(57)【要約】    組成物は、外膜小胞（ＯＭＶ）のような異なる小胞の混合物から調製され、そしてワクチンはそれに基づく。他の組成物は、単一の小胞中に、別々の小胞に由来する抗原および／または他の小胞成分の組み合わせを含み、ワクチンもまた、それから調製される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つの異なるグラム陰性菌のソースから得られる外膜小胞（ＯＭＶ）を含む組成物であって、該ソースの少なくとも１つが非病原性種である、組成物。
【請求項２】
前記グラム陰性菌のソースの少なくとも１つが、Neisseria meningitidisである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記グラム陰性菌のソースの少なくとも１つが、共生ナイセリア属である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む、請求項１から３のいずれかの項に記載の組成物。
【請求項５】
グラム陰性菌の少なくとも３つの種から得られるＯＭＶを含む、請求項１から４のいずれかの項に記載の組成物。
【請求項６】
ＯＭＶを含む組成物であって、該ＯＭＶが、ナイセリア属の第１および少なくとも第２の異なる種から得られ、
１．該第１の種がナイセリア属の病原性種であり；そして
２．該第２の種がナイセリア属の共生種である、
組成物。
【請求項７】
薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記第１および少なくとも第２の種のいずれかまたは両方が、異種抗原も含む、請求項６または７に記載の組成物。
【請求項９】
共生ナイセリア属の少なくとも２つの種からの外膜タンパク質（ＯＭＰ）およびリポ多糖（ＬＰＳ）を含む、ＯＭＶ。
【請求項１０】
共生ナイセリア属の少なくとも２つの異なる株からのＯＭＰおよびＬＰＳを含む、ＯＭＶ。
【請求項１１】
請求項１から８のいずれかの項に記載の組成物の有効量を投与する工程を含む、グラム陰性菌感染に対して動物にワクチン接種する方法。
【請求項１２】
請求項１から８のいずれかの項に記載の組成物の有効量を投与する工程を含む、動物においてグラム陰性菌感染を治療する方法。
【請求項１３】
前記グラム陰性菌感染が、髄膜炎菌性髄膜炎または敗血症である、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記動物がヒトである、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記有効量が、非経口投与される、請求項１１から１４のいずれかの項に記載の方法。
【請求項１６】
前記有効量が、鼻内投与される、請求項１１から１４のいずれかの項に記載の方法。
【請求項１７】
ＯＭＶ組成物を調製する方法であって、
１．グラム陰性菌の第１の種からＯＭＶを得る工程であって、該第１の種が、ヒトに対して病原性または非病原性のいずれかである、工程；
２．該第１とは異なるグラム陰性菌の少なくとも第２の種からＯＭＶを得る工程であって、該第２の種が、ヒトに対して非病原性である、工程；および
３．（１）および（２）からの該ＯＭＶを組み合わせる工程、
を包含する、方法。
【請求項１８】
ワクチンを調製する方法であって、
１．グラム陰性菌の第１の種からＯＭＶを得る工程であって、該第１の種が、ヒトに対して病原性または非病原性のいずれかである、工程；
２．該第１とは異なるグラム陰性菌の少なくとも第２の種からＯＭＶを得る工程であって、該第２の種が、ヒトに対して非病原性である、工程；および
３．薬学的に受容可能なキャリアとともに（１）および（２）からの該ＯＭＶを組み合わせる工程、
を包含する、方法。
【請求項１９】
前記グラム陰性菌の第１の種が、N. meningitidisである、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記グラム陰性菌の第１および／または少なくとも第２の種が、共生ナイセリア属である、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記グラム陰性菌の第１および少なくとも第２の種のいずれかまたは両方が、異種ポリペプチドを含む、請求項１７から２０のいずれかの項に記載の方法。
【請求項２２】
１．第１の抗原性成分を含む、第１のソースから得られるリポソーム；および
２．第２の抗原性成分を含む、グラム陰性菌から得られるＯＭＶ、
を含む、組成物。
【請求項２３】
脂質小胞を含む組成物であって、
１．第１の抗原性成分を含むリポソームを合成する工程；
２．グラム陰性菌からＯＭＶを得る工程であって、該ＯＭＶが第２の抗原性成分を含む、工程；
３．該（１）のリポソームと該（２）のＯＭＶとを混合する工程；および
４．必要に応じて、該混合物をエネルギー的な組み合わせ工程に供する工程、
によって得られ得る、組成物。
【請求項２４】
前記第１および前記第２の抗原性成分の両方を含むハイブリッド脂質小胞を形成するために融合されるように、前記リポソームと前記ＯＭＶとを混合することによって得られ得る、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
請求項２２から２４のいずれかの項に記載の組成物および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項２６】
請求項２２から２４のいずれかの項に記載の組成物の有効量を投与する工程を含む、動物においてグラム陰性菌感染を治療または予防する方法。
【請求項２７】
組成物を調製する方法であって、
１．第１の小胞を含む第１の組成物を得る工程であって、該第１の小胞が、第１の抗原性成分を有する、工程；
２．第２の小胞を含む第２の組成物を得る工程であって、該第２の小胞が、グラム陰性菌からのＯＭＶであり、そして該第１の抗原性成分とは異なる第２の抗原性成分を有する、工程；および
３．該第１および第２の組成物を組み合わせて第３の小胞含有組成物を得る工程であって、該第３の小胞含有組成物が、該第１の抗原性成分および該第２の抗原性成分の両方を有する第３の小胞を含む、工程、
を包含する、方法。
【請求項２８】
前記第３の小胞の精製された調製物を得るために、前記第３の小胞含有組成物から前記第３の小胞を分離する工程を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記第１の小胞が、リポソームまたはＯＭＶである、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＯＭＶが、ナイセリア属由来である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
