(57)【要約】本発明は哺乳類ドナーからの未熟膵臓組織の採取、および膵臓組織が血管新生を行い成熟しうる条件下における、哺乳類レシピエントの腹腔内への上記組織の移植、またそれによるレシピエントにおいて少なくともインスリンを産生する、機能性キメラ的膵臓内分泌部を成長させることを含む、哺乳類レシピエントの膵臓マスを増加させるための組織および組成物に関する新規な方法を提供する。本発明はまた、単に膵臓組織の治療、レシピエントの免疫抑制およびレシピエントの共刺激遮断に用いる方法および組成物だけでなく、哺乳類レシピエントの膵臓マスを増加させるため、哺乳類レシピエントの腹腔内への移植に適応化された哺乳類の未熟膵臓組織を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの哺乳類ドナーから由来の未熟膵臓組織を採取し、膵臓組織が血管新生を行って成熟しうるようになる条件下にて哺乳類レシピエントの腹腔内に当該未熟組織を移植し、それによってレシピエントにおいて少なくともインスリンを産生する機能性キメラ的膵臓内分泌部を成長させることを含む、哺乳類レシピエントの膵臓マスを増加させる方法。
【請求項２】
哺乳類レシピエントがヒトである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
哺乳類ドナーがブタである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
ドナーの妊娠期間の約２０日目から約３５日目までの間に当該組織の採取を行う、請求項３記載の方法。
【請求項５】
該組織がレシピエントの上腸間膜動脈の分枝に隣接して移植される、請求項２記載の方法。
【請求項６】
該組織がレシピエントの網嚢内に移植される、請求項５記載の方法。
【請求項７】
該組織が、少なくとも１実質的に抗原提示細胞が無く、少なくとも１つの実質的に血管新生を行わない膵臓原基の少なくとも１つの非消化、非分裂部分を含む、請求項１記載の方法。
【請求項８】
該原基が少なくとも腹側の膵臓原基を含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
該原基が少なくとも背側の膵臓原基を含む、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
該組織が少なくとも１つの全膵臓を含む、請求項７記載の方法。
【請求項１１】
該レシピエントによる該組織の拒絶反応の可能性を減少させるため、少なくとも１つの免疫抑制組成物をレシピエントに投与する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
該レシピエントによる該組織の拒絶反応の可能性を減少させるため、少なくとも１つの共刺激遮断組成物をレシピエントに投与する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
組織の移植後の増殖および成長を増強するため、該組織を処理する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
哺乳類レシピエントの膵臓マスを増加させるため、哺乳類レシピエントの腹腔内への移植に適応した哺乳類未熟膵臓組織であって、少なくとも実質的に抗原提示細胞が無く、少なくとも１つの実質的に血管新生を行わない膵臓原基の少なくとも１つの非消化、非分裂部分を含む、該組織。
【請求項１５】
該組織を調整するか、または移植前および採取後に組織を冷却下で維持することで組織を移植に適応させる、請求項１４記載の組織。
【請求項１６】
該組織を成長因子に接触させることで、該組織が移植に適応化される、請求項１４記載の組織。
【請求項１７】
該組織が少なくとも１つの腹側の膵臓原基を含む、請求項１４記載の組織。
【請求項１８】
該組織が少なくとも１つの背側の膵臓原基を含む、請求項１４記載の組織。
【請求項１９】
該組織が少なくとも１つの全膵臓を含む、請求項１４記載の組織。
【請求項２０】
少なくとも１つの哺乳類ドナーから由来の未熟膵臓組織を採取し、膵臓組織が血管新生を行って成熟しうるようになる条件下にて哺乳類レシピエントの腹腔内に該組織を移植し、それによってレシピエントにおいて少なくともインスリンを産生する機能性キメラ的膵臓内分泌部を成長させることを含む、糖尿病の治療を必要とする哺乳類レシピエントにおける糖尿病の治療法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願）
本出願は２００２年３月２５日に出願された米国仮出願番号６０／３６７，１８１の利益を請求するものであり、仮にその内容が十分に記載されているとしてもその内容を本明細書の一部とするものである。 
（本発明の行政権）
本発明は国立衛生研究所からの政府保証Ｒ０１ ＤＫ５３４９７の支援により作成された。アメリカ合衆国政府は本発明に関して特定の権利を有する。
【０００２】
（技術分野）
本発明は生物工学の分野、特に哺乳類レシピエントの膵臓マスを増加させるための方法、組織および組成物に関連する。
【０００３】
（背景技術）
特発性または原発性糖尿病は、完全に発現された形で、絶対的または相対的なインスリンの欠乏、空腹時高血糖、糖尿、およびアテローマ性動脈硬化症、微小血管障害、腎症および末梢神経障害の発病への著しい傾向によって特徴付けられる、炭水化物、脂肪および蛋白質の代謝の慢性障害である。グルコースの利用が不十分であることは全ての糖尿病患者に特徴的であるが、ベータ細胞の損失から起きる明らかに限定された重度のインスリン欠損だけの患者もいる。多数の残りの糖尿病患者は、末梢組織におけるインスリンに対する著しい抵抗性に伴うインスリンの分泌反応の障害に罹患している。
