(57)【要約】本発明は、ミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーター（ＭＣＡ）を介してカルシウム流出を阻害する因子を用いてインスリン分泌を変更するための組成物および方法を提供する。それによって処置方法が提供され、そしてこの処置方法は特に、真性糖尿病を有するかまたは真性糖尿病を有する危険性があると疑われる被験体の処置のために有用である。ミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーターをコードする遺伝子配列の同定、このような配列の発現および発現されたＭＣＡ産物を用いたスクリーニングアッセイに関連する組成物および方法もまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
真性糖尿病を処置するための方法であって、真性糖尿病を有するかまたは真性糖尿病を有する危険性を有する疑いのある被験体に、ミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーター活性を選択的に損なう因子を含む、治療有効量の薬学的組成物を投与する工程を包含する、方法。
【請求項２】
真性糖尿病を処置するための方法であって、真性糖尿病を有するかまたは真性糖尿病を有する危険性を有する疑いのある被験体に、ミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーター活性を選択的に損なう因子を含む、治療有効量の薬学的組成物を投与する工程を包含し、ここで、該因子は、インスリン分泌を増強する、方法。
【請求項３】
真性糖尿病を処置するための方法であって、真性糖尿病を有するかまたは真性糖尿病を有する危険性を有する疑いのある被験体に、ミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーター活性を選択的に損なう因子を含む、治療有効量の薬学的組成物を投与する工程を包含し、ここで、該因子は、グルコースによって刺激されるインスリン分泌を増強する、方法。
【請求項４】
真性糖尿病を処置するための方法であって、真性糖尿病を有するかまたは真性糖尿病を有する危険性を有する疑いのある被験体に、ミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーター活性を選択的に損なう因子を含む、治療有効量の薬学的組成物を投与する工程を包含し、ここで、該因子は、超生理学的グルコース濃度によって刺激されるインスリン分泌を増強し、かつ、空腹時生理学的グルコース濃度の存在下でインスリン分泌を増強しない、方法。
【請求項５】
前記真性糖尿病が、２型糖尿病である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記真性糖尿病が、若年者の成人発症型糖尿病である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記薬学的組成物が、経口投与される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記因子が、空腹時生理学的グルコース濃度の存在下でインスリン分泌を実質的に変更しない、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
候補因子が、膜透過性である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記膜が、原形質膜およびミトコンドリア膜からなる群より選択される少なくとも１つの膜である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ミトコンドリア膜が、ミトコンドリア内膜およびミトコンドリア外膜からなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
生物学的サンプル中でのミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーターポリペプチドの存在を決定するための方法であって、以下の工程：
ミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーターポリペプチドを含む生物学的サンプルを、ミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーターリガンドと、該ミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーターリガンドの、ミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーターポリペプチドへの結合を可能にするに充分な条件下でかつ充分な時間にわたって接触させる工程；および
該ミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーターリガンドの、ミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーターポリペプチドへの結合を検出し、それによって、該生物学的サンプル中でのミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーターポリペプチドの存在を決定する工程
を包含する、方法。
【請求項１３】
前記ミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーターリガンドが、化合物番号１またはその誘導体を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーターリガンドが、検出可能に標識されている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記検出可能に標識されているミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーターリガンドが、放射性標識された置換基を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記放射性標識された置換基が、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ、４５Ｃａおよび３５Ｓからなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記検出可能に標識されているミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーターリガンドが、蛍光置換基を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記検出可能に標識されているミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーターリガンドが、共有結合したビオチンを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
ミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーターを生物学的サンプルから単離するための方法であって、以下の工程：
ミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーターポリペプチドを含む疑いのある生物学的サンプルを、ミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーターリガンドと、該ミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーターリガンドの、ミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーターポリペプチドへの結合を可能にするに充分な条件下でかつ充分な時間にわたって接触させる工程；および
該ミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーターポリペプチドを回収し、それによって、ミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーターを生物学的サンプルから単離する工程
を包含する、方法。
【請求項２０】
前記ミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーターリガンドが、固相に共有結合している、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーターリガンドが、固相に非共有結合的に結合している、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記被験体に、該被検体中の循環グルコース濃度を低下させる１以上の因子を投与する工程をさらに包含する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
循環グルコース濃度を低下させる因子が、インスリン、インスリン分泌促進剤、インスリン増感剤、肝臓グルコース排出のインヒビターおよびグルコース吸収を損なう因子からなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記インスリン分泌促進剤が、スルホニル尿素化合物および非スルホニル尿素化合物からなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記因子が、以下の構造：
【化１】
2005503993.tif 000018
を有するかまたはその立体異性体、プロドラッグもしくは薬学的に受容可能な塩であり、ここで、
Ｚは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（＝Ｏ）またはＳ（＝Ｏ）２であり；
Ｒは、水素、アルキルまたは置換アルキルであり；
Ｒ１およびＲ２は、同じであるかまたは異なっており、そしてそれぞれの出現箇所で、独立してハロゲン、シアノ、ニトロ、モノ−もしくはジ−アルキルアミノ、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキルまたは置換複素環アルキルであり；そして
ｎおよびｍは、同じであるかまたは異なっており、そして独立して、０、１、２、３または４である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
Ｚが酸素である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
Ｚが硫黄である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
ｎが１である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
ｍが１である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
Ｒ１がハロゲンである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
Ｒ２がハロゲンである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
Ｒ１が８位でハロゲンである、請求項３０に記載方法。
【請求項３３】
Ｒ２が２位でハロゲンである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
Ｒが水素である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３５】
Ｒが置換アルキルである、請求項２５に記載の方法。
【請求項３６】
アルキルが、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲａで置換されている、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
Ｒａが水素またはアルキルである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
アルキルが、−ＣＯＮＲａ（アルカンジイル）ＯＲｂまたは−ＣＯＮＲｃ（アルカンジイル−Ｏ）１−６（アルカンジイル）ＮＲａＲｂで置換されている、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
−ＣＯＮＲａ（アルカンジイル）ＯＲｂが、−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）２ＯＣＨ３である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
