(57)【要約】【解決手段】本発明は、動物細胞中で異種タンパク質を発現することに用い得る、カルジオウイルス若しくはアフトウイルスのゲノムに由来するレプリコン又は自己複製ＲＮＡ分子に関する。例えば裸のＲＮＡの形態で動物宿主中に注射されると、これらのレプリコンは、エンコードされた異種タンパク質の翻訳を可能にする。エンコードされた異種タンパク質が外来抗原である場合、これらのレプリコンは、エンコードされた異種タンパク質に対する免疫応答を誘導する。本発明は、カルジオウイルス又はアフトウイルスのゲノムを用いてこれらのレプリコンを構築する。本発明は、裸のＲＮＡとして注射された場合、動物宿主において、いずれの種類のキャリアーやアジュバントの助けなしに、これらのレプリコンがレプリコンにエンコードされた異種タンパク質に対して免疫応答を誘導することができることを明らかにする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡ分子が：
ａ）ＲＮＡウイルスの非構造タンパク質をエンコードするＲＮＡ配列；
ｂ）ウイルスの複製に必要なウイルスの非エンコードＲＮＡ配列；及び
（ｃ）異種タンパク質又は異種タンパク質のフラグメントをエンコードするＲＮＡ配列
からなる、ＲＮＡウイルスのウイルスゲノムの自己複製組換えプラス鎖ＲＮＡ分子。
【請求項２】
ＲＮＡ分子が：
（ａ）ＲＮＡウイルスの非構造タンパク質をエンコードするＲＮＡ配列；
（ｂ）ウイルスの複製に必要なウイルスの非エンコードＲＮＡ配列；及び
（ｃ）異種タンパク質又は異種タンパク質のフラグメントをエンコードするＲＮＡ配列
からなり、
ａ）のＲＮＡ配列及び／若しくはｂ）のウイルスの非エンコードＲＮＡ配列が、変異した、又は、切断された形態である
ＲＮＡウイルスのウイルスゲノムの自己複製組換えプラス鎖ＲＮＡ分子。
【請求項３】
ＲＮＡウイルスが、カルジオウイルス又はアフトウイルス属である
請求項１又は２記載の自己複製組換えプラス鎖ＲＮＡ分子。
【請求項４】
ＲＮＡウイルスが、メンゴウイルスである
請求項３記載の自己複製組換えプラス鎖ＲＮＡ分子。
【請求項５】
さらに、メンゴウイルスＶＰ２遺伝子のシス作用複製エレメント（ＣＲＥ）からなる
請求項４記載の自己複製組換えプラス鎖ＲＮＡ分子。
【請求項６】
さらに、サイラーウイルスＶＰ２遺伝子のシス作用複製エレメント（ＣＲＥ）からなる
請求項４記載の自己複製組換えプラス鎖ＲＮＡ分子。
【請求項７】
異種タンパク質が、生理活性タンパク質、レポータータンパク質、細胞毒性タンパク質、病原体のタンパク質又は腫瘍のタンパク質から選択される
請求項１〜６のいずれか一つに記載の自己複製組換えプラス鎖ＲＮＡ分子。
【請求項８】
レポータータンパク質が、緑色蛍光タンパク質である
請求項７記載の自己複製組換えプラス鎖ＲＮＡ分子。
【請求項９】
病原体のタンパク質が、インフルエンザ核タンパク質又はインフルエンザ赤血球凝集素である
請求項７記載の自己複製組換えプラス鎖ＲＮＡ分子。
【請求項１０】
異種タンパク質のフラグメントが、前記異種タンパク質の抗原又はエピトープである
請求項１〜６のいずれか一つに記載の自己複製組換えプラス鎖ＲＮＡ分子。
【請求項１１】
少なくとも一つの請求項１〜７及び９〜１０のいずれかに記載の自己複製組換えプラス鎖ＲＮＡ分子、並びに、医薬上受容な担体からなるワクチン。
【請求項１２】
自己複製組換えプラス鎖ＲＮＡ分子が、裸のＲＮＡである
請求項１１記載のワクチン。
【請求項１３】
自己複製組換えプラス鎖ＲＮＡ分子が、包膜されている
請求項１１記載のワクチン。
【請求項１４】
医薬上受容な担体が、水、石油、動物油、植物油、ピーナッツオイル、大豆油、鉱油、ごま油、食塩水、水溶性デキストロース、グリセロール溶液、ポリカチオン性粒子、タンパク質粒子、プロタミン粒子、リポソーム及び金粒子から選択される
請求項１１〜１３記載のワクチン。
【請求項１５】
（ａ）医薬上受容な担体中で、少なくとも一つの請求項１〜７及び９〜１０のいずれかに記載の自己複製組換えプラス鎖ＲＮＡ分子を調製し；
（ｂ）工程（ａ）の調製物で宿主を免疫する
ことからなる宿主中での防御免疫応答の誘導方法。
【請求項１６】
請求項１〜７及び９〜１０のいずれか一つに記載の自己複製組換えプラス鎖ＲＮＡ分子が、裸の形態で調製される
請求項１５記載の宿主中での免疫応答の誘導方法。
【請求項１７】
請求項１〜７及び９〜１０のいずれか一つに記載の自己複製組換えプラス鎖ＲＮＡ分子が、包膜されたＲＮＡである
請求項１５記載の宿主中での免疫応答の誘導方法。
【請求項１８】
医薬上受容な担体が、水、石油、動物油、植物油、ピーナッツオイル、大豆油、鉱油、ごま油、食塩水、水溶性デキストロース、グリセロール溶液、ポリカチオン性粒子、タンパク質粒子、プロタミン粒子、リポソーム及び金粒子から選択される
請求項１５〜１７記載の方法。
【請求項１９】
宿主が、ヒト、ブタ、イヌ、ネコ、ウシ、ニワトリ、マウス又はウマである
請求項１５〜１８記載の方法。
【請求項２０】
ＲＮＡ分子が：
（ａ）ＲＮＡウイルスの非構造タンパク質をエンコードするＲＮＡ配列；
（ｂ）ウイルスの複製に必要なウイルスの非エンコードＲＮＡ配列；及び
（ｃ）異種タンパク質又は異種タンパク質のフラグメントをエンコードするＲＮＡ配列
からなるＲＮＡウイルスのウイルスゲノムの自己複製組換えプラス鎖ＲＮＡ分子をエンコードするＤＮＡ分子。
【請求項２１】
ＲＮＡ分子が：
（ａ）ＲＮＡウイルスの非構造タンパク質をエンコードするＲＮＡ配列；
（ｂ）ウイルスの複製に必要なウイルスの非エンコードＲＮＡ配列；及び
（ｃ）異種タンパク質又は異種タンパク質のフラグメントをエンコードするＲＮＡ配列
からなり、
ａ）のＲＮＡ配列及び／若しくはｂ）のウイルスの非エンコードＲＮＡ配列が、変異した、又は、切断された形態である
ＲＮＡウイルスのウイルスゲノムの自己複製組換えプラス鎖ＲＮＡ分子をエンコードするＤＮＡ分子。
【請求項２２】
ＲＮＡウイルスが、カルジオウイルス又はアフトウイルス属である
請求項２０又は２１記載のＤＮＡ分子。
【請求項２３】
ＲＮＡウイルスが、メンゴウイルスである
請求項２２記載のＤＮＡ分子。
【請求項２４】
さらに、メンゴウイルスＶＰ２遺伝子のシス作用複製エレメント（ＣＲＥ）からなるＲＮＡをエンコードする
請求項２３記載のＤＮＡ分子。
【請求項２５】
さらに、サイラーウイルスＶＰ２遺伝子のシス作用複製エレメント（ＣＲＥ）からなるＲＮＡをエンコードする
請求項２３記載のＤＮＡ分子。
【請求項２６】
異種タンパク質が、生理活性タンパク質、レポータータンパク質、細胞毒性タンパク質、病原体のタンパク質又は腫瘍のタンパク質から選択される
請求項２０〜２５のいずれか一つに記載のＤＮＡ分子。
【請求項２７】
レポータータンパク質が、緑色蛍光タンパク質である
請求項２６記載のＤＮＡ分子。
【請求項２８】
病原体のタンパク質が、インフルエンザ核タンパク質又はインフルエンザ赤血球凝集素である
請求項２６記載のＤＮＡ分子。
【請求項２９】
異種タンパク質のフラグメントが、前記異種タンパク質の抗原又はエピトープである
請求項２６記載のＤＮＡ分子。
【請求項３０】
さらに、適切なクローニングベクターからなる
請求項２６記載のＤＮＡ分子。
【請求項３１】
ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２６（受理番号Ｉ−２６６８にて、２００１年５月２１日にＣＮＣＭ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ、２８  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ、７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５、Ｆｒａｎｃｅに寄託）又はそのフラグメントの配列、及び、発現しうる形態での異種タンパク質又は異種タンパク質のフラグメントをエンコードするＤＮＡ配列
からなるＤＮＡ分子。
【請求項３２】
ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２６（受理番号Ｉ−２６６８にて、２００１年５月２１日にＣＮＣＭ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ、２８  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ、７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５、Ｆｒａｎｃｅに寄託）の変異した若しくは切断された形態又はそのフラグメントの配列、及び、発現しうる形態での異種タンパク質又は異種タンパク質のフラグメントをエンコードするＤＮＡ配列
からなるＤＮＡ分子。
【請求項３３】
異種タンパク質が、生理活性タンパク質、レポータータンパク質、細胞毒性タンパク質、病原体のタンパク質又は腫瘍のタンパク質から選択される
請求項３１又は３２記載のＤＮＡ分子。
【請求項３４】
レポータータンパク質が、緑色蛍光タンパク質である
請求項３３記載のＤＮＡ分子。
【請求項３５】
病原体のタンパク質が、インフルエンザ核タンパク質又はインフルエンザ赤血球凝集素である
請求項３３記載のＤＮＡ分子。
【請求項３６】
異種タンパク質のフラグメントが、前記異種タンパク質の抗原又はエピトープである
請求項３１又は３２記載のＤＮＡ分子。
【請求項３７】
ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２７（受理番号Ｉ−２６６９にて、２００１年５月２１日にＣＮＣＭ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ、２８  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ、７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５、Ｆｒａｎｃｅに寄託）又はそのフラグメントの配列、及び、異種タンパク質又は異種タンパク質のフラグメントをエンコードするＤＮＡ配列
からなるＤＮＡ分子。
【請求項３８】
ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２７（受理番号Ｉ−２６６９にて、２００１年５月２１日にＣＮＣＭ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ、２８  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ、７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５、Ｆｒａｎｃｅに寄託）の変異した若しくは切断された形態又はそのフラグメントの配列、及び、発現しうる形態での異種タンパク質又は異種タンパク質のフラグメントをエンコードするＤＮＡ配列
からなるＤＮＡ分子。
【請求項３９】
異種タンパク質が、生理活性タンパク質、レポータータンパク質、細胞毒性タンパク質、病原体のタンパク質又は腫瘍のタンパク質から選択される
請求項３７又は３８記載のＤＮＡ分子。
【請求項４０】
病原体のタンパク質が、インフルエンザ核タンパク質又はインフルエンザ赤血球凝集素である
請求項３９記載のＤＮＡ分子。
【請求項４１】
異種タンパク質のフラグメントが、前記異種タンパク質の抗原又はエピトープである
請求項３７又は３８記載のＤＮＡ分子。
【請求項４２】
（ａ）医薬上受容な担体中で、少なくとも一つの請求項２０〜４１のいずれかに記載のＤＮＡ分子を調製し；
（ｂ）工程（ａ）の調製物で宿主を免疫する
ことからなる宿主中での防御免疫応答の誘導方法。
【請求項４３】
ＤＮＡ分子が、裸のＤＮＡである
請求項４２記載の宿主中での防御免疫応答の誘導方法。
【請求項４４】
ＤＮＡ分子が、包膜されている
請求項４２記載の宿主中での防御免疫応答の誘導方法。
【請求項４５】
受容な媒体中における、少なくとも、請求項２０〜４１に記載のＤＮＡ分子又は請求項１〜７及び９〜１０に記載の自己複製組換えプラス鎖ＲＮＡ分子
からなる治療組成物。
【請求項４６】
受容な媒体中における、少なくとも、請求項２０〜４１に記載のＤＮＡ分子又は請求項１〜７及び９〜１０に記載の自己複製組換えプラス鎖ＲＮＡ分子
からなる治療キット。
【請求項４７】
（ａ）請求項２０〜４１のいずれかに記載のＤＮＡ分子及び請求項１〜７及び９〜１０のいずれかに記載の自己複製組換えプラス鎖ＲＮＡ分子から選択される少なくとも１つの分子を、医薬上受容な担体中で調製し；
（ｂ）工程（ａ）の調製物で宿主を免疫する
ことからなる宿主中での免疫応答の調節方法。
【請求項４８】
医薬上受容な担体が、水、石油、動物油、植物油、ピーナッツオイル、大豆油、鉱油、ごま油、食塩水、水溶性デキストロース、グリセロール溶液、ポリカチオン性粒子、タンパク質粒子、プロタミン粒子、リポソーム及び金粒子から選択される
請求項４２記載の方法。
【請求項４９】
宿主が、ヒト、ブタ、イヌ、ネコ、ウシ、ニワトリ、マウス又はウマである
請求項４２記載の方法。
【請求項５０】
（ａ）請求項１〜７及び９〜１０のいずれかに記載の自己複製組換えプラス鎖ＲＮＡ分子又は請求項２０〜４１のいずれかに記載のＤＮＡ分子を、キャプシドタンパク質のＰ１前駆体を発現する細胞にトランスフェクションし；
（ｂ）トランスフェクションされた細胞から包膜された自己複製組換えプラス鎖ＲＮＡ分子を調製し；
（ｃ）工程（ｂ）の調製物で宿主を免疫する
ことからなる、ＲＮＡウイルスのウイルスゲノムの包膜された自己複製レプリコンプラス鎖ＲＮＡ分子を製造することによりＲＮＡウイルスのウイルスゲノムの自己複製レプリコンプラス鎖ＲＮＡ分子の免疫原性を向上させる方法。
【請求項５１】
（ａ）請求項１〜７及び９〜１０のいずれかに記載の自己複製組換えプラス鎖ＲＮＡ分子を濃縮し；
（ｂ）工程（ａ）の濃縮されたＲＮＡ分子で宿主を免疫する
ことからなるＲＮＡウイルスのウイルスゲノムの自己複製レプリコンプラス鎖ＲＮＡ分子の免疫原性を向上させる方法。
【請求項５２】
ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２８（受理番号Ｉ−２８７９にて、２００２年５月１６日にＣＮＣＭ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ、２８  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ、７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５、Ｆｒａｎｃｅに寄託）の配列
からなる請求項３１記載のＤＮＡ分子。
【請求項５３】
