(57)【要約】  本発明は、ダプトマイシン生合成遺伝子クラスターの全てまたは一部分を含む核酸分子を提供する。ダプトマイシン生合成遺伝子クラスターは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、好ましくは、Ｓ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ由来であり得る。本発明はまた、Ｓ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ由来の他の核酸分子を提供する。本発明はさらに、核酸分子によってコードされたポリペプチド、ポリペプチドに特異的に結合する抗体、ならびに核酸分子を使用する方法、ダプトマイシンおよび他の化合物を産生するためのポリペプチドおよび抗体を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ由来の、ダプトマイシン非リボソームペプチドシンセターゼ（ＮＲＰＳ）またはそのサブユニットをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子であって、該核酸分子がＤｐｔＢＣをコードし、さらに該核酸分子がｐＲＨＢ１５９でない、単離された核酸分子。
【請求項２】
前記核酸分子が、配列番号１１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記核酸分子がｄｐｔＢＣであるか、または、該核酸分子が配列番号１２の核酸配列を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記核酸分子が、Ｓ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ由来の核酸配列、ＢＡＣクローン  Ｂ１２：０３Ａ０５由来の核酸配列を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項５】
ダプトマイシンＮＲＰＳまたはそのサブユニットをコードする単離された核酸分子であって、該単離された核酸分子が、ダプトマイシンＮＲＰＳまたはそのサブユニットをコードする参照核酸分子と選択的にハイブリダイズし、該参照核酸分子が、以下：
（ａ）ｄｐｔＢＣの核酸配列；
（ｂ）ＤｐｔＢＣのアミノ酸配列をコードする核酸配列；
（ｃ）配列番号１１のアミノ酸をコードする核酸配列；および
（ｄ）配列番号１２の核酸配列；
からなる群より選択される核酸配列を含み、
ここで該核酸分子がｐＲＨＢ１５９でない、単離された核酸分子。
【請求項６】
前記核酸分子が、低度にストリンジェントな条件、中度にストリンジェントな条件および高度にストリンジェントな条件からなる群より選択される条件下でハイブリダイズする、請求項５に記載の単離された核酸分子。
【請求項７】
ダプトマイシンＮＲＰＳまたはそのサブユニットをコードする単離された核酸分子であって、該核酸分子が、以下：
（ａ）ｄｐｔＢＣの核酸配列；
（ｂ）ＤｐｔＢＣのアミノ酸配列をコードする核酸配列；
（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列をコードする核酸配列；および
（ｄ）配列番号１２の核酸配列；
からなる群より選択される核酸配列と、少なくとも５０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、
ここで該核酸分子がｐＲＨＢ１５９でない、単離された核酸分子。
【請求項８】
前記相同性分子が、（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つの核酸配列に対して、少なくとも６０％の配列同一性を示す、請求項７に記載の核酸分子。
【請求項９】
前記配列同一性が少なくとも７０％である、請求項８に記載の核酸分子。
【請求項１０】
前記配列同一性が少なくとも８０％である、請求項９に記載の核酸分子。
【請求項１１】
前記配列同一性が少なくとも９０％である、請求項１０に記載の核酸分子。
【請求項１２】
前記配列同一性が少なくとも９５％である、請求項１１に記載の核酸分子。
【請求項１３】
ダプトマイシンＮＲＰＳまたはそのサブユニットをコードする単離された核酸分子であって、該単離された核酸分子が、以下：
（ａ）ｄｐｔＢＣの核酸配列；
（ｂ）ＤｐｔＢＣのアミノ酸配列をコードする核酸配列；
（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列をコードする核酸配列；および
（ｄ）配列番号１２の核酸配列、
からなる群より選択される核酸配列を含む、核酸分子の対立遺伝子の改変体である、単離された核酸分子。
【請求項１４】
核酸配列の一部分を含む単離された核酸分子であって、該部分が以下：
（ａ）配列番号１１のアミノ酸５００３〜５００７を含むポリペプチドの前記アミノ酸配列をコードする核酸配列；および
（ｂ）配列番号１２のヌクレオチド６８３５０〜６８３６４を含む核酸配列；
からなる群より選択される少なくとも１４個のヌクレオチドであり、
ここで該核酸分子がｐＲＨＢ１５９でない、単離された核酸分子。
【請求項１５】
前記核酸分子が、ダプトマイシンＮＲＰＳ由来の少なくとも１個のドメインをコードする、請求項１４に記載の単離された核酸分子。
【請求項１６】
前記核酸分子が、ダプトマイシンＮＲＰＳ由来の少なくとも１個のモジュールをコードする、請求項１４に記載の単離された核酸分子。
【請求項１７】
前記部分が、前記核酸配列の少なくとも１７個のヌクレオチドを含む、請求項１４に記載の核酸分子。
【請求項１８】
前記部分が、前記核酸配列の少なくとも２０個のヌクレオチドを含む、請求項１７に記載の核酸分子。
【請求項１９】
前記部分が、前記核酸配列の少なくとも２５個のヌクレオチドを含む、請求項１８に記載の核酸分子。
【請求項２０】
前記部分が、前記核酸配列の少なくとも５０個のヌクレオチドを含む、請求項１９に記載の核酸分子。
【請求項２１】
請求項１４〜請求項２０のいずれか１項に記載の核酸分子であって、ヌクレオチド長が１４〜６０個のオリゴヌクレオチドである、核酸分子。
【請求項２２】
請求項１〜請求項２１のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項２３】
前記ベクターが、前記核酸分子の転写を制御する発現制御配列を含む、請求項２２に記載のベクター。
【請求項２４】
前記発現制御配列が、原核細胞内での前記核酸分子の発現を制御する、請求項２３に記載のベクター。
【請求項２５】
請求項１〜請求項２１のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、宿主細胞。
【請求項２６】
請求項２２〜請求項２４のいずれか１項に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２７】
ＤｐｔＢＣ、またはそのドメイン、モジュールもしくは部分を産生する方法であって、前記ポリペプチドが産生される条件下で、請求項２５または請求項２６に記載の宿主細胞を培養する工程を包含し、該ポリペプチドを単離する工程を任意に包含する、方法。
【請求項２８】
単離されたポリペプチドであって、以下：
（ａ）ｄｐｔＢＣの核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
（ｂ）ＤｐｔＢＣのアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列；および
（ｄ）配列番号１２の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項２９】
請求項１〜請求項１３のいずれか１項に記載の核酸分子によってコードされる、単離されたポリペプチド。
【請求項３０】
請求項１４〜請求項２１のいずれか１項に記載の核酸分子によってコードされる、単離されたポリペプチド。
【請求項３１】
請求項２８〜請求項３０のいずれか１項に記載のポリペプチドと選択的に結合する、抗体。
【請求項３２】
請求項３１に記載の抗体であって、該抗体が、インタクトな免疫グロブリン；Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄＡｂもしくはＣＤＲフラグメントである抗原結合部分；単鎖抗体；キメラ抗体；二価抗体；または前記ポリペプチドに対する特異的な抗原結合を与えるに十分該免疫グロブリンの少なくとも一部分を含むポリペプチドである、抗体。
【請求項３３】
中和抗体である、請求項３２に記載の抗体。
【請求項３４】
活性化抗体である、請求項３２に記載の抗体。
【請求項３５】
モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、請求項３２に記載の抗体。
【請求項３６】
請求項２８〜請求項３０のいずれか１項に記載のポリペプチドと選択的に結合する抗体を調製する方法であって、以下の工程：
（ａ）該ポリペプチドにより、非ヒト動物を免疫する工程；および
（ｂ）該抗体を単離する工程、
を包含する、方法。
【請求項３７】
サンプルがダプトマイシンＮＲＰＳまたはダプトマイシンＮＲＰＳサブユニットをコードする核酸分子を含むか否かを決定する方法であって、以下の工程：
（ａ）請求項１〜請求項２１のいずれか１項に記載の核酸分子を提供する工程；
（ｂ）選択的なハイブリダイゼーション条件下で、該核酸分子を該サンプルと接触させる工程；および
（ｃ）該核酸分子が、該サンプル中の核酸分子と選択的にハイブリダイズしたか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項３８】
ダプトマイシンを産生する方法であって、以下の工程：
（ａ）宿主細胞内に、配列番号１を含む核酸分子を導入する工程；および
（ｂ）ダプトマイシンが産生される条件下で、該宿主細胞を培養する工程、
を包含する、方法。
【請求項３９】
前記核酸分子がＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ由来である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記核酸分子がＳ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ由来である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記核酸分子が、前記全ダプトマイシン生合成遺伝子クラスターを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記核酸分子が、ＤｐｔＡ、ＤｐｔＢＣまたはＤｐｔＤを含むペプチドをコードする、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
前記核酸分子が、配列番号９、配列番号１１および配列番号７からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記核酸分子が、ｄｐｔＡ、ｄｐｔＢＣおよびｄｐｔＤからなる群より選択される核酸配列を含むか、または該核酸分子が、配列番号１０、配列番号１２および配列番号３からなる群より選択される核酸配列を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
前記核酸分子が、ＢＡＣ  クローンＢ１２：０３Ａ０５由来のＳ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ由来の核酸配列を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４６】
請求項３８に記載の方法であって、前記核酸分子が、ダプトマイシン遺伝子クラスターまたはその部分をコードする参照核酸分子と選択的にハイブリダイズし、該参照核酸分子が、以下：
（ａ）ｄｐｔＡ、ｄｐｔＢＣおよびｄｐｔＤからなる群より選択される核酸配列；
（ｂ）ＤｐｔＡ、ＤｐｔＢＣおよびＤｐｔＤからなる群より選択されるポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列；
（ｃ）配列番号９、配列番号１１および配列番号７からなる群より選択されるポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列；
（ｄ）配列番号１０、配列番号１２および配列番号３からなる群より選択される核酸配列；
（ｅ）ＢＡＣ  クローンＢ１２：０３Ａ０５由来のＳ．ｒｅｓｅｏｓｐｏｒｕｓ核酸配列由来の核酸配列、
からなる群より選択される核酸配列を含む、方法。
【請求項４７】
請求項３８に記載の方法であって、さらに前記ダプトマイシンを単離する工程を包含する、方法。
【請求項４８】
細胞によってダプトマイシンの産生を増加させる方法であって、以下の工程：
（ａ）ダプトマイシンを発現する宿主細胞を提供する工程；
（ｂ）該宿主細胞の染色体の中性部分に核酸分子を導入する工程であって、該核酸分子の導入が、該核酸分子を含まない細胞と比較して、細胞によるダプトマイシンの産生を増加させる結果となる、工程；および
（ｃ）ダプトマイシンが産生される条件下で、該宿主細胞を培養する工程；
を包含し、
ここで、該核酸分子が、以下：
（ｉ）ｄｐｔＢＣの核酸配列；
（ｉｉ）ＤｐｔＢＣのアミノ酸配列をコードする核酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列をコードする核酸配列；および
（ｉｖ）配列番号１２の核酸配列、
からなる群より選択される核酸配列を含む、方法。
【請求項４９】
前記宿主細胞が、前記ダプトマイシン生合成遺伝子クラスターを含むＳ．ｒｅｓｅｏｓｐｏｒｕｓまたはＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
配列番号２４、配列番号５４、配列番号７４、配列番号９４、配列番号９８および配列番号１００からなる群より選択される核酸配列を含むか、または、配列番号９３、配列番号９７および配列番号９９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子であって、ここで、該核酸分子がｐＲＨＢ１６０、ｐＲＨＢ１６６、ｐＲＨＢ６１３、ｐＲＨＢ６１４またはｐＲＨＢ６８０でない、核酸分子。
【請求項５１】
配列番号９３、配列番号９７、および配列番号９９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、または、配列番号２４、配列番号５４、配列番号７４、配列番号９４、配列番号９８および配列番号１００からなる群より選択される核酸分子によってコードされる、ポリペプチド。
【請求項５２】
配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３および配列番号１３５からなる群より選択される核酸配列を含むか、または、配列番号１０４、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４および配列番号１３６からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子であって、ここで、該核酸分子がｐＲＨＢ１７４でない、核酸分子。
【請求項５３】
配列番号１０４、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４および配列番号１３６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、または、配列番号１０２、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３および配列番号１３５からなる群より選択される核酸分子によってコードされる、ポリペプチド。
【請求項５４】
請求項５１または請求項５３のいずれかに記載のポリペプチドに結合する、抗体。
【請求項５５】
リポペプチドまたはそのペプチドコアを産生する方法であって、以下の工程：
（ａ）細胞中に、ダプトマイシン生合成遺伝子クラスター以外のＮＲＰＳ遺伝子クラスターを含む細胞を提供する工程；
（ｂ）該ダプトマイシン生合成遺伝子クラスター由来のＮＲＰＳの全てまたは一部分をコードする、少なくとも１つの遺伝子を該細胞へ導入する工程；および
（ｃ）該リポペプチドまたはそのペプチドコアが産生される条件下で、該細胞を培養する工程、
を包含する、方法。
【請求項５６】
リポペプチドまたはそのペプチドコアを産生する方法であって、以下の工程：
（ａ）細胞内にダプトマイシン生合成遺伝子クラスターを含む細胞を提供する工程；
（ｂ）該ダプトマイシン生合成遺伝子クラスター以外のＮＲＰＳ遺伝子クラスター由来のＮＲＰＳの全てまたは一部分をコードする、少なくとも１つの他の遺伝子を該細胞内に導入する工程；および
（ｃ）該リポペプチドまたはそのペプチドコアが産生される条件下で、該細胞を培養する工程、
を包含する、方法。
【請求項５７】
前記ダプトマイシン生合成遺伝子クラスターが、該ダプトマイシン生合成遺伝子クラスターの天然に存在するヌクレオチド配列を含む、請求項５５または請求項５６のいずれかに記載の方法。
【請求項５８】
前記ダプトマイシン生合成遺伝子クラスターが、該ダプトマイシン生合成遺伝子クラスターの前記天然に存在するヌクレオチド配列と比較して、改変されたヌクレオチド配列を含む、請求項５５または請求項５６のいずれかに記載の方法。
【請求項５９】
前記改変されたヌクレオチド配列が、前記天然に存在するダプトマイシン生合成遺伝子クラスターのＮＲＰＳによってコードされるアミノ酸と比較して、該ダプトマイシン生合成遺伝子クラスターによってコードされるＮＲＰＳによって組み入れられた１またはそれ以上のアミノ酸を改変する、該ダプトマイシン生合成遺伝子クラスターの１またはそれ以上のモジュールの改変または置換を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記ダプトマイシン生合成遺伝子クラスター以外の前記ＮＲＰＳ遺伝子クラスターが、該ＮＲＰＳ遺伝子クラスターの天然に存在するヌクレオチド配列を含む、請求項５５または請求項５６のいずれかに記載の方法。
【請求項６１】
前記ダプトマイシン生合成遺伝子クラスター以外の前記ＮＲＰＳ遺伝子クラスターが、該ＮＲＰＳ遺伝子クラスターの天然に存在するヌクレオチド配列と比較して、改変されたヌクレオチド配列を含む、請求項５５または請求項５６のいずれかに記載の方法。
【請求項６２】
前記改変されたヌクレオチド配列が、前記天然に存在するＮＲＰＳ遺伝子クラスターのＮＲＰＳによってコードされるアミノ酸と比較して、該ＮＲＰＳ遺伝子クラスターによって組み入れられた１またはそれ以上のアミノ酸を改変する、該ＮＲＰＳ遺伝子クラスターの１またはそれ以上のモジュールの改変または置換を含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記ダプトマイシン生合成遺伝子クラスターが、該ダプトマイシン生合成遺伝子クラスターの天然に存在するヌクレオチド配列を含み、そして、該ダプトマイシン生合成遺伝子クラスター以外の前記ＮＲＰＳ遺伝子クラスターが、該ＮＲＰＳ遺伝子クラスターの天然に存在するヌクレオチド配列を含む、請求項５５または請求項５６のいずれかに記載の方法。
【請求項６４】
前記ダプトマイシン生合成遺伝子クラスターが、該ダプトマイシン生合成遺伝子クラスターの天然に存在するヌクレオチド配列と比較して、改変されたヌクレオチド配列を含み、そして、該ダプトマイシン生合成遺伝子クラスター以外の前記ＮＲＰＳ遺伝子クラスターが、該ＮＲＰＳ遺伝子クラスターの天然に存在するヌクレオチド配列と比較して、改変されたヌクレオチド配列を含む、請求項５５または請求項５６のいずれかに記載の方法。
【請求項６５】
前記ダプトマイシン生合成遺伝子クラスターの改変されたヌクレオチド配列および、その該ダプトマイシン生合成遺伝子クラスター以外の前記ＮＲＰＳ遺伝子クラスターが、前記天然に存在する遺伝子クラスターのＮＲＰＳによってコードされたアミノ酸と比較して、該ＮＲＰＳ遺伝子クラスターによって組み込まれた１またはそれ以上のアミノ酸を改変する該ダプトマイシン生合成遺伝子クラスターまたは、該ＮＲＰＳ遺伝子クラスター、の１またはそれ以上のモジュールの改変または置換を包含する、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
請求項５５または請求項５６のいずれかに記載の方法であって、さらに、前記ダプトマイシン生合成遺伝子クラスター以外のＮＲＰＳ遺伝子クラスター由来のＮＲＰＳの全てまたは一部分をコードする、少なくとも１個以上の遺伝子を前記細胞に導入する工程を包含する、方法。
【請求項６７】
請求項５５または請求項５６のいずれかに記載の方法であって、さらに、前記ダプトマイシン生合成遺伝子クラスター由来のＮＲＰＳの全てまたは一部分をコードする、少なくとも１個以上遺伝子を前記細胞に導入する工程を包含する、方法。
【請求項６８】
請求項５５または請求項５６のいずれかに記載の方法であって、さらに、前記リポペプチドまたはそのペプチドコアを単離する工程を包含する、方法。
【請求項６９】
請求項５５または請求項５６のいずれかに記載の方法によって産生される、細胞。
【請求項７０】
請求項５５または請求項５６のいずれかに記載の方法によって産生される、リポペプチドまたはそのペプチドコア。
【請求項７１】
リポペプチドまたはそのペプチドコアを産生する方法であって、以下の工程：
（ａ）細胞内にダプトマイシン生合成遺伝子クラスターを含む細胞を提供する工程；
（ｂ）該遺伝子クラスターによる組み込みに関する少なくとも１つのアミノ酸を改変するために、該ダプトマイシン生合成遺伝子クラスターの１またはそれ以上のモジュールを改変または交換する工程；
（ｃ）該ダプトマイシン生合成遺伝子クラスターまたは別のＮＲＰＳ遺伝子クラスター由来のＮＲＰＳの全てまたは一部分をコードする、少なくとも１つの他の遺伝子を細胞内に導入する工程；および
（ｄ）該リポペプチドまたはそのペプチドコアが産生される条件下で、該細胞を培養する工程、
を包含する、方法。
【請求項７２】
リポペプチドまたはそのペプチドコアを産生する方法であって、以下の工程：
（ａ）細胞中にＮＲＰＳ遺伝子クラスターを含む細胞を提供する工程；
（ｂ）細胞内に、ダプトマイシン生合成遺伝子クラスターを導入する工程；
（ｃ）該遺伝子クラスターによる組み込みに関する少なくとも１つのアミノ酸を改変するために、該ダプトマイシン生合成遺伝子クラスターの１またはそれ以上のモジュールを改変または交換する工程；および
（ｄ）該リポペプチドまたはそのペプチドコアが産生される条件下で、該宿主細胞を培養する工程、
を包含する、方法。
【請求項７３】
リポペプチドまたはそのペプチドコアを産生する方法であって、以下の工程：
（ａ）細胞内にＮＲＰＳ遺伝子クラスターを含む細胞を提供する工程；
（ｂ）細胞内にダプトマイシン生合成遺伝子クラスターを提供する工程；
（ｃ）該遺伝子クラスターによる組み込みに関する少なくとも１つのアミノ酸を改変するために、該ダプトマイシン生合成遺伝子クラスターの１またはそれ以上のモジュールを改変または交換する工程；
（ｄ）該細胞内に該改変されたダプトマイシン生合成遺伝子クラスターを導入する工程；および
（ｅ）該リポペプチドまたはそのペプチドコアが産生される条件下で、該宿主細胞を培養する工程、
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
細菌（放線菌を含む）および真菌は、多様な一群の低分子量ペプチド化合物および低分子量ポリケチド化合物（約２〜４８残基長）を合成する。これらの化合物の生合成は、非リボソーム性ペプチドシンテターゼ（ＮＲＰＳ）およびポリケチドシンターゼ（ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｅ）（ＰＫＳ）によって触媒される。ＮＲＰＳプロセスは、遺伝暗号によるリボソーム媒介ＲＮＡ翻訳を含まず、リボソームによってＲＮＡテンプレートから翻訳されたペプチドと比較して、非常に多数の構造的多様性を示すペプチドを産生し得る。これらとしては、Ｄ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸ならびにＤ−ヒドロキシ酸およびＬ−ヒドロキシ酸の取込み；直鎖状、環状または分岐のある環状の構造を形成する、ペプチド骨格内でのバリエーション；ならびにさらなる構造的改変（酸化、アシル化、グリコシル化、Ｎ−メチル化および複素環式環形成を包含する）が挙げられる。有用な薬理学的特性（例えば、抗生物質性、抗ウイルス性、抗真菌性、駆虫性、シデロフォア性、細胞増殖抑制性、免疫抑制性、抗コレステロール血症性および抗癌性）、農芸化学的特性または物理化学的特性（例えば、バイオサーファクタント特性）を有する、リボソームによらず合成された多くのペプチドが見出されている。
【０００２】
リボソームによらず合成されたペプチドは、１以上のサブユニットを含む、大きな（例えば、約２００〜２０００ｋＤａ）多機能性ＮＲＰＳ酵素複合体によって組み立てられる。例としては、ダプトマイシン、バンコマイシン、エチノカンジンおよびシクロスポリンが挙げられる。同様に、ポリケチドは、１以上のサブユニットを含む、大きな多機能性ＰＫＳ酵素複合体によって組み立てられる。例としては、エリスロマイシン、タイロシン、モネンシンおよびアベルメクチン（ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎ）が挙げられる。いくつかの例では、複合体分子は、混合ＰＫＳ／ＮＲＰＳ系によって合成され得る。例としては、ラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎ）、ブレオマイシンおよびエポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）が挙げられる。
【０００３】
ＮＲＰＳは、通常、ＮＲＰＳ複合体を構成する１以上のオープンリーディングフレームからなる。ＮＲＰＳ複合体は、タンパク質テンプレートとして作用し、このタンパク質テンプレートは、一連のタンパク質生合成単位を含み、このタンパク質生合成単位は、特定の構築ブロック基質に結合してこれを活性化し、そしてペプチド鎖形成およびペプチド鎖伸長を触媒するように構成されている。（例えば、ＫｏｎｚおよびＭａｒａｈｉｅｌ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６，３９−４８頁（１９９９）およびその中で引用される参考文献；ｖｏｎ  Ｄｏｅｈｒｅｎら，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６，２７３−２７９頁（１９９９）およびその中で引用される参考文献；ならびにＣａｎｅおよびＷａｌｓｈ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６，３１９−３２５頁（１９９９）およびその中で引用される参考文献を参照のこと−各々は、その全体が、本明細書中に参考として援用される）。各ＮＲＰＳまたはＮＲＰＳサブユニットは、１以上のモジュールを含む。「モジュール」は、単一の構築ブロック（例えば、アミノ酸）を、成長中のペプチド鎖へと取り込ませる触媒単位として定義される。ＮＲＰＳタンパク質テンプレートを形成する生合成モジュールの順序および特異性は、最終的なペプチド産物の配列および構造を指示する。
【０００４】
ＮＲＰＳの各モジュールは、ペプチド鎖伸長に必要とされる特異的反応を触媒することを担う、別個の折り畳まれたタンパク質ドメインを含む、半自律活性部位として作用する。最小のモジュール（単一のモジュール複合体における）は、以下の少なくとも２つのコアドメインからなる：１）アミノ酸（または時には、ヒドロキシ酸）を活性化することを担う、アデニル化ドメイン；および２）酵素に結合したパンテテイン補因子へと活性化中間体を転移させることを担う、チオール化ドメインまたはアシルキャリアドメイン。大部分のモジュールはまた、以下を含む：３）活性化中間体の間でのペプチド結合形成を触媒することを担う縮合ドメイン。図９を参照のこと。これらの３つのコアドメインを補充するのは、例えば、結合したアミノ酸中間体のＮメチル化（Ｍまたはメチル化ドメイン）およびＬ体からＤ体への変換（Ｅまたはエピマー化ドメイン）、ならびに複素環式環形成（Ｃｙまたは環化ドメイン）を媒介し得る、変動する数のさらなるドメインである。これらのドメインは通常、特定のアミノ酸モチーフまたは特徴によって特徴付けられる。これは、ＮＲＰＳおよび混合ＮＲＰＳ／ＰＫＳ酵素複合体によって組立てられる、成熟ペプチド産物の多数の構造的多様性および機能的多様性に寄与する、近傍のモジュール内に係留された中間体に対して局所的に作用する、このような補助的なドメインの組合せである。
【０００５】
各最小モジュールのアデニル化ドメインは、同属アミノ酸の特異的認識および特異的活性化を触媒する。非リボソーム性ペプチド生合成のこの初期工程では、各ＮＲＰＳモジュールの同属アミノ酸は、アデニル化ドメインに結合され、そして不安定なアシルアデニレート（付随したＡＴＰ加水分解を伴う）として活性化される。例えば、Ｓｔａｃｈｅｌｈａｕｓら，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．６：４９３−５０５（１９９９）およびＣｈａｌｌｉｓら，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．７：２１１−２２４（２０００）を参照のこと（各々、その全体が本明細書中に参考として援用される）。大部分のＮＲＰＳモジュールでは、アシルアデニレート中間体は、次に、このモジュールのＴ（チオール化）ドメイン（ペプチジルキャリアタンパク質またはＰＣＰドメインともいわれる）へと転移され、ここで、この中間体は、チオエステル中間体へと変換され、そしてトランスチオール化反応を介して、共有結合した酵素補因子（４’−ホスホパンテテイニル（４’−ＰＰ）中間体）へと係留される。Ｄ配置のアミノ酸またはＮ−メチル化アミノ酸を取込むことを担うモジュールは、余分の改変ドメインを有し得、この改変ドメインは、研究されたいくつかのＮＲＰＳでは、ＡドメインとＴドメインとの間に位置する。
【０００６】
次いで、各モジュール中の、酵素に結合した中間体は、例えば、中間体がＮＲＰＳへと共有結合したままでの、次のモジュール中の次のアミノ酸の隣接したアミノ基への、１つのモジュール中の１つの残基のチオエステル活性化カルボキシル基の転移を含む段階的縮合反応によって組立てられてペプチド産物となる。各縮合反応は、２つの最小モジュールの間に通常位置する、縮合（Ｃ）ドメインによって触媒される。ＮＲＰＳ中の縮合ドメインの数は、一般に、最終的な（直鎖状）ペプチド中のペプチド結合の数に対応する。余分のＣドメインは、ペプチド鎖終結および環化反応に関与することが提唱されているいくつかのＮＲＰＳ中に見出されている（例えば、シクロスポリンシンテターゼのアミノ末端で、およびラパマイシンのカルボキシル末端で；例えば、ＫｏｎｚおよびＭａｒａｈｉｅｌ，前出を参照のこと）。しかし、多くの他のＮＲＰＳ複合体は、（約２８Ｋ〜３５Ｋの相対分子量の）Ｃ末端チオエステラーゼ（Ｔｅ）ドメインによって触媒される反応において全長鎖を遊離する。
【０００７】
大部分のＮＲＰＳ複合体のチオエステラーゼドメインは、ヒスチジンおよび酸性残基に対して保存された三次元配置において、保存されたセリン（それほど頻繁ではないが、システインまたはアスパルテート）残基を含む、触媒性３つ組（周知のキモトリプシン機構の触媒性３つ組と類似する）を使用する。例えば、Ｖ．Ｄｅ  Ｃｒｅｃｙ−Ｌａｇａｒｄ、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第４巻，Ｊ．Ｗ．Ｋｅｌｌｙ編（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ），１９９９，２２１−２３８頁（各々、その全体が、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。チオエステル切断は、２工程プロセスである。第１（アシル化）工程では、全長ペプチド鎖は、チオール化ドメイン中のチオール係留酵素中間体（上記を参照のこと）から、Ｔｅドメイン中の保存されたセリン残基へと転移されて、アシル−Ｏ−Ｔｅエステル中間体を形成する。第２（脱アシル化）工程では、Ｔｅドメインセリンエステル中間体は、エステル中間体が水によって攻撃される（加水分解）か、または活性化分子内求核剤によって攻撃される（環化）かに依存して、加水分解される（それによって、直鎖状の全長産物を遊離する）か、または環化を受けるかのいずれかである。
【０００８】
ＮＲＰＳスーパーファミリーの多様なメンバー由来のＣ末端チオエステラーゼドメインの配列比較は、しばしば、保存されたセリン残基の約２５アミノ酸下流にアスパラギン酸残基が続く、セリン触媒性残基（ＧＸＳＸＧモチーフ）を含む、保存されたモチーフを明らかにした。第２の型のチオエステラーゼ（遊離のチオエステラーゼ酵素）は、いくつかのペプチド二次代謝産物およびポリケチド二次代謝産物の生合成に関与することが公知である。例えば、ＳｃｈｎｅｉｄｅｒおよびＭａｒａｈｉｅｌ，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１６９，４０４−４１０頁（１９９８）、ならびにＢｕｔｌｅｒら，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６，８７−２９２頁（１９９９）（各々、その全体が、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。これらのチオエステラーゼはしばしば、効率的な天然の産物の合成に必要とされる。Ｂｕｔｌｅｒらは、ポリケチドタイロシン遺伝子クラスター中に見出される遊離のチオエステラーゼ（これは、効率的なタイロシン産生に必要とされる）が、編集機能およびプルーフリーディング機能に関与し得ると仮定した。
【０００９】
ＮＲＰＳ多酵素複合体のモジュール編成は、これらのモジュールをコードするゲノムＤＮＡのレベルに反映される。いくつかの異なるＮＲＰＳをコードする遺伝子の編成およびＤＮＡ配列が研究されている。（例えば、その全体が本明細書中に参考として援用される、Ｍａｒａｈｉｅｌ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４，５６１−５６７頁（１９９７）を参照のこと）。ＮＲＰＳの特定の機能的ドメインを特徴付ける保存された配列が、多くの多様な生物に由来するＮＲＰＳ配列を比較することによって同定されており、これらの保存された配列モチーフを用いて、新たなＮＲＰＳ遺伝子およびモジュールを同定および単離するために有用なプローブが設計されている。
【００１０】
ＰＫＳ酵素複合体およびＮＲＰＳ酵素複合体のモジュラー構造を利用し、インビボでの遺伝子操作および組換えによってモジュールの数および位置をＤＮＡレベルで変更することによって、新たな特異性を有する新規酵素を操作し得る。機能的ハイブリッドＮＲＰＳが、例えば、モジュール全体の融合に基づいて構築されている。例えば、それらの全体が本明細書中に参考として援用される、Ｇｏｋｈａｌｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４，４８２−４８５頁（１９９９）；Ｍｏｏｔｚら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９７，５８４８−５８５３頁（２０００）を参照のこと。組換え技術を用いて、異種のＰＫＳまたはＮＲＰＳ複合体に由来するドメインを好首尾に交換し得る。例えば、それらの全体が本明細書中に参考として援用される、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２５７，３０８−３１８頁（１９９８）；ＭｃＤａｎｉｅｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９６，１８４６−１８５１頁（１９９９）；米国特許第５，６５２，１１６号および同第５，７９５，７３８号；ならびに国際公開ＷＯ  ００／５６８９６を参照のこと。
【００１１】
アデニル化ドメインの基質結合ポケットを形成する残基を変更することによってモジュール内の新たな基質特異性を操作することもまた、記載されている。例えば、その全体が本明細書中に参考として各々援用される、ＣａｎｅおよびＷａｌｓｈ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６，３１９−３２５（１９９９）；Ｓｔａｃｈｅｌｈａｕｓら，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６，４９３−５０５（１９９９）；ならびにＷＯ  ００／５２１５２を参照のこと。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのペプチドシンテターゼＧｒｓＡアデニル化ドメイン（ＰｈｅＡ）（この構造は既知である）の配列と、原核生物および真核生物のＮＰＲＳ由来の１６０個の他のアデニル化ドメインの配列とを比較することによって、例えば、Ｓｔａｃｈｅｌｈａｕｓら（前出）およびＣｈａｌｌｉｓら，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，７，２１１−２２４頁（２０００）は、種々のアミノ酸基質に関するアデニル化（Ａ）ドメインサイン配列（遺伝暗号のコドンと類似する）を規定した。これらのサイン配列の収集物から、推定のＮＲＰＳ選択性付与コード（遺伝暗号と同様に縮重性を有する）が定式化された。
【００１２】
モジュールを付加、欠失もしくは交換することによって（または１以上のモジュール内でドメインを付加、欠失もしくは交換することによって）新たなモジュラーテンプレート構造および新たな基質特異性を有するＮＲＰＳを操作する能力は、変更された特性および潜在的に有利な特性を有する、新規ペプチドの産生を可能にする。エリスロマイシン前駆体（ＤＥＢＳ）を合成するＰＫＳを、ラパマイシンＰＫＳ（これは、選択的基質特異性をコードする）に由来する対応配列で置換することによって系統的に改変することによって、例えば、５０を超える新規ポリケチドを含むコンビナトリアルライブラリーを調製した。その全体が本明細書中に参考として各々援用される、例えば、ＷＯ  ００／６３３６１およびＭｃＤａｎｉｅｌら（１９９９）（前出）を参照のこと。
【００１３】
抗生物質および他の潜在的に毒性の化合物を産生する多数の細菌は、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）トランスポーターを合成する。ＡＢＣトランスポーターは、プロトン依存性膜内外電気化学的電位差を使用して、毒性の細胞代謝産物（例えば、抗生物質）を輸送し、そして環境から物質（例えば、鉄または他の金属）を取り込む。３つの型のＡＢＣトランスポーターおよび抗生物質耐性を担うポンプをコードする遺伝子が存在し、そしてこれらはしばしば、抗生物質産生生物中の生合成クラスターに関連付けられている（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒにおけるアクチノロジン（ａｃｔｉｎｏｒｈｏｄｉｎ）耐性）。例えば、本明細書中に参考として援用される、Ｍｅｎｄｅｚら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１５８：１−８（１９９８）を参照のこと。全て、ＷａｌｋｅｒのＡモチーフおよびＢモチーフを含むＡＴＰ結合領域を有する。同書。Ｉ型系は、親水性ＡＴＰ結合ドメインおよび疎水性内在性膜ドメインについての別個の遺伝子を含む。ＩＩＩ型系は、疎水性Ｎ末端および親水性のＡＴＰ結合Ｃ末端を有するタンパク質をコードする単一の遺伝子を含む。ＩＩ型トランスポーターは、疎水性ドメインを有さず、そして２セットのＷａｌｋｅｒモチーフをＡ：Ｂ：Ａ：Ｂの順序で有する。
【００１４】
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｌａｕｃｅｓｃｅｎｓの遺伝子（ＳｔｒＶ（ＰＩＲ登録番号Ｓ５７５６１）およびＳｔｒＷ（ＰＩＲ登録番号Ｓ５７５６２））は、ストレプトマイシン関連化合物に対する耐性に関連したＩＩＩ型トランスポーターをコードする。両方の遺伝子は、５’−ヒドロキシストレプトマイシン抗生物質生合成遺伝子クラスター内に存在する。例えば、本明細書中に参考として援用される、Ｂｅｙｅｒら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５０：７７５−８４（１９９６）を参照のこと。ドキソルビシンおよび関連の抗生物質に対する耐性は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ中の２つのＩ型トランスポーター（これらは、ｄｒｒＡおよびｄｒｒＢによってコードされる）によって付与される。例えば、本明細書中に参考として援用される、Ｇｕｉｆｏｉｌｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８５５３−５７（１９９１）を参照のこと。さらに、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｃｈｅｉから単離されたｄｒｒＡＢホモログは、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ中でアクチノロジンＰＫＳプロモーターの制御下で発現された場合、多剤耐性を付与する。例えば、本明細書中に参考として援用される、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｍｏｒｅｎｏら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：６９２９−３６（１９９８）を参照のこと。
【００１５】
ダプトマイシン（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，第２版，Ｗ．Ｒ．Ｓｔｒｏｈｌ編（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．），１９９７，４１５−４３５頁においてＲ．Ｈ．Ｂａｌｔｚによって記載される）は、ＮＲＰＳによって作製された、リボソームによらず合成されたペプチドの一例である。ダプトマイシン（ＬＹ１４６０３２としても公知）は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓの発酵によって産生される、環状のリポペプチド抗生物質である。ダプトマイシンは、Ｓ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓのＡ−２１９７８Ｃ因子型抗生物質のメンバーであり、そして３アミノ酸鎖を介して環状の１０アミノ酸ペプチドのＮ末端トリプトファンへと連結されたｎ−デカノイル側鎖を含む。この化合物は、治療選択肢が制限されている深刻な感染（例えば、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、バンコマイシン耐性腸球菌、糖ペプチド中間体感受性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌、およびペニシリン耐性Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを含むがこれらに限定されない細菌によって引き起こされる感染）を処置するための種々の処方物において開発されている。例えば、Ｔａｌｌｙら，Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ  ８：１２２３−１２３８，１９９９を参照のこと。グラム陽性細菌に対するダプトマイシンの抗生物質作用は、その膜電位妨害能力およびリポテイコ酸合成阻害能力に起因している。
【００１６】
ダプトマイシン生合成経路に関与するタンパク質（ダプトマイシンＮＲＰＳを含む）をコードする遺伝子の同定は、改善された抗生物質（例えば、より大きな効力を有する）を産生し得るか；天然もしくは新規の抗生物質を増大した量で産生し得るか；または有用な生物学的特性を有する他のペプチド産物を産生し得る、改変されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓおよび他の宿主株を生成する際の第一工程を提供する。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓダプトマイシン生合成遺伝子クラスターに関連する組成物および方法（単離された核酸および単離されたタンパク質を含む）は、米国仮出願第６０／２４０，８７９号（２０００年１０月１７日出願）；同第６０／２７２，２０７号（２００１年２月２８日出願）；および同第６０／３１０，３８５号（２００１年８月８日出願）（これらは全て、その全体が本明細書中に参考として援用される）に記載されている。
【００１７】
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓおよび異種の宿主における発現のための全長ダプトマイシンＮＲＰＳテンプレートを構築するために、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓのダプトマイシン生合成遺伝子クラスターの遺伝的編成およびモジュラー編成を同定することはさらに有利である。特に、ダプトマイシン遺伝子クラスターがチオエステラーゼ（Ｔｅ）ドメインを含むか否かを知ることは有利である。そうであれば、そのＴｅドメインが単離され得、そしてこれを用いて、融合体または遊離ペプチドとしての発現によって、新たなＮＲＰＳモジュールおよびテンプレートにおけるペプチド鎖終結が触媒され得る。例えば、それらの全体が本明細書中に参考として各々援用される、ｄｅ  Ｆｅｒｒａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，２５３０４−２５３０９頁（１９９７）；Ｇｕｅｎｚｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，１４４０３−１４４１０頁（１９９８）；およびＴｒａｕｇｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，４０７，２１５−２１８頁（２０００）を参照のこと。ダプトマイシン生合成に関与するポリペプチドをコードする他の核酸分子を同定することもまた有利である。これらとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：脂質テイルをダプトマイシンのペプチドドメインへと結合させることに関与する酵素、抗生物質耐性を調節するポリペプチド、およびＡＢＣトランスポーター。抗生物質耐性を調節するポリペプチドおよびＡＢＣトランスポーターを用いて、ダプトマイシンおよび関連の抗生物質に対する耐性を付与し得るか、またはダプトマイシンおよび関連の抗生物質に対する細菌の耐性を増大、改変もしくは低減し得る。抗生物質耐性に関与するポリペプチドもまた、ダプトマイシンおよび関連の抗生物質を改変して耐性細菌に対してこれらをより強力にし得るように、細菌の耐性機構を決定するに有用である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１８】
（発明の要旨）
本発明は、ダプトマイシン生合成遺伝子クラスター（好ましくはＳ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ由来のダプトマイシン生合成遺伝子クラスター）の全てまたは一部を含む核酸分子を提供することによってこれらの課題に取り組む。この核酸分子は、ＤｐｔＡ、ＤｐｔＢＣもしくはＤｐｔＤをコードし得るか、またはＳ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓのダプトマイシン生合成遺伝子クラスター由来のｄｐｔＡ遺伝子、ｄｐｔＢＣ遺伝子もしくはｄｐｔＤ遺伝子のうちの１以上を含み得る。
【００１９】
本発明はまた、ダプトマイシン生合成遺伝子クラスター由来の、遊離チオエステラーゼをコードする核酸分子および内在性チオエステラーゼをコードする核酸分子を提供する。この核酸分子は、ＤｐｔＨ、もしくはＤｐｔＤ由来のチオエステラーゼドメインをコードし得るか、またはダプトマイシン生合成遺伝子クラスター由来のｄｐｔＨ遺伝子もしくはｄｐｔＤ遺伝子を含み得る。
【００２０】
本発明の別の目的は、Ｓ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ由来の核酸配列を含む、細菌人工染色体由来のＤＮＡ配列を含む核酸分子を提供することである。この核酸分子は好ましくは、細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンＢ１２：０１Ｇ０５、Ｂ１２：０６Ａ１２、Ｂ１２：１２Ｆ０６、Ｂ１２：１８Ｈ０４、Ｂ１２：２０Ｃ０９またはＢ１２：０３Ａ０５のうちのいずれか１つ由来のＳ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ核酸配列を含む。（これらのうち、Ｂ１２：０３Ａ０５のみが寄託されている；ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３１４１（２００１年３月１日寄託）。好ましい実施形態では、この核酸分子は、ポリペプチドをコードする。別の好ましい実施形態では、この核酸分子は、本明細書中に記載されるような、ダプトマイシン生合成に関与するポリペプチド（例えば、ｄｐｔＡ、ｄｐｔＢＣ、ｄｐｔＤ、ｄｐｔＥ、ｄｐｔＦ、ｄｐｔＨ、ＡＢＣトランスポーター、または抗生物質耐性を調節するポリペプチド）をコードする。
【００２１】
本発明はまた、上記の核酸分子の、選択的にハイブリダイズする核酸分子または相同な核酸分子を提供する。本発明はさらに、対立遺伝子改変体およびそれらの一部分を提供する。本発明はさらに、上記の核酸分子の転写を制御する、１以上の発現制御配列を含む核酸分子を提供する。この発現制御配列は、ダプトマイシン生合成遺伝子クラスターの発現制御配列に由来し得るか、または異種の核酸配列に由来し得る。
【００２２】
別の実施形態では、本発明は、ダプトマイシン生合成遺伝子クラスター由来のチオエステラーゼおよび／またはダプトマイシンのＮＲＰＳをコードする核酸配列を含む遺伝子由来の１以上の発現制御配列を含む核酸分子を提供する。好ましくは、この核酸分子は、ダプトマイシンのＮＲＰＳまたはｄｐｔＨの発現制御配列の一部分または全てを含む。
【００２３】
本発明の別の目的は、上記の核酸分子のうちの１以上を含む、ベクターおよび／または宿主細胞を提供することである。好ましい実施形態では、このベクターおよび／または宿主細胞は、ＤｐｔＡ、ＤｐｔＢＣ、ＤｐｔＤ、ＤｐｔＥ、ＤｐｔＦおよび／もしくはＤｐｔＨの全てもしくは一部分、または上記のＢＡＣクローンの全てもしくは一部分をコードする核酸分子を含む。宿主細胞は、ＮＲＰＳまたはＰＫＳ（例えば、ダプトマイシンＮＲＰＳ）の全てまたは一部分を含み得る。この宿主細胞は、１以上のチオエステラーゼをさらに含み得る。
【００２４】
本発明の別の目的は、ダプトマイシン生合成遺伝子クラスター由来のポリペプチド（好ましくは、Ｓ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓのダプトマイシン生合成遺伝子クラスター由来のポリペプチド）を提供することである。このポリペプチドは、ＤｐｔＡ、ＤｐｔＢＣまたはＤｐｔＤであり得る。
【００２５】
本発明はまた、内在性チオエステラーゼまたは遊離チオエステラーゼ由来のポリペプチド（好ましくは、Ｓ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓのダプトマイシン生合成遺伝子クラスター由来のポリペプチド）を提供する。好ましい実施形態では、このポリペプチドは、チオエステラーゼに由来する。このポリペプチドは、ＤｐｔＨまたはＤｐｔＤ由来のチオエステラーゼドメインに由来し得る。
【００２６】
本発明はまた、ＢＡＣクローンＢ１２：０１Ｇ０５、Ｂ１２：０６Ａ１２、Ｂ１２：１２Ｆ０６、Ｂ１２：１８Ｈ０４、Ｂ１２：２０Ｃ０９またはＢ１２：０３Ａ０５のうちのいずれか１つの核酸分子によってコードされるポリペプチドを提供する。これらのポリペプチドとしては、とりわけ、脂質テイルをダプトマイシンのペプチドドメインへと結合させる際に関与する酵素、抗生物質耐性を調節するポリペプチド、およびＡＢＣトランスポーターが挙げられる。
【００２７】
本発明の別の目的は、上記のポリペプチドのフラグメントを提供することである。１つの実施形態では、このフラグメントは、本明細書中で定義されるような、少なくとも１つのドメインまたはモジュールを含む。別の実施形態では、このフラグメントは、このポリペプチドの少なくとも１つのエピトープを含む。
【００２８】
本発明の別の目的は、ダプトマイシンＮＲＰＳポリペプチド、チオエステラーゼおよび本明細書中に提供されるＢＡＣクローンの核酸分子によってコードされるポリペプチドの、変異体タンパク質、融合タンパク質、相同タンパク質または対立遺伝子改変体である、ポリペプチドを提供することである。
【００２９】
