(57)【要約】本発明は、２つのステップを用いて、生物学的分子を利用可能なアミノ基を有する固体支持体に固定化するためのシステムを提供する。第１のステップでは、前記利用可能なアミノ基が活性化化合物の第１の脱離基を置換して、活性化された支持体を形成するように、求核置換反応が起こる。第２のステップでは、前記活性化された支持体が生物学的分子に反応して、以下の化学式（Ｉ）の化合物が生成される。化学式（Ｉ）において、Ｓは固体支持体であり、Ｘは、以下の化学式（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）からなるグループから選択されることが好ましく、Ｒは、約１８個以下の炭素原子を有する、アルキル基、アリル基およびＯＲ１からなるグループから選択され、Ｒ１は、約１８個以下の炭素原子を有する、アルキル基およびアリル基からなるグループから選択され、Ｘ１は、ＮＨ、酸素およびイオウからなるグループから選択され、Ｂは生物学的分子である。
2005507076.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１個の反応性のアミノ基、チオール基またはヒドロキシル基を有する生物学的分子を、少なくとも１個の利用可能なアミノ基を有する固体支持体に結合させる方法であって、
（ａ）Ｌ１およびＬ２は脱離基で、Ｘは求核置換が可能な部分で、反応の結果、Ｌ１が前記固体支持体の利用可能なアミノ基で置換されて、活性化された支持体を形成する、
Ｌ１−Ｘ−Ｌ２
の構造を有する活性化化合物に前記固体支持体の利用可能なアミノ基を反応させるステップと、
（ｂ）前記活性化された支持体に前記生物学的分子を反応させて、Ｌ２を置換し、前記生物学的分子を前記固体支持体に結合するステップとを含む、方法。
【請求項２】
Ｌ１およびＬ２は、ハロゲン、イミダゾール、トリアゾール、ピロール、チアゾール、テトラゾールおよびＯ−アリル−Ｒからなるグループから独立に選択され、Ｒはハロゲン基、ニトロ基、シアノ基、アルコキシ基からなるグループから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｘは以下の化学式からなるグループから選択され、
【化１】
2005507076.tif 000010
Ｒは、約１８個以下の炭素原子を有する、アルキル基、アリル基およびＯＲ１からなるグループから選択され、
Ｒ１は、約１８個以下の炭素原子を有する、アルキル基およびアリル基からなるグループから選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記活性化化合物はカルボニル１，２，４−ジトリアゾールである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｂ）は、約５乃至約２５ナノリットルの前記生物学的分子を、前記活性化された支持体の１または２以上の部位の約１０ミクロン乃至約５００ミクロンの直径を有する円形のスポットに付着させるステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記付着させるステップは、前記活性化された固体支持体にプリントすることを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ステップｂにおいて、前記反応は加湿チャンバーで行われる、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
ステップｂにおいて、前記反応は加湿チャンバーで行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ａ）は有機溶液中で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ａ）は第３有機塩基の存在下で行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｂ）は水溶液中で行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１個のアミノ基、チオール基またはヒドロキシル基を有する生物学的分子を、少なくとも１個の利用可能なアミノ基を有する固体支持体に結合させる方法であって、
（ａ）Ｌ１およびＬ２は同一の脱離基で、Ｘは求核置換可能で、反応の結果、Ｌ１は前記固体支持体の利用可能なアミノ基で置換されて、活性化された支持体を形成する、
Ｌ１−Ｘ−Ｌ２
の構造を有する活性化化合物に、前記固体支持体の利用可能なアミノ基を反応させるステップと、
（ｂ）前記生物学的分子を前記活性化された固体支持体に反応させて、Ｌ２を置換し、前記生物学的分子を前記固体支持体に結合させるステップとを含む、方法。