−ＣＯＮＲｃ（アルカンジイル−Ｏ）１−６（アルカンジイル）ＮＲａＲｂが、−ＣＯＮＨ｛（ＣＨ２）２Ｏ｝２（ＣＨ２）２ＮＨ２である、請求項３８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は一般に、ミトコンドリアの活性に影響を与える因子を用いてインスリン分泌を変更するための組成物および方法に関する。より詳細には、本発明は、特に、ミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーターを介してカルシウム流出を阻害することによって、細胞内カルシウムのミトコンドリア調節を変更する因子の投与を包含する処置方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
２型糖尿病、すなわち、「後期発症型」糖尿病は、先進国の人口の５〜１０パーセントに罹患する、一般的な変性疾患である。２型糖尿病（「２型ＤＭ」）を発症する傾向は、報告によれば、母系遺伝し、このことは、ミトコンドリアの遺伝的関与を示唆する（Ａｌｃｏｌａｄｏ，Ｊ．Ｃ．およびＡｌｃｏｌａｄｏ，Ｒ．，Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｊ．３０２：１１７８−１１８０（１９９１）；Ｒｅｎｙ，Ｓ．Ｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍ．２３：８８６−８９０（１９９４））。糖尿病は、強力な遺伝的要素を有する、不均質な障害である；一卵性双生児は非常に一致しており、罹患した個体の一親等の間には、高い疾患発生数が存在する。
【０００３】
細胞レベルでは、後期発症型の真性糖尿病の存在またはその素因についての危険性に特有であり得る病理学的表現型としては、変化したミトコンドリア呼吸機能の１以上の指標（例えば、損なわれたインスリン分泌、減少したＡＴＰ合成および上昇したレベルの反応性酸素種）の存在が挙げられる。研究によって、２型ＤＭには、特定の関連障害が先行し得るかまたは特定の関連障害が関連し得ることが示された。例えば、米国において４０００万人の個体が、損なわれたグルコース耐性（ＩＧＴ）に罹患していることが評価されている。グルコース負荷の後、ＩＧＴ患者中の循環グルコース濃度は、非罹患個体よりも高いレベルまで上昇し、そしてベースラインレベルまでよりゆっくりと戻る。少ない百分率のＩＧＴ個体（５〜１０％）は、毎年、非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）へと進行する。この形態の真性糖尿病（２型ＤＭ）は、膵臓β細胞によるインスリン放出の減少およびインスリンに対する末端器官応答の低下に関連する。真性糖尿病および真性糖尿病に先行するかまたは真性糖尿病に関連する条件の他の症状としては、肥満、血管病理、末梢神経障害および感覚神経障害、ならびに失明が挙げられる。
【０００４】
膵臓β細胞からのグルコース媒介インスリン分泌は、複雑な順序の細胞内事象によって誘発される（図１）。グルコースは、ＧＬＵＴ−２グルコーストランスポーターを介してβ細胞によって取り込まれる；これは続いて、グルコキナーゼによってリン酸化されてグルコースリン酸となり、これは、解糖経路に入る。解糖によって産生された還元型の等価物（ＮＡＤＨ）および基質（ピルビン酸）はミトコンドリアに入り、そして増加した呼吸および酸化的リン酸化に燃料を供給する。その結果、細胞のＡＴＰレベルが上昇して、原形質膜のＫ＋−ＡＴＰチャネルの閉鎖を誘発し、この膜を分極させ、そしてカルシウムの流入を可能にする。カルシウムは、以下の２つの主な役割を有するようである：細胞からのインスリンの放出を刺激すること（例えば、Ｋｅｎｎｅｄｙら，１９９６  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：２５２４；Ｍａｅｃｈｌｅｒら，１９９７  ＥＭＢＯ  Ｊ．１６．３８３３）、およびミトコンドリアのＡＴＰ産生の「フィードフォワード」調節因子として作用すること（例えば、ＣｏｘおよびＭａｔｌｉｂ，１９９３  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１４：４０８）。後者は、ミトコンドリアのカルシウムユニポーターを介したカルシウムのミトコンドリア取り込みによって達成される（例えば、Ｎｅｗｇａｒｄら，１９９５  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：６８９；Ｍａｇｎｕｓら，１９９８  Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７４：Ｃ１１７４−Ｃ１１８４）。ミトコンドリアのカルシウムの上昇は、カルシウム感受性デヒドロゲナーゼの刺激を通して呼吸および酸化的リン酸化を刺激する（Ｒｕｔｔｅｒら，１９８８  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２５２：１８１；Ｒｕｔｔｅｒら，１９９３  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２２３８５）。しかし、ミトコンドリアのカルシウムの上昇は一過性である。なぜなら、カルシウムは、調節されたカルシウム流出チャネル（例えば、ミトコンドリアのカルシウムアンチポーター（例えば、ミトコンドリアのナトリウム／カルシウム交換体（ｍＮＣＥ；例えば、Ｎｅｗｇａｒｄ  １９９５；Ｍａｇｎｕｓ  １９９８を参照のこと；ミトコンドリア膜トランスポーターの一般的概説については、例えば、Ｚｏｎａｔｔｉら，１９９４  Ｊ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒ．２６：５４３およびその中に引用される参考文献を参照のこと）としても公知のミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーター（ＭＣＡ）））を介して細胞質に戻るからである。ＭＣＡインヒビターの使用は、心臓機能に対するそれらの潜在的影響について意図されている（例えば、ＣｏｘおよびＭａｔｌｉｂ，１９９３  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１４：４０８−４１３）が、このような使用は、糖尿病のような特定の他の適応症については示唆されていない。従って、例えば、上昇したミトコンドリア内カルシウム濃度は、上記のように、インスリン分泌および酸化的ＡＴＰ合成に関連付けられている（例えば、Ｋｅｎｎｅｄｙら，１９９６  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：２５２４；Ｍａｅｃｈｌｅｒら，１９９７  ＥＭＢＯ  Ｊ．１６：３８３３；ＣｏｘおよびＭａｔｌｉｂ，１９９３  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａ���ｏｌ．Ｓｃｉ．１４：４０８）とはいえ、酸化的ＡＴＰ合成とインスリン分泌との間のインデューサー−エフェクターの関係は、一般には受け入れられていない（例えば、Ｎｅｗｇａｒｄ，１９９５  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：６８９を参照のこと）。さらに、ＭＣＡの現在利用可能なインヒビターは、ＭＣＡについて特異的でないか、または極めて高濃度でのみ有用であるかのいずれかであると考えられており、薬学的組成物についてのそれらの見かけの適切さを排除している（ＣｏｘおよびＭａｔｌｉｂ，１９９３  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１４：４０８−４１３）。
【０００５】
２型ＤＭについての現在の薬理学的治療は、注射されたインスリン、および血中グルコースレベルを低下させるために設計された経口薬剤を含む。現在利用可能な経口薬剤としては、以下が挙げられる：（ｉ）スルホニル尿素（これは、グルコースに対する膵臓β細胞の感受性を増強することによって作用し、それによって所定のグルコース負荷に応じてインスリン分泌を増加させる）；（ｉｉ）ビグアニド（これは、グルコース廃棄率を改善し、そして肝臓グルコース排出量を阻害する）；（ｉｉｉ）チアゾリジンジオン（これは、核ペルオキシソームプロリファレーター（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ）活性化レセプター（ＰＰＡＲ、例えば、Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ，１９９８  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４７：５０７−５１４；Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓら，１９９７  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．８：１５９−１６６；Ｓｔａｅｌｓら，１９９７  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ７９：９５−９９を参照のこと）との相互作用を介して末梢のインスリン感度を改善する）、（ｉｖ）レパグリニド（ｒｅｐａｇｌｉｎｉｄｅ）（これは、ＡＴＰ依存性カリウムチャネルとの相互作用を介してインスリン分泌を増強する）；および（ｖ）アカルボース（ａｃａｒｂｏｓｅ）（これは、炭水化物の腸吸収を減少させる）。２型糖尿病を処置するための現在利用可能な薬物（例えば、スルホニル尿素）はインスリン分泌を改善するとはいえ、基底インスリン分泌およびインスリン刺激インスリン分泌の両方がこのような化合物によって増強される。その結果、望ましくない慢性高インスリン血症、低血糖症および／または過剰体重増加が、このような薬物での処置後にもたらされ得る（Ｃｏｂｂら，１９９８  Ａｎｎ．Ｒｅｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３３．２１３−２２２；Ｋｒｅｎｔｚら，１９９４  Ｄｒｕｇ  Ｓａｆｅｔｙ  １１：２２３−２４１）。
【０００６】
それゆえ、現在の薬理学的治療はいずれも、２型ＤＭにおける基本的生化学的欠陥を矯正しないことが明らかである。現在利用可能なこれらの処置はいずれも、２型ＤＭにおける生理学的異常（例えば、損なわれたインスリン分泌、インスリン耐性および／または過剰の肝臓グルコース排出）のすべてを改善するわけではない。さらに、処置の失敗は、これらの薬剤について一般的であり、その結果、多剤治療が頻繁に必要である。
【０００７】
ミトコンドリアは、高等生物の細胞における主なエネルギー源である、細胞小器官である。これらの細胞小器官は、細胞呼吸、酸化的プロセスおよび代謝プロセスの広範なアレイの直接的かつ間接的な生化学的調節（代謝エネルギー産生、好気呼吸および細胞内カルシウム調節を含む）を提供する。例えば、ミトコンドリアは、電子伝達鎖（ＥＴＣ）活性の部位であり、酸化的リン酸化を駆動して代謝エネルギーをアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の形態で産生し、そしてこれはまた、細胞内カルシウムホメオスタシスにおけるミトコンドリアの中心的役割の基礎となる。これらのプロセスは、ミトコンドリアの電気化学的膜電位の維持を必要とし、そしてこのような膜電位の不全は、種々の障害をもたらし得る。
【０００８】
ミトコンドリアは、細胞小器官と細胞質ゾルとの間の界面として役立つミトコンドリア外膜、複数の部位での外膜への結合を形成するようである非常に折り畳まれたミトコンドリア内膜、およびこれらの２つのミトコンドリア膜の間の膜間腔を含む。ミトコンドリア内膜内の部分区画（ｓｕｂｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）は通常、ミトコンドリアマトリクスといわれる（概説については、例えば、Ｅｒｎｓｔｅｒら，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９１：２２７ｓ，１９８１を参照のこと）。外膜は、約１０キロダルトン未満の分子量を有するイオン性および非イオン性の溶質が自由透過性であるが、ミトコンドリア内膜は、多くの低分子（特定のカチオンを含む）について、選択的かつ調節された透過性を示し、そして大きな（約１０ｋＤよりも大きな）分子に対しては不透過性である。
【０００９】