本発明はまた、抗体を提供し、この抗体は、ダプトマイシンＮＲＰＳのポリペプチド、ダプトマイシン生合成遺伝子クラスターのチオエステラーゼポリペプチドまたはＢＡＣクローンＢ１２：０１Ｇ０５、Ｂ１２：０６Ａ１２、Ｂ１２：１２Ｆ０６、Ｂ１２：１８Ｈ０４、Ｂ１２：２０Ｃ０９もしくはＢ１２：０３Ａ０５のうちのいずれか１つ由来の核酸分子によってコードされるポリペプチドに特異的に結合する。本発明はまた、抗体を提供し、この抗体は、上記のポリペプチドまたはタンパク質のうちのいずれか１つの、フラグメント、ポリペプチド変異体、融合タンパク質、対立遺伝子改変体によってコードされるポリペプチドまたは相同タンパク質に結合し得る。これらの抗体を用いて、本発明のポリペプチドの存在もしくは量を検出し得るか、またはポリペプチドの活性を阻害もしくは活性化し得る。
【００３０】
本発明の別の目的は、宿主細胞中に核酸分子を導入し、そしてポリペプチドを発現させることによって、本明細書中に記載される核酸分子を用いてこのポリペプチドを組換え産生するための方法を提供することである。
【００３１】
本発明はまた、本発明の核酸分子を用いて、本明細書中に記載される核酸分子と比較して類似または同一の核酸配列を有する核酸分子を検出または増幅するための方法を提供する。
【００３２】
これらの核酸分子およびポリペプチドは、例えば、天然の産物の生合成および産生のために、ならびに新規の化合物の操作された生合成のために、有用である。これらのダプトマイシンＮＲＰＳおよび／またはチオエステラーゼを用いて、ダプトマイシンおよび他のリポペプチド（天然に存在する化合物および新規の化合物の両方を含む）を産生し得る。これらのポリペプチドは、環状リポペプチドまたは非環状リポペプチド、ならびに非リボソーム性ペプチド合成によって産生される他の化合物の産生のためにインビトロで用いられ得る。あるいは、本発明の核酸分子は、宿主細胞中に導入されて発現され得、次いでこの宿主細胞を用いて、リポペプチドおよび非リボソーム性ペプチド合成によって産生される他の化合物を産生し得る。
【００３３】
本発明の別の目的は、非リボソーム性ペプチド合成によって新規の化合物を産生し得る、新規の遺伝子クラスターを提供することである。新規の遺伝子クラスターは、ダプトマイシン生合成遺伝子クラスターのヌクレオチドを変更して（特に、ダプトマイシンＮＲＰＳのヌクレオチド、ドメインまたはモジュールを変更して）、非リボソーム性ペプチド合成に関与する新たなポリペプチドを作製することによって入手され得る。このようにして、異なるアミノ酸は、天然に存在するポリペプチドによって産生されるペプチドではなく、非リボソーム性ペプチド合成によって産生されるペプチド中に取り込まれ得る。本発明はまた、本明細書中に記載される方法によって産生される化合物を包含する。
【００３４】
本発明の別の目的は、本発明の核酸配列およびアミノ酸配列を保存した、コンピュータ読み取り可能な手段を提供することである。コンピュータ読み取り可能な手段の記録は、配列の読み取りおよび提示のために、そして本発明の配列の他の配列に対する比較、アラインメントおよび順番付けのためにアクセスされ得る。
【００３５】
（発明の詳細な説明）
（定義および一般的用語）
本明細書中で他に定義しない限り、本発明に関連して用いられる科学用語および技術用語は、当業者によって通常理解される意味を有さねばならない。さらに、文脈によってそうではないことが必要とされない限り、単数形の用語は、複数形を包含しなければならず、そして複数形の用語は、単数形を包含しなければならない。一般に、本明細書中に記載される、細胞培養および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質化学および核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションに関連して用いられる命名法およびこれらの技術は、当該分野で周知で、かつ通常用いられるものである。本発明の方法および技術は、そうでないと示されない限り、一般に、当該分野で周知の従来方法に従って、そして本明細書全体に引用および考察される種々の一般的参考文献およびより具体的な参考文献に記載されるとおりに行われる。例えば、以下を参照のこと：Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２０００）；Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２、および２０００に対する増補）；Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第４版，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９９）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９８）；ならびにＴ．Ｋｉｅｓｅｒら，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｗｉｃｈ（２０００）；これらの各々は、その全体が、本明細書中に参考として援用される。
【００３６】
酵素反応および精製技術は、当該分野で一般に達成されるように、または本明細書中に記載されるように、製造業者の指示に従って実施される。本明細書中に記載される、分析化学、合成有機化学、ならびに医薬品化学および製薬化学に関連して用いられる命名法、ならびにこれらの実験手順および実験技術は、当該分野で周知であり、そして一般に用いられる。標準的な技術は、化学合成、化学分析、薬学的調製、処方、および送達、および患者の処置のために用いられる。
【００３７】
以下の用語は、そうでないと示されない限り、以下の意味を有すると理解されなければならない：
用語「チオエステラーゼ」とは、チオエステル結合の切断（これは、環状分子または直鎖状分子の産生をもたらし得る）を触媒し得る酵素をいう。
【００３８】
用語「チオエステラーゼ活性」とは、チオエステル結合の切断を触媒する、チオエステラーゼ（またはそのムテイン、相同タンパク質、アナログ、誘導体、融合タンパク質もしくはフラグメント）の酵素活性をいう。チオエステラーゼ活性は、例えば、結合定数および／または解離常数、触媒速度ならびに基質回転率を包含する。ポリペプチドのチオエステラーゼ活性は、ＤｐｔＨのチオエステラーゼ活性、ＤｐｔＤのチオエステラーゼドメインのチオエステラーゼ活性、ｄｐｔＨによってコードされるポリペプチドのチオエステラーゼ活性、ｄｐｔＤのチオエステラーゼドメインによってコードされるポリペプチドのチオエステラーゼ活性、配列番号７のチオエステラーゼドメインのアミノ酸配列を有するポリペプチドのチオエステラーゼ活性、または配列番号８のアミノ酸配列を有するポリペプチドのチオエステラーゼ活性のうちの１つと同じであり得る。このチオエステラーゼ活性はまた、上記のチオエステラーゼのうちの１つのチオエステラーゼ活性とは異なり得る；例えば、これは、増大または低下した触媒活性、異なる結合定数および／もしくは解離定数、または触媒作用に関して異なる基質を有し得る。「低減」または「増大」したチオエステラーゼ活性とは、それぞれ、このチオエステラーゼの低減した触媒活性または増大した触媒活性をいう。
【００３９】
「ダプトマイシン生合成遺伝子クラスター由来のチオエステラーゼ」は、ダプトマイシンの合成に関与するポリペプチドをコードする遺伝子クラスターの遺伝子のうちの１つによってコードされる、チオエステラーゼまたはチオエステラーゼドメインである。好ましくは、このチオエステラーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ由来のダプトマイシン生合成遺伝子クラスターに由来し、好ましくは、Ｓ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ由来のダプトマイシン生合成遺伝子クラスターに由来する。
【００４０】
「ダプトマイシン生合成遺伝子クラスター」は、生物における（好ましくは、細菌細胞における）ダプトマイシンの合成について必要である、多数のポリペプチドをコードする核酸分子と本明細書中で定義される。ダプトマイシン生合成遺伝子クラスターは、少なくとも、ＤｐｔＡ、ＤｐｔＢＣ、ＤｐｔＤおよびＤｐｔＨをコードする核酸分子、またはそれらのムテイン、相同タンパク質、対立遺伝子改変体もしくはフラグメントをコードする核酸分子、ならびに、ダプトマイシン合成に必要とされる他のポリペプチドをコードする他の核酸配列を含む。好ましくは、ダプトマイシン生合成遺伝子クラスターは、ＢＡＣ  Ｂ１２：０３Ａ０５のうちの、その部分が細菌細胞中に導入されて発現された場合に、ダプトマイシンの合成を可能にする部分を含む。
【００４１】
「ダプトマイシンＮＲＰＳ」は、適切な細菌細胞中でダプトマイシンを合成し得るＮＲＰＳと本明細書中で定義される。ダプトマイシンＮＲＰＳは、適切な細胞中で発現された場合に、ダプトマイシンの合成を指示し得る、ポリペプチドサブユニットＤｐｔＡ、ＤｐｔＢＣおよびＤｐｔＤ（またはそれらのムテイン、相同タンパク質、対立遺伝子改変体もしくはフラグメント）を包含する。ダプトマイシンＮＲＰＳは、ＤｐｔＨおよび／または他のポリペプチド（例えば、ＤｐｔＥまたはＤｐｔＦ）をさらに含み得る。好ましくは、このダプトマイシンＮＲＰＳは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ由来のダプトマイシン生合成遺伝子クラスターに由来し、より好ましくはダプトマイシンＮＲＰＳは、Ｓ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ由来する。用語「ダプトマイシンＮＲＰＳ」は、このダプトマイシンＮＲＰＳを用いて、ダプトマイシンのみを合成し得ることを意味しない。むしろ、本明細書中で用いられる場合、この用語は、このＮＲＰＳが、もともとダプトマイシン生合成遺伝子クラスターに由来したことを記載する目的のためにのみ用いられる。このダプトマイシンＮＲＰＳを用いて、本明細書中に記載されるように、ダプトマイシン以外の分子を合成し得る。
【００４２】
「遺伝子」は、ポリペプチドをコードする核酸配列およびそのポリペプチドをコードする核酸配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む核酸分子と定義される。例えば、遺伝子は、プロモーター、１以上のエンハンサー、ポリペプチドをコードする核酸配列、下流の調節配列、およびおそらく、ＲＮＡの発現の調節に関与する他の核酸配列を含み得る。
【００４３】
核酸分子またはポリペプチドは、その核酸分子もしくはポリペプチドが、特定の種から単離された場合、またはその核酸分子もしくはポリペプチドが、特定の種から単離された核酸分子もしくはポリペプチドに対して相同である場合、その特定の種に「由来」する。
【００４４】
用語「ｄｐｔＡ」、「ｄｐｔＢＣ」および「ｄｐｔＤ」とは、ダプトマイシンＮＲＰＳのサブユニットをコードする核酸分子をいう。好ましい実施形態では、この核酸分子は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓに由来し、より好ましくは、この核酸分子は、Ｓ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓに由来する。好ましい実施形態では、ｄｐｔＡ、ｄｐｔＢＣおよびｄｐｔＤは、それぞれ、配列番号９、配列番号１１および配列番号７のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。用語「ｄｐｔＡ」、「ｄｐｔＢＣ」および「ｄｐｔＤ」とはまた、これらの遺伝子の対立遺伝子改変体をいい、これらは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの他の種または他のＳ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ株から入手され得る。
【００４５】
用語「ｄｐｔＨ」とは、コードするドメインが、Ｓ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓのダプトマイシン生合成遺伝子クラスター由来のチオエステラーゼをコードする遺伝子であって、ここで、天然に存在するチオエステラーゼが、「遊離」チオエステラーゼである、遺伝子をいう。遊離チオエステラーゼは、天然に存在する場合、より大きなポリペプチドの機能的ドメインではないチオエステラーゼである。ｄｐｔＨ遺伝子はまた、以下で考察されるように、この遺伝子のコード領域の上流にある発現制御配列を包含する。１つの実施形態では、ｄｐｔＨのこの発現制御配列は、配列番号５の核酸配列を有する。用語「ｄｐｔＨ」とはまた、配列番号８によって規定されるポリペプチドをコードする核酸をいう。用語「ｄｐｔＨ」はまた、この遺伝子の対立遺伝子改変体をいい、これは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの他の種または他のＳ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ株から入手され得る。
【００４６】
用語「対立遺伝子改変体」とは、天然に存在する２以上の選択的形態の遺伝子のうちの１つであって、各対立遺伝子が、異なるヌクレオチド配列を保有するものをいう。対立遺伝子改変体は、同じポリペプチドまたは異なるポリペプチドをコードし得る。本明細書中で用いられる場合、対立遺伝子は、参考核酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有し、参照核酸分子によってコードされるポリペプチドと類似または同一の生物学的特性を有するポリペプチドをコードする、遺伝子である。
【００４７】
用語「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」とは、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドのいずれかのヌクレオチド、またはいずれかの型の改変形態のヌクレオチドの、少なくとも１０塩基長のポリマー形態をいう。この用語は、一本鎖形態のＤＮＡおよび二本鎖形態のＤＮＡを包含する。さらに、ポリヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオチド結合および／または天然に存在しないヌクレオチド結合によって一緒に連結された、天然に存在するヌクレオチドおよび改変ヌクレオチドのいずれかまたは両方を含み得る。
【００４８】
「単離された」または「実質的に純粋な」核酸またはポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡまたは混合ポリマー）は、その天然の宿主細胞においてネイティブポリヌクレオチドに自然に付随する他の細胞成分（例えば、リボソーム、ポリメラーゼ、または天然に会合しているゲノム配列）から実質的に分離されたものである。この用語は、以下の核酸またはポリヌクレオチドを包含する：（１）その天然に存在する環境から取り出された、核酸もしくはポリヌクレオチド、（２）「単離されたポリヌクレオチド」が自然で見出されるポリヌクレオチドの全てもしくは一部分と会合していない、核酸もしくはポリヌクレオチド、（３）自然では連結していないポリヌクレオチドに作動可能に連結されている、核酸もしくはポリヌクレオチド、または（４）より大きな配列の一部分として自然には生じない、核酸もしくはポリヌクレオチド。用語「単離された」または「実質的に純粋な」はまた、組換えＤＮＡ単離体もしくはクローン化ＤＮＡ単離体、化学的に合成されたポリヌクレオチドアナログ、または異種の系によって生物学的に合成されたポリヌクレオチドアナログを参照して用いられ得る。
【００４９】
核酸分子またはポリヌクレオチドの「一部分」とは、参照核酸分子の少なくとも１４ヌクレオチドの部分的な連続配列を含む核酸分子をいう。好ましくは、一部分は、参照核酸分子のうちの少なくとも１７ヌクレオチドまたは少なくとも２０ヌクレオチドを含む。より好ましくは、一部分は、参照核酸分子のうちの、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００または少なくとも１０００ヌクレオチドから、参照核酸分子より１ヌクレオチド短いものまでを含む。核酸分子の一部分は、他の核酸配列を含まなくてもよい。あるいは、核酸の一部分は、他の核酸分子由来の他の核酸配列を含み得る。
【００５０】
用語「オリゴヌクレオチド」とは、一般に、２００ヌクレオチド長以下を含むポリヌクレオチドをいう。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、１０〜６０ヌクレオチド長であり、最も好ましくは、１２ヌクレオチド長、１３ヌクレオチド長、１４ヌクレオチド長、１５ヌクレオチド長、１６ヌクレオチド長、１７ヌクレオチド長、１８ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、３０ヌクレオチド長、４０ヌクレオチド長、５０ヌクレオチド長または６０ヌクレオチド長である。オリゴヌクレオチドは、（例えば、プローブまたはプライマーとして使用するための）一本鎖であり得るか、または（例えば、変異体遺伝子の構築において使用するための）二本鎖であり得る。本発明のオリゴヌクレオチドは、センスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれかであり得る。オリゴヌクレオチドは、所望の場合、検出のための標識を含み得る。
【００５１】
本明細書中で言及される用語「天然に存在するヌクレオチド」は、天然に存在するデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを包含する。本明細書中で言及される用語「改変されたヌクレオチド」は、改変または置換された糖基などを有するヌクレオチドを包含する。本明細書中で言及される用語「ヌクレオチド結合」は、ヌクレオチド結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニラデエート、ホスホロアミデートなど）を包含する。例えば、ＬａＰｌａｎｃｈｅら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：９０８１（１９８６）；Ｓｔｅｃら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０６：６０７７（１９８４）；Ｓｔｅｉｎら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：３２０９（１９８８）；Ｚｏｎら，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ６：５３９（１９９１）；Ｚｏｎら，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，８７−１０８頁（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９１））；Ｓｔｅｃら，米国特許第５，１５１，５１０号；ＵｈｌｍａｎｎおよびＰｅｙｍａｎ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９０：５４３（１９９０）（これらの開示は、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【００５２】
そうでないと明記されない限り、センス方向のポリヌクレオチド配列の左側の末端は５’末端であり、そしてこの配列の右側の末端は３’末端である。さらに、センス配向のポリヌクレオチド配列の左側方向は５’方向といわれ、一方、このポリヌクレオチド配列の右側方向は３’方向といわれる。
【００５３】
核酸配列に関して、用語「配列同一性パーセント」または「同一の」とは、２つの配列中の、最大に対応するように整列した場合に同じである残基をいう。配列同一性比較の長さは、少なくとも約９ヌクレオチド、通常少なくとも約２０ヌクレオチド、より通常な少なくとも約２４ヌクレオチド、代表的には少なくとも約２８ヌクレオチド、より代表的には少なくとも約３２ヌクレオチド、そして好ましくは少なくとも約３６以上のヌクレオチドのストレッチにわたってであり得る。ヌクレオチド配列同一性を測定するために用いられ得る、当該分野で公知の多数の異なるアルゴリズムが存在する。１つの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、Ｂｌａｓｔ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）を用いて比較され得る。例えば、ポリヌクレオチド配列は、ＦＡＳＴＡ、ＧａｐまたはＢｅｓｔｆｉｔ（これらは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎにおけるプログラムである）を用いて比較され得る。ＦＡＳＴＡは、問合せ配列と検索配列との間での最良の重複領域のアラインメントおよび配列同一性パーセントを提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ，１９９０，（本明細書中に参考として援用される））。例えば、核酸配列の間の配列同一性パーセントは、ＦＡＳＴＡをそのデフォールトパラメーター（ワードサイズ（ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ）６およびスコアリング行列についてのＮＯＰＡＭ因子）で用いて、またはＧａｐを、本明細書中に参考として援用されるＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１に提供されるようなそのデフォールトパラメーターで用いて決定され得る。
【００５４】
用語「実質的相同性」または「実質的類似性」は、核酸またはそのフラグメントを言及する場合、適切なヌクレオチド挿入またはヌクレオチド欠失を用いて別の核酸（またはその相補鎖）と最適に整列されたとき、上記で考察したような、配列同一性の任意の周知のアルゴリズム（例えば、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＧａｐ）によって測定して、ヌクレオチド塩基のうちの、少なくとも約５０％、より好ましくは６０％において、そのヌクレオチ塩基のうちの、通常少なくとも約７０％、より通常は少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、そしてより好ましくは少なくとも約９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％において、ヌクレオチド配列同一性が存在することを示す。
【００５５】
あるいは、核酸またはそのフラグメントが、選択的ハイブリダイゼーション条件下で、別の核酸に対して、別の核酸の１本の鎖に対して、またはそれらの相補鎖に対してハイブリダイズした場合、実質的相同性または類似性が存在する。代表的に、少なくとも約１４ヌクレオチドにわたって少なくとも約５５％（好ましくは少なくとも約６５％、より好ましくは少なくとも約７５％、そして最も好ましくは少なくとも約９０％）の配列同一性が存在する場合、選択的ハイブリダイゼーションが生じる。例えば、本明細書中に参考として援用される、Ｋａｎｅｈｉｓａ，１９８４を参照のこと。
【００５６】
核酸ハイブリダイゼーションは、当業者によって容易に認識されるように、塩濃度、温度、溶媒、ハイブリダイズする種の塩基組成、相補的領域の長さ、およびハイブリダイズする核酸間のヌクレオチド塩基の不一致数のような条件によって影響を受ける。核酸ハイブリダイゼーション実験に関して、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」および「ストリンジェントな洗浄条件」は、多数の異なる物理的パラメーターに依存する。最も重要なパラメーターとしては、ハイブリダイゼーション温度、核酸の塩基組成、塩濃度および核酸の長さが挙げられる。当業者は、これらのパラメーターをどのようにして変動させて、ハイブリダイゼーションの特定のストリンジェンシーを達成するかがわかる。
【００５７】
一般に、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、特定のセットの条件下で、特定のＤＮＡハイブリッドに関する熱融解点（Ｔｍ）よりも約２５℃下で実施される。「ストリンジェントな洗浄」は、特定のセットの条件下で、特定のＤＮＡハイブリッドに関するＴｍよりも約５℃低い温度で実施される。このＴｍは、標的配列のうちの５０％が、完全に一致したプローブに対してハイブリダイズする温度である。本明細書中に参考として援用される、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出，９．５１頁を参照のこと。
【００５８】
特定のＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに関するＴｍは、以下の式によって評価され得る：
Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（Ｇ＋Ｃの割合）−０．６３（ホルムアミドの％）−（６００／ｌ）（ここで、ｌは、でのハイブリッドの塩基対長である）。
【００５９】
特定のＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドに関するＴｍは、以下の式によって評価され得る：
Ｔｍ＝７９．８℃＋１８．５（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．５８（Ｇ＋Ｃの割合）＋１１．８（Ｇ＋Ｃの割合）２−０．３５（ホルムアミドの％）−（８２０／ｌ）。
【００６０】
特定のＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに関するＴｍは、以下の式によって評価され得る：
Ｔｍ＝７９．８℃＋１８．５（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．５８（Ｇ＋Ｃの割合）＋１１．８（Ｇ＋Ｃの割合）２−０．５０（ホルムアミドの％）−（８２０／ｌ）。
【００６１】
一般に、Ｔｍは、２つの核酸配列間での不一致１％毎に１〜１．５℃減少する。従って、当業者は、ハイブリダイゼーション条件および／または洗浄条件を変更して、標的核酸に対してより高い程度またはより低い程度の配列同一性を有する配列を獲得し得る。例えば、標的核酸配列から、１０％までの不一致を含む、ハイブリダイズする核酸を得るために、完全に一致したハイブリッドの算出Ｔｍから１０℃〜１５℃が差し引かれ、次いで、ハイブリダイゼーション温度および洗浄温度がそれに従って調整される。プローブ配列はまた、特定の条件下で二重鎖ＤＮＡに対して特異的にハイブリダイズして、三重鎖または他のより高次のＤＮＡ複合体を形成し得る。このようなプローブの調製および適切なハイブリダイゼーション条件は、当該分野で周知である。
【００６２】
サザンブロットもしくはノーザンブロットにおける、またはライブラリーをスクリーニングするための、フィルター上での１００より多くの相補的残基を有する相補的核酸配列のハイブリダイゼーションに関するストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、５０％ホルムアミド／６×ＳＳＣにて、４２℃で、少なくとも１０時間（好ましくは１２〜１６時間）である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の別の例は、ホルムアミドなしの６×ＳＳＣにて、６８℃で、少なくとも１０時間（好ましくは１２〜１６時間）である。サザンブロットもしくはノーザンブロットにおける、またはライブラリーをスクリーニングするための、フィルター上での１００より多くの相補的残基を有する相補的核酸配列のハイブリダイゼーションに関する低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の一例は、６×ＳＳＣにて、４２℃で、少なくとも１０時間（好ましくは１２〜１６時間）である。類似するが同一ではない核酸配列を同定するためのハイブリダイゼーション条件は、塩濃度を一定（６×ＳＳＣ）に保持しながら、ハイブリダイゼーション温度を６８℃から４２℃へと変更することによって、またはハイブリダイゼーション温度および塩濃度を一定（例えば、４２℃でかつ６×ＳＳＣ）に保持しながら、ホルムアミド濃度を５０％から０％へと変化させることによって、実験的に同定され得る。ハイブリダイゼーション緩衝液はまた、バックグラウンドを低下させるためのブロッキング剤を含み得る。これらの薬剤は、当該分野で周知である。本明細書中に参考として援用される、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出，８．４６頁および９．４６〜９．５８頁を参照のこと。
【００６３】
洗浄条件もまた、ストリンジェンシー条件を変化させるために変更され得る。ストリンジェントな洗浄条件の一例は、０．２×ＳＳＣ洗浄液にて、６５℃で、１５分間である（ＳＳＣ緩衝液に関しては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出を参照のこと）。しばしば、高ストリンジェンシー洗浄の前に低ストリンジェンシー洗浄が行われて、過剰なプローブが除去される。１００塩基対を超える二重鎖ＤＮＡに関する例示的な中程度のストリンジェンシーの洗浄は、１×ＳＳＣにて、４５℃で、１５分間である。このような二重鎖に関する例示的な低ストリンジェンシー洗浄は、４×ＳＳＣにて、４０℃で、１５分間である。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて無関係のプローブに関して観察される２×以上のシグナル対ノイズ比は、特異的ハイブリダイゼーションの検出を示す。
【００６４】
本明細書中に記載されるように、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、互いに実質的に同一であるポリペプチドをコードする場合、依然として互いに実質的に相同である。これは、例えば、核酸が、遺伝暗号の縮重によって許容されるような高いコドン縮重を用いて合成または組換えによって作製される場合に起こる。
【００６５】
本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方、ならびに上記のものの合成形態および混合ポリマーを包含し得る。これらは、当業者によって容易に認識されるように、化学的もしくは生化学的に改変され得るか、または天然に存在しないヌクレオチド塩基または誘導体化ヌクレオチド塩基を含み得る。このような改変としては、例えば、標識、メチル化、１以上の天然に存在するヌクレオチドのアナログでの置換、ヌクレオチド間改変（例えば、非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）、荷電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、ペンダント部分（例えば、ポリペプチド）、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレーター、アルキレーター、および改変された結合（例えば、αアノマー核酸など））が挙げられる。水素結合および他の化学的相互作用を介して、指定された配列に対して結合する能力についてポリヌクレオチドを模倣する合成分子もまた包含される。このような分子は、当該分野で公知であり、そして例えば、ペプチド結合が、分子の骨格中のリン酸結合に置き換わっている分子を包含する。
【００６６】
核酸配列に適用される場合、用語「変異した」は、核酸配列中のヌクレオチドが、参照核酸配列と比較して、挿入、欠失または変更され得ることを意味する。単一の改変が１つの位置になされてもよく（点変異）、または複数のヌクレオチドが、１つの位置で挿入、欠失もしくは変更されてもよい。さらに、１以上の変更が、核酸配列内の任意の数の位置でなされてもよい。好ましい実施形態では、この核酸配列は、チオエステラーゼについての野生型核酸配列である。この核酸配列は、以下に記載の変異誘発技術を含め、当該分野で公知の任意の方法によって変異され得る。
【００６７】
用語「エラープローンＰＣＲ」とは、ＰＣＲ産物の全長にわたって高い割合の点変異が得られるように、ＤＮＡポリメラーゼのコピー忠実度が低い条件下でＰＣＲを実施するためのプロセスをいう。例えば、Ｌｅｕｎｇら，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１，１１−１５頁（１９８９）ならびにＣａｌｄｗｅｌｌおよびＪｏｙｃｅ  ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌｉｃ．，２，２８−３３頁（１９９２）を参照のこと。
【００６８】
用語「オリゴヌクレオチド特異的変異誘発」とは、目的の任意のクローン化ＤＮＡセグメントにおいて部位特異的変異の作製を可能にするプロセスをいう。例えば、Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１，５３−５７頁（１９８８）を参照のこと。
【００６９】
用語「アセンブリＰＣＲ」とは、小さなＤＮＡフラグメントの混合物からのＰＣＲ産物のアセンブリを含むプロセスをいう。１つの反応の産物が、別の反応の産物の始まりとなって、多数の異なるＰＣＲ反応が、同じバイアル中で並行して行われる。
【００７０】
用語「有性ＰＣＲ変異誘発」または「ＤＮＡシャッフリング」とは、配列相同性に基づいたＤＮＡ分子のランダムな断片化、続いて、誤りがちのＰＣＲ反応におけるプライマー伸長による交叉の固定によって引き起こされる、異なるが高度に関連したＤＮＡ配列のＤＮＡ分子間でのインビトロでの強制的相同組換えと結び付いた、誤りがちのＰＣＲ方法をいう。例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９１，１０７４７−１０７５１頁（１９９４）を参照のこと。ＤＮＡシャッフリングは、いくつかの関連遺伝子間で実施され得る（「ファミリーシャッフリング」）。
【００７１】
用語「インビボでの変異誘発」とは、ＤＮＡ修復経路のうちの１以上における変異を保有するある株の細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＤＮＡの増殖を含む、目的の任意のクローン化ＤＮＡにおいてランダム変異を作製するプロセスをいう。これらの「ミューテーター」株は、野生型の親のランダム変異率よりも高いランダム変異率を有する。このミューテーター株においてＤＮＡを増殖させることは、最終的に、このＤＮＡ内にランダム変異を生じる。
【００７２】
用語「カセット変異誘発」とは、二本鎖ＤＮＡ分子の小さな領域を、そのネイティブ配列とは異なった合成オリゴヌクレオチド「カセット」で置換するための任意のプロセスをいう。このオリゴヌクレオチドはしばしば、完全および／または部分的にランダム化されたネイティブ配列を含む。
【００７３】
用語「反復的アンサンブル変異誘発」とは、メンバーごとにアミノ酸配列が異なる、表現型的に関連した変異体の多様な集団を産生するために開発された、タンパク質操作（タンパク質変異誘発）のためのアルゴリズムをいう。この方法は、フィードバック機構を使用して、連続した回のコンビナトリアルカセット変異誘発を制御する。例えば、ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｖａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９，７８１１−７８１５頁（１９９２）を参照のこと。
【００７４】
用語「指数関数的アンサンブル変異誘発」とは、小さな残基グループが並行してランダム化されて、各変更された位置で、機能的タンパク質をもたらすアミノ酸が同定される、独特でかつ機能的な変異体の百分率が高いコンビナトリアルライブラリーを作製するためのプロセスをいう。例えば、ＤｅｌｅｇｒａｖｅおよびＹｏｕｖａｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｒｅｓ．，１１，１５４８−１５５２頁（１９９３）；ならびにｒａｎｄｏｍ  ａｎｄ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ａｒｎｏｌｄ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４，４５０−４５５頁（１９９３）を参照のこと。上記で言及した参考文献の各々は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【００７５】
「作動可能に連結された」発現制御配列とは、その発現制御配列が目的の遺伝子と連続しており、その目的の遺伝子を制御する結合物、ならびにトランスでまたは少し離れて作用してその目的の遺伝子を制御する発現制御配列をいう。
【００７６】
用語「発現制御配列」は、本明細書中で使用される場合、それが作動可能に連結されているコード配列の発現をもたらすために必要であるポリヌクレオチド配列をいう。発現制御配列は、核酸配列の転写、転写後事象および翻訳を制御する配列である。発現制御配列としては、以下が挙げられる：適切な転写開始配列、転写終結配列、プロモーター配列およびエンハンサー配列；効率的なＲＮＡプロセシングシグナル（例えば、スプライシングシグナルおよびポリアデニル化シグナル）；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を高める配列（例えば、リボソーム結合部位）；タンパク質安定性を高める配列；ならびに所望の場合、タンパク質分泌を高める配列。このような制御配列の性質は、宿主生物に依存して異なる；原核生物では、このような制御配列は一般に、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列を含む。用語「制御配列」とは、その存在が発現に必須である全ての構成要素を少なくとも包含することを意図し、そしてまた、その存在が有利であるさらなる構成要素（例えば、リーダー配列および融合パートナー配列）を包含し得る。
【００７７】
用語「ベクター」は、本明細書中で使用される場合、それに連結された別の核酸を輸送し得る核酸分子をいうことが意図される。ベクターの１種は、「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントが連結され得る環状二本鎖ＤＮＡループをいう。他のベクターとしては、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）および酵母人工染色体（ＹＡＣ）が挙げられる。別の型のベクターは、ウイルスベクターであり、ここで、さらなるＤＮＡセグメントが、ウイルスゲノムに連結され得る。細菌細胞に感染するウイルスベクターは、バクテリオファージといわれる。特定のベクター（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター）は、それらが導入された宿主細胞において自立複製し得る。他のベクターは、宿主細胞中へと導入されると、宿主細胞のゲノム中に組み込まれ得、それにより、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結される遺伝子の発現を指示し得る。このようなベクターは、本明細書中で、「組換え発現ベクター」（または単に、「発現ベクター」）といわれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターはしばしば、プラスミドの形態である。本明細書中では、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが最も一般的に用いられる形態のベクターであるので、交換可能に用いられ得る。しかし、本発明は、等価な機能を果たす他の形態の発現ベクターを包含することを意図する。
【００７８】
用語「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）は、本明細書中で用いられる場合、組換え発現ベクターが導入された細胞をいうことを意図する。このような用語は特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫をもいうことを意図することが理解されるべきである。変異または環境の影響のいずれかに起因して、その後の世代において特定の改変が生じ得るので、そのような子孫は、実際、親細胞と同一でないかもしれないが、依然として、本明細書中で用いられる場合の用語「宿主細胞」の範囲に含まれる。
【００７９】
用語「ポリペプチド」は、天然に存在するおよび天然に存在しないの両方の、タンパク質およびポリペプチド、ポリペプチドフラグメント、ならびにポリペプチドの変異体、誘導体およびアナログを包含する。本明細書中で使用される場合、ポリペプチドは、少なくとも６アミノ酸を、好ましくは、少なくとも８アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも１２アミノ酸、少なくとも１５アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、少なくとも２５アミノ酸または少なくとも３０アミノ酸を含み、そしてより好ましくはこのポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドの全長である。ポリペプチドは、モノマーまたはポリマーであり得る。さらに、ポリペプチドは、単一のポリペプチド内に多数の異なるモジュールを含み得、これらの各々は、１以上の別個の活性を有する。本発明による好ましいポリペプチドは、ダプトマイシン生合成遺伝子クラスターに由来するチオエステラーゼ、ならびにそれらのフラグメント、変異体、アナログおよび誘導体を含む。
【００８０】
用語「単離されたタンパク質」または「単離されたポリペプチド」は、誘導のその起源または供給源が、以下であることによって、タンパク質またはポリペプチドである：（１）そのネイティブな状態でそれに付随している、天然で関連している成分と関連していない、（２）同じ種由来の他のタンパク質を含まない、（３）異なる種由来の細胞によって発現される、または（４）天然では生じない。従って、化学的に合成されたか、またはポリペプチドをもともと誘導した細胞とは異なる細胞系において合成されたポリペプチドは、その天然で関連している成分から「単離」されている。ポリペプチドまたはタンパク質はまた、当該分野で周知のタンパク質精製技術を用いた単離によって、天然で関連している成分を実質的に含まないようになれ得る。
【００８１】
タンパク質またはポリペプチドは、サンプルのうちの少なくとも約６０％〜約７５％が、単一種のポリペプチドを示す場合、「実質的に純粋」、「実質的に均質」または「実質的に精製された」である。このポリペプチドまたはタンパク質は、モノマーまたはマルチマーであり得る。実質的に純粋なポリペプチドまたはタンパク質は代表的に、タンパク質サンプルのうちの約５０％  Ｗ／Ｗ、約６０％  Ｗ／Ｗ、約７０％  Ｗ／Ｗ、約８０％  Ｗ／Ｗまたは約９０％  Ｗ／Ｗ、より通常は約９５％を構成し、そして好ましくは９９％を超えて純粋である。タンパク質の純度または均質性は、当該分野で周知の多数の手段（例えば、タンパク質サンプルのポリアクリルアミドゲル電気泳動、続いてこのゲルを当該分野で周知の染料で染色した際の単一のポリペプチドバンドの可視化）によって示され得る。特定の目的のために、より高い解像度が、ＨＰＬＣまたは精製に関して当該分野で周知の他の手段を使用することによって提供され得る。
【００８２】
用語「ポリペプチドフラグメント」は、本明細書中で用いられる場合、全長ポリペプチドと比較してアミノ末端および／またカルボキシ末端が欠失しているポリペプチドをいう。好ましい実施形態では、このポリペプチドフラグメントは、このフラグメントのアミノ酸配列が、天然に存在する配列における対応する位置と同一である、連続配列である。フラグメントは代表的に、少なくとも６アミノ酸長、少なくとも７アミノ酸長、少なくとも８アミノ酸長、少なくとも９アミノ酸長または少なくとも１０アミノ酸長であり、好ましくは少なくとも１２アミノ酸長、少なくとも１４アミノ酸長、少なくとも１６アミノ酸長または少なくとも１８アミノ酸長であり、より好ましくは少なくとも２０アミノ酸長であり、より好ましくは少なくとも２５アミノ酸長、少なくとも３０アミノ酸長、少なくとも３５アミノ酸長、少なくとも４０アミノ酸長または少なくとも４５アミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも５０アミノ酸長または少なくとも６０アミノ酸長であり、そしてさらにより好ましくは少なくとも７０  アミノ酸長である。
【００８３】
「誘導体」とは、一次構造配列が実質的に相同であるが、例えば、インビボまたはインビトロでの化学的改変および生化学的改変を含むか、またはネイティブポリペプチドには見出されないアミノ酸を取り込んでいる、ポリペプチドまたはそのフラグメントをいう。このような改変としては、当業者によって容易に認識されるように、例えば、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン付加、（例えば、放射性核種での）標識、および種々の酵素的改変が挙げられる。ポリペプチドおよび置換基を標識するための種々の方法またはこのような目的のために有用な標識は、当該分野で周知であり、そして放射性同位体（例えば、１２５Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、および３Ｈ）、標識された抗リガンド（ａｎｔｉｌｉｇａｎｄ）（例えば、抗体）に結合するリガンド、発蛍光団、化学発光剤、酵素、ならびに標識されたリガンドについての特異的結合対のメンバーとして作用し得る抗リガンドを包含する。標識の選択は、必要とされる感度、プライマーとの結合体化の容易さ、安定性の必要要件、および入手可能な機器に依存する。ポリペプチドを標識するための方法は、当該分野で周知である。本明細書中に参考として援用される、Ａｕｓｕｂｅｌら，１９９２を参照のこと。
【００８４】
用語「融合タンパク質」とは、異種のアミノ酸配列に結合したポリペプチドまたはフラグメントを含むポリペプチドをいう。融合タンパク質は有用である。なぜなら、これらは、２以上の異なるタンパク質に由来する２以上の所望の機能的エレメントを含むように構築され得るからである。融合タンパク質は、目的のポリペプチド由来の少なくとも１０連続したアミノ酸を、より好ましくは少なくとも２０アミノ酸または少なくとも３０アミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも４０アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸または少なくとも６０アミノ酸、なおより好ましくは少なくとも７５アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸または少なくとも１２５アミノ酸を含む。融合タンパク質は、異なるタンパク質またはペプチドをコードする核酸配列とインフレームで、そのポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする核酸配列を構築し、次いでその融合タンパク質を発現させることにより、組換えによって産生され得る。あるいは、融合タンパク質は、そのポリペプチドまたはそのフラグメントを別のタンパク質に対して架橋することによって、化学的に産生され得る。
【００８５】
用語「非ペプチド性アナログ」とは、参照ポリペプチドの性質と類似した性質を有する化合物をいう。非ペプチド性化合物はまた、「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｅｔｉｃ）」または「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）」と称される。例えば、本明細書中に参考として援用される、Ｆａｕｃｈｅｒｅ，Ｊ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．１５：２９（１９８６）；ＶｅｂｅｒおよびＦｒｅｉｄｉｎｇｅｒ  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３９２頁（１９８５）；ならびにＥｖａｎｓら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９（１９８７）を参照のこと。このような化合物はしばしば、コンピュータ化分子モデリングの助けを借りて開発される。有用なペプチドに対して構造的に類似するペプチド模倣物を用いて、等価な効果を生じ得る。一般に、ペプチド模倣物は、典型ポリペプチド（すなわち、所望の生化学的特性または薬理学的活性を有するポリペプチド）（例えば、チオエステラーゼ）に対して構造的に類似するが、当該分野で周知の方法によって、−−ＣＨ２ＮＨ−−、−−ＣＨ２Ｓ−−、−−ＣＨ２−ＣＨ２−−、−−ＣＨ＝ＣＨ−−（シスおよびトランス）、−−ＣＯＣＨ２−−、−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−、および−ＣＨ２ＳＯ−−からなる群より選択される結合によって必要に応じて置換された１以上のペプチド結合を有する。コンセンサス配列のうちの１以上のアミノ酸の、同じタイプのＤ−アミノ酸による体系的置換（例えば、Ｌ−リジンの代わりのＤ−リジン）をまた用いて、より安定なペプチドを作製し得る。さらに、コンセンサス配列または実質的に同一のコンセンサス配列バリエーションを含む拘束されたペプチドは、当該分野で公知の方法（本明細書中に参考として援用される、ＲｉｚｏおよびＧｉｅｒａｓｃｈ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７（１９９２））によって；例えば、そのペプチドを環化する分子内ジスルフィド架橋を形成し得る内部システイン残基を付加することによって、作製され得る。
【００８６】
「ポリペプチド変異体」または［ムテイン」とは、その配列が、ネイティブタンパク質または野生型タンパク質のアミノ酸配列と比較して１以上のアミノ酸の置換、挿入または欠失を含む、ポリペプチドをいう。ムテインは、１つの位置での単一アミノ酸が別のアミノ酸へと変更されている１以上のアミノ酸の点置換を有し得るか、天然に存在するタンパク質の配列において１以上のアミノ酸がそれぞれ挿入もしくは欠失されている１以上の挿入および／もしくは欠失を有し得るか、ならびに／またはアミノ末端もしくはカルボキシ末端のいずれかもしくは両方にアミノ酸配列の短縮を有し得る。さらに、ムテインは、天然に存在するタンパク質と同じかまたは異なる生物学的活性を有し得る。例えば、ムテインは、増大または低減した生物学的活性を有し得る。本発明の好ましい実施形態では、ムテインは、天然に存在するチオエステラーゼと同じかまたはそれより増大したチオエステラーゼ活性を有する。ムテインは、野生型タンパク質に対して少なくとも５０％の配列相同性、少なくとも６０％の配列相同性または少なくとも７０％配列相同性を有し、より好ましくは、野生型タンパク質に対して少なくとも８０％の配列相同性、少なくとも８５％の配列相同性または少なくとも９０％の配列相同性を有するムテインであり、さらにより好ましくは、少なくとも９５％の配列相同性、少なくとも９６％の配列相同性、少なくとも９７％の配列相同性、少なくとも９８％の配列相同性または少なくとも９９％の配列同一性を示すムテインである。配列相同性は、任意の一般的配列分析アルゴリズム（例えば、ＧａｐまたはＢｅｓｔｆｉｔ）によって、デフォールトパラメーターを用いて測定され得る。
【００８７】
好ましいアミノ酸置換は、以下のアミノ酸置換である：（１）タンパク質分解に対する感受性を低減するアミノ酸置換、（２）酸化に対する感受性を低減するアミノ酸置換、（３）タンパク質複合体を形成する結合親和性を変更するアミノ酸置換、（４）結合親和性または酵素活性を変更するアミノ酸置換、および（５）このような誘導体、アナログ、融合タンパク質およびムテインの他の物理化学的特性または機能的特性を付与または改変するアミノ酸置換。単一または複数のアミノ酸置換（好ましくは、保存的アミノ酸置換）は、天然に存在する配列において（好ましくは、分子間接触を形成するドメインの外側のポリペプチド部分において）作製され得る。保存的アミノ酸置換は、親配列の構造的特徴を実質的に変化させるべきでない（例えば、置換アミノ酸は、親配列において生じるヘリックスを破壊する傾向も、親配列を特徴付ける他の型の二次構造を破壊する傾向も有すべきでない）。当該分野で認識されるポリペプチドの二次構造および三次構造の例は、以下に記載される：Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ編，Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎおよびＣｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４））；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．ＢｒａｎｄｅｎおよびＪ．Ｔｏｏｚｅ編，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９１））；ならびにＴｈｏｒｎｔｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：１０５（１９９１）（これらは各々、本明細書中に参考として援用される）。
