(57)【要約】本発明は、ニック形成剤を用いる遺伝子発現分析のための方法および組成物を提供する。本発明は、ｃＤＮＡ集団中の標的ｃＤＮＡ分子、または生物学的サンプル中の標的ｍＲＮＡ分子の存在もしくは非存在を決定するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（Ａ）（ｉ）ｃＤＮＡ集団のｃＤＮＡ分子または生物学的サンプルのＲＮＡ分子、（ｉｉ）テンプレート核酸分子、（ｉｉｉ）認識配列を認識するニック形成剤、（ｉｖ）ＤＮＡポリメラーゼ、および（ｖ）１つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸、を含む、混合物を形成する工程；（Ｂ）一本鎖核酸分子が増幅される条件に、混合物を維持する工程；ならびに（Ｃ）一本鎖核酸分子の存在もしくは非存在を検出して、ｃＤＮＡ集団中の標的ｃＤＮＡ分子の存在もしくは非存在を決定するか、または生物学的サンプル中の標的ｍＲＮＡの存在もしくは非存在を決定する工程。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｃＤＮＡ集団中の標的ｃＤＮＡ分子の存在もしくは非存在を決定するため、または生物学的サンプル中の標的ｍＲＮＡ分子の存在もしくは非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（Ａ）  以下：
（ｉ）  該ｃＤＮＡ集団の該ｃＤＮＡ分子または該生物学的サンプルの該ＲＮＡ分子、
（ｉｉ）  以下：
（ａ）  ニック形成剤認識配列の一方の鎖を含み、そして
（ｂ）  該標的ｃＤＮＡが一本鎖である場合、該標的ｃＤＮＡに少なくとも実質的に相補的であるか、
該標的ｃＤＮＡが二本鎖である場合、該標的ｃＤＮＡの一方の鎖に少なくとも実質的に相補的であるか、または
該標的ｍＲＮＡに少なくとも実質的に相補的である、テンプレート核酸分子、
（ｉｉｉ）  該認識配列を認識するニック形成剤、
（ｉｖ）  ＤＮＡポリメラーゼ、および
（ｖ）  １つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸、
を含む、混合物を形成する工程；
（Ｂ）  該標的ｃＤＮＡが該ｃＤＮＡ集団中に存在するならば、または該標的ｍＲＮＡが該生物学的サンプル中に存在するならば、該標的ｃＤＮＡの一部、該標的ｍＲＮＡの一部、または該テンプレート核酸分子の一部をテンプレートとして用いて一本鎖核酸分子が増幅される条件に、該混合物を維持する工程；ならびに
（Ｃ）  該一本鎖核酸分子の存在もしくは非存在を検出して、該ｃＤＮＡ集団中の該標的ｃＤＮＡ分子の存在もしくは非存在を決定するか、または該生物学的サンプル中の該標的ｍＲＮＡの存在もしくは非存在を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記テンプレート核酸は、前記ニック形成剤認識配列の一方の鎖の配列に対して３’側に配置される配列を含み、該配列は、前記標的ｃＤＮＡが一本鎖である場合、該標的ｃＤＮＡの３’部分に少なくとも実質的に相補的であるか、該標的ｃＤＮＡが二本鎖である場合、該標的ｃＤＮＡの一方の鎖の３’部分に少なくとも実質的に相補的であるか、または前記標的ｍＲＮＡに少なくとも実質的に相補的である、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記標的ｃＤＮＡは、二本鎖であり、そして前記ニック形成剤認識配列を含み、そしてここで、前記テンプレート核酸は、該標的ｃＤＮＡの部分を含み、該標的ｃＤＮＡは、該ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含む、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、前記標的ｃＤＮＡは、一本鎖であり、そして前記ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み、そしてここで、前記テンプレート核酸は、該ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含む、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、前記標的ｃＤＮＡが二本鎖であり、そして前記ニック形成剤認識配列を含み、そしてここで、前記テンプレート核酸は、３’から５’へと、以下：
（ｉ）  該ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含む該標的ｃＤＮＡの鎖に対して、少なくとも実質的に相補的である配列、
（ｉｉ）  ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、および
（ｉｉｉ）  該ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含む該標的ｃＤＮＡの鎖に実質的に相補的ではない配列、
を含む、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、前記標的ｃＤＮＡが一本鎖であり、そして前記ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み、そしてここで、前記テンプレート核酸は、３’から５’へと、以下：
（ｉ）  該標的ｃＤＮＡに少なくとも実質的に相補的である配列、
（ｉｉ）  該ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、および
（ｉｉｉ）  該標的ｃＤＮＡに実質的に相補的ではない配列、
を含む、方法。
【請求項７】
前記標的ｃＤＮＡが固定される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記テンプレート核酸分子が、前記ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記テンプレート核酸分子が、前記ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列中の１つ以上のヌクレオチドが、前記標的ｃＤＮＡまたは前記標的ｍＲＮＡのヌクレオチドと従来の塩基対を形成しない、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｃＤＮＡ分子もしくは前記ｃＤＮＡ集団または前記生物学的サンプルの前記ＲＮＡ分子が、固体支持体に固定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記テンプレート核酸分子が、固体支持体に固定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項９に記載の方法であって、ここで、前記ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列に対して５’側に配置される配列は、該ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列に対して５’側に配置される配列と少なくとも実質的に同一である、方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、ここで、前記ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列に対して５’側に配置される配列は、ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列に対して５’側に配置される配列と厳密に同一である、方法。
【請求項１５】
前記ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列に対して５’側に配置される配列は、少なくとも１０ヌクレオチドである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記ニック形成剤が、ニック形成エンドヌクレアーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ニック形成エンドヌクレアーゼが、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ニック形成剤が、制限エンドヌクレアーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記工程（Ｂ）が、等温条件下で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記工程（Ｂ）が、５０℃〜７０℃で行われる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記工程（Ｂ）が、６０℃で行われる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法であって、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼが、ｅｘｏ−Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｂｓｔ、ｅｘｏ−Ｐｆｕ、ｅｘｏ−Ｂｃａ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｔ５  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、ファージＭ２  ＤＮＡポリメラーゼ、ファージＰｈｉＰＲＤ１  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、ＰＲＤ１  ＤＮＡポリメラーゼ、９°ＮｍＴＭ  ＤＮＡポリメラーゼ、およびＴ４  ＤＮＡポリメラーゼホモ酵素からなる群より選択される、方法。
【請求項２４】
前記５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼが、ｅｘｏ−Ｂｓｔポリメラーゼ、ｅｘｏ−Ｂｃａポリメラーゼ、ｅｘｏ−Ｖｅｎｔポリメラーゼ、９°ＮｍＴＭ  ＤＮＡポリメラーゼ、またはｅｘｏ−Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔポリメラーゼである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、鎖置換活性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、鎖置換活性を有さない、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記工程（Ｂ）が、鎖置換促進剤の存在下で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法であって、ここで、前記鎖置換促進剤は、ＢＭＲＦ１ポリメラーゼ補助サブユニット、アデノウイルスＤＮＡ結合タンパク質、単純ヘルペスウイルスタンパク質ＩＣＰ８、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、ファージＴ４遺伝子３２タンパク質、ウシ胸腺ヘリカーゼ、およびトレハロースからなる群より選択される、方法。
【請求項２９】
前記鎖置換促進剤が、トレハロースである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記工程（Ｂ）の前記一本鎖核酸分子が、多くとも２４ヌクレオチドを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記工程（Ｂ）の前記一本鎖核酸分子が、多くとも２０ヌクレオチドを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記工程（Ｂ）の前記一本鎖核酸分子が、多くとも１７ヌクレオチドを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記工程（Ｂ）の前記一本鎖核酸分子が、多くとも１２ヌクレオチドを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記工程（Ｂ）の前記一本鎖核酸分子が、多くとも８ヌクレオチドを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
請求項１に記載の方法であって、前記工程（Ｃ）が、質量分析、液体クロマトグラフィー、蛍光偏光、核酸ハイブリダイゼーション、および電気泳動からなる群より選択される技術の使用により少なくとも部分的に行われる、方法。
【請求項３６】
前記工程（Ｃ）が、液体クロマトグラフィーの使用により、少なくとも部分的に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
前記工程（Ｃ）が、質量分析の使用により、少なくとも部分的に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
前記工程（Ｃ）が、液体クロマトグラフィーおよび質量分析の使用により少なくとも部分的に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
サンプル中のｍＲＮＡの存在もしくは非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）  テンプレートとして、該サンプル中の該ｍＲＮＡ分子を用いて一本鎖ｃＤＮＡ分子を合成する工程；
（ｂ）  以下：
（ｉ）  工程（ａ）からの一本鎖ｃＤＮＡ分子；
（ｉｉ）  一本鎖核酸プローブであって、該一本鎖核酸プローブは、３’から５’までに、標的核酸の３’部分に少なくとも実質的に相補的である配列、およびニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含む、一本鎖核酸プローブ、
を含む、混合物を形成する工程；
（ｃ）  工程（ｂ）の混合物からハイブリダイズしていないプローブを取り除く工程；
（ｄ）  該ニック形成剤認識配列を認識するニック形成剤の存在下で増幅反応を行う工程；および
（ｅ）  工程（ｄ）の増幅産物の存在もしくは非存在を検出および／または特徴付けして、該サンプル中の該標的核酸の存在もしくは非存在を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項４０】
前記一本鎖ｃＤＮＡ分子の５’末端が固定される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記工程（ａ）が、固定されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いて行われる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ｃＤＮＡ集団中のニック形成剤認識配列を含む二本鎖標的ｃＤＮＡ分子の存在もしくは非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（Ａ）  該ｃＤＮＡ集団、該ニック形成剤認識配列を認識するニック形成剤、ＤＮＡポリメラーゼ、および１つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸を含む混合物を形成する工程；
（Ｂ）  標的ｃＤＮＡ分子が該ｃＤＮＡ集団中に存在するならば、該標的ｃＤＮＡ分子の一方の鎖をテンプレートとして用いて一本鎖核酸分子が増幅される条件に、該混合物を維持する工程；および
（Ｃ）  工程（Ｂ）において増幅した該一本鎖核酸フラグメントの存在もしくは非存在を検出して、該標的ｃＤＮＡの存在もしくは非存在を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項４３】
前記ｃＤＮＡ集団は、制限エンドヌクレアーゼで消化された後、前記工程（Ａ）の前記ニック形成剤、前記ＤＮＡポリメラーゼ、および１つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸と混合される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
ｃＤＮＡ集団をプロファイリングするための方法であって、該方法は、以下：
（Ａ）  該ｃＤＮＡ集団、ニック形成剤、ＤＮＡポリメラーゼ、および前記１つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸を含む混合物を形成する工程；
（Ｂ）  該ニック形成剤の認識配列を含むｃＤＮＡ分子をテンプレートとして用いて一本鎖核酸分子が増幅される条件に、該混合物を維持する工程；および
（Ｃ）  該一本鎖核酸フラグメントを特徴付けして、該ｃＤＮＡ集団をプロファイルする工程、
を包含する、方法。
【請求項４５】
前記ｃＤＮＡ集団は、制限エンドヌクレアーゼで消化された後、前記工程（Ａ）の前記ニック形成剤、前記ＤＮＡポリメラーゼ、および前記１つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸と混合される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記ニック形成剤が、ニック形成エンドヌクレアーゼである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記ニック形成剤が、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、ｅｘｏ−Ｂｓｔポリメラーゼ、ｅｘｏ−Ｂｃａポリメラーゼ、ｅｘｏ−Ｖｅｎｔポリメラーゼ、９°ＮｍＴＭ  ＤＮＡポリメラーゼ、およびｅｘｏ−Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔポリメラーゼから選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
前記工程（Ｂ）が、等温条件で行われる、請求項４４に記載の方法。
【請求項５０】
前記工程（Ｃ）の前記１つ以上の一本鎖核酸フラグメントが、多くとも２５のヌクレオチドを有する、請求項４４に記載の方法。
【請求項５１】
前記工程（Ｃ）の前記１つ以上の一本鎖核酸フラグメントが、多くとも１７のヌクレオチドを有する、請求項４４に記載の方法。
【請求項５２】
前記工程（Ｃ）の前記１つ以上の一本鎖核酸フラグメントが、多くとも１２のヌクレオチドを有する、請求項４４に記載の方法。
【請求項５３】
前記工程（Ｃ）の前記１つ以上の一本鎖核酸フラグメントが、多くとも８のヌクレオチドを有する、請求項４４に記載の方法。
【請求項５４】
前記工程（Ｃ）が、液体クロマトグラフィーの使用により、少なくとも部分的に行われる、請求項４４に記載の方法。
【請求項５５】
前記工程（Ｃ）が、質量分析の使用により、少なくとも部分的に行われる、請求項４４に記載の方法。
【請求項５６】
前記工程（Ｃ）が、液体クロマトグラフィーおよび質量分析の使用により、少なくとも部分的に行われる、請求項４４に記載の方法。
【請求項５７】
ｃＤＮＡ集団中の標的ｃＤＮＡ分子の存在もしくは非存在を決定するため、または生物学的サンプル中の標的ｍＲＮＡの存在もしくは非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（Ａ）  以下：
（ｉ）  該ｃＤＮＡ集団中の該ｃＤＮＡ分子、または該生物学的サンプル中の該ＲＮＡ分子；
（ｉｉ）  以下：
（ａ）  ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列、該ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、またはその両方；および
（ｂ）  該鎖自体またはその伸長産物のいずれかが、該ニック形成剤認識配列を認識するニック形成剤によりニック形成可能な、ニック形成部位を含む該鎖中の５’突出部、または
該鎖もその伸長産物も、該ニック形成部位を含まない該鎖中の３’突出部、
を含む、部分的に二本鎖の核酸プローブを含む、混合物を形成する工程であって、
ここで、各突出部は、該標的ｃＤＮＡが一本鎖である場合、該標的ｃＤＮＡに少なくとも実質的に相補的な核酸配列を含むか、
該標的ｃＤＮＡが二本鎖である場合、該標的ｃＤＮＡの一方の鎖に少なくとも実質的に相補的な核酸配列を含むか、または
該標的ｍＲＮＡに少なくとも実質的に相補的な核酸配列を含む、工程；
（Ｂ）  該ｃＤＮＡ分子またはｍＲＮＡ分子にハイブリダイズしている該プローブ分子を、該ｃＤＮＡ分子またはｍＲＮＡ分子にハイブリダイズしていないプローブ分子から分離する工程；
（Ｃ）  該ハイブリダイズしたプローブ分子および該ニック形成剤認識部位を認識するニック形成剤の存在下で増幅反応を行って、該標的ｃＤＮＡが該ｃＤＮＡ集団中に存在する場合、または該標的ｍＲＮＡが該生物学的サンプル中に存在する場合、テンプレートとして該部分的に二本鎖の核酸プローブの一方の鎖を用いて、一本鎖核酸フラグメントを増幅する工程；ならびに
（Ｄ）  工程（Ｃ）の一本鎖核酸フラグメントの存在もしくは非存在を検出して、該ｃＤＮＡ集団中の該標的ｃＤＮＡの存在もしくは非存在を決定するか、または該生物学的サンプル中の該標的ｍＲＮＡの存在もしくは非存在を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項５８】
前記ｃＤＮＡ集団中の前記ｃＤＮＡ分子または前記生物学的サンプルの前記ＲＮＡ分子が、固体支持体に固定される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記ニック形成剤が、ニック形成エンドヌクレアーゼである、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
ｃＤＮＡ集団中の標的ｃＤＮＡ分子の存在もしくは非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（Ａ）  第１のオリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第２のＯＤＮＰ、および該ｃＤＮＡ集団中の該ｃＤＮＡ分子の混合物を形成する工程であって、ここで、
（ｉ）  該標的ｃＤＮＡが第１の鎖および第２の鎖を有する二本鎖核酸である場合、
該第１のＯＤＮＰは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列のセンス鎖のヌクレオチド配列、および該標的核酸の該第１の鎖の第１の部分に少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、そして
該第２のＯＤＮＰは、該標的核酸の第２の鎖の第２の部分に少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、そして制限エンドヌクレアーゼ認識配列の一方の鎖の配列を含み、該第２の部分は、該標的核酸の該第２の鎖中の該第１の部分の該相補鎖に対して３’側に配置されるか、あるいは、
（ｉｉ）  該標的核酸が一本鎖核酸である場合、
該第１のＯＤＮＰは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列のセンス鎖のヌクレオチド配列、および該標的核酸の第１の部分に少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列を含み、そして
該第２のＯＤＮＰは、該標的核酸の第２の部分に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして制限エンドヌクレアーゼ認識配列の一方の鎖の配列を含み、該第２の部分は、該標的核酸の該第１の部分に対して５’側に配置される、工程；
（Ｂ）  該標的ｃＤＮＡが該ｃＤＮＡ集団中に存在する場合、該混合物を以下の条件：
（ｉ）  該第１のＯＤＮＰおよび該第２のＯＤＮＰを伸長させて、該第１のＯＤＮＰおよび該第２のＯＤＮＰを含む伸長産物を生成する条件；
（ｉｉ）  必要に応じて、工程（ｉ）の伸長産物を、該制限エンドヌクレアーゼ認識配列を認識する制限エンドヌクレアーゼを用いて消化して、消化産物を提供する条件；
（ｉｉｉ）該ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列を認識するニック形成エンドヌクレアーゼの存在下で、工程（Ｂ）（ｉ）の伸長産物の一方の鎖または工程（Ｂ）（ｉｉ）の消化産物をテンプレートとして用いて一本鎖核酸フラグメントが増幅される条件、
に供する工程；および
（Ｃ）  工程（Ｂ）（ｉｉ）の一本鎖核酸フラグメントの存在もしくは非存在を検出して、該ｃＤＮＡ集団中の該標的ｃＤＮＡの存在もしくは非存在を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項６１】
前記ＲＥＲＳがＩＩ型制限エンドヌクレアーゼにより認識可能である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
ｃＤＮＡ集団中の標的ｃＤＮＡ分子の存在もしくは非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（Ａ）  第１のオリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第２のＯＤＮＰ、および該ｃＤＮＡ集団中の該ｃＤＮＡ分子の混合物を形成する工程であって、ここで、
（ｉ）  該標的ｃＤＮＡが第１の鎖および第２の鎖を有する二本鎖核酸である場合、
該第１のＯＤＮＰは、第１のニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のセンス鎖のヌクレオチド配列、および該標的ｃＤＮＡの該第１の鎖の第１の部分に少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、そして
該第２のＯＤＮＰは、該標的核酸の第２の鎖の第２の部分に少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、そして第２のＮＥＲＳのセンス鎖の配列を含み、該第２の部分は、該標的ｃＤＮＡの該第２の鎖中の該第１の部分の該相補鎖に対して３’側に配置されるか、あるいは、
（ｉｉ）  該標的ｃＤＮＡが一本鎖核酸である場合、
該第１のＯＤＮＰは、第１のＮＥＲＳのセンス鎖のヌクレオチド配列、および該標的ｃＤＮＡの第１の部分に少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列を含み、そして
該第２のＯＤＮＰは、該標的核酸の第２の部分に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして第２のＮＥＲＳのセンス鎖の配列を含み、該第２の部分は、該標的ｃＤＮＡの該第１の部分に対して５’側に配置される、工程；
（Ｂ）  該標的ｃＤＮＡが該ｃＤＮＡ集団中に存在する場合、該混合物を以下の条件：
（ｉ）  該第１のＯＤＮＰおよび該第２のＯＤＮＰを伸長させて、該第１のＮＥＲＳおよび該第２のＮＥＲＳの両方を含む伸長産物を生成する条件；
（ｉｉ）該第１のＮＥＲＳおよび該第２のＮＥＲＳを認識する１つ以上のニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）の存在下で、工程（Ｂ）（ｉ）の伸長産物の一方の鎖をテンプレートとして用いて一本鎖核酸フラグメントが増幅される条件、
に供する工程；
（Ｃ）  工程（Ｂ）（ｉｉ）の一本鎖核酸フラグメントの存在もしくは非存在を検出して、サンプル中の該標的核酸の存在もしくは非存在を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項６３】
前記第１のＮＥＲＳおよび前記第２のＮＥＲＳが、同一である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記第１のＯＤＮＰ、前記第２のＯＤＮＰ、または両方のＯＤＮＰが、固体支持体に固定される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
ｃＤＮＡ集団中の標的ｃＤＮＡの存在または非存在を決定する方法であって、該方法は、以下：
（Ａ）  第１のオリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第２のＯＤＮＰ、および該ｃＤＮＡ集団中の該ｃＤＮＡ分子の混合物を形成する工程であって、ここで、
（ｉ）  該標的ｃＤＮＡが第１の鎖および第２の鎖を有する二本鎖核酸である場合、
該第１のＯＤＮＰは、第１の制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＲＥＲＳ）のセンス鎖のヌクレオチド配列、および該標的ｃＤＮＡの該第１の鎖の第１の部分に少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、そして
該第２のＯＤＮＰは、該標的核酸の第２の鎖の第２の部分に少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、そして第２のＲＥＲＳのセンス鎖の配列を含み、該第２の部分は、該標的ｃＤＮＡの該第２の鎖中の該第１の部分の該相補鎖に対して３’側に配置されるか、あるいは、
（ｉｉ）  該標的ｃＤＮＡが一本鎖核酸である場合、
該第１のＯＤＮＰは、第１のＲＥＲＳのセンス鎖のヌクレオチド配列、および該標的ｃＤＮＡの第１の部分に少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列を含み、そして
該第２のＯＤＮＰは、該標的核酸の第２の部分に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして第２のＲＥＲＳのセンス鎖の配列を含み、該第２の部分は、該標的ｃＤＮＡの該第１の部分に対して５’側に配置される、工程；
（Ｂ）  該標的ｃＤＮＡが該ｃＤＮＡ集団中に存在する場合、該混合物を以下の条件：
（ｉ）  該第１のＯＤＮＰおよび該第２のＯＤＮＰを伸長させて、該第１のＲＥＲＳおよび該第２のＲＥＲＳの両方を含む伸長産物を生成する条件；
（ｉｉ）該第１のＲＥＲＳおよび該第２のＲＥＲＳを認識する１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）の存在下で、工程（Ｂ）（ｉ）の伸長産物の一方の鎖をテンプレートとして用いて一本鎖核酸フラグメントが増幅される条件、
に供する工程；ならびに
（Ｃ）  工程（Ｂ）（ｉｉ）の一本鎖核酸フラグメントの存在もしくは非存在を検出して、ｃＤＮＡ集団中の該標的ｃＤＮＡの存在もしくは非存在を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項６６】
前記第１のＲＥＲＳが、前記第２のＲＥＲＳと同一である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記第１のＯＤＮＰ、前記第２のＯＤＮＰ、または両方のＯＤＮＰが固定される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
ｃＤＮＡ集団中の標的ｃＤＮＡ分子の存在または非存在を決定するか、あるいは生物学的サンプル中の標的ｍＲＮＡの存在または非存在を決定する方法であって、該方法は、以下：
（Ａ）  以下：
（ｉ）  該ｃＤＮＡ集団の該ｃＤＮＡ分子、または該生物学的サンプル中の該ＲＮＡ分子、
（ｉｉ）  以下：
（ａ）  第１のニック形成剤認識配列の一方の鎖を含み、そして
（ｂ）  該標的ｃＤＮＡが一本鎖の場合、該標的ｃＤＮＡに少なくとも実質的に相補的であるか、
該標的ｃＤＮＡが二本鎖の場合、該標的ｃＤＮＡの一方の鎖に少なくとも実質的に相補的であるか、または
該標的ｍＲＮＡに少なくとも実質的に相補的である、
第１の一本鎖テンプレート核酸分子（Ｔ１）、
（ｉｉｉ）  該第１のニック形成剤認識配列を認識する第１のニック形成剤、
（ｉｖ）  ＤＮＡポリメラーゼ、および
（ｖ）  １つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸；
を含む混合物を形成する工程；
（Ｂ）  該標的ｃＤＮＡが該ｃＤＮＡ集団中に存在するならば、または該標的ｍＲＮＡが該生物学的サンプル中に存在するならば、該標的ｃＤＮＡの部分、該標的ｍＲＮＡの部分、または該テンプレート核酸分子の部分をテンプレートとして用いて第１の一本鎖核酸分子（Ａ１）が増幅される条件に、該混合物を維持する工程；
（Ｃ）  Ａ１に対して少なくとも実質的に相補的であり、そして第２のニック形成剤認識配列の一方の鎖を含む、第２の一本鎖テンプレート核酸分子（Ｔ２）を提供する工程；
（Ｄ）  テンプレートとしてＡ１またはＴ２のいずれかを用いて、第２のニック形成剤認識配列を認識する第２のニック形成剤の存在下で増幅反応を行って、第２の一本鎖核酸分子（Ａ２）を増幅する工程；および
（Ｅ）  Ａ２の存在または非存在を検出して、該ｃＤＮＡ集団中の該標的ｃＤＮＡ分子の存在または非存在、あるいは生物学的サンプル中の該標的ｍＲＮＡの存在または非存在を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項６９】
請求項６８に記載の方法であって、ここで、前記第１のテンプレート核酸は一本鎖であり、そして前記第１のニック形成剤認識配列の一方の鎖の配列に対して３’側に位置付けられ、該標的ｃＤＮＡが一本鎖である場合に、該標的ｃＤＮＡの３’部分に対して少なくとも実質的に相補的であるか、該標的ｃＤＮＡが二本鎖である場合に、該標的ｃＤＮＡの一方の鎖に対して少なくとも実質的に相補的であるか、または該標的ｍＲＮＡに対して少なくとも実質的に相補的である、配列を含む、方法。
【請求項７０】
請求項６８に記載の方法であって、ここで、前記標的ｃＤＮＡは二本鎖であり、そして前記第１のニック形成剤認識配列を含み、そしてここで、前記第１のテンプレート核酸が、該第１のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含む、該標的ｃＤＮＡの部分を含む、方法。
【請求項７１】
請求項６８に記載の方法であって、ここで、前記標的ｃＤＮＡが一本鎖であり、そして前記第１のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み、そしてここで、前記第１のテンプレート核酸分子が、該第１のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含む、方法。
【請求項７２】
請求項６８に記載の方法であって、ここで前記標的ｃＤＮＡが二重鎖であり、そして前記第１のニック形成剤認識配列を含み、そしてここで、該第１のテンプレート核酸が、３’から５’へと、以下：
（ｉ）  該第１のニック形成剤認識配列のセンス鎖に配列を含む、該標的ｃＤＮＡの鎖に少なくとも実質的に相補的である配列、
（ｉｉ）  該第１のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、
（ｉｉｉ）  該第１のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含む該標的ｃＤＮＡの鎖に実質的に相補的ではない配列、
を含む、方法。
【請求項７３】
請求項６８に記載の方法であって、ここで前記標的ｃＤＮＡが一本鎖であり、そして前記第１のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み、そしてここで、該第１のテンプレート核酸が、３’から５’へと、以下：
（ｉ）  該標的ｃＤＮＡに少なくとも実質的に相補的である配列、
（ｉｉ）  該第１のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、および
（ｉｉｉ）  該標的ｃＤＮＡに実質的に相補的ではない配列、
を含む、方法。
【請求項７４】
前記標的ｃＤＮＡが固定される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７５】
前記Ｔ１が、前記第１のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７６】
