(57)【要約】本発明は、ヒトまたは動物体の微生物またはウイルス感染を予防または治療するための乳アポタンパク質またはその混合物の使用に関する。これは潜在的病原体の付着を阻害することにより達成されると考えられる。より好ましくは、少なくとも1の乳アポタンパク質またはその混合物を少なくとも1の遊離脂肪酸またはその混合物もしくはそのモノグリセリドおよび/または少なくとも1の有機酸またはその塩もしくはエステルまたはその混合物のいずれかまたは両方と同時にもしくは連続的に投与する。活性物質は、非経口溶液剤、軟膏、点眼薬、鼻スプレー、膣内用具、外科用被覆剤、医療用食品または飲料、口腔ヘルスケア製剤、および粘膜適用薬を含む医薬的に許容されるデリバリーシステムにより送達することができよう。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトおよび動物体中またはその表面への潜在的病原体の付着を阻害するための乳アポタンパク質またはその混合物の使用。
【請求項２】
ヒトおよび動物体中またはその表面への潜在的病原体の付着を阻害する医薬を製造するための乳アポタンパク質またはその混合物の使用。
【請求項３】
医薬的に許容される担体中に少なくとも1の乳アポタンパク質またはその混合物を含む医薬的に許容されるデリバリーシステム。
【請求項４】
該または各乳アポタンパク質が乳アポリポタンパク質である先の請求項のいずれかに記載の使用またはデリバリーシステム。
【請求項５】
該または各乳アポリポタンパク質がβ-ラクトグロブリン、脂肪小球膜、およびα-ラクトアルブミンまたはその混合物から選ばれる乳リポタンパク質から得られる請求項4記載の使用またはデリバリーシステム。
【請求項６】
乳アポタンパク質またはその混合物を乳清または乳ホエーを酵素、好ましくはリパーゼで加水分解し、酵素を変性させ、そしてアポタンパク質リッチ分画を分離することにより製造する先の請求項のいずれかに記載の使用またはデリバリーシステム。
【請求項７】
乳アポタンパク質またはその混合物を乳清または乳ホエーを酵素、好ましくはリパーゼで加水分解することにより製造する請求項1〜5のいずれかに記載の使用またはデリバリーシステム。
【請求項８】
乳が牛乳またはヤギの乳である先の請求項のいずれかに記載の使用またはデリバリーシステム。
【請求項９】
さらに少なくとも1の遊離脂肪酸もしくはその混合物、またはそのモノグリセリドもしくはその混合物を含む先の請求項のいずれかに記載の使用またはデリバリーシステム。
【請求項１０】
該または各脂肪酸が飽和もしくは不飽和であり、C4-C24の炭素原子が同数の炭化水素鎖、またはその混合物を有する請求項9に記載の使用またはデリバリーシステム。
【請求項１１】
該または各不飽和脂肪酸がC14-C24の炭化水素鎖を有し、好ましくはパルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、αおよびγリノール酸、アラキドン酸、エイコサペンタン酸、およびテトラコセン酸、ならびにそれらのモノグリセリドまたはその混合物から選ばれる請求項10に記載の使用またはデリバリーシステム。
【請求項１２】
該または各不飽和脂肪酸がC4-C18の炭化水素鎖を有し、好ましくは酪酸、イソ酪酸、コハク酸、カプロン酸、アジピン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、およびステアリン酸、ならびにそれらのモノグリセリド、またはその混合物から選ばれる請求項10に記載の使用またはデリバリーシステム。
【請求項１３】
さらに少なくとも1の有機酸またはその塩もしくはエステル、またはその混合物を含む先の請求項のいずれかに記載の使用またはデリバリーシステム。
【請求項１４】
有機酸がグリコール酸、シュウ酸、乳酸、グリセリン酸、タルトロン酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、マロン酸、グルタル酸、プロペン酸、cisまたはtransブテン酸、およびクエン酸、またはその塩もしくはエステル、またはその混合物から選ばれる請求項13に記載の使用またはデリバリーシステム。
【請求項１５】
さらに抗酸化剤、好ましくはα-トコフェロールを含む先の請求項のいずれかに記載の使用またはデリバリーシステム。
【請求項１６】
感染症を全身的に治療または予防するための非経口注入用溶液剤の形の請求項2〜15のいずれかに記載の使用またはデリバリーシステム。
【請求項１７】
皮膚感染症の予防または治療における局所適用用軟膏の形の請求項2〜15のいずれかに記載の使用またはデリバリーシステム。
【請求項１８】
Candida albicans感染症の再発を予防または治療するための膣内用クリームもしくはゲルまたはペッサリーの形の請求項2〜15のいずれかに記載の使用またはデリバリーシステム。
【請求項１９】
感染症を予防または治療するための外科用被覆剤の形の請求項2〜15のいずれかに記載の使用またはデリバリーシステム。
【請求項２０】
眼、鼻、口、腸、または生殖器に対する粘膜適用薬の形の請求項2〜15のいずれかに記載の使用またはデリバリーシステム。
【請求項２１】
眼の感染症を予防または治療するための点眼薬の形の請求項20に記載の使用またはデリバリーシステム。
【請求項２２】
キャリアーからの抗生物質耐性微生物の伝搬を阻害するための鼻内スプレーの形の請求項20に記載の使用またはデリバリーシステム。
【請求項２３】
腸感染症に対する予防剤として用いる食品または飲料の形の請求項20に記載の使用またはデリバリーシステム。
【請求項２４】
口腔衛生を改善するかまたは口腔疾患に対する予防剤としての歯磨き粉、チューインガム、口腔洗浄液、または他の歯磨き剤から選ばれる口腔ヘルスケア製剤の形の請求項20に記載の使用またはデリバリーシステム。
【請求項２５】
請求項1〜5のいずれかに従属するとき、加水分解乳清または乳ホエーが0.5〜25mg/mLの濃度範囲である請求項7〜24のいずれかに記載の使用またはデリバリーシステム。
【請求項２６】
乳アポタンパク質またはその混合物が0.5〜10mg/ml、好ましくは3〜7mg/mlの濃度範囲で存在する先の請求項のいずれかに記載の使用またはデリバリーシステム。
【請求項２７】
遊離脂肪酸もしくはそのモノグリセリド、またはその混合物が0.5〜5mg/mlの濃度で存在する請求項9〜12のいずれかに記載の使用またはデリバリーシステム。
【請求項２８】
有機酸もしくはその塩もしくはエステル、またはその混合物が0.5〜5mg/mlの濃度で存在する請求項13または14に記載の使用またはデリバリーシステム。
【請求項２９】
乳アポタンパク質またはその混合物、および遊離脂肪酸またはそのモノグリセリド、またはその混合物が同時にかまたはいずれかの順番で6時間以内に連続的に投与される請求項9〜12および27のいずれかに記載の使用またはデリバリーシステム。
【請求項３０】
請求項1〜8のいずれかに従属するとき、乳アポタンパク質もしくはその混合物、およびその有機酸または塩もしくはエステルまたはその混合物が同時にかまたはいずれかの順番で6時間以内に連続的に投与される請求項13、14および28のいずれかに記載の使用またはデリバリーシステム。
【請求項３１】
請求項9〜12のいずれかに従属するとき、乳アポタンパク質またはその混合物、遊離脂肪酸またはモノグリセリドまたはその混合物、その有機酸もしくは塩またはエステル、またはその混合物が同時にかまたはいずれかの順番でそれぞれ6時間以内に連続的に投与される請求項13、14および28のいずれかに記載の使用またはデリバリーシステム。
【請求項３２】
化粧用スキンケア用の請求項2〜15のいずれかに記載の使用またはデリバリーシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトまたは動物体の微生物またはウイルス感染を予防もしくは治療するための乳アポタンパク質の使用に関する。より具体的には、これら乳アポタンパク質は潜在的病原体の付着および/または増殖を阻害するために単独で、または1またはそれ以上の短鎖有機酸およびその塩もしくはエステル、例えばクエン酸、および/または1またはそれ以上の遊離脂肪酸およびそのモノエステルと組み合わせて用いることができよう。
【背景技術】
【０００２】
乳は、分娩した後の成熟雌哺乳動物の乳腺から産生される白い液体である。哺乳動物は、本発明の目的のためのヒト、哺乳動物を含む哺乳綱の温血脊椎動物であり、ウシ、ヒツジ、ヤギ、およびキリンのような反芻亜目の有蹄、偶蹄哺乳動物がより好ましい。ウシおよびヤギから得られる乳は、ただこれら供給源からの乳が商業規模で容易に利用できるという理由で本発明の乳アポタンパク質の好ましい供給源である。
【０００３】
乳清(milk serum)は、カゼインミセルと乳脂肪小球が懸濁している透明の液体マトリックスを説明するのに酪農業界で一般に用いられる用語である。反芻動物由来の乳清は、乳糖、ラクトース；乳抗体、ラクトフェリンおよび酵素を含む種々のタンパク質；およびβ-ラクトグロブリンを含む種々のリポタンパク質を含む。乳清は乳アポタンパク質の好ましい供給源である。
【０００４】
