(57)【要約】  本発明の分野は、一般的に、抑制活性を持つＴ細胞を誘導するために用いる方法に関する。より具体的に、該方法は、増強された抑制活性を持つプロフェッショナル制御Ｔ細胞およびサイトカイン産生Ｔ細胞を生成するために使用する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
通常のＴ細胞およびプロフェッショナル制御Ｔ細胞を含むＣＤ４＋Ｔ細胞の集団を、
ＣＤ４＋Ｔ細胞の該集団において、抑制活性を有するプロフェッショナル制御Ｔ細胞の数を増やすのに十分な時間、
（ｉ）少なくとも１つのサイトカイン；
（ｉｉ）少なくとも１つのＴ細胞アクチベーター；および
（ｉｉｉ）少なくとも１つの非Ｔアクセサリー細胞集団、
を含む制御組成物で処理することを含む、制御Ｔ細胞を生成する方法。
【請求項２】
ＣＤ４＋Ｔ細胞の該集団がナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞集団である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
増強された抑制活性を有する活性化された制御Ｔ細胞を生成する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
ａ）通常のＴ細胞を、
サイトカイン産生制御Ｔ細胞の集団を生成するのに十分な時間、
（ｉ）少なくとも１つのサイトカイン; 
（ｉｉ）少なくとも１つのＴ細胞アクチベーター;および
（ｉｉｉ）少なくとも１つの非ＴアクセサリーＴ細胞集団
を含む制御組成物で処理すること、
を含む、制御Ｔ細胞を生成する方法。
【請求項５】
ＣＤ４＋Ｔ細胞の該集団がナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞集団である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
増強された抑制活性を有する活性化された制御Ｔ細胞を生成する、請求項４記載の方法。
【請求項７】
制御Ｔ細胞の表面上のＣＤ１２２の発現を誘導するための方法であって、通常のＴ細胞およびプロフェッショナル制御Ｔ細胞を含むＣＤ４＋Ｔ細胞集団を、それらの表面上のＣＤ１２２マーカーを発現する制御Ｔ細胞を生成するのに十分な時間、
（ｉ）少なくとも１つのサイトカイン;
（ｉｉ）少なくとも１つのＴ細胞アクチベーター；および
(ｉｉｉ）少なくとも１つの非Ｔアクセサリー細胞集団、
を含む制御組成物で、処理することを含む方法。
【請求項８】
ａ）活性化されたプロフェッショナル制御Ｔ細胞および通常のＴ細胞を含むＣＤ４＋Ｔ細胞集団をつくること；そして、
ｂ）少なくとも１つのＴ細胞アクチベーターを、プロフェッショナル制御Ｔ細胞およびサイトカイン産生制御Ｔ細胞を含む制御細胞集団を生成するのに十分な時間、該ＣＤ４＋Ｔ細胞集団に加えること、
を含む、制御Ｔ細胞を生成する方法。
【請求項９】
ＣＤ４＋Ｔ細胞の該集団がナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞集団である、請求項８の方法。
【請求項１０】
増強された抑制活性を持つ活性化された制御Ｔ細胞を生成する、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
該サイトカインがＴＧＦ-β、ＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＴＮＦαからなる群から選択される、請求項１−７のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
該Ｔ細胞アクチベーターが、可溶性抗原、抗原のペプチドフラグメント、アロ抗原、抗ＣＤ２、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８およびＬＦＡ-３およびブドウ状球菌エンテロトキシンＢ(ＳＥＢ)からなる群から選択される、請求項１−１０に記載の方法。
【請求項１３】
該制御組成物が、Ｂ細胞、マクロファージ、単球および樹状細胞からなる群から選択される非Ｔアクセサリー細胞の少なくとも１つの集団をさらに含む、請求項１−７記載の方法。
【請求項１４】
望ましくない免疫応答を示すレシピエントに、該制御Ｔ細胞を投与することをさらに含む、請求項１−１３に記載の方法。
【請求項１５】
該制御Ｔ細胞を、異常型免疫応答を示すレシピエントに投与することをさらに含む、請求項１−１３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００１年１２月２１日に提出された米国特許出願番号６０／３７４１０２および２００２年４月１９日に提出された米国特許出願番号６０／３４２６５５の出願日の利益を請求するものである。
【０００２】
（本発明の分野）
本発明の分野は、一般的に、抑制活性を有するＴ細胞の誘導に使用される方法に関する。より具体的には、該方法は、強い抑制活性を持つプロフェッショナル制御Ｔ細胞およびサイトカイン産生Ｔ細胞を生成するために使用される。
【０００３】
多くの免疫不全（免疫疾患）は、自己と非自己を区別する免疫系の機能不全を特徴とし得る。例えば、自己免疫疾患は自己と非自己を区別する免疫系の機能不全によって引き起こされる。これらの疾患において、該免疫系は、自己組織に攻撃的に反応し、この反応が炎症および組織損傷を最終的に引き起こす。自己免疫疾患は、２つの基本的なカテゴリーに分類され得る：抗体媒介疾患、例えば、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、尋常性天疱瘡、重症筋無力症、溶血性貧血、血小板減少症、グレーブス病、シェーグレン症候群および皮膚筋炎症；および細胞媒介疾患、例えば、橋本病、多発性筋炎、炎症性腸疾患、多発性硬化症、糖尿病、リウマチおよび強皮症である。
【０００４】
一方、外来抗原を認識し、応答する免疫系の能力は、ある状況においては望ましくない。例えば、臓器移植の拒絶反応、すなわち移植拒絶反応は、レシピエントの免疫系が外来組織適合性抗原を認識する場合に起きる。同様に、血縁でない(または同種（異型）)ドナー由来の造血幹細胞の移植手術は、ドナー軸細胞調製物がＴリンパ球を一般的に含有するために、致死的応答、いわゆる移植片対宿主病(ＧＶＨＤ)を誘因し得る。ＧＶＨＤは、ドナーＴリンパ球がレシピエントの組織適合性抗原を外来物質として認識し、多臓器機能不全および破壊によって応答する場合におこる。
【０００５】
自己免疫不全の症候を緩和するための方法および移植拒絶反応を防止するための方法には、強い抗炎症性および免疫抑制作用を持つステロイド、例えばプレドニゾンの使用が包含されるのが普通である。使用され得る他の強い免疫抑制薬物には、アザチオプリン、シクロスポリンおよびシクロホスファミドが包含される。これら全ての薬物は、免疫系の全体的な低下による好ましくない副作用をもっている。
【０００６】
さらに望ましいストラテジーは、望ましくない副作用を示さない方法を同定することであろう。制御Ｔ細胞(サプレッサーＴ細胞としても呼ばれる)を生成することにより免疫系を「リセットする」ための方法は、米国特許番号６２２８３５９および６３５８５０６、６５５７７６５ならびに米国特許出願番号０９／６５３９２４および０９／８３３５２６で説明されており、その全てを出典明示により本明細書の一部とする。これら方法は、病気に冒された個体における正常な制御細胞機能の修復を目的とする。
【０００７】
従って、本発明の目的は、自己免疫不全（疾患）を処置し、移植拒絶反応および移植片対宿主病となる免疫応答を防止するのに使用し得る制御Ｔ細胞を生成させるために、末梢リンパ様組織を処理する方法を提供することである。
【０００８】
（発明の要約）
上記の目的に従って、本発明は、ex vivo 末梢血液単球細胞(ＰＢＭＣ)の試料において制御Ｔ細胞を生成させるのに使用され得る組成物および方法を提供する。そのように生成された制御Ｔ細胞は、プロフェッショナルＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御細胞またはサイトカイン産生制御細胞であり得る。好ましくは、制御細胞の数および抑制活性の両方が増加される。
【０００９】
制御組成物は、サイトカイン、Ｔ細胞アクチベーター、Ｔ細胞刺激因子、非Ｔアクセサリー(accessory)細胞および中和抗サイトカイン抗体を含む多数の成分を含み得る。これらの成分は、同じクラスの化合物由来の１以上の化合物を包含する全ての組合せで添加し得る。すなわち、２種以上のサイトカインを一緒に混合することもあり得る。また、該組成物は、様々のクラスの化合物、例えば１種以上のサイトカイン、Ｔ細胞アクチベーターなどの化合物を含み得る。
【００１０】
さらなる態様において、本発明は、本細書中に記載の制御組成物を用いて生成された制御Ｔ細胞を投与することを含む、異常型または望ましくない免疫応答を阻害する方法を提供する。
【００１１】
別の態様において、本発明は、本発明の方法、すなわち、制御組成物と細胞のインキュベーションを実施するためのキットを提供する。
【００１２】
（図面の簡単な説明）
図１Ａ−Ｃは、大部分の通常のＴ細胞（conventional T cell）（２）およびバージンプロフェッショナル（professional）制御Ｔ細胞（３）を含むＴ細胞集団（１）で開始する制御Ｔ細胞を生成するための好ましい実施態様を示す。制御組成物を用いる、バージンＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の標的化は、増強された抑制活性を持つ ＞５０％活性化されたプロフェッショナル調節ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞（４）を含む処理されたＴ細胞集団（６）を生成する。これらの細胞は、強い接触依存性の抑制活性(図１Ａ)を発達させるために誘導されたバージン制御細胞または他のＴ細胞の子孫であり得る。
