(57)【要約】  本発明は、Ａ群連鎖球菌およびＣ群連鎖球菌によって引き起こされる感染および疾患の処置および予防のための抗原性組成物および方法を提供する。特に、本発明は、低分子量のヒアルロン酸、キャリアに結合した低分子量のヒアルロン酸、およびこれらを含む組成物を提供する。この組成物は、Ａ群連鎖球菌およびＣ群連鎖球菌と交差反応性であり、そしてネイティブなヒアルロン酸と最小限交差反応性である、低分子量のヒアルロン酸に対して抗体を誘発する。本発明は、これらの感染された少量に対する能動的および受動的な免疫原生保護の両方、またはＡ群連鎖球菌およびＣ群連鎖球菌での感染の危険性の保護を提供するために特に有用である。さらに、本発明は、Ａ群連鎖球菌およびＣ群連鎖球菌によって引き起こされる感染および疾患の診断に有用な方法および組成物を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫学的に適切なポリペプチドキャリアに共有結合したヒアルロン酸を含む、免疫原性結合体分子。
【請求項２】
請求項１に記載の免疫原性結合体であって、約５０％よりも多い前記ヒアルロン酸分子が、非還元末端グルクロン酸および／または不飽和グルクロン酸残基を保有する、免疫原性結合体。
【請求項３】
請求項２に記載の免疫原性結合体であって、前記ヒアルロン酸が約４００Ｋｄ以下の分子量かつ約６００ダルトン以上の分子量を有する低分子量のヒアルロン酸である、免疫原性結合体。
【請求項４】
請求項３に記載の免疫原性結合体であって、少なくとも９０％以上の前記低分子量のヒアルロン酸フラグメントが、非還元末端のグルクロン酸および／または不飽和グルクロン酸残基を保有する、免疫原性結合体。
【請求項５】
請求項３に記載の免疫原性結合体であって、少なくとも９５％以上の前記低分子量のヒアルロン酸フラグメントが、非還元末端のグルクロン酸および／または不飽和グルクロン酸残基を保有する、免疫原性結合体。
【請求項６】
請求項３に記載の免疫原性結合体であって、少なくとも９８％以上の前記低分子量のヒアルロン酸フラグメントが、非還元末端のグルクロン酸および／または不飽和グルクロン酸残基を保有する、免疫原性結合体。
【請求項７】
請求項３に記載の免疫原性結合体であって、少なくとも９９％以上の前記低分子量のヒアルロン酸フラグメントが、非還元末端のグルクロン酸および／または不飽和グルクロン酸残基を保有する、免疫原性結合体。
【請求項８】
請求項３に記載の免疫原性結合体であって、前記低分子量のヒアルロン酸が、少なくとも約４グリコシル残基のサイズである、免疫原性結合体。
【請求項９】
請求項３に記載の免疫原性結合体であって、前記低分子量のヒアルロン酸が、約２個〜約２０個のジサッカリドサブユニットを保有する、免疫原性結合体。
【請求項１０】
請求項９に記載の免疫原性結合体であって、前記低分子量のヒアルロン酸が、約２個〜約１０個のジサッカリドサブユニットである、免疫原性結合体。
【請求項１１】
請求項３に記載の免疫原性結合体であって、前記ポリペプチドキャリアが、破傷風毒素、ジフテリア毒素、百日咳毒素、連鎖球菌由来の免疫原性ポリペプチド、インフルエンザ由来の免疫原性ポリペプチド、髄膜炎菌由来の免疫原性ポリペプチド、肺炎球菌由来の免疫原性ポリペプチド、およびＥ．ｃｏｌｉ由来の免疫原性ポリペプチドからなる群から選択される、免疫原性結合体。
【請求項１２】
請求項３に記載の免疫原性結合体であって、前記ポリペプチドキャリアが、ナイセリア属由来のポーリンである、免疫原性結合体。
【請求項１３】
請求項３に記載の免疫原性結合体であって、該結合体が直接結合している、免疫原性結合体。
【請求項１４】
請求項３に記載の免疫原性結合体であって、該結合体が、低分子量のヒアルロン酸の非還元末端の糖としてグルクロン酸または不飽和グルクロン酸を含むエピトープに結合する抗体を誘発する、免疫原性結合体。
【請求項１５】
請求項３に記載の免疫原性結合体であって、該結合体が、細菌中に存在するカプセル化ヒアルロン酸に結合する抗体を誘発する、免疫原性結合体。
【請求項１６】
請求項１５に記載の免疫原性結合体であって、前記細菌が、Ａ群連鎖球菌またはＣ群連鎖球菌である、免疫原性結合体。
【請求項１７】
請求項３に記載の結合体および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項１８】
生理学的に受容可能なアジュバントをさらに含む、請求項１７に記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
低分子量のヒアルロン酸−ポリペプチド結合体分子を調製する方法であって、該方法は、低分子量のヒアルロン酸フラグメントを免疫学的に適切なポリペプチドに共有結合させる工程を包含し、ここで約５０％以上の該低分子量のヒアルロン酸フラグメントが、非還元末端でグルクロン酸および／または不飽和グルクロン酸残基を有する、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、該方法が、低分子量のヒアルロン酸を、免疫学的に適切なポリペプチドに共有結合させる工程を包含し、該工程が、還元性のアミノ化を包含する、方法。
【請求項２１】
請求項３に記載の免疫原性結合体分子に結合する、精製された抗体。
【請求項２２】
請求項２１に記載の精製された抗体であって、前記低分子量のヒアルロン酸フラグメントが、少なくとも約４グリコシル残基のサイズである、精製された抗体。
【請求項２３】
請求項２２に記載の精製された抗体であって、前記ヒアルロン酸フラグメントが、少なくとも約４グリコシル残基のサイズであり、かつ約４０ｋＤ以下のサイズである、精製された抗体。
【請求項２４】
Ａ群連鎖球菌またはＣ群連鎖球菌の感染を処置または阻害するために有効な薬学的組成物であって、該組成物は、請求項１７に記載の組成物によって誘発される抗体、請求項２１に記載の抗体、またはリポソームに結合体化された低分子量のヒアルロン酸によって誘発される抗体からなる群から選択される抗体を含む、薬学的組成物。
【請求項２５】
哺乳動物における抗体応答を誘発する方法であって、該方法が、個々の哺乳動物に、抗体応答を誘発するのに十分な量の請求項１７に記載の薬学的組成物の量を投与する工程を包含する、方法。
【請求項２６】
前記哺乳動物がヒトである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項２５に記載の方法であって、前記薬学的組成物が、筋内投与、皮下投与、心膜内投与、または静脈内投与される、方法。
【請求項２８】
請求項２５に記載の方法であって、前記薬学的組成物が、体重１ｋｇあたり、約０．１〜約５０μｇの量で投与される、方法。
【請求項２９】
請求項３に記載の免疫原性結合体を含む、ヒトにおける抗低分子量ヒアルロン酸抗体の有効なレベルを誘発する、ワクチン。
【請求項３０】
哺乳動物における連鎖球菌の感染を阻害する方法であって、該方法が、感染を阻害するために十分な量の請求項３に記載の薬学的組成物を哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３１】
ＨＡを含む細菌による哺乳動物における感染の進行を阻害する方法であって、該方法が、該感染の進行を阻害するのに十分な量の請求項２４に記載の薬学的組成物を含む組成物を、該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法であって、前記細菌が、Ａ群連鎖球菌またはＣ群連鎖球菌である、方法。
【請求項３３】
請求項２１に記載の抗体を備える、連鎖球菌による感染を検出するための診断免疫アッセイキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ヒアルロン酸／ポリペプチド結合体分子、およびこれらを含む薬学的組成物に関する。特に、本発明は、Ａ群連鎖球菌およびＣ群連鎖球菌の両方と交差反応するヒアルロン酸に対する抗体を惹起する、ヒアルロン酸分子に関し、より好ましくは、低分子量ヒアルロン酸（ＬＭＷ−ＨＡ）分子、およびＬＭＷ−ＨＡ／ポリペプチド結合体分子に関する。本発明の分子およびこれらを含有する薬学的組成物は、Ａ群連鎖球菌およびＣ群連鎖球菌によって引き起こされる感染の処置および予防のために、ならびにこれらによって引き起こされる疾患の診断のために有用である。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ヒアルロン酸（ＨＡ）は、天然に存在するグリコサミノグリカンである。このヒアルロン酸は、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびグルクロン酸の反復単位から構成される。図１を参照のこと。ＨＡは、動物組織（例えば、脊髄液、眼内液、滑液、皮膚）中、およびいくつかの連鎖球菌中（例えば、Ａ群連鎖球菌およびＣ群連鎖球菌の鞘中）にもまた存在する。このようなムコイドまたはＡ群連鎖球菌の高度に被包性の株は、異常に重篤な感染および急性のリウマチ熱の両方に関連する（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９２，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６６：３７４−３８２）。Ａ群連鎖球菌およびＣ群連鎖球菌によって引き起こされる、ヒト侵襲性軟組織感染は、有意な罹患率および死亡率に関連する。Ｃ群連鎖球菌はまた、咽頭炎および反応性関節炎に関連する。さらに、Ｃ群連鎖球菌感染は、ウマにおいて流行する。
