(57)【要約】  本発明は、ミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質をコードする核酸配列、前記タンパク質の免疫原性断片をコードする前記核酸配列の一部、前記核酸配列またはその一部を含むＤＮＡ断片、組換えＤＮＡ分子、生組換えキャリア及び宿主細胞に関する。本発明はまた、前記配列によりコードされるミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質及びその免疫原性部分に関する。本発明は更に、前記核酸配列及びその一部、前記核酸配列またはその一部を含むＤＮＡ断片、組換えＤＮＡ分子、生組換えキャリア及び宿主細胞、タンパク質またはその免疫原性部分、並びに前記タンパク質またはその免疫原性部分に対する抗体を含むワクチンに関する。また、本発明はワクチン中及びワクチンの作成のための前記タンパク質の使用に関する。更には、本発明は診断薬またはワクチン接種の目的のための前記核酸配列、タンパク質または抗体の使用に関する。本発明は前記ワクチンの作成方法にも関する。最後に、本発明は前記核酸、タンパク質または前記タンパク質に対する抗体を含む診断キットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５に示すミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス(Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis)タンパク質遺伝子の核酸配列と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同性を有する、９ｋＤミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質をコードする核酸配列または前記タンパク質の免疫原性断片をコードする前記核酸配列の一部。
【請求項２】
配列番号３に示すミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質遺伝子の核酸配列と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同性を有する、１４ｋＤミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質をコードする核酸配列または前記タンパク質の免疫原性断片をコードする前記核酸配列の一部。
【請求項３】
配列番号１に示すミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質遺伝子の核酸配列と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同性を有する、２８ｋＤミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質をコードする核酸配列または前記タンパク質の免疫原性断片をコードする前記核酸配列の一部。
【請求項４】
配列番号７に示すミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質遺伝子の核酸配列と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同性を有する、４７ｋＤミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質をコードする核酸配列または前記タンパク質の免疫原性断片をコードする前記核酸配列の一部。
【請求項５】
配列番号９に示すミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質遺伝子の核酸配列と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同性を有する、ミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質をコードする核酸配列または前記タンパク質の免疫原性断片をコードする前記核酸配列の一部。
【請求項６】
配列番号１１に示すミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質遺伝子の核酸配列と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同性を有する、ミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質をコードする核酸配列または前記タンパク質の免疫原性断片をコードする前記核酸配列の一部。
【請求項７】
配列番号１３に示すミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質遺伝子の核酸配列と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同性を有する、ミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質をコードする核酸配列または前記タンパク質の免疫原性断片をコードする前記核酸配列の一部。
【請求項８】
配列番号１５に示すミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質遺伝子の核酸配列と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同性を有する、ミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質をコードする核酸配列または前記タンパク質の免疫原性断片をコードする前記核酸配列の一部。
【請求項９】
配列番号１７に示すミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質遺伝子の核酸配列と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同性を有する、ミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質をコードする核酸配列または前記タンパク質の免疫原性断片をコードする前記核酸配列の一部。
【請求項１０】
５．６０から６．１５のＰＩを有する６０ｋＤミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質をコードする核酸配列または前記タンパク質の免疫原性断片をコードする前記核酸配列の一部。
【請求項１１】
４．２０から４．７５のＰＩを有する３３ｋＤミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質をコードする核酸配列または前記タンパク質の免疫原性断片をコードする前記核酸配列の一部。
【請求項１２】
請求項１から１１に記載の核酸配列を含むＤＮＡ断片。
【請求項１３】
機能的に連結したプロモーターの制御下で請求項１から１１項記載の核酸配列または請求項１２項に記載のＤＮＡ断片を含む組換えＤＮＡ分子。
【請求項１４】
請求項１から１１に記載の核酸配列、請求項１２に記載のＤＮＡ断片または請求項１３に記載の組換えＤＮＡ分子を含む生組換えキャリア。
【請求項１５】
請求項１から１１に記載の核酸配列、請求項１２に記載のＤＮＡ断片、請求項１３に記載の組換えＤＮＡ分子または請求項１４に記載の生組換えキャリアを含む宿主細胞。
【請求項１６】
配列番号６に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％の配列相同性を有することを特徴とする９ｋＤミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質または前記タンパク質の免疫原性断片。
【請求項１７】
配列番号４に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％の配列相同性を有することを特徴とする１４ｋＤミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質または前記タンパク質の免疫原性断片。
【請求項１８】
配列番号２に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％の配列相同性を有することを特徴とする２８ｋＤミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質または前記タンパク質の免疫原性断片。
【請求項１９】
配列番号８に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％の配列相同性を有することを特徴とする４７ｋＤミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質または前記タンパク質の免疫原性断片。
【請求項２０】
配列番号１０に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％の配列相同性を有することを特徴とするミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質または前記タンパク質の免疫原性断片。
【請求項２１】
配列番号１２に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％の配列相同性を有することを特徴とするミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質または前記タンパク質の免疫原性断片。
【請求項２２】
配列番号１４に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％の配列相同性を有することを特徴とするミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質または前記タンパク質の免疫原性断片。
【請求項２３】
配列番号１６に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％の配列相同性を有することを特徴とするミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質または前記タンパク質の免疫原性断片。
【請求項２４】
配列番号１８に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは９４％の配列相同性を有することを特徴とするミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質または前記タンパク質の免疫原性断片。
【請求項２５】
５．６０から６．１５のＰＩを有するミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス６０ｋＤタンパク質または前記タンパク質の免疫原性断片。
【請求項２６】
４．２０から４．７５のＰＩを有するミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス３３ｋＤタンパク質または前記タンパク質の免疫原性断片。
【請求項２７】
請求項１から１１に記載の核酸配列によりコードされることを特徴とする請求項１６から２６に記載のミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質または前記タンパク質の免疫原性断片。
【請求項２８】
ワクチン中に使用するための請求項１６から２６に記載のミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質またはその免疫原性断片、或いは請求項１から１１に記載の核酸配列。
【請求項２９】
ミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス感染撲滅用ワクチンを製造するための請求項１から１１に記載の核酸配列、請求項１２に記載のＤＮＡ断片、請求項１３に記載の組換えＤＮＡ分子、請求項１４に記載の生組換えキャリア、請求項１５に記載の宿主細胞、または請求項１６から２６に記載のタンパク質またはその免疫原性断片の使用。
【請求項３０】
少なくとも１つの請求項１６から２６に記載のミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質または前記タンパク質の免疫原性断片に加えて医薬的に許容され得る担体を含むことを特徴とするミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス感染を撲滅するためのワクチン。
【請求項３１】
請求項１から１１に記載の核酸配列、請求項１２に記載のＤＮＡ断片、請求項１３に記載の組換えＤＮＡ分子、請求項１４に記載の生組換えキャリアまたは請求項１５に記載の宿主細胞に加えて医薬的に許容され得る担体を含むことを特徴とするミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス感染を撲滅するためのワクチン。
【請求項３２】
請求項１６から２６に記載のタンパク質または前記タンパク質の免疫原性断片に対する抗体に加えて医薬的に許容され得る担体を含むことを特徴とするミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス感染を撲滅するためのワクチン。
【請求項３３】
アジュバントを含むことを特徴とする請求項３０から３２に記載のワクチン。
【請求項３４】
ウシに対して病原性のウイルスまたは微生物から誘導した追加抗原、前記抗原に対する抗体または前記抗原をコードする遺伝情報を含むことを特徴とする請求項３０から３２に記載のワクチン。
【請求項３５】
ウシに対して病原性のウイルスまたは微生物がウシヘルペスウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス、パラインフルエンザ３型ウイルス、ウシパラミクソウイルス、口蹄疫ウイルス、パスツレラ・ヘモリチカ、ウシ呼吸器合胞ウイルス、タイレリア種、バベシア種、トリパノソーマ種、アナプラズマ種、ネオスポラ・カニヌム、スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・アガラクチエ、マイコプラズマ、エシェリヒア・コリ、エンテロバクター、クレブシエラ、シトロバクター及びストレプトコッカス・ダイスガラクチエからなる群から選択されることを特徴とする請求項３４に記載のワクチン。
【請求項３６】
請求項１から１１に記載の核酸配列、請求項１２に記載のＤＮＡ断片、請求項１３に記載の組換えＤＮＡ分子、請求項１４に記載の生組換えキャリア、請求項１５に記載の宿主細胞、請求項１６から２６に記載のタンパク質または請求項１６から２６に記載のタンパク質に対する抗体を医薬的に許容され得る担体と混合することを含む請求項３０から３５に記載のワクチンの作成方法。
【請求項３７】