【００１３】
図１Ｂは、活性化されたプロフェッショナル制御Ｔ細胞（４）と通常のＴ細胞（２）を混合し、そしてＴ細胞アクチベーターにより刺激することを含む別の好ましい実施態様を示す。この実施態様において、プロフェッショナル制御細胞は、その他のＴ細胞を、Ｔ細胞耐性とよばれる現象によりサイトカイン産生Ｔ細胞（５）となるように誘導する。
【００１４】
別の実施態様において、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋の枯渇した通常のＴ細胞（２）の制御組成物による処理は、増強された抑制活性（図１Ｃ）を持つ活性化されたサイトカイン産生制御Ｔ細胞（５）となるようにこれら細胞を誘導する。
【００１５】
図２ＡおよびＢは、ＴＧＦ-βの共刺激が、全ＣＤ４＋ＣＤ２５＋およびＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞のパーセンテージと絶対数を顕著に増加させることを示す。ＴＧＦ-βの用量依存効果が示されている。また、ＴＧＦによって共刺激されたＴ細胞によって生成されるサイトカインも、ＣＤ８＋細胞を増加させる。
【００１６】
図３は、ＴＧＦ-βの抑制効果が、モノクローナル抗体でＩＬ−２を中和することによって克服されていることを示す。ＴＧＦ-βの用量依存性の共刺激特性は、少量の抗ＩＬ−２で消失される。このような用量では、ＴＧＦ-βを含まないＴ細胞活性化に影響はなかった。大量の抗ＩＬ−２は、ＩＬ−２活性を完全に阻害し、順にＴＧＦ-βに対する抑制効果を導いた。
【００１７】
図４Ａ−Ｆは、ＩＬ−２およびＴＧＦ−βの組合せが、プロフェッショナルＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞を刺激し、それらの抑制活性を増加させることを示す。このことは、Ｔ細胞アクチベーターとして同種抗原を用いることにより、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋細胞(図４ＡおよびＢ)のナイーブフラクションから単離された小さな「バージン」ＣＤ２５＋サブセットについて証明した。抑制は、３つのエフェクターと標的細胞の比によって、十分に確立されたクロミニウム放出アッセイを用いる刺激因子のリンパ芽球に対する細胞毒性のＴリンパ球（ＣＴＬ）活性の生成を阻害することによって評価した。ほとんどのＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞は、先に活性化されたもの、もしくはメモリーＣＤ４５ＲＯ＋サブセットに含まれている。これら制御細胞の抑制活性を示す研究は、図４Ｃおよび４Ｄに示す。ＩＬ−２(１０Ｕ／ｍｌ)±ＴＧＦ-β１(１ng/ml)によって、５日間、他のＴ細胞に対する同種（異型）活性化されたメモリーＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の抑制効果を示す。リンパ球の混合を、同じドナーで繰返し、活性化されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞を、１：１０比で自家移植した応答Ｔ細胞に加えた。応答細胞を、カルボキシフルオロセインで標識し、循環ＣＤ８＋細胞のパーセンテージおよび絶対数を、活性化６日後に評価した。白色棒線は、活性化されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞を添加しない循環ＣＤ８＋細胞を示す。灰色の棒線はＩＬ−２によって活性化されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の効果を示し、黒色棒線はＩＬ−２およびＴＧＦ-βによって活性化された細胞の効果を示す。抑制活性は、抗ＴＧＦ-βによって低下されない。抑制活性を評価するために同種（異型）ＣＴＬ活性の生成阻害を用いると、ＩＬ−２およびＴＧＦ-βの組合せ物は、通常のナイーブＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５細胞、および前もって活性化されたまたはメモリーＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ２５−細胞のサイトカイン-依存性抑制活性が増加する(図４ＥおよびＦ)。抗ＴＧＦ-βは、コントロールＣＤ４＋細胞で観察されるレベルにＣＴＬ活性を増加することによって細胞の抑制効果を消失した。ＴＧＦ-βの存在下で、スーパー抗原、スタフィロコッカス・エンテロトキシンＢによって誘導される抑制活性は、抗ＴＧＦ-βによって消失される。この実施例において、通常のＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞は、制御細胞となるように誘導される。
【００１８】
図５Ａ−Ｄは、ＴＧＦ-βの共刺激因子効果を媒介するＣＤ２５＋サブセットの重大な役割を確認するものである。ナイーブＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ−細胞を調製し、これらを細胞選別化によってＣＤ２５＋とＣＤ２５−細胞にさらに分画した。これらの細胞を、ＩＬ−２(１０Ｕ／ｍｌ)±ＴＧＦ-β１(１ng/ml)による同種（異型）混合リンパ球反応において活性化した。図５Ａは、ＴＧＦ-βが媒介した細胞数における２倍の増加は、＜１％ＣＤ２５＋細胞の除去により消失されたことを示す。ＣＤ２５＋細胞とＣＤ２５−細胞との１：１０の比での添加により、この効果が回復した。図５ＢおよびＣは、ＴＧＦ-βで誘導された細胞数の増加は穏やかであるが、細胞の表現型が著しく変化した場合と類似した実験を示す。ＴＧＦ-βは、ＣＤ２５およびＣＴＬＡ−４の両方を発現する細胞の数を著しく増加させた。この効果はＣＤ２５＋サブセットが除去された場合に失われた。ＣＤ２５＋細胞とＣＤ２５−細胞との１：１０の比での添加は、この効果を回復させた。図５Ｄは、該細胞をＴＧＦ-βなしで再度刺激した場合、ＣＤ２５＋細胞を含有するそれらの調製物が、ＣＤ２５＋サブセットが除去された場合のものと比較して著しく増加したことを示す。
【００１９】
図６は、ＴＧＦ-βで調節され、活性化されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞が、抑制活性を発生させるように通常のＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞を誘導し得ることを示唆する実験を示す。実験設計は、図５に示したものと同様である。ＴＧＦ-β有りとＴＧＦ-βなしで同種活性化された、ナイーブＣＤ４＋細胞、精製ＣＤ２５＋細胞、ＣＤ２５枯渇細胞、およびＣＤ２５＋細胞とＣＤ２５−細胞の混合物を、新しいＴ細胞に１：１０の比で添加し、同じ同種（異型）刺激因子細胞で同種（異型）活性化した。培養６日後のＣＤ８＋ＣＤ２５＋細胞のパーセンテージを測定した。水平の線は、添加されたＣＤ４＋細胞を含まないＣＤ８＋とＣＤ２５＋細胞のパーセンテージを示す。ＣＤ２５−細胞によってではなく、ＣＤ２５＋細胞によって顕著な抑制が示された。ＣＤ２５＋細胞をＣＤ２５−細胞と１：１０の比で混合し、ＴＧＦ-βで同種（異型）活性化した場合、それらの抑制活性は、同じような数の精製されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞に相当する。また、この実験は、ＩＬ−２およびＴＧＦ-βの抑制誘導特性が、ＣＤ４＋細胞のＣＤ２５＋サブセットに全く限定されないことを示す。ＣＤ２５＋細胞が枯渇されたナイーブＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋細胞のＩＬ−２およびＴＧＦ-β処理もまた、抑制活性を誘導した。この抑制は抗ＴＧＦ-βで消失されなかった。
【００２０】
図７ＡおよびＢは、ＩＬ−２およびＴＧＦ-βが、抑制細胞となるようにＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−細胞を誘導する場合の他の実験を示す。多様なＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋サブセットを、±ＴＧＦ-βで活性化し、ＣＴＬ活性の生成阻害による抑制活性について試験した。この実験において、全てのＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋細胞の抑制活性は、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５-サブセットと同一であった(図７Ａ)。抗ＴＧＦ-βは、この抑制活性を逆転させなかった(図７Ｂ)。
【００２１】
