(57)【要約】本発明は、標的化構築物を提供し、この構築物は、標的化部分、核酸およびペイロードを含む。このペイロードは、検出可能な標識または治療剤であり得る。この核酸は、標的細胞中に存在するＲＮＡに相補的なアンチセンス分子であり得る。この標的化構築物は、標的細胞に、インビボまたはインビトロでこのペイロードを導入するために使用され得る。従って、本発明は、診断目的および治療目的のために使用され得る。標的化オリゴヌクレオチド構築物であって、該構築物は、生物中のある部位に局在化する標的化部分；目的の核酸に相補的な核酸；および検出可能な標識、を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的化オリゴヌクレオチド構築物であって、該構築物は、以下：
生物中のある部位に局在化する標的化部分；
目的の核酸に相補的な核酸；および
検出可能な標識、
を含む、標的化オリゴヌクレオチド構築物。
【請求項２】
前記標的化部分が、脂質、抗体、レクチン、リガンド、糖、ステロイド、ホルモン、栄養素およびタンパク質から選択される、請求項１に記載の標的化オリゴヌクレオチド構築物。
【請求項３】
前記検出可能な標識が、化学発光標識、放射性同位体、蛍光標識、常磁性造影剤および金属キレートから選択される、請求項１に記載の標的化オリゴヌクレオチド構築物。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドアナログから選択される、請求項１に記載の標的化オリゴヌクレオチド構築物。
【請求項５】
前記検出可能な標識および前記標的化部分が、前記オリゴヌクレオチドにカップリングされる、請求項１に記載の標的化オリゴヌクレオチド構築物。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドおよび前記検出可能な標識が、前記標的化部分にカップリングされる、請求項１に記載の標的化オリゴヌクレオチド構築物。
【請求項７】
前記標的化部分および前記オリゴヌクレオチドが、前記検出可能な標識にカップリングされる、請求項１に記載の標的化オリゴヌクレオチド構築物。
【請求項８】
標的化オリゴヌクレオチド構築物であって、該構築物は、以下：
生物中のある部位に局在化する標的化部分；
目的の核酸に相補的なオリゴヌクレオチド；および
治療剤、
を含む、標的化オリゴヌクレオチド構築物。
【請求項９】
前記標的化部分が、脂質、抗体、レクチン、リガンド、糖、ステロイド、ホルモン、栄養素およびタンパク質から選択される、請求項８に記載の標的化オリゴヌクレオチド構築物。
【請求項１０】
前記治療剤が、酵素、酵素インヒビター、レセプターリガンド、放射性同位体、抗生物質、ステロイド、ホルモン、ポリペプチド、糖ペプチド、リン脂質および薬物から選択される、請求項８に記載の標的化オリゴヌクレオチド構築物。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドアナログから選択される、請求項８に記載の標的化オリゴヌクレオチド構築物。
【請求項１２】
前記治療剤および前記標的化部分が、前記オリゴヌクレオチドにカップリングされる、請求項８に記載の標的化オリゴヌクレオチド構築物。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチドおよび前記治療剤が、前記標的化部分にカップリングされる、請求項８に記載の標的化オリゴヌクレオチド構築物。
【請求項１４】
前記標的化部分および前記オリゴヌクレオチドが、前記治療剤にカップリングされる、請求項８に記載の標的化オリゴヌクレオチド構築物。
【請求項１５】
標的化オリゴヌクレオチド構築物を調製するための方法であって、該方法は、以下：
生物中のある部位に局在化する標的化部分を、目的の核酸に相補的なオリゴヌクレオチドに接続することによって、結合体を形成する工程；および
検出可能な標識を、該結合体に接続する工程、
を包含する、方法。
【請求項１６】
標的化オリゴヌクレオチド構築物を調製するための方法であって、該方法は、以下：
生物中のある部位に局在化する標的化部分を、検出可能な標識に接続することによって、結合体を形成する工程；および
目的の核酸に相補的なオリゴヌクレオチドを、該結合体に接続する工程、
を包含する、方法。
【請求項１７】
標的化オリゴヌクレオチド構築物を調製するための方法であって、該方法は、以下：
検出可能な標識を、目的の核酸に相補的なオリゴヌクレオチドに接続することによって、結合体を形成する工程；および
生物中のある部位に局在化する標的化部分を、該結合体に接続する工程、
を包含する、方法。
【請求項１８】
標的化オリゴヌクレオチド構築物を調製するための方法であって、該方法は、以下：
生物中のある部位に局在化する標的化部分を、目的の核酸に相補的なオリゴヌクレオチドに接続することによって、結合体を形成する工程；および
治療剤を、該結合体に接続する工程、
を包含する、方法。
【請求項１９】
標的化オリゴヌクレオチド構築物を調製するための方法であって、該方法は、以下：
生物中のある部位に局在化する標的化部分を、治療剤に接続することによって、結合体を形成する工程；および
目的の核酸に相補的なオリゴヌクレオチドを、該結合体に接続する工程、
を包含する、方法。
【請求項２０】
標的化オリゴヌクレオチド構築物を調製するための方法であって、該方法は、以下：
治療剤を、目的の核酸に相補的なオリゴヌクレオチドに接続することによって、結合体を形成する工程；および
生物中のある部位に局在化する標的化部分を、該結合体に接続する工程、
を包含する、方法。
【請求項２１】
請求項１に記載の標的化オリゴヌクレオチド構築物を細胞に導入するための方法であって、細胞を請求項１に記載の標的化オリゴヌクレオチドと接触させて、その結果、該標的化オリゴヌクレオチドが該細胞に導入される工程、を包含する、方法。
【請求項２２】
前記細胞がインビトロである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
患者における生理学的状態を処置するための方法であって、該生理学的状態を処置するのに十分な量の請求項８に記載の標的化構築物を投与する工程を包含する、方法。
【請求項２４】
被験体における生理学的状態を画像化するための方法であって、該方法は、以下：
該被験体に請求項１に記載の標的化構築物を投与する工程；および
該患者において前記標識を検出する工程、
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
治療剤および診断剤としての遺伝子の重要性が現れているので、診断用途および治療用途における核酸の使用が活発になっている。核酸は、遺伝子発現の存在または非存在を検出するため、または疾患状態と関連した変異を識別するためのプローブとして用いられ得る。核酸はまた、標的遺伝子の発現を阻害するアンチセンス治療剤として用いられ得る。さらに、ベクターは、細胞において遺伝子を挿入または欠失させ、それにより、罹患した細胞の遺伝子型を変化させるために用いられ得る。近年、核酸は、他の分子に連結されて、治療剤の効果を増大させている。
【０００２】
Ｔｕｌｌｉｓに対する米国特許第４，９０４，５８２号、Ｂｒｕｓｈに対する米国特許第５，４２０，３３０号、Ｍａｎｏｈａｒａｎに対する米国特許第５，８３４，６０７号、Ｈｏｓｔｅｔｌｅｒらに対する米国特許第５，２２３，２６３号、およびＢｉｓｃｈｏｆｂｅｒｇｅｒに対する米国特許第５，７６３，２０８号、ならびに国際出願公開ＷＯ９６／０７３９２、ＷＯ９０／１０４４８、およびＷＯ９６／１８３７２は、構築物の膜輸送を増大する疎水性／親油性の部分に連結された核酸を開示する。広範な種々の電荷または非電荷の脂質およびその誘導体は、外来分子の膜間輸送を促進することが知られている。
【０００３】
Ｃｏｏｋらに対する米国特許第５，８５２，１８２号および同第５，５７８，７１８号、ならびにＬｉｎらに対する米国特許第５，４１４，０７７号は、チオール−誘導体化オリゴヌクレオチドを表す。このチオール部分は、オリゴヌクレオチドを、他の分子（例えば、ペプチド、タンパク質、親油性分子、ステロイドまたはレポーター分子）に連結するために用いられる。
【０００４】
Ａｇｒａｗａｌらに対する米国特許第５，５１０，４７５号は、修飾オリゴヌクレオチドを保有するレポーター分子を議論する。
【０００５】
国際出願公開ＷＯ９５／０２４２２は、特定の細胞に対してオリゴヌクレオチドを標的化するために、抗体に結合されたオリゴヌクレオチドに関する。
【０００６】
Ｃｏｏｋらに対する米国特許第５，５１４，７８６号は、ＲＮＡの切断に寄与するか、またはそれををもたらす、核酸、インターカレーティング部分、および反応性タンパク質を含む構築物を開示する。
【０００７】
Ｇｒｙａｚｎｏｖに対する米国特許第５，８３０，６５８号は、標的結合部分としてオリゴヌクレオチド、および検出可能なシグナルを生成し得るシグナル生成部分（例えば、ビオチン）を含む分枝したポリマーを開示する。
【０００８】
Ｌｏｗらに対する米国特許第５，８２０，８４７号および５，６８８，４８８号、ならびにＥｌｍａｌｅｈらに対する米国特許第５，７１６，５９４号は、フォレート、ビオチン、およびリボフラビンのような栄養素を分子（例えば、核酸）に連結して、対応するレセプターを発現する細胞（特に、腫瘍細胞および感染の部位）によるそれらの取り込みを容易にすることを議論する。
【０００９】
しかし、上記の構築物は、オリゴヌクレオチドおよび治療剤または診断剤を標的化して、それにより、治療剤または診断剤の、標的細胞へのより速く、特異的な送達を可能にするために、非オリゴヌクレオチド分子を使用していない。インビボでの標的細胞（腫瘍および感染の部位）内で治療剤または画像化剤をより特異的に局在化するための、単純で、迅速な方法は、標的細胞における薬剤の保持を促進する特定の方法を必要とする。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、少なくとも３つの部分：標的化部分（Ｔ．Ｍ．）、核酸（Ｎ．Ａ．）、およびペイロード（ｐａｙｌｏａｄ）を含む核酸構築物に関する。これらの構築物は、インビトロで、生物または細胞の所望に位置に、診断用ペイロード、治療用ペイロード、または他のペイロードを特異的に指向させるために用いられ得る。
【００１１】
１つの局面では、標的化オリゴヌクレオチド構築物は、生物のある部位に局在化する標的化部分、目的の核酸に相補的なオリゴヌクレオチド、および検出可能な標識を含む。生物内の部位は、異常な生理学的状態の位置、または特定の組織型であり得る。標的化部分は、脂質、抗体、レクチン、リガンド、糖、ステロイド、ホルモン、栄養素、またはタンパク質であり得る。検出可能な標識は、化学発光標識、放射性同位体、蛍光標識、常磁性造影剤、または金属キレートであり得る。オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドアナログであり得る。１つの実施形態では、検出可能な標識および標的化部分は、オリゴヌクレオチドにカップリングされる。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドおよび検出可能な標識は、標的化部分に結合される。さらに別の実施形態では、標的化部分およびオリゴヌクレオチドは、検出可能な標識にカップリングされる。
【００１２】
別の局面では、標的化オリゴヌクレオチド結合体は、生物内のある部分に局在化する標的化部分、目的の核酸に相補的なオリゴヌクレオチド、および治療剤を含む。標的化部分は、脂質、抗体、レクチン、リガンド、糖、ステロイド、ホルモン、栄養素、またはタンパク質であり得る。オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドアナログであり得る。治療剤は、酵素、酵素インヒビター、レセプターリガンド、放射性同位体、抗生物質、ステロイド、ホルモン、ポリペプチド、糖ペプチド、リン脂質、または薬物であり得る。１つの実施形態では、検出可能な標識および標的化部分は、オリゴヌクレオチドにカップリングされる。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドおよび検出可能な標識は、標的化部分にカップリングされる。さらに別の実施形態では、標的化部分およびオリゴヌクレオチドは、検出可能な標識にカップリングされる。
【００１３】
別の局面では、本発明は、異常な生理学的状態の部位に局在化する標的化部分を、目的の核酸に相補的なオリゴヌクレオチドに連結することによって、結合体を形成すること、およびこの結合体に検出可能な標識を連結することにより、標的化オリゴヌクレオチド構築物を調製する方法を提供する。別の実施形態では、この方法は、異常な生理学的状態の部位に局在化する標的化部分を、検出可能な標識に連結することによって、結合体を形成すること、およびこの結合体に、目的の核酸に相補的なオリゴヌクレオチドを連結することを包含する。さらに別の実施形態では、この方法は、検出可能な標識を、目的の核酸に相補的なオリゴヌクレオチドに連結することによって、結合体を形成すること、およびこの結合体を異常な生理学的状態の部位に局在化する標的化部分に連結することを包含する。
【００１４】
関連する局面では、本発明は、異常な生理学的状態の部位に局在化する標的化部分を目的の核酸に相補的なオリゴヌクレオチドに連結することにより、結合体を形成すること、および治療剤をこの結合体に連結することによって、標的化オリゴヌクレオチド構築物を調製するための方法を提供する。別の実施形態では、この方法は、異常な生理学的状態の部位に局在化する標的化部分を治療剤に連結することによって、結合体を形成すること、およびこの結合体を目的の核酸に相補的なオリゴヌクレオチドに連結することを包含する。さらに別の実施形態では、この方法は、治療剤を、目的の核酸に相補的なオリゴヌクレオチドに連結することによって、結合体を形成すること、およびこの結合体を異常な生理学的状態の部位に局在化する標的化部分に連結することを包含する。
【００１５】
本発明はさらに、生理学的状態を処置するために十分な量の標的化構築物を投与することによって、患者における生理学的状態を処置するための方法を提供する。さらに、本発明は、患者に検出可能な標識を含む標的化構築物を投与し、そしてこの患者においてこの標識を検出することによって、患者における生理学的状態を画像化するための方法を提供する。
【００１６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、少なくとも３つの部分：標的化部分（Ｔ．Ｍ．）、核酸（Ｎ．Ａ．）、およびペイロードを含む核酸構築物を提供する。標的化部分は、特定の標的領域に局在化する際、標的細胞に入る際、および／または標的レセプターに結合する際に、構築物を補助する任意の分子構造であり得る。核酸は、標的領域もしくは標的細胞において活性であるか、またはこの領域もしくは細胞に存在することが既知であるか、あるいはこのことが予想される核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなど）に相補的であるように選択された、オリゴヌクレオチドであり得る。例えば、核酸は、細胞に感染すると疑われるウイルスのＲＮＡもしくはＤＮＡ、特定の型の腫瘍細胞において発現される核酸、または異常な状態もしくは組織型と関係する任意の他の核酸に対して相補的な、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。ペイロードは、治療剤（例えば、薬物、放射線治療用原子など）、検出可能な標識（例えば、蛍光、放射能、放射性不透物質など）、またはインビボもしくはインビトロである部位もしくは細胞型（例えば、異常な状態の部位または組織型）に送達されることが所望される任意の他の薬剤であり得る。好ましい複合体は、標的細胞により内在化される前の有意なアンカップリングを防ぐのに十分に安定である。しかし、複合体は、標的細胞内の適切な条件下で除去可能（ｃｌｅａｒａｂｌｅ）であり得る。標的化構築物は、１を超えるペイロード（例えば、治療剤および検出可能な標識、薬物ならびに治療用原子など）を含み得る。標的化構築物の種々の部分は、以下でさらにより詳細に議論される。
【００１７】
（定義）
本明細書中で用いられる場合、以下の用語および句は、以下に示される意味を有する。
【００１８】
用語「抗体」は、本明細書中で用いられる場合、例えば、任意のアイソタイプの完全抗体（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥなど）を含むことが意図され、そしてそのフラグメント（これもまた、脊椎動物（例えば、哺乳動物）のタンパク質と特異的に反応性である）を含む。抗体は、従来の技術を用いてフラグメント化され得、そしてフラグメントは、完全抗体について上記されるのと同じ様式における有用性についてスクリーニングされ得る。従って、この用語は、特定のタンパク質と選択的に反応し得る、抗体分子のタンパク質分解的切断された部分または組み換え的に調製された部分のセグメントを含む。このようなタンパク質分解フラグメントおよび／または組み換えフラグメントの非制限的な例としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ならびにペプチドリンカーにより連結されたＶ［Ｌ］ドメインおよび／またはＶ［Ｈ］ドメインを含む単鎖抗体（ｓｃＦｖ）が挙げられる。このｓｃＦｖは、２つ以上の結合部位を有する抗体を形成するために共有結合または非共有結合され得る。本発明は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、または抗体の他の精製した調製物および組み換え抗体を含む。
【００１９】
「アンチセンス」核酸とは、（例えば、転写および／または翻訳を阻害することによって）発現を阻害するような細胞条件下で、核酸（例えば、細胞のｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡ）と特異的にハイブリダイズする（例えば、結合する）核酸をいう。この結合は、従来の塩基対相補性によってか、または例えば、ＤＮＡ二重鎖に結合する場合には、二重らせんの主溝における特異的相互作用を介し得る。
【００２０】
「相補的な」核酸とは、この用語が本明細書中で使用される場合、高度にストリンジェントな条件下または中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るのに十分な相補性を有し、それによって安定な二重鎖を形成する、配列をいう。「完全に相補的な」核酸とは、ヌクレオチド配列を有する核酸をいい、ここで、一方の核酸の各塩基は、他方の核酸の各塩基に相補的であり、これによって、これら２つの核酸の相補的配列の各位置にて、塩基対形成が可能になる。
【００２１】
「結合体化」とは、イオン結合、または好ましくは、共有結合（例えば、架橋剤を介する）を意味する。
【００２２】
語、標的化治療剤または画像化剤の「有効量」とは、感染、腫瘍または他の標的を、排除、低減または維持する（例えば、それらの伝播を防止する）のに必要な量または十分な量をいう。この有効量は、処置される疾患もしくは状態、投与される特定の標的化構築物、被験体の大きさ、または疾患もしくは状態の重篤度のような因子に依存して、変更され得る。当業者は、過度な実験を要さず、特定の化合物の有効量を経験的に決定することができる。
【００２３】
「フォレート（ｆｏｌａｔｅ）」とは、この用語が本明細書中で使用される場合、葉酸、またはその誘導体もしくはアナログ、またはフォレートレセプターに結合する関連化合物をいう。葉酸、フォリン酸、プテロポリグルタミン酸（ｐｔｅｒｏｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ）、およびフォレートレセプター結合プテリジン（例えば、テトラヒドロプテリン、ジヒドロフォレート、テトラヒドロフォレート、ならびにそれらのデアザアナログおよびジデアザアナログ）は、本発明に従って使用される好ましい複合体形成リガンドである。用語「デアザ」アナログおよび「ジデアザ」アナログとは、天然に存在する葉酸構造において、１個または２個の窒素原子が炭素原子で置換されている、当該分野で認識されているアナログをいう。例えば、デアザアナログとしては、１−デアザアナログ、３−デアザアナログ、５−デアザアナログ、８−デアザアナログ、および１０−デアザアナログが挙げられる。ジデアザアナログとしては、例えば、１，５−ジデアザアナログ、５，１０−ジデアザアナログ、８，１０−ジデアザアナログ、および５，８−ジデアザアナログが挙げられる。本発明のための複合体形成リガンドとして有用な他のフォレートは、フォレートレセプター結合アナログアミノプテリン、アメトプテリン（メトトレキサート）、Ｎ１０−メチルフォレート、２−デアミノ−ヒドロキシフォレート、デアザアナログ（例えば、１−デアザメトプテリンまたは３−デアザメトプテリン）、および３’，５’−ジクロロ−４−アミノ−４−デオキシ−Ｎ１０−メチルプテロイルグルタミン酸（ジクロロメトトレキサート）である。フォレートレセプターに結合して、構築物のレセプター媒介性エンドサイトーシス輸送を開始し得る他の適切なリガンドとしては、フォレートレセプターに対する抗イディオタイプ抗体が挙げられる。
【００２４】
「ヒトモノクローナル抗体」または「ヒト化」マウス抗体とは、これらの用語が本明細書中で使用される場合、例えば、欧州特許出願公開番号０，４１１，８９３  Ａ３に開示される様式と類似の様式で、マウスＦｖ領域（すなわち、抗原結合部位を含む）またはその相補性決定領域をコードするヌクレオチド配列を、少なくともヒト定常ドメイン領域およびＦｃ領域をコードするヌクレオチド配列で遺伝子組換えすることによって「ヒト化された」、マウスモノクローナル抗体をいう。いくつかのさらなるマウス残基はまた、ヒト可変領域のフレームワークドメイン内に保持されて、適切な標的部位結合特徴を確実にし得る。ヒト化抗体は、宿主レシピエントの抗体またはポリペプチドの免役反応性を減少すると認識され、これによって、半減期が増加されかつ有害な免役反応の可能性が低下され得る。
【００２５】
