(57)【要約】本発明は、目的のヌクレオチド配列をゲノムに組み込むための方法および組成物を提供する。特に、本発明の方法は、レンチウイルスベクターと卵母細胞、初期段階胚、または胞胚の原形質膜を、ウイルスベクターの侵入および後に続く目的のヌクレオチド配列のゲノムへの組み込みを許容する条件下で接触させる工程を包含する。本発明はさらに、移植前の胚の形成を可能にする条件下でレンチウイルスベクターと接触した卵母細胞または胚を培養する工程を包含する。続いて、移植前の胚は、レシピエント脊椎動物に移入され得、これは、少なくとも１つの遺伝的に改変された動物への発生を可能にされる。これによって、本発明の方法および組成物は、遺伝的に改変された動物、特に脊椎動物と特に哺乳動物の生成を可能にする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的のヌクレオチド配列を脊椎動物のゲノムに組み込む方法であって、
ａ）原形質膜を有する単離された初期段階胚を提供する工程；および
ｂ）該原形質膜を、目的のヌクレオチド配列を含む少なくとも第１のレンチウイルスベクターを含む組成物と接触させる工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、ここで、
ａ）前記単離された初期段階胚がさらに透明帯を含み、該透明帯および前記原形質膜が卵黄周囲腔を規定し；そして
ｂ）前記原形質膜との接触工程が、前記組成物の該卵黄周囲腔への導入工程を包含する、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記初期段階胚が受精卵母細胞である、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記初期段階胚が、２細胞期胚、４細胞期胚、８細胞期胚、および桑実胚からなる群から選択される、方法。
【請求項５】
請求項２に記載の方法であって、ここで、第１のレンチウイルスベクターを含む組成物が、微量注入によって卵黄周囲腔に導入される、方法。
【請求項６】
請求項３に記載の方法であって、ここで、前記目的の第１ヌクレオチド配列が受精卵母細胞のゲノムに組み込まれる、方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記目的の第１のヌクレオチド配列がポリペプチドをコードする、方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、ここで、第１のレンチウイルスベクターが、ヒト免疫不全ウイルスおよびサル免疫不全ウイルスからなる群から選択されるウイルスに由来する、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、ここで、第１のレンチウイルスベクターがｔｒａｎｓ−ウイルスベクターである、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、ここで、前記ｔｒａｎｓ−ウイルスベクターが、ｔｒａｎｓ−レンチウイルスベクターまたはｔｒａｎｓ−レトロウイルスベクターである、方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法であって、ここで、脊椎動物がマウス、ウサギ、ヒツジ、ウシ、鳥類、およびラットからなる群から選択される、方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記組成物がさらに、目的の第２のヌクレオチド配列を含む第２のレンチウイルスベクターを含む、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、ここで、第１および第２のレンチウイルスベクタ−が、ヒト免疫不全ウイルスおよびサル免疫不全ウイルスからなる群から選択されるウイルスに由来される、方法。
【請求項１４】
請求項１２に記載の方法であって、ここで、第１および第２のレンチウイルスベクターがｔｒａｎｓ−ウイルスベクターである、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、ここで、前記ｔｒａｎｓ−ウイルスベクターがｔｒａｎｓ−レンチウイルスベクターまたはｔｒａｎｓ−レトロウイルスベクターである、方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記方法がさらに、移植前の胚の形成を可能にする条件下で初期段階胚を培養する工程を包含する、方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、さらに、前記移植前の胚をレシピエント脊椎動物へ移入し、そして前記移植前の胚を少なくとも１頭の脊椎動物に発生させる工程を包含する、方法。
【請求項１８】
請求項１６に記載の方法であって、ここで、
ａ）前記初期段階胚がさらに透明帯を含み、該透明帯および前記原形質膜が卵黄周囲腔を規定し；そして
ｂ）前記原形質膜との接触工程が、目的の第１のヌクレオチド配列を含む少なくとも前記第１のレンチウイルスベクターを含む組成物を、該卵黄周囲腔へ導入する工程を包含する、
方法。
【請求項１９】
請求項１６に記載の方法であって、ここで、前記初期段階胚が受精卵母細胞である、方法。
【請求項２０】
請求項１６に記載の方法であって、ここで、前記初期段階胚が２細胞胚、４細胞胚、８細胞胚、または桑実胚である、方法。
【請求項２１】
請求項１８に記載の方法であって、さらに前記移植前の胚をレシピエント脊椎動物へ移入し、そして前記移植前の胚を少なくとも１つの遺伝的に改変された脊椎動物に発生させる工程を包含する、方法。
【請求項２２】
請求項１８に記載の方法であって、ここで、第１のレンチウイルスベクターを含む組成物が、微量注入を介して卵黄周囲腔に導入される、方法。
【請求項２３】
請求項１９に記載の方法であって、ここで、前記目的の第１のヌクレオチド配列が受精卵母細胞のゲノムに組み込まれる、方法。
【請求項２４】
請求項１６に記載の方法であって、ここで、前記組成物がさらに、目的の第２のヌクレオチド配列を含む第２のレンチウイルスベクターを含む、方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、さらに前記移植前の胚をレシピエント脊椎動物へ移入し、そして前記移植前の胚を少なくとも１つの遺伝的に改変された脊椎動物に発生させる工程を包含する、方法。
【請求項２６】
単離された初期段階胚および目的のヌクレオチド配列を含む、有効濃度の少なくとも第１のレンチウイルスベクターを含む組成物であり、ここで、該初期段階胚が非ヒト脊椎動物である、組成物。
【請求項２７】
請求項２６に記載の組成物であって、ここで、前記初期段階胚が受精卵母細胞である、組成物。
【請求項２８】
請求項２６に記載の組成物であって、ここで、前記初期段階胚が２細胞胚、４細胞胚、８細胞胚、または桑実胚である、組成物。
【請求項２９】
請求項２６に記載の組成物であって、ここで、
ａ）前記単離された初期段階胚がさらに透明帯を含み、該透明帯および前記原形質膜が卵黄周囲腔を規定し；そして
ｂ）前記レンチウイルスベクターが卵黄周囲腔にある、
組成物。
【請求項３０】
請求項２９に記載の組成物であって、ここで、前記目的の第１のヌクレオチド配列がポリペプチドをコードする、組成物。
【請求項３１】
請求項２６に記載の組成物であって、ここで、前記レンチウイルスベクターがヒト免疫不全ウイルスおよびサル免疫不全ウイルスからなる群から選択されるウイルスに由来する、組成物。
【請求項３２】
請求項２６に記載の組成物であって、ここで、前記レンチウイルスベクターがｔｒａｎｓ−ウイルスベクターである、組成物。
【請求項３３】
請求項３２に記載の組成物であって、ここで、前記ｔｒａｎｓ−ウイルスベクターが、ｔｒａｎｓ−レンチウイルスベクターまたはｔｒａｎｓ−レトロウイルスベクターである、組成物。
【請求項３４】
請求項２６に記載の組成物であって、ここで、非ヒト脊椎動物が、マウス、ウサギ、ヒツジ、ウシ、鳥類、およびラットからなる群から選択される、組成物。
【請求項３５】
請求項２６に記載の組成物であって、さらに目的の第２のヌクレオチド配列を含む、有効濃度の第２のレンチウイルスベクターを含む、組成物。
【請求項３６】
目的のヌクレオチド配列を脊椎動物のゲノムに組み込む方法であって；
ａ）原形質膜を有する単離された卵母細胞を提供する工程；および
ｂ）該原形質膜を、目的のヌクレオチド配列を含む少なくとも第１のレンチウイルスベクターを含む組成物と接触させる工程
を含む、方法。
【請求項３７】
請求項３６に記載の方法であって、ここで、
ａ）前記単離された卵母細胞がさらに透明帯を含み、該透明帯および前記原形質膜が卵黄周囲腔を規定し；そして
ｂ）前記原形質膜との接触工程が、さらに前記組成物を該卵黄周囲腔へ導入する工程を包含する、
方法。
【請求項３８】
単離された卵母細胞および目的のヌクレオチド配列を含む、有効濃度の少なくとも第１のレンチウイルスベクターを含む組成物であって、ここで、前記卵母細胞が脊椎動物からである、組成物。
【請求項３９】
請求項３８に記載の組成物であって、
ａ）前記単離された卵母細胞がさらに透明帯を含み、該透明帯および前記原形質膜が卵黄周囲腔を規定し；そして
ｂ）前記レンチウイルスベクターが卵黄周囲腔にある、
組成物。
【請求項４０】
目的のヌクレオチド配列を脊椎動物のゲノムに組み込む方法であって、
ａ）原形質膜を有する単離された胞胚を提供する工程；および
ｂ）該原形質膜と、目的のヌクレオチド配列を含む少なくとも第１のレンチウイルスベクターを含む組成物を接触させる工程
を包含する、方法。
【請求項４１】
請求項４０に記載の方法であって、ここで、前記レンチウイルスベクターが、ヒト免疫不全ウイルスおよびサル免疫不全ウイルスからなる群から選択されるウイルスに由来する、方法。
【請求項４２】
請求項４０に記載の方法であって、ここで、レンチウイルスベクターがｔｒａｎｓ−ウイルスベクターである、方法。
【請求項４３】
単離された胞胚および目的のヌクレオチド配列を含む、有効濃度の少なくとも第１のレンチウイルスベクターを含む組成物であって、ここで、該胞胚が非ヒト脊椎動物からである、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、目的のヌクレオチド配列を動物のゲノムに組み込むための方法および組成物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
動物の遺伝的構造を操作する能力は、機能的に遺伝子を特徴付け、そして遺伝子を共作用させるための複雑なネットワークを分析するために、モデル生物において幅広く使用される。遺伝的に改変されたモデル生物は、遺伝子機能に関する洞察を得るための有望なルートであることを示した。例えば、家畜における遺伝的改変は、疾患に対する抵抗性、成長速度、飼料効率、胴体組成物を改善し、そして食肉産生の栄養性の質および健康性を高めるような検査方法を可能にする。しかし、そのような遺伝的に改変された動物を生成するための現行の方法は、コストがかかりそして不十分なままである。
【０００３】
しばしば、前核の微量注入は、トランスジェニック動物を生成するための好ましい方法であった。このアプローチにおいて、前核は微量注入され、これは、数百個の導入遺伝子コピーの送達を生じる。レシピエントの母体に移入された微量注入胚のうち、１０〜３０％が出生まで生存し、そしてこれらのうちの１〜１０％のみがトランスジェニックである。さらに、導入遺伝子は、遺伝的に改変された株の約半分のみにおいて発現される。
【０００４】
あるいは、核移入またはクローニングは、遺伝的に改変された動物を生成するために使用される別の方法である。これらの方法において、導入遺伝子は体細胞に導入され、そしてこの細胞は新規遺伝子を取り込んだ細胞を選択するために培養される。次いで、これらの遺伝子の核は、摘出された未受精卵の細胞質へ移入される。生まれた全動物がトランスジェニックであることが核移入によって確認される一方で、胎児の生存率は非常に低く、そして技術自体が技術的に難しい。
【０００５】
あるいは、レトロウイルス感染（遺伝情報がＲＮＡ分子として転移される）は、胚へ遺伝子を移入するために通常使用される方法である。レトロウイルスＲＮＡを細胞へ進入させ、そしてＤＮＡに逆転写させた後、ＤＮＡプロウイルスの宿主細胞ゲノムへの組み込みは、レトロウイルスインテグラーゼおよびレトロウイルスゲノムの末端にある特異的なヌクレオチド配列によって媒介される（Ｇｏｆｆら（１９９２）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２６：５２７〜５４４およびＢｒｏｗｎら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅ．８６：２５２５〜２５２９）。ほとんどのレトロウイルスは、分裂細胞中のみで組み込み得る（Ｋｕｌｋｏｓｌｙら（１９９４）Ｐａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．６１：１８５〜２０３；Ｒｏｅら（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：２０９９〜２１０８、Ｍｉｌｌｅｒら（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：１２：４２３９〜４２４２）。ＨＩＶおよび他のレンチウイルス以外のレトロウイルスの組み込みのために決定的に必要なことは、有糸分裂の間の核膜の破壊である。何年にもわたって反復された試みは、遺伝子量およびこのプロセスを使用するタイミングの制御不能によって、生まれたほとんど全ての動物が、異なる組織中の異なる遺伝子組み込みの位置によって特徴付けられる遺伝的モザイクであることを示した（Ｊａｅｎｉｓｃｈら（１９８０）Ｃｅｌｌ  １９：１８１〜１８８）。これは、遺伝子発現の分析に適切なホモ接合株およびヘテロ接合株を確立するために異種交配を必要とする。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
遺伝的に改変された動物を生成するためのより十分な手段として、新規な方法および組成物が必要とされる。
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、目的のヌクレオチド配列を動物、詳細には脊椎動物、詳細には哺乳動物のゲノムへの組み込みのための方法および組成物を提供する。本発明の方法は、単離された卵母細胞、初期段階の胚、または原形質膜を有する胞胚を提供する工程、および原形質膜を、有効濃度の少なくとも第１のレンチウイルスベクターまたはそれと機能的に等価なベクター（目的のヌクレオチド配列を含む）を含む組成物とを接触させる工程を包含する。本発明の付随的な方法は、さらに、移植前の胚の形成を可能にする条件下で卵母細胞、初期段階胚、または胞胚を培養する工程を包含する。さらなる方法は、移植前の胚のレシピエント脊椎動物への移入工程および移植前の胚を少なくとも１つの遺伝的に改変された脊椎動物に発生させることを可能にする工程を包含する。
【０００８】
本発明の特定の方法において、初期段階の胚は、受精卵母細胞、２細胞期の胚、４細胞期の胚、８細胞期の胚、または桑実胚を含む。
【０００９】
本発明のさらなる方法は、単離された卵母細胞、初期段階の胚、または胞胚の原形質膜と有効濃度の少なくとも第１のレンチウイルスベクターまたはそれと機能的に等価なベクター（目的の第１ヌクレオチド配列を含む）および目的の第２ヌクレオチド配列を含む第２のレンチウイルスベクターを含む組成物とを接触させる工程を包含する。
【００１０】
本発明の他の方法において、卵母細胞または初期段階の段階胚は、さらに透明帯（透明帯および原形質膜は、卵黄周囲腔を規定する）を含む。この実施形態において、少なくとも第１レンチウイルスベクターまたはそれと機能的に等価なベクター（目的のヌクレオチド配列を含む）を含む組成物は、卵黄周囲腔へ導入される。特定の実施形態において、導入方法は、微量注入を包含する。
【００１１】
本発明のさらなる方法は、単離された卵母細胞また初期段階の胚の卵黄周囲腔へ、有効濃度の目的の第１ヌクレオチド配列を含む第１レンチウイルスベクターおよび目的の第２ヌクレオチド配列を含む第２レンチウイルスベクターを含む組成物を導入する工程を包含する。
【００１２】
さらに、本発明の方法は、ヒト免疫不全ウイルスおよびサル免疫不全ウイルスからなる群から選択されるウイルスに由来するレンチウイルスベクターまたはそれと機能的に等価なベクターの使用を含む。他の実施形態において、レンチウイルスベクターは、トランスウイルスベクターである。さらに他の実施例において、トランスベクターは、トランスレンチウイルスベクターまたはトランスレトロウイルスベクターである。
【００１３】
本発明の組成物は、単離された卵母細胞、初期段階の胚、または胞胚および有効濃度の少なくとも第１のレンチウイルスベクターまたはそれと機能的に等価なベクター（目的のヌクレオチド配列を含む）を含む。さらなる組成物として、さらに卵母細胞または透明帯（透明帯および原形質膜は、卵黄周囲腔を規定し、そして、レンチウイルスベクターは、卵黄周囲腔内に存在する）を含む初期段階の胚が挙げられる。
【００１４】
さらに本発明の組成物は、単離された卵母細胞、初期段階の胚、または胞胚および有効濃度の少なくとも有効濃度の第１レンチウイルスベクターまたはそれと機能的に等価なベクター（目的の第１ヌクレオチド配列を含む）ならびに有効濃度の第２レンチウイルスベクターまたは機能的に等価なベクター（目的の第２ヌクレオチドを含む）を含む。さらなる組成物としては、卵黄周囲腔内に有効濃度の第１レンチウイルスベクターもしくは機能的に等価なベクター（目的の第１ヌクレオチド配列を含む）および有効濃度の第２レンチウイルスベクターもしくは機能的に等価なベクター（目的の第２ヌクレオチド配列を含む）を有する卵母細胞または初期段階の胚が挙げられる。
【００１５】
本発明の他の実施形態において、本発明の組成物のレンチウイルスベクターは、ヒト免疫不全ウイルスおよびサル免疫不全ウイルスからなる群から選択されるウイルスに由来する。特定の実施形態において、レンチウイルスベクターは、トランスウイルスベクターである。さらに他の実施例において、トランスベクターは、トランスレンチウイルスベクターまたはトランスレトロウイルスベクターである。
【００１６】
（発明の詳細な説明）
目的のヌクレオチド配列を動物のゲノムに組み込むための方法および組成物が提供される。特に本発明の方法は、ウイルスベクターの進入および引き続く目的のヌクレオチド配列とゲノムとの組み込みを許容する条件下で、卵母細胞、初期段階の胚、または胞胚と目的のヌクレオチド配列を含むレンチウイルスベクターとを接触させる工程を包含する。方法は、さらに、移植前胚の形成を考慮する条件下で、レンチウイルスベクターまたはそれと機能的に等価なベクターと接触された未受精卵母細胞、初期段階の胚、または胞胚を培養する工程を包含する。引き続いて、移植前の胚は、レシピエント動物（少なくとも遺伝的に改変された動物に発達することが可能にされる）へ移入され得る。
【００１７】
