(57)【要約】本発明は、改変されたパントテナート生合成酵素活性を有する微生物を用いた3-(2-ヒドロキシ-3-メチル-ブチリルアミノ)-プロピオン酸(HMBPA)及びα-ヒドロキシイソ吉草酸(α-HIV)の製造方法を特徴とする。組換え微生物及びそれを培養するための条件も特徴とする。また、HMBPAを含む組成物及びα-HIVを含む組成物も特徴とする。
2005503758.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
3-(2-ヒドロキシ-3-メチル-ブチリルアミノ)-プロピオン酸(HMBPA)が産生されるような条件下で微生物を培養し、該微生物によって産生されたHMBPAを検出することを含む、HMBPAの製造方法。
【請求項２】
3-(2-ヒドロキシ-3-メチル-ブチリルアミノ)-プロピオン酸(HMBPA)が産生されるような条件下で微生物を培養し、該微生物によって産生されたHMBPAを単離することを含む、HMBPAの製造方法。
【請求項３】
3-(2-ヒドロキシ-3-メチル-ブチリルアミノ)-プロピオン酸(HMBPA)が産生されるように、過剰のα-ケトイソ吉草酸及び過剰のβ-アラニンの存在下で増加したケトリダクターゼ活性又は増加したパントテナートシンテターゼ活性を有する微生物を培養することを含む、HMBPAの製造方法。
【請求項４】
3-(2-ヒドロキシ-3-メチル-ブチリルアミノ)-プロピオン酸(HMBPA)が産生されるように、過剰のα-ケトイソ吉草酸及び過剰のβ-アラニンの存在下で増加したケトリダクターゼ活性及び増加したパントテナートシンテターゼ活性を有する微生物を培養することを含む、HMBPAの製造方法。
【請求項５】
前記微生物が改変されたpanE遺伝子を含む、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
前記panE遺伝子を過剰発現させ、脱調節させるか、又は複数コピーで存在させる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記微生物が改変されたpanE1遺伝子を含む、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項８】
前記微生物が改変されたpanE2遺伝子を含む、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項９】
前記微生物が改変されたpanE1遺伝子及び改変されたpanE2遺伝子を含む、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項１０】
前記微生物が改変されたpanC遺伝子を含む、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項１１】
前記panC遺伝子を過剰発現させ、脱調節させるか、又は複数コピーで存在させる、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項１２】
前記微生物が増加したアセトヒドロキシ酸イソメロリダクターゼ活性をさらに有する、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項１３】
3-(2-ヒドロキシ-3-メチル-ブチリルアミノ)-プロピオン酸(HMBPA)が産生されるように、過剰のα-ケトイソ吉草酸及び過剰のβ-アラニンの存在下で増加したアセトヒドロキシ酸イソメロリダクターゼ活性を有する微生物を培養することを含む、HMBPAの製造方法。
【請求項１４】
前記微生物が改変されたilvC遺伝子を含む、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ilvC遺伝子を過剰発現させ、脱調節させるか、又は複数コピーで存在させる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記微生物が低下したケトパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性をさらに有する、請求項３、４又は１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記微生物が改変されたpanB遺伝子を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記微生物がpanB遺伝子を欠失している、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
3-(2-ヒドロキシ-3-メチル-ブチリルアミノ)-プロピオン酸(HMBPA)が産生されるように、過剰のα-ケトイソ吉草酸及び過剰のβ-アラニンの存在下で低下したケトパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を有する微生物を培養することを含む、HMBPAの製造方法。
【請求項２０】
3-(2-ヒドロキシ-3-メチル-ブチリルアミノ)-プロピオン酸(HMBPA)の産生がパントテナートの産生と比較して増強されるような条件下で組換え微生物を培養することを含む、パントテナートと比較してHMBPAの産生を増強する方法。
【請求項２１】
2-ヒドロキシイソ吉草酸(α-HIV)が産生されるような条件下でPanE1又はPanE2を過剰発現し、さらに低下したPanC又はPanD活性を有する微生物を培養することを含む、α-HIVの製造方法。
【請求項２２】
3-(2-ヒドロキシ-3-メチル-ブチリルアミノ)-プロピオン酸(HMBPA)が産生されるような条件下でserAもしくはglyAの発現又は活性が低下した組換え微生物を培養することを含む、HMBPAの製造方法。
【請求項２３】
3-(2-ヒドロキシ-3-メチル-ブチリルアミノ)-プロピオン酸(HMBPA)が産生されるような条件下でserA及びglyAの発現又は活性が低下した組換え微生物を培養することを含む、HMBPAの製造方法。
【請求項２４】
前記微生物を、増加した安定状態のグルコースの条件下で培養する、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記微生物を、低下した安定状態の溶存酸素の条件下で培養する、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記微生物を、低下したセリンの条件下で培養する、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法に従って製造された生成物。
【請求項２８】
リダクターゼ活性の増加をもたらすケトパントエートリダクターゼをコードする少なくとも1個の遺伝子中の改変を有し、ケトパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性の低下をもたらすpanB遺伝子中の突然変異又は欠失を有する、3-(2-ヒドロキシ-3-メチル-ブチリルアミノ)-プロピオン酸(HMBPA)を産生する組換え微生物。
【請求項２９】
ケトパントエートリダクターゼをコードする遺伝子がpanE遺伝子である、請求項２８に記載の組換え微生物。
【請求項３０】
前記panE遺伝子がpanE1遺伝子である、請求項２９に記載の組換え微生物。
【請求項３１】
前記panE遺伝子がpanE2遺伝子である、請求項２９に記載の組換え微生物。
【請求項３２】
前記微生物がpanE1及びpanE2中に改変を有する、請求項２８に記載の組換え微生物。
【請求項３３】
アセトヒドロキシ酸イソメロリダクターゼ活性の増加をもたらすilvC中の改変をさらに有する、請求項２８に記載の組換え微生物。
【請求項３４】
アセトヒドロキシ酸イソメロリダクターゼ活性の増加をもたらすilvC中の改変を有し、ケトパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性の低下をもたらすpanB遺伝子中の突然変異又は欠失を有する、3-(2-ヒドロキシ-3-メチル-ブチリルアミノ)-プロピオン酸(HMBPA)を産生する組換え微生物。
【請求項３５】
前記微生物がバチルス(Bacillus)属に属する、請求項２８〜３４のいずれか１項に記載の組換え微生物。
【請求項３６】
枯草菌(Bacillus subtilis)である、請求項３５に記載の組換え微生物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
化合物を合成する従来の手段は、基質の利用性及び／又はコスト、生成物の複雑な混合物を溶解させる上での難しさ、大量の精製形態の化合物の合成における複雑さ、並びにキラル化合物の製造における難しさなどの因子により制限されるプロセスである、バルク化合物からの合成を介する。従って、研究者たちは近年、例えば、医薬化合物、研究用試薬、栄養補助食品、ビタミン、栄養補給剤、抗生物質などの合成において、種々の生合成プロセスにとって有用な酵素を発現する細菌系又は微生物系に注目してきた。特に、生物転換プロセスは、好ましい化合物の好ましい製造手段として評価されてきており、最近では直接微生物合成の方法が薬学及び農学の領域における多くの研究の焦点になっている。
【発明の開示】
【０００２】
関連出願
本発明は、2001年1月19日に出願された先願の仮出願第60/263,053号(係属中)の利益を請求するものである。本発明はまた、1999年9月21日に出願された米国特許出願第09/400,494号(放棄)の一部継続出願である、2000年9月21日に出願された米国特許第09/667,569号(係属中)に関連する。米国特許出願第09/667,569号も、2000年6月7日に出願された先願の仮出願第60/210,072号、2000年7月28日に出願された仮出願第60/221,836号、及び2000年8月24日に出願された仮出願第60/227,860号の利益を請求するものである。上記の参照出願のそれぞれの全内容は、この参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【０００３】
発明の概要
本発明は、本明細書において「β-アラニン2-(R)-ヒドロキシイソ吉草酸」、「β-アラニン2-ヒドロキシイソ吉草酸」、「β-アラニル-α-ヒドロキシイソ吉草酸」、「N-(2-ヒドロキシ-3-メチル-1-オキソブチル)-β-アラニン(「HMOBA」)及び／又は「ファントテナート」と互換的に呼ばれる、[R]-3-(2-ヒドロキシ-3-メチル-ブチリルアミノ)-プロピオン酸又は3-(2-ヒドロキシ-3-メチル-ブチリルアミノ)-プロピオン酸(「HMBPA」)の直接微生物合成のためのプロセスに関する。特に、通常、パントテナート及び／又はイソロイシン-バリン(ilv)生合成に関連する特定の酵素を過剰発現するように遺伝子操作された微生物において、パントテナート生合成の鍵となる前駆体、すなわちα-ケトイソ吉草酸(α-KIV)及びβ-アラニンと競合する代替的な生合成経路が存在することが発見された。α-KIVは、種々の還元酵素により触媒されてα-ヒドロキシイソ吉草酸(α-HIV)に変換され、α-HIVは続いてβ-アラニンと縮合してHMBPAを生成する。
【０００４】
一実施形態において、本発明は、HMBPAが生成されるように、過剰のα-ケトイソ吉草酸及び過剰のβ-アラニンの存在下で、ケトリダクターゼ活性又はパントテナートシンテターゼ活性が増加した微生物を培養することを含む、3-(2-ヒドロキシ-3-メチル-ブチリルアミノ)-プロピオン酸(HMBPA)の製造方法を特徴とする。別の実施形態において、本発明は、HMBPAが生成されるように、過剰のα-ケトイソ吉草酸及び過剰のβ-アラニンの存在下で、ケトリダクターゼ活性及びパントテナートシンテターゼ活性が増加した微生物を培養することを含む、3-(2-ヒドロキシ-3-メチル-ブチリルアミノ)-プロピオン酸(HMBPA)の製造方法を特徴とする。一実施形態において、前記微生物は改変されたpanE遺伝子、例えば、改変されたpanE1遺伝子及び／又は改変されたpanE2遺伝子(例えば、panE遺伝子を過剰発現させ、脱制御させるか、又はマルチコピーで存在させる)を有する。別の実施形態において、前記微生物は、改変されたpanC遺伝子(例えば、panC遺伝子を過剰発現させ、脱調節させるか、又はマルチコピーで存在させる)を有する。別の実施形態において、前記微生物はさらに、増加したアセトヒドロキシ酸イソメロリダクターゼ活性を有する。別の実施形態において、前記微生物を、HMBPAが生成されるように、過剰のα-ケトイソ吉草酸及び過剰のβ-アラニンの存在下で、アセトヒドロキシ酸イソメロリダクターゼ活性が増加した条件下で培養する。さらに別の実施形態において、前記微生物は、改変されたilvC遺伝子(例えば、ilvC遺伝子を過剰発現させ、脱制御させるか、又はマルチコピーで存在させる)を含む。さらに別の実施形態において、前記微生物はさらに、低下したケトパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を有する(例えば、改変されたpanB遺伝子、例えば、欠失させられたpanB遺伝子を有する)。
【０００５】
別の態様において、本発明は、HMBPAを生成するように、過剰のα-ケトイソ吉草酸及び過剰のβ-アラニンの存在下で、低下したケトパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を有する微生物を培養することを含む、3-(2-ヒドロキシ-3-メチル-ブチリルアミノ)-プロピオン酸(HMBPA)の製造方法を特徴とする。別の態様において、本発明は、HMBPA生成がパントテナート生成と比較して増強されるような条件下で組換え微生物を培養することを含む、パントテナートと比較して3-(2-ヒドロキシ-3-メチル-ブチリルアミノ)-プロピオン酸(HMBPA)の生成を増強する方法を特徴とする。別の態様において、本発明は、α-HIVが生成されるような条件下で、PanE1又はPanE2を過剰発現し、さらに低下したPanC又はPanD活性を有する微生物を培養することを含む、2-ヒドロキシイソ吉草酸(α-HIV)の製造方法を特徴とする。別の態様において、本発明は、HMBPAが生成されるような条件下でserAもしくはglyAの発現又は活性が減少した組換え微生物を培養することを含む、3-(2-ヒドロキシ-3-メチル-ブチリルアミノ)-プロピオン酸(HMBPA)の製造方法を特徴とする。別の態様において、本発明は、HMBPAが生成されるような条件下でserA及びglyAの発現又は活性が減少した組換え微生物を培養することを含む、3-(2-ヒドロキシ-3-メチル-ブチリルアミノ)-プロピオン酸(HMBPA)の製造方法を特徴とする。上記微生物の培養条件としては、例えば、安定状態のグルコースが増加した条件、安定状態の溶存酸素が減少した条件、及び／又はセリンが減少した条件下での培養が挙げられる。上記プロセス及び／又は方法に従って製造された生成物もまた特徴とする。また、上記方法において用いられる組換え微生物も特徴とする。