「特発性糖尿病」なる語は、一般的に上記の特徴を有する障害の混成群を包含する。該疾患について、少なくとも２種の主要なならびに数種のあまり一般的でない変種が同定されている。第１の主要な変種であるインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）（Ｉ型）は、糖尿病患者の約１０％を占める。第２の主要な変種である、インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）（ＩＩ型）は、全ての糖尿病患者の残り９０％に相当する。外因性に産生されたインスリンを使用した通常のインスリン置換療法および、または糖尿病患者の食事を注意してモニタリングしない限り、患者は広範囲にわたる消耗性の症候を経験し、その中の何人かは昏睡および最終的には死亡に進展しうる。
【０００４】
哺乳類において、膵臓は正常血糖の維持に関与する主要臓器である。一般的に、成熟哺乳類膵臓は背側膵臓および腹側膵臓と呼ばれる２つの膵芽（または原基）より発達する。これらの原基は、膵臓を形成する発達中に融合するが背側原基が最初に出現し、膵臓のほとんどを形成する。腹側原基は胆管の傍に発生し、膵臓の頭部および鉤状突起を形成する。
成熟膵臓は外分泌（消化）および内分泌（ホルモン）の両方の機能を有する。外分泌機能としては消化を促進する酵素の分泌が挙げられる。膵臓のホルモンの機能は、少なくとも、共同で血中のグルコースレベルの調節を補助する２つのホルモンである、インスリンおよびグルカゴンの分泌を含む。膵臓の内分泌機能に関して、インスリンを生成および分泌をするのは、ランゲルハンス島と呼ばれる領域に構成されたベータ細胞である。グルカゴンはランゲルハンス島内のアルファ細胞により分泌される。
【０００５】
外科的手法により糖尿病レシピエントにおける膵臓マスおよび、または機能を置換しようと、数多くの試みがなされてきた。例えば、死後のヒトの膵臓由来の消化および単離されたランゲルハンス島を免疫抑制された糖尿病のヒトに移植することが糖尿病を治療する上で確立されているが、実験的手段にすぎない。現在の技術では、この技術を制限する主たる原因は移植に利用できるヒト膵臓組織の供給が不十分であるということである。加えて、移植された島の断片のみが宿主に生着するため、島組織は、消化および単離の手順の間に、ならびに移植後に消失または減少するかもしれない。島内でのベータ細胞のマス増加はまた、このような移植片はベータ細胞マスの拡大の可能性の制限を示すため、最適ではないと言える。さらに、いずれの死後の移植に関係する免疫抑制および関連する問題はかなり重要でありうる。
【０００６】
全ての未熟、胎児ラット膵臓の、ラットの腎皮膜下空間、前眼窩（anterior eye chamber）、精巣、皮下嚢（subcutaneous pocket）、第三脳室、および頬嚢への同種移植はまた当該分野で公知のものである。このような作業はまた、移植組織の成長および分化に対するインスリン治療の効果を含む。
コラゲナーゼで消化および単離された成熟ラットおよびハムスターの島の、ハムスターの皮膚のひだおよび横紋筋組織への移植により、単離された島が再び血管新生することもまた公知である。シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）および１５−デオキシスペルグアリン（deoxyspergualin）（ＤＯＳ）の、少なくとも２つの免疫抑制処方がこのような異種移植片に有用であることが公知である。同様に、分散された発達中のラット膵臓（細分、分離およびコラゲナーゼで消化）を、アロキサン糖尿病ラットの腹腔または腎皮膜下部位へ注入することで、少なくとも一時的に糖尿病が寛解することは公知である。
【０００７】
胎児ブタ膵臓の単離された島クラスタはまた、ヒト糖尿病患者への異種移植片として利用されてきた。このように、ブタ胎児より膵島を単離、およびヒト糖尿病患者の静脈内に島を注入することは公知である。このような操作に伴う重要な問題は、免疫抑制の維持にシクロスポリン、プレドニゾロンおよびアザチオプリンが必要であることである。付加的な問題は、このような移植片は、レシピエントが循環グルコースレベルの調節能を獲得することを補助しないことである。
従来の方法の短所は有意である。分散またはクラスタ細胞を用いる方法は、レシピエントあたり多量のドナー組織および通常は複数のドナーを必要とする。強力な免疫抑制もまた、移植細胞の急性拒絶反応の回避を補助するため必要とされる。さらに、分散した形式の細胞およびクラスタ移植片が与えられても、実際の移植を管理することは難しく、かつて発達するキメラ臓器が作成されたことは一度もない。その他の相違点では、従来の成人または未熟な膵臓組織全体の移植は、本発明の組織よりも実質的により発達した組織を利用し、移植片部位として腹膜に焦点をあてるものではない。結果として、従来の技術は、膵臓の外分泌機能の望ましくないおよび不必要な発達の可能性だけでなく、超急性および、または急性血管拒絶反応の危険性の増加を示す。本発明のみが、少なくとも超急性および急性血管移植拒絶反応を本質的に回避または減少する一方で、外分泌機能でなく、内分泌機能を有する新たに血管新生したキメラ膵臓臓器の成長方法を提供する。
【０００８】