【０００３】
Ａ群連鎖球菌およびＣ群連鎖球菌のムコイドコロニー形態は、ヒアルロン酸からなる被包ポリサッカリドの豊富な産生の結果である。Ａ群連鎖球菌のヒアルロン酸被包は、最近、これらの生物の病原性において、多くの重要な役割を示すことが示された。特に、ＨＡ被包は、Ａ群連鎖球菌ムコイドを食作用から保護し、ビルレンスにおいて重要な役割を有する（Ｗｅｓｓｅｌｓら、１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８３１７−２１；Ｄａｌｅら、１９９６，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６４：１４９５−５０１；およびＭｏｓｅｓら、１９９７  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｍｏｌ  ６５；６４−７１）。さらに、ＨＡ被包は、Ｍタンパク質媒介性粘着性を調節し、ヒトケラチノサイト上のＣＤ４４への接着に関するリガンドとして作用する。Ａ群連鎖球菌のＨＡ被包は、高度に保存され表面露出されており、このことは、ＨＡが、咽頭粘膜および皮膚に対する他の細菌株の接着に関する一般的なな吸着部位を提供し得ることを示す（Ｓｃｈｒａｇｅｒら、１９９８，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１：１７０８−１６）。
【０００４】
グラム陽性病原体（例えば、連鎖球菌）の感染の予防および処置は、処置することが困難でかつ一旦樹立されたら根絶することが困難である耐性株の発生に起因して、特に重要である。胸腺依存性（ＴＤ）抗原（例えば、タンパク質）に対する、ポリサッカリド抗原または免疫学的に不活性な炭水化物ハプテンの結合体化は、これらの免疫原性を強化するけれども、このような免疫学的応答は、ＨＡに対して惹起される場合、ＨＡ含有細菌（例えば、Ａ群連鎖球菌またはＣ群連鎖球菌）に対する保護を提供するかどうかは、明白ではなかった。さらに、哺乳動物組織および連鎖球菌の両方のＨＡの存在は、宿主組織で指向される自己免疫応答を誘発する能力に起因して、連鎖球菌感染を処置または予防するための炭水化物抗原としてのＨＡの開発を複雑化する。
【０００５】
最近まで、ＨＡは、非免疫原性分子であると考えられてきた（Ｍｅｙｅｒ，１９３６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１１４：６８９およびＨｕｍｐｈｒｅｙｓ，１９４３，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３７：４６０）。しかし、より最近の研究は、天然に存在するＨＡに対する抗体が、いくつかの種において存在することを示す（Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌ，１９８２，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１０８：１４８８）。Ｆｉｌｌｉｔらは、リポソームに結合した抗体を用いて、マウス中にＨＡに対する抗体を導入した。Ｆｉｌｌｉｔらは、ＨＡが、免疫原性であることを報告し、分子上の２つの抗原決定基を同定した。Ｆｉｌｌｉｔらはまた、リポソーム上のＨＡの提示の形態が、ＨＡの免疫原性に対して重要であることに留意した。最終的に、Ｆｉｌｌｉｔらは、ＨＡ抗体が、硫酸ヘパランと交差反応性であり、そしてこのような交差反応性は、自己免疫性脈管疾患の病原に関与し得ることを報告した（Ｆｉｌｌｉｔら、１９８８，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：９７１−９８２）。上記に要約された報告に基づけば、ＨＡまたはＨＡ結合体が、ＨＡ含有細菌（例えば、Ａ群連鎖球菌またはＣ群連鎖球菌）からの感染を予防または処置するために有用な免疫応答を惹起するかどうかは、予測不能なままである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、ポリペプチドまたはタンパク質キャリアへと結合体化されたＨＡおよびＬＭＷ−ＨＡを含有する免疫原性組成物を提供する。本発明の結合体化分子は、ＨＡを含有する細菌（例えば、Ａ群連鎖球菌およびＣ群連鎖球菌）に対して交差反応性である抗体を惹起するために有用である。本発明の結合体化分子およびこれらを含有する薬学的組成物は、このような細菌（Ａ群連鎖球菌およびＣ群連鎖球菌を含む）によって引き起こされる感染および疾患の処置およびそれらの診断に関する方法において有用である。
【０００７】
本出願人らは、驚くべきことに、これらのＬＭＷ−ＨＡ結合体が、哺乳動物において免疫原性であることを発見した。さらにより驚くべきことには、本出願人らは、本発明の結合体によって惹起された抗体が、Ａ群連鎖球菌およびＣ群連鎖球菌と交差反応性であるが、哺乳動物組織に関連するネイティブなＨＡと、ほんの最小限交差反応性であることを発見した。
【０００８】
ＬＭＷ−ＨＡをポリペプチドへと結合体化するための方法としては、還元的アミノ化、臭化シアンを用いた処置、キャリア上の遊離アミノ基とＬＭＷ−ＨＡ上のカルボキシレート部分との間のアミド結合形成、またはリンカー分子の使用による方法が挙げられる。本発明は、ＬＭＷ−ＨＡの結合体分子を含有する薬学的組成物およびＨＡ含有細菌（例えば、Ａ群連鎖球菌およびＣ群連鎖球菌）による感染の処置のため、ワクチンとして、および診断薬として抗体を惹起するためのこれらの組成物の使用を提供する。炭水化物Ｔ細胞独立応答をＴ細胞依存性応答へと転換する任意のポリペプチドは、キャリアとしての使用に対して適切である。例としては、毒素または類毒素（破傷風毒素、ジフテリア毒素、および百日咳毒素）、ナイセリア類ポーリン（例えば、淋菌のＰｏｒＡ、および髄膜炎菌のＰｏｒＢ）が挙げられる。
【０００９】
本発明はまた、免疫原性ＬＭＷ−ＨＡ−ポリペプチド結合体由来の、薬学的組成物、ワクチンおよび他の免疫学的試薬を提供する。
【００１０】
本発明はさらに、細菌の感染に対して哺乳動物を免疫する方法に関する。この方法は、本発明の治療有効量の薬学的組成物を、疾患を引き起こす生物からの感染を阻止するための哺乳動物へと投与する工程を包含する。この方法は、ＨＡ含有細菌（例えば、Ａ群連鎖球菌およびＣ群連鎖球菌）による感染を予防または処置するために有用である。
【００１１】
本発明はまた、哺乳動物、好ましくは、ヒトにおいて、本発明のＬＭＷ−ＨＡ−ポリペプチド結合体を用いて抗体を惹起する方法を提供する。本発明はまた、本発明のポリサッカリドポリペプチド結合体を使用した、哺乳動物の免疫に対する応答において惹起される免疫グロブリン組成物および単離された抗体を提供する。このような免疫グロブリン組成物および単離された抗体は、治療剤および診断試薬として有用である。
【００１２】
産生された免疫グロブリンおよび抗体は、ＬＭＷ−ＨＡに対して特異的である。本発明の結合体分子はまた、周知の方法に従って、モノクローナル抗体および抗イディオタイプ抗体を惹起するために有用である。
【００１３】
（発明の詳細な説明）
ヒアルロン酸は、防御応答および／または治療的応答を惹起するための免疫原として使用される。特に、ＨＡは、表面上にＨＡを有する細菌（例えば、Ａ群連鎖球菌およびＣ群連鎖球菌）と交差反応性である免疫応答を惹起するために有用である。理論によって拘束されることなく、Ａ群連鎖球菌およびＣ群連鎖球菌と交差反応性のエピトープは、約３または４残基長であり、非還元性末端に位置する。両方のエピトープが保護されている場合、非還元性末端グルクロン酸残基が、飽和であるかまたは不飽和であるかの有意な差異は、存在しないように見える。さらに、末端グルクロン酸が、血液および他の体液中で不飽和グルクロン酸へと転換されることは明らかである。ＨＡは、グルコサミニル残基またはグルクロニル残基のいずれかにおいて終結し得、この免疫応答は、ＨＡの非還元末端でのグルクロン酸または不飽和グルクロン酸の割合が、Ｎ−アセチルグルコサミンの割合を超えて増加する場合、強化される。
【００１４】