【０００６】
本発明の方法に従って製造された化合物は種々の利用法を有する。例えば、HMBPAを用いて、HMG CoAリダクターゼ(II)の阻害剤を合成することができる(Gordonら、Bio. Med. Chem. Lett. 1(3):161(1991))。HMG CoAリダクターゼ(II)の阻害剤は、高コレステロール血症及び冠動脈硬化症の進行の治療における使用のために研究されてきた。また、HMG CoAリダクターゼ(II)の阻害剤は、危険に晒された患者における心血管事象の危険性を低下させるのに用いられてきた。さらに、HMBPAの前駆体である2-ヒドロキシイソ吉草酸(α-HIV)は、例えば、皮膚の加齢の予防において栄養補給特性を有することが証明された。特に、α-HIV(又は2-ヒドロキシバリン)などのα-ヒドロキシ酸を用いて、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コラーゲン、エラスチン、及び他の皮膚成分の生合成を増加させることにより、皮膚の厚みの増加を誘導することが見出されたα-ヒドロキシエステルを合成することができる。前記化合物を用いて、加齢による染み、皮膚の線、しわ、光老化及び加齢などの皮膚の障害を治療することができる。
【０００７】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかであろう。
【０００８】
発明の詳細な説明
本発明は、少なくとも部分的には、細菌における新規な生合成経路、すなわち、[R]-3-(2-ヒドロキシ-3-メチル-ブチリルアミノ)-プロピオン酸(「HMBPA」)生合成経路の発見に基づく。特に、細菌は、イソロイシン-バリン(ilv)生合成経路の重要生成物であり、パントテナート生合成経路の前駆体であるα-ケトイソ吉草酸(α-HIV)からHMBPAを生成することができることが発見された。細菌におけるHMBPAの生成は、少なくともパントテナート生合成酵素ケトパントエートリダクターゼ(panE1遺伝子産物)及び／又はアセトヒドロキシ酸イソメロリダクターゼ(ilvC遺伝子産物)を必要とし、α-KIVの還元により形成された2-ヒドロキシイソ吉草酸(α-HIV)と、β-アラニンとの縮合から得られ、後者の反応はパントテナート生合成酵素であるパントテナート合成酵素(panC遺伝子産物)により触媒される。HMBPAの生成は、微生物におけるケトパントエートリダクターゼ(例えば、PanE1)及び／又はPanE2及び／又はアセトヒドロキシ酸イソメロリダクターゼ活性(例えば、IlvC)を、例えば、該酵素をコードする遺伝子を過剰発現又は脱調節させることにより増加させることによって達成される。HMBPAの最適な生成は、例えば、ケトパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ(例えば、PanB)をコードするpanB遺伝子を改変又は欠失させることにより、微生物におけるケトパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性(例えば、PanB遺伝子産物)を減少又は欠失させ、必要に応じて、さらに該微生物におけるケトパントエートリダクターゼ及び／もしくはPanE2及び／もしくはアセトヒドロキシ酸イソメロリダクターゼ活性を増加させることによって達成される。HMBPAの生成には基質であるα-KIV及びβ-アラニンが必要であり、後者は、例えば、β-アラニンの供給及び／又はアスパラギン酸-α-デカルボキシレート活性(panD遺伝子産物)の増加により提供される。基質濃度(すなわち、α-KIV及び／又はβ-アラニン)の増加はさらにHMBPAの生成を増強する。α-KIVの生成を、ilvBNCD遺伝子及び／又はalsSを過剰発現させることにより増加させることができる。さらに、HMBPAの生成を、適当に遺伝子操作された微生物におけるセリンの利用能又は合成を制限することにより増加させることができる。
【０００９】
本発明がより容易に理解されるようにするために、まず特定の用語を本明細書に定義する。
【００１０】
用語「パントテナート生合成経路」は、パントテナートの形成又は合成に用いられるパントテナート生合成酵素(例えば、生合成酵素をコードする遺伝子によりコードされるポリペプチド)、化合物(例えば、前駆体、基質、中間体又は生成物)、コファクターなどを伴う生合成経路を含む。用語「パントテナート生合成経路」は、微生物における(例えば、in vivo)パントテナートの合成をもたらす生合成経路並びにin vitroにおけるパントテナートの合成をもたらす生合成経路を含む。
【００１１】
用語「パントテナート生合成酵素」は、パントテナート生合成経路の化合物(例えば、中間体又は生成物)の形成に用いられる任意の酵素を含む。例えば、α-ケトイソ吉草酸(α-KIV)からのパントエートの合成は、中間体であるケトパントエートを介して進行する。ケトパントエートの形成は、パントテナート生合成酵素であるケトパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（panB遺伝子産物)によって触媒される。パントエートの形成は、パントテナート生合成酵素であるケトパントエートリダクターゼ(panE遺伝子産物)によって触媒される。アスパラギン酸からのβ-アラニンの合成は、パントテナート生合成酵素であるアスパラギン酸-α-デカルボキシラーゼ(panD遺伝子産物)によって触媒される。パントエート及びβ-アラニンからのパントテナートの形成(例えば、縮合)は、パントテナート生合成酵素であるパントテナートシンテターゼ(panC遺伝子産物)によって触媒される。新規に発見されたHMBPA生合成経路に基づくと、パントテナート生合成酵素も、本明細書に記載されるHMBPA生合成経路における酵素としての代替的な機能を有する。
【００１２】
用語「パントテナート」は、「パントテン酸」とも呼ばれる遊離酸形態のパントテナート並びに「パントテン酸塩」とも呼ばれる任意のその塩(例えば、パントテナート又はパントテン酸の酸性水素を、例えば、カルシウム、ナトリウム、カリウム、アンモニウムなどの陽イオンで置換することにより誘導される)を含む。用語「パントテナート」はまた、パントテナートのアルコール誘導体をも含む。好ましいパントテン酸塩は、パントテン酸カルシウム又はパントテン酸ナトリウムである。好ましいアルコール誘導体はパントテノールである。本発明のパントテン酸塩又はアルコールは、本明細書に記載される遊離酸から従来の方法によって調製された塩及び／又はアルコールを含む。別の実施形態においては、本発明の微生物によりパントテン酸カルシウムを直接合成する。同様に、本発明のパントテン酸塩を、従来の方法により遊離酸形態のパントテナート又はパントテン酸に変換することができる。
【００１３】
用語「イソロイシン-バリン生合成経路」は、ピルビン酸のバリン又はイソロイシンへの変換の形成又は合成において用いられるイソロイシン-バリン生合成酵素(例えば、生合成酵素をコードする遺伝子によりコードされるポリペプチド)、化合物(例えば、前駆体、基質、中間体又は生成物)、コファクターなどを含む。用語「イソロイシン-バリン生合成経路」は、微生物(例えば、in vivo)におけるバリン又はイソロイシンの合成をもたらす生合成経路並びにin vitroでバリン又はイソロイシンの合成をもたらす生合成経路を含む。図1は、イソロイシン-バリン生合成経路の模式図を含む。イソロイシン-バリン生合成酵素は太字のイタリック体で描かれており、その対応する遺伝子はイタリック体で示されている。
【００１４】
用語「イソロイシン-バリン生合成酵素」は、イソロイシン-バリン生合成経路の化合物(例えば、中間体又は生成物)の形成において用いられる任意の酵素を含む。図1に従えば、ピルビン酸からのバリンの合成は、中間体であるアセトラクテート、α,β-ジヒドロキシイソ吉草酸(α,β-DHIV)及びα-ケトイソ吉草酸(α-KIV)を介して進行する。ピルビン酸からのアセトラクテートの形成は、イソロイシン-バリン生合成酵素であるアセトヒドロキシ酸シンテターゼ(ilvBN遺伝子産物、又はあるいは、alsS遺伝子産物)によって触媒される。アセトラクテートからのα,β-DHIVの形成は、イソロイシン-バリン生合成酵素であるアセトヒドロキシ酸イソメロリダクターゼ(ilvC遺伝子産物)によって触媒される。α,β-DHIVからのα-KIVの合成は、イソロイシン-バリン生合成酵素であるジヒドロキシ酸デヒドラターゼ(ilvD遺伝子産物)によって触媒される。さらに、分枝鎖アミノ酸トランスアミナーゼにより、バリン及びイソロイシンをそれぞれ対応するα-ケト化合物と相互変換することができる。新規に発見されたHMBPA生合成経路に基づくと、イソロイシン-バリン生合成酵素も、本明細書に記載されるHMBPA生合成経路における酵素としての代替的な機能を有する。
【００１５】
用語「3-(2-ヒドロキシ-3-メチル-ブチリルアミノ)-プロピオン酸(「HMBPA」)生合成経路」は、HMBPAの形成又は合成に用いられるパントテナート生合成経路と伝統的に関連づけられている生合成酵素及び化合物(例えば、基質など)を伴う代替的な生合成経路を含む。用語「HMBPA生合成経路」は、微生物(例えば、in vivo)におけるHMBPAの合成をもたらす生合成経路並びにin vitroでHMBPAの合成をもたらす生合成経路を含む。
【００１６】
用語「HMBPA生合成酵素」は、HMBPA生合成経路の化合物(例えば、中間体又は生成物)の形成に用いられる任意の酵素を含む。例えば、α-ケトイソ吉草酸(α-KIV)からの2-ヒドロキシイソ吉草酸(α-HIV)の合成は、panE1もしくはpanE2遺伝子産物(あるいは、パントテナート生合成には有意に寄与しない、本明細書においてケトパントエートリダクターゼとも呼ばれるPanE1もしくはα-ケト酸リダクターゼとも呼ばれるPanE2)によって触媒され、及び／又はilvC遺伝子産物(あるいは、本明細書においてアセトヒドロキシ酸イソメロリダクターゼとも呼ばれる)によって触媒される。β-アラニン及びα-HIVからのHMBPAの形成は、panC遺伝子産物(あるいは、本明細書においてパントテナートシンテターゼとも呼ばれる)によって触媒される。
【００１７】
用語「3-(2-ヒドロキシ-3-メチル-ブチリルアミノ)-プロピオン酸(「HMBPA」)」は、「3-(2-ヒドロキシ-3-メチル-ブチリルアミノ)-プロピオナート」とも呼ばれる、遊離酸形態のHMBPA、並びに「3-(2-ヒドロキシ-3-メチル-ブチリルアミノ)-プロピオン酸塩」又は「HMBPA塩」とも呼ばれる、任意のその塩(例えば、[R]-3-(2-ヒドロキシ-3-メチル-ブチリルアミノ)-プロピオン酸又は[R]-3-(2-ヒドロキシ-3-メチル-ブチリルアミノ)-プロピオナートの酸性水素を、陽イオン、例えば、カルシウム、ナトリウム、カリウム、アンモニウムで置換することにより誘導される)を含む。好ましいHMBPA塩は、カルシウムHMBPA又はナトリウムHMBPAである。本発明のHMBPA塩は、本明細書に記載される遊離酸から従来の方法により調製された塩を含む。同様に、本発明のHMBPA塩を、従来の方法により遊離酸形態の[R]-3-(2-ヒドロキシ-3-メチル-ブチリルアミノ)-プロピオン酸又は[R]-3-(2-ヒドロキシ-3-メチル-ブチリルアミノ)-プロピオナートに変換することができる。
【００１８】
本発明の種々の態様を以下の小節でさらに詳細に説明する。
【００１９】
I. 種々のパントテナート及び／又はイソロイシン-バリン(ilv)及び／又はHMBPA生合成酵素をコードする遺伝子のターゲッティング
一実施形態において、本発明は、パントテナート生合成経路及び／又はイソロイシン-バリン(ilv)生合成経路及び／又はHMBPA生合成経路の種々の生合成酵素を標的化又は改変することを特徴とする。特に、本発明は、前記生合成酵素をコードする遺伝子を改変又は変化させることにより、前記経路に関連する種々の酵素活性を改変することを特徴とする。
【００２０】
本明細書で用いる用語「遺伝子」は、生物において、遺伝子間DNA(すなわち、該生物の染色体DNA中で天然には遺伝子に隣接し、及び／又は遺伝子を分離する介在又はスペーサーDNA)によって、別の遺伝子又は他の遺伝子から分離されうる核酸分子(例えば、DNA分子又はその断片)を含む。あるいは、遺伝子は別の遺伝子とわずかに重複し(例えば、第1の遺伝子の3'末端が第2の遺伝子の5'末端と重複する)、それらの重複した遺伝子が遺伝子間DNAにより他の遺伝子から分離されていてもよい。遺伝子は酵素又は他のタンパク質分子(例えば、タンパク質をコードする連続的なオープンリーディングフレーム(ORF)などのコード配列を含んでもよい)の合成を指令するか、又は生物においてそれ自身が機能的であってもよい。生物中の遺伝子が、本明細書で定義されるようなオペロン中でクラスター化され、該オペロンは遺伝子間DNAにより他の遺伝子及び／又はオペロンから分離されていてもよい。本明細書で用いられる「単離された遺伝子」は、遺伝子が誘導される生物の染色体DNA中の遺伝子に天然で隣接する本質的には遊離の配列である(すなわち、第2又は別のタンパク質をコードする近接コード配列、近接した構造配列などとは離れて存在する)遺伝子を含み、場合によってはさらに、例えば、プロモーター配列及び／又はターミネーター配列などの5'及び3'調節配列を含む。一実施形態において、単離された遺伝子は、タンパク質を主にコードする配列(例えば、バチルス(Bacillus)タンパク質群をコードする配列)を含む。別の実施形態において、単離された遺伝子は、タンパク質のコード配列(例えば、バチルス(Bacillus)タンパク質)並びに該遺伝子が由来する生物の染色体DNAから得られる5'及び／又は3'近接調節配列(例えば、5'及び／又は3'近接バチルス(Bacillus)調節配列)を含む。好ましくは、単離された遺伝子は、該遺伝子が由来する生物の染色体DNA中の該遺伝子に天然で隣接する、約10 kb、5 kb、2 kb、1 kb、0.5 kb、0.2 kb、0.1 kb、50 bp、25 bp又は10 bp未満のヌクレオチド配列を含む。
