(57)【要約】  【課題】主としてマイクロ滴定プレート（ＭＴＰ）での試料分析において、それも特に試料の検査および／または診断において，試料光Ｌのスペクトル分割および複数検出チャネルによる検出を行う、さらに検出チャネルの少なくとも一部において個別チャネル信号の合算および／または集約を少なくとも１回行う、多量の試料処理が可能な、試料担体上および／または試料担体中の蛍光性、ルミネセンス発光性および／または吸光性物質の同定のための方法および／または装置であって、ただし好ましくは、試料担体上に検査物質（ＰＲＢ）と共に少なくとも１つの標準試料（ＳＴＤ）および／または少なくとも１つのブランク試料（ＢＬＫ）が配置されていて、第１段階で少なくとも１つの標準試料（ＳＴＤ）のスペクトルが記録されるものとする。
2005513497.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
主としてマイクロ滴定プレート（ＭＴＰ）での試料分析、特に試料の検査および／または診断において、
試料光のスペクトル分割および複数検出チャネルによる検出、
さらに検出チャネルの少なくとも一部において個別チャネル信号の合算および／または集約を少なくとも１回行う、
多量の試料処理が可能な、試料担体上および／または試料担体中の蛍光性、ルミネセンス発光性および／または吸光性物質の同定のための方法および／または装置。
【請求項２】
試料担体上に検査物質（ＰＲＢ）と共に、少なくとも１つの標準試料（ＳＴＤ）および／または少なくとも１つのブランク試料（ＢＬＫ）が配置されている、請求項１に記載の方法および／または装置。
【請求項３】
第１段階で少なくとも１つの標準試料（ＳＴＤ）のスペクトルが記録される、上記請求項の１つに記載の方法および／または装置。
【請求項４】
測定のなされる観察対象のスペクトル領域（ＳＲＩ）が、好ましくは測定された標準スペクトルに基づき、自動的にまたは入力手段によって決定される、上記請求項の１つに記載の方法および／または装置。
【請求項５】
観察対象であるスペクトル領域（ＳＲＩ）の少なくとも１つに対して、対応の検出チャネルが合算される、上記請求項の１つに記載の方法および／または装置。
【請求項６】
合算検出チャネルの領域変更および／または個別検出チャネルまたはチャネルグループの遮断が行なわれる、上記請求項の１つに記載の方法および／または装置。
【請求項７】
ＰＲＢ：試料物質の測定信号、
ＳＴＤ：標準試料の測定信号、
ＢＬＫ：基礎状態（ブランク試料）の測定信号
として、
試料物質の相対信号強度が
商（ＰＲＢ−ＢＬＫ）／（ＳＴＤ−ＢＬＫ）
から求められる、上記請求項の１つに記載の方法および／または装置。
【請求項８】
ＳＴＤおよび／またはＢＬＫについて、複数試料から平均値が算出される、上記請求項の１つに記載の方法および／または装置。
【請求項９】
少なくとも１つの試料物質について、標準試料を手掛かりに、少なくとも２つの成分へのスペクトル成分分解が行われる、上記請求項の１つに記載の方法および／または装置。
【請求項１０】
成分分解によって、少なくとも２つの成分の比率が求められる、上記請求項の１つに記載の方法および／または装置。
【請求項１１】
分散素子、好ましくは格子またはプリズムが、および少なくとも１つの方向への位置分解を行う受光装置が配備されている、上記請求項の１つに記載の方法および／または装置。
【請求項１２】
受光装置がセル型検出器である、上記請求項の１つに記載の方法および／または装置。
【請求項１３】
セル型検出器が、マルチチャネルＰＭＴである、上記請求項の１つに記載の方法および／または装置。
【請求項１４】
複数の検出チャネル間でのスペクトル重点配分、検出チャネルの信号に対応する重点配分チャネルの合算および検出チャネルの合算が行われる、上記請求項の１つに記載の方法および／または装置。
【請求項１５】
重点配分描画線が直線である、上記請求項の１つに記載の方法および／または装置。
【請求項１６】
検出チャネルの信号が、変換されデジタル方式で読み出され、重点配分および総和が、コンピュータによりデジタル方式で行われる、上記請求項の１つに記載の方法および／または装置。
【請求項１７】
抵抗のカスケードによりアナログデータ加工を伴う重点配分および総和が行われる、上記請求項の１つに記載の方法および／または装置。
【請求項１８】
抵抗が調整可能である、上記請求項の１つに記載の方法および／または装置。
【請求項１９】
重点配分描画線が調整可能である、上記請求項の１つに記載の方法および／または装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料担体上または試料担体中に存在する活性化学物質の同定のための方法および装置に関するものである。スペクトル帯域全体の同時記録により、擬似陽性障害信号から活性化学物質を弁別する新しい可能性が開ける。これは、特に、多量の試料処理量が要求される応用例（ハイスループットスクリーニング、診断法）の場合に非常に重要である。
【背景技術】
【０００２】
化学分析法では、試料分析用の標準試料担体としてはマイクロ滴定プレート（ＭＴＰ）が定着している。９６，３８４または１５３６個の窪み（ウェル）が設けられたタイプがあり、それらにより相応数の試料を同時に調製および分析することが可能である。これら試料担体の型式はいわゆるＳＢＳ基準によって定められている（ｗｗｗ．ｓｂｓ．ｏｒｇ）。
【０００３】
