(57)【要約】本発明は、タンパク質をデンプン由来の修飾多糖へカップリングさせる方法に関する。修飾多糖とタンパク質との結合相互作用は、修飾多糖分子の末端アルデヒド基もしくはこのアルデヒド基の化学反応の結果として生じた官能基と、多糖分子のアルデヒド基もしくは結果として生じた官能基と反応するタンパク質の官能基と、の間のカップリング反応の結果である共有結合に基づく。カップリング反応の直接的な結果として生じる結合は、上記の共有結合へのさらなる反応によって任意で修飾できる。本発明はさらにまた、本カップリング方法において形成されたコンジュゲートを含む医薬組成物ならびにヒトまたは動物の身体の予防療法または治療のための前記コンジュゲートおよび組成物の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒドロキシアルキルデンプン−タンパク質コンジュゲートであって、ヒドロキシアルキルデンプン分子とタンパク質との結合相互作用が、（ｉ）ヒドロキシアルキルデンプン分子の末端アルデヒド基または当該アルデヒド基から化学反応によって誘導された官能基と、（ii）ヒドロキシアルキルデンプン分子の当該アルデヒド基またはそれから誘導された官能基と反応することのできるタンパク質の官能基と、の間のカップリング反応の結果である共有結合に基づき、必要に応じて、カップリング反応から直接生じる結合を上記の共有結合を生じさせる別の反応によって修飾できることを特徴とするヒドロキシアルキルデンプン−タンパク質コンジュゲート。
【請求項２】
ヒドロキシアルキルデンプン分子の末端アルデヒド基から化学反応により誘導された官能基が、当該末端アルデヒド基と反応させられた二官能性リンカー分子の官能基の１つであることを特徴とする、請求項１に記載のヒドロキシアルキルデンプン−タンパク質コンジュゲート。
【請求項３】
タンパク質の反応性官能基が、当該タンパク質にカップリングさせられた二官能性リンカー分子の官能基の１つであることを特徴とする、請求項１または２に記載のヒドロキシアルキルデンプン−タンパク質コンジュゲート。
【請求項４】
タンパク質の反応性官能基が、元のアミノ酸配列の組み換え修飾によってタンパク質内に導入されていることを特徴とする、請求項１または２に記載のヒドロキシアルキルデンプン−タンパク質コンジュゲート。
【請求項５】
共有結合が、ヒドロキシアルキルデンプン分子の末端アルデヒド基の選択的酸化によって形成されたカルボキシル基または活性化カルボキシル基と、タンパク質の第一級アミノ基またはチオール基との間のカップリング反応の結果であることを特徴とする、請求項１、３または４に記載のヒドロキシアルキルデンプン−タンパク質コンジュゲート。
【請求項６】
共有結合が、ヒドロキシアルキルデンプン分子の末端アルデヒド基の選択的酸化によって形成された活性化カルボキシル基と、タンパク質の第一級アミノ基との間のカップリング反応の結果のアミド結合であることを特徴とする、請求項５に記載のコンジュゲート。
【請求項７】
共有結合が、ヒドロキシアルキルデンプン分子の末端アルデヒド基と、タンパク質の第一級アミノ基との間のシッフ塩基を形成するためのカップリング反応、およびシッフ塩基のアミンへの還元反応の結果であるアミン結合であることを特徴とする、請求項１、３または４に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
ヒドロキシアルキルデンプン分子が約４〜約１，０００ｋＤの範囲内の分子量を有することを特徴とする、請求項１から７のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項９】
ヒドロキシアルキルデンプン分子が約４〜約５０ｋＤの分子量を有することを特徴とする、請求項８に記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
ヒドロキシアルキルデンプン分子が約７０〜約１，０００ｋＤの分子量を有することを特徴とする、請求項８に記載のコンジュゲート。
【請求項１１】
ヒドロキシアルキルデンプン分子が約１３０ｋＤの分子量を有することを特徴とする、請求項１０に記載のコンジュゲート。
【請求項１２】
ヒドロキシアルキルデンプン分子が約０．３〜約０．７の置換度を有することを特徴とする、請求項１から１１のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項１３】
ヒドロキシアルキルデンプン分子が、約８〜１２のＣ6に対するＣ2の置換の比率を有することを特徴とする、請求項１から１２のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項１４】
ヒドロキシアルキルデンプン分子がヒドロキシエチルデンプン分子であることを特徴とする、請求項１から１３のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項１５】
タンパク質が、調節もしくは触媒機能、シグナル伝達もしくは輸送機能、または免疫反応機能もしくは免疫反応の誘導機能を有することを特徴とする、請求項１から１４のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項１６】
タンパク質が、酵素、抗体、抗原、輸送タンパク質、生体接着タンパク質、ホルモンおよびプロホルモン、成長因子および成長因子受容体、サイトカイン、受容体、サプレッサー、アクチベーター、インヒビターまたはそれらの機能的誘導体もしくはフラグメントからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１５に記載のコンジュゲート。
【請求項１７】
タンパク質が、α−、β−もしくはγ−インターフェロン、インターロイキン、血清タンパク質、例えばアルブミンもしくは凝固因子、エリスロポイエチン、ミオグロビン、ヘモグロビン、プラスミノーゲンアクチベーター、ＢＣＧＦ、ＢＤＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＮＧＦ、ＰＤＧＦ、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、コロニー刺激因子、ＢＭＰ、ソマトメジン、ソマトトロピン、ソマトスタチン、インスリン、ゴナドトロピン、α−ＭＳＨ、トリプトレリン、プロラクチン、カルシトニン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド、例えばＧＬＰ−１もしくはＧＬＰ−２、エキセンジン、レプチン、ガストリン、セクレチン、インテグリン、視床下部ホルモン、例えばＡＤＨ、オキシトシン、リベリンもしくはスタチン、甲状腺ホルモン、例えばチロキシン、チロトロピン、チロリベリン、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、ＬＨ、ＦＳＨ、色素性ホルモン、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ヒルジン、リポタンパク質もしくはアポリポタンパク質、例えばＡｐｏ−Ｂ、Ａｐｏ−Ｅ、Ａｐｏ−Ｌa、オリゴリシンタンパク質、ＲＧＤタンパク質、レクチンもしくはリシン、ミツバチ毒もしくはヘビ毒、免疫毒素、ブタクサアレルゲン、Ｅ抗原、免疫グロブリン、またはこれらのタンパク質の１つに対する対応する受容体あるいはこれらのタンパク質もしくは受容体の１つの機能的誘導体もしくはフラグメントであることを特徴とする、請求項１５または１６に記載のコンジュゲート。
【請求項１８】
タンパク質が、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、グルタミナーゼ、グルタミナーゼ−アスパラギナーゼ、フェニルアラニンアンモニア−リアーゼ、トリプトファナーゼ、チロシナーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、エンドトキシナーゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、カリクレイン、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、サーモリシン、リパーゼ、ウリカーゼ、アデノシンジホスファターゼ、プリン−ヌクレオシドホスホリラーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコダーゼ、グルコン酸オキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヒアルロニダーゼ、組織因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、ＭＡＰキナーゼ、ＤＮＡ分解酵素、ＲＮＡ分解酵素、ラクトフェリン、およびそれらの機能的誘導体もしくはフラグメントから選択される酵素であることを特徴とする、請求項１５または１６に記載のコンジュゲート。
