(57)【要約】本発明は、試験される抗原のT細胞エピトープを構成するペプチドの組がその上に固定された固体担体を用いて、細胞性免疫(抗原に対する)を検出する方法、該方法を実行するためのキットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロで抗原に対する細胞性免疫を検出および／または特徴づけするための、該抗原のTエピトープを構成する少なくとも1つのペプチドが付着した固体担体の使用。
【請求項２】
ペプチドが固体担体に付着していることを特徴とする、個体の末梢血単核細胞中に存在するCD4+ Tリンパ球および／またはCD8+ Tリンパ球を含む生体試料を、該個体のMHC分子により提示され得る抗原の1つもしくは複数のTエピトープを構成する1つ以上の該ペプチドと接触させ、この接触により活性化されたエフェクターTリンパ球を検出することにより、該抗原に対する該個体の細胞性免疫応答をインビトロで検出および／または特徴づけするための方法。
【請求項３】
そのうちの少なくとも1つが個体のMHC分子により提示されることが可能であり、抗原の2つの異なるTエピトープを構成する少なくとも2つのペプチドが、固体担体に付着していることを特徴とする、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
ペプチドの混合物が固体担体に付着していることを特徴とする、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
固体担体が、ペプチドがマイクロタイトレーションプレートの少なくとも2つの異なるウェルに付着している該プレートからなり、生体試料が少なくとも2つのアリコートに分割され、その各々を該ペプチドの1つと接触させることを特徴とする、請求項3に記載の方法。
【請求項６】
用いられるペプチドが、1つまたは複数のCD4+ Tエピトープを構成することを特徴とする、請求項2〜5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
用いられるペプチドが、1つまたは複数のCD8+ Tエピトープを構成することを特徴とする、請求項2〜5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
−固体担体に付着し、それぞれが抗原の同定されたTエピトープを構成する、同じ抗原に由来するペプチドの組；および
−活性化されたエフェクターTリンパ球を検出する手段
を含む、請求項2〜7のいずれか1項に記載の方法を行うためのキット。
【請求項９】
固体担体に付着し、それぞれが抗原の同定されたTエピトープを構成する、同じ抗原に由来するペプチドの組を含み、該組が、CD4+ Tエピトープを構成する少なくとも1つのペプチド、およびCD8+ Tエピトープを構成する少なくとも1つのペプチドを含む、請求項2〜5のいずれか1項に記載の方法を行うためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞性免疫を検出するための新規の手段に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞媒介性免疫は、ウイルス、および宿主細胞内で進化することができ、それにより抗体から逃れる、ある種の細菌またはある種の原生動物のような微生物に対する免疫応答において、主要な役割を演じる。これは、移植の拒絶反応および腫瘍の破壊の現象にも含まれる。
【０００３】
体液性免疫の場合には、分子エフェクターはBリンパ球により分泌される抗体であるが、細胞性免疫の分子エフェクターはTリンパ球の細胞質膜に固定されたTcR受容体である。
【０００４】
TcRによるTエピトープの認識は、抗体によるBエピトープの認識に含まれるものよりも、さらにより複雑な機構を含む。具体的には、TcRは、エピトープが提示細胞の表面におけるMHC(主要組織適合複合体)のクラスIまたはクラスII分子と結合する場合、そのエピトープを構成するペプチドのみを認識する。よってCD4およびCD8 Tリンパ球のTcRは、MHCのクラスII分子およびクラスI分子によりそれぞれ提示されるエピトープを認識する。
【０００５】