【００８８】
本明細書中で使用される場合、２０種の従来のアミノ酸およびそれらの略号は、従来の使用法に従う。本明細書中に参考として援用される、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第２版，Ｅ．Ｓ．ＧｏｌｕｂおよびＤ．Ｒ．Ｇｒｅｎ編，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．（１９９１））を参照のこと。２０種の従来のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、天然に存在しないアミノ酸（例えば、α−，α−二置換アミノ酸）、Ｎ−アルキルアミノ酸、および他の従来ないアミノ酸もまた、本発明のポリペプチドについての適切な構成要素であり得る。従来ないアミノ酸の例としては、以下が挙げられる：γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、ｓ−Ｎ−メチルアルギニン、ならびに他の同様のアミノ酸およびイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）。本明細書中で用いられるポリペプチドの表記においては、標準的な使用法および慣習に従って、左側の方向がアミノ末端の方向であり、そして右側の方向がカルボキシ末端の方向である。
【００８９】
タンパク質は、そのタンパク質のコードされるアミノ酸配列が、異なる生物のタンパク質のコードされるアミノ酸配列に対して類似する配列を有する場合、別の生物由来のタンパク質に対して「相同性」を有するかまたは「相同」である。あるいは、タンパク質は、２つのタンパク質が類似のアミノ酸配列を有する場合、別のタンパク質に対して相同性を有し得るかまたは相同であり得る。２つのタンパク質は「相同」であるといわれるが、これは、これらのタンパク質の間に進化的関係が必ずしもあることを意味しない。その代わり、用語「相同」は、その２つのタンパク質が、類似のアミノ酸配列を有することを意味すると定義される。好ましい実施形態では、相同タンパク質は、野生型タンパク質に対して少なくとも５０％の配列同一性、少なくとも６０％の配列同一性または少なくとも７０％の配列同一性を示すタンパク質であり、好ましくは、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性または少なくとも９９％の配列同一性を示す、相同タンパク質である。さらに、多くの場合、類似のアミノ酸配列を有するタンパク質は類似の機能を有するとはいえ、用語「相同」は、そのタンパク質が、互いに機能的に類似しなければならないことを意味しない。
【００９０】
「相同」が、タンパク質またはペプチドを参照して使用される場合、同一ではない残基位置がしばしば保存的アミノ酸置換によって異なることが認識される。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されている置換である。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変更しない。２以上のアミノ酸配列が、保存的置換によって互いに異なる場合、配列同一性パーセントまたは相同性の程度は、その置換の保存的性質を補正するように上側に調整され得る。この調整を行うための手段は、当業者に周知である（例えば、本明細書中に参考として援用される、Ｐｅａｒｓｏｎら，１９９４を参照のこと）。
【００９１】
以下の６つの群は各々、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：
１．セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；
２．アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３．アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４．アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５．イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ならびに
６．フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【００９２】
ポリペプチドについての配列相同性（配列同一性ともいわれる）は代表的に、配列分析ソフトウェアを用いて測定される。例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，９１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ５３７０５を参照のこと。タンパク質分析ソフトウェアは、種々の置換、欠失および他の改変（保存的アミノ酸置換を含む）に対して割り当てられた相同性の尺度を使用して、類似の配列を一致させる。例えば、ＧＣＧは、デフォールトパラメーターで用いられて、密接に関連したポリペプチド（例えば、異なる種の生物由来の相同なポリペプチド）間での、または野生型タンパク質とそのムテインとの間での、配列相同性または配列同一性を決定し得るプログラム（例えば、「Ｇａｐ」および「Ｂｅｓｔｆｉｔ」）を含む。例えば、ＧＣＧ第６．１版を参照のこと。
【００９３】
ポリペプチド配列を、種々の生物由来の多数の配列を含むデータベースに対して比較する場合の好ましいアルゴリズムは、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ（特に、ｂｌａｓｔｐ、ｔｂｌａｓｔｎまたはＢｌａｓｔＸ）である。本明細書中に参考として援用される、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７）を参照のこと。ＢｌａｓｔＸ（これは、翻訳されたヌクレオチド配列をタンパク質データベースに対して比較する）は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎに存在するサーバを介してオンラインで実施され得る。ｂｌａｓｔｐ（これは、タンパク質配列をタンパク質データベースに対して比較する）に関して好ましいパラメーターは以下である：
Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ  ｖａｌｕｅ：      １０（デフォールト）
Ｆｉｌｔｅｒ：                            ｓｅｇ（デフォールト）
Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ａ  ｇａｐ：    １１（デフォールト）
Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄ  ａ  ｇａｐ：１（デフォールト
Ｍａｘ．ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ：            １００（デフォールト）
Ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ：                      １１（デフォールト）
Ｎｏ．ｏｆ  ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ：    １００（デフォールト）
Ｐｅｎａｌｔｙ  Ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ６２。
【００９４】
相同性に関して比較されるポリペプチド配列の長さは一般に、少なくとも約１６アミノ酸残基であり、通常少なくとも約２０残基であり、より通常は少なくとも約２４残基であり、代表的には少なくとも約２８残基であり、そして好ましくは約３５残基より多くである。多数の種々の生物由来の配列を含むデータベースを検索する場合、アミノ酸配列を比較することが好ましい。
【００９５】
アミノ酸配列を用いたデータベース検索は、ｂｌａｓｔｐ以外の、当該分野で公知のアルゴリズムによって測定され得る。例えば、ポリペプチド配列は、ＦＡＳＴＡ（ＧＣＧ第６．１版におけるプログラム）を用いて比較され得る。ＦＡＳＴＡは、問合せ配列と検索配列との間で最良に重複する領域のアラインメントおよび配列同一性パーセントを提供する（本明細書中に参考として援用される、Ｐｅａｒｓｏｎ，１９９０）。例えば、アミノ酸配列間の配列同一性パーセントは、本明細書中に参考として援用されるＧＣＧ第６．１版において提供されるようなそのデフォールトパラメーター（２のｗｏｒｄ  ｓｉｚｅおよびＰＡＭ２５０スコア付け行列）でＦＡＳＴＡを用いて決定され得る。
【００９６】
「抗体」とは、インタクトな免疫グロブリン、またはインタクトな抗体とその抗原特異的結合について競合する、その抗原結合部分をいう。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術によって、またはインタクト抗体の酵素切断もしくは化学的切断によって産生され得る。抗原結合部分としては、とりわけ、以下が挙げられる：Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、および相補性決定領域（ＣＤＲ）フラグメント、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、二価抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）およびポリペプチドへの特異的抗原結合を付与するに充分な、免疫グロブリンの少なくとも一部分を含むポリペプチド。Ｆａｂフラグメントは、ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインからなる１価のフラグメントである；Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、ジスルフィド架橋によってヒンジ領域で連結された２つのＦａｂフラグメントを含む２価のフラグメントである；Ｆｄフラグメントは、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなる；Ｆｖフラグメントは、抗体の単一アームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなる；そして、ｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６，１９８９）は、ＶＨドメインからなる。
【００９７】
単鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、ＶＬ領域およびＶＨ領域が、これらが単一のタンパク質鎖として作製されるのを可能にする合成リンカーを介して対になって、１価の分子を形成している抗体である（Ｂｉｒｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６，１９８８およびＨｕｓｔｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３，１９８８）。二価抗体は、ＶＨドメインおよびＶＬドメインが、単一ポリペプチド鎖上で発現されるが、これらの２つのドメインが同じ鎖上で対になるのを可能にするには短すぎて、それによって、強制的にこれらのドメインを別の鎖の相補的ドメインと対にならせて、２つの抗原結合部位を作製させるリンカーを用いる、２価の二重特異性抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８，１９９３，およびＰｏｌｊａｋら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３，１９９４を参照のこと）。１以上のＣＤＲは、共有結合的または非共有結合的のいずれかで分子中に取り込まれて、これを免疫付着因子（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ）とし得る。免疫付着因子は、より大きなポリペプチド鎖の一部としてＣＤＲを取り込み得るか、ＣＤＲを別のポリペプチド鎖に対して共有結合し得るか、またはＣＤＲを非共有結合的に取り込み得る。これらのＣＤＲは、免疫付着因子が目的の特定の抗原に対して特異的に結合するのを可能にする。キメラ抗体は、１つの抗体由来の１以上の領域と、１以上の他の抗体由来の１以上の領域とを含む抗体である。
【００９８】
抗体は、１以上の結合部位を有し得る。１より多くの結合部位が存在する場合、これらの結合部位は、互いに同一であっても異なっていてもよい。例えば、天然に存在する免疫グロブリンは、２つの同一の結合部位を有し、単鎖抗体またはＦａｂフラグメントは、１つの結合部位を有し、一方、「二重特異性」抗体または「二機能性」抗体は、２つの異なる結合部位を有する。
【００９９】
「単離された抗体」は、以下の抗体である：（１）そのネイティブな状態で付随している、天然で会合している成分（他の天然で会合している抗体を含む）と会合していない抗体、（２）同じ種由来の他のタンパク質を含まない抗体、（３）異なる種由来の細胞によって発現された抗体、または（４）天然では生じない抗体。
【０１００】
「中和抗体」または「阻害抗体」は、ポリペプチドの活性を阻害するかまたはそれが通常結合するリガンドへのポリペプチドの結合をブロックする抗体である。例えば、中和抗チオエステラーゼ抗体は、チオエステラーゼの活性をブロックする抗体であり得る。「活性化抗体」は、ポリペプチドの活性を増大させる抗体である。例えば、活性化抗チオエステラーゼ抗体は、チオエステラーゼの活性を増大させる抗体である。
【０１０１】
用語「エピトープ」は、免疫グロブリンまたはＴ細胞レセプターに特異的に結合し得る任意のタンパク質決定基を包含する。エピトープ性決定基は通常、分子のうちの化学的に活性な表面のグルーピング（例えば、アミノ酸または糖側鎖）からなり、そして通常、特定の三次元構造特徴、ならびに特定の電荷特徴を有する。抗体は、解離定数が≦１μＭ、好ましくは≦１００ｎＭ、そして最も好ましくは≦１０ｎＭである場合、抗原を特異的に結合するといわれる。
【０１０２】
用語患者は、ヒト被験体および獣医学的被験体を包含する。
【０１０３】
本明細書および特許請求の範囲の全体を通して、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または語尾変化（例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、言及された整数または整数群を含むが、任意の他の整数も整数群も排除しないことを意味すると理解される。
【０１０４】
（核酸分子、調節配列、ベクター、宿主細胞およびポリペプチドを作製する組換え方法）
（核酸分子）
１つの局面では、本発明は、チオエステラーゼもしくはダプトマイシンＮＲＰＳまたはそれらのサブユニットをコードする核酸分子を提供する。１つの実施形態では、この核酸分子は、ＤｐｔＡ、ＤｐｔＢＣまたはＤｐｔＤのうちの１以上をコードする。好ましい実施形態では、これらの核酸分子は、配列番号９、配列番号１１または配列番号７のアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含むポリペプチドをコードする。別の好ましい実施形態では、この核酸分子は、ｄｐｔＡ、ｄｐｔＢＣおよび／またはｄｐｔＤを含む。さらに好ましい実施形態では、この核酸分子は、配列番号１０、配列番号１２または配列番号３のうちのいずれか１つを含む核酸配列を含む。
【０１０５】
別の実施形態では、この核酸分子は、ダプトマイシン生合成遺伝子クラスターに由来するチオエステラーゼをコードする。好ましい実施形態では、この核酸分子は、遊離チオエステラーゼまたは内在性チオエステラーゼである、ダプトマイシン生合成遺伝子クラスターに由来するチオエステラーゼをコードする。別の好ましい実施形態では、この核酸分子は、ＤｐｔＨを、またはＤｐｔＤのチオエステラーゼドメインをコードする。より好ましい実施形態では、この核酸分子は、配列番号７のチオエステラーゼドメインのアミノ酸配列を含むかポリペプチドをコードするか、または配列番号８のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、この核酸分子は、ダプトマイシン生合成遺伝子クラスター由来の、ｄｐｔＤまたはｄｐｔＨの、チオエステラーゼコードドメインを含む。別の好ましい実施形態では、この核酸分子は、配列番号６もしくは配列番号３の核酸配列、またはそれらのチオエステラーゼコード部分を含む領域を含む。別の実施形態では、この核酸分子はまた、ダプトマイシンＮＲＰＳまたはそのサブユニットをコードする。ダプトマイシン生合成遺伝子クラスターのｄｐｔＡ、ｄｐｔＢＣ、ｄｐｔＤおよびｄｐｔＨならびに他の遺伝子の単離および同定に関して、実施例１〜６を参照のこと。
【０１０６】
別の実施形態では、この核酸分子は、アシルＣｏＡリガーゼをコードする。好ましい実施形態では、この核酸分子はＤｐｔＥをコードし、好ましくは核酸分子は配列番号１５をコードする。より好ましい実施形態では、この核酸分子は、ｄｐｔＥを含む。さらにより好ましい実施形態では、この核酸分子は、配列番号１６を含む。別の実施形態では、この核酸分子は、アシルトランスフェラーゼをコードする。好ましい実施形態では、この核酸分子はＤｐｔＦをコードし、好ましくは核酸分子は配列番号１７をコードする。より好ましい実施形態では、この核酸分子は、ｄｐｔＦを含む。さらにより好ましい実施形態では、この核酸分子は、配列番号１８を含む。
【０１０７】
本発明の別の実施形態は、Ｓ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ由来の核酸配列を含む細菌人工染色体（ＢＡＣ）由来のＤＮＡ配列を含む核酸分子を提供する。好ましい実施形態では、この核酸分子は、ＢＡＣクローンＢ１２：０１Ｇ０５、Ｂ１２：０６Ａ１２、Ｂ１２：１２Ｆ０６、Ｂ１２：１８Ｈ０４、Ｂ１２：２０Ｃ０９またはＢ１２：０３Ａ０５のうちのいずれか１つ由来のＳ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓの核酸配列を含む。好ましい実施形態では、この核酸分子は、Ｂ１２：０３Ａ０５（ＡＴＣＣ受託ＰＴＡ−３１４０、２００１年３月１日寄託）由来のＳ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓの核酸配列を含む。この核酸分子は、このＢＡＣクローン中のＳ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓの核酸配列全体を含み得るか、またはその一部分を含み得る。好ましい実施形態では、この一部分は、ポリペプチドをコードし得る少なくとも１つの核酸配列を含む核酸分子であり、好ましくは、全長ポリペプチドをコードし得る少なくとも１つの核酸配列を含む核酸分子（すなわち、その開始コドンからその停止コドンまでのポリペプチドをコードする核酸分子）である。１つの好ましい実施形態では、この一部分は、ダプトマイシン生合成に関与するポリペプチド（例えば、限定されないが、ｄｐｔＡ、ｄｐｔＢＣ、ｄｐｔＤ、ｄｐｔＥ、ｄｐｔＦまたはｄｐｔＨ）をコードする核酸分子を含む。
【０１０８】
別の実施形態では、ＢＡＣクローン由来の一部分は、以下の配列番号から選択されるポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子である：１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０４、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４または１３６。別の実施形態では、ＢＡＣクローン由来のこの一部分は、以下の配列番号から選択される核酸配列を含む核酸分子である：２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３または１３５。
【０１０９】
配列番号１１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドおよび配列番号１１２のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ダプトマイシン生合成のレギュレーターである。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓにおける生合成経路の機能に関しては、複数のレギュレーターが必要とされる（Ｂａｔｅら，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６，６１７−６２４，１９９９；Ｂａｌｔｚ，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．２２，３０８−３８１，１９９５）。例えば、Ｓ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓにおけるビアラフォスについての生合成経路は、遺伝子ｂｐｒＡを含み、この遺伝子は、抗生物質産生において正の調節役割を有する（Ｒａｉｂａｕｄら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３，４４５４−４４６３，１９９１）。抗生物質産生の増大が、種々の産生株において正のレギュレーター遺伝子のコピー数を増大させることによって達成され得ることもまた示されている（例えば、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ，Ｖｏｇｔｌｉら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４，６４３−６５３，１９９４；Ｓ．ａｒｇｉｌｌａｃｅｕｓにおいて、Ｌｏｍｂｏら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１，６４２−６４７，１９９９およびＳ．ｐｅｕｃｅｔｉｕｓにおいて、Ｏｔｔｅｎら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４６，１４５７−１４６８，２０００）。配列番号１１０の調節アクチベーターポリペプチド（これは、配列番号１０９のヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる）は、ｂｒｐＡおよびｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓにおいて見出される他の調節タンパク質とだけでなく、定数（ｑｕｏｒｕｍ）の感知に関与するｌｕｘＲファミリーのタンパク質とも、同一性および類似性を共有する。これらは全て、２成分転写アクチベーターのファミリーのＤＮＡ結合タンパク質である（Ｋｅｎｎｅｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５，１３５−１４１，２００２）。従って、配列番号１１０のこの調節アクチベーターポリペプチドを用いて、Ｓ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓにおけるダプトマイシンの収量を増大させ得る。この調節アクチベーターの遺伝子または生物学的に活性なその部分は、組込み性または自立複製の発現ベクター中にクローン化され得、そしてＳ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ中に１以上のコピー数で１以上の中立の部位へと再導入され得る。トランスジェニック株は、発酵され得、そして実施例９に記載されるとおりにダプトマイシン産生に関して分析され得、そして野生型株よりも多量のダプトマイシンを産生するために用いられ得る。
【０１１０】
配列番号１１２のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、配列番号１１１のヌクレオチド配列によってコードされ、このポリペプチドは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ由来の推定のＤｅｏＲファミリーの転写調節因子ならびに種々の異化産物リプレッサー（ＬａｃＩ、ｒｂｓＲ、ｍａｌＲ、ＲＥＧ１）と、有意な量の同一性および相同性を共有する。これらのタンパク質はプロモーター領域に結合して、転写を妨げる（ＺｅｎｇおよびＳａｘｉｌｄ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１，１７１９−１７２９，１９９９；ＯｓｋｏｕｉａｎおよびＳｔｅｗａｒｔ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２，３８０４−３８１２，１９９０）。従って、この遺伝子は、ダプトマイシン生合成の負の調節因子である。それゆえ、この負の調節因子遺伝子の破壊もしくは欠失またはそのタンパク質産物の阻害は、ダプトマイシンの構成的発現および／または収量増加をもたらすはずである。別の実施形態では、負の調節遺伝子を欠失し得、そして複数コピーの正の調節遺伝子を挿入して、ダプトマイシン産生をさらにより増大させ得る。
【０１１１】
配列番号１９、配列番号２１、配列番号２９、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号６３、配列番号６７、配列番号７５および配列番号７７のアミノ酸配列（配列番号２０、配列番号２２、配列番号３０、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号６４、配列番号６８、配列番号７６または配列番号７８の核酸配列）を有するポリペプチドは、ＡＢＣトランスポーターである。これらのポリペプチドのうちのいくつかは、Ｗａｌｋｅｒモチーフを有するポンプ様ポリペプチドであり、一方、他のポリペプチドは、金属スカベンジング（例えば、鉄またはマンガンの輸送）において役割を有するポリペプチドである（表６および表７を参照のこと）。配列番号７６を含む核酸分子は、Ｓ．ｒｏｃｈｅｉおよびＳ．ｐｅｕｃｅｔｉｕｓのＤｒｒＡ（Ｐ３２０１０）遺伝子の（ＡＡＤ４４２２９．１）のＯＲＦ１に対するその配列類似性によって決定したところ、ＡＢＣトランスポーター系のＡＴＰ結合構成要素をコードする。コードされるポリペプチドは、Ｗａｌｋｅｒ  ＡモチーフおよびＷａｌｋｅｒ  Ｂモチーフの両方を有する。さらに、その合成は、内在性膜構成要素をコードするＳ．ｐｅｕｔｉｃｅｕｓ  ＤｒｒＢ産物（ＡＡＡ７４７１８．１）に対するその配列類似性によって決定したところ、配列番号７８を含む核酸分子（これは、ＤｒｒＢ様ポリペプチドをコードする）の合成と翻訳的に共役しているようである。配列番号２１のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ＳｔｒＶホモログであり、一方、配列番号１９のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、Ｓｔｒｗホモログである。例えば、Ｂｅｙｅｒら，１９９６，前出を参照のこと。このＳｔｒＶホモログは、両方のＷａｌｋｅｒモチーフを有し、一方、このＳｔｒＷホモログは、１つだけのＷａｌｋｅｒ  Ｂモチーフを有する。このポリペプチドをコードする両方の核酸配列は、相補鎖にあり、そして翻訳的に調節されるようである。これらは、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒホモログであるＧ８Ａ．０１およびＧ８Ａ．０２（ｅｍｂｌ  ＣＡＢ８８９３１、ＣＡＢ８８９３２）を有する。表６および表７を参照のこと。
【０１１２】
別の局面では、ＢＡＣクローンの一部分は、以下をコードする核酸配列を含む核酸分子である：オキシドレダクターゼ；デヒドロゲナーゼ；抗生物質耐性に関与する転写調節因子；ＮｏｖＡＢＣ関連ポリペプチド（これは、抗微生物剤であるノボビオシンの生合成に関与する）；モノオキシゲナーゼ；アシルＣｏＡチオエステラーゼ；ＤＮＡヘリカーゼ；ＤＮＡリガーゼ；ヒドロラーゼ；耐熱性中性プロテアーゼ；ダプトマイシンの輸送において有用であり得るＡＢＣトランスポーター；内生胞子形成に関与するｓｐｏ  ＶＫ様タンパク質；セリンプロテアーゼ；ならびに隔壁形成および芽胞形成の間のＤＮＡ分離に関与するＦｔｓＫ／ＳｐｏＩＩＩＥ様タンパク質。これらの核酸分子およびコードされるポリペプチドは、ダプトマイシン生合成において有用であり得る；例えば、アシルＣｏＡチオエステラーゼは、チオエステラーゼに関して上記に提供される理由から有用であり得、そしてまた、ダプトマイシンのペプチドドメインに対する脂質テイルの付加において重要であり得る。これらの核酸分子によってコードされる酵素もまた、有用である。なぜなら、これらを、他のオキシドレダクターゼ、デヒドロゲナーゼ、モノオキシゲナーゼ、ヒドロラーゼ、セリンプロテアーゼもしくは中性プロテアーゼ、ＤＮＡヘリカーゼまたはＤＮＡリガーゼが当該分野で用いられるのと同様に用い得るからである。顕著なことに、転写調節因子は、ダプトマイシン耐性または他の抗生物質耐性を増大または低減するために、周知の方法を用いて変異させられ得る。ＮｏｖＡＢＣ関連ポリペプチドをコードする核酸分子は、ＮｏｖＡＢＣが例えば、ノボビオシンまたは関連の抗微生物剤を産生するために当該分野で用いられるのと同様に用いられ得る。上記の活性を有するポリペプチドは、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０４、配列番号１０８、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４および配列番号１３６のアミノ酸配列を含み、そして配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３および配列番号１３５の核酸配列によってコードされる。
【０１１３】
別の局面では、ＢＡＣクローンの一部分は、規定された機能を有さないが、他のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ由来の核酸分子およびポリペプチドに対して高度に相同であるポリペプチドをコードする、核酸分子である。これらの核酸分子（配列番号６２、配列番号６６、配列番号７０、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９６、配列番号１０２、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５および配列番号１２７）、これらがコードするポリペプチド（配列番号６１、配列番号６５、配列番号６９、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号９５、配列番号１０１、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６および配列番号１２８）およびこれらのポリペプチドに対する抗体を用い、例えば、微生物学的試験または法医学において有用な標準的な生物学的技術およびタンパク質化学技術（例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイまたはウェスタンブロッティング）を用いて、他のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種を同定し得る。別の実施形態では、ＢＡＣクローンの一部分は、規定された機能を有さず、別の種由来の核酸分子に対してもポリペプチドに対しても高度には相同ではないポリペプチドをコードする、核酸分子である。これらの核酸分子（配列番号３２、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号７２および配列番号７４）は、それにもかかわらず有用である。なぜなら、これらは、ダプトマイシン生合成遺伝子クラスターに近く、それゆえ、ダプトマイシン生合成遺伝子クラスターの全てまたは一部分をコードする核酸分子を同定するために用いられ得るからである。ＢＡＣクローンのうちの、ポリペプチドをコードしない部分は、同じ理由から有用である。さらに、配列番号３１、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号７１および配列番号７３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを用いて、Ｓ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓを同定するために用いられ得る抗体を作製し得る。これらのポリペプチドは、あらゆる他の種に対して高度に相同ではないので、これらの抗体は、Ｓ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓについて高度に特異的であるようである。
【０１１４】
別の局面では、本発明は、上記の通りの核酸分子に対して選択的にハイブリダイズする核酸分子を提供する。好ましい実施形態では、本発明は、ＤｐｔＡ、ＤｐｔＢＣ、ＤｐｔＤまたはＤｐｔＨをコードする核酸分子に対して選択的にハイブリダイズする核酸分子を提供する。別の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号９、配列番号１１、配列番号７または配列番号８をコードする核酸分子に対して選択的にハイブリダイズする核酸分子を提供する。さらにより好ましい実施形態では、本発明は、ｄｐｔＡ、ｄｐｔＢＣ、ｄｐｔＤまたはｄｐｔＨの核酸配列を含む核酸分子に対して選択的にハイブリダイズする核酸分子を提供する。別の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号１０、配列番号１２、配列番号３または配列番号６の核酸配列を含む核酸分子に対して選択的にハイブリダイズする核酸分子を提供する。本発明はまた、以下のＢＡＣクローンのうちのいずれか１つに由来するＳ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ核酸配列（好ましくは、Ｂ１２：０３Ａ０５に由来するＳ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ核酸配列）を含む核酸分子に対して選択的にハイブリダイズする核酸分子を提供する：Ｂ１２：０１Ｇ０５、Ｂ１２：０６Ａ１２、Ｂ１２：１２Ｆ０６、Ｂ１２：１８Ｈ０４、Ｂ１２：２０Ｃ０９またはＢ１２：０３Ａ０５。好ましい実施形態では、本発明は、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０４、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４もしくは配列番号１３６をコードする核酸分子に対して、または配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３もしくは配列番号１３５の核酸配列を含む核酸分子に対して、選択的にハイブリダイズする核酸分子を提供する。上記の核酸配列のいずれかの選択的ハイブリダイゼーションは、低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で実施され得る。好ましい実施形態では、この選択的ハイブリダイゼーションは、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で実施される。本発明の好ましい実施形態では、このハイブリダイズする核酸分子を用いて、本発明のポリペプチドを組換え発現し得る。
【０１１５】
別の局面では、本発明は、ダプトマイシンＮＲＰＳもしくはそのサブユニットをコードする核酸、ダプトマイシン生合成遺伝子クラスター由来のチオエステラーゼ、またはＢＡＣクローン（Ｂ１２：０１Ｇ０５、Ｂ１２：０６Ａ１２、Ｂ１２：１２Ｆ０６、Ｂ１２：１８Ｈ０４、Ｂ１２：２０Ｃ０９もしくは好ましくはＢ１２：０３Ａ０５）のうちのいずれか１つに由来するＳ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ核酸配列を含む核酸分子に対して相同である核酸分子を提供する。本発明は、ＤｐｔＡ、ＤｐｔＢＣ、ＤｐｔＤまたはＤｐｔＨをコードする核酸分子に対して相同である核酸分子を提供する。１つの実施形態では、この核酸分子は、配列番号９、配列番号１１、配列番号７または配列番号８のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子に対して相同である。好ましい実施形態では、この核酸分子は、ｄｐｔＡ、ｄｐｔＢＣまたはｄｐｔＤのうちのいずれか１以上に対して相同である。別の実施形態では、この核酸分子は、ｄｐｔＤのチオエステラーゼドメインによってかまたはｄｐｔＨによってコードされるチオエステラーゼに対して相同である。より好ましい実施形態では、この核酸分子は、配列番号１０、配列番号１２、配列番号３または配列番号６の核酸配列を有する核酸分子に対して相同である。別の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０４、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４もしくは配列番号１３６をコードする核酸分子に対して、または配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３もしくは配列番号１３５の核酸配列を含む核酸分子に対して相同である核酸分子を提供する。好ましい実施形態では、相同な核酸分子は、本明細書中に記載の核酸分子と、少なくとも６０％の配列同一性、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性または少なくとも８５％の配列同一性を有する核酸配列である。より好ましい実施形態では、この相同な核酸分子は、本明細書中に記載される核酸分子と、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸分子である。さらに、１つの実施形態では、相同な核酸分子は、ダプトマイシンＮＲＰＳもしくはそのサブユニットをコードする核酸分子、チオエステラーゼ、または本明細書中に記載されるポリペプチドをコードする核酸分子に対して、その全長にわたって相同である。別の実施形態では、相同な核酸分子は、その長さの一部分のみについて、本明細書中に記載される核酸分子に対して相同であり、ここで、この一部分は、この核酸分子のうちの少なくとも５０ヌクレオチドであり、好ましくは少なくとも１００ヌクレオチドであり、より好ましくは少なくとも２００ヌクレオチドであり、さらにより好ましくは少なくとも３００ヌクレオチドである。
【０１１６】
別の実施形態では、本発明は、ダプトマイシンＮＲＰＳもしくはそのサブユニットをコードする遺伝子、ダプトマイシン生合成遺伝子クラスター由来のチオエステラーゼ、またはＢＡＣクローン（Ｂ１２：０１Ｇ０５、Ｂ１２：０６Ａ１２、Ｂ１２：１２Ｆ０６、Ｂ１２：１８Ｈ０４、Ｂ１２：２０Ｃ０９またはＢ１２：０３Ａ０５）のうちのいずれか１つ由来のＳ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ核酸配列を含む核酸分子の対立遺伝子改変体である核酸を提供する。好ましい実施形態では、本発明は、ｄｐｔＡ、ｄｐｔＢＣ、ｄｐｔＤまたはｄｐｔＨの対立遺伝子改変体である核酸を提供する。さらにより好ましい実施形態では、この対立遺伝子改変体は、遺伝子の改変体であり、ここでその遺伝子は、ＤｐｔＡ、ＤｐｔＢＣ、ＤｐｔＤまたはＤｐｔＨをコードする。別の好ましい実施形態では、この対立遺伝子改変体は、配列番号９、配列番号１１、配列番号７または配列番号８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子の改変体である。なおさらに好ましい実施形態では、この対立遺伝子改変体は、遺伝子の改変体であり、ここで、この遺伝子は、配列番号１０、配列番号１２、配列番号３または配列番号６の核酸配列を有する。ｄｐｔＨ、またはｄｐｔＤのチオエステラーゼの対立遺伝子改変体は、好ましくは、配列番号７のチオエステラーゼドメインのアミノ酸配列を有するポリペプチドの酵素活性または配列番号８のアミノ酸配列を有するポリペプチドの酵素活性と比較して同じかまたは類似する酵素活性を有するチオエステラーゼをコードする。ｄｐｔＡ、ｄｐｔＢＣまたはｄｐｔＤの対立遺伝子改変体は、好ましくは、それぞれ、配列番号９、配列番号１１または配列番号７のアミノ酸配列を有するダプトマイシンＮＲＰＳと同じ活性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、本発明は、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０４、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４もしくは配列番号１３６をコードする核酸分子の対立遺伝子改変体、または配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３もしくは配列番号１３５の核酸配列を含む核酸分子に対する対立遺伝子改変体を提供する。好ましい実施形態では、この対立遺伝子改変体は、このポリペプチドの同じ生物学的活性を有するポリペプチドをコードする；例えば、これは、ＡＢＣトランスポーター活性を有するポリペプチドをコードする。
【０１１７】
本発明のさらなる目的は、本発明の核酸配列の一部分を含む核酸分子を提供することである。本発明は、ダプトマイシンＮＲＰＳ、そのサブユニット、ダプトマイシン生合成遺伝子クラスター由来のチオエステラーゼをコードする核酸分子の一部分、またはＢＡＣクローン（Ｂ１２：０１Ｇ０５、Ｂ１２：０６Ａ１２、Ｂ１２：１２Ｆ０６、Ｂ１２：１８Ｈ０４、Ｂ１２：２０Ｃ０９または好ましくはＢ１２：０３Ａ０５）のうちのいずれか１つ由来のＳ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ核酸配列を含む核酸分子の一部分を提供する。本発明はまた、上記の通り、選択的にハイブリダイズするかまたは相同な核酸分子の一部分を提供する。本発明は、上記の通り、核酸分子の対立遺伝子改変体の一部分を提供する。一部分は、少なくとも１０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチド、少なくとも３５ヌクレオチド、少なくとも４０ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも１５０ヌクレオチド、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも２５０ヌクレオチドまたは少なくとも３００ヌクレオチドを含む。核酸部分の最大のサイズは、核酸分子が１より多くの遺伝子をコードする場合、核酸分子全体よりも１ヌクレオチド短く、または核酸分子が単一のポリペプチドをコードする場合、全長タンパク質をコードする核酸分子よりも１ヌクレオチド短い。
【０１１８】
別の局面では、このハイブリダイズするかまたは相同な核酸分子、対立遺伝子改変体、またはその核酸分子の一部分は、ネイティブな（野生型）ポリペプチドと同じ生物学的活性を有するポリペプチドをコードする。
【０１１９】
別の局面では、本発明は、以下に記載される通り、融合タンパク質、相同タンパク質、ポリペプチドフラグメント、ムテインまたはポリペプチドアナログをコードする核酸分子を提供する。
【０１２０】
本発明の核酸分子は、単一のポリペプチドまたは複数のポリペプチドをコードし得る。１つの実施形態では、本発明は、複数の、翻訳が共役したポリペプチドをコードする核酸分子（例えば、ＤｐｔＡ、ＤｐｔＢＣおよびＤｐｔＤをコードする核酸分子）を提供する。本発明はまた、Ｓ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓに由来する単一のポリペプチド（例えば、ＤｐｔＡ、ＤｐｔＢＣまたはＤｐｔＤ）またはそれらのポリペプチドフラグメント、ムテイン、融合タンパク質、ポリペプチドアナログもしくは相同タンパク質をコードする核酸分子を提供する。本発明はまた、他のＳ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ配列とは関連していない核酸配列（例えば、発現制御配列）を提供する。
【０１２１】
特定の実施形態では、本発明の核酸分子は、以下のプラスミドまたはコスミドのいずれもが先行技術の一部であって、本願において作成された任意の特定の請求項の範囲に入る程度に、その全体が本明細書中に参考として援用される、ＭｃＨｅｎｎｅｙら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０：１４３−１５１（１９９８）によって、ｐＲＨＢ１５３、ｐＲＨＢ１５７、ｐＲＨＢ１５９、ｐＲＨＢ１６０、ｐＲＨＢ１６１、ｐＲＨＢ１６２、ｐＲＨＢ１６６、ｐＲＨＢ１６８、ｐＲＨＢ１６９、ｐＲＨＢ１７０、ｐＲＨＢ１７２、ｐＲＨＢ１７３、ｐＲＨＢ１７４、ｐＲＨＢ５９９、ｐＲＨＢ６０２、ｐＲＨＢ６０３、ｐＲＨＢ６１３、ｐＲＨＢ６１４、ｐＲＨＢ６８０、ｐＲＨＢ６７８またはｐＲＨＢ５８８と称される、プラスミド、コスミドのいずれか１以上を含まないかもしれない。さらに、実施された分析は、ＭｃＨｅｎｎｅｙら，前出において引用されたプラスミドまたはコスミド中のダプトマイシン挿入物のうちのいくつかの位置および方向が間違っていることを示した。
【０１２２】
（発現制御配列）
別の実施形態では、本発明は、ダプトマイシン生合成遺伝子クラスターに由来するチオエステラーゼまたはダプトマイシンＮＲＰＳをコードする核酸配列を含む遺伝子由来の１以上の発現制御配列を含む核酸分子を提供する。好ましい実施形態では、この核酸分子は、ダプトマイシンＮＲＰＳまたはｄｐｔＨの発現制御配列の一部分または全てを含む。なおより好ましい実施形態では、この核酸分子は、配列番号２または配列番号５の全てまたは一部分を含む。別の好ましい実施形態では、この核酸分子は、ＢＡＣクローン（Ｂ１２：０１Ｇ０５、Ｂ１２：０６Ａ１２、Ｂ１２：１２Ｆ０６、Ｂ１２：１８Ｈ０４、Ｂ１２：２０Ｃ０９または好ましくはＢ１２：０３Ａ０５）のうちのいずれか１つに由来するＳ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ核酸配列由来の発現制御配列を含む。理論によって束縛されることを望まないが、ダプトマイシン生合成遺伝子クラスター（配列番号２）中のｄｐｔＡの上流の核酸配列は、ｄｐｔＡ、ｄｐｔＢＣおよびｄｐｔＤについてネイティブな発現制御配列を含むと考えられる。さらに、ｄｐｔＡ、ｄｐｔＢＣおよびｄｐｔＤについての単一の転写産物が作製され、そしてＤｐｔＡ、ＤｐｔＢＣおよびＤｐｔＤの発現が、翻訳的に共役していると考えられる。
【０１２３】
好ましい実施形態では、ダプトマイシン生合成遺伝子クラスター由来のダプトマイシンＮＲＰＳおよび／またはチオエステラーゼをコードする核酸配列を含む、遺伝子の発現制御配列全体を用いて転写が制御される。別の実施形態では、ダプトマイシン生合成遺伝子クラスター由来のダプトマイシンＮＲＰＳおよび／またはチオエステラーゼをコードする核酸配列を含む遺伝子の発現制御配列の一部分のみを用いて転写が制御される。当業者は、当該分野で公知の方法を用いて、その遺伝子のどの部分を用いて転写を制御するかを決定し得る。例えば、ダプトマイシンＮＲＰＳおよび／またはチオエステラーゼ遺伝子の発現制御配列の全てまたは一部分を含む核酸配列を、レポーター遺伝子を含むベクターに連結し得る。このようなレポーター遺伝子の例としては、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、グリーン蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼなどが挙げられるがこれらに限定されない。この発現制御配列を含む核酸分子は、レポーター遺伝子のプロモーターまたはエンハンサーとして作用し得るように、ベクターに連結される。このベクターは宿主細胞中に導入され、そして発現が誘導される。次いで、レポーター遺伝子産物の産生についてアッセイして、その発現制御配列のその部分が、転写を活性化または調節するに充分であるか否かを決定し得る。核酸配列が、転写を調節するために充分であるか否かを決定する方法は、当該分野で慣用的であり、そして周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、前出を参照のこと。
【０１２４】
本明細書中に記載される発現制御配列の全てまたは一部分を（またはこれらの発現制御配列もしくはそれらの一部分を複数コピー）含む核酸分子は、第二の核酸分子に作動可能に連結されて、その第二の核酸分子の転写を調節し得る。１つの実施形態では、本発明は、異種核酸分子（例えば、Ｓ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓによって通常発現されないポリペプチドをコードする核酸分子）に作動可能に連結された発現制御配列を含む核酸分子を提供する。別の好ましい実施形態では、この発現制御配列を含む核酸分子は、ベクター（好ましくは、細菌ベクター）へと導入される。より好ましい実施形態では、このベクターは、細菌宿主細胞中へと、より好ましくはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓまたはＥ．ｃｏｌｉ中へと、そしてさらにより好ましくはＳ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ宿主細胞、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ宿主細胞またはＳ．ｆｒａｄｉａｅ宿主細胞中へと導入される。
【０１２５】
本発明はまた、ダプトマイシンＮＲＰＳに含まれるポリペプチドをコードする核酸配列、ダプトマイシン生合成遺伝子クラスター由来のチオエステラーゼをコードする核酸配列、またはＢＡＣクローン由来の核酸分子もしくは本明細書中に記載のそれらの一部分へと作動可能に連結された、本明細書中に記載された通りのＳ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ由来の発現制御配列を含む核酸配列を提供する。この発現制御配列は、ＤｐｔＡ、ＤｐｔＢＣ、ＤｐｔＤもしくはＤｐｔＨをコードする核酸分子へと、本発明のＢＡＣクローン（好ましくはＢ１２：０３Ａ０５）由来のＳ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ配列由来のポリペプチドをコードする核酸分子へと、またはそれらのフラグメント、相同タンパク質、ムテイン、アナログ、誘導体もしくは融合タンパク質をコードする核酸分子へと作動可能に連結され得る。この発現制御配列は、配列番号９、配列番号１１、配列番号７もしくは配列番号８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列へと、またはそれらのフラグメントへと、作動可能に連結され得る。好ましくは、この発現制御配列は、ｄｐｔＡ、ｄｐｔＢＣ、ｄｐｔＤまたはｄｐｔＨのうちの１以上のコード領域へと作動可能に連結される。より好ましい実施形態では、この発現制御配列は、配列番号１０、配列番号１２、配列番号３もしくは配列番号６から選択される核酸配列へと、またはそれらの一部分へと、作動可能に連結される。本発明はまた、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０４、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４もしくは配列番号１３６のアミノ酸配列を含むポリペプチドのコード領域へと、または配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３もしくは配列番号１３５の核酸配列を含む核酸分子へと、作動可能に連結された発現制御配列を提供する。
【０１２６】
別の実施形態では、本発明は、ダプトマイシンＮＲＰＳ、そのサブユニット、モジュールもしくはドメインをコードする核酸分子、チオエステラーゼをコードする核酸分子、本発明のＢＡＣクローンに由来するＳ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ配列に由来するポリペプチドをコードする核酸分子の転写を指向する、１以上の発現制御配列を含む核酸分子を提供し、ここで、この発現制御配列は、ダプトマイシン生合成遺伝子クラスターに由来しない。適切な発現制御配列の例は、以下に提供される。
【０１２７】
（発現ベクター、宿主細胞およびポリペプチドを産生する組換え方法）