ネイティブなＨＡは、本発明に従って結合体を調製するために使用され得るが、好ましくは、大きさが約３または４サッカリドから約２０００サッカリドあるいは約６００ダルトンから約４００ＫｄであるＬＭＷ−ＨＡが、結合体を調製するために使用される。より好ましくは、ＬＭＷ−ＨＡは、約４サッカリドまたは２反復単位から約１００反復単位、すなわち大きさが約８００ダルトンから約４０Ｋｄである。ＬＭＷ−ＨＡについて最も好ましい大きさは、約４反復単位から約１０または約２０反復単位すなわち約８００ダルトンから約４Ｋｄまたは８Ｋｄである。ＬＭＷ−ＨＡは、ネイティブなＨＡから得られ得、このＬＭＷ−ＨＡは、代表的には、４００Ｋｄから数百万ダルトンの分子量を有する（シグマからまたは米国特許第４，１４１，９７３号に従って生成することによって入手可能である）、超音波処理を含む種々の方法によって（Ｋｕｂｏ  Ｋら、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ  Ｊ．，１９９３，１０（６）：４３５）あるいは化学的方法（Ｂｌａｔｔｅｒ  Ｇ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．１９９６，２８８：１０９−１２５およびＨａｌｋｅｓ  Ｋ．Ｍ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．１９９８，３０９：１６１−１６４）および／または酵素的方法（Ｄｅ  Ｌｕｃａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９５  １１７：５８６９−５８７０）によって得られえる、。
【００１５】
本発明はまた、非還元末端にグルクロン酸残基を含有するＬＭＷ−ＨＡ分子を提供する。グルクロン酸末端ＨＡフラグメントを得るための１つの方法は、Ｋｕｂｏ  Ｋら、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ  Ｊ．，１９９３，１０（６）：４３５の方法に従うネイティブＨＡの超音波処理による。グルクロン酸末端を有する分子の割合は、エキソ−β−Ｎ−アセチルグルコサミナーゼを用いる超音波処理生成物の処理によって増加され得、任意の非還元末端Ｎ−アセチルグルコサミン残基を除去し、分子の非還元末端グルクロニル残基を、高いパーセントでＬＭＷ−ＨＡに提供する。ＬＭＷ−ＨＡを得るための代替的な方法は、非還元末端にＮ−アセチルグルコサニミル残基とグルクロニル残基との混合物を含有する分子を産生するための穏やかな酸条件下で、ネイティブなＨＡを処置する工程を包含する。酸脱重合されたＬＭＷ−ＨＡ上の末端非還元グルコサミニル基を、エキソ−β−Ｎ−アセチルグルコサミナーゼを用いて除去し得、ＬＭＷ−ＨＡに分子の非還元末端にグルクロニル残基を提供する。図２を参照のこと。本発明はまた、非還元末端に４，５−不飽和グルクロニル残基を含有するＬＭＷ−ＨＡ分子を提供する。図３を参照のこと。４，５−不飽和グルクロニル末端ＨＡフラグメントを得るための１つの方法は、ヒアルロニダーゼを用いるネイティブなＨＡの処置による方法である。
【００１６】
本発明に関する使用のためのＬＭＷ−ＨＡは、フラグメントから成り、ここで、少なくとも約９０％のＬＭＷ−ＨＡフラグメントが、非還元末端に、グルクロン酸または不飽和グルクロン酸を有する。好ましくは、少なくとも約９５％の、本発明に関する使用のためのＬＭＷ−ＨＡフラグメントは、非還元末端にグルクロン酸または不飽和グルクロン酸を有する。
【００１７】
超音波処理を使用する場合、ネイティブなＨＡは、適切な溶媒（リン酸緩衝化生理食塩水）中に溶解され得、この溶液は、所望される量の脱重合が得られるまで超音波処理される。例えば、Ｋｕｂｏら、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ，１９９３，１０：４３５を参照のこと。このような処置によって得られるＬＭＷ−ＨＡは、好ましくは、約１０〜２０Ｋｄの分子量を有し、非還元末端に主にグルクロン酸残基（すなわち、９５％を超える）を含有する。
【００１８】
さらに、非還元末端にＮ−アセチルグルコサミニル残基とグルコサミニル残基との混合物を含有するＬＭＷ−ＨＡフラグメントを、緩やかな酸条件下で、ＨＡの処置によって得ることができる。この方法によって得られるＬＭＷ−ＨＡフラグメントの約５０％は、これらフラグメントの非還元末端にグルクロン酸を有する。酸処置に続いて、末端非還元グルコサミニル基を、エキソ−β−Ｎ−アセチルグルコサミナーゼ（Ｓｉｇｍａから入手可能）を用いてフラグメントから選択的に除去し得、分子の末端のグルクロニル残基を曝露する。反応条件を変化させることによって、末端非還元グルコサミニル基を有するフラグメントのパーセントを、制御する。例えば、反応を、完了の種々の点で、熱またはｐＨを用いて酵素を変性することによって停止し、所望される割合の、非還元末端にグルクロン酸を有するフラグメントを得ることができる。
【００１９】
さらに、還元末端にＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミンまたはβ−Ｄ−グルクロン酸のいずれかを有するＬＭＷ−ＨＡを、当該分野で公知である方法によって化学的に合成し得る。Ｂｌａｔｔｅｒ  Ｇ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．１９９６，２８８：１０９−１２５およびＨａｌｋｅｓ  Ｋ．Ｍ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．１９９８，３０９：１６１−１６４を参照のこと。例えば、適切に保護されたグルコサミン−グルクロン酸ジサッカリドを、まず、対応するモノサッカリドから調製し得る。このモノサッカリドを、当該分野で公知の方法によって（例えば、グリコシルドナーとしてα−トリクロロアセトアミドグルコピラノースの使用によって）結合し得る。次いで、得られたジサッカリドを、このジサッカリド自体と繰り返し結合して、種々の大きさのＬＭＷ−ＨＡを形成し得る。例えば、ジサッカリドのグルクロン酸部分の上のアノマー保護基は、選択的に除去され得る。この部分に対する好ましい保護基は、４−メチルフェニル基である。還元末端ジサッカリド（すなわち、第１のグリコシルアクセプター）について、アノマー位置を、例えば、硝酸セリウムアンモニウムを用いて処置することによる４−メトキシフェニル基のアノマー性水酸基への第１の転換によって、メトキシ部分へと転換し得る。得られたアノマー性水酸基を、トリクロロアセトニトリルおよびＤＢＵを用いた処理によって、α−トリクロロアセトイミデート部分へと転換し得る。α−トリクロロアセトイミデート部分を、無水メタノールを用いた処置、続いてのトリメチルシリルトリフラートおよびトリメチルアミンを用いた処置によって、メトキシ部分へと転換し得る。グリコシルドナーとして使用されるジサッカリドについて、そのアノマー位置を、上記に記載されるように、α−トリクロロアセトイミデート部分へと転換し得る。上記に記載されるメトキシ保護されたジサッカリドは、グルコサミン残基の３位の保護基を選択的に除去した後、グリコシルアクセプターとして使用され得る。この位置の好ましい保護基としては、エタノール中のチオ尿素およびピリジンを用いて除去し得るクロロアセチル基である。このジサッカリドドナーを、繰り返し様式で、アクセプターに結合し、ＬＭＷ−ＨＡを産生し得る。すなわち、各連続的な結合は、さらなる反復単位を有するＬＭＷ−ＨＡを産生する。グルコサミン残基に対するさらなる好ましい保護基は、４，６−Ｏ−ベンジリデン基および２−Ｎ−トリクロロアセトアミド基である。グルクロン酸残基に対するさらなる好ましい保護基は、６−ベンゾイル基および４−Ｏ−ベンゾイル基ならびにＣ６メチルエステルである。これらの保護基および代替的な保護基の使用は、Ｔ．Ｗ．ＧｒｅｅｎｅおよびＰ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓによる「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  Ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，」第２版、１９９１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（参考として本明細書中に援用される）に記載される。
【００２０】
ＨＡフラグメントをまた、ウリジン二リン酸糖およびＨＡシンテターゼを使用して酵素的に合成する。例えば、Ｄｅ  Ｌｕｃａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９５  １１７：５８６９−５８７０を参照のこと。これらの後２つの方法は、任意のパーセントの、末端にグルクロン酸を有するＬＭＷ−ＨＡの合成を可能にする。従って、酵素分解、酵素合成または化学的合成によるＬＭＷ−ＨＡの形成は、約９８％を超える非還元末端にグルクロン酸または不飽和グルクロン酸を有するＬＭＷ−ＨＡフラグメント、あるいは約９９％を超えるこのフラグメントの産生を可能にする。
【００２１】
