(57)【要約】本発明は、有効成分、特に、タンパク質を送達する粒子のコロイド懸濁液に関する。前記粒子は、中性疎水性αヒドロキシカルボン酸ポリマーブロックと少なくとも一部がイオン化されているペプチドα鎖を有する直鎖親水性ポリアミノ酸ブロックとで構成されるジブロックコポリマーに基づいている。界面活性剤の不在下で自発的に生成し得る前記αヒドロキシカルボン酸ポリマー/直鎖ポリアミノ酸送達粒子は安定している。前記送達粒子はコロイド懸濁液中、非溶解状態で少なくとも1種の有効成分を結合し、その遅延放出または持続放出を可能にする。本発明はまた、それから送達粒子が誘導される粉末固体および該固体と前記送達粒子のコロイド懸濁液の調製に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
特に、有効成分(AP)を送達するために用いられ得るサブミクロンサイズの粒子のコロイド懸濁液であって、これらの粒子が、
α-ペプチド結合型親水性直鎖ポリアミノ酸（PAA）の少なくとも１つのブロック(このPAAブロックを構成する親水性アミノ酸AAIは相互に同一であるかまたは異なっている)、
およびα-ヒドロキシカルボン酸ポリマー(HCAP)、好ましくは、乳酸ポリマー(LAP)またはグリコール酸ポリマー(GAP)で構成されている少なくとも１つの疎水性ポリマーの少なくとも１つのブロック
を含む両親媒性コポリマーに基づく個別化された超分子配置をとっており、
両親媒性コポリマーとAAIに対する溶媒ではない液体とを一緒にすることにより、界面活性剤の不在下で自発的に生成し得ること、
界面活性剤の不在下であっても安定していること、
コポリマーのAAIの少なくとも一部がイオン化された形態であること
粒子が懸濁液中、非溶解状態で少なくとも１つのAPと会合し、特にin vivoで持続および／または遅延した仕方でそれを放出することが可能であること
を特徴とするコロイド懸濁液。
【請求項２】
両親媒性コポリマーを有機溶媒に溶かし、この溶液と水性液とを一緒にすることにより得られることを特徴とする、請求項１に記載の懸濁液。
【請求項３】
AAIが親水性アミノ酸AAIであること、
HCA/AAI比が0.1より大きいこと、
HCAPブロックの絶対長がモノマー2個より大きく、好ましくはモノマー10個より大きく、より好ましくはモノマー20〜60個の間であること
を特徴とする、請求項１または２に記載の懸濁液。
【請求項４】
AAIに基づくPAAブロックがそれを少なくとも5個、好ましくは、少なくとも20個、および一層より好ましくは、少なくとも30〜100個含んでいることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の懸濁液。
【請求項５】
粒子がHCAP/AAI「ジブロック」であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の懸濁液。
【請求項６】
AAIがイオン化可能な側鎖を有するアミノ酸から選択され、カルボキシル型および／または塩の形態の天然アミノ酸GluおよびAspが特に好ましいことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の懸濁液。
【請求項７】
水性であり、かつ安定であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の懸濁液。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の懸濁液から得られることを特徴とする、微粉砕固体。
【請求項９】
請求項８に記載の微粉砕固体を調製する方法であって、
1) 少なくとも１つのHCAP(好ましくは、LAPまたはGAP)ブロックポリマーを使用するかまたはα-ヒドロキシカルボン酸、好ましくは、乳酸またはグリコール酸のモノマーの重合により調製すること(このHCAPブロックは、好ましくは、BOC-エタノールアミンおよびBOC-アミノプロパノール(BOC=ButOxyCarbonyl)からなる群から選択される少なくとも１つの保護反応性基により(有利にはその末端の少なくとも一方で)官能基化されている)、
2) 工程1)のHCAPポリマーブロックを脱保護すること、
3) AAI親水性アミノ酸 N-カルボキシアミノ酸無水物(NCA)で構成されているモノマーおよび／またはAAI親水性アミノ酸前駆体N-カルボキシアミノ酸無水物(NCA)で構成されているモノマー（保護基を有する）の共重合を、好ましくは、N-メチルピロリドン(NMP)、ジメチルホルムアミド(DMF)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ジメチルアセトアミド(DMAc)、ピロリドンおよびジクロロメタンからなる群から選択される少なくとも1種の有機溶媒の存在下で実施すること(より具体的には後者が好ましい)、
4) 工程2)の脱保護したHCAPポリマーブロックをポリAAIブロック重合媒質に、重合前、重合中または重合後に添加すること、
5) 所望により、AAI 親水性アミノ酸前駆体を１以上のポリAAIブロックを得るために脱保護すること、
6) 上記工程の終了時に得られたHCAP-ポリAAIブロックコポリマーを沈殿させること、
7) 工程6)で得られたHCAP-ポリAAIブロックコポリマー沈殿物を溶かし、この溶液を少なくとも1種の、HCAP-ポリAAIブロックコポリマーに対する非溶媒を含む液体、好ましくは、水(この液体はHCAP-ポリAAIブロックコポリマーのAAIの少なくとも一部をイオン化するように選択されたpHを有する)と一緒にすること、
8) 所望により、少なくとも1種の親水性有効成分APを粒子と会合すること、
9) 所望により、工程7)の懸濁液を精製すること、
10) 所望により、工程7)の懸濁液を濃縮すること、
11) 粒子を含む微粉砕固体を集めるために液体媒質を除去すること
を特徴とする、方法。
【請求項１０】
官能基化したHCAPブロックを重合前および／または重合の開始時に投入する(好ましくは、20〜120℃の温度、標準気圧で行う)ことを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
AAIに対する溶媒ではない水性媒質を請求項８に記載の微粉砕固体および／または請求項９または１０に記載の方法により得られる微粉砕固体と一緒にすることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の懸濁液を調製する方法。
【請求項１２】
請求項９に記載の方法の工程1〜7を含み、および、所望により、8および／または9および／または10を含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の懸濁液を調製する方法。
【請求項１３】
親水性APと粒子の会合を、該親水性APを含む液相と粒子のコロイド懸濁液とを一緒にすることにより行うことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の懸濁液を調製する方法。
【請求項１４】
親水性APと粒子の会合を、固体状態の該APと粒子のコロイド懸濁液とを一緒にすることにより行うことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の懸濁液を調製する方法。
【請求項１５】
請求項８に記載の微粉砕固体および／または請求項９に記載の方法により得られる微粉砕固体と親水性APを含む液相とを一緒にすることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の懸濁液を調製する方法。
【請求項１６】
請求項８に記載の微粉砕固体および／または請求項９に記載の方法により得られる微粉砕固体と固体形態の親水性APとを一緒にすること、およびこの固体混合物を液相、好ましくは、水溶液中に分散させることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の懸濁液を調製する方法。
【請求項１７】
HCAP-ポリAAI、好ましくは、ポリ乳酸-ポリAAIまたはポリグリコール酸-ポリAAIのコポリマーからなることを特徴とする、請求項９または１０に記載の方法の中間生成物。
【請求項１８】
好ましくは、
○ワクチン、
○タンパク質および／またはペプチド(それらのうち、最も好ましくは、ヘモグロビン、シトクロム、アルブミン、インターフェロン、サイトカイン、抗原、抗体、エリスロポエチン、インスリン、成長ホルモン、第VIIIおよびIX因子、インターロイキンまたはその混合物、造血刺激因子が選択される)、
○多糖類(さらに詳しくは、ヘパリンが選択される)、
○核酸、および好ましくは、RNAまたはDNAオリゴヌクレオチド、
○種々の抗癌化学療法種に属する非ペプチドタンパク質分子、特に、アントラサイクリンおよびタキソイド、
○およびその混合物
から選択される少なくとも1種の親水性有効成分を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の懸濁液および／または請求項９〜１６のいずれか一項に記載の方法により得られる懸濁液および／または請求項８に記載の微粉砕固体。
【請求項１９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の懸濁液および／または請求項９〜１６のいずれか一項に記載の方法により得られる懸濁液および／または請求項８に記載の微粉砕固体を含むことを特徴とする、医薬、栄養、植物保護または化粧専門品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有効成分(AP)の投与に使用できる送達粒子(DP)の分野に関する。この有効成分は、好ましくは、経口、経鼻、膣、眼球、皮下、静脈内、筋肉内、皮内、腹膜内、脳内、非経口経路などを経由して動物またはヒトに投与する医薬品または栄養物である。化学的性質の点から見て、本発明に特に関係するAPは、（限定されるものではないが）親水性または両親媒性の、例えば、タンパク質、糖タンパク質、ペプチド、多糖類、リポ多糖類、ポリヌクレオチドおよび有機分子である。