ＥＴＣ活性を媒介する５つのうちの４つの多サブユニットタンパク質複合体（複合体Ｉ、複合体ＩＩＩ、複合体ＩＶおよび複合体Ｖ）は、ミトコンドリア内膜に局在する。残りのＥＴＣ複合体（複合体ＩＩ）は、マトリクス中に位置する。ＥＴＣ内で起こることが公知の少なくとも３つの別個の化学的反応において、プロトンは、ミトコンドリアマトリクスから、内膜を横切って、膜間腔へと移動する。荷電種のこの不均衡によって、「プロトン駆動力」（ＰＭＦ）といわれる、約２２０ｍＶの電気化学的膜電位が作り出される。ＰＭＦは、しばしば、表記Δｐによって表され、等式Δｐ＝ΔΨｍ−ＺΔｐＨによる、内膜をまたがった電位差（ΔΨｍ）とｐＨ差（ΔｐＨ）との合計に対応し、ここで、Ｚは、−２．３０３ＲＴ／Ｆを表す。Ｚの値は、ΔｐおよびΔΨｍがｍＶで表される場合、２５℃で−５９であり、そしてΔｐＨはｐＨ単位で表される（例えば、Ｅｒｎｓｔｅｒら，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９１．２２７ｓ，１９８１およびその中に引用される引用文献を参照のこと）。
【００１０】
ΔΨｍは、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）のリン酸化のためのエネルギーを提供して、ＥＴＣ複合体ＶによってＡＴＰを生じる（このマトリクスへのプロトンの輸送と化学量論的に共役しているプロセス）。ΔΨｍはまた、ミトコンドリアへの細胞質ゾルのＣａ２＋の流入についての駆動力でもある。ミトコンドリア内のＣａ２＋の正常な変化は、正常な代謝調節と関連している（Ｄｙｋｅｎｓ，１９９８，Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ＆  Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｂｅａｌ，ＨｏｗｅｌｌおよびＢｏｄｉｓ−Ｗｏｌｌｎｅｒ編，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２９−５５頁；Ｒａｄｉら，１９９８，Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ＆  Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｂｅａｌ，ＨｏｗｅｌｌおよびＢｏｄｉｓ−Ｗｏｌｌｎｅｒ編，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，５７−８９頁；ＧｕｎｔｅｒおよびＰｆｅｉｆｆｅｒ，１９９１，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７：Ｃ７５５；Ｇｕｎｔｅｒら，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６７：３１３，１９９４）。例えば、変動レベルのミトコンドリアの遊離Ｃａ２＋は、酵素のアロステリックな調節（ＣｒｏｍｐｔｏｎおよびＡｎｄｒｅｅｖａ，Ｂａｓｉｃ  Ｒｅｓ．Ｃａｒｄｉｏｌ．８８：５１３−５２３，１９９３によって概説される）；ならびにグリセロリン酸シャトル（ＧｕｎｔｅｒおよびＧｕｎｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．Ｂｉｏｍｅｍｂｒ．２６：４７１，１９９４）を介して、増加したＡＴＰ利用に応じた酸化的代謝の調節を担い得る。
【００１１】
正常なミトコンドリア機能は、ミトコンドリアマトリクス内の過剰なＣａ２＋の隔離による、細胞質ゾルの遊離カルシウムレベル（生理学的生物学的シグナル伝達から生じる、一過的に上昇した細胞質ゾルの遊離カルシウムを含む）の調節を含む。細胞型に依存して、細胞質ゾルのＣａ２＋濃度は代表的に、５０ｎＭ〜１００ｎＭである。正常に機能する細胞では、Ｃａ２＋レベルが２００ｎＭ〜３００ｎＭに達したとき、ミトコンドリアは、ミトコンドリア内膜内のＣａ２＋ユニポーターを介した流入と、Ｎａ＋依存性カルシウムキャリアおよびＮａ＋非依存性カルシウムキャリア（特にＭＣＡを含む）の両方を介したＣａ２＋流出との間の平衡の関数として、Ｃａ２＋を蓄積し始める。この迅速なユニポーター機構の低い親和性は、主なユニポーター機能が、細胞質ゾルの遊離カルシウムレベルの上昇（これは、生物学的シグナル伝達機構の一部として生じる、原形質膜をまたがったカルシウム流入から生じ得る）に応じた細胞質ゾルのＣａ２＋を低下させることであり得ることを示唆する（ＧｕｎｔｅｒおよびＧｕｎｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．Ｂｉｏｍｅｍｂｒ．２６：４７１，１９９４；Ｇｕｎｔｅｒら，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６７：３１３，１９９４）。特定の例では、例えば、膵臓β細胞では、細胞質カルシウムにおける生理学的上昇は、グルコース（または他の分泌促進剤）に応じて生じ、そしてミトコンドリアによるカルシウム取り込みをもたらし、増加したＡＴＰ合成を刺激する。同様に、主なカルシウムアンチポーター（例えば、ＭＣＡ）機能は、（例えば、グルコース感受性細胞のグルコース刺激から生じ得、そして酸化的ＡＴＰ合成の一過性の増加を生じ得る）ミトコンドリアのＣａ２＋流入に応じてミトコンドリアのＣａ２＋濃度を低下させるためであり得る。従って、とりわけ、細胞質ゾル区画とミトコンドリア区画との間での、ミトコンドリアによって調節されたカルシウムサイクリングは、細胞内ＡＴＰレベルの操作の機会を提供し得る（例えば、ＣｏｘおよびＭａｔｌｉｂ，１９９３  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１４：４０８−４１３；Ｍａｔｌｉｂら，１９８３  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．８９：３２７；Ｍａｔｌｉｂ  １９８５  Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒａｐ．２３３：３７６；Ｍａｔｌｉｂら，１９８３  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．３２：２８３７）。
【００１２】
細胞内カルシウムのミトコンドリアの調節の意義および糖尿病（これは、不適切かつ持続した高血糖症によって特徴付けられる、任意の広範な疾患状態を含む）に対するこのミトコンドリア活性の関係を考慮すると、ミトコンドリアのカルシウムホメオスタシスを制御するための、改善された組成物および方法についての明らかな必要性が存在する。糖尿病についての改善された治療を提供するために、ミトコンドリア内の細胞内区画とミトコンドリア外の細胞内区画との間のミトコンドリアのカルシウムサイクリングを変更する因子は、有益であり得、そしてこのような因子を特異的に検出するためのアッセイが必要とされる。明らかに、例えば、変更されたミトコンドリア機能の基礎である、２型ＤＭの原因であるかまたは２型ＤＭに関連する生化学的欠損および／または代謝欠損が、ミトコンドリア起源を有し得るかまたはミトコンドリア外起源を有し得るかにかかわらず、このような欠損を正すことに標的化される、改善された治療についての必要性が存在する。本発明は、インスリン分泌を増強することによって、糖尿病、そして特に２型ＤＭを処置するために有用である、ミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーター機能の調節に関連した組成物および方法を提供し、そして他の関連の利点を提供する。
【００１３】
（発明の要旨）
本発明は、真性糖尿病を処置するための方法に関連し、この方法は、真性糖尿病を有するかまたは真性糖尿病を有する危険性を有する疑いのある被験体に、ミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーター活性を選択的に損なう因子を含む、治療有効量の薬学的組成物を投与する工程を包含する。特定の実施形態では、この因子は、インスリン分泌を増強し、そして特定の他の実施形態では、この因子は、グルコースによって刺激されるインスリン分泌を増強する。特定の他の実施形態では、この因子は、超生理学的グルコース濃度によって刺激されるインスリン分泌を増強し、そして生理学的グルコース濃度の存在下ではインスリン分泌を増強しない。特定のさらなる実施形態では、この方法は、この被験体に、この被験体における循環グルコース濃度を低下させる１以上の因子を投与する工程をさらに包含し、この因子は、特定のなおさらなる実施形態では、インスリン、インスリン分泌促進剤、インスリン増感剤、肝臓グルコース排出のインヒビターまたはグルコース吸収を損なう因子である。特定の他のさらなる実施形態では、このインスリン分泌促進剤は、スルホニル尿素化合物または非スルホニル尿素化合物（例えば、レパグリニド）である。
【００１４】
特定の実施形態では、この真性糖尿病は、２型糖尿病または若年者の成人発症型糖尿病である。特定の実施形態では、この薬学的組成物は、経口投与される。特定の実施形態では、この因子は、生理学的グルコース濃度の存在下ではインスリン分泌を実質的には変更しない。特定の実施形態では、この候補因子は、膜透過性である。特定の実施形態では、この膜は、原形質膜およびミトコンドリア膜からなる群より選択される膜の少なくとも１つである。特定の実施形態では、このミトコンドリア膜は、ミトコンドリア内膜およびミトコンドリア外膜からなる群より選択される。
【００１５】
特定の実施形態では、生物学的サンプル中のミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーターポリペプチドの存在を決定するための方法が提供され、この方法は、ミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーターポリペプチドを含む生物学的サンプルを、ミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーターリガンドと、このミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーターリガンドの、ミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーターポリペプチドへの結合を可能にするに充分な条件下でかつ充分な時間にわたって接触させる工程；およびこのミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーターリガンドの、ミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーターポリペプチドへの結合を検出し、それによって、この生物学的サンプル中でのミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーターポリペプチドの存在を決定する工程を包含する。
【００１６】
特定の実施形態では、このミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーターリガンドは、以下に規定されるとおりの構造（Ｉ）の化合物（例えば、化合物番号１）を含む。特定の実施形態では、このミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーターリガンドは、検出可能に標識されている。特定の実施形態では、この検出可能に標識されているミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーターリガンドは、放射性標識された置換基を含む。特定の実施形態では、この放射性標識された置換基は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ、４５Ｃａおよび３５Ｓからなる群より選択される。特定の実施形態では、この検出可能に標識されているミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーターリガンドは、蛍光置換基を含む。特定の実施形態では、この検出可能に標識されているミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーターリガンドは、共有結合したビオチンを含む。
【００１７】
特定の実施形態では、ミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーターを生物学的サンプルから単離するための方法が提供され、この方法は、ミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーターポリペプチドを含む疑いのある生物学的サンプルを、ミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーターリガンドと、このミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーターリガンドの、ミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーターポリペプチドへの結合を可能にするに充分な条件下でかつ充分な時間にわたって接触させる工程；およびこのミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーターポリペプチドを回収し、それによって、ミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーターを生物学的サンプルから単離する工程を包含する。特定の実施形態では、このミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーターリガンドは、固相に共有結合している。特定の実施形態では、このミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーターリガンドは、固相に非共有結合的に結合している。