試料の処置（溶液添加、混合、培養）と並んで化学反応の分析も重要なポイントである。ここでは、測定量として適用される各種光学パラメータが多数ある。特に薬剤作用物質の研究では様々な分析手段（アッセイ）が存在する。物理測定量としては、例えば蛍光強度（ＦＬ）、蛍光偏光（ＦＰ）、蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、蛍光寿命（ＦＬＤ）、ルミネセンス（ＬＵＭ）および吸光（ＡＢＳ）が用いられる。様々な分析型式の一覧は“Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；  ｔｈｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ”（Ｊｏｈｎ  Ｐ、Ｄｅｌｖｉｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．１９９７年刊）の第１５章に見られる。特殊分析例は第１７、１８、１９、２２、２３および２４章に記述されている。
【０００４】
簡単な分析では１波長で測定および評価がなされる。もちろん、分析に複数波長が必要なフォーマットも存在する。
【０００５】
それには次のような例がある  ：
レシオイメージング
特殊な結合パートナー（例えば、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｈ＋のような配位子）と可逆的相互作用を起こすと、その結果として当該色素（Ｉｎｄｏ−１、ＳＮＡＲＦ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．、図１１Ｂ参照）の蛍光放出ではスペクトルシフトが発生する。所定の時点に観察体積において測定した放出スペクトルには、通例２つの色素状態、すなわちＦＦ（遊離色素）とＦＢ（結合配位子を持つ色素）が関与しているが（図１１Ａ）、所定体積である場合、その相対的割合もまた、解離定数（ＫＤ）で表わされる色素、配位子間の親和性によって特徴付けられている。したがって、ＦＦとＦＢの蛍光比率は配位子濃度の尺度である。
【０００６】
ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）は、励起された蛍光団（ドナー）からもう一方の蛍光団（アクセプタ）への無ビームでの光子エネルギー移動である。その前提条件は、特に、ドナーの放出スペクトルとアクセプタの励起スペクトルのオーバーラップおよびドナーとアクセプタの緊密な空間結合である。
【０００７】
ＦＲＥＴ現象はバイオメディカル分野では、例えばイオンや代謝基質（Ｃａ２＋、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ）の濃度を、あるいはその他、例えば配位子依存性の構造変化（例えば、タンパク質の燐酸化反応状態、ＤＮＡの立体配座における変化）を測定、追跡するのに利用される。
これは、ＦＲＥＴパートナーであるドナーとアクセプタ（例えば、合成フルオロクロムＦＩＴＣとローダミン、または遺伝学上コード分類される蛍光性タンパク質ＣＦＰとＹＦＰ）を、観察対象であるイオン、代謝基質または配位子との特殊な相互作用によって２次構造に変化を見せる分子に結合させるか（例えば、宮脇その他共著寄稿論文「ＵＳＡ国立アカデミー協会会報９６号」２１３５〜２１４０ページ（１９９９年３月刊）、図１３参照）、あるいは永続的に、または周辺条件の依存下で相互作用をする２つの分子をそれぞれ１つに結合させることで実現する。
【０００８】
図１２は、ドナーとアクセプタ間の距離が異なる場合におけるＦＲＥＴパートナーのそれぞれの放出スペクトルを表わしている（Ａ−距離大でＦＲＥＴなし、Ｂ−距離小でＦＲＥＴ相互作用あり）。双方いずれの場合も、観察体積における遊離ＦＲＥＴ系と配位子結合ＦＲＥＴ系との成分差は、ＦＲＥＴ系の蛍光放出におけるスペクトル差と関連している。好ましい形態のドナー蛍光励起では、配位子結合の増減が両ＦＲＥＴパートナーの蛍光放出における逆方向の振幅変化として現われる。
【０００９】
均等時間分解蛍光法
この場合でも信号測定に２波長（ここでは６２０ｎｍと６６５ｎｍ）の比率が使用される。それに関する説明は、“Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；  ｔｈｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ”（Ｊｏｈｎ  Ｐ、Ｄｅｌｖｉｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．１９９７年刊）の第１９章に見られる。
【００１０】
ハイスループットスクリーニング
薬剤作用物質の研究において新薬開発の出発点になるのは、特殊な生物分子と相互作用する化学活性物質の探索である。当物質は、薬剤に到るまでの加工過程において最適化に役立っている。相互作用の検出は、物理的に測定可能な信号を通じて反応の検出可能な分析法によって行う。
【００１１】
いわゆる１次検査では（１０万までの）様々な物質について、その活性面に照準して分析検査する。その目的は、活性度最大の物質を選択することにある。活性度は絶対値としてではなく、標準試料または１００％対照試料と称される既知物質の活性度に対する相対値として測定される。同様の処置過程が診断法にもある−この場合、患者試料を特定の疾病パラメータに照準して試料物質に対し分析検査する。
