(57)【要約】    本発明は腫瘍性及び非腫瘍性疾患における細胞分化の低下を抑える医薬品組成物の調製のための逆転写酵素（ＲＴ）抑制剤化合物の使用に関するものであって、前記化合物はＲＴサブユニットｐ６６の疎水性ポケットに結合できる。かかる使用に特に好ましいものは以下の化合物である：ネビラピン、エファビレンツ、デラビルジン、それらの対応する塩及び／又は医薬品として受入可能な誘導体。
2005513147.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性成分として逆転写酵素（ＲＴ）の少なくとも１つの抑制化合物の有効量を含んでなり、前記化合物はＲＴサブユニットｐ６６に疎水性ポケットを結合させることができることを特徴とする、腫瘍性及び非腫瘍性疾患における細胞分化の低下を抑える医薬品。
【請求項２】
前記腫瘍性疾患が、白血病ならびに上皮癌、間葉性腫瘍、神経系の腫瘍、テラトカルシノーマ、繊維−及び骨−肉腫、結腸癌、乳癌、神経膠腫及び肝癌の様な固形癌の群から選択される、請求項１に記載の医薬品。
【請求項３】
腫瘍性及び非腫瘍性疾患における細胞分化の低下を抑える医薬品組成物の調製のための逆転写酵素の少なくとも１つの抑制化合物の使用。
【請求項４】
前記化合物が、分化した細胞を表現型上正常な細胞に再転換させる、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記腫瘍性疾患が、白血病ならびに上皮癌、間葉性腫瘍、神経系の腫瘍、テラトカルシノーマ、繊維−及び骨−肉腫、結腸癌、乳癌、神経膠腫及び肝癌の様な固形癌の群から選択される、請求項３に記載の使用。
【請求項６】
前記化合物が５，１１−ジヒドロ−６Ｈ−ジピリド［３，２−ｂ：２’，３’−ｅ］［１，４］ジアゼピン類の化合物より選択される、請求項３〜５のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
前記化合物がネビラピン、エファビレンツ、デラビリジン、それらの対応する塩及び／又は医薬品として受入可能な誘導体の群から選択される、請求項３〜５のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
前記医薬品組成物が、経口、静脈内、筋肉内又は皮下注射投与用の組成物の調製のためにキャリア及び／又は希釈剤及び／又は溶媒及び／又は賦形剤を更に含む、請求項３〜７のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
前記医薬品組成物がピル、懸濁液又は溶液の形状である、請求項３〜８のいずれかに記載の使用。
【請求項１０】
抗増殖活性を持つ医薬品組成物の調製のための５，１１−ジヒドロ−６Ｈ−ジピリド［２，３−ｂ：２’３’−ｅ］［１，４］ジアゼピンの使用。
【請求項１１】
抗増殖活性を持つ医薬品組成物の調製のためのネビラピン、エファビレンツ、デラビリジン、それらの対応する塩及び／又は医薬品として受入可能な誘導体の群から選択される少なくとも１つの化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は癌のような増殖性及び分化型疾患の治療及び／又は予防において治療的使用のための細胞増殖の拮抗剤及び細胞分化の誘導剤としての逆転写酵素（ＲＴ）非ヌクレオシド抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
内因性の非末端重合性逆転写酵素（ＲＴ）はあらゆる真核生物ゲノム中に豊富に存在する２種類の反復要素：レトロトランスポゾン及び内因性レトロウイルス（非特許文献１、非特許文献２）にコードされている酵素である。一般には、ＲＴをコードする遺伝子の発現は分化を終了した正常組織では抑制されているが−この場合は基礎レベルでのみ検出できる−哺乳動物の生殖細胞系、胚組織及び腫瘍細胞では非常に活発である。細胞増殖や分化といった基本的なプロセスでＲＴが果たす役割はまだ明らかにされていない。それぞれ商品名ＶＩＲＡＭＵＮＥ（登録商標）、ＳＵＳＴＩＶＡ（登録商標）及びＲＥＳＣＲＩＰＴＯＲ（登録商標）としても知られるネビラピン（Ｎｅｖｉｒａｐｉｎｅ）、エファビレンズ（Ｅｆａｖｉｒｅｎｚ）及びレスクリプター（Ｒｅｓｃｒｉｐｔｏｒ）は非ヌクレオシド性ＲＴ抑制剤として知られており、抗レトロウイルス剤としてＡＩＤＳ治療に広く用いられている。具体的には、ネビラピンは実験式Ｃ15Ｈ14Ｎ4Ｏを持つ。純粋状態では、それは分子量２６６．３０２、融点２４７〜２４９℃及び水溶解度０．１ｍｇ／ｍｌ、エタノール溶解度５．５ｍｇ／ｍｌの結晶固体であり、特許文献１の記載の指示に従って調製できる。ネビラピン（５，１１−ジヒドロ−１１−シクロプロピル−４−メチル−６Ｈ−ジピリド−［３，２−ｂ：２’３’−ｅ］［１，４］ジアゼピン−６−オン）は５，１１−ジヒドロ−６Ｈ−ジピリド［３，２−ｂ：２’３’−ｅ］［１，４］ジアゼピンの化合物群に含まれ、それらはＲＴの非ヌクレオシド抑制剤として知られており、特許文献１に記載のようにＨＩＶ感染の予防及び治療に用いられている。
【０００３】
エファビレンズ（分子量３１５．６８）（−）−６−クロロ−４−シクロプロピルエチニル−４−トリフルオロメチル−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−３，１−ベンゾキシザジン−オン［参照により本明細書への記載に代える：１．非特許文献３］
