(57)【要約】本発明はヒトの糖質結合タンパク質(CHOP)、およびCHOPを同定しコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、発現ベクター、宿主細胞、抗体、アゴニストおよびアンタゴニストをも提供する。本発明はまた、CHOPの異常発現に関連する疾患を診断、治療または予防する方法をも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）乃至（f）からなる群から選択した単離されたポリペプチド。
（ａ）  SEQ ID NO:1-10（配列番号１乃至10）からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｂ）  SEQ ID NO:1-3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7-10からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90％が同一であるような天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（ｃ）  SEQ ID NO:4のアミノ酸配列に対して少なくとも９３％が同一であるような天然アミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｄ）  SEQ ID NO:6のアミノ酸配列に対して少なくとも99％が同一であるような天然アミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｅ）  SEQ ID NO：1-10からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および
(f)  SEQ ID NO:1-10からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片
【請求項２】
SEQ ID NO:1-10からなる群から選択したアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
請求項1のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項２のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
SEQ ID NO:11-20からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含む、請求項４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項３に記載のポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞。
【請求項８】
請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを含む遺伝形質転換体。
【請求項９】
請求項１のポリペプチドを生産する方法であって、
（ａ）  前記ポリペプチドの発現に好適な条件下で、請求項１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチドで形質転換される細胞を培養する過程と、
（ｂ）  そのように発現した前記ポリペプチドを回収する過程とからなり、前記組換えポリヌクレオチドが、請求項１に記載の前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーター配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:1-10からなる群から選択した或るアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に記載のポリペプチドと特異結合するような単離された抗体。
【請求項１２】
以下の（ａ）乃至（e）からなる群から選択した単離されたポリヌクレオチド。
（ａ）  SEQ ID NO：11-20からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
（ｂ）  SEQ ID NO:11-20からなる群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％が同一であるような天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
（ｃ）  (a)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｄ）  （ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、および
（ｅ）  （ａ）〜（ｄ）のRNA等価物
【請求項１３】
請求項12に記載のポリヌクレオチドの少なくとも６０の連続したヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項12に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
（ａ）  前記サンプル中の前記標的ポリヌクレオチドに相補的な配列を持つ少なくとも２０の連続したヌクレオチドを持つプローブを用いて前記サンプルをハイブリダイズする過程と、
（ｂ）  前記ハイブリダイゼーション複合体の存在・不存在を検出し、該複合体が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程、とを含み、前記プローブと前記標的ポリヌクレオチドあるいはその断片との間でハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で、プローブが前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズすることを特徴とする方法。
【請求項１５】
前記プローブが少なくとも６０の連続したヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
請求項12に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
（ａ）  ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、
（ｂ）  前記の増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の有無を検出し、該標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１のポリペプチドと、薬剤として許容できる賦形剤とを含むことを特徴とする組成物。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:1-10からなる群から選択したアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項17に記載の組成物。
【請求項１９】
機能的CHOPの発現低下に関連する疾患又は病状を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に対して請求項17に記載の組成物を投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１に記載のポリペプチドのアゴニストとして有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）  請求項１のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝すステップと、
（ｂ）  前記サンプルにおいてアゴニスト活性を検出するステップとを含むことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２１】
請求項20に記載の方法によって同定したアゴニスト化合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを含むことを特徴とする組成物。
【請求項２２】
機能的なCHOPの発現の低下に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療が必要な患者に請求項21の組成物を投与することを含むことを特徴とする治療方法。
【請求項２３】
請求項１に記載のポリペプチドのアンタゴニストとして有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）  請求項１のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝すステップと、
（ｂ）  前記サンプルにおいてアンタゴニスト活性を検出するステップとを含むことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法によって同定したアンタゴニスト化合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを含むことを特徴とする組成物。
【請求項２５】
機能的CHOPの過剰な発現に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療を要する患者への請求項24の組成物の投与を含む治療方法。
【請求項２６】
請求項１に記載のポリペプチドに特異結合する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）  請求項１のポリペプチドを適切な条件下で少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、
（ｂ）  請求項１のポリペプチドの試験化合物との結合を検出し、それによって請求項１のポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程を含む方法。
【請求項２７】
請求項１に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）  請求項１のポリペプチドの活性が許容される条件下で、請求項１のポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、
（ｂ）  請求項１に記載のポリペプチドの活性を試験化合物の存在下で算定する過程と、
（ｃ）  試験化合物の存在下での請求項１のポリペプチドの活性を、試験化合物の不存在下での請求項１のポリペプチドの活性と比較する過程を含み、試験化合物の存在下での請求項１のポリペプチドの活性の変化が、請求項１のポリペプチドの活性を調節する化合物を標示するような方法。
【請求項２８】
請求項５の配列を含む標的ポリヌクレオチドの発現を変容させるのに効果的な化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）  前記標的ポリヌクレオチドの発現に好適な条件下で、該標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝露する過程と、
（ｂ）  前記標的ポリヌクレオチドの発現改変を検出する過程と、
（ｃ）  可変量の前記化合物の存在下と前記化合物の不存在下で、前記標的ポリヌクレオチドの発現を比較する過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項２９】
試験化合物の毒性を算定する方法であって、
（ａ）  核酸を含む生物学的サンプルを前記試験化合物で処理する過程と、
（ｂ）  処理した前記生物学的サンプルの核酸と、請求項12のポリヌクレオチドの少なくとも２０の連続するヌクレオチドを持つプローブをハイブリダイズさせる過程であって、このハイブリダイゼーションゼーションが、前記プローブと前記生物学的サンプル中の標的ポリヌクレオチドとの間で特異的なハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で行われ、前記標的ポリヌクレオチドが、請求項12のポリヌクレオチドまたはその断片のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである、前記過程と、
（ｃ）  ハイブリダイゼーション複合体の収量を定量する過程と、
（ｄ）  前記処理された生物学的サンプル中のハイブリタイゼーション複合体の量を、処理されていない生物学的サンプル中のハイブリタイゼーション複合体の量と比較する過程とを含み、前記処理された生物学的サンプル中のハイブリタイゼーション複合体の量の差が、前記試験化合物の毒性を標示するような方法。
【請求項３０】
生物学的サンプル中のCHOPの発現に関連する症状または疾患に対する診断試験法であって、
（ａ）  前記生物学的サンプルと請求項11の抗体との混合を、前記抗体が前記ポリペプチドに結合し、抗体とポリペプチドとの複合体を形成するのに適した条件下で行う過程と、
（ｂ）  前記複合体を検出する過程とを含み、前記複合体の存在が、前記生物学的サンプル中の前記ポリペプチドの存在と相関することを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項11の抗体であって、
（ａ）  キメラ抗体
（ｂ）  単鎖抗体
（ｃ）  Fab断片
（ｄ）  F（ab'）2 断片
（ｅ）  またはヒト化抗体である抗体。
【請求項３２】
請求項１１に記載の抗体と、許容できる賦形剤とを含む組成物。
【請求項３３】
被検者のCHOPの発現に関連する病状又は疾患の診断方法であって、請求項32に記載の組成物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３４】
前記抗体が標識されることを特徴とする請求項３２に記載の組成物。
【請求項３５】
被検者のCHOPの発現に関連する病状又は疾患の診断方法であって、請求項34に記載の組成物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項11に記載の抗体の特異性を有するポリクローナル抗体を調製する方法であって、
（ａ）  抗体反応を誘発する条件下で、SEQ ID NO:1-10からなる群から選択したアミノ酸配列またはその免疫原性断片を含むポリペプチドを用いて動物を免疫化する過程と、
（ｂ）  前記動物から抗体を単離する過程と、
（ｃ）  前記単離された抗体を前記ポリペプチドでスクリーニングし、それによって、SEQ ID NO：1-10からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異結合するポリクローナル抗体を同定する過程とを含むような方法。
【請求項３７】
請求項36に記載の方法で産出したポリクローナル抗体。
【請求項３８】
請求項37に記載のポリクローナル抗体及び適切なキャリアーを含む組成物。
【請求項３９】
請求項１１に記載の抗体の特異性を有するモノクローナル抗体を作製する方法であって、
（ａ）  抗体反応を誘発する条件下で、SEQ ID NO:1-10からなる群から選択したアミノ酸配列またはその免疫原性断片を含むポリペプチドを用いて動物を免疫化する過程と、
（ｂ）  前記動物から抗体産出細胞を単離する過程と、
（ｃ）  前記抗体産出細胞と不死化した細胞とを融合して、モノクローナル抗体を産出するハイブリドーマ細胞を形成する過程と、
（ｄ）  前記ハイブリドーマ細胞を培養する過程と、
（ｅ）  SEQ ID NO：1-10からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異結合するようなモノクローナル抗体を前記培養物から単離する過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項39に記載の方法で産出したモノクローナル抗体。
【請求項４１】
請求項40に記載のモノクローナル抗体及び適切なキャリアーを含む組成物。
【請求項４２】
Fab発現ライブラリをスクリーニングすることにより産出されることを特徴とする請求項１１に記載の抗体。
【請求項４３】
組換え免疫グロブリンライブラリのスクリーニングにより前記抗体を産出することを特徴とする請求項１１に記載の抗体。
【請求項４４】
SEQ ID NO:1-10 からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドをサンプル中に検出する方法であって、
（ａ）  請求項１１に記載の抗体と前記ポリペプチドとの特異結合を許容する条件下で、前記抗体と１サンプルとをインキュベートする過程と、
（ｂ）  特異結合を検出する過程とを含み、該特異結合が、SEQ ID NO：1-10からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドがサンプル中に存在することを標示することを特徴とする方法。
【請求項４５】
SEQ ID NO:1-10 からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドを精製する方法であって、
（ａ）  請求項１１に記載の抗体と前記ポリペプチドとの特異結合を許容する条件下で、前記抗体と１サンプルとをインキュベートする過程と、
（ｂ）  前記サンプルから前記抗体を分離し、SEQ ID NO:1-10からなる群から選択したアミノ酸配列を含む精製ポリペプチドを得る過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４６】
マイクロアレイの少なくとも１つが請求項１３に記載のポリヌクレオチドであることを特徴とするマクロアレイ。
【請求項４７】
ポリヌクレオチドを含むサンプルの発現プロファイルを作製する方法であって、
（ａ）  サンプル中のポリヌクレオチドを標識化する過程
（ｂ）  ハイブリダイゼーション複合体が形成されるのに適した条件下で請求項４６のマイクロアレイのエレメントとサンプル中の標識化ポリヌクレオチドとを接触させる過程と、
（ｃ）  サンプル中のポリヌクレオチドの発現を定量する過程を含む方法
【請求項４８】
或る固体基板上の固有の物理的位置に付着された種々のヌクレオチド分子を有するアレイであって、少なくとも１つの前記ヌクレオチド分子が、或る標的ポリヌクレオチドの少なくとも30の連続したヌクレオチド群と特異的にハイブリダイズ可能な最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列を含み、前記の標的ポリヌクレオチドが請求項１２に記載のポリヌクレオチドであることを特徴とするアレイ。
【請求項４９】
請求項４８に記載のアレイで、前記の最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの配列が前記の標的ポリヌクレオチドの少なくとも30の連続したヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
【請求項５０】
請求項４８に記載のアレイで、前記の最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの配列が前記の標的ポリヌクレオチドの少なくとも60の連続したヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
【請求項５１】
請求項48に記載のアレイで、前記の最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの配列が前記の標的ポリヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
【請求項５２】
請求項48に記載のアレイで、マイクロアレイであることを特徴とするアレイ。
【請求項５３】
請求項48に記載のアレイで、前記のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの最初の配列を含むヌクレオチド分子にハイブリダイズした前記の標的ポリヌクレオチドを有することを特徴とするアレイ。
【請求項５４】
請求項48に記載のアレイで、リンカーが少なくとも１つの前記のヌクレオチド分子と前記の固体基板を連結していることを特徴とするアレイ。
【請求項５５】
請求項48に記載のアレイで、基板上の固有の物理的位置の各々が複数のヌクレオチド分子を含み、任意の単一の固有の物理的位置でのその複数のヌクレオチド分子は同一の配列を有し、基板上の固有の物理的位置の各々は、基板上の別の固有の物理的位置でのヌクレオチド分子の配列とは異なる配列を有するヌクレオチド分子を含むことを特徴とするアレイ。
【請求項５６】
SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５７】
SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含む請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項５８】
SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５９】
SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６０】
SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６１】
SEQ ID NO:6のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６２】
SEQ ID NO:7のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６３】
SEQ ID NO:8のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６４】
SEQ ID NO:9のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６５】
SEQ ID NO:10のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６６】
SEQ ID NO:11のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６７】
SEQ ID NO:12のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６８】
SEQ ID NO:13のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６９】
SEQ ID NO:14のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７０】
SEQ ID NO:15のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７１】
SEQ ID NO:16のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７２】
SEQ ID NO:17のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７３】
SEQ ID NO:18のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７４】
SEQ ID NO:19のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７５】
SEQ ID NO:20のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖質結合タンパク質の核酸配列及びアミノ酸配列に関する。本発明はまた、これらの配列を利用した糖質代謝、細胞増殖異常、自己免疫／炎症性の疾患、生殖系疾患、遺伝疾患、輸送疾患、神経系疾患および癌の診断・治療・予防に関する。本発明はさらに、糖質結合タンパク質の核酸配列及びアミノ酸配列の発現における外来性化合物の効果についての評価に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖または糖類、澱粉およびセルロースを含む糖質は複数の水酸基を持つアルデヒドまたはケトン化合物である。糖質は哺乳動物の細胞において3つの重要な役割を持っている。糖質は、エネルギー貯蔵分子、燃料および代謝中間体として機能する。糖質は解糖によって分解されてエネルギーを放出するか、あるいはグリコーゲンとして後の使用のために貯蔵することができる。糖質代謝の重要性は、血液のグルコースレベルを維持するために敏感な調節システムが用意されていることからわかる。インスリンとグルカゴンという２つの膵臓ホルモンがそれぞれ細胞によるグルコースの取り込みと貯蔵および細胞によるグルコースの放出を促進する。デオキシリボースとリボースという糖はそれぞれDNAとRNAの構造的サポートの一部を形成していて、糖質機能の2番目の例となっている。3番目として、糖質は分泌性タンパク質および膜タンパク質および脂質の翻訳後修飾の手段を提供する。実際、真核細胞膜の内容の2〜10％は、膜の糖タンパク質および糖脂質のオリゴ糖である。糖タンパク質および糖脂質の糖質修飾により、広範な構造多様性が生み出され、これらが主に原形質膜の細胞外の側にあるため、細胞間認識に重要な役割を果たす(Stryer, L. (1988) Biochemistry, W.H. Freeman および Company, New York NY, 298-299、 331-347ページ)。
【０００３】
タンパク質はいくつかの方法で糖質に会合している。糖タンパク、糖脂質、グリコサミノグリカン、およびプロテオグリカンなどの糖質含有高分子は細胞表面や細胞外マトリックスに見つけられる。細胞外マトリックスは、細胞から分泌された多様な糖タンパクおよび糖質結合タンパク質から構成され、細胞表面と密接した組織的な網状にアセンブリされている。周囲のマトリックスと細胞との相互作用は細胞の形、強度、柔軟性、運動性、および接着に影響する。これらの動的な性質は、細胞増殖、細胞分化、組織の構成、および胚発生を制御するシグナル伝達経路と密接に関連している。
【０００４】
糖タンパクは共有結合で付着した糖質を有しており、これらの炭水化物はこれらのタンパク質が分泌経路を通過する時に付加されたものである。糖質を結合、修飾、または分解する目的で、いくつかのタンパク質は糖質を含む高分子と非共有結合的に会合する。糖タンパク質には、細胞接着分子、受容体、血液型抗原、成長因子および抗体が含まれる。これらのタンパク質は細胞間認識およびシグナル伝達、神経伝達物質の認識および／または破壊、神経インパルスの伝達および免疫機能などの細胞プロセスに関与している。
【０００５】
オリゴ糖修飾により、広範な構造多様性が得られる。N-およびO-結合型のオリゴ糖がタンパク質に受け渡され、修飾されるが、これは小胞体（ER）およびゴルジで起こる一連の酵素反応によって達成される。オリゴ糖はフォールディングの途中およびその後でタンパク質を安定化し、膜内でタンパク質を配向させ、タンパク質の可溶性を改善し、リソソーム標的のシグナルの役割を果たす。
【０００６】
重度にグリコシル化された糖タンパク質は、プロテオグリカンとも呼ばれる。軟骨などの結合組織の細胞外マトリックスのプロテオグリカンは重量を支える関節において負荷を分散するために必須である。細胞表面に付着したプロテオグリカンは細胞を細胞外マトリクスに固着させる。細胞外プロテオグリカンおよび細胞表面プロテオグリカンはいずれも成長因子に結合することにより細胞表面受容体への結合とその後のシグナル伝達経路の誘発を促進する(Lodish, H. 他 (1995) Molecular Cell Biology, Scientific American Books, New York NY, 1139-1142ページ)。
【０００７】
糖質はグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）も形成するが、これは二糖ユニットの反復から構成される直鎖状の分岐のない多糖である。GAGは遊離状態で存在するか、あるいはコアタンパク質が1つ以上のGAGに結合してできた大分子であるプロテオグリカンの一部として存在する。GAGは細胞表面、細胞内部および細胞外マトリクスに見られる。ＧＡＧヒアルロン酸（ＨＡ）は、特に柔らかい結合組織で多数の細胞の細胞害マトリックスに見られ、滑液に豊富である（Pitsillides, A.A. 他 (1993) Int. J. Exp. Pathol. 74:27-34）。水および原形質タンパク質のホメオスタシスに関する機能を持つＨＡは細胞の制御、発生、および分化で重要な役割を果たしていると思われる。
【０００８】
糖脂質は、リン脂質およびコレステロールとともに細胞の膜を形成する。糖脂質の例としては、赤血球上の血液型抗原およびニューロンの髄鞘中のガングリオシドが挙げられる。原形質膜の細胞外側の糖タンパク質と糖脂質の修飾は細胞間認識にとって重要である(Stryer, 前出, pp. 298-299, 331-347; Lodish, 他, 前出,  612-615ページ)。
【０００９】
レクチンは、細胞表面の糖質に特異的かつ可逆的に結合し、その結果、細胞の凝集をもたらす細胞外糖タンパク質である( Drickamer, K. および Taylor, M. E. (1993) Annu. Rev. Cell Biol. 9:237-264)。この機能は、免疫反応の活性化に特に重要である。レクチンは炎症部位でリンパ球の凝集と細胞分裂促進の刺激を仲介する（Lasky, L.A. (1991) J. Cell. Biochem. 45:139-146; Paietta, E. 他 (1989) J. Immunol. 143:2850-2857）。
【００１０】
レクチンは、糖結合特異性に基づいてサブファミリーに分類される。ガレクチンサブファミリーは、特に、チオール依存性の方法でβガラクトシド糖質部分に結合するレクチンを含む（Hadari, Y.R. 他 (1995) J. Biol. Chem. 270:3447-3453）。ガレクチンは広範囲に発現され、発生的に制御されている。すべてのガレクチンはＮ末端のシグナルペプチドを欠いているため、ガレクチンは通常でない分泌機構によって細胞外に出されていると示唆されている。2つのクラスのガレクチンが、分子量とオリゴマー形成の特徴に基づいて定義されている。ガレクチンは、ガラプチン（galaptin）ドメインとしても知られる、特徴的な糖認識ドメイン（CRD）を含む。このドメインは長さが約140アミノ酸残基で、いくつかの保存された残基を含んでいる( Prosite PDOC00279 Vertebrate galactoside-binding lectin signatureを参照)。
【００１１】
もう一つの例はインテレクチンで、これはガラクトフラノシル（galactofuranosyl）残基および細菌性アラビノガラクタンに結合するCa2+依存性のレクチンである。インテレクチンは細菌の糖質認識および微生物への免疫反応の誘発において役割を持っている可能性がある。
【００１２】
糖質修飾酵素
グルタミン：フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼ（GFAT）はアミノトランスフェラーゼとしても知られる酵素であり、L-グルタミンとD-フルクトース-6-リン酸がL-グルタミン酸とD-グルコサミン-6-リン酸を形成する可逆反応を触媒する。この反応はヘキソサミンの生合成経路の律速過程である(ExPASy ENZYME: EC 2.6.1.16)。D-グルコサミン-6-リン酸は糖タンパク質とプロテオグリカンに組み込まれるUDP-N-アセチルグルコサミン(UDP-GlcNAc) およびその他のヘキソサミンの生合成において役割を持っている。GFATはN-およびO-結合型のグリコシル化の前駆体の利用可能性を調節する。グルコサミンはトランスフォーミング成長因子(TGF)-β1産生を促進する(Kolm-Litty, V. 他 (1998) J. Clin. Invest. 101:160-169)。GFAT活性はタイプIIの糖尿病のインスリン耐性において役割を持っており、GFATの過剰発現はインスリン耐性につながる。ヘキソサミン代謝は、グリコーゲン合成の律速酵素であるグリコーゲンシンターゼをはじめ、PP1G(グリコーゲン結合タンパク質ホスファターゼ)、ピルビン酸キナーゼおよびグルコース輸送体GLUT1を調節しているように見える(McClain, D.A. および Crook, E.D. (1996) Diabetes 45:1003-1009)。
【００１３】
グルコサミン-6-リン酸デアミナーゼ（GNPDA）はイソメラーゼとしても知られているが、D-グルコサミン-6-リン酸と水がD-フルクトース-6-リン酸とアンモニアを形成する可逆反応を触媒する(ExPASy ENZYME EC 5.3.1.10)。この反応によりヘキソサミン系と解糖経路が連結され、糖タンパク質、糖脂質およびシアル酸含有高分子においてヘキソサミンの異化によるエネルギー源を供給している可能性がある。GNPDAはエネルギー要求量の大きな組織で発現している(Wolosker, H. 他 (1998) FASEB J. 12:91-99)。
【００１４】
UDP-グルコースデヒドロゲナーゼ (UDPGD)という酵素は UDP-グルコース、 2 NAD+および水が UDP-グルクロン酸と2 NADH を形成する可逆反応を触媒する(ExPASy ENZYME EC 1.1.1.22)。UDP-グルクロン酸はGAGの生合成に必要である。GAGはシグナル伝達経路において或る役割を果たしているように見える(Binari, R.C. 他 (1997) Development 124:2623-2632)。
【００１５】
Man9-マンノシダーゼはN結合型オリゴ糖の早期プロセッシングに関与するα1,2-マンノシダーゼ (グリコシルヒドロラーゼ) である。この酵素はMan9-(GlcNAc)2 および Man5-(GlcNAc)2.におけるα1,2-マンノシド結合の特異的切断を触媒する。哺乳動物の細胞で複数のα1,2-マンノシダーゼが同定されており、N-糖タンパク質の特定のクラスのプロセッシングに必要である可能性がある。Man9-マンノシダーゼは短い細胞質内尾部、単一の膜貫通ドメインおよび大きな管腔触媒ドメインを持つタイプIIの膜タンパク質である。ヒトの腎臓酵素はゴルジに局在している(Bause, E. 他 (1993) Eur. J. Biochem. 217:535-540; Bieberich, E. および Bause, E. (1995) Eur. J. Biochem. 233:644-649)。
【００１６】
DPM1は小胞体の中にある酵素であり、GDP-マンノースとドリコールリン酸からドリコールリン酸マンノース（DPM）を産生する反応を触媒する。DPM1の活性はDPM2によって調節されるが、DPM2はDPM1を小胞体（ER）に誘導し、ドリコールリン酸への親和性を強める。DMP2は（ER）膜内に存在し、２つの推定上の膜貫通ドメインと１つの推定上のER局在化シグナル（C末端の近く）を含んでいる。
【００１７】
グリコシル化
グリコシル化は、任意の数の糖質鎖（オリゴ糖）がタンパク質の特定の部位（グリコシル化部位）に共有結合することを指す。グリコシル化はグリコシル化タンパク質(糖タンパク質)のコンフォメーション、安定性、輸送、分泌、抗原性、クリアランスおよび活性に必須な翻訳後修飾である。結合するオリゴ糖の組成はタンパク質に特異的であり、単純な場合（主にマンノース残基）もあり、複雑な場合（N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)残基、シアル酸残基およびガラクトース残基が加わる）もある。糖タンパク質は少数の糖質基をもつ場合もあり、分子量的にタンパク質よりも糖質がより大きな割合を有することもある。後者のグリコシル化の程度が重度の糖タンパク質は分子の組成が主に糖質であることを強調するためにプロテオグリカンとも呼ばれる。任意の2つの構成糖質残基の間に形成される糖類結合のタイプ(たとえば α, β, 1,2-, 1,4-) も糖タンパク質の構造と機能の決定に重要な分子的特徴である。
【００１８】
グリコシル化により、タンパク質の親水性が増加する。キャリアタンパク質、抗体およびリソソームタンパク質など、多くの糖タンパク質は溶液(たとえば血漿)中に遊離した状態で見出される。その他の糖タンパク質は膜に結合している。膜結合糖タンパク質の場合は、糖質側鎖が膜脂質二重層内における糖タンパク質の配向を決めるのに役立つ。分子のグリコシル化領域は膜の内側または外側の水性環境と相互作用し、糖タンパク質のより疎水性のドメイン（通常はグリコシル化されていない非極性アミノ酸残基からなる）は膜内のリン脂質と相互作用する。
【００１９】
オリゴ糖側鎖の追加はアスパラギン（Asn）残基の-NH２基（N-グリコシル化）またはセリン（Ser）残基の-OH基（O-グリコシル化）で起こる。N-グリコシル化のプロセスは真核細胞の小胞体（ER）で始まり、ゴルジ体で完了する。O-グリコシル化はゴルジだけで起こる。特性が調べられている全ての糖タンパク質のうち、９０％はN-グリコシル化されていて、その中にはさらにO-グリコシル化されているものもいないものもある。O-グリコシル化だけされているのは僅か１０％である(Apweiler, R. 他 (1999) Biochim. Biophys. Acta 1473:4-8)。約75000のSWISS-PROTタンパク質配列のうちで、殆ど３分の２は推定上のN-グリコシル化部位を含み、自然に置けるこのタンパク質修飾の重要性を示唆している(Apweiler 他,  前出)。N-グリコシル化に関与する生化学的ステップはよく調べられており、以下はその概説である。
【００２０】
N-グリコシル化
糖質のタンパク質へのN結合はAsn-X-Ser または Asn-X-Thr (Ser = セリン, Thr = トレオニン, および X = プロリン以外の任意のアミノ酸)という一次アミノ酸配列状況においてアスパラギン（Asn）残基側鎖の窒素原子を通じて起こる。N結合型オリゴ糖の組成はきわめて多様であるが、グリコシル化を担う経路の最初のステップは共通である。２つのN-アセチルグルコサミン（GlcNAｃ）、９つのマンノース、３つのグルコース残基からなる１４残基のコアオリゴ糖が１つのユニットとしてドリコールリン酸供与分子から標的タンパク質の受容Asn残基の-NH2基に転移される。通常、コアオリゴ糖の３つのグルコース残基はグルコシダーゼIおよびIIによって除去されて、「高マンノースオリゴ糖（high mannose oligosaccharides）」側鎖となる。これらの部分的にプロセッシングされたN結合型糖タンパク質は順次ERからゴルジのcis, medial, および trans層板を通じて輸送される(Bonay, P. 他 (1996) J. Biol. Chem. 271:37193726)。ゴルジマンノシダーゼI(cis-層板), N-アセチル-グルコサミントランスフェラーゼ (GluNAcT; medial-層板)および ゴルジマンノシダーゼ II (trans-層板)を使ってさらにコアマンノース残基を除去するためにオリゴ糖の修飾がさらに行われることもある。ゴルジマンノシダーゼIによってマンノース残基の一部を除去した後、コアオリゴ糖の残りのマンノース残基をゴルジマンノシダーゼIIで除去するためにはGluNAcTによって単一のGlcNAcを付加する必要がある。
【００２１】
マンノース-１-リン酸グアニルトランスフェラーゼはタンパク質グリコシル化の早期ステップに関与している。この酵素は糖代謝に関与していて、酵素反応産物は糖タンパク質の合成に向けられる。マンノース-１-リン酸グアニルトランスフェラーゼ１（MPG1）はNDP-ヘキソースピロホスホリラーゼとも呼ばれており、マンノース代謝においてGTPとαD-マンノース１-リン酸の二リン酸とCDP-エタノールアミンへの変換を触媒する。この酵素はCDP-グルコースピロホスホリラーゼと非常に良く似ていて、細胞周期の進行の調節に関与してる可能性もある。GTP:αD-マンノース-１-リン酸グアニルトランスフェラーゼ１（MPG1）のｃDNAコードが最近、糸状菌（Trichoderma reesei） 株のｃDNAから単離された(Kruszewska, J.S. 他 (1998) Curr. Genet. 33:44550)。この1.6 kb cDNA のヌクレオチド配列は、３６４アミノ酸のタンパク質をコードするORFを示した。配列比較により、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae） グアニルトランスフェラーゼ遺伝子１（MPG1）と７０％の同一性、そして分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe） の相同体とは７５％の同一性を示した。
【００２２】
部分的にプロセッシングされた糖タンパク質の残りのコア糖部分にN-アセチル-グルコサミン、N-アセチルノイラミン酸（シアル酸）、ガラクトースおよびその他の糖部分を付加することにより、複雑なオリゴ糖側鎖ができてくる。これらの修飾はtrans-層板および trans-ゴルジネットワーク (TGN)で起こり、N-アセチル-グルコサミルトランスフェラーゼ I (GlcNAcTsI)、 シアリルトランスフェラーゼ (ST)および ガラクトシルトランスフェラーゼ (GalT)を含む数多くの酵素が関与している。これらの酵素の多くについて、オリゴ糖側鎖の構成糖残基間の特異的なα または β、 1,2-、 1,3-、 1,4-または1,6- 二糖結合をもたらす複数のアイソフォームが存在する。糖質側鎖内の結合の立体化学的性質とタイプが、出来てくる糖タンパク質の全体的な構造と機能に寄与している(Lehninger, A. L. 他 (1993) Principles of Biochemistry, Worth Publishers, New York NY, 931ページ; Lewin, B. (1997) GenesVI, Oxford University Press, New York NY,  1030-1033ページ)。
【００２３】
ガラクトシルトランスフェラーゼ類は、グリコシルトランスフェラーゼ（糖転移酵素）のサブセットであり、溶液に遊離している糖脂質または糖タンパク質の一部であるN末端アセチルグルコサミン（GlcNAc）オリゴ糖鎖にガラクトース（Gal）を転移する（Kolbinger, F.他 (1998) J. Biol. Chem. 273:433-440; Amado, M.他 (1999) Biochim. Biophys. Acta 1473:35-53）。ガラクトシルトランスフェラーゼは細胞表面および可溶性細胞外タンパク質として見出され、ゴルジ体にも存在する。β1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼは、Gal(β1-3)GlcNAc結合を有するI型糖鎖を形成する。β1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼは、短いサイトゾルドメイン、１つの膜貫通ドメイン、および８つの保存された領域を持つ１つの触媒ドメインを有すると考えられる（Kolbinger他、前出； Hennet, T.他 (1998) J. Biol. Chem. 273:58-65）。マウスUDP−ガラクトース：β−N−アセチルグルコサミンβ1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼ−Iでは、領域１がアミノ酸残基の７８−８３、領域２がアミノ酸残基の９３−１０２、領域３がアミノ酸残基１１６−１１９、領域４がアミノ酸残基１４７−１５８、領域５がアミノ酸残基の１７２−１８３、領域６がアミノ酸残基の２０３−２０６、領域７がアミノ酸残基の２３６−２４６、領域８がアミノ酸残基の２６４−２７５に位置する。マウスUDP−ガラクトース：β−N−アセチルグルコサミンβ1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼ−Iの領域８内に存在する１配列の１変異体が、細菌ガラクトシルトランスフェラーゼ類にも存在することから、この配列が、或るガラクトシルトランスフェラーゼ配列モチーフを規定することを示唆する（Hennet, T. 前出）。近年の研究は、brainiacタンパク質はβ1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼであることを示唆している（Yuan, Y.他(1997) Cell 88:9-11; Hennet 他、 前出）。