抗原の「Tエピトープ」は、適切なMHCの関係において、Tリンパ球のTcR受容体により認識され得る、そして該リンパ球の活性化を誘導し得る該抗原のいずれかのペプチド断片として定義される。
【０００６】
Tエピトープのサイズは、ペプチドを提示するMHC分子のクラスに依存して変動する；クラスI MHC分子により提示されるCD8+ Tエピトープは、8〜10アミノ酸のサイズであり、クラスII MHC分子により提示されるCD4+ Tエピトープは、13〜25アミノ酸のサイズである。
【０００７】
同じ抗原について、そして同じMHCクラスについては、エピトープの配列は、関係するMHCの対立遺伝子により変動する。
多数の抗原について、種々のクラスII MHCまたはクラスI MHC対立遺伝子に拘束されるTエピトープの多くの種類が同定されており、これらのエピトープの配列は、文献において入手可能である。
【０００８】
TcR/MHC-結合Tエピトープ相互作用は、T細胞の表面における分子および提示細胞の表面における分子の相互作用に起因する種々の共刺激(costimulation)シグナルの存在下で、リンパ球刺激を誘導し、エフェクターTリンパ球を産生する細胞増殖となる。
【０００９】
エフェクターリンパ球は、種々のタイプの免疫応答を定義するそれらのエフェクター機能に従って、種々の集団に一緒にグループ化することができる。これらの集団は、種々の分子(サイトカイン、溶解因子(lytic factors))を分泌するそれらの能力、または特定の分子の組み合わせにより特に区別される。例えば、CD4+またはCD8+細胞を区別し得るエフェクターリンパ球のうち、サイトカイン、特にインターロイキン2 (IL-2)およびガンマインターフェロン(γ-IFN)の分泌を特徴とするTh1およびT1リンパ球、ならびにIL-4、IL-5、IL-6およびIL-10のようなサイトカインを分泌するTh2またはT2細胞が挙げられる。
【００１０】
免疫原との最初の接触から約1ヶ月後に、かなりを検出し得る体液性免疫とは異なり、細胞媒介性免疫は、この最初の接触後、数日にわたって現れる；次いでこれは、増殖することができ、その後の同じ免疫源の提示の間にエフェクター機能を迅速に獲得することができる記憶Tリンパ球の形態で長期間存続する。
【００１１】
よって、細胞性免疫は良好な指標を構成することができ、所定の抗原に対する免疫応答の非常に初期の検出、および関連した免疫応答のタイプの決定をさせる。
抗原特異的エフェクターTリンパ球の検出は、例えばワクチンの開発の関係において、種々の研究所で用いられており、免疫エピトープを探索し、免疫原性応答の強度およびタイプを評価する。
【００１２】
抗原に対する細胞性免疫を評価するのにますます一般に用いられているアプローチは、該抗原の既知のTエピトープを構成するペプチドを提供し、そしてこれらのペプチドに対するTリンパ球反応性を分析することである。
このアプローチは、細胞媒介性応答を産生する病理を診断または監視するために、理論的には用いることができる。しかしながら、抗原/抗体複合体の形成を実証することによりインビトロで迅速に検出することができる体液性免疫とは異なり、細胞性免疫の検出は、常用の試験の関係において用いることが困難な、面倒な技術の使用を含む。
実際に：
1)  TcRによる、試験されるエピトープの認識と、リンパ球の活性化を許容する条件下において、リンパ球に該エピトープを提示し；
2)  活性化されたエフェクターリンパ球を検出する
ことが必要である。
【００１３】
最近開発された方法のいくつかは、エフェクター細胞の検出を簡略化することを可能にする。例として、VERSTEEGENら(J. Immunol. Methods、111、25〜29、1988)により最初に記載されたELISPOT法は、末梢血細胞のうちに存在するエピトープ特異的エフェクターTリンパ球を検出し、特徴づけすることを可能にするが、これはTエピトープに相当するペプチドでの再刺激後に該リンパ球により分泌される因子を検出することによる。
【００１４】
