(57)【要約】【課題】レイン及びジアセレインの新規な治療への応用【解決手段】本発明は、レイン及びジアセレインの新規な治療への応用に関する。レイン及びジアセレイン、並びにその塩及びエステルは、ヘムオキシゲナーゼ酵素率の上昇を必要とする疾病を治療し、細胞及び組織へのストレスの予防及び阻害、並びに臓器及び組織移植拒絶反応の治療及び予防を提供するために使用され得る。
2005538098.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘムオキシゲナーゼ酵素のレベル増加を必要とする疾患の治療のためのヒト及び獣医治療法におけるレイン（ｒｈｅｉｎ）及びレイン誘導体の使用。
【請求項２】
レイン及びレイン誘導体は、次の一般式（Ｉ）：
【化１】
2005538098.tif 000004
（式中、Ｒは、水素原子、又はアルキル基、又はアルカリ若しくはアルカリ土類金属原子を表し、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なっており、式Ｒ’−ＣＯＯ−（式中、Ｒ’は、１から４個の炭素原子のアルキル基である）のアシルオキシ基又はヒドロキシ基を表す）によって表される請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記誘導体が、レイン又はジアセレイン（ｄｉａｃｅｒｅｉｎ）である請求項２に記載の使用。
【請求項４】
レイン誘導体が、１日当たり２５から５００ｍｇの用量で投与される請求項１から３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
レイン誘導体が、経口経路で投与され得る形状である請求項１から４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
ヘムオキシゲナーゼ酵素のレベル増加を必要とする疾患の治療のための医薬品製造用のレイン及びレイン誘導体の使用。
【請求項７】
レイン及びレイン誘導体が、次の一般式（Ｉ）：
【化２】
2005538098.tif 000005
（式中、Ｒは、水素原子、又はアルキル基、又はアルカリ若しくはアルカリ土類金属原子を表し、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なっており、式Ｒ’−ＣＯＯ−（式中、Ｒ’は、１から４個の炭素原子のアルキル基である）のアシルオキシ基又はヒドロキシ基を表す）によって表される請求項６に記載の使用。
【請求項８】
誘導体が、レイン又はジアセレインである請求項７に記載の使用。
【請求項９】
レイン誘導体が、１日当たり２５から５００ｍｇの用量で投与される請求項６から８のいずれかに記載の使用。
【請求項１０】
レイン誘導体が、経口経路で投与され得る形状である請求項６から９のいずれかに記載の使用。
【請求項１１】
単位量が、２５ｍｇから５０ｍｇである請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
レイン誘導体が、非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）又はＣＯＸ−２阻害剤と結合される請求項６から１１のいずれかに記載の使用。
【請求項１３】
治療が、移植拒絶反応を治す又は予防することを目的とする請求項６から１２のいずれかに記載の使用。
【請求項１４】
治療が、細胞及び組織へのストレス効果を予防及び阻害することを目的とする請求項６から１２のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幾つかの急性及び慢性病態の原因に作用すること、細胞及び組織へのストレス効果の予防及び阻害を確実に行うこと、及び臓器及び組織移植拒絶反応の予防及び治療を確実に行うことによる、有効量のレイン（ｒｈｅｉｎ）若しくはジアセレイン(ｄｉａｃｅｒｅｉｎ)、又はその塩若しくはエステルの一方の投与によるヘムオキシゲナーゼ酵素レベルの上昇を必要とする疾患のヒト及び動物治療法における治療、並びにヘムオキシゲナーゼ酵素レベルの上昇を必要とする疾病を治療する医薬品を製造するためのレイン若しくはジアセレイン、又はその塩若しくはエステルの一方の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系の反応は、生体を狙う幾つかのタイプ及び形状の攻撃（「ストレス」）への反応の生理病理学的メカニズムである。この反応は、例えばＨａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１４版（１９９８）、７４９−７５４で参照される、幾つかの重要な病的形状の原因であり得る。多数の研究が、免疫系要素の反応開始の原因である媒介物、及び初期でのこの反応の薬理学的かつ治療的制御に向けられてきた。これらの研究は、例えば急性炎症の治療における、効率的な医薬品の製造及び市場取引を可能にした。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
