(57)【要約】本発明は、翻訳後の糖化が、骨からの正常な骨シアロ蛋白と比較して、アミノ酸ＴＧＬＡＡを含むアミノ酸１２０〜１３５の領域において変異し、あるいは不完全である腫瘍細胞からのヒトの骨シアロ蛋白に存在するエピトープに結合することを特徴とする、ヒトの骨シアロ蛋白（ＢＳＰ）に抗する抗体または複数の抗体に関する。抗体は、腫瘍の病気の診断および予後、特に、初期乳癌の場合の骨転移の診断および予後のための免疫学的検定に用いられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
翻訳後の糖化が、骨からの正常な骨シアロ蛋白と比較して、アミノ酸ＴＧＬＡＡを含むアミノ酸１２０〜１３５（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ：ＳＩＡＬＨＵＭＡＮ，Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ２１８１５，信号配列なし）の領域において変異し、あるいは不完全である腫瘍細胞からのヒトの骨シアロ蛋白に存在するエピトープに結合することを特徴とする、ヒトの骨シアロ蛋白（ＢＳＰ）に抗する抗体または複数の抗体。
【請求項２】
抗原として、化学的または自然に、糖化において変異した骨シアロ蛋白で形成された
請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
抗原として腫瘍細胞からの骨シアロ蛋白で形成された
請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
腫瘍細胞の遺伝子操作により、糖化において変異した前記骨シアロ蛋白が形成された
請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
キャリア（ｃａｒｒｉｅｒ）蛋白に適切に結合したときに、アミノ酸配列ＴＧＬＡＡまたはＹＴＧＬＡＡを含むペプチド抗原に抗して形成された
請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
骨蛋白の正常な糖化ができないドナーの骨材料からの糖化が変異した骨シアロ蛋白が用いられた
請求項２に記載の抗体。
【請求項７】
ニワトリのＩｇＹ抗体である
請求項１〜６のいずれかに記載の抗体。
【請求項８】
ヒトの抗体あるいはヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）された抗体である
請求項１〜６のいずれかに記載の抗体。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の抗体が用いられる、体液、特に血清中における腫瘍細胞からの骨シアロ蛋白の測定方法。
【請求項１０】
骨転移の診断および予後のための請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
医薬の生産のための請求項１〜８のいずれかに記載の抗体の利用。
【請求項１２】
活性成分として、請求項１〜８のいずれかに記載の抗体を含む薬学（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）組成物。
【請求項１３】
骨転移の予防および治療のための請求項１２に記載の薬学組成物。
【請求項１４】
診断方法または医薬の生産のためのターゲッティング（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）手段としての請求項１〜８のいずれかに記載の抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、骨代謝および骨構造の疾病の診断および監視のための、特に、初期の癌の骨転移の診断、予後、予防および治療のための、体液中の骨シアロ蛋白（ｂｏｎｅ  ｓｉａｌｏｐｒｏｔｅｉｎ，ＢＳＰ）の免疫学的測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  骨シアロ蛋白（ＢＳＰ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて相対質量が約８０ｋＤａを有するホスホリル化された骨糖蛋白である。ＢＳＰに対するｃＤＮＡは、約３３ｋＤａのペプチド配列をコード（ｃｏｄｅ）する（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｌ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，２３４７−５１；ＵＳ  ５  ３４０  ９３４）。ＢＳＰはいくつかの基質（ｍａｔｒｉｘ）蛋白の一つであり、骨、ぞうげ質、石灰化軟骨などの鉱化組織におけるその発生は限定されている。ＢＳＰは骨基質中の非コラーゲン（ｎｏｎ−ｃｏｌｌａｇｅｎｉｃ）蛋白全体の約１０〜１５％に相当する。それは、ルールとして、ぞうげ質、骨および軟骨の形成に貢献する細胞、例えば、骨芽細胞、発達している骨細胞、肥大性の軟骨細胞、ぞうげ芽細胞およびセメント芽細胞で発現される。【０００３】  これと並んで、ＢＳＰはまた、胎盤のトロホブラストおよびある種の癌細胞、例えば、肺癌、乳癌、前立腺癌、甲状腺癌および神経芽腫の初期および二次の腫瘍、多発骨髄種および骨転移によっても形成される。腫瘍によるＢＳＰの発現の程度は、癌の重大さに相関する（ｗａｌｔｒｅｇｎｙ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，ヒトの乳癌および前立腺眼での内蔵転移と比較して骨転移における骨シアロ蛋白の増加した発現，ｉｎ  Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，２０００，１５（５），８３４−４３；Ｂｅｌｌａｈｃｅｎｅ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，ヒトの初期乳癌において骨シアロ蛋白の発現が骨転移の進展と関連している，ｉｎ  Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１９９６，１１，６６５−６７０；Ｗａｌｔｒｅｇｎｙ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，治療院に局限したヒト前立腺癌における骨シアロ蛋白の予後的価値，ｉｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，１９９８，９０，１０００−１００８；Ｂｅｌｌａｈｃｅｎｅ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，初期乳癌における骨シアロ蛋白の発現は低生存率と関連する，ｉｎ  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９９６，６９，３５０−３５３）。【０００４】  ぞうげ質、骨および軟骨に対して、ＢＳＰには２つの機能があると考えられている。付着分子として、組織基質上の細胞の付着および散在（ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ）をもたらすと考えられる。試験管内で、それは生物学的アパタイトの結晶核を形成することから、生体内において鉱化作用に貢献するのではと考えられる。眠らされた（ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ）マウスにおけるＢＳＰ遺伝子のスイッチオフ（ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  ｏｆｆ）は、骨格の構築および機能の識別しうる崩壊へと導かない。