(57)【要約】【課題】【解決手段】  キラルな芳香族ヒドロキシケトンを、ＡＨＡＳやＴＳＡＳ等の２−ヒドロキシ−３−オキソ酸シンターゼを用い、高収率で調製するためのバイオトランスフォーメーションプロセス。本プロセスでは、置換されていてもよいアリールアルデヒドとオキソ酸とを反応させ、種々の薬物の生成においてシントンとして有用である、（Ｒ）−フェニルアセチルカルビノール等の高純度の鏡像異性体を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式（Ｉ）
【化１】
2005514953.tif 000017
（式中、ＲはＨ又はＣ1-6アルキル基を示し；Ａｒはアリール基を示し；前記アリール基は、Ｎ、Ｓ、及びＯから選択される一種以上のヘテロ原子を含んでもよく；前記アリール基は縮合環を有してもよく；前記アルキル基及び前記アリール基は、Ｃ1-3アルキル基、Ｃ1-3アルコキシ基、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、ＮＨ2、ＣＮ、及びＮＲ1Ｒ2から選択される１〜３個の置換基で置換されてもよく；Ｒ1及びＲ2は、独立にＨ又はＣ1-4アルキル基であり；前記Ｃ1-3アルキル基は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、及びＯＨから選択される置換基によって更に置換することができる）で表わされる芳香族α−ヒドロキシケトンを調製するプロセスであって、該プロセスは、式（ＩＩ）
【化２】
2005514953.tif 000018
で表わされるアルデヒドと、式（ＩＩＩ）
【化３】
2005514953.tif 000019
（式（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）中、Ａｒ及びＲは式（Ｉ）の定義と同様である）で表わされる２−オキソ酸とを、ＡＨＡＳ及びＴＳＡＳから選択される２−ヒドロキシ−３−オキソ酸シンターゼと、チアミンピロホスフェート（ＴＰＰ）と、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）と、金属イオンと、緩衝液とを含む混合物の存在下で反応させること含むプロセス。
【請求項２】
式（Ｉ）で表わされる化合物の鏡像異性体の一方が過剰に形成される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
芳香族α−ヒドロキシケトンがキラルな芳香族α−ヒドロキシケトンである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項４】
式（Ｉ）で表わされる化合物が（Ｒ）−アリールアシルカルビノールである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項５】
２−オキソ酸がピルビン酸である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項６】
２−オキソ酸がグリオキシル酸、２−ケト酪酸、及び２−ケトバレリアン酸から選択される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項７】
アリール基がフェニル基、ベンジル基、ナフチル基、フリル基、ピリジニル基、及びチエニル基から選択される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項８】
アルデヒドが、置換ベンズアルデヒドである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項９】
アルデヒドがベンズアルデヒドである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１０】
式（Ｉ）で表わされる化合物がフェニルアセチルカルビノール（ＰＡＣ）である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１１】
式（Ｉ）で表わされる化合物が（Ｒ）−ＰＡＣである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１２】
ＰＡＣが酵素反応生成物の９５％超を占める、請求項１０に記載のプロセス。
【請求項１３】
ＰＡＣが酵素反応生成物の９９％超を占める、請求項１０に記載のプロセス。
【請求項１４】
（Ｒ）−ＰＡＣが、酵素反応で生成されるＰＡＣの９０％超を占める、請求項１１に記載のプロセス。
【請求項１５】
（Ｒ）−ＰＡＣが、酵素反応で生成されるＰＡＣの９５％超を占める、請求項１１に記載のプロセス。
【請求項１６】
前記２−ヒドロキシ−３−オキソ酸シンターゼがバクテリア由来の酵素を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１７】
前記２−ヒドロキシ−３−オキソ酸シンターゼが酵母酵素、真菌酵素、及び植物酵素から選択される酵素を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１８】
前記２−ヒドロキシ−３−オキソ酸シンターゼが野生型タンパク質を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１９】
前記２−ヒドロキシ−３−オキソ酸シンターゼが組換えタンパク質を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２０】
前記２−ヒドロキシ−３−オキソ酸シンターゼが遺伝子工学的に改変されたタンパク質を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２１】
前記２−ヒドロキシ−３−オキソ酸シンターゼが変異タンパク質を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２２】
前記２−ヒドロキシ−３−オキソ酸シンターゼがＡＨＡＳ酵素を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２３】
前記２−ヒドロキシ−３−オキソ酸シンターゼがＴＳＡＳ酵素を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２４】