【００１２】
上記の過程で基本的に重要なのは、常に対照物質との関連で測定する点である。操作過程の変更による測定結果の誤差を避けるため、いずれの分析でも、例えばマイクロプレートのいくつかのウェルに当該対照物質を投入して、それも同時に測定する。
測定された信号は、次式により相対信号強度に変換される：
相対信号物質＝（測定された信号物質−測定された基礎状態）／（測定された信号標準・測定された基礎状態）
基礎状態とは、検査物質または対照物質が添付されていない場合の溶液中での信号測定（ブランク測定）の対象である。ブランク測定でも標準物質の場合と同様のことが当てはまり、各分析は、例えばマイクロプレート上の当該ウェブを使用することによって測定される。
【００１３】
実際の作業では、（検出限界の定義付けをする）信号と対照物質の信号との間にできるだけ大きな有効利用測定領域が取れるように務めるべきである。分析の品質にとって重要な標識になるのは、検出反応の特殊性である。分析が特殊であればあるほど、擬似陽性／擬似陰性の結果発現が少なくなる。測定信号が陽性であるのに、反応が起きていないのが擬似陽性信号である。これは、例えばＦＬ分析で検査物質が固有の蛍光を有している場合とか、ＡＢＳ分析で検査物質に色がついている場合に起こり得る。擬似陰性信号は、信号が計測されなかったのに反応が起きている場合である。この場合も、個々の試料の生化学特性が原因になっていることがある。
【００１４】
分析による物理測定量の検出には、いわゆるマイクロプレートリーダが使用される。この装置は、その構造面からは、それぞれのウェルを透過光または投射光で照明し、感光性センサにより測定値を記録する光度計または蛍光計と比較することができる。検査のための特定波長領域の選択はカラーフィルタまたは干渉フィルタにより行う。
【００１５】
複数波長に対する一斉検出ではそれぞれを逐次測定する。当該波長は選択可能な帯域通過フィルタによって求められる。それに代わり、複数の検出器が使用されることもあり、その場合ではダイクロイック分離ミラーがそれぞれ検出器毎に当該波長領域を選択する（“Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；  ｔｈｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ”／Ｊｏｈｎ  Ｐ、Ｄｅｌｖｉｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．１９９７年刊、３５７ページ参照）。
【非特許文献１】宮脇その他共著寄稿論文「ＵＳＡ国立アカデミー協会会報９６号」２１３５〜２１４０ページ（１９９９年３月刊）、図１３
【非特許文献２】High Throughput Screening；the discovery of bioactive substances（John P,Delvin編、Marcel Dekker Inc.１９９７年刊）の第１９章
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
上記方法の短所は、選択可能な検出帯数およびその帯域が使用されたフィルタによって定まっていること、および２つ以上の波長帯域による測定では時間がかかることである。特に反応動力学の測定では短時間測定が有利である。異なった色素で波長領域がオーバーラップしている場合、隣接信号のクロストークをできる限り小さく抑えるには、現状技術では検出フィルタの帯域を極めて狭く選択しなければならない。
【００１７】
励起領域および放出領域の自由な選択には、使用装置に応じて励起光および放出光の波長を自由に選択することのできる格子型モノクロメータの備わったリーダも使用できる。この装置により、ウェブ毎に検出光のスペクトルが記録できる。勿論このプロセスもモノクロメータの走査過程に基づいて逐次的に行われる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明に基づく方法は従来法に比べ次の長所を持っている：
本発明に基づく方法によれば、同時に使用できる色素のスペクトルシグネチャの数を、すなわち、例えば同時に検査する細胞の特性数を増やすことができる。個別色素のスペクトルシグネチャが強くオーバーラップする場合、現状技術では個別色素の蛍光信号を別々に検出するには波長領域の制限が必要である。それにより検出感度が低下する。すなわち、検出器のノイズが大きくなる。それは、増幅度を高める結果である。
【００１９】
本発明に基づく方法ではこれが阻止される。さらに、非特殊性の蛍光信号である自家蛍光および測定装置の蛍光を分離除去することができる。
この方法は、測定過程で同時に記録される、複数の−それもオーバーラップしている放出スペクトル帯域を定義付けることができる。スペクトル分解の適用により、検出光信号のスペクトル成分が広い波長領域に亘って求めることができる。これにより、特殊色素のスペクトルシグネチャを測定することが可能になる。複数色素の混合如何は、スペクトルシグネチャを手掛かりに判別することができる。
なお、対照物質および基礎状態のシグネチャもそれぞれの測定の際に同時に求める。そのようにして、測定された試料信号から特殊成分を決定することができる。その際、擬似陽性または擬似陰性の結果を導く非特殊性成分は分離する。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