【００１８】
本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照すれば、明らかになる。本明細書中に開示される全ての参考文献は、あたかも各々が個々に援用されたかのように、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【００１９】
（発明の詳細な説明）
本発明は一部、糖尿病を有するかまたは糖尿病を有する危険性を有する疑いのある被験体に、ミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーター（ＭＣＡ）の選択的インヒビターを含む、薬学的組成物を投与することによって、真性糖尿病を処置するための方法に関する。本明細書中でずっと詳細に記載されるように、このようなインヒビターは実質的に、好ましい実施形態ではインスリン分泌を増強し、そして特定の好ましい実施形態では、このＭＣＡインヒビターは、超生理学的グルコース濃度によって刺激されるインスリン分泌（例えば、グルコース刺激インスリン分泌）を増強するが、正常な生理学的グルコース濃度（例えば、基底インスリン分泌）が存在する条件下では実質的にインスリン分泌を増強しない。それゆえ、本発明は部分的に、糖尿病が特定の因子を用いて効果的に処置され得るという予想外の観察に関し、ここで、基底インスリン分泌に対してグルコース刺激インスリン分泌を優先的に増強する様式でＭＣＡおよび／または他のミトコンドリアのカルシウム流出機構を妨害するような因子が選択され得る。従って、以下に詳細に述べられるように、本発明は、ＭＣＡ活性を損なうことに関連する、これまで認識されていない利点を提供し、そのために、これらの利点は、糖尿病の処置に関する。
【００２０】
非限定的な理論によれば、本発明は、薬理学的介入を活用して、増加しかつ維持されたミトコンドリア内カルシウム濃度を維持し、それによって、酸化的リン酸化およびその後の細胞内ＡＴＰ濃度の上昇を駆動する方法に関する。この理論によればさらに、このような上昇したＡＴＰ濃度は、本明細書中に提供されるように、増強されたインスリン分泌を促進し、そして充分なインスリンを提供して超生理学的循環グルコース濃度を低下させ、そして好ましくはこれらを正常レベルまたは正常レベル付近の濃度に戻すという望ましい結果をもたらす。
【００２１】
本発明の特定の他の好ましい実施形態では、本明細書中に提供されるように、ＭＣＡ活性を選択的に損なう、治療有効量の因子を被験体に投与する工程を包含し、そして循環グルコース濃度を低下させる因子を投与する工程をさらに包含する、糖尿病を処置するための方法が提供される。２型ＤＭを処置するための現在の因子は、上記のように、この疾患における基本的生化学的欠損を正すことなく血中グルコースレベルを低下させ得るが、それゆえ、特定の例においては、本開示に従ってＭＣＡ活性を損なう因子を、既存の血糖低下因子と組み合わせることが所望され得る。従って、例えば、例示のためであって限定のためではないが、カリウム／ＡＴＰチャネルを閉じる、スルホニル尿素のクラスの薬剤の薬物またはより近年開発された非スルホニル尿素クラスの薬剤の薬物は、ＭＣＡ活性を損なう因子と組み合わされ得る。他の非限定的な例として、ミトコンドリアの代謝についての基質を供給する因子（例えば、ＫＣｌ、α−ケトイソカプロン酸またはロイシン）、インスリン増感剤（例えば、チアゾリジンジオン）、肝臓グルコース排出のインヒビター（例えば、メトホルミン）またはグルコース取り込みブロッカー（例えば、アカルボース）もまた、２型ＤＭまたは潜在的に他の状態の処置においてＭＣＡ活性を損なう因子の効果を増強し得る。
【００２２】
本発明の状況では、ミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーター活性を選択的に損なう因子としては、以下の一般構造（Ｉ）を有する化合物（その立体異性体、プロドラッグおよび薬学的に受容可能な塩を含む）が挙げられる：
【００２３】
【化２】
2005503993.tif 000002
ここで、
Ｚは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（＝Ｏ）またはＳ（＝Ｏ）２であり；
Ｒは、水素、アルキルまたは置換アルキルであり；
Ｒ１およびＲ２は、同じであるかまたは異なっており、そしてそれぞれの出現箇所で、独立してハロゲン、シアノ、ニトロ、モノ−もしくはジ−アルキルアミノ、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキルまたは置換複素環アルキルであり；そして
ｎおよびｍは、同じであるかまたは異なっており、そして独立して、０、１、２、３または４である。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、上記で使用される用語は以下の意味を有する。
【００２５】
「アルキル」は、１〜１０個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖の、飽和または不飽和の、環状または非環状の、炭化水素を意味し、一方、「低級アルキル」は、同じ意味を有するが、１〜６個の炭素原子しか有さない。代表的な飽和直鎖アルキルとしては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルなどが挙げられ；一方、飽和分枝鎖アルキルとしては、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチルなどが挙げられる。不飽和アルキルは、隣接する炭素原子の間に少なくとも１個の二重結合または三重結合を含む（それぞれ、「アルケニル」または「アルキニル」ともいわれる）。代表的な直鎖アルケニルおよび分枝鎖アルケニルとしては、エチルエニル、プロピルエニル、１−ブテニル、２−ブテニル、イソブチルエニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−メチル−１−ブテニル、２−メチル−２−ブテニル、２，３−ジメチル−２−ブテニルなどが挙げられる；一方、代表的な直鎖アルキニルおよび分枝鎖アルキニルとしては、アセチルエニル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−メチル−１ブチニルなどが挙げられる。代表的な飽和環式アルキルとしては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどが挙げられ；一方、不飽和環式アルキルとしては、シクロペンテニルおよびシクロヘキセニルなどが挙げられる。シクロアルキルはまた、本明細書中で、「炭素環式」環構造といわれ、そして８〜１４個の炭素原子を有する二環式環構造および三環式環構造（例えば、１以上の芳香族炭素環式環（例えば、フェニル）または非芳香族炭素環式環（例えば、シクロヘキサン）に縮合したシクロアルキル（例えば、シクロペンタンまたはシクロヘキサン））が挙げられる。
【００２６】
「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素を意味する。
【００２７】
「オキソ」は、カルボニル基（すなわち、＝Ｏ）を意味する。
【００２８】
「シアノ」は、−ＣＮを意味する。
【００２９】
「ニトロ」は、−ＮＯ２を意味する。
【００３０】
「ハロアルキル」は、少なくとも１つの水素原子がハロゲンで置換されたアルキル（例えば、トリフルオロメチルなど）を意味する。
【００３１】
「モノ−またはジ−アルキルアミノ」はそれぞれ、１個の水素原子がアルキルで置換されたかまたは両方の水素原子がアルキルで置換された、アミノ（すなわち、−ＮＨ２）を意味する。
【００３２】
「アルカンジイル」は、２個の水素原子が、同じ炭素原子または異なる炭素原子から除去されている二価アルキル（例えば、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２−など）を意味する。
【００３３】
「アリール」は、芳香族炭素環式部分（例えば、フェニルまたはナフチル）を意味する。
【００３４】
「アリールアルキル」は、少なくとも１個のアルキル水素原子がアリール部分で置換されたアルキル（例えば、ベンジル、−（ＣＨ２）２フェニル、−（ＣＨ２）３フェニル、−ＣＨ（フェニル）２など）を意味する。
【００３５】
「ヘテロアリール」は、５員〜１０員で、かつ窒素、酸素および硫黄から選択された少なくとも１つのヘテロ原子を有し、そして少なくとも１個の炭素原子を含む、芳香族複素環式環（単環式環構造および二環式環構造の両方を含む）を意味する。代表的なヘテロアリールは、ピリジル、フリル、ベンゾフラニル、チオフェニル、ベンゾチオフェニル、キノリニル、ピロリル、インドリル、オキサゾリル、ベンゾオキサゾリル、イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、イソオキサゾリル、ピラゾリル、イソチアゾリル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、シンノリニル（ｃｉｎｎｏｌｉｎｙｌ）、フタラジニルおよびキナゾリニルである。
【００３６】
「ヘテロアリールアルキル」は、少なくとも１個のアルキル水素原子がヘテロアリール部分で置換されたアルキル（例えば、−ＣＨ２ピリジニル、−ＣＨ２ピリミジニルなど）を意味する。
【００３７】
「複素環」は、飽和、不飽和または芳香族のいずれかであり、かつ窒素、酸素および硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を含む、５員〜７員の単環式または７員〜１０員の二環式の複素環式環であって、ここで、この窒素および硫黄のヘテロ原子は必要に応じて酸化され得、そして窒素へテロ原子は必要に応じて四級化され得る、複素環式環（上記の複素環のうちのいずれかがベンゼン環に縮合した二環式環を含む）を意味する。この複素環は、任意のヘテロ原子または炭素原子を介して結合され得る。複素環としては、上記のとおりのヘテロアリールが挙げられる。従って、上記に列挙したヘテロアリールに加えて、複素環としてはまた、モルホリニル、ピロリジノイル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ヒダントイニル、バレロラクタミル、オキシラニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロピリミジニル（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｒｉｍｉｄｉｎｙｌ）、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニルなどが挙げられる。
【００３８】
「複素環アルキル」は、少なくとも１個のアルキル水素原子が複素環で置換されたアルキル（例えば、−ＣＨ２モルホリニルなど）を意味する。
【００３９】