【０００５】  腫瘍においてＢＳＰはマイクロ石灰化（ｍｉｃｒｏｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）に参加すると考えられ（Ｃａｓｔｒｏｎｏｖｏ，Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，マイクロ石灰化に関連する乳癌は鉱化した悪性の細胞であることの証拠，ｉｎ  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．，１９９８，１２，３０５−３０８）、腫瘍細胞の転移による骨の転移増殖に参加すると考えられる（Ｂｅｌｌａｈｃｅｎｅ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，初期乳癌における骨シアロ蛋白の発現は低生存率と関連する，ｉｎ  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９９６，６９，３５０−３５３）。初期癌患者の血清中のＢＳＰ濃度の���ベルは、これらの患者が骨転移を持つあるいは初期腫瘍から生じそうであるかどうかの診断に役立つ（Ｉｎａ−Ａｌｅｘａｎｄｒａ  Ｍｅｉｅｒ氏の学位テーマ，骨シアロ蛋白（ＢＳＰ）の測定のための放射免疫測定の進展（″Ｅｎｔｗｉｃｋｌｕｎｇ  ｅｉｎｅｓ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ  ｚｕｒ  Ｂｅｓｔｉｍｍｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｂｏｎｅｓｉａｌｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＳＰ）″），１９９６，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｆａｃｈｈｏｃｈｓｃｈｕｌｅ），Ｓｐｅｃｉａｌｉｓｔ  Ｆｉｅｌｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＦＢ  Ｃｈｅｍｉｓｃｈｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ）；Ｍａｒｋｕｓ  Ｋａｒｍａｔｓｃｈｅｋ氏の博士論文，ヒトの骨からの骨シアロ蛋白の単離、血清中のその測定に対する放射免疫測定の構成（″Ｉｓｏｌｉｅｒｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｂｏｎｅｓｉａｌｏｐｒｏｔｅｉｎ  ａｕｓ  ｈｕｍａｎ  Ｋｎｏｓｈｅｎ，Ａｕｆｂａｕ  ｅｉｎｅｓ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ  ｚｕｒ  ｄｅｓｓｅｎ  Ｍｅｓｓｕｎｇ  ｉｎ  Ｓｅｒｕｍ″），１９９６，Ｓｐｅｃｉａｌｉｓｔ  Ｆｉｅｌｄ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｔｈｃｈｎｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ（ＦＢ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅ  ｄｅｒ  Ｔｅｃｈｎｉｓｃｈｅｎ  Ｈｏｃｈｓｃｈｕｌｅ  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）；Ｄｉａｌ  Ｉ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，初期乳癌患者の上昇した骨シアロ蛋白は骨転移の有力なマーカーである，ｉｎ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ＡＳＣＯ，１９９８，１７，Ａｂｓｔｒａｃｔ  ４６１；Ｄｉｅｌ  Ｉ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，初期乳癌患者の血清の骨シアロ蛋白は続く骨転移に対する予後的（ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ）マーカーである，ｉｎ  Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９９９，５，３９１４−１９；ＤＥ  １９８  １３  ６３３；ＤＥ  １９８  ２１  ５３３；ＷＯ  ９９／５０６６６）。【０００６】  最近の仮説によると、ＢＳＰはトロホブラストおよびＢＳＰが生成した腫瘍を免疫システムによる攻撃から保護すると考えられている。即ち、ＢＳＰは、コンプリメントリシス（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｌｙｓｉｓ）の代わりのパス（ｐａｔｈ）を制限すると知られている補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）システムのＨ因子に高い親和力で結合する。また、ＢＳＰは、それ自身の識別配列（アルギニン−グリシン−アスパアラギン酸塩、ＲＧＤ）を通して、細胞表面のインテグリンレセプタに特異的に結合できる。ＢＳＰの発現の場合、腫瘍細胞は血液中および組織液中のＨ因子をそれらの細胞の表面に結合する、あるいは、それらの周りで高濃度にすると考えられる。そのようなＢＳＰの母体の血液の補体システムからの保護は、胎盤におけるトロホブラストに対してもなされると考えられる（Ｆｅｄａｒｋｏ  Ｎ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，骨シアロ蛋白およびオステオポンチンと結合しているＨ因子は腫瘍細胞の補体を介した（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｍｅｄｉａｔｅｄ）攻撃の逃避を可能にする，ｉｎ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００，２７５，１６６６６−１６６７２；ＷＯ  ００／０６２０６５）。【０００７】  さらにまた、ＢＳＰの機能が新脈管形成において疑われている。破骨細胞および骨芽���胞の骨基質への付着に従って、基質中のＲＧＤ識別配列の細胞壁上のアルファ（ｖ）ベータ（３）インテグリンレセプタへの結合を通して、内皮の細胞の付着、散在および配向が恐らくＢＳＰを介しているということもまた観察されている。即ち、腫瘍の周りでの血管形成は、腫瘍細胞でのＢＳＰの発現と平行して生じる（Ｂｅｌｌａｈｃｅｎｅ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，骨シアロ蛋白はヒトの内皮の細胞の付着および転移を伝え、新脈管形成を促進する，ｉｎ  Ｃｒｉｃ，Ｒｅｓ．２０００，８６（８），８８５−９１）。【０００８】  このようにＢＳＰは腫瘍の形成および転移において事件の中心に立っている。従って、ＲＧＤ配列を介してのＢＳＰの腫瘍および上皮細胞のビトロネクチンまたはインテグリンレセプタへの結合は、拮抗質によって制限されうる（ＵＳ  ６  ０６９  １５８；ＵＳ  ６  ００８  ２１３；ＵＳ  ５  ８４９  ８６５；ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｌｕｉｊｍ  ｅｔ  ａｌ．，骨シアロ蛋白ペプチドは試験管内での癌細胞の骨への付着の有力な抑制物質である，ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９９６，５６，１９４８−１９５５）。