(57)【要約】本発明は、好ましくは血漿容量増量剤として、ヒトまたは動物の体の外科的または治療的処置のための方法での、または診断方法での適用のための、＞１０〜２５モル％の間の枝分かれ平均程度、および４０，０００〜８００，０００ダルトンの平均重量を示す、高分枝アミロペクチン、およびその誘導体に関する。ヒドロキシ−エチル化アミロペクチンに基づく血漿容量増量剤は、ヒドロキシエチル化の結果として、不完全な代謝、したがって、副作用に関連する一時的組織保存の不利を示す。本発明にしたがって、前者と同様の不利を示さない、ポリサッカライドに基づく新規の血漿容量増量剤が提供される。適合可能な、そのような方法で、天然植物アミロペクチンを、糖転位によって改変することにより得ることができる、高分枝アミロペクチンに基づく、改善された、完全に代謝される血漿容量増量剤において、高程度の枝分かれが、非常に微々たる程度のヒドロキシエチル化を、全くまたはほとんど必要でないように、血清−α−アミラーゼ分解の制御を可能にする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトまたは動物の体の外科的または治療的処置のための方法での、または診断方法での適用のための、＞１０〜２５モル％の間の枝分かれ平均程度、および４０，０００〜８００，０００ダルトンの平均重量を示す、高分枝アミロペクチン、およびその誘導体。
【請求項２】
血漿容量増量剤としての請求項１記載の高分枝アミロペクチン。
【請求項３】
微小循環の改善のための請求項１記載の高分枝アミロペクチン。
【請求項４】
ｌｅｕｃａｐｈｅｒｅｓｉｓに関連した、細胞調製における沈殿作用補助剤としての、請求項１記載の高分枝アミロペクチン。
【請求項５】
赤血球のような血液成分の凍結保存のための、請求項１記載の高分枝アミロペクチン。
【請求項６】
枝分かれ平均程度が、１１〜１６モル％の間であり、分子量Ｍｗが９０，０００〜３００，０００ダルトンの間である、先行する請求項の１つに記載の高分枝アミロペクチン。
【請求項７】
枝分かれ平均程度が、１３〜１６モル％の間であり、分子量Ｍｗが１２０，０００〜２５０，０００ダルトンの間である、先行する請求項１〜５の１つに記載の高分枝アミロペクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は高度分枝したアミロペクチンの利用に関連する。とりわけ、本発明は特定の枝分かれの程度および特定の分子量Ｍｗを示す高度分枝アミロペクチンの新規利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
血漿増量剤の開発の歴史過程において、血漿のコロイド浸透圧の天然担体、すなわちアルブミンの球状構造に到達することが、常にひとつの目標であった。グリコーゲンはヒト組織中に自然保持されるポリサッカライドとして既に生成するものであり、この球状構造に最も近い。グリコーゲンの球状構造は、自身の非常に高度な枝分かれの結果成り立っている。構造的な観点からみると、グリコーゲンは、直線部位にα−１，４グリコシド結合を持ち、α−１，６グリコシドの枝分かれ部位が結合しているグルコースポリサッカライドである。グリコーゲンそれ自体は安価な粗原料として手に入らないため、ワーデンシェーム（Ｗｉｅｄｅｒｓｈｅｉｍ）は１９５７年に、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）血漿増量剤の生産のための開始原料として枝分かれの少ないアミロペクチンの代わりに用いることを提唱した。それまで、ヒドロキシエチルデンプンは、血漿増量剤として非常に大規模に、いくつかの別種の形状で利用されている。かかる開発にはヒロキシエチルデンプン型（ＨＥＳ型）の新型のものが得られており、新型のものは、凝固誘導または組織内の中間体滞留などの最小の副作用を伴いながら最適な効果を示す。
【０００３】
ＨＥＳの種々のタイプには、分子量、平均置換度および置換パターンが異なるものが市販されている。これらの開発により成し遂げられた確実な進歩にも関わらず、近年、最適化されたＨＥＳ型においてさえも、特に、完全に代謝されないなどのいくつかの不都合が残っている。
【０００４】