組成物を調製する方法であって、
１．第１の小胞を含む第１の組成物を得る工程であって、該小胞が、グラム陰性菌からのＯＭＶであり、そして抗原性成分を有する、工程；
２．第２の小胞を含む第２の組成物を得る工程であって、該第２の小胞が、該小胞の水性コア内に可溶性の生物学的に活性な成分を含む、工程；および
３．該第１および第２の組成物を組み合わせて第３の小胞含有組成物を得る工程であって、該第３の小胞含有組成物が、該抗原性成分の両方を含みそして水性コア内に可溶性の生物学的に活性な成分も含む第３の小胞を含む、工程、
を包含する、方法。
【請求項３２】
前記第３の小胞の精製された調製物を得るために、前記第３の小胞含有組成物から前記第３の小胞を分離する工程を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記第１の小胞が、ナイセリア属由来である、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記第２の小胞が、リポソームである、請求項３１から３３のいずれかの項に記載の方法。
【請求項３５】
請求項２７から３４のいずれかの項に記載の方法に従って得られ得る、組成物。
【請求項３６】
請求項３５に記載の組成物および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項３７】
請求項３５に記載の組成物の有効量を投与する工程を含む、動物においてグラム陰性菌感染を治療または予防する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グラム陰性菌から得られ得るリポソームおよび外膜小胞（ＯＭＶ）のような小胞を含む組成物、このような組成物の製造方法、およびそれに基づくワクチンの分野に関する。特に、本発明は、ナイセリア属の種から得られるＯＭＶを含むワクチンおよび薬学的組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
非常に多くのヒトおよび動物の病原体は、グラム陰性に分類される細菌に入り、ナイセリア属、モラクセラ属、キンゲラ属、アシネトバクター属、ブルセラ属、ボルデテラ属、ヘモフィルス属、エシェリキア属、クラミジア属、レジオネラ属、シュードモナス属、プロテウス属、およびエルシニア属のメンバーが挙げられる。Neisseria meningitidis（髄膜炎菌）は、髄膜炎菌性髄膜炎を引き起こしそして世界中の健康問題として特に重要な生物である。多くの国々では、この疾患の発症率が増加している。N. meningitidisはまた、髄膜炎菌性敗血症の原因であり、これは、急速な発症および高い死亡率に関連し、約２２％の症例が死亡している。他のグラム陰性菌は、髄膜炎（H. influenzae）、ペスト（Y. pestis）、胃腸炎（E. coli）、性病（N. gonorrhoeae）、および院内感染（P. aeruginosa）を含むある範囲のヒトの感染症の原因である。
【０００３】
グラム陰性菌感染、および特にグラム陰性病原体による感染に対して、動物、特にヒトにおいて防御免疫を提供する別の広いスペクトルのワクチンを提供することが所望される。
【０００４】
多くの公知のワクチンは莢膜多糖の調製物に基づいているが、これらのワクチンは、しばしば、その防御価に限界がある。例えば、髄膜炎菌性疾患に対する防御免疫を提供するためのワクチンは、防御は株特異的な傾向にあるので、制限された防御のみを提供しているが、N. meningitidisには多くの異なる株がある。血清群抗原、莢膜多糖に基づくワクチンは、感染に対して短寿命の防御のみを提供し、そして北米およびヨーロッパで通常見られる多くの株に対して防御しない。実際、Ｂ群髄膜炎菌莢膜からの多糖のようなある種の莢膜多糖は、本質的には、ヒトにおいて非免疫原性である。
【０００５】
多くのグラム陰性菌の外膜は、非常に動的であり、そして発芽を休止しそして周囲環境中に放出される小胞を生成し得る。これらの外膜小胞（ＯＭＶ）は、細胞表面突起ともいい、これは生物の抗原性プロファイルに寄与する多くの外膜タンパク質（ＯＭＰ）およびリポ多糖（ＬＰＳ）を含む。
【０００６】
これまでの莢膜多糖ベースのワクチンで見られる不利点を克服し得ることを期待して、ＯＭＶベースのワクチンを生成するために多くの試みが行われてきた。Bjuneら（Lancet (1991) 338: 1093-1096頁）には、Ｂ群N. meningitidisからのＯＭＶからなるワクチンが記載されている（ノルウェーワクチン）。Bjuneらは、このワクチンがノルウェーでの臨床試験において５７．２％の髄膜炎菌性疾患に対して防御効力を誘導し得たことを示す。同様のワクチンが、キューバにおいて製造されており（Sierraら、NIPH Ann (1991) 12月; 14(2): 195-207頁）、そして高いレベルの効力がこの国で観察された。しかし、ブラジルにおける多くの研究では、特に小児において、キューバのワクチンよりも弱い効力しか示さなかった（de Moraesら、Lancet (1992) 10月31日; 340(8827): 1074-1078頁）。
【０００７】
広いスペクトルの防御を達成することに関する困難性に対するために、研究者らは、ＯＭＶの免疫原性の可能性を増強し得る特定の抗原を有するＯＭＶを「富化」することを試みている。WO-A-00/25811では、N. meningitidisから単離されたＯＭＶは異種抗原（例えば、Ｔｂｐ）と組み合わされ、または遺伝学的に改変されたN. meningitidisはこのような組換え抗原を組換え発現し、そして抗原が富化されたＯＭＶはそれに由来する。同様のアプローチが、WO-A-01/09350において研究者らによって採用され、これは、N. meningitidis、M. catarrhalis、およびH. influenzae由来のＯＭＶを含むワクチン組成物を記載しており、ある実施態様では、これらの生物は、特定の免疫原性部分を過剰発現するように遺伝学的に改変されている。
【０００８】
さらなるＯＭＶベースのワクチン組成物は、HexamenTMまたはオランダワクチンとして公知である（Cartwrightら、Vaccine 17 (1999), 2612-2619頁）。HexamenTMワクチン組成物は、N. meningitidisの２つのワクチン株であるPL16215およびPL10124を用いて組換え産生される６つの異なるＰｏｒＡタンパク質を含むN. meningitidis ＯＭＶを含む。各株は、莢膜ネガティブであり、そして３つの異なるＰｏｒＡタンパク質であるCPS-P1.7,16;P1.5,2;P1.19,15およびCPS-P1.5C,10;P1.12,13;P1.7h,4をそれぞれ産生する。