ＥＰ  １  ０８４  ７１９  Ａ１は、損傷した骨および結合組織の修復の補助するための活性物質としてＢＳＰを有する薬学（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）組成物を教示する。ＷＯ  ９４／１３３１０は、活性成分として黄色ブドウ球菌の蛋白に結合するＢＳＰを有する組成物を教示する。ＷＯ  ００／３６９１９は、目的のある監視と、石灰化を促進する腫瘍および結合組織の細胞中のＢＳＰの発現の抑制のための調節要素を開示する。【０００９】  体液中で、遊離したＢＳＰは補体Ｈ因子によって高い親和力で捕捉結合され、ＢＳＰは種々のレセプタと結合でき、その測定は扱いにくい。従って、ウサギの中でＢＳＰの種々のペプチド部分構造に抗する抗体が生成され（Ｆｉｓｈｅｒ，Ｌ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，ヒトおよびある種の動物モデルの骨基質の非コラーゲン蛋白への抗血清およびｃＤＮＡプローブ（ｐｒｏｂｅ），Ａｃｔａ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｓｃａｎｄ  Ｓｕｐｐｌ．，１９９５，２６６，６１−６５５）、組換えＢＳＰに抗する抗体が生成され（Ｓｔｕｂｂｓ  ＪＴ  ３ｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  自然および組換えシアロ蛋白の評価：鉱物に結合し、細胞に付着した領域の描写およびＲＧＤ領域の構造解析，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１９９７，１２（８），１２１０−２２）、また、骨から単離されたＢＳＰに抗する抗体が生成され、それら抗体はヒトの血清中でどのＢＳＰも識別することができなかった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを通しての血清蛋白の分離の後でのみ、ＢＳＰはこれらのウエスタンブロットで検出できる。１５０ｋＤａの明らかにより大きなＨ因子分子が恐らくより小さなＢＳＰ（約６５ｋＤａ）を抗体が結合できないところまで遮蔽（ｍａｓｋ）する。さらに、Ｈ因子は血清中に過剰に存在する（０．５ｍｇ  Ｈ因子／ｍＬ、ＢＳＰの健康なヒトの場合の２０ｎｇ／ｍｌ血清未満および腫瘍患者の場合の最大１６０ｎｇ／ｍｌと比較して）。Ｈ因子との結合のために、試料調製を減らすことなく、体液中のＢＳＰを免疫学的に直接測定することは不可能であると主張されてきた（Ｆｅｄａｒｋｏ  Ｎ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，骨シアロ蛋白およびオステオ���ンチンと結合しているＨ因子は腫瘍細胞の補体を介した攻撃の逃避を可能にする，ｉｎ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００，２７５，１６６６６−１６６７２；ＷＯ  ００／０６２０６５）。次の我々の研究は、そのような試料調製あるいは蛋自分解（ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ）が体液中のＢＳＰの定量を許容するが、得られた値は腫瘍学的目的のために一つの答えが与えられるのも許容しない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】  体液中のＢＳＰの免疫学的測定の方法を可能にすることが本発明の目的である。特に、体液中のＢＳＰを直接測定する方法を可能にすることが目的である。骨の初期癌の離れた転移の予後および診断と関連した目的のため、骨転移の診断のため、および、医学的応用のために、ＢＳＰに抗する抗体を可能にすることが本発明のさらなる目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】  この目的は請求項１に係る抗体および体液中のＢＳＰの測定のためのそれらの使用により達成される。ヒトの骨シアロ蛋白（ＢＳＰ）に抗する抗体は、特に腫瘍細胞からのヒトの骨シアロ蛋白に存在するエピトープに結合し、それの翻訳後の糖化は、骨からの正常な骨シアロ蛋白と比較して、アミノ酸ＴＧＬＡＡを含むアミノ酸１２０〜１３５（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ：ＳＩＡＬＨＵＭＡＮ，Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ２１８１５，信号配列なし）の領域において変異し、あるいは不完全である。それらは抗原として骨シアロ蛋白で形成されてもよく、好ましくは、腫瘍細胞からの骨シアロ蛋白で形成され、それは化学的または自然に、糖化において変異したものである。糖化において変異した骨シアロ蛋白は腫瘍細胞の遺伝子操作により形成されることもできる。それはまた、キャリア（ｃａｒｒｉｅｒ）蛋白に適切に結合したときに、アミノ酸ＴＧＬＡＡまたはＹＴＧＬＡＡを含むペプチド抗原に抗して形成されることができる。さらなる実施形態では、抗体は、骨蛋白の正常な糖化ができないドナーの骨材料からの糖化が変異した骨シアロ蛋白によって形成される。補体反応にかかわりがないことから、特にこれらの抗体がヒトの抗体あるいはヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）された抗体である時には、ニワトリのＩｇＹ抗体が特に好ましい。【００１２】  本発明に係る抗体は、体液、特に血清中における腫瘍細胞の骨シアロ蛋白の測定方法に使用することができる。この方法で、骨転移の診断および予後がもたらされうる。もちろん抗体はまた、例えば骨転移の予防および治療のための活性成分として、あるいはまた、診断手段または医薬の生産のためのターゲッティング手段として、診断に用いられてもよく、もし可能なら、医薬の生産に用いてもよい。【００１３】  本発明のさらなる目的は、本発明の抗体を通した免疫シンチグラフィによる、腫瘍および転移の診断的局限化である。それによって、抗ＢＳＰ抗体は放射能でマークされ、患者の循環系に注入される。それらは特異的に腫瘍および転移組織と結合し、体内でのそれらの分布は、例えばシンチスキャナを用いて、絵によって表示可能である。【００１４】  Ｈ因子とＢＳＰの複合体に結合するために、抗体は、結合相手に遮蔽されていないＢＳＰのエピトープを識別しなければならない。そのような抗体の生産は、以前は可能ではなかった。本発明は、そのような抗体を可能にする。なぜならその抗体は、折り畳まれた（ｆｏｌｄｅｄ）骨シアロ蛋白（ＢＳＰ）のイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）に抗して検出され、腫瘍細胞からの組み込まれた骨シアロ蛋白によってのみ形成されるエピトープに結合するからであり、それの糖化は、骨からの正常な骨シアロ蛋白と比較して、アミノ酸配列ＴＧＬＡＡまたはＹＴＧＬＡＡを含むアミノ酸１２０〜１３５の領域において変異し、あるいは不完全であり、あるいは間違えている。通常は、蛋白上の翻訳後のあるいは複合の糖構造に抗する特定の抗体を得ることはできず、それはそのような糖構造が同様の方法で加えられ、多くの異なる蛋白を形成するからである。同様に、抗体は多くの異なる蛋白のある種の糖構造に抗して反応し、ルールとして、特異的ではなく、重要性もないと考えられる。これは、腫瘍���胞からの骨シアロ蛋白とは異なる。変えられた、あるいは間違えた糖構造は、骨シアロ蛋白の異なる折り畳みをもたらし、アミノ酸あるいはペプチド構造と、多くの残された糖残基の両方に関連する、新しいエピトープを形成する。