(57)【要約】  本発明は、分子標的とプローブ分子との特異的相互作用を測定するための反応容器、装置および方法に関する。本発明は、特に、実験用反応容器に典型的な規模と形態からなり、所与の領域に固定化されているプローブ分子を備えた支持要素がその基部表面の１つに配置されている、反応容器に関する。
2005514632.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子標的とプローブ分子との特異的相互作用を検出するための反応容器であって、実験用反応容器（チューブ）に典型的な形状と寸法とを有し、所定領域にプローブ分子が固定化された支持要素がその基部表面中の１表面に配置されていることを特徴とする反応容器。
【請求項２】
前記実験用反応容器の基部表面が前記支持要素を受承するための凹所を有することを特徴とする請求項１に記載の反応容器。
【請求項３】
支持要素の検出表面の部分が光学的に透過性であることを特徴とする請求項１または２に記載の反応容器。
【請求項４】
前記検出表面と向かい合う基部表面が光学的に透過性であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の反応容器。
【請求項５】
前記支持要素の材料がガラスおよびシリコンのうち少なくともいずれかであり、好ましくは、Ｂｏｒｏｆｌｏａｔ（登録商標）３３、石英ガラス、単結晶ＣａＦ２および単結晶シリコンからなる群から選択されることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の反応容器。
【請求項６】
前記容器の材料が、ガラスと、ガラスセラミックと、プラスチック被覆ガラスと、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ＰＶＣ、ポリメチルメタクリレート、シリコンプラスチック、ゴム、ポリテトラフルオロエチレンおよび／またはナイロンなどのプラスチックと、ステンレス鋼、白金および／またはアルミニウムなどの金属とからなる群から選択されることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の反応容器。
【請求項７】
１００μｌ〜２．５ｍｌの範囲の充填容積、好ましくは１．５ｍｌの充填容積を有することを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の反応容器。
【請求項８】
固定化プローブ分子がタンパク質ライブラリー、ペプチドライブラリーおよび核酸ライブラリーからなる群から選択される物質ライブラリーであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の反応容器。
【請求項９】
前記タンパク質ライブラリーが抗体ライブラリー、受容体タンパク質ライブラリーおよび膜タンパク質ライブラリーのうち少なくともいずれかであることを特徴とする請求項８に記載の反応容器。
【請求項１０】
前記ペプチドライブラリーが受容体リガンドのライブラリー、薬理学的に活性なペプチドのライブラリーおよびペプチドホルモンのライブラリーのうち少なくともいずれかであることを特徴とする請求項８に記載の反応容器。
【請求項１１】
前記核酸ライブラリーがＤＮＡ分子ライブラリーおよびＲＮＡ分子ライブラリーのうち少なくともいずれかであることを特徴とする請求項８に記載の反応容器。
【請求項１２】
分子標的とプローブ分子との特異的相互作用を検出するための装置であって、
ａ）請求項１〜１１のいずれか１項に記載の少なくとも１つの反応容器と、
ｂ）該特異的相互作用を検出するための検出装置と、
からなる装置。
【請求項１３】
前記検出装置がカメラと、任意選択で読み出し光学部品と、からなることを特徴とする請求項１２に記載の装置。
【請求項１４】
前記カメラがＣＣＤカメラまたはＣＭＯＳカメラであることを特徴とする請求項１３に記載の装置。
【請求項１５】
さらに光源を含むことを特徴とする請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１６】
前記光源が支持体の均一な照射を保証することを特徴とする請求項１５に記載の装置。
【請求項１７】
光源がスペクトル干渉により支持体の均一な照射を保証する複数の拡散発光光源からなる照射アレイであることを特徴とする請求項１５または１６に記載の装置。
【請求項１８】
光源がレーザー、発光ダイオード（ＬＥＤ）、表面発光体および高圧ランプからなる群から選択されることを特徴とする請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１９】
反応容器の蓋が均一な照射を保証するように構成されていることを特徴とする請求項１２〜１８のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２０】
光フィルタと、任意選択でフィルタ交換器と、からさらになることを特徴とする請求項１２〜１９のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２１】
光源と支持体との間に位置する半透明鏡からさらになることを特徴とする請求項１２〜２０のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２２】
反応容器が検出装置と直接接触していることを特徴とする請求項１２〜２１のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２３】
連続的な検出が保証されるように複数の反応容器が配置されていることを特徴とする請求項１２〜２２のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２４】
温度制御ユニットからさらになることを特徴とする請求項１２〜２３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２５】
検出装置により記録される信号強度を収集し、
任意選択で、仮想信号強度のアナログ像への変換を保証する
ためにプログラムされているコンピュータからさらになることを特徴とする請求項１２〜２４のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２６】
分子標的とプローブ分子との特異的相互作用を検出する方法であって、
ａ）請求項１〜１１のいずれか１項に記載の反応容器または請求項１２〜２５のいずれか１項に記載の装置を用意する工程と、
ｂ）該標的を、所定領域またはアレイ要素上に配置されているプローブ分子と相互作用させる工程と、
ｃ）相互作用を検出する工程と、
からなる方法。
【請求項２７】
前記相互作用を検出するために、相互作用が起こるアレイ要素上に析出物を生じる反応を行うことを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
工程ｃ）において、前記析出物の生成の時間的推移を、前記アレイ要素上で信号強度の形で検出することを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記アレイ要素上に析出物の形成をもたらす反応が、可溶性基質の金属析出物への変換であることを特徴とする請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記アレイ要素上に析出物の形成をもたらす反応が、元素銀を形成するための、銀化合物、好ましくは、硝酸銀、乳酸銀、酢酸銀または酒石酸銀の化学的還元であることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
還元剤がホルムアルデヒドおよびヒドロキノンからなる群から選択されることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
可溶性基質の金属析出物への変換が、標的に結合した金属クラスターまたはコロイド状金属粒子の存在下で起こることを特徴とする請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
可溶性基質の金属析出物への変換が、金クラスターまたはコロイド状金粒子の存在下で起こることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
金属クラスターまたはコロイド状金属粒子の標的への結合が、直接または標的に結合したアンカー分子を介して起こることを特徴とする請求項２９〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
標的とプローブとの相互作用が、２つのヌクレオチド配列間のハイブリッド形成であることを特徴とする請求項２６〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
アレイ要素上の析出物の存在の検出が、光線、好ましくはレーザー光線もしくは発光ダイオードの、析出物による反射、吸収または拡散によって行われることを特徴とする請求項２６〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
マイクロアレイを用いる試験を行うための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のデバイスまたは請求項１２〜２５のいずれか１項に記載の装置の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子標的とプローブ分子との特異的相互作用を検出するための反応容器、装置および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物医学的試験は、既知の量で、既知の位置に存在する分子（すなわち、分子プローブ）と検出すべき未知の分子または検出すべき未知の複数の分子（すなわち、分子標的分子）との相互作用の検出に基づいていることが多い。現代の試験では、１つの試料を複数のプローブを用いて並行して同時に分析することが可能なように、プローブを支持体、いわゆるマイクロアレイまたはチップ上に物質ライブラリーの形で沈着させる（非特許文献１）。マイクロアレイを作製するために、プローブを、通常、例えば特許文献１における実施例に記載されているように適切なマトリックス上に所定の方法で固定化する（例えば特許文献２、特許文献３を参照）か、または合成により調製する（例えば特許文献４）。
【０００３】
プローブと標的分子との相互作用を、通常次のように検出する。すなわち、１または複数のプローブをマイクロアレイの形態の特定のマトリックス上に固定した後、標的を溶液中でプローブと接触させ、規定の条件下でインキュベートする。インキュベーションの結果として、プローブと標的との間に特異的相互作用が起こる。この場合に認められる結合は、標的分子に対して特異的でないプローブに対する標的分子の結合よりも確実に安定である。特異的に結合しなかった標的分子を除去するために、システムを適切な溶液で洗浄するか、または加熱する。
【０００４】
標的とそのプローブとの特異的相互作用は、標的分子とマイクロアレイとの相互作用の前、相互作用時または相互作用後に標的分子に組込まれたマーカーの種類に通常依存する複数の方法により検出することが可能である。そのようなマーカーは、特異的な標的／プローブ相互作用を、他の従来の検出方法、特に、質量を感知する方法と比較して空間分解能が高く費用が少ない蛍光光学を用いて読み出すことが可能なように、一般に蛍光基を含む（非特許文献２；非特許文献３）。
【０００５】
マイクロアレイ上に固定化された物質ライブラリーおよび標的分子の化学的性質によって、核酸と核酸との間、タンパク質とタンパク質との間ならびに核酸とタンパク質との間の相互作用をこの試験原理を用いて検討することが可能である（総説については、非特許文献４を参照されたい）。
【０００６】
抗体ライブラリー、受容体ライブラリー、ペプチドライブラリーおよび核酸ライブラリーは、マイクロアレイまたはチップ上に固定化し得る物質ライブラリーとみなすことが可能である。
【０００７】
核酸ライブラリーは、格段に重要な役割を果たしている。これらは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子またはリボ核酸（ＲＮＡ）分子が固定化されているマイクロアレイである。
【０００８】
ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の形であり、かつ蛍光基で標識された標的分子が、マイクロアレイの核酸プローブへ結合する前提条件は、標的分子とプローブ分子の両方が１本鎖核酸の形で存在することである。効率的かつ特異的なハイブリッド形成は、そのような分子間でのみ起こり得る。１本鎖の核酸標的分子および核酸プローブ分子は、一般的に、熱変性ならびに温度、イオン強度およびへリックス不安定化分子の濃度のようなパラメータを最
適に選択することによって得られる。したがって、ほぼ完全に相補的な配列、すなわち互いに対応する配列を有するプローブのみが標的配列との対を維持することが保証される（非特許文献５）。
【０００９】
生物学的試験法におけるマイクロアレイの使用の典型的な例は、生物医学的診断における試料中の微生物の検出である。この場合、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の遺伝子が遍在的に分布し、個々の種に特有な配列部分を有するという事実を利用する。これらの種特異的配列を１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの形態でマイクロアレイ上に沈着させる。分析すべき標的ＤＮＡ分子を分析すべき試料から最初に分離し、マーカー、例えば、蛍光標識を供する。このように標識した標的ＤＮＡ分子をマイクロアレイ上に沈着させたプローブと溶液中でインキュベートし、非特異的に発生した相互作用を適切な洗浄工程により除去し、特異的相互作用を蛍光光学的評価により検出する。このようにして、１つの試料中の例えば複数の微生物を同時に検出することが可能である。この試験方法では、検出可能な微生物の数は、理論的にはマイクロアレイ上に沈着された特異的プローブの数にのみ依存する。
【００１０】
これらの試験の実際上の実施のために、マイクロアレイまたはチップを、洗浄およびハイブリッド形成工程に必要な液体交換用の出入り口を有する閉鎖チャンバに固定する。そのようなシステムは、例えば、特許文献５および特許文献６に記載されている。特許文献７は、わずかな設計変更を経れば本発明におけるアレイ適用例での使用に好適な分析物測定法用の支持体を記載している。
【００１１】
スライドガラス上に沈着させた表面結合ＤＮＡライブラリーは、通常ＤＮＡ配列分析に用いられている。これまでは、これらのスライドガラス上でハイブリッド形成反応を行うために特殊なハイブリッド形成チャンバまたはインキュベーションチャンバが使用されてきた。これらの従来から知られているチャンバ内でのハイブリッド形成溶液の調合と混合を確実にするためには、用いる装置に特別に適応させた、したがって高価で費用がかかる機器が必要である。
【００１２】
特許文献８は、ＤＮＡチップ上でＰＣＲならびにハイブリッド形成反応を行うのに適したフローセルを記載している。同明細書に記載のフローセルは、例えば加熱混合機（エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）［ドイツ連邦共和国ハンブルグ所在］）や実験用遠心分離機（ヘレウス（Ｈｅｒａｅｕｓ）［ドイツ連邦共和国ハナウ（Ｈａｎａｕ）所在］のような実験室で従来用いられていた機器を使用する必要のない多くの技術的特徴を備えた、複雑な構造上の要素である。
【００１３】
特許文献６には、ＤＮＡチップを含むカートリッジが記載されている。このカートリッジ内で、ＤＮＡチップ上でＰＣＲとハイブリッド形成反応の両方を行うことが可能である。特許文献９には、既知の配列の核酸分子を備えた基材が所定領域に配されている凹所を有する本体が記載されている。該本体は、試料液体を注入可能な密封（シーリング）された空洞を有する。充填チャネルはセプタムを用いて密閉され、本体またはカートリッジを満たすために注入カニューレにより開けられる。上で述べたカートリッジを使用するには、この目的のために特別に備えられた装置を同様に必要とする。
【００１４】
特許文献１０には、小型化された一体型核酸診断装置が記載されている。この装置は、１つまたは複数の試料の収集、それらの調製およびその後の複数の試料の分析の実施に用いることが可能である。そのような装置は、カートリッジ上で行われるすべての工程を組合せ、小型化することによりＤＮＡチップによる分析を自動的に行うために用いることが可能である。そのような装置の供給は非常に高額で、費用がかかる。
【００１５】
特許文献１１には、凹所が設けられている各位置に試料マトリックスを有するウエーハが底部となっているマイクロタイタープレートを製造する方法が記載されている。特許文献１２には、複数の反応容器が互いに隣接して密着して配列され、各反応容器に分子試料マトリックスが供される、生物学的試験の同時実施の方法が記載されている。この生物学的チップ反応容器プレートは、分子試料マトリックス上の相互作用を適切な読取装置により読み出すことが可能なように構成されている。このようにして、数多くの生物学的試料を、分子試料マトリックスを用いて、互いに隣接して並行して検査することが可能である。同文献に記載されている反応容器プレートは、個別の試験を実施するのには適していない。そのような反応容器プレートの製造は、特許文献１１に記載されている。
【００１６】