レスクリプター（分子量５５２．６８）［１−（５−メタンスルホンアミド）−１Ｈ−インドール−２−イル−カルボニル］−４−［３−（イソプロピルアミノ）−２−ピリジニル］ピペラジン］（参照により本明細書への記載に代える：１．非特許文献４、２．非特許文献５。
【特許文献１】欧州特許第４２９，９８７号公報
【非特許文献１】ｄｉ  Ｍａｒｚｏ  Ｖｅｒｏｎｅｓｅ  Ｆ、Ｃｏｐｅｌａｎｄ  ＴＤ、ＤｅＶｉｃｏ  ＡＬ、Ｒａｈｍａｎ  Ｒ、Ｏｒｏｓｚｉａｎ  Ｓ、Ｇａｌｌｏ  ＲＣ、Ｓａｍｇａｄｈａｒａｎ  ＭＧ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （１９８６年）２３１、１２８９〜９１−Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈｌｙ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｐ６６／ｐ５１  ａｓ  ｔｈｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ｏｆ  ＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ
【非特許文献２】Ｇｒｏｂ  ＰＭ、Ｗｕ  ＪＣ，  Ｃｏｈｅｎ  ＫＡ，  Ｉｎｇｒａｈａｍ  ＲＨ，  Ｓｈｉｈ  ＣＫ，  Ｈａｒｇｒａｖｅ  ＫＤ，ＭｃＴａｇｕｅ  ＴＬ，  Ｍｅｒｌｕｚｚｉ  ＶＪ  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  （１９９２年）８，１４５〜５２  Ｎｏｎｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ＨＩＶ−１  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ：ｎｅｖｉｒａｐｉｎｅ  ａｓ  ａ  ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ  ｄｒｕｇ
【非特許文献３】ＹＯＵＮＧ，Ｓ．Ｄ．；ＢＲＩＴＣＨＥＲ，Ｓ．Ｆ．；ＴＲＡＮ，Ｌ．Ｏ．；ＰＡＹＮＥ，Ｌ．Ｓ．；ＬＵＭＭＡ，Ｗ．Ｃ．；ＬＹＬＥ，Ｔ．Ａ．；ＨＵＦＦ，Ｊ．Ｒ．；ＡＮＤＥＲＳＯＮ，Ｐ．Ｓ．；ＯＬＳＥＮ，Ｄ．Ｂ．；ＣＡＲＲＯＬＬ，Ｓ．Ｓ．；ＰＥＴＴＩＢＯＮＥ、Ｄ．Ｊ．；Ｏ’ＢＲＩＥＮ，Ｊ．Ａ；ＢＡＬＬ，  Ｒ．Ｇ．；ＢＡＬＡＮＩ，Ｓ．Ｋ．；ＬＩＮ，Ｊ．Ｈ．；ＬＯＮＧ，Ｗ．Ｊ．；ＢＹＲＮＥＳ，Ｖ．Ｗ．；ＥＭＩＮＩ，Ｅ．Ａ．；ＥＴ  ＡＬ．，Ｌ−７４３，７２６（ＤＭＰ−２６６）：Ａ  ＮＯＶＥＬ、ＨＩＧＨＬＹ  ＰＯＴＥＮＴ  ＮＯＮＮＵＣＬＥＯＳＩＤＥ  ＩＮＨＩＢＩＴＯＲ  ＯＦ ＴＨＥ  ＨＵＭＡＮ  ＩＭＭＵＮＯＤＥＦＩＣＩＥＮＣＹ  ＶＩＲＵＳ  ＴＹＰＥ  １  ＲＥＶＥＲＳＥ  ＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴＳＥ．ＡＮＴＩＭＩＣＲＯＢ  ＡＧＥＮＴＳ  ＣＨＥＭＯＴＨＥＲ  ３９（１２）：２６０２〜２６０５（１９９５年）
【非特許文献４】ＲＯＭＥＲＯ，Ｄ．Ｌ．；ＭＯＲＧＥ，Ｒ．Ａ．；ＧＥＮＩＮ，Ｍ．Ｊ．；ＢＩＬＥＳ，Ｃ．；ＢＵＳＳＯ，Ｍ．；ＲＥＳＮＩＣＫ，Ｌ．；ＡＬＴＨＡＵＳ，Ｉ．Ｗ．；ＲＥＵＳＳＥＲ，Ｆ．；ＴＨＯＭＡＳ，Ｒ．Ｃ．；ＴＡＲＰＬＥＹ，Ｗ．Ｇ．ＢＩＳ（ＨＥＴＥＲＯＡＲＹＬ）ＰＩＰＥＲＡＺＩＮＥ（ＢＨＡＰ）  ＲＴ  ＩＮＨＩＢＩＴＯＲＳ：ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ−ＡＣＴＩＶＩＴＹ  ＲＥＬＡＴＩＯＮＳＨＩＰＳ  ＯＦ  ＮＯＶＥＬ  ＳＵＢＳＴＩＴＵＴＥＤ  ＩＮＤＯＬＥ  ＡＮＡＬＯＧＵＥＳ  ＡＮＤ  ＴＨＥ  ＩＤＥＮＴＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＭＯＮＯＭＥＴＨＡＮＥＳＵＬＦＯＮＡＴＥ（Ｕ−９０１５２Ｓ）．Ｊ  ＭＥＤ  ＣＨＥＭ  ３６（１０）：１５０５〜１５０８（１９９３年）
【非特許文献５】ＲＯＭＥＲＯ，Ｄ．Ｌ．；ＯＬＭＳＴＥＤ，  ＲＡ．；ＰＯＥＬ，Ｔ．Ｊ．；ＭＯＲＧＥ，Ｒ．Ａ．；ＢＩＬＥＳ，Ｃ．；ＫＥＩＳＥＲ，Ｂ．Ｊ．；ＫＯＰＴＡ，Ｌ．Ａ．；ＦＲＩＩＳ，Ｊ．Ｍ．；ＨＯＳＬＥＹ，Ｊ．Ｄ．；ＳＴＥＦＡＮＳＫＩ，Ｋ．Ｊ．；ＷＩＳＨＫＡ，Ｄ．Ｇ．；ＥＶＡＮＳ，Ｄ．Ｂ．；ＭＯＲＲＩＳ，Ｊ．；ＳＴＥＨＬＥ，Ｒ．Ｇ．；ＳＨＡＲＭＡ，Ｓ．Ｋ．；ＹＡＧＩ，Ｙ．；ＶＯＯＲＭ  ＡＮ，Ｒ．Ｌ．；ＡＤＡＭＳ，Ｗ．Ｊ．；ＴＡＲＰＬＥＹ，Ｗ．Ｇ．ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ  ＤＥＬＡＶＩＲＤＩＮＥ／ＡＴＥＶＩＲＤＩＮＥ  ＲＥＳＩＳＴＡＮＴ  ＨＩＶ−１：ＩＤＥＮＴＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  （ＡＬＫＹＬＡＭＩＮＯ）ＰＩＰＥＲＩＤＩＮＥ−ＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧ  ＢＩＳ（ＨＥＴＥＲＯＡＲＹＬ）ＰＩＰＥＲＡＺＩＮＥＳ  ＡＳ  ＢＲＯＡＤ  ＳＰＥＣＴＲＵＭ  ＨＩＶ−１  ＲＥＶＥＲＳＥ  ＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴＡＳＥ  ＩＮＨＩＢＩＴＯＲＳ．Ｊ  ＭＥＤ  ＣＨＥＭ  ３９（１９）：３７６９〜３７８９（１９９６年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