【０００９】
Ruppe Van der Voortら（Vaccine (2000) 18(14); 1334-1343頁）は、hexamenワクチンが、ワクチン中に含まれる６つのすべてのＰｏｒＡ血清亜型に対する特異的血清殺菌抗体を誘導することを示している。しかし、HexamenTMワクチンは、いくつかの欠点がある。現在では、宿主毒性の問題のため、単一のN. meningitidis細胞において６つのすべてのＰｏｒＡタンパク質を発現することはできない。したがって、３つのＰｏｒＡが１つの細胞で発現され、３つは他の細胞で発現される。３つのＰｏｒＡを発現しているそれぞれの細胞培養物からのＯＭＶを得、次いで混合して６価ワクチンを得る。
【００１０】
ＰｏｒＡは、免疫優性抗原であり、これは、ＯＭＶ表面上に提示されるほとんどの他の抗原をマスクすることを意味し、すなわち、HexamenTMワクチンは、防御抗原としてＰｏｒＡに対して非常に偏っている。これは、次に、HexamenTMワクチンのＰｏｒＡとは抗原的に異なるＰｏｒＡを発現するN. meningitidisの株に対して集団における選択圧になる。したがって、HexamenTMワクチンによって防御されないN. meningitidisの株がやがて優勢になる危険性があり、その結果、ヒト集団において現在疾患に感染しそして疾患を引き起こしている株に対して防御するために、ワクチンを連続的に改変する努力が進行している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
多くの細菌種および単一の細菌属内の少なくとも広い範囲の株からの感染に対する広いスペクトルの防御を提供するＯＭＶワクチン組成物を提供することが所望される。ある範囲のグラム陰性菌の株、および特にN. meningitidisによって引き起こされる疾患に対する広いスペクトルの長期の防御を提供するＯＭＶベースのワクチンを生成することが、特に所望される。
【００１２】
小胞含有組成物を調製するさらなるおよび／または改良された方法を提供することがさらに所望される。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
したがって、本発明は、N. meningitidisのようなグラム陰性菌病原体からの感染に対して広い範囲の防御を提供し得る、小胞、特にＯＭＶを含む組成物、およびそれに基づくワクチン組成物ならびにその製造方法を提供する。
【００１４】
本発明の組成物およびワクチンの利点は、ＯＭＶが多様なグラム陰性菌ソースに由来し、そのため組成物が宿主免疫系に広いスペクトルの抗原を提示することが可能であり、それによって広いスペクトルの防御免疫を生じることである。
【００１５】
本発明はまた、小胞、特にＯＭＶを組み合わせる方法、それによって得られる小胞、およびそれに基づくワクチン組成物を提供する。組み合わせることの利点としては、得られる小胞における小胞内容物の制御および／または抗原の組み合わせの容易化が挙げられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の理解を容易にするために、本明細書で使用される多くの用語を以下でより詳細に定義する。
【００１７】
グラム陰性菌は、通常の公知のグラム染色方法において脱色に耐えることができない細菌である。グラム陰性菌は、複雑な多層の細胞壁によって特徴づけられ、そしてしばしば、外層多糖莢膜を有する（例えば、N. meningitidis）が、いくつかの種ではこの莢膜がない（例えば、N. lactamica）。
【００１８】
本明細書で使用される場合、用語「病原性」とは、特に動物においておよび特にヒトにおいて疾患を引き起こし得る生物をいう。
【００１９】
用語「非病原性」とは、動物において、特にヒトにおいて疾患を引き起こさない生物をいう。この用語は共生生物を包含する。共生生物は、疾患の徴候なく宿主生物でコロニー形成し得る生物である。共生生物の例としては、N. lactamica、N. sicca、N. cinerea、N. perflava、N. subflava、N. elongata、N. flavescens、およびN. polysacchareaなどの共生ナイセリア属の種が挙げられる。
【００２０】
外膜小胞（ＯＭＶ）は、細胞表面突起ともいい、グラム陰性菌の外膜の断片から形成されるかまたはこれに由来する小胞である。ＯＭＶは、代表的には、外膜タンパク質（ＯＭＰ）、脂質、リン脂質、ペリプラズム材料、およびリポ多糖（ＬＰＳ）を含む。グラム陰性菌、特にN. meningitidisのような病原菌は、しばしば、突起形成として公知のプロセスにおけるビルレント感染中にＯＭＶが脱落する。ＯＭＶはまた、以下の実施例で詳述する多くの化学変性プロセスによってグラム陰性菌から得られ得る。脂質二重層を含み代表的には水性のコアを包んでいるリポソームは、本発明の目的においてはＯＭＶと等価な合成物を構成すると見なされ得、そしてＯＭＶについて記載する本発明の実施態様は、リポソームを用いて行いそしてリポソームに関する実施態様に準じて適用する。リポソームとＯＭＶとの違いは、例えば、リポソームの内容物の制御は可能であるがＯＭＶ内容物はあまり容易には制御可能ではないという実施態様で見られ得る。
【００２１】
本明細書で使用される場合、用語「ワクチン」は、生物、代表的には病原性生物による感染に対して動物に接種して動物を免疫するために用いられる薬学的または治療的組成物として定義される。ワクチンは、代表的には、１以上の生物に由来する１以上の抗原を含み、これは、動物に投与する際に、活性な免疫を刺激しそしてこれらのまたは関連の病原性生物による感染に対してその動物を防御する。
【００２２】
医薬品として処方されるワクチン組成物は、代表的には、キャリアを含む。溶液または液体エアロゾル懸濁液で処方されるならば、適切なキャリアとしては、生理食塩溶液、スクロース溶液、または他の薬学的に受容可能な緩衝溶液が挙げられ得る。エアロゾル処方物は、代表的には、さらに界面活性剤を含む。代わりのワクチン組成物としては、マイクロカプセル化したＯＭＶ組成物が挙げられる。このようなマイクロカプセルは、一般的に、例えば、ポリラクチド−コ−グリコリド（ＰＬＧ）から製造される、生体適合性ポリマーのシェルまたはコアを含む。ワクチン組成物は、例えば、投与が非経口経路による場合、さらにアジュバントを含み得る。適切なアジュバントとしては、水酸化アルミニウムが挙げられる。