【００２１】
用語「オペロン」は、少なくとも1個の遺伝子又はORFの5'もしくは3'末端のいずれかで配列が重なっていてもよい少なくとも2個の近接する遺伝子又はORFを含む。用語「オペロン」は、1個以上の近接する遺伝子又はORF(例えば、酵素(例えば、生合成酵素)をコードする構造遺伝子)と結合したプロモーター及びおそらくは調節エレメントを含む遺伝子発現の協調単位を含む。遺伝子(例えば、構造遺伝子)の発現を、例えば、調節タンパク質を調節エレメントに結合させること又は転写を終結させないことにより、協調的に調節することができる。オペロンの遺伝子(例えば、構造遺伝子)を転写させて、タンパク質の全部をコードする単一のmRNAを得ることができる。
【００２２】
本明細書で用いる「突然変異を有する遺伝子」又は「突然変異遺伝子」は、突然変異体によりコードされるポリペプチド又はタンパク質が野生型の核酸分子又は遺伝子によりコードされるポリペプチド又はタンパク質とは異なる活性を示すような、少なくとも1個の変化(例えば、置換、挿入、欠失)を含むヌクレオチド配列を有する遺伝子を含む。一実施形態において、突然変異を有する遺伝子又は突然変異遺伝子は、例えば、同様の条件下でアッセイした場合(例えば、同じ温度で培養した微生物中でアッセイした場合)、野生型遺伝子によりコードされるポリペプチド又はタンパク質と比較して増加した活性を有するポリペプチド又はタンパク質をコードする。本明細書で用いる、「増加した活性」又は「増加した酵素活性」は、野生型の核酸分子又は遺伝子によりコードされるポリペプチド又はタンパク質の活性より少なくとも5％高い活性であり、好ましくは野生型の核酸分子又は遺伝子によりコードされるポリペプチド又はタンパク質の活性より少なくとも5〜10％高い、より好ましくは少なくとも10〜25％高い、さらにより好ましくは少なくとも25〜50％高い、50〜75％高い、又は75〜100％高い活性である。上記で限定された値の中間である範囲、例えば、75〜85％、85〜90％、90〜95％も、本発明に包含されることが意図される。本明細書で用いる「増加した活性」又は「増加した酵素活性」はまた、野生型遺伝子によりコードされるポリペプチド又はタンパク質の活性よりも少なくとも1.25倍高い活性、好ましくは、1.5倍高い活性、より好ましくは少なくとも2倍高い活性、さらにより好ましくは、野生型遺伝子によりコードされるポリペプチド又はタンパク質の活性よりも少なくとも3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍以上高い活性をも含む。
【００２３】
別の実施形態において、突然変異を有する遺伝子又は突然変異遺伝子は、例えば、同様の条件下でアッセイした場合(例えば、同じ温度で培養した微生物中でアッセイした場合)、野生型遺伝子によりコードされるポリペプチド又はタンパク質と比較して低下した活性を有するポリペプチド又はタンパク質をコードする。突然変異遺伝子はまた、ポリペプチドをコードしないか、又は野生型ポリペプチドの産生レベルが低下したものでもよい。本明細書で用いる、「低下した活性」又は「低下した酵素活性」は、野生型の核酸分子又は遺伝子によりコードされるポリペプチド又はタンパク質の活性より少なくとも5％低い活性であり、好ましくは野生型の核酸分子又は遺伝子によりコードされるポリペプチド又はタンパク質の活性より少なくとも5〜10％低い、より好ましくは少なくとも10〜25％低い、さらにより好ましくは少なくとも25〜50％低い、50〜75％低い、又は75〜100％低い活性である。上記で限定された値の中間である範囲、例えば、75〜85％、85〜90％、90〜95％も、本発明に包含されることが意図される。本明細書で用いる「低下した活性」又は「低下した酵素活性」はまた、欠失又は「ノックアウト」された活性(例えば、野生型の核酸分子又は遺伝子によりコードされるポリペプチド又はタンパク質の活性より約100％低い)をも含む。
【００２４】
特定の目的のタンパク質の活性を測定するための任意のよく認知されたアッセイに従って、活性を測定することができる。活性を直接的に測定又はアッセイすること、例えば、細胞又は微生物から単離又は精製されたタンパク質の活性を測定することができる。あるいは、細胞もしくは微生物内、又は細胞外培地中で活性を測定又はアッセイすることができる。例えば、突然変異遺伝子(すなわち、低下した酵素活性をコードする突然変異体)についてのアッセイを、微生物、例えば、該酵素が温度感受性である突然変異微生物中で該突然変異遺伝子を発現させ、該突然変異遺伝子を、酵素活性に関して温度感受性(Ts)突然変異を相補する能力についてアッセイすることにより達成することができる。「増加した酵素活性」をコードする突然変異遺伝子は、例えば、対応する野生型遺伝子よりも効率的にTs突然変異体を相補するものであってよい。「低下した酵素活性」をコードする突然変異遺伝子は、例えば、対応する野生型遺伝子よりも非効率的にTs突然変異体を相補するものである。
【００２５】
核酸又は遺伝子配列におけるただ1個の置換(例えば、対応するアミノ酸配列中でのアミノ酸の変化をコードする塩基置換)でさえ、対応する野生型のポリペプチド又はタンパク質と比較して、コードされるポリペプチド又はタンパク質の活性に劇的に影響し得ることは当業者には明らかであろう。本明細書で定義されるような突然変異遺伝子(例えば、突然変異体ポリペプチドもしくはタンパク質をコードする)は、突然変異遺伝子が変化した活性を有するタンパク質もしくはポリペプチドをコードするタンパク質相同体をコードしている核酸もしくは遺伝子と容易に識別でき、場合によっては、野生型遺伝子を発現する対応する微生物と比較して、前記突然変異遺伝子を発現するか又は前記突然変異体タンパク質もしくはポリペプチドを産生する微生物(すなわち、突然変異微生物)における、異なるかもしくは別の表現型として観察可能である。一方、タンパク質相同体は、野生型遺伝子を発現する対応する微生物と比較して、同一又は実質的に類似した活性を有し、場合によっては、微生物中で産生される場合には表現型的に識別できないこともある。従って、相同体と突然変異体とを識別するのに役立つのは、例えば、核酸分子、遺伝子、タンパク質又はポリペプチド間の配列同一性の程度ではなく、むしろ、相同体と突然変異体とを識別するコードされるタンパク質又はポリペプチドの活性である。すなわち相同体は、例えば、低い配列同一性(例えば、30〜50％の配列同一性)を有するが、実質的に等価な機能的活性を有し、突然変異体は、例えば、99％の配列同一性を有するが、劇的に異なるか又は変化した機能的活性を有する。
【００２６】
本発明で使用するための核酸分子、遺伝子、タンパク質又はポリペプチドを、HMBPA生合成経路、ilv生合成経路又はパントテナート生合成経路を有する任意の微生物から得られることも、当業者には明らかであろう。当業者であれば、そのような核酸分子、遺伝子、タンパク質もしくはポリペプチドを、相同性スクリーニング、配列比較などの公知の技術を用いて同定し、これらの核酸分子、遺伝子、タンパク質もしくはポリペプチドの発現又は産生が組換え微生物中で起こるような方法で(例えば、本明細書に記載され、当業者にも公知の技術に従って、適当なプロモーター、リボソーム結合部位、発現もしくは組込みベクターを用いることにより、あるいは転写が増加するように遺伝子の配列を改変する(優先コドン使用を考慮する)ことなどにより)改変することができる。
【００２７】
一実施形態においては、本発明の遺伝子は、グラム陽性の微生物(例えば、微生物を取り囲むグラム陽性壁の存在により、塩基性染料、例えば、クリスタルバイオレットを保持する微生物)に由来する。用語「に由来する」(例えば、グラム陽性微生物「に由来する」は、微生物中に天然で見出される(例えば、グラム陽性微生物中で天然に見出される)遺伝子を指す。好ましい実施形態において、本発明の遺伝子は、バチルス(Bacillus)、コリネバクテリウム(Cornyebacterium)(例えば、コリネバクテリウム・グルタミクム(Cornyebacterium glutamicum))、ラクトバチルス(Lactobacillus)、ラクトコッカス(Lactococci)及びストレプトミセス(Streptomyces)からなる群より選択される属に属する微生物に由来する。より好ましい実施形態においては、本発明の遺伝子は、バチルス(Bacillus)属の微生物に由来する。別の好ましい実施形態においては、本発明の遺伝子は、枯草菌(Bacillus subtilis)、バチルス・レンチモルブス(Bacillus lentimorbus)、バチルス・レンタス(Bacillus lentus)、バチルス・フィルムス(Bacillus firmus)、バチルス・パントテンチクス(Bacillus pantothenticus)、バチルス・アミロリクエファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)、バチルス・サーキュランス(Bacillus circulans)、バチルス・コアグランス(Bacillus coagulans)、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、バチルス・プミルス(Bacillus pumilus)、バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)、バチルス・ハロズランス(Bacillus halodurans)、及び例えば、16S rRNA型を特徴とする1群バチルス(Bacillus)種からなる群より選択される微生物に由来する。別の好ましい実施形態において、前記遺伝子はバチルス・ブレビス(Bacillus brevis)又はバチルス・ステアロテルモフィルス(Bacillus stearothermophilus)に由来する。別の好ましい実施形態において、本発明の遺伝子は、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バチルス・アミロリクエファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、枯草菌(Bacillus subtilis)、及びバチルス・プミルス(Bacillus pumilus)からなる群より選択される微生物に由来する。特に好ましい実施形態において、前記遺伝子は、枯草菌(Bacillus subtilis)に由来する(例えば、枯草菌(B. subtilis)由来遺伝子である)。用語「枯草菌(Bacillus subtilis)に由来する」又は「枯草菌(Bacillus subtilis)由来」は、微生物枯草菌(Bacillus subtilis)に天然で見出される遺伝子を含む。本発明の範囲に含まれるのは、例えば、バチルス(Bacillus)もしくは枯草菌(B. subtilis)のcoaX遺伝子、serA遺伝子、glyA遺伝子、coaA遺伝子、pan遺伝子及び／又はilv遺伝子などのバチルス(Bacillus)由来遺伝子(例えば、枯草菌(B. subtilis)由来遺伝子)である。
【００２８】
別の実施形態において、本発明の遺伝子は、グラム陰性(塩基性染料を排出する)微生物に由来する。好ましい実施形態において、本発明の遺伝子は、サルモネラ(Salmonella)(例えば、ネスミチフス菌(Salmonella typhimurium))、エシェリキア(Escherichia)、クレブシエラ(Klebsiella)、セラチア(Serratia)、及びプロテウス(Proteus)からなる群より選択される属に属する微生物に由来する。より好ましい実施形態においては、本発明の遺伝子は、エシェリキア(Escherichia)属の微生物に由来する。さらにより好ましい実施形態においては、本発明の遺伝子は大腸菌(Escherichia coli)に由来する。別の実施形態においては、本発明の遺伝子は、サッカロミセス(Saccharomyces)(例えば、酵母菌(Saccharomyces cerevisiae))に由来する。
【００２９】
II. 組換え核酸分子及びベクター
本発明はさらに、本明細書に記載された遺伝子(例えば、単離された遺伝子)、好ましくはバチルス(Bacillus)遺伝子、より好ましくは枯草菌(Bacillus subtilis)遺伝子、さらにより好ましくは枯草菌(Bacillus subtilis)のパントテナート生合成遺伝子及び／又はイソロイシン-バリン(ilv)生合成遺伝子及び／又はHMBPA生合成遺伝子を含む組換え核酸分子(例えば、組換えDNA分子)を特徴とする。用語「組換え核酸分子」は、組換え核酸分子が由来する元々の又は天然の核酸分子とヌクレオチド配列において異なるような変更、改変又は操作された(例えば、1個以上のヌクレオチドの付加、欠失又は置換により)核酸分子(例えば、DNA分子)を含む。好ましくは、組換え核酸分子(例えば、組換えDNA分子)は、調節配列に機能し得る形で連結された本発明の単離された遺伝子を含む。用語「調節配列に機能し得る形で連結された」は、目的の遺伝子のヌクレオチド配列を、遺伝子の発現(例えば、増強した、増加した、構成的な、基底的な、減少した、低下した又は抑制された発現)、好ましくは、該遺伝子によりコードされる遺伝子産物の発現(例えば、組換え核酸分子を、本明細書に定義される組換えベクターに含ませる場合、及び微生物中に導入する場合)を可能にする様式で調節配列に連結することを意味する。
【００３０】