しかしながら、周知のように化学的に言えば、ヒドロキシエチルエーテル基は代謝に対して極度に安定であり、そのためヒドロキシエチルエーテル基を持つヒドロキシエチルデンプンの無水グルコースユニットを代謝させることが実際不可能である。さらに知られているように、ヒドロキシエチルデンプン分子中でα−１，４グリコシド結合のみが非置換グルコースユニットから形成される血漿α−アミラーゼにより分解されうる。このような理由から、ＨＥＳａの最適化タイプの場合であっても最小限、少なくとも一定の期間にわたり、いまだに顕著な組織滞留が確かめられることがわかった。
【０００５】
さらに不都合なのは、ＨＥＳはアルブミンの理想的な球状構造を持たず、そのため固有の粘性がアルブミンよりも相当高いことである。循環への適用に続いて、分解の意味において、総血液粘性が影響を受けることから、血漿増量剤の場合には比較的低い粘性が望ましい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、アミロペクチン誘導体ヒドロキシエチルデンプンが完全に代謝されないことによる不都合を持たない、アミロペクチンに基づいた、新規の改善された血漿増量剤を開発するにあたって課題が存在する。同時に、新規の血漿増量剤はより球状の構造を持ち、ゆえに比較的低い粘性溶液を形成できることが必要であった。
【０００７】
特定のアミロペクチンを適用できるさらなる分野を広げることもまた、本発明の課題の一つであると考え得る。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
これらの課題ならびにさらなる課題は、詳細には列記していないが、しかしながら、請求項１の対象によって達成される導入説明から、自由に、そして簡単に誘導可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の好ましい実施様態は、請求項１を参照にする各請求項の事象である。
＞１０〜２５モル％の枝分かれ平均値、および４０，０００〜８００，０００ダルトンの範囲での重量平均分子量を示す、高分枝アミロペクチン、および必要によりその誘導体をヒトまたは（哺乳動物の体を含む）動物の体の外科的若しくは治療的処置方法、または診断方法に使用することで、直接の予測可能な様式ではなく、また高分枝アミロペクチンに対する医療領域での多数の新規で、興味深い適用を広げることが可能である。他方で、現在の実施においていまだによく使用される、デンプンに基づくＨＥＳ産物に対する、ほとんど理想的な代用品が、危険な副作用が非常に少ない、
「血漿増容量（ｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｕｍｅ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）」領域にとりわけ関連して提供される。
【００１０】
血漿増容量に関して言えば、本発明に関する大規模な研究および調査の結果、実際は、血漿増量剤の適用により、従来導入されているヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ産物）と比較すると、血漿増量剤適用後数時間、または数日後の血液循環中および尿中のヒドロキシエチルデンプンの残留画分で、枝分かれの程度が著しく増加することが明らかになった。枝分かれの程度は、枝分かれ部位を持つ無水グルコースのモル％で表した場合、おおよそ、適用２時間後に５モル％から７モル％以上に、適用７時間後には８モル％に増加した。
【００１１】
同時に、導入後４８時間または４２時間の全尿画分で、９または１０モル％という、さらに高度な枝分かれ程度が見られた。この現象は分子量、適用したヒドロキシエチルデンプンの置換の程度または置換型に関係なく観察された。このことは、これらの画分が分解の際に、およそ１０モル％の枝分かれ程度であると文献に示されているグリコーゲンに似た構造および／または枝分かれの仕方を次第に獲得することを示す。
【００１２】
驚くことに、アミロペクチン中およびその誘導体中の、α−（１，６）枝分かれが比較的安定であることが、優性α−アミラーゼ分解と比較して、分解可能なポリサッカライドを完全に産出できるがしかし、薬物動態および／または容量効果に関して理想的な血漿増量剤の性質を維持しているような範囲で、アミロペクチンの分解を減少させるのに活用できることが分かった。