前記Ｔ１が、前記第１のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７７】
前記Ｔ２が、前記第２のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７８】
前記Ｔ２が、前記第２のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７９】
前記ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列中の１つ以上のヌクレオチドが、前記標的ｃＤＮＡまたは前記標的ｍＲＮＡのヌクレオチドと従来の塩基対を形成しない、請求項７５に記載の方法。
【請求項８０】
前記ｃＤＮＡ分子もしくはｃＤＮＡ集団、または生物学的サンプル中のＲＮＡ分子が、固体支持体に固定される、請求項６８に記載の方法。
【請求項８１】
前記テンプレート核酸分子が、固体支持体に固定される、請求項６８に記載の方法。
【請求項８２】
前記ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列に対して５’側に配置される配列が、該ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列に対して５’側に配置される配列に少なくとも実質的に同一である、請求項７６に記載の方法。
【請求項８３】
前記ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列に対して５’側に配置される配列が、ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列に対して５’側に配置される配列に厳密に同一である、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列に対して５’側に配置される配列が、少なくとも１０ヌクレオチドである、請求項８２に記載の方法。
【請求項８５】
前記第１のニック形成剤および前記第２のニック形成剤の両方が、ニック形成エンドヌクレアーゼである、請求項６８に記載の方法。
【請求項８６】
前記第１のニック形成剤および前記第２のニック形成剤が同一である、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記ニック形成エンドヌクレアーゼが、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉである、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記第１のニック形成剤および前記第２のニック形成剤が、制限エンドヌクレアーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項８９】
請求項６８に記載の方法であって、前記工程（Ａ）〜（Ｄ）が、単一の容器中で行われる、方法。
【請求項９０】
請求項６８に記載の方法であって、前記工程（Ｂ）および（Ｄ）が、等温条件下で行われる、方法。
【請求項９１】
請求項９０に記載の方法であって、前記工程（Ｂ）および（Ｄ）が、５０℃〜７０℃で行われる、方法。
【請求項９２】
請求項９１に記載の方法であって、前記工程（Ｂ）および（Ｄ）が、６０℃で行われる、方法。
【請求項９３】
請求項１に記載の方法であって、前記工程（Ｂ）および（Ｄ）が、５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼの存在下で行われる、方法。
【請求項９４】
請求項９３に記載の方法であって、ここで、前記５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼが、ｅｘｏ−Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−Ｂｓｔ、ｅｘｏ−Ｐｆｕ、ｅｘｏ−Ｂｃａ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｔ５  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、ファージＭ２  ＤＮＡポリメラーゼ、ファージＰｈｉＰＲＤ１  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、ＰＲＤ１  ＤＮＡポリメラーゼ、９°ＮｍＴＭＤＮＡポリメラーゼ、およびＴ４  ＤＮＡポリメラーゼホロ酵素からなる群より選択される、方法。
【請求項９５】
前記５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼが、ｅｘｏ−Ｂｓｔポリメラーゼ、ｅｘｏ−Ｂｃａポリメラーゼ、ｅｘｏ−Ｖｅｎｔポリメラーゼ、９°ＮｍＴＭＤＮＡポリメラーゼ、またはｅｘｏ−Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔポリメラーゼである、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
請求項６８に記載の方法であって、前記工程（Ｂ）および（Ｄ）が、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼの存在下で行われる、方法。
【請求項９７】
請求項６８に記載の方法であって、前記工程（Ｂ）および（Ｄ）が、鎖置換活性を有さないＤＮＡポリメラーゼの存在下で行われる、方法。
【請求項９８】
請求項６８に記載の方法であって、前記工程（Ｂ）および（Ｄ）が、鎖置換促進因子促進因子の存在下で行われる、方法。
【請求項９９】
請求項９８に記載の方法であって、ここで、前記鎖置換促進因子促進因子が、ＢＭＲＦ１ポリメラーゼ補助サブユニット、アデノウイルスＤＮＡ結合タンパク質、単純ヘルペスウイルスタンパク質ＩＣＰ８、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、ファージＴ４遺伝子３２タンパク質、ウシ胸腺ヘリカーゼ、およびトレハロースからなる群より選択される、方法。
【請求項１００】
前記鎖置換促進因子が、トレハロースである、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記Ａ１が、多くとも２４ヌクレオチドを有する、請求項６８に記載の方法。
【請求項１０２】
前記Ａ１が、多くとも２０ヌクレオチドを有する、請求項６８に記載の方法。
【請求項１０３】
前記Ａ１が、多くとも１７ヌクレオチドを有する、請求項６８に記載の方法。
【請求項１０４】
前記Ａ１が、多くとも１２ヌクレオチドを有する、請求項６８に記載の方法。
【請求項１０５】
前記Ａ１が、多くとも８ヌクレオチドを有する、請求項６８に記載の方法。
【請求項１０６】
前記Ａ２が、多くとも２４ヌクレオチドを有する、請求項６８に記載の方法。
【請求項１０７】
前記Ａ１が、多くとも２０ヌクレオチドを有する、請求項６８に記載の方法。
【請求項１０８】
前記Ａ１が、多くとも１７のヌクレオチドを有する、請求項６８に記載の方法。
【請求項１０９】
前記Ａ１が、多くとも１２ヌクレオチドを有する、請求項６８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記Ａ１が、多くとも８ヌクレオチドを有する、請求項６８に記載の方法。
【請求項１１１】
請求項６８に記載の方法であって、前記工程（Ｅ）が、質量分析、液体クロマトグラフィー、蛍光偏光、核酸ハイブリダイゼーション、および電気泳動からなる群より選択される技術を使用することにより、少なくとも部分的に行われる、方法。
【請求項１１２】
請求項６８に記載の方法であって、前記工程（Ｅ）が、液体クロマトグラフィーの使用により少なくとも部分的に行われる、方法。
【請求項１１３】
請求項６８に記載の方法であって、前記工程（Ｅ）が、質量分析の使用により少なくとも部分的に行われる、方法。
【請求項１１４】
請求項６８に記載の方法であって、前記工程（Ｅ）が、液体クロマトグラフィーおよび質量分析の使用により少なくとも部分的に行われる、方法。
【請求項１１５】
ｃＤＮＡ集団における標的ｃＤＮＡ分子の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（Ａ）以下：
（ｉ）  該ｃＤＮＡ集団の該ｃＤＮＡ分子、
（ｉｉ）  以下：
（ａ）  第１のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含み、そして
（ｂ）  該標的ｃＤＮＡが一本鎖の場合、該標的ｃＤＮＡに少なくとも実質的に相補的であるか、または
該標的ｃＤＮＡが二本鎖の場合、該標的ｃＤＮＡの一方の鎖に少なくとも実質的に相補的である、
第１の一本鎖テンプレート核酸分子（Ｔ１）、
（ｉｉｉ）  ３’から５’へと、以下：
（ａ）  該第１のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列に対して５’側に配置されるＴ１の配列と少なくとも実質的に同一である配列、および
（ｂ）  第２のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、
を含む、第２の一本鎖テンプレート核酸分子（Ｔ２）、
（ｉｖ）  該第１のニック形成剤認識配列を認識する第１のニック形成剤、
（ｖ）  該第２のニック形成剤認識配列を認識する第２のニック形成剤、
（ｖｉ）  ＤＮＡポリメラーゼ、および
（ｖｉｉ）  １つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸；
を含む混合物を形成する工程；
（Ｂ）  該標的ｃＤＮＡが、該ｃＤＮＡ集団中に存在するならば、Ｔ２をテンプレートとして用いて第１の一本化核酸（Ａ２）が増幅される条件に、該混合物を維持する工程；および
（Ｃ）  Ａ２の存在または非存在を検出して、該ｃＤＮＡ集団中の該標的ｃＤＮＡの存在または非存在を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１１６】
前記第１のニック形成剤認識配列が、第２のニック形成剤認識配列と同一である、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
請求項１１５に記載の方法であって、ここで、前記Ｔ２が、前記第２のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖に対して５’に配置される配列に少なくとも実質的に同一である、該第２のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖に対して３’側に配置される配列を含む、方法。
【請求項１１８】
請求項１１５に記載の方法であって、ここで、前記第２のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖に対して３’側に配置される配列が、該第２のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖に対して５’に配置される配列と厳密に同一である、方法。
【請求項１１９】
前記ｃＤＮＡ集団の前記ｃＤＮＡ分子が固定される、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１２０】
前記Ｔ１が固定される、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１２１】
前記Ｔ２が固定される、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１２２】
請求項１１５に記載の方法であって、ここで、前記Ｔ２が、前記第２のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列に対して３’に配置される配列に少なくとも実質的に同一である、該第２のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列に対して５’側に配置される配列を含む、方法。
【請求項１２３】
前記第２のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列に対して５’側に配置される配列が、多くとも１０ヌクレオチドの長さである、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
ｃＤＮＡ集団における標的ｃＤＮＡ分子の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（Ａ）以下：
（ｉ）  該ｃＤＮＡ集団の該ｃＤＮＡ分子、
（ｉｉ）  以下：
（ａ）  第１のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み、そして
（ｂ）  該標的ｃＤＮＡが一本鎖の場合、該標的ｃＤＮＡに少なくとも実質的に相補的であるか、または
該標的ｃＤＮＡが二本鎖の場合、該標的ｃＤＮＡの一方の鎖に少なくとも実質的に相補的である、
第１の一本鎖テンプレート核酸分子（Ｔ１）、
（ｉｉｉ）  ３’から５’へと、以下：
（ａ）  該第１のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列に対して３’側に配置されるＴ１の配列と少なくとも実質的に相補的である配列、および
（ｂ）  第２のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、
を含む、第２の一本鎖テンプレート核酸分子（Ｔ２）、
（ｉｖ）  該第１のニック形成剤認識配列を認識する第１のニック形成剤、
（ｖ）  該第２のニック形成剤認識配列を認識する第２のニック形成剤、
（ｖｉ）  ＤＮＡポリメラーゼ、および
（ｖｉｉ）  １つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸；
を含む混合物を形成する工程；
（Ｂ）  該標的ｃＤＮＡが該ｃＤＮＡ集団中に存在するならば、Ｔ２をテンプレートとして用いて第１の一本化核酸（Ａ２）が増幅される条件に、該混合物を維持する工程；ならびに
（Ｃ）  Ａ２の存在または非存在を検出して、該ｃＤＮＡ集団中の該標的ｃＤＮＡ分子の存在または非存在を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１２５】
前記第１のニック形成剤認識配列が、前記第２のニック形成剤認識配列と同一である、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
前記ｃＤＮＡ集団の前記ｃＤＮＡ分子が固定される、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２７】
前記Ｔ１が固定される、請求項１２４の方法。
【請求項１２８】
前記Ｔ２が固定される、請求項１２４の方法。
【請求項１２９】
ｃＤＮＡ集団における標的ｃＤＮＡ分子の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（Ａ）以下：
（ｉ）  該ｃＤＮＡ集団の該ｃＤＮＡ分子、
（ｉｉ）  以下：
（ａ）  第１のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含み、そして
（ｂ）  該標的ｃＤＮＡが一本鎖の場合、該標的ｃＤＮＡに少なくとも実質的に相補的であるか、または
該標的ｃＤＮＡが二本鎖の場合、該標的ｃＤＮＡの一方の鎖に少なくとも実質的に相補的である、
第１の一本鎖テンプレート核酸分子（Ｔ１）、
（ｉｉｉ）  ３’から５’へと、以下：
（ａ）  該第１のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列に対して５’側に配置されるＴ１の配列と少なくとも実質的に同一である配列、および
（ｂ）  第２のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列、
を含む、第２の一本鎖テンプレート核酸分子（Ｔ２）、
（ｉｖ）  該第１のニック形成剤認識配列を認識する第１のニック形成剤、
（ｖ）  該第２のニック形成剤認識配列を認識する第２のニック形成剤、
（ｖｉ）  ＤＮＡポリメラーゼ、および
（ｖｉｉ）  １つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸；
を含む混合物を形成する工程；
（Ｂ）  該標的ｃＤＮＡが該ｃＤＮＡ集団中に存在するならば、該第１のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖に対して５’側に配置されるＴ１の配列と少なくとも実質的に同一である、第１の一本鎖核酸分子（Ａ２）が増幅される条件下に、該混合物を維持する工程；ならびに
（Ｃ）  Ａ２の存在または非存在を検出して、該ｃＤＮＡ集団中の該標的ｃＤＮＡ分子の存在または非存在を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１３０】
前記第１のニック形成剤認識配列が、前記第２のニック形成認識配列と同一である、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
前記ｃＤＮＡ集団の前記ｃＤＮＡ分子が固定される、請求項１２９の方法。
【請求項１３２】
Ｔ１が固定される、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３３】
Ｔ２が固定される、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３４】
ｃＤＮＡ集団における標的ｃＤＮＡ分子の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（Ａ）以下：
（ｉ）  該ｃＤＮＡ集団の該ｃＤＮＡ分子、
（ｉｉ）  以下：
（ａ）  第１のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み、そして
（ｂ）  該標的ｃＤＮＡが一本鎖の場合、該標的ｃＤＮＡに少なくとも実質的に相補的であるか、または
該標的ｃＤＮＡが二本鎖の場合、該標的ｃＤＮＡの一方の鎖に少なくとも実質的に相補的である、
第１の一本鎖テンプレート核酸分子（Ｔ１）、
（ｉｉｉ）  ３’から５’へと、以下：
（ａ）  該第１のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列に対して３’側に配置されるＴ１の配列と少なくとも実質的に相補的である配列、および
（ｂ）  第２のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列、
を含む、第２の一本鎖テンプレート核酸分子（Ｔ２）、
（ｉｖ）  該第１のニック形成剤認識配列を認識する第１のニック形成剤、
（ｖ）  該第２のニック形成剤認識配列を認識する第２のニック形成剤、
（ｖｉ）  ＤＮＡポリメラーゼ、および
（ｖｉｉ）  １つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸；
を含む混合物を形成する工程；
（Ｂ）  該標的ｃＤＮＡが該ｃＤＮＡ集団中に存在するならば、該第１のニック形成剤認識配列のセンス鎖に対して３’側に配置されるＴ１の配列に対して少なくとも実質的に同一である、第１の一本鎖核酸分子（Ａ２）が増幅される条件に、該混合物を維持する工程；ならびに
（Ｃ）  Ａ２の存在または非存在を検出して、該ｃＤＮＡ集団中の該標的ｃＤＮＡ分子の存在または非存在を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１３５】
前記第１のニック形成剤認識配列が、前記第２のニック形成認識配列と同一である、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３６】
前記ｃＤＮＡ集団の前記ｃＤＮＡ分子が固定される、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３７】
前記Ｔ１が固定される、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３８】
前記Ｔ２が固定される、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３９】
ｃＤＮＡ集団における標的ｃＤＮＡ分子の存在または非存在を決定するか、あるいは生物学的サンプル中の標的ｍＲＮＡ分子の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（Ａ）以下：
（ｉ）  該ｃＤＮＡ集団の該ｃＤＮＡ分子、該生物学的サンプル中の標的ＲＮＡ分子、
（ｉｉ）  ３’から５’へと、以下：
（ａ）  該標的ｃＤＮＡが一本鎖の場合、該標的ｃＤＮＡの３’部分に少なくとも実質的に相補的である第１の配列、または
該標的ｃＤＮＡが二本鎖の場合、該標的ｃＤＮＡの一方の鎖の３’部分に少なくとも実質的に相補的である第１の配列、または
該標的ｍＲＮＡの３’部分に少なくとも実質的に相補的である、第１の配列、
（ｂ）  第１のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、および
（ｃ）第２の配列、
を含む、第１のテンプレート核酸分子（Ｔ１）、
（ｉｉｉ）  ３’から５’へと、以下：
（ａ）  Ｔ１の第２の配列と少なくとも実質的に同一である第１の配列、
（ｂ）  第２のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、および
（ｃ）  第２の配列、
を含む、第２のテンプレート核酸分子（Ｔ２）、
（ｉｖ）  該第１のニック形成剤認識配列を認識する第１のニック形成剤、
（ｖ）  該第２のニック形成剤認識配列を認識する第２のニック形成剤、
（ｖｉ）  ＤＮＡポリメラーゼ、および
（ｖｉｉ）  １つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸；
を含む混合物を形成する工程；
（Ｂ）  該標的ｃＤＮＡが該ｃＤＮＡ集団中に存在するならば、Ｔ２の第２の配列をテンプレートとして用いて一本鎖核酸分子（Ａ２）が増幅される条件に、該混合物を維持する工程；および
（Ｃ）  Ａ２の存在または非存在を検出して、該ｃＤＮＡ集団中の該標的ｃＤＮＡ分子の存在または非存在、あるいは該生物学的サンプル中の該標的ｍＲＮＡの存在または非存在を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１４０】
前記Ｔ２の第２の配列が、Ｔ２の第１の配列に少なくとも実質的に同一である、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
前記Ｔ２の第２の配列が、Ｔ２の第１の配列と厳密に同一である、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４２】
前記第１のニック形成剤および前記第２のニック形成剤が同一である、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４３】
前記第１のニック形成剤および前記第２のニック形成剤が、ニック形成エンドヌクレアーゼである、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４４】
前記第１のニック形成剤および第２のニック形成剤が、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉである、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４５】
ｃＤＮＡ集団における第１のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含む標的ｃＤＮＡ分子の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（Ａ）以下：
（ｉ）  該ｃＤＮＡ集団の該ｃＤＮＡ分子、
（ｉｉ）  ３’から５’へと、以下：
（ａ）  該第１のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列に対してすぐ５’側に配置される該標的ｃＤＮＡの部分に少なくとも実質的に相補的である第１の配列、
（ｂ）  第１のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、および
（ｃ）第２の配列、
を含む、第１のテンプレート核酸分子（Ｔ１）、
（ｉｉｉ）  ３’から５’へと、以下：
（ａ）  Ｔ１の第２の配列と少なくとも実質的に同一である第１の配列、
（ｂ）  第２のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、および
（ｃ）  第２の配列、
を含む、第２のテンプレート核酸分子（Ｔ２）、
（ｉｖ）  該第１のニック形成剤認識配列を認識する第１のニック形成剤、
（ｖ）  該第２のニック形成剤認識配列を認識する第２のニック形成剤、
（ｖｉ）  ＤＮＡポリメラーゼ、および
（ｖｉｉ）  １つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸；
を含む混合物を形成する工程；
（Ｂ）  該標的ｃＤＮＡが該ｃＤＮＡ集団中に存在するならば、Ｔ２の第２の配列をテンプレートとして用いて一本鎖核酸分子（Ａ２）が増幅される条件下に、該混合物を維持する工程；ならびに
（Ｃ）  Ａ２の存在または非存在を検出して、該ｃＤＮＡ集団中の該標的ｃＤＮＡの存在または非存在を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１４６】
前記Ｔ２の第２の配列が、前記Ｔ２の第１の配列と少なくとも実質的に同一である、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１４７】
前記Ｔ２の第２の配列が、前記Ｔ２の第１の配列と厳密に同一である、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１４８】
前記第１のニック形成剤および前記第２のニック形成剤が、同一である、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１４９】
前記第１のニック形成剤および前記第２のニック形成剤が、ニック形成エンドヌクレアーゼである、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５０】
前記第１のニック形成剤および前記第２のニック形成剤が、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉである、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５１】
前記Ｔ１の第１の配列が、前記第１のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列に対してすぐ５’側に配置された前記標的ｃＤＮＡの部分に対して厳密に相補的である、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１５２】
前記Ｔ１の第２の配列が、前記第１のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列に対してすぐ３’側に配置された前記標的ｃＤＮＡの部分と少なくとも実質的に相補的である、請求項１４５または１５１に記載の方法。
【請求項１５３】
前記Ｔ１の第２の配列が、前記第１のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列に対してすぐ３’側に配置された前記標的ｃＤＮＡの部分に対して厳密に相補的である、請求項１５２に記載の方法。
【請求項１５４】
天然に存在するゲノムＤＮＡ、または天然に存在するｍＲＮＡのｃＤＮＡの部分に少なくとも実質的に同一である配列を含む核酸であって、ここで、
（Ａ）  天然に存在するゲノムＤＮＡまたは天然に存在するｍＲＮＡのｃＤＮＡの部分は、３’から５’へと、以下：
（ｉ）  ３〜５０ヌクレオチドの長さである第１の配列、
（ｉｉ）  ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、および
（ｉｉｉ）  ８〜５０ヌクレオチドの長さである第２の配列、
からなり；
（Ｂ）  該核酸は、多くとも１２０ヌクレオチドの長さであり；そして
（Ｃ）該核酸が、配列Ａ（ｉｉ）を含む、核酸。
【請求項１５５】
前記配列Ａ（ｉ）が、５〜１０ヌクレオチドの長さである、請求項１５４に記載の核酸。
【請求項１５６】
前記配列Ａ（ｉｉｉ）が、１２〜２４ヌクレオチドの長さである、請求項１５４または１５５に記載の核酸。
【請求項１５７】
前記ニック形成剤認識配列が、ニック形成エンドヌクレアーゼにより認識可能である、請求項１５４に記載の核酸。
【請求項１５８】
前記ニック形成エンドヌクレアーゼが、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉである、請求項１５７に記載の核酸。
【請求項１５９】
前記核酸が、天然に存在するゲノムＤＮＡの部分を含む、請求項１５４に記載の核酸。
【請求項１６０】
前記核酸が、天然に存在するｍＲＮＡのｃＤＮＡの部分を含む、請求項１５４に記載の核酸。
【請求項１６１】
前記核酸が、多くとも３０ヌクレオチドの長さである、請求項１５４に記載の核酸。
【請求項１６２】
前記核酸が、多くとも２５ヌクレオチドの長さである、請求項１５４に記載の核酸。
【請求項１６３】
前記核酸が、多くとも２０ヌクレオチドの長さである、請求項１５４に記載の核酸。
【請求項１６４】
前記核酸が、その３’末端または５’末端を介して固定される、請求項１５４に記載の核酸。
【請求項１６５】
請求項１５４に記載の核酸であって、ここで、前記天然に存在するゲノムＤＮＡまたは前記天然に存在するｍＲＮＡのｃＤＮＡの前記部分と少なくとも実質的に同一である前記配列が、該天然に存在するゲノムＤＮＡまたは該天然に存在するｍＲＮＡのｃＤＮＡの該部分と厳密に同一である、核酸。
【請求項１６６】
請求項１５４に記載の核酸であって、ここで、前記天然に存在するゲノムＤＮＡまたは前記天然に存在するｍＲＮＡのｃＤＮＡの前記部分と少なくとも実質的に同一である前記配列が、該天然に存在するゲノムＤＮＡまたは該天然に存在するｍＲＮＡのｃＤＮＡの該部分と少なくとも９５％同一である、核酸。
【請求項１６７】
請求項１５４に記載の核酸であって、ここで、前記天然に存在するゲノムＤＮＡまたは前記天然に存在するｍＲＮＡのｃＤＮＡの前記部分と少なくとも実質的に同一である前記配列が、該天然に存在するゲノムＤＮＡまたは該天然に存在するｍＲＮＡのｃＤＮＡの該部分と少なくとも９８％同一である、核酸。
【請求項１６８】
一本鎖核酸であって、以下：
（ａ）  多くとも１００ヌクレオチドの長さであり、
（ｂ）  ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含み、
（ｃ）  ｃＤＮＡ分子に実質的に相補的であり、そして
（ｄ）  該ニック形成剤認識配列を認識するニック形成剤の存在下で、一本鎖核酸フラグメントを増幅するためのテンプレートとして機能し得る、一本鎖核酸。
【請求項１６９】
一本鎖核酸であって、以下：
（ａ）  多くとも１００ヌクレオチドの長さであり、
（ｂ）  ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み、
（ｃ）  ｃＤＮＡ分子に実質的に相補的であり、そして
（ｄ）  該ｃＤＮＡ分子にアニールする場合、該ニック形成剤認識配列を認識するニック形成剤の存在下で、該ｃＤＮＡ分子の部分を増幅することが可能である、一本鎖核酸。
【請求項１７０】
前記一本鎖核酸が、多くとも５０ヌクレオチドの長さである、請求項１６８または１６９に記載の一本鎖核酸。
【請求項１７１】
前記一本鎖核酸が、多くとも３０ヌクレオチドの長さである、請求項１６８または１６９に記載の一本鎖核酸。
【請求項１７２】
前記一本鎖核酸が、多くとも２５ヌクレオチドの長さである、請求項１６８または１６９に記載の一本鎖核酸。
【請求項１７３】
前記一本鎖核酸が、多くとも２０ヌクレオチドの長さである、請求項１６８または１６９に記載の一本鎖核酸。
【請求項１７４】
前記ニック形成剤が、ニック形成エンドヌクレアーゼである、請求項１６８または１６９に記載の一本鎖核酸。
【請求項１７５】
前記ニック形エンドヌクレアーゼが、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉである、請求項１７４に記載の一本鎖核酸。
【請求項１７６】
前記一本鎖核酸が、前記ｃＤＮＡ分子の部分と厳密に同一である、請求項１６８または１６９に記載の一本鎖核酸。
【請求項１７７】
前記一本鎖核酸が、固体支持体に固定される、請求項１６８または１６９に記載の一本鎖核酸。
【請求項１７８】
ｃＤＮＡ集団における標的ｃＤＮＡ分子の存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（Ａ）  以下：
（ｉ）  該ｃＤＮＡ集団の該ｃＤＮＡ分子、
（ｉｉ）  以下：
（ａ）  認識配列の外側にニックを形成するニック形成剤により認識可能な、二本鎖ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み、そして
（ｂ）  該一本鎖標的核酸の第１の領域、または二本鎖標的核酸の一方の鎖の第１の領域に少なくとも実質的に相補的である、
オリゴヌクレオチドプライマー；ならびに
（ｉｉｉ）  部分的に二本鎖の核酸であって、
（ａ）  二本鎖ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列、および
（ｂ）  該一本鎖標的ｃＤＮＡの第２の領域、もしくは該一本鎖標的ｃＤＮＡの第１の領域に対して５’側に配置される、該二本鎖標的ｃＤＮＡの第２の領域、または該二本鎖標的ｃＤＮＡの一方の鎖の第２の領域に、少なくとも実質的に相補的である、３’突出部、
を含む、部分的に二本鎖の核酸、
を含む混合物を、
該オリゴヌクレオチドプライマーと、該一本鎖標的ｃＤＮＡの第１の領域または該二本鎖核酸の一方の鎖の第１の領域との間のハイブリダイゼーション、および該部分的に二本鎖の核酸の３’突出部と、該一本鎖標的ｃＤＮＡの第２の領域または該二本鎖核酸の一方の鎖の第２の領域との間のハイブリダイゼーションを可能にする条件下で形成する工程；
（Ｂ）  該オリゴヌクレオチドプライマーおよび部分的に二本鎖の核酸に、該第２の領域でハイブリダイズした、該一本鎖標的ｃＤＮＡまたは該二本鎖標的ｃＤＮＡの一方の鎖を消化する工程；ならびに
（Ｃ）  該ニック形成剤の存在下で、テンプレートとして、工程（Ｂ）において消化した該一本鎖標的ｃＤＮＡの部分、または該二本鎖標的ｃＤＮＡの一方の鎖の部分を用いて一本鎖核酸分子を増幅する、増幅反応を行う工程、ならびに
（Ｄ）  工程（Ｃ）の一本鎖核酸分子の存在または非存在を検出して、該ｃＤＮＡ集団中の該標的ｃＤＮＡ分子の存在または非存在を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１７９】
前記二本鎖ニック形成剤認識配列が、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉにより認識可能である、請求項１７８に記載の方法。
【請求項１８０】
請求項１７８に記載の方法であって、ここで、前記二本鎖ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列中のヌクレオチドは、前記オリゴヌクレオチドプライマーが、前記標的核酸にアニールする場合、前記一本鎖標的ｃＤＮＡまたは前記二本鎖ｃＤＮＡの一方の鎖の別のヌクレオチドと、従来の塩基対合を形成しない、方法。
【請求項１８１】
前記ＴＲＥＲＳが、ＰｌｅｌまたはＭｌｙｌにより認識可能である、請求項１７８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、分子生物学の分野に関し、より具体的には、核酸を含む方法および組成物に関し、そしてなおより具体的には、ニック形成剤を用いる遺伝子発現分析に関連する方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術の説明）