【００２３】
ワクチンは、適切には、多くの経路によって動物に投与される。例えば、非経口的には、例えば、筋肉内、経皮、または他の経路では、例えば、鼻内、経口、局所、または任意の他の通常公知の投与経路である。
【００２４】
ある種のタンパク質は、グラム陰性菌において組換え発現され得、それによって細菌の外膜の抗原性プロファイルの富化または変更を可能にする。細菌ソース生物の遺伝学的改変は、それによって、これらの生物から得られるＯＭＶの抗原性プロファイルの操作を可能にする。正常には細菌外膜に存在せずしたがってそれに由来するＯＭＶに存在しないタンパク質が、組換え発現技法によって導入される場合、これらの「非天然」タンパク質およびポリペプチドは、異種抗原と記載される。WO-A-00/25811およびWO-A-01/09350の内容は本明細書に援用される。したがって、本発明の利点は、ワクチンが、感染または毒性のより大きな危険性を有し得る生きた弱毒化したまたは死んだ病原性生物よりもむしろＯＭＶを含むことである。
【００２５】
本発明の第１の局面は、異なる小胞調製物を混合する。これは、第１のＯＭＶ調製物の免疫原性を変更するためにまたはそれぞれの調製物中の有用な特性を混合するために行われ得る。
【００２６】
本発明は、それによって、２以上のソースに由来する小胞を含む組成物を提供する。小胞は、好ましくは、水性コアを取り囲む脂質二重層を含む脂質小胞である。代表的には、脂質小胞は、単ラメラ構造であるが（すなわち、単一脂質二重層が水性コアを取り囲む）、多ラメラ脂質小胞も、本発明の組成物に適切に使用される。
【００２７】
これらの脂質小胞は、好ましくは、リポソームのような合成小胞であるか、または天然に存在するＯＭＶ（Ｎ−ＯＭＶ）の抽出によってまたはデタージェント抽出（Ｄ−ＯＭＶ）を用いて細菌、例えば、外膜小胞（ＯＭＶ）から得られる。これらは、代表的には、ナノモルからマイクロモルの範囲で、例えば、１ｎｍから１００μｍ、より代表的には１０ｎｍから１０μｍ、および好ましくは３０ｎｍから１μｍのサイズを有する。抗原性成分は、脂質小胞の３つの主要なコンパートメントのいずれかまたはすべてに位置し得る：これらは、すなわち、
１．例えば、膜アンカードメインまたは脂質部分への付着によって、脂質小胞の内表面または外表面のいずれかに付着される；
２．例えば、抗原性成分が、それ自体が疎水性または脂質ベースの実体である場合、脂質二重層に挿入される；または
３．脂質小胞の水性中心／コア内に位置する。
【００２８】
リポソームが本発明の組成物および方法に利用される場合、これらは、代表的には、多くの異なる脂質および脂肪酸を含み得る。本発明のリポソーム中に含むために適切な脂質としては、ホスファチジルイノシトール-(4,5)-ジホスフェート、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、コレステロール、β-オレオリル-γ-パルミトイル、ある種のリポ多糖およびガラクトセブロシドが挙げられるが、これらに限定されない。リポソームは、多くのソースから市販で得られ得、そして本発明での使用に適切なリポソームを調製する方法は、当該技術分野で公知である。
【００２９】
本発明に使用するための脂質小胞は、好ましい抗原性成分を富化および／または追加され得る。それらがリポソームまたはＯＭＶであるかどうかにかかわらず、脂質小胞を追加するための方法としては、エネルギー的な組み合わせ工程が、必要に応じて、３つの上記の脂質小胞コンパートメントの１以上への抗原性成分の組込みを容易にするために適用され得る場合、インビトロでの直接組み合わせによるものが挙げられる。好ましいエネルギー的組み合わせ方法としては、ホモジネーション、超音波処理、押出し（エクストルーション）、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
【００３０】
リポソームに関する１つの利点は、脂質小胞の正確な抗原性組成物が制御され、そしてバッチ毎の品質制御が生物学的ソースに由来する脂質小胞よりも容易に維持され得ることである。さらに、リポソームの物理的特性、例えばサイズは、二重層の脂質組成を改変することによって、より容易に制御される。
【００３１】
しかし、ある種の抗原性成分は、インビトロで合成すること、または生物学的ソースから純品を単離することが困難である。さらに、ある種の抗原性成分は、合成リポソーム中に抗原的に活性な形態で組み込むことが困難である。したがって、このような場合、ＯＭＶは、好ましい脂質小胞である。ＯＭＶを使用することのさらなる利点は、抗原性成分が、ＯＭＶが得られそれによって脂質小胞中に好ましい抗原性成分を組込むための好都合な方法を提供する宿主生物中で合成され得ることである。
【００３２】
特定の成分が本発明の脂質小胞中で所望されない状況では、例えば、エンドトキシンでは、リポソームまたはＯＭＶを用いる場合、異なる選択肢が適用される。リポソームの組成は合成的に制御されるので、所望されない成分がリポソームに簡単には付加されないことは明らかである。これは、リポソームの使用に関するさらなる利点を示す。ＯＭＶが脂質小胞として好ましい場合、ＯＭＶは、所望されない成分が天然には含まれないまたは低い生物、例えば、共生生物から得られ得る。あるいは、所望されない成分をコードまたはその産生を調節する遺伝子が欠失または沈黙しているようなノックアウト生物が、生成され得る。
【００３３】
本発明で使用するための脂質小胞はまた、水性中心／コア内に、抗原以外の生物学的に活性な成分を含み得る。この成分は、可溶性アジュバント、サイトカイン、免疫調節剤、医薬品、賦形剤、タンパク質、ポリペプチド、および薬理学的または薬学的に活性な薬剤から適切に選択される。
【００３４】
本発明はまた、グラム陰性菌の少なくとも２つの異なる種から得られたＯＭＶを含む組成物を提供し、この種の少なくとも１つは非病原性種である。一般的に、すべてのこのような細菌は、適切であると考えられるが、本発明での使用に特に適切なグラム陰性種としては、ナイセリア属、モラクセラ属、キンゲラ属、アシネトバクター属、ブルセラ属、ボルデテラ属、ポルフィロモナス属、アクチノバシラス属、ボレリア属、セラチア属、カンピロバクター属、ヘリコバクター属、ヘモフィルス属、エシェリキア属、レジオネラ属、サルモネラ属、シュードモナス属、およびエルシニア属から選択される種が挙げられる。本発明の特定の実施態様では、組成物は、N. meningitidisの株から選択される病原性種を含む。
【００３５】