請求項１から１１に記載の核酸配列またはそのプライマー、請求項１６から２６に記載のタンパク質またはその免疫原性断片、または請求項１項から２６に記載のタンパク質と反応性の抗体及び適当な検出手段を含む診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ  ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ  ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）タンパク質をコードする核酸配列、前記タンパク質の免疫原性断片をコードする前記核酸配列の一部、前記核酸配列またはその一部を含むＤＮＡ断片、組換えＤＮＡ分子、生組換えキャリア及び宿主細胞に関する。本発明はまた、前記配列によりコードされるミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質及びその免疫原性部分に関する。本発明は更に、前記核酸配列及びその一部、前記核酸配列またはその一部を含むＤＮＡ断片、組換えＤＮＡ分子、生組換えキャリア及び宿主細胞、タンパク質またはその免疫原性部分、及び前記タンパク質またはその免疫原性部分に対する抗体を含むワクチンに関する。また、本発明はワクチン中及びワクチンの作成のための前記タンパク質の使用に関する。更には、本発明は診断薬またはワクチン接種の目的のための前記核酸配列、タンパク質または抗体の使用に関する。本発明は前記ワクチンの作成方法にも関する。最後に、本発明は前記核酸、タンパク質または前記タンパク質に対する抗体を含む診断キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ミコバクテリウム属の細菌はグラム陽性抗酸性微生物である。この属には、多数の重要なヒト及び動物病原体が含まれている。その中には、現在世界中で食肉及び乳製品業界において非常に多大な経済的損失を招く反芻動物の病気につながる慢性肉芽腫感染である傍結核症またはヨーネ病の原因菌であるミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスがある。世界中で家畜の群の大部分（２０〜７０％）が感染している。ヨーロッパでの毎年の推定損失は約ＧＢＰ  ２０７／乳牛である。米国での毎年の推定損失は約１５億米国ドルである（Ｎ．Ｂ．Ｈａｒｒｉｓ及びＲ．Ｇ．Ｂａｒｌｅｔｔａ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｌｏｂｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，１４：４８９−５１２（２００１））。
【０００３】
ミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスは、反芻動物における明白な病原性に加えて、最も一般的に遠位回腸及び結腸に影響を及ぼすだけでなく口から肛門及び肛門周囲部分までの胃腸管の任意の部分でも起こり得るヒトの非特異的慢性経壁炎症性疾患であるクローン病の原因であると疑われている（Ｐ．Ｑｕｉｒｋｅ，Ｇｕｔ，４５：７５５−７６０（２００１）；「クローン病とパラツベルクローシスの可能性ある関係(Possible links between Crohn's disease and Paratuberculosis)」，ヨーロッパ委員会，Ｄ−Ｇ健康及び消費者の保護(D-G Health and Consumer Protection)，２０００年３月２１日付の動物健康及び動物福祉に関する科学委員会の報告書(Report of the Scientific Committee on Animal Health and Animal Welfare)）。クローン病の重大な問題の１つはこの病気の治療法がない事実である。この病気の状態は、いったんかかると一生そのままで、死亡率が高くなる。
【０００４】
低温殺菌乳中に予期せずにミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスのより高熱耐性の株が存在していることに加えて、その株がクローン病の発生に関与していると疑われることから、人口に対する潜在的健康影響に関する関心が増えつつある。この最近の予期せぬ所見はＮ．Ｓｕｎｇ及びＭ．Ｔ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎｍ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６４：９９９−１００５（１９９８）に記載されている。この問題に対する意識が高まると、傍結核症をコントロール及び根絶するのに有効な診断薬及びワクチンの開発に対する緊急性が再び生じた。
【０００５】
ミコバクテリウム・アビウム(Mycobacterium avium)はミコバクテリウムの大部分を占め、３つの亜種、すなわちにミコバクテリウム・アビウム亜種アビウム（ａｖｉｕｍ）、ミコバクテリウム・アビウム亜種シルバチクム（ｓｉｌｖａｔｉｃｕｍ）及びミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスに分類され得る。ミコバクテリウム・アビウム亜種アビウムは土壌及び健康に見える動物を含めた自然環境、鳥類及び動物に広く分布している。ミコバクテリウム・アビウム亜種アビウム単離物は日和見病原体であり、通常免疫低下宿主において感染及び病気を生じさせる。ミコバクテリウム・アビウム亜種アビウム株１０４の完全ゲノム配列が現在決定されている。ミコバクテリウム・アビウム亜種シルバチクムはシカにおいて傍結核症に似た病気を生じさせ得る。多くの反芻動物は６ヶ月齢前でもミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスに感染するが、病気は通常少なくとも２歳以降になってからしか発症しない。この間細菌は宿主細胞の内部で生存していると考えられるが、細菌が糞便中に検出されるようになる期間胃腸管の内腔で感染の細胞外エピソードも起こる（感染の後期段階では頻度が高くなる）。現在利用されているミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスに対する（免疫）診断薬の感度、特に初期または不顕性感染の検出に関する感度は比較的低く、従って前記診断薬は病気コントロールのためのツールとして有効でない。家畜の群を病気から守るのに有効であると一部考えられている全細胞ミコバクテリアワクチンが使用されるが、このワクチンはウシ結核症の免疫診断を本質的に干渉し、病気の伝染を抑制しない。今までにミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスの幾つかの抗原成分が同定された。既に公開されているミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスの抗原分子は糖脂質及び小型実験動物で生じた本質的に単一特異性早期血清を用いて同定されたタンパク質抗原からなる。細胞壁糖脂質分子リポアラビノマンナン（ＬＡＭ）は細菌が放出する細胞濾液に対するモノクローナル抗体により認識することにより同定され、その後血清診断的ＥＬＩＳＡの開発のために精製され、使用された（Ｍｕｔｈａｒｉａら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６５：３８７−３９４（１９９７）；Ｊａｒｋら，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５１：１８９−１９８（１９９７））。加えて、分子量１４ｋＤ（Ｏｌｓｅｎら，Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８：７９７−８０１（２００１））、１８ｋＤ（バクテリオフェリチン；Ｅｌｓａｇｈｉｅｒら，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９０：５０３−５０８（１９９２））、１９ｋＤ（ＡｈｐＤ；Ｏｌｓｅｎら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６８：８０１−８０８（２０００））、２４ｋＤ（ｐ２４ＢＣＤ；；Ｅｌｓａｇｈｉｅｒら，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９０：５０３−５０８（１９９２））、３０ｋＤ（ｐ３０；Ｂｕｒｒｅｌｓら，Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｐａｔｈｏｌ，４５：３１１−３２０（１９９５））、３４ｋＤ（Ｇｉｌｏｔら，Ｊ．Ｂａｃｔ．，１７５：４９３０−４９３５（１９９３）；ＤｅＫｅｓｅｌら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３１：９４７−９５４（１９９３）；Ｃｏｅｔｓｉｅｒら，Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：４４６−４５１（１９９８））、３４．５ｋＤ（Ｍｕｔｈａｒｉａら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６５：３８７−３９４（１９９７））、３５ｋＤタンパク質（Ｄｈｅｅｎａｄｈａｙａｌａｎ及びＣｈａｎｇ，未公開データー）、３８ｋＤ（Ｅｌｓａｇｈｉｅｒら，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９０：５０３−５０８（１９９２））、４４．３ｋＤ（Ｍｕｔｈａｒｉａら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６５：３８７−３９４（１９９７））、４５ｋＤ（ＡｈｐＣ；Ｏｌｓｅｎら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６８：８０１−８０８（２０００））、６５ｋＤ（ｈｓｐ６５；Ｋｏｅｔｓら，Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ．，７０：１０５−１１５（１９９９））、７０ｋＤ（ｈｓｐ７０；Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９：４５５２（１９９１）；Ｋｏｅｔｓら，Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，７０：１０５−１１５（１９９９））を有するタンパク質抗原、及びスーパーオキシドジムスターゼ分子（Ｍｕｌｌｅｒａｄら，ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３４：８１（２００２））が同定され、部分的に特徴づけられた。これらの幾つかしか診断薬またはワクチンの開発のために評価されていない（３４ｋＤ；Ｃｏｅｔｓｉｅｒら，Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ，Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：４４６−４５１（１９９８））。従って、現在の診断薬及びワクチンは依然としてかなり粗な抗原物質をベースとしている。リポアラビノマンナン（Ｍｕｔｈａｒｉａら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６５：３８７−３９４（１９９７）；Ｊａｒｋら，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５７：１８９−１９８（１９９７））及び３４ｋＤ抗原（Ｇｉｌｏｔら，Ｊ．Ｂａｃｔ．，１７５：４９３０−４９３５（１９９３）；ＤｅＫｅｓｅｌら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３１：９４７−９５４（１９９３）；Ｃｏｅｔｓｉｅｒら，Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：４４６−４５１（１９９８））は診断薬及びワクチンへの使用のためにＤＥ１９６２１４８８及びＷＯ９２１６６２８に記載されている。幾つかの他の分子が診断薬、ワクチン及び治療薬中に使用されている。挿入配列ＩＳＭ−１（ＥＰＯ２８８３０６及びＵＳ５２２５３２４）、マイコバクテリアＤＡＰ分子（ＵＳ９５２３２２６）、３６ｋＤ抗原（ＵＳ５７７６６９２）、可溶性抗原調製物（ＲＵ２１１８５３８）、鉄還元能力を有する細胞外タンパク質（ＤＥ１９７２８８３４）及びアシラーゼ（国際特許出願公開第９９４９０５４号パンフレット）上でコードされるタンパク質が存在する。
【発明の開示】
【０００６】
本発明の目的は、哺乳動物、より具体的にはヒト及びウシにおけるミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスの病原作用に対する保護を与えることができるポリペプチドを提供することである。更に、多数の前記ポリペプチド及び前記ポリペプチドに対する抗体が有効な診断ツールを提供する。
【０００７】
今や驚くことに、先ず９種のポリペプチドが発現ライブラリーにおいて特異的に同定され、単離され、２つの追加ポリペプチドがプロテオミクスで同定され、これらの各ポリペプチドは、ミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスに対する免疫応答を誘導でき、ワクチン成分として適当であることが知見された。
【０００８】
本発明者らは、前記ポリペプチドが単独でまたは相互に組み合わせてワクチン成分として使用され得、哺乳動物、より具体的にはヒト及びウシにおけるミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス感染に対する保護を与えるために実際寄与し、ミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスにより生ずるダメージを減らすのを助けることを知見した。
【０００９】
本発明のワクチン成分（該ワクチン成分をコードする遺伝子）及び診断ツールを検出するために３種のアプローチを使用した。これらのアプローチは実施例により詳細に記載されている。１つのアプローチでは、発現ライブラリー中で免疫反応性ミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質をコードする遺伝子を検出するために非常に特異的な抗血清を使用している。使用した抗血清は、この抗血清がミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスに長期間感染したウシから得た点で発現ライブラリーのスクリーニングのために通常使用されている抗血清と異なる。更に、前記抗血清はミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスに自然に感染したことが判明しているが、結核、ブルセラ症またはロイコーシスに感染した病歴のないウシから採取した。このことは、スクリーニングに使用するための試験血清を得る前の約２年以内の少なくとも２つの糞便サンプルがミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス陽性であったという所見及び傍結核を引き起こし、パラツベルクローシス抗原と交差反応する菌に対する抗体または他の免疫応答が本質的にないという所見から明らかであった。こうして採取した血清はミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス抗原に対する免疫スクリーニングにおいて非常に有用である。なぜならば、前記血清は関連ミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスペプチド断片に対して非常に広く反応性であるのに対して、傍結核、ブルセラ症またはロイコーシスを引き起こす病原体との特異的反応性を本質的に全くまたは非常に少ししか示さないからである。
【００１０】
このアプローチにより、コード配列が下記するように配列番号１、３及び５に示される３つの新規な免疫原性タンパク質の所見が得られた。
【００１１】
今回、第１タンパク質をコードする遺伝子をクローン化し、配列決定し、免疫原性決定基を含む遺伝子の核酸配列は配列番号１に示されている。完全長遺伝子は２８ｋＤの分子量を有するタンパク質（配列番号２に示す）をコードする。
【００１２】