我々のグループの予備研究は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精（ＩＶＦ）アッセイで調製した胚培養体に加えた場合、ネビラピン及びエファビレンツは共に初期マウス胚の発生を迅速かつ効果的に停止することを示している。この観察は、両薬剤が細胞増殖を抑制できる可能性を最初に示したものであり、我々が腫瘍細胞に対するそれらの効果を試験するきっかけとなった。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は非ヌクレオシドＲＴ抑制剤が細胞増殖を低下させながら細胞分化を促進するという発見に基づいている。
【０００６】
ここに用いる用語「抑制剤」は、ＲＴ分子との直接結合を介して酵素活性を妨害する化合物を意味する。より具体的には、ネルビラピン及びエファビレンツは共に、触媒部位近くに局在しているＲＴサブユニットｐ６６の疎水性ポケットに結合し、それによりその機能を無効にする。この定義に従い、そして本発明の範囲内では、上記市販化合物、即ちＶＩＲＡＭＵＮＥ（ネビランピン）、ＳＵＳＴＩＶＡ（エファビレンツ）及びＲＥＳＣＲＩＰＴＯＲ（デラビルジン）ならびＲＴ活性を妨害できるその他化合物は、細胞分化低下及び未制御の細胞増殖を特徴とする病気の治療及び／又は予防に用いることができる。故に本発明の目的は、予防及び／又は治癒的治療に使用して脱分化型の病気の分化低下を阻止でき、及び腫瘍治療に抗増殖性薬剤として使用できる、上記メカニズムによるＲＴ抑制活性を示す非ヌクレオシド化合物の使用である。具体的には、細胞の増殖及び脱分化のプロセスを拮抗するＲＴ抑制剤は、ヒトの腫瘍、特に白血病ならびにテラトカルシノーマ、繊維肉腫や骨肉腫、結腸癌、乳癌、神経膠腫及び肝癌といった固形癌を含む上皮性腫瘍、間葉性腫瘍及び神経系の腫瘍の治療に用いることができる。
【０００７】
本発明では薬学的に近い形態をも含め、非ヌクレオシドＲＴ抑制剤としての活性を有し、現在ＡＩＤＳの治療に用いられている市販化合物の使用が非ヌクレオチドＲＴ抑制剤の中に含まれるのは明らかである。なかでもＶｉｒａｍｕｎｅ（登録商標）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）、Ｓｕｓｔｉｖａ（登録商標）（エファビレンツ）（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）及びＲｅｓｃｒｉｐｔｏｒ（登録商標）（Ａｇｏｕｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）が特に好ましい。
【０００８】
一般に使用され、そして市販の医薬品形態を持つ上記引用化合物、具体例としてネビラピンは、細胞分化及び／又は細胞増殖の制御が必要な場合に用いる医薬組成物の調製に有用な、従って分化及び抗腫瘍活性を持つ化合物例と考えられる。分子の治療効果はそれらのＲＴ抑制能力と関連して見いだされるものである。
【０００９】
発明の別の目的は、分化及び抗腫瘍作用を用いた哺乳動物、特にヒトにおける細胞増殖の予防又は治療処理である。
【００１０】
その他目的は発明の詳細な説明から明らかになるだろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
まず我々はＰＣＲをベースとしたＲＴアッセイを用いて、各種マウス及びヒト腫瘍細胞株抽出物の中に内因性のＲＴ活性、即ち抑制剤の標的となる酵素を検出した。
【００１２】
次に我々はマウス前駆細胞（即ちＣ２Ｃ７筋原前駆細胞；ＮＩＨ／３Ｔ３胚繊維芽細胞）ならびにマウス及びヒト腫瘍細胞株（Ｆ９テラトカルシノーマ；Ｌ９２９繊維肉腫細胞；ＨＴ−２９結腸癌細胞；エストロゲン受容体発現（ＥＲ＋）ＭＣＦ−７乳癌細胞；ＥＲ発現陰性（ＥＲ−）のＭＤＡ−２３１乳癌細胞；Ｕ３４３Ｍｇ神経膠腫細胞及びＳａｏｓ−２骨肉腫細胞）の培養体に３５０〜４００μＭのネビラピン又は１０〜２０μＭのエファビレンツを数日間加えた。結果はＲＴ抑制剤が細胞増殖率の低下を誘導し、細胞分化を促進することを示した。形態学的、機能的及び免疫表現型アッセイより、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞株（ＮＢ４、ＨＬ６０、Ｋａｓｕｍｉ−１）及びＡＭＬ患者由来の初代芽球細胞でも分化が観察されることが示された。
【００１３】
ネビラピン曝露前後にＦ９細胞より抽出したｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析は、細胞周期を決定制御する一群の遺伝子の遺伝子発現が大きく再プログラミングされることを示した：サイクリンＤ１及びＤ３はダウンレギュレーションを受けた；逆にその拮抗体であるｐ１６はアップレギュレーションを受けた；程度は低いがｐ２７キナーゼ抑制剤ならびにＲｂ−１及びＲｂ−２網膜芽腫関連遺伝子もダウンレギュレーションを受けた。
【００１４】
これらの結果はａ）内因性のＲＴ活性が腫瘍形成に関係していること、及びｂ）ＲＴ抑制剤が腫瘍表現型から正常表現型への変換を促進するという見方を支持している。前駆細胞が発現しない特異的分化マーカーを使って、即ちＦ９細胞についてはコラーゲンＩＶα鎖そしてＣ２Ｃ７細胞についてはミオシンをそれぞれ使って、ネビラピンが誘導する分化について多能性Ｆ９及び胚性Ｃ２Ｃ７細胞株で詳しく調べた。さらに形態（核／細胞質比率及び好塩基性斑の減少）、機能（ＮＢＴアッセイ）及び免疫表現型（系統特異的表面抗原の発現）レベルの研究は、ネビラピン処理がＡＭＬ患者由来初代形質転換芽球細胞のヒトＡＭＬ細胞株に存在する分化阻止を救済できることを示した。