牛乳は酪農業界でバターやチーズを得るために加工される。機械的撹拌を用いて乳脂肪小球を破壊してバターを得、またカゼインを沈殿させてチーズを製造するためのカードを得る。これら加工後に残る液体残留物が一般に乳ホエー(milk whey)と呼ばれる。乳ホエーは、実質的に、主として脂肪小球膜から生じるリポタンパク質含有量が増加した乳清である。乳ホエーは乳アポタンパク質の好ましい供給源である。本明細書で用いている用語「乳清アポタンパク質」は、乳清または乳ホエーから得られる乳アポタンパク質を包含することを意図する。
【０００５】
乳清中には種々の異なるリポタンパク質と糖タンパク質が存在し、これらはすべて脂質および/または炭化水素が結合しているタンパク質の骨格により特徴づけられる。酵素的加水分解を用いてこのタンパク質の骨格から脂質および/または炭化水素を除去し、対応するアポタンパク質を製造することができよう。乳清アポタンパク質は単離されているが、そのような乳清アポタンパク質の医療的使用は知られていない。
【０００６】
脂質または脂肪には、同じかまたは異なっていてよい脂肪酸のトリエステル、およびトリアシルグリセロールまたはトリグリセリドとしても記載されるグリセロールが含まれる。さらに加水分解を用いてこれらエステル結合を破壊し、トリアシルグリセロールから遊離脂肪酸を遊離させることができよう。子ウシ前胃リパーゼを用いた乳脂質からの遊離脂肪酸の遊離はCynthia Q Sunら(Chemico-Biological Interactions 140 (2002), pp 185-198)が報告している。この著者は、グラム陽性である腸球菌(Enterococci)およびグラム陰性である大腸菌群に対する遊離脂肪酸の増殖阻害特性について報告しているが、乳清アポタンパク質の役割に関しては触れていない。
【０００７】
遊離脂肪酸は強力な抗菌活性と抗ウイルス活性を示すことが知られている。特に、リノール酸、リノレン酸、カプリル酸、およびカプロン酸が虫歯菌のStreptococcus mutansを阻害し、歯垢を全般的に減少させることをSchusterら(Pharmacology and Therapeutics in Dentistry 5：pp25-33; 1980)が報告している。この著者によれば、グラム陰性に分類される細菌は最も感受性であるが、グラム陽性菌はほとんど影響を受けない。さらに、Halldor Thormarら(Antimicrobial Agents and Chemotherapy; Jan 1987, pp27-31)は、遊離脂肪酸およびそのモノエステルの抗ウイルス活性について精査し、エンベロープ(被膜)を持つウイルスに対する多不飽和長鎖脂肪酸および中鎖飽和脂肪酸(およびそのモノグリセリドエステル)の効果、ならびにエンベロープを持たないウイルスに対して比較的不活性であることを証明している。その殺ウイルス効果はおそらくウイルスエンベロープ自身を不安定化することによる。より最近、遊離脂肪酸の殺菌活性がR. Corinne Sprongら (Antimicrobial Agents and Chemotherapy, April 2001, pp 1298-1301)により精査され、C10:0およびC12:0脂肪酸が強力な殺菌剤であることがわかった。C10:0およびC12:0遊離脂肪酸およびそのモノグリセリドの殺真菌特性はGudmundur Bergssonら(Antimicrobial Agents and Chemotherapy, November 2001, pp 3209-3212)が記載している。
【０００８】
多くの潜在的病原性細菌は、皮膚、髪、および粘膜に普通にみられる共生生物であり、それらは表面上皮細胞層に付着することによりこれら領域にコロニーを形成するが、通常、粘液および汗中の宿主の分泌免疫系により抑えられる。これら内在種により生じる疾病は、通常、これら内在病原体の増殖を可能にする宿主の分泌免疫能のなんらかの衰弱の結果として生じる。
【０００９】
宿主組織に対する病原性細菌の付着は、一般的に病因論における第一段階であると受け取られているので、付着をブロックする能力は感染症の予防に有用なはずである。そのような付着のメカニズムは様々であり、多くの微生物が種々の特異因子と非特異因子の両方を用いる。例えば、ブドウ球菌はフィブロネクチンに特異的に結合する細胞外テイコ酸を分泌し、カンジダ種はマンノタンパク質のグリコカリックスを使用し、連鎖球菌は水に不溶性のグリカンを使用して歯にコロニーを形成する。これら因子の多様性のため、広範囲の潜在的病原性種に対して有効な単一のインヒビターを発明することは不可能と長い間考えられてきた。
【００１０】
ある種のドナー動物のワクチン接種により誘導された抗体の使用が多くの状況で試みられてきたが、固有の特異性のためこれら抗体の治療的使用はそれらが産生された種に対する使用に限定される。
【００１１】
上記公表データすべてにおいて、広範囲の細菌、真菌、およびウイルスの増殖を阻害するための遊離脂肪酸の使用が開示されているが、ヒトおよび動物の健康管理における潜在的病原体の付着および/または増殖の阻害において、1またはそれ以上の乳アポタンパク質と共に投与したときのその有効性を開示または示唆する公表データは知られていない。
【００１２】
感染症の医学的および獣医的管理における一般的な方法は、真菌、細菌(共に用語「微生物」に含まれる)、またはウイルスであってよい感染性物質を阻害するために設計された抗生物質の適用である。長期使用すると、多くの抗生物質は感染性物質による耐性の発達によりその有効性を失う。抗生物質耐性の問題は、感染性物質が皮膚および呼吸器の一般的生息物であり、それ自体が長い間に頻繁に多様な抗生物質に曝露され、これら物質に対する耐性を発達させる術後の状況で最も深刻である。多数のこれら通常無害な物質は外科的もしくは看護的処置の間に広まり、患者の免疫トレランスが疾病または長期の医療的介入により弱まっているときに感染症が生じる可能性がある。このような感染症は院内感染として説明されることが多い。
【００１３】
あるそのような院内感染は一般にMRSA(methicillin resistant Staphylococcus aureus(メチシリン耐性黄色ブドウ球菌))と呼ばれる。Staphylococcus aureusは、通常感染を生じることなく不顕性に保菌されている多くの個体の気道に普通にみられる生息物である。その遍在的性質のため、通常用いられる多くの構成物質に曝露されたと考えられ、今やメチシリンを含むすべての通常用いられる抗生物質に耐性な菌株が存在する。バンコマイシンは、MRSAの「最後の手段となる薬剤」であるが、最近、バンコマイシンに耐性の菌株が出現してきた。さらに、バンコマイシン耐性Enterococcus faecalis(VREF)は、消化管の一般的な生息物であり、外科的処置中にそこから広がり、他の院内感染を引き起こすことがある。
【００１４】
遺伝子水平伝達は、ある種から別の種への遺伝的耐性の潜在的伝達を説明する生物学的用語である。VREFのような種からClostridium difficile(Pseudomembranous colitis)のような病原性種への抗生物質耐性の伝達は、潜在的に悲惨な事象であり、医療従事者の間で大きな関心事となるものである。
【００１５】
したがって、そのような抗生物質耐性感染、および従来の治療では難治性の他のものを治療するのに用いることができる新規抗菌物質、ならびに現在有効な治療法がないウイルス感染を治療するための新規抗ウイルス物質の大きな必要性がある。
【００１６】
本発明の目的は、病原体の付着を遅らせ(好ましくはブロックする)、そしてヒトまたは動物体への微生物もしくはウイルス感染を予防または治療することである。
【００１７】
本発明のさらなる目的は、付着を遅らせまたはブロックすることと増殖の阻害を組み合わせることによりさらに大きな有用性を達成することである。
【００１８】
本発明のさらなる目的は、限定されるものではないが乳清のような害のない物質を用いることによりこれらの有用性を達成することである。これは多くの積極的な化学ベースの薬剤を用いる賢明であると考えられるものよりはるかに高頻度の使用を促すからである。
(発明の説明)
【００１９】
第一の態様において、本発明はヒトまたは動物体の微生物またはウイルス感染を予防または治療するための少なくとも1の乳アポタンパク質の使用に関する。これにより制限されることを望むものではないが、これは潜在的病原性種の付着の阻害によりもたらされるものと考えられる。具体的には、乳リポタンパク質および乳糖タンパク質から結合脂質および/または炭化水素を除去した後に残る、より正しくは乳清アポタンパク質と呼ばれる乳清タンパク質の骨格は、以下に例示するようにヒト上皮細胞に対する潜在的病原体の付着の強力で広域スペクトラムな阻害を示す。乳清を供給源に用いると、その結合脂肪酸および/または炭化水素部分を除去した残りのアポタンパク質は両性であり、宿主細胞表面に細菌または他の病原体が付着するのを阻害することにより第一段階で病因を予防する。両性タンパク質は、疎水性(脂溶性)末端と親水性(水溶性)末端の両方を有する。多くの微生物種の細胞表面は、両性タンパク質の疎水性末端が引きつけられる脂質または糖脂質層を有する。このように、乳清のアポタンパク質は、病原体の表面を覆い、粗な分子バリアーを築き、病原体(例えば、真菌、細菌、またはビリオン)が宿主細胞表面に十分近接して付着を確立するのを阻害する。
【００２０】