【００２４】
UDP−Gal：GlcNAc−1,4−ガラクトシルトランスフェラーゼ（−1,4−GalT）が、Gal(βl−4)GlcNAc結合を有するII型炭化水素鎖の形成を触媒する（Sato, T.他 (1997) EMBO J. 16: 1850-1857）。この酵素の可溶型は膜結合型の切断によって形成される。β1,4−ガラクトシルトランスフェラーゼ類に保存されているアミノ酸としては、ジスルフィド結合で連結された２つのシステインと、触媒ドメインにおける推定上のUDP−ガラクトース結合部位とを含む（Yadav, S.及びBrew, K. (1990) J. Biol. Chem. 265:14163-14169; Yadav, S. P.及びBrew, K. (1991) J. Biol. Chem. 266:698-703；  Shaper, N. L.他(1997) J. Biol. Chem. 272:31389-31399）。βl,4−ガラクトシルトランスフェラーゼは、糖タンパク質または糖脂質上に糖質鎖を合成するのに加えて、いくつかの特定の役割を有する。βl,4−ガラクトシルトランスフェラーゼはα−ラクトアルブミンと共にヘテロ二量体の一部として、乳腺ラクトースの生成に作用する。精子の表面上のβl,4−ガラクトシルトランスフェラーゼは、卵を特異的に認識する受容体として働く。細胞表面β1,4−ガラクトシルトランスフェラーゼ類はまた、細胞接着、細胞認識、細胞／基底膜相互作用、正常な細胞遊走、および転移性細胞遊走において作用する(Shur, B. (1993) Curr. Opin. Cell Biol. 5:854-863; Shaper, J. (1995) Adv. Exp. Med. Biol. 376:95104; Masri, K.A. 他 (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 157:657-663）。
【００２５】
合成酵素は細胞の適正な機能に重要な役割を果たす糖質修飾酵素のもう一つのクラスである。たとえば、シアリル化複合糖質の生成には、シチジン5'-モノリン酸 N-アセチルノイラミン酸 (CMP-Neu5Ac または CMP-シアル酸)の合成が必要であるが、この反応はCMP-Neu5Ac合成酵素によって触媒される(Munster, A.K. 他 (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:9140-9145)。細胞表面の糖タンパク質および糖脂質のシアル酸はさまざまな組織の適正な構造と機能に寄与している。シリアリルトランスフェラーゼ（ST）はグリコシルトランスフェラーゼのサブセットであり、シアル酸を（CMP-シアル酸から）糖タンパク質および糖脂質の糖質基に転移する反応を触媒する。ゴルジの中にはさまざまなタイプIIのこれらの膜タンパク質が存在する。この遺伝子ファミリのクローンされたメンバーは、N末端の細胞質尾部領域、膜貫通領域および大（L）、小（S）および極小（VS）と名づけられた３つのシアリルモチーフを含む大きな管腔領域を共通してもっている。L-シアリルモチーフは供与基質の結合に寄与し、高度に保存された４８〜４９アミノ酸からなる一続きの中に８つの不変な残基を持っている。２３アミノ酸からなるS-シアリルモチーフは供与基質および受容基質の両方の結合に寄与する(Datta, A. 他 (1997) Indian J. Biochem. Biophys. 34:157-65)。代表的なシアリルトランスフェラーゼST3GalI (~350 残基)の場合、L、SおよびVS領域はそれぞれアミノ酸１３８〜１８２，２６４〜２８６および３０９〜３２１に対応する。このファミリのクローンされたメンバーとしてはその他にST6GalNAcI と ST8SiaIなどがある。ST6GalNAcIは他の既知のシアリルトランスフェラーゼよりも大きく、500 アミノ酸残基からなっている(Tsuji, S. 他 (1996) Glycobiology (letter) 6:vvii; Geremia, R. 他 (1997) Glycobiology (letter) 7:vvii; Datta, A. 他 (1995) J. Biol. Chem. 270:14971500; Datta, A. 他 (1998) J. Biol. Chem. 273:96089618; Tsuji, S. 他 (1998) J. Biochem. 120:113)。シアリルトランスフェラーゼは細胞抽出物中に豊富に存在するわけではないが、いくつかはクローンされ、発現されている。少なくとも、１つのインヒビターが合成されている(Horenstein, B. 他 (1996) J. Am. Chem. Soc. 118:1037110379)。
【００２６】
糖代謝に関与するその他のさまざまな酵素は直接的または間接的にグリコシル化（ERおよびゴルジで起こるイベントの上流にある）に関与する。これらの酵素の多くはもともと細菌と植物で同定されたもので、ヒトについてはそれほどよく調べられていないが、同様の機能を持ったヒトの相同体が存在する可能性がある。たとえば、ADP-グルコースピロホスホリラーゼは細菌と植物のα1,4グルカン（グリコーゲンまたは澱粉）の生合成の非常に重要なステップを触媒する。すなわちグルコース-１-リン酸とATPから活性化グルコシル供与体であるADP-グルコースを合成するステップである。ADP-グルコースピロホスホリラーゼはアロステリック調節された四量体の酵素である。植物のADP-グルコースピロホスホリラーゼサブユニットには数多くの保存された配列領域がある。さらに、シグネチャパターンであると考えられている領域が３つある。始めの２つの領域はN末端にあり、大腸菌（Escherichia coli） の酵素のアロステリック部位および基質結合部位の一部であると提案されている。第３のパターンは酵素の中央部分の保存された領域に対応している。
【００２７】
糖質代謝疾患
糖質代謝はいくつかの疾患において変化している。糖尿病は、血糖が異常に高い状態（高血糖）として特徴付けられる。I型糖尿病は膵臓インスリン分泌細胞の自己免疫による損失が原因で発生する。II型糖尿病はグルコースへのインスリン分泌反応の障害およびインスリン耐性が原因で発生し、肥満と関連している。低血糖、すなわち血糖が異常に低い状態は薬物使用、糖質代謝酵素の遺伝的欠損、癌、肝臓病、および腎臓病を含むいくつかの原因がある(Berkow, R. 他 (1992) The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, インターネット版、 8節、 91章、 Diabetes Mellitus, Hypoglycemia)。
【００２８】
タンパク質のグリコシル化に関与する酵素の突然変異はいくつかの疾患を起こす。たとえば、αマンノシダーゼの突然変異は先天的な赤血球異形成貧血のI型およびαBリソソームマンノシドーシスを引き起こす(Isselbacher, K.J. 他 (1994) Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, Inc. New York NY, 2092-2093ページ; および Online Mendelian Inheritance In Man, 224100)。
【００２９】
グルコシダーゼは、さまざまなグルコシドのグリコシド結合の加水分解を通じて糖質からグルコースを放出する反応を触媒する糖質修飾酵素のもう一つのクラスを代表している。遺伝性疾患のI型ゴーシェ病は血液性異常として特徴付けられているが、白血球のβ-グルコシダーゼレベルのアッセイを通じてヘテロ接合性またはホモ接合性の個人からの検出が可能である(Raghavan, S.S. 他 (1980) Am. J. Hum. Genet. 32:158-173)。ゴーシェ病の３つの型全ての患者が、グルコセレブロシドの生分解の最初のステップを触媒するグルコセレブロシダーゼと呼ばれる酵素の欠乏を示す。脳においては、グルコセレブロシドは脳の発生と神経の髄鞘の形成中の複合脂質の代謝回転から生じる。他の組織においては、グルコセレブロシドは主に古い赤血球および白血球の生分解から生じる。
【００３０】
ガレクチンは、細胞-細胞および細胞-マトリクスの間の相互作用に関連する疾患や健康状態で多くの役割を果たす。例えば、ある種のガレクチンは炎症部位に関連し、細胞表面の免疫グロブリンE分子に結合する。更に、ガレクチンが癌転移で重要な役割を果たしている可能性がある。ガレクチンの過剰発現は、ヒトとマウスでの転移潜在性と相関がある。さらに、抗ガレクチン抗体は、細胞凝集や足場非依存性成長などの、細胞形質転換に関連する過程を阻害する。
【００３１】
前立腺癌腫瘍抗体１（PCTA−１）としても知られるガレクチン-8は、癌の進行に関与すると考えられる新規なガレクチンである（Su, Z.-Z. 他 (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7252-7257）。ガレクチン-8は浸襲性の前立腺癌と初期段階の前立腺癌で発現されるが、正常な前立腺細胞または良性の前立腺肥大細胞では発現されない。
【００３２】
糖質代謝の欠陥は癌とも関連付けられている。GAGとプロテオグリカンの発現の減少はヒトの肺癌と関連付けられている(Nackaerts, K. 他 (1997) Int. J. Cancer 74:335-345)。糖質決定基のシアリル-ルイスAとシアリル-ルイスXはしばしばヒトの癌細胞で発現される。これらの決定基、すなわち細胞接着分子E-セレクチンのリガンドは癌細胞の血管内皮への接着に関与し、癌の血行性転移に寄与している(Kannagi, R. (1997) Glycoconj. J. 14:577-584)。細胞表面糖タンパク質のN結合糖質コア構造の改変は、大腸および膵臓の癌に関連付けられている(Schwarz, R.E. 他 (1996) Cancer Lett. 107:285-291)。胃腸の癌において、細胞表面糖脂質および糖タンパク質のSda血液型糖質構造の発現の減少が観察されている(Dohi, T. 他 (1996) Int. J. Cancer 67:626-631)。
【００３３】
グリコサミノグリカンレベルの変化はいくつかの自己免疫疾患と関連付けられている。自己免疫性甲状腺疾患および自己免疫性糖尿病の患者にはさまざまなGAGの増加および減少の両方が起こる。GAGに対する抗体が全身性紅斑性狼瘡および自己免疫性甲状腺疾患の患者で見つかっている(Hansen, C. 他 (1996) Clin. Exp. Rheum. 14:S59-S67)。グリコサミノグリカンヒアルロナン（ＨＡ）は腫瘍細胞の接着と遊走を誘導し、ＨＡの小断片は脈管形成を起こす。血清中のＨＡは肝臓病や慢性関節リウマチのような種々の炎症状態の診断に用いられる。ＨＡの蓄積によって起こる間質性浮腫は、種々の器官で機能障害を起こす可能性がある(Laurent, T.C. および Fraser, J.R. (1992) FASEB J. 6:2397-2404)。ヒアルロニダーゼは、ＨＡのＮ-アセチルβ-Ｄ-グルコサミンとＤ-グルクロン酸残基の間の１、4結合の無作為の加水分解を触媒してＨＡをオリゴ糖に分解する酵素である。ヒアルロニダーゼは細胞接着、感染、脈管形成、およびシグナル伝達で機能している可能性がある。ヒアルロニダーゼは、生殖、癌、および炎症に関係する。前立腺腫瘍組織でのヒアルロニダーゼ活性は、正常な前立腺と良性の前立腺過形成での活性と比べて有意に高くなっている（Lokeshwar, V.B. 他 (1996) Cancer Res. 56:651-657）。
【００３４】
哺乳類の精巣で発現されるタンパク質でマウスとヒトの精子の原形質膜に存在するPH−20は、ヒアルロニダーゼ活性を持っている（Lin, Y. 他 (1994) J. Cell Biol. 125:1157-63）。PH-20によって、精子は哺乳類の卵子の外層を貫通できる。卵子の外層は、ＨＡが多く含まれた細胞外マトリクスに埋め込まれた約3000の卵丘細胞から構成されている。この層を貫通することが、受精過程で重要なステップである。PH-20はまたいくつかの腫瘍細胞でも発現されている。精巣以外からの哺乳動物ヒアルロニダーゼとしては、HYAL1ヒアルロニダーゼ（ヒトの血清で発現される）とリソソームのヒアルロニダーゼＨＹＡＬ２（多くの細胞で発現される）が含まれる（Lepperdinger, G. 他 (1998) J. Biol. Chem. 273:22466-22470）。ＨＹＡＬ２は、一酸化窒素合成酵素のようなシグナル伝達経路に関与する酵素の発現、および脈管形成を誘導する特異なＨＡ断片を産生する役割をもっている可能性がある。リソソームタイプのヒアルロニダーゼは、サイトカインで制御される過程で肺の線維芽細胞でＨＡを分解し得る（Sampson, P.M. 他 (1992) J. Clin. Invest. 90:1492-1503）。種々のヘビ、ハチ、スズメバチ、オニダルマオコゼ、カモノハシ、サソリ、およびトカゲなどの多くの動物の毒にはヒアルロニダーゼが含まれている。毒のヒアルロニダーゼは、毒の拡散を助ける因子として作用すると考えられる。
【００３５】
数多くのヒトの病気がタンパク質のグリコシル化の遺伝的または後天的欠損に関連付けられている。糖質欠損糖タンパク質症候群（CDGS）は数多くの障害および病気におけるグリコシル化の多数の改変を含んでいる。CDGSは遺伝的マルチシステム障害（hereditary multisystem disorder）(Matthijs, G. 他 (1997) Nat. Genet. 16:88-92)であり、重症の精神運動性遅滞または精神薄弱および血栓症、出血または卒中様発作にみられる凝血異常を引き起こす。CDGSの特徴的な生化学的異常は糖タンパク質の低グリコシル化（N結合）である(Freeze, H. および Aebi, M. (1999) Biochim. Biophys. Acta 1455:167-78)。CDGSのタイプに依存するが、糖タンパク質の糖質側鎖は切り詰められるか、タンパク質コアから完全に失われている。CDGSはいくつかの異なるタイプに分類されている。もっとも多く見られる形態であるCDGS １A型はホスホマンノムターゼ（PMM1）欠損が原因で起こる(Matthijs, G. (1998) Am. J. Hum. Genet. 62:54250)。PMM1はMPG1（上記）の上流で機能し、D-マンノース-6-リン酸からD-マンノース-1-リン酸への変換を触媒する。後者はタンパク質のグリコシル化の初期ステップに必要である。
【００３６】
CDGSの2つ目の形態はCDGS １B型と呼ばれ、これもまた記載されている(Niehues, R. 他 (1998) J. Clin. Invest. 101:1414-1420)。CDGS １B型は精神運動障害と精神薄弱にはならないが、そのかわりにタンパク漏出症、重度の低血糖症、嘔吐、下痢、および先天的な肝線維症を特徴とする胃腸疾患になる。にもかかわらず、CDGS １B型の患者の一部は血栓症および命に関わる出血にかかることがある。ホスホマンノースイソメラーゼ（PMI）の欠損はこの症候群の原因である可能性が最も高いと考えられている。殆どの症状は食事のマンノースサプリメントで抑えることができる(Niehues 他, 前出、 Freeze および Aebi,前出)。この形態のCDGSは利用可能なマンノースの減少を示すヒトの遺伝性代謝異常として最初のものである。
【００３７】
グルコシルトランスフェラーゼ機能の欠陥もいくつかのヒトの病気において重要な役目を果たす。ガラクトシルトランスフェラーゼは自己免疫/炎症疾患に関与しているかもしれない。というのは、自己免疫甲状腺疾患を持つ多くの人々がα1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼの酵素産物に対する抗体を血液内に高レベルで持っているからである(Etienne-Decerf, J. 他 (1987) Acta Endocrinol. 115:67-74)。ヒトの卵巣癌細胞株からは異常な切断を受けた可溶性のβ1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼが分泌される(Uejima, T. 他 (1992) Cancer Res. 52:6158-6163)。β1,4-GalT-欠損形質転換マウスはある実験において成長遅滞を示した(Asano, M. 他 (1997) EMBO J. 16:18501857)。その一方で別の研究においてマウスの α1,4-GalT の標的不活性化は通常致死的であった (Furukawa, K. 他 (1999) Biochim. Biophys. Acta. 1473:5466)。3つ目の研究においては、形質転換マウスにおけるα1,3ガラクトシルトランスフェラーゼの構成的過剰発現は尿中のタンパク質分泌の増加、体重減少、毛髪成長への部分的な損傷、および早死につながった(Ikematsu, S. 他 (1999) Glycoconj. J. 1999 16:7376)。ガラクトシルトランスフェラーゼは、細胞成長、発生、および分化の調節にも関係があると言われていて、胚形成および腫瘍の発生に重要な役割を果たしている可能性がある。膜結合型のタンパク質分解性切断により、いくつかの場合で得られた分泌性ガラクトシルトランスフェラーゼは、結合糖質に結合することで細胞表面受容体をトリガする可能性があり、また調節されたやり方で細胞表面分子上の糖質を修飾する可能性がある。細胞外糖質部分は発生的に調節されていて、細胞遊走の調節に関与している可能性が高い(Shur, B. 他 (1984) Mol. Cell. Biochem. 61:143158; Paulson, J. および Colley, K. (1989) J. Biol. Chem. 264:17615-17618)。β1,6GlcNAcを持つN結合型糖タンパク質の発現は、ヒトの乳癌および大腸癌の腫瘍進行のマーカーとして使用されてきており、ヒトの神経膠腫試料からの星状細胞は正常個人の星状細胞と比較してこれらのタイプの糖タンパク質のレベルが増えていることが見出されている(Yamamoto, H. 他 (2000) Cancer Res. 2000 60:134142)。これらの知見は、グルコシルトランスフェラーゼのもう一つのアイソフォームであるβ1,6GlcNAcTも腫瘍の形成または侵襲性において役割を果たしている可能性を示唆している。
【００３８】
シアリルトランスフェラーゼもヒトの病気に関係があるとされている。ヒトの絨毛癌組織で2,6-シアリルトランスフェラーゼのレベルが上がっていることが見出された (しかし2,3-シアリルトランスフェラーゼではレベルが上がっていなかった) 。これは転写レベルでの上方制御の結果であると考えられている(Fukushima, K. (1998) Cancer Res. 58:43014306)。2,6-シアリルトランスフェラーゼを過渡的にヒトの発癌性神経膠腫細胞株に形質移入すると細胞の侵襲性が低減する(Yamamoto, H. (1997) J. Neurochem. 68:25662576)。1ヶ月以上にわたってカロリーの少なくとも3分の1をアルコールから得ていたラットの肝臓において、慢性のアルコール(エタノール)消費により、Gal-β1,4-GlcNAc-α2,6シアリルトランスフェラーゼ (α2,6-ST) の活性が減少する。肝臓のα2,6-ST 活性は1週間の間アルコールを絶つことにより正常に戻った。核Run OnアッセイとｍRNA安定性アッセイによると、α2,6-STの減少はα2,6-ST mRNA の半減期が５０％減少した結果であった(Rao, M. (1999) Metabolism 48:797803)。臨床的鬱病の患者グループでは血漿α2,6-シアリルトランスフェラーゼ活性の有意な減少も見られた。この種の鬱病はグルコルチコイド受容体（GR）機能の変化に起因すると考えられている。これらの知見は、α2,6-ST 酵素または活性レベルが臨床的鬱病に寄与しているか、あるいは少なくともコルチゾル受容体機能障害の有用な生化学的マーカーであることを示唆している(Maguire, T. 他 (1997) Biological Psychiatry 41:11311136)。
【００３９】
グリコシル化の欠陥およびその欠陥を引き起こす酵素欠損にかかわるその他のヒトの病気としては、(i) アスパルチルグルコサミン尿症（精神薄弱を引き起こすアスパルチルグルコサミニダーゼ欠損）、(ii) GM1 および GM2 ガングリオシド蓄積症、（それぞれ、β-ガラクトシダーゼおよびβNアセチルヘキソサミニダーゼの欠損）（糖脂質貯蔵疾患の原因）、(iii) αマンノシドーシスおよびβ-マンノシドーシス（それぞれα-マンノシダーゼおよびβ-マンノシダーゼの欠損に起因する）（神経機能障害の原因）、および(iv) ノイラミン酸欠損に起因するシアリドーシス（肝脾腫大症および神経発生障害が特徴）、などがある。
【００４０】
発現プロファイル
アレイ技術は、単一の多型遺伝子の発現や、多数の関連遺伝子または無関係の遺伝子の発現プロファイルを探求する簡単な方法を提供し得る。単一遺伝子の発現を試験するときは、アレイを用いて或る特定遺伝子又はその変異体の発現を検出する。発現プロフィールを試験するときは、アレイは次のような試験を行うプラットフォームを提供する。即ちどの遺伝子が組織特異的か、ハウスキーピング機能を行うか、シグナル伝達カスケードの一部であるか、又は、特定の遺伝的素因や、条件、疾患、または障害に、特異的に関連する遺伝子であるかの試験である。
【００４１】
遺伝子発現プロファイル作製の潜在的応用は特に、疾患の、診断、予後診断、および治療の向上に関わる。例えば、大腸癌患者に由来する組織に発現されるレベルと配列との双方を、正常組織に発現されるレベルおよび配列と比較しうる。
【００４２】
結腸癌は遺伝子と環境の両者と因果関係がある。幾つかの分子経路が結腸癌の発生と関係があり、これらの経路いずれかの鍵遺伝子の発現は先天性または後天性突然変異或いは高メチル化により失われる可能性がある。発現における変化が結腸癌または結腸癌発症の素因の早期の指標となりうる遺伝子の同定が特に必要とされている。
【００４３】
たとえば、異常なパターンのDNAメチル化がヒトの腫瘍に一貫して発生し、広範なゲノムの低メチル化部分と、局在的にメチル化の増加した部分が同時に含まれることは周知である。特に結腸癌では、結腸癌に先行する前癌性ポリープなど、腫瘍進行においてこれらの変化が早期に発生することが知られる。実際、DNAメチル化を行う酵素であるDNAメチルトランスフェラーゼは、結腸癌または癌に先行する良性ポリープの患者の組織学的に正常な粘膜で著しく増加する。そしてこの増加は結腸腫瘍の進行中に継続する(Wafik 他 (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3470-3474)。DNAメチル化の増加は、「CpG島」と呼ばれるゲノムDNAのG+Cリッチ領域に生じ、この「CpG島」は遺伝子の周囲の「開いた」転写構造を維持するために重要であり、これらの領域が過度にメチル化すると、遺伝子転写を止める「閉じた」構造になる。このようなCpG島の異常メチル化による分化遺伝子の静止または下方制御によって不死化細胞の分化を防ぎ得ることが示唆されている(Antequera, F. 他 (1990) Cell 62:503-514)。
【００４４】
家族性大腸腺腫症(FAP)は大腸癌に先行するまれな常染色体優性症候群であり、大腸腺腫性ポリポーシス(APC)遺伝子の先天性突然変異によって起こる。FAPは平均年令４４才で癌に進行する多発性結腸直腸腺腫の早期発症を特徴とする。APC遺伝子は、APC-β-カテニン-Tcf (T-細胞因子)経路の一部である。この経路の障害により、結腸上皮細胞の規則的な複製化、接着、遊走が失われ、ポリープの成長につながる。APC-β-カテニン-Tcf 経路が活性化された後、一連の他の遺伝的変化が続き、正常結腸粘膜から転移性癌への移行を伴う。これらの変化にはK-Ras癌原遺伝子の突然変異、メチル化パターンの変化、および癌抑制遺伝子p53 と Smad4/ DPC4の突然変異または喪失が含まれる。突然変異したAPC遺伝子の遺伝は稀な現象であるが、APCの喪失または突然変異や、APC-β-カテニン-Tcf経路への結果的効果は、一般的集団の大部分の大腸癌患者にとって中心的となると考えられる。
【００４５】
遺伝性非ポリポーシス結腸直腸癌 (HNPCC) はFAPほどよく定義されていない表現型の、別の先天性常染色体優性症候群である。結腸直腸癌症例の約２％を占めるHNPCCは癌の早期発症の傾向および、他の癌、特に子宮内膜、尿路、胃および胆道系に関連する癌の発症によって区別される。HNPCCは、DNAミスマッチ修復(MMR)経路の1つか複数の遺伝子の突然変異から発生する。２つのヒトMMR遺伝子MSH2およびMLH1の突然変異は、これまでに同定されたHNPCCファミリーの大部分に見出される。DNA  MMR経路は複製中のDNAポリメラーゼの作用から生じるエラーを同定し、修復する。さらに、MMR活性が喪失されると、アポトーシスを調節するBAX 遺伝子および細胞増殖を制御するTGFβ受容体II遺伝子の喪失などのような他の遺伝子の突然変異および欠失の蓄積による、癌の進行を生じる。DNA  MMR欠損患者では、DNAへの修復できない損傷の可能性があるため、癌への進行は通常より急速である。
【００４６】
潰瘍性腸炎は大腸癌に対する原因としては小さいが、罹病した患者は癌を発症する危険性が約20倍になる。進行は、組織学的に正常な組織においても現れ得る、p53 遺伝子の早期の喪失を特徴とする。潰瘍性大腸炎から中間のポリープ状態を経ないで異形成/癌へ疾患が進行することは、大腸粘膜における増殖細胞の大腸内容物への曝露から生じた変異原活性が高度であることを示唆する。
【００４７】
ほとんどすべての大腸癌は、エストロゲン受容体(ER)遺伝子が沈黙した細胞から発生する。ER遺伝子転写の不活性化は年齢に関係しており、ER遺伝子の過剰メチル化に関連する(Issa, J.P. 他 (1994) Nat. Genet. 7:536-540)。培養した結腸癌細胞に外因性ER遺伝子を導入することにより、著しく成長が抑制される。結腸上皮細胞におけるERタンパク質の喪失とその結果の癌発症との間のつながりは確立されていない。
【００４８】
大腸癌に関連、また、本疾患の発生と進行に、特に遺伝子の下方制御または欠失に関連する、多数の遺伝子変容が存在することは明らかであり、これら変容は癌発生の早期指標を提供する可能性があり、疾患進行のモニタ-にまたは有望な治療標的の提供にも使用される可能性がある。大腸癌の或る症例に影響した特定の遺伝子群は、この疾患の分子的進行に依存する。大腸癌および前癌状態に関連する更なる遺伝子を同定することにより、本疾患の発症および進行に関連する、より信頼できる診断的パターンが得られるであろう。
【００４９】
新規の糖結合タンパク質、およびそれらをコードするポリヌクレオチドの発見により、新規の組成物を提供することで当分野の要望に応えることができる。 この新規の組成物は、糖質代謝、細胞増殖異常、自己免疫／炎症性の疾患、生殖系疾患、遺伝疾患、輸送疾患、神経系疾患および癌のの診断・治療・予防において有用であり、また、糖結合タンパク質の核酸配列及びアミノ酸配列の発現における外来性化合物の影響についての評価にも有用である。
【発明の開示】
【発明の効果】
【００５０】
本発明は、総称して「CHOP」、個別には「CHOP-1」、「CHOP-2」、「CHOP-3」、「CHOP-4」、「CHOP-5」、「CHOP-6」、「CHOP-7」、「CHOP-8」、「CHOP-9」および「CHOP-10」と呼ばれるような、実質的に精製されたポリペプチドである糖質結合タンパク質を提供する。或る実施態様において本発明は、（ａ）SEQ ID NO:1-10からなる群から選択したアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-10からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％が同一である天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-10からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）SEQ ID NO:1-10からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片を含む群から選択した単離されたポリペプチドを提供する。一実施態様では、SEQ ID NO:1-10のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。
【００５１】
また、本発明は（ａ）SEQ ID NO:1-10からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-10からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を持つ或る天然アミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-10からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）SEQ ID NO:1-10からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリヌクレオチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施態様では、該ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:1-10からなる群から選択した或るポリペプチドをコードする。別の実施態様では、ポリヌクレオチドはSEQ ID NO:11-20からなる群から選択される。
【００５２】
本発明は更に、(a)SEQ ID NO:1-10からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、(b)SEQ ID NO:1-10からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90％が同一である天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、(c)SEQ ID NO:1-10からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）SEQ ID NO:1-10からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片から構成される群から選択されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に連結したプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチドを提供する。一実施態様では、本発明は組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞を提供する。別の実施態様では、本発明は組換えポリヌクレオチドを含む遺伝形質転換生物体を提供する。
【００５３】
また、本発明は、（ａ）SEQ ID NO:1-10からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-10からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90%が同一である天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-10からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-10からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片から構成される群から選択したポリペプチドを製造する方法を提供する。 製造方法は、（ａ）組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞をポリペプチドの発現に適した条件下で培養する過程と、（ｂ）そのように発現したポリペプチドを回収する過程とを有し、組換えポリヌクレオチドはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーター配列を有する。
【００５４】
本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:1-10からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-10からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-10からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-10からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片から構成される群から選択されたポリペプチドに特異結合するような単離された抗体を提供する。
【００５５】
本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:11-20からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、（ｂ）SEQ ID NO:11-20からなる群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）に相補的なポリヌクレオチド配列、（ｄ）（ｂ）に相補的なポリヌクレオチド配列、および（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のRNA等価物からなる群から選択された単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施態様では、ポリヌクレオチドは少なくとも６０の連続したヌクレオチドを有する。
【００５６】
本発明は更に、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法を提供する。ここで、標的ポリヌクレオチドは（ａ）SEQ ID NO:11-20からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、（ｂ）SEQ ID NO:11-20からなる群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）に相補的なポリヌクレオチド、（ｄ）（ｂ）に相補的なポリヌクレオチド、および（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のRNA等価物からなる群から選択されたポリヌクレオチドの配列を有する。検出方法は、（ａ）サンプル中の前記の標的ポリヌクレオチドに相補的な配列を含む、少なくとも２０の連続したヌクレオチドを含むプローブを用いて該サンプルをハイブリダイズする過程と、（ｂ）ハイブリダイゼーション複合体の存在・不存在を検出し、複合体が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程からなり、プローブと標的ポリヌクレオチドあるいはその断片の間でハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で、プローブは標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする。一実施態様では、プローブは少なくとも60の連続したヌクレオチドを含む。
【００５７】
本発明はまた、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法を提供する。ここで、標的ポリヌクレオチドは、（ａ）SEQ ID NO:11-20からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｂ）SEQ ID NO:11-20からなる群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（ｄ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、および（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のRNA等価物からなる群から選択された配列のポリヌクレオチドを有する。検出方法は、（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、（ｂ）前記の増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の存在・不存在を検出し、該標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程を含む。
【００５８】
本発明は更に、或る有効量のポリペプチドと薬物として許容し得る或る賦形剤とからなる、或る組成物を提供する。有効量のポリペプチドは、（ａ）SEQ ID NO:1-10からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-10からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-10からなる群から選択した或るアミノ酸配列を含むポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-10からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択される。一実施態様では、この組成物はSEQ ID NO:1-10からなる一群から選択されたアミノ酸配列を持つ。更に、本発明は、機能的CHOPの発現の低下に関連した疾患や症状の治療を必要とする患者への、この組成物の投与を含む方法を提供する。
【００５９】
本発明はまた、（ａ）SEQ ID NO:1-10からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-10からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-10からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-10からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択したポリペプチドのアゴニストとしての有効性を確認するために、或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）該ポリペプチドを有するサンプルを或る化合物に曝す過程と、（ｂ）サンプル中のアゴニスト活性を検出する過程からなる。別法では、本発明は、この方法によって同定されたアゴニスト化合物と好適な医薬用賦形剤とを含む組成物を提供する。更なる別法では、本発明は、この組成物の患者への投与を含む、機能的CHOPの発現の低下に関連した疾患やその症状の治療方法を提供する。
【００６０】
本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:1-10からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-10からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-10からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-10からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択したポリペプチドのアンタゴニストとしての有効性につき、或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）該ポリペプチドを含むサンプルを或る化合物に曝す過程と、（ｂ）サンプル中のアンタゴニスト活性を検出する過程からなる。或いは本発明は、この方法で同定したアンタゴニスト化合物と薬物として許容し得る賦形剤とを有する組成物を提供する。更なる別法では、本発明は、機能的CHOPの過剰な発現に関連した疾患やその症状の治療方法を提供し、その内にはそのような治療を必要とする患者にこの組成物を投与することが含まれる。
【００６１】
本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:1-10からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-10からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-10からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）SEQ ID NO:1-10からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片を含む群から選択されたポリペプチドに特異結合する化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプチドを適切な条件下で少なくとも１つの試験化合物と混合させる過程と、（ｂ）試験化合物とのポリペプチドの結合を検出し、それによってポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程とを含む。
【００６２】
本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:1-10からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-10からなる群から選択したアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-10からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-10からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドの活性を調節する或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）該ポリペプチドの活性にとり許容し得る条件下で、該ポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、（ｂ）該ポリペプチドの活性をこの試験化合物の存在下で算定する過程と、（ｃ）この試験化合物の存在下での該ポリペプチドの活性をこの試験化合物の不存在下での該ポリペプチドの活性と比較する過程からなり、この試験化合物の存在下での該ポリペプチドの活性の変化は、該ポリペプチドの活性を調節する化合物を標示する。
【００６３】
更に本発明は、SEQ ID NO:11-20からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つ標的ポリヌクレオチドの発現を改変する効果につき、或る化合物をスクリーニングする一方法を提供する。この方法は、（ａ）この標的ポリヌクレオチドを有するサンプルを或る化合物に曝露する過程と、（ｂ）この標的ポリヌクレオチドの発現の改変を検出する過程と、（ｃ）可変量のこの化合物の存在下でのこの標的ポリヌクレオチドの発現と、この化合物の不在下での発現とを比較する過程とからなる。
【００６４】