【００１３】
したがって、本発明は高分枝アミロペクチンおよびそのような高分枝アミロペクチンの誘導体の、医学領域における利用を含む。
アミロペクチンという語は、一般的に、第一にグルコース分子間にα−（１，４）およびα−（１，６）結合を持つデンプンまたはデンプン産物を示すと理解すべきである。これらの鎖の枝分かれは、α−（１，６）結合を介して起こる。天然に存在するアミロペクチンの場合には、枝分かれはだいたいおよそ１５〜３０グルコース部分ごとに不規則に起こる。天然に存在するアミロペクチンの分子量はとても高く、すなわち１０7〜２×１０8ダルトンの範囲である。アミロペクチンもまた、ある一定の制限内でヘリックスを形成すると仮定される。
【００１４】
アミロペクチンの枝分かれの程度を定義することができる。アミロペクチンの無水グルコース分子全数に対する、枝分かれ部位（α−（１，６）結合）を持つ無水グルコース分子数の比が枝分かれの尺度であり、この比をモルで表わす。天然に存在するアミロペクチンの枝分かれの程度はおよそ４モル％である。しかしながら、単離について考えると、アミロペクチンのクラスターおよび分子部分は、天然の平均枝分かれ程度に比べ、枝分かれの程度が高いことが知られている。
【００１５】
本発明の目的に沿った高分枝アミロペクチンというのは、天然のアミロペクチンよりも有意に高い程度の枝分かれを持つようなアミロペクチンである。アミロペクチンは多分散系の物質であるため、いずれの場合でも、枝分かれの程度は平均値（枝分かれ程度の平均）である。
【００１６】
そのような高分枝アミロペクチンは、改変していないアミロペクチンまたはヒドロキシエチルデンプンに比べ、枝分かれした無水グルコースのモル％で表わされた、枝分かれの程度がより有意に高く、したがってこれらの構造関係についてグリコーゲンにより近似する。
高分枝アミロペクチンを本発明にしたがって適用するためには、＞１０〜２５モル％の平均範囲の枝分かれ程度が必要である。このことは、本発明の目的に見合って有用なアミロペクチンは平均的にα−（１，６）結合を持ち、したがっておよそ１０〜１４グルコース単位毎に枝分かれ部位があることを指す。枝分かれ程度が１０モル％以下であると、枝分かれしたアミロペクチンの分解が十分に遅延されない（例えば、血漿増量剤として用いた場合）。枝分かれ程度が２５モル％を超えると、血漿増量剤として用いるような時、例えば排除されるなど、分解が過度に遅延する。
【００１７】
医学領域で利用するのに好ましいアミロペクチン型の特徴は、枝分かれ程度が１１〜１６モル％であることである。
また他の好ましい高分枝アミロペクチンの枝分かれ程度は１３〜１６モル％である。
さらに、高分枝アミロペクチンの分子量Ｍｗもまた重要である。分子量Ｍｗは、本平均値を提供する関連した算出法により測定可能なものとして、分子量の重量平均として示している。これらの方法としては、水性ＧＰＣ、ＨＰＬＣ、光分散などがあげられる。
【００１８】
本発明にしたがって利用するのに好適な高度枝分かれアミロペクチンは、一般的に分子量の平均値が４０，０００〜８００，０００ダルトンを示す。分子量の下限値は、本質的に、高分枝の化合物の場合に、およそ４０，０００ダルトンに設定されるべきで、これはいわゆる「腎閾値（ｒｅｎａｌ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）」からの、好ましい適用の場合に得られる。Ｍｗが４０，０００ダルトンよりも少ない場合には、その分子はあまりに急速に腎臓を通過してしまう。Ｍｗが８００，０００ダルトンを超えると、球状構造の場合に、もはや限界粘性が分子量に依存せず、言及するほどのさらなる有効性が得られない。
血漿増量剤として利用するのに好ましいＭｗ平均値は９０，０００〜３００，０００ダルトンであり、１２０，０００〜２５０，０００ダルトンの分子量Ｍｗが特にふさわしい。
【００１９】
本発明の特定の実施例は、平均の枝分かれ程度が１１〜１６モル％で、分子量Ｍｗが９０，０００〜３００，０００ダルトンである高分枝アミロペクチンを含む。本発明の他の適切な実施例には、平均の枝分かれ程度が１３〜１６モル％であり、分子量Ｍｗが１２０，０００〜２５０，０００ダルトンである高分枝アミロペクチンが含まれる。