正常な状態で、ストレス（化学、熱、機械、感染性等）に対する生体の保護及び応答メカニズムは、反応の根底にある原因を制御し、かつ過程を停止することができる。確かに、研究者は、免疫系要素の反応が、急性初期後の第二期で治まり得ることをしばしば発見してきた。しかしながら、この反応の自然良性進行、及びその薬理学的かつ治療的制御の問題を検討した研究は、僅かである。
【０００４】
原因の持続性、及び／又は治療の無効果のために、免疫系要素の反応は、慢性になり得る。慢性状態への進行は、頻繁に起こり、かつ特にＴａｒｋｏｗｓｋｉ  Ａ．ら、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ（１９８８）４：１５−１８；及びＬｅｖｙ  Ｂ．Ｄ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００１）２：６１２−６１９で参照される、種々の重要な病的様相を取り得る。この、慢性状態への進行に関する問題は、多数の研究プロジェクトの中心にある。しかしながら現在利用できる、満足のゆく治療は、僅かである。その上、これらの治療はしばしば、患者にとって耐えがたく、かつ低用量でも深刻な有害事象を引き起こし得る。
【０００５】
幾つかの作業は、免疫系要素の反応の自然良性進行に対するある種の内生要素の影響を示した。Ｄ．Ｗｉｌｌｉｓら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９９６）２：ｐｐ．８７−９０）は、このように酵素、ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）が、急性炎症反応の最も進んだ段階で漸次発現すること、及びこの反応の消散期に先行することを示した。この反応中に起きる主要な事象の干渉性モデルは、このようにして図１に示す（ラットにカラゲーンを注入した後の誘発胸膜炎のモデル）が、この中で「ＨＯ−１」は、ヘムオキシゲナーゼ−１のレベルを、「ｉＮＯＳ」は、誘発性酸化窒素合成酵素を、かつ「ＰＧＥ２」は、プロスタグランジンＥ２を表す。ヘムオキシゲナーゼのレベルは、時間が経つにつれ漸次増加し、かつ免疫系要素の反応の減少に先行することが観察され得る。
【０００６】
ヘムオキシゲナーゼ酵素は、「熱ショックタンパク」（ＨＳＰ）のクラスに属する：それは、「熱ショックタンパク３２Ｋ」（ＨＳＰ３２）（Ｋｅｙｓｅ  Ｓ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８６：９９−１０３参照）としても知られる。マウスマクロファージ培養、ヒト軟骨細胞及びラット大腿骨頭の摘出軟骨に対してインビトロで出願人が実施した実験により確認されるように、ＨＳＰは、発現がストレス（熱、低酸素、酸化、金属による中毒等）によって刺激されるタンパク群に属する。図２は、ラット大腿骨頭軟骨モデルにおける熱ショック（４３℃で１時間）後のＨＳＰ３２（ＨＯ−１）及びＨＳＰ７０の発現を分析する「ウェスタンブロット」（対象となるタンパクのレベルの感度の高い測定方法）の結果を示す（Ｃｏｎｔ．＝対照）。
【０００７】
ＨＳＰは、ストレスに関連した防御及び細胞修復メカニズムにおいて非常に重要な役割を演じる。特に、ＨＯ−１は、炎症反応中に非常に重要な変調効果を有する：炎症は、酵素レベルが増加すると抑制され、他方で酵素阻害は、炎症反応の増加を引き起こす（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９９６）２：８７−９０）。
【０００８】
ＨＯ−１の発見及びその効果の評価は、ストレスへの細胞反応の薬理学的かつ治療的制御の可能性を示唆した；確かに、特に免疫抑制患者において観察されたような、細胞及び組織ストレスを含む幾つかの状態の治療用に、酵素ＨＯ−１のレベル増加に有利に働きそうな、かつ／又はそれを維持しそうな医薬品を使うことは、好適であろう。
【０００９】
その上、ストレスへの反応の原因である細胞メカニズムは、組織又は臓器移植への反応として観察される現象中にも作動する（Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１４版（１９９８）、１７６０−６８）。従って、組織及び臓器移植中に観察される移植片の劣化から生体を保護するために、酵素ＨＯ−１のレベル増加に有利に働きそうな、かつ移植拒絶反応の予防及び治療に有用な医薬品を使うことも、好適であろう。