核酸配列は、これらを適切な発現ベクター中で発現制御配列へと作動可能に連結し、そしてその発現ベクターを用いて適切な単細胞宿主を形質転換することによって発現され得る。発現制御配列は、核酸配列の転写、転写後事象および翻訳を制御する配列である。発現制御配列への本発明の核酸配列のこのような作動的連結は、もちろん、予めその核酸配列の一部でなかったとしても、その核酸配列の上流の適切なリーディングフレームでの、翻訳開始コドン（ＡＴＧまたはＧＴＧ）の提供を含む。
【０１２８】
広範な種々の宿主／発現ベクターの組合せが、本発明の核酸配列を発現させる際に用いられ得る。例えば、有用な発現ベクターは、染色体の核酸配列、非染色体性核酸配列および合成核酸配列のセグメントからなっていてもよい。
【０１２９】
好ましい実施形態では、細菌宿主細胞を用いて、本発明の核酸分子を発現させる。細菌宿主についての有用な発現ベクターとしては、以下が挙げられる：細菌プラスミド（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ由来の細菌プラスミド；ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＵＣベクター、ｃｏｌ  Ｅ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９およびそれらの誘導体を包含する）、より広範な宿主域のプラスミド（例えば、ＲＰ４）、ファージＤＮＡ（例えば、λファージの多数の誘導体（例えば、ＮＭ９８９、λＧＴ１０およびλＧＴ１１）および他のファージ（例えば、Ｍ１３および線維状１本鎖ファージＤＮＡ））。好ましいベクターは、細菌人工染色体（ＢＡＣ）である。より好ましいベクターは、実施例２に記載されるように、ｐＳｔｒｅｐｔｏＢＡＣである。
【０１３０】
他の実施形態では、真核生物宿主細胞（例えば、酵母細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞）が用いられ得る。酵母ベクターとしては、以下が挙げられる：酵母組込みプラスミド（例えば、ＹＩｐ５）および酵母複製プラスミド（ＹＲｐシリーズおよびＹＥｐシリーズのプラスミド）、酵母動原体プラスミド（ＹＣｐシリーズのプラスミド）、ｐＧＰＤ−２、２μプラスミドおよびそれらの誘導体、ならびに改良されたシャトルベクター（例えば、ＧｉｅｔｚおよびＳｕｇｉｎｏ，Ｇｅｎｅ，７４，５２７−３４頁（１９８８）に記載されるシャトルベクター（ＹＩｐｌａｃ、ＹＥｐｌａｃおよびＹＣｐｌａｃ））。哺乳動物細胞における発現は、種々のプラスミド（ｐＳＶ２、ｐＢＣｌ２ＢＩ、およびｐ９１０２３を含む）ならびに溶菌ウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、およびバキュロウイルス）、エピソーム性ウイルスベクター（例えば、ウシ乳頭腫ウイルス）およびレトロウイルスベクター（例えば、マウスレトロウイルス）を用いて達成され得る。昆虫細胞に関して有用なベクターとしては、バキュロウイルスベクターおよびｐＶＬ  ９４１が挙げられる。
【０１３１】
さらに、広範な種々の発現制御配列のうちのいずれかをこれらのベクターにおいて用いて、本発明のＤＮＡ配列を発現し得る。このような有用な発現制御配列としては、上記の発現ベクターの構造遺伝子と関連する発現制御配列が挙げられる。転写を制御する発現制御配列としては、例えば、プロモーター、エンハンサーおよび転写終結部位が挙げられる。転写後事象を制御する、真核生物細胞中の発現制御配列としては、スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位、ならびに転写されたＲＮＡの半減期を改変する配列（例えば、ポリ（Ａ）付加またはＲＮＡ結合タンパク質についての結合部位を指向する配列）が挙げられる。翻訳を制御する発現制御配列としては、以下が挙げられる：リボソーム結合部位、特定の細胞区画へと標的化されたかもしくは特定の細胞区画内でのポリペプチド発現を指向する配列、ならびに翻訳の速度または効率を改変する、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域の配列。
【０１３２】
有用な発現制御配列の例としては、例えば、以下が挙げられる：ＳＶ４０もしくはアデノウイルスの初期プロモーターおよび後期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系もしくはＴＲＣ系、Ｔ３プロモーターおよびＴ７プロモーター、λファージの主要オペレーター領域および主要プロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセレートキナーゼもしくは他の解糖酵素についてのプロモーター、酸性ホスファターゼ（例えば、Ｐｈｏ５）のプロモーター、酵母α接合系のプロモーター、ＧＡＬ１プロモーターもしくはＧＡＬ１０プロモーター、ならびに原核生物細胞もしくは真核生物細胞またはそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することが公知の、他の構成性プロモーター配列および誘導性プロモーター配列、ならびにそれらの種々の組合せ。他の発現制御配列としては、ダプトマイシン生合成遺伝子クラスター由来の発現制御配列（例えば、前出に記載の発現制御配列）が挙げられる。
【０１３３】
好ましい核酸ベクターとしてはまた、選択マーカー遺伝子または増幅可能マーカー遺伝子、および目的の遺伝子のコピー数を増幅するための手段が挙げられる。このようなマーカー遺伝子は、当該分野で周知である。核酸ベクターはまた、安定化配列（例えば、ｏｒｉ様配列またはＡＲＳ様配列およびテロメア様配列）を含み得るか、あるいは、宿主細胞ゲノムへの特異的組込みまたは非特異的組込みに好都合であるように設計され得る。好ましいマーカー遺伝子および安定化配列は、ｐＳｔｒｅｐｔｏＢＡＣに開示されており、これは、実施例２において記載されている。好ましい実施形態では、本発明の核酸配列は、目的のコードされる核酸配列を含む、タンパク質をコードするＲＮＡの高レベルの発現を可能にする発現ベクター中にインフレームで挿入される。核酸のクローニング方法および配列決定方法は、当業者に周知であり、そして一揃いの実験マニュアル（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出，１９８９；およびＡｕｓｕｂｅｌらを含む）に記載される。生物学的試薬、化学的試薬および免疫学的試薬の製造業者からの製品情報もまた、有用な情報を提供する。実施例２は、好ましい核酸のクローニング方法および配列決定方法を提供する。
【０１３４】
もちろん、全てのベクターおよび発現制御配列が、本発明の核酸配列を発現させるために等しく良好に機能するわけではない。同じ発現系を用いたからといって、全ての宿主が等しく良好に機能するわけでもない。しかし、当業者は、これらのベクター、発現制御配列および宿主の中から、過度の実験を行うことなく、本発明の範囲から逸脱することなく、選択を行い得る。例えば、ベクターを選択する際に、宿主が考慮されなければならなり。なぜなら、そのベクターは、その中で複製されなければならないからである。このベクターのコピー数、コピー数を制御する能力、組込みを制御する能力（ある場合）、およびそのベクターによってコードされる任意の他のタンパク質（例えば、抗生物質または他の選択マーカー）の発現もまた考慮されるべきである。
【０１３５】
発現制御配列を選択する際に、種々の要因もまた考慮されるべきである。これらとしては、例えば、以下が挙げられる：その配列の相対強度、その制御性、および（特に、潜在的二次構造に関しての）本発明の核酸配列とのその適合性。単細胞宿主は、選択されたベクターとの適合性、本発明の核酸配列によってコードされる産物の毒性、それらの分泌特徴、それらがポリペプチドを正確に折り畳む能力、それらの発酵必要要件もしくは培養必要要件、およびそれらからの本発明の核酸配列によってコードされる産物の精製の容易さを考慮することによって、選択されるべきである。
【０１３６】
組換え核酸分子およびより詳細には、本発明の発現ベクターを用いて、本発明のポリペプチドを組換えポリペプチドとして異種宿主細胞中で発現し得る。本発明のポリペプチドは、本発明による核酸配列から組換えによって発現された、全長または全長よりも短いポリペプチドフラグメントであり得る。このようなポリペプチドとしては、生物学的活性を有しても有さなくてもよい、アナログ、誘導体およびムテインが挙げられる。好ましい実施形態では、これらのポリペプチドは、異種細菌宿主細胞中で発現される。より好ましい実施形態では、これらのポリペプチドは、異種Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ宿主細胞中で、さらにより好ましくはＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ宿主細胞またはＳ．ｆｒａｄｉａｅ宿主細胞中で発現される。例えば、以下の実施例７を参照のこと。
【０１３７】
形質転換方法および核酸を宿主細胞中へ導入する他の方法（例えば、結合体化、プロトプラスト形質転換もしくはプロトプラスト融合、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染およびプロトプラスト融合）は、当該分野で周知である種々の方法（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，前出およびＳａｍｂｒｏｏｋら，前出を参照のこと）によって達成され得る。細菌細胞、酵母細胞、植物細胞または哺乳動物細胞は、発現ベクター（例えば、プラスミド、コスミドなど）で形質転換またはトランスフェクトされ、ここで、この発現ベクターは、目的の核酸を含む。あるいは、これらの細胞は、目的の核酸を含むウイルス発現ベクターによって感染され得る。用いられる宿主細胞、ベクター、および形質転換方法に依存して、このポリペプチドの一過性または安定した発現は、構成的または誘導性である。当業者は、ポリペプチドを一過性に発現させるかまたは安定した様式で発現させるかを、そしてそのタンパク質を構成的に発現させるかまたは誘導的に発現させるかを、決定し得る。
【０１３８】
広範な種々の単細胞宿主細胞は、本発明のＤＮＡ配列を発現させる際に有用である。これらの宿主としては、周知の真核生物宿主および原核生物宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞株、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細胞株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ細胞株、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ細胞株、真菌細胞株、酵母細胞株、昆虫細胞株（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ＳＦ９））、動物細胞株（例えば、ＣＨＯ細胞株、ＢＨＫ細胞株、ＭＤＣＫ細胞株および種々のマウス細胞株（例えば、３Ｔ３細胞株およびＷＥＨＩ細胞株）、アフリカミドリザル細胞株（例えば、ＣＯＳ１細胞株、ＣＯＳ７細胞株、ＢＳＣ１細胞株、ＢＳＣ４０細胞株およびＢＭＴ１０細胞株）ならびにヒト細胞株（例えば、ＶＥＲＯ細胞株、ＷＩ３８細胞株、およびＨｅＬａ細胞株））ならびに組織培養中の植物細胞が挙げられ得る。好ましい実施形態では、この宿主細胞は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓである。より好ましい実施形態では、この宿主細胞は、Ｓ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓまたはＳ．ｆｒａｄｉａｅである。
【０１３９】
組換えタンパク質のトランスフェクション、発現および精製の特定の詳細は、充分に実証されており、当業者によって理解される。さらに、細菌細胞発現系における外来遺伝子の組換え産生において用いられる工程の各々の種々の技術的局面についての詳細は、当該分野における多数の教科書および実験マニュアルに見出され得る。例えば、本明細書中に参考として援用される、Ａｕｓｕｂｅｌら，前出、およびＳａｍｂｒｏｏｋら，前出、およびＫｉｅｓｅｒら，前出を参照のこと。
【０１４０】
（ポリペプチド）
（チオエステラーゼおよびそのフラグメント）
本発明の別の目的は、ダプトマイシン合成に関与するチオエステラーゼに由来するポリペプチドを提供することである。１つの実施形態において、このポリペプチドは、ダプトマイシン生合成遺伝子クラスターに由来する。好ましい実施形態では、このポリペプチドは、内在性チオエステラーゼまたは遊離チオエステラーゼに由来する。より好ましい実施形態では、このポリペプチドは、ＤｐｔＤのチオエステラーゼドメインまたはＤｐｔＨのアミノ酸配列を含む。さらにより好ましい実施形態では、このポリペプチドは、配列番号７のチオエステラーゼドメインのアミノ酸配列または配列番号８のアミノ酸配列を含む。チオエステラーゼ由来のポリペプチドはまた、以下のいずれかのＢＡＣクローン由来のＳ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ核酸配列によってコードされ得る：Ｂ１２：０１Ｇ０５、Ｂ１２：０６Ａ１２、Ｂ１２：１２Ｆ０６、Ｂ１２：１８Ｈ０４、Ｂ１２：２０Ｃ０９またはＢ１２：０３Ａ０５（好ましくは、Ｂ１２：０３Ａ０５由来）。本明細書中に規定されるようなポリペプチドは、本明細書の教示に従い、そして当業者に周知の方法を使用して、上記で考察したように組換え生成され得るか、このタンパク質を天然において発現する細胞から単離され得るか、または化学合成され得る。例えば、実施例３〜６を参照のこと。
【０１４１】
このポリペプチドは、本明細書中に規定されるような、チオエステラーゼのフラグメントを含み得る。チオエステラーゼ全体の中の一部分のみまたはそのフラグメントのみを含むポリペプチドは、チオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしてもしなくてもよい。チオエステラーゼ活性を有さないポリペプチドは、それがフラグメントであろうと、アナログであろうと、ムテインであろうと、相同性タンパク質であろうと、または誘導体であろうと、特に、抗チオエステラーゼ抗体を調製するために動物を免疫するためにやはり有用である。しかし、好ましい実施形態では、この部分またはフラグメントは、チオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。ポリペプチドがチオエステラーゼ活性を有するか否かを決定する方法は、以下に記載される。さらに、好ましい実施形態において、このフラグメントは、ＧＸＳＸＧチオエステラーゼモチーフを含むアミノ酸配列を含む（実施例３を参照のこと）。より好ましい実施形態では、このフラグメントは、配列番号７のチオエステラーゼドメインまたは配列番号８のアミノ酸配列にそれぞれ由来する、チオエステラーゼのモチーフＧＷＳＦＧまたはＧＴＳＬＧを含むアミノ酸配列を含む。
【０１４２】
チオエステラーゼをコードするポリペプチドのフラグメントは、そのチオエステラーゼをコードするＤＮＡを短縮化（ｔｒｕｎｃａｔｅ）し、次いで、それを組換え的に発現させることによって、生成され得る。あるいは、フラグメントは、全長ポリペプチドの中の一部分を化学合成することによって生成され得る。フラグメントはまた、組換えポリペプチドまたは単離された天然に存在するポリペプチドのいずれかを酵素的に切断することによっても生成され得る。ポリペプチドフラグメントを生成する方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、およびＡｕｓｕｂｅｌら、前出、を参照のこと）。１つの実施形態では、チオエステラーゼの一部分のみまたはフラグメントのみを含むポリペプチドは、チオエステラーゼを化学的または酵素的に切断することによって生成され得る。好ましい実施形態では、ポリペプチドフラグメントは、宿主細胞においてそのチオエステラーゼのフラグメントをコードする核酸分子を発現させることによって生成される。
【０１４３】
（ダプトマイシンＮＲＰＳポリペプチド、ならびにそのサブユニットおよびフラグメント）
本発明の別の目的は、ダプトマイシンＮＲＰＳまたはそのサブユニットに由来するポリペプチドを提供することである。ダプトマイシンＮＲＰＳは、サブユニットＤｐｔＡ、ＤｐｔＢＣおよびＤｐｔＤを含む。以下の実施例３〜６においてより詳細に考察されるように、各サブユニットは、特定のビルディングブロック基質に結合し、そしてその基質を活性化し、そしてペプチド鎖の形成および伸長を触媒するための、多数のモジュールを含む。さらに、各モジュールは、縮合化、アデニル化およびチオール化に関与する多数のドメインを含む。さらに、いくつかのモジュールは、実施例６においてより詳細に考察される、エピマー化ドメインを含む。ＤｐｔＤはまた、上記および実施例５において考察されるような、チオエステラーゼドメインを含む。
【０１４４】
１つの実施形態では、このポリペプチドは、ＤｐｔＡ、ＤｐｔＢＣおよび／またはＤｐｔＤ由来のアミノ酸配列を含む。さらにより好ましい実施形態では、このポリペプチドは、配列番号９、１１または７のアミノ酸配列を含む。ダプトマイシンＮＲＰＳポリペプチドはまた、以下のいずれかのＢＡＣクローン由来のＳ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ核酸配列によってコードされ得る：Ｂ１２：０１Ｇ０５、Ｂ１２：０６Ａ１２、Ｂ１２：１２Ｆ０６、Ｂ１２：１８Ｈ０４、Ｂ１２：２０Ｃ０９またはＢ１２：０３Ａ０５（好ましくは、Ｂ１２：０３Ａ０５由来）。本明細書中に規定されるようなポリペプチドは、本明細書の教示に従い、そして当業者に周知の方法を使用して、上記で考察したように組換え生成され得るか、このタンパク質を天然において発現する細胞から単離され得るか、または化学合成され得る。アミノ酸配列ならびにＤｐｔＡ、ＤｐｔＢＣおよびＤｐｔＤのモジュールおよびドメインに関しては、例えば、実施例３〜６を参照のこと。
【０１４５】
このポリペプチドは、本明細書中に規定されるようなダプトマイシンＮＲＰＳのフラグメントを含み得る。１つの実施形態において、フラグメントは、ダプトマイシンＮＲＰＳサブユニットの１つ以上の完全モジュールを含む。別の実施形態において、フラグメントは、ダプトマイシンＮＲＰＳサブユニットの１つ以上のドメインを含む。さらに別の実施形態において、フラグメントは、完全なドメインも完全なモジュールも含まなくてよいが、１つ以上のドメインまたはモジュールの一部分のみを含み得る。ダプトマイシンＮＲＰＳの完全なドメインも完全なモジュールも含まないポリペプチドは、それがフラグメントであろうと、アナログであろうと、ムテインであろうと、相同性タンパク質であろうと、または誘導体であろうと、特に、抗チオエステラーゼ抗体を調製するために動物を免疫するためにやはり有用である。より好ましい実施形態では、このフラグメントは、アミノ酸への結合のために必要とされるアデニル化ドメインの部分を少なくとも含む、アミノ酸配列を含む。ドメインのこの部分は、実施例５において下記で考察されるように、特定のアデニル化ドメインのアミノ酸ポケットコード（ｐｏｃｋｅｔ  ｃｏｄｅ）によって区切られる。
【０１４６】
上記で考察したように、本発明のポリペプチドのフラグメントは、組換え的に、化学合成によって、または酵素的切断によって、生成され得る。
【０１４７】
（Ｓ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ  ＢＡＣクローン由来のポリペプチド）
本発明の別の目的は、本発明のＳ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ  ＢＡＣクローン由来の核酸分子またはその部分によってコードされるポリペプチドを提供することである。１つの実施形態において、本発明は、以下に由来する核酸分子またはその部分によってコードされるポリペプチドを提供する：１Ｇ０５、Ｂ１２：０６Ａ１２、Ｂ１２：１２Ｆ０６、Ｂ１２：１８Ｈ０４、Ｂ１２：２０Ｃ０９、または、好ましくは、Ｂ１２：０３Ａ０５。好ましい実施形態において、本発明は、配列番号１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０４、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４もしくは１３６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３もしくは１３５の核酸配列を含む核酸分子によってコードされるポリペプチド、を提供する。別の好ましい実施形態では、本発明は、ＤｐｔＥもしくはＤｐｔＦであるポリペプチド、配列番号１５もしくは配列番号１７のアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはｄｐｔＥもしくはｄｐｔＦによってコードされるポリペプチド、または配列番号１６もしくは配列番号１８の核酸配列によってコードされるポリペプチドを提供する。別の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号１９、２１、２９、４５、４７、４９、６３、６７、７５および７７のアミノ酸配列を含むＡＢＣトランスポーター、または配列番号２０、２２、３０、４６、４８、５０、６４、６８、７６もしくは７８の核酸配列によってコードされるＡＢＣトランスポーターを提供する。別の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号２３、２５、２７、２９、３３、３５、３７、９１、９３、９７および９９から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドによって提供されるような、オキシドレダクターゼ（例えば、デヒドロゲナーゼ）；抗生物質耐性に関与する、転写調節因子；ＮｏｖＡＢＣ関連ポリペプチド（これは、抗菌剤であるノボビオシンの生合成に関与する）；モノオキシゲナーゼ；アシルＣｏＡチオエステラーゼ；ＤＮＡヘリカーゼ；またはＤＮＡリガーゼであるポリペプチドを提供する。別の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号６１、６５、６９、７９、８１、８３、８５、８７、９５および１０１から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドによって提供されるような、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓのポリペプチドと高度に相同なポリペプチドを提供する。本明細書中に規定されるようなポリペプチドは、本明細書の教示に従い、そして���業者に周知の方法を使用して、上記で考察したように組換え生成され得るか、このタンパク質を天然において発現する細胞から単離され得るか、または化学合成され得る。本発明はまた、本明細書中に規定されるようなＢＡＣクローン由来のポリペプチドをコードする核酸分子のフラグメントを含むポリペプチドを提供する。上記で考察したように、本発明のポリペプチドのフラグメントは、組換え的に、化学合成によって、または酵素的切断によって、生成され得る。
【０１４８】
（ムテイン、相同性タンパク質、対立遺伝子改変体、アナログおよび誘導体）
本発明の別の目的は、本明細書中に提供されるダプトマイシンＮＲＰＳ、そのサブユニット、チオエステラーゼ、もしくはＳ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓのＢＡＣ核酸分子によってコードされるポリペプチド、またはそれらの部分の変異体タンパク質（ムテイン）、融合タンパク質、相同性タンパク質、または対立遺伝子改変体であるポリペプチドを提供することである。変異体チオエステラーゼは、天然に存在するチオエステラーゼと比較して、同じかまたは異なる酵素活性を有し得、そしてネイティブのタンパク質のアミノ酸配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、重複、欠失、再編成、または置換を含む。１つの実施形態において、このムテインは、天然に存在するチオエステラーゼと比較して、同じかまたは減少したチオエステラーゼ活性を有する。別の実施形態では、この変異体チオエステラーゼは、天然に存在するチオエステラーゼと比較して、増加したチオエステラーゼ活性を有する。好ましい実施形態では、ダプトマイシン生合成遺伝子クラスターの中のチオエステラーゼのムテインが、チオエステラーゼ活性を改変するために使用され得る。例えば、実施例１２および１３を参照のこと。別の実施形態では、変異体ダプトマイシンＮＲＰＳまたはそのサブユニットは、天然に存在するダプトマイシンＮＲＰＳと同じかまたは異なるアミノ酸特異性、チオール化活性、縮合化活性、または存在する場合には、エピマー化活性を有し得る。ダプトマイシンＮＲＰＳムテインを使用して、ＮＲＰＳのアミノ酸認識、結合、エピマー化、または他の触媒特性を改変し得る。例えば、実施例１２および１６を参照のこと。同様に、本発明のＳ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ  ＢＡＣ核酸分子によってコードされるポリペプチドのムテインは、類似の生物学的活性を有し得るかまたは異なる生物学的活性を有し得るが、好ましくは、類似の生物学的活性を有する。
【０１４９】
本発明のムテインは、天然に存在する変異体微生物からの単離もしくは実験的に変異誘発された微生物からの単離によって生成され得るか、ポリペプチドの化学的操作によって生成され得るか、または改変された核酸分子を含む宿主細胞から生成され得る。好ましい実施形態では、このムテインは、改変された核酸分子を含む宿主細胞から生成される。ムテインはまた、合成化学技術または半合成化学技術を使用して、アミノ酸残基を別のアミノ酸残基に改変することによって化学的に生成され得る。ポリペプチドのムテインは、ダプトマイシンＮＲＰＳ、そのサブユニットもしくはチオエステラーゼをコードする核酸配列に変異を導入するか、またはＳ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓのＢＡＣ核酸分子に変異を導入すること、次いで、それを組換え的に発現させることによって、生成され得る。これらの変異は、標的化（ここでは、特定のコードアミノ酸が改変される）であり得るか、または非標的化（ここでは、ポリペプチド内の無作為なコードアミノ酸が改変される）であり得る。無作為なアミノ酸改変を有するムテインは、チオエステラーゼ活性、アミノ酸特異性、チオール化活性、エピマー化活性、または縮合化活性（以下に記載される）のような特定の生物学的活性についてスクリーニングされ得る。ムテインはまた、当該分野で公知の方法を使用して、例えば、オキシドレダクターゼ活性、ＡＢＣトランスポーター活性、モノオキシゲナーゼ活性、またはＤＮＡリガーゼ活性もしくはＤＮＡヘリカーゼ活性についてスクリーニングされ得る。複数の無作為な変異が、当該分野で周知の方法によって（例えば、誤りがちなＰＣＲ、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、アセンブリＰＣＲ、有性的ＰＣＲ変異誘発（ｓｅｘｕａｌ  ＰＣＲ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、インビボ変異誘発、カセット変異誘発、再帰的アンサンブル変異誘発（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  ｅｎｓｅｍｂｌｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、指数関数的アンサンブル変異誘発（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｓｅｍｂｌｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、および部位特異的変異誘発によって）、遺伝子に導入され得る。標的化されたアミノ酸改変または無作為なアミノ酸改変を有するムテインを生成する方法は、当該分野で周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、Ａｕｓｕｂｅｌら、前出、米国特許第５，２２３，４０８号、および上記で考察された参考文献（各々が、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【０１５０】
本発明はまた、ダプトマイシン生合成遺伝子クラスター由来のダプトマイシンＮＲＰＳ、そのサブユニット、チオエステラーゼに対して相同性であるか、または本明細書中に記載されるようなＳ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓのＢＡＣ核酸分子によりコードされるポリペプチドに対して相同である、ポリペプチドを提供する。１つの実施形態では、このポリペプチドは、ＤｐｔＤのチオエステラーゼドメインもしくはＤｐｔＨに対して相同性であるか、またはｄｐｔＤのチオエステラーゼドメインもしくはｄｐｔＨによってコードされるポリペプチドに対して相同性である。好ましい実施形態では、このポリペプチドは、配列番号７のチオエステラーゼドメインのアミノ酸配列を有するチオエステラーゼ、または配列番号８のアミノ酸配列を有するチオエステラーゼに対して相同性である。別の実施形態では、このポリペプチドは、ＤｐｔＡ、ＤｐｔＢＣもしくはＤｐｔＤに対して相同性であるか、またはｄｐｔＡ、ｄｐｔＢＣもしくはｄｐｔＤによってコードされるポリペプチドに対して相同性である。より好ましい実施形態において、このポリペプチドは、配列番号９、１１または３のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して相同性である。本発明はまた、本明細書中に記載されるＳ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓのＢＡＣクローン（例えば、１Ｇ０５、Ｂ１２：０６Ａ１２、Ｂ１２：１２Ｆ０６、Ｂ１２：１８Ｈ０４、Ｂ１２：２０Ｃ０９、または、好ましくは、Ｂ１２：０３Ａ０５）由来の核酸分子によってコードされるポリペプチドに対して相同性であるポリペプチドを提供する。好ましい実施形態において、本発明は、配列番号１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０４、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４もしくは１３６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３もしくは１３５から選択される核酸配列を含む核酸分子によってコードされるポリペプチドに対して相同なポリペプチドを提供する。
【０１５１】
好ましい実施形態において、この相同なポリペプチドは、本発明のポリペプチドに対して、かなりの配列同一性を示すポリペプチドである。より好ましい実施形態では、この相同なポリペプチドは、配列番号９、１１、７、もしくは８または配列番号１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０４、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４もしくは１３６のアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、または８０％の配列同一性を示すポリペプチドである。さらにより好ましい実施形態では、この相同なポリペプチドは、配列番号９、１１、７、もしくは８または配列番号１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０４、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４もしくは１３６のアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を示すポリペプチドである。
【０１５２】
相同なタンパク質は、別の種に由来する天然に存在するタンパク質、特に、別のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種に由来するタンパク質、または別のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ株に由来するタンパク質であり得、ここで相同なタンパク質は、配列番号９、１１、７、もしくは８または配列番号１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０４、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４もしくは１３６のアミノ酸配列に対して、かなりの配列同一性を示すアミノ酸配列を含む。天然に存在する相同なタンパク質は、他の種または他の株から直接に単離され得る。あるいは、天然に存在する相同なタンパク質をコードする核酸分子が単離され得、そしてその相同なタンパク質を組換え的に発現させるために使用し得る。別の実施形態において、相同なタンパク質は、核酸分子の無作為変異と、それに続くその核酸分子の発現とによって実験的に生成されるタンパク質であり得る。別の実施形態において、相同なタンパク質は、ポリペプチドのコードアミノ酸を改変するように１つ以上のコドンを特異的に変異させることによって実験的に生成されるタンパク質であり得る。
【０１５３】
別の実施形態では、本発明は、ダプトマイシン生合成遺伝子クラスター由来のチオエステラーゼ、またはダプトマイシンＮＲＰＳもしくはそのサブユニットをコードする遺伝子の対立遺伝子改変体によってコードされるポリペプチドを提供する。好ましい実施形態では、本発明は、ｄｐｔＡ、ｄｐｔＢＣ、ｄｐｔＤまたはｄｐｔＨの対立遺伝子改変体によってコードされるポリペプチドを提供する。さらにより好ましい実施形態では、このポリペプチドは、配列番号９、１１、７または８のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子の対立遺伝子改変体によってコードされる。さらにより好ましい実施形態では、このポリペプチドは、遺伝子の対立遺伝子改変体によってコードされ、ここでこの遺伝子は、配列番号１０、１２、３または６の核酸配列を有する。対立遺伝子改変体は、本明細書中に記載されるチオエステラーゼ、ダプトマイシンＮＲＰＳまたはそれらのサブユニットと同じかまたは異なる生物学的活性を有し得る。好ましい実施形態では、対立遺伝子改変体は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの別の種に由来し、さらにより好ましくは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓの株に由来する。別の実施形態では、本発明は、以下のいずれかのＢＡＣクローン由来のＳ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ核酸配列の対立遺伝子改変体によってコードされるポリペプチドを提供する：Ｂ１２：０１Ｇ０５、Ｂ１２：０６Ａ１２、Ｂ１２：１２Ｆ０６、Ｂ１２：１８Ｈ０４、Ｂ１２：２０Ｃ０９またはＢ１２：０３Ａ０５（好ましくは、Ｂ１２：０３Ａ０５由来）。好ましい実施形態において、このポリペプチドは、配列番号１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０４、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４もしくは１３６のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子の対立遺伝子改変体によってコードされるか、または配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３もしくは１３５の核酸配列を有する遺伝子の対立遺伝子改変体によってコードされる遺伝子の対立遺伝子改変体によってコードされる。
【０１５４】
別の実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチドの誘導体を提供する。好ましい実施形態において、この誘導体は、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化、グリコシル化、またはユビキチン化されている。別の好ましい実施形態において、この誘導体は、例えば、放射性同位元素（例えば、１２５Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、および３Ｈ）で標識されている。別の好ましい実施形態において、この誘導体は、発蛍光団、化学発光剤、酵素および抗リガンド（これは、標識化されたリガンドに対する特異的結合対メンバーとして役立ち得る）で標識されている。好ましい実施形態において、このポリペプチドは、ダプトマイシンの生合成に関与するチオエステラーゼである。さらにより好ましい実施形態において、このポリペプチドは、ＤｐｔＤのチオエステラーゼドメインを含むかもしくはＤｐｔＨのアミノ酸配列を含むか、または、ｄｐｔＤのチオエステラーゼコードドメインもしくはｄｐｔＨによってコードされるチオエステラーゼである。別の好ましい実施形態では、このポリペプチドは、ダプトマイシンＮＲＰＳまたはそのサブユニットであり、より好ましくは、ＤｐｔＡ、ＤｐｔＢＣまたはＤｐｔＤであり、さらにより好ましくは、ｄｐｔＡ、ｄｐｔＢＣまたはｄｐｔＤによってコードされるポリペプチドである。さらにより好ましい実施形態では、このポリペプチドは、配列番号９、１１、７もしくは８のアミノ酸配列を有するか、またはそれらのムテイン、対立遺伝子改変体、相同性タンパク質もしくはフラグメントである。好ましくは、チオエステラーゼ誘導体は、ダプトマイシンの生合成に関与するチオエステラーゼと同じかまたは同様のチオエステラーゼ活性を有し、より好ましくは、この誘導体は、配列番号７のチオエステラーゼドメインのアミノ酸配列を有するチオエステラーゼまたは配列番号８のアミノ酸配列を有するチオエステラーゼと同じかまたは同様のチオエステラーゼ活性を有する。別の好ましい実施形態において、ダプトマイシンＮＲＰＳまたはＮＲＰＳサブユニットの誘導体は、天然に存在するダプトマイシンＮＲＰＳまたはそのサブユニットと同じかまたは同様の活性を有する。さらに別の実施形態において、この誘導体は、以下のいずれかのＢＡＣクローン由来のＳ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ核酸配列由来の核酸分子によってコードされるポリペプチドに由来する：Ｂ１２：０１Ｇ０５、Ｂ１２：０６Ａ１２、Ｂ１２：１２Ｆ０６、Ｂ１２：１８Ｈ０４、Ｂ１２：２０Ｃ０９、または好ましくは、Ｂ１２：０３Ａ０５。好ましい実施形態において、この誘導体は、配列番号１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０４、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４もしくは１３６のアミノ酸配列を有するポリペプチドに由来するか、または配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３もしくは１３５の核酸配列を有する遺伝子によってコードされるポリペプチドに由来する。
【０１５５】
本発明はまた、非ペプチドアナログを提供する。好ましい実施形態において、この非ペプチドアナログは、ダプトマイシン合成に関与するチオエステラーゼと構造的に類似するか、ダプトマイシンＮＲＰＳもしくはそのサブユニットと構造的に類似するか、またはＳ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ  ＢＡＣクローン由来の核酸分子によってコードされるポリペプチドと構造的に類似するが、ここで１つ以上のペプチド結合は、以下：−−ＣＨ２ＮＨ−−、−−ＣＨ２Ｓ−−、−−ＣＨ２−ＣＨ２−−、−−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−−ＣＯＣＨ２−−、−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−および−ＣＨ２ＳＯ−−からなる群より選択される結合によって置換されている。別の実施形態では、非ペプチドアナログは、より安定なペプチドを生成するための、チオエステラーゼまたはダプトマイシンＮＲＰＳもしくはそのサブユニットの１つ以上のアミノ酸の、同じ型のＤ−アミノ酸による置換を含む。好ましくは、非ペプチドアナログおよびペプチドアナログは両方とも、ダプトマイシンの生合成に関与する天然に存在するポリペプチドと同じかまたは類似の生物学的活性を有し、より好ましくは、このアナログは、配列番号９、１１、７もしくは８のアミノ酸配列を有するポリペプチドと同じかまたは類似の生物学的活性を有する。本発明はまた、以下のいずれかのＢＡＣクローン由来のＳ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ核酸配列によってコードされるポリペプチドのアナログを提供する：Ｂ１２：０１Ｇ０５、Ｂ１２：０６Ａ１２、Ｂ１２：１２Ｆ０６、Ｂ１２：１８Ｈ０４、Ｂ１２：２０Ｃ０９またはＢ１２：０３Ａ０５（好ましくは、Ｂ１２：０３Ａ０５由来）。本発明は、配列番号１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０４、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４もしくは１３６のアミノ酸配列を有するポリペプチドのアナログ、または配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３もしくは１３５の核酸配列を有する遺伝子によってコードされるアナログを提供する。
【０１５６】
（融合タンパク質）
本発明のポリペプチドは、遺伝的マーカー、酵素的マーカー、または化学的マーカーもしくは免疫学的マーカー（例えば、エピトープタグ）のような他の分子と融合され得る。融合パートナーとしては、とりわけ、以下が挙げられる：ｍｙｃ、血球凝集素（ＨＡ）、ＧＳＴ、免疫グロブリン、β−ガラクトシダーゼ、ビオチンｔｒｐＥ、プロテインＡ、β−ラクタマーゼ、α−アミラーゼ、マルトース結合タンパク質、アルコールデヒドロゲナーゼ、ポリヒスチジン（例えば、ポリペプチドのアミノ末端および／またはカルボキシル末端における６個のヒスチジン）、ｌａｃＺ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、酵母α接合因子、ＧＡＬ４転写活性化ドメインもしくはＤＮＡ結合ドメイン、ルシフェラーゼ、および血清タンパク質（オボアルブミン、アルブミンおよびＩｇＧの定常ドメイン）。例えば、Ｇｏｄｏｗｓｋｉら、１９８８、およびＡｕｓｕｂｅｌら、前出、を参照のこと。融合タンパク質はまた、酵素（例えば、第ＸＩＩＩ因子、トリプシン、ペプシン、または当該分野で公知の任意の他の酵素）によって認識される部位のような、特異的酵素切断部位を含み得る。融合タンパク質は、代表的に、上記のような組換え核酸方法によって作製されるか、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、１９６３（本明細書中で参考として援用される）に記載のような技術を使用して化学合成されるか、または化学的な架橋によって生成されるかのいずれかである。
【０１５７】
タグ化された融合タンパク質は、容易な位置づけ、スクリーニング、およびエピトープまたは酵素タグを介した特異的結合を可能にする。Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９１、第１６章を参照のこと。いくつかのタグにより、目的のタンパク質が、Ｍ１３のようなファージミドの表面上に提示されることが可能となる。これは、所望されるタンパク質標的に結合し得るパンニング剤について有用である。融合タンパク質の別の利点は、エピトープまたは酵素タグが、精製を単純化し得るという点である。これらの融合タンパク質は、しばしば１つの工程で、アフィニティクロマトグラフィーによって、精製され得る。例えば、Ｈｉｓ６タグ化タンパク質は、Ｎｉアフィニティカラムにおいて精製され得、そしてＧＳＴ融合タンパク質は、グルタチオンアフィニティカラムにおいて精製され得る。同様に、ＩｇＧのＦｃドメインを含む融合タンパク質は、プロテインＡカラムまたはプロテインＧカラムにおいて精製され得、そしてｍｙｃのようなエピトープタグを含む融合タンパク質は、抗−ｃ−ｍｙｃ抗体を含むイムノアフィニティカラムを使用して精製され得る。エピトープタグが、精製後に切断され得る酵素的切断部位によって、本発明の核酸分子によりコードされるタンパク質から分離されていることが好ましい。
【０１５８】
融合タンパク質の第２の利点は、エピトープタグが、スクリーニング標的に対する親和性結合を通して、その融合タンパク質をプレートまたはカラムに結合させるために使用され得るという点である。
【０１５９】
従って、別の局面では、本発明は、ダプトマイシン生合成遺伝子クラスターに由来するチオエステラーゼのすべてまたは一部分を含む融合タンパク質を提供し、そしてこのような融合タンパク質をコードする核酸分子を提供する。別の局面は、ダプトマイシンＮＲＰＳまたはそのサブユニットのすべてまたは一部分を含む融合タンパク質を提供し、そしてこのようなタンパク質をコードする核酸分子を提供する。例えば、実施例１１〜１６を参照のこと。本発明はまた、以下のいずれかのＢＡＣクローン由来の核酸分子によってコードされるポリペプチドのすべてまたは部分を含む、融合タンパク質を提供する：Ｂ１２：０１Ｇ０５、Ｂ１２：０６Ａ１２、Ｂ１２：１２Ｆ０６、Ｂ１２：１８Ｈ０４、Ｂ１２：２０Ｃ０９またはＢ１２：０３Ａ０５。好ましい実施形態では、この融合タンパク質は、ｄｐｔＡ、ｄｐｔＢＣ、ｄｐｔＤまたはｄｐｔＨのうちの１つ以上によってコードされるポリペプチドのすべてまたは一部分を含む。別の好ましい実施形態では、この融合タンパク質は、ｄｐｔＡ、ｄｐｔＢＣ、ｄｐｔＤまたはｄｐｔＨに選択的にハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドを含む。より好ましい実施形態では、この融合タンパク質は、配列番号９、１１、７もしくは８のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、またはそのフラグメント、ムテイン、相同性タンパク質、誘導体もしくはアナログであるポリペプチドを含む。さらにより好ましい実施形態では、この融合タンパク質をコードする核酸分子は、配列番号１０、１２、３もしくは６の核酸配列のすべてもしくは部分を含むか、またはその核酸配列を含む核酸分子に選択的にハイブリダイズするかまたはその核酸分子に対して相同である核酸配列のすべてもしくは部分を含む。本発明はまた、以下のいずれかのＢＡＣクローン由来のＳ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ核酸配列によってコードされるポリペプチド配列を含む、融合ポリペプチドを提供する：Ｂ１２：０１Ｇ０５、Ｂ１２：０６Ａ１２、Ｂ１２：１２Ｆ０６、Ｂ１２：１８Ｈ０４、Ｂ１２：２０Ｃ０９またはＢ１２：０３Ａ０５（好ましくは、Ｂ１２：０３Ａ０５由来）。本発明は、配列番号１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０４、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４もしくは１３６のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む融合タンパク質、またはそのフラグメント、ムテイン、相同性タンパク質、誘導体もしくはアナログであるタンパク質を含む融合タンパク質を提供する。本発明はまた、配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３もしくは１３５によりコードされるポリペプチドを含む融合タンパク質、または上記核酸配列を含む核酸分子に選択的にハイブリダイズするかまたはその核酸分子に対して相同である核酸配列のすべてもしくは部分を含む融合タンパク質を提供する。
【０１６０】
本発明の１つの局面では、ダプトマイシン生合成遺伝子クラスター由来のチオエステラーゼのすべてまたは一部分を含む融合タンパク質は、非リボソーム性タンパク質合成に関与するポリペプチド由来の他のモジュール（異種モジュールまたはハイブリッドモジュールを含む）を含む。例えば、実施例１２Ｅ、ＧおよびＨ、ならびに実施例１３を参照のこと。別の好ましい実施形態では、融合タンパク質は、チオエステラーゼをコードする１つ以上のアミノ酸配列を含み、ここでこのチオエステラーゼは、互いに同一であっても異なっても良い。例えば、実施例１１Ｅ〜Ｇ（ダプトマイシンチオエステラーゼ遺伝子の重複）、実施例１２（改変されたＮＲＰＳチオエステラーゼ融合タンパク質の生成）、および実施例１３（遊離チオエステラーゼ融合タンパク質の生成）を参照のこと。
【０１６１】
別の実施形態において、本発明は、２つ以上の異なるチオエステラーゼに由来するアミノ酸配列のハイブリッドである融合タンパク質、およびこのような融合タンパク質をコードする核酸分子を提供する。このハイブリッド融合タンパク質は、異なるチオエステラーゼの２つ、３つまたはそれより多くの部分から構成され得る。ハイブリッドチオエステラーゼは、異なる特異性または同じ特異性を有し得る。
【０１６２】
（チオエステラーゼおよびダプトマイシンＮＲＰＳの活性をアッセイする方法）
チオエステラーゼのフラグメント、ムテイン、相同性タンパク質、アナログ、誘導体または融合タンパク質が、野生型チオエステラーゼポリペプチドと同じ生物学的活性を有するのか、増強された生物学的活性を有するのか、または減少された生物学的活性を有するのかを決定するために、当該分野で公知の多くの方法が存在する。１つの実施形態では、適切なチオエステル結合の切断および／または対応する生成物の放出をモニターするチオエステラーゼアッセイが、インビトロで実施される。当該分野で周知の任意の多数のチオエステラーゼアッセイ（光標識化基質または放射性標識化基質を使用するアッセイを含む）、が使用され得る。
【０１６３】
好ましい実施形態において、ＮＲＰＳによるペプチド合成と関連付けられるチオエステラーゼ活性は、細胞性アッセイを使用して決定される。例えば、フラグメント、ムテイン、相同性タンパク質または融合タンパク質をコードする核酸分子は、ｄｐｔＤまたはｄｐｔＨのチオエステラーゼドメインの１つまたは両方を欠損するダプトマイシン生合成遺伝子クラスターを含む細菌細胞に導入され得る。あるいは、核酸分子は、異なる化合物（例えば、異なるリポペプチド）を生成する、異なる生合成遺伝子クラスターを含む細菌細胞に導入され得る。好ましい実施形態において、その細菌細胞は、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓである。核酸分子は、当該分野で公知の任意の方法（接合、形質転換、エレクトロポレーション、プロトプラスト融合などを含む）によって、細菌細胞に導入され得る。この核酸分子を含む細菌細胞は、その核酸分子によってコードされるポリペプチドが発現される条件下でインキュベートされる。インキュベーション後、その細菌細胞は、その細菌細胞が所望のリポペプチドを生成するか否かを決定するために、例えば、ＨＰＬＣおよび／またはＬＣ／ＭＳによって分析され得る。例えば、下記の実施例７〜９に記載される、ダプトマイシンを発現させる方法を参照のこと。チオエステラーゼ活性が、抗細胞増殖特性を有するペプチド（例えば、抗生剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、または抗有糸分裂剤）の合成と関連付けられる場合、当業者に公知の所望のアッセイが使用され得る。
【０１６４】
あるいは、チオエステラーゼのフラグメント、ムテイン、相同性タンパク質、アナログ、誘導体または融合タンパク質を、ｄｐｔＤまたはｄｐｔＨのチオエステラーゼドメインの１つまたは両方を欠損するダプトマイシン生合成遺伝子クラスターを含む細胞（特に、細菌細胞）に導入し得る。インキュベーション後、その細菌細胞は、その細菌細胞が所望のリポペプチドを生成するか否かを決定するために、例えば、実施例７に記載されるように、ＨＰＬＣおよび／またはＬＣ／ＭＳによって分析され得る。同じ方法が、異なる化合物（例えば、異なるリポペプチド）を生成する、異なる生合成遺伝子クラスターを含む細胞で使用され得る。
【０１６５】
好ましい実施形態では、フラグメント、ムテイン、相同性タンパク質、アナログ、誘導体または融合タンパク質は、ＧＸＳＸＧチオエステラーゼモチーフを含むアミノ酸配列を含む（実施例３を参照のこと）。より好ましい実施形態では、フラグメント、ムテイン、相同性タンパク質、アナログ、または誘導体は、配列番号７および配列番号８にそれぞれ由来する、チオエステラーゼモチーフＧＷＳＦＧまたはＧＴＳＬＧを含むアミノ酸配列を含む。
【０１６６】
当該分野で公知の同様の方法を使用して、ダプトマイシンＮＲＰＳまたはそのサブユニットのフラグメント、ムテイン、相同性タンパク質、アナログ、誘導体または融合タンパク質が、野生型ＮＲＰＳまたはそのサブユニットと同じ生物学的活性を有するかまたは異なる生物学的活性を有するかが決定され得る。