それによって、本発明の方法および組成物は、遺伝的に改変された動物、詳細には脊椎動物、およびより詳細には哺乳動物の産出を考慮する。他のレトロウイルスとは違って、レンチウイルスベクターは、プロウイルスゲノムを標的細胞の染色体へ組み込むために細胞分裂を必要としない（Ｎａｌｄｉｎｉら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：２６３：７（本明細書中で参考として援用される）。レンチウイルスのプロウイルスゲノムは、第１細胞分裂前に卵母細胞または受精卵母細胞のゲノムへ組み込み得るので、本発明の方法の特定の実施形態は、目的のヌクレオチド配列の存在についてモザイクである遺伝的に改変された動物の頻度の減少を可能にする。
【００１８】
さらに、本明細書中で証明されるように、本発明の方法におけるレンチウイルスベクターの使用は、遺伝的に改変された動物が産出される頻度を実質的に増加させる。本発明の方法が、複数の独立した組み込み事象を可能にするように、複数の組み込み事象を含む単一のＦ０動物が、組み込み部位を個々の座で有する複数の創始体を産出するために異系交配され得る。そのように、１００％より大きい形質転換効率は達成可能である。詳細には、本発明の方法は、約５％〜約１０％、約１０％〜約２０％、約２０％〜約６０％、約６０％〜約８０％、約８０％〜約１００％、約１００％〜約１２５％、約１２５％〜約１７５％、約１７５％〜約２００％、約２００％〜約３００％またはより高い形質転換効率を生じる。本明細書中で使用される場合、「形質転換効率」は、産出された個々の遺伝可能な遺伝的に改変された動物の数を、レンチウイルスベクターと接触される卵母細胞または胚の総数で割ったものとして規定される。
【００１９】
本発明はまた、目的の複数のヌクレオチド配列を未受精卵母細胞、初期段階の胚、または胞胚のゲノムへ導入するための方法および組成物を提供する。特定の実施形態において、ＤＮＡ組み込みの増加した効率ならびにモザイク動物が本発明の方法および組成物によって生成される頻度の減少は、目的の複数のヌクレオチド配列を組み込んだ非モザイク動物が生成される効率を改善する。
【００２０】
（Ｉ．胚発生の種々の段階でのレンチウイルスベクターの卵母細胞および胚への導入）
本発明は、遺伝的に改変された動物の産出のための稀有な方法および組成物を提供する。詳細には、この新規の方法は、未受精卵母細胞、初期段階の胚、または胞胚段階の胚と有効濃度の少なくとも第１レンチウイルスベクター（目的の第１ヌクレオチド配列を含む）を含む組成物とを接触させる工程を包含する。本発明の方法は、目的のヌクレオチド配列を未受精卵母細胞、初期段階の胚または胞胚へ組み込むために効率の良い方法を提供し、そしてそれによって遺伝的に改変された動物を産出するための有効な方法を提供する。
【００２１】
本発明の方法が任意の動物において実行され得る一方で、詳細には動物は脊椎動物であり、そしてより詳細には脊椎動物は哺乳動物である。特定の実施形態において、脊椎動物はヒトである。他の実施形態において、脊椎動物は、非ヒト脊椎動物である。本明細書中で使用される場合、本発明の「非ヒト脊椎動物」は、「遺伝的に改変された非ヒト脊椎動物」を産出し得る全ての非ヒト脊椎動物を含む。そのような非ヒト脊椎動物としては、げっ歯類、非ヒト霊長類、ヒツジ（ｏｖｉｎｅ）、ウシ（ｂｏｖｉｎｅ）、反芻動物、ウサギ（ｌａｇｏｍｏｒｐｈ）、ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）、ヤギ、ウマ、ネズミ、イヌ、ネコ、鳥類などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、非ヒト脊椎動物としては、マウス、ラット、ヒツジ（ｓｈｅｅｐ）、ウシ（ｃａｔｔｌｅ）、ブタ（ｐｉｇ）、鳥類、およびウサギ（ｒａｂｂｉｔ）が挙げられる。本発明の方法および組成物によって達成される動物は、さらに胚段階および胎児段階を含む全ての発生状態で個々の動物を含むことがさらに認識される。
【００２２】
「遺伝的に改変された動物」または「遺伝的に改変された脊椎動物」によって、そのゲノムが目的の核酸配列の組み込みによって変更された１つ以上の細胞を含む任意の動物が意味される。目的のヌクレオチド配列は、遺伝的に改変された動物の体性および／または原基株化細胞のいずれかのゲノムに組み込まれ得る。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、「卵母細胞」とは雌性生殖細胞をいい、そして一次卵母細胞、二次卵母細胞、および成熟した未受精卵を含む。卵母細胞は、卵質によって囲まれる大きな核（すなわち、卵核胞）を有する巨細胞である。卵質は、ｍＲＮＡ、リボソーム、ミトコンドリア、卵黄タンパク質などを含む非核性の細胞質含有物を含む。卵母細胞の膜は、本明細書中で「原形質膜」として称される。哺乳動物の卵母細胞は、さらに透明帯と呼ばれる細胞外エンベロープによって取り囲まれ、精子は、卵母細胞の原形質膜と接触する前に、これに結合しそして貫通しなければならない。用語「卵黄周囲腔」とは、哺乳動物の卵母細胞および受精卵母細胞の透明帯と原形質膜との間に位置する空間をいい、そして初期の胚発生段階を通して維持される（すなわち、透明帯は、移植前に胚胞盤から発生される）。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、「初期段階の胚」は、卵母細胞の受精（すなわち、受精卵母細胞）に始まり、そして２細胞段階、４細胞段階、８細胞段階、および桑実胚（１６〜３２細胞段階の胚）に伸展する全ての胚発生の段階を含む。本明細書中で規定されるように、初期段階の胚は、胞胚段階の発生を含まない。本明細書中で使用される場合、「胞胚」によって割腔と呼ばれる空洞を取り囲む細胞の空洞球の発生によって特徴付けられる胚発生段階が意図される。当業者は、胞胚の組織化全体が、生物によって変化することを理解する。例えば、「胚盤胞」とは、外部の栄養膜細胞および内部の細胞質量から作られる細胞の空洞球によって特徴付けられる分裂段階の哺乳動物胚をいう。
【００２５】
「受精卵母細胞」によって、発生の「１細胞」段階での胚が意図される。発生のこの段階は、受精によって引き金を引かれ、そして第２減数分裂；第２極体の突出；父系の前核および母系の前核の形成；およびＤＮＡ複製によって特徴付けられる。本明細書中で使用される場合、用語「受精卵母細胞」に含まれる発生段階は受精に始まり、そして受精卵母細胞の２細胞胚への分裂で終わる。
【００２６】
本明細書で規定されるように、「単離された」卵母細胞、「単離された」初期段階の胚（すなわち、受精卵母細胞、２細胞段階、４細胞段階、８細胞段階または桑実胚）、または「単離された」胞胚は、ドナー雌性の天然のインビボ環境から除去されている。
【００２７】
（Ａ．レンチウイルスベクターと種々の発生段階の卵母細胞および胚と接触させる方法）
本発明は、目的のヌクレオチドを脊椎動物のゲノムへ組み込む方法を提供し、これは、未受精卵母細胞、初期段階の胚（すなわち、受精卵母細胞、２細胞胚、４細胞胚、または８細胞胚、あるいは桑実胚）、あるいは胞胚を提供する工程およびそれらを有効濃度の少なくとも第１レンチウイルスベクターまたはそれらと機能的に等価なベクター（目的のヌクレオチドを有する）を含む組成物を接触させる工程を包含する。「接触させる」によって、レンチウイルスと卵母細胞、初期段階の胚、または胞胚との直接の接触が意図される。
【００２８】
より特定の実施形態において、本発明の方法は、卵母細胞、初期段階の胚（すなわち、受精卵母細胞、２細胞胚、４細胞胚、または８細胞胚、あるいは桑実胚）または胞胚の原形質膜と、有効濃度の少なくとも第１レンチウイルスベクターまたは目的のヌクレオチドを有するそれらと機能的に等価なベクターを含む組成物を接触させる工程を包含する。「原形質膜と接触させる」によって、レンチウイルスと卵母細胞、初期段階の胚または胞胚の原形質膜との直接接触が意図される。当業者は、種々の方法が、ウイルスベクターおよび原形質膜を直接接触させるために使用され得ることを理解する。
【００２９】
例えば、卵母細胞または初期段階の胚が透明帯を保持する場合、「接触させる」は、レンチウイルスベクターの卵黄周囲腔への導入を含む。この実施形態において、原形質膜および透明帯（透明帯および原形質膜は、卵黄周囲腔を規定する）を有する卵母細胞または初期段階の胚を提供し；そしてウイルスベクターの細胞への進入を許容する条件下で、有効濃度の少なくとも第１レンチウイルスベクター（目的の第１ヌクレオチドを含む）を含む組成物を透明帯へ導入することによって、目的のヌクレオチド配列は、脊椎動物のゲノムへ組み込まれる。
【００３０】
「導入される」によって、透明帯に貫入し、そしてそれによってレンチウイルスベクターの透明帯への導入を可能にするための当該分野において公知の任意の方法の使用が意図される。レンチウイルスベクターの導入方法としては、例えば、ウイルスの卵黄周囲腔への微量注入（Ｃｈａｎｇら（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９１：３０９〜３１２、Ｃｈａｎら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：１４０２８〜３３および米国第６，０８０，９１２号（本明細書中で参考として援用される）；ならびにウイルスベクターが透明帯へ進入することを可能にする条件下で、未受精卵母細胞または原形質膜および透明帯を含む初期段階の胚（すなわち、受精卵母細胞、２細胞、４細胞、８細胞、また桑実胚）のインキュベーションが挙げられる。
【００３１】
微量注入技術が使用される場合、当業者は、ほとんどの脊椎動物の卵母細胞の卵黄周囲腔が、少なくとも約１〜３００ピコリッターの注入された流体で調節し得ることを理解する。そのように、高いウイルス力価を有するレンチウイルスベクターは、好ましくは、本発明の方法において使用される。高い力価のストックの使用は、有効濃度のウイルス粒子の卵黄周囲腔への導入を可能にする。
【００３２】
本発明のレンチウイルスベクターは、好ましくは、１ｍｌあたり約１×１０６、約１×１０７、約１×１０８、約１×１０９、約１×１０１０、約１×１０１１またはより高い形質導入単位のストック力価を有する。あるいは、本発明のレンチウイルスベクターは、１ｍｌあたり約５×１０６〜約５×１０７、約５×１０７〜約５×１０８、約５×１０８〜約５×１０９、約５×１０９〜約５×１０１０またはより高い形質導入単位のストック力価を有し得る。特定の実施形態において、ウイルス力価は、１ｍｌあたり少なくとも約２．９×１０９の形質導入単位である。当業者は、必要とされる濃度でウイルスストックを生成するための方法を知っている。
【００３３】
本発明の別の実施形態において、透明帯は、卵母細胞または初期段階の胚（すなわち、受精卵母細胞）から除去され得る。この実施形態において、「接触させる」は、有効濃度のレンチウイルスベクターを含む組成物を卵母細胞または初期段階の胚（すなわち、受精卵母細胞、２細胞、４細胞、８細胞または桑実胚）とともにインキュベートすることを含み得る。透明帯を除去するための方法は、当該分野において公知である。例えば、Ｈｏｇｅｎら（１９９４）Ｍａｎｉｐｕｌａｔｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第２版  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと。この実施形態において、卵母細胞または初期段階の胚を接触させるための例示的な条件は、例えば、卵母細胞または初期段階の胚およびレンチウイルスベクターを、４％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、因子Ｖ、胚試験用、Ｓｉｇｍａ注文番号Ａ−３３１１）を補充したＱｕｉｎｎｓ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  Ｈｅｐｅｓ緩衝化培地（Ｓａｇｅ  Ｂｉｏｆａｒｍ、注文番号１０２０）および４％ＢＳＡを補充したＱｕｉｎｎｓ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓａｇｅ  Ｂｉｏｆａｒｍ、注文番号１０２６）を含む緩衝液中でインキュベートすることを含む。特定の実施形態において、有効濃度は、１μｌあたり約１×１０３、約１×１０４、約１×１０５、約１×１０６、約１×１０７または約１×１０８の形質導入単位のウイルス粒子のウイルス濃度を含む。あるいは、ウイルス粒子濃度は、１μｌあたり約５×１０３〜約５×１０４、約５×１０４〜約５×１０５、約５×１０５〜約５×１０６、約５×１０６〜約５×１０７、約５×１０７〜約１×１０８の形質導入単位の範囲にあり得る。
【００３４】
他の実施形態において、レンチウイルスと接触された胚が、発生の胞胚段階にある場合、接触方法は、ウイルス粒子の割腔空洞への注入を含み得る。例えば、Ｗｏｌｆｇａｎｇら（２００１）ＰＮＡＳ  ９８：１０７２８〜１０７３２（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【００３５】
「有効量」または「有効濃度」によって、卵母細胞、初期段階の胚、または胞胚と少なくとも１つのウイルスベクター粒子を接触させるために十分なウイルスベクター粒子の濃度を意味する。あるいは、有効量は、卵母細胞、初期段階の胚、または胞胚と約１個〜１０個のウイルス粒子、約１０個〜約５０個のウイルス粒子、約５０個〜約１００個のウイルス粒子、約１００個〜約１０００個のウイルス粒子、約１０００個〜約２０００個のウイルス粒子、約２０００個〜約５０００個のウイルス粒子、約５０００個〜約１×１０４個のウイルス粒子、約１×１０４個〜約１×１０５個のウイルス粒子、約１×１０５個〜約１×１０６個のウイルス粒子またはより多いウイルス粒子を接触させることを含む。
【００３６】
本発明の１つの実施形態において、卵黄周囲腔への微量注入前にレンチウイルスストックは滴定されそして希釈され、そのため、結果として生じた遺伝的に改変された動物に組み込まれた多数のプロウイルスゲノムが制御される。当業者は、所望の多数の組み込み事象に必要とされる適切な濃度のウイルス粒子を決定し得る。
【００３７】
本発明の他の実施形態において、原形質膜は、有効濃度の少なくとも２つのレンチウイルスベクター（目的の少なくとも２つの異なるヌクレオチド配列を有する）を含む組成物と接触される。本発明の方法がモザイク動物の産出を最小にするように、この実施形態は、目的の少なくとも２つのヌクレオチド配列を組み込んだ遺伝的に改変された動物を産出する改善された効率を考慮する。
【００３８】
「薬学的に受容可能なキャリア」によって、ウイルスベクターの貯蔵、投与、および／または生物学的活性を促進するような、当該分野において慣用的に使用されるキャリアが意図される。適切なキャリアは、安定であるべきである（すなわち、処方物中の他の成分と反応できない）。それは、使用される濃度でレシピエントにおいて、有意な副作用を産生すべきではない。そのようなキャリアは、一般的に当該分野において公知である。例示的な薬学的に受容可能キャリアとしては、無菌的な発熱物質を含まない水および無菌的な発熱物質を含まない生理食塩水溶液が挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、さらに、薬学的に受容可能なキャリアは、例えば、ウイルス粒子が細胞へ進入する能力を改善するさらなる化合物を含み得る。そのような化合物は、二価性化合物のような種々のカチオン化合物（ポリブレンおよびＤＥＡＥ）を含む。
【００３９】
卵母細胞、初期段階の胚、および胞胚を得る方法が、当該分野において公知である。例えば、受精卵母細胞は、排卵および受精のタイミングが性腺刺激ホルモンの投与よりもむしろ環境条件によって制御される天然の交配から得られ得る。あるいは、性腺刺激ホルモンは、交配前に雌性に対して排卵される卵の数を増加させるために投与され得る。当業者は、目的の種、雌性ドナーの年齢および体重、性腺刺激ホルモンの投与量、性腺刺激ホルモン投与のタイミング、および繁殖用雄性の生殖効率が、受精卵母細胞を得るために使用される特定の方法に影響を及ぼすことが理解される。あるいは、卵母細胞は、インビトロで受精され得る。そのような卵母細胞の単離、その成熟、および受精の方法は、公知である。例えば、米国特許第５，７４１，９５７号；米国特許第６，０８０，９１２号；Ｌｏｎｅｒｇａｎら（１９９４）Ａｃｔａ  Ｖｅｔ  Ｓｃａｎｄ  ３５：３０７〜２０；Ｎａｇａｉら（２００１）Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ５５：１２９１〜３０１（ウシについて）；Ｍｏｏｒら（１９９０）Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｕｐｐｌ  ４０：１９７〜２１０、Ｎａｇａｉら（２００１）Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ５５：１２９１〜３０１；Ｋｉｋｕｃｈｉら（１９９９）Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  ６０：３３６〜４；Ｆｕｎａｈａｓｈｉら（１９９７）Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ  Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｕｐｐｌ  ５２：２７１〜８３（ブタについて）；Ｗａｎｇら（２００１）Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  １２２：８０９〜８１６およびＨｏｇｅｎら（１９９４）Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（マウスについて）；および、Ｔｅｏｔｉａら（２００１）Ｓｍａｌｌ  Ｒｕｍｉｎ  Ｒｅｓ  ４０：１６５〜１７７（ヤギについて）を参照のこと。これらの参考文献の全ては、本明細書中で参考として援用される。また、Ｊａｃｋｓｏｎら（２０００）Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｅｒｓｉｔｙ  ＰｒｅｓｓおよびＰｉｎｋｅｒｔら（１９９４）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ａｎｉｍａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（いずれもまた、参考として援用される）；Ｃｈａｎら（１９９８）ＰＮＡＳ  ９５：１４０２８〜１４０３３；Ｐａｒｒｉｓｈら（１９８６）Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ２５：５９１〜６００；およびＬｅｉｂｆｒｉｅｄら（１９７９）Ｊ．Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ４８：７６〜８６を参照のこと。
【００４０】
（Ｂ．移植前の胚の形成および胚移入の方法）
