(57)【要約】本発明は、吸着膜、および１つまたは複数のこのような膜を含む装置である。膜および装置の両方は、少なくとも１００のペクレ数（Ｐｅ）を有する。膜および装置は、生物薬学産業で存在するような蛋白質を含む流れの中の微量汚染物質を除去するように構成されている。好ましい膜は、密な孔径分布と、高い処理量の分離を可能にする高い透過性を有する。本発明の装置は、プリーツフィルタ、接線流フィルタ、またはらせん状に巻かれたフィルタなどの平膜を含むことができる。好ましくは、装置は、１つまた複数の層の膜が、ディスクの２つの大きな表面のそれぞれに対して密封される積層ディスク構成で形成される。このような装置の１つは、一連のディスクで形成され、それぞれのディスクは、ディスクの２つの大きな表面のそれぞれに対して密封されている８つの層の膜を有する。これらのディスクは、一方の端部に入口を、他方の端部に出口を有する密封されたカプセル内に配置されている。ディスクは、出口から出るすべての流体が、ディスクの片側の膜を最初に通過させることによって出るように密封されている。
2005508249.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
入口および出口を有するハウジングと、１つまたは複数の層の吸着膜とを備える膜吸着装置であって、少なくとも１００のペクレ数（Ｐｅ）を有する装置。
【請求項２】
前記Ｐｅが少なくとも１５０である、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記Ｐｅが少なくとも２００である、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記Ｐｅが少なくとも５００である、請求項１に記載の装置。
【請求項５】
前記Ｐｅが少なくとも２０００である、請求項１に記載の装置。
【請求項６】
前記Ｐｅが約１００から約４０００である、請求項１に記載の装置。
【請求項７】
前記１つまた複数の層の膜が、１つまたは複数の有孔ディスク上に形成され、前記膜の内縁および外縁が前記有孔ディスクに対して密封され、濾過された液体が流れることができる前記膜と前記ディスクとの間の空間と、前記濾過された液体のためのディスクからの出口とを形成している、請求項１に記載の装置。
【請求項８】
前記１つまたは複数の膜が少なくとも１００のＰｅを有する、請求項１に記載の装置。
【請求項９】
前記１つまたは複数の膜が少なくとも２００のＰｅを有する、請求項１に記載の装置。
【請求項１０】
前記１つまたは複数の膜が少なくとも５００のＰｅを有する、請求項１に記載の装置。
【請求項１１】
前記１つまたは複数の膜が少なくとも１０００のＰｅを有する、請求項１に記載の装置。
【請求項１２】
前記１つまたは複数の膜が約１００から約４０００までの範囲のＰｅを有する、請求項１に記載の装置。
【請求項１３】
前記入口と前記１つまた複数の層の膜との間に配置された流れ分配器をさらに備える、請求項１に記載の装置。
【請求項１４】
膜および装置がそれぞれ少なくとも１００のＰｅを有する、膜ベースの吸着装置を選択するステップと、あらゆる微量汚染物質も除去するために前記装置の前記膜を通って水溶性蛋白質を含む流れを流すステップと含む、水溶性蛋白質を含む流れから微量汚染物質を除去するためのプロセス。
【請求項１５】
前記微量汚染物質が、ウイルス、内毒素、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらの混合物から成る群から選択される、請求項１４に記載のプロセス。
【請求項１６】
（ａ）膜または膜吸着装置を、知られているｐＨおよび導電率で平衡緩衝液で平衡化させるステップと、（ｂ）前記膜を、平衡緩衝液中で知られている濃度の特定の溶質で攻撃するステップと、（ｃ）時間、攻撃容積、およびその他の膜へ攻撃される材料の全体量に関連する適切な変数から成る群から選択される値に応じて、前記膜の下流側の溶質の破過を監視するステップと、（ｄ）前記膜吸着装置に直接関連がある流れ特性を決定するために、溶質破過曲線を解析するステップと、（ｅ）ステップ（ｄ）で計算された結果を、知られている一体型装置による結果と比較するステップとを含む、膜吸着器のペクレ数を決定するためのプロセス。
【請求項１７】
前記（ｄ）の解析が、破過曲線の鋭さを計算することによる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ステップ（ｃ）の監視が、検知器による、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記（ｄ）の解析が、溶質破過の時間を監視することによる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記ステップ（ｄ）の解析が、溶質破過の最初の開始と溶質破過の一部分から成る群から選択されたある時点で、膜吸着器へ攻撃される材料の全体量に関する変数を監視することによる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記ステップ（ｄ）の解析が、溶質破過の特定の一部分で、膜吸着器へ攻撃される材料の全体量に関する変数を監視することによる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記ステップ（ｄ）の解析が、溶質破過の約５％から約５０％である特定の一部分で、膜吸着器へ攻撃される材料の全体量に関する変数を監視することによる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
前記ステップ（ｄ）の解析が、溶質破過の約５％から約２０％である特定の一部分で、膜吸着器へ攻撃される材料の全体量に関する変数を監視することによる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
前記ステップ（ｄ）の解析が、溶質破過の約５％から約１０％である特定の一部分で、膜吸着器へ攻撃される材料の全体量に関する変数を監視することによる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
前記ステップ（ｄ）の解析が、破過曲線の鋭さと、溶質破過の最初の開始を計算することによる、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、選択された成分を液体流から除去するための吸着膜、および吸着膜を含む装置に関する。より具体的には、本発明は、それぞれが１００よりも大きいペクレ数（Ｐｅ）を有する、膜および１つまたは複数のこのような膜を含む装置を有する、膜ベースの吸着装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