上述した従来技術を考慮すれば、一方では簡単かつ費用効率よく提供することが可能であり、他方ではマイクロアレイによる検出試験を簡単に行うために使用可能な装置について多大な必要性が存在することは明らかである。特に、実験室で日常的に使用されている一般的な機器および道具類の使用が可能な、マイクロアレイによる試験を実施するための装置が必要とされている。一般的に、単純な設計、容易な取扱い、汚染源の回避、再現性のある試験の実施および低製造費用を特徴とする、マイクロアレイによる試験を実施するための機器が必要とされている。
【００１７】
現在のところ、プローブ・アレイに基づく分析は一般的に蛍光光学を用いて読み出されている（非特許文献２；非特許文献３を参照のこと）。しかし、従来の検出法の欠点は、場合によってかなりの技術的労力が必要であることと該検出法に伴う費用が高いことである。
【００１８】
最近、比較的少ない技術的労力でプローブと標的との相互作用を定性的および／または定量的に検出することを可能にする多くのアレイ法が開発されている。
特許文献１３および特許文献１４には、時間分解析出反応によるプローブ・アレイ上の分子相互作用の定量的および定性的検出の方法ならびに関連する機器および単回使用の物品が記載されている。
【００１９】
特許文献１５は、物質ライブラリーを現代のコンパクトディスク（ＣＤ）に類似したディスク上に位置の特定が可能なように沈着させた装置を記載している。ディスクを回転させることによって、ディスク上の特定の物質を扱うことが可能である。次いで読取機器のリードヘッドをディスクの半径に沿って移動させることが可能である。ディスクの部位を、積算され、標準的なＣＤプレーヤーを用いて読み出し可能なトラックにより決定することが可能である。試料の標的物質との相互作用は、透過光または入射光の吸収測定および蛍光測定により遂行することが可能である。同様に、磁気リードヘッドを用いて検出可能な磁性粒子を沈着させることが可能である。相互作用反応を可視化するために、ストレプトアビジン／ビオチン−金複合体により析出が媒介される銀析出物を用いた染色が特に提案されている。
【００２０】
特許文献１６は、物質ライブラリーの相互作用反応を可視化するためのスライドガラス上の銀の析出の方法を開示している。この目的のために必要な読取機器も記載されている。
【特許文献１】国際公開第００／１２５７５号パンフレット
【特許文献２】米国特許第５４１２０８７号明細書
【特許文献３】国際公開第９８／３６８２７号パンフレット
【特許文献４】米国特許第５１４３８５４号明細書
【特許文献５】米国特許第６２８７８５０号明細書
【特許文献６】国際公開第０１／０２０９４号パンフレット
【特許文献７】独国特許出願公開第１９９  ４０  ７５０号明細書
【特許文献８】独国特許出願公開第１０１  ４９  ６８４．２号明細書
【特許文献９】国際公開第９５／３３８４６号パンフレット
【特許文献１０】米国特許第５８５６１７４号明細書
【特許文献１１】米国特許第５５４５５３１号明細書
【特許文献１２】米国特許第５８７４２１９号明細書
【特許文献１３】独国特許出願公開第１００３３３３４．６号明細書
【特許文献１４】国際公開第０２／０２８１０号パンフレット
【特許文献１５】国際公開第９９／３５４９９号パンフレット
【特許文献１６】国際公開第００／７２０１８号パンフレット
【非特許文献１】ディー  ジェイ  ロックハート、イー  エー  ウィンツェラー（Ｄ．Ｊ．Ｌｏｃｋｈａｒｔ、Ｅ．Ａ．Ｗｉｎｚｅｌｅｒ）、「ゲノミクス、遺伝子発現およびＤＮＡアレイ（Genomics、gene expression and DNA arrays ）」、Ｎａｔｕｒｅ、２０００年、第４０５巻、８２７〜８３６ページ
【非特許文献２】エー  マーシャル、ジェイ  ホジソン（Ａ．Ｍａｒｓｈａｌｌ、Ｊ．Ｈｏｄｇｓｏｎ）、「ＤＮＡチップ：アレイの可能性（DNA chips: An array of possibilities）」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９８年、第１６巻、２７〜３１ページ
【非特許文献３】ジー  ラムセイ（Ｇ．Ｒａｍｓａｙ）、「ＤＮＡチップの最先端（DNA Chips: State of the art ）」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９８年、第１６巻、４０〜４４ページ
【非特許文献４】エフ  ロッツパイヒ、エイチ  ゾーバス（Ｆ．Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ、Ｈ．Ｚｏｒｂａｓ）、１９９８年、「バイオ分析（Bioanalytik ）」、ドイツ連邦共和国ベルリン  ハイデルベルク所在のスペクトルムアカデミシャー出版（Spektrum Akademischer Verlag）
【非特許文献５】エー  エー  ライチ、ティー  シュワルザッヒャー、ディー  ジャクソン、アイ  ジェー  ライチ（Ａ．Ａ．Ｌｅｉｔｃｈ、Ｔ．Ｓｃｈｗａｒｚａｃｈｅｒ、Ｄ．Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｉ．Ｊ．Ｌｅｉｔｃｈ）、１９９４年、「インビトロのハイブリッド形成（In vitro Hybridisierung ）、スペクトルムアカデミシャー出版（Spektrum Akademischer Verlag）、ドイツ連邦共和国ベルリン  ハイデルベルク、オックスフォード（Heidelberg Berlin Oxford）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
したがって、本発明の目的は、単純な構成、容易な取扱いおよび故に費用対効果が高い製造を特徴とするアレイ法を実施するための装置を提供することである。本発明の他の目的は、そのような装置に用いることが可能で、同様に容易な取扱いと、卓上遠心分離機やピペットのような実験室で通常使用される機器との適合性を特徴とする反応容器を提供することである。本発明のさらなる目的は、汚染源を回避した単一チャンバシステムでマイクロアレイによる試験を実施可能とする反応容器を提供することである。さらに、本発明の目的は、比較的少ない技術的労力で検出法の使用を可能にするアレイ法を実施するための装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明の上記目的およびさらなる目的は、特許請求の範囲に明記する事柄を提供することにより解決される。好ましい実施形態は、従属項に定義されている。
該目的は、実験用反応容器に典型的な形状および／または典型的な寸法を有する反応容器であって、所定領域上に固定化されているプローブ分子を備えた支持要素がその基部表面の１つに配置されている反応容器を提供することにより、本発明に従って解決される。
【００２３】
実験室、特に生物学実験室で通常用いられている、例えば卓上遠心分離機やピペットの
ような、標準的実験用反応容器用の機器を使用することが可能であるので、分子標的とプローブ分子との特異的相互作用を検出するための本発明の反応容器の使用は、検出反応を行うための追加の機器または追加の付属品を購入する必要がないという重要な利点を有する。本発明の反応容器の他の利点は、該反応容器がハイブリッド形成チャンバとしても機能するので、別個のインキュベーションチャンバが不要であることである。さらに、プローブ分子が固定化されている支持体の表面は、従来の実験用反応容器に典型的な蓋固定またはキャップ固定、例えばエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）反応容器の安全ロックキャップ固定により汚染および他の不利な外的影響から保護される。
【００２４】
典型的な形状および寸法を有する実験用反応容器は、本発明との関連においては、特に生物学または分子生物学の実験室において標準型１．５ｍｌ容の単回使用反応容器として通常使用される反応容器として理解される。そのような実験用反応容器は、チューブ、また最も有名な製造業者の名をとって特にエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）チューブまたは「Ｅｐｐｉｓ」（ドイツ連邦共和国ハンブルグ）とも呼ばれている。したがって、典型的な形状および寸法を有する実験用反応容器は、エッペンドルフ社（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）により標準的反応容器または安全ロック反応容器として供給される。もちろん、エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）製の実験用反応容器に特に典型的であるような形状および寸法を有する、グライナー（Ｇｒｅｉｎｅｒ）［ドイツ連邦共和国フリケンハウゼン（Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ）所在］、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）［ドイツ連邦共和国エシュボルン（Ｅｓｃｈｂｏｒｎ）所在］、ヘレウス（Ｈｅｒａｅｕｓ）［ドイツ連邦共和国ハナウ（Ｈａｎａｕ）所在］およびバイオプラスチックス（ＢＩＯｐｌａｓｔｉｃｓ）［オランダ国ランドグラーフ（Ｌａｎｄｇｒａａｆ）所在］ならびに他の製造業者のような製造業者の反応容器を本発明との関連において用いることが可能である。典型的な形状および寸法を有する実験用反応容器の例を図２１に示す。
【００２５】
本発明との関連において、典型的な形状および寸法の実験用反応容器は、丸底フラスコもしくは三角フラスコのような他のフラスコ、ビーカーまたはメスシリンダーではないと特に理解される。
【００２６】
本発明の反応容器は、所定領域上に固定化されたプローブ分子を有する支持要素がその基部表面の１表面上に配置されているという点が、前記の反応容器と異なっている。所定領域に固定化されたプローブ分子を有するそのような支持要素を、以降チップまたはアフィニティ・マトリックスとも呼ぶ。支持体上の所定領域を、以降アレイ要素とも呼ぶ。
【００２７】
そのようなチップを組込むことによって従来の実験用反応容器を改造するにもかかわらず、反応容器は、実験用反応容器の典型的な形状および／または寸法を有する。本発明による反応容器は、したがって、回転対称の形状、特に、円筒形または略円筒形の形状を有する。従来の実験用反応容器の典型的形状およびしたがって本発明の反応容器の実現可能な形状のうち、円筒形の基本形状から逸脱した円錐形も含まれ、アフィニティ・マトリックスの方向に先細りしていることが好ましい。典型的な形状は、さらに円筒形または略円筒形の部分と円錐形の部分の組合せである（とりわけ図１〜４および２１を参照）。実験用反応容器が典型的な形状および寸法を有する結果、本発明の反応容器は、エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）またはヘレウス（Ｈｅｒａｅｕｓ）のような製造業者製のものなど従来の卓上遠心分離機と特に適合性が高い。すなわち、本発明の反応容器は、通常の卓上遠心分離機における遠心分離に適している。標準的実験用反応容器に関する、したがって本発明の反応容器にも関する通常の最大外径は、０．８ｃｍ〜２ｃｍ、好ましくは１．０ｃｍ〜１．５ｃｍ、特に好ましくは１．１ｃｍ〜１．３ｃｍの範囲にある。さらに好ましい外径は、０．９ｃｍまで、１．２ｃｍまで、１．４ｃｍまで、１．６ｃｍまで、１．７ｃｍまでである。反応容器の高さは通常、１．５ｃｍ〜５．０ｃｍ、好ましくは２．０ｃｍ〜４．０ｃｍ、特に好ましくは２．５ｃｍ〜３．５ｃｍ、最も好ましくは２．８ｃ
ｍ〜３．２ｃｍである。さらに好ましい高さは、２．６ｃｍまで、２．７ｃｍまで、２．９ｃｍまで、３．０ｃｍまで、３．１ｃｍまで、３．３ｃｍまで、３．４ｃｍまでである。特別な実施形態においては、高さは１．０ｃｍ以上であってもよい。本発明の反応容器は、通常の卓上遠心分離機で遠心分離することが可能であり、したがって、例えば、エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）製の標準ローターを備えた標準卓上遠心分離機のような従来の卓上遠心分離機内で、また、通常のラックおよび例えば、エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）製のチューブラックのような反応容器用のラックまたはホルダ内でも使用することが可能である。例えば、エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）製の可変および固定容量ピペットのような通常のピペットまたはシリンジを、分析すべき試料および検出反応を行うために必要な他の試薬を反応容器に挿入するために用いることが可能である。
【００２８】
本発明の反応容器内にチップを配置することにより、標的分子とプローブ分子との相互作用を例えば、蛍光検出または放射化学的方法のような通常の方法により検出することが可能となる。吸収測定の適用は、特に費用効率良く行うことが可能であるので、特に有利であることが証明されている。そのような吸収測定は、相互作用反応が起きた表面の領域において起こる反応性染色法を用いることによって大幅に改善し、費用対効果をより大きくすることが可能である。この場合、金ナノ球体で標識した標的分子における銀の析出（特許文献１３および特許文献１４を参照）が特に有効であることが証明された。銀の析出を検出するために、光源として任意の発光波長の１つまたは複数の発光ダイオードを用い、かつ、例えばチップの所定領域上の相互作用を空間分解検出するためのＣＣＤカメラを有する装置を用いることが可能である。
【００２９】
以下の定義を、とりわけ本発明の説明のために用いる。
本発明との関連において、プローブ・アレイは、各プローブの位置が個別に決定されている、表面上の分子プローブの配置構成として理解される。アレイは、画定された部位または所定領域、すなわちいわゆるアレイ要素（特に好ましくは特定のパターンで配置されている）からなり、各アレイ要素が通常１種のプローブのみを含むことが好ましい。
【００３０】
本発明との関連において、プローブまたはプローブ分子は、特異的な特有の結合挙動または特異的反応性により他の分子を検出するために用いる分子として理解される。アレイ上に配置するプローブについては、固体表面に結合させることが可能で特異的親和性を有する任意の種類の分子とすることが可能である。好ましい実施形態において、これは、ペプチド、タンパク質、核酸および／またはそれらの類似体などの種類の生体高分子を含む。プローブは、特に好ましくは、核酸および／または核酸類似体である。ＤＮＡおよびＲＮＡ分子のいずれも核酸として用いることが可能である。例えば、オリゴヌクレオチドプローブは、アレイ表面に固定化されている、１０〜１００塩基、好ましくは１５〜５０塩基、特に好ましくは２０〜３０塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドからなっていてよい。
【００３１】
本発明との関連において、標的または標的分子は、分子プローブを用いて検出される分子として理解される。本発明の好ましい実施形態において、検出される標的は、核酸である。しかし、本発明のプローブ・アレイは、タンパク質／プローブ相互作用、抗体／プローブ相互作用等を検出するために用いることも可能である。
【００３２】
本発明との関連において、アレイ要素または所定領域は、分子プローブの沈着のために画定された表面上の領域として理解される。占められたすべてのアレイ要素の総計がプローブ・アレイである。
【００３３】
本発明との関連において、標識は、検出可能なユニット、例えば、発蛍光団、または検
出可能なユニットが結合し得るアンカー基を意味する。
本発明との関連において、基質は、反応媒体中に溶解した形で存在する分子または分子の組合せであって、触媒または結晶核および／または変換剤によって局所的に析出するものと理解される。変換剤は、例えば、銀の析出におけるような還元剤、または酵素的酸化による色素の生産におけるような酸化剤であり得る。
【００３４】
本発明との関連において、支持要素または支持体は、その上にプローブ・アレイが構築されている固体と理解される。その上に配置されたプローブを備えた支持要素を以降チップとも呼び、また、本発明の特別な実施形態において該支持要素は実際のチップが配置されている基部要素も含み得る。
【００３５】
支持要素は、実験用反応容器に、例えばその蓋に挿入したり強固に固定したりすることが可能なように好ましくはチップ表面を成形することによって、実験用反応容器内に簡単に挿入または締め付け固定することによって本発明の反応容器内に配置させることが可能である。あるいは、実験用反応容器の基部表面を、支持要素をその上に取り付けることが可能なように平らにする。技術的な理由で必要な場合、支持体またはチップを本発明の反応容器の側壁に挿入することも可能である。
【００３６】
しかし、有利な実施形態において、実験用反応容器の基部表面、好ましくは底部は、支持体を受承するための凹所を有する。支持体またはチップを、例えば、この凹所に接着剤で接着し、かつ／または締付け固定し、かつ／またはネジ留めし、かつ／または溶接、特にレーザー溶接により溶接し、かつ／または内側および外側のうち少なくとも一方から留め金により留めることが可能である。これらの実施形態において、本発明の反応容器は、実験用反応容器の典型的な形状と寸法、およびアフィニティ・マトリックス、特に表面結合物質ライブラリーを受承するための囲いとして形成された開口部を有する。本発明の反応容器のそのような実施形態の例を、図１〜４に示す。そこで示した変形例に加えて、支持体の固定の種類のさらなる組合せは、必然的に実現可能である。
【００３７】