未授精卵母細胞、初期段階の胚（すなわち、受精卵母細胞、２細胞胚、４細胞胚、８細胞胚、または桑実胚）、または胞胚と、レンチウイルスベクターとを接触させた後、この胚は、「移植前の胚」を形成を可能にする条件下で、インビトロで培養される。そのような移植前の胚は、好ましくは、およそ１６〜１５０細胞またはそれ以上の、詳細にはおよそ１６〜６４細胞を含む。
【００４１】
当業者は、移植前の胚を培養するために必要な方法は、レンチウイルスベクターと接触された卵母細胞または胚の発生段階に依存して、変更し得ることを知られている。例えば、初期段階の胚または胞胚が接触される場合、受精卵母細胞を培養する方法が当該分野において公知であり、そしてＧｏｒｄｏｎら（１９８４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １０１：４１４；Ｈｏｇａｎら（１９８６）Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（マウスの胚について）；Ｈａｍｍｅｒら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：６８０（ウサギの胚およびブタの胚について）；Ｇａｎｄｏｌｆｉら（１９８７）Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．８１：２３〜２８；Ｒｅｘｒｏａｄら（１９８８）Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．６６：９４７〜９５３（ヒツジの胚について）；およびＥｙｅｓｔｏｎｅら（１９８９）Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．８５：７１５〜７２０；Ｃａｍｏｕｓら（１９８４）Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．７２：７７９〜７８５；およびＨｅｙｍａｎら（１９８７）Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ２７：５９８６（ウシの胚について）によって記載されるものを含む。
【００４２】
未授精卵母細胞がウイルスベクターと接触される実施形態において、移植前の胚の形成は、成熟卵母細胞を精子とともに培養することを含む。そのようなインビトロでの受精の方法は、当該分野において公知である。例えば、米国特許第６，０８０，９１２号；Ｃｈａｎら（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９１：３０９〜３１２；およびＣｈａｎら（１９９８）ＰＮＡＳ  ９５：１４０２８〜１４０３３（これらは全て、本明細書中で参考として援用される）。
【００４３】
移植前の胚は、その後、遺伝的に改変された動物の発生および誕生を許容するために、標準方法によって適切なレシピエント雌性に移入される。次いで、創始の遺伝的に改変された動物の異種交配により、ヘテロ接合動物およびホモ接合動物を産出し得る。そのような方法は、当該分野において公知である。例えば、Ｈｏｇｅｎら（１９９４）Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第２版  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと。
【００４４】
用語「子孫」とは、動物がヌクレオチド配列についてヘテロ接合またはホモ接合であるか否かにも関わらず、特定の遺伝的に改変された動物（すなわち、そのゲノムに組み込まれた目的の１つ以上のヌクレオチド配列を有する動物）に由来されるかまたは由来する任意のおよび全ての後の世代をいう。目的のヌクレオチド配列を含む任意の成功した世代の子孫は、本明細書中に含まれ、その結果、目的のヌクレオチド配列を不明確に含む子孫、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３世代などは、この定義に含まれる。
【００４５】
（Ｃ．目的の組み込まれたヌクレオチド配列の検出工程）
潜在的なＦ０創始の遺伝的に改変された動物（すなわち、レンチウイルスと接触した卵母細胞または胚から生まれた哺乳動物）は、当該分野において公知の技術（ＰＣＲ分析および／または制限酵素消化ならびに／あるいはサザンブロット分析が挙げられるが、これらに限定されない）によって初めに同定され得る。Ｈｏｇｅｎら（１９９４）Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（本明細書中で参考として援用される）。当業者は、創始の遺伝的に改変された動物の同定は、種々の発生段階で生じ、胚をレシピエント雌性へ移入する前（胎内、分娩後、または誕生後）を含む。
【００４６】
目的のヌクレオチド配列のゲノムへの組み込みをアッセイする方法は、当該分野において周知である。例えば、目的のヌクレオチド配列の組み込みまたは関連の選択マーカーは、移植前の胚においてアッセイされ得る。この発生段階での検出は、遺伝的な改変が生じそしてそれによってレシピエント雌性における遺伝的に改変された胚の引き続く移植を許容する胚の同定を可能にする。この方法において、１つ以上の細胞は、移植前の胚から除去される。本質的に、必要とされるもの全ては、目的のヌクレオチド配列の組み込みを分析しない胚の１つが満期まで胎内で発生するために十分な細胞数であることである。移植前の胚からのサンプル細胞の単離後、目的のヌクレオチド配列の検出のためのゲノムＤＮＡの分析が実行され得る。例えば、米国特許第５，７４１，９５７号（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【００４７】
当業者は、さらに、移植前の胚における遺伝的な改変の検出は、また同じ遺伝型を有する遺伝的に改変された動物のクローン集団を産出させるために、レシピエント雌性に移植され得る遺伝的に改変された胚のクローン集団を産出するための胚のクローニング工程と組み合わせされ得る。同じ「遺伝型」によって、ゲノムＤＮＡが個々の胚と／または遺伝的に改変された動物集団との間で実質的に同一であることが意味される。有糸分裂の間に、さらなる細胞および／または動物のうちの１つの遺伝型におけるバリエーションを産生し得る種々の体細胞変異が生じ得る。従って、同じ遺伝型を有する集団は、個々のバリエーションまたは部分集団のバリエーションを証明し得る。
【００４８】
あるいは、目的のヌクレオチド配列の組み込みは、胚発生のより後期の段階でアッセイされ得る。例えば、組織の胎内および分娩後の分析が実行され得る。胎内分析は、いくつかの技術（例えば、エコスコープガイダンス下での羊膜の腔経膣的な穿刺を含む）によって実行される。例えば、Ｂｏｗｇｓｏら（１９７５）Ｂｅｔ．Ｒｅｓ．９６：１２４〜１２７およびＲｕｍｓｅｙら（１９７４）Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．３９：３８６〜３９１（いずれも本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。そのような方法によって得られた細胞は、ゲノム改変のためにＰＣＲ分析に供されるゲノムＤＮＡを含む。あるいは、胎児細胞は、絨毛膜穿刺によって回復され得る。この方法はまた、経膣的におよびエコスコープガイダンス下で実行され得る。得られた絨毛膜細胞は、遺伝的改変が生じたか否かを決定するために、ＰＣＲ分析に供される。
【００４９】
遺伝的改変はまた、誕生後検出され得る。例えば、組織生検（例えば、推定の遺伝的に改変された動物の耳または尾部から）が得られ、そして遺伝的な改変の存在について分析され得る。さらに、遺伝的改変はまた、ｍＲＮＡ配列、組織、分泌物（すなわち、唾液）または他の生体流体中の目的のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの発現について、あるいは目的のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ構築物中に含まれる選択マーカーによって産生される遺伝型についてアッセイによって検出され得る。
【００５０】
（ＩＩ．レンチウイルスおよびレンチウイルスベクター）
本発明は、受精卵母細胞の原形質膜を目的のヌクレオチド配列を有するレンチウイルスベクターと接触させることによって、目的のヌクレオチド配列をゲノムへ組み込む方法を、哺乳動物に提供する。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、「レンチウイルスベクター」とは、目的のヌクレオチド配列を含む改変されたプロウイルスのＲＮＡゲノムを有する組み換え的に改変されたレンチウイルスをいう。本明細書中で規定されるように、本発明のレンチウイルスベクターは、少なくとも一部は、レトロウイルスのサブファミリーｌｅｎｔｉｖｉｒｉｎａｅに由来される（そのファミリーメンバーが、未分割細胞に感染する能力によって特徴付けられる）。当業者は、結果として生じたレンチウイルスベクターが、未分割細胞に組み込む能力を保持する限り、本発明の方法において使用されるレンチウイルスベクターの成分は、任意のウイルス供給源、詳細にはレトロウイルス供給源、より詳細にはレンチウイルス供給源に由来し得ることを理解する。
【００５２】
レンチウイルスベクターは、ファミリーＲｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅおよびサブファミリーｌｅｎｔｉｖｉｒｉｎａｅのウイルスに由来される。レンチウイルスは、免疫系に影響を及ぼすゆっくりとした進行性疾患に関連し（Ｃｏｆｆｉｎら（１９９７）Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（本明細書中で参考として援用される）、そして未分割細胞へのゲノムへ組み込む能力によって特徴付けられる。レンチウイルスとしては、種々の霊長類のウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルス［ＨＩＶ−１および２］、あるいはサル免疫不全ウイルス［ＳＩＶ］）および非霊長類のウイルス（例えば、マエディ−ビスナウイルス［ＭＶＶ］、ネコ免疫不全ウイルス［ＦＩＶ］、インクワイア感染性貧血ウイルス［ＥＩＡＶ］、ヤギ関節脳炎ウイルス［ＣＡＥＶ］およびウシ免疫不全ウイルス［ＢＩＶ］ウイルス）が挙げられる。総説として、例えば、Ｒｏｍａｎｏら（２０００）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  １８：１９〜３９を参照のこと。
【００５３】
本発明の方法において有用な多くのレンチウイルスベクターは、当該分野において公知であり、そしてＰａｒｏｌｉｎら（１９９４）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．６８：３８８８〜３８９５；Ｎａｉｄｉｎｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．（１９９６）２７２：２６３〜２６７；Ｚｕｆｆｅｒｅｙら（１９９７）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：８７１〜８７５；Ｕｃｈｉｄａら（１９９８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９５：１１９３９〜１１９４４；Ｋｉｍら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８１１〜８１６；Ｐｏｅｓｃｈｌａら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９３：１１３９５〜１１３９９；Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉら（１９９８）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７２：８８７３〜８８８３；Ｇａｓｍｉら（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：１８２８〜１８３４；Ｂｕｃｈｓｃｈａｃｈｅｒら（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１〜２７３９；およびＤｒｏｐｕｌｉｃら（１９９６）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．９３：１１１０３〜１１１０８；（これらの全ては、本明細書中で参考として援用される）によって記載されるが、これらに限定されないようなＨＩＶ−１ベースのベクターが挙げられる。さらに、自己不活性（ＳＩＮ）レンチウイルスベクターは開発され、そして本発明における使用を見出す。例えば、Ｚｕｆｆｅｒｅｙら（１９９８）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７２：９８７３〜９８８０およびＭｉｙｏｓｈｉら（１９９８）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７２：８１５０〜８１５７（両方とも本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。ＨＩＶ−２ウイルスベクターはまた、当該分野において公知である。例えば、Ｐｏｅｓｃｈｌａら（１９９６）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９３：１１３９５〜１１３９９を参照のこと。さらに、ＦＩＶウイルスベクターは公知である。例えば、Ｊｏｈｎｓｔｏｎら（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７３：４９９１〜５０００；Ｊｏｈｎｓｔｏｎら（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７３：２４９１〜２４９８；およびＰｏｅｓｃｈｌａら（１９９８）Ｎａｔ  Ｍｅｄ４：３５４〜３５７を参照のこと。
【００５４】
あるいは、本発明の方法において有用なレンチウイルスベクターはまた、ＲＮＡ偽型レンチウイルスベクターを含み得る。ヘテロ接合のプロウイルスゲノムＲＮＡをパッケージするレトロウイルス粒子とは、ＲＮＡ偽型として称される。ＲＮＡ偽型ベクターは、パッケージングベクターと移入ベクターとの間のホモ接合の組換えについての強力な利点または減少された危険性を有する。例えば、Ｒｉｚｖｉら（１９９３）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．６７：２６８１〜２６８８およびＥｍｂｒｅｔｓｏｎら（１９８７）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．６１：２６７５〜２６８３（両方とも本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。例えば、例えば、ＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２ベースのベクターは、Ｃｏｒｂｅａｕおよび共同研究者によって設計された（Ｃｏｒｂｅａｕら（１９９８）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：９９〜１０４）。さらに、ＨＩＶ−１／ＳＩＶ由来のベクターは、近年Ｗｈｉｔｅら（１９９９）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７３：２８３２〜２８４０において記載された。これらの参考文献はそれぞれ、本明細書中で参考として援用される。
【００５５】
開発された他のレンチウイルスとしては、ヤギ関節脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）をベースにした複製欠損性ベクター（Ｍｓｅｌｌｉ−Ｌａｋｈａｌら（１９９８）Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ．１４３：６８１〜６９５）；ウマ感染性貧血ウイルス（Ｍｉｔｃｈｅｌｌら（１９９８）Ｌａｎｃｅｔ．３５１：３４６）；およびウシ免疫不全ウイルスが挙げられる。これらの参考文献はそれぞれ、本明細書中で参考として援用される。
【００５６】
さらに、当業者は、本発明の方法において使用されるレンチウイルスベクター系は、「複製欠損性」であり得ることを理解する。「複製欠損性」によって、ウイルス粒子は、標的細胞中での完全なウイルス粒子を再構築出来ず、その結果複製出来ずそして他の細胞へ広がることが出来ないウイルスベクターが意図される。
【００５７】
特定の実施形態において、本発明の方法において使用されるレンチウイルスベクターは、「感染性」である。「感染性」によって、ウイルス粒子が標的細胞への進入を達成出来ることが意図される。他の実施形態において、本明細書中の方法において使用されるレンチウイルスベクターは、標的細胞への「形質導入」出来る。「形質導入」によって、ウイルスベクターが標的細胞への進入を達成し、そして遺伝子移入ベクターを標的細胞のゲノムへ組み込むことが意図される。
【００５８】
目的のヌクレオチド配列をゲノムへ組み込むために設計される組み換えレンチウイルスベクターを産生する方法は、当該分野において公知である。簡単には、例えば、レンチウイルスベクターは、例えば少なくとも３つの遺伝的エレメント：遺伝子導入構築物、パッケージング構築物、およびＥｎｖ発現構築物（Ｎａｌｄｉｎｉら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７２，２６３〜２６７；Ｂｕｒｎｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９０：８０３３〜８０３７；および、Ｗｈｉｔｅら（１９９９）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７３：２８３２〜２８４０）を含む一過性の発現ベクターによって産生され得る。遺伝子導入構築物は、レトロウイルスのシス作用性エレメントおよび目的のヌクレオチド配列を含む。この導入構築物は、標的細胞のゲノムへ挿入される改変されたプロウイルスゲノム上に含まれる。パッケージング構築物は、エンベロープを除いて、ウイルス構造タンパク質の発現に指向する。パッケージング構築物（主にＧａｇ／Ｐｏｌ）によって発現されるタンパク質は、キャプシドおよびポリメラーゼ成分を形成し、そしてレトロウイルスＲＮＡゲノムおよびその逆転写されたＤＮＡ産物における特定のシス作用性配列を認識する（Ｍｉｌｌｅｒら（１９９７）Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：８０３〜８１５）。この認識は、逆転写および組み込みを誘導する。エンベロープ構築物は、代表的には、ヘテロ接合のエンベロープ（例えば、水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質Ｇ［ＶＳＶ−Ｇ］）を含む。３つの発現構築物は、細菌性プラスミドの形成において維持され、そして複製欠損性ウイルスのストックを産生するために、哺乳動物細胞へトランスフェクトされ得る（Ｗｈｉｔｅら（１９９９）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７３：２８３２〜２８４０およびＮａｌｄｉｎｉら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７２：２６３〜２６７（両方とも本明細書中で参考として援用される）。