【０００２】
本発明は、さらに詳しく言えば、有利には、疎水性ポリマーブロックおよびポリGluタイプの親水性ポリアミノ酸ブロックに基づく、サブミクロンのタイプの送達粒子のコロイド懸濁液に関する。
【０００３】
本発明は裸の粒子それ自体、およびAPを保持した粒子からなるAP送達系の両方を対象としている。
【０００４】
本発明はまた、これらのDPを含む微粉砕固体にも関する。本発明はまた、APを保持した粒子の該コロイド懸濁液を調製するための方法にも関する。
【背景技術】
【０００５】
DPへのAPの封入の目的は、特に、作用の持続時間を変更することおよび／または治療部位へそれらを運搬することおよび／または該APのバイオアベイラビリティーを向上させることにある。多数の封入技術がすでに提案されている。こうした技術は、第１に、治療作用部位へのAPの輸送を可能にし、一方で、生体攻撃(加水分解、酵素による消化など)から保護し、第２に、作用部位でのAPの放出を制御して、生体が利用可能な量を所望のレベルに維持することを目的としている。こうした生体内の輸送および滞留の変化に関係するAPは、例えば、タンパク質であるが、他の生成物、合成または天然起源の有機分子でもあり得る。M.J. Humphreyによる総説(S. DavisおよびL. Illum編、「ペプチド薬剤のための送達系(Delivery system for peptide drugs)」、Plenum Press, N.Y. 1986)は、APのバイオアベイラビリティーの改善に関する問題ならびに送達および放出制御系の利点を記述している。
【０００６】
DPを形成するために考えられ得る全ての材料のうち、ポリマーは、その固有の特性からますます使用されるようになっている。DPについて得ることが所望される仕様に関しては、それらは特に要求が厳しく、特に以下の仕様を含む。
【０００７】
1  第1の望ましい仕様は、DPが有機溶媒および／または界面活性剤の助けを借りなくても安定した水性懸濁液を形成し得ることが有利であることであろう。
【０００８】
2  APを変性させない方法によりDPおよびDP-AP系を得ることができることがそれにとって望ましい。
【０００９】
3  もう1つの望ましい仕様は、DPを構成するポリマーが生体適合性であり、(排泄により)排除されることが可能であり、および／または生分解性であり、さらに好ましくは、それが生物に対して毒性を示さない生成物に代謝されることであろう。さらに、生物における生分解が十分に短い時間であるのがよい。
【００１０】
4  DPの大きさが液体中の懸濁状態で孔径が0.2μm以下であるフィルターにより滅菌濾過することができる十分に小さいものであることもまた望ましいであろう。
【００１１】
5  DPは、有利には、APの放出速度を制御可能であるのがよい。
【００１２】
6  もう1つの重要な仕様は、DP-AP系が優れた注射可能な医薬品を構成し得ることであろう。注射、例えば、静脈、皮下または筋肉注射により投与するためのこの向上した性質、「注射可能性(injectability)」は、
(i)(所定の治療投与量に対しての)注射量の減少、
(ii)粘度の低さ
を特徴とする。  
治療投与量のAPを最少量のDPと併用する場合にこれらの2つの性質が満たされる。言い換えれば、DPは高いAP保持率を有する必要がある。
【００１３】
7  注射用製剤におけるDPに特有のコストは低いのがよく、ここでもまた、DPは高いAP保持率を有するのがよい。要するに、DPに求められる重要な仕様は、大きさが小さいことおよび保持率が高いことである。
【００１４】
8  DPを構成するポリマーが免疫応答を誘発しないことも有利である。
【００１５】
9  親水性および両親媒性APのファミリー、特に、タンパク質に対しては、会合および放出の容易さの点から、また、性質を変性させないという点からAPのこのファミリーに適合するDPを有することがよいと思われる。
【００１６】
上述の従前の技術上の提案では、この一連の仕様を満足させようと試みている。例示として、従前の提案(a)〜(j)を記述する:
(a)特許US-A-5 286 495は、反対の電荷を有する物質、すなわち、アルギン酸塩(負に荷電)およびポリリジン(正に荷電)を用いて水相中のタンパク質を噴霧することにより封入する方法に関する。この製造方法により大きさが35μmよりも大きな粒子を製造することができる。
【００１７】
(b)さらに、APを保持させた微粒子を製造するためにエマルション技術が一般的に使用される。例えば、特許出願WO 91/06286、WO 91/06287およびWO 89/08449では、例えば、ポリ乳酸タイプのポリマーを可溶化するために有機溶媒を使用するようなエマルション技術が開示されている。しかしながら、溶媒が、特に、ペプチドまたはポリペプチドAPを変性させる可能性があることが判明した。
【００１８】
(c)X. FoxおよびK. Doseにより「分子進化と生命の起源(Molecular Evolution and the origin of Life)」、Marcel Dekker Inc.刊行(1977)において、早くも1970年代には記載されたプロテノイドと呼ばれる生体適合性DPも知られている。したがって、特許出願WO 88/01213では、溶解性がpHに依存する合成ポリペプチドの混合物に基づく系を提案している。この発明にしたがってマトリックス微粒子を得るためには、ポリペプチドの混合物を可溶化した後、pHを変化させてプロテノイド粒子を沈殿させる。この沈殿をAPの存在下で行うと、このAPが粒子内に封入される。
【００１９】
(d)注意すべきものとして、本発明の特徴を示すAPの送達の分野とは異なる分野に属する成果である米国特許第4 351 337号も記述する。この特許では、体内の極めて正確な部位に付着し、そこに位置づけられる大量のインプラントが開示されている。これらのインプラントは、アミノ酸のN-カルボキシ無水物(NCA)モノマーの共重合により得られるコポリ(アミノ酸)-例えば、ポリ(グルタミン酸-ロイシン)またはポリ(グルタミン酸ベンジル-ロイシン)のコポリマーからなる微視的大きさ(160μmおよび2000μmに等しい長さを有する)の中空管またはカプセルである。APはポリマーとAPの混合物から溶媒を蒸発させる技術によって封入される。米国特許第4 450 150号は、上記の米国特許第4 351 337号と同じファミリーに属し、本質的に同じ目的を有する。構成PAAはポリ(グルタミン酸-グルタミン酸エチル)である。
【００２０】
(e)PCT特許出願WO 97/02810では、少なくとも一部が結晶性である生分解性ポリマー(乳酸ポリマー)の複数の層状粒子と該粒子上に吸着されたAPを含んでなる有効成分を制御放出する組成物を開示している。この場合、有効成分の放出は、脱着によって行われる。
【００２１】
(f)PCT特許出願WO 96/29991の主題は、AP(特に、インスリンなどの親水性APを挙げている)の送達に有用なポリアミノ酸粒子である。これらの粒子の大きさは10〜500nmである。WO 96/29991による粒子は、PAAを水溶液と一緒にすることによって自発的に生成する。PAAは、疎水性中性アミノ酸AAOモノマーと親水性のイオン化可能なAAIモノマーとを含んでなる。
【００２２】
これらの粒子は、インスリンを、PAAの質量に対してせいぜい6.5乾燥重量％のインスリン量まで保持することができる。保持率Taは、後に記載する手順Maにより測定される。
【００２３】
(g)特許出願EP 0 583 955(US-B 5 449 513)は、疎水性APを物理的に取り込むことができる高分子ミセルを開示している。これらのミセルはブロックコポリマー、PEG/ポリAANO(AANO=Amino Acide Neutre hydrophObe=疎水性中性アミノ酸)からなる。AANOは、Leu、Val、Phe、Bz-O-Glu、Bz-O-Aspであってよく、後のほうが好ましい。これらのPEG/ポリAANOミセルに取り込まれる疎水性有効成分APは、例えば、アドリアマイシン、インドメタシン、ダウノマイシン、メトトレキサート、マイトマイシンである。
【００２４】
(h)米国特許第5 514 380号は、乳酸ポリマーブロックとポリ(エチレンオキシド)(PEG)ブロックとを含んでなるコポリマー（医薬品の放出用マトリックスとして有用である）を開示している。このコポリマーから調製される微粒子については何も触れていない。
【００２５】
(i)さらに、有効成分を持続放出するためのPEG/乳酸ポリマー(LAP)コポリマーに基づく粒子を記述する数多くの刊行物が知られている。特に、
-Biomaterials 17(1996) 1575-1581頁, Vittazら、
-Polym. Adv. Technol. 10, 647-654頁 (1999), Kinnら
が挙げられる。
【００２６】
コポリ(PEG)(LAP)粒子の場合では、APおよびコポリ(PEG)(LAP)を有機溶媒で同時溶解することにより、APをLAPコア内に物理的に封入する。このことから、タンパク質で構成されているAPは、APが変性する危険性が大きいことから、これらのコポリ(PEG)(LAP)粒子に封入することは難しいと考えられる。
【００２７】