図８Ａ−Ｊは、ＩＬ−２およびＴＧＦ-βが、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ２５＋細胞の、前もって活性化されたもしくはメモリーフラクションの増殖および抑制活性を、内生的抑制効果が克服された後に増強させることを示す。抑制因子細胞誘導に対するＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ２５＋細胞の内生的ネガティブ・フィードバック効果は、ＴＧＦ-βで全ＣＤ４＋細胞を同種（異型）活性化して制御細胞を生成することによって示された。ＣＴＬ活性の生成阻害は、抑制を評価するために用いた。ＴＧＦ-βは、全体のＣＤ４＋細胞によって生成される抑制活性が、ＣＤ４５ＲＯサブセット、またはＣＤ２５＋フラクションが枯渇した場合よりも有意に低いことを示す(図８ＡおよびＢ)。図８Ｃは、ＣＤ２５＋抑制細胞の除去により、同種（異型）活性化後のＣＤ４＋細胞の数が相応じて増加したことを示す。水平の線は、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋細胞の開始数を示す。大部分のＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞はＣＤ４５ＲＯフラクションに含まれるため、ＴＧＦ-βは、混合リンパ球反応の後に復活したＴ細胞数を確実に低下させた。図８Ｄ−Ｆは、ＩＬ−２が、ＴＧＦ-βの阻害効果を克服し得るということを示す。ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ細胞を調製し、いくつかでＣＤ２５＋細胞を枯渇していた。２つの集団は、上記のようにＩＬ−２およびＴＧＦ-βによって同種（異型）細胞で刺激した。６日後に全数および発現するＣＤ２５およびＣＴＬＡ-４を測定した。ＩＬ−２単独との比較において、ＩＬ−２およびＴＧＦ-βの組合せは、穏やかであるが、その全ての数（図８Ｄ）、ＣＤ２５＋細胞(図８Ｅ)、ＣＴＬＡ−４＋の細胞数(図８Ｆ)を有意に増加させた。対照的に、ＴＧＦ-βは、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ２５−細胞に対する阻害効果を示した。これらの研究は、ＩＬ−２およびＴＧＦの共刺激因子的効果が、特異的にＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ２５サブセットを標的としたことを示唆するものであった。図８Ｇは、ＩＬ−２およびＴＧＦ-βの組合せが、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ２５＋細胞の増殖を増加させることを示す。水平の線は、出発の細胞集団を示す。ＩＬ−２およびＴＧＦ-βにより、これらＣＤ２５＋Ｔ細胞の数は、培地中で５０％低下したが、それらはＩＬ−２およびＴＧＦ-βで培養した場合３３％増加した。図８Ｈは、ＣＤ１２２に関するＴＧＦ-β-依存性の上方調節を示す。ＣＤ２５＋が標的とされ、ＣＤ２５＋の枯渇はこの効果を消失させた。図８ＩおよびＪは、ＣＤ２５＋枯渇ナイーブＣＤ４＋であっても、ＴＧＦ-βの独立した抑制活性を発生させるように誘導し得ることを示す。ＩＬ−２をＴＧＦ-βに添加することにより、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−細胞が抗ＴＧＦ-βによって消失されない強い抑制活性を発生させることを可能にした。
【００２２】
図９Ａ−Ｄは、プロフェッショナルＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御Ｔ細胞によって提示される特性を表す表面マーカーの発現に対するＴＧＦ-βの共刺激因子的効果を示す。ＣＤ２５に加えて、これらはＣＴＬＡ-４およびＣＤ６２Ｌを包含する。ＣＤ２５＋細胞、ＣＴＬＡ−４＋細胞およびＣＤ６２Ｌ細胞の全数が、ＴＧＦ-βを含有する培養物中で増加した(図９Ａ、Ｂ、Ｃ)。さらに、ＴＧＦ-βは、ＣＤ１２２、ＩＬ−２受容体のベータ鎖の発現を増強した(図９Ｄ)。この受容体は、ＩＬ−２とＩＬ−１５を結合し、シグナル伝達に関与する。該ＣＤ４＋ＣＤ２５＋サブセットは、このサブセットの枯渇化が受容体発現の著しい増強を消失させたのでＴＧＦ-βの特異的な標的であった。 
【００２３】
図１０は、ＩＬ−２受容体のβ鎖を抗１２２で遮断することが、ＣＤ２５＋細胞の抑制活性を消失し得ることを示す。Ｔ細胞を同種（異型）細胞で刺激し、ＣＴＬ活性を評価した。免疫磁気ビーズベッドを用いるＣＤ２５＋細胞の部分的な枯渇はＣＴＬ活性を増強させたが、これは全抑制細胞活性が減少したことを示唆するものである。抗ＣＤ１２２の様々な用量でＩＬ−２Ｒβ鎖からのＩＬ−２シグナル伝達を遮断することにより、さらに強いＣＴＬ活性を増強した。この効果は、少量の細胞表面のＣＤ２５を用いてＴ細胞の活性を遮断し、ＣＤ２５の発現を損失させる抑制細胞を阻害することを理由とする。
【００２４】
図１１ＡおよびＢは、ＩＬ−２およびＴＧＦ-βの組合せに加えて、ＩＬ−１５およびＴＧＦ−βが、ＣＤ４＋細胞に対して共刺激因子的効果を持つことを示す。ＣＤ４＋細胞を、同種（異型）の非Ｔ細胞±ＴＧＦ-βで刺激し、ＣＤ１２２およびＣＤ２５ＣＴＬＡ-４のダブルポジティブ細胞の発現をフローサイトメトリーで定量した。ＩＬ−１５のＴＧＦ-βへの添加は、ＩＬ−２およびＴＧＦ-βの組合せと同様に、これらのマーカーの発現を増強した。
【００２５】
本発明の詳細な説明
本発明は、ex vivoで制御Ｔ細胞を生成する方法を目的とする。該方法は、ナイーブＴ細胞を単離すること、それらを制御組成物で処理することを包含する。制御組成物による処理は、生成された制御Ｔ細胞の数および抑制活性を増加させる。この増強された抑制活性は、Ｔ細胞の増殖および分化に非常に重要な細胞表面の受容体の誘導により媒介されると考えられる。
【００２６】
さらに、本明細書に記載の方法によって生成される制御Ｔ細胞は、増強された抑制活性を有する制御細胞を発生するように他のＴ細胞集団を誘導する。抑制活性を誘導するこの能力は、感染耐性と呼ばれる現象により起こりうる(参照、Waldmann H., et al, (1993) Science, 259:974-7)。制御Ｔ細胞は、自己反応性Ｔ細胞が活性化され、および免疫病理の原因となることを防ぐ。また、制御Ｔ細胞は細菌の抗原が免疫媒介組織損傷を誘導することを防止する(参照、Zheng, et al., (2002) J. Immunol., 169: 4183-4189)。
【００２７】
いくつかの制御Ｔ細胞サブセットは同定されてきた(参照、Zheng, et al., (2002) J. Immunol., 169: 4183-4189)。例えば、胸腺において、ＣＤ４＋Ｔ細胞(ＣＤ４＋ＣＤ２５＋)のサブセットは、ＩＬ−２受容体複合体(ＣＤ２５)のα鎖を構成的に発現する。これらＣＤ４＋細胞は、自己免疫性および移植拒絶反応の防止、ホメオスタシスリンパ球増殖のコントロール、リンパ球ヌードにおける胚中心形成の調節を包含する広い範囲の抑制活性を示す。これら細胞は、接触依存、ＴＧＦ-β依存、メカニズムによって抑制され、「プロフェッショナル」制御Ｔ細胞として呼ばれる。
【００２８】
Ｔｈ３またはＴｈ３様細胞とよばれる他の制御細胞は、ＴＧＦ-βの免疫抑制レベルを生み出すＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかでありうる。これらの細胞は、経口または鼻腔内免疫化の応答において、末梢リンパ様組織、例えば粘膜リンパ様組織で生成する。Ｔｈ３細胞は、実験的アレルギー性脳炎および糖尿病を含むいくつかの実験的自己免疫疾患において、保護的役割を果たす。
【００２９】
初代の通常のＴ細胞(ＣＤ４＋ＣＤ２５-)およびいくつかのバージンＣＤ４＋ＣＤ２５＋プロフェッショナル制御Ｔ細胞を含むナイーブＣＤ４＋細胞集団を、制御性組成物で処理すると、いくつかのバージンプロフェッショナル制御Ｔ細胞が刺激されて、増殖し、増強された抑制活性を有する活性化されたプロフェッショナル制御細胞が生成する(参照、図１Ａ)。図１Ａに示したように、ナイーブ(ＣＤ４５ＲＡ＋ＲＯ−)ＣＤ４＋細胞は、一般的に９９％の通常のＴ細胞(ＣＤ４＋ＣＤ２５-)である。しかし、制御組成物で活性化された場合、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞のパーセンテージは、これらの細胞が処理されたＣＤ４＋細胞集団の全ての５０％以上を含むように、著しく増加した。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋の集団は、バージンＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の子孫、およびバージンＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞によって制御細胞となるように活性化されたその他のＴ細胞を包含する。この現象は、このサブセットを除去することによって排除され得るので、バージンＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御細胞のサブセットに依存する(Yamagiwa et al, (2001) J. Immuno. 166:7282-89)。
【００３０】
活性化されたプロフェッショナル制御Ｔ細胞が、通常のＴ細胞と混合される場合、それらは、Ｔ細胞の活性化によって処理されるときにサイトカイン産生制御Ｔ細胞集団を生成する(図１Ｂ)。重要なことに、サイトカインを含む制御組成物による反復処理は、サイトカイン産生制御Ｔ細胞のこの集団を生成するのに必要でない。
【００３１】
また、サイトカイン産生制御Ｔ細胞は、通常のＴ細胞を制御組成物で処理することによってプロフェッショナルＣＤ２５＋Ｔ細胞が枯渇した通常のＴ細胞から生成され得る(参照、図１Ｃ)。
【００３２】
すなわち、制御組成物とともにＴ細胞調製物における少数のバージンＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞を標的とすることにより、（１）強い抑制活性を有するプロフェッショナル制御Ｔ細胞の顕著な発現；および（２）サイトカイン産生細胞となる通常のＴ細胞の誘導を生じる。生成されたプロフェッショナルおよびサイトカイン産生細胞の集団は、処理されたＴ細胞集団の組成物、制御組成物の組成物および非Ｔアクセサリー細胞が添加されるかどうかに依存する。
【００３３】
上記アプローチの１つによって生成される１以上の制御Ｔ細胞サブセットの投与は、個体において望ましくない免疫応答を阻害するのに使用される。例えば、抗体媒介自己免疫不全に罹った個体において、本発明は、末梢血液Ｔ細胞の抗体産生を下方調節する能力を回復し、細胞媒介性免疫応答を回復する。細胞媒介機能不全に罹った患者において、本発明は、別のＴ細胞において細胞毒性のＴ細胞活性を抑制する制御Ｔ細胞を生成する。臓器移植を受けた患者において、本発明は、レシピエントＴ細胞がドナー臓器の破壊することから守る。軸細胞の移植を受ける患者において、本発明はドナー軸細胞がレシピエント細胞および組織を破壊することを防止する。