支持体またはチップを内側から取り付けることは、例えば、遠心分離機に用いるとき、または試料液体を沸点近くの温度に加熱するときに内圧が高くなっても、支持体またはチップが反応容器中のその固定から外に押し出されることはあり得ないという利点がある。しかし、その取り付けには外側からの取り付けよりも多くの努力が必要である。
【００３８】
締付け接合部またはネジもしくは留め金で留めるデバイス、または所定位置に固定するためのデバイスによって、反応容器と支持体またはチップとの間に液体が浸透できない摩擦接続が得られる。そのような変形形態は、支持体またはチップを内側から反応容器に挿入するという利点と組立てが簡単であるという利点とを合わせ持っている。この場合の欠点は、接合箇所、例えば、締付け接合箇所が追加されること、および部品の数が多くなることである。
【００３９】
本発明の反応容器を製造する際には、特に前記の製造業者の１つによる射出成形された標準的実験用反応容器を通常出発点とする。これを底部で切断し、この目的のために特別に設計された装置で再融解させる。そのような方法は、少数の製品については特に適している。多数の製品については、前記の実施形態の１つにおいて反応容器を直接射出成形することが可能である。
【００４０】
アフィニティ・マトリックスをほこりや汚染物質から保護するために、反応容器の下面に保護フィルムを張るもしくは貼付し、使用直前に反応容器から除去することが有利である。
【００４１】
所定領域に固定化されたプローブ分子を含む支持要素が配置されている基部表面は、通常、本発明の反応容器の底部である。
代替例として、支持体を反応容器の蓋に取り付けてもよい。支持要素またはチップ表面を反応容器の蓋に取り付けることは、アフィニティ・マトリックスが検出反応の準備および／または実施のための１つまたは複数の反応工程における条件に対して敏感に反応する場合に特に有利である。これらの反応工程は、本発明の反応容器のこの実施形態において直立の反応容器中で行わせることが可能であり、それにより、アフィニティ・マトリックスまたはチップが反応溶液または試料溶液と接触せずに、保護される。検出反応を行うためには、次いで本発明の反応容器を反転、すなわち蓋を下にして、試料が表面結合プローブと接触するようにする。このようにして、アフィニティ・マトリックスまたはチップの熱的および化学的負荷が減少する。
【００４２】
本発明の反応容器の支持要素は、検出表面の部分が光学的に透過性かつ／または非蛍光性であることが好ましい。検出表面は、プローブ分子が所定領域に固定化されている支持要素の領域と理解すべきである。本発明の好ましい実施形態において、プローブ分子は、他の基部要素を含む支持要素を伴わずに支持要素上に直接沈着されている。
【００４３】
他の好ましい実施形態において、プローブ分子は、好ましくは光学的に透過性かつ／または非蛍光性のチップ上に沈着され、次いでそのチップは同チップによって定められる検出領域が好ましくは光学的に透過性かつ／または非蛍光性である基部要素に強固に接続される。チップの寸法は、基部要素の寸法よりも小さい。この場合、プローブ分子を保持するチップと基部要素とが一緒になって支持要素を形成する。
【００４４】
本発明の反応容器の好ましい実施形態において、支持要素の検出表面と向かい合う基部表面は、検出表面に対応する領域が同様に光学的に透過性かつ／または非蛍光性である。
一般的に、本発明のプローブ・アレイは、その表面上にプローブを有するアレイの形成を可能にする支持体を含む。そのような支持体は、とりわけ、ガラス、フィルタ、電子装置、ポリマー、金属材料等ならびにこれらの材料の任意の組合せからなる群から選択される材料から製造することが可能である。
【００４５】
支持要素は、光学的に透過性かつ／または非蛍光性材料からなることが好ましい。そのような材料は、例えば、ガラス、Ｂｏｒｏｆｌｏａｔ（登録商標）３３（例えば、ショット（Ｓｃｈｏｔｔ）［ドイツ連邦共和国イエナ（Ｊｅｎａ）所在］から入手可能）、石英ガラス、単結晶ＣａＦ２（例えば、ショット（Ｓｃｈｏｔｔ）から入手可能）、単結晶シリコン、フェニルメチルメタクリレートおよび／またはポリカーボネートを含む。
【００４６】
プローブ分子を支持要素に直接載せないで、チップに載せる場合、チップは、同様に光学的に透過性かつ／または非蛍光性の材料からなることが好ましい。材料は、特に、ガラス、Ｂｏｒｏｆｌｏａｔ（登録商標）３３、石英ガラス、単結晶ＣａＦ２、単結晶シリコン、フェニルメチルメタクリレートおよび／またはポリカーボネートを含む。
【００４７】
支持要素またはチップ用の前述の光学的に透過性または非蛍光性の材料に加えて、通常のフィルタ、セラミック、金属、半金属および／またはプラスチック材料も使用可能である。例えば、ＤＮＡライブラリー用に特別に製造されたナイロン膜を支持材料として使用することが可能である。
【００４８】
反応容器のコンテナの材料は、実験用反応容器に通常使用されている材料に相当するものであり、例えば、ガラス、ガラスセラミック、プラスチック被覆ガラスならびにポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ＰＶＣ、ポリメチルメタクリレート、シリコンプラスチック、ゴム、ポリテトラフルオロエチレンおよび／またはナ
イロンのようなプラスチックまたは有機ポリマーからなる群から選択される。特別な実施形態において、金属、特にステンレス鋼、白金および／またはアルミニウムも適切な材料として使用可能である。
【００４９】
反応容器は、実験用反応容器の典型的な寸法を有する。典型的な充填容積は、１００μｌ〜２．５ｍｌの範囲にあり、特別な実施形態においてはこれより高いことも、低いこともありうる。特に好ましくは、反応容器は最大１．５ｍｌの標準的なエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）チューブの通常の充填容積を有する。さらなる好ましい充填容積は、最大０．４ｍｌ、最大０．５ｍｌ、最大０．７ｍｌ、最大１．０ｍｌ、最大２．０ｍｌである。
【００５０】
支持要素上に固定化されたプローブ分子は、通常物質ライブラリーを構成する。本発明との関連において、物質ライブラリーは、表面に固定化されている種々の物質の集合と理解すべきである。表面上の物質の配置は、一意的に識別される特定の部位が各物質に対して割り当てられ、かつ各物質が他の物質から完全に分離して固定化されるようになされている。
【００５１】
物質ライブラリーは、タンパク質物質ライブラリー、ペプチド物質ライブラリーおよび核酸物質ライブラリーを含んでいてよい。タンパク質物質ライブラリーは、抗体、受容体分子および膜タンパク質のライブラリーを特に含んでいてよい。可能なペプチドライブラリーは、特に、受容体リガンドライブラリー、薬理学的に活性なペプチドライブラリーおよびペプチドホルモンライブラリーである。
【００５２】
核酸物質ライブラリーは、特に、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子ライブラリーである。ＤＮＡ分子ライブラリーにおいて、微生物のリボソームＤＮＡ配列を支持要素に付着させうることが特に好ましい。さらに、ＳＮＰ分析用の核酸物質ライブラリーを含んでいてよい。いわゆる「発現プロファイリング」を可能にするタンパク質または核酸物質ライブラリーも妥当である。他の代替ライブラリーは、コンビナトリアル物質ライブラリーである。
【００５３】
物質ライブラリーを、反応容器の試料空間と接触するように支持要素に供する。反応容器の支持要素は、その表面に物質ライブラリーを備えた１つの検出表面を有し、少なくとも検出領域が光学的に透過性であることを特徴とすることが好ましい。
【００５４】
本発明の実施形態の他の有利な点は、形成された反応容器が密封されており、水を含む試料を、液体または試料が蒸発して漏出することなく、最高１００℃の温度に加熱可能であることである。すなわち、本発明の反応容器は、広範囲の温度で用いることが可能であり、液体窒素（−１９６℃）で凍結させたとき沸騰水浴中と同様に有効である。同様に、本発明の反応容器は、例えば、１２１℃で１５分間オートクレーブにかけて耐えさせるのにも適している。さらに、本発明の反応容器は、酸、塩基およびアルコール、アセトンまたはフェノールのような有機溶媒に対して化学的にも耐性であることが好ましい。
【００５５】
本発明の反応容器は、例えば、Ｅａｓｙ−ｔｏ−Ｏｐｅｎ（商品名）（ビオザイム（Ｂｉｏｚｙｍ）［ドイツ連邦共和国オルデンドルフ（Ｏｌｄｅｎｄｏｒｆ）所在］、Ｓａｆｅ−Ｌｏｃｋ（商品名）（エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ））等の実験用反応容器に通常使用されているキャップまたはキャップ固定具を備えていることが好ましい。このようにして、反応容器が密封され、かつ特に片手で容易に開けられることが保証される。
【００５６】
支持要素が反応容器の凹所に挿入される場合、反応容器の十分な密封は、支持要素を凹所に差し込み、かつ／または締め付け、次いで、必要な場合、必要な部分に密封材料を供することにより通常達成される。
【００５７】
接着剤は、通常、市販の塗布具を用いて塗布する。考えられる接着剤は、Ｓｙｌｇａｒｄ（登録商標）１８２またはＳｙｌｇａｒｄ（登録商標）１８４（ダウ・コーニング（Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ）［米国ミシガン州ミッドランド（Ｍｉｄｌａｎｄ）所在］のような白金架橋ポリジメチルシロキサンであることが好ましい。あるいは、シリコン接着剤、ポリウレタン接着剤、エポキシ樹脂接着剤、シアノアクリレート接着剤、アクリル接着剤および／または熱接着剤のような他の接着剤を使用することが可能である。シリコンゴムおよび／またはゴム材料等の種々のゴムを密封材料として使用することが可能である。
【００５８】
反応容器中に配置した支持要素は、いわゆるＤＮＡチップであることが好ましい。そのようなＤＮＡチップは、例えば、ガラス表面の所定領域にＤＮＡ配列を個別に割り当てて該ガラス表面に結合させたＤＮＡライブラリーを含む。
【００５９】
本発明との関連において、画定された部位に固定化されたプローブを備えたプローブ・アレイは、一般的に、従来から知られている方法を用いて製造することが可能である。ＤＮＡチップは、一般に共通のスポッティング法または特定の空間分解合成法により生産することが好ましい。光ガイドＤＮＡ合成（ｌｉｃｈｔｇｅｆｕｅｈｒｔｅ  ＤＮＡ‐Ｓｙｎｔｈｅｓｅ）を用いた合成法のような別の方法も製造用に検討可能である。プローブ・アレイまたはチップ、特にＤＮＡチップを製造する方法は当業者に知られており、とりわけ独国特許第１９７  ０６  ５７０号、欧州特許第０  ９６９  ９１８号および国際公開第９８／３６８２７号パンフレットに記載されている。
【００６０】
プローブ・アレイは、２つの基本的に異なる方法により択一的に製造することが好ましい。
１つの方法において、個別に合成されたプローブ、例えば、オリゴヌクレオチドを、極めて少量の液体を確実に空間特異的に沈着させる自動機械、いわゆるスポッターを用いて表面に沈着させ、これに共有結合または非共有結合により結合させる。この方法は連続的に行われる。各スポットには個別にプローブを備えつける。
【００６１】
別法として、プローブ・アレイをプローブ（例えば、オリゴヌクレオチドプローブ）の部位特異的ｉｎ  ｓｉｔｕ合成により製造する。合成は、例えばウエーハ規模で並行して行われる。アレイ表面を活性化する適切な試薬またはアレイ表面上でのプローブ合成のための適切な保護基は、当業者に知られている。
【００６２】
アレイ表面上の分子の固定化は、特異的に行われても非特異的に行われてもよい。特異的固定化には、固定化しようとする分子の特定の化学官能基と基材の表面との相互作用の選択性が必要である。非共有結合性の特異的固定化の例は、ストレプトアビジン被覆基材へのビオチン標識核酸の結合である。アミノ修飾核酸は、アミノ基とエポキシド、カルボキシ官能基またはアルデヒドとの反応により特異的に固定化することが可能である。固定化は、プローブの末端リン酸基またはバイオポリマープローブの単量体構築ブロックを介してアミノ化した表面上に行うことが好ましい。
【００６３】
部位特異的固定化は、複数の機構および化学官能基により行われ、共有結合性でも非共有結合性でもあり得る。この例は、ポリ−Ｌ−リシン修飾基材表面上の核酸の固定化だけでなく、エポキシ化、アミノ化基材表面またはアルデヒド官能基により占有された基材表面上への非化学修飾核酸の固定化もある。
【００６４】
同様に同業者に知られている方法も、本発明の反応容器に挿入されるプローブ・アレイを製造するために基材上の所定の部位へ少量の材料を沈着させるために用いることが可能である。いくつかのそのような方法が、例えば、非特許文献１に記載されている。
【００６５】
本発明の反応容器の特別な実施形態を、図面を参照して以下に詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６６】
図１の反応容器（１）は、実質的に市販の通常の反応容器の寸法を有し、大量に製造されているようなポリプロピレン製の標準的な１．５ｍｌ反応容器に類似していることが好ましい。同容器は、アフィニティ・マトリックス（１００）を挿入することが可能な保持装置が供される開口部（８、１０）（本発明に関しては、凹所とも称する）を有する。保持装置は、一般的に、アフィニティ・マトリックス（１００）のための支持表面（６、１１）、表面結合物質ライブラリー（１０２）が試料と接触することを可能にするための液体開口部（８）、および透過光の検出を可能にする観察開口部（１０）からなる。さらに、開口部（８、１０）には、反応容器（２）におけるアフィニティ・マトリックスの結合を簡単にするために接着縁部（７、９）を設けることが可能である。アフィニティ・マトリックス（１００）を反応容器内に差し込む必要のないようにするために、特殊な迅速作動開閉部を設けることが可能である。この場合、密封効果は、シーリングにより達成することが可能である。反応容器は、蓋（３）により閉めることが可能である。
【００６７】
ホルダに組込まれたアフィニティ・マトリックス（１００）を、反応容器（２）内の種々の位置に設置することが可能である。したがって、図１〜４に示すように、アフィニティ・マトリックスを反応容器の底部に取り付けることが可能である。この場合、アフィニティ・マトリックス（１００）は常に試料物質に曝露される。
【００６８】
アフィニティ・マトリックス（１００）が１つまたは複数の処理工程に敏感に反応する場合、該マトリックスを蓋（３）に取り付けることも可能である。次いで、アフィニティ・マトリックスが試料と接触せず、従ってアフィニティ・マトリックスが保護される直立状態の反応容器（１）を用いて、必要な試料の条件調整工程を行う。次に検出反応のために、反応容器を倒立させて試料が表面結合物質ライブラリー（１０２）と接触するようにする。これにより、アフィニティ・マトリックス（１００）の熱負荷および化学的負荷が軽減されることになる。
【００６９】
アフィニティ・マトリックス（１００）を、様々な方法で反応容器（２）に結合させることが可能である。図１に示す変形例では、アフィニティ・マトリックスを支持体（６）上の液体開口部（８）に外側から取り付ける。接着剤を接着縁部（７）に入れると、流動と毛細管作用によりアフィニティ・マトリックス（１００）が封じ込められ、液封され温度に対して安定な状態で反応容器（２）に接続される。あるいは、アフィニティ・マトリックス（１００）を例えば、レーザー溶接により反応容器（２）に溶接することも可能である。表面結合物質ライブラリー（１０２）が試料溶液に接触し得るように、アフィニティ・マトリックス（１００）を反応容器に取り付ける。アフィニティ・マトリックス（１００）を取り付けた後に、図５〜１５に示すように読取機器（１０００）を用いて光学的な透過光検出を行うことが可能である。
【００７０】
あるいは、図２に示すように、アフィニティ・マトリックス（１００）を内側から取り付けることも可能である。この変形例では、支持表面と接着縁部が反応容器の反応空間内にある。このことは、例えば、遠心分離機に用いるとき、または反応空間内で試料液体を沸点近くの温度に加熱するときに内圧が高くなっても、アフィニティ・マトリックス（１００）がそのホルダから押し出されることはあり得ないという利点がある。しかし、その取り付けには多くの努力が必要である。
【００７１】
図３にアフィニティ・マトリックス（１００）がチップ支持体に取り付けられている変形例を示す。次にチップ支持体（２００）を反応容器（２）に押し付ける。締付け接合部
またはネジ（２０１）により、反応容器（２）とチップ支持体（２００）との間の摩擦性かつ液体不浸透性の接続が得られる。この変形例は、内側から反応容器に挿入されるアフィニティ・マトリックス（１００）の利点と組立てが簡単であるという利点とを合わせ持っている。欠点は、例えば、締付け接合のような他の接合箇所があることと部品の数がより多いことである。
【００７２】
図４に、反応容器（２）へのアフィニティ・マトリックス（１００）の結合が不必要になるような、内側から挿入された締付けスリーブ（３００）により反応容器（２）と締付けスリーブ（３００）との間にアフィニティ・マトリックス（１００）が締付けられている変形例を示す。しかし、この設計は、アフィニティ・マトリックス（１００）の液封締め付けを確実にするために、締付けスリーブ（３００）と反応容器（２）を非常に高精度で製造することを必要とする。別の変形例では、締付けスリーブ（３００）を反応容器（２）にねじ込むことが可能である。
【００７３】
本発明の別の態様において、以下の工程からなる分子標的とプローブ分子との間の特異的相互作用を検出する方法を提供する：