【０１６７】
（抗体）
本発明の遺伝子によってコードされるポリペプチドは、当業者に周知の種々の技術を使用して、本発明のポリペプチドならびにそのフラグメント、ムテイン、相同性タンパク質、アナログ、誘導体または融合タンパク質に結合するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を誘発するために用いられ得る。本発明のポリペプチドに対する抗体は、本発明のポリペプチドと免疫学的に反応性である免疫グロブリン分子またはその部分である。
【０１６８】
本発明のポリペプチドに対する抗体は、哺乳動物宿主を免疫することによって生成され得る。このような抗体は、ポリクローナル性またはモノクローナル性であり得る。好ましくは、このような抗体は、モノクローナル性である。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を生成する方法は、当業者に周知である。このような方法の概説としては、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８８）ならびにＡｕｓｕｂｅｌら、前出（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。本発明のポリペプチドとの免疫反応性の決定は、当該分野で周知の任意のいくつかの方法（イムノブロットアッセイおよびＥＬＩＳＡによることを含む）によってなされ得る。
【０１６９】
１０−８Ｍ−１の親和性、または好ましくは、１０−９〜１０−１０Ｍ−１の親和性、あるいはそれより強い親和性を有するモノクローナル抗体は、代表的に、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８に記載されるような、標準的な手順によって作製される。簡潔には、適切な動物を選択し、そして所望される免疫プロトコルに従う。適切な期間の後に、その動物の脾臓を切り出し、そして適切な選択条件下で、個々の脾臓細胞を、代表的には、不死化骨髄腫細胞に融合する。その後、細胞をクローン分離し、そして各クローンの上清を、それらの所望の抗原領域に対して特異的な適切な抗体の生成について試験する。
【０１７０】
他の適切な技術としては、抗原性ポリペプチドにインビトロでリンパ球を曝露すること、あるいは、ファージベクターまたは類似のベクター中にある抗体ライブラリーを選択することが、挙げられる。Ｈｕｓｅら、１９８９を参照のこと。本発明のポリペプチドおよび抗体は、改変されて使用され得るか、または改変されずに使用され得る。頻繁には、ポリペプチドおよび抗体は、検出可能なシグナルを提供する物質と共有結合または非共有結合のいずれかをすることによって、標識される。広範な種類の標識および結合体化技術が、公知であり、そして科学文献および特許文献の両方において広範に報告されている。適切な標識としては、放射性核種、酵素、基質、補因子、インヒビター、蛍光剤、化学発光剤、磁気粒子などが挙げられる。そのような標識の使用を教示する特許としては、米国特許第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号、同第３，９３９，３５０号；同第３，９９６，３４５号；同第４，２７７，４３７号；同第４，２７５，１４９号；および同第４，３６６，２４１号（これらは、本明細書において参考として援用される）が挙げられる。また、組換え免疫グロブリンが、生成され得る（米国特許第４，８１６，５６７号（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。
【０１７１】
本発明の抗体はまた、異なる種（例えば、マウスおよびヒト）由来の免疫グロブリン配列からかまたは同じ由来の免疫グロブリン軽鎖配列の部分および免疫グロブリン重鎖配列の部分から形成された、ハイブリッド分子であり得る。抗体は、単鎖抗体であっても、ヒト化抗体であってもよい。抗体は、多重結合特異性を有する分子（例えば、当業者に公知の多数の技術（ハイブリッドハイブリドーマの作製、ジスルフィド交換、化学的架橋、２つのモノクローナル抗体間にペプチドリンカーを付加すること、２組の免疫グロブリン重鎖と免疫グロブリン軽鎖とを特定の細胞株中に導入することなどが挙げられる）のうちのいずれか１つによって調製される、二機能性抗体）であり得る。
【０１７２】
本発明の抗体はまた、ヒトモノクローナル抗体（例えば、不朽化ヒト細胞により生成されるヒトモノクローナル抗体、「ヒト」抗体を生成可能なＳＣＩＤ−ｈｕマウスもしくは他の非ヒト動物により生成されるヒトモノクローナル抗体、またはクローン化したヒト免疫グロブリン遺伝子の発現により生成されるヒトモノクローナル抗体）であり得る。ヒト化抗体の調製は、米国特許第５，７７７，０８５号および同第５，７８９，５５４号（本明細書中に参考として援用される）により教示されている。
【０１７３】
要約すると、当業者は、本発明の教示を提供されると、本発明の抗体の生物学的特性を変化させるために使用され得る種々の方法（所定の抗体分子の安定性もしくは半減期、免疫原性、毒性、親和性、もしくは収量を増加もしくは減少させるために使用され得る方法が挙げられる）または本発明の抗体を特定の適用のためにより適切にし得る他の任意の様式で本発明の抗体を変化させるために使用され得る種々の方法を利用可能である。
【０１７４】
好ましい実施形態において、本発明の抗体は、ダプトマイシン合成に関与するチオエステラーゼに結合するか、またはダプトマイシンＮＲＰＳもしくはそのサブユニットに結合する。より好ましい実施形態において、この抗体は、ｄｐｔＡ、ｄｐｔＢＣ、ｄｐｔＤまたはｄｐｔＨによってコードされるポリペプチドもしくはフラグメントに結合する。別の好ましい実施形態において、この抗体は、ｄｐｔＡ、ｄｐｔＢＣ、ｄｐｔＤまたはｄｐｔＨに選択的にハイブリダイズする核酸分子によってコードされる、ポリペプチドに結合する。より好ましい実施形態において、この抗体は、配列番号９、配列番号１１、配列番号７、もしくは配列番号８のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合するか、またはそのフラグメント、ムテイン、相同タンパク質、誘導体、アナログ、もしくは融合タンパク質である、ポリペプチドに結合する。なおより好ましい実施形態において、この抗体は、配列番号１０、配列番号１２、配列番号３、または配列番号６の核酸配列の全てもしくは一部を含む核酸分子によってコードされる、ポリペプチドに結合する。別の実施形態において、この抗体は、配列番号１０、配列番号１２、配列番号３、もしくは配列番号６の核酸分子を含む核酸分子に選択的にハイブリダイズするかまたは相同である核酸分子のうちの全てもしくは一部を含む核酸分子によってコードされる、ポリペプチドに結合する。
【０１７５】
本発明は、ＢＡＣクローンＢ１２：０１Ｇ０５、Ｂ１２：０６Ａ１２、Ｂ１２：１２Ｆ０６、Ｂ１２：１８Ｈ０４、Ｂ１２：２０Ｃ０９、もしくはＢ１２：０２Ａ０５のうちのいずれか１つに由来する（好ましくは、Ｂ１２：０３Ａ０５に由来する）Ｓ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ核酸配列によってコードされる、ポリペプチドに選択的に結合する抗体を提供する。このポリペプチドは、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０４、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、もしくは配列番号１３６から選択されるアミノ酸配列を含み得るか、または配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３もしくは配列番号１３５の核酸配列によりコードされる。好ましくは、この抗体は、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１１０、もしくは配列番号１１２から選択されるアミノ酸配列または配列番号６１、配列番号６５、配列番号６９、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号９５および配列番号１０１から選択されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチドに選択的に結合する。本発明はまた、そのフラグメント、ムテイン、相同タンパク質、誘導体、アナログもしくは融合タンパク質に選択的に結合する、抗体を提供する。
【０１７６】
（コンピューター読出し可能な手段）
本発明のさらなる局面は、本発明の核酸配列およびアミノ酸配列を格納するためのコンピューター読出し可能な手段である。好ましい実施形態において、本明細書中に記載される核酸配列およびアミノ酸配列の全てを、完全な配列セットとしてかまたは任意の組み合わせで格納するためのコンピューター読出し可能な手段を提供する。このコンピューター読出し可能な手段の記録は、読出しおよびディスプレイのため、ならびにプログラムのアプリケーションのためのコンピューターシステムとのインターフェースのために、アクセスされ得、そのプログラムは、特定の基準を満たすデータについての照会の際にデータを位置決定すること、配列の比較、１組の区順を満たす配列のアライメントまたは順序決定などを可能にする。
【０１７７】
本発明の核酸配列およびアミノ酸配列は、検索分析のために有用なデータベースおよび配列分析アルゴリズムにおける構成要素として、特に有用である。本明細書中で使用される場合、用語「本発明の核酸配列」および「本発明のアミノ酸配列」とは、コンピューター読出し可能な形態で換算もしくは格納されているか換算もしくは格納され得る、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの検出可能な任意の化学的または物理的な特徴を意味する。これらとしては、クロマトグラフスキャンデータまたはピークデータ、写真データまたはそれからのスキャンデータ、および質量分析データが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７８】
本発明は、本発明の配列を格納している、コンピューター読出し可能な媒体を提供する。コンピューター読出し可能な媒体は、以下のうちの１つ以上を包み得る：本発明の核酸配列の配列を含む核酸配列；本発明のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列；１組の核酸配列（その配列のうちの少なくとも１つが、本発明の核酸配列を含む）；１組のアミノ酸配列（その配列のうちの少なくとも１つが、本発明のアミノ酸配列を含む）；本発明の１つ以上の核酸配列の配列を含む核酸配列を示すデータセット；本発明のアミノ酸配列をコードする核酸配列を示すデータセット；１組の核酸配列（その配列のうちの少なくとも１つが、本発明の核酸配列の配列を含む）；１組のアミノ酸配列（その配列のうちの少なくとも１つが、本発明のアミノ酸配列を含む）；本発明の核酸配列の配列を含む核酸配列を示すデータセット；本発明のアミノ酸配列の配列を含むアミノ酸をコードする核酸配列を示すデータセット。このコンピューター読出し可能な媒体は、情報またはデータを格納するために使用される任意の組成物（例えば、市販のフロッピー（登録商標）ディスク、テープ、ハードドライブ、コンパクトディスク、およびビデオディスクが挙げられる）であり得る。
【０１７９】
また、本発明により提供されるのは、文字配列（特に、遺伝子配列）の分析のための方法である。好ましい配列分析方法としては、例えば、配列相同性分析方法（例えば、同一性分析および類似性分析）、ＲＮＡ構造分析、配列アセンブリ、分岐学的分析、配列モチーフ分析、オープンリーディングフレーム決定、核酸塩基呼び出し、および配列決定クロマトグラムピーク分析が挙げられる。
【０１８０】
コンピューターベースの方法が、核酸相同性同定を実施するために提供される。この方法は、本発明の核酸の配列を含む核酸をコンピューター読出し可能な媒体中に提供する工程；およびその核酸配列を少なくとも１つの核酸配列またはアミノ酸配列と比較して、相同性を同定する工程、を包含する。
【０１８１】
コンピューターベースの方法がまた、アミノ酸相同性同定を実施するためにも提供され、この方法は、本発明のアミノ酸の配列を含むアミノ酸をコンピューター読出し可能な媒体中に提供する工程；およびそのアミノ酸配列を少なくとも１つの核酸配列またはアミノ酸配列と比較して、相同性を同定する工程、を包含する。
【０１８２】
コンピューターベースの方法が、重複する核酸配列を単一の核酸配列へと集合させるために、なおさらに提供され、この方法は、本発明の核酸の配列を含む第１核酸配列をコンピューター読出し可能な媒体中に提供する工程；およびこの第１核酸配列と第２核酸配列との間の少なくとも１つの重複領域についてスクリーニングする工程、を包含する。
【０１８３】
（核酸分子をプローブおよびプライマーとして使用する方法）
１つの実施形態において、本発明の核酸分子は、その核酸分子に選択的にハイブリダイズする核酸分子を同定または増幅するためのプローブもしくはプライマーとして使用され得る。好ましい実施形態において、そのプローブまたはプライマーは、ダプトマイシン生合成遺伝子クラスター由来のダプトマイシンＮＲＰＳ、そのサブユニット、またはチオエステラーゼをコードする核酸分子に、由来する。そのプローブまたはプライマーはまた、ダプトマイシン生合成遺伝子クラスターのダプトマイシンＮＲＰＳ遺伝子またはチオエステラーゼ遺伝子に由来する発現制御配列に由来し得る。好ましい実施形態において、そのプローブまたはプライマーは、ｄｐｔＡ，ｄｐｔＢＣ、ｄｐｔＤまたはｄｐｔＨに由来する。より好ましい実施形態において、そのプローブまたはプライマーは、配列番号９、配列番号１１、配列番号７、または配列番号８のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、核酸分子に由来する。なおより好ましい実施形態において、そのプローブまたはプライマーは、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３もしくは配列番号１３５の核酸配列を有する、核酸分子に由来する。別の実施形態において、そのプローブまたはプライマーは、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０４、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、もしくは配列番号１３６をコードする、核酸配列に由来する。
【０１８４】
一般的に、プローブまたはプライマーは、少なくとも１０ヌクレオチド長であり、より好ましくは少なくとも１２ヌクレオチド長であり、より好ましくは少なくとも１４ヌクレオチド長であり、そしてなおより好ましくは少なくとも１６ヌクレオチド長である。なおより好ましい実施形態において、そのプローブまたはプライマーは、少なくとも１８ヌクレオチド長であり、なおより好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド長であり、そしてなおより好ましくは少なくとも２２ヌクレオチド長である。プライマーおよびプローブはまた、長さがより長くもあり得る。例えば、プローブまたはプライマーは、２５ヌクレオチド長であり得るか、または３０ヌクレオチド長、４０ヌクレオチド長、もしくは５０ヌクレオチド長であり得る。オリゴヌクレオチドプローブを使用する核酸ハイブリダイゼーションを実施する方法は、当該分野で周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）を参照のこと。例えば、第１１章および第１１．３１〜１１．３２頁および第１１．４０〜１１．４４頁（これらの部分は、短いプローブの放射性標識を記載する）、ならびに第１１．４５〜１１．５３頁（この部分は、オリゴヌクレオチドプローブについてのハイブリダイゼーション条件（プローブハイブリダイゼーションについての特異的条件（第１１．５０〜１１．５１頁を含む）を記載する）。プライマーを使用してＰＣＲを実施する方法もまた、当該分野で周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）およびＡｕｓｕｂｅｌ（前出）を参照のこと。ＰＣＲ方法は、本発明の核酸分子の対立遺伝子改変体およびフラグメントを同定および／または単離するために使用され得る；ＰＣＲはまた、そのプライマーにハイブリダイズし増幅され得る核酸分子を同定および／または単離するために使用され得、そして本発明の相同性タンパク質、アナログ、融合タンパク質またはムテインをコードする核酸分子を単離するために使用され得る。
【０１８５】
（化合物の生合成のためにチオエステラーゼを使用する方法−Ｄｐｔ遺伝子の操作）
本発明のダプトマイシン生合成遺伝子クラスターの遺伝子は、新規な生合成ペプチド産物を生成するためかまたはその遺伝子クラスターから発現される１つ以上の遺伝子の調節を変更するために、種々の様式で操作され得る。例えば、図１を参照のこと。
【０１８６】
（チオエステラーゼをコードする遺伝子の破壊）
１つの局面において、本発明は、細菌細胞におけるＮＲＰＳ経路またＰＫＳ経路に関与するチオエステラーゼをコードする遺伝子を破壊または欠失するための方法を提供する。好ましくは、この方法は、ダプトマイシン生合成遺伝子クラスターにおけるチオエステラーゼをコードする遺伝子またはその一部を破壊または欠失させる工程を包含する。完全なチオエステラーゼをコードする遺伝子の破壊または欠失は、その最終産物に対する中間体である化合物の生成を生じる可能性がある。１つの局面において、完全なチオエステラーゼをコードする遺伝子またはその一部は、破壊または欠失され得る。好ましい実施形態において、Ｓ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓにおけるダプトマイシン生合成遺伝子クラスターの完全なチオエステラーゼをコードする遺伝子の破壊または欠失は、直鎖状リポペプチド化合物を生成する。この直鎖状リポペプチド化合物は、宿主細胞において異なる内因性チオエステラーゼまたは外部から提供された異なるチオエステラーゼによってＮＲＰＳからの放出が触媒された場合に、直接使用され得る。このような直鎖状リポペプチド化合物は、内因性チオエステラーゼ活性によってＮＲＰＳから放出されない場合は、潜在的であるが未だ同定されていないチオエステラーゼポリペプチドを試験するため、またはチオエステラーゼ融合物、フラグメント、ムテイン、誘導体、アナログもしくはホモログポリペプチドを活性について試験するために、有用な中間体であり得る。この直鎖状リポペプチド化合物は、あるいは、新規なリポペプチドの生成のための中間体として使用され得る。
【０１８７】
別の局面において、遊離チオエステラーゼをコードする遺伝子が、ＮＲＰＳを含む細菌細胞において、破壊または欠失され得る。遊離チオエステラーゼは、ＮＲＰＳにおいて生成されるペプチド化合物のプルーフリーディングに関与すると考えられるので、遊離チオエステラーゼをコードする遺伝子の破壊または欠失は、その遊離チオエステラーゼの存在下で生成される化合物と比較して変異を有する、化合物の生成をもたらし得る。これらの変異した化合物は、新規なリポペプチドを生成するために使用され得る。例えば、実施例１３を参照のこと。
【０１８８】
好ましい実施形態において、この方法は、ダプトマイシン生合成遺伝子クラスターにおけるｄｐｔＤのチオエステラーゼコード部分を破壊もしくは欠失させるか、またはｄｐｔＨを破壊または欠失させる工程を包含する。なおより好ましい実施形態において、この方法は、配列番号７のチオエステラーゼドメインのアミノ酸配列を有するかまたは配列番号８のアミノ酸配列を有する、チオエステラーゼをコードする遺伝子を破壊または欠失させる工程を包含する。本発明はまた、チオエステラーゼをコードする遺伝子を破壊または欠失させる方法を包含し、この方法において、その遺伝子は、配列番号７のチオエステラーゼドメインのアミノ酸配列を有するかもしくは配列番号８のアミノ酸配列を有するチオエステラーゼをコードする遺伝子と選択的にハイブリダイズするかまたはそのチオエステラーゼをコードする遺伝子と相同である、遺伝子である。別の好ましい実施形態において、チオエステラーゼの破壊または欠失は、下記のように、非リボソーム性ペプチド合成と関与する遺伝子クラスターを変化させる方法と組み合わされ得る。
【０１８９】
チオエステラーゼをコードする遺伝子の破壊は、本明細書の教示に従って、当業者に公知の任意の方法によって達成され得る。好ましい実施形態において、チオエステラーゼをコードする遺伝子の破壊は、例えば、ＨｏｓｔｅｄおよびＢａｌｔｚ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７９，ｐｐ．１８０〜１８６（１９９７）；Ｂｕｔｌｅｒら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６，ｐｐ．２８７〜２９２（１９９９）；およびＸｕｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９５，ｐｐ．１２１１１〜１２１１６（１９９８）（これら各々は、その全体が本明細書中で参考として援用される）に教示される方法を使用して、標的化遺伝子破壊により達成され得る。例えば、実施例１１を参照のこと。
【０１９０】
（チオエステラーゼを使用して生成される環状ペプチドおよび環化部位の変更）
ＮＲＰＳに関与する天然に存在するポリペプチドにおいて、完全なチオエステラーゼが、そのポリペプチドのカルボキシ末端に位置決めされ、そこで、その完全なインテグラーゼは、生成物環化に関与する。１つの局面において、本発明は、チオエステラーゼをコードするモジュールの位置を変化させることによって、環状ペプチドの環化部位（または直鎖状ペプチドの放出）を変化させる方法を提供する。１つの実施形態において、環化部位が、そのチオエステラーゼをコードするモジュールを、そのチオエステラーゼモジュールが天然で存在する領域の上流の領域においてＮＲＰＳと関与するポリペプチドをコードする遺伝子中に挿入することによって、変更され得る。この実施形態において、産生される環状ペプチドは、天然に存在する環状ペプチドよりも小さい。例えば、実施例１２を参照のこと。
【０１９１】
好ましい実施形態において、このモジュールは、ダプトマイシン生合成遺伝子クラスター由来の完全なチオエステラーゼをコードする。より好ましい実施形態において、このモジュールは、ＤｐｔＤのチオエステラーゼドメインを含む。なおより好ましい実施形態において、このモジュールは、配列番号７のアミノ酸配列の全てまたは一部（好ましくは、配列番号７のチオエステラーゼドメインを含む一部）を有する、ポリペプチドをコードする。別の好ましい実施形態において、このモジュールは、配列番号７のチオエステラーゼドメインの全てもしくは一部をコードする核酸分子または配列番号３の核酸配列の全てもしくは一部を含むチオエステラーゼドメインをコードする核酸分子と、相同であるかまたはそれらの核酸分子に選択的にハイブリダイズする、核酸分子を含む。
【０１９２】
あるいは、そのペプチドにアミノ酸を付加すること（またはそのペプチド内のアミノ酸を改変すること）に関与する他のモジュールが、そのチオエステラーゼをコードするモジュールの上流に挿入され得る。例えば、実施例１２を参照のこと。そのようなモジュールは、少なくとも１つのアデニル化ドメインと、チオール化ドメインまたはアシルキャリアドメインとを含む、最小モジュールを含む。好ましい実施形態において、挿入されるモジュールは、縮合ドメインもまた含む。さらなるドメイン（Ｍドメイン、Ｅドメイン、および／またはＣｙドメインを含む）もまた、このチオエステラーゼモジュールの上流に挿入され得る。このチオエステラーゼドメインの上流に挿入されるモジュールの型は、望まれたアミノ酸残基の型に依存する。特定のアミノ酸を付加および／または改変するモジュールを挿入する方法は、当該分野で周知である。例えば、Ｍｏｏｔｚら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０，ｐｐ．３４１〜３４８（１９９９）（本明細書中に全体が参考として援用される）を参照のこと。このチオエステラーゼの上流に１つ以上のモジュールを付加すると、天然に存在する環状ペプチドよりも大きく、かつ天然に存在する環状ペプチドと異なるアミノ酸残基を含み得る、環状ペプチドを合成可能なＮＲＰＳに関与するポリペプチドが生成される。
【０１９３】
（チオエステラーゼのインビボでの使用）
本発明の遺伝子の別の用途は、ＮＲＰＳを発現する細胞における生成物の収量を改善することである。例えば、実施例１１を参照のこと。収量を増加させるために使用され得る核酸分子としては、正の調節因子をコードする核酸分子、アシルＣｏＡチオエステラーゼをコードする核酸分子、ＡＢＣトランスポーターをコードする核酸分子、ＮｏｖＡＢＣ関連ポリペプチドをコードする核酸分子、ＤｐｔＡをコードする核酸分子、ＤｐｔＢＣをコードする核酸分子、ＤｐｔＤをコードする核酸分子、ダプトマイシン耐性およびダプトマイシンチオエステラーゼをコードするポリペプチド（ＤｐｔＤおよびＤｐｔＨを含む）をコードする核酸分子が、挙げられる。完全なダプトマイシン生合成遺伝子クラスター、ダプトマイシンＮＲＰＳまたはそれらの任意のドメインもしくはサブユニットはまた、重複され得る。好ましい実施形態において、ダプトマイシン生合成遺伝子クラスター由来の遊離チオエステラーゼおよび／または完全チオエステラーゼが、ダプトマイシンの生成を改善するために細胞中に導入される。別の好ましい実施形態において、さらなる遊離チオエステラーゼコピーが、上記のように、変化したＮＲＰＳポリペプチドを含む細胞中に導入され得る。いかなる理論によって拘束されることも望まないが、さらなるチオエステラーゼコピーおよび／または完全チオエステラーゼコピーは、細菌細胞のプルーフリーディング能力（例えば、遊離チオエステラーゼ）または環化能力および／もしくはペプチド放出能力（例えば、完全チオエステラーゼ）を増加することによって、そのペプチドのＮＲＰＳプロセシングを改善し得る。
【０１９４】
好ましい実施形態において、チオエステラーゼをコードするさらなる核酸分子コピーが、細胞中に導入され得る。例えば、実施例１１を参照のこと。このチオエステラーゼの導入は、当該分野で公知の任意の方法によって実施され得る。より好ましい実施形態において、そのさらなる遺伝子コピーは、強力な発現制御配列の調節制御下にある。これらの配列は、上記のように、別のチオエステラーゼ遺伝子に由来し得るか、または異種配列に由来し得る。さらに、チオエステラーゼをコードする核酸分子が、そのチオエステラーゼが別個のポリペプチドとして発現されるように、細胞中に導入され得る。これは、遊離チオエステラーゼについて特に有用であり得る。あるいは、チオエステラーゼをコードする核酸分子が、そのチオエステラーゼが多ドメインタンパク質の一部を形成するように、細胞中に導入され得る。これは、例えば、ＮＲＰＳを形成するポリペプチドまたはＮＲＰＳと相互作用するポリペプチド中への相同組換えによって、達成され得る。これは、完全チオエステラーゼによって特に有用であり得るが、必要というわけではない。
【０１９５】
別の実施形態において、遊離チオエステラーゼコピーおよび／または完全チオエステラーゼコピーが、ダプトマイシン生合成遺伝子クラスター以外のＮＲＰＳ複合体を発現する細胞中に、導入され得る。例えば、実施例１３を参照のこと。１つの好ましい実施形態において、その複合体は、ＮＲＰＳ複合体である。別の好ましい実施形態において、その複合体は、ＰＫＳ複合体または混合ＰＫＳ／ＮＲＰＳ複合体である。多数のＰＫＳ複合体およびＮＲＰＳ複合体が、当該分野で公知である。例えば、バンコマイシンを生成する複合体、ブレオマイシンを生成する複合体、Ａ５４１４５を生成する複合体、ＣＤＡを生成する複合体、アンホマイシンを生成する複合体、エキノカンジン（ｅｃｈｉｎｏｃａｎｄｉｎ）を生成する複合体、シクロスポリンを生成する複合体、エリスロマイシンを生成する複合体、チロシン（ｔｙｌｏｓｉｎ）を生成する複合体、モネンシンを生成する複合体、アベルメクチン（ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎ）を生成する複合体、ペニシリンを生成する複合体、セファロスポリンを生成する複合体、プリスチナマイシンを生成する複合体、エリスロマイシンを生成する複合体、ラパマイシンを生成する複合体、スピノシンを生成する複合体、ジデムニンを生成する複合体、ジスコバハミアン（ｄｉｓｃｏｂａｈａｍｉａｎ）を生成する複合体、およびエポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）を生成する複合体を、参照のこと。上記のように、遊離チオエステラーゼおよび／または完全チオエステラーゼの付加は、細菌のプルーフリーディング能力（遊離チオエステラーゼ）または環化能力（完全チオエステラーゼ）を増加することによって、ペプチドのＮＲＰＳプロセシングまたはＰＫＳプロセシングを改善し得る。遊離チオエステラーゼおよび／または完全チオエステラーゼの添加は、上記の方法によって達成され得る。
【０１９６】
好ましい実施形態において、細胞中に導入されるチオエステラーゼコード核酸分子は、ダプトマイシン生合成遺伝子クラスター由来のチオエステラーゼである。好ましい実施形態において、その遺伝子は、ｄｐｔＤのチオエステラーゼコードドメインであるかまたはｄｐｔＨである。より好ましくは、その核酸分子は、配列番号７もしくは配列番号８のチオエステラーゼドメインのアミノ酸配列を有するチオエステラーゼをコードするか、またはチオエステラーゼ活性を有する、その相同タンパク質、融合タンパク質、ムテイン、誘導体、アナログ、もしくはフラグメントである。
【０１９７】
（ＮＲＰＳによる新規化合物の生成のために遺伝子クラスターを変化させる方法）
（ＮＲＰＳポリペプチドモジュールおよびＮＲＰＳポリペプチドドメインの変化）
別の局面において、本発明は、ＮＲＰＳにおけるモジュールの数または位置を変化させる方法を提供する。１つの実施形態において、１つ以上のモジュールが、そのＮＲＰＳから欠失され得る。これらの欠失は、天然に存在するペプチド産物よりも短いペプチド産物のＮＲＰＳによる、合成をもたらす。別の実施形態において、１つ以上のドメインが、ＮＲＰＳから欠失され得る。この場合、ＮＲＰＳにより生成される生成物は、この欠失が存在しない場合に生成されるペプチドと比較して、化学的変化を有する（例えば、エピマー化ドメインおよび／またはメチル化ドメインが欠失された場合）。
【０１９８】
別の実施形態において、１つ以上のモジュールまたはドメインが、そのＮＲＰＳに付加され得る。この場合、そのＮＲＰＳにより合成されるペプチドは、それぞれ、天然に存在するそのペプチドよりも長いか、またはさらなる化学的変化を有する。例えば、エピマー化ドメインまたはメチル化ドメインが付加される場合、生じるペプチドは、それぞれ、余分なＤ−アミノ酸を含むか、またはメチル化アミノ酸を含む。なおさらなる実施形態において、１つ以上のモジュールが変異され得る。例えば、アデニル化ドメインが、そのドメインが天然に存在するアデニル化ドメインとは異なるアミノ酸特異性を有するように、変異され得る。ダプトマイシンＮＲＰＳについてのアミノ酸ポケットコード（これは、どのアミノ酸が、モジュール１〜１３の各アデニル化ドメイン内に結合するかを決定する）が、実施例５に記載される。表２もまた参照のこと。そのアミノ酸コードを所有していると、当業者は、種々の周知技術によって、変異誘発を実施して１つのモジュール中のコードを別のコードと交換し、それによって変化したＮＲＰＳにより合成されて生じるペプチドの最終的アミノ酸組成および／または配列を変化させ得る。例えば、実施例１２Ａを参照のこと。別の実施形態において、１つ以上のサブユニットが、このＮＲＰＳに付加され得るかまたは欠失され得る。
【０１９９】
なおさらなる実施形態において、１つ以上のドメイン、モジュール、またはサブユニットが、相補性によって新規なペプチドを生成するために、別のドメイン、モジュール、またはサブユニットで置換され得る。この場合、変化したＮＲＰＳにより生成されるペプチドは、例えば、天然に存在するペプチドと比較して、１つ以上の異なるアミノ酸を有する。さらに、ドメイン、モジュール、もしくはサブユニットの挿入、欠失、置換および変異の種々の組み合わせが、目的のペプチドを生成するために使用され得る。例えば、天然に存在するモジュール、天然に存在するドメインもしくは天然に存在するサブユニットを、改変されたモジュール、改変されたドメインもしくは改変されたサブユニットで置換し得るか、またはある生物由来のＮＲＰＳからの天然に存在するモジュール、天然に存在するドメインもしくは天然に存在するサブユニットを、別の生物由来のＮＲＰＳのモジュール、ドメイン、もしくはサブユニットで置換し得る。例えば、実施例１２Ｃを参照のこと。このモジュール、ドメイン、もしくはサブユニットの改変は、部位特異的変異誘発、ドメイン交換（モジュール改変またはサブユニット改変について）、モジュール中もしくはサブユニット中のドメインの欠失、挿入もしくは置換、またはサブユニット中のモジュールの欠失、挿入もしくは置換によって、実施され得る。さらに、ドメイン、モジュール、またはサブユニットが、そのドメイン、モジュール、またはサブユニットが機能しないように、当該分野で公知の任意の方法を使用して破壊され得る。これらの破壊としては、例えば、シングルクロスオーバー破壊体（ｄｉｓｒｕｐｔａｎｔ）または別の遺伝子（例えば、選択もしくはスクリーニングを可能にする遺伝子）による相同組換えを介した置換のような技術が、挙げられる。
【０２００】
改変されたＮＲＰＳ複合体により生成される生成物は、ネイティブリポペプチドとは異なる組み込まれたアミノ酸を有し、ネイティブリポペプチドとは異なるアミノ酸化学変化（例えば、メチル化およびエピマー化）を有し、そしてネイティブリポペプチドより短いかもしれないし、長いかもしれない。そのドメイン、モジュール、またはサブユニットは、任意の数の望ましいＮＲＰＳ（２つのＮＲＰＳ、３つのＮＲＰＳ、または４つのＮＲＰＳが挙げられる）に由来し得る。さらに、本発明は、完全チオエステラーゼドメインを含むこれらの変化したＮＲＰＳ複合体および完全チオエステラーゼドメインを含まないこれらの変化したＮＲＰＳ複合体を企図する。例えば、実施例１２Ｂ〜Ｊを参照のこと。
【０２０１】
そのモジュール、ドメインおよび／またはサブユニットの供給源は、ダプトマイシン生合成遺伝子クラスターＮＲＰＳに由来し得るか、あるいは別のリポペプチドまたは他のペプチド供給源をコードするＮＲＰＳに由来し得る。これらのペプチド供給源としては、糖ペプチド遺伝子クラスター、混合経路遺伝子クラスター、およびヘモジデリン貪食細胞遺伝子クラスターが挙げられる。さらに、そのモジュール、ドメイン、および／またはサブユニットの供給源は、適切な任意の供給源（ストレプトミセス供給源および非ストレプトミセス供給源の両方を含む）から入手され得る。非ストレプトミセス供給源としては、放線菌類供給源（例えば、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）；原核生物非放線菌類（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓおよびシアノバクテリア）；ならびに非細菌供給源（例えば、真菌）が、挙げられる。
【０２０２】
ＮＲＰＳまたはその一部は、目的の宿主細胞に対して異種であり得るか、またはその宿主細胞に対して内因性であり得る。１つの実施形態において、ダプトマイシンＮＲＰＳまたはその一部（例えば、そのドメイン、モジュール、またはサブユニット）が、当業者に公知の任意のベクター（例えば、プラスミド、コスミド、バクテリオファージ、またはＢＡＣ）上にて、その宿主細胞中に導入される。そのダプトマイシンＮＲＰＳまたはその一部が導入される宿主細胞は、内因性ＮＲＰＳまたはその一部（例えば、そのドメイン、モジュール、またはサブユニット）を含み得る。あるいは、異種ＮＲＰＳまたはその一部が、異種ダプトマイシンＮＲＰＳまたはその一部を含む宿主細胞中に、導入され得る。ダプトマイシンＮＲＰＳ、他のＮＲＰＳ、またはＮＲＰＳドメイン、ＮＲＰＳモジュール、もしくはＮＲＰＳサブユニットは、天然に存在する配列または改変された配列のいずれかを有し得る。別の実施形態において、そのダプトマイシンＮＲＰＳまたはその一部は、その宿主細胞に対して内因性である（例えば、その宿主細胞は、Ｓ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓである）。天然に存在するＮＲＰＳもしくは改変されたＮＲＰＳ、またはそれらのドメイン、モジュール、もしくはサブユニットが、ダプトマイシンＮＲＰＳまたはその一部を含む宿主細胞中に導入され得る。その異種ドメイン、異種モジュール、異種サブユニット、または異種ＮＲＰＳは、構成的プロモーターまたは調節可能なプロモーターを含み得、これらのプロモーターは、当業者にとって公知である。そのプロモーターは、細胞中に導入される核酸分子に対して、同種または異種のいずれかであり得る。１つの実施形態において、そのプロモーターは、上記のように、ダプトマイシン生合成遺伝子クラスター由来であり得る。
【０２０３】
このＮＲＰＳまたはその一部（例えば、ドメイン、モジュール、またはサブユニット）を含む核酸分子は、エピソームにて維持され得るか、またはゲノム中に組み込まれ得る。この核酸分子は、例えば、ファージ組み込み部位にて、ゲノム中に導入され得る。さらに、その核酸分子は、内因性ＮＲＰＳもしくは異種ＮＲＰＳまたはその一部の部位にてか、またはゲノム中のいずれかの部位にて、ゲノム中に導入され得る。この核酸分子は、そのゲノム中にすでに存在するＮＲＰＳのドメイン、モジュール、もしくはサブユニットの機能の全てもしくは一部を破壊するような様式で、導入され得るか、またはそのＮＲＰＳもしくはその一部の機能を破壊しない様式で、導入され得る。
【０２０４】
これらのＮＲＰＳにより生成されるペプチドは、新規な化合物として有用であり得るか、または新規な化合物を生成する際に有用であり得る。好ましい実施形態において、その新規な化合物は、抗生物質化合物として有用であるか、または抗生物質化合物を生成するために使用され得る。別の好ましい実施形態において、その新規な化合物は、有用な活性（抗生物質特性、抗真菌特性、抗ウイルス特性、抗寄生生物特性、抗有糸分裂特性、静菌特性、抗腫瘍特性、免疫調節特性、抗コレステロール血症特性、ヘモジデリン貪食細胞特性、農薬特性（例えば、殺虫特性）または物理化学的特性（例えば、界面活性剤特性）が挙げられるが、これらに限定されない）を有する他のペプチドとして有用であるか、またはそのような他のペプチドを生成するために使用され得る。より好ましい実施形態において、変化したＮＲＰＳポリペプチドを使用して生成される化合物は、ダプトマイシン関連化合物（２０００年１２月１５日出願の米国特許出願番号０９／７３８，７４２、同０９／７３７，９０８、および同０９／７３８，５３５に記載される、ダプトマイシン関連化合物が挙げられる）の合成において使用され得る。
【０２０５】
さらに、非リボソーム合成ペプチドおよび非リボソーム合成ポリケチドの多岐の改変体が、宿主細胞培養の間に利用可能な基質プールを変化させることによって、達成され得る。例えば、ダプトマイシンの商業的生成は、ダプトマイシン産生株であるＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓをデカン酸の存在下で培養することの結果であり、デカン酸は、この最終産物のリポペプチドプロフィールを変化させる。例えば、米国特許第４，８８５，２４３号を参照のこと。ポリケチド中間体のＮ−アセチルシステアミン（ＳＮＡＣ）アナログの供給は、遊離カルボン酸またはエステルアナログと比較した場合に、そのポリケチド中への中間体の取り込みの実質的増加を生じた。例えば、Ｙｕｅら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９，ｐｐ．１２５３〜１２５５（１９８７）；ＣａｎｅおよびＹａｎｇ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９，１２５５〜１２５７（１９８７）；Ｃａｎｅら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１５．ｐｐ．５２２〜５２６およびｐｐ．５２７〜５３５（１９９３）；Ｃａｎｅら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１７，ｐｐ．６３３〜６３４（１９９５）；Ｐｉｅｄｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１７，ｐｐ．１１３７３〜１１３７４（１９９５）（この各々は、全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。アミノ酸のＳＮＡＣアナログは、ＮＲＰＳ中にインビトロで組み込まれている。Ｅｈｍａｎら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，７，ｐｐ．７６５〜７７２（２０００）。従って、ＮＲＰＳ生成ペプチド中に非天然基質を組込むためにＳＮＡＣまたは他のパンテテイン模倣物を供給することは、可能である。
【０２０６】
さらに、非リボソーム合成ペプチドおよび非リボソーム合成ポリケチドの多様性はまた、１つ以上のＮＲＰＳ遺伝子およびＰＫＳ遺伝子（天然モジュールもしくは天然ドメイン、ハイブリッドモジュールもしくはハイブリッドドメイン、または変化したモジュールもしくは変化したドメインをコードする）を、異種宿主細胞（すなわち、そのＮＲＰＳ遺伝子およびＰＫＳ遺伝子またはＮＲＰＳモジュールまたはＰＫＳモジュールが由来する宿主細胞以外の宿主細胞）において発現させることによっても、達成され得る。
【０２０７】
さらに、ダプトマイシンまたは関連化合物に対する細菌細胞の耐性を増加させるために、ＡＢＣトランスポーターまたは抗生物質耐性に関与する他のポリペプチドを発現させ得る。このＡＢＣトランスポーターは、自系細胞（すなわち、その遺伝子を含む細胞）において過剰発現され得るか、または異種細胞（すなわち、通常はその遺伝子を有さない細胞）において発現され得る。さらに、ダプトマイシンに対して耐性である細胞を選択することを可能にするために、本発明のＡＢＣトランスポーター遺伝子または本明細書中に記載される抗生物質耐性に関与する別のポリペプチドを発現させ得る。この選択は、ダプトマイシン耐性機構を決定するために有用であり得るか、または抗生物質耐性が選択される標準的分子生物学的技術において使用され得る。
【０２０８】
（本発明の化合物、その薬学的組成物、ならびに化合物および組成物を使用する処置方法）
本発明の別の目的は、本発明のチオエステラーゼ、そのＮＲＰＳまたはサブユニット、ならびにその塩、エステル、アミド、エーテルおよび保護された形態を使用することによって生成され得る、ペプチドまたはリポペプチド、ならびにこれらのペプチド、リポペプチドもしくはその塩を含む薬学的組成物を提供することである。好ましい実施形態において、そのリポペプチドは、上記のような、ダプトマイシンまたはダプトマイシン関連リポペプチドである。
【０２０９】
本発明のペプチド、リポペプチドまたは他の化合物は、任意の種々の当該分野で慣用的かつ周知のプロトコルを使用して、抗生物質活性を有するか否かが決定され得る。単離または精製された化合物のいずれが使用されてもよく、例えば、発酵培養ブロスまたは細胞溶解物に存在する未精製化合物が使用されてもよい。グラム陽性細菌またはグラム陰性細菌の試験株のいずれかまたはその両方が使用されてもよく、効力を決定する決定するために種々の試験株が使用されてもよい。好ましい実施形態において、細菌試験株は、グラム陽性試験株である。より好ましい実施形態において、細菌試験株は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、より好ましくは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓである。抗生物質活性を決定するために使用され得る方法の例は、米国特許第４，２０８，４０８号および同第４，５３７，７１７号に提供される。当業者は、他の潜在的な抗生物質および他の試験株が使用され得ることを認識する。
【０２１０】
ペプチド、リポペプチドまたはそれらの薬学的に受容可能な塩は、疾患、特に、細菌感染の治療的処置または予防的処置のための経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、エアロゾル投与、局所的投与または非経口投与のために処方され得る。好ましい実施形態において、このリポペプチドは、ダプトマイシンまたはダプトマイシン関連リポペプチドである。本明細書中で「ダプトマイシン」、「ダプトマイシン関連リポペプチド」または「リポペプチド」に対する言及は、その薬学的に受容可能な塩を包含する。ペプチド（ダプトマイシンまたはダプトマイシン関連リポペプチドを含む）は、目的のペプチドまたはリポペプチドと適合性の任意の薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を使用して処方され得る。ヒト治療のために種々の抗菌剤を投与するための方法の一般的記載については、例えば、以下を参照のこと：Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ：Ａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  ６０００  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｂｙ  Ｔｒａｄｅ  Ｎａｍｅ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒ，Ａｓｈｇａｔｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｍ．ＡｓｈおよびＩ．Ａｓｈ編，１９９６；Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ：Ａｎ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｓ．Ｂｕｄａｖａｒｉ編，年刊書；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ；Ｍａｒｔｉｎｄａｌｅ：Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ｋ．Ｐａｒｆｉｔｔ編，１９９９；ならびにＧｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，Ｌ．Ｓ．Ｇｏｏｄｍａｎら編；それらの内容は、本明細書中に参考として援用される。本発明のペプチドまたはリポペプチドは、従来の薬学的キャリアおよび賦形剤と混合され得、錠剤、カプセル剤、エリキシル、懸濁液、シロップ、カシェ剤、クリームなどの形態で使用され得る。ペプチドまたはリポペプチドは、本明細書中で議論されるような他の治療剤および抗生物質と混合され得る。本発明の化合物を含む組成物は、活性化合物の約０．１〜約９０重量％、より一般には、約１０〜約３０％を含む。
【０２１１】
本発明の組成物は、制御放出システム（例えば、カプセル剤）または徐放送達システム（例えば、生体浸食性（ｂｉｏｅｒｏｄａｂｌｅ）マトリクス）を使用して送達され得る。本発明の組成物の投与に適切な薬物送達のための例示的な遅延型放出送達システムは、米国特許第４，４５２，７７５号（Ｋｅｎｔに対して発行）、同第５，２３９，６６０号（Ｌｅｏｎａｒｄに対して発行）、同第３，８５４，４８０号（Ｚａｆｆａｒｏｎｉに対して発行）に記載される。
【０２１２】
この組成物は、一般的なキャリアおよび賦形剤（例えば、トウモロコシ澱粉またはゼラチン、ラクトース、スクロース、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、リン酸二カルシウム、塩化ナトリウムおよびアルギン酸）を含み得る。この組成物は、クロスカルメロースナトリウム、微結晶性セルロース、トウモロコシデンプン、グリコール酸ナトリウムデンプンおよびアルギン酸を含み得る。
【０２１３】
含まれ得る錠剤結合剤は、アカシアガム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン（Ｐｏｖｉｄｏｎｅ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、スクロース、デンプンおよびエチルセルロースである。
【０２１４】
使用され得る滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウムまたは他のステアリン酸金属、ステアリン酸、シリコーン流体、タルク、蝋、オイルおよびコロイド状シリカが挙げられる。
【０２１５】
ペパーミント、冬緑油、サクランボ香味料などのような矯味矯臭剤もまた、使用され得る。着色剤を添加し、投薬形態を審美的な外観にするか、または製品の同定を補助することもまた望ましい。
【０２１６】
経口使用のためには、固体処方物（例えば、錠剤およびカプセル剤）が特に有用である。徐放調製物または腸溶性調製物もまた、考案され得る。小児用および老齢者用適用のためには、懸濁液、シロップおよび咀嚼剤が特に適切である。経口投与のために、薬学的組成物は、例えば、錠剤、カプセル剤、懸濁液または液体の形態である。薬学的組成物は、好ましくは、治療的に有効な量の活性成分を含む投薬単位の形態で作製される。このような投薬単位の例は、錠剤およびカプセル剤である。治療目的のために、錠剤およびカプセル剤は、活性成分に加えて、結合剤（例えば、アカシアガム、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ソルビトール、またはトラガカント）；充填剤（例えば、リン酸カルシウム、グリシン、ラクトース、トウモロコシデンプン、ソルビトール、またはスクロース）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、シリカ、またはタルク）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプン）、矯味矯味剤または着色剤、あるいは受容可能な湿潤剤のような従来のキャリアを含み得る。経口液体調製物は、一般に、水溶液またはオイル状溶液、懸濁液、エマルジョン、シロップまたはエリキシルの形態にあり、これは、懸濁剤、乳化剤、非水性薬剤、保存剤、着色剤、および矯味矯臭剤のような従来の添加剤を含み得る。経口液体調製物は、リポペプチドミセルまたはリポペプチドのモノマー形態を含み得る。液体調製物のための添加剤の例は、アカシア、アーモンド油、エチルアルコール、分画ココナツ油、ゼラチン、グルコースシロップ、グリセリン、水素化食用脂肪、レシチン、メチルセルロース、パラヒドロキシ安息香酸メチルまたはパラヒドロキシ安息香酸プロピル、プロピレングリコール、ソルビトール、またはソルビン酸が挙げられる。
【０２１７】
静脈内（ＩＶ）用途のために、水溶性形態のペプチドまたはリポペプチドは、任意の一般に使用される静脈内流体中に溶解され得、注入により投与され得る。静脈内処方物は、キャリア、賦形剤または安定化剤を含み得る（カルシウム、ヒト血清アルブミン、クエン酸塩、酢酸塩、塩化カルシウム、炭酸塩、および他の塩が挙げられるが、これらに限定されない）。静脈内流体としては、生理食塩水またはリンゲル溶液が挙げられるが、これらに限定されない。ペプチドまたはリポペプチドはまた、注射器、カニューレ、カテーテルおよびラインの中に入れられ得る。
【０２１８】
非経口投与のための処方物は、水性または非水性の等張滅菌注射溶液または懸濁液の形態であり得る。これらの溶液または懸濁液は、経口投与のための処方物中における使用について言及された１以上のキャリアを有する、滅菌散剤または顆粒剤から調製され得る。リポペプチドミセルは、非経口投与のために特に望ましくあり得る。化合物は、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、トウモロコシ油、ベンジルアルコール、塩化ナトリウム、および／または種々の緩衝液中に溶解され得る。筋肉内調製物のために、リポペプチド化合物または適切な溶解性塩形態の化合物（例えば、塩酸塩）の滅菌処方物が、薬学的希釈剤（例えば、注射用水（ＷＦＩ）、生理食塩水または５％グルコース）中に溶解されて投与され得る。
【０２１９】
注射可能デポー形態は、生体分解性ポリマー（例えば、ポリラクチド−ポリグリコリド）中に化合物のマイクロカプセル化マトリクスを形成することにより作製され得る。薬物  対  ポリマーの比および使用される特定のポリマーの性質に依存して、薬物放出の速度は、制御され得る。他の生体分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。デポー注射可能処方物はまた、薬物を、身体組織と適合性のミクロエマルジョンの中に捕捉することにより調製される。
【０２２０】