ＬＭＷ−ＨＡを、当該分野において公知である方法によってキャリアへと結合し得る。例えば、ＤｉｃｋおよびＢｅｕｒｒｅｔ、Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｃｒｕｓｅら編、Ｃｏｎｔｒｉｂ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｂａｓｅｌ，Ｋａｒｇｅｒ，１９８９，第１０巻、４８頁−１１４頁ならびにＪｅｎｎｉｎｇｓおよびＳｏｏｄ、Ｎｅｏｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌｅｅら編、第１０章、３２５頁−３７１頁、１９９４，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏを参照のこと。方法としては、還元的アミノ化、カルボキシレート部分を介したカップリング、リンカーの使用、および臭化シアンまたはその誘導体の使用が挙げられる。ＬＭＷ−ＨＡをキャリアに結合体化する場合、ポリサッカリドの非還元末端でのエピトープの改変を避けることが好ましい。ＬＭＷ−ＨＡをキャリアに結合体化する好ましい方法は、直接的結合体化による（例えば、還元末端サッカリドでの還元的アミノ化による）方法である。例えば、還元末端基を、例えば、水素化ホウ素を用いた還元末端の還元、続いての過ヨウ素酸酸化および還元的アミノ化によって、ＬＭＷ−ＨＡへと選択的に導入し得る。例えば、Ｊｅｎｎｉｎｇｓ、米国特許第４，３５６，１７０号を参照のこと。
【００２２】
ＬＭＷ−ＨＡを、骨格に沿った種々の位置でキャリアへ結合体化する方法がまた、使用され得る。例えば、ＬＭＷ−ＨＡは、過ヨウ素酸の使用によって活性化され、ポリサッカリドの骨格残基中にアルデヒド基が生成され得、次いで、この活性化されたＬＭＷ−ＨＡを、還元剤（例えば、水素化ホウ素）の存在下で、遊離アミノ基を含有するキャリアを用いて処理される。これらの方法はまた、架橋を可能にする単一のＬＭＷ−ＨＡへと、１つを超えるキャリア分子の結合体化を可能にする。
【００２３】
本発明の結合体分子のポリペプチド構成成分は、ＬＭＷ−ＨＡへと結合体化された場合、Ｔ細胞依存性応答を引き起こす、任意の生理学的に耐性のタンパク質またはペプチドであり得る。用語ポリペプチドは、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質（ネイティブなタンパク質、改変されたタンパク質、または組換えタンパク質）を包含する遺伝的用語であることを意図される。キャリアとして有用なポリペプチドの例としては、細菌性毒素、トキソイド、ポーリン、外膜タンパク質、および架橋性タンパク質物質が挙げられるがこれらに限定されない。このようなポリペプチドとしては、破傷風毒素、ジフテリア毒素、百日咳毒素、連鎖球菌由来の免疫原性ポリペプチド、肺炎球菌由来の免疫原性ポリペプチド、およびＥ．ｃｏｌｉ由来の免疫原性ポリペプチドが挙げられるがこれらに限定されない。特に、破傷風毒素、ジフテリア毒素、ＣＲＭ１９７、ならびに、血友病患者、Ｅ．ｃｏｌｉおよびナイセリア属由来のポーリンポリペプチド（例えば、ｒＰｏｒＢ）が好ましい。例えば、米国特許第５，４３９，８０８号を参照のこと。
【００２４】
本発明に従って調製された結合体分子は、代表的に、ポリサッカリドフラグメントの骨格の末端の１つの結合部位を介して、少なくとも１つの低分子量ヒアルロン酸フラグメントに結合されるキャリアポリペプチドまたはキャリアタンパク質を含有する。従って、本発明は、所望される場合、低分子量ヒアルロン酸結合体分子を生産する能力を提供し、ここでそのポリサッカリド成分は、その１つの末端を除いて、そのキャリアによって遮蔽されていない。これらの型の結合体は、新生糖タンパク質（ｎｅｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）と称され得る。例えば、ＤｉｃｋおよびＢｅｕｒｒｅｔ（前述）を参照のこと。あるいは、架橋した結合体を、本発明に従って形成し得る。これらの型の結合体は、格子（ｌａｔｔｉｃｅ）結合体と称され得る。例えば、ＤｉｃｋおよびＢｅｕｒｒｅｔ（前述）を参照のこと。
【００２５】
本発明の結合体分子におけるＬＭＷ−ＨＡ対ポリペプチドまたはタンパク質の分子比率は、好ましくは、１分子のポリペプチドまたはタンパク質につき約１〜約１００分子のＬＭＷ−ＨＡである。より好ましくは、この比率は、１分子のポリペプチドまたはタンパク質につき、約１０〜約２０分子のＬＭＷ−ＨＡまたはエピトーブである。あるいは、ＬＭＷ−ＨＡ対ポリペプチドまたはタンパク質の比率は、重量によって決定され得る。例えば、本発明の結合体分子は、ポリペプチドまたはタンパク質の重量に対して、約１０重量％と約５００重量％との間のＬＭＷ−ＨＡである。好ましくは、本発明の結合体は、ポリペプチドまたはタンパク質の重量に対して、約３０重量％〜約１００重量％のＬＭＷ−ＨＡである。１つの実施形態において、非常に低分子量のヒアルロン酸（すなわち、約２０未満の反復単位）を使用して、エピトープの密度を増加する結合体を形成する。ＬＭＷ−ＨＡ／ポリペプチドまたはタンパク質の比率の変化は、結合体化条件、特に結合体化反応の出発成分の比率を調整することによって、達成され得る。
【００２６】
ポリペプチドまたはタンパク質と結合体化された低分子量ヒアルロン酸を含有する結合体分子を提供することに加えて、本発明はまた、多価結合体、ならびにこの多価結合体を含む薬学的組成物およびワクチンを包含し、ここで異なるポリサッカリドが１つのポリペプチドと結合体化される。例えば、低分子量ヒアルロン酸を、他のポリサッカリドと種々の組み合せで、ポリペプチドまたはタンパク質に結合し得る。このようなポリサッカリドの例は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｏｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｂ型由来のカプセルポリサッカリド；Ｂ群連鎖球菌  Ｉａ型、ならびにＩｂ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型およびＶＩＩＩ型のポリサッカリド；膜炎菌性群Ａ、ＢおよびＣのポリサッカリド；ならびにＡ群連鎖球菌のポリサッカリドがある。
【００２７】
本発明に従う免疫原性結合体は、哺乳動物特にヒトおよびウマにおける、Ａ群連鎖球菌およびＣ群連鎖球菌のような、ＨＡ含有細菌による感染に対する保護を提供するために重要である、有用な薬学的組成物（例えば、ワクチン）を提供する。さらに、これらのワクチンは、出生前の新生児に保護的な抗体を提供する手段として、妊娠中の女性への投与に有用である。
【００２８】
本発明の免疫原性組成物は、予防目的、治療目的および診断目的に対して有用なモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体または抗イディオタイプ抗体を惹起するための手段として使用され得る。診断は、ＨＡ含有細菌（例えば、Ａ群連鎖球菌またはＣ群連鎖球菌）により引き起こされる種々の感染または疾患のモニターおよび検出において、特に有用である。本発明の免疫原性組成物は、特にＡ群連鎖球菌またはＣ群連鎖球菌により感染した個体、またはそれらによる感染の危険性のある個体において、能動性かつ受動性の両方の免疫原保護における使用のための免疫原として、使用され得る。受動性保護のために使用される殺菌性抗体は、本発明の任意の免疫原性組成物で哺乳動物を免疫して、次いで殺菌性抗体を回収することによって、作製される。本発明と共に使用するための殺菌性抗体は、血清中か、γグロブリン画分のような部分的に精製された画分中か、または精製された抗体中に存在し得る。例えば、ＩｇＧは粗製タンパク質混合物（例えば、血清または腹水液）から、プロテインＡ−アガロースまたはプロテインＧ−アガロースを使用することによって、精製され得る。プロテインＡは、ＩｇＧのＦｃ部分に結合する。プロテインＧもまたＦｃ領域に結合するが、またＦａｂ領域にも結合し得、ＩｇＧのＦ（ａｂ）’２フラグメントの精製のために有用にする。ＩｇＧの粗製サンプルを、プロテインＡ−アガロースまたはプロテインＧ−アガロースのカラムを使用して精製し得る。血清サンプル、腹水液または組織培養物上清を、カラムに適用する前に、緩衝液で少なくとも１：１に希釈する。サンプルを適用した後、大部分の不純物を除去するまで、このカラムを、洗浄緩衝液（例えば、２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４））で洗浄する。次いで、ＩｇＧを溶出緩衝液（例えば、１００ｍＭ  グリシン（ｐＨ３．０））で溶出する。次いで、そのＩｇＧをダイアフィルトレーションによって濃縮し得るか、またはさらにイオン交換クロマトグラフィーもしくはサイズ排除クロマトグラフィーによって精製し得る。  
【００２９】
「ヒト化」抗体（キメラ抗体およびＣＤＲ−移植化抗体を含む）、抗体フラグメント、および特に特許請求されるモノクローナル抗体に基づく二価特異性（ｂｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体は、原核生物細胞または真核生物細胞において生成される組換え抗体関連産物と同様に、本発明の意図する範囲内である。例えば、抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）は、本発明の抗体の可変領域についての構造（配列）情報の決定を基に、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞のような宿主細胞によって培養物中で産生され得る。例えば、米国特許第６，１８０，３７７号を参照のこと。可変領域の配列情報はまた、ＣＤＲ−移植化抗体の調製を可能とする。さらに、キメラ抗体（例えば、マウス／ヒト抗体）は、形質転換されたマウスのミエローマ細胞またはハイブリドーマ細胞を使用して調製され得、そして二価特異性抗体は、ハイブリッドのハイブリドーマ細胞によって産生され得る。