【００１５】
これらの発見に基づいて、我々は上記メカニズムによるＲＴ抑制活性を示す非ヌクレオシド化合物は横紋筋肉腫の様な脱分化型疾患に見られる分化低下を抑える薬物として、ならびに腫瘍、特に白血病及びテラトカルシノーマ、繊維肉腫や骨肉腫、結腸癌、乳癌、神経膠腫や肝癌等の固形癌を含む上皮癌、間葉性腫瘍及び神経系腫瘍の治療のための抗増殖性薬物として、予防的及び／又は治癒的治療に使用することを提言している。
【００１６】
好ましい化合物は、非ヌクレオシド化合物としての活性を持つ、市販され、且つＡＩＤＳ治療に用いられている化合物である。特に好ましいものは：Ｖｉｒａｍｕｎｅ（ネビラピン）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）、Ｓｕｓｔｉｖａ（エファビレンツ）（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）及びＲｅｓｃｒｉｐｔｏｒ（デラビルジン）（Ａｇｏｕｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）である。
【００１７】
一般に使用されている市販の医薬品形態の上記化合物及び特別な例としてのネビラピンは、分化を管理しなければならず同時に細胞増殖を抑制する症例に採用される医薬品組成物、従って分化作用及び抗腫瘍作用を持つ医薬品組成物の調製に有用な物質の例として提案されている。分子の治療効果はそれらのＲＴ抑制能と関連するものである。
【００１８】
発明による細胞増殖の予防的又は治療的処理は、哺乳動物、特にヒトで実施できる。
【００１９】
処理を必要とする被検者は非ヌクレオシドＲＴ抑制剤としての活性を示す化合物の少なくとも１つを治療効果量用いて治療することができ、被験者に治療的利益を与えることができる。
【００２０】
発明の非ヌクレオシド化合物を薬品組成物中に用いて分化及び抗腫瘍作用を持つ薬剤を調製できる。本発明に記載する使用に適した組成物は、少なくとも１つの活性成分の有効量と、ピル、溶液、懸濁液といった医薬品として使用可能な調剤への活性化合物の加工を容易にする１又はそれ以上の生理学的に受け入れ可能なキャリア及び／又は希釈剤及び／又は溶媒及び／又は賦形剤及び添加剤とを一つに混合することで得られるだろう。これら医薬品組成物は周知の方法、例えば通常の混合、溶解、顆粒化、ドラシュ化、研和化、乳剤化、カプセル化、封入又は凍結乾燥の工程により製造されるだろう。調剤は選択した投与経路に合わせ適切に行われる。医薬品組成物は経口又は静脈内、筋肉内もしくは皮下注射により投与されるだろう。
【００２１】
用途、投与量及び投与方法は、欧州特許第４２９、９８７号に記載の指示に従う。
【００２２】
投与量及び投与の様式は疾患のタイプ及び重症度によって変わる。
【００２３】
次に上記分子を使用した幾つかの実験実施例を記載することにする。しかし本発明による好ましい化合物の化学構造は多様であることから、発明はかかる分子に限定されるものではなく、ＲＴ抑制剤として活性を示す他化合物も同様に使用できることが理解されるであろうことを強調しなければならない。
【００２４】
以下の実施例は例示であり、本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例１】
【００２５】
（腫瘍細胞の内因性ＲＴ活性）
本明細書記載の抑制剤の標的であるＲＴ酵素活性は、本発明の中でＰＣＲをベースとするアッセイで試験したマウス及びヒト起源両方の細胞株全てに検出されている。図１Ａにまとめた結果は、全ての細胞株の細胞溶解物が外因性ＲＮＡ（ＭＳ２ファージＲＮＡ）をｉｎ  ｖｉｔｒｏで逆転写できるＲＴ活性を持ち、予想通りの大きさ、即ち１１２ｂｐ（レーン１〜１３）の増幅産物を生成したことを示している；ｃＤＮＡは、インキュベーション混合物からＭＳ２ＲＮＡ（レーン１４）又は細胞溶解物（レーン１６）を除くと合成されなかった。更にＲＴ活性は細胞溶解物をネビラピンと前インキュベーションすると容量依存的に抑制された：１１２ｂｐ産物は１００μＭ（レーン２２）とのインキュベーションでは低下したが、１（レーン２０）又は１０μＭ（レーン２１）とのインキュベーションでは低下しなかった。腫瘍細胞内のＲＴ酵素の存在は、ウエスタンブロッティング分析でも確認された。図１Ｂは、タンパク質分子が特異的抗ＲＴポリクローナル抗体によって、完全細胞（ＷＣＥ）及び核溶解物内の両方に認められることを示している。
【００２６】
これらの結果はＲＴが腫瘍細胞内に、タンパク質としても、酵素活性としても存在していること、そしてそれがネビラピンで抑制されることを示している。
【実施例２】
【００２７】
（マウス及びヒト細胞培養体とネビラピンのインキュベーション：細胞倍加細胞の減速）