例えばこの技術は、インフルエンザウイルスのエピトープに特異的なCD8+エフェクターTリンパ球を同定する(LALVANIら、J. Exp. Med. 186、859〜865、1997)；ワクチン中に用いられている種々のHIV1エピトープに相当するペプチドに対するCD8+ T応答を分析する(GAHERY-SEGARDら、J. Virol.、74、1694〜1703、2000)；ESAT-6抗原のエピトープに特異的なエフェクターTリンパ球を検出することによりマイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)感染の存在を検出する(LALVANIら、Am. J. Respir. Crit. Care Med.、163、824〜828、2001) のに用いられている。
【００１５】
上記の出版物に記載されたアッセイは、試験されるペプチドのそれぞれの溶液を、末梢血単核細胞(PBMC)のフィコール勾配での分離により得られる懸濁物に添加することにより行われた；これらの条件下では、これらのペプチドが、MHC分子により直接載せられ、リンパ球に提示されることが、実際に知られている。
【００１６】
今回、本発明者らは驚くべきことに、個体のTリンパ球を、該Tリンパ球により認識されるエピトープを構成し、固体担体に付着したペプチドと接触させることが、該エピトープに特異的なエフェクターTリンパ球の活性化となることを知った。
【００１７】
本発明の主題は、インビトロで抗原に対する細胞性免疫を検出および／または特徴づけするための、該抗原のTエピトープを構成する少なくとも1つのペプチドが付着した固体担体の使用である。
【００１８】
詳細には、本発明の主題は、ペプチドが固体担体に付着していることを特徴とする、個体の末梢血単核細胞(PBMC)中に存在するCD4+ Tリンパ球および／またはCD8+ Tリンパ球を含む生体試料を、該個体のMHC分子により提示され得る抗原の1つもしくは複数のTエピトープを構成する1つ以上の該ペプチドと接触させ、この接触により活性化されたエフェクターTリンパ球を検出することにより、該抗原に対する該個体の細胞性免疫応答をインビトロで検出および／または特徴づけするための方法である。
【００１９】
生体試料は、精製CD4+またはCD8+ Tリンパ球の調製物からなることができる。また、上記個体からの血液試料より得られたPBMCの調製物からなることもできる；有利には、全血を用いることができる。
【００２０】
本発明による方法の好ましい実施形態によると、その少なくとも1つが個体のMHC分子により提示されることが可能であり、上記抗原の2つの異なるTエピトープを構成する少なくとも2つのペプチドが、上記固体担体に付着している。
この実施形態の有利な構成によると、上記ペプチドの混合物が上記固体担体に付着している。
この実施形態の他の有利な構成によると、上記固体担体は、上記ペプチドがマイクロタイトレーションプレートの少なくとも2つの異なるウェルに付着している該プレートからなり、生体試料は少なくとも2つのアリコートに分割され、その各々を該ペプチドの1つと接触させる。
【００２１】
ペプチドの混合物の使用は、関係する抗原に対する細胞媒介性免疫応答の存在を迅速に検出することを可能にする。種々のペプチドの別々の使用は、この応答の構成要素のよりよい分析を行うことを可能にする。
全ての場合において、用いられるペプチドは、1つもしくは複数のCD4+ Tエピトープ、または1つもしくは複数のCD8+ Tエピトープを構成する。1つもしくは複数のCD4+ Tエピトープ、または1つもしくは複数のCD8+ Tエピトープを、別々にまたは混合物として、同時に用いることも可能である。
【００２２】
本発明による方法の他の実施形態は、従来技術で既知の細胞性免疫応答のインビトロでの検出の方法において用いられるものと同じであることが可能である。
例えば、固体担体に付着したペプチドと試験される生体試料は、ペプチドが液相に存在する従来技術の方法と同じ条件下で接触させる。一般には、この接触は、5%のCO2の存在下での37℃における5〜20時間のインキュベーションにより行われる。
【００２３】
同様に、活性化されたエフェクターTリンパ球の検出は、通常の方法により行うことができる。