本発明は更に、試験化合物の毒性の算定方法を提供する。この方法には、以下の過程がある。（ａ）核酸群を有する生体サンプルを試験化合物で処理する過程。（ｂ）処理済み生体サンプルの核酸群をハイブリダイズする過程。この過程には、次のようなプローブを用いる。（i）SEQ ID NO:11-20からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ii）SEQ ID NO:11-20からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然ポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（iii）（i）に相補的な配列を持つポリヌクレオチド、（iv）（ii）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（v）（i）〜（iv）のRNA等価物、からなる群から選択した或るポリヌクレオチドの少なくとも２０の連続したヌクレオチドからなるプローブである。ハイブリダイゼーションは、前記プローブと生物学的サンプル中の標的ポリヌクレオチドの間に特定のハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で発生し、前記標的ポリヌクレオチドは、（i）SEQ ID NO:11-20からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ii）SEQ ID NO:11-20からなる群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％が同一である天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（iii）（i）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（iv）（ii）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、および（v）（I）〜（iv）のRNA等価物からなる群から選択する。或いは、標的ポリヌクレオチドは、上記（i）〜（v）からなる群から選択したポリヌクレオチド配列の断片と、（ｃ）ハイブリダイゼーション複合体の量を定量する過程と、（ｄ）処理した生物学的サンプルのハイブリダイゼーション複合体の量を、非処理の生物学的サンプルのハイブリダイゼーション複合体の量と比較する過程を含み、処理した生物学的サンプルのハイブリダイゼーション複合体の量との差は、試験化合物の毒性を意味する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６５】
（本発明の記載について）
本発明のタンパク質、ヌクレオチド配列及び方法について説明する前に、説明した特定の装置、材料及び方法に本発明が限定されるものではなく、改変し得ることを理解されたい。また、ここで使用する専門用語は特定の実施例を説明する目的で用いたものに過ぎず、特許請求の範囲にのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図したものではないことも併せて理解されたい。
【００６６】
請求の範囲及び明細書中で用いている単数形の「或る」及び「その（この）」の表記は、文脈から明らかにそうでないとされる場合を除いて複数のものを指す場合もあることに注意しなければならない。従って、例えば「或る宿主細胞」と記されている場合にはそのような宿主細胞が複数あることもあり、「或る抗体」と記されている場合には単数または複数の抗体、及び、当業者に公知の抗体の等価物等についても言及しているのである。
【００６７】
本明細書中で用いる全ての技術用語および科学用語は、特に定義されている場合を除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書で説明するものと類似あるいは同等の任意の装置、材料及び方法を用いて本発明の実施または試験を行うことができるが、ここでは好適な装置、材料、方法について説明する。本発明で言及する全ての刊行物は、刊行物中で報告されていて且つ本発明に関係して用い得る、細胞株、プロトコル、試薬およびベクターについて説明および開示する目的で引用しているものである。本明細書のいかなる開示内容も、本発明が先行技術の効力によってこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【００６８】
（定義）
用語「CHOP」は、天然、合成、半合成或いは組換え体など全ての種（特にウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ及びヒトを含む哺乳動物）から得られる実質的に精製されたCHOPのアミノ酸配列を指す。
【００６９】
用語「アゴニスト」は、CHOPの生物学的活性を強めたり、模倣する分子を指す。このアゴニストは、CHOPに直接相互作用するか、或いはCHOPが関与する生物学的経路の成分と作用して、CHOPの活性を調節するタンパク質、核酸、糖質、小分子、任意の他の化合物や組成物を含み得る。
【００７０】
「対立遺伝子変異体／変異配列」は、CHOPをコードする、別の形態の遺伝子である。対立遺伝子変異体は、核酸配列における少なくとも１つの突然変異から作製し得る。また、変異RNAまたはポリペプチドからも作製し得る。ポリペプチドの構造または機能は、変異することもしないこともある。或る遺伝子は、その天然型の対立遺伝子変異配列を全く持たない場合もあり、１個以上持つこともある。対立遺伝子変異体を生じさせる通常の突然変異性変化は一般に、ヌクレオチドの自然な欠失、付加または置換による。これら各種の変化は、単独であるいは他の変化と共に、或る配列内で１回以上、生じ得る。
【００７１】
CHOPをコードする「変容した／改変された」核酸配列としては、様々なヌクレオチドの欠失、挿入、或いは置換がありながら、CHOPと同じポリペプチド、或いはCHOPの機能特性の少なくとも１つを備えるポリペプチドをもたらす配列もある。この定義には、CHOPをコードするポリヌクレオチド配列の正常な染色体の遺伝子座ではない位置での対立遺伝子変異配列との不適当或いは予期しないハイブリダイゼーション、並びにCHOPをコードするポリヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可能な或いは検出困難な多形性を含む。コードされるタンパク質も「変容する／改変される」ことがあり、また、サイレント変化を生じた結果、機能的に等価なCHOPとなるような、アミノ酸残基の欠失、挿入または置換を持ち得る。意図的なアミノ酸置換は、生物学的或いは免疫学的にCHOPの活性が保持される範囲で、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／または両親媒性についての類似性に基づいて成され得る。例えば、負に帯電したアミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸があり、正に帯電したアミノ酸にはリジン及びアルギニンがある。親水性値が近似している非荷電極性側鎖を有するアミノ酸には、アスパラギンとグルタミン、セリンとトレオニンがある。親水性値が近似している非荷電側鎖を有するアミノ酸には、ロイシンとイソロイシンとバリン、グリシンとアラニン、フェニルアラニンとチロシンが含まれうる。
【００７２】
用語「アミノ酸」及び「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質配列、或いはそれらの任意の断片を指し、天然の分子及び合成分子を含む。「アミノ酸配列」が天然のタンパク質分子の配列を指す場合、「アミノ酸配列」及び類似の用語は、アミノ酸配列を記載したタンパク質分子に関連する完全で元のままのアミノ酸配列に限定するものではない。
【００７３】
用語「増幅」は、核酸配列の複製物を作製することに関連する。増幅は通常、当業者によく知られたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術を用いて行う。
【００７４】
「アンタゴニスト」の語は、CHOPの生物学的活性を阻害或いは弱める分子を指す。アンタゴニストは、CHOPに直接相互作用するか、或いはCHOPが関与する生物学的経路の成分と作用して、CHOPの活性を調節する抗体、核酸、糖質、小分子、任意の他の化合物や組成物などのタンパク質を含み得る。
【００７５】
「抗体」の語は、抗原決定基と結合することができる、そのままの免疫グロブリン分子やその断片、例えばFab,、F(ab')2 及びFv断片を指す。CHOPポリペプチドと結合する抗体は、免疫抗原として、そのままのポリペプチド、または関心のある小ペプチドを含む断片を用いて作製可能である。動物（マウス、ラット、ウサギ等）を免疫化するために用いるポリペプチドまたはオリゴペプチドは、ＲＮＡの翻訳、または化学合成によって得られるポリペプチドまたはオリゴペプチドに由来し得るもので、好みに応じてキャリアータンパク質に抱合することも可能である。通常用いられるキャリアーであってペプチドと化学結合するものは、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン及びスカシガイのヘモシアニン（KLH）等がある。その結合ペプチドは、動物を免疫化するために用いる。
【００７６】
用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する分子の領域（即ちエピトープ）を指す。タンパク質またはタンパク質断片を用いて宿主動物を免疫化する場合、タンパク質の多数の領域が、抗原決定基（タンパク質の特定の領域または３次元構造）に特異結合する抗体の産生を誘導し得る。抗原決定基は、抗体に結合するための無損傷抗原（即ち免疫応答を誘導するために用いられる免疫原）と競合し得る。
【００７７】
用語「アプタマー（aptamer）」は、核酸またはオリゴヌクレオチド分子であって、特定の分子ターゲットに結合する分子を指す。アプタマーはin vitroでの進化プロセスに由来する（例えば、SELEX（Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichmentの略、試験管内選択法）、米国特許第5,270,163号に記述）。これは、大規模な組み合わせライブラリ群から標的特異的アプタマー配列を選択するプロセスである。アプタマー組成は、２本鎖または１本鎖であってもよく、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体、または他のヌクレオチド様分子を含み得る。アプタマーの各ヌクレオチド成分は修飾された糖基を持つことがあり（例えば、リボヌクレオチドの2'-OH基は2'-Fまたは2'-NH2によって置換され得る）、これは、ヌクレアーゼへの抵抗性または血中でのより長い寿命など、所望の特性を向上し得る。循環系からアプタマーが除去される速度を遅くするために、アプタマーを高分子量キャリアー等の分子に抱合させることができる。アプタマーは、たとえば架橋剤の光活性化によって各々のリガンドと特異的に架橋させることができる（Brody, E.N. および Gold, L. (2000) J. Biotechnol. 74:5-13）。
【００７８】
「intramer」の用語はin vivoで発現されるアプタマーを意味するたとえば、ワクシニアウイルスに基づく或るＲＮＡ発現系は、白血球の細胞質内で特定のＲＮＡアプタマーが高レベルで発現するために使用されている（Blind, M. 他 (1999) Proc. Natl Acad. Sci. USA 96:3606-3610）。
【００７９】
「spiegelmer」の語はＬ-ＤＮＡ、Ｌ-ＲＮＡその他の左旋性ヌクレオチド誘導体またはヌクレオチド様分子を含むアプタマーを指す。左旋性ヌクレオチドを含むアプタマーは、右旋性のヌクレオチドを含む基質に通常作用する天然の酵素による分解に耐性がある。
【００８０】
本明細書において「アンチセンス」は、特定の核酸配列のセンス（コーディング）鎖と塩基対を形成し得る任意の組成物を指す。アンチセンス成分には、DNAや、RNAや、ペプチド核酸（PNA）や、ホスホロチオ酸、メチルホスホン酸またはベンジルホスホン酸等の修飾されたバックボーン結合を有するオリゴヌクレオチドや、2'-メトキシエチル糖または2'-メトキシエトキシ糖等の修飾された糖類を有するオリゴヌクレオチドや、或いは5-メチルシトシン、2-デオキシウラシルまたは7-デアザ-2'-デオキシグアノシン等の修飾された塩基を有するオリゴヌクレオチドがある。アンチセンス分子は、化学合成または転写を含む任意の方法で製造することができる。相補的アンチセンス分子は、ひとたび細胞に導入されたら、細胞が産生した天然核酸配列との塩基対を形成し、転写または翻訳を阻止する二重鎖を形成する。「負」または「マイナス」という表現は、ある参考ＤＮＡ分子のアンチセンス鎖を意味し、「正」または「プラス」という表現はある参考ＤＮＡ分子のセンス鎖を意味する。
【００８１】
用語「生物学的に活性」は、天然分子の構造的、調節的、或いは生化学的な機能を有するタンパク質を指す。同様に、「免疫学的に活性」または「免疫原性」は、天然、組換え体、または合成のCHOPまたはそれらの任意のオリゴペプチドが、適当な動物或いは細胞の特定の免疫応答を誘発して特定の抗体と結合する能力を指す。
【００８２】
「相補(的)」または「相補性」の語は、塩基対形成によってアニーリングする2つの一本鎖核酸の間の関係を指す。例えば、「5'-AGT-3'」は、その相補配列「3'-TCA-5'」との対を形成する。
【００８３】
「所定のポリヌクレオチド配列を含む組成物」または「所定のアミノ酸配列を含む組成物」は広い意味で、所定のポリヌクレオチド配列若しくはアミノ酸配列を含む任意の組成物を指す。この組成物には、乾燥製剤または水溶液が含まれ得る。CHOP 若しくはCHOP の断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。このプローブは、凍結乾燥状態で保存可能であり、糖質などの安定化剤と結合させることが可能である。ハイブリダイゼーションにおいては、塩（例えばNaCl）、界面活性剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム；SDS）及びその他の構成成分（例えばデンハート液、脱脂粉乳、サケの精子のDNA等）を含む水溶液中にプローブを分散させることができる。
【００８４】
「コンセンサス配列」は、不要な塩基を分離するためにDNA配列の解析を繰り返し行い、XL-PCRキット（PE Biosystems,Foster City CA）を用いて５'及び／または３'の方向に伸長され、再度シークエンシングされた核酸配列、またはGELVIEW 断片構築システム（GCG, Madison, WI）またはPhrap (University of Washington, Seattle WA)等の断片構築用のコンピュータプログラムを用いて１つ或いはそれ以上のオーバーラップするcDNAやEST、またはゲノムDNA断片から構築された核酸配列を指す。伸長及びアセンブリの両方を行ってコンセンサス配列を作製する配列もある。
【００８５】
用語「保存的なアミノ酸置換」は、元のタンパク質の特性を殆ど変えない置換を指す。即ち、置換によってそのタンパク質の構造や機能が大きくは変わらず、そのタンパク質の構造、特にその機能が保存される。下表は、タンパク質中で元のアミノ酸と置換できて、保存アミノ酸置換と認められるアミノ酸を示している。
2005501526.tif 000002
【００８６】
保存アミノ酸置換では通常、（ａ）置換領域におけるポリペプチドのバックボーン構造、例えばβシートやα螺旋構造、（ｂ）置換部位における分子の電荷または疎水性、及び／または（ｃ）側鎖の大部分を保持する。
【００８７】
用語「欠失」は、１個以上のアミノ酸残基が欠如するアミノ酸配列の変化、或いは１個以上のヌクレオチドが欠如する核酸配列の変化を指す。
【００８８】
用語「誘導体」は、化学修飾されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。例えば、アルキル基、アシル基、ヒドロキシル基またはアミノ基による水素の置換は、ポリヌクレオチド配列の化学修飾に含まれ得る。ポリヌクレオチド誘導体は、天然分子の生物学的または免疫学的機能を少なくとも１つは保持しているポリペプチドをコードする。ポリペプチド誘導体は、グリコシル化、ポリエチレングリコール化（pegylation）、或いは任意の同様なプロセスであって、誘導起源のポリペプチドの少なくとも１つの生物学的若しくは免疫学的機能を保持するプロセスによって、修飾されたポリペプチドである。
【００８９】
「検出可能な標識」は、測定可能な信号を発生し得る、ポリヌクレオチドやポリペプチドに共有結合或いは非共有結合するレポーター分子や酵素を指す。
【００９０】
「差次的発現」は少なくとも2つの異なったサンプルを比較することによって決められる、増加（上方調節）、あるいは減少（下方調節）、または欠損した、遺伝子またはタンパク質の発現を指す。このような比較は例えば、処理済サンプルと不処理サンプル、または病態のサンプルと正常サンプルの間で行われ得る。
【００９１】
「エキソンシャフリング」は、異なるコード領域（エキソン）の組換えを意味する。1つのエキソンがコードされたタンパク質の1つの構造的または機能的ドメインを代表し得るため、安定したサブストラクチャーを再分類することによって、新しいタンパク質が組立てられることが可能であり、新しいタンパク質機能の進化を促進できる。
【００９２】
「断片」は、CHOPの又はCHOPをコードするポリヌクレオチドの固有の部分であって、その親配列（parent sequence）と配列は同一であるが親配列より長さが短いものを指す。断片は、定義された配列の全長から１ヌクレオチド／アミノ酸残基を差し引いた長さよりも短い長さを有し得る。例えば或る断片は、５〜１０００の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有し得る。プローブ、プライマー、抗原、治療用分子として、或いはその他の目的のために用いられる断片は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、１００、１５０、２５０若しくは５００の連続したヌクレオチド或いはアミノ酸残基長さであり得る。断片は、分子の特定領域から選択的に選択し得る。例えば、ポリペプチド断片は、所定の配列に示すような最初の２５０または５００アミノ酸（またはポリペプチドの最初の２５％または５０％）から選択された或る長さの連続したアミノ酸を有し得る。これらの長さは明らかに例として挙げているものであり、本発明の実施例では、配列表、表及び図面を含む明細書に裏付けされた任意の長さであってよい。
【００９３】
SEQ ID NO:11-20 の断片は、例えば、この断片を得たゲノム内の他の配列とは異なる、SEQ ID NO:11-20 を明確に同定する固有のポリヌクレオチド配列の領域を含む。SEQ ID NO:11-20のある断片は、例えば、ハイブリダイゼーションや増幅技術、またはSEQ ID NO:11-20を関連ポリヌクレオチド配列から区別する類似の方法に有用である。SEQ ID NO:11-20の断片の正確な長さ及び断片に対応するSEQ ID NO:11-20の領域は、断片に対する意図した目的に基づき当業者が慣例的に決定することが可能である。
【００９４】
SEQ ID NO:1-10 のある断片は、SEQ ID NO:11-20のある断片によってコードされる。 SEQ ID NO:1-10 のある断片には、SEQ ID NO:1-10を特異的に同定する固有のアミノ酸配列領域が含まれている。 例えば、SEQ ID NO:1-10 のある断片は、SEQ ID NO:1-10を特異認識する抗体を産出するための免疫原性ペプチドとして有用である。 SEQ ID NO:1-10 のある断片の正確な長さ、及びその断片に対応するSEQ ID NO:1-10 の領域は、断片に対する意図した目的に基づき当業者が慣例的に決定することが可能である。
【００９５】
「完全長」ポリヌクレオチド配列とは、少なくとも１つの翻訳開始コドン（例えばメチオニン）、オープンリーディングフレーム及び翻訳終止コドンを有する配列である。「完全長」ポリヌクレオチド配列は、「完全長」ポリペプチド配列をコードする。
【００９６】
「相同性」の語は、２つ以上のポリヌクレオチド配列または２つ以上のポリペプチド配列の配列類似性、または配列同一性を意味する。
【００９７】
ポリヌクレオチド配列についての用語「一致率」または「一致性％」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる、２つ以上のポリヌクレオチド配列間の一致する残基の百分率のことである。このようなアルゴリズムは、２配列間のアラインメントを最適化するために、比較する配列において、標準化された再現性のある方法でギャップを挿入しうるので、２つの配列をより有意に比較できる。
【００９８】
ポリヌクレオチド配列間の一致率は、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメントプログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトのパラメータを用いて決定できる。このプログラムは、LASERGENE ソフトウェアパッケージ(一組の分子生物学的分析プログラム) (DNASTAR, Madison WI)の一部である。このCLUSTAL Vは、HigginsおよびSharp (1989) （CABIOS 5:151-153）、Higgins他 (1992) （CABIOS 8:189-191）に記載されている。ポリヌクレオチド配列を２つ１組でアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ktuple=2、gap penalty=5、window=4、「diagonals saved」=4と設定する。「weighted（重み付けされた）」残基重み付け表が、デフォルトとして選択される。一致率は、アラインメントされたポリヌクレオチド配列間の「percent similarity（類似性パーセント）」としてCLUSTAL Vによって報告される。
【００９９】
或いは、一般的に用いられ且つ自由に入手できる配列比較アルゴリズム一式が、国立バイオテクノロジー情報センター（NCBI）Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）から提供されており（Altschul, S.F. 他 (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410）、これはメリーランド州ベセスダにあるNCBI及びインターネット（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）を含む幾つかの情報源から入手可能である。このBLASTソフトウェア一式には、既知のポリヌクレオチド配列と様々なデータベースの別のポリヌクレオチド配列とのアラインメントに用いられる「blastn」を含む、様々な配列分析プログラムが含まれる。「BLAST 2 Sequences」と呼ばれるツールが入手可能であり、２つのヌクレオチド配列の直接のペアワイズで比較するために用いられる。「BLAST 2 Sequences」は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlにアクセスして、対話形式で利用ができる。「BLAST 2 Sequences」ツールは、blastn および blastp（以下に記載）の両方に用い得る。BLASTプログラムは、一般的には、ギャップ（gap）などのパラメータをデフォルト設定にセットして用いる。例えば、２つのヌクレオチド配列を比較するために、デフォルトパラメータとして設定された「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12（2000年4月21日）を用いてblastnを実行してもよい。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
Matrix:BLOSUM62
Reward for match: 1
Penalty for mismatch: -2
Open Gap:5 及びExtension Gap：2 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 11
Filter:on
一致率は、ある定義された配列の全長（例えば特定のSEQ IDナンバーで定義された配列）で測定し得る。或いは、より短い長さ、例えば、定義された、より大きな配列から得られた断片（例えば少なくとも２０、３０、４０、５０、７０、１００または２００の連続したヌクレオチドの断片）の長さと比較して一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図及び配列リストを含めた本明細書に記載された配列に裏付けられた任意の配列長さの断片を用いて、一致率を測定し得る長さを説明し得ることを理解されたい。
【０１００】
高度の相同性を示さない核酸配列が、それにもかかわらず遺伝子コードの縮重が原因で類似のアミノ酸配列をコードする場合がある。この縮重を利用して核酸配列内で変化を生じさせて、全ての核酸配列が実質上同一のタンパク質をコードするような多数の核酸配列を生成し得ることを理解されたい。
【０１０１】
ポリペプチド配列に用いられる用語「一致率」または「一致性％」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる２つ以上のポリペプチド配列間の一致する残基の百分率のことである。ポリペプチド配列アラインメントの方法は公知である。保存的アミノ酸置換を考慮するアラインメント方法もある。既に詳述したこのような保存的置換は通常、置換部位の電荷および疎水性を保存するので、ポリペプチドの構造を（したがって機能も）保存する。
【０１０２】
ポリペプチド配列間の一致率は、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメントプログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトのパラメータを用いて決定できる（既に説明したのでそれを参照されたい）。CLUSTAL Vを用いて、ポリペプチド配列をペアワイズアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ktuple=1、gap penalty=3、window=5、「diagonals saved」=5と設定される。PAM250マトリクスが、デフォルトの残基重み付け表として選択される。ポリヌクレオチドアラインメントと同様に、CLUSTAL Vは、アラインメントされたポリペプチド配列対間の「類似率」として一致率を報告する。
【０１０３】
或いは、NCBI BLASTソフトウェア一式を用いてもよい。例えば、２つのポリペプチド配列をペアワイズで比較する場合、「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12（2000年4月21日）のblastpをデフォルトパラメータに設定して用い得る。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
Matrix:BLOSUM62
Open Gap:11 及びExtension Gap：1 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 3
Filter:on
一致率は、定義された（例えば特定の配列番号で定義された）ポリペプチド配列全体の長さと比較して測定し得る。或いは、より短い長さ、例えばより大きな定義されたポリペプチド配列から得られた断片（例えば少なくとも１５、２０、３０、４０、５０、７０または１５０の連続した残基の断片）の長さと比較して一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図及び配列リストを含めた本明細書に記載された配列に裏付けられた任意の配列長さの断片を用いて、或る長さであってその長さに対して一致率を測定し得る長さを説明し得ることを理解されたい。
【０１０４】
「ヒト人工染色体（HAC）」は、約６kb 〜１０MbのサイズのDNA配列を含み得る、安定した染色体複製の分離及び維持に必要な全てのエレメントを含む直鎖状の小染色体である。
【０１０５】
用語「ヒト化抗体」は、もとの結合能力を保持しつつよりヒトの抗体に似せるために、非抗原結合領域のアミノ酸配列が変えられた抗体分子を指す。
【０１０６】
「ハイブリダイゼーション」とは、所定のハイブリダイゼーション条件下で、ある一本鎖ポリヌクレオチドがある相補的な一本鎖と塩基対を形成するアニーリングのプロセスである。特異的ハイブリダイゼーションは、２つの核酸配列が高い相補性を共有することを示すものである。特異的ハイブリダイゼーション複合体は許容されるアニーリング条件下で形成され、「洗浄」ステップ後もハイブリダイズされたままである。洗浄ステップは、ハイブリダイゼーションプロセスのストリンジェンシーを決定する際に特に重要であり、更にストリンジェントな条件では、非特異結合（即ち完全には一致しない核酸鎖間の対の結合）が減少する。核酸配列のアニーリングに対する許容条件は、本技術分野における当業者が慣例的に決定する。 許容条件はハイブリダイゼーション実験の間は一定でよいが、洗浄条件は所望のストリンジェンシーを得るように、従ってハイブリダイゼーション特異性も得るように実験中に変更することができる。アニーリングが許容される条件は、例えば、温度が６８℃で、約６×SSC、約１％（w/v）のSDS、並びに約１００μｇ／ｍｌのせん断して変性したサケ精子DNAが含まれる。
【０１０７】
一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは或る程度、洗浄ステップを実行する温度を基準にして表すことができる。このような洗浄温度は通常、所定のイオン強度及びpHにおける特定の配列の融点（Tm）より約５〜２０℃低くなるように選択する。このTmは、所定のイオン強度及びpHの条件下で、完全に一致するプローブに標的配列の５０％がハイブリダイズする温度である。Tmを計算する式及び核酸のハイブリダイゼーション条件はよく知られており、Sambrook 他 、1989（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1-3巻, Cold Spring Harbor Press, Plainview NYに記載されており、特に2巻の9章）を参照されたい。
【０１０８】
本発明のポリヌクレオチド間の高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションでは、約０．２x SSC及び約0.１％のSDSの存在の下、約６８℃で１時間の洗浄過程を含む。別法では、約６５℃、６０℃、５５℃、または４２℃の温度で行う。SSC濃度は、約０.１％のSDS存在下で、約０.１〜２×SSCの範囲で変化し得る。通常は、ブロッキング剤を用いて非特異ハイブリダイゼーションを阻止する。このようなブロッキング剤には、例えば、約100〜200μg/mlのせん断した変性サケ精子DNAがある。特定条件下で、例えばRNAとDNAのハイブリダイゼーションに有機溶剤、例えば約３５〜５０％v/vの濃度のホルムアミドを用いることもできる。洗浄条件の有用なバリエーションは、当業者には自明であろう。ハイブリダイゼーションは、特に高ストリンジェント条件下では、ヌクレオチド間の進化的な類似性を示唆し得る。このような類似性は、ヌクレオチド群及びヌクレオチドにコードされるポリペプチド群について、類似の役割を強く示唆している。
【０１０９】
用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基間の水素結合によって、形成された２つの核酸配列の複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体は、溶解状態で形成し得る（C0tまたはR0t解析等）。或いは、一方の核酸配列が溶解状態で存在し、もう一方の核酸配列が固体支持体（例えば紙、膜、フィルタ、チップ、ピンまたはガラススライド、或いは他の適切な基板であって細胞若しくはその核酸が固定される基板）に固定されているような２つの核酸配列間に形成され得る。
【０１１０】
用語「挿入」或いは「付加」は、１個以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチドがそれぞれ追加されるアミノ酸配列或いは核酸配列の変化を指す。
【０１１１】
「免疫応答」は、炎症、外傷、免疫異常症、伝染性疾患または遺伝性疾患に関連する症状を指し得る。これらの症状は、細胞及び全身の防御系に作用し得る種々の因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、その他のシグナル伝達分子の発現によって特徴づけることができる。
【０１１２】
「免疫原性断片」は、生物（例えば哺乳類）に導入すると免疫応答を引き起こし得る、CHOPのポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片を指す。用語「免疫原性断片」はまた、本明細書で開示するまたは当分野で周知のあらゆる抗体生産方法に有用な、CHOPの任意のポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片をも指す。
【０１１３】
用語「マイクロアレイ」は、基板上の複数のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物の構成を指す。
【０１１４】
用語「エレメント」または「アレイエレメント」は、マイクロアレイ上に固有の指定された位置を有する、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物を指す。
【０１１５】
用語「モジュレート」または「活性を調節」は、CHOPの活性を変化させることを指す。例えば、調節によって、CHOPのタンパク質活性、或いは結合特性、またはその他の生物学的特性、機能的特性或いは免疫学的特性の変化が起こる。
【０１１６】
「核酸」及び「核酸配列」の語は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはこれらの断片を指す。「核酸」及び「核酸配列」の語は、ゲノム起源または合成起源のDNAまたはRNAであって一本鎖または二本鎖であるか或いはセンス鎖またはアンチセンス鎖を表し得るようなDNAまたはRNAや、ペプチド核酸（PNA）や、任意のDNA様またはRNA様物質を指すこともある。
【０１１７】
「機能的に連結した」は、第１の核酸配列と第２の核酸配列が機能的な関係にある状態を指す。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合には、そのプロモーターはそのコード配列に機能的に連結している。同一のリーディングフレーム内で２つのタンパク質コード領域を接続する必要がある場合、一般に、機能的に連結したDNA配列は非常に近接するか、或いは連続的に隣接し得る。
【０１１８】
「ペプチド核酸（PNA）」は、末端がリシンで終わるアミノ酸残基のペプチドのバックボーンに結合した、少なくとも約５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを含む、アンチセンス分子または抗遺伝子剤を指す。末端のリジンは、この組成に溶解性を与える。PNAは、相補的一本鎖DNAまたはRNAに優先的に結合して転写の伸長を停止するものであり、ポリエチレングリコール化して細胞におけるPNAの寿命を延長し得る。
【０１１９】
CHOPの「翻訳後修飾」としては、脂質化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ラセミ化、タンパク質分解切断、及びその他の当分野で既知の修飾を含み得る。これらのプロセスは、合成的或いは生化学的に生じ得る。生化学的修飾は、CHOPの酵素環境に依存し、細胞の種類によって異なり得る。
【０１２０】
「プローブ」とは、核酸配列の内、CHOPやそれらの相補配列、またはそれらの断片をコードし、同一配列や対立遺伝子核酸配列、または関連する核酸配列の検出に用いる配列を指す。プローブは、単離されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであって、検出可能な標識またはレポーター分子に結合したものである。典型的な標識には、放射性アイソトープ、リガンド、化学発光試薬及び酵素がある。「プライマー」とは、相補的な塩基対を形成して標的のポリヌクレオチドにアニーリング可能な、通常はDNAオリゴヌクレオチドである短い核酸である。プライマーは次に、DNAポリメラーゼ酵素によって標的DNA鎖に沿って延長し得る。プライマー対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による核酸配列の増幅（及び同定）に用い得る。
【０１２１】
本発明に用いるようなプローブ及びプライマーは通常、既知の配列の、少なくとも15の連続したヌクレオチドを含んでいる。特異性を高めるために長めのプローブ及びプライマー、例えば開示した核酸配列の少なくとも２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または１５０の連続したヌクレオチドからなるようなプローブ及びプライマーを用いてもよい。これよりもかなり長いプローブ及びプライマーもある。表、図面及び配列リストを含む本明細書に裏付けされた任意の長さのヌクレオチドを用いることができるものと理解されたい。
【０１２２】
プローブ及びプライマーの調製及び使用方法については、Sambrook他、 1989 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1-3巻, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY)、Ausubel 他, 1987( Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. & Wiley-Intersciences, New York NY)、Innis他、 1990 (PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications Academic Press, San Diego CA等)を参照されたい。PCRプライマー対を既知の配列から得るには、例えば、そのためのコンピュータプログラム、例えばPrimer（Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge MA）を用い得る。
【０１２３】
プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの選択は、そのような目的のために本技術分野で既知のソフトウェアを用いて行う。例えばOLIGO 4.06ソフトウェアは、各１００ヌクレオチドまでのPCRプライマー対の選択に有用であり、オリゴヌクレオチド及び最大５,０００までの大きめのポリヌクレオチドであって３２キロベースまでのインプットポリヌクレオチド配列から得たものを分析するのにも有用である。類似のプライマー選択プログラムには、拡張能力のための追加機能が組込まれている。例えば、PrimOUプライマー選択プログラム（テキサス州ダラスにあるテキサス大学南西部医療センターのゲノムセンターから一般向けに入手可能）は、メガベース配列から特定のプライマーを選択することが可能であり、従ってゲノム全体の範囲でプライマーを設計するのに有用である。Primer3プライマー選択プログラム（Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research（マサチューセッツ州ケンブリッジ）より入手可能）を用いれば、プライマー結合部位として避けたい配列を指定できる「非プライミングライブラリ（mispriming library）」を入力できる。Primer3は特に、マイクロアレイのためのオリゴヌクレオチドの選択に有用である。（後二者のプライマー選択プログラムのソースコードは、それぞれの情報源から得てユーザー固有のニーズを満たすように変更してもよい。）PrimerGenプログラム（英国ケンブリッジ市の英国ヒトゲノムマッピングプロジェクト-リソースセンターから一般向けに入手可能）は、多数の配列アラインメントに基づいてプライマーを設計し、それによって、アラインメントされた核酸配列の最大保存領域または最小保存領域の何れかとハイブリダイズするようなプライマーの選択を可能にする。従って、このプログラムは、固有であって保存されたオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの断片の同定に有用である。上記選択方法のいずれかによって同定したオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの断片は、ハイブリダイゼーション技術において、例えばPCRまたはシークエンシングプライマーとして、マイクロアレイエレメントとして、或いは核酸のサンプルにおいて完全または部分的相補的ポリヌクレオチドを同定する特異プローブとして有用である。オリゴヌクレオチドの選択方法は、上記の方法に限定されるものではない。
【０１２４】
本明細書における「組換え核酸」は天然の配列ではなく、２つ以上の配列の離れたセグメントを人工的に組み合わせた配列である。この人為的組合せはしばしば化学合成によって達成するが、より一般的には核酸の単離セグメントの人為的操作によって、例えばのSambrookらの文献（前出）に記載されているような遺伝子工学的手法によって達成する。組換え核酸の語は、単に核酸の一部が付加、置換または欠失により改変された核酸も含む。しばしば組換え核酸には、プロモーター配列に機能的に連結した核酸配列が含まれる。このような組換え核酸は、例えばある細胞を形質転換するために使用されるベクターの一部とすることが可能である。
【０１２５】
或いはこのような組換え核酸は、ウイルスベクターの一部であって、例えばワクシニアウイルスに基づくものであり得る。そのようなワクシニアウイルスは哺乳動物に接種され、その組換え核酸が発現されて、その哺乳動物ないで防御免疫応答を誘導するように使用することができる。
【０１２６】
「調節因子」は、通常は遺伝子の非翻訳領域に由来する核酸配列であり、エンハンサー、プロモーター、イントロン及び５'及び３'の非翻訳領域（UTR）を含む。調節エレメントは、転写、翻訳またはRNA安定性を調節する宿主タンパク質またはウイルスタンパク質と相互作用する。
【０１２７】
「レポーター分子」は、核酸、アミノ酸または抗体の標識に用いられる化学的または生化学的な部分である。レポーター分子には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤、基質、補助因子、阻害因子、磁気粒子及びその他の当分野で既知の成分がある。
【０１２８】
DNA配列に対する「RNA等価物」とは、基準となるDNA配列と同じ直鎖の核酸配列から構成されるが、窒素性塩基のチミンがウラシルで置換され、糖鎖のバックボーンがデオキシリボースではなくリボースからなる。
【０１２９】
用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられている。CHOP、CHOPをコードする核酸、またはその断片を含むと推定されるサンプルは、体液と、細胞からの抽出物や細胞から単離された染色体や細胞内小器官、膜と、細胞と、溶液中に存在するまたは基板に固定されたゲノムDNA、RNA、cDNAと、組織と、組織プリント等を含み得る。
【０１３０】
用語「特異的結合」及び「特異的に結合する」は、タンパク質若しくはペプチドと、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、若しくは任意の天然若しくは合成の結合組成物との間の相互作用を指す。この相互作用は、タンパク質の特定の構造（例えば抗原決定基即ちエピトープ）であって結合分子が認識するものが存在するか否かに依存していることを意味している。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、結合していない標識した「Ａ」及び抗体を含む反応液に、エピトープＡを含むポリペプチド或いは結合していない無標識の「Ａ」が存在すると、抗体と結合する標識Ａの量が減少する。
【０１３１】
用語「実質的に精製された」は、自然の環境から取り除かれてから、単離あるいは分離された核酸配列あるいはアミノ酸配列であって、自然に結合している組成物が少なくとも６０％除去されたものであり、好ましくは７５％以上除去、最も好ましくは９０％以上除去されたものを指す。
【０１３２】
「置換」とは、一つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドをそれぞれ別のアミノ酸またはヌクレオチドに置き換えることである。
【０１３３】
用語「基板」は、任意の好適な固体或いは半固体の支持物を指し、膜及びフィルター、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁気または非磁気ビード、ゲル、チューブ、プレート、ポリマー、微小粒子、毛細管が含まれる。基板は、壁、溝、ピン、チャネル、孔等、様々な表面形態を有することができ、基板表面にはポリヌクレオチドやポリペプチドが結合する。
【０１３４】
「転写イメージ」または「発現プロファイル」は、所定条件下での所定時間における特定の細胞の種類または組織による集合的遺伝子発現のパターンを指す。
【０１３５】
「形質転換(transformation)」とは、外来DNAが受容細胞に導入されるプロセスのことである。形質転換は、本技術分野で知られている種々の方法に従って自然条件または人工条件下で生じ得るものであり、外来性の核酸配列を原核宿主細胞または真核宿主細胞に挿入する任意の既知の方法を基にし得る。形質転換の方法は、形質転換する宿主細胞の種類によって選択する。限定するものではないが形質転換方法には、ウイルス感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、熱ショック、リポフェクション及び微粒子銃を用いる方法がある。「形質転換された細胞」には、導入されたDNAが自律的に複製するプラスミドとして或いは宿主染色体の一部として複製可能である安定的に形質転換された細胞が含まれる。さらに、限られた時間に一過的に導入DNA若しくは導入RNAを発現する細胞も含まれる。
【０１３６】
ここで用いる「遺伝形質転換体」とは任意の生物体であり、限定するものではないが動植物を含み、生物体の１若しくは数個の細胞が、ヒトの関与によって、例えば本技術分野でよく知られている形質転換技術によって導入された異種核酸を有する。 核酸の細胞への導入は、直接または間接的に、細胞の前駆物質に導入することによって、計画的な遺伝子操作によって、例えば微量注射法によって或いは組換えウイルスの導入によって行う。或る実施例において、核酸はレンチウイルスベクターのような組換えウイルスベクターを用いた感染によって導入することができる(Lois, C. 他(2002) Science 295:868-872)。遺伝子操作の語は、古典的な交雑育種或いは試験管内受精を指すものではなく、組換えDNA分子の導入を指すものである。本発明に基づいて予期される遺伝形質転換体には、バクテリア、シアノバクテリア、真菌及び動植物がある。本発明の単離されたDNAは、本技術分野で知られている方法、例えば感染、形質移入、形質転換またはトランス接合（transconjugation）によって宿主に導入することができる。本発明のDNAをこのような生物体に移入する技術はよく知られており、前出のSambrook他 (1989) 等の参考文献に与えられている。
【０１３７】
特定の核酸配列の「変異体」は、核酸配列１本全部の長さに対して特定の核酸配列と少なくとも４０％の相同性を有する核酸配列であると定義する。 その際、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（1999年5月7日）を用いてblastnを実行する。このような核酸対は、所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の相同性を示し得る。或る変異体は、例えば「対立遺伝子」変異体（前述）、「スプライス」変異体、「種」変異体または「多型性」変異体として説明し得る。スプライス変異体は参照分子とかなりの相同性を有し得るが、mRNAプロセッシング中のエキソンの選択的スプライシングによって通常、より多くまたはより少数のヌクレオチドを有することになる。対応するポリペプチドは、追加機能ドメインを有するか或いは参照分子に存在するドメインが欠落していることがある。種変異体は、種によって異なるポリヌクレオチド配列である。結果的に生じるポリペプチドは通常、相互にかなりのアミノ酸相同性を有する。多型性変異体は、与えられた種の個体間で特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列中での変異である。多型変異配列はまた、ポリヌクレオチド配列の１つのヌクレオチドが異なる「１塩基多型性」（SNP）も含み得る。SNPの存在は、例えば特定の個体群、病状または病状性向を示し得る。
【０１３８】
特定のポリペプチド配列の「変異体」は、ポリペプチド配列の１本の長さ全体で特定のポリペプチド配列に対して少なくとも４０％の相同性を有するポリペプチド配列として定義される。定義づけには、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（1999年5月7日）を用いてblastpを実行する。このようなポリペプチド対は、一方のポリペプチドの或る所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示し得る。
【０１３９】
（発明）
本発明は、新規の糖質結合タンパク質（CHOP）の発見、CHOPをコードするポリヌクレオチド、および、糖質代謝、細胞増殖異常、自己免疫／炎症性の疾患、生殖系疾患、遺伝疾患、輸送疾患、神経系疾患および癌の診断、治療、ならびに予防に対するこれらの組成の使用に基づいている。
【０１４０】
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の命名の概略である。各ポリヌクレオチド及びその対応するポリペプチドは、１つのIncyteプロジェクト識別番号（IncyteプロジェクトID）と相関する。各ポリペプチド配列は、ポリペプチド配列識別番号（ポリペプチドSEQ ID NO）とIncyteポリペプチド配列番号（IncyteポリペプチドID）によって表示した。各ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドSEQ ID NO）とIncyteポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（IncyteポリヌクレオチドID）によって表示した。
【０１４１】
表２は、GenBankタンパク質(genpept)データベースとPROTEOMEデータベースとに対するBLAST分析で同定した、本発明のポリペプチド群に相同な配列群を示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド配列識別番号（ポリペプチド SEQ ID NO:）とそれに対応するIncyte ポリペプチド配列番号（Incyte ポリペプチド ID）を示す。列３は、最も近いGenBank相同体のGenBank識別番号（GenBank ID NO:）を示す。列４は、各ポリペプチドとその相同体との間の一致について確率スコアを示す。列５は、GenBankとPROTEOME データベースの相同体の注釈を示し、更に該当箇所には関連する引用文献も示す。これら全ては引用することを以って本明細書の一部とする。
【０１４２】
表３は、本発明のポリペプチドの様々な構造的特徴を示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドのポリペプチド配列識別番号(SEQ ID NO:)およびそれに対応するIncyteポリペプチド配列番号(IncyteポリペプチドID)を示す。列３は、各ポリペプチドのアミノ酸残基数を示す。列４および列５はそれぞれ、GCG配列分析ソフトウェアパッケージのMOTIFSプログラム（Genetics Computer Group, Madison WI）によって決定された、リン酸化およびグリコシル化の可能性のある部位を示す。列６は、シグネチャ配列、ドメイン、およびモチーフを含むアミノ酸残基を示す。列７は、タンパク質の構造／機能の分析のための分析方法を示し、該当箇所にはさらに分析方法に利用した検索可能なデータベースを示す。
【０１４３】
表２及び表３は共に、本発明の各々のポリペプチドの特性を要約しており、それら特性が請求の範囲に記載されたポリペプチドが糖結合タンパク質であることを確立している。  例えばSEQ ID NO:1は、残基Q170から残基W909までが、マウスのα-グルコシダーゼIIのαサブユニット(GenBank ID g2104689)に対して54％同一であると、Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)で判定された（表2参照）。BLAST確率スコアは1.4e-258であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:1はまた、１つのグリコシルヒドロラーゼファミリー1ドメインを有するが、これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された （表3参照）。BLIMPS及びMOTIFS 解析よりのデータは、SEQ ID NO:1がグリコシルヒドロラーゼであることをさらに確証する証拠を提供する。別の例において、SEQ ID NO:4 はウシのα1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ (GenBank ID g163124)と残基E20からT276まで55%の同一性を有することがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって決定された（表2参照）。BLAST確率スコアは5.8e-77であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。BLAST解析よりのデータは、SEQ ID NO:4 がα1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼである、さらに実証的な証拠を提供する。また他の例として、SEQ ID NO:7は、残基M2から残基F402まで、マウストのβ1,6-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼB （GenBank ID g9650954）と７７％同一であることがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって示された（表2参照）。BLAST確率スコアは2.1e-177であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:7はまた、１つのコア2/I分岐酵素（core-2/I-branching enzyme）ドメインを有するが、これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメイン群のPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された （表3参照）。更なるBLAST解析から得られたデータは、SEQ ID NO:7がβ1,6-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼBであることを裏づける証拠を提供する。また他の例として、SEQ ID NO:9はヒトのインテレクチン (GenBank ID g8096221) と残基M8 から残基Q200まで81％の同一性を有することがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって示された（表2参照）。BLAST確率スコアは2.1e-83であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:９はインテレクチンであることが、PROTEOMEデータベースを使ったBLAST解析によって示された。SEQ ID NO:9はまた、フィブリノーゲン ドメインを有するが、 これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された （表3参照）。PRODOMデータベースのBLAST解析からのデータは、SEQ ID NO:9がレクチンである、さらに実証的な証拠を提供する。また他の例として、SEQ ID NO:10はヒトのカーゴ選択タンパク質（cargo selection protein）（マンノース-6-リン酸受容体結合タンパク質）（GenBank ID g14043157）と残基T35から残基E387まで３６％同一であることがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)に��って示された（表2参照）。BLAST確率スコアは1.1e-51であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:10 はまた、エンドソーム小胞に局在するタンパク質（マンノース-6-リン酸受容体のエンドソームからゴルジ装置への輸送を仲介する）であり、また47 kDa のエンドソーム/エンドソーム小胞細胞質尾部相互作用タンパク質およびペリリピン（perilipin）タンパク質であるタンパク質に相同性を持つことがPROTEOMEデータベースを使ったBLAST解析によって示された。SEQ ID NO:10はまた、ペリリピン ドメインを有するが、 これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された （表3参照）。BLAST_PRODOM データベースを用いるBLAST解析よりのデータは、SEQ ID NO:10がペリリピンの相同体あることをさらに確証する証拠を提供する。SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6および SEQ ID NO:8 については、同様の方法で分析し、注釈を付けた。SEQ ID NO:1-10の解析のためのアルゴリズム及びパラメータが表７で記述されている。
【０１４４】
表４に示すように、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列は、cDNA配列またはゲノムDNA由来のコード（エキソン）配列を用いて、或いはこれら２種類の配列を任意に組み合わせてアセンブリした。列１は本発明の各ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドSEQ ID NO）および対応するIncyteポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（Incyte ID）、および塩基対の各ポリヌクレオチド配列の長さを示している。列２は、本発明の全長ポリヌクレオチド配列を構築するために使われたｃDNA配列および／またはゲノム配列のヌクレオチド開始位置（5'）と終了位置（3'）を示し、またSEQ ID NO：11-20を同定するための、またはSEQ ID NO：11-20と関連するポリヌクレオチド配列とを区別するための技術（例えば、ハイブリダイゼーション技術または増幅技術）で有用なポリヌクレオチド配列の断片のヌクレオチド開始位置（5'）と終了位置（3'）を示す。
【０１４５】
表４の列２で記述されたポリヌクレオチド断片は、具体的にはたとえば組織特異的なｃDNAライブラリまたはプールされたcDNAライブラリに由来するIncyte cDNAを指す場合がある。或いは列2の識別番号は、完全長ポリヌクレオチド配列のアセンブリに寄与するGenBank cDNAまたはESTを指す場合もある。さらに、列2のポリヌクレオチド断片は、ENSEMBL（The Sanger Centre、英国ケンブリッジ）データベースから由来した配列（即ち「ENST」命名を含む配列）を同定し得る。或いは、列2で記述されたポリヌクレオチド断片は、NCBI RefSeq Nucleotide Sequence Records データベースから由来する場合もあり（即ち「NM」または「NT」の命名を含む配列）、またNCBI RefSeq Protein Sequence Recordsから由来する場合もある（即ち「NP」の命名を含む配列）。または列で記述されたポリヌクレオチド断片は、「エキソンスティッチング（exon-stitching）」アルゴリズムにより結び合わせたcDNA及びGenscan予想エキソンの両方からなるアセンブリ体を意味する場合がある。例えば、FL_XXXXXX_N1_N2_YYYYY_N3_N4  として同定されるポリヌクレオチド配列はアルゴリズムが適用される配列のクラスターの識別番号がXXXXXXであり、アルゴリズムにより生成される予測の番号がYYYYY であり、（もし存在すれば）N1,2,3..が解析中に手動で編集された可能性のある特定のエキソンであるような「縫合された」配列である( 実施例５参照 )。または、列2のポリヌクレオチド断片は「エキソンストレッチング（exon-stretching）」アルゴリズムにより結び合わせたエキソンの集合を指す場合もある。例えば、FLXXXXXX_gAAAAA_gBBBBB_1_N として同定されるポリヌクレオチド配列は「ストレッチ」配列である。ここでXXXXXXはIncyteプロジェクト識別番号、gAAAAAは「エキソンストレッチング」アルゴリズムを適用したヒトゲノム配列のGenBank識別番号、gBBBBBは一番近いGenBankタンパク質相同体のGenBank識別番号またはNCBI RefSeq 識別番号である。（実施例５を参照。）あるRefSeq配列が「エキソンストレッチング」アルゴリズムのためのタンパク質相同体として使用された場合では、RefSeq識別番号（「NM」、「NP」、または「NT」によって表される）が、GenBank識別（即ち、gBBBBB）の代わりに使用される場合もある。
【０１４６】
或いは、接頭コードは、手動で編集された構成配列、ゲノムDNA配列から予測された構成配列、または組み合わされた配列解析方法から由来する構成配列を同定する。次の表は、構成配列の接頭コードと、接頭コードに対応する配列分析方法の例を列記する(実施例４と５を参照)。
2005501526.tif 000003
【０１４７】
場合によっては、最終コンセンサスポリヌクレオチド配列を確認するために表4に示すような配列の適用範囲と重複するIncyte cDNAの適用範囲が得られたが、それに関連するIncyte cDNA識別番号は示さなかった。
【０１４８】
表５は、Incyte cDNA配列を用いてアセンブリされた完全長ポリヌクレオチド配列のための代表的なcDNAライブラリを示している。代表的なcDNAライブラリは、上記のポリヌクレオチド配列を構築及び確認するために用いられるIncyte cDNA配列によって最も頻繁に代表されるIncyte cDNAライブラリである。cDNAライブラリを作製するために用いた組織およびベクターを表５に示し、表６で説明している。
【０１４９】
本発明はまた、CHOPの変異体も含む。好適なCHOPの変異体は、CHOPアミノ酸配列に対して、少なくとも約80％、あるいは少なくとも約90％、さらには少なくとも約95％のアミノ酸配列同一性を有し、CHOPの機能的または構造的特徴を少なくとも1つ含む変異体である。
【０１５０】
本発明はまた、CHOPをコードするポリヌクレオチドを提供する。特定の実施態様で本発明は、CHOPをコードする、SEQ ID NO:11-20 からなる群から選択した1配列を持つポリヌクレオチド配列を提供する。SEQ ID NO:11-20のポリヌクレオチド配列には、配列表に示したように等価RNA配列をも含むが、そこでは窒素塩基チミンの出現はウラシルに置換され、糖のバックボーンはデオキシリボースではなくリボースで構成される。
【０１５１】
本発明は、また、CHOPをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列をも含む。詳細には、このようなポリヌクレオチド配列の変異配列は、CHOPをコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも70％のポリヌクレオチド配列同一性、或いは少なくとも85％のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも95％ものポリヌクレオチド配列同一性を有する。本発明の特定の実施形態では、SEQ ID NO:11-20からなる一群から選択された１核酸配列との少なくとも約７０％のポリヌクレオチド配列同一性、或いは少なくとも約８５％のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも約９５％ものポリヌクレオチド配列同一性を有する、SEQ ID NO:11-20からなる一群から選択された１配列を持つポリヌクレオチド配列の変異配列を提供する。上記したポリヌクレオチド変異配列は何れも、CHOPの機能的或いは構造的特徴の少なくとも１つを有するアミノ酸配列をコードし得る。
【０１５２】
さらに、あるいは別法において、本発明のポリヌクレオチド変異体はCHOPをコードするポリヌクレオチド配列のスプライス変異体である。或るスプライス変異配列はCHOPをコードするポリヌクレオチド配列との顕著な配列同一性を持つ部分複数を有し得るが、mRNAプロセッシング中のエキソン群の選択的スプライシングによって生ずる、配列の数ブロックの付加または欠失により、通常、より多数またはより少数のポリヌクレオチドを有することになる。或るスプライス変異配列には、約７０％未満、または約６０％未満、あるいは約５０％未満のポリヌクレオチド配列同一性が、CHOPをコードするポリヌクレオチド配列との間で全長に渡って見られるが、このスプライス変異配列のいくつかの部分には、CHOPをコードするポリヌクレオチド配列の各部との、少なくとも約７０％、あるいは少なくとも約８５％、または少なくとも約９５％、なおまたは１００％の、ポリヌクレオチド配列同一性を有することとなる。上記したスプライス変異配列は何れも、CHOPの機能的或いは構造的特徴の少なくとも１つを有するアミノ酸配列をコードする。
【０１５３】
遺伝暗号の縮重により、CHOPをコードする種々のポリヌクレオチド配列が作り出され、中には、既知のいかなる天然遺伝子のポリヌクレオチド配列群とも最小の類似性しか有しない配列もあることは、当業者には理解されよう。したがって本発明には、可能コドン選択に基づく組合せの選択によって産出し得るあらゆる可能なポリヌクレオチド配列のバリエーションを網羅し得る。これらの組み合わせは、天然のＰＰのポリヌクレオチド配列に適用される標準的なトリプレット遺伝暗号を基に作られ、全ての変異が明確に開示されているとみなす。
【０１５４】
CHOPをコードするヌクレオチド配列及びその変異配列は一般に、好適に選択されたストリンジェントな条件下で、天然のCHOPのヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能であるが、非天然のコドンを含めるなどの実質的に異なった使い方のコドンを有するCHOP或いはその誘導体をコードするヌクレオチド配列を作ることは有利となり得る。宿主が特定のコドンを利用する頻度に基づいて、特定の真核宿主又は原核宿主に発生するペプチドの発現率を高めるようにコドンを選択することが可能である。コードされたアミノ酸配列を変えないで、CHOP及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に変更する別の理由は、天然の配列から作られる転写物より例えば長い半減期など好ましい特性を備えるRNA転写物を作ることにある。
【０１５５】
本発明はまた、CHOP及びその誘導体をコードするDNA配列またはそれらの断片を完全に合成化学によって作り出すことも含む。作製後、当分野で公知の試薬類を用いて、この合成配列を任意の多くの入手可能な発現ベクター及び細胞系中に挿入し得る。更に、合成化学を用いて、CHOPまたはその任意の断片をコードする配列に突然変異を誘発し得る。
【０１５６】
更に本発明には、種々のストリンジェントな条件下で、請求項に記載されたポリヌクレオチド配列、特に、SEQ ID NO:11-20及びそれらの断片とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列が含まれる(例えば、Wahl, G.M.及びS.L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399-407; and Kimmel. A.R. (1987) Methods Enzymol. 152:507-511.を参照)。アニーリング及び洗浄条件を含むハイブリダイゼーションの条件は、「定義」に記載されている。
【０１５７】
DNAシークエンシングの方法は当分野では公知であり、本発明のいずれの実施例もDNAシークエンシング方法を用いて実施可能である。DNAシークエンシング方法には酵素を用いることができ、例えばDNAポリメラーゼIのクレノウ断片、SEQUENASE（US Biochemical, Cleveland OH）、Taqポリメラーゼ（Applied Biosystems）、熱安定性T7ポリメラーゼ（Amersham, Biosciences, Piscataway NJ）を用いることができる。或いは、例えばELONGASE増幅システム（Invitrogen, Carlsbad CA）において見られるように、ポリメラーゼと校正エキソヌクレアーゼを併用することができる。好適には、MICROLAB2200液体転移システム（Hamilton, Reno, NV）、PTC200サーマルサイクラー（MJ Research, Watertown MA）及びABI CATALYST 800サーマルサイクラー（Applied Biosystems）等の装置を用いて配列の準備を自動化する。次に、ABI 373 或いは 377 DNAシークエンシングシステム（Applied Biosystems）、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム（Amersham Biosciences）または当分野でよく知られている他の方法を用いてシークエンシングを行う。結果として得られた配列を当分野でよく知られている種々のアルゴリズムを用いて分析する（Ausubel, F.M. (1997) Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY, 7.7ユニット、Meyers, R.A. (1995) Molecular Biology and Biotechnology, Wiley VCH, New York NY, 856-853ページ）。
【０１５８】
当分野で周知の、PCR法をベースにした種々の方法と、部分的ヌクレオチド配列とを利用して、CHOPをコードする核酸配列を伸長し、プロモーターや調節エレメントなど、上流にある配列を検出し得る。例えば、使用し得る方法の１つである制限部位PCR法は、ユニバーサルプライマー及びネステッドプライマーを用いてクローニングベクター内のゲノムDNAから未知の配列を増幅する方法である（Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic 2:318-322）。別の方法にインバースPCR法があり、これは広範な方向に伸長させたプライマーを用いて環状化した鋳型から未知の配列を増幅する方法である。鋳型は、既知のゲノム遺伝子座及びその周辺の配列からなる制限酵素断片から得る（Triglia, T.他 (1988) Nucleic Acids Res 16:8186）。第３の方法としてキャプチャPCR法があり、これはヒト及び酵母菌人工染色体DNAの既知の配列に隣接するDNA断片をPCR増幅する方法に関与している（Lagerstrom, M.他(1991) PCR Methods Applic 1:111-119）。この方法では、PCRを行う前に複数の制限酵素の消化及びライゲーション反応を用いて未知の配列領域内に組換え二本鎖配列を挿入することが可能である。また、未知の配列を検索するために用い得る別の方法については当分野で知られている（Parker, J.D.他 (1991) Nucleic Acids Res. 19:3055-3060）。更に、PCR、ネステッドプライマー及びPromoterFinder（商標）ライブラリ（Clontech, Palo Alto CA）を用いてゲノムDNAをウォーキングすることができる。この手順は、ライブラリ類をスクリーニングする必要がなく、イントロン／エキソン接合部の発見に有用である。全てのPCRベースの方法に対して、市販されているソフトウェア、例えばOLIGO 4.06プライマー分析ソフトウェア（National Biosciences, Plymouth MN）或いは別の好適なプログラムを用いて、長さが約２２〜３０ヌクレオチド、GC含有率が約５０％以上、温度約６８℃〜７２℃で鋳型に対してアニーリングするようにプライマーを設計し得る。
【０１５９】
完全長cDNAをスクリーニングする際は、より大きなcDNAを含むようにサイズ選択されたライブラリを用いるのが好ましい。更に、ランダムプライマーのライブラリは、しばしば遺伝子の５'領域を有する配列を含み、オリゴd(T)ライブラリが完全長cDNAを作製できない状況に対して好適である。ゲノムライブラリ群は、５'非転写調節領域への、配列の伸長に有用であろう。
【０１６０】
市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシングまたはPCR産物のサイズを分析し、またはそのヌクレオチド配列を確認することができる。具体的には、キャピラリーシークエンシングは、電気泳動による分離のための流動性ポリマーと、４つの異なるヌクレオチドに特異的であるような、レーザで活性化されるフルオロフォアと、発光された波長の検出に利用するCCDカメラとを有し得る。出力／光の強度は、適切なソフトウェア（Applied Biosystems社のGENOTYPER、SEQUENCE NAVIGATOR等）を用いて電気信号に変換し得る。サンプルのロードからコンピュータ分析及び電子データ表示までの全プロセスがコンピュータ制御可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しないようなDNA小断片のシークエンシングに特に適している。
【０１６１】
本発明の別の実施例では、CHOPをコードするポリヌクレオチド配列またはその断片を組換えDNA分子にクローニングして、適切な宿主細胞内にCHOP、その断片または機能的等価物を発現させることが可能である。遺伝暗号固有の縮重により、実質的に同じ或いは機能的に等価のアミノ酸配列をコードする別のDNA配列が作られ得り、これらの配列をCHOPのクローン化及び発現に利用可能である。
【０１６２】
CHOPをコードする配列を種々の目的で改変するため、当分野で一般的に既知の方法を用いて、本発明のヌクレオチド配列を組換えることができる。この目的には、遺伝子産物のクローン化、プロセッシングおよび／または発現の調節が含まれるが、これらに限定されるものではない。遺伝子断片及び合成オリゴヌクレオチドのランダムなフラグメンテーション及びＰＣＲ再アセンブリによるＤＮＡシャッフリングを用い、ヌクレオチド配列を組み換えることが可能である。例えば、オリゴヌクレオチドを介した部位特異的変異誘導を利用して、新規な制限部位の作製、グリコシル化パターンの変更、コドン優先の変更、スプライス変異体の生成等を起こす突然変異を導入し得る。
【０１６３】
本発明のヌクレオチドを、MOLECULARBREEDING (Maxygen Inc., Santa Clara CA; 米国特許第5,837,458号; Chang, C.-C. 他 (1999) Nat. Biotechnol. 17:793-797; Christians, F.C. 他 (1999) Nat. Biotechnol. 17:259-264; Crameri, A. 他 (1996) Nat. Biotechnol. 14:315-319)などのDNAシャフリング技術を用いてシャフリングして、CHOPの生物学的または酵素的な活性、或いは他の分子や化合物と結合する能力などのCHOPの生物学的特性を変更或いは改良することができる。DNAシャッフリングは、遺伝子断片のPCRを介する組換えを用いて遺伝子変異体のライブラリを作製するプロセスである。ライブラリはその後、所望の特性を持つ遺伝子変異体群を同定する、選択またはスクリーニングの手順を経る。続いて、これら好適な変異体をプールし、更に反復してDNAシャッフリングおよび選択／スクリーニングを行い得る。従って、人工的な育種及び急速な分子の進化によって多様な遺伝子が作られる。例えば、ランダムポイント突然変異を持つ単一の遺伝子の断片を組み換えて、スクリーニングし、その後所望の特性が最適化されるまでシャッフリングし得る。或いは、所定の遺伝子を同種または異種のいずれかから得た同一遺伝子ファミリーの相同遺伝子と組み換え、それによって天然に存在する複数の遺伝子の遺伝多様性を、指図された制御可能な方法で最大化させることができる。
【０１６４】
別の実施例によれば、CHOPをコードする配列は、当分野で周知の化学的方法を用いて、全体或いは一部が合成可能である（Caruthers. M.H.他（1980）Nucl. Acids Res. Symp. Ser 7:215-223; 及びHorn, T.他（1980）Nucl. Acids Res. Symp. Ser.225-232）。別法として、化学的方法を用いてCHOP自体またはその断片を合成することが可能である。例えば、種々の液相または固相技術を用いてペプチド合成を行うことができる（Creighton, T. (1984) Proteins, Structures and Molecular Properties, WH Freeman, New York NY,  55-60ページ、Roberge, J.Y. 他 (1995) Science 269:202-204）。自動合成はABI 431Aペプチドシンセサイザ（Applied Biosystems）を用いて達成し得る。更にCHOPのアミノ酸配列または任意のその一部は、直接的な合成の際の変更、及び／または他のタンパク質または任意のその一部からの配列との組み合わせにより、天然のポリペプチド配列を有するポリペプチドまたは変異体ポリペプチドを作製することが可能である。
【０１６５】
ペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィーを用いて実質上精製可能である（Chiez, R.M.及び F.Z. Regnier (1990) Methods Enzymol. 182:392-421）。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析またはシークエンシングによって確認することができる（前出のCreighton, 28-53ページ）。
【０１６６】
生物学的に活性なCHOPを発現させるために、CHOPをコードするヌクレオチド配列またはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入し得る。好適な発現ベクターとは、好適な宿主に挿入されたコーディング配列の転写および翻訳の制御に必要なエレメント群を持つベクターである。これらのエレメントには、ベクター及びCHOPをコードするポリヌクレオチド配列におけるエンハンサー、構成型及び発現誘導型のプロモーター、５'及び３'の非翻訳領域などの調節配列が含まれる。必要なエレメント群は、強度および特異性が様々である。特定の開始シグナルによって、CHOPをコードする配列のより効果的な翻訳を達成することが可能である。開始シグナルの例には、ATG開始コドンと、コザック配列など近傍の配列とが含まれる。CHOPをコードする配列及びその開始コドン、上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入された場合は、更なる転写調節シグナルや翻訳調節シグナルは必要なくなるであろう。しかしながら、コード配列あるいはその断片のみが挿入された場合は、インフレームATG開始コドンなど外因性の翻訳制御シグナルが発現ベクターに含まれるようにすべきである。外因性の翻訳エレメント群および開始コドン群は、様々な天然物および合成物を起源とし得る。発現の効率は、用いられる特定の宿主細胞系に好適なエンハンサーを包含することによって高めることができる（Scharf, D. 他 (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125-162）。
【０１６７】
当業者に周知の方法を用いて、CHOPをコードする配列、好適な転写及び翻訳調節エレメントを含む発現ベクターを作製することが可能である。これらの方法には、in vitro組換えDNA技術、合成技術、及びin vivo遺伝子組換え技術が含まれる（Sambrook 他, 前出, ch. 4, 8, および 16-17; Ausubel, F.M. 他 (1995) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY, ch. 9, 13, および 16）。
【０１６８】
種々の発現ベクター／宿主系を利用して、CHOPをコードする配列を保持および発現し得る。限定するものではないがこのような発現ベクター／宿主系には、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換させた細菌などの微生物等や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌や、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルスCaMVまたはタバコモザイクウイルスTMV）または細菌発現ベクター（例えばTiプラスミドまたはpBR322プラスミド）で形質転換させた植物細胞系、動物細胞系がある（前出のSambrook 他; 前出のAusubel ; Van Heeke, G. および S.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:55035509; Engelhard, E.K. 他 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227; Sandig, V. 他 (1996) Hum. Gene Ther. 7:1937-1945; Takamatsu, N. (1987) EMBO J. 6:307311; The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw Hill, New York NY, pp. 191196; Logan, J. および T. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:36553659; および Harrington, J.J. 他 (1997) Nat. Genet. 15:345-355）。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルス由来の発現ベクターまたは種々の細菌性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ポリヌクレオチド配列を標的器官、組織または細胞集団へ送達することができる（Di Nicola, M. 他 (1998) Cancer Gen. Ther. 5(6):350-356、Yu, M. 他 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(13):6340-6344、Buller, R.M. 他 (1985) Nature 317(6040):813-815; McGregor, D.P. 他 (1994) Mol. Immunol. 31(3):219-226、Verma, I.M. および N. Somia (1997) Nature 389:239-242）。本発明は使用される宿主細胞によって限定されるものではない。
【０１６９】
細菌系では、CHOPをコードするポリヌクレオチド配列の使用目的に応じて多数のクローニングベクターおよび発現ベクターを選択し得る。例えば、CHOPをコードするポリヌクレオチド配列の日常的なクローニング、サブクローニング、増殖には、PBLUESCRIPT(Stratagene, La Jolla CA)またはpSPORT１プラスミド(Invitrogen)などの多機能の大腸菌ベクターを用いることができる。ベクターの多数のクローニング部位にCHOPをコードする配列をライゲーションするとlacＺ遺伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌の同定のための比色スクリーニング法が可能となる。更にこれらのベクターは、クローニングされた配列におけるin vitro転写、ジデオキシのシークエンシング、ヘルパーファージによる一本鎖のレスキュー、入れ子状態の欠失の生成にも有用であろう例えば抗体類の産生などに多量のCHOPが必要な場合は、CHOPのハイレベル発現を指示するベクター類が使用できる。例えば、強力な誘導SP６バクテリオファージプロモーターまたは誘導T7バクテリオファージプロモーターを含むベクターが使用できる。
【０１７０】
酵母の発現系を使用してCHOPを産出し得る。α因子、アルコールオキシダーゼ、PGHプロモーター等の構成型或いは誘導型のプロモーターを含む多数のベクターが、出芽酵母菌（Saccharomyces cerevisiae） またはピキア酵母（Pichia pastoris）に使用可能である。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質を分泌或いは細胞内への保持のいずれかに誘導し、安定した増殖のために外来配列の宿主ゲノムへの組込みを可能にする（前出のAusubel他 (1995)、Bitter, G.A. 他 (1987) Methods Enzymol. 153:516544、 Scorer, C.A. 他 (1994) Bio/Technology 12:181-184）。
【０１７１】
植物系もCHOPの発現に用い得る。CHOPをコードする配列の転写は、ウイルスプロモーター、例えば単独あるいはTMV由来のオメガリーダー配列と組み合せて用いられるようなCaMV由来の35Sおよび19Sプロモーターによって促進される（Takamatsu, N. (1987) EMBO J. 6:307311）。或いは、RUBISCOの小サブユニット等の植物プロモーターまたは熱ショックプロモーターを用いてもよい（Coruzzi, G. 他 (1984) EMBO J. 3:16711680、 Broglie, R. 他 (1984) Science 224:838843、 Winter, J. 他 (1991) Results Probl. Cell Differ. 17:85105）。これらの構成物は、直接DNA形質転換または病原体を媒介とする形質移入によって、植物細胞内に導入可能である（『マグローヒル科学技術年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology) (1992) McGraw Hill New York NY, 191-196ページ）。
【０１７２】
哺乳類細胞においては、多数のウイルスベースの発現系を利用し得る。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、後発プロモーター及び３連リーダー配列からなるアデノウイルス転写物／翻訳複合体にCHOPをコードする配列を結合し得る。非必須のE1またはE3領域へウイルスのゲノムを挿入し、宿主細胞でCHOPを発現する感染ウイルスを得ることが可能である。更に、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサー等の転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させ得る。SV40またはEBVをベースにしたベクターを用いてタンパク質を高レベルで発現させることもできる。