本発明のキメラ膵臓は、宿主内で機能的マスを実質的に増加させ、または少なくとも増加させる能力を有し、宿主内で少なくとも標準に近い血糖レベルを確立させる。これは、少なくとも、１）移植段階での未熟膵臓組織移植片におけるインスリンの欠乏、および移植後２週での発達した島におけるこのような分泌インスリンの存在；および２）ストレプトゾトシン（streptozotocin）糖尿病ラットでの未熟膵臓組織の移植と組織が発達および成熟する結果としての、宿主の正常血糖の間のおおよそ３０日の遅延、により反映される。
したがって、従来のいずれの方法においても、ヒト糖尿病の効果的な治療に至ることができなかったことに鑑みれば、レシピエントの膵臓マスを増加させるため、未熟膵臓組織を哺乳類レシピエントに移植する新たな方法、組織および組成物を開発する必要がある。
【０００９】
（発明の開示）
本発明の１つの具体例は、少なくとも１つの哺乳類ドナーから由来の未熟膵臓組織を採取し、膵臓組織が血管新生を行って成熟しうるようになる条件下にて哺乳類レシピエントの腹腔内に当該未熟組織を移植し、それによってレシピエントにおいて少なくともインスリンを産生する機能性キメラ的膵臓内分泌部を成長させることを含む、哺乳類レシピエントの膵臓マスを増加させる方法を目的とする。
本発明のもう１つの具体例は、哺乳類レシピエントの膵臓マスを増加させるため、哺乳類レシピエントの腹腔内への移植に適応化された哺乳類の未熟膵臓組織である。
【００１０】
本発明のもう１つの具体例は、移植された組織の拒絶反応の可能性を減少させるため、レシピエントの免疫抑制性組成物およびレシピエントが未熟膵臓組織の哺乳類レシピエントの腹腔内への移植を免疫抑制する方法に関する。
本発明のもう１つの具体例は、移植された組織の拒絶反応の可能性を減少させるため、レシピエントの共刺激遮断組成物およびレシピエントが未熟膵臓組織の哺乳類レシピエントの腹腔内への移植の免疫反応を共刺激遮断する方法に関する。
【００１１】
本発明のもう１つの具体例は、組織の移植後の増殖および成長を増強するため、採取された組織を処理するための組成物および方法を含む。この具体例は、哺乳類レシピエントの腹腔内への移植に適用した単離された哺乳類未熟膵臓組織をその哺乳類レシピエントでの移植された組織の移植後の増殖および成長を増強するために移植の前に成長因子と一緒にインキュベートすることを含んでいてもよい。
本明細書の各具体例において、未熟膵臓組織は、採取の段階で本質的にドナーからの血管新生を受けておらず、本質的に抗原提示細胞が存在しない、哺乳類胎児の膵臓組織を含んでよい。
【００１２】
本発明の目的は、未熟な哺乳類膵臓組織を哺乳類レシピエントに移植し、レシピエントの膵臓マスを増加させる方法、組織および組成物を提供することである。
他の態様および特徴は、以下で部分的に明白となり部分的に指摘されるだろう。
【００１３】
（図面の記載）
図１Ａは、マウスの大網へ移植後１４日の、胎生日数（Ｅ）２８日のブタ後腎（ｐｍ）である；
図１Ｂおよび１Ｃは、マウスの大網へ移植後１４日の、ヘモトキシリン（hemotoxylin）およびエオシン（「Ｈ＆Ｅ」）で染色された、パラフィン包埋ブタ後腎の切片を示す。糸球体が標識されている（ｇ）；
図１Ｄは、マウスの大網へ移植した１４日後に、マウス特異的内皮細胞マーカー抗ＣＤ３１で染色された、発達したブタ後腎のパラフィン包埋切片を示す。ブタ後腎にある染色陽性（ＣＤ３１陽性）のマウス起源の血管構造（矢印および矢じり）を示す；倍率をＡ＆Ｂ（Ａ）について、そしてＣおよびＤについて示す。
【００１４】
図２Ａはマウスの大網へ移植後１４日のブタ後腎（ｍ）である；
図２Ｂないし２Ｅは、移植された後腎のＨ＆Ｅ染色された切片を示す。糸球体が標識されており（ｇ）、倍率をＡ＆Ｂ（Ｂ）、Ｃ、ＤおよびＥについて示す；
図３Ａは、Ｅ１２．５のルイスラット胎児由来の十二指腸（ｄｕｏ）切片の写真である。背側膵臓原基（ｄｐ）および腹側膵臓原基（ｖｐ）が標識されている；
図３Ｂは、十二指腸が切除されたｄｐおよびｖｐのＨ＆Ｅで染色された切片である；
図３Ｃは、図３Ｂに示される背側膵臓の拡大図であり、図３Ｃは管状房状細胞の凝集帯を示す（矢印）；
【００１５】
図４Ａは、Ｅ１２．５のルイスラット胎児から得られた膵臓原基のＨ＆Ｅ切片を示す；
図４Ｂは、抗インスリン抗体で染色された原基の隣接する切片を示し、組織切片において陽性の染色を示していない；
図４Ｃから４Ｆは、移植後２週の膵臓原基を示し、４Ｃおよび４Ｅは対照染色切片を、および４Ｄおよび４Ｆは抗インスリン抗体での染色を示している。矢印は陽性染色構造としてのランゲルハンス島を示す；
【００１６】
図５Ａは、成体ルイスラットの腹膜内への移植後６週の背側膵臓原基が起源である対照抗体染色切片である。陰性染色組織を矢印で示す；
図５Ｂは、抗インスリン抗体に染色された隣接する切片である。矢印は島組織を示す。組織は成長し、移植後２週でより多くの島が存在する；
図５Ｃおよび５Ｄは、各々、もう１つの対照抗体染色切片およびもう１つの抗インスリン染色切片の拡大図である。
図５Ｅおよび５Ｆは、抗インスリン抗体で染色された組織切片であり、導管上皮に接続されたままの発達中の導管の島を矢印で示す；
【００１７】
図６は、移植後おおよそ１５週の膵臓原基を図示しており、腹膜脂肪に覆われた間質内の島組織のキメラ臓器構造を示し、矢印は島を示す；
図６ＡはＨ＆Ｅ染色切片を示す；
図６Ｂは対照染色切片を示す；
図６Ｃおよび６Ｄは抗インスリン染色切片を示す；
【００１８】
図７Ａは、移植後１５週に回収された膵臓組織の切片を示し、島を矢印により示す；
図７Ｂは、比較のために、新生児ラットからの背側膵臓原基の切片を示す。島は矢印で示されるが、腺房細胞は矢じりで示される；