【００１０】
レイン、及びジアセレインを含むその誘導体の幾つかは、医薬品の作用物質としてヒト及び獣医治療法に使用されてきた。良好な収率で、かつ非常に低い含有量のアロエエモジン及び他の好ましくない不純物を示す、その治療法での使用に適合する純度のジアセレインを得るために、製造方法が開発された。
【００１１】
ヒト治療法において、ジアセレインは、骨関節炎を示し、かつ動くことに苦痛及び困難を感じる患者に投与された。その上、ジアセレインによる治療は、骨関節炎の進行の速度を落とし、良好な使用安全性を有する。しかしながら、ジアセレイン及びレインは、両方共、骨関節炎の急性期において、中程度の鎮痛及び抗炎症症候性活性を有する（Ｎｇｕｙｅｎら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ（１９９４）３７：５２９−５３６）。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
今般、出願人によって行われ、かつジアセレイン及びレインの作用機序を明らかにすることを目指す作業及び実験は、思いがけなくも、レイン、ジアセレイン又はそれらの塩若しくはエステルが、ＨＯ−１の形成を著しく促進し、かつストレスへの細胞及び組織反応の制御メカニズムに有利に働くことを示した。従って、レイン、ジアセレイン又はその塩若しくはエステルの投与が、ストレス関連の有害事象から生体を保護することを実証することが可能であった。
【００１３】
その上、レイン、ジアセレイン又はその塩若しくはエステルの投与は同様に、免疫系細胞による臓器又は組織の劣化、及び特に軟骨の劣化から生体を保護し、かつ臓器及び組織移植への反応として生じる現象を制御し、このことは、臓器及び組織移植片拒絶反応の予防及び治療における使用を検討することを可能にする。
【００１４】
従って、本発明は、高レベルのヘムオキシゲナーゼ酵素を必要とする疾患の治療におけるヒト及び獣医治療法、細胞及び組織へのストレス効果の予防及び阻害、並びに臓器及び組織移植片拒絶反応の予防及び治療のための、ジアセレイン、及び更に一般的にはレイン及びレイン誘導体の使用に関する。
【００１５】
本発明は、高レベルのヘムオキシゲナーゼを必要とする状態の治療のための医薬品製造用のレイン及びレイン誘導体、特にジアセレインの使用にも関する。
【発明の効果】
【００１６】
従って、レイン及びジアセレインは、その塩及びエステルと共に、細胞及び組織へのストレスの影響の予防及び阻害、並びに臓器及び組織移植片拒絶反応の治療を必要とする被験者での臓器及び組織移植片拒絶反応の予防及び治療において、高レベルのヘムオキシゲナーゼに有利に働く、又はそれを維持するために特に好適であるように見える。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明で使用され得るレイン及びレイン誘導体、特にジアセレインは、次の一般式（Ｉ）：
【００１８】
【化３】
2005538098.tif 000003
【００１９】
（式中、Ｒは、水素原子又はアルキル基、例えばメチル、エチル又はプロピル基、又はアルカリ若しくはアルカリ土類金属原子、例えばナトリウム、カリウム又はカルシウム原子を表し、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なっており、式Ｒ’−ＣＯＯ−（式中、Ｒ’は、１から４個の炭素原子のアルキル基、例えばメチル、エチル又はイソプロピル基である）のアシルオキシ基又はヒドロキシ基を表す）によって表すことができる。
【００２０】
上記一般式（Ｉ）中、Ｒは好ましくは水素原子を表し、かつＲ１及びＲ２は、好ましくはヒドロキシ又はアセトキシ基を表す。Ｒが水素原子であり、かつＲ１及びＲ２がアセトキシ基−ＣＯＯＣＨ３である上記一般式（Ｉ）は、ジアセレインのものである。
【００２１】
ジアセレイン及びレインは、技術の公知の方法に従って、例えばセンノシドのようなアロエ又はセンナ葉抽出生成物から、又は酸化クロムによる酸化が後に続くバルバロインアセチル化によって調製され得る。欧州特許第８０１６３９号明細書及び欧州特許第９０９２６８号明細書に記載された合成プロセスも使用できる。例えば、これらのプロセスは、酸化的脱保護の後にレイン及びジアセレインに容易に変換され得るテトラヒドロアントラキノンを得るために、非環式ジエンを用いたユグロンのようなナフトキノンに対するディールス・アルダー反応である。
【００２２】
これらのプロセスの結果、得られるジアセレインは、薬剤基準を完全に満たし、かつ所望のあらゆる保証を与える生成物を得るために必要であれば精製され得る。例えば、欧州特許第７５４１７３号明細書に記載された精製プロセスが、使用でき、これによるとトリエチルアミン及び酢酸カリウムの作用によって、後に続く微酸性媒体中での加水分解によって、可溶性ジアセレイン塩が調製される。