当業界で公知のように、多くの異なる核酸配列が１つの同一タンパク質をコードし得る。この現象は通常アミノ酸をコードする各トリプレットの第２及び特に第３塩基におけるゆらぎとして公知である。この現象により、同一タンパク質をコードする２つの核酸配列に非相同が生じ得る。よって、原則として、７０％くらいの低い配列相同性を有する２つの核酸配列は１つの同一タンパク質をコードし得る。
【００１３】
従って、本発明の第１実施態様の１形態は、ミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質をコードする核酸配列または前記タンパク質の免疫原性断片をコードする前記核酸の一部に関し、前記核酸配列またはその一部は配列番号１に示すミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質遺伝子の核酸配列と少なくとも８５％の相同性を有する。
【００１４】
免疫原性断片の概念を以下に定義する。免疫原性断片をコードする核酸配列の長さは通常少なくとも１８ヌクレオチド、しばしば２１ヌクレオチドであるが、好ましくは２４、２７、３０、３３、更には３６ヌクレオチドである。
【００１５】
ポリアクリルアミドゲルでのゲル電気泳動で測定される本発明のすべてのタンパク質の分子量は、当業界でしばしば経験する分子量測定のわずかな変動のためにある程度異なり得る。よって、本発明のタンパク質の分子量は理論分子量±５ｋＤであると解釈されるべきである。
【００１６】
好ましくは、本発明のミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質をコードする核酸配列または前記タンパク質の免疫原性断片をコードする前記核酸配列の一部は、配列番号１に示すミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質遺伝子の核酸配列と少なくとも９０％、好ましくは９３％、より好ましくは９５％の相同性を有する。
【００１７】
より好ましくは、相同性レベルは９８％、９９％、更には１００％である。
【００１８】
ヌクレオチド相同性レベルは、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂ１２．ｈｔｍｌに見つけることができるサブプログラム“ＢＬＡＳＴＮ”を選択することによりコンピュータープログラム“ＢＬＡＳＴ  ２  ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ”を用いて測定することができる。このプログラムについては、Ｔａｔｉａｎａ  Ａ．Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，１７４：２４７−２５０（１９９９）を参照されたい。使用するパラメーターはデフォルトパラメーターである：整合についてのリワード  ＋１；非整合についてのペナルティー  −２；オープンギャップ  ５；拡張ギャップ  ２；ギャップ  ｘ＿ドロップオフ  ５０。
【００１９】
配列番号１、または下記する配列番号３、５、７、９、１０、１３、１５または１７に示す配列に相補的なヌクレオチド配列、或いは本発明の配列のタンデムアレーを含むヌクレオチド配列も本発明の範囲内である。
【００２０】
この実施態様の別の形態は、配列番号３に示すミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質遺伝子の核酸配列に対して少なくとも８５％の相同性を有する、１４ｋＤミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質をコードする核酸配列または前記タンパク質の免疫原性断片をコードする前記核酸配列の一部に関する。
【００２１】
好ましくは、本発明の１４ｋＤミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質をコードする核酸配列または前記タンパク質の免疫原性断片をコードする前記核酸配列の一部は配列番号３に示すミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質遺伝子の核酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９３％、より好ましくは９５％の相同性を有する。
【００２２】
より好ましくは、相同性レベルは９８％、９９％、更には１００％である。
【００２３】
前記実施態様の更に別の形態は、配列番号５に示すミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質遺伝子の核酸配列に対して少なくとも８５％の相同性を有する、９ｋＤミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質をコードする核酸配列または前記タンパク質の免疫原性断片をコードする前記核酸配列の一部に関する。
【００２４】
好ましくは、本発明の９ｋＤミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質をコードする核酸配列または前記タンパク質の免疫原性断片をコードする前記核酸配列の一部は配列番号５に示すミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質遺伝子の核酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９３％、より好ましくは９５％の相同性を有する。
【００２５】
より好ましくは、相同性レベルは９８％、９９％、更には１００％である。
【００２６】
免疫学的に重要なポリペプチドを検出するために使用される別のアプローチは、ミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質に対する高特異的モノクローナル抗体の使用に基づいていた。このアプローチは上記したミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスに対する特定抗血清を用いるアプローチよりも高い特異性を有するという利点を有する。前記したモノクローナル抗体を用いると、更に６個の免疫原性ミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質が同定、単離された。
【００２７】
従って、この実施態様の別の形態は、配列番号７に示すミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質遺伝子の核酸配列に対して少なくとも８５％の相同性を有する、４７ｋＤミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質をコードする核酸配列または前記タンパク質の免疫原性断片をコードする前記核酸配列の一部に関する。
【００２８】
好ましくは、本発明の４７ｋＤミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質をコードする核酸配列または前記タンパク質の免疫原性断片をコードする前記核酸配列の一部は配列番号７に示すミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質遺伝子の核酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９３％、より好ましくは９５％の相同性を有する。
【００２９】
より好ましくは、相同性レベルは９８％、９９％、更には１００％である。
【００３０】
この実施態様の別の形態は、配列番号９に示すミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質遺伝子の核酸配列に対して少なくとも８５％の相同性を有する、ミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質をコードする核酸配列または前記タンパク質の免疫原性断片をコードする前記核酸配列の一部に関する。
【００３１】
好ましくは、本発明のミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質をコードする核酸配列または前記タンパク質の免疫原性断片をコードする前記核酸配列の一部は配列番号９に示すミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質遺伝子の核酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９３％、より好ましくは９５％の相同性を有する。
【００３２】
より好ましくは、相同性レベルは９８％、９９％、更には１００％である。
【００３３】
この実施態様の別の形態は、配列番号１１に示すミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質遺伝子の核酸配列に対して少なくとも８５％の相同性を有する、ミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質をコードする核酸配列または前記タンパク質の免疫原性断片をコードする前記核酸配列の一部に関する。
【００３４】
好ましくは、本発明のミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質をコードする核酸配列または前記タンパク質の免疫原性断片をコードする前記核酸配列の一部は配列番号１１に示すミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質遺伝子の核酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９３％、より好ましくは９５％の相同性を有する。
【００３５】
より好ましくは、相同性レベルは９８％、９９％、更には１００％である。
【００３６】
この実施態様の別の形態は、配列番号１３に示すミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質遺伝子の核酸配列に対して少なくとも８５％の相同性を有する、ミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質をコードする核酸配列または前記タンパク質の免疫原性断片をコードする前記核酸配列の一部に関する。
【００３７】
好ましくは、本発明のミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質をコードする核酸配列または前記タンパク質の免疫原性断片をコードする前記核酸配列の一部は配列番号１３に示すミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質遺伝子の核酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９３％、より好ましくは９５％の相同性を有する。
【００３８】
より好ましくは、相同性レベルは９８％、９９％、更には１００％である。
【００３９】
この実施態様の別の形態は、配列番号１５に示すミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質遺伝子の核酸配列に対して少なくとも８５％の相同性を有する、ミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質をコードする核酸配列または前記タンパク質の免疫原性断片をコードする前記核酸配列の一部に関する。
【００４０】
好ましくは、本発明のミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質をコードする核酸配列または前記タンパク質の免疫原性断片をコードする前記核酸配列の一部は配列番号１５に示すミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質遺伝子の核酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９３％、より好ましくは９５％の相同性を有する。
【００４１】
より好ましくは、相同性レベルは９８％、９９％、更には１００％である。
【００４２】
この実施態様の別の形態は、配列番号１７に示すミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質遺伝子の核酸配列に対して少なくとも８５％の相同性を有する、ミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質をコードする核酸配列または前記タンパク質の免疫原性断片をコードする前記核酸配列の一部に関する。
【００４３】
好ましくは、本発明のミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質をコードする核酸配列または前記タンパク質の免疫原性断片をコードする前記核酸配列の一部は配列番号１７に示すミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質遺伝子の核酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９３％、より好ましくは９５％の相同性を有する。
【００４４】
より好ましくは、相同性レベルは９８％、９９％、更には１００％である。
【００４５】
ミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスのプロテオームの注意深い分析に基づく第３のアプローチにより、２つの新規ワクチン成分が検出された。このアプローチは２Ｄ−ゲルでの免疫原性タンパク質の同定に基づく。このアプローチの利点は、発現ライブラリーで見つかっていないか同定されていないタンパク質が今回ワクチン成分として明確に同定できる点で他のアプローチよりも有利である。方法の詳細は実施例２に記載する。
【００４６】
よって、本発明の別の実施態様は、５．６０〜６．１５のＰＩを有する６０ｋＤミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質に関する。このタンパク質は、図１Ｂ及びＤにおいて約５スポットの水平列（例えば２Ｄ−ゲル電気泳動用サンプルの調製により誘導される各種翻訳後修飾またはアーチファクトを表すイソ型の小さな違いによる）として目に見える。
【００４７】
更に、別の実施態様は、４．２０〜４．７５のＰＩを有する３３ｋＤミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質に関する。このタンパク質は、図１Ａ及びＤにおいて約３スポットの水平列（例えば２Ｄ−ゲル電気泳動用サンプルの調製により誘導される各種翻訳後修飾またはアーチファクトを表すイソ型の小さな違いによる）として目に見える。
【００４８】
上記タンパク質が今回明確に同定されたので、これらのタンパク質を配列決定することできる。例えば、最初の１５Ｎ末端アミノ酸は当業界で公知の一般的手順に従って決定され得る。Ｎ末端配列決定は例えば現在市販されており、ルーチン的にタンパク質配列決定を専門としている会社により実施されている。その後、前記タンパク質をコードする遺伝子が縮重プローブを用いて容易に決定し得る。これらの技術は当業界で公知である。
【００４９】
本発明は新規なミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質をコードする核酸配列を開示しているので、今回初めて前記タンパク質を十分量得ることが可能である。これは、例えば本発明の前記タンパク質またはその免疫原性断片をコードする遺伝子の全部または一部を発現させるべく発現系を用いることにより実施され得る。よって、核酸配列に関する実施態様のより好ましい形態では、本発明は本発明の核酸配列を含むＤＮＡ断片に関する。ＤＮＡ断片は本発明の核酸配列に対する担体として機能するヌクレオチドである。前記ＤＮＡ断片は、例えば本発明の核酸配列がクローン化されるプラスミドであり得る。前記ＤＮＡ断片は以下に記載するように例えばプライマーとして使用するためのＤＮＡの量を増加させるために、ＤＮＡワクチン接種目的のため、及び本発明の核酸配列を発現させるために有用である。