【００１９】
図８Ａは、島内の細胞の電子顕微鏡検査画像を示し、細胞は結晶化インスリン（矢印）を表す離心濃染核（eccentric dense core）を含む神経分泌顆粒でパックされている；
図８Ｂは、顆粒の高倍率像を示す；
図９は、３５日の期間に渡る、同種移植されたラット、手術を施していない対照、および糖尿病が誘導されたラットの比較グルコースレベルを示す；
図１０は、４ヶ月の期間に渡る、同種移植されたラット、手術を施していない対照、および糖尿病が誘導されたラットの比較グルコースレベルの比較を示す； 
【００２０】
図１１Ａは、異種移植された（ラットからビヒクル処理されたマウス）未熟膵臓組織の、移植後４週の横断面を示すスライドである；
図１１Ｂは、異種移植された（ラットから共刺激遮断処理されたマウス）未熟膵臓組織の、移植後４週の横断面を示すスライドである；および
図１２は、異なる染色プロトコルを示す異種移植されたラットの膵臓の横断面を示す：
図１２Ａは、対照血清を示す；
図１２Ｂは、インスリン産生細胞を明らかにする抗インスリン抗体の使用を示す；および
図１２Ｃは、膵島（各枠において矢印により同定される）を明らかにする結合ゴモリ染色を示す。
【００２１】
（発明の詳細な記載）
以下の詳細な説明は、本発明を実施する際に当業者を補助するために設けられている。当該説明は、本明細書に記載の具体例における修正および変形を、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、当業者が行うことができる場合、過度に本発明を制限するものと解釈されるべきでない。
全ての出版物、特許、特許出願、データベース、およびその他の文献、本明細書にて参照された全ての関連出願、およびそこで引用される全ての文献は、その出典を明示することで本明細書の一部とする。
【００２２】
本願において引用される本発明の１つの具体例は、哺乳類ドナーからの未熟膵臓組織の採取、および膵臓組織が宿主が起源である血管より血管新生を受け成熟しうる条件下、哺乳類レシピエントの腹腔内への該組織の移植を含み、それによるレシピエントにおいて少なくともインスリンを産生する、機能を有するキメラの内分泌を行う膵臓を成長させる、哺乳類レシピエントの膵臓マスを増加させるための新規な方法を対象とする。未熟膵臓組織は、採取の段階で、少なくとも実質的にドナーからの血管新生を受けておらず、少なくとも実質的に抗原提示細胞が存在しない、哺乳類の未熟膵臓組織を含んでよい。
【００２３】
好ましい具体例は、少なくとも１つの哺乳類胎児のドナー、好ましくはブタのドナー、からの、実質的に抗原提示細胞が存在せず、実質的に血管化されていない背側、腹側、または背側および腹側が結合した膵臓原基を少なくとも１つ含む該組織である、未熟膵臓組織の採取を含む。該組織は、ヒト糖尿病患者の腹腔内で上腸間膜動脈の枝に隣接する部位に移植される。移植後、該組織は血管新生を行って成熟し、それによりレシピエントにおいて少なくともインスリンを産生する、機能を有するキメラの内分泌を行う膵臓が発達する。当該好ましい方法はまた、移植された組織の拒絶反応の予防を補助するために、免疫抑制剤または共刺激遮断剤をレシピエントの免疫系に投与することを含んでよい。
【００２４】
当該好ましい方法はまた、組織の移植後の成長および発達を増強するために、組織を処理する方法および組成物を含んでよい。
適当な哺乳類ドナーは、生理学的な類似性、臓器の大きさ、抗原の側面、ドナーの利用性、および膵臓の内分泌機能の類似性を含む様々の因子だけでなく、公知の移植プロトコルに基づいて宿主との適合性により選択される。
ヒトレシピエントにとって好ましい哺乳類のドナーは、無菌で飼育され、崩壊促進因子およびＣＤ５９などのいくつかのヒト蛋白質に可能な限りトランスジェニックであるブタ、またはアルファガルトランスフェラーゼ欠損ブタだろう。他の因子の中で、臓器の大きさが同等であり、およびドナーとして一般的に入手可能であるため、ブタはヒトのレシピエントにとって好ましい異種のドナーである。さらに、グルコースホメオスタシスの過程おおびインスリン分泌の調節が、ブタとヒトで非常に類似している。
【００２５】
加えて、ヒト未熟膵臓組織が、ヒトレシピエントに同種移植するのに好ましいだろう。
好ましい具体例において、未熟膵臓組織は、採取の段階でドナーにおいて本質的に血管新生を受けていない、少なくとも１つの胎児背側または膵臓原基を含んでよい。当該組織はさらに、背側および腹側原基を両方、このような原基を１つまたはそれ以上、全膵臓（背側および腹側の両方、または融合した原基）、または１つまたはそれ以上のドナー由来のこのような組織を含んでよい。全ての原基を使用することが好ましいが、このような組織の非消化、非分離部位を含むものも同様に本発明の未熟膵臓組織の範囲内にある。
【００２６】
未熟膵臓組織は、少なくとも１つのドナーより適当な発達段階で、すなわち背側および腹側原基が融合する直前または融合した後の数日以内で、血管新生および組織内でドナーにより抗原提示細胞が生成および分布されるより先に採取されるだろう。未熟膵臓組織は未熟膵臓が形成され始めた後すぐに採取されることが好ましく、ドナー組織より、膵臓内または膵臓外より発生する血管が存在するより先に分離されうる。血管新生より先に採取することは、膵臓原基が採取される発達中の胎児において成熟抗原提示細胞はまだ形成されていないだろうし、仮に形成されていても無血管の膵臓原基内には移動していないであろうから特に好ましい。この段階で、未熟膵臓組織は抗原提示細胞が存在しない、または実質的に存在しないと考えることができる。