【００５９】
当業者は、レンチウイルスベクターは種々の方法で設計され得、そしてなお、本発明の方法において有用な「機能的に等価」なウイルス粒子を産生する。特にトランスベクター系に関連するようなより詳細な「機能的に等価」の考察が、以下に提供される。当業者は、その概念が、他の公知のレンチウイルスベクター系に同等に適用するこの考察から認識する。
【００６０】
（Ａ．トランスウイルスベクター）
本発明の１つの実施形態において、使用されるレンチウイルスベクターは、「トランスウイルス」ベクターを含む。本明細書で使用される場合、「トランスウイルスベクター」設計を有するレンチウイルスベクターは、ＧａｇおよびＰｏｌポリタンパク質をコードする別個の（少なくとも一部）ヌクレオチド配列として特徴付けられる。「ポリタンパク質」によって、個々のタンパク質へプロセスされる単一の前駆体ポリペプチドが意図される。例えば、ＨＩＶ  Ｐｏｌポリタンパク質は、逆転写酵素およびインテグラーゼを含む。ＨＩＶ  Ｇａｇポリタンパク質は、例えば、ＭＡ、ＣＡ、ＮＣ、およびｐ６を含む。
【００６１】
トランスウイルスベクター設計において、Ｇａｇ−Ｐｒｏ−Ｐｏｌポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、少なくとも２つの別個の部分に分割される。第１のＤＮＡセグメントは、ＧａｇまたはＧａｇ／Ｐｒｏあるいは機能的にそれらと等価なポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および逆転写酵素および／またはインテグラーゼあるいはそれらと機能的に等価な酵素をコードする少なくとも第２のＤＮＡセグメントを含む。言い換えれば、トランスウイルス系は逆転写酵素およびインテグラーゼをコードするポリペプチドが、機能的ＧａｇポリペプチドをコードするＤＮＡセグメント以外の少なくとも１つの他のＤＮＡセグメントから、イントランスで供給される他のウイルスベクター系とは区別可能である。従って、トランスウイルスベクター系は、部分的には、遺伝的組み換えによって複製可能なレトロウイルスを産生する可能性を減少することによって、より安全ウイルスベクターを可能にする。
【００６２】
１つの実施形態において、トランスベクター設計は、「トランスレンチウイルスベクター」を含む。「トランスレンチ」ウイルスベクター設計は、Ｇａｇ−Ｐｒｏ−Ｐｏｌポリタンパク質を少なくとも２つの部分：ＧａｇまたはＧａｇ−Ｐｒｏを発現する第１のＤＮＡセグメントならびに逆転写酵素および／またはインテグラーゼを発現する少なくとも第２のＤＮＡセグメントにおいて発現することによって特徴付けられる。「トランスレンチ」ウイルスベクター設計は、さらにＶｐｒおよび／またはＶｐｘポリペプチドまたはそれらと機能的に等価なポリペプチドを、ウイルス粒子に対する逆転写酵素およびインテグラーゼへ標的化するための使用によって特徴付けられる。この設計において、Ｖｐｒおよび／またはＶｐｘポリペプチドは、機能的な逆転者酵素およびインテグラーゼをウイルス粒子へ送達するためのビヒクルとして使用される。トランスレンチウイルスベクター設計において使用されるＶｐｒ／Ｖｐｘ融合タンパク質の設計に関するさらなる詳細は、以下で概説される。
【００６３】
さらに別の実施形態において、トランスベクター設計は、「トランスレトロウイルスベクター」設計を含む。以下でさらに詳細に説明されるように、「トランスレトロウイルス」ベクターは、少なくとも２つの部分：ＧａｇまたはＧａｇ−Ｐｒｏを発現する第１のＤＮＡセグメントならびに逆転写酵素および／またはインテグラーゼを発現する少なくとも第２のＤＮＡセグメントにおいて、Ｇａｇ−Ｐｒｏ−Ｐｏｌポリタンパク質を発現することによって特徴付けられる。「トランスレトロウイルス」ベクター設計は、ウイルス粒子に対して逆転写酵素およびインテグラーゼを標的化するためにウイルス粒子に標的化され得るＧａｇポリペプチド、またはそれと機能的に等価なポリペプチドの少なくともフラグメントの使用によって、さらに特徴付けられる。この設計において、Ｇａｇポリペプチドのフラグメントは、機能的な逆転写酵素およびインテグラーゼをウイルス粒子へ送達するためのビヒクルとして使用される。トランスレトロウイルスベクター設計の設計に関するさらなる詳細は、以下で概説される。
【００６４】
当業者は、トランスレトロウイルスベクター設計は、任意のレトロウイルス供給源に由来するウイルスベクターにおいて使用され得る。従って、本発明の特定の実施形態において、トランスレトロウイルスベクターは、レンチウイルス以外のレトロウイルスに由来される。そのようなレトロウイルスベクターは、モロニー白血病ウイルス（ＭＬＶ）、エーベルソンマウス白血病ウイルス、ＡＫＲ（内在性）マウス白血病ウイルス、トリ癌腫、ミル・ヒルウイルス２、トリ白血症ウイルス−ＲＳＡ、トリ骨髄芽球ウイルス、トリ骨髄球腫ウイルス２９、ウシシンシチウムウイルス、ヤギ関節脳炎ウイルス、ニワトリシンシチウムウイルス、ウマ感染性貧血ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ネコシンシチウムウイルス、フィンケル−ビスキス−ジンキス  マウス肉腫ウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、フジナミ肉腫ウイルス、ガードナ−アーンステインネコ肉腫ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、モルモットＣ型オンコウイルス、アルディ−ズッカーマンネコ肉腫、ハーベイマウス肉腫、ヒト泡沫状ウイルス、ヒトスプマウイルス、ヒトＴリンパ増殖性ウイルス１型、ヒトＴリンパ増殖性ウイルス２型、Ｊａａｇｓｉｅｋｔｅウイルス、カーステンマウス肉腫ウイルス、ラングールウイルス、マッソン−プフィッツァーサルウイルス、モロニーマウス肉腫ウイルス、マウス乳癌ウイルス、ヒツジ肺腺癌ウイルス、ブタＣ型オンコウイルス、網内ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、サル泡沫状ウイルス、サル肉腫、サルＴリンパ増殖性ウイルス、サルＤ型ウイルス１型、シンダー−タイレンネコ肉腫、リスザルレトロウイルス、トレーガーダック脾臓壊死ウイルス、ＵＲ２肉腫、バイパーレトロウイルス、ビスナ／マエディーウイルス、ヨウモウザル肉腫、およびＹ７３肉腫ヒト免疫不全ウイルス、Ｙ７３肉腫サル免疫不全ウイルス、Ｙ７３肉腫ネコ免疫不全ウイルス、およびＹ７３肉腫ウシ免疫不全ウイルス（ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ）を含むがこれらに限定されないレトロウイルスに由来し得るが、これらに限定されない。米国特許出願第０９／５７８，５４８号もまた参照のこと。
【００６５】
「トランス」ウイルスベクターの設計、「トランスレンチ」ウイルスベクター設計、および「トランスレトロウイルス」ベクター設計の完全な記載およびこれらのウイルス粒子を産生するために使用されるウイルスベクター系は、米国特許出願第０９／０８９，９００号；同第０９／７０９，７５１号；同第０９／４６０，５４８号；米国特許第６，００１，９８５号；ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ００／１８５９７、Ｗｕら（１９９７）ＥＭＢＯ  １６：５１１３〜５１２２（全て本明細書中で参考として援用される）において、詳細に記載されている。
【００６６】
本明細書の方法において使用されるトランスウイルスベクター系の非限定例示は、図１〜２において提供される。これらの例において、トランスベクター系は、以下の構成要素：ｅｎｖ構築物、パッケージング構築物、トランス酵素構築物、およびレトロウイルス遺伝子導入ベクターを含む。トランスウイルス系の「パッケージング構築物」は、Ｇａｇ／Ｐｒｏ（図１〜２において囲まれた構造として示される一方で、逆転写酵素（ＲＴ）およびインテグラーゼ（ＩＮ）をコードするヌクレオチド配列は、構築物から完全に欠失されるかまたは機能的ポリペプチドの発現を防止するいくつかの様式で破壊されるかのいずれかであった。逆転写酵素ポリペプチドおよびインテグラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、本明細書中で「トランス酵素構築物」として称されるＤＮＡのストレッチ上のパッケージング構築物にイントランスで提供される。それによって、ウイルス発現系は、逆転写酵素およびインテグラーゼをコードするヌクレオチド配列からＧａｇ−Ｐｒｏを分割することによって、Ｇａｇ−Ｐｒｏ−Ｐｏｌ構造を和らげる。
【００６７】
トランスウイルス系によって産生されるトランスウイルスベクターは、Ｇａｇ／Ｐｏｌがポリタンパク質として発現される３つのベクター系を使用するウイルスベクターから物理的に識別され得る。例えば、Ｗｕら（１９９７）ＥＭＢＯ  Ｊ．１６：５１１３〜５１２２およびＷｕら（２０００）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ  １：４７〜５５（３つのベクターレンチウイルスベクターと比較される場合、トランスレンチウイルス粒子における未分割のＶｐｒ／Ｖｐｘ融合タンパク質を同定するためのアッセイおよびトランスウイルスベクターにおける遺伝的組み換えの減少されたレベルを測定するアッセイを提供する）を参照のこと。
【００６８】
本明細書中で使用される場合、「核酸配列」は、しばしばＤＮＡフラグメントおよびＲＮＡフラグメントの両方を包含する一般用語として使用される。本発明の物質が、改変されたレトロウイルスゲノムおよびそのプロウイルス対応物を含む場合、言及される特定の機能的配列は、ＲＮＡ形態およびＤＮＡ形態の両方で生じる。対応する遺伝子座は、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方における出現について、交換可能に言及される。例えば、ψパッケージングシグナルは、パッケージングシグナルとしてレトロウイルスＲＮＡゲノム中で機能する；しかし、対応する配列は、プロウイルスＤＮＡにおいて生じる。わずかに異なった形態ではあるが、同様に、プロモーター配列、エンハンサー配列、およびターミネーター配列が、ゲノムＲＮＡ形態およびプロウイルスＤＮＡ形態の両方で生じる。ウイルスの生活環の種々の相におけるこれらの機能性の互換性は、当業者によって理解され、従って、ＤＮＡ状態またはＲＮＡ状態に関するかなり緩い用語が、しばしばそれらを称する際に使用される。特に、塩基の連続により特定化された配列は、これらの特定の配列およびその相補体（ＤＮＡ形態およびＲＮＡ形態の両方で）を含むことが理解されるべきである。
【００６９】
トランスウイルスベクター系の種々のエレメント（例えば、遺伝子移入ベクター、パッケージング構築物、エンベロープ構築物、およびトランスウイルスベクター系のトランス酵素構築物に関して使用される構成要素を含む）の記載が以下で提供されるが、当業者は、容易に「機能的に等価」な構築物を産生し得ることが理解される。「機能的に等価」な構築物によって、各ＤＮＡ構築物（すなわち、パッケージング構築物、遺伝子移入ベクター、エンベロープ構築物、およびトランス酵素構築物）は、本明細書中で例示される特定のベクター構築物と実質的に同じ構造を有することが意図される。
【００７０】
トランスウイルスベクター系の種々のベクター中の遺伝的エレメントが、任意のウイルス供給源、詳細にはレトロウイルス供給源、およびより詳細にはレンチウイルス供給源由来であり得ることが、さらに理解される。トランスベクター系の種々の構成要素の機能的等価性についての例およびアッセイは、以下により十分に記載される。表１は、ＨＩＶ−１ゲノムの種々の遺伝的エレメントについての参考文献を提供し、そしてＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ０３３８１９に基づく一方で、他のレトロウイルスおよび／またはレンチウイルス由来の配列は当該分野において公知であり、そして所定の宿主種の動物に対して指向する機能的に等価なベクターおよびベクター発現系を構築するために使用され得ることが認識される。表１中で概説される構成要素およびその機能のより詳細な説明は、Ｃｏｆｆｉｎら（１９９７）Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（本明細書中で参考として援用される）において見出され得る。さらに、当業者は、種々の遺伝的エレメントにおける対立遺伝子バリエーションが、ウイルスの異なる単離体の間で存在し、そしてそのような改変体が、本発明の構築物において使用され得ることを認識する。例えば、そのようなウイルス単離体は、Ｌｉら（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：６５８７；Ｇｈｏｓｈら（１９９３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９４：８５８；および米国特許第５，８６９，３１３号（全て本明細書中で参考として援用される）において記載される。
【００７１】
【表１】
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本発明の機能的に等価な配列はまた、それぞれのネイティブの配列と実質的に同じ機能を保持するレトロウイルスゲノムの種々のフラグメントを含む。そのようなフラグメントは、少なくとも約１０個、１５個連続するヌクレオチド、少なくとも約２０個連続するヌクレオチド、少なくとも約２４個、５０個、６０個、８０個、１００個、１２０個、１４０個、１６０個、１８０個、２００個、２２０個、２４０個、２６０個、２８０個、３００個、３４０個、３６０個、３８０個、または目的の特定の遺伝的エレメントの全連続ヌクレオチドまでを含む。そのようなフラグメントは、ネイティブのウイルスゲノムを切断するような制限酵素の使用によって；ウイルスゲノムのネイティブなヌクレオチド配列からヌクレオチド配列を合成することによって獲られ得るか；またはＰＣＲ技術の使用によって得られ得る。詳細には、Ｍｕｌｌｉｓら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５５：３３５〜３５０およびＥｒｌｉｃｈ編（１９８９）ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照のこと。ここでも、種々のベクター構成要素の改変体（例えば、部位特異的突然変異誘発から生じる改変体）は、本発明の方法によって包含される。以下により詳細に記載されるように、機能的等価物を決定するための方法は、当該分野において利用可能である。
【００７２】
「改変体」によって、実質的に類似の配列が意図される。従って、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列について、改変体は、レンチウイルスベクター系の種々の構成要素と機能的に等価な配列を含む。改変体のヌクレオチド配列はまた、例えば、部位特異的突然変異誘発によって生成された、合成的に誘導されたヌクレオチド配列を含むが、これはなお、ネイティブ配列の機能を保持する。概して、本発明のヌクレオチド配列改変体またはアミノ酸配列改変体は、それぞれのネイティブのヌクレオチド配列と少なくとも７０％、概して８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。
【００７３】
ヌクレオチド配列の改変体は、遺伝コードの縮重に起因して保存的に異なるアミノ酸配列をコードし得る。これらの天然に存在する対立遺伝子改変体は、周知の分子生物学的技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびハイブリダイゼーション技術）の使用で同定され得る。改変体ヌクレオチド配列はまた、例えば、部位特異的突然変異誘発の使用によって生成された、合成的に誘導されたヌクレオチド配列を含むが、これはなお、機能的に等価なままである。
【００７４】
本発明において使用されるレンチウイルスベクター系において使用される、種々の全長ポリペプチドまたは成熟ポリペプチドについてのアミノ酸配列に関連して、改変体は、１つ以上のアミノ酸の、ネイティブポリペプチドのＮ末端および／もしくはＣ末端に対する欠失（いわゆる短縮）または付加；１つ以上のアミノ酸の、ネイティブポリペプチドにおける１つ以上の部位での欠失または添加；あるいは、１つ以上のアミノ酸の、ネイティブポリペプチドにおける１つ以上の部位での置換によって、ネイティブのポリペプチドから誘導されるポリペプチドを含む。そのような改変体は、例えば、遺伝的な多型またはヒトの操作から生じ得る。そのような操作の方法は、当該分野において一般的に公知である。
【００７５】
例えば、ポリペプチドのアミノ酸配列改変体は、目的の特定ベクターエレメントをコードするクローン化ＤＮＡ配列における突然変異によって調製され得る。突然変異誘発およびヌクレオチド配列変更のための方法は、当該分野において周知である。例えば、ＷａｌｋｅｒおよびＧａａｓｔｒａ編（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８〜４９２；Ｋｕｎｋｅｌら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７〜３８２；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；米国特許第４，８７３，１９２号；およびこれらにおいて引用された参考文献（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。種々のベクターのポリペプチドの生物学的活性に作用を及ぼさないと思われる適切なアミノ酸置換に関するガイダンスは、Ｄａｙｈｏｆｆら（１９７８）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）（本明細書中で参考として援用される）のモデルにおいて見出され得る。１つのアミノ酸と類似の特性を有する別のアミノ酸との交換のような保存的置換が好ましくあり得る。保存的置換の例としては、Ｇｌｙ←→Ａｌａ、Ｖａｌ←→Ｉｌｅ←→Ｌｅｕ、Ａｓｐ←→Ｇｌｕ、Ｌｙｓ←→Ａｒｇ、Ａｓｎ←→Ｇｌｎ、およびＰｈｅ←→Ｔｒｐ←→Ｔｙｒが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７６】
ネイティブヌクレオチド配列またはネイティブポリペプチドの改変体は、ネイティブ配列またはネイティブポリペプチドとの十分な同一性を有する。改変体は、わずか１個〜１０個のアミノ酸残基（例えば、６個〜１０個）、わずか５個のアミノ酸残基、わずか４個、３個、２個のアミノ酸残基、またはわずか１個のアミノ酸残基が異なり得る。ヌクレオチド配列の改変体は、わずか１個〜３０個のヌクレオチド（例えば、６個〜２０個）、わずか５個、わずか４個、３個、２個、またはわずか１個のヌクレオチド残基が異なり得る。