前記２−ヒドロキシ−３−オキソ酸シンターゼが大腸菌由来のＡＨＡＳアイソザイムＩタンパク質を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２５】
前記２−ヒドロキシ−３−オキソ酸シンターゼが大腸菌由来のＡＨＡＳアイソザイムＩＩタンパク質を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２６】
前記２−ヒドロキシ−３−オキソ酸シンターゼが大腸菌由来のＴＳＡＳを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２７】
前記２−ヒドロキシ−３−オキソ酸シンターゼがヒスチジン−タグ化タンパク質を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２８】
前記２−ヒドロキシ−３−オキソ酸シンターゼが宿主細胞で過剰発現した部位特異性ＡＨＡＳ ＩＩ変異体を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２９】
前記２−ヒドロキシ−３−オキソ酸シンターゼが安定化酵素を含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項３０】
前記２−ヒドロキシ−３−オキソ酸シンターゼが固定化された酵素を含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項３１】
酵素反応に用いる全成分を一回分量として反応液に添加する、請求項１〜２７のいずれか一項に記載のバイオトランスフォーメーションプロセス。
【請求項３２】
酵素反応に用いる成分の内の数種を複数回に分けて或いは連続的に反応液に添加する、請求項１〜２７のいずれか一項に記載のバイオトランスフォーメーションプロセス。
【請求項３３】
混合物のｐＨが５〜９である、請求項２８又は２９に記載のプロセス。
【請求項３４】
混合物のｐＨが６．５〜７．５である、請求項２８又は２９に記載のプロセス。
【請求項３５】
混合物がＭＥＳ、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ、ＰＩＰＥＳ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＳ、トリシン、ビシン、及びホスフェートから成る群より選択される緩衝液を含む、請求項２８又は２９に記載のプロセス。
【請求項３６】
緩衝液の濃度が０．０１Ｍ〜０．２５Ｍである、請求項２８又は２９に記載のプロセス。
【請求項３７】
アルデヒドとオキソ酸を各々２ｍＭ〜１００ｍＭの濃度となるように添加する、請求項２８又は２９に記載のプロセス。
【請求項３８】
ＴＰＰとＦＡＤを各々０．０２ｍＭ〜０．２ｍＭの濃度となるように添加する、請求項２８又は２９に記載のプロセス。
【請求項３９】
マグネシウムイオンを０．２ｍＭ〜２ｍＭの濃度となるように添加する、請求項２８又は２９に記載のプロセス。
【請求項４０】
ＤＴＴを０．１ｍＭ〜２ｍＭの濃度となるように添加する、請求項２８又は２９に記載のプロセス。
【請求項４１】
酵素を０．０１ｍｇ／ｍＬ〜１．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように添加する、請求項２８又は２９に記載のプロセス。
【請求項４２】
酵素を０．１〜１０Ｕ／ｍＬの濃度となるように添加する、請求項２８又は２９に記載のプロセス。
【請求項４３】
混合物の温度が１５〜４０℃である、請求項２８又は２９に記載のプロセス。
【請求項４４】
前記混合物が２−プロパノール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、及びアセトアミドから選択される水混和性有機溶媒を０〜５０％（ｖ／ｖ）の濃度で含む、請求項１〜４０のいずれか一項に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２−ヒドロキシ−３−オキソ酸シンターゼ、例えばＡＨＡＳファミリーに関連する酵素を用い、置換されていてもよいアリールアルデヒドと２−オキソ酸とからキラルな芳香族α−ヒドロキシケトン（ＰＡＣ等）を調製するためのバイオトランスフォーメーションプロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
通常、鏡像異性体の一方のみが所望の生物学的活性を有し、他方は不活性又は有毒でさえあるため、立体特異性（鏡像特異性）は医薬等の生体活性化合物の機能に関して極めて重要である。従って、このような分子の化学合成においては、合成プロセス中のあるステージにおいて鏡像異性体を分離するという困難な工程を行なわなければならない。或いはキラルな前駆体（キラルシントン）の鏡像異性体の一方のみを用いて前記合成を開始しなければならない。有機化合物の合成において酵素を用いると、酵素反応は位置選択的であり且つ立体特異的であるため、副生成物の生成が抑制され温和な反応条件下で高い反応速度が提供されるだけでなく、化学的手法のみを用いた合成における上述の問題が解決される。バイオテクノロジーの多くは、非結合酵素や非結合酵素含有細胞を用いるバイオ触媒を広く利用している。
【０００３】
キラルなα−ヒドロキシケトン類は、有機化学や医薬化学における基礎物質として広く用いられており、例えば、ビタミンＥやある種の抗真菌薬、抗糖尿病薬等の合成に用いられる。キラルα−ヒドロキシケトンの中で重要なものには（Ｒ）−フェニルアセチルカルビノール（（Ｒ）−ＰＡＣ）がある。（Ｒ）−ＰＡＣは、α及びβアドレナリン作動特性を有する種々の薬物の製造の際にシントンとして使用される。このような薬物としては、Ｌ−エフェドリンやプソイドエフェドリン、ノルエフェドリン、ノルプソイドエフェドリン、フェニルプロパノールアミンが挙げられる。これらの薬物は、充血緩和剤や抗喘息薬、血管収縮剤等として使用される。
【０００４】
（Ｒ）−ＰＡＣは何十年もの間、種々の発酵酵母（殆どの場合はサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae））を用いて、ベンズアルデヒドのバイオトランスフォーメーションによって得られてきた（スキーム１）。