前記乳アポタンパク質は遊離脂肪酸またはそのモノエステル(モノグリセリドを含む)と共に用いるのが好ましい。知られているように、遊離脂肪酸およびそのモノグリセリドは、増殖を阻害することにより広範な種に対する強力な抗菌剤および抗ウイルス剤である。すなわち、少なくとも1の乳アポタンパク質および少なくとも1の遊離脂肪酸もしくはそのモノエステルの同時または連続(いずれかの順番で)投与は増殖を阻害し、広範囲の微生物およびウイルス種の付着を阻害する。乳清または乳ホエーを加水分解することにより得られる製剤は乳アポタンパク質と遊離脂肪酸の両方を含む。
【００２１】
あるいはまた、前記乳アポタンパク質は、短鎖有機酸またはそのエステルもしくは塩と共に用いられる。すなわち、少なくとも1の乳アポタンパク質および少なくとも1の短鎖有機酸もしくはそのエステルまたは塩の同時または連続(いずれかの順番で)投与は増殖を阻害し、広範囲の微生物およびウイルス種の付着を阻害する。
【００２２】
さらに好ましくは、前記乳アポタンパク質は、遊離脂肪酸およびそのモノエステルならびに短鎖有機酸およびその塩およびエステルの両方と共に用いることができよう。すなわち、少なくとも1の乳アポタンパク質、少なくとも1の遊離脂肪酸もしくはそのモノエステル、および少なくとも1の短鎖有機酸もしくはそのエステルまたは塩の同時または連続(あらゆる順番で)投与は増殖を阻害し、広範囲の微生物およびウイルス種の付着を阻害する。3成分すべてを含む製剤は乳清または乳ホエーを加水分解することにより製造することができる。
【００２３】
本発明において、少なくとも1の乳清アポタンパク質またはその混合物の、所望により少なくとも1の遊離脂肪酸もしくはそのモノエステルまたはその混合物、および/または所望により少なくとも1の短鎖有機酸もしくはその塩またはエステルまたはその混合物と一緒の使用は、消化管および口咽頭路、粘膜上皮、および皮膚の抗生物質耐性感染症の治療に有用であることが示されるであろう。
【００２４】
MRSAおよびVREFのような微生物の感染症および多くのウイルス感染症は健康への重大な脅威となるが、身体の一般的共生物質であり、長期間の不快感や疾患を生じるかもしれない無害な物質は少ないように思われる。この一例はStreptococcus mutans菌による虫歯の発生である。虫歯は通常表面的な問題と考えられているので、歯科医が治療する。しかしながら、Streptococcus mutansによる口のコロニー形成が全身循環において心臓組織と交差反応し、長期にわたる心臓疾患を生じ、そして他の器官に自己免疫障害を生じるかも知れない抗体を生じることを示唆する証拠がある。
【００２５】
本発明において、乳清アポタンパク質の使用はStreptococcus mutansの付着を阻害し、虫歯予防に有用な添加剤を提供することにより、長期の健康的利益をもたらすことを示す。
【００２６】
酵母Candida albicansは多くの個体の皮膚および粘膜の一般的な生息物であり、無症候性に保菌されている。Candida(カンジダ)は最初に粘膜上皮細胞の表面に付着することにより粘膜にコロニー形成し、そこで増殖し、腔カンジダ症を生じる細胞腔に侵入する。
【００２７】
これら組織から分泌された粘液の成分は、通常、ある個体では正常な分泌能力を衰弱させ、発病プロセスを確立する付着と増殖を阻害する。乳清アポタンパク質(付着阻害性)および遊離脂肪酸またはそのモノエステルおよび/または有機酸またはその塩もしくはエステル(共に増殖阻害性)の使用は、再発性腔カンジダ症にかかりやすいそれら個体に適切な予防をもたらすであろう。
【００２８】
ウイルス感染症は従来の抗生物質に反応しない。例えばHerpes simplex(単純ヘルペス)の治療に用いられる「Acyclovir」のような専門的抗ウイルス薬が利用可能であるが、一般にこれらは高価であり非常に狭い範囲のウイルス感染症に限定される。多くのウイルス感染症は全身的局面を有するが、あるものは、しばしば罹患した個体に最大の不快感をもたらす皮膚発疹、疱疹、および腫れ物として現れる局所症状を有する。乳清アポタンパク質と遊離脂肪酸およびそのモノエステルを含む製剤の局所適用の使用は局所抗ウイルス活性をもたらし、全身的抗ウイルス処置の補助剤として用いると外部症状を軽減するであろう。
【００２９】
「Famvir」は、Varicella zoster(帯状疱疹)の二次感染の治療における経口投与用の全身的抗ウイルス剤として設計されたAcyclovir (Smith Kline Beecham)の専売製剤である。Varicella(水痘)ウイルスは、破裂してかさぶたを形成する、化膿した小胞の広範囲にわたる皮疹を伴う一次感染で鶏痘を生じる。該感染は激しい痒みを生じ、腫れ物を引っ掻くと広範囲にわたる瘢痕が残ることがある。ウイルスは、回復後何年にもわたって潜伏したままであり、ストレスや免疫を損なう状態により再活性化することがある。二次感染は帯状疱疹として知られており、激しい痛みを伴う皮疹を特徴とする。本明細書に記載の乳清アポタンパク質および遊離脂肪酸およびそのモノエステルを含む局所製剤の使用は皮膚表面の症状を最小限に抑え、従来の抗ウイルス療法の有用な補助剤として作用する。風疹(麻疹)およびヘルペス(cold sores)のような表面(皮膚)の局面がある同等の他の感染症が局所適用に適した臨床的適応症である。
【００３０】
乳清または乳ホエーを加水分解する以下に説明する標準的製剤は0.5〜25mg/mlの範囲の濃度で病原体に対する有効性が期待される。もちろん、必要な濃度は対決すべき病原体の数とその相対濃度に依存するであろう。同様に、アポタンパク質、遊離脂肪酸、および有機酸の望ましい濃度範囲も対決すべき病原体の数とその相対濃度に依存するであろう。
遊離脂肪酸
【００３１】
遊離脂肪酸は、炭化水素鎖と少なとも1つのカルボン酸官能基を含む有機酸であり、必ずではないが、通常、後者が末端位である。脂肪酸は、飽和(炭化水素鎖中のすべての炭素-炭素結合が単結合である)または不飽和(炭化水素鎖中に少なくとも1個の炭素-炭素二重または三重結合がある)であり得る。遊離脂肪酸またはそのモノエステルは好ましくは天然であるか、あるいはまた例えば、限定されるものではないが乳清、卵黄、および植物油のような天然の供給源から加水分解することにより放出される。
好ましくは、有用な抗菌性および抗ウイルス性遊離脂肪酸は飽和または不飽和であり、炭素数が偶数(C4-24)の炭化水素鎖またはその混合物を有する。
【００３２】
適切な不飽和遊離脂肪酸は、C14-C24の炭化水素鎖を有し、好ましくはパルミトレイン酸(C16：1)、オレイン酸(C18：1)、リノール酸(C18：2)、αおよびγリノール酸(C18：3)、アラキドン酸(C20：4)、エイコサペンタエン酸(C20：5)、およびテトラコセン酸(C24：1)(ここで、括弧内の数字は、炭化水素鎖の炭素数を示し、コロンの後に二重(または三重)結合の数は不飽和の程度を示す。)から選ばれる。
【００３３】
適切な飽和脂肪酸は、C4-C18の炭化水素鎖を有し、好ましくは真菌、ならびにグラム陰性菌、大腸菌、およびブドウ球菌に対して有効な、酪酸またはイソ酪酸(C4：0)、コハク酸(C4：0)、カプロン酸(C6：0)、アジピン酸(C6：0)、カプリル酸(C8：0)、カプリン酸(C10：0)、ラウリン酸(C12：0)、ミリスチン酸(C14：0)、パルミチン酸(C16：0)、およびステアリン酸(C18：0)から選ばれる。
【００３４】
天然または非天然の遊離脂肪酸またはそのモノエステルは、限定されるものではないがメチル化もしくはアセチル化のような短鎖アルキル化、エステル化、および抗菌作用を修飾する他の多くの誘導体化を含む化学的置換により修飾することができると理解すべきであり、そのような修飾遊離脂肪酸も本発明の一部を構成することを意図する。しかしながら、本発明の目的において、乳清、卵黄、および植物油から選ばれる天然の脂肪のリザーバーから放出されるような、天然の非修飾遊離脂肪酸またはその混合物またはそのモノエステル、好ましくはそのモノグリセリドを用いるのが好ましい。
【００３５】
乳清の脂質内容の加水分解は、治療または予防目的で微生物およびウイルス増殖の広範囲の阻害が有効に得られる遊離脂肪酸の適切な混合物を提供する。以下の表は、乳清脂質の脂肪酸組成の典型的分類を示す。
表1：乳清脂質の脂肪酸組成
酪酸 (C4：0)               4%
カプロン酸 (C6：0)         2.1%
カプリル酸 (C8：0)         1.2%
カプリン酸 (C10：0)        2.6%
ラウリン酸 (C12：0)        3.0%
ミリスチン酸 (C14：0)     10.6%
パルミチン酸 (C16：0)     27%
パルミトレイン酸 (C16：1)  2.3%
ステアリン酸 (C18：0)     12.8%
オレイン酸(C18：1)        26%
リノール酸 (C18：2)        2.3%
リノレン酸 (C18：3)        1.6%
水で100%とする。
有機酸
【００３６】