(j)論文、Biomaterials 19(1998) 1501-1505頁/K.E. Gonsalvesらは、ポリ(L-乳酸)(Asp)コポリマーの微粒子(粒径=200nm)およびポリ(L-乳酸)(Ser)コポリマーの微粒子(粒径=200nm)について記述している。これらのコポリ(LAP)(PAA)粒子(PAA=ポリアミノ酸)は、ポリビニルアルコール(PVA)の安定化(界面活性剤)水溶液とコポリ(LAP)(PAA)有機溶液(CH2Cl2)とを機械攪拌することによりエマルション形態で得られる。これらの中空球状粒子は外層を形成するPVA界面活性剤により安定し、内層はコポリ(LAP)(PAA)からなる。これらの粒子が存在するためには、安定化PVA界面活性剤を使用する必要がある。PAAの少なくとも一部がイオン化していることについては疑いの余地がない。さらに、著者はこれらのポリ(LAP)(PAA)粒子を医薬品の制御放出に利用できると見込んでいる。この判断に対しての技術的な試験による裏づけはない。この論文では、これらの微粒子を含んでなる安定したコロイド懸濁液について、さらに、コロイド懸濁液中、非溶解形態で少なくとも１つの有効成分と会合する微粒子の能力についても開示されていない。
【００２８】
それゆえ、上述の従前の技術上の提案は、上記の仕様のリストを完全に満たすものではなく、特に、粒子と有効成分(特に、タンパク質)との会合およびこれらのAP保持粒子が送達により該APを変性させることなくin vivoにおいてそれらを放出させる能力に関して満たしていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２９】
この明白な事実から、本質的な目的は、界面活性剤の助けを借りずに、(生理学的pHにおいて)安定でAP(特に、タンパク質などの感受性AP)の送達に好適なDPの水性懸濁液を自発的に生成する新規なDPを提供することを可能とすることである。
【００３０】
本発明のもう1つの本質的な目的は、安定したコロイド水性懸濁液または粉末形態として、ポリ(アミノ酸)(PAA)に基づく新規なDPを提供することであり、新規なDPは上記仕様リストの仕様1〜9をできるだけ満たさなければならない。
【００３１】
本発明のもう1つの本質的な目的は、特に、APの保持率の点およびAPの放出速度の制御の点でその特性が完全に制御されるDPの新規な懸濁液を提供することである。
【００３２】
本発明のもう1つの本質的な目的は、注射可能な医薬用懸濁液を提供することである。このような懸濁液に求められる仕様は、注射量が少ないことと粘度が低いことである。注射投与量当たりのコロイド粒子の質量は、治療効力を損なわないようにこれらの粒子により運ばれる有効成分APの量を限定することなく、可能な限り小さいことが重要である。
【００３３】
本発明のもう1つの本質的な目的は、上記仕様を満たし、かつ、投与、例えば、ヒトまたは動物への経口投与に好適な適切な製剤を構成する有効成分を送達する粒子を含む水性コロイド懸濁液または微粉砕固体を提供することである。
【００３４】
本発明のもう1つの本質的な目的は、滅菌するために0.2μmフィルターで濾過し得る有効成分を送達する粒子を含むコロイド懸濁液を提供することである。
【００３５】
本発明のもう1つの本質的な目的は、特に、有効成分(特に、タンパク質、例えば、インスリン、IFN、IL-2、第VIII因子、EPOなど)のベクターとして有用である疎水性PAA/親水性ポリマーブロックの粒子(乾燥粒子または液体中懸濁状態の粒子)を製造する方法を提案することであり、この方法は有効成分を変性させずに使用することがより簡単でなければならず、さらに、得られる粒子の平均粒径の精密な制御が常に可能でなければならない。
【００３６】
本発明のもう1つの本質的な目的は、特に、経口、経鼻、膣、眼球、皮下、静脈内、筋肉内、皮内、腹膜内、脳内または非経口投与に向けた医薬品(例えば、ワクチン)を製造するための水性懸濁液または固体形態での上記粒子の使用であり、これらの医薬品の親水性有効成分は、特に、タンパク質、糖タンパク質、ペプチド、多糖類、リポ多糖類、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドであり得る。
【００３７】
本発明のもう1つの目的は、製造が容易で経済的であり、加えて生体適合性を有し、きわめて高いレベルのバイオアベイラビリティーのAPを提供することが可能である、有効成分が持続放出されるタイプの医薬品を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００３８】
(特に)製品に関する目的は、まず第1に、特に、APを送達するために用いられ得るサブミクロンサイズの粒子のコロイド懸濁液であって、これらの粒子は、
α-ペプチド結合型親水性直鎖ポリアミノ酸（PAA）の少なくとも１つのブロック(このPAAブロックを構成するそれぞれの親水性アミノ酸AAIは相互に同一であるかまたは異なっている)、
およびα-ヒドロキシカルボン酸ポリマー(HCAP)、好ましくは、乳酸ポリマー(LAP)またはグリコール酸ポリマー(GAP)で構成されている少なくとも１つの疎水性ポリマーの少なくとも１つのブロック
を含む両親媒性コポリマーに基づく個別化された超分子配置をとっており、
両親媒性コポリマーとAAIに対する溶媒ではない液体とを一緒にすることにより、界面活性剤の不在下で自発的に生成し得ること、
界面活性剤の不在下であっても安定していること、
コポリマーのAAIの少なくとも一部がイオン化された形態であること
粒子が懸濁液中、非溶解状態で少なくとも１つのAPと結合し、特にin vivoで持続および／または遅延した仕方でそれを放出することが可能であること
を特徴とするコロイド懸濁液に関する本発明により達成される。
【００３９】
生理学的pHにおいて安定しているコロイド水性懸濁液または微粉砕固体状態のこれらの新規な送達粒子DPの発明の基礎の1つは、(疎水性α-ヒドロキシカルボン酸ポリマー)(親水性ポリアミノ酸)ブロックコポリマーを独自に選択したことにあり、このブロックコポリマーを選択したことによって、どんなpHにも適する界面活性剤の不在下で、どんな生理学的pHにおいても安定しているコロイド懸濁液(好ましくは、水性)を形成するサブミクロンサイズの粒子を得ることが可能になる。
【００４０】
これらの(HCAP)(PAA)微粒子が懸濁状態でそれらのAAIの少なくとも一部がイオン化された形態であるという事実もまた、画期的な特徴をなす。
【００４１】
これらのサブミクロンサイズの粒子のもう1つの注目すべき利点は、コロイド懸濁液中、非溶解状態で、それゆえ、攻撃的な有機溶媒または界面活性剤の不在下でAPのそれらの表面への吸着を可能にするそれらの能力にある。こうした会合は、溶解状態のAPの微粒子コアへの物理的封入方法とは区別される。このような封入条件は、特定のAPを変性させる。本発明の微粒子に関する場合ではこのようなことはない。
【００４２】
さらに、ポリ(AAI)/(ポリラクチドおよび／またはグリコリドおよび／またはカプロラクトン)両親媒性ブロックコポリマーに基づく粒子がin vivoでAP、特に、タンパク質と会合し、それらを放出することが可能であることが、特に驚くべきことであり、予想できないことである。
【００４３】
HCAP/ポリAAIブロックコポリマーの構造およびAAIアミノ酸の性質は、
ポリマー鎖が自発的に構造化して大きさの小さい粒子(DP)の形をとり、
これらの粒子が水中および生理的媒質(pH=6〜8)中で安定したコロイド懸濁液を形成し、
DPが非溶解のコロイド状態で水性媒質中、APを変性させない自然な機構によりタンパク質または他のAPと会合し、
DPが生理的媒質で、さらに詳しくは、in vivoでAPを放出し、放出速度がDPの前駆体であるHCAP/ポリAAIコポリマーの性質に依存する
ように選択される。
【００４４】
このように、コポリマーの個々の構造を調整することにより、速度および定量的観点からAPの会合および放出の現象を制御することができる。
【００４５】
好ましくは、懸濁液が両親媒性コポリマーを有機溶媒で溶かし、この溶媒と水性液とを一緒にすることにより得られることを特徴とする。
【００４６】
粒子を構成するコポリマーをもう少し定義するために、それらがブロックからなるものであることを示してもよい。
【００４７】
よって、本発明のDPの好ましい具体例によれば、
AAIは親水性アミノ酸AAIであり、
HCA/AAI比は0.1より大きく、
HCAPブロックの絶対長はモノマー2個より大きく、好ましくはモノマー10個より大きく、より好ましくはモノマー20〜100個である。
【００４８】
本願では、「HCA」とは、HCAPの構成モノマーを意味するものである。
【００４９】
有利には、AAIに基づくPAAブロックがそのAAIを少なくとも5個、好ましくは、少なくとも20個、および一層より好ましくは、少なくとも30〜100個含んでいる。
【００５０】
一層より好ましくは、粒子がHCAP/AAI「ジブロック」である。
【００５１】
AAIはイオン化可能な側鎖を有するアミノ酸から選択され、カルボキシル基を有する形態および／または塩の形態の天然アミノ酸GluおよびAspが特に好ましい。
【００５２】
粒子を構成するPAAブロックは、例えば、30〜600、好ましくは、50〜200、および一層より好ましくは、60〜150の重合度dpを有する。
【００５３】
本発明は、以上で定義した裸の粒子の懸濁液を対象とするだけでなく、少なくとも１つの有効成分APを含む粒子の懸濁液もまた対象としており、好ましくは、本発明の懸濁液が水性であり、かつ安定である。これらの粒子は、APを保持しているか否かを問わず、液体、好ましくは、水性液に分散した形態(懸濁液)をとっていることが有利であるが、以上で定義したようなDP懸濁液から得られる微粉砕固体状態をとっていてもよい。
【００５４】
したがって、本発明は、DPのコロイド懸濁液(好ましくは、水性懸濁液)のほか、本発明の懸濁液から得られるDPを含む微粉砕固体にも関する。
【００５５】