【００５０】
核酸配列を発現させるための必須要件は、核酸配列がプロモーターの制御下にあるように前記核酸配列に機能的に連結した適当なプロモーターである。当業者に自明のように、プロモーターの選択はタンパク質発現のための宿主細胞として使用される細胞において遺伝子転写できる真核、原核またはウイルスプロモーターにも及ぶ。よって、前記実施態様のより好ましい形態は、本発明のＤＮＡ断片及び／または核酸配列を含む組換えＤＮＡ分子に関し、前記核酸配列は機能的に連結したプロモーターの制御下にある。これは、例えば一般的な分子生物学技術を用いて得ることができる（Ｍａｎｉａｔｉｓ／Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，「分子クローニング：実験マニュアル(Molcecular cloning: a laboratory manual)」，ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−３０６−６（１９８９））。
【００５１】
機能的に連結したプロモーターは、該プロモーターに連結している核酸配列の転写をコントロールし得るプロモーターである。前記プロモーターは、発現のために使用される細胞において機能するならば本発明の新規遺伝子の天然プロモーターまたはミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスの別のプロモーターであり得る。宿主細胞が細菌の場合、使用され得る有用な発現制御配列には、Ｔｒｐプロモーター及びオペレーター（Ｇｏｅｄｄｅｌら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，８：４０５７（１９８０））；ｌａｃプロモーター及びオペレーター（Ｃｈａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ，２７５：６１５（１９７８））；外膜タンパク質プロモーター（Ｋ．Ｎａｋａｍｕｒａ及びＭ．Ｉｎｏｕｇｅ，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１：７７１−７７５（１９８２））；バクテリオファージラムダプロモーター及びオペレーター（Ｅ．Ｒｅｍａｕｔら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１１：４６７７−４６８８（１９８３））；α−アミラーゼ（枯草菌）プロモーター及びオペレーター；転写配列及び選択宿主細胞に適合する他の発現強化及び制御配列が含まれる。宿主細胞が酵母の場合、有用な発現制御配列には例えばα−交配因子が含まれる。昆虫細胞の場合、バキュロウイルスの多面体またはｐ１０プロモーターが使用され得る（Ｇ．Ｅ．Ｓｍｉｔｈら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３：２１５６−６５（１９８３））。宿主細胞が脊椎動物起源の場合、有用な発現制御配列の例には（ヒト）サイトメガロウイルス前初期プロモーター（Ｂ．Ｓｅｅｄら，Ｎａｔｕｒｅ，３２９：８４０−８４２（１９８７）；Ｅ．Ｆ．Ｆｙｎａｎら，ＰＮＡＳ，９０：１１４７８−１１４８２（１９９３）；Ｊ．Ｂ．Ｕｌｍｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９：１７４５−１７４８（１９９３））；ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ（ＲＳＶ；Ｇ．Ｍ．Ｇｏｒｍａｎら，ＰＮＡＳ，７９：６７７７−６７８１（１９８２）；上掲のＦｙｎａｎら；上掲のＵｌｍｅｒら）；ＭＰＳＶ  ＬＴＲ（Ｓｔａｃｅｙら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５０：７２５−７３２（１９８４））；ＳＶ４０前初期プロモーター（Ｊ．Ｓｐｒａｇｕｅら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，４５：７７３（１９８３））；ＳＶ−４０プロモーター（Ｐ．Ｗ．Ｂｅｒｍａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２：５２４−５２７（１９８３））；メタロチオネインプロモーター（Ｒ．Ｌ．Ｂｒｉｎｓｔｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２９６：３９−４２（１９８２））；熱ショックプロモーター（Ｖｏｅｌｌｍｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：４９４９−５３（１９８５））；Ａｄ２の主要後期プロモーター及びβ−アクチンプロモーター（Ｔａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ，３５６：１５２−１５４（１９９２））が含まれる。調節配列にはターミネーター及びポリアデニル化配列も含まれる。使用され得る配列の中には、公知のウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ＳＶ４０ポリアデニル化配列、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）ターミネーター及びポリアデニル化配列がある。
【００５２】
細菌、酵母、真菌、昆虫及び脊椎動物発現系は非常に頻繁に使用される系である。前記系は当業界で公知であり、通常例えば米国カリフォルニア州パロアルト、ファビアン・ウェイに所在のＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．から入手し得る。前記した発現系の次には、寄生虫ベースの発現系が魅力的な発現系である。前記系は、例えば仏国特許出願公開第２７１４０７４号明細書及び米国特許出願第０８／０４３１０９号明細書（Ｓ．Ｈｏｆｆｍａｎ及びＷ．Ｒｏｇｅｒｓ，１９９３年１２月１日付け公開）に記載されている。
【００５３】
本発明のこの実施態様の更に好ましい形態は、本発明のミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質またはその免疫原性断片をコードする核酸配列、本発明のＤＮＡ断片または本発明の組換えＤＮＡ分子を含む生組換えキャリア（ＬＲＣ）に関する。前記ＬＲＣは追加遺伝子情報（この場合には、本発明のミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質またはその免疫原性断片をコードする核酸配列）がクローン化されている微生物またはウイルスである。前記ＬＲＣに感染したウシはキャリアの免疫原に対してだけでなく、例えば１つ以上の本発明の新規なミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質遺伝子のような遺伝コードが更にＬＲＣにクローン化されるタンパク質の免疫原性部分に対しても免疫応答を生ずる。
【００５４】
細菌性ＬＲＣとして、当業界で公知の弱毒化サルモネラ株が非常に魅力的に使用され得る。また、生組換えキャリア寄生虫は例えばＡ．Ｎ．Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ，Ｉｎｔ．Ｊｏｕｒｎ，Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．，２８：１１２１−１１３０（１９９８）に記載されている。更に、ＬＲＣウイルスは核酸配列を標的細胞に運ぶ方法として使用され得る。生組換えキャリアはベクターウイルスとも称される。ベクターとしてしばしば使用されるウイルスは、ワクシニアウイルス（Ｐａｎｉｃａｌｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：４９２７（１９８２））、ヘルペスウイルス（欧州特許出願公開第０４７３２１０号明細書）及びレトロウイルス（Ｄ．Ｖａｌｅｒｉｏら，Ｓ．Ｊ．Ｂａｕｍ，Ｋ．Ａ．Ｄｉｃｋｅ，Ｅ．Ｌｏｔｚｏｖａ及びＤ．Ｈ．Ｐｌｕｚｎｉｋ編，「今日の実験的血液学(Experimental Haematology today)−１９８８」，ｐ．９２−９９，ニューヨークに所在のＳｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９８９）発行）である。
【００５５】
当業界で公知のインビボ相同組換えの技術は、宿主動物において本発明の挿入核酸配列の発現を誘導し得る組換え核酸配列を選択した細菌、寄生虫またはウイルスのゲノムに導入するために使用される。
【００５６】
本発明のこの実施態様の最後の形態は、本発明のタンパク質をコードする核酸配列、前記核酸配列を含むＤＮＡ断片、または機能的に連結したプロモーターの制御下で前記核酸配列を含む組換えＤＮＡ分子を含む宿主細胞に関する。この形態は本発明のミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質またはその免疫原性断片をコードする核酸分子を含む生組換えキャリアを含む宿主細胞にも関する。宿主細胞は細菌起源、例えば大腸菌、枯草菌及びラクトバシラス種の細胞とｐＢＲ３２２のような細菌ベースのプラスミド、ｐＥＸシリーズ、ｐＥＴシリーズまたはｐＧＥＸシリーズのような細菌発現ベクター、またはバクテリオファージの組み合わせであり得る。宿主細胞は真核起源のもの、例えば酵母特異的ベクター分子との組合せの酵母細胞；高級真核細胞、例えばベクターまたは組換えバキュロウイルスと組合せた昆虫細胞（Ｌｕｃｋｏｗら，Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：４７−５５（１９８８））；例えばＴｉ−プラスミドベースベクターまたは植物ウイルスベクター（Ｋ．Ａ．Ｂａｒｔｏｎら，Ｃｅｌｌ，３２：１０３３（１９８３））と組み合わせた植物細胞；哺乳動物細胞、例えば適当なベクターまたは組換えウイルスを含むＨｅｌａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣｒａｎｄｅｌｌ  Ｆｅｌｉｎｅ腎臓細胞であり得る。
【００５７】
本発明の別の実施態様は、本発明の新規なミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質及びその免疫原性断片に関する。
【００５８】
免疫原性断片の概念を以下に定義する。
【００５９】
この実施態様の１形態は、配列番号２に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは好ましい順に９４％、９５％、更には９６％の配列相同性を有する、２８ｋＤミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質及びその免疫原性断片に関する。
【００６０】
より好ましくは、相同性レベルは好ましい順に９７％、９８％、９９％、更には１００％である。
【００６１】
本発明の配列番号２及び下記する配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８に示すミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質の免疫原性断片は、好ましくは少なくとも６、より好ましくは好ましい順に７、８、９、１０、１２、１５、２０、３０、更には４０アミノ酸の長さを有する。
【００６２】
この実施態様の更に好ましい形態は、配列番号１に示す核酸配列によりコードされるミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質及び前記タンパク質の免疫原性断片に関する。
【００６３】
上記したように、細菌は宿主細胞内で生存するが、胃腸管の内腔における感染の細胞外エピソードも起こる。このことは、細胞性及び抗体媒介免疫応答が疾患に対する十分な防御において役割を果たすことを意味している。実施例に示すように、Ｔ細胞応答及びＢ細胞応答の両方をチェックする検査が本発明のタンパク質のワクチン成分としての価値を調べるために使用される。
【００６４】
本発明の別の形態は、配列番号４に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは好ましい順に９４％、９５％、更には９６％の配列相同性を有する、１４ｋＤミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質及びその免疫原性断片に関する。
【００６５】
より好ましくは、相同性レベルは好ましい順に９７％、９８％、９９％、更には１００％である。
【００６６】
本発明の更に別の好ましい形態は、配列番号３に示す核酸配列によりコードされる１４ｋＤミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質及び前記タンパク質の免疫原性断片に関する。
【００６７】
本発明の更に別の形態は、配列番号６に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは好ましい順に９４％、９５％、更には９６％の配列相同性を有する、９ｋＤミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質及びその免疫原性断片に関する。
【００６８】
より好ましくは、相同性レベルは好ましい順に９７％、９８％、９９％、更には１００％である。
【００６９】
本発明の更に別の好ましい形態は、配列番号５に示す核酸配列によりコードされる９ｋＤミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質及び前記タンパク質の免疫原性断片に関する。
【００７０】
本発明の別の形態は、配列番号８に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは好ましい順に９４％、９５％、更には９６％の配列相同性を有する、４７ｋＤミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質及びその免疫原性断片に関する。
【００７１】
より好ましくは、相同性レベルは好ましい順に９７％、９８％、９９％、更には１００％である。
【００７２】
本発明の更に別の好ましい形態は、配列番号７に示す核酸配列によりコードされる４７ｋＤミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質及び前記タンパク質の免疫原性断片に関する。
【００７３】
本発明の別の形態は、配列番号１０に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは好ましい順に９４％、９５％、更には９６％の配列相同性を有する、ミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質及びその免疫原性断片に関する。
【００７４】
より好ましくは、相同性レベルは好ましい順に９７％、９８％、９９％、更には１００％である。
【００７５】
本発明の更に別の好ましい形態は、配列番号９に示す核酸配列によりコードされるミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質及び前記タンパク質の免疫原性断片に関する。
【００７６】