【０００５】
【化１】
2005514953.tif 000002
【０００６】
ピルベートからアセトアルデヒドへの酵素による通常の脱カルボキシル反応に伴う合成副反応において、酵素であるピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）の活性は、酵母内でのＰＡＣの生成に関与している（ハンク（Hanc）Ｏら、Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ  ４３（１９５６）４９８）。
【０００７】
細胞を用いる他のバイオトランスフォーメーションと同様、上のプロセスには、酵母細胞に対するベンズアルデヒドの毒性や、各種細胞性酵素の作用による多くの副生成物（例えば、ベンジルアルコール）の生成という限界がある。これらの要因は目的生成物の収量を低下させ、精製手続を複雑にする。チェコ特許ＣＳ９３６２７（１９６０年）（特許文献１）には、糖蜜と、粗ショ糖と、ベンズアルデヒドとを含む系のＰＡＣへのバイオトランスフォーメーションを開始する前に、酵母細胞を強酸で前処理し反応混合物における安定性を増強させることが記載されている。東ドイツ特許ＤＤ５１６５１（１９６６年）（特許文献２）には、アセトアルデヒドをベンズアルデヒドと共に酵母発酵ブロスに加え、必要とされる生成物が生成されるような方向へと反応を導くことが記載されている。ＷＯ９００４６３１（１９９０年）（特許文献３）には、ベンズアルデヒドとピルベートからＰＡＣを生成するバイオトランスフォーメーションにおいて、変異誘発によって改良した酵素（サッカロミセス・セレビシエ或いはカンジダ・フラレイ（Candida flarei））を使用することが記載されている。特開平９−２３４０９０（１９９７年）（特許文献４）には、サッカロミセス・セレビシエを用いたベンズアルデヒドとピルベートのバイオトランスフォーメーションによる（１Ｒ,２Ｓ）−１−フェニル−１,２−プロパンジオールの生成が記載されている。ＷＯ９９６３１０３（１９９９年）（特許文献５）は、置換芳香族アルデヒドとピルベートから対応するヒドロキシルケトンを生成するバイオトランスフォーメーションに関し、ここでは有機溶媒において酵母が媒介する触媒作用を利用している。特開２０００−９３１８９（２０００年）（特許文献６）には、トルロプシス（Torulopsis）属とカンジダ属の酵母を用いた光学活性なα−ヒドロキシケトンの生成が記載されている。ＷＯ０１４４４８６（２００１年）公報（特許文献７）では、超臨界液体或いは液化ガスの存在下、酵母を用い、置換又は未置換の芳香族アルデヒドとピルビン酸を縮合させてカルビノール化合物を生成している。
【特許文献１】チェコ特許ＣＳ９３６２７（１９６０年）
【特許文献２】東ドイツ特許ＤＤ５１６５１（１９６６年）
【特許文献３】ＷＯ９００４６３１（１９９０年）
【特許文献４】特開平９−２３４０９０（１９９７年）
【特許文献５】ＷＯ９９６３１０３（１９９９年）
【特許文献６】特開２０００−９３１８９（２０００年）
【特許文献７】ＷＯ０１４４４８６（２００１年）
【０００８】
所望の反応の触媒として精製酵素を用いることにより、全細胞を用いるバイオトランスフォーメーションの欠点のいくつかを克服できる可能性がある。これについてはサッカロミセス・セレビシエやザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）由来のピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）や、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）由来のギ酸ベンゾイルデカルボキシラーゼを用いる合成の可能性が研究されてきた（例えば、クロウト（Crout）Ｄ．Ｈ．Ｇ.）ら、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ ９（１９９４）１〜３０）。精製した酵素を用いて（Ｒ）−ＰＡＣを生成するという、信頼性の高い工業的プロセスを開発する場合、（Ｒ）−ＰＡＣの生成効率及び製造条件下での酵素の安定性という二要因が主に重要である。ブルーン（Bruhn）ら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ２３４（１９９５）６５０〜６；ＤＥ１９５２３２６９（１９９６））は、部位特定的変異によってザイモモナス・モビリス由来のＰＤＣの触媒特性を改善した。しかしながら、Ｃ−Ｃ結合生成反応（carboligation）におけるピルベートの総利用効率は非常に低いままで、３．５％のピルベートが所望の生成物へと変換されたのみであり、大部分のピルベートは脱炭酸反応によりアセトアルデヒドに変換されるものであった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、本発明の目的は、置換されていてもよいアリールアルデヒドとα−ケト酸とから、高収率でキラル芳香族α−ヒドロキシケトン（ＰＡＣ等）を調製するためのバイオトランスフォーメーションプロセスを提供することである。本発明者らは、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ：国際分類グループＥＣ４．１．３．１８に属し、アセトラクテートシンターゼとしても知られている）に関する系統的研究を行なった。ＡＨＡＳの触媒作用を受ける通常の生理学的反応は、二種のα−ケト酸の脱炭酸縮合であり、（Ｓ）−アセトヒドロキシ酸が生成される（スキーム２）。この反応においては、付加的な駆動力や酸化還元剤を必要としない。合成の際には、ＡＴＰ或いはＮＡＤ等の補因子の再生は必要無く、フラビンアデニンジヌクレオチド補因子（ＦＡＤ）やチアミン二リン酸（ＴＰＰ）、二価の金属イオンが存在しなければならないだけである。
【００１０】
【化２】
2005514953.tif 000003
【００１１】
本発明者らは、ＡＨＡＳ酵素を「非天然物由来」の基質に対しても利用できることを既に見出している（バラック（Barak）Ｚ.ら、J. Bacteriol. １６９（１９８７）３７５０〜６；ゴロップ（Gollop）N.ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８（１９８９）６３１０〜７；イブダー（Ibdah）M.ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５（１９９６）１６２８２〜９１）。