【００２７】
膵臓が成長して採取が遅くなりすぎた組織、例えば可視化できる血管を有する組織は、抗原提示細胞および細胞表面抗原を含む可能性が大きく、したがってレシピエントによる拒絶反応の脅威がより大きくなる。成長および血管新生の好ましい段階で採取された組織は、実質的に抗原提示細胞が存在しないだろうし、これは、非同種移植片移植における少なくとも超急性および急性の血管拒絶反応の可能性が、血管新生を受けた移植片または抗原提示細胞を含む移植片の移植と比較して、大きく減少することを意味する。
膵臓組織を採取するための特定の成長段階は、ドナーの種にしたがって変化するだろう。ラットでは、膵臓は２２日の妊娠期間で１１ないし１２日目に形成され、未熟膵臓組織の採取に好ましい時期は約１２日目と約１３日目の間である。マウスでは、膵臓の形成は１９日の妊娠期間で１０ないし１１日目頃であり、約１１日目から約１２日目が採取に好ましい。ブタでは、膵臓は、１１５日の妊娠期間で１６ないし１８日目に形成され、好ましい採取は約２０日目から約３８日目に、より好ましい採取の期間は約２５日目から約３５日目、および最も好ましい採取の日数は約２９日目である。ヒトでは、膵臓は、２７０日の妊娠期間で３１ないし４０日目に形成され、約４０日目から約５０日目、または妊娠１期の初期が採取に好ましい。
【００２８】
本発明の１つの態様において、レシピエントは哺乳類で、いずれの年齢でもありうる。好ましいレシピエントはヒトで、より好ましくはヒトのＩＩ型またはＩ型糖尿病患者である。もう１つの好ましい具体例において、このようなレシピエントは、上記疾患の１つに罹患した結果として、膵臓実質の機能の低下を示す。
好ましい方法は、未熟膵臓組織が血管新生を行い成熟を開始しうる条件下、哺乳類レシピエントの腹腔内に、少なくとも１つの胎児哺乳類ドナーの全膵臓原基を含む未熟膵臓組織を移植し、それによってレシピエントにおいて少なくともインスリンを産生する、機能を有するキメラ的膵臓内分泌部を成長させることを含む。膵臓組織は、当業者に公知の方法を使用してレシピエントの腹腔内へ移植される。
【００２９】
１つの具体例において、膵臓組織は、上腸間膜動脈の分枝に隣接するレシピエントの大網の近くに移植され、好ましくは網嚢に移植される。本明細書に記載の技術を使用して移植された未熟膵臓組織は、最初、血管新生を行うことができず、したがって成長して少なくとも一部はレシピエントの血管により血管形成され、少なくとも１つのキメラ的膵臓内分泌部を成長させる。キメラ膵臓は、少なくともインスリン、可能であればグルカゴンおよびソマトスタチンを産生および放出しうる、成熟した機能を有するランゲルハンス島の形成により特徴付けられる。
レシピエントによる血管新生は、移植された異種組織の受容を促進するだろう。より明確には、移植片内での血管新生の欠損、および移植の際の移植された組織とレシピエントの間での血管吻合の欠損は、組織の少なくとも超急性および急性の血管拒絶反応を回避するうえで補助となる。このように、本発明の異種移植は、２つのより重症な型の臓器拒絶反応を避け、血管新生を行うことが可能で、宿主内で機能性キメラ的臓器へと成長する。
【００３０】
未熟膵臓組織の同種移植の場合、いずれの胎児の原基も、このような移植を必要とする同種のレシピエント内に移植することができる。所望により、リンパ球混合培養反応などの当該分野で公知のいずれかの方法を使用してドナーおよびレシピエントの間でＭＨＣ（主要組織適合性抗原複合体）単相型適合を行ってもよい。
本発明のキメラ的膵臓内分泌部の血管新生および成熟に適当な条件はまた、移植された組織の成長および機能化を促進し、移植片の拒絶反応を防ぐ術前または術後の方法、および組成物の使用を含んでよい。同系移植および異種移植のあるケースにおいては、移植された膵臓組織の宿主拒絶反応がなく、したがって免疫抑制および、または共刺激方法および組成物は回避されるだろう。さらに、発明の未熟膵臓組織は、成長因子および、宿主内でのインスリン産生ベータ細胞の成長である、宿主内での増殖および成長を亢進し、移植拒絶反応の可能性を減少する組成物で処理することで、本発明における使用に適応化させることができる。
【００３１】
本発明のもう１つの態様は、哺乳類レシピエントの膵臓実質を増加させるため、未熟膵臓組織の哺乳類レシピエントの腹腔内への移植に用いる、レシピエントの刺激遮断組成物および方法（実施例処方１および処方２を参照）である。公知のように、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、同種および異種移植片の、血管を形成しない急性のＴ細胞媒介拒絶反応において重大な役割を果たす。このように、レシピエントのＴ細胞反応の共刺激を遮断することにより、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化およびまたは機能を標的とすることで、このような拒絶反応を抑え込むことは、本発明において有効であることが証明された。移植された組織に対する宿主のＴ細胞反応を標的および下方調節する、適当な免疫調節物質および方法を使用してもよく、そのことは本発明において意図されるものである。
第１のこのような方法は、ＣＴＬＡ４Ｉｇ（Genetics Institute, Cambridge MA）および抗ＣＤ２（Pharmingen, San Diego CA）の組成物を含み、これらは移植の前、間および後にレシピエントに投与されてよい。
【００３２】