【請求項１３】
Ｌ１およびＬ２は、ハロゲン、イミダゾール、トリアゾール、ピロールピラゾール、チアゾール、テトラゾールおよびＯ−アリル−Ｒからなるグループから選択され、Ｒはハロゲン基、ニトロ基、シアノ基およびアルコキシ基からなるグループから選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
Ｘは以下の化学式からなるグループから選択され、
【化２】
2005507076.tif 000011
Ｒは、約１８個以下の炭素原子を有する、アルキル基、アリル基およびＯＲ１からなるグループから選択され、
Ｒ１は、約１８個以下の炭素原子を有する、アルキル基およびアリル基からなるグループから選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記活性化化合物はカルボニル１，２，４−ジトリアゾールである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
以下の化学式を有する生物学的分子に結合した固体支持体であって、
【化３】
2005507076.tif 000012
Ｓは前記固体支持体であり、
Ｘは以下の化学式からなるグループから選択され、
【化４】
2005507076.tif 000013
Ｒは、約１８個以下の炭素原子を有する、アルキル基、アリル基およびＯＲ１からなるグループから選択され、
Ｒ１は、約１８個以下の炭素原子を有する、アルキル基およびアリル基からなるグループから選択され、
Ｘ１は、ＮＨ、酸素およびイオウからなるグループから選択され、
Ｂは生物学的分子である、固体支持体。
【請求項１７】
以下の化学式
【化５】
2005507076.tif 000014
を有する請求項１６に記載の固体支持体。
【請求項１８】
ステップ（ａ）の後でかつステップ（ｂ）の前に前記固体支持体から未結合の化合物を洗浄するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
固体支持体に有機分子を結合させる方法であって、
（ａ）前記固体支持体を活性化するステップと、
（ｂ）少なくとも６０パーセントの相対湿度を有する加湿チャンバー内で、前記固体支持体に前記有機分子を反応させるステップとを含む、固体支持体に有機分子を結合させる方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
以下の説明は、本発明に関連する情報の概要を提示するものであって、ここに提示される情報または引用される刊行物のいずれかが本発明の先行技術であることの承認ではない。
【０００２】
固体支持体に固定化（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）または結合した生物学的分子は、アッセイのような診断および分析の手順で有用である。固体支持体に生物学的分子を固定化する方法の１つは、活性化化合物として、フッ化アシル（ａｃｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ、以下「ＡｃＦ」という。）を利用する。この結合方法に関する情報は、以下の特許文献１および２に見つけることができる。別の方法は、生物学的分子を固体支持体に結合するための活性化化合物として、カルボニルジイミダゾール（以下「ＣＤＩ」という。）を利用する。前記ＣＤＩ法の活性化の方法のステップおよび結合の化学は以下の非特許文献１に説明されている。
【特許文献１】
米国特許第６，１４６，８３３号明細書
【特許文献２】
米国特許第６，１１０，６９９号明細書
【非特許文献１】
Ｇｒｅｇ、Ｔ．、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ａ．、Ｋｒｉｓｈｎａ  ＭａｌｌｉａおよびＰａｕｌ、Ｋ．、Ｓｍｉｔｈ、「固定化アフィニティリガンド技術（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」、６４−６７頁、（１９９２年、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．社刊）
【０００３】