【０１７３】
ヒト人工染色体（HAC）を用いて、プラスミドに含まれ得る断片やプラスミドから発現し得る断片より大きなDNAの断片群を送達することもできる。治療のために約６kb〜１０MbのHACを作製し、従来の輸送方法（リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、またはベシクル）で供給する(前出のHarrington 他)。
【０１７４】
哺乳動物系内の組換えタンパク質の長期にわたる産生のためには、細胞株におけるCHOPの安定した発現が望ましい。例えば、発現ベクターを用いて、CHOPをコードする配列を株化細胞に形質転換することが可能である。このような発現ベクターは、ウイルス起源の複製及び／または内在性の発現要素や、同じ或いは別のベクターの上の選択マーカー遺伝子を含む。ベクターの導入後、選択培地に移す前に強化培地で約1〜2日間、細胞を増殖させ得る。選択可能マーカーの目的は選択剤への抵抗性を与えることであり、選択可能マーカーの存在により、導入した配列をうまく発現するような細胞の成長および回収が可能となる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖可能である。
【０１７５】
任意の数の選択系を用いて、形質転換細胞株を回収できる。限定するものではないがこのような選択系には、tk−細胞のために用いられる単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子と、apr−細胞のために用いられる単純ヘルペスウイルスのアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子がある（Wigler, M. 他 (1977) Cell 11:223-232、Lowy, I. 他 (1980) Cell 22:817-823）。また、選択の基礎として代謝拮抗物質、抗生物質あるいは除草剤への耐性を用いることができる。例えばdhfrはメトトレキセートに対する耐性を与え、neoはアミノグリコシド系ネオマイシン及びG-418に対する耐性を与え、alsはクロルスルフロンに対する耐性を、patはホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を各々与える（Wigler, M. 他 (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3567-3570、Colbere-Garapin, F. 他 (1981) J. Mol. Biol. 150:1-14）。この他の選択可能な遺伝子、例えば、代謝のための細胞の必要条件を変えるtrpB及びhisDは、文献に記載されている（Hartman, S.C.及び R.C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047-8051）。可視マーカー、例えばアントシアニン、緑色蛍光タンパク質（GFP；Clontech）、βグルクロニダーゼ及びその基質βグルクロニド、またはルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリン等を用いてもよい。これらのマーカーを用いて、形質転換体を同定するだけでなく、特定のベクター系に起因する一過性或いは安定したタンパク質発現を定量することも可能である（Rhodes, C.A. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131）。
【０１７６】
マーカー遺伝子発現の有無によって目的の遺伝子の存在が示唆されても、その遺伝子の存在および発現の確認が必要な場合もある。例えば、CHOPをコードする配列がマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、CHOPをコードする配列を含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により同定可能である。または単一プロモーター制御下で、CHOPをコードする配列とタンデムにマーカー遺伝子を配置することも可能である。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は通常、タンデム遺伝子の発現も示す。
【０１７７】
一般に、CHOPをコードする核酸配列を含み且つNAAPを発現する宿主細胞は、当業者によく知られている種々の方法を用いて同定することが可能である。限定するものではないが当業者によく知られている方法には、DNA-DNA或いはDNA-RNAハイブリダイゼーションと、PCR増幅とがあり、また、核酸配列或いはタンパク質配列の検出、定量、或いはその両方を行うための、膜系、溶液ベース或いはチップベースの技術を含む、タンパク質の生物学的検定法または免疫学的検定法もある。
【０１７８】
特異的ポリクローナル抗体または特異的モノクローナル抗体を用いてCHOPの発現の検出と計測とを行うための免疫学的方法は、当分野で既知である。このような技術の例としては、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、蛍光活性化細胞選別（FACS）などが挙げられる。CHOP上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、２部位のモノクローナルベースイムノアッセイ（two-site, monoclonal-based immunoassay）が好ましいが、競合の結合アッセイも用いることもできる。これらのアッセイ及びこれ以外のアッセイは、当分野で公知である（Hampton. R. 他 (1990) Serological Methods, a Laboratory Manual. APS Press. St Paul. MN, Sect. IV、Coligan, J. E. 他 (1997) Current Protocols in Immunology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience, New York NY、Pound, J.D. (1998) Immunochemical Protocols, Humans Press, Totowa NJ）。
【０１７９】
多岐にわたる標識方法及び抱合方法が、当業者に知られており、様々な核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイにこれらの方法を用い得る。CHOPをコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ或いはPCRプローブを産出する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いるPCR増幅法がある。別法として、CHOPをコードする配列、またはその任意の断片をmRNAプローブの生成のためのベクターにクローニングすることも可能である。このようなベクターは、当分野において知られており、市販もされており、T7、T3またはSP6などの好適なRNAポリメラーゼおよび標識されたヌクレオチドを加えて、in vitroでRNAプローブの合成に用いることができる。このような方法は、例えばAmersham Biosciences、Promega（Madison WI）、U.S. Biochemicalなどから市販されている種々のキットを用いて実行することができる。検出を容易にするために用い得る好適なレポーター分子あるいは標識には、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子のほか、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤などがある。
【０１８０】
CHOPをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培地でのこのタンパク質の発現および回収に好適な条件下で培養される。形質転換細胞から製造されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用される配列、ベクター、あるいはその両者に依存する。CHOPをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜及び真核細胞膜を透過するCHOPの分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理解されよう。
【０１８１】
更に、宿主細胞株の選択は、挿入した配列の発現をモジュレートする能力、または発現したタンパク質を所望の形に処理する能力によって行い得る。限定するものではないがこのようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化がある。タンパク質の「プレプロ」または「プロ」形を切断する翻訳後のプロセシングを利用して、タンパク質の標的への誘導、折りたたみ及び／または活性を特定することが可能である。翻訳後の活性のための固有の細胞装置及び特徴のある機構を有する種々の宿主細胞（例えばCHO、HeLa、MDCK、MEK293、WI38等）は、American Type Culture Collection（ATCC, Manassas, VA）から入手可能であり、外来タンパク質の正しい修飾及び処理を確実にするように選択し得る。
【０１８２】
本発明の別の実施例では、CHOPをコードする天然の核酸配列、修飾された核酸配列、または組換えの核酸配列を上記した任意の宿主系の融合タンパク質の翻訳となる異種配列に連結させ得る。例えば、市販の抗体によって認識できる異種部分を含むキメラCHOPタンパク質が、CHOPの活性のインヒビターに対するペプチドライブラリのスクリーニングを促進し得る。また、異種タンパク質部分および異種ペプチド部分も、市販されている親和性マトリックスを用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。限定されるものではないがこのような部分には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（GST）、マルトース結合タンパク質（MBP）、チオレドキシン（Trx）、カルモジュリン結合ペプチド（CBP）、6-His、FLAG、c-myc、赤血球凝集素（HA）がある。GSTは固定化グルタチオン上で、MBPはマルトース上で、Trxはフェニルアルシンオキシド上で、CBPはカルモジュリン上で、そして6-Hisは金属キレート樹脂上で、同族の融合タンパク質の精製を可能にする。FLAG、c-mycおよび赤血球凝集素（HA）は、これらのエピトープ標識を特異的に認識する市販のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を用いた、融合タンパク質の免疫親和性精製を可能にする。また、CHOPをコードする配列と異種タンパク質配列との間にあるタンパク質分解切断部位を融合タンパク質が含むように遺伝子操作すると、CHOPが精製の後に異種部分から切断され得る。融合タンパク質の発現および精製方法は、前出のAusubel他（1995）10章に記載されている。市販されている種々のキットを用いて融合タンパク質の発現および精製を促進することもできる。
【０１８３】
本発明の別の実施例では、TNTウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽抽出系（Promega）を用いてin vitroで、放射能標識したCHOPの合成が可能である。これらの系は、T7、T3またはSP6プロモーターと機能的に連結したタンパク質コード配列の転写及び翻訳をカップルさせる。翻訳は、例えば35Sメチオニンのような放射能標識したアミノ酸前駆体の存在下で起こる。
【０１８４】
本発明のCHOPまたはその断片を用いて、CHOPに特異結合する化合物をスクリーニングすることができる。少なくとも１つまたは複数の試験化合物を用いて、CHOPへの特異的な結合をスクリーニングすることが可能である。試験化合物としては、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えばリガンドまたは受容体）または小分子が挙げられる。  一実施例では、このように同定された化合物は、例えばリガンドやその断片などのNTTの天然のリガンド、または天然の基質、構造的または機能的な擬態性または自然結合パートナーに密接に関連している（Coligan, J.E. 他 (1991) Current Protocols in Immunology 1(2)の5章等を参照）。別の実施例においては、こうして同定された化合物は受容体CHOPの天然のリガンドである(たとえば、Howard, A.D. 他 (2001) Trends Pharmacol. Sci.22:132-140; Wise, A. 他 (2002) Drug Discovery Today 7:235-246)。
【０１８５】
別の実施例においては、その化合物は、CHOP  が結合する天然受容体、或いは少なくとも受容体のある断片、リガンド結合部位または結合ポケットの全体または一部を含む受容体のある断片に密接に関連し得る。たとえば、この化合物はシグナルを伝播する能力を持つCHOPの受容体であるかもしれないし、あるいはシグナルを伝播する能力のないCHOPのおとり受容体であるかもしれない(Ashkenazi, A. および V.M. Divit (1999) Curr. Opin. Cell Biol. 11:255-260; Mantovani, A. 他 (2001) Trends Immunol. 22:328-336)。この化合物は既知の技法を用いて合理的に設計することができる。こうした技法の例としては、化合物エタネルセプト（etanercept）(ENBREL; Immunex Corp., Seattle WA)の作製に用いられた技法がある。この化合物はヒトのリューマチ性関節炎の治療に効果的である。エタネルセプトは遺伝子操作されたｐ７５腫瘍壊死因子（TNF）受容体二量体であり、ヒトのIgG1のFc部分に連結されている(Taylor, P.C. 他 (2001) Curr. Opin. Immunol. 13:611-616)。
【０１８６】
一実施例では、CHOPへの特異的な結合、刺激または阻害を行う化合物に対するスクリーニングには、分泌タンパク質或いは細胞膜上のタンパク質の何れか一方としてCHOPを発現する好適な細胞の作製が含まれる。好適な細胞には、哺乳動物、酵母、ショウジョウバエ、または大腸菌からの細胞が含まれる。CHOPを発現する細胞またはCHOPを含有する細胞膜断片を試験化合物と接触させて、CHOPまたは化合物のいずれかの結合、刺激または阻害を分析する。
【０１８７】
或るアッセイは、単に試験化合物をポリペプチドに実験的に結合させ、フルオロフォア(蛍光標識試薬)、放射性同位体、酵素抱合体、または他の検出可能な標識により、その結合を検出できる。例えば、このアッセイは、少なくとも1つの試験化合物を、溶液中のあるいは固体支持物に固定されたCHOPと結合させるステップと、CHOPとこの化合物との結合を検出するステップを含む場合がある。別法では、標識された競合物の存在下での試験化合物の結合の検出及び測定を行うことができる。更にこのアッセイでは、無細胞再構成標本、化学ライブラリまたは天然の生成混合物を用いて実施することができ、試験化合物は、溶液中で遊離させるか固体支持体に固定させる。
【０１８８】
ある化合物が天然のリガンドに結合したり天然のリガンドがその天然の受容体に結合するのを阻害する能力を検定するためのアッセイを使うことができる。こうしたアッセイの例としては、米国特許第5,914,236号および第6,372,724号に記載されたような放射ラベルアッセイを含む。関連した実施態様では、1つ以上のアミノ酸置換が或るポリペプチド化合物(受容体など)に導入され、その天然リガンドに結合する能力を向上または改変しうる(Matthews, D.J. および J.A. Wells. (1994) Chem. Biol. 1:25-30)。もう一つの関連する実施例においては、ポリペプチド化合物（たとえばリガンド）に1つ以上のアミノ酸置換を行うことにより、天然受容体への結合能力を改善または改変することができる(Cunningham, B.C. および J.A. Wells (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3407-3411; Lowman, H.B. 他 (1991) J. Biol. Chem. 266:10982-10988)。
【０１８９】
本発明のCHOPまたはその断片を用いて、CHOPの活性をモジュレートする化合物をスクリーニングし得る。このような化合物には、アゴニスト、アンタゴニスト、部分的アゴニスト、または逆アゴニスト等が含まれる。ある実施態様では、CHOPの活性が許容される条件下でアッセイを実施し、そのアッセイでは少なくとも1つの試験化合物をCHOPと混合し、試験化合物の存在下でCHOPの活性を試験化合物不在下でのCHOPの活性と比較する。試験化合物の存在下でのCHOPの活性の変化は、CHOPの活性をモジュレートする化合物の存在を示唆する。別の実施態様において、試験化合物をCHOPの活性に適した条件下でCHOPを含むin vitroまたは無細胞再構成系と結合させてアッセイを実施する。これらアッセイの何れかにおいて、CHOPの活性を調節する試験化合物は間接的に結合する場合があり、その際は試験化合物と直接接触する必要がない。少なくとも１つから複数の試験化合物をスクリーニングすることができる。
【０１９０】
別の実施態様では、胚性幹細胞（ES細胞）における相同組換えを用いて動物モデル系内で、CHOPまたはその哺乳類相同体をコードするポリヌクレオチドを「ノックアウト」する。このような技術は当技術分野において周知であり、ヒト疾患動物モデルの作製に有用である（米国特許第5,175,383号及び第5,767,337号）。例えば129/SvJ細胞株等のマウスES細胞は初期のマウス胚に由来し、培地で増殖させることができる。このES細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（neo: Capecchi, M.R.（1989）Science 244:1288-1292）などのマーカー遺伝子で破壊した、目的の遺伝子を持つベクターで形質転換する。このベクターは、相同組換えにより宿主ゲノムの対応する領域に組み込まれる。或いは、Cre-loxP系を用いて相同組換えを行い、組織特異的または発生段階特異的に目的遺伝子をノックアウトする(Marth, J.D. (1996) Clin. Invest. 97:1999-2002; Wagner, K.U.他(1997) Nucleic Acids Res.25:4323-4330).  形質転換したES細胞を同定し、例えばC57BL/6マウス系等から採取したマウス細胞胚盤胞に微量注入する。胚盤胞を偽妊娠メスに外科的に導入し、得られるキメラ子孫の遺伝形質を決め、これを交配させてヘテロ接合性系またはホモ接合性系を作製する。このようにして作製した遺伝子組換え動物は、潜在的な治療薬や毒性薬物で検査されうる。
【０１９１】
CHOPをコードするポリヌクレオチドをin vitroでヒト胚盤胞由来のES細胞において操作することが可能である。ヒトES細胞は、内胚葉、中胚葉及び外胚葉の細胞の種類を含む少なくとも８つの別々の細胞系統に分化する可能性を有する。これらの細胞系統は、例えば神経細胞、造血系統及び心筋細胞に分化する（Thomson, J.A. 他 (1998) Science 282:1145-1 147）。
【０１９２】
CHOPをコードするポリヌクレオチドを用いて、ヒト疾患をモデルとした「ノックイン」ヒト化動物（ブタ）または遺伝子組換え動物（マウスまたはラット）を作製することもできる。ノックイン技術を用いて、CHOPをコードするポリヌクレオチドのある領域を動物ES細胞に注入し、注入した配列を動物細胞ゲノムに組み込ませる。形質転換細胞を胞胚に注入し、胞胚を上記のように移植する。遺伝子組換え子孫または近交系について研究し、可能性のある医薬品を用いて処理し、ヒトの疾患の治療に関する情報を得る。別法では、例えばGCRECを乳汁内に分泌するなどCHOPを過剰に発現する哺乳動物近交系は、便利なタンパク質源となり得る（Janne, J. 他 (1998) Biotechnol. Annu. Rev. 4:55-74）。
【０１９３】
（治療）
CHOPのある領域と糖結合タンパク質の領域との間に、例えば配列およびモチーフの内容における化学的および構造的類似性が存在する。さらに、CHOPを発現する組織の例が、表６および実施例11に見つけられる。従って、CHOPは、糖質代謝、細胞増殖異常、自己免疫／炎症性の疾患、生殖系疾患、遺伝疾患、輸送疾患、神経系疾患および癌においてある役割を果たすと考えられる。CHOPの発現若しくは活性の増大に関連する疾患の治療においては、CHOPの発現または活性を低下させることが望ましい。また、CHOPの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、CHOPの発現または活性を増大させることが望ましい。
【０１９４】
従って、一実施例において、CHOPの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、患者にCHOPまたはその断片や誘導体を投与することが可能である。限定されるものではないが、そのような疾患として、先天性II型異常赤血球産生症性貧血、糖尿病、インスリン依存型真性糖尿病、非インスリン依存型真性糖尿病、フルクトース-1,6-ジホスファターゼ欠乏症、ガラクトース血症、グルカゴノーマ、遺伝性フルクトース不耐症、低血糖症、マンノシドーシス、ノイラミニダーゼ欠乏症、肥満、ガラクトースエピメラーゼ欠乏症、糖原病、リソソーム蓄積症、果糖尿、五炭糖尿症、糖質欠損糖タンパク質症候群（１A型および１B型CDGS）、自己免疫性甲状腺疾患、アスパルチルグルコサミン尿症、GM１ガングリオシド蓄積症、GM2ガングリオシド蓄積症、β-ガタクトシダーゼβ-N-アセチルヘキソサミニダーゼ欠乏症、糖脂質蓄積症、神経機能不全、シアリドーシス、肝脾腫大症、および遺伝性ピルビン酸代謝異常が含まれ；    細胞増殖異常には日光性角化症、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症が含まれ；    自己免疫/炎症性疾患には、後天性免疫不全症候群(AIDS)、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血症、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー皮膚炎、皮膚筋炎、真性糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、胎児赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、慢性関節リウマチ炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷が含まれ；  生殖系疾患としては、プロラクチン産生障害、不妊症、卵管疾患、排卵欠損症、子宮内膜症、性周期障害、月経周期障害、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣過刺激症候群、子宮内膜癌、卵巣癌、子宮筋腫、自己免疫疾患、子宮外妊娠、催奇形、乳がん、繊維嚢胞性乳房疾患、乳漏症、精子形成破壊、精子異常生理、精巣癌、前立腺癌、良性前立腺肥大、前立腺炎、パイロニー病、性交不能、男性乳癌、女性化乳房、高ゴナドトロピン性腺機能低下症、低ゴナドトロピン性腺機能低下症、偽性半陰陽、無精子症、早発性卵巣不全症、アクロシン欠乏症、思春期遅延、逆行性射精、無射精anejaculation、および血管芽細胞腫、嚢胞褐色細胞腫(cystsphaeochromocytomas)、傍神経節腫、副睾丸の嚢腺腫、および内リンパ嚢腫瘍が含まれ；  遺伝疾患としては副腎脳白質ジストロフィー、Alport症候群、コロイデレミア、デュシェンヌおよびベッカー型筋ジストロフィー、ダウン症候群、嚢胞性線維症、慢性肉芽腫症、ゴーシェ病、ハンチントン病、Marfan症候群���筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー、ピクノディスオストーシス、Refsum症候群、網膜芽細胞種、鎌形赤血球貧血症、サラセミア、ウェルナー症候群、von Willebrand症候群、ウィルムス腫瘍、ゼルウィガー症候群、ペルオキシソームアシルCoAオキシダーゼ欠乏症、ペルオキシソームチオラーゼ欠乏症、ペルオキシソーム二価性タンパク質欠乏症、ミトコンドリアカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼおよびカルニチン欠乏症、ミトコンドリア長鎖アシルCoAデヒドロゲナーゼ欠乏症、ミトコンドリア中鎖アシルCoAデヒドロゲナーゼ欠乏症、ミトコンドリア短鎖アシルCoAデヒドロゲナーゼ欠乏症、ミトコンドリア電子伝達フラビンタンパク質および電子伝達フラビンタンパク質：ユービキノンオキシドレダクターゼ欠乏症、ミトコンドリア三価性タンパク質欠乏症およびミトコンドリア短鎖３ヒドロキシアシルCoAデヒドロゲナーゼ欠乏症が含まれ；  輸送疾患としては、運動不能症、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症, 顔面神経麻痺、シャルコー・マリー・ツース病、 尿崩症, 高カリウム血性周期性四肢麻痺、 正常カリウム血性周期性四肢麻痺, パーキンソン病、 悪性高体温症, 多剤耐性, 重症筋無力症, ジストニー, 末梢神経障害；  輸送に関連する心臓疾患として例えば狭心症, 徐脈性不整脈, 頻脈性不整脈, 高血圧, QT延長症候群, 心筋炎, 心筋症, ネマリンミオパシー, 中心核ミオパシー, 脂質ミオパシー, ミトコンドリアミオパシー, 甲状腺中毒性ミオパシー, エタノールミオパシー, 皮膚筋炎, 封入体筋炎, 感染性筋炎, 多発性筋炎；  輸送に関連する神経疾患として例えばアルツハイマー病, 記憶喪失、双極性障害、痴呆、 鬱病、 癲癇、トゥーレット病、パラノイド精神病、 および精神分裂病(統合失調症)；   輸送に関連するその他の疾患として例えば神経線維腫症、ヘルペス後神経痛、三叉神経障害, サルコイドーシス、 鎌状赤血球貧血、 ウィルソン病、 白内障、 不妊症、 肺動脈狭窄、 感音常染色体難聴、 高血糖症、 低血糖症、 グレーヴズ病、 甲状腺腫、 クッシング病、 アジソン病、 グルコース・ガラクトース吸収不良症候群、グリコーゲン貯蔵病、高コレステロール血症、 副腎脳白質ジストロフィー、Menkes病、 後角症候群、 von Gierke病、シスチン尿症、 イミノグリシン尿症、Hartup病、およびファンコーニ病が含まれ；  神経の疾患の中には、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、ピック病、ハンチントン病、及びその他の錐体外路障害、筋萎縮性側策硬化及びその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患、プリオン病（クールー、クロイツフェルト‐ヤコブ病、ゲルストマン症候群、及びGerstmann-Straussler-Scheinker症候群を含む）、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管芽腫（cerebelloretinal hemangioblastomatosis）、脳３叉神経血管症候群、ダウン症候群を含む中枢神経系性の精神薄弱及び他の発生障害、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄障害、筋ジストロフィー及びその他の神経筋障害、末梢���経疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎、遺伝性、代謝性、内分泌性、及び中毒性の筋疾患、重症筋無力症、周期性四肢麻痺、精神病（気分性、不安性の障害）、季節性障害（SAD）、静座不能、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群、ジストニー、帯状疱疹後神経痛、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核部変性症、及び家族性の前頭側頭性健忘症とが含まれ；  癌としては腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、および奇形癌など、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、および子宮の癌が含まれる。
【０１９５】
別の実施態様では、CHOPまたはその断片や誘導体を発現し得るベクターを患者に投与して、上記しだけに限られるものではないが疾患を含むCHOPの発現または活性の低下に関連した疾患を治療または予防することも可能である。
【０１９６】
さらに別の実施態様では、実質的に精製されたCHOPを含む組成物を好適な医薬用キャリアと共に患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むCHOPの発現または活性の低下に関連した疾患を治療または予防することも可能である。
【０１９７】
更に別の実施例では、CHOPの活性を調節するアゴニストを患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むCHOPの発現または活性の低下に関連した疾患を治療または予防することも可能である。
【０１９８】
更なる実施例では、CHOPの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、患者にCHOPのアンタゴニストを投与することが可能である。限定するものではないが、このような疾患の例には、上記した細胞増殖異常、自己免疫／炎症性の疾患、生殖系疾患、および神経系疾患が含まれる。一実施態様では、CHOPと特異的に結合する抗体が直接アンタゴニストとして、或いはCHOPを発現する細胞または組織に薬剤を運ぶターゲッティング或いは送達機構として間接的に用いられ得る。
【０１９９】
別の実施態様では、限定するものではないが上に列記した疾患を含む、CHOPの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、CHOPをコードするポリヌクレオチドの相補配列を発現するベクターを被験者に投与し得る。
【０２００】
別の実施態様では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、相補配列、またはベクターを、別の好適な治療薬と組み合わせて投与することもできる。併用療法で用いる好適な治療薬は、当業者が従来の医薬原理に従って選択し得る。治療薬と組合せることにより、上記した種々の疾患の治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法を用いることにより少量の各薬剤で医薬効果をあげることが可能となり、それによって副作用の可能性を低減し得る。
【０２０１】
CHOPのアンタゴニストは、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能である。詳しくは、精製されたCHOPを用いて抗体を作ったり、治療薬のライブラリをスクリーニングしてCHOPと特異的に結合するものの同定が可能である。CHOPへの抗体も、本技術分野で公知の方法を用いて製造することが可能である。限定するものではないがこのような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Fab断片、およびFab発現ライブラリによって作られた断片が含まれ得る。中和抗体（即ち二量体の形成を阻害する抗体）は通常、治療用に好適である。一本鎖抗体（例えば由来はラクダまたはラマ）は強力な酵素阻害剤である可能性があり、ペプチド擬態の設計および免疫吸着剤およびバイオセンサの開発に有用である可能性がある(Muyldermans, S. (2001) J. Biotechnol. 74:277-302)。
【０２０２】
抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、ヒト及びその他のものを含む種々の宿主が、CHOPまたは任意の断片、または免疫原性の特性を備えるそのオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。限定するものではないがこのようなアジュバントには、フロイントアジュバントと、水酸化アルミニウム等のミネラルゲルアジュバントと、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、スカシガイのヘモシニアン、ジニトロフェノール等の界面活性剤とがある。ヒトに用いられるアジュバントの中では、BCG（カルメット‐ゲラン杆菌）及びコリネバクテリウム‐パルバム（Corynebacterium parvum）が特に好ましい。
【０２０３】
CHOPに対する抗体を誘導するために用いるオリゴペプチド、ペプチドまたは断片は、少なくとも約５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を持つものが好ましく、一般的には約１０個以上のアミノ酸からなるものとなる。これらのオリゴペプチド、ペプチドまたは断片は、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であることが望ましい。CHOPのアミノ酸の短いストレッチは、ＫＬＨなどの別のタンパク質の配列と融合し、キメラ分子に対する抗体が産生され得る。
【０２０４】
CHOPに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって、抗体分子を産生する任意の技術を用いて作製することが可能である。限定するものではないがこのような技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術及びEBV-ハイブリドーマ技術がある（Kohler, G. 他 (1975) Nature 256:495-497、Kozbor, D. 他 (1985) .J. Immunol. Methods 81:31-42、Cote, R.J. 他 (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030、Cole, S.P. 他 (1984) Mol. Cell Biol. 62:109-120）。
【０２０５】
更に、ヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺伝子をスプライシングするなどの、「キメラ抗体」作製のために発達した技術が、好適な抗原特異性及び生物学的活性を備える分子を得るために用いられる（Morrison, S.L.他. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81−4851−4855; Neuberger, M.S.他. (1984) Nature 312:604-608; Takeda, S.他 (1985) Nature 314:452,454）。別法では、当分野で周知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して、CHOP特異性一本鎖抗体を生成する。関連特異性を有するがイディオタイプ組成が異なるような抗体を、ランダムな組合せの免疫グロブリンライブラリからチェーンシャッフリングによって産生することもできる（Burton D.R. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10134-10137）。
【０２０６】
抗体の産生は、リンパ球集団におけるin vivo産生の誘導によって、或いは文献に開示されているように非常に特異的な結合試薬の免疫グロブリンライブラリまたはパネルのスクリーニングによっても行い得る（Orlandi, R. 他 (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833-3837、Winter, G. 他 (1991) Nature 349:293-299）。
【０２０７】
CHOPに対する特異結合部位を持つ抗体断片をも産生し得る。例えば、限定するものではないが、このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって作製されるF(ab')2 断片と、F(ab')2 断片のジスルフィド架橋を還元することによって作製されるFab断片とがある。或いは、Fab発現ライブラリを作製することによって、モノクローナルFab断片を所望の特異性と迅速且つ容易に同定することが可能となる（Huse, W.D. 他 (1989) Science 246:1275-1281）。
【０２０８】
種々の免疫学的検定（イムノアッセイ）を用いてスクリーニングすることにより、所望の特異性を有する抗体を同定し得る。確立された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の何れかを用いる競合結合アッセイ、または免疫放射線アッセイのための数々のプロトコルが、当分野では周知である。 通常このようなイムノアッセイには、CHOPとその特異抗体との間の複合体形成の計測が含まれる。二つの非干渉性CHOP エピトープに対して反応性のモノクローナル抗体を用いる、２部位モノクローナルベースのイムノアッセイが一般に利用されるが、競合的結合アッセイも利用することができる(Pound、前出)。
【０２０９】
ラジオイムノアッセイ技術と共にScatchard分析などの様々な方法を用いて、CHOPに対する抗体の親和性を評価し得る。親和性を結合定数Kaで表すが、このKaは、平衡状態の下でCHOP抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモル濃度で除して得られる値である。多数のCHOPエピトープに対して親和性が不均一なポリクローナル抗体医薬のＫａは、CHOPに対する抗体の平均親和性または結合活性を表す。モノクローナル抗体は或る特定のCHOPエピトープに対して単一特異的であり、モノクローナル抗体の或る製剤について判定したKaは、親和性の真の測定値を表す。Ka値が約１０9〜１０12 L/molの範囲にあるような高親和性抗体試薬は、CHOP抗体複合体が激しい操作に耐えなければならないイムノアッセイに用いるのが好ましい。Ka値が１０６〜１０７Ｌ／ｍｏｌの低親和性抗体医薬は、CHOPが抗体から最終的に活性化状態で解離する必要がある免疫精製（immunopurification）及び類似の処理に用いるのが好ましい。 (Catty, D. (1988) Antibodies, Volume I: A Practical Approach. IRL Press, Washington, DC; Liddell, J. E. and Cryer, A. (1991) A Practical Guide to Monoclonal Antibodies, John Wiley & Sons, New York NY)。
【０２１０】
ポリクローナル抗体製剤の抗体価および結合活性を更に評価して、後に使う或る適用例に対するこのような試薬の品質および適性を決定することができる。例えば、少なくとも１〜２ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体、好ましくは５〜１０ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体を含むポリクローナル抗体製剤は一般に、CHOP抗体複合体を沈殿させなければならない処理に用いられる。抗体の特異性、抗体価、結合活性、様々な適用例における抗体の品質や使用に対する指針については、一般に入手可能である（Catty、前出、Coligan 他、前出）。
【０２１１】
本発明の別の実施態様では、CHOPをコードするポリヌクレオチド、またはその任意の断片や相補配列を、治療目的で使用できる。ある実施態様では、CHOPをコードする遺伝子のコーディング領域や調節領域に相補的な配列やアンチセンス分子（DNA及びRNA、修飾ヌクレオチド）を設計して遺伝子発現を変更することができる。このような技術は当分野では周知であり、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは大きな断片が、CHOPをコードする配列の制御領域から、またはコード領域に沿ったさまざまな位置から設計可能である（Agrawal, S., 編集 (1996) Antisense Therapeutics, Humana Press Inc., Totawa NJ 等を参照）。
【０２１２】
治療に用いる場合、アンチセンス配列を適切な標的細胞に導入するのに好適な、任意の遺伝子送達系を用いることができる。アンチセンス配列は、転写時に標的タンパク質をコードする細胞配列の少なくとも一部に相補的な配列を発現する発現プラスミドの形で細胞内に送達することが可能である（Slater, J.E. 他 (1998) J. Allergy Clin. Immunol. 102(3):469-475 及び Scanlon, K.J. 他 (1995)9(13):1288-1296）。アンチセンス配列はまた、例えばレトロウイルスやアデノ関連ウイルスベクター等のウイルスベクターを用いて細胞内に導入することもできる（Miller, A.D. (1990) Blood 76:271、前出のAusubel、Uckert, W. 及び W. Walther (1994) Pharmacol. Ther. 63(3):323-347）。その他の遺伝送達機構には、リポソーム系、人工的なウイルスエンベロープ及び当分野で公知のその他のシステムが含まれる（Rossi, J.J. (1995) Br. Med. Bull. 51(1):217-225; Boado、R.J.他 (1998) J. Pharm. Sci. 87(11):1308-1315、Morris, M.C. 他 (1997) Nucleic Acids Res. 25(14):2730-2736）。
【０２１３】
本発明の別の実施態様では、CHOPをコードするポリヌクレオチドを、体細胞若しくは生殖細胞の遺伝子治療に用い得る。遺伝子治療を行うことにより、（i）遺伝子欠損症（例えばＸ染色体鎖遺伝（Cavazzana-Calvo, M. 他 (2000) Science 288:669-672）により特徴付けられる重度の複合型免疫欠損(SCID)-X1の場合）、先天性アデノシンデアミナーゼ（ADA）欠損症に関連する重度の複合型免疫欠損（Blaese, R.M. 他 (1995) Science 270:475-480、Bordignon, C. 他 (1995) Science 270:470-475）、嚢胞性繊維症（Zabner, J. 他 (1993) Cell 75:207-216: Crystal、R.G. 他 (1995) Hum. Gene  Therapy 6:643-666、Crystal, R.G. 他 (1995) Hum. Gene Therapy 6:667-703）、サラセミア（thalassamia）、家族性高コレステロール血症、第VIII因子若しくは第IX因子欠損に起因する血友病（Crystal, 35  R.G. (1995) Science 270:404-410、Verma, I.M. および N. Somia (1997) Nature 389:239-242）を治療し、（ii）条件的致死性遺伝子産物を発現させ（例えば制御不能な細胞増殖に起因する癌の場合）、（iii）細胞内の寄生虫（例えばヒト免疫不全ウイルス(HIV)（Baltimore, D. (1988) Nature 335:395-396、Poescbla, E. 他 (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:11395-11399）、B型若しくはC型肝炎ウイルス（HBV、HCV）、Candida albicans及びParacoccidioides brasiliensis等の真菌寄生虫、並びにPlasmodium falciparum及びTrypanosoma cruzi等の原虫寄生体に対する防御機能を有するタンパク質を発現させることができる。CHOPの発現若しくは調節に必要な遺伝子の欠損が疾患を引き起こす場合、導入した細胞の好適な集団からCHOPを発現させて、遺伝子欠損によって起こる症状の発現を緩和することが可能である。