また、本発明の別の形態は、配列番号１２に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは好ましい順に９４％、９５％、更には９６％の配列相同性を有する、ミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質及びその免疫原性断片に関する。
【００７７】
より好ましくは、相同性レベルは好ましい順に９７％、９８％、９９％、更には１００％である。
【００７８】
本発明の更に別の好ましい形態は、配列番号１１に示す核酸配列によりコードされるミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質及び前記タンパク質の免疫原性断片に関する。
【００７９】
また、本発明の別の形態は、配列番号１４に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは好ましい順に９４％、９５％、更には９６％の配列相同性を有する、ミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質及びその免疫原性断片に関する。
【００８０】
より好ましくは、相同性レベルは好ましい順に９７％、９８％、９９％、更には１００％である。
【００８１】
本発明の更に別の好ましい形態は、配列番号１３に示す核酸配列によりコードされるミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質及び前記タンパク質の免疫原性断片に関する。
【００８２】
また、本発明の別の形態は、配列番号１６に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは好ましい順に９４％、９５％、更には９６％の配列相同性を有する、ミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質及びその免疫原性断片に関する。
【００８３】
より好ましくは、相同性レベルは好ましい順に９７％、９８％、９９％、更には１００％である。
【００８４】
本発明の更に別の好ましい形態は、配列番号１５に示す核酸配列によりコードされるミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質及び前記タンパク質の免疫原性断片に関する。
【００８５】
また、本発明の別の形態は、配列番号１８に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９２％、より好ましくは好ましい順に９４％、９５％、更には９６％の配列相同性を有する、ミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質及びその免疫原性断片に関する。
【００８６】
より好ましくは、相同性レベルは好ましい順に９７％、９８％、９９％、更には１００％である。
【００８７】
本発明の更に別の好ましい形態は、配列番号１７に示す核酸配列によりコードされるミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質及び前記タンパク質の免疫原性断片に関する。
【００８８】
タンパク質相同性のレベルはｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ，ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂ１２．ｈｔｍｌに見つけることができるサブプログラム“ＢＬＡＳＴＰ”を選択することによりコンピュータープログラム“ＢＬＡＳＴ  ２  ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ”を用いて測定することができる。このプログラムについては、Ｔａｔｉａｎａ  Ａ．Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，１７４：２４７−２５０（１９９９）を参照されたい。使用するマトリックス：“ｂｌｏｓｕｍ  ６２”。使用するパラメーターはデフォルトパラメーターである：オープンギャップ  １１；拡張ギャップ  １；ギャップ  ｘ＿ドロップオフ  ５０。
【００８９】
本発明に包含される特定タンパク質に関して、各ミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス株間に天然変異が存在し得ると理解される。これらの変異は全配列中のアミノ酸の違いにより、前記配列中のアミノ酸の欠失、置換、挿入、逆位または付加により示され得る。本質的に生物学的及び免疫学的活性を変化させないアミノ酸置換は、例えばＮｅｕｒａｔｈら，「タンパク質(Proteins)」，ニューヨークに所在のＡｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９７９年）発行に記載されている。関連アミノ酸間のアミノ酸置換または進化中にしばしば起こる置換は、特にＳｅｒ／Ａｌａ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｉｌｅ／Ｖａｌである（例えば、Ｍ．Ｄ．Ｄａｙｈｏｆ，「タンパク質配列及び構造の図表集(Atlas of protein sequence and structure)」，第５巻，補遺３，ワシントン・ディー・シーに所在のＮａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．（１９７８年）発行）。他のアミノ酸置換には、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｔｈｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ及びＡｌａ／Ｇｌｕが含まれる。この情報に基づいて、Ｌｉｐｍａｎ及びＰｅａｒｓｏｎはタンパク質を迅速に高感度で比較し（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７：１４３５−１４４１（１９８５））、相同タンパク質間の機能類似性を決定する方法を開発した。本発明の例示実施態様のアミノ酸置換並びに欠失及び／または挿入を有する変異は、生じたタンパク質がその免疫反応性を保持している限り本発明の範囲である。これは、異なる圃場単離物から単離した本発明のミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質が約７０％の相同性レベルを有しているが同一のタンパク質が同一の免疫学的特性で表されることの説明である。ミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス感染に対してまたは少なくとも前記感染の発症に対して免疫応答を誘導し得るタンパク質を与える本発明の特定タンパク質のアミノ酸配列の変異は“本質的に免疫原性に影響を及ぼさない”と見做される。
【００９０】
タンパク質を例えばワクチン接種の目的または抗体を作成するために使用する場合、前記タンパク質は必ずしも全タンパク質として使用する必要がない。そのままで或いはＫＬＨのような担体にカップリングさせたときにタンパク質に対する免疫応答を誘導し得るタンパク質の断片、いわゆる免疫原性断片を使用することも可能である。「免疫原性断片」は脊椎動物宿主において免疫応答を誘導し得る能力を維持した完全長タンパク質の断片を指し、例えばＢ細胞またはＴ細胞エピトープを含む。簡単に言えば、免疫原性断片は本発明のミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質に対する免疫原性応答を誘導し得る断片である。この場合、各種技術が抗原断片（決定基）をコードするＤＮＡ断片を簡単に同定するために利用し得る。Ｇｅｙｓｅｎら（国際特許出願公開第８４／０３５６４号パンフレット；同第８６／０６４８７号パンフレット；米国特許第４，８３３，０９２号明細書；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８１：３９９８−４００２（１９８４）；Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈ．，１０２：２５９−２７４（１９８７））が記載している方法、所謂ＰＥＰＳＣＡＮ方法がエピトープ（タンパク質の免疫学的に重要な領域）を検出するための実施が容易で迅速な十分に確立された方法である。この方法は世界中で使用されており、当業者に公知である。この（実験的）方法は特にＢ細胞及びＴ細胞エピトープを検出するために適している。また、タンパク質をコードする遺伝子の配列が与えられているならば、コンピューターアルゴリズムにより現在公知のエピトープとの配列及び／または構造の一致に基づいて免疫学的に重要なエピトープとして特定タンパク質断片を設計することができる。これらの領域の決定は、Ｈｏｏｐ及びＷｏｏｄｓの親水性基準（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７８：３８２４８−３８２８（１９８１））及びＣｈｏｕ及びＦａｓｔｍａｎの二次構造アスペクト（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，４７：４５−１４８（１９８７）；米国特許第４，５５４，１０１号明細書）の組合せに基づく。Ｔ細胞エピトープも同様にＢｅｒｚｏｆｓｋｙの両親媒性基準（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５：１０５９−１０６２（１９８７）；米国特許出願第０７／００５，８８５号明細書）を用いてコンピューターにより配列から予測され得る。要約した概説は、一般的原理についてはＳｈａｎ  Ｌｕら，Ｔｉｂｔｅｃｈ，９：２３８−２４２（１９９１）、マラリアエピトープについてはＧｏｏｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５：１０５９−１０６２（１９８７）、概説についてはＬｕ，Ｖａｃｃｉｎｅ，１０：３−７（１９９２）、ＨＩＶエピトープについてはＢｅｒｚｏｆｓｋｙ，Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ，５：２４１２−２４１８（１９９１）に見つけられる。免疫原性断片は通常少なくとも６、より一般的には７〜８アミノ酸、好ましくは８以上、例えば９、１０、１２、１５、更には２０以上のアミノ酸の長さを有する。よって、前記断片をコードする核酸配列は少なくとも１８、より一般的には２４、好ましくは２７、３０、３６、４５、更には６０核酸の長さを有する。
【００９１】
従って、本発明の別の実施態様の１形態は、上記した本発明のミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質またはその免疫原性断片の少なくとも１つに加えて医薬的に許容され得る担体を含むミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス感染を撲滅するためのワクチンに関する。
【００９２】
本発明の別の実施態様は、ワクチン中に使用するための本発明のミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質またはその免疫原性断片に関する。
【００９３】
本発明の更に別の実施態様は、ワクチン、より具体的にはミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス感染を撲滅するワクチンを作成するための本発明の核酸配列、ＤＮＡ断片、組換えＤＮＡ分子、生組換えキャリア、宿主細胞、或いはタンパク質またはその免疫原性断片の使用に関する。
【００９４】
本発明のワクチンの１つの作成方法は、細菌を増殖後、その細菌または上清からミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質またはその免疫原性断片を生化学的に精製することを含む。しかしながら、この方法ではワクチンを作成するのに非常に時間がかかる。
【００９５】
従って、ワクチン中に本発明のミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質またはその免疫原性断片をコードする遺伝子の発現産物を使用することが非常に便利である。これは、ワクチン成分として好適な９個の新規なミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質をコードする遺伝子の核酸配列が本発明で提供されたので今回初めて可能となった。
【００９６】
上記した遺伝子の発現産物をベースとするワクチンは、本発明のタンパク質またはその免疫原性断片を下記する医薬的に許容され得る担体と混合することにより容易に作成され得る。
【００９７】
或いは、本発明のワクチンは、本発明のタンパク質またはその免疫原性断片を発現し得る上記した生組換えキャリアを含み得る。例えばサルモネラキャリアまたはウイルスキャリア（例えば、ヘルペスウイルスベクター）をベースとするようなワクチンはミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスの感染の自然な様式により良く似ているのでサブユニットワクチンよりも有利である。更に、免疫化のためには組換えキャリアを低量しか必要としないので自己増殖も有利である。
【００９８】
ワクチンは、本発明のタンパク質またはその免疫原性断片を含む上記した宿主細胞をベースとし得る。
【００９９】
本発明のワクチンは、例えば死滅全細菌ワクチン及び生弱毒化ワクチンに比して更に有利である。全細胞をベースとするワクチンはすべての抗原決定基、すなわち細菌上に存在するすべてのエピトープに対する抗体を誘導する。従って、前記ワクチンに対して生ずる抗体パネルはフィールド感染後生ずる抗体パネルに匹敵する。その結果、動物が感染しているのかワクチン接種されたかを区別することは不可能である。ワクチン成分として本発明のタンパク質またはその免疫原性断片、すなわち全細菌のサブユニットを使用すると、ワクチン接種された動物のみが投与したサブユニットに対する抗体を生ずるという利点がある。疑われる動物の抗体パネルをワクチン接種した動物及びフィールド感染動物の抗体パネルと比較さえすれば、その動物がフィールド感染しているかまたはワクチン接種されているかが分かる。以下に詳細に説明する検査のために、簡単なＥＬＩＳＡ検査が十分である。１つ以上のサブユニットをベースとするワクチンはマーカーワクチンとして公知である。これらのワクチンはフィールド感染を区別し得る点でマークされる。マーカーワクチンの概念を以下に詳細に検討する。
【０１００】
非常に魅力的なマーカーワクチンは配列番号６に示す配列を有する９ｋＤタンパク質またはその免疫原性断片をベースとするワクチンである。その理由は、ミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスに対する抗体とミコバクテリウム・ボビス(Mycobacterium bovis)に対する抗体との交差反応性が比較的高レベルであるからである。ミコバクテリウム・ボビスはウシ結核の原因菌である。この細菌に他の動物種も感染させる。更に、この病気は人畜共通性感染病であり、ヒトに伝染し得る。世界保健機構（ＷＨＯ）は１９９０〜１９９９年のヒト型結核菌（ＴＢ）の罹患者及び死亡者はそれぞれ８８００万人及び３０００万人であり、多くは発展途上国の症例である。（ミコバクテリウム・ボビスにより生ずる）人畜共通性感染ＴＢは、サーベイランス及び管理活動がしばしば不十分であったりまたはないので、感染の多くの疫学及び公衆衛生がかなり未知のままである多くの発展途上国の動物に存在する。
【０１０１】