ａ）前述した本発明の反応容器を用意する工程、
ｂ）標的と、所定領域に配置したプローブ（アレイ要素）とを相互作用させる工程、および
ｃ）相互作用を検出する工程。
【００７４】
分析すべき標的は、あらゆる種類の試料中、好ましくは生物学的試料中に存在し得る。本発明の方法によりそれらを検出し、定量する前に、標的を分離し、精製し、コピーし、かつ／または増幅することが好ましい。
【００７５】
増幅は通常、従来のＰＣＲ法により行われる。増幅は、２段階法による多重ＰＣＲとして行われることが好ましい（国際公開第９７／４５５５９号も参照されたい）。第１段階で、３’末端が遺伝子特異的な融合プライマーと、５’末端が普遍領域である融合プライマーとを用いて多重ＰＣＲを行う。後者は、多重反応に用いられるすべての順方向および逆方向プライマーについて同じである。この第１段階では、プライマーの量が制約的となる。その結果、サイクル数がすべての生成物についてプライマーの制約に達するのに十分であるならば、すべての多重生成物を標準的なモル濃度レベルまで増幅することが可能である。第２段階で、融合プライマーの５’領域と同じである普遍プライマーを加える。所望の量のＤＮＡが得られるまで増幅が行われる。
【００７６】
本発明の方法において、検出は、工程ｃ）で検出される少なくとも１つの標識を結合標的に供給することによって行うことが好ましい。
別の実施形態において、標的分子との分子相互作用を検出する役割を果たす、プローブ・アレイ上に配置されたプローブ分子は、少なくとも１つの標識、および少なくとも１つの所定の切断部位、すなわち、特異的に不安定化または切断可能な不安定結合または選択的に切断可能な結合を含む。選択的に切断可能な結合が標識とアレイ表面へのプローブの連結位置との間に配置されることにより、プローブと標的との間の分子相互作用の特異的検出に標識または検出可能ユニットを用いることが可能となっている。この場合、所定の切断部位または選択的に切断可能な結合は、結合の切断によりアレイ表面から検出可能ユニットまたは検出可能ユニットを含むアンカー基が脱離するように、プローブ分子内に配置されている。他方で、プローブ分子が標的分子と特異的に相互作用した標識では、標識に結合したプローブの切断生成物またはプローブ断片が、標的との相互作用によりアレイ表面に固定化されているプローブの第２の切断生成物と結合したままなので、標識もアレイ表面と結合したままである。少なくとも１つの所定の切断部位を含むそのようなプローブ分子の調製については、独国特許出願第１０１  ４２  ６４３．７号に詳細に記載され
ている。
【００７７】
この実施形態では、選択的に切断可能な結合は、プローブがアレイ表面に固定化されているときに、該結合も効率的に切断可能であるように提供されることが好ましい。選択的に切断可能な結合は、化学的および／または物理的方法により選択的に切断可能であることが好ましい。表面における効率のよい切断は、原子およびイオンのような小さい物質により特に保証される。したがって、不安定な結合は、単純な化学物質により、例えば、イオン、特に好ましくは酸陰イオン、塩基陽イオン、フッ化物ならびに／または、水銀イオンおよび／もしくは銀イオンのような重金属イオンを加えることにより、選択的に切断可能であることが好ましい。
【００７８】
個別に合成されたオリゴヌクレオチドを固定化することによってアレイを製造する場合、選択的に切断可能な結合は、アレイ表面上にプローブを固定化する際に用いる条件下で安定である。アレイ表面上での部位特異的合成によりｉｎ  ｓｉｔｕでプローブを製造する場合、不安定結合を合成手法の一部として効率的に生成させうることが好ましい。不安定結合がホスホロアミダイト化学を用いて調製可能ならば、これが特に好ましい。同じことが検出可能ユニットの導入にも当てはまる。
【００７９】
したがって、選択的に切断可能な結合は、従来のＤＮＡまたはＲＮＡ合成によって生成可能な核酸中に存在することが好ましい。本発明によるプローブ・アレイのプローブ分子は、式Ａ１−Ｓ−Ａ２（式中、Ｓは少なくとも１つの選択的に切断可能な結合を含む核酸または核酸構築ブロックであり、Ａ１およびＡ２は任意の核酸または核酸類似体である）を有する核酸を含むことが特に好ましい。プローブ分子は、２つの核酸または核酸類似体Ａ１およびＡ２のうちの１つを介して本発明のプローブ・アレイの表面に固定化され、一方、もう１つは少なくとも１つの標識を有する。Ｓは、選択的に切断可能な結合により架橋されているヌクレオチド２量体であることが好ましい。
【００８０】
選択的に切断可能な結合を含む、特に好ましいＤＮＡヌクレオチド構築ブロックＳの例を次の式Ｉに示す。
【００８１】
【化１】
2005514632.tif 000003
【００８２】
この場合、ＸおよびＹは、好ましくはＯ、ＮＨおよびＳからなる群から互いに独立に選択することが可能であり、同時にＯではない。
Ｂは、プリン誘導体アデニンおよびグアニンならびにピリミジンのシトシンおよびチミ
ンなどの核酸塩基を表す。
【００８３】
そのようなオリゴヌクレオチドプローブのヌクレオチド配列内の選択的に切断可能な結合は、好ましくは、ホスホチオエート結合またはホスホロアミデート結合である。ホスホチオエート結合、すなわち糖−Ｏ−Ｐ−Ｓ−糖結合で、ホスホジエステル結合、すなわち非修飾オリゴヌクレオチドの糖−Ｏ−Ｐ−Ｏ−糖結合が置換されていることが特に好ましい。この実施形態では、２つのヌクレオシドがホスホチオエート結合により結合されている。
【００８４】
別例として、ヌクレオチド配列内の選択的に切断可能な結合が、例えば、ホスホノチオエート結合のような他の硫黄または窒素修飾エステル結合であってもよい。
本発明によるプローブ・アレイのプローブ分子内の選択的に切断可能な結合の調製に関するさらなる例は、アミド基、１，２−ジオール基、ジスルフィド基および／またはスルホニル基、ならびに米国特許第５１１８６０５号に記載され、該特許に規定されている条件下で切断可能な他の基である。しかし、これらの基は、とりわけ、従来の核酸合成を用いてオリゴヌクレオチドプローブに組込むことが不可能であるため、さほど好ましくない。
【００８５】
あるいは、プローブ分子内の選択的に切断可能な結合を切断するために物理的方法を用いることも可能である。例えば、選択的に切断可能な結合を光分解により選択的に切断することが可能である。光分解により選択的に切断可能な結合を含み、本発明によるプローブ・アレイのプローブ分子の合成に用いることが可能であるヌクレオチド構築ブロックは、例えば、米国特許第５３６７０６６号、米国特許第５５５２５３８号および米国特許第５５７８７１７号に記載されている。
【００８６】
化学的または物理的に選択的に切断可能な結合を含む特に好ましいＲＮＡヌクレオチド構築ブロックのさらなる例を以下の式ＩＩに示す。
【００８７】
【化２】
2005514632.tif 000004
【００８８】
ここで、ＸおよびＹは、好ましくはＯ、ＮＨおよびＳからなる群から互いに独立に選択することが可能であり、ＰＧが不安定な保護基でない場合には、同時にＯではない。
ＰＧは、Ｈおよび
【００８９】
【化３】
2005514632.tif 000005
【００９０】
のような不安定な保護基からなる群から選択されることが好ましい。
式ＩＩ中のＢは、プリン誘導体アデニンおよびグアニンならびにピリミジンのシトシンおよびウラシルなどの核酸塩基を表す。
【００９１】
しかし、通常の大気、温度および光条件下で安定な選択的に切断可能な結合を含むプローブ分子が好ましい。
別の実施形態において、不安定結合は酵素法により選択的に切断可能である。そのような不安定結合を含むヌクレオチド構築ブロックの例は、米国特許第４７７５６１９号および米国特許第４８７６１８７号に記載されている。しかし、プローブ分子の固定化の結果として選択的に切断可能な結合が表面に接近することにより酵素活性が著しく阻害されるので、本発明に関しては、選択的に切断可能な結合を切断するための酵素法はさほど好ましくない。したがって、酵素による切断反応は、非常に低い効率を有するにすぎず、偽陽性の測定結果による望ましくない高い信号バックグラウンドが生ずる。したがって、本発明によるプローブ・アレイの好ましい実施形態において、選択的に切断可能な結合は、酵素法により選択的に切断され得ない。
【００９２】
本発明によるプローブ・アレイの他の好ましい実施形態において、選択的に切断可能な結合は、アレイ表面上のプローブの固定化部位とプローブ標識の位置との間のほぼ中央に位置する。したがって、標的と、結合切断後に表面に残存するプローブの残りに相当する固定化プローブ断片との相互作用の可能性は、大幅に減少するか、またはほとんど不可能である。他方で、選択的に切断可能な結合がアレイ表面に近すぎる場合、標的とアレイ表面に固定化されているプローブ断片とのハイブリッド形成は十分に安定でないので、切断後のプローブ分子と標的分子との複合体はもはや十分に安定化されない。これは、偽陰性測定結果をもたらす。
【００９３】
既に述べたように、標的またはプローブに結合している標識は、検出可能なユニットまたはアンカー基を介して標的またはプローブに結合している検出可能なユニットであることが好ましい。本発明の方法は、検出または標識の可能性に関して極めて柔軟である。したがって本発明の方法は、複数の物理的、化学的または生化学的検出方法に適合する。唯一の要件は、検出すべきユニットまたは構造がプローブまたは標的、例えば、オリゴヌクレオチドに直接結合しているか、または該オリゴヌクレオチドに結合し得るアンカー基を介して結合可能であることである。
【００９４】
標識の検出は、蛍光、磁気、電荷、質量、親和力、酵素活性、反応性、金マーカー等に基づくものであり得る。例えば、標識は、蛍光団（フルオロフォア）で標識された構造または構築ブロックを用いることに基づくものであってよい。蛍光検出に関連して、標識は、それらの合成中または合成後に標的またはプローブに結合し得る任意の色素であってよい。したがって、例としては、Ｃｙ色素（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）［スウェーデン  ウプセラ（Ｕｐｐｓａｌａ）所在］、アレクサ（Ａｌｅｘａ）色素、テキサスレッド、フルオレセイン、ローダミン（モレキュラー・プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）［米国オレゴン州ユージーン所在］、サマリウム、イッテルビウムおよびユウロピウムのようなラ
ンタニド（イージーアンドジー（ＥＧ＆Ｇ）［ドイツ連邦共和国フライブルク市ワラク（Ｗａｌｌａｃ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）所在］である。
【００９５】
蛍光マーカーに加えて、発光マーカー、金属マーカー、酵素マーカー、放射性マーカーおよび／またはポリマーマーカーも、標的またはプローブに結合されるマーカーまたは検出ユニットとして使用可能である。
【００９６】
同様に、核酸もタグ付きリポーターとのハイブリッド形成（サンドイッチ・ハイブリッド形成）により検出可能なマーカー（タグ）として用いることが可能である。プライマー伸長、ライゲーションおよびＲＣＡのような種々の分子生物学的検出反応を用いてタグを検出することが可能である。
【００９７】
本発明による方法の別の実施形態において、検出可能ユニットを、アンカー基を介して標的またはプローブに結合させる。用いるアンカー基は、ビオチン、ジゴキシゲニン等であることが好ましい。アンカー基は、特異的に結合する成分、例えば、それ自体が検出可能であるか、または検出可能な反応を誘発するストレプトアビジン複合体または抗体複合体との後続反応において変換される。アンカー基を用いる場合、アンカー基の検出可能なユニットへの変換は、標的を含む試料の添加前、添加中または添加後、あるいは必要な場合にはプローブ中の選択的に切断可能な結合の切断前、切断中または切断後に起こり得る。
【００９８】
本発明によるタグ付加または標識は、タグ付き分子とプローブ分子との相互作用によっても起こり得る。例えば、タグ付加は、前述のようにタグ付加されたオリゴヌクレオチドの１つと、１つのオリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチド標的とのハイブリッド形成によって起こり得る。
【００９９】
本発明との関連において適切なさらなるタグ付加法および検出システムは、例えば、非特許文献４の第２３．３章および第２３．４章に記載されている。
本発明による方法の好ましい実施形態において、析出をもたらす特定の溶解度積を有する付加物を結果として生ずる検出方法を用いる。ほとんど不溶性の通常着色された生成物に変換可能な基質を特にタグ付加に用いる。例えば、基質がほとんど不溶性の生成物へ変換するのを触媒する酵素は、このタグ付加反応に用いることが可能である。アレイ要素上に析出物を生じさせるのに適した一連の可能な反応ならびに析出物を検出する可能性は、例えば、その内容を本願明細書において特に参照する、特許文献１６および特許文献１４に記載されている。
【０１００】
本発明による方法の特に好ましい実施形態において、プローブ／標的相互作用が起こったアレイ要素上でほとんど不溶性の析出物を生成するべく可溶性基質の反応を触媒するタグ、あるいは、プローブ／標的相互作用が起こったアレイ要素上でほとんど不溶性の析出物へと可溶性基質が変換するための結晶核として作用するタグを、結合した標的に与える。
【０１０１】
したがって、このようにして、本発明の方法の使用により、複数のプローブ／標的相互作用を同時に定性および定量分析することが可能となるが、その場合１０００μｍ以下、好ましくは１００μｍ以下、特に好ましくは５０μｍ以下の大きさを有する個々のアレイ要素を実現し得る。
【０１０２】
酵素マーカーの使用は、免疫細胞化学において、またマイクロタイタープレートを用いる免疫学的試験において周知である（イー  リデルおよびアイ  ウイークス（Ｅ．Ｌｉｄｅｌｌ  ａｎｄ  Ｉ．Ｗｅｅｋｓ）、「抗体技術（Antibody Technology ）」、ＢＩＯＳ
サイエンティフィック・パブリッシャー・リミテッド（ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）、１９９５年を参照）。したがって、例えば、酵素は、ほとんど不溶性の一般に着色された生成物への基質の変換を触媒する。
【０１０３】
アレイ上の分子相互作用を検出するための他の可能性には、金属タグの使用が含まれる。この場合、例えば、コロイド状金または所定の金クラスターを、必要であればストレプトアビジンのような特定の媒介分子を介して標的と結合させる。金のタグ付加により発生した染色を銀のようなより卑な金属との後続の反応により増強することが好ましく、この場合、標的に結合した金のタグが、例えば、銀イオンを還元して銀析出物を生成するための結晶核または触媒として作用する。金のタグに結合している標的は、本明細書において以降金複合体とも呼ばれる。
【０１０４】
本発明による方法のこの実施形態において、プローブ／標的相互作用は、相対的に定量化することが可能である。プローブ・アレイ上に結合した標的の濃度の相対的定量化は、可溶性基質の反応を触媒してプローブ／標的相互作用が起こったアレイ要素上にほとんど不溶性の析出物を生成させる、あるいは、そのような反応における結晶核として作用する、標的に結合したタグの濃度により析出物または沈着物を検出することによって行う。例えば、微小な金（Ｎａｎｏｇｏｌｄ）でタグ付けしたＨＰＬＣ精製オリゴヌクレオチドの場合、結合標識と金粒子との比は１：１である。本発明の他の実施形態において、この比は、その何倍か、または何分の１かであってよい。
【０１０５】
本発明による検出方法のこの実施形態において、検出は、結合標的に結合した標識の触媒作用により、プローブ／標的相互作用が起こったアレイ要素上に生じた析出物により引き起こされる透過光吸収または入射光反射を測定することによって行う。
【０１０６】
コロイド状金または所定の金クラスターが標的に結合している場合、これらの金属標識の存在によって光吸収が引き起こされる。しかし、光吸収を増強するために、そのような相互作用ハイブリッド、すなわち、例えばコロイド状金または所定の金クラスターのような標識を備えた標的により、非透過性の析出物を触媒的に沈着させることが好ましい。析出物としての銀の使用は、金複合体の場合には特に有利であることが見出された。
【０１０７】
透過光吸収を測定することによるプローブ／標的相互作用の定性的および／または定量的検出については、実施例を参照して以下に説明する。当然、以下に述べる方法は前述の銀／金染色に限定されるものではなく、可溶性基質の反応を触媒してプローブ／標的相互作用が起こったアレイ要素上にほとんど不溶性の析出物を生成する標識、あるいは、プローブ／標的相互作用が起こったアレイ要素上で可溶性基質をほとんど不溶性の析出物へ変換させるための結晶核として作用する標識を結合した標的に付与するすべての検出方法にも適切に適用することが可能である。
【０１０８】
標的分子は、最初に例えばＰＣＲを用いてビオチン化する。該ＰＣＲ生成物を、物質ライブラリー（１０２）、例えばＤＮＡライブラリーに対してハイブリッド形成させる。次いで、ビオチン化ハイブリッド、例えば、ＤＮＡハイブリッドと反応する、ストレプトアビジンで官能化した金ビーズを本発明の反応容器（１）に加えた。金の触媒作用のもとで、例えば硝酸銀をヒドロキノンで還元することにより、ここで表面に特異的に結合している金ビーズ上に銀析出物を生じさせることが可能である（とりわけ、特許文献１６、特許文献１３、エム  エー  ハヤト（Ｍ．Ａ．Ｈａｙａｔ）、「Ｉｍｍｕｎｏｇｏｌｄ−Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ」、シーアールシー・プレス（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ）［ニューヨーク所在］、１９９５年を参照されたい）。