本発明のもう1つの本質的な目的は、(上記のような)選択した粒子をコロイド懸濁液および微粉砕固体として製造することに関する。考えられる製造方法は、本質的には前駆体HCAP/ポリAAIコポリマーを合成することとそれらを構造化した粒子へと変換することからなる。
【００５６】
さらに詳しくは、まず第1に、以上で記述した、特に、有効成分(Ap)を送達するために用いられ得るサブミクロンサイズの粒子で構成されている微粉砕固体の製造方法に関する。ここで、これらの粒子は、
以下のものを含む両親媒性コポリマーに基づいており、
α-ペプチドを有する直鎖親水性ポリアミノ酸（PAA）の少なくとも１つのブロック(このPAAブロックを構成するそれぞれの親水性アミノ酸AAIは相互に同一であるかまたは異なっている)、
およびα-ヒドロキシカルボン酸ポリマー(HCAP)-好ましくは、乳酸ポリマー(LAP)またはグリコール酸ポリマー(GAP)-に基づいている疎水性ポリマーの少なくとも１つのブロック
界面活性剤の不在下でさえもコロイド懸濁液を生成し得、
コロイド懸濁液中、非溶解状態で少なくとも１つのAPと会合し、特にin vivoで持続および／または遅延した仕方でそれを放出することが可能である、
個別化された超分子配置をとっている。
【００５７】
この方法は、
1) 少なくとも１つのHCAP(好ましくは、LAPまたはGAP)ブロックポリマーを使用するかまたはα-ヒドロキシカルボン酸、好ましくは、乳酸またはグリコール酸のモノマーの重合により調製すること(このHCAPブロックには、好ましくは、BOC-エタノールアミンおよびBOC-アミノプロパノール(BOC=ButOxyCarbonyl)からなる群から選択される少なくとも１つの保護反応性基により(有利にはその末端の少なくとも一方で)官能基化されている)、
2) 工程1)のHCAPポリマーブロックを脱保護すること、
3) AAI親水性アミノ酸 N-カルボキシアミノ酸無水物(NCA)で構成されているモノマーおよび／またはAAI親水性アミノ酸前駆体N-カルボキシアミノ酸無水物(NCA)で構成されているモノマー（保護基を有する）の共重合を、好ましくは、N-メチルピロリドン(NMP)、ジメチルホルムアミド(DMF)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ジメチルアセトアミド(DMAc)、ピロリドンおよびジクロロメタンからなる群から選択される少なくとも1種の有機溶媒の存在下で実施すること(より具体的には後者が好ましい)、
4) 工程2)の脱保護したHCAPポリマーブロックをポリAAIブロック重合媒質に、重合前、重合中または重合後に添加すること、
5) 所望により、AAI 親水性アミノ酸前駆体を１以上のポリAAIブロックを得るために脱保護すること、
6) 上記工程の終了時に得られたHCAP-ポリAAIブロックコポリマーを沈殿させること、
7) 工程6)で得られたHCAP-ポリAAIブロックコポリマー沈殿物を溶かし、この溶液を少なくとも1種の、HCAP-ポリAAIブロックコポリマーに対する非溶媒を含む液体、好ましくは、水(この液体はHCAP-ポリAAIブロックコポリマーのAAIの少なくとも一部をイオン化するように選択されたpHを有する)と一緒にすること、
8) 所望により、少なくとも1種の親水性有効成分APを粒子と会合すること、
9) 所望により、工程7)の懸濁液を精製すること、
10) 所望により、工程7)の懸濁液を濃縮すること、
11) 粒子を含む微粉砕固体を集めるために液体媒質を除去すること
を特徴とする。
【００５８】
工程1)のHCAPはそれ自体公知の方法、ラクチド、グリコリドまたはカプロラクトンの重合により得るか、あるいは、市販の製品(例えば、ポリラクチド、ポリラクチド/グリコリド、ポリカプロラクトン)であることが有利である。
【００５９】
これらのHCAPを得るための方法については、例えば、次の特許：US 4 835 293、US 5 023 349およびFR 2 692 263に記述されている。
【００６０】
工程2)の脱保護は、それ自体公知の方法、例えば、酸加水分解(例えば、トリフルオロ酢酸)により実施される。
【００６１】
この方法の第3の工程は、例えば、論文"Biopolymers, 15, 1869(1976)"およびH.R. Kricheldorfによる書籍「アミノ酸-N-カルボキシ無水物および関連するヘテロ環化合物(-Aminoacid-N-carboxy Anhydride and Related Heterocycles)」、Springer Verlag(1987)に記載されているN-カルボキシ(アミノ酸)無水物(NCA)重合の公知技術に基づいている。
【００６２】
好ましくは、官能基を導入したHCAPブロックを工程3)の重合前および／または重合の開始時に投入する(好ましくは、20〜120℃の温度、標準気圧で行う)。
【００６３】
この工程3)は、非プロトン性溶媒(好ましくは、1,4-ジオキサン)および／またはプロトン性溶媒(好ましくは、ピロリドン)および／または水および／またはアルコール(メタノールが特に好ましい)から選択される少なくとも1種の補助溶媒の存在下で実施することが有利である。
【００６４】
一層より好ましくは、NCA-AAIは、O-アルキル化またはO-アリール化グルタミン酸またはアスパラギン酸のNCA、例えば、NCA-Glu-O-Me、NCA-Glu-O-EtまたはNCA-Glu-O-Bz(Me=メチル/Et=エチル/Bz=ベンジル)である。
【００６５】
他の試験パラメーター、例えば、
・合成中の、有機溶媒(好ましくは、ジクロロメタン)中のNCAおよび／またはHCAPブロックポリマーの濃度、
・および／または考えられる補助溶媒の濃度または性質、
・反応混合物の温度、
・親水性ポリマーの添加のモード、
・減圧の使用、
・反応時間など、
を、当業者に周知の所望の効果に合せて調整する。
【００６６】
1つの変形(この方法を工程5a)終了時に中断し、工程5)終了後から続けて行う)によれば、得られたHCAP-ポリAAIコポリマーを、好ましくは、水中で沈殿させ、この沈殿物を集める。この変形は、HCAP-ポリAAIコポリマーが安定した中間生成物を成す沈殿として単離される粒子のバッチ式製造に対応する。この沈殿物を、例えば、濾過し、洗浄し、乾燥してもよい。
【００６７】
工程8)において１種以上のAPと粒子との会合を行うため、本発明による複数の方法を使用することができる。
【００６８】
これらの方法についての非限定的な例を以下に記述する。
【００６９】
第1の方法によれば、APと粒子との会合を、APを含む(水性または非水性)液相と粒子のコロイド懸濁液とを一緒にすることにより行う。
【００７０】
第2の方法によれば、APと粒子との会合を、固体状態のAPと粒子のコロイド懸濁液とを一緒にすることにより行う。固体APは、例えば、凍結乾燥物、沈殿物、粉末などの形態であってよい。
【００７１】
第3の方法によれば、生成物として、また、それを得るための特性により以上に記載した微粉砕固体(ポリラクチド/ポリAAI)とAPを含む(水性または非水性)液相とを一緒にする。
【００７２】
第4の方法によれば、生成物として、また、それを得るための特性により以上に記載した微粉砕固体と固体形態のAPとを一緒にする。次いで、この固体混合物を液相、好ましくは、水溶液中に分散させる。
【００７３】
これら全ての方法において、使用するAPは純粋な形態でも、予め配合した形態でもよい。
【００７４】
任意選択の工程9)により、不純物(塩)および溶媒を、いずれかの好適な物理的分離処理、例えば、ダイアフィルトレーション(透析)、濾過、pHの変更、クロマトグラフィーなどにより除去する。
【００７５】
これは、例えば、蒸留または他の好適な物理的手段：限外濾過、遠心分離により濃縮され得る[工程10)]構造化粒子の懸濁液(好ましくは、水性懸濁液)を与える。
【００７６】
工程11)において粒子を液体懸濁媒質から分離するために、水相を、所望により、例えば、乾燥(例えば、オーブンでの乾燥)、凍結乾燥または他の好適な物理的手段：限外濾過、遠心分離により除去する。この工程11)の終了時に白色の微粉砕固体が回収される。
【００７７】
注目すべきは、上記方法の工程1)、2)、3)、4)、5)、6)、7)および、所望により、8)の実施が、高いAP保持率を有するサブミクロンサイズの粒子のコロイド懸濁液の製造に対応することである。
【００７８】
コロイド懸濁液のこの製造中、工程6)-のポリラクチドおよび／またはポリグリコリドおよび／またはポリカプロラクトン-ポリ(AAI)両親媒性コポリマーは、HCAPの少なくとも一部が溶解し、AANOの少なくとも一部が不溶である水性媒質中に置かれる。HCAP/ポリAAIコポリマーは、この水性媒質中ナノ粒子として存在する。
【００７９】
本発明のDP懸濁液を製造するための代替法は、生成物として、また、それを得るための方法により以上に記載した微粉砕固体とAAIに対する溶媒ではない水性媒質とを一緒にすることにある。
【００８０】
ナノメートルサイズの粒子が得られれば、懸濁液を滅菌フィルターで濾過し得、そうすることで、注射可能な滅菌医薬用液体を容易にかつより低いコストで得ることが可能になる。本発明により、粒子の懸濁液に対して滅菌濾過することが可能であるという事実は、大きな利益である。
【００８１】
本発明はまた、上記方法の新規な中間生成物であって、粒子前駆体であるHCAP-ポリAAIコポリマーからなることを特徴とする中間生成物も対象とする。
【００８２】
その態様のもう１つによれば、本発明は、以上で定義し、および／または以上で提示した方法により得られる懸濁液および／または微粉砕固体に関し、この懸濁液およびこの固体は、好ましくは、
ワクチン、