【００３４】
すなわち、本発明は、末梢血液単球細胞(ＰＢＭＣ)からＴ細胞を単離すること、およびそれらの細胞を、抑制活性を有する制御Ｔ細胞の生成を誘導する少なくとも１つの化合物を含む制御組成物で処理することを含む、制御Ｔ細胞を生成する方法を導き出す。
【００３５】
末梢Ｔリンパ球
成人のヒト免疫系、末梢Ｔ細胞において、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両方は、（ａ）活性化要件；（ｂ）エフェクター機能(例えば、サイトカイン合成)；(ｃ)回帰挙動（homing behavior）；（ｄ）接着機能；および（ｅ）細胞表面表現型を含む、多くの相関する機能的および表現型の特徴によって、２つの主なサブセット、ナイーブ対メモリー - エフェクターに分離し得る。未成熟(すなわち、新生児)免疫系において優性であり、大部分の成熟胸腺細胞に類似する推定ナイーブサブセットは、下記態様を示す：（ａ）リコール抗原にほとんどもしくは全く応答しない；（ｂ）エフェクターシリン（cylines）、例えばインターフェロン-γを産生する能力をほとんどもたないか、もしくは全くもたない;（ｃ）ＴＣＲ媒介活性化のための高い共刺激要件；（Ｄ）ＭＨＣに制限された細胞毒性のＴ細胞中の不十分な成熟；（ｅ）３次部位でなく２次リンパ様組織におけるin vivo局在化に有効；（ｆ）アポトーシスおよび対応するこれらの機能的特徴に対する相対的に低い感受性；（ｇ）高分子量の優性、ＣＤ４５タンパク質チロシンホスファターゼの低活性ＲＡアイソフォーム；（ｈ）多くの一般的な接着分子、例えば、ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８(ＬＦＡ−１)、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１)、ＣＤ２、ＣＤ５８(ＬＦＡ−３)およびＣＤ４４、アポトーシス-トリガー分子のＣＤ９５／Ｆaxおよび第３次皮膚選択性回帰受容体ＣＬＡの均一な低い発現；（ｉ）末梢リンパ球ヌード回帰受容体Ｌ−セレクチンおよび共刺激性分子ＣＤ２７の均一な高い発現；および（ｊ）パイエル板回帰受容体α４β７インテグリンの均一な穏やかな発現 (Picker and Siegelman, (1999) "Lymphoid Tissue and Organs"in W. E. Paul, ed., Fundamental Immunology, 4th ed., chapter 14, pp 479-531)。
【００３６】
対照的に、リコール（recall）抗原に応答し得る莫大な数の細胞を含み、適当な活性化の後に前記のナイーブサブセットからin vitroで生じ得る該メモリー-エフェクターサブセットは、低分子量、高活性のＲＯＣＤ４５アイソフォームを優先的に発現し、有効なエフェクター機能（例えば、エフェクターサイトカインの産生、細胞毒性）を提示し、そしてＣＤ９５／ＦＡＳ発現の増加、アポトーシスに対する感受性の増加、ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８などの上記の一般的な接着分子の高レベル、ならびにＬ−セレクチン、α４β７インテグリンおよびＣＤ２７の不均一な発現を示す(Picker and Siegelman, (1999) "Lymphoid Tissues and Organs  in W. E. Paul, ed., Fundamental Immunology, 4th ed., chapter 14, pp 479-531)。メモリーエフェクターＴ細胞分化の特異的なマーカーは、広くヒトに通用するが、同様のナイーブメモリーＴ細胞の２つの分類が動物にも存在する。
【００３７】
このように、本発明の方法はＴ細胞の単離で始まる。下記に示すように、該方法は、ナイーブとメモリー-エフェクターＴ細胞の単離を提供する。ＣＤ４５ＲＡ＋／ＲＯ−を発現するＴ細胞を意味する本明細書中の「ナイーブＴ細胞」は、それらが免疫化抗原に暴露されていないために分化されておらず、本明細書中に記載のような「ナイーブＴ細胞」の特徴的な形態を持つ。ＣＤ４５ＲＡ−／ＲＯ＋を発現するＴ細胞を意味する本明細書中の「メモリー-エフェクターＴ細胞」は、免疫化抗原に暴露されているために分化されており、「メモリー-エフェクター」Ｔ細胞の上記の特徴的な形態を持つ。
【００３８】
Ｔ細胞の単離
末梢血液単球細胞(ＰＢＭＣ)を、標準技術を用いて、個体の静脈血液をヘパリン化して採取した(参照、Zheng, et al., (2002) J. Immunol., 169: 4183-4189)。本明細書中の「末梢血液単核細胞」または「ＰＢＭＣ」は、リンパ球(Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞などを包含する)および単球を意味する。好ましくは、赤血球を残すか、または患者に戻してＰＢＭＣのみを取り出す。当業者には既知のように、例えば、白血球処理（leukophoresis）技術を用いて行う。一般的には、５〜７リットルの白血球処理過程をなし、主にＰＢＭＣを患者から除き、残っている血液成分を戻す。細胞試料の回収は、当業者には既知の抗凝集剤、例えばヘパリンの存在下でなすのが好ましい。
【００３９】
一般的に、ＰＢＭＣを含む試料は、広範な方法で前処理し得る。一般的に、該細胞は、回収と同時に濃縮しない場合、または細胞をさらに精製および／または濃縮しない場合に、一旦回収してから細胞をさらに濃縮する。該細胞を洗浄し、計測し、緩衝液中で懸濁せしめる。
【００４０】
一般的に、ＰＢＭＣは、当業者に標準的な技術を用いて処理のために濃縮する。好ましい実施態様において、leukopheresis回収過程は、より完全な下記概説のように、滅菌されたleukopakにおいて制御組成物の試薬または用量を含有し得るＰＢＭＣが濃縮された試料をもたらす。一般的に、例えば、当業者には既知のFicoll-Hypaque 密度勾配遠心分離のような、さらなる濃縮/精製過程を実施する。
【００４１】
分離または濃縮方法は、抗体被覆磁気ビーズを用いる磁性分離、アフィニティー・クロマトグラフィー、もしくはモノクローナル抗体と結合するか補体を使用する細胞毒性薬物、固体マトリックスに結合したモノクローナル抗体を用いる「パニング」を含むが、これに限定するものではない。例えば、磁気ビーズ、アガロース・ビーズ、ポリスチレンビーズ、ホロー（follow）ファイバー膜およびプラスチック表面などの固体マトリックスに結合した抗体を直接分離に供しうる。抗体に結合した細胞は、細胞懸濁液から固体支持体を物理的に分離することによって、除去もしくは濃縮し得る。この抽出条件および方法は、用いられるシステムに対する特定のファクターに依存する。適切な条件の選択は当業者には既知であろう。
【００４２】
抗体は、ビオチンと共役し、支持体上に結合したアビジンまたはストレプトアビジンで除去し得るか、または蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ)とともに用い得る蛍光色素に接合（結合）して、細胞分離を可能にし得る。全ての技術は、所望の細胞の生存性に有害でない限り用いることができる。
【００４３】
好ましい実施態様において、ＰＢＭＣはオートメーション化された閉鎖系において分離する。そのような１つの例は、Nexell Isolex 300i Magnetic Cell Selection Systemである。一般的に、閉鎖系は、滅菌性を維持し、細胞分離、抑制細胞機能の活性化および開発に使用される方法の標準化を保証するのに好ましい。
【００４４】
好ましい実施態様において、例えば、自己抗体、阻害剤など、当業者には既知の技術を用いてＰＢＭＣは洗浄し、血清タンパク質および可溶性血液成分を除去する。一般的に、これは、生理的培地または緩衝液の添加の後の遠心分離を包含する。これを必要に応じて繰返してよい。ＰＢＭＣは、生理学的培地中で、好ましくは、ＡＩＭ−Ｖ血清不含培地(Life Technologies)(血清には、ＴＧＦ-βの阻害剤の顕著な量が含まれるので）に再懸濁されるのが好ましいが、緩衝液、例えば、Hanks balanced salt solution (HBBS) または 生理学的生理食塩水緩衝液（ＰＢＳ）は使用され得る）も用い得る。
【００４５】
好ましい実施態様において、末梢血液リンパ球(ＰＢＬ)は、ＰＢＭＣを、連続Percoll密度勾配に加えることによって調製し、高密度フラクションを回収した。ある実施態様において、ＰＢＭＣは、ＰＢＬの単離前に上記のように、濃縮し、洗浄する。Ｔ細胞は、２-アミノエチルイソチオウロニウム臭化物処理されたＳＲＢＣを用いて直ぐにロゼット化することによって調製する。Ｔ細胞は、さらに、ＣＤ１６、ＣＤ７４およびＣＤ１１Ｂに対する抗体(Ａｂｓ)を用いる染色および免疫磁気ビーズを用いて反応性細胞を消失させることによって、ロゼット化細胞からさらに精製する。このフラクション中のＣＤ３＋細胞の％は、９６％よりも高いのが普通である(参照、Zheng, et al., (2002) J. Immunol., 169: 4183-4189)。
【００４６】
好ましい実施態様において、ＣＤ８＋細胞は、負の選択によって調製する(参照、Zheng, et al., (2002) J. Immunol., 169: 4183-4189)。
【００４７】
好ましい実施態様において、ＣＤ４＋細胞は、免疫磁気ビーズを用いる負の選択によって、ＣＤ８に対するＡｂｓで染色されるＴ細胞から調製する。ＣＤ４＋細胞の精製度は、９５％よりも高いのが普通である。ＣＤ２５枯渇Ｔ細胞は、細胞選別によってＣＤ４＋Ｔ細胞から調製する。選別の前に、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋集団は、全ＣＤ４＋Ｔ細胞の中でおおよそ３-５％であった。選別後、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋集団は、０.３％よりも少なかった(参照、Zheng, et al., (2002) J. Immunol., 169: 4183-4189)。