【０１０９】
銀析出物による光の吸収は、析出した銀の量に依存する。したがって、銀析出物の中を
通って放射される光の強度Ｉはランベルト‐ベールの法則に類似した以下の関数を用いて計算することが可能である。
【０１１０】
Ｉ＝Ｉ０＊ｅｘｐ（−ａ＊ｂ）                      （Ｉ）
ここで、Ｉは吸収後の光の強度、Ｉ０は吸収前の光の強度、ａは吸収係数であり銀析出物による単位面積当たりの遮光量ｂを乗ずる。強度Ｉと時間ｔは、測定量として得ることができる。これらの測定量は、物質ライブラリーを含む支持要素を照射し、カメラを用いて透過光を記録することにより得られる（図１９を参照）。この記録を、銀析出を行う間に一定の間隔で繰り返す。個々のライブラリー領域（スポット）の明度値を各記録について評価し、それにより各スポットの強度Ｉを求める。明度値は、例えば、ＩｃｏｎｏＣｌｕｓｔ（登録商標）（クロンディアグ（Ｃｌｏｎｄｉａｇ）［ドイツ連邦共和国イエナ（Ｊｅｎａ）所在］のような標準的なソフトウエアを用いて自動的に計算することが可能である。図２０に示す測定曲線は、Ｉ／Ｉ０を時間ｔの関数としてプロットして得られる。式（Ｉ）により示されるランベルト‐ベールの法則を、そのようにして得られた銀析出の経時変化と以下のように関連づけることが可能である。
【０１１１】
銀ビーズ１個による遮光面積Ｆは、
Ｆ＝π＊ｒ２                                    （ＩＩ）
である。
【０１１２】
表面要素当たりの析出速度は１つのスポットについて一定とみなし得るので、銀ビーズ群の半径ｒも一定の速度で増加する。すなわち、
ｒ＝ｄｒ／ｄｔ＊ｔ                              （ＩＩＩ）
である。
【０１１３】
銀析出物による単位面積当たりの遮光量ｂは、単位面積当たりの銀ビーズの数Ｎ、銀ビーズ１個当たりの遮光面積Ｆおよび定数ｋに比例する。
ｂ＝Ｎ＊Ｆ＊ｋ                                  （ＩＩＩ）
したがって、時間ｔの関数としての強度Ｉの関数は、以下のように計算される：
Ｉ＝Ｉ０＊ｅｘｐ（−ａ’＊ｔ２）                （ＩＶ）
（式中、ａ’は未知の集成銀の吸収定数である）。
【０１１４】
各々の銀析出反応について個々の析出速度を推測しなければならず、また、表面上の非特異的反応についても同様である。すなわち、
Ｉ＝Ｉ０＊ｅｘｐ（−ａ’Ｈ＊ｔ２）                （Ｖ）
（式中、ａ’Ｈは非特異的な銀の吸収定数）である。
【０１１５】
したがって、各スポットｉにおいて、特異的析出反応と非特異的析出反応とが起こる。すなわち、
Ｉｉ＝Ｉ０ｉ＊（ｅｘｐ（−ａ’ｉ＊ｔ２）＋ｅｘｐ（−ａ’Ｈ＊ｔ２））＋Ｏｉ 
（ＶＩ）
（式中、Ｏは装置に依存するオフセット値）である。
【０１１６】
単位面積当たりの析出した金ビーズの数は、一方では金ビーズで標識された標的の量に、他方では標的、例えば標的ＤＮＡと、プローブ、例えばスポットＤＮＡとの結合強度に依存する。対応するアレイ要素上のプローブと相互作用する標的が試料中に存在しない場合、金ビーズはこのアレイ要素またはスポットの表面に析出しない。プローブと標的との結合が弱い場合、このアレイ要素の表面には非常に少数の金ビーズしか沈着しない。
【０１１７】
ｂとしたがってａ’は金ビーズの数Ｎとしたがって銀ビーズの数Ｎに正比例するので、
ａ’は標的ＤＮＡの濃度と該標的ＤＮＡのアレイ要素またはスポットｉ上での結合強度の尺度である。
【０１１８】
図２０に、標的ＤＮＡに対してハイブリッド形成させた２つのスポットの銀析出の経時変化を示す。標的ＤＮＡが一方のスポットのプローブと完全に相補的で、他方のスポットのプローブに対しては誤対合（ミスマッチ）を有するように、両スポットのＤＮＡプローブは１塩基異なっている。銀の吸収定数ａ’は、式（ＶＩ）を用いた非線型回帰により両測定曲線から計算することが可能である。完全な対合の場合には、この定数は２．５６６×１０−６秒−２であり、誤対合の場合には４．８３×１０−７秒−２である（実施例２も参照のこと）。このように、２つの定数はほぼ１０の１乗分だけ異なっている。したがって、定数ａ’の計算は、スポット上の標的ＤＮＡの結合の強さと濃度についての重要な測定量として使用することが可能である。さらに、析出反応の時定数τは、定数ａ’から決定することが可能である。すなわち、
τｔ＝（１／ａ’ｉ）０．５                        （ＶＩＩ）
である。
【０１１９】
回帰の結果として、Ｉ０とＯをさらなるパラメータとして決定することが可能である。ＤＮＡライブラリーの照射の不均一性は、光の強度Ｉ０を用いて補正することが可能である。あるいは、後の時点で経時的に記録されるすべての追加の像のフラットフィールド補正を、時間ｔ＝０における全ＤＮＡライブラリーの像を用いて行うことが可能である。測定の妥当性は、パラメータＯを用いて評価することが可能である。
【０１２０】
測定値に対する指数関数の正しい適合には非線型回帰アルゴリズム（エイチ  アール  シュワルツ（Ｈ．Ｒ．Ｓｃｈｗａｒｚ）、「Ｎｕｍｅｒｉｓｃｈｅ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｋ」、トイブネル出版（Ｔｅｕｂｎｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ）［ドイツ連邦共和国シュトゥットガルト所在］、１９９８年）が必要であるので、経時変化から測定値を判定するために正確度は低いがより頑健な、したがって線型法を用いることが有利であり得る。この目的のために、時間値を２乗し、測定強度値の対数をとる。次いでそのようにして得られる値を１次線型式に当てはめる。それにより得られる回帰パラメータを測定値として、また妥当性の検定のために用いることが可能である。照射不均一性はもはや線型法を用いてＩ０により補正することは可能でないが、平面場補正を用いることは依然として可能である。
【０１２１】
評価のさらなる変形は、所定時間後の測定値として個々のスポットのグレー値を直接用いることにある。しかし、この方法は、どの時間が評価に最適であるかを事前に評価することが不可能であり、測定値の統計的信頼性が比較的低いという欠点を有する。さらに、照射の不均一性は平面場補正によってしか行うことができない。
【０１２２】
本発明による方法のさらなる好ましい実施形態では、工程ｃ）においてアレイ要素上の析出物形成の時間推移が信号強度の形で検出される。この方法で、結合標的の相対的な定量的な量を正確に決定することが確実となり得る。そのような方法は、特許文献１４に詳細に記載されている。
【０１２３】
既に述べたように、標的に、プローブ／標的相互作用が起こったアレイ要素上で可溶性基質の反応を触媒してほとんど不溶性の析出物を生成する標識、あるいは、そのような反応における結晶核として作用する標識が付与されることが好ましい。
【０１２４】
本発明の１実施形態では、標的にそのようなタグを直接付与することが可能である。
あるいは、標的に直接タグ付加をせず、標的およびタグ付き化合物と相互作用するプローブとのサンドイッチ・ハイブリッド形成またはサンドイッチ反応によりタグ付加を行う。そのような方法の例は以下のとおりである。
【０１２５】
−  標的配列と相補的であるタグ付きオリゴヌクレオチドとのサンドイッチ・ハイブリッド形成。
−  標的配列と連鎖的にハイブリッド形成する標識オリゴヌクレオチドのサンドイッチ・ハイブリッド形成。標的配列と連鎖的にハイブリッド形成する標識オリゴヌクレオチドは、本発明との関連においては、少なくとも１つが標的配列および他のオリゴヌクレオチドの両方と相補的である１組の標識オリゴヌクレオチドとして理解される。その他のオリゴヌクレオチドは、ハイブリッド形成時に標的配列に結合したタグ付きオリゴヌクレオチドの鎖が形成されるように、自己相補的または互いに相補的である。
【０１２６】
−  例えば国際公開第９９／１０３６２号パンフレットに記載されている多重にタグ付加された構造、例えば、デンドリマーと結合している標的配列と相補的であるオリゴヌクレオチドとのサンドイッチ・ハイブリッド形成。
【０１２７】
標的のタグとの結合に関する他の好ましい可能性は、例えば米国特許第６１０３４７４号に記載されているように、連続的な配列を形成する、標的へのホモポリマー領域（例えば、ポリ−Ａ配列）の合成的または酵素的付加を含む。この実施形態では、前述の変形例を用いて、ホモポリマー配列と相補的なタグ付きオリゴヌクレオチドを用いたサンドイッチ・ハイブリッド形成によりタグ付加を行うことが好ましい。
【０１２８】
本発明の他の好ましい実施形態において、タグ付き塩基の同時組込み、特に好ましくはホモポリマー配列との相補性を示す環状１本鎖鋳型を用いるＲＣＡメカニズムを用いる、標的に付加されるホモポリマー配列部分の増幅により、信号の増幅を実施する。
【０１２９】
全て揃っているというわけではないが、以下の表１に標的とプローブとの相互作用が起こったアレイ要素上に析出物を生じさせるのに適したいくつかの可能な反応の概要を示す。
【０１３０】
【表１】
2005514632.tif 000006
【０１３１】
酵素または金、特に、ナノ結晶性金による生物学的試料の標識については、十分に記載されている（特に、非特許文献４、イー  リデルおよびアイ  ウイークス（Ｅ．Ｌｉｄｅｌｌ  ａｎｄ  Ｉ．Ｗｅｅｋｓ）、「抗体技術（Antibody Technology ）」、ＢＩＯＳサイエンティフィック・パブリッシャー・リミテッド（ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）、１９９５年を参照のこと）。
【０１３２】
本発明の方法における不溶性析出物を介したプローブ／標的相互作用の検出のさらなる可能性は以下の文献に記載されている。「免疫金‐銀染色、原理、方法および応用（Immunogold-Silver Staining、Principles、Methods and Applications）、エム  エー  ハヤト（Ｍ．Ａ．Ｈａｙａｔ）編、ＣＲＣプレス（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ）、１９９５年；エーリッヒ  エイチ、ブガワン  ティー、ベゴビッチ  エービー、シャルフ  エス、グリフィス  アール、サイキ  アール、ヒグチ  アール、ウォルシュ  ピーエス（Ｅｒｌｉｃｈ  Ｈ、Ｂｕｇａｗａｎ  Ｔ、Ｂｅｇｏｖｉｃｈ  ＡＢ、Ｓｃｈａｒｆ  Ｓ、Ｇｒｉｆｆｉｔｈ  Ｒ、Ｓａｉｋｉ  Ｒ、Ｈｉｇｕｃｈｉ  Ｒ、Ｗａｌｓｈ  ＰＳ）、シータス社（Ｃｅｔｕｓ  Ｃｏｒｐ．）ヒト遺伝学部（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）［米国９４６０８カリフォルニア州エメリービレ（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ）所在］、「ＰＣＲ増幅と固定化プローブを用いたＨＬＡ−ＤＲ、ＤＱおよびＤＰタイピング（HLA-DR、DQ and DP typing using PCR amplification and immobilized probes）」
、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ、１９９１年、２月〜４月、第１８巻（１〜２号）、３３〜５５ページ；ブサト  エヌ、バット  シーエー（Ｂｓａｔ  Ｎ、Ｂａｔｔ  ＣＡ）、コーネル大学食品科学部（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ、Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）［米国１４８５３ニューヨーク州イサカ（Ｉｔｈａｃａ）所在］、「リステリア菌の非放射性検出のための改変逆ドットブロットおよびネスティドＰＣＲアッセイの組合せ（A combined modified reverse dot-blot and nested PCR assay for the specific non-radioactive detection of Listeria monocytogene ）」、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ、１９９３年６月、第７巻（３号）、１９９〜２０７ページ；ブガワン  ティーエル、ベゴビッチ  エービー、エーリッヒ  エイチエー（Ｂｕｇａｗａｎ  ＴＬ、Ｂｅｇｏｖｉｃｈ  ＡＢ、Ｅｒｌｉｃｈ  ＨＡ）、シータス社（Ｃｅｔｕｓ  Ｃｏｒｐ．）ヒト遺伝学部（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）［米国９４６０８カリフォルニア州エメリービレ（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ）所在］、「酵素的に増幅されたＤＮＡと配列特異的な非放射性プローブを用いたＨＬＡ−ＤＰＢの迅速タイピング（Rapid HLA-DPB typing using enzymatically amplified DNA and nonradioactive sequence-specific oligonucleotide probes）」Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９９０年、第３２巻（４号）、２３１〜４１ページおよびＩｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９９１年、第３４巻（６号）、４１３ページの正誤表；エリアオウ  ジェーエフ、パルメード  エフ、アビネンス  オー、エドウアード  イー、バラグール  ピー、ニコラス  ジェーシー、クロット  ジェー（Ｅｌｉａｏｕ  ＪＦ、Ｐａｌｍａｄｅ  Ｆ、Ａｖｉｎｅｎｓ  Ｏ、Ｅｄｏｕａｒｄ  Ｅ、Ｂａｌｌａｇｕｅｒ  Ｐ、Ｎｉｃｏｌａｓ  ＪＣ、Ｃｌｏｔ  Ｊ）、セント・エロイ・ホスピタル免疫学研究室（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｉｎｔ  Ｅｌｏｉ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）［フランス国ＣＨＵモンペリエ（Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ）所在］、「非放射性の逆ドットブロット方法論による包括的ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子タイピング（Generic HLA-DRBI gene oligotyping by a nonradioactive reverse dot-blot methodology）」Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｎｕｎｏｌ、１９９２年１２月、第３５巻（４号）、２１５〜２２ページ；モエレマンス  エム、ダニールス  ジー、ファンディジク  エー、ランガンガー  ジー、デメイ  ジェー（Ｍｏｅｒｅｍａｎｓ  Ｍ、Ｄａｎｅｅｌｓ  Ｇ、Ｖａｎ  Ｄｉｊｃｋ  Ａ、Ｌａｎｇａｎｇｅｒ  Ｇ、Ｄｅ  Ｍｅｙ  Ｊ）、「免疫金および免疫金／銀染色を用いたドットブロット免疫重層アッセイにおける抗原抗体反応の高感度な可視化（Sensitive visualization of antigen-antibody reactions in dot and blot immune overlay assays with immunogold and immunogold/silver staining）」Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９８４年１１月３０日、第７４巻（２号）、３５３〜６０ページ；クレマース  エーエフ、ジャンセンインデワル  エヌ、ウィーガント  ジェー、ダークス  アールダブリュ、ワイスビーク  ピー、ファンデルプレグ  エム、ランデジェント  ジェーイー（Ｃｒｅｍｅｒｓ  ＡＦ、Ｊａｎｓｅｎ  ｉｎ  ｄｅ  Ｗａｌ  Ｎ、Ｗｉｅｇａｎｔ  Ｊ、Ｄｉｒｋｓ  ＲＷ、Ｗｅｉｓｂｅｅｋ  Ｐ、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｌｏｅｇ  Ｍ、Ｌａｎｄｅｇｅｎｔ  ＪＥ）、「非放射性ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション。反射型電子顕微鏡を用いた数種の免疫組織化学的検出システムの比較（Non-radioactive in situ hybridization。A comparison of several immunocytochemical detection system using reflection-contrast and electron microscopy ）」、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、
１９８７年、第８６巻（６号）、６０９〜１５ページ。
【０１３３】
本発明との関連において、とりわけ以下の変形形態は、不溶性析出物を用いるプローブ／標的相互作用の検出について実施可能である。