「画像化剤」とは、標的と結合する際に検出可能な画像を生成し得る組成物を意味し、これらとしては、放射性核種（例えば、Ｉｎ−１１１、Ｔｃ−９９ｍ、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５  Ｆ−１８、Ｇａ−６７、Ｇａ−６８）が挙げられ、陽子射出断層撮影法（ＰＥＴ）およびシングルフォトンエミッショントモグラフィー（ＳＰＥＣＴ）については、不対スピン原子および遊離ラジカル（例えば、Ｆｅ、ランタニド、およびＧｄ）が挙げられ、そして磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）については、造影剤（例えば、キレート化（ＤＴＰＡ）マンガン）が挙げられる。
【００２６】
「核酸」とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、および適切な場合、リボ核酸（ＲＮＡ）のようなポリヌクレオチドをいう。この用語はまた、ヌクレオチドアナログから作製されるＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかの等価物、アナログを含み、かつ適用可能な場合、記載される一本鎖（センス鎖またはアンチセンス鎖）ポリヌクレオチドおよび二本鎖ポリヌクレオチドである実施形態のように、理解されるべきである。この用語は、オリゴヌクレオチド（例えば、約１００塩基以下、より好ましくは約５０塩基未満、そして最も好ましくは約２５塩基未満を含む配列）を包含する。
【００２７】
用語「ペイロード（ｐａｙｌｏａｄ）」は、治療剤（例えば、薬物、放射線療法用の原子など）、検出可能な標識（例えば、蛍光標識、放射性標識、放射線不透過性標識など）、または標的部位（例えば、異常状態の部位）に送達されることが所望される他の任意の部分を含む。
【００２８】
「薬学的に受容可能なキャリア」は、標的化治療剤と同時に投与され得る物質を含むことが意図され、そしてこれによって、化合物がその意図される機能を果たすことが可能になる。このようなキャリアの例としては、溶液、溶媒、分散媒体、遅延剤、エマルジョンなどが挙げられる。薬学的に活性な物質に対するこのような媒体の使用は、当該分野で周知である。標的化構築物とともに使用するのに適切な任意の他の従来のキャリアもまた、本発明の範囲内である。
【００２９】
「低分子」とは、約２０００ａｍｕ未満、好ましくは、約１０００ａｍｕ未満、そしてなおさらに好ましくは、約５００ａｍｕ未満の分子量を有する組成物をいう。
【００３０】
「被験体」とは、ヒトまたは非ヒト動物（例えば、非ヒト霊長類、ラット、マウス、ウシ（ｃｏｗ）、ブタ、ウマ、ヒツジ（ｓｈｅｅｐ）、ヒツジ（ｏｖｉｎｅ）、ウシ（ｂｏｖｉｎｅ）、サル、ネコ、イヌ、ヤギなど）を意味する。
【００３１】
「標的」とは、標的化構築物が結合する、インビボ部位またはインビトロ部位を意味する。好ましい標的は、腫瘍（例えば、脳腫瘍、肺腫瘍（小細胞または非小細胞）、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、胸部腫瘍および結腸腫瘍、ならびに他の癌腫および肉腫）である。別の好ましい標的は、（例えば、細菌、ウイルス（例えば、ＨＩＶウイルス、疱疹ウイルス、肝炎ウイルス）および病原性真菌（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐ．）による）感染部位である。特に好ましい標的感染生物は、薬物耐性である生物（例えば、腸内細菌科、エンテロコッカス属、インフルエンザ菌、ヒト型結核菌、淋菌、熱帯熱マラリア原虫、緑膿菌、志賀赤痢菌、黄色ブドウ球菌、肺炎連鎖球菌）である。標的は、標的化部分が結合する分子構造（例えば、ハプテン、エピトープ、レセプター、ｄｓＤＮＡフラグメント、炭水化物、または酵素）をいい得る。さらに、この標的は、組織型（例えば、ニューロン組織、腸組織、膵臓組織など）であり得る。特定の例示的な組織が、以下の表１および表２に提供される。
【００３２】
本発明の方法で標的として作用し得る「標的細胞」としては、酵母、植物細胞および動物細胞（例えば、ヒト細胞）を含む、原核生物および真核生物が挙げられる。本発明の方法を使用して、インビトロ（すなわち、細胞培養物中）またはインビボにおける生存細胞の細胞機能を改変し得、ここでこの細胞は、植物組織または動物組織の一部を形成するか、またはさもなければ、植物組織または動物組織中に存在する。従って、この細胞は、例えば、成長植物の根、茎または葉を形成し得、そして本発明の方法は、標的化構築物と標的化された細胞との接触を促進する任意の様式で、このような植物細胞に対して実施され得る。あるいは、この標的細胞は、動物の組織の一部を形成し得る。従って、これらの標的細胞としては、例えば、以下が挙げられる：消化管の管壁細胞（例えば、口腔粘膜および咽頭粘膜）、小腸の絨毛を形成する細胞、大腸の管壁細胞、本発明の複合体の吸入によって接触され得る、動物の呼吸器系（鼻腔／肺）の管壁細胞、経皮細胞／表皮細胞、ならびに膣および直腸の細胞、内臓細胞（胎盤細胞、およびいわゆる血液／脳関門を含む）など。
【００３３】
「標的化構築物（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）」または「標的化構築物（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）」とは、標的化部分（Ｔ．Ｍ．）、核酸（Ｎ．Ａ．）およびペイロードを含む、分子複合体をいう。これらの要素のうちの少なくとも２つは、好ましくは互いに共有結合する。「共有結合性の標的化複合体」とは、本明細書中でさらに記載されるように、その標的化部分、核酸およびペイロードが互いに共有結合している標的化複合体をいう。
【００３４】
「標的化オリゴヌクレオチド構築物」とは、その核酸がオリゴヌクレオチドである、標的化構築物をいう。
【００３５】
用語「標的化部分」とは、その構築物が、特定の標的領域に局在化し、標的細胞に侵入し、そして／または標的レセプターに結合するのを補助する、任意の分子構造をいう。例えば、脂質（カチオン性脂質、中性脂質、およびステロイド性脂質、ビロゾーム、およびリポソームを含む）、抗体、レクチン、リガンド、糖、ステロイド、ホルモン、栄養分、およびタンパク質が、標的化部分として作用し得る。
【００３６】
「治療剤」とは、宿主に対する生物学的影響を有し得る薬剤を意味する。好ましい治療剤は、腫瘍または感染の（全身的または局所的な）確立または増殖を予防し得る。例としては、ホウ素含有化合物（例えば、カルボラン）、化学療法ヌクレオチド、薬物（例えば、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤）、エンジイン（ｅｎｅｄｉｙｎｅ）（例えば、カリケマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、エスペラマイシン（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎ）、ジネマイシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）、ネオカルチノスタチン（ｎｅｏｃａｒｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）発色団、およびケダルシジン（ｋｅｄａｒｃｉｄｉｎ）発色団、重金属錯体（例えば、シスプラチン）、ホルモンアンタゴニスト（例えば、タモキシフェン）、非特異的（非抗体）タンパク質（例えば、糖オリゴマー）、オリゴヌクレオチド（例えば、標的核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ配列）に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド）、ペプチド、光力学的薬剤（例えば、ローダミン１２３）、放射性核種（例えば、Ｉ−１３１、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８、Ｙ−９０、Ｂｉ−２１２、Ａｔ−２１１、Ｓｒ−８９、Ｈｏ−１６６、Ｓｍ−１５３、Ｃｕ−６７およびＣｕ−６４）、毒素（例えば、リシン）、および転写に基づく医薬、が挙げられる。腫瘍の確立または増殖を処置または予防するための好ましい実施形態において、治療剤は、放射線核種、毒素、ホルモンアンタゴニスト、重金属錯体、オリゴヌクレオチド、化学療法ヌクレオチド、ペプチド、非特異的（非抗体）タンパク質、ホウ素化合物またはエンジインである。細菌感染の確立または増殖を処置または予防するための好ましい実施形態において、この治療剤とは、抗生物質、放射線核種またはオリゴヌクレオチドである。ウイルス感染の確立または増殖を処置または予防するための好ましい実施形態において、この治療剤とは、抗ウイルス化合物、放射線核種、またはオリゴヌクレオチドである。真菌感染の確立または増殖を処置または予防するための好ましい実施形態において、この治療剤とは、抗真菌化合物、放射線核種、またはオリゴヌクレオチドである。治療剤は、細胞の増殖を遅延もしくは阻害することによるか、または細胞を殺傷するかもしくは細胞における細胞死（アポトーシス）を誘導することによって、治療効果を有し得る。
【００３７】
疾患の「処置」とは、少なくとも１つの疾患の症状を、改善、治癒、または予防することをいう。
【００３８】
（Ｉ．標的化部分）
構築物の、特定の標的領域への局在化、標的細胞への進入および／または標的レセプターへの結合を補助する標的化部分は、処置または画像化されるべき特定の状態または部位に基づき選択され得る。標的化部分は、任意の多数の異なる化学実体をさらに含み得る。１つの実施形態において、この標的化部分は、低分子である。
【００３９】
レセプター媒介エンドサイトーシス活性が、外因性分子（例えば、タンパク質および核酸）を細胞送達するために利用されてきた。一般的に、特定のリガンドが、目的の外因性分子（すなわち外因性化合物）への共有結合、イオン結合、または水素結合により化学的に結合体化され、結合体において標的レセプターによりなお認識される部分（リガンド部分）を有する結合体分子を形成する。この技術を用いて、光毒性のタンパク質であるソラレンが、インスリンに結合体化され、そしてインスリンレセプターエンドサイトーシス経路により内在化され（Ｇａｓｐａｒｒｏ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１４１（２）、ｐｐ．５０２−５０９、１９８６年１２月１５日）；ガラクトース末端アシアログリコプロテインについての肝細胞特異的レセプターが、ＤＮＡプラスミドに非共有複合体化されたアシアロオルソムコイド−ポリ−Ｌ−リジンの肝細胞特異的な膜貫通送達のために利用されており（Ｗｕ，Ｇ．Ｙ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６２（１０）、ｐｐ．４４２９−４４３２、１９８７）；上皮増殖因子についての細胞レセプターが、細胞内部への、ＥＧＦに共有結合したポリヌクレオチドの送達のために利用されており（Ｍｙｅｒｓ、欧州特許出願番号８６８１０６１４．７（１９９８年６月６日公開））；有機金属ビタミンＢ１２−内性因子複合体に対する腸内に位置する細胞レセプターが、脊椎動物宿主の循環系への、ビタミンＢ１２と複合体化した薬物、ホルモン、生体活性ペプチドまたは免疫源の送達を媒介するために用いられており、そして経口投与を介して腸に送達されている（Ｒｕｓｓｅｌｌ−Ｊｏｎｅｓら、欧州特許出願番号８６３０７８４９．９（１９８７年４月２９日公開））；マンノース−６−ホスフェートレセプターが、細胞への低密度リポタンパク質を送達するために用いられている（Ｍｕｒｒａｙ，Ｇ．Ｊ．およびＮｅｖｉｌｌｅ，Ｄ．Ｍ．Ｊｒ．、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ，Ｖｏｌ．２５５（２４），ｐｐ．１１９４−１１９４８，１９８０）；コレラ毒素結合サブユニット結合レセプターが、インスリンレセプターを欠く細胞にインスリンを送達するために用いられている（ＲｏｔｈおよびＭａｄｄｏｘ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓ．Ｖｏｌ．１１５，ｐ．１５１、１９８３）；そしてヒト絨毛膜ゴナドトロピンレセプターが、細胞を殺傷するために、ＨＣＧに結合されたリシンａ−鎖を、適切なＨＣＧレセプターを有する細胞に送達するために使用されている（ＯｅｌｔｍａｎｎおよびＨｅａｔｈ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、ｖｏｌ．２５４、ｐ．１０２８（１９７９））。
【００４０】
特に好ましい実施形態は、ビオチン（天然に存在するビタミン、これは腫瘍および感染部位に効率的に局在化することが示されている）である。さらに、米国特許第５，７１６，５９４号に記載されるように、造影剤および治療剤は、ビオチンに結合する場合、このような部位に首尾よく送達される。別の好ましい低分子の標的化部分は、葉酸である（米国特許第５，８２０，８４７号を参照のこと）。種々の癌は、葉酸レセプターを過剰発現するので、葉酸は、癌細胞を標的化するのに特に有用である。Ｌａｄｉｎｏら（Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １９９７，７３（６）：８５９−６）を参照のこと。リボフラビンおよびその誘導体は、癌細胞への構築物の送達を標的化するための低分子標的化部分である（例えば、米国特許第５，６８８，４８８号を参照のこと）。さらなる栄養分は、レセプター媒介エンドサイトーシスを誘発すると考えられ、従って、本出願の特許請求の範囲の有用な標的化部分としては、以下が挙げられる：カルニチン、イノシトール、リポ酸、ニコチン酸、パントテン酸、チアミン、ピリドキサール、アスコルビン酸ならびに脂質可溶ビタミンＡ、Ｄ、ＥおよびＫ。低分子の標的化部分の第２の例示的な型は、ステロイド脂質（例えば、コレステロール）およびステロイドホルモン（例えば、エストラジオール、テストステロン）などが挙げられる。
【００４１】
別の実施形態において、標的化部分は、タンパク質を含み得る。タンパク質の特定の型は、標的化部位または標的化細胞の既知の特性に基づいて選択され得る。例えば、対応する抗原が、標的化部位で提示される場合、プローブは、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれかの抗体であり得る。特定のレセプターが、標的化細胞によって発現する状況において、標的化部分は、レセプターに結合し得るタンパク質またはペプチド擬態性（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）のリガンドを含み得る。公知の細胞表面レセプターのタンパク質リガンドとしては、以下が挙げられる：低密度のリポタンパク質、トランスフェリン、インスリン、フィブリン溶解性酵素、抗ＨＥＲ２、血小板結合タンパク質（例えば、アネキシン）および生物学的応答調節因子（インターロイキン、インターフェロン、エリスロポイエチンおよびコロニー刺激因子を含む）。また、抗ＥＧＦレセプター抗体（これは、レセプターへの結合の後、一部が核に移動する）は、標的化細胞核へのＡｒｇｅｒエミッターおよび核結合薬物の送達を容易にするための、本発明の使用のための好ましい標的化部分である。
【００４２】
細胞の特定の型に結合する多数のモノクローナル抗体（ヒトにおける腫瘍関連抗原に特異的なモノクローナル抗体を含む）は開発されている。多数のモノクローナル抗体の中で使用され得るこのようなモノクローナル抗体は、以下である：抗ＴＡＣまたは他のインターロイキン−２レセプター抗体；２５０キロダルトンのヒト黒色腫関連プロテオグリカンに対する９．２．２７およびＮＲ−ＭＬ−０５；および全癌（ｐａｎｃａｒｃｉｎｏｍａ）の糖タンパク質に対するＮＲ−ＬＵ−１０。本発明において使用される抗体は、インタクトな（全体の）分子、そのフラグメント、またはその機能的等価物であり得る。抗体フラグメントの例は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ＦａｂおよびＦｖフラグメント（これらは、従来の方法または遺伝子操作またはタンパク質操作によって生成され得る）である。
【００４３】
他の好ましい標的化部分は、標的化特異的レセプターによって認識される糖（例えば、グルコース、フコース、ガラクトース、マンノース）が挙げられる。例えば、本出願の特許請求の範囲の構築物は、マンノース残基（例えば、遊離窒素にＣ−グリコシドとして結合する）とグリコシル化して、腫瘍発現マンノースレセプター（例えば、膠芽細胞腫および神経節細胞腫）および細菌（これもまた、マンノースレセプターを発現することが公知である）（Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，ＣＲ  ａｎｄ  ＭＤ  Ｂｅｄｎａｒｓｋｉ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２３：２４３（１９９２）；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：２２４２，５５４３（１９９２））ならびに潜在的な他の病原性因子に対して高親和性結合を有する標的化構築物を得ることができる。特定の細胞（例えば、悪性細胞および血液細胞（例えば、Ａ、ＡＢ、Ｂなど））は、対応するレクチンが標的化部分として役立ち得る特定の炭水化物を提示する。
【００４４】
本発明において、標的化部分としての使用に適切であり得るさらなるリガンドとしては、ハプテン、エピトープ、およびｄｓＤＮＡフラグメントならびにそのアナログおよび誘導体が挙げられる。このような部分は、抗体、そのフラグメントまたはアナログ（擬態性タンパク質（ハプテンおよびエピトープに対して）およびＺｉｎｃフィンガータンパク質（ｄｓＤＮＡフラグメントに対して）を含む）に特異的に結合する。
【００４５】
（表Ｉ．例示的標的化および標的化部分）
【００４６】
【表１】
2005503795.tif 000002
（表ＩＩ．例示的組織選択性標的化部分）
【００４７】
【表２】
2005503795.tif 000003
抗体は、細胞表面上に特定の抗原を発現する細胞を標的化する有効な手段であり、従って、特定の細胞（例えば、癌細胞または特定の組織由来の細胞）を選択的に標的化するために使用され得る。さらに、抗体は、標準のプロトコルを使用することによって作製され得る（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ：１９８８）を参照のこと）。哺乳動物（例えば、マウス、ハムスターまたはウサギ）は、ペプチドの免疫原性形態を用いて免疫化され得る（例えば、抗体応答を誘発し得るポリペプチドまたは抗原性フラグメント、もしくは上記のような融合タンパク質）。
【００４８】
１つの例示的な技術において、ポリペプチドの抗原性調製を用いて動物を免疫化した後、抗血清、所望される場合、血清から単離されたポリクローナル抗体を得ることができる。モノクローナル抗体を産生するために、抗体産生細胞（リンパ球）は、免疫化動物から回収され得、そして不死化細胞（例えば、骨髄腫細胞）を用いて、標準的な体細胞融合手順によって融合され得、ハイブリドーマ細胞を得る。このような技術は、当該分野で周知であり、そして例えば、以下の技術が挙げられる：ハイブリドーマ技術（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，（１９７５）  Ｎａｔｕｒｅ，２５６：  ４９５−４９７によって本来開発された）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂａｒら（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，４：７２）およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら（１９８５）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．ｐｐ．７７−９６）。ハイブリドーマ細胞は、本発明のポリペプチドと特異的に反応する抗体およびこのようなハイブリドーマ細胞を含む培養物から単離されたモノクローナル抗体の産生のために免疫化学的にスクリーニングされ得る。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、用語抗体は、本発明の哺乳動物ポリペプチドの１つと、また特異的に反応するそのフラグメントを含むことが意図される。抗体は、従来の技術を使用してフラグメント化され得、そのフラグメントは、全体の抗体についての上記と同様の様式で有用性についてスクリーニングされ得る。例えば、Ｆ（ａｂ）２フラグメントは、ペプシンを用いて抗体を処理することによって生成され得る。この得られたＦ（ａｂ）２フラグメントは、ジスルフィド結合を還元するように処理され、Ｆａｂフラグメントを生成し得る。本発明の抗体は、二特異的（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）、単鎖ならびにキメラおよび少なくとも１つの抗体のＣＤＲ領域によって与えられた本発明のタンパク質に対して親和性を有するヒト化分子を含むことが意図される。
【００５０】
好ましい標的化部分は、少なくとも約１０−６Ｍ，好ましくは１０−７Ｍ、より好ましくは１０−８Ｍおよび最も好ましくは１０−９ＭのＫＤの親和性でそれぞれの標的化分子への構築物の結合を容易にする。そのレセプターに対する標的化部分の結合は、標的化部分の有意な量が、標的化部分が細胞に取り込まれるのを可能にするのに十分に長く結合するのを可能するのに十分であるべきである。レセプターに対するリガンドの親和性は、当該分野で周知の方法によって決定され得る。
【００５１】
好ましい標的化構築物は、インビボで投与される場合、高い標的化対非標的化の比を示す。好ましい比率は、少なくともも２：１であり、より好ましくは少なくとも３：１であり、そして最も好ましくは少なくとも５：１である（すなわち、標的化部分が、他のレセプターに対して、２倍、３倍または５倍より多くその特定のレセプターに結合する）。特定の実施形態において、標的化構築物は、被験体またはインビトロで特定の細胞に局所的に投与される。このような実施形態において、標的化構築物は異なる組織上に到達しないので、標的化部分はまた、このような部位に局在化される細胞表面分子と相互作用し得るという結果にはならないようである。従って、標的化部分の特定のレベルは、因子（例えば、標的化構築物の投与の型）に依存する。