上記の２つの方法は、１または２以上の欠点を抱えている。ＡｃＦ法およびＣＤＩ法は２または３以上のステップを有し、ステップの追加は生物学的分子の結合のコストを上昇させる。例えば、これらの方法は、該方法において生物学的分子の結合が起こる前に、サクシニル化のステップのような追加のリンカーの化学反応を必要とする。前記方法において生物学的分子を結合するためのステップがより多く必要になるにつれて調製コストは上昇する。ＡｃＦ法およびＣＤＩ法は、固体支持体への生物学的分子の装荷量（ｌｏａｄｉｎｇ）が少ない。ＡｃＦ法およびＣＤＩ法は、この装荷量が少ないことの帰結として、低濃度の被検体の検出用アッセイに用いられるとき、感度が低い。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、上記の代替的技術よりも効率的で、経済的で、簡単で、迅速な生物学的分子の固体支持体への固定化と、より高感度の被検体検出とに用いるシステムの必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の概要
本発明は上記の必要性を満たす。本発明は、少なくとも１個のアミノ基を有する固体支持体に、少なくとも１個のアミノ基、チオール基またはヒドロキシル基を有する生物学的分子を結合する方法を提供する。
【０００６】
本発明による方法は、（ｉ）少なくとも１個の利用可能なアミノ基を有する固体支持体と、（ｉｉ）活性化化合物とを反応させることを含む。任意的に、前記反応は、前記活性化化合物が溶解可能な第１の溶液中で行われる。前記活性化化合物は以下の構造を有する。
【０００７】
化学式（１）
Ｌ１−Ｘ−Ｌ２
上記の化学式（１）で、Ｌ１およびＬ２は脱離基、すなわち求核置換反応において置換
されることがある官能基で、Ｘは求核置換可能な部分（ｍｏｉｅｔｙ）である。Ｌ１およびＬ２は、ハロゲン、イミダゾール、トリアゾール、ピロールピラゾール、チアゾール、テトラゾールおよびＯ−アリル−Ｒからなるグループから独立に選択されることがあり、Ｒは、ハロゲン基、ニトロ基、シアノ基およびアルコキシ基からなるグループから選択される。Ｘは、以下の化学式からなるグループから選択されることが好ましい。
【０００８】
【化１】
2005507076.tif 000003
【０００９】
上記化学式で、Ｒは、約１８個以下の炭素原子を有する、アルキル基、アリル基およびＯＲ１基からなるグループから選択され、Ｒ１は、約１８個以下の炭素原子を有する、アルキル基およびアリル基からなるグループから選択される。
【００１０】
第１ステップの反応の結果、前記固体支持体の利用可能なアミノ基によってＬ１が置換され、活性化された支持体を形成する。
【００１１】
本発明の第２ステップは、少なくとも１個の反応性のあるアミノ基、チオール基またはヒドロキシル基を有する生物学的分子を、前記活性化された支持体に反応させることを含む。任意的に、第２ステップは第２の溶液中で実施される。第２の溶液中の前記生物学的分子を含む低濃度の溶液が前記活性化された支持体の１または２以上の部位に付着される（ｄｅｐｏｓｉｔｅｄ）とき、反応は加湿チャンバー内で行われることが好ましい。第２ステップの化学反応の結果、前記生物学的分子の前記反応性のアミノ基、チオール基またはヒドロキシル基がＬ２を置換し、前記生物学的分子を前記固体支持体に結合する。生物学的分子が結合した前記固体支持体は以下の化学式を有する。
【００１２】
【化２】
2005507076.tif 000004
【００１３】
上記化学式でＸ１は、反応性のアミノ基、チオール基またはヒドロキシル基からそれぞれ供与される、ＮＨ、酸素およびイオウからなるグループから選択され、Ｂは前記生物学的分子である。
【００１４】
図面
本発明のこれらの特徴、観点および利点は、以下の説明と、特許請求の範囲と、活性化化合物としてカルボニル１，２，４−ジトリアゾールを用いる本発明の方法のステップを示す添付図面とを用いて、より良く理解されるであろう。
【００１５】
発明の詳細な説明
以下に、本発明の実施態様と、該実施態様の複数の変形とを説明する。しかし、この説明は、本発明をこれらの具体的な実施態様に限定するものとして解釈されるべきではない。当業者は、多数の他の実施態様も認識するであろう。
【００１６】
本発明は、少なくとも１個のアミノ基、チオール基またはヒドロキシル基を有する生物学的分子を、少なくとも１個の利用可能なアミノ基を有する固体支持体に結合するためのシステムと、これにより形成された新規な化合物とを提供する。本発明は複数の利点を有する。１の利点は、本発明が前記ＣＤＩ法およびＡｃＦ法より単純で、迅速でコストが安いことであるが、これは本発明が生物学的分子を固体支持体に結合するためにより少ないステップを用いるためである。別の利点は、本発明が前記ＡｃＦ法およびＣＤＩ法より効率的で、結果として固体支持体への生物学的分子の装荷量がより多いことである。別の利点は、本発明が被検体の検出にＣＤＩ法より高感度であることである。
【００１７】
本発明は、アッセイまたは薬物検出キットの構成要素のような、分析および診断の手順のための構成要素の調製に有用である。本発明は、例えば、サイトカインの量および存在と、生物個体（ｏｒｇａｎｉｓｍ）における疾病の存在と、治療薬の量および存在と、感染源に由来する核酸の検出とのような、生物学的分子を伴うアッセイにおいて、利用可能である。
