然変異体p53；p97メラノーマ抗原；CEA(癌胎児性抗原)などが挙げられる。本発明を用いて、種々の疾患を治療又は予防することができることは容易に明らかであろう。
【００４６】
前記組成物は一般的には、水、生理食塩水、グリセロール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、エタノールなどの1種以上の「製薬上許容し得る賦形剤又はビヒクル」を含む。さらに、湿潤剤又は乳化剤、pH緩衝化物質などの助剤をそのようなビヒクル中に存在させてもよい。
【００４７】
以下は本発明を実施するための特定の実施形態の例示的な例である。以下の実施例においては、金針を用いてパルス電場を与えることができるが、これらの実施例は例示的な目的のみのために提示しているものであり、いかなる意味においても本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【００４８】
実施例1
本実験の目的は、ステンレススチール製針電極の完全性に対するエレクトロポレーションパルスの影響を定量的に測定することであった。本実験は、針跡での組織の変色が観察されたこと、及び前記電極が、好ましくはポリヌクレオチド送達に用いられるパルス条件下でin vivoでのエレクトロポレーションの目的に用いた後に劣化の徴候を示したという事実により、導かれた。劣化の徴候としては、元々は滑らかで光沢のある針表面の凹凸化、点食及び薄片化、銀色から暗褐色及び黒色への色の変化、並びに鋭い針先の鈍化などが挙げられる。これらの劣化の徴候は、これらの電極を通じて送達したパルスの回数に伴って、約30回のパルスの送達後に針の直径の減少が肉眼で見えるようになる程度まで増大した。従って、ステンレススチール製電極がエレクトロポレーション条件下では化学的に不活性であり、生体適合性であるという一般的に考えられている前提は疑問の余地があるものであった。
【００４９】
針の製造に用いたステンレススチールは、約74％の鉄(Fe)、18％のクロム(Cr)及び8％のニッケル(Ni)の組成を有していた。少量のCr及びNiでさえ、局所組織に対する毒性を引き起こし、また、可溶性形態にあるCr及びNiが血流及びリンパ系を介して体中に分散した場合、全身毒性をもたらすことが知られている。ステンレススチール製針電極から剥離した金属の量を測定するために、以前に記載された(G.A. Hofmannら、Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 16:523-569 (1999))6本針アレイ電極の6つのサンプルをUSP等級のリン酸緩衝生理食塩水中に、13 mmの深さまで浸し、持続期間がそれぞれ25 ms及び60 msの200V方形波エレクトロポレーションパルスを2 Hzで印加した。対照サンプルを、電気パルスを送達しないことを除いては正確に同じように調製した。エレクトロポレーションしたサンプル中で観察された固体破片を、酸の添加により溶解した。次いで、試験サンプル中の金属イオンの量を、誘導結合プラズマ質量分析(Inductive Coupled Plasma Mass Spectrometry; ICPMS)により測定した。結果を表2にまとめる。この試験の驚くべき結果としては、アッセイした溶液中で検出された金属の総量が、確立された電気化学の法則及び測定された電荷移動(印加されたクーロン)に基づく計算値から可溶化されると予測された最大量よりも約5倍多かったことが挙げられる。この驚くべき知見についての考えられる説明は、その量が電極表面からの固体粒子の転位に起因するものであるということである。比較的不活性であり、腐食抵抗性であると考えられるステンレススチールは、既知の電解プロセスにより影響を受けるだけでなく、固体金属粒子の剥離をもたらすその表面での構造的な崩壊も被るようである。この予想外の現象は、針電極が数十ミリ秒間曝露される高い電流密度又は高い電場強度により引き起こされるのかもしれない。ブレオマイシンのin vivoでの送達に用いられるものなどの、より短い持続期間のものであるがより高い電場強度及び電流密度のパルスが、in vivoでのポリヌクレオチド送達に用いられる電気的条件よりもこれらのステンレススチール製針に与える破壊効果が小さいということは興味深い。換言すれば、電気化学の業界における技術者が予測する量に対して数倍過剰である、電極から放出される多量の金属が、エレクトロポレーションの治療用途におけるそのような電極の使用に直接影響を及ぼすという新規な知見である。
【００５０】
可溶化された金属の原子価状態は調べられていない。しかしながら、in vivoエレクトロポレーションの際、より低い原子価状態の毒性よりも毒性が大きい、より高い原子価状態のCr及びNiが生成されること、従って、Ni及びCrが二価状態にあると仮定する場合、生物学的利用可能量の金属イオンの毒性作用はより大きいであろうことを考慮に入れる必要がある。
【００５１】
金属剥離結果の線形外挿により、約3000回の60 msパルス、又は約7000回の25 msパルス後に、電極針が完全に崩壊する(22ゲージ針、長さ13 mm)ことが示唆される。しかしながら、線形外挿はこの場合、妥当なものではないかもしれず、針の劣化は実際にはパルス数の増加に伴って加速するかもしれない。
【表２】
2005521496.tif 000003
【００５２】
実施例2