もし存在するならば適切な有機酸は、少なくとも1個のカルボン酸官能基を持った短い炭化水素鎖(例えばC2-6)を有する。用語「酸」は、その塩やエステルを含むことを意図する。炭化水素鎖は飽和もしくは不飽和、直鎖もしくは分岐鎖、置換もしくは非置換であってよい。適切な有機酸には、グリコール酸、シュウ酸、乳酸、グリセリン酸、タルトロン酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、マロン酸、グルタル酸、プロペン酸、cisもしくはtransブテン酸、およびクエン酸が含まれる。有機酸のうち、3個のカルボン酸部分を有する3個の炭素鎖であるクエン酸が好ましい。クエン酸は、哺乳動物における炭化水素の代謝中に産生され、弱い有機酸であり、水酸化ナトリウムのようなアルカリ溶液で中和してナトリウム塩-クエン酸ナトリウムを得てよい。したがって、クエン酸は体内に天然に低濃度で存在する。本発明が示し、クレームしているように、クエン酸ナトリウムを上記のごとく乳清アポタンパク質に加えると脂肪酸の効力は特定細菌のin vitro培養において増幅することができよう。
抗菌剤および抗ウイルス剤としての有用性
【００３７】
単独の乳清アポタンパク質を用いて達成される付着阻害の多特異的性質、または遊離脂肪酸および/または有機酸と組み合わせた乳清アポタンパク質を用いる付着阻害および増殖阻害の多特異的性質により、非常に広範囲の潜在的病原体を扱うことができよう。
【００３８】
重要なグラム陽性菌には、Streptococci(連鎖球菌)、Lactobacilli(乳酸桿菌)、Corynebacteria(コリネバクテリア)、Propionibacteria(プロピオニバクテリア)、Actinomycetes(放線菌類)、Clostridia(クロストリジウム)、Bacillus(バチルス)、およびEnterococcus(腸球菌)が含まれる。
【００３９】
グラム陰性菌には、Staphylococci(ブドウ球菌)が含まれ、Enterobacteria(腸内細菌)、Escherichia(大腸菌)、Salmonella(サルモネラ)、Shigella(シゲラ)、およびChlamydia(クラミジア)も感受性である。
【００４０】
真菌種のうち、酵母Candida albicans、およびTrichophyton(白癬菌)種を含む皮膚糸状菌が感受性であることが示された。
【００４１】
有意に感受性の原性動物には、Entamoeba histolytica、Giardia lamblia、およびCryptosporidium neoformatansが含まれる。
【００４２】
用語「微生物」は、細菌、真菌、および原性動物を含むことを意図する。
【００４３】
重要なエンベロープを持つビリオンには、ヘルペスウイルス科(単純ヘルペス、帯状疱疹、およびエプスタイン・バー)、ポックスウイルス科(オルソポックスウイルスおよびアビポックスウイルス)、トガウイルス科(アルファウイルス、フラビウイルス、ルビウイルス、およびペストウイルス)、コロナウイルス科(気管支炎ウイルス)、レトロウイルス科(ヒトT細胞白血病、およびヒト免疫不全ウイルス)、インフルエンザウイルス、リッサウイルス(Lyssavirus)、カリフォルニア脳炎ウイルス、ラッサウイルス、パラミクソウイルス、ニューモウイルス、およびモービリウイルスが含まれる。
医薬的および美容的に許容されるデリバリーシステム
【００４４】
医薬的および美容的有効量の少なくとも1の遊離脂肪酸およびそのモノエステルおよび/または医薬的および美容的有効量の少なくとも1の有機酸およびそのエステルまたは塩を含むかまたは含まない、医薬的および美容的有効量の少なくとも1の乳清アポタンパク質を含む医薬的に許容されるデリバリーシステムを投与して臨床的に有用な効果を達成することができよう。
【００４５】
軟膏は、皮疹、水疱、および膿疱に現れるウイルスおよび細菌感染の表面症状(これにはヘルペス、帯状疱疹、ニキビ、および感染性皮膚炎が含まれる)を軽減する有用な送達メカニズムを提供する。
【００４６】
包帯および創傷被覆剤(ドレッシング)は感染部位で活性物質を持続放出するよう浸漬することができよう。
【００４７】
特にメチシリン耐性Staphylococcus aureusの場合は、該デリバリーシステムは、既知の担体の汚染除去のために鼻スプレーを含んでいてよい。皮膚ローションの形のデリバリーシステムの使用は皮膚および毛髪の局所的汚染除去をもたらすであろう。
【００４８】
該デリバリーシステムは眼の感染症を治療もしくは予防するため点眼剤を含んでいてよい。
【００４９】
該デリバリーシステムは、酵母Candida albicansの再発性感染を抑制し、また外因性の細菌およびウイルス性疾患に対する予防法として女性のケアに通常用いられる、膣内クリームもしくはゲル、例えば水和および潤滑ゲル、またはペッサリーを含むことができよう。
【００５０】
該デリバリーシステムは、活性成分が持続放出ポリマー中に分布している外科手術後用創傷被覆剤を含むことができよう。そのようなデリバリーシステムを用いてMRSAおよび他の抗生物質耐性菌により生じる院内感染を最小限に抑えることができよう。
【００５１】
該デリバリーシステムは、さらに抗酸化賦形剤を含み、全身性抗ウイルスおよび/または抗菌効果を得るために非経口的にかまたはIV注入により投与することができよう。
【００５２】
あるいはまたはさらに該デリバリーシステムは、活性成分が腸溶コーティングされ、胃から腸への輸送を促すことができる食品または乳様飲料を含む(ここで、活性成分はPseudomembraneous colitisを含む腸の感染症に対する予防薬として用いることができる。)。
【００５３】
該デリバリーシステムは、虫歯および歯垢を減らし、歯肉炎、歯周炎、および再発性腔カンジダ症に対する長期の保護をもたらすための、口腔衛生製品、例えばチューインガム、口腔洗浄液、歯磨き粉、および義歯接着剤、および固定剤を含んでいてよい。
【００５４】
該デリバリーシステムは、活性物質が微生物および/またはウイルス性の損傷、およびSalmonella(サルモネラ)やCampylobacter(カンピロバクター)のような微生物により生じる食品媒介疾患の可能性を予防する加工食品を含むことができよう。
(図面の説明)
【００５５】
図1は、4つの別個のサイズ排除クロマトグラムを示し、これらにはA、B、C、およびDの記号を付している。
【００５６】
A)  時間；0時間、処置前：280nm照射でのRt7.174分間のフロントランニングピークは330nmで可視的な基底ピークを持つ。330nm吸光度は、この主要分画を構成する大タンパク質と結合した脂質部分に由来する。
【００５７】
B)  時間；処置開始後2時間：7.174分間の一次ピークが低下し、Rt9.7および10.6分間の2つのレイトランニング分画が同時に増加する。330nm脂質分画は低下し、レイトランニング分画と330nm吸光度の可視的増加はみられない。
【００５８】
C)  時間；8時間：脂質分画のさらなる低下を示すが、レイトランニング280nmタンパク質の有意な変化はみられない。
【００５９】
D)  時間；16時間：インキュベーションを延長してもいずれの波長でも全体的プロフィールの変化はみられない。
【００６０】
図2は、酵素加水分解の前および後の被検物質、乳清の効果の測定値として頬側上皮細胞に対するCandida albicansの付着を用いている。「コントロール」は、阻害物質の存在なしに達成された平均総付着(36%)を示す。1mg/mlおよび2mg/mlの加水分解前の乳清は、コントロール付着のおよそ39%の阻害を示す(22%付着、36%付着から低下)。5mg/mlの加水分解前では、45%の付着阻害が達成される。同じ物質は、酵素的加水分解後に同じ濃度を示す。1mg/mlは同じ物質の加水分解前より明らかに効果が低いが、2mg/mlでは62%阻害(39%に比べて)があり、5mg/mlでは前加水分解の45%に比べて100%の付着阻害がある。
【００６１】
図3は、標準的製剤の脂質およびタンパク質分画のそれぞれから得られるカンジダの相対的付着阻害を示す。「コントロール」は、45%付着である。1mg/mlのタンパク質分画は19%付着(58%阻害)を示し、2mg/ml付着は、3%に低下し、94%阻害であり、5mg/mlで完全にブロックされる。これに対して、いかなる濃度の脂質分画にも可視的な付着阻害効果はみられなかった。
【００６２】
図4は、図3に示したのと同じ脂質およびタンパク質分画を用いる、Candida albicansの増殖に対する10、8、および6mg/mlの脂質分画の相対的増殖阻害特性を示す。光学濃度(密度)の消失に基づく10mg/mlでの酵母培養の可視的破壊に伴う濃度増加として増殖阻害特性の漸進性の増加がみられる。
【００６３】
図5は、Candida albicansの増殖を用いる上記図3のタンパク質分画の効果を示す。試験したあらゆる濃度でもタンパク質分画による明らかな蔵書化合物阻害はみられない。
【００６４】
図6は、0、1、および5mg/mlの標準製剤のカンジダ増殖阻害特性を示し、最も高濃度で90%阻害が得られる。
【００６５】
図7は、阻害物質をCandida albicansを5時間正常に増殖させた後に加える介入増殖アッセイを示す。濃度8および6mg/mlでの阻害の即時性が明らかである。より低濃度では該効果はより遅いが、全体的阻害は4mg/mlで有効であり、2mg/mlでもある程度の阻害が明らかである。
【００６６】