【００１８】
ここで生物学的分子と称されるものは、いかなる有機分子をも網羅し、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡおよびＲＮＡのような核酸、ポリペプチド、ハプテンおよび糖質を含むが、これらに限定されない。ここでポリペプチドと称されるものは、タンパク質と、抗体と、これらのいずれかの断片とを網羅し、含むが、これらに限定されない。ハプテンは、一般に薬物、ホルモンおよび合成化合物のような低分子であり、該合成化合物は、治療薬および乱用薬物（ｄｒｕｇｓ  ｏｆ  ａｂｕｓｅ）の使用に関連する化合物を含むが、これらに限定されない。
【００１９】
乱用薬物に関連するハプテンの例は、コカイン、モルヒネおよびニコチンの代謝または利用に関連する化合物を含むが、これらに限定されない。治療薬に関するハプテンの例は、トブラマイシン、フェノバルビトール、テオフィリン、ジゴキシンおよびゲンタマイシンの利用に関連する化合物を含むが、これらに限定されない。
【００２０】
本発明の方法に用いられる生物学的分子は、少なくとも１個の反応性のアミノ基、チオール基またはヒドロキシル基を有する。少なくとも１個の反応性のアミノ基、チオール基またはヒドロキシル基を有する生物学的分子の例は、少なくとも１個の表面アミノ基を有するポリペプチドと、アミノ基誘導体化（ａｍｉｎｏ  ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ）オリゴヌクレオチドと、チオール化オリゴヌクレオチドと、チオール含有タンパク質とを含む。少なくとも１個の反応性のアミノ基、チオール基またはヒドロキシル基を有する、ポリペプチド、ハプテンおよび糖は、シグマ社（ミズーリ州６３１７８、セントルイス、Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  １４５０８）から購入可能である。前記ポリペプチドが、３次元形状を有するタンパク質または抗体のとき、アミノ基その他の反応性官能基が表面に配置されることは、前記置換反応が起こって、前記固体支持体に前記ポリペプチドを結合するうえで好ましい。少なくとも１個の表面の反応性のアミノ基、チオール基またはヒドロキシル基を有する多数のポリペプチドが本発明において利用可能である。例えば、リジンを含むポリペプチドは、少なくとも１個の表面のアミノ基を有することが典型的である。リジンは利用可能なアミノ基を有するアミノ酸である。利用可能な他のポリペプチドは、スルホヒドロキシ（ｓｕｌｆｈｙｄｒｏｘｙ）基含有タンパク質を含む。
【００２１】
前記官能基を有する生物学的分子としてのオリゴヌクレオチドの例は、アミノ基誘導体化オリゴヌクレオチドと、少なくとも１個の遊離チオール基を有するオリゴヌクレオチドとを含む。アミノ化オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ合成機ＡＢＩ３９４（カリフォルニア州９４４０４、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、８５０  Ｌｉｎｃｏｌｎ  Ｃｅｎｔｒｅ  Ｄｒｉｖｅ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から購入）を用いて、製造者のプロトコールに従い、３’アミノ基修飾剤Ｃ７  ＣＰＧ（バージニア州２０１６４、２２８２５  Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、Ｄａｖｉｓ  Ｄｒｉｖｅ、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社から購入）で合成することができる。前記アミノ基は、オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端に付加される場合がある。３’アミノ化オリゴヌクレオチドが本発明のアミノ化オリゴヌクレオチドの調製に用いられることが好ましい。アミノ基誘導体化オリゴヌクレオチドの調製方法は、引用によりここに取り込まれる米国特許第６，１１０，６６９号明細書にも説明されている。さらに、少なくとも１個の遊離のチオール基を有するオリゴヌクレオチドが、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社から購入された支持体で製造者のプロトコールに従って合成される場合がある。
【００２２】
当業者は、アッセイその他の診断または分析の手順において使用するために、生物学的分子が改変される場合があることを認めるであろう。本発明はこれらの改変を意図する。