タンパク質および／またはペプチド(それらのうち、最も好ましくは、ヘモグロビン、シトクロム、アルブミン、インターフェロン、サイトカイン、抗原、抗体、エリスロポエチン、インスリン、成長ホルモン、第VIIIおよびIX因子、インターロイキンまたはその混合物、造血刺激因子が選択される)、
多糖類(さらに詳しくは、ヘパリンが選択される)、
核酸、および好ましくは、RNAまたはDNAオリゴヌクレオチド、
種々の抗癌化学療法種に属する非ペプチドタンパク質分子、特に、アントラサイクリンおよびタキソイド、
およびその混合物
から選択される少なくとも1種の親水性有効成分を含む。
【００８３】
最終的に、本発明は、親水性APを保持した、以上で定義した懸濁液または微粉砕固体を含むことを特徴とする、医薬、栄養、植物保護または化粧専門品に関する。
【００８４】
その目的のもう１つによれば、本発明はまた、APが制御放出されるタイプの医薬品を製造するための、APを保持したこれらのDP(懸濁液または固体形態)の使用も対象とする。
【００８５】
それらは、例えば、好ましくは、経口、経鼻、膣、眼球、皮下、静脈内、筋肉内、皮内、腹膜内、脳内または非経口投与され得るものであり得る。
【００８６】
想定され得る化粧品用途は、例えば、本発明のDPと結合したAPを含み、経皮的に適用可能な組成物である。
【００８７】
最終的に、本発明は、APを保持した、以上で定義した懸濁液および／または微粉砕固体を含むことを特徴とする、医薬、栄養、植物保護または化粧専門品に関する。
【００８８】
その目的のもう１つによれば、本発明はまた、APが制御放出されるタイプの医薬品を製造するための、APを保持したこれらのDP(懸濁液または固体形態)の使用も対象とする。
【００８９】
医薬品の場合、それらは、例えば、好ましくは、経口、経鼻、膣、眼球、皮下、静脈内、筋肉内、皮内、腹膜内、脳内または非経口投与され得るものであり得る。
【００９０】
想定され得る化粧品用途は、例えば、本発明のDPと結合したAPを含み、経皮的に適用可能な組成物である。
【００９１】
関連する植物保護製品は、例えば、除草剤、殺虫剤(pesticide)、殺昆虫剤(insecticide)、殺菌剤などであり得る。
【００９２】
以下の実施例により、本発明の種々の生成物/方法/適用の態様について本発明をよりよく理解できる。これらの実施例はポリラクチド/PAAI粒子の製造(有効成分を保持しているか否かを問わない)を例示し、それらによってさらにこれらの粒子の構造上の特徴および特性も提示する。
【実施例】
【００９３】
ブロックコポリマーの合成は4つの主要な工程で行われる:
1.保護された二官能性開始剤によるラクチドの重合、
2.ポリマーと結合した開始剤の脱保護、
3.開始剤の脱保護された官能基での第2のモノマーの重合、
4.第2のモノマーの保護基の脱保護。
【００９４】
実施例1：ポリ(乳酸)20-ブロック-(グルタミン酸)50
1.1  BOC-アミノプロピル-ポリ(乳酸)20：L-ラクチド(5g, 34.70mmol, Aldrich 16101-127)と蒸留トルエン(27ml)を窒素下で乾燥した丸底フラスコに導入する。加熱を80℃で1時間行う。tert-ブトキシカルボニルアミノプロパノール(0.58g, 3.30mmol, Fluka 381029/1)と新たに蒸留したトルエン(23ml)との混合物を別の丸底フラスコで調製し、-10℃に冷却する。ジエチル亜鉛(1.5ml, 1.65mmol, トルエン中1.1M, Aldrich 72560-099)をBOC-アミノプロパノールに添加した後、この反応物を周囲温度に戻し、その後、これをラクチドモノマーに添加して重合を開始する。トルエン溶液(10%)に4mlの酢酸を添加することにより重合を停止させる。次いで、反応媒質をロータリーエバポレーターで濃縮し、過剰のメタノールで沈殿させる。ポリマーを濾過により回収した後、真空乾燥させる。収率：98%。特性評価：Tg：30-37℃。1H NMR(CDCl3)：δ＝1.4ppm(s, 9H, CCH3), 1.55ppm(d, 6H, 3J=7.1Hz, CHCH3), 1.85ppm(q, 2H, 3J=6.3Hz, CH2CH2CH2), 3.1ppm(q, 2H, 3J=6.2Hz, CH2NH), 4.15ppm(t, 2H, 3J=6.0Hz, CH2O), 4.35ppm(q, 1H, 3J=6.9Hz, CH3CHOH), 4.8ppm(m, 1H, NH), 5.15ppm(q, 2H, 3J=7.1Hz, CHCH3)。13C NMR(CDCl3)：δ＝17ppm(2C, CHCH3), 20.7ppm(1C, CH3CHOH), 28.7ppm(3C, CH3C), 29.5ppm(CH2CH2CH2), 37.5ppm(CH2NH), 63.5ppm(CH2O), 67ppm(CH3CHOH), 69.5ppm(2C, CH), 156ppm(NHC=O), 170ppm(CHC(O)O)。
【００９５】
1.2  アミノプロピル-ポリ(乳酸)20：ポリラクチド(4g, 2.65mmol)と蒸留ジクロロメタン(45ml)を窒素気流下で丸底フラスコに導入する。トリフルオロ酢酸(8ml, 0.1mol, Sigma 19H3648)を導入し、この溶液を、CO2が発生しなくなるまで、攪拌しながら周囲温度に30分間置く。反応媒質の溶媒をロータリーエバポレーターで蒸発除去する。40mlのジクロロメタンを添加し、この溶液を、洗液のpHが中性になるまで、40mlのNaHCO3水溶液(5%)で2回、次に、40mlの蒸留水で2回洗浄する。有機相をMgSO4で乾燥させた後、濾過する。溶媒をロータリーエバポレーターで蒸発除去した後、ポリマーを真空乾燥させる。収率：95%。特性評価：1H NMR(CDCl3)：δ＝1.55ppm(d, 6H, 3J=7.1Hz, CH3), 1.85ppm(q, 2H, 3J=6.3Hz, CH2CH2CH2), 2.8ppm(q, 2H, 3J=6.2Hz, CH2NH2), 4.15ppm(t, 2H, 3J=6.0Hz, CH2O), 4.35ppm(q, 1H, 3J=6.9Hz, CH3CHOH), 5.15ppm(q, 2H, 3J=7.1Hz, CH)。
【００９６】
1.3  ポリ(グルタミン酸ベンジル)50-プロピル-ポリ(乳酸)20：L-グルタミン酸ベンジル N-カルボキシ無水物(8.68g, 33.0mmol)を丸底フラスコに導入する。脱保護したポリラクチド(1g, 0.66mmol)を新たに蒸留したジクロロメタン(40ml)で可溶化した後、中空管を用いて導入する。この反応媒質を磁気攪拌しながら周囲温度に3時間置く。溶媒をロータリーエバポレーターで蒸発除去した後、ポリマーを一次真空(primary vacuum)下で乾燥させる。収率：85%。特性評価：1H NMR(TFA d)：δ＝1.55ppm(m, 6H, CH3), 1.95ppm(m, 2H, CH2CH2C=O), 2.35ppm(m, 2H, CH2CH2C=O), 4.60ppm(m, 1H, O=CCHNH), 5.0ppm(m, 2H, CH), 5.25ppm(m, 2H, CH2Ph), 7.10ppm(m, 5H, Ph)。13C NMR(DMSO d6)：δ＝17ppm(CH3), 27ppm(CH2CH2COO), 30ppm(CH2CH2COO), 52ppm(O=CCHNH), 66ppm(CH2Ph), 128-136ppm(Ph), 168-170ppm(OC=O), 172ppm(NC=O)。
【００９７】
1.4  ポリ(グルタミン酸)50-プロピル-ポリ(乳酸)20：コポリマー(5g, 20mmolのベンジルエステル)を丸底フラスコに導入し、10℃においてトリフルオロ酢酸(44ml, 0.57mol)で可溶化する。メタンスルホン酸(44ml, 0.68mol)とアニソール(11ml, 0.10mol)を窒素気流下で導入し、この反応媒質を攪拌しながら3時間放置する。ポリマーを過剰の冷エチルエーテルで沈殿させ、濾過により回収し、エチルエーテルで洗浄し、真空乾燥させる。収率：99%。特性評価：1H NMR(TFA d)：δ＝1.55ppm(m, 6H, CH3), 1.95ppm(m, 2H, CH2CH2C=O), 2.35ppm(m, 2H, CH2CH2C=O), 4.60ppm(m, 1H, O=CCHNH), 5.0ppm(m, 2H, CH)。13C NMR(DMSO d6)：δ＝17ppm(CH3), 27ppm(CH2CH2COOH), 30ppm(CH2CH2COOH), 52ppm(OCCHNH), 69ppm(CH), 168-170ppm(O=CO), 172ppm(O=CNH)。
【００９８】
実施例2：ポリ(乳酸)30-ブロック-(グルタミン酸)80