遺伝子発現分析は、疾患ならびに生物の成長および発達に関与する遺伝子を同定するために重要である。このような分析の感度を増加させるために、ｃＤＮＡ分子が、検出または定量される前に増幅され得る。多数の核酸増幅方法が、ｃＤＮＡを増幅するために使用され得、この方法は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、および鎖置換増幅（ＳＤＡ）である。核酸増幅のために広く使用される方法のほとんど（例えば、ＰＣＲ）が、変性および再アニーリングのサイクルを達成するために、異なる温度のサイクルを必要とする。他の方法は、等温で実施され得るが、複数セットのプライマー（例えば、好熱性ＳＤＡのバンパープライマー）を必要とする。従って、遺伝子発現分析の感度を増加させるための、より単純かつより効率的なｃＤＮＡ増幅方法について、当該分野において長期にわたり、必要性が感じられている。
【０００３】
本発明は、この必要性および以下に記載されるような関連する必要性を満たす。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の簡単な要旨）
ｃＤＮＡ分子のような核酸を増幅するための、現在利用可能な方法とは対照的に、本発明は、複数セットのオリゴヌクレオチドプライマーの使用を必要としない、核酸増幅のための方法を提供する。さらに、本発明は、等温条件下で実施され得、従って、異なる温度のサイクルを提供するための設備に関連する費用を回避し得る。
【０００５】
１つの局面において、本発明は、ｃＤＮＡ集団中の標的ｃＤＮＡ分子の存在もしくは非存在を決定するため、または生物学的サンプル中の標的ｍＲＮＡ分子の存在もしくは非存在を決定するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：
（Ａ）  以下：
（ｉ）  ｃＤＮＡ集団のｃＤＮＡ分子または生物学的サンプルのＲＮＡ分子、
（ｉｉ）  以下：
（ａ）  ニック形成剤認識配列の一方の鎖を含み、そして
（ｂ）  標的ｃＤＮＡが一本鎖である場合、標的ｃＤＮＡに少なくとも実質的に相補的であるか、
標的ｃＤＮＡが二本鎖である場合、標的ｃＤＮＡの一方の鎖に少なくとも実質的に相補的であるか、または
標的ｍＲＮＡに少なくとも実質的に相補的である、テンプレート核酸分子、
（ｉｉｉ）  認識配列を認識するニック形成剤、
（ｉｖ）  ＤＮＡポリメラーゼ、および
（ｖ）  １つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸、
を含む、混合物を形成する工程；
（Ｂ）  標的ｃＤＮＡがｃＤＮＡ集団中に存在するならば、または標的ｍＲＮＡが生物学的サンプル中に存在するならば、標的ｃＤＮＡの一部、標的ｍＲＮＡの一部、またはテンプレート核酸分子の一部をテンプレートとして用いて一本鎖核酸分子が増幅される条件に、混合物を維持する工程；ならびに
（Ｃ）  一本鎖核酸分子の存在もしくは非存在を検出して、ｃＤＮＡ集団中の標的ｃＤＮＡ分子の存在もしくは非存在を決定するか、または生物学的サンプル中の標的ｍＲＮＡの存在もしくは非存在を決定する工程。
【０００６】
特定の実施形態において、テンプレート核酸は、ニック形成剤認識配列の一方の鎖の配列に対して３’側に配置される配列を含み、この配列は、標的ｃＤＮＡが一本鎖である場合、標的ｃＤＮＡの３’部分に少なくとも実質的に相補的であるか、標的ｃＤＮＡが二本鎖である場合、標的ｃＤＮＡの一方の鎖の３’部分に少なくとも実質的に相補的であるか、または標的ｍＲＮＡに少なくとも実質的に相補的である。
【０００７】
いくつかの実施形態において、標的ｃＤＮＡは、二本鎖であり、そしてニック形成剤認識配列を含み、そしてここで、テンプレート核酸は、標的ｃＤＮＡの、ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含む部分を含む。
【０００８】
他の実施形態において、標的ｃＤＮＡは、一本鎖であり、そしてニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み、そしてここで、テンプレート核酸は、ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態において、標的ｃＤＮＡが二本鎖であり、そしてニック形成剤認識配列を含み、そしてここで、テンプレート核酸は、３’から５’へと、以下を含む：
（ｉ）  ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含む標的ｃＤＮＡの鎖に対して、少なくとも実質的に相補的である配列、
（ｉｉ）  ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、および
（ｉｉｉ）  ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含む標的ｃＤＮＡの鎖に実質的に相補的ではない配列。
【００１０】
特定の実施形態において、標的ｃＤＮＡが一本鎖であり、そしてニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み、そしてここで、テンプレート核酸は、３’から５’へと、以下を含む：
（ｉ）  標的ｃＤＮＡに少なくとも実質的に相補的である配列、
（ｉｉ）  ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、および
（ｉｉｉ）  標的ｃＤＮＡに実質的に相補的ではない配列。
【００１１】
いくつかの実施形態において、テンプレート核酸分子が、ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含む。このような実施形態において、ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列中の１つ以上のヌクレオチドが、標的ｃＤＮＡまたは標的ｍＲＮＡのヌクレオチドと従来の塩基対を形成しても形成しなくてもよい。
【００１２】
他の実施形態において、テンプレート核酸分子が、ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含む。
【００１３】
別の局面において、本発明は、サンプル中のｍＲＮＡの存在もしくは非存在を決定するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）  テンプレートとして、サンプル中のｍＲＮＡ分子を用いて一本鎖ｃＤＮＡ分子を合成する工程；
（ｂ）  以下：
（ｉ）  工程（ａ）からの一本鎖ｃＤＮＡ分子；
（ｉｉ）  一本鎖核酸プローブであって、一本鎖核酸プローブは、３’から５’へと、標的核酸の３’部分に少なくとも実質的に相補的である配列、およびニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含む、一本鎖核酸プローブ、
を含む、混合物を形成する工程；
（ｃ）  工程（ｂ）の混合物からハイブリダイズしていないプローブを取り除く工程；
（ｄ）  ニック形成剤認識配列を認識するニック形成剤の存在下で増幅反応を行う工程；および
（ｅ）  工程（ｄ）の増幅産物の存在もしくは非存在を検出および／または特徴付けして、サンプル中の標的核酸の存在もしくは非存在を決定する工程。
【００１４】
いくつかの実施形態において、一本鎖ｃＤＮＡ分子の５’末端は、例えば、固定されたオリゴヌクレオチドプライマーの使用によって固定される。
【００１５】
別の局面において、本発明は、ｃＤＮＡ集団中のニック形成剤認識配列を含む二本鎖標的ｃＤＮＡ分子の存在もしくは非存在を決定するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：
（Ａ）  ｃＤＮＡ集団、ニック形成剤認識配列を認識するニック形成剤、ＤＮＡポリメラーゼ、および１つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸を含む混合物を形成する工程；
（Ｂ）  標的ｃＤＮＡ分子が、ｃＤＮＡ集団中に存在するならば、標的ｃＤＮＡ分子の一方の鎖をテンプレートとして用いて一本鎖核酸分子が増幅される条件に、混合物を維持する工程；および
（Ｃ）  工程（Ｂ）において増幅した一本鎖核酸フラグメントの存在もしくは非存在を検出して、標的ｃＤＮＡの存在もしくは非存在を決定する工程。
【００１６】
別の局面において、本発明は、ｃＤＮＡ集団をプロファイリングするための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：
（Ａ）  ｃＤＮＡ集団、ニック形成剤、ＤＮＡポリメラーゼ、および１つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸を含む混合物を形成する工程；
（Ｂ）  ニック形成剤の認識配列を含むｃＤＮＡ分子をテンプレートとして用いて一本鎖核酸分子が増幅される条件に、混合物を維持する工程；および
（Ｃ）  一本鎖核酸フラグメントを特徴付けして、ｃＤＮＡ集団をプロファイルする工程。
【００１７】
別の局面において、本発明は、ｃＤＮＡ集団中の標的ｃＤＮＡ分子の存在もしくは非存在を決定するため、または生物学的サンプル中の標的ｍＲＮＡの存在もしくは非存在を決定するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：
（Ａ）  以下：
（ｉ）  ｃＤＮＡ集団中のｃＤＮＡ分子、または生物学的サンプル中のＲＮＡ分子；
（ｉｉ）  以下：
（ａ）  ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列、ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、またはその両方；および
（ｂ）  鎖自体またはその伸長産物のいずれかが、ニック形成剤認識配列を認識するニック形成剤によりニック形成可能な、ニック形成部位を含む鎖中の５’突出部、または
鎖もその伸長産物も、ニック形成部位を含まない鎖中の３’突出部、
を含む、部分的に二本鎖の核酸プローブ、
を含む、混合物を形成する工程であって、
ここで、各突出部は、標的ｃＤＮＡが一本鎖である場合、標的ｃＤＮＡに少なくとも実質的に相補的な核酸配列を含むか、
標的ｃＤＮＡが二本鎖である場合、標的ｃＤＮＡの一方の鎖に少なくとも実質的に相補的な核酸配列を含むか、または
標的ｍＲＮＡに少なくとも実質的に相補的な核酸配列を含む、工程；
（Ｂ）  ｃＤＮＡ分子またはｍＲＮＡ分子にハイブリダイズしているプローブ分子を、ｃＤＮＡ分子またはｍＲＮＡ分子にハイブリダイズしていないプローブ分子から分離する工程；
（Ｃ）  ハイブリダイズしたプローブ分子およびニック形成剤認識部位を認識するニック形成剤の存在下で増幅反応を行って、標的ｃＤＮＡがｃＤＮＡ集団中に存在する場合、または標的ｍＲＮＡが生物学的サンプル中に存在する場合、テンプレートとして部分的に二本鎖の核酸プローブの一方の鎖を用いて、一本鎖核酸フラグメントを増幅する工程；ならびに
（Ｄ）  工程（Ｃ）の一本鎖核酸フラグメントの存在もしくは非存在を検出して、ｃＤＮＡ集団中の標的ｃＤＮＡの存在もしくは非存在を決定するか、または生物学的サンプル中の標的ｍＲＮＡの存在もしくは非存在を決定する工程。
【００１８】
別の局面において、本発明は、ｃＤＮＡ集団中の標的ｃＤＮＡ分子の存在もしくは非存在を決定するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：
（Ａ）  第１のオリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第２のＯＤＮＰ、およびｃＤＮＡ集団中のｃＤＮＡ分子の混合物を形成する工程であって、ここで、
（ｉ）  標的ｃＤＮＡが第１の鎖および第２の鎖を有する二本鎖核酸である場合、
第１のＯＤＮＰは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列のセンス鎖のヌクレオチド配列、および標的核酸の第１の鎖の第１の部分に少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、そして
第２のＯＤＮＰは、標的核酸の第２の鎖の第２の部分に少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、そして制限エンドヌクレアーゼ認識配列の一方の鎖の配列を含み、第２の部分は、標的核酸の第２の鎖中の第１の部分の相補鎖に対して３’側に配置されるか、あるいは、
（ｉｉ）  標的核酸が一本鎖核酸である場合、
第１のＯＤＮＰは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列のセンス鎖のヌクレオチド配列、および標的核酸の第１の部分に少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列を含み、そして
第２のＯＤＮＰは、標的核酸の第２の部分に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして制限エンドヌクレアーゼ認識配列の一方の鎖の配列を含み、第２の部分は、標的核酸の第１の部分に対して５’側に配置される、工程；
（Ｂ）  標的ｃＤＮＡがｃＤＮＡ集団中に存在する場合、混合物を以下の条件：          
（ｉ）  第１のＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰを伸長させて、第１のＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰを含む伸長産物を生成する条件；
（ｉｉ）  必要に応じて、工程（ｉ）の伸長産物を、制限エンドヌクレアーゼ認識配列を認識する制限エンドヌクレアーゼを用いて消化して、消化産物を提供する条件；
（ｉｉｉ）ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列を認識するニック形成エンドヌクレアーゼの存在下で、テンプレートとして、工程（Ｂ）（ｉ）の伸長産物の一方の鎖または工程（Ｂ）（ｉｉ）の消化産物を用いて一本鎖核酸フラグメントを増幅する条件、
に供する工程；
（Ｃ）  工程（Ｂ）（ｉｉ）の一本鎖核酸フラグメントの存在もしくは非存在を検出して、ｃＤＮＡ集団中の標的ｃＤＮＡの存在もしくは非存在を決定する工程。
【００１９】
別の局面において、本発明は、ｃＤＮＡ集団中の標的ｃＤＮＡ分子の存在もしくは非存在を決定するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：
（Ａ）  第１のオリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第２のＯＤＮＰ、およびｃＤＮＡ集団中のｃＤＮＡ分子の混合物を形成する工程であって、ここで、
（ｉ）  標的ｃＤＮＡが第１の鎖および第２の鎖を有する二本鎖核酸である場合、
第１のＯＤＮＰは、第１のニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮＥＲＳ）のセンス鎖のヌクレオチド配列、および標的ｃＤＮＡの第１の鎖の第１の部分に少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、そして
第２のＯＤＮＰは、標的核酸の第２の鎖の第２の部分に少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、そして第２のＮＥＲＳのセンス鎖の配列を含み、第２の部分は、標的ｃＤＮＡの第２の鎖中の第１の部分の相補鎖に対して３’側に配置されるか、あるいは、
（ｉｉ）  標的ｃＤＮＡが一本鎖核酸である場合、
第１のＯＤＮＰは、第１のＮＥＲＳのセンス鎖のヌクレオチド配列、および標的ｃＤＮＡの第１の部分に少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列を含み、そして
第２のＯＤＮＰは、標的核酸の第２の部分に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして第２のＮＥＲＳのセンス鎖の配列を含み、第２の部分は、標的ｃＤＮＡの第１の部分に対して５’側に配置される、工程；
（Ｂ）  標的ｃＤＮＡがｃＤＮＡ集団中に存在する場合、混合物を以下の条件：
（ｉ）  第１のＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰを伸長させて、第１のＮＥＲＳおよび第２のＮＥＲＳの両方を含む伸長産物を生成する条件；
（ｉｉ）第１のＮＥＲＳおよび第２のＮＥＲＳを認識する１つ以上のニック形成エンドヌクレアーゼ（ＮＥ）の存在下で、テンプレートとして、工程（Ｂ）（ｉ）の伸長産物の一方の鎖を用いて、一本鎖核酸フラグメントを増幅する条件、
に供する工程；ならびに
（Ｃ）  工程（Ｂ）（ｉｉ）の一本鎖核酸フラグメントの存在もしくは非存在を検出して、サンプル中の標的核酸の存在もしくは非存在を決定する工程。
【００２０】
別の局面において、本発明は、ｃＤＮＡ集団中の標的ｃＤＮＡの存在または非存在を決定する方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：
（Ａ）  第１のオリゴヌクレオチドプライマー（ＯＤＮＰ）、第２のＯＤＮＰ、およびｃＤＮＡ集団中のｃＤＮＡ分子の混合物を形成する工程であって、ここで、
（ｉ）  標的ｃＤＮＡが第１の鎖および第２の鎖を有する二本鎖核酸である場合、
第１のＯＤＮＰは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＲＥＲＳ）のセンス鎖のヌクレオチド配列、および標的ｃＤＮＡの第１の鎖の第１の部分に少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、そして
第２のＯＤＮＰは、標的核酸の第２の鎖の第２の部分に少なくとも実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、そして第２のＲＥＲＳのセンス鎖の配列を含み、第２の部分は、標的ｃＤＮＡの第２の鎖中の第１の部分の相補鎖に対して３’側に配置されるか、あるいは、
（ｉｉ）  標的ｃＤＮＡが一本鎖核酸である場合、
第１のＯＤＮＰは、第１のＲＥＲＳのセンス鎖のヌクレオチド配列、および標的ｃＤＮＡの第１の部分に少なくとも実質的に同一であるヌクレオチド配列を含み、そして
第２のＯＤＮＰは、標的核酸の第２の部分に少なくとも実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、そして第２のＲＥＲＳのセンス鎖の配列を含み、第２の部分は、標的ｃＤＮＡの第１の部分に対して５’側に配置される、工程；
（Ｂ）  標的ｃＤＮＡがｃＤＮＡ集団中に存在する場合、混合物を以下の条件：
（ｉ）  第１のＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰを伸長させて、第１のＲＥＲＳおよび第２のＲＥＲＳの両方を含む伸長産物を生成する条件；
（ｉｉ）第１のＲＥＲＳおよび第２のＲＥＲＳを認識する１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）の存在下で、テンプレートとして、工程（Ｂ）（ｉ）の伸長産物の一方の鎖を用いて、一本鎖核酸フラグメントを増幅する条件、
に供する工程；ならびに
（Ｃ）  工程（Ｂ）（ｉｉ）の一本鎖核酸フラグメントの存在もしくは非存在を検出して、ｃＤＮＡ集団中の標的ｃＤＮＡの存在もしくは非存在を決定する工程。
【００２１】
別の局面において、本発明は、ｃＤＮＡ集団中の標的ｃＤＮＡ分子の存在もしくは非存在を決定するため、または生物学的サンプル中の標的ｍＲＮＡ分子の存在もしくは非存在を決定するための方法を提供し、この方法は、以下：
（Ａ）以下：
（ｉ）上記ｃＤＮＡ集団の上記ｃＤＮＡ分子または上記生物学的サンプルの上記ＲＮＡ分子、
（ｉｉ）以下：
（ａ）第１のニック形成剤認識配列の一方の鎖を含み、そして
（ｂ）上記標的ｃＤＮＡが一本鎖である場合、上記標的ｃＤＮＡに少なくとも実質的に相補的であるか、
上記標的ｃＤＮＡが二本鎖である場合、上記標的ｃＤＮＡの一方の鎖に少なくとも実質的に相補的であるか、または
上記標的ｍＲＮＡに少なくとも実質的に相補的である、第１の一本鎖テンプレート核酸分子（Ｔ１）、
（ｉｉｉ）上記第１のニック形成剤認識配列を認識する第１のニック形成剤、
（ｉｖ）ＤＮＡポリメラーゼ、および
（ｖ）１つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸、
を含む、混合物を形成する工程；
（Ｂ）上記標的ｃＤＮＡが上記ｃＤＮＡ集団中に存在するならば、または上記標的ｍＲＮＡが上記生物学的サンプル中に存在するならば、上記標的ｃＤＮＡの一部、上記標的ｍＲＮＡの一部、または上記テンプレート核酸分子の一部をテンプレートとして用いて第１の一本鎖核酸分子（Ａ１）が増幅される条件に、上記混合物を維持する工程；
（Ｃ）Ａ１に対して少なくとも実質的に相補的であり、そして第２のニック形成剤認識配列の一方の鎖を含む、第２の一本鎖テンプレート核酸分子（Ｔ２）を提供する工程；
（Ｄ）テンプレートとしてＡ１またはＴ２のいずれかを用いて、上記第２のニック形成剤認識配列を認識する第２のニック形成剤の存在下で増幅反応を行って、第２の一本鎖核酸分子（Ａ２）を増幅する工程；ならびに
（Ｅ）Ａ２の存在または非存在を検出して、上記ｃＤＮＡ集団中の上記標的ｃＤＮＡ分子の存在または非存在、あるいは上記生物学的サンプル中の上記標的ｍＲＮＡの存在または非存在を決定する工程、
を包含する。
【００２２】
いくつかの実施形態では、上記第１のテンプレート核酸は、一本鎖であり、そして上記第１のニック形成剤認識配列の一方の鎖の配列に対して３’側に位置付けられ、上記標的ｃＤＮＡが一本鎖である場合に、上記標的ｃＤＮＡの３’部分に対して少なくとも実質的に相補的であるか、上記標的ｃＤＮＡが二本鎖である場合に、上記標的ｃＤＮＡの一方の鎖に対して少なくとも実質的に相補的であるか、または上記標的ｍＲＮＡに対して少なくとも実質的に相補的である配列を含む。
【００２３】
いくつかの実施形態では、上記標的ｃＤＮＡは、二本鎖であり、そして上記第１のニック形成剤認識配列を含み、そしてここで、上記第１のテンプレート核酸は、上記第１のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含む上記標的ｃＤＮＡの部分を含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、上記標的ｃＤＮＡは、一本鎖であり、そして上記第１のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み、そしてここで、上記第１のテンプレート核酸分子は、上記第１のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含む。
【００２５】
特定の実施形態において、上記標的ｃＤＮＡは、二本鎖であり、そして上記第１のニック形成剤認識配列を含み、そしてここで、上記第１のテンプレート核酸は、３’から５’へと、以下：
（ｉ）上記第１のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含む、上記標的ｃＤＮＡの鎖に少なくとも実質的に相補的である配列、
（ｉｉ）上記第１のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、および
（ｉｉｉ）上記第１のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含む、上記標的ｃＤＮＡの鎖に実質的に相補的ではない配列、
を含む。
【００２６】
特定の実施形態では、上記標的ｃＤＮＡは、一本鎖であり、そして上記第１のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み、そしてここで、上記第１のテンプレート核酸は、３’から５’へと、以下：
（ｉ）上記標的ｃＤＮＡに少なくとも実質的に相補的である配列、
（ｉｉ）上記第１のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、および
（ｉｉｉ）上記標的ｃＤＮＡに実質的に相補的ではない配列、
を含む。
【００２７】
別の局面では、本発明は、ｃＤＮＡ集団中の標的ｃＤＮＡ分子の存在もしくは非存在を決定するための方法を提供し、この方法は、以下：
（Ａ）以下：
（ｉ）上記ｃＤＮＡ集団の上記ｃＤＮＡ分子、
（ｉｉ）以下：
（ａ）第１のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含み、そして
（ｂ）上記標的ｃＤＮＡが一本鎖の場合、上記標的ｃＤＮＡに少なくとも実質的に相補的であるか、または
上記標的ｃＤＮＡが二本鎖の場合、上記標的ｃＤＮＡの一方の鎖に少なくとも実質的に相補的である、
第１の一本鎖テンプレート核酸分子（Ｔ１）、
（ｉｉｉ）３’から５’へと、以下：
（ａ）上記第１のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列に対して５’側に配置される上記Ｔ１の配列と少なくとも実質的に同一である配列、および
（ｂ）第２のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、
を含む、第２の一本鎖テンプレート核酸分子（Ｔ２）、
（ｉｖ）上記第１のニック形成剤認識配列を認識する第１のニック形成剤、
（ｖ）上記第２のニック形成剤認識配列を認識する第２のニック形成剤、
（ｖｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、および
（ｖｉｉ）１つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸；
を含む、混合物を形成する工程；
（Ｂ）上記標的ｃＤＮＡが、上記ｃＤＮＡ集団中に存在するならば、上記Ｔ２をテンプレートとして用いて第１の一本化核酸分子（Ａ２）が増幅される条件に、上記混合物を維持する工程；ならびに
（Ｃ）Ａ２の存在または非存在を検出して、上記ｃＤＮＡ集団中の上記標的ｃＤＮＡ分子の存在または非存在を決定する工程、
を包含する。
【００２８】
別の局面では、本発明は、ｃＤＮＡ集団中の標的ｃＤＮＡ分子の存在または非存在を決定するための方法を提供し、この方法は、以下：  
（Ａ）以下：
（ｉ）上記ｃＤＮＡ集団の上記ｃＤＮＡ分子、
（ｉｉ）以下：
（ａ）第１のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み、そして
（ｂ）上記標的ｃＤＮＡが一本鎖の場合、上記標的ｃＤＮＡに少なくとも実質的に相補的であるか、または
上記標的ｃＤＮＡが二本鎖の場合、上記標的ｃＤＮＡの一方の鎖に少なくとも実質的に相補的である、
第１の一本鎖テンプレート核酸分子（Ｔ１）、
（ｉｉｉ）３’から５’へと、以下：
（ａ）上記第１のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列に対して３’側に配置されるＴ１の配列と少なくとも実質的に相補的である配列、
（ｂ）第２のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、
を含む、第２の一本鎖テンプレート核酸分子（Ｔ２）、
（ｉｖ）上記第１のニック形成剤認識配列を認識する第１のニック形成剤、
（ｖ）上記第２のニック形成剤認識配列を認識する第２のニック形成剤、
（ｖｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、および
（ｖｉｉ）１つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸；
を含む、混合物を形成する工程；
（Ｂ）上記標的ｃＤＮＡが、上記ｃＤＮＡ集団中に存在するならば、Ｔ２をテンプレートとして用いて第１の一本鎖核酸分子（Ａ２）が増幅される条件に、上記混合物を維持する工程；ならびに
（Ｃ）Ａ２の存在または非存在を検出して、上記ｃＤＮＡ集団中の上記標的ｃＤＮＡ分子の存在または非存在を決定する工程、
を包含する。
【００２９】
別の局面では、本発明は、ｃＤＮＡ集団中の標的ｃＤＮＡ分子の存在または非存在を決定するための方法を提供し、この方法は、以下：
（Ａ）以下：
（ｉ）上記ｃＤＮＡ集団の上記ｃＤＮＡ分子、
（ｉｉ）以下：
（ａ）第１のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含み、そして
（ｂ）上記標的ｃＤＮＡが一本鎖の場合、上記標的ｃＤＮＡに少なくとも実質的に相補的であるか、または
上記標的ｃＤＮＡが二本鎖の場合、上記標的ｃＤＮＡの一方の鎖に少なくとも実質的に相補的である、
第１の一本鎖テンプレート核酸分子（Ｔ１）、
（ｉｉｉ）３’から５’へと、以下：
（ａ）上記第１のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列に対して５’側に配置されるＴ１の配列と少なくとも実質的に同一である配列、および
（ｂ）第２のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列、
を含む、第２の一本鎖テンプレート核酸分子（Ｔ２）、
（ｉｖ）上記第１のニック形成剤認識配列を認識する第１のニック形成剤、
（ｖ）上記第２のニック形成剤認識配列を認識する第２のニック形成剤、
（ｖｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、および
（ｖｉｉ）１つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸；
を含む、混合物を形成する工程；
（Ｂ）上記標的ｃＤＮＡが上記ｃＤＮＡ集団中に存在するならば、上記第１のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖に対して５’側に配置されるＴ１の配列に対して少なくとも実質的に同一である、第１の一本鎖核酸分子（Ａ２）を増幅する条件に、上記混合物を維持する工程；ならびに
（Ｃ）Ａ２の存在または非存在を検出して、上記ｃＤＮＡ集団中の上記標的ｃＤＮＡ分子の存在または非存在を決定する工程、
を包含する。
【００３０】
別の局面では、本発明は、ｃＤＮＡ集団中の標的ｃＤＮＡ分子の存在または非存在を決定するための方法を提供し、この方法は、以下：
（Ａ）以下：
（ｉ）上記ｃＤＮＡ集団の上記ｃＤＮＡ分子、
（ｉｉ）以下：
（ａ）第１のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み、そして
（ｂ）上記標的ｃＤＮＡが一本鎖の場合、上記標的ｃＤＮＡに少なくとも実質的に相補的であるか、または
上記標的ｃＤＮＡが二本鎖の場合、上記標的ｃＤＮＡの一方の鎖に少なくとも実質的に相補的である、
第１の一本鎖テンプレート核酸分子（Ｔ１）、
（ｉｉｉ）３’から５’へと、以下：
（ａ）上記第１のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列に対して３’側に配置されるＴ１の配列と少なくとも実質的に相補的である配列、および
（ｂ）第２のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列、
を含む、第２の一本鎖テンプレート核酸分子（Ｔ２）、
（ｉｖ）上記第１のニック形成剤認識配列を認識する第１のニック形成剤、
（ｖ）上記第２のニック形成剤認識配列を認識する第２のニック形成剤、
（ｖｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、ならびに
（ｖｉｉ）１つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸；
を含む、混合物を形成する工程；
（Ｂ）上記標的ｃＤＮＡが上記ｃＤＮＡ集団中に存在するならば、上記第１のニック形成剤認識配列のセンス鎖に対して３’側に配置されるＴ１の配列に対して少なくとも実質的に同一である、第１の一本鎖核酸分子（Ａ２）を増幅する条件に、上記混合物を維持する工程；ならびに
（Ｃ）Ａ２の存在または非存在を検出して、上記ｃＤＮＡ集団中の上記標的ｃＤＮＡ分子の存在または非存在を決定する工程、
を包含する。
【００３１】
別の局面では、本発明は、ｃＤＮＡ集団中の標的ｃＤＮＡ分子の存在または非存在を決定するためか、あるいは生物学的サンプル中の標的ｍＲＮＡ分子の存在または非存在を決定するための方法を提供し、この方法は、以下：
（Ａ）以下：
（ｉ）上記ｃＤＮＡ集団の上記ｃＤＮＡ分子、または上記生物学的サンプル中の上記ＲＮＡ分子、
（ｉｉ）３’から５’へと、以下：
（ａ）上記標的ｃＤＮＡが一本鎖の場合、上記標的ｃＤＮＡの３’部分に少なくとも実質的に相補的である第１の配列、または
上記標的ｃＤＮＡが二本鎖の場合、上記標的ｃＤＮＡの一方の鎖の３’部分に少なくとも実質的に相補的である第１の配列、または
上記標的ｍＲＮＡの３’部分に少なくとも実質的に相補的である、第１の配列、
（ｂ）第１のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、および
（ｃ）第２の配列、
を含む、第１のテンプレート核酸分子（Ｔ１）、
（ｉｉｉ）３’から５’へと、以下：
（ａ）Ｔ１の上記第２の配列と少なくとも実質的に同一である第１の配列、
（ｂ）第２のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、および
（ｃ）第２の配列、
を含む、第２のテンプレート核酸分子（Ｔ２）、
（ｉｖ）上記第１のニック形成剤認識配列を認識する第１のニック形成剤、
（ｖ）上記第２のニック形成剤認識配列を認識する第２のニック形成剤、
（ｖｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、ならびに
（ｖｉｉ）１つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸；
を含む、混合物を形成する工程；
（Ｂ）上記標的ｃＤＮＡが上記ｃＤＮＡ集団中に存在するならば、Ｔ２の上記第２の配列をテンプレートとして用いて一本鎖核酸分子（Ａ２）が増幅される条件下で、上記混合物を維持する工程；ならびに
（Ｃ）Ａ２の存在または非存在を検出して、上記ｃＤＮＡ集団中の上記標的ｃＤＮＡ分子の存在または非存在、あるいは上記生物学的サンプル中の上記標的ｍＲＮＡの存在または非存在を決定する工程、
を包含する。
【００３２】
別の局面では、本発明は、ｃＤＮＡ集団において、第１のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含む標的ｃＤＮＡ分子の存在または不在を決定する方法を提供し、この方法は：
（Ａ）以下を含む混合物を形成する工程：
（ｉ）上記ｃＤＮＡ集団のｃＤＮＡ分子、
（ｉｉ）３’から５’へと、以下を含む第１のテンプレート核酸分子（Ｔ１）：
（ａ）上記第１のニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列のすぐ５’に位置する標的ｃＤＮＡの部分に少なくとも実質的に相補的である第１の配列、
（ｂ）第１のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、および
（ｃ）第２の配列、
（ｉｉｉ）３’から５’へと、以下を含む第２のテンプレート核酸分子（Ｔ２）：
（ａ）上記Ｔ１の第２の配列に少なくとも実質的に同一である第１の配列、
（ｂ）第２のニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、および
（ｃ）第２の配列、
（ｉｖ）上記第１のニック形成剤認識配列を認識する第１のニック形成剤、
（ｖ）上記第２のニック形成剤認識配列を認識する第２のニック形成剤、
（ｖｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、および
（ｖｉｉ）１以上のデオキシヌクレオシド三リン酸（単数または複数）；