【００１２】
２−ヒドロキシ−３−オキソ酸シンターゼの他の例としては、タルトロン酸セミアルデヒドシンターゼ（ＴＳＡＳ；国際分類グループＥＣ４．１．１．４７に属し、グリオキシル酸カルボリガーゼとしても知られている）があり、触媒活性のみならず、その配列や他の性質に関してもＡＨＡＳと近い関係にある。ＴＳＡＳが関与する通常の生理学的反応も、二種の２−オキソ酸の脱炭酸縮合であり、通常はグリオキシル酸からタルトロン酸セミアルデヒドを生成する（スキーム３）。
【００１３】
【化３】
2005514953.tif 000004
【００１４】
本発明者らは、ＴＳＡＳが非天然物由来の基質に対しても反応する物質として利用できることを見出した。
【００１５】
従って、本発明の別の目的は、ＡＨＡＳファミリーに関する２−ヒドロキシ−３オキソ酸シンターゼを用い、置換されていてもよいアリールアルデヒドと２−オキソ酸とからキラルな芳香族α−ヒドロキシケトン（ＰＡＣ等）を調製するためのバイオトランスフォーメーションプロセスを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、ＡＨＡＳやタルトロン酸セミアルデヒドシンターゼ等の２−ヒドロキシ−３オキソ酸シンターゼを用い、置換されていてもよいアリールアルデヒドと２−オキソ酸からキラル芳香族α−ヒドロキシケトン（ＰＡＣ等）を高収率で調製するためのバイオトランスフォーメーションプロセスに関する。前記バイオトランスフォーメーションプロセスは、式（Ｉ）
【００１７】
【化４】
2005514953.tif 000005
【００１８】
（式中、ＲはＨ又はＣ1-6アルキル基を示し；Ａｒはアリール基を示し；前記アリール基は、芳香族系であり、Ｎ、Ｓ、及びＯから選択される一種以上のヘテロ原子を含んでもよく；前記アリール基は縮合環を有してもよく；前記アルキル基及び前記アリール基は、Ｃ1-3アルキル基、Ｃ1-3アルコキシ基、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、ＮＨ2、ＣＮ、及びＮＲ1Ｒ2から選択される１〜３個の置換基で置換されてもよく；Ｒ1及びＲ2は、独立にＨ又はＣ1-4アルキル基であり；前記Ｃ1-3アルキル基は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、及びＯＨから選択される置換基によって更に置換されていてもよい）の化合物の調製を、式（ＩＩ）
【００１９】
【化５】
2005514953.tif 000006
【００２０】
の化合物とを式（ＩＩＩ）
【００２１】
【化６】
2005514953.tif 000007
【００２２】
（式（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）中、ＡｒとＲは前述の定義と同様である）の化合物とを、２−ヒドロキシ−３−オキソ酸シンターゼと、緩衝液と、ＴＰＰと、ＦＡＤと、マグネシウムイオン又はマグネシウムの代わりに酵素を活性化できる他の二価金属陽イオンとを含む混合物の存在下、反応させることにより行なうことを含む。
【００２３】
本発明に係るバイオトランスフォーメーションプロセスにおいては、式（ＩＩＩ）の化合物が脱炭酸反応によりＲＣＨ＝Ｏに変化して失われる量が１％より少ないので、高いＣ−Ｃ結合生成反応効率が得られる。更には、条件を適切に選択することにより、式（ＩＩＩ）の化合物の９８％より多く、或いは式（ＩＩ）の化合物の９９％より多くを、所望の生成物である化合物Ｉへと変換できる。
【００２４】
本発明に係るプロセスの他の特徴は、生成物がキラリティを有することであり、この生成物は、（Ｒ）−アリールアシルカルビノール等のキラル芳香族α−ヒドロキシケトンである。本発明は、その一様相において、基質がピルベートとベンズアルデヒドであり、生成物がＰＡＣであり、（Ｒ）−ＰＡＣの鏡像体過剰率は９７％を超える。
【００２５】
本発明のプロセスは酵素反応に関し、アセトラクテートシンターゼやタルトロン酸セミアルデヒドシンターゼ等のＡＨＡＳファミリーに関する２−ヒドロキシ−３−オキソ酸シンターゼに特有の特性を利用する。本プロセスには、植物若しくはバクテリアのＡＨＡＳやＴＳＡＳ酵素を用いることができる。これらは野生型や組換え型、遺伝子工学的改変型、変異型のいずれであってもよく、固定化されているか、或いは安定化されていてもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明者らは、ＡＨＡＳ酵素及びＴＳＡＳ酵素が、芳香族アルデヒドと２−オキソ酸とからキラルなα−ヒドロキシケトンを生成する縮合反応を効率的に触媒することを見出した。本発明者らは、反応の立体特異性を検討し、置換ベンズアルデヒドを２−オキソ酸と反応させると、高い鏡像体過剰率で（Ｒ）−アリールアシルカルビノールが生成することを見出した。
【００２７】
バイオトランスフォーメーションは、緩衝液、Ｍｇ2+、ＴＰＰ、ＦＡＤ、二種の基質、及びＡＨＡＳ酵素又はＴＳＡＳ酵素を含有する混合物で行なった。全体の収支バランスは、スキーム４に示すように記述できる。式中、ＲとＡｒは、「課題を解決するための手段」の記述と同様に定義される。
【００２８】
【化７】
2005514953.tif 000008
【００２９】
混合物は、酵素反応終了後、エチルエーテル等の有機溶媒で抽出し、生成物はＦＩＤとＭＳ検出器を有するＧＣで分析した。生成物の構造は、1Ｈ−ＮＭＲ分光法と旋光性測定によって確認した。生成物の鏡像体純度は、キラル固定相を含むカラムを用いて、ＦＩＤを備えたＧＣで測定した。また、アルデヒド誘導体の消費速度は、分光測光法により決定した。
【００３０】