上記の指標、すなわち枝分かれ程度および分子量により、目的の効果を発揮させることができ、したがって好ましい薬物動態、特に好ましいα−アミラーゼ分解が達成される。この関連において、アミロペクチンの枝分かれ程度は重要な役割を持つ。しかしながら、分子量もまた、関連した動態に影響を与える。さらに、枝分かれ部位の配置を変化させることにより、アミロペクチンの分解の速度論に影響を与え、望ましい方向に向かわせることができうる。
【００２０】
しかしながら、α−アミラーゼによるアミロペクチンの分解、およびその結果の血漿増量剤としての効果にとって重要なのは、枝分かれの程度である。高度に枝分かれしていることにより、α−アミラーゼによる攻撃が大いに遅れ、また高密度の枝分かれ部位を持つ分子領域においては、α‐アミラーゼがそこに接近できない為に、攻撃は全く排除される。それでもそのような化合物も、他の酵素によりオリゴ糖、そして最終的にはグルコースまで分解されうる。
【００２１】
本発明にしたがって用いられる高分枝アミロペクチンは、必要であれば誘導体の形態で得てもよい。そのような誘導体としては、例えば、化学的または生物工学的に得ることが可能なアミロペクチンの化学的誘導体があげられる。
高分枝アミロペクチンの好ましい誘導体は、ヒドロキシエチルアミロペクチン、ヒドロキシプロピルアミロペクチン、およびアセチルアミロペクチンである。これらのうち、実際、ヒドロキシエチルアミロペクチンが使用に対して特に有利である。アミロペクチン分解の動態もまた、必然的に誘導によって影響を受ける。しかしながら、これらの場合に、誘導の程度、例えばヒドロキシエチレン化の程度を相当低くすることが、標準的に枝分かれしたアミロペクチンから産生したヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）と比べ、それに匹敵する量的効果または同様の薬物動態を得るために有効である。
【００２２】
本発明の目的にしたがって好適な、特に好ましくは血漿増量剤としての利用に適した高度枝分かれアミロペクチンは、α−１，４グリコシド結合の加水分解、およびα−１，６グリコシド化合物への変換を触媒する、いわゆる枝分かれ酵素による酵素的変換のような公知の様式で産出される。いわゆる転移酵素は、例えば国際公開広報第ＰＣＴ  ＷＯ  ００１８８９３号にしたがった藻類からの抽出など、公知の手法で抽出することができる。しかしながら、米国特許第４４５４  １６１号および欧州特許第０４１８９４５号から、その他のグリコーゲン枝分かれ酵素も、相当する物として用いることも可能であることが知られている。酵素的な糖転位は、公知の手法、例えば蝋質のトウモロコシデンプンを、ｐＨおよそ７．５、温度およそ３０℃の穏やかな条件下で、水性溶液中にてインキュベートすることにより行なう。続く反応調製物の調製も、まずｐＨを変えるか、またはろ過工程により酵素を不活性化させるか除去するという公知の手法で行なう。
【００２３】
好ましくは塩酸を用いて行なう続く加水分解工程において、産物の分子量を望ましいものに調整する。続いて約３，０００ダルトン分離能の膜を用いた膜分離精製により、産物から低分子化合物を除去し、酸性加水分解調製物の中和の間に一般的な塩が形成される。産物を例えば噴霧乾燥などにより単離する。
高分枝アミロペクチンは血漿増量剤としての利用から離れて、他の医学領域でも有用である。高分枝アミロペクチンは、標準の枝分かれ型のデンプンに基づく標準ＨＥＳ産物を利用できる、治療および外科分野における応用に利用できる。
【００２４】
血漿増量剤としての利用から離れたこととしては、好ましくは微小循環の改善への利用、白血球分離採血法に関連した細胞分離における沈殿補助剤としての利用、または赤血球または顆粒球などの血液組成物の冷凍保存への利用などがあげられる。
【実施例１】
【００２５】
（実施例１）
異なる枝分かれを持つα−１−４／α−１−６グルコサッカライドを用いた比較分解試験
【００２６】