【００７７】
「配列同一性」によって、改変体のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の特定化された連続セグメントが整列され、そして参照配列のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と比較された場合、同じヌクレオチド残基またはアミノ酸残基は、改変体配列および参照配列内で見出されることが意図される。配列整列および配列間の同一性を決定するための方法が、当該分野において周知である。２つのヌクレオチド配列の最適整列に関連して、改変体ヌクレオチド配列の連続セグメントは、参照ヌクレオチド配列に関する付加ヌクレオチド配列または欠失ヌクレオチドを有し得る。同様に、２つのアミノ酸配列の最適な整列の目的のために、改変体アミノ酸配列の連続セグメントは、参照のアミノ酸配列に関して、付加アミノ酸残基または欠失アミノ酸残基を有し得る。参照ヌクレオチド配列または参照アミノ酸配列との比較のために使用される連続セグメントは、少なくとも２０個連続するヌクレオチドまたはアミノ酸残基を含み、そして３０個、４０個、５０個、１００個、あるいはそれ以上のヌクレオチド残基またはアミノ酸残基であり得る。改変体ヌクレオチド配列または改変体アミノ酸配列においてギャップを含めることに関連して増加した配列同一性についての補正は、ギャップペナルティーを割り当てることによってなされ得る。配列整列の方法は、当該分野において周知である。
【００７８】
２つの配列の間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。例えば、アミノ酸配列のパーセント同一性は、ギャップオープンペナルティー１２およびギャップ伸長ペナルティー２、ＢＬＯＳＵＭマトリクス６２を用いてアフィン６ギャップ検索を使用する、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムを使用して決定され得る。あるいは、アミノ酸配列のパーセント同一性は、ギャップオープンペナルティー２５およびギャップ伸長ペナルティー５を使用するＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムを使用して決定される。そのような配列同一性の決定は、例えば、ＴｉｍｅＬｏｇｉｃ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ＧからのＤｅＣｙｐｈｅｒ  Ｈａｒｄｗａｒｅ  Ａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒを使用して実行され得る。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ  ２：４８２〜４８９（本明細書中で参考として援用される）において教示される。あるいは、デフォルトパラメーターを使用する整列プログラムＧＣＧ  Ｇａｐ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ、Ｓｕｉｔｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．１）が使用され得る。ＧＣＧ  Ｇａｐプログラムは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｃｈのアルゴリズムを適用し、そしてオープンギャップペナルティー３および伸長ギャップペナルティー１を有するヌクレオチド配列の整列のために使用され得る。２つの配列の比較のために使用される数学的アルゴリズムの別の好ましい非限定的な例は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４のアルゴリズムであり、これは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３〜５８７７で改変された。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３のＮＢＬＡＳＴプログラムおよびＸＢＬＡＳＴプログラムへ組み込まれる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、十分な配列同一性を有するヌクレオチドを得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝１００、ワード長＝１２）で実行され得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、十分な配列同一性を有するアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝５０、ワード長＝３）で実行され得る。比較目的のためのギャップ化整列を得るために、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９において記載されるように使用され得る。あるいは、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔは、分子間の距離関係を検出する反復検索を実行するために使用され得る。Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）（前出）を参照のこと。ＢＬＡＳＴプログラム、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムおよびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、個々のプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターが使用され得る。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと。配列の比較のために使用される別の好ましい非限定な数学アルゴリズムの例は、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１〜１７のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれ、このプログラムは、ＧＣＧ配列整列ソフトウェアパッケージの部分である。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを使用する場合、ＰＡＭ１２０重量残基表、ギャップ長ペナルティー１２、およびギャップペナルティー４が使用され得る。
【００７９】
本発明の好ましい実施形態において、以下で記載されるＤＮＡ構築物は、ベクターまたはプラスミド上に含まれる。このプラスミドは、細菌複製起点、１つ以上の選択マーカー、プラスミド構築物が一本鎖で存在することを可能にするシグナル（すなわち、Ｍ１３複製起点）、マルチクローニングサイト、および「哺乳動物」複製起点（すなわち、ＳＶ４０またはアデノウイルスの複製起点）を含み得る。そのようなベクターは、当該分野において公知である。
【００８０】
（１．遺伝子移入ベクター）
上で記載されるように、トランスウイルスベクター系は、パッケージング構築物、ｅｎｖ構築物、およびトランス酵素構築物との組み合わせで遺伝子移入ベクターを提供し、これらは、複製適合のウイルスの形成を除外するトランスウイルスパッケージング細胞株の構築を可能にする。
【００８１】
本明細書中で使用される場合、「遺伝子移入ベクター」とは、欠くことのできない「シス作用性」の構成要素（遺伝子移入ベクターの転写を可能にする）を有するヌクレオチド配列；遺伝子移入ベクターｍＲＮＡ（すなわち、改変されたプロウイルスゲノム）のウイルス粒子へのカプセル化；遺伝子移入ベクターｍＲＮＡの逆転写；および遺伝子移入ベクターの標的細胞ゲノムへの組み込みをいう。
【００８２】
上述される機能を実行するシス作用性の核酸配列は、当該分野において周知である。例えば、遺伝子移入ベクターは、以下の構成要素を含み得る：５’ＬＴＲ；パッケージングシグナル；Ｒｅｖ応答性エレメント（ＲＲＥ）；および３‘ＬＴＲあるいはこれらのエレメントのそれぞれの任意の機能的改変体または誘導体。遺伝子移入ベクターは、所望の標的細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結された、目的の少なくとも１つのヌクレオチド配列をさらに含み得る。これらの構成要素のそれぞれは、以下により詳細に記載される。
【００８３】
５’ＬＴＲ配列および３’ＬＴＲ配列は、遺伝子移入ベクターの他のエレメントに近接する。ＬＴＲ配列は、プロウイルスゲノムの標的細胞のゲノムへの組み込みのために重要な他のシス作用性配列エレメントとともに、例えば、プロモーター／エンハンサーエレメントを含む複数のエレメントを含む。ＬＴＲの種々のシス作用性エレメントとしては、例えば、単一の前駆体ｍＲＮＡにおけるレトロウイルス遺伝子移入ベクターの発現を指向するウイルスプロモーター配列およびエンハンサー配列を含むＵ５領域（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０３３８１９のｎｔ９７〜１８１）およびＵ３領域（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０３３８１９のｎｔ８６３１〜９０８５）が挙げられる。他のＬＴＲの構成要素としては、ＲＮＡ転写開始に必要とされる配列（すなわち、トランス活性化領域（ＴＡＲ））、ポリアデニル化シグナル（ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ＡＦ０３３８１９のｎｔ１〜９６）を含むＲ領域が挙げられる。ＨＩＶ−１ウイルスについてのＬＴＲ配列および機能的な改変体のより完全な記載は、Ｐｅｒｅｉｒａら（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２８：６６３〜６６８（本明細書中で参考として援用される）において見出され得る。当業者は、遺伝子移入ベクターの種々の構成要素は、それらが５’ＬＴＲエレメントおよび３’ＬＴＲエレメントに対して内部に存在する限り、任意の順序で配列され得ることを理解する。移入ベクターは、逆転写の開始の際に機能するｔＲＮＡプライマー結合部位配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０３３８１９のｎｔ１８２〜１９９）をさらに含み得る。そのような変更は、当業者に公知である。自己不活性化（ＳＩＮ）ベクターのＬＴＲに対する改変のようなＬＴＲに対する改変がなされ得ることがさらに認識される。そのような変更は、当業者に公知である。
【００８４】
本明細書中で使用される場合、「パッケージングシグナル」または「ψシグナル」とは、ウイルスＲＮＡのウイルス粒子へのカプセル化のためにシスで必要とされる核酸配列をいう。本発明の方法において使用されるパッケージングシグナルは、遺伝子移入ベクターのウイルス粒子へのカプセル化のために必要とされる最小パッケージングシグナルであり得る。本発明の好ましいレトロウイルス遺伝子移入ベクターのためのこの最小のパッケージング配列は、改変されたプロウイルスゲノム（すなわち、遺伝子移入ベクター）のウイルス粒子への取り込みを指向するために十分である。
【００８５】
公知のパッケージングシグナルの改変体またはフラグメントは、改変体がレトロウイルス遺伝子移入ベクターのウイルス粒子へのカプセル化を指向する限り、本発明の方法において使用され得ることが認識される。例えば、最小のパッケージング配列を囲む配列を含む延長されたパッケージングシグナルは、遺伝子移入ベクターのウイルス粒子へのカプセル化の効率を増加させ得る。ＨＩＶパッケージングシグナルは、Ｍｃｂｉｒｄｅら（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：４５４４〜４５５４（本明細書中で参考として援用される）において、さらに特徴付けられている。
【００８６】
遺伝子移入ベクターはまた、Ｒｅｖ応答性エレメント（ＲＲＥ）を含み得る。このエレメントの存在は、ＲｅｖがＲＲＥを含むｍＲＮＡの核外移行に指向することを可能にする。ＲＲＥおよびその機能的な改変体の配列は、当該分野において公知である。例えば、Ｂｅｒｃｈｔｏｌｄら（１９９５）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２１１：２８５〜２８９；Ｄｉｌｌｏｎら（１９９０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：４４２８〜４４３７；Ｌｅら（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８：１６１３〜１６２３（全ては、参考として援用される）を参照のこと。Ｒｅｖ／ＲＲＥは、他のエレメント（例えば、Ｒｅｖに依存するＨＩＶ−１複製を可能にすることが示されたマッソン−プフィッツァーサルウイルス（ＭＰＭＶ）からのシス作用性の２１９ヌクレオチドの構成的な輸送エレメント（ＣＴＥ）を含む）で置換され得ることがさらに認識
される。例えば、Ｂｒａｙら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１２５６〜１２６０を参照のこと。
【００８７】
遺伝子移入ベクターは、目的のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ構築物をさらに含む。従って、ウイルス粒子によって標的細胞に導入された場合、遺伝子移入ベクターに含まれる目的のヌクレオチド配列は、発現され得る。目的のヌクレオチド配列およびこの配列を含むＤＮＡ構築物は、以下により十分に記載される。遺伝子移入ベクターは、目的の少なくとも１つのさらなるヌクレオチド配列を含み得ることがさらに認識される。
【００８８】
遺伝子移入ベクターは、プロモーターと作動可能に連結された選択マーカーを含む少なくとも１つのＤＮＡ構築物をさらに含み得る。選択マーカーの使用に関する詳細は、以下により詳細に記載される。当業者は、多数の可能性が存在することを理解する。選択マーカーの発現のために選択されたプロモーターは、遺伝子移入ベクターのパッケージング細胞株または標的細胞のゲノムへの組み込みをモニタリングするために、マーカーが使用されるか否かに依存することがさらに理解される。
【００８９】
図１〜２は、トランスウイルス系由来の遺伝子移入ベクターの非限定的な例を例示する。例示された構築物は、以下の構成要素に近接するＨＩＶ−１由来のＬＴＲ配列を含む：パッケージングシグナル；ＲＲＥ；中枢ポリプリン区域（ｃｅｎｔｒａｌ  ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ  ｔｒａｃｔ）（ＰＰＴ）およびＣＭＶプロモーターに作動可能に連結された目的のヌクレオチド配列。
【００９０】
（２．トランス酵素構築物）
トランス酵素構築物は、そのネイティブ構成とは異なる逆転写酵素およびインテグラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。特に、トランス酵素構築物は、機能的な逆転写酵素ポリペプチドおよび／またはインテグラーゼポリペプチドに作動可能に連結された、ウイルス粒子に対して標的される能力によって特徴付けられる第１ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする。例えば、ＨＩＶビリオン関連アクセサリータンパク質（ＶｐｒまたはＶｐｘ）あるいはその改変体またはフラグメントは、インテグラーゼ活性および逆転写活性を有するポリペプチドをトランスウイルスベクター粒子に送達するためのビヒクルとして使用され得る。この「トランスレンチ」ウイルスベクター設計は、図１において例示される。特に、トランス酵素構築物は、インテグラーゼおよび／または逆転写酵素あるいはその機能的な改変体およびフラグメントを含む少なくとも１つの異種ポリペプチドに対してインフレームで融合された、ＶｐｒポリペプチドまたはＶｐｘポリペプチドあるいはその機能的な改変体またはフラグメントを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含み得る。そのようなトランス酵素構築物は、当該分野において公知である。例えば、Ｌｉｕら（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：７７０４〜７７１０、Ｗｕら（１９９７）ＥＭＢＯ  Ｊ．１６：５１１３〜５１２２；米国特許第６，００１，９８５号；１９９８年６月３日に出願された米国特許出願０９／０８９，９００；および１９９９年１２月１４日に出願された米国出願第０９／４６０，５４８号（全て本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【００９１】
本明細書で使用される場合、「融合タンパク質」によって、インフレーム発現のために結合される少なくとも２つの異種ポリペプチド配列を有するポリペプチドが意図される。すなわち、異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、単一の翻訳産物に翻訳される。１つの実施形態において、トランス酵素構築物によってコードされる融合タンパク質は、ＶｐｒポリペプチドまたはＶｐｘポリペプチドあるいはその機能的なフラグメントまたは改変体を含む一方で、第２のポリペプチドは、インテグラーゼ活性または逆転写酵素活性を有するポリペプチドを含む。本発明の他の実施形態において、トランス酵素構築物によってコードされる融合タンパク質は、全ての３つのポリペプチドすなわち、Ｖｐｒ／Ｖｐｘ、逆転写酵素、およびインテグラーゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む（。
【００９２】
ＶｐｒポリペプチドおよびＶｐｘポリペプチドをコードする配列は、当該分野において公知である。例えば、米国特許第５，８６１，１６１号（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。ＶｐｒポリペプチドまたはＶｐｘポリペプチドのフラグメントおよび改変体が使用され得、そしてビリオン粒子へ組み込まれる能力を保持する。この活性を保持するＶｐｒ／Ｖｐｘポリペプチドのフラグメントおよび改変体の例は公知である。例えば、Ｐａｘｔｏｎら（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：７２２９〜７２３７および米国特許番号６，０４３，０８１号（両方とも本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。さらに、ＶｐｒポリペプチドまたはＶｐｘポリペプチドがビリオンに組み込まれるか否かを決定するためのアッセイは、当該分野において慣用的である。簡単には、マーカーポリペプチドに融合されるＶｐｒポリペプチド／Ｖｐｘポリペプチドのフラグメントまたは改変体は、ウイルス粒子を産生し得るパッケージング細胞株中で発現される。細胞株は培養され、そしてウイルス粒子が産生される。ウイルス粒子は単離され、そしてマーカータンパク質の存在についてアッセイされる。例えば、Ｐａｘｔｏｎら（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：７２２９〜７２３７を参照のこと。