しかしながら、これらのエピトープは変質した（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）腫瘍細胞からのＢＳＰに特徴的である。【００１５】  これらのエピトープに抗する抗体は、適用可能なら精製あるいは骨ＢＳＰのイソフォームへの吸収を通して、抗原として、糖化において化学的にあるいは自然に変えられたＢＳＰによって生産することができる。好ましくは、抗体は、抗原として腫瘍細胞からのＢＳＰの利用で生産することができる。腫瘍細胞からのＢＳＰは、困難があってのみ、十分な量を単離することができるので、腫瘍細胞の糖化において変異したＢＳＰの遺伝子操作された発現はより抜きの方法である。ある患者は骨材料の中に糖化において変異したＢＳＰを持つことが発見された。これは、これらの患者が、その多くは非常に高齢で深刻な骨粗しょう症を患っているが、少なくとも一部において正常に糖化されていないＢＳＰを生産することを意味する。このＢＳＰはまた、原理的に、本発明の抗体を得るための抗原に適している。部分的に糖化したイソフォームの単離は、ＢＳＰの腫瘍イソフォームと同等であるが、記載された手順と類似して実行できる（Ｋａｒｍａｔｓｃｈｅｋ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ヒトの骨シアロ蛋白の向上した精製および均一な放射免疫測定の進展，ｉｎ  Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ，１９９７，４３（１１），２０７６−８２）。【００１６】  抗体は、マウス、モルモット、ウサギ、イヌ、ヤギ、ブタ、ヒト、ロバあるいはウマの中で形成することができ、また、全ての哺乳類でも可能である。特に好ましいのはトリの免疫化であり、特にニワトリが好ましい。それは、大きな進化の差に起因して、ＢＳＰの腫瘍イソフォームに抗する抗体が特に容易に得られるからである。さらに、ＩｇＹ抗体の存在は、補体システムの活性化に導かず、それは、Ｈ因子とＢＳＰの間の可能な結合に起因して扱いにくくなりうる。本発明の抗体は、Ｈ因子と結合しているＢＳＰの腫瘍イソフォームを識別する。【００１７】  従って、本発明の主題は、腫瘍によって形成されたイソフォームに抗する特別な抗体と、抗体治療あるいはまた免疫シンチグラフィのためのそれら使用である。抗ＢＳＰ抗体によってもたらされる副次的効果として、抗体と細胞毒または放射性同位体の抱合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の利用における、骨基質および骨細胞に抗する免疫システムの活性化を通しての骨およびぞうげ質の直接および間接のダメージおよび／または直接の破壊が議論されてきている。さらに、免疫シンチグラフィは、骨基質に結合する抗ＢＳＰ抗体では、想像もできない。基質は放射能でマークされ、腫瘍の局限化は不可能となる。【００１８】  ヒトのＢＳＰに特異的な抗体は、腫瘍の治療および局限化に適している。それらは、骨基質あるいは骨格およびぞうげ質の細胞を生成するＢＳＰに結合しないか、してもわずかな程度であるからである。本発明の特に好ましい応用では、腫瘍ＢＳＰに特異的な抗体が腫瘍の治療に使用され、追加的にＨ因子との複合体中のＢＳＰを識別させる��腫瘍患者におけるそのような特異的な抗体の応用の後、血液および組織液中の遊離した腫瘍ＢＳＰおよびＨ因子に結合したＢＳＰは中和され、これにより補体活性化に抗する保護が除去され、腫瘍細胞は免疫システムによって破壊のために特異的にマークされ（例えば、補体カスケードの伝統的な（ｃｌａｓｓｉｃａｌ）活性化を通して）、例えば、骨基質あるいはぞうげ質に抗する免疫システムの活性化を通しての副次的な効果がなくなってしまう。本発明のさらなる応用は、ヒトの多クローン性の抗ＢＳＰ抗体がトランスジェニック（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）のヒト化した免疫システムを持つニワトリのタマゴから単離される。【００１９】  さらに、マウスあるいはニワトリからの単クローン性抗体が適しており、それらは上述の条件を満たし、スクリーニングにより得ることができる。本発明の特異的な応用では、この目的のために、実施例によって説明される単クローン性の細胞系が利用される。さらに、例えば蛋白分解的に（ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ）、あるいは遺伝子操作により、抗体のフラグメントから得られるＦａｂフラグメントが適している。【００２０】  特に、Ｈ因子との複合体中のＢＳＰを識別し、骨基質中のＢＳＰに結合しない、ヒト化した多および単クローン性の抗体が適している。しかし、マウスとニワトリの抗体の適用で、ヒトの抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）あるいは抗ニワトリ抗体（ＨＡＣＡ）を通して期待される特定の治療上の効果がある。ＨＡＭＡおよびＨＡＣＡは、生物の腫瘍抗原に対する免疫反応を誘起し、強めることができる。しかし、腫瘍マーカーの測定において、ＨＡＭＡとＨＡＣＡの干渉が生じ、それは試験管内の測定方法を崩壊させる。このように、腫瘍マーカーに対してみせかけの高い測定値が生じる。これは、適切な抗体を用いた免疫シンチグラフィあるいは免疫治療の後で発生し、試験管内での正確な腫瘍マーカーの測定は、ＨＡＭＡおよびＨＡＣＡの吸収の後でのみなされる。【００２１】  これらの効果は、ヒト化された抗体の利用を通して抑制されうる。多クローン性のヒト化した抗ＢＳＰ抗体は、例えば、トランスジェニックニワトリのＢＳＰでの免疫化によって得られ、そのニワトリに対して、胎芽の幹細胞の中で、免疫グロブリン（ＩｇＹ）のニワトリに特有のＦｃ部分に対する遺伝子領域がヒトに特有のものに交換される（ＵＳ  ５  ３４０  ７４０；ＵＳ  ５  ６５６  ４７９）。ヒト化された抗体はそれからニワトリのタマゴの中に沈積され、卵黄から単離可能である（Ｍｏｈａｍｍｅｄ  Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ，，遺伝子操作したヒトの抗体のニワトリの卵黄への沈積，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９８，４：１１５−１２５）。【００２２】  ヒト化した単クローン性の抗体の生産のために、標準的な方法に従って、マウスあるいはニワトリの適切な抗ＢＳＰ抗体とのハイブリドーマ細胞を得てもよく、また、これらの細胞中に含まれた遺伝子材料から、ヒト化された抗体が組換えを介して進展してもよい（ＵＳ  ５  ５８５  ０８９；ＵＳ  ５  ５６５  ３３２；ＵＳ  ５  ２２５  ５３９；ＵＳ  ５  ６９３  ７６１；ＵＳ  ５  ５８５  ０８９；ＵＳ  ５  ５３０  １０１）。【００２３】  本発明のさらなる特徴および利点が、図面を伴う実施例を参照して、これから説明される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】  実施例１−ウエスタンブロットにおける腫瘍および骨特異のＢＳＰイソフォームの特性評価