前記異種タンパク質のエピトープが、リンパ球性脈絡髄膜炎核タンパク質のＮＰ１１８−１２６エピトープである
請求項３６又は４１記載のＤＮＡ分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物細胞中で異種タンパク質を発現することに用い得る、カルジオウイルス（ｃａｒｄｉｏｖｉｒｕｓｅｓ）及びアフトウイルス（ａｐｈｔｏｖｉｒｕｓｅｓ）に由来するレプリコン又は自己複製ＲＮＡに関するものである。例えば裸のＲＮＡの形態で動物宿主に注入されると、これらのレプリコンは、エンコードされた異種タンパク質の翻訳を可能にする。エンコードされた異種タンパク質が外来抗原である場合、これらのレプリコンは、エンコードされた異種タンパクに対する免疫応答を誘導する。本発明は、カルジオウイルス及びアフトウイルスのゲノムを用いてこれらのレプリコンを構築する。本発明は、裸のＲＮＡとして注射された場合、動物宿主において、いずれの種類のキャリアーやアジュバントの助けなしに、これらのレプリコンが、レプリコンにエンコードされた異種タンパク質に対して免疫応答を誘発することができることを明らかにする。
【背景技術】
【０００２】
遺伝的免疫感作は、ワクチンの開発のために選択しうる強力な手段である。これは、外来タンパク質をエンコードする遺伝子配列を有するＤＮＡ発現ベクターの摂取に基づく。例えば、インフルエンザ核タンパク質（ＮＰ）をエンコードする裸のＤＮＡベクターでの免疫感作は、抗体及び細胞の応答を誘導し、インフルエンザＡウイルス変異株による同種間及び種間の両方の対抗感染から動物宿主を守ることが示されている（２、２７、２８）。ＤＮＡ免疫感作の利点としては、製造の容易性、ワクチンの精製及び投与の容易性、並びに、長期持続する免疫性が得られることが挙げられる。
【０００３】
ＤＮＡ免疫感作に関する長期免疫性は、注入されたＤＮＡの長期存続及び発現に関連があるようである。実際、マウスモデルにおいて、注入されたＤＮＡ分子が１年を超えて存続することが示されている（３１）。しかしながら、臨床上の観点から、宿主ゲノムへのＤＮＡ配列の組込みの危険の可能性というその理由で、ある疑問が残る。動物での予備的な研究はゲノム組込みの事象を示していないが（１９）、このような組込みは、挿入変異、癌原遺伝子の活性化、又は、染色体の不安定性を引き起こすことができ、癌等の疾患になるであろう（３５）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
この潜在的な問題を回避するため、発明者らは、プラス鎖ＲＮＡウイルスゲノムに由来する裸の自己複製ＲＮＡ分子又はレプリコンを作成した。ＲＮＡは、既に、遺伝的免疫感作のためのＤＮＡに代わるものとして提案されているが、このアプローチの開発は、ＲＮＡの細胞内半減期が短いこと、及び、いたるところに存在するＲＮａｓｅにより分解されることから、新たな問題に直面している。当初の試みは、ｍＲＮＡを用いて免疫応答を誘発し、投与中ＲＮＡを保護するため、金粒子被覆遺伝子銃によるデリバリー（２５）、又は、リポソーム被包注射（１７）により、筋内投与を行った（５）。これらの分子のデリバリー及びエンコードされた異種タンパク質の発現をさらに向上させるため、プラス鎖ＲＮＡウイルスのゲノムに由来する、包膜された自己複製ＲＮＡ又はレプリコンが細胞内に異種配列を伝達するために開発されている。これらのレプリコンでは、ゲノムの構造遺伝子が異種配列により置換されているが、複製を１回行うことができるように、その非構造遺伝子は保持されている。この分子設計により、外来タンパク質の発現が可能である。
【０００５】
アルファウイルス（ａｌｐｈａｖｉｒｕｓｅｓ）、セムリキ森林ウイルス（Ｓｅｍｌｉｋｉ  Ｆｏｒｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ；ＳＦＶ）、シンドビスウイルス（Ｓｉｎｄｂｉｓ  ｖｉｒｕｓ）及びベネズエラウマ脳炎ウイルス（Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ  ｅｑｕｉｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）のゲノムをこの方法で扱い、外来タンパク質を発現させている（１１、２４）。ＲＮＡベースのレプリコンのタンパク質によるパッケージングは、これらを安定化し、得られるウイルス様粒子の注入を可能にして異種タンパク質に対する免疫応答の配列を誘導する。同様に、ポリオウイルス（ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ）のプラス鎖ＲＮＡは、そのキャプシドコーディング配列が欠失しており、外来タンパク質が発現でき（３、２１）、ウイルス様粒子にパッケージングされた場合、ポリオウイルスレセプターを遺伝子導入したマウスに注射すると免疫応答を誘発することができる（１８、２３）。
【０００６】
包装されたＲＮＡ分子の研究とは反対に、本発明者らは、裸のＲＮＡレプリコンが免疫応答を誘導する能力を研究しており、その複製の性質が多量のＲＮＡを投入する必要性を軽減するので、これらのベクターをパッケージングすることが不要であることを論じている。赤血球凝集素（ＨＡ）及びインフルエンザＡウイルスのＮＰ分子をエンコードする組換えＳＦＶベクターの場合、裸のＲＮＡの注入は、特異的抗体を誘導することがわかっている（６、３４）。最近、ＳＦＶ由来の組換えレプリコンはインフルエンザＡ、呼吸系発疹及びルーピングイル（Ｌｏｏｐｉｎｇ  Ｉｌｌ）ウイルス（１０）、及び、モデル抗原として使用したｌａｃＺに対する細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ）（３３）に対する防御抗体を誘導することができたことを報告した発表者がいる。
【０００７】
本発明者らは、最近、内部インフルエンザＡ  ＮＰタンパク質（ｒＳＦＶ−ＮＰ）をエンコードする組換えＳＦＶレプリコンが、裸の形態でのＲＮＡの注入により、インフルエンザＡウイルスに対する液性及び細胞性の免疫応答を誘出することができ、その応答はプラスミドＤＮＡにより誘導される応答と同程度であることがわかったことを報告した。さらに、本発明者らは、ｒＳＦＶ−ＮＰレプリコンの裸での注射は、より良好に記載されたＤＮＡ免疫感作法が行う場合と同程度に、インフルエンザＮＰの免疫優性（ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ）エピトープに特異的なＣＴＬ応答を誘導すること、及び、マウスに適合させたインフルエンザウイルスで対抗されたマウスの肺疾患ウイルスの荷重を減少させることができたことを明らかにした。
【０００８】
本発明者らはまた、内部インフルエンザＡ  ＮＰタンパク質（ｒΔＰ１−Ｅ−ＮＰ）をエンコードするポリオウイルスレプリコンが、裸の形態でのＲＮＡの注入により、セムリキｒＳＦＶ−ＮＰレプリコンが行うよりも大幅に弱い液性免疫応答をマウスにおいて誘出することができたことを報告した。さらに、ｒΔＰ１−Ｅ−ＮＰレプリコンＲＮＡを注入したマウスにおいて、インフルエンザＮＰに対するＣＴＬ応答は検出されなかった（３０）。よって、発明者らは、例えば裸のＲＮＡの形態でそれらを注射した後、動物細胞及び動物宿主における異種細胞を発現するための新規レプリコンを構築するために、ピコルナウイルス（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）科の他のウイルスのメンバーのゲノムの使用を調査することを決定した。同じ遺伝子的機構を共有するアフトウイルス及びカルジオウイルスのメンバーは、この目的に用いることができた。実施例として、本発明者らは、カルジオウイルスの原型としてメンゴウイルス（Ｍｅｎｇｏ  ｖｉｒｕｓ）を用いた。
【０００９】
メンゴウイルスゲノムを基にしたレプリコンを構築するために、本発明者らは、どの遺伝子配列が、分子の複製に影響することなく欠失させることができるかを測定した。このために、メンゴウイルスゲノムにおいて、Ｌ−Ｐ１−２Ａ前駆体タンパク質のコーディング領域の全て又は一部を含むフレーム欠失のシリーズが作成された。対応するサブゲノムＲＮＡ分子の複製の性質を分析した。本発明者らは、ＶＰ２コーディング領域の短い核酸配列を除いて、Ｌ−Ｐ１−２Ａ前駆体のコーディング領域の全てを、その複製能力に影響を及ぼすことなくメンゴウイルスゲノムから除去することができたことを明らかにした。実際、本発明者らは、メンゴウイルスゲノムの核酸１１３７〜１２６７を含む領域（番号は、ｖＭＣ２４弱毒化株のものである）が、サブゲノムメンゴウイルスＲＮＡ分子がトランスフェクションされた細胞において複製することができるために必ず必要であるシス作用複製エレメント（Ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｅｌｅｍｅｎｔ（ＣＲＥ））を含むことを明らかにした（１５）。ここでの状況は、対応するサブゲノムＲＮＡ分子の複製に影響を及ぼすことなくキャプシドタンパク質前駆体（Ｐ１）の全体を欠失することができる点で、ポリオウイルスゲノム及びアフトウイルスゲノムについて観察されたこととは著しく異なる（１、１２）。
【００１０】
メンゴウイルス由来レプリコンを構築した後、本発明者らは、サブゲノムメンゴウイルスレプリコンが、異種配列を発現し得ることを明らかにした。レプリコンの免疫原性は、種々の方法により向上させることができる。例えば、発明者らは、キャプシドタンパク質のＰ１前駆体を発現する細胞にトランスフェクションした場合、イントランス（ｉｎ  ｔｒａｎｓ）でメンゴウイルスレプリコンを包膜することができることを明らかにした。レプリコンＲＮＡはまた、Ｈｏｅｒｒらにより記載されたように、ポリカチオン性ペプチドプロタミンにより濃縮することができる（３７）。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、カルジオウイルス属のウイルスのゲノムから構築されたレプリコンの構築及び使用について記載する。同様のレプリコンは、アフトウイルス属のウイルスゲノムからも構築することができるが、これは、アフトウイルスもピコルナウイルス科の一員であり、カルジオウイルスと同一の遺伝子的機構を共有しているからである。
【００１２】
本明細書において、「レプリコン」という語は、自己複製組換えプラス鎖ＲＮＡ分子を含むが、これに限定されない。
本明細書において、「プラス鎖」という語は、タンパク質を直接エンコードするＲＮＡ鎖を含むが、これに限定されない。
本明細書において、「発現」及びその変形の全ては、タンパク質又はタンパク質の一部の生産を上昇するか、エンコードすることを含むが、これらに限定されない。
【００１３】
本発明は、ＲＮＡ分子が：
（ａ）ＲＮＡウイルスの非構造タンパク質をエンコードするＲＮＡ配列；
（ｂ）ウイルスの複製に必要なウイルスの非エンコードＲＮＡ配列；及び
（ｃ）異種タンパク質又は異種タンパク質のフラグメントをエンコードするＲＮＡ配列
からなる、ＲＮＡウイルスのウイルスゲノムの自己複製組換えプラス鎖ＲＮＡ分子（レプリコン）を提供する。
【００１４】
上記レプリコンの好適な態様によると、ａ）の非構造タンパク質をエンコードするＲＮＡ配列及び／若しくはｂ）のウイルスの複製に必要なウイルスの非エンコードＲＮＡ配列のどちらかは、変異した、又は、切断された（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）形態である。
上記レプリコンの他の好適な態様によると、ＲＮＡウイルスは、カルジオウイルス属又はアフトウイルス属である；好ましくは、メンゴウイルスである；最も好ましくは、上記レプリコンが、さらに、メンゴウイルス又はサイラーウイルス（Ｔｈｅｉｌｅｒ’ｓ  ｖｉｒｕｓ）ＶＰ２遺伝子のシス作用複製エレメント（ＣＲＥ）からなる。
【００１５】
上記レプリコンの他の好適な態様によると、ｃ）で定義される異種タンパク質は、生理活性タンパク質、レポータータンパク質、細胞毒性タンパク質、病原体のタンパク質又は腫瘍のタンパク質から選択される；好ましくは、レポータータンパク質は、緑色蛍光タンパク質であり、病原体のタンパク質は、インフルエンザ核タンパク質又はインフルエンザ赤血球凝集素である。
上記レプリコンの他の好適な態様によると、ｃ）で定義される異種タンパク質のフラグメントは、上記異種タンパク質の抗原又はエピトープである。
【００１６】
レプリコンは、キャプシドコーディング配列の全部又は一部を欠失し、複製に必要なコーディング及び非コーディング配列の全てを保持することにより構築することができる。ゲノムの複製配列を保持することにより、適切な細胞において、ウイルスの及び異種の遺伝子産物を発現することができる。例えば、メンゴウイルスＶＰ２遺伝子に見られるＣＲＥは、複製に必須である。
レプリコンは、種々の方法により調製することができる。一つの態様においては、バクテリオファージＴ７、Ｔ３又はＳＰ６ポリメラーゼ等のＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを用いて、適切なＤＮＡ配列をインビトロで転写する。他の態様では、適切なＤＮＡ配列を含むプラスミドで動物細胞をトランスフェクションし、次いで、トランスフェクションされた細胞からレプリコンＲＮＡを単離することによりレプリコンを製造することができる。例えば、レプリコンをエンコードする相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、ポリメラーゼＩの下流の転写調節及び肝炎δリボザイムのｃＤＮＡの上流に配置することができる。本明細書において、「トランスフェクション」という語は、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥ−デキストラン処理、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム（例えばリポフェクチン）、プロテインパッケージング（例えば擬ウイルス粒子中に）、プロタミン濃縮等のＤＮＡ若しくはＲＮＡを細胞内に導入する手段によりＤＮＡ又はＲＮＡを細胞内に導入することを含むが、これに限定されない。
【００１７】
本発明はまた、本発明の自己複製組換えプラス鎖ＲＮＡ分子の製造に有用な以下のＤＮＡ分子を提供する：
−本発明のＲＮＡウイルスのウイルスゲノムの自己複製組換えプラス鎖ＲＮＡ分子をエンコードするＤＮＡ分子。好ましい態様では、上記ＤＮＡ分子はさらに、適切なクローニングベクターからなる、
−ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２６及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７（受理番号Ｉ−２６６８及び２６６９にて、２００１年５月２１日にそれぞれＣＮＣＭ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ、２８、ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ、７５７２４  Ｐａｒｉｓ  ｃｅｄｅｘ  １５、Ｆｒａｎｃｅに寄託されたプラスミド）又はそのフラグメントから選択される配列、並びに、発現しうる形態での異種タンパク質又は異種タンパク質のフラグメントをエンコードするＤＮＡ配列からなるＤＮＡ分子；好ましくは、上記ＤＮＡ分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８（受理番号Ｉ−２８７９にて、２００２年５月１６日にＣＮＣＭ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ、２８、ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ、７５７２４  Ｐａｒｉｓ  ｃｅｄｅｘ  １５、Ｆｒａｎｃｅに寄託されたプラスミド）からなるＤＮＡ分子であり、
−ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２６及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７（受理番号Ｉ−２６６８及び２６６９にて、２００１年５月２１日に、それぞれＣＮＣＭ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ、２８、ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ、７５７２４  Ｐａｒｉｓ  ｃｅｄｅｘ  １５、Ｆｒａｎｃｅに寄託されたプラスミド）の変異した若しくは切断された形態又はそのフラグメントの配列から選択される配列、及び、発現しうる形態での異種タンパク質又は異種タンパク質のフラグメントをエンコードするＤＮＡ配列からなるＤＮＡ分子。
【００１８】
上記ＤＮＡ分子の好ましい態様によると、異種タンパク質は、生理活性タンパク質、レポータータンパク質、細胞毒性タンパク質、病原体のタンパク質又は腫瘍のタンパク質から選択される；好ましくは、レポータータンパク質は、緑色蛍光タンパク質であり、病原体のタンパク質は、インフルエンザ核タンパク質、インフルエンザ赤血球凝集素、又は、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス核タンパク質であり、異種タンパク質フラグメントは、上記異種タンパク質の抗原又はエピトープ、好ましくは、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルスのＮＰ１１８−１２６エピトープである。
【００１９】
本発明のレプリコンは、種々の使用が可能である。第一の態様においては、レプリコンは、レプリコンに異種ポリペプチドをコードする配列を挿入し、動物細胞又は動物宿主内にレプリコンを導入することにより、動物細胞又は動物宿主において異種タンパク質を発現することに用いることができる。ある態様においては、動物宿主は、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ニワトリ、マウス又はウマである。好ましい態様では、動物宿主はヒトである。レプリコンは、筋内注射、金粒子被覆遺伝子銃によるデリバリー、タンパク質でパッケージした注射（例えば擬ウイルス粒子中へのパッケージ）、プロタミン濃縮注射又はリポソームで被包した注射を含む種々の手段により宿主に導入することができる。例えば、メンゴウイルス由来レプリコンは、直接注射することにより、注入位置上若しくはその近傍で治療タンパク質の一過的な発現、又は、毒性タンパク質若しくはプロアポプトティック（ｐｒｏａｐｏｐｔｏｔｉｃ）タンパク質の充実性腫瘍中における発現を可能にするので、抗腫瘍遺伝子治療の形態を提供する。加えて、組換えレプリコンは、便利に検出されるレポータータンパク質を発現するために、インビトロ又はインビボで用いることができる。これらのレプリコンは、ＲＮＡ複製及びＲＮＡデリバリーをモニターすることに用いることができるので、動物細胞トランスフェクション又は動物宿主へのＲＮＡデリバリーの最適化を可能にする。最後に、レプリコンは、例えばタンパク質の特性決定、タンパク質の製造又はタンパク質の局在化の更なる研究のために、興味のある全てのタンパク質の発現に用いることができる。
【００２０】
他の態様においては、レプリコンは、動物宿主において、エンコードされた異種タンパク質に対する免疫応答を誘導することに用いることができる。よって、本発明のレプリコンは、医薬上受容な担体とともにワクチンを構築することができる。医薬上の担体としては、水等の滅菌した液体、石油、動物油、植物油、ピーナッツオイル、大豆油、鉱油、ごま油を含む油、食塩水、水溶性デキストロース、グリセロール溶液、ポリカチオン性粒子、タンパク質粒子、プロタミン粒子、リポソーム、金粒子等のＲＮＡを濃縮し得るタンパク質、分子等が挙げられるが、これらに限定されない。レプリコンは、例えば、「裸の」又は包膜されたＲＮＡの形態で注入することができる。本明細書において、「裸の」という語は、いずれのタンパク質とも会合していないＲＮＡ分子を含むが、これに限定されない。
【００２１】
一つの例としては、レプリコンは、バクテリア、カビ、ウイルス、寄生生物を含むいずれの病原体の抗原決定基であっても発現することができる。レプリコンはまた、腫瘍抗原、又は、腫瘍抗原と病原体抗原との組み合わせを発現することができる。このようなレプリコンは、病原体又は腫瘍に対する免疫応答を誘導することができるので、対応する疾患に対するワクチンを包含する。この点で、強い細胞性免疫応答を誘導するメンゴウイルス由来レプリコンの能力は、有効な特性である。
【００２２】
二つ目の例としては、レプリコンは、既に病気である個体を治療する免疫療法剤として用いることができる。特に、レプリコンは、既存の免疫応答を強化したり、個体中に既に存在する病原体又は腫瘍抗原に対する新たな応答を誘導したりすることができるので、対応する疾患に対する治療を包含する。例えば、Ｂ型肝炎は、この方法においてＢ型肝炎ウイルス表面抗原を発現するレプリコンを投与することにより治療することができる。
【００２３】
三つ目の例としては、レプリコンは、同じ抗原又は異なる抗原に由来するＴ細胞エピトープのストリング（ｓｔｒｉｎｇ）を要素とする合成ポリペプチドを発現するために、構築することができる。これらのエピトープは、ＣＤ４＋  Ｔ細胞（ヘルパーＴ細胞）又はＣＤ８＋  Ｔ細胞（ＣＴＬｓ）を特異的に刺激することができる。このようなレプリコンは、（１）ＨＬＡ変異性を考慮に入れて多種特異的な免疫応答を誘導すること、及び、（２）抗原逸脱による病原体又は腫瘍細胞の免疫応答回避を制限することができる。
【００２４】
四つ目の例としては、いずれの生理活性タンパク質であってもレプリコンにより発現することができる。ある態様においては、生理活性タンパク質は、宿主の免疫応答を調節することができる、サイトカインやケモカイン等の免疫調節タンパク質である。外来抗原を発現するレプリコンと同じ時及び位置に注射された場合、サイトカインレプリコンは、外来抗原に対して誘導される免疫応答を調節することができる。これらのレプリコンはまた、単独で用いて、全ての病原体抗原又は癌抗原に対する免疫応答を調節することができる。これらのレプリコンはまた、適切に投与された場合、自己免疫病理を調節することができる。
【００２５】
よって、本発明は、少なくとも一つの本発明の自己複製組換えプラス鎖ＲＮＡ分子、及び、医薬上受容な担体からなるワクチンを提供する。
上記ワクチンの好適な態様においては、自己複製組換えプラス鎖ＲＮＡ分子は、裸のＲＮＡである。
上記ワクチンの他の好適な態様においては、自己複製組換えプラス鎖ＲＮＡ分子は、包膜されている。
【００２６】
本発明はまた：
（ａ）医薬上受容な担体中で、本発明の自己複製組換えプラス鎖ＲＮＡ分子及びＤＮＡ分子から選択される少なくとも一つの分子を調製し；
（ｂ）工程（ａ）の調製物により宿主を免疫する
ことからなる宿主中での防御免疫応答の誘導方法を提供する。
上記方法の好適な形態においては、工程（ａ）の自己複製組換えプラス鎖ＲＮＡ分子及びＤＮＡ分子は、裸である。
上記方法の他の好適な形態においては、工程（ａ）の自己複製組換えプラス鎖ＲＮＡ分子は、包膜されている。
【００２７】
本発明はまた、受容な媒体中における、本発明の自己複製組換えプラス鎖ＲＮＡ分子及びＤＮＡ分子から選択される少なくとも一つの分子からなる治療組成物を提供する。
本発明はまた、受容な媒体中における、本発明の自己複製組換えプラス鎖ＲＮＡ分子及びＤＮＡ分子から選択される少なくとも一つの分子からなる治療キットを提供する。
【００２８】
本発明はまた：
（ａ）本発明の自己複製組換えプラス鎖ＲＮＡ分子及びＤＮＡ分子から選択される少なくとも１つの分子を医薬上受容な担体中で調製し；
（ｂ）工程（ａ）の調製物で宿主を免疫する
ことからなる宿主中での免疫応答の調節方法を提供する。
上記方法の他の好適な態様において、医薬上受容な担体は、水、石油、動物油、植物油、ピーナッツオイル、大豆油、鉱油、ごま油、食塩水、水溶性デキストロース、グリセロール溶液、ポリカチオン性粒子、タンパク質粒子、プロタミン粒子、リポソーム及び金粒子から選択される。
上記方法の他の好適な態様においては、宿主はヒト、ブタ、イヌ、ネコ、ウシ、ニワトリ、マウス又はウマから選択される。
【００２９】
本発明はまた：
（ａ）本発明のＤＮＡ又は自己複製組換えプラス鎖ＲＮＡ分子をキャプシドタンパク質のＰ１前駆体を発現する細胞にトランスフェクションし；
（ｂ）トランスフェクションされた細胞から包膜された自己複製組換えプラス鎖ＲＮＡ分子を調製し；
（ｃ）工程（ｂ）の調製物で宿主を免疫する
ことからなる、ＲＮＡウイルスのウイルスゲノムの包膜された自己複製組換えプラス鎖ＲＮＡ分子を製造することによるＲＮＡウイルスのウイルスゲノムの自己複製組換えプラス鎖ＲＮＡ分子の免疫原性を向上させる方法を提供する。
【００３０】
本発明はまた：
（ａ）本発明の自己複製組換えプラス鎖ＲＮＡ分子を濃縮し；
（ｂ）工程（ａ）の濃縮されたＲＮＡ分子で宿主を免疫する
ことからなるＲＮＡウイルスのウイルスゲノムの自己複製組換えプラス鎖ＲＮＡ分子の免疫原性を向上させる方法を提供する。
本発明は、図面及び実施例により更に明らかにされ、その中では、レプリコンがメンゴウイルスゲノムから作成される。しかしながら、これらの例は、本発明の実例として示されたものであり、本発明を限定するものではないことが理解されるべきである。
【００３１】
図面の簡単な説明
図１は、メンゴウイルスゲノム由来サブゲノム組換えレプリコンをエンコードするプラスミドの概略図である。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨＡ及びＮＰ遺伝子は、斜線を引いた箱で示す。ＣＲＥは、点をつけた箱で示す。ＨＡタンパク質シグナルペプチド（ＳＰ）及びＨＡ膜貫通領域（ＴＭ）は、黒いバンドで示す。
【００３２】
図２は、ウサギ網状赤血球溶解物中での組換えメンゴウイルスポリプロテインのインビトロ転写及びプロセシングを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。分子量マーカーの位置を右側に示す。メンゴウイルスタンパク質前駆体とともにいくつかのその主要な切断産物を左側に示す。組換えレプリコンにエンコードされたＧＦＰ−ＮＰ及びＧＦＰポリペプチド、並びに、インフルエンザＮＰは、塗りつぶした矢印で示す。
【００３３】
図３は、サブゲノムメンゴウイルス由来レプリコンの複製を示すスロットブロットである。トランスフェクション終了から所定時間経過後、細胞質ＲＮＡを、分析のために回収した。
図４は、組換えレプリコンｒＭΔＢＢ、ｒＭΔＢＢ−ＧＦＰ又はｒＭΔＸＢＢ−ＧＦＰでトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞におけるＧＦＰ発現のフルオロサイトメーターの示数である。
【００３４】
図５は、組換えレプリコンｒＭΔＢＢ−ＮＰでトランスフェクションした［35Ｓ］メチオニンラベルＨｅＬａ細胞中で発現した、免疫沈降させたインフルエンザＮＰタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。ロードした試料は以下のとおりである：モック（ｍｏｃｋ）トランスフェクションしたＨｅＬａ細胞（レーン１）；レプリコンｒＭΔＢＢ（レーン２）、ｒＭΔＢＢ−ＮＰ（レーン３）又はｒＭΔＢＢ−ＧＦＰ−ＮＰ（レーン４）でトランスフェクションし、トランスフェクション後１０時間で回収したＨｅＬａ細胞；モック感染ＨｅＬａ細胞（レーン５）及びトランスフェクション後２０時間で回収したＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスで感染させたＨｅＬａ細胞（レーン６）。分子量、並びに、ウイルスＨＡタンパク質、ウイルスＮＰタンパク質及びウイルスＭ１タンパク質の位置は、右側に示す。
【００３５】
図６は、ｒＭΔＢＢ−ＮＰで免疫したＣ５７ＢＬ／６マウス中のＮＰ特異的ＣＴＬ活性の誘導を示すＣＴＬアッセイである。４匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの群を、以下のワクチン接種実験計画により、３週間の間隔で免疫した：５０μｇのｐＣＩ（○）又はｐＣＩ−ＮＰ（●）ＤＮＡを１回注射；２５μｇのｒＭΔＢＢ（□）又はｒＭΔＢＢ−ＮＰ（■）ＲＮＡを２回注射。最終の注射から３週間後に脾細胞を回収し、インビトロで刺激し、次いで、ＮＰ３６６ペプチドにより負荷をかけた（ａ）又は負荷をかけない（ｂ）同系のＥＬ４標的細胞に対するクロム放出アッセイにおける細胞溶解活性をテストした。特異的溶解の割合を、種々のエフェクター：標的比で示す。２回の実験のうちの１つのデータを示す。最終の注射から３週間後、材料と方法に記載のように、免疫優性のＮＰ３６６ペプチド（ｃ）の存在下でＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより、インフルエンザウイルス特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の頻度を測定した。データは、１０5脾臓細胞あたりのＳＦＣ数で示す。
【００３６】