【００５２】
標的化レセプター以外の構造に対する標的化部分の反応性は、アッセイ（例えば、標的化部分を標識するかまたは標識した標的化構築物を使用して；組織切片とインキュベートし；そして標識の位置を決定する）によって決定され得る。アッセイはまた、動物（例えば、マウスまたはラット）で行なわれ得る。例えば、標的化構築物は、非ヒト動物に投与され得、そして種々の位置に存在する構築物の量は、例えば、実施例に記載されるように測定される。
【００５３】
特定の実施形態において、標的化構築物は、内在化ポリペプチド配列（例えば、ａｎｔｅｐｅｎｎｅｐｅｄｉａタンパク質、ＨＩＶトランス活性化（Ｔａｔ）タンパク質、マストパラン（Ｔ．Ｈｉｇａｓｈｉｊｉｍａら（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１４１７６）、メリチン、ボムボリチン（ｂｏｍｂｏｌｉｔｔｉｎ）、δ溶血素、パーダキシン（ｐａｒｄａｘｉｎ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、クラスリン、ジフテリア毒素、Ｃ９補体タンパク質または前記タンパク質のうちの１つのフラグメント）を含み得る。内在化ペプチドは、例えば、トランスサイトーシスによって、相対的に高い割合で、細胞膜を横断し得、それによってそれらが結合する分子の細胞性取り込みを促進する。特定の内在化ポリペプチド（例えば、Ｔａｔ）はまた、核または他の細胞構造に局在することが公知である。従って、このような内在化ペプチド配列を含む本発明の標的化構築物は、このような配列を欠損する構築物に対して、標的化細胞による増加した取り込みを示し得る。
【００５４】
内在化ポリペプチドは、標的化部分の一部であり得るか、または標的化構築物の分離要素であり得る。本発明の１つの実施形態において、内在化ポリペプチドは、標的化部分として役立つ（このような標的化部分の以下の実施例を参照のこと）。別の実施形態において、内在化ポリペプチドは、標的化構築物の１つ以上の他の要素に共有結合される。例えば、内在化ポリペプチドは、標的化部分；核酸；ペイロード；標的化部分および核酸；または標的化部分およびペイロードに結合され得る。標的化構築物中の内在化ポリペプチドの好ましい位置は、例えば、標的化細胞、標識された標的化構築物を使用してインビトロアッセイを行い、そして細胞に取り込まれる標識の量の測定することよって決定され得る。
【００５５】
１つの実施形態において、内在化ポリペプチドは、ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ａｎｔｅｐｅｎｎｅｐｅｄｉａタンパク質またはそのホモログから誘導される。６０アミノ酸長のホメオドメインのホメオタンパク質ａｎｔｅｐｅｎｎｅｐｅｄｉａは、生物学的膜を通して転移することが示されており、そして対である異種のポリペプチドの転移を促進し得る。例えば、Ｄｅｒｏｓｓｉら（１９９４）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９：１０４４４−１０４５０；Ｐｅｒｅｚら（１９９２）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １０２：７１７−７２２を参照のこと。近年、このタンパク質の１６アミノ酸長と同じぐらい小さいフラグメントが内在化を駆動するのに十分であることが証明された。Ｄｅｒｏｓｓｉら（１９９６）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１：１８１８８−１８１９３を参照のこと。本発明は、標的化構築物単独に対して、統計的に有意な量で、標的化構築物の膜貫通輸送を増加するのに十分なａｎｔｅｐｅｎｎｅｐｅｄｉａタンパク質（またはそのホモログ）の少なくとも一部を含む標的化構築物を意図する。
【００５６】
内在化ペプチドの別の例は、ＨＩＶトランス活性化（ＴＡＴ）タンパク質である。このタンパク質は、４つのドメインに分けられる明らかである（Ｋｕｐｐｕｓｗａｍｙら（１９８９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：３５５１−３５６１）。精製ＴＡＴタンパク質は、組織培養物中の細胞によって取り込まれ（Ｆｒａｎｋｅｌら（１９８９）Ｃｅｌｌ  ５５：１１８９−１１９３）、そしてペプチド（例えば、ＴＡＴの３７〜６２残基に対応するフラグメント）は、インビトロで細胞によって迅速に取り込まれる（Ｇｒｅｅｎら（１９８９）Ｃｅｌｌ  ５５：１１７９−１１８８）。高度な塩基性領域は、内在化および核に対する内在化部分の標的化を媒介する（Ｒｕｂｅｎら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：１−８）。高度な塩基性領域（例えば、ＣＦＩＴＫＡＬＧＩＳＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＳ（配列番号１））に存在する配列を含むペプチドまたはアナログは、標的化構築物に結合体化し、内在化および細胞内の環境に対してこの構築物を標的化することを助ける。
【００５７】
いずれの特定の理論によって束縛されることを望まず、親水性ポリペプチドはまた、レセプター媒介トランスサイトーシスによって膜を横断し得る輸送可能なペプチドに標的化構築物を結合するか、または結合体化することによって、膜バリアを横切って生理学的に輸送され得る。この型の適切な内在化ペプチドは、例えば、ヒストン、インスリン、トランスフェリン、塩基性アルブミン、プロラクチンおよびインスリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−ＩＩ）または他の増殖因子の全てまたは一部を使用して生成され得る。例えば、インスリンフラグメント（これは、毛細管細胞上のインスリンレセプターに対して親和性を示し、そして血糖の減少において、インスリンよりも効果的でない）は、レセプター媒介トランスサイトーシスによって膜貫通輸送し得る。好ましい増殖因子由来内在化ペプチドとしては、例えば、以下が挙げられる：ＥＧＦ（上皮増殖因子）由来ペプチド（例えば、ＣＭＨＩＥＳＬＤＳＹＴＣ（配列番号２）およびＣＭＹＩＥＡＬＤＫＹＡＣ（配列番号３））；ＴＧＦ−β（形質転換増殖因子β）由来ペプチド；ＰＤＧＦ由来ペプチド（血小板由来増殖因子）またはＰＤＧＦ−２；ＩＧＦ−Ｉ由来ペプチド（インスリン様増殖因子）またはＩＧＦ−ＩＩ；およびＦＧＦ（線維芽細胞増殖因子）由来ペプチド。親水性ポリペプチドは、標的化構築物中に含まれ得るか、または標的化部分を構成し得る。
【００５８】
転移／内在化ペプチドの別のクラスは、ｐＨ依存膜結合を示す。酸性ｐＨでらせん状のコンホメーションを想定する内在化ペプチドについて、内在化ペプチドは、両親媒性の特性（例えば、疎水性界面および親水性界面の両方を有する）を取得する。より詳細には、ｐＨ約５．０〜５．５の範囲内で、内在化ペプチドはα−らせんを形成し、両親媒性構造は、標的化膜への部分の挿入を促進する。α−ヘリックス誘発酸性ｐＨ環境は、例えば、細胞のエンドソーム内に存在する低いｐＨ環境において見出され得る。このような内在化ペプチドを使用して、エンドソーム区画から細胞質へとエンドサイトーシスの機構によって取り込まれる標的化構築物の輸送を促進し得る。
【００５９】
好ましいｐＨ依存膜結合内在化ペプチドとしては、高いパーセンテージのヘリックス形成残基（例えば、グルタミン、メチオニン、アラニンおよびロイシン）が挙げられる。さらに、好ましい内在化ペプチド配列としては、ｐＨ５〜７の範囲内でｐＫａを有するイオン化残基が挙げられ、その結果、十分に荷電していない膜結合ドメインは、標的化細胞膜への挿入を可能にするｐＨ５でペプチド内に存在する。
【００６０】
この点に関して、特に好ましいｐＨ依存的膜結合性内部移行ペプチドは、ａａ１−ａａ２−ａａ３−ＥＡＡＬＡ（ＥＡＬＡ）４−ＥＡＬＥＡＬＡＡ−アミド（配列番号４）であり、これは、Ｓｕｂｂａｒａｏら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６：２９６４（１９８７））のペプチド配列の改変物を表す。このペプチド配列において、最初のアミノ酸残基（ａａ１）は、好ましくは、標的化タンパク質結合体への内部移行ペプチドの化学的結合体化を容易にする独特な残基（例えば、システインまたはリジン）である。アミノ酸残基２〜３は、異なる膜に対する内部移行ペプチドの親和性を調節するように選択され得る。例えば、残基２および３の両方がｌｙｓまたはａｒｇである場合、この内部移行ペプチドは、負の表面電荷を有する脂質の膜または部分（ｐａｔｃｈ）に結合する能力を有する。残基２〜３が中性アミノ酸である場合、この内部移行ペプチドは、中性の膜に挿入する。
【００６１】
さらに他の好ましい内部移行ペプチドとしては、以下が挙げられる：アポ−リポタンパク質Ａ−１およびＢのペプチド；ペプチド毒素（例えば、メリチン、ボンボリチン（ｂｏｍｂｏｌｉｔｔｉｎ）、δ溶血素およびパルダキシン（ｐａｒｄａｘｉｎ））；抗生ペプチド（例えば、アラメチシン（ａｌａｍｅｔｈｉｃｉｎ））；ペプチドホルモン（例えば、カルシトニン、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、βエンドルフィン、グルカゴン、副甲状腺ホルモン、膵ポリペプチド）；および多数の分泌タンパク質のシグナル配列に対応するペプチド。さらに、例示的な内部移行ペプチドは、酸性ｐＨで内部移行ペプチドのαヘリックス特性を増強する置換基の結合を通して改変され得る。
【００６２】
本発明における使用のために適切なさらに別のクラスの内部移行ペプチドは、生理的ｐＨでは「隠される」が、標的細胞エンドソームの低いｐＨ環境においては露出される、疎水性ドメインを含む。ｐＨにより誘導されるこの疎水性ドメインのアンフォールディングおよび露出に際して、この部分は脂質二重層に結合し、そして細胞の細胞質中への共有結合性標的化構築物のトランスロケーションをもたらす。このような内部移行ペプチドは、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素Ａ、クラスリンまたはＤｉｐｈｔｈｅｒｉａ毒素において同定された配列により模られ得る。
【００６３】
孔形成タンパク質または孔形成ペプチドもまた、本明細書における内部移行ペプチドとして機能し得る。孔形成タンパク質または孔形成ペプチドは、例えば、Ｃ９補体タンパク質、細胞溶解性Ｔ細胞分子またはＮＫ細胞分子から得られ得るかまたはそれらから誘導され得る。これらの部分は、膜において環様の構造を形成し得、それにより、膜を通過し細胞の内側へと、結合された標的化構築物を輸送させる。
【００６４】
単に内部移行ペプチドの膜インターカレーションのみでも、細胞膜を横切る標的化構築物のトランスロケーションに十分であり得る。しかし、トランスロケーションは、細胞内酵素の基質（すなわち、「アクセサリーペプチド（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  ｐｅｐｔｉｄｅ）」）を、内部移行ペプチドに結合させることによって改善され得る。アクセサリーペプチドは、細胞膜を通して細胞質側に突き出る内部移行ペプチド部分（１つまたは複数）に結合されることが好ましい。アクセサリーペプチドは、トランスロケーション／内部移行部分またはアンカーペプチドの一端に、有利なように結合され得る。本発明のアクセサリー部分は、１つ以上のアミノ酸残基を含み得る。１つの実施形態において、アクセサリー部分は、細胞のリン酸化のための基質を提供し得る（例えば、アクセサリーペプチドは、チロシン残基を含み得る）。
【００６５】
この点に関して例示的なアクセサリー部分は、ＧＮＡＡＡＡＲＲ（配列番号５）（Ｅｕｂａｎｋｓら（１９８８）Ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｍａｒｓｈａｌｌ（編），ＥＳＣＯＭ，Ｌｅｉｄｅｎ  ５６６−６９）のような、Ｎ−ミリストイルトランスフェラーゼに対するペプチド基質である。この構築物において、内部移行するペプチドは、このアクセサリーペプチドのＣ末端に結合される。なぜなら、Ｎ末端のグリシンが、このアクセサリー部分の活性に重要であるからである。このハイブリッドペプチドは、標的化構築物に結合されると、Ｎ−ミリスチル化され、そして細胞膜を横切ってトランスロケーションされる。
【００６６】
（ＩＩ．核酸）
目的の核酸に対して相補的であるように設計された、本標的化構築物のオリゴヌクレオチド部分は、関連する遺伝子の転写を阻害し得るか、その遺伝子の発現についてのプローブとして役立ち得るか、細胞における構築物の局在化を補助し得るか、標的細胞による構築物の保持を促進し得るか、またはそれらの任意に組み合わされた効果を奏し得る。好ましい実施形態において、本構築物の核酸部分は、特定の核酸を発現する標的細胞による構築物の保持を選択的に促進することによって、標的化部分を増強させるために役立つ。
【００６７】
本発明のオリゴヌクレオチド部分は、通常のパターンのモノマー−ヌクレオシド相互作用（例えば、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型の塩基対形成、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型または逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型の塩基対形成など）によって、標的ポリヌクレオチドに特異的に結合し得る任意の高分子化合物を含み得る。オリゴヌクレオチド部分は、その効力、薬物動態学的特性または物理的特性を増強するために改変され得る。例えば、脂質可溶度の増強および／またはヌクレアーゼ消化に対する耐性は、アルキルホスホネートオリゴヌクレオシドまたはアルキルホスホトリエステルオリゴヌクレオチドを形成するように、ヌクレオチド間ホスホジエステル結合におけるリン酸エステルの酸素を、アルキル基またはアルコキシ基で置換することによって生じることが知られている。これらのような非イオン性オリゴヌクレオチドは、相補的核酸配列と安定な複合体を形成する能力を保持しつつ、ヌクレアーゼ加水分解に対する耐性を増加し、そして／または、細胞性取り込みを増加することによって特徴付けられる。特に、アルキルホスホネートは、ヌクレアーゼによる切断に対して安定であり、かつ脂質に可溶性である。アルキルホスホネートオリゴヌクレオチドの調製は、Ｔｓｏら、米国特許第４，４６９，８６３号に開示される。
【００６８】
好ましくは、ヌクレアーゼ耐性は、ヌクレアーゼ耐性のヌクレオシド間結合を提供することによって、本発明の構築物に付与される。多くのこのような結合（例えば、ホスホロチオエート（ＺｏｎおよびＧｅｉｓｅｒ，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，６：５３９−５６８（１９９１）；Ｓｔｅｃら，米国特許第５，１５１，５１０号；Ｈｉｒｓｃｈｂｅｉｎ，米国特許第５，１６６，３８７号；Ｂｅｒｇｏｔ，米国特許第５，１８３，８８５号）；ホスホロジチオエート（Ｍａｒｓｈａｌｌら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９：１５６４−１５７０（１９９３）；ＣａｒｕｔｈｅｒｓおよびＮｉｅｌｓｅｎ，国際出願ＰＣＴ／ＵＳ８９／０２２９３）；ホスホルアミデート（例えば、−ＯＰ（＝Ｏ）（ＮＲ１  Ｒ２）−Ｏ−であってここで、Ｒ１およびＲ２は、水素またはＣ１〜Ｃ３アルキルである）；Ｊａｇｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７：７２３７−７２４６（１９８８）；Ｆｒｏｅｈｌｅｒら，国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９０／０３１３８）；ペプチド核酸（Ｎｉｅｌｓｅｎら，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，８：５３−６３（１９９３），国際出願ＰＣＴ／ＥＰ９２／０１２２０）；メチルホスホネート（Ｍｉｌｌｅｒら，米国特許第４，５０７，４３３号，Ｔｓ’ｏら，米国特許第４，４６９，８６３号；Ｍｉｌｌｅｒら，米国特許第４，７５７，０５５号）；および種々の型のＰ−キラル結合）が当該分野で公知であり、特に、ホスホロチオエート（Ｓｔｅｃら，欧州特許出願５０６，２４２（１９９２）およびＬｅｓｎｉｋｏｗｓｋｉ，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２１：１２７−１５５（１９９３））が知られている。さらなるヌクレアーゼ耐性結合としては、以下が挙げられる：ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニリデート、アルキルホスホトリエステル（例えば、メチルホスホトリエステルまたはエチルホスホトリエステル）、カルボネート（例えば、カルボキシメチルエステル）、カルバメート、モルホリノカルバメート、３’−チオホルムアセタール、シリル（例えば、ジアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）−シリルまたはジフェニルシリル）、スルファメートエステルなど。このような結合およびこのような結合をオリゴヌクレオチド中に導入する方法は、多くの文献に記載されており、例えば、一般には、ＰｅｙｍａｎおよびＵｌｍａｎｎ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９０：５４３−５８４（１９９０）；Ｍｉｌｌｉｇａｎら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３６：１９２３−１９３７（１９９３）；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら，国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／０６８５５に概説されている。
【００６９】
ヌクレアーゼ消化に対する耐性はまた、Ｄａｇｌｅら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８，４７５１−４７５７（１９９０）の手順に従って、ホスホロアミダイドで、５’末端および３’末端の両方のヌクレオチド間結合を改変することによって達成され得る。
【００７０】
好ましくは、ホスホジエステル結合のリンアナログ（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデート、またはメチルホスホネート）が、本発明の化合物に使用される。より好ましくは、ホスホロチオエートが、ヌクレアーゼ耐性結合として使用される。
【００７１】
ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド間ホスホジエステル結合において、酸素に代わる硫黄の置換を含む。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、荷電されたホスフェートアナログの水溶性を保持しつつ、二重鎖形成のための有効なハイブリダイゼーション特性と、実質的なヌクレアーゼ耐性とを併せ持つ。電荷は、レセプターを介する細胞性取り込みの特性を付与すると考えられる（Ｌｏｋｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８６，３４７４−３４７８（１９８９））。
【００７２】
好ましい結合基に加えて、本発明の化合物は、さらなる改変（例えば、ホウ素化塩基（Ｓｐｉｅｌｖｏｇｅｌら、５，１３０，３０２号）；コレステロール部分（Ｓｈｅａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８：３７７７−３７８３（１９９０）またはＬｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８６：６５５３−６５５６（１９８９））；およびピリミジンの５−プロピニル改変（Ｆｒｏｅｈｌｅｒら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，３３：５３０７−５３１０（１９９２）））を含み得ることが理解される。
【００７３】
好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチド部分は、市販の自動化ＤＮＡ合成装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）モデル３８０Ｂ、３９２または３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置）において、従来の手段により合成される。好ましくは、例えば、以下の文献において開示されるような、ホスホルアミダイト化学を使用する：ＢｅａｕｃａｇｅおよびＩｙｅｒ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４８：２２２３−２３１１（１９９２）；Ｍｏｌｋｏら，米国特許第４，９８０，４６０号；Ｋｏｓｔｅｒら，米国特許第４，７２５，６７７号；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら，米国特許第４，４１５，７３２号；同第４，４５８，０６６号；および同第４，９７３，６７９号。
【００７４】