用語「調節配列」は、他の核酸配列(すなわち、遺伝子)の発現に影響を与える(例えば、モジュレート又は調節する)核酸配列を含む。一実施形態においては、調節配列を、特定の目的の遺伝子に対して、目的の調節配列及び遺伝子について、例えば、天然の位置及び／又は向きで天然に出現するときに観察されるのと類似したもしくは同一の位置及び／又は向きで組換え核酸分子中に含ませる。例えば、目的の遺伝子を、天然の生物中で目的の遺伝子に付随するか、又は近接する調節配列に機能し得る形で連結された(例えば、「天然の」調節配列に(例えば、「天然の」プロモーターに)機能し得る形で連結された)組換え核酸分子中に含ませることができる。あるいは、目的の遺伝子を、天然の生物中で別の(例えば、異なる)遺伝子に付随するか、又は近接する調節配列に機能し得る形で連結された組換え核酸分子中に含ませることができる。あるいは、目的の遺伝子を、別の生物に由来する調節配列に機能し得る形で連結された組換え核酸分子中に含ませることができる。例えば、他の微生物に由来する調節配列(例えば、他の細菌の調節配列、バクテリオファージの調節配列など)を、特定の目的遺伝子に機能し得る形で連結することができる。
【００３１】
一実施形態において、調節配列は非天然の配列(例えば、化学的に合成された配列を含む、改変、突然変異、置換、誘導体化、欠失された配列)である。好ましい調節配列としては、プロモーター、エンハンサー、終結シグナル、終結抑制シグナル及び他の発現制御エレメント(例えば、転写されたmRNA中の、リプレッサー又はインデューサーが結合する配列並びに／又は転写及び／もしくは翻訳調節タンパク質などの結合部位)が挙げられる。そのような調節配列は、例えば、Sambrook, J., Fritsh, E.F.及びManiatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual.第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載されている。調節配列としては、微生物中でヌクレオチド配列の構成的発現を指令するもの(例えば、構成的プロモーター及び強力な構成的プロモーター)、微生物中でヌクレオチド配列の誘導的発現を指令するもの(例えば、キシロース誘導性プロモーターなどの誘導性プロモーター)並びに微生物中でヌクレオチド配列の発現を減衰させるか、又は抑制するもの(例えば、アテニュエーションシグナル又はリプレッサー配列)が挙げられる。また、調節配列を除去又は欠失させることにより、目的の遺伝子の発現を調節することも本発明の範囲に含まれる。例えば、目的の遺伝子の発現が増強されるように、転写の負の調節に関与する配列を除去することができる。
【００３２】
一実施形態において、本発明の組換え核酸分子は、プロモーターもしくはプロモーター配列に機能し得る形で連結された少なくとも1個の細菌遺伝子産物(例えば、パントテナート生合成酵素、イソロイシン-バリン生合成酵素及び／もしくはHMBPA生合成酵素)をコードする核酸配列又は遺伝子を含む。本発明の好ましいプロモーターとしては、バチルス(Bacillus)プロモーター及び／又はバクテリオファージプロモーター(例えば、バチルス(Bacillus)に感染するバクテリオファージ)が挙げられる。一実施形態においては、プロモーターはバチルス(Bacillus)プロモーターであり、好ましくは強力なバチルス(Bacillus)プロモーター(例えば、バチルス(Bacillus)中の生化学的ハウスキーピング遺伝子に関連するプロモーター又はバチルス(Bacillus)中の解糖経路遺伝子に関連するプロモーター)である。別の実施形態においては、プロモーターはバクテリオファージプロモーターである。好ましい実施形態においては、前記プロモーターはバクテリオファージSP01に由来するものである。特に好ましい実施形態においては、プロモーターは、例えば、それぞれ以下の配列を有するP15、P26又はPvegからなる群より選択される：
GCTATTGACGACAGCTATGGTTCACTGTCCACCAACCAAAACTGTGCTCAGTACCGCCAATATTTCTCCCTTGAGGGGTACAAAGAGGTGTCCCTAGAAGAGATCCACGCTGTGTAAAAATTTTACAAAAAGGTATTGACTTTCCCTACAGGGTGTGTAATAATTTAATTACAGGCGGGGGCAACCCCGCCTGT(配列番号１)、
GCCTACCTAGCTTCCAAGAAAGATATCCTAACAGCACAAGAGCGGAAAGATGTTTTGTTCTACATCCAGAACAACCTCTGCTAAAATTCCTGAAAAATTTTGCAAAAAGTTGTTGACTTTATCTACAAGGTGTGGTATAATAATCTTAACAACAGCAGGACGC (配列番号２)、及び
GAGGAATCATAGAATTTTGTCAAAATAATTTTATTGACAACGTCTTATTAACGTTGATATAATTTAAATTTTATTTGACAAAAATGGGCTCGTGTTGTACAATAAATGTAGTGAGGTGGATGCAATG (配列番号３)。さらなる好ましいプロモーターとしては、バチルス(Bacillus)(例えば、枯草菌(Bacillus subtilis))中での高レベルの発現を促進するtef(翻訳延長因子(TEF)プロモーター)及びpyc(ピルビン酸カルボキシラーゼ(PYC)プロモーター)が挙げられる。例えば、グラム陽性微生物における使用のためのさらなる好ましいプロモーターとしては、限定されるものではないが、amy及びSPO2プロモーターが挙げられる。例えば、グラム陰性微生物における使用のためのさらなる好ましいプロモーターとしては、限定されるものではないが、cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIQ、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、λ-PR又はλ-PLが挙げられる。
【００３３】
別の実施形態において、本発明の組換え核酸分子は、ターミネーター配列(例えば、転写終結配列)を含む。用語「ターミネーター配列」は、mRNAの転写を終結させるのに役立つ調節配列を含む。ターミネーター配列(又はタンデム転写ターミネーター)はさらに、例えば、ヌクレアーゼに対して、mRNAを安定化させるのに役立つ(例えば、mRNAに構造物を付加することにより)。
【００３４】
さらに別の実施形態において、本発明の組換え核酸分子は、前記配列を含むベクターの検出を可能にする配列(すなわち、検出マーカー及び／又は選択マーカー)、例えば、抗生物質耐性をコードする遺伝子又は栄養要求性突然変異を克服する配列、例えば、trpC、蛍光マーカー、薬剤マーカー、及び／又は比色マーカー(例えば、lacZ/β-ガラクトシダーゼ)を含む。さらに別の実施形態において、本発明の組換え核酸分子は、人工リボソーム結合部位(RBS)又は人工RBS中で転写されるようになる配列を含む。用語「人工リボソーム結合部位(RBS)」は、少なくとも1個のヌクレオチドが天然のRBS(例えば、天然の遺伝子中に見出されるRBS)と異なる、リボソームが(例えば、翻訳を開始するために)結合するmRNA分子(例えば、DNA内にコードされる)内の部位を含む。好ましい人工RBSは、約5〜6、7〜8、9〜10、11〜12、13〜14、15〜16、17〜18、19〜20、21〜22、23〜24、25〜26、27〜28、29〜30個以上のヌクレオチドであって、天然のRBS(例えば、目的の遺伝子の天然RBS、例えば、天然panB RBS TAAACATGAGGAGGAGAAAACATG (配列番号４)又は天然panD RBS ATTCGAGAAATGGAGAGAATATAATATG (配列番号５))とは約1〜2、3〜4、5〜6、7〜8、9〜10、11〜12、13〜15個以上異なるヌクレオチド、を含む。
【００３５】
好ましくは、異なるヌクレオチドは、比較のために最適にアラインメントした場合、それらが理想的なRBSの1個以上のヌクレオチドと同一となるように置換される。理想的なRBSとしては、限定されるものではないが、AGAAAGGAGGTGA (配列番号６)、TTAAGAAAGGAGGTGANNNNATG (配列番号７)、TTAGAAAGGAGGTGANNNNNATG (配列番号８)、AGAAAGGAGGTGANNNNNNNATG (配列番号９)、及びAGAAAGGAGGTGANNNNNNATG (配列番号１０)が挙げられる。人工RBSを用いて、特定の遺伝子に連結した天然のRBSを置換することができる。人工RBSは、特定の遺伝子の翻訳を増加させるのが好ましい。好ましい人工RBS(例えば、枯草菌(B. subtilis)のpanBなどのpanBの翻訳を増加させるためのRBS)としては、CCCTCTAGAAGGAGGAGAAAACATG (配列番号１１)及びCCCTCTAGAGGAGGAGAAAACATG (配列番号１２)が挙げられる。好ましい人工RBS(例えば、枯草菌(B. subtilis)のpanDなどのpanDの翻訳を増加させるためのRBS)としては、TTAGAAAGGAGGATTTAAATATG (配列番号１３)、TTAGAAAGGAGGTTTAATTAATG (配列番号１４)、TTAGAAAGGAGGTGATTTAAATG (配列番号１５)、TTAGAAAGGAGGTGTTTAAAATG (配列番号１６)、ATTCGAGAAAGGAGG TGAATATAATATG (配列番号１７)、ATTCGAGAAAGGAGGTGAATAATAATG (配列番号１８)及びATTCGTAGAAAGGAGGTGAATTAATATG (配列番号１９)が挙げられる。
【００３６】
本発明はさらに、本明細書に記載される核酸分子(例えば、遺伝子又は該遺伝子を含む組換え核酸分子)を含むベクター(例えば、組換えベクター)を特徴とする。用語「組換えベクター」は、該組換えベクターが由来する天然の核酸分子に含まれる核酸配列よりも多い、少ない、又は異なる核酸配列を含むように、変化、改変又は操作されたベクター(例えば、プラスミド、ファージ、ファージミド、ウイルス、コスミド又は他の精製された核酸ベクター)を含む。好ましくは、前記組換えベクターは、例えば、本明細書に定義されるような、プロモーター配列、ターミネーター配列及び／もしくは人工リボソーム結合部位(RBS)などの調節配列に機能し得る形で連結された、生合成酵素をコードする遺伝子又は該遺伝子を含む組換え核酸分子を含む。別の実施形態において、本発明の組換えベクターは、細菌における複製を増強する配列(例えば、複製増強配列)を含む。一実施形態において、複製増強配列は、大腸菌に由来するものである。別の実施形態において、複製増強配列はpBR322に由来するものである。
【００３７】
さらに別の実施形態において、本発明の組換えベクターは抗生物質耐性配列を含む。用語「抗生物質耐性配列」は、宿主生物(例えば、バチルス(Bacillus))に対して抗生物質に対する耐性を促進又は付与する配列を含む。一実施形態において、抗生物質耐性配列は、cat(クロラムフェニコール耐性)配列、tet(テトラサイクリン耐性)配列、erm(エリスロマイシン耐性)配列、neo(ネオマイシン耐性)配列、kan(カナマイシン耐性)配列及びspec(スペクチノマイシン耐性)配列からなる群より選択される。本発明の組換えベクターはさらに、相同組換え配列(例えば、宿主生物の染色体への目的の遺伝子の組換えを可能にするように設計された配列)を含む。例えば、宿主染色体への組換えのための相同的標的として、bpr、vpr、及び／又はamyE配列を用いることができる。さらに、ベクターの設計は遺伝子操作する微生物の選択、望まれる遺伝子産物の発現レベルなどの因子に依存して調節することができることは当業者には理解できるであろう。
【００３８】
IV. 組換え微生物
本発明はさらに、本明細書に記載されたベクター又は遺伝子(例えば、野生型及び／又は突然変異遺伝子)を含む微生物、すなわち、組換え微生物を特徴とする。本明細書で用いる用語「組換え微生物」は、それが由来する天然の微生物と比較して、変化、改変された、もしくは異なる遺伝子型及び／又は表現型(例えば、遺伝子の改変が該微生物のコード核酸配列に影響する場合)を示すように、遺伝的に変化、改変又は操作された(例えば、遺伝子操作された)微生物(例えば、細菌、酵母細胞、菌類細胞など)を含む。
【００３９】
一実施形態において、本発明の組換え微生物はグラム陽性生物(例えば、微生物を取り囲むグラム陽性の壁の存在により、塩基性染料、例えば、クリスタルバイオレットを保持する該微生物)である。好ましい実施形態において、前記組換え微生物はバチルス(Bacillus)、コリネバクテリウム(Cornyebacterium)、ラクトバチルス(Lactobacillus)、ラクトコッカス(Lactococci)及びストレプトミセス(Streptomyces)からなる群より選択される属に属する微生物である。より好ましい実施形態において、前記組換え微生物はバチルス(Bacillus)属のものである。別の好ましい実施形態において、前記組換え微生物は枯草菌(Bacillus subtilis)、バチルス・レンチモルブス(Bacillus lentimorbus)、バチルス・レンタス(Bacillus lentus)、バチルス・フィルムス(Bacillus firmus)、バチルス・パントテンチクス(Bacillus pantothenticus)、バチルス・アミロリクエファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)、バチルス・サーキュランス(Bacillus circulans)、バチルス・コアグランス(Bacillus coagulans)、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、バチルス・プミルス(Bacillus pumilus)、バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)、バチルス・ハロズランス(Bacillus halodurans)、及び他の1群バチルス(Bacillus)種、例えば、16S rRNA型を特徴とするもの、からなる群より選択される。別の好ましい実施形態において、前記組換え微生物はバチルス・ブレビス(Bacillus brevis)又はバチルス・ステアロテルモフィルス(Bacillus stearothermophilus)である。別の好ましい実施形態において、前記組換え微生物はバチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バチルス・アミロリクエファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、枯草菌(Bacillus subtilis)及びバチルス・プミルス(Bacillus pumilus)からなる群より選択される。