マウスＣ２Ｃ７筋原前駆細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３胚繊維芽細胞、Ｆ９テラトカルシノーマ及びＬ９２９繊維肉腫細胞、及び以下の細胞株由来のヒト細胞：Ｓａｏｓ−２骨肉腫細胞、ＨＴ−２９結腸癌細胞、ＭＤＡ−２３１乳癌細胞（ＥＲ−）、ＭＣＦ７乳癌細胞（ＥＲ＋）、Ｕ３４３神経膠腫細胞を１０〜２０％の胎児血清及び保存溶液（２５０ｍＭ）を１００％ＤＭＳＯで希釈した３５０μＭネビラピン液を含むＤＭＥＭで培養した。細胞を３５ｍｍペトリ皿に２〜５×１０4の密度で播き、５〜６時間後にネビラピンに曝露した。指定した時間にサンプルを抜き取り、ネビラピン曝露及びコントロール（ＤＭＳＯ曝露）培養体の細胞数を測定した。図２にまとめた結果は、ネビラピンへの曝露（破線）が全ての細胞株で増殖率を下げることを示している。薬物のこの抑制作用に対する反応には細胞のタイプ特異的な差が幾つか観察された：Ｆ９テラトカルシノーマ細胞は最も強い反応を示し、１２０時間の曝露後の増殖率は５倍低下した。同等の効果はＨＴ−２９結腸癌細胞でも示された。Ｓａｏｓ−２骨肉腫細胞は最も反応が遅いタイプであり、曝露５日目になってようやくコントロール培養体に比べ増殖率が低下し始めた。
【実施例３】
【００２８】
（細胞培養体とネビラピンとのインキュベーション：細胞周期からの離脱）
ネビラピン曝露培養細胞のＦＡＣＳ分析は、あるタイプの細胞で細胞周期プロフィールに変化があることを示した：図３Ａに見られる様に、ＮＩＨ／３Ｔ３、ＨＴ−２９、ＭＣＦ−７及びＵ３４３Ｍｇの培養体では、ネビラピン処理７２時間後にＧ０／Ｇ１  ＤＮＡ含有量を持つ細胞が蓄積したのに対し、同時に行ったコントロールサンプルは増殖培養細胞に典型的な細胞周期プロフィールを示した。これに伴って、ネビラピンに曝露したＮＩＨ／３Ｔ３、ＨＴ−２９、ＭＣＦ−７（図３Ｂ）及びＵ３４３Ｍｇ神経膠腫細胞（未提示）では、曝露なしのコントロールに比べサイクリンＤ１のレベルが大きく低下した。
【実施例４】
【００２９】
（細胞培養体とネビラピンとのインキュベーション：分化誘導）
特徴がよく分かっているパターンでｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化できるモデル細胞システムを用いて、ネビラピンが細胞分化のプロセスに影響することが示された。単核筋芽細胞として増殖するマウスＣ２Ｃ７筋原随伴細胞は、増殖因子を除去すると分化を誘導することができ、筋肉特異的遺伝子を発現する多核筋管を形成する。我々の実験では、ネビラピンあり、又は無しにＣ２Ｃ７細胞を９０時間培養してから（この間にコントロールの培養体は定常密度に達した）分化培地に移し４８時間置いた。明視野顕微鏡を使ってスコア化（無作為に選び出した視野のｎ＝３００細胞）したところ、多核筋管（即ち３個以上の核を持つ細胞）と単核／２核細胞の比率がネビラピン処理サンプルでは約１：１であったの対し未処理サンプルでは１：２であった。細胞単層をさらに筋肉分化の後期マーカーであるミオシン重鎖（ＭＨＣ）に対するポリクローナル抗体を用いた免疫蛍光法（ＩＦ）で分析した。４８時間分化培地に維持したコントロール培養体では、多核型のＭＨＣ含有筋管は、ネビラピンで前処理した培養体のもの（図４Ｄ）に比べ細く、非常に小さかった（図４Ｃ）。コントロール培養体では単独筋芽細胞は殆どＭＨＣ陰性であった（図４Ａ）の対し、ネビラピン処理プレートの単独筋芽細胞ではミオシン合成が既に活性化されていた（図４Ｅ）。
【００３０】
ネビラピンはまたテラトカルシノーマＦ９細胞の分化も誘発した。未処理のＦ９細胞は円形であり、増殖中に凝集する傾向があった（図５ａ）。周知の分化促進因子であるレチノイン酸（ＲＡ）に曝露すると、７２時間後には凝集形成傾向の低下、分化形態の出現を伴った細胞表面接着及び再編成の増加を含む形態分化に特徴的な徴候が出現した（図５ｅ）。同様の変化がネビラピン曝露培養体にも観察された（図５ｉ）。形態再編成に伴って、ＲＡに反応して誘導される分化マーカーであり（図５ｇ）、コントロールの培養体では合成が低レベルである（図５ｃ）ＩＶ型コラーゲン（α１）鎖の合成が増加した（図５ｋ）。図４と５の結果をまとめると、ネビラピンは２種類の細胞で分化を誘発、又はその開始を促進することが示された。
【実施例５】
【００３１】
（ネビラピン処理はヒト急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）芽球の分化を誘導する）
我々は、前急性骨髄細胞芽球に存在しその分化を阻止しているｔ（１５；１７）癌タンパク質ＰＭＬ／ＲＡＲを発現している急性前骨髄細胞ＮＢ４、及び急性骨髄芽急性白血病ＨＬ６０細胞株におけるネビラピンの効果を、既知である両細胞のＲＡ誘導顆粒球細胞分化感受性と比較して分析した。５日間のネビラピン処理では両細胞株とも骨髄単球に似た形態の細胞が顕著に出現した（図６）のに対し、１μＭのＲＡでは報告通り後骨髄球様の形態を持つ細胞が誘導され（図６及び未提示データ）。次に我々はＲＡ又はネビラピン存在下に４日間培養した後、３種類の表面抗原、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４及びＣＤ１５の発現を分析した（表１）。ＣＤ１１ｂの誘導は顆粒球分化を伴い、そしてＣＤ１４は単球特異的抗原であると考えられており、そしてＣＤ１５は骨髄単球抗原である。ＣＤ１４とＣＤ１１ｂの同時誘導は単球分化と関係している。ＲＡ処理は顆粒球分化の誘導と一致して、両細胞株でＣＤ１１ｂ及びＣＤ１５レベルを上げたが、ＣＤ１４レベルは上げなかった。ネビラピン処理ＮＢ４及びＨＬ６０細胞には、強いＣＤ１５の発現と程度は低いがＣＤ１１ｂ及びＣＤ１４マーカーの発現誘導を認めた。即ちネビラピン処理は骨髄単球分化マーカーの発現を誘導したが、これは形態学研究の結果と一致した。ネビラピン処理はまたＮＢＴ色素還元アッセイにおいて陽性細胞数を約２．０〜３．５倍増加した（表２）。