膜クロマトグラフィまたは垂直方向流れの膜ベースの吸着器の使用は、良く知られている。米国特許第４，８９５，８０６号、およびMembrane Chromatography: Preparation and Application to Protein Separation, Zeng, X, Biotechnol. Prog 1999, vol15, p.1003-1019参照。
【０００３】
これらの装置はすべて、入口および出口を有するハウジングと、入口に入るすべての液体が、出口に到達する前に１つまたは複数の膜層を通って流れなければならないように、入口と出口との間に配置された吸着性の膜の１つまたは複数の層とで基本的に形成されている。膜は、通常、表面修飾、現位置での共重合またはグラフト化、吸着性の材料からの直接形成によって、または膜の形成中に膜マトリックス内に吸着性の粒子（クロマトグラフィ媒体など）を含むことによって吸着性になる。この方法により、液体流の１つまたは複数の構成物質が、膜表面に結合され、流れから除去される。濾過ステップの完了後、結合された物質は、異なる溶液を追加すること、またはｐＨ状態を変更すること、またはその他の当技術分野で良く知られている方法によって溶出され、廃棄か処理のいずれかをされて、どんな目的のためにも使用される。
【０００４】
通常、除去される物質は、関心対象の蛋白質である。ウイルス、内毒素、核酸、宿主細胞蛋白質、および類似のものなどの、流れの中の物質の残りのものは、妨害されずに装置を通過し、システムから除去される。
【０００５】
当該蛋白質を除去する代わりに、ウイルス、内毒素、核酸、宿主細胞蛋白質、および類似のものなどの微量の汚染物質を、流れから除去することも提案されてきた。従来は、このことは、第４級アミンの化学的性質を備える媒体を含むクロマトグラフィカラムの使用を通じて行われてきた。この方法は、関心対象の製品のより高い収率などのいくつかの利点を有する。しかし、この方法は、いくつかの欠点を有する。一例として、カラムの使用は、カラム構成要素の能力をあまり十分に利用しない結果となり、通常１％未満である。また、処理は時間を消費し、主に流れがクロマトグラフィ媒体に面しているのに必要な長い滞留時間のため、完了するのにしばしば数時間かかる。最後に、媒体、追加の緩衝溶液のコストは、品質管理およびその使用に付随する検証コストとともに、この用途のためにクロマトグラフィカラムを使用することの経済性にかなり影響を与える。
【０００６】
上記の問題点を克服するために、クロマトグラフィ媒体の代わりに膜ベースの吸着器を使用する可能性が、述べられてきた。しかし、現在の装置は、克服する必要があるそれ自体の問題点を有する。これらの装置の問題点は、これらが効率的ではなく、そのため作製および操作するのに費用がかかるということである。単に層を追加することだけでは効率は増加しない。その代わりに、装置の製造およびその操作の費用を単に追加するに過ぎない。効率を改善するために、クロマトグラフィカラムで従来使用されているものと同様のテーパ付きエンドプレートおよびスクリーンなどの様々な流れ分配装置が試されてきた。しかし、全体的な結果は満足のいくものではなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
効率的であり、その能力を使用し、高い処理量を有し、好ましくは、再使用前の装置の清浄化および再確認の必要性を除去するように使い捨て可能である、膜吸着装置が必要である。本発明は、特に微量汚染物質除去のためのこのような膜および装置を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、吸着膜、および１つまたは複数のこのような膜を含む装置である。膜および装置の両方は、少なくとも１００のペクレ数（Ｐｅ）を有する。膜および装置は、たとえば生物薬学産業で存在するような蛋白質を含む流れの中の微量汚染物質を除去するように構成されている。好ましい膜は、密な孔径分布と、（捕捉機構が配位子ベースであるか否かにかかわらず）一様な捕捉機構の密度および容量と、高い処理量の分離を可能にする高い透過性を有する。
【０００９】
本発明の装置は、プリーツフィルタ、接線流フィルタ、またはらせん状に巻かれたフィルタなどの平膜を含むことができる。好ましくは、装置は、１つまた複数の層の膜が、ディスクの２つの大きな表面のそれぞれに対して密封される、積層ディスク構成で形成される。このような装置の１つは、一連のディスクで形成され、それぞれのディスクは、ディスクの２つの大きな表面のそれぞれに対して密封されている８つの層の膜を有する。これらのディスクは、一方の端部に入口を、他方の端部に出口を有する密封されたカプセル内に配置されている。ディスクは、出口から出るすべての流体が、ディスクの片側の膜を最初に通過させることによって出るように密封されている。このような装置は線形に拡大縮小可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
供給流内の微量汚染物質のレベルは、様々であり得るが、通常は低く、ほぼ百万分率（ｐｐｍ）の範囲またはそれ未満であり、望まれているのは、ウイルス、内毒素、ＤＮＡ、宿主細胞蛋白質などの汚染物質を、検知できないレベルまで除去することである。たとえば、通常の供給流中には、１から１０ｐｐｍのウイルスレベル、１００ピコグラム／ｍＬのＤＮＡ、１０ＥＵ（内毒素単位）／ｍＬの内毒素、および約１０から約１００ナノグラム／ｍＬの宿主細胞蛋白質がある。これらの汚染物質を効果的、効率的に除去することは困難な作業である。
【００１１】
効率的な膜ベースの吸着装置を、それぞれが少なくとも１００のペクレ数（Ｐｅ）を有する膜および装置構成の使用によって、蛋白質精製での使用のために作製できることが見出された。膜および装置が両方とも、１００以上のＰｅを有するとき、高い保持率および効率が、良好な流れおよび収率特性と共に達成される。また、使用者にとって非常に有用である線形に拡張可能である装置を作製することができる。
【００１２】