【００２３】
図１を参照して、本発明は、固体支持体に生物学的分子を固定化するための２つのステップを含む。本方法の第１のステップは、第１の溶液中で、少なくとも１個の利用可能なアミノ基を有する固体支持体と、第１の溶液中に溶解可能な活性化化合物とを反応させて、活性化固体支持体を形成することを含む。本方法の第２のステップは、第２の溶液中で、第１のステップ由来の活性化固体支持体に、少なくとも１個の反応性のアミノ基、チオール基またはヒドロキシル基を有する生物学的分子を反応させることを含む。第２のステップの結果、前記固体支持体に結合した生物学的分子ができる。
【００２４】
利用可能なアミノ基を固体支持体に結合させることができる固体支持体は、天然材料および合成材料を含むが、これらに限らない広範囲の材料を含む。天然材料は、セルロースおよびアガロースを含むが、これらに限らない。合成材料は、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリメタクリル酸、ナイロンを含むが、これらに限らない。本発明に用いられる固体支持体は、ビーズ、プレート、フィルムその他の構造のような異なる形状をとる場合がある。利用可能なアミノ基を有する固体支持体を容易する手順は当業者に周知であり、手順の例は、引用によりここに取り込まれる米国特許第５，１１２，７３６号明細書に説明される。
【００２５】
第１の溶液は、アセトニトリル（ＡｃＣＮ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジクロロメタン、ジクロロエタン、トルエンおよびテトロヒドロフナン（ｔｅｔｒｏｈｙｄｒｏｆｕｎａｎ）のような有機溶媒の場合がある。
【００２６】
前記活性化化合物はの構造
Ｌ１−Ｘ−Ｌ２
を有する。
【００２７】
上記化学式で、Ｌ１およびＬ２は求核置換反応の脱離基であり、Ｘは求核置換可能な部分である。Ｌ１およびＬ２は、ハロゲン、イミダゾール、トリアゾール、ピロール、ピラゾール、チアゾール、テトラゾールおよびＯ−アリル−Ｒからなるグループから独立に選択されることが好ましいが、Ｒは、ハロゲン基、ニトロ基、シアノ基およびアルコキシ基からなるグループから選択される。Ｘは以下の化学式からなるグループから選択されることが好ましい。
【００２８】
【化３】
2005507076.tif 000005
【００２９】
上記化学式で、Ｒは、約１８個以下の炭素原子を有する、アルキル、アリルおよびＯＲ１からなるグループから選択され、ＯＲ１は、約１８個以下の炭素原子を有する、アルキルおよびアリルからなるグループから選択される。
【００３０】
好ましい活性化化合物は、以下の構造式を有するカルボニル１，２，４−ジトリアゾールである。
【００３１】
【化４】
2005507076.tif 000006
【００３２】
（カルボニル１，２，４−ジトリアゾールは、ミズーリ州、セントルイス、シグマ社から入手可能である。）タンパク質および適当な活性化化合物は、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、２塩化カルボニル（ｃａｒｂｏｎｙｌ  ｄｉｃｈｌｏｒｉｄｅ）およびクロロぎ酸ニトロフェニルを含むが、これらに限られない。
【００３３】
トリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、トリブチルアミン、トリメチルアミンのような第３有機塩基（ｔｅｒｔｉａｒｙ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｂａｓｅ）が第１の溶液に添加されて、第１の反応の速度および効率を増加させる。
【００３４】
第１のステップで起こる化学反応は、前記活性化化合物と、前記固体支持体の利用可能なアミノ基との間の求核置換反応である。前記活性化化合物の第１の脱離基Ｌ１は、前記固体支持体の利用可能かアミノ基に置換されて、活性化された支持体を形成する。カルボニル１，２，４−ジトリアゾールが活性化化合物のとき、前記活性化された支持体は以下の構造を有する。
【００３５】
【化５】
2005507076.tif 000007
【００３６】
第２の溶液は、炭酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液のような緩衝液を含む水溶液の場合があるか、あるいは、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＣＨ３ＣＮおよびＣＨ２Ｃｌ２のような有機溶媒を利用する場合がある。
【００３７】
第２のステップで起こる化学反応は、前記活性化固体支持体と、第２の溶液中の前記生物学的分子との間の求核置換反応である。前記活性化固体支持体の第２の脱離基Ｌ２は、それぞれの生物学的分子の前記反応性のアミノ基、チオール基またはヒドロキシル基で置換される。得られる新規な組成物は、以下の構造式を有する。