【００３２】
ネビラピンの分化効果を、ＲＡ誘導顆粒球分化の感受性が低い、ｔ（８；２１）転座産物ＡＭＬ１／ＥＴＯを発現しているＫａｓｕｍｉ−１細胞株の様な骨髄性白血病細胞、及び２名のＡＭＬ患者に由来する初代芽球細胞で更に分析した。ネビラピン処理は、実際に増殖を停止することはないが、ゆっくりとではあるが一定に細胞周期Ｇ１期に細胞を蓄積した（データ未提示）。さらにＫａｓｕｍｉ−１細胞及び初代ＡＭＬ芽球細胞は共にネビラピン処理に反応し、（ｉ）初期核分離を伴う染色質凝縮、細胞質好塩基性の低下及び核周辺におけるゴルジ領域の出現（ＡＭＬ＃１例に特有の顆粒が見られた）から成る骨髄単球分化と関連した形態変化（図６）；（ｉｉ）ＮＢＴ陽性度の増加により示される機能変化（表２）；（ｉｉｉ）骨髄性免疫表現型マーカーであるＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４及びＣＤ１５の発現変化（表１及びデータ未提示）の誘導で表される分化を開始した。初代ＡＭＬ芽球に誘導された骨髄性分化の程度は、ＮＢ４及びＨＬ６０細胞に誘導されたものと同等であった。
【００３３】
【表１】
2005513147.tif 000003
【００３４】
【表２】
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【実施例６】
【００３５】
（ネビラピン処理Ｆ９細胞における細胞周期制御遺伝子の発現変化）
ネビラピンの増殖及び分化に対する影響能力が特定遺伝子の発現の変化に反映するかを調べるために、コントロール、ネビラピン−及びＲＡ−曝露Ｆ９細胞よりＲＮＡを抽出し、半定量ＲＴ−ＰＣＲ分析にかけた。我々はＤ型サイクリン；増殖抑制因子；アポトーシス変調因子；及びハウスキーピングタンパク質をコードする遺伝子群について調べた。代表的なパネルを図７Ａに示し、定量化した結果を図７Ｂに示した。最も顕著な変化はサイクリンＤ１遺伝子について示され、ネビラピンに曝露しなかったＦ９培養体に比べネビラピン曝露培養体では７倍ダウンレギュレーションされ、一方Ｄ型サイクリンの主要な拮抗因子をコードするｐ１６INKAaは８倍近くアップレギュレーションされた。アップレギュレーションは細胞形態及び接着に反応して増殖を決定的に変調するｐ２７Ｋｉｐ１；増殖サイクルからの離脱と関連するＲｂ−２／ｐ１３０；及び幾つかのタイプの細胞で増殖停止を促進できるＢｃｌ−２にも見られた。サイクリンＤ３発現はネビラピンに反応してダウンレギュレーションを受けた。ハウスキーピング遺伝子（β−アクチン、ＧＡＰＤＨ）ならびにｐ５３の発現には影響がないことから、これらの変化は特異的であった。
【実施例７】
【００３６】
（マウス細胞培養体とエファビレンツとのインキュベーション：当量量効果）
ＮＩＨ／３Ｔ３胚繊維芽細胞及びＦ９テラトカルシノーマ細胞を、１０〜２０％の胎児血清、及び２濃度のエファビレンツ、即ち１００％ＤＭＳＯ保存溶液（１０ｍＭ）を希釈して得た１０及び２０μＭのエファビレンツを含むＤＭＥＭで培養した。細胞を３５ｍｍペトリ皿に２〜５×１０4の密度で播き、５〜６時間後にエファビレンツに曝露した。指定した時間にサンプルを抜き取り、同時に行った非曝露細胞培養体と比較しながら、ネエファビレンツ曝露培養体の細胞数を測定した。図８の結果は、非曝露細胞（実線）に比べエファビレンツへの曝露（破線）は容量依存的な形で両方の細胞株の増殖率を下げることを示している。
【実施例８】
【００３７】
（ヒト細胞培養体とエファビレンツとのインキュベーション：時間依存性）
エファビレンツの効果をヒトＨｅＬａ腺癌及びＳａｏｓ−２骨肉腫細胞で更に調べた。両細胞株を上記条件（実施例６）で培養した。薬物への曝露時間を延長した場合に、増殖抑制の効果が高まるか調べるために、両細胞株を連続する２サイクルの中でエファビレンツに曝露した：第一サイクルでは５日間２０μＭのエファビレンツに細胞を連続曝露した；その後細胞を希釈してから再度接種し、翌日に新しい薬物を用いて２回目の曝露サイクルを開始した。図９の結果は、ＨｅＬａ（パネルＡ）及びＳａｏｓ−２（パネルＢ）細胞株は共にエファビレンツに感受性であり、細胞増殖率が大きく低下したことを示している。この抑制効果は時間依存的であったが、それはＨｅＬａ及びＳａｏｓ−２培養体のいずれでも第一曝露サイクル（５日間）が１．６−及び１．５−倍の減少をそれぞれもたらしたのに対し、第二サイクル（曝露開始から２０日目までに実施した）では５−及び４−倍の減少を得たからである。
【実施例９】
【００３８】
（ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるネビラピンの抗腫瘍作用：モーリス３９２４Ａラット肝癌の治療）
ａ）ラット株及び腫瘍の特徴
ラット株：ＡＣＩ／Ｔ近交系（約１８０グラム）
腫瘍：モーリス３９２４Ａ肝癌は増殖の速い腫瘍で、近交系ＡＣＩ／Ｔ動物に発生する。接種３週後の腫瘍サイズは約１０ｃｍ3であった。
【００３９】
腫瘍細胞の調製：肝癌細胞は接種後約２週の動物から調製した。腫瘍は動物から外科的に取り出し、結合組織及び壊死組織から分離し、小片に切り刻んだ。次に腫瘍断片を滅菌した生理溶液に浮遊させ、サイズの大きな針が付いた２０ｍｌのシリンジを用いて一方の大腿部の内側に接種した。通常は０．５ｍｌの細胞浮遊液を注射した。腫瘍移植の成功率はほぼ９９％であった。
方法：ネビラピン液（保存液＝１８０ｍｇ／２ｍｌ  ＤＭＳＯ）を毎日０．２ｍｌ／ラットの割合で１１日間（１８ｍｇ／ラット／日）注射して３匹のラットをネビラピンで前処理した。１１日目に前処理したラットと３匹の未処理コントロールラットに肝癌細胞を皮下接種した。