【請求項１９】
有効量の請求項１から１８のいずれかに記載のコンジュゲートおよび医薬上許容される担体、ならびに必要に応じてさらに賦形剤および有効成分を含む医薬組成物。
【請求項２０】
ヒトまたは動物の治療または予防療法のための請求項１から１８のいずれかに記載のコンジュゲートまたは請求項１９に記載の組成物の使用。
【請求項２１】
請求項１から１８のいずれかに記載のヒドロキシアルキルデンプン−タンパク質コンジュゲートを調製する方法であって、カップリング反応が、ヒドロキシアルキルデンプン分子の末端アルデヒド基もしくはこのアルデヒド基から化学反応によって誘導された官能基と、ヒドロキシアルキルデンプン分子のこのアルデヒド基もしくはそれから誘導された官能基と反応することのできるタンパク質の官能基と、の間で水溶液中で実施され、必要に応じて、カップリング反応において直接生じる結合がさらなる反応によって修飾されることを特徴とする方法。
【請求項２２】
カップリング反応の反応溶媒が、水、または水と有機溶媒との混合液であって、混合液の水分含有量が少なくとも８０％である混合液である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ヒドロキシアルキルデンプン分子の末端アルデヒド基が選択的酸化によって対応するカルボキシル官能基へ転換させられ、これが引き続いて水溶液中において活性化条件下でタンパク質の遊離アミノ基と反応させられ、ヒドロキシアルキルデンプン分子がアミド結合によりタンパク質へ結合されることを特徴とする請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
アルデヒド基の選択的酸化が、塩基性水溶液中においてヨウ素または金属イオンを用いて実施されることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
カップリング反応が、カルボジイミドの存在下で実施されることを特徴とする請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
カルボジイミドが、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）であることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ヒドロキシアルキルデンプン分子の末端アルデヒド基がタンパク質の遊離アミノ基へカップリングされてシッフ塩基を形成し、形成されたシッフ塩基がアミンへ還元され、ヒドロキシアルキルデンプン分子がアミン結合によってタンパク質へ結合されることを特徴とする、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２８】
カップリングおよび還元の両方が、水溶液中で起きることを特徴とする、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
還元剤が、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウムまたは有機ホウ素錯体であることを特徴とする、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
カップリング反応および還元反応が、同時に実施されることを特徴とする、請求項２７から２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
末端アルデヒド基で選択的に酸化されたヒドロキシアルキルデンプンを調製する方法であって、ヒドロキシアルキルデンプンが塩基性水溶液中で２：１から２０：１のヨウ素対ＨＡＳのモル比で反応させられることを特徴とする方法。
【請求項３２】
ヨウ素対ＨＡＳのモル比が、約５：１から６：１であることを特徴とする、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ａ）所定量のヒドロキシアルキルデンプンが温蒸留水中に溶解させられ、１モル当量よりいくらか低いヨウ素水溶液が添加され、
ｂ）ヨウ素溶液の約５〜１５倍のモル濃度のＮａＯＨ溶液が、添加後に溶液が再び透明になり始めるまで数分の間隔で、反応溶液へ緩徐に滴下により添加され、
ｃ）反応溶液へ１モル当量よりいくらか低いヨウ素水溶液が再び添加され、
ｄ）ＮａＯＨ溶液の滴下による添加が再開され、
ｅ）ヒドロキシアルキルデンプンに対して、およそ５．５〜６モル当量のヨウ素溶液および１１〜１２モル当量のＮａＯＨ溶液が添加されるまでステップｂ）からｄ）が繰り返され、
ｆ）この反応が停止させられ、反応溶液が脱塩され、陽イオン交換クロマトグラフィーにかけられ、凍結乾燥法によって反応生成物が入手される、
ことを特徴とする、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
ヨウ素水溶液が、およそ０．０５〜０．５Ｎのヨウ素溶液であることを特徴とする、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ＮａＯＨ溶液のモル濃度が、ヨウ素溶液のモル濃度の約１０倍であることを特徴とする、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
末端アルデヒド基で選択的に酸化されたヒドロキシアルキルデンプンを調製する方法であって、ＨＡＳがＣｕ2+イオンおよびＡｇ+イオンから選択される過剰モルの安定化された金属イオンを含むアルカリ水溶液中で酸化されることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ここ数十年間の遺伝子工学における急激な発展は、治療上の潜在的有益性を有するタンパク質に対する極めて多数の新規遺伝子の同定をもたらし、そして生物学的発現系を用いて純粋またはほぼ純粋な対応する遺伝子産物を難なく相当大量に産生する可能性を導いた。
【背景技術】
【０００２】
しかしそのようなタンパク質を例えば診断、治療およびバイオトランスフォーメーションにおいて実際に使用すると、特に生理的ｐＨ値でのそれらの安定性および溶解性が不十分なために困難に遭遇することが多いという問題が持ち上がってきた。そのようなタンパク質の２つの例は、腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αまたはインターロイキン−２である。
【０００３】
溶解性に関する問題はさらに大腸菌等の原核生物系での糖タンパク質の発現において極めて頻回に発生するが、それは大腸菌が天然グリコシル化を伴わずに発現し、場合によっては溶解性が相当に大きく低下するためである。このため、かなり高額の費用がかかる真核生物発現系を使用する必要が生じることがある。
【０００４】
身体の治療に使用された場合、多くのタンパク質は血液循環から極めて急速に除去されるか、または分解されてしまう。全身的に投与した場合、約７０ｋＤを超える分子量を有するタンパク質は、細網内皮系によって、または細胞受容体との特異的相互作用によって血液循環から除去される可能性がある。約７０ｋＤ未満の分子量を有するもっと小さなタンパク質は、さらに（排出限界が約７０ｋＤである）腎臓での糸球体濾過によって大量に除去される可能性がある。
【０００５】
上記の問題を取り除くために近年実施されてきたアプローチは、そのような問題のあるタンパク質を、例えばポリエチレングリコールおよびデキストラン等の優れた水溶性を備える生体適合性ポリマーへカップリングさせる方法である。一方ではこのカップリングによって分子量を７０ｋＤの閾値より上へ増加させることができるので小さなタンパク質の血漿滞留時間を劇的に増加させることができ、さらに他方では親水性ポリマー部分によって水性媒体中での溶解度を改善することができる。
【０００６】
さらに多くの場合に有益な、そのようなポリマーへタンパク質をカップリングさせる方法に関連している可能性がある作用は、結合したポリマーによるタンパク質分子上のプロテアーゼ認識部位および抗原決定基のマスキングに基づく作用である。一方ではそれにより治療用タンパク質のタンパク質分解を実質的に回避することが可能になり、他方では外因性の治療用タンパク質によるアレルギー反応の誘導が実質的に抑制される。そこで分子量が増加することに加えて、タンパク質はポリマーの存在によって酵素分解から、さらにしばしば熱変性からも保護される。多くの場合、タンパク質の安定性およびインビボ半減期は顕著に増加し、それにより免疫原性および抗原性が低下する。
【０００７】
現在までに、ポリエチレングリコールまたはデキストランを用いて、一般に好ましくはより単純な生成物を提供するＰＥＧを用いて、多くの修飾が実施されてきている。
【０００８】