有利には、これらのリンパ球により分泌される可溶性因子(サイトカインまたは溶解因子)を分析する。例えばIL-2またはγ-IFNを分析することは、Th1またはT1応答の特徴づけを可能にし、IL-4、IL-5、IL-6またはIL-10を分析することは、Th2またはT2応答の特徴づけを可能にする。実質的にCD8+ Tリンパ球を特徴づける、ケモカイン(RANTES)のような他の可溶性因子、または溶解機能をもつ分子(パーフォリン/グランザイム)も分析できる。
【００２４】
本発明の関係において任意に用いることができる、活性化されたTリンパ球を検出するための他の方法は、例えばサイトカインの細胞内ラベリングである。
試験されるペプチドを細胞懸濁物に添加する、従来技術で既知の細胞性免疫の検出のための方法に比べて、本発明による方法は、特に種々のペプチドの並行した使用を含む分析の場合に、マイクロタイトレーションプレートのウェルまたはチューブの列において通常行われるアッセイ手順を、かなり簡略化することを可能にする。
【００２５】
詳しくは、従来技術の方法は、プレートの各ウェル中、もしくは列の各チューブ中で、規定されたペプチドまたはペプチドの規定された混合物の試験される細胞への添加を必要とするが、本発明の実行の意味においては、プレートのウェルの各々またはチューブの各々が所望のペプチドまたはペプチドの混合物でコートされた、予め準備したプレートまたはチューブを用いることが可能である。このことは、必要な操作をかなり減少させることを可能にし、よってアッセイを行うのに必要な時間の合計を減少させ、そして誤差の原因を制限することによりその再現性を増大させる。
【００２６】
さらに、固体担体へのペプチドの付着は、上記ペプチドを安定化し、液状媒体中で迅速に起こる分解からそれらを保護することを可能にする。実例として、ポリスチレンマイクロタイトレーションプレートのウェルへの吸着により付着したペプチドの場合、ペプチドは、20℃において少なくとも24時間、4℃において少なくとも1週間、−80℃のフリーザーにおいて少なくとも15日間、Tリンパ球の特異的活性化のそれらの特性を維持するが、同じペプチドの溶液は、37℃において数時間でそれらの特性を失う。
【００２７】
さらに、本発明は用いられるペプチドの濃度をかなり減少させるという利点を有し、よって費用の大幅な減少を許容する。
【００２８】
本発明の主題は、固体担体に付着し、それぞれが抗原のTエピトープを構成する、同じ抗原に由来するペプチドの組を含む、本発明に従って方法を行うためのキットでもある。
本発明に従ってキットを製造するために、特に抗原/抗体分析キットに通常用いられるものと同じタイプの固体担体および該担体にペプチドを付着させる方法を用いることができる。
例えば、ポリスチレン、ポリエチレンまたはポリビニルクロライドのようなプラスチック材料からつくられた担体、ニトロセルロースからつくられた担体、ガラスのようなシリカベースの材料でつくられた担体などを用いることができる。
【００２９】
ペプチドの付着は、それ自体が公知の方法により行うことができる；最も適切な技術の選択は、関係する担体および選択されるペプチドの物理化学的特性に依存する。
例えば、ペプチドを担体上で直接合成すること、または該担体に、予め合成したペプチドを付着させることが可能である。
例えば、ペプチドの付着は、吸着により行うことができる。担体および付着の条件は、もちろん、試験される生体試料の添加および該試料とのインキュベーションの間におけるペプチドの脱着を回避するように選択される。
【００３０】
有利には、ペプチドは、直接またはスペーサーアームを介して、共有結合により担体に付着する。この場合、担体の表面はカルボジイミド誘導体、N-ヒドロキシスクシンイミド誘導体、スルホスクシンイミド誘導体などのような剤により活性化することができる。
アビジンでコートした担体に付着したビオチン化ペプチドも、用いることができる。
【００３１】
担体は、チューブもしくはチューブの組、マイクロタイトレーションプレート、1つ以上の細片、ビーズなどの形態にあることができる。
【００３２】
抗原は、特に、感染性微生物(ウイルス、原生動物、細菌)、腫瘍抗原、自己免疫抗原またはアレルゲンであることができる。微生物である場合、組を構成するペプチドは、この生物の種々の抗原性タンパク質に由来することができる。