【００３０】
本発明の薬学的組成物およびワクチンは、代表的には、低分子量ヒアルロン酸および／または結合体を適切な薬学的に受容可能なキャリア（例えば、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水または他の注射可能な溶液）中に分散させることによって、形成される。薬学的組成物またはワクチンは、非経口（例えば、皮下、腹腔内または筋肉内）で投与され得る。ワクチンのような薬学的組成物において、慣用的な添加物もまた添加され得る；例えば、安定化剤（例えば、ラクトースまたはソルビトール）、およびアジュバント（例えば、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウム、モノホスホリル脂質Ａ、ＱＳ２１またはステアリルチロシン）。このような薬学的組成物は、低分子量ヒアルロン酸、この結合体、または低分子量ヒアルロン酸および／もしくはこの結合体に対する抗体を含み得る。この組成物は、単独で投与され得るか、または少なくとも１つの他の薬剤（例えば、アジュバントまたは安定化化合物）と組み合わせて投与され得、これらは任意の滅菌の生体適合性の薬学的キャリア（生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、および水が挙げられるが、これらの限定されない）において投与され得る。この組成物は、患者に単独で投与され得るか、または他の因子、薬物、ホルモン、または生物学的応答変更因子と組み合わせて投与され得る。
【００３１】
薬学的組成物およびワクチンは、免疫原性応答を惹起するのに十分な量で投与される。投薬量は通常、体重１ｋｇ当たり約０．１〜５０μｇの範囲内の結合体分子である。投薬量は、個体のサイズ、重量または年齢に基づいて調整され得、そして十分に当該技術の標準の技量内である。一連の用量を、最適な免疫のために投与し得る。個体における抗体応答を、抗体の力価または殺菌活性を決定することによってモニターし得、そして必要な場合、応答を増強させるために、個体を追加免疫し得る。
【００３２】
本発明は、ＨＡ含有細菌（特に、Ａ群連鎖球菌またはＣ群連鎖球菌）に感染した哺乳動物またはそれらに曝される危険性にある哺乳動物に、受動性免疫を提供するために有用である、抗体（例えば、精製した抗体）、γグロブリン画分および血清を含有する組成物を提供する。連鎖球菌により引き起こされる多くの病理の中に、重要な羅患率および死亡率と関係する、侵襲性の軟組織感染がある。例えば、Ａｓｈｂａｕｇｈら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９９８，１０２：５５０を参照のこと。本発明により提供される、ＩｇＧ、抗体フラグメント、抗体、γグロブリン画分、および血清は、ＨＡ含有細菌（例えば、Ａ群連鎖球菌およびＣ群連鎖球菌）からの感染、ならびにこのような感染の結果として生じる組織壊死および他の病理を、阻害または防止するために有用である。抗体（例えば、精製した抗体）、γグロブリン画分、および血清を含む薬学的組成物は、代表的には、適切な薬学的に受容可能なキャリア（例えば、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水または他の注射可能な溶液）中に抗体を分散させることによって形成される。この薬学的組成物は、非経口（例えば、皮下、腹腔内または筋肉内）で投与され得る。薬学的組成物において、慣用的な添加物もまた添加され得る。この組成物は、単独で投与され得るか、または少なくとも１つの他の因子（例えば、安定化化合物（これは任意に滅菌して投与され得る）、生物適合性薬学的キャリア（生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロースおよび水が挙げられるが、これらに限定されない））と組み合わせて投与され得る。この組成物は、患者に単独で投与され得るか、または他の因子、薬物、ホルモン、または生物学的応答変更因子と組み合わせて投与され得る。
【００３３】
抗体を含有する薬学的組成物は、細菌の感染を阻害するのに十分な量で投与される。投薬量は、個体のサイズ、重量または年齢に基づいて調整され得、そして十分に当該技術の標準の技量内である。一連の用量を、最適な免疫のために投与し得る。個体における用量応答を、抗体の力価または殺菌活性を決定することによってモニターし得、そして必要な場合、応答を増強させるために、個体にさらなる用量を投与し得る。
【００３４】
本発明に従って調製された抗体はまた、種々の免疫試薬の調製および免疫アッセイにおける使用のために、有用である。例えば、免疫アッセイについては、低分子量ヒアルロン酸フラグメントまたはそれらの結合体は、リンカー（例えば、ポリペプチドリンカー）に直接的に固定されるか、またはリンカーを介して固体支持体に固定化され得る。結合体を作製するために使用される方法に類似の方法を、固定化のために使用し得る。次いで、抗体は、当業者に公知の種々の免疫アッセイ系において使用され得、これらの系としては、ＨＡ含有細菌（例えば、Ａ群連鎖球菌およびＣ群連鎖球菌）の存在を検出するための放射性免疫アッセイおよびＥＬＩＳＡが挙げられる。このようなアッセイは、血清または他の体液中の、Ａ群連鎖球菌抗体またはＣ群連鎖球菌抗体の存在についてのアッセイによって、個体中の感染の存在を診断するために、使用され得る。
【００３５】
本明細書中に提供される実施例は、本発明の実施の種々の局面を例示するためのみに表され、そして何らかの目的に本発明の範囲を限定するために意図されるものではない。本明細書中で引用される全ての刊行物、特許および論説は、その全体が本明細書中に援用される。
【実施例】
【００３６】
（実施例１）
（ＬＭＷ−ＨＡの調製）
（酸加水分解によるヒアルロン酸の脱重合）
ヒアルロン酸（１００ｍｇ、Ｌｉｆｅｃｏｒｅ  ロット１−９０６２−５）を、１０ｍｌの０．０５Ｎ  ＨＣｌ溶液に添加した。この混合物を８０℃で２時間加熱して、そして攪拌して固体を完全に溶解した。次いで、このサンプルを１００℃でさらに１．５時間加熱した。脱重合を、様々な時点で反応混合物からアリコートを取り出してモニターし、そしてＳｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）１２ＨＲ１０／３０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を備えたＢｉｏ−Ｒａｄシステム（Ｂｉｏｌｏｇｉｃ）で分析した。この溶液を、０．５Ｎ  ＮａＯＨで中和して、次いで分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）３，５００のＤｉａｆｌｏ（登録商標）膜で透析し、そして凍結乾燥した。この生成物をＳｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００ＰＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムを通して分子サイズ分画して、６５ｍｇの固体生成物を得た。５００ＭＨｚでのサンプルの１Ｈ−ＮＭＲ分析は、ジサッカリド反復単位のヒアルロン酸（ＨＡ）の構造を確認した。生成されたフラグメントの平均分子量は、多角性（ｍｕｌｔｉａｎｇｌｅ）レーザー光散乱フォトメトリーと組み合わせたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ  ＭＡＬＬＳ）によって、約１２，０００ダルトンであると見積もった。
【００３７】
（非還元性末端にＤ−グルクロン酸を含むＨＡオリゴサッカリドの調製）
ヒアルロン酸（１００ｍｇ、Ｌｉｆｅｃｏｒｅ  ロット１−９０６２−５）を、０．１Ｎ  ＨＣｌ溶液で８０℃で１０時間処理する。この溶液を、０．５Ｎ  ＮａＯＨで中和して、そしてＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムを通して水で溶出して脱塩する。脱塩した生成物を凍結乾燥して、そしてβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３０；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）で処理して、約４〜約２０個の反復単位を有し、そしてその非還元性末端にＤ−グルクロン酸を含む、ＬＭＷ−ＨＡフラグメントを得る。このオリゴコッサリドの構造を、ＮＭＲ分光分析およびメチル化分析によって確認する。
【００３８】
（超音波処理によるヒアルロン酸の脱重合）