ヒトの骨肉腫細胞系ＵＭＲ−７，ＭＨＨ−ＥＳ  １、乳癌細胞系ＭＣＦ−７（エストロゲンレセプタ陽性）および骨から精製されたヒトのＢＳＰ（Ｋ−ＢＳＰ）の血清を除去した上澄みが、１０％ジェル上で、還元および変性させる条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使って分離され、電気泳動的にニトロセルロースに移された。薄膜は単クローン性のマウスの抗体と培養された。ＢＳＰの検出はペルオキシダーゼに結合した山羊の抗ネスミ抗体を通じて、また、Ｘ線フィルムの化学発光的検出によりなされた。結果を図１に示す。左側にマーカーの分子量とパスを示した。単一および２個の矢印の頭は骨／骨肉腫のＢＳＰとＭＣＦ−７  ＢＳＰの異なるふるまいを示す。後者は追加的に高い分子量のバンド（三重の矢印）を含み、それは他のトラックには存在しない。このように、ある腫瘍細胞系からのＢＳＰは、骨からのＢＳＰおよび骨肉腫細胞系からのＢＳＰよりも明らかに高い分子量を有し、これによってこれを越えてさらに高い分子量の第２のイソフォームが観察できる。【００２５】  実施例２−ＢＳＰおよびＢＳＰペプチド部分構造に対するニワトリの免疫による多クローン性抗体の生成
Ｋａｒｍａｔｓｃｈｅｋらによって記載された手順に従って患者から単離されたＢＳＰに対してニワトリとウサギが免疫化された。
タマゴの黄身と血清、多クローン性免疫グロブリンが単離され、ＢＳＰの様々なペプチド部分構造に対する結合がＥＬＩＳＡプロセスにより試された。表１はこのエピトープ地図の結果を示す。これにより、プロプレＢＰＳ（リーダー配列を含む）の全３１７のアミノ酸長のペプチド配列のペプチド部分構造が化学的に合成され、マイクロ滴定プレートに結合され、そのプレート上で抗体が培養された。抗ＩｇＹ免疫グロブリンあるいは抗ウサギＩｇＹ免疫グロブリンとともにペルオキシダーゼと共同での培養と、それに続く基質としての色素体の変性を通しての酵素反応の後に、結合試験がなされた。【００２６】
【表１】
2005508870.tif 000002
【００２７】  結果は、得られたニワトリの抗体はＢＳＰのＣ末端配列に選択的に結合する一方、ウサギの抗体はより広い領域にわたって結合することを示す。【００２８】  さらに、ＢＳＰのペプチド構造（１）とのウサギの免疫によって、このペプチド部分構造と選択的に反応するが、また、ヒトの骨ＢＳＰに特異的である多クローン性抗体（Ａ０００１）が得られた。【００２９】  ＴｙｒＴｈｒＧｌｙＬｅｕＡｌａＡｌａＩｌｅＧｌｎＬｅｕＰｒｏＬｙｓＬｙｓＡｌａＧｌｙＡｓｐ（位置１２４〜１３８）    （１）【００３０】  しかし、後にキャリアとしてウシのサイログロブリンに結合する、例えば（２）などのペプチド部分構造（３）とのウサギの免疫で得られた多クローン性抗体（ＡＫｔＢＳＰ）は、合成したペプチド部分構造を反応するが、ヒトの骨ＢＳＰとは反応しない。これらの抗体は、驚くことに、腫瘍細胞からＢＳＰを排他的に識別する。【００３１】  ＴｙｒＴｈｒＧｌｙＬｅｕＡｌａＡｌａ（位置１２４〜１３０）    （２）
ＴｈｒＧｌｙＬｅｕＡｌａＡｌａ（位置１２５〜１３０）    （３）【００３２】  研究のために、多クローン性抗体Ａ００２（Ｌ．Ｗ．Ｆｉｓｈｅｒから得た）およびＡ００３（ｖａｎ  Ｒｙｄｅｎ医師から得た）をさらに用いた。これらの抗体は、ペプチド部分結合（４）または（５）との免疫の後に得られた。【００３３】  ＴｙｒＧｌｕＳｅｒＧｌｕＡｓｎＧｌｙＧｌｕＰｒｏＡｒｇＧｌｙＡｓｐＡｓｎＴｙｒＡｒｇＡｌａＴｙｒＧｌｕＡｓｐ（Ａ００２）    （４）
ＬｅｕＬｙｓＡｒｇＰｈｅＰｒｏＶａｌＧｌｎＧｌｙＧｌｙ    （５）【００３４】  前者のペプチドＢＳＰ（位置２７８〜２９５）のＣ末端から生じ、インテグリン型のレセプタに対するＢＳＰのＲＧＤ（ＡｒｇＧｌｙＡｓｐ）識別配列を含む。後者のペプチドはＢＳＰ初期構造のＮ末端から生じた。また、これらのペプチドはそれぞれの部分構造を選択的に識別し、ヒトの骨ＢＳＰと特異的に反応した。【００３５】  実施例３−免疫のための乳癌細胞からの組換えＢＳＰの生成
プラスミドＢ６−５ｇ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｌ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，ヒトの骨シアロ蛋白．推定された蛋白配列および染色体の局限化，ｉｎ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９０，２６５（４），２３４７−５１）からヒトのＢＳＰに対する完全なｃＤＮＡ（シグナルペプチドを除く）がＰＣＲにより増幅され、エピソームの（ｅｐｉｓｏｍａｌ）真核細胞の発現ベクターｐＣＥＰ−Ｐｕ（Ｋｏｈｆｅｌｄｔ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．，プロテオグリカンテスティカン（ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ｔｅｓｔｉｃａｎ）の細胞外のカルシウム結合モジュールの特性，ｉｎ  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９７，４１４（３），５５７−６１）中で複製された。プライマーは以下の（６）および（７）の通りだった。【００３６】  Ｎｈｅ  Ｉ  ＢＳＰ（センス）：
５’ＧＣＣＣＧＣＴＡＧＣＣＴＴＣＴＣＡＡＴＧＡＡＡＡＡＴＴＴＧＣＡＴＣＧ−３’    （６）
Ｎｏｔ  Ｉ  ＢＳＰ（アンチセンス）：
５’−ＣＡＡＴＧＡＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＡＧＴＡＡＴＴＣ−３’’    （７）【００３７】  プライマーとともに導入されたＮｈｅ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉの切り取り（ｓｌｉｃｉｎｇ）部位は、発現ベクターＰＣＥＰ−ＰＵにおける複製に必要であった。このベクターはさらに、蛋白の精製の促進のために、様々なタグ（ｔａｇ）、即ち、Ｈｉｓ、Ｍｙｃ、Ｇ８Ｔのある多重複製部位の５’末端においてもたらされた。これらのタグは、プロテアーゼ（即ち第Ｘ因子またはエンテロキナーゼ）により蛋白の精製の後で分離できる。正しい読み取り枠が保持されたことが塩基配列決定により確認された。【００３８】  発現構造物は、とりわけ次のヒトの細胞系へと安定なトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を伝えるリポソーム（Ｒｏｃｈｅ社のトランスフェクション試薬ＦＵＧＥＮＥＴＭ）として導入された：
−胚の腎臓細胞系ＥＢＮＡ−２９３
−骨肉腫細胞系ＳＡＯＳ−２およびＭＧ−６３
−ヒトの乳癌細胞系ＭＣＦ−７【００３９】  組換え発現はＭＣＦ−７およびＥＢＮＡ−２９３中のみで得られた（図２参照）。骨肉腫細胞系はトランスフェクションを繰り返し試みても発現しなかった。【００４０】  実施例４−変質した細胞および骨ＢＳＰからの組換えＢＳＰの糖化の解析
短命な細胞がトランスフェクションの後４８時間、２日間の間血清のない媒体中で培養された。ＦＣＳ中の蛋白が組換えＢＳＰの精製をより困難にしないように、ＢＳＰ発現細胞は、合流（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）の達成（ａｔｔａｉｎｍｅｎｔ）の後、血清のない条件下で培養された。これらの条件下では、ＥＢＮＡ−２９３細胞のみが２〜４よりも長く生き残ることができた。組換えＢＳＰの発現はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブトッロ法を通して監視された。【００４１】  血清のない細胞培養の上澄み液の研究は、ＢＳＰおよび種々のタグの存在の両方に関して、これら全ての細胞系にウエスタンブロットの陽性信号の結果をもたらした。【００４２】  トランスフェクションされたＭＣＦ−７細胞系の２．５リットルの血清のない培養上澄み液がニッケルのＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭのカラムにより精製され、それから２５０μｇの均一なＨｉｓ−ｍｙｃ−ＥＫ−ＢＳＰが得られた。