ペクレ数（Ｐｅ）は、ペクレ解析から導かれ、汚染物質に対する破過曲線の生成に関連している。基本的に、試験材料（すなわち微量汚染物質を代表するもの）が、選択された吸着性の膜または装置を通って流され、濾液中の試験材料の量が測定される。Ｘ軸上に容積、Ｙ軸上に破過％で、値がグラフ上にプロットされる。１０未満のものなどの低いＰｅ値に対しては、試験材料の破過は、膜装置の能力のかなり下でほぼ直ちに出現し、すなわち不十分な効率を示す。１００を超える、および好ましくは１０００を超えるものなどの高いＰｅ値に対しては、破過曲線は、理想値に近づき始め、破過は、装置の能力、すなわち高い効率に対応する。
【００１３】
図１は、上記で説明したＰｅ値の理論上のプロットを示している。理想のプロットは垂直な線である。曲線が垂直に近いほど、Ｐｅ値はより高くなる。
【００１４】
確証された生物薬剤学的な用途での微量汚染物質の除去などの、吸着性の用途に対しては、いかなる感知可能なレベルでの濾液の汚染も許されないため、破過は重要な問題である。Ｐｅ値は、膜およびそれを含む装置の吸着性能の重要な予測変数であることが見出された。
【００１５】
また、ウイルス除去では、Ｐｅ値は、膜および装置のＬＲＶと相関関係がある。ＬＲＶは、対数減少値を意味しており、２つの数の比によって表される。ウイルスの用途では、これは、濾液中に見出されるウイルス粒子の数に対するフィルタの上流側に含まれるウイルス粒子の数によって表される。したがって、４のＬＲＶは、膜が、１０４の粒子で攻撃され（ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ）、１つのみが濾液中で見出されたことを意味している。この比の対数は４である。このことは、膜が、すべてのウイルス粒子の９９．９９％を除去することが可能であることを意味している。
【００１６】
イオン交換能力は、すべての装置が、除去される汚染物質の量に対して過度の能力を有するため、微量汚染物質の除去のための吸着装置での満足できる性能の予測変数ではない。問題は、しばしばｐｐｍの範囲で存在する汚染物質を、効率的に、かつできる限り完全に除去することを確実にすることである。
【００１７】
（全膜領域を効果的に攻撃するために十分な流体分布を与えながら、上流側および下流側の死容積を最小化するように最適に構成された装置内に収容されている）膜のペクレ数、または１つまたは複数の膜を含む装置のペクレ数を決定するために、出願人が使用する方法は、以下の通りである。
【００１８】
（１）膜または膜吸着装置を、知られているｐＨおよび導電率で平衡緩衝液で平衡化させること。
【００１９】
（２）膜または膜吸着装置を、平衡緩衝液内で知られている濃度の特定の溶質で攻撃すること。特定の溶質の選択は、通常、その特定の機構によっての吸着器と結合の可能性（または不可能性）、およびその下流側での容易な検知の可能性に基づく（ＵＶ検知のための様々な発色団、蛍光的にラベル付けされた溶質など）。攻撃溶質の濃度の選択は、通常、溶質吸着に関連する熱力学原理（吸着等温特性）および試験の特定の目的の両方に基づく。たとえば、試験の目的が、特定の膜吸着装置の性能を特徴付けることである場合、緩衝液および溶質の状態および濃度を、溶質の膜吸着器との結合特性が溶質の吸着等温線の線形部分内にあるように選択することになる。しかし、試験の目的が、膜のみを通る流れの特性を特徴付けることである場合（それによって、上流側の死容積の影響を最小化する）、通常、緩衝液および溶質の状態および濃度を、溶質の膜吸着器との結合特性が、溶質の吸着等温線の非線形部分内にあるように選択することになる。
【００２０】
（３）適切な検知器を使用して、時間、攻撃容積、またはその他の膜吸着器に攻撃される材料の全体量に関連する適切な変数に応じて、膜吸着器の下流側の溶質の破過を監視すること。
【００２１】
（４）膜吸着装置の直接関連がある流れ特性を決定するために、溶質破過曲線を解析すること。この解析は、以下を含むことができる。
【００２２】
（ａ）破過曲線の鋭さを計算すること。破過曲線の鋭さを計算するための手段の１つは、有効ペクレ数（Ｐｅ）を計算することによる。その詳細は以下で説明する。高いＰｅ値は、膜吸着器を通る一様な流れ、捕集機構の一様な密度および分布、および膜吸着器の表面全体への効率的な流れの分布に関連している。高いＰｅ値を有する装置は、良好な微量不純物の保持特性を有する傾向がある。低いＰｅ値は、膜吸着装置に関連する不十分な流れ分布特性、膜吸着器の過度に大きな流れ分散特性、不十分な捕集機構の分布および／または密度、またはこれらのうちの２つ以上の組合せに関連している。低いＰｅ値は、微量不純物の保持特性が弱められたことを示す。
【００２３】
（ｂ）溶質破過の最初の開始か、溶質破過の特定の一部分（たとえば５％または１０％）のいずれかで、時間（またはその他の膜吸着器に攻撃される材料の全体量に関する適切な変数）を監視すること。ある標準値（たとえば５０％破過）と比較した溶質の早すぎる破過は、微量不純物の保持特性を弱くすることがある欠陥の存在を示す。早すぎる破過を検知する能力は、上記ステップ（ａ）で計算した破過曲線の鋭さに大いに依存する。たとえば、極めて鋭い破過曲線を呈する膜吸着装置での欠陥の検知は、破過曲線が極めて広がった装置よりもずっと容易である。破過曲線の鋭さは、高いＰｅ数を本質的に有する膜を使用し、低い死容積および良好な流れ分布特性を有する膜吸着器を構成することによって、非線形な吸着の熱力学特性を利用することによって、または上記のいずれかの組合せによって強められる。
【００２４】
（ｃ）破過曲線の鋭さと、溶質の破過の最初の開始の両方を計算すること（ステップ（ａ）および（ｂ）の組合せ）。このようにして、微量不純物の保持特性を弱くすることがある欠陥および／または流れ分布特性（膜または装置のいずれかに関連する）を、検知することができる。
【００２５】
（５）ステップ（４）で計算された結果を、知られている一体型装置による結果と比較し、それによって、膜吸着器または膜吸着装置の完全性、またはこのような装置の微量不純物を除去する能力のいずれかを決定すること。
【００２６】
上記で述べたように、破過曲線の鋭さを決定するこのような手段の１つは、有効ペクレ数（Ｐｅ）を計算することによる。破過曲線は、通常Ｓ字型の形状である（Ｓ字型）。ＬａｐｉｄｕｓおよびＡｍｕｎｄｓｏｎ（Lapidus,L. and N.R.Amundson, "Mathematics of adsorption in beds. VI. The effect of longitudinal diffusion in ion-exchange and chromatographic columns", J.Phys. Chem., 56, 984 (1952)）は、破過曲線の鋭さに関する数学的モデルを、様々なモデルパラメータに対して開発した。これは以下で示される。