【００４８】
好ましい実施態様において、ＣＤ４＋細胞は、未分化のナイーブなＣＤ４＋Ｔ細胞のみを含むようにさらに精製する。これは、モノクローナル抗体を用いてＣＤ４５ＲＯ＋細胞からＣＤ４＋細胞を枯渇することによって行う。
【００４９】
ＮＫＴ細胞は、当業者には既知の標準技術によって単離しうる(参照、例えば、Gray, et al. (1998) J. Immunol., 160: 2248、出典明示により本明細書の一部とする)。
【００５０】
所望により、Ｂ細胞は、単球およびＮＫ細胞の枯渇について５ｍＭ Ｌ−ロイシンメチルエステル（ＬＭＥ）により処理されたロゼッタ化していないＰＢＭＣから得る。このようにして得た細胞をＣＤ３、ＣＤ１６およびＣＤ１１ｂに対するＡｂｓで染色し、免疫磁気ビーズによって反応性細胞を枯渇させる。得られる集団は、９０％以上のＣＤ２０＋および０.５％のよりも少ないＣＤ３＋である（参照、Zheng, et al., (2002) J. Immunol., 169: 4183-4189)。
【００５１】
ある実施態様においてＴ細胞サブセット、例えば、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞は、制御組成物による処理後までＰＢＭＣから単離しない。これらの実施態様において、Ｔ細胞は、制御組成物によって処理された後に単離し、１以上の処理されたＴ細胞サブセットは、免疫不全に罹っている患者に戻す。
【００５２】
上記の好ましい態様に加えて、当業者には周知のように、Ｔ細胞を単離するためにその他の多くの方法がある。
【００５３】
一旦精製または単離された細胞は、小分けし、好ましくは液体窒素中で凍結し、または下記のように即時使用し得る。凍結された細胞は、必要に応じて溶解して使用する。用い得る凍結保護剤は、ジメチルスルホキシドスルホキシド(ＤＭＳＯ)(Lovelock, J. E. and Bishop, M. W. H., 1959, Nature 183:1394-1395; Ashwood-Smith, M. J., 1961, Nature 190:1204-1205)、ヘタスターチ（hetastarch）、グリセロール、ポリビニルピロリドン(Rinfret, A. P., 1960, Ann. N.Y. Acad. Sci. 85:576)、ポリエチレングリコール(Sloviter, H. A. and Ravdin, R. G., 1962, Nature 196:548)、アルブミン、デキストラン、スクロース、エチレングリコール、ｉ−エリスリトール、Ｄ−リビトール、Ｄ−マンニトール(Rowe, A. W., et al., 1962, Fed. Proc. 21:157)、Ｄ−ソルビトール、ｉ−イノシトール、Ｄ-ラクトース、塩化コリン(Bender, M. A., et al., 1960, J. Appl. Physiol. 15:520)、アミノ酸(Phan The Tran and Bender, M. A., 1960, Exp. Cell Res. 20:651)、メタノール、、アセトアミド、グリセロールモノアセテート(Lovelock, J. E., 1954, Biochem. J. 56:265)および無機塩(Phan The Tran and Bender, M. A., 1960, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 104:388; Phan The Tran and Bender, M. A., 1961, in Radiobiology Proceedings of the Third Australian Conference on Radiobiology, Ilbery, P. L. T., ed., Butterworth, London, p. 59)を含むが、これらに限定するものではない。典型的には、細胞は、１０％ＤＭＳＯ、５０％血清および４０％ＲＰＭＩ１６４０ 培地に保存する。細胞分離および精製方法は、米国特許番号５８８８４９９に記載されており、出典明示により本明細書の一部とする。
【００５４】
制御Ｔ細胞の生成
一旦単離されたＴ細胞を、制御組成物で処理し、増強された抑制活性を持った活性化された制御Ｔ細胞を生成する。本明細書中の「制御Ｔ細胞」は、他のＴ細胞における細胞毒性のＴ細胞活性を防止し、抗体産生を阻害し、遅延型高感受性応答を抑制し、単球または樹状細胞または抗原提示細胞としてのＢ細胞機能を阻害する能力を発展させるＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットを意味する。上記で検討したように、いくつかの制御Ｔ細胞サブセットが存在する。これらのＴ細胞サブセットは、２つのカテゴリーに広く分けられる：（１）プロフェッショナル制御Ｔ細胞；および（２）サイトカイン産生制御細胞。
【００５５】
本明細書中「プロフェッショナル制御Ｔ細胞」は、α鎖のＩＬ−２受容体複合体、ＣＤ２５を構成的に発現するＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットを意味する。すなわち、プロフェッショナル制御Ｔ細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋である。これら細胞は、抗体産生を下方調節すること、細胞毒性のＴ細胞活性を阻害すること、他のＴ細胞の活性化を抑制することを含む、広い範囲の抑制活性を示す。これら抑制活性は、他の細胞に直接結合するためにプロフェッショナル制御Ｔ細胞を必要とし（すなわち、接触依存性）、１以上の阻害シグナルを伝達する。サイトカイン、例えば、インターロイキン１０またはＴＧＦ-βは、これら抑制活性の誘導に必要ではない(すなわち、サイトカイン依存);すなわち、活性は中和化モノクローナル抗体をこれらサイトカインに添加することによって消失しない。
【００５６】
プロフェッショナル制御Ｔ細胞は、バージンまたは活性化されたプロフェッショナル制御細胞としてさらに選別しうる。本明細書中「バージンプロフェッショナル制御Ｔ細胞」は、本明細書に記載の制御組成物で処理されていないプロフェッショナル制御Ｔ細胞を意味する。本明細書中「活性化したプロフェッショナル制御Ｔ細胞」は、本明細書に記載の制御組成物で処理され、そしてこの処理の結果として増強された抑制活性を示す、プロフェッショナル制御Ｔ細胞を意味する。活性化されたプロフェッショナル制御細胞は、ＣＤ４＋細胞から誘導する。
【００５７】
本明細書中「サイトカイン産生制御Ｔ細胞」は、ＴＧＦ-βの免疫抑制レベルを生成するＮＫＴ細胞、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔｈ３またはＴｈ３様細胞を意味する。これらの細胞がＩＬ−２受容体複合体のα鎖を構成的に発現しない場合、それらはＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞である。サイトカイン産生制御Ｔ細胞も自己免疫的に抑制し得るが、それらは、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞の一般的なフィードバックレギュレーターとしての主な機能である。活性化されたサイトカイン産生制御Ｔ細胞は、制御組成物で処理されたＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞またはＮＫＴ細胞から生じうる。 
【００５８】
好ましい実施態様において、ＰＢＭＣの処理または単離したＴ細胞サブセットは、制御Ｔ細胞の数およびそれら抑制活性の両方を増加する。図１に記載のようにＴ細胞集団においてバージンプロフェッショナル制御因子の数は、全体の１％より低い。制御組成物による処理の後、この集団のプロフェッショナル制御Ｔ細胞のパーセンテージは、１％より少なかったものから、１０％以上に増加した。好ましい態様において、該集団のプロフェッショナル制御Ｔ細胞の％は、２５％以上に増加した。さらに好ましくは、該集団のプロフェッショナル制御Ｔ細胞の％は、５０％以上に増加した。より好ましくは、該集団のプロフェッショナル制御Ｔ細胞の％は、７０％以上に増加した。
【００５９】
本明細書中「抑制活性」は、Ｔ細胞およびＢ細胞を包含する他のリンパ球、単球および樹状細胞の活性化を阻害するための制御Ｔ細胞の能力を意味する。本明細書中「増強された抑制活性」とは、ＴＧＦ-βを含む制御組成物の存在下で活性化された制御Ｔ細胞を意味する。これら制御Ｔ細胞は、調節されていない制御細胞よりも少ない数で他の免疫細胞の活性を阻害し得る。プロフェッショナル制御Ｔ細胞の該抑制活性は、当業者には既知の同種（異型）混合リンパ球反応によって測定され、いくつかの図に記載されている。例えば、リンパ様組織から単離されるプロフェッショナル調節ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、１：１〜１：４の比で他の細胞に添加した場合の抑制活性を示す（Shevach, E.M. (2000) Regulatory T cells in autoimmunity.  Annu. Rev. Immunol.,18, 423-449）。対照的に、１：１０から１：１００以下の、ＴＧＦ-βを含む制御組成物の存在下において生じる活性化したＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞は、強い抑制効果を発揮する(Yamagiwa et al, (2001) J. Immuno. 166: 7282-89).