図７は、図６と同じワクチン接種実験計画に従ってｒＭΔＢＢ−ＮＰで免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＮＰ−特異的抗体の誘導を示すＥＬＩＳＡである。５又は６匹のマウスの所定の群において、精製されたスプリットＡ／ＰＲ／８／３４ビリオンを抗原として用いた直接ＥＬＩＳＡテストにおけるバックグラウンドの値の２倍に等しい４５０ｎｍでの吸光度の値を与える、プール血清の最大希釈の逆数で力価を表す。
【００３７】
図８は、ｒＭＢＢΔ−ＮＰで免疫し、次いでインフルエンザウイルスで対抗したマウスでの肺疾患ウイルス荷重のグラフ図である。白丸は各群の平均値を表し、バーは標準偏差を示す。２回の実験のうちの１つのデータを示す。
図９Ａは、ウサギ網状赤血球における天然型ＨＡのインビトロ転写を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。ｒＭΔＦＭ−ＨＡ組換えレプリコンによりエンコードされたインフルエンザＨＡポリペプチドは、塗りつぶした矢印により示し、切断されていない前駆体は、塗りつぶしていない矢印により示す。
【００３８】
図９Ｂは、トランスフェクションされた真核生物細胞において、モノシストロン性メンゴウイルスレプリコンは、外来糖化タンパク質を発現することができないことを示すスロットブロットである。トランスフェクション終了から所定時間経過後、細胞質ＲＮＡを回収し、分析のため、ナイロンメンブレン上にスロットブロットした。
図１０は、組換えメンゴウイルスレプリコンにより感染した［35Ｓ］メチオニンラベルＨｅＬａ細胞において発現した、免疫沈降させたＧＦＰ融合ポリペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。ロードした試料は、以下のとおりであった：モック感染ＨｅＬａ細胞、又は、レプリコンＲＮＡ、ｒＭΔＢＢ−ＧＦＰ、ｒＭΔＢＢ−ＧＦＰ−ＮＰ１１８（２クローン）又はｒＭΔＢＢ−ＧＦＰ−ｌｃｍｖＮＰに感染させたＨｅＬａ細胞。分子量（ｋＤａ）を、左に示す。
【００３９】
図１１は、ｒＭΔＢＢ−ＧＦＰ−ＮＰ１１８及びｒＭΔＢＢ−ＧＦＰ−ｌｃｍｖＮＰレプリコンＲＮＡ、並びに、コントロールとしてｐＣＭＶ−ＮＰ及びｐＣＭＶ−ＭＧ３４プラスミドＤＮＡで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＬＣＭＶ特異的Ｔ細胞の誘導を示すＥＬＩＳＰＯＴアッセイである。最終の注射から３週間後、材料と方法に記載のように、免疫優性ＮＰ１１８−１２６ペプチドの存在下で、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより、ＬＣＭＶ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の頻度を測定した。データは、１０5脾臓細胞あたりのＳＦＣ数で表す。
図１２は、組換えメンゴウイルスレプリコンｒＭΔＢＢ−ＧＦＰ、ｒＭΔＢＢ−ＧＦＰ−ＮＰ１１８、又は、ｒＭΔＢＢ−ＧＦＰ−ｌｃｍｖＮＰでトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞におけるＧＦＰ発現のフルオロサイトメーターの示数である。
【００４０】
実施例
メンゴウイルスゲノムに由来するレプリコンｃＤＮＡを、プラス鎖方向に、バクテリアプラスミドのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターの下流、ユニークＢａｍＨ  Ｉ切断部位の上流にクローニングした。バクテリアプラスミドをＢａｍＨ  Ｉで線状化した後、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いてウイルスＲＮＡ様転写産物を合成したが、転写産物は、動物細胞のトランスフェクション、又は、動物宿主への注射に用いることができた。
【００４１】
第一のレプリコンシリーズであるｒＭΔＢＢシリーズを材料と方法及び実施例１に記載のように構築した。Ｌ−Ｐ１−２Ａ前駆体のコーディング配列のほぼ全ては、ＣＲＥを除いて、欠失した。これらのレプリコンは、トランスフェクションされたＨｅＬａ細胞において複製し、続いて、ベクター由来の残基とともに融合タンパクとしてＧＦＰ又はインフルエンザＮＰを発現した。裸のＲＮＡの形態で注入された場合、ｒＭΔＢＢ−ＮＰレプリコンは、マウスにおいて抗ＮＰ免疫応答を誘導した。このストラテジーに基づいて、他のレプリコンを構築した；これらは、実施例９に記載のように、複製し、続いて、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）のＮＰ、及び、Ｈ２dマウスのＬＣＭＶの免疫優性ＮＰ１１８−１２６エピトープに対応する合成ポリペプチドの発現を起こした。
【００４２】
第二のレプリコンシリーズであるｒＭΔＦＭシリーズを、外来タンパク質配列と融合したベクター配列の量を最小にすることにより、外来配列をより天然の形で発現するように構築した。これらのｒＭΔＦＭレプリコンもまた、トランスフェクションされたＨｅＬａ細胞中で複製した。これに比べて、ＳＰ及びＴＭ領域を含むインフルエンザＨＡ配列の全体を含むｒＭΔＦＭ−ＨＡ組換えレプリコンは、複製能力がなかった。
【００４３】
ピコルナウイルスのゲノムは、通常、糖タンパク質をエンコードしない。本発明者らは、ポリオウイルスゲノムに由来するレプリコンについて以前に示したように、モノシストロン性メンゴウイルス由来レプリコンは外来糖化タンパク質を発現できないことに注目した。しかしながら、本発明者らは、以前にジシストロン性ポリオウイルス（ＰＶ）レプリコンが糖タンパク質を発現しうることを明らかにしている。特に、本発明者らは、ＥＭＣＶインターナルリボソームエントリーサイト（ＩＲＥＳ）の挿入によりＨＡとＰＶ配列との翻訳を分離したジシストロン性レプリコン、ｒΔＰＶ−ＩＲ−ＨＡを構築した。ｒΔＰＶ−ＩＲ−ＨＡレプリコンは、トランスフェクションにおいて複製し、正しく糖化されたＨＡの細胞表面での発現を可能にした（２９）。同様に、ジシストロン性メンゴウイルスレプリコンは、外来のウイルス性又は哺乳類のＩＲＥＳの挿入により構築することができ、ウイルス性若しくは腫瘍の抗原又は生理活性ポリペプチド等の糖化されたタンパク質の複製及び発現の能力についてテストすることができた。
【００４４】
材料と方法
細胞、ウイルス及びプラスミド
ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ受理番号  ＣＣＬ−２）を、５％  ＣＯ2下、５％の熱不活性化したウシ胎児血清（ＦＣＳ）（ＴｅｃｈＧｅｎ＃８０１００５０）を添加したＤＭＥＭ完全培地（１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、４．５ｍｇ／ｍｌ  Ｌ−グルコース、１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリン及び１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンを含むＤｕｌｂｅｃｃｏの改良Ｅａｇｌｅ培地、）中、３７℃で培養した。
ＥＬ４（マウスリンパ腫、Ｈ−２b）（ＡＴＣＣ受理番号  ＴＩＢ−３９）及びＰ８１５（マウス肥満細胞腫、Ｈ−２d）（ＡＴＣＣ受理番号  ＴＩＢ−６４）細胞を、１０％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ完全培地（ＲＰＭＩ  １６４０、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５０μＭ  β−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン）中で維持した。
マウス適応インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４（ｍａ）（Ｈ１Ｎ１）は、以前に記載された（２０）ように、未感作のマウスに感染させた肺のホモジネートの連続継代に由来した。後続のウイルスストックは、１１日齢ふ化鶏卵の単独の尿膜管（ｓｉｎｇｌｅ  ａｌｌａｎｔｏｉｃ  ｐａｓｓａｇｅ）により生産され、それらはマウスに対する病原性に影響を与えなかった。
【００４５】
プラスミドｐＣＩ−ＮＰは、別のところで記載（３０）のように、インフルエンザＮＰのコーディング配列を発現プラスミドｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＃Ｅ１７３１）のＳａｌ  Ｉ及びＳｍａ  Ｉサイトの間であり、ＣＭＶ即時型エンハンサー／プロモーターの下流に挿入することにより構築した。プラスミドｐＣＩ−ＮＰは、コドン１０７（Ｅ：ＧＡＧ→ＧＡＡ）におけるサイレント突然変異、及び、コドン２７７における付加的なＰｒｏ→Ｓｅｒ変異とともに、Ａ／ＰＲ／８／３４（ｍａ）ＮＰ  ｃＤＮＡの共通配列を含み、依頼により発明者が提供することができる。コドン２７７における変異は、主要な組織適合クラスＩ（ＭＨＣ−Ｉ）により制限される、興味のある免疫優性エピトープ、ＮＰ３６６−３７４に直接影響を及ぼさない。
【００４６】
組換えレプリコンのインビトロ転写のためのプラスミドの構築
Ｌ−Ｐ１−２Ａ欠失及び置換のあるメンゴウイルスｃＤＮＡを含むプラスミドは、弱毒化されたメンゴウイルス株の感染性ｃＤＮＡの全長をファージＴ７プロモーターの下流に含むプラスミドｐＭＣ２４（ｐＭ１６．１とも名付けられた；Ａｎｎ  Ｐａｌｍｅｎｂｅｒｇ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩより提供）に由来した（８）。
【００４７】
プラスミドｐＭΔＢＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２６）は、ヌクレオチド７３７〜３７８７がＳａｃ  Ｉ／Ｘｈｏ  Ｉポリリンカー（ＧＡＧＣＴＣＧＡＧ）（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１）及びメンゴウイルスＣＲＥを含むｖＭＣ２４  ｃＤＮＡのヌクレオチド１１３７〜１２６７に置換されたサブゲノムメンゴウイルスｃＤＮＡを含む（図１）。プラスミドｐＭΔＢＢは、プラスミドｐＭＮ３４（１５）をＢｓｔＢ  Ｉで消化し、その後、セルフライゲーションを行うことにより構築した。ｐＭΔＢＢを有するバクテリアは、受理番号Ｉ−２６６８にて、２００１年５月２１日にＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅに寄託した。プラスミドｐＭΔＮ３４は、ｐＭΔＢＢにデザインが類似しているが、メンゴウイルスゲノムのより小さい部分（ヌクレオチド７３７〜３６８０）が除去されている。
【００４８】
プラスミドｐＭΔＸＢＢは、ｐＭΔＢＢプラスミドからの配列を含むＣＲＥを除去するようにして構築した。簡単に、オリゴヌクレオチド５’−ＴＣＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＴ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２）及び５’−ＣＧＡＡＧＣＴＡＧＣＣ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３）をアニーリングし、プラスミドｐＭＮΔ３４のＸｈｏ  Ｉ及びＢｓｔ  Ｂ  Ｉサイトの間にクローニングすることにより、Ｘｈｏ  Ｉ−Ｂｓｔ  ＢＩリンカーを得た。陽性のクローンを、バイオダイターミネーターシーケンシングキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＃Ｐ／Ｎ４３０３１５０）及びＡＢＩ３７７オートメーテッドシーケンサー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて配列決定した。
【００４９】
クローニングの目的で、プラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ＃６０８５−１）をテンプレートとし、両者ともＳａｃ  Ｉ制限酵素部位（下線部）を含むオリゴヌクレオチド
５’−ＧＣＴＧＡＧＣＴＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣ−３’  （ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４）；及び
５’−ＧＣＡＧＡＧＣＴＣＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣＣＧ  −３’  （ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．５）をプライマーとして、プルーフリーディングＰＷＯポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  ＃１６４４９４７）を用いたＰＣＲにより、ＧＦＰをエンコードする配列を増幅した。ＧＦＰ配列は、プラスミドｐＭΔＢＢ及びｐＭΔＸＢＢのＳａｃ  Ｉサイトにフレームとして挿入され、それぞれ、プラスミドｐＭΔＢＢ−ＧＦＰ並びにｐＭΔＸＢＢ−ＧＦＰを得た。陽性のクローンは、上述したように配列決定した。
【００５０】
ｐＭΔＢＢ−ＮＰプラスミドは、２段階で構築した。第一に、インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４（ｍａ）  ＮＰの変異ｃＤＮＡを含む組換えｃＤＮＡフラグメントをＰＷＯポリメラーゼを用いて作成した後、オーバーラップ伸長ＰＣＲプロトコルを行った（２２）。コドン２７７における変異を正しいＰｒｏ２７７に戻し、コドン１６０にサイレント変異（Ｄ：ＧＡＴ→ＧＡＣ）を導入して、後続の実験の目的でＢａｍＨ  Ｉサイトを消失させるため、突然変異誘発を行った。簡単に、プラスミドｐＣＩ−ＮＰ及びオリゴヌクレオチド
５’−ＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．６）  及び
５’−ＣＡＣＡＴＣＣＴＧＧＧＧＴＣＣＡＴＴＣＣＧＧＴＧＣＧＡＡＣ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．７）、
並びに、プラスミドｐＴＧ−ＮＰ２４（参考文献３０に記載のｐＴＧ−ＮＰ８２に類似しているが、Ｐ２７７Ｓ変異を含まない）及びオリゴヌクレオチド
５’−ＡＣＣＧＧＡＡＴＧＧＡＣＣＣＣＡＧＧＡＴＧＴＧＣＴＣＴＣＴＧ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．８）及び
５’−ＧＴＣＣＣＡＴＣＧＡＧＴＧＣＧＧＣＴＡＣ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．９）