（Ｂ）標的ｃＤＮＡが上記ｃＤＮＡ中に存在するならば、上記Ｔ２の第２の配列をテンプレートとして用いて一本鎖核酸分子（Ａ２）が増幅される条件に、上記混合物を維持する工程；および
（Ｃ）Ａ２の存在または不在を検出し、上記ｃＤＮＡ集団中の標的ｃＤＮＡ分子の存在または不在を検出する工程、を包含する。
【００３３】
別の局面では、本発明は、天然に存在するゲノムＤＮＡまたは天然に存在するｍＲＮＡのｃＤＮＡの一部分に少なくとも実質的に同一である配列を含む核酸を提供し、ここで、
（Ａ）上記天然に存在するゲノムＤＮＡまたは天然に存在するｍＲＮＡのｃＤＮＡの一部分は、３’から５’へと、以下からなり：
（ｉ）長さが３〜５０ヌクレオチドである第１の配列、
（ｉｉ）ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列、および
（ｉｉｉ）長さが８〜５０ヌクレオチドである第２の配列、
（Ｂ）上記核酸は、多くても長さが１２０ヌクレオチドであり；そして
（Ｃ）上記核酸は、配列Ａ（ｉｉ）を含む。
【００３４】
別の局面において、本発明は、一本鎖核酸を提供し、この核酸は、
（ａ）多くとも長さが１００ヌクレオチドであり、
（ｂ）ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含み、
（ｃ）ｃＤＮＡ分子に実質的に相補的であり、そして
（ｄ）上記ニック形成剤認識配列を認識するニック形成剤の存在下で一本鎖核酸フラグメントを増幅するためのテンプレートとして機能し得る。
【００３５】
関連する局面において、本発明は、一本鎖核酸を提供し、この一本鎖核酸は、
（ａ）多くとも長さが１００ヌクレオチドであり、
（ｂ）ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み、
（ｃ）ｃＤＮＡ分子に実質的に相補的であり、そして
（ｄ）上記ｃＤＮＡ分子にアニールするとき、ニック形成剤認識配列を認識するニック形成剤の存在下でｃＤＮＡ分子の一部分の増幅を可能にする。
【００３６】
別の局面では、本発明は、ｃＤＮＡ集団において標的ｃＤＮＡ分子の存在または不在を決定する方法を提供し、この方法は：
（Ａ）以下：
（ｉ）上記ｃＤＮＡ集団のｃＤＮＡ分子；
（ｉｉ）以下のオリゴヌクレオチドプライマー、
（ａ）上記認識配列の外側でニックを形成するニック形成剤により認識可能な二本鎖ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み、そして
（ｂ）上記一本鎖標的核酸または二本鎖標的核酸の第１の領域に少なくとも実質的に相補的である、オリゴヌクレオチドプライマー；および
（ｉｉｉ）以下の部分的に二本鎖である核酸、
（ａ）ＩＩ制限エンドヌクレアーゼ認識配列、および
（ｂ）一本鎖標的ｃＤＮＡ、またはこの一本鎖標的ｃＤＮＡの第１の領域の５’に位置する二本鎖標的ｃＤＮＡの１つの鎖、またはこの二本鎖標的ｃＤＮＡの１つの鎖の第２の領域に少なくとも実質的に相補的である３’突出部を含む、核酸；を含む混合物を、上記オリゴヌクレオチドプライマーと、上記一本鎖ｃＤＮＡの第１の領域または上記二本鎖核酸の１つの鎖との間、および上記部分的に二本鎖である核酸の３’突出部と、上記一本鎖標的ｃＤＮＡまたは上記二本鎖核酸の１つの鎖の第２の領域との間のハイブリダイゼーションを可能にする条件下で形成する工程；
（Ｂ）上記一本鎖標的ｃＤＮＡ、または上記第２の領域において、上記オリゴヌクレオチドプライマーおよび上記部分的に二本鎖である核酸にハイブリダイズした二本鎖標的ｃＤＮＡの１つの鎖を消化する工程；
（Ｃ）ニック形成剤の存在下、テンプレートとして、上記工程（Ｂ）で消化された一本鎖標的ｃＤＮＡまたは二本鎖標的ｃＤＮＡの１つの鎖の一部分を用いて一本鎖核酸分子を増幅する増幅反応を実施する工程；および
（Ｄ）上記工程（Ｃ）の一本鎖核酸分子の存在または不在を検出し、上記ｃＤＮＡ集団中の標的ｃＤＮＡ分子の存在または不在を決定する工程、を包含する。
【００３７】
本発明のこれらおよびその他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照する際明らかとなる。
【００３８】
（発明の詳細な説明）
本発明は、遺伝子発現分析のための方法、組成物およびキットを提供し、この分析は、例えば、生物学的サンプル中のｃＤＮＡ集団中の標的ｃＤＮＡまたは標的ｍＲＮＡの存在または非存在を決定する。本発明に従って、標的ｃＤＮＡの存在は、一本鎖核酸分子を直線的にまたは指数関数的に増幅する反応をトリガーする。一本鎖核酸分子の検出は、ｃＤＮＡ集団中の標的ｃＤＮＡの存在または生物学的サンプル中の標的ｍＲＮＡの存在を示す。本方法は、核酸増幅反応を使用するので、低いレベルの遺伝子発現の検出において敏感である。
【００３９】
（Ａ．定義）
本発明のより詳細な説明を提供する前に、以下のように、本明細書中で使用される場合の慣例を規定し、そして定義を提供することは、本発明の理解により有用であり得る。さらなる定義もまた、本発明の記載の全体にわたって提供される。
【００４０】
用語「３’」および「５’」は、核酸の一本鎖内の特定の部位の位置を記載するために、本明細書中で使用される。核酸内の位置が、参照ヌクレオチド「に対して３’」または参照ヌクレオチド配列「の３’」である場合、これは、その位置が参照ヌクレオチドまたは参照ヌクレオチド配列の３’末端と核酸の参照ヌクレオチド鎖の３’ヒドロキシルとの間に位置することを意味する。同様に、核酸内の位置が、参照ヌクレオチド「に対して５’」または参照ヌクレオチド配列「の５’」である場合、これは、参照ヌクレオチドまたは参照ヌクレオチド配列の５’末端と核酸の参照ヌクレオチド鎖の５’リン酸との間に位置することを意味する。さらに、ヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド「に対してすぐ３’」または参照ヌクレオチド配列「のすぐ３’」である場合、これは、このヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチドまたは参照ヌクレオチド配列の３’末端にすぐ隣接することを意味する。同様に、ヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド「に対してすぐ５’」または参照ヌクレオチド配列「のすぐ５’」である場合、これは、このヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチドまたは参照ヌクレオチド配列の５’末端にすぐ隣接することを意味する。
【００４１】
「一本鎖核酸の３’部分」は、核酸の３’末端を含む核酸の部分をいう。同様に、「一本鎖核酸の５’部分」は、核酸の５’末端を含む核酸の部分をいう。
【００４２】
「二本鎖核酸の１つの鎖の３’部分」は、核酸のこの鎖の３’末端を含む核酸のこの鎖の部分をいう。同様に、「二本鎖核酸の１つの鎖の５’部分」は、核酸のこの鎖の５’末端を含む核酸のこの鎖の部分をいう。
【００４３】
「天然に存在するゲノムＤＮＡ」および「天然に存在するｃＤＮＡ」は、それぞれ、精製された形態または精製されない形態のいずれにおいてでも、天然に存在するゲノムＤＮＡ分子およびｃＤＮＡ分子をいう。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、「ニック形成」は、完全に二本鎖の核酸分子または部分的に二本鎖の核酸分子の二本鎖の部分の、ニック形成を行う酵素によって認識されるヌクレオチド配列に対する特定の位置での一方の鎖のみの切断をいう。核酸がニック形成される特定の位置は、「ニック形成部位」（ＮＳ）といわれる。
【００４５】
「ニック形成剤」（ＮＡ）は、完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子の特定のヌクレオチド配列を認識し、そしてこの認識配列に対して特定の位置で核酸分子のただ１つの鎖を切断する酵素である。ニック形成剤としては、完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子が、半改変された認識／切断配列を含む場合、ニック形成エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ）および制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＨｉｎｃＩＩ）が挙げられるがこれらに限定されず、この半改変された認識／切断配列において、一本の鎖は、制限エンドヌクレアーゼによるその鎖（すなわち、誘導体化されたヌクレオチドを含む鎖）の切断を阻止する少なくとも１つの誘導体化されたヌクレオチドを含む。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、「ニック形成エンドヌクレアーゼ」（ＮＥ）は、完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子のヌクレオチド配列を認識し、そして認識配列に対して特定の位置で核酸分子のただ１つの鎖を切断するエンドヌクレアーゼをいう。少なくとも１つの誘導体化されたヌクレオチドを含むことによって改変され、完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子の誘導体化されたヌクレオチド含有鎖の切断を阻止する、その認識配列を必要とする、制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）と違って、ＮＥは、代表的に、ネイティブなヌクレオチドのみを含むヌクレオチド配列を認識し、そしてこのヌクレオチド配列を含む完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子の１つの鎖のみを切断する。
【００４７】
本明細書中で使用される場合、「ネイティブなヌクレオチド」は、アデニル酸、グアニル酸、シチジル酸、チミジル酸またはウリジル酸をいう。「誘導体化されたヌクレオチド」は、ネイティブなヌクレオチドではないヌクレオチドをいう。
【００４８】
ＮＡが認識する完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子のヌクレオチド配列は、「ニック形成剤認識配列」（ＮＡＲＳ）といわれる。同様に、ＮＥが認識する完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子のヌクレオチド配列は、「ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列」（ＮＥＲＳ）といわれる。ＲＥが認識する特定の配列は、「制限エンドヌクレアーゼ認識配列」（ＲＥＲＳ）といわれる。本明細書中で使用される場合、「半改変されたＲＥＲＳ」は、１つの鎖の認識配列が、少なくとも１つの誘導体化されたヌクレオチド（例えば、α−チオデオキシヌクレオチド）を含み、これは、ＲＥＲＳを認識するＲＥによる鎖（すなわち、認識配列内に誘導体化されたヌクレオチドを含む鎖）の切断を阻止する二本鎖ＲＥＲＳをいう。
【００４９】
特定の実施形態において、ＮＡＲＳは、１つの鎖の配列の各ヌクレオチドが、もう１つの鎖の対応する位置のヌクレオチドに対して相補的である二本鎖ヌクレオチド配列である。このような実施形態において、ＮＡＲＳを認識するＮＡによってニック形成可能なＮＳを含む鎖におけるＮＡＲＳの配列は、「ＮＡＲＳのセンス鎖の配列」または「二本鎖ＮＡＲＳのセンス鎖の配列」といわれ、一方、ＮＳを含まない鎖におけるＮＡＲＳ配列は、「ＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列」または「二本鎖ＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列」といわれる。
【００５０】
同様に、ＮＥＲＳが、１つの鎖がもう１つの鎖に厳密に相補的である二本鎖ヌクレオチド配列である実施形態において、ＮＥＲＳを認識するＮＥによってニック形成可能なＮＳを含む鎖に位置するＮＥＲＳの配列は、「ＮＥＲＳのセンス鎖の配列」または「二本鎖ＮＥＲＳのセンス鎖の配列」といわれ、一方、ＮＳを含まない鎖に位置するＮＥＲＳの配列は、「ＮＥＲＳのアンチセンス鎖の配列」または「二本鎖ＮＥＲＳのアンチセンス鎖の配列」といわれる。例えば、例示的なニック形成エンドヌクレアーゼ（Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ）の認識配列およびニック形成部位は、以下に示され、切断部位を示すために「黒逆三角形」を用い、そして任意のヌクレオチドを示すためにＮを用いる：
【００５１】
【化１】
2005516610.tif 000002
Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ認識配列のセンス鎖の配列は、５’−ＧＡＧＴＣ−３’であるのに対して、アンチセンス鎖の配列は、５’−ＧＡＣＴＣ−３’である。
【００５２】
同様に、半改変されたＲＥＲＳを認識するＲＥによってニック形成可能なＮＳを含む鎖（すなわち、いずれの誘導体化されたヌクレオチドも含まない鎖）に位置する半改変されたＲＥＲＳの配列は、「半改変されたＲＥＲＳのセンス鎖の配列」といわれ、半改変されたＲＥＲＳを含む核酸の「半改変されたＲＥＲＳのセンス鎖」に位置し、一方、ＮＳを含まない鎖（すなわち、誘導体化されたヌクレオチドを含む鎖）における半改変されたＲＥＲＳの配列は、「半改変されたＲＥＲＳのアンチセンス鎖の配列」といわれ、半改変されたＲＥＲＳを含む核酸の「半改変されたＲＥＲＳのアンチセンス鎖」に位置する。
【００５３】
特定の他の実施形態において、ＮＡＲＳは、１つ以上のヌクレオチドミスマッチを有する最大限に部分的に二本鎖のヌクレオチド配列であるが、上記されるような二本鎖のＮＡＲＳのインタクトなセンス配列を含む。本明細書中で使用される慣例に従って、ＮＡＲＳを記載する文脈において、２つの核酸分子が、互いにアニールし、ハイブリダイズされた産物を形成し、このハイブリダイズされた産物がＮＡＲＳを含み、そしてハイブリダイズされた産物のＮＡＲＳ内に少なくとも１つのミスマッチ塩基対が存在する場合、このＮＡＲＳは、単に部分的に二本鎖であると考えられる。このようなＮＡＲＳは、特定のニック形成剤（例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ）によって認識され得、このニック形成剤は、これらのニック形成活性に対して二重鎖認識配列のただ１つの鎖を必要とする。例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩのＮＡＲＳは、特定の実施形態において、以下のようなインタクトなセンス鎖を含み得：
５’−ＧＡＧＴＣ−３’
３’−ＮＮＮＮＮ−５’
ここで、Ｎは、任意のヌクレオチドを示し、１つの位置のＮは、他の位置のＮと同一であってもそうでなくてもよいが、この認識配列の中に少なくとも１つのミスマッチ塩基対が存在する。この状況において、ＮＡＲＳは、少なくとも１つのミスマッチヌクレオチドを有するとして特徴付けられる。
【００５４】
特定の他の実施形態において、ＮＡＲＳは、１つ以上の一致していないヌクレオチドを有する部分的なまたは完全な一本鎖ヌクレオチド配列であるが、上記されるように、二本鎖ＮＡＲＳのインタクトなセンス鎖を含む。本明細書中で使用される慣例に従って、ＮＡＲＳを記載する文脈において、２つの核酸分子（すなわち、第１および第２の鎖）が、互いにアニールし、ハイブリダイズされた産物を形成し、このハイブリダイズされた産物が、ＮＡによって認識される第１の鎖内のヌクレオチド配列を含み（すなわち、ハイブリダイズされた産物は、ＮＡＲＳを含む）、そしてＮＡによって認識される配列中の少なくとも１つのヌクレオチドが、ハイブリダイズされた産物が形成される場合に、第２の鎖中のヌクレオチドに対応しない（すなわち、それと向かい合わない）場合、このハイブリダイズされた産物のＮＡＲＳ内に少なくとも１つの一致しないヌクレオチドが存在し、そしてこのＮＡＲＳが部分的または完全に一本鎖であると考えられる。このようなＮＡＲＳは、特定のニック形成剤（例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ）によって認識され得、このニック形成剤は、これらのニック形成活性のために、二本鎖認識配列のただ１つの鎖を必要とする。例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩのＮＡＲＳは、特定の実施形態において、以下のようなインタクトなセンス鎖を含み得：
５’−ＧＡＧＴＣ−３’
３’−Ｎ０−４−５’
（ここで、「Ｎ」は、任意のヌクレオチドを示し、０−４は、ヌクレオチド「Ｎ」の数を示し、１つの位置での「Ｎ」は、別の位置での「Ｎ」と同じであってもそうでなくてもよい）、この鎖は、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩの二本鎖認識配列のセンス鎖を含む。この例において、相補鎖中の対応するヌクレオチドが存在しないという点において、Ｇ、Ａ、Ｇ、ＴまたはＣの少なくとも１つは、一致しない。この状況は、例えば、ハイブリダイズされた産物中に「ループ」が存在し、特に、センス配列がループ内に完全にまたは部分的に存在する場合、生じる。
【００５５】
本明細書中に使用される場合、句「核酸分子を増幅すること」または「核酸分子の増幅」は、特定の核酸分子の２つ以上のコピーを作製することをいう。「核酸分子を指数関数的に増幅すること」または「核酸分子の指数関数的増幅」は、２つ以上の核酸増幅反応を含むタンデムな増幅系による、特定の核酸分子の増幅をいう。このような系において、第１の増幅反応からの増幅産物は、第２の核酸増幅反応について、少なくとも初期増幅プライマーとして機能する。言い換えると、第１の増幅反応からの増幅産物は、初期プライマー伸長の間、少なくともプライマーとして機能するが、続いてのプライマー伸長の間、プライマーとして機能してもしなくてもよい。本明細書中で使用される場合、用語「核酸増幅反応」は、核酸分子（Ｔ）を使用して、核酸分子（Ａ）の１つより多くのコピーを作製するためのプロセスをいい、この核酸分子（Ｔ）は、テンプレートとして核酸分子Ａの配列に相補的な配列を含む。本発明に従って、第１および第２の核酸増幅反応の両方は、ニック形成反応およびプライマー伸長反応を使用する。
【００５６】
本明細書中で使用される場合、「初期増幅プライマー」は。テンプレート核酸にアニールするプライマーであり、核酸増幅反応を開始する。開始プライマーは、初期プライマー伸長のためのプライマーとして機能しなければならないが、任意の続いてのプライマー伸長のためのプライマーである必要はない。例えば、プライマーＡ１がテンプレート核酸Ｔ２の一部にアニールし、このテンプレート核酸Ｔ２が、ＮＡＲＳのセンス鎖に対して３’の位置で、ＮＡＲＳのセンス鎖の配列を含むと仮定のこと。ＤＮＡポリメラーゼの存在下において、Ａ１の３’末端は、二本鎖ＮＡＲＳを含む、二本鎖の核酸分子または部分的に二本鎖の核酸分子（Ｈ２）を産生するためのテンプレートとしてＴ２を使用して伸長される。ＮＡＲＳを認識するＮＡの存在下において、Ｈ２は、開始プライマーＡ１に相補的な鎖においてニック形成される。ニック形成部位に３’末端を含み、開始プライマーＡ１を含まない鎖は、ＮＡおよびＤＮＡポリメラーゼの存在下において、続いてのプライマー伸長のためのプライマーとして機能し得る。Ａ１は、開始プライマーとみなされるが、第１のプライマー伸長に対してのみプライマーとして機能するが、続いてのプライマー伸長に対しては、プライマーとして機能しない。
【００５７】
第１の核酸が、第２の核酸の消化産物または第２の核酸分子もしくはテンプレートとしてその相補物の一部を使用した増幅産物のいずれかである場合、第１の核酸分子（「第１の核酸」）が、別の核酸分子（「第２の核酸」）「に由来する」かまたは別の核酸分子（「第２の核酸」）「から生じる」。第１の核酸分子は、第２核酸の少なくとも一部と厳密に同一である配列または厳密に相補的である配列を含まなければならない。
【００５８】
第１の配列の相補物が、所定の反応混合物（例えば、核酸増幅混合物）中の第２の配列にアニールし得る場合、第１の核酸配列は、第２の核酸配列に「少なくとも実質的に同一」である。特定の好ましい実施形態において、第１の配列は、第２の配列に「厳密に同一」であり、つまり、各位置での第１の配列のヌクレオチドは、同じ位置での第２の配列のヌクレオチドと同一であり、第１の配列は、第２の配列と同じ長さである。
【００５９】
第１の配列が、所定の反応混合物（例えば、核酸増幅混合物）中の第２の配列にアニールし得る場合、第１の核酸配列は、第２の核酸配列と「少なくとも実質的に相補的」である。特定の好ましい実施形態において、第１の配列は、第２の配列に「厳密にまたは完全に相補的」であり、つまり、第１の配列の各ヌクレオチドは、その対応する位置で第２の配列のヌクレオチドと相補的であり、第１の配列は、第２の配列と同じ長さである。
【００６０】
本明細書中で用いられる場合、２本鎖核酸の他方の鎖（「第２鎖」のことをいう）中の別の位置（例えば、規定された位置）「に対応する」位置に位置する２本鎖核酸の一方の鎖（「第１鎖」のことをいう）中のヌクレオチドは、第２鎖中の対応する位置のヌクレオチドに相補的な第１鎖中のヌクレオチドのことをいう。同様に、２本鎖核酸の他方の鎖（「第２鎖」のことをいう）内のニック形成部位に対応する２本鎖核酸の一方の鎖（「第１鎖」のことをいう）中の位置は、第２鎖中の２つのヌクレオチドに相補的な（この間にニックが生じる）第１鎖中の２つのヌクレオチド間の位置のことをいう。
【００６１】
「ｃＤＮＡ集団のプロファイリング」は、テンプレートとしてのｃＤＮＡ集団における１種類以上のｃＤＮＡ分子を用いて増幅される、１種類以上の１本鎖核酸分子の特徴付けのことをいう。そのような特徴付けは、ｃＤＮＡ集団における特定のｃＤＮＡの存在または非存在を示し得る。そのことはまた、１つのｃＤＮＡ集団と別のｃＤＮＡ集団との比較において有用であり得る。
【００６２】
「ｃＤＮＡ集団」は、１種類位以上のｃＤＮＡ分子を含む組成物のことをいう。このｃＤＮＡ分子は、実質的に精製され得、その結果、この組成物中に存在するｃＤＮＡ分子以外の分子は最小量である。言い換えると、このｃＤＮＡ集団は、主としてｃＤＮＡ分子を含む。あるいは、ｃＤＮＡ集団におけるこれらのｃＤＮＡ分子は、部分的に精製され得、その結果、ｃＤＮＡ分子以外の少なくとも数種類の分子がｃＤＮＡ集団から除去される。特定の実施形態において、ｃＤＮＡ集団におけるこれらのｃＤＮＡ分子は、精製されていなくてもよい。言い換えると、このｃＤＮＡ集団は、基本的に、ｃＤＮＡ集団を得る生物学的サンプルと同一である。
【００６３】
（Ｂ．線形的核酸増幅法を用いた遺伝子発現分析）
１つの局面において、本発明は、ニック形成剤の存在下での線形的核酸増幅反応を用いた遺伝子発現分析のための方法を提供する。本発明の方法を用いて、ｃＤＮＡ集団をプロファイルし得るのと同様に、ｃＤＮＡ集団における標的ｃＤＮＡの存在もしくは非存在、または生物学的サンプルにおける標的ｍＲＮＡの存在もしくは非存在を決定し得る。
【００６４】
（１．概要）
本発明に従って、ｃＤＮＡ集団における標的ｃＤＮＡの存在は、ニック形成剤認識配列および少なくとも標的ｃＤＮＡ分子の一部を含む、完全な２本鎖核酸分子または部分的な２本鎖核酸分子（「開始核酸分子（Ｎ１）」）の生成を可能にする。Ｎ１分子中の認識配列を認識するニック形成剤およびＤＮＡポリメラーゼの存在下で、テンプレートとしてＮ１分子の一部を用いて、１本鎖核酸分子（Ａ１）を増幅し得る。Ａ１分子の検出は、ｃＤＮＡ集団における標的ｃＤＮＡの存在を示す。特定の実施形態において、標的ｃＤＮＡ自体が、ニック形成剤認識配列を含み、従って、開始核酸（Ｎ１）分子として機能し得る。しかし、ｃＤＮＡ集団に標的ｃＤＮＡが存在しない場合、少なくとも標的ｃＤＮＡの一部を含む開始核酸（Ｎ１）分子は、生成されない。従って、テンプレートとして開始核酸分子の一部を用いても、１本鎖核酸分子は、増幅されない。従って、そのような１本鎖核酸分子の検出の失敗は、ｃＤＮＡ集団における標的ｃＤＮＡの非存在を示し得る。
【００６５】
代表的な実施形態の主な工程を、図１に示す。この実施形態において、テンプレート核酸（Ｔ１）をｃＤＮＡ集団に加え、ｃＤＮＡ集団が、標的ｃＤＮＡを含むか否かを検出する。このＴ１分子は、少なくとも実質的に標的ｃＤＮＡと相補的であり、そしてニック形成剤認識配列の一方の鎖の配列を含む。標的ｃＤＮＡが、ｃＤＮＡ集団に存在する場合、Ｔ１分子とアニールし、部分的な２本鎖核酸（Ｎ１）を形成する。ＤＮＡポリメラーゼ存在下で、一方または両方のＮ１分子の３’末端が伸長され、ニック形成剤認識配列の両方の鎖を含む、完全な２本鎖核酸分子（Ｈ１）を形成する（工程（ａ））。Ｈ１分子内のニック形成剤認識配列を認識するニック形成剤存在下で、Ｈ１は、ニックにより切断され、ニック形成部位に３’末端および５’末端が生じる（工程（ｂ））。ニック形成部位に５’末端を含むフラグメントが、十分に短い（例えば、１７ヌクレオチド未満のヌクレオチド長）場合、このフラグメントは、特定の反応条件（例えば、６０℃で）下で、Ｈ１の他の部分から分離する。しかし、このフラグメントが容易に分離しない場合、このフラグメントは、５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損でありかつ鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼの存在下で、ニック形成部位に３’末端を含むフラグメントの伸長によって置換され得る（工程（ｄ））。鎖置換はまた、鎖置換促進因子が存在する場合、ＤＮＡポリメラーゼの鎖置換活性の非存在下でも生じ得る。そのような伸長は、再度ニックにより切断され得、ニック形成剤についての、新しいニック形成部位を再生する（工程（ｅ））。新しいニック形成部位に５’末端を含むフラグメント（Ａ１）は、再度、容易にＨ１の他の部分から分離し得るか、または新しいニック形成部位での３’末端からの伸長によって置換され得る（工程（ｆ））。このニック形成−伸長サイクルは、複数回繰り返され得（工程（ｇ））、核酸フラグメントＡ１の線形的な蓄積が生じる。
【００６６】
上記のように、Ｔ１分子は、ニック形成剤認識配列の一方の鎖の配列を含む。特定の実施形態において、Ｔ１分子は、ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含み得る。このような実施形態の例は、図２に示され、代表的なニック形成剤認識配列としてＮ．ＢｓｔＮＢ  Ｉの認識配列を用いている。この図において、開始核酸分子Ｎ１は、１本鎖標的ｃＤＮＡ（または、２本鎖標的ｃＤＮＡの一方の鎖）またはその一部を以下の３つの領域（領域Ｘ１、領域Ｙ１および領域Ｚ１）を有するＴ１とアニーリングすることよって形成される部分的な２本鎖核酸分子である。領域Ｘ１、領域Ｙ１および領域Ｚ１は、それぞれ、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉ認識配列のアンチセンス鎖の配列に対してすぐ３’側に続く領域、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉの認識配列のアンチセンス鎖の配列の３’末端からトリガーＯＤＮＰ（すなわち、３’−ＣＡＣＡＧＮＮＮＮ−５’（ここでＮは、Ａ、Ｔ、ＧまたはＣであり得る））の伸長生成物内のＮ．ＢｓｔＮＢ  Ｉのニック形成部位の３’末端ヌクレオチドに対応するヌクレオチドまでの領域、および領域Ｙ１に対してすぐ５’側に続く領域であると規定される。標的ｃＤＮＡは、少なくとも、領域Ｘ１に対して実質的に相補的であり、ＤＮＡポリメラーゼ存在下での核酸伸長のためのプライマーとして機能する。生じた伸長生成物（Ｈ１）は、２本鎖Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉ認識配列を含み、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉによってニックにより切断され得る。このニックにより切断される生成物（トリガーＯＤＮＰの配列を含む）は、ＤＮＡポリメラーゼによって、そのニック形成部位の３’末端から再度伸長され得、ニック形成部位でＮ．ＢｓｔＮＢ  Ｉによって生成される５’末端を含む鎖と置換される。このニック形成−伸長サイクルは、複数回繰り返され、領域Ｚ１に対して正確に相補的である、置換された鎖（Ａ１）が蓄積する。
【００６７】
特定の実施形態において、Ｔ１分子は、ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み得る。このような実施形態の例は、図３に示され、代表的なニック形成剤認識配列としてＮ．ＢｓｔＮＢ  Ｉの認識配列を用いている。この図において、開始核酸分子Ｎ１は、１本鎖標的ｃＤＮＡ（または、２本鎖標的ｃＤＮＡの一方の鎖）またはその一部を、以下の３つの領域（領域Ｘ１、領域Ｙ１および領域Ｚ１）を有するＴ１とアニーリングすることよって形成される部分的な２本鎖核酸分子である。領域Ｘ１、領域Ｙ１および領域Ｚ１は、それぞれ、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  ＩによるＮ１の伸長生成物（すなわち、Ｈ１）のニック形成部位に対してすぐ３’側に続く領域、ニック形成部位からＮ．ＢｓｔＮＢ  Ｉの認識配列のセンス鎖の配列（すなわち、５’−ＧＡＧＴＣＮＮＮＮ−３’（ここでＮは、Ａ、Ｔ、ＧまたはＣであり得る））の５’末端までの領域、および領域Ｙ２に対してすぐ５’側に続く領域であると規定される。標的ｃＤＮＡは、少なくとも、領域Ｘ１に対して実質的に相補的であり、ＤＮＡポリメラーゼ存在下での核酸伸長のためのプライマーとして機能する。生じた伸長生成物（Ｈ１）は、２本鎖Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉ認識配列を含み、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉによってニックにより切断され得る。このニックにより切断される生成物（Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉの認識配列のセンス鎖の配列を含む）は、ＤＮＡポリメラーゼによって、そのニック形成部位の３’末端から再度伸長され得、ニック形成部位でＮ．ＢｓｔＮＢ  Ｉによって生成される５’末端を含む鎖と置換される。このニック形成−伸長サイクルは、複数回繰り返され、ニック形成部位の５’末端を含む、置換された鎖Ａ１の蓄積が生じる。
【００６８】
標的ｃＤＮＡのテンプレート核酸分子へのアニーリングに加え、開始核酸分子Ｎ１を提供するために、多様な他の方法が用いられ得る。例えば、特定の実施形態において、標的ｃＤＮＡ自体が、ニック形成剤認識配列を含み、従って、Ｎ１分子として機能し得る。あるいは、種々のプライマー対を用いて、Ｎ１分子を調製し得る。開始核酸を調製するための多様な方法についての詳細な説明は、別の章において、以下に提供される。
【００６９】
（２．ｍＲＮＡ集団またはｃＤＮＡ集団、および標的ｍＲＮＡ分子または標的ｃＤＮＡ分子）
本発明のｍＲＮＡは、目的のｍＲＮＡ分子を含み得、そしてｃＤＮＡを調製するためにさらに使用され得る、任意の生物学的サンプルから単離され得る。特に、この生物学的サンプルは、任意の細胞、器官、組織、生検材料などであり得る。目的のサンプルは、哺乳動物（特にヒト）、植物、細菌および下等真核生物細胞（例えば、酵母、真菌細胞）に由来する。例示的な生物学的サンプルとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：癌生検、神経変性斑、神経変性の兆候を示す脳領域の生検、皮膚サンプル、血球サンプル、結腸直腸生検など。例示的な細胞としては、筋肉細胞、肝細胞、繊維芽細胞、神経細胞、上皮細胞および真皮細胞、血球（例えば、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球）、肥満細胞、単球、顆粒球およびマクロファージが挙げられる。さらに、高感受性に起因して、遺伝子発現分析のための本発明の方法は、単一細胞から単離されたｍＲＮＡを分析するために使用され得る。
【００７０】
特定の実施形態において、２つの別個の生物学的サンプル由来のｃＤＮＡ集団が、差示的に発現される遺伝子を同定するために比較される。このような比較について、一方のサンプルは、遺伝的疾患もしくは病原体感染を有する疑いがあるか、またはこれらを有する危険性がある被験体由来であり得、他方のサンプルは、健常なコントロール被験体由来であり得る。あるいは、これら２つのサンプルは、同じ生物学的供給源であるが、異なる発生段階由来であり得る。特定の実施形態において、一方のサンプルは、所望の形質（例えば、疾患耐性）を有する被験体由来であり得るが、他方のサンプルは、同じ形質を有さない被験体由来であり得る。他の実施形態において、一方のサンプルは、化学物質（例えば、薬物または毒性物質）で処置された被験体由来であり、他方のサンプルは、未処置のコントロール被験体由来である。
【００７１】
ｍＲＮＡを単離する方法およびｃＤＮＡ合成の方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６、１９８７を参照のこと）。このような方法は、一般に、細胞、組織またはサンプルの溶解、および抽出手順によるＲＮＡの回収を含む。これらの手順は、カオトロピック剤（例えば、グアニジニウムチオシアネート）での処置、その後の溶媒（フェノールおよびクロロホルム）を用いるＲＮＡ抽出によって、特に実施され得る。これらは、総ＲＮＡ単離についてのＵＳ７３７５０キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）のような市販のキットを使用して、容易に実施され得る。ｍＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡ分子のポリ（Ａ）テイルに結合するオリゴ（ｄＴ）プライマーを使用して、総細胞ＲＮＡから精製され得る（Ｊａｃｏｂｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：２５４、１９８７（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。これに関して、ｍＲＮＡの調製は、市販のキット（例えば、ＵＳ７２７００キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して、実施され得る。あるいは、ランダムプライマー（すなわち、ランダム配列を有するプライマー）が、総細胞ＲＮＡからｍＲＮＡを精製するために使用され得る（Ｓｉｎｇｈら、Ｃｅｌｌ  ５２：４１５、１９８８；Ｖｉｎｓｏｎら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２：８０１、１９８８を参照のこと）。オリゴ（ｄＴ）プライマーまたはランダムプライマーのいずれかが、ｍＲＮＡの精製を促進するために、固定化され得る。特定の他の実施形態において、ｍＲＮＡは、最初に総ＲＮＡを単離せずに、生物学的サンプルから直接単離され得る。
【００７２】
次いで、単離／精製されたｍＲＮＡは、従来の分子生物学的技術に従う逆転写によって、第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのテンプレートとして使用され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと）。逆転写は、逆転写酵素およびプライマーを使用して、一般に実施される。
【００７３】
多くの逆転写酵素が、文献中に記載されており、そして市販されている（例えば、１４８３１８８キット、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）。例示的な逆転写酵素としては、トリウイルスであるＡＭＶ（トリ骨髄芽球症ウイルス）、マウス白血病ウイルスであるＭＭＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）、Ｙｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ−８（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｍ１９４１およびＭ２１０１）由来の逆転写酵素が挙げられるが、これらに限定されない。これらの酵素に適用される作業条件は、当業者に周知である。