【００４０】
別の実施形態において、前記組換え微生物はグラム陰性(塩基性染料を排出する)生物である。好ましい実施形態において、前記組換え微生物は、サルモネラ(Salmonella)、エシェリキア(Escherichia)、クレブシエラ(Klebsiella)、セラチア(Serratia)及びプロテウス(Proteus)からなる群より選択される属に属する微生物である。より好ましい実施形態において、前記組換え微生物はエシェリキア(Escherichia)属のものである。さらにより好ましい実施形態において、前記組換え微生物は大腸菌(Escherichia coli)である。別の実施形態において、前記組換え微生物は、サッカロミセス(Saccharomyces)(例えば、酵母菌(S. cerevisiae))である。
【００４１】
本発明の好ましい「組換え」微生物は、脱調節されたパントテナート生合成経路もしくは酵素、脱調節されたイソロイシン-バリン(ilv)生合成経路もしくは酵素、及び／又は脱調節されたHMBPA生合成経路もしくは酵素を有する微生物である。用語「脱調節された」又は「脱調節」は、微生物中の生合成酵素のレベルもしくは活性が変更又は改変されるような、微生物における生合成経路中の酵素をコードする少なくとも1個の遺伝子の変更又は改変を含む。好ましくは、生合成経路中の酵素をコードする少なくとも1個の遺伝子を、その遺伝子産物が増強又は増加するように変更又は改変する。用語「脱調節された経路」はまた、生合成経路中の酵素をコードする2個以上の遺伝子が、2個以上の生合成酵素のレベルもしくは活性が変更又は改変されるように変更又は改変された生合成経路をも含んでもよい。微生物において経路を「脱調節する」(例えば、所与の生合成経路において2個以上の遺伝子を同時に脱調節する)能力は、2個以上の酵素(例えば、2又は3個の生合成酵素)が、「オペロン」(本明細書に定義されている)と呼ばれる遺伝物質の連続断片上で互いに近接して出現する遺伝子によってコードされている微生物に特有の現象から生じることがある。オペロンに含まれる遺伝子の協調的な調節のせいで、単一のプロモーター及び／もしくは調節エレメントの変更又は改変が該オペロンによりコードされる各遺伝子産物の発現の変化又は改変をもたらし得る。調節エレメントの変更又は改変としては、限定されるものではないが、内因性プロモーター及び／もしくは調節エレメントの除去、強力なプロモーター、誘導性プロモーターもしくは多重プロモーターの付加又は遺伝子産物の発現が改変されるような調節配列の除去、オペロンの染色体での位置の改変、リボソーム結合部位などのオペロンに近接するかもしくはオペロン内にある核酸配列の変更、オペロンのコピー数の増加、オペロンの転写及び／もしくはオペロンの遺伝子産物の翻訳に関与するタンパク質(例えば、調節タンパク質、サプレッサー、エンハンサー、転写活性化因子など)の改変、又は当業界で日常的な遺伝子発現を脱調節する任意の他の従来手段(限定されるものではないが、例えば、リプレッサータンパク質の発現を阻止するためのアンチセンス核酸分子の使用など)が挙げられる。脱調節はまた、例えば、フィードバック耐性であるか、又はより高いもしくはより低い比活性を有する酵素を得るための1個以上の遺伝子のコード領域の変更をも伴ってもよい。
【００４２】
別の好ましい実施形態においては、少なくとも1個のパントテナート生合成酵素、少なくとも1個のイソロイシン-バリン生合成酵素、及び／もしくは少なくとも1個のHMBPA生合成酵素を過剰発現するように、組換え微生物を設計又は遺伝子操作する。用語「過剰発現された」又は「過剰発現」は、微生物の操作前に発現されたもの又は操作されていない同等の微生物において発現されたものよりも高いレベルでの遺伝子産物(例えば、生合成酵素)の発現を含む。一実施形態において、遺伝子操作されていない同等の微生物において発現されるものよりも高いレベルの遺伝子産物を過剰発現するように、前記微生物を設計又は遺伝子操作することができる。
【００４３】
遺伝子操作としては、限定されるものではないが、特定の遺伝子の発現に関連する調節配列もしくは部位の変更又は改変(例えば、強力なプロモーター、誘導性プロモーターもしくは多重プロモーターの付加、又は発現が構成的であるような調節配列の除去による)、特定の遺伝子の染色体での位置の改変、リボソーム結合部位などの特定の遺伝子に近接する核酸配列の変更、特定の遺伝子のコピー数の増加、特定の遺伝子の転写及び／もしくは特定の遺伝子産物の翻訳に関与するタンパク質(例えば、調節タンパク質、サプレッサー、エンハンサー、転写活性化因子など)の改変、又は当業界で日常的な特定の遺伝子の発現を脱調節する任意の他の従来手段(限定されるものではないが、例えば、リプレッサータンパク質の発現を阻止するためのアンチセンス核酸分子の使用など)が挙げられる。遺伝子操作はまた、例えば、経路を遮断するか、又はリプレッサーを除去するための遺伝子の欠失をも含む。微生物が欠失された遺伝子を有することを特徴とする実施形態においては、当業者であれば、微生物の生存性が危うくならないようにするために、培地中に存在させるか、又は培地に添加する必要がある少なくとも低レベルの特定の化合物を理解できるであろう。しばしば、そのような低レベルのものは、日常的に配合される複合培地中に存在する。さらに、商業的もしくは工業的に魅力のある量の生成物を産生するような条件下で培養された欠失遺伝子を有する微生物を培養することを特徴とするプロセスにおいては、特定の化合物をわずかに増加したレベルで培地に補充する必要がある。例えば、欠失されたpanB遺伝子を有する微生物を培養することを特徴とするプロセスにおいては、少なくとも低レベル、例えば、日常的に配合される複合培地中に見出されるレベルのパントテナートを培地中に存在させる必要があるが、一方、商業的もしくは工業的に魅力のある量の、例えば、HMBPAを製造するためには、わずかに増加したレベルのパントテナートを培地に添加すればよい。例えば、商業的もしくは工業的に魅力のある量のHMBPAを製造するために、10〜30 mg/Lのパントテナートを培地に添加することができる。
【００４４】
別の実施形態において、微生物の操作前に発現されるか、又は操作されていない同等の微生物において発現されるものよりも高いレベルの遺伝子産物を過剰発現させるように、前記微生物を物理的又は環境的に操作することができる。例えば、微生物を、特定の遺伝子の転写及び／又は特定の遺伝子産物の翻訳を増加させることが知られているかもしくは考えられる薬剤で処理するか、又はその存在下で培養して、その転写及び／又は翻訳を増強又は増加させることができる。あるいは、特定の遺伝子の転写及び／又は特定の遺伝子産物の翻訳を増加させるように選択された温度で、微生物を培養して、その転写及び／又は翻訳を増強又は増加させることができる。
【００４５】
V. 組換え微生物の培養及び発酵
用語「培養」は、本発明の生きた微生物を維持及び／又は増殖させること(例えば、培養物もしくは株を維持及び／又は増殖させること)を含む。一実施形態においては、本発明の微生物を液体培地中で培養する。別の実施形態においては、本発明の微生物を固形培地又は半固形培地中で培養する。好ましい実施形態においては、本発明の微生物を、該微生物の維持及び／もしくは増殖にとって必須又は有益である栄養素(例えば、炭水化物、炭化水素、油、脂肪、脂肪酸、有機酸及びアルコールなどの炭素源又は炭素基質；ペプトン、酵母抽出物、肉抽出物、モルト抽出物、尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム及びリン酸アンモニウムなどの窒素源；リン酸、そのナトリウム塩及びカリウム塩などのリン源、マグネシウム、鉄、マンガン、カルシウム、銅、亜鉛、ホウ素、モリブデン、及び／又はコバルト塩などの微量元素；並びにアミノ酸、ビタミン、増殖促進剤などの増殖因子)を含む培地(例えば、滅菌した液体培地)中で培養する。
【００４６】
好ましくは、本発明の微生物を、制御されたpH下で培養する。用語「制御されたpH」は、所望の生成物(例えば、HMBPA)の産生をもたらす任意のpHを含む。一実施形態においては、微生物を約7のpH値で培養する。別の実施形態においては、微生物を6.0〜8.5のpH値で培養する。所望のpHを、当業者には公知のいくつかの方法により維持することができる。
【００４７】
また好ましくは、本発明の微生物を制御された通気下で培養する。用語「制御された通気」は、所望の生成物(例えば、HMBPA)の産生をもたらすのに十分な通気(例えば、酸素)を含む。一実施形態においては、例えば、培地中に溶解した酸素の量を調節することにより、培養物中の酸素レベルを調節することにより通気を制御する。好ましくは、培養物の通気を、培養物を攪拌することにより制御する。プロペラもしくは同様の機械的な攪拌装置により、培養容器(例えば、チューブもしくはフラスコ)を回転もしくは振とうすることにより、又は種々のポンプ装置により、攪拌を提供することができる。滅菌した空気又は酸素を培地に通過させること(例えば、発酵混合物に通過させること)により、通気をさらに制御することができる。また好ましくは、本発明の微生物を、過剰に泡立たせることなく(例えば、消泡剤の添加により)培養する。
【００４８】
さらに、本発明の微生物を制御された温度下で培養することができる。用語「制御された温度」は、所望の生成物(例えば、HMBPA)の産生をもたらす任意の温度を含む。一実施形態においては、制御された温度は、15〜95℃の温度を含む。別の実施形態においては、制御された温度は、15〜70℃の温度を含む。好ましい温度は、20〜55℃であり、より好ましくは約30〜50℃である。
【００４９】
微生物を液体培地中で培養(例えば、維持及び／もしくは増殖)することができ、好ましくは、静置培養、試験管培養、振とう培養(例えば、回転振とう培養、振とうフラスコ培養など)、通気攪拌培養、又は発酵などの従来の培養手段により、連続的又は断続的に培養する。好ましい実施形態においては、前記微生物を振とうフラスコ中で培養する。より好ましい実施形態においては、前記微生物を発酵槽中で培養する(例えば、発酵プロセス)。本発明の発酵プロセスとしては、限定されるものではないが、バッチ式、供給バッチ式及び連続的な発酵のプロセス又は方法が挙げられる。用語「バッチ式プロセス」又は「バッチ式発酵」とは、培地、栄養素、補充添加物などの組成を発酵の開始時点で設定し、発酵中に変化を加えない閉鎖系を意味するが、過剰な培地の酸性化及び／又は微生物の死を防止するためにpH及び酸素濃度などの因子を制御する試みを行ってもよい。用語「供給バッチ式プロセス」又は「供給バッチ式」発酵とは、発酵が進行するにつれて、1種以上の基質又は補充物を添加する(例えば、段階的に増加させるか、又は連続的に添加する)こと以外は、バッチ式発酵と同じ意味である。用語「連続的プロセス」又は「連続的発酵」は、規定の発酵培地を発酵槽に連続的に添加し、さらに、好ましくは、所望の生成物(例えば、HMBPA)の回収のために、等量の使用後培地、すなわち「馴らし培地」を同時に採取する系を意味する。そのような様々なプロセスが開発されており、当業界で周知である。
【００５０】
用語「所望の化合物が産生されるような条件下で培養する」は、所望の化合物の産生がもたらされるか、もしくは産生される特定の化合物を所望の収率で得るのに好適もしくは十分な条件(例えば、温度、圧力、pH、期間など)下で微生物を維持及び／又は増殖させることを含む。例えば、所望の量の化合物(例えば、HMBPA)を産生させるのに十分な時間にわたり、培養を継続する。好ましくは、化合物の好適な産生を実質的に達成するのに十分な時間(例えば、好適な濃度のHMBPAもしくは好適な比のHMBPA：パントテナートに達するのに十分な時間)にわたり、培養を継続する。一実施形態においては、培養を約12〜24時間継続する。別の実施形態においては、培養を、約24〜36時間、36〜48時間、48〜72時間、72〜96時間、96〜120時間、120〜144時間、又は144時間以上継続する。さらに別の実施形態においては、少なくとも約5〜10 g/Lの化合物が約36時間以内に産生されるような条件、少なくとも約10〜20 g/Lの化合物が約48時間以内に産生されるような条件、又は少なくとも約20〜30 g/Lの化合物が約72時間以内に産生されるような条件下で、微生物を培養する。さらに別の実施形態においては、少なくともHMBPA：HMBPA＋パントテナート比1:10(すなわち、例えば、生成物のサンプルをHPLCにより分析した場合のピークを比較することにより測定される、10％HMBPA 対 90％パントテナート)が達成されるような条件、好ましくは、少なくとも2:10の比(20％HMBPA 対 90％パントテナート)が達成されるような条件、より好ましくは、少なくとも2.5:10の比(25％HMBPA 対 75％パントテナート)が達成されるような条件、より好ましくは、少なくとも3:10(30％HMBPA 対 70％パントテナート)、4:10(40％HMBPA 対 60％パントテナート)、5:10(50％HMBPA 対 50％パントテナート)、6:10(60％HMBPA 対 40％パントテナート)、7:10(70％HMBPA 対 30％パントテナート)、8:10(80％HMBPA 対 20％パントテナート)、9:10(90％HMBPA 対 10％パントテナート)以上の比が達成されるような条件下で、微生物を培養する。
【００５１】