非病原性種は、適切には、任意の非病原性グラム陰性種であり得る。以下でより詳細に記載される本発明の特定の実施態様では、組成物は、共生ナイセリア属から得られるＯＭＶを含む。
【００３６】
本発明の組成物は、２つのソースのみからのＯＭＶを含むことに限定する必要はない。本発明はまた、３つくらいの少ないソースから数１０以上までの、複数のグラム陰性菌ソースからのＯＭＶを含む組成物を提供する。これは、構築されるべきＯＭＶの多様性のライブラリーに適しており、そのため、ＯＭＶのある組み合わせは、正確な必要性に従って、特定の所定のスペクトルのワクチン接種の有効範囲を提供するように、組成物中に処方され得る。例えば、病原体のある株が特定の地理的領域に流行する場合、この病原体に特異的なＯＭＶは、改良された局所効力を提供するために広いスペクトルのワクチン組成物中に組み込まれる。
【００３７】
単一のワクチン組成物中に複数のＯＭＶを組み合わせることは、広いスペクトルの免疫を与えることが可能な組成物を提供し、そしてＰｏｒＡのような免疫優性抗原の「希釈」を可能にし、これは他に、組成物中に存在する他の抗原をマスクする。
【００３８】
本発明の他の組成物は、ＯＭＶを含み、このＯＭＶは、ナイセリア属の第１のおよび少なくとも第２の異なる種から得られ得：
１．第１の種は、ナイセリア属の病原性種であり；そして
２．少なくとも第２の種は、ナイセリア属の共生種である。
【００３９】
本発明の特定の実施態様では、この組成物は、ナイセリア属の第１のおよび少なくとも第２の異なる種から得られるＯＭＶを含み：
１．第１の種は、N. meningitidisおよびN. gonorrhoeaeを含む群から選択され；そして
２．少なくとも第２の種は、N. lactamica、N. sicca、N. cinerea、N. perflava、N. subflava、N. elongata、N. flavescens、およびN. polysacchareaを含む群から選択される。
【００４０】
本発明のさらに特定の実施態様では、組成物中のいくつかまたはすべてのＯＭＶはまた、異種抗原を含む。適切な異種抗原としては、細胞膜関連タンパク質、またはペリプラズムタンパク質が挙げられ、例えば、ＰｏｒＡ；Ｃｕ−Ｚｎ−ＳＯＤ；ＴｓｐＡ、ＬｂｐＡ、ＬｂｐＢ、ｐｉｌＱ、ＴｂｐＡ；ＴｂｐＢおよび／またはＮｓｐＡである。これらはまた、非ナイセリア由来であり得、例えば、B. pertussis毒素、ジフテリア毒素、破傷風毒素、麻疹抗原、ＨＩＶ抗原、天然痘抗原、および／または炭疽抗原である。本発明のＯＭＶが、宿主免疫系に抗原の好都合な提示を提供し、それによって広いスペクトルの長期の防御免疫が可能になることに留意すべきである。
【００４１】
本発明の第３の組成物は、ＯＭＶを含む組成物であり、このＯＭＶは、第１のナイセリア属ソースおよび第１とは異なる少なくとも第２のナイセリア属ソースから得られる。用語「ソース」は、ＯＭＶが得られるかまたは単離されるナイセリア属の属および／または株をいうために使用される。したがって、ＯＭＶがN. meningitidis K454株から抽出される場合、これは、ＯＭＶのナイセリア属ソースである。
【００４２】
本発明の１つの実施態様では、第１のナイセリア属ソースは、共生ナイセリア属であり、そしてこの少なくとも第２のナイセリア属ソースは、病原性ナイセリア属である。あるいは、第１のナイセリア属ソースは、共生ナイセリア属であり、そしてこの少なくとも第２のナイセリア属ソースも、共生ナイセリア属であるが第１とは異なる種または株である。例えば、第１のソースは、適切には、N. lactamicaであり、そして第２のソースは、N. cinereaである。第２の例では、第１のソースは、N. lactamica Y921009株であり、そして第２のソースは、N. lactamica 2086株である。さらなる選択肢は、同じ株の異なる遺伝学的変異体を利用することである。
【００４３】
既述のように、本発明はまた、１以上の異種抗原を組換え発現するように遺伝学的に改変されるナイセリア属ソースに由来するＯＭＶ組成物を利用する。これは、所望の抗原性ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターで細胞を形質転換することによって達成され得る。あるいは、内因性ポリペプチドは、細胞の表面上またはペリプラズム内のいずれかに発現されるようにいくつかの方法でアップレギュレートまたは改変され、それによって細胞から抽出されるＯＭＶに組み込まれ得る。このようなタンパク質は、細胞に内因性であるが、ＯＭＶの異常なレベルでの存在は、さらに、用語「異種抗原」の範囲内に入ると考えられ得る。
【００４４】
本発明の特定の実施態様では、第１のナイセリア属ソースは、第１の異種抗原を発現する共生ナイセリア属であり、そして第２のナイセリア属ソースは、第１の抗原とは異なる第２の異種抗原を発現するナイセリア属である。本発明のさらなる実施態様では、第１のナイセリア属ソースは、第１の異種抗原を発現する共生ナイセリア属であり、そして少なくとも第２のナイセリア属ソースは、第１の抗原とは異なる第２の異種抗原を発現する同じまたは類似の株の共生ナイセリア属である。各ソースは、さらに必要に応じて、多数の異種抗原を発現し得る。
【００４５】
本発明の第４の組成物は、ナイセリア属のようなグラム陰性菌の少なくとも２つの異なる種に由来する外膜タンパク質（ＯＭＰ）および／またはリポ多糖（ＬＰＳ）を含むＯＭＶを含む。本発明の特定の実施態様では、ＯＭＶは、適切には、共生ナイセリア属および病原性ナイセリア属を含む２つの種のナイセリア属に、共生ナイセリア属の少なくとも２つの種に、あるいは同じ共生種の２つの異なる株に由来する。ＯＭＶは、必要に応じて、さらに１以上の組換え発現したポリペプチドを含み得る。
【００４６】
共生体に由来するＯＭＶが、代表的には、病原性種の外膜で見られるＬＰＳよりも低い毒性のＬＰＳを有することが、本発明の１つの利点である。したがって、共生ＯＭＶを含むワクチン組成物は、代表的には、病原性ＯＭＶを含む組成物よりも、有害反応を誘起することがより少ない。
【００４７】
しかし、ＯＭＶのＬＰＳ内容物はまた、特に鼻内投与される組成物において免疫応答をそれ自体が増強するアジュバント効果を提供する。適切には、潜在的なＬＰＳ毒性が極端なアレルギー性反応を引き起こすようである場合、グラム陰性菌のＬＰＳ零変異体またはＬＰＳが改変された種からＯＭＶを由来させることがさらなる選択肢である。
【００４８】