【００７４】
逆転写に使用されるプライマーは、種々の型のものであり得る。これは、４〜１０ヌクレオチド（好ましくはヘキサヌクレオチド）を含むランダムオリゴヌクレオチドであり得る。この型のランダムプライマーの使用は、文献中に記載されており、そしてＲＮＡ分子内の異なる部位での逆転写のランダムな開始を可能にする。あるいは、４マー〜２０マー（好ましくは１５マー）を含むポリ（ｄＴ）プライマーが使用され得る。特定の実施形態において、ｍＲＮＡの単離において使用されるプライマーはまた、ｃＤＮＡ合成でも使用される。
【００７５】
第二鎖ｃＤＮＡは、ＲＮａｓｅ  ＨおよびＤＮＡポリメラーゼを使用して合成され得る。あるいは、これは、アダプター配列を第一鎖ｃＤＮＡ分子に最初に連結し、そして第一鎖ｃＤＮＡをテンプレートとして使用して、このアダプター配列に対して相補的なプライマーを伸長させることによって、合成され得る。
【００７６】
合成されたｃＤＮＡは、溶液中に存在し得るか、または例えば、ｍＲＮＡを単離するため、およびｃＤＮＡを合成するための固定されたプライマー（例えば、その５’末端を介して固定されたポリ（ｄＴ）ｎ）を介して、固体支持体に連結され得る。
【００７７】
その発現が目的のものである任意の遺伝子が、本発明によって分析され得る。特定の実施形態において、この遺伝子は、疾患または障害（特にヒトの疾患または障害）に関連する。他の実施形態において、この遺伝子は、その遺伝子の起源である生物の所望の形質に関連する。なお他の好ましい実施形態において、この遺伝子は、その遺伝子が単離される被験体の発生に関与する。いくつかの実施形態において、この遺伝子は、この遺伝子が単離される生物の外部刺激（例えば、光、薬物およびストレスによる処置）に対する応答に関与する。
【００７８】
（３．開始核酸（Ｎ１）を調製するための種々の実施形態）
遺伝子発現分析のために有用な開始核酸分子は、種々のアプローチによって提供され得る。例えば、Ｎ１は、標的ｃＤＮＡまたはその一部を、Ｔ１分子にアニールすることによって、獲得され得る。あるいは、Ｎ１は、直接標的ｃＤＮＡ自体であり得るか、または標的ｃＤＮＡに直接由来し得、ここで、この標的ｃＤＮＡは、二重鎖であり、かつニック形成剤認識配列を含む。Ｎ１はまた、種々のオリゴヌクレオチドプライマー対を使用しても調製され得る。Ｎ１分子を提供するためのこれらおよび他の手段が、以下に記載される。
【００７９】
（ａ．アニーリングによる）
本発明の特定の実施形態において、Ｎ１は、標的ｃＤＮＡ分子をＴ１分子でアニーリングすることによって、提供される。標的ｃＤＮＡが一本鎖である場合、この標的ｃＤＮＡは、この標的ｃＤＮＡの３’部分に少なくとも実質的に相補的なＴ１分子をアニーリングするために直接使用され得る。あるいは、一本鎖標的ｃＤＮＡは、切断されて、より短いフラグメントを産生し得、ここで、これらのフラグメントのうちの１つ以上は、Ｔ１分子をアニーリングするために使用され得る。標的ｃＤＮＡが二本鎖である場合、この標的ｃＤＮＡは、変性され得、そしてＴ１分子をアニーリングするために直接使用され得る。あるいは、この二本鎖標的ｃＤＮＡは、まず切断されて、より短い二本鎖フラグメントを与え得、次いで、これらのより短いフラグメントが変性され、このうちの一方が、Ｔ１分子をアニーリングし得る。
【００８０】
上で議論されるように、Ｔ１分子は、一本鎖標的ｃＤＮＡまたは二本鎖標的ｃＤＮＡの１つの鎖に対して、少なくとも実質的に相補的でなければならない。さらに、増幅反応混合物中のＴ１分子の数は、好ましくは、遺伝子発現分析において限定要因にならないように、標的ｃＤＮＡの数より大きい。
【００８１】
Ｎ１分子を提供するためのこの型の方法の１つの例は、図４に示される。この図において、二本鎖標的ｃＤＮＡを含み得るｃＤＮＡ集団は、標的ｃＤＮＡにおける配列を認識する制限エンドヌクレアーゼで消化される。消化産物が変性され得、そして標的ｃＤＮＡがｃＤＮＡ集団中に存在する場合には、標的ｃＤＮＡの消化産物の１つの鎖は、消化産物の鎖の３’部分に少なくとも実質的に相補的なＴ１分子にアニーリングされ得る。
【００８２】
Ｎ１分子を提供するためのこの型の方法の別の例は、図５に示される。標的ｃＤＮＡ（またはそのフラグメント）自体が、ニック形成剤（ｎｉｃｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）認識配列を含む。標的ｃＤＮＡが変性され、そして標的ｃＤＮＡのうちの１つの鎖が、Ｔ１分子にアニーリングする。Ｔ１分子は、標的ｃＤＮＡの、ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含む部分である。Ｔ１分子への、標的ｃＤＮＡの１つの鎖のアニーリングは、増幅反応のための最初の核酸分子Ｎ１を提供する。
【００８３】
標的ｃＤＮＡがニック形成剤認識配列を含む、関連する実施形態において、Ｔ１分子は、Ｔ１分子の３’部分においてニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列（すなわち、領域Ｘおよび領域Ｙ）を含むが、Ｔ１分子の５’部分（すなわち、領域Ｚ）においては含まない、標的ｃＤＮＡの鎖（すなわち、標的ｃＤＮＡの第一鎖）に少なくとも実質的に相補的であるように設計され得る（図６）。Ｔ１の３’部分は、ＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列を含み、その結果、標的ｃＤＮＡの上記鎖にＴ１をアニーリングすることによって形成される最初の核酸は、二本鎖ＮＡＲＳを含む。ＮＡＲＳを認識するＮＡの存在下で、Ｎ１分子がニックを形成される。次いで、ニック形成部位における３’末端は、Ｔ１分子におけるＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列に対して５’の領域を、テンプレートとして使用して、伸長される。得られる増幅産物は、標的ｃＤＮＡの一部ではなく、ＮＡＲＳのアンチセンス鎖（すなわち、領域Ｚ１）の配列に対して５’に位置するＴ１の領域に相補的な、一本鎖核酸分子である。
【００８４】
Ｎ１分子を提供するためのこの型の方法の別の例は、図２１に示される。この例において、そのＮＡＲＳの外側でニック形成するニック形成試薬によって認識されるＮＡＲＳが、例示的なニック形成剤として使用される。オリゴヌクレオチドプライマー（すなわち、Ｔ１分子）が、一本鎖標的核酸（ｍＲＮＡ、第一鎖ｃＤＮＡ、または二本鎖ｃＤＮＡの１つの鎖）をテンプレートとして使用して一本鎖核酸分子を増幅するために、使用される。プライマーは、５’から３’へと、以下の３つの領域を含む：領域Ａ、領域Ｂ、および領域Ｃ。領域Ｂは、二本鎖ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列からなり、ここで、領域Ａおよび領域Ｃは、それぞれ領域Ｂに対してすぐ５’およびすぐ３’に位置する領域である。オリゴヌクレオチドプライマーは、標的核酸と少なくとも実質的に相補的であり、その結果、一本鎖核酸の増幅を可能にする条件下で、このオリゴヌクレオチドプライマーは、標的をアニーリングし得、そしてＤＮＡポリメラーゼの存在下で、その３’末端から伸長する。得られる伸長産物は、オリゴヌクレオチドプライマーの領域Ｂに、標的核酸におけるヌクレオチドと従来の塩基対を形成しない１つ以上のヌクレオチドが存在し得る場合でさえも、二本鎖ニック形成剤認識配列を認識するニック形成剤の存在下で、ニックを形成され得る。「従来の塩基対」とは、完全にかまたは部分的に二本鎖の核酸の１つの鎖のヌクレオチドと、その核酸の他方の鎖における別のヌクレオチドとの間で、標準的なワトソン−クリックモデルに従って形成される塩基対（例えば、Ｇ：Ｃ、Ａ：Ｔ、およびＡ：Ｕ）である。５’末端を含むニック形成産物は、比較的短い場合には（例えば、１８ヌクレオチド長以下）標的核酸から容易に解離し得るか、またはニック形成部位において３’末端を含むニック形成生成物の伸長によって置換され得る。ニック形成剤がその認識配列の外側でニックを形成する場合、伸長産物は、ポリヌクレオチドプライマーの領域Ｂ（すなわち、ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列）を維持し、従って、ニック形成剤によって再ニック形成され得る。上記ニック形成伸長サイクルは、複数回反復され得、ニック形成部位に５’末端を含む一本鎖核酸分子の増幅を生じる。
【００８５】
１つ以上のミスマッチが、領域Ｂと標的核酸におけるその対応領域との間に存在する実施形態において、領域Ｂを認識するニック形成剤のニック形成活性は、領域Ｂと標的におけるその対応領域との間のミスマッチの数の増加と共に低下する。例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉは、二本鎖認識配列を含む二重鎖をニック形成する際、その二本鎖認識配列のセンス鎖の配列を含むが、その認識配列のセンス鎖と、二重鎖の対向する鎖におけるその対応領域との間に、１つのミスマッチを有する二重鎖のニック形成において、約半分である。Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉのニック形成活性は、その二本鎖認識配列のセンス鎖の配列を含むが、その認識配列のセンス鎖におけるヌクレオチドのいずれかと従来の塩基対を形成するヌクレオチドを他方の鎖に有さない二重鎖でニックを形成する場合、その最大レベルの約１０％〜２０％に低下する。
【００８６】
特定の実施形態において、その認識配列中でニックを形成するニック形成剤はまた、標的におけるヌクレオチドと従来の塩基対を形成しない、領域Ｂにおけるヌクレオチドが、領域Ｂにおけるニック形成部位に対して５’の位置である場合に、使用され得る。オリゴヌクレオチドプライマーと標的との間で形成された二重鎖が、領域Ｂにおけるニック形成剤によってニックを形成された後に、このニック形成部位における３’末端は、伸長して領域Ｂを再生（ｒｅｇｅｒａｔｅ）し得る。このような再生は、ニック形成−伸長サイクルの反復を可能にする。さらに、領域Ｂと標的におけるその対応領域との間のミスマッチは、ニック形成部位の３’末端からの伸長に影響を与えてはならない。一般に、従来の塩基対を形成しないニック形成部位と領域Ｂにおけるヌクレオチドとの間の距離が長いほど、そのミスマッチは、伸長に対する不利な影響が低い。
【００８７】
領域Ａは、オリゴヌクレオチドプライマーの標的核酸へのアニーリングを容易にするか、または可能にする。さらに、この領域は、ニック形成部位の３’末端を含むニック形成産物が、標的へのアニーリングを維持すること、およびＤＮＡポリメラーゼの存在下で３’末端から伸長することを可能にする。特定の実施形態において、領域Ａは、最大で１００、７５、５０、２５、２０、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、または２ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、領域Ａにおいて、標的核酸中のヌクレオチドと従来の塩基対を形成しない、１つ以上のヌクレオチドが存在し得る。
【００８８】
オリゴヌクレオチドプライマーは、領域Ｃを有しても有さなくても良い。領域Ｃが存在する場合、特定の実施形態において、この領域Ｃは、最大で１００、７５、５０、２５、２０、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ヌクレオチド長であり得る。領域Ｃと、標的核酸におけるその対応領域との間に、ミスマッチが存在し得る。しかし、ミスマッチの存在は、オリゴヌクレオチドプライマーと標的との間に形成される二重鎖のニック形成、または二重鎖の伸長産物のニック形成を、依然として可能にする必要がある。さらに、ミスマッチの存在は、ニック形成部位において３’末端を含むニック形成産物の伸長が、ＤＮＡポリメラーゼの存在下でその末端から伸長することを、依然として可能にする必要がある。領域Ｃが、領域Ｂを認識するニック形成剤によってニック形成可能なニック形成部位を含む場合、一般に、領域Ｃの５’末端とニック形成部位との間のヌクレオチドは、標的におけるヌクレオチドと従来の塩基対を形成する。
【００８９】
本発明は、サンプル中の標的核酸（すなわち、標的ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ）の存在を検出するために有用である。標的核酸がサンプル中に存在する場合、これは、標的に対して少なくとも実質的に相補的でオリゴヌクレオチドプライマー（すなわち、Ｔ１分子）とアニーリングし、そして標的の一部をテンプレートとして使用して、一本鎖核酸（すなわち、Ａ１分子）の増幅を開始する。しかし、この標的核酸が非存在である場合、オリゴヌクレオチドプライマーは、標的とアニーリングし得ず、そしてこの標的の一部をテンプレートとして使用して、一本鎖核酸分子は増幅されない。従って、一本鎖増幅産物の存在または非存在を決定することによって、サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定し得る。
【００９０】
標的ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡは、任意の目的のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡであり得る。オリゴヌクレオチドプライマーにおける二本鎖ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列の存在は、プライマーと標的との間で形成される二重鎖が、二本鎖ニック形成剤認識配列を認識するニック形成剤によってニックを形成されるために十分であるので、この標的は、認識配列のセンス鎖内のヌクレオチドと従来の塩基対を形成する、二本鎖認識配列のインタクトなアンチセンス鎖またはヌクレオチドのいずれかさえも有する必要はない。しかし、ニック形成剤のニック形成活性は、対向する鎖のヌクレオチドと従来の塩基対を形成しない認識配列のセンス鎖のヌクレオチドの数の増加と共に低下するので、標的核酸の一部にアニーリングする場合に、プライマーにおける認識配列のセンス鎖中のヌクレオチドが標的のヌクレオチドと１つ以上の従来の塩基対を形成するように、オリゴヌクレオチドプライムを設計することが好ましい。
【００９１】
特定の実施形態において、以下に記載されるように、比較的短い一本鎖核酸を合成することが望ましくあり得る。このような実施形態において、標的核酸は、最初に、酵素的切断、化学的切断、または機械的切断に供され得る。比較的短い一本鎖核酸としては、多くとも２００、１５０、１００、７５、５０、４０、３０、２５、２０、１８、１６、１４、１２、１０、９、８、７、６、５、または４のヌクレオチドを含む核酸が挙げられる。酵素的切断は、例えば、標的核酸における特定の配列を認識する制限エンドヌクレアーゼを用いて核酸分子を消化することによって達成され得る。あるいは、酵素的切断は、核酸分子における特定の配列を認識するニック形成剤で、標的核酸をニック形成することによって、達成され得る。酵素的切断はまた、Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ（米国特許第４，９３５，３５７号）によるオリゴヌクレオチド特異的切断であり得る。化学的切断および機械的切断は、せん断のような、核酸分子を切断するために適切な、当該分野において公知の任意の方法によって達成され得る。切断生成物は、二本鎖である場合、まず変性され得、そして引き続いて、上記オリゴヌクレオチドプライマーにアニーリングされ得る。
【００９２】
標的核酸の酵素的切断および引き続くこの標的の一部に相補的な一本鎖核酸の増幅の１つの例示的な実施形態が、図２２に示されている。二本鎖ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーが、一本鎖標的核酸（すなわち、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡの第一鎖、またはｃＤＮＡの第二鎖）の第一領域にアニーリングされ、一方で部分的に二本鎖の核酸は、第一領域に対して５’に位置する標的核酸の第二領域にアニーリングされる。この二本鎖核酸分子は、標的核酸の第二領域の一部に少なくとも実質的に、好ましくは正確に相補的な、二本鎖部分および３’突出部におけるＩＩ型制限酵素認識配列（ＴＲＥＲＳ）の二本鎖認識配列を含む。ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼは、その二本鎖認識配列の外側の核酸を切断するので、部分的に二本鎖の核酸分子は、部分的に二本鎖の核酸分子の３’突出部と標的核酸の第二領域との間に形成される二重鎖内で切断するよう設計され得る。このような切断の結果、標的核酸のより短いフラグメントがテンプレートとして使用され、一本鎖核酸フラグメントを増幅する。
【００９３】
特定の実施形態において、センス鎖がオリゴヌクレオチドプライマーの領域Ｂに存在する二本鎖ニック形成剤認識配列は、二本鎖ＴＲＥＲＳと同一であり得る。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーの領域Ｂは、ニック形成エンドヌクレアーゼＮ．ＢｓｔＮＢ  Ｉによって認識される配列「５’−ＧＡＧＴＣ−３’」からなり得、一方で部分的に二本鎖の核酸分子におけるＴＲＥＲＳは、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼＰｌｅｌおよびＭｌｙｌによって認識される
５’−ＧＡＧＴＣ−３’
３’−ＣＴＣＡＧ−５’
であり得る。このような実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーの領域Ｂと、標的核酸における対応領域との間に、ミスマッチが存在することが必要である。換言すれば、領域Ｂにおける１つ以上のヌクレオチドは、標的におけるヌクレオチドと従来の塩基対を形成しない。ミスマッチの存在は、ＴＲＥＲＳを認識するＩＩ型制限エンドヌクレアーゼによる、オリゴヌクレオチドプライマーと標的の第一領域との間に形成される二重鎖の切断を防止する。
【００９４】
Ｎ１分子を提供するためのこの型の方法の別の例が、図７に示される。この例において、認識配列の外側でニックを形成するニック形成剤によって認識可能なニック形成剤認識配列が、例示的な認識配列として使用される。この図に示されるように、ｃＮＤＡ集団のｃＮＤＡ分子は、その５’末端を介して固定される。これらの固定された核酸は、Ｔ１分子（これは、３’から５’へと、ｃＤＮＡ集団に存在し得る標的ｃＤＮＡに少なくとも実質的に相補的な配列、およびニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含む）と混合される。標的ｃＤＮＡがｃＤＮＡ集団に存在する場合、Ｔ１分子は、標的核酸とハイブリダイズして、Ｎ１分子を形成し、そして標的ｃＮＤＡが付着した固相を洗浄することによって、ハイブリダイズしていないＴ１分子から分離され得る。ＤＮＡポリメラーゼおよびニック形成剤認識配列を認識するニック形成剤の存在下で、Ｎ１は、一本鎖核酸分子Ａ１を増幅するためのテンプレートとして使用される。しかし、標的ｃＤＮＡがｃＤＮＡ集団に存在しない場合には、Ｔ１は、集団中のいずれのｃＤＮＡ分子ともハイブリダイズし得ず、従って、固体支持体から洗浄除去される。その結果、固体支持体に付着したＮ１は形成され得ず、そしてＮ１の一部に相補的な一本鎖核酸分子は増幅され得ない。
【００９５】
（ｂ．ニック形成剤認識配列を含む標的ｃＤＮＡ）
特定の実施形態において、標定ｃＤＮＡ自体が、二本鎖ニック形成剤認識配列を含み、ｃＤＮＡ集団において存在する場合、Ｎ１分子として直接機能し得る。標的ｃＤＮＡがまた、制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含む場合、制限エンドヌクレアーゼ認識配列を認識する制限エンドヌクレアーゼによって最初に消化され得る。ニック形成剤認識配列を含むこの消化生成物は、開始核酸分子（Ｎ１）として機能し得る。例示的ニック形成剤認識配列（例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉ）としてのニック形成剤認識配列の外側にニック形成する、ニック形成エンドヌクレアーゼにより認識可能なニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列を有する実施形態が、図８に例示される。
【００９６】
他の実施形態において、開始核酸分子Ｎ１は、ニック形成剤認識配列および標的ｃＤＮＡもしくは標的ｍＲＮＡに少なくとも実質的に相補的な突出部を有する、部分的に二本鎖の核酸分子である。例示的なニック形成剤認識配列としてのニック形成剤認識配列の外側にニック形成する、ニック形成エンドヌクレアーゼにより認識可能なニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列をＮ１が有する例示的な実施形態が、図９に例示される。この図に示されるように、このＮ１分子は、伸長の際に、ニック形成部位を含むかまたはニック形成部位を形成するかのいずれかである鎖に、５’突出部を含み得る。あるいは、このＮ１分子は、伸長の際に、ニック形成部位を含みもせず、ニック形成部位を形成もしない鎖に、３’突出部を含み得る。Ｎ１分子の突出部は、標的核酸分子にアニールし得るように、標的ｃＤＮＡ分子（または標的ｍＲＮＡ）に少なくとも実質的に相補的でなければならない。Ｎ１の標的ｃＤＮＡ（または標的ｍＲＮＡ）へのアニーリングは、標的ｃＤＮＡが、目的のｃＤＮＡ集団中に存在するかまたは、標的ｍＲＮＡが目的の生物学的サンプル中に存在する場合に、標的ｃＤＮＡとＮ１分子との間に形成される複合体（「標的−Ｎ１複合体」）の単離を可能にする。
【００９７】
例えば、ｃＤＮＡ集団中のｃＤＮＡ分子または生物学的サンプル中のｍＲＮＡ分子は、図９に示されるように、固体支持体に固定化され得る。このような固定化は、当該分野で公知の任意の方法（固定または組織プリンティングの使用が挙げられるが、これらに限定されない）により行われ得る。次いで、特定の標的ｃＤＮＡまたは標的ｍＲＮＡに実質的に相補的な突出部を有するＮ１分子は、ｃＤＮＡ集団または生物学的サンプルに適用される。標的ｃＤＮＡがｃＤＮＡ集団中に存在するか、または標的ｍＲＮＡが生物学的サンプル中に存在する場合、Ｎ１は、その突出部を介して、標的核酸にハイブリダイズする。ｃＤＮＡ集団または生物学的サンプルは引き続いて洗浄されて、全てのハイブリダイズしなかったＮ１分子が除去される。ＤＮＡポリメラーゼおよびＮ１におけるＮＥＲＳを認識するニック形成エンドヌクレアーゼの存在下で、一本鎖核酸分子Ａ１は、増幅される。しかし、標的ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡが、ｃＤＮＡ集団（または生物学的サンプル）中に存在しない場合、Ｎ１は、サンプル中のいずれの核酸分子にもハイブリダイズすることができず、よってサンプルから洗い流される。従って、洗浄されたｃＤＮＡ集団（または生物学的サンプル）が、核酸増幅反応混合物（すなわち、テンプレートとしてＮ１の部分を使用する一本鎖核酸増幅に必要な成分（例えば、Ｎ１分子におけるＮＥＲＳを認識するＮＥおよびＤＮＡポリメラーゼ）の全てを含む混合物）とともにインキュベートされ、Ｎ１の上記の部分に相補的な一本鎖核酸分子は増幅されない。
【００９８】
標的核酸分子を固定化するほかに、標的−Ｎ１複合体は、Ｎ１分子を、ｃＤＮＡ集団（または生物学的サンプル）中の標的ｃＤＮＡ（またはｍＲＮＡ）分子と最初にハイブリダイズさせ、次いで、標的核酸と会合する官能基によりその複合体を単離することによって精製され得る。例えば、ｃＤＮＡ集団中のｃＤＮＡ分子は、ビオチン分子で標識され得、その標的−Ｎ１標的複合体は、続いて、標的と結合したビオチン分子を介して精製され得る（例えば、固定化ストレプトアビジンで複合体を沈澱させる）。
【００９９】
（ｃ．オリゴヌクレオチドプライマーの使用）
本発明の特定の実施形態では、開始核酸分子Ｎ１は、種々のオリゴヌクレオチドプライマー対を使用して生成される、完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子である。Ｎ１分子を調製するためにＯＤＮＰ対を使用する方法は、図１０〜１２と合わせて、以下に記載される。
【０１００】
１つの実施形態では、Ｎ１に対する前駆体は、二本鎖のＮＡＲＳおよびＲＥＲＳを含む。このＮＡＲＳおよびＲＥＲＳは、ＯＤＮＰ対を使用することにより、この前駆体に組み込まれる。例示的なＮＡＲＳとして、その認識配列の外側でニックを形成するＮＥによって認識可能なＮＥＲＳ（例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉ）および例示的なＲＥＲＳとして、ＩＩｓ型の制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＴＲＥＲＳ）を用いた実施形態を、図１０に示す。この図に示されるように、第１のＯＤＮＰは、ＮＥＲＳの１つの鎖の配列を含むが、第２のＯＤＮＰは、ＴＲＥＲＳの１つの鎖の配列を含む。これらの２つのＯＤＮＰが、標的ｃＤＮＡの一部分を増幅するためのプライマーとして使用される場合、生じる増幅産物（すなわち、Ｎ１に対する前駆体）は、二本鎖のＮＥＲＳおよび二本鎖のＴＲＥＲＳの両方を含む。ＴＲＥＲＳを認識するＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼの存在下において、この増幅産物は、二本鎖ＮＥＲＳを含む核酸分子Ｎ１を生成するように消化される。
【０１０１】
別の実施形態では、Ｎ１に対する前駆体は、２つの二本鎖ＮＡＲＳを含む。この２つのＮＡＲＳは、２つのＯＤＮＰを使用することにより、Ｎ１に対する前駆体に組み込まれる。例示的なＮＡＲＳとしてその認識配列の外側にニックを形成するニック形成エンドヌクレアーゼによって認識可能なＮＥＲＳを用いた実施形態を、図１１に示す。この図に示されるように、両方のＯＤＮＰは、ＮＥＲＳのセンス鎖の配列を含む。これらの２つのＯＤＮＰを、標的ｃＤＮＡの一部分を増幅するためのプライマーとして使用する場合、生じる増幅産物は、２つのＮＥＲＳを含む。これらの２つのＮＥＲＳは、互いに対して同一であっても同一でなくてもよいが、好ましくは、これらの２つのＮＥＲＳは同一である。ＮＥＲＳを認識するＮＥ（１つまたは複数）の存在下において、この増幅産物は、２回（各鎖において１回）ニック形成されて、二本鎖のＮＥＲＳを各々含む２つの核酸分子（Ｎ１ａおよびＮ１ｂ）を生成する。
【０１０２】
さらに別の実施形態において、Ｎ１に対する前駆体は、２つの半改変ＲＥＲＳを含む。この２つの半改変ＲＥＲＳは、２つのＯＤＮＰを使用することによって、この前駆体に組み込まれる。この実施形態を図１１に示す。この図に示されるように、第１のＯＤＮＰおよび第２のＯＤＮＰは両方とも、ＲＥＲＳの１つの鎖の配列を含む。これらの２つのＯＤＮＰを、改変デオキシヌクレオシド三リン酸の存在下において標的ｃＤＮＡの一部分を増幅するためのプライマーとして使用する場合、生じる増幅産物は、２つの半改変ＲＥＲＳを含む。これらの２つの半改変ＲＥＲＳは、互いに対して同一であっても同一でなくてもよい。半改変ＲＥＲＳを認識するＲＥ（１つまたは複数）の存在下において、上記の増幅産物はニック形成されて、半改変ＲＥＲＳの少なくとも１つの鎖の配列を各々含む、部分的に二本鎖の２つの核酸分子（Ｎ１ａおよびＮ１ｂ）を生成する。
【０１０３】
（４．ニック形成剤）
特定のヌクレオチド配列を認識し、そしてこの配列を含む核酸の１つの鎖のみを切断する任意の酵素が、本発明のニック形成剤として使用され得る。このような酵素は、ＮＥ（ネイティブのヌクレオチドから構成される特定の配列を認識する）、またはＲＥ（半改変認識配列を認識する）であり得る。
【０１０４】
ニック形成エンドヌクレアーゼは、その認識配列と重なるニック形成部位を有しても有さなくてもよい。その認識配列の外側にニック形成する例示的なＮＥは、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉであり、これは、５’−ＧＡＧＴＣ−３’から構成される固有の核酸配列を認識するが、この認識配列の３’末端を超えて４ヌクレオチドにニック形成する。Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉの認識配列およびニック形成部位を、以下で、
【０１０５】
【化２】
2005516610.tif 000003
で示し、切断部位を示す。ここで、文字Ｎは、任意のヌクレオチドを示す：
【０１０６】
【化３】
2005516610.tif 000004
Ｎ．Ｂｓｔ  ＮＢ  Ｉは、米国特許第６，１９１，２６７号に記載されるようにして、調製および単離され得る。このニック形成エンドヌクレアーゼを使用するための緩衝液および条件はまた、この’２６７特許に記載される。その認識配列の外側にニック形成するさらなる例示的なＮＥは、Ｎ．ＡｌｗＩであり、これは、以下の二本鎖認識配列を認識する：
【０１０７】
【化４】
2005516610.tif 000005
Ｎ．ＡｌｗＩのニック形成部位もまた、記号：
【０１０８】
【化５】
2005516610.tif 000006
により示される。両方のＮＥは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）から入手可能である。Ｎ．ＡｌｗＩはまた、Ｘｕら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：１２９９０−５，２００１）に記載されるように、ＩＩｓ型ＲＥ  ＡｌｗＩを変異させることによって、調製され得る。
【０１０９】
そのＮＥＲＳ内にニック形成する例示的なＮＥとしては、Ｎ．ＢｂｖＣｌ−ａおよびＮ．ＢｂｖＣｌ−ｂが挙げられる。これら２つのＮＥの認識配列およびＮＳ（記号：
【０１１０】
【化６】
2005516610.tif 000007
で示す）を、以下に示す：
【０１１１】
【化７】
2005516610.tif 000008
両方のＮＥは、ＮＥＢから入手可能である。
【０１１２】
さらなる例示的なニック形成エンドヌクレアーゼとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｎ．ＢｓｔＳＥ  Ｉ（Ａｂｄｕｒａｓｈｉｔｏｖら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（Ｍｏｓｋ）３０：１２６１−７，１９９６）、操作されたＥｃｏＲ  Ｖ（Ｓｔａｈｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：６１７５−８０，１９９６）、操作されたＦｏｋ  Ｉ（Ｋｉｍら、Ｇｅｎｅ  ２０３：４３−４９，１９９７）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ由来のエンドヌクレアーゼＶ（Ｈｕａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．４０：８７３８−４８，２００１）、Ｃｖｉ  Ｎｉｃｋａｓｅ（例えば、ＣｖｉＮＹ２Ａ、ＣｖｉＮＹＳＩ、Ｍｅｇａｂａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，Ｎｅｂｒａｓｋａ）（Ｚｈａｎｇら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２４０：３６６−７５，１９９８；Ｎｅｌｓｏｎら、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７９：４２３−８，１９９８；Ｘｉａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：９４７７−８７，１９８８）、および操作されたＭｌｙ  Ｉ（すなわち、Ｎ．Ｍｌｙ  Ｉ）（ＢｅｓｎｉｅｒおよびＫｏｎｇ，ＥＭＢＯ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ２：７８２−６，２００１）。さらなるＮＥは、他の制限エンドヌクレアーゼ、特に、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼを、ＥｃｏＲ  Ｖ、ＡｌｗＩ、Ｆｏｋ  Ｉおよび／またはＭｌｙ  Ｉを操作するための方法と類似の方法を使用して操作することによって、得られ得る。
【０１１３】
ニック形成剤として有用なＲＥは、その半改変された認識配列で二本鎖核酸にニック形成する任意のＲＥであり得る。この半改変された二本鎖認識配列にニック形成する例示的なＲＥとしては、ＡｖａＩ、ＢｓｌＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｏＢＩ、ＢｓｒＩ、ＢｓｔＮＩ、ＢｓｔＯＩ、Ｆｎｕ４ＨＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｉｎｄＩＩおよびＮｃｉＩが挙げられるがこれらに限定されない。半改変された認識配列にニック形成するさらなるＲＥは、米国特許第５，６３１，１４７号に記載される鎖保護アッセイによってスクリーニングされ得る。
【０１１４】
特定の実施形態において、ニック形成剤は、ＤＮＡ−ＲＮＡ二重鎖においてヌクレオチド配列を認識し得、二重鎖の一方の鎖にニック形成する。特定の他の実施形態において、ニック形成剤は、二本鎖ＲＮＡにおいてヌクレオチド配列を認識し得、ＲＮＡの一方の鎖にニック形成する。
【０１１５】
特定のニック形成剤は、少なくとも部分的に二本鎖の基質核酸中に、二本鎖の認識配列のセンス鎖の存在のみを、ニック形成活性のために必要とする。例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩは、基質核酸のニック形成において活性であり、この核酸は、１つの鎖に、１つ以上のヌクレオチドが基質核酸のもう１つの鎖上のヌクレオチドと従来の塩基対（例えば、Ｇ：Ｃ、Ａ：Ｔ、またはＡ：Ｕ）を形成しない認識配列「５’−ＧＡＧＴＣ−３’」のセンス鎖の配列を含む。
【０１１６】
（５．ＤＮＡポリメラーゼ）
本発明において有用なＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損であるが鎖置換活性を有する任意のＤＮＡポリメラーゼであり得る。このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、ｅｘｏ−  Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ−  Ｂｓｔ、ｅｘｏ−  Ｐｆｕ、およびｅｘｏ−  Ｂｃａが挙げられるがこれらに限定されない。本発明において有用なさらなるＤＮＡポリメラーゼは、スクリーニングされ得るか、または米国特許第５，６３１，１４７号（その全体を本明細書中に参考として援用される）に記載される方法によって作製され得る。鎖置換活性は、以下に記載される鎖置換促進因子の存在によってさらに増強される。
【０１１７】