本発明の方法はさらに、所望の化合物(例えば、HMBPA)を回収する工程を含んでもよい。所望の化合物を「回収すること」は、培地から化合物を抽出、収穫、単離又は精製することを含む。限定されるものではないが、従来の樹脂(例えば、陰イオンもしくは陽イオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂など)を用いた処理、従来の吸着剤(例えば、活性炭、ケイ酸、シリカゲル、セルロース、アルミナなど)を用いた処理、pHの変更、溶媒抽出(例えば、アルコール、酢酸エチル、ヘキサンなどの従来の溶媒を用いるもの)、透析、濾過、濃縮、結晶化、再結晶化、pH調整、凍結乾燥などの当業界で公知の任意の従来の単離法又は精製法に従って、化合物の回収を実施することができる。例えば、まず培養物から微生物を除去することにより、培地から化合物を回収することができる。次いで、培地を陽イオン交換樹脂に通過させるか、又はその上を通過させて、無機陰イオン及び目的の化合物より強い酸性度を有する有機酸を除去する。続いて、得られた化合物を本明細書に記載するような塩(例えば、カルシウム塩)に変換することができる。
【００５２】
好ましくは、本発明の所望の化合物を、得られる調製物が他の培地成分を実質的に含まない(例えば、培地成分及び／もしくは発酵副生成物を含まない)ように、「抽出」、「単離」又は「精製」する。用語「他の培地成分を実質的に含まない」は、所望の化合物の調製物（この化合物は、それが生成される培地成分もしくは培養の発酵副生成物から分離したものである）を含む。一実施形態において、前記調製物は、約80％(乾燥重量で)を超える所望の化合物(例えば、約20％未満の他の培地成分又は発酵副生成物)、より好ましくは、約90％を超える所望の化合物(例えば、約10％未満の他の培地成分又は発酵副生成物)、さらに好ましくは、約95％を超える所望の化合物(例えば、約5％未満の他の培地成分又は発酵副生成物)、最も好ましくは、約98〜99％を超える所望の化合物(例えば、約1〜2％未満の他の培地成分又は発酵副生成物)を有する。所望の化合物を塩に誘導体化した場合、該化合物はさらに、塩の形成に関連する化学的夾雑物を含まないのが好ましい。所望の化合物をアルコールに誘導体化した場合、該化合物はさらに、アルコールの形成に関連する化学的夾雑物を含まないのが好ましい。
【００５３】
代替的な実施形態においては、例えば、微生物が生物学的に有害でない(例えば、安全である)場合には、所望の化合物を微生物から精製しない。例えば、培養物全体(又は培養上清)を、生成物供給源(例えば、粗生成物)として用いることができる。一実施形態において、該培養物（又は培養上清）を変更なしに使用する。一実施形態においては、該培養物(又は培養上清)を濃縮する。さらに別の実施形態においては、前記培養物(又は培養上清)を乾燥又は凍結乾燥する。
【００５４】
好ましくは、本発明の製造方法は非常に高収率で所望の化合物の生成をもたらす。用語「非常に高収率」は、同等の製造方法にとって通常であるレベルと比較して十分に上昇するか、もしくはそれを超える産生レベル又は収率、例えば、所望の生成物の商業的製造(例えば、商業的に実現可能な費用での該生成物の製造)にとって十分なレベルにまで上昇した生成レベル又は収率、を含む。一実施形態においては、本発明は、所望の生成物(例えば、HMBPA)が2 g/Lを超えるレベルで生成されるような条件下で組換え微生物を培養することを含む製造方法を特徴とする。別の実施形態においては、本発明は、所望の生成物(例えば、HMBPA)が10 g/Lを超えるレベルで生成されるような条件下で組換え微生物を培養することを含む製造方法を特徴とする。別の実施形態においては、本発明は、所望の生成物(例えば、HMBPA)が20 g/Lを超えるレベルで生成されるような条件下で組換え微生物を培養することを含む製造方法を特徴とする。さらに別の実施形態においては、本発明は、所望の生成物(例えば、HMBPA)が30 g/Lを超えるレベルで生成されるような条件下で組換え微生物を培養することを含む製造方法を特徴とする。さらに別の実施形態においては、本発明は、所望の生成物(例えば、HMBPA)が40 g/Lを超えるレベルで生成されるような条件下で組換え微生物を培養することを含む製造方法を特徴とする。本発明はさらに、十分に増加したレベルの化合物が商業的に望ましい時間内に生成されるような条件下で組換え微生物を培養することを含む所望の化合物の製造方法を特徴とする。
【００５５】
操作される生合成酵素又は生合成酵素の組合せに応じて、所望の化合物が生成されるような少なくとも1種の生合成前駆体を含む本発明の微生物を提供する(例えば、供給する)ことが望ましい、又は必要である。用語「生合成前駆体」又は「前駆体」は、微生物の培養培地に供給、導入、接触もしくは含有させた場合、所望の生成物の生合成を増強もしくは増加させるのに役立つ薬剤又は化合物を含む。一実施形態においては、前記生合成前駆体又は前駆体はアスパラギン酸である。別の実施形態においては、前記生合成前駆体又は前駆体はβ-アラニンである。添加するアスパラギン酸又はβ-アラニンの量は、微生物の生産性を増強するのに十分な培地中の濃度(例えば、HMBPAの生成を増強するのに十分な濃度)をもたらす量であるのが好ましい。用語「過剰なβ-アラニン」は、目的の微生物を培養するのに日常的に用いられるものよりも増加した、又は高いレベルのβ-アラニンを含む。例えば、本発明の実施例に記載されるバチルス(Bacillus)微生物の培養は、日常的には約0〜5 g/Lのβ-アラニンの存在下で行われる。従って、過剰なβ-アラニンレベルは、約5〜10 g/L、又はより好ましくは約5〜20 g/Lのレベルのβ-アラニンを含んでもよい。本発明の生合成前駆体を、濃縮溶液もしくは懸濁液の形態(例えば、水もしくは緩衝液などの好適な溶媒中)又は固体の形態(例えば、粉末の形態)で添加することができる。さらに、本発明の生合成前駆体を、所与の時間に渡って連続的又は断続的に、単一のアリコートとして添加することができる。
【００５６】
さらに別の実施形態においては、前記生合成前駆体はバリンである。さらに別の実施形態においては、前記生合成前駆体はα-ケトイソ吉草酸である。好ましくは、バリン及びα-ケトイソ吉草酸を、所望の生成物(例えば、HMBPA)の生成が起こるのに十分な培地中の濃度をもたらす量で添加する。用語「過剰なα-KIV」は、目的の微生物を培養するのに日常的に用いられるものよりも増加した、又は高いα-KIVのレベルを含む。例えば、本発明の実施例に記載されるバチルス(Bacillus)微生物の培養を、約0〜5 g/Lのα-KIVの存在下で行うことができる。従って、過剰なα-KIVレベルは、約5〜10 g/L、より好ましくは約5〜20 g/Lのレベルを含んでもよい。用語「過剰なバリン」は、目的の微生物を培養するのに日常的に用いられるものよりも増加した、又は高いレベルのバリンを含む。例えば、本発明の実施例に記載されるバチルス(Bacillus)微生物の培養を、約0〜0.5 g/Lのバリンの存在下で日常的に行うことができる。従って、過剰なバリンレベルは、約0.5〜5 g/L、より好ましくは約5〜20 g/Lのレベルのバリンを含んでもよい。生合成前駆体はまた、本明細書においては「補充の生合成基質」とも呼ばれる。
【００５７】
さらに、本発明の特定の態様は、増加した安定状態のグルコースの条件、低下した安定状態の溶存酸素の条件、及び／又は低下したセリンの条件下で微生物(例えば、組換え微生物)を培養することを含む。用語「増加した安定状態のグルコース」は、目的の微生物の培養に日常的に用いられるものよりも増加した、又は高い安定状態のグルコースレベルを含む。例えば、本発明の実施例に記載されるバチルス(Bacillus)微生物の培養を、約0.2〜1.0 g/Lの安定状態グルコースの存在下で日常的に行う。従って、増加した安定状態のグルコースレベルは、約1〜2 g/L、約2〜5 g/L、及び好ましくは約5〜20 g/Lのレベルの安定状態グルコースを含んでもよい。用語「低下した安定状態の溶存酸素」は、目的の微生物の培養に日常的に用いられるものよりも低い安定状態の溶存酸素レベルを含み、例えば、増加した安定状態のグルコースレベルと逆相関する。例えば、本発明の実施例に記載されるバチルス(Bacillus)微生物の培養を、約10〜30％の溶存酸素の存在下で日常的に行う。従って、減少した安定状態の溶存酸素は、約0〜10％、及び好ましくは約0〜5％のレベルの安定状態の溶存酸素を含んでよい。用語「低下したセリン」は、目的の微生物の培養に日常的に用いられるレベルのより低い範囲内のセリンレベルを含む。例えば、本発明の実施例に記載されるバチルス(Bacillus)微生物の培養を、約0〜0.5 g/Lのセリンの存在下で日常的に行う。従って、低下したセリンレベルは、例えば、0〜0.1 g/Lのレベルのセリンを含んでもよい。
【００５８】
本発明の別の態様は、本明細書に記載の組換え微生物を特徴とする生体内変換プロセスを含む。用語「生体内変換プロセス」は、「生物転換プロセス」とも呼ばれ、適当な基質及び／又は中間化合物の所望の生成物(例えば、HMBPA)への生成(例えば、変換又は転換)をもたらす生物学的プロセスを含む。
【００５９】
一実施形態において、本発明は、HMBPAが生成されるような条件下で、還元酵素(例えば、PanE1、PanE2及び／又はIlvC)を過剰発現する微生物と、適当な基質又は前駆体とを接触させ、該HMBPAを回収することを含む、HMBPAの製造のための生体内変換プロセスを特徴とする。別の実施形態において、本発明は、HMBPAが生成されるような条件下で、低下又は欠失したPanB活性を有する微生物と、適当な基質又は前駆体とを接触させ、該HMBPAを回収することを含む、HMBPAの製造のための生体内変換プロセスを特徴とする。さらに別の実施形態において、本発明は、HMBPAが生成されるような条件下で、少なくとも1個の還元酵素を過剰発現し、低下又は欠失したPanB活性を有する微生物と、適当な基質又は前駆体とを接触させ、該HMBPAを回収することを含む、HMBPAの製造のための生体内変換プロセスを特徴とする。上記の生体内変換を実行するのに好ましい組換え微生物は、本明細書に記載の組換え微生物を含む。さらに別の実施形態において、本発明は、HMBPAが生成されるような条件下で、α-HIV及びβ-アラニンと、単離又は精製されたPanCとを接触させることを含む生体内変換反応を特徴とする。必要に応じて、α-KIVと、精製又は単離された還元酵素(例えば、PanE1、PanE2及び／又はIlvC)及び還元性等価物の供与源、例えば、NADHとを接触させることにより、α-HIVを取得することができる。α-HIV又はHMBPAが生成される条件は、それぞれα-HIV又はHMBPAの所望の生成をもたらす任意の条件を含んでもよい。さらに別の実施形態において、本発明は、PanE1及び／もしくはPanE2、並びに／又はIlvCを過剰発現し、低下又は欠失したPanCもしくはPanD(それぞれHMBPAもしくはβ-アラニンの合成を低下させる)を有する微生物を、α-HIVが生成されるような条件下で培養することを含む、α-HIVの製造方法を含む。
【００６０】
前記生体内変換反応に用いる微生物及び／又は酵素は、それらの意図される機能(例えば、所望の化合物を生成すること)を発揮するのを可能にする形態のものである。前記微生物は全細胞であってもよく、又は所望の最終結果を得るのに必要な細胞の一部分のみであってもよい。前記微生物を、懸濁したり(例えば、緩衝溶液もしくは培地などの適当な溶液中に)、リンスしたり(例えば、微生物の培養物から培地を含まないようにリンスする)、アセトン乾燥したり、固定化したり(例えば、ポリアクリルアミドゲルもしくはκ-カラギーナンを用いて、又は合成支持体、例えば、ビーズ、マトリクスなどの上に)、定着させたり、架橋したり又は浸透可能にしたりする(例えば、化合物、例えば、基質、中間体もしくは生成物が、膜又は壁をより容易に通過できるように、膜及び／又は壁を浸透可能にする)ことができる。
【００６１】
本発明を、限定的に解釈されるべきではない以下の実施例によりさらに説明する。本願を通して引用される全ての参考文献、特許及び公開特許出願の内容は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【実施例】
【００６２】
実施例
実施例I：[R]-3-(2-ヒドロキシ-3-メチル-ブチリルアミノ)-プロピオン酸(HMBPA)生合成経路の探索及び特徴付け
パントテナートの製造のためのバチルス(Bacillus)株の探索において、米国特許出願第09/400,494号及び米国特許出願第09/667,569号に記載のパントテナート生合成経路及びイソロイシン-バリン(ilv)経路(図1)に関与する酵素に対して、種々の遺伝子操作を行った。例えば、脱調節されたpanBCDオペロンを有する株及び／又は脱調節されたpanE1を有する株は、増強されたパントテナート産生を示した(β-アラニン及びα-KIVの存在下で培養した場合)。ilvBNC及びilvDについてさらに脱調節された株は、β-アラニンのみの存在下で、増強されたパントテナート産生を示した。さらに、panDをさらに脱調節することにより、β-アラニン非依存性を達成することができた。
【００６３】
例示株は、トリプトファン原栄養株であり、Spec及びTet耐性であり、panBCD遺伝子座でpanBCDについて脱調節され、panE1遺伝子座でpanE1について脱調節され(枯草菌(B. subtilis)ゲノム中の2個の遺伝子は、E.coliのpanEであるpanE1及びpanE2と相同であり、前者はパントテナート産生に関与する主要なケトパントエートリダクターゼをコードするが、一方、panE2はパントテナート合成に寄与しない(米国特許出願第09/400,494号))、ilvD遺伝子座でilvDについて脱調節され、amyE遺伝子座でilvBNCカセットを過剰発現し、bpr遺伝子座でpanDを過剰発現する、PA824株である。
【００６４】
PA824によるパントテン酸の産生を、14 Lの発酵容器中で調べた。バッチ及び供給培地の組成は以下の通りである。
【００６５】
2005503758.tif 000003
2005503758.tif 000004
【００６６】