局所的使用のために、本発明の化合物はまた、皮膚に、または鼻および喉の粘膜に適用されるように、適切な形態で調製され得、クリーム、軟膏、液体スプレー、または吸入薬、ロゼンジ、または喉塗布剤の形態を採用し得る。このような局所的処方物はさらに、活性成分の表面浸透を容易にするために、化合物（例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ））を含み得る。局所的調製物のために、ダプトマイシン、ダプトマイシン関連リポペプチドまたはそれらの適切な塩形態の滅菌処方物が、クリーム、軟膏、スプレーまたは他の局所的包帯（ｄｒｅｓｓｉｎｇ）にて投与され得る。局所的調製物はまた、ダプトマイシンまたはダプトマイシン関連リポペプチド組成物を含浸させた包帯（ｂａｎｄａｇｅ）の形態であり得る。
【０２２１】
眼または耳への適用のために、本発明の化合物は、疎水性または親水性の基剤中に処方された液体または半液体形態にて、軟膏、クリーム、ローション、塗布剤または散剤として提示され得る。
【０２２２】
直腸投与のために、本発明の化合物は、従来のキャリア（例えば、ココアバター、蝋または他のグリセリド）と混合した坐剤の形態にて投与され得る。
【０２２３】
エアロゾル調製物のために、ペプチドまたはリポペプチドまたはその化合物の塩形態の滅菌処方物は、吸入器（例えば、計量吸入器およびネブライザ）において使用され得る。リポペプチドミセルの滅菌処方物はまた、エアロゾル調製物のために使用され得る。エアロゾル化形態は、呼吸器感染（例えば、肺炎および洞に基づく感染）を処置するために特に有用であり得る。
【０２２４】
あるいは、本発明の化合物は、適切な薬学的に受容可能なキャリア中で送達するときに再構成するための散剤形態であり得る。１つの実施形態において、化合物の単位投薬形態は、滅菌された密封されたアンプル中にある適切な希釈剤中の化合物またはその塩の形態の溶液であり得る。単位投薬量中の化合物の濃度は、使用される化合物およびその溶解度および医師により所望される用量に依存して、例えば、約１％〜約５０％まで変化し得る。この組成物が、投薬単位を含む場合、各投薬単位は、好ましくは、５０〜５００ｍｇの活性物質を含む。成人を処置するために、使用される投薬量は、好ましくは、投与の経路および頻度に依存して、１００ｍｇ〜３ｇ／日の範囲である。
【０２２５】
さらなる局面において、本発明は、ヒトおよび他の動物における感染、特にグラム溶性細菌により引き起こされる感染を処置するための方法を提供する。用語「処置（する）」は、感染の予防および宿主動物が感染した後に確立された感染の制御の両方を示すために使用される。確立された感染は、急性または慢性のものであり得る。この方法は、ヒトまたは他の動物に、有効用量の本発明の化合物を投与する工程を包含する。例えば、有効用量のダプトマイシンは、一般に、約０．１〜約２５ｍｇ／ｋｇのダプトマイシン、ダプトマイシン関連リポペプチドまたはそれらの薬学的に受容可能な塩である。ダプトマイシンまたはダプトマイシン関連リポペプチドは、モノマーであってもよく、リポペプチドミセルの一部であってもよい。好ましい用量は、約１〜約２５ｍｇ／ｋｇのダプトマイシンまたはダプトマイシン関連リポペプチドまたはそれらの薬学的に受容可能な塩である。より好ましい用量は、約１〜１２ｍｇ／ｋｇのダプトマイシンまたはその薬学的に受容可能な塩である。ダプトマイシンのこれらの投薬量は、当業者によって開始点として使用されて、本発明の改変ＮＲＰＳ複合体によって生成される、有効投薬量の他の直鎖状ペプチドおよび環状ペプチドを決定および最適化し得る。
【０２２６】
１つの実施形態において、本発明は、治療的に有効な量の、本発明の改変ＮＲＰＳにより生成される改変ダプトマイシンまたは他の抗細菌ペプチドまたは抗細菌リポペプチドを用いて、被験体における感染、特に、グラム陽性細菌により引き起こされる感染を処置するための方法を提供する。ダプトマイシンまたは抗細菌ペプチドまたは抗細菌リポペプチドは、モノマーであってもよいし、リポペプチドミセル中にあってもよい。抗細菌剤を送達するための例示的な手順は、米国特許第５，０４１，５６７号（Ｒｏｇｅｒｓに発行された）およびＰＣＴ特許出願番号ＥＰ９４／０２５５２（公開番号ＷＯ９５／０５３８４）に記載され、その内容全体は、本明細書中にその全体が参考として援用される。本明細書中で使用される場合、句「治療的に有効な量」は、発症を防止するか、症状を緩和するか、または細菌感染の進行を止める、本発明に従う改変ＮＲＰＳにより生成される改変ダプトマイシンまたは他の抗細菌ペプチドまたは抗細菌リポペプチドの量を意味する。用語「処置（する）」は、感染の発生の予防および感染の制御もしくは排除の両方のために、被験体に、治療的に有効な量の本発明の化合物を投与することとして規定される。用語「被験体」は、本明細書中で記載される場合、哺乳動物、植物または細胞培養物として規定される。好ましい実施形態において、被験体は、ペプチドまたはリポペプチド化合物の処置が必要なヒトまたは他の動物患者である。
【０２２７】
ペプチドまたはリポペプチド抗生物質化合物は、一日あたりの単一の一日用量または複数用量として投与され得る。処置レジメンは、長期（例えば、数日間または２〜４週間）にわたる投与を必要とし得る。投与用量あたりの量または投与される総量は、感染の性質および重篤度、患者の年齢および一般的健康状態、患者の抗生物質に対する耐性または感染に関与する微生物のような要因に依存する。投与方法は、１９９９年９月２４日出願の米国特許出願第０９／４０６，５６８号（本明細書中に参考として援用される（これは、１９９８年９月２５日出願の米国仮特許出願第６０／１０１，８２８号および１９９９年３月２４日出願の同第６０／１２５，７５０号の利益を主張する））に開示される。
【０２２８】
本発明の方法は、改変ダプトマイシンまたは他のペプチド抗生物質またはリポペプチド抗生物質、またはそれらの薬学的組成物を、グラム陽性細菌感染を軽減または排除することに有効な量が必要な患者に投与する工程を包含する。この抗生物質は、経口により、非経口により、吸入により、局所的に、直腸に、鼻に、口腔に、膣に、または移植されたレザバにより、外部ポンプによりまたはカテーテルにより投与され得る。この抗生物質は、眼の用途またはエアロゾル化用途のために調製され得る。本発明の改変ＮＲＰＳにより生成される改変ダプトマイシン、ペプチド抗生物質またはリポペプチド抗生物質、またはそれらの薬学的組成物はまた、膿瘍、室または関節に直接注射されてもよいし、投与されてもよい。非経口投与としては、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、関節内注射、滑膜内注射、槽注射、髄腔内注射、肝内注射、病巣内注射および頭蓋内注射または注入が挙げられる。好ましい実施形態において、ダプトマイシンまたは別ペプチドまたはリポペプチドは、静脈内、皮下にまたは経口に投与される。
【０２２９】
本発明の方法は、細菌感染を有する患者を処置するために使用され得る。ここで感染は、任意の型のグラム陽性細菌により引き起こされるかまたは悪化している。好ましい実施形態において、本発明の改変ＮＲＰＳにより生成される改変ダプトマイシン、ダプトマイシン関連リポペプチド、または別のペプチド抗生物質もしくはリポペプチド抗生物質、またはそれらの薬学的組成物は、本発明の方法に従って患者に投与される。別の好ましい実施形態において、細菌感染は、細菌により引き起こされ得るかまたは悪化し得る可能性があり、これらの細菌としては、メチシリン感受性およびメチシリン耐性ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、およびコアギュラーゼ陰性ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉが挙げられる）、糖ペプチド媒介感受性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＧＩＳＡ）、ペニシリン感受性およびペニシリン耐性ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｖｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｉｕｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉグループＣ、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉグループＧおよびｖｉｒｉｄａｎｓ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉが挙げられる）、ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ（バンコマイシン感受性株およびバンコマイシン耐性株（例えば、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓおよびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）が挙げられる）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｉｆｏｒｍｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｉｎｎｏｃｕｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｍｏｓｕｍ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｊｅｉｋｅｉｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｎｔｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｓｐｐ．、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｎａｅｒｏｂｉｕｓ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｓａｃｃａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｇｎｕｓ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｃｒｏｓ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｒｅｖｏｔｉｉ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｕｓ、Ｐ��ｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ、およびＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３０】
ダプトマイシンの古典的に「耐性」の株に対する抗細菌活性は、インビトロ実験においてダプトマイシンの古典的に「感受性」の株に対する抗細菌活性に匹敵する。さらに、ダプトマイシンについての感受性株に対する最小阻害濃度（ＭＩＣ）値は、代表的には、バンコマイシンの最小阻害濃度値の１／４より小さい。従って、好ましい実施形態において、本発明の改変ＮＲＰＳにより生成される改変ダプトマイシン、ダプトマイシン関連リポペプチド抗生物質、ペプチドまたはリポペプチド抗生物質、またはそれらの薬学的組成物は、本発明の方法に従って、バンコマイシンを含む他の抗生物質に耐性の細菌感染を示す患者に投与される。さらに、糖ペプチド  抗生物質とは異なって、ダプトマイシンは、グラム陽性細菌に対する迅速な濃度依存性殺菌活性を示す。従って、好ましい実施形態において、ダプトマイシン、リポペプチド抗生物質、またはそれらの薬学的組成物は、本発明の方法に従って、迅速に作用する抗生物質治療の必要がある患者に投与される。
【０２３１】
本発明の方法は、身体における任意の器官または組織のグラム陽性細菌感染のために使用され得る。これらの器官または組織としては、骨格筋、皮膚、血流、腎臓、心臓、肺および骨が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法は、限定されないが、皮膚および軟組織感染、菌血症、および尿路感染を処置するために使用され得る。本発明の方法は、集団獲得性呼吸器感染（中耳炎、副鼻孔炎、慢性気管支炎、および肺炎（薬物耐性Ｓｔｒｅｐｔｏｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅまたはＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅにより引き起こされる肺炎が挙げられる）が挙げられるが、これらに限定されない）を処置するために使用され得る。本発明の方法はまた、異なる型のグラム陽性細菌を包含する混合感染、または、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌（好気性の糞性（ｃａｐｒｏｐｈｉｌｉｃ）細菌、または嫌気性の細菌を包含する）を包含する混合感染を処置するために使用され得る。これらの型の感染は、腹腔内感染および産科学的（ｏｂｓｔｅｔｒｉｃａｌ）／婦人科学的感染を包含する。本発明の方法は、肺炎、腹腔内敗血症、皮膚および軟組織感染、ならびに骨および関節の感染が挙げられるが、これらに限定されない、院内感染（ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）のための段階的減少両方（ｓｔｅｐ−ｄｏｗｎ  ｔｈｅｒａｐｙ）において使用され得る。本発明の方法はまた、心内膜炎、腎炎、敗血性関節炎（ｓｅｐｔｉｃ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）および骨髄炎が挙げられるが、これらに限定されない感染を処置するために使用され得る。好ましい実施形態において、任意の上記の疾患が、ダプトマイシン、リポペプチド抗生物質、またはそれらの薬学的組成物を使用して処置され得る。さらに、疾患は、モノマー形態またはミセル形態のいずれかにおいて、ダプトマイシンまたはリポペプチド抗生物質を使用して処置され得る。
【０２３２】
本発明に従う改変ＮＲＲＳにより生成される改変ダプトマイシン、ダプトマイシン関連リポペプチド、または別のペプチドもしくはリポペプチドはまた、患者または動物の食事または給餌において投与され得る。局所的食餌取り込みの一部として投与される場合、改変ダプトマイシンまたは他のペプチドもしくはリポペプチドの量は、食餌の１重量％未満、好ましくは、０．５重量％以下であり得る。動物の食餌は、通常の食糧（ｆｏｏｄｓｔｕｆｆ）であり得、これに対して、改変ダプトマイシンまたは他のペプチドもしくはリポペプチドが添加され得るか、または前もって混ぜてあるものに添加され得る。
【０２３３】
本発明の方法はまた、改変ダプトマイシンまたは他のペプチド抗生物質もしくはリポペプチド抗生物質以外に、１以上の抗真菌剤および／または１以上の抗生物質を同時に投与しながら実施され得る。抗真菌剤、および改変ダプトマイシンまたは他のペプチド抗生物質もしくはリポペプチド抗生物質以外の抗生物質の同時投与は、混合感染（例えば、異なる型のグラム陽性細菌により引き起こされる感染、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌の両方により引き起こされる感染、または細菌および真菌の両方により引き起こされる感染）のために有用であり得る。さらに、改変ダプトマイシンまたは他のペプチド抗生物質もしくはリポペプチド抗生物質は、１以上の同時投与される抗生物質の毒性プロフィールを改善し得る。ダプトマイシンおよびアミノグリコシドの投与は、アミノグリコシドにより引き起こされる腎臓毒性を改善し得ることが示された。好ましい実施形態において、抗生物質および／または抗真菌剤は、改変ダプトマイシン、他のペプチド抗生物質もしくはリポペプチド抗生物質と同時に、または改変ダプトマイシンまたは別のペプチド抗生物質もしくはリポペプチド抗生物質を含む薬学的組成物中において投与され得る。
【０２３４】
抗細菌剤、および改変ダプトマイシンまたは他のペプチド抗生物質もしくはリポペプチド  抗生物質と同時投与され得るそれらのクラスとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ペニシリンおよび関連薬物、カルバペネム、セファロスポリンおよび関連薬物、アミノグリコシド、バシトラシン、グラミシジン、ムピロシン（ｍｕｐｉｒｏｃｉｎ）、クロラムフェニコール、チアンフェニコール、フシジン酸ナトリウム、リンコマイシン、クリンダマイシン、マクロライド、ノボビオシン、ポリミキシン、リファマイシン、スペクチノマイシン、テトラサイクリン、バンコマイシン、テイコプラニン（ｔｅｉｃｏｐｌａｎｉｎ）、ストレプトグラミン（ｓｔｒｅｐｔｏｇｒａｍｉｎ）、抗葉酸剤（スルホンアミド、トリメトプリム、およびそれらの組み合わせを含む）ならびにピリメタミン、合成抗細菌剤（ニトロフラン、マンデル酸メテナミンおよび馬尿酸メテナミンを含む）、ニトロイミダゾール、キノロン、フルオロキノロン、イソニアジド、エタンブトール、ピラジンアミド、パラアミノサリチル酸（ＰＡＳ）、シクロセリン、カプレオマイシン、エチオナミド、プロチオナミド（ｐｒｏｔｈｉｏｎａｍｉｄｅ）、チアセタゾン（ｔｈｉａｃｅｔａｚｏｎｅ）、バイオマイシン、エベミノマイシン（ｅｖｅｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、糖ペプチド、グリシルサイクリン（ｇｌｙｃｙｌｃｙｌｃｌｉｎｅ）、ケトリド（ｋｅｔｏｌｉｄｅ）、オキサゾリジノン（ｏｘａｚｏｌｉｄｉｎｏｎｅ）；イミペネム（ｉｍｉｐｅｎｅｎ）、アミカシン、ネチルマイシン、ホスホマイシン、ゲンタマイシン、セフトリアキソン、Ｚｉｒａｃｉｎ、ＬＹ  ３３３３２８、ＣＬ  ３３１００２、ＨＭＲ  ３６４７、Ｌｉｎｅｚｏｌｉｄ、Ｓｙｎｅｒｃｉｄ、アズトレオナム、およびメトロニダゾル、Ｅｐｉｒｏｐｒｉｍ、ＯＣＡ−９８３、ＧＶ−１４３２５３、Ｓａｎｆｅｔｒｉｎｅｍ  ｓｏｄｉｕｍ、ＣＳ−８３４、Ｂｉａｐｅｎｅｍ、Ａ−９９０５８．１、Ａ−１６５６００、Ａ−１７９７９６、ＫＡ  １５９、Ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ  Ａ、ＤＸ８７３９、ＤＵ  ６６８１；Ｃｅｆｌｕｐｒｅｎａｍ、ＥＲ  ３５７８６、Ｃｅｆｏｓｅｌｉｓ、Ｓａｎｆｅｔｒｉｎｅｍ  ｃｅｌｅｘｅｔｉｌ、ＨＧＰ−３１、Ｃｅｆｐｉｒｏｍｅ、ＨＭＲ−３６４７、ＲＵ−５９８６３、Ｍｅｒｓａｃｉｄｉｎ、ＫＰ  ７３６、リファラジル；Ｋｏｓａｎ、ＡＭ  １７３２、ＭＥＮ  １０７００、Ｌｅｎａｐｅｎｅｍ、  ＢＯ  ２５０２Ａ、ＮＥ−１５３０、ＰＲ  ３９、Ｋ１３０、ＯＰＣ  ２００００、ＯＰＣ  ２０４５、Ｖｅｎｅｐｒｉｍ、ＰＤ  １３８３１２、ＰＤ  １４０２４８、ＣＰ  １１１９０５、Ｓｕｌｏｐｅｎｅｍ、ｒｉｔｉｐｅｎａｍ  ａｃｏｘｙｌ、ＲＯ−６５−５７８８、シクロチアリジン、Ｓｃｈ−４０８３２、ＳＥＰ−１３２６１３、ｍｉｃａｃｏｃｉｄｉｎ  Ａ、ＳＢ−２７５８３３、ＳＲ−１５４０２、ＳＵＮ  Ａ００２６、ＴＯＣ  ３９、ｃａｒｕｍｏｎａｍ、Ｃｅｆｏｚｏｐｒａｎ、Ｃｅｆｅｔａｍｅｔ  ｐｉｖｏｘｉｌ、ならびにＴ  ３８１１。
【０２３５】
好ましい実施形態において、本発明に従う改変ＮＲＰＳにより生成される改変ダプトマイシンまたはペプチド抗生物質もしくはリポペプチド抗生物質と同時投与され得る抗細菌剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：イミペネム（ｉｍｉｐｅｎｅｎ）、アミカシン、ネチルマイシン、ホスホマイシン、ゲンタマイシン、セフトリアキソン、テイコプラニン、Ｚｉｒａｃｉｎ、ＬＹ  ３３３３２８、ＣＬ  ３３１００２、ＨＭＲ  ３６４７、Ｌｉｎｅｚｏｌｉｄ、Ｓｙｎｅｒｃｉｄ、アズトレオナム、およびメトロニダゾル。
【０２３６】
改変ダプトマイシンまたは他のペプチド抗生物質もしくはリポペプチド抗生物質と同時投与され得る抗真菌剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｃａｓｐｏｆｕｎｇｅｎ、Ｖｏｒｉｃｏｎａｚｏｌｅ、Ｓｅｒｔａｃｏｎａｚｏｌｅ、ＩＢ−３６７、ＦＫ−４６３、ＬＹ−３０３３６６、Ｓｃｈ−５６５９２、Ｓｉｔａｆｌｏｘａｃｉｎ、ＤＢ−２８９ポリエン（例えば、アンホテリシン、ナイスタチン、Ｐｒｉｍａｒｉｃｉｎ）；アゾール（例えば、フルコナゾール、イトラコナゾール、およびケトコナゾール）；アリルアミン（例えば、ナフチフィンおよびテルビナフィン（Ｔｅｒｂｉｎａｆｉｎｅ）；ならびに抗代謝産物（例えば、フルシトシン）。他の抗真菌剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：本明細書中に参考として援用される、Ｆｏｓｔｅｌら，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  ５：２５−３２（２０００）に開示されるもの。Ｆｏｓｔｅｌらは、抗真菌化合物を開示し、この化合物としては、Ｃｏｒｙｎｅｃａｎｄｉｎ、Ｍｅｒ−ＷＦ３０１０、Ｆｕｓａｃａｎｄｉｎｓ、Ａｒｔｒｉｃｈｉｔｉｎ／ＬＬ  １５Ｇ２５６ｙ、Ｓｏｒｄａｒｉｎｓ、Ｃｉｓｐｅｎｔａｃｉｎ、アゾキシバシリン（Ａｚｏｘｙｂａｃｉｌｌｉｎ）、ＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎおよびＫｈａｆｒｅｆｕｎｇｉｎが挙げられる。
【０２３７】
改変ダプトマイシンまたは他のペプチド抗生物質もしくはリポペプチド抗生物質（ダプトマイシン関連リポペプチドを含む）は、細菌感染が根絶または軽減されるまで、本発明の方法に従って投与され得る。１つの実施形態において、本発明に従う改変ＮＲＰＳにより生成される改変ダプトマイシン、または他のペプチドもしくはリポペプチドは、３日〜６ヶ月の期間にわたり投与される。好ましい実施形態において、改変ダプトマイシン、または他のペプチドもしくはリポペプチドは、７〜５６日間投与される。より好ましい実施形態において、改変ダプトマイシン、または他のペプチドもしくはリポペプチドは、７〜２８日間投与される。なおより好ましい実施形態において、改変ダプトマイシンまたは他のペプチド抗生物質もしくはリポペプチド抗生物質は、７〜１４日間投与される。別の実施形態において、その抗生物質は、３〜７日間投与される。本発明に従う改変ＮＲＰＳによって生成された改変ダプトマイシン、または他のペプチドもしくはリポペプチドは、本発明に従って、所望される場合に、より長い期間またはより短い期間にわたり投与され得る。
【０２３８】
本発明がより十分に理解され得るために、以下の実施例が示される。これらの実施例は、  例示目的に過ぎず、如何様にも本発明の範囲を限定するとは解釈されない。
【実施例】
【０２３９】
（実施例１：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓダプトマイシン生合成遺伝子クラスターの最初の配列決定）
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ株Ａ２１９７８．６（アメリカンタイプカルチャーコレクション受託番号３１５６８）を、コスミドライブラリーの構築のために使用した。ゲノムＤＮＡを、Ｓａｕ３Ａ１およびアルカリホスファターゼで部分的に消化した（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。約４０ｋｂ長のＤＮＡを単離し、ＢａｍＨＩ消化コスミドｐＫＣ１４７１に連結し、ＨｏｓｔｅｄおよびＢａｌｔｚ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７９，ｐｐ．１８０−１８６（１９９７）に記載されるように、Ｇｉｇａｐａｃｋ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｅｘｔｒａｃｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．）を用いてパッケージングした。パッケージされたＤＮＡを、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ−ＭＦＲ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．）に導入し、コスミドＤＮＡを含む個々のクローンを、９６ウェルドットブロット装置において指示したアレイとして保存した。マイクロタイターウェルの行から１２の培養物をプールし、プラスミドｐＲＨＢ１５３に由来する２．１−ｋＢ  ＳｐｈＩフラグメントのＤＮＡに対するハイブリダイゼーションおよびｐＲＨＢ１５７由来の５．２−ｋＢ  ＤｒａＩ−ＫｐｎＩフラグメント（ともに、Ｓ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ（ＭｃＨｅｎｎｅｙら、前出を参照のこと）からクローニングされたＮＲＰＳ配列を含む）によりスクリーニングした。ハイブリダイズするプールからの個々のコスミドを、同じプローブに対するハイブリダイゼーションにより同定した。
【０２４０】
コスミドおよびプラスミドＤＮＡを、流体力学的に剪断し、次いで、標準的な１％アガロースゲル上で電気泳動により分離した。２５００〜３０００ｂｐ長の分離されたＤＮＡフラグメントを、ゲルから切り出し、Ｇｅｎｅ  ＣｌｅａｎＴＭ手順（ＢＩＯ  １０１，Ｉｎｃ．）により精製した。次いで、ゲル精製したＤＮＡフラグメントの末端を埋め、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端にした。これらのＤＮＡフラグメントを、独特のＢｓｔＸＩ−リンカーアダプタ（５’−ＧＴＣＴＴＣＡＣＣＡＣＧＧＧＧ−３’−配列番号１３、および５’−ＧＴＧＧＴＧＡＡＧＡＣ−３’−配列番号１４（１００〜１０００倍モル濃度過剰））に連結した。これらのリンカーは、ＢｓｔＸＩ切断ｐＧＴＣベクター（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）に相補的であるが、オーバーハングは、自己相補的（ｓｅｌｆ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）ではない。従って、リンカーは、コンカテマー化することもなく、切断されたベクター（ｏｐｅｎ  ｖｅｃｔｏｒ）を容易に自己連結することもない。そのリンカーに適応した挿入物を、１％アガロースゲル上での電気泳動によって組み込まれていないリンカーから分離し、ＧｅｎｅＣｌｅａｎＴＭを用いて精製した。精製されたリンカーに適応した挿入物を、ＢｓｔＸＩ切断ｐＧＴＣベクターに連結して、「ショットガン」サブクローンライブラリーを構築した。
【０２４１】
次いで、そのｐＧＴＣライブラリーを、ＤＨ５αコンピテント細胞（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、ＤＨ５α形質転換プロトコル）に形質転換した。形質転換を、アンピシリンおよびＩＰＴＧ／Ｘｇａｌ（ＩＰＴＧ＝イソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド；Ｘｇａｌ＝５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル（ｉｎｄｏｙｌ）−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を含む抗生物質プレートにプレートすることによって評価した。プレートを、３７℃で一晩インキュベートした。形質転換体を、プレート精製し（ｐｌａｔｅ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ）、以下のプラスミドを含むその精製クローンを拾って、さらに分析した。
【０２４２】
プラスミドｐＲＨＢ１６０（約５０ｋｂのＳ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ  ＤＮＡの挿入物を含む）、ｐＲＨＢ６１３（約１５ｋｂの挿入物を含む）、ｐＲＨＢ６１４（約１３ｋｂの挿入物を含む）、およびｐＲＨＢ１５９（約５１ｋｂの挿入物を含む）を、ＤＮＡ配列決定のために選択した（ＭｃＨｅｎｎｅｙら、前出を参照のこと）。
【０２４３】
上記プラスミドを形質転換した培養物の個々の株を、３７℃にて一晩増殖させた。ＤＮＡを、シリカビーズＤＮＡ調製法（Ｅｎｇｅｌｓｔｅｉｎら，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｃｏｍｐ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３（４）：２３７−２４１，１９９８）を使用して精製した。このようにして、２５ｍｇのＤＮＡをクローン毎に得た。次いで、これらの精製ＤＮＡサンプルを、主にＡＢＩ色素ターミネーター化学を使用して配列決定した。その後の全ての工程は、ＡＢＩ３７７またはＡｍｅｒｓｈａｍ自動化ＤＮＡ配列決定法により、製造業者の説明書に従う配列決定に基づいた。このＡＢＩ色素ターミネーター配列読み取りを、ＡＢＩ３７７またはＡｍｅｒｓｈａｍ  ＭｅｇａＢａｃｅＴＭキャピラリー機械のいずれかで行った。このデータを、ゲルのレーン追跡の後に、ＵＮＩＸ（登録商標）搭載機に移した。基本細胞および品質スコアを、プログラムＰＨＲＥＤ（Ｅｗｉｎｇら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．８：１７５−１８５，１９９８）を使用して決定した。読み取りを、ＰＨＲＡＰ（Ｐ．Ｇｒｅｅｎ，Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  ｏｆ  ＤＯＥ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｃｏｎｔｒａｃｔｏｒ−Ｇｒａｎｔｅｅ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  Ｖ，Ｊａｎ．１９９６，ｐ．１５７）を用いて、デフォルトプログラムパラメーターおよび品質スコアにより組み立てた。最初の組立は、６×範囲にて行った。
【０２４４】
（実施例２：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ生合成遺伝子クラスタのさらなるＤＮＡ分子の単離および分析）
メガ塩基ＤＮＡの調製物のための菌糸体を、Ｆ１０Ａブロス（２％寒天、２５％可溶性デンプン、０．２％デキストロース、０．５％酵母抽出物、０．５％ペプトンおよび０．３％炭酸カルシウム）中で３０℃にて振盪したＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ（ＮＲＲＬ１１３７９）（ＡＴＣＣ番号３１５６８）の一晩培養物から得た。洗浄した細胞を、ＳｅａｋｅｒｍＴＭ  ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，１％  終濃度）中に包埋し、リゾチーム（２ｍｇ／ｍＬ  ＴＥ）中で３７℃にて３時間インキュベートし、次いで、０．１×ＮＬＳ＋０．２ｍｇ／ｍＬ  プロテイナーゼＫ中で、５０℃にて一晩溶解して、ゲルマトリクス中にＤＮＡを放出した。ＤＮＡを含むアガロースを、ＢａｍＨＩで３７℃にて処理する前に、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８）で洗浄した。次いで、部分的に消化したＤＮＡを、６Ｖ／ｃｍ、１２０°、１２℃に設定したＣＨＥＦ  Ｍａｐｐｅｒ  ＤＲＩＩＩ（Ｂｉｏｒａｄ）を使用する、パルス場電気泳動（ｐｕｌｓｅｄ−ｆｉｅｌｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）により、０．６％  アガロースゲル（０．５×ＴＢＥ中）における２工程のサイズ選択プロセスに供した。最初の選択は、２２〜４４秒の線形傾斜したスイッチ時間を用いた、１４時間のランからなった。１００〜２００ｋｂのラムダコンカテマーサイズマーカーと同時に移動するＤＮＡを含むゲルを切り出し、３〜５秒の線形傾斜を用いた１８時間のランのために第２のゲルに入れた。サイズマーカーと比較して７５〜１４５ｋｂと推測されたＤＮＡを、ＴＡＥ中に電気溶出した。（ＭｉｎｉＰｒｏｔｅａｎ  ＩＩ  Ｃｅｌｌ  ｍｏｄｅｌ，Ｂｉｏｒａｄ）。
【０２４５】
単一コピーのＢＡＣライブラリークローニングベクターｐＳｔｒｅｐｔｏＢＡＣ  Ｖを、ｐＢＡＣｅ３．６（Ｆｒｅｎｇｅｎら，Ａ  ｍｏｄｕｌａｒ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｖｅｃｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，５８：２５０−２５３（１９９９））から得た。このｐＢＡＣｅ３．６を改変して、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓにおける接合および部位特異的組み込みのために、２つのマーカー（Ｅ．ｃｏｌｉにおける選択のためのＡｍｐＲおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓにおける選択のためのＡｐｒａＲ）、ならびにファージｊＣ３１由来のｏｒｉＴ配列およびａｔｔＰ配列を含めた。図６を参照のこと。Ｓ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ  ＤＮＡとの連結のためのｐＳｔｒｅｐｔｏＢＡＣ  Ｖベクターを調製するために、このベクターを、まず、ＢａｍＨＩで消化し、反応を、熱により不活化した（６５℃、１時間）。次いで、ＤＮＡを、エビアルカリホスファターゼで３０分間脱リン酸化した（ｄｅｐｈｏｓｐｏｒｙｌａｔｅｄ）。２つのバンド（ｐＵＣフラグメントに対応する１３ｋｂおよび３ｋｂ）を、０．６％  アガロースゲル上で分離し、１３ｋｂバンドを、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎスピンカラムを用いて精製した。
【０２４６】
２００ｎｇのＳ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ  ＤＮＡを、１５０μｌ反応系において、７５ｎｇのＢａｍＨＩ切断してホスファターゼ処理した（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｄ）ｐＳｔｒｅｐｔｏＢＡＣ  ＶベクターＤＮＡに、９ＵのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて連結した。１６℃で１６時間後、連結物を、６５℃にて３０分加熱し、１０％  ポリエチレングリコール８０００に対して透析し、３００Ｖおよび４ｋΩの電圧ブースターを備える細胞ポレーター（ｃｅｌｌ  ｐｏｒａｔｏｒ）（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を使用して、１０μｌのＤＨ１０Ｂ  エレクトロコンピテント細胞（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）に形質転換した。細胞を、１００ｍｇ／ｍＬ  アプラマイシン（ａｐｒａｍｙｃｉｎ）および５％  スクロースを含有する培地（ＬＢ寒天）にプレートした。サンプルクローンの分析により、３９ｋｂ〜１０５ｋｂの範囲の挿入物が示された。挿入物の平均サイズは、７１．４ｋｂであり、標準偏差は、１４．７ｋｂであった。約２，０００のクローンを、９６ウェルマイクロタイタープレート中で−８０℃にて保管した。
【０２４７】
このＢＡＣライブラリーを、プライマー対（以下に示されるＰ６１／Ｐ６２、Ｐ７２／Ｐ７３およびＰ７４／Ｐ７５）を使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてスクリーニングした。ヌクレオチド位置とは、配列番号１の番号付けをいい、「Ｃ」は、プライマー配列が、配列番号１の相補鎖に対応することを示す。
【０２４８】
【表１】
2005508622.tif 000002
ＰＣＲを、以下の条件下で行った：９４℃で４５秒、５４℃で３０秒、７２℃で１分（３２サイクル）。Ｔａｑポリメラーゼ、ならびにアクセサリ試薬を、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）から入手し；全ての反応系に、５％  ＤＭＳＯを含めた。
【０２４９】
クローンＢ１２：０３Ａ０５を、プライマー対Ｐ６１／Ｐ６２（上記を参照のこと）を用いて最初に検出し、続いて、他の２つのプライマー対を用いてポジティブヒットであることを確認した。クローンＢ１２：０３Ａ０５のＤＮＡを、標準的なアルカリホスファターゼ溶解手順により得て、ＤＮＡ配列決定のために使用した（以下を参照のこと）。
【０２５０】
ダプトマイシン遺伝子クラスターの部分を含む他の多数のクローン（ｄｐｔ関連クローン）を、ＢＡＣライブラリーから単離した。これらのクローンとしては、Ｂ１２：０１Ｇ０５（挿入サイズ８２ｋｂ）、Ｂ１２：０６Ａ１２（挿入サイズ８５ｋｂ）、Ｂ１２：１２Ｆ０６（挿入サイズ６５ｋｂ）、Ｂ１２：１８Ｈ０４（挿入サイズ４６ｋｂ）およびＢ１２：２０Ｃ０９（挿入サイズ６５ｋｂ）が挙げられる。これらのＢＡＣクローンのＨｉｎＤＩＩＩ消化を示す、図７を参照のこと。このダプトマイシン遺伝子クラスター領域から単離された他のＢＡＣとしては、Ｂ１２：０９Ｄ０２、Ｂ１２：１７Ｆ０８、Ｂ１２：０５Ｄ０８、Ｂ１２：１５Ｈ０７、Ｂ１２：２１Ｆ１０およびＢ１２：１６Ｄ１２が挙げられる。これらのＢＡＣは、１８０〜２００ｋｂをカバーする。図８は、ダプトマイシン遺伝子クラスターに対する、これらのＢＡＣクローンの近似位置を示す。
【０２５１】
実施例２において決定されたダプトマイシン生合成遺伝子クラスター配列の伸長を、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）、業者の推奨する反応ミックスおよび条件、ならびに以下のプライマー（Ｃは、プライマー配列が、配列番号１の相補鎖に対応することを示す）を使用して、クローンＢ１２：０３Ａ０５由来のＢＣＡ  ＤＮＡの１μｇのアリコートを配列決定することによって達成した：
【０２５２】
【表２】
2005508622.tif 000003
2005508622.tif 000004
電気泳動図（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈａｎｅｒｏｇｒａｍ）を調査し、必要に応じて補正して、そして配列を、ＭａｃＶｅｃｔｏｒＴＭのＡｓｓｅｍｂｌｙＬｉｇｎ  Ｍｏｄｕｌｅを使用して整列した。整列した配列（コンティグ（ｃｏｎｔｉｇ））を、分析および注解のために、ＭａｃＶｅｃｔｏｒＴＭファイルとして保存した。潜在的なＯＲＦおよび潜在的な終止／開始の同定を、ＭａｃＶｅｃｔｏｒＴＭにおいてオープンリーディングフレームオプションを使用して実施した。
【０２５３】
９０ｋｂの配列の分析により、ダプトマイシン生合成遺伝子クラスター領域中の合計３８個のオープンリーディングフレームを示した。図２を参照のこと。これらのＯＲＦは、２２８塩基対（ｂｐ）〜２２ｋｂの範囲のサイズである。３つの最も大きいＯＲＦは、以下に考察されるような、ＮＲＰＳ遺伝子である。ＮＲＰＳ遺伝子の１つは、保存されたモチーフＧＸＳＸＧの存在に基づいて、チオエステラーゼ活性を有すると予測された（実施例３を参照のこと）。別の予測されたオープンリーディングフレームもまた、チオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードする（実施例３を参照のこと）。多数の潜在的ＡＢＣトランスポーターもまた、同定した。
【０２５４】
ダプトマイシン生合成遺伝子クラスターの配列を、配列番号１に示す。図２もまた参照のこと。ダプトマイシン非リボソームペプチドシンテターゼ（ＮＲＰＳ）をコードするこれらの遺伝子は、ｄｐｔＡ、ｄｐｔＢＣおよびｄｐｔＤと称される。本発明者らは、上流のＯＲＦの一部ではない、目的のＯＲＦの開始から上流の全ての配列をプローブ領域と称した。ｄｐｔＡ、ｄｐｔＢＣおよびｄｐｔＤは、重複した開始コドンおよび終止コドンを有し、そして明らかに翻訳的に結合しているので（例えば、ｄｐｔＢＣのＴＧＡ終止コドンは、ｄｐｔＤのＡＴＧ開始コドン（これはおそらく、それ自体のリボソーム結合部位に関連する）と重複する）、本発明者らは、クラスター全体（ｄｐｔＥ、ｄｐｔＦ、ｄｐｔＡ、ｄｐｔＢＣおよびｄｐｔＤを含む）のプロモーターを、ダプトマイシンＮＰＲＳプロモーターとして示す。
【０２５５】
ダプトマイシンＮＲＰＳ  ｄｐｔＡ遺伝子のＯＲＦ（配列番号１のヌクレオチド３８５５５−５６０４７）のＤＮＡ配列は、配列番号１０に示される。このＯＲＦは、１７４９３ヌクレオチド長である。コードされたＤｐｔＡタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号９に示される。このタンパク質は、５８３０アミノ酸残基長である。
【０２５６】
ダプトマイシンＮＲＰＳ  ｄｐｔＢＣ遺伝子のＯＲＦ（配列番号１のヌクレオチド５６０４４−７８０６０）のＤＮＡ配列は、配列番号１２に示される。このＯＲＦは、２２０１７ヌクレオチド長である。コードされたＤｐｔＢＣタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１１に示される。このタンパク質は、７３３８アミノ酸残基長である。
【０２５７】
ダプトマイシンＮＲＰＳ  ｄｐｔＤ遺伝子のＯＲＦ（配列番号１のヌクレオチド７８０５７−８５１９６）のＤＮＡ配列は、配列番号３に示される。このＯＲＦは、７１４０ヌクレオチドである。ｄｐｔＤ遺伝子のＯＲＦは、そのＣ末端にＩ型チオエステラーゼ（ＴＥＩ）ドメインをコードする。予測されたＤｐｔＤタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号７に示される（図３を参照のこと）。このタンパク質は、２３７９アミノ酸長である。
【０２５８】
ｄｐｔＥ遺伝子およびｄｐｔＦ遺伝子は、ｄｐｔＡとダプトマイシンＮＰＲＳプロモーターとの間に位置する。
【０２５９】
ｄｐｔＨチオエステラーゼをコードする遺伝子のＤＮＡ配列は、配列番号４に示される（配列番号１のヌクレオチド８５４９８−８６３５０）；ｄｐｔＨのプロモーター領域は、配列番号５に示される（配列番号１のヌクレオチド８５４９８−８５５３４）；そしてｄｐｔＨのオープンリーディングフレームは、配列番号６に示される（配列番号１のヌクレオチド８５５３５−８６３５０）。予測されたＤｐｔＨタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号８に示される（図４を参照のこと）。
【０２６０】
ダプトマイシンＮＲＰＳのプロモーター領域（配列番号１のヌクレオチド３６０１８−３６４０７）は、配列番号２に示される。
【０２６１】
９０ｋｂのコンティグの下流のＤＮＡの配列を、ＧＰＳ−１  Ｇｅｎｏｍｅ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ  （Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）のようなシステムを使用して、トランスポゾンプライミング配列決定によって、プラスミドｐＶ１０７から、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｓが作製した。プラスミドｐＶ１０７は、Ｂ１２：０３Ａ０５ゲノムからＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で切断されたベクターｐＮＥＢ１９３中に、標準的な技術を使用してサブクローニングされた、約２８ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントを含む。このフラグメントは、ＧＴＣ２フラグメントと呼ばれる。適切な数のトランスポゾンタグ化ライブラリークローンを配列決定して、６倍冗長なコンティグを作製し、そしてＰＣＲ産物のさらなる局所的配列決定を使用して、必要な配列を洗練した。コンティグの５’末端と既存の９０ｋｂとの間の重複をコンティグから除去し、その結果、ｐＶ１０７由来の配列（ＧＴＣ２ともいう）の開始は、１で始まる。ＧＴＣ２フラグメントの配列は、配列番号１０６に提供される。
【０２６２】
（実施例３：チオエステラーゼとしてのｄｐｔＤ遺伝子およびｄｐｔＨ遺伝子の同定）
非リボソームペプチドシンテターゼおよびチオエステラーゼに典型的なアミノ酸モチーフを、ｄｐｔＤ遺伝子およびｄｐｔＨ遺伝子の調査によって同定し、そしてこれらの翻訳産物を予測した。アミノ酸配列モチーフＧＸＳＸＧ（ここで、Ｘは、リボソームにより産生されるタンパク質中に翻訳によって挿入される２０種のＬ−アミノ酸のうち任意の１つである）は、チオエステラーゼを示す（Ｍｏｏｔｚら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：６８４３−６８５０，１９９７（その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。配列番号７〜８を、ＧＸＳＸＧチオエステラーゼモチーフについて調査した。配列番号７において、チオエステラーゼモチーフＧＷＳＦＧに対するアミノ酸配列一致が座標２２００−２２０４にて見出され、これは、配列番号１のヌクレオチド８４６５４−８４６６８によってコードされる。配列番号８において、チオエステラーゼモチーフＧＴＳＬＧに対するアミノ酸配列一致が座標９７１０１において見出され、これは、配列番号１のヌクレオチド８５８２３−８５８３８によってコードされる。
【０２６３】
配列番号７のＤｐｔＤタンパク質を、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのＣＤＡ  ＩＩＩタンパク質と整列させた。このアラインメントを、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ（ｖ１．４）プログラムを、スローペアワイズアラインメントモード（ｓｌｏｗ  ｐａｉｒｗｉｓｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｍｏｄｅ）で使用して、実施した。１０．０のオープンギャップペナルティ、０．１の拡張ギャップペナルティおよびｂｌｏｓｕｍ類似性マトリクスを、ＣＤＡ  ＩＩＩタンパク質に対して使用した。ＣＤＡ  ＩＩＩタンパク質は、カルボキシ末端チオエステラーゼドメインを有する非リボソームペプチドシンテターゼである（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＡＬ０３５７０７、バージョンＡＬ０３５７０７．１  ＧＩ：４４９０９７８（本明細書中でその全体が参考として援用される）を参照のこと）。このアラインメントに使用したＣＤＡ  ＩＩＩのアミノ酸配列を、２つのＧＥＮＢＡＮＫコスミド配列（ＡＬ０３５７０７およびＡＬ０３５６４０）由来のコンティグを作成し、次いでＧＥＮＢＡＮＫに登録されたコンティグ中のオープンリーディングフレームを翻訳することによって、ＭａｃＶｅｃｔｏｒプログラムを使用して作成した。配列比較（図３）により、７７０５および１２２３の保存された同一性のアラインメントスコアが明らかとなり、比較された２つの配列間の有意な類似性が示された。ＤｐｔＤタンパク質およびＣＤＡ  ＩＩＩタンパク質のＧＸＳＸＧチオエステラーゼモチーフを、この分析において整列した。
【０２６４】
配列番号８のＤｐｔＨタンパク質のＧＸＳＸＧチオエステラーゼモチーフを、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのＣＤＡ  ＩＩＩタンパク質（ＣＡＡ７１３３８タンパク質、上記を参照のこと）のＧＸＳＸＧチオエステラーゼモチーフと整列した。アラインメントを、スローペアワイズアラインメントモードでＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ（ｖ１．４）プログラムで実施した。ＧＥＮＰＥＰＴ記録ＣＡＡ７１３３８（バージョンＣＡＡ７１３３８．１  ＧＩ：２６４７９７５（本明細書中でその全体が参考として援用される））のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓチオエステラーゼタンパク質に対して、１０．０のオープンギャップペナルティ、０．１の拡張ギャップペナルティ、およびｂｌｏｓｕｍ類似性マトリクスを使用した。アラインメント（図４）により、９５５および１４５の保存された同一性のアラインメントスコアが明らかとなり、比較された２つの配列間の有意な類似性が示された。
【０２６５】
これらの分析は、ｄｐｔＤおよびｄｐｔＨがチオエステラーゼタンパク質（特に、配列番号７〜８のタンパク質）をコードすることを示す。
【０２６６】
（実施例４：ダプトマイシンＮＲＰＳの同定）
（ダプトマイシンＮＲＰＳサブユニットとしてのｄｐｔＤの同定）
上記（実施例２および３）のｄｐｔＤ  ＤＮＡ配列の予測された翻訳産物を、ＮＲＰＳ文献中に記載された種々のタンパク質モチーフの存在について、目で見て調査した。縮合ドメインを示すｄｐｔＤ縮合（「Ｍ」）モチーフを、配列番号１のヌクレオチド７８４８６−７８５０９にて同定した（実施例４〜６において考察されるヌクレオチド位置の全ては、配列番号１を参照する）。例えば、ＮＲＰＳ中の種々のモチーフについては、Ｋｌｅｉｎｋａｕｆら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３６，ｐｐ．３３５−３５１（１９９６）を；そしてＰｏｓｐｉｅｃｈら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４２，ｐｐ．７４１−７４６（１９９６）を参照のこと。ＡＴＰ結合（「Ｃ」）モチーフを、ヌクレオチド７９８９６−７９９２８にて同定し、ＡＴＰ結合（「Ｅ」）モチーフを、ヌクレオチド８０４５１−８０４８６にて同定し、ＡＴＰａｓｅ（「Ｆ」）モチーフを、ヌクレオチド８０５５６−８０５７９にて同定し、そしてＡＴＰ結合（「Ｇ」）モチーフを、ヌクレオチド８０６５２−８０６７５にて同定した。これらのモチーフは、集合的に、アデニル化ドメインを示す。チオール化（ｔｈｉｏｌａｔｉｏｎ）（「Ｊ」）モチーフ（これは、チオール化（ＰＣＰ）ドメインを示す）を、ヌクレオチド８１０４８−８１０６２にて同定した。上記モチーフおよびこれらが示すドメインは、ｄｐｔＤのモジュール１に属する；ダプトマイシンシンテターゼに関しては、これは、モジュール１２である。
【０２６７】
別のｄｐｔＤ縮合（「Ｍ」）モチーフ（これは、縮合ドメインを示す）を、ヌクレオチド８１６２１−８１６４４にて同定した。別のＡＴＰ結合（「Ｃ」）モチーフを、ヌクレオチド８３１１４−８３１４７にて同定し、ＡＴＰ結合（「Ｅ」）モチーフを、ヌクレオチド８３６６７−８３７０２にて同定し、ＡＴＰａｓｅ（「Ｆ」）モチーフを、ヌクレオチド８３７７２−８３７９５にて同定し、そしてＡＴＰ結合（「Ｇ」）モチーフを、ヌクレオチド８３８６８−８３８９１にて同定した。上記モチーフは、集合的に、別のアデニル化ドメインを示す。また、チオール化（「Ｊ」）モチーフ（チオール化（ＰＣＰ）ドメインの指標）を、ヌクレオチド８４２５５−８４２６９にて同定した。上記モチーフおよびこれらが示すドメインは、ｄｐｔＤのモジュール２に属する：ダプトマイシンシンテターゼに関しては、これは、モジュール１３である。
【０２６８】
上記の予測されたモチーフおよびドメインに対応するＤｐｔＤアミノ酸配列を同定した（ＤｐｔＤについての全てのアミノ酸位置は、配列番号７中のアミノ酸位置を参照する）。ＤｐｔＤのモジュール１（ダプトマイシンシンテターゼのモジュール１２に対応する）に属するこれらのモチーフおよびこれらが示すドメインは、以下の通りである：ＤｐｔＤ縮合（「Ｍ」）モチーフを、座標１４４−１５１にて同定した；ＡＴＰ結合（「Ｃ」）モチーフを、座標６１４−６２４にて同定した；ＡＴＰ結合（「Ｅ」）モチーフを、座標７９９−８１０にて同定した；ＡＴＰａｓｅ（「Ｆ」）モチーフを、座標８３４−８４１にて同定した；ＡＴＰ結合（「Ｇ」）モチーフを、座標８６６−８７３にて同定した；そしてチオール化（「Ｊ」）モチーフを、座標９９８−１００２にて同定した。
【０２６９】
ＤｐｔＤのモジュール２（ダプトマイシンシンテターゼのモジュール１３に対応する）に属するＤｐｔＤモチーフおよびこれらが示すドメインは、以下の通りである：ＤｐｔＤ縮合（「Ｍ」）モチーフを、座標１１８９−１１９６にて同定した；ＡＴＰ結合（「Ｃ」）モチーフを、座標１６８７−１６９７にて同定した；ＡＴＰ結合（「Ｅ」）モチーフを、座標１８７１−１８８２にて同定した；ＡＴＰａｓｅ（「Ｆ」）モチーフを、座標１９０６−１９１３にて同定した；ＡＴＰ結合（「Ｇ」）モチーフを、座標１９３８−１９４５にて同定した；そしてチオール化（「Ｊ」）モチーフを、座標２０６７−２０７１にて同定した。これらのＡＴＰ結合モチーフは、アデニル化ドメインを示す。
【０２７０】
（ダプトマイシンＮＲＰＳサブユニットとしてのｄｐｔＡおよびｄｐｔＢＣの同定）
特定のＭモチーフ、Ｃモチーフ、Ｅモチーフ、Ｆモチーフ、ＧモチーフおよびＪモチーフを、ｄｐｔＡおよびｄｐｔＢＣにおいて類似の様式で同定した。各モチーフの配列および型、各モチーフが見出される遺伝子およびモジュール、ならびに各モチーフのアミノ酸座標およびヌクレオチド座標を、以下の表１に示す：
【０２７１】
【表３】
2005508622.tif 000005