のＰＣＲ増幅により、２つのオーバーラップＤＮＡフラグメントを作成した。両者ともＸｈｏ  Ｉ制限酵素部位（下線部）を含むオリゴヌクレオチド
５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＣＧＴＣＴＣＡＡＧＧＣＡＣＣＡＡＡＣＧ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１０）；及び
５’−ＧＣＧＡＡＴＴＣＴＣＧＡＧＡＴＴＧＴＣＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＧＣＡＴＴＧＴＣ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１１）
を用いて作成した融合ＰＣＲ産物を、プラスミドｐＴＧ１８６（１３）のＥｃｏＲ  Ｉサイトにクローニングして、プラスミドｐＴＧ−Ｒ４を得た。陽性のクローンは、上述のように配列決定した。第二に、ｐＴＧ−Ｒ４をＸｈｏ  Ｉで切断したものに由来するＮＰエンコード配列を、ＮＰ配列がメンゴウイルスポリプロテイン配列の残りの部分とフレームとなるようにｐＭΔＢＢのＸｈｏ  Ｉサイトに挿入することにより、プラスミドｐＭΔＢＢ−ＮＰを得た。ユニークＳａｃ  Ｉサイトを用いてｐＭΔＢＢプラスミドに行ったことと同様の方法（上記参照）で、ＧＦＰコーディング配列をｐＭΔＢＢ−ＮＰプラスミドに挿入してプラスミドｐＭΔＢＢ−ＧＦＰ−ＮＰを得た。ｐＭΔＢＢ−ＧＦＰ−ｌｃｍｖＮＰプラスミドの構築のために、オリゴヌクレオチド
５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＣＧＡＧＡＴＧＴＣＣＴＴＧＴＣＴＡＡＧＧＡＡＧＴＴＡＡＧ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ  １２）及び
５’−ＧＣＧＡＡＴＴＣＴＣＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＡＣＡＴＴＴＧＧＧＣＣＴＣ−３’  （ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ．１３）
とともにプラスミドｐＣＭＮ−ＮＰ（３９）をテンプレートとして用いて、ＬＣＭＶウイルスのＮＰコーディング配列をＰＣＲにより増幅した。得られたＤＮＡフラグメントを、プラスミドｐＭΔＢＢ−ＧＦＰのＸｈｏ  Ｉサイトにクローニングした。陽性のクローンは、上述のように配列決定した。
【００５１】
ＬＣＭＶのＮＰ１１８−１２６  Ｈ２d制限免疫優性エピトープのコーディング配列を再構築するために、１００μＭの濃度のオリゴヌクレオチド
５’ＴＣＧＡＡＧＣＴＡＧＣＧＡＡＡＧＡＣＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＡＧＧＴＧＴＧＴＡＴＡＴＧＧＧＴＡＡＴＴＴＧＡＣＡＣ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１４）及び
５’ＴＣＧＡＧＴＧＴＣＡＡＡＴＴＡＣＣＣＡＴＡＴＡＣＡＣＡＣＣＴＧＡＡＧＣＴＴＧＧＧＧＴＣＴＴＴＣＧＣＴＡＧＣＴ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１５）
を７５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．７中、１００℃で５分、次いで２０℃で１時間アニーリングすることにより、合成リンカーを得た。このリンカーをｐＭΔＢＢ−ＧＦＰプラスミドのＸｈｏ  Ｉサイトに挿入して、プラスミドｐＭΔＢＢ−ＧＦＰ−ＮＰ１１８を得た。陽性のクローンは、上述のように配列決定した。
【００５２】
ｐＭΔＦＭプラスミド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）の構築のために、１００μＭの濃度のオリゴヌクレオチド
５’ＴＣＧＡＧＧＣＴＡＧＣＣＡＧＣＴＴＴＧＡＡＴＴＴＴＧＡＣＣＴＴＣＴＴＡＡＧＣＴＴＧＣＧＧＧＡＧＡＣＧＴＣＧＡＧＴＣＣＡＡＣＣＣＴＧＧＧＣＣＣＴ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１６）及び
５’ＴＣＧＡＡＧＧＧＣＣＣＡＧＧＧＴＴＧＧＡＣＴＣＧＡＣＧＴＣＴＣＣＣＧＣＡＡＧＣＴＴＡＡＧＡＡＧＧＴＣＡＡ  ＡＡＴＴＣＡＡＣＡＧＣＴＧＧＣＴＡＧＣＣ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１７）
を７５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．７中、１００℃で５分、次いで２０℃で１時間、ともにアニーリングすることにより、合成リンカーを得た。このリンカーをｐＭΔＢＢプラスミドのＸｈｏ  Ｉサイトに挿入して、プラスミドｐ２ＡＢを得た。次に、オリゴヌクレオチド
５’−ＣＧＡＧＣＡＴＧ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１８）及び
５’−ＣＴＡＧＣＡＴＧＣＴＣＧＡＧＣＴ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１９）
をアニーリングすることにより、第二のリンカーを得た。このリンカーをｐΔ２ＡＢのＳａｃ  Ｉ及びＮｈｅ  Ｉサイトの間に挿入して、プラスミドｐＭΔＦＭを得た。陽性のクローンは、上述のように配列決定した。ｐＭΔＦＭプラスミドを含むバクテリアは、受理番号Ｉ−２６６９で２００１年５月２１日にＣＮＣＭに寄託した。
【００５３】
インフルエンザＨＡ配列をクローニングするために、５Ｍ  グアニジンイソチオシアネート及びフェノールを用い、標準ＲＮＡ抽出手順を用いて、Ａ／ＰＲ／８／３４（ｍａ）に感染させたマウスの肺のホモジネートからウイルスのゲノムＲＮＡを抽出した。得られたウイルスＲＮＡは、ｃＤＮＡに逆転写した。次に、開始コドンの前、及び、終始コドンの後にＢａｍＨ  Ｉサイトを含むＨＡコーディング配列は、ＰＷＯポリメラーゼ、並びに、オリゴヌクレオチド
５’−ＣＴＧＧＡＴＣＣＡＡＡＡＴＧＡＡＧＧＣＡＡＡＣＣＴ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２０）；及び
５’−ＣＡＧＧＡＴＣＣＴＡＧＡＴＧＣＡＴＡＴＴＣＴＧＣＡＣＴＧ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２１）
を用いたＰＣＲにより増幅した。得られたＤＮＡフラグメントは、プラスミドｐＴＧ１８６のＢａｍ  ＨＩサイトにクローニングして、プラスミドｐＴＧ−ＨＡ８を得た。
【００５４】
次いで、オリゴヌクレオチド
５’−ＧＡＡＡＧＧＣＡＡＡＣＣＴＡＣＴＧＧＴＣＣＴＧＴＴ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２２）及び
５’−ＣＧＴＧＣＡＧＴＣＧＡＣＡＧＧＡＴＧＣＡＴＡＴＴＣＴＧＣＡＣＴＧＣＡＡＡＧ−３’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２３）
を用い、テンプレートとしてプラスミドｐＴＧ−ＨＡ８を用いたＰＣＲにより、Ａ／ＰＲ／８／３４（ｍａ）ウイルスのＨＡのコーディング配列を増幅した。オリゴヌクレオチドは、得られるＤＮＡフラグメントがＳａｌ  Ｉにより消化され、プラスミドｐ２ΔＡＢのクレノー切断Ｓａｃ  Ｉサイト及びＮｈｅ  Ｉサイトの間にフレームでクローニングしてプラスミドｐＭΔＦＭ−ＨＡを得ることができるように設計した。陽性のクローンは、上述のように配列決定した。このプラスミドは組換えレプリコンｃＤＮＡを含み、翻訳開始ＡＵＧに続いて口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）の２Ａ／２Ｂ自己触媒切断部位とともにフレームとなるように連結されたＨＡ配列があり、ＣＲＥ、元のメンゴウイルス２Ａ／２Ｂ切断部位、及び、残りのウイルスポリプロテインが続く（図１）。
【００５５】
プラスミドＤＮＡのインビトロ転写
メンゴウイルス由来プラスミドをＢａｍＨ  Ｉで線状化し、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＲｉｂｏＭＡＸ−Ｔ７  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  ＲＮＡ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｐｒｏｍｅｇａ  ＃Ｐ１３００）を製造業者の使用説明書に従って用いて転写した。インビトロでの研究のために、反応混合物をＲＱ１  ＤＮａｓｅ（１．５Ｕ／μｇ  ＤＮＡ、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＃Ｍ６１０１）で３７℃、２０分間処理し、フェノール−クロロホルムで抽出し、最初に酢酸アンモニウム−イソプロピルアルコール中で、次に酢酸ナトリウム−イソプロピルアルコール中で、標準の分子生物学的手法に従って沈殿させ、エンドトキシンフリーＰＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に再懸濁した。インビトロ翻訳の研究のために、反応混合物を、酢酸アンモニウム−イソプロピルアルコールで１回沈殿させ、ＲＮａｓｅフリーの水に再懸濁した以外は、同じ方法で処理した。
【００５６】
ウサギ網状赤血球溶解物のインビトロでの翻訳
インビトロで合成したＲＮＡ（１０μｇ／ｍｌ）を、０．８ｍＣｉ／ｍｌの［35Ｓ］−メチオニン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＃ＳＪ１５１５；１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、０．５ｍＭのＭｇＣｌ2及び１００ｍＭのＫＣｌを添加したＦｌｅｘｉ（登録商標）ウサギ網状赤血球溶解物システム（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＃Ｌ４５４０）を用いてインビトロで翻訳した。反応混合物を３０℃で３時間インキュベートし、１０ｍＭ  ＥＤＴＡに入った１００μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ  Ａで、３０℃、１５分間処理し、１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上の電気泳動により分析し、Ｋｏｄａｋ  Ｘ−ＯＭＡＴフィルムにオートラジオグラフした。
【００５７】
ＲＮＡトランスフェクション
ＨｅＬａ細胞へのＲＮＡトランスフェクションは、Ｅａｓｙｊｅｃｔ  ｐｌｕｓ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ（Ｅｑｕｉｂｉｏ)を用いたエレクトロポレーションにより行った。簡単に、１６×１０6個の細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで２回洗浄し、８００μｌの氷冷ＰＢＳに再懸濁し、電極間０．４ｃｍのキュベットの中で、３２μｇのＲＮＡ又はＤＮＡの存在下、シングルパルス（２４０Ｖ、１８００μＦ、最大抵抗）でエレクトロポレーションした。すぐに細胞を２％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ完全培地に移し、直径３５ｍｍの組織培養ディッシュに広げ、３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートした。
【００５８】
ＲＮＡ複製の分析
トランスフェクション後、異なった時間間隔で、細胞質ＲＮＡを標準の方法を用いて調製した（２６）。１×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、７％ホルムアルデヒド中、６５℃で１５分間変性した後、ＲＮＡサンプルをナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＃ＲＰＮ２０３Ｎ）上にスポットし、メンゴウイルスＲＮＡのヌクレオチド６０２２〜７６０６と相補的な32ＰラベルＲＮＡプローブでハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液及び０．１％ＳＤＳを含む溶液中、６５℃で１８時間行った。メンブレンを２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液で、室温にて３回、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液で６５℃にてさらに３回洗浄した。最後に、メンブレンをＳＴＯＲＭ（登録商標）８２０  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）上で露光し、Ｉｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔプログラム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて分析した。
【００５９】
ＲＮＡでトランスフェクションした細胞中におけるＧＦＰ発現の分析
上述のように、ＨｅＬａ細胞をトランスフェクションした。トランスフェクション後８〜１２時間で、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳ中で洗浄し、１００μｌ  ＰＢＳ、１％パラホルムアルデヒド中、４℃で６０分インキュベーションにより固定した。次いで、サンプルをＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフルオロサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上で蛍光強度を分析した。
【００６０】
ＲＮＡでトランスフェクションした細胞中におけるインフルエンザＮＰ発現の分析
インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４に感染させた、又は、ＲＮＡ／ＤＮＡでトランスフェクションした細胞を［35Ｓ］−メチオニン（５０μＣｉ／ｍｌ；Ａｍｅｒｓｈａｍ；１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）で２時間、ピーク発現の時に代謝的にラベルした。ピーク発現時間は、ｒＭΔＢＢ−ＧＦＰレプリコンＲＮＡ又はｐＣＩ−ＧＦＰプラスミドＤＮＡでトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞におけるＧＦＰ発現の研究により決定した。ＲＮＡでトランスフェクションした細胞については、ピーク発現はトランスフェクション後６〜９時間に観察された。ＤＮＡでトランスフェクションした細胞については、ピーク発現はトランスフェクション後２０時間に観察された。Ａ／ＰＲ／８／３４インフルエンザウイルスで感染させたＨｅＬａ細胞については、ピーク発現はトランスフェクション後２０時間に観察された。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％  ＮＰ４０及び０．５％  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｓｉｇｍａ）で溶解した。細胞抽出物は、ＲＩＰＡバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％デオキシコレート、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、０．５％  ＮＰ４０、及び、０．５％  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ）中、インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスに対して作成したウサギ抗体を有するプロテインＡセファロースビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＃１７−０７８０−０１）の存在下、４℃で一晩免疫沈降させた。免疫沈降物をＲＩＰＡバッファーで洗浄し、６５℃でＬａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．８、２％ＳＤＳ、５％  β−メルカプトエタノール、２０％グリセロール）中で溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、Ｋｏｄａｋ  Ｘ−ＯＭＡＴフィルム上にオートラジオグラフして視覚化した。
【００６１】
ＲＮＡでトランスフェクションした細胞中におけるＧＦＰ融合タンパク質発現の分析
ＲＮＡ／ＤＮＡでトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞の抽出物は、ＧＦＰに対して作成したウサギ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃４６−００９２）を用いた以外は上述したようにして免疫沈降し、ＮＰ発現を分析した。
【００６２】
免疫化
７〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６雄マウス（ＩＦＦＡ  ＣＲＥＤＯ）に、５０μｇのプラスミドＤＮＡ又は２５μｇのメンゴウイルスレプリコンＲＮＡのいずれかを含む１００μｌ  ＰＢＳを筋内（ｉ．ｍ．）に注射した。ブースター注射は、３週間の間隔でｉ．ｍ．注射により投与した。注射に用いたＤＮＡは、Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ  ＰＣ２０００キット（Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ  ＃７４０５７６）を用い、その後、トリトンＸ１１４、次いでフェノール−クロロホルムによる抽出工程を行って調製した。次いで、サンプルをＱＣＬ−１０００エンドトキシンキット（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ  ＃５０−６４７Ｕ）で測定して、エンドトキシンが存在しないこと（＜１００Ｕ／ｍｇ）をテストした。ＲＮＡ調製物は、注射の前後にアガロースゲル電気泳動により分析して、分解が起こっていないことを確認した。
【００６３】
抗体力価
最終の注射から３週間後、マウスの血液を回収した。プール血清サンプルの系列希釈を用いて、１ウェルあたり０．５μｇの、界面活性剤で破壊したＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスを抗原としたＥＬＩＳＡにより、ＮＰ特異的抗体の力価を決定した。簡単に、０．２Ｍ炭酸ナトリウム、０．２Ｍ重炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６中の界面活性剤で破壊したＡ／ＰＲ．８／３４ウイルス  ０．５μｇで、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（ＮＵＮＣ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ、＃４３９４５４）を４℃で一晩コートした。結合した抗体は、１／２０００希釈のセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＃ＢＩ２４１３Ｃ）で検出し、供給業者が示すようにしてＴＭＢペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ  ＃５０−７６−００）を添加することにより視覚化した。
力価は、バックグラウンドの値の２倍と等しい４５０ｎｍでの吸光度を与えるプール血清の希釈の逆数として計算した。プール血清は、４〜５匹のマウスの群から調製した。
【００６４】
細胞毒性アッセイ
最終の注射から３週間後、脾臓細胞を回収し、直立型Ｔ７５フラスコ中の、１０％ＦＣＳ、１．０ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム及び２．５％コンカナバリンＡ上清を添加したＲＰＭＩ完全培地中に２×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌで接種した。脾細胞は、５％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ完全培地中、１０μＭ  ＮＰ３６６ペプチド（ＡＳＮＥＮＭＥＴＭ、Ｎｅｏｓｙｓｔｅｍ；ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２４）で３７℃、３時間パルスされた１０6同系脾臓細胞／ｍｌで７日間、再刺激し、洗浄して照射した（２５００ｒａｄｓ）。再刺激されたエフェクター細胞の細胞毒活性は、実質的に（９）に記載のようにして、標準の４時間51Ｃｒ放出細胞毒性アッセイを用いて測定した。ＥＬ４及びＰ８１５標的細胞は、51Ｃｒラベル中にＮＰ３６６ペプチド（１０μＭ）でパルスしたものとしなかったものとがあった。放射活性の自然及び最大放出は、培地のみ、又は、１％トリトンＸ−１００中でそれぞれインキュベートすることにより測定した。特異的51Ｃｒ放出の割合は、（放出の実験値−自然放出）／（最大放出−自然放出）×１００  のように算出した。
【００６５】
ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
最終の注射から３週間後、脾臓細胞を回収し、標準のＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイシステムにより、インフルエンザ又はＬＣＭＶウイルス特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の存在を分析した。簡単に、脾臓細胞は、ラット抗マウスＩＦＮγ抗体（Ｒ４−６Ａ２、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でコートした９６ウェルＭｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ  ＨＡニトロセルロースプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中、支持細胞として１ウェルあたり５×１０5個の放射（２０００ｒａｄｓ）された同系の脾臓細胞の存在下、１μＭ  インフルエンザＮＰ３６６合成ペプチド（ＡＳＮＥＮＭＥＴＭ、Ｎｅｏｓｙｓｔｅｍ；ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２４）ＬＣＭＶ  ＮＰ１１８−１２６ペプチド（ＲＰＱＡＳＧＶＹＭ、Ｎｅｏｓｙｓｔｅｍ、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．  ２５）及びＩＬ−２（１０Ｕ／ｍｌ）で２０時間刺激した。ビオチン化ラット抗マウスＩＦＮγ抗体（ＸＭＧ１．２、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、アルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジン（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）及びＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質（Ｓｉｇｍａ）でのインキュベーションを連続して行うことにより、スポットを明らかにした。ＩＦＮγ生産細胞の頻度は、各ウェル中でのスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数を数えることにより測定した。結果は、１０5個の脾臓細胞あたりのＳＦＣの数で示した。
【００６６】
Ａ／ＰＲ／８／３４（ｍａ）ウイルスによるマウスの対抗感染
３回目の免疫化から１又は３週間後、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１００ｍｇ／ｋｇケタミン（Ｍｅｒｉａｌ）で軽く麻酔をかけ、４０μｌＰＢＳ中の１００ｐｆｕ（０．１ＬＤ50）のＡ／ＰＲ／８／３４（ｍａ）ウイルスで鼻腔内に対抗した。対抗後７日でマウスを犠牲にした。肺のホモジネートを調製し、標準のプラークアッセイ（３６）により、ＭＤＣＫ細胞単層上でウイルス力価を測定した。マウスの個体について測定したウイルス力価のｌｏｇ10について、Ｓｔｕｄｅｎｔの独立ｔ検定を用い、少量のサンプルに用いられる仮定（変数の正規分布、母集団についての同じ分散を比較する）をもとに統計的分析を行った。
プラスミドｐＭΔＢＢ及びｐＭΔＦＭを有するバクテリアは、以下のように、ＣＮＣＭ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ、２８、ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ、７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５、Ｆｒａｎｃｅに寄託した：
【００６７】
【表１】
2005508610.tif 000002
【００６８】
実施例１：メンゴウイルスゲノム由来組換えレプリコンの製造
メンゴウイルスゲノム由来レプリコンの製造のために、キャプシドタンパク質のＬ−Ｐ１−２Ａ前駆体のコード配列がＳａｃ  Ｉ／Ｘｈｏ  Ｉポリリンカーと、元来ＶＰ２キャプシドタンパク質コーディング配列に位置していた（１５）メンゴウイルスＣＲＥとで置換されたプラスミドベクターｐＭΔＢＢをまず構築した。この置換は、２Ａの１９個のＣ末端アミノ酸と２Ｂの最初のアミノ酸（７）とで構成される最適２Ａ／２Ｂ自己触媒切断部位に対応する配列を維持するような方法で行った（図１）。特に、Ｔ７バクテリオファージφ１０プロモーターの下流に弱毒化された株のメンゴウイルスの完全な感染性ｃＤＮＡを有するプラスミドｐＭＣ２４は、構造Ｌ及び２Ａタンパク質をエンコードするＬ−Ｐ１−２Ａ領域であるヌクレオチド７３７〜３７８７を欠失させた。欠失した配列をＳａｃ  Ｉ、Ｘｈｏ  Ｉポリリンカー及びメンゴウイルスＣＲＥを含む配列で置換した。２Ａ／２Ｂサイトでのインシス自己触媒切断に最適な配列を含む２Ａの２２個のＣ末端アミノ酸をエンコードする配列を、上述のようにして保持した。得られたプラスミド、ｐＭΔＢＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、８０１７塩基対）は、合成ｒＭΔＢＢレプリコンＲＮＡのＴ７ＲＮＡポリメラーゼによるインビトロ転写が可能であった。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６の最初の塩基は、レプリコンＲＮＡの最初の塩基に相当し、転写前にプラスミドの線状化に用いるＢａｍＨ  Ｉサイトは、４８３７の位置であり、Ｔ７プロモーターは、ヌクレオチド７９９９〜８０１７であり、２Ｇ残基（ヌクレオチド８０１６〜８０１７）は、実際は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼとこのプラスミドとから作成される合成転写産物の一部分である。
【００６９】
ＧＦＰ、インフルエンザＮＰ又はＧＦＰ−ＮＰ融合タンパク質の配列を、次いで、ＣＲＥ及び再構築された２Ａ／２Ｂ切断部位の上流のｐＭΔＢＢのポリリンカーに、メンゴウイルスのポリプロテインをエンコードする残りの配列とフレームとなるように挿入して、プラスミドｐＭΔＢＢ−ＧＦＰ、ｐＭΔＢＢ−ＮＰ並びにｐＭΔＢＢ−ＧＦＰ−ＮＰを得た（図１）。
ネガティブコントロールの目的のためのプラスミドｐＭΔＸＢＢ及びｐＭΔＸＢＢ−ＧＦＰは、それぞれ、これらのΔＸがメンゴウイルスＣＲＥを含まないことを構成する以外は、ｐＭΔＸＢＢ及びｐＭΔＸＢＢ−ＧＦＰと類似している（図１）。
【００７０】
本願に記載の全てのプラスミドは、従来公知の技術を用いて実験室で得られた。これらの核酸配列は公知であり、入手可能である。ＰＣＲ増幅により得られたものである場合は、挿入物の完全な配列を確認している。
【００７１】
ｒＭΔＢＢ、ｒＭΔＢＢ−ＧＦＰ、ｒＭΔＢＢ−ＮＰ及びｒＭΔＢＢ−ＧＦＰ−ＮＰプラスミドＤＮＡのＴ７ＲＮＡポリメラーゼによるインビトロ転写に由来し、Ｂａｍ  ＨＩで線状化された組換えＲＮＡ、ｒＭΔＢＢ、ｒＭΔＢＢ−ＧＦＰ、ｒＭΔＢＢ−ＮＰ及びｒＭΔＢＢ−ＧＦＰ−ＮＰは、ウサギ網状赤血球溶解物中、インビトロで翻訳された。翻訳産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、オートラジオグラフィーで視覚化した。図２に示すように、レプリコンにエンコードされたポリプロテインは、２Ｃ、３Ｃ、３Ｄ及び３ＣＤタンパク質等の切断の最終産物から明らかなように、全て３Ｃプロテアーゼで切断され、ＲＮＡ増幅に必要な非構造タンパク質を発現した。これに対して、再構築された２Ａ／２Ｂサイトの正しいインシス切断は各ｒＭΔＢＢ由来レプリコンでは観察されなかった。発明者らは、外来配列はリンカーをエンコードする７個の残基、ＣＲＥエンコードポリペプチド（ＣＲＥＰ、４４アミノ酸）及び２Ａタンパク質の最後の２２残基とともに融合タンパク質として発現され、外来ポリペプチドの大きさを約８ｋＤまで大きくしていると予想した。組換えｒＭΔＢＢ−ＮＰレプリコンについては、適切に切断されたＮＰ−ＣＲＥＰ−２Ａ*融合タンパク質の発現は予想される分子量である６３ｋＤａにバンドが存在することにより明らかにされるであろうが、分子量約７０ｋＤａ又はもう少し重いところにバンドが観察された（図２）。これに対して、ＧＦＰ−ＣＲＥＰ−２Ａ*及びＧＦＰ−ＮＰ−ＣＲＥＰ−２Ａ*融合タンパク質は、予想される分子量と同様の分子量で泳動された（それぞれ、３５ｋＤａ及び８９ｋＤａ）。