【数１】
2005508249.tif 000003
【００２７】
ここで、
ＣＡは、廃液溶質濃度である。
Ｃ０は、入口溶質濃度である。
Ｖは、攻撃容積である。
Ｖｂａｒは、５０％破過（ＣＡ／Ｃ０＝０．５）での攻撃容積である。
Ｐｅは、ペクレ数である。
【００２８】
技術的な観点から見ると、この等式は、線形システムに対して導かれた。しかし、いかなる破過曲線を説明するためにもこの形の等式を使用することができる。したがって、この等式を、実験的に決定された破過曲線に単にフィッティングすることによって、有効Ｐｅを決定することができる。破過曲線データをこの等式にフィッティングさせるための様々な手段は、（ａ）すべてのデータを同時に使用して最良のフィッティング（最小二乗誤差を最小化するもの）を決定する最小二乗フィット、（ｂ）離散した複数の点（２または３）が使用されるマルチポイント法、または（ｃ）他のいくつかの方法のいずれかを含む。方法（ｂ）の例は、Ｐｅ対
【数２】
2005508249.tif 000004
の総括的なプロットを作製するために等式（１）を使用することである。ここで、Ｖ１０、Ｖ５０、およびＶ９０は、それぞれ１０、５０、および９０％溶質破過に対応する破過容積である。その後、実験破過曲線から、Ｖ１０、Ｖ５０、およびＶ９０の値を決定する。その後、総括的なＰｅプロットから、有効Ｐｅ数を決定する。しかし、これは、破過曲線の鋭さを定量化することができる１つの手段に過ぎないことに留意されたい。
【００２９】
上記のプロセスは、膜または装置のＰｅを得るための好ましい手段であるが、破過曲線の鋭さを定量化し、それによって同じタイプの関連する情報を提供する他の方法を開発することもできる。本発明は、これらの方法を本発明の教示の中に包含されかつ含まれることを意味している。
【００３０】
本装置の膜は、所望の汚染物質除去レベルを達成するのに十分に高いペクレ数を有さなければならない。通常、膜自体は、約１００から１０，０００を超えるまでのＰｅを有する。好ましくは、Ｐｅは少なくとも１００、より好ましくは少なくとも２００、さらに好ましくは少なくとも５００または少なくとも１０００、および最も好ましくは少なくとも１０，０００またはそれ以上である。
【００３１】
装置のＰｅは、通常、膜のＰｅ以下であることが見い出されている。現在まで、膜のＰｅよりも高いＰｅを有することが可能である装置は見い出されていない。不十分な流れ分布、膜を装置内に組み込む方法（プリーツ化、積層ディスク、その他の方法）、および類似のものなどの様々な装置特性が、装置のＰｅ数に不利な影響を与え得る。したがって、所望の装置Ｐｅよりも高いＰｅを有する膜の使用が推奨される。
【００３２】
膜は、超高分子量ポリエチレンを含むポリエチレン、ポリプロピレン、ＥＶＡコポリマーおよびアルファオレフィン、メタロセンオレフィン系ポリマーなどオレフィン、ＰＦＡ、ＭＦＡ、ＰＴＦＥ、ポリカーボネート、ＰＶＣなどビニルコポリマー、ナイロンなどポリアミド、ポリエステル、セルロース、セルロースアセテート、再生セルロース、セルロース複合材料、ポリサルホン、ポリエーテルサルホン、ポリアリルサルホン、ポリフェニルサルホン、ポリアクリロニトリル、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、およびそれらの混合物から選択された、ポリマーで形成された微孔質またはマクロ孔質の膜とすることができる。また、デラウェア州ウィルミントンのＥ．Ｉ．ＤｕＰｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙから市販されている、Ｔｙｖｅｋ（登録商標）ペーパーなどの同じ材料の不織布および織布、セルロースパッド、マサチューセッツ州ベッドフォードのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されているＭＩＬＬＩＳＴＡＫ＋（商標）濾過媒体などの類似の繊維媒体を使用することができる。選択される膜は、Ｐｅ、所望の濾過特性、濾過される粒子のタイプおよびサイズ、および所望の流れに応じる。
【００３３】
選択される膜は、所望の液体流から１つまたは複数の種を吸着することが可能でなければならない。再生セルロース膜などの膜は、本質的に機能性であり、したがってさらなる処理は必要ない。しかし、大部分の場合、選択される膜は、機能化されていないか、または不十分に機能化されているかのいずれかであり、したがって膜を追加処理することが必要である。膜を機能的にするいくつかの良く知られている方法がある。"Membrane Chromatography: Preparation and Applications to Protein Separation", Zeng, X. Biotechnol. Prog 1999, vol 15, p.1003-1019参照。機能上の特徴は、親水性、疎水性、帯電性（正または負）、親油性、疎油性、および配位子の化学的性質のうちの１つまたは複数であることができる。
【００３４】
膜材料を機能的にする最も一般的な方法は、形成中に膜構造内に機能的な材料を組み込むこと、機能化する材料で膜の表面を処理すること、および機能的な材料を表面上に、グラフト化または重合および架橋させること、および膜表面と結合した配位子を使用することを含む。
【００３５】
形成中に膜構造内にイオン交換樹脂またはクロマトグラフィ媒体などの固体様材料を追加することができる。米国特許第５，５３１，８９９号参照。別法として、所望の機能性を提供するために、膜を作製するために使用されるバッチ材料内にＰＶＰなどの液体の成分を追加することができる。
【００３６】
好ましくは、事前成形された膜の表面処理を使用する。表面は、膜のすべての表面、上面および下面、ならびに膜構造内の孔の内壁を意味している。これは、米国特許第４，９４４，８７９号で教示されているように適切な位置で重合および架橋されたモノマーであってもよく、または、米国特許第５，６２９，０８４号および米国特許第５，８１４，３７２号で教示されているようなポリマーであってもよい。米国特許第５，１３７，６３３号は、２つの成分、親性のためのモノマー、および膜に正の帯電性を追加するエピクロロヒドリンを追加すること教示している。
【００３７】
別法として、米国特許第４，３４０，４８２号で教示されているように、膜表面上でポリマーをグラフト化することもできるが、これは、厳しい処理条件を強いられること、およびこのような条件下で生じる膜構造の劣下のために好ましくはない。