用語「置換」は、本明細書中で使用される場合、少なくとも１個の水素原子が置換基で置換された上記の基（すなわち、アルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環および／または複素環アルキル）のいずれかを意味する。オキソ置換基（「＝Ｏ」）の場合、２個の水素原子が置換される。置換基としては、以下が挙げられる：ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、置換アルキル（例えば、ハロアルキル、モノ−またはジ置換アミノアルキル、アルキルオキシアルキルなど）、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、置換複素環アルキル、−ＮＲａＲｂ、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｒｂ、−ＮＲｃＣ（＝Ｏ）ＮＲａＲｂ、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＯＲｂ、−ＮＲａＳＯ２Ｒｂ、−ＯＲａ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒａ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲａ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａＲｂ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒａ、−ＯＣ（＝Ｏ）ＯＲａ、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａＲｂ、−ＮＲａＳＯ２Ｒｂ、−ＣＯＮＲａ（アルカンジイル）ＯＲｂ、−ＣＯＮＲｃ（アルカンジイル−Ｏ）１−６（アルカンジイル）ＮＲａＲｂまたは式−Ｙ−Ｚ−Ｒａの基（ここで、Ｙはアルカンジイル、置換アルカンジイルまたは直接結合であり、Ｚは−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（＝Ｏ）−、−Ｓ（＝Ｏ）２−、−Ｎ（Ｒｂ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−Ｎ（Ｒｂ）Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｂ）−または直接結合であり、ここで、Ｒａ、ＲｂおよびＲｃは同じであるかまたは異なっており、そして独立して水素、アミノ、アルキル、置換アルキル（ハロアルキルを含む）、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環式アルキルまたは置換複素環式アルキルであるか、またはＲａおよびＲｂはそれに結合している窒素原子と一緒になって、複素環または置換複素環を形成する）。
【００４０】
１つの実施形態では、Ｚは硫黄であり、そして別の実施形態では、Ｚは酸素であり、そしてこれらの化合物はそれぞれ、以下の構造（ＩＩ）または（ＩＩＩ）を有する：
【００４１】
【化３】
2005503993.tif 000003
さらに特定の実施形態では、構造（ＩＩ）および（ＩＩＩ）のＲは水素であり、そしてこの化合物は以下の構造（ＩＩ−１）または（ＩＩＩ−１）を有する：
【００４２】
【化４】
2005503993.tif 000004
さらにより特定の実施形態では、ｎおよびｍは両方とも１であり、構造（ＩＩ−１）および（ＩＩＩ−１）のＲ１およびＲ２は両方ともハロゲンであり、そしてこの化合物は以下の構造（ＩＩ−２）または（ＩＩＩ−２）を有し、ここで、各出現箇所の「Ｘ」は、同じであるかまたは異なっており、そしてハロゲン（すなわち、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨード）から独立して選択される：
【００４３】
【化５】
2005503993.tif 000005
さらなる実施形態では、Ｒは、置換アルキル（例えば、メチル）であり、ここで、置換基は−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲａであり、そしてこの化合物は以下の構造（ＩＶ）を有する：
【００４４】
【化６】
2005503993.tif 000006
構造（ＩＶ）のより特異的な実施形態では、Ｒａは水素またはアルキル（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチルなど）である。
【００４５】
他の実施形態では、Ｒはさらに、それぞれ、構造（Ｖ）および（ＶＩ）によって表されるように、置換アルキル（例えば、メチル）であるが、−ＣＯＮＲａ（アルカンジイル）ＯＲｂまたは−ＣＯＮＲｃ（アルカンジイル−Ｏ）１−６（アルカンジイル）ＮＲａＲｂで置換されている：
【００４６】
【化７】
2005503993.tif 000007
Ｒ１基およびＲ２基の位置に関して、以下の番号付けスキームが本明細書中に使用される：
【００４７】
【化８】
2005503993.tif 000008
従って、より特定の実施形態において、ｎおよびｍは両方とも１であり、Ｒ１は８位にあり、そしてＲ２は２位にあり、そしてこの化合物は以下の構造（ＶＩＩ）を有する：
【００４８】
【化９】
2005503993.tif 000009
上記の構造（Ｉ）の化合物は、有機化学の分野における当業者に公知の技術によって、そして実施例により詳細に例示されるように作製され得る。しかし、一般に、このような化合物は、以下の反応スキームによって作製され得る。
【００４９】
【化１０】
2005503993.tif 000010
上記反応スキームの工程ａにおいて、ケトン１は、ＮａＢＨ４との反応によって対応するアルコール２へと変換され、これは次いで、工程ｂにおいてＣＳ２との接触によって中間体３へと変換される。この中間体は、工程ｃにおいて最初にＨ２Ｏ２およびＫＯＨと、そして次にＮａ２Ｓ２Ｏ４およびＮａＯＨとの反応によってチオール４へと変換される。Ｚ＝Ｓである構造（Ｉ）の化合物は、工程ｄにおいてＣｌＣＯＣＨ２Ｃｌとの反応によって形成される。このようなベンゾチアゼピンシステムの合成は、Ｈｉｒａｉら、米国特許第４，２９７，２８０号および同第４，３４１，７０４号によってずっと詳細に記載される。
【００５０】
【化１１】
2005503993.tif 000011
あるいは、上記の反応スキームの工程ａにおいて、出発ケトン１は、アルコール２へと還元され、続いて工程ｂにおいてＴＦＡの存在下でグリコール酸メチルで処理されて、チオエーテル３が得られる。アルカリ加水分解は、工程ｃにおいて達成され、続いて工程ｄにおいて環化されて、構造（Ｉ）（ここでＺ＝Ｓ）の所望の化合物が提供される。
【００５１】
チオエーテル（Ｚ＝Ｓ）の、対応するスルフィニル（Ｚ＝ＳＯ）アナログおよびスルホニル（Ｚ＝ＳＯ２）アナログへの変換は、室温での、ＴＨＦ水溶液中での過ヨウ素酸ナトリウムでの酸化によって達成され得る。
【００５２】
【化１２】
2005503993.tif 000012
上記の反応スキームの工程ｅにおいて、ケトン５のアミン基は、ＣｌＣＨ２ＣＯＣｌとの反応によって中間体６へと変換され、次いで工程ｆにおいて、ＮａＢＨ４との接触により、対応するアルコール７へと変換される。Ｚ＝Ｏであり、そしてＲ＝Ｈである、構造（Ｉ）の化合物は、工程ｇにおいて、Ｎａ／ｉＰｒＯＨとの反応によって形成される。このようなベンゾオキサゼピン系の合成は、Ｈｉｒａｉら、米国特許第４，２９７，２８０号および同第４，３４１，７０４号によってずっと詳細に記載される。
【００５３】
（反応スキーム３）
上記の反応スキーム１Ａ、１Ｂおよび２において、Ｒ部分は、水素であり得る。この場合、窒素基は、実施例により充分に記載されるように、公知の技術を用いて脱プロトン化され得、続いて、所望のＲ基が付加され得る。
【００５４】
「薬学的に受容可能な塩」とは、このような化合物と、有機酸もしくは無機酸（酸付加塩）または有機塩基もしくは無機塩基（塩基付加塩）との組み合わせから誘導される、本発明の化合物の塩をいう。本発明の化合物は、遊離の塩基形態または塩形態のいずれかで用いられ得、両方の形態とも、本発明の範囲内にあるとみなされる。
【００５５】
本発明の化合物は一般に、遊離の酸または塩基として利用され得る。あるいは、本発明の化合物は、酸付加塩または塩基付加塩（ｂａｓｅｄ  ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｓａｌｔ）の形態で用いられ得る。本発明の遊離塩基アミノ化合物の酸付加塩は、当該分野で周知の方法によって調製され得、そして有機酸および無機酸から形成され得る。適切な有機酸としては、マレイン酸、フマル酸、安息香酸、アスコルビン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、酢酸、シュウ酸、プロピオン酸、酒石酸、サリチル酸、クエン酸、グルコン酸、乳酸、マンデル酸、桂皮酸、アスパラギン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、グリコール酸、グルタミン酸およびベンゼンスルホン酸が挙げられる。適切な無機酸としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸および硝酸が挙げられる。塩基付加塩としては、アンモニウムイオンならびに他の適切なカチオンが挙げられる。従って、用語、構造（Ｉ）の「薬学的に受容可能な塩」は、任意でかつすべての受容可能な塩の形態を包含することを意図する。
【００５６】
さらに、プロドラッグもまた、本発明の文脈に包含される。プロドラッグは、このようなプロドラッグを患者に投与した場合に構造（Ｉ）の化合物をインビボで放出する、任意の共有結合したキャリアである。プロドラッグは一般に、改変が、慣用的な操作によって、またはインビボにおいてのいずれかで切断されて親化合物を生じるような方法で官能基を改変することによって調製される。
【００５７】
立体異性体に関して、構造（Ｉ）の化合物は、キラル中心を有し得、そしてラセミ化合物、ラセミ混合物および個々のエナンチオマーまたはジアステレオマーとして生じ得る。これらの混合物を含め、このようなすべての異性体の形態は、本発明の範囲内に包含される。さらに、構造（Ｉ）の化合物の結晶形態のうちのいくつかは、同質異像として存在し得、これは、本発明に包含される。さらに、構造（Ｉ）の化合物のいくつかはまた、水または他の有機溶媒と溶媒化合物を形成し得る。このような溶媒化合物は、本発明の範囲内に同様に包含される。
【００５８】
循環グルコース濃度を低下させる因子」としては、当該分野で公知であるような、そして本明細書中で提供される、任意の血糖低下剤（抗糖尿病剤（例えば、スルホニル尿素化合物および非スルホニル尿素化合物）を含む）が挙げられ、そしてさらに、ビグアニド、チアゾリジンジオン、レパグリニド、アカルボース、メトホルミンまたは他の血糖低下組成物（例えば、６ＬＰ−１およびそのアナログ、ＤＰＰ−ＩＶインヒビター、α−ケトイソカプロン酸、ロイシンまたは他のアミノ酸のアナログ）が挙げられ得る。
【００５９】
「生物学的サンプル」は、本明細書中に記載されるような、任意の組織または細胞調製物を包含し得、そして「ミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーターポリペプチドを含む生物学的サンプル」は、本明細書中に提供されるような、ミトコンドリアからのＣａ２＋流出を媒介する、発現されたＭＣＡポリペプチドまたは他のミトコンドリアの分子成分が存在すると考えられる、任意の組織または細胞調製物を包含する。生物学的サンプル（ＭＣＡポリペプチドを含むサンプルを含む）は、血液サンプル、生検標本、組織外植片、器官培養物または任意の他の組織もしくは細胞調製物を、被験体または生物学的供給源から得ることによって提供され得る。被験体または生物学的供給源は、ヒトまたは非ヒト動物、初代細胞培養物または培養適応細胞株（染色体に組み込まれたかまたはエピソーム性の組換え核酸配列を含み得る遺伝子操作された細胞株、不死化細胞株もしくは不死化可能細胞株、体細胞ハイブリッドもしくは細胞質ハイブリッド「サイブリッド」細胞株、分化した細胞株もしくは分化可能細胞株、形質転換細胞株などを含むがこれらに限定されない）であり得る。生物学的サンプルは、例えば、組換え細胞株から、またはトランスジェニック動物から誘導され得る。
【００６０】
特定の好ましい実施形態では、被験体または生物学的供給源は、真性糖尿病を有することが既知であるか、または真性糖尿病を有する危険性を有する疑いのある、ヒトである。特定のさらに好ましい実施形態では、真性糖尿病は２型糖尿病であり、そして特定の他のさらに好ましい実施形態では、真性糖尿病は若年者の成人発症型糖尿病（ＭＯＤＹ）である。本明細書中に記載されるように、そして当該分野で公知であるように、真性糖尿病（例えば、２型糖尿病、ＭＯＤＹ）の存在または真性糖尿病を有する危険性を決定するための周知の基準が確立されており、そしてこれらは、例えば、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  ２０００（２０００  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２３：増補１）または他の箇所（例えば、ｗｗｗ．ｄｉａｂｅｔｅｓ．ｏｒｇ／（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎのウェブサイトを参照のこと）に見出され得る。糖尿病に関する、これらの認識された生理学的パラメーターのうち、当業者は、循環中のグルコースおよびインスリンの濃度の決定のための種々の方法論が確立されていることを認識する。例えば、本明細書中に提供されるような生物学的サンプル（例えば、血液、血清または血漿のサンプル）中のインスリンを定量するための方法としては、インスリンに特異的に結合する抗体を用いたラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）が挙げられ得る。ＲＩＡについてのバリエーション（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイおよび免疫沈降分析）、ならびに生物学的サンプル中のインスリンまたはプロインスリンの存在についての他のアッセイは、当業者に容易に明らかであり、そしてこれらとしては、分泌促進剤（例えば、グルコース、ＫＣｌ、アミノ酸、スルホニル尿素、フォルスコリン、グリセルアルデヒド、スクシネートまたは細胞馴化培地中でインスリンまたはプロインスリンを増加もしくは減少させ得る他の因子）の存在下または非存在下で、細胞によるインスリン分泌を測定するアッセイがさらに挙げられ得る。このような方法をまた用いて、インスリン分泌細胞によって産生されるかまたはこれらの細胞から放出されるインスリンの量を定量し得る。