三重鎖形成が所望される実施形態では、標的配列の選択に対して制限が存在する。一般的には、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型の結合を介した第３鎖の結合が、二本鎖標的のホモピリミジン−ホモプリン軌跡に沿って最も安定となる。通常、塩基トリプレットは、Ｔ−Ａ＊ＴまたはＣ−Ｇ＊Ｃモチーフ（ここで、「−」はＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ対形成を示し、そして「＊」は、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型の結合を示す）において形成される；しかし、他のモチーフもまた可能である。例えば、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対形成は、条件および鎖の組成に依存して、第３鎖（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ鎖）と、その第３鎖が結合する二重鎖のプリン富化鎖との間において平行および逆平行な方向を可能にする。特定の実施形態において所望されるような三重鎖の安定性を最大限にするため、さもなくばそのような三重鎖の安定性を調節するための適切な配列、方向、条件、ヌクレオシド型（例えば、リボースヌクレオシドが使用されるか、デオキシリボースヌクレオシドが使用されるか）、塩基改変（例えば、メチル化シトシンなど）の選択についての広範な指針が、文献において存在する：例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８８：９３９７−９４０１（１９９１）；Ｒｏｂｅｒｔｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，５８：１４６３−１４６６（１９９２）；Ｄｉｓｔｅｆａｎｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９０：１１７９−１１８３（１９９３）；Ｍｅｒｇｎｙら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：９７９１−９７９８（１９９２）；Ｃｈｅｎｇら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４：４４６５−４４７４（１９９２）；ＢｅａｌおよびＤｅｒｖａｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０：２７７３−２７７６（１９９２）；ＢｅａｌおよびＤｅｒｖａｎ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４：４９７６−４９８２；Ｇｉｏｖａｎｎａｎｇｅｌｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８９：８６３１−８６３５（１９９２）；ＭｏｓｅｒおよびＤｅｒｖａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：６４５−６５０（１９８７）；ＭｃＳｈａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：５７１２−５７２１（１９９２）；Ｙｏｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８９：３８４０−３８４４（１９９２）；ならびにＢｌｕｍｅら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０：１７７７−１７８４（１９９２）。
【００７５】
オリゴヌクレオチド部分の長さは、多くの文献（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら，国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０５３０５；またはＳｚｏｓｔａｋら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ，６８：４１９−４２９（１９７９））において説明されるような、特異的な結合が所望される標的ポリヌクレオチドにおいてのみ生じ、そして他の偶発的な部位では生じないことを保証するに十分な大きさであり得る。所望される長さは、いくつかの要因によって決定され、この要因としては、約３０〜４０ヌクレオチド長よりも長いオリゴマーの合成および精製に関する不便さおよび費用、より長いオリゴヌクレオチドはより短いオリゴヌクレオチドよりもミスマッチについて寛容性がより高いこと、結合または特異性を増強するための改変が存在するか否か、二重鎖結合が所望されるか三重鎖結合が所望されるか、などが挙げられる。一般的に、本発明において有用なオリゴヌクレオチドは、約１２〜６０ヌクレオチドの範囲の長さを有する。より好ましくは、本発明の化合物は、約１５〜４０ヌクレオチドの範囲の長さを有し；そして最も好ましくは、本発明の化合物は、約１８〜３０ヌクレオチドの範囲の長さを有する。
【００７６】
一般的に、本発明の実施に用いられるオリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの選択した部分に完全に相補的である配列を有する。しかし、完全な相補性は、特に、大きなオリゴマーでは必須ではない。従って、本明細書中での、標的ポリヌクレオチド「に対するヌクレオチド配列相補性」との言及は、標的セグメントとの１００％の相補性を有する配列を意味する必要はない。一般的に、標的（例えば、癌遺伝子のｍＲＮＡ）と安定な二重鎖を形成するのに十分な相補性を有する任意のオリゴヌクレオチド（すなわち、「ハイブリダイズ可能」であるオリゴヌクレオチド）が、適切である。安定な二重鎖形成は、ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの配列および長さ、ならびに標的ポリヌクレオチドとの相補性の程度に依存する。一般的に、ハイプリダイズするオリゴマーが大きくなれば、より多くのミスマッチが容認され得る。１を超えるミスマッチは、約２１未満のヌクレオチドのオリゴマーに適切であり得ない。当業者は、得られた二重鎖の、融解温度、従って、熱安定性に依存して、任意の所定のオリゴマー配列と標的配列との間で容認され得る、ミスマッチの程度を容易に決定し得る。
【００７７】
本発明のオリゴヌクレオチドにより形成されたハイブリッドの熱安定性は、融解（または鎖解離）曲線により決定され得る。５０％の鎖解離の温度が、融解温度（Ｔｍ）として取られ、これは、次いで、安定性の簡便な測定を提供する。Ｔｍ測定は、代表的に、約１．０と２．０Ｍとの間の標的濃度およびオリゴヌクレオチド濃度を用いて、中性ｐＨの生理食塩溶液中で実行される。代表的な条件は、以下の通りである：１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）または１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）中に１５０ｍＭ  ＮａＣ１および１０ｍＭ  ＭｇＣ１２。融解曲線に関するデ−タは、室温から約８５℃にオリゴヌクレオチド／標的ポリヌクレオチド複合体のサンプルを加熱することにより蓄積される。サンプルの温度を上昇させながら、２６０ｎｍ光の吸収が、例えば、Ｃａｒｙ（Ａｕｓｔｒａｌｉａ）モデルＩＥまたはＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）モデルＨＰ８４５９ＵＶ／ＶｌＳ分光光度計およびモデルＨＰ８９１００Ａ温度コントローラーなどのような装置を用いて、１℃間隔でモニターされる。このような技術は、異なる長さおよび組成物のオリゴヌクレオチドの結合強度を測定および比較するための簡便な手段を提供する。
【００７８】
特定の実施形態では、核酸部分は、アンチセンスオリゴヌクレオチドとして機能することにより、遺伝子の転写を阻害または抑制するように機能し得る。
【００７９】
標的ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡを含む場合、転写物の任意の部分に相補的でありかっこの部分とハイプリダイズ可能なオリゴヌクレオチドは、原則的には、翻訳を阻害するために有効である。細胞により合成される各タンパク質は、特定のメッセンジャ−ｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ）によりコードされるので、このことが生じる。特定のＲＮＡの翻訳が阻害される場合、この翻訳に由来するタンパク質産物が、同様に低減される。特定の標的ｍＲＮＡ配列に相補的である（アンチセンス）ように設計されたオリゴヌクレオチド配列は、標的配列に結合し、それによって、特定のｍＲＮＡの翻訳を阻害する。ＲＮＡにハイブリダイズして、複合体を形成することにより、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡのリボゾームへの結合をブロックして翻訳阻害を生じると考えられる。あるいは、センス分子およびアンチセンス分子により形成される二重鎖は、分解することがより容易であり得る。他の理論は、ＲＮＡ転写を阻害するために、アンチセンスＲＮＡが、相補的ＤＮＡと形成姿勢し得る複合体を記載する。従って、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、翻訳を直接阻害するか、または転写の阻害を通じてかのいずれかによって、所定の遺伝子産物の翻訳を阻害し得る。
【００８０】
翻訳は、開始コドンの部位または開始コドンの付近でｍＲＮＡをブロックすることにより、最も有効に阻害されると考えられる。従って、ｍＲＮＡ転写物の５’領域に相補的なオリゴヌクレオチドが好ましい。開始コドン（転写物の翻訳部分の５’末端の第１のコドン）またはこの開始コドンに隣接するコドンを含む、標的ｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００８１】
標的ｍＲＮＡ転写物の５’領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド（特に、開始コドンを含む領域）が好ましい一方で、有用なアンチセンスオリゴマーはまた、ｍＲＮＡ転写物の翻訳部分において見出される配列に相補的であるオリゴマーに限定されないが、５’−非翻訳領域および３’−非翻訳領域中に、またはこれらの領域にわたって、ならびにプロモ−ター領域およびイントロン中に含まれるヌクレオチド配列に対して相補的なオリゴマーも含むことが理解されるべきである。特定の実施形態では、標的化構造物は、「センス」核酸を含む。
【００８２】
本発明の範囲内に含まれるものはまた、２つ以上の核酸分子を含む標的化構築物である。核酸は、同じ遺伝子に指向され得るか、または、これらは、異なる遺伝子に対して指向され得る（またはこれらに対して相補的であり得る）。例えば、標的細胞が、高レベルのｃ−ｍｙｂＲＮＡおよびｃ−ｆｏｓＲＮＡを発現する細胞である場合、標的化構築物は、ｃ−ｍｙｂＲＮＡに相補的であるオリゴヌクレオチド、およびｃ−ｆｏｓＲＮＡに相補的であるオリゴヌクレオチドを含み得る。異なる核酸は、互いに共有連結され得るか、またはこれらは、互いに連結され得ない。
【００８３】
標的化構築物の核酸は、好ましくは、一本鎖である。核酸は、好ましくは、約１２〜約１００のヌクレオチド、より好ましくは、約１２〜約５０のヌクレオチド長、および、さらにより好ましくは、約１５〜約２５のヌクレオチド長である。しかし、約１００から約２００、５００または１０００ヌクレオチドを有する核酸もまた、本発明の範囲内である。より長いヌクレオチドがまた、本発明に従って用いられ得る。本明細書中で用いられる場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、本明細書中で、一本鎖核酸と交換可能に用いられ、そしてヌクレオチドの数を限定することを意図しない。
【００８４】
例示的標的核酸は、標的細胞において高レベルで発現される、例えば、癌細胞を標的化する場合、標的核酸は、癌遺伝子のＲＮＡ（例えば、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｒａｓ、ｃ−ｆｏｓ、またはｃ−ｊｕｎ）に相補的であり得る。ｒａｓのアンチセンスインヒビターの臨床開発に関する潜在性は、例えば、Ｃｏｗｓｅｒｔ，Ｌ，Ｍ．，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ（１９９７）１２：３５９−３７１により議論される。
【００８５】
一般的に、核酸を、特定の細胞を標的化するための標的化構築物へと組み込むために選択する場合、以下のプロトコルに従う。標的細胞において高レベルで発現される１以上の遺伝子が同定される。このような遺伝子は、文献から公知であり得るか、またはこれらは同定され得る。例えば、細胞株からＲＮＡが抽出され、ＲＮＡからｃＤＮＡが合成され、そしてｃＤＮＡは、種々の遺伝子のＤＮＡを含むブロットまたはアレイにハイブリダイズされる。次いで、１つ以上の標的遺伝子は、ハイブリダイゼーション結果に基づいて選択され得る。好ましい標的遺伝子は、他の細胞型において（少なくとも、標的細胞に近い細胞において）有意に発現されないものである。従って、ハウスキーピング遺伝子は、特定の実施形態についての最良の選択ではないかもしれない。次いで、１つ以上の潜在的標的遺伝子の異なる部分に相補的であるアンチセンス核酸は、例えば、ＰＣＲ増幅、または合成により、調製され得る。次いで、これらの核酸は、標的化構築物へと組み込まれ得、そして標的化構築物の組込みおよび保持のレベルは、例えば、実施例に記載されるように、決定され得る。
【００８６】
（ＩＩｌ．ペイロード（Ｐａｙｌｏａｄ））
本発明の標的化構築物は、標的部位または標的細胞に送達される、広範な種々の化学実体のいずれかを含み得る。一般的に、ペイロードは、造影剤および治療剤として分類され得る。造影剤は、例えば、光発光、放射線放射、または化学シグナルによって、放射線（例えば、ｘ線）を吸収することによって、あるいは、さもなければ、未処理細胞に対して処理細胞の特徴を変化させることによって、検出可能であるペイロードを含む。治療剤は、標的部位の異常な状態（例えば、腫瘍または感染）に対抗することによって、好ましくは、生物学的に活性であるペイロードを含む。
【００８７】
標的化構築物において有用な治療剤は、多数の化学実体（例えば、酵素、薬物、放射性核種、酵素、インヒビターなど）のいずれかであり得る。例えば、治療剤として有用な部分はとしては、以下が挙げられる：アミノ酸およびその誘導体；鎮痛薬（例えば、アセトアミノフェン、アスピリン、およびイブプロフェン）；ぜん息治療薬；鎮痙薬；抗うつ薬（例えば、アミトリプチリン、フロキセチン、ノルトリプチリン、およびイミプラミン）；制吐薬；抗真菌剤（アリアミン、イミダゾール、ポリエン、およびトリアゾールを含む）；抗原およびそれに対する抗体；抗ヒスタミン薬（例えば、クロロフェニラミンおよびプロモフェニラミン）；抗高血圧薬（例えば、クロニジン、メチルドパ、プラゾシン、ベラパミル、ニフェジピン、カプトプリル、およびエナラプリル）；抗炎症薬（非ステロイド薬（例えば、アミノアリールカルボン酸誘導体、アリール酢酸誘導体、アリール酪酸誘導体、アリールカルボン酸、アリールプロピオン酸誘導体、ピラゾール、ピラゾロン、サリチル酸誘導体、チアジンカルボキサミドなど）、ならびにステロイド剤（例えば、糖質コルチコイド）を含む）；抗菌剤（例えば、アミノグリコシド、アンフェニコール、シノキサシン、シクロフロキサシン、２，４−ジアミノピリミジン、−ラクタム（例えば、カルバペネム（ｃａｒｂａｐｅｎｅｍ）、セファロスポリン、セファマイシン、モノバクタム、オキサセフェム、およびペニシリン）、リンコサミド、マクロライド、ニトロフラン、ノルフロキサシン、ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質（例えば、デフェンシン、バシトラシン、ポリミキシン、セクロピン、マゲイニンＩＩ、インドリシジン、ラナレキン、プロテグリン、ガリナシン、トリトリプチシン、ラクトフェリシン、ドロソマイシン、ホロトリシン、サナシン（ｔｈａｎａｔｉｎ）、デルマセプチン（ｄｅｒｍａｓｅｐｔｉｎ）、イツリン（ｉｔｕｒｉｎ）、シリンゴマイシン、ニッコマイシン、ポリオキシン、ＦＲ−９００４０３、エキノカンジン（ｅｃｈｉｎｏｃａｎｄｉｎ）、ヌ−モカンジン（ｐｎｅｕｍｏｃａｎｄｉｎ）、アクレアシン（ａｃｌｅａｃｉｎ）、ムルンドカンジン（ｍｕｌｕｎｄｏｃａｎｄｉｎ）、ＷＦ１１８９９、オーレオカンジン（ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎ）、シゾトリン（ｓｃｈｉｚｏｔｒｉｎ）Ａ、カペジン、ゼアマチン、シクロペプチド、およびＤ４ｅ１）、キノロンおよびアナログ、スルホンアミド、スルホン、テトラサイクリン）；制吐薬；抗パーキンソン病薬；鎮痙薬；アポタンパク質、気管支拡張薬（例えば、アルブテロールおよびテオフィリン）；抗ウイルス薬（プリン／ピリミジノン（例えば、アシクロビル、ジデオキシ−シチジン、ジデオキシ−アデノシン、またはジデオキシ−イノシン、インターフェロン、アマンタジン、リバビリン）を含む）；β遮断薬（例えば、プロプラノロール、メトプロパノロール、アテノロール、ラベトロール、チモロール、ペンブトロール、およびピンドロール）；制癌剤（化学治療薬を含む）；心血管薬（抗不整脈薬、強心配糖体、抗狭心症薬、および血管拡張薬を含む）；中枢神経系薬（刺激薬、向精神薬、抗躁病薬、および抑制薬を含む）；補酵素；鎮咳剤；うっ血除去薬；利尿薬���酵素；酵素インヒビター；去痰薬；糖タンパク質；Ｈ−２アンタゴニスト（例えば、ニザチジン、シメチジン、ファモチジン、およびラニチジン）；ハプテンおよびそれらに対する抗体；ホルモン、脂質、リポソ−ム；粘液溶解薬；筋弛緩薬；少なくとも１つの非ペプチド連結が、ペプチド連結と置き換わったタンパク質アナログ；リン脂質；プロスタグランジン；放射性核種（例えば、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、９０Ｙ、２１２Ｂｉ、２１１Ａｔ、８９Ｓｒ、１６６Ｈｏ、１５３Ｓｍ、６７Ｃｕおよび６４Ｃｕ）；レセプターおよび他の膜タンパク質；捕虫葉オリゴペプチド；刺激薬；毒素（例えば、アフラトキシン、ジゴキシン、ルブラトキシン、およびキサントトキシン（ｘａｎｔｈｏｔｏｘｉｎ））；トランキライザ（例えば、ジアゼパム、コルジアゼポキシド、オキサゼパム、アルプラゾラム、およびトリアゾラム）；ならびにビタミンおよびミネラルおよび栄養添加物。他の治療薬については、例えば、Ｍｅｒｋ  Ｉｎｄｅｘを参照のこと。現在使用されて得る治療薬に加えて、本発明は、開発中または開発されるであろう薬剤、および感染、炎症性応答、腫瘍、または他の異常な状態を処置するか、またはこれらの進行を阻止するのに有効である薬剤を意図する。
【００８８】
標的化構築物は、代替としてまたはさらに、当業者に公知であり、そしてインビボまたはインビトロで化合物を検出またはモニターするために用いられる手段にある程度依存して、種々の造影剤のいずれかを用いて標識され得る。陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）および単光子射出コンピュ−ター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）のための好ましい造影剤としては、Ｆ１８、Ｔｃ−９９ｍ、およびＩ−１２３が挙げられる。磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）のための好ましい造影剤としては、不対スピン電子またはフリ−ラジカルを有する適切な原子が挙げられる。
【００８９】
ペイロードが、画像化能力において機能することが意図される場合、このペイロードは、放射性核種または常磁性造影剤、蛍光標識もしくは化学発光標識、または他の型の検出可能なマーカーのような部分を含む。上記の造影剤は、本発明に従う任意の標識を含み得る。高い特異性および感受性の標識は、放射性核種により提供され、これらは、次いで、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）または単光子射出コンピュ−ター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）による画像化を用いて検出され得る。より好ましくは、本発明の造影剤は、１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、９９ｍＴｃ、１８Ｆ、６８Ｇａ、６７Ｇａ、７２Ａｓ、８９Ｚｒ、６４Ｃｕ、６２Ｃｕ、１１１Ｉｎ、２０３Ｐｂ、１９８Ｈｇ、１１Ｃ、９７Ｒｕ、および２０１Ｔｌからなる群より選択される放射性核種、または常磁性造影剤（例えば、ガドリニウム、コバルト、ニッケル、マンガン、および鉄）を含む。以下で議論されるように、これらの原子は、標的化部分またはオリゴヌクレオチドヘと直接取り込まれ得るか、または別々の化学構造を通じて付着され得る。キレート化放射性核種の使用に関するさらなる情報は、米国特許第５，７８３，１７１号および同第５，６８８，４８８号において見出され得る。
【００９０】
（ＩＶ．標的化構築物を作製する方法）
標的化部分、核酸、およびペイロードの連結は、用いられる条件に耐えるために十分に安定である、２つ以上の成分の間に連結を生じ、かついずれの成分の機能も変化させない、任意の手段によりもたらされ得る。好ましくは、これらの間の連結は共有結合である。種々の部分が、各部分の所望の活性を維持する任意のオーダーまたは任意の立体配置でアセンブルされ得る。２つの部分は、これらの部分の末端に存在する官能基を連結することによってか、またはいずれかの部分の任意の位置に存在する適切な官能基を連結することによって、互いに結合され得る。あるいは、３つの部分全てが、共通の継ぎ手分子に連結され得る。このような構造は、図１に模式的に示される。種々の部分を連結するために適切な方法が、以下で議論される。
【００９１】
多数の化学架橋方法が公知であり、そして本発明の構築物の様々な部分を結合体化するために潜在的に適用可能である。多くの公知の化学架橋方法は、非特異的である（すなわち、これらは、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または他の分子上の任意の特定の部位に、カップリング点を方向付けない）。結果として、非特異的架橋剤の使用は、機能的部分を攻撃し得るか、または活性部位を立体的にブロックし得、それによって、結合体化タンパク質を生物学的に不活化する。
【００９２】