デキストランのカップリングは、例えばストレプトキナーゼ、プラスミン、ヘモグロビンまたはアプロチニン等のほんの数種のタンパク質についてのみ報告されている。しかし、デキストランのコンジュゲートはしばしば、おそらくはデキストラン分解生成物により誘発される高度のアレルゲン性、低い代謝安定性、そして多くの場合にカップリング反応における低収率を示す。このためこれらのデキストランのカップリング生成物の中で、現在までにヒトまたは動物における治療使用のために承認されたものはない。
【０００９】
ＰＥＧを用いた誘導体化ははるかにより頻回に実施されてきたので、現在はこの方法がタンパク質の分子量を増加させるための標準方法であると見なすことができる。これらの誘導体の一部は、米国では種々の相における臨床試験中であるか、あるいは既に承認されている。ＰＥＧ−ヘモグロビンは、ポリマーカップリングに関連して最も多く調査されてきたタンパク質であるスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）のＰＥＧ付加物と同様に、現在第III相試験中である。ＰＥＧにカップリングしたアスパラギナーゼは、既に急性リンパ球性白血病の治療に使用されている。２００１年には、ＰＥＧ−インターフェロン−αがＣ型肝炎患者の治療のために承認された。
【００１０】
しかしこれらのＰＥＧコンジュゲートの使用に関しては、掻痒、過敏性反応および膵炎等の不快感から危険性を伴う程度までの副作用が報告されている。さらに、ＰＥＧカップリング後には頻回にタンパク質の生物学的活性が大きく低下し、ＰＥＧコンジュゲートの分解産物の代謝についてはまだ実質的に解明されておらず、健康上の危険性が生じる可能性がある。
【００１１】
国際特許出願第99/49897号は、ヒドロキシエチルデンプンまたはデキストラン等の酸化開環させた多糖のアルデヒド基をタンパク質の第一級アミン基と反応させることにより形成されるヘモグロビンのコンジュゲートについて記載している。しかしこの場合、使用された多糖は多官能試薬として機能し、調整するのが困難な特性を備える極めて不均一な生成混合物を生じさせる。
【００１２】
米国特許第6,083,909号は、選択的に酸化されたヒドロキシエチルデンプンをＤＭＳＯ中のヘモグロビンへカップリングさせる方法を記載している。しかし本発明者らの調査では、ヘモグロビンはＤＭＳＯ中では変性するために生物学的活性を消失するので、上記の条件下で所望の生成物を入手することはできないことが証明された。
【００１３】
そこで今なお、生理学的に良好に忍容され、それを用いるとタンパク質の溶解性を改善できる、またはタンパク質の血漿滞留時間を増加させることのできる、デキストランまたはＰＥＧにカップリングしたタンパク質の代替物に対する必要性が存在する。
【発明の開示】
【００１４】
このため、本発明の１つの目的はそのような代替物を提供すること、そしてそのような代替タンパク質誘導体を調製するための単純かつ効率的な方法を開発することである。
【００１５】
本発明によると、この目的は、ヒドロキシアルキルデンプン−タンパク質コンジュゲートであって、ヒドロキシアルキルデンプン分子とタンパク質との結合相互作用が、ヒドロキシアルキルデンプン分子の末端アルデヒド基もしくはこのアルデヒド基から化学反応によって誘導された官能基と、ヒドロキシアルキルデンプン分子のこのアルデヒド基もしくはそれから誘導された官能基と反応することのできるタンパク質の官能基と、の間のカップリング反応の結果である共有結合に基づき、必要に応じて、カップリング反応から直接生じる結合を上記の共有結合を生じさせる別の反応によって修飾できることを特徴とするコンジュゲートによって達成される。
【００１６】
本発明にはさらに、これらのコンジュゲートを含む医薬組成物、ヒトもしくは動物の身体における予防療法または治療のためのこれらのコンジュゲートおよび組成物の使用、ならびにこれらのコンジュゲートおよび組成物を調製する方法が含まれる。
【００１７】
驚くべきことに、上記に記載した反応は、条件を適切に選択すると水溶液中で実施することができるので、したがって多くの場合にタンパク質の生物学的活性を完全に、または部分的に保持できることが見いだされている。
【００１８】
この場合、カップリング反応のための水性反応溶媒は、好ましくは水、または水と有機溶媒との混合液であって、この混合液中の水の比率は重量で少なくとも約７０％、好ましくは重量で少なくとも約８０％、より好ましくは重量で少なくとも約９０％である混合液である。
【００１９】
カップリング反応におけるヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）対タンパク質のモル比は、通例は約２０：１から１：１であり、好ましくは約５：１から１：１である。
【００２０】
本発明のヒドロキシアルキルデンプン−タンパク質コンジュゲートの残留生物学的活性は、タンパク質の初期活性に対して、通例は少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、いっそうより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明により使用されるヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）は、知られている方法によって、例えば、様々な所望の分子量範囲および置換度を有する酸化アルキレンまたは２−クロロアルカノール、例えば２−クロロエタノール（例えば、デンプンのヒドロキシエチル化についての米国特許第5,218,108号を参照されたい）による、アンヒドログルコース単位のＣ2および／またはＣ6位置における、デンプンのヒドロキシアルキル化によって調製できる。さらにまた、市販で入手できるいずれかの調製物を使用することも可能である。本明細書で使用する「ヒドロキシアルキルデンプン」におけるアルキル基化の定義にはメチル、エチル、イソプロピルおよびｎ−プロピルが含まれるが、特に好ましいのはエチルである。ＨＥＳの実質的な長所は、既に生体適合性の血漿増量剤として規制官庁によって承認されており、臨床的に大規模で使用されている点にある。
【００２２】
ヒドロキシアルキルデンプンの平均分子量は、約３ｋＤ〜数百万ダルトンの範囲内、好ましくは約４ｋＤ〜約１，０００ｋＤ、より好ましくは約４ｋＤ〜約５０ｋＤの範囲内、または約７０ｋＤ〜約１，０００ｋＤの範囲内であってよいが、特に好ましいのは約１３０ｋＤである。小さなタンパク質へカップリングさせるためには、ヒドロキシアルキルデンプンの平均分子量は好ましくはそのコンジュゲートを用いて上記に言及した７０ｋＤの閾値を超えるように選択される。他方大きなタンパク質をカップリングさせるためには、ヒドロキシアルキルデンプンの分子量は好ましくは前記範囲のより低い領域内であろう。カップリングはタンパク質内の複数の部位で可能であるが、１つの高分子量の代わりに複数の小さなポリマー鎖をカップリングさせるのが有益な場合がある。置換度（修飾されたアンヒドログルコース単位の数のアンヒドログルコース単位の総数に対する比率）も同様に変動する可能性があり、頻回には約０．２〜０．８、好ましくは約０．３〜０．７の範囲内にあり、より好ましくは約０．５である（注意：数は、０〜１である「置換度」に関連する）。Ｃ6に対するＣ2の置換(ratio of C2 to C6 substitution)の比率は、通例は４〜１６、好ましくは８〜１２の範囲内にある。
【００２３】
これらのパラメーターは、知られている方法によって調整できる。ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）の代用血液としての使用についての経験は、ＨＥＳの血漿中滞留時間が分子量、置換度、および置換のタイプ（Ｃ2置換またはＣ6置換）に依存しており、分子量が大きいほど、置換度が高いほど、そしてＣ2置換の比率が高いほど滞留時間が増加することを証明している。
【００２４】
これらの関係は本発明のヒドロキシアルキルデンプン−タンパク質コンジュゲートにも該当するので、血漿中の特定コンジュゲートの滞留時間は多糖の比率によって調整することができる。
【００２５】
１３０ｋＤの平均分子量および０．５の置換度を備える、および２００ｋＤの平均分子量および０．２５の置換度を備えるヒドロキシエチルデンプン生成物は、既に代用血液として臨床的に使用されているので、本発明に使用するためにも適合する。
【００２６】
本発明において適切なタンパク質は、基本的には、ＨＡＳ分子の官能基と反応するために必要な官能基、例えば遊離アミノ基、チオール基またはカルボキシル基を有するあらゆるタンパク質である。
【００２７】
所望の官能基は、同様にタンパク質を適切な生理的に忍容される二官能性リンカー分子と反応させることによって導入することもできる。リンカー分子上でカップリングした残りの反応性官能基は、その後は同様に本発明のための「タンパク質の反応性官能基」と見なされる。
【００２８】