本発明に係るバイオトランスフォーメーションプロセスが行なわれる反応液は、好ましくはｐＨを６〜９に維持する緩衝液を含有する。この緩衝液は、０．０１Ｍ〜０．２５Ｍの濃度であり、ＭＥＳ、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ、ＰＩＰＥＳ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＳ、トリシン、ビシン、及びホスフェートから成る群より選択されるのが好ましいが、これらに限定されるものではない。反応混合物は更に、ＴＰＰ、ＦＡＤ、マグネシウムイオン、及び二種の基質を各々０．１ｍＭ〜１００ｍＭの濃度で含有する。また、一種以上の非緩衝性の塩を総量０〜１５０ｍＭの濃度で含有してもよい。マグネシウムイオンは、カルシウムやバリウム、マンガン、亜鉛、コバルト、ニッケル等の酵素を活性化できる他の二価金属陽イオンで置換することができる。混合物は、水混和性有機溶媒を０〜５０％（ｖ／ｖ）の濃度で含むことができる。水混和性有機溶媒は、２−プロパノール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、及びアセトアミドから成る群から選択されるのが好ましいが、これらに限定されるものではない。酵素の濃度は、０．０１〜１．０ｍｇ／ｍＬ或いは０．１〜１０Ｕ／ｍＬである。ここで単位Ｕは、１分間に生成されるα−ヒドロキシケトンの量をμｍｏｌ単位で表わすものである。反応液は、酵素の安定性を高めるために、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）等の還元剤を０．０１〜１０ｍＭの濃度で含有してもよい。反応液の温度は１５〜４０℃が好ましい。
【００３１】
好ましい実施形態においては、本発明に係るバイオトランスフォーメーションプロセスを、ｐＨ６．５〜７．５、温度３０℃、温和な撹拌下、１ｍＭのＭｇ2+、０．１ｍＭのＴＰＰ、０．０５ｍＭのＦＡＤ、６０ｍＭのＫＣｌの条件下で行なう。
【００３２】
ＡＨＡＳが触媒する反応における副生成物の生成は、基質の濃度に依存することが既に見出されている。更に、酸素濃度がアルデヒドの消費に殆ど影響を及ぼさず、またＨＰＬＣにおいて酸化生成物が検出されなかったことから、アリールアルデヒドは、いかなる酸化的な副反応によっても消費されないことが既に見出されている。
【００３３】
本発明に係るバイオトランスフォーメーションプロセスの好ましい一実施形態においては、２−ヒドロキシ−３−オキソ酸シンターゼ酵素は、バー・イラン（Bar-Ilan）らが、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４０（２００１）１１９４６〜５４に記載した方法により調製した、大腸菌（Escherichia coli（ＷＴ））由来の野生型ＡＨＡＳアイソザイムＩＩである。本発明の他の好ましい実施形態においては、ＡＨＡＳ酵素は、組換えＡＨＡＳアイソザイムＩＩであり、Ｎ末端融合したためアフィニティー基づく精製が可能である。本発明の他の好ましい実施形態においては、ＡＨＡＳ酵素は、Ｎ末端を融合した組換えＡＨＡＳアイソザイムＩである。本発明の他の実施形態においては、ＡＨＡＳは、バクテリア酵素、酵母酵素、真菌酵素、及び植物酵素から選択される酵素を含む。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態においては、ピルベートは、ＡＨＡＳアイソザイムＩＩの存在下、置換されていてもよいベンズアルデヒドと反応する。本発明者らは、前記反応中のピルベートとベンズアルデヒドの酵素による縮合により誘導されると予想される二種の化合物、即ちＰＡＣ及び２−ヒドロキシプロピオフェノン（２−ＨＰＰ）（スキーム５）、の濃度をＧＣとＨＰＬＣを用いて測定した。
【００３５】
【化８】
2005514953.tif 000009
【００３６】
加熱せずに反応を進行させた場合は、生成物２−ＨＰＰの全生成物に占める割合は、０．２〜０．８％であった。酸化生成物であるフェニルプロパンジオン（ＰＰＤ）は、好ましい保存状態においては検出できず、生成物の０．１％より少なかった。ＰＰＤは長時間保存した場合のみに検出された。ＰＡＣの絶対配置は、Ｒ（−）であった。
【００３７】
上述のバイオトランスフォーメーションに用いたＡＨＡＳ酵素の比活性（ＰＡＣ生成の初期速度に基づく）は、３Ｕ／ｍｇより高かった。組換えＡＨＡＳ Ｉを用いたバイオトランスフォーメーションにおいては、ベンズアルデヒドとピルベートの縮合におけるＣ−Ｃ結合生成反応の効率は、ベンズアルデヒドが過剰に存在する場合は９８％（ピルベートの消費量基準）より高く、ピルベートが過剰の場合は９９％より（ベンズアルデヒドの消費量基準）高かった。反応で生成された（Ｒ）−ＰＡＣの鏡像体過剰率は９７％以上であった。
【００３８】
本発明の各種利点は、従来技術との比較により明らかとなる。次の表は、本発明に従って行なったバイオトランスフォーメーションとザイモモナス・モビリス由来の変異ピルビン酸デカルボキシラーゼを用いた米国特許第６００４７８９号に従って行なったバイオトランスフォーメーションとの比較を示す。
【００３９】
表に示すように、ＰＤＣ酵素として変異により活性部位を改善したもののみを用い、一方、ＡＨＡＳ酵素としては野生型をそのまま用いた場合でさえも、バイオトランスフォーメーションにおける各パラメータは、ＰＤＣ酵素よりもＷＴ ＡＨＡＳ ＩＩの方が良い値を示している。ＡＨＡＳ酵素の活性部位は、ＰＤＣ酵素の活性部位よりも、第二の基質との縮合反応がうまく進むように設計されていると思われる。
【００４０】
【表１】
2005514953.tif 000010
【００４１】
本発明の他の一実施形態においては、変異ＷＴ ＡＨＡＳ ＩＩ酵素を用いる。この変異により、酵素の特異性が変化し、或いは比活性が向上する。好ましい一実施形態においては、酵素Ｗ４６４Ｌが用いられる。この酵素は、ＷＴ ＡＨＡＳ ＩＩを遺伝子工学的に改変し大腸菌内で過剰発現させたものであり、ヘキサヒスチジン−タグ化組換え融合タンパク質であって、単一の変異を有する。Ｗ４６４Ｌの変異は、天然の反応においては第二の基質であるピルベートよりも２−ケトブチレートを指向する酵素特異性を野生型タンパクに比べ低下させることが知られており（イブダー（Ibdah）Ｍ.ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５（１９９６）１６２８２〜９１）、基質であるベンズアルデヒドの高い濃度、又は生成物であるＰＡＣによって該酵素が阻害されるまで酵素感受性の低下をもたらす。他の好ましい一実施形態においては、酵素Ｍ２５０Ａが用いられる。Ｍ２５０Ａも、ＷＴ ＡＨＡＳ ＩＩを遺伝子工学的に改変した組換え融合タンパク質であって、単一の変異を有する。変異体Ｍ２５０Ａの（Ｒ）−ＰＡＣ生成速度は、野生型酵素と同じであるが、ＡＨＡＳの通常の生成物であるアセトラクテート（ＡＬ）の生成速度は野生型酵素より低く、（Ｒ）−ＰＡＣの生成効率は改善されている。これらの知見は、特定の基質に対する特異性の向上や活性の向上、基質と生成物による不活性化に対する安定性と抵抗性の改善等、酵素の特性を所望の方向へと導くように酵素を改変することができる可能性を示している。