【００７２】
発明者らは、ｒＭΔＢＢ−ＮＰレプリコンで作成されたＮＰタンパク質の予想される大きさと実際の大きさとの不一致は、２Ａ／２Ｂ切断が起こらず、２Ｂタンパク質（１５１アミノ酸）の大きさとすれば、代わりに２Ｂポリペプチドの内部、Ｎ末端の約３分の１で切断が起こったと説明する。この場合、ｒＭΔＢＢ−ＮＰベクターにエンコードされたＮＰ関連異種配列は、ＮＰ−ＣＲＥＰ−２Ａ*−Δ２Ｂ融合ポリペプチドとして発現した。ＮＰ配列及びＣＲＥによりエンコードされ、切断部位の前に位置するアミノ酸の伸長により、残りの２Ａ配列が切断を許さないような方法で折りたたまれていることが可能である。発明者らは、現時点では２Ｂポリペプチドの内部での異常な切断の発生について説明を持っていないが、他のピコルナウイルスについては、特にプロセシングカスケードの切断事象が１つブロックされた場合（４）、代わりのプロセシング経路が既に記述されている。
【００７３】
実施例２：メンゴウイルスゲノム由来レプリコン、ｒＭΔＢＢ、ｒＭΔＢＢ−ＧＦＰ、ｒＭΔＢＢ−ＮＰ及びｒＭΔＢＢ−ＧＦＰ−ＮＰの複製の特性決定
発明者らは、次に、ＲＮＡの複製に影響を与えることなくメンゴウイルスゲノム中に外来配列を挿入することができるか否かについて測定した。追加として、インフルエンザＮＰが非特異的にＲＮＡと結合することが示されている（１４、３２）ことから、メンゴウイルスＲＮＡとの相互作用は、全体の複製効率に影響すると仮定できた。よって、ｒＭΔＢＢ、ｒＭΔＢＢ−ＧＦＰ、ｒＭΔＢＢ−ＮＰ及びｒＭΔＢＢ−ＧＦＰ−ＮＰの合成ＲＮＡ転写産物をＨｅＬａ細胞にトランスフェクションし、全細胞質ＲＮＡを、トランスフェクション後、種々の時間で抽出した。メンゴウイルスＲＮＡのヌクレオチド６０２２〜７６０６に相補的な［32Ｐ］放射性ラベルリボプローブを用いたスロットブロッティング後のハイブリダイゼーションにより、全てのＲＮＡについての効率的な転写が示された（図３）。発明者らの研究では、細胞はエレクトロポレーションによりトランスフェクションされ、古典的なＤＥＡＥ−デキストラン法よりも効率的であった（＞５０％の細胞がトランスフェクションされた）。これらの条件下、キャプシドタンパク質の存在、非存在に関わらず、４種全てのＲＮＡが細胞変性作用（ＣＰＥ）を誘発し、トランスフェクション後２４時間で、細胞単層の通常の破壊が起こった（データは示していない）。まとめて考えると、これらの結果は、ＧＦＰやＮＰコーディング配列等の外来配列の挿入は、ＲＮＡ複製に負の影響を与えなかったことを説明した。
【００７４】
実施例３：組換えメンゴウイルス由来レプリコンによる緑色蛍光タンパク質の発現
ＧＦＰ発現は、メンゴウイルス由来レプリコンでトランスフェクションされた細胞の５３０ｎｍの蛍光をモニターするサイトフルオロメトリーにより分析した。ＨｅＬａ細胞は、モック（ｍｏｃｋ）トランスフェクションするか、又は、ｒＭΔＢＢ、ｒＭΔＢＢ−ＧＦＰ若しくはｒＭΔＸＢＢ−ＧＦＰレプリコンＲＮＡでのエレクトロポレーションによりトランスフェクションした。予備的実験の結果によると、全てのテストされたレプリコンについてＧＦＰピーク発現の期間が７〜１２時間の範囲であるので、トランスフェクション後９時間で、細胞をトリプシン処理し、次いで、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフルオロサイトメーターで蛍光強度を分析した。図４に示すように、ＧＦＰ発現はｒＭΔＢＢ−ＧＦＰでトランスフェクションした細胞で観察されたが、モックトランスフェクションされた細胞又は空のベクターｒＭΔＢＢでトランスフェクションされた細胞では観察されなかった。興味深いことに、レプリコンｒＭΔＸＢＢ−ＧＦＰ  ＲＮＡでトランスフェクションされた細胞は全く蛍光を示さなかったことから、メンゴウイルスのＣＲＥがＲＮＡ複製に必要であることを確認し、よって、外来配列の重要な発現にＲＮＡ複製が必要であることを示した。つまり、メンゴウイルス由来組換えレプリコンは、トランスフェクションされた細胞中で、ＧＦＰの効率的な発現を支配することが示された。
【００７５】
実施例４：組換えメンゴウイルス由来レプリコンによるインフルエンザ核タンパク質の発現
核タンパク質の発現は、方法に記載のように、メンゴウイルス由来レプリコンでトランスフェクションした、又は、Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルスに感染した細胞の細胞質抽出物のＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスに対する抗体での免疫沈降により分析された。ＨｅＬａ細胞は、レプリコンＲＮＡでのエレクトロポレーションによりトランスフェクションされ、予備的実験の結果に従って、ピーク発現時に［35Ｓ］メチオニンで２時間代謝的にラベルした。細胞質抽出物を調製し、インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４に対して作成したポリクローナル抗体でタンパク質を免疫沈降し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、オートラジオグラフィーで視覚化した。図５に示すように、見かけの分子量が７０ｋＤａのタンパク質は、ｒＭΔＢＢ−ＮＰでトランスフェクションした細胞の抽出物から特異的に免疫沈降された（レーン３）。予想通り、モックトランスフェクションした細胞又は空のベクターｒＭΔＢＢ由来のレプリコンＲＮＡでトランスフェクションした細胞からは免疫反応性タンパク質は検出されなかった。
【００７６】
メンゴウイルス由来レプリコンにより発現されたＮＰ融合ポリペプチドは、見かけの分子量７０ｋＤで泳動され（図５、レーン３）、Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルスに感染した細胞で発現したＮＰの天然型（レーン６）の分子量５５ｋＤよりも大幅に大きい。実施例１で論じたように、この分子量の差は、インビトロ翻訳実験で観察されたように、ＮＰ−ＣＲＥＰ−２Ａ*融合タンパク質の追加のアミノ酸残基及び２Ｂタンパク質の追加の残基を説明する。重ねて、この結果は、メンゴウイルスポリプロテインの２Ａ／２Ｂサイトでのタンパク質分解のプロセシングが起こらず、代わりに２Ｂ配列の内部の切断部位が用いられたとの仮説と一致する。興味深いことに、レプリコンＲＮＡの全体の複製効率に影響を及ぼさなかったことから、この代わりのプロセシング経路はメンゴウイルスポリプロテインプロセシングカスケードの一部であり得ることを示唆した。
【００７７】
組換えレプリコンｒＭΔＢＢ−ＧＦＰ−ＮＰでのＨｅＬａ細胞のトランスフェクション（図５、レーン４）によってもまた、高いレベルのＮＰ関連タンパク質の発現が見られた。重ねて、ＮＰ関連物質が予想されたよりも高い分子量に泳動されたことから（８９ｋＤａではなく、約９７ｋＤａ）、２Ａ／２Ｂサイトでの切断は起きていないようであった。
よって、メンゴウイルス由来組換えレプリコンは、少なくとも２２００ヌクレオチドまでの異種配列の、トランスフェクションした細胞における効率的な発現を支配することが示された。
【００７８】
実施例５：組換えメンゴウイルス由来レプリコンを裸のＲＮＡとして注射した後のＮＰ特異的ＣＴＬ応答の誘導
異種特異的免疫応答を誘発するために裸のメンゴウイルス由来レプリコンを注射することの可能性を確立するために、発明者らは、裸のＲＮＡとして注射された組換えｒＭΔＢＢ−ＮＰが、特にＮＰの優性Ｈ−２Ｄb制限エピトープ、ＮＰ３６６に対して、ＮＰ特異的ＣＴＬ応答を誘発し得るかについて測定した。
【００７９】
このために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１ヶ月の間隔で２５μｇのｒＭΔＢＢ−ＮＰ裸のＲＮＡを２回、又は、ポジティブコントロールとして５０μｇのｐＣＩ−ＮＰを１回、筋内注射した。この免疫化計画は、以前の実験に従って定め、ほぼ致死量のインフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４（ｍａ）感染から回復したマウスから得られた値よりわずかに低いレベルで、検出し得るＮＰ特異的ＣＴＬ応答を誘導するのに、１回の注射のプラスミドＤＮＡで充分であるとの観察に基づいた（データ示さず）。免疫したマウスの脾細胞は、最終の注射から３週間後に回収し、ＮＰ３６６ペプチドによりインビトロで刺激し、方法に記載のように、古典的なクロム放出アッセイにより７日後に細胞溶解活性をテストした。ｒＭΔＢＢ−ＮＰ  ＲＮＡ又はｐＣＩ−ＮＰ  ＤＮＡを注射したマウスから開始した脾臓細胞培養物は、ＮＰ３６６ペプチドで負荷をかけた同系のＥＬ４細胞を特異的に溶解した（図６ａ）。ｒΔＢＢ−ＮＰレプリコンＲＮＡにより誘導されたＣＴＬ活性は、ｐＣＩ−ＮＰ  ＤＮＡにより誘導されたものと非常に類似しており、高かった（即ち、エフェクター対標的比が６．７：１のときの特異的溶解が６０％〜７０％）。全ての場合において、コントロールの未感作のマウス、又は、ＮＰ配列を有していないコントロールベクターで免疫したマウスからの刺激された脾細胞では溶解が観察されなかった（図６、塗りつぶしていない印）；ペプチドで装薬されていない同系の標的からも溶解が検出されなかった（図６ｂ）。最後に、全てのエフェクター個体群について、同種Ｐ８１５標的細胞（Ｈ−２d）の溶解は、ペプチドとインキュベーションしたか否かに関わらず、バックグラウンドのレベルであり（データ示さず）、細胞溶解活性は、Ｈ−２制限であり、クラスＩ制限ＣＤ８＋  Ｔ細胞エフェクターに由来するようであることを示した。
【００８０】
最後に、ｒＭΔＢＢ−ＮＰ  ＲＮＡ及びｐＣＩ−ＮＰ  ＤＮＡの２回のｉ．ｍ．注射により誘導された特異的Ｔ細胞応答を、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより定量化した。ＩＦＮγ産生細胞の頻度は、材料と方法に記載のように、インフルエンザウイルス免疫優性ＮＰ３６６ペプチドで、免疫したマウスの脾臓細胞をインビトロ刺激した応答により測定した。図６ｃに示すように、Ｔ細胞頻度は非常に高く、レプリコンＲＮＡ及びプラスミドＤＮＡで免疫したマウスと同じ範囲（１０5脾細胞あたり１００個）であった。予想通り、ＮＰ３６６の非存在下、又は、モックコントロールとしての空のベクターで免疫したマウスの脾臓細胞からは、１０5脾臓細胞あたり１未満のＳＦＣが得られた。
【００８１】
これらの所見は、メンゴウイルスレプリコンは、裸のＲＮＡとして注射された場合、免疫原性であり、インフルエンザＮＰの配列等の挿入外来配列に対する異種特異的免疫性を誘導することができることを示した。
【００８２】
実施例６：組換えレプリコンｒＭΔＢＢ−ＮＰで免疫後のＮＰ特異的抗体の誘導
裸のＲＮＡとして注射された組換えｒＭΔＢＢ−ＮＰがインフルエンザウイルス抗原に対する特異的抗体を誘導し得るかを評価するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに２５μｇのｒＭΔＢＢ−ＮＰ  ＲＮＡ又はポジティブコントロールとしての５０μｇのＰＣＩ−ＮＰ  ＤＮＡを３週間の間隔で３回、筋内注射した。最終の注射（ＤＮＡについては１又は２、ＲＮＡについては２）の３週間後に血清を回収した。特異的抗ＮＰ抗体の応答を、材料と方法に記載のようにして、ＥＬＩＳＡで試験した。
【００８３】
図７に示すように、２５μｇの裸のｒＭΔＢＢ−ＮＰ  ＲＮＡの２回の注射は、インフルエンザＮＰに対する血清抗体を誘導した。ＮＰ特異的ＥＬＩＳＡ力価は、５０μｇのプラスミドｐＣＩ−ＮＰ  ＤＮＡを１回注射することによる値よりもわずかに高かったが、ｐＣＩ−ＮＰ  ＤＮＡを２回注射後に得られた値より著しく低かった。
実施例５にあるように、これらの所見は、メンゴウイルスレプリコンは、裸のＲＮＡとして注射された場合、免疫原性であり、インフルエンザＮＰの挿入外来配列に対する異種特異的免疫応答を誘導することができることを示した。まとめて考えると、実施例５及び６は、メンゴウイルスレプリコンが、エンコードされた異種タンパク質に対する体液性（抗体）及び細胞性（ＣＴＬｓ）の両方の免疫応答を誘導し得ることを明らかにする。
【００８４】
実施例７：インビボでの防御免疫性
ｒＭΔＢＢ−ＮＰがインビボでの防御免疫性を生ずることができることを示すために、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１群あたり６匹）を３週間の間隔で３回、２５μｇのｒＭΔＢＢ若しくはｒＭΔＢＢ−ＮＰレプリコンＲＮＡ、又は、５０μｇのｐＣＩ若しくはｐＣＩ−ＮＰプラスミドＤＮＡのいずれかで免疫した。最終の注射から３週間後、マウスを、１０2ｐｆｕ（０．１ＬＤ５０）のマウスに適応させたＡ／ＰＲ／８／３４で対抗し、肺のウイルス力価を対抗感染の７日後に測定した。図８に示すように、各ＮＰエンコードベクターを注射したマウスでのウイルス負荷は、対応する空のベクターを注射したマウスより非常に低かった（ｐ＜０．００１；Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。
【００８５】
発明者らのマウス適応ウイルス株の高い毒性に関連するとみられるウイルス力価の低下は穏やかであったが（Ｃ５７ＢＬ／６マウスについてＬＤ５０は１０3ｐｆｕであった）、裸のＲＮＡ免疫により達成された力価の低下は、より良好に記述された裸のＤＮＡ免疫により得られるものと同様に効率的であったことは、記載に値する。この所見は、メンゴウイルス由来レプリコンでの裸のＲＮＡ免疫により誘導される免疫応答（ほぼＣＴＬｓであろう）が、肺疾患ウイルスの力価を減少することによるインフルエンザに対する防御に貢献し得ることを示す。
【００８６】
実施例８：メンゴウイルスゲノム由来組換えｒＭΔＦＭレプリコンの製造