【００９３】
トランスベクター設計の別の実施形態は、図２において例示される。この特定の非限定的な実施例における設計は、インテグラーゼ活性および逆転写酵素活性を有するポリペプチドをトランスウイルスベクター粒子へ送達するためにウイルス粒子に標的化される能力を保持するＧａｇポリペプチドのフラグメントを使用するトランスレトロウイルスベクター設計として、本明細書中で称される。
【００９４】
詳細には、この実施形態において、トランス酵素構築物は、ウイルス粒子に対して標的化される能力を保持するＧａｇポリペプチドのフラグメントを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含み得、これは、インテグラーゼおよび／または逆転写酵素あるいはその機能的な改変体およびフラグメントを含む少なくとも１つの異種ポリペプチドに対して、インフレームで融合されている。そのようなトランス酵素構築物は、当該分野において公知である。例えば、１９９９年１２月１４日に出願された米国特許出願第０９／５７８，５４８号を参照のこと。
【００９５】
１つの実施形態において、トランス酵素構築物によってコードされる融合タンパク質が、ウイルス粒子に対して標的される能力を保持するＧａｇのフラグメントを含む一方で、第２のポリペプチドは、インテグラーゼ活性または逆転写酵素活性を有するポリペプチドを含む。本発明の他の実施形態において、トランス酵素構築物によってコードされる融合タンパク質は、全ての３つのポリペプチド（すなわち、Ｇａｇ：逆転写酵素：インテグラーゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００９６】
Ｇａｇポリペプチドをコードする配列は、当該分野において公知である。Ｇａｇポリペプチドのフラグメントおよび改変体は、ビリオン粒子に取り込まれる能力を保持する。この活性を保持するＧａｇポリペプチドのフラグメントおよび改変体の例は公知である。
【００９７】
インテグラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列もまた、公知である（表１を参照のこと）。インテグラーゼは、ウイルスの生活環の多くの局面に関与する。例えば、インテグラーゼは、ビリオン構築および成熟プロセスの種々のステップに関与し、そして、宿主細胞内のウイルスゲノムの逆転写および組み込みに関与することが示されてきた（Ｌｉｅら（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：８８３１〜８８３６およびＣｒａｉｇｉｅら（２００１）Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．Ｍａｎｕｓｃｒｉｐｔ  Ｒ１０００２７２００）。本発明の方法において使用されるインテグラーゼポリペプチドは、任意のウイルス供給源、特にレトロウイルス供給源、特にレンチウイルス供給源由来であり得る。
【００９８】
インテグラーゼポリペプチドあるいはその改変体またはフラグメントは、インテグラーゼ活性を有する。インテグラーゼ活性によって、ポリペプチドが、ウイルス粒子の産生を支持する（すなわち、ウイルス組み立て、成熟、および／または組み込みを支持する）に十分な活性を保持することが意図される。ウイルス組み立て、成熟、および組み込みに影響を及ぼすインテグラーゼポリペプチドの領域は、当該分野において公知である（これらの機能を決定するためのアッセイが公知であるように）。例えば、インテグラーゼの触媒中心における変異は、ウイルス粒子の感染性を減少する。例えば、Ｌｉｕら（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：７７０４〜７７１０；Ｗｕら（２０００）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：４７〜５５；およびＣｒａｉｇｉｅら（２００１）Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．Ｍａｎｕｓｃｒｉｐｔ  Ｒ１０００２７２００ならびにＬｉｕら（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２３：８８３１〜８８３６（全て本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【００９９】
逆転写酵素をコードするヌクレオチド配列は、当該分野において公知である（表１を参照のこと）。逆転写酵素は、プライマーとして細胞性ｔＲＮＡを使用する、一本鎖のＲＮＡテンプレートから二本鎖で直鎖のＤＮＡの合成に関与する。本発明において使用される逆転写酵素は、任意のレトロウイルス供給源、特にレンチウイルス供給源（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、およびＳＩＶを含むが、これらに限定されない）由来であり得る。逆転写酵素ポリペプチドあるいはその改変体またはフラグメントは、逆転写酵素活性を有する。
【０１００】
「逆転写酵素活性」によって、ポリペプチドが、ウイルス粒子の産生を支持する（遺伝子移入ベクターの複製を触媒する）ために十分な活性を保持することが意図される。逆転写活性を測定するためのアッセイは、当該分野において公知である。例えば、逆転写酵素活性の測定は、人工的なテンプレート／プライマー構築物およびヌクレオチドの基質として、トリチウム化デオキシヌクレオチド三リン酸を使用して実行され得る。このアッセイ系は、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で沈殿され得るＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドにおける放射活性の取り込みの検出に基づく。逆転写活性を決定するための他の方法は、例えば、米国特許第６，１３２，９９５号（本明細書中で参考として援用される）において見出され得る。
【０１０１】
１つの翻訳産物に翻訳される（すなわち、インフレームで融合される）異種ポリペプチドをコードする少なくとも２つのヌクレオチド配列を有する発現ベクターを生成することが、当該分野の十分な技術範囲内である。さらに、当業者は、リンカー配列がペプチドのコード領域をインフレームのままにしておく限り、リンカーは、トランス酵素構築物の異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列との間に配置され得ることを理解する。そのようなリンカー配列としては、例えば、パッケージング構築物上でコードされるプロテアーゼによって認識されるプロテアーゼ切断部位が挙げられる。そのような配列は、当該分野において公知であり、そして例えば、ＨＩＶ−１ゲノムの逆転写酵素コード配列に対して５’の３３個のヌクレオチドあるいは、ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ＬＯ２３１７のインテグラーゼコード配列に対して５’に位置する１８個のヌクレオチドを含む。例えば、Ｗｕら（１９９７）ＥＭＢＯ  Ｊ．１６：５１１３〜５１２２を参照のこと。当業者は、ＶｐｒまたはＶｐｘポリペプチドからの逆転写酵素またはインテグラーゼの効果的な切断を生じるためのそのような配列の使用方法を認識する。
【０１０２】
複製欠損トランスウイルス粒子を産生するために、インテグラーゼおよび逆転写酵素の両方が、ＧａｇポリペプチドまたＧａｇ／Ｐｒｏポリペプチドをコードするパッケージング構築物に対してパッケージング細胞株中で、イントランスで発現される。本発明の１つの実施形態において、逆転写酵素およびインテグラーゼを含む融合タンパク質は、２つの別個のトランス酵素構築物に関するパッケージング細胞株中で発現される。この実施形態において、パッケージング細胞株は、少なくとも２つのトランス酵素構築物を含む。トランスレンチウイルスベクターを使用する場合、一例として、ＶｐｘまたはＶｐｒおよび逆転写酵素を含む第１の融合タンパク質、ならびにＶｐｘまたはＶｐｒおよびインテグラーゼを含む融合タンパク質をコードする第２のトランス酵素構築物が設計される。これらの構築物におけるポリペプチドの順序は、変更し得ることが理解される。さらに、トランスレトロウイルスベクター設計は、同様の方法で使用され得ることが理解される。
【０１０３】
トランス酵素構築物の別の実施形態において、逆転写酵素およびインテグラーゼあるいはそれらの改変体またはフラグメントをコードするポリペプチドが、１つの翻訳産物として発現される。この実施形態において、トランス酵素構築物は、以下のポリペプチドあるいはその機能的改変体またはフラグメントを有する（インフレームで融合される）融合タンパク質をコードする：ＶｐｒまたはＶｐｘ、逆転写酵素、およびインテグラーゼ。例えば、米国特許出願第０９／０８９，９００号およびＷｕら（１９９７）ＥＭＢＯ  Ｊ．１６：５１１３〜５１２２を参照のこと。
【０１０４】
トランス酵素構築物の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、パッケージング細胞株中で活性なプロモーターと作動可能に連結される。トランス酵素構築物を含むＤＮＡ構築物は、またパッケージング細胞株において機能的である転写停止領域および翻訳停止領域をさらに含み得る。目的のプロモーターとしては、例えば、ニワトリβアクチンプロモーターＣＭＶ、ＨＩＶ−２  ＬＴＲ、ＳＨＶＴＫプロモーター、ＲＳＶプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーターおよびＳＶ４０プロモーターが挙げられる。
【０１０５】
図１は、トランスレンチウイルスベクター系のトランス酵素構築物の１つの非限定的な例を例示する。この構築物は、以下の作動可能に連結される構成要素を含む：ＣＭＶプロモーター；Ｖｐｒポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；逆転写酵素をコードするヌクレオチド配列；インテグラーゼをコードするヌクレオチド配列；ＨＩＶ−２からのＲＲＥ；およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナル。図１において例示されるトランス酵素構築物は、逆転写酵素のＮ末端プロテアーゼ切断部位および逆転写酵素ポリペプチドとインテグラーゼポリペプチドとの間のプロテアーゼ切断部位を保存する。
【０１０６】
（３．パッケージング構築物）
上で記述されるように、本発明の方法において使用されるトランスウイルス粒子は、パッケージング構築物（遺伝子導入ベクター、ｅｎｖ構築物、およびトランス酵素構築物との組み合わせで、複製能力のあるウイルスの形成を除外するパッケージング細胞株の構築を可能にする）をさらに提供する。
【０１０７】
パッケージング構築物は、機能的なインテグラーゼポリペプチドも逆転写酵素ポリペプチドもコードしない短縮化Ｇａｇ／Ｐｏｌ（すなわち、Ｇａｇ／Ｐｒｏ）配列をコードする、少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む核酸配列として特徴付けられる。Ｇａｇ／Ｐｒｏポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、コアマトリクスおよびヌクレオカプシドポリペプチドを作る種々の構造タンパク質を含む。この配列は、機能的プロテアーゼをさらにコードする。Ｇａｇ／Ｐｒｏ配列は、本明細書中の他の箇所で記載されるように任意のレトロウイルスに由来し得る。このようなＧａｇ／Ｐｒｏ配列は、当該分野において公知であり、そして、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ＡＦ０３３８１９のヌクレオチド３３６〜２０９９が挙げられる。
【０１０８】
パッケージング構築物は、複製欠損のウイルス粒子の産生のために必要とされるウイルスゲノム（特に、レトロウイルスゲノム）からのヌクレオチド配列をさらに含み得る。パッケージング構築物において含まれ得る遺伝的エレメントの例としては、Ｖｉｆ、Ｔａｔ、およびＲｅｖをコードするヌクレオチド配列が挙げられるが、これらに限定されない。しかし、パッケージング構築物は、機能的なエンベロープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、機能的な逆転写酵素ポリペプチド、および機能的インテグラーゼポリペプチドを含まない。これらの配列は、全体的または部分的に欠失されているか、あるいは機能的なポリペプチドの翻訳を防止するように変更されている。さらに、パッケージング構築物は、機能的なパッケージングシグナル（ψシグナル）を欠き、それによってこの構築物から産生されるＲＮＡが、ウイルス粒子に取り込まれるのを防止する。
【０１０９】
米国特許出願０９／０８９，９００においてより詳細に説明されるように、逆転写酵素およびインテグラーゼがパッケージング構築物中で変異される方法は、ウイルス粒子の感染性に影響を及ぼし得る。逆転写酵素およびインテグラーゼが、トランス酵素構築物においてイントランスで発現される場合、任意の変化は、ポリペプチドの機能を破壊し、そして感染性で複製欠損のトランスウイルスベクターの産生をなお可能にするパッケージング構築物において、逆転写酵素配列および／またはインテグラーゼ配列に対してなされ得ることが理解される。例えば、１つの実施形態において、逆転写酵素配列およびインテグラーゼ配列は、プロテアーゼ配列に対して３’で終止コドンを含むように変更される。複数の変異が逆転写酵素配列およびインテグラーゼ配列に導入され得ることがさらに理解される。例えば、逆転写酵素のコード配列中に翻訳終止を初期に導入することに加えて、少なくとも１つのさらなる「致命的な」変異が、逆転写酵素コード配列および／またはインテグラーゼコード配列内に位置付けられ得る。このさらなる突然変異は、完全なＧａｇ−Ｐｏｌコード領域をパッケージング構築物とトランス酵素構築物との間の遺伝的な組み換えによって回復する可能性をさらに減少させる。
【０１１０】
パッケージング構築物のヌクレオチド配列は、パッケージング細胞株において活性なプロモーターをさらに含むＤＮＡ構築物中に含まれる。このＤＮＡ構築物は、パッケージング細胞株中で機能的でもある転写停止領域および翻訳停止領域をさらに含み得る。目的のプロモーターとしては、例えば、ＣＭＶ、ＨＩＶ−２  ＬＴＲ、ＨＣＭＶ−ＩＥ（Ｎａｌｄｉｎｉら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：２６３〜２６７）、ＳＨＶＴＫプロモーター、ＲＳＶプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーターおよび、ＳＶ４０プロモーターが挙げられる。このパッケージング構築物は、活性プロモーターに作動可能に連結される選択可能なマーカーをさらに含み得る。
【０１１１】
当業者は、パッケージング構築物の種々の機能的改変体が想定され得ることを認識する。図１〜２は、本発明の方法において有用なパッケージング構築物の非限定的な例を例示する。この構築物は、Ｇａｇ／Ｐｒｏ、Ｖｉｆ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ（ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号Ｌ０２３１７のｎｔ２５８〜８３８４）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されるＣＭＶプロモーターを含む。図１のパッケージング構築物は、逆転写酵素コード配列およびインテグラーゼコード配列の第１のアミノ酸位置で翻訳停止コドン（ＴＡＡ）、ψシグナルの欠失、Ｖｐｒコード配列におけるフレームシフト変異、ｎｅｆ遺伝子の完全欠失、不活性なＶｐｕポリペプチドを生じる内部欠失、およびＥｎｖポリペプチドをコードするヌクレオチドの欠失をさらに含む。パッケージング構築物の構築のより詳細な記載については、米国特許出願０９／０８９，９００を参照のこと。
【０１１２】
（４．Ｅｎｖ構築物）
本発明は、上述されるパッケージング構築物、遺伝子移入ベクター、およびトランス酵素構築物の組み合わせで、複製が完全なトランスウイルスベクター粒子の形成を除外するｅｎｖ構築物を提供する。
【０１１３】
トランスウイルス系のｅｎｖ構築物は、活性プロモーターと作動可能に連結されるエンベロープタンパク質あるいはその機能的な改変体またはフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む。種々のエンベロープポリペプチドが、当該分野において公知である。本発明のウイルス粒子が感染し得る宿主細胞の範囲は、使用されるエンベロープコード配列に依存して変化し得ることが認識される。本発明において有用であるウイルスエンベロープタンパク質としては、ＨＩＶエンベロープポリペプチドタンパク質（表１を参照のこと）、ＭＬＶエンベロープ糖タンパク質（Ｐａｇｅら（１９９０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：５２７０〜５２７６）、水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）（Ｙｅｅら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：９５６４〜９５６８およびＢｕｒｎｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：８０３３〜８０３７）またはエボラおよびマコラ（Ｍａｋｏｌａ）のエンベロープポリペプチド（Ｋｏｂｉｎｇｅｒら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９：２２５〜２３０）が挙げられる。本発明の好ましい実施形態において、選択されたｅｎｖコード配列は、ウイルス粒子の受精卵母細胞への侵入を可能にする。本発明の方法において、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ−Ｇ）のＧタンパク質あるいはそのフラグメントまたは改変体が、ｅｎｖ構築物において使用される。本発明の方法において有用なさらなるエンベロープポリペプチドを決定するための偽型決定アッセイは、当該分野において周知である。トランスウイルスベクター粒子は、Ｅｎｖ構築物の非存在において構築され得ることがさらに理解される。
【０１１４】