2005508622.tif 000006
表１中のアミノ酸座標は、各タンパク質のアミノ酸配列を参照する（ＤｐｔＡ：配列番号９；ＤｐｔＢＣ：配列番号１１）。ヌクレオチド位置は、配列番号１のヌクレオチド位置を参照する。
【０２７２】
（実施例５：アミノ酸ポケットコードの注釈）
アミノ酸ポケットコードとは、同族アミノ酸の認識および／または同族アミノ酸の結合に関与すると考えられているアデニル化（Ａ）ドメイン中のアミノ酸残基のセットをいう。１３個のダプトマイシンシンテターゼモジュールについてのアミノ酸ポケットコードを、以下に示す（表２）。
【０２７３】
Ｓｔａｃｈｅｌｈａｕｓら、（１９９９），Ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ−ｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇ  ｃｏｄｅ  ｏｆ  ａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎ  ｎｏｎｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６：４９３−５０５に記載されるように、ダプトマイシンシンテターゼモジュールについてのアミノ酸ポケットコードを、ＮＲＰＳ  Ａドメイン（アミノ酸結合ポケット）と整列された推定Ｄｐｔ翻訳産物の、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ  ７．０を使用して作成されたアラインメントの、Ｂｌａｓｔ分析または目で見た調査によって、同定した。Ｃｈａｌｌｉｓら、（２０００），Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ｎｏｎｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎｓ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．７：２１１−２２４もまた参照のこと。
【０２７４】
【表４】
2005508622.tif 000007
2005508622.tif 000008
表２のアミノ酸座標は、各タンパク質（ＤｐｔＡ：配列番号９；ＤｐｔＢＣ：配列番号１１；ＤｐｔＤ：配列番号７）のアミノ酸配列をいう。そのヌクレオチド位置は、配列番号１のヌクレオチド位置をいう。
【０２７５】
ダプトマイシン遺伝子クラスターにおけるアスパラギン酸およびアスパラギンについてのアデニル化ドメイン全体と、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのＣＤＡ  ＩＩＩ  ＮＲＰＳにおけるアスパラギン酸、アスパラギン、およびスレオニンについてのアデニル化ドメインとの間の類似性を、図１０に示す。アミノ酸を整列し、そして系統図を、ＭａｃＶｅｃｔｏｒを用いて構築した。命名法は、以下の通りである：遺伝子の名前−−遺伝子におけるモジュール数−−活性化されるアミノ酸（１文字コード）。そのアラインメントは、ダプトマイシン遺伝子クラスターにおけるアスパラギン酸およびアスパラギンについてのアデニル化ドメインが、それらが非関連アミノ酸（例えば、スレオニン）由来のドメインに対するよりも互いに対して類似していることを示す。さらに、そのアラインメントは、ダプトマイシン遺伝子クラスターにおけるアスパラギン酸およびアスパラギンのアデニル化ドメインが、それらがＣＤＡにおけるアスパラギン酸およびアスパラギンのモジュールに対して類似するよりも、互いに対して類似していることを示す。
【０２７６】
（実施例６：ダプトマイシンＮＰＲＳにおけるエピメラーゼドメインの同定）
ＤｐｔＡ、ＤｐｔＢＣ、およびＤｐｔＤのアミノ酸配列を、エピメラーゼドメインの特徴的な配列について調べた。エピメラーゼドメインは、Ｌ−アミノ酸からＤ−アミノ酸への変換を担っており、そして代表的に、約１．４〜１．６ｋｂのＤＮＡによりコードされる。
【０２７７】
ダプトマイシン遺伝子クラスターには、合計２つのエピメラーゼドメインが存在すると予想される。というのも、ダプトマイシンが、２つのＤ−アミノ酸（Ｄ−ＡｌａおよびＤ−Ｓｅｒ）を含むことが公知であったからである。１つのエピメラーゼドメインを、モジュール８（Ｄ−Ａｌａ）およびモジュール１１（Ｄ−Ｓｅｒ）の各々において同定した。モジュール８および１１は、エピメラーゼドメインを含まなかったモジュールよりも約１．４ｋｂ大きい（エピメラーゼドメインを含まないモジュールについて各々３．２ｋｂと比較して、モジュール８および１１についての各々約４．６ｋｂ）。さらに、モジュール８および１１は、エピメラーゼドメインの指標となるモチーフ（モチーフＫ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、およびＱを含む）を含む（ＫｌｅｉｎｋａｕｆおよびＶｏｎ  Ｄｏｈｒｅｈ，２３６：３５５−３５１（１９９６）を参照のこと）。表３を参照のこと。
【０２７８】
驚くべきことに、エピメラーゼドメインを、モジュール２においても同定した。モジュール２は、予想よりも１．６ｋｂ大きい。さらに、モジュール２は、エピメラーゼドメインに特徴的な多くのモチーフ（モチーフＫ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、およびＱを含む）を含む。表３を参照のこと。この予期せぬ発見は、ダプトマイシンにおけるアスパラギンが、Ｄ配置であることを示唆する。
【０２７９】
【表５】
2005508622.tif 000009
表３におけるアミノ酸座標は、各々のタンパク質のアミノ酸配列をいう（ＤｐｔＡ：配列番号９；ＤｐｔＢＣ：配列番号１１；ＤｐｔＤ：配列番号７）。ヌクレオチド位置は、配列番号１におけるヌクレオチド位置をいう。
【０２８０】
ダプトマイシンにおけるアスパラギンがＤ配置であることを確認するために、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を実施した。アミノ酸オルニチン、グリシン、スレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、およびアデシル化トリプトファンを含むヘキサペプチド（Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｏｒｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ）を分解によりダプトマイシンから単離した。上記ペプチドを、Ｄ−ＡｓｎまたはＬ−Ａｓｎのいずれかを含むペプチドを分離する条件下で、ＨＰＬＣにより分析した。ＨＰＬＣは、上記単離されたペプチドについての単一の大ピークのみを示した。図１１、左パネルを参照のこと。ダプトマイシンから単離されたこのペプチドを、研究室で合成され、そしてＤ−Ａｓｎを含む同一配列のペプチドと混合した。このペプチド混合物を、以前と同一条件下でＨＰＬＣにより分析し、そして単一のみのピークを含むことを示した。図１１、中パネルを参照のこと。さらに、ダプトマイシンから単離されたペプチドを、Ｌ−Ａｓｎを含む同一配列の合成ペプチドと混合した。ＨＰＬＣ分析は、２つのピークを示した。図１１、右パネルを参照のこと。これらの実験は、天然に存在するダプトマイシンが、Ｌ−ＡｓｎではなくＤ−Ａｓｎを含むことを確認する。
【０２８１】
実施例２〜７に示される実験から、ダプトマイシンＮＲＰＳの組織が決定された。図１２は、ｄｐｔＡ、ｄｐｔＢＣ、およびｄｐｔＤの組織を示す。ｄｐｔＡは、５つのモジュール（モジュール１〜５）を含み、ｄｐｔＢは６つのモジュール（モジュール６〜１１）を含み、そしてｄｐｔＤは、２つのモジュール（モジュール１２〜１３）およびチオエステラーゼドメインを含む。表４は、１３個のモジュール、それらのドメイン、ｄｐｔ遺伝子、およびそれらの同族アミノ酸の間の対応を要約する。「Ｃ」は、触媒ドメインを表し、「Ａ」は、アデニル化ドメインを表し、「Ｔ」は、チオール化ドメインを表し、「Ｅ」は、エピメラーゼドメインを表し、そして「Ｔｅ」は、チオエステラーゼドメインを表す。
【０２８２】
【表６】
2005508622.tif 000010
（実施例７：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ由来のダプトマイシン遺伝子クラスターを有するＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓの形質転換）
クローンＢ１２：０３Ａ０５由来のＢＡＣ  ＤＮＡを含むＥ．ｃｏｌｉ細胞（実施例２を参照のこと）を、５ｍＬのＬｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ；Ｄｉｆｃｏ）中で、３７℃で一晩攪拌しながら（２５０ｒｐｍ）増殖させた。ＢＡＣ  ＤＮＡを、標準的なアルカリ溶解手順によって単離した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出，「Ｓｍａｌｌ  ｓｃａｌｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ」を参照のこと）。
【０２８３】
Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＴＫ６４胞子を使用して、２５ｍＬのＹＥＭＥおよびスクロース培地に播種し、そして培養物を３０℃で４０時間インキュベートした。次いで、この培養物を採取し、そして菌糸体を上清からペレット化により除去し、そしてＰ−緩衝液で数回洗浄した（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ；Ｔｏｂｉａｓ  Ｋｉｅｓｅｒ，Ｍｅｒｖｙｎ  Ｊ．Ｂｉｂｂ，Ｍａｒｋ  Ｊ．Ｂｕｔｔｎｅｒ，Ｋｅｉｔｈ  Ｆ．ＣｈａｔｅｒおよびＤａｖｉｄ  Ｈｏｐｗｏｏｄ（Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｗｉｃｈ，２０００）（「Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」）。新鮮なプロトプラストを、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（前出（ｐ．５６））に記載される方法に従って調製し、そして０．５ｍＬの部分（約１０８〜１０９のプロトプラスト）にアリコートし、そして３０００ｒｐｍで７分間の遠心分離によって、ペレット化した。上清の大部分を除去し、ペレットおよび約５０μＬの上清を残した。このペレットを残りの上清中に再懸濁させ、ここに、クローンＢ１２：０３Ａ０５由来のＢＡＣ  ＤＮＡ（ＴＥ中５０ｎｇ／μＬ）を添加した（５μＬ）。３５０μＬのＰ−緩衝溶液中２５％ＰＥＧ−１０００を添加する前後に、この懸濁液を穏やかに混合した（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、前出）。
【０２８４】
このプロトプラスト懸濁混合物を、等量で、３つの乾燥したＲ５Ｔプレート（その最初の重量の約１５％を失うまで乾燥させた：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、前出を参照のこと）上に広げた。接種したプレートを３０℃で一晩インキュベートした。１６〜１８時間の増殖後、これらのプレートを３ｍＬのアプラマイシン溶液（２０％グリセロール中１ｍｇ／ｍＬ）と重ねて、各プレートにおいて約１００μｇ／ｍＬの最終濃度を提供し、そしてこれらのプレートを３０℃でインキュベートした。３日後、これらのプレートは、試験によって、アプラマイシン選択の存在下で増殖するコロニーを含有することが決定された。２つのコロニーを拾い、そして１００μＬのアプラマイシンを含有する２つのＦ１０Ａ寒天プレート（２．５％寒天、０．３％炭酸カルシウム、０．５％蒸留器可溶物（ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ  ｓｏｌｕｂｌｅ）、２．５％可溶性デンプン、０．５％酵母抽出物、０．２％ブドウ糖および０．５％バクトペプトン（ｂａｃｔｏｐｅｐｔｏｎｅ）；１Ｌの脱イオンおよびオートクレーブされた水中に懸濁）に線条にし、そしてコロニーが胞子形成するまで、３０℃でインキュベートした。Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、前出に記載される方法に従って、胞子を採取し、そして２０％グリセロール懸濁液として−２０℃で貯蔵した。
【０２８５】
ダプトマイシン遺伝子クラスターを含むＢＡＣ  ＤＮＡ（クローンＢ１２：０３Ａ０５由来、ＣＢＵＫ１３６７４２）でのＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓの形質転換体由来の胞子を、適切な培地中で増殖させ、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）およびＬＣ−ＭＳによって分析して、これらが野生型リポペプチドプロフィールを産生したか否かを決定した（実施例９を参照のこと）。
【０２８６】
（実施例８：ダプトマイシン遺伝子クラスターを含むＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＴＫ６４クローンの形成）
ダプトマイシン遺伝子クラスターを含むＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＴＫ６４クローン（クローンＢ１２：０３Ａ０５由来）の胞子を、１０日前の培地Ａ（２％照射燕麦（Ｑｕａｋｅｒ）、０．７％トリプトン（Ｄｉｆｃｏ）、０．２％ダイズペプトン（Ｓｉｇｍａ）、０．５％塩化ナトリウム（ＢＤＨ）、０．１％痕跡塩溶液、１．８％寒天ｎｏ．２（Ｌａｂ  Ｍ）、０．０１％アプラマイシン（Ｓｉｇｍａ））の斜面培養を５ｍＬの１０％水性グリセロール（ＢＤＨ）中に懸濁させることによって、採取した。１．５ｍＬ低温バイアル中で、１ｍＬのこの懸濁物は、出発物質を含有し、これを、−１３５℃での貯蔵から回復させた。０．３ｍＬの出発物質を培地Ａ１の傾斜上に無菌的に配置し、そして２８℃で９時間インキュベートすることによって、培養前のもの（ｐｒｅ−ｃｕｌｔｕｒｅ）を生成した。
【０２８７】
培養前のものを４ｍＬの０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ８０（Ｓｉｇｍａ）溶液で無菌的に処理することによって、種培養物を作製し、そしてこの傾斜表面を穏やかに浸軟して、植物性の菌糸体および胞子の懸濁物を作製した。この懸濁液の２ｍＬのアリコートを、２５０ｍＬのバッフル付きフラスコ（４０ｍＬの栄養分溶液Ｓ（１％  Ｄ−グルコース（ＢＤＨ）、１．５％グリセロール（ＢＤＨ）、１．５％ダイズペプトン（Ｓｉｇｍａ）、０．３％塩化ナトリウム（ＢＤＨ）、０．５％麦芽抽出物（Ｏｘｏｉｄ）、０．５％酵母抽出物（Ｌａｂ  Ｍ）、０．１％Ｊｕｎｌｏｎ  ＰＷ１００（ＨｏｎｅｙｗｅｌｌおよびＳｔｅｉｎ  Ｌｔｄ）、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ８０（Ｓｉｇｍａ）、４．６％  ＭＯＰＳ（Ｓｉｇｍａ）を含み、ｐＨ７．０に調整され、そしてオートクレーブされた）に移し、そして２４０ｒｐｍで４４時間、３０℃で振盪した。
【０２８８】
５％の種培養物を、バッフル付きの２５０ｍＬフラスコ（５０ｍＬ培地Ｐ（１％グルコース（ＢＤＨ）、２％可溶性デンプン（Ｓｉｇｍａ）、０．５％酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ）、０．５％カゼイン（Ｓｉｇｍａ）、４．６％  ＭＯＰＳ（Ｓｉｇｍａ）を含み、ｐＨ７に調整され、そしてオートクレーブされた）に無菌的に移し、そして２４０ｒｐｍで７日間、３０℃で振盪することによって、生成培養物を作製した。
【０２８９】
（実施例９：ダプトマイシン遺伝子クラスターを含むＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＴＫ６４クローンの醗酵物からの、Ａ２１９７８Ｃリポペプチドの精製および分析）
実施例８に記載された生成培養物を、分析の１０分前に２ｍＬの全培養物を無菌的に取り出し、そして遠心分離することによって、分析のためにサンプリングした。５０マイクロリットルまでの体積の上清を分析して、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓによって産生されるにつれて、ネイティブなリポペプチド（Ａ２１９７８Ｃ）の産生についてモニタリングした。この分析を、周囲温度で、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ２６９０  ＨＰＬＣシステム、ならびに４．６×５０ｍｍ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ８  ３．５μｍカラムおよびＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｓｅｃｕｒｉｔｙ  Ｇｕａｒｄ  Ｃ８カートリッジを備える９９６  ＰＤＡ検出器を使用して、実施した。勾配を、最初、９０％水および１０％アセトニトリルに２．５分間維持し、次いで、６分間にわたって１００％アセトニトリルへの直線勾配にした。流速は、１．５ｍＬ／分であり、そして勾配を、０．０１％トリフルオロ酢酸で緩衝する。図５Ａに示されるように、言及される分析条件下で、醗酵の２日目までに、ダプトマイシンのものと同じＵＶ／可視スペクトルを用いて、ネイティブリポペプチドの３つ（Ｃ１、Ｃ２、およびＣ３）の生成が、５．６２分、５．７７分、および５．９０分の保持時間のＨＰＬＣピーク（λｍａｘ２２３．８ｎｍ、２６１．５ｎｍ、および３６４．５ｎｍ）によって示されるように、明らかであった。次いで、これらのリポペプチドは、７日間、各サンプリング時点の醗酵において、明らかなままであった。リポペプチドＣ１、Ｃ２、およびＣ３の全収量は、醗酵材料１リットルあたり１０〜２０ｍｇの範囲であった。
【０２９０】
液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）分析を、Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＳＳＱ７１０ｃ  ＬＣ−ＭＳシステムで、電子スプレーイオン化を使用して、陽イオンモードにおいて、２００〜２０００ダルトンの走査範囲および２秒間の走査で、実施した。クロマトグラフィー分離を、０．０１％ギ酸を含有する水−アセトニトリルの直線勾配（最初の０．５分間の遅延の後に１０％アセトニトリルから１００％アセトニトリルまで６分間にわたって増加し、次いで１００％アセトニトリルでさらに３．５分間維持し、その後、再平衡化される）で溶出するＷａｔｅｒｓ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ８カラム（２．１×５０ｍｍ、３．５μｍ粒子サイズ）で達成した。流速は、０．３５ｍＬ／分であり、そしてこの方法を、周囲温度で実施した。
【０２９１】
３つのネイティブリポペプチドの同定を、１６３４．７、１６４８．７、および１６６２．７のｍ／ｚの分子イオン（［Ｍ＋Ｈ］＋）によって示されるように確認した。この分子イオンは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓによって産生される、Ａ２１９７８Ｃリポペプチドの主要な代謝産物Ｃ１、Ｃ２、およびＣ３のそれぞれについて報告された質量に一致する（Ｄｅｂｏｎｏら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，４０，７６１−７７７頁（１９８７））。
【０２９２】
類似の実験を、ＢＡＣクローン０１Ｇ０６、Ｂ１２：０６Ａ１２、Ｂ１２：１２Ｆ０６およびＢ１２：１８Ｈ０４を使用して実施した。これらのＢＡＣクローンのいずれか１つを含むＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ細胞のいずれも、ダプトマイシンを産生し得なかった。
【０２９３】
（実施例１０：ダプトマイシンの産生のための、ダプトマイシン遺伝子クラスターを含むＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＴＫ６４クローンの供給バッチ（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）醗酵）
ダプトマイシン遺伝子クラスターを含むＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＴＫ６４クローン（クローンＢ１２：０３Ａ０５由来）の細胞を、培地Ａ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓを参照のこと；５ｍＬの１０％水性グリセロール（ＢＤＨ）中の２％照射燕麦（Ｑｕａｋｅｒ）、０．７％トリプトン（Ｄｉｆｃｏ）、０．２％ダイズペプトン（Ｓｉｇｍａ）、０．５％塩化ナトリウム（ＢＤＨ）、０．１％痕跡塩溶液、１．８％寒天ｎｏ．２（Ｌａｂ  Ｍ）、０．０１％アプラマイシン（Ｓｉｇｍａ））の１０日前の斜面培養を懸濁させることによって、再生した。１ｍＬの出発物質を含む１．５ｍＬの低温バイアルを、−１３５℃での貯蔵から回復させ、そして速やかに解凍した。培養前のものを、０．３ｍＬの出発物質を培地Ａの傾斜上に無菌的に配置し、そして２８℃で９日間インキュベートすることによって、産生した。種培養物の接種のための材料を、培養前のものを４ｍＬの０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ８０（Ｓｉｇｍａ）溶液で無菌的に処理し、そして傾斜表面を穏やかに浸軟し、植物性の菌糸体および胞子の懸濁物を作製することによって、作製した。
【０２９４】
２４０ｒｐｍで２日間、３０℃にて振盪した栄養溶液Ｓ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓを参照のこと；前出）（２５０ｍＬ）を含む２Ｌバッフルエルレンマイヤーフラスコに、１ｍＬのインキュベーション物質を無菌的に入れることによって、種培地を作製した。
【０２９５】
１４Ｌの栄養溶液Ｐ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓを参照のこと；前出）を含む種培地を２０Ｌの発酵槽に無菌的に移すことによって、産生培養物を作製した。産生発酵槽を、３５０ｒｐｍで攪拌し、０．５ｖｖｍで曝気し、そして、温度を３０℃に制御した。２０時間のインキュベーションの後に、発酵の全体に亘り５ｇ／時間にて５０％（ｗ／ｖ）のグルコース溶液をこの培地に供給した。
【０２９６】
４０時間のインキュベーションの後に、デカン酸：オレイン酸メチル（それぞれ、Ｓｉｇｍａ製、Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ製）の５０：５０（ｗ／ｗ）の混合物を、残りの発酵のために０．５ｇ／時間で発酵槽に供給した。この培養物を、１１２時間後に回収し、そして、ボウル遠心機によるバッチ処理によってバイオマスを培養物上清から取り出した。
【０２９７】
このバイオマスを捨て、そして、この清澄化した発酵ブロスを抽出のために保持した。直径６０ｍｍ×長さが３００ｍｍであるＨＰ２０樹脂のカラム（これは水で予め平衡化しておいた）に、このブロス（約１０Ｌ）を１００ｍＬ／分の速度でロードした。このカラムを、２Ｌの水、次いで、１．５Ｌの（水中の）８０％エタノールで同じ流速にて洗浄した。最終的に、その結合物質を、２Ｌのエタノールで溶出し、次いで、減圧下で水に溶けた濃縮物とした。この濃縮物を、精製水で１Ｌに希釈して、そして酢酸エチル（７００ｍＬ）で３回分配した。この酢酸エチル画分を分析して、廃棄し、そしてこの水相を粉末へと凍結乾燥した。
【０２９８】
ダプトマイシンを、同一のパッキングを用いた、２個の４０ｍｍ×１００ｍｍ  Ｗａｔｅｒｓ  ＮｏｖａＰａｋ  Ｃ１８  ６μｍユニットおよび４０ｍｍ×１０ｍｍ  Ｇｕａｒｄ−Ｐａｋからなる半径方向に圧縮したカートリッジカラムを使用する高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により単離した。凍結乾燥した材料（１５０〜２００ｍｇ）を、水に溶解して、初期濃度が水９０％かつアセトニトリル１０％であり、その後１０分に亘って、水２０％かつ８０％アセトニトリルへと線形的に増大し、その後さらに１分間で１００％アセトニトリルへと直に増大する勾配を使用して、これらのカラムでクロマトグラフィーにかけた。２２３ｎｍにおけるＵＶ吸収を、ダプトマイシンの溶出についてモニターした。ダプトマイシンのピークは約９分間で溶出し、そして、そのピークを複数回試行にて回収しかつあわせた。次いで、このサンプルを減圧下でエバポレートし、その後、減圧乾燥して３０ｍｇの精製した化合物を生成した。前物質の一部分のみを処理した。
【０２９９】
この精製した化合物を、はじめに、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ２６９０ＨＰＬＣシステムおよび９９６ＰＤＡ検出器と使用してＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｓｅｃｕｒｉｔｉｙ  Ｇｕａｒｄ  Ｃ８カートリッジを用いて４．６×５０ｍｍ  Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ８  ３．５μｍ粒径カラムにて周囲温度で逆相ＨＰＬＣにより分析した。このカラムを、水−アセトニトリル勾配で溶出した。この勾配は、最初は、２．５分間に亘って水９０％を維持し、その後、６分間に亘って流速１．５ｍＬ／分で１００％アセトニトリルまで線形的に上昇させた。この勾配を、０．０１％トリフルオロ酢酸で緩衝化した。このクロマトグラフィー分析によって、この精製化合物の保持時間（５．５２分間）およびＵＶ吸収スペクトル（λｍａｘ２２３．８ｎｍ，２６１．５ｎｍ，３６６．９ｎｍ）がダプトマイシンの保持時間およびＵＶ吸収スペクトルに一致することを確認した。ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）によって、１６２０．６としての分子イオン（ＭＨ＋）を確認し（図５Ｂ）、そしてこの１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ６−ＤＭＳＯ）は、ダプトマイシンについて記録された１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ６−ＤＭＳＯ）と視覚的に十分な一致を与えた（図５Ｃ）。
【０３００】
ダプトマイシンとしてのこの物質の同定を、１３ＣＮＭＲ実験によってさらに確認した。
【０３０１】
フェドバッチ型発酵はまた、より大きなスケール（例えば、６０，０００Ｌ）で達成され得る。
【０３０２】
（実施例１１：収量増加のためのダプトマイシン遺伝子の使用）
（第１章  ポジティブ調節遺伝子の重複）
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓの染色体における中立ゲノム部位（ｎｅｕｔｒａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｉｔｅ）は、ＴＮ５０９７または関連するトランスポゾンをトランスボゾン突然変異誘発、その後の発酵分析によって同定されている。この中立部位を、その中立部位およびトランスポゾンの外側で切断する制限エンドヌクレアーゼを使用して染色体から切り出し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ中でクローニングし、そして、そのトランスポゾンの中の抗生物質耐性マーカーの発現（ＴＮ５０９７の場合ではハイグロマイシン耐性）について選択する。このアプローチの一例を、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｄｉａｅにおける中立部位である、チロシンプロデューサーを同定するために使用した。Ｂａｌｔｚら，Ａｎｔｏｎｉｅ  ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ，７１  ｐｐ．１７９〜１８７（１９９７）（これは、本明細書中で全体が参考として援用される）を参照のこと。Ｓ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓのおける中立部位の同定の例は、ＭｃＨｅｎｎｅｙら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８０、ｐｐ．１４３〜１５１（１９９８）（これは、本明細書中で全体が参考として援用される）において記載されている。
【０３０３】
ダプトマイシン遺伝子クラスターに由来する調節遺伝子（配列番号１０９）は、プラスミド中で中立部位にてクローニングされている。適切なプラスミドは、以下を含むプラスミドである：単回交差を含む最初の組換え体を選択するための抗生物質耐性遺伝子（ＨｏｓｔｅｄおよびＢａｌｔｚ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７９、ｐｐ．１８０〜１８６（１９９７））、カウンター選択マーカー（例えば、野生型のｒｐｓＬ遺伝子）、クローン化された調節遺伝子ならびに上流配列および下流配列を染色体の中立部位に挿入し、そしてそのプライスミド配列を除去する二重交差を含む組替え体を選択するためにストレプトマイシンに対する感受性を付与するリボソームプロテイン遺伝子、ならびにこのプラスミドの修復を促進するための熱感受性レプリコン。この二重交差は、ストレプトマイシンに対して通常は耐性である宿主株において生じる。なぜならば、宿主がｒｐｓＬ遺伝子における変異を有するからである。ｒｐｓＬの野生型（ストレプトマイシン感受性）の対立遺伝子は、ストレプトマイシンによりも優性であるので、ストレプトマイシン耐性を発現する組み換え体は、中立部位の２つのアームにおける二重交差によってそのプライスミド上のｒｐｓＬ遺伝子を除去し、このクローニングしたダプトマイシン調節遺伝子をその染色体に挿入したはずである。組換え体が発酵することで、この組換え体が、このクローニングしたダプトマイシン調節遺伝子を欠く親株と比較して、増大した収量を産生することの確証を得た。
【０３０４】
（ＡＢＣトランスポーター遺伝子の重複）
ダプトマイシンクラスター（上流配列および下流配列を含む）由来の１つ以上のＡＢＣトランスポーター遺伝子を、上で記載した中立部位のベクターにクローニングして、そして、実施例１１Ａに記載のように、二重交差によって、Ｓ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ染色体に挿入する。組替え体が発酵することで、この組換え体が、クローニングされたＡＢＣトランスポーター遺伝子を欠く親株と比較してダプトマイシンの増大したレベルを生じることの確証を得る。
【０３０５】
（ｎｏｖＡホモログ、ｎｏｖＢホモログ、ｎｏｖＣホモログの重複）
ダプトマイシン遺伝子クラスター（上流配列および下流配列を含む）に由来するｎｏｖＡホモログ、ｎｏｖＢホモログおよびｎｏｖＣホモログを含むＤＮＡのセグメントを、中立部位ベクターにクローニングして、そして、実施例１１Ａに記載のように、二重交差によって、Ｓ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ染色体に挿入する。この組換え体が発酵することで、クローニングされたｎｏｖＡホモログ遺伝子、ｎｏｖＢホモログ遺伝子およびｎｏｖＣホモログ遺伝子を欠く親株と比較してダプトマイシンの増大したレベルを生じることの確証を得る。
【０３０６】
（ダプトマイシン生合成遺伝子の重複）
ダプトマイシン生合成遺伝子である、ｄｐｔＡ、ｄｐｔＢＣ、ｄｐｔＤ、ｄｐｔＥ、ｄｐｔＦ、ｄｐｔＧおよびｄｐｔＨ（脂質性アシルＣｏＡリガーゼ、ＮＲＰＳの３つのサブユニット、ｄｐｔＤの完全なチオエステラーゼおよびｄｐｔＨの遊離エステラーゼを含む）を、ＢＡＣベクターにクローニングする。このベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉからＳ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓへの接合のための、ｐｈｉＣ３１付着機能および一体化機能（ａｔｔ／ｉｎｔ）ならびにプラスミドＲＫ２由来のｏｒｉＴ（Ｂａｌｔｚ、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｏｒｂｉｏｌ．、６：７６〜８３（１９９８）（これは、本明細書中でその全体が援用される））を含む。ダプトマイシン遺伝子を含むＢＡＣを、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｓ１７．１または自律複製プラスイミドＲＫ２（前出）を含む株からの接合によってＳ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓへ導入する。あるいは、ＢＡＣベクターは、ダプトマイシン遺伝子クラスターへの相同組換えによってその染色体に入り込む。組換え体が発酵することで、クローニングされたダプトマイシン遺伝子を欠く親株と比較してダプトマイシンの増大したレベルを生じることの確証を得る。
【０３０７】
（ダプトマイシンチオエステラーゼ遺伝子の重複）
ダプトマイシン遺伝子クラスター（配列番号１）は、少なくとも２つの遺伝子（ｄｐｔＤおよびｄｐｔＨ）を含み、この２つの遺伝子は、チオエストラーゼ活性を有するタンパク質の特徴である保存された配列モチーフを含むアミノ酸配列をコードする、オープンリーディングフレーム（それぞれ、配列番号３および配列番号６）またはそれらのドメインを有する。ＤｐｔＤアミノ酸配列およびＤｐｔＨアミノ酸配列については、それぞれ、配列番号７および配列番号８を参照のこと。これらのチオエステラーゼ遺伝子またはチオエストラーゼドメインのうちのいずれか１つまたは両方は、上記の実施例１１Ａに記載の手順に従って重複されえる。
【０３０８】
発現制御配列（例えば、配列番号１また配列番号２における中立的な配列）に対して作動的な様式で必要に応じて連結されているｄｐｔＤ  ＯＲＦ配列（例えば、配列番号１、配列番号３）を含み、そして上流配列および下流配列を必要に応じて含むＤＮＡのセグメントが、中立的な部位のベクターにクローニングして、そして二重交差によって実施例１１Ａに記載のようにＳ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓの染色体に挿入する。組換え体が組換え体が発酵することで、クローニングされたｄｔｐＤ遺伝子を欠く親株と比較してダプトマイシンの増大したレベルを生じることの確証を得る。
【０３０９】
同様に、発現制御配列（例えば、配列番号１、配列番号４また配列番号５における中立的な配列）に対して作動的な様式で必要に応じて連結されているｄｐｔＨ  ＯＲＦ配列（例えば、配列番号４、配列番号６）を含み、そして上流配列および下流配列を必要に応じて含むＤＮＡのセグメントを、中立的な部位のベクターにクローニングされ、そして二重交差によって、実施例１１Ａに記載のようにＳ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓの染色体に挿入する。組換え体が発酵することで、クローニングされたｄｔｐＨ遺伝子を欠く親株と比較してダプトマイシンの増大したレベルを生じることの確証を得る。
【０３１０】
他の適切な宿主（すなわち、ＮＲＰＳまたはＰＫＳの複数酵素複合体）は、改善したペプチド産生のためにチオエステラーゼ活性を有するダプトマイシン遺伝子クラスター由来のタンパク質をコードするＤＮＡのセグメントで形質転換され得る。あるいは、ＤＮＡのこのようなセグメントによってコードされるポリペプチドが、当業者に周知のタンパク質移入技術によって、Ｓ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓまたは他の適切な宿主に導入され得る。
【０３１１】
（ダプトマイシン耐性遺伝子の重複）
ダプトマイシン耐性遺伝子を、天然においてはダプトマイシンに対して感受性の適切なストレプトマイシン宿主でのクローニングおよび発現によって同定する。このクローニングしたダプトマイシン耐性遺伝子を、中立部位ベクターに中立部位で挿入し、実施例１１Ａに記載のように二重交差によってＳ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓに挿入する。組換え体が発酵することで、クローニングされたダプトマイシン耐性遺伝子を欠く親株と比較してダプトマイシンの増大したレベルを生じることの確証を得る。
【０３１２】
（ダプトマイシン生合成遺伝子および付随遺伝子の重複）
ＢＡＣクローンＢ１２：０３Ａ０５を、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（前出）に記載されるような接合によって、野生型Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ  Ａ２１９７８．６（ＡＴＣＣ寄託番号３１５６８、ＣＢＵＫ１３６７３７）およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ  Ａ２１９７８．６５（ＮＲＲＬ寄託番号１５９９８，ＣＢＵＫ１３６８７９）に導入し、接合完了体（それぞれ、ＣＢＵＫ  １３６９２７およびＣＢＵＫ  １３６８０１６）を生成した。親株および接合完了体株を、実施例８に記載のように３連で培地Ｐ（各々０，１％である、無菌濾過後のグルタミン酸、Ｎａ塩（ＢＤＨ）オルニチン（Ｓｉｇｍａ）およびアスパラギン酸（Ｓｉｇｍａ）を添加した）中で発酵させた。
【０３１３】
培養物を、１０日間の実験の間で、サンプリングしそしてＨＰＬＣで分析した。このＨＰＬＣは、実施例９に記載のように実施されるが、ただし、上清のうち５μｌのみが注入される。発酵を開始してから４０〜５６時間後までに、３種のＳ，ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓのネイティブリポペプチド（Ａ２１９７８Ｃ１、Ａ２１９７８Ｃ２およびＡ２１９７８Ｃ３）の産生が、きわめて明らかであった。これらのリポペプチドは、続くサンプリング時点ごとでの発酵物中に存在して、他のＡ２１９７８Ｃ因子に対する多様化が、経過時間のおわりにおいて明らかになった。これらの３つの発酵複製物を平均化して、接合完了体のＣＢＵＫ１３６９２７（２８４ｍｇ／Ｌ）およびＣＢＵＫ１３０８１６（１４８８ｍｇ／Ｌ）によって産生されたＡ２１９７８Ｃリポペプチドの最大収量は、それぞれ、親株であるＣＢＵＫ  １３６７３７（１４３ｍｇ／Ｌ）およびＣＢＵＫ  １３６８７９（７２６ｍｇ／Ｌ）によって産生される最大収量の２倍であった。
【０３１４】
（実施例１２：新規産物を産生するためのダプトマイシン生合成遺伝子の使用）
（Ａ．アミノ酸特異性コードの部位特異的突然変異誘発によるペプチド構造の改変：第２位におけるＤ−ＡｓｎからＤ−Ａｓｐの変換）
ダプトマイシン中の１３アミノ酸のためのアミノ酸特異性コードを表１に示す（上記の実施例６を参照のこと）。ＮＲＰＳにおけるアデニル化ドメインアミノ酸特異性コードを同定および変更することの議論については、Ｓｔａｃｈｅｌｈａｕｓら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、６、ｐｐ．４９３−５０５（１９９９）（これは、本明細書中で参考として全体が援用される）を、参照のこと。ダプトマイシンの第３位、第７位、第９位、における３つのＬ−ａｓｐの全てに関するコードは同一である：ＤＬＴＫＬＧＡＶ（ここで、これらの文字は標準的なアミノ酸略号を示す）。第２位におけるＤ−Ａｓｎのためにコードは、ＤＬＴＫＬＧＤＶであり、そして、これは１つのアミノ酸（第７位におけるＡの代わりのＤ）だけ差異がある。このＤ−Ａｓｎ特異性コードを、ＰＳ  Ｉのモジュール２におけるアデニル化ドメインでの部位特異的変化を生じることによってＤ−Ａｓｐを特定するコードに変更する。
【０３１５】
モジュール２の変異バージョンを、遺伝子置換（実施例１１を参照のこと）によってＳ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓの染色体に挿入する。カウンター選択マーカー（例えば、野生型ｒｐｓＬ遺伝子）を、遺伝子置換によってモジュール２のアデニル化ドメインに挿入する。この変異モジュール２アデニル化ドメイン（Ｄ−Ａｓｐについてのコード配列を含み、そして適切な温度感応性プラスミドの隣接領ＤＮＡ（特異的コードの各側において約１〜５ｋｂ）を、ダプトマイシン生合成について破壊したＳ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ株に挿入する。単回交差を含む組換え体を、プラスミド上の抗生物質耐性マーカー（例えば、ハイグロマイシン耐性、アプラマイシン（ａｐｒａｍｙｃｉｎ）耐性またはチオストレプトン（ｔｈｉｏｓｔｒｅｐｔｏｎ）耐性）について選択することによって非許容性の温度で選択した。宿主株が染色体性ｒｐｓＬ遺伝子における変異によるストレプトマイシン耐性である場合、この遺伝子置換を完結するため二重交差体がストレプトマイシン耐性について選択され得る。この組換え体は、抗生物質産生についてスクリーニングされる。ダプトマイシンの新規誘導体を、分離および分析し、例えば、以下に記載の方法に従った構造を確認する：米国特許第ＲＥ  ３２，３３３号、米国特許第ＲＥ  ３２，４５５号、米国特許第４，８７４，８４３号、米国特許第４，４８２，４８７号、米国特許第４，５３７，７１７号、および米国特許第５，９１２，２２６号。
【０３１６】
（Ｂ．異なるアミノ酸特異性のうちの１つのためのアミノ酸コードモジュールの分子交換）
ダプトマイシンは、４つの酸性アミノ酸を有している：第３位、第７位、および第９位の３つのＬ−ａｓｐ残基ならびに第１２位の３−メチル−Ｇｌｕ（３−ＭＧ）
（表１、実施例６を参照のこと）。ダプトマイシンの新規誘導体を、Ｌ−ａｓｐを特定するドメインと３−ＭＧを特定するアデニル化ドメインを交換することによって、生じる。３−ＭＧモジュールのアデニル化ドメインを、分子遺伝的手順によって取り除かれたＬ−ａｓｐアデニル化ドメインに隣接するＬ−ａｓｐモジュールのセグメントに挿入する。Ｌ−ｓａｐモジュールに由来する隣接ＤＮＡを含むハイブリッド３−ＭＧモジュールを、適切に構築された遺伝子置換ベクターに挿入し、そしてこのハイブリッドモジュールを、実施例１１Ａに示されるような相同性二重交差によってＬ−ａｓｐモジュールと交換した。この同じ手順を、他の２つのＬ−ａｓｐモジュールについて繰り返した。これらの組換え体は、第３位、第７位、および第９位のＬ−ａｓｐにおいて置換した３−ＭＧを含み、かつこの分子中において全体で４つのネガティブ変化を保持するダプトマイシンの３つの新規誘導体を産生する。
【０３１７】
（Ｃ．異なるアミノ酸の取り込みを触媒するサブユニットとの非リボソーム製ペプチドシンターゼ（ＮＲＰＳ）サブユニットの交換）
このダプトマイシンのＮＲＰＳの第３のサブユニット（表１、実施例６を参照）をコードする遺伝子は、アミノ酸１２（３−ＭＧ）および１３（Ｌ−ｋｙｎ）の取り込みについて特異性をコードする２つのモジュールを含む。環状リポペプチドであるＣＤＡ（Ｋｅｍｐｔｅｒら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３６、ｐｐ．４９８〜５０１（１９９７）；Ｃｈｏｎｇら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１４４、ｐｐ．１９３〜１９９（これら各々は本明細書中で参考として全体が援用される））の生合成のための第３のサブユニットをコードする遺伝子はまた、少なくとも２つ（この場合、アミノ酸１０（３−ＭＧ）および１１（Ｌ−ｔｒｐ））をコードする。第１３位において、Ｌ−ｋｙｎの代わりにＬ−ｔｒｐを含むダプトマイシン誘導体は、遺伝子ｄｐｔＤを破壊することによって、およびｄｐｔＤをＣＤＡのためのＰＳＩＩＩをコードする遺伝子で置き換えることによって、生成される。強力なプロモーター（例えば、ｅｒｍＥｐ＊プロモーター；Ｂａｌｔｚ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６，ｐｐ．７６〜８３（１９９８）（これらは本明細書中で参考として全体が援用される））からＰＳＩＩＩ遺伝子を発現し、そして、これを実施例１１Ａにおいて記載されたようにＳ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓゲノム中の中立部位に挿入することによって、ＣＤＡ  ＰＳＩＩＩがｄｐｔＤ変異を補完することを可能にし、そして、Ｌ−ｋｙｎに代わってＬ−ｔｒｐを伴い変更されたダプトマイシンの産生を生じる。この組換え体が発酵すると、この組換え体の産物が実施例９に記載のようにＬＣ−ＭＳによって分析される。
【０３１８】
類似の操作を、他のサブユニットのトランス補完のために、すなわち、ダプトマイシン生合成遺伝子クラスターのサブユニットにおける破壊または欠損を作製し、次いで、１つ以上のＮＲＰＳ由来の天然サブユニットまたは改変されたサブユニットによってイントランスで補完するように、実施し得る（後者は、実施例１２にわたって、特に実施例１２Ａ、１２Ｂまたは１２Ｈ、１２Ｊに記載される方法を使用して作製され得るように、ダプトマイシン生合成遺伝子クラスターサブユニットの改変されたバージョンによるトランス補完を含み得る）。次いで、ＮＲＰＳサブユニット間のトランス補完は、新規の非リボソーム性ペプチド生成を導き得、これらをこれまでの例において記載されたように解析し得る。
【０３１９】
ダプトマイシン生合成遺伝子クラスターおよびカルシウム依存性抗生物質（ＣＤＡ）生合成遺伝子クラスターの部分を使用してトランス補完実験を実施するために、ダプトマイシン生合成遺伝子クラスターのセット、ダプトマイシン遺伝子のセット、またはダプトマイシン生合成遺伝子およびアクセサリー遺伝子のセット（例えば、ＢＡＣクローンＢ１２：０３Ａ０５に含まれるような遺伝子）を、他の天然株または操作された株またはａｃｔｙｎｏｍｙｃｅｔｅｓの種への形質転換または接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）によって導入する。これらのレシピエントは、公知の二次代謝物の生産体、または特徴付けられていない株であり得るか、またはダプトマイシンの生合成のためではなく他の生合成経路を実行する組換え技術によって作製され得る。形質転換体または過接合体（ｅｘ−ｃｏｎｊｕｇａｎｔ）を種々の培地で培養し、そしてブロス全体またはその抽出物を、新規のダプトマイシン様化合物またはダプトマイシン耐性の試験生物体に対する生物学的活性のいずれかについてスクリーニングする。
【０３２０】
いくつかの例において、補完はダプトマイシン生合成経路におけるいくつかの遺伝子の不活性化によって容易にされる。ＢＡＣ  Ｂ１２：０３Ａ０５においてＮＲＰＳのサブユニットをコードする配列を、１つ以上のネイティブなＮＲＰＳ遺伝子クラスターまたは導入された遺伝子クラスターを既に発現する異種性宿主への導入の前に、マーカー遺伝子によって欠失または置換して、改変されたＢ１２：０３Ａ０５を形成し得る。次いで、改変されたＢ１２：０３Ａ０５クローンおよび内在性宿主ＮＲＰＳ遺伝子によってコードされる酵素サブユニットは、細胞質内で会合してヘテロマーの多酵素（ｍｕｌｔｉｅｎｚｙｍｅ）複合体を形成し、これは新規ペプチドの産生を導き得る。他の場合において、欠失は、Ｂ１２：０３Ａ０５またはダプトマイシンＮＲＰＳを含む一部が、既に１つ以上のネイティブＮＲＰＳ遺伝子クラスターまたは導入されたＮＲＰＳ遺伝子クラスターを発現する異種性宿主に導入した後に、作製され得る。例えば、ｄｐｔＤを破壊したかまたはｄｐｔＤを欠失したバージョンのＢ１２：０３Ａ０５は、Ｂ１２：０３Ａ０５が導入されているＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ株において作製され得る。Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓは、ＣＤＡについての遺伝子クラスターのネイティブなコピーを保有する。得られた株を培養しそして分析して、ＣＤＡ  ＰＳＩＩＩと改変されたＢ１２：０３Ａ０５との間の補完が位置１３においてＬ−ｋｙｎの代りにＬ−ｔｒｐを含むダプトマイシン誘導体の産生へと誘導することを示す。この例の１つの実施形態において、新規リポペプチドを、実施例７に記載されるＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＴＫ６４／Ｂ１２：０３Ａ０５株を使用するトランス補完によって産生し得る。
【０３２１】
新規リポペプチドを産生するために、隣接するＤＮＡ配列を横切る相同組換えを使用して、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＴＫ６４／Ｂ１２：０３Ａ０５におけるｄｐｔＤのコード領域の大部分を、異種性マーカー遺伝子に交換した。相同性組換えを実施するために、ｄｐｔＤの直接の上流領域（「５’フラグメント」）および下流領域（「３’フラグメント」）を含む２つのフラグメントを、固有の制限部位（下線部）が導入されている５’末端の延長を有する、以下のプライマーセットを使用して、染色体Ｓ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ  ＤＮＡから増幅した：
【０３２２】
【表７】
2005508622.tif 000011
増幅したフラグメントを、ｐＮＥＢ１９３（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）のマルチクローニング部位中の対応する固有の部位に繋げてクローニングした。得られた構築物ｐＳＤ００２を、方向について制限消化分析によって確認し、そしてＰＣＲによって作製された部分において誤りのないことについて配列決定によって確認した。マーカー遺伝子のｅｒｍＥ（エリスロマイシン耐性遺伝子；Ｈｏｐｗｏｏｄ、前出を参照のこと）を含むＳｐｅＩフラグメントを、ｐＳＤ００２のＸｂａＩ部位に挿入し、そして制限消化分析によって確認した。このようにして得られたプラスミドｐＳＤ００５は、ｄｐｔＤの上流および下流のＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡストレッチによって挟まれたｅｒｍＥからなるカセットを含む。一旦相同組換えによってダプトマイシン生合成遺伝子クラスター経路に挿入されると、このカセットは、最初の３１ｂｐおよび最後の１２ｂｐを除いて、全てのｄｐｔＤをｅｒｍＥで本質的に置換する。次いで、置換カセットを含む領域を、温度感受性複製起点およびｒｐｓＬ（ＴＫ６４バックグラウンドにおいて使用され得るストレプトマイシン感受性を付与する遺伝子）を保有するベクター（ｐＲＨＢ５３８のクローニング部位が改変されたバージョン；Ｈｏｓｔｅｄら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：１８０−１８６、１９９７）中にサブクローニングして、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓへの導入のために一連の最終的なプラスミドｐＳＤ０３０を作製した。
【０３２３】
プラスミドｐＳＤ０３０を、本質的に実施例７における上記のように、プロトプラスト形質転換によってＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓに導入した。プロトプラストと細胞との形質転換混合物を、Ｒ２Ｙｅプレート上で穏やかに広げ、そして３０℃で約１６時間インキュベートした。次いで各プレートに１．２５ｍｇのエリスロマイシンを含む１ｍＬの水を張り、一旦液体が培地中に吸収されると、終濃度５０μｇ／ｍｌを生じた。７日後に形質転換プレート上に生じたエリスロマイシン耐性コロニーを、２５ｍＬのＴＳＢ（Ｈｏｐｗｏｏｄ、前出）＋エリスロマイシン中に播種し、そして３０℃で４８時間インキュベートした。この菌糸体を収集し、そして菌糸体容量の１／１０を浸漬（ｍｅｃｅｒａｔｅ）し、そして２５ｍＬのＴＳＢ＋エリスロマイシンの新たなアリコートに移した。次いで、得られた溶液を４０℃でインキュベートし、そしてｐＳＤ０３０の温度感受性レプリコンに対して選択した。４８時間後、この菌糸体を遠心分離によって収集し、浸漬し、そして２ｍＬ  ＴＳＢの最終容量に懸濁した。この懸濁物の１００μＬを、５０μｇ／ｍＬのエリスロマイシンおよび３０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含むＳＰＭＲプレート（Ｂａｂｃｏｃｋら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：２８０２−２８０８、１９８８）上に広げた。生存するコロニーをスクリーニングし、そしてＣＢＵＫ  １３７８６０のような株を同定するためにＰＣＲによって正しい遺伝子型を有することが示された。ここで、ｅｒｍＥは首尾良くｄｐｔＤに置換された。
【０３２４】