適切なリンカー分子は、一方の端ではタンパク質の反応性官能基と共有結合することのできる基群、例えばアミノ基、チオール基、もしくはカルボキシル基を、そして他方の端では同様に末端アルデヒド基または化学反応によってそれから誘導された官能基と共有結合することのできる基群、例えばカルボキシル基、活性化カルボキシル基、アミノ基もしくはチオール基を含んでいる。リンカー分子の２つの官能基間には、適切な長さの生体適合性架橋分子、例えばアルカン由来の基群、（オリゴ）アルキレングリコール基群またはその他の適切なオリゴマー基群がある。アミノ基と反応することのできる好ましい基群は、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、イミドエステルまたはその他の活性化カルボキシル基である；チオール基と反応することのできる好ましい基群は、例えばマレイミド基およびカルボキシル基である；アルデヒド基またはカルボキシル基と反応することのできる好ましい基群は、例えばアミノ基またはチオール基である。
【００２９】
ＳＨ官能基とＮＨ官能基とを結び付けるためのリンカー分子の例は、
ＡＭＡＳ  （Ｎ−α（マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステル）
ＢＭＰＳ  （Ｎ−β（マレイミドプロピルオキシ）スクシンイミドエステル）
ＧＭＢＳ  （Ｎ−γ（マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステル）
ＥＭＣＳ  （Ｎ−ε（マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミドエステル）
ＭＢＳ  （ｍ（マレイミドベンゾイル）−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）
ＳＭＣＣ  （スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）
ＳＭＰＢ  （スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート）
ＳＰＤＰ  （スクシンイミジル３−（２−スルホ−ピリジルジチオ）プロピオネート）
Ｓｕｌｆｏ−ＧＭＢＳ  （Ｎ−γ（マレイミドブチリルオキシ）スルホスクシンイミドエステル）
Ｓｕｌｆｏ−ＥＭＣＳ  （Ｎ−ε（マレイミドカプロイルオキシ）スルホスクシンイミドエステル）、である。
【００３０】
ＳＨ官能基とＳＨ官能基とを結び付けるためのリンカー分子の例は、
ＢＭＢ  （１，４−ビス−マレイミドブタン）
ＢＭＤＢ  （１，４−ビス−マレイミド−２，３−ジヒドロキシブタン）
ＢＭＨ  （ビス−マレイミドヘキサン）
ＢＭＯＥ  （ビス−マレイミドエタン）
ＤＴＭＥ  （ジチオ−ビス−マレイミドエタン）
ＨＢＶＳ  （１，６−ヘキサン−ビス−ビニルスルホン）
ＢＭ（ＰＥＯ）3  （１，８−ビス−マレイミドトリエチレングリコール）
ＢＭ（ＰＥＯ）4  （１，１１−ビス−マレイミドテトラエチレングリコール）、である。
【００３１】
ＮＨ官能基とＮＨ官能基とを結び付けるためのリンカー分子の例は、
ＢＳＯＣＯＥＳ  （ビス−（２−スクシンイミジルオキシカルボニルオキシ）エチル）スルホン
ＢＳ3  （ビス−（スルホスクシンイミジル）スベレート）
ＤＦＤＮＢ  （１，５−ジフルオロ−２，４−ニトロベンゼン）
ＤＭＡ  （ジメチルアジピミデート塩酸）
ＤＳＧ  （ジスクシンイミジルグルタレート）
ＤＳＳ  （ジスクシンイミジルスベレート）
ＥＧＳ  （エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）、である。
【００３２】
ＳＨ官能基とＣＨＯ官能基とを結び付けるためのリンカー分子の例は、
ＢＭＰＨ  （Ｎ−（β−マレイミドプロピオン酸）ヒドラジドＴＦＡ）
ＥＭＣＡ  （Ｎ−（ε−マレイミドカプロン酸）ヒドラジド）
ＫＭＵＨ  （Ｎ−（κ−マレイミドウンデカン酸）ヒドラジド）
Ｍ2Ｃ2Ｈ  （４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシルヒドラジド塩酸）
ＭＰＢＨ  （４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）ブチル酸ヒドラジド塩酸）
ＰＤＰＨ  （３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド）、である。
【００３３】
ＳＨ官能基とＯＨ官能基とを結び付けるためのリンカー分子の例は、
ＰＭＰＩ  （Ｎ−（ｐ−マレイミドフェニル）イソシアネート）である。
【００３４】
ＳＨ官能基をＣＯＯＨ官能基へ転換させるためのリンカー分子の例は、
ＢＭＰＡ  （Ｎ−β−マレイミドプロピオン酸）
ＥＭＣＨ  （Ｎ−β−マレイミドカプロン酸）
ＫＭＵＡ  （Ｎ−κ−マレイミドウンデカン酸）、である。
【００３５】
ＮＨ官能基をＣＯＯＨ官能基へ転換させるためのリンカー分子の例は、ＭＳＡ（メチルＮ−スクシンイミジルアジペート）もしくはその長鎖ホモログまたは対応するエチレングリコールの誘導体である。
【００３６】
ＣＯＯＨ官能基をＮＨ官能基へ転換させるためのリンカー分子の例は、ＤＡＢ（１，４−ジアミノブタン）もしくはその長鎖ホモログまたは対応するエチレングリコールの誘導体である。
【００３７】
立体障害を回避するために分子のアミノ基と反応してこの分子から遠く離れた部位で保護アミノ基を提供するリンカー分子の例は、ＴＦＣＳ（Ｎ−ε（トリフルオロアセチルカプロイルオキシ）−スクシンイミドエステル）である。
【００３８】
また別の適切なリンカー分子は当業者には知られていて市販で入手できる、または必要に応じて、ＨＡＳおよびカップリングされるタンパク質内で存在して所望である官能基に依存して設計し、知られている方法によって調製できる。
【００３９】
本発明のための用語「タンパク質」は、少なくとも９〜１２アミノ酸、好ましくは少なくとも１５アミノ酸、より好ましくは少なくとも２５アミノ酸、特に好ましくは少なくとも５０アミノ酸を含むあらゆるアミノ酸配列を含み、そしてさらに天然誘導体、例えばプレ形もしくはプロ形、糖タンパク質、リンタンパク質、もしくは合成修飾誘導体、例えば融合タンパク質、ネオ糖タンパク質、または遺伝子工学法により修飾されたタンパク質、例えば融合タンパク質、好ましいカップリング部位へ導入するためのアミノ酸置換を備えるタンパク質を含むことが意図されている。
【００４０】
ヒトまたは動物の身体における予防療法または治療のためには、当該タンパク質は身体内で特定の所望機能を実施する。このため本タンパク質は、好ましくは例えば調節もしくは触媒機能、シグナル伝達もしくは輸送機能、または免疫反応機能もしくは免疫反応の誘導機能を有する。
【００４１】
本タンパク質は、例えば酵素、抗体、抗原、輸送タンパク質、生体接着タンパク質、ホルモン、成長因子、サイトカイン、受容体、サプレッサー、アクチベーター、インヒビターまたはそれらの機能的誘導体もしくはフラグメントからなる群から選択することができる。「機能的誘導体もしくはフラグメント」とは、この関連において親分子の例えば少なくとも１０〜３０％、好ましくは５０％を超える、いっそうより好ましくは７０％を超える、最も好ましくは９０％を超える程度までの全部または一部の所望の生物学的特性もしくは活性を維持している誘導体もしくはフラグメントを意味する。そのようなフラグメントの特に好ましい例は、抗体フラグメントである。
【００４２】
特定の例は、α−、β−もしくはγ−インターフェロン、インターロイキン、例えばＩＬ−１からＩＬ−１８、成長因子、例えば上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板成長因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、脳由来成長因子（ＢＤＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、Ｂ細胞成長因子（ＢＣＧＦ）、脳由来神経栄養成長因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養成長因子（ＣＮＴＦ）、トランスフォーミング成長因子、例えばＴＧＦ−αもしくはＴＧＦ−β、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えばＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＢＭＰ（骨形態形成タンパク質）、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦ−αもしくはＴＮＦ−β、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ソマトメジン、血清タンパク質、例えば第II〜XIII凝固因子、アルブミン、エリスロポイエチン、ミオグロビン、ヘモグロビン、プラスミノーゲンアクチベーター、例えば組織プラスミノーゲンアクチベーター、ホルモンもしくはプロホルモン、例えばインスリン、ゴナドトロピン、メラノサイト刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）、トリプトレリン、視床下部ホルモン、例えば抗利尿ホルモン（ＡＤＨ）およびオキシトシン、ならびにリベリンおよびスタチン、副甲状腺ホルモン、甲状腺ホルモン、例えばチロキシン、チロトロピン、チロリベリン、プロラクチン、カルシトニン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２等）、エキセンジン、例えばエキセンジン−４、レプチン、バソプレシン、ガストリン、セクレチン、インテグリン、糖タンパク質ホルモン（例、ＬＨ、ＦＳＨ等）、色素性ホルモン、リポタンパク質およびアポリポタンパク質、例えばＡｐｏ−Ｂ、Ａｐｏ−Ｅ、Ａｐｏ−Ｌa、免疫グロブリン、例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤもしくはそれらのフラグメント、ヒルジン、組織経路インヒビター、植物タンパク質、例えばレクチンもしくはリシン、ミツバチ毒、ヘビ毒、免疫毒素、Ｅ抗原、ｂｕｔｒｏｘｏｂｉｎａ、α−プロテイナーゼインヒビター、ブタクサアレルゲン、メラニン、オリゴリシンタンパク質、ＲＧＤプロタンパク質、または、必要に応じてこれらのタンパク質の１つに対する対応する受容体；あるいはこれらのタンパク質もしくは受容体の機能的誘導体もしくはフラグメントである。
【００４３】
適切な酵素は、例えば炭水化物特異的酵素、タンパク質分解酵素、オキシダーゼ（酸化酵素）、オキシドレダクターゼ（酸化還元酵素）、トランスフェラーゼ（転移酵素）、ヒドロラーゼ（加水分解酵素）、リアーゼ（脱離酵素）、イソメラーゼ（異性化酵素）、キナーゼ（リン酸化酵素）およびリガーゼ（合成酵素）からなる群から選択することができる。特定の非限定的例は、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、グルタミナーゼ、グルタミナーゼ−アスパラギナーゼ、フェニルアラニンアンモニア−リアーゼ、トリプトファナーゼ、チロシナーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、エンドトキシナーゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、カリクレイン、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、サーモリシン、リパーゼ、ウリカーゼ、アデノシンジホスファターゼ、プリン−ヌクレオシドホスホリラーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコダーゼ、グルコン酸オキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヒアルロニダーゼ、組織因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、ＭＡＰキナーゼ、ＤＮＡ分解酵素、ＲＮＡ分解酵素、ラクトフェリン、およびそれらの機能的誘導体もしくはフラグメントである。
【００４４】
上記で言及したように、カップリング反応に含まれるＨＡＳ分子の官能基は、末端アルデヒド基もしくは化学反応によってそれらから誘導された基である。
【００４５】
そのような化学反応の１つの例は、例えばヨウ素、臭素もしくはその他の金属イオン等の軽度の酸化剤を用いての、あるいは必要に応じて第二反応において活性化誘導体内へ転換されるカルボキシル基を用いての、カルボキシル基もしくは活性化カルボキシル基、例えばエステル、ラクトン、アミドへの電気化学的酸化による、このアルデヒド基の選択的酸化である。このカルボキシル基もしくは活性化カルボキシル基はその後、タンパク質の第一級アミノ基またはチオ−ル基へカップリングさせてアミド結合またはチオエステル結合を形成することができる。
【００４６】
特に好ましい調製法では、このアルデヒド基は塩基性水溶液中でヨウ素対ＨＡＳのモル比が好ましくは２：１から２０：１、特に好ましくは約５：１から６：１の過剰モルのヨウ素を用いて選択的に酸化される。実施例１に記載の最適化された方法では、最初に所定量のヒドロキシアルキルデンプンが高温蒸留水中に溶解させられ、そして好ましくは約０．０５〜０．５Ｎ、特に好ましくは約０．１Ｎの濃度で１モル当量よりいくらか低いヨウ素水溶液が添加される。この後に、ヨウ素溶液の約５〜１５倍、好ましくは約１０倍のモル濃度のＮａＯＨ水溶液が、添加後に溶液が再び透明になり始めるまで、反応溶液へ数分の間隔をおいて緩徐に滴下により添加される。１モル当量よりいくらか低い上記のヨウ素水溶液が再び反応溶液へ添加され、滴下によるＮａＯＨ溶液の添加が再開され、ヒドロキシアルキルデンプンに対して、約５．５〜６モル当量のヨウ素溶液および１１〜１２モル当量のＮａＯＨ溶液が添加されるまで、ヨウ素およびＮａＯＨの添加が繰り返される。その後この反応が停止させられ、反応溶液は例えば透析または限外濾過によって脱塩され、陽イオン交換クロマトグラフィーにかけられ、そして凍結乾燥法によって反応生成物が入手される。この方法では、ＨＡＳの分子量とは無関係に実質的な定量的収率が達成される。
【００４７】
また別の特に好ましい実施形態では、選択的酸化は、同様にほぼ定量的収率で金属イオン、例えばＣｕ++またはＡｇ+のアルカリ安定化溶液を用いて行われる（実施例２）。この場合には、およそ３〜１０倍過剰モルの酸化剤を使用することが好ましい。
【００４８】
形成された、選択的に酸化されたヒドロキシアルキルデンプン（ｏｘ−ＨＡＳ）は、引き続いて活性化試薬の存在下で所望のタンパク質の遊離アミノ基と反応させられてアミド結合を形成する。適切な活性化試薬の例は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、チオフェノール、ｐ−ニトロフェノール、ｏ，ｐ−ジニトロフェノール、トリクロロフェノール、トリフルオロフェノール、ペンタクロロフェノール、ペンタフルオロフェノール、１−ヒドロキシ−ｌＨ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、ＨＯＯＢｔ、ＨＮＳＡ、２−ヒドロキシピリジン、３−ヒドロキシピリジン、３，４−ジヒドロ−４−オキソベンゾトリアジン−３−オール、４−ヒドロキシ−２，５−ジフェニル−３（２Ｈ）−チオフェノン１，１−ジオキシド、３−フェニル−ｌ−（ｐ−ニトロフェニル）−２−ピラゾリン−５−オン）、［１−ベンゾ−トリアゾリル−Ｎ−オキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート］（ＢＯＰ）、［１−ベンゾトリアゾリルオキシトリピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、［Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、［Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、［Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ビス（ペンタメチレン）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート、［Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ビス（テトラメチレン）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、または好ましくはカルボジイミド、例えば１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）、特に好ましくはＥＤＣである。類似のカップリング反応についての参考文献に記載された従来型方法とは対照的に、驚くべきことにこの関連において、原則としてカルボジイミドを使用すると、さもなければ必須のトリアゾール等のまた別の活性化剤、例えばＨＯＢｔの使用は不要であり、それらを使用すると収率がさらに悪化さえすることが見いだされている。これとは対照的に、ＥＤＣの存在下およびＨＯＢｔの不在下での様々なモデル化合物へのｏｘ−ＨＡＳの本発明のカップリング反応では、ＨＥＳの分子量とは実質的に無関係に高い収率を達成することが可能であった（実施例を参照）。
【００４９】