【０２１４】
本発明の更なる実施態様では、CHOPの欠損による疾患や障害を、CHOPをコードする哺乳類発現ベクターを作製し、これらのベクターを機械的手段によってCHOP欠損細胞に導入することによって治療する。in vivoあるいはex vitroの細胞に用いる機械的導入技術には、（i）個々の細胞内への直接的なDNA微量注射法、（ii）遺伝子銃、（iii）リポソームを介した形質移入、（iv）受容体を介した遺伝子導入、および（v）DNAトランスポゾンの使用がある（Morgan, R.A. および W.F. Anderson（1993）Annu. Rev. Biochem. 62:191-217、Ivics, Z.（1997）Cell 91:501-510; Boulay, J-L. およびH. Recipon（1998）Curr. Opin. Biotechnol. 9:445-450）。
【０２１５】
CHOPの発現に効果的である発現ベクターには、限定するものではないが、PCDNA 3.1、EPITAG、 PRCCMV2、PREP、 PVAX, PCR2-TOPOTA ベクター (Invitrogen, Carlsbad CA)、 PCMVSCRIPT、 PCMV-TAG、PEGSH/PERV (Stratagene, La Jolla CA)およびPTETOFF、PTETON、 PTRE2、 PTRE2LUC、 PTKHYG (Clontech, Palo Alto CA)が含まれる。CHOPを発現させるために、（i）恒常的に活性なプロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（CMV）、ラウス肉腫ウイルス（RSV）、SV40ウイルス、チミジンキナーゼ（TK）、若しくはβ−アクチン遺伝子等）、(ii)誘導性プロモーター（例えば、市販されているT-REXプラスミド（Invitrogen）に含まれている、テトラサイクリン調節性プロモーター（Gossen, M. and H. Bujard (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:5547-5551; Gossen, M. 他 (1995) Science 268:1766-1769; Rossi, F.M.V. and H.M. Blau (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:451-456））、エクジソン誘導性プロモーター（市販されているプラスミドPVGRXR及びPINDに含まれている：Invitrogen）、FK506／ラパマイシン誘導性プロモーター、またはRU486／ミフェプリストーン誘導性プロモーター（Rossi および Blau, 前出）、または（iii）正常な個体に由来するGCRECをコードする内在性遺伝子の天然のプロモーター若しくは組織特異的プロモーターを用いることが可能である。
【０２１６】
市販のリポソーム形質転換キット（例えばInvitrogen社のPERFECT LIPID TRANSFECTION KIT）を用いれば、当業者は経験にそれほど頼らないでもポリヌクレオチドを培養中の標的細胞に導入することが可能になる。別法では、リン酸カルシウム法（Graham. F.L. 及び A.J. Eb (1973) Virology 52:456-467）若しくは電気穿孔法（Neumann, B. 他 (1982) EMBO J. 1:841-845）を用いて形質転換を行う。初代培養細胞にDNAを導入するためには、標準化された哺乳動物の形質移入プロトコルの修飾が必要である。
【０２１７】
本発明の別の実施態様では、CHOPの発現に関連する遺伝子欠損によって起こる疾患や障害は、(i)レトロウイルス末端反復配列(LTR)プロモーター若しくは独立したプロモーターの調節の下でCHOPをコードするポリヌクレオチドと、(ii)好適なRNAパッケージングシグナルと、(iii)追加のレトロウイルス・シス作用性RNA配列及び効率的なベクターの増殖に必要なコード配列を伴うRev応答性エレメント(RRE)と、からなるレトロウイルスベクターを作製して治療することができる。レトロウイルスベクター（例えばPFB及びPFBNEO）はStratagene社から市販されており、刊行データ（Riviere, I. 他 (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:6733-6737）に基づいている。上記データを引用することをもって本明細書の一部とする。ベクターは、好適なベクター産生細胞株（VPCL）において増殖され、VPCLは、標的細胞上の受容体に対する親和性を有するエンベロープ遺伝子またはVSVg等の汎親和性エンベロープタンパク質を発現する（Armentano, D. 他 (1987) J. Virol. 61:1647-1650、Bender, M.A. 他 (1987) J. Virol. 61:1639-1646、Adam, M.A. および A.D. Miller (1988) J. Virol. 62:3802-3806、Dull, T. 他 (1998) J. Virol. 72:8463-8471、Zufferey, R. 他 (1998) J. Virol. 72:9873-9880）。Riggに付与された米国特許第5,910,434号（「Method for obtaining retrovirus packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant」）において、レトロウイルスパッケージング細胞株を得るための方法が開示されており、引用することをもって本明細書の一部とする。レトロウイルスベクターの増殖、細胞集団（例えばCD4+ Ｔ細胞）の形質導入、及び形質導入した細胞の患者への戻しは、遺伝子治療の分野では当業者に公知の方法であり、多数の文献に記載されている（Ranga, U. 他 (1997) J. Virol. 71:7020-7029、Bauer, G. 他 (1997) Blood 89:2259-2267、Bonyhadi, M.L. (1997) J. Virol. 71:4707-4716、Ranga, U. 他 (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:1201-1206、Su, L. (1997) Blood 89:2283-2290）。
【０２１８】
別法では、アデノウイルス系遺伝子治療の或る送達系を用いて、CHOPの発現に関連する１つ以上の遺伝子異常を有する細胞群に、CHOPをコードするポリヌクレオチド群を送達する。アデノウイルス系ベクターの作製及びパッケージングについては、当業者に公知である。複製欠損型アデノウイルスベクターは、免疫調節タンパク質をコードする遺伝子を膵臓の無損傷の膵島内に導入するために融通のきくことが証明された（Csete, M.E.他 (1995) Transplantation 27:263-268）。使用できる可能性のあるアデノウイルスベクターは、Armentanoに付与された米国特許第5,707,618号（「Adenovirus vectors for gene therapy」）に記載されており、引用することをもって本明細書の一部とする。アデノウイルスベクターについては、Antinozzi 他 (1999) Annu. Rev. Nutr. 19:511-544 及び VermaおよびSomia (1997) Nature 18:389:239-242も参照されたい。両文献は、引用することをもって本明細書の一部とする。
【０２１９】
別法では、ヘルペス系遺伝子治療の送達系を用いて、CHOPの発現に関連する１つ或いは複数の遺伝子異常を有する標的細胞に、CHOPをコードするポリヌクレオチドを送達する。単純疱疹ウイルス（HSV）系のベクターは、HSV親和性の中枢神経細胞にCHOP を導入する際に特に重要である。ヘルペス系ベクターの作製及びパッケージングは、当業者に公知である。複製適格性単純ヘルペスウイルス（HSV）I型系のベクターは、レポーター遺伝子を霊長類の眼に送達するために用いられてきた（Liu, X. 他 (1999) Exp. Eye Res.169:385-395）。HSV-1ウイルスベクターの作製についても、DeLucaに付与された米国特許第5,804,413号（「Herpes simplex virus swains for gene transfer」）に開示されており、該特許の引用をもって本明細書の一部とする。 米国特許第5,804,413号には、ヒト遺伝子治療を含む目的のために好適なプロモーターの制御下において細胞に導入される少なくとも１つの外在性遺伝子を有するゲノムを含む組換えHSV d92についての記載がある。上記特許はまた、ICP4、ICP27及びICP22のために除去される組換えHSV系統の作製及び使用について開示している。HSVベクターについては、Goins他 (1999) J. Virol. 73:519-532 及び Xu他(1994) Dev. Biol. 163:152-161も参照されたい。両文献は、引用をもって本明細書の一部とする。クローン化ヘルペスウイルス配列の操作、巨大ヘルペスウイルスのゲノムの異なった部分を含む多数のプラスミドを形質移入した後の組換えウイルスの産生、ヘルペスウイルスの成長及び増殖、並びにヘルペスウイルスの細胞への感染は、当業者に公知の技術である。
【０２２０】
別法では、或るαウイルス(正の一本鎖RNAウイルス)ベクターを用いて、CHOPをコードするポリヌクレオチド群を標的細胞群に送達する。プロトタイプのαウイルスであるセムリキ森林熱ウイルス（Semliki Forest Virus, SFV）の生物学的研究が広範に行われており、遺伝子導入ベクターがSFVゲノムに基づいていることが分かった（Garoff, H. 及び K.-J. Li (1998) Cun. Opin. Biotech. 9:464-469）。αウイルスRNAの複製中に、通常はウイルスのキャプシッドタンパク質をコードするサブゲノムRNAが作り出される。このサブゲノムRNAは、完全長のゲノムRNAより高いレベルに複製されるため、酵素活性（例えばプロテアーゼ及びポリメラーゼ）を有するウイルスタンパク質に比べてキャプシッドタンパク質が過剰産生される。同様に、CHOPをコードする配列をαウイルスゲノムのキャプシッドをコードする領域に導入することによって、ベクター導入細胞において多数のCHOPをコードするRNAが産生され、高いレベルでCHOPが合成される。通常はαウイルスの感染が数日以内での細胞溶解に関係する一方で、シンドビスウイルス（SIN）の変異体を有するハムスター正常腎臓細胞（BHK-21）の持続的な感染を確立する能力は、αウイルスの溶解複製を遺伝子治療に適用できるように好適に変更可能であることを示唆している（Dryga, S.A. 他 (1997) Virology 228 :74-83）。様々な宿主にαウイルスを導入できるので、様々なタイプの細胞にCHOPを導入することができる。或る集団におけるサブセットの細胞の特定形質導入は、形質導入前に細胞の選別を必要とし得る。αウイルスの感染性cDNAクローンの処置方法、αウイルスのcDNA及びRNAの形質移入方法及びαウイルスの感染方法は、当業者に公知である。
【０２２１】
転写開始部位由来のオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子発現を阻害することも可能である。転写開始部位(transcription initiation site)とは例えばスタート部位(start site)から数えて約−10と約＋10の間である。同様に、三重らせん塩基対の形成方法を用いて阻害が可能となる。三重らせん塩基対形成は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合のために充分に開く、二重らせんの能力を阻害するので有用である。三重らせんDNAを用いる最近の治療の進歩については文献に記載がある（Gee, J.E. 他 (1994) in: Huber, B.E.及び B.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY, 163-177ページ）。相補配列またはアンチセンス分子もまた、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってmRNAの翻訳を阻止するべく設計することができる。
【０２２２】
リボザイムは酵素的RNA分子であり、RNAの特異的切断を触媒するためにリボザイムを用いることもできる。リボザイム作用のメカニズムは、相補的標的RNAへのリボザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションとその後に起こる内ヌクレオチド鎖切断に関与している。例えば、人工的に作製されたハンマーヘッド型リボザイム分子が、CHOPをコードする配列の内ヌクレオチド鎖分解性の切断を特異的且つ効果的に触媒できる可能性がある。
【０２２３】
任意のRNA標的内の特異的リボザイム切断部位は、GUA、GUU、GUC配列を含めたリボザイム切断部位に対して標的分子をスキャンすることによって先ず同定される。一度同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０リボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列が、そのオリゴヌクレオチドを機能不全にするような２次構造の特徴をもっていないかを評価することが可能になる。候補標的の適合性の評価も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのアクセス可能性をテストすることによって行うことができる。
【０２２４】
本発明の相補リボ核酸分子およびリボザイムは、核酸分子合成のために当分野でよく知られている任意の方法を用いて作製し得る。任意の方法には、固相フォスフォアミダイト化学合成等のオリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法がある。或いは、CHOPをコードするDNA配列のin vitro及びin vivo転写によってRNA分子を産出し得る。このようなDNA配列は、T7やSP6等の好適なRNAポリメラーゼプロモーターを用いて多様なベクター内に取り込むことが可能である。或いは、相補的RNAを構成的或いは誘導的に合成するようなこれらcDNA産物を、細胞系、細胞または組織内に導入することができる。
【０２２５】
細胞内の安定性を高め、半減期を長くするためにRNA分子を修飾することができる。限定するものではないが可能な修飾としては、分子の5'末端、3'末端、あるいはその両方において隣接配列群を追加することや、分子の主鎖内においてホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエートまたは2'O-メチルを使用することが含まれる。この概念は、PNAの産出に固有のものであり、これら全ての分子に拡大することができる。それには、内因性エンドヌクレアーゼによって容易には認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、及びウリジンにアセチル−、メチル−、チオ−及び同様の修飾をしたものの他、非従来型塩基、例えばイノシン、クエオシン（queosine）、ワイブトシン（wybutosine）等を加えることでできる。
【０２２６】
本発明の更なる実施例は、CHOPをコードするポリヌクレオチドの発現の改変に有効な化合物をスクリーニングする方法を含む。限定するものではないが特異ポリヌクレオチドの発現変化を起こすのに有効な化合物には、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、転写因子その他のポリペプチド転写制御因子、及び特異ポリヌクレオチド配列と相互作用し得る非高分子化学的実体がある。有効な化合物は、ポリヌクレオチド発現のインヒビターまたはエンハンサーのいずれかとして作用することによりポリヌクレオチド発現を変異し得る。従って、CHOPの発現または活性の増加に関連する疾患の治療においては、CHOPをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害する化合物が治療上有用であり、CHOPの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、CHOPをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に促進する化合物が治療上有用であり得る。
【０２２７】
或る特定ポリヌクレオチドの発現を改変する際の有効性について、少なくとも１個、または複数個の試験化合物をスクリーニングし得る。試験化合物は、当分野で通常知られている任意の方法により得られる。このような方法には、ポリヌクレオチドの発現を変異させる場合と、既に、市販のまたは私的な、天然または非天然の化合物ライブラリから選択する場合と、標的ポリヌクレオチドの化学的及び／または構造的特性に基づく化合物を合理的にデザインする場合と、組合せ的にまたは無作為に生成した化合物のライブラリから選択する場合に有効であることが知られているような化合物の化学修飾がある。CHOPをコードするポリヌクレオチドを含むサンプルは、少なくとも１つの試験化合物に曝露して得る。サンプルには例えば、無傷細胞、透過化処理した細胞、無細胞再構成系または再構成生化学系があり得る。CHOPをコードするポリヌクレオチドの発現における改変は、当分野で周知の任意の方法でアッセイする。通常は、CHOPをコードするポリヌクレオチドの配列に相補的なヌクレオチド配列を有するプローブを用いたハイブリダイゼーションにより、特定のヌクレオチドの発現を検出する。ハイブリダイゼーション量を定量し、それによって１つ以上の試験化合物に曝露される及び曝露されないポリヌクレオチドの発現の比較に対する基礎を形成し得る。試験化合物に曝露されるポリヌクレオチドの発現における変化の検出は、ポリヌクレオチドの発現を変異する際に試験化合物が有効であることを示している。特異ポリヌクレオチドの発現改変に有効な化合物に対して、例えば分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）遺伝子発現系（Atkins, D. 他 (1999) 米国特許第5,932,435号、Arndt, G.M. 他 (2000) Nucleic Acids Res. 28:E15）またはHeLa細胞等のヒト細胞株（Clarke, M.L. 他 (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 268:8-13）を用いてスクリーニングを実行する。本発明の或る特定の実施態様は、或る特定ポリヌクレオチド配列に対するアンチセンス活性について、オリゴヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸、修飾したオリゴヌクレオチド）の組み合わせライブラリをスクリーニングする過程に関する（Bruice, T.W. 他 (1997) U.S. Patent No. 5,686,242、Bruice, T.W. 他. (2000) U.S. Patent No. 6,022,691)。
【０２２８】
ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が利用可能であり、in vivo、in vitro及びex vivoの使用に対して同程度に適している。ex vivo治療の場合、ベクターを患者から採取した幹細胞内に導入し、クローニング増殖して同一患者に自家移植で戻すことができる。トランスフェクション、リポソーム注入またはポリカチオンアミノポリマーによる送達は、当分野でよく知られている方法を用いて実行することができる（Goldman, C.K. 他 (1997) Nat. Biotechnol. 15:462-466）。
【０２２９】
上記の治療方法はいずれも、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サルなどの哺乳類を含めて治療が必要な全ての被験体に適用できる。
【０２３０】
本発明の追加実施例は、通常薬剤として許容できる賦形剤で処方される活性成分を有する組成物の投与に関連する。賦形剤には例えば、糖、でんぷん、セルロース、ゴム及びタンパク質がある。様々な処方が通常知られており、詳細はRemington's Pharmaceutical Sciences（Maack Publishing, Easton PA）の最新版に記載されている。このような成分は、CHOP、CHOPに対する抗体、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト、またはCHOPインヒビターから構成し得る。
【０２３１】
本発明に用いられる組成物は、任意の数の経路によって投与することができ、限定するものではないが経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸がある。
【０２３２】
肺から投与する組成物は、液状または乾燥粉末状で調製し得る。このような組成物は通常、患者が吸入する直前にエアロゾル化する。小分子（例えば従来の低分子量有機薬）の場合には、速効製剤のエアロゾル送達は当分野で公知である。高分子（例えばより大きなペプチド及びタンパク質）の場合には、当該分野において肺の肺胞領域を介しての肺送達が最近向上したことにより、インスリン等の薬剤を実質的に血液循環へ輸送することを可能にした（Patton, J.S. 他, 米国特許第5,997,848号）。肺送達は、針注射なしに投与する点で優れており、有毒な可能性のある浸透エンハンサーの必要性をなくす。
【０２３３】
本発明での使用に適した組成物には、所定の目的を達成するために必要なだけの量の活性成分を含有する成分が含まれる。有効投与量の決定は、当業者の能力の範囲内で行う。
【０２３４】
CHOPを有する、またはその断片群を有する高分子群を直接、細胞内に送達すべく、特殊な種々の形状の組成物群が調製され得る。例えば、細胞不透過性高分子を含むリポソーム製剤は、細胞融合及び高分子の細胞内送達を促進し得る。別法では、CHOP またはその断片をHIV Tat-1タンパク質の陽イオンN末端部に結合することもできる。このようにして生成された融合タンパク質は、マウスモデル系の脳を含む全ての組織の細胞に形質導入することがわかっている（Schwarze, S.R. 他 (1999) Science 285:1569-1572）。
【０２３５】
任意の化合物に対して、先ず細胞培養アッセイ、例えば新生物性細胞の細胞培養アッセイにおいて、あるいは、動物モデル、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、サルまたはブタなどにおいて、治療有効量を推定することができる。動物モデルはまた、好適な濃度範囲及び投与経路を決定するためにも用い得る。このような情報を用いて、次にヒトに対する有益な投与量及び投与経路を決定することができる。
【０２３６】
治療有効量とは、症状や容態を回復させる、たとえばCHOPまたはその断片、CHOPの抗体、CHOPのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターなど、活性成分の量を指す。治療有効性および毒性は、細胞培養または動物実験における標準的な薬学手法によって、例えばED50（集団の５０％の治療有効量）またはLD50（集団の５０％の致死量）統計を計算するなどして判定できる。毒性効果の治療効果に対する投与量の比は、治療指数であり、LD50/ED50比として表すことができる。高い治療指数を示すような組成物が望ましい。細胞培養アッセイと動物実験とから得られたデータは、ヒトに用いる投与量の範囲の策定に用いられる。このような組成物が含まれる投与量は、毒性を殆ど或いは全く含まず、ED50を含むような血中濃度の範囲にあることが好ましい。用いられる投与形態、患者の感受性及び投与の経路によって、投与量はこの範囲内で様々に変わる。
【０２３７】
正確な投与量は、治療が必要な被験者に関する要素を考慮して、現場の医者が決定することになる。効果的なレベルの活性成分を与え、或いは所望の効果を維持するべく、投与量及び投与を調節する。被験者に関する要素としては、疾患の重症度、患者の通常の健康状態、患者の年齢、体重及び性別、投与の時間及び頻度、薬剤の配合、反応感受性及び治療に対する応答等を考慮する。作用期間が長い組成物は、特定の製剤の半減期及びクリアランス率によって３〜４日毎に１度、１週間に１度、或いは２週間に１度の間隔で投与し得る。
【０２３８】
通常の投与量は、投与の経路にもよるが約０.１〜１００,０００μgであり、合計で約１gまでとする。特定の投与量及び送達方法に関するガイダンスは文献に記載されており、現場の医者は通常それを利用することができる。当業者は、タンパク質またはインヒビターに対する処方とは異なる、ヌクレオチドに対する処方を利用することになる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、状態、位置等に特異的なものとなる。
【０２３９】
（診断）
別の実施例では、CHOPに特異的に結合する抗体を、CHOPの発現によって特徴付けられる障害の診断に、または、CHOPやCHOPのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターで治療を受けている患者をモニターするためのアッセイに用い得る。診断目的に有用な抗体は、上記の治療の箇所で記載した方法と同じ方法で調合される。CHOPの診断アッセイには、ヒトの体液から、あるいは細胞や組織の抽出物から、抗体および標識を用いてCHOPを検出する方法が含まれる。この抗体は修飾されたものもされていないものも可能であり、レポーター分子との共有結合または非共有結合で標識化できる。レポーター分子としては広くさまざまな種類が本分野で知られており、また使用可能であるが、そのうちのいくつかは上記で説明されている。
【０２４０】
CHOPを測定するための様々なプロトコル、例えばELISA、RIA、FACS等が当分野では周知であり、変容した、あるいは異常なレベルのCHOPの発現を診断するための基盤を提供する。正常或いは標準的なCHOPの発現の値は、複合体の形成に適した条件下で、正常な哺乳動物、例えばヒトなどの被験者から採取した体液または細胞とCHOPに対する抗体とを結合させることによって決定する。標準複合体形成量は、種々の方法、例えば測光法で定量できる。被験者、対照、及び疾患生検組織からの各サンプルのCHOPの発現の量が基準値と比較される。標準値と被験者との偏差が疾患を診断するパラメータとなる。
【０２４１】
本発明の別の実施例では、CHOPをコードするポリヌクレオチドを診断のために用いることもできる。用いられることができるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、相補的RNA及びDNA分子、そしてPNAが含まれる。このポリヌクレオチドを用いて、疾患と相関し得るCHOPを発現する生検組織における遺伝子の発現を検出し定量する。この診断アッセイを用いて、CHOPの存在の有無、更に過剰な発現を調べ、治療中のCHOP値の調節を監視する。
【０２４２】
一実施形態では、CHOPまたは近縁の分子をコードする遺伝子配列を含むポリヌクレオチド配列を検出可能なPCRプローブを用いたハイブリダイゼーションによって、CHOPをコードする核酸配列を同定することが可能である。プローブが高度に特異的な領域（例えば５'調節領域）から作られている、或いはやや特異性の低い領域（例えば保存されたモチーフ）から作られているかにかかわらず、そのプローブの特異性と、ハイブリダイゼーション或いは増幅のストリンジェンシーによって、そのプローブがCHOPをコードする自然界の配列のみを同定するかどうか、或いは対立遺伝子や関連配列コードする自然界の配列のみを同定するかどうかが決まるであろう。
【０２４３】
プローブはまた、関連する配列の検出に利用され、CHOPをコードする任意の配列と少なくとも５０％の配列同一性を有し得る。本発明のハイブリダイゼーションプローブはDNAまたはRNAとすることができ、SEQ ID NO:11-20の配列、或いはCHOP遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンを含むゲノム配列に由来し得る。
【０２４４】
CHOPをコードするDNA群に対して特異的なハイブリダイゼーションプローブの作製方法としては、CHOPまたはCHOP誘導体をコードするポリヌクレオチド配列を、mRNAプローブ作製用ベクターにクローニングする方法を含む。ｍＲＮＡプローブ作製のためのベクターは、当業者に知られており、市販されており、好適なＲＮＡポリメラーゼ及び好適な標識されたヌクレオチドを加えることによって、in vitroでＲＮＡプローブを合成するために用いられ得る。ハイブリダイゼーションプローブは、種々のレポーターの集団によって標識され得る。レポーター集団の例としては、32Pまたは35S等の放射性核種、或いはアビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合されたアルカリホスファターゼ等の酵素標識などが挙げられる。
【０２４５】
CHOPをコードするポリヌクレオチド配列を、CHOPの発現に関係する疾患の診断に用い得る。限定されるものではないが、そのような疾患として、先天性II型異常赤血球産生症性貧血、糖尿病、インスリン依存型真性糖尿病、非インスリン依存型真性糖尿病、フルクトース-1,6-ジホスファターゼ欠乏症、ガラクトース血症、グルカゴノーマ、遺伝性フルクトース不耐症、低血糖症、マンノシドーシス、ノイラミニダーゼ欠乏症、肥満、ガラクトースエピメラーゼ欠乏症、糖原病、リソソーム蓄積症、果糖尿、五炭糖尿症、糖質欠損糖タンパク質症候群（１A型および１B型CDGS）、自己免疫性甲状腺疾患、アスパルチルグルコサミン尿症、GM１ガングリオシド蓄積症、GM2ガングリオシド蓄積症、β-ガタクトシダーゼβ-N-アセチルヘキソサミニダーゼ欠乏症、糖脂質蓄積症、神経機能不全、シアリドーシス、肝脾腫大症、および遺伝性ピルビン酸代謝異常が含まれ；    細胞増殖異常には日光性角化症、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症が含まれ；    自己免疫/炎症性疾患には、後天性免疫不全症候群(AIDS)、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血症、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー皮膚炎、皮膚筋炎、真性糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、胎児赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、慢性関節リウマチ炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷が含まれ；  生殖系疾患としては、プロラクチン産生障害、不妊症、卵管疾患、排卵欠損症、子宮内膜症、性周期障害、月経周期障害、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣過刺激症候群、子宮内膜癌、卵巣癌、子宮筋腫、自己免疫疾患、子宮外妊娠、催奇形、乳がん、繊維嚢胞性乳房疾患、乳漏症、精子形成破壊、精子異常生理、精巣癌、前立腺癌、良性前立腺肥大、前立腺炎、パイロニー病、性交不能、男性乳癌、女性化乳房、高ゴナドトロピン性腺機能低下症、低ゴナドトロピン性腺機能低下症、偽性半陰陽、無精子症、早発性卵巣不全症、アクロシン欠乏症、思春期遅延、逆行性射精、無射精anejaculation、および血管芽細胞腫、嚢胞褐色細胞腫(cystsphaeochromocytomas)、傍神経節腫、副睾丸の嚢腺腫、および内リンパ嚢腫瘍が含まれ；  遺伝疾患としては副腎脳白質ジストロフィー、Alport症候群、コロイデレミア、デュシェンヌおよびベッカー型筋ジストロフィー、ダウン症候群、嚢胞性線維症、慢性肉芽腫症、ゴーシェ病、ハンチントン病、Marfan症候群、筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー、ピクノディスオストーシス、Refsum症候群、網膜芽細胞種、鎌形赤血球貧血症、サラセミア、ウェルナー症候群、von Willebrand症候群、ウィルムス腫瘍、ゼルウィガー症候群、ペルオキシソームアシルCoAオキシダーゼ欠乏症、ペルオキシソームチオラーゼ欠乏症、ペルオキシソーム二価性タンパク質欠乏症、ミトコンドリアカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼおよびカルニチン欠乏症、ミトコンドリア長鎖アシルCoAデヒドロゲナーゼ欠乏症、ミトコンドリア中鎖アシルCoAデヒドロゲナーゼ欠乏症、ミトコンドリア短鎖アシルCoAデヒドロゲナーゼ欠乏症、ミトコンドリア電子伝達フラビンタンパク質および電子伝達フラビンタンパク質：ユービキノンオキシドレダクターゼ欠乏症、ミトコンドリア三価性タンパク質欠乏症およびミトコンドリア短鎖３ヒドロキシアシルCoAデヒドロゲナーゼ欠乏症が含まれ；  輸送疾患としては、運動不能症、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症, 顔面神経麻痺、シャルコー・マリー・ツース病、 尿崩症, 高カリウム血性周期性四肢麻痺、 正常カリウム血性周期性四肢麻痺, パーキンソン病、 悪性高体温症, 多剤耐性, 重症筋無力症, ジストニー, 末梢神経障害；  輸送に関連する心臓疾患として例えば狭心症, 徐脈性不整脈, 頻脈性不整脈, 高血圧, QT延長症候群, 心筋炎, 心筋症, ネマリンミオパシー, 中心核ミオパシー, 脂質ミオパシー, ミトコンドリアミオパシー, 甲状腺中毒性ミオパシー, エタノールミオパシー, 皮膚筋炎, 封入体筋炎, 感染性筋炎, 多発性筋炎；  輸送に関連する神経疾患として例えばアルツハイマー病, 記憶喪失、双極性障害、痴呆、 鬱病、 癲癇、トゥーレット病、パラノイド精神病、 および精神分裂病(統合失調症)；   輸送に関連するその他の疾患として例えば神経線維腫症、ヘルペス後神経痛、三叉神経障害, サルコイドーシス、 鎌状赤血球貧血、 ウィルソン病、 白内障、 不妊症、 肺動脈狭窄、 感音常染色体難聴、 高血糖症、 低血糖症、 グレーヴズ病、 甲状腺腫、 クッシング病、 アジソン病、 グルコース・ガラクトース吸収不良症候群、グリコーゲン貯蔵病、高コレステロール血症、 副腎脳白質ジストロフィー、Menkes病、 後角症候群、 von Gierke病、シスチン尿症、 イミノグリシン尿症、Hartup病、およびファンコーニ病が含まれ；  神経の疾患の中には、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、ピック病、ハンチントン病、及びその他の錐体外路障害、筋萎縮性側策硬化及びその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患、プリオン病（クールー、クロイツフェルト‐ヤコブ病、ゲルストマン症候群、及びGerstmann-Straussler-Scheinker症候群を含む）、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管芽腫（cerebelloretinal hemangioblastomatosis）、脳３叉神経血管症候群、ダウン症候群を含む中枢神経系性の精神薄弱及び他の発生障害、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄障害、筋ジストロフィー及びその他の神経筋障害、末梢神経疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎、遺伝性、代謝性、内分泌性、及び中毒性���筋疾患、重症筋無力症、周期性四肢麻痺、精神病（気分性、不安性の障害）、季節性障害（SAD）、静座不能、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群、ジストニー、帯状疱疹後神経痛、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核部変性症、及び家族性の前頭側頭性健忘症とが含まれ；  癌としては腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、および奇形癌など、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、および子宮の癌が含まれる。変異CHOPの発現を検出するために、患者から採取した体液或いは組織を利用して、CHOPをコードするポリヌクレオチド配列を、サザン法やノーザン法、ドットブロット法、或いはその他の膜系の技術、PCR法と、ディップスティック（dipstick）、ピン（pin）、およびマルチフォーマトのELISA様アッセイ、及びマイクロアレイに使用することが可能である。このような定性方法または定量方法は、当分野で公知である。
【０２４６】
或る特定の態様では、CHOPをコードするヌクレオチド配列群は、関連する障害、特に上記した障害を検出するアッセイ類において有用であり得る。CHOPをコードするヌクレオチド配列は標準法で標識化され、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件下で、患者から採取した体液または組織のサンプルに添加することができる。好適なインキュベーション期間が経過したらサンプルを洗浄し、シグナルを定量して標準値と比較する。患者サンプルのシグナル量が制御サンプルと比べて著しく変化している場合は、サンプル内のCHOPをコードするヌクレオチド配列の変異レベルは関連する疾患の存在を示している。このようなアッセイは、動物実験、臨床試験における特定の治療効果を評価するため、あるいは個々の患者の治療をモニターするために用いることもできる。
【０２４７】
CHOPの発現に関連する疾患の診断基準を提供するために、発現のための正常あるいは標準プロフィールを確立する。これは、ハイブリダイゼーション或いは増幅に好適な条件の下、動物或いはヒトの何れかの正常な被験者から抽出された体液或いは細胞と、CHOPをコードする配列或いはその断片とを混合させることにより達成され得る。実質的に精製されたポリヌクレオチドを既知量用いて行った実験から得た値を正常な被験者から得た値と比較することにより、標準ハイブリダイゼーションを定量することができる。このようにして得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得たサンプルから得た値と比較することができる。標準値からの偏差を用いて疾患の存在を確定する。
【０２４８】
疾患の存在が確定されて治療プロトコルが開始されると、患者の発現レベルが正常な被検者に観察されるレベルに近づき始めたかどうかを測定するため、ハイブリダイゼーションアッセイを定期的に繰り返し得る。連続アッセイから得られた結果を用いて、数日から数ヶ月の期間にわたる治療の効果を示し得る。
【０２４９】
癌に関しては、個体からの生体組織における異常な量の転写物（過少発現または過剰発現）の存在は、疾患の発生素質を示したり、実際に臨床的症状が現れる前に疾患を検出する方法を提供し得る。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防方法または積極的な治療法を早くから利用し、それによって癌の発生または更なる進行を防止することが可能となる。
【０２５０】
CHOPをコードする配列群から設計されたオリゴヌクレオチド群の、更なる診断への利用には、PCRの利用が含まれ得る。これらのオリゴマーは、化学的に合成するか、酵素により生産するか、或いはin vitroで産出し得る。オリゴマーは、好ましくはCHOPをコードするポリヌクレオチドの断片、或いはCHOPをコードするポリヌクレオチドと相補的ポリヌクレオチドの断片を含み、最適条件下で特定の遺伝子や条件を識別するべく利用される。また、オリゴマーは、やや緩いストリンジェント条件下で、近縁のＤＮＡ或いはＲＮＡ配列の検出、定量、或いはその両方のため用いることが可能である。
【０２５１】
或る特定態様においては、CHOPをコードするポリヌクレオチド配列群に由来するオリゴヌクレオチドプライマー類を用いて、一塩基多型（SNP）を検出し得る。SNPは、多くの場合にヒトの先天性または後天性遺伝病の原因となるような置換、挿入および欠失である。限定するものではないがＳＮＰの検出方法には、ＳＳＣＰ（single-stranded conformation polymorphism）及び蛍光ＳＳＣＰ（ｆＳＳＣＰ）がある。ＳＳＣＰでは、CHOPをコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でＤＮＡを増幅する。ＤＮＡは例えば、病変組織または正常組織、生検サンプル、体液その他に由来し得る。ＤＮＡ内のＳＮＰは、一本鎖形状のＰＣＲ生成物の２次及び３次構造に差異を生じさせる。差異は非変性ゲル中でのゲル電気泳動法を用いて検出可能である。ｆＳＣＣＰでは、オリゴヌクレオチドプライマーを蛍光性に標識する。それによってＤＮＡシークエンシング機などの高処理機器でアンプリマー（amplimer）の検出が可能になる。更に、インシリコSNP（in silico SNP, isSNP）と呼ばれる配列データベース分析法は、一般的なコンセンサス配列に配列されるような個々のオーバーラップするDNA断片の配列を比較することにより、多型性を同定し得る。これらのコンピュータベースの方法は、ＤＮＡの実験室での調整及び統計モデル及びＤＮＡ配列クロマトグラムの自動分析を用いたシークエンシングのエラーに起因する配列の変異をフィルタリングして除去する。別の態様では、例えば高処理MASSARRAYシステム（Sequenom, Inc., San Diego CA）を用いた質量分析によりSNPを検出し、特徴付ける。
【０２５２】
SNPはヒトの病気の遺伝的基礎を研究するために使える可能性がある。たとえば、少なくとも１６個の一般的なSNPがインスリン非依存性の糖尿病と関連付けられている。SNPはまた、嚢胞性線維症、鎌形血球貧血、慢性肉芽腫性疾病等の単一遺伝子病の現れ方の違いを研究するために有用である。たとえば、マンノース結合レクチン（MBL2）の変異体は嚢胞性線維症の肺での有害な現れ方との相関が示されている。SNPはまた、薬理ゲノミックス（命のかかわる毒性など、患者の薬への反応に影響する遺伝的変異体の同定）にも役立つ。たとえば、Nアセチルトランスフェラーゼのある変異体は抗結核薬剤イソニアジドに対する高頻度の末梢神経障害と関連付けられているし、ALOX5のコアプロモーターのある変異体は５リポオキシゲナーゼ経路を標的とする抗喘息薬剤による治療への臨床的反応を弱くする。異なる集団におけるＳＮＰ分布の分析は、遺伝的浮動、突然変異、組換え、選択の研究において、また集団の起源と移動の追跡以外にも有用である（Taylor, J.G. 他 (2001) Trends Mol. Med. 7:507-512; Kwok, P.-Y. および Z. Gu (1999) Mol. Med. Today 5:538-543; Nowotny, P. 他 (2001) Curr. Opin. Neurobiol. 11:637-641）。