本発明の実施においてカップリング特異性を増大させる好ましいアプロ−チは、架橋される分子の一方または両方において、一回のみまたは数回見出される、官能基への直接的化学カップリングである。例えば、多くのタンパク質の中で、チオール基を含む唯一のタンパク質アミノ酸であるシステインは、数回のみ出現する。また、例えば、ポリペプチドが、リジン残基を含まない場合、一級アミンに特異的な架橋試薬は、このポリペプチドのアミノ酸末端について選択的である。カップリングの特異性を増大させるためのこのアプロ−チの首尾よい利用は、分子が、その分子の生物学的活性の損失なしに変化され得る、分子の領域中の適切な反応性残基を有することを必要とする。
【００９３】
以下の実施例で実証されるように、システイン残基は、これらが、架橋反応におけるこれらの関与が、生物学的活性を妨害するようであるポリペプチド配列の一部に存在する場合に置換され得る。システイン残基が置換される場合、代表的には、ポリペプチドの折り畳みにおいて生じる変化を最小限にすることが望ましい。ポリペプチド折り畳みにおける変化は、置換が、そしてシステインと化学的でかつ立体的に類似する場合に最小化される。これらの理由のため、セリンは、システインについての置換物として好適である。以下の実施例で実証されるように、システイン残基は、架橋目的のためにポリペプチドのアミノ酸配列へと導入され得る。システイン残基が導入される場合、アミノ末端またはカルボキシ末端でのまたはこれらの末端付近での導入が好ましい。従来の方法は、目的のポリペプチドが、化学合成により生成されても、組換えＤＮＡの発現により産生されても、このようなアミノ酸修飾について利用可能である。
【００９４】
２つの成分のカップリングは、カップリング剤または結合剤を介して達成され得る。利用され得るいくつかの分子間架橋剤が存在する（例えば、Ｍｅａｎｓ，Ｇ．Ｅ．およびＦｅｅｎｅｙ，Ｒ．Ｅ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ,Ｈｏｌｄｅｎ−Ｄａｙ，１９７４，３９−４３頁を参照のこと）。これらの試薬の中には、例えば、Ｊ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）またはＮ，Ｎ’−（１，３−フェニレン）ビスマレイミド（これらの両方は、スルフヒドリル基に非常に特異的であり、そして不可逆的連結を形成する）；Ｎ，Ｎ’−エチレン−ビス−（ヨードアセトアミド）または６〜１１の炭素メチレン架橋を有するような他の試薬（これは、スルフヒドリル基に比較的特異的である）；および１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（これは、アミノ基およびチロシン基と不可逆的連結を形成する）がある。この目的のために有用な他の架橋剤としては、以下が挙げられる：ｐ，ｐ’−ジフルオロ−ｍ，ｍ’−ジニトロジフェニルスルホン（これは、アミノ基およびフェノール基と不可逆的な架橋を形成する）；ジメチルアジピミデート（これは、アミノ基に特異的である）；フェノール−１，４−ジスルホニルクロリド（これは、アミノ基と主に反応する）；ヘキサメチレンジイソシアネートもしくはジイソチオシアネート、またはアゾフェニル−ｐ−ジイソシアネート（これは、アミノ基と主に反応する）；グルタルアルデヒド（これは、いくつかの異なる側鎖と反応する）およびジスジアゾベンジジン（これは、チロシンおよびヒスチジンと主に反応する）。
【００９５】
架橋剤は、ホモ二官能性（すなわち、同じ反応を受ける２つの官能基を有する）であり得る。好ましいホモ二官能性架橋剤は、ビスマレイミドヘキサン（「ＢＭＨ」）である。ＢＭＨは、２つのマレイミド官能基を含み、これは、穏和な条件下（ｐＨ６、５〜７．７）でスルフヒドリル含有化合物と特異的に反応する。２つのマレイミド基は、炭化水素鎖により接続される。従って、ＢＭＨは、システイン残基を含むポリペプチドの不可逆的架橋に有用である。
【００９６】
架橋剤はまた、ヘテロ二官能性であり得る。ヘテロ二官能性の架橋剤は、２つの異なる官能基（例えば、アミン反応性基およびチオール反応性基（これらは、それぞれ、遊離のアミンおよびチオールを有する２つのタンパク質を架橋する））を有する。ヘテロ二官能性は、２つの化学実体（例えば、ホモタンパク質ポリマー）を結合体化し、それにより、不必要な副反応の発生を減少させるための、より特異的なカップリング方法を設計する能力を提供する。広範な種々のヘテロ二官能性架橋リンカーは、当該分野で公知である。ヘテロ二官能性架橋剤の例は、以下である：スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、１−エチル−３−（３一ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロライド（ＥＤＣ）；４−スクシンイミジルオキシカルボニル−ａ−メチル−ａ−（２−ピリジルジチオ）ートルエン（ＳＭＰＴ）、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル６−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート］ヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）一シクロヘキサン−１−カルボキシレート（「ＳＭＣＣ」）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（「ＭＢＳ」）、およびスクシンイミド４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（「ＳＭＰＢ」）、ＭＢＳの伸長した鎖アナログ。これらの架橋リンカーのスクシンイミジル基は、一級アミンと反応し、そしてチオール反応性マレイミドは、システイン残基のチオールと共有結合を形成する。
【００９７】
架橋剤は、頻繁に、水中で低い溶解性を有する。親水性部分（例えば、スルホネート基）は、その水溶解性を改善するために、架橋試薬に添加され得る。Ｓｕｌｆｏ−ＭＢＳおよびＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣは、水溶解性について改変された架橋試薬の例である。
【００９８】
ヘテロ二官能性架橋リンカーの部分として有用である別の反応性基は、チオール反応性基である。一般的な、チオール反応性基としては、マレイミド、ハロゲン、およびピリジルジスルフィドが挙げられる。マレイミドは、わずかに酸性から中性（ｐＨ６．５−７．５）の条件下で、数分で、遊離のスルフヒドリル（システイン残基）と特異的に反応する。
ハロアルキル基（例えば、ヨードアセチル官能基）は、生理学的ｐＨでチオール基と反応する。これらの反応基の両方は、安定なチオールエーテル結合の形成を生じる。
【００９９】
ヘテロ二官能性架橋リンカーに加えて、ホモ二官能性架橋リンカーおよび光活性架橋リンカーを含む、多数の他の架橋剤が存在する。ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）およびジメチルピメリミデート−２ＨＣ１（ＤＭＰ）は、有用な二官能性架橋剤の例であり、そしてビス−［β−（４−アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）およびＮ−スクシンイミジル−６（４’−アジド−２’−ニトロフェニル−アミノ）ヘキサノエート（ＳＡＮＰＡＨ）は、本発明における使用に有用な光活性架橋リンカーの例である。タンパク質カップリング技術の最近の総説については、Ｍｅａｎｓら（１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １：２−１２（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【０１００】
多くの架橋剤が、細胞条件下で本質的に明確ではない結合体を生じる。しかし、いくつかの架橋剤は、共有結合（例えば、ジスルフィド（これは、細胞条件下で明確である））を含む。例えば、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（「ＤＳＰ」）、Ｔｒａｕｔ試薬、およびＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（「ＳＰＤＰ」）は、周知の切断可能なリンカーである。切断可能な架橋剤の使用は、ペイロードが、標的への送達の後に、構築物から分離することを可能し得る。直接的ジスルフィド結合もまた有用であり得る。さらなる切断可能な連結は当該分野で公知であり、そして本発明の特定の実施形態に有利になるように用いられ得る。
【０１０１】
化合物（例えば、タンパク質、標識、および他の化学実体）をヌクレオチドに連結するための多くの方法が当業者に公知である。いくつかの新規の架橋剤（例えば、Ｎ−マレイミドブチリルオキシ−スクシンイミドエステル（「ＧＭＢＳ」）およびｓｕｌｆｏ−ＧＭＢＳ）は、低下した免疫原性を有する。置換基は、Ｏｇｉｌｖｉｅ，Ｋ．Ｋ．ら、Ｐｕｒｅ  ａｎｄ  Ａｐｐｌ  Ｃｈｅｍ（１９８７）５９：３２５およびＦｒｏｅｈｌｅｒ，Ｂ．Ｃ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９８６）１４：５３９９により記載されるような、アミダイト化学またはＨ−ホスホネート化学を用いて、予め構築されたオリゴヌクレオチドの５’末端に付着されている。置換基はまた、Ａｓｓｅｌｉｎｅ，Ｕ．ら、Ｔｅｔ  Ｌｅｔｔ（１９８９）３０：２５２１により記載されるように、オリゴマーの３’末端に付着されている。この最後の方法は、ジイソプロピルアミンを、アクリジン部分を保有する３’ホスホネートからはずし、次いで、リンの酸化の後に除去させるために、固体支持体に付着された２，２’−ジチオエタノールを利用する。他の置換基は、代替の方法（ポリリジン（Ｂａｙａｒｄ，Ｂ．，ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８６）２５：３７３０；Ｌｅｍａｉｔｒｅ，Ｍ．ら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（１９８７）６：３１１）を含む）によりオリゴマーの３’末端に結合されており、そしてさらに、ジスルフィドは、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ，Ｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９８７）１５：５３０５により記載されるように、様々な基を、３’末端に結合するために用いられている。３’末端で置換されるオリゴヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼによる分解に対して、増大した安定性および増大した耐性を示すことが公知である（Ｌａｎｃｅｌｏｔ，Ｇ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８５）２４：２５２１；Ａｓｓｅｌｉｎｅ，Ｕら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８４）８１：３２９７）。非ヌクレオチド実体を、オリゴヌクレオチドに付着させるさらなる方法は、米国特許第５，３２１，１３１号および同第５，４１４，０７７号において議論される。
【０１０２】
あるいは、オリゴヌクレオチドは、リンカーアームを介して塩基に付着された基を有する、１つ以上の改変オリゴヌクレオチドを含み得る。例えば、Ｌａｎｇｅｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ，Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．７８（１１）：６６３３−６６３７，１９８１）は、アリルアミンリンカーアームによる、ｄＵＴＰのＣ−５位へのビオチンの付着を記載する。ビオチンおよび他の基の、リンカーアームを介するピリミジンの５位への付着はまた、米国特許第４，７１１，９５５号において議論される。リンカーアームを介して、ピリミジンの５位または他の位置に付着された標識されたヌクレオチドもまた、米国特許第４，９４８，８８２号において示唆される。二官能性アミンを有するシトシンのＮ４位の亜硫酸水素触媒アミノ基転移は、Ｓｃｈｕｌｍａｎら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９（５）：１２０３−１２１７，１９８１）およびＤｒａｐｅｒら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９：１７７４−１７８１，１９８０）により記載される。この方法により、化学実体は、リンカーアームを介して、シチジンまたはシチジン含有ポリヌクレオチドに付着される。シチジンのＮ４位へのビオチンの付着は、米国特許第４，８２８，９７９号に開示され、そしてＮ４位でのシチジンヘのある部分の連結はまた、米国特許第５，０１３，８３１号および同第５，２４１，０６０号に示される。米国特許第５，４０７，８０１号は、オリゴヌクレオチド三重鎖の調製を記載し、ここで、リンカーアームは、亜硫酸水素触媒アミノ基転移を介して、デオキシシチジンヘと結合体化される。このリンカーアームとしては、アミノアルキルリンカーアームまたはカルボキシアルキルリンカーアームが挙げられる。米国特許第５，４０５，９５０号は、リンカーアームが、シトシン塩基のＮ４位に付着されるシチジンアナログを記載する。
【０１０３】
上記のものを含む、多数の架橋剤が、市販されている。これらの使用についての詳細な指示は、販売元から容易に入手可能である。タンパク質架橋および結合体調製物に関する一般的な参考文献は、Ｓ．Ｓ．Ｗｏｎｇ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）である。
【０１０４】
化学架橋は、スペーサーアームの使用を含み得る。スペーサーアームは、結合体化部分の間の分子内可撓性を提供するかまたはこれらの間の分子内距離を調整し、それにより、生物学的活性を保存することを補助し得る。スペーサーアームは、スペーサーアミノ酸を含むポリペプチド部分の形態であり得る。あるいは、スペーサーアームは、「長鎖ＳＰＤＰ」（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ，，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩｌＩ，，カタログ番号２１６５１Ｈ）のような、架橋剤の一部であり得る。
【０１０５】
種々のカップリング剤または架橋剤（例えば、プロテインＡ、カルボジイミド、ジマレイミド、ジチオービス−ニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、およびＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、６−ヒドラジノニコチミド（ＨＹＮＩＣ）、Ｎ３ＳおよびＮ２Ｓ２）は、標的化構築物を合成するための周知の手順において用いられ得る。例えば、ビオチンは、Ｈｎａｔｏｗｉｃｈら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｒａｄｉａｔ．ｌｓｏｔｏｐ．３３：３２７（１９８２）の二環式無水物法により、ＤＴＰＡを介して、オリゴヌクレオチドに結合体化され得る。
【０１０６】
さらに、スルホスクシンイミジル６−（ビオチンアミド）ヘキサノエート（ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン、これは、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌから購入され得る）、「ビオシチン」（ビオチンのリジン結合体）は、一級アミンの有効性に起因して、ビオチン化合物を作製するために有用であり得る。さらに、対応するビオチン酸塩化物または酸前駆体は、公知の方法により、治療剤のアミノ誘導体とカップリングされ得る。
【０１０７】
標的化構築物の部分の２つがポリペプチドを含む場合、さらなる連結技術が、利用可能である。例えば、組換え技術は、例えば、ペイロードをコードする遺伝子をインターナライズするポリペプチド配列をコードする遺伝子と連結し、そして得られた遺伝子構築物を結合体を構築し得る細胞へと導入することによって、インターナライズするポリペプチド配列を、ポリペプチド標的化部分またはペイロードに共有的に付着するために用いられ得る。あるいは、２つの別々のヌクレオチド配列が細胞において発現され得るか、または公知の技術を用いて化学的に合成され、そして、次いで、連結され得るか、または合わせた配列が、単一のアミノ酸配列として化学的に合成され得（すなわち、いずれか一方に、両方の構築物が存在する）、従って、引き続いての連結を排除する。
【０１０８】
画像化標識は、標的化部分またはオリゴヌクレオチドの原子に直接共有結合により、標的化構築物へと組み込まれ得るか、または標識は、キレート構造を通してか、またはマンニトール、グルコネート、グルコヘプトネート、タータラートなどのような補助的な分子を通して、標的分子と非共有的または共有的に会合し得る。キレート化構造が、標識分子と標的分子との間の空間的近さを提供するために用いられる場合、キレート構造は、構築物と直接会合し得るか、またはこれは、マンニトール、グルコネート、グルコヘプトネート、タータラートなどのような補助分子を通して、構築物と会合し得る。
【０１０９】
任意の適切なキレート構造は、共有的会合または非共有的会合を通じて、放射性核種と構築物との間の空間的近さを提供するために用いられ得る。多くのこのようなキレ−ティング構造が当該分野で公知である。好ましくは、キレート構造は、Ｎ２Ｓ２構造、ＮＳ３構造、Ｎ４構造、イソニトリル含有構造、ヒドラジン含有構造、ＨＹＮＩＣ（ヒドラジノニコチン酸）含有構造、２−メチルチオールニコチン酸含有構造、カルボキシレート含有構造などである。いくつかの場合、キレート化は、別々のキレート化構造を含むことなしに、達成され得る。なぜならば、放射性核種は、標的化部分の原子に（例えば、種々の部分の中の酸素原子に）直接キレート化するからである。
【０１１０】
放射性核種は、特定の放射性核種のリガンドヘのキレート化、会合、または付着をもたらすかまたは最適化する公知の手順を用いて、標的分子の空間に近位に配置され得る。例えば、１２３Ｉが放射性核種である場合、造影剤は、公知の放射ヨウ素標識手順（例えば、クロラミンＴを用いる直接的放射ヨウ素標識、ハロゲンまたは有機金属基を交換する放射ヨウ素標識など）に従って標識され得る。放射性核種が、９９ｍＴｃである場合、造影剤は、９９ｍＴｃをリガンド分子に付着させるのに適切な任意の方法を用いて標識され得る。好ましくは、放射性核種が９９ｍＴｃである場合、マンニトール、グルコネート、グルコヘパトネート、またはタータラートのような補助分子は、キレート構造を伴ってか、またはキレート構造を伴わないで、標識反応混合物中に含まれる。より好ましくは、９９ｍＴｃは、マンニトールおよび標的分子の存在下で、スズを用いて９９ｍＴｃＯ４を還元することにより、標的分子に対して空間的に近位に配置される。酒石酸スズまたは非スズ還元剤（例えば、亜ジチオン酸ナトリウム）を含む、他の還元剤もまた、本発明の心血管造影剤を作製するために用いられ得る。
【０１１１】
一般に、標識方法論は、放射性核種の選択、標識されるべき部分および調査の下での臨床条件とともに変更される。９９ｍＴｃおよび１１１Ｉｎを使用する標識方法は、例えば、以下に記載されている：Ｐｅｔｅｒｓ，Ａ．Ｍ．ら、Ｌａｎｃｅｔ  ２：９４６−９４９（１９８６）；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｓ．Ｃ．ら、Ｓｅｍｉｎ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．１４（２）：６８−８２（１９８４）；Ｓｉｎｎ，Ｈ．ら、Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．（Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ）１３：１８０，１９８４）；ＭｃＡｆｅｅ，Ｊ．Ｇ．ら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．１７：４８０−４８７，１９７６；ＭｃＡｆｅｅ，Ｊ．Ｇ．ら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．１７：４８０−４８７，１９７６；Ｗｅｌｃｈ，Ｍ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．１８：５５８−５６２，１９７７；ＭｃＡｆｅｅ，Ｊ．Ｇ．ら、Ｓｅｍｉｎ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．１４（２）：８３，１９８４；Ｔｈａｋｕｒ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｓｅｍｉｎ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．１４（２）：１０７，１９８４；Ｄａｎｐｕｒｅ，Ｈ．Ｊ．ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｒａｄｉｏｌ．，５４：５９７−６０１，１９８１；Ｄａｎｐｕｒｅ，Ｈ．Ｊ．ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｒａｄｉｏｌ．５５：２４７−２４９，１９８２；Ｐｅｔｅｒｓ，Ａ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３９−４４，１９８２；Ｇｕｎｔｅｒ，Ｋ．Ｐ．ら、Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  １４９：５６３−５６６，１９８３；およびＴｈａｋｕｒ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２６：５１８−５２３，１９８５。１２５Ｉでの標識の例は、以下の実施例において詳細に記載されている。
【０１１２】