シグマ（ＳＩＧＭＡ）社製のカキ由来グリコーゲンを、ＤＭＳＯと、３０％のＤＭＳＯ含量の水の混合物中、７０℃、ｐＨ６．０においてノボザイムス（ＮＯＶＯＺＹＭＥＳ）社製の温度耐性α−アミラーゼＢＡＮ４８０Ｌを用いて分解した。ガスクロマトグラフィーにより、分子量の変化を測定することにより反応の過程を観測し、約２時間後に酵素活性に苛性ソーダ溶液を加え、反応を止めた。中和後、１，０００ダルトンおよび２５，０００ダルトンの標準分離酢酸セルロース限外ろ過の方法を用いた限外ろ過により産物を分画した。続いて産物をイオン交換Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲ  ２００  Ｃおよび活性化炭素で処理し、エタノールで沈殿させ、８０℃にて乾燥させた。
枝分かれ程度を１Ｈ  ＮＭＲ分光学法（アノマープロトンシグナルの積分）により決定したところ、１５モル％であった。平均分子量Ｍｗは、７，０００ダルトンであった。
弱沸騰蝋質トウモロコシデンプン（≧９５％アミロペクチン）（セレスター（Ｃｅｒｅｓｔａｒ）社製）を上記と同様の方法で処理した。単離された、枝分かれクラスターの高度枝分かれ画分の枝分かれ程度は１１モル％であり、平均分子量Ｍｗは８，０００ダルトンであった。
【００２７】
続いてアミロペクチンおよびグリコーゲンの高分枝クラスター画分について、３７℃にてｐＨ７．２のリン酸緩衝液中、１％ブタ膵臓α−アミラーゼ（ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）社製）溶液を用いて、酵素０．５ＩＵ／ｍｌで分解試験を行い、ゲルクロマトグラフィーを用いて分子量の変化を測定することにより、分解動態を観測した。市販のヒドロキシエチルデンプン血漿増量剤を用いた分解の比較試験も行なった（ボルベン（Ｖｏｌｕｖｅｎ、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｋａｂｉ）社製）。分解動態は明確に異なっていた。分子量の半減期（出発物質の平均分子量Ｍｗの、初期値の半分への減少）について、枝分かれ程度が１５％の画分の場合は、６０分であり、ボルベンの血漿増量剤の時と同様の条件下での試験で測定した半減期に達した。
一方、平均枝分かれ程度が１１モル％である画分の半減期は、わずか２５分であり、かなり短かった。
【００２８】
（実施例２）
ＮＭＲによる測定で平均枝分かれ程度が４モル％であったＣｅｒｅｓｔａｒ社製の蝋質酸分解トウモロコシデンプンについて、実施例１で得られたデータにしたがって、ブタ膵臓α−アミラーゼによる分解試験を行なった。この目的のために、１％溶液をおよそ９０℃まで短時間加熱することにより、ｐＨ７．２でリン酸緩衝液中にゼラチン化し、冷却した後調製物に、分量が０．５ＩＵ／ｍｌになるように酵素を加えた。
試験温度は３７℃であった。
【００２９】
ゲルクロマトグラフィーを用いて分子量の変化を測定することにより、分解動態を観測した。実施例１と同様の条件下において、開始物質の分子量は１０分以内に半減した。
実施例１の高分枝α−１−４／α−１−６グルコサッカライドと比較すると、平均して相対的に枝分かれ程度が低い蝋質酸分解トウモロコシデンプンは、α−アミラーゼにより速くに分解されるため、血漿増量剤としては有用でない。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
このように、２つの実施例１および２から、分子量が低くても枝分かれの程度が高ければα−アミラーゼ分解が遅くなり、その効果を血漿増量剤製品に利用できることが実証された。
【国際公開パンフレット】
2005501930.tif 000002
2005501930.tif 000003
2005501930.tif 000004
2005501930.tif 000005
2005501930.tif 000006
2005501930.tif 000007
2005501930.tif 000008
2005501930.tif 000009
2005501930.tif 000010
2005501930.tif 000011
2005501930.tif 000012
2005501930.tif 000013
2005501930.tif 000014