カルボキシル基もしくは活性化カルボキシル基とタンパク質の遊離第一級アミノ基（例、リシンまたはアルギニン残基）との反応の代わりに、タンパク質のチオール基との類似の反応もまた基本的には可能である。しかしながら、これに関連して、システインは通例Ｓ−Ｓ架橋に含まれているため、カップリング反応には利用できないことを考慮に入れなければならない。他方、遊離システインが存在する場合は、それらは頻回に触媒作用において重要な役割を果たす、またはサブユニットの接触部位に含まれている。これらのシステインの修飾は、次に生物学的活性の部分的または完全な消失を生じさせるであろう。この問題は、従来型の遺伝子工学方法、例えばタンパク質におけるその活性には何の役割も果たさないことが知られている部位での指向性突然変異誘発または化学的ペプチド合成により遊離システインを導入することによって排除できよう。この方法でカップリング部位を最適に制御することができる。タンパク質内への他の反応性アミノ酸、例えばＬｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕの標的を絞った導入もまた同様の方法で可能であろう。
【００５０】
ヒドロキシアルキルデンプン分子の反応性基は、さらにまた末端アルデヒド基の化学反応により産生したアミン基またはチオール基であってよい。例えば、アルデヒド基の還元アミノ化は、水素および触媒の存在下またはシアノ水素化ホウ素ナトリウムの存在下でのアンモニアとの反応によって実施できる。結果として生じたアミノ基またはチオール基は、その後タンパク質（例、任意で活性化されたグルタミン酸またはアスパラギン酸）の遊離カルボキシル基と反応させてアミド結合またはチオエステル結合を形成することができる。
【００５１】
また別の可能性は、ヒドロキシアルキルデンプン分子の末端アルデヒド基または化学反応によってそれから誘導された官能基を適切な生理的に忍容される二官能性リンカー分子と反応させることである。この場合には、カップリング反応のための「化学反応によりヒドロキシアルキルデンプン分子の末端アルデヒド基から誘導された官能基」は、それと末端アルデヒド基もしくはそれから誘導された官能基が反応させられている二官能性リンカー分子の残りの反応性官能基である。同様にこの方法で末端アルデヒド基を所望の官能基へ転換させることも可能である。
【００５２】
適切なリンカー分子は、一方の端で末端アルデヒド基もしくは化学反応によってそれから誘導された官能基、例えばカルボキシル基、活性化カルボキシル基、アミノ基もしくはチオール基と共有結合することのできる１つの基を、そして他方の端ではタンパク質の反応性官能基、例えばアミノ基、チオール基もしくはカルボキシル基と共有結合することのできる１つの基を含んでいる。リンカー分子の２つの官能基間には、適切な長さの生体適合性架橋分子、例えばアルカン由来の基群、（オリゴ）アルキレングリコール基群またはその他の適切なオリゴマー基群がある。アミノ基と反応することのできる好ましい基群は、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、イミドエステルまたはその他の活性化カルボキシル基である；チオール基と反応することのできる好ましい基群は、例えばマレイミド基およびカルボキシル基である；アルデヒド基またはカルボキシル基と反応することのできる好ましい基群は、例えばアミノ基またはチオール基である。
【００５３】
適切なリンカー分子の多数の特定かつ非限定的例は、タンパク質へのリンカー分子の結合に関連して既に上記に記載されている。
【００５４】
本発明のまた別の創意に富むカップリング法では、末端アルデヒド基はタンパク質の（例、リシンもしくはアルギニン残基またはＮ−末端の）第一級アミノ基と直接に反応させられてシッフ塩基を形成する。形成されたシッフ塩基は、それに引き続き、または平行して、適切な還元剤を用いた反応によって還元させられ、水性媒体中で安定性であるタンパク質とＨＡＳとの間の結合を生じさせる。好ましい還元剤は、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、有機ホウ素錯体、例えば４−（ジメチルアミノ）ピリジン−ホウ素錯体、Ｎ−エチルジイソプロピルアミン−ホウ素錯体、Ｎ−エチルモルホリン−ホウ素錯体、Ｎ−メチルモルホリン−ホウ素錯体、Ｎ−フェニルモルホリン−ホウ素錯体、ルチジン−ホウ素錯体、トリエチルアミン−ホウ素錯体、トリメチルアミン−ホウ素錯体である；適切な立体選択的還元剤は、例えば三酢酸水素化ホウ素ナトリウム、トリエチル水素化ホウ素ナトリウム、トリメトキシ水素化ホウ素ナトリウム、トリ−ｓｅｃ−ブチル水素化ホウ素カリウム（Ｋ−セレクトリド）、トリ−ｓｅｃ−ブチル水素化ホウ素ナトリウム（Ｎ−セレクトリド）、トリ−ｓｅｃ−ブチル水素化ホウ素リチウム（Ｌ−セレクトリド）、トリアミル水素化ホウ素カリウム（ＫＳ−セレクトリド）およびトリアミル水素化ホウ素リチウム（ＬＳ−セレクトリド）である。
【００５５】
収率は、反応条件を適切に変化させることにより改善することができる。そのような最適化試験のためのパラメーターは、反応混合物（水素化ホウ素アルカリにより可能なタンパク質分解）のｐＨ、インキュベーションの温度および所要時間、ならびにワンポット反応のための還元剤の性質である。また別の代替法は、２つのステップで反応を実施する可能性であり、その場合には還元ステップのために固定化還元剤を使用できる。
【００５６】
カップリング反応の生成物は知られている方法で調査することができ、そしてカップリング効率を確認することができる。そこで、例えば、タンパク質中の遊離第一級アミノ基をトリニトロベンゼンスルホン酸とのカップリングの前後に測定できる(Habeeb, ASAF, Anal. Biochem. 14, 328-336(1966))。第一級アミンを含む反応のカップリング収率は、フルオレスカミンを用いての低反応性アミンの誘導体化および蛍光の測定によって確認することもできよう。分子量分布は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびゲル透過法（ＧＰＣ）によって確認できる。コンジュゲート内のタンパク質含量はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび引き続いての銀染色によって検出できるが、他方糖含量は膜上へのブロッティング後にＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離されたバンドのグリカン特異的染色によって確認することができる。グリカンの定量的測定もまた可能である。タンパク質上のカップリング部位の正確な同定は、ペプチドマッピングおよび／またはＭＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法またはエレクトロスプレーイオン化質量分析法によって可能である。この方法を使用すると、カップリングを最適化して分子量分布やもしかすると（例えば、タンパク質上の反応性基の反応性が相違する場合は）生成物のカップリング部位さえもあらかじめ決定することが可能である。
【００５７】
本発明のコンジュゲートは、必要に応じてそれ自体で、またはヒトもしくは動物の身体における予防療法または治療のための医薬組成物の形状で使用できる。
【００５８】
このタイプの組成物には、有効成分としての医薬上有効量の本発明のコンジュゲート、および医薬上適切な担体、ならびに必要に応じてその他の治療上または医薬上の成分または賦形剤が含まれる。賦形剤には、例えば希釈剤、緩衝剤、香味料、結合剤、界面活性剤、増粘剤、潤滑剤、保存料（酸化防止剤を含む）および調製物を所定レシピエントの血液と等張性にするために役立つ物質を含むことができる。医薬上有効量とは、病理的状態を緩和する、治癒させる、または予防するための治療中に単回または複数回投与で所定の有益な作用を示すために十分な量である。医薬上容認される担体とは、医薬上の有効成分および患者の身体の両方と適合する担体である。
【００５９】
組成物の形状は、所望または適合する投与経路に依存して変動する。好ましい経路は、非経口投与、例えば皮下、筋内、静脈内、動脈内、関節内、クモ膜下、硬膜外注射、または必要に応じて注入である。鼻腔内、気管内または局所投与もまた可能である。本発明により結合された成長因子の局所投与は、例えば創傷治癒の速度を高める可能性がある。医薬組成物は、有益にも１用量単位の形状で供給する、そして製薬部門においてよく知られているいずれかの方法によって製造することができる。
【００６０】
本発明のコンジュゲートは、さらにまた他のタンパク質−ポリマーコンジュゲート、例えばＰＥＧ−タンパク質コンジュゲートが使用されているその他すべての産業部門でも使用できる。一部の特定の非限定的例は、異種相での反応のための固定化触媒もしくは反応剤としての、または（免疫）アフィニティー・クロマトグラフィーのためのカラム材料としてのＨＡＳ−タンパク質コンジュゲートの使用である。また別の考えられる使用は、本明細書に開示した本発明のＨＡＳ−タンパク質コンジュゲートの特性に関する知識を備えた当業者にはすぐに明白になるであろう。
【実施例】
【００６１】
下記の実施例は、本発明をより詳細に、しかしそれを限定せずに説明することが意図されている。特別には、類似の反応はヒドロキシメチルデンプンおよびヒドロキシプロピルデンプンを用いても実施することができ、そして類似の結果を達成できる。