合成された標的化構築物は、高磁場ＮＭＲスペクトル、ならびにＩＲ、ＭＳおよび光学回転の標準方法を使用して特徴付けられ得る。元素分析、ＴＬＣおよび／またはＨＰＬＣは、純度を測定するのに使用され得る。少なくとも約８０％の純度、好ましくは、少なくとも約９０％の純度、より好ましくは、少なくとも約９５％の純度、そしてさらにより好ましくは、少なくとも約９８％の純度が好ましい。ＴＬＣおよび／またはＨＰＬＣもまた、このような化合物を特徴付けるために使用され得る。
【０１１３】
一旦調製されると、候補標的化構築物は、対応する標的に結合する能力について、感染部位へのインビボ結合について、または腫瘍へのインビトロもしくはインビボ結合について、スクリーニングされ得る。細胞中の標的化構築物の内在化および保持は、例えば、実施例に記載されるように決定され得る。さらに、標的化構築物の安定性は、血清（例えば、ヒト血清）中で化合物をインキュベートすることによって、そしてこの化合物の潜在的な分解を長期にわたって測定することによって、試験され得る。安定性はまた、この化合物を被験体（ヒトまたは非ヒト）に投与することによって、種々の期間（例えば、３０分、１時間、２４時間）で血液サンプルを得ることによって、そして誘導された代謝産物または関連した代謝産物についてそれらの血液サンプルを分析することによって、決定され得る。
【０１１４】
（Ｖ．標的化構築物の投与）
治療用途について、適切な標的化構築物の有効量は、任意の様式（この様式によって、化合物は、適切な標的によって取り込まれ得る）によって、被験体に投与され得る。好ましい投与経路としては、経口および経皮（例えば、パッチを介する）が挙げられる。他の投与経路の例としては、注射（皮下注射、静脈内注射、非経口注射、腹腔内注射、髄腔内注射など）が挙げられる。注射は、ボーラス注入または連続注入であり得る。
【０１１５】
本発明の薬学的組成物としては、種々の機能（薬物濃度の調節、溶解度の調節、化学安定性、粘度の調節、吸収増強、ｐＨの調節などが挙げられる）を提供する種々の成分を含み得る薬学的キャリアが挙げられる。この薬学的キャリアは、適切な液体ビヒクルまたは賦形剤および任意の補助添加剤を包含し得る。この液体ビヒクルおよび賦形剤は、従来型であり市販されている。これらの実例は、蒸留水、生理学的生理食塩水、デキストロースの水溶液などである。水溶液処方物について、好ましくは、その薬学的組成物としては、好ましくはｐＨ約７と８との間の、緩衝剤（例えば、リン酸緩衝剤）または他の有機酸塩が挙げられる。弱溶解性化合物を含有する処方物について、例えば、０．０４〜０．０５％（ｗ／ｖ）の量の非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０）を使用することによって、マイクロエマルジョンが用いられ、溶解度が増加され得る。他の成分としては、抗酸化薬（例えば、アスコルビン酸）、親水性ポリマー（例えば、単糖類、二糖類、および他の糖質（セルロースまたはその誘導体）、デキストリン、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、および製薬化学（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、最新版（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．））において周知の類似の成分が挙げられ得る。
【０１１６】
本発明の標的化構築物としては、それらの薬学的に受容可能な塩が挙げられ、これらの塩としては、アルカリ土類（例えば、ナトリウムまたはマグネシウム）、アンモニウムまたはテトラアルキルアンモニウムの塩が挙げられる。他の薬学的に受容可能な塩としては、有機カルボン酸（例えば、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、イセチオン酸、ラクトビオン酸、およびコハク酸）；有機スルホン酸（例えば、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、およびベンゼンスルホン酸）；ならびに無機酸（例えば、塩酸、硫酸、リン酸、およびスルファミン酸）が挙げられる。ヒドロキシル基を有する化合物の薬学的に受容可能な塩としては、適切なカチオン（例えば、ナトリウム、アンモニウムなど）を有する、このような化合物のアニオンが挙げられる。
【０１１７】
この標的化構築物は、好ましくは、非経口投与、最も好ましくは、静脈内投与される。静脈内注射用の好ましい処方物は、この標的化構築物に加えて、等張性ビヒクル（例えば、塩化ナトリウム液、リンガー液、デキストロース液、デキストロースおよび塩化ナトリウム液、乳酸化リンガー液、または当該分野で公知のような他のビヒクル）を含むべきである。あるいは、この構築物は、放出制御性投薬形態で、皮下投与され得る。
【０１１８】
従来型キャリアでの投与に加えて、この標的化構築物は、種々の専門的なオリゴヌクレオチド送達技術によって、投与され得る。本発明の薬学的組成物とともに使用するのに適切な徐放系としては、フィルム、マイクロカプセルなどの形態の半透性ポリマーマトリクスが挙げられ、これらとしては、ポリラクチド；Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、および類似の物質（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０５３０５）が挙げられる。
【０１１９】
標的化構築物は、例えば、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第ＩＩ巻、Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｔｅｒｉａｌ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓに記載されるように、治療送達用のリポソームにカプセル化され得る。この標的化構築物は、その溶解度に依存して、水層および脂質層の両方に存在し得るか、または一般にリポソーム懸濁液と呼ばれるものに存在し得る。疎水性層は、排他的ではなく一般的に、リン脂質（例えば、レクチンおよびスフィンゴミエリン）、ステロイド（例えば、コレステロール）、イオン性界面活性剤（ジアセチルホスフェート、ステアリルアミン、またはホスファチジン酸）、および／または疎水性の性質を持った他の材料を含む。
【０１２０】
腫瘍または感染部位を処置または予防する好ましい用量は、５μｇ〜１００ｍｇの範囲内である。しかし、正確な用量は、大部分が、投与される治療剤の毒性に依存する。例えば、被験体は、１ミリグラムより多いブレオマイシン用量に耐えることができない。さらに、特定の化学療法ペプチドは、被験体にマイクログラム量で与えられた場合、血友病および他の血液障害を引き起こす。しかし、即時性の標的化構築物による治療剤の選択的な標的は、正常な体細胞に対する他の毒性効果を低減させる。
【０１２１】
（ＶＩ．標的化構築物の画像化の使用）
適切な画像化剤で標識される標的化構築物を、特定の腫瘍細胞株、組織型、または細菌感染組織培養物、ウイルス感染組織培養物もしくは真菌感染組織培養物に添加して、特定の候補標的化治療の結合親和性を試験し得る。標識された標的化構築物はまた、適切な被験体（例えば、サル、イヌ、ブタ、ウシ）に注射され得、次いで、腫瘍、組織型、またはインビボでの感染部位へのその結合がモニタリングされ得る。
【０１２２】
本発明の画像化剤は、当業者によって（例えば、核医学の専門医によって）、本発明の方法に従って使用され、被験体中の感染部位または炎症部位が画像化され得る。いかなる感染部位または炎症部位も、本発明の画像化剤を使用して画像化され得る。
【０１２３】
画像は、腫瘍部位、感染部位、または炎症部位にて蓄積する画像化剤の空間分布の差異によって、作製され得る。この空間分布は、特定の標識に適切な任意の手段（例えば、γ線カメラ、ＰＥＴ装置、ＳＰＥＣＴ装置など）を使用して、測定され得る。強いスポットが画像内にほとんど現れない場合、いくらかの病変がある証拠になり得、このことは、周辺組織に蓄積する画像化剤の濃度に対して、より低濃度の画像化剤が蓄積している組織の存在を示している。あるいは、病変は、画像内のより強いスポットとして検出可能であり得、このことは、周辺組織に蓄積する画像化剤の濃度に対して、病変部位における画像化剤の濃度が増加した領域を示している。病変におけるより低量またはより高量の画像化剤の蓄積は、視覚的に容易に検出され得る。あるいは、この画像化剤の蓄積の程度は、放射活性、蛍光または他の発光を定量するための公知の方法を使用して、定量され得る。特定の有用な画像化アプローチは、１種より多い画像化剤を使用して、同時研究を実施する。
【０１２４】
好ましくは、本発明の画像化剤の検出可能に有効な量が、被験体に投与され得る。本発明に従って、本発明の画像化剤の「検出可能に有効な量」は、臨床用途に利用可能な機器を使用して受容可能な画像を生じるのに十分な量として定義される。本発明の画像化剤の検出可能に有効な量は、１回以上の注射で投与され得る。本発明の画像化剤の検出可能に有効な量は、個人の感受性の程度、年齢、性別および個人の体重、個人の特異体質応答、線量測定のような因子によって変更され得る。本発明の画像化剤の検出可能に有効な量はまた、機器および膜関連因子によっても変更され得る。このような因子の最適化は、十分に、当業者のレベルの範囲内である。
【０１２５】
診断目的および画像化研究期間に使用される画像化剤の量は、この画像化剤を標識するために使用される放射性核種、患者の体重、処置されている状態の性質および重篤度、患者が経験する治療処置の性質、ならびに患者の特異体質応答に依存する。究極的には、担当医が、各個々の患者に投与する画像化剤の量、およびその画像化研究期間を決定する。
【０１２６】
本発明に従って処置され得る疾患および状態としては、特定の細胞を殺傷するまたはそれら細胞の増殖を低下もしくは阻害することが望ましい、任意の状態が挙げられる。このような実施形態において、細胞を殺傷する標的化構築物の有効荷重（ｐａｙｌｏａｄ）は、毒素であり得る。このような状態としては、過剰な細胞増殖または未制御の細胞増殖（例えば、良性癌および悪性癌）から生じる状態が挙げられる。一般には、増殖性疾患または状態のいかなる型も、本発明の標的化構築物を用いて（すなわち、それらの疾患および状態の少なくとも１つの症状を改善するために）処置され得る。処置され得る他の疾患としては、自己免疫疾患およびウイルス感染が挙げられる。
【０１２７】
疾患は、本発明の標的化オリゴヌクレオチドを被験体に投与することによって処置され得る。あるいは、標的化オリゴヌクレオチドは、エキソビボで細胞（例えば、被験体の細胞）に投与され得る。従って、１つの実施形態において、本発明は、疾患を有する被験体を処置するための方法を提供し、この方法は、被験体由来の細胞を得る工程、この細胞を、エキソビボで本発明の標的化構築物と接触させる工程、およびこの細胞を被験体中に戻して導入する工程を包含する。本発明の標的化構築物のエキソビボ投与はまた、処置目的ではなく、画像化目的のためにも使用され得る。
【０１２８】
本発明は、多数の癌の型（固形腫瘍、ならびに血球の癌、リンパ腫および白血病）を処置するために使用され得る。固形腫瘍癌としては、卵巣癌、乳癌、結腸直腸癌、黒色腫、膵臓癌、胃癌、胆嚢癌、食道癌、肺癌、神経膠腫、腎臓癌、および甲状腺癌が挙げられる。これらの腫瘍において特異的に発現される遺伝子は、例えば、米国特許第６，０９３，３９９号に記載される。例えば、乳癌を処置するために標的化構築物が指向され得る標的化遺伝子としては、以下が挙げられる：ｂｃｌ−１、ｂｃｌ−２、バソプレシン関連タンパク質；Ｎｏｒｔｈら、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．，３４（３）：２２９−３５（１９９５）；Ｈｅｌｌｅｍａｎｓ，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７２（２）：３５４−６０（１９９５）；およびＨｕｒｌｉｍａｎｎら、Ｖｉｒｃｈｏｗｓ  Ａｒｃｈ．，４２６（２）．１６３−８（１９９５）を参照のこと。他の癌腫を標的化するための遺伝子としては、例えば、以下が挙げられる：ｃ−ｍｙｃ、ｉｎｔ−２、ｈｓｔ−１、ｒａｓおよびｐ５３変異体；Ｉｓｓｉｎｇら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１３（６Ｂ）：２５４１−５１（１９９３）；Ｔｊｏａら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ，２８（１）：６５−９（１９９６）；Ｓｕｚｉｃｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２（２５）：１１５５３−７（１９９５）；およびＧｊｅｒｔｓｅｎら、Ｌａｎｃｅｔ，３４６（８９８７）：１３９９−４００（１９９５）を参照のこと。Ｂ細胞リンパ腫に標的化するための遺伝子としては、以下が挙げられる：ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３７、ならびに米国特許第６，０９９，８４６号に記載される遺伝子。腎臓癌腫に関連する遺伝子は、ＲＡＧＥ（Ｇａｕｇｌｅｒら、（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４４：３２３）である。前立腺癌に関連する遺伝子としては、以下が挙げられる：前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）（米国特許第５，５３８，８６６号）；前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）（Ｗａｔｔ  Ｋ  Ｗら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８６）８３：３１６６−３１７０）；および前立腺の酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）（Ｓｈａｒｉｅｆ，Ｆ．Ｓ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ（１９８９）１８０：７９−８６；Ｔａｉｌｏｒ，Ｐ．Ｇ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９９０）１８：４９２８）。膵臓癌または結腸直腸癌の処置について、標的化遺伝子は、癌胎児抗原（ＣＥＡ）（例えば、Ｂｅｎｃｈｉｍｏｌら、Ｃｅｌｌ，５７：３２７−３２４，１９８９を参照のこと）であり得る。黒色腫の処置について、標的化遺伝子は、メラニン細胞分化抗原−ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ  Ａ（Ｃｏｕｌｉｅら、１９９４，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：３５；Ｈａｗａｋａｍｉら、１９９４，ＰＮＡＳ  ９１：３５１５；Ｂａｋｋｅｒら、１９９４，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１００５）、ｇｐ１００、チロシナーゼ／アルビノ、ｐ９７黒色腫抗原、および種々のＭＡＧＥのいずれか（黒色腫関連抗原Ｅ）（ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ４などを含む）（Ｂｏｏｎ，Ｔ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ（１９９３年３月）：８２−８９；例えば、Ｚ���ａｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５６（２）：７００−１０（１９９６）；Ｋａｗａｋａｍｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８０（１）：３４７−５２（１９９４）；およびＴｏｐａｌｉａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１（２０）：９４６１−５（１９９４））であり得る。上記の遺伝子の少なくともいくつかは、膜タンパク質をコードするので、標的化構築物の標的化部分はまた、これらの膜タンパク質にも指向され得る。従って、特定の実施形態において、この標的化部分および核酸は、同じ遺伝子またはタンパク質に標的化される。
【０１２９】
ウイルス感染の処置について、標的化構築物は、ウイルスタンパク質をコードする核酸を含み得る。慢性感染を生じるウイルスとしては、以下が挙げられる：ヘパドナウイルス（ＨＢＶを含む）、レンチウイルス（ＨＩＶを含む）、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＶＺＶ、およびＨＨＶ−６を含む）、ならびにフラビウイルス属／ペスチウイルス属（ＨＣＶを含む）、ならびにＴ細胞白血病およびミエロパシーを引き起こすヒトレトロウイルス（例えば、ヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−２）。本発明に従ってまた処置され得る慢性感染を引き起こす他の生物体としては、例えば、以下が挙げられる：病原性原生動物亜界（例えば、ニューモシスティス、トリパノソーマ属、マラリアおよびトキソプラスマ）、細菌（例えば、ミコバクテリア、サルモネラ属およびリステリア属）および真菌（例えば、カンジダ属およびアスペルギルス属）。多数のこれらのウイルスのヌクレオチド配列（異なる種、株、および単離体を含む）は、当該分野で公知である。総説については、以下を参照のこと：Ｒｏｂｉｎｓｏｎ（１９９０）（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）；Ｌｅｖｙ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，５７：１８３−２８９（１９９３）（ＨＩＶ）；およびＣｈｏｏら、Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ，１２：２７９−２８８（１９９２）（ＨＣＶ）。
【０１３０】
例えば、ヘルペスウイルスのファミリーウイルス（単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）１型および２型（例えば、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２）を含む）による感染の処置について、標的化構築物は、以下に相補的なオリゴヌクレオチドを含み得る：糖タンパク質ｇＢ、ｇＤまたはｇＨをコードする遺伝子；水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶ  ｇＢおよびｇＨを含む）由来の遺伝子；ならびに他のヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ６およびＨＨＶ７を含む）由来の遺伝子。（例えば、Ｃｈｅｅら、Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓｅｓ（サイトメガロウイルス遺伝子の総説については、Ｊ．Ｋ．ＭｃＤｏｕｇａｌｌ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  １９９０）１２５−１６９頁；種々のＨＳＶ−１遺伝子の議論については、ＭｃＧｅｏｃｈら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）６９：１５３１−１５７４；ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２  ｇＢ遺伝子およびｇＤ遺伝子の議論については、米国特許第５，１７１，５６８号；ＥＢＶゲノムにおける遺伝子の同定については、Ｂａｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３１０：２０７−２１１；そして、ＶＺＶの総説については、ＤａｖｉｓｏｎおよびＳｃｏｔｔ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）６７：１７５９−１８１６を参照のこと）。
【０１３１】
ウイルスの肝炎ファミリー（Ａ型肝炎ウイルス、（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、デルタ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）およびＧ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）を含む）による感染はまた、本明細書中に記載されるように処置され得る。例によって、ＨＣＶのウイルスゲノム配列は、その配列を得るための方法と同様に、公知である。例えば、国際公開番号ＷＯ  ８９／０４６６９；ＷＯ  ９０／１１０８９；およびＷＯ  ９０／１４４３６を参照のこと。このＨＣＶゲノムは、数種のウイルスタンパク質（Ｅ１（Ｅとしてもまた公知である）およびＥ２（Ｅ２／ＮＳＩとしてもまた公知である）ならびにＮ−末端ヌクレオカプシドタンパク質（「コア」と呼ばれる）を含む）をコードする（ＨＣＶタンパク質（Ｅ１およびＥ２を含む）の議論については、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（１９９１）１４：３８１−３８８を参照のこと）。これらのタンパク質の各々をコードする遺伝子は、ウイルス感染を処置するために、本明細書中記載される標的化構築物で標的化され得る。
【０１３２】
標的化構築物が、ウイルスによって感染されていない細胞に侵入する場合でさえ、この標的化構築物は、ウイルス感染細胞内でより効率的に保持されると予測される。
【０１３３】
本発明はまた、細胞集団内の特定の細胞を選択的に改変（例えば、殺傷または標識）するための方法を提供する。１つの実施形態において、この細胞集団は、インビトロにある。この細胞集団は、被験体から得られ得る。この細胞集団は、本発明の標的化構築物とともにインキュベートされ得、ここで、その標的化部分は、標的された細胞（すなわち、改変されることが望ましい集団内の細胞）の細胞膜タンパク質（例えば、レセプター）と特異的に結合し、かつその核酸部分は、好ましくは高レベルで標的化細胞型において発現される遺伝子に相補的である。少なくとも数種の標的化細胞中に標的化構築物を取り込んだ後、細胞集団、またはその画分は、被験体（この被験体は、細胞集団が得られるものと、同じであっても異なっていてもよい）に投与され得る。