バッチ培地の最終容量は6 Lである。微量元素溶液SM-1000Xは、以下の組成を有する：0.15 g Na2MoO4・2H2O、2.5 g H3BO3、0.7 g CoCl2・6H2O、0.25 g CuSO4・5H2O、1.6 g MnCl2・4H2O、0.3 g ZnSO4・7H2Oを水に溶解する(最終容量1 L)。
【００６７】
バッチ培地に60 mlの振とうフラスコのPA824培養物(SVY培地中のOD＝10：740 ml H2O中のDifco Veal Infusion培養液25 g、Difco Yeast抽出物5 g、グルタミン酸ナトリウム5 g、(NH4)2SO4 2.7 g、オートクレーブ；200 mlの滅菌した1 M K2HPO4 (pH 7)及び60 mlの滅菌した50％グルコース溶液を加える(最終容量1 L))を接種した。グルコース制限供給バッチとして12 L/分の通気速度で、43℃にて発酵を行った。最初に供給されたグルコース(2.5 g/L)は指数増殖期中に消費された。その後、以下のような供給溶液の連続供給により、グルコース濃度を0.2〜1 g/Lに維持した。
【００６８】
2005503758.tif 000005
【００６９】
可変供給速度ポンプをコンピューター制御し、アルゴリズムによりタンク中のグルコース濃度に関連付けた。この実験では、総供給量は6 Lであった。
【００７０】
発酵中のpHは7.2に設定した。コンピューター制御に接続したpH測定により、制御を達成した。25％ NH3溶液又は20％ H3PO4溶液のいずれかを供給することにより、pH値を維持した。NH3は同時に発酵のための窒素源として働く。攪拌及び通気速度の調節により、溶存酸素濃度[pO2]を30％に設定した。シリコーンオイルの添加により、気泡形成を制御した。供給溶液の添加を停止した後、すなわち、この実施例では48時間後、[pO2]値が95％に達するまで発酵を継続した。次いで、30分間滅菌して微生物を殺傷することにより、発酵を停止させた。発酵培養液のサンプルを寒天プレート上に塗布することにより、滅菌の成功を証明した。滅菌及び遠心分離による細胞の除去後の発酵培養液中のパントテナート力価は21.7 g/Lであった(HPLC分析により測定)。
【００７１】
HPLC分析のために、発酵培養液サンプルを滅菌水で希釈した(1:40)。この希釈液5μlをHPLCカラム(Aqua C18、5μm、150*2.0 mm、Phenomenex(登録商標))に注入した。カラムの温度を40℃に保持した。移動相Aは14.8 mM H3PO3であり、移動相Bは100％アセトニトリルであった。流速は0.5 mL/分で一定であった。勾配を印加した：
開始時      2％移動相B
0-3分      3％移動相Bまで線形増加
3-3.5分    20％移動相Bまで線形増加
UV検出器(210 nm)により、検出を行った。ランタイムは7分であり、さらにその時間後に3分行った。パントテン酸の保持時間は3.9分であった。上記サンプルのHPLCクロマトグラムを図4に示す。
【００７２】
保持時間4.7分を有するピークに関連する化合物の同定
記載された発酵条件下で、PA824により通常約20〜30 g/Lのパントテナートが得られる。有意な量のパントテナートの産生に加えて、この系で約4.7分の保持時間で溶出される第2の化合物が見出された。発酵で形成された第2の顕著な生成物は、[R]-3-(2-ヒドロキシ-3-メチル-ブチリルアミノ)-プロピオン酸(HMBPA)(本明細書においては「β-アラニン2-(R)-ヒドロキシイソ吉草酸」、「β-アラニン2-ヒドロキシイソ吉草酸」、及び／又は「β-アラニル-α-ヒドロキシイソ吉草酸」とも呼ばれる)であることが示された。それは、その質量スペクトル(図5；相対モノアイソトピック質量189)、逆相フラッシュクロマトグラフィー(移動相10 mM KH2PO4、アセトニトリル含量を増加させながら(1〜50％)行う)によるクロマトグラフィー精製後の1H-及び13C-NMR(データは示さない)により同定された。
【００７３】
前記化合物の正体を検証するために、ラセミ体β-アラニン2-ヒドロキシイソ吉草酸の意図的な合成を以下のように行った。β-アラニン(2.73 g/30 mmol)及びナトリウムメトキシド(5.67 gのメタノール中30％溶液／31.5 mmol)をメタノール(40 mL)に溶解した。メチル2-ヒドロキシイソ吉草酸(2-ヒドロキシ-3-メチル酪酸メチルエステル)(3.96 g/30 mmol)を添加し、18時間還流した。次いで、回転蒸発によりメタノールを除去し、tert-ブタノール(50 mL)により置換した。カリウムtert-ブトキシドを添加し(50 mg)、26時間還流した。溶媒を減圧下で除去し、残渣を水(50 mL)に溶解し、強酸性イオン交換樹脂(H＋-型Lewatite(登録商標)S 100 G1; 100 mL)に通過させた。さらに水を用いてイオン交換樹脂を洗浄した。水性溶出物を１つに合わせて、減圧下で水を除去した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル；溶出液として酢酸エチル中の2％酢酸)にかけ、生成物画分を蒸発させたところ、固体残渣が得られた。この残渣を酢酸エチル／トルエン(それぞれ10 mL/20 mL)から再結晶させたところ、分析的に純粋なHMBPA(β-アラニン2-ヒドロキシイソ吉草酸)が得られ、質量スペクトルにおいて190(189＋H+)の相対モノアイソトピック質量を示し、発酵から得られた生成物と同じ1H-NMR共鳴を示した。
【００７４】
HMBPA生成をもたらす生合成経路を図2に示す。[R]-3-(2-ヒドロキシ-3-メチル-ブチリルアミノ)-プロピオン酸(HMBPA)の化学構造を図3に示す。図2に示されるように、HMBPAは、PanC酵素により触媒される、α-ヒドロキシイソ吉草酸(α-HIV)とβ-アラニンの縮合生成物である。α-HIVはα-KIVの還元により生成され、この反応は還元酵素PanE(例えば、PanE1及び／もしくはPanE2)並びに／又はIlvCにより触媒される。
【００７５】
前記化学構造及びHMBPA生成をもたらす生合成経路に基づいて、本発明者らは、公知のパントテナート及びイソロイシン-バリン(ilv)経路と、新規に特徴付けられたHMBPA生合成経路との相互作用を説明するための以下のモデルを作成した。少なくとも一態様において、このモデルは、生合成酵素PanBの基質であるα-KIVと競合する少なくとも2つの経路、すなわち、パントテナート生合成経路及びHMBPA生合成経路が微生物中に存在することを述べている(α-KIVと競合する第3及び第4の経路は、α-KIVからのバリン又はロイシンの生成をもたらすものであり、例えば、図1を参照されたい)。少なくともパントテナート生合成経路及びHMBPA生合成経路はさらに、酵素PanCの競合的基質、すなわち、α-HIV及びパントエートを生成する。このモデルは、PanB活性の低下がα-HIV合成(及び究極的には、HMBPA合成)のためのα-KIVの利用性を増加させ、微生物により合成されるパントエート及び／又はパントテナートの量を減少させることを予測している。逆に、PanB活性の増加は、パントエート／パントテナート合成のためのパントエート及びケトパントエートの利用性を増加させるであろう。以下の実施例は、このモデルの実験的な支持、及びさらに、このモデルに基づくHMBPAの生成を増加させるための例示的プロセスを提供するものである。
【００７６】
実施例II-VI:
実施例II〜VIについては、パントテナート及び／又はHMBPAの定量を以下のように実施した。水又は5％アセトニトリル中に、発酵培地のアリコートを1:100に希釈し、試験管培養物のアリコートを1:10に希釈した後、Phenomenex Aqua(登録商標) 5μ C18 HPLCカラム(250 x 4.60 mm、125A)上に注入した。移動相A＝5％アセトニトリル、リン酸でpH 2.5に調整した50 mMリン酸一ナトリウムバッファー；及びB＝95％アセトニトリル、5％H2O。
【００７７】
線形勾配は以下の通りであった。
【００７８】
2005503758.tif 000006
【００７９】
さらなるパラメーター及び装置は以下の通りであった：流速＝1.0 ml/分；注入容量＝20μl；検出器＝Hewlett Packard 1090シリーズDAD UV検出器-3014、シグナルA＝197 nm、ref.＝450 nm、ファームウェア改訂版E；カラム加熱器＝オーブン温度40℃；ハードウェア＝Hewlett Packard Kayak(登録商標)XA；及びソフトフェア＝Hewlett Packard Chemstation Plus(登録商標)ファミリー改訂版A.06.03[509]。
【００８０】
これらの発酵条件下で、PA824は通常約30〜40 g/Lのパントテナートを産生する。HMBPAは、この系では約13分の時点で溶出する。
【００８１】
実施例II：ケトパントエートリダクターゼはHMBPAの産生に寄与し、バチルス(Bacillus)におけるケトパントエートリダクターゼ活性の増加はHMBPA産生の増強をもたらす
実施例Iに記載したように、HMBPAに対応する新規なHPLCピークがpanE1を過剰発現する微生物において観察されたが、これはケトパントエートリダクターゼの増加がHMBPAの産生(さらに、パントテナートの産生)に寄与することを示唆している。以前に述べたように、枯草菌(B. subtilis)ゲノム中の2個の遺伝子は、ケトパントエートリダクターゼをコードする大腸菌(E. coli)のpanE遺伝子と相同であり、panE1及びpanE2と名づけられている。バチルス(Bacillus)においては、panE1遺伝子はパントテナート産生に関与する主要なケトパントエートリダクターゼをコードするが、panE2はパントテナート合成に寄与しない。実際、P26プロモーターからのpanE2の過剰発現は、パントテナート力価の低下をもたらす(例えば、米国特許出願第09/400,494号を参照)。
【００８２】
従って、panE1遺伝子産物により産生されるのに加えて、HMBPAを作るのに必要な有意な割合のα-HIVをpanE2遺伝子産物により産生させることが可能かどうかを試験した。panE2遺伝子産物が、α-KIVをα-HIVに還元することができるが、ケトパントエートをパントエートに有意に還元することができない酵素であると仮定された。
【００８３】
この仮説を試験するために、PA248株の染色体DNAに由来するΔpanE2::catカセット(ΔpanE2::cat)(配列番号２４として記載、構築については、例えば米国特許出願第09/400,494号を参照)を用いて形質転換することにより、パントテナート産生株PA824からpanE2を欠失させて、PA919株を得た。PA919の3つの単離株を、SVY＋β-アラニン中で増殖させた試験管培養物中で、パントテナート及びHMBPAの産生についてPA824と比較した。
【表１】
2005503758.tif 000007
【００８４】
表1のデータに示されるように、PA919の3つの単離株は全て、PA824よりも約4倍低いHMBPAを産生したが、これはpanE2遺伝子産物がHMBPA合成の強力な誘導物質であることを示している。さらに、HMBPA産生の有意な増加を、panE2の過剰発現により簡単に達成することができる。panE2の過剰発現のための例示プラスミド、すなわちpAN238を配列番号２５として記載する(図10)。
【００８５】
実施例III. 微生物中のPanB活性の低下によるHMBPA産生の増加
P26panBCDカセットを欠失し、vpr遺伝子座で増幅させたP26panC*Dカセット及び野生型P26panBカセット(PA666)又はbpr遺伝子座で増幅させたP26ΔpanBカセット(PA664)を含む、PA365(PA377のRL-1系列等価物、米国特許出願第09/667,569号に記載)に由来する株を以下のように構築した。公知又は考えられるPanBタンパク質のC末端アミノ酸のアラインメントを図6に示す。保存又は半保存されたアミノ酸残基を有すると同定された1、2及び3と呼ばれる3つの領域を、図の上部の矢印により示す。枯草菌(B. subtilis)のPanBタンパク質(RBS02239)を下線で示す。PanBタンパク質のうちの2つ(RCY14036及びCAB56202.1)は、領域3を欠いているが、一方、後者のPanBタンパク質は領域2をも欠いており、領域1を占める保存されていないアミノ酸残基を有する。
【００８６】
領域1、2及び3を欠く枯草菌(B. subtilis)のPanB変異体を作製した。最終産物から領域3、領域2及び3、又は3つの領域の全てを欠くように、枯草菌(B. subtilis)のpanB遺伝子を増幅するための3' PCRプライマーを設計することにより、所望の変異体を作製した。PCR産物を作製し、大腸菌(E. coli)発現ベクターpASK-1BA3中にクローニングし、それぞれプラスミドpAN446、pAN447、及びpAN448を作製した。次いで、このプラスミドを、panB6突然変異を含む大腸菌(E. coli)株SJ2中に形質転換し、相補性試験を行った。領域3を欠くpAN446のみが相補可能であった。これは、領域3は枯草菌(B. subtilis)のPanB活性にとって必須ではないが、領域2は活性又は安定性にとって必要であることを示している。
【００８７】