2.1  BOC-アミノプロピル-ポリ(乳酸)30：L-ラクチド(5g, 34.70mmol, Aldrich 16101-127)をグローブボックス内で窒素雰囲気下で予め火炎処理した丸底フラスコに導入する。新たに蒸留したトルエン(27ml)を、中空管を用いて丸底フラスコに導入し、これを磁気攪拌しながら80℃に1時間置く。tert-ブトキシカルボニルアミノプロパノール(0.40g, 2.30mmol, Fluka 381029/1)と新たに蒸留したトルエン(23ml)を予め火炎処理した丸底フラスコに導入し、浴槽内で磁気攪拌しながら-10℃に置く。ジエチル亜鉛のトルエン溶液(1.0ml, 1.15mmol, 1.1M, Aldrich 72560-099)をこの溶液に滴下する。次いで、この反応媒質を磁気攪拌しながら周囲温度に放置する。1時間後、L-ラクチド溶液を窒素気流下で反応媒質に導入し、その後、これを攪拌しながら80℃に1時間置く。トルエン溶液(10%)に4mlの酢酸を添加することにより重合を停止させる。次いで、反応媒質をロータリーエバポレーターで濃縮し、過剰の冷メタノールで沈殿させる。沈殿したポリマーを濾過により回収した後、一次真空下で乾燥させる。収率：98%。特性評価：Tg：30-37℃。1H NMR(CDCl3)：δ＝1.4ppm(s, 9H, CCH3), 1.55ppm(d, 6H, 3J=7.1Hz, CHCH3), 1.85ppm(q, 2H, 3J=6.3Hz, CH2CH2CH2), 3.1ppm(q, 2H, 3J=6.2Hz, CH2NH), 4.15ppm(t, 2H, 3J=6.0Hz, CH2O), 4.35ppm(q, 1H, 3J=6.9Hz, CH3CHOH), 4.8ppm(m, 1H, NH), 5.15ppm(q, 2H, 3J=7.1Hz, CHCH3)。13C NMR(CDCl3)：δ＝17ppm(2C, CHCH3), 20.7ppm(1C, CH3CHOH), 28.7ppm(3C, CH3C), 29.5ppm(CH2CH2CH2), 37.5ppm(CH2NH), 63.5ppm(CH2O), 67ppm(CH3CHOH), 69.5ppm(2C, CH), 156ppm(NHC=O), 170ppm(CHC(O)O)。
【００９９】
2.2  アミノプロピル-ポリ(乳酸)30：ポリラクチド(4g, 1.85mmol)と新たに蒸留したジクロロメタン(45ml)を窒素気流下でバブリング装置と連結されている予め火炎処理した丸底フラスコに導入する。トリフルオロ酢酸(8ml, 0.1mol, Sigma 19H3648)を導入し、この溶液を、CO2が発生しなくなるまで、攪拌しながら周囲温度に30分間置く。反応媒質の溶媒をロータリーエバポレーターで蒸発除去する。ポリラクチドを40mlのジクロロメタンで可溶化する。この有機相を、洗液のpHが中性になるまで、40mlのNaHCO3水溶液(5%)で2回、次に、40mlの蒸留水で2回洗浄する。次いで、有機相をMgSO4で乾燥させた後、濾過する。溶媒をロータリーエバポレーターで蒸発除去した後、ポリマーを一次真空下で乾燥させる。収率：95%。特性評価：1H NMR(CDCl3)：δ＝1.55ppm(d, 6H, 3J=7.1Hz, CH3), 1.85ppm(q, 2H, 3J=6.3Hz, CH2CH2CH2), 2.8ppm(q, 2H, 3J=6.2Hz, CH2NH2), 4.15ppm(t, 2H, 3J=6.0Hz, CH2O), 4.35ppm(q, 1H, 3J=6.9Hz, CH3CHOH), 5.15ppm(q, 2H, 3J=7.1Hz, CH)。
【０１００】
2.3  ポリ(グルタミン酸ベンジル)80-プロピル-ポリ(乳酸)30：L-グルタミン酸ベンジル N-カルボキシ無水物(9.74g, 37.0mmol)(Flamel Technologies提供品)を秤量し、グローブボックス内において窒素雰囲気下で、予め火炎処理した丸底フラスコに導入する。脱保護したポリラクチド(1g, 0.46mmol)を新たに蒸留したジクロロメタン(45ml)で可溶化した後、中空管を用いて導入する。この反応媒質を磁気攪拌しながら周囲温度に3時間置く。溶媒をロータリーエバポレーターで蒸発除去した後、ポリマーを一次真空下で乾燥させる。収率：85%。特性評価：1H NMR(TFA d)：δ＝1.55ppm(m, 6H, CH3), 1.95ppm(m, 2H, CH2CH2C=O), 2.35ppm(m, 2H, CH2CH2C=O), 4.60ppm(m, 1H, O=CCHNH), 5.0ppm(m, 2H, CH), 5.25ppm(m, 2H, CH2Ph), 7.10ppm(m, 5H, Ph)。13C NMR(DMSO d6)：δ＝17ppm(CH3), 27ppm(CH2CH2COO), 30ppm(CH2CH2COO), 52ppm(O=CCHNH), 66ppm(CH2Ph), 128-136ppm(Ph), 168-170ppm(OC=O), 172ppm(NC=O)。
【０１０１】
2.4  ポリ(グルタミン酸)80-プロピル-ポリ(乳酸)30：コポリマー(5g, 20.3mmolのベンジルエステル)を窒素気流下で、予め火炎処理した丸底フラスコに導入する。これをトリフルオロ酢酸(44ml, 0.57mol)で可溶化する。その後、この溶液を攪拌しながら10℃に置く。メタンスルホン酸(44ml, 0.68mol)とアニソール(11ml, 0.10mol)を窒素気流下で導入する。この反応媒質を攪拌しながら10℃に3時間放置した後、過剰の冷エチルエーテルで沈殿させる。沈殿したポリマーを濾過により回収し、エチルエーテルで洗浄し、一次真空下で乾燥させる。収率：99%。特性評価：1H NMR(TFA d)：δ＝1.55ppm(m, 6H, CH3), 1.95ppm(m, 2H, CH2CH2C=O), 2.35ppm(m, 2H, CH2CH2C=O), 4.60ppm(m, 1H, O=CCHNH), 5.0ppm(m, 2H, CH)。13C NMR(DMSO d6)：δ＝17ppm(CH3), 27ppm(CH2CH2COOH), 30ppm(CH2CH2COOH), 52ppm(OCCHNH), 69ppm(CH), 168-170ppm(O=CO), 172ppm(O=CNH)。
【０１０２】
実施例3：ポリ(乳酸)50-ブロック-(グルタミン酸)50
3.1  BOC-アミノプロピル-ポリ(乳酸)50：L-ラクチド(5g, 34.70mmol, Aldrich 16101-127)を秤量し、グローブボックス内で窒素雰囲気下で、予め火炎処理した丸底フラスコに導入する。新たに蒸留したトルエン(27ml)を、中空管を用いて丸底フラスコに導入し、これを磁気攪拌しながら80℃に1時間置く。tert-ブトキシカルボニルアミノプロパノール(0.24g, 1.3mmol, Fluka 381029/1)と新たに蒸留したトルエン(23ml)を予め火炎処理した丸底フラスコに導入し、浴槽内で磁気攪拌しながら-10℃に置く。ジエチル亜鉛のトルエン溶液(0.63ml, 0.69mmol, 1.1M, Aldrich 72560-099)をこの溶液に滴下する。次いで、この反応媒質を磁気攪拌しながら周囲温度に放置する。1時間後、L-ラクチド溶液を窒素気流下で反応媒質に導入し、その後、これを攪拌しながら80℃に1時間置く。トルエン溶液(10%)に4mlの酢酸を添加することにより重合を停止させる。次いで、反応媒質をロータリーエバポレーターで濃縮し、過剰の冷メタノールで沈殿させる。沈殿したポリマーを濾過により回収した後、一次真空下で乾燥させる。収率：98%。特性評価：Tg：30-37℃。1H NMR(CDCl3)：δ＝1.4ppm(s, 9H, CCH3), 1.55ppm(d, 6H, 3J=7.1Hz, CHCH3), 1.85ppm(q, 2H, 3J=6.3Hz, CH2CH2CH2), 3.1ppm(q, 2H, 3J=6.2Hz, CH2NH), 4.15ppm(t, 2H, 3J=6.0Hz, CH2O), 4.35ppm(q, 1H, 3J=6.9Hz, CH3CHOH), 4.8ppm(m, 1H, NH), 5.15ppm(q, 2H, 3J=7.1Hz, CHCH3)。13C NMR(CDCl3)：δ＝17ppm(2C, CHCH3), 20.7ppm(1C, CH3CHOH), 28.7ppm(3C, CH3C), 29.5ppm(CH2CH2CH2), 37.5ppm(CH2NH2), 63.5ppm(CH2O), 67ppm(CH3CHOH), 69.5ppm(2C, CH), 156ppm(NHC=O), 170ppm(CHC(O)O)。
【０１０３】
3.2  アミノプロピル-ポリ(乳酸)50：ポリラクチド(4g, 1.11mmol)と新たに蒸留したジクロロメタン(45ml)を窒素気流下でバブリング装置と連結されている予め火炎処理した丸底フラスコに導入する。トリフルオロ酢酸(80ml, 0.1mol, Sigma 19H3648)を導入し、この溶液を、CO2が発生しなくなるまで、攪拌しながら周囲温度に30分間置く。反応媒質の溶媒をロータリーエバポレーターで蒸発除去する。ポリラクチドを40mlのジクロロメタンで可溶化する。この有機相を、洗液のpHが中性になるまで、40mlのNaHCO3水溶液(5%)で2回、次に、40mlの蒸留水で2回洗浄する。次いで、有機相をMgSO4で乾燥させた後、濾過する。溶媒をロータリーエバポレーターで蒸発除去した後、ポリマーを一次真空下で乾燥させる。収率：95%。特性評価：1H NMR(CDCl3)：δ＝1.55ppm(d, 6H, 3J=7.1Hz, CH3), 1.85ppm(q, 2H, 3J=6.3Hz, CH2CH2CH2), 2.8ppm(q, 2H, 3J=6.2Hz, CH2NH2), 4.15ppm(t, 2H, 3J=6.0Hz, CH2O), 4.35ppm(q, 1H, 3J=6.9Hz, CH3CHOH), 5.15ppm(q, 2H, 3J=7.1Hz, CH)。
【０１０４】
3.3  ポリ(グルタミン酸ベンジル)50-プロピル-ポリ(乳酸)50：L-グルタミン酸ベンジル N-カルボキシ無水物(3.65g, 13.8mmol)を秤量し、グローブボックス内において窒素雰囲気下で、予め火炎処理した丸底フラスコに導入する。脱保護したポリラクチド(1g, 0.27mmol)を新たに蒸留したジクロロメタン(17ml)で可溶化した後、中空管を用いて導入する。この反応媒質を磁気攪拌しながら周囲温度に3時間置く。溶媒をロータリーエバポレーターで蒸発除去した後、ポリマーを一次真空下で乾燥させる。収率：85%。特性評価：1H NMR(TFA d)：δ＝1.55ppm(m, 6H, CH3), 1.95ppm(m, 2H, CH2CH2C=O), 2.35ppm(m, 2H, CH2CH2C=O), 4.60ppm(m, 1H, O=CCHNH), 5.0ppm(m, 2H, CH), 5.25ppm(m, 2H, CH2Ph), 7.10ppm(m, 5H, Ph)。13C NMR(DMSO d6)：δ＝17ppm(CH3), 27ppm(CH2CH2COO), 30ppm(CH2CH2COO), 52ppm(O=CCHNH), 66ppm(CH2Ph), 128-136ppm(Ph), 168-170ppm(OC=O), 172ppm(NC=O)。