【０１３４】
１つの実施形態において、特定のリンパ球が、被験体の血球または骨髄細胞から取り除かれる。従って、この被験体の血球または骨髄細胞が得られ、標的化構築物の存在下、インビトロでインキュベートされ（ここにおいて、その標的化部分は、リンパ球に特異的に結合して取り除かれるが、本質的には、サンプル中の他の細胞（または少なくとも、サンプル中の他の主要な細胞）には結合しない）、そしてその標的化構築物は、その標的化細胞を殺傷するための治療用化合物またはそれら細胞の増殖を阻害するための治療用化合物をさらに含む。この標的化部分は、特定のＴリンパ球レセプター（例えば、自己抗原に結合するレセプター）に結合するリガンドであり得、この場合において、このリガンドは、自己抗原、またはＴ細胞レセプターによって識別される自己抗原のエピトープを有するその部分であり得る。治療用化合物は、アフラトキシンのような毒素であり得る。細胞と標的化構築物とのインキュベーションは、有意な量の標的化リンパ球がその標的化構築物を取り込むことができるのに十分な時間、行われ得る。インキュベーション時間は、そのインキュベーション時間の間に集団内に残存している標的化リンパ球の量をモニタリングすることによって決定され得る。インキュベーション後、細胞集団は、被験体に投与され戻され得る。標的化構築物もまた被験体に投与され得ることが、理解される。
【０１３５】
従って、本発明は、例えば、以下の自己免疫疾患を処置するための方法を提供する：インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）（自己抗原は、島細胞抗原（グルタミン酸デカルボキシラーゼを含む））；重症筋無力症（自己抗原は、アセチルコリンレセプターである）；および、自己免疫性甲状腺炎またはグレーヴズ病（甲状腺濾胞上皮細胞自己抗原）。他の潜在的な自己免疫疾患としては、以下が挙げられる：多発性硬化症；エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、ＡＬＳ（ルー・ゲーリグ病）、ならびに間質性膀胱炎および前立腺炎。
【０１３６】
本発明の標的化構築物はまた、一般に、任意の炎症性疾患にも使用され得、ここにおいて、その炎症性疾患の原因となるかまたはその炎症性疾患を悪化させるリンパ球の増殖を阻害するか、またはそのリンパ球を破壊することが望ましい。
【０１３７】
本発明は、いかなる様式においても制限されるように構成されるべきではない、以下の実施例によってさらに例示される。本出願の全体を通して引用される、参考文献、発行された特許、公開または非公開の特許出願を含めた、全ての引用文献の内容は、本明細書中で参考として明確に援用される。他に指示がなければ、本発明の実施は、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来技術（これらは、当業者の範囲内である）を用いる。このような技術は、文献において、完全に説明されている。（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，１９５号；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；第１５４巻および第１５５巻（Ｗｕら編）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第Ｉ巻〜第ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）を参照のこと）。
【実施例】
【０１３８】
（例示）
（実施例Ｉ：誘導体化ポリヌクレオチドの調製）
この実施例は、５’末端にて核酸分子を放射標識するための従来技術を記載する。
【０１３９】
ｃ−ｍｙｂ−オクタデカマー（ｏｃｔａｄｅｃａｍｅｒ）オリゴヌクレオチド（アンチセンスＹ−ＧＴＧ−ＴＣＧ−ＧＧＧ−ＴＣＴ−ＣＣＧ−ＧＧＣ（配列番号６））およびセンスＹ−ＧＣＣ−ＣＧＧ−ＡＧＡ−ＣＣＣ−ＣＧＡ−ＣＡＣ（配列番号７））を、以下で詳細に記載されるように、合成し、そして５’末端にて、高収率および高純度のヘキシルアミノホスホチオエート（Ｙ＝ＮＨ２−（ＣＨ２）６−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＳＨ）Ｏ−）を用いて誘導体化した。次いで、これらの誘導体化したｃ−ｍｙｂオリゴマーを、ＤＭＳＯ／水中、ｐ−ヨード［１２５Ｉ］−Ｎ−スクシンイミジルベンゾエートとともに反応させることによって放射ヨウ素標識し、これを、以下にもまた詳細に記載されるように、対応するｐ−トリブチルスズ−Ｎ−スクシンイミジルベンゾエートから、高収率および高純度で調製した（図２ＡおよびＢ）。適切なヨウ化物を加え、細胞取り込みを最適化するのに適切な特定の活性に到達させた。次いで、これは、ＯＤＮの標識効率を増加させた。
【０１４０】
（オリゴヌクレオチド合成）
オリゴヌクレオチドホスホロチオエートを、標準的なホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄｉｔｅ）化学による自動化シンセサイザー（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  ８７００，Ｍｉｌｌｉｇｅｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＩＶＩＡ）を用いて調製した。Ｎ−モノメトキシトリチルアミノヘキサ−６−オキシ−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホロアミダイト（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、最終カップリングに使用して、製造業者のプロトコルに従って５’末端を誘導体化した。ホスホロチオエート結合を、Ｂｅａｕｃａｇｅチオール剤（ｔｈｉｏｌａｔｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｉｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．，Ｕｚｎａｎｓｋｉ，Ｂ．，Ｂｏａｌ，Ｊ．，Ｓｔｏｒｍ，Ｃ．，Ｅｇａｎ，Ｗ．，Ｍａｔｓｕｋｕｒａ，Ｍ．，Ｂｒｏｄｅｒ，Ｓ．，Ｚｏｎ，Ｇ．，Ｗｉｌｋ，Ａ．＆  Ｋｏｚｉｏｌｋｉｅｗｉｃｚ  Ｍ．（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８，２８５５−２８５９）を用いて酸化することによって導入した。その粗製オリゴヌクレオチドである「ＭＭＴ−ｏｎ」ホスホロチオエートを、アセトニトリル（緩衝液Ａ：０．１Ｍ  酢酸アンモニウム、緩衝液Ｂ：８０％  アセトニトリル：２０％  緩衝液Ａ、ｖ／ｖ）の勾配を用いる、Ｃ−１８逆相カラム（１×２０ｃｍ）でのクロマトグラフィーによって調製した。溶出条件は、以下であった：１００％  Ａを２分間、その後、２ｍｌ／分の一定流速で、４５分間にわたって８０％  Ｂの線形勾配。８０％酢酸を用いてモノメトキシトリチル基を除去した後、オリゴヌクレオチドを、蒸留水に対して透析した（３６〜４０時間、Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｏｒ膜、分子量カットオフ：３５００Ｄａ）。ＷＡＸ−カラムによるＨＰＬＣおよびＰＡＧＥ電気泳動（２０％ゲル）は、単一種を示した（Ｍｅｔｅｌｅｖ，Ｖ．＆  Ａｇｒａｗａｌ，Ｓ．（１９９２）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２００，３４２−３４６）。
【０１４１】
（ｐ−トリ−Ｎ−ブチルスタニル安息香酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ｐ−ＢｕＡＴＥ）の調製）
パラ−ヨード安息香酸（２０．０ｇ）、メタノール（２００ｍＬ）および濃硫酸（５ｍＬ）の溶液を、加熱し、２０時間還流し、冷却し、５０ｍＬまで濃縮し、そして１Ｎの炭酸水素ナトリウム４００ｍＬを注いだ。この混合物を、エーテル（３×３００ｍＬ）で抽出し、そしてこのエーテル層を、水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、そして乾燥するまでエバポレートして、メチルパラ−ヨードベンゾエートをオフホワイトの固体として得た。これは、シリカゲルでのＴＬＣ（ヘキサン：酢酸エチル  ９５：５、Ｒｆ：０．７）により、単成分であった。この生成物を、さらに精製することなく使用した。
【０１４２】
乾燥トルエン（５０ｍＬ）中、メチルパラ−ヨードベンゾエート（５．２５ｇ、２０ｍｍｏｌ）、ヘキサブチルジチン（１７．５ｇ、３０ｍｍｏｌ）およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）酸化パラジウム（０．２２ｇ、０．２ｍｍｏｌ）を、１１０℃にて２４時間、窒素下で加熱した。この反応溶液を、冷却し、デカンタし、そして乾燥するまでエバポレートした。その濃い油状の残渣を、溶出液としてヘキサン：酢酸エチル（９：１）を使用する、シリカゲル（２３０ｇ）によるカラムクロマトグラフィーによって精製した。純粋な生成物を含有する画分を合わせて、乾燥するまでエバポレートして、透明なオイル６．８５ｇ（１６ｍｍｏｌ、８０％収率）を得た。
【０１４３】
水酸化カリウム（１．１５ｇ、２０ｍｍｏｌ）を、エタノール（１５０ｍＬ）中、メチルｐ−トリブチルスタニルベンゾエート（ｔｒｉｂｕｔｙｌｓｔａｎｎｙｌｂｅｎｚｏａｔｅ）（６．７ｇ、１６ｍｍｏｌ）の溶液に加え、そしてその混合物を、６時間加熱し、室温まで冷却し、そして１．６ｇの酢酸を含有する氷水（５０ｍＬ）中に注いだ。この混合物を、エーテル（３×２５０ｍＬ）で抽出し、そしてそのエーテル層を、ブラインで洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、そして乾燥するまでエバポレートした。得られたオイル（６．２ｇ）を、精製することなく、次の工程に使用した。
【０１４４】
オイル（６．２ｇ）を、５０ｍＬの乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中に溶解し、そしてジシクロヘキシルカルボジイミド（３．６４ｇ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（２．０４ｇ）を、連続して加えた。この反応混合物を、４０℃にて２０時間維持し、濾過してジシクロヘキシル尿素を除去し、そして乾燥するまでエバポレートした。この油状残渣を、溶出液としてヘキサン：酢酸エチル（３：１）を使用する、シリカゲル（１９０ｇ）によるカラムクロマトグラフィーによって精製した。この生成物を濃縮して、２工程の間に６０％収率にて透明なオイル（４．９ｇ、９．５ｍｍｏｌ）を得、これは、全収率の４８％であった。この化合物を調製するための手順を、図２Ａに要約する。メタトリ−ｎ−ブチルスタニル安息香酸およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを、本質的に、同じ様式で調製した。全ての生成物について、ＮＭＲスペクトルは、以前に報告されたスペクトル（Ｈａｎｓｏｎ，Ｒ．Ｎ．，Ｆｒａｎｋｅ，Ｌ．，Ｌｅｅ，Ｓ．Ｈ．＆  Ｓｅｉｔｚ，Ｄ．Ｅ．（１９８７）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄ．Ａｐｐｌ．Ｉｎｓｔｒｕｍ．［Ａ］３８，６４１−６４５）と同一であった。
【０１４５】
（Ｎ−スクシンイミジル−ｐ−［１２５Ｉ］−ベンゾエート（ｐ−ＩＢＴＥ）の調製）
ｐ−ＢｕＡＴＥの放射ヨウ素標識を、いくつかの改変を用いて、前記のように行った（Ｚａｌｕｔｓｋｙ，Ｍ．Ｒ．＆  Ｎａｒｕｌａ，Ａ．Ｓ．（１９８８）Ｉｎｔ  Ｊ．Ｒａｄ．Ａｐｐｌ．Ｉｎｓｔｒｕｍ．［Ａ］３９，２２７−２３２）。代表的には、１０〜２０μｌのＮａ１２５Ｉ（４００〜５００μｌ  Ｃｉ、Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＮａＯＨ中、２，５００〜３，０００μＣｉ／ｍｏｌ、ｐＨ：７〜８．５）、１０μｌのＫｌ（０．０４Ｎ）含有水、５〜１５μｌの２％酢酸含有クロロホルム、１０μｌのｔ−ブチルヒドロペルオキシド含有クロロホルム（１Ｍ）および２００μｇのｐ−ＢｕＡＴＥ含有クロロホルム（２ｍｇ／ｍｌ）を、５ｍｌの反応用バイアルに入れた。この反応を、室温にて、２０分間攪拌しながら行い、そして１０μｌの１０％  ＫＦ、１０μｌの飽和ＮａＨＳＯ３および１０μｌの飽和Ｎａ２ＣＯ３でクエンチした。この混合物を、ＣＨ２Ｃｌ２（３×１ｍｌ）で抽出し、そしてＮａ２ＳＯ４を含むカラム（４×０．４ｃｍ、パスツールピペット）によって脱水した。この溶媒を、窒素流下で、乾燥するまでエバポレートし、そしてその残渣を、３００μｌのクロロホルム中に溶解し、そして０．５ｇのシリカゲルカラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ，Ｉｎｃ．）に充填し、これを、１０ｍｌのクロロホルムで予洗した。放射標識された化合物を含有する画分（３×０．５ｍｌ、２〜５）を合わせて、窒素流を用いて、乾燥するまでエバポレートした。放射活性ストリップスキャナ（Ｂｉｏｓｃａｎ）を使用するＴＬＣシリカゲル（ヘキサン：酢酸エチル  ３：２、Ｒｆ＝０．４）によって決定された放射化学純度は、９６％を越えた。放射化学収率は、４０〜５６％の範囲であった。
【０１４６】
（［１２５Ｉ］ｃ−ｍｙｂオリゴヌクレオチドの調製）
５’アミノ誘導体化オリゴヌクレオチド（「Ｓ−ＯＤＮ」）（０．４〜０．５ｍｇ）を、０．１Ｎ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．５）の滅菌溶液５０μｌ中に溶解した。５０μｌのＤＭＳＯ中に溶解した放射ヨウ素標識化ｐ−ＩＢＴＥを添加し、この混合物を、１５０℃で１時間反応させた。放射標識化Ｓ−ＯＤＮを、ＰＢＳで溶出する、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｉｎｃ．）での２サイクルのサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。アリコート（０．７ｍｌ）を、所望の画分を合わせる前に、ＵＶ吸収（ＯＤ２６０ｎｍ）および放射活性についてモニタリングした。この化合物を調製するための手順を、図２Ｂに例示する。Ｓ−ＯＤＮ（センスおよびアンチセンスｃ−ｍｙｂ）のストック溶液を、各々の配列中に存在するヌクレオチドのモル吸光係数を考慮して、２６０ｎｍでの吸収によって決定された量の未標識物質の添加によって、９６μＭに調節した（３１）。各溶液の１０μｌアリコートは、約２２，０００ＣＰＭ（１５．４ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）を含んだ。ラットにおける生体分布実験において、放射標識Ｃ−ｍｙｂアンチセンスを、未標識化合物で希釈しなかった；比活性（７，４００ｍＣｉ１２５Ｉ／ｍｍｏｌｅのＯＤＮ）。
【０１４７】
ヘキシルアミノテザーでのオリゴヌクレオチドホスホロチオエートの６位の誘導体化は、オリゴマーの特異的放射標識のための一般的かつ簡便な方法を示す。遊離アミノ基は、疎水性溶媒（例えば、ＤＭＳＯ）中の活性化エステルの迅速な求核攻撃を促進する。室温で、この反応は、１時間以内に完了し、そして放射標識収率は、比較的高かった（＞４０％）（図２Ｂ）。この収率は、活性化エステルを溶解するために水溶液が使用される場合に、減少した（＜６％）。これらの条件下で、より低い温度およびより長いインキュベーション時間は、収率を改善しなかった。イオン交換カラムによる単純な精製により、高い放射化学的純度が得られた（＞９６％）。
【０１４８】
（実施例２）
（５’−ｐ−ヨード−［１２５Ｉ］−ベンゾエート誘導体化ｃ−ｍｙｂの放射安定性）
放射標識化合物を、−２０℃で６ヶ月間保存した。この時間の間に、この溶液を９回解凍し、そして１〜２時間にわたって４〜１０℃の間の温度で維持した。次いで、この生成物の完全性を、Ｃ−１８  ＲＰ  ＨＰＬＣ（Ｍｉｃｒｏｓｏｒｂ；５ｍ、２５ｃｍ×４．６ｍｍ）によって評価した。移動相は、以下からなった：緩衝液Ａ：０．１Ｎ  酢酸Ｎａ（ｐＨ６．３）、緩衝液Ｂ−アセトニトリル。溶出条件は、以下であった：１００％のＡ、０〜３分；０〜５０％のＢ（３〜３０分）、流速＝１．５ｍｌ／分。吸光度を、２５４ｎｍでモニタリングした。１２５Ｉ放射活性を、ウェルカウンター（ＬＫＢ）で各画分（０．７５ｍｌ）を計数することによって測定した。図３に示されるように、放射標識化合物は、−２０℃で保存された場合には、少なくとも６ヶ月までにわたって安定であった。
【０１４９】
（実施例３）
（ヒト血清における１２５Ｉ−ｃ−ｍｙｂホスホロチオエートの安定性）
ヒト血清を、０．９％  ＮａＣｌで６０％（Ｗ／Ｖ）まで希釈し、そして０．２ｇｍ  Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）フィルタで濾過した。２５μｌ（９６Ｍ、２，２００ＣＰＭ／ｌ）のＳ−ＯＤＮ（センスｃ−ｍｙｂ）を、８０μｌの血清溶液に添加して、２２μＭの最終濃度を得た。この混合物のアリコートを、３６〜３７℃の水浴中で、０時間、１時間、２時間および４時間にわたってインキュベートし、そしてサンプルを、分析まで−２０℃で保存した。
【０１５０】
分析に使用したカラムおよび溶出液は、上記と同じであった。溶出プロフィールを改変して、ＯＤＮの溶出前にカラムからタンパク質を洗浄（ｆｌｕｓｈ）した。溶出条件は、以下であった：１００％のＡ（０〜１０分）、０〜１００％のＢ（１１〜３０分）、１００％のＢ（３０〜３５分）、流速＝１．５ｍｌ／分。放射活性を、アリコート（各々、０．５分間にわたって収集された）において測定した。
【０１５１】
これらの結果は、３６〜３７℃にて４時間までの、ヒト血清（４５％）との１２５Ｉ−ｃ−ｍｙｂホスホロチオエート（２μＭ）のインキュベーションが、最小の脱ヨウ素化（＜２％）；１〜２分でのピーク溶出を生じたことを示した。画分のＨＰＬＣ分析は、ほとんどの放射活性が、ＵＶ活性オリゴヌクレオチド分子と関連したことを示した。予測されるように、ＨＰＬＣ分析は、この放射標識オリゴヌクレオチドの分解についての主要な部位が、３’末端であったことを示唆した（１７〜１８分の間のピーク溶出）。ヒト血清中の分解産物は、４時間のインキュベーション後に、６．４％増加した。
【０１５２】
画像化適用または治療適用のいずれかのために、悪性組織に対して活性なアンチセンスオリゴヌクレオチドを標的化することは、その５’末端に放射性標識を配置することによって改善され得、そして安定性は、以前に記載されたように（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．，Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｄ．Ｄ．，Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｊ．Ｇ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ａ．，Ｓｔｒｕｈｌ，Ｋ．，Ａｌｂｒｉｇｈｔ，Ｌ．Ｍ．，Ｃｏｅｎ，Ｄ．Ｍ．＆Ｖａｒｋｉ，Ａ．（１９８７）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ．（Ｊ．Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、ｐｐ．Ａ．３Ｄ．１−８）、その３’末端をブロックすることによって改善される。血清中での放射ヨウ素化オクタデカマーの安定性は、トリチウム化Ｓ−ＯＤＮでの研究（Ｔｅｍｓａｍａｎｉ，Ｊ．ら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．１９９３，３，２７７−２８４；Ａｇｒａｗａｌ，Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９１，８８，７５９５−７５９９）の結果と良好に一致した。インビトロおよびインビボで検出された微量な程度の脱ヨウ素化は、この放射標識方法が、代謝的に安定な放射性医薬品を生じることを示す。この放射標識のインビボでの安定性は、画像化研究の解釈を単純化するはずである。
【０１５３】
（実施例４）
（時間の関数としての、オリゴヌクレオチドのインビトロ取り込み）
この実施例は、標識化ｃ−ｍｙｂオリゴヌクレオチドの取り込みを、３つの異なる細胞株において時間の関数として記載する。
【０１５４】
ＮＩＨ−３Ｔ３マウス繊維芽細胞、ヒト神経芽細胞腫（ＳＫ−Ｎ−ＳＨ）およびヒト腸平滑筋細胞（ＨＩＳＭ）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．２０１１０から得た。細胞を、５％ＣＯ２／９５％空気下で、１０％（Ｖ／Ｖ）ウシ胎仔血清およびペニシリン／ストレプトマイシンを含むイーグルＭＥＭまたはＤＭＥＭ中で、７５ｃｍ２のフラスコ中で増殖させた。他の補充物を、ＡＴＣＣの指示に従って添加した。細胞を、各実験の３６〜４８時間前に、１２ウェルプレートに播種し、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞株およびＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞株について約１０５細胞／ウェル、そしてよりゆっくりと増殖しているＨＩＳＭ細胞について約２．５〜３×１０４細胞／ウェルの最終細胞数を与えた。コンフルエント未満の単層を使用した。
【０１５５】