あるいは、特定の実施形態において、鎖置換活性を有さないＤＮＡポリメラーゼが、使用され得る。このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、ｅｘｏ−Ｖｅｎｔ、Ｔａｑ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｔ５  ＤＮＡポリメラーゼおよびＰｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、これらのＤＮＡポリメラーゼの使用は、鎖置換促進因子（ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ）の存在を必要とする。「鎖置換促進因子」は、ＤＮＡポリメラーゼに触媒される、ニック形成部位の３’末端からの核酸伸長の間の鎖置換を促進する任意の化合物または組成物である。本発明において有用な、例示的な鎖置換促進因子の例としては、ＢＭＲＦ１ポリメラーゼアクセサリーサブユニット（Ｔｓｕｒｕｍｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６７：７６４８−５３，１９９３）、アデノウイルスＤＮＡ結合タンパク質（Ｚｉｊｄｅｒｖｅｌｄおよびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｌｉｅｔ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６８：１１５８−６４，１９９４）、単純ヘルペスウイルスタンパク質ＩＣＰ８（ＢｏｅｈｍｅｒおよびＬｅｈｍａｎ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６７：７１１−５，１９９３；ＳｋａｌｉｔｅｒおよびＬｅｈｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１０６６５−９，１９９４）、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＲｉｇｌｅｒおよびＲｏｍａｎｏ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：８９１０−９，１９９５）、ファージＴ４遺伝子３２タンパク質（ＶｉｌｌｅｍａｉｎおよびＧｉｅｄｒｏｃ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：１４３９５−４４０４，１９９６）、ウシ胸腺ヘリカーゼ（Ｓｉｅｇｅｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１３６２９−３５，１９９２）およびトレハロースが挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態では、トレハロースが、増幅反応混合物中に存在する。
【０１１８】
本発明において有用な、さらなる例示的なＤＮＡポリメラーゼとしては、ファージＭ２  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、Ｇｅｎｅ  ８４：２４７，１９８９）、ファージＰｈｉＰＲＤ１  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｊｕｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：８２８７，１９８７）、Ｔ５  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら、Ｇｅｎｅ  ９７：１３−１９，１９９１）、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、ＰＲＤ１  ＤＮＡポリメラーゼ（ＺｈｕおよびＩｔｏ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１２１９：２６７−７６，１９９４）、９°ＮｍＴＭＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）（Ｓｏｕｔｈｗｏｒｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：５２８１−５，１９９６；Ｒｏｄｒｉｑｕｅｚら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０２：４４７−６２，２０００）およびＴ４  ＤＮＡポリメラーゼホロ酵素（ＫａｂｏｏｒｄおよびＢｅｎｋｏｖｉｃ、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．５：１４９−５７，１９９５）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１９】
あるいは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼが使用され得る。例えば、このようなＤＮＡポリメラーゼは、ニック形成の後、テンプレート核酸から自動的に解離する短い核酸フラグメントを増幅するために有用であり得る。
【０１２０】
ニック形成剤が、ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖のＤＮＡ鎖にニックを入れる特定の実施形態において、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが使用され得る。ニック形成剤が、ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖にニックを入れる他の実施形態において、ＤＮＡプライマーから伸長させるＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ））が使用され得る。両方の事例において、標的ＲＮＡは、ｃＤＮＡに逆転写される必要はなく、そして標的ｍＲＮＡに対して少なくとも実質的に相補的であるテンプレート核酸分子と直接に混合され得る。
【０１２１】
（６．Ａ１分子）
上記のように、Ａ１分子は、テンプレートとしてＮ１の一部を使用して増幅される。特定の実施形態において、Ａ１は比較的短くあり得、２５個以下のヌクレオチド、２０個以下のヌクレオチド、１７個以下のヌクレオチド、１５個以下のヌクレオチド、１０個以下のヌクレオチド、または８個以下のヌクレオチドを有する。このような短さは、Ｎ１分子を作製する際に使用されるＴ１分子またはＯＤＮＰを適切に設計することによって達成され得る。例えば、図４〜７に示される実施形態について、Ｔ１は、ＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列に対して５’側に短い領域を有するように設計され得る。図９に示される実施形態については、部分的に二重鎖のＮ１分子が、Ｎ１における認識配列を認識するニック形成薬剤によってニック形成可能なニック形成部位に対応する位置に対して５’側に位置した短い領域を有するように設計され得る。図１０〜１２に示される実施形態については、ＯＤＮＰ対が、プライマーが標的核酸にアニーリングする場合に、互いに近くにあるように設計され得る。Ａ１分子の短さは、有利であり得る。なぜなら、この短さは、増幅効率および増幅速度を増大させるからである。さらに、この短さは、鎖置換活性を有さないＤＮＡポリメラーゼを使用することを可能にする。この短さはまた、Ａ１が質量分析のような特定の技術を介した初期増幅プライマーとして使用されるＡ１分子の検出を容易にする。
【０１２２】
（７．反応条件）
本発明は、ニック形成薬剤およびＤＮＡポリメラーゼの存在下で一本鎖核酸分子を増幅した。このような増幅反応において、ＤＮＡポリメラーゼは、ＮＡがテンプレート核酸と混合される前、混合された後、または混合されると同時に、核酸分子（例えば、テンプレート核酸分子）と混合され得る。好ましくは、ニック形成−伸長反応緩衝液は、ＮＡおよびＤＮＡポリメラーゼの両方に適切であるように最適化される。例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  ＩがＮＡであり、ｅｘｏ−ＶｅｎｔがＤＮＡポリメラーゼである場合、ニック形成−伸長緩衝液は、０．５×Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉ緩衝液および１×ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液であり得る。例示的な１×Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉ緩衝液は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、および１ｍＭ  ジチオスレイトール（２５℃にてｐＨ７．５）であり得る。例示的な１×ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液は、１０ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃にてｐＨ８．８）、１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、および０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００であり得る。当業者は、ＮＡおよびＤＮＡポリメラーゼのための反応緩衝液を容易に見いだし得る。
【０１２３】
さらに、ＤＮＡポリメラーゼが解離性である（すなわち、このＤＮＡポリメラーゼは、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼのようなテンプレート核酸から比較的乖離しやすい）特定の実施形態において、反応混合物中のＮＡ  対  ＤＮＡポリメラーゼの比はまた、全長核酸分子の最大増幅のために最適化され得る。本明細書中で使用される場合、「全長」核酸分子とは、そのテンプレートの５’末端配列に相補的な配列を含む、増幅された核酸分子をいう。言い換えると、全長核酸分子は、完全な遺伝子伸長反応の増幅産物である。ＮＡの量が、ＤＮＡポリメラーゼの量に対して過剰である反応混合物において、部分的な増幅産物が、生成され得る。部分的増幅産物の生成は、ＮＡによる、部分的に増幅した核酸分子の過剰なニック形成およびその後のこれらの分子のテンプレートからの解離に起因し得る。このような解離は、その部分的に増幅した核酸分子がさらに伸長しないようにする。
【０１２４】
異なるＮＡまたは異なるＤＮＡポリメラーゼは、異なるニック形成活性またはプライマー伸長活性を有し得るので、全長核酸分子の最大の増幅に適切な、特定のＮＡ  対  特定の解離性ＤＮＡポリメラーゼの比は、特定のＮＡおよびＤＮＡポリメラーゼに特に依存して変化する。しかし、特定のＮＡと特定のＤＮＡポリメラーゼとの所定の組み合わせについては、その比は、異なるＮＡ  対  ＤＮＡポリメラーゼ比を有する反応混合物中で指数関数的な核酸増幅反応を行い、当該分野で公知の技術を使用して（例えば、液体クロマトグラフィーまたは質量分析法により）その増幅産物を特徴付けることにより最適化され得る。全長核酸分子の最大の生成を可能にする比は、将来的な増幅反応において使用され得る。
【０１２５】
特定の好ましい実施形態において、本発明のニック形成反応および伸長反応は、等温条件下で行われる。本明細書中で使用される場合、「等温的に」および「等温条件」とは、増幅過程の間、反応の温度が本質的に一定に保持された（すなわち、同じ温度であるか、または上限温度と下限温度との差異が２０℃以下である同じ狭い温度範囲内である）反応条件のセットをいう。本発明の増幅方法の利点は、上限温度と下限温度との間で温度をサイクルさせる必要がないことである。ニック形成反応および伸長反応の両方が、同じ温度にて、または同じ狭い温度範囲内で行われる。温度を維持するために使用される装置が、反応混合物の温度を少ない程度で変動させることが可能である場合、このような変動は、増幅反応に不利益ではない。等温増幅のための例示的な温度としては、５０℃〜７０℃の間の任意の温度、または５０℃〜７０℃、５５℃〜７０℃、６０℃〜７０℃、６５℃〜７０℃、５０℃〜５５℃、５０℃〜６０℃、もしくは５０℃〜６５℃の間の温度範囲が挙げられるが、これらに限定されない。多くのＮＡおよびＤＮＡポリメラーゼは、上記の例示的温度にてまたは上記の例示的な温度範囲内で活性である。例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いるニック形成反応およびｅｘｏ−  Ｂｓｔポリメラーゼ（ＢｉｏＲａｄ）を用いる伸長反応の両方は、約５５℃にて行われ得る。約５０℃〜７０℃の間で活性な他のポリメラーゼとしては、ｅｘｏ−  Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ｅｘｏ−  Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ｅｘｏ−Ｐｆｕ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）、ｅｘｏ−Ｂｃａ（Ｐａｎｖｅｒａ）およびＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｇｒａｄｅ  Ｔａｑ（Ｐｒｏｍｅｇａ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２６】
制限エンドヌクレアーゼが、ニック形成薬剤として使用される場合、改変デオキシリボヌクレオシド三リン酸は、半改変（ｈｅｍｉｍｏｄｉｆｉｅｄ）制限エンドヌクレアーゼ認識配列を生成するために必要である。制限エンドヌクレアーゼ認識配列中に改変デオキシリボヌクレオシド三リン酸を含む二本鎖核酸の一方の鎖の切断の阻害に寄与する任意の改変デオキシリボヌクレオシド三リン酸が使用され得る。例示的な改変デオキシリボヌクレオシド三リン酸としては、２’−デオキシシチジン５’−Ｏ−（１−チオ三リン酸）［すなわち、ｄＣＴＰ（．α．Ｓ）］、２’−デオキシグアノシン５’−Ｏ−（１−チオ三リン酸）、チミジン−５’−Ｏ−（１−チオ三リン酸）、２’−デオキシシチジン５’−Ｏ（１−チオ三リン酸）、２’−デオキシウリジン５’−三リン酸、５−メチルデオキシシチジン５’−三リン酸、および７−デアザ−２’−デオキシグアノシン５’−三リン酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２７】
（８．増幅された一本鎖核酸の検出および／または特徴付け）
ｃＤＮＡ集団中の標的ｃＤＮＡまたは生物学的サンプル中の標的ｍＲＮＡの存在は、増幅産物（Ａ１）を検出および／または特徴付けすることによって検出され得る。一本鎖核酸分子を検出または特徴付けするために適切な任意の方法が、使用され得る。例えば、増幅反応は、標識が、増幅核酸分子に組み込まれるように、標識デオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で行われ得る。核酸フラグメントへの組み込みに適した標識、およびその後のフラグメントの検出のための方法は、当該分野で公知であり、例示的な標識としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：放射標識（例えば、３２Ｐ、３３Ｐ、１２５Ｉまたは３５Ｓ）、呈色反応生成物を生じ得る酵素（例えば、アルカリホスファターゼ）、蛍光標識（例えば、フルオレセインイソチオシアネート）（ＦＩＴＣ）、ビオチン、アビジン、ジゴキシゲニン、抗原、ハプテン、または蛍光色素。
【０１２８】
あるいは、増幅核酸分子は、実質的に、好ましくは完全に、増幅核酸分子に相補的な標識された検出因子（ｄｅｔｅｃｔｏｒ）オリゴヌクレオチドの使用によって検出され得る。標識されたデオキシヌクレオシド三リン酸と同様に、検出因子オリゴヌクレオチドはまた、放射活性タグ、化学発光タグ、または蛍光タグ（蛍光分極（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）または蛍光共鳴エネルギー移動を使用する検出に適したものが挙げられる）などで標識され得る。Ｓｐａｒｇｏら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ７：３９５−４０４，１９９３；Ｈｅｌｌｙｅｒら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  １７３：９３４−４１，１９９６；Ｗａｌｋｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：３４８−５３，１９９６；Ｗａｌｋｅｒら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４２：９−１３，１９９６；Ｓｐｅａｒｓら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４７：１３０−７，１９９７；Ｍｅｈｒｐｏｕｙａｎら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  １１：３３７−４７，１９９７；およびＮａｄｅａｕら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７６：１７７−８７，１９９９を参照のこと。
【０１２９】
特定の実施形態において、増幅核酸分子は、さらに特徴付けられ得る。その特徴付けにより、これらの核酸分子の正体が確認され得、従って、ｃＤＮＡ集団中の標的ｃＤＮＡまたは生物学的サンプル中の標的ｍＲＮＡの存在が確認され得る。このような特徴付けは、一本鎖核酸フラグメントを特徴付けるために適した任意の公知の方法を介して行われ得る。例示的な技術としては、クロマトグラフィー（例えば、液体クロマトグラフィー）、質量分析および電気泳動が挙げられるが、これらに限定されない。種々の例示的な方法の詳細な記載は、米国特許仮出願第６０／３０５，６３７号および同第６０／３４５，４４５号（それらの全体が本明細書中に参考として援用される）に見いだされ得る。
【０１３０】
増幅産物を検出および／または特徴付けして、ＤＮＡ集団中の標的ｃＤＮＡまたは生物学的サンプル中の標的ｍＲＮＡの存在を検出することに加えて、標的核酸の存在は、増幅反応において生じた完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子（例えば、それらのＨ１生成物、Ｈ２生成物またはニック形成生成物）を検出することによって検出され得る。特定の実施形態において、二本鎖核酸分子の検出は、二本鎖核酸分子に特異的に結合する蛍光化合物（すなわち、蛍光插入剤）を増幅混合物に付加することによって行われ得る。蛍光插入剤の付加により、核酸増幅のリアルタイムモニタリングが可能になる。あるいは、二本鎖核酸分子（例えば、Ｈ１およびＨ２）の生成を最大にするために、ニック形成伸長反応混合物中のＮＥ（ＤＮＡポリメラーゼではない）を、不活性化し得る（例えば、熱処理によって）。ＮＥの不活性化により、反応混合物中の全てのニック形成された核酸分子が、二本鎖核酸分子を生成するために伸長することが可能になる。種々の蛍光插入剤は、当該分野で公知であり、本発明において使用され得る。例示的な薬剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：米国特許第４，１１９，５２１号；同第５，５９９，９３２号、同第５，６５８，７３５号；同第５，７３４，０５８号；同第５，７６３，１６２号；同第５，８０８，０７７号；同第６，０１５，９０２号；同第６，２５５，０４８号および同第６，２８０，９３３号において開示されているもの、ＧｌａｚｅｒおよびＲｙｅ，Ｎａｔｕｒｅ  ３５９：８５９−６１，１９９２ならびにＳＹＢＲ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ  ＷＡにおいて議論されているもの。
【０１３１】
（９．遺伝子発現プロファイリング）
遺伝子が生物学的サンプル中で発現されるか否かを決定するための方法に加えて、本発明はまた、サンプル中の複数遺伝子の発現をプロファイリングするための方法を提供する。例えば、生物学的サンプルに由来するｍＲＮＡ用いて生成された二本鎖ｃＤＮＡ分子は、制限エンドヌクレアーゼで最初に消化されて、比較的短いｃＤＮＡフラグメントを提供し得る。これらのｃＤＮＡフラグメントは、核酸増幅に適した反応緩衝液中で、ニック形成薬剤およびＤＮＡポリメラーゼと混合され得る。ニック形成薬剤の認識配列を含むそのｃＤＮＡフラグメントは、従って、一本鎖核酸を増幅するためのテンプレートとして機能し得る。増幅された一本鎖核酸は、分離および／または特徴付けされ得る。これらの増幅核酸の特徴付けは、１以上の目的のｃＤＮＡ分子の存在または非存在を示し得る。さらにこのような特徴付けはまた、生物学的サンプルに由来するｃＤＮＡ集団のプロフィールとして機能し得る。これは、別の生物学的サンプルに由来するｃＤＮＡ集団のプロフィールと比較され得る。
【０１３２】
特定の実施形態において、増幅核酸の全てが、特徴付けられるわけではない。言い換えると、これらの実施形態において、所定の基準を満たす特定の増幅核酸のみが、特徴付けられる必要がある。例えば、増幅核酸分子は、始めに、液体クロマトグラフィーによって分離され得、短い核酸フラグメントを含む画分のみが、例えば、質量分析によりさらに特徴付けられる。ｃＤＮＡ分子の消化は、その後の質量分析に適した比較的短いフラグメントの増幅を増大させる。しかし、ｃＤＮＡ分子が、ニック形成薬剤およびＤＮＡポリメラーゼと混合される前に、消化される必要はない。
【０１３３】
（１０．固定化核酸および核酸のアレイ）
特定の実施形態において、本発明に従って指数関数的に核酸増幅に関与する核酸またはオリゴヌクレオチドは、固体支持体（「基材」ともいわれる）に固定され得る。固定され得るこの核酸またはオリゴヌクレオチドとしては、標的ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ、開始核酸（以下に記載される）、トリガーＯＤＮＰ、およびＴ１分子を調製するために有用であるオリゴヌクレオチドプライマーが挙げられる。特定の実施形態において、このような核酸またはオリゴヌクレオチドは、それらが一本鎖である場合にそれらの５’末端もしくは３’末端を介して固定され得るか、またはそれらが二本鎖である場合に一方の鎖の５’末端もしくは３’末端’を介して固定され得る。
【０１３４】
核酸またはオリゴヌクレオチドを固定するための方法は、当該分野で公知である。特定の実施形態において、本発明の核酸またはオリゴヌクレオチド（例えば、Ｎ１分子を調製するために必要なＴ１分子またはＯＤＮＰ）は、アレイを形成するために基材に固定され得る。本明細書中で使用される場合、「アレイ」とは、異なる領域において固体支持体上に配置され得る核酸またはオリゴヌクレオチドの集団をいう。各領域は、核酸またはオリゴヌクレオチドが結合または沈着されない距離だけいくらか分離される。いくつかの実施形態において、領域サイズは、２０〜５００ミクロンであり、近隣領域の中心間距離は、５０〜１５００ミクロンの範囲である。本発明のアレイは、２〜９、１０〜１００、１０１〜４００、４０１〜１，０００、または１，０００個を超える異なる領域を含み得る。
【０１３５】
一般に、核酸またはオリゴヌクレオチドは、以下の２つの方法において基材に固定され得る：（１）核酸またはオリゴヌクレオチドを基材上に直接合成すること（しばしば、「インサイチュ合成」といわれる）、または（２）核酸またはオリゴヌクレオチドを別々に合成またはさもなければ調製して、次いでこれらを、基材に位置づけまたは結合させること（ときおり、「合成後結合」といわれる）。インサイチュ合成について、主な技術は、フォトリソグラフィーである。簡潔には、この技術は、固体支持体の表面を、例えば、連結エレメントを通じて基材に結合される酸素原子を保護する感光性基で改変することを包含する。保護化ヒドロキシル基のこのアレイは、フォトリソグラフィーマスクを通じて照射され、照射された領域において反応性ヒドロキシル基を生成する。同じ感光性基で５’−ヒドロキシルにて保護された３’−Ｏ−ホスホルアミダイト活性化デオキシヌクレオシドは、次いで、表面に提示され、カップリングが、照射された領域のヒドロキシル基を通じて発生する。さらなる化学的反応の後に、基材はすすがれ、その表面は、第２のマスクを通じて照射されて、さらなるヒドロキシル基がカップリングのために曝される。第２の５’保護し、３’−Ｏ−ホスホルアミダイト活性化したデオキシヌクレオシドは、表面に提示される。選択的光脱保護およびカップリングサイクルは、所望のセットの生成物が得られるまで反復される。アレイ製作におけるフォトリソグラフィーの使用についての詳細な記載は、以下の特許または公開特許出願において見いだされ得る：米国特許第５，１４３，８５４号；同第５，４２４，１８６号；同第５，８５６，１０１号；同第５，５９３，８３９号；同第５，９０８，９２６号；同第５，７３７，２５７号；および公開ＰＣＴ特許出願番号ＷＯ９９／４０１０５；ＷＯ９９／６０１５６；ＷＯ００／３５９３１。
【０１３６】
合成後付着アプローチは、予め存在するオリゴヌクレオチドを基材に付着するための方法を必要とする。１つの方法は、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用を用いる。簡単に述べれば、ビオチンとストレプトアビジンとが、共有結合ではないが、強度において共有結合に等価であると考えられ得る非常に強い相互作用を形成することが周知である。あるいは、予め合成された核酸もしくはオリゴヌクレオチド、または予め調製された核酸もしくはオリゴヌクレオチドを、基材に共有結合し得る。例えば、カルボジイミドは、３つの異なるアプローチで一般に用いられ、ＤＮＡを固体支持体に結合する。１つのアプローチでは、支持体は、次に、カルボジイミドおよびカルボキシ改変オリゴヌクレオチドで処理されるヒドラジド基でコートされる。あるいは、複数のカルボン酸基をもつ基材は、アミノ改変オリゴヌクレオチドおよびカルボジイミドで処理され得る。エポキシドを基礎にした化学もまた、アミン改変オリゴヌクレオチドと用いられる。予め存在するオリゴヌクレオチドを基材に付着するための方法の詳細な記載は、以下の参考文献中に見出され得る：米国特許第６，０３０，７８２号；同第５，７６０，１３０号；同第５，９１９，６２６号；公開されたＰＣＴ特許出願番号ＷＯ００／４０５９３；Ｓｔｉｍｐｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９２：６３７９〜６３８３（１９９５）；Ｂｅａｔｔｉｅら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４１：７００〜７０６（１９９５）；Ｌａｍｔｕｒｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：２１２１〜２１２５（１９９４）；Ｃｈｒｉｓｅｙら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：３０３１〜３０３９（１９９６）；およびＨｏｌｍｓｔｒｏｍら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０９：２７８〜２８３（１９９３）。
【０１３７】
主要な合成後付着技法は、インクジェットおよび機械的スポットを含む。インクジェットは、インクジェットプリンティング工業に由来するディスペンサを用いて核酸またはオリゴヌクレオチドを散布することを含む。この核酸オリゴヌクレオチドは、供給源プレートからプリントヘッド中に上に引き抜かれ、そして次に基材の上の位置に移動される。次いで、核酸またはオリゴヌクレオチドは、小オリフィスを通じて押され、プリントヘッドから基材の表面上に小滴の射出を引き起こす。アレイ製作においてインクジェットを用いる詳細な記載は、以下の特許中に見出され得る：米国特許第５，７００，６３７号；第６，０５４，２７０号；第５，６５８，８０２号；同５，９５８，３４２号；同６，１３６，９６２号および同第６，００１，３０９号。
【０１３８】
機械的スポットは、剛直性のピンの使用を含む。ピンは、核酸またはオリゴヌクレオチド溶液中に浸漬され、それによって小容量の溶液をピンの先端上に移す。ピン先端を基材に触れさせてスポットを残し、その直径は、ピン、核酸またはオリゴヌクレオチド溶液、および基材の表面エネルギーによって決定される。機械的スポットは、一回の核酸またはオリゴヌクレオチドローディグで複数のアレイをスポットするために用いられ得る。アレイ製作において機械的スポットを用いる詳細な記載は、以下の特許および公開された特許出願中に見出され得る：米国特許第６，０５４，２７０号；同第６，０４０，１９３号；同第５，４２９，８０７号；同第５，８０７，５２２号；同第６，１１０，４２６号；同第６，０６３，３３９号；および同第６，１０１，９４６号；ならびに公開されたＰＣＴ特許出願番号ＷＯ９９／３６７６０；同９９／０５３０８；同００／０１８５９；および００／０１７９８。
【０１３９】
当業者は、上記に記載した技法の他に、他の方法もまた、基材に核酸またはオリゴヌクレオチドを固定することにおいて用いられ得ることを認識する。このような方法の記載は、制限されないで、以下の特許または公開された特許出願中に見出され得る：米国特許第５，６７７，１９５号；同第６，０３０，７８２号；同第５，７６０，１３０号；および同第５，９１９，６２６号；ならびに公開されたＰＣＴ特許出願番号ＷＯ９８／０１２２１；ＷＯ９９／４１００７；ＷＯ９９／４２８１３；ＷＯ９９／４３６８８；ＷＯ９９／６３３８５；ＷＯ００／４０５９３；ＷＯ９９／１９３４１；およびＷＯ００／０７０２２。
【０１４０】
アレイを形成するために本発明の核酸またはオリゴヌクレオチドが固定される基材は、適切な材料から調製される。好ましくは、この基材は剛直性であり、そして実質的に平坦である表面を有している。いくつかの実施形態では、この表面は、領域を輪郭で分ける一段高い部分を有し得る。このような輪郭は、増幅反応混合物を互いに別個の領域で分離し、そして別個の領域における増幅産物が個々に分析され、または特徴付けられるべきことを可能にする。適切な材料は、制限されないで、シリコン、ガラス、紙、セラミック、金属、非金属、およびプラスチックを含む。代表的な基材は、シリコンウェーハおよびホウケイ酸塩スライド（例えば、顕微鏡ガラススライド）である。特に有用な固体支持体の例は、半導体の構築に電子工業で通常用いられているシリコンウェーハである。これらのウェーハは１つの側面が高度に研磨され、かつ反射性であり、そしてシラン化学を用いてポリ（エチレンイミン）のような種々のリンカーで容易に被覆され得る。ウェーハは、ＷａｆｅｒＮｅｔ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡのような企業から商業的に入手可能である。
【０１４１】
意図される適用に依存して、当業者は、本発明のアレイの固定された分子の組成を変動し得る。例えば、本発明のＴ１またはＯＤＮＰ分子は、アレイの別個の領域毎に固定されてもよいし、されなくてもよい。好ましくは、アレイの別個の領域中の核酸またはオリゴヌクレオチドは均一である。より好ましくは、核酸またはオリゴヌクレオチドが固定されるアレイの別個の領域毎にある核酸またはオリゴヌクレオチドは均一である。本明細書で用いられる用語「均一」は、別個の領域中の核酸またはオリゴヌクレオチド分子の各々が、同じ領域中の別の核酸またはオリゴヌクレオチド分子と同じ配列をもつことを示す。あるいは、アレイの別個の領域の少なくとも１つにある核酸またはオリゴヌクレオチドは異質である。本明細書で用いられる用語「異質」は、別個の領域にある少なくとも１つの核酸またはオリゴヌクレオチドが、その領域中の別の核酸またはオリゴヌクレオチドとは異なる配列を有することを示す。いくつかの実施形態では、上記に記載の核酸またはオリゴヌクレオチド以外の分子はまた、アレイの別個の領域のいくつかまたはすべてに存在し得る。例えば、アレイの質の内部コントロールとして有用な分子が、アレイの別個の領域のいくつかまたはすべてに付着され得る。このような分子の別の例は、ハイブリダイゼーションストリンジェンシーの指標として有用な核酸であり得る。他の実施形態では、アレイの別個の領域毎における核酸またはオリゴヌクレオチドの組成は同一である。このようなアレイは、選択された集団の生物中の特定遺伝子中の遺伝子変動を決定することで、または特定遺伝子中の変異と関連する疾患または障害の平行する診断で有用であり得る。
【０１４２】
想定される適用に依存して、本発明の固定された核酸またはオリゴヌクレオチド（例えば、Ｔ１またはＴ２分子）は、種々の標的核酸に少なくとも実質的に相補的または同一であるオリゴヌクレオチド配列を含み得る。このような標的核酸は、制限されないで、動物における遺伝性疾患、発癌遺伝子、疾患素因に関連する遺伝子、法医学および／または父性決定のために有用なゲノムＤＮＡ、植物または動物において所望の特徴に関連するか、またはそれを与える遺伝子、および感染性生物のゲノムまたはエピソーム性ＤＮＡを含む。本発明のアレイは、別個の領域中の特定の型の標的核酸に少なくとも実質的に相補的であるかまたは同一である核酸またはオリゴヌクレオチドを含み得る。例えば、アレイは、第１の別個の領域中に疾患素因に関連する第１の遺伝子に少なくとも実質的に相補的であるかまたは同一である核酸またはオリゴヌクレオチド、第２の別個の領域中にこれもまた疾患素因に関連する第２の遺伝子に少なくとも実質的に相補的であるかまたは同一である別の核酸またはオリゴヌクレオチド、第３の別個の領域中にこれもまた疾患素因に関連する第３の遺伝子に少なくとも実質的に相補的であるかまたは同一であるなお別の核酸またはオリゴヌクレオチドを有し得る。このようなアレイは、（ヒトを含む）個々の動物または植物の疾患素因を決定するために有用である。あるいは、アレイは標的の機能によりカテゴリー分けされる複数の型の標的核酸に少なくとも実質的に相補的または同一である核酸またはオリゴヌクレオチドを有し得る。
【０１４３】
さらに、アレイは、種々の可能な遺伝子変動を含む標的核酸の一部分に少なくとも実質的に相補的であるかまたは同一である核酸またはオリゴヌクレオチドを含み得る。例えば、アレイの第１の領域は、標的の１つの対立遺伝子の遺伝子変動を含む標的遺伝子の一部分に少なくとも実質的に相補的であるかまたは同一である核酸またはオリゴヌクレオチドを含み得る。アレイの第２の領域は、標的の別の対立遺伝子の遺伝子変動を含む標的遺伝子の一部分に少なくとも実質的に相補的であるかまたは同一である固定核酸またはオリゴヌクレオチドを含み得る。このアレイは、標的のさらなる対立遺伝子の遺伝子変動を含む標的遺伝子の一部分に少なくとも実質的に相補的であるかまたは同一である固定核酸またはオリゴヌクレオチドを含むさらなる領域を有し得る。
【０１４４】
一般に、アレイ環境における首尾良い性能のために、固定された核酸またオリゴヌクレオチドは、安定であり、そしてハイブリダイゼーション、洗浄または増幅反応が実施される温度でのインキュベーションのような、種々の処理の間に解離してはならない。固定された核酸またオリゴヌクレオチドの密度は、次の分析に十分でなければならない。本発明の方法に適切なアレイには、代表的には１０００〜１０１２、好ましくは１０００〜１０６、１０６〜１０９、または１０９〜１０１２のＯＤＮＰ分子が少なくとも１つの別個の領域中に固定される。しかし、基材への他の核酸の非特異的結合は最小でなければならない。固定プロセスは、指数的核酸増幅に必要な固定核酸またはオリゴヌクレオチドの能力を妨害するべきではない。
【０１４５】
特定の実施形態では、リンカーを介して基材に間接的に結合した本発明の核酸またはオリゴヌクレオチドを有することが所望され得る。このリンカー（「連結エレメント」とも称される）は、核酸またはオリゴヌクレオチドを基材から距離を置くために供される化学的鎖を備える。特定の実施形態では、このリンカーは、切断可能であり得る。連結エレメントを配置する多くの方法がある。１つの一般的アプローチでは、基材は、多くの反応末端／部位をもつ連結エレメントを提供するポリマー層で被覆される。一般的な例は、ポリリシンで被覆されたガラススライドであり、これは商業的に入手可能である。別の例は、公開されたＰＣＴ出願番号ＷＯ９９／０４８９６および米国特許第６，１５０，１０３号に記載のような、ポリ（エチレンイミン）で被覆された基材である。
【０１４６】
アレイを形成しない本発明の核酸分子について、これらは、アレイを調製することで有用である上記に記載の方法を経由して固定され得る。さらに、当該分野で公知の任意の方法が用いられ得る。例えば、本発明の標的ｍＲＮＡは、固定プリンティングまたは組織プリンティングの使用により固定され得る。標的ｃＤＮＡは、最初に合成され得、そして次に、ニトロセルロースメンブレンまたはナイロンメンブレンのような、核酸またはオリゴヌクレオチドに結合する基材に固定され得る。あるいは、標的ｃＤＮＡは、基材上に固定されたオリゴヌクレオチドプライマーによるなどのように、基材上に直接合成され得る。
【０１４７】
（Ｃ．指数的核酸増幅方法を用いる遺伝子発現分析）
１つの局面では、本発明は、標的ｃＤＮＡまたは標的ｍＲＮＡの存在下で一本鎖核酸分子を指数的に増幅する。この指数的核酸増幅は、増幅された一本鎖核酸分子の検出の感度を増大し、そしてそれ故、標的ｃＤＮＡまたは標的ｍＲＮＡの存在を検出する感度を増大する。
【０１４８】