共刺激遮断の第２の方法は、抗ＣＤ１１ａ（Pharmingen, San Diego CA）、抗ＣＤ４５ＲＢ（Clone 23G2, Pharmingen, San Diego CA）および抗ＣＤ１５４（Clone MR1, Pharmingen, San Diego CA）を含み、これらはまた移植の前、間および後に投与されてよい。
少なくとも異種移植の場合には、本発明はレシピエントに用いる免疫抑制方法および組成物を含むだろう。これは通常、移植後にレシピエントを免疫抑制することでなされる。シクロスポリンＡ（ＣＳＡ）処理は、ドナー組織の拒絶反応を防ぐのに十分な免疫抑制を提供する。移植拒絶反応を防ぐためのＣＳＡ処理方法は、医学分野で公知である。局所免疫抑制技術は、Gruber（1992）, Transplantation 54: 1-11により記載される。米国特許第５，５６０，９１１号では、自然発生ヒト抗動物抗体のイディオタイプに拮抗する抗体は、異種移植片拒絶反応を阻害するのに有用であると開示されている。抗リンパ球グロブリンはまた、移植拒絶反応を防ぐことが公知である（Lacyら. （1981）, Diabetes 30: 285-291）。免疫抑制の代わりとして、移植された膵臓を移植の前にその抗原性を減少するために処理し得る。表面修飾による移植片の免疫原性を減少させる典型的な解決法が、Faustman ＷＯ  ９２／０４０３３（１９９２）により開示されている。
【００３３】
本発明の好ましい態様において、未熟膵臓組織を受けたレシピエントが服用する免疫抑制物組成物は、催糖尿病性が低いと証明された免疫抑制物質の使用に基づくであろう。例えば、コルチコステロイド、シクロスポリンＡまたはタクロリムスの使用は、本明細書に記載の移植目的に制限することができる。免疫抑制処理が成功する例は、長期高用量シロリムス（Sirolimus）（非催糖尿病性）、長期低用量のタクロリムス（催糖尿病性）および短期のダクリツマブを必要とする、エドモントン法（Shapiroら, 2000）で使用された方法に基づくものであってもよい。
未熟膵臓組織は、移植前だが採取後にも冷却（おおよそ４℃）する準備をするか、または冷却下で維持することで、移植に適応させることができる。本発明はさらに、単離された哺乳類の未熟膵臓組織を、成長因子、成長培地、および組織の移植後の成長および発達を増強する他の化合物および組成物に接触させることによって、膵臓組織を移植に適応させることを含む。このような組成物の１つは、採取後および移植前の、ＨａｍｓＦ１２：Ｄｕｌｂｅｃｃｏの修飾Ｅａｇｌｅｓ培地（好ましくは５０から１００ｕｌの５０：５０の混合液）内の、肝細胞成長因子（好ましくは１０ないし９Ｍ）およびＶＥＧＦ（好ましくは５μｇ／ｍｌ）を含んでもよい。好ましい具体例において、組織を該組成物と一緒に３／４ないし３時間、４℃でインキュベートする。
【００３４】
採取された組織は、移植片の成長を増強するため、様々の成長因子および成長促進物質、またはそれらの組み合わせにより処理されてもよい。例えば、採取された組織を肝細胞成長因子（ＨＧＦ）と接触させてベータ細胞の増殖を強化し、インビボで島実質を増加させてもよい。同様に、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を用いて、膵島の血管新生を増加させてもよい。成長および成熟化を強化するプロトコルを計画かつ実行するのに利用することのできる他の成長因子は、とりわけ、以下の：臓器培養液内で維持される膵臓原基内での内分泌細胞の直系決定を調節しうる、表皮成長因子（ＥＧＦ）ファミリーリガンド；ベータ細胞の分化を促進するベータセルリン（ＢＴＣ）；およびソマトスタチン産生デルタ細胞の成長に影響するノイレグリン（Neuregulin）（ＮＲＧ−４）；インビトロで腺房の分化を阻害するレチノイド拮抗薬；変換増殖因子ファミリー（ＴＧＦｓ）、成長因子（ＩＧＦｓ）、ガストリン、アクチビンＡのメンバー、および線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーのメンバーを含む。
移植片、特にベータ細胞の成長の強化は、インスリン、特に異種インスリンをレシピエントに外科手術後に投与することで増強することができる。好ましい具体例において、本発明は、移植された組織の発達を増強するため移植後に異種インスリンを患者に投与する工程を含む。
【００３５】
十分な成長期間の後、発明の移植された組織がインスリン分泌能を有することが明らかである。組織を腹腔内へ移植しているため、分泌されたインスリンは、レシピエントの門脈系内に直接放出される。したがって、発明の方法および組成物を使用した未熟膵臓組織の移植は、レシピエントの機能的な内分泌マスが増加する一因となる。
また、十分な成長期間の後、外分泌膵臓組織がキメラ膵臓に存在しないことは明らかである。その代わりに、それは図７に示されるようにランゲルハンス島および間質組織から構成される。したがって、キメラ膵臓からの外分泌膵臓分泌物をドレナージする方法を考案する必要はない。
【００３６】
実施例
以下の実施例を用いて、本発明の具体例を記載する。本明細書の請求項の範囲内における他の具体例は、本明細書で開示される本発明の明細または実践を考慮することで当業者には明白となるであろう。実施例と共に明細書は単なる例示として解され、本発明の範囲および精神は添付した特許請求の範囲で表される。
【００３７】
ブタからマウスへの移植に用いる共刺激遮断処方