【実施例】
【００２３】
ＨＯ−１に対するジアセレイン、レイン及びその塩又はエステルの効果を立証するために、出願人が実施した研究は、以下に示すような有効なモデルを使用して行われた。
【００２４】
インビトロ作業及び実験は、次のモデルを使用した：
【００２５】
１．−  熱ストレス無し、及び熱ストレス（４３℃で１時間）後の、赤血球（％ｗ／ｖ）、赤血球可溶化物（３×１０６）、又はヘモグロビン（％ｗ／ｖ）で処理された、組織培養、及び特にラット大腿骨頭軟骨の有効なモデル。軟骨全体は、放射性硫酸の組み込みによって測定された（３５ＳＯ４、回数／分  ＣＰＭ（ｃｏｕｐｓ  ｐｅｒ  ｍｉｎｕｔｅｓ）、ＣＰＭ）。このモデルで、図３、４に示すように、細胞生存度の減少及び細胞による放射性硫酸の組み込み減少によって証明されるように、赤血球、赤血球可溶化物、及びヘモグロビンは細胞破壊を引き起こす。
【００２６】
図３は、赤血球によって引き起こされる細胞破壊が、放射性硫酸の細胞組み込み減少によって立証されるように、用量依存性であることを示す（モデル：％ｖ／ｖの赤血球を有するラット大腿骨頭軟骨；Ｃｏｎｔ．＝対照：赤血球のない溶液；３５ＳＯ４＝放射性硫酸；ｓｅｍ＝標準誤差）。
【００２７】
同様に、図４は、ヘモグロビンによって引き起こされる細胞破壊が、放射性硫酸の細胞組み込み減少によって立証されるように、用量依存性であることを示す（モデル：％ｖ／ｖのヘモグロビンを有するラット大腿骨頭軟骨；Ｃｏｎｔ．＝対照：ヘモグロビンのない溶液；３５ＳＯ４＝放射性硫酸；ｓｅｍ＝標準誤差）。
【００２８】
この組織培養モデルにおいて、ストレスによって予め誘発されたＨＳＰは、細胞による放射性硫酸の組み込み増加によって図５で証明するように細胞破壊を予防する（モデル：熱ストレス（４３℃で１時間）下の、かつ次にヘモグロビン（１％ｗ／ｖ）によって処理されたラット大腿骨頭軟骨；３５ＳＯ４＝放射性硫酸；ｓｅｍ＝標準誤差）。
【００２９】
２．−  熱ストレス無し、及び熱ストレス（４３℃で１時間）後の、赤血球（％ｗ／ｖ）、赤血球可溶化物（３×１０６）、又はヘモグロビン（％ｗ／ｖ）で処理された、細胞培養、及び特にヒト軟骨細胞の有効なモデル。細胞培養全体は、その細胞生存度（対照と比較した生存細胞）、アポトーシスの存在（核分断；対象と比較した数及び百分率）、及び放射性硫酸の組み込み（３５ＳＯ４；回数／分、ＣＰＭ）によって測定された。
【００３０】
大腿骨頭軟骨ですでに観察されたように、赤血球、赤血球可溶化物、及びヘモグロビンは、このモデルにおいても細胞破壊を引き起こす。しかしながら、ストレス誘発ＨＳＰは、生存細胞を算出する図６に示すように、この細胞破壊を予防し、かつ細胞を保存する（モデル：熱ストレス（４３℃で１時間）下の、かつ赤血球可溶化物（３×１０６）によって処理されたヒト軟骨細胞；ｓｅｍ＝標準誤差）。
【００３１】
これらの実験に基づき、出願人によって実施された研究は、図７ａ、７ｂ及び７ｃを参照して、以下に詳細に示すように、ＨＯ−１の発現に対するジアセレイン、レイン及びその塩又はエステルの効果を立証した。
【００３２】
図７ａは、ジアセレインが、対照及び基準溶液と比較した時に、ＨＯ−１の発現の用量依存性増加を引き起こすことを示す「ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｓ）」（モデル：ラット大腿骨頭軟骨；Ｃｏｎｔ．＝対照；Ｖｅｈ．＝基準溶液；ジアセレイン：１０μＭ及び１００μＭ）である。
【００３３】
図７ｂ及び７ｃも、濃度１０−５Ｍで、ジアセレイン有り及び無しで（図７ｂ：それぞれカラム「D∈」及び「Ｃ∈」）、又はレイン有り及び無しで（図７ｃ）、培養され、かつその後、１５、３０及び６０分（図７ｂ）及び０、１５、３０、６０、１２０分及び１８時間（図７ｃ）で分析された細胞（モデル：マウスマクロファージ）の「ウェスタンブロット」である。対象となるタンパク、ＨＯ−１の同一性は、その分子量によって確認された（図の左側の第１カラム）。これらの結果は、ジアセレイン及びレインが、ＨＯ−１発現の時間依存性増加を引き起こすことを証明する。
【００３４】
以上に記載されたインビトロモデルを使用し、出願人が行った研究は、ジアセレイン、レイン及びその塩又はエステルが、図８及び９に詳細に示すように、ＨＯ−１に対する効果の結果、細胞完全性を保存することも証明した。
【００３５】
図８（モデル：ヒト軟骨細胞；可溶化物＝３×１０６の赤血球の溶解生成物；ジアセレイン：１００μＭ；ｓｅｍ＝標準誤差）は、ジアセレインによる処理が、赤血球可溶化物により引き起こされる細胞破壊を予防することを示す。