そのように精製された発現生成物は部分的に糖化（ｇｌｙｇｌｏｓｙｌａｔｅｄ）されたが、ＢＳＰ配列ＹＴ１２５ＬＰＡＡ中のトレオニンであるトレオニン１２５の糖化はなかった。【００４３】  糖解析のために、Ｎ−グリカンが酵素的に（ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ）組換えＢＳＰまたは骨ＢＳＰからペプチドＮ−グリコシダーゼ  Ｆ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ、Ｒｏｃｈｅ社）により分離された。酵素は全てのＮ−グリカン型のアスパラギンからの触媒反応の（ｃａｔａｙｌｙｔｉｃ）分離をもたらした。消化のために、２０〜２００μｇのＢＳＰがエタノールおよび沈殿剤ペレット中で沈殿され、１％ＳＤＳ、β−メルカプトエタノール、０．１Ｍ  ＥＤＴＡ中、室温で３０分間過剰の酵素とともに培養された。続いてＮ−グリコシダーゼによる３７℃で一晩の消化がなされた。Ｎ−グリカン溶液から塩分を除去するために、消化は１５０ｍｇ炭素カラム（Ｃａｒｂｏｇｒａｐｈ、Ａｌｌｔｅｃｈ社）を通してなされ、Ｎ−グリカンは２５％ａＣＮとともに０．０５％ＴＦＡ中に溶解した。【００４４】  Ｏ−グリカンは、キット（Ｏグリカン放出キット、Ｇｌｙｃｏ社）を用いてヒドラジン分解によってＢＳＰから切り取られた（ｓｌｉｃｅｄ）。このために、約２００μｇの塩分のないＢＳＰが２４時間凍結乾燥され、アルゴン保護ガス下で５０μｌのヒドラジン試薬を添加され、６０℃で５時間分解および培養された。ヒドラジンは真空化で引かれた。続いて酢酸無水物でＮアセチル基の再Ｎアセチル化がなされた。【００４５】  Ｎ−およびＯ−グリカンは、特定の末端グリコシダーゼで連続的に消化された、蛍光色素２アミノベンズアミド（Ｆｌｕｋａ社）および２位のＡＢがマークされた（２−ＡＢｍａｒｋｅｄ）オリゴ糖でマークされ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により解析された。【００４６】  解析の議論
ヒトのＢＳＰのアミノ酸配列は、位置８８（ＮＴＴ）、１６１（ＮＧＴ）、１６６（ＮＳＴ）および１７４（ＮＧＳ）の４つの潜在的Ｎアセチル化部位を含む。Ｏ−糖化に対して、同等の意見が一致した配列（ｃｏｍｐａｒａｂｌｅ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は知られていない。全ての同定されたＮ−グリカン構造は、骨から単離されたＢＰＳ上および組換えＥＢＮＡ−２９３  ＢＳＰ上の両方に見つけられた。しかし、Ｎ−グリカンの総計におけるそれぞれの構造の百分率の割合には差があった。このように、骨のＢＳＰ  Ｎ−グリカンの主要部分は、トリアンテナリー（ｔｒｉａｎｔｅｎａｒｙ）構造（５８％）であり、ＥＢＮＡ細胞系ではテトラアンテナリー（ｔｅｔｒａａｎｔｅｎａｒｙ）構造（４８％）であった。【００４７】  組換えＢＳＰのＯ−糖化部位の限局化のために、Ｏ−グリカンは、ノイラミニダーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼとの蛋白の連続的消化によって、コア（ｃｏｒｅ）−ＧａＩＮＡｃまで、除去された。部分的に糖除去（ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）蛋白は、それからトリプリンとＶ８プロテアーゼでの処理でペプチド断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）へと分解された。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によりペプチドの質量が決定され、一部のペプチドはＰＳＤ−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により塩基排列決定された。この方法により、組換えＢＳＰの８つのＯ−糖化部位について、５つはペプチド２１１−２９９（ＴＴＴＳＰ・・・ＱＶＹＲ）上、最大３つは配列ＴＧＬＡＡを有するＡＳ１２０およびＡＳ１３５間のペプチド上、と決定できた。もちろん、組換えＢＳＰにおいて、配列ＤＡＴＰＧＴＧにおけるトレオニンはＯ−糖化された。骨ＢＳＰに、第３のＯ−糖化がなされた。組換えＢＳＰに、第３の糖化部位はなかった。恐らく、この糖化部位はＴＧＬＡＡ−ＢＳＰ部分構造上にある。【００４８】  実施例５−タマゴの黄身からの抗ＢＳＰ  ＩｇＹの生成
治療および免疫シンチグラフィのための抗ＢＳＰ  ＩｇＹを、より大量に精製するために、種々の方法が述べられている。ＡｋｉｔａおよびＮａｋａｉの方法（Ａｋｉｔａ  Ｅ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，腸毒素産生性Ｅ．ｃｏｌｉ株で免疫化されたニワトリのタマゴからの免疫グロブリンの生産のための４つの精製方法の比較，ｉｎ  Ｊ  Ｉｍｍｕｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９３，１６０（２），２０７−１４）は優先的に用いられている。【００４９】  タマゴ生産に対し、１週間あたり４．５個の生産性を持ち、黄身１つあたり特定のＩｇＹを１０ｍｇ以上の生産する”Ｌａｈｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｅ”または”ＬａｈｍａｎｎＢｒｏｗｎ”などの生産性の高い種が用いられている。フロイントアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  Ａｄｊｕｖａｎｔ）中で、ヒトの骨から単離された、または組換えられたＢＳＰ抗源に免疫処理がなされ、フロイントアジュバントによって、約０．１ｍｇのＢＳＰの基本的な免疫処理の後で、ブースター注入が６週間毎に与えられる。通常は、これらのニワトリの約３０％が免疫処理に反応しない。タマゴが過酢酸を用いて外側から殺菌され、それから割られ、黄身が白身から分離された。それから黄身は、５〜１０倍の体積の氷で冷やされたｐＨが５と５．２の間の蒸留水とともに泡立てられ、２〜５℃で２〜６時間以上培養された。それによって、実質的にリポ蛋白である黄身は粒状となって沈殿した。水の上澄み液はそれからフィルターペーパーを通して綺麗に濾過された（例えばＷｈａｔｍａｎ１番）。【００５０】  この上澄み液から、直接あるいは親和力クロマトグラフィを通して抗ＢＳＰ  ＩｇＹが均一的に精製できる。ＢＳＰは、化学的に共有結合で結合しており、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂカラムを通して、臭化シアンによって活性化され、ヒトの骨から、あるいは組換えしたヒトの細胞系の培養上澄み液から、単離された。１ｇのＩｇＹを結合するのに、０．５ｇの固定されたＢＳＰ（約５ｍｌのＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭの共有結合で結合された）が必要である。【００５１】  結合されたＩｇＹは酸勾配を介して溶出し、その後溶液は中和される。この溶液は、それから、塩分および濃縮した抗体を除去されなければならず、それはクロスフロー（ｃｒｏｓｓｆｌｏｗ）法（例えばＡｍｉｃｏｎＴＭ、１００，０００ダルトンの収率のらせんフィルターＳＹ  １００）で大規模に可能である。【００５２】  実施例６−ＢＳＰ  Ｈ因子複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）に結合した抗ＢＳＰ  ＩｇＹの単離