組を構成するペプチドの選択は、関係する抗原、およびキットを用いようとするその使用にもちろん依存する。これらは、関係する抗原のCD4+またはCD8+ Tエピトープを構成するとして以前に同定されたペプチドである。
【００３３】
有利には、この組は、異なるMHC対立遺伝子により提示され得るペプチドを含む。これは、CD4+ Tエピトープを構成するペプチド、CD8+ Tエピトープを構成するペプチドまたはこれらの2つのタイプのエピトープの混合物からなることが可能である。
該組を構成するペプチドは、混合され、混合物の形態で固体担体に付着され得る。固体担体がマイクロタイトレーションプレートまたはチューブの組である場合、マイクロタイトレーションプレートのウェルのうちの1つの内部、またはチューブのうちの1つの内部に付着されている、種々のペプチドまたはペプチドの組み合わせを別々に付着させることができる。
【００３４】
本発明によるキットは、活性化されたエフェクターTリンパ球を検出するための手段を含むこともできる。これらの手段は、上記リンパ球により産生される可溶性因子を分析するための試薬からなることが可能である。
【００３５】
本発明は、例えば：
−細胞性免疫応答を産生する、種々の病原性の剤での感染の進展をスクリーニングし、そして監視する関係において、ヒトまたは動物の衛生に用いることができる。例として、HIV (ヒト免疫不全ウイルス) 1および2、FIV (ネコ免疫不全ウイルス)、HTLV-1 (ヒトTリンパ球ウイルスタイプI)、種々のタイプの肝炎のウイルスなどのようなウイルス；トキソプラズマ(Toxoplasma)またはプラスモディウム(Plasmodium)のような寄生生物；プリオンなどが挙げられる。
−腫瘍起源の病理の進展をスクリーニングし、そして監視する関係において、ヒトまたは動物の衛生に用いることができる。例としては、黒色腫、乳癌、骨髄性白血病、ヒトパピローマウイルスに関連する子宮頸癌のような、ウイルス感染に関連する癌などが挙げられる。
【００３６】
−自己免疫疾患の進展をスクリーニングし、そして監視する関係において、ヒトまたは動物の衛生に用いることができる。例として、I型糖尿病、多発硬化症などが挙げられる。
−アレルギータイプの疾患の進展をスクリーニングし、そして監視する関係において、ヒトまたは動物の衛生に用いることができる。例として、草、花粉、ある種の医薬製品のようなアレルゲンが挙げられる。
【００３７】
関係する使用に関わらず、本発明は、細胞媒介性の免疫の検出により、臨床上の徴候の発現前に、また体液性応答の発現前に、病理の発現または進展の非常に初期の診断を許容する。このことは、よりよい治療上のストラテジーを選択し、患者にとっての治療の成功のよりよい機会を与える、より迅速な医療上の決定を行うことを可能にする。
【００３８】
本発明は、種々のウイルス病原体に対する特異的な細胞性免疫の特徴づけのためのその実行を説明する、限定しない実施例に言及する以下のさらなる記載により、より明確に理解されるであろう。
【００３９】
実施例1：Tエピトープを構成するペプチドの固体担体への付着
3つの異なるウイルス：HIV-1ウイルス(ヒト免疫不全ウイルス)、CMV (サイトメガロウイルス)およびEBVウイルス(エプスタイン−バーウイルス)の既知のCD8+エピトープを構成する種々のペプチドを合成した。
【００４０】
これらのペプチドは次のごとくである：
HIV-1ウイルス：
gag 77〜85 (SLYNTVATL、HLA A2)
GAG 260〜268 (EIYKRWIIL、HLA A2)
Nef 82〜91 (KAALDLSHFL、HLA A2)
CMVウイルス：
GB 619〜628 (FIAGNSAYEYV、HLA A2)
IEI 378〜389 (SDEEEAIVAYTL、HLA B18)
EBVウイルス：
EBNA 3A 379〜387 (RPPIFIRRL、HLA B7)
EBNA 3C 163〜171 (EGGVGWRHV、HLA B44)。
【００４１】
これらのペプチドを、次のプロトコルを用いてポリスチレンプレートのウェルの底に付着させた。
カーボネートバッファー中のペプチド10 μgを、96ウェルのマイクロタイトレーションプレート (ポリスチレンプレート、NUNC MAXISORB)に沈着させた。ペプチドの付着は、周囲温度で2時間の吸着により行う。付着しなかったペプチドをPBS で2回洗浄することにより除去する。