【００３６】
図９（モデル：ヒト軟骨細胞；可溶化物＝３×１０６の赤血球の溶解生成物；レイン：１００μＭ；ｓｅｍ＝標準誤差）は、レインによる処理が、赤血球可溶化物により引き起こされるアポトーシスを予防することを示す。
【００３７】
ジアセレイン、レイン及びその塩又はエステルの効果に関する、以上に記載したモデルにより、出願人がインビトロで行った作業及び実験の主要な結論は、次の通りである：
−  ジアセレイン、レイン及びその塩又はエステルは、細胞完全性の保護において、役割を果たすＨＯ−１酵素のレベルの用量依存性増加を誘発する；
−  ＨＯ−１のこの増加の結果、ジアセレイン、レイン及びその塩又はエステルは、ストレス誘発有害反応に直面する時に、細胞及び組織完全性を保存する；
−  ジアセレイン、レイン及びその塩又はエステルは、アポトーシス（核分断、続いて細胞破壊及び死が後に起こる）を予防する。
【００３８】
出願人は、以下に記載したモデルを使用して、インビボ作業及び実験も行った。
【００３９】
組織反応、並びに破壊及び拒絶現象の強度に対するジアセレイン、レイン及びその塩又はエステルの効果は、マウス中のラット組織の組織劣化及び誘発肉芽腫のモデルを使用して、組織移植に続いて評価された（Ｂｏｔｔｏｍｌｅｙ  ＫＭら、Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ（１９９８）６：１９−２３）。
【００４０】
方法は、次のステップを含む：
−  摘出組織（ウィスターラット、雄）が、滅菌綿内に置かれ、かつＴＯマウスに皮下移植される；
−  皮下移植片は、２週間の期間中、保持される；
−  指示した適量でのジアセレイン、レイン、その塩又はエステル、並びに対照及び比較による、動物の毎日の治療；
−  移植組織及び反応性肉芽腫の収集；
−  組織炎症反応（肉芽腫の大きさ、浸出物中の炎症細胞の数及び浸出物の体積の評価）、及び拒絶反応（移植組織の劣化の評価）の程度の測定。
【００４１】
以上に記載されたモデルを使用し、出願人が行った研究は、ジアセレイン、レイン及びその塩又はエステルが、以下で図１０、１１及び１２に詳細に示すように、ラット組織のマウスへの移植により引き起こされる組織反応（肉芽腫の形成、炎症細胞の漸増、浸出物の形成）を減少させ、かつ移植組織の完全性を保存することを証明した。
【００４２】
図１０は、ジアセレインによる治療が、組織反応（反応性肉芽腫の形成）の用量依存性減少を引き起こすことを示す（ジアセレイン：経口経路で５、１５及び５０ｍｇ／ｋｇ；＊＊対照と比較した統計的有意差：ｐ＜０．０１）。
【００４３】
図１１は、ラット組織のマウスへの移植により引き起こされる組織反応が、ジアセレインによる治療によって用量依存的に減少することを示す（図１１の左側：炎症細胞数；右側：浸出物の体積）（Ｃｏｎｔ．＝対照；ジアセレイン：経口経路で５、１５及び５０ｍｇ／ｋｇ；＊対照と比較した統計的有意差：ｐ＜０．０５）。
【００４４】
図１２は、ジアセレインによる治療が、移植組織のコラーゲン（図１２の左側）及びグリコサミノグリカン（ＧＡＧ；右側）の含有量の保存によって立証されるように、投与されるジアセレインの用量に従って移植組織の完全性を保存することを示す（ジアセレイン：経口経路で５、１５及び５０ｍｇ／ｋｇ；対照と比べた統計的有意差：＊ｐ＜０．０５：＊＊ｐ＜０．０１）。
【００４５】
以上に記載したモデルによるインビボでのジアセレイン、レイン及びその塩又はエステルの効果に関し、出願人が行った作業及び実験の主要な結論は、次の通りである：
−  ジアセレイン、レイン及びその塩又はエステルは、ラット組織のマウスへの移植により引き起こされる組織反応（肉芽腫の大きさ、炎症細胞数、浸出物の体積）を減少させる；
−  ジアセレイン、レイン及びその塩又はエステルは、組織反応に直面する時、移植組織の完全性を保存する；
−  ジアセレイン、レイン及びその塩又はエステルは、移植組織の破壊及び拒絶反応を予防する。
【００４６】
急性炎症現象の治療のために、最も広く使用される医薬品は、ある種の有害事象、及び特に胃及び腸潰瘍を誘発する傾向を示すとしても、非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）である（Ｇｏｏｄｍａｎ及びＧｉｌｍａｎ、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ；第９版、ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ）。これらの有害事象は、シクロオキシゲナーゼ−１酵素（ＣＯＸ−１；構成性イソ型）の阻害に関係する。
【００４７】