【００６２】
［実施例１］
〔ヨウ素を用いたヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）の選択的酸化〕
１０ｇのＨＥＳ−１３０ｋＤを丸底フラスコ内の１２ｍＬの脱イオン水へ添加し、加熱しながら溶解させた。この溶液へ２ｍＬのＩ2溶液（０．１Ｎ）を添加した。２ｍＬの１．０ＮのＮａＯＨを含むピペットを二方活栓を介してフラスコへ接続し、４分毎に約１滴ずつの滴下によりＮａＯＨ溶液を添加した。約０．２ｍＬのＮａＯＨ溶液の添加後にこの溶液が脱色したので、この時点で２ｍＬの０．１Ｎヨウ素溶液からなる第二部分を添加した。この反応は、計１４ｍＬのヨウ素溶液および２．８ｍＬのＮａＯＨ溶液を添加した後に完了した。次にこの反応混合液を脱イオン水に対して透析した。
【００６３】
ラクトン化：
アルドン酸塩基をアルドン酸基に転換させるために、部分脱塩した溶液を陽イオン交換カラム（Amberlite IR-120、Ｈ+形）上でクロマトグラフィーにかけた。引き続いて、凍結乾燥により水分を除去したところ、ラクトン形が得られた。
【００６４】
酸化度の測定：
どの場合にも、１ｍＬのアルカリ性銅試薬（３．５ｇのＮａ2ＰＯ4、５０ｍＬのＨ2Ｏ中に溶解させた４．０ｇの酒石酸カリウムナトリウムに１０ｍＬのＩＮのＮａＯＨ、８．０ｍＬの濃度１０％（重量／容積）のＣｕＳＯ4溶液および１０ｍＬのＨ2Ｏ中に溶解させた０．０８９ｇのヨウ素酸カリウム（ＫＩ）を加え、さらに１８ｇの硫酸ナトリウムを添加した後に１００ｍＬとした）をＮ2大気下で１ｍＬのサンプル溶液中にピペットで入れた。この混合液を１００℃で４５分間加熱した。冷却した後、０．２ｍＬの濃度２．５％のＫＩ溶液および０．１５ｍＬの１ＭのＨ2ＳＯ4を添加した。５分後、フェノールレッド指示薬溶液１滴（１％（重量／体積））を添加し、５ｍＭのＮａ2Ｓ2Ｏ3を用いて色が消失するまで滴定を実施した。未反応アルデヒド基の濃度は、滴定剤の消費量から計算できる。
【００６５】
ほぼ定量的収率が達成された（＞９８％）。この方法によって、低分子量（例、１０ｋＤ、２５ｋＤ、４０ｋＤ）のヒドロキシエチルデンプンと全く同様に、高分子量（例、１３０ｋＤ、２５０ｋＤ、４００ｋＤ）のヒドロキシエチルデンプンを類似の高収率で酸化することが可能である。
【００６６】
［実施例２］
〔Ｃｕ2+イオンを用いたＨＥＳの選択的酸化〕
０．２４モルのＨＥＳ−１３０ｋＤの溶液を１０ｍＬの脱イオン水中で加熱しながら調製した。この溶液を１００ｍＬ丸底フラスコ中で７０〜８０℃の温度へ加熱し、そして１．１７モルの安定化されたＣｕ2+（例えば、安定剤としてのロッシェル塩またはその他の安定剤）および希ＮａＯＨ水溶液を添加した（最終濃度０．１ＮのＮａＯＨ）。次に温度を１００℃へ上昇させ、赤みがかった色が現れるまでこの反応を進行させた。この反応を停止させ、反応混合液を４℃へ冷却した。赤みがかった沈殿物を濾過により除去した。脱イオン水に対して濾液を透析し、次に実施例１と同様にラクトンへ転換させ、凍結乾燥した。酸化は定量的に起きた（収率＞９８％）。この方法によって低分子量ＨＥＳ（例、ＨＥＳ−１０ｋＤ、ＨＥＳ−２５ｋＤ、ＨＥＳ−４０ｋＤ）および高分子量ＨＥＳ種を酸化させることも可能であった。
【００６７】
［実施例３］
〔ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）への選択的に酸化された高分子量ＨＥＳ（ｏｘ−ＨＥＳ−１３０ｋＤ）のカップリング〕
マグネチックスターラーを装備した丸底フラスコ内で穏やかに加熱することによって、４．３ｇのｏｘ−ＨＥＳ−１３０ｋＤおよび２００ｍｇのＨＳＡ（Sigma社、タウフキルヘン）を水に完全に溶解させた。この溶液へ水に溶解させた３０ｍｇのエチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＣ）を添加した。２時間にわたり極めて穏やかに撹拌した後に、３０ｍｇのＥＤＣからなる第二部分を添加した。さらに２時間にわたり極めて穏やかに撹拌した後に、４０ｍｇのカルボジイミドからなる第三部分を添加した。反応混合液をこれらの条件下で一晩放置し、１５時間にわたり蒸留水に対して透析し、そして凍結乾燥した。カップリングの成功は、ゲル透過クロマトグラフィー、ＰＶＤＦ膜上でのブロッティング後のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび炭水化物特異的染色（Glyco-Digキット、Roche-Boehringer社、バーゼル）によって証明された。カップリング生成物の収率は約９０％であった。
【００６８】
［実施例４］
〔ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）への選択的に酸化された低分子量ＨＥＳ（ｏｘ−ＨＥＳ−１０ｋＤ）のカップリング〕
マグネチックスターラーを装備した丸底フラスコ内で７．４ｇのｏｘ−ＨＥＳ−１０ｋＤおよび５０ｍｇのＨＳＡを水に完全に溶解させた。この反応は、高分子量ＨＥＳについて上記で説明した方法によって、計２８２ｍｇのＥＤＣを３つのアリコートに分けて添加することで実施した。この反応混合液を上記で記載したように同様に透析して凍結乾燥した。分析（上記と同様）によりカップリング生成物が入手されたことが証明されたが、収率は高分子量ｏｘ−ＨＥＳとのカップリングにおけるよりいくらか低かった。
【００６９】
［実施例５］
〔ミオグロビン（Ｍｂ）へのｏｘ−ＨＥＳ−１３０ｋＤのカップリング〕
４．３ｇのｏｘ−ＨＥＳ−１３０ｋＤを水（６〜７ｍＬ）に完全に溶解させ、次に１０ｍＬの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中に溶解させた１００ｍｇのＭｂ（Sigma社、タウフキルヘン）を添加した。カップリング反応は３０ｍｇのＥＤＣを添加することにより開始させた。ＥＤＣの添加は、計９０ｍｇのカルボジイミドが消費されるまで２時間毎に繰り返した。この反応混合液を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、凍結乾燥した。ＧＰＣは明確な生成物のピークを示したが、これは滞留容積中において４５０ｎｍで検出された。これから８８％のカップリング収率を計算することができた。ＨＥＳ結合(hesylated)ミオグロビンの酸素結合能力は、未修飾Ｍｂの結合能力の約７６％であった。
【００７０】
［実施例６］
〔スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）へのｏｘ−ＨＥＳ−１０ｋＤのカップリング〕
容積で１部のｏｘ−ＨＥＳ−１０ｋＤ（１．０５ｇ／ｍＬ）水溶液を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）中に溶解させた容積で１部のＳＯＤ溶液（７ｍｇ／ｍＬ）（Sigma社、タウフキルヘン）と一緒に室温でインキュベートした。カップリング反応は、２４時間にわたって２８０ｍｇのＥＤＣを５回に分けて添加することにより開始させた。反応の進行はリン酸緩衝液中でのＧＰＣ分析により追跡し、２８０ｎｍで検出した。２４時間後、分離カラムの高分子量領域で８１％のタンパク質が所見されたため、この時点で反応を停止させた。この反応混合液に３０ｋＤ膜を用いたダイアフィルトレーションを受けさせ、その後で凍結乾燥した。生成物についての質量分析は、約３：１のＨＥＳ：タンパク質の平均モル比を示した。
【００７１】
［実施例７］
〔ｏｘ−ＨＥＳ−１３０ｋＤのストレプトキナーゼ（ＳＫ）へのカップリング〕
極めて少量の５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中へ、３．８ｋｇのｏｘ−ＨＥＳ−１３０ｋＤを３５ｍｇのストレプトキナーゼ（Sigma社、タウフキルヘン）と一緒に溶解させた。室温で、４６．５ｍｇのＥＤＣおよび２０ｍｇの１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢｔ）を添加し、計２４時間にわたり穏やかに撹拌しながら反応を維持させた。透析および凍結乾燥後、ＧＰＣ分析によってＨＥＳコンジュゲートとして７８％のタンパク質が所見された。銀染色法を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、ストレプトキナーゼの分子量の明確な増加を観察することができた。これと平行して、ジゴキシゲニン法を用いて炭水化物構造を高分子周波帯で明白に検出することができた。
【００７２】
［実施例８］
〔ｏｘ−ＨＥＳ−１３０ｋＤのヒトインターロイキン−１（ＩＬ−２）へのカップリング〕