【００４２】
実施例2：HIV-1に対する細胞性免疫の特徴づけ
HIV-1に対して血清陽性の患者(HLA-A2)の血液から精製したPBMCを、次のようにして試験した：
1)  リンパ球の活性化：
通常培地(RPMI、10%のBSA)中の細胞懸濁物200 μl (105細胞)を、上記の実施例1に記載のようにしてHIV-1ペプチドが付着した各ウェル中で沈着させる。
ポジティブコントロールとして、通常のELISPOT法によりアッセイを行った：同じ患者からのPBMCの懸濁物200 μl (105細胞)を、NUNC 96ウェルプレート(ペプチドが付着したものと同一)のウェル中に沈着させ、通常培地の溶液中のgag 77〜85、GAG 260〜268またはNef 82〜91ペプチド10μgと混合する。
【００４３】
2つのアッセイにおいて、コントロールとして、ペプチドなしのウェル中にPBMCを沈着させた。
プレートを5%のCO2存在下のインキュベーター中で37℃において一晩インキュベートする。
【００４４】
2)  活性化されたCD8+ Tリンパ球の選択：
次の日、活性化されたCD8+細胞の存在を、次のプロトコルに従って明らかにする：
96ウェルのニトロセルロースプレート(MILLIPORE)を、カーボネートバッファー中に1μg/ml に希釈した抗γ-IFN 抗体(MABTECH、1-D1K) 100μl/ウェルを用いて、37℃において2時間コートした。
次いでプレートをPBS中に洗浄し、100 μl/ウェルの割合でRPMI、10% FCSを用いて、37℃において2時間飽和させた。
【００４５】
上記の1)に記載のようにして活性化した細胞懸濁物200μlを、このプレートに沈着させる。インキュベーションを37℃、5% CO2で5時間行う。
1×PBS中での1回の洗浄、および0.05% TWEENを含むPBS中での5回の洗浄の後、100μl/ウェルの抗-γ-IFNビオチン抗体(MABTECH、7-B6-1-ビオチン)を1μg/mlで添加し、インキュベーションを周囲温度にて2時間行う。
【００４６】
プレートをPBS-0.05% TWEEN中に5回洗浄する。
PBS-0.05% TWEEN、1% BSA中に1/5000まで希釈したエクストラアビジン-AKP (SIGMA、No. 2636) 100μl/ウェルを添加する。インキュベーションを、周囲温度にて1時間行う。プレートを再びPBS-0.05% TWEEN中に5回洗浄する。
検出を、BIORADキット(No. 170-6432)を用いて行う。
半時間〜1時間後、プレートを水で洗浄することにより反応を停止する。プレートを空気乾燥させる。
【００４７】
結果を図1に示す。
A：通常のELISPOTアッセイ；
B：固体担体に付着したペプチドを用いて行ったアッセイ。
両方の場合において、gag 77〜85ペプチドだけがγ-IFNを分泌するCD8+エフェクターTリンパ球の活性化を誘導する。これらの結果は、固体担体に付着したペプチドの使用が、液相に提示されたペプチドのものと少なくとも同程度に、エフェクター細胞の活性化の誘導について効果的であることを示す。
【００４８】
実施例3：CMVに対する細胞性免疫の特徴づけ
患者(HLA-A2、B18)の血液から精製したPBMCを、次のようにして試験した。
通常培地の懸濁物中の2×105細胞を、上記の実施例1に記載のようにして、CMV ペプチドが付着した各ウェル中に沈着させた。
ポジティブコントロールとして、通常のELISPOT法によりアッセイを行った：同じ患者からのPBMCの懸濁物の2×105細胞を、96ウェルプレート(NUNC) (ペプチドが付着したものと同じ)のウェルに沈着させ、GB 619〜628またはIEI 378〜389ペプチド10μgと混合する。
【００４９】
2つのアッセイにおいて、コントロールとして、PBMCをペプチドなしのウェル中に沈着させた。
上記の実施例2に記載のようにしてプレートのインキュベーションと検出を行う。
結果を図2に示す。
A：通常のELISPOTアッセイ；
B：固体担体に付着したペプチドを用いて行ったアッセイ。