ヒアルロン酸（１００ｍｇ、Ｌｉｆｅｃｏｒｅ  ロット１−９０６２−５）を、２０ｍｌの１０ｍＭ  ＰＢＳ緩衝液中に溶解し、そしてその懸濁液を溶解するまで攪拌する。このサンプルを、Ｂｒａｎｓｏｎソニケーター  モデル４５０（超音波の設定：出力コントロール：３；デューティサイクル：５０％；温度；２℃）で１８時間、超音波処理した。透析および凍結乾燥の後、５７ｍｇの固体生成物を回収した。生じた超音波処理したヒアルロン酸の平均分子量を、ＭｉｎｉＤａｗｎ装置を（Ｗｙａｔｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）およびＳｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）１２ＨＲ１０／３０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用する、ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳによって、１８，０００ダルトンであると決定した。５００ＭＨｚでのサンプルの１Ｈ−ＮＭＲ分析は、ジサッカリド反復単位のヒアルロン酸の構造を確認した。
【００３９】
（実施例２）
（ＬＭＷ−ＨＡ結合体の調製）
（ＮａＢＨ４を用いた酸処理したヒアルロン酸の還元）
塩酸で脱重合したヒアルロン酸（６５ｍｇ）を、６．５ｍｌの脱イオン水に溶解した。このｐＨを０．５Ｎ  ＮａＯＨで１０に調整し、そしてその溶液に６４．５ｍｇのＮａＢＨ４を添加した。この反応混合物を、室温で２時間放置した。過剰量のＮａＢＨ４を１Ｍ  酢酸で壊した。ＭＷＣＯ  ３，５００のＤｉａｆｌｏ（登録商標）膜を用いて脱イオン水に対してで透析し、その後凍結乾燥して、３５ｍｇの固体生成物を得た。
【００４０】
（還元性酸処理されたヒアルロン酸の過ヨウ素酸酸化）
還元され、そしてサイズ分け（ｓｉｚｅ）されたポリサッカリドの２つの１８ｍｇのサンプルを、１．３ｍｌおよび０．８７ｍｌの１０ｍＭ  ＮａＩＯ４水溶液に溶解して、それぞれ１０％および２０％の酸化度（ｄ．ｏ．）を達成した。この反応を暗所で、室温で２時間攪拌して、そして各々を２０μｌのエチレングリコールでクエンチした。次いで、この反応混合物を透析してそして凍結乾燥して、１７ｍｇの固体生成物を得た。
【００４１】
（酸処理したヒアルロン酸−破傷風毒素結合体（ＬＭＷ−ＨＡ／ＴＴ）の調製）
過ヨウ素酸酸化（ｄ．ｏ．１０％および２０％）酸処理したヒアルロン酸（それぞれ１０ｍｇ）および精製した破傷風毒素モノマー（各サンプルにつき５ｍｇ、Ｓｔａｔｅｎｓ  Ｓｅｒｕｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃｏｐｅｎｈａｒｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を、０．５ｍＬの０．２Ｍ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）に溶解した。再結晶されたシアノ水素化ホウ素ナトリウム化水素（各サンプルにつき１０ｍｇ）を添加し、そしてこの混合物を室温で一晩放置した。反応の進行を様々な時点で、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）１２ＨＲ１０／３０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を備えたＢｉｏ−Ｒａｄシステム（Ｂｉｏｌｏｇｉｃ）を使用してモニターした。ポリサッカリドのタンパク質への結合は、カラムのボイド（排除）（ｖｏｉｄ）容量において溶出するＵＶ（２８０ｎｍ）のピークの漸増によって示した。結合体化が完了した後、１ｍｌの０．１Ｎ  ＮａＯＨ中の１０ｍｇのＮＡＢＨ４を各サンプルに添加して、任意の残留する結合体化されていないアルデヒドを還元した。この結合体を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００ＰＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のカラム（１．６×６０ｃｍ）へ通過させて０．０１％チメロザールを含む１０ｍＭ  ＰＢＳで溶出することによって、精製した。ボイド容量のピークに対応する画分をプールし、そして４℃で保存した。これらは、それぞれポリサッカリドにおける１０％酸化および２０％酸化に対して、設計された１および２の結合体であった。
【００４２】
（超音波処理したヒアルロン酸の過ヨウ素酸酸化）
２６ｍｇおよび３０ｍｇの超音波処理したポリサッカリドの２つのサンプルを、それぞれ、各々２ｍｌおよび１．５ｍｌの脱イオン水に溶解し、そして０．６５ｍｌおよび１．５ｍｌの１０ｍＭ  ＮａＩＯ４水溶液で処理して、それぞれ、１０％および２０％の酸化度（ｄ．ｏ．）に達した。この反応物を暗所にて室温で２時間攪拌して、そして各々の反応を２０μｌのエチレングリコールでクエンチした。次いで、この溶液を透析しそして凍結乾燥して、それぞれ２４ｍｇおよび２５ｍｇの生成物を生じ得た。
【００４３】
（超音波処理したヒアルロン酸−破傷風毒素結合体（ＬＭＷ−ＨＡ／ＴＴ）の調製）
超音波処理して、そして過ヨウ素酸で酸化したＨＡ（各々のサンプル７ｍｇ、ｄ．ｏ．１０％および２０％）および精製した破傷風毒素モノマー（各サンプルにつき３．５ｍｇ）を、３５０μｌのｐＨ７．４の０．２Ｍ  リン酸ナトリウムに溶解した。シアノ水素化ホウ素水素ナトリウム（各サンプルにつき７ｍｇ）を添加し、そしてこの混合物を室温で一晩放置した。各々の結合体化反応の進行を、様々な時点で反応混合物からアリコートを取り出し、続いてＳｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）１２ＨＲ１０／３０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を備えたＢｉｏ−Ｒａｄシステム（Ｂｉｏｌｏｇｉｃ）で分析することによってモニターした。ポリサッカリドのポリペプチドとの結合体化を、カラムのボイド容量中のＵＶ吸収ピーク（２８０ｎｍ）の溶出の漸増によって示した。結合体化が完了した後、ＮａＢＨ４（各サンプルにつき１ｍｌの０．１Ｎ  ＮａＯＨ中に１０ｍｇ）を反応混合物に添加して、任意の残留する接合されていないアルデヒドを還元した。この結合体を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００ＰＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のカラムへ通過させて０．０１％チメロザールを含む１０ｍＭ  ＰＢＳで溶出することによって、精製した。ボイド容量のピークに対応する画分をプールし、そして４℃で保存した。これらは、それぞれポリサッカリドにおける１０％酸化および２０％酸化に対して、設計された結合体３および結合体４であった。
【００４４】
（組換えクラス３ナイセリアのポーリンとの超音波処理したヒアルロン酸のカップリング（ＬＭＷ−ＨＡ／ｒＰｏｒＢ））
超音波処理し、そして過ヨウ素酸で酸化したヒアルロン酸（２０ｍｇ、２０％のｄ．ｏ．）およびｒＰｏｒＢ（１０ｍｇ）を、７１７μｌの０．２５Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．５）（０．２５Ｍ  ＮａＣｌおよび０．０５％  Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  Ｚ３，１４（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を含む）に溶解した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（２０ｍｇ）を添加し、そしてこの混合物を３７℃で１日間インキュンベートした。この結合体化が完了した後、この反応混合物に、１ｍｌの０．１Ｎ  ＮａＯＨ中の１０ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加し、残留するアルデヒドを除いた。この結合体を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００ＰＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のカラムへ通過させて、０．０１％チメロザールを含む１０ｍＭ  ＰＢＳで溶出することによって、精製した。２８０ｎｍのＵＶ吸収によってモニターしながら、ボイド容量のピークに対応する画分をプールし、そして４℃で保存し、そして結合体５として標識した。
【００４５】
（ＥＬＩＳＡのコーティング抗原としての、ヒアルロン酸−ヒト血清アルブミン（ＬＭＷ−ＨＡ／ＨＡＳ）の調製）
１０％のｄ．ｏ．を有する、酸処理および超音波処理した過ヨウ素酸酸化ヒアルロン酸およびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、Ｆｌｕｋａ）の両方を、０．５ｍｌのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中に溶解した。シアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加して、そしてこの混合物を３７℃で１日間インキュベートした。結合体化が完了した後、他の結合体について記載されるように、この反応混合物に０．１Ｎ  ＮａＯＨ中の水素化ホウ素ナトリウムを添加して、任意の残留するアルデヒドを除いた。結合体を透析し、そして凍結乾燥した。