【００３８】
【化６】
2005507076.tif 000008
【００３９】
上記式で、Ｘ１は、前記生物学的分子のアミノ基、チオール基またはヒドロキシル基からそれぞれ供与される、ＮＨ、酸素およびイオウからなるグループから選択され、Ｂは前記生物学的分子である。
【００４０】
前記活性化された支持体（３）がアミノ基誘導体化オリゴヌクレオチドと反応するとき、得られる組成物は以下の構造を有する。
【００４１】
【化７】
2005507076.tif 000009
（５）
【００４２】
本発明の別の実施態様（ｖｅｒｓｉｏｎ）では、第２のステップは、第２の溶液中の生物学的分子を含む低濃度の溶液が前記活性化固体支持体の１または２以上の部位に付着されるとき、加湿チャンバー内で実施されることが好ましい。ここで用いられる低濃度とは、約１０ミクロン乃至約５００ミクロンの直径を有する円形のスポット内の約５乃至２５ナノリットルの溶液の濃度を指す。湿度は、少なくとも６０パーセントの相対湿度であることが好ましい。加湿チャンバーを形成する密閉容器内の湿度は、約８０パーセントから１００パーセントまでの相対湿度であることがより好ましい。低濃度の前記溶液が加湿チャンバー内で反応するときには、非加湿チャンバー内で同じ反応をする場合と比較すると、著しく高い装荷量の生物学的分子が前記固体支持体に装荷される。低濃度の溶液を付着または散布（ｄｉｓｐｅｎｓｅ）する技術は、分析または診断の手順でしばしば用いられる。限定としてではなく例示として、インクジェット技術およびピエゾ電気マイクロジェット印刷技術が、低濃度の溶液を送達するために利用されてきており、前記固体支持体にスポットを「プリントする」とよばれる。低濃度の溶液を有するスポットのアレイが前記固体支持体にプリントされる。固体支持体に生物学的分子をプリントする方法は、引用によりここに取り込まれる米国特許第６，１４６，８３３号明細書に説明されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
本発明は、この節で説明された好ましい実施態様に限定されない。前記実施態様は例示に過ぎず、当業者は、本発明に従う多くの他の実施態様が可能であることを認識するであろう。これまで一般的に本発明を説明してきたが、同じ発明は、例示のために提示され、特記されない限り本発明を限定することを意図しない以下の実施例を参照して、より容易に理解されるであろう。
【実施例１】
【００４４】
アミン基誘導体化プレートの調製
本実施例は、本発明に用いる固体支持体の調製を説明する。ポリプロピレンのプレートが、引用によりここに取り込まれる米国特許第５，１１２，７３６号明細書の手順に従ってアミノ化された。前記プレートは、以下の条件下で、Ｐｌａｓｍａ  Ｓｃｉｅｎｃｅモデル０１５０Ｅアミネーター（Ａｍｉｎａｔｏｒ、カリフォルニア州９４５３３、２７００  Ｍａｘｗｅｌｌ  Ｗａｙ、Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ、Ｐｌａｓｍａ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ａｉｒｃｏ  Ｃｏａｔｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を使って、プラズマチャンバー内に入れて、アンモニアガスでアミノ化された。
【００４５】
ステップＩ：アンモニア、０．２５６トル、４分間
ステップＩＩ：アンモニア、０．３０６トル、プラズマ電力４０％（ＲＦ）、２分間
ステップＩＩＩ：アンモニア、０．２５６トル、２分間
ステップＩＶ：アルゴン（Ａｒ）０．２６５トル、１０分間
【実施例２】
【００４６】
加湿チャンバーおよび非加湿チャンバー内での、本発明と、ＣＤＩ法と、ＡｃＦ法とによる、アミノ化オリゴヌクレオチドのプレートへの装荷量の比較
本実施例は、加湿チャンバーと非加湿チャンバーとの両方において、本発明と、ＣＤＩ法と、ＡｃＦ法とを比較した。アミノ化されたプレートは実施例１に従って、それぞれの方法用に調製された。本発明に従う活性化固体支持体を作成するために、前記アミノ化されたプレートは、アルゴン存在下のグローブボックス内で、３−５％  無水（ｄｒｙ）トリエチルアミンを含む無水ＡｃＣＮ溶液中の０．１Ｍ  カルボニル１，２，４−ジトリアゾール（ミズーリ州、セントルイス、シグマ）と２−３時間反応させられた。前記プレートは３回洗浄され、風乾された。
【００４７】