両方の場合において、GB 619〜628ペプチドだけがγ-IFNを分泌するCD8+エフェクターTリンパ球の活性化を誘導する。これらの結果は、HIV-1ペプチドの場合に観察されたことを確かにする。
【００５０】
実施例4：固体担体に付着したペプチドの保存
上記の実施例1に記載のようにしてウェルにEBVペプチドが付着したプレートを：
A)  20℃で24時間；
B)  4℃で7日間；
C)  −80℃で15日間
保存した。
通常培地の懸濁液中に患者(HLA B7/B44)の血液から精製したPBMC 2×105を、これらのプレートの各ウェル中に沈着させ、上記の実施例3に記載のようにして試験する。
【００５１】
結果を図3に示す。
A：20℃で24時間の保存；
B：4℃で7日間の保存；
C：−80℃で15日間の保存。
これらの結果は、保存条件が、固体担体に付着したペプチドのエフェクター細胞−活性化特性を変更しないことを示す。
【００５２】
実施例5：固体担体に付着したペプチドの混合物を用いた、EBVに対する細胞性免疫の検出
EBVの公知のCD8+ Tエピトープを構成する次のペプチド：
EBNA 3C 163〜171 (EGGVGWRHV、B44)、
EBNA 3A 603〜611 (RLRAEAGVK、A3)、
EBNA 4 416〜424 (IVTDFSVIK、A11)、
EBNA 3C 881〜891 (QPRAPIRPIPT、B7)
EBNA 3A 379〜387 (RPPIFIRRL、B7)、および
EBNA 6 290〜299 (EENLLDFVRF、B44)、
の混合物を、次のプロトコルに従って、ポリスチレンチューブの内壁に付着させた：
カーボネートバッファー中に希釈した各ペプチド10μgを、ポリスチレンチューブ(15 mlチューブ、CORNING)中に沈着させた。ペプチドの付着は、周囲温度にて2時間の吸着により行う。付着しなかったペプチドは、PBS中に2回洗浄することにより除去する。
【００５３】
患者(HLA：A3〜A11、B7/B44)からの全血2 mlを、このようにして得たチューブ内に5時間インキュベートした。
このインキュベーション後、全血を1500 rpmで10分間遠心分離し、血液からの上清(血漿)を移した。血漿(100、50および12.50μl)を、抗-γ-IFN抗体で予めインキュベートした96ウェルプレート上に、20℃の温度において2時間、重複して沈着させた。洗浄後、ビオチン化抗-γ-IFN 2次抗体を、20℃の温度において1時間添加した。次いでエクストラアビジン-APを20℃の温度において1時間添加し、MUP 基質(アルカリホスファターゼの基質) 100μlが反応の現像を可能にした。読み取りを30分後に行った。
【００５４】
結果を図4に示す。
図4の凡例：
【表１】
2005501257.tif 000002
これらの結果は、患者の全血を用いて、ウイルスに特異的な細胞性応答の存在の検出(ここではEBVウイルスの検出)が可能であることを示す。この細胞性応答は、ウイルスに特異的であり、γ-IFNの産生が、血漿の種々の希釈において検出された。全血のみ(ネガティブコントロール)またはEBVウイルスペプチドとインキュベートした全血から得られたγ-IFNの産生の間の差異は、有意であった。患者1056の血液中に存在する細胞は、活性化され、そしてEBVウイルス由来CD8+ペプチドの存在下の特定の方法でγ-IFNを産生した。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】
2005501257.tif 000003
【図２】
2005501257.tif 000004
【図３】
2005501257.tif 000005
【図４】
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【国際公開パンフレット】
2005501257.tif 000007
2005501257.tif 000008
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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