【０１０５】
3.4  ポリ(グルタミン酸)50-プロピル-ポリ(乳酸)50：コポリマー(3g, 10.27mmolのベンジルエステル)を窒素気流下で、予め火炎処理した丸底フラスコに導入する。これをトリフルオロ酢酸(22.5ml, 0.29mol)で可溶化する。その後、この溶液を攪拌しながら10℃に置く。メタンスルホン酸(22.5ml, 0.35mol)とアニソール(5.5ml, 0.05mol)を窒素気流下で導入する。この反応媒質を攪拌しながら10℃に3時間放置した後、過剰の冷エチルエーテルで沈殿させる。沈殿したポリマーを濾過により回収し、エチルエーテルで洗浄し、一次真空下で乾燥させる。収率：99%。特性評価：1H NMR(TFA d)：δ＝1.55ppm(m, 6H, CH3), 1.95ppm(m, 2H, CH2CH2C=O), 2.35ppm(m, 2H, CH2CH2CH2C=O), 4.60ppm(m, 1H, O=CCHNH), 5.0ppm(m, 2H, CH)。13C NMR(DMSO d6)：δ＝17ppm(CH3), 27ppm(CH2CH2COOH), 30ppm(CH2CH2COOH), 52ppm(OCCHNH), 69ppm(CH), 168-170ppm(O=CO), 172ppm(O=CNH)。
【０１０６】
実施例4：ポリ(乳酸)80-ブロック-(グルタミン酸)20
4.1  BOC-アミノプロピル-ポリ(乳酸)80：L-ラクチド(5.2g, 36.09mmol, Aldrich 16101-127)と蒸留トルエン(27ml)を窒素下で乾燥した丸底フラスコに導入する。加熱を80℃で1時間行う。tert-ブトキシカルボニルアミノプロパノール(0.16g, 0.91mmol, Fluka 381029/1)と新たに蒸留したトルエン(23ml)との混合物を別の丸底フラスコで調製し、-10℃に冷却する。ジエチル亜鉛(0.4ml, 0.44mmol, トルエン中1.1M, Aldrich 72560-099)をBOC-アミノプロパノールに添加した後、この反応物を周囲温度に戻し、その後、これをラクチドモノマーに添加して重合を開始する。トルエン溶液(10%)に0.5mlの酢酸を添加することにより重合を停止させる。次いで、反応媒質をロータリーエバポレーターで濃縮し、過剰のメタノールで沈殿させる。ポリマーを濾過により回収した後、真空乾燥させる。収率：98%。特性評価：Tg：30-37℃。1H NMR(CDCl3)：δ＝1.4ppm(s, 9H, CCH3), 1.55ppm(d, 6H, 3J=7.1Hz, CHCH3), 1.85ppm(q, 2H, 3J=6.3Hz, CH2CH2CH2), 3.1ppm(q, 2H, 3J=6.2Hz, CH2NH), 4.15ppm(t, 2H, 3J=6.0Hz, CH2O), 4.35ppm(q, 1H, 3J=6.9Hz, CH3CHOH), 4.8ppm(m, 1H, NH), 5.15ppm(q, 2H, 3J=7.1Hz, CHCH3)。13C NMR(CDCl3)：δ＝17ppm(2C, CHCH3), 20.7ppm(1C, CH3CHOH), 28.7ppm(3C, CH3C), 29.5ppm(CH2CH2CH2), 37.5ppm(CH2NH), 63.5ppm(CH2O), 67ppm(CH3CHOH), 69.5ppm(2C, CH), 156ppm(NHC=O), 170ppm(CHC(O)O)。
【０１０７】
4.2  アミノプロピル-ポリ(乳酸)80：ポリラクチド(4.5g, 2.98mmol)と蒸留ジクロロメタン(54ml)を窒素気流下で丸底フラスコに導入する。トリフルオロ酢酸(9ml, 0.11mol, Sigma 19H3648)を導入し、この溶液を、CO2が発生しなくなるまで、攪拌しながら周囲温度に30分間置く。反応媒質の溶媒をロータリーエバポレーターで蒸発除去する。50mlのジクロロメタンを添加し、この溶液を、洗液のpHが中性になるまで50mlのNaHCO3水溶液(5%)で2回、次に、50mlの蒸留水で2回洗浄する。有機相をMgSO4で乾燥させた後、濾過する。溶媒をロータリーエバポレーターで蒸発除去した後、ポリマーを真空乾燥させる。収率：95%。特性評価：1H NMR(CDCl3)：δ＝1.55ppm(d, 6H, 3J=7.1Hz, CH3), 1.85ppm(q, 2H, 3J=6.3Hz, CH2CH2CH2), 2.8ppm(q, 2H, 3J=6.2Hz, CH2NH2), 4.15ppm(t, 2H, 3J=6.0Hz, CH2O), 4.35ppm(q, 1H, 3J=6.9Hz, CH3CHOH), 5.15ppm(q, 2H, 3J=7.1Hz, CH)。
【０１０８】
4.3  ポリ(グルタミン酸ベンジル)20-プロピル-ポリ(乳酸)80：L-グルタミン酸ベンジル N-カルボキシ無水物(2.70g, 10.26mmol)を丸底フラスコに導入する。脱保護したポリラクチド(3g, 1.98mmol)を新たに蒸留したジクロロメタン(15ml)で可溶化した後、中空管を用いて導入する。この反応媒質を磁気攪拌しながら周囲温度に3時間置く。溶媒をロータリーエバポレーターで蒸発除去した後、ポリマーを一次真空下で乾燥させる。収率：85%。特性評価：1H NMR(TFA d)：δ＝1.55ppm(m, 6H, CH3), 1.95ppm(m, 2H, CH2CH2C=O), 2.35ppm(m, 2H, CH2CH2C=O), 4.60ppm(m, 1H, O=CCHNH), 5.0ppm(m, 2H, CH), 5.25ppm(m, 2H, CH2Ph), 7.10ppm(m, 5H, Ph)。13C NMR(DMSO d6)：δ＝17ppm(CH3), 27ppm(CH2CH2COO), 30ppm(CH2CH2COO), 52ppm(O=CCHNH), 66ppm(CH2Ph), 128-136ppm(Ph), 168-170ppm(OC=O), 172ppm(NC=O)。
【０１０９】
4.4  ポリ(グルタミン酸)20-プロピル-ポリ(乳酸)80：コポリマー(5.2g, 20.8mmolのベンジルエステル)を丸底フラスコに導入し、10℃においてトリフルオロ酢酸(22ml, 0.29mol)で可溶化する。メタンスルホン酸(22ml, 0.34mol)とアニソール(5.6ml, 0.05mol)を窒素気流下で導入し、この反応媒質を攪拌しながら10℃に3時間放置する。ポリマーを過剰の冷エチルエーテルで沈殿させ、濾過により回収し、エチルエーテルで洗浄し、真空乾燥させる。収率：99%。特性評価：1H NMR(TFA d)：δ＝1.55ppm(m, 6H, CH3), 1.95ppm(m, 2H, CH2CH2C=O), 2.35ppm(m, 2H, CH2CH2C=O), 4.60ppm(m, 1H, O=CCHNH), 5.0ppm(m, 2H, CH)。13C NMR(DMSO d6)：δ＝17ppm(CH3), 27ppm(CH2CH2COOH), 30ppm(CH2CH2COOH), 52ppm(OCCHNH), 69ppm(CH), 168-170ppm(O=CO), 172ppm(O=CNH)。
【０１１０】
実施例5：ポリ(乳酸)30-ブロック-(グルタミン酸)100
5.1  BOC-アミノプロピル-ポリ(乳酸)30：L-ラクチド(6g, 41.64mmol, Aldrich 16101-127)をグローブボックス内において窒素雰囲気下で、火炎処理した丸底フラスコに導入する。新たに蒸留したトルエン(27ml)を、中空管を用いて丸底フラスコに導入し、これを磁気攪拌しながら80℃に1時間置く。tert-ブトキシカルボニルアミノプロパノール(0.73g, 4.20mmol), Fluka 381029/1)と新たに蒸留したトルエン(23ml)を予め火炎処理した丸底フラスコに導入し、浴槽内で磁気攪拌しながら-10℃に置く。ジエチル亜鉛のトルエン溶液(1.9ml, 2.19mmol, 1.1M, Aldrich 72560-099)をこの溶液に滴下する。次いで、この反応媒質を磁気攪拌しながら周囲温度に放置する。1時間後、L-ラクチド溶液を窒素気流下で反応媒質に導入し、その後、これを攪拌しながら80℃に1時間置く。トルエン溶液(10%)に5mlの酢酸を添加することにより重合を停止させる。次いで、反応媒質をロータリーエバポレーターで濃縮し、過剰の冷メタノールで沈殿させる。沈殿したポリマーを濾過により回収した後、一次真空下で乾燥させる。収率：98%。特性評価：Tg：30-37℃。1H NMR(CDCl3)：δ＝1.4ppm(s, 9H, CCH3), 1.55ppm(d, 6H, 3J=7.1Hz, CHCH3), 1.85ppm(q, 2H, 3J=6.3Hz, CH2CH2CH2), 3.1ppm(q, 2H, 3J=6.2Hz, CH2NH), 4.15ppm(t, 2H, 3J=6.0Hz, CH2O), 4.35ppm(q, 1H, 3J=6.9Hz, CH3CHOH), 4.8ppm(m, 1H, NH), 5.15ppm(q, 2H, 3J=7.1Hz, CHCH3)。13C NMR(CDCl3)：δ＝17ppm(2C, CHCH3), 20.7ppm(1C, CH3CHOH), 28.7ppm(3C, CH3C), 29.5ppm(CH2CH2CH2), 37.5ppm(CH2NH), 63.5ppm(CH2O), 67ppm(CH3CHOH), 69.5ppm(2C, CH), 156ppm(NHC=O), 170ppm(CHC(O)O)。