【００６１】
個々の被験体の間で、循環グルコースレベルおよび循環インスリンレベルにおいて大きな量的変動が存在し得ることが当業者に充分認識されている（例えば、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  ２０００，２０００  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２３（増補１）およびその中に引用された参考文献を参照のこと）ので、本発明は、好ましい実施形態において、本明細書中に提供されるように、ＭＣＡ活性を選択的に損なう因子を含む薬学的組成物を用いて糖尿病を処置するための方法であって、ここで、この因子が、生理学的グルコース濃度（すなわち、空腹時条件下または基底代謝条件下）でのインスリン分泌を実質的に増強せず、そしてここでこの因子は、超生理学的グルコース濃度（すなわち、非空腹時条件下またはグルコース刺激条件下）でインスリン分泌を実質的に増強する方法を意図する。本発明の特定の好ましい実施形態は、ヒトにおける糖尿病を処置するための組成物および方法に関するが、本発明は、このように制限される必要はない。特に、当業者は、糖尿病（不適切なおよび／または持続した期間の高カルシウム血症によって特徴付けられる任意の疾患状態（例えば、２型ＤＭまたは他の真性糖尿病）を含む）が、多数の非ヒト動物に存在する状態であり得ることを容易に認識する（例えば、Ｆｏｒｄ，１９９５  Ｖｅｔｅｒｉｎ．Ｃｌｉｎｉｃｓ  ｏｆ  Ｎ．Ａｍｅｒ．：Ｓｍａｌｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ２５（３）：５９９−６１５）。従って、非ヒト動物における糖尿病のこれらおよび他の症状発現の処置に有用であり得るとして本明細書中に提供される組成物および方法は、本発明の範囲および趣旨の範囲内にある。
【００６２】
従って、正常または空腹時の生理学的グルコース濃度とは、正常でない条件（例えば、摂食後またはグルコース刺激の他の条件）下で達成される一過性の超生理学的、非空腹時または他の一時的に上昇したグルコース濃度とは異なる、正常条件（例えば、空腹時基底条件）下での被験体の循環中のグルコースの濃度をいう。例えば、例示および非限定として、種々の要因（例えば、生理学的状態、食餌、活性レベル、被験体の健康および／または遺伝的構成など）に依存して、代謝恒常性機構（インスリン分泌を含む）は代表的に、摂食または他のグルコース刺激後に到達する循環グルコース濃度よりも有意に低い空腹時条件下で比較的狭い範囲の循環グルコース濃度を維持するように作動する。このような上昇したグルコース濃度（これは代表的に、経時的に維持されない）は、恒常性機構によって維持されることが求められる正常なまたは空腹時状態からの逸脱を反映し、そして、本明細書中で、超生理学的グルコース濃度といわれる。従って、そしてさらなる非限定的な例として、多くの正常な個体は、約４０〜８０ｍｇ／ｄｌまたはその付近の、そして一般に約１１０ｍｇ／ｄｌ未満の、空腹時または生理学的循環グルコース濃度を維持し得、これは一般に、「損なわれた空腹時グルコース」を有すると特徴付けられた個体において１２６ｍｇ／ｄｌ未満であり得、そしてこれは一般に、糖尿病として特徴付けられる個体において１２６ｍｇ／ｄｌよりも上であり得（例えば、Ｇａｖｉｎら，２０００  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２３（増補１）：Ｓ４−Ｓ１９およびその中に引用される参考文献を参照のこと）、その結果、このような空腹時または生理学的グルコース濃度よりも統計学的に有意な様式で高い、摂食または他の形態のグルコース刺激によって誘導されるグルコース濃度は、超生理学的グルコース濃度とみなされ得る。同様に、循環インスリン濃度、および本発明によるＭＣＡ活性を損なう因子が、上昇したインスリン濃度をもたらす程度に関して、個体間には大きな変動が存在し得る。それゆえ、本発明は、「増強された」インスリン分泌とは、ＭＣＡ活性を損なう因子によって、超生理学的グルコース刺激後に、ＭＣＡ活性を損なう因子が空腹時または生理学的条件下で検出可能なインスリン濃度を上昇させる（存在する場合）程度よりも統計学的に有意な様式でより大きな程度まで検出可能に上昇したインスリン濃度をいうことを意図する。従って、好ましい実施形態では、ＭＣＡ活性を選択的に損なう因子は、超生理学的グルコース濃度によって刺激されるインスリン分泌を増強させ、空腹時グルコース濃度の存在下でインスリン分泌を増強しない。
【００６３】
本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、他に定義しない限り、当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有することが意図されることに留意することは、本発明の理解のために重要である。本明細書中で用いられる技術はまた、他に言及されない限り、当業者に公知の技術である。本出願を通して、種々の刊行物は括弧内に参照される。これらの刊行物の開示はその全体が、本出願において、本明細書中に参考として援用される。
【００６４】
特定の緩衝剤、培地、試薬、細胞、培養条件などまたはこれらの何らかのサブクラスに対する参照は、限定されることは意図しないが、当業者が、この考察が提示される特定の文脈において目的であるかまたは価値があると認識するような全ての関連の物質を包含すると解釈されるべきである。例えば、１つの緩衝液系または培養培地を別のもので置換し、その結果、異なるが公知の方法を用いて、示唆された方法、物質または組成物の使用が指向する目的と同じ目的を達成することはしばしば可能である。
【００６５】
本発明の特定の実施形態に従って、ＭＣＡ活性を損なう因子および／または循環グルコース濃度を低下させる因子の「治療有効量」が投与され得る。当業者は、容易にかつ過度の実験を要せずに、本明細書中に提供される治療有効量とは何であるかを決定し得る。従って、例えば、そして本明細書中の他のどこかに記載されるように、糖尿病の文脈では、そしてより詳細には糖尿病治療の効力をモニタリングする文脈では、循環血液グルコース濃度の周期的決定は、被験体の血液グルコースが正常な生理学的レベルを獲得したか否かを決定するために慣用的に実施され得る（例えば、Ｇａｖｉｎら，２０００  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２３（増補１）：Ｓ４−Ｓ１９およびその中に引用される参考文献を参照のこと）。必要に応じて、またはさらに、意図される特定の実施形態に従って、血液インスリンおよび／またはグリケーションされたヘモグロビンレベルをモニタリングすることが所望され得、これは、本明細書中に記載されるように、多数の慣用的な方法論および充分に確立された方法論のいずれかに従って実施され得る。
【００６６】
当業者は、候補ＡＴＰ生合成因子の存在下および非存在下でのＡＴＰ生合成経路によるＡＴＰ産生を容易に比較し得る。ＡＴＰ産生の慣用的な決定は、定量的ＡＴＰ検出についての任意の公知の方法を用いて、例えば、例示であって限定ではないが、必要に応じてクロマトグラフィー単離を含む、サンプルからの微分抽出によって；分光光度法によって；適切な形態の、検出可能に標識されたＡＴＰ前駆体分子（例えば、３２Ｐなど）と接触したサンプルから回収された標識ＡＴＰの定量によって；ＡＴＰ合成もしくは分解に関連した酵素活性の定量によって；または当該分野で公知の他の技術によって達成され得る。従って、本発明の特定の実施形態では、生物学的サンプル中のＡＴＰの量または生物学的サンプル中のＡＴＰの産生（ＡＴＰ産生速度を含む）は、変化したミトコンドリア機能の指標であり得る。１つの実施形態では、例えば、ＡＴＰは、ＡＴＰ依存性プロセスである、Ｄ−ルシフェリンの、ルシフェラーゼによって触媒された酸化のルミネセンスを測定することによって定量され得る。
【００６７】
本明細書中に記載される場合、ＭＣＡ活性を選択的に損なう因子は、特定の好ましい実施形態では、カルシウムカチオンの膜貫通輸送を妨害し得、それにより、このような活性は、カルシウムを検出することによって決定され得る。種々のカルシウム指示薬（以下の蛍光指示薬を含むがこれらに限定されない）は当該分野で公知であり、そして溶液中でまたは細胞内シグナルとして検出可能なシグナル（例えば、細胞質ゾル中のカルシウムのレベルに比例するシグナル）を作製するために適切である：例えば、ｆｕｒａ−２（ＭｃＣｏｒｍａｃｋら，１９８９  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ９７３：４２０）；ｍａｇ−ｆｕｒａ−２；ＢＴＣ（米国特許第５，５０１，９８０号）；ｆｌｕｏ−３、ｆｌｕｏ−４、ｆｌｕｏ−５Ｆおよびｆｌｕｏ−５Ｎ（米国特許第５，０４９，６７３号）；ｆｕｒａ−４Ｆ、ｆｕｒａ−５Ｆ、ｆｕｒａ−６Ｆおよびｆｕｒａ−ＦＦ；ｒｈｏｄ−２、ｒｈｏｄ−５Ｆ；Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｇｒｅｅｎ  ５ＮＴＭ；ベンゾチアザ−１およびベンゾチアザ−２；など（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲから入手可能（例えば、Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ−−Ｍｅｔｈｓ．Ｉｎ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．−Ｖｏｌ．１１４），Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｄ．（編），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９もまた参照のこと）。
【００６８】
Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｇｒｅｅｎ  ５ＮＴＭは、本発明による使用のために特に好ましいカルシウム指示薬分子である。しかし、用いられる特定のアッセイ条件に依存して、当業者は、適切なカルシウム指示薬を、上記のカルシウム指示薬から、または他のカルシウム指示薬から、本明細書中の教示に従って、そしてこのような指示薬の既知の特性（例えば、溶解度、安定性など）に基づいて選択し得る。例えば、例示のためであって限定ではないが、細胞透過性指示薬もしくは細胞不透過性指示薬が必要とされるか否か（例えば、サンプルが、透過化された細胞を含むか否か）、カルシウムについての指示薬の親和性（例えば、本明細書中に提供されるようなサンプル内のカルシウム濃度の動的作業範囲）および／または蛍光スペクトル特性（例えば、カルシウム依存性蛍光励起シフト）は全て、適切なカルシウム指示薬の選択における要因であり得る。Ｃａｌｃｉｕｍ−Ｇｒｅｅｎ−５ＮＴＭ（カリウム塩）は市販される（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ；Ｃ−３７３７）。Ｃａｌｃｉｕｍ−Ｇｒｅｅｎ−５ＮＴＭは、低親和性Ｃａ２＋指示薬である（例えば、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８  ＢＡＰＴＡ−５Ｎのように）。低親和性指示薬が好ましい。なぜなら、このアッセイにおいて使用されるＣａ２＋濃度のためである。高親和性色素は、より低いＣａ２＋濃度を必要とし、それゆえ、アッセイにおいて用いられる数よりも少数の細胞、従ってアッセイにおいて用いられる数よりも少数のミトコンドリアが必要とされる。
【００６９】