各実験の一日目に、インキュベーション培地を、（剥離した細胞または死細胞を除去するために）１０％  ＦＣＳを含む新たなＤＭＥＭで置換し、そして血小板を、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、この培地を、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液および放射標識化ｃ−ｍｙｂホスホロチオエートアナログ（最終濃度５μＭ）を含む３５０μｌのＤＭＥＭで置換した。一定の条件を確実にするために、この培地を、５％ＣＯ２含有雰囲気中で、３７℃にて、予めインキュベートした。全ての実験を、三連ウェルで少なくとも２回実施した。これらの細胞を、図４に示される時間にわたって、オリゴヌクレオチドとインキュベートした。
【０１５６】
各インキュベーション時間の終わりで、細胞に関連するＳ−ＯＤＮ放射活性の濃度（取り込み反応速度論）を決定するために、ウェルを、１．０ｍｌの氷冷リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ、３×）で洗浄して、細胞外の放射活性を除去し、その後０．５ｍｌの１Ｎ  ＮａＯＨで溶解した。この細胞溶解物をプールし、３７℃で少なくとも２時間のインキュベーション後に、引き続き水で洗浄した（０．５ｍｌ）。１２５Ｉ放射活性を、ウェル型自動γカウンターで測定した。細胞数を、温ＰＢＳ（×３）で洗浄し、その後トリプシン処理した平行ウェルから決定した。
【０１５７】
統計的分析を、一方向または二方向のＡｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｖａｒｉａｎｃｅ（ＡＮＯＶＡ）によって実施した。個々の平均を、複数の比較について較正して、Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定によって比較した。全ての結果を、平均±ｓｅｍで表す。０．０５未満のＰ値を、有意とみなした。
【０１５８】
ＨＩＳＭ細胞株、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞株およびＮＩＨ−３Ｔ３細胞株による、センスおよびアンチセンスの１２５Ｉ−ｃ−ｍｙｂホスホロチオエートについての取り込み反応速度論は、全ての場合において、インキュベーション時間の関数としての増大した細胞取り込みを実証した（図４）。３つ全ての細胞株において、ｃ−ｍｙｂホスホロチオエートのセンス形態の取り込みは、対応するアンチセンス化合物の取り込みよりも低かった。予測されるように、センス取り込みとアンチセンス取り込みとの間の最も大きい差異は、ＨＩＳＭ細胞において観察された（図４Ａ）。この細胞株は、ｃ−ｍｙｂを発現することが公知である。オリゴヌクレオチドの非特異的取り込みは、多くの細胞株において観察されているので（Ａｇｒａｗａｌ，Ｓ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２，１９９８，ｐｐ．５１９−５２８）、神経芽細胞腫細胞および繊維芽細胞における非特異的取り込みは、驚くべきことではない。
【０１５９】
（実施例５）
（濃度の関数としての、オリゴヌクレオチドのインビトロ取り込み）
この実施例は、３つの異なる細胞株において、標識化ｃ−ｍｙｂオリゴヌクレオチドの取り込みをオリゴヌクレオチド濃度の関数として記載する。
【０１６０】
ＨＩＳＭ細胞、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞およびＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、上記のように、放射標識したｃ−ｍｙｂのセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドと共にインキュベートした。但し、これらのオリゴヌクレオチドとの全てのインキュベーションは、４０分間行い、濃度は、図５に示されるとおりであった。
【０１６１】
これらの結果は、ＨＩＳＭ細胞が、漸増する濃度の放射標識化アンチセンスと共に顕著な取り込みの増加（１μＭで約１０％および７．５μＭで約３０％）を示したが、一方、標識化センスが、僅かな変化だけ（７．５μＭで約７％に対して、１μＭで約５％）しか示さなかったことを示す（図５Ａ）。神経芽細胞腫細胞株を用いて、研究した濃度範囲にわたって、アンチセンス取り込みは変化しなかった（１〜７．５μＭの濃度について約７％）（図５Ｂ）。同じ濃度範囲にわたって、センス化合物は、より低い取り込み（約２％）を示した。繊維芽細胞細胞株について、１μＭでの取り込み％は、センスおよびアンチセンスの両方について類似であった（約４％）（図５Ｃ）。この取り込みは、漸増するセンス濃度と共に減少した（７．５μＭで−１％）が、一方アンチセンスでは、取り込みが７．５μＭで約５．５％まで僅かに減少したのと比べて、５μＭでは約６％まで増大した。これらの知見は、トリチル化オリゴヌクレオチドを用いて実施した研究の結果と一致する。
【０１６２】
図６はまた、１μＭのオリゴヌクレオチド濃度での２０秒間のインキュベーション後（最初の２つの柱）、または１μＭもしくは７．５μＭのオリゴヌクレオチド濃度での４０分間のインキュベーション後（図６の柱３〜６）に、ＳＫ−ＳＮ−ＮＨ細胞株に取り込まれた放射標識したセンスおよびアンチセンスのｃ−ｍｙｂオリゴヌクレオチドの量を示す。
【０１６３】
５μＭの最終総濃度で４０分間にわたるＳＫ−Ｓ−ＮＨ細胞とのインキュベーションの前に、室温で１０分間にわたって等モル濃度で、センスおよびアンチセンスのストック溶液のアリコートを同時インキュベートすることは、細胞に結合した放射活性を、ほぼバックグラウンドレベルにまで低減させた（図６の最後の柱）。比較として、同じ細胞を、５μＭのアンチセンスｃ−ｍｙｂと共に４０分間にわたってインキュベートした（図６の最後から２つ目の柱）。これらの結果は、一本鎖Ｓ−ＯＤＮについての輸送系の特異性の程度（Ｌｏｋｅ，Ｓ．Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６，３４７４−３４７８；Ｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ａ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３，３２，４８５５−４８６１）ならびに、細胞結合および細胞取り込みに対する分子電荷の重要な役割を示す
（実施例６）
（オリゴヌクレオチドの取り込みおよび保持）
この実施例は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの保持が、センスオリゴヌクレオチドの保持よりも高いこと、そして細胞中のＲＮＡの存在が、対応するアンチセンス分子の保持を増大することを、実証する。
【０１６４】
ＨＩＳＭ細胞、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞およびＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、上記のように、１２５Ｉ−ｃ−ｍｙｂホスホロチオエートセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｓ−ＯＤＮ）５μＭと共に、１時間または２時間にわたってインキュベートした。Ｓ−ＯＤＮとの細胞のインキュベーション後、放射活性培地を完全に吸引し、そしてウェルを、１ｍｌの予め暖めたＤＭＥＭ（３７℃／５％ＣＯ２）で穏やかに洗浄した。次いで、細胞を、１ｍｌのＤＭＥＭ（３７℃／５％ＣＯ２）と共に３０分間（洗浄期間）インキュベーションし、その後冷ＰＢＳで２回洗浄した（洗浄反応速度論）。
【０１６５】
ｃ−ｍｙｂセンス配列およびｃ−ｍｙｂアンチセンス配列の吸収および相対的保持を、表１および図７に示す。ＨＩＳＭ細胞株について、インキュベーションの１時間後および２時間後にとられた１２５Ｉ−ｃ−ｍｙｂホスホロチオエートアンチセンスの放射活性の８０％よりも多くが、３０分間にわたって保持された（表１中のデータは、正規化された細胞結合放射活性として示される）が、一方で、センスオリゴマーでは、放射活性の５２％だけが保持された。これらの知見は、トリチル化オリゴヌクレオチドを用いて得られた結果と一致する。神経芽細胞腫細胞株で、１２５Ｉ−ｃ−ｍｙｂホスホロチオエートアンチセンスの保持は、６０分間および１２０分間のインキュベーションにわたって、それぞれ、６６％および８２％であった。対応するセンス化合物では、保持は有意に低く、６０分間および１２０分間のインキュベーションにわたって、それぞれ、３８％および４４％であった。最初の細胞結合放射活性は、ヒト由来のＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞株およびＨＩＳＭ細胞株と比較して、ＮＩＨ−３Ｔ３マウス繊維芽細胞において高かった。しかし、保持値（表１）は、ヒト細胞株において有意により高かった。ＨＩＳＭ細胞は、ｃ−ｍｙｂ  ｍＲＮＡ配列を発現することが公知であるので（Ｓｉｍｏｎｓ，Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，１９９２，３５９，６９−７０；Ｓｉｍｏｎｓ，Ｍ．ら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，１９９２，７０，８３５−８４３）、他の２種の細胞株の取り込みおよび保持と比較した、ＨＩＳＭ細胞による放射標識化ｃ−ｍｙｂアンチセンス（センスではなく）の、より高い取り込みおよび保持は、細胞中のｍＲＮＡの存在が、このような細胞における本発明の構築物の取り込みおよび保持を増大させることを示唆する。
【０１６６】
（表ＩＩＩ．１時間もしくは２時間の連続インキュベーションおよび３０分間の洗浄期間後の、３つの細胞株における１２５Ｉ−ｃ−ｍｙｂセンスオリゴヌクレオチドおよび１２５Ｉ−ｃ−ｍｙｂアンチセンスオリゴヌクレオチドの保持％（詳細については、方法を参照のこと））
【０１６７】
【表３】
2005503795.tif 000004
（実施例７）
（ラットにおけるｃ−ｍｙｂアンチセンスの生体分布）
ＣＤ  Ｆｉｓｈｅｒラット（１７５〜２２５ｇ）に、尾部静脈を介して、１５〜２０μＣｉの放射標識化ｃ−ｍｙｂアンチセンスを注射した（ラット１匹当たり、約１０μｇのｃ−ｍｙｂアンチセンス）。これらのラットを、注射の５分後、３０分後、６０分後および１２０分後に、頸部脱臼によって屠殺し、そして血液、心臓、肝臓、腎臓、筋肉、胃、胃腸管および脳のサンプルを計量し、そしてウェル型γカウンターを用いて放射活性を測定した。放射活性の減衰について較正するため、および投与された用量の関数としての各器官における放射活性の濃度の算出を可能にするために、注射した用量のアリコートを、同時に計数した。これらの結果を、１グラム当たりの注射用量％（％  Ｉ．Ｄ．／ｇ）として示した。６匹のラットを、各時点において研究した。
【０１６８】
図８に示される結果は、ラットにおける１２５Ｉ標識化ｃ−ｍｙｂオクタデカマーが、循環からの迅速なクリアランス（主に、腎クリアランスによって説明される）を示すことを示す。低レベルの取り込みが、静止性組織（骨、骨格筋および特に脳（ここでは、血液脳関門が、蓄積をさらにブロックする））において観察された。他方、迅速に分裂する組織（例えば、胃粘膜および胃腸管）は、放射標識のいくらかの蓄積を示した。これらの結果は、Ｚａｍｅｃｎｉｋら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９４，９１，３１５６−３１６０）（これは、Ｓ−ＯＩＤＮの細胞侵入が、細胞周期事象に関連することを示す）によって公開されたデータと一致する。遊離ヨウ素は、胃における放射活性の蓄積を部分的に説明するだけである。本発明者らの結果は、脱ヨウ素化が、４時間のインキュベーション後の、ヒト血清における活性の２％のみであったことを示した。本発明の実験において使用されるｃ−ｍｙｂアンチセンスオリゴヌクレオチドは、４つ連続するＧ残基（これは、それ自体、細胞内の生体保持において役割を果たす）を有するセグメントを含む。
【０１６９】
結果として、本発明者らは、以下を記載する：（ｉ）単純かつ迅速な放射ヨウ素化のために、ｃ−ｍｙｂホスホロチオエートを誘導体化するための、簡便かつ有効な方法。放射標識化産物は、インビトロおよびインビボで優れた放射化学的安定性を有する。（ｉｉ）１２５Ｉ−ｃ−ｍｙｂ−ホスホロチオエートは、種々の細胞株において、配列特異的な取り込みおよび保持を示した。（ｉｉｉ）相補的ｃ−ｍｙｂ  ｍＲＮＡ発現を発現することが公知であるヒト平滑筋細胞は、最も高いレベルの取り込みおよび保持を示し、そしてトリチル化化合物を用いたインビトロ研究およびインビボ研究の結果を確認し、そして（例えば、細胞における取り込みおよび／または保持を増大させるために）標的化複合体中にアンチセンス分子を含むことの利点を確認する。（ｉｖ）ラットの平行研究における生体分布研究を、トリチル化オリゴヌクレオチドを用いて実施した。これらの結果は、新規放射標識手順が、アンチセンスの生化学的特性を変更せず、従って、診断的画像化および放射線療法についての新規トレーサーを提供し得ることを示す。
【０１７０】
（等価物）
本明細書中に記載される実施例および実施形態は、限定ではなく例示としてであり、そして特許請求の範囲に示される本発明の精神および範囲から逸脱することなしに、他の実施例が使用され得ることが、当業者に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０１７１】
【図１】図１は、核酸分子（Ｎ．Ａ．）、標的化部分（Ｔ．Ｍ．）、およびペイロードから構成される、標的化構築物の構造の模式図を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、スキーム１の化学合成を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、スキーム２の化学合成を示す。
【図３】図３は、−２０℃で６ヶ月間保存した後の、１２５Ｉ−ｃ−ｍｙｂアンチセンス（点線）ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドおよび１２５Ｉ−ｃ−ｍｙｂセンス（連続線）ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）図である。
【図４】図４Ａは、時間の関数として、ＨＩＳＭ細胞による、１２５Ｉ−ｃ−ｍｙｂホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（上の線）および１２５Ｉ−ｃ−ｍｙｂホスホロチオエートセンスオリゴヌクレオチド（下の線）の量を示す。図４Ｂは、時間の関数として、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞による、１２５Ｉ−ｃ−ｍｙｂホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（上の線）および１２５Ｉ−ｃ−ｍｙｂホスホロチオエートセンスオリゴヌクレオチド（下の線）の量を示す。図４Ｃは、時間の関数として、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞による、１２５Ｉ−ｃ−ｍｙｂホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（上の線）および１２５Ｉ−ｃ−ｍｙｂホスホロチオエートセンスオリゴヌクレオチド（下の線）の量を示す。
【図５】図５Ａは、細胞培養物に添加されたオリゴヌクレオチドの濃度の関数として、１０５細胞あたりの、ＨＩＳＭ細胞による、１２５Ｉ−ｃ−ｍｙｂホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（上の線）および１２５Ｉ−ｃ−ｍｙｂホスホロチオエートセンスオリゴヌクレオチド（下の線）の取り込み％を示す。データを、１０５細胞あたりの、適用された活性の合計のパーセントに対して正規化する。図５Ｂは、細胞培養物に添加されたオリゴヌクレオチドの濃度の関数として、１０５細胞あたりの、ＳＫ−Ｓ−ＮＨ細胞による、１２５Ｉ−ｃ−ｍｙｂホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（上の線）および１２５Ｉ−ｃ−ｍｙｂホスホロチオエートセンスオリゴヌクレオチド（下の線）の取り込み％を示す。データを、１０５細胞あたりの、適用された活性の合計のパーセントに対して正規化する。図５Ｃは、細胞培養物に添加されたオリゴヌクレオチドの濃度の関数として、１０５細胞あたりの、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞による、１２５Ｉ−ｃ−ｍｙｂホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（上の線）および１２５Ｉ−ｃ−ｍｙｂホスホロチオエートセンスオリゴヌクレオチド（下の線）の取り込み％を示す。データを、１０５細胞あたりの、適用された活性の合計のパーセントに対して正規化する。
【図６】図６は、２０秒間（最初の２つのカラム）または４０分間にわたって、表示される濃度のオリゴヌクレオチドと共にインキュベートしたＳＫ−Ｓ−ＮＨ細胞による、１２５Ｉ−ｃ−ｍｙｂホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（格子縞のカラム）および１２５Ｉ−ｃ−ｍｙｂホスホロチオエートセンスオリゴヌクレオチド（単色のカラム）または２つの混合物（最後のカラム）の取り込みを（１ウェルあたりの放射活性の量として）示す。
【図７】図７は、６０分間または１２０分間、オリゴヌクレオチドとインキュベートし、次いで、オリゴヌクレオチドなしで３０分間倍地中で洗浄およびインキュベーション（すなわち、洗い流し）した、ＨＩＳＭ細胞、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞およびＮＩＨ−３Ｔ３細胞による、１２５Ｉ−ｃ−ｍｙｂホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび１２５Ｉ−ｃ−ｍｙｂホスホロチオエートセンスオリゴヌクレオチドの取り込みおよび保持を示す。
【図８】図８は、１グラムあたりの注入用量のパーセントとして表される、オリゴヌクレオチドでのラットの注射（「ｐ．ｉ．」）の後の種々の時間で、ラットの種々の器官に存在する（「生体分布」）、１２５Ｉ−ｃ−ｍｙｂホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドの量を示す。各値は、６匹の動物についての平均±ｓｅｍである。
【図１】
2005503795.tif 000005
【図２Ａ】
2005503795.tif 000006
【図３】
2005503795.tif 000007
【図４】
2005503795.tif 000008
【図５】
2005503795.tif 000009
【図６】
2005503795.tif 000010
【図７】
2005503795.tif 000011
【図８】
2005503795.tif 000012
【国際公開パンフレット】
2005503795.tif 000013
2005503795.tif 000014
2005503795.tif 000015
2005503795.tif 000016
2005503795.tif 000017
2005503795.tif 000018
2005503795.tif 000019
2005503795.tif 000020
2005503795.tif 000021
2005503795.tif 000022
2005503795.tif 000023
2005503795.tif 000024
2005503795.tif 000025
2005503795.tif 000026
2005503795.tif 000027
2005503795.tif 000028
2005503795.tif 000029
2005503795.tif 000030
2005503795.tif 000031
2005503795.tif 000032
2005503795.tif 000033
2005503795.tif 000034
2005503795.tif 000035
2005503795.tif 000036
2005503795.tif 000037
2005503795.tif 000038
2005503795.tif 000039
2005503795.tif 000040
2005503795.tif 000041
2005503795.tif 000042
2005503795.tif 000043
2005503795.tif 000044
2005503795.tif 000045
2005503795.tif 000046
2005503795.tif 000047
2005503795.tif 000048
2005503795.tif 000049
2005503795.tif 000050
2005503795.tif 000051
2005503795.tif 000052
2005503795.tif 000053
2005503795.tif 000054
2005503795.tif 000055
2005503795.tif 000056
2005503795.tif 000057
2005503795.tif 000058
2005503795.tif 000059
2005503795.tif 000060
2005503795.tif 000061
2005503795.tif 000062
2005503795.tif 000063
2005503795.tif 000064
2005503795.tif 000065
2005503795.tif 000066
2005503795.tif 000067
2005503795.tif 000068
2005503795.tif 000069
2005503795.tif 000070
2005503795.tif 000071
2005503795.tif 000072
2005503795.tif 000073
2005503795.tif 000074
2005503795.tif 000075
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005503795.tif 000076
【国際調査報告】
2005503795.tif 000077