シクロオキシゲナーゼ酵素のもう一つのイソ型、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２；炎症発症において誘発されるイソ型）の存在の発見は、潜在的により特定かつ安全な薬剤の開発に向けて新しい展望を開いた。現在利用可能なＮＳＡＩＤは、ＣＯＸ−２の作用の選択的阻害剤として作用し、かつ従って炎症に作用し、上部胃腸管に関連するより有害でない事象を引き起こす。新しいクラスの薬剤、セレコキシブ及びロフェコキシブのような、ＣＯＸ−２阻害剤は、炎症疾病の対症治療のためにこのようにして開発された。
【００４８】
しかしながら、「伝統的な」ＮＳＡＩＤにせよ、ＣＯＸ−２阻害剤にせよ、ヘムオキシゲナーゼ酵素に関する限り、有利な効果は観察されなかった。
【００４９】
出願人によって行われた研究は、伝統的なＮＳＡＩＤ及びＣＯＸ−２阻害剤が、ラット組織のマウスへの移植により引き起こされる組織反応（肉芽腫、炎症細胞浸潤、浸出物）を減少させることを確認した。しかしながら、添付の図１３、１４及び１５に示すように、伝統的なＮＳＡＩＤも、ＣＯＸ−２阻害剤も、レイン及びジアセレインとは反対に、移植組織の完全性を保存しない。
【００５０】
図１３は、ラット組織のマウスへの移植により引き起こされる組織反応（反応性肉芽腫の形成）の減少に関する、一方でＣＯＸ−２阻害剤（ロフェコキシブ）、かつ他方でジアセレインによる治療効果の比較を示す（ジアセレイン：５、１５及び５０ｍｇ／ｋｇ、ロフェコキシブ：３ｍｇ／ｋｇ、経口経路で；対照と比較した統計的有意差：＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１）。
【００５１】
図１４は、ラット組織のマウスへの移植により引き起こされる組織反応の減少に関する、一方でロフェコキシブ、かつ他方でジアセレインによる治療効果の比較を可能にする。左側のグラフは、細胞浸潤を示し、右側のものは、浸出物の体積を示す（Ｃｏｎｔ．＝対照；ＤＡＲ：ジアセレイン：２、１０及び５０ｍｇ／ｋｇ、ロフェコキシブ：３ｍｇ／ｋｇ、経口経路で；対照と比較した統計的有意差：＊ｐ＜０．０５）。
【００５２】
図１５は、移植組織の完全性の保存に関する、一方でロフェコキシブ、かつ他方でジアセレインによる治療効果の間の差の比較を可能にする。左側のグラフは、コラーゲン含有量に対応し、右側のものは、組織のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）含有量に対応する（ジアセレイン：５、１５及び５０ｍｇ／ｋｇ、ロフェコキシブ：３ｍｇ／ｋｇ、経口経路で；対照と比較した統計的有意差：＊ｐ＜０．０５：＊＊ｐ＜０．０１）。
【００５３】
得られた結果は、ジアセレイン及びレインの特性が、特に移植組織の保存及びこの組織の拒絶反応に関して、伝統的な非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）又はＣＯＸ−２阻害剤のような他の薬剤のそれと著しく異なることを示す。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明によれば、作用が治療される病変に応じて相補的であり得る、伝統的なＮＳＡＩＤ又はＣＯＸ−２阻害剤と、ジアセレイン若しくはレイン又はその塩若しくはエステルを結合させることは、有用であり得る。このようにしてジアセレインは、ジクロフェナクのようなＮＳＡＩＤと、１日当たり２５から１５０ｍｇの用量で、又はロフェコキシブのようなＣＯＸ−２阻害剤と、１日当たり１０から５０ｍｇの用量で結合され得る。
【００５５】
先に示したように、ジアセレイン、レイン及びその塩又はエステルは、好適には、高レベルのヘムオキシゲナーゼ酵素を必要とする疾患の治療のためのヒト及び獣医治療法に、細胞及び組織へのストレス効果の予防及び阻害に、かつ組織及び臓器移植拒絶反応を予防及び治療するために使用され得る。例えば、指示された用量でのその使用は、以下に列挙した疾患の治療に特に有用である。
−  末梢神経障害及び慢性皮膚潰瘍のような、Ｉ及びＩ型糖尿病に関連した炎症、
−  黄斑変性
−  網膜炎、
−  非感染性中間又は後部ブドウ膜炎
−  緑内障
−  （紅斑性狼瘡、強皮症、サルコイドーシスのような）「結合性（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｉｓ）」
−  伝統的な治療（光線療法及び／又は光化学治療）の無効果、又は不耐性、又は禁忌の場合の、結節性紅斑及び成人性アトピー皮膚炎
−  筋無力症及び膵臓線維症
−  慢性副鼻腔炎、閉塞性慢性気管支炎、気管支拡張
−  （肺、腎、及び骨局在性を有する）結核及び（寄生虫病、リーシュマニア症、塵肺症でのような）肉芽腫の形成の予防