【００４２】
他の好ましい一実施形態においては、ＷＴ ＡＨＡＳ Ｉを基に大腸菌内で過剰発現させた、組換えヘキサヒスチジン−タグ化融合タンパク質を用いる。この酵素は、ベンズアルデヒドの存在下、アセトラクテートを（Ｒ）−ＰＡＣに変換することができる。ピルベートとベンズアルデヒドが等モル量存在する場合には、アセトラクテートの生成の初期速度はＰＡＣの生成速度よりも速いにもかかわらず、（Ｒ）−ＰＡＣの収量は最大化される。
【００４３】
本発明の他の好ましい実施形態においては、グリオキシル酸、ピルビン酸、２−ケト酪酸、及び２−ケトバレリアン酸から選択されるオキソ酸をアリールアルデヒドと反応させる。アリール基は、フェニル基、ナフチル基、ベンジル基、ピリジニル基、フリル基、及びチエニル基から選択される。
【００４４】
本発明の他の好ましい実施態様においては、置換されていてもよいベンズアルデヒドとピルベートとを、ＡＨＡＳアイソザイムＩの存在下反応させる。ＷＴ ＡＨＡＳ Ｉが触媒するピルベートと３−ヒドロキシベンズアルデヒドの縮合において、本発明者らは、９９％より多い３−ヒドロキシベンズアルデヒドが消費されることを確認した。同様に、ＡＨＡＳアイソザイムＩを用いて、４−ヒドロキシベンズアルデヒド、３−メトキシベンズアルデヒド、４−メトキシベンズアルデヒド、２−メチルベンズアルデヒド、３−メチルベンズアルデヒド、４−メチルベンズアルデヒド、３−シアノベンズアルデヒド、４−シアノベンズアルデヒド、２−ホルミルピリジン、３−ホルミルピリジン、４−ホルミルピリジン、２−ホルミルナフタレン、及びクロロベンズアルデヒドから選択されるアルデヒドとピルベートとを反応させた場合は、ヒドロキシケトンへの転換率は９０％より高かった。
【００４５】
従って本発明は、ＡＨＡＳファミリーに関連する２−ヒドロキシ−３−オキソ酸シンターゼを用いて、エフェドリンに関連した薬物の前駆体等の特定のキラルα−ヒドロキシケトンを合成するプロセスを提供する。当業者に知られているように、酵素は種々の形態をとることができる。これらの形態としては、粗タンパク質や精製酵素が挙げられ、これには遊離の非安定化酵素や安定化酵素、更には固定化されたものが含まれる。酵素反応の各要素は、反応混合物に一回分量として加えてもよいが、連続的に加えてもよい。反応は、不混和性或いは部分的に混和性の非水溶媒の二相系で行なうことができる。本発明に係るバイオトランスフォーメーションの生成物は、例えば水相からジエチルエーテルに抽出する等、当業者に知られた方法によって分離でき、更には、既知の方法によって精製できる。
【００４６】
上述してきたように、本発明は次の式（Ｉ）
【００４７】
【化９】
2005514953.tif 000011
【００４８】
（式中、ＲはＨ又はＣ1-6アルキル基を示し；Ａｒはアリール基を示し；前記アリール基は芳香族系であり；前記アリール基はＮ、Ｓ、及びＯから選択される一種以上のヘテロ原子を含んでもよく；前記アリール基は縮合環を有してもよく；前記アルキル基及び前記アリール基は、Ｃ1-3アルキル基、Ｃ1-3アルコキシ基、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、ＮＨ2、ＣＮ、及びＮＲ1Ｒ2から選択される１〜３個の置換基で置換されてもよく；Ｒ1及びＲ2は、独立にＨ又はＣ1-4アルキル基であり；前記Ｃ1-3アルキル基は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、及びＯＨから選択される置換基によって更に置換されることができる）で表わされる芳香族α−ヒドロキシケトンの調製を、式（ＩＩ）
【００４９】
【化１０】
2005514953.tif 000012
【００５０】
で表わされるアルデヒドと、式（ＩＩＩ）
【００５１】
【化１１】
2005514953.tif 000013
【００５２】
（式（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）中、ＡｒとＲは式（Ｉ）の定義と同様である）で表わされる２−オキソ酸とを、ＡＨＡＳ及びタルトロン酸セミアルデヒドシンターゼから選択される２−ヒドロキシ−３オキソ酸シンターゼと、緩衝液と、ＴＰＰと、ＦＡＤと、マグネシウム陽イオン又は酵素を活性化できる他の二価金属陽イオンとを含む混合物の存在下で反応させることにより調製するバイオトランスフォーメーションプロセスに関する。
【実施例】
【００５３】
材料及び手続
材料
ピルビン酸ナトリウム、ＦＡＤ、ＴＰＰ、ベンズアルデヒド及び他の芳香族アルデヒドはシグマアルドリッチ社（Sigma-Aldrich）から入手した。他の材料は全て、分析グレードのものを用いた。
【００５４】
バイオ触媒
野生型（ＷＴ）の大腸菌由来のＡＨＡＳアイソザイムＩＩは、大腸菌ＢＬ２１／ｐＲＳＥＴｉｌｖＧＭ株において過剰発現させたＮ末端ヘキサヒスチジン−タグ化タンパク質として得た。これを変異体ＡＨＡＳ ＩＩ Ｗ４６４Ｌ及びＡＨＡＳ ＩＩ Ｍ２５０Ａに用いた。ＡＨＡＳ ＩをコードするｉｌｖＢＮ遺伝子を、大腸菌のＤＮＡからＰＣＲにより増幅し、発現ベクターｐＥＴ２８（ｃ）に挿入した。ＡＨＡＳ Ｉのヘキサヒスチジン−タグ融合タンパク質を発現するプラスミドが得られ、これを大腸菌ＢＬ２１に導入し形質転換した。細菌の成長及びクローニングされた遺伝子の発現は、バー・イラン（Bar-Ilan）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４０（２００１）１１９４６〜５４に記載されているように行った。タンパク質は、文献にある非変性プロトコル（メンデル（Mendel）ら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３２５（２００３）２７５〜８４）を用い、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースカラム（キアゲン社（Quiagen）、ドイツ、ヒルデン）で精製した。