【０２５３】
CHOPの発現を定量するために用いられ得る方法には、ヌクレオチドの放射標識或いはビオチン標識、調節核酸の相互増幅（coamplification）、及び標準的な曲線に結果が加えられたものが含まれる（Melby, P.C.他(1993) J. Immunol. Methods, 159:235-44；Duplaa, C.他(1993) Anal. Biochem. 229-236）。目的のオリゴマーが種々の希釈液中に存在し、分光光度法または比色反応によって定量が迅速になるような高処理フォーマットのアッセイを行うことによって、複数のサンプルの定量速度を加速することができる。
【０２５４】
更に別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドまたはより長い断片を、マイクロアレイにおけるエレメントとして用いることができる。多数の遺伝子の関連発現レベルを同時にモニターする転写イメージング技術にマイクロアレイを用いることが可能である。これについては、以下に記載する。マイクロアレイはまた、遺伝変異体、突然変異及び多型性の同定に用いることができる。この情報を用いることで、遺伝子機能を決定し、疾患の遺伝的根拠を理解し、疾患を診断し、遺伝子発現の機能としての疾病の進行／後退をモニターし、疾病治療における薬剤の活性を開発及びモニターすることができる。特に、患者にとって最もふさわしく、有効的な治療法を選択するために、この情報を用いて患者の薬理ゲノムプロフィールを開発することができる。例えば、患者の薬理ゲノムプロファイルに基づき、患者に対して高度に効果的で副作用を殆ど示さない治療薬を選択することができる。
【０２５５】
別の実施例では、CHOP、CHOPの断片、CHOPに特異的な抗体をマイクロアレイ上のエレメントとして用いることができる。マイクロアレイを用いて、上記のようなタンパク質−タンパク質相互作用、薬剤−標的相互作用及び遺伝子発現プロフィールをモニターまたは測定することが可能である。
【０２５６】
或る実施態様は、或る組織または細胞タイプの転写イメージを作製する、本発明のポリヌクレオチドの使用に関連する。転写イメージは、特定の組織または細胞タイプにより遺伝子発現の包括的パターンを表す。包括的遺伝子発現パターンは、所与の条件下で所与の時間に発現した遺伝子の数および相対存在量を定量することにより分析し得る（Seilhamer 他の米国特許第5,840,484号 「Comparative Gene Transcript Analysis」は特に引用することを以って本明細書の一部となす）。従って、特定の組織または細胞タイプの転写または逆転写全体に本発明のポリヌクレオチドまたはその補体をハイブリダイズすることにより、転写イメージを生成し得る。或る実施例では、本発明のポリヌクレオチドまたはその補体がマイクロアレイ上のエレメントのサブセットを複数含むような高処理フォーマットでハイブリダイゼーションを発生させる。結果として得られる転写イメージは、遺伝子活性のプロファイルを提供し得る。
【０２５７】
転写イメージは、組織、細胞株、生検またはその生体サンプルから単離した転写物を用いて作製し得る。転写イメージは従って、組織または生検サンプルの場合にはin vivo、または株化細胞の場合にはin vitroでの遺伝子発現を反映する。
【０２５８】
本発明のポリヌクレオチドの発現のプロフィールを作製する転写イメージはまた、工業的または天然の環境化合物の毒性試験のみならず、in vitroモデル系及び薬剤の前臨床評価と併せて使用し得る。全ての化合物は、作用および毒性のメカニズムを標示し、しばしば分子フィンガープリントまたは毒性シグネチャと称される、特徴的な遺伝子発現パターンを惹起する（Nuwaysir, E.F. 他（1999）Mol. Carcinog. 24:153-159、Steiner, S. および N.L. Anderson（2000）Toxicol. Lett. 112-113:467-471、該文献は特に引用を以って本明細書の一部となす）。試験化合物が、既知の毒性を有する化合物のシグネチャと同一のシグネチャを有する場合には、毒性特性を共有している可能性がある。フィンガープリントまたはシグネチャは、多数の遺伝子および遺伝子ファミリからの発現情報を含んでいる場合に、最も有用且つ正確である。理想的には、ゲノム全域にわたる発現の測定が、最高品質のシグネチャを提供する。たとえ、発現が任意の試験された化合物によって変化しない遺伝子があったとしても、それらの発現レベルを残りの発現データを標準化するために使用できるため、それらの遺伝子は重要である。標準化手順は、異なる化合物で処理した後の発現データの比較に有用である。毒性シグネチャの要素への遺伝子機能を割り当てることは毒性機構の解明に役立つが、毒性の予測につながるシグネチャの統計的な一致には遺伝子機能の知識は必要ではない（２０００年２月２９日に米国国立環境健康科学研究所（National Institute of Environmental Health Sciences）より発行されたPress Release 00-02はhttp://www.niehs.nih.gov/oc/news/toxchip.htmで入手可能である）。従って、中毒学的スクリーニングの際に毒性シグネチャを用いて、全ての発現した遺伝子配列を含めることは重要且つ望ましいことである。
【０２５９】
或る実施例では、核酸を有する生体サンプルを試験化合物で処理することにより、この試験化合物の毒性を算定する。処理した生物学的サンプル中で発現した核酸は、本発明のポリヌクレオチドに特異的な１つ若しくは複数のプローブでハイブリダイズし、それによって本発明のポリヌクレオチドに対応する転写レベルを定量し得る。処理した生物学的サンプル中の転写レベルを、未処理生物学的サンプル中のレベルと比較する。両サンプルの転写レベルの差は、処理されたサンプル中で試験化合物が引き起こす毒性反応を示す。
【０２６０】
別の実施態様は、本発明のポリペプチド配列群を用いて或る組織または細胞タイプのプロテオームを分析することに関する。プロテオームの語は、特定の組織または細胞タイプでのタンパク質発現の包括的パターンを指す。プロテオームの各タンパク質成分は、個々に更に分析の対象とすることができる。プロテオーム発現パターン即ちプロフィールは、所与の条件下で所与の時間に発現したタンパク質の数及び相対存在量を定量することにより分析し得る。従って細胞のプロテオームのプロフィールは、特定の組織または細胞タイプのポリペプチドを分離及び分析することにより作成し得る。或る実施例では、１次元等電点電気泳動によりサンプルからタンパク質を分離し、２次元ドデシル硫酸ナトリウムスラブゲル電気泳動により分子量に応じて分離するような２次元ゲル電気泳動により分離が達成される（前出のSteiner および Anderson）。タンパク質は、通常クーマシーブルーまたは銀染色液または蛍光染色液などの物質を用いてゲルで染色することにより、分散した、独自の位置にある点としてゲル中で可視化される。各タンパク質スポットの光学密度は、通常サンプル中のタンパク質レベルに比例する。異なるサンプル、例えば試験化合物または治療薬で処理または未処理のいずれかの生物学的サンプルから得られるタンパク質スポットの光学密度を比較し、処理に関連するタンパク質スポット密度の変化を同定する。スポット内のタンパク質は、例えば化学的または酵素的切断とそれに続く質量分析を用いる標準的な方法を用いて部分的にシークエンシングする。スポット内のタンパク質の同一性は、その部分配列を、好適には少なくとも５個の連続するアミノ酸残基を、本発明のポリペプチド配列と比較することにより決定し得る。場合によっては、決定的なタンパク質同定のための更なる配列が得られる。
【０２６１】
プロテオームのプロファイルは、CHOPに特異的な抗体を用いてCHOP発現レベルを定量することによっても作成し得る。或る実施例では、マイクロアレイ上でエレメントとして抗体を用い、マイクロアレイをサンプルに曝して各アレイ要素へのタンパク質結合レベルを検出することによりタンパク質発現レベルを定量する（Lueking, A. 他 (1999) Anal. Biochern. 270:103-111、Mendoze, L.G. 他 (1999) Biotechniques 27:778-788）。検出は当分野で既知の様々な方法で行うことができ、例えば、チオール反応性またはアミノ反応性蛍光化合物とサンプル中のタンパク質を反応させ、各アレイエレメントにおける蛍光結合の量を検出し得る。
【０２６２】
プロテオームレベルでの毒性シグネチャも中毒学的スクリーニングに有用であり、転写レベルでの毒性シグネチャと並行に分析するべきである。或る組織の或るタンパク質に対しては、転写とタンパク質の存在量の相関が乏しいこともあるので（Anderson, N.L. 及び J. Seilhamer (1997) Electrophoresis 18:533-537）、転写イメージにはそれ程影響しないがプロテオームのプロフィールを変化させるような化合物の分析においてプロテオーム毒性シグネチャは有用たり得る。更に、体液中の転写物の分析はmRNAの急速な分解のために困難なので、プロテオームのプロフィール作成はこのような場合により信頼し得、情報価値があり得る。
【０２６３】
別の実施例では、タンパク質を含有する生体サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。処理された生物学的サンプル中で発現したタンパク質は、各タンパク質の量を定量し得るように分離する。各タンパク質の量を、未処理生物学的サンプル中の対応するタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する反応を示す。個々のタンパク質は、個々のタンパク質のアミノ酸残基をシークエンシングし、これら部分配列を本発明のポリペプチドと比較することにより同定する。
【０２６４】
別の実施例では、タンパク質を含有する生体サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。生物学的サンプルから得たタンパク質は、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を用いてインキュベートする。抗体により認識されたタンパク質の量を定量する。処理された生物学的サンプル中のタンパク質の量を、未処理生物学的サンプル中のタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する反応を示す。
【０２６５】
マイクロアレイは、本技術分野でよく知られている方法を用いて調製し、使用し、そして分析する（Brennan, T.M. 他 (1995) の米国特許第5,474,796号、Schena, M. 他 (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619、Baldeschweiler 他の (1995) PCT出願第WO95/251116号、Shalon, D.他の (1995) PCT出願第WO95/35505号、Heller, R.A. 他 (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2150-2155、Heller, M.J. 他の (1997) 米国特許第5,605,662号）。様々なタイプのマイクロアレイが公知であり、詳細については、DNA Microarrays: A Practical Approach, M. Schena, 編集. (1999) Oxford University Press, Londonに記載されている。 該文献は、特に引用することを以って本明細書の一部となす。
【０２６６】
本発明の別の実施態様ではまた、CHOPをコードする核酸配列群を用いて、天然ゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブ群を作製し得る。コード配列または非コード配列のいずれかを用いることができ、或る例では、コード配列より非コード配列の方が好ましい。例えば、多重遺伝子ファミリーのメンバー内でのコード配列の保存により、染色体マッピング中に望ましくないクロスハイブリダイゼーションが生じる可能性がある。核酸配列は、特定の染色体、染色体の特定領域または人工形成の染色体、例えば、ヒト人工染色体（HAC）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC）、細菌P1産物、或いは単一染色体cDNAライブラリに対してマッピングされる（Harrington他 (1997) Nat Genet. 15:345-355、Price, C.M. (1993) Blood Rev. 7:127-134、Trask, B.J. (1991) Trends Genet. 7:149-154）。一度マッピングすると、本発明の核酸配列を用いて、例えば病状の遺伝と特定の染色体領域やまたは制限酵素断片長多型（RFLP）の遺伝とが相関するような遺伝子連鎖地図を作成可能である（Lander, E.S. 及び D. Botstein (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7353-7357）。
【０２６７】
蛍光原位置ハイブリッド形成法（FISH）は、他の物理的及び遺伝地図データと相関し得る（Heinz-Ulrich, 他 (1995) 前出のMeyers, 965-968ページ等を参照）。遺伝地図データの例は、種々の科学雑誌あるいはOnline Mendelian Inheritance in Man（ＯＭＩＭ）のウェブサイトに見ることができる。物理的な染色体地図上のCHOPをコードする遺伝子の位置と、特定の疾患との相関性、あるいは特定の疾患に対する素因との相関性は、この疾患と関連するDNAの領域の決定に役立ち得るため、ポジショナルクローニングの作業を促進し得る。
【０２６８】
確定した染色体マーカーを用いた連鎖分析等の物理的マッピング技術及び染色体標本原位置ハイブリッド形成法を用いて、遺伝地図を拡張することができる。例えばマウスなど別の哺乳動物の染色体上に遺伝子を配置することにより、正確な染色体上の遺伝子座が未知でも、関連するマーカー類をしばしば明らかにし得る。この情報は、ポジショナルクローニングその他の遺伝子発見技術を用いて遺伝的疾患を探す研究者にとって価値がある。疾患または症候群が、血管拡張性失調症の11q22-23領域等、特定の遺伝子領域への遺伝的結合によって大まかに位置決めがなされると、該領域に対する任意のマッピングにより更なる調査のための関連遺伝子或いは調節遺伝子を表すことができる（Gatti, R.A.他 (1988) Nature 336:577-580）。転座、反転などに起因する、健常者、保有者、罹病者の三者間における染色体位置の相違を検出する場合にも、本発明のヌクレオチド配列を用い得る。
【０２６９】
本発明の別の実施態様では、CHOP、その触媒作用断片あるいは免疫原性断片またはそのオリゴペプチド群を、種々の任意の薬剤スクリーニング技術における、化合物のライブラリ群のスクリーニングに用い得る。薬剤スクリーニングに用いる断片は、溶液中に遊離しているか、固体支持物に固定されるか、細胞表面上に保持されるか、細胞内に位置することになろう。CHOPと検査する薬剤との結合による複合体の形成を測定してもよい。
【０２７０】
別の薬剤スクリーニング方法は、目的のタンパク質に対して好適な結合親和性を有する化合物を高処理能力でスクリーニングするために用いられる（Geysen,他 (1984) PCT出願番号 WO84/03564）。この方法においては、多数の異なる小さな試験用化合物を固体基板上で合成する。試験用化合物は、CHOP、或いはその断片と反応してから洗浄される。次に、結合したCHOPを本技術分野で周知の方法で検出する。精製したCHOPはまた、上記した薬剤スクリーニング技術に用いるプレート上に直接コーティングできる。別法では、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持物に固定することもできる。
【０２７１】
別の実施例では、CHOPと特異結合可能な中和抗体がCHOPとの結合について試験用化合物と競合する、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる。この方法では、抗体が、１若しくは数個の抗原決定因子をCHOPと共有するペプチドの存在を検出する。
【０２７２】
別の実施例では、CHOPをコードするヌクレオチド配列を、将来に開発される分子生物学技術であり、現在知られているヌクレオチド配列の特性（限定はされないが、トリプレット遺伝コード、特異的な塩基対相互作用等を含む）に依存する新技術に用い得る。
【０２７３】
更に詳細説明をしなくとも、当業者であれば以上の説明を以って本発明を最大限に利用できるであろう。従って、これ以下に記載する実施例は単なる例示目的にすぎず、いかようにも本発明を限定するものではない。
【０２７４】
本明細書において開示した全ての特許、特許出願及び刊行物、特に米国特許第60/293,768号、第60/309,548号、第60/314,400号、第60/343,706号及び第60/337,999号は、言及することをもって本明細書の一部となす。
【実施例】
【０２７５】
１  cDNAライブラリの作製
Incyte cDNA群の由来は、LIFESEQ GOLDデータベース (Incyte Genomics, Palo Alto CA)に記載されたcDNAライブラリ群である。幾つかの組織はホモジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネート溶液に溶解し、他の組織はホモジナイズしてフェノールにまたは変性剤群の好適な混合液に溶解した。混合液の１例であるTRIZOL（Invitrogen）は、フェノールとグアニジンイソチオシアネートとの単相溶液である。結果として得られた溶解物は、塩化セシウムで遠心分離するかクロロホルムで抽出した。イソプロパノールか、酢酸ナトリウムとエタノールか、いずれか一方、或いは別の方法を用いて、溶解物からＲＮＡを沈殿させた。
【０２７６】
ＲＮＡの純度を高めるため、ＲＮＡのフェノールによる抽出及び沈殿を必要な回数繰り返した。場合によっては、ＤＮA分解酵素でＲＮＡを処理した。殆どのライブラリでは、オリゴd(T)連結常磁性粒子（Promega）、OLIGOTEXラテックス粒子（QIAGEN, Chatsworth CA）またはOLIGOTEX mRNA精製キット（QIAGEN）を用いて、ポリ(A+) RNAを単離した。別法では、別のRNA単離キット、例えばPOLY(A)PURE mRNA精製キット（Ambion, Austin TX）を用いて組織溶解物からRNAを直接単離した。
【０２７７】
場合によってはStratagene社へのRNA提供を行い、対応するｃＤＮＡライブラリをStratagene社が作製することもあった。そうでない場合は、UNIZAPベクターシステム（Stratagene）またはSUPERSCRIPTプラスミドシステム（Invitrogen）を用いて本技術分野で公知の推奨方法または類似の方法でcDNAを合成し、cDNAライブラリを作製した（前出のAusubel, 5.1-6.6ユニット）。逆転写は、オリゴd(T)またはランダムプライマーを用いて開始した。合成オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖cDNAに連結反応させ、好適な制限酵素でcDNAを消化した。殆どのライブラリに対して、cDNAのサイズ（３００〜１０００bp）選択は、SEPHACRYL S1000、SEPHAROSE CL2BまたはSEPHAROSE CL4Bカラムクロマトグラフィー（Amersham Biosciences）、或いは調製用アガロースゲル電気泳動法を用いて行った。 合成オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖cDNAに連結反応させ、好適な制限酵素または酵素でcDNAを消化した。 好適なプラスミドは、例えばPBLUESCRIPTプラスミド（Stratagene）、PSPORT1 プラスミド(Invitrogen)、PCDNA2.1 プラスミド (Invitrogen, Carlsbad CA)、PBK-CMV プラスミド (Stratagene)、PCR2-TOPOTAプラスミド (Invitrogen)、PCMV-ICISプラスミド (Stratagene)、pIGEN (Incyte Genomics, Palo Alto CA)、pRARE (Incyte Genomics)、plNCY（Incyte Genomics）等およびその誘導体である。組換えプラスミドは、Stratagene社のXL1-Blue、XL1-BIueMRFまたはSOLR、あるいはInvitrogen社のDH5α、DH10BまたはElectroMAX DH10Bなど適格な大腸菌細胞に形質転換した。
【０２７８】
2cDNAクローンの単離
UNIZAPベクターシステム（Stratagene）を用いたin vivo切除によって、或いは細胞溶解によって、実施例1のようにして得たプラスミドを宿主細胞から回収した。プラスミドの精製には、下記の少なくとも１つを用いた。すなわちMagicまたはWIZARD Minipreps DNA精製システム（Promega）、AGTC Miniprep精製キット（Edge Biosystems, Gaithersburg MD）、QIAGEN社のQIAWELL 8 Plasmid、QIAWELL 8 Plus PlasmidおよびQIAWELL 8 Ultra Plasmid精製システム、R.E.A.L. Prep 96プラスミド精製キットのいずれかである。プラスミドは、沈殿させた後、0.1mlの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥しないで４℃で保管した。
【０２７９】
別法では、高処理フォーマットにおいて直接結合ＰＣＲ法を用いて宿主細胞溶解物からプラスミドＤＮＡを増幅した（Rao, V.B. (1994) Anal. Biochem. 216:1-14）。宿主細胞の溶解および熱サイクリング過程は、単一反応混合液中で行った。サンプルを処理し、それを３８４ウェルプレート内で保管し、増幅したプラスミドＤＮＡの濃度をPICOGREEN色素（Molecular Probes, Eugene OR）及びFLUOROSKANII蛍光スキャナ（Labsystems Oy, Helsinki, Finland）を用いて蛍光分析的に定量した。
【０２８０】
3シークエンシング及び分析
実施例２に記載したようにプラスミドから回収したIncyte cDNAを、以下に示すようにシークエンシングした。cDNAのシークエンス反応は、標準的方法或いは高処理装置、例えばABI CATALYST 800 サーマルサイクラー（Applied Biosystems）またはPTC-200 サーマルサイクラー（MJ Research）をHYDRAマイクロディスペンサー（Robbins Scientific）またはMICROLAB 2200（Hamilton）液体転移システムと併用して処理した。cDNAのシークエンス反応は、Amersham Biosciences 社が提供する試薬、またはABIシークエンシングキット、例えばABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reaction kit（Applied Biosystems）の試薬を用いて準備した。ｃＤＮＡのシークエンス反応の電気泳動的分離及び標識したポリヌクレオチドの検出には、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム（Applied Biosystems）か、標準ABIプロトコル及び塩基呼び出し(base calling)ソフトウェアを用いるABI PRISM 373または377シークエンシングシステム（Applied Biosystems）か、或いはその他の本技術分野で既知の配列解析システムを用いた。ｃＤＮＡ配列内のリーディングフレームは、標準的方法（前出のAusubel,  7.7ユニットに概説）を用いて決定した。ｃＤＮＡ配列の幾つかを選択して、実施例８に記載した方法で配列を伸長させた。
【０２８１】
Incyte cDNA配列に由来するポリヌクレオチド配列は、ベクター、リンカー及びポリ(A)配列を除去し、あいまいな塩基対をマスクすることによって有効性を確認した。 その際、BLAST、動的プログラミング及び隣接ジヌクレオチド頻度分析に基づくアルゴリズム及びプログラムを用いた。次に、IncyteのcDNA配列、またはその翻訳を公共のデータベース（例えばGenBankの霊長類及びげっ歯類、哺乳動物、脊椎動物、真核生物のデータベースと、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM）と、ヒト、ラット、マウス、線虫、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）、および鵞口瘡カンジダ（Candida albicans ）からの配列を含むPROTEOMEデータベース（Incyte Genomics, Palo Alto CA）、及びPFAM等隠れマルコフモデル（HMM）に基づいたタンパク質ファミリーデータベース並びに、SMART(Schultz, J. 他(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:5857-5864、Letunic, I. 他 (2002) Nucleic Acids Res. 30:242-244)のようなHMMに基づいたタンパク質ドメインデータベースから選択したデータベースに対して問い合わせた。（HMMは、遺伝子ファミリのコンセンサス１次構造を分析する確率的アプローチである。例えばEddy, S.R. (1996) Cuff. Opin. Struct. Biol. 6:361-365等を参照）。問合せは、BLAST、FASTA、BLIMPS及びHMMERに基づくプログラムを用いて行った。Incyte cDNA配列を構築し、完全長のポリヌクレオチド配列を産出した。あるいは、GenBank cDNA群、GenBank EST群、スティッチされた配列群、ストレッチされた配列群、またはGenscan予測コード配列群（実施例４および５を参照）を用い、Incyte cDNAの集団を完全長まで伸長させた。PhredとPhrapとConsedとに基づくプログラムを用いて構築し、GenMarkとBLASTとFASTAとに基づくプログラムを用いて、cDNAの集団を、オープンリーディングフレームについてスクリーニングした。完全長ポリヌクレオチド配列を翻訳し、対応する完全長ポリペプチド配列を引き出した。あるいは、本発明のポリペプチドは、完全長翻訳ポリペプチドの任意のメチオニン残基で開始し得る。完全長ポリペプチド配列群の続いての分析としての問い合わせを、GenBankタンパク質データベース群（genpept）、SwissProt、PROTEOMEデータベース群、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOMおよびProsite等のデータベースや、PFAM、INCY、およびTIGRFAM等の隠れマルコフモデル（HMM）ベースのタンパク質ファミリーデータベース群、並びにSMART等のHMMベースのタンパク質ドメインデータベース群に対し行った。完全長ポリヌクレオチド配列はまた、MACDNASIS PROソフトウェア（日立ソフトウェアエンジニアリング, South San Francisco CA）およびLASERGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いて分析する。ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列アラインメントは、アラインメントした配列と配列の一致率も計算するMEGALIGNマルチシークエンスアラインメントプログラム（DNASTAR）に組み込まれているようなCLUSTALアルゴリズムによって特定されるデフォルトパラメータを用いて作製する。
【０２８２】
Incyte ｃＤＮＡ及び完全長配列の分析及びアセンブリに利用したツール、プログラム及びアルゴリズムの概略と、適用可能な説明、参照文献、閾値パラメータを表7に示す。用いたツール、プログラム及びアルゴリズムを表７の列１に、それらの簡単な説明を列２に示す。列３は好適な引用文献であり、全ての文献はそっくりそのまま引用を以って本明細書の一部となす。適用可能な場合には、列４は２つの配列が一致する強さを評価するために用いたスコア、確率値その他のパラメータを示す（スコアが高いほど、または確率値が低いほど、２配列間の相同性が高くなる）。
【０２８３】
完全長ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の組み立て及び分析に用いる上記のプログラムは、SEQ ID NO:11-20のポリヌクレオチド配列断片の同定にも利用できる。 ハイブリダイゼーション及び増幅技術に有用である約２０〜約４０００ヌクレオチドの断片を表４の列2に示した。
【０２８４】
４  ゲノムDNAからのコード配列の同定及び編集
推定上の糖結合タンパク質は、公共のゲノム配列データベース（例えば、gbpriやgbhtg）においてGenscan遺伝子同定プログラムを実行して初めに同定された。Genscanは、様々な生物からのゲノムDNA配列を分析する汎用遺伝子同定プログラムである（Burge, C. 及び S. Karlin (1997) J. Mol. Biol. 268:78-94、Burge, C. 及び S. Karlin (1998) Curr. Opin. Struct. Biol. 8:346-354）。プログラムは予測エキソンを連結し、メチオニンから終止コドンに及ぶ構築されたｃＤＮＡ配列を形成する。Genscanの出力は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列のFASTAデータベースである。Genscanが一度に分析する配列の最大範囲は、30kbに設定した。これらのGenscan推定cDNA配列の内、どの配列が糖結合タンパク質をコードするかを決定するために、コードされたポリペプチドをPFAMモデルにおいて糖結合タンパク質について問合せて分析した。潜在的な糖結合タンパク質はまた、糖結合タンパク質として注釈が付けられていたIncyte cDNA配列への相同性を基に同定された。こうして選択されたGenscan予測配列は、次にBLAST分析により公共データベースgenpept及びgbpriと比較した。必要であれば、genpeptからのトップBLASTヒットと比較することによりGenscan予測配列を編集し、余分なまたは省略されたエキソンなど、Genscanが予測した配列におけるエラーを補正した。BLAST分析はまた、Genscan予測配列の、いかなるIncyte cDNAまたは公共cDNAカバレッジ（coverage）の発見にも用いられ、したがって転写の証拠を提供した。Incyte cDNAカバレッジが利用できた場合には、この情報を用いてGenscan予測配列を補正または確認した。完全長ポリヌクレオチド配列は、実施例３に記載した構築プロセスを用いて、Incyte cDNA配列および／または公共cDNA配列でGenscan予測コード配列を構築して得た。或いは、完全長ポリヌクレオチド配列は編集または未編集のGenscan予測コード配列に完全に由来する。
【０２８５】
５  ｃDNA配列データを使ったゲノム配列データのアセンブリ
ステッチ配列（Stitched Sequence）
部分cDNA配列は、実施例４に記載のGenscan遺伝子同定プログラムにより予測されたエキソンを用いて伸長させた。実施例３に記載されたように構築された部分ｃＤＮＡは、ゲノムＤＮＡにマッピングし、関連するｃＤＮＡ及び１つ若しくは複数のゲノム配列から予測されたGenscanエキソンを含むクラスタに分解した。ｃＤＮＡ及びゲノム情報を統合するべくグラフ理論及び動的プログラミングに基づくアルゴリズムを用いて各クラスタを分析し、引き続いて確認、編集または伸長して完全長配列を産出するような潜在的スプライシング変異体を生み出した。区間全体の長さがクラスタ中の２以上の配列に存在するような配列を同定し、そのように同定された間隔は推移により等しいと考えられた。例えば、１つのｃＤＮＡ及び２つのゲノム配列に間隔が存在する場合、３つの間隔は全て等しいと考えられる。このプロセスは、無関係であるが連続したゲノム配列をｃＤＮＡ配列により結び合わせて架橋し得る。このようにして同定された区間を、親配列（parent sequence）に沿って現われるようにステッチアルゴリズムで縫い合わせ、可能な最も長い配列および変異配列を作製する。１種類の親配列に沿って発生した間隔と間隔との連鎖（ｃＤＮＡ−ｃＤＮＡまたはゲノム配列−ゲノム配列）は、親の種類を変える連鎖（ｃＤＮＡ−ゲノム配列）に優先した。結果として得たスティッチ配列群を翻訳し、BLAST分析で公共データベースgenpeptおよびgbpriと比較した。Genscanにより予測された不正確なエキソンは、genpeptからのトップのBLASTヒットと比較することにより修正した。必要な場合には、追加cDNA配列を用いるかゲノムＤＮＡの検査により配列を更に伸長させた。
【０２８６】
ストレッチ配列（Stretched Sequence）
部分ＤＮＡ配列は、BLAST分析に基づくアルゴリズムにより完全長まで伸長された。先ず、BLASTプログラムを用いて、GenBankの霊長類、げっ歯類、哺乳動物、脊椎動物及び真核生物のデータベースなどの公共データベースに対し、実施例３に記載されたように構築された部分ｃＤＮＡを問い合わせた。次に、最も近いGenBankタンパク質相同体をBLAST分析によりIncyte cDNA配列または実施例４に記載のGenScanエキソン予測配列のいずれかと比較した。結果として得られる高スコアリングセグメント対（HSP）を用いてキメラタンパク質を産出し、翻訳した配列をGenBankタンパク質相同体上にマッピングした。元のGenBankタンパク質相同体に対し、キメラタンパク質内では挿入または欠失が起こり得る。GenBankタンパク質相同体、キメラタンパク質またはその両方をプローブとして用い、公共のヒトゲノムデータベースから相同ゲノム配列を検索した。このようにして、部分的なDNA配列を相同ゲノム配列の付加によりストレッチすなわち伸長した。結果として得られるストレッチ配列を検査し、完全遺伝子を含んでいるか否かを判定した。
【０２８７】
６  CHOPをコードするポリヌクレオチドの染色体マッピング
SEQ ID NO:11-20を構築するために用いた配列を、BLAST及びSmith-Watermanアルゴリズムを用いて、Incyte LIFESEQデータベース及び公共のドメインデータベースの配列と比較した。SEQ ID NO:11-20と一致するこれらのデータベースの配列を、Phrapなどの構築アルゴリズム（表７）を使用して、連続しオーバーラップする配列のクラスター群に組み入れた。スタンフォード・ヒトゲノムセンター（SHGC）、ホワイトヘッド・ゲノム研究所（WIGR）、Genethon等の公的な情報源から入手可能な放射線ハイブリッド及び遺伝地図データを用いて、クラスタ化された配列が前もってマッピングされたかを決定した。マッピングされた配列がクラスタに含まれている場合は、個々の配列番号を含めてそのクラスタの全配列が地図上の位置に割り当てられた。
【０２８８】
地図上の位置は、ヒト染色体の範囲または間隔として表される。センチモルガン間隔の地図上の位置は、染色体の短腕(p-arm)の末端に関連して測定する。（センチモルガン（cM）は、染色体マーカー間の組換え頻度に基づく計測単位である。平均して、１cMは、ヒト中のDNAの１メガベース（Mb）にほぼ等しい。尤も、この値は、組換えのホットスポット及びコールドスポットに起因して広範囲に変化する。）cM距離は、各クラスタ内に配列が含まれる放射線ハイブリッドマーカー類に対して境界を提供するGenethonによってマッピングされた遺伝マーカー群に基づく。NCBI「GeneMap'99」（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genemap/）などの公的に入手可能なヒト遺伝子マップおよびその他の情報源を用いて、既に同定されている疾患遺伝子群が、上記した区間内若しくは近傍に位置するかを決定できる。
【０２８９】
７.ポリヌクレオチド発現の分析
ノーザン分析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験用技術であり、特定の細胞種或いは組織からのRNAが結合されている膜への標識されたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを伴う(Sambrook他,前出, 7章; Ausubel. F.M. 、前出, 4章及び16章)。
【０２９０】
BLASTを適用した類似のコンピュータ技術を用いて、GenBankやLifeSeq（Incyte Genomics）等のｃDNAデータベースにおいて同一または関連分子を検索した。ノーザン分析は、多数の膜系ハイブリダイゼーションよりも非常に速い。更に、特定の同一を厳密な或いは相同的なものとして分類するか否かを決定するため、コンピュータ検索の感度を変更することができる。検索の基準は積スコアであり、次式で定義される。
2005501526.tif 000004
積スコアは、２つの配列間の類似度と、配列が一致する長さとの両方を考慮している。積スコアは、０〜１００の規準化された値であり、次のようにして求める。BLASTスコアにヌクレオチドの配列一致率を乗じ、その積を２つの配列の短い方の長さの５倍で除する。BLASTスコアを計算するには、或る高スコアリングセグメント対（HSP）内の一致する各塩基に＋５のスコアを割り当て、各不一致塩基に−４を割り当てる。２つの配列は、２以上のHSPを共有し得る（ギャップにより隔離される）。２以上のHSPがある場合には、最高BLASTスコアの塩基対を用いて積スコアを計算する。積スコアは、断片的オーバーラップとBLASTアラインメントの質とのバランスを表す。例えば積スコア１００は、比較した２つの配列の短い方の長さ全体にわたって１００％一致する場合のみ得られる。積スコア７０は、一端が１００％一致し、７０％オーバーラップしているか、他端が８８％一致し、１００％オーバーラップしているかのいずれかの場合に得られる。積スコア50は、一端が100％一致し、50％オーバーラップしているか、79％一致し、100％オーバーラップしているかのいずれかの場合に得られる。
【０２９１】
あるいは、CHOPをコードするポリヌクレオチド配列を、由来する組織源について分析する。例えば幾つかの完全長配列は、少なくとも一部は、オーバーラップするIncyte cDNA配列群を用いて構築される（実施例３を参照）。各cDNA配列は、ヒト組織から作製されたcDNAライブラリに由来する。各cDNA配列は、ヒト組織から作製されたcDNAライブラリに由来する。各ヒト組織は、以下の生物／組織カテゴリー即ち心血管系、結合組織、消化器系、胎芽構造、内分泌系、外分泌腺、女性生殖器、男性生殖器、生殖細胞、血液及び免疫系、肝、筋骨格系、神経系、膵臓、呼吸器系、感覚器、皮膚、顎口腔系、非分類性／混合性または尿路の１つに分類される。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。同様に、各ヒト組織は、以下の疾患／病状カテゴリー即ち癌、細胞株、発達、炎症、神経性、外傷、心血管、プール、その他の１つに分類される。 各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。演算結果の割合は、CHOPをコードするcDNAの組織特異発現または疾患特異発現を反映する。 cDNA配列及びcDNAライブラリ／組織情報については、LIFESEQ GOLDデータベース（Incyte Genomics, Palo Alto CA）で見られる。
【０２９２】
８  ポリヌクレオチドをコードするCHOPの伸長
完全長のポリヌクレオチド配列はまた、完全長分子の適切な断片から設計したオリゴヌクレオチドプライマー群を用いて該断片を伸長させて産生した。或るプライマーは既知の断片の５'伸長を開始するべく合成し、別のプライマーは既知の断片の３'伸長を開始するべく合成した。開始プライマーは、長さが約２２〜３０ヌクレオチド、GC含有率が約５０％以上となり、約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニーリングするように、OLIGO 4.06ソフトウェア（National Biosciences）或いは別の適切なプログラムを用いて、cDNAから設計した。 ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体を生ずるようなヌクレオチドの伸長は全て回避した。
【０２９３】
配列を伸長するために、選択されたヒトｃＤＮＡライブラリを用いた。２段階以上の伸長が必要または望ましい場合には、付加的プライマーあるいはプライマーのネステッドセットを設計した。
【０２９４】
高忠実度の増幅が、当業者によく知られている方法を利用したPCR法によって得られた。 PCRは、PTC-200 サーマルサイクラー（MJ Research, Inc.）を用いて９６穴プレート内で行った。反応混合液は、鋳型DNA及び200 nmolの各プライマー、Mg２+と(NH4)2SO4とβ−メルカプトエタノールを含むバッファー、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Biosciences)、ELONGASE酵素(Invitrogen)、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を含む。 プライマーの組、PCI AとPCI Bに対して以下のパラメータで増幅を行った。ステップ1：94℃で3分間、ステップ2：94℃で15秒間、ステップ3：60℃で1分間、ステップ4：68℃で2分間、ステップ5：ステップ2、3および4を20回繰り返す、ステップ6：68℃で5分間、ステップ7：4℃で保存。別法では、プライマー対であるT7とSK+とに対して以下のパラメータで増幅を行った。ステップ1: 94℃, 3分、 ステップ 2: 94℃, 15 秒、ステップ 3: 57℃, 1 分、ステップ 4: 68℃, 2 分、 ステップ 5: ステップ2、3および 4を20回反復する。  ステップ6: 68℃、 5 分、ステップ7:  4℃で保存する。
【０２９５】
各ウェルのDNA濃度は、１X TE及び0.5μlの希釈していないPCR産物に溶解した100μlのPICOGREEN定量試薬(0.25(v/v) PICOGREEN; Molecular Probes, Eugene OR)を不透明な蛍光光度計プレート(Corning Costar, Acton MA)の各ウェルに分配してDNAが試薬と結合できるようにして測定する。サンプルの蛍光を計測してDNAの濃度を定量すべく、プレートをFluoroskan II（Labsystems Oy, Helsinki, Finland）でスキャンした。反応混合物のアリコット5〜10μlを1％アガロースゲル上で電気泳動法によって解析し、どの反応が配列の伸長に成功したかを判定した。
【０２９６】
伸長させたヌクレオチドは、脱塩及び濃縮して３８４ウェルプレートに移し、CviJIコレラウイルスエンドヌクレアーゼ（Molecular Biology Research, Madison WI）を用いて消化し、pUC 18ベクター（Amersham Biosciences）への再連結反応前に音波処理またはせん断した。ショットガン・シークエンシングのために、消化したヌクレオチドを低濃度（0.6〜0.8％）のアガロースゲル上で分離し、断片を切除し、寒天をAgar ACE（Promega）で消化した。伸長させたクローンをＴ４リガーゼ（New England Biolabs, Beverly MA）を用いてpUC 18ベクター（Amersham Biosciences）に再連結し、Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）で処理して制限部位のオーバーハングを満たし、大腸菌細胞に形質移入した。形質移入した細胞を選択して抗生物質を含む培地に移し、それぞれのコロニーを切りとってLB/2Xカルベニシリン培養液の384ウェルプレートに３７℃で一晩培養した。