【００３８】
処理された上記の膜は、そのままで使用されてもよい、または必要に応じて、第４級アミンなどの配位子を、異なるまたは増加した選択性を与えるために、その表面に結合させることができる。通常、この膜表面は、最初に、親水性を与えるために処理され、次に、配位子がリンカーアームを介して膜表面に付着される。米国特許第４，９２３，９０１号、米国特許第５，５４７，７６０号、米国特許第５，６１８，４３３号、および米国特許第５，９８０，９８７号参照。
【００３９】
上記の方法のいずれか、ならびに吸着する膜を結果として生じるその他の方法を、本発明で使用することができる。
【００４０】
所要のＰｅおよび所望の能力を提供するのに十分な膜が装置内にあるべきである。装置の構成に応じて、このことは通常、装置内の１つ以上の層の膜を意味する。所与の装置構成で所望のＰｅを達成するために必要な最少数の膜層があることが見出された。必要な数は、選択される膜および装置構成に応じる。通常、２層から４層が、所望のＰｅを与えるのに十分であることが見い出されている。例３に示すような本発明の好ましい実施形態では、１つの層が十分に高いＰｅ数を提供し、３つの層が、選択された膜で得ることができる最大のＰｅを提供した。その後、所望の能力を提供するためにさらなる層を追加することができる。
【００４１】
また、特定の汚染物質に対して最も効果的な膜を選択することによって、さらに大きな効果を達成するために２つ以上の異なる層を使用することができる。
【００４２】
本発明に有用な市販製品は、マサチューセッツ州ベッドフォードのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されているＤｕｒａｐｏｒｅ（登録商標）膜として知られている、公称孔径０．６５ミクロンの膜を含む。この膜は、親性を与え、正の電荷を担持するように改良されている。この膜は、８層構成で以下で説明するペクレ試験で試験したとき、少なくとも２０００、好ましくは４０００のＰｅを有する。本発明で有用な他の膜は、マサチューセッツ州ベッドフォードのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されているＣＨＥＭＰＵＲＥ１膜、およびミネソタ州ミネアポリスの３Ｍから市販されているＥＭＰＯＲ膜を含む。これらは両方、膜構造に粒子状クロマトグラフィ媒体を組み込んだ膜である。また、マサチューセッツ州ベッドフォードのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されている帯電ＰＬシリーズの膜、マサチューセッツ州ベッドフォードのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されているＩＣＤＭ膜、ニューヨーク州イーストヒルズのＰａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されているＭｕｓｔａｎｇ膜、およびドイツのＳａｒｔｏｒｉｕｓ株式会社から市販されているＳａｒｔｏｂｉｎｄ膜などの再生セルロース膜である。
【００４３】
本発明に適した装置を構成する際、いくつかの要因が、装置の成功および高いＰｅ値の達成に寄与することがわかった。第１に、膜は、本明細書で規定されるＰｅ試験で少なくとも１００のＰｅを有さなければならない。第２に、選択される膜は、比較的に本質的に狭い孔径の分布を有するべきである。このことは、所与のタイプの膜に対して達成可能である最大のＰｅ数を達成することを可能にする。また、このことは、分離を行うために必要とされる層の最小数を決定する。さらに、膜は、膜全体を通してできる限り均等な捕集部位の密度を有するべきである。Ｐｅは、膜内の不十分なまたは一様でない捕集機構分布（たとえば不十分な配位子分布）によって、不利な影響を受けることがあると考えられている。
【００４４】
また、できる限り均等で一様な流れを維持するために、上流側の死容積および混合ゾーンを最小化する装置構成を選択するように努めるべきである。最後に、様々な流路の滞留時間分布を最小化し、それによって、流れを最大にし、装置内のある点から別の点への流れをできる限り一様に保つように、上流側および下流側の流路を構成すべきである。
【００４５】
本発明の適切に構成された装置の追加の利点は、装置が線形に拡大縮小可能であることである。「線形に拡大縮小可能であること」は、研究、パイロット、および生産の拡大縮小プロセスに有用であるサイズの所与のＰｅを有する装置を構成すること、および装置のすべての性能を、使用されるプロセスのサイズにかかわらず本質的に同一にすることが可能であることを意味している。たとえば、このことは、小規模の装置で行われる作業が、追加の面積および体積を有する同一の装置構成を選択し、かつ使用することを可能にし、パイロットおよび生産スケールでのＰｅで作業させることを可能にすることを意味している。このことは、それぞれの規模で装置を再設計する必要性を除去し、そのプロセスを生産レベルにまで拡大しようとするとき、選択された装置がすべての使用のために作動する知識および安全性を提供することにおいて大きな利点である。このことは、拡大に必要なコストおよび時間を削減し、プロセスおよび装置の検証を単純化する。
【００４６】
本発明の装置は、プリーツフィルタ、接線流フィルタ、またはらせん状に巻かれたフィルタなどの平膜を含むことができる。好ましくは、装置は、ディスク構成で、より好ましくは、１つまた複数の層の膜が、ディスクの２つの大きな表面のそれぞれに対して密封される積層ディスク構成で形成される。このような装置の１つは、一連のディスクで形成され、それぞれのディスクは、ディスクの２つの大きな表面のそれぞれに対して密封されている２つ以上、好ましくは８つの層の膜を有する。これらのディスクは、一方の端部に入口を、他方の端部に出口を有する密封されたカプセル内に配置されている。ディスクは、出口から出るすべての流体が、ディスクの片側の膜を最初に通過させることによって出るように密封されている。ディスクの配置は、一様で平行な流体分布、および混合または死容積のほとんどない比較的低い圧力降下での流れを提供する膜の平行な配置を提供する。
【００４７】