この指数的核酸増幅は、上記に記載の直線状核酸増幅反応を少なくとも別の核酸増幅反応と連結することにより実施される。第２の増幅反応の主要なステップを図１３に示す。この反応では、第１の核酸増幅反応（図１）で増幅された一本鎖核酸分子（Ａ１）は、第２のテンプレート核酸（Ｔ２）分子の存在下で初期増幅プライマーとして用いられ得る。Ｔ２は、３’〜５’に：Ａ１に実質的に相補的である配列、ニック形成剤認識配列の１つの鎖の配列を含む。Ａ１がＴ２にアニールするとき、得られる部分的に二本鎖の核酸分子は、「第２の増幅反応の初期核酸分子（Ｎ２）」と称される。ＤＮＡポリメラーゼの存在下、Ａ１からの伸長は、二本鎖ニック形成剤認識配列を含むハイブッド（Ｈ２）を生成する（工程（ａ））。認識配列を認識するニック形成剤の存在下、Ｈ２はニックを形成され、ニック形成部位で３’末端および５’末端を生成する（工程（ｂ））。ニック形成部位で５’末端を含むフラグメントが十分に短い場合（例えば、長さが１８ヌクレオチドより少ない）、それは、特定の条件下（例えば、６０℃で）Ｈ２のその他の部分から解離し得る。しかし、このフラグメントが、Ｈ２のその他の部分から容易に解離しない場合、それは、５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損であり、かつ鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼの存在下で、ニック形成部位に３’末端を有するフラグメントの伸長により置換され得る（工程（ｃ））。鎖置換はまた、鎖置換促進剤の存在下で生じ得る。このような伸長は、ニック形成剤により再ニック形成され得る新たなニック形成部位を再度創製する（工程（ｄ））。新たなＮＳで５’末端を含むフラグメント（「Ａ２」と称される）は、再び、Ｈ２のその他の部分から容易に解離され得るか、またはニック形成部位で３’末端からの伸長により置換され得る（工程（ｅ））。このニック形成−伸長サイクルは、複数回繰り返され得（工程（ｆ））、核酸フラグメントＡ２の指数的蓄積／増幅を生じる。
【０１４９】
上記のように、Ｔ２分子は、ニック形成剤認識配列の１つの鎖の配列を含む。特定の実施形態では、Ｔ２分子は、ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含み得る。このような実施形態の例は、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉの認識配列を例示のニック形成剤認識配列として用い、図１２に示される。図１４では、Ａ１の増幅は、図２中のそれと同じであり、ここで、Ｔ１は、ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含む。次いで、Ａ１は、第２のテンプレート（Ｔ２）の領域Ｘ２にアニールされ、これはまた、２つのさらなる領域：領域Ｙ２およびＺ２を有し、第２の増幅反応のために初期核酸分子Ｎ２を形成する。領域Ｙ２は、領域Ｙ１と類似の配列（すなわち、３’−ＣＴＣＡＧＮＮＮＮ−５’ここで領域Ｙ２中の複数のＮは、領域Ｙ１中の同じ位置におけるそれらと同一であり得るか、または異なり得る）を有し、その一方、領域Ｘ２およびＺ２は、領域Ｙ２の３’末端および５’末端のすぐ次の領域をそれぞれいう。Ｔ２をテンプレートとして用いる伸長は、Ａ１の５’末端配列が領域Ｘ２の３’末端配列にアニールするか否かに依存して、二本鎖核酸フラグメント（Ｈ２）または部分的に二本鎖の核酸フラグメント（Ｈ２）を生成する。得られるＨ２は、二本鎖Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉ認識配列を含み、これは、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉによりニックを形成され得る。ニック形成部位の３’末端は、ニック形成部位で５’末端を含む鎖Ａ２を置換して、ＤＮＡポリメラーゼにより再び伸長され得る。このニック形成−伸長サイクルは複数回繰り返され、置換された鎖Ａ２の蓄積／増幅を生じる。Ａ２の増幅は指数的である。なぜなら、それは、２つの連結された直線状増幅反応の最終増幅産物であるからである。
【０１５０】
Ａ２は、領域Ｚ２をテンプレートとして増幅されるので、Ａ２は、領域Ｚ２がＡ１に少なくとも実質的に相補的である配列、またはＡ１に実質的に相補的でない配列を有するよう設計することによりＡ１と少なくとも実質的に同一である配列、またはＡ１とは異なる配列を有するように設計され得る。１つの実施形態では、領域Ｚ２は、Ａ１に少なくとも実質的に相補的であり、その結果、領域Ｘ２およびＺ２の両方がＡ１にアニールし得る。Ａ１のＺ２へのアニーリングは、しかし、Ａ１の３’末端またはニック形成部位でのＨ２のニックを形成された産物の３’末端からの伸長により置換され得、そしてそれ故、Ａ２増幅の速度に有意に影響しない。なぜなら、この実施形態では、Ａ２はＡ１に少なくとも実質的に同一であり、Ａ２もまた、領域Ｘ２にアニールし、そしてそれ自身の増幅を開始するからである。このような増幅は、Ａ２増幅の速度およびレベルを劇的に増加し得る。
【０１５１】
Ｔ２がニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含む別の例の実施形態を図１５に示す。この実施例では、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉの認識配列が、ニック形成剤認識配列の例として用いられる。第１の増幅反応におけるＡ１の増幅は、図３におけるそれと同じであり、ここで、第１のテンプレートＴ１は、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉの認識配列のセンス鎖の配列を含む。第２の増幅反応におけるＡ２の増幅は、図１４におけるそれと同じである。
【０１５２】
特定の他の実施形態において、Ｔ２分子は、ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み得る。このような実施形態の例が、例示的なニック形成剤認識配列としてＮ．ＢｓｔＮＢＩの認識配列を使用して、図１６に示される。図１６において、Ａ１の増幅は、図２における増幅と同じであり、ここで、Ｔ１は、ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含む。次いで、Ａ１は、第２の増幅反応のための開始プライマーとして使用される。Ａ１は、Ｔ２のＲｅｇｉｏｎ  Ｘ２（これはまた、２つのさらなる領域（Ｒｅｇｉｏｎ  Ｙ２およびＺ２）を有する）にアニーリングされて、その第２の増幅反応のための開始核酸分子Ｎ２を形成する。Ｒｅｇｉｏｎ  Ｙ２は、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩの認識配列のセンス鎖の配列、およびその配列に対して直接３’側の４つのヌクレオチド（すなわち、３’−ＮＮＮＮＣＴＧＡＧ−５’（ここで、Ｎの各々は、Ａ、Ｔ、ＧまたはＣであり得る））からなり、一方、Ｒｅｇｉｏｎ  Ｘ２およびＺ２は、Ｒｅｇｉｏｎ  Ｙ２の、それぞれ３’末端および５’末端のすぐ次の領域をいう。テンプレートとしてＴ２を使用したＡ１の伸長は、完全にかまたは部分的に二本鎖であり得る伸長産物（Ｈ２）を提供し、これは、Ａ１の５’末端配列がＲｅｇｉｏｎ  Ｘ２の３’末端配列にアニーリングされるか否かに依存する。Ｈ２は、二本鎖Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ認識配列を含むので、このＨ２は、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩの存在下でニック形成され得る。このニック形成部位において得られた３’末端は、ＤＮＡポリメラーゼによって再度伸長され、Ｒｅｇｉｏｎ  Ｘ２を置き換える。このニック形成−伸長サイクルは、複数回繰り返され、結果として、そのニック形成部位にて５’末端を含む置換された鎖Ａ２の蓄積／増幅を生じる。Ａ１の５’末端配列がＲｅｇｉｏｎ  Ｘ２の３’末端配列にアニーリングする場合、Ａ２は、Ｒｅｇｉｏｎ  Ｘ２と正確に同一である。そうでなければ、Ａ２およびＲｅｇｉｏｎ  Ｘ２は、それらが異なる長さを有する場合、互いに実質的に相補的である。Ａ２の増幅は、指数関数的である。なぜなら、これは、２つの連結した線形増幅反応の最終増幅産物であるからである。
【０１５３】
Ｔ２がニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含む実施形態の別の例が、図１７に示される。この例において、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩの認識配列は、例示的なニック形成剤認識配列として使用される。第１の増幅反応におけるＡ１の増幅は、図３における増幅と同じであり、ここで、この第１のテンプレートであるＴ１は、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩの認識配列のセンス鎖の配列を含む。第２の増幅反応におけるＡ２の増幅は、図１６における増幅と同じである。
【０１５４】
上記の例示的な実施形態に加えて、指数関数的な核酸増幅は、第２の線形増幅反応を用いて線形増幅を行う遺伝子発現分析に関連する節において記載される種々の線形増幅方法を連結させることによって、行われ得る。これらの節において記載される線形増幅反応によって増幅された一本鎖核酸分子は、ニック形成剤認識配列の一方の鎖の配列を含む第２のテンプレート核酸Ｔ２にアニーリングされ得る。得られる開始核酸Ｎ２は伸長され得、そして第２の一本鎖核酸分子Ａ２を増幅するためのテンプレートとして使用され得る。
【０１５５】
いくつかの他の実施形態において、指数関数的な核酸増幅は、１つのテンプレート核酸（すなわち、Ｔ１分子）のみの存在下で行われ得る。例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩの認識配列を例示的な認識配列として使用する、図２３に示される実施形態において、Ｔ１分子のＲｅｇｉｏｎ  Ｘ１およびＲｅｇｉｏｎ  Ｚ１の両方が、トリガーＯＤＮＰの配列（「Ｓ１」とも呼ばれる）に実質的に相補的であるかまたは正確に相補的である、同一な配列（「Ｓ１’」とも呼ばれる）を含む。第１の増幅の間、Ａ１は、Ｒｅｇｉｏｎ  Ｚ１をテンプレートとして使用して増幅されるので、Ａ１は、Ｓ１と同じ配列を有する。次いで、Ａ１は、Ｔ１の別の分子をテンプレートとして使用する第２の増幅反応のためのオリゴヌクレオチドプライマーとして機能し得る。第１の増幅反応のためのオリゴヌクレオチドプライマーおよびテンプレートは、それぞれ、第２の増幅反応ためのプライマーおよびテンプレートの配列と同一の配列を有するので、この第２の増幅反応から得られる増幅核酸フラグメント（Ａ２）は、第１の増幅反応からの増幅核酸フラグメント（Ａ１）の配列と同じ配列を有する。次いで、Ａ２は、Ｔ１の別の分子をテンプレートとして使用して、Ａ２に同一である核酸フラグメント（Ａ３）を増幅させる第３の増幅反応のためのオリゴヌクレオチドプライマーとして機能し得る。上記のプロセスは、全てのＴ１分子がトリガーＯＤＮＰ分子もしくは増幅フラグメント（すなわち、Ａ１、Ａ２，Ａ３など）にアニーリングされるか、またはこれらの核酸増幅反応の他の必要な成分の１つ（例えば、デオキシヌクレオシド三リン酸）が消耗されるまで、複数回繰り返され得る。
【０１５６】
上記の核酸増幅プロセスの間、トリガーＯＤＮＰ（標的ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ由来）の存在は、以前の増幅反応からの増幅核酸フラグメント（これは、引き続く増幅反応のための増幅プライマーとして機能する）によって連結された、複数増幅反応を開始する。各反応は、Ｔ１分子をテンプレートとして使用し、トリガーＯＤＮＰと同一の配列を有する核酸フラグメントを増幅させる。最終結果は、テンプレートＴ１分子の存在下における、トリガーＯＤＮＰの非常に高速な増幅である。
【０１５７】
トリガーＯＤＮＰの１テンプレート増幅のいくつかの実施形態において、Ｒｅｇｉｏｎ  Ｘ１は、トリガーＯＤＮＰの配列（Ｓ１）に少なくとも実質的に相補的である配列（Ｓ１ｘ’）以外のさらなる配列を含み得る。このさらなる配列は、Ｔ１中のＳ１ｘ’とＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列との間にあり得、かつ５ヌクレオチド以下、１０ヌクレオチド以下、１５ヌクレオチド以下、２０ヌクレオチド以下、２５ヌクレオチド以下、５０ヌクレオチド以下、または１００ヌクレオチド以下を含み得る。同様に、Ｒｅｇｉｏｎ  Ｚ１もまた、Ｓ１ｘ’に少なくとも実質的に同一である配列（Ｓ１ｚ’）以外のさらなる配列を含み得る。しかし、このようなさらなる配列がＲｅｇｉｏｎ  Ｚ１に存在する場合、Ｓ１ｚ’は、この配列がＲｅｇｉｏｎ  Ｙ１またはその３’部分に相補的でない場合に、Ｔ１の５’末端に位置付けられる必要があり、その結果、さらなる配列は、別のＴ１分子をテンプレートとして使用してＡ１が伸長されるのを防止するように、Ａ１の３’末端において存在しない。いくつかの実施形態において、このさらなる配列は、Ｔ１中のＮＡＲＳのアンチセンス鎖の配列とＳ１ｚ’との間に存在し、かつ５ヌクレオチド以下、１０ヌクレオチド以下、１５ヌクレオチド以下、２０ヌクレオチド以下、２５ヌクレオチド以下、５０ヌクレオチド以下、または１００ヌクレオチド以下を含む。
【０１５８】
トリガーＯＤＮＰの上記の指数関数的な増幅の特定の実施形態において、Ｔ１は、多くとも、５０ヌクレオチド長、７５ヌクレオチド長、１００ヌクレオチド長、１５０ヌクレオチド長、または２００ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態において、Ｓ１ｘ’および／またはＳ１ｚ’は、少なくとも６ヌクレオチド長、８ヌクレオチド長、１０ヌクレオチド長、１２ヌクレオチド長、１４ヌクレオチド長、１６ヌクレオチド長、１８ヌクレオチド長、または２０ヌクレオチド長である。いくつかの好ましい実施形態において、Ｓ１ｘ’および／またはＳ１ｚ’は、８〜２４ヌクレオチド長であり、より好ましくは、１２〜１７ヌクレオチド長である。
【０１５９】
上記のように、本発明の指数関数的な核酸増幅方法は、２以上の核酸増幅反応を一緒に連結させ、各増幅反応は、ニック形成剤の存在下で行われる。一方の増幅反応のためのニック形成剤は、他方の増幅反応のためのニック形成剤と異なっていてもよい。あるいは、異なる増幅反応のためのニック形成剤は、互いに同一であってもよく、その結果、一方のニック形成剤のみが、核酸分子の指数関数的な増幅のために必要とされる。
【０１６０】
同様に、一方の増幅反応のＤＮＡポリメラーゼは、他方の増幅反応のＤＮＡポリメラーゼと異なっていてもよい。あるいは、異なる増幅反応のためのニック形成剤は、互いに同一であってもよく、その結果、一方のＤＮＡポリメラーゼのみが、核酸分子の指数関数的な増幅のために必要とされる。
【０１６１】
特定の実施形態において、第２の増幅反応は、等温条件下で行われる。いくつかの実施形態において、第１の増幅反応と第２の増幅反応の両方が、等温条件下で行われる。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、第１の増幅反応と第２の増幅反応の両方が、１個の容器内で行われ、従って、同一条件下で行われる。このような実施形態において、増幅反応混合物中のＴ２分子の数は、好ましくは、Ｔ１分子の数よりも多いが、必ずしもＴ１分子の数より多い必要があるわけではない。Ｔ１分子の数よりもＴ２分子の数が多いほうが好ましいことは、Ｔ２分子が、Ｔ１分子をテンプレートとして使用して増幅される一本鎖核酸分子Ａ１のためのアニーリングパートナーとして使用されるという事実に起因する。言い換えると、第１の増幅反応の間、各Ｔ１分子はテンプレートとして使用され、複数コピーのＡ１を作製する。従って、Ｔ１分子の各々について、複数のＴ２分子は、好ましくは、単一のＴ１分子をテンプレートとして使用して増幅される複数のＡ１分子のためのアニーリングパートナーを提供するために存在する。
【０１６３】
本発明のＴ２分子は、固体支持体に固定されていても固定されていなくてもよい。固定されている場合、その固体支持体の別個の領域上の複数のＴ２分子は、アレイを形成し得、その結果、二回目の核酸増幅は、このアレイ上で行われる。このようなアレイは、上記のような本発明の他の核酸分子のアレイ（例えば、Ｔ１アレイ）の１つと類似の型のアレイであり得る。
【０１６４】
特定の実施形態において、第２の増幅反応の増幅産物は、相対的に短くあり得、かつ多くとも、２５ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、または８ヌクレオチドを有する。このような短い長さのものは、適切に設計したＴ２分子によって達成され得る。短い長さのＡ２分子が、有利であり得る。なぜなら、この短い長さのＡ２分子が、増幅効率および増幅速度を増加させるからである。さらに、これにより、鎖置換活性を有さないＤＮＡポリメラーゼの使用が可能になる。これはまた、質量分光測定分析のような特定の技術によるＡ２分子の検出を容易にする。
【０１６５】
本発明の核酸増幅方法は、２つの核酸増幅反応を一緒に連結させることに限定されない。特定の実施形態において、第２の増幅反応は、第３の増幅反応にさらに連結され得る。言い換えると、第２の増幅反応の間に増幅された核酸分子Ａ２は、別の核酸分子「Ｔ３」の一部にアニーリングされ得、この核酸分子Ｔ３は、第３の増幅反応において核酸分子「Ａ３」の増幅を誘発するために、ＮＡＲＳの一方の鎖の配列を含む。さらなる増幅反応が、その鎖に加えられ得る。例えば、Ａ３は、順に、ＮＡＲＳの一方の鎖もまた含んでいる別の核酸分子「Ｔ４」の一部にアニーリングし得、そして第４の増幅反応において核酸分子「Ａ４」の増幅を誘発し得る。引き続く各増幅反応は、その以前の増幅反応からの増幅フラグメントの線形増幅を生じるので、増幅系において増幅反応の数が多くなれば、増幅レベルはより高くなる（但し、この系の他の成分（例えば、テンプレート核酸分子、ＮＡ、およびＤＮＡポリメラーゼ）は、その増幅速度も増幅レベルも限定しない）。
【０１６６】
（Ｄ．遺伝子発現分析用の組成物およびキット）
１つの局面において、本発明は、核酸分子を提供し、この核酸分子は、二本鎖ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を有する、天然に存在するゲノムＤＮＡまたは天然に存在するｍＲＮＡのｃＤＮＡの一部に少なくとも実質的に同一である配列を含む。この核酸配列は、多くとも、２００ヌクレオチド長、１５０ヌクレオチド長、１２０ヌクレオチド長、１００ヌクレオチド長、７５ヌクレオチド長、５０ヌクレオチド長、４０ヌクレオチド長、３０ヌクレオチド長、２５ヌクレオチド長、または２０ヌクレオチド長である。この核酸配列は、３’側から５’側へと、３つの領域（Ｒｅｇｉｏｎ  Ａ、ＢおよびＣ）を含む。Ｒｅｇｉｏｎ  Ａは、多くとも、１００ヌクレオチド長、７５ヌクレオチド長、５０ヌクレオチド長、４０ヌクレオチド長、３０ヌクレオチド長、２５ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、１５ヌクレオチド長、１０ヌクレオチド長、８ヌクレオチド長、７ヌクレオチド長、６ヌクレオチド長、５ヌクレオチド長、４ヌクレオチド長、または３ヌクレオチド長のヌクレオチド配列である。Ｒｅｇｉｏｎ  Ｂは、天然に存在するゲノムＤＮＡまたは天然に存在するｍＲＮＡのｃＤＮＡの一部に存在するニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列である。Ｒｅｇｉｏｎ  Ｃは、多くとも、１００ヌクレオチド長、７５ヌクレオチド長、５０ヌクレオチド長、４０ヌクレオチド長、３０ヌクレオチド長、２５ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、１５ヌクレオチド長、１０ヌクレオチド長、８ヌクレオチド長、７ヌクレオチド長、６ヌクレオチド長、５ヌクレオチド長、４ヌクレオチド長、または３ヌクレオチド長のヌクレオチド配列である。この核酸は、上記のような（例えば、図５）二本鎖ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含むｍＲＮＡ分子またはｃＤＮＡ分子を検出するための、テンプレートとして機能し得る。
【０１６７】
特定の実施形態において、本発明の核酸分子は、ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を有する、天然に存在するゲノムＤＮＡまたは天然に存在するｍＲＮＡのｃＤＮＡの一部に正確に同一である配列を含む。他の実施形態において、この核酸分子は、ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を有する、天然に存在するゲノムＤＮＡまたは天然に存在するｍＲＮＡのｃＤＮＡの一部に実質的に同一である配列を含む。天然に存在するゲノムＤＮＡまたは天然に存在するｍＲＮＡのｃＤＮＡの一部に実質的に同一である核酸分子の配列は、この天然に存在するゲノムＤＮＡまたは天然に存在するｍＲＮＡのｃＤＮＡの一部に、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり得る。この文脈において、２つの核酸のパーセント配列同一性は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０，１９９０）のＢＬＡＳＴプログラムを、それらのデフォルトパラメータとともに使用して決定される。これらのプログラムは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−７，１９９３）におけるように改変された、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−８，１９９０）のアルゴリズムを実行する。ＢＬＡＳＴプログラムは、例えば、ウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）にて利用可能である。
【０１６８】
本発明はまた、標的ｃＤＮＡまたは標的ｍＲＮＡおよびニック形成剤の存在下において、一本鎖核酸フラグメントを増幅する際にテンプレートとして機能し得る一本鎖核酸分子を提供する。この一本鎖核酸分子は、多くとも、２００ヌクレオチド長、１５０ヌクレオチド長、１２０ヌクレオチド長、１００ヌクレオチド長、７５ヌクレオチド長、５０ヌクレオチド長、４０ヌクレオチド長、３０ヌクレオチド長、２５ヌクレオチド長、または２０ヌクレオチド長であり、ニック形成剤によって認識可能な二本鎖ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含み、かつ標的ｃＤＮＡ分子または標的ｍＲＮＡ分子に実質的に相補的である。
【０１６９】
関連した局面において、本発明は、標的ｃＤＮＡまたは標的ｍＲＮＡにアニーリングした際に、ニック形成剤の存在下でこの標的ｃＤＮＡまたは標的ｍＲＮＡの一部の増幅を可能にする一本鎖核酸分子をさらに提供する。この一本鎖核酸分子は、多くとも、２００ヌクレオチド長、１５０ヌクレオチド長、１２０ヌクレオチド長、１００ヌクレオチド長、７５ヌクレオチド長、５０ヌクレオチド長、４０ヌクレオチド長、３０ヌクレオチド長、２５ヌクレオチド長、または２０ヌクレオチド長であり、ニック形成剤によって認識可能な二本鎖ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含み、かつ標的ｃＤＮＡ分子または標的ｍＲＮＡ分子に実質的に相補的である。
【０１７０】
本発明はまた、遺伝子発現分析用のキットを提供する。このようなキットは、以下の構成要素の、１種、２種、数種、または全てを備え得る：（１）二本鎖ニック形成剤認識配列の１つの鎖を含むテンプレートＴ１分子；（２）ニック形成剤（例えば、ＮＥまたはＲＥ）；（３）ニック形成剤（２）のために適切な緩衝液；（４）ＤＮＡポリメラーゼ；（５）ＤＮＡポリメラーゼ（４）のために適切な緩衝液；（６）ｄＮＴＰ；（７）改変ｄＮＴＰ；（８）コントロールテンプレートおよび／またはテンプレート核酸を増幅するためのコントロールオリゴヌクレオチドプライマー；（９）クロマトグラフィーカラム；（１０）クロマトグラフィーによる核酸の特徴付けまたは分離を行うための緩衝液；（１１）鎖置換促進剤（ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ）（例えば、１Ｍのトレハロース）；（１２）マイクロタイタープレートまたはマイクロウェルプレート；（１３）液体クロマトグラフィーおよび／または質量分析法のためのオリゴヌクレオチド標準（例えば、６マー、７マー、８マー、１２マーおよび１６マー）；ならびに（１４）このキットを使用するための指示書冊子。上記の多数の構成要素の詳細な説明は、上記に与えられている。
【０１７１】
特定の実施形態において、本発明の組成物は、ＮＡに特異的な緩衝液もＤＮＡポリメラーゼに特異的な緩衝液も含有しない。代わりに、この組成物は、ニック形成剤とＤＮＡポリメラーゼとの両方に適切な緩衝液を含有する。例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩがニック形成剤であり、そしてｅｘｏ−ＶｅｎｔがＤＮＡポリメラーゼである場合、このニック形成−伸長緩衝液は、０．５×Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ緩衝液および１×ｅｘｏ−Ｖｅｎｔ緩衝液であり得る。
【０１７２】
指数関数的な核酸増幅を行う遺伝子発現分析のために、このキットは、第２の増幅反応において使用される１種以上のさらなる構成要素をさらに備え得る。これらの構成要素としては、以下が挙げられる：（１）第２のニック形成剤；（２）第２のＤＮＡポリメラーゼ；および（３）第２のテンプレート核酸分子Ｔ２。
【０１７３】
関連した局面において、本発明は、指数関数的な核酸増幅を行う遺伝子発現分析用の組成物を提供する。このような組成物は、一般に、上記のような（図１４〜１７）第１の核酸増幅反応および第２の核酸増幅反応においてそれぞれ機能するように設計された、少なくとも部分的に二本鎖の第１の核酸分子（Ｎ１またはＨ１）および少なくとも部分的に二本鎖の第２の核酸分子（Ｎ２またはＨ２）の組み合わせを含有する。
【０１７４】
本発明の組成物は、単純にその成分を混合することによってか、または組成物の形成を生じる反応を実施することによって、作製され得る。本発明のキットは、その成分のいくつかを混合することによって調製され得るか、または個々の容器中にその成分の各々を維持する。
【０１７５】
（Ｅ．発明の適用）
本明細書中の上記に詳細に考察されるように、本発明は、ニック形成剤（ｎｉｃｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を使用する、遺伝子発現分析のための方法および組成物を提供する。本発明は、広範な種々の適用において有用性を見出し、ここで、生物学的サンプル中の目的の遺伝子が発現される場所を決定することが必要であり、そしてここで、２つの核酸集団を比較することが所望され得る。このような適用としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：植物もしくは動物において感染性疾患を引き起こすかまたは食物安全性に関与する、感染性生物の同定および／または特徴付け、ならびに植物、動物もしくはヒトにおける疾患関連遺伝子、または植物もしくは動物における所望の形質（例えば、高収穫量、増加した疾患耐性および高栄養価）に関連する遺伝子の同定および／または特徴付け。
【０１７６】
例えば、本発明は、病原体特異的遺伝子発現を検出することによって、目的の生物学的サンプル中の病原体を検出するために有用である。あるいは、特定の形質（例えば、疾患耐性または疾患感受性）に関連することが既知の遺伝子の発現を検出するために使用され得、従って、サンプルが得られた特定の被験体が特定の形質を有する可能性を予測するために有用である。
【０１７７】
さらに、本発明はまた、ｃＤＮＡ集団をプロファイリングするための方法を提供する。２つのｃＤＮＡ集団間のプロファイルの比較は、両方のｃＤＮＡ集団に共通するｃＤＮＡ分子および一方の集団には存在するがもう片方には存在しないｃＤＮＡ分子を同定し得る。このような同定は、一方のｃＤＮＡ集団が単離された一方の生物のみによって保有され、そして他方のｃＤＮＡ集団が調製された他方の生物には保有されない表現型に関連する核酸分子の同定および／または特徴付けを助ける。
【０１７８】
以下の実施例は、例示として提供されるのであって、限定としてではない。
【実施例】
【０１７９】
（実施例１）
（核酸配列の指数関数的増幅）
この実施例は、ニック形成制限エンドヌクレアーゼおよびＤＮＡポリメラーゼを使用する、特定の核酸配列の指数関数的増幅を記載する。
【０１８０】
この実施例において使用したオリゴヌクレオチドは、ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ）から獲得し、そしてその配列を、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉ認識配列のセンス鎖またはアンチセンス鎖の配列に下線を付して、以下に示す：
【０１８１】
【化８】
2005516610.tif 000009
以下の反応混合物を、室温でアセンブルさせた：
７５μｌ  水
１０μｌ  １０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液（ＮＥＢ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）より）
５μｌ  １０×Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ（ＮＥＢより）
５μｌ  Ｔ１（０．２ナノモル／μｌ）
５μｌ  ＴＯＰ１（０．２ナノモル／μｌ）。
【０１８２】
この混合物を、９５℃に加熱し、次いで５０℃に冷却し、そして５０℃で１０分間維持した。５０℃でのインキュベーション後、以下の二重鎖（Ｎ１）を形成した：
【０１８３】
【化９】
2005516610.tif 000010
上記の混合物を、以下を含む反応混合物へと希釈した：
２５μｌ  １０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液（ＮＥＢより）
１２．５μｌ  １０×Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ（ＮＥＢより）
０．５μｌ  上記の二重鎖混合物
１０μｌ  ２５ｍＭ  ｄＮＴＰ（ＮＥＢより）
１００μｌ  １Ｍ  トレハロース（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）より）
２５単位  Ｎ．ＢｓｔＮＢＩニック形成酵素（ＮＥＢより）
５単位  ｅｘｏ−Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢより）
５μｌ  Ｔ２
１０２μｌ  水。
【０１８４】
この反応物を、６０℃で１５分間インキュベートした。１５分後、１０μｌの反応物をサンプリングし、そして質量分析に供した。
【０１８５】
６０℃でのインキュベーション後、以下の二重鎖（Ｈ１）を、ＤＮＡポリメラーゼの作用によってフィルイン（ｆｉｌｌ  ｉｎ）した。「黒逆三角形」は、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩのニック形成部位を示す：
【０１８６】
【化１０】
2005516610.tif 000011
このニック形成酵素は、Ｈ１の上側の鎖を切断し、そして配列５’−ｃｃａｇｔｃｇｔａｇｇｔ−３’（「Ａ１」と称する）を有するフラグメントを放出する。このフラグメント（すなわち、Ａ１）が作製されると、以下の二重鎖（Ｎ２）が、６０℃の反応混合物中で形成される：
【０１８７】
【化１１】
2005516610.tif 000012
ポリメラーゼは、この二重鎖をフィルインして、以下のフラグメント（Ｈ２）を形成する：
【０１８８】
【化１２】
2005516610.tif 000013
Ｎ．ＢｓｔＮＢＩは、この二重鎖にニックを形成し、そして配列５’−ｔｔｃｃａｇｔｃｇｔａｇｇｔ−３’を有するフラグメント（「Ａ２」と称する）を生成し、このフラグメントは、Ｔ２に、以下の部分的に二本鎖のフラグメントを形成する準備をさせ得る：
【０１８９】
【化１３】
2005516610.tif 000014
上記の部分的に二本鎖のフラグメントは、ＤＮＡポリメラーゼによってフィルインされて、以下の二重鎖を形成する：
【０１９０】
【化１４】
2005516610.tif 000015
次いで、この二重鎖に、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉによってニック形成し、フラグメント５’−ｔｔｃｃａｇｔｃｇｔａｇｇｔ−３’（すなわち、Ａ２）を生成する。このニック形成および伸長のプロセスを、複数回繰り返し、Ａ２分子の増幅を生じる。
【０１９１】
増幅されたフラグメントＡ２は、以下のような、予測された質量／電荷プロフィールを有する：
【０１９２】
【表１】
2005516610.tif 000016
増幅されたフラグメントＡ２の質量分析を、図１８に示す。上のパネルは、１４４８．６の質量／電荷比を有するフラグメントについての、イオン電流を示す。総イオン電流は、２２９単位である。中央のパネルは、ダイオードアレイからのトレースを示す。下のパネルは、質量分析器からの総イオン電流を示す。
【０１９３】
コントロール実験における質量分析を、図１９に示す。上のパネルは、質量分析器からの総イオン電流を示す。中央のパネルは、１４４８．６の質量／電荷比を有するフラグメントについての、イオン電流を示す。総イオン電流は、４３単位であり、これは、バックグラウンドのみを示す。下のパネルは、ダイオードアレイからのトレースを示す。
【０１９４】
上記の結果は、フラグメントＡ２の指数関数的な増幅（１０９倍の増幅が観察された）が存在したこと、そしてＴＯＰ１が省かれたコントロール実験においては産物が生成されなかったことを示す。
【０１９５】
（実施例２）
（１つのテンプレートを使用する、オリゴヌクレオチドの指数関数的増幅）
この実施例は、１つだけのテンプレート核酸を使用する、オリゴヌクレオチドの指数関数的増幅を記載する。
【０１９６】
この実施例において使用するオリゴヌクレオチド配列は以下の通りであり、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉの認識配列のアンチセンス鎖の配列には、下線を付している：
【０１９７】
【化１５】
2005516610.tif 000017
上記のテンプレートおよびトリガーは、これらが互いにアニールする場合に、以下の二重鎖を形成する：
【０１９８】
【化１６】
2005516610.tif 000018
ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ｅｘｏ−Ｖｅｎｔまたは９°ＮｍＴＭ）の存在下で、上記の二重鎖は、トリガーオリゴヌクレオチドの３’末端から伸長されて、下線を付したＮ．ＢｓｔＮＢ  Ｉの認識配列の両方の鎖の配列を有する、以下の伸長産物を形成する：
【０１９９】
【化１７】
2005516610.tif 000019
Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉの存在下で、上記の伸長産物はニック形成され、そして部分的に日本鎖の核酸およびトリガーオリゴヌクレオチドの配列と同一の配列を有する一本鎖核酸フラグメント（Ａ１）を生成する：
【０２００】
【化１８】
2005516610.tif 000020
上記の伸長およびニック形成は、複数回反復されて、Ａ１分子の増幅を生じ得る。さらに、Ａ１分子は、一本鎖Ｔ１分子にアニールして、Ａ１分子のさらなる増幅を生じ得る。
【０２０１】
以下の反応混合物を、４℃でアセンブルした：
１００μｌ  １０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液
５０μｌ  １０×Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ緩衝液
１６μｌ  ２５ｍＭ  ｄＮＴＰ
０．５μｌ  Ｔ１（１００ｐｍｏｌ／μｌ）