エンベロープポリペプチドのフラグメントまたは改変体は、複製欠損ウイルス粒子の産生を支持する（すなわち、レトロウイルス粒子のエンベロープへ取り込まれ得、そして標的細胞に結合し得、そしてウイルス粒子が標的細胞に侵入することを可能にし得る）ために十分な活性を保持する。Ｅｎｖポリペプチドあるいはそのフラグメントまたは改変体の機能を決定するためのアッセイは、当該分野において公知である。例えば、本発明のＥｎｖポリペプチドのフラグメントまたは改変体の発現は、そのパッケージング細胞株中で産生されるベクターが、未処置の感受性細胞に（マーカーとなる薬剤選択に対して耐性となるような）選択可能なマーカーを伝達することを可能にする。
【０１１５】
任意のプロモーター配列は、それがパッケージング細胞株において活性である限り、ｅｎｖ構築物において使用され得る。そのようなプロモーター配列は、本明細書中の他のところで記載されている。適切なポリアデニル化シグナルの代表的な例としては、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン停止／ポリアデニル化配列、およびインスリンポリアデニル化配列が挙げられる。
【０１１６】
ｅｎｖ構築物は、選択可能なマーカーをコードするヌクレオチド配列をさらに含み得る。そのような選択可能なマーカーの例としては、抗生物質（例えば、ピューロマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシンなど）に対する宿主耐性を付与し得るか、またはアミノ酸アナログなどに対する耐性を付与し得るヌクレオチド配列が挙げられる。他の選択可能なマーカーは、当該分野において周知であり、これは、例えば、βｇａｌ、ＧＦＰ、およびルシフェラーゼが挙げられる。当業者は、多数の可能性を理解する。
本発明のｅｎｖの構築物の例示的および非限定的な例として、ｅｎｖ構築物が、図１において示される。この構築物は、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルに作動可能に連結するＶＳＶ−Ｇコード領域に作動可能に連結する最初期プロモーターを含む。
【０１１７】
（５．パッケージング細胞株）
本発明の方法において使用されるトランスウイルス粒子は、当該分野において公知である技術を使用して生成される。例えば、米国特許第４，６５０，７６４号、および米国特許出願第０９／０８９，９００号（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。本方法は、パッケージング細胞株へトランス酵素構築物、遺伝子移入構築物、ｅｎｖ構築物、およびパッケージング構築物を組み込む工程；パッケージング細胞株をウイルス粒子の形成を可能にする適切な条件下で培養する工程；およびトランスウイルス粒子を単離する工程を包含する。広く種々の動物細胞が、本発明のパッケージング細胞株（例えば、脊椎動物、またはヒト、ネコ、ヤギ、ウシ、ヒツジ、イヌ、およびマウスのような哺乳動物から得た細胞を含む）を調製するために使用され得る。適切なパッケージング細胞としては、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ２）；ＨＴ１０８０（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ１２１）；２９３（ＡＴＣＣ番号１５７３）；および２９３Ｔ細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１８】
種々のベクター構築物は、当該分野において公知の任意の方法によってパッケージング細胞に導入され得る。そのような方法としては、エレクトロポレーション、リポソームの使用、およびＣａＰＯ４沈殿が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ａｕｓａｂｅｌら（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｇ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，および米国特許第５，７３９，０８１号（両方とも本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。トランスレンチウイルス系の種々の構築物が、一過性でパッケージング細胞株中で発現され得るか、あるいは、任意のまたは全ての構築物が、パッケージング細胞のゲノムに安定に組み込まれ得ることがさらに認識される。
【０１１９】
トランスレンチウイルス粒子が産生される条件下でパッケージング細胞株を培養する方法および引き続くレトロウイルスベクター粒子の単離がまた、当該分野において公知である。例えば、レトロウイルスベクターパッケージング細胞株は、標準的培養技術（種々の単層培養系のいずれかを含む）を使用して培養され得る。そのようなパッケージング細胞株は、Ｔフラスコ、回転式ボトル、またはバイオリアクター中で培養され得る。５％胎児ウシ血清を含むＡＩＭ−Ｖ培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、Ｎ．Ｙ）または１０％熱不活化胎児ウシ血清を補充し、高いグルコース（４．５ｇ／ｌ）を有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）のような任意の適切な培地が使用され得る。
【０１２０】
レトロウイルスベクター粒子を単離する方法は、当該分野において公知であり、例えば、米国特許第５，６６１，０２２号および米国特許第６，０１３，５１７号（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。本明細書中で使用される場合、「精製されたトランスウイルスベクター粒子」は、レトロウイルスベクター粒子の少なくとも５０重量％、６０重量％、７０重量％。８０重量％、好ましくは少なくとも８５重量％、およびより好ましくは少なくとも９０重量％、９３重量％、９５重量％、９８重量％、９９重量％を含むトランスウイルスベクター粒子の調製を意味する。
【０１２１】
（ＩＩＩ．目的のヌクレオチド配列）
本明細の方法および組成物において、レンチウイルスベクターの改変されたプロウイルスゲノムは、目的の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。目的の核酸配列は、遺伝的に改変された動物に対して異種であっても同種であってもよい。異種によって、動物のゲノム中で天然にみいだされないヌクレオチド配列が意図される。同種によって、動物中で天然に見出され、そして天然に存在する配列のものとは異なる位置で動物のゲノムに組み込まれるヌクレオチド配列が意図される。
【０１２２】
目的の任意のヌクレオチド配列は、本発明の方法において使用され得る。その発現が検出可能な表現型を生じるヌクレオチド配列が、特に目的である。これらの結果、哺乳動物における異種産物の発現または内在性の産物の増加した発現を指向することによって達成され得る。あるいは、これらの結果は、１つ以上の内在性産物（例えば、動物における種々の酵素または補因子）の発現を減少させることによって達成され得る。当業者は、目的のそのようなヌクレオチド配列が、ポリペプチド、リボザイム、またはアンチセンス配列をコードし得ることを理解する。
【０１２３】
目的の遺伝子は、工業市場（ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  ｍａｒｋｅｔ）および遺伝的に改変された動物の発生に関与する市場の興味を反映する。目的のヌクレオチド配列の一般的なカテゴリとしては、例えば、雌性哺乳動物のミルク中での組換えポリペプチドの産生；疾患の研究のための動物モデルの産生；疾患（例えば、乳腺炎のような乳腺の疾患）に対して高い耐性を有する動物の産出；および動物の血液、尿あるいは他の適切な生体流体または組織中での組換えポリペプチドの産生に関与する配列が挙げられる。さらに、目的のヌクレオチド配列は、発生、変異誘発、奇形発生、動物の成長、再生、および例えば、肉／ミルク産生を改善するかまたは特定の作物学的特性を付与するために設計された遺伝子改変の効率の研究を進めるための方法として選択され得る。
【０１２４】
目的のヌクレオチド配列の非限定的な例としては、ミルクタンパク質（すなわち、ラクトフェリン、リゾチーム、分泌性免疫グロブリン、ラクトアルブミン、胆汁酸塩刺激性リパーゼなど）；血清タンパク質（すなわち、アルブミン、免疫グロブリン、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、プロテインＣなど）；および、工業酵素（すなわち、真核生物供給源および原核生物供給源由来のプロテアーゼ、リパーゼ、キチナーゼ、あるいはリグナーゼ）をコードする配列が挙げられる。組換えＤＮＡ配列としては、組換えポリペプチドをコードするゲノムおよびｃＤＮＡ配列が挙げられる。さらに、目的のヌクレオチド配列は、種々の生理学的プロセスにおけるその役割について選択され得、そしてその結果として、薬物の開発において使用するためのモデル動物系を産生して化合物の効能および毒性を評価するために使用される（Ｌｉｇｇｉｔｔら（１９９２）Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ，２２（９〜１０）：１０４３〜１０５４）。
【０１２５】
特定の実施形態において、ヌクレオチド配列は、リボザイムを含む。リボザイムは、ＲＮＡを含む種々の反応（ポリヌクレオチド鎖の切断およびライゲーションを含む）を行なうリボ核酸（ＲＮＡ）から構成される酵素である。リボザイムの特異性は、リボザイムの標的ドメインと基質ＲＮＡとの間の塩基対形成（水素結合）によって決定される。標的ドメインのヌクレオチドの変更は、この特異性を改変し得る。リボザイムの触媒ドメインもまた、酵素の活性または安定性を増強するために変化され得る。リボザイムを設計する方法は、当該分野において公知である。例えば、米国特許第５，６４６，０３１号；同第５，６４６，０２０号；および同第５，６３９，６５５号（全て本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【０１２６】
あるいは、ヌクレオチド配列は、アンチセンスヌクレオチド配列を含み得る。この実施形態において、目的のヌクレオチド配列は、遺伝的に改変された動物の標的化された配列と相補的な配列を有するヌクレオチドを含む。アンチセンス配列によって標的化された核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかであり得る。標的化されたヌクレオチド配列は、その発現が目的の表現型に関連する細胞性遺伝子を含む。アンチセンス相互作用が生じるはずである部位または標的化された遺伝子内の部位は、例えば、標的化された配列によってコードされるポリペプチドの発現を調節するはずであり（転写レベルまたは翻訳レベルのいずれかで）、それによって、得られた遺伝的に改変された動物の表現型を変更する。アンチセンスオリゴヌクレオチドで標的化するための好ましい部位は、標的化された遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳開始コドンまたは停止コドンを含む領域を含む。転写開始コドンまたは「５’キャップ部位」および５’キャップ領域（キャップ化ｍＲＮＡの先端５’末端での約２５個〜約５０個の連続ヌクレオチドを含む）もまた、アンチセンスヌクレオチド配列の効果的な標的であり得る。
【０１２７】
別の実施形態において、遺伝子移入ベクター中に含まれる目的のヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列を含み、発現される場合、この配列は、ＲＮＡ干渉を媒介し得るＲＮＡ分子を含む。「ＲＮＡ干渉」によって、標的遺伝子と同一であるかまたは十分な配列同一性を有するＲＮＡの存在が、標的細胞から転写されるメッセンジャーＲＮＡの分解を生じる現象が意図される（Ｓｈａｒｐ（２００１）Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．１５：４８５〜４９０（本明細書中で参考として援用される））。この実施形態において、ウイルスベクターは標的細胞と接触され、そしてこの標的細胞（または生物）は、干渉ＲＮＡの発現およびその結果としての標的ｍＲＮＡの分解を可能にする条件下で維持される。
【０１２８】
ＲＮＡ干渉を媒介するＲＮＡは、ＲＮＡ分子、ＲＮＡセグメントまたはＲＮＡフラグメントを含み得る。これらの用語は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、単離されたＲＮＡ（部分的に精製されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、または組換えで産生されたＲＮＡ）、および１つ以上ヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または変更によって、天然に存在するＲＮＡとは異なる変更ＲＮＡを含む。
【０１２９】
この実施形態において使用される目的のヌクレオチド配列から発現された干渉ＲＮＡは、１本の鎖あたり２つ以上の核酸ポリマーのヌクレオチドを含み得る。特定の実施形態において、干渉ＲＮＡを含む目的のヌクレオチドは二本鎖であり、そして１本の鎖あたり約５０個〜約４０個のヌクレオチド塩基、１本の鎖あたり約４０個〜約３０個のヌクレオチド塩基または１本鎖あたり約１５個〜約５０個のヌクレオチド塩基を含む。「ｓｉＲＮＡ」によって、二本鎖ＲＮＡとして特徴付けられ、そして１本鎖あたり３０個未満のヌクレオチド塩基あるいは１本の鎖あたり約１０個〜約３０個のヌクレオチド、１本の鎖あたり約１５個〜約３０個のヌクレオチドまたは１本の鎖あたり約２１個〜約２５個のヌクレオチドである短い干渉ＲＮＡが意図される。干渉ＲＮＡ配列および標的配列と完全に対応が存在する必要は無いが、その対応は、ＲＮＡが標的ｍＲＮＡのＲＮＡ干渉切断へ指向することを可能にするために十分でなければならないことが認識される。ＲＮＡ干渉についてアッセイするための方法は当該分野において公知であり、そして例えば、ノーザン解析または検出可能な表現型についてのアッセイが挙げられる。米国出願公開２００２／０１３２７８８および米国出願公開２００２／０１６２１２６（両方とも本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【０１３０】
ＲＮＡ干渉を媒介するＲＮＡを発現させそして設計する方法は、当該分野において公知である。例えば、Ｐａｕｌら（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：５０５〜５０８（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。例えば、１つの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、細胞間プロセッシング後にｓｉＲＮＡを生じる折り畳みステムループ構造として発現される。これらのｓｉＲＮＡは、標的細胞中のｓｉＲＮＡ様分子へ細胞内にプロセスされる。別の実施形態において、ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、標的細胞中で個々に転写される。この実施形態において、標的細胞のセンス鎖を含む第１のｓｉＲＮＡが発現され、そして標的遺伝子のアンチセンス鎖を含む第２のｓｉＲＮＡが発現される。第１および第２のｓｉＲＮＡが同じまたは別個の遺伝子導入ベクター中に含まれ得ることがさらに認識される。米国出願公開第２００２／０１３２７８８号；米国出願公開第２００２／０１６２１２６号および米国出願第２００２／００８６３５６号（全てが本明細書中で参考として援用される）もまた参照のこと。
【０１３１】
当業者は、種々のプロモーターが干渉ＲＮＡを発現するために使用され得ることを理解する。例えば、Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターのＩＩＩ型クラス（例えば、Ｕ６またはＨ１プロモーター）は成功することが証明されている。例えば、Ｔｕｓｃｈｌ（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：４４６〜４４８；ＭｉｙａｇｉｓｈｉおよびＴａｉｒａ（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：４９７〜５００；ＰａｕｌｅおよびＷｈｉｔｅ（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２８：１２８３−１２９８（全ては本明細書で参考として援用される）を参照のこと。Ｐｏｌ  ＩＩプロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを含む）の様な他のプロモーターが使用され得る。例えば、Ｘｉａら（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：１００６〜１０１０（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。当業者は、ポリアデニル化シグナルがまた、干渉ＲＮＡの発現を改善するために添加され得ることをさらに理解する。
【０１３２】
干渉ＲＮＡが標的遺伝子の発現を減少させる（部分的にまたは完全に）ための方法として使用され得ることが、さらに認識される。遺伝子発現を減少させるこの方法は、治療上または研究のために（例えば、疾患状態にあるモデルを作製するために、遺伝子の機能を試験するために、薬剤が遺伝子上で作用するか否かを評価するため、創薬のために標的を確認するためになど）使用され得る。遺伝子機能が削除されるこれらの例において、得られた細胞または生物はまた、「ノックアウト」または「ノックダウン」として称され得る。さらに、多くの疾患は、特定の遺伝子または遺伝子の群の異常な発現から生じる。ＲＮＡ干渉は、遺伝子発現を阻害し、それによって疾患の症状を減少するかまたは疾患を治療するために使用され得る。
【０１３３】
目的のヌクレオチド配列は、ＤＮＡ構築物中に含まれる。特定の実施形態において、ＤＮＡ構築物は、標的細胞中で目的のヌクレオチド配列の発現のために必要な全てのエレメントを含む。従って、ウイルス粒子によって標的細胞へ導入される場合、レンチウイルスベクターの改変されたプロウイルスゲノム中に含まれる目的のヌクレオチド配列が発現され得る。
【０１３４】
「作動可能に連結される」によって、個々のヌクレオチド配列は、目的のヌクレオチド配列の発現が５’調節配列および３’調節配列の調節制御の下にあるように連結されることが意図される。目的のヌクレオチド配列がポリペプチドをコードする場合、「作動可能に連結される」は、コード配列の発現が適切なリーディングフレームで生じるようなヌクレオチド配列の連結を、さらに包含する。遺伝子導入ベクターは、プロモーターに作動可能に連結される少なくとも１つのさらなる目的のヌクレオチド配列を含み得る。
【０１３５】