図２は、本発明の装置の第１の実施形態を示している。この装置は、マサチューセッツ州ベッドフォードのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されているＭＩＬＬＥＸ（登録商標）装置を基にした小規模の装置である。この装置は、入口１２を有する上部部分１０と、出口１６および有孔の膜支持プラットホーム１８を有する底部部分１４とを備える。膜のパケット２０が、すべての流体が、出口１６に到達する前に膜パケット２０を通過しなければならないように、上部部分１２と底部部分１４が互いに密封される前に底部部分１４に対して密封される。選択された膜の能力および装置の所望の能力に応じて、パケット２０内で２つ以上の層の膜を使用することができることが見出された。好ましい実施形態では、２５ｍｍ直径のＭＩＬＬＥＸ（登録商標）装置が、３．５ｃｍ２の前面面積および０．３５ｍｌの底容積（ｂｅｄ  ｖｏｌｕｍｅ）を有する装置になるように、８層の０．６５親水性帯電ＤＵＲＡＰＯＲＥ（登録商標）膜が載置された。
【００４８】
パケットは、内縁および外縁の周囲を密封される。これは、ヒートシールを使用して達成されたが、エポキシおよびウレタン接着剤、振動溶接、ポリオレフィンオーバーモールドなどの他の方法を使用することもできる。必要に応じて、装置密封プロセスの一部としてではなく、装置内でパケットを別個に密封することができる。
【００４９】
図３は、本発明で有用な積層ディスク装置の一部分を示している。これは、大規模（パイロットまたは生産）プロセスで使用される。図示した装置は、マサチューセッツ州ベッドフォードのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されているＭＩＬＬＩＤＩＳＫ（登録商標）を基にしている。この図３では、１連のディスク３０は、その２つの主面のそれぞれに結合された１つまたは複数の吸着性の膜の層を有する。ディスク３０は、互いに離隔され、スペーシングラグ３２によって変形を防止するために、その外縁で互いに付着されている。ディスクはまた、図５に示す内側密封リム３３によって互いに密封され、装置の出口プレート３４に取り付けられている。この出口プレート３４は、表面の中央の出口（図示せず）を有する比較的平坦な表面（図示せず）と、この場合その外表面上のＯリングである密封部３８を含む出口ネック３６とから成る。出口ネック３６は、装置の下側ハウジング部片４０の装置出口３８の内部表面に嵌合し、かつ内部表面を密封する。
【００５０】
図４は、装置全体を拡大図で示している。図中ですでに説明した部品は、図３と同じ番号を有する。ディスク３０に加えて、出口プレート３４（装置出口３８内に装着されて示されている）、本体４１および上部ハウジング部片４２がある。２つのベント／ドレイン４４Ａおよび４４Ｂも示されている。装置入口が４６として示されている。上部ハウジング部片４２、本体４１、および下部ハウジング部片４０は、漏密なハウジングを形成するように、すべて互いに密封されている。金属の場合、セクションを互いに溶接することができる。好ましくは、これらはすべてプラスチック製であり、互いに溶剤接合、熱接合、または互いにプラスチック溶接されている。ハウジングは３つの部片で示されているが、その成形型の構成に応じて、それ以上またはそれ以下の部片で容易に作製することができる。
【００５１】
図５は、図４の実施形態で使用されているディスク５０を示している。内側リム５２が、ディスクの出口として作用する中央開口５４、および図３に関連して議論した内側密封リム３３と隣接して形成されている。外側リム５６および内側リム５２は、膜のための密封点として作用する平坦な領域５７および５８を有する。また、膜を支持し、膜間の通路として働く役割をする一連の半径方向リブ６０および同心リブ６２と、膜を通過した流体のための開口５４とが示されている。また、図３に関連して議論したラグ３２も示されている。
【００５２】
図６は、流体流路を有する図４の装置の部分横断面を示している。流体は、入口（図示せず）を通ってディスク５０の外側へ供給される。流体は、ディスク５０の両側で密封された膜６４に入る。流体は、リブ６０および６２によって形成された通路に沿って、中央開口５４に隣接する流体窓６６まで通過し、そこから出口３８を通って装置から出る。
【００５３】
図７は、図４の装置の１枚のディスクを通る流路のさらに詳細な横断面を示している。流体窓６６をより明確に見ることができ、流体が遮られずに中央開口５４へ流れることを可能にしている。
【００５４】
好ましい実施形態では、３．２５インチ（８２．５５ｍｍ）直径のＭＩＬＬＩＤＩＳＫ（登録商標）装置が、６枚のディスクを有し、それぞれが、各ディスクの両側に８層の０．６５親水性帯電ＤＵＲＡＰＯＲＥ（登録商標）膜を載置され、０．０４５ｍ２の前面面積と０．０４５Ｌの底容積を有する装置にされている。
【００５５】
別の実施形態では、３．２５インチ（８２．５５ｍｍ）直径のＭＩＬＬＩＤＩＳＫ（登録商標）装置が、６０枚のディスクを有し、それぞれが、各ディスクの両側に８層の０．６５親水性帯電ＤＵＲＡＰＯＲＥ（登録商標）膜を載置され、０．４５ｍ２の前面面積と０．４５Ｌの底容積を有する装置にされている。
【００５６】
本発明で有用である他の形式の装置は、プリーツ状平膜カートリッジ、特に２つ以上の層の膜を有するものと、米国特許第５，１４７，５４２号、米国特許第５，１７６，８２８号、米国特許第５，８２４，２１７号、および米国特許第５，９２２，２００号に示されているような、ＰＲＯＳＴＡＫ（登録商標）、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）、ＰｅｌｌｉｃｏｎＩＩ（登録商標）、ＰｅｌｌｉｃｏｎＸＬ（登録商標）カセットとして、マサチューセッツ州ベッドフォードのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されている接線流カセットと、米国特許第５，１２８，０３７号で教示されて、マサチューセッツ州ベッドフォードのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからＨＥＬＩＣＯＮ（登録商標）カートリッジとして市販されているものなどのらせん状にまかれたカートリッジとを含む。
【００５７】
エンドキャップ、入口、出口、ハウジング、ディスクなどの装置の構成部品は、金属、セラミック、ガラス、またはプラスチックなどの様々な材料から作製することができる。好ましくは、構成部品は、比較的低コストおよび良好な化学的安定性のため、ステンレス鋼、特に３１６ステンレス鋼またはアルミニウムなどの金属、または、より好ましくは、ポリオレフィン、特にポリエチレンおよびポリプロピレン、ホモポリマーまたはコポリマー、およびエチレンビニルアセテート（ＥＶＡ）コポリマー、ポリカーボネート、スチレン、ＰＴＦＥ樹脂、ＰＦＡなどの熱可塑性のペルフルオル化されたポリマー、ＰＶＤＦ、ナイロンおよびその他のポリアミド、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）、および上記のいずれかの混合物などのプラスチックで形成される。