【００５５】
酵素反応速度
反応は、数種類の方法の内の一方法により行うことができる。芳香族アルデヒドの消費を測定する直接分光分析アッセイにおいては、３０２ｎｍの波長について分光分析を行い、ベンズアルデヒドの消失速度から酵素反応の初期速度を測定した（ε＝４５４Ｍ-1ｃｍ-1）。酵素反応は、ピルビン酸ナトリウム及びベンズアルデヒド又は置換ベンズアルデヒドを含む適切な緩衝液中、１ｍＬの石英キュベットに入れてベックマン（Beckman）分光光度計（ＤＵ６４０）により３７℃で行った。反応は、ＡＨＡＳ ＩＩを添加することにより開始させた。ＡＨＡＳ ＩＩの添加は、終濃度０．２〜０．５ｍｇ／ｍＬになるように行った。ベンズアルデヒドの溶解補助のため、イソプロパノールやジメチルスルホキシド等の水混和性有機溶媒を２％まで添加することができる。
【００５６】
ベンズアルデヒドが副反応の酸化反応によって消費されるという可能性について調べるため、低酸素圧（Ｎ2で反応溶液をバブリング）下で反応を行って試験したところ、ベンズアルデヒドの消費速度に対する酸素の影響は殆どないことがわかった。
【００５７】
酵素反応におけるＰＡＣ及びアセトラクテートの生成の初期速度は、ヴェスターフェルト（Westerfeld）アッセイを多少変更した示差（differential）クレアチン−ナフトール比色分析法により同時に測定することもできる。反応は、緩衝液、基質及び補因子を含む反応液にＡＨＡＳを添加することにより開始させた。各時点で反応液から５００μＬずつ分液して５０％（ｖ／ｖ）Ｈ2ＳＯ4（５０μＬ）に添加し反応を終了させた。この試料を、３７℃で１５分間インキュベートし、アセトラクテートをアセトインに変換した。このクエンチした試料の一部（５〜１５０μＬ）を１．４ｍＬとし、０．５％クレアチン溶液（１ｍＬ）と、ナフトールを２．５ＮのＮａＯＨに溶解した５％溶液（１ｍＬ）とを加えた。３７℃で１５分間インキュベートした後、４９０ｎｍ及び５８０ｎｍの吸光度をベックマン分光光度計で測定した。ＰＡＣ及びアセトラクテート由来の各呈色生成物は異なる吸収スペクトルを示すため、両生成物の濃度を同時測定できる。
【００５８】
別の方法として、ＰＡＣとその異性体である２−ＨＰＰの生成反応の進行をＨＰＬＣ（Ｃ１８−ＴＳＫゲルカラム（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ）、溶離液：３０％アセトニトリル／０．５％酢酸（ｖ／ｖ）、ウォーターズ（Waters）の６００Ｅ溶媒輸送システム及び日本分光（Jasco）のＭＤ−２０１０ダイオードアレイ分光分析計を使用）により確認した。この場合はアセトラクテートの検出はできなかった。
【００５９】
バイオトランスフォーメーション
５〜３０ｍＭのピルビン酸ナトリウム及びベンズアルデヒド（１：１）の存在下、０．１ＭのＰＩＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ６．５）、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、６０ｍＭ ＫＣｌ、０．１ｍＭ ＴＰＰ及び０．０５ｍＭ ＦＡＤを含む混合物中で反応を行った。ベンズアルデヒドの溶解補助のためイソプロパノール（終濃度２％）を用いた。ＡＨＡＳアイソザイムＩＩを終濃度０．３ｍｇ／ｍＬとなるように添加し、反応を開始した。酵素反応終了後、反応液をエチルエーテル（１０ｍＬ）で二度抽出した。有機相をＭｇＳＯ4で乾燥し、減圧下溶媒を除去し、ＧＣ−ＭＳにより生成物の分離・分析を行った。
【００６０】
バイオトランスフォーメーション後の分析
ＭＳ検出器（ヒューレッド・パッカード社）を備えたＧＣシステムを用いて生成物を分析した。分離は、キャリアガスとしてヘリウムを用いてＲＴＸ−１ ３０ｍキャピラリカラムにより行った。インジェクタの温度は２５０℃であった。カラム温度は、５０℃で５分間保持し、その後１５℃／分で２５０℃に昇温した。保持時間は、ＰＰＤは１１．９分、ＰＡＣは１２．７分、２−ＨＰＰは１３．１分であった。これら化合物の相対量を評価するためフレームイオン化検出器（２２０℃）を用いた。生成物の同定は1Ｈ−ＮＭＲ分光により行った。
【００６１】
ＰＡＣの鏡像体純度をＧＣ（リポデックス（Lipodex）Ｅ０．２５μｍキラルカラム（０．２５ｍｍ×２５ｍ）、キャリアガス：水素）により行った。操作条件は、インジェクタ２００℃、カラム１２０℃、ＦＩＤ２２０℃であった。保持時間は、（Ｓ）−ＰＡＣが１０．２３分、（Ｒ）−ＰＡＣが１１．３４分であった。旋光性は、パーキン・エルマー３４１偏光計を用いてクロロホルム中で測定した。
【００６２】
実施例１
５ｍＭ ピルビン酸ナトリウム及び５ｍＭ ベンズアルデヒドを反応緩衝液（０．１Ｍトリシン−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、６０ｍＭ ＫＣｌ、０．１ｍＭ ＴＰＰ、及び０．０５ｍＭ ＦＡＤ）に加え、この反応液（１ｍＬ）を１ｍＬ石英キュベットに入れて３７℃の分光光度計内に設置した。３３ｍｇ酵素／ｍＬのＡＨＡＳアイソザイムＩＩ溶液（１０μＬ）を加え、反応を開始した。３０２ｎｍの吸光度の値は０．１６１ＯＤ／分の速度で直線的に減少したので、ε＝４５４Ｍ-1ｃｍ-1とすると、ベンズアルデヒド濃度は０．３６μｍｏｌ／分で減少したことになる。これに相当する活性は１．０７Ｕ／ｍｇである。
【００６３】
実施例２
基質として５ｍＭ ピルベートと５ｍＭ ３−ヒドロキシベンズアルデヒドを用いて実施例１と同様に反応速度を測定した。３４６ｎｍの吸光度の値は０．１５ＯＤ／分の速度で直線的に減少したので、ε＝４８０Ｍ-1ｃｍ-1とすると、ヒドロキシベンズアルデヒド濃度は０．３μｍｏｌ／分で減少したことになる。これに相当する活性は０．９３Ｕ／ｍｇである。
【００６４】
実施例３