本発明の１実施形態において、標的には、可溶性基質の不溶性生成物への変換を触媒する触媒、好ましくは酵素が付与されている。アレイ要素上に析出物の形成をもたらす反応は、この場合、標的に結合した触媒、好ましくは酵素の存在下における可溶性基質の不溶性生成物への変換である。酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびグルコースオキシダーゼからなる群から選択されることが好ましい。可溶性基質は、３，３’−ジアミノベンジジン、４−クロロ−１−ナフトール、３−アミノ−９−エチルカルバゾール、ｐ−フェニレンジアミン−ＨＣｌ／ピロカテコール、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、ナフトール／ピロニン、ブロモクロルインドリルリン酸
、ニトロブルーテトラゾリウム（ニトロテトラゾリウムブルー）およびフェナジンメトサルフェートからなる群から選択される。例えば、無色の可溶性水素供与体、例えば、３，３’−ジアミノベンジジンは、過酸化水素の存在下で不溶性の有色生成物に変換される。酵素の西洋ワサビペルオキシダーゼは、供与体から水素イオンを過酸化水素に転移させ、水を生成させる。
【０１３４】
本発明の好ましい実施形態において、アレイ要素上に析出物の形成をもたらす反応は、金属析出物の生成である。特に好ましくは、アレイ要素上に析出物の形成を起こす反応は、銀化合物、好ましくは硝酸銀、乳酸銀、酢酸銀または酒石酸銀の元素銀への化学的還元である。ホルムアルデヒドおよび／またはヒドロキノンを還元剤として用いることが好ましい。
【０１３５】
特に好ましくは、金属化合物の析出は標的に結合した金属クラスターまたはコロイド状金属粒子、特に金クラスターまたはコロイド状金粒子の存在下で起こる。すなわち、この場合、金属クラスターまたはコロイド状金属粒子が標的に結合した標識を形成する。例えば硝酸銀が元素状態の銀に変換されるが、この場合、溶液から銀イオンが金の上に結晶核として蓄積し、第２工程で、例えばホルムアルデヒドまたはヒドロキノンのような還元剤を用いて還元される。それにより元素状態の銀の不溶性析出物が生成される。
【０１３６】
別の実施形態において、金属化合物の析出は標的に結合したポリアニオンの存在下で起こる。標的それ自体がポリアニオンでない場合、そのような標的を核生成のために用いることが可能である。ポリアニオンで標識した標的を、例えば、硝酸銀溶液に曝露する。次に、銀陽イオンがポリアニオン上に選択的に蓄積する。その後、還元剤を用いて銀イオンを元素状態の銀に変換する。
【０１３７】
標的への酵素または触媒または金属クラスターまたはコロイド状金属粒子またはポリアニオンの結合は、直接または標的に結合したアンカー分子を介して行うことが可能である。基本的には、前述のタグを標的に直接結合させる必要はない。適切なアンカー分子、例えば、標識に結合させたストレプトアビジンを介してその後タグの結合を実現することも可能である。
【０１３８】
各触媒または結晶核とアンカー分子の特異的結合相手とからなる複合体も上述の方法を実施するために用いることが可能である。その場合、アレイ要素上に析出物の形成をもたらす反応は、標的に結合したアンカー分子への特異的結合相手の結合である。
【０１３９】
そのような結合相手／アンカー分子対は、ビオチン／アビジンもしくはストレプトアビジンもしくは抗ビオチン抗体、ジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニン免疫グロブリン、ＦＩＴＣ／抗ＦＩＴＣ免疫グロブリンおよびＤＮＰ／抗ＤＮＰ免疫グロブリンからなる群から選択されることが好ましい。
【０１４０】
前述の実施形態のそれぞれにおいて、可溶性基質が不溶性の析出生成物へと触媒的に変換される。表面に近接する結果、生成物は表面上に直接析出し、様々な洗浄法に非感受性の固体析出物を形成する。
【０１４１】
本発明の関連において、標識、特に酵素または金属クラスターまたはコロイド状金属粒子またはポリアニオンを、プローブとの相互作用の前、相互作用の間または相互作用の後に標的に結合させることも可能である。
【０１４２】
本発明の好ましい実施形態において、標的とプローブとの相互作用は２つのヌクレオチド配列の間のハイブリッド形成である。プローブ・アレイ上に配置されたプローブと標的
とのハイブリッド形成は、既知の標準プロトコールによっても起こる（特に、非特許文献４を参照されたい）。形成されたハイブリッドは、例えば、ソラーレンを挿入後の架橋結合を介した共有結合、あるいは、米国特許第４５９９３０３号に記載のような、例えばインターカレーターの結合による非共有結合により、安定化させることが可能である。
【０１４３】
プローブ・アレイ上に配置したプローブと標的とのハイブリッド形成またはハイブリッド形成済み標的の標識の後に、非特異的に、したがって、比較的弱く結合した化合物を除去する洗浄段階を通常設ける。
【０１４４】
別例として、標的とプローブとの相互作用は、抗原構造物と対応する抗体もしくはその高頻度可変領域との反応であるか、または受容体と対応するリガンドとの反応である。
特異的プローブによる標的の結合または認識は、通常、至適条件下での自発的な非共有結合である。非共有結合性化学結合も含まれる。媒体の組成ならびに他の化学的および物理的因子が結合の速度と強さに影響する。したがって、例えば核酸認識の場合、厳密性が低いほど、そして温度が高いほど、完全には相補的でない２つの鎖の間の結合の速度と強さは低い。抗原／抗体またはリガンド／受容体相互作用の結合条件を最適化することも必要であるが、結合条件は通常特異性が低い。
【０１４５】
本発明の１実施形態において、アレイ要素上の析出物の存在は、該析出物による光線、好ましくはレーザー光線または発光ダイオードの反射、吸収または散乱により検出される。析出物は粒状であるため、光線の反射を変化させる。析出物はまた、従来の検出装置により記録可能な強い光散乱をもたらす。析出物、例えば、銀析出物が暗色表面として見える場合、光の吸収も検出および記録可能である。検出の分解能は、カメラの画素数に依存する。特に好ましい実施形態において、特に好ましくは、記録カメラの露光時間が試料のすべての信号を合わせて１つの像を形成することが確実となるような走査速度で走査しながら、アレイ要素を光源が均一に照射する状態で該アレイ要素上の析出物が検出される。
【０１４６】
例えば、特異的反応により増強された領域は、透過光（遮光によるコントラスト）または入射光（反射によるコントラスト）における非常に単純な光学的構造物により検出可能である。遮光領域で検出される強度は、例えば金粒子のような標識による占有密度および粒子の核生成状態に正比例する。
【０１４７】
本発明の別の実施形態において、電気伝導性を有する、または誘電率が周囲と異なる析出物を用いる場合、反応を電気的に検出することも可能である。
電気測定は、微小電極アレイの使用、または微小キャパシタンス・センサの使用による伝導度測定により、あるいは電界効果トランジスタ・アレイ（ＦＥＴアレイ）を用いた電位測定により行うことが可能である。微小電極を用いる伝導度測定では、２つの電極の間の電気抵抗の変化を析出反応中に追跡する（イー  ブラウン、ワイ  エイチェン、ユー  シバン、ジー  ベン−ヨセフ（Ｅ．Ｂｒａｕｎ、Ｙ．Ｅｉｃｈｅｎ、Ｕ．Ｓｉｖａｎ、Ｇ．Ｂｅｎ−Ｙｏｓｅｐｈ）、Ｎａｔｕｒｅ、１９９８年、第３９１巻、７７５ページ）。微小キャパシタンス・センサを用いる誘電率測定の場合、相互に配置させた２つの電極のキャパシタンスの変化を測定する（エム  マドウ（Ｍ．Ｍａｄｏｕ）、「微小加工技術の基礎（Fundamentals of Microfabrication）」、ＣＲＣプレス［ボカラトン（Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ）所在］、１９９７年）。ＦＥＴアレイを用いる電位測定では、センサ表面上の電位の変化を測定する（エム  マドウ（Ｍ．Ｍａｄｏｕ）、「微小加工技術の基礎（Fundamentals of Microfabrication）」、ＣＲＣプレス［ボカラトン（Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ）所在］、１９９７年）。
【０１４８】
放射性または放射標識された基質を用いる場合、アレイ要素上の析出物の存在をオートラジオグラフィー、フルオログラフィーおよび／または間接オートラジオグラフィーによ
り検出することが可能である。したがって、オートラジオグラフィーでは、放射性析出物で覆われた表面をＸ線フィルムに直接接触させる。フルオログラフィーでは、放射性析出物で覆われた表面を、放射性放射エネルギーを蛍光に変換するサリチル酸ナトリウムのような蛍光化学物質で被覆する。増感スクリーンを用いる間接オートラジオグラフィーでは、β線放射性析出物で覆われた表面を、放射線を青色光に変換する増感スクリーン上に載せる（エフ  ロットスペイチ、エイチ  ゾーバス（Ｆ．Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ、Ｈ．Ｚｏｒｂａｓ）を参照、上記参照）。しかし、放射能を用いる検出法は、健康上のリスクおよびそれに関して満たすべき安全上の規制のため、望ましくないことが多い。
【０１４９】
本発明のさらに別の実施形態において、アレイ要素上の析出物の存在を、走査型電子顕微鏡、電子プローブ微量分析（ＥＰＭＡ）、磁気光学カー顕微鏡、磁気力顕微鏡（ＭＦＭ）、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）、ミラージュ効果の測定、走査型トンネル顕微鏡（ＳＴＭ）および／または超音波反射断層撮影法により検出する。
【０１５０】
ＳＥＭおよび／またはＥＰＭＡを用いる反応の検出は、基質の種類とほぼ無関係である。走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）では、収束させた電子線で試料を走査する（ジェー  ゴールドスタインら（Ｊ．Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．）、「走査型電子顕微鏡とＸ線微量分析（Scanning Electron Microscopy and X-Ray Microanalysis）」、プレナム（Ｐｌｅｎｕｍ）［ニューヨーク所在］、１９８１年）。電子プローブ微量分析（ＥＰＭＡ）では、収束電子線により誘発される２次過程を空間分解分析に用いる（ジェー  ゴールドスタインら（Ｊ．Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．）、「走査型電子顕微鏡とＸ線微量分析（Scanning Electron Microscopy and X-Ray Microanalysis）」、プレナム（Ｐｌｅｎｕｍ）［ニューヨーク所在］、１９８１年）。
【０１５１】
磁性を有する、または磁気粒子でタグ付けした基質を用いる場合、反応を磁気光学カー顕微鏡またはＭＦＭにより検出することが可能である。磁気光学カー顕微鏡では、磁場による光の偏光面の回転を用いる（カーおよびファラデー効果）（エー  フバート、アール
シェファー（Ａ．Ｈｕｂｅｒｔ、Ｒ．Ｓｃｈａｅｆｅｒ）、「磁区（Magnetic Domains）」、スプリンガー（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）、１９９８年）。
【０１５２】
反応の結果としての表面上の基質による光学密度の変化は、ミラージュ効果により検出することが可能である。ミラージュ効果では、収束レーザー光線の吸収による表面の局所加熱を、それに伴う屈折率の変化を用いて測定する。表面を走査して、局所表面吸収特性の像を得る（エー  マンデリス（Ａ．Ｍａｎｄｅｌｉｓ）、「光熱および光音響の科学と技術における進歩（Progress in Photothermal and Photoacoustic Science and Technology ）」、第１巻、エルゼビア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）［ニューヨーク所在］、１９９２年）。基質による相互作用反応を検出するための他の熱空間分解法は、基質析出物の結晶化または析出のエンタルピーを測定するマイクロサーモフィル（Ｍｉｋｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ）である（ジェー  エム  ケーラー、エム  チーレン（Ｊ．Ｍ．Ｋｏｅｈｌｅｒ、Ｍ．Ｚｉｅｒｅｎ）、Ｔｈｅｒｍｏｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ、１９９８年、第３１０巻、２５ページ）。
【０１５３】
ＳＴＭおよびＡＦＭも基質による反応の検出に適している。原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）では、マイクロチップまたはナノチップが表面をスキャンすることにより表面の形態（トポグラフィ）を測定する（イー  ブラウン、ワイ  エイチェン、ユー  シバン、ジー  ベン−ヨセフ（Ｅ．Ｂｒａｕｎ、Ｙ．Ｅｉｃｈｅｎ、Ｕ．Ｓｉｖａｎ、Ｇ．Ｂｅｎ−Ｙｏｓｅｐｈ）、Ｎａｔｕｒｅ、１９９８年、第３９１巻、７７５ページ）。磁気力顕微鏡ＭＦＭは、ナノチップを介して局所的磁化率の差を検出する（エー  フバート、アール  シェファー（Ａ．Ｈｕｂｅｒｔ、Ｒ．Ｓｃｈａｅｆｅｒ）、「磁区（Magnetic Domains）」、スプリンガー（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）、１９９８年）。走査型トンネル顕微鏡ＳＴＭでは、
ナノ表面トポグラフィを測定するためにナノチップを用いてトンネル電流を測定する（オー  マルチ、エム  アメリン（Ｏ．Ｍａｒｔｉ、Ｍ．Ａｍｒｅｉｎ）、「生物学におけるＳＴＭとＳＦＭ（STM and SFM in biology）」、アカデミックプレスインコーポレイテッド（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．）［サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）所在］、１９９３年）。
【０１５４】
超音波反射断層撮影法のような比較的変わった方法も使用し得る。断層撮影法は、３次元像を円板状に編集する方法である（エフ  ナッテラー（Ｆ．Ｎａｔｔｅｒｅｒ）、「コンピュータ断層撮影の数学的解析法（Mathematical methods of computer tomography ）」、Ｗｅｓｔｄｔ．Ｖｌｇ．［ウィースバーデン（Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ）所在］、１９９７年）。超音波反射断層撮影法の場合、超音波反射の測定を用いて断層写真を得る（ブイ
フライシャー、エフ  ベルグナー（Ｖ．Ｆｌｅｉｓｃｈｅｒ、Ｆ．Ｂｅｒｇｎｅｒ）、ＤＧＺｆＰ  ＮＤＴ会議ドレスデン（Ｄｒｅｓｄｅｎ）、１９９７年）。
【０１５５】
本発明のさらなる態様は、
ａ）前述した本発明の少なくとも１つの反応容器と、
ｂ）特異的相互作用を検出するための検出装置と、
からなる、前述の方法を実施するための装置に関する。
【０１５６】
前述した免疫金／銀染色のような、相互作用に関して反応による増強効果を有する染色法を用いる場合、通常用いられる蛍光測定と異なり、本発明による装置の総費用が極めて低くなるように、単純な吸光度または反射測定により検出を行うことが可能である。
【０１５７】
本発明による装置は、プローブと標的との相互作用が起こったアレイ要素上に析出をもたらす反応により検出を行う、前述のような検出法に用いることが好ましい。検出装置または読取機器に挿入可能な反応容器中で、析出物の形態の相互作用生成物が、試料または標的とプローブとの特異的相互作用の結果としていくつかのアレイ要素上に生成する。これらの相互作用生成物は、相互作用していない物質とは異なる吸収係数を有する。この効果を、前述のように適切な反応を用いて著しく増強することができる。
【０１５８】
検出装置は、プローブ・アレイの全領域を通常記録するカメラ、特にＣＣＤもしくはＣＭＯＳカメラまたは類似のカメラであることが好ましい。あるいは、走査法を反応容器について読み出すための検出装置に用いることも可能である。
【０１５９】
本発明による装置の特別の実施形態において、検出装置はさらに読み出し用光学部品を含む。
好ましい実施形態では、本発明による装置は、少なくとも１つの光源も含む。本発明との関連において光源は、支持体への均一な照射が確実になされるものであることが好ましい。光源は、レーザー、発光ダイオード（ＬＥＤ）、表面発光体および高圧ランプからなる群から選択されることが特に好ましい。
【０１６０】
点光源に加えて、照明アレイの形の光源も本発明の装置に用いることが可能である。この実施形態では、例えば、光源が複数の拡散放射光源からなり該光源の重ね合わせが均一な照射をもたらすということによって、支持体の均一な照射が保証され得る。したがって、例えば、マトリックス形式に配置されている拡散散乱ＬＥＤは、試料から短距離の地点における均一な照射の実現を可能にするものである。
【０１６１】
均一な照射はまた、本発明による反応容器の蓋を適切な構造とすることによっても達成され得る。この方法では、本発明の反応容器の蓋が拡散ディスク／レンズの機能を有する。
【０１６２】
本発明のさらなる好ましい実施形態では、装置へ反応容器を挿入するために脇へ旋回させることが可能な旋回アームに光源が取り付けられている。光源はその後、アフィニティ・マトリックスを照射するために反応容器の上に旋回させることが可能である。この方法では、物質ライブラリーが正しい画面上に位置するように、反応容器を反応容器ホルダに押し込むことが可能である。その結果、結像光学部品または読み出し光学部品の焦点再調節は不必要となる。代替例として、異なる種類の反応容器を記録することが可能なように、読取機器または検出装置に焦点調節装置を装着することが可能である。