【０１１１】
5.2  アミノプロピル-ポリ(乳酸)30：ポリラクチド(3g, 1.39mmol)と新たに蒸留したジクロロメタン(36ml)を窒素気流下でバブリング装置と連結されている予め火炎処理した丸底フラスコに導入する。トリフルオロ酢酸(6ml, 0.08mol, Sigma 19H3648)を導入し、この溶液を、CO2が発生しなくなるまで、攪拌しながら周囲温度に30分間置く。反応媒質の溶媒をロータリーエバポレーターで蒸発除去する。ポリラクチドを40mlのジクロロメタンで可溶化する。この有機相を、洗液のpHが中性になるまで、40mlのNaHCO3水溶液(5%)で2回、次に、40mlの蒸留水で2回洗浄する。次いで、有機相をMgSO4で乾燥させた後、濾過する。溶媒をロータリーエバポレーターで蒸発除去した後、ポリマーを一次真空下で乾燥させる。収率：97%。特性評価：1H NMR(CDCl3)：δ＝1.55ppm(d, 6H, 3J=7.1Hz, CH3), 1.85ppm(q, 2H, 3J=6.3Hz, CH2CH2CH2), 2.8ppm(q, 2H, 3J=6.2Hz, CH2NH2), 4.15ppm(t, 2H, 3J=6.0Hz, CH2O), 4.35ppm(q, 1H, 3J=6.9Hz, CH3CHOH), 5.15ppm(q, 2H, 3J=7.1Hz, CH)。
【０１１２】
5.3  ポリ(グルタミン酸ベンジル)100-プロピル-ポリ(乳酸)30：グルタミン酸ベンジル N-カルボキシ無水物(33g, 125.4mmol)(Flamel Technologies提供品)を秤量し、グローブボックス内において窒素雰囲気下で、予め火炎処理した丸底フラスコに導入する。脱保護したポリラクチド(2.9g, 1.33mmol)を新たに蒸留したジクロロメタン(165ml)で可溶化した後、中空管を用いて導入する。この反応媒質を磁気攪拌しながら周囲温度に3時間置く。溶媒をロータリーエバポレーターで蒸発除去した後、ポリマーを一次真空下で乾燥させる。収率：93%。特性評価：1H NMR(TFA d)：δ＝1.55ppm(m, 6H, CH3), 1.95ppm(m, 2H, CH2CH2C=O), 2.35ppm(m, 2H, CH2CH2C=O), 4.60ppm(m, 1H, O=CCHNH), 5.0ppm(m, 2H, CH), 5.25ppm(m, 2H, CH2Ph), 7.10ppm(m, 5H, Ph)。13C NMR(DMSO d6)：δ＝17ppm(CH3), 27ppm(CH2CH2COO), 30ppm(CH2CH2COO), 52ppm(O=CCHNH), 66ppm(CH2Ph), 128-136ppm(Ph), 168-170ppm(OC=O), 172ppm(NC=O)。
【０１１３】
5.4  ポリ(グルタミン酸)100-プロピル-ポリ(乳酸)30：コポリマー(11g, 44.66mmolのベンジルエステル)を窒素気流下で、予め火炎処理した丸底フラスコに導入する。これをトリフルオロ酢酸(100ml, 1.30mol)で可溶化する。その後、この溶液を攪拌しながら10℃に置く。メタンスルホン酸(100ml, 1.55mol)とアニソール(25ml, 0.23mol)を窒素気流下で導入する。この反応媒質を攪拌しながら10℃に3時間放置した後、過剰の冷エチルエーテルで沈殿させる。沈殿したポリマーを濾過により回収し、エチルエーテルで洗浄し、一次真空下で乾燥させる。収率：99%。特性評価：1H NMR(TFA d)：δ＝1.55ppm(m, 6H, CH3), 1.95ppm(m, 2H, CH2CH2C=O), 2.35ppm(m, 2H, CH2CH2C=O), 4.60ppm(m, 1H, O=CCHNH), 5.0ppm(m, 2H, CH)。13C NMR(DMSO d6)：δ＝17ppm(CH3), 27ppm(CH2CH2COOH), 30ppm(CH2CH2COOH), 52ppm(OCCHNH), 69ppm(CH), 168-170ppm(O=CO), 172ppm(O=CNH)。
【０１１４】
実施例6：実施例4のポリマーからのナノ粒子の形成
実施例4のポリマー粉末0.5gを90/10 w/w THF/エタノール混合物20gに溶かす。この溶液を4容量の0.1Mリン酸緩衝水溶液に滴下する。得られた分散液は拡散分散液である。
【０１１５】
実施例7：実施例6のナノ粒子の流体力学的直径の測定
実施例6の拡散分散液をBiomax YM 300 メンブレンでダイアフィルトレーションする。ナノ粒子を保持液中に濃縮する。次いで、それらを定容量で800mlの弱い緩衝水(塩を含まない2×10-4Mリン酸緩衝液)に対して透析する。動的光散乱により測定した粒子の流体力学的直径は240nmである。
【０１１６】
実施例8：実施例7のポリマー粒子に吸着されるインスリンの最大量の測定
pH7.4において等張な状態で10mg/mlに濃縮された実施例7のナノ粒子を、漸増濃度のヒト組換えインスリン溶液と25℃で16時間接触させる。遊離インスリン、すなわち、ナノ粒子に吸着されていないインスリンの量を、立体排除クロマトグラフィーにより決定する。この目的のために、調製物をToso Haas TSK G4000 PWXLカラムに注入する。遊離インスリンを、Agilentシリーズ 1100 UV-検出器により214nmで検出する。こうして、図1の吸着等温線が得られる。この等温線のプラトー値により、乾燥コポリマーの単位質量当たりに吸着したインスリンの最大量、Amを決定することが可能である。Am=6% w/wであることが分かる。
【０１１７】
実施例9：実施例5のポリマーからのナノ粒子の形成
実施例5のポリマーを26.7g/lに濃縮したエタノール溶液として準備する。この溶液をそのまま4容量の0.1Mリン酸緩衝水溶液に滴下する。得られた分散液は拡散分散液である。
【０１１８】
実施例10：実施例9のナノ粒子の流体力学的直径の測定
実施例9の拡散分散液をBiomax YM 300 メンブレンでダイアフィルトレーションする。ナノ粒子が保持液中に濃縮されることが分かる。次いで、それらを定容量で800mlの弱い緩衝水(塩を含まない2×10-4Mリン酸緩衝液)に対して透析する。動的光散乱により測定した粒子の流体力学的直径は220nmである。
【０１１９】
実施例11：実施例10の粒子に吸着されるインスリンの最大量の測定
実施例8と同じ方法を行うことにより、実施例5のポリマーのナノ粒子に対するインスリンの吸着等温線を得る。この等温線のプラトー値により、乾燥コポリマーの単位質量当たりに吸着したインスリンの最大量、Amを決定することが可能である。Am=1% w/wであることが分かる。
【０１２０】
実施例12：実施例3のポリマーのナノ粒子の特性
実施例3のコポリマーのナノ粒子を実施例6および9に開示する方法により製造し、単離する。動的光散乱により測定したナノ粒子の流体力学的直径は450nmである。これらのナノ粒子に吸着したインスリンの最大量を、実施例8および11に開示するように測定する。Am=2.5% w/wであることが分かる。
【０１２１】
実施例13：実施例3のポリマーからのナノ粒子の形成
実施例3のポリマー500mgを100mlのDMFにより60℃で10分以内に溶かす。この溶液を200mlのジイソプロピルエーテルに-40℃でゆっくりと注ぎ、激しく攪拌する。この溶液を周囲温度に2時間静置した後、1500rpmで20分間遠心分離する。ペレットをBuchner No.4 漏斗で濾過し、沈殿物をジイソプロピルエーテルで洗浄する。沈殿物をベーンポンプにより真空乾燥させる。
【０１２２】
実施例14：絶食させた健常なイヌにおけるインスリン保持DPの薬物動態学および薬力学
実施例8のインスリン(Basulin(登録商標))と会合した実施例7のHCAP-ポリAAI微粒子の調製物を、膵全切除術により糖尿病にし、また、その前の晩から絶食させたイヌに注射した。調製物の午前11時の胸部皮下経路による投与は、動物の生体重1kg当たりインスリン0.5IU/kgの用量で行った。投与量は0.18〜0.24mlとする。-4、-2、0、1、2、4、6、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44および48時間の時点に頚静脈を穿刺して、血液1mlをヘパリンナトリウム管に吸引採取する。全血30μlを使用して即座に血中グルコースレベルを測定する。次いで、インスリンについてのアッセイに向け、採取管を遠心分離し、沈降させ、血漿を-20℃で保存する。以下に示す図2の結果は、インスリンが最大12時間放出されること(実線)と、注射後最大20時間持続する、かなり血中グルコースを低下させる効果(不連続線)を示している。
【０１２３】
この実施例は、本発明のDPの存在下ではインスリンが変性しないことを証明している。
【０１２４】
さらに、この実施例は、本発明のナノ粒子を、変更したタンパク質の放出に有効に使用できるDPで構成されていることを示している。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】実施例8のナノ粒子の分散液へのインスリン(9.3mg/ml)の吸着等温線。
【図２】実施例7の粒子に吸着されたインスリン(用量0.6IU/kg)の投与後の健常ブタの血中インスリンおよび血中グルコースプロフィール。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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