−  （ウイルス又はアルコール由来の）慢性肝炎、慢性膵臓炎
−  血液透析中の患者の糸球体腎炎、ネフローゼ症候群及び毒血症（「尿毒症」）
−  第三度熱傷を負った免疫抑制患者の日和見感染症、骨髄炎
−  溶血性貧血、鎌状赤血球貧血、関節血症
−  アテローム斑発生、出血性発作、血栓静脈炎
−  （患者が同種の骨髄移植片を有するとしても）後天性骨髄不全
−  組織（軟骨、皮膚、骨髄）又は臓器（肝臓、腎臓、心臓）移植片拒絶反応の予防
−  腎移植初期を含む、移植片拒絶反応及び移植後の拒絶反応の予防、並びに移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の予防又は治療的処置
−  特に最初に免疫抑制プロトコルにより治療された患者における拒絶反応の治療。
【００５６】
ジアセレイン及びレインは、両方共、水及びアルコール中で非常に僅かに可溶性であり、かつ従って好ましくは経口経路で投与される。薬剤領域での経口経路での通常の投与形状が、適切であり、かつ例えば薬剤は、錠剤、カプセル又は軟質ゼラチンカプセルの形状、又は他の適切ないかなる剤形でも投与され得る。
【００５７】
投与の特に適切な形状は、ジアセレインが、良好な生物学的利用能が得られることを可能にする、液体油及び非イオン性界面活性剤と混合されるカプセル又は軟質カプセルを記載している欧州特許第８６２４２３号明細書に記載されたものである。本発明で使用され得るもう一つの形状は、米国特許第６１２４３５８号明細書に記載されており、かつラウリル硫酸、例えばラウリル硫酸ナトリウムとのレイン又はジアセレインの共同微粉化（ｃｏｍｉｃｒｏｎｉｓａｔｉｏｎ）によって調製される。
【００５８】
薬量は、患者の健康状態に応じて医師によって決定されるが、一般的に１日当たり２５ｍｇから５００ｍｇであり、好ましくは１日当たり５０ｍｇから１００ｍｇである。それは、成人の被験者において、患者の体重とは比較的無関係である。経口投与の単位量は、一般的に２５ｍｇから５０ｍｇである。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】ラットにカラゲーンを注入した後の誘発胸膜炎のモデルである。
【図２】図２は、ラット大腿骨頭軟骨モデルにおける熱ショック（４３℃で１時間）後のＨＳＰ３２（ＨＯ−１）及びＨＳＰ７０の発現を分析する「ウェスタンブロット」（対象となるタンパクのレベルの感度の高い測定方法）の結果を示す（Ｃｏｎｔ．＝対照）。
【図３】図３は、赤血球によって引き起こされる細胞破壊が、放射性硫酸の細胞組み込み減少によって立証されるように、用量依存性であることを示す（モデル：％ｖ／ｖの赤血球を有するラット大腿骨頭軟骨；Ｃｏｎｔ．＝対照：赤血球のない溶液；３５ＳＯ４＝放射性硫酸；ｓｅｍ＝標準誤差）。
【図４】図４は、ヘモグロビンによって引き起こされる細胞破壊が、放射性硫酸の細胞組み込み減少によって立証されるように、用量依存性であることを示す（モデル：％ｖ／ｖのヘモグロビンを有するラット大腿骨頭軟骨；Ｃｏｎｔ．＝対照：ヘモグロビンのない溶液；３５ＳＯ４＝放射性硫酸；ｓｅｍ＝標準誤差）。
【図５】熱ストレス（４３℃で１時間）下の、かつ次にヘモグロビン（１％ｗ／ｖ）によって処理されたラット大腿骨頭軟骨；３５ＳＯ４＝放射性硫酸；ｓｅｍ＝標準誤差。
【図６】熱ストレス（４３℃で１時間）下の、かつ赤血球可溶化物（３×１０６）によって処理されたヒト軟骨細胞；ｓｅｍ＝標準誤差。
【図７ａ】図７ａは、ジアセレインが、対照及び基準溶液と比較した時に、ＨＯ−１の発現の用量依存性増加を引き起こすことを示す「ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｓ）」（モデル：ラット大腿骨頭軟骨；Ｃｏｎｔ．＝対照；Ｖｅｈ．＝基準溶液；ジアセレイン：１０μＭ及び１００μＭ）である。
【図７ｂ】図７ｂは、濃度１０−５Ｍで、ジアセレイン有り及び無しで（それぞれカラム「D∈」及び「Ｃ∈」）培養され、かつその後、１５、３０及び６０分で分析された細胞（モデル：マウスマクロファージ）の「ウェスタンブロット」である。
【図７ｃ】図７ｃは、濃度１０−５Ｍで、レイン有り及び無しで（それぞれカラム「D∈」及び「Ｃ∈」）培養され、かつその後、０、１５、３０、６０、１２０分及び１８時間で分析された細胞（モデル：マウスマクロファージ）の「ウェスタンブロット」である。
【図８】図８（モデル：ヒト軟骨細胞；可溶化物＝３×１０６の赤血球の溶解生成物；ジアセレイン：１００μＭ；ｓｅｍ＝標準誤差）は、ジアセレインによる処理が、赤血球可溶化物により引き起こされる細胞破壊を予防することを示す。