【０１６３】
他の実施形態では、反応容器の蓋を圧入することが可能である調整凹所を本発明の装置に設ける。その結果、アフィニティ・マトリックスのねじれが回避される。
析出物の形成を光学的に検出するための本発明の装置の例示的構造の構成要素は、均一な照射のための低電力（５００ｍｃｄ）光源、例えばＬＥＤと、検出器、例えばＣＣＤカメラとから構成される。特に、金／銀システムを用いる場合、触媒による基質の析出を介した増強効果の結果として、表面の光学的特性の変化が著しいため、析出物を検出するのに平床型スキャナ、スライド・スキャナまたは同等の装置で十分である。
【０１６４】
蛍光検出用の同等の高感度ＣＣＤシステムが約１０〜１８秒を必要とするのに対し、典型的な検出時間が１秒より有意に少ないため、信号伝達がビデオ標準に相当する安価な消費者向けカメラを使用することが可能である。
【０１６５】
本発明による装置のさらなる有利な実施形態では、装置はさらに光学フィルタを含む。そのようなフィルタは、一方ではスペクトルを限定して均一に照射することを可能にし、他方では異なる波長で試料を照射することを可能にする。さらなる変形形態において、本発明による装置はフィルタ交換器をさらに含む。これらのフィルタ交換器を用いて光学フィルタを迅速に交換することが可能であり、それにより、例えば不純物により発生する可能性のある不正確な情報が一意的に認識され、除去される。
【０１６６】
さらなる好ましい実施形態において、特に、支持要素の反射率を測定する場合、装置はさらに光源と支持要素との間に半透明鏡を含む。この実施形態において、光源からの光は半透明鏡を通過して試料上に達し、該半透明鏡および必要ならば読み出し光学部品により、カメラ上に反射像が結像される。
【０１６７】
反射率を測定することに関する好ましい実施形態では、表面鏡をさらに支持要素の下側に取り付ける。この実施形態において、反射が不十分な試料の欠点が透過効果により補われるが、この場合照射光は、独立の鏡としての、または試料支持体の裏面に沈積させた層としての試料後方の鏡層により反射される。この場合、例えば、表面発光体を支持要素の反対側、および例えばＣＣＤカメラのセンサに対して配置することが可能である。このように、非常に小型の配置構成とすることが可能である。
【０１６８】
さらなる実施形態では、読み出し光学部品を介してＣＣＤカメラのセンサと直接接触するセル内に試料を設置する。この場合、読み出し光学部品またはセルとカメラとの間の結合媒体は、例えばショット（Ｓｃｈｏｔｔ）から入手可能なファイバーボードまたはイメージ・ケーブルまたはイメージ・ラインであることが好ましい。この実施形態では、本発明の反応容器は、間に試料容積を有する２つの面−平行プレートからなるセルである。表面結合物質ライブラリーを含むチップをこのセルに挿入し、分光計におけるセルのように読み出すことが可能である。
【０１６９】
本発明による装置は、試料が測定中に安定な温度で保存されることを保証する温度制御ユニットをさらに有することが好ましい。これによって、結果の再現が確実となる。
他の実施形態において、連続的検出が保証されるように複数の反応容器を装置内に配置する。例えば、本発明の装置内に試料を雑誌または回転木馬の形で配置することにより、時差的な連続読み出しを実現することが可能である。
【０１７０】
本発明の装置が、
−  検出装置により記録された信号強度を収集し、
−  必要な場合、信号強度をアナログ画像に変換する
ためにプログラムされているコンピュータをさらに含むことがさらに好ましい。
【０１７１】
本発明との関連において、画像とは、プローブ・アレイにおける実測信号強度の図解を示し、かつ、例えばスクリーンまたは記録用プリンターに直接伝達可能な画素の群と理解される。
【０１７２】
既に詳細に述べたように、結晶核として作用する金粒子上の例えば元素状態の銀のような析出物の沈着による増強過程中の時間分解検出と、本発明の方法を用いた時間挙動からの相対的占有密度の計算とによって、８ビット検出技術を用いた場合でさえも測定データの動的分解能を格段に増加させることが可能である。このために必要な装置の構造は、反応チャンバの機械的記録と改良型収集ソフトウエアの点で異なっている。ソフトウエア、例えば、Ｉｃｏｎｏｃｌｕｓｔ（登録商標）ソフトウエア（クロンディアグ（Ｃｌｏｎｄｉａｇ））は、連続的に得られる記録を処理することを特徴とする。この目的のために、個々のプローブ・アレイ要素を用いて求めるグレー値を各測定時間ごとに求める。すべてのアレイ要素について、仮想の信号強度を析出物の形成の関数として時間依存的に計算する。この値から出発して、例えば、最後の測定のグレー値を速度と測定時間の積と関係づける。それにより測定範囲の広がりが得られる。したがって、安価な８ビットカメラを用いた場合でさえも、弱いプローブ／標的相互作用および強いプローブ／標的相互作用の非常に良好な分解能ならびに結合標的の正確な定量化が達成される。
【０１７３】
そのような構造の小型化の可能性は非常に高いので、前記システム全体を野外使用のための独立携帯型装置として設計することが可能である。さらに、特に好ましい実施形態において、本発明の装置は高度に集積された独立ユニットとしても実現し得る。したがって、例えば、医学診断、科学捜査、細菌スクリーニングなどのような高感度のマイクロアレイの適用を、門外漢が医学および生物学施設を使用せずに迅速に実施することが可能である。
【０１７４】
したがって、本発明の反応容器は、例えば市販のエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）チューブのような従来の反応容器の基部表面の１つ、例えば同容器の底または蓋に挿入された支持体またはチップまたはアレイを備えた標準的実験用反応容器または標準的マイクロチューブを含む。この配置構成により、実質的に取扱いが容易になり、再現性が高くなる。溶液は本発明の反応容器にピペットで容易に分注することが可能であり、インキュベートおよび処理、例えば、ほとんどすべての施設、特に分子生物学の施設で利用可能なマイクロチューブ用機器を用いて遠心分離する処理、が可能である。
【０１７５】
本発明による装置の特別な実施形態について、図面を参照して下に詳細に説明する。
図５〜１２に表面結合物質ライブラリー（１０２）を読み取るために使用可能な様々な光学的原理を示す。検出および読取装置に用いる反応容器中で、試料または標的と物質ライブラリー（１０２）のいくつかのライブラリー要素のプローブとの特異的相互作用が起こり、それにより相互作用生成物がいくつかの表面上に生成する。
【０１７６】
これらの相互作用生成物は、純物質とは異なる吸収係数を有し、この効果は、適切な反応により著しく増強させることが可能である。相互作用反応の前、相互作用反応中および
／または相互作用反応の後の表面結合物質ライブラリーの吸収または反射比を図５〜１７に示す読み出しシステム（１０００）により画像化する。
【０１７７】
図５〜１２では、読み出し原理をより十分に図解するために、反応容器（１）については表面結合物質ライブラリー（１００）だけを表示してある。図１３〜１７には、表面結合物質ライブラリー（１００）上の析出物の画像化に関する２つの特定の実施形態を示す。ここに示す読取機器（１０００）の代わりに、走査法を用いて反応容器（１）を読み出すことも可能である。
【０１７８】
さらに、図５〜１７の説明を前述の銀析出反応と組み合わせたＤＮＡチップ（１００）の使用に関して示すが、もちろん、これに限定はされない。
図５に反応容器（１）を読み出すための本発明による装置の基本配置を示す。非干渉性光源（１００１）からの光は照射光学部品（１００２）によりチューブ（１）内にあるライブラリー・チップ（１００）上の表面結合ＤＮＡライブラリーに照射される。信号は、読み出し光学部品（１００４）を用いてＣＣＤカメラ（１００５）により記録される。
【０１７９】
図６に図５と同じ配置を示す。ただし、照射光線の光路に光学フィルタ（１００６）を挿入することによって照射光のスペクトル範囲を制限する点が異なっている。非干渉性光源（１００１）からの光は照射光学部品（１００２）により反応容器（１）内にあるライブラリー・チップ（１００）上の表面結合ＤＮＡライブラリーに照射される。信号は、読み出し光学部品（１００４）を用いてＣＣＤカメラ（１００５）により記録される。フィルタ交換器（１００７）を用いてこれらのフィルタを迅速に交換する機会があることは、例えば、汚染によって引き起こされる可能性がある正しくない情報が明らかに特定され、除去される可能性があるという、評価上の利点がある。
【０１８０】
図７に示す装置では、点光源（１００１）の代わりに照射アレイ（１００８）を用いている。照射アレイ（１００８）からの光は照射光学部品（１００２）を用いて反応容器（１）内にあるライブラリー・チップ（１００）上の表面結合ＤＮＡライブラリー（１０２）に均一に照射される。信号は、読み出し光学部品（１００４）を用いてＣＣＤカメラ（１００５）により記録される。マトリックス形式に配置された拡散散乱ＬＥＤにより、試料に対して短距離で均一な照射の実現を可能であることが好ましい。
【０１８１】
図８に示す本発明の装置の配置では、カメラのＣＣＤセンサ（１００５）がアフィニティ・マトリックス（１００）と直接接触している小型リーダー（１０００）を示す。このような接触は、ファイバーボード（１０１２）を用いることによって、または、直接の接触が不可能である場合はイメージ・ケーブルを用いることによってより大きい距離について成されることも可能である。非干渉性光源（１００１）からの光は照射光学部品（１００２）を用いて反応容器（１）内にあるライブラリー・チップ（１００）上の表面結合ＤＮＡライブラリーに照射される。試料からの信号をＣＣＤカメラ（１００５）により直接記録する。
【０１８２】
図９に示す読取機器（１０００）では、試料を入射光で測定する。前述した読取機器または検出装置（１０００）と異なり、ＤＮＡライブラリー（１０２）の反射率をこの装置で測定する。非干渉性光源（１００１）からの光は照射光学部品（１００２）を用いて半透明鏡を通って反応容器（１）内にあるライブラリー・チップ（１００）上の表面結合ＤＮＡライブラリーに照射される。反射信号が半透明鏡（１００９）により読み出し光学部品（１００４）上へと屈折し、そこからＣＣＤカメラ（１００５）上に像が造られる。
【０１８３】
銀析出物はさほど良好な反射特性を有さないので、図１０に示す配置が入射光測定において有利である。非干渉性光源（１００１）からの光は照射光学部品（１００２）を用い
て半透明鏡を通って反応容器（１）内にあるライブラリー・チップ（１００）上の表面結合ＤＮＡライブラリー（１０２）に照射される。反射信号が半透明鏡（１００９）により読み出し光学部品（１００４）上へと屈折し、そこからＣＣＤカメラ（１００５）上に像が造られる。試料の反射が不十分であるという欠点は、透過効果により、独立の鏡としての、または試料支持体の裏面に施された層としての試料の後ろの鏡層（１０１０）を用いて照射光が反射されることによって補われる。
【０１８４】
図１１には、透明な試料空間、好ましくはセル（１０１１）であって、光学的に平坦な外表面をとおしてファイバーボード（１０１２）により該試料空間へのレシーバーの良好な結合を達成可能とする試料空間内への、本発明の装置の可能な配置を示す。非干渉性光源（１００１）からの光は照射光学部品（１００２）を用いてセルの透明壁をとおしてライブラリー・チップ（１００）上の表面結合ＤＮＡライブラリー（１０２）に照射される。セルの透明壁をとおして試料からの信号がＣＣＤカメラ（１００５）により直接記録される。ファイバーボード（１０１２）またはイメージ・ラインを、セルとＣＣＤカメラとの結合媒体として用いることが可能である。
【０１８５】
図１２に示す装置は、図１１に示す読取機器（１０００）の極めて小型の配置を示す。非常に小型のセンサは、例えば電子発光法または低温陰極蛍光法に基づく拡散表面発光体（１０１３）を用いる場合に実現することが可能である。この拡散発光体（１０１３）の場合、非干渉性光源（１００１）からの光はセルの透明壁をとおしてライブラリー・チップ（１００）に直接照射される。試料からの信号をＣＣＤカメラ（１００５）により直接記録する。
【０１８６】
図１３および１４に、読取機器（１０００）を平面図および断面図で示す具体例としての実施形態を示す。作動原理は、図１に示す装置の作動原理に対応している。小型装置の寸法を実現するために、屈折鏡をアフィニティ・マトリックス（１００）と結像光学部品との間に設置した。光源（１００８）からの光は反応容器（１）に入射し、次いで、ＤＮＡチップ（１００）をとおして屈折鏡上に到達する。ここからＤＮＡチップ（１００）の像が結像光学部品（１００４）を介してＣＣＤカメラ（１００５）上に投影される。光源（１００８）は、反応容器（１）を読取機器（１０００）に挿入するために脇に旋回させることが可能である旋回アームに組込まれた発光ダイオードから構成される。その後、アフィニティ・マトリックス（１００）を照射するために該旋回アームを反応容器（１）の上に旋回させる。この場合、ＤＮＡライブラリー（１０２）が正しい画面に位置するように、該旋回アームによって反応容器（１）が反応容器ホルダ（１１００）に押し込まれる。その結果結像光学部品（１００４）の焦点再調節は不要となる。反応容器（１）の蓋が押し込まれる調整凹所（１１０２）を上側に設ける。それにより、アフィニティ・マトリックス（１０２）のねじれが回避される。反応容器（１）内を再現性のある状態に維持するために、ペルティエ素子（１２００）を反応容器ホルダ（１１００）に設置する。それにより反応容器（１）内の温度を制御することが可能となる。より高い温度に設定することを可能にするために、反応容器ホルダ（１１００）にさらに抵抗加熱を備えることが可能である。あるいは、反応容器ホルダ（１１００）を循環冷媒により温度調節することも可能である。
【０１８７】
図１５に、旋回アーム（１１０１）がスライダー（１３００）によって置き換えられている点で図１３と異なる読取機器（１０００）を示す。該スライダー（１３００）は直線状の軸受（１３１０）により反応容器（１）上を摺動する。この場合、可動往復台（１３２０）が反応容器（１）を４つの圧縮ばね（１３２１）により反応容器ホルダ（１１００）に押し込む。反応容器（１）がその正しい位置をとり、スライダー（１３００）の摺動する動きにより固定されるように、調整ギャップ（１３２２）が反応容器（１）の蓋（３）を受容する。図１７に読取機器が開いた状態での反応容器（１）に対するスライダー（
１３００）の位置を示す。可動往復台（１３００）が図に示す矢印に沿って移動し、それにより反応容器（１）を閉じる。読取機器（１０００）を用いて測定可能とするために、同時に光源（１００８）を反応容器（１）の上に摺動させる。スライダー（１３００）が閉じているとき、往復台（１３２０）は光源と反応容器（１）との間に位置する。可動往復台は、アフィニティ・マトリックス（１００）を照射可能にするために検出開口部（１３２３）を有する。
【０１８８】
以下の実施例は、本発明を例示するために用いるものであり、決して限定的なものとはみなされない。
【実施例１】
【０１８９】
（反応容器（１）の製造）
ポリプロピレン製で公称内容積１．５ｍｌの、エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）の標準的な反応試験チューブを再融解のために用いた。この目的のために反応チューブの底側にキャップを付け、その側から一部の材料を旋削した。次いで、チューブをピン上にのせ、熱金型上に押し付けて、開口部または凹所（８）、チップ支持体（６）ならびに接着縁部（７）をチューブに型押した（図１を参照）。
【実施例２】
【０１９０】
（銀検出を用いる反応容器（１）中の核酸のハイブッリド形成の検出および特異性）
ａ）試験系
ヒトｃｙｐ２Ｄ６遺伝子はヒトシトクロムＰ４５０をコードする。この酵素は、様々な薬物および活性物質の代謝において重要な役割を果たしている。ｃｙｐ２Ｄ６遺伝子における突然変異は、ある種の薬剤に対する過敏症または不耐性をもたらすことがある。ｃｙｐ２Ｄ６について少なくとも１４種のそのような突然変異（点突然変異または欠失）が記載されている。これらの突然変異（Ｇ１７４９Ｃ、ｄＴ１７９５、Ｇ１９３４Ａ、Ｇ２０６４Ａ）を選別するためには、各野生型または突然変異が分析する試料中に存在するかどうかを試験しなければならない。
【０１９１】
ｂ）ＤＮＡライブラリー（１０２）の生産と反応容器（１）を用いた組立
ＭｉｃｒｏＧｒｉｄＩＩ  Ａｒｒａｙｅｒ（商品名）（バイオロボティックス（ＢｉｏＲｏｂｏｔｉｃｓ）［英国ケンブリッジ所在］）を用いて、２１〜２５ヌクレオチドの長さを有する４０種のアミノ修飾オリゴヌクレオチド（プローブ）をエポキシ化ガラス表面（スライドガラスの寸法：７５ｍｍ×２５ｍｍ）（１０１）上の画定された部位に沈着させ、共有結合により固定化した（ライブラリー要素またはアレイ要素）。プローブを、それぞれ第１が野生型、第２が突然変異であるライブラリー要素の対に分割した。
【０１９２】
オリゴヌクレオチド配列は以下のとおりであった（５’−３’方向の配列で、５’−ＮＨ２修飾されている）。
【０１９３】
【表２】
2005514632.tif 000007
【０１９４】
2005514632.tif 000008
【０１９５】