図8は、1、2、および5mg/mlの標準製剤のアンジダ付着阻害特性を示す(ここで、酵母は頬側上皮細胞に曝露する前10分間、被検物質に曝露することにより前処理した。)。1mg/mlでは、53%の付着阻害がみられたが、2および5mg/mlでは付着は生じない。この実施例ではタンパク質ブランクはウシ血清アルブミン1mg/mlであり、(標準製剤の53%に対して)単に13%阻害を示す。
【００６７】
図9は、上記図8で用いた同じ標準製剤を示し、カンジダ培養に曝露する前10分間、頬側上皮細胞を前処理している。1mg/mlでは55%の付着阻害がみられたが、2および5mg/mlでは付着は完全に阻害される。この実施例のタンパク質ブランクはオボアルブミン除去卵白であり、1mg/mlでは約12%の付着阻害を示す。
【００６８】
図10は、標準製剤がメチシリン耐性Staphylococcus aureus(MRSA)の増殖をコントロール(リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を試験「ブランク」として用いる。)に対して約50%阻害することを示す。標準製剤にクエン酸ナトリウム2、4、および5mg/mlを添加すると、より高濃度で増殖は徐々に0まで阻害される。
【００６９】
図11は、クエン酸ナトリウムおよびBSAと比較した標準製剤の、MRSAの頬側上皮細胞への付着の阻害特性を示す。
【００７０】
5mg/mlで標準製剤は、98%の付着阻害を達成するが、クエン酸ナトリウムは同じ濃度で約10%阻害し、タンパク質ブランクの効果はみられない。
【００７１】
図12は、虫歯を生じる微生物Streptococcus mutansの増殖は、明細書に記載の試験条件下5mg/mlの標準製剤により阻害されることを示す。
【００７２】
図13は、Streptococcus mutansが、ここで歯エナメル質の代用品として用いるヒドロキシアパタイトビーズに付着することを示す。標準製剤は試験条件下で0.8mg/mlでほぼ100%の付着阻害を達成する。クエン酸ナトリウムは0.8mg/mlで本微生物の付着に約10%の影響を及ぼすが、タンパク質ブランクとして用いたウシ血清アルブミンは、これら試験条件下で約30%の阻害を達成する。
(方法および材料)
【００７３】
乳清タンパク質は、新鮮全乳、好ましくは反芻動物の新鮮全乳から、遠心器を用いて乳脂肪を最初に分離することにより抽出することができよう。次に、上清をカゼインが沈殿するpH4.5に酸性化する。さらに遠心し、乳の糖分である乳糖、乳清タンパク質および溶解物質を含む透明上清が生じるであろう。次に、乳清の固体内容のかなりの割合を示す乳糖(50%まで)を、透析または限外ろ過により除去する。得られた「結合タンパク質リッチ」分画はおおよそ以下の組成(v/v)を有するであろう：
β-ラクトグロブリン       56%
α-ラクトアルブミン       11%
γ-グロブリン             12%
血清アルブミン             6%
ラクトフェリン             4%
ムチン                     2%
酵素                       1%
微量タンパク質             1%
タンパク質結合脂質(脂肪)   7%
【００７４】
これらタンパク質の多くは、それらと結合した大量の非タンパク質高分子との複合体リポタンパク質または糖タンパク質であるが、反芻哺乳動物由来のホエーの主要タンパク質成分は、ホエーの70%までおよび初乳(分娩後の最初の乳)の90%を示すことがあるβ-ラクトグロブリンである。β-ラクトグロブリンはそれと結合した大量のイソプレノイド、レチノールを有するリポタンパク質であるが、脂質および脂肪酸は非タンパク質成分のかなりの部分を構成する。
【００７５】
あるいはまた、乳清タンパク質の常套的供給源は、酪農産業のホエー粉末であり、これは多くの異なる供給源から市販されている。多くの場合において、市販業者はすでに乳糖内容を除去しており(ただし、「結合タンパク質リッチ」物質は脂肪含量6〜10%である)、そのような物質は本発明に用いる好ましい供給源物質である。いくつかの市販業者は、液体ホエーの棚持ちを増加するために超高温(UHT)を用いるが、そのような処理はタンパク質の骨格を変性させ、本明細書に記載の目的に役立たない物質にする。脂肪含量は6%以下である場合は、本明細書に記載の酵素加水分解用に再構成(精製水(逆浸透による精製水)する時にホエー粉末に乳脂肪を加え戻すことにより補うことができよう。
【００７６】
標準化低乳糖ホエー粉末の適切な市販供給源は、ホエータンパク質濃縮物「Carbelac 80」(Carbery Milk Products, Ballineen, County Cork, Ireland)である。
(増殖阻害アッセイ)
【００７７】
種々の細菌および酵母の増殖阻害は、被検物質、例えば乳清アポタンパク質、遊離脂肪酸/モノエステルおよび/または有機酸/塩/エステルを含むかまたは含まない適切な培地中で該微生物を増殖させることにより証明することができ、試験形式は培地ブランクおよびコントロールを用いて適切に構築される。マイクロタイタープレートアッセイを用いて試験ポイント数を増加させてよく、増殖を光学濃度測定を用いて測定する。
【００７８】
種々の濃度の被検物質を加えて生じる希釈効果がないことを裏付けるため、被検溶液を、該細菌または酵母用の適切な新鮮増殖培地中に適切な量の被検物質を溶解または懸濁させることにより製造する。典型的には、被検溶液を、新鮮増殖培地の終量10m中に例えば被検物質200mgを溶解することにより製造される濃度20mg/mlのストック溶液から製造する。ストック溶液を6000rpmで10分間遠心して懸濁した固体を除去する。次に、ストック溶液を適切な容量のストック溶液および新鮮増殖培地を用いて無菌的に希釈し、例えば10、8、6、4、2mg/mlの試験濃度とする。
【００７９】
20mg/mlのストック溶液から約10mg/mlとする希釈工程は本明細書では1：2と記載しており、これによりストック溶液1容量を希釈液1容量で希釈し、終量2容量とすることを意味する。この慣例は本明細書のすべての希釈工程を示すために本明細書において用いるであろう。
【００８０】
製造した溶液を予め37℃に温める。製造した接種材料100μlを加える直前に必要な各ウェルに100μlを加える。すなわち、試験濃度10mg/mlを試験ウェル中でさらに1：2希釈し、「10mg/ml」が実際には試験ウェルそれ自身中で5mg/mlであるようにする。Multiskan Ascentは、それぞれODを読む前に培養が確実に均等に分布するように用いる自動撹拌周期を持つ。
【００８１】
Candida albicansの増殖阻害に関して、「Nunc」96ウェルマイクロタイタープレート(Nalge Nunc International, Copenhagen, Denmark)を用い、その各ウェルを前記の200μlに保つ。試験ポイントは4つ一組で行う。接種物は下記のごとく製造した新鮮増殖細菌もしくは酵母100μlからなる。各ウェルの終量は適切な希釈の被検物質100μlおよび新鮮培地中の接種物100μlを含む総量200μlからなる。
【００８２】
接種したプレートを「Multiskan Ascent」(LabSystems, Helsinki, Finland)でインキュベーションしたマイクロタイタープレートリーダーにロードし、18時間までの期間37℃に保ち、その間、ウェルの光学濃度変化を600nmで毎時間測定する。増殖周期の終わりに、4つ一組のウェルそれぞれを平均して結果を処理し、変化をグラフに示す。
【００８３】
酵母：5%(w/v)グルコース添加Oxoid Yeast Minimal Media(オキソイド酵母最小培地)(Oxoidは登録商標である)中のCandida albicansの12時間(一夜)培養を37℃の新鮮培地で1：10希釈し、各ウェルに100μl加える。
【００８４】
酵母Candida albicansは、増殖最適pHが4.0〜4.5であり、その病原性プロセスの多くもこのpH範囲で最適である。上記増殖アッセイは、pH4.0の50mM乳酸ナトリウム緩衝液を用いて一部変更して酵母最小培地および試験溶液を製造し、標準製剤が有効なiv vitro環境をより適切に反映する。
【００８５】
したがって、同様の方法論を用い、増殖培地を一部変更して細菌(および真菌)の増殖および増殖阻害を測定することができよう。本明細書において共に例として示すStreptococcus mutansおよびStaphylococcus aureusの場合、増殖培地はOxoid Brain Heart Infusion Broth(Oxoidは登録商標である)である。
【００８６】
付着アッセイ：
付着およびその阻害の測定には、適切な基質の選択と、その基質に付着する(または付着しない)微生物の数を数える方法が必要である。ほとんどの潜在的な病原体は粘膜上皮細胞に付着し、代表的粘膜上皮細胞の常套的供給源は頬の内側から容易に回収することができよう。頬側上皮細胞(BEC)を以下のごとく木製舌圧子を用いて口中の粘膜を掻き取って回収する。
【００８７】
頬側上皮細胞の回収：