４５ｍｇのｏｘ−ＨＥＳ−１３０ｋＤを０．５ｍＬの５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）中へ穏やかに加熱しながら完全に溶解させた。０．２５ｍｇのヒトＩＬ−２（Sigma社、タウフキルヘン）を添加すると溶液は不透明になり、その後この混合液を４〜６時間にわたり室温で撹拌した。次に各２時間の間隔をあけて５ｍｇのＥＤＣを４回に分けて添加して一晩撹拌し続けると、透明な溶液が生じた。ＧＰＣ分析により、約６５％のカップリング収率が明らかになった。
【００７３】
［実施例９］
〔ｏｘ−ＨＥＳ−２５ｋＤのヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）へのカップリング〕
０．３ｍｇのｈＴＮＦα（Sigma社、タウフキルヘン）を０．４ｍＬの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中に溶解させた８６ｍｇのｏｘ−ＨＥＳ−２５ｋＤへ添加した。濁った溶液を約２時間撹拌し、その後に１ｍｇのＥＤＣおよび０．５ｍｇのＨＯＢｔを添加した。約６時間にわたり撹拌し続けると、その反応時間中に溶液は透明になった。限外濾過法によりカップリング生成物を単離し、凍結乾燥し、そしてＧＰＣにより分析して２８０ｎｍで検出した。この場合は、およそ７４％のカップリング収率が見いだされた。
【００７４】
［実施例１０］
〔ｏｘ−ＨＥＳ−１３０ｋＤのグルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−１）へのカップリング〕
７．４ｇのｏｘ−ＨＥＳ−１３０ｋＤを加熱かつ穏やかに撹拌することにより極めて少量の水中へ溶解させた。５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中のアミド形にある１０ｍｇのＧＬＰ−１（Bachem社、スイス）溶液をピペットで添加した。反応は３５ｍｇのＥＤＣを添加することにより開始させ、２時間にわたり注意深く撹拌した。これを２回以上繰り返したが、それはこの時間後には２８０ｎｍでのＧＰＣ分析でペプチドピークがもはや明白にはならなかったため、すなわちカップリング生成物へのほぼ完全な転換が発生したためであった。３０ｋＤ膜を使用してこのカップリング生成物をダイアフィルトレーションにかけ、そしてリン酸緩衝液から凍結乾燥した。ＭＡＬＤＩ質量分析法の結果からペプチドとＨＥＳとの間の化学量論比が１：１であると結論することができた。
【００７５】
［実施例１１］
〔高分子量ＨＥＳ（ＨＥＳ−１３０ｋＤ）のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）へのカップリング〕
９．７５ｇのＨＥＳ−１３０ｋＤを水（６〜７ｍＬ）に完全に溶解させ、次に１ｍＬの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に溶解させた５０ｍｇのＨＳＡを添加した。この反応混合液をマグネチックスターラーを用いて撹拌した。次にこの溶液をＮａＢＨ3ＣＮ（５０〜７０ｍｇ）と混合し、数分間穏やかに撹拌した。この溶液をさらに２時間毎に１５分間ずつ撹拌した。さらにＮａＢＨ3ＣＮ（約５０ｍｇ）のまた別のアリコートを添加した。最終的には（ほぼ３６時間の反応時間後）、総量２８５ｍｇのＮａＢＨ3ＣＨＮを使用していた。この溶液をその後透析し、凍結乾燥した。分析は実施例４に記載した通りに実施した。カップリング効率は約６５％であった。
【００７６】
［実施例１２］
〔低分子量ＨＥＳ（ＨＥＳ−１３０ｋＤ）のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）へのカップリング〕
４．５ｇのＨＥＳを水（４〜５ｍＬ）に完全に溶解させ、その後１ｍＬの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に溶解させた５０ｍｇのＨＳＡを添加した。溶液が透明になったときに、マグネチックスターラーを用いた撹拌によって実行して必要な場合は、ＮａＢＨ4（５０〜７０ｍｇ）を添加し、穏やかに撹拌しながら混合した。この溶液を２時間にわたり撹拌ぜずに放置し、次に高分子量ＨＥＳとの反応の場合と同様に、２時間毎に１５分間ずつ撹拌した。溶液が気泡（Ｈ2発生）をもはや示さなくなったときに、また別のＮａＢＨ4（約５０ｍｇ）のアリコートを添加した。最終的には、総量１８０ｍｇのＮａＢＨ4を使用していた。この溶液をその後透析して凍結乾燥した。ゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって分析を実施したところ、収率は約１５％であった。
【００７７】
［実施例１３］
〔ＨＥＳ−４０ｋＤのアスパラギナーゼへのカップリング〕
３．０ｇのＨＥＳ−４０ｋＤを水（約４ｍＬ）に完全に溶解させた。それに６ｍＬの０．１Ｍホウ酸塩緩衝液（ｐＨ９．０）中に溶解させた８０ｍｇのアスパラギナーゼ（Sigma社、タウフキルヘン）の溶液を添加し、この反応混合液が透明になるまで撹拌した。次に温度を３７℃へ上昇させ、そして２時間後に約５０ｍｇのＮａＢＨ3ＣＮを添加した。この反応サイクルを３回以上繰り返した。０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に対して反応混合液を透析することによって生成物を作製した。カップリング生成物の収率は約６１％であり、アスパラギナーゼ活性の約７３％を回収することができた。
【００７８】
［実施例１４］
〔ＨＥＳ−１３０ｋＤのヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）へのカップリング〕
５０ｇのＨＥＳ−１３０ｋＤを水（約０．２ｍＬ）に完全に溶解させた。それに０．２ｍＬの０．１Ｍホウ酸塩緩衝液（ｐＨ９．０）中に溶解させた０．２５ｍｇのヒトＩＬ−２（Sigma社、タウフキルヘン）の懸濁液を添加し、反応混合液が透明になるまで（４時間）撹拌した。ＮａＢＨ3ＣＮの１ｍｇ部分を各４時間間隔で添加し、そして撹拌し続けた。さらに２４時間の反応時間後、この混合液を０．１ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に対して透析し、凍結乾燥した。カップリング生成物の収率は、ＧＰＣ分析によると約４２％であった。
【００７９】
［実施例１５］
〔ＨＥＳ−１３０ｋＤのインスリンへのカップリング〕
４．０ｇのＨＥＳ−１３０ｋＤを水（約６ｍＬ）に完全に溶解させた。それに７．５ｍＬの０．１Ｍホウ酸塩緩衝液（ｐＨ９．０）中に溶解させた５５ｍｇのウシ膵由来インスリン（Sigma社、タウフキルヘン）を添加し、約２４時間にわたり３７℃で撹拌した。還元剤ＮａＢＨ3ＣＮ（３０ｍＬ中の６０ｍｇ）を８時間にわたり滴下により緩徐に添加した。この反応混合液をさらに２４時間にわたり撹拌し、限外濾過法（３０ｋＤ）により塩および未反応試薬を取り除いた。凍結乾燥すると安定性カップリング生成物が得られた。使用したインスリンの約５５％がＨＥＳコンジュゲートとして回収された。
【００８０】
［実施例１６］
〔ｏｘ−ＨＥＳ−１３０ｋＤのスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）へのカップリング〕
１３０ｍｇのｏｘ−ＨＥＳ−１３０ｋＤを６ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ６）中に完全に溶解させ、次に１ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ６）中に溶解させた１０ｍｇのＳＯＤ（Roche社、マンハイム）を添加した。カップリング反応は、１０ｍｇのＥＤＣを添加することにより開始させた。ＥＤＣの添加は、３９ｍｇのカルボジイミドが消費されるまで３時間毎に繰り返した。この反応をＧＰＣにより２５８ｎｍで監視した。２４時間後、分離カラムの高分子量領域で５０％のタンパク質が所見されたので反応を停止させた。この反応混合液を２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に対して透析し、凍結乾燥した。ＳＯＤ活性は初期活性の９５％であった。カップリングしたＧＰＣ−光散乱法によるＨＥＳタンパク質サンプルの質量分布の測定によって、ＨＥＳ対タンパク質の１：１のモル比が明らかになった。
【００８１】
［実施例１７］
〔ｏｘ−ＨＥＳ−７０ｋＤのグルカゴンへのカップリング〕
グルカゴン（６６×１０-9モル、０．２３ｍｇ）、ｏｘＨＥＳ−７０ｋＤ（６．６×１０-6モル、１２３ｍｇ）を丸底フラスコ内のリン酸緩衝液（１ｍＬ、ｐＨ５）中に溶解させた。２６ｍｇのＥＤＣを１時間間隔で１０回に分けて添加した。２４時間の反応時間後、水１０ｍＬを添加することで反応を停止させた。カップリング生成物は、水に対して透析した後にＧＰＣおよびイオン交換クロマトグラフィーによって精製した。凍結乾燥により、８８ｍｇの白色カップリング生成物（７３％）が得られた。
【国際調査報告】
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