外来配列をより天然型で発現するために、発明者らは、外来配列に融合するベクター配列の大きさを最小にする可能性について探求した。これを達成するために、ｐＭΔＢＢにエンコードされたレプリコンのポリリンカーとＣＲＥ配列との間に、ＦＭＤＶの２Ａ／２Ｂ自己触媒切断部位の配列を挿入することによりプラスミドｐＭΔＦＭを構築した（図１）。その最適な形態では、切断部位は２Ａタンパク質の１９個のＣ末端残基及び２Ｂタンパク質の最初のプロリンを含む２０個のアミノ酸で構成される（７）。
【００８７】
得られるプラスミドｐＭΔＦＭ（８０９２塩基対）は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７に対応する：最初の塩基はレプリコンＲＮＡの最初の塩基に対応し、転写前のプラスミドの線状化に用いられるＢａｍＨＩサイトは４９１２の位置であり、Ｔ７プロモーターはヌクレオチド８０７４〜８０９２であり、２Ｇ残基（ヌクレオチド８０９１〜８０９２）は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼとこのプラスミドとから得られた合成転写産物の一部である。
【００８８】
次に、インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４（ｍａ）ウイルスのＨＡ遺伝子の配列を、ｐＭΔＦＭのＳａｃ  Ｉ及びＮｈｅ  Ｉサイトの間でありＦＭＤＶ  ２Ａ配列のすぐ上流に残りのポリプロテイン配列とフレームとなるように挿入し、プラスミドｐＭΔＦＭ−ＨＡを得た。
これらの構築物がポリプロテインに翻訳され、予想通り最終産物に切断されることを確かめるために、上述したように、対応する線状化プラスミドをインビトロで転写し、合成ＲＮＡをウサギ網状赤血球溶解物中で翻訳した。全てのレプリコンは、２Ｃ、３Ｃ、３Ｄ及び３ＣＤウイルスポリペプチドの存在により証明されたように、正しく切断された最終産物と類似の翻訳プロファイルを示した（図９Ａ）。
【００８９】
特に、再構築されたＦＭＤＶ  ２Ａ／２Ｂサイトの正しいインシス切断は、組換えレプリコンｒＭΔＢＢ−ＨＡで観察された；ＦＭＤＶ  ２Ａタンパク質（２１ａａ）及びポリリンカー（５ａａ）の２６個の余剰アミノ酸残基を含む、正しく切断されたＨＡ−２Ａ*融合タンパク質の発現は、予想される分子量、６５ｋＤａにバンドが存在することにより証明された（図９Ａ）。興味深いことに、より大きい分子量のバンドの存在は、このインビトロ翻訳アッセイにおける切断が１００％効率的ではないことを示唆した。
【００９０】
対応する親のレプリコンｒＭΔＦＭについては、３．４ｋＤａ  ＭＣＳ−２Ａ融合タンパク質として現れるであろうこのような切断産物は、その大きさが小さいことから認識できなかったが、見かけの分子量が１６ｋＤａのポリペプチドが存在した；このポリペプチドは、メンゴウイルスＣＲＥ、メンゴウイルス２Ａの最後の２２残基及び２ＢのＮ末端をつなぐ配列に相当すると考えられ、以前ｒＭΔＢＢ及びｒＭΔＢＢ−ＮＰレプリコンの場合に見られたように、この場合、元のメンゴウイルス２Ａ／２Ｂは切断されずに残っているが、ＦＭＤＶ  ２Ａ／２Ｂサイトは切断されたことを示唆した。
【００９１】
これら第二世代のレプリコンの複製効率を試験するために、ＨｅＬａ細胞を合成ＲＮＡでエレクトロポレーションによりトランスフェクションし、トランスフェクション後異なった時間間隔で細胞質ＲＮＡを抽出し、メンゴウイルスゲノムのヌクレオチド６０２２〜７６０６に相補的なメンゴウイルス特異的［32Ｐ］−ラベルリボプローブとのノザンハイブリダイゼーションにより分析した。図９Ｂに示すように、ｒＭΔＦＭレプリコンはその親であるｒＭΔＢＢと同様に効率的に複製を行い、新規に作成された２Ａ／２Ｂ切断がＲＮＡ合成に影響を与えなかったことを示した。一方、ｒＭΔＦＭ−ＨＡ組換えレプリコンは、複製能力がなかった。
【００９２】
ｒＭΔＦＭ−ＨＡレプリコンに存在するＨＡがＳＰ及びＴＭ領域を含んでいたので、この所見は他のピコルナウイルス、ポリオウイルスのゲノムから構築されたレプリコンの場合にも同様であろう。実際、ポリオウイルスレプリコンポリプロテインのすぐＮ末端にＳＰが存在すると、対応するＲＮＡの複製が排除されることがわかっている（１、１６）。発明者らは、最近、ΔＰ１ポリオウイルスレプリコンの複製が、糖化膜貫通タンパク質であるインフルエンザＨＡの完全配列の挿入により破壊されたことを示すことにより、この所見を確認した（２９）。さらに、発明者らは、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ等の異種ＩＲＥＳを外来配列の間に挿入し、Ｐ２Ｐ３ポリプロテイン配列を存置することによりジシストロン性となるようにこれらのレプリコンを作成した場合、ポリオウイルスゲノム由来でありそのＰ１領域を欠失したレプリコンを用いることによりＨＡの糖化配列を発現することが可能であったことを示した（２９）。
【００９３】
この結果、ジシストロン性メンゴウイルスレプリコンを構築することができる。これは、第一に、外来のウイルス又は哺乳類のＩＲＥＳをＳａｃ  Ｉ／Ｘｈｏ  ＩポリリンカーとｐＭΔＢＢプラスミドの残りのポリプロテイン配列との間に挿入することにより行うことができる。例えば、このようなジシストロン性メンゴウイルスレプリコンは、ウマ鼻炎ウイルスタイプＡ又はタイプＢの外来ＩＲＥＳを挿入することにより構築することができるが、これは、これら両方のＩＲＥＳが、カルジオウイルス属の原型であるＥＭＣＶウイルスのＩＲＥＳと翻訳因子について効率的に競合することができるからである（３８）。このようなジシストロン性メンゴウイルスレプリコンは、本発明者らによるジシストロン性ポリオウイルスレプリコンについての以前の研究により明らかにされたように、複製して糖化された外来ポリペプチドを発現することができる。例えば、インフルエンザＨＡ配列は、これらの新規ジシストロン性メンゴウイルスレプリコンのうちの一つに挿入することができる。
【００９４】
ポリペプチドの抗原性や生理活性に糖化が鍵となるパラメーターである場合、これらの新規ジシストロン性メンゴウイルスレプリコンにより、興味のある外来抗原やタンパク質の発現が可能となる。例えば、メンゴウイルスジシストロン性レプリコンは、Ｂ型肝炎ウイルスのＨＢｓ抗原、ヒト免疫不全ウイルスのエンベロープ糖タンパク質等のウイルス抗原、ヒト腫瘍細胞の表面抗原等の癌抗原のいずれを発現するのにも用いることができる。
【００９５】
メンゴウイルスｒＭΔＦＭレプリコンベクターは、ウサギ網状赤血球溶解物で観察されたように、トランスフェクションされた細胞において非糖化外来タンパク質の天然の発現を行うことに用いることもできる。
【００９６】
実施例９：メンゴウイルスレプリコンによる、他の抗原、ＬＣＭＶ核タンパク質（ＮＰ）又はＬＣＭＶ  ＮＰ１１８−１２６エピトープの発現
裸のＲＮＡとして接種されたメンゴウイルス由来レプリコンが他の抗原に対して異種特異的免疫応答を誘導することができることを示すために、発明者らはｒＭΔＢＢ−ＧＦＰ−ｌｃｍｖＮＰ及びｒＭΔＢＢ−ＧＦＰ−ＮＰ１１８レプリコンを構築した。これらのレプリコンは、それぞれ、ＧＦＰとの融合タンパク質として、ＬＣＭＶのＮＰ及びＮＰ１１８−１２６  Ｈ２d制限免疫優性エピトープをエンコードしている。
【００９７】
これを達成するために、プラスミドｐＭΔＢＢ−ＧＦＰ−ｌｃｍｖＮＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８、１０４１７塩基対）を、材料と方法に記載のようにして構築した。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８の最初の塩基は、レプリコンＲＮＡの最初の塩基に対応する。転写の前のプラスミドの線状化に用いるＢａｍＨＩサイトは、７２３７の位置である。Ｔ７ポリメラーゼは、ヌクレオチド１０３９９〜１０４１７であり、２Ｇ残基（ヌクレオチド１０４１６〜１０４１７）は、実際、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼとこのプラスミドとから作成された合成転写産物の一部である。
【００９８】
次に、ＧＦＰとの融合ポリペプチドとしてのＬＣＭＶ  ＮＰの発現が、ｒＭΔＢＢ−ＧＦＰ−ｌｃｍｖＮＰレプリコンＲＮＡでエレクトロポレーションされたＨｅＬａ細胞の細胞質ゾル抽出物中に、予想された分子量、９７ｋＤａのバンドが存在することにより明らかにされた（図１０）。ＧＦＰ発現もまた、レプリコンでトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞の５３０ｎｍでの蛍光をモニターするサイトフルオロメトリーにより証明された。同様に、１５個のアミノ酸前駆体（ＮＰ−１１６−１３０、約１．７ｋＤａ）としてのＮＰ１１８−１２６  ＬＣＭＶエピトープの発現は、融合タンパク質として、ＧＦＰよりわずかに重く（３５ｋＤａ）検出された。このことは、上述の親のｒＭΔＢＢ−ＧＦＰレプリコンの場合と同様に、組換えｒＭΔＢＢ−ＧＦＰ−ｌｃｍｖＮＰ及びｒＭΔＢＢ−ＧＦＰ−ＮＰ１１８ＲＮＡが複製を起こし、挿入された配列の合成を可能にしたことを示した。さらに、実施例３とともに、適切なメンゴウイルス由来レプリコンのＲＮＡ複製のマーカーとしてＧＦＰ発現を容易に用いることができることを示した。
【００９９】
最後に、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、２５μｇ  ｒＭＢＢ−ＧＦＰ、ｒＭΔＢＢ−ＧＦＰ−ｌｃｍｖＮＰ若しくはｒＭΔＢＢ−ＧＦＰ−ＮＰ１１８裸のＲＮＡ、又は、ポジティブコントロールとしての５０μｇ  ｐＣＭＶ−ＮＰ若しくはｐＣＭＶ−ＭＧ３４（４０）裸のＤＮＡを２回、ｉ．ｍ．注射した。ＩＦＮγ産生細胞の頻度を、材料と方法に記載のように、ＬＣＭＶ免疫優性ＮＰ１１８−１２６ペプチドでの免疫されたマウスの脾臓細胞のインビトロ刺激に対する応答としてＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定した。図１１に示すように、ｒＭΔＢＢ−ＧＦＰ−ｌｃｍｖＮＰ及びｒＭΔＢＢ−ＧＦＰ−ＮＰ１１８レプリコンの両方が、高頻度でＬＣＭＶ特異的Ｔ細胞を誘導した（１０5脾細胞あたり７０〜２００個）。興味深いことに、これらの頻度は、プラスミドＤＮＡによる遺伝的免疫感作後に観察された値よりもわずかに高いものであった。
【０１００】
結論として、これらの所見は、メンゴウイルスレプリコンが、完全長の外来抗原、又は、外来エピトープに相当する短い関連ペプチドのいずれの免疫原性の形態でも発現することができることから、これらが異種特異的免疫応答を誘導するための用途が広い手段であることを示す。
【０１０１】
本発明を完全に記述すると、同等の範囲で本発明の意図及び範囲を逸脱することなく、また、不要な実験を行うことなく、本発明を実施することができることが、当業者らにより認識されるであろう。加えて、本発明は、いくつかの実施形態及び実施例に鑑みて記載されており、本発明者らは、更なる変更が可能であると信じる。本願は、上述した普遍の原理に従う本発明の全ての変形、使用又は適応を保護することを意図する。
本明細書に記載した全ての参考文献、手引、特許及び特許出願は、全てが引例として本明細書に組み込まれる。
【０１０２】
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【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】図１は、メンゴウイルスゲノム由来サブゲノム組換えレプリコンをエンコードするプラスミドの概略図である。
【図２】図２は、ウサギ網状赤血球溶解物中での組換えメンゴウイルスポリプロテインのインビトロ転写及びプロセシングを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。
【図３】図３は、サブゲノムメンゴウイルス由来レプリコンの複製を示すスロットブロットである。
【図４】図４は、組換えレプリコンｒＭΔＢＢ、ｒＭΔＢＢ−ＧＦＰ又はｒＭΔＸＢＢ−ＧＦＰでトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞におけるＧＦＰ発現のフルオロサイトメーターの示数である。
【図５】図５は、組換えレプリコンｒＭΔＢＢ−ＮＰでトランスフェクションした［35Ｓ］メチオニンラベルＨｅＬａ細胞中で発現した、免疫沈降させたインフルエンザＮＰタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。
【図６】図６は、ｒＭΔＢＢ−ＮＰで免疫したＣ５７ＢＬ／６マウス中のＮＰ特異的ＣＴＬ活性の誘導を示すＣＴＬアッセイである。
【図７】図７は、図６と同じワクチン接種実験計画に従ってｒＭΔＢＢ−ＮＰで免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＮＰ−特異的抗体の誘導を示すＥＬＩＳＡである。
【図８】図８は、ｒＭＢＢΔ−ＮＰで免疫し、次いでインフルエンザウイルスで対抗したマウスでの肺疾患ウイルス荷重のグラフ図である。
【図９Ａ】図９Ａは、ウサギ網状赤血球における天然型ＨＡのインビトロ転写を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、トランスフェクションされた真核生物細胞において、モノシストロン性メンゴウイルスレプリコンは、外来糖化タンパク質を発現することができないことを示すスロットブロットである。
【図１０】図１０は、組換えメンゴウイルスレプリコンにより感染した［35Ｓ］メチオニンラベルＨｅＬａ細胞において発現した、免疫沈降させたＧＦＰ融合ポリペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。
【図１１】図１１は、ｒＭΔＢＢ−ＧＦＰ−ＮＰ１１８及びｒＭΔＢＢ−ＧＦＰ−ｌｃｍｖＮＰレプリコンＲＮＡ、並びに、コントロールとしてｐＣＭＶ−ＮＰ及びｐＣＭＶ−ＭＧ３４プラスミドＤＮＡで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＬＣＭＶ特異的Ｔ細胞の誘導を示すＥＬＩＳＰＯＴアッセイである。
【図１２】図１２は、組換えメンゴウイルスレプリコンｒＭΔＢＢ−ＧＦＰ、ｒＭΔＢＢ−ＧＦＰ−ＮＰ１１８、又は、ｒＭΔＢＢ−ＧＦＰ−ｌｃｍｖＮＰでトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞におけるＧＦＰ発現のフルオロサイトメーターの示数である。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2005508610.tif 000009
【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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