歯の臨床試験に用いる標準木製舌圧子はスズホイルで包み、オートクレーブする。pH6.8に調整した0.9%(w/v)塩化ナトリウムを含む0.1Mリン酸カリウム(すなわちPBS)の5.0ml部分標本を無菌25mlサンプル瓶に入れる。次に、舌圧子を用いてボランティアの頬の内側をこすり、掻き取った回収物をPBS容器に移す。回収したサンプルを1000rpmで3分間遠心し、BECを沈殿させ、懸濁液中の細菌および他の口腔の破片を除去する。これらチューブから上清をデカントし、さらに新鮮無菌PBS 5mlを加え、BECを2回再懸濁および再遠心して「洗浄細胞」とする。
【００８８】
多くの異なる細菌および酵母の算定方法があり、これらはすべて当業者によく知られており、これらには生存プレート算定法、直接顕微鏡的算定法、ラジオシンチレーション標識法、および蛍光標識法が含まれる。選択した基質に付着する病原体の能力と干渉しないあらゆる有効な算定方法が適している。
【００８９】
以下に示す実施例では、直接顕微鏡的算定法を酵母カンジダに、蛍光標識法を細菌用に選んだ。しかしながら、より重要なことは、通常、基質は算定と干渉するので付着細胞を算定する試みと識別可能な標準ポピュレーション由来の付着しない酵母および細菌の数を算定した。
【００９０】
該技術の基礎には、標準化基質(BECの数)に標準化(既知)数の酵母または細菌を曝露し、60分間のインキュベーション期間で細胞を付着させ、次いで結合ポピュレーションを10ミクロンのナイロンメッシュでろ過することが含まれる。メッシュにはBECおよびそれに付着した酵母または細菌が保持され、非付着酵母または細菌は洗い流され、濾液中のそれらを算定し、非付着の最初のポピュレーションのパーセンテージで表現することができよう(付着パーセントはこれと逆になる)。
【００９１】
酵母およびBECの直接顕微鏡的算定は、目盛り付き血球計算板スライドを用いて行い、該方法は当業者によく知られている。
【００９２】
細菌の蛍光標識は蛍光色素、例えばBCECF/AM (Calbiochem Biosciences Inc., La Jolla, CA)およびSyto 13 (Molecular Probes, Oregon, USA)を用いて付着後に行う(濾液中のそれら細胞による)。標識方法は色素の製造業者が説明する通りである。蛍光の量は、蛍光光度計(Fluroscan, Lab-Systems, Helsinki, Finland)を用いて測定され、存在する細菌の数と直接相関がある。
【００９３】
以下の一般的方法を用いて酵母Candida albicansのBECに対する付着および上記の血清アポタンパク質の製剤を用いるその付着の阻害を測定することができよう。同じ一般的方法は、Staphylococcus aureusのBECに対する付着の阻害、およびStreptococcus mutans(ただし、Streptococcus mutansに対する基質は、Merckから入手できる、歯エナメル質の代用物として用いられる粉末ヒドロキシアパタイトである)の付着の阻害の測定に適している。
【００９４】
多くのタイプカルチャーがカルチャーコレクションにおいて病原性を失っているのでCandida albicansの新鮮臨床分離株が好ましい。臨床分離株が利用可能でなければ、C. albicans ATCC 10231型株を用いて代表得的結果を得ることができよう(ATCCはAmerican Type Culture Collection(Maryland USA)である。)。
【００９５】
酵母はOxoid Malt Extract Agar (Oxoidは登録商標である。)上でルーチン的に培養される。Oxoid Yeast Extract Peptone Dextrose brothを液体培養に用い、これらに新鮮寒天プレートから接種し、撹拌しながら37℃で10時間培養する。10時間後、酵母を遠心して回収し、pH6.8の無菌PBSで洗浄する。
【００９６】
洗浄BECおよび洗浄新鮮増殖酵母細胞を顕微鏡的に算定し、濃度を酵母が1X105およびBECが1X103のオーダーとなるよう調整する。混合すると等量の2つの溶液は酵母100個/BECの比になる。
【００９７】
種々の濃度の乳清アポタンパク質のような被検物質の試験では、これらを酵母または頬側細胞の最終懸濁液に用いる所望の強度のPBS(pH6.8)に加える。典型的には、濃度5、2、および1mg/mlを用い、BECのプレコーティングまたは酵母のプレコーティングにより付着を阻害する該製剤の効果を測定する試験を行う。付着開始時に2つの懸濁液の他方と混合する前にほんの10分間だけ「プレコーティング」する。該製剤は、頬側上皮細胞のプレコーティングまたはCandida albicansのプレコーティングのいずれでも有効であることを示す。すなわち、いずれかまたは両方のこれら表面上に保護分子バリアーを作ることによりさらに大きな有用性を得ることができよう。具体的には、プレコーティング頬側上皮細胞は付着が確立されるのを抑制するが、病原体(この場合は酵母)のプレコーティングはすでに確立されたコロニー形成が他の領域に広がるのを抑制するであろう。
【００９８】
等量の2溶液/懸濁液を混合し、静かに撹拌しながら60分間インキュベーションし、次いで混合物を確定多孔度10ミクロンのナイロンメッシュでろ過する。濾液中の酵母数を顕微鏡的に算定し、最初のポピュレーションのパーセンテージで表す。高病原性臨床分離株を用いる場合、40%までの付着が達成されることも珍しくない。
実施例1
乳清遊離脂肪酸および乳清アポタンパク質の製造
【００９９】
無乳糖ホエー粉末(Carbelac 80(Carbery Milk Products))が出発物質である。Carbelac 80は典型的には100%ホエーであり、そのうち典型的にはスキムが0%で、80%がタンパク質、5%が水分、8%が脂肪、および3%が灰分である。この出発物質30gを終量1Lのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(pH6.8)に溶解する。これに適切な組成の種々のエステラーゼ(主にリパーゼだが、アミラーゼおよびプロテアーゼも含む)酵素、例えばSigmaから入手できる「Lipase Type 2 Crude(ブタ膵臓由来粗リパーゼ2型)」1gを加える。混合物を37℃で18時間インキュベーションし、60℃で10分間加熱処理して酵素を不活化し、次いでスプレー乾燥する。
【０１００】
他の適切なエステラーゼ酵素には、限定されるものではないが、「Palatase」および「Novozyme」(Novo Nordisk(Copenhagen, Denmark)から市販されている)が含まれ、これを無乳糖ホエー30gあたり50:50混合物(w/w)1gで用いる。
【０１０１】
アポタンパク質および遊離脂肪酸/モノグリセリド形成の過程に次いで図1に示すクロマトグラフィを行う。Sephacryl S-200および溶出用緩衝液としてPBS(pH6.8)を用いるゲルろ過(サイズ排除)HPLCは、酵素加水分解時の主な事象を示すための適切な解像度をもたらすだろう。溶離剤をモニターするため2波長を用いるのが好都合である。すなわち、280nmでタンパク質を照射し、波長330nmでこれらタンパク質と結合した脂質/炭化水素成分を照射する。Rt(保持時間)7.174分間のフロントランニングピーク(図1A)は、大タンパク質の早期溶出を示し、脂質部分は背景ピークとして見られる。加水分解(図1B(2時間および1C(8時間))の過程で、フロントピークおよびその結合脂質/炭化水素は、9.7および10.6分間で2つのレイトランニング分画(280nm)(これらはフロントピーク由来の小タンパク質およびアポタンパク質である)の濃度の同量の増加を伴って消失する。図1Dは、加水分解を延長(16時間)してもいずれの波長でもRtのさらなる変化を示さないことを示す。
【０１０２】
上記方法を用い、酵素処理無乳糖ホエー(またはアポタンパク質リッチおよび遊離脂肪酸リッチ分画)の典型的組成は以下の「典型的製剤」からなるであろう。
成分                                    %(v/v)
β-ラクトグロブリンのアポタンパク質      25-35
脂肪小球のアポタンパク質                  5-15
遊離脂肪酸                               15-25 (表1参照)
残存脂質 (コレステロールを含む)           5-15
α-ラクトグロブリンのアポタンパク質       5-15
γ-グロブリンのアポタンパク質             6-10
血清アルブミン                            1-3
α-トコフェロール                         2-6
クエン酸ナトリウム                        2-6
リン酸ナトリウム                          1-3
【０１０３】
アポタンパク質製造方法は、界面活性剤、例えばコール酸のような胆汁酸塩の精製成分の添加、および/またはカルシウム塩のような適切な酵素補助因子の添加、および/またはクエン酸ナトリウムのような適切な緩衝剤の添加により促進することができよう。MRSAの増殖阻害のようなある種の適用において、残存クエン酸ナトリウムも増殖阻害特性に寄与するが、付着の阻害には寄与しない。遊離脂肪酸およびそのモノグリセリドの安定性は例えばα-トコフェロール(ビタミンE)のような抗酸化剤の添加により向上させることができよう。