【００６０】
一旦単離されてから、該細胞は制御組成物で処理する。本明細書中「処理する」は、該細胞が、制御Ｔ細胞活性を発生させるのに十分な期間、制御組成物でインキュベートすることを意味する。このインキュベーションは、生理的温度であるのが一般的である。
【００６１】
本明細書中「制御組成物」は、望ましくない免疫応答を抑制するようにＴ細胞を誘導し得る組成物を意味する。本明細書中の「望ましくない免疫応答」は、自己と非自己を区別したり、外来抗原に応答する免疫系、すなわち移植組織への免疫応答の欠陥を特徴とする免疫系の機能不全を意味する。すなわち、望ましくない免疫応答には、Ｔ細胞活性化の阻害、自発的抗体および自己抗体産生、または細胞毒性、または両方の阻害を含むが、これらに限定するものではない。
【００６２】
制御組成物は、多数の成分を含み得る：（１）サイトカイン；（２）刺激因子細胞(すなわち、照射をされたＴ細胞枯渇単球細胞(参照、米国特許出願番号０９/８３３５２６)；（３）Ｔ細胞アクチベーター；（４）非Ｔアクセサリー細胞；および（５）抗サイトカイン中和モノクローナル抗体を包含する。
【００６３】
制御組成物の濃度は、組成物中に含まれる化合物の同一性によって変化するが、一般に、生理学的濃度であり、所望の効果、すなわち制御細胞の特異的型の増強を提供するのに必要な濃度である。
【００６４】
一般的には、制御組成物は、サイトカインを包含する。適当なサイトカインには、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１５、ＴＧＦ−βおよびＴＮＦ−αが含まれるが、これらに限定するものではない。好ましいサイトカインには、ＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＴＧＦ-βが含まれる。
【００６５】
好ましい実施態様において、ＴＦＧ−βは、制御組成物の成分である。本明細書中で「形質転換増殖因子−β」または「ＴＧＦ-β」は、３つのアイソフォームのＴＧＦ-β１、ＴＧＦ-β２およびＴＧＦ-β３を包含するＴＧＦ-βのいずれか１つのファミリーを意味する；参照、Massague, J. (1980), J. Ann. Rev. Cell Biol 6:597. Lymphocytes and monocytes produce the β１ isoform of this cytokine(Kehrl, J.H. et al. (1991), Int J Cell Cloning 9: 438-450)。ＴＦＧ−βは、処理される哺乳動物細胞に対して活性化するＴＧＦβのいずれの形態でもあり得る。ヒトにおいて、組換えＴＦＧ−βは現在のところ好ましい。一般的には、使用されるＴＧＦ-βの濃度は、約２picograms/mlの細胞懸濁液から約１０ngの範囲で、約１０pgから約４ngが好ましく、約１００pgから約２ngが特に好ましく、１ng/mlが理想的である。
【００６６】
好ましい実施態様において、ＩＬ−２を制御組成物において使用する。ＩＬ−２は、処理される哺乳類細胞に対して活性である、どのような形態であってもよい。ヒトにおいて、組換え体ＩＬ−２が現在のところ好ましい。一般的に、使用されるＩＬ−２濃度は、細胞懸濁液の約１Unit/mlから約１００U/mlの範囲で、約５U/mlから約２５U/mlが好ましく、特に１６U/mlが好ましい。好ましい実施態様においては、ＩＬ−２を単独で使用しない。
【００６７】
好ましい実施態様において、ＩＬ−１５を、制御組成物において使用する。ＩＬ−１５は、処理される哺乳動物の細胞に活性であるＩＬ−１５のいずれかの形態であってもよい。ヒトにおいては、組換え体ＩＬ−１５が現在のところ好ましい。一般的には、使用されるＩＬ−１５の濃度は、約１Unit/mlから約１００U/mlで、約５U/mlから約２５U/mlの範囲の細胞懸濁液が好ましく、１０U/mlが特に好ましい。好ましい実施態様においては、ＩＬ−１５を単独で使用しない。
【００６８】
好ましい実施態様において、制御組成物はＴ細胞アクチベーターを含む。適当なＴ細胞アクチベーターは、可溶性抗原、抗原のペプチドフラグメント、同種（異型）抗原、抗ＣＤ２抗ＣＤ３抗ＣＤ２８、ＬＦＡ３および有糸分裂促進物を包含する。当業者には既知のように抗ＣＤ３、可溶性抗原および抗原のペプチドフラグメントは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ)アクチベーターである。
【００６９】
ＣＤ２はＴリンパ球によって発現された細胞表面糖タンパク質である。本明細書中で「ＣＤ２アクチベーター」は、ＣＤ２シグナル経路を開始する化合物を意味する。好ましいＣＤ２アクチベーターは、抗ＣＤ２抗体(OKT11, American Type Culture Collection, Rockville MD and GT2, Huets, et al., (1986) J. Immunol. 137:1420)を含む。加えて、制御組成物においてＣＤ２リガンドＬＦＡ−３を包含する抗ＣＤ２抗体の組合せ物を用いうる。一般的には、使用されるＣＤ２アクチベーターの濃度は、ＴＧＦ-β産生を誘導するのに十分なものである。使用される抗ＣＤ２抗体の濃度は、約１ng/mlから約１０μg/ml、範囲であって、約１０ng/mlから約１００ng/mlが特に好ましい。
【００７０】
ある実施態様において、細胞を活性化するための有糸分裂促進物を使用するのが望ましい;すなわち、多くの休止細胞は大量のサイトカイン受容体を含有しない。有糸分裂促進物、例えば、コンカナバリンＡ(ＣｏｎＡ)またはブドウ状球菌エンテロトキシンＢ(ＳＥＢ)の使用により、細胞の刺激がサイトカイン受容体を生成させることを可能にし、順に、本発明の方法をより効果的になし得る。有糸分裂促進物で用いる場合、当業者には知られているように、一般的に、１μg/mlから約１０μｇ/mlの範囲の濃度で使用する。さらに、有糸分裂促進物、例えば当業者には既知のα-メチルマンノシドを除去するための成分によって細胞を洗浄することが望まれる。
【００７１】
好ましい実施態様において、非Ｔアクセサリー細胞または等価な代用物は、制御組成物に使用する。制御組成物において包含され得る非Ｔアクセサリー細胞は、Ｂ細胞、マクロファージ、単球および樹状細胞である。
【００７２】
好ましい実施態様において、抗サイトカイン中和化モノクローナル抗体を、制御組成物において使用する。適当な抗サイトカイン中和化モノクローナル抗体には、抗ＴＧＦ-βが含まれる。
【００７３】
ある実施態様において、例えば、移植拒絶反応またはＧＶＨＤにおいて使用するための制御Ｔ細胞の生成、刺激因子細胞(例えば、照射を受けたＴ細胞枯渇細胞)は、制御組成物(参照、米国特許出願番号０９/６５３９２４および０９/８３３５２６)に含まれる。
【００７４】
従って、少なくとも１つの上記成分を含む制御組成物を、活性化された制御Ｔ細胞を生成するために使用し得る。この制御組成物は、化合物の同クラスからの１以上の化合物を含有しうる、すなわち、２以上のサイトカインを共に混合し得る。また、該組成物は、様々なクラスの化合物、例えば、サイトカインおよびＴ細胞アクチベーターなどの化合物を含有し得る。従って、下記：（１）１つのサイトカイン；（２）２以上のサイトカイン；（３）少なくとも１つのサイトカイン、およびＴ細胞アクチベーター；（４）少なくとも１つのサイトカイン、Ｔ細胞アクチベーター、および刺激因子；（５）少なくとも１つのサイトカイン、Ｔ細胞アクチベーター、および非Ｔアクセサリー細胞；および（６）少なくとも１つのサイトカイン、Ｔ細胞アクチベーター、および抗サイトカイン抗体、（７）非Ｔアクセサリー細胞を持つ、もしくは持たない、少なくとも１つのサイトカインおよび少なくとも１つのＴ細胞アクチベーター；および（８）非Ｔアクセサリー細胞を持つ、もしくは持たない、少なくとも１つのサイトカイン、少なくとも１つのＴ細胞アクチベーター、少なくとも１つの抗サイトカイン抗体；および（９）非Ｔアクセサリー細胞を持たない、もしくは持つ、少なくとも１つのサイトカイン、少なくとも１つのＴ細胞アクチベーター、少なくとも１つの刺激因子、少なくとも１つの抗サイトカイン抗体；を含有する制御組成物を用いて、活性化された制御Ｔ細胞を生成し得る。当業者には周知のように、上記に挙げた組み合わせ物は、網羅的という意味ではなく、本発明の制御組成物において包含され得る成分の起こり得る組合せ物についての例として提供されている。
【００７５】
当業者には分かるであろうが、使用される組合せ物は、Ｔ細胞増殖、Ｔ細胞分化もしくは両方が所望の結果であるかどうかによる。さらに、与えられた処理によって生成するプロフェッショナル制御細胞に対するサイトカイン産生制御細胞の数は、開始集団におけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞のパーセンテージに依存して変化し、Ｔ細胞アクチベーターおよびシグナルの特性は、非Ｔアクセサリー細胞によって提供される。
【００７６】
好ましい実施態様において、ＩＬ−２およびＴＧＦ-βを一緒に使用して、増強された抑制活性をもつ活性化された制御Ｔ細胞を生成する。当業者は分かるであろうが、プロフェッショナル制御Ｔ細胞およびサイトカイン産生Ｔ細胞の両方は、この制御組成物を用いて生成し得る。さらに、プロフェッショナル制御Ｔ細胞およびサイトカイン産生Ｔ細胞は、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ナイーブＣＤ４＋細胞などを包含する様々なＴ細胞サブセットから生成せしめうる。
【００７７】
好ましい実施態様において、ＩＬ−１５およびＴＧＦ−βは一緒に用いて、増強された抑制活性により活性化された制御Ｔ細胞を生成する。当業者にはわかるであろうが、プロフェッショナル制御Ｔ細胞およびサイトカイン産生Ｔ細胞の両方が、この制御組成物を用いて生成し得る。さらに、プロフェッショナル制御Ｔ細胞およびサイトカイン産生Ｔ細胞は、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ナイーブＣＤ４＋細胞などを包含する様々なＴ細胞サブセットから生成せしめ得る。
【００７８】
好ましい実施態様において、ＩＬ−２、ＴＧＦ-βおよびＣＤ２アクチベーターを用いて、増強された抑制活性を有する活性化された制御Ｔ細胞を生成する。当業者にはわかるであろうが、プロフェッショナル制御Ｔ細胞およびサイトカイン産生Ｔ細胞の両方は、この制御組成物を用いて生成し得る。さらに、プロフェッショナル制御Ｔ細胞およびサイトカイン産生Ｔ細胞は、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ナイーブＣＤ４＋細胞などを包含する様々なＴ細胞サブセットから生成し得る。他の好ましい組合せ物は、ＩＬ−１５、ＴＧＦ−βおよびＣＤ２アクチベーターを包含する。
【００７９】
好ましい実施態様において、ＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＴＧＦ-βを用いて、増強された抑制活性を有する活性化された制御Ｔ細胞を生成する。
【００８０】
好ましい実施態様において、ＩＬ−２、ＴＧＦ−βおよび抗サイトカイン抗体を用いて、増強された抑制活性を有する活性化された制御Ｔ細胞を生成する。他の好ましい組み合わせ物は、ＩＬ−１５、ＴＧＦ−βおよび抗サイトカインを包含する。