【００４６】
（表１：ＬＭＷ−ＨＡ／タンパク質結合体の生理化学的特性：
【００４７】
【表１】
2005508854.tif 000003
結合体中のヒアルロン酸およびタンパク質の含量を、それぞれカルバゾールアッセイ（ウロン酸について）（Ｂｉｔｔｅｒ，Ｔ．１９６２  Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４：３３０）およびクマシー（ＢｉｏＲａｄ）アッセイによって測定した。
【００４８】
（実施例３）
（ヒアルロン酸オリゴサッカリドインヒビターの単離）
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙａｌｕｒｏｌｙｔｉｃｕｓ由来のヒアルロン酸リアーゼ（ＥＣ  ４．２．２．１）（Ｓｉｇｍａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（１０ｍＭ  ＰＢＳ中の３アンプルの内容物）を、超音波処理したヒアルロン酸（６０ｍｇ）に添加し、そして３７℃で１．５時間インキュベートした。この反応混合物を水浴中で１００℃で１分間煮沸することによって反応を停止した。酵素的消化の進行を、この反応混合物からアリコートを取り出し、そしてＳｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）ペプチドカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を備えたＢＩＯ−ＲＡＤシステム（Ｂｉｏｌｏｇｉｃ）での分析（溶離液として１０ｍＭ  ＰＢＳ、流速０．７５ｍｌ／分）によって、モニターした。この溶液を、さらなる精製まで４℃で保存した。
【００４９】
ダイオードアレイ検出器、プログラム可能な自動インジェクター、フラクションコレクター、ならびにシステム制御およびデータ取得／処理のためのＨｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェアプログラムを備える、ＨＰＬＣ  １０９０（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  １０９０  Ｓｅｒｉｅｓ  ＩＩ）を使用して、Ｍｏｎｏ−Ｑ  ＨＲ５／５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いる陰イオン交換クロマトグラフィーによって、オリゴサッカリドの単離を実施した。分離のために、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中の塩化ナトリウムの段階的勾配を使用した。それぞれ１８〜２６分の間に溶出するダイマー（ＤＰ２）、および２８〜３１分の間に溶出するテトラマー（Ｄ４）に対応する、２つのオリゴサッカリドの画分を回収し、凍結乾燥し、そしてＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）および溶離液として脱イオン水を使用して、脱塩した。オリゴサッカリドの構造を、５００ＭＨｚでの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの調査によって確認した。ＤＰ２オリゴサッカリドは、Δ４，５−β−ＧｌｃＵ−（１，３）−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃに対応し、そしてＤＰ４オリゴサッカリドはΔ４，５−β−ＧｌｃＵ−（１，３）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１，４）−β−Ｄ−ＧｌｃＵ−（１，３）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃに対応した。
【００５０】
（実施例４）
（血清学の研究：低分子量のヒアルロン酸（ＬＭＷ−ＨＡ）に対するウサギ抗血清の免疫特異性）
（免疫原性の研究）
ニュージーランド白ウサギを、１回目の用量についてはフロイントの完全アジュバント、そして２回目および３回目の用量についてはフロイントの不完全アジュバント中のＬＭＷ−ＨＡ／ＴＴの１用量あたり、１０μｇの結合体化ポリサッカリドで、２１日間隔（０日目、２１日目、および４１日目）で３回、皮下免疫した。ウサギの耳から、２１日目、３１日目および４１日目に採血し、そして心臓の穿刺試験を、３回目の免疫後１０日目に実行した。
【００５１】
（ＬＭＷ−ＨＡ／ＨＳＡコーティングプレート上でのウサギ抗血清の力価測定）
マイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ  Ｐｏｌｙｓｏｒｐ）を、３７℃で１時間、ＰＢＳ（５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ＝７．４））で希釈した、超音波処理されたＬＭＷ−ＨＡ／ＨＳＡまたは酸加水分解されたＬＭＷ−ＨＡ／ＨＳＡ結合体（１００μＬ／ウェルあたり約２５ｎｇのＰＳ）のいずれかで受動的にコーティングした。プレートをＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ＰＢＳ  Ｔｗｅｅｎ（ｐＨ＝７．４））で洗浄した後、このプレートを、室温で１時間、１５０μＬ／ウェルＰＢＳ＋０．１％  ウシ血清アルブミン（ＰＢＳ＋ＢＳＡ（ｐＨ７．４））でポストコーティング（ｐｏｓｔ−ｃｏａｔ）した。ポストコーティング後、このプレートを、再度洗浄し、そして使用するまで２〜８℃で保存した。
【００５２】
ウサギ抗血清を、超音波処理されたＬＭＷ−ＨＡ／ＨＳＡまたは酸加水分解されたＬＭＷ−ＨＡ／ＨＳＡのいずれかでコーティングされたマイクロタイタープレートのウェル中で、１００μＬ／ウェルの最終用量になるまでＰＢＳ  Ｔｗｅｅｎで連続希釈し、そして室温で１時間インキュベートした。このプレートを、ＰＢＳ  Ｔｗｅｅｎで洗浄し、そしてＰＢＳ  Ｔｗｅｅｎ中で１：２，５００に希釈された１００μＬのヤギ抗ウサギＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、各ウェルに添加した。室温で１時間インキュベートした後、このプレートを、再度洗浄し、そして１００μＬのＴＭＢ基質溶液（ＫＰＬ）を、各ウェルに添加した。このプレートを、室温で５〜１０分間インキュベートし、そして色の発色を、各ウェルに１００μＬのＯｎｅ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｓｔｏｐ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＫＰＬ）を添加することによって停止させた。各ウェルの光学濃度を、４５０ｎｍで読み取り、そして力価測定曲線を、各状態について作成した。
【００５３】
（ＬＭＷ−ＨＡ／ＨＳＡコーティングしたプレート上の超音波処理されたＬＭＷ−ＨＡ／ＴＴに対するウサギ抗血清の結合の阻害）
マイクロタイタープレートを、上記のようにコーティングした。ウサギ抗超音波処理ＬＭＷ−ＨＡ／ＴＴ抗血清を、超音波処理されたＬＭＷ−ＨＡ／ＨＳＡ結合体でコーティングされたプレート上で力価測定した。最大シグナルの約１／２に対応する希釈を、阻害の研究に適切なように選択した。このウサギ抗血清を、ＰＢＳ  Ｔｗｅｅｎ中に希釈した。インヒビターを、Ｔｉｔｅｒｔｕｂｅ（登録商標）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中で希釈した抗血清を含む緩衝液中で連続希釈し、そして各サンプルの１００μＬをＴｉｔｅｒｔｕｂｅ（登録商標）から採取し、そしてコーティングされたマイクロタイタープレートのウェルに直接添加した。サンプルを、マイクロタイタープレートで、室温で１時間インキュベートした。このマイクロタイタープレートを、ＰＢＳ  Ｔｗｅｅｎで洗浄し、次いで、ＰＢＳ  Ｔｗｅｅｎ中１：２，５００に希釈された１００μＬのヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ結合体（ＫＰＬ）を、各ウェルに添加した。このプレートを、室温で１時間インキュベートし、そしてＰＢＳ  Ｔｗｅｅｎで洗浄した。１００μＬのＴＭＢ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＫＰＬ）を、各ウェルに添加した。このプレートを、室温で５分間〜１０分間インキュベートし、そして色の発色を、各ウェルに１００μＬのＯｎｅ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｓｔｏｐ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＫＰＬ）を添加することによって停止させ、そして４５０ｎｍでの吸光度を読み取った。阻害を、いずれのインヒビターも存在しない状態での、希釈抗血清で達成される最大シグナルのパーセントとして決定した。
【００５４】
（ニュージーランド白ウサギの免疫応答）