前記ＡｃＦ法用の活性化固体支持体を作成するためには、米国特許第６，１４６，８３３号明細書および米国特許第６，１１０，６９号明細書に説明されている手順をが用いられた。ＣＤＩ法用の活性化固体支持体を作成するためには、Ｇｒｅｇ、Ｔ．、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ａ．、Ｋｒｉｓｈｎａ  ＭａｌｌｉａおよびＰａｕｌ、Ｋ．、Ｓｍｉｔｈ、「固定化アフィニティリガンド技術（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」、６４−６７頁、（１９９２年、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．社刊）に説明されている手順が用いられた。
【００４８】
それぞれの方法用の活性化固体支持体に結合される生物学的分子は、ＤＮＡ合成機ＡＢＩ３９４（カリフォルニア州、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から購入）を用いて、製造者のプロトコールに従い、３’アミノ基修飾剤Ｃ７  ＣＰＧ（バージニア州、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）で合成された３’−アミノ化オリゴヌクレオチド−５’−Ｃｙ３であった。Ｃｙ３は、蛍光色素であるシアニン色素で、バージニア州２０１６６、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、４４９０１  Ｆａｌｃｏｎ  ＰｌａｃｅのＧｌｅｎＲｅｓｅｒａｃｈ社から購入可能である。それぞれの方法において、４％  Ｎａ２ＳＯ４を含むｐＨ９．３の重炭酸緩衝液中の２０ΦＭ  ３’−アミノ化オリゴヌクレオチド−５’−Ｃｙ３が、Ｂｉｏｍｅｋ２０００（カリフォルニア州、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を用いて、密閉された無塵の加湿チャンバー内でプリントすることにより、前記プレートの複数の部位に約５−２５ナノリットルで約１０ミクロン乃至約５００ミクロンの直径を有する円形のスポット内に３ｘ３のアレイ状に付着された。プリントされた前記プレートは、実験のある観点のためには加湿チャンバー内で、実験の別の観点のためには非加湿チャンバー内で、終夜放置された。それぞれの方法で、未反応の活性化官能基は、５０ｍＭ  炭酸塩緩衝液、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍｇ／ｍｌ  カゼインで室温にて終夜不活性化され（ｑｕｅｎｃｈｅｄ）、水洗されて、電荷結合素子カメラ（ＣＣＤカメラ）の下で観察された（ｉｍａｇｅｄ）。前記ＣＣＤカメラは５７０ｎｍの蛍光発光を集光し、前記蛍光の発光の強度または輝度は、前記プレートへの前記オリゴヌクレオチドの装荷量に対応した。
【００４９】
実施例２についてのＣＣＤカメラの結果は、加湿チャンバーおよび非加湿チャンバーの条件下で、それぞれの濃度レベルで、他の方法に比べて本発明がより強度の信号、すなわち、前記固体支持体へのオリゴヌクレオチドの装荷量がより大量であることを示した。加湿チャンバーの条件下では、本発明は全ての濃度で他の方法よりも強い強度を示した。非加湿チャンバー条件下では、本発明は、濃度の増加とともに相対的に大きな強度の増加を示したが、他の方法は、濃度の増加とともにより少ない増加を示した。
【００５０】
実施例２のＣＣＤカメラの結果は、本発明だけでなく、全ての方法で、非加湿チャンバーでの結果と対比して加湿チャンバーで反応させたときのほうが前記アミノ化オリゴヌクレオチドの装荷量がより高かったことを示した。
【実施例３】
【００５１】
ＩＬ８アッセイを用いてＣＤＩ法と対比された本発明の感度
実施例３は、実験プロトコールと、被検体の検出における本発明とＣＤＩ法との感度の比較から得られた結果とを説明する。アミノ化プレートは、実施例１に従ってそれぞれの方法用に調製された。３’−アミノ化オリゴヌクレオチドが合成され、以下の２つの例外を除いて、実施例２に説明された手順に従ってプリントされた。第１の例外は、３ｘ３のアレイ状にプリントされた前記アミノ化オリゴヌクレオチドが、該アミノ化オリゴヌクレオチドを含む液体の入ったプリント用ピンが前記プレートの表面に５回接するように、４回重複プリント（４  ｏｖｅｒ  ｐｒｉｎｔｓ）を行ったことである。第２の例外は、前記反応が加湿チャンバーのみで行われたことである。
【００５２】
ＩＬ８アッセイが、本発明とＣＤＩ法との間での比較評価を提供するために利用された。本実験で用いられたＩＬ８アッセイのプロトコールは、引用によりここに取り込まれた米国特許第５，５４８，２１３号明細書に説明されたものと同一のプロトコールであった。具体的には、前記プロトコールは以下に詳細に説明されている。