処方１：本実施例において、発達中のブタ後腎組織（発達中の腎臓原基）を、ブタドナーよりマウスレシピエント内へと移植した。治療方法は、レシピエントＣ５７Ｂ１／６Ｊマウスに、ＣＴＬＡ４Ｉｇの組成物を、移植前２および１日目に、移植の日に、および移植後５日目に、０．５ｍｇ／日にて投与し；および、抗ＣＤ２の組成物を、移植の日および移植後の３、７および１０日目に、０．５ｍｇ投与することを含む。図１Ａに示されるのは、マウスの大網への移植後１４日のブタ後腎（ｍ）である。Ｈ＆Ｅで染色された、パラフィン包埋後腎の切片を、図１ＢおよびＣに示す。糸球体を標識する（ｇ）。図１Ｄはマウス特異的抗ＣＤ３１で染色されたパラフィン包埋切片を示す（６）。血管（矢印）および糸球体系蹄毛細血管ループ（矢じり）は、ブタ後腎において示す。これらの血管およびループはマウス由来である（染色＋マウス特異的抗ＣＤ３１のため）。糸球体（ｇ）を標識する。このように、移植されたブタ組織はマウスレシピエント内で拒絶されることなく、実際に成長し、その成長の間にレシピエントにより血管新生がなされた。
【００３８】
処方２：この方法および組成物はまた、ブタからマウスへの後腎の移植により具現化される。レシピエントマウスは、移植の日および移植後０、１、７および１４日目に、０．２ｍｇの抗ＣＤ１１ａで静脈内的に；移植３および２日目に０．２ｍｇで、移植前の１日目に０．３ｍｇで、および移植の日および移植後１ないし１０日目に０．１ｍｇの抗ＣＤ４５ＲＢで静脈内的に；および、移植の前の日、移植の日および移植後２および４日目に、０．２５ｍｇの抗ＣＤ１５４で静脈内的に処理された。図２Ａに示されるのは、マウスの大網への移植後１４日のブタ後腎（ｍ）である。Ｈ＆Ｅで染色された切片を、図２ＢないしＥで示す。尿管（ｕ）が図２Ｂでは標識されている。腎発生帯（ネフロンに発達）を示す（図２ＣおよびＤの矢印）。糸球体（ｇ）を図２Ｄおよび２Ｅにおいて標識する。再び、移植後の図により、後腎が宿主内で拒絶反応を起こさずに血管を形成し、成長したことが確立される。
【００３９】
胎児膵臓原基の移植はランゲルハンス島の形成をもたらす。
背側および腹側の膵臓両方よりなる膵臓原基をＥ１２．５ルイスラット胎児より切開の範囲下で外科的に採取し、無菌状態下で氷冷された生理食塩水内に浮遊させた（図３Ａ参照）。切除から２時間以内に、膵臓原基を成体ルイスラットの大網内に移植した。移植後２週で、成体ルイスラットを殺し、組織学的分析のために膵臓移植片を摘出した。ヘマトキシリンおよびエオシンで染色された組織マスの、固定、パラフィン包埋および薄切りされた切片を組織学的試験に付し、移植された膵臓原基は、ランゲルハンス島を含む組織へと増殖および成長したことが明らかとなった。
図３Ａに示されるのは、Ｅ１２．５ルイスラット胎児からの十二指腸（ｄｕｏ）の切片の写真である。背側膵臓（ｄｐ）および腹側膵臓（ｖｐ）を標識する。図３Ｂに示されるのは、十二指腸が切除された背側および腹側膵臓原基の、Ｈ＆Ｅで染色された切片である。図３Ｃは、３Ｂに示される背側および腹側膵臓原基の拡大図である。
【００４０】
インスリンに対する免疫反応力がＥ１２．５で膵臓原基に存在するかどうかを決定するために、本発明者らは付加的な染色を実行した。図４Ａは、Ｅ１２．５ルイスラット胎児より得られた膵臓原基のＨ＆Ｅで染色された切片を示す。図４Ｂは、抗インスリン抗体で染色された隣接する切片を示す。Ｅ１２．５においてインスリンに対して陽性となった染色は検出されていない。
ルイスラットの大網内への全ての膵臓原基の移植後２週までに、組織は分化した。図４Ｃに示されるのは、対照抗体で染色された切片、および４Ｄに示されるのは、隣接するインスリンで染色された切片である。対応する陰性（４Ｃ）および陽性（４Ｄ）組織を示す（矢じり）。４Ｅに示されるのは、移植後２週のもう１つの移植された膵臓の対照染色された切片、および４Ｆに示されるのは、隣接するインスリンで染色された切片である。ランゲルハンス島を示す（矢印）。倍率はＡ＆Ｂ（Ａ）、Ｃ＆Ｄ（Ｃ）およびＥ＆Ｆ（Ｅ）で示される。
【００４１】
２週を過ぎた膵臓原基の増殖および成長、およびインスリン免疫反応力の形式を特徴付けるため、本発明者らは、Ｅ１２．５膵臓原基の移植後６または１５週に、宿主腹膜内に存在する構造物を調査した。図５Ａに示されるのは、成体ルイスラットの腹膜内に移植後６週の、膵臓原基より発生した、対照抗体で染色された切片である。図５Ｂに示されるのは、抗インスリン抗体で染色された隣接する切片である。島組織を示す（矢印）。図５Ｃおよび５Ｄに示されるのは、もう１つの対照抗体で染色された切片の拡大図（図５Ｃ）、および抗インスリン抗体で染色された隣接する切片（図５Ｄ）である。図５ＥないしＦは、抗インスリン抗体で染色された切片で、導管上皮（ｄ）に接続したままの成長中の導管の島を示す（矢印）。倍率はＡ＆Ｂ（Ａ）、Ｃ＆Ｄ（Ｃ）およびＥ＆Ｆ（Ｅ）で示される。
図６は移植後１５週の膵臓原基を示す。図６Ａに示されるのは、Ｈ＆Ｅで染色された切片、および図６Ｂに示されるのは、対照の血清で染色された切片である。対応する抗インスリン抗体で染色された切片は、図６Ｃに示される。図６Ｄは、抗インスリン抗体で染色された、腫大したランゲルハンス島を示す。矢印は島を示す。倍率はＡからＣはＡにおいて、およびＤにおいて示される。「臓器」は、腹膜脂肪に覆われた間質内の島組織よりなる新しい臓器である。腹膜には炎症性反応は無く、これは活性を有する外分泌の分泌活性を示す。
【００４２】
結合Ｇｏｍｏｒｉ法は、ベータ細胞を紫に、および腺房細胞を明桃色に染色する。図７Ａに示されるのは、移植後１５週の発達した膵臓原基由来の切片である。図７Ｂに示されるのは、新生児ラット由来の背側膵臓の切片である。島（矢印）および腺房細胞（矢じり）を示す。予測通り、結合Ｇｏｍｅｒｉ陽性（明桃色）の腺房組織は図７Ｂに存在する。対照的に、非染色間質に覆われた島組織は図７Ａにのみ存在する。倍率を示す（Ｂ）。