上のバイオトランスフォーメーションの段落に記載した反応液（１０ｍＬ）を含む２０ｍＬフラスコ２個を３０℃で振とうした。一方のフラスコには基質を１０ｍＭの濃度で加え、他方のフラスコには３０ｍＭの濃度で加えた。ＡＨＡＳアイソザイムＩＩ（３ｍｇ）を加えて反応を開始し、１時間後、ジエチルエーテル（１０ｍＬ）を加えて反応を終了させ、抽出を行い、更に１０ｍＬを用いて再抽出を行った。抽出物を記載のように乾燥し、溶媒を完全に除去した後、ジクロロメタンに再度溶解した。この試料を、ＦＩＤを備えたＧＣ−ＭＳ及びＧＬＣにより分析した。マススペクトルでは、フェニルアセチルカルビノール（ＰＡＣ）、２−ヒドロキシプロピオフェノン（２−ＨＰＰ）及びフェニルプロパンジオン（ＰＰＤ）に相当する３種の成分が確認された。次表に、ＦＩＤにより確認された３種の生成物の相対面積を示す。
【００６５】
【表２】
2005514953.tif 000014
【００６６】
実施例４
５０ｍＬの４０ｍＭ ベンズアルデヒド及び７０ｍＭ ピルベート（それぞれ合計２．ｍｍｏｌ及び３．５ｍｍｏｌ）を０．１ＭのＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．０）、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．１ｍＭ ＴＰＰ、０．０５ｍＭ ＦＡＤ、６０ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ ＤＴＴに加え、これをフラスコに入れて３０℃で緩やかに攪拌した。ＡＨＡＳアイソザイムＩ（１６ｍｇ）を加えて反応を開始し、１．５時間後、ジエチルエーテル（５０ｍＬ）を加えて反応を終了させ、抽出を行い、更に５０ｍＬを用いて再抽出を行った。抽出物をＭｇＳＯ4で乾燥し、溶媒を完全に除去した後、試料をクロロホルムに再度溶解した。この試料を、ＦＩＤを備えたＧＣ−ＭＳ及びＧＬＣにより分析した。マススペクトルでは、フェニルアセチルカルビノール（ＰＡＣ）、２−ヒドロキシプロピオフェノン（２−ＨＰＰ）及びフェニルプロパンジオン（ＰＰＤ）に相当する３種の成分が確認された。次表に、ＦＩＤにより検出された３種の生成物のそれぞれの相対面積を示す。
【００６７】
【表３】
2005514953.tif 000015
【００６８】
ベンズアルデヒドから生成物への転化率が９９％を超えることがＨＰＬＣ及びＧＣにより分かった。精製（workup）後、最終純度９８．６％のＰＡＣが２６４ｍｇ（純ＰＡＣとして１．７４ｍｍｏｌ）得られた（ＰＡＣの理論収量２ｍｏｌに対する収率は８７％であった）。この試料を、キラルカラム及びＦＩＤを備えたＧＣにより分析し、光学活性を偏光計により調べた。旋光性は負（左）であったため、この生成物が（−）−（Ｒ）−ＰＡＣであることが確認された。この（Ｒ）−ＰＡＣの鏡像体過剰率は９７％超であった。
【００６９】
実施例５
３０ｍＭ ３−ヒドロキシベンズアルデヒドと５０ｍＭ ピルビン酸ナトリウムとを含む反応液１ｍＬを上述の実施例に記載した緩衝液に加え、室温で穏やかに攪拌した。ＡＨＡＳアイソザイムＩ（０．５ｍｇ）を加えて反応を開始し、１時間後、クロロホルム（１ｍＬ）を加えて反応を終了させ、抽出を行った後、高速遠心分離を行った。有機相を試料としてＦＩＤを備えたＧＣ−ＭＳ及びＧＬＣにより分析した。分析により、３−ヒドロキシベンズアルデヒドが生成物に完全に変換されていることがわかった。マススペクトルでは、３−ヒドロキシ−フェニルアセチルカルビノール（３−ＯＨ−ＰＡＣ）、１−（３−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシプロパン−１−オン（ＨＰＨ）及び１−（３−ヒドロキシフェニル）−プロパン−１，２−ジオン（ＨＰＨ）に相当する３種の成分が確認された。次表に、ＦＩＤにより検出された３種の生成物の相対面積を示す。
【００７０】
【表４】
2005514953.tif 000016
【００７１】
実施例６
ＡＨＡＳ ＩＩの変異体Ｗ４６４Ｌ及びＭ２５０Ａ（それぞれ単一の部位特異的変異を有する）を用いて実施例１と同様に酵素反応速度を測定した。活性はそれぞれ、１．７２Ｕ／ｍｇ及び１．６６Ｕ／ｍｇ（１Ｕ＝１分間に消費されるベンズアルデヒドが１μｍｏｌ）であった。これにより、（構造モデルに従い）第２の基質のための結合ポケットの形成に関与するアミノ酸を置換することにより、酵素の触媒特性が改善されることがわかった。
【００７２】
実施例７
３０ｍＭ ベンズアルデヒド及び３０ｍＭ ピルベートを０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．０）、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．１ｍＭ ＴＰＰ、０．０５ｍＭ ＦＡＤ、６０ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ  ＤＴＴに加え、３０℃でインキュベートした。単一の部位特異的変異を含むＡＨＡＳ ＩＩ変異体Ｍ２５０Ａ（０．３２ｍｇ／ｍＬ）を加えて反応を開始した。ＰＡＣ及びＡＬの生成初期速度を示差比色分析法により測定したところ、それぞれ２．７μｍｏｌ／分／ｍｇ及び０．２４μｍｏｌ／分／ｍｇであった。反応２時間後のＰＡＣ及びＡＬの計算最終濃度はそれぞれ１８ｍＭ及び２ｍＭであった。これにより、基質結合ポケット或いはアクセスチャネルに関与するアミノ酸の置換により、ベンズアルデヒドに対する特異性が高くなり、副生成物の生成が減少するため、酵素プロセスにおける収率が改善されることがわかった。
【００７３】
本発明を各種具体的な実施例により説明してきたが、多くの変更や変形が可能である。従って、添付の特許請求の範囲内において、記載以外の方法で本発明を実現することができることが理解される。アセトラクテートシンターゼやタルトロン酸セミアルデヒドシンターゼ等のＡＨＡＳファミリーに関連する酵素は、基質として種々のアルデヒドを許容できることが示された。また、野生型酵素を変異することにより、酵素の特性を所望のものとなるように変更できることも示された。本発明を実現するためＥＣ４．１．３．１８或いはＥＣ４．１．１．４７に関連する他の酵素を使用できることは当業者には明らかであろう。前記酵素について本発明者らが新たに見出した特性を利用すれば、既存のバイオ触媒プロセスに匹敵するプロセスの確立、種々のキラルなα−ヒドロキシケトンの製造、更に他の重要なキラルシントンへの新たな経路の提供という大きな可能性が開ける。
【国際調査報告】
2005514953.tif 000020
2005514953.tif 000021