作用物質の選抜検査法
本発明による方法は、試料放出光のスペクトル分割による検出に基づいており、様々なスペクトル成分の総合判定による。
本発明の長所は特に次の点にある：
ＦＬ帯域の高感度同時検出
フレキシブルな検出帯域の構成
分析結果のスピーディな視覚観察の可能性
測定値の形成における、複合物の生化学特性に基づく成分弁別の可能性
【００２１】
ＭＴＰは座標系を様々な試料ポジション（ＳＢＳ基準に従い座標Ａ１、Ａ２…）により定義付けする。
図７は９６ウェル型ＭＴＰの１例である。そこには、座標１〜１２およびＡ〜Ｈのウェルが描かれており、それぞれが走査テーブルによるＸ／Ｙポジショニングを通じて、迅速、高精度に特定される。
本発明に基づく装置の場合、規格標準ＭＴＰの座標が走査テーブルの制御プログラム中に予備保存されている。また、ここではＨ１２として例示されている１ウェル内の精確なｘ／Ｘポジショニングも可能である。
【００２２】
１試料ポジション内の多重測定の場合、同じウェル座標を持ちながら、１ウェル内のポジションを、さらに定義付けする追加ポジション座標として区別される、いわゆるサブウェルデータを求める。サブウェルデータの分析は、１ウェル内の測定信号に不均質が、つまり使用システムの分解機能で検出可能な不均質が発生する場合に重要になる。この不均質は検査試料全体の中でのサブポピュレーション（例えば、細胞の培養またはビーズアンサンブルなど）を推察させる。
【００２３】
以下では、このサブポピュレーションの分析についてはこれ以上立ち入らないことにする。ただし、本発明に基づく方法はこの分析操作法も含んでいる。
ＭＴＰ上には標準試料ＳＴＤと、ＳＴＤも検査対象物質を含まない、基礎状態の信号を測定するためのブランク試料（ＢＬＫ）が設置される。ＰＲＢと称される領域には検査対象試料が置かれる。
【００２４】
特定スペクトル領域（ＳＲＩ観察対象スペクトル領域）の決定
本発明に基づく方法の場合、第１ステップで対象試料（ＳＴＤ）のスペクトルが記録される。スペクトルおよびスペクトル領域の記録方法は「検出ユニットの説明」の章に詳述されている。記録されたスペクトルは、オペレータに対して制御ＰＣ上グラフィック表示される。上記方法によりスペクトルが記録された後では、オペレータはスペクトル全体から検査対象としての照準スペクトル領域（ＳＲＩ対象スペクトル領域）を選択することができる。このプロセスは検査当初に１回行う。それ以降は確定ＳＲＩについて測定を実施する。
【００２５】
オペレータによるＳＲＩの設定は、例えば次のように行うことができる（図１０）：
複数の蛍光色素を使用する場合、標準試料としてはすべての蛍光色素を含む１試料でも、あるいはそれぞれの色素を１つずつ含んでいる複数の試料でも可能である。後者の場合ＳＲＩの決定は各標準試料毎に行う。
次例では１つのＳＴＤウェル内に４色素が存在する。必要な励起帯域（Ａ１〜Ａ４）をすべて使用したスペクトル走査記録により、個別の励起帯域間で総合チャネルを形成することができる：
それが図１０のＥ１〜Ｅ４であり、放出最大波長を含んでいる。この総合チャネルは個別色素の蛍光帯域部分に相当する。
【００２６】
放出帯域の相互オーバーラップが強い色素の場合、このようにしてスペクトル信号の一部だけを利用することができる。その場合、放出光全体に対する帯域幅の選択如何では、感度が弱い、または色素の特殊性が十分に出ないという結果になることがある。
本発明に基づく方法において、強くオーバーラップする蛍光の弁別目的の改良開発については後段で説明する。
【００２７】
検出帯域は手動設定のほか、ＭＴＰウェル内の参照試料としての各個別ＦＬコンポーネントからそれぞれのスペクトルを測定して、比較器閾値を越えた、ただし光源の励起帯域とは異なるスペクトル成分を検出用として選択することにより自動決定も可能である。
様々なＳＲＩ設定のための第２の方法では蛍光重心の測定が行われる。その目的のため、検出器内では、励起光で照明されるすべての個別チャネルが遮断される。各ＳＲＩは、使用色素それぞれの放出特性に変化があることから特徴的な蛍光重心を有している。
したがって、特徴的な蛍光重心の位置により様々なＳＲＩの区別ができ、別々に観察することができる。
【００２８】
続いて、個別のＳＲＩ毎に、改めて色素特性に照準した適合化設定が行われる。
加えて、オペレータにより任意の個別チャネルを遮断することもできる。これは、特に単一または複数の励起帯域を抑制する上で有意である。
【００２９】
標準試料及びブランク試料との測定値比較計算
本発明に基づく方法では、測定値の算出および表示は絶対値によらない。そうではなく、測定対象量は既知の参照試料およびブランク試料との比較における測定信号の相対強度である。
標準試料（ＳＴＤ）とブランク試料（ＢＬＫ）はプレートのレイアウトにより、あるいは分析プレート間の参照プレートからの較正により決定する。各測定値を標準／ブランクの比と対比する。次に、測定強度からの計算によって得られる測定量を分析強度と定義付けする。測定試料と参照試料のスペクトルシグネチャを考慮した、さらに別な分析強度測定法については後段で説明する。
上記のＳＲＩは標準試料（ＳＴＤ）を基に予め決めておく。
定義：  分析強度＝（ＰＲＢ−ＢＬＫ）／（ＳＴＤ−ＢＬＫ）。
ＳＴＤ、ＰＲＢ、ＢＬＫは個別測定値で、または複数回測定からの平均値で表わすことができる。
【００３０】
複数ＳＲＩの同時測定
図８には測定及び計算過程が図式化して示してある。