ミコバクテリウム・ボビスが他の動物に接触伝染性であることがミコバクテリウム・ボビスの根絶が試みられている理由の１つである。この目的を達成するのに必要な手段の１つはウシＰＰＤ  ＤＴＨ検査のような診断検査でミコバクテリウム・ボビス陽性であると判明したウシを根絶することである。上記したように、感染の原因に関係なくミコバクテリウム・ボビスとミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスに対する血清の交差反応性のために本試験で陽性と判明した動物が根絶される。
【０１０２】
よって、本発明のサブユニットワクチンによるワクチン接種とミコバクテリウム・ボビスまたはミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスのいずれかによるフィールド感染を明確に区別し得る診断検査は非常に貴重なツールであろう。
【０１０３】
本発明の作用効果の１つは、ミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質がＰＰＤ検査でミコバクテリウム・ボビスと交差反応を示さないことが判明したことである。配列番号６に示すアミノ酸配列を有するタンパク質が上記タンパク質に属する。
【０１０４】
従って、この実施態様の好ましい形態は配列番号６に示すタンパク質またはその免疫原性断片を含むワクチンに関する。
【０１０５】
上記したマーカー目的のために使用し得る特性を必須としないワクチンを望むならば、本発明の他のタンパク質、または６５ｋＤまたは７０ｋＤ熱ショックタンパク質またはその免疫原性断片を添加することが有利である。前記配合ワクチンにより、単一ワクチンに比してワクチンの効果が高められる。より好ましい実施態様では、本発明のワクチンは９ｋＤタンパク質及び１つ以上の本発明の他のタンパク質、または熱ショックタンパク質またはその免疫原性質断片を含む。
【０１０６】
上記したワクチンはすべて能動的ワクチン接種に寄与し、すなわち宿主の防御系をトリガーする。或いは、抗体は例えば家兎において生じ得るか、または下記する抗体産生細胞株から得ることができる。その後、前記抗体はワクチン接種／防御しようとする哺乳動物に対して投与され得る。このワクチン接種方法の受動的ワクチン接種は哺乳動物が既に感染しているときに選択されるワクチン接種であり、自然免疫応答をトリガーするのに時間を要しない。突然高感染圧や免疫低下者になりがちな哺乳動物にワクチン接種するための好ましい方法でもある。この場合投与された本発明のタンパク質またはその免疫原性断片に対する抗体はミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスと干渉することがある。このアプローチはミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス発生を低下または停止する点で有利である。よって、本発明のこの実施態様の他の形態は、本発明のミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質または前記タンパク質の免疫原性断片に対する抗体に加えて医薬的に許容され得る担体を含むミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス感染を撲滅するためのワクチンに関する。
【０１０７】
本発明の更に別の実施態様は、本発明のミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質または前記タンパク質の免疫原性断片に対する抗体に関する。
【０１０８】
本発明の抗体を大規模に作成する方法も当業界で公知である。前記方法は、ファージディスプレイのために糸状菌における本発明のタンパク質をコードする遺伝情報（の断片）のクローン化を利用している。この技術は、ｈｔｔｐ：／／ａｘｉｍｔ１．ｉｍｔ．ｕｎｉ−ｍａｒｂｕｒｇ．ｄｅ／〜ｒｅｋ／ａｅｐｐｈａｇｅ．ｈｔｍｌで“糸状菌ファージディスプレイ”の欄の“抗体エンジニアリングファージ”、及びＲ．Ｃｏｒｔｅｓｅら，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１２：２６２−２６７（１９９４）；Ｔ．Ｃｌａｃｋｓｏｎ及びＪ．Ａ．Ｗｅｌｌｓ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．，１２：１７３−１８３（１９９４）；Ｊ．Ｄ．Ｍａｒｋｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：１６００７−１６０１０（１９９２）；Ｇ．Ｗｉｎｔｅｒら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３−４５５（１９９４）及びＭ．Ｌｉｔｔｌｅら，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ａｄｖ．，１２：５３９−５５５（１９９４）の文献に記載されている。前記ファージはその後ラクダ重鎖抗体を発現するラクダ発現ライブラリーをスクリーニングするために使用される（Ｓ．Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ及びＭ．Ｌａｕｗｅｒｅｙｓ，Ｊｏｕｒｎ．Ｍｏｌｅｃ．Ｒｅｃｏｇｎ．，１２：１３１−１４０（１９９９）及びＭ．Ａ．Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，４１４：５１２−５２６（１９９７））。所望抗体を発現するライブラリーからの細胞は複製され得、その後抗体の大規模発現のために使用され得る。
【０１０９】
更に別の実施態様は、本発明の抗体及び医薬的に許容され得る担体を混合することを含む本発明のワクチンの作成方法に関する。
【０１１０】
ワクチン接種の別の効率的な方法は当該抗原をコードするＤＮＡを直接ワクチン接種することである。タンパク質をコードするＤＮＡを用いる直接ワクチン接種は多種類のタンパク質で成功している。例えば、Ｄｏｎｎｅｌｌｙら，Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ，２：２０−２６（１９９３）を参照されたい。より具体的には、ＤＮＡワクチン接種によるミコバクテリウム・アビウムに対する防御はＭ．Ｖａｌａｚ−Ｆａｉｒｃｌｏｔｈら，Ｉｎｆｅｃｔ．＆  Ｉｍｍｕｎ．，６７：４２４３−４２５０（１９９９）に記載されている。このワクチン接種方法はミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質感染に対してウシをワクチン接種するために非常に魅力的である。よって、本発明のこの実施態様の他の形態は、医薬的に許容され得る担体と共に本発明のタンパク質またはその免疫原性断片をコードする核酸配列を含むワクチン、前記核酸配列を含むＤＮＡ断片を含むワクチンまたは本発明の組換えＤＮＡ分子を含むワクチンに関する。好ましくは、９ｋＤタンパク質またはその免疫原性断片をコードし、配列番号５に記載されている核酸配列は上記した理由でワクチン接種のために使用される。より好ましくは、前記配列が上記した本発明の別のタンパク質またはその免疫原性断片をコードする配列と組み合わされる。
【０１１１】
本発明のＤＮＡワクチン中に使用するのに適したＤＮＡプラスミドの例は細菌、真核及び酵母宿主細胞のための慣用のクローニングプラスミドまたは発現プラスミドであり、前記プラスミドの多くが市販されている。前記プラスミドの公知例はｐＢＲ３２２及びｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。本発明のＤＮＡ断片または組換えＤＮＡ分子はヌクレオチド配列のタンパク質発現を誘導し得なければならない。ＤＮＡ断片または組換えＤＮＡ分子は１つ以上の本発明のヌクレオチド配列を含み得る。更に、ＤＮＡ断片または組換えＤＮＡ分子は他のヌクレオチド配列、例えば非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを有する免疫刺激オリゴヌクレオチドまたは他の抗原性タンパク質または補助サイトカインをコードするヌクレオチド配列を含み得る。
【０１１２】
本発明のワクチン中に使用される本発明のヌクレオチド配列または本発明のヌクレオチド配列を含むＤＮＡプラスミドは好ましくは転写調節配列に作動的にリンクさせて、裸のまままたはデリバリーシステムに封入され得る。
【０１１３】
好適なデリバリーシステムは脂質ベシクル、イスコム(iscom)、デンドロマー、ニオソム、微粒子（特にキトサンベースの微粒子）、多糖類マトリックス等であり、これらは以下に記載するように当業界で公知である。サルモネラ種のような弱毒化生細菌及び上記したヘルペスウイルスベクターのような弱毒化生ウイルスもデリバリーシステムとして非常に好適である。
【０１１４】
この実施態様の別の形態は本発明の組換えＤＮＡ分子を含むワクチンに関する。
【０１１５】
ＤＮＡワクチンは、例えば無針注射器を用いるような皮内投与により容易に投与され得る。この投与方法により、ＤＮＡがワクチン接種しようとする動物の細胞に直接デリバリーされる。１０ｐｇ〜１０００μｇの範囲のＤＮＡの量でよい結果が得られる。特にＤＮＡが自己増殖性の場合少量で十分である。好ましくは、微生物中１〜１００μｇの量が使用される。
【０１１６】
更なる実施態様において、本発明のワクチンは更に１つ以上のウシ病原性生物及びウイルス由来の抗原、前記抗原に対する抗体またはその抗原をコードする遺伝情報及び／または医薬用成分、例えば抗生物質をも含む。勿論、前記した抗原、抗原に対する抗体または遺伝情報はミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス起源を持ち、例えば別のミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス抗原であり得る。別のウシ病原性生物またはウイルスから選択される抗原、抗体または遺伝情報であってもよい。前記生物及びウイルスをウシヘルペスウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス、パラインフルエンザ３型ウイルス、ウシパラミクソウイルス、口蹄疫ウイルス、パスツレラ・ヘモリチカ、ウシ呼吸器合胞ウイルス、タイレリア種、バベシア種、トリパノソーマ種、アナプラズマ種、ネオスポラ・カニヌム（Ｎｅｏｓｐｏｒａ  ｃａｎｉｎｕｍ）、黄色ブドウ球菌、ストレプトコッカス・アガラクチエ、マイコプラズマ、大腸菌、エンテロバクター、クレブシエラ、シトロバクター及びストレプトコッカス・ダイスガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｓ  ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）からなる群から選択することが好ましい。
【０１１７】
上記したように、本発明の１つ以上のミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質をベースとするワクチンはマーカーワクチンとしても非常に好適である。マーカーワクチンは、ワクチン接種哺乳動物と圃場感染哺乳動物を例えば野生型感染により誘導される抗体パネルと異なる特徴的な抗体パネルに基づいて区別できるワクチンである。異なる抗体パネルは、例えば野生型ミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス上に存在する免疫原性タンパク質がワクチン中に存在していないときに誘導される。その場合、宿主はワクチン接種後前記タンパク質に対する抗体を産生しない。よって、本発明のミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質をベースとするワクチンは特定タンパク質に対する抗体しか誘導しないのに対して、野生型、生弱毒化または不活化全ミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスをベースとするワクチンはすべてまたは殆どのタンパク質に対する抗体を誘導する。
【０１１８】
本発明のミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質を除く他のミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質を含むウェル及び１つ以上の本発明の精製ミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質のみを含むウェルを有する簡単なＥＬＩＳＡ検査は、ウシ由来の血清を検査し、そのウシが本発明のタンパク質ワクチンをワクチン接種したのかまたはミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスフィールド感染しているかを区別するのに十分である。
【０１１９】
本発明のワクチンはすべて医薬的に許容され得る担体を含む。医薬的に許容され得る担体の例は滅菌水または滅菌生理的塩類溶液であり得る。より複雑な形態では、担体は例えば緩衝液であり得る。
【０１２０】
ワクチンの作成方法は、本発明のタンパク質またはその免疫原性断片及び／または前記タンパク質またはその免疫原性断片に対する抗体及び／または核酸配列及び／または本発明のＤＮＡ断片、組換えＤＮＡ分子、生組換えキャリアまたは宿主と医薬的に許容され得る担体を混合することを含む。
【０１２１】
本発明のワクチンは、好ましくは免疫刺激物質、所謂アジュバントをも含む。一般的にアジュバントは宿主の免疫応答を非特異的にブーストする物質からなる。多数のアジュバントが当業界で公知である。ウシワクチン中に頻繁に使用されているアジュバントの例はムラミルジペプチド、リポポリサッカライド、数種のグルカン及びグリカン、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）（ホモポリマー）である。前記ワクチンは所謂ベヒクルをも含み得る。ベヒクルは共有結合以外でタンパク質に結合する化合物である。前記ベヒクルはいずれも当業界で公知のバイオマイクロカプセル、マイクロアルギネート、リポソームまたはマクロゾルである。マイクロ粒子、特にキトサンを主成分とするマイクロ粒子が特に経口ワクチン接種に使用する場合ワクチンベヒトルとして非常に好適である。
【０１２２】
抗原を部分的に埋め込む特定形態のベヒクルはいわゆるＩＳＣＯＭ（欧州特許出願公開第１０９，９４２号明細書、同第１８０，５６４号明細書、同第２４２，３８０号明細書）である。加えて、ワクチンは１つ以上の好適な界面活性剤または乳化剤、例えばＳｐａｎまたはＴｗｅｅｎを含み得る。
【０１２３】
好ましくは、抗原は容易に入手し得且つ家畜及び／またはヒトへの使用のために登録されているアジュバンド、例えば水酸化アルミニウム、Ｔｈ２様調節アジュバントと併用される。
【０１２４】
防御を改善するためにプラスミドの内部または外部にＧｐＧオリゴヌクレオチド配列を付加することも好ましい。
【０１２５】
多くの場合、ワクチンは例えば分解傾向タンパク質を分解から保護するため、ワクチンの寿命を延長させるため、または凍結乾燥効率を高めるために安定剤と混合されている。有用な安定剤は、例えばＳＰＧＡ（Ｂｏｖａｒｎｉｋら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，５９：５０９（１９５０））；炭水化物、例えばソルビトール、マンニトール、トレハロース、スターチ、スクロース、デキストランまたはグルコース；タンパク質、例えばアルブミンまたはカゼイン、またはその分解産物；及び緩衝液、例えばアルカリ金属リン酸塩である。また、ワクチンは生理学的に許容され得る希釈剤中に懸濁され得る。言うまでもなく、アジュバンドを添加したり、ベヒクル化合物または希釈剤を添加したり、タンパク質を乳化または安定化させる他の方法も本発明に包含される。
【０１２６】
本発明のタンパク質またはその免疫原性断片をベースとする本発明のワクチンは非常に好適には１〜１００μｇ−タンパク質／動物の量で投与され得るが、原則としてより少量も使用可能である。１００μｇ以上の用量は免疫学的に非常に好適であるが、商業的には余り魅力的でない。
【０１２７】
生弱毒化組換えキャリア、例えば上記したＬＲＣ−ウイルス、寄生虫及び細菌をベースとするワクチンは感染中に自己増殖するので非常に低量で投与され得る。よって、細菌及びウイルスに対する非常に好適な量は１０３〜１０９ＣＦＵ／ＰＦＵである。
【０１２８】
本発明のワクチンは、例えば皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、または粘膜表面に（例えば、口腔または鼻内に）投与され得る。
【０１２９】
病気を効果的に防御するためには、ミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス感染を迅速且つ正しく診断することが重要である。よって、本発明の別の目的はミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス感染を検出するのに適した診断ツールを提供することである。
【０１３０】
本発明の核酸配列、タンパク質及び抗体も診断薬中に使用するのに適している。従って、本発明の別の実施態様は、診断薬中に使用するための本発明の核酸配列、タンパク質及び抗体に関する。
【０１３１】
本発明の核酸配列またはその断片はウシにおけるミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスの存在を検出するために使用され得る。ミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスに感染した哺乳動物から採取されるサンプルは本発明のタンパク質をコードする核酸配列を含めた前記細菌に由来する核酸物質を含む。前記核酸配列は本発明の核酸配列とハイブリダイズする。本発明の核酸配列と反応性の核酸配列を検出するのに好適な方法にはハイブリダイゼーション技術が含まれ、この中にはＰＣＲ技術及びＮＡＳＢＡ技術が含まれるが、これらに限定されない。よって、本発明の核酸配列はＰＣＲ及び／またはＮＡＳＢＡ技術に使用するためのプローブ及びプライマーを作成するために使用され得る。
【０１３２】
ミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスの検出用診断検査キットは、例えば検査しようとするウシから単離したミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスを前記ツールと反応させることができるツールを含み得る。前記ツールは、例えば本発明の核酸配列をベースとする特定プローブまたは（ＰＣＲ−）プライマー（プライマー断片とも称される）である。ミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスの遺伝情報が動物中に存在しているならば、この情報は例えば特定ＰＣＲ−プライマーに特異的に結合し、例えばｃＤＮＡ合成後ＰＣＲ反応で増幅されるようになるであろう。その後、ＰＣＲ反応産物はＤＮＡゲル電気泳動で容易に検出され得る。一般的なＰＣＲ教書に、ミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスＤＮＡとの選択的ＰＣＲ反応のためのプライマーの長さを決定する方法が記載されている。少なくとも１２ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有するプライマー断片が多くの場合に使用されているが、１５以上のヌクレオチド、好ましくは１８ヌクレオチドのプライマーがある程度より選択的である。特に、少なくとも２０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも３０ヌクレオチドの長さを有するプライマーは非常に一般的に適用され得る。ＰＣＲ技術はＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ及びＤｒｅｋｓｌｅｒ，「ＰＣＲプライマー、実験マニュアル(PCR primers, a laboratory manual)」，ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−４４７−５（１９９５）に包括的に記載されている。
【０１３３】
少なくとも１２、好ましくは１５、より好ましくは１８、更には好ましくは好ましい順に２０、２２、２５、３０、３５または４０ヌクレオチドの長さを有する本発明の核酸配列または前記核酸配列のプライマーであって、前記核酸配列またはその一部が配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５または１７に示す核酸配列と少なくとも７０％相同性を有するものも本発明の一部である。前記プライマーは、少なくとも１２ヌクレオチドの長さを有し且つ配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５または１７に示す核酸配列と少なくとも７０％、より好ましくは８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、更には１００％の相同性を有すると解される。前記核酸配列は、該配列がコードするＤＮＡの量を高めるためにＰＣＲ反応またはハイブリダイセーション反応においてプライマー断片として使用され得る。これにより、診断ツール、例えば上記したミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスを検出するための診断ツールとして使用するための特定核酸配列のブロットを迅速に増幅または検出することができる。
【０１３４】
遺伝材料に関する別の検査は、例えば唾液から得た後、典型的ＤＮＡ精製にかけ、放射能または色素標識プライマ断片を用いる典型的なハイブリダイゼーションにかけたミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス材料に基づいている。色標識及び放射能標識した断片は通常検出手段と称される。ＰＣＲ反応及びハイブリダイゼション反応はいずれも当業界で公知であり、例えばＭａｎｉａｔｉｓ／Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，「分子クローニング：実験マニュアル(Molcecular cloning: a laboratory manual)」，ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−３０６−６）に記載されている。
【０１３５】
従って、本発明の１実施態様は、ミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス核酸配列を検出するための診断検査キットに関する。前記検査キットは本発明の核酸配列またはそのプライマー断片を含む。
【０１３６】
本発明の特定ミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質の抗原物質の検出に基づき、よってミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス感染の検出に適した診断検査キットは、例えば一般的なＥＬＩＳＡ検査を含み得る。前記検査の１例では、ＥＬＩＳＡプレートのウェルの壁を本発明のタンパク質に対する抗体で被覆する。試験しようとする材料とインキュベート後、標識した抗−ミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス抗体をウェルに添加する。その後、発色反応により、ミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス由来の抗原材料の存在が示される。
【０１３７】
従って、本発明の更に別の実施態様は、ミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスの抗原材料を検出するための診断検査キットに関する。この検査キットは本発明のタンパク質またはその断片に対する抗体を含む。
【０１３８】
本発明のミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質の血清中の検出に基づく、よってミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス感染の検出に適した診断検査キットは、例えば一般的なＥＬＩＳＡ検査を含み得る。前記検査では、ＥＬＩＳＡプレートのウェルの壁を本発明のミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質タンパク質で被覆してもよい。試験しようとする材料とインキュベート後、前記タンパク質に対する標識抗体をウェルに添加する。その後、発色反応しなければ、ミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスに対する抗体の存在が示される。
【０１３９】
従って、本発明の更に別の実施態様は、ミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスに対する抗体を検出するための診断検査キットに関する。前記検査キットは本発明のミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質またはその断片を含む。
【０１４０】
イムノアッセイの設計は変更し得る。例えば、イムノアッセイは競合または直接反応に基づき得る。更に、プロトコルは固体支持体を使用しても、または多孔性材料を使用してもよい。抗体−抗原複合体の検出は標識抗体の使用を含み得る。標識の例は酵素、蛍光分子、化学蛍光分子、放射活性分子または染料分子であり得る。サンプル中の本発明のタンパク質と反応性の抗体を検出するための適当な方法には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、イムノフルオレッセンス検査（ＩＦＴ）及びウェスタンブロット分析が含まれる。
【０１４１】
例えば上記したように発現される本発明のタンパク質またはその免疫原性断片は、ポリクローナル、単特異的またモノクローナル抗体またはその誘導体であり得る抗体を作成するために使用され得る。ポリクローナル抗体を所望するときには、ポリクローナル血清を産生及び加工するための技術は当業界で公知である（例えば、Ｍａｙｅｒ及びＷａｌｔｅｒ編，「細胞及び分子生物学における免疫化学的方法(Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology)」，ロンドンに所在のＡｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７年）発行）。本発明のタンパク質または本発明のその免疫原性断片に反応性のモノクローナル抗体は当業界で公知の方法（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７（１９７５））により近交系マウスを免疫化することにより作成され得る。
【０１４２】
ミコバクテリウム・アビウム亜種アビウムがミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスと非常に高い相同性を有していることが判明した。ミコバクテリウム・アビウム亜種アビウムはかなり高い頻度でブタで見られ、更に高い頻度でヒト、特にＨＩＶ陽性のような免疫欠乏ヒトでみられる。
【０１４３】
従って、上記した本発明のタンパク質はブタ及びヒトの両方においてミコバクテリウム・アビウム亜種アビウムに対するワクチン接種目的及びブタ及びヒトにおいて診断目的で同様に使用され得る。
【実施例１】
【０１４４】
発現ライブラリーのスクリーニング
診断薬、治療薬及びワクチン中に使用するためのミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス中の抗原を同定し、特徴づけるために、ゲノム発現ライブラリーをλ−ＴｒｉｐｌｅＥｘ発現ベクターを用いてＣｌｏｎｔｅｃｈマニュアル（ｐＴ３００３−１）及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｇｉｇａｐａｃ  ＩＩＩ  Ｇｏｌｄ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇマニュアルに従って構築した。簡単に説明すると、ミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス株３１６Ｆから単離した細菌ゲノムＤＮＡをＴｓｐ５０９Ｉで部分消化し、スクロース勾配遠心により得た２．５キロベース対の平均サイズの断片をＥｃｏＲＩ消化した脱リン酸化λ−ＴｒｉｐｌＥｘアームに連結させた。パッケージング反応をＧｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩ  Ｇｏｌｄ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｅｘｔｒａｃｔ及び宿主株大腸菌ＸＬ１Ｂｌｕｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｓ０９２４））を用いて実施した。ライブラリーを平板培養後、約１０６ファージプラークの免疫スクリーニングを１）ポジティブウシ血清（３８６９と呼ぶ）及び２）特異的抗−ミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスモノクローナル抗体を用いて実施した。この結果、１２５個のポジティブλ−ＴｒｉｐｌＥｘ組換え体が選択された。これらの１２５個のポジティブファージ組換え体のうち１１７個がＣｌｏｎｔｅｃｈマニュアル（ＰＴ３００３−１）に記載されているプロトコルを用いてプラスミド（ｐＴｒｉｐｌＥｘ）組換え体にうまく変換された。
【０１４５】
１１７個のｐＴｒｉｐｌＥｘ組換え体のＤＮＡ配列決定により、これらの組換え体はそれぞれ異なる抗原性タンパク質またはその断片を発現する複数の抗原グループに分類される。配列番号２、４及び６は血清３８６９を用いて単離した組換え体中に認められ、配列番号８はＦａｂＧ４に対するモノクローナル抗体を用いて単離した組換え体中に認められ、配列番号１０、１２、１４、１６及び１８は５個のミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスの抗原分子に対する５個のモノクローナル抗体（１３．６７．１Ａ、１０．６５．３Ｂ、１３．６７．２Ａ、１０．３２．３Ｂ及び１０．６６．４Ｂ）を用いて単離した組換え体中に認められた。ミコバクテリアゲノム情報を含む各種データーベースに対するＢｌａｓｔ検索により、更に複数の抗原性ポリペプチド及びそのコード化遺伝子が特徴付けられた。配列番号１９及び２１中に認められ、記載されているｈｓｐ６５及びｈｓｐ７０熱ショックタンパク質抗原を除いて、上記した抗原断片はいずれもミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスに対する上記した既知の抗原の中でミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス関連抗原またはその形態として同定されなかった。
【実施例２】
【０１４６】
関連タンパク質を同定するためのプロテオミクスアプローチ
ａ）  サンプル作成