８０μｌ  ２０００単位／ｍｌ  Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ（ＮＥＢ）
２４μｌ  ９°ＮｍＴＭ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）
１０μｌ  ４００×ＳＹＢＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ  ＷＡ）
７４０μｌ  水。
【０２０２】
この反応混合物を、４℃で完全に混合した。１５０μｌの反応混合物を第一のチューブに配置し、そして１００μｌを９つのさらなるチューブに配置した。トリガーを、水で１００倍に希釈し、次いで１μｌを第一のチューブに配置した。次いで、９３倍希釈物を作製した。
【０２０３】
３０μｌの各反応物を、光サイクラーキャピラリーに添加した。このキャピラリーを、示された時間にわたって、６０℃でインキュベートした。それぞれの結果を、図２０に示す。この図は、時間の関数として、光サイクラーキャピラリーの１つにおける蛍光の蓄積を示す。これらのデータを、以下の表に要約する：
【０２０４】
【表２】
2005516610.tif 000021
上記の結果は、トリガーオリゴヌクレオチドの出発濃度の差異が測定および比較され得る約２０，０００倍の範囲が存在することを示す。
【０２０５】
（実施例３）
（オリゴヌクレオチドの線形増幅）
この実施例は、テンプレート二重鎖からのオリゴヌクレオチドの線形増幅を記載する。このテンプレート二重鎖を、２つのオリゴヌクレオチドを以下に示すように互いにアニールすることによって形成する。Ｎ．ＢｓｔＮＢＩの認識配列を、以下に示す：
【０２０６】
【化１９】
2005516610.tif 000022
ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、上記二重鎖の凹部をフィルインして、以下の伸長産物を提供する：
【０２０７】
【化２０】
2005516610.tif 000023
Ｎ．ＢｓｔＮＢＩの存在下で、上記の伸長産物は、ニック形成されて、以下のニック形成産物を生成する：
【０２０８】
【化２１】
2005516610.tif 000024
上記の伸長およびニック形成のサイクルは、複数回反復されて、フラグメント５’−ａｇｔｔｃｃａｇｔｃｇｔａｔｇｇ−３’の増幅を生じ得る。このフラグメントは、液体クロマトグラフィーおよび質量分析によって、検出および特徴付けされ得る。これは、１６６３．１ダルトンにて３の質量／電荷比、１２４７．１ダルトンにて４の質量／電荷比、そして９９７．１ダルトンにて５の質量／電荷比を有する。
【０２０９】
以下の反応物を、４℃にてアセンブルした。
【０２１０】
７４０μｌ  ヌクレアーゼを含まない脱イオン水
１１０μｌ  １０×Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ緩衝液（ＮＥＢ）
５５μｌ  １０×Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ緩衝液（ＮＥＢ）
１μｌ  １ピコモル／μｌのＮＢｂｔ１６オリゴヌクレオチド
１μｌ  １ピコモル／μｌのＩＴＡＴＯＰオリゴヌクレオチド
８０μｌ  ２０００単位／ｍｌのＮ．ＢｓｔＮＢＩ（ＮＥＢ）
２４μｌ  ５０００単位／ｍｌの９°ＮｍＴＭ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）
１６μｌ  ２５ｍＭ  ｄＮＴＰ（ＮＥＢ）。
【０２１１】
この反応混合物を、ＰＣＲチューブ中で、２０個の５０μｌアリコートに分割した。これらのチューブを、ＭＪ  サーモサイクラー上に６０℃で配置し、そして示された時間にわたってインキュベートした。次いで、これらのサンプルを、以下の液体クロマトグラフィー質量分析に供した。
【０２１２】
カラム緩衝液は、以下の通りである：緩衝液Ａは、０．０５Ｍのジメチルブチルアミンアセテート（ｐＨ７．６）を含むが、一方で緩衝液Ｂは、０．０５Ｍのジメチルブチルアミンアセテート（ｐＨ７．６）、５０％アセトニトリルを含む。
【０２１３】
アセトニトリルの浅い勾配を使用して、オリゴヌクレオチドを溶出し、そしてサンプルを清浄化する。この勾配の分析部分は、５％アセトニトリルで開始し、そして約９０秒にわたって１５％まで増大し、次いで、たった数秒にわたってカラムへと４５％アセトニトリルの「プラグ」を迅速に押す洗浄を行い、その後、５％アセトニトリルの出発条件に戻る。
【０２１４】
使用するカラムは、ＧｕａｒｄカラムＸｔｅｒｒａ２．×２０ｍｍ、３．５ミクロン、ＭＳＣ１８である。このカラムの前方は、フリットホルダ（Ｕｐｃｈｕｒｃｈ  Ａ３５６フリットホルダ、Ｕｐｃｈｕｒｃｈ  Ａ７０１  Ｐｅｅｋ  Ｐｒｅｆｉｌｔｅｒ  Ｆｒｉｔ  ０．５ミクロンを有する）中のフリットである。
【０２１５】
液体クロマトグラフィーからの画分を、質量分析器（エレクトロスプレー入り口を有するＭｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＴ  Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｉｎｃ．、Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ  ＵＫ）に注入した。注入容量は、１０マイクロリットルであった。これらのサンプルを、走査範囲８００〜２０００ａｍｕで、エレクトロスプレーネガティブモードで流した。１２４７．１ダルトンでの相対的質量単位のタイムコース結果を、以下の表中に示す：
【０２１６】
【表３】
2005516610.tif 000025
（実施例４）
（検出のために蛍光インターカレーティング剤を使用する、遺伝子発現分析）
以下のシステムは、任意の型の生物学的サンプル中のＩＬ−１  ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの測定を可能にする。標的ｃＤＮＡを、最初に、生物学的サンプルから作製し、そして引き続いて、一本鎖オリゴヌクレオチドの指数関数的増幅を誘発する。
【０２１７】
（ＩＬ−１  ７７１システム）
Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉ認識配列のセンス鎖の配列を含むｃＤＮＡフラグメントおよびこのｃＤＮＡフラグメントに実質的に相補的な第一のテンプレートを、以下に示す。Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉの認識配列のセンス鎖およびアンチセンス鎖の配列に、下線を付す。７５１は、ＩＬ−１  ｃＤＮＡの、最初に示されたヌクレオチドの数である。
【０２１８】
ｃＤＮＡフラグメント（部分的な配列のみを示す）：
【０２１９】
【化２２】
2005516610.tif 000026
上記のｃＤＮＡフラグメントおよび第一のテンプレートは、互いにアニールした場合に、以下の二重鎖を形成する：
【０２２０】
【化２３】
2005516610.tif 000027
Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉの存在下で、上記の二重鎖は、ニック形成されて、以下のニック形成された産物を生成する：
【０２２１】
【化２４】
2005516610.tif 000028
ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、上記の部分的に二本鎖のニック形成産物は、伸長されて、以下の伸長産物を形成する：
【０２２２】
【化２５】
2005516610.tif 000029
この伸長産物は、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉによって再びニック形成されて、以下のニック形成産物を生成する：
【０２２３】
【化２６】
2005516610.tif 000030
部分的に二本鎖のニック形成産物は、再び伸長され得、そしてこの伸長産物は、再びニック形成され得る。このようなニック形成−伸長サイクルは、複数回反復されて、以下のオリゴヌクレオチドの増幅を生じ得る：
【０２２４】
【化２７】
2005516610.tif 000031
増幅されたオリゴヌクレオチドＡ１は、第二のテンプレートＴ２にアニールして、以下の二重鎖を形成し得る：
【０２２５】
【化２８】
2005516610.tif 000032
上記の二重鎖は、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で伸長されて、以下の伸長産物を生成し得る：
【０２２６】
【化２９】
2005516610.tif 000033
上記の伸長産物は、ニック形成剤の存在下でニック形成されて、以下のニック形成産物を提供し得る：
【０２２７】
【化３０】
2005516610.tif 000034
上記のニック形成反応によって生成される一本鎖オリゴヌクレオチドは、Ａ１の配列と同一の配列を有し、従って、別のＴ２分子にアニールし得、そしてそれ自体を増幅し得る。
【０２２８】
（ＩＬ−１Ｌ９１４系）
認識配列Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉのセンス鎖の配列を含むｃＤＮＡフラグメントと、そのｃＤＮＡフラグメントと実質的に相補的な第１テンプレートとが、以下に示される。そのＮ．ＢｓｔＮＢ  Ｉの認識配列のセンス鎖の配列およびアンチセンス鎖の配列に、下線を付してある。９０１は、ＩＬ−１  ｃＤＮＡの最初に示されたヌクレオチドの数である。
【０２２９】
ｃＤＮＡフラグメント（部分配列のみ示される）：
【０２３０】
【化３１】
2005516610.tif 000035
第１テンプレートＴ１：
【０２３１】
【化３２】
2005516610.tif 000036
上記ｃＤＮＡフラグメントおよび第１テンプレートとは、互いにアニールした場合に、以下の二重鎖を形成する：
【０２３２】
【化３３】
2005516610.tif 000037
Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉの存在下で、上記二重鎖はニック形成して、以下のニック形成生成物を生成する：
【０２３３】
【化３４】
2005516610.tif 000038
ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、上記部分的に二重鎖であるニック形成生成物は伸長されて、以下の伸長生成物を形成する：
【０２３４】
【化３５】
2005516610.tif 000039
この伸長生成物は、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉにより再びニック形成され得、そして以下のニック形成生成物を生成し得る：
【０２３５】
【化３６】
2005516610.tif 000040
この部分的に二重鎖であるニック形成生成物は、再伸長され得、そしてその伸長生成物は、再びニック形成され得る。そのようなニック形成伸長サイクルは、複数回反復され得、以下のオリゴヌクレオチドの増幅をもたらし得る：
【０２３６】
【化３７】
2005516610.tif 000041
増幅されたオリゴヌクレオチドＡ１は、第２テンプレートＴ２にアニールして以下の二重鎖を形成し得る：
【０２３７】
【化３８】
2005516610.tif 000042
上記二重鎖は、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で伸長され得て、以下の伸長生成物を形成し得る：
【０２３８】
【化３９】
2005516610.tif 000043
上記伸長生成物は、Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉの存在下でニック形成され得て、以下のニック形成生成物を提供し得る：
【０２３９】
【化４０】
2005516610.tif 000044
上記のニック形成反応により生成される一本鎖オリゴヌクレオチド物は、Ａ１の一本鎖オリゴヌクレオチドと同一の配列を有し、従って、別のＴ２分子にアニール可能であり、かつＡ１自体を増幅可能である。
【０２４０】
（ＲＮＡ調製およびｃＤＮＡ合成）
総ＲＮＡを、フェノール−クロロホルム法により抽出した。そしてその総ＲＮＡを、ＭｅｓｓａｇｅＣｌｅａｎキット（Ｇｅｎｅ  Ｈｕｎｔｅｒ，Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，ＴＮ）を使用して、ＤＮアーゼＩを用いて３７℃にて１時間消化した。ＱＩＡＧＥＮ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）Ｏｌｉｇｏｔｅｘ  ｍＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを使用して、オリゴ（ｄＴ）−セルロースクロマトグラフィーによりポリ（Ａ）＋ＲＮＡを抽出した。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡからｃＤＮＡを合成するために、１μｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡを、１μｌの１０×ＣＤＳプライマー混合物と混合し、５×反応緩衝液と、１０×ｄＮＴＰと、０．５μｌの１００ｍＭジチオスレイトールと、５０単位のモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＣＬＯＮＴＥＣＨ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）との混合物とともに、総体積１０μｌにおいて、予熱したサーマルサイクラーにおいて７０℃にて２分間インキュベートし、５０℃にて２分間インキュベートし、その後、５０℃にて２５分間インキュベートした。１μｌの１０×終結混合物を添加することによりその反応を停止させ、ｃＤＮＡを、Ｃｈｒｏｍａ  Ｓｐｉｎ−２００カラム（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）にて精製した。
【０２４１】
以下の反応物を、４℃にてアセンブルした。
【０２４２】
１００μｌの１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液
５０μｌの１０×Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ緩衝液
１６μｌの２５ｍＭ  ｄＮＴＰ
０．５μｌのＴ１オリゴヌクレオチド（１００ｐｍｏｌ／μｌ）
１．０μｌのＴ２オリゴヌクレオチド（１００ｐｍｏｌ／μｌ）
８０μｌの２０００単位／ｍｌのＮ．ＢｓｔＮＢＩニック形成酵素（ＮＥＢ）
２４μｌの９°ＮｍＴＭＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）
１０μｌの４００×ＳＹＢＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ  ＷＡ）
７４０μｌの水。
【０２４３】
この反応物を、４℃にて徹底的に混合し、その後、１５０μｌを第１チューブ中に配置し、１００μｌをさらなる９個のチューブ中に配置した。そのＲＮＡを、０．０１ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ中で１〜１００倍希釈し、その後、１μｌを第１チューブ中に配置した。その後、５個の１０倍希釈物を作製した。
【０２４４】
２５μｌの各反応物を、光サイクラーキャピラリーに添加した。このキャピラリーを、６０℃にて２０分間インキュベートした。そのデータを、以下の表にまとめる：
【０２４５】
【表４−１】
2005516610.tif 000045
【０２４６】
【表４−２】
2005516610.tif 000046
（実施例５）
（検出のために液体クロマトグラフィーおよび質量分光計を使用する、遺伝子発現分析）
ＩＬ−１  ７７１系およびＩＬ−１  ９１４系のためのテンプレートは、実施例４と同じである。以下の反応物を氷上でアセンブルし、予熱したサーマルサイクラーに６０℃にて１０分間配置した：
１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液
０．５×Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ緩衝液
４００μＭ  ｄＮＴＰ
０．１μＭのＴ２オリゴヌクレオチド
０．２μｌのＴ１オリゴヌクレオチド
１５０単位／ｍｌのＮ．ＢｓｔＮＢＩ
５０単位の９°ＮｍＴＭポリメラーゼ（ＮＥＢ）
１×１０−６ピコモル〜１×１０−１ピコモルのｃＤＮＡ（ＩＬ−１  ｍＲＮＡから変換した）。
【０２４７】
その後、そのサンプルを、実施例３に記載されるような液体クロマトグラフィー／質量分光分析に供した。ＩＬ−１  ７７１系およびＩＬ−１  ９１４系における増幅されるフラグメントの推定質量を、以下の表に示す：
【０２４８】
【表５】
2005516610.tif 000047
ＩＬ−１標的の対数増幅の結果を、以下の表に示す：
【０２４９】
【表６】
2005516610.tif 000048
（実施例６）
（ニック形成剤認識配列中にミスマッチを含むテンプレート核酸を使用する、核酸増幅）
以下のオリゴヌクレオチドが合成された。そのオリゴヌクレオチドをＭＷＧ（ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｈｉｇｈ  Ｐｏｉｎｔ，ＮＣ）から得た。このオリゴヌクレオチドを、１００ピコモル／μｌにて、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよび０．００１Ｍ  ＥＤＴＡ中に配置した。Ｎ．ＢｓｔＮＢＩの二本鎖認識配列のセンス鎖の配列に下線を付しており、一方、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩの二本鎖認識配列のアンチセンス鎖の対応位置のヌクレオチドとは異なるヌクレオチドを、イタリック体にしている：
【０２５０】
【化４１−１】
2005516610.tif 000049
【０２５１】
【化４１−２】
2005516610.tif 000050
以下の混合物を合わせ、その後、その混合物２５μｌを、マイクロタイタープレート中の各ウェルに添加した。
【０２５２】
２５０μｌの１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液（ＮＥＢ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）
１２５μｌの１０×Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ（ＮＥＢ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）
１００μｌの２５ｍＭ  ｄＮＴＰ（ＮＥＢ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）
１０００μｌの１Ｍトレハロース（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）
２５０単位のＮ．ＢｓｔＮＢＩニック形成酵素（ＮＥＢ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）
５０単位のＶｅｎｔエキソＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）
１０２０μｌの超純水。
その後、個々の二重鎖各々２５μｌを、マイクロタイタープレートに添加した。２つのオリゴヌクレオチドプライマーをまず希釈し、それらを最終濃度１ピコモル／μｌにて溶液（１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）および０．５×Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ緩衝液）中に配置することによって、この二重鎖を形成させた。この１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液は、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４からなり、一方、１×Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ緩衝液は、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴからなる。その後、この混合物を１００℃まで１分間加熱し、その後、５０℃にて１０分間保持して、二重鎖を形成させた。そのプレートを４℃にて再密封し、その後、６０℃まで１時間加熱した。
【０２５３】
以下の二重鎖を試験した：
【０２５４】
【化４２−１】
2005516610.tif 000051
【０２５５】
【化４２−２】
2005516610.tif 000052
【０２５６】
【化４２−３】
2005516610.tif 000053
【０２５７】
【化４２−４】
2005516610.tif 000054
そのプレートを、ＬＣ／ＭＳ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＴＤ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ  ＵＫおよびＢｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）上にローディングした。このＬＣ／ＭＳは、ネガティブモードで電子スプレーを使用するＬＣＴ飛行時間型質量分光計である。条件は、以下の通りであった：
このクロマトグラフィーシステムは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ−１１００であった。このＡｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ−１１００は、バイナリーポンプ、脱気器、カラムオーブン、ダイオードアレイ検出器、およびサーモスタット付きマイクロウェルプレートオートインジェクター（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）から構成された。このカラムは、Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｔｅｒｒａであり、３μＭ粒径を有するＣ１８パッキングを組込んでおり、３００オングストロームの孔径、２．１ｍｍ×５０ｍｍを有した（Ｗａｔｅｒｓ  ｉｎｃ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）。このカラムに、５ｍＭトリエチルアミン酢酸（ＴＥＡＡ）中のアセトニトリル勾配を用いて３０℃にて通した。緩衝液は５ｍＭ  ＴＥＡＡであり、緩衝液Ｂは５ｍＭ  ＴＥＡＡおよび２５％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリルであった。この勾配は、１０％Ｂでの１分間保持にて始まり、その後、４分間かけて５０％Ｂまで上昇し、その後、３０秒間で９５％Ｂまで上昇し、最終的に、合計通過時間６分間で１０％Ｂまで戻った。そのカラム温度は、３０℃にて一定に保持した。流速は、０．４１６ｍｌ／分であった。注入体積は、１０μｌであった。質量分光計へのフローは、２００μｌ／分であった。ＬＣフローの半分を、Ｔ字管を使用して廃液へと転送した。その質量分光計は、電子スプレー入口を備えたＭｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＴ飛行時間型質量分光計（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）であった。サンプルを、電子スプレーネガティブモードにて通した。スキャン範囲は、７００ａｍｕ〜２３００ａｍｕであり、１秒スキャン時間を使用した。機器パラメーターは、以下であった：ＴＤＣ開始電圧７００、ＴＤＣ停止電圧５０、ＴＤＣ閾値０、ＴＤＣ利得制御０、ＴＤＣエッジ制御０、Ｌｔｅｆｆ  １１１７．５、Ｖｅｆｆ  ４６００。供給源パラメーターは、以下であった：脱溶媒和気体８６２Ｌ／時間、キャピラリー３０００Ｖ、サンプルコーン２５Ｖ、ＲＦレンズ２００Ｖ、抽出コーン２Ｖ、脱溶媒和温度２５０℃、供給源温度１５０℃、ＲＦ  ＤＣオフセット１．４Ｖ、ＦＲ  ＤＣオフセット２．１Ｖ、開口部６Ｖ、加速２００Ｖ、焦点１０Ｖ、ステアリング０Ｖ、ＭＣＰ検出器２７００Ｖ、プッシャーサイクル時間（手動）６０、イオンエネルギー４０Ｖ、チューブレンズ０Ｖ、グリッド２．７４Ｖ、ＴＯＦ飛行管４６２０Ｖ、反射１７９０Ｖ。
【０２５８】
抽出した以下のイオン流をモニターした：以下のフラグメント
【０２５９】
【化４３】
2005516610.tif 000055
が以下の二重鎖：
【０２６０】
【化４４】
2005516610.tif 000056
および他の上記の二重鎖から遊離されるべきであり、このフラグメントについて、１１４４．７付近で１１４４．７ダルトン±１ダルトン。
【０２６１】
その結果を以下の表に示す：
【０２６２】
【表７−１】
2005516610.tif 000057
【０２６３】
【表７−２】
2005516610.tif 000058
本願にて言及されそして／または出願データシート中に列挙される上記の米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物すべては、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【０２６４】
上記から、本発明の特定の実施形態が例示のために本明細書中に記載されているが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく種々の改変がなされ得ることが、認識される。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲によって以外は、限定されない。
【図面の簡単な説明】
【０２６５】
【図１】図１は、直線状核酸増幅反応を実施する遺伝子発現分析のための一般的方法の主要ステップの概略図である。
【図２】図２は、直線状核酸増幅反応を実施する遺伝子発現分析のための例示の方法の主要ステップの概略図である。テンプレート核酸分子Ｔ１は、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩの認識配列のアンチセンス鎖の配列を含む。
【図３】図３は、直線状核酸増幅反応を実施する遺伝子発現分析のための例示の方法の主要ステップの概略図である。テンプレート核酸分子Ｔ１は、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩの認識配列のセンス鎖の配列を含む。
【図４】図４は、直線状核酸増幅反応を実施する遺伝子発現分析のための例示の方法の主要ステップの概略図である。標的ｃＤＮＡは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含む。
【図５】図５は、直線状核酸増幅反応を実施する遺伝子発現分析のための例示の方法の主要ステップの概略図である。標的ｃＤＮＡは、二本鎖ニック形成剤認識配列を含む。テンプレート核酸分子Ｔ１は、ニック形成剤認識配列のアンチセンス鎖の配列を含む標的ｃＤＮＡの１つの鎖の一部分である。
【図６】図６は、直線状核酸増幅反応を実施する遺伝子発現分析のための例示の方法の主要ステップの概略図である。標的ｃＤＮＡは、二本鎖ニック形成剤認識配列を含む。テンプレート核酸分子Ｔ１は、Ｔ１分子の領域ＸおよびＹ中の標的ｃＤＮＡの第１の鎖に少なくとも実質的に相補的であるが、Ｔ１分子の領域Ｚ中の標的ｃＤＮＡの第１の鎖に実質的に相補的でない。
【図７】図７は、直線状核酸増幅反応を実施する遺伝子発現分析のための例示の方法の主要ステップの概略図である。標的ｃＤＮＡは、その５’末端を経由して固定化される。
【図８】図８は、直線状核酸増幅反応を実施する遺伝子発現分析のための例示の方法の主要ステップの概略図である。標的ｃＤＮＡは、二本鎖ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列および制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含む。
【図９】図９は、直線状核酸増幅反応を実施する遺伝子発現分析のための例示の方法の主要ステップの概略図であり、そしてニック形成剤認識配列を含む、部分的に二本鎖である初期核酸分子Ｎ１を用いる。標的核酸（ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ）は、固体支持体に固定化されている。その認識配列（例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ）の外側でニックを形成するニック形成エンドヌクレアーゼにより認識可能であるニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列が例示のニック形成剤認識配列として用いられる。
【図１０】図１０は、直線状核酸増幅反応を実施する遺伝子発現分析のための例示の方法の主要ステップの概略図であり、そして初期核酸分子Ｎ１を調製することにおいて２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。１つのプライマーは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列のセンス鎖の配列を含み、その一方、他のプライマーは、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＴＲＥＲＳ）の１つの鎖の配列を含む。
【図１１】図１１は、直線状核酸増幅反応を実施する遺伝子発現分析のための例示の方法の主要ステップの概略図であり、そして初期核酸分子Ｎ１を調製することにおいて２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。両方のプライマーは、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識配列のセンス鎖の配列を含む。
【図１２】図１２は、直線状核酸増幅反応を実施する遺伝子発現分析のための例示の方法の主要ステップの概略図であり、そして初期核酸分子Ｎ１を調製することにおいて２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。両方のプライマーは、半改変された制限エンドヌクレアーゼ認識配列のセンス鎖の配列を含む。
【図１３】図１３は、指数関数的核酸増幅を実施する遺伝子発現分析のための部分的プロセスの概略図である。この指数関数的核酸増幅の第２の増幅反応のみが示される。
【図１４】図１４は、指数関数的核酸増幅を実施する遺伝子発現分析のための例示の方法の主要ステップの概略図である。Ｎ．ＢｓｔＮＢＩの認識配列を、例示のニック形成剤認識配列として用いる。第１のテンプレートＴ１および第２のテンプレートＴ２の両方が、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩの認識配列のアンチセンス鎖の配列を含む。
【図１５】図１５は、指数関数的核酸増幅を実施する遺伝子発現分析のための例示の方法の主要ステップの概略図である。Ｎ．ＢｓｔＮＢＩの認識配列を、例示のニック形成剤認識配列として用いる。第１のテンプレートＴ１は、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩの認識配列のセンス鎖の配列を含み、その一方、第２のテンプレートＴ２は、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩの認識配列のアンチセンス鎖の配列を含む。
【図１６】図１６は、指数関数的核酸増幅を実施する遺伝子発現分析のための例示の方法の主要ステップの概略図である。Ｎ．ＢｓｔＮＢＩの認識配列を、例示のニック形成剤認識配列として用いる。第１のテンプレートＴ１は、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩの認識配列のアンチセンス鎖の配列を含み、その一方、第２のテンプレートＴ２は、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩの認識配列のセンス鎖の配列を含む。
【図１７】図１７は、指数関数的核酸増幅を実施する遺伝子発現分析のための例示の方法の主要ステップの概略図である。Ｎ．ＢｓｔＮＢＩの認識配列を、例示のニック形成剤認識配列として用いる。第１のテンプレートＴ１および第２のテンプレートＴ２は、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩの認識配列のセンス鎖の配列を含む。
【図１８】図１８は、増幅されたＤＮＡフラグメントの質量スペクトル分析を示す。上のパネルは、質量／電荷比１４４８．６をもつフラグメントのイオン電流を示す。中央のパネルは、ダイオードアレイからのトレースを示す。下のパネルは、質量スペクトルメーターからの総イオン電流を示す。
【図１９】図１９は、コントロール実験における質量スペクトル分析を示す。上のパネルは、ダイオードアレイからのトレースを示す。上のパネルは、質量スペクトルメーターからの総イオン電流を示す。中央のパネルは、質量／電荷比１４４８．６をもつフラグメントのイオン電流を示す。下のパネルは、ダイオードアレイのトレースを示す。
【図２０】図２０は、代表的な核酸増幅反応混合物の蛍光の蓄積を、時間の関数として示す。
【図２１】図２１は、ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを用いる一本鎖核酸分子を増幅する方法の概略図を示す。
【図２２】図２２は、ニック形成剤認識配列のセンス鎖の配列、および二本鎖ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ認識配列（ＴＲＥＲＳ）を含む部分的に二本鎖の核酸分子を含むオリゴヌクレオチドプライマーを用いる、一本鎖核酸分子を増幅する方法の概略図を示す。
【図２３】トリガーＯＤＮＰの指数関数的増幅の例示の方法の主要なステップの概略図を示し、ここで、唯一のテンプレート（Ｔ１）が用いられ、そしてＮ．ＢｓｔＮＢＩの認識配列が例示のＮＡＲＳとして用いられる。
【図１】
2005516610.tif 000059
【図２】
2005516610.tif 000060
【図３】
2005516610.tif 000061
【図４】
2005516610.tif 000062
【図５】
2005516610.tif 000063
【図６】
2005516610.tif 000064
【図７】
2005516610.tif 000065
【図８】
2005516610.tif 000066
【図９】
2005516610.tif 000067
【図１０】
2005516610.tif 000068
【図１１】
2005516610.tif 000069
【図１２】
2005516610.tif 000070
【図１３】
2005516610.tif 000071
【図１４】
2005516610.tif 000072
【図１５】
2005516610.tif 000073
【図１６】
2005516610.tif 000074
【図１７】
2005516610.tif 000075
【図１８】
2005516610.tif 000076
【図１９】
2005516610.tif 000077
【図２０】
2005516610.tif 000078
【図２１】
2005516610.tif 000079
【図２２】
2005516610.tif 000080
【図２３】
2005516610.tif 000081
【国際調査報告】
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2005516610.tif 000083
2005516610.tif 000084
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