実験当初にＳＲＩを決定する。その方法は「スペクトル領域の決定」の章に記述されている。
次に、各マイクロプレートからＳＲＩについて個別ウェル内の測定値を決定する。ＢＬＫとＳＴＤの測定値から平均値を求める（複数試料の場合）。
個々のＳＲＩにおける試料測定値をＳＴＤおよびＢＬＫの平均値と比較計算する。
データはＰＣに表示および／または保存される。
【００３１】
ここで説明した方法が、例えばＦＲＥＴ測定（上記参照）のための比率計測定法に利用されるところは、試料をＦＲＥＴパートナー１の最適励起（ドナー励起）近くの光で照射する点である。
マルチチャネル検出器で捕捉されるスペクトル領域は、当該ＳＴＤ試料によりＳＲＩの定義付けされた両ＦＲＥＴパートナーの放出領域を含んでいる。ＭＴＰ（上記参照）ではドナーとアクセプタの放出比も同時に測定できる。
【００３２】
成分分解
マイクロプレート上で対照試料を使用することにより、いずれの実験においても測定対象信号のスペクトル経過についての情報が入手できる。以下では、この情報の利用下で測定対象信号の非特殊成分を差し止める上で、あるいはオーバーラップしているスペクトルの測定値を分離する上で有用な方法について説明する。
ここでは、分析用アルゴリズム、例えば、試料から放射された蛍光信号全体に対して個別色素が関与している部分を選択表示するためのアルゴリズムについて記述する。
【００３３】
分析は定量的に、あるいは定性的に行うことができる。定量分析では、試料からの全放射蛍光信号に対する各個別色素の関与成分（すなわち濃度）をウェル毎に計算する。
アルゴリズムとしては、例えば、直線的成分分解分析法が利用される（参考文献：Ｌａｎｓｆｏｒｄほか共同寄稿；Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｏｐｔｉｃｓ  ６（３）、３１１〜３１８ページ（２００１年７月刊））。
個別色素の蛍光スペクトルについての定義付けをする、分析に必要な参照スペクトルを、ＭＴＰ上に存在する標準試料（ＳＴＤ、図７参照）から求める。
【００３４】
定性分析の場合は選別を行う。すなわち、試料からの全放射蛍光信号に対して最大の関与割合を持つ色素だけを各ウェル毎に選定する。これには、例えば、主成分分析（ＰＣＡ／参考文献：  Ｉ．Ｔ．Ｊｏｌｉｆｆｅ著、Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ社出版、ニューヨーク、１９８６年刊）などのアルゴリズムを使用する。この種のアルゴリズムは、測定値を擬似色表示、いわゆる画像マスキング（色素マスク）により制御ＰＣ上に表示させることができる。この場合、同色領域には同一色素が存在する。この表示により、（サブ）ウェルデータの分析において、ウェル内同一場所での色素の共存を確認することができる。
【００３５】
ＳＴＤおよびＢＬＫによる成分分解
図９には２成分への分解過程の詳細が図式化されている。
各マイクロプレート毎にウェル内のスペクトル値を測定する。
ＳＴＤおよびＢＬＫのウェルについては、同じような試料が存在する場合平均値を求める。
次に、ＳＴＤの使用下で各試料につき２成分へのスペクトル分解を行う。それにより、特殊成分ＳＰ（＝ＳＴＤ成分）と非特殊成分ＵＳ（＝拡散光、自己蛍光）とを含むデータセットが得られる。
これらの両データ群は表示または保存することができる。
【００３６】
ＷＬ（波長）シフトによる検出での成分分解
成分分解法のもう１つの適用領域は、色素の放出スペクトルが存在イオン濃度に依存して変化する場合の、または結合パートナーとの空間近距離によって変化する場合のラチオメトリー法である。
２つの短波長域で強度測定して商を求める代わりに、成分分解の方法で両成分の比率を決定することができる。
この方法の長所は、測定には本質的に強い信号を使用するところにある（その場合では全スペクトル領域が考慮されるからである）。「ＳＴＤおよびＢＬＫによる成分分解」との相違は、それぞれスペクトルの極値を示す参照試料として２つのＳＴＤ（結合ｖｓ遊離、または豊富なイオンｖｓ乏しいイオン）を使用する点である。成分分解は、その場合３成分をも、すなわち（それぞれのＳＴＤに対して）２つの特殊成分と非特殊成分を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
図１には本発明の主要素子がブロック図として図式化されている。
吸光測定（ＡＢＳ）の場合、広帯幅光源ＬＱからの光Ｌは結像光学系ＢＯにより試料にフォーカシングされ、試料の背後で検出される（図１ａ）。
蛍光測定（ＦＬ）の場合では、波長選択素子ＷＳにより広帯幅光源ＬＱから特殊励起波長が選択され、結像光学系ＢＯにより試料にフォーカシングされる（図１ｂ）。
波長の選択は、例えば、然るべきフィルタ、プリズム、ダイクロイック分離ミラーによって、またはこれら素子の組み合わせによっても行うことができる。これに代わり、単色光源も可能である。例として、マルチラインレーザまたはレーザモジュール内での個別レーザの組み合せがある。この場合波長選択は、例えば、ＡＯＴＦまたは回折素子、分散素子によって行う。
【００３８】
蛍光検出の場合（図１ｂ、１ｃ）、およびそれに準ずるものとして吸光検出例の図１ａ、１ｃの場合でも、放出光は、励起光を検出光から分離するための素子、例えばダイクロイックビームスプリッタ−により励起光から分離する。
例えば吸光測定のための透光装置の場合、およびルミネセンス測定（ＬＵＭ）の場合でもこの種の素子は完全に省くことも可能である。