【００８１】
好ましい実施態様において、ＩＬ−２、ＴＧＦ-βおよびＴＣＲアクチベーターを用いて、抑制活性を持つＴ細胞を生成する。他の好ましい組合せ物は、ＩＬ−２、ＴＧＦ-β、ＴＣＲアクチベーターおよび非Ｔアクセサリー細胞を包含する；ＩＬ−１５、ＴＧＦ−βおよびＴＣＲアクチベーター；ＩＬ−１５、ＴＧＦ−β、ＴＣＲアクチベーターおよび非Ｔアクセサリー細胞。
【００８２】
当業者にはわかるであろうが、２次培養においてＴ細胞を制御組成物でもって、または制御組成物なしで反復刺激することは、最高の抑制活性を発現するのに必要であり得る。
【００８３】
好ましい実施態様において、Ｔ細胞アクチベーターを用いて、サイトカイン産生制御Ｔ細胞を生成する。この実施態様において、Ｔ細胞アクチベーターは、通常のＴ細胞と活性化されたプロフェッショナル制御Ｔ細胞とを組み合わせて使用し、活性化されたサイトカイン産生制御Ｔ細胞を生成する。
【００８４】
該細胞が処理されると、それらは抑制活性および患者への移植手術についての適合性について評価し得る。例えば、試料は、下記：滅菌試験；グラム染色、微生物研究；ＬＡＬ試験；マイコプラズマ試験；細胞型を同定するためのフローサイトメトリー；機能試験などのために取出し得る。これのような、また、その他のリンパ球研究は、処理前および後になし得る。好ましい分析は、処理されたＴ細胞における免疫応答を顕在化し得る試験もしくは標的細胞集団を標識することであり、処理されたＴ細胞を標識集団とインキュベートし、抑制活性の指標として細胞生存性を測定することである(参照、各図面)。アッセイ、例えば、実施例１および図面の簡単な説明に記載のアッセイが、抑制活性を測定するために使用し得る。
【００８５】
アッセイ、例えば米国特許番号６,３５８,５０６に記載のような（出典明示により本明細書の一部とする）アッセイは、プロフェッショナル制御Ｔ細胞を同定するために使用しうる。中和抗体およびＩＬ−１０の処理細胞の集団への添加は、サイトカイン産生Ｔ細胞(参照、実施例１)を同定するために使用し得る。
【００８６】
制御Ｔ細胞の使用
抑制活性を持つＴ細胞が生成されたらすぐに、患者において免疫応答を緩和するために投与し得る。本明細書中で「免疫応答」は、外来または自己の抗原に対する宿主応答を意味する。好ましくは、抑制活性を持つＴ細胞は、外来抗原への異常型免疫応答または望ましくない免疫応答を防止するのに使用し得る。本明細書中「異常型免疫応答」は、自己と非自己を区別する免疫系の機能不全、または外来抗原への応答に対する機能不全を意味する。言い換えると、異常型免疫応答は、患者の症候に導く不適当に制御された免疫応答である。本明細書中の「不適当な制御」は、不適当な誘導、不適当な抑制および／または応答性がないことを意味する。異常型免疫応答には、下記に限定するものではないが、組織損傷および生物自身の組織についての抗体産生によって生じる炎症、ＩＬ−２、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの産生の阻害および細胞毒性または非細胞毒性作用のメカニズムによって生じる組織損傷が含まれる。本明細書中で「望ましくない免疫応答」は、移植患者において観察される外来抗原に対する応答を意味する。すなわち、望ましくない免疫応答には、ＧＶＨＤおよび移植拒絶反応と関連した応答を包含する。
【００８７】
本明細書中の「患者」は、処置（理）される哺乳動物の対象を意味し、加えてヒトの患者が好ましい。あるケースにおいて、本発明の方法は、実験動物、獣医学的適用および疾患のためのマウス、ラットおよびハムスターを包含するゲッ歯類；および霊長類の動物モデルの開発に使用し得るが、これらの動物に限定するものではない。
【００８８】
好ましい実施態様において、本発明は異常型免疫応答を阻害する。抗体媒介自己免疫不全に罹患した患者において、本発明は、末梢血液Ｔ細胞を制御組成物でex vivo処理することにより、その能力を回復させて、抗体産生を下方調節し、細胞介在免疫応答を回復する。細胞媒介不全に罹患した患者において、本発明は、他のＴ細胞において細胞毒性のＴ細胞活性を抑制する制御Ｔ細胞を生成する。
【００８９】
従って、好ましい実施態様において、本発明は、患者において抗体媒介自己免疫不全を処理する方法を提供する。本明細書中「抗体媒介自己免疫疾患」は、個々のそれら自身の細胞または組織の構成成分に対する抗体を発生させる疾患を意味する。抗体媒介自己免疫疾患には、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、尋常性天疱瘡、重症筋無力症、溶血性貧血、血小板減少症、グレーブス病、皮膚筋炎およびシェーグレン疾患を包含するが、これらに限定するものではない。本発明の方法を用いる処理に好ましい自己免疫疾患はＳＬＥである。
【００９０】
さらに、抗体媒介不全に罹患する患者が、細胞媒介免疫応答における欠陥を持つことは、頻繁である。本明細書中「細胞媒介免疫応答における欠陥」は、感染に対する宿主防御の損傷を意味する。感染に対する損傷された宿主防御は、損傷された遅延過敏症、損傷されたＴ細胞の細胞毒性および損傷されたＴＧＦ-βの産生を包含するが、これらに限定するものではない。他の欠陥には、ＩＬ−１０の産生増加およびＩＬ−２、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの産生低下が含まれるが、これらに限定するものではない。本発明の方法を用いて、精製されたＴ細胞を刺激し、ＩＬ−２の産生、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの産生を増加し、ＩＬ−１０の産生を低下する。本方法を用いて刺激され得るＴ細胞には、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋が含まれるが、これらに限定するものではない。
ある態様において、抗体媒介不全は処理されない。
【００９１】
好ましい実施態様において、本発明は、患者において細胞媒介自己免疫不全を処理する方法を提供する。本明細書中「細胞媒介自己免疫疾患」は、個々の細胞が、活性化されるか、刺激されて、細胞毒性となり、そして自身の細胞または組織を攻撃する疾患を意味する。一方で、個体の自己免疫細胞は、作用の細胞毒性または非細胞毒性メカニズムによって、組織損傷を引き起こすように、他の細胞を個々に刺激し得る。細胞媒介自己免疫疾患には、橋本病、多発筋炎、炎症性腸疾患、多発性硬化症、糖尿病、リウマチおよび強皮症が含まれるが、これらに限定するものではない。
【００９２】
本明細書中の自己免疫疾患を「治療すること」は、少なくとも１つの自己免疫疾患の症候が、本明細書中に記載の方法によって改善されることを意味する。これは、客観的および主観的ファクターの両方を含む多くの方法で評価され得る。例えば、疾患に関する免疫学的明示を評価し得る；例えば、自発抗体および自己抗体産生のレベル、特にＳＬＥの場合においてＩｇＧ産生が低下する。全抗体レベルを測定し得るか、または抗二重鎖ＤＮＡ(ds ＤＮＡ)抗体、抗ヌクレオタンパク質抗体、抗Ｓｍ、抗Ｒｈｏおよび抗Ｌａを含むが、これらに限定しない自己抗体を測定し得る。細胞毒性の活性は、本明細書中の概説のように評価し得る。身体的症候、例えばＳＬＥにおける発疹の消失もしくは低下が変化することがある。変化を測定するために、腎臓機能試験を実施し；炎症に関連する組織損傷の研究室的証拠を評価しうる。循環する免疫複合体のレベルおよび血清補体レベルの減少は、もう一つの改善の証拠である。ＳＬＥの場合において、貧血の低下が見られることがある。患者に必要とされる薬物、例えば免疫抑制剤を低下させる能力は、成功した処理の示唆であり得る。処理の成功に関するその他の評価は、特定の自己免疫疾患の当業者には既知であろう。
【００９３】
好ましい実施態様において、抗体産生の量または質、すなわちタイプを評価し得る。すなわち、例えば、抗体の全レベルを評価し得る、すなわち抗体の特異的な型のレベル、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、抗ＤＮＡ自己抗体、抗ヌクレオタンパク質(ＮＰ)抗体などを評価しうる。制御Ｔ細胞は、Ｔ細胞活性化を抑制するか、またはin vitroの特異的な標的Ｔ細胞に対するＴ細胞の細胞毒性を防止するそれらの能力について評価する(参照、米国特許番号6,358,506、出典明示により本明細書中の一部とする)。
【００９４】
処理後、該細胞は、移植するか患者に戻す。これは、当業者には既知のように、一般的に行い、当業者に既知のような静脈投与によって、患者に処理された細胞を注入または導入することを含むのが普通である。例えば、該細胞は、滅菌シリンジまたは他の滅菌トランスファーメカニズムを用いる注射によりFenwall infusion bag(50 ml)に入れる。次いで、該細胞は、すぐに、ある時間、例えば１５分間にわたって、患者にフリー・フローＩＶのラインに静脈投与によって注入した。ある実施態様において、追加の試薬、例えば、緩衝液または塩をさらに添加してもよい。
【００９５】
該細胞を患者に戻した後、必要であれば、一般的な上記したように該処理の効果を評価しうる。すなわち、免疫学的疾患の徴候を評価しうる；例えば、全抗体または特異的免疫グロブリンの力価、腎臓機能試験、組織損傷評価などをなし得る。Ｔ細胞機能の試験、例えばＴ細胞数、表現型、活性化状態および抗原および／または有糸分裂促進物への応答能も評価し得る。
【００９６】
該処理は、必要もしくは所望に応じて反復しうる。例えば、該処理は、試験中１週間に１度もしくは試験中に１週間に複数回、例えば、２週間で３−５回以上行う。一般的に、自己免疫疾患の症候の改善は、ある期間、好ましくは少なくとも１ヶ月持続する。試験期間中、該患者が症候の再発を経験するなら、その時点で処理を反復してもよい。
【００９７】
キット
好ましい実施態様において、本発明は、本発明の方法、すなわち制御組成物と細胞とのインキュベーションを実施するためのキットをさらに提供する。該キットは、多数の成分を有している。例えば、該キットは、抗体媒介または細胞媒介の自己免疫疾患を有する患者からの受容細胞に適応する細胞処理容器を含んでもよい。容器は、滅菌であるべきである。ある実施態様において、細胞処理容器は、細胞の回収に用いる。例えば、入り口部分を用いて白血球処理機までつなげられるように用いうる。別の態様において、分離細胞回収容器を用い得る。
【００９８】
好ましい実施態様において、該キットは、特異的なＴ細胞サブセットを精製し、患者に移し戻すように広大された自動化閉鎖系システムにおける使用に適合されてもよい。
【００９９】
当業者にはわかるであろうが、細胞処理容器の形態および組成物を変えることも可能である。一般的に該容器は、ＩＶバッグに類似した柔らかいバッグまたは細胞培養容器に類似した堅い容器を包含する多くの様々な形態で存在する。攪拌ができるように形成され得る。一般的に、容器の組成物は、適切な生物学的に不活性な、全ての材料、例えば、ガラスまたはプラスチック（ポリプロピレン、ポリエチレンなどを包含する）である。細胞処理容器は、１以上の入口もしくは出口を、細胞、試薬、制御組成物などの導入または除去のために持ち得る。例えば、該容器は、患者に再導入する前に、分析するために細胞のフラクションの除去のための試料採取口を含みうる。同様に、該容器は、患者中に細胞を導入することができる排出口を含み得る；例えば、該容器は、ＩＶセットアップに結合するためのアダプターを包含し得る。