本発明のアッセイにおいて用いられ得る他のカルシウム感受性検出可能試薬としては、Ｃａｌｃｅｉｎ、Ｃａｌｃｅｉｎ  Ｂｌｕｅ、Ｃａｌｃｉｕｍ−Ｇｒｅｅｎ−１、Ｃａｌｃｉｕｍ−Ｇｒｅｅｎ−２、Ｃａｌｃｉｕｍ−Ｇｒｅｅｎ−Ｃ１８、Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｏｒａｎｇｅ、Ｃａｌｃｉｕｍ−Ｏｒａｎｇｅ−５Ｎ、Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｃｒｉｍｓｏｎ、Ｆｌｕｏ−３、Ｆｌｕｏ−３  ＡＭエステル、Ｆｌｕｏ−４、Ｆｕｒａ−２、Ｆｕｒａ−２ＦＦ、Ｆｕｒａ  Ｒｅｄ、Ｆｕｒａ−Ｃ１８、Ｉｎｄｏ−１、Ｂｉｓ−Ｆｕｒａ−２、Ｍａｇ−Ｆｕｒａ−２、Ｍａｇ−Ｆｕｒａ−５、Ｍａｇ−Ｉｎｄｏ−１、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  Ｇｒｅｅｎ、Ｑｕｉｎ−２、Ｑｕｉｎ−２  ＡＭ（アセトキシメチル）エステル、Ｍｅｔｈｏｘｙｑｕｉｎ  ＭＦ、Ｍｅｔｈｏｘｙｑｕｉｎ  ＭＦ  ＡＭエステル、Ｒｈｏｄ−２、Ｒｈｏｄ−２  ＡＭエステル、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ−Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｇｒｅｅｎ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８  ＢＡＰＴＡ−１、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８  ＢＡＰＴＡ−２、ＢＴＣ、ＢＴＣ  ＡＭエステル（全てＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ，ＯＲから）およびエクオリンが挙げられる。上記のように、特定の好ましい実施形態では、ミトコンドリア内のカルシウム濃度は、ミトコンドリアに標的化されたエクオリンを用いて直接決定される。
【００７０】
本明細書中で使用される場合、ミトコンドリアは、「ミトコンドリアの分子成分」から構成され、これは、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸もしくはそれらの誘導体；脂質、脂肪などもしくはそれらの誘導体；炭水化物、糖などもしくはそれらの誘導体、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、プリン、ピリミジンもしくは関連分子またはそれらの誘導体など；あるいはミトコンドリアの構成要素である別の生物学的分子であり得る。「ミトコンドリアの分子成分」としては、「ミトコンドリアの孔成分」が挙げられるがこれらに限定されない。「ミトコンドリアの孔成分」は、上記のようにミトコンドリア膜に特有の選択的透過性を調節する任意のミトコンドリアの分子成分（カルシウムに結合する分子成分、カルシウムを輸送する分子成分、さもなければカルシウムおよび／またはミトコンドリア膜のいずれかの側での他のイオンレベルの維持に関与する分子成分を含む）である。従って、ミトコンドリアの孔成分としてはまた、本明細書中に記載されるカルシウム流入を確立するのを担うミトコンドリア分子成分（例えば、ミトコンドリアのカルシウムユニポーター）またはカルシウム流出を確立するのを担うミトコンドリア分子成分（例えば、ＭＣＡ）が挙げられる。
【００７１】
ＭＣＡまたはミトコンドリア内のカルシウム濃度に影響を与える因子と相互作用する他の任意のミトコンドリアの分子成分の単離、ならびに必要に応じて同定および／または特徴付けもまた、所望され得、そして本発明の範囲内である。一旦因子は、本明細書中ならびに米国出願第０９／１６１，１７２号、同第０９／３３８，１２２号および同第０９／４３４，３５６４号に提供されるように、ミトコンドリアの活性（例えば、ミトコンドリアの透過性特性（例えば、ミトコンドリア結合、カルシウム（および必要に応じてナトリウム）カチオンの輸送または調節）を変更することが示されたら、当業者は、このような因子によって特異的に認識され、そしてミトコンドリアのカルシウム輸送の調節に関与する分子種を単離するために慣用的に用いられ得る種々のアプローチに精通しており、ここで、「単離する」とは、本明細書中で用いられる場合、天然の生物学的環境からのこのような分子種の分離をいう。
【００７２】
ミトコンドリアの分子成分（例えば、ＭＣＡまたは人工的に（例えば、薬理学的に）影響を受けてミトコンドリア内カルシウム濃度を維持し得るミトコンドリアの別の分子成分）を単離するための技術は、その生物学的供給源から成分を分離するために有用な任意の生物学的および／または生化学的方法を包含し得、そしてその後の特徴付けは、標準的な生化学的手順および分子生物学的手順に従って実施され得る。当業者は、生物学的出発材料および他の要因に依存して適切な方法を選択し得る。このような方法としては、生物学的サンプル中の細胞性成分およびミトコンドリア成分を放射標識または他の方法で検出可能に標識すること、細胞分画、密度勾配、微分抽出、塩析、限外濾過、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、電気泳動、親和性技術またはミトコンドリアの孔成分と相互作用する因子についての使用のために適応され得る任意の他の適切な分離方法が挙げられ得るがこれらに限定される必要はない。部分精製された成分に対する抗体は、当該分野で公知の方法に従って開発され得、そしてこのような成分を検出および／または単離するために用いられ得る。本明細書中に提供されるような任意の生物学的サンプルは、生物学的出発材料の適切な供給源であり得る。
【００７３】
例えば、そして生物学的サンプルにおけるＭＣＡポリペプチドの存在を決定するための方法または生物学的サンプルからＭＣＡを単離するための方法を含む特定の好ましい実施形態では、ミトコンドリアの分子成分（例えば、ＭＣＡ）は、単離されたミトコンドリアの調製物から、および／または単離された亜ミトコンドリア粒子（ＳＭＰ）の調製物から、入手され得る。ミトコンドリアを単離するための技術およびＳＭＰを調製するための技術は当業者に周知であり、そして選択された特定の条件について適切な場合、特定のマイナーな改変を含み得る（例えば、Ｓｍｉｔｈ，Ａ．Ｌ．，Ｍｅｔｈｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０：８１−８６；Ｄａｒｌｅｙ−Ｕｓｍａｎら（編），Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ；Ｓｔｏｒｒｉｅら，１９９０  Ｍｅｔｈｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：２０３−２５５）。細胞もしくは組織溶解産物、ホモジネート、抽出物、懸濁物、画分など、または部分精製もしくは完全精製したミトコンドリアの分子成分（例えば、ミトコンドリアタンパク質（例えば、ＭＣＡ））を含有する他の調製物もまた、これらおよび関連の実施形態において有用であり得る。特定の他の関連の実施形態に従って、１以上の単離されたミトコンドリア分子成分（例えば、単離されたＭＣＡタンパク質）は、膜小胞（例えば、単層膜小胞または多層膜小胞）に存在し得るか、または天然から誘導されたかもしくは合成のリポソームもしくはプロテオリポソームまたは膜で囲まれた同様の区画などへと、一般に受け入れられている方法論（例えば、Ｊｅｚｅｋら，１９９０  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５．１０５２２−１０５２６）に従って再構成され得る。
【００７４】
アフィニティー技術は、本発明の方法に従って使用するためのＭＣＡタンパク質またはポリペプチドの単離の文脈において特に有用であり、そしてＭＣＡポリペプチドを含む特異的結合相互作用を利用して分離をもたらす任意の方法を含み得る。例えば、酵素またはＭＣＡポリペプチドは共有結合したオリゴ糖部分を含み得るので、アフィニティー技術（例えば、レクチンによる炭水化物の結合を許容する条件下での適切な固定化レクチンへのＭＣＡポリペプチドの結合）は、特に有用なアフィニティー技術であり得る。他の有用なアフィニティー技術としては、特異的ＭＣＡタンパク質またはポリペプチド抗原を単離および／または検出するための免疫学的技術が挙げられ、この技術は、抗体の抗原結合部位とその因子に存在する抗原決定基との間の特異的結合相互作用に頼っている。抗体または他の親和性試薬の、抗原に対する結合は「特異的」であり、ここで、結合相互作用は、約１０４Ｍ−１以上の、好ましくは約１０５Ｍ−１以上の、より好ましくは約１０６Ｍ−１以上の、そしてさらにより好ましくは約１０７Ｍ−１以上のＫａを含む。結合パートナーまたは抗体の親和性は、従来の技術（例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄら，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０（１９４９）に記載される技術）を用いて容易に決定され得る。
【００７５】
免疫学的技術としては、イムノアフィニティークロマトグラフィー、免疫沈降、固相免疫吸着または他のイムノアフィニティー法が挙げられるがこれらに限定される必要はない。これらおよび他の有用なアフィニティー技術については、複合体を単離および特徴付けするための技術（アフィニティー技術を含む）に関する詳細について、例えば、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｒ．Ｋ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，１９８７，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ；Ｗｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９８６，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｏｓｔｏｎ；およびＨｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．ら，Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（これらはその全体が本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【００７６】
本明細書中に提供されるようなアフィニティー方法に関する特定の特に好ましい実施形態に従って、ＭＣＡポリペプチドを、ＭＣＡリガンドがＭＣＡポリペプチドに結合するのを可能にする条件下でそれに充分な時間にわたって、ＭＣＡリガンドと接触させ得る。好ましくは、特定の実施形態では、ＭＣＡリガンドは、本明細書中に記載されるように、固相支持体に固定化される。他の特定の好ましい実施形態では、ＭＣＡリガンドは、本明細書中にまた記載されるように、検出可能に標識される。従って、例えば、ＭＣＡリガンドは、放射性核種（例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ，３Ｈ、１４Ｃ、４５Ｃａまたは３５Ｓ）で標識され得、それについての選択プロトコルおよび標識プロトコルは当該分野で公知であり、そして特定のリガンドの化学組成物の機能によって変動する。本発明による使用のためのＭＣＡリガンドとしては、本明細書中に提供されるようなＭＣＡに特異的に結合し得る、天然に存在するかまたは合成の任意の分子が挙げられる。例えば、本明細書中に記載される標識された化合物番号１（化合物１）または本明細書中にまた記載されるその誘導体は、固体支持体に共有結合され得るかまたは合成によってもしくは合成後にトリチウムで標識され得る。別の例として、トリチウム化テトラフェニルホスホニウム（３Ｈ−ＴＰＰ）（ＭＣＡインヒビターＴＰＰの、検出可能に標識された誘導体（Ｓｖｉｃｈａｒら，１９９９  ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ  １０：１２５７；Ｋａｒａｄｊｏｖら，１９８６  Ｃｅｌｌ  Ｃａｌｃｉｕｍ  ７：１１５）は、有用なＭＣＡリガンドであり得る。本発明の方法による使用のために固相に固定化され得るかまたは検出可能に標識され得る他のＭＣＡリガンドとしては、クロナゼパムおよびその誘導体、ジルチアゼムおよびその誘導体、または本明細書中に提供され、当該分野で公知であるような、他のベンゾジアゼピンおよび関連化合物が挙げられる（例えば、ＣｏｘおよびＭａｔｌｉｂ，１９９３  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１４：４０８；Ｃｈｉｅｓｉら，１９８８  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３７：４３９９）。
【００７７】