【００５３】
ステップＩ。カゼイン緩衝液中の抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲート１４０ｎｇ／ウェルを添加し、前記プレートを３７°Ｃで１時間振盪した。前記プレートを洗浄緩衝液（１ｘＴｒｉｓ緩衝生理食塩水中の０．０２％  Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。
【００５４】
ステップＩＩ。ウェルあたりカゼイン緩衝液中の１０００−１ｐｇ／ｍｌの範囲の抗原を添加し、３７°Ｃ１時間反応させ、洗浄緩衝液で３回洗浄した。アッセイで用いられた抗原濃度は、０ｐｇ／ｍｌ、１ｐｇ／ｍｌ、５ｐｇ／ｍｌ、１０ｐｇ／ｍｌ、２５ｐｇ／ｍｌ、５０ｐｇ／ｍｌ、２５０ｐｇ／ｍｌおよび１０００ｐｇ／ｍｌであった。
【００５５】
ステップＩＩＩ。ウェルあたり５０ｎｇのビオチン化抗体（ミネソタ州５５４１３、Ｍｉｎｎａｐｏｌｉｓ、６１４  ＭｃＫｉｎｌｅｙ  Ｐｌａｃｅ  Ｎ．Ｅ．、Ｒ＆Ｄｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ社から購入）を添加し、３７°Ｃ１時間インキュベーションをし（ｉｎｃｕｂａｔｅ）、３回洗浄した。
【００５６】
ステップＩＶ。水１ｍｌに１ｍｇ溶解したストレプトアビジンＰＢｘ１を、１：１５０希釈し、５０Φｌ／ウェルで添加して、３７°Ｃ１時間インキュベーションし、洗浄緩衝液で３回洗浄した。５０Φｌの洗浄緩衝液が各ウェルに保存され、ＣＣＤカメラを用いて観察された。前記ＣＣＤカメラは６７０ｎｍの蛍光発光を集光したが、該蛍光発光は、オリゴヌクレオチドでタグ付けされた抗体の前記固体支持体への装荷量に対応していた。
【００５７】
実施例３のＣＣＤカメラの結果は、同一の被検体濃度では、本発明のほうがＣＤＩ法よりも高い検出感度であることを証明した。前記蛍光発光または前記スポットの輝度は、前記被検体の検出量に対応していた。本発明は、１ｐｇ／ｍｌからスポット（ＣＣＤで捕捉された輝度）を検出し、濃度が１０００ｐｇ／ｍｌまで増加するにつれて輝度が増大した。これに対し、ＣＤＩ法は、約２５ｐｇ／ｍｌまではスポットを検出しはじめなかった。したがって、本発明は、ＣＤＩ法よりも高い感度を示した。
【００５８】
理論に拘泥するわけではないが、発明者は、本発明のほうが感度が高いことはアミノ化オリゴヌクレオチドの装荷量が大きいことが原因であるかもしれないと信じた。本発明の方法で得られた大きい装荷量は、競合する加水分解に対してトリアゾール化尿素結合（ｔｒｉａｚｏｌｙｌ  ｕｒｅａ  ｌｉｎｋａｇｅ）の安定性が増大し、これにより、アミノ化オリゴヌクレオチドが前記プレートに結合する機会が増加したためであると推定される。少なくとも１個の反応性のアミノ基、チオール基またはヒドロキシル基を有する他の生物学的分子は、本発明の下では、ＣＤＩ法を用いた生物学的分子の結合よりも高い感度および大きい装荷量を示すはずである。
【００５９】
本発明を以上のとおり説明してきたが、これまで説明し、また特許請求の範囲に記載されるとおりの本発明の範囲および正当な意味から逸脱することなく多数の改変および適応が行われる場合があることは明らかなはずである。
【００６０】
本発明はそのいくつかの好ましい実施態様についてかなり詳しく説明されたが、他の実施態様が可能である。したがって、添付する特許請求の範囲の趣旨および範囲はここに説明された好ましい実施態様の説明に限定されるべきではない。
【００６１】
特許請求の範囲、要約および図面を含む明細書に説明された全ての特徴と、開示されたいかなる方法または工程の全てのステップとは、かかる特徴および／またはステップの少なくとも一部が相互に排除的である組合せを除いて、いずれかの組合せで結合される場合がある。特許請求の範囲、要約および図面を含む明細書で開示されたそれぞれの特徴は、特記されないかぎり、同一、均等または類似の目的を果たす代替的な特徴によって置換可能である。したがって、特記されないかぎり、開示されたそれぞれの特徴は、均等または類似の特徴の上位概念の一例である。
【００６２】
特定の機能を実行する「手段」または特定の機能を実行する「ステップ」と明記していない請求項の要素は、米国特許法第１１２条に定める「手段」または「ステップ」の条項として解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】活性化化合物としてカルボニル１，２，４−ジトリアゾールを用いる本発明の方法のステップを示す工程図。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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