【０１０４】
ホエーのγ-グロブリン(免疫グロブリン)含量は、ドナー動物の免疫により操作することができよう。免疫方法はよく知られており、免疫グロブリンの特異性は、ワクチン中の該微生物の弱毒株を用い、あらゆる特定微生物に合わせて、増幅することができよう。そのような免疫ホエーの使用は本発明の範囲内であるが、「天然の」γ-グロブリンがいかなる微生物に対しても特定の特異性を持たない非免疫ホエーの使用が好ましい。
【０１０５】
この得られた加水分解物質は、虫歯菌のStreptococcus mutans、酵母Candida albicans、およびメチシリン耐性Staphylococcus aureusを用いた以下の実施例に示すように増殖阻害および付着阻害を示す。
【０１０６】
以下に記載し、例示する「標準製剤」は以下のものを含む(v/v)：
β-ラクトグロブリンのアポタンパク質      32%
脂肪小球膜のアポタンパク質                8%
遊離脂肪酸                               22% (表1参照)
残存脂質 (コレステロールを含む)           8%
α-ラクトグロブリンのアポタンパク質      10%
γ-グロブリンのアポタンパク質             8%
血清アルブミン                            2%
α-トコフェロール                         5%
クエン酸ナトリウム                        3%
リン酸ナトリウム                          2%
【０１０７】
該加水分解処置は、活性化前のホエー中に存在しない付着阻害特性を活性化する。図2は、Candida albicansの頬側上皮細胞に対する付着の阻害について加水分解前乳清と加水分解後乳清(標準製剤は後者である)を比較することによりこの効果を示す。観察されるように、非加水分解乳清はある程度の付着阻害を示すが、加水分解乳清存在下で顕著な濃度依存性の付着阻害がみられ、5mg/mlではCandida albicansの付着は検出されない。
乳清アポタンパク質の分離：
【０１０８】
標準製剤は、脂質およびアポタンパク質分画を分離するためのクロロホルム：メタノール抽出法を用いて分画化することができよう。
【０１０９】
該方法は、濃度10mg/ml(リン酸緩衝生理食塩水、pH6.8)の標準製剤を用いて行った。この溶液1mlをクロロホルム5mlおよびメタノール2.5mlを含むガラスチューブに加えた。混合物を30秒間撹拌(vortexed)し、次いで30分間撹拌し(agitated)、次いで溶媒層の分離が完結するまで放置する。各溶媒分画の部分標本を減圧乾燥した。あらゆる極性化合物(タンパク質)は極性溶媒(メタノール)分画中に存在し、非極性のもの(脂肪酸)はクロロホルム層に保持されるだろう。乾燥メタノール分画を初期容量の1/10となるようにリン酸緩衝生理食塩水(pH6.8)にとり、乾燥クロロホルム分画を初期容量の1/10となるようにエタノールにとり、試験のためにPBSで希釈した。
【０１１０】
図3は、アポタンパク質リッチ分画および脂質リッチ分画両方の付着阻害特性を示し、付着の濃度依存性阻害がアポタンパク質リッチ分画に関連し、脂質リッチ分画に関連しない。実際に、5mg/mlではCandida albicansの付着は実質的に検出できなかった。
【０１１１】
図4は、Candida albicansの脂質リッチ分画の濃度依存性増殖阻害特性を示し、図5はアポタンパク質リッチ分画が増殖に対する効果がないことを示す(実際に、増加する濃度のタンパク質分画から10mg/mlでいくらかの増殖の増幅がある。)。
実施例2
【０１１２】
上記「方法と材料」に記載の増殖アッセイを用い、標準製剤のCandida albicansの新鮮臨床分離株に対する増殖阻害特性を評価した。該アッセイはマイクロタイタープレート形式であり、各試験濃度は4つ一組で行った。増殖は20時間にわたり600nmで測定し、結果を図6に示す。標準製剤(5mg/ml)は、標準製剤添加0mg/mlのコントロールに対してほぼ90%の増殖阻害を示した。1mg/mlの標準製剤は中間の結果を示した。
【０１１３】
同様のアッセイ方法の使用(ただし、正常増殖5時間後に試験物質を添加する)は、介入アッセイとして本明細書に記載している。標準製剤を0mg/ml〜8mg/mlの濃度で加える。試験濃度は、予備加熱(37℃に)被検溶液を加えるときは、すべてのウェル中に同様の希釈効果があるように設定する。Candida albicansの新鮮臨床分離株に関する介入アッセイの結果を図7に示す。データは被検物質の添加により生じる5時間の光学濃度変化を除去するために加工している。標準製剤のC. albicansの増殖に対する急速で劇的な濃度依存性阻害効果は、8、6、4、および2mg/mlの濃度で明らかである。
実施例3
【０１１４】
標準製剤は増殖ならびに付着を阻害する。付着アッセイ方法は上記「方法と材料」に記載している。実施例2の同じ製剤を用い、該新鮮臨床分離株のBECに対する付着に対する阻害効果を図8および9に示す。
【０１１５】
図8において、酵母細胞はBECに加える前に標準製剤に10分間曝露している。図9において、BECは酵母懸濁液に加える前に標準製剤に10分間曝露している。
【０１１６】
これらアッセイ両方の「コントロール」は、阻害物質が存在しないとき、試験条件下で達成される付着がそれぞれ41%および35%であることを示す。カンジダの前処置における標準製剤1mg/mlの添加は付着を20%(53%阻害)に低下させるが、BEC前処理では同じ濃度で付着を16%(55%阻害)に低下させる。酵母およびBECの両前処理において標準製剤2および5mg/mlで、該試験条件下で100%の付着阻害がみられる。
【０１１７】
図8の「タンパク質ブランク」はウシ血清アルブミンであり、図9ではオボアルブミン除去卵白を用いた。これらは共に1mg/mlで使用し、標準製剤の効果が「単なる」タンパク質濃度による効果でないことを示すことを意図している。
実施例4
【０１１８】
標準製剤のメチシリン耐性Staphylococcus aureus (MRSA)の増殖および付着の両方に対する有効性を図10および11に示す。
【０１１９】
MRSAは、血液寒天上でルーチン的に継代培養され、単一コロニーを用いて上記「方法および材料」に記載のごとくOxoid Brain Heart Infusion Brothのチューブに接種する。8時間後、接種物を上記方法論を用い、増殖および付着アッセイに用いる。
【０１２０】
MRSAは、他の微生物ほど遊離脂肪酸/モノグリセリドに感受性ではなく、標準製剤中に含まれるようなクエン酸塩の添加はこの特定微生物の増殖の有意義な阻害に必須である。
【０１２１】
図10は、標準製剤5mg/mlの効果を示し、増加する濃度のクエン酸三ナトリウム(0、2、4、および5mg/ml)ではクエン酸三ナトリウム4または5mg/mlを標準製剤5mg/mlに加えると完全な増殖阻害が達成される。クエン酸三ナトリウムを試験溶液に加えるが、試験溶液は「増殖アッセイ」に記載の増殖培地を用いて調製する。具体的には、記載のごとく標準製剤のストック溶液(濃度20mg/ml)を等量のクエン酸三ナトリウム(濃度20mg/ml)と混合する。すなわち、1：2希釈が標準製剤10mg/mlおよびクエン酸三ナトリウム10mg/mlを含む溶液で達成される。上記のごとく、この複合製剤は、試験ウェル中で標準製剤5mg/mlおよびクエン酸三ナトリウム5mg/mlである。もちろん、同様に20mg/mlの標準製剤のストック溶液を16mg/mlまたは8mg/mlを含む等量のクエン酸三ナトリウムと混合し、図10に示すようにそれぞれ4および2mg/mlクエン酸三ナトリウムを添加した標準製剤が得られる。
【０１２２】
MRSAはBECに付着し、ここではこれらをCandida albicansについて説明したのと同様に用いる。クエン酸ナトリウム単独ではMRSAのBECに対する付着に効果がないが、図11に示すように、試験条件下で5mg/mlの標準製剤(クエン酸ナトリウム無添加)でほぼ完全な付着阻害が得られる。
実施例5
【０１２３】
微生物Streptococcus mutansは、歯のエナメル質表面に盛んに付着するので虫歯の起因物質と考えられている。炭化水素の発酵は乳酸の分泌をもたらし、歯のエナメル質の溶解と虫歯の発生がみられる局所pHまで低下させる。
【０１２４】
図12は、Streptococcus mutansの増殖に対する5mg/mlの標準製剤の効果を示す。試験は、上記のすべての増殖アッセイについて記載したように行う。5mg/mlの標準製剤で15時間にわたり該微生物の完全な増殖阻害がみられる。同じ期間中、標準製剤の代わりにリン酸緩衝生理食塩水(pH6.8)を加えたコントロールの増殖は期待対数増加を示す。
【０１２５】
Streptococcus mutansの付着阻害の測定において、Merckから得たヒドロキシアパタイト粉末を歯のエナメル質の代用品として用いた。試験方法は、以下の変更を除き、上記「方法および材料」に記載した通りである：600nmで光学濃度0.1に調整した新鮮培養1mlを唾液でコートしたヒドロキシアパタイトビーズ5mgに加え、1時間付着させ、次いで低速で遠心して細菌が付着したヒドロキシアパタイトを沈殿させる。上清に残存する細菌の数が付着していない最初のポピュレーションのパーセンテージであり、最初のポピュレーションのパーセンテージとして表し、逆が付着の阻害パーセントである。