【０２９７】
細胞を溶解して、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Biosciences)及びPfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を用いて以下の手順でDNAをPCR増幅した。ステップ1: 94℃, 3分、 ステップ 2: 94℃、 15 秒、ステップ 3: 60℃、 1 分、ステップ 4: 72℃、 2 分、 ステップ 5: ステップ2、3および 4を29回反復する。  ステップ6: 72℃、5 分、ステップ7:  4℃で保存する。上記のようにPICOGREEN試薬(Molecular Probes)でDNAを定量した。DNAの回収率が低いサンプルは、上記と同一の条件を用いて再増幅した。サンプルは20％ジメチルスルホキシド（１：２, v/v）で希釈し、DYENAMIC エネルギートランスファー シークエンシングプライマー、及びDYENAMIC DIRECT kit（Amersham Biosciences）またはABI PRISM BIGDYE ターミネーターサイクル シークエンシング反応キット（Terminator cycle sequencing ready reaction kit）（Applied Biosystems）を用いてシークエンシングした。
【０２９８】
同様に、上記手順を用いて完全長ポリヌクレオチド配列を検証し、或いはそのような伸長のために設計されたオリゴヌクレオチド及び適切なゲノムライブラリを用いて5'調節配列を得る。
【０２９９】
９  CHOP がコードするポリヌクレオチドのSNP(一塩基多型)の同定
一塩基多型（SNP）として知られる一般的なDNA配列変異体がLIFESEQ データベース(Incyte Genomics)を用いてSEQ ID NO:11-20 において同定された。実施例３に記述したように、同じ遺伝子からの配列を一緒にまとめてクラスター化し、構築した。一連のフィルタから成るアルゴリズムが、ＳＮＰを他の配列変異体から区別するために用いられた。予備フィルターは最小Phredクオリティスコア１５を要求することによって大多数のベースコールエラーを除去し、配列アラインメントエラーとスプライス変異体、キメラおよびベクター配列の不適正なトリミングによるエラーを除去した。高度染色体解析の自動化手順により、オリジナルのクロマトグラムファイルの中の推定上のSNPの近傍を解析した。クローンエラーフィルターは、統計的に生成されたアルゴリズムを使って、実験室の処理中に入ってくる（逆転写酵素、ポリメラーゼまたは体細胞性突然変異などに起因する）エラーを同定した。クラスタリングエラーフィルターは統計的に生成されたアルゴリズムを使って、近い相同体や偽遺伝子のクラスタリングによるエラーおよび非ヒト配列によるコンタミネーションに起因するエラーを同定した。最後のフィルターセットは免疫グロブリンまたはT細胞受容体で見つかる複製とSNPを除去した。
【０３００】
４つの異なるヒトの集団における対立遺伝子頻度を解析するために、ある種のSNPを選択して、高スループットMASSARRAYシステム(Sequenom, Inc.) を使った質量分析で特性を測定した。白人集団は９２人（男性４６人、女性４６人）で、８３人がユタ州出身、４人がフランス人、３人がベネズエラ、そして２人がアーミッシュだった。アフリカ人は１９４人（男性97人、女性９７人）からなり、その全てがアフリカ系アメリカ人であった。ラテンアメリカ系集団は324人（男性162人、女性162人）からなり、その全てがメキシコのラテンアメリカ系であった。アジア系集団は１２６人（男性６４人、女性６２人）からなり、報告された親の内訳は中国人が４３％、日本人が３１％、韓国人が１３％、ベトナム人が５％、その他のアジア系が８％であった。対立遺伝子頻度は最初に白人集団で解析された。この集団内で対立遺伝子変異を示さなかったSNPはその他３つの集団ではテストしない場合もあった。
【０３０１】
１０  個々のハイブリダイゼーションプローブの標識化及び使用
SEQ ID NO:11-20から導き出されたハイブリダイゼーションプローブを用いて、cDNA、mRNA、またはゲノムDNAをスクリーニングする。約20塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記載するが、より大きなヌクレオチド断片に対しても本質的に同一の手順が用いられる。オリゴヌクレオチドは、OLIGO 4.06ソフトウェア（National Biosciences）等の最新ソフトウェアを用いて設計し、各オリゴマー５０pmolと、[γ-32P]アデノシン３リン酸 （Amersham Biosciences）２５０μCiと、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（DuPont NEN, Boston MA）を混合することにより標識する。標識したオリゴヌクレオチドは、SEPHADEX G-25超細繊分子サイズ排除デキストラン ビードカラム（Amersham Biosciences）を用いて実質的に精製する。下記のいずれか１つのエンドヌクレアーゼで消化されたヒトゲノムDNAの、典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析において、毎分107カウントの標識されたプローブを含むアリコットを用いる。すなわちAse I、Bgl II、Eco RI、Pst I、Xba I、またはPvu II(DuPont NEN)である。
【０３０２】
各消化物から得たDNAは、０.７％アガロースゲル上で分画してナイロン膜（Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH）に移す。ハイブリダイゼーションは、４０℃で１６時間行う。 非特異的シグナルを除去するため、例えば０.１×クエン酸ナトリウム食塩水及び０.５％ドデシル硫酸ナトリウムに一致する条件下で、ブロットを室温で順次洗浄する。オートラジオグラフィーまたはそれに代わるイメージング手段を用いてハイブリダイゼーションパターンを視覚化し、比較する。
【０３０３】
１１  マイクロアレイ
マイクロアレイの表面上でアレイエレメントの結合または合成は、フォトリソグラフィ、ピエゾ式印刷（インクジェット印刷、前出のBaldeschweiler他等を参照）、機械的マイクロスポッティング技術及びこれらから派生したものを用いて達成することが可能である。上記各技術において基板は、均一且つ無孔の固体とするべきである（Schena 、 前出）。推奨する基板には、シリコン、シリカ、スライドガラス、ガラスチップ及びシリコンウエハがある。或いは、ドットブロット法またはスロットブロット法に類似のアレイを利用して、熱的、紫外線的、化学的または機械的結合手順を用いて基板の表面にエレメントを配置及び結合させてもよい。通常のアレイは、手作業で、または利用可能な方法や機械を用いて作製でき、任意の適正数のエレメントを有し得る（Schena, M. 他 (1995) Science 270:467-470、Shalon. D. 他 (1996) Genome Res. 6:639-645、Marshall, A. および J. Hodgson (1998) Nat. Biotechnol. 16:27-31）。
【０３０４】
完全長ｃＤＮＡ、発現配列タグ（EST）、またはその断片またはオリゴマーは、マイクロアレイのエレメントと成り得る。ハイブリダイゼーションに好適な断片またはオリゴマーを、レーザGENEソフトウェア（DNASTAR）等の本技術分野で公知のソフトウェアを用いて選択することが可能である。アレイエレメント群を、生体サンプル中のポリヌクレオチド群とハイブリダイズする。生体サンプル中のポリヌクレオチドは、検出を容易にするために蛍光標識などの分子タグに抱合させる。ハイブリダイゼーション後、生体サンプルからのハイブリダイズされていないヌクレオチドを除去し、蛍光スキャナを用いて各アレイエレメントでのハイブリダイゼーションを検出する。あるいは、レーザー脱離および質量スペクトロメトリを用いてもハイブリダイゼーションを検出し得る。マイクロアレイ上の或るエレメントにハイブリダイズする各ポリヌクレオチドの、相補性の度合と相対存在度とを算定し得る。 一実施態様におけるマイクロアレイの調製および使用について、以下に詳述する。
【０３０５】
組織または細胞サンプルの準備
グアニジニウムチオシアネート法を用いて組織サンプルから全RNAを単離し、オリゴ(dT)セルロース法を用いてポリ(A)+RNAを精製する。各ポリ(A)+RNAサンプルを、MMLV逆転写酵素、0.05pg/μlのオリゴ(dT)プライマー（21mer）、１×第一鎖合成バッファー、0.03unit/μlのRNアーゼ阻害因子、500μMのdATP、500μMのdGTP、500μMのdTTP、40μMのdCTP、40μMのdCTP-Cy3（BDS）またはdCTP-Cy5（Amersham Biosciences）を用いて逆転写する。逆転写反応は、GEMBRIGHTキット（Incyte）を用いてポリ(A)+RNA含有の25体積ml内で行う。特異的対照ポリ(A)+RNAは、非コード酵母ゲノムDNAからin vitro転写により合成する。各反応サンプル（１つはＣｙ3、もう１つはＣｙ5標識）は、２.５mlの０.５M水酸化ナトリウムで処理し、８５℃で２０分間インキュベートし、反応を停止させてRNAを分解させる。サンプルは、２つの連続するCHROMA SPIN 30ゲル濾過スピンカラム（CLONTECH Laboratories, Inc. (CLONTECH), Palo Alto CA）を用いて精製する。 混合後、２つの反応サンプルは、１mlのグリコーゲン（１mg/ml）、６０mlの酢酸ナトリウム及び３００mlの１００％エタノールを用いてエタノール沈殿させる。サンプルは次に、SpeedVAC（Savant Instruments Inc., Holbrook NY）を用いて乾燥して仕上げ、１４μlの５×SSC／０.２％SDS中で再懸濁する。
【０３０６】
マイクロアレイの準備
本発明の配列を用いて、アレイエレメントを作製する。各アレイエレメントは、クローン化ｃＤＮＡインサートによりベクター含有細菌性細胞から増幅する。ＰＣＲ増幅は、cDNAインサートに隣接するベクター配列に相補的なプライマーを用いる。３０サイクルのＰＣＲによって、１〜２ngの初期量から５μgを超える最終量までアレイエレメントを増幅する。増幅したアレイエレメントは、SEPHACRYL-400（Amersham Biosciences）を用いて精製する。
【０３０７】
精製したアレイエレメントは、ポリマーコートされたスライドグラス上に固定する。顕微鏡スライドグラス（Corning）は、処理中及び処理後に０.１％のSDS及びアセトン中で超音波処理をかけ、蒸留水で非常に良く洗浄する。スライドグラスは、４％フッ化水素酸（VWR Scientific Products Corporation (VWR), West Chester PA）中でエッチングし、蒸留水中で非常に良く洗浄し、９５％エタノール中で０.０５％アミノプロピルシラン（Sigma）を用いてコーティングする。コーティングしたスライドガラスは、１１０℃のオブンで硬化させる。
【０３０８】
米国特許第5,807,522号で説明されている方法を用いて、コーティングしたガラス基板にアレイエレメントを付加する。 該特許は、引用を以って本明細書の一部となす。平均濃度が100ng/μlのアレイエレメントDNA１μlを高速機械装置により開放型キャピラリープリンティングエレメント（open capillary printing element）に充填する。装置はここで、スライド毎に約５nlのアレイエレメントサンプルを加える。
【０３０９】
マイクロアレイには、STRATALINKER ＵＶ架橋剤（Stratagene）を用いてＵＶ架橋する。マイクロアレイは、室温において０.２％ＳＤＳで１度洗浄し、蒸留水で３度洗浄する。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)（Tropix, Inc., Bedford MA）中の０.２％カゼイン中において６０℃で３０分間マイクロアレイをインキュベートした後、前に行ったように０.２％ＳＤＳ及び蒸留水で洗浄することにより、非特異結合部位をブロックする。
【０３１０】
ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション反応液は、５×SSC、０.２％SDSハイブリダイゼーション緩衝液にCy3及びCy5標識したcDNA合成産物を各０.２μg含む９μlのサンプル混合体を含めたものである。サンプル混合体は、６５℃まで５分間加熱し、マイクロアレイ表面上に等分して１.８cm2 のカバーガラスで覆う。アレイを、顕微鏡用スライドよりわずかに大きい空洞を有する防水チェンバーに移す。チェンバーのコーナーに１４０μlの５×SSCを加えることにより、チェンバー内部を湿度100%に保持する。アレイを含むチェンバーは、６０℃で約６．５時間インキュベートする。アレイは、第１洗浄緩衝液中（１×SSC,０.１％SDS）において４５℃で１０分間洗浄し、第２洗浄緩衝液中（０.１×SSC）において４５℃で１０分間各々３度洗浄して乾燥させる。
【０３１１】
検出
レポーター標識ハイブリダイゼーション複合体は、Ｃｙ3の励起のためには４８８nm、Ｃｙ5の励起のためには６３２nmでスペクトル線を発生し得るInnova70混合ガス10Ｗレーザ（Coherent, Inc., Santa Clara CA）を備えた顕微鏡で検出する。励起レーザ光の焦点をアレイ上に置くため、20×顕微鏡対物レンズ（Nikon, Inc., Melville NY）を用いる。アレイを含むスライドを、顕微鏡の、コンピュータ制御のX-Yステージに置き、対物レンズを通してラスタースキャンする。本実施例で用いる1.8cm×1.8cmのアレイは、解像度20μmでスキャンする。
【０３１２】
２つの異なるスキャンで、混合ガスマルチラインレーザは２つの蛍光色素を連続的に励起する。発光された光は、波長に基づき分離され、２つのフルオロフォアに対応する２つの光電子増倍管検出器（PMT R1477, Hamamatsu Photonics Systems, Bridgewater NJ）に送られる。好適なフィルタ群をアレイと光電子増倍管との間に設置して、シグナルをフィルタする。用いるフルオロフォアの最大発光の波長は、Cy3では565nm、Cy5では650nmである。装置は両方の蛍光色素からのスペクトルを同時に記録し得るが、レーザ源において好適なフィルタを用いて、蛍光色素１つにつき１度スキャンし、各アレイを通常２度スキャンする。
【０３１３】
スキャンの感度は通常、既知濃度でサンプル混合体に添加されるｃＤＮＡ対照種により発生されるシグナル強度を用いて較正する。アレイ上の特定の位置には相補的ＤＮＡ配列が含まれ、その位置におけるシグナルの強度を重量比1：100,000でハイブリダイゼーション種と相関させる。異なる源泉（例えば試験される細胞及び対照細胞など）からの２つのサンプルを、各々異なる蛍光色素で標識し、他と異なって発現した遺伝子を同定するために単一のアレイにハイブリダイズする場合には、２つの蛍光色素で較正するｃＤＮＡのサンプルを標識し、ハイブリダイゼーション混合液に各々等量を加えることによって較正を行う。
【０３１４】
光電子増倍管の出力は、IBMコンパチブルPCコンピュータにインストールされた12ビットRTI-835Hアナログディジタル（A/D）変換ボード（Analog Devices, Inc., Norwood MA）を用いてディジタル化される。ディジタル化されたデータは、青色（低シグナル）から赤色（高シグナル）までの擬似カラー範囲へのリニア20色変換を用いてシグナル強度がマッピングされたようなイメージとして表示される。データは、定量的にも分析される。2つの異なる蛍光色素を同時に励起および測定する場合には、各蛍光体の発光スペクトルを用いて、データはまず蛍光色素間の光学的クロストーク（発光スペクトルの重なりに起因する）を補正する。
【０３１５】
グリッドが蛍光シグナルイメージ上に重ねられ、それによって各スポットからのシグナルはグリッドの各エレメントに集められる。各エレメント内の蛍光シグナルは統合され、シグナルの平均強度に応じた数値が得られる。シグナル分析に用いるソフトウェアは、GEMTOOLS遺伝子発現分析プログラム（Incyte）である。GEMTOOLSプログラム（Incyte Genomics）を使って、発現が少なくとも2倍変化したアレイエレメント、SB比が少なくとも2.5であるもの、およびエレメントスポットサイズが少なくとも４０％であるものは差次的に発現していると同定された。
【０３１６】
発現
たとえば、SEQ ID NO:19  は、大腸癌患者の大腸組織で、同じドナーのマッチした微視的正常組織と比較して、差次的発現を示したが、これはマイクロアレイ分析で判定した。SEQ ID NO:19の発現は癌の大腸癌組織において少なくとも2倍減少していた。したがって、SEQ ID NO:19は、大腸癌を含む細胞増殖性障害の段階決定および診断アッセイに有用である。
【０３１７】
１２  相補的ポリヌクレオチド
CHOPをコードする配列に、或いはその任意の一部に対して相補的な配列は、天然CHOPの発現を、検出し、低下させ、または阻害するために用いられる。約15〜30塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、これより小さなあるいは大きな配列の断片の場合でも、本質的に同じ手順を用いる。適切なオリゴヌクレオチドを設計するため、Oligo 4.06ソフトウェア（National Biosciences）およびCHOPのコーディング配列を用いる。転写を阻害するためには、最も独特な５'配列から相補的オリゴヌクレオチドを設計し、これを用いて、プロモーターがコーディング配列に結合するのを防止する。翻訳を阻害するためには、相補的なオリゴヌクレオチドを設計して、リボソームがCHOPをコードする転写物に結合するのを阻害する。
【０３１８】
１３  CHOPの発現
CHOPの発現及び精製は、細菌若しくはウイルスを基にした発現系を用いて行うことができる。細菌でCHOPが発現するために、抗生物質耐性遺伝子及びcDNAの転写レベルを高める誘導性のプロモーターを含む好適なベクターにcDNAをサブクローニングする。このようなプロモーターとしては、lacオペレーター調節エレメントと併用するT5またはT7バクテリオファージプロモーター、およびtrp-lac（tac）ハイブリッドプロモーターが含まれるが、これらに限定するものではない。組換えベクターを、BL21（DE3）等の好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性をもつ細菌が、イソプロピルβ−Dチオガラクトピラノシド(IPTG)で誘発されるとCHOPを発現する。真核細胞でのCHOPの発現は、昆虫細胞株または哺乳動物細胞株に一般にバキュロウイスルスとして知られているAutographica californica核多角体病ウイルス(AcMNPV)を感染させて行う。バキュロウイルスの非必須ポリヘドリン遺伝子をCHOPをコードするcDNAと置換するには、相同組換えを行うか、或いは、転移プラスミドの媒介を伴う、細菌の媒介による遺伝子転移を行う。ウイルスの感染力は維持され、強力なポリヘドリンプロモーターによって高レベルのcDNA転写が行われる。組換えバキュロウイルスは、多くの場合は夜蛾の１種Spodoptera frugiperda（Sf9）昆虫細胞への感染に用いるが、ヒト肝細胞への感染に用いることもある。後者の感染の場合は、バキュロウイルスの更なる遺伝的変更が必要になる。（前出のEngelhard 他、前出のSandig 他 ）。
【０３１９】
殆どの発現系では、CHOPが、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ(GST)、またはFLAGや6-Hisなどのペプチドエピトープ標識で合成された融合タンパク質となるため、未精製の細胞溶解物からの組換え融合タンパク質の親和性ベースの精製が素早く１回で行うことができる。GSTは日本住血吸虫からの26kDaの酵素であり、タンパク質の活性および抗原性を維持した状態で、固定化したグルタチオン上での融合タンパク質の精製を可能とする（Amersham Biosciences）。精製の後、GST部分を特定の操作部位でCHOPからタンパク分解的に切断できる。ＦＬＡＧは８アミノ酸のペプチドであり、市販されているモノクローナル及びポリクローナル抗ＦＬＡＧ抗体（Eastman Kodak）を用いて免疫親和性精製を可能にする。６ヒスチジン残基が連続して伸長した6-Hisは、金属キレート樹脂上での精製を可能にする（QIAGEN）。タンパク質の発現および精製の方法は、前出のAusubel他(1995)10章、16章に記載されている。これらの方法で得た精製CHOP を直接用いて以下の実施例１７、１８、および１９の、適用可能なアッセイを行うことができる。
【０３２０】
１４  機能的アッセイ
CHOP機能は、哺乳動物細胞培養系において生理学的に高められたレベルでのCHOPをコードする配列の発現によって評価する。 cDNAを高いレベルで発現する強いプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターにcDNAをサブクローニングする。選択されるベクターには、PCMV SPORTプラスミド（Invitrogen, Carlsbad  CA）及びPCR 3.1プラスミド（Invitrogen）が含まれ、どちらもサイトメガロウイルスプロモーターを有する。リポソーム製剤あるいは電気穿孔法を用いて、5〜10μgの組換えベクターをヒト細胞株、例えば内皮由来または造血由来の細胞株に、一過的に形質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む1〜2μgのプラスミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入された細胞と形質移入されていない細胞を区別する手段が与えられる。また、標識タンパク質の発現によって、ｃＤＮＡの組換えベクターからの発現を正確に予想できる。標識タンパク質は、例えば緑色蛍光タンパク質（GFP；Clontech）、CD64またはCD64-GFP融合タンパク質から選択できる。自動化された、レーザー光学に基づく技術であるフローサイトメトリー（FCM）を用いて、GFPまたはCD64-GFPを発現する形質移入された細胞を同定し、それらの細胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。ＦＣＭは、細胞死に先行するか或いは同時に発生する現象を診断する蛍光分子の取込を検出して計量する。このような現象として挙げられるのは、プロピジウムヨウ化物によるＤＮＡ染色によって計測される核ＤＮＡ内容物の変化、前方散乱光と90°側方散乱光によって計測される細胞サイズと顆粒状性の変化、ブロモデオキシウリジンの取込量の低下によって計測されるDNA合成の下方調節、特異抗体との反応性によって計測される細胞表面及び細胞内におけるタンパンク質の発現の変化、及び蛍光複合アネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形質膜組成の変化とがある。フローサイトメトリー法については、Ormerod, (1994)Flow Cytometry, Oxford, New York NYに記述がある。
【０３２１】
遺伝子発現におけるCHOPの影響は、CHOPをコードする配列とCD64またはCD64-GFPのどちらかが形質移入された高度に精製された細胞集団を用いて評価することができる。CD64またはCD64-GFPは、形質移入された細胞表面で発現し、ヒト免疫グロブリンG（IgG）の保存された複数の領域に結合する。形質移入された細胞と形質移入されない細胞とは、ヒトIgGかCD64に対する抗体かのどちらかで被覆された磁気ビーズを用いて効率的に分離することができる(DYNAL, Lake Success NY)。mRNAは、当業者に周知の方法で細胞から精製することができる。CHOPと、目的とする他の遺伝子とをコードするmRNAの発現は、ノーザン分析やマイクロアレイ技術で分析することができる。
【０３２２】
１５  CHOPに特異的な抗体の作製
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(PAGE；Harrington, M.G. (1990) Methods Enzymol. 1816−3088-495)または他の精製技術で実質的に精製されたCHOP を用いて、標準的なプロトコルで動物(例えば、ウサギ、マウス等)を免疫化して抗体を作り出す。
【０３２３】
或いは、レーザGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いてCHOPアミノ酸配列を解析し、免疫原性の高い領域を決定する。そして対応するオリゴペプチドを合成し、このオリゴペプチドを用いて当業者によく知られている方法で抗体を生成する。例えばＣ末端付近或いは隣接する親水性領域等の、適切なエピトープの選択については、当分野で公知である（前出のAusubel, 1995, 11章）。
【０３２４】
通常は、長さ約１５残基のオリゴペプチドを、FMOC ケミストリを用いるABI 431A ペプチドシンセサイザ（Applied Biosystems）を用いて合成し、N-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（MBS）を用いた反応によってKLH（Sigma-Aldrich, St. Louis MO）に結合させて、免疫原性を高める（前出のAusubel, 1995）。完全フロイントアジュバントにおいて、オリゴペプチド-KLH複合体を用いてウサギを免疫化する。得られた抗血清の抗ペプチド活性及びCHOP活性を検査するには、ペプチドまたはCHOPを基板に結合し、１％BSAを用いてブロッキング処理し、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギIgGと反応させる。
【０３２５】
１６  特異的抗体を用いる天然CHOPの精製
天然CHOP或いは組換えCHOPを、CHOPに特異的な抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィにより実質的に精製する。イムノアフィニティーカラムは、CNBr-活性化SEPHAROSE（Amersham Biosciences）のような活性化クロマトグラフィー用レジンと抗CHOP抗体とを共有結合させることにより形成する。結合後に、製造者の使用説明書に従ってこのレジンをブロックし、洗浄する。
【０３２６】
CHOPを有する培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、CHOPを優先的に吸着できる条件で（例えば、界面活性剤の存在下で高イオン強度のバッファーで）そのカラムを洗浄する。そのカラムを、抗体とCHOPとの結合を切るような条件で（例えば、ｐＨ２〜３のバッファー、或いは高濃度の尿素またはチオシアン酸塩イオンのようなカオトロピックイオンで）溶出させ、CHOPを回収する。
【０３２７】
１７  CHOPと相互作用する分子の同定
CHOPまたは生物学的に活性なその断片を、125I ボルトンハンター試薬で標識する（Bolton A.E.及びW.M. Hunter (1973) Biochem. J. 133:529）。マルチウェルプレートに予め配列しておいた候補の分子を、標識したCHOPと共にインキュベートし、洗浄して、標識したCHOP複合体を有する全てのウェルをアッセイする。様々なCHOP濃度で得られたデータを用いて、候補分子と結合したCHOPの数量及び親和性、会合についての値を計算する。
【０３２８】
或いは、CHOPと相互作用する分子は、Fields および Song（1989, Nature 340:245-246）に記載されているような酵母２ハイブリッドシステムを用いて分析するか、またはMATCHMAKERシステム（Clontech）等の２ハイブリッドシステムに基づく市販のキットを用いて分析する。
【０３２９】
CHOPはまた、高処理型の酵母２ハイブリッドシステムを使用するPATHCALLINGプロセス（CuraGen Corp., New Haven CT）に用いて、遺伝子の２つの大きなライブラリによってコードされるタンパク質間の全ての相互作用を決定することができる（Nandabalan, K. 他 (2000) 米国特許第6,057,101号）。
【０３３０】
１８  CHOP活性の実証
ガラクトシルトランスフェラーゼ活性アッセイ＃１
CHOPのβ1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ活性およびβ1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ活性は、放射性アッセイにおけるUDP-ガラクトースからGlcNAc末端オリゴサッカライド鎖へのガラクトースの転移を測定することによって測定できる(Kolbinger, F. 他(1998) J. Biol. Chem. 273:58-65; Hennet, T. 他 (1998) J. Biol. Chem. 273:58-65)。CHOPのアリコットを、14 μl のアッセイ用ストック溶液(180 mM のカコジル酸ナトリウム、pH 6.5、1 mg/ml のウシ血清アルブミン、0.26 mM のUDP-ガラクトース、2 μl のUDP-[3H]ガラクトース)、1 μl の MnCl2 (500 mM)および 2.5 μl の GlcNAcβO-(CH2)8-CO2Me (ジメチルスルホキシド中に37 mg/ml )  で37℃にて約1時間 インキュベートする。この反応は1mlの水を加えて停止させ、C18 Sep-Pak カートリッジ(Waters)に搭載し、カラムを2回5mlの水で洗浄して未反応のUDP-[3H]ガラクトースを除去する。反応生成物の[3H]ガラクトシル化GlcNAcβO-(CH2)8-CO2Me は水で洗浄する間はカラムに結合されたままであり、5mlのエタノールで溶出する。溶出された物質の放射活性は液体シンチレーションカウンターで測定され、これはサンプル中のCHOPガラクトシルトランスフェラーゼ活性に比例する。
【０３３１】
ガラクトシルトランスフェラーゼ活性アッセイ＃2
別方法として、CHOPのβ1,4ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を[14C]ガラクトースのDP[14C]Gal からオボアルブミンへの転移の定量化によって求めることができる。約50 μlの反応液は、50 mMの HEPES (pH 7.35)、 10 mMの MnCl2、 1.5 mgのオボアルブミン、 50 mMの NaCl、 5 μlの UDP[14C]ガラクトース (25 nCi)、 および 5 μl の CHOPを含む。このアッセイを60 ℃ で 30分間インキュベートし、氷冷した2.5％のリンタングステン酸 (w/v)（1 M HCl中）を加えて停止させた。取り込まれなかったUDP[14C]GalはWhatman GF/Cグラスファイバーフィルタによるろ過で分離した。フィルタは一度2.5％のリンタングステン酸(w/v)で洗浄し、氷冷したエタノールでリンスした。フィルタを乾燥してから、シンチレーションカウンタを使って放射能を測定した。放射能の量はCHOPの活性に比例する(Verdon, B. および Berger, E. (1983) in Galactosyltransferase. Methods of Enzymatic Analysis, Bergmeyer, H. 他 (編集), 第III巻、第３版、 Verlag Chemie, Weinheim, Deerfield Beach, Basel, 374381ページ; Tilo, S. 他(1996) J. Biol. Chem. 271:33983405)。
【０３３２】
シアリルトランスフェラーゼ活性アッセイ＃１
別方法として、CHOPのシアリルトランスフェラーゼ活性を次の方法でアッセイできる。このアッセイで使用するシアリルトランスフェラーゼ受容体は6(5フルオレセインカルボキサミド)ヘキサン酸サクシミジルエステル (FCHASE)と反応させたアミノフェニルグリコシドから得られる。概略すると、10 mgのp-アミノフェニルグリコシドを0.5 mlの0.2 M 酢酸トリエチルアミンバッファ（pH8.2）に溶かす。FCHASE を0.5 ml のメタノールに溶かし、先のアミノフェニルグリコシド溶液に加える。この混合液を室温の暗い場所で約3時間攪拌し、凍結乾燥し、約 200 μl の 50%アセトニトリルに再び懸濁する。シリカ薄層クロマトグラフィ（TLC）プレートに混合液をスポットして、酢酸エチル/メタノール/水/酢酸溶媒系で展開する。排気チェンバーの中で乾燥した後、黄色い生成物を掻き取り、蒸留水で溶出し、濃縮、脱塩の後、SepPak C18逆相カートリッジに結合させる。カートリッジを数倍量の水で洗浄し、５０％のアセトニトリルで溶出させた後、公知の分光法で定量する。シアリルトランスフェラーゼ受容体を調製した後、20 μl の容量、37 ℃の温度で酵素反応を行う。このときの溶液は50 mM MES (pH 6.0)および10 mM MnCl2,のバッファに0.2 または 1.0 mMの標識化受容体、0.2 mMのCMPNeu5Ac供与体およびさまざまな量のCHOPを加えたものである。10 mM NaOH による希釈によって反応を停止し、キャピラリー電気泳動法で分析する。キャピラリー電気泳動法（CE）はアルゴンイオンレーザ誘導蛍光検出器（励起＝488 nm；  発光＝520 nm）を使って行う。FCHASE2,3シアリルNアセチルラクトサミンからなる生成物ピークを同定し、定量する。これはサンプル中のシアリルトランスフェラーゼ活性に比例する(Wakarchuk, W. 他 (1996) J. Biol. Chem. 271:1916619173; Gilbert, M. (1996) J. Biol. Chem. 271:2827128276)。
【０３３３】
シアリルトランスフェラーゼ活性アッセイ＃2
別方法として、CHOPのシアリルトランスフェラーゼ活性を次の方法でアッセイできる。シアリルトランスフェラーゼのアッセイは、10 mMのMgCl2、 0.3% Triton CF54、 100 mMのカコジル酸ナトリウムバッファ (pH 6.0)、 0.66 mMのの非標識化 CMPNeu5Ac 供与体、 4400 dpm/μl CMP[14C]Neu5Ac (トレーサー)、 CHOP溶液および基質を含む全容量20〜50 μlの反応混合液で行う。反応混合液を37 ℃で2時間インキュベートし、500 μlの水を加えて反応を停止する。生成物をC18 Sep-Pakカートリッジで単離し、エタノール/ピリジン/n-ブタノール/酢酸/水(100:10:10:3:30)の溶媒系を使った薄層クロマトグラフィ（TLC）で分析する (Okajima, T. 他 (1999) J. Biol. Chem. 274:1147911486)。放射能標識された生成物は、当業者に知られた標準的なオートラジオグラフィー技法で可視化する。CHOPのシアリルトランスフェラーゼ活性はオートラジオグラムのシグナルに比例する。
【０３３４】
シアリルトランスフェラーゼ活性アッセイ＃3
別方法として、CHOPのシアリルトランスフェラーゼ活性を次の方法でアッセイできる。CHOPをコードするプラスミドにより、ヒトの胚腎細胞（293）を安定に形質転換する。細胞を225 cm2 の組織培養フラスコでコンフルエンスまで成長させ、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に掻き入れることによって収穫する。細胞をペレット化して、約1 ml の 1% Triton X100、 50 mM NaCl、 5 mM MnClおよび25 mM MES (pH 6.0)に再び懸濁する。ピペット操作とボルテックスを繰り返すことで細胞ペレットを溶かす。この未精製のホモジネートを1000 x gで10分間遠心してクリアにして、そのまま酵素源として使用する。アッセイ混合物は、250,000 cpm の CMP[14C]Neu5Acをトレーサーとして加えた50 μM CMPNeu5Ac、0.1% Triton CF54、 20 mM カコジル酸塩 (pH 6.0) および 10 μl の CHOP含有抽出液からなり、反応容量は30 μlである。糖タンパク質および糖脂質生成物はゲルろ過によってCMPNeu5Acから分離し、溶出した分画内の標識の量を定量してサンプル内のCHOP活性の相対量を求める(Sjoberg, E. 他 (1996) J. Biol. Chem. 271:74507459)。
【０３３５】
O-グルコシルトランスフェラーゼのトランスフェラーゼ活性アッセイ
CHOPのO-グルコシルトランスフェラーゼ活性を次の方法でアッセイできる。使用の直前に、CHOP試薬を氷冷した脱塩バッファ(20 mM Tris pH 8.0、 20% グリセロール、 0.02% NaN3)で希釈する。受容体としては約3 mMの濃度のペプチド基質(Kreppel, L. 他 (1999) J. Biol. Chem. 274:3201532022)を使用する。反応の中のペプチドは、SPSephadexカラムを使って反応物から分離する。修飾されたペプチドと修飾されないペプチドをSeppak C18にロードする。修飾されないペプチドは50 mMの蟻酸、0.5 M NaClを含む10 ml の50 mM蟻酸、および10 mMの蒸留水で溶出する。修飾されたペプチドは、メタノールを使ってカートリッジから直接シンチレーションバイアルに溶出する。酵素活性は毎分転位されるGlcNAcのマイクロモル数で表されるが、これはサンプル中のCHOP活性のレベルに比例する(Kreppel 他, 前出)。
【０３３６】
マンノシダーゼ活性のアッセイ
CHOPのマンノシダーゼ活性はMan9 (GlcNAc)2オリゴ糖からマンノースを放出させる能力によって測定する(Schweden, J. 他 (1986) Eur. J. Biochem. 157:563-570)。200 mM リン酸バッファ（pH 6.5）と1% Triton X-100に溶かしたCHOPを[14C](Man9)(GlcNAc)2 (2-3 x 103 cpm)と混合し、最終容量を30 μlとし、37℃で60分反応させる。30 μlの氷酢酸を加えて反応を停止させる。放出された  マンノースの量は2-プロパノール/酢酸/水(容積比29/4/9)によるペーパークロマトグラフィで分析するが、これは開始サンプル内のCHOPの活性に比例する。
【０３３７】
糖質結合アッセイ
CHOP活性は、βガラクトシド糖に結合する能力として実証される。CHOPがラクトシルセファロースカラムにかけられ、そのカラムを0.1Ｍのラクトースで溶出する。溶出液中のCHOPの存在は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって検出され、CHOPのβガラクトシド糖への結合能力を示す。
【０３３８】
ヒアルロナン加水分解アッセイ
CHOPの活性は、 ヒアルロナン(HA)を加水分解する能力によっても測定することができる(Lepperdinger, 前出)。放射能標識されたＨＡを、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドとN-ヒドロキシ サルフォサクシンイミド（sulfosuccinimide）を使って、微量定量プレートに固定化する。CHOPとインキュベーションした後の可溶化された放射能が液体シンチレーションカウンターを使って測定され、その放射能は開始サンプルのCHOP活性と比例する。
【０３３９】
細胞形質転換アッセイ
別法では、CHOP活性は、NIH３T3マウス線維芽細胞の形質転換を調節する能力によって測定される。CHOPをコードするcDNAは好適な真核生物発現ベクターにサブクローンされる。このベクターは当分野で周知の方法を用いてNIH3T3 細胞に形質移入される。形質移入細胞と非形質移入細胞を、発癌性形質転換細胞の定量化できる特徴的性質について比較する。すなわち、接触阻害の喪失に関連する培養中の高密度増殖、懸濁液中または軟寒天での増殖、血清必要性の低下、および免疫不全マウスに注入された場合の腫瘍誘発能について評価する。CHOPの活性は、CHOPで形質移入されたNIH３T3細胞と非形質移入細胞の形質転換の程度に比例する。
【０３４０】
１９  CHOP関連α1,3ガラクトシルトランスフェラーゼ活性の発現と精製
可溶でα1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ(α1,3-GalT)活性を持つ触媒活性のあるCHOPを、CHOPを発現するプラスミドで形質移入した、ほぼコンフルエントなヒトの胚腎(293)細胞の培地から精製する。培地を20 mM HEPES (pH 7.0) と 5 mM MnCl2,に対して一晩、4℃で透析する。そのときバッファを何度か取替え、次にUDPヘキサノールアミン-セファロース(4 μmol/ml レジン)のアフィニティカラムにかける。溶出液のA280がバックグランドレベルになるまで、カラム透析バッファと0.75 M NaClを含む透析バッファで洗浄する。結合した酵素は透析バッファに5 mM UDPを溶かしたもので溶出し、Centricon10 (Millipore)を使って濃縮する。精製された酵素の均一度は、10% SDSPAGEゲル上の分離により求める(Kim, S. 他 (1997) J. Biol. Chem. 272:1362213628)。
【０３４１】
当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本発明の記載した方法及びシステムの種々の改変を行い得る。本発明について説明するにあたり特定の好適実施例に関連して説明を行ったが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。分子生物学または関連分野の専門家には明らかな、本明細書に記載する本発明の実施方法の様々な修正は、明確に特許請求の範囲内にあるものとする。
【０３４２】
（表の簡単な説明）
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の命名法の概略を示す。
【０３４３】
表２は、本発明のポリペプチド群のGenBank識別番号と、最も近いGenBank相同体の注釈（annotation）と、PROTEOMEデータベース識別番号と、PROTEOMEデータベース相同体群の注釈とを示す。  各ポリペプチドとそのGenBank相同体が一致する確率スコアも併せて示す。
【０３４４】
表３は、予測されるモチーフ及びドメインを含む本発明のポリヌクレオチド配列の構造的特徴を、ポリペプチドの分析に用いるための方法、アルゴリズム及び検索可能なデータベースと共に示す。
【０３４５】
表４は、本発明のアセンブリされたポリヌクレオチド配列およびポリヌクレオチド配列から選択された断片のSEQ ID NO:、Incyte IDおよび長さを示す。
【０３４６】
表５は、本発明のポリヌクレオチドの代表的なcDNAライブラリを示す。
【０３４７】
表６は、表５に示したcDNAライブラリの作製に用いた組織及びベクターを説明する付表である。
【０３４８】
表7は、本発明のポリヌクレオチドとポリペプチドの分析に用いたツール、プログラム、アルゴリズムを、適用可能な説明、参照文献及び閾値パラメータと共に示す。
【０３４９】
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表７
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表7(続)
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
2005501526.tif 000208
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