ワトソン−リード培地中のミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス３１６Ｆの培養物から遠心により細胞を収集した。細胞ペレットをＰＢＳ（ＰＢＳ  ４０ｍｌ中１０ｇのペレット）で１回洗浄し、−８０℃で５ｍｌずつ保存した。融解後、各サンプルを冷（４℃）ＰＢＳ（１００ｍｌ）で２回洗浄し、冷ＰＢＳ（５ｍｌ）中に懸濁した。プロテイナーゼ阻害剤（ペプスタチン  １２．５ｕｇ、ロイペプチン  ２５ｕｇ、Ｐｅｆａｂｌｏｃ（商品名）ＳＣ  １２５ｕｇ、アプロチニン  ５ｕｇ）を添加し、懸濁液を氷上Ｂｒａｎｓｏｎ音波装置２５０を用い、１００％出力及び５０％間隔で１０分間音波処理した。その後Ｕｒｅｕｍ（９Ｍ）、ＤＴＴ（７０ｍＭ）及びトリトンＸ−１００（２％）を添加し、溶液を時々振とうさせながら室温において３０分間保持した。その後、懸濁液を１６℃において５，０００ｇで１５分間、１６℃において１００，０００ｇで３０分間遠心した。次いで、生じたサンプルをＰｌｕｓＯｎｅ−２−Ｄクリーンアップキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて製造業者のプロトコルに従って処理して、微量の塩、多糖類、核酸及び脂質を除去した。サンプルのタンパク質濃度をＲＣ  ＤＣプロテインアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて測定し、サンプルを２Ｄ−ＰＡＧＥまで−８０℃で保存した。通常、２Ｄ−ＰＡＧＥの後に銀染色または免疫ブロッティングを実施するときには約１００ｕｇのタンパク質サンプルを用い、２Ｄ−ＰＡＧＥの後にクーマシーブリリアントブルー染色を実施するときには最高１５００ｕｇのタンパク質サンプルを用いた。
【０１４７】
ｂ）  ２Ｄ−ＰＡＧＥ
等電点電気泳動（ＩＥＦ）をＥｔｔａｎ  ＩＰＧｐｈｏｒ等電点電気泳動システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において製造業者のプロトコルに従ってセラミック製ストリップホルダーを用いてＩＰＧｐｈｏｒストリップ及びＩＥＦを再水和して実施した。典型的には、１．４ｍｇ  ＤＴＴ及び０．５％  ｕｌ  ＩＰＧ緩衝液を含有する再水和緩衝液中にタンパク質サンプル（４５０ｕｌ）を添加した後２０℃においてインキュベーションＯ／Ｎを実施することにより２４ｃｍストリップを再水和し、タンパク質負荷した。その後、ＩＥＦを製造業者の指示に従って実施した。ＩＥＦ後、ストリップを二次元ＰＡＧＥまで−２０℃において保存し得る。二次元ＰＡＧＥのために、１４０ｍｇ  ＤＴＴを含有する平衡緩衝液（１４ｍｌ）中室温において１５分間振とうした後、３５０ｍｇ  ヨードアセタミドを含有する平衡緩衝液（１５ｍｌ）中室温において１５分間振とうすることによりストリップを平衡化した。次いで、ストリップをカソード緩衝液中に短時間浸した後二次元ＰＡＧＥにかけた。電気泳動はＥｔｔａｎ  Ｄａｌｔｔｗｅｌｖｅ大型フォーマット垂直システムを製造業者（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の指示に従って用い、１２．５％  Ｅｔｔａｎ  Ｄａｌｔ  ＩＩゲル（２６×２０ｃｍ、厚さ１ｍｍ）中で実施した。銀染色のために、ゲルを４０％  エタノール、１０％  酢酸溶液中で固定し、プラスワン銀染色キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて染色した。クーマシーブリリアントブルー染色のために、ゲルをＰｈａｓｔＧｅｌ  Ｂｌｕｅ  Ｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を製造業者の指示に従って用いて染色した。免疫ブロッティングのために、タンパク質をＴｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  ＳＤ半ドライ電気泳動移動セル（Semi Dry Electrophoretic Transfer Cell）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｓ）を製造業者の指示に従って用いてニトロセルロース（Ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ＢＡ８５；Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ）に移した。タンパク質スポットのモノクローナルまたはポリクローナル抗体による認識は、５％  スキムミルク、ホースラディシュペルオキシラーゼにコンジュゲートした家兎抗−マウスまたは抗−ウシ抗体、並びに基質としてペルオキシド、ＴＭＢ及びＤＯＮＳを含むＰＢＳ緩衝液を用いて一般的プロトコルを用いて実施した。
【０１４８】
結果：
図１に示すように、このアプローチにより２つの免疫学的に高度に関連するタンパク質を検出できた。１つのタンパク質は５．６０〜６．１５のＰＩを有する６０ｋＤミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質である。これは図１Ｂ及びＤにおいて約５個の水平列として目に見える。他のタンパク質は４．２０〜４．７５のＰＩを有する３３ｋＤミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスタンパク質である。これは図１Ａ及びＤにおいて約３個の水平列として目に見える。
【実施例３】
【０１４９】
１４ｋＤタンパク質、９ｋＤタンパク質、Ｈｓｐ７０及びＨｓｐ６５のワクチン接種または感染ヤギ由来のＴ細胞による認識
実験的にミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスを感染させたヤギ由来の末梢血におけるＴ細胞の刺激をウシγ−インターフェロン試験（ＢＯＶＩＧＡＭ；オーストラリア国ビクトリア、パークビルに所在のＣＳＬ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を製造業者のプロトコルに従って用いて検出した。以下の抗原を全血（１．５ｍｌ）に添加した：組換え精製１４ｋＤタンパク質、９ｋタンパク質、Ｈｓｐ７０及びＨｓｐ６５（０．５及び５ｕｇ）、並びにミコバクテリウム・ボビス株ＡＮ５（オランダ国のＩＤ−Ｌｅｌｙｓｔａｄが産生）、ミコバクテリウム・アビウム亜種アビウム株Ｄ４（オランダ国のＩＤ−Ｌｅｌｙｓｔａｄが産生）及びミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス株３＋５／Ｃ（オランダ国のＩＤ−Ｌｅｌｙｓｔａｄが産生）から誘導される３種のＰＰＤ（３ｕｇ）。前記抗原のそれぞれについて、約２年前に１ｍｌのミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス株ＤＳＵ  Ｎｏ．４０５６５０（ＯＤ６６０＝０．０５９）を１２回（４週間にわたり、毎週月曜日、水曜日及び金曜日）経口感染させた９匹のヤギからのサンプルを隔週用いて連続３回試験した。これらの動物のうち５匹（１８８〜１９３）に対して感染の４週間前に弱毒化ミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス株３１６Ｆ（オランダ国のＩＤ−Ｌｅｌｙｓｔａｄが産生）をベースとする実験的に死滅させたワクチン０．５ｍｌをワクチン接種した。≧０．１（バックグラウンド値を補正した）の吸光度値及びバックグラウンド値の≧２倍は、抗原の存在のために高いγ−インターフェロン産生を示すと見做された。
【０１５０】
結果：
試験したすべての組換え抗原が少なくとも１匹の動物において高いγ−インターフェロン産生を誘導した。このことは、これらの抗原がＴ細胞性免疫応答において役割を果たすことを示す。典型的な実験を表１に示す。９匹の動物のうち５匹（５６％）が９ｋＤ抗原に対して高い応答を示し、９匹の動物のうち３匹（３３％）が１４ｋＤ抗原に対して高い応答を示し、９匹の動物のうち８匹（９０％）がｈｓｐ６５に対して高い応答を示し、９匹の動物のうち３匹（３３％）がｈｓｐ７０に対して高い応答を示した。
【０１５１】
【表１】
2005514041.tif 000002
【実施例４】
【０１５２】
１４ｋＤ、９ｋＤ、４７ｋＤ、７０ｋＤ及び６５ｋＤタンパク質での子ウシの免疫化、特異的抗体応答の検出及びＤＴＨ反応性の検出
ａ）免疫化
１４ｋＤ、９ｋＤ、４７ｋＤ、７０ｋＤ及び６５ｋＤタンパク質の免疫原性及びミコバクテリウム・ボビスから誘導したＰＰＤに対する（交差性）ＤＴＨ応答を誘導する能力を評価するために、子ウシを以下のように免疫化した：
１）弱毒化ミコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス３１６Ｆ（オランダ国のＩＤ−Ｌｅｌｙｓｔａｄが産生）をベースとする死滅全細胞ワクチン；動物４匹、
２）Ｗ／Ｏアジュバント中の精製組換え１４ｋＤタンパク質；動物４匹、
３）Ｗ／Ｏアジュバント中の精製組換え９ｋＤタンパク質；動物４匹、
４）Ｗ／Ｏアジュバント中の精製組換え４７ｋＤタンパク質；動物４匹、
５）Ｗ／Ｏアジュバント中の精製組換えＨｓｐ７０；動物２匹、
６）Ｗ／Ｏアジュバント中の精製組換えＨｓｐ６５；動物２匹、
７）Ｗ／Ｏアジュバントのみ；動物３匹。
０日目及び１２７日目に下表に示す量の抗原を初回及び追加免疫接種した。
【０１５３】
【表２】
2005514041.tif 000003
【０１５４】
０日目（１ｍｌ）及び１２７日目（０．５ｍｌ）に実験ワクチンを用いて免疫化した。血清サンプルを５２日目及び１７８日目に採取した。ＤＴＨ試験を−５６日目（免疫化前に動物のＤＴＨ状態を確認するために）、５２日目及び１７８日目に実施した。
【０１５５】
ｂ）血清中の抗体検出
各免疫群の１つの代表的動物からの血清サンプル中の総ＩｇＧ抗体を標準ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び免疫ブロッティングプロトコルを用いて検出することにより抗原の免疫原性及びそのＰＰＤ中の存在を確認した。前記プロトコルでは、レーンに精製組換え１４ｋＤ、９ｋＤ、４７ｋＤ、６５ｋＤ及び７０ｋＤタンパク質（２．５ｕｇ）及び各種抽出物（ミコバクテリウム・ボビス株ＡＮ５から誘導した全細胞音波処理物及びＰＰＤ；ミコバクテリウム・アビウム・パラツベルクローシス株Ｂ８５４からの全細胞音波処理物；ミコバクテリウム・アビウム・パラツベルクローシス株３＋５／Ｃから誘導したＰＰＤ）（２．５ｕｇ）を充填した。
【０１５６】
結果：
すべての代表的な血清中の抗体が対応の組換え１４、９、４７、６５及び７０ｋＤタンパク質を検出した（図２，パネルＡ−Ｅ，レーン１）。組換え１４ｋＤタンパク質に対する抗体はミコバクテリウム・ボビス及びミコバクテリウム・アビウム・パラツベルクローシス全細胞音波処理物およびＰＰＤでは対応抗原を認識できなかった（図２，パネルＡ，レーン２−４）。組換え９ｋＤタンパク質に対する抗体はミコバクテリウム・ボビス及びミコバクテリウム・アビウム・パラツベルクローシス全細胞音波処理物及びミコバクテリウム・アビウム・パラツベルクローシスＰＰＤでは対応抗原を認識したが、ミコバクテリウム・ボビスＰＰＤでは対応タンパク質を認識しなかった（図２，パネルＢ，レーン２−４）。組換え４７ｋＤタンパク質に対する抗体はミコバクテリウム・ボビス及びミコバクテリウム・アビウム・パラツベルクローシス全細胞音波処理物では対応抗原を弱く認識したが、ＰＰＤでは対応バンドを認識しなかった（図２，パネルＣ，レーン２−４）。組換え６５及び７０ｋＤタンパク質に対する抗体はミコバクテリウム・ボビス及びミコバクテリウム・アビウム・パラツベルクローシス全細胞音波処理物及びＰＰＤで対応抗原を認識した（図２，パネルＤ及びＥ，レーン２−４）。
【０１５７】
更に、抗原の免疫原性を血清サンプル中の全ＩｇＧ抗体を標準ＥＬＩＳＡプロトコルを用いて検出することにより確認した。前記プロトコルでは、ウェルを各種ミコバクテリウム・アビウム・パラツベルクローシス株（Ｂ８５４、５２５５、３１６Ｆ、３＋５／Ｃ、Ｔｅｐｓ）またはミコバクテリウム・ボビス株ＡＮ５の各種抽出物（全細胞音波処理物、ＫＣＬ抽出物、分泌タンパク質）（５ｕｇ）及び組換え精製１４ｋＤ、９ｋＤ、４７ｋＤ、７０ｋＤ及び６５ｋＤタンパク質（５ｕｇ）で被覆した。任意に、ＯＤ＝１．０で１／８０以上の力価をポジフィブ応答の指標と見做した。
【０１５８】
結果：
初期及び追加免疫後１４ｋＤ、９ｋＤ、４７ｋＤ、７０ｋＤ及び６５ｋＤタンパク質に対して強い特異的抗体応答が検出された（力価＞６４０；表２及び３）。９ｋＤタンパク質に対する特異的抗体力価が追加免疫化後検出された（力価１６０；表２及び３）。
【０１５９】
【表３】
2005514041.tif 000004
2005514041.tif 000005
【０１６０】
【表４】
2005514041.tif 000006
2005514041.tif 000007
【０１６１】
ｃ）  ＤＴＨ反応性
遅延型過敏性（ＤＴＨ）反応をＥＵ−指示６４／４３２（指示９７／１２及び９８／４６により補正）に従って実施した。簡単に説明すると、２０００ＩＥトリＰＰＤ、２０００及び５０００ＩＥウシＰＰＤを注射し、７２時間後の皮膚厚さの増加を検出した。２ｍｍ以上増加したならばＤＴＨ応答がポジティブと見做す。全細胞死滅パラツベルクローシスワクチン群では、ウシＰＰＤ反応性が初回及び追加免疫後４匹すべての動物で検出された（表４）。初回免疫後１４ｋＤタンパク質（１／４）及びＨｓｐ６５（１／２）をワクチン接種した動物、及び追加免疫後４７ｋＤタンパク質（１／４）をワクチン接種した動物においてウシＰＰＤ反応性が検出された。ウシＰＰＤ反応性は９ｋＤタンパク質及び７０ｋＤタンパク質で免疫化した群では検出されなかった（表４）。
【０１６２】
結果：
９ｋＤ及びＨｓｐ７０タンパク質はＤＴＨ  ＰＰＤ試験で応答を与えない。感染に対する防御に寄与せず、更にＤＴＨ  ＰＰＤ試験でＰＰＤと交差反応しないワクチンが必要な場合には、本発明の新規な９ｋＤタンパク質が選択されるワクチン成分であり、Ｈｓｐ７０との組合せが好ましい。
【０１６３】
【表５】
2005514041.tif 000008
2005514041.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【０１６４】
【図１】１Ａは２Ｄ−ゲルのウェスタンブロットにおいて４．２０〜４．７５のＰＩを有し、約３スポットの水平列として目に見える３３ｋＤタンパク質の存在を示す。１Ｂは２Ｄ−ゲルのウェスタンブロットにおいて５．６０〜６．１５のＰＩを有し、約５スポットの水平列として目に見える６０ｋＤタンパク質の存在を示す。１Ｃは３３ｋＤタンパク質及び６０ｋＤタンパク質の両方の特定スポットが目に見えるクーマシーブリリアントブルーで染色した２Ｄ−ゲルを示す。１Ｄは３３ｋＤタンパク質及び６０ｋＤタンパク質の両方の特定スポットが目に見える銀染色した２Ｄ−ゲルを示す。
【図２】組換え精製１４ｋＤタンパク質（パネルＡ）、組換え精製９ｋＤタンパク質（パネルＢ）、組換え４７ｋＤ（パネルＣ）、組換え精製７０ｋＤタンパク質（パネルＤ）及び組換え６５ｋＤ（パネルＥ）で免疫化した動物からの血清サンプル（１７８日）の免疫ブロット。レーン１：１４ｋＤ（Ａ）、９ｋＤ（Ｂ）、４７ｋＤ（Ｃ）、７０ｋＤ（Ｄ）または６５ｋＤ（Ｅ）の組換え精製タンパク質。レーン２：ミコバクテリウム・ボビス株ＡＮ５全細胞音波処理物。レーン３：ミコバクテリウム・アビウム・パラツベルクローシス株Ｂ８５４全細胞音波処理物。レーン４：ミコバクテリウム・アビウム・パラツベルクローシス株３＋５／Ｃ誘導ＰＰＤ。レーン５：ミコバクテリウム・ボビス株ＡＮ５誘導ＰＰＤ。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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