【００５８】
膜、および／または１つまたは複数の膜を含む装置の完全性を決定するための方法も、本発明の一部であり、それは以下のようである。
【００５９】
膜または装置が、吸着する溶質で攻撃される。攻撃緩衝液および溶質の濃度は、溶質の膜との結合が、ラングミュア吸着式に従い、溶質濃度が、吸着等温線の非線形部分にあるのに十分であるように選択される。等温線の非線形部分で動作するための理由は、好ましい吸着熱力学が、溶質の破過の鋭さを強調するからである（試験の感受性を向上させるために、破過はできる限り鋭いことが重要である）。試験の出力は、所定の低い破過レベル（通常１０％未満、好ましくは約１から約５％）での破過時間と、破過フロントの広さ（通常、５０％破過に対する、５％破過から９５％破過までの時間によって測定される）である。この試験は、本明細書で説明したような８層積層ディスク装置の１層での欠陥を検知することが可能である。一体型の膜および装置については、低いレベルの破過は、極めて鋭い。欠陥が存在するとき、早すぎる破過が生じ、それによって低いレベルの破過時間が減少し、いくつかの例では、破過フロントの広さに不利な影響を与える。データをプロットすることによって、欠陥が存在するかを見つけることができる。
【００６０】
図８は、本発明の膜を有する上記で説明した８層積層ディスク構成を使用して、本完全性試験によって得られたプロットの例を示している。攻撃溶液は、ｐＨ８．０での２．５ｍＭトリス緩衝液中の５０マイクログラム／ｍｌのトシルグルタミン酸から成る。曲線１００は、一体型膜の破過曲線を示している。鋭い、連続した溶質破過が、約１６０秒の開始時間で生じていることに留意されたい。曲線１０２は、最上部の膜層に意図的に誘発された欠陥を有する８層の装置を示している。１０２で見られるように、トシルグルタミン酸の早すぎる破過が観察され、約１２０秒の破過時間で生じている。この早すぎる破過は、膜吸着器内のある流路のイオン交換能力が、他の流路よりも早く使い果たされる（すなわち、７つの膜層しか横切らない流路対８つの膜層すべてを横切る流路）ために生じる。吸着床の残りの部分は、１６０秒の時間枠内で使い果たされる。小さな欠陥の存在を検知するための感受性は、以下のことによって強化することができることに留意されたい。
【００６１】
（ａ）より一様な流れ特性を有する膜（高いＰｅ数を有する膜）を用いること、これは、たとえばＤｕｒａｐｏｒｅ膜のような極めて狭い孔径分布の膜を使用することによって得ることができる。膜が、破過曲線調査を達成できる最大の鋭さを本質的に決定するため、これは好ましい方法である。以下で説明する方法は、膜吸着器が装置内に配置されたとき生じる、観測可能な破過曲線の鋭さの減少を最小化することしかできない。
【００６２】
（ｂ）溶質の吸着が、さらに、吸着等温線（ラングミュア動力学を振舞う吸着等温線に対して）の非線形部分にあるように、溶質攻撃条件を変更すること（すなわち、溶質濃度を増加させること）。
【００６３】
（ｃ）溶質および検知システムを、より低い溶質濃度をより容易に検知できるように変更すること。
【００６４】
（ｄ）より良好な流れ分布特性を有するように装置を構成すること。
【００６５】
［例］
［例１］
トシルグルタミン酸の破過曲線が、３つの異なる膜吸着器、８層の正帯電された０．６５μｍ  Ｄｕｒａｐｏｒｅ膜（発明と記載）と、２つの他の市販されている膜吸着器（６０層の膜を含む膜Ｘと、３層の膜を含む膜Ｙと記載）とで作製された３．５ｃｍ２装置で測定された。すべての膜吸着器が、良好な流れ分布特性を有するように構成されたハウジング内で試験された。装置は、最初に、装置を完全に濡らして、結果に負の影響を与えるあらゆる潜在する溜まった空気も除去するためにＤＩ水を勢いよく流された。次に、膜吸着器が、ｐＨ８．０、約２０ｍＬの２．５ｍＭトリス緩衝液を勢いよく流された。緩衝液の平衡化後、膜吸着器は、次に、ｐＨ８．０、２．５ｍＭトリス中の５０μｇ／ｍｌの濃度のトシルグルタミン酸を攻撃された。結果として得られた破過曲線が、図９に示されている。図で見られるように、本発明の膜吸着器は、約４０００のＰｅ数（上記の等式（１）で測定したように）で、極めて鋭い破過を示した。膜Ｘおよび膜Ｙは、それぞれ１００および２０程度の測定Ｐｅ数で、ずっと広がった破過を示した。これらのデータは、Ｄｕｒａｐｏｒｅ膜に固有の流れ特性が、他の試験された膜吸着器よりもずっと良好であることを示している。このことは２つの重要な意味を有する。第１に、微量不純物の除去が、Ｄｕｒａｐｏｒｅ膜吸着器によってより活発になることが予想される。実際、ウイルス除去データ（例２で示される）は、この膜吸着器が、１秒未満の滞留時間で５ＬＲＶを超えるウイルスを除去することが可能であることを示している。第２に、微量不純物の保持に負の影響を与える可能性がある欠陥の存在は、Ｄｕｒａｐｏｒｅ膜吸着器で検知するのがかなり容易である。Ｄｕｒａｐｏｒｅ膜吸着器は、完全性試験をより容易に行うことができ、ウイルス検証実験にかなり役立つ。
【００６６】
［例２］
８層の正に帯電された０．６５μｍ  Ｄｕｒａｐｏｒｅ膜で作製されている４つの異なる３．５ｃｍ２膜吸着器が、φＸ−１７４、２８ｎｍ直径バクテリオファージで攻撃された。実験結果（図示せず）は、バクテリオファージが、微量レベルの哺乳類ウイルスを除去するための膜吸着器の能力を理解するための優れたマーカーであることを示している。装置は、最初に、装置を完全に濡らして、結果に負の影響を与えるあらゆる潜在する溜まった空気も除去するためにＤＩ水を勢いよく流された。次に、膜吸着器が、ｐＨ８．０、約２０ｍＬの２５ｍＭトリス緩衝液を勢いよく流された。緩衝液の平衡化後、膜吸着器は次に、ｐＨ８．０、２５ｍＭトリス中の３００ｍＬの１．５×１０７ｐｆｕ／ｍＬ  φＸ−１７４を攻撃された。４つの装置はそれぞれ、異なる流速で攻撃された（１０、２０、４０、または６０ｍＬ／分のいずれか）。バクテリオファージで攻撃した後、供給部および廃液だめのサンプルについて、バクテリオファージ濃度が検査された。最後に、バクテリオファージＬＲＶ値が、ｌｏｇ１０（供給部濃度／廃液濃度）として計算された。バクテリオファージＬＲＶが、図１０に、攻撃線形速度の関数としてプロットされた。図に見られるように、ウイルス除去は、常に５ＬＲＶよりも大きい。この結果は、本質的に流速と無関係である。６０ｍＬ／分の流速（約１０５０ｃｍ／時の線形速度）で、膜吸着器内での溶液の滞留時間は、０．３５秒程度のであることに留意されたい。これらのデータは、ウイルス除去に負の影響を与える可能性がある最小の質量移動および動力学的限界が存在することを示している。これらのデータはまた、この特定の膜の固有の分布特性が極めて良好であることを示している。