多クローン性のニワトリの抗体の骨基質中のＢＳＰとのわずかな反応が、Ｈ因子との複合体中のＢＳＰと反応するこれらの抗体の選択を通して排除できる。この目的のために、Ｈ因子またはＢＳＰは、化学的に共有結合で結合しており、臭化シアンによって活性化されたＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂを通して、骨から単離され、あるいは、遺伝子操作され、その後、多くのＢＳＰあるいはＨ因子がカラムに適用され、結合されるので、基質中の全ての配位子が相手（ｐａｒｔｎｅｒ）と複合化する。濾過された黄身抽出物は、それからこの親和力カラムに適用され、実施例４のように、ＢＳＰ−Ｈ因子中の遊離したエピトープに特異的に結合する抗体の分画（ｆｒａｃｔｉｏｎ）が得られる。【００５３】  実施例７−トランスジェニックニワトリ中でのヒトの抗ＢＳＰ抗体の生成
抗ＢＳＰ  ＩｇＹは、ヒトの治療あるいは診断において弱点がある。無関係な蛋白反応などの側面に影響が予期され、生物学的な半減期はヒトの抗体と比べてたった１２〜２４時間にしか至らない。ＩｇＹは補体システムを活性化しない。【００５４】  ＢＳＰに抗するヒトの抗体は、特にトランスジェニックニワトリ中で生成でき、その中で、遺伝子ターゲッティングにより、抗体形成の責を負う遺伝子における鳥類の免疫グロブリンに対する定数領域がヒトの免疫クロブリンに対する定数領域で置き換えられた。適切なニワトリの幹細胞およびベクターシステムが米国特許５，３４０，７４０、５，６５６，４７９および５，４６４，７６４に記載されている。ＢＳＰとの免疫化の後で、そのようなニワトリはタマゴ中のヒトの抗体の生成物と反応する。【００５５】  実施例８−ヒトの乳癌細胞系におけるＢＳＰの発現の免疫ブロット法解析
腫瘍細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳癌細胞系、エストロゲンレセプタ陽性）およびＴ−４７−Ｄ（乳癌細胞系、エストロゲンレセプタ陽性）が、免疫沈殿バッファで抽出され、ＢＳＰがヒトのＢＳＰに抗するウサギの多クローン性抗体混合物Ａ０００１で沈殿された。沈殿物は変性の後でＳＤＳジェルに適用され、電気泳動にかけられ、蛋白はニトロセルロース薄膜に移動した。その後、続いて、抗ＢＳＰウサギ抗血清Ａ００１と単クローン性のマウスの抗ＢＳＰ抗体（ＢＳＰ１．２）で免疫着色し、それによって第２の抗体として、ウサギのＩｇＧおよびマウスのＩｇＧに抗するヤギの抗体のペルオキシダーゼ抱合体が採用された。Ａ、Ｂの両ブロットで、免疫沈殿ＢＳＰのバンドは７００００ダルトンにおいて明瞭に識別できた。【００５６】  腫瘍細胞の細胞表面上のＢＳＰの存在の有無を示すために、乳癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＣＦ−７の細胞表面がビオチニル化され、免疫沈殿バッファで抽出され、ＢＳＰがヒトのＢＳＰに抗するウサギの多クローン性抗体混合物Ａ０００１で沈殿された。沈殿物は変性の後でＳＤＳジェルに適用され、電気泳動にかけられ、蛋白はニトロセルロース薄膜に適用された。それからこの薄膜上のビオチニル化された蛋白は、ＥＣＬシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）において、ペルオキシダーゼとストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎｅ）の抱合体で証明された。【００５７】  実施例８ａ−乳癌細胞系内および上のＢＳＰの発現
先立つ浸透（ｐｅｒｍｅａｂｌｉｓａｔｉｏｎ）の有りおよび無しの両方で、系Ｔ−４７−ＤおよびＭＤＡ−ＭＢ−２３１のヒトの乳癌細胞が、免疫蛍光法的に（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｌｙ）蛍光と共役した（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）ウサギの抗ブタＢＳＰ抗体とヤギの抗ウサギ抗体とでマークされた。浸透の後、蛍光的にマークされたＢＳＰは両細胞系で識別できる。浸透無しでは、Ｔ−４７−Ｄ細胞系のみで、ＢＳＰは免疫蛍光法により証明できた。【００５８】  実施例９−ＲＴ−ＰＣＲを介した腫瘍細胞におけるＢＳＰ発現の検出
腫瘍細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳癌細胞系、エストロゲンレセプタ陰性）、ＭＣＦ−７（乳癌細胞系、エストロゲンレセプタ陽性）、Ｔ−４７−Ｄ（乳癌細胞系、エストロゲンレセプタ陽性）および参照細胞としてのヒトの線維芽細胞（ＨＧＦ）から、ｍＲＮＡが単離され、逆トランスクリプターゼによって相補的ｃＤＮＡが生成され、ＢＳＰの特異的なプライマー（ｐｒｏｍｅｒ）を持つＰＣＲにより、ＢＳＰ−ｃＤＮＡが増幅された。ＢＳＰ−ｍＲＮＡの発現は乳癌細胞系ＭＣＦ−７において特に高く、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＴ−４７−Ｄの細胞では少なく、また、参照細胞系においては検出できなかった。【００５９】  実施例１０−ヒト化した単クローン性抗体の生成
単クローン性抗体ＢＳＰ１．２は、その腫瘍ＢＳＰとの特異的な結合に起因して、初期腫瘍および転移の治療に使用できる。それによって、抗体はある腫瘍の細胞の表面にＢＳＰ上に結合し、例えば補体カスケードの活性化を介して、細胞を破壊して免疫システムを刺激する。同様に、多クローンあるいは単クローン性抗ＢＳＰ  ＩｇＹもまた、治療に使用できる。この抗体が用いられると、ヒトの免疫システムはそれ自身の抗体−ヒトの抗マウスＩｇＧ抗体（ＨＡＭＡ）あるいはヒトの抗ニワトリＩｇＹ抗体（ＨＡＣＡ）−の形成に作用する。ＨＡＭＡおよびＨＡＣＡは、腫瘍の抗原に対する生物の免疫反応を誘起あるいは強化できる。しかし、腫瘍マーカーの測定において、ＨＡＭＡとＨＡＣＡの干渉が生じ、それは試験管内の測定方法を崩壊させる。このように、腫瘍マーカーに対してみせかけの高い測定値が生じる。【００６０】  このように、ヒト化された単クローン性抗体は、特に治療および免疫シンチグラフィに適している。単クローン性抗ＢＳＰ抗体を生成するハイブリドーマ細胞系から適切にヒト化された抗体をいかにして導くかについて、複数の方法が説明されている。【００６１】  実施例１１−抗ＢＳＰ抗体と細胞毒（ｐｏｉｓｏｎ）および放射性同位体との抱合体
発明のさらなる応用では、抗ＢＳＰ抗体またはそれらのＦａｂフラグメントに、細胞毒および放射性同位体が化学的に共有結合で結合するだろう。ヨウ素１２５またはヨウ素１３１などの放射性同位体でマークされた抗体は、免疫シンチグラフィを介しての腫瘍限局化のためのより少量の適用に対して、また、腫瘍の直接破壊のためのより大量の適用に対して、安定である。そのような化学的な抱合体は、例えば抗体のヨウ素１２５あるいはヨウ素１３１でのヨウ素化により、生成できる（Ｇａｒｖｅｙ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ，，免疫学の方法３ｒｄｅｄ．，Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｐｕｂｌ．，１７７，１７１−１８２）。放射能免疫治療および免疫シンチグラフィに対する安定な方法の概論はここに記載がある：Ｖｕｉｌｌｅｚ，放射能免疫ターゲッティング：診断および治療での使用，雄牛の癌中で．２０００，８７（１１），８１３−２７。【００６２】  実施例１２−細胞表面でのＢＳＰの発現での腫瘍の治療