試料の光は、結像光学系ＤＯにより波長分散素子上に結像する。この分散素子ＤＩにより光はスペクトル成分に分割される。角分散素子としては、例えば、プリズム、格子および音響光学素子が使用される。分散素子によってスペクトル成分に分割された光は、続いてマルチチャネル・ビームライン検出器ＤＥ上に結像する。このビームライン検出器ＤＥは波長別に放出信号を測定して、それを電気信号Ｓに変換する。
【００３９】
次に、以下に詳説する、本発明に基づく結合方法により、個別チャネルの相互接続、すなわち個別チャネルを通じてのビームライン検出器による総合測定を行う。
加えて、励起波長抑制のために検出ユニットの前にラインフィルタを設置することもできる。
図２は装置全体を表わした実施例である。
試料Ｐを保持する試料担体ＰＴは、ここではマイクロ滴定プレート（ＭＴＰ）であり、主として走査テーブルＴとして形成されている。すなわち、これは少なくともＸ／Ｙ方向にはスピーディな動きをする。
【００４０】
ＭＴＰの照明は、下方から個別ウェルの容器底を通して行われる。照明は光源ＬＱによるが、その光はここでは光ガイドへ誘導され、第１照明光学系ＢＯ１、グレーフィルタ付き強度制御用および励起フィルタ付き波長選択用のフィルタ回転車ＦＲ１,ＦＲ２、それにダイクロイックビームスプリッタＤＳＴ、対物レンズＯを通って試料Ｐに到達する。それぞれの試料から出た光は、ビームスプリッタＤＳＴの通過後、検出光学系ＤＯを経て検出器ＤＥに到達する。
照明光の一部は、レーザ出力の監視のため、ビームスプリッタＳＴ２で分離されてモニタダイオードＭＤへ送り込まれる。
【００４１】
測定は、（ＭＴＰウェル内に設置された）試料毎に１回ずつ、またはウェル内で複数回ずつ行うことができる。試料担体ＰＴに設置された試料Ｐは逐次的に測定する。この目的のため、試料Ｐを含む試料担体ＰＴを、光学装置上方にある走査テーブルＴによって移動させる。これに代わるものとして、試料をホルダに固定し、光学装置をｘｙスキャナにより試料に対して相対移動させる方法もあろう。
【００４２】
図２は蛍光およびルミネセンスの測定実施例、図３は吸光測定の例を示している。後者の例では検出装置ＤＥは試料上方に配置されている。
ここではビームスプリッタＤＳＴの代わりに、例えばミラーＳＰが配備されていて、照明光はそれにより側方に、つまりＭＴＰの方向に誘導される。
少なくとも検出器および走査テーブルの制御装置はＰＣと連結しており、そのＰＣは別途調整素子または評価素子と結合させることができる。
後段で、特に図５および６を手掛かりに詳しく述べているように、評価装置は検出装置ＤＥに含み入れることができる。
【００４３】
図１のブロック図に示された検出ユニットの光線進行路として可能な態様が図４に描かれている。
その構造の主要部はＣｅｒｎｙ  Ｔｕｒｎｅｒ構造である。試料からの光Ｌは、図２、３に示されたＤＯからの平行な光を受け止める検出光学系ＤＯ１によりフォーカシングされる。制御遮光絞りＳＢが使用できるが、しかし必ずしも必要でない。
【００４４】
第１結像ミラーＭ２は蛍光を平行化する。続いて、光は線形格子Ｇ、例えばｍｍ当り６５１本のラインを持つ格子に衝突する。格子は光をその波長に応じて様々な方向に回折させる。第２結像ミラーＭ１は、スペクトル分割された個々の波長成分をビームライン検出器ＤＥの対応チャネルにフォーカシングする。この場合、浜松ホトニクスのビームライン型２次電子増幅器Ｈ７２６０の使用が特に有利である。当検出器は３２のチャネルを有し、高い感度を持っている。上記実施態様の自由なスペクトル領域は約３５０ｎｍである。
【００４５】
この装置では自由なスペクトル領域は、ビームライン型検出器の３２チャネルに均等に分配されていて、そのため、分解能は約１０ｎｍである。したがってこの装置は、分光測定には限定された範囲でしか適していない。しかし、迅速スクリーニングシステムでの使用には有利である。それは、検出帯域が比較的広いので、検出チャネル当りの信号がなお比較的大きいからである。加えて、例えば格子をｐｈｉ分回転させることにより、および／またはビームライン受信器を波長分割方向にｄｉ分移動させることにより、自由なスペクトル領域をシフトさせることも可能である（図４参照）。
【００４６】
上記の実施態様では、各個別チャネルにより、帯域幅として約１０ｎｍのスペクトル幅を持つ放出スペクトルが検出され有利である。しかし、分析対象の色素からの放出は数１００ｎｍの波長領域に亘っている。したがって、本発明に基づく装置では使用色素の蛍光帯域に対応した個別チャネルの総合測定が行われる。
それには第１段階で、ＭＴＰ上にある参照試料について、いわゆるスペクトルスキャンを行い、例えば画像情報としての個別チャネルの情報を読み出す。検出器のすべての個別チャネルを同時に読み出すことができない場合は、その技術レベルに応じて個別チャネルの読出しを逐次的に行う（マルチプレックス）。この場合、使用色素に対応した複数の励起波長により試料を同時照射するのが好ましい。そのようにして、測定試料内に存在する個別色素のスペクトル成分総和を記録する。
【００４７】
続いて、オペレータは個別チャネルを任意に検出帯域（放出帯域）に集約、つまり合算することができる。合算領域の選択は、例えば個別チャネルにおける試料信号のヒストグラム表示により行うことができる。ヒストグラムは、試料に使用された色素の全放出スペクトルの総和を表わしている。この合算は、励起された色素の放出スペクトルに基づいて行うのが好ましい。その場合、それぞれの励起波長を遮って、様々な検出帯域における様々な色素の信号を合算する。