本発明のＯＭＶは、適切には、グラム陰性菌の異なる種または株のようなソースから混合され得る。あるいは、ＯＭＶは、必要に応じて、同じ共生株由来であるが各ソースが異なる異種抗原を発現するソースから得られ得る。同じ株のソースからの異なるＯＭＶのさらなる例は、ＯＭＶが生物の増殖サイクル中の異なる期のグラム陰性菌ソースから得られる場合である。ＯＭＶは、次いで、その増殖サイクル全体を通して生物の表面抗原性プロファイルを示す単一の組成物に組み合わされる。
【００４９】
本発明の第２の局面は、１つの小胞または１つのタイプの小胞の成分を他の小胞に移すように異なる小胞調製物を組み合わせる。例えば、リポソームがリポソームと、リポソームがＯＭＶと、およびＯＭＶがＯＭＶと組み合わされる。
【００５０】
したがって、本発明は、組成物を調製する方法を提供し、この方法は、
１．第１の小胞を含む第１の組成物を得る工程であって、該第１の小胞が第１の抗原性成分を有する、工程；
２．第２の小胞を含む第２の組成物を得る工程であって、該第２の小胞が第１の抗原性成分とは異なる第２の抗原性成分を有する、工程；および
３．第３の小胞含有組成物を得るように該第１および第２の組成物を組み合わせる工程であって、該第３の小胞含有組成物が、第１の抗原性成分および第２の抗原性成分の両方を有する第３の小胞を含む、工程、を包含する。
【００５１】
脂質小胞を調製するための第２の局面のさらなる方法は、
ａ．第１の抗原性成分を含むリポソームを合成する工程；
ｂ．生物からＯＭＶを得る工程であって、該ＯＭＶが第２の抗原性成分を含む、工程；および
ｃ．該第１および第２の抗原性成分の両方を含む小胞を形成するように、（ａ）のリポソームを（ｂ）のＯＭＶと混合する工程、を包含する。
【００５２】
ＯＭＶ含有組成物を調製するための第２の局面のなおさらなる方法は、
１．グラム陰性菌の第１の種からＯＭＶを単離する工程であって、該第１の種がヒトに対して病原性または非病原性のいずれかである、工程；
２．該第１とは異なるグラム陰性菌の少なくとも第２の種からＯＭＶを単離する工程であって、該第２の種がヒトに対して非病原性である、工程；
３．（１）および（２）からのＯＭＶを組み合わせて、工程１からのＯＭＶの少なくとも一部および工程２からのＯＭＶの少なくとも一部を含むハイブリッドＯＭＶを形成する工程、を包含する。
【００５３】
本発明の第２の局面は、上記方法を用いて得られ得るおよび得られる組成物、すべてそれに基づく、薬学的組成物、本明細書に記載されるような医療処置の方法、および本明細書に記載されるような使用にも広がる。
【００５４】
本発明のこの局面の方法の使用では、異なる小胞を含む２つの別々の組成物を組み合わせることは、それぞれの組成物間に抗原の移動を生じるように行われ、その結果、第１および第２の元の両方の小胞に由来する抗原性成分を含む第３のタイプの小胞が生成する。この組み合わせの利点は、結果として第１および第２の両方の抗原性成分を含む小胞が提供され、そしてこれがこのような両方の抗原性成分を含む小胞の均一調製物を提供するように精製され得ることである。
【００５５】
両方の抗原性成分を有する小胞を提供するこの手段は、例えば、両方の抗原性成分を発現するために細菌のトランスフェクションを行うことよりも容易であり得る。さらに、理解され得るように、抗原の多くの異なる組み合わせの均一調製物は、目的の個々の抗原性成分を含む個々の小胞を含む開始材料から調製され得る。異なる抗原は、同じ細菌宿主において異なるレベルで発現され得る。各それぞれの小胞の開始量／濃度の制御によって、それぞれの抗原と小胞との組み合わせの上記の方法を用いて、最終的に得られる組み合わせた小胞中の抗原の相対量／濃度が制御され得る。
【００５６】
第３の小胞の精製された調製物を得るために、第３の小胞含有組成物から第３の小胞を分離することが好ましい。これは、二重免疫方法を用いて行われ得る。したがって、第１の精製は、第１の抗原に特異的な（例えば、固定化された）抗体を用いて行われ；次いで、第２の精製は、第２の抗原に特異的な抗体を用いて行われ、これは両方の抗原を含む小胞に対して組成物を精製する。
【００５７】
ＯＭＶおよびリポソームの両方、およびそれらの組み合わせは、第２の局面の方法に適切であり、ＯＭＶは、好ましくは、既述のグラム陰性菌由来であるが特にナイセリア属に由来する。
【００５８】
本発明の第２の局面の発展において、抗原以外の（またはそれに加えて）成分を含むリポソームは、抗原含有小胞と組み合わされ得る。
【００５９】
したがって、組成物を調製するこのような１つの方法は、
１．第１の小胞を含む第１の組成物を得る工程であって、該小胞が、抗原性成分を有する、工程；
２．第２の小胞を含む第２の組成物を得る工程であって、該第２の小胞が、該小胞の水性コア内に可溶性の生物学的に活性な成分を含む、工程；および
３．該第１および第２の組成物を組み合わせて第３の小胞含有組成物を得る工程であって、該第３の小胞含有組成物が、両方の抗原性成分を含みそして水性コア内に可溶性の生物学的に活性な成分も含む第３の小胞を含む、工程、を包含する。
【００６０】
これらの得られた小胞は、使用者の制御で、１つのソースからの抗原と他のリポソーム成分とを組み合わせて、その結果、ワクチン接種用の小胞の調製のためのさらなる方法および他の使用を提供するという利点を与える。
【００６１】
本発明の好ましい組成物において、１以上の抗原性成分を含むリポソームは、単一の組成物中でＯＭＶと組み合わされる。改変されたエネルギー的な組み合わせ工程が採用される融合事象の後、結果としてハイブリッドまたはキメラ脂質小胞が形成される。
【００６２】
本発明のさらに好ましい組成物において、１以上の抗原性成分を含むリポソームは、単一の組成物中でＯＭＶと組み合わされ、そのためＯＭＶからの抗原は交換されるかまたはリポソームに移され、そしてその逆である。抗原交換工程の後、リポソームおよびＯＭＶは、（例えば、遠心分離によって）分離され、そして本明細書にさらに記載されるようなワクチン組成物としての本来の適用のための異なる組成物を形成し得る。
【００６３】
本発明のさらなる局面は、該組成物中の各ＯＭＶがナイセリア属の少なくとも２つの異なる種からのＯＭＰおよびＬＰＳを含むことで特徴づけられる、ＯＭＶ組成物を提供する。必要に応じて、ナイセリア属の少なくとも１つの種は、共生ナイセリア属である。さらに必要に応じて、１つの種は、ナイセリア属の病原性の種、例えば、N. meningitidisまたはN. gonorrhoeaeである。
【００６４】
本発明のさらなる例では、ＯＭＶ組成物を調製する方法が提供され、以下の工程：
１．グラム陰性菌の第１の種からＯＭＶを得る工程であって、該第１の種が、ヒトに対して病原性または非病原性のいずれかである、工程；
２．第１とは異なるグラム陰性菌の少なくとも第２の種からＯＭＶを得る工程であって、該第２の種が、ヒトに対して非病原性である、工程；および