スライドガラス表面（１０１）上の１つの完全な（矩形）ＤＮＡライブラリー（１０２）は、合計１２×１０＝１２０種が沈着されたライブラリー要素と、読取機器（１０００）の像に光学的に適応させるための７種のタグとからなっている。４０種のオリゴヌクレオチドプローブのそれぞれをＤＮＡライブラリー（１０２）上に３回繰り返して沈着させた（ライブラリー要素の配置については図１８を参照）。ライブラリー要素は０．２ｍｍの間隔を有し、全ＤＮＡライブラリー（１０２）が２．４ｍｍ×２．４ｍｍの領域を覆っていた。このようにしてスライドガラス当たり全体で１００を越える同じＤＮＡライブラリー（１０２）を生成することが可能になった。
【０１９６】
０．１Ｍリン酸緩衝液／２．２％硫酸ナトリウムに溶解したそれぞれ１０μＭのオリゴヌクレオチド溶液からライブラリー要素をスライドガラス上に沈着させた。次いで、６０
℃で３０分間焼成して、ライブラリー要素をスライドガラス上のエポキシド基に共有結合させた。これに続いて、以下の順序、すなわち
６００ｍｌの２回蒸留したＨ２Ｏ＋６００μｌのトリトンＸ１００で５分間
６００ｍｌの２回蒸留したＨ２Ｏ＋６０μｌのＨＣｌ（濃）で２×２分間
１００ｍＭ  ＫＣｌ溶液で３０分間
２回蒸留したＨ２Ｏで１分間すすぎ
圧縮空気で乾燥
の多段階洗浄工程に供した。
【０１９７】
スライドガラスの洗浄および乾燥工程の完了後、該スライドガラスを３．１５ｍｍ×３．１５ｍｍのガラス片（以下ＤＮＡチップ（１００）と呼ぶ）に切断した。２．４ｍｍ×２．４ｍｍの寸法を有するちょうど１つのＤＮＡライブラリー（１０２）を、それぞれのチップ（１００）上に配した。次いで、チップ（１００）を図１に示す方法で反応容器（１）に挿入し、接着縁部（７）に塗布したポリジメチルシロキサンで接着した。
【０１９８】
ｃ）ＤＮＡライブラリーに対するハイブリッド形成用の標的の調製
分析すべき試料（以下標的と呼ぶ）は、ｃｙｐ２Ｄ６のエキソン３／４（ＫＤＬ２４、関連する突然変異に対する野生型として配列決定することにより遺伝子型を決定）を対象とした患者ＤＮＡのビオチン標識ＰＣＲ物とした。ＰＣＲ混合物は次のとおり、すなわち
プライマー１：ｃｙｐ２Ｄ６＿３／４−ｆ、配列５’−ＣＡＣＧＣＧＣＡＣＧＴＧＣＣＣＧＴＣＣＣＡ−３’、最終濃度２００ｎＭ
プライマー２：ｃｙｐ２Ｄ６＿３／４ｒ−５’Ｂｉｏ、配列５’−Ｂｉｏ−ＣＴＣＴＣＧＣＴＣＣＧＣＡＣＣＴＣＧＣＧＣＡＧＡ−３’、最終濃度２００ｎＭ
ｄＮＴＰｓ、最終濃度２００μＭ
Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）ｃＤＮＡ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−Ｍｉｘ（商品名）（５０倍、クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）［米国パロアルト（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ）所在］、最終濃度１倍
Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）ｃＤＮＡ  ＰＣＲ反応緩衝液（商品名）（１０倍、クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）［米国パロアルト（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ）所在］、最終濃度１倍
鋳型ＤＮＡ（ＫＤＬ２４）、８０ｎｇ
水を加えて５０μｌとする
とした。
【０１９９】
次いで、以下のプログラム、すなわち
１  変性（１０分、９５℃）
２  変性（３０秒、９５℃）
３  アニーリング（３０秒、６５℃）
４  伸長（８０秒、７２℃）
５  工程２〜４を２９回反復
６  伸長（７分、７２℃）
７  冷却（４℃、後続の処理まで）
を用いてＰＣＲを行った。
【０２００】
ｄ）反応容器（１）におけるプローブ・アレイのハイブリッド形成および複合化
反応容器（１）中でハイブリッド形成反応させるため、得られたＰＣＲ生成物のうち４μｌを１４６μｌの６×ＳＳＰＥ緩衝液（１Ｌの２回蒸留したＨ２Ｏ中５２．５９ｇ  ＮａＣｌ、８．２８ｇ  ＮａＨ２ＰＯ４×Ｈ２Ｏ、２．２２ｇ  ＥＤＴＡ×２Ｈ２Ｏであり、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整）／０．１％ＳＤＳと混合し、組立て済みの反応容器（１）に加えた。ハイブリッド形成溶液を変性（５分、９５℃）した後、緩やかに振とうしな
がら６５℃で６０分間インキュベーションを行った。次いで、ハイブリッド形成溶液を反応容器（１）から除去した。その後、２つの洗浄工程、すなわち、２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ（３０℃で５００μｌ）および２×ＳＳＣ（２０℃で５００μｌ）で各１０分間の洗浄工程に供した。次いで、調製済み複合溶液（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｇｏｌｄ（商品名）、ブリティッシュ・バイオセル・インターナショナル（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｂｉｏｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、ＥＭ．ＳＴＰ５、最終濃度は６×ＳＳＰＥ／０．１％ＳＤＳ中２５０ｐｇ／μｌ）を反応容器（１）中のチップ（１００）に加え、反応容器（１）を３７℃で１５分間インキュベートした。複合溶液を除去した後、反応容器（１）中のチップ（１００）を振とうしながら２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ（３０℃で５００μｌ）、２×ＳＳＣ（２０℃で５００μｌ）および０．２×ＳＳＣ（２０℃で５００μｌ）でそれぞれ１０分間洗浄した。
【０２０１】
ｅ）検出
銀増強のために、反応容器（１）中の組込みチップ（１００）を銀現像液（ブリティッシュ・バイオセル・インターナショナル（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｂｉｏｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）［英国カーディフ（Ｃａｒｄｉｆｆ）所在］、ＳＥＫＬ１５）で覆い、反応容器（１）を銀の読取機器（１０００）に挿入した。読取機器（１０００）は、調節（Ｔｅｍｐｅｒｉｅｒｕｎｇ）付きの試料受容部、読み出し部および照明を供えた旋回アーム（１１０１）からなっている（図１３および１４を参照）。試料を複数のＬＥＤの拡散照射アレイ（１００８）を用いた透過光で照射した。追加の拡散器により試料の均一な照射が可能になり、偏りは最大値から１０％未満であった。
【０２０２】
試料を透過で読み出した。この目的のために、備え付けの受容部に試料を挿入した。試料の正しい位置決めは、受容部（１１０２）を特別に成形することにより確保した。開閉部を開いて反応容器（１）を該受容部に挿入した。この位置では、反応容器（１）の蓋がアフィニティ・マトリックス（１００）をねじれさせることはない。位置が正しいときにのみ、照明を測定位置に旋回させることが可能である。測定位置では、旋回アームが反応容器（１）、したがってアフィニティ・マトリックスを同時に固定する。
【０２０３】
評価方法については、読み出し用のひずみのない光学部品（１００４）を使用することが有利であることが証明された。視野深さの大きい光学部品を用いることにより、カメラに対する試料の位置を調節する必要はなかった。焦点調節は不要であった。アフィニティ・マトリックス上の単位面積当たりの物質の密度に応じて、用いるＣＣＤカメラ（１００５）を、ＣＣＩＲ方式か、またはより高分解能ものとする。測定中、抵抗加熱またはペルティエ素子（１２００）により試料の温度を安定に維持した。
【０２０４】
等量の開始剤と促進剤を混合して、銀現像液を調製した。２５℃（±０．１℃）での２０分間のインキュベーション中に銀増強の時間応答を一連の写真（１０秒ごとの像）により記録した（図１９を参照）。
【０２０５】
時系列でのすべての画像についてのライブラリー要素の光学密度を、Ｃｌｏｎｄｉａｇ（登録商標）からの画像評価ソフトウエアＩｃｏｎｏＣｌｕｓｔ（登録商標）を用いて求めた。図２０に要素Ｇ１９３４Ａ＋４（突然変異型）およびＧ２０６４Ａ−ＷＴ（野生型）に関する経時変化を示す。
【０２０６】
測定値ａＧ１９３４Ａ＋４およびａＧ２０６４Ａ−ＷＴを、説明に示した評価の手順に従って計算した。これらはａＧ１９３４Ａ＋４＝４．８３＊１０−７秒―２およびａＧ２０６４Ａ−ＷＴ＝２．５６６＊１０−６秒−２であった。
【図面の簡単な説明】
【０２０７】
【図１】開口部または凹所（８）が、アフィニティ・マトリックス（１００）を外側から取り付けることが可能な支持面（６）を有する反応容器（２）の底部に組込まれていることを示す図。アフィニティ・マトリックス（１００）を、この目的のために備えられている接着縁部（７）に接着剤を塗布して接着する。
【図２】開口部（１０）が、アフィニティ・マトリックス（１００）を内側から取り付けることが可能な支持面（１１）を有する反応容器（２）の底部に組込まれていることを示す図。アフィニティ・マトリックス（１００）を、この目的のために備えられている接着縁部（９）に接着剤を塗布して接着する。
【図３】反応容器（２）の底部に締付け接合部（２０１）が備えられていることを示す図。チップ支持体（２００）をこの締付け接合部（２０１）に液封式に押し込むことが可能である。チップ支持体は開口部（１０）を有し、該開口部に備えられている支持面にアフィニティ・マトリックス（１００）を取り付け、接着することが可能である。
【図４】本実施形態において、アフィニティ・マトリックス（１００）が反応容器（２）と締付けスリーブ（３００）との間に液封式に締付けられているため接着が必ずしも必要でないことを示す図。
【図５】本発明の反応容器におけるアレイを読み出すための基本配置を示す図。非干渉性光源（１００１）からの光が照射光学部品（１００２）を用いてチューブ内にあるライブラリー・チップ（１００）上の表面結合ＤＮＡライブラリーに均一に照射される。ＣＣＤカメラ（１００５）からの信号を読み出し光学部品（１００４）を用いて記録する。
【図６】照射光線の光路に光学フィルタ（１００６）を組込むことによって照射光のスペクトル範囲を制限するという変形形態を有する、図５と同じ配置を示す図。フィルタ交換器（１００７）を用いてこれらのフィルタを交換する機会があることは、例えば、汚染によって引き起こされる可能性のある正しくない情報が明らかに特定され、除去されうるという、評価上の利点がある。
【図７】本実施形態において、古典的な照射光源の代わりに照射アレイ（１００８）が用いられることを示す図。マトリックス形に配置構成された拡散散乱ＬＥＤにより試料から短距離での均一な照射の実現を可能にすることが好ましい。
【図８】カメラのＣＣＤセンサ（１００５）がアフィニティ・マトリックス（１００）と直接接触している、図１の配置の小型形を示す図。この接触は、ファイバーボード（１０１２）を用いて、あるいは直接接触が不可能である場合にはイメージ・ケーブルによってより大きい距離でも行うことが可能である。
【図９】入射光で試料を読み出すための配置を示す図。この場合、半透明鏡（１００９）が用いられている。
【図１０】銀試料はさほど良好な反射特性を有さないので、この図に示すような配置が有利であることを示す図。ここで、試料の反射が不十分であるという欠点は、独立の鏡としての、または試料支持体の裏面に沈積された層としての試料後方の鏡層（１０１０）により照射光が反射される透過効果により補われる。
【図１１】透明試料空間、好ましくはセル（１０１１）であって、光学的に平坦な外表面をとおしてのファイバーボード（１０１２）による該試料空間への受容部の良好な結合を達成することを可能にする試料空間における配置を示す図。図８に示すような非常に小型のセンサは、例えば、電子発光法または低温陰極蛍光法に基づく拡散表面発光体（１０１３）を用いることにより実現することが可能である。
【図１２】図１１に示す読取機器（１０００）の非常に小型の配置構成を示す図。
【図１３】図７に示す原理に従って作動し、小型装置の寸法とするために屈折鏡をアフィニティ・マトリックス（１００）と結像光学部品（１００４）との間に組込んだ点で異なる読取機器の断面図。光源（１００８）は、反応容器（１）を読取機器に挿入するために脇に旋回させることが可能である旋回アーム（１１０１）に組込まれた発光ダイオードから構成される。その後、アフィニティ・マトリックス（１００）を照射するために該旋回アームを反応容器（１）の上に旋回させる。
【図１４】平面図（操作者側からの図）であることを除いて、図１３に対応する図。反応容器（１）の蓋を押し込むことが可能な調整凹所（１１０２）が上部に設けられている。その結果、アフィニティ・マトリックスのねじれが回避される。
【図１５】旋回アーム（１１０１）がスライダー（１３００）によって置き換えられている点で図１３とは異なる読取機器（１０００）を示す図。スライダー（１３００）を直線状の軸受（１３１０）により反応容器（１）上を摺動させる。この場合、可動往復台（１３２０）が反応容器（１）を反応容器ホルダ（１１００）に押し込む。
【図１６】スライダー（１３００）の可動往復台（１３２０）の平面図。往復台（１３２０）が４つの圧縮ばね（１３２１）により反応容器（１）に押し付けられている。反応容器（１）がその正しい位置をとり、固定されるように、調整ギャップ（１３２２）が反応容器（１）の蓋（３）を受容する。
【図１７】読取機器が開いた状態での反応容器（１）に対するスライダー（１３００）の位置を示す断面図。可動往復台（１３００）が矢印に沿って移動し、それにより読取機器を閉じる。スライダーは、光源（１００１）からの光が通過可能な検出開口部（１３２３）を有する往復台（１３２０）を押し下げる圧縮ばね（１３２１）から構成される。
【図１８】２．４ｍｍ×２．４ｍｍの寸法を有するアレイ（１０２）の配置図。各々３連のプローブの名称を示してある。「Ｍ」＝マーカー／標識／タグ。
【図１９】本発明の反応容器におけるビオチン標識野生型ＰＣＲ（エキソン３／４、ＫＤＬ２４）のハイブリッド形成の時系列画像の中から選択した画像（１５分間の銀現像の後）を示す図。チップの配置は図１に示す。
【図２０】２つのスポットの銀析出による黒化の時間的挙動を示す図。一方のスポットは標的ＤＮＡの完全な相補的配列（野生型Ｇ２０６４Ａ−ＷＴ）を有し、他方は１塩基異なっている（突然変異Ｇ１９３４Ａ＋４）。関連する回帰関数もプロットしてある。
【図２１】ポリプロピレン製で、充填容積が１．５ｍｌの２種の標準反応容器の写真。
【符号の説明】
【０２０８】
１…反応容器、２…アフィニティ・マトリックスを受承する囲いとしての形状の開口部（凹所）を有する反応容器、３…蓋、４…接合ストリップ、５…シーリング、６…チップ支持体外側、７…接着縁部外側、８…液体開口部、９…接着縁部内側、１０…観察開口部、１１…チップ支持体内側、１００…ライブラリー・チップ、アフィニティ・マトリックスまたはＤＮＡチップ、１０１…基材、１０２…表面結合物質ライブラリー、２００…チップ支持体、２０１…締付け接合部、３００…締付けスリーブ、３０１…シーリング面、１０００…読取機器、１００１…光源、１００２…照射光学部品、１００４…読み出し光学部品、１００５…センサ、好ましくはＣＣＤカメラ、１００６…光学透過フィルタ、１００７…フィルタ交換器、１００８…照射アレイ、好ましくはＬＥＤの配置構成、１００９…半透明鏡、１０１０…鏡またはＤＮＡライブラリー支持体の鏡面処理、１０１１…セル、１０１２…ファイバーボード、１０１３…拡散表面発光体、１０１４…屈折鏡、１１００…反応容器ホルダ、１１０１…旋回アーム、１１０２…調整凹所、１２００…ペルティエ素子、１３００…スライダー、１３１０…直線状の軸受、１３２０…可動往復台、１３２１…圧縮ばね、１３２２…調整ギャップ、１３２３…検出開口部、１３２４…支持面。
【図１】
2005514632.tif 000009
【図２】
2005514632.tif 000010
【図３】
2005514632.tif 000011
【図４】
2005514632.tif 000012
【図５】
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【図６】
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【図７】
2005514632.tif 000015
【図８】
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【図９】
2005514632.tif 000017
【図１０】
2005514632.tif 000018
【図１１】
2005514632.tif 000019
【図１２】
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【図１３】
2005514632.tif 000021
【図１４】
2005514632.tif 000022
【図１５】
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【図１６】
2005514632.tif 000024
【図１７】
2005514632.tif 000025
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
2005514632.tif 000028
【図２１】
2005514632.tif 000029
【国際調査報告】
2005514632.tif 000030
2005514632.tif 000031
2005514632.tif 000032
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