この試験の目的は、ポリヌクレオチドのin vivo送達に用いるエレクトロポレーション条件下で毒性金属の剥離が比較的少量となる好適な組成の針電極を見出すことであった。実施例1に示されるように、ステンレススチール製針電極からは金属イオン及び金属粒子の双方の形態で、相当量の毒性金属が剥離し得る。一番懸念すべきはCr及びNiである。鉄は懸念度が低い。Cr及びNiは共に、医学文献によく記載されているように、種々の毒性を引き起こし得ることが知られている。Niはかなりの数の人においてアレルギーを引き起こすことも知られている。
【００５３】
エレクトロポレーションのための針電極はいくつかの要件を満たさなければならない。その機械的特性は、それらを、過度の圧力を加える必要なく、皮膚を通過して容易に筋肉及び他の組織中に挿入することができるようなものでなければならない。針は、挿入される間に湾曲しないように十分に硬くなければならず(針アレイ中の針は互いに平行を維持しなければならない)、それらは硬い障害物(例えば、骨)と遭遇した場合、又は偶発的に曲げ力を受けた場合にも折れたり砕けたりしないように、脆いものであってはならない。針はまた、容易かつ経済的に製造することができるものでなければならない。さらに、針は十分に導電性であり生体適合性でなければならない。エレクトロポレーションの際に針から発生する任意の電解産物又は電解粒子は有意な局所又は全身毒性を生じてはならない。
【００５４】
本発明者らは、異なるめっき法を用いて金でコーティングした、卑金属としてタングステン又はステンレススチールのいずれかからなる種々の針を試験した。試験法には機械試験並びに電気化学試験を用いた。電気化学試験は、これまで未使用の針アレイをリン酸緩衝生理食塩水(USP等級)中に1 cmの深さまで浸し、6回の200V方形波パルスを2 Hzの周波数及び種々のミリ秒パルスの持続期間にて印加することにより実施した。電極の極性を各パルス後に逆転させた。パルス後、生理食塩水溶液をICPMSにより金(Au)、タングステン(W)、Fe、Ni及びCrについて分析した。試験した針のいくつかの分析結果を表3にまとめる。ステンレススチール製電極と比較して、ss/金 #3の針では、エレクトロポレーション後の溶液中のCr、Fe及びNiの減少を示した。金の濃度は897 ppbであり、これは無視できるレベルの毒性に当たる。W/金 #3型の針(金でコーティングしたタングステン針)は、無視できるレベルのCr、Fe及びNiを示した。タングステン及び金の濃度は毒性の観点からは取るに足らないものであった。これらの結果から、エレクトロポレーション治療におけるステンレススチール製針の使用と関連する毒性は、針電極に好適な機械的及び電気的特性を有し、容易かつ経済的に製造することができ、そしてエレクトロポレーション治療法に用いた場合に治療しようとする被験体に与える毒性が最小になる材料を選択することによって、顕著に低下させることができることが結論付けられるであろう。
【表３】
2005521496.tif 000004
【００５５】
実施例3
この試験の目的は、標的細胞にポリヌクレオチドを送達するために、in vivoエレクトロポレーションを模倣する条件下で試験した場合の、種々の金属組成からなる電極の生体適合性を評価することであった。生理食塩水の対照と共に、3つの異なる型の針を評価した。めっきしていない304ステンレススチール製針、金めっき304ステンレススチール製針、及び金めっきタングステン製針を、4本針アレイの形態で試験した。これらのアレイにおいては、4本の針を0.86 x 0.5 cmの長方形の四隅にある非導電性ハンドルに取り付けた。この4本の針を、2つの向かい合う針の対のそれぞれが同時にパルスされるように、パルス発生器に接続した。各対における＋電極と−電極との間の距離は0.86 cmであり、2つの対の間の距離は0.5 cmであった。各アレイの4本の針を、各々12 mlの生理食塩水中に2.8 cmの深さまで浸し、2 Hzの方形波パルスを用いて、各々200Vで60ミリ秒間、10回パルスした。パルスした後、6 mlの各サンプルを細胞毒性試験に用い、6 mlを化学分析に用いた。細胞毒性試験については、各6 mlのサンプルを、50％仔ウシ血清を含む2 mlの4× MEM(最少必須培地)と混合し、pHを、NaHCO3を用いて7.2に調整した(「試験溶液」)。6ウェルの細胞培養プレートにL929細胞を播き、5％ CO2/空気雰囲気下、10％仔ウシ血清を含む1× MEM中、37℃にて細胞を80〜90％の集密度まで増殖させた。培地をウェルから除去し、各試験溶液の各2 mlのサンプルを3つ、それぞれウェルごとに加えた。プレートを、生細胞を中性赤で染色した後、顕微鏡評価により48±3時間インキュベートした。3つのサンプルからなる各セットについてスコアを平均化し、それを記録した。細胞毒性アッセイの陰性及び陽性対照も実験した。表4は、結果をスコアリングするのに用いた基準を記載するものである。細胞毒性スコアを表5にまとめる。得られた結果に基づくと、めっきしていないステンレススチール製針は実質的な細胞毒性を示したが、金を塗布したステンレススチール製針及びタングステン製針は共に、検出可能な細胞毒性を示さなかった。
【表４】
2005521496.tif 000005
【００５６】
【表５】
2005521496.tif 000006
【国際調査報告】
2005521496.tif 000007