2005501930.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】平成15年5月16日(2003.5.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトまたは動物の体の外科的または治療的処置のための方法での、または診断方法での適用のための、分岐部位を持つ無水グルコースのモル％で表した場合に、＞１０〜２５モル％の間の枝分かれ平均程度であり、および４０，０００〜８００，０００ダルトンの平均重量を示す、高分枝アミロペクチン、およびその誘導体。
【請求項２】
血漿容量増量剤としての、請求項１記載の高分枝アミロペクチン。
【請求項３】
微小循環の改善のための、請求項１記載の高分枝アミロペクチン。
【請求項４】
ｌｅｕｃａｐｈｅｒｅｓｉｓに関連した、細胞調製における沈殿作用補助剤としての、請求項１記載の高分枝アミロペクチン。
【請求項５】
顆粒球の赤血球のような、血液成分の凍結保存のための、請求項１記載の高分枝アミロペクチン。
【請求項６】
枝分かれ平均程度が、１１〜１６モル％の間であり、分子量Ｍｗが９０，０００〜３００，０００ダルトンの間である、先行する請求項の１つに記載の高分枝アミロペクチン。
【請求項７】
枝分かれ平均程度が、１３〜１６モル％の間であり、分子量Ｍｗが１２０，０００〜２５０，０００ダルトンの間である、先行する請求項１〜５の１つに記載の高分枝アミロペクチン。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
特定のアミロペクチンを適用できるさらなる分野を広げることもまた、本発明の課題の一つであると考え得る。


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
これらの課題ならびにさらなる課題は、詳細には列記していないが、しかしながら、請求項１の対象によって達成される導入説明から、自由に、そして簡単に誘導可能である。本発明の好ましい実施様態は、請求項１を参照にする請求項の対象である。


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
ヒトまたは（哺乳動物の体を含む）動物の体の外科的または治療的処置のための方法での、または診断方法での適用のために、分岐部位を持つ無水グルコースのモル％で表した場合に、＞１０〜２５モル％の平均枝分かれ程度、および４０，０００〜８００，０００ダルトンの範囲での平均分子量を示す、高分枝アミロペクチン、および必要である場合、その誘導体を使用することで、一方で、直接の予測可能な様式ではなく、高分枝アミロペクチンに対する医療領域での、多数の新規で、興味深い適用を広げることが可能である。他方で、現在の実施においていまだによく使用される、デンプンに基づくＨＥＳ産物に対する、ほとんど理想的な代用品が、危険な副作用が非常に少ない、「血漿増容量（ｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｕｍｅ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）」領域にとりわけ関連して提供される。


【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
血漿増量に関して言えば、本発明に関する大規模な研究および調査の結果、実際は、血漿増量剤の適用により、従来導入されているヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ産物）と比較すると、血漿増量剤適用後数時間、または数日後の血液循環中および尿中のヒドロキシエチルデンプンの残留画分で、枝分かれの程度が著しく増加することが明らかになった。枝分かれの程度は、枝分かれ部位を持つ無水グルコースのモル％で表した場合、おおよそ、適用２時間後に５モル％から７モル％以上に、適用７時間後には８モル％に増加した。




【国際調査報告】
2005501930.tif 000016
2005501930.tif 000017
2005501930.tif 000018
2005501930.tif 000019
2005501930.tif 000020
2005501930.tif 000021