【図９】図９（モデル：ヒト軟骨細胞；可溶化物＝３×１０６の赤血球の溶解生成物；レイン：１００μＭ；ｓｅｍ＝標準誤差）は、レインによる処理が、赤血球可溶化物により引き起こされるアポトーシスを予防することを示す。
【図１０】図１０は、ジアセレインによる治療が、組織反応（反応性肉芽腫の形成）の用量依存性減少を引き起こすことを示す（ジアセレイン：経口経路で５、１５及び５０ｍｇ／ｋｇ；＊＊対照と比較した統計的有意差：ｐ＜０．０１）。
【図１１】図１１は、ラット組織のマウスへの移植により引き起こされる組織反応が、ジアセレインによる治療によって用量依存的に減少することを示す（図１１の左側：炎症細胞数；右側：浸出物の体積）（Ｃｏｎｔ．＝対照；ジアセレイン：経口経路で５、１５及び５０ｍｇ／ｋｇ；＊対照と比較した統計的有意差：ｐ＜０．０５）。
【図１２】図１２は、ジアセレインによる治療が、移植組織のコラーゲン（図１２の左側）及びグリコサミノグリカン（ＧＡＧ；右側）の含有量の保存によって立証されるように、投与されるジアセレインの用量に従って移植組織の完全性を保存することを示す（ジアセレイン：経口経路で５、１５及び５０ｍｇ／ｋｇ；対照と比べた統計的有意差：＊ｐ＜０．０５：＊＊ｐ＜０．０１）。
【図１３】図１３は、ラット組織のマウスへの移植により引き起こされる組織反応（反応性肉芽腫の形成）の減少に関する、一方でＣＯＸ−２阻害剤（ロフェコキシブ）、かつ他方でジアセレインによる治療効果の比較を示す（ジアセレイン：５、１５及び５０ｍｇ／ｋｇ、ロフェコキシブ：３ｍｇ／ｋｇ、経口経路で；対照と比較した統計的有意差：＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１）。
【図１４】図１４は、ラット組織のマウスへの移植により引き起こされる組織反応の減少に関する、一方でロフェコキシブ、かつ他方でジアセレインによる治療効果の比較を可能にする。左側のグラフは、細胞浸潤を示し、右側のものは、浸出物の体積を示す（Ｃｏｎｔ．＝対照；ＤＡＲ：ジアセレイン：２、１０及び５０ｍｇ／ｋｇ、ロフェコキシブ：３ｍｇ／ｋｇ、経口経路で；対照と比較した統計的有意差：＊ｐ＜０．０５）。
【図１５】図１５は、移植組織の完全性の保存に関する、一方でロフェコキシブ、かつ他方でジアセレインによる治療効果の間の差の比較を可能にする。左側のグラフは、コラーゲン含有量に対応し、右側のものは、組織のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）含有量に対応する（ジアセレイン：５、１５及び５０ｍｇ／ｋｇ、ロフェコキシブ：３ｍｇ／ｋｇ、経口経路で；対照と比較した統計的有意差：＊ｐ＜０．０５：＊＊ｐ＜０．０１
【図１】
2005538098.tif 000006
【図３】
2005538098.tif 000007
【図４】
2005538098.tif 000008
【図５】
2005538098.tif 000009
【図６】
2005538098.tif 000010
【図８】
2005538098.tif 000011
【図９】
2005538098.tif 000012
【図１０】
2005538098.tif 000013
【図１１】
2005538098.tif 000014
【図１２】
2005538098.tif 000015
【図１３】
2005538098.tif 000016
【図１４】
2005538098.tif 000017
【図１５】
2005538098.tif 000018
【図２】
2005538098.tif 000019
【図７ａ】
2005538098.tif 000020
【図７ｂ】
2005538098.tif 000021
【図７ｃ】
2005538098.tif 000022
【国際調査報告】
2005538098.tif 000023
2005538098.tif 000024
2005538098.tif 000025
2005538098.tif 000026
2005538098.tif 000027
2005538098.tif 000028
2005538098.tif 000029
2005538098.tif 000030
2005538098.tif 000031
2005538098.tif 000032
2005538098.tif 000033
2005538098.tif 000034
2005538098.tif 000035
2005538098.tif 000036
2005538098.tif 000037
2005538098.tif 000038
2005538098.tif 000039
2005538098.tif 000040
2005538098.tif 000041
2005538098.tif 000042