この分析の次の工程は、pAN446由来のpanB遺伝子を枯草菌(B. subtilis)発現ベクターに導入した後、枯草菌(B. subtilis)中でコードされるPanBタンパク質の活性を試験するのに好適な株にそれを導入することであった。これを行うために、P26panBCDオペロンを欠失した株をまず作製した。最初に、panB RBSのすぐ上流に位置するBseRI部位とpanD中に位置するBglII部位との間にcat遺伝子を挿入し、プラスミドpAN624(図7)を作製することにより、これを達成した。pAN624の配列を配列番号２０として記載する。panB及びpanCの全てを除去された、得られた欠失-置換突然変異(ΔpanBCD::cat624)を、形質転換によりPA354中に交叉させ、1 mMパントテナートを補充したプレート上でクロラムフェニコールに対する耐性について選択した。形質転換体の1つを保存し、PA644と命名した。PA644から単離された染色体DNAをPCRにより分析したところ、欠失-置換突然変異を含むことが示された。期待された通り、PA644は、増殖のためにパントテナートを必要とするが、遺伝子操作されたilv遺伝子(P26ilvBNC P26ilvD)及びPA354中にもともと存在するP26panE1遺伝子を保持している。かくして、それは、PanBを除き、過剰生成されたパントエート合成に関与する酵素を全て持っている。最も短いpanB欠失を含む遺伝子を枯草菌(B. subtilis)発現ベクターpOTP61(米国特許出願第09/667,569号に記載)中に挿入し、プラスミドpAN627を作製した。同時に、野生型panB対照遺伝子をpOTP61中に挿入し、プラスミドpAN630を作製した。大腸菌(E. coli)ベクター配列を欠く、各プラスミドのNotI断片を連結させ、PA644中に形質転換し、テトラサイクリンに対する耐性について選択した。
【００８８】
各形質転換に由来する1個の形質転換体を保存し、PA628に由来する染色体DNAを用いてさらに形質転換し、Pan+について選択した。PA628は、vpr遺伝子座に組み込まれた多コピーのP26panC*D発現プラスミド(pAN620)を含む。パントテナート産生に対するpanB遺伝子突然変異の直接的効果を決定するために、配列番号２１として記載され、図8に図示されるプラスミドpAN620がパントテナート合成に必要な残りの2個の酵素(PanC及びPanD)を提供する。各形質転換に由来する4個の形質転換体を単離し、10 g/Lアスパラギン酸を含むSVY培地中で48時間増殖させた後、パントテナート産生についてアッセイした。3'欠失したpanB遺伝子を有する形質転換体をPA664と命名し、野生型遺伝子を含むものをPA666と呼んだ。データは、PA664中の3'欠失したpanB遺伝子が非常に低下した活性を有するPanBタンパク質をコードすることを示していた。HMBPA産生について試験するために、PA365、PA666及びPA664の試験管培養物を、α-KIV又はパントエートを添加した、及び添加しないSVY＋アスパラギン酸培地中で48時間増殖させた後、以前に記載されたようにHMBPA及びパントテナートについてアッセイした。
【表２】
2005503758.tif 000008
【００８９】
表2に示されたデータは、補充物の非存在下では、PA664は最も多くのHMBPAを産生したが、PA666は最も少ないHMBPAを産生したことを示しており、これはPanB活性とHMBPA産生の間に逆相関関係があることを示唆している。これは、2つの経路がPanBの基質であるα-KIVと競合し、PanCの競合的基質を産生すると予測するモデルと一致する；PanB活性の低下がα-HIV合成のためのα-KIVの利用性を増加させ、HMBPA産生を増加させ、それに対応して、合成されるパントエートの量を減少させると期待される。α-KIVを培地に添加した場合、3つの株は全て、非常に多量のHMBPAを産生した。この結果は、図2に示されるように、α-KIVがHMBPAに対する前駆体であり、過剰のα-KIVがHMBPA産生を促進することの証拠となる。この結果はまた、HMBPAの合成が少なくとも部分的には過剰のα-KIV産生のオーバーフロー効果に起因することを示唆している。パントエートを培地に添加した場合、HMBPAは3つの株全てにおいて、約50％低下した。逆に、各株は有意により多いパントテナートを産生した。この結果も、2つの経路がPanCの競合的基質(α-HIV及びパントエート)を産生するというモデルと一致する。総合すれば、上記の結果はさらに、パントエート合成の低下はHMBPA産生の促進並びにパントテナートレベルの低下に有益であることを示唆している。
【００９０】
実施例IV. HMBPA:パントテナートレベルの調節方法
実施例I及びIIで証明されたように、PanE1及び／又はPanE2はHMBPA産生の増強並びにPanB活性の低下に寄与する。本実施例は、PanE1の過剰発現がパントテナート産生と比較してHMBPA産生を増加させる一方、PanBの過剰発現がパントテナート産生と比較してHMBPA産生を低下させることを証明する。さらに、IlvCを過剰発現する株において、HMBPA産生が増強される。
【００９１】
PA668は、vpr又はpanB遺伝子座で増幅された余剰コピー数のP26panBを含むPA824の誘導株である。PA668を、クロラムフェニコールを用いた複数コピーの選択を可能にするpanB発現ベクター(pAN636)を用いて構築した。pAN636の配列を配列番号２２として記載し、このベクターを図9に模式的に図示する。大腸菌(E. coli)ベクター配列を欠く、pAN636のNotI制限断片を連結した後、これを用いてPA824を形質転換し、5μg/mlのクロラムフェニコールを含むプレート上で選択した。30μg/mlのクロラムフェニコールに耐性を有する形質転換体を単離し、48時間の試験管培養物中でのパントテナート産生についてスクリーニングした。示された単離株はPA824より少ないHMBPAを産生する(逆に、PA824より約10％多いパントテナートを産生する)。vpr又はpanE1遺伝子座で増幅された余剰コピー数のP26panE1を含むPA824である、PA669と呼ばれる第2の株を構築した。PA824を、プラスミドpAN637の自己連結されたNotI断片を用いて形質転換し、クロラムフェニコールに対する耐性について選択することにより、PA669株を構築した。pAN637の配列を配列番号２３として記載し、このベクターを図10に模式的に図示する。PA669の2つの単離株をさらなる試験のために選択した；PA669-5は、2つの株から作製された全細胞抽出物のSDS-PAGE分析により判断されるように、PA669-7よりも少ないPanE1を産生する。
【００９２】
PA824、PA668-2、PA668-24株の試験管培養物、及びPA669の2つの単離株(PA669-5及びPA669-7)を、3種の異なる培地(SVY、SVY＋アスパラギン酸、及びSVY＋アスパラギン酸＋パントエート)中で48時間増殖させた後、パントテナート、HMBPA、及びβ-アラニンについてアッセイした(表3)。
【表３】
2005503758.tif 000009
【００９３】
これらの株はいずれも、SVY培地においては検出可能な量のHMBPAを産生しなかった。全株はほぼ等量のパントテナート及び少量のβ-アラニンを産生したが、これはβ-アラニンがこれらの培養物におけるパントテナート及びHMBPA合成の双方を制限しており、β-アラニンが双方の化合物の前駆体であることを示唆している。SVY＋アスパラギン酸培地中で増殖させた場合、2つのPA669単離株はPA824よりも多いHMBPAを産生したが、双方のPA668単離株はPA824よりも少ないHMBPAを産生した。最も多いPanE1を産生する株(PA669-7)が最も多いHMBPA(及び最も少ないパントテナート)を産生したことは注目に値する。これは、高いレベルのPanE1が、より低いパントテナート合成を犠牲にしてHMBPAの産生を促進することを示唆している。また、2つの株からの抽出物のSDS-PAGE分析により、それらがほぼ等しいレベルのPanBを産生することが示された場合でさえ、PA668-24がPA668-2よりも多いHMBPAを産生したことも興味深い。SDS-PAGE分析はまた、PA668-24がPA668-2よりも非常に多いIlvCを作ることも示した。これらのデータに基づくと、安定状態レベルのα-KIVを増加させること、及び／又はα-KIVからのα-HIV形成を触媒することによって、IlvCがHMBPA合成に影響を与えること、そしてそれによりHMBPAの産生へのシフトが観察されることが説明されること、が提唱される。
【００９４】
表3中の最後のデータセットは、増殖培地へのパントエートの添加が、以前に検出可能なレベルを産生した全株によるHMBPA産生を、例えば、パントテナートに向かう合成にシフトすることにより、低下させたことを示している。これはさらに、α-HIV及びパントエートがPanCの競合的基質であるモデルを支持するものである。
【００９５】
実施例V：セリンの利用性を制限することによるHMBPA産生の増加
HMBPA産生に対するパントテナートの比率も、微生物培養物中のセリン又はメチレンテトラヒドロ葉酸の利用性を調節することにより制御することができると仮定された。特に、セリンの利用性を低下させるとパントテナート産生と比較してHMBPA産生を増加させることができるが、セリンの利用性を増加させるとパントテナート産生と比較してHMBPA産生を低下させるであろうことが提唱される。この方法は、PanB基質であるメチレンテトラヒドロ葉酸がセリンから誘導されるという理解に基づくものである。かくして、セリンレベルの調節は、PanB基質レベルを有効に調節するはずである。この仮説を試験するために、SVYグルコース＋5 g/L β-アラニン及び±5 g/Lセリンの試験管培養中、48時間、43℃にてPA824を増殖させた。
【表４】
2005503758.tif 000010
【００９６】
表4に示されるように、セリンの添加は産生レベルを低下させるが、逆にパントテナート産生を増加させる。HMBPA産生レベルを調節するためにメチレンテトラヒドロ葉酸を低下させる少なくとも1つの方法は、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ(glyA遺伝子産物)の活性を低下させることによって、好適に遺伝子操作された微生物におけるメチレンテトラヒドロ葉酸生合成を低下させることである。HMBPA産生を調節するためにセリンレベルを低下させる少なくとも1つの方法は、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ(serA遺伝子産物)の活性を低下させることである。
【００９７】
実施例VI：組換え微生物の培養条件を改変することによるHMBPA産生の増加
少なくとも1つの発酵物(発酵物P162)において、HMBPA産生のレベルが35 g/Lに達した。簡単に述べると、PA824株の発酵を、実施例Iに記載のように行ったが、以下のように配合されたPFM-155培地を用いた。
【００９８】
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2005503758.tif 000012
【００９９】
しかしながら、発酵中のプロセス制御の損失の結果として、溶存酸素が16〜17時間で乏しくなり、16時間後にはグルコースが蓄積し始めた。
【０１００】
発酵条件におけるこれらの変化は、16時間で、又は16時間後に以下の有意な結果をもたらした。すなわち、HMBPAの合成が、パントテナート合成の対応する低下と共に増加し始めた。16時間の前の4時間の間に、培養物は7 g/lのHMBPAを産生し、その後の4時間に9.0 g/lのHMBPAを産生した。パントテナートは逆に12〜16時間と16〜20時間にそれぞれ10 g/l及び6.0 g/l産生された。20〜36時間のHMBPA合成の平均速度は1.0 g/l時間であった。全体として、発酵物P162は36時間で35 g/lのHMBPAを産生した。
【０１０１】
かくして、グルコースの過剰供給、及び／又は溶存酸素の制限(例えば、約16時間で始まる)は、HMBPA産生の増加をもたらすようである。従って、HMBPA産生を増加(パントテナート産生と比較して)させるための2つの方法は、安定状態のグルコースレベルを増加させること、及び／又は安定状態の溶存酸素レベルを低下させることである。
【０１０２】
等価物
当業者であれば、日常的な実験のみを用いて、本明細書に記載された本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、又は確認することができるであろう。そのような等価物は以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】図1はパントテナート及びイソロイシン-バリン(ilv)生合成経路の模式図である。パントテナート生合成酵素を太字で示し、その対応する遺伝子をイタリック体で示す。イソロイシン-バリン(ilv)生合成酵素を太字のイタリック体で示し、その対応する遺伝子をイタリック体で示す。
【図２】図2は枯草菌(B. subtilis)において[R]-3-(2-ヒドロキシ-3-メチル-ブチリルアミノ)-プロピオン酸(「HMBPA」)をもたらす生合成経路の模式図である。
【図３】図3は[R]-3-(2-ヒドロキシ-3-メチル-ブチリルアミノ)-プロピオン酸(「HMBPA」)の構造の模式図である。
【図４】図4はPA824の14L発酵物から得た培地のサンプルのHPLCクロマトグラムである。
【図５】図5は[R]-3-(2-ヒドロキシ-3-メチル-ブチリルアミノ)-プロピオン酸の相対モノアイソトピック質量を示す質量スペクトルである。
【図６】図6は公知又は考えられるPanBタンパク質に由来するC末端アミノ酸のアラインメントを示す。
【図７】図7はプラスミドpAN624の構築の模式図である。
【図８】図8はプラスミドpAN620の構築の模式図である。
【図９】図9はプラスミドpAN636の構築の模式図である。
【図１０】図10はクロラムフェニコールを用いて単一又は複数コピーについての選択を可能にするプラスミドpAN637の構築の模式図である。
【図１１】図11はP26プロモーターから枯草菌(B. subtilis) panE2を過剰発現させるためのプラスミドpAN238の構築の模式図である。
【図１】
2005503758.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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2005503758.tif 000025
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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