結果：接種から１７日後、コントロールラットは２〜４ｃｍ3の典型的な腫瘍を示したが、一方ネビラピン前処理動物は１匹が注射部位に数ミリメートルの小さな結節を示しただけであった。図１０の時間曲線は、コントロール（実線）及びネビラピン処理ラット（破線）に腫瘍増殖速度に差があることを示している。
【００４０】
コントロールの増殖曲線は３匹の動物の平均値を示しているが、一方ネビラピンの曲線は処理動物の中で小さな腫瘍が発生した１匹の動物の増殖速度を表している。腫瘍組織を未処理及びネビラピン処理ラットの両方から外科的に取り出し、組織学分析にかけた。図１１は、未処理サンプル（パネルＣＴＲ）に比べて、ネビラピン処理ラット（パネルＮＥＶ）由来のサンプルでは形質転換面積が大きく減少し、そして細胞が明瞭なアポトーシスの特徴を表していることを示している。
【００４１】
結論すると、ネビラピン前処理は遺伝的に肝癌が発生しやすいラットに実験的に誘導した肝癌の発生及び増殖を効果的に拮抗した。２匹のラットは腫瘍接種後も最後まで健康な状態を保ったが、残りの１匹には小さな腫瘍が見つかった。未処理ラットは、同一条件で増殖が速い腫瘍を発生し（３／３）、２７日以内に死亡した。
【実施例１０】
【００４２】
（Ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるネビラピンの抗腫瘍活性：腹水腫瘍を接種したＢＡＬＢ／Ｃマウスの治療）
方法：８日前に接種した動物から採取した腹水０．２ｍｌを注射して１０匹のＢＡＬＢ／Ｃマウスに腹水腫瘍細胞を腹腔内接種した（２回）。同じ日に、腫瘍細胞を接種した１０匹のマウスの５匹に１ｍｇ／マウス／日（保存液１０ｍｇ／ｍｌのＤＭＳＯ溶液）を腹腔内注射してネビラピン処理を開始した。マウスは７日間連続してネビラピン処理した。
【００４３】
結果：７〜８日後、動物を屠殺して調べたところコントロール動物は全て５〜７ｍｌの腹水を含む膨張した腹部を示した。これに対しネビラピン処理した動物５匹のうち３匹（３／５）は健康のままで、腫瘍増殖を示す証拠はなかった；腫瘍発生がないことは、腫瘍接種１５日後にこれら動物のうち２匹を屠殺して剖検した時に確認された。残りの処理動物はその後変わらず健康を維持した。腹水を接種されたマウスは１２〜１４日しか生存しないことを思い出すとよい。結論すると、この実験は腫瘍接種と同時に注射したネビラピンが５匹のマウスのうち３匹で腹水腫瘍細胞の発生を永久的に阻止すること、そして未処理ラットでは腫瘍が発生し（５／５）、接種後１２〜１４日に全て死亡したことを立証した。
【実施例１１】
【００４４】
（Ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるエファビレンツの抗腫瘍活性：モーリス３９２４Ａラット肝癌の治療）
方法と結果：モーリス肝癌細胞（３９２４Ａ株）を４匹のラットに接種した。同日、そのうちの２匹にエファビレンツを１ｍｇ／ラット／日注射しエファビレンツ処理を開始した。図１２はコントロール（実線）及びエファビレンツ処理動物（破線）における腫瘍の増殖率を示している。腫瘍はコントロール動物では急速に増殖し、動物は接種後２７日目に２匹とも死亡した；これに対し２匹の処理動物のうち１匹のみが非常に小さな腫瘍を発生し、一方残りの１匹は完全な健康を維持した。
【００４５】
結論すると、この実験は腫瘍接種と同時に開始したエファビレンツ処理は、モーリス肝癌の発生及び増殖を効果的に拮抗することを立証した。２匹の処理ラットのうち１匹は腫瘍接種後数週間健康を保ったのに対し、もう１匹は極小さな腫瘍を発生した。未処理ラットは同一条件下に腫瘍を発生し（２／２）、２７日目に死亡した。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】マウス及びヒト細胞株の逆転写酵素。図１ＡはＭＳ２  ＲＮＡを次のタイプのヒト細胞（レーン１〜９）及びマウス細胞（１０〜２２）より得た細胞溶解物とインキュベーションした後の機能的ＲＴ活性を示す：レーン１、ＮＢ４白血病細胞；レーン２、Ｒ４白血病細胞；レーン４、Ｋａｓｕｍｉ−１白血病細胞；レーン４、ＨＬ６０白血病細胞；レーン５、Ｓａｏｓ−２骨肉腫細胞；レーン６、ＭＤＡ−２３１乳癌細胞；レーン７、ＭＣＦ７乳癌細胞；レーン８、Ｕ３４３  Ｍｇ神経膠腫細胞；レーン９、ＨＴ−２９結腸癌細胞；レーン１０、ＮＩＨ／３Ｔ３胚繊維芽細胞；レーン１１、Ｃ２Ｃ７筋芽細胞；レーン１２、Ｆ９テラトカルシノーマ細胞；レーン１３、Ｌ９２９繊維肉腫細胞；レーン１４、ＭＳ２  ＲＮＡを含まないＦ９溶解物とのコントロール反応物；レーン１５、緩衝液のみ；レーン１６、哺乳動物細胞溶解物なし；レーン１７、ＭＳ２  ＲＮＡ及び細胞溶解物共になし；レーン１８、市販ＲＴとの陽性コントロール反応；レーン１９、ＭＳ２−特異的オリゴなし；レーン２０〜２２：１（レーン２０）、１０（レーン２１）及び１００（レーン２２）μＭネビラピンと前インキュベーションしたＦ９溶解物を用いた完全反応。レーンＭ、ＤＮＡ分子量マーカー；レーン２３、市販Ｒｔを用いた陽性コントロール反応。ＷＣＥ及び核内のＲＴタンパク質（上パネル）及びα−チューブリン（下パネル）のウエスタンブロット分析。ＷＣＥは：Ｆ９（レーン１）、ＮＩＨ／３Ｔ３（レーン２）、ＭＣＦ７（レーン３）、ＭＤＡ−２３１（レーン４）、ＮＢ４（レーン５）、ＨＬ６０（レーン６）及びＭＬ２胚細胞（レーン７）より得た。核抽出物は：Ｆ９（レーン１）、ＭＣＦ７（レーン２）、ＭＤＡ−２３１（レーン３）、ＮＩＨ  ３Ｔ３（レーン４）、ＨＬ６０（レーン５）及びＮＢ４（レーン６）より得た。