【００６７】
［例３］
トシルグルタミン酸破過曲線が、様々な層数の正に帯電された０．６５μｍ  Ｄｕｒａｐｏｒｅ膜（１、３、５、７および８層）から成る、５つの異なる膜吸着器で測定された。膜吸着器は、最初に、装置を完全に濡らして、結果に負の影響を与えるあらゆる潜在する溜まった空気も除去するためにＤＩ水を勢いよく流された。次に、膜吸着器は、ｐＨ８．０、約２０ｍＬの２．５ｍＭトリス緩衝液を勢いよく流された。緩衝液の平衡化後、膜吸着器は、次に、ｐＨ８．０、２．５ｍＭトリス中の５０μｇ／ｍｌの濃度のトシルグルタミン酸で攻撃された。膜吸着器のＰｅ数が、（上記で説明したように）１０％、５０％、および９０％破過時間に基づいて計算された。データを以下に表にした。添付の表に見られるように、測定Ｐｅ数のすべてが極めて高く、この膜吸着器の極めて良好な流れ分布特性を示している。このことは、１層の装置のＰｅ数が５００よりも大きいという事実でさらに強調されている。これらのデータに基づいて、この膜が、微量不純物除去用の膜吸着器として使用するための理想的な候補となることが期待される。
【表１】
2005508249.tif 000005
【００６８】
［例４］
異なる層数の正に帯電された０．６５μｍ  Ｄｕｒａｐｏｒｅ膜の膜層で作製されている７つの異なる３．５ｃｍ２膜吸着器が、φＸ−１７４、２８ｎｍ直径バクテリオファージで攻撃された。装置は、最初に、装置を完全に濡らして、結果に負の影響を与えるあらゆる潜在する溜まった空気も除去するためにＤＩ水を勢いよく流された。次に、膜吸着器が、ｐＨ８．０、約２０ｍＬの２５ｍＭトリス緩衝液を勢いよく流された。緩衝液の平衡化後、膜吸着器は、次に、流速２０ｍＬ／分で、ｐＨ８．０、２５ｍＭトリス中の３００ｍＬの１．５×１０７ｐｆｕ／ｍＬ  φＸ−１７４で攻撃された。バクテリオファージで攻撃された後、供給部および廃液だめのサンプルについて、バクテリオファージ濃度が検査された。最後に、バクテリオファージＬＲＶ値が、ｌｏｇ１０（供給部濃度／廃液濃度）として計算された。バクテリオファージＬＲＶが、図１１に、膜吸着層数の関数としてプロットされた。図に見られるように、３膜層よりも多い膜層を含む装置については、ウイルス除去は、常に５ＬＲＶよりも大きい。この結果は、高い膜Ｒｅ数によるものであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】一連のＰｅ値のグラフを示す図である。
【図２】本発明の第１の実施形態による本発明の装置の切断図である。
【図３】本発明の第１の実施形態による本発明の装置の一部分の分解図である。
【図４】本発明の第２の実施形態による本発明の装置の分解図である。
【図５】本発明の実施形態の１つで有用なディスクの平面図である。
【図６】図３の実施形態による装置、および該装置を通る流体流路の代表的な断面図である。
【図７】図３の実施形態による装置および図６の装置を通る流体流路の代表的な断面詳細図である。
【図８】一体型の膜パケット、および弱められた１つの層を有する膜パケットによって得られたＰｅ値を示す図である。
【図９】現在市販されている吸着膜に対するＰｅデータのグラフである。
【図１０】線形攻撃速度の関数としてプロットされたバクテリオファージＬＲＶを示す図である。
【図１１】膜吸着層の数の関数としてプロットされたバクテリオファージＬＲＶを示す図である。
【図１】
2005508249.tif 000006
【図２】
2005508249.tif 000007
【図３】
2005508249.tif 000008
【図４】
2005508249.tif 000009
【図５】
2005508249.tif 000010
【図６】
2005508249.tif 000011
【図７】
2005508249.tif 000012
【図８】
2005508249.tif 000013
【図９】
2005508249.tif 000014
【図１０】
2005508249.tif 000015
【図１１】
2005508249.tif 000016
【国際公開パンフレット】
2005508249.tif 000017
2005508249.tif 000018
2005508249.tif 000019
2005508249.tif 000020
2005508249.tif 000021
2005508249.tif 000022
2005508249.tif 000023
2005508249.tif 000024
2005508249.tif 000025
2005508249.tif 000026
2005508249.tif 000027
2005508249.tif 000028
2005508249.tif 000029
2005508249.tif 000030
2005508249.tif 000031
2005508249.tif 000032
2005508249.tif 000033
2005508249.tif 000034
2005508249.tif 000035
2005508249.tif 000036
2005508249.tif 000037
2005508249.tif 000038
2005508249.tif 000039
2005508249.tif 000040
2005508249.tif 000041
2005508249.tif 000042
2005508249.tif 000043
2005508249.tif 000044
2005508249.tif 000045
2005508249.tif 000046
2005508249.tif 000047
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005508249.tif 000048
2005508249.tif 000049
【国際調査報告】
2005508249.tif 000050
2005508249.tif 000051
2005508249.tif 000052
2005508249.tif 000053