３．（１）および（２）からのＯＭＶを組み合わせる工程、を包含する。
【００６５】
ワクチン組成物を調製する方法も提供され、この方法は、以下の工程：
３．薬学的に受容可能なキャリアとともに（１）および（２）からのＯＭＶを組み合わせる工程、を含むこと以外は、上記の方法と実質的に同一である。
【００６６】
細菌ソースからＯＭＶを抽出するために適切な方法としては、デオキシコール酸抽出、Tris/HCl/EDTA抽出、および酢酸リチウム抽出が挙げられる。このような抽出を行うためのプロトコルは、以下の実施例により詳細に記載される。しかし、精製および単離のために十分なＯＭＶを放出させるために細菌の細胞外膜の破壊を可能にする任意の化学的および／または物理的技法が、実際に、本発明の組成物の調製に適切であることは、当業者に理解される。
【００６７】
本発明の特定の実施態様では、組み合わせたＯＭＶは、低出力ホモジナイザー（例えば、WaringブレンダーまたはSilversonホモジナイザー、あるいは超音波処理によって）中でホモジナイズされる。この追加の工程は、混合物中のＯＭＶを破壊する効果を有し、そのため、これらは融合してハイブリッドＯＭＶを形成する。このようにして、単一のＯＭＶは、複数の細菌ソースからのＯＭＰ、ＬＰＳ、および異種抗原を含み得る。融合したキメラＯＭＶは、好都合には、独特の免疫利用可能形態で宿主免疫系に多数の抗原を提示することを可能にする。
【００６８】
本発明のさらなる局面は、本発明の組成物を利用して、グラム陰性菌感染に対して、動物、特にヒトに、ワクチン接種する方法を提供する。特に、本発明は、髄膜炎菌感染に対して動物にワクチン接種する方法を提供する。グラム陰性菌感染に対するヒトを含む動物のワクチン接種における、本発明の組成物の使用も提供される。グラム陰性菌感染に対する防御免疫を刺激するために動物に接種するためのワクチンの製造における、本発明の組成物の使用が、さらに提供される。ＬＰＳ毒性が低くそしてＬＰＳがアジュバントとして機能し得るので、ＯＭＶは、経粘膜投与される組成物に使用される。
【００６９】
本発明を、ここで、添付の図面を参照して特定の実施例で説明する。
【実施例】
【００７０】
実施例１
ＯＭＶを生成するためのデオキシコール酸抽出
この方法は、非経口送達用のthe Norwegian Institute of Public Health ＯＭＶワクチンを生成するために使用された方法に基づく（Fredriksen, JHら (1991) Production and characterisation of menB-vaccine "Folkehelsa": an outer membrane vesicle vaccine against groupB meningococcal disease. NIPH Annals 14 (2): 67B 80）。
【００７１】
試薬：
Frantz培地
緩衝液１：10mM EDTA、0.5％(w/v)デオキシコール酸（ＤＯＣ）、0.01％(w/v)チオメルサールを含む0.1Ｍ Tris-HCl pH 8.6。
緩衝液２：２mM EDTA、1.2％(w/v)ＤＯＣ、20％(w/v)スクロース、0.01％(w/v)チオメルサールを含む50mM Tris-HCl pH 8.6。
緩衝液３：３％(w/v)スクロース、0.01％(w/v)チオメルサールを含む50mM Tris-HCl pH 8.6。
【００７２】
方法
１．適切なN. meningitidisまたは共生ナイセリア属の株を、培養物が初期定常期に達するまで、37℃にて振盪しながらFrantz培地中で増殖させた。
２．一旦培養物が初期定常期に達すると、培養物を４〜８℃にて一晩保存した。
３．培養物を、４℃にて、5000×ｇで15分間の遠心分離によって採取した。
４．ペレットに、緩衝液１を、緩衝液対バイオマスが５：１(v/w)の比を用いて加えた。
５．懸濁液を、４℃にて20,000×ｇで30分間遠心分離し、そして上清を保持した。
６．工程４で用いた量の３分の１に減じた容量の0.1Ｍ Tris緩衝液で、抽出を繰り返した。再度、上清を保持した。
７．工程５および６からの上清をプールし、そして４℃にて100,000×ｇで２時間超遠心分離した。
８．得られたＯＭＶペレットを、緩衝液２に再懸濁した。
９．超遠心分離を、工程７のように繰り返した。
10．次いで、ＯＭＶを緩衝液３中でホモジナイズした。
11．ＯＭＶ調製物を４〜８℃にて保存した。
【００７３】
実施例２
ＮＯＭＶ（天然ＯＭＶ）を生成するためのTris-HCl/EDTA抽出
この方法は、N.B. Saundersらによって用いられた方法に基づく（Immunogenicity of intranasally Administered Meningococcal Native Outer Membrane Vesicles in Mice. Infection and Immunity (1999) 67 (1): 113-119頁）。この方法で調製したＯＭＶは、ヒトボランティアにおいて鼻内ワクチンとして使用されている。
【００７４】
試薬：
ストックＮＯＭＶ緩衝液：0.15Ｍ NaCl、0.05Ｍ Tris-HCl、0.01Ｍ EDTA pH 7.5。
【００７５】
方法:
１．培養物（Fe制限）を、１株あたり500mlのFrantz培地中で調製した。
２．工程１における500ml培養物からの細胞を、3500rpmにて15分間遠心分離した。
３．細胞を、25mlのＮＯＭＶ緩衝液に再懸濁した。
４．懸濁液を、56℃で30分間温めた。
５．懸濁液を、Waringブレンダー中で３分間（低速で）剪断した。
６．懸濁液を、23,500ｇにて20分間遠心分離した。
７．懸濁液を保持した。
８．ペレットを12mlの蒸留水に再懸濁し、そして23,500ｇにて20分間遠心分離した。
９．上清を保持し、そして工程７からの上清と合わせた。
10．上清を、23,500ｇにて20分間遠心分離した。
11．上清を保持し、そして100,000ｇにて２時間遠心分離した。
12．ペレットを、蒸留水から再ペレット化することによって洗浄した。
13．得られたＮＯＭＶを、ＰＢＳ中で４℃にて保存した。
【００７６】
実施例３
ＯＭＶを生成するための酢酸リチウム抽出
これは、ＯＭＶを生成するさらなる代替方法である（Hamel, J.ら、1987, J. Med. Microbiol. 23, 163-170）。
【００７７】
試薬：
酢酸リチウム緩衝液：200mM 酢酸リチウム＋５mM EDTA pH 6.0
【００７８】
方法:
１．ブロス培養液（Fe制限）を、１株あたり100mlのＭＨＢ中で調製した。
２．100ml培養物からの細胞を、3500rpmにて15分間遠心分離した。
３．細胞を、20mlの酢酸リチウム緩衝液（ＬｉＡｃ）に再懸濁した（750mlの培養物について、30mlのＬｉＡｃ中に細胞ペレットを再懸濁した）。
４．懸濁液を、攪拌しながら（180rpm）37℃にて３時間インキュベートした。
５．次いで、細胞懸濁液を、21ゲージ針に７回通過させた。あるいは、ビーズビーターを使用し得る。
６．懸濁液を、16000rpmにて20分間遠心分離した。
７．上清を注意深く回収した。
８．上清を35,000rpmにて２時間遠心分離し、そしてペレットを採集した。
９．ペレットをＰＢＳに再懸濁し、そして４℃にて保存した。
【００７９】
実施例４
非経口投与に適切なＯＭＶベースのワクチンの生成のための代わりのデオキシコール酸抽出方法
１．株を、初期定常期までFrantz培地（135ｌ）中で培養し、細胞を、連続流遠心分離によって採取し、そしてNaCl緩衝液に再懸濁した。
２．細胞懸濁液を、30分間ホモジナイズし、懸濁液の総湿重量を決定した。
３．細胞懸濁液を、2900×ｇで60分間遠心分離し、そしてペレットを、7.5：１湿重量の比で0.1Ｍ Tris−10mM EDTA緩衝液に再懸濁した。
４．小胞の抽出を、0.1Ｍ Tris，10mM EDTA，10％デオキシコール酸（ＤＯＣ）の1/20容量の添加によって行った。
５．小胞を、細胞破砕物から４℃にて20000×ｇで１時間で分離した。
６．小胞を含む上清を、４℃にて125000×ｇで２時間の超遠心分離によって濃縮した。
７．ＯＭＶペレットを、0.1Ｍ Tris，10mM EDTA，0.5％ＤＯＣ緩衝液に再懸濁し、そして懸濁液を再度、４℃にて125000×ｇで２時間遠心分離した。
８．濃縮したＯＭＶを、３％スクロース溶液に再懸濁した。
９．アジュバントを含むワクチンを調製するために、ＯＭＶ抽出物を、アジュバントとしてのAlPO4と等モル量で混合した。
【００８０】
実施例５
ブレンドしたＯＭＶワクチン組成物
実施例１〜４に記載した方法のいずれかに従って調製した別々のＯＭＶ抽出物を、N. meningitidisおよびN. lactamicaから得る。ＯＭＶ抽出物を、実施例４の工程９のように組み合わせる。
【００８１】
実施例６
ブレンドしたＯＭＶワクチン組成物
N. meningitidisおよびN. lactamica培養物を、実施例１〜４に記載したＯＭＶ抽出方法を行う前に、一緒に混合する。濃縮したＯＭＶを、３％スクロール溶液に再懸濁する。
【００８２】
実施例７
ブレンドしたＯＭＶ組成物
ＯＭＶ抽出物を、実施例１〜４に記載した方法のいずれかに従ってN. meningitidisおよびN. lactamicaから得る。それぞれの抽出物を、単一の組成物に組み合わせ、次いでホモジナイズする。濃縮したＯＭＶを、３％スクロール溶液に再懸濁する。
【００８３】
実施例８
ブレンドしたＯＭＶ組成物
試薬
Y92 1009株からのN. lactamica ＯＭＶ
MC 58（B:15:P1.7,16）株からのN. meningitidis ＯＭＶ
抗髄膜炎菌血清亜型（ＰｏｒＡ）P1.7モノクローナル抗体（NIBSC、UKからの95/706）
AffiniPure抗マウスIgG（Jackson Immuno Research Laboratories）６nm金コロイド結合体
ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中の２％ウシ血清アルブミン）
結合緩衝液（ＰＢＳ中0.02％ Tween 20、0.1％ＢＳＡ、５％ウシ新生仔血清）
１％リンタングステン酸カリウム（ＰＴＡ）染色
【００８４】
方法
N. lactamica（ＮＬ）およびN. meningitidis（ＮＭ）ＯＭＶを、−20℃での保存庫から取り出し、そして室温で融解させた。ＯＭＶの混合物を、等容量のＮＬおよびＮＭ ＯＭＶをガラス容器に添加し、ピペットを用いて穏やかに攪拌することによって別々に調製した；次いで、すべてのＯＭＶを、必要になるまで４℃にて保存した。
【００８５】
ＮＭ、ＮＬ、ならびにＯＭＶ混合物を、３つの別々の炭素コーティングした銅グリッド上に置き、そして乾燥させた。次いで、グリッドを、髄膜炎菌ＰｏｒＡモノクローナル抗体の１：500希釈液の100μl中に入れ、そして室温で２時間インキュベートした。グリッドを、ブロッキング緩衝液（２％ＢＳＡを含むＰＢＳ）で２回洗浄し、そして0.02％ Tween 20、0.1％ＢＳＡ、５％ウシ新生仔血清を含むＰＢＳ中のAffiniPure抗マウスIgG（Jackson Immuno Research Laboratories）に結合した６nm金コロイド粒子の１：20希釈液に添加した。
【００８６】
室温での１時間のインキュベーション後、グリッドを、ブロッキング緩衝液で２回、蒸留水で１回洗浄し、そして１％リンタングステン酸カリウム（ＰＴＡ）で５〜10秒間染色した。次いで、グリッドを電子顕微鏡によって検査した。これらを図１〜３に示す。
【００８７】
図１、２、および３において、黒いドットは、６nm金粒子での標識を示す。図１では、ＮＭ ＯＭＶは、６nm金粒子で均一に標識され、これはＰｏｒＡがすべてのＯＭＶに存在することを示す。図２では、標識がなく、ＮＬ ＯＭＶがＰｏｒＡ（共生ナイセリア属で見られない病原体特異的抗原）を含まないという事実に一致する。ＮＭおよびＮＬ ＯＭＶの組み合わせを示す図３の結果は、ＯＭＶが再び金粒子で均一に標識されたことを示す。標識は均等であり、そしてすべてのＯＭＶにわたるものであり、ＯＭＶの１つの画分のみに制限されない。したがって、混合物中のＯＭＶの半分は元来ＰｏｒＡを含まなかったが、ブレンド後、すべてのＯＭＶはＰｏｒＡについて陽性に染色し、これは、今ではすべてのＯＭＶがＰｏｒＡを含むことを示す。
【００８８】
したがって、本発明は、小胞含有調製物、特にＯＭＶベースの調製物、ならびにそれらの生成方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】N. meningitidisのＯＭＶの調製物の電子顕微鏡写真を示す。
【図２】N. lactamicaのＯＭＶの調製物の電子顕微鏡写真を示す。
【図３】本発明によるN. meningitidisおよびN. lactamicaのＯＭＶのブレンドの電子顕微鏡写真を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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