【００４８】
例えば８つのチャネルを同時に読み出すことができれば、上記３２のチャネル検出器使用の場合ではそれぞれ４つのチャネルを通じて合算を行う。総数Ｎ＝３２チャネルの読出しがｎ＝４段階で行われる。その場合、総和設定ウィンドウではそれぞれ１個別チャネル（Ｌ／ｎ＝４／４＝１）づつシフトされる。
【００４９】
図５には、ビームライン検出器の個別チャネルがそれぞれ１ラインずつ図示されている。なお、個別チャネルのＮは個別信号Ｃに対応している。この方法は３２の個別チャネルを４段階で読み出すのに比べ、全３２画素の信号情報が全測定時間に亘り個々のスペクトル値計算に取り入れられるという利点がある。これ以外の方法では、各検出チャネルは測定時間の１／４の間しか読出しされない。
【００５０】
以下では、検出チャネルを通じての総和から、如何にして個別スペクトル値が再取得できるかについて記述する。
個別チャネルの測定信号はＣｋ，ｊ（図５のブロック図参照）で表わしている。ただし、ｋ＝１…Ｎはチャネル番号で、ｊ＝０…ｎ−１はシフトＬ／ｎの倍数である。信号が検出器の縁から消えない場合は、図５にグレーで示したように、検出器の最終個別チャネルは、Ｌ／ｎの幅分だけが測定に供されるように、一部をカバー（遮蔽）することができる。これは、計算から人為的要素を回避するために必要である。
【００５１】
Ｎ・ｎスペクトル値Ｓｍの計算には、下記アルゴリズムに従い個別チャネル総和の差を求める。
【数１】
2005513497.tif 000003
【００５２】
そのようにして算出したスペクトル値Ｓ（中間値）は、続いて、表示画像上に、例えばスペクトルスキャンの間にグラフィック描画することができる。
様々な個別チャネルからの総和、つまりＣｋ，ｊ測定は図６に図示されている通りである。その場合、個別チャネルの信号は増幅器Ａにより改めて電圧信号に変換される。次に、個別電圧信号は画素上滞留時間のあいだ積分器Ｉで積分される。
【００５３】
予備選択したスペクトル領域の同時記録
放出帯域の計算はデジタルで、あるいはまたアナログでも行うことができる。両装置については以下で詳しく説明する。総合信号のデジタル計算装置は図６Ａに図式化されている。この場合、マルチチャネルＰＭＴの陽極に流れる電流は、それぞれ第１増幅器Ａ（電流／電圧変換器として接続）により電圧に変換および増幅される。電圧は積分器Ｉに導かれ、そこで然るべき時間（例えば画素上滞留時間）のあいだ信号を積分する。
【００５４】
よりスピーディな評価には、積分器Ｉの後に比較器Ｋを接続するが、それは簡易比較器としてスイッチング閾値を持ち、それを上回った場合にデジタル出力信号を生成するようになっているか、あるいはウィンドウ型比較器として形成されていて、入力信号がスイッチング閾値の上限と下限のあいだにある場合に、または入力信号がスイッチング閾値外（閾値より下または上）にある場合にデジタル出力信号を生成するようになっている。
比較器またはウィンドウ型比較器の配置は、積分器Ｉの前でも後でも可能である。積分器なしの配置接続（いわゆる増幅器モード）も同様に考え得る。増幅器モードの配置では、さらに比較器が、然るべきレベルに適合させた上で設置される。
【００５５】
比較器Ｋのアウトプットは、アクティブチャネルに直接接続する（オンライン）スイッチレジスタＳＲ用の制御信号として用いられる。あるいはアクティブチャネルの個別選択（オフライン）を行うために、その状態が追加連結器Ｖを通じてコンピュータに伝達される。
スイッチレジスタＳＲの出力信号は、後続のアナログ／デジタル変換ＡＤのために、レベル適合化用の別な増幅器Ａ１に直接送られる。ＡＤ変換値は然るべきデータ伝送装置によりコンピュータ（ＰＣまたはデジタル信号プロセッサＤＳＰ）に送られ、そこで総合信号の計算が行われる。
【００５６】
図６には、図６Ａの装置と等価のアナログデータ処理に基づく装置が描かれている。この場合、個別チャネルの信号は増幅器Ａにより改めて電圧信号に変換される。続いて、個々の電圧信号は積分器Ｉ内で画素上滞留時間だけ積分される。積分器の後に、積分された信号と参照信号との比較を行なう比較器Ｋが接続されている。積分された信号が比較器閾値より小さい場合、当該個別チャネル内では蛍光信号は測定されていないか、または測定された信号が小さすぎるということになろう。このような場合では、個別チャネルの信号加工は続行すべきでない。当チャネルが総信号に関与しているのは雑音成分だけだからである。比較器はこのような場合ＳＲを通じてスイッチを作動させ、当該個別チャネルを実測画素に対して遮断する。すなわち比較器とスイッチとの組み合わせによって、実測像点にとって重要なスペクトル領域が自動的に選択される。
【００５７】
続いて、スイッチレジスタＳＲと連結するデマルチプレクサＭＰＸを持つ個別チャネルの積分電圧信号をレジスタＲＥＧ・Ｇ１により様々な加算ポイントに接続させることができる。図６には８種の加算ポイントｓｐが描かれている。レジスタＲＥＧ・Ｇ１の制御はコンピュータの制御線Ｖ１によって行なわれる。各加算ポイントｓｐはそれぞれ、選択した個別チャネルの加算を行う加算増幅器ＳＶの一部を形成している。図６には全部で８つの加算増幅器ＳＶが描かれている。
【００５８】
続いて、総合信号はそれぞれ、アナログ／デジタル変換器によってデジタル信号に変換され、コンピュータ又はＤＳＰによりさらに加工される。加算増幅器ＳＶは変動する非直線性特性線に従って作動させることもできる。