本明細書中で使用される場合、目的のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ構築物は、転写の５’から３’方向で、標的化された宿主細胞（すなわち、遺伝的に改変された動物の細胞）において機能的な転写開始領域および翻訳開始領域、目的のヌクレオチド配列、ならびに転写停止領域および翻訳停止領域を含み得る。転写開始領域、プロモーターは、標的細胞に対してネイティブまたは異物であり得る。さらに、プロモーターは、天然の配列または合成配列であり得る。「異物」によって、転写開始領域は、レンチウイルスベクターが導入される標的細胞中で見出されないことが意図される。異種プロモーターを使用して配列を発現させることが好ましくあり得る一方で、ネイティブプロモーター配列が使用され得る。停止領域は、転写開始領域を有してネイティブであり得るか、目的の作動可能に連結されたＤＮＡ配列を有してネイティブであり得るか、または別の供給源に由来され得る。
【０１３６】
プロモーターが標的細胞において活性である限り、任意のプロモーターは、目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。そのようなプロモーターは、構成的プロモーターであり得る（すなわち、βアクチンプロモーター（Ｂａｌｌｉｎｇら（１９８９）Ｃｅｌｌ  ５８：３３７〜３４７およびＢｅｄｄｉｎｇｔｏｎら（１９８９）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １０５：７３３〜７３７）、メタロチオネインプロモーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒら（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２２：８０９〜８１４およびＩｗａｍｏｔｏら（１９９１）ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３１６７〜３１７５）、ＨＭＧＣＲプロモーター（Ｍｅｈｔａｌｉら（１９９０）Ｇｅｎｅ  ９１：１７９〜１８４およびＴａｍら（１９９２）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１５：７０３〜７１５）、およびヒストンＨ４プロモーター（Ｃｈｏｉら（１９９１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：３０７０〜３０７４）。さらなるプロモーターエレメントまたはエンハンサーエレメントは、例えば、原核生物プロモーターデータベースおよび米国特許第６，２７１，４３６号（本明細書中で参考として援用される）において見出され得る。
【０１３７】
あるいは、プロモーターは、条件的に活性である。「条件的」なプロモーターによって、このプロモーターは、特に活性化されるまでサイレントである（または、発現の減少を示す）ことが意図される。プロモーターは、実験操作（例えば、薬物または他の活性な薬剤の投与）によって活性化され得るか、あるいは、プロモーターは、特定の発生段階または特定の組織において活性化され得る。
【０１３８】
発生的に調節される条件的なプロモーターは、例えば、未分化細胞中で活性なプロモーター（ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｐｇｋ）プロモーターおよびオクトマー結合性転写因子４（Ｏｃｔ−４）プロモーターを含む）を含む。
【０１３９】
「組織に好ましいプロモーター」は、実質的に選択された組織または細胞の型においてのみ発現されるが、遺伝的に改変された動物中でそのような組織または細胞の型におけるヌクレオチド配列の発現が、動物に対して有害でない場合、他の組織および／または細胞の型における二次的な発現は、受容可能である。組織に好ましいプロモーター（ミルク中での発現に指向するプロモーターを含む）は、哺乳動物組織における発現に指向するホエイ酸プロモーター（欧州特許公開第０  ２６４  １６６号およびＰＣＴ公開第ＷＯ８８／００２３９号）、αラクトアルブミンプロモーター（ＰＣＴ公開第ＷＯ８８／０１６４８号）、ラットβカゼインプロモーター（欧州特許公開第０  ２７９５８２号）およびウシカゼインプロモーター（ＰＣＴ公開第ＷＯ８８／１０１１８号）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、米国特許第５，７４１，９５７号もまた参照のこと。これらの参考文献のそれぞれは、本明細書中で参考として援用される。
【０１４０】
目的のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ構築物は、目的のヌクレオチド配列および／または得られた遺伝子産物の発現、安定化、および／または位置付けを容易にする種々の配列を含み得ることが、さらに認識される。そのような配列としては、エンハンサー、イントロン、および転写後エレメント（例えば、ウッドコック肝炎ウイルス転写後領域（ＷＰＲＥ）またはＰＰＴ−ＣＴＳあるいはその機能的に改変体）が挙げられる。例えば、Ｚｕｆｆｅｒｅｙら（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：２８８６〜２８９２および２０００年１１月１０日に出願された米国特許出願第０９／７０９，７５１号（両方とも本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。さらに他の実施形態において、目的のヌクレオチドは配列を含むＤＮＡ構築物は、精製または標識化（例えば、抗体で）のための親和性タグをさらに含む。
【０１４１】
あるいは、目的のヌクレオチド配列は、プロモーター配列を欠くＤＮＡ構築物中において含まれ得る。この実施形態において、標的細胞の内在性プロモーターに対して５’側での配列の組み込みに続いて、目的のヌクレオチド配列が発現される。当業者は、所望の方法で目的のヌクレオチド配列を発現する（すなわち、所望の発生段階、組織、またはレベルで発現する）同定された動物に対して、目的のヌクレオチド配列を含む創始動物を容易にスクリーニングし得る。
【０１４２】
レンチウイルスベクターのプロウイルスゲノムは、プロモーターに作動可能に連結される選択マーカーを含む少なくとも１つのＤＮＡ構築物を、さらに含み得る。選択マーカーとしては、ルシフェラーゼ（Ｌｉｒａら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：７２１５〜７２１９およびＬｅｅら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１５８７５〜１５８８５）、β−ｇａｌ（Ｇｏｒｉｎｇら（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：４５６〜４５８）、ＧＦＰ、クロラムフェニコールトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）（Ｏｖｅｒｂｅｅｋら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ａｃｉ．８７：７８１５〜７８１９）、およびヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）（Ｐｉｎｋｅｒｔら（１９８７）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１：２６８〜２７６）が挙げられるが、これら限定されない。当業者は、多数の可能性が存在することを理解する。
【０１４３】
当業者は、使用されるべき適切な選択マーカーを認識する。例えば、ｌａｃＺは、胚全体が染色され得る動物における組織または位置特異的な遺伝子発現の研究のために特に有用である。ＣＡＴおよびルシフェラーゼは、感受性および定量的であるが、これらのマーカーは、発現の分布様式について視覚的な検出を可能にしない。ヒト成長ホルモンは、容易に検出され得、そして分布位置および分布の定量化の両方について有用である。
【０１４４】
ＤＮＡ構築物の調製において、適切な配向および必要に応じて適切なリーディングフレームのＤＮＡ配列を供給するために、種々のＤＮＡフラグメントが操作され得る。この末端に、アダプターまたはリンカーは、ＤＮＡフラグメントに連結するために使用され得る。この目的のために、インビトロでの変異誘発、プライマー修復、制限、アニリーング、再構築（例えば、塩基転位および塩基転換）が含まれ得る。
【０１４５】
（実験）
（実施例１：レンチウイルスベクターと原形質膜との接触による遺伝的に改変されたマウスの生成）
（Ａ．トランスレンチウイルスベクター）
（プラスミド）
ｐＰＣＷ−ｅＧＦＰ遺伝子導入ベクターを構築するために、ＥＧＦＰ  ｃＤＮＡ（ｐＥＧＦＰ−Ｃ１に由来する、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を含むＰＣＲで増幅したＤＮＡフラグメントは、ｐＨＲ−ＣＭＶ−ＬａｃＺプラスミドのＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ部位に連結し（Ｎａｌｄｉｎｉら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：２６３〜７）、ｐＨＲ−ＣＭＶ−ｅＧＦＰを生成した。次いで、中枢ポリプリン路（ＰＰＴ）および中枢末端部位（ＣＴＳ）を含むＤＮＡの１５０ｂｐの配列（４３２７〜４４８３に配位する）を、ＨＩＶ−１  ｐＳＧ３分子クローン（Ｇｈｏｓｈら（１９９３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９４：８５８〜８６４）からＰＣＲで増幅し、そしてｐＨＲ−ＣＭＶ−ｅＧＦＰの独特のＣｌａＩ部位でライゲーションした。ｅＧＦＰ発現（Ｚｕｆｆｅｒｅｙら（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７：２８８６．）を増加させるために、ウッドコック肝炎ウイルス（ＷＰＲＥ）に由来する転写後調節エレメントをｅＧＦＰの下流に挿入し、ｐＰＣＷ−ｅＧＦＰ遺伝子導入ベクターを生成した。この構築物を、Ｆｉｓｈｅｒ  ３３４（ａ）およびＦｉｓｈｅｒ  ３４４（ｂ）ラットを除く表２中で示される細胞実験において使用した。
【０１４６】
Ｆｉｓｈｅｒ  ３４４（ａ）として表２において参照するトランスジェニック動物を、ｐｇｋ−ｅＧＦＰ遺伝子導入ベクターを使用して生成した。この構築物は、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（ｐｇｋ）をＣＭＶプロモーターの代わりに使用することを除いて、上述されるｐＰＣＭ−ｅＧＦＰ遺伝子導入ベクターと同一である。
【０１４７】
Ｆｉｓｈｅｒ  ３４４（ｂ）として表２において参照するトランスジェニック動物を、ＥＦ１α―ＡＰＰ−ｅＧＦＰ遺伝子導入ベクターで作製した。この構築物は、ＩＲＥＳによってＧＦＰに連結するアルツハイマーアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の変異体バージョンを示す。
【０１４８】
（ベクターストックの調製）
トランスレンチウイルスベクターは、以前に記載された（Ｗｕら（２０００）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ２：４７〜５５）独特の安全機能を有するＨＩＶ−ベースのベクターを示す。簡単には、複製コンピテントなレトロウイルス（ＲＣＲ）の生成する危険性を減少させるために、ベクターストックを、ＲＴおよびＩＮをＧａｇ−Ｐｏｌから分離し、そしてそれらをＨＩＶ−１ビリオン関連タンパク質Ｖｐｒを有する融合対としてイントランスで送達するＴｒａｎｚＶｅｃｔｏｒＴＭ（Ｔｒａｎｚｙｍｅ、Ｉｎｃ．、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ  ＡＬ）レンチウイルスパッケージング系を使用して産生した。従って、トランスレンチウイルスベクターのストックを、３μｇのｐＣＭＶ−ｇａｇ−ｐｒｏパッケージングプラスミド、１．０μｇのｐＣＭＶ−ｖｐｒ−ＲＴ−ＩＮトランス酵素プラスミド、１．５μｇのｐＭＤ．Ｇ（ＶＳＶＧ）発現プラスミド、および３μｇの遺伝子導入（ｐＰＣＷ−ｅＧＦＰ）プラスミドを、リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿方法によってサブコンフルエントな２９３Ｔ細胞の単層培養にトランスフェクトすることによって産生した。上清を６０時間後に回収し、低速度の遠心分離（１０００ｇ、１０分）によって清澄し、そして０．４５μｍの孔径のフィルターで濾過した。ベクター粒子を、超遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ  ＳＷ２８ローター、２３，０００ｒｐｍ、２ｈｒ）によって濃縮した。ベクターの力価を決定するために、０．２、０．０４、０．００８、０．００１６、０．０００３２、および０．００００６４μｌの上清ストックをＨｅＬａ細胞の培養物に感染させるために使用し、そしてＧＦＰ陽性（緑）細胞コロニーを２日後に蛍光顕微鏡を使用して計数した。それぞれＧＦＰ陽性細胞コロニーは、１形質導入単位（ＴＵ）として測定した。使用した精製ウイルスの力価は、２．９×１０９ＴＵ／ｍｌであった。ウイルスのアリコートを、使用まで−８０°Ｃで保存した。
【０１４９】
（Ｂ．受精マウス卵母細胞の単離および微量注入ならびに移植前胚の導入）
ＰＭＳ（ＦＳＨ＝卵胞刺激ホルモンを含む妊馬血清）を腹腔内（ｉ．ｐ．）でマウス１頭あたり５０ＩＵで注射することによって、雌性マウスに過剰に排卵させた。４６〜４８時間後、ＨＣＧ（ヒト性腺刺激ホルモン）を、ｉ．ｐ．でマウス１頭あたり３．７５ＩＵで注射し、そして交配させた。
【０１５０】
翌日、受精卵母細胞を卵管から回収した。回収した卵母細胞の周囲にある卵丘細胞を、１％ヒアルロニダーゼを含むヘペス緩衝化胚培地で洗浄することによって除去した。卵丘細胞を除去した後、卵母細胞を、ヘペス緩衝化胚培地で洗浄し、残ったヒアルロニダーゼを除去した。受精卵母細胞を、パラフィン油を重ねた「切断培養培地」に移入した。卵母細胞を、加湿インキュベーター中で３７．０°Ｃで、空気中のＣＯ２が７％の状態で加湿させた。０．５〜４時間後、卵母細胞をヘペス緩衝化胚培地中で洗浄し、次いでパラフィン油を重ねたガラススライド上に水滴で置いた。ＣＶＭ−ｅＧＦＰ導入遺伝子を含むウイルス粒子を（１０９／ｍｌで）ガラスの注射針中に充填し、そして卵母細胞の卵黄周囲腔（ＰＶＳ）に微量注入した。注入を、４００倍率下で実行した。１卵母細胞あたりおよそ１００ピコリットル量を注入した。前核注入（３３％までの卵母細胞溶解率を生じる）と比較して、ＰＶＳ注入についての卵母細胞溶解率は、約５％以下である。
【０１５１】
首尾よく注入された卵母細胞は、一晩パラフィン油を重ねた「切断培地」中で３７．０°Ｃで、空気中のＣＯ２が７％の状態で培養した。翌日、卵母細胞は、二（２）細胞胚に発達した。胚を、偽妊娠雌性の卵管に移した。１９日後、子孫が生まれた。観察した妊娠率は、前核を使用した注入の際の７５％と比較して１００％であった。
【０１５２】
３週齢で、注入由来の子孫を、ｅＧＦＰおよびＣＮＶ診断プローブを使用するサザンブロット分析によってスクリーニングした。得られた遺伝的に改変された子孫の比率は、前核を使用した注入の際の１％〜２０％以下と比較して６５％であった。表２は、本発明の結果を要約する。
【０１５３】
図３は、本発明の方法および組成物が、各創始物から個々の株を生成するための受容能力を有することの証明を提供する。図３Ａは、第１のｅＧＦＰトランスジェニック創始物１１７ ０４０の１つのうちの子孫（Ａ世代）の尾部先端部から作られたゲノムＤＮＡを示し、これを野生型マウス（ＢＡＬＢ／ｃＪ）と交配した。ゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩで制限酵素消化し、０．８％アガロースゲル（上の画像）で泳動し、そして標準的プロトコールを使用してサザンブロット移動させた。ゲル上のポジティブコントロールは、ＡｓｎＩ、ＳｔｕＩおよびＡｌｗ４４Ｉで制限酵素消化したＰｅＧＦＰ−Ｃ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）であり、そして二重ゲル精製した。
【０１５４】
図３Ｂは、サザンブロットの結果（それに続くＥｃｏ４７ＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ（約７５０ｂｐ）で消化したＰｅＧＦＰ−Ｃ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から単離した、３２Ｐ標識化ｅＧＦＰでのプロービングならびに二重ゲル精製）を提供する。サザンの画像中で見られる子孫の異なる分離パターンの数は、この技術がそれぞれの創始物から個々の株を生成するための能力を有することを有効に実証する。この場合、およそ１２個の異なる個々の組み込みパターンが存在する。
【０１５５】
サザンブロットオートラジオグラフィー（図３Ｂ）上の矢印は、共通の結合パターンおよび尾部生検中でｅＧＦＰを発現するマウスの導入遺伝子組み込みを示す。図３Ｂに存在する星印は、その尾部の生検を行い（未固定であり染色されない）、そして共焦点顕微鏡（ＢｉｏＲａｄ  Ｖｉｅｗｓｃａｎ  ＤＶＣ  ２５０  ｌｏｗ  ｌａｓｅｒ  ｐｏｗｅｒ、４×対物レンズ下で４８８ｎｍのレーザー線）を使用してｅＧＦＰ蛍光について分析した。図３Ｃで提供した画像は、はっきりとした蛍光を示す共焦点画像である。共焦点画像に対するネガティブコントロールは、ネガティブ同腹仔遺伝型Ａ世代マウスであった。
【０１５６】
【表２】
2005538685.tif 000003
本明細書中で記述される全ての公開および特許出願は、本発明に関係のある当業者のレベルを示す。全ての公開および特許出願は、それぞれ個々の公開または特許出願が具体的にそして個々に参考として援用されることが示されるかのうように、同じ範囲で本明細書中で参考として援用される。
【０１５７】
前記の発明は、理解を明確にする目的のために例示および例として、いくらか詳細に記載されているが、特定の変化および改変が添付された実施形態の範囲内で実行され得ることが明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１】図１は、本発明の方法において使用され得るレンチウイルスベクターの非限定的な例を図解で例示する。特に、図１は、本発明の方法において使用され得るトランスウイルス粒子を生成するために使用される４つ（４）の異なるＤＮＡ構築物を含む「トランスレンチウイルス」ベクター設計の例示を提供する（不活性逆転写酵素およびインテグラーゼは、囲まれていない）。
【図２】図２は、トランスレトロウイルスベクター設計の非限定的な例示を提供する。
【図３】図３は、本発明の方法および組成物が、それぞれの創始動物から複数のそれぞれのトランスジェニック株を生成する能力を有することの証明を提供する。図３Ａは、第１のｅＧＦＰ創始動物のうちの１つの子孫の尾部クリップから作られたゲノムＤＮＡを示す。図３Ｂは、ＧＦＰに対してプローブするサザンブロッティングを示す。図３は、共焦点レーザーを提供する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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