ＢＳＰが腫瘍細胞の表面で発現するか、生検材料から初めて測定された。腫瘍細胞の表面にＢＳＰが検出できた患者は、ニワトリやマウスの抗ＢＳＰ抗体、対応するヒト化された抗体、および、これらの抗体の細胞毒あるいは放射性同位体との抱合体による治療に適していると考えられる。【００６３】  細胞の表面で発現した腫瘍マーカーに抗するように向けられた治療抗体での腫瘍の処置は、技術の状態（ｓｔａｔｅ）である。このように、ヒト化された抗体ヘルセプチン（ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）により、ヒトの上皮の成長因子のレセプタに抗して、冒されたのが約２５％の転移形態中においても、乳癌は成功裏に治療できる（Ｈｏｔａｌｉｎｇ  ＴＥ  ａｔ  ａｌ．，ヒト化された抗ＨＥＲ２抗体ｒｈｕＭＡｂ  ＨＥＲ２が、抗体に依存し、細胞を介した（ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ）細胞毒性をＦｃｇＲ  ＩＩＩを介して伝える（要約），Ｐｒｏｃ．Ａｎｎｕ．Ｍｅｅｔ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９６；３７：４７；Ｐｅｇｒａｍ  ＭＤ  ｅｔ  ａｌ．，ヒト化された抗ＨＥＲ２抗体のフェーズＩＩＩ治療院での試みにおける乳癌患者の抗体に依存し、細胞を介した細胞毒性（要約），Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９７；３８：６０２）。【００６４】  ヘルセプチンと同様に、適当な抗ＢＳＰ抗体は輸液として、例えば、第１の適用において９０分の輸液、後で３０分の輸液として、適用できる。輸液の頻度および抗体の量は血液中での抗体の半減期（ヒト化された抗体で約６日、ニワトリ抗体で２４時間未満）および体重に応じて決められる。【００６５】  実施例１３−細胞あるいはＢＳＰ−Ｈ因子複合体に結合していない遊離ＢＳＰの中和による腫瘍の治療
上述の方法で、患者の腫瘍細胞が細胞表面上に検出できないＢＳＰを発現するか測定された。これらの腫瘍の場合、細胞が血液中あるいは組織液中にＢＳＰを放ち、補体カスケードの代わりのパスの不活性化のために、あるいは、骨組織中への移動のために、例えばＨ因子の結合を通してこれを用いると仮定される。この腫瘍タイプに対するさらなる可能な尺度は、血液血清中のＢＳＰの増加した濃度（＞２０ｎｇ／ｍｌ血清）である。これらの場合、抗ＢＳＰ抗体は遊離した腫瘍ＢＳＰまたはＨ因子との複合体中の腫瘍ＢＳＰの中和のために用いられうる。投与量は、血清中および組織液中に遊離して存在するＢＳＰの量に関して設定できる。治療のために、Ｈ因子との複合体中の遊離したＢＳＰのエピトープを識別できる、ニワトリおよびマウスの抗ＢＳＰ抗体、および、ヒト化された抗ＢＳＰ抗体が考えられる。また、蛋白分解の消化（Ｇａｒｖｅｙ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，免疫学の方法３ｒｄｅｄ．，Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｐｕｂｌ．，１９７７，２５６−２６６）による標準的な手順に沿って調製できる、これらのＦａｂフラグメントも考えられる。また、遺伝子操作されたＦａｂフラグメントは、上記の抗ＢＳＰ抗体から誘導され、そのような治療に考慮されていく。【００６６】  このように本発明は、アミノ酸ＴＧＬＡＡを含むアミノ酸１２０〜１３５（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ：ＳＩＡＬＨＵＭＡＮ，Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ２１８１５，信号配列なし）の領域において翻訳後のＯ−糖化を腫瘍ｈＢＳＰが含まないので、腫瘍細胞のｈＢＳＰのエピトープのみに特異的に結合するヒトの骨シアロ蛋白（ｈＢＳＰ）に抗する可能な抗体を作成する。骨からの正常なｈＢＳＰとは異なる。抗体は、補体Ｈ因子との複合体中における腫瘍遺伝子の血清ｈＢＳＰを識別でき、このように診断および治療の有用な機器を構成する。【００６７】  実施例１４−透析および前立腺患者の血清の一連のＲＩＡ測定
本発明による抗体はＥＬＩＳＡにおけるトラッパ（ｔｒａｐｐｅｒ）抗体として用いられ、相対的な一連の測定において、透析患者（”正常な”ＢＳＰ）と腫瘍に起因してそれぞれ大きく増加したＢＳＰ値を有する前立腺患者の血清中のＢＳＰの量が測定された。【００６８】  本発明によるニワトリの多クローン性抗体によりヒトの骨シアロ蛋白の血清濃度が測定され、それはまた、腫瘍細胞あるいは病気のために強く冒された組織からのヒトの骨シアロ蛋白上に存在するエピトープに結合し、それは、健康な骨からの正常な骨シアロ蛋白と比較して、アミノ酸ＴＧＬＡＡを含むアミノ酸１２０〜１３５の領域において変異し、あるいは不完全である、ヒトのＢＳＰ上における翻訳後の糖化である。ルールとして、１００μｌの抗体溶液が１２５Ｉでマークされた骨シアロ蛋白と混合された。２４時間の４℃での培養の後に、第２の抗体の１００μＬの溶液が加えられ（ロバの抗ニワトリＩｇＧ）、２時間の４℃での培養の後に、反応混合物が２０００ｇで遠心分離され、上澄み液が除去された。ＰＢＳ中で２５０μＬで洗浄し、続いて遠心分離（２０００ｇで１０分）した後に、上澄み液が再び除去され、カウンタ液（ｃｏｕｎｔｅｒ  ｆｌｕｉｄ）の添加後にペレット（ｐｅｌｌｅｔ）の放射能がガンマカウンタで１分間測定された。【００６９】  必要な較正曲線を通常の方法で、この場合では４パラメータ曲線アルゴリズムを用いて、作成した。ルールとして、標準値は、０、１．９、３．８、７．５、１５、３０、６０および１２０μｇ／Ｌ  ＢＳＰを含む。患者試料への標準物質の添加を通しての分析的な精度の評価は、平均で９９％を越える幅の回復をもたらした。較正曲線の例に対するコンピュータプリントアウトが図４に示される。【００７０】  以下の表にした一連の測定値は、本発明による抗体の助けにより、患者の腫瘍および血清中の変異していないＢＳＰを、定量的に、Ｈ因子の存在下で、患者の特定の病気の賞状に依存せず、信頼性高く測定することができる。困難で間違えやすいＨ因子などの血清蛋白のＢＳＰからの分離は必要ない。特に、腫瘍細胞からのＢＳＰは信頼性高く測定でき、初期腫瘍および転移可能性の予後および評価において重大な進歩をもたらす。【００７１】
【表２−１】
2005508870.tif 000003
【表２−２】
2005508870.tif 000004
【表２−３】
2005508870.tif 000005
【表２−４】
2005508870.tif 000006
【００７２】
【表３】
2005508870.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】ＢＳＰの腫瘍および骨特有のイソフォームのウエスタンブロットである。
【図２】単クローンのマウスの抗ＢＳＰ抗体を用いての発現構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）ＧＳＴ−ＥＫ−ＢＳＰおよびｈｉｓ６−ｍｙｃ−ＥＫ−ＢＳＰを有するトランスフェクションされていないＥＢＮＡ−２９３細胞（負制御）およびトランスフェクションされたＥＢＮＡ−２９３細胞の細胞培養上澄みのウエスタンブロットである。
【図３】フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）ら（１９９１）による明らかにされていないＢＳＰのアミノ酸配列である。
【図４】測定較正曲線のためのコンピュータ出力の例である。
【図１】
2005508870.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
2005508870.tif 000011
【国際調査報告】
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