【０１００】
キットは、少なくとも１つの用量の制御組成物を含む。本明細書中で使用される「用量」は、制御組成物、例えばサイトカイン、の効果を生じるに十分な量を意味する。ある場合において、複数回用量を包含しうる。ある実施態様において、用量は、ポート（口）を持ちうる細胞処理容器に添加されてもよいが、あるいは、好ましい実施態様において、該用量は、もともと細胞処理容器中に存在してもよい。好ましい実施態様において、該用量は、安定性のために、細胞培地もしくは他の試薬を用いて元に戻し得る凍結乾燥形態である。 
【０１０１】
ある実施態様において、該キットは、さらに、緩衝液、塩、培地、タンパク質、薬物などを包含する少なくとも１つの試薬をさらに含んでもよい。例えば、有糸分裂促進物、モノクローナル抗体および細胞分離のための処理済磁気ビーズが包含される。
【０１０２】
ある実施態様において、該キットは、該キットを用いるための説明指示書を含む。
【０１０３】
下記の実施例は、上記に説明した本発明の方法を、より完全に説明し、さらに、本発明の多様な態様を実施するための最良のモデルを示すために役立つ。これらの実施例は、本発明の範囲を制限するためのものでなく、むしろこれを説明するものであると解する。本明細書中で引用文献は、出典明示により本明細書の一部とする。
【実施例】
【０１０４】
実施例１
ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に対するＴＧＦ-βの共刺激の効果
ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の増殖に対する効果
図１に示すように、ＴＧＦ-βによる共刺激は、全ＣＤ４＋ＣＤ２５＋およびＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞のパーセンテージおよび絶対数を著しく増加する。しかし、ＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞の増加は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋サブセットに依存し、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋サブセットの枯渇はＴＧＦ-βの成長促進効果を消失させる。同様に、小さい効果をＣＤ８＋細胞で観察した。
【０１０５】
これらの実験では、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞から、抗ＣＤ２５で染色することによってＣＤ２５＋細胞を枯渇した。染色細胞を免疫磁気ビーズで除去した。全Ｔ細胞サブセットおよびＣＤ２５枯渇Ｔ細胞サブセットを、同種（異型）的照射を受けた非Ｔ細胞と混合し、グレードｄ量のＴＧＦ-βと共に６日間培養した。培養期間の終了時で、各サブセットおよびＣＤ２５を発現したものの全数を測定した。
【０１０６】
異なる細胞表面マーカーを発現するＣＤ４＋の増殖に対する効果
図２Ａおよび２Ｂは、ＣＤ４＋サブセットに対する同種（異型）混合リンパ球反応におけるＴＧＦ-βによる刺激後の細胞表面マーカーの発現を示す。全ＣＤ４＋細胞、ＣＤ２５枯渇のＣＤ４＋細胞、およびナイーブＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−細胞を試験した。全ＣＤ４＋細胞およびナイーブ細胞上の発現ＣＤ２５に対するＴＧＦ-βの用量依存効果を観察した。開始集団におけるＣＤ２５の枯渇はこの効果を消滅させた。すなわち、ＴＧＦ-βが、ＣＤ４＋細胞のＣＤ４＋ＣＤ２５＋サブセットを増殖することがわかった。
【０１０７】
同様のＴＧＦ-β用量依存効果を、ＣＤ４＋サブセットに対してＣＤ６２Ｌ(Ｌセレクチン)の発現で観察した。この結果は、ＣＤ６２ＬがプロフェッショナルＣＤ＄＋ＣＤ２５＋細胞によって発現されることを示す他の結果と一致する。ＴＧＦ-βの共刺激効果は、ＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞にも存在する。
【０１０８】
さらに、ＴＧＦ-βは、ＣＴＬＡ-４およびＣＤ１２２、ＩＬ−２受容体のβ鎖の発現を増加した。 
【０１０９】
ＣＤ４＋サブセットの抑制活性に対する効果
図３Ａ−Ｄは、様々なＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットによって抑制活性を誘導する際にＴＧＦ-βの効果を示す。これらの実験において、精製されたＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットを、細胞選別によって得、上記の混合リンパ球反応(ＭＬＲ)においてＴＧＦ-β(１ng/ml)で調節した。次いで、精製されたＣＤ４＋サブセットを、Ｔ細胞の細胞毒性の生成を阻害し得る能力について試験した。図３ＡおよびＢは、精製したＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞が、顕著な抑制活性を持ち、この活性は顕著に増加するということ、すなわちＴＧＦ-βによる調節によって増強することを示す。図３Ｃおよび３Ｄは、ＴＧＦ-βが同様の効果を有すること、すなわち他のＴ細胞サブセット：ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ２５-およびＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ４＋細胞のサブセットに対する抑制活性を顕著に増加すること示す。ＩＬ−２の添加は、抑制活性に関するこの増強を必要としなかった。 
【０１１０】
中和化モノクローナル抗体およびこれら細胞の抑制活性を遮断するＩＬ−１０の添加は、少なくともいくつかの観察した抑制活性はサイトカイン依存性であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】図１Ａ−Ｃは、大部分の通常のＴ細胞（２）およびバージンプロフェッショナル制御Ｔ細胞（３）を含むＴ細胞集団（１）で開始する制御Ｔ細胞を生成するための好ましい実施態様を示す。
【図２】図２ＡおよびＢは、ＴＧＦ-βの共刺激が、全ＣＤ４＋ＣＤ２５＋およびＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞のパーセンテージと絶対数を顕著に増加させることを示す。
【図３】図３は、ＴＧＦ-βの抑制効果が、モノクローナル抗体でＩＬ−２を中和することによって克服されていることを示す。
【図４】図４Ａ−Ｆは、ＩＬ−２およびＴＧＦ−βの組合せが、プロフェッショナルＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞を刺激し、それらの抑制活性を増加させることを示す。
【図５Ａ】図５Ａは、ＴＧＦ-βの共刺激因子効果を媒介するＣＤ２５＋サブセットの重大な役割を確認するものである。図５Ａは、ＴＧＦ-βが媒介した細胞数における２倍の増加は、＜１％ＣＤ２５＋細胞の除去により消失されたことを示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＴＧＦ-βで誘導された細胞数の増加は穏やかであるが、細胞の表現型が著しく変化した場合と類似した実験を示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ＴＧＦ-βで誘導された細胞数の増加は穏やかであるが、細胞の表現型が著しく変化した場合と類似した実験を示す。
【図５Ｄ】図５Ｄは、該細胞をＴＧＦ-βなしで再度刺激した場合、ＣＤ２５＋細胞を含有するそれらの調製物が、ＣＤ２５＋サブセットが除去された場合のものと比較して著しく増加したことを示す。
【図６】図６は、ＴＧＦ-βで調節され、活性化されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞が、抑制活性を発生させるように通常のＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞を誘導し得ることを示唆する実験を示す。
【図７】図７ＡおよびＢは、ＩＬ−２およびＴＧＦ-βが、抑制細胞となるようにＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５−細胞を誘導する場合の他の実験を示す。
【図８】図８Ａ−Ｊは、ＩＬ−２およびＴＧＦ-βが、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ２５＋細胞の、前もって活性化されたもしくはメモリーフラクションの増殖および抑制活性を、内生的抑制効果が克服された後に増強させることを示す。
【図９】図９Ａ−Ｄは、プロフェッショナルＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御Ｔ細胞によって提示される特性を表す表面マーカーの発現に対するＴＧＦ-βの共刺激因子的効果を示す。
【図１０】図１０は、ＩＬ−２受容体のβ鎖を抗１２２で遮断することが、ＣＤ２５＋細胞の抑制活性を消失し得ることを示す。
【図１１】図１１ＡおよびＢは、ＩＬ−２およびＴＧＦ-βの組合せに加えて、ＩＬ−１５およびＴＧＦ−βが、ＣＤ４＋細胞に対して共刺激因子的効果を持つことを示す。
【図１】
2005514054.tif 000002
【図２】
2005514054.tif 000003
【図３】
2005514054.tif 000004
【図４】
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【図５Ａ】
2005514054.tif 000006
【図５Ｂ】
2005514054.tif 000007
【図５Ｃ】
2005514054.tif 000008
【図５Ｄ】
2005514054.tif 000009
【図６】
2005514054.tif 000010
【図７】
2005514054.tif 000011
【図８Ａ】
2005514054.tif 000012
【図８Ｂ】
2005514054.tif 000013
【図８Ｃ】
2005514054.tif 000014
【図８Ｄ】
2005514054.tif 000015
【図８Ｅ】
2005514054.tif 000016
【図８Ｆ】
2005514054.tif 000017
【図８Ｇ】
2005514054.tif 000018
【図８Ｈ】
2005514054.tif 000019
【図８Ｉ】
2005514054.tif 000020
【図８Ｊ】
2005514054.tif 000021
【図９】
2005514054.tif 000022
【図１０】
2005514054.tif 000023
【図１１Ａ】
2005514054.tif 000024
【図１１Ｂ】
2005514054.tif 000025
【国際調査報告】
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2005514054.tif 000027
2005514054.tif 000028