ＣＢＵＫ  １３７８６０の出発材料を、本質的に実施例１０に記載されるように調製し、これを使用してシード培養物を作製した。生成培養物をまた、本質的に実施例１０に記載されるように作製したが、エアレーションは０．７ｖｖｍだった。このファーメンターのｐＨを１４％（ｖ／ｖ）の水酸化アンモニウム溶液を用いてｐＨ６．５０にコンピューター制御した。５０％（ｗ／ｖ）グルコース溶液を、発酵の間にわたって０．３６ｇ／Ｌ／ｈｒで培養物にフィードした。
【０３２５】
２０Ｌの発酵物からの生物量を廃棄し、そして清澄した溶液を、オープンガラスカラムに適用し、Ｍｉｔｓｕｂｕｓｈｉ  ＨＰ２０樹脂（６０×３００ｍｍ）を用いて充填し、そしてメタノールおよび水を用いて整えた。溶出の前に、このカラムを２Ｌの水で洗浄し、その後２Ｌのメタノール／水（１：４）で洗浄した。次いでこのカラムを２Ｌのメタノール／水（４；１）で溶出し、その後１Ｌのメタノールで溶出し、そして２つの別々の画分として収集した。
【０３２６】
液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）電子スプレーイオン化（ＥＳＩ）分析は、両方の画分がＡ２１９７８Ｃ／ＣＤＡハイブリッド分子を含むことを示し、そしてより複雑でないメタノール／水（４：１）の画分をさらに処理した。これを、減圧下で水相残渣からエバポレートし、次いで、水で５００ｍｌにした。次いで、２Ｌの分離漏斗で３×５００ｍＬの酢酸エチルを用いて戻し抽出（ｂａｃｋ  ｅｘｔｒａｃｔ）して、水相画分および有機相画分を得た。ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）は、このハイブリッド分子が有機相には存在しないことを示し、そしてこれを廃棄した。水相画分を一晩凍結乾燥した。
【０３２７】
ハイブリッド分子を、Ｗａｔｅｒｓ  Ｐｒｅｐ  ＬＣシステムおよび４０×１０ｍｍガードを有するＷａｔｅｒｓ  ４０×２００ｍｍ  ＮｏｖａーＰａｋ  Ｃ１８  ６０Åの半径方向に６μｍ圧縮された二重カートリッジを使用して、分取用高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製した。凍結乾燥した物質を水に溶解し、そして勾配方法を使用して精製した。この方法を、９０％水＋１０％アセトニトリルで２分間保持し、そして１３分間にわたって２５％水＋７５％アセトニトリルへの直線勾配に供した。流速は５５ｍＬ／分であり、そして勾配全体を０．０４％のトリフルオロ酢酸を用いて緩衝化した。画分を回収し、そして、走査範囲２００〜２０００ダルトンおよび２秒間走査を用いて、陽イオンモードで電子スプレーイオン化（ＥＳＩ）を使用する、Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＳＳＱ７１０Ｃ  ＬＣ−ＭＳシステム上でＬＣ−ＭＳによって分析した。このＬＣ−ＭＳ分析のためのクロマトグラフィー分離を、Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ８カラム（４．６×５０ｍｍ、３．５μｍの粒子径）で達成した。このクロマトグラフィーは、０．０１％ギ酸を含む水−アセトニトリルの直線勾配を用い、０．５分間の開始遅延の後に６分間にわたって１０％〜１００％にアセトニトリルを増加させ、次いで再平衡化する前にさらに３．５分間１００％アセトニトリルで続けて溶出した。流速は１．５ｍＬ／分であり、この方法を周囲温度で行った。
【０３２８】
この分析は、Ａ２１９７８Ｃ／ＣＤＡハイブリッドを、ネイティブＡ２１９７８ＣのリポペプチドＡ２１９７８Ｃ１（分枝したＣ１１アシル鎖を有する）、およびＡ２１９７８Ｃ２（分枝したＣ１２アシル鎖を有する）の予想アナログとして同定した。ここで、ネイティブのキヌレニン（ｋｙｎｕｒｅｎｉｎｅ）残基はトリプトファン残基で置換されている。両方の画分は、ＮＭＲ研究の前にさらなる精製を必要とした。Ｃ１１ハイブリッド（Ａ）を、０．０４％のトリフルオロ酢酸で緩衝化した、６０％水＋４０％アセトニトリルを用いる定組成（ｉｓｏｃｒａｃｔｉｃ）方法を使用してさらに精製した。１．８ｍｇの物質を単離した。Ｃ１２ハイブリッド（Ｂ）最終精製工程は、０．０４％のトリフルオロ酢酸で緩衝化した、５８％水＋４２％アセトニトリルを用いる定組成方法を使用した。約１．５ｍｇの物質を単離した。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを、図１３に示す。ＡおよびＢについてのＵＶ最大値およびＥＳＩ−ＭＳ分子イオン情報（陰イオンモードにおいて観察される二価イオン）を、以下に示す：
【０３２９】
【表８】
2005508622.tif 000012
改変されたバージョンのダプトマイシンＮＲＰＳ（例えば、ｄｐｔＡの欠失、ｄｐｔＡ＋ｄｐｔＤの欠失、など）を、他の二次代謝物産生株（例えば、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ、Ｓ．ｆｒａｄｉａｅ、Ｓ．ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓなど）に導入する同様の実験はまた、ダプトマイシン骨格に基づく誘導化合物を生成した。ＮＲＰＳサブユニットを個別に発現して交換され得る場合、当業者は、Ｓ．ｒｅｓｅｓｏｐｏｒｕｓまたは他の発現宿主において、１つ以上の天然のＮＲＰＳサブユニットまたは改変したＮＲＰＳサブユニット（上記のような、改変されたバージョンのダプトマイシン合成酵素を含む）を単独または組み合わせで用いて、全てのサブユニットをトランス補完し得るかまたは置換し得る。例として、以下の改変されたＳ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ株を作出し得る；ｄｐｔＡおよびｄｐｔＤがネイティブの遺伝子座から欠失、ｄｐｔＢＣ発現がインタクト。次いで、この株を、異所に組み込んだｄｐｔＡによってか、位置２（実施例１２）でのａｓｎの代りにａｓｐを組み込むように部位特異的変異誘発によって改変され、そしてｋｙｎ受容モジュールをＣＤＡ  ＰＳＩＩＩのｔｒｐ受容モジュールに置換するように異所に組み込まれたｄｐｔＤによってか、または異所に組み込まれたＣＤＡＩＩＩによって、補完され得る。同様の株を作出する別の方法は、ｄｔＡ、ｄｐｔＤ欠失ＢＡＣ  Ｂ１２：０３Ａ０５を、アスバラギンの代わりにアスバラギン酸が組み込まれた改変されたｄｐｔＡサブユニットを既に保有するＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＴＫ６４派生体の中に導入することである。このような株を発酵して、部分２においてａｓｐを、かつ部分１３においてｔｒｐを有するダプトマイシン誘導体を回収し得る。
【０３３０】
（Ｄ．ダプトマイシン環の拡大またはテールの延長を引き起こすための１つ以上のモジュールの挿入）
単純ＮＲＰＳ延長モジュールは、ドメイン「Ｃ−Ａ−Ｔ」（縮合ドメイン、アデニル化ドメインおよびチオール化ドメイン）を含むものとして定義され得る。モジュールの連結のために、そしてさらなる内部モジュールをその中に挿入するためにダプトマイシンＮＲＰＳ内に許容される部位を同定するために、このドメイン、および内部ドメインの領域を、可撓性「リンカー」配列の配列指標について試験した。例えば、Ｍｏｏｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９７、５８４８−５８５３（２０００）（これは本明細書中においてその全体が参考として援用される）。追加モジュールをコードする配列を、例えば、上記の実施例１１Ａに記載されるような、周知の遺伝子組換え技術を使用して、上流Ｔドメインと下流Ｃドメインとの間のリンカー配列に挿入する。
【０３３１】
モジュールＤＮＡの単離は、生産生物体より抽出された染色体ＤＮＡから得られる。種々の単離技術（例えば、制限酵素を用いて染色体ＤＮＡを切断してサザンブロットによって目的モジュールをコードするフラグメントを同定した後にこれを単離すること、または例えば、適切なプライマーを使用した遺伝子増幅（ＰＣＲ）による目的モジュールの単離）が、使用され得る。増幅されたフラグメントの配列決定および特徴付け、ならびにクローニングが、従来技術に従って実施され得る。新規モジュールは、ダプトマイシンの環を拡大するために、ｄｐｔＡにおいてＬ−ＴｈｒおよびＧｌｙを特定するモジュールの間；ｄｐｔＢＣにおいてＬ−ＯｒｎおよびＬ−Ａｓｐ、またはＬ−ＡｓｐおよびＤ−Ａｌａを特定するモジュールの間；ｄｐｔＢＣにおいてＬ−ＡｓｐおよびＧｌｙ、またはＧｌｙおよびＤ−Ｓｅｒを特定するモジュールの間；ならびにｄｐｔＤにおいて３−ＭＧおよびＬ−Ｋｙｎを特定するモジュールの間に、挿入され得る。新規モジュールは、ダプトマイシンのテールを伸長するために、ｄｐｔＡ遺伝子中のＬ−ＴｒｐおよびＤ−Ａｓｎを特定するモジュールの間、Ｄ−ＡｓｎおよびＬ−Ａｓｐを特定するモジュールの間、またはＬ−ＡｓｐおよびＬ−Ｔｙｒを特定するモジュールの間に、挿入され得る。このモジュール挿入は、実施例１１Ａにおいて記載されるダブルクロスオーバー（ｄｏｕｂｌｅ  ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ）についての方法を使用して実行され得る。
【０３３２】
（Ｅ．チオエラスターゼモジュールに隣接するさらなるカルボキシル末端モジュールの挿入、およびチオエラスターゼモジュールから上流のさらなるカルボキシル末端モジュールの挿入）
種々のＮＲＰＳおよびＰＫＳのカルボキシ末端チオエラスターゼドメイン（「Ｔｅドメイン」）は、非天然ペプチドおよびポリケチド基質を切断し得る（すなわち、連鎖停止を触媒し得る）。Ｍｏｏｔｚら、前出を参照のこと；また、Ｆｅｒｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２、２５３０４−２５３０９（１９９７）を参照のこと（これらの各々は本明細書によってその全体が参考として援用される）。Ｔｅドメインは、加水分解酵素として作用して直鎖生成物を放出し得るか、またはシクラーゼとして作用して環状ペプチドを放出し得る。それにもかかわらず、ＮＲＰＳまたはＰＫＳ中で、天然の構造においてシクラーゼとして機能するＴｅドメインは、新規のモジュール構造へと操作された場合に加水分解酵素として機能し得ることが、証拠によって示される。（単離されたＣ末端Ｔｅドメインは、重要な「認識アミノ酸」が基質のＣ末端およびＮ末端にある限り、種々の基質に対して環化を触媒することが示された。；Ｔｒａｕｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、４０７、２１５−２１８、２０００を参照のこと）。
【０３３３】
また、いくらかのＣ末端Ｔｅドメインが、移動する場合、天然のＮＲＰＳまたはＰＫＳのモジュラー構造の上流に直接存在するタンパクドメインの一部との結合を維持することによって、最良に機能することも示されている。Ｇｕｅｎｚｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３、１４４０３−１４４１０（１９９８）（本明細書中でその全体が参考として援用される）を参照のこと。Ｔｅドメインと直接の上流（Ｎ末端）のドメインの一部との結合を維持することがまた、新規モジュラー構造中でＴｅドメインのシクラーゼ機能を維持するのに貢献し得ることは、可能性がある。
【０３３４】
従って、Ｔｅドメインから上流に追加モジュールを挿入するため、およびそれに作動可能に連結させるために、当業者は、Ｃ−Ａ−ＴモジュールとＣ末端Ｔｅドメインとの間のリンカー配列を、上記のように、標準的な遺伝子操作を使用して同定し得、そしてその中に追加モジュールをコードする配列を挿入し得る。必要に応じて、当業者は、最後から２番目のチオール化（Ｔ−）ドメインのＣ末端部分がＴｅドメインに連結された（か、またはそれ以外にグラフトされた）ままである、新規のハイブリッドＣ末端Ｔｅドメイン（「Ｔ−／Ｔｅドメイン」）を操作し得る。Ｇｕｅｎｚｉら、１９９８、前出を参照のこと。次いで、追加モジュールをコードする配列を、上記の実施例１１Ａのように、周知の遺伝子組換え技術を使用して、ハイブリッドＴ−／Ｔｅドメインから上流の、同定されたリンカー領域内に挿入する。
【０３３５】
（Ｆ．ダプトマイシン環の収縮を引き起こすかまたはテールの短縮を引き起こす１つ以上の分子の内部欠失）
ダブルクロスオーバーおよび抗生物質プレート上での選択によって、染色体上で、内部モジュールの欠失を得るために、欠失されるべきモジュールの下流のフラグメントのライゲーションによって融合された、欠失されるべきモジュールから上流に位置する染色体ＤＮＡフラグメントを含むプラスミドを調製する必要がある。このプラスミドはまた、野生型ｒｐｓＬ遺伝子を保有し、ストレプトマイシン耐性の遺伝的背景（実施例１１Ａを参照のこと）における組換え体に対するストレプトマイシン感受性、シングルクロスオーバーの選択のための抗生物質耐性遺伝子（例えば、アプラマイシン耐性、チオストレプトン耐性またはハイグロマイシン耐性）、および温度上昇で回復し得る温度感受性レプリコンを付与する。交換されるべきモジュールの上流のＤＮＡ領域に、相同組換えによってプラスミドを挿入するシングルクロスオーバーは、温度を上昇させて、抗生物質耐性について選択され得る。次いで、このモジュールを欠失させる、二回目のクロスオーバーは、ストレプトマイシンを含む培地で選択され得る（従って、全てのプラスミド配列を削除する）。適切なモジュールの欠失を有する組換え体を、適切な制限ヌクレアーゼを用いて切断されたＳ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓのＤＮＡのサザンブロットハイブリダイゼーションによって確認し得る。このアプローチは、例えば、ｄｐｔＢＣからＬ−ＡｓｐモジュールまたはＧｌｙモジュールを欠失させるために採用され得る。このアプローチはまた、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−ＡｓｐまたはＬ−ＡｓｎおよびＬ−Ａｓｐの両方を一緒に特定するｄｐｔＡ遺伝子において、これらモジュールを欠損させるために使用され得る。
【０３３６】
（Ｇ．ダプトマイシン環（ｄａｐｔｏｍｙｃｉｎ  ｒｉｎｇ）の縮小を引き起こすための末端チオエステラーゼモジュールの転移）
ダプトマイシンＮＲＰＳ（ＤｐｔＤ）における最後のモジュールのカルボキシル末端に存在するチオエステラーゼ（Ｔｅ）領域をコードする配列は、内部モジュールコード領域の末端に対して上流に転移され得る。この転移は、短縮型の直鎖ペプチドまたは環状ペプチドを産生する、規定された短縮産物の放出を生じる。Ｔｅの転移は、上の実施例１２Ａおよび１２Ｆにおいて記載されるのとほぼ同じダブルクロスオーバーによって達成され得る。
【０３３７】
（ダプトマイシン  ＮＲＰＳ遺伝子と他のＮＲＰＳ遺伝子またはＰＫＳ遺伝子との間での分子交換）
（ａ．異なるＮＲＰＳまたはＰＫＳについてのダプトマイシンチオエステラーゼ）
有用な特性を有する新規のペプチドおよび／またはハイブリッドペプチド／ポリケチド産物を合成し得るハイブリッドモジュラーシンテターゼを生成するために、上記のような周知の分子遺伝学的方法を使用して、本発明のダプトマイシンＮＲＰＳのＣ末端Ｔｅドメインをコードする配列（例えば、ＤｐｔＤ）を、他の種々の宿主に由来する他のＮＲＰＳモジュラー遺伝子またはＰＫＳモジュラー遺伝子をコードする配列に関連するように（単独か、または１つ以上の上流のモジュールもしくはその部分とともにのいずれかで）移動し得る。例えば、Ｓｔａｃｈｅｌｈａｕｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６９，６９−７２頁（１９９５）ならびにＣａｎｅおよびＫｈｏｓｌａ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６，３１９−３２５頁（１９９９）を参照のこと；これらの各々は、その全体が本明細書中に参考として援用される。同様に、本発明の遊離チオエステラーゼをコードするダプトマイシン配列（例えば、ＤｐｔＨ）は、ハイブリッドモジュラーシンテターゼを生成するために、移動して他のＮＲＰＳまたはＰＫＳコードモジュラー遺伝子に会合し得る。
【０３３８】
（ｂ．ダプトマイシンと他のＮＲＰＳおよび／またはＰＫＳとの間のモジュールおよびドメインの交換）
本発明のダプトマイシン生合成遺伝子クラスター由来の種々の配列（ドメインおよびモジュール構造が挙げられるが、これらに限定されない）は、ハイブリッドＮＲＰＳモジュラーシンテターゼおよびハイブリッドＮＲＰＳ／ＰＫＳモジュラーシンテターゼ（ダプトマイシン生合成遺伝子クラスター由来の配列を含む）を生成するために、同種および異種の宿主における、ダプトマイシン配列と、天然または合成のＮＲＰＳ配列およびＰＫＳ配列との間の遺伝子組換え反応（遺伝子重複、転換、置換など）で使用するためのプラスミドおよび他のベクターを構築するために使用され得る。このようなハイブリッドシンテターゼは、新規でありかつ有用な特性を有することが予測される新規のペプチドおよびポリケチド産物を生成する。
【０３３９】
（通常アセチル化しない非リボソーム合成ペプチドのリポペプチド誘導体の作製）
ダプトマイシンの脂肪酸テールは、ｄｐｔＥ遺伝子およびｄｐｔＦ遺伝子の生成物によって接触され、ｄｐｔＡの開始で縮合ドメインと結合して作用するとみなされる。これらの遺伝子および遺伝子フラグメントは、外来非リボソーム合成ペプチドのアシル化バージョンを作製するためか、またはダプトマイシンのアシル化された短縮誘導体を作製するために、外来非リボソームペプチドシンターゼ遺伝子の開始位置に移動され得るか、あるいはダプトマイシン遺伝子クラスターの内部位置（遺伝子の開始位置（例えば、ｄｐｔＢＣまたはｄｐｔＤの５’）またはモジュールの開始位置（例えば、モジュール２の５’）における遺伝子内のいずれか）に移動され得る。この外来遺伝子（例えば、環を拡張もしくは縮小させるような改変が実施されたダプトマイシンの種々のバージョン）は、本明細書中に記載されるペプチド配列において置換されたアミノ酸を有するために、別の天然の微生物または組換え技術によって生じた微生物に由来し得る。
【０３４０】
（ペプチド構造におけるアミノ酸立体異性体の改変）
ＮＲＰＳによって生成されるアミノ酸骨格における立体特異性は、ドナーモジュールのエピメラーゼドメインおよびアクセプターモジュールの別個の縮合ドメインの存在によって決定される。このアミノ酸の立体異性体における変更は、ドナーモジュールへのエピメラーゼドメインの添加、またはアクセプターモジュールへの適切な縮合ドメインの置換によって達成され得る。変更はまた、ドナーモジュールからエピメラーゼドメインの除去、またはアクセプターにおける適切な縮合ドメインの置換によって作製され得る。例えば、エピメラーゼドメインは、ｄｐｔＡのモジュール２から削除され、そしてｄｐｔＡのモジュール３の縮合ドメインは、Ｄ−アミノ酸を通常受け取らない別のモジュールから縮合ドメインに交換され得る。有用なエピメラーゼおよび縮合ドメインは、ダプトマイシンクラスターおよび他の非リボソームペプチドシンテターゼ遺伝子において見出され得る。
【０３４１】
（実施例１３：遊離チオエステラーゼの使用）
（Ａ．モジュールのＮＲＰＳおよびＰＫＳによって生成物生成の効率を増加させるための、同種系または異種系におけるｄｐｔＤ関連配列またはｄｐｔＨ関連配列の発現）
チロシジンシンテターゼから切り取られたＣ末端Ｔｅドメインは、「認識アミノ酸」が基質のＣ末端およびＮ末端において主要である限り、種々のペプチド基質において環化を触媒することが示されている。Ｔｒａｕｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，４０７，２１５−２１８，  ２０００を参照のこと。ダプトマイシンＮＲＰＳ（例えば、ｄｐｔＤ）のＣ末端に由来する配列は、同様に、同種宿主または異種宿主（またはインビトロ系）において、単独または適切な融合タンパク質の形態で単離および発現され得、ペプチドおよびポリケチド産物（これらは、ダプトマイシンＴｅドメインが基質末端に結合（ｂｉｎｄ）および連結（ｊｏｉｎ）するために必要とされる、主要な基質認識アミノ酸を天然に（または操作されて）有する）の環化を触媒する（以下を参照のこと）。
【０３４２】
独立した発現のためにダプトマイシンシンテターゼ（ＮＲＰＳ）のＣ末端Ｔｅドメイン由来の配列を単離する場合、最後から２つめのアミノ酸モジュールからの天然のＣ末端配列を含むことが望ましくあり得る。例えば、Ｇｕｅｎｚｉら、１９９８，前出を参照のこと。種々のｄｐｔＤおよび上流に由来する配列の組み合わせは、当該分野において周知の技術を使用して試験され得、ＤｐｔＡおよび／またはＤｐｔＢＣのような上流のポリペプチドから独立して発現される場合、ダプトマイシンＮＲＰＳのＣ末端Ｔｅドメインのチオエステラーゼ活性を最適化し得る。ダプトマイシンのＣ末端Ｔｅドメインの独立した発現は、標準的な分子生物学的技術を用いて達成され得る。ダプトマイシンＮＲＰＳのＣ末端Ｔｅドメインの独立した発現は、適切に構築された発現ベクターにおいて、天然のダプトマイシンＮＰＲＳプロモーター配列（配列番号２）から下流のｄｐｔＤ  ＯＲＦ（配列番号３）のチオステラーゼドメインに由来する挿入配列によって達成される。あるいは、ダプトマイシンＮＲＰＳのＣ末端Ｔｅドメインの独立した発現は、異種プロモーターから下流のｄｐｔＤ  ＯＲＦ（配列番号３）のチオエステラーゼドメインの挿入によって達成され、これは、構成的に活性であるか、あるいは調節された様式において、オンまたはオフされ得る異種プロモーターに由来する。当業者は、宿主細胞に依存的な様式での発現または過剰発現のために適切なプロモーターおよびベクターの選択の際に考慮される因子を正確に認識する。
【０３４３】
本発明のダプトマイシン生合成遺伝子クラスターの遊離チオエステラーゼドメインに由来する配列（ｄｐｔＨ）は、新規の環状ペプチドなどを試験および開発するために同種宿主または異種宿主において同様に発現され得る。
【０３４４】
ダプトマイシンの主要な認識アミノ酸は、ダプトマイシンのアミノ酸残基の体系的な変異誘発、続いて、単離されたＴｅドメインによって触媒される反応における、改変されたダプトマイシン基質の各々を使用する環化アッセイによって同定される。ダプトマイシン環化のために必要なＣ末端アミノ酸残基およびＮ末端アミノ酸残基は、ペプチドおよびポリケチド構築ブロック単位が挿入され得る、新規な基質骨格中で同定および操作される。基質操作は、当業者に周知な技術を使用して、核酸配列レベルまたはペプチドレベルで実施され得る。好ましい基質の長さおよび組成は、当業者に周知の要素を考慮して実験的に決定され得、そしてこれらとしては、基質結合効率、触媒速度、得られる環生成物の生物学的活性、および最終生成物の精製の容易さが挙げられる（が、これらに限定されない）。
【０３４５】
（Ｂ．校正機能に影響を与えるためのｄｐｔＤまたはｄｐｔＨの突然変異誘発化）
ダプトマイシン遺伝子クラスター由来のｄｐｔＨ遺伝子は、いくつかのペプチドおよびポリケチド二次代謝物の生合成に関与することが知られている遊離チオエステラーゼ酵素に関連する。例えば、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  およびＭａｒａｈｉｅｌ，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１６９，４０４−４１０頁（１９９８）ならびにＢｕｔｌｅｒら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６，８７−２９２頁（１９９９）を参照のこと（これらの全体は、参考として本明細書中に援用される）。編集チオエステラーゼが、しばしば効率的な天然の生成物合成に必要とされることが示唆された。Ｂｕｔｌｅｒらは、ポリケチドタイロシン遺伝子クラスターにおいて発見された遊離チオエステラーゼが編集機能および校正機能に関わり得るという見解を示し、このことは、効率的な生成物の処方物において示唆されたチオエステラーゼの役割と一致する。
【０３４６】
ダプトマイシンｄｐｔＨ（遊離チオエステラーゼをコードする）遺伝子またはｄｐｔＤのチオエステラーゼコードドメイン（Ｃ末端Ｔｅをコードする）遺伝子の同種または異種の発現は、モジュラーＮＲＰＳおよびＰＫＳによる生成物生成の効率に影響を与え得る。ダプトマイシンチオエステラーゼＩＩ型酵素（ＤｐｔＨ）の、提案された編集機能および校正機能（ならびに、潜在的には、ダプトマイシン遺伝子クラスターのＣ末端から取り外され、そして別個に発現される場合、Ｉ型チオエステラーゼ酵素の編集機能および校正機能）は、慣習的な突然変異誘発および他の組換えＤＮＡ技術（例えば、ＤＮＡ複製の忠実度に反対の影響を与えることが知られている）によって変更され得る。チオエステラーゼ遺伝子の変更形態および変異形態は、適切な発現系において発現され得、そして変更された生物学的特性を有するチオエステラーゼ酵素をコードする遺伝子についてスクリーニングされ得る。通常よりも高いアミノ酸の誤取り込み率を有するチオエステラーゼ酵素が特に所望される。このような変異体は、新規であり、かつ有用な生物学的特性を有するペプチドおよびペプチド／ポリケチドハイブリッド生成物の広範な多様性を作り出すのに有用である。
【０３４７】
（実施例１４：関連遺伝子の同定および単離のためのダプトマイシン生合成遺伝子の使用）
ＮＲＰＳまたは別のリポペプチドをコードするＮＲＰＳの成分に由来する配列を同定するために使用され得る特性を同定するために、本発明の核酸配列およびアミノ酸配列と、別のリポペプチド経路由来の対応する配列とを比較し得る。
【０３４８】
アミノ酸３−メチルグルタミン酸（３ＭＧ）は非凡であるが、ダプトマイシン、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ由来のカルシウム依存性抗生物質（ＣＤＡ）、およびＳ．ｆｒａｄｉａｅによって作られるＡ５４１４５化合物において見いだされる。３ＭＧアデニル化ドメインをコードするＳ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ核酸配列とＳ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ核酸配列との比較、ならびに他のアミノ酸をアデニル化する遺伝子に由来する類似配列との比較を使用して、以下のプライマー対Ｐ１４０およびＰ１４１：
Ｐ１４０  ＡＣＳＳＷＳＧＧＳＧＴＳＳＣＣＴＴＣＡＴＧＡＡ（配列番号１６０）
Ｐ１４１  ＡＴＧＧＴＧＴＴＣＧＡＧＡＡＣＴＡＹＣＣ  （配列番号１６１）
を作製した。
【０３４９】
Ｓ．ｆｒａｄｉａｅコスミドライブラリークローンを、標準的な技術を使用して、Ｐ１４０およびＰ１４１を用いるＰＣＲによってスクリーニングした。ＰＣＲ反応は、約７００ｂｐの核酸産物を生じ、これらの配列は、Ｓ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓおよびＳ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒにおける３ＭＧアデニル化ドメインをコードする領域に類似することを証明した。プライマーウォーキング（ｗａｌｋｉｎｇ）による配列の伸長は、同定された領域がＡ５４１４５内の３ＭＧモジュールであったことを確認した。
【０３５０】
この方法をまた、Ｄ−アミノ酸活性化モジュールの下流の縮合ドメインをコードするＮＲＰＳ経路の一部分を同定するために使用した。Ｄ−アミノ酸は、非リボソーム合成ペプチドにおいて見出される異常なアミノ酸であり、そしてこれらに会合する縮合ドメインについてのプライマーを使用して、このようなアミノ酸を伴う経路を同定し得る。Ｓ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓダプトマイシンの核酸配列およびＳ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  ＣＤＡ配列（これらのＤ−アミノ酸縮合ドメインをコードする）を、互いに比較し、かつＬ−アミノ酸と会合する他の縮合ドメイン由来の類似配列と比較して、以下のプライマー対Ｐ１４４およびＰ１４５：
Ｐ１４４  ＳＣＳＣＴＳＣＡＧＧＡＧＧＧＳＨＴＳＳＴＳＴＴＣＣ（配列番号１６２）
Ｐ１４５  ＣＣＧＡＡＳＡＣＳＡＣＧＴＣＧＴＣＳＣＧＳＣＣ（配列番号１６３）
を作製した。
【０３５１】
Ｓ．ｆｒａｄｉａｅコスミドライブラリークローンを、標準的な技術を使用して、Ｐ１４４およびＰ１４５を用いるＰＣＲによってスクリーニングした。ＰＣＲ反応は、約８００ｂｐの核酸分子生成物を生じ、この配列が、Ｓ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓおよびＳ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒにおけるＤ−アミノ酸の下流の縮合ドメインに類似することが証明された。１つより多いドメインに一致する配列を得た。このことは、この経路が１つより多いＤ−アミノ酸を有することを示唆した。
【０３５２】
リポペプチド経路遺伝子クラスターの他の遺伝的特徴のための特別なプライマーセットを開発するために、ダプトマイシン経路（例えば、エピメラーゼドメイン、またはペプチドに脂肪酸を縮合させる役割を果たす第１のアデニル化モジュールの縮合ドメインをコードする領域、ならびにアシル化に関与する遺伝子（例えば、ＤｐｔＥおよびＤｐｔＦ）をコードする領域）の配列の理解に基づくこれらのアプローチを使用し得る。
【０３５３】
【表９】
2005508622.tif 000013
2005508622.tif 000014
2005508622.tif 000015
９０ｋｂフラグメントのＯＲＦ−１は、ＯＲＦの部分配列である。なぜなら、ＯＲＦの３’末端（終止コドンを含む）は、ＳＰ６フラグメントにおいて終結するからである。ＯＲＦ１配列の３’末端の核酸配列（終止コドンを含む）は、配列番号１０３のヌクレオチド１３０２０〜１２８７６に一致する。従って、９０ｂｐフラグメントのＯＲＦ１の全長オープンリーディングフレームは、配列番号１９（配列番号１のヌクレオチド１６３５〜１の相補鎖）からなり、後に配列番号１０３のヌクレオチド１３０２０〜１２８７６の相補鎖が続く。
【０３５４】
【表１０】
2005508622.tif 000016
2005508622.tif 000017
2005508622.tif 000018
2005508622.tif 000019
2005508622.tif 000020
2005508622.tif 000021
2005508622.tif 000022
2005508622.tif 000023
2005508622.tif 000024
2005508622.tif 000025
【０３５５】
【表１１】
2005508622.tif 000026
2005508622.tif 000027
2005508622.tif 000028
【０３５６】
【表１２】
2005508622.tif 000029
2005508622.tif 000030
（実施例１５：アクチノロジンの非存在下でのＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓにおけるダプトマイシンの異種産生）
遺伝的効果および培地の効果の両方を改変して、異種宿主中でのＡ２１９７８Ｃリポペプチドの発現を改善した。ｄｐｔ遺伝子クラスターＢＡＣを保有する種々の株を、遺伝子クラスターを有さないコントロール株と並行して、振盪フラスコ発酵において増殖させ、そして清浄化したブロスを、ＨＰＬＣにより、Ａ２１９７８Ｃリポペプチド系列の存在について分析した。ＢＡＣクローンＢ１２０３Ａ０５上のｄｐｔクラスターを、標準的技術を用いるプロトプラスト生成（Ｋｅｉｓｅｒ，Ｔ．ら、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｎｏｒｗｉｃｈ、２０００）によりＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓに導入した。試験される株としては、ｄｐｔ遺伝子クラスターを保有するＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓのＴＫ２３株およびＴＫ６４株の両方、ならびにアクチノロジン経路を部分的に欠失した、遺伝的に改変したバージョンのＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＴＫ２３を含んだ。他の適合性かつ適切な作用ノックアウト株が、当該分野で公知である。ＴＫ６４は、ストレプトマイシン耐性を与えるｒｐｓＬ（ｓｔｒ−６）変異を保有する点で、Ｔ２３と異なり、この株は、アクチノロジンの産生における増強にも関連した（Ｓｈｉｍａら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１７８（２４）、７２７６〜７２８４（１９９６））。アクチノロジンファミリーは、多くの発酵条件下で、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓにより大量に産生される有色のポリケチドであり、これは、発酵由来の他の二次代謝物の検出および精製を妨害する。
【０３５７】
Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓからのアクチノロジン産生を排除するために、その経路の一部を欠失するようなカセットを構築した。アクチノロジンポリケチドシンターゼ経路を保有する８ｋｂフラグメント（ＭａｌｐａｒｔｉｄａおよびＨｏｐｗｏｏｄ、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、２０５、６６−７３（１９８６））を、ｐＵＣ１９へとクローニングした；１．４ｋｂのＤＮＡを、このフラグメントの中心から除去し、それによりａｃｔＩｏｒｆＩの３’末端およびａｃｔＩｏｒｆＩＩのほとんど全てを欠失させた。次いで、このフラグメントを、耐性マーカーｅｒｍＥ（Ｂｉｂｂら、Ｇｅｎｅ、３８（１〜３）、１５〜２６（１９８５））により置換した。次いで、この欠失カセットを、温度感受性プラスミドｐＧＭ１６０に移し、そしてＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＴＫ２３へと導入した。次いで、これらの組換え株を、４０時間発酵させ、次いで選択培地にプレートし、いくつかのコロニーのスクリーニングから、適切な表現型を有するものを単離した。次いで、これらの株の遺伝子型を、サザンブロットにより確認した。ＢＡＣベクターのみを保有するＴＫ６４およびＴＫ２３の両方のＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ株も、コントロール株として試験した。株の注釈について表９を参照のこと。
【０３５８】
【表１３】
2005508622.tif 000031
ｒｐｓＬの欄における＋は、野生型の状態を示す。
【０３５９】
多数の異なる培地を、最初に調査したが、２つの異なる培地を、それらがＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓにおけるＡ２１９７８Ｃリポペプチドの産生を支持する能力について、より詳細に試験した。これらの培地の両方は、Ｓ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓにおけるＡ２１９７８Ｃリポペプチドの良好も産生を支持する。培地Ａは、１％のグルコース（ＢＤＨ）、２％可溶性デンプン（Ｓｉｇｍａ）、０．５％の酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ）、０．５％のカゼイン（Ｓｉｇｍａ）、４．６％のＭＯＰＳ（Ｓｉｇｍａ）から構成され、ｐＨ７に調整され、そしてオートクレーブ滅菌された複合培地であった。培地Ｂは、微量元素およびビタミンと共に、２％グリセロール、０．２５％のスクロース、１．２％のプロリン、１．５％のＭＯＰＳ、０．０５６％のＫ２ＨＰＯ４、０．０５％のＮａＣｌから構成され、そしてｐＨ７に調整され、そしてろ過滅菌された規定された培地であった。
【０３６０】
発酵を、１００ｍｇ／Ｌのアプラマイシンを−１３５℃で貯蔵された凍結バイアル（ｃｒｙｏｖｉａｌ）からの約０．２５ｍｌの物質とともに、富化したオートミールスロープ（ｏａｔｍｅａｌ  ｓｌｏｐｅ）の接種により開始した。２８℃での７〜１０日後のインキュベーションの後、混合した菌糸体および胞子の懸濁液を、４ｍｌの０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ８０の添加により作製し、そして２ｍｌを、バッフルフラスコ中の２５ｍｇ／Ｌのアプラマイシンを含む４０ｍｌの接種培地中に接種して、接種段階を開始した。接種フラスコを、２４０ｒｐｍおよび３０℃で、２４〜２８時間振盪し、次いで、５％を、５０ｍｌの培地Ａまたは培地Ｂの入った産生フラスコに移した。複製フラスコを、約１ｍｌのブロスを吸引により取り出すことにより、産生発酵期間の２日目〜６日目までサンプリングし、１０，０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離し、そしてその上清を、ＨＰＬＣにより分析した。分析を、４．６×５０ｍｍ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ８  ３．５μＭカラムおよびＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｓｅｃｕｒｉｔｙ  Ｇｕａｒｄ  Ｃ８カートリッジと共に、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ２６９０  ＨＰＬＣシステムおよび９９６  ＰＤＡ検出器を使用して周囲温度で実施した。最初に、勾配を９０％水および１０％アセトニトリルで２．５分間維持し、次いで、６分間にわたり、１００％アセトニトリルまで、線形勾配させた。流速は、１．５ｍｌ分−１であり、勾配は、０．０１％トリフルオロ酢酸を用いて緩衝した。５０μｌまでの上清を注入して、ネイティブのＡ２１９８７Ｃリポペプチドの産生についてモニターした。
【０３６１】
予想された分子量の確認を、エレクトロスプレーイオン化を陽イオンモード、２００〜２０００ダルトンのスキャンレンジおよび２秒スキャンで用いるＦｉｎｎｉｇａｎ  ＳＳＱ７１０ｃシステムを用いるＬＣ−ＭＣ分析を用いることにより得た。ＬＣ法を、Ｗａｔｅｒ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ８カラム（２．１×５０ｍｍ  ３．５μｍ粒子サイズ）で実行した。この方法は、９０％水、１０％アセトニトリルおよび０．０１％蟻酸の初期条件を０．５分間、維持し、次いで、６分間にわたり、１００％アセトニトリルおよび０．０１％蟻酸まで線形勾配させた。次いで、この方法を、３．５分間維持し、次いで、再び平衡化させた。この方法を、周囲温度で実施した。
【０３６２】
培地Ａ中のＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＴＫ６４（１３６７４２）におけるＡ２１９７８Ｃリポペプチド系列の異種発現を、ＨＰＬＣにより分析した。特徴的なＵＶ／可視スペクトルを有する３種類のＡ２１９７８Ｃリポペプチドの産生は、上記の分析条件下で、５．６１分、５．７７分、および５．８９分の保持時間で明白であった（λｍａｘ  ２２３．８ｎｍ、２６１．５ｎｍおよび３６４．５ｎｍ）。ＬＣ−ＭＳ分析において、これらの３種類のＡ２１９７８Ｃリポペプチドは、１６３４．７、１６４８．７、および１６６２．７のｍ／ｚで分子イオン（Ｍ−Ｈ）＋を生じ、これは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓにより産生される主要なＡ２１９７８Ｃリポペプチド代謝物Ｃ１、Ｃ２、およびＣ３について報告された質量とそれぞれ一致する（Ｄｅｂｏｎｏら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ、ＸＬ（６）、７６１〜７７７（１９８７））。Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＴＫ２３（１３７０２７）におけるｄｐｔ遺伝子クラスターの異種発現についての類似の産物プロフィールもまた、同じ条件下で得られた。アクチノロジン産生を増強することが報告されているｒｐｓＬ変異が存在しないのにも関らず、この株において、同様に高いアクチノロジン産生レベルが観察された。Ａ２１９７８Ｃリポペプチドは、ＢＡＣベクターがただ組み込まれただけのＴＫ６４コントロール株（１３６７３６）またはＴＫ２３コントロール株（１３７０２８）の発酵において検出されなかった。
【０３６３】
これらの株により粗ブロスにおいて産生されたＡ２１９７８Ｃリポペプチドの量は、ＣＤＡ複合体のメンバーを含む、ホストピーク（ｈｏｓｔ  ｐｅａｋ）を有する同時クロマトグラフィーに起因して、正確に定量され得なかった；しかし、これら３種類の主要なリポペプチドの最大収率の合計を、約２０ｍｇ／Ｌと見積もった。Ａ２１９７８Ｃリポペプチドは、多数の宿主の代謝物と共に発酵の初期に産生された。
【０３６４】
Ａ２１９７８Ｃリポペプチドの産生のプロフィールはまた、培地Ａ中のＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＴＫ２３（１３７０２４）作用ノックアウト株の発酵物から観察された。この株におけるインタクトの作用経路の不存在は、規定培地Ｂの適用を可能にし、ここで、正常に高いレベルの作用が支持される。規定培地のバリエーションを、評価し、そして２〜４ｇ／ＬのレベルのＫ２ＨＰＯ４が、Ａ２１９７８Ｃリポペプチドの産生および幾分かの宿主代謝物の抑制の両方について有利であることが見出された。ＨＰＬＣ分析は、より多くのホスフェートを補充した培地中で、５０時間、増殖した１３７０２４の粗ブロスから得られたプロフィールであって、ホスフェート補充なしでの培地Ｂ中でのＡ２１９７８Ｃリポペプチドの産生と比較して非常に明白なＨＰＬＣプロフィールを明らかにした。発酵が進むにつれて、そしてホスフェートの抑制解除が生じるにつれて、宿主代謝物のレベルおよび多様性が増加したが、培地Ａにおいて以前に観察されたレベルまでは増加しなかった。しかし、発酵の初期において、多くの宿主代謝物の産生が抑制されたが、ＣＤＡ系列のリポペプチドの産生は抑制されなかった。ＣＤＡは、非リン酸化形態およびリン酸化形態で存在し得る。用いられるクロマトグラフィー条件下で、非リン酸化形態のＣＤＡは、Ａ２１９７８Ｃリポペプチドと同じ領域において同時にクロマトグラフ分析され、検出および定量を複雑にした。発酵培地へのホスフェートの取りこみは、少なくとも最初に、リン酸化形態のＣＤＡの産出に偏らせ、このことは、ＨＰＬＣによる３種類のＡ２１９７８Ｃリポペプチドから十分解明された。ＣＤＡ産生に対するこの効果はまた、多量にホスフェートを補充した培地Ｂにおける、ｄｐｔ遺伝子クラスターを含まないＢＡＣプラスミドを組み込まれたＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＴＫ２３作用ノックアウト株（１３７０２６）であるコントロール株の発酵から明らかであった。
【図面の簡単な説明】
【０３６５】
【図１】図１は、ダプトマイシンＮＲＰＳ遺伝子が、遺伝子発現またはコードされるタンパク質の発現を変更するために操作され得る方法の模式図である。
【図２Ａ】図２Ａは、ＢＡＣクローンＢ１２：０３Ａ０５の模式図である。この図は、９０ｋｂの領域（９０ｋｂフラグメントといわれる）、約１３ｋｂの領域（本明細書中でＳＰ６フラグメントといわれる）、および約２５〜２８ｋｂの領域（本明細書中でＧＴＣ２フラグメントといわれる）を示す。配列番号１は、９０ｋｂフラグメントの核酸配列を示す。配列番号１０３は、ＳＰ６フラグメントの核酸配列を示す。このＳＰ６フラグメントは、この９０ｋｂフラグメントに左側で隣接する。ＧＴＣ２フラグメントは、この９０ｋｂフラグメントに右側で隣接する。配列番号１０４は、このＧＴＣ２フラグメントの核酸配列を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、９０ｋｂフラグメントの模式図を示す。ダプトマイシン生合成遺伝子クラスターの領域には、３８個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在する。これらは、ポリペプチドをコードする核酸配列である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、このＳＰ６フラグメントの模式図を示す。このＳＰ６フラグメント中には、９個のＯＲＦが存在する。この９０ｋｂフラグメントおよびこのＳＰ６フラグメントのＯＲＦについてのアミノ酸配列の識別名および核酸配列の識別名に関しては、表５を参照のこと。
【図２Ｄ】図２Ｄは、このＧＴＣ２フラグメントの模式図を示す。
【図３】図３は、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗプログラムを用いた、ＤｐｔＤのアミノ酸配列（配列番号７）と、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのカルシウム依存性抗生物質（ＣＤＡ）ＩＩＩタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１６４）との比較を示す。実施例３を参照のこと。
【図４】図４は、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗプログラムを用いた、ＤｐｔＨ（配列番号８）と、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのＣＤＡ  ＮＲＰＳに関連した推定ヒドロラーゼ（チオエステラーゼと推定される）のアミノ酸配列（配列番号１６５）との比較を示す。実施例３を参照のこと。
【図５Ａ】図５Ａ〜図５Ｃは、ダプトマイシン生合成遺伝子クラスターＣＢＵＫ１３８７４２を含む、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓのＴＫ６４クローン（ＡＴＣＣ受託ＰＴＡ３１４０、２００１年３月１日に寄託）から産生される、ダプトマイシンまたはＡ２１９７８Ｃリポペプチドの分析を示す。図５Ａは、ＣＢＵＫ１３８７４２のブロスのＨＰＬＣ分析を示す。下のパネルは、ＨＰＬＣ溶出物について２００ｎｍ〜６００ｎｍの範囲にわたって観察された最大吸光度を、時間に対してプロットするトレースを示す。３つのネイティブリポペプチド（リポペプチドＡ２１９７８Ｃ１（Ｃ１リポペプチド）、Ａ２１９７８Ｃ２（Ｃ２リポペプチド）およびＡ２１９７８Ｃ３（Ｃ３リポペプチド））の存在は、それぞれ、５．６１分、５．７７分および５．８９分の保持時間のピークによって示される。上のパネルは、これらのピークについて観察されたＵＶ可視スペクトルを示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ダプトマイシン遺伝子クラスターを含む、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓのＴＫ６４クローンのデカン酸供給発酵物から精製されたダプトマイシンのＥＳＩ質量スペクトルを示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ＣＢＵＫ１３８７４２のデカン酸供給発酵物から精製されたダプトマイシンの１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯにおいて）を示す。
【図６】図６は、クローニングベクターｐＳｔｒｅｐｔｏＢＡＣ  Ｖの図である。
【図７】図７は、ダプトマイシン生合成遺伝子クラスター由来のＢＡＣクローンのＨｉｎＤＩＩＩ消化物を示す。レーン１は、Ｂ１２：０１Ｇ０５（８２ｋｂの挿入物）を示し；レーン２は、Ｂ１２：０３Ａ０５（１２０ｋｂの挿入物）を示し；レーン３は、Ｂ１２：０６Ａ１２（８５ｋｂの挿入物）を示し；レーン３は、Ｂ１２：１２ＦＧ０６（６５ｋｂの挿入物）を示し；レーン５は、Ｂ１２：１８Ｈ０４（４６ｋｂの挿入物）を示し、そしてレーン６は、Ｂ１２：２０Ｃ０９（６５ｋｂの挿入物）を示す。
【図８】図８は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓのうちのダプトマイシンＮＰＲＳ領域のうちの約１８０ｋｂ〜２００ｋｂを含む、いくつかのＢＡＣクローンのマップを示す。
【図９】図９は、ＮＲＰＳの遺伝子構造の模式図である。
【図１０】図１０は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ由来の、ダプトマイシンＮＲＰＳおよびＣＤＡ  ＮＲＰＳ中のＡｓｎおよびＡｓｐを指定するドメインについてのアデニル化（Ａ）ドメイン類似性を示す、系統樹である。実施例５を参照のこと。
【図１１】図１１は、Ａｓｎの立体化学を決定するＨＰＬＣ分析の結果を示す。実施例６を参照のこと。
【図１２】図１２は、ダプトマイシンＮＲＰＳの編成を示す、模式図である。
【図１３】図１３は、実施例１２Ｃに記載されたとおりに産生された新規のリポペプチドの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。
【配列表】
2005508622.tif 000032
2005508622.tif 000033
2005508622.tif 000034
2005508622.tif 000035
2005508622.tif 000036
2005508622.tif 000037
2005508622.tif 000038
2005508622.tif 000039
2005508622.tif 000040
2005508622.tif 000041
2005508622.tif 000042
2005508622.tif 000043
2005508622.tif 000044
2005508622.tif 000045
2005508622.tif 000046
2005508622.tif 000047
2005508622.tif 000048
2005508622.tif 000049
2005508622.tif 000050
2005508622.tif 000051
2005508622.tif 000052
2005508622.tif 000053
2005508622.tif 000054
2005508622.tif 000055
2005508622.tif 000056
2005508622.tif 000057
2005508622.tif 000058
2005508622.tif 000059
2005508622.tif 000060
2005508622.tif 000061
2005508622.tif 000062
2005508622.tif 000063
2005508622.tif 000064
2005508622.tif 000065
2005508622.tif 000066
2005508622.tif 000067
2005508622.tif 000068
2005508622.tif 000069
2005508622.tif 000070
2005508622.tif 000071
2005508622.tif 000072
2005508622.tif 000073
2005508622.tif 000074
2005508622.tif 000075
2005508622.tif 000076
2005508622.tif 000077
2005508622.tif 000078
2005508622.tif 000079
2005508622.tif 000080
2005508622.tif 000081
2005508622.tif 000082
2005508622.tif 000083
2005508622.tif 000084
2005508622.tif 000085
【図１】
2005508622.tif 000086
【図２Ａ】
2005508622.tif 000087
【図２Ｂ】
2005508622.tif 000088
【図２Ｃ】
2005508622.tif 000089
【図２Ｄ】
2005508622.tif 000090
【図３】
2005508622.tif 000091
【図３−１】
2005508622.tif 000092
【図４】
2005508622.tif 000093
【図５Ａ】
2005508622.tif 000094
【図５Ｂ】
2005508622.tif 000095
【図５Ｃ】
2005508622.tif 000096
【図６】
2005508622.tif 000097
【図７】
2005508622.tif 000098
【図８】
2005508622.tif 000099
【図９】
2005508622.tif 000100
【図１０】
2005508622.tif 000101
【図１１】
2005508622.tif 000102
【図１２】
2005508622.tif 000103
【図１３】
2005508622.tif 000104
【国際調査報告】
2005508622.tif 000105
2005508622.tif 000106
2005508622.tif 000107