８匹のニュージーランド白ウサギを、超音波処理されたヒアルロン酸−破傷風毒素（ＬＭＷ−ＨＡ／ＴＴ）または酸加水分解されたヒアルロン酸−破傷風毒素（ＬＭＷ−ＨＡ／ＴＴ）結合体のいずれかを３回皮下注射して免疫した（各結合体について４匹の動物）。図４は、超音波処理されたＬＭＷ−ＨＡ／ＴＴ結合体免疫原についてのそれぞれ個々のウサギに対する免疫応答を示す。４匹の動物全ては、５０，０００を越えるＥＬＩＳＡ力価でヒアルロン酸に応答した。図５は、酸加水分解されたＬＭＷ−ＨＡ／ＴＴ結合体で免疫された個々のウサギに対する免疫応答を示す。個々の動物４匹全ては、約１０，０００以上のＥＬＩＳＡ力価でヒアルロン酸に応答した。
【００５５】
ウサギの免疫応答を、免疫に使用した結合体の性質に特異的に依存するように実行した。図６は、超音波処理されたＬＭＷ−ＨＡ／ＴＴ結合体で免疫した動物由来の抗体が、酸加水分解されたＬＭＷ−ＨＡ／ＨＳＡよりも超音波処理されたＬＭＷ−ＨＡ／ＨＳＡでコーティングされたプレートに対して、一般により速やかに反応することを示す。これらの異なるコーティング抗原間には、少なくとも１オーダーの免疫反応性の大きさの違いがある。この逆は、酸加水分解されたＬＭＷ−ＨＡ／ＴＴ結合体で免疫した動物に当てはまる。図７は、超音波処理されたＬＭＷ−ＨＡ／ＨＳＡ固相と反対に、酸加水分解されたＬＭＷ−ＨＡ／ＨＳＡ結合体に対するこれらの抗血清について１オーダーの大きさの優位を示す。
【００５６】
（ニュージーランド白ウサギにおける超音波処理されたＬＭＷ−ＨＡ／ＴＴによって生成される抗血清の特異性）
超音波処理されたＬＭＷ−ＨＡ／ＴＴ結合体での免疫によってウサギにおいて生成される抗血清の特異性を、マイクロタイタープレート阻害研究によって試験した。超音波処理されたＬＭＷ−ＨＡ／ＴＴで免疫されたウサギ＃７５２９５由来の抗血清を用いる阻害研究の結果は、図８および９に示される。図８は、超音波処理されたＨＡのいくつかの種、およびインヒビターとして使用される酸加水分解されたＨＡのいくつかの種を示す。この実験において、全ての形態の酸加水分解されたＨＡは、コーティングされた超音波処理されたＬＭＷ−ＨＡ／ＨＳＡに結合する抗体の乏しいインヒビターであった。このインヒビターの超音波処理された種に関して、この傾向は、より小さいＨＡフラグメントが超音波処理によって生成されると、フラグメントがインヒビターとしてより効果的になることを明らかにする。これは、より小さいＨＡ分子が、より大きな種よりも単位質量あたりより多いエピトープを表すことを示す。
【００５７】
図９に示される結果は、この発見をさらに説明する。本明細書中で、超高分子量のネイティブＨＡが、非常に乏しいインヒビターとして考えられ、２０ｋＤ  ＨＡよりもほぼ３オーダー小さい大きさが、免疫原として使用される。より小さい種をまた、この実験においてインヒビターとして使用した。テトラサッカリド形態のＨＡは、比較的効果的なインヒビターであったが、その一方で、ジッサカリドおよびＤ−グルクロン酸の形態は、固相に結合した抗体を全く阻害しなかった。
【００５８】
阻害研究からの結果を、ウサギ＃７２７００由来の抗血清を用いて実行し、これらをまた、超音波処理されたＬＭＷ−ＨＡ／ＴＴ結合体を用いて免疫した。これらは、図１０および１１に示される。これらの結果は、前述のウサギ＃７５２９５から得られた結果と酷似する。図１０は、図９において見られた結果と類似の結果を示す。すなわち、テトラサッカリド形態のＨＡおよび超音波処理された（２０Ｋ）免疫原形態のＨＡは、良好に阻害する一方で、ジサッカリドおよびネイティブ形態のＨＡは、ほとんど阻害しない。ＨＡのサイズと免疫反応性との間の関係を、ヘキササッカリド形態のＨＡを用いてさらに試験した。これらの結果は、図１１に示される。これらの結果は、この形態のＨＡが、抗体結合を完全に阻害し得ることを示す。これらの研究から、少なくともテトラサッカリド形態（２つの反復するサブユニット）のＨＡが、完全な阻害のために必要であることが明らかである。このジサッカリド形態のＨＡは、阻害のために不十分であり、そしてネイティブ形態の分子は、最適なインヒビターではない。故に、大きなネイティブＨＡ分子のサイズの減少が、免疫認識のために好ましい。
【００５９】
（実施例５）
（マウスにおける免疫原性研究）
（ヒアルロン酸−タンパク質結合体に対するマウスにおいて生成される抗血清）
ＢＬＡＢ／ｃマウスおよびＣＤ１マウスの両方を、ＬＭＷ−ＨＡ／タンパク質結合体ワクチンを３回注射して免疫した。この結合体は、ウサギを用いたように、超音波処理されたＬＭＷ−ＨＡ／ＴＴ、またはｒＰｏｒＢ（ＬＭＷ−ＨＡ／ｒＰｏｒＢ）に結合体化した超音波処理されたＨＡのいずれかであった。このＬＭＷ−ＨＡ／ＴＴ結合体ワクチンは、ネガティブコントロールの応答よりも高い免疫応答を生じなかった。しかし、ＬＭＷ−ＨＡ／ｒＰｏｒＢ結合体は、免疫された動物の１００％において測定可能なＥＬＩＳＡ力価を生じた。ＢＡＬＢ／ｃマウスおよびＣＤ１マウスのそれぞれについて、図１２および１３にこれらのデータを示す。
【００６０】
（実施例６）
（保護実験）
（受動的免疫）
ＬＭＷ−ＨＡ／ＴＴ結合体に対するウサギ抗血清を、成体Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける受動的免疫における保護アッセイのために使用した。滅菌ＰＢＳ中で半分に希釈したウサギ抗血清（０．５ｍｌ）を、Ａ群連鎖球菌（ＧＡＳ）６型または３型のＬＤ９０チャレンジ用量でチャレンジ（ＩＰ）する前に２時間腹腔内（ＩＰ）注射した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）およびフロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ）で免疫したウサギの抗血清、ならびに破傷風毒素に結合体化したＡ群連鎖球菌の炭水化物に対して惹起したウサギ抗血清は、コントロール血清として保護実験に含んだ。生存を、チャレンジ後１０日目間追従した。
【００６１】
ＧＡＳ６型または３型の用量の範囲でのＩＰチャレンジによる２時間後の、ＰＢＳ／ＣＦＡで免疫したウサギ抗血清を用いたＢａｌｂ／ｃマウスの免疫後に、ＬＤ９０を明らかに決定した。ＧＡＳ６型および３型についてのＬＤ９０を、それぞれ５×１０３ｃｆｕ／ｍＬおよび２×１０５ｃｆｕ／ｍＬと決定した。チャレンジの結果を、図１４および１５に示す。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】ヒアルロン酸（ＨＡ）の構造。
【図２】超音波処理および／または酸処理による、抗原性低分子量ＬＭＷ−ＨＡの産生。
【図３】連鎖球菌ＨＡ保護性エピトープの構造；ａ）超音波処理ＨＡ由来のテトラサッカリド；ｂ）ヒアルロニダーゼの作用後に生成されたテトラサッカリド。
【図４】超音波処理されたＨＡ−ＴＴ結合体に対する、ウサギ抗血清のＥＬＩＳＡ力価。
【図５】酸加水分解されたＬＭＷ−ＨＡ／ＴＴ結合体に対するウサギ抗血清のＥＬＩＳＡ力価。
【図６】超音波処理されたＬＭＷ−ＨＡ／ＴＴ結合体に対するウサギ抗血清の滴定。
【図７】酸加水分解されたＬＭＷ−ＨＡ／ＴＴ結合体に対するウサギ抗血清の滴定。
【図８】ＬＭＷ−ＨＡ／ＨＳＡコーティングプレート上の、酸加水分解されたＨＡ、超音波処理されたＨＡ、および超音波処理されたＨＡ結合体を用いたウサギ抗血清（７５２９５番）の阻害。
【図９】ＬＭＷ−ＨＡ／ＨＳＡコーティングプレート上の、超音波処理されたＨＡ、ネイティブなＨＡ、Ｄ−グルクロン酸、ＨＡジサッカリド、およびＨＡテトラサッカリドを用いたウサギ抗血清（７５２９５番）の阻害。
【図１０】ＬＭＷ−ＨＡ／ＨＳＡコーティングプレート上の、超音波処理されたＨＡ、Ｄ−グルクロン酸、ＨＡジサッカリド、およびＨＡテトラサッカリドを用いたウサギ抗血清（７２７００番）の阻害。
【図１１】ＬＭＷ−ＨＡ／ＨＳＡコーティングプレート上の、超音波処理されたＨＡ、ネイティブなＨＡ、ＨＡジサッカリド、ＨＡテトラサッカリドおよびＨＡヘキササッカリド／オクタサッカリドサギを用いた抗血清（７２７００番）の阻害。
【図１２】ＬＭＷ−ＨＡ／ｒＰｏｒＢ結合体に対するＢＡＬＢ／ｃマウス抗血清のＥＬＩＳＡ力価。
【図１３】ＬＭＷ−ＨＡ／ｒＰｏｒＢ結合体に対するＣＤ１マウス抗血清のＥＬＩＳＡ力価。
【図１４】ウサギ抗血清を用いたＢａｌｂ／ｃマウスの受動免疫；ＧＡＳ６型（４，４００ｃｆｕ／ｍＬ）。それぞれ、白三角、ＰＢＳ／ＣＦＡに対するウサギ抗血清；白丸、超音波処理されたＬＭＷ−ＨＡ／ＴＴに対するウサギ抗血清；黒丸、超音波処理されたＬＭＷ−ＨＡ／ＴＴに対するウサギ抗血清；黒三角、超音波処理されたＬＭＷ−ＨＡ／ＴＴに対するウサギ抗血清。
【図１５】ウサギ抗血清を用いたＢａｌｂ／ｃマウスの受動免疫；ＧＡＳ３型（２．５×１０５ｃｆｕ／ｍＬ）。それぞれ、白三角、ＰＢＳ／ＣＦＡに対するウサギ抗血清；白丸、超音波処理されたＬＭＷ−ＨＡ／ＴＴに対するウサギ抗血清；黒丸、酸加水分解されたＬＭＷ−ＨＡ／ＴＴに対するウサギ抗血清；黒三角、酸加水分解されたＬＭＷ−ＨＡ／ＴＴに対するウサギ抗血清。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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