【０１２６】
図13は標準製剤の用量依存性の付着阻害効果を示し、0.8mg/mlでほぼ完全な阻害が達成される。さらに、この例ではウシ血清アルブミンを「タンパク質ブランク」として用い、またこの試験系ではBSAは0.8mg/mlで約30%の阻害効果を有するが、クエン酸ナトリウムは約10%の付着阻害を示す。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】4つの別個のサイズ排除クロマトグラムを示し、これらにはA、B、C、およびDの記号を付している。A)  時間；0時間、処置前：280nm照射でのRt7.174分間のフロントランニングピークは330nmで可視的な基底ピークを持つ。330nm吸光度は、この主要分画を構成する大タンパク質と結合した脂質部分に由来する。B)  時間；処置開始後2時間：7.174分間の一次ピークが低下し、Rt9.7および10.6分間の2つのレイトランニング分画が同時に増加する。330nm脂質分画は低下し、レイトランニング分画と330nm吸光度の可視的増加はみられない。C)  時間；8時間：脂質分画のさらなる低下を示すが、レイトランニング280nmタンパク質の有意な変化はみられない。D)  時間；16時間：インキュベーションを延長してもいずれの波長でも全体的プロフィールの変化はみられない。
【図２】酵素加水分解の前および後の被検物質、乳清の効果の測定値として頬側上皮細胞に対するCandida albicansの付着を示す。「コントロール」は、阻害物質の存在なしに達成された平均総付着(36%)を示す。1mg/mlおよび2mg/mlの加水分解前の乳清は、コントロール付着のおよそ39%の阻害を示す(22%付着、36%付着から低下)。5mg/mlの加水分解前では、45%の付着阻害が達成される。同じ物質は、酵素的加水分解後に同じ濃度を示す。1mg/mlは同じ物質の加水分解前より明らかに効果が低いが、2mg/mlでは62%阻害(39%に比べて)があり、5mg/mlでは前加水分解の45%に比べて100%の付着阻害がある。
【図３】標準的製剤の脂質およびタンパク質分画のそれぞれから得られるカンジダの相対的付着阻害を示す。「コントロール」は、45%付着である。1mg/mlのタンパク質分画は19%付着(58%阻害)を示し、2mg/ml付着は、3%に低下し、94%阻害であり、5mg/mlで完全にブロックされる。これに対して、いかなる濃度の脂質分画にも可視的な付着阻害効果はみられなかった。
【図４】図3に示したのと同じ脂質およびタンパク質分画を用いる、Candida albicansの増殖に対する10、8、および6mg/mlの脂質分画の相対的増殖阻害特性を示す。光学濃度の消失に基づく10mg/mlでの酵母培養の可視的破壊に伴う濃度増加として増殖阻害特性の漸進性の増加がみられる。
【図５】Candida albicansの増殖を用いる上記図3のタンパク質分画の効果を示す。試験したあらゆる濃度でもタンパク質分画による明らかな蔵書化合物阻害はみられない。
【図６】0、1、および5mg/mlの標準製剤のカンジダ増殖阻害特性を示し、最も高濃度で90%阻害が得られる。
【図７】阻害物質をCandida albicansを5時間正常に増殖させた後に加える介入増殖アッセイを示す。濃度8および6mg/mlでの阻害の即時性が明らかである。より低濃度では該効果はより遅いが、全体的阻害は4mg/mlで有効であり、2mg/mlでもある程度の阻害が明らかである。
【図８】1、2、および5mg/mlの標準製剤のアンジダ付着阻害特性を示す(ここで、酵母は頬側上皮細胞に曝露する前10分間、被検物質に曝露することにより前処理した。)。1mg/mlでは、53%の付着阻害がみられたが、2および5mg/mlでは付着は生じない。この実施例ではタンパク質ブランクはウシ血清アルブミン1mg/mlであり、(標準製剤の53%に対して)単に13%阻害を示す。
【図９】上記図8で用いた同じ標準製剤を示し、カンジダ培養に曝露する前10分間、頬側上皮細胞を前処理している。1mg/mlでは55%の付着阻害がみられたが、2および5mg/mlでは付着は完全に阻害される。この実施例のタンパク質ブランクはオボアルブミン除去卵白であり、1mg/mlでは約12%の付着阻害を示す。
【図１０】標準製剤がメチシリン耐性Staphylococcus aureus(MRSA)の増殖をコントロール(リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を試験「ブランク」として用いる。)に対して約50%阻害することを示す。標準製剤にクエン酸ナトリウム2、4、および5mg/mlを添加すると、より高濃度で増殖は徐々に0まで阻害される。
【図１１】クエン酸ナトリウムおよびBSAと比較した標準製剤の、MRSAの頬側上皮細胞への付着の阻害特性を示す。5mg/mlで標準製剤は、98%の付着阻害を達成するが、クエン酸ナトリウムは同じ濃度で約10%阻害し、タンパク質ブランクの効果はみられない。
【図１２】虫歯を生じる微生物Streptococcus mutansの増殖は、明細書に記載の試験条件下5mg/mlの標準製剤により阻害されることを示す。
【図１３】Streptococcus mutansが、ここで歯エナメル質の代用品として用いるヒドロキシアパタイトビーズに付着することを示す。標準製剤は試験条件下で0.8mg/mlでほぼ100%の付着阻害を達成する。クエン酸ナトリウムは0.8mg/mlで本微生物の付着に約10%の影響を及ぼすが、タンパク質ブランクとして用いたウシ血清アルブミンは、これら試験条件下で約30%の阻害を達成する。
【図１】
2005501863.tif 000002
【図２】
2005501863.tif 000003
【図３】
2005501863.tif 000004
【図４】
2005501863.tif 000005
【図５】
2005501863.tif 000006
【図６】
2005501863.tif 000007
【図７】
2005501863.tif 000008
【図８】
2005501863.tif 000009
【図９】
2005501863.tif 000010
【図１０】
2005501863.tif 000011
【図１１】
2005501863.tif 000012
【図１２】
2005501863.tif 000013
【図１３】
2005501863.tif 000014
【国際公開パンフレット】
2005501863.tif 000015
2005501863.tif 000016
2005501863.tif 000017
2005501863.tif 000018
2005501863.tif 000019
2005501863.tif 000020
2005501863.tif 000021
2005501863.tif 000022
2005501863.tif 000023
2005501863.tif 000024
2005501863.tif 000025
2005501863.tif 000026
2005501863.tif 000027
2005501863.tif 000028
2005501863.tif 000029
2005501863.tif 000030
2005501863.tif 000031
2005501863.tif 000032
2005501863.tif 000033
2005501863.tif 000034
2005501863.tif 000035
2005501863.tif 000036
2005501863.tif 000037
2005501863.tif 000038
2005501863.tif 000039
2005501863.tif 000040
2005501863.tif 000041
2005501863.tif 000042
2005501863.tif 000043
2005501863.tif 000044
2005501863.tif 000045
2005501863.tif 000046
2005501863.tif 000047
2005501863.tif 000048
2005501863.tif 000049
2005501863.tif 000050
2005501863.tif 000051
2005501863.tif 000052
2005501863.tif 000053
2005501863.tif 000054
2005501863.tif 000055
2005501863.tif 000056
2005501863.tif 000057
2005501863.tif 000058
2005501863.tif 000059
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005501863.tif 000060
【国際調査報告】
2005501863.tif 000061
2005501863.tif 000062
2005501863.tif 000063
2005501863.tif 000064