【図２】ネビラピンはマウス及びヒト細胞株の増殖を抑制する。細胞はネビラピンあり（点線）及びなし（ＤＭＳＯ、実線）で培養した。増殖率は細胞接種時の初期細胞数を１とした場合の、指示時点の測定細胞数との比で表した。点は平均値を表し、バーは全てのタイプの細胞について少なくとも３回独立に行ったアッセイの標準偏差を表す。
【図３Ａ】コントロール及びネビラピン曝露細胞の細胞周期分析。細胞周期相の分布はネビラピン処理開始から７２時間後にＦＡＣＳを用い決定した。Ｕ３４３神経膠腫細胞株では、細胞周期は二倍体細胞分画（全細胞の約２／３が相当する）及び異数性を示す残りの分画（約１／３）と別々に分析した。
【図３Ｂ】ネビラピンあり（＋、レーン２、４及び６）又は無し（−、レーン１、３及び５）で７２時間培養した表示タイプの細胞の抽出物におけるサイクリンＤ１のウエスタンイムノブロッティング分析。フィルターを抗アクチン抗体で再プローブ処理し、負荷量が当量になるように調整した（下パネル）。
【図４】ネビラピン曝露後のＣ２Ｃ７筋原細胞の分化。分化培地で培養する前にＤＭＳＯ（Ａ、Ｃ）又はネビラピン（Ｂ、Ｄ、Ｅ）で前処理したＣ２Ｃ７筋原細胞を抗ＭＨＣ（ＦＩＴＣ、緑）及びヘキスト３３２５８で染色し核を見える様にした（青）；一つにまとめた像を示す。倍率２０倍では、コントロール培養（図４Ａ）ではネビラピン処理後（図４Ｂ）に比べ筋管は細く、発生頻度も低い。図４ＣはＡの筋管の６０倍拡大像である。図４ＤはＢの筋管の６０倍拡大像である。図４ＥはＢの視野内にあるＭＨＣ陽性筋管の６０倍拡大像である。
【図５】ＲＡ−及びネビラピン−曝露Ｆ９細胞の形態分化。ＤＭＳＯ（コントロール、図５ａ、図５ｂ、図５ｃ、図５ｄ）、ネビラピン（図５ｅ、図５ｆ、図５ｇ、図５ｈ）又はＲＡ（図５ｉ、図５ｊ、図５ｋ、図５ｌ）に曝露したＦ９培養体をまず培養７２時間後にｉｎ  ｖｉｖｏで調べ、その形態再形成を記録した（パネル図５ａ、図５ｅ、図５ｉ、対物６０倍）。９６時間後、サンプルを固定し、ＩＶ型コラーゲン（α１）鎖（図５ｃ、図５ｇ、図５ｋ）のＩＦ及びＤＡＰＩ核染色（図５ｂ、図５ｆ、図５ｊ）で処理した；各写真を統合したものを図５ｄ、図５ｈ及び図５ｌに表した（対物１００倍）。
【図６】ネビラピン処理はＡＭＬ芽球の分化阻止を解除する。５日間の４００μＭネビラピン（Ｎｅｖ）処理後の、ライト−ギムザ染色で示した前骨髄細胞株ＮＢ４；ＨＬ６０細胞；及び２名のＡＭＬ患者由来の芽球（ＡＭＬ＃１及びＡＭＬ＃２）の形態分化。ＮＢ４細胞は顆粒球分化を誘導する１μＭのＲＡでも処理した。未処理の細胞をコントロールとして示した。
【図７】ネビラピンはＦ９細胞に遺伝子発現の変動を誘導する。ＤＭＳＯ（コントロール）、ネビラピン又はＲＡと共に培養したＦ９細胞の全ＲＮＡを、指定の遺伝子のオリゴヌクレオチドを用いたＲＴ−ＰＣＲ増幅にかけ、ブロッティングし、内部オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションした。代表的なパネルを図７Ａに示す。図７Ｂ：遺伝子発現内の量的変動。内部オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションしたＲＴ−ＰＣＲ産物をデンシトメトリーで定量化した。コントロール培養物に対するネビラピン培養物のシグナル比を、同一実験でβ−アクチンについて得た比で標準化した。黒塗りの棒グラフは各遺伝子について少なくとも３回行った実験の平均値を表し、白色の棒グラフは標準偏差を表す。
【図８】エファビレンツはマウス細胞株の増殖を抑制する（図８Ａ  ３Ｔ３細胞株；図８Ｂ：Ｆ９細胞）。細胞をエファビレンツあり（点線）及び無し（ＤＭＳＯ、実線）で培養した。増殖率は接種細胞初期数を１とした時の、これに対する指示時点の細胞数の比で表した。点は独立に行った少なくとも３回のアッセイの平均値を表す。
【図９】エファビレンツはヒト細胞株の増殖を抑制する（図９Ａ  ＨｅＬａ第一サイクル；図８Ｂ：ＨｅＬａ第２サイクル、図９Ｃ  ＳＡＯＳ第一サイクル、図９Ｄ  ＳＡＯＳ第二サイクル）。細胞をエファビレンツあり（点線）及び無し（ＤＭＳＯ、実線）で培養した。増殖率は接種細胞初期数を１とした時の、これに対する指示時点の細胞数の比で表した。点は独立に行った少なくとも３回のアッセイの平均値を表す。
【図１０】コントロール（実線）及びネビラピン処理ラット（破線）におけるモーリス肝細胞癌の増殖。腫瘍増殖率は容積（ｃｍ3単位）を時間（接種後日数）で除し表した。
【図１１】ネビラピン処理（パネルＮＥＶ）及び未処理サンプル（パネルＣＴＲ）ラットの組織サンプル。上パネル（対物１０倍）では、図１１ＢのＮＥＶパネル内に見られる形質転換面積が未処理（ＣＴＲ）組織（図１１Ａ）に比べ顕著に小さくなっている。下パネル（対物４０倍）では、アポトーシスを起こしている細胞がＮＥＶ（図１１Ｄ）では明瞭に見られるが、ＣＴＲサンプル（図１１Ｃ）では見られない。
【図１２】コントロール（実線）及び２匹のエファビレンツ処理（破線、ＥＦＶ１及びＥＦＶ２）ラットにおけるモーリス肝癌細胞の増殖。腫瘍増殖率は容積（ｃｍ3単位）を時間（接種後日数）で除し表した。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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