ベータ細胞がインスリン顆粒を含むかどうかを示すため、電子顕微鏡検査が実行された。図８Ａは島内の細胞を示す。その細胞質は、結晶化インスリン（矢印）を表す離心濃染核を含む神経分泌顆粒でパックされている。顆粒の高倍率を図８Ｂに示す。
【００４３】
膵臓原基の移植によるストレプトゾトシン糖尿病の治療
基線血中グルコースレベルの測定（０日）の後、ストレプトゾトシン糖尿病をルイスラットに誘導した。対照集団（対照、ｎ＝８）は、ストレプトゾトシンの代わりにビヒクルを与えられた。ストレプトゾトシンまたはビヒクル投与後５日目に、血中グルコースレベルを測定した。ストレプトゾトシン糖尿病ラットのうち、１０の膵臓原基が腹膜内に移植された（ｎ＝３移植）。他のラットは偽手術を受けた（Ｎ＝７糖尿病）。グルコースレベルは、ビヒクルまたはストレプトゾトシンの投与後１４、２８および３５日目のＡＭ８時に再び測定された。図９に示されるように、グルコースレベルは、５、１４、２８および３５日目に対照と比較して、糖尿病ラットにおいて上昇した。対照的に、３５日目まで、対照および移植された（以前は高血糖の）ラットの間ではグルコースレベルに違いは無かった。**ｐ＜０．０１対当日の対照；*Ｐ＜０．０５対当日の対照、ダネット多重比較法。
【００４４】
グルコース負荷試験が、第２の対照ラットの集団（ｎ＝６）、糖尿病ラット（ｎ＝４）および移植された（以前は高血糖の）ラット（ｎ＝６）に対して、移植された集団内に１０の膵臓原基を移植後１８週に、Brownら， Diabetes 30: 9-13 （1981）において記載される方法論を使用して、実行された。ラットは絶食され、タオルを巻いて抑制され、尾の静脈内に急速注射経由で、０．５ｇ／ｋｇ体重の用量でＤ−グルコースを与えられた。血液サンプルが後で尾の静脈より収集された。グルコース消失の割合を表すＫ値（％／分）は、１０、２０および３０分の値を使用して決定された。対照ラットおよび糖尿病ラットにおけるグルコース消失を表すＫ値（％／分）は、各々２．９２±０．４４および０．４８±０．２６であり、Brownらにより報告された値（対照＞糖尿病、ｐ＜０．０１）と同等であった。移植されたラットのＫ値は、２．８２±０．４６であり、対照と有意には異なるものではなく、糖尿病動物と比較すると有意に上昇した。
グルコースレベルは、図９に示されるデータを作成するために使用されたラットにおいて、毎週測定されてきた。正常血糖が４ヶ月（１６週）持続した（図１０）。
【００４５】
胎児膵臓原基の異種移植
Ｅ１２．５ルイスラットの膵臓原基を、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスの大網内に移植した。数匹の宿主マウスを上記と全く同様に共刺激遮断物質［ｈＣＴＬＡ４−Ｉｇ：０．２ｍｇを経腹膜的に、移植の日（０日）に；および移植後２および４日目に；抗ＣＤ４５ＲＢ（クローン２３Ｇ２）：０．１ｍｇを静脈内的に、移植前の３日目（−３日）から０日まで、および０．１ｍｇを経腹膜的に、移植後１ないし１０日目に；および、抗ＣＤ１５４：０．２５ｍｇを経腹膜的に、移植後０、２および４日目に］で処理した。他のマウスはビヒクルの注射で処理された。
【００４６】
図１１Ａは、ビヒクルで処理されたＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウスの大網内へ移植後４週のルイスラット膵臓原基を示す。図１１Ｂは、共刺激遮断物質で処理されたＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウスの大網内へ移植後４週のルイスラット膵臓原基を示す。図１１Ａに示される未分化膵臓組織とは対照的に、島（矢印）は図１１Ｂにおいて識別できる。
図１２は、共刺激遮断を受けた成人Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスの大網内へ移植後４週の、第２のＥ１２．５ルイスラット膵臓原基を示す。図１２Ａは対照血清；図１２Ｂは抗インスリン抗体；図１２Ｃは結合ゴモリ染色である。島を示す（矢印）。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
（原文に記載なし）
【図１】
2005521497.tif 000002
【図２】
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【図３】
2005521497.tif 000004
【図４】
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【図５】
2005521497.tif 000006
【図６】
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【図７】
2005521497.tif 000008
【図８】
2005521497.tif 000009
【図９】
2005521497.tif 000010
【図１０】
2005521497.tif 000011
【図１１】
2005521497.tif 000012
【図１２】
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【国際調査報告】
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