別な装置（デジタル検出（図６Ａ型）およびアナログ検出（図６型））では、個別検出チャネルの入力信号は、以下によって操作、もしくは加工する：  つまり、（Ａ）における増幅の変更、（Ｉ）における積分時間の変更によるか、あるいは積分器前での追加オフセットの入力および／または光子計数装置における計数光子のデジタル的影響による。両方法は相互間で任意に組み合わせることもできる。
【００５９】
Ｖ１を通じての総和パターンの変更は、画像に基づき、記録後あるいは画像点／試料点または画像セル／画像スプリットの走査中に行なうことができる。ＭＰＸのスイッチング速度に対する要求は、調整の種類に依存する。例えば像点に対する調整では、走査はこの像点に対する積分時間内に（すなわち、数マイクロ秒で）行わねばならない。調整が画像単位で行われる場合は、走査は数ミリ秒〜数秒間でなされねばならない。
【００６０】
個別チャネルの信号計算は、Ｃｋ，ｊの使用下、上記のアルゴリズムにより行う。
本発明に基づく装置によれば、マルチトラッキングへの適用において、すなわち、測定過程中での照明波長および／または照明強度の切換時に検出帯域の迅速な変換が可能である。この変換は数ミクロン秒のあいだに行うことができる。それによって、例えば試料の同一箇所を異なった検出帯域で検査することも可能である。ポリクロメータまたはＡＯＦ付きレーザによる励起光の迅速変換が要求される測定は、検出帯域のこの迅速な切換により実現できる。
【００６１】
図６の装置は図６Ａの装置に対していくつかの長所を持っている。最も目立つ長所は、単に総合チャネル（つまり、使用色素の検出帯域）をデジタルデータに変換してコンピュータに送り込むだけでよいことである。これにより、コンピュータ処理の必要なデータは最小比率に抑えられる。このことは、極めて迅速に経過する動力学的過程を記録するために、本方法をｍｓ領域での動力学に適用した場合では特に重要である。
【００６２】
また、この方法を利用すれば、使用されるビームライン検出器の個別チャネル数、従ってまた、検出可能なスペクトル領域の広さおよび／またはスペクトルセンサの分光分解能に関して何ら制限を受けることはない。しかも、変換可能な信号レベルも図６Ａに示された装置の方が遥かに低い。そのため、この場合の方が信号対雑音比の想定値は小さくなる。
上記の両装置では、個別チャネル信号の検出には主として積分器スイッチングが用いられた。また、光子の計数も個別チャネル内で制限なく行うことができ、光子数の加算が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】測定値捕捉のための構成要素、吸光測定（ＡＢＳ）の場合（１ａ）、螢光測定（ＦＬ）の場合（１ｂ）、ＡＢＳ、ＦＬ、ルミネセンス（ＬＵＭ）の場合（１ｃ）
【図２】蛍光およびルミネセンスの測定装置
【図３】吸光測定の実施例
【図４】検出ユニットの光線進行路
【図５】ビームライン検出器の個別チャネル
【図６】アナログデータ処理装置
【図６Ａ】デジタルデータ処理装置
【図７】９６ウェル型ＭＴＰ
【図８】複数ＳＲＩの測定及び計算過程の図式
【図９】２成分への分解過程の図式
【図１０】ＳＲＩの設定
【図１１】ＦＦ（遊離色素）とＦＢ（結合配位子を持つ色素）色素の螢光放出（Ａ）、結合パートナー色素の螢光放出（Ｂ）
【図１２】ＦＲＥＴパートナーのそれぞれの放出スペクトル、距離大でＦＲＥＴ無し（Ａ）、距離小でＦＲＥＴ相互作用有り（Ｂ）
【符号の説明】
【００６４】
ＭＯ      結像光学系
ＤＩ      分散素子
ＬＱ      光源
ＢＯ      光学系
ＦＲ      フィルタ回転車
ＤＳＴ      ダイクロイックビームスプリッタ
Ｏ      対物レンズ
ＤＯ      検出光学系
ＭＤ      モニタダイオード
ＰＴ      試料担体
Ｐ      試料
Ｔ      走査テーブル
ＳＰ      ミラー
ＤＥ      検出装置
ＳＢ      制御遮光絞り
Ｍ      ミラー
Ｇ      格子
Ｋ      比較器
ＳＲ      スイッチレジスタ
Ｖ      連結器
Ａ      増幅器
Ｉ      積分器
ＭＰＸ      デマルチプレクサ
ＲＥＧ      レジスタ
ｓｐ      加算ポイント
ＳＶ      加算増幅器
【図１】
2005513497.tif 000004
【図２】
2005513497.tif 000005
【図３】
2005513497.tif 000006
【図４】
2005513497.tif 000007
【図５】
2005513497.tif 000008
【図６】
2005513497.tif 000009
【図６Ａ】
2005513497.tif 000010
【図７】
2005513497.tif 000011
【図８】
2005513497.tif 000012
【図９】
2005513497.tif 000013
【図１０】
2005513497.tif 000014
【図１１】
2005513497.tif 000015
【図１２】
2005513497.tif 000016
【国際調査報告】
2005513497.tif 000017
2005513497.tif 000018
2005513497.tif 000019
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