特定の他の実施形態では、生物学的サンプル細胞は、カルシウム調節タンパク質（例えば、ＭＣＡ）を発現し得るか、それを発現するように誘導され得るか、またはそれをコードして発現する遺伝子でトランスフェクトされ得る。カルシウム調節タンパク質としては、細胞内または細胞小器官内のカルシウムレベルを直接的または間接的に変更する（例えば、上昇または下降させる）、天然に存在するかまたは人工的に操作された任意のポリペプチドまたはタンパク質が挙げられる。カルシウム調節タンパク質の例としては、カルモジュリン、カルセケストリン、カルパインＩおよびＩＩ、カルパスタチン、カルビンジン−Ｄ９ｋ、オステオカルシン、オステオネクチン、Ｓ−１００タンパク質、トロポニンＣおよび多数の膜貫通カルシウムチャネルが挙げられる。カルシウム調節タンパク質としてはまた、ミトコンドリアのカルシウムユニポーターが挙げられる。カルシウムアンチポーター（例えば、ＭＣＡ）の機能は、種々の正常な代謝プロセス、アポトーシスおよび特定の疾患機構において役割を果たし得る。
【００７８】
例えば、いくつかの膜貫通カルシウムチャネルは、遊離カルシウムの細胞内での結合、輸送または調節に関連する機能的なポリペプチドドメイン（例えば、カルシウム結合ドメイン、ＥＦＨＡＮＤドメイン、イオン輸送ドメイン、リガンドチャネルドメインおよび／またはカルモジュリン結合ＩＱドメイン）を含む。ＥＦＨＡＮＤ、Ｉｏｎ  Ｃｈａｎｎｅｌ，Ｌｉｇａｎｄ  ＣｈａｎｎｅｌおよびＩＱ。イオン輸送についての情報に関しては、例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：３８９８−３９５，１９９２；Ｊａｎら，Ｃｅｌｌ  ６９：７１５−７１８，１９９２を参照のこと。カルシウム結合／輸送についての情報に関しては、例えば、ＲｙＲ（リアノジンレセプター）Ｃｈｅｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１４６７５−１４６７８，１９９８を参照のこと。Ｌ型Ｃａ２＋チャネルについての情報に関しては、例えば、Ｈｏｃｋｅｒｍａｎら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３７：３６１−３９６，１９９７を参照のこと。リガンドチャネルについての情報に関しては、例えば、Ｔｏｎｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：１５１０−１５１２，１９９５を参照のこと；ＩＱに関しては、例えば、Ｘｉｅら，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：３０６−３１２，１９９４を参照のこと。ＥＦＨＡＮＤについての情報に関しては、例えば、Ｐｅｒｓｅｃｈｉｎｉら，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１２：４６２，１９８９；Ｉｋｕｒａ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２１：１４，１９９６；Ｇｕｅｒｉｎｉ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３５．２７１；Ｋａｋａｌｉｓら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３６２：５５，１９９５を参照のこと。従って、これらまたは他のカルシウム調節タンパク質は、本明細書中に提供されるような生物学的サンプルに存在する細胞中で発現され得る。
【００７９】
本発明によって意図される特定の実施形態によれば、細胞は、透過化した細胞であり得、これは、原形質膜の選択的透過性を失うことになる様式で処理された細胞を包含する。別の例として、本明細書中に提供されるような特定のカルシウム指示薬分子は、原形質膜を通して容易には透過性でないかもしれず、その結果、これらは、細胞の透過化の後にのみ、細胞質ゾルへと効率的に侵入できるかもしれない。なお別の例として、本発明の方法に従って試験される特定の候補因子は、原形質膜を通過できないかもしれず、その結果、透過化された細胞は、このような因子の潜在的効果について適切な試験細胞を提供する。当業者は、例えば、例示のためであって限定ではないが、界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）、洗剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）、リン脂質、リン脂質結合タンパク質、酵素、ウイルス膜融合タンパク質などの使用を通して；浸透活性因子の使用を通して；化学的架橋因子を使用することによって；エレクトロポレーションなどを含む物理化学的方法によって；または他の透過化方法論によって、細胞を透過化するための方法に精通している。
【００８０】
従って、例えば、細胞は、種々の公知の技術のいずれか（例えば、細胞を溶解して膜を可溶化するために用いられる濃度よりも低い濃度（すなわち、臨界ミセル濃度未満）での、１以上の洗剤（例えば、ジギトニン、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００ＴＭ、ＮＰ−４０ＴＭ、オクチルグルコシドなど）への曝露）を用いて透過化され得る。特定の通常のトランスフェクション試薬（例えば、ＤＯＴＡＰ）もまた用いられ得る。ＡＴＰ（これもまた、通常固定剤（例えば、ホルムアルデヒド）として用いられるよりも低い濃度の化学物質であり得る）をまた用いて、インタクトな細胞を透過化し得る。したがって、本発明の特定の実施形態では、インタクトな細胞を使用することが好適であり得、そして特定の他の実施形態では、透過化細胞の使用が好適であり得る。細胞を透過化するための他の方法としては、例えば、例示であって限定ではないが、界面活性剤、洗剤、リン脂質、リン脂質結合タンパク質、酵素、ウイルス膜融合タンパク質などの使用を通して；特定の細菌毒素（例えば、（α−溶血素））への曝露による；溶血素（例えば、サポニン（これはまた、ジギトニンと同様、非イオン性洗剤である）との接触による；浸透活性因子の使用を通して；化学的架橋因子の使用による；エレクトロポレーションなどを含む物理化学的方法による；または他の透過化方法論（例えば、物理的操作（例えば、エレクトロポレーションなど）を含む）によることが挙げられる。細胞を透過化するための方法に精通した当業者は、特に選択された細胞株に対する因子の毒性、細胞に侵入することが所望される因子の分子の大きさなどを含むがこれらに限定されない因子に基づいて最も適切な透過化因子を決定し得る（例えば、Ｓｃｈｕｌｚ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９２：２８０−３００，１９９０を参照のこと）。
【００８１】
本発明による使用のための候補因子（本明細書中に提供されるような薬学的組成物における使用のための因子を含む）は、本明細書中に提供されるように、ＭＣＡ活性を選択的に損ない得ることが公知であるかまたはそう疑われている物質の任意の組成物であり得る。上記のように、好ましい実施形態によるＭＣＡ活性としては、例えば、Ｌｉら（１９９２  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１７９８３）、ＣｏｘおよびＭａｔｌｉｂ（１９９３  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１４：４０８）ならびに単離されそして部分的に特徴付けられた特定のナトリウムカルシウム交換ポリペプチドに関する他のものに記載されるカルシウム−ナトリウムアンチポーター交換活性が挙げられるが、本発明はそのように限定される必要はない。従って、ＭＣＡ活性はまた部分的に、一時的に増加したミトコンドリア内カルシウム濃度を引き起こす条件（例えば、グルコース刺激）の後にミトコンドリアからのカルシウム流出を媒介する、本明細書中に提供されるような、１以上のさらなるミトコンドリア分子成分に由来し得、その結果、本発明の因子はまた、これらのさらなる成分によって、カルシウム流出を有用に完全にまたは部分的に阻害し得る。本明細書中に提供されるように、ＭＣＡ活性を決定するために用いられ得る種々の方法は当業者に公知であり、そして例示であって限定ではないが、ミトコンドリア内のカルシウム濃度の直接測定（例えば、ミトコンドリアに標的化されたエクオリンまたは他のカルシウム指示薬分子を用いることによる；Ｍａｅｃｈｌｅｒら，１９９７  ＥＭＢＯ  Ｊ．１６：３８３３；Ｋｅｎｎｅｄｙら，１９９６  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：２５２４；およびその中に引用された参考文献）または細胞質ゾルカルシウム指示薬分子（例えば、Ｆｕｒａ−２または他の指示薬）によって報告されるような、ミトコンドリアによって細胞質ゾルへと放出されたカルシウムの間接的決定（例えば、Ｊｕｎｇら，１９９５  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：６７２；Ｌｉら，１９９２  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１７９８３）を包含する。
【００８２】
従って、ＭＣＡ活性は、ミトコンドリア内および／またはミトコンドリア外のカルシウム濃度を、本明細書中で記載されるような細胞ベースのアッセイにおいてカルシウム指示薬分子によって生成されるシグナルを検出可能に変更する様式でモニタリングすることによって決定され得る。カルシウム指示薬分子によって生成されるシグナルの検出可能な変更とは代表的に、複数の時点のうちの少なくとも１つで検出されたシグナルの統計学的に有意な変更（例えば、増加または減少）をいう。細胞ベースのアッセイ以外の他のアッセイ（単離されたミトコンドリアによるカルシウム放出のアッセイもしくは当該分野で公知のような亜ミトコンドリア粒子（ＳＭＰ）によるカルシウム取り込みのアッセイ、または本明細書中に提供されるようなＭＣＡ活性を有することが疑われる少なくとも１つの単離されたポリペプチドを用いて再構築された人工的リポソームもしくは合成小胞などのアッセイを含む）もまた、本発明によって意図される。従って、例えば、ＭＣＡ活性は、任意の方法論に従って検出され得、それによって、膜をまたがったカルシウム移動が決定され得、そして特に、膜の少なくとも一方の側での変更された（例えば、統計学的に有意な様式で増加または減少した）ナトリウム濃度に応じた、膜を介したカルシウム移動が決定され得る。例示であって限定ではないが、ＭＣＡ活性は、カルシウム感受性蛍光色素（例えば、Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｇｒｅｅｎ  ５Ｎ）、カルシウム感受性電極またはカルシウム感受性非蛍光色素（例えば、Ｃｈｉｅｓｉら，１９８８  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３７：４３９９；Ｒｉｚｚｕｔｏら，１９８７  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２４６：２７１；Ｃｈｉｅｓｉら，１９８７  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３６：２７３５；Ｖａｇｈｙら，１９８２  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：６０００；Ｂａｙｓａｌら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２９１：３９３を参照のこと）を用いて観察される、膜を介したカルシウム移動として検出され得る。
【００８３】
好ましくは、候補因子は、可溶性形態で提供される。理論によって束縛されることを望まないが、候補因子は、ミトコンドリア内および／またはミトコンドリア外の遊離のカルシウムレベルを調節する、ミトコンドリアの分子成分（例えば、ＭＣＡ）の活性を（例えば、カルシウムチャネルとの物理的接触によって）直接的に変更し得るか、または（例えば、サンプル中に存在する１以上のさらなる分子成分（例えば、ミトコンドリア分子成分）との相互作用によって（ここで、このようなさらなる成分は、この因子との接触に応じてミトコンドリアのカルシウム調節活性を変更する））間接的にそのようにし得る。代表的に、そして好ましい実施形態では、例えば、高処理能力スクリーニングのために、候補因子は、「ライブラリー」、すなわち化合物、組成物または分子のコレクションとして提供される。このような分子としては代表的に、「低分子」として当該分野で公知であって、かつ１０５ダルトン未満、好ましくは１０４ダルトン未満、そしてさらにより好ましくは１０３ダルトン未満の分子量を有する化合物が挙げられる。
【００８４】
例えば、試験化合物のライブラリーのメンバーは、複数の反応容器の各々の中の複数のサンプルに、本明細書中に提供されるように、高処理能力スクリーニングアレイにおいて投与され得、その各々は、ミトコンドリア（またはミトコンドリアもしくはＳＭＰ、またはＭＣＡで再構成されたリポソームまたは小胞）を含む少なくとも１つの細胞およびカルシウム指示薬分子を、本明細書中に提供されるような条件下で含む。サンプルを、カルシウム流出についての刺激（例えば、グルコース感受性細胞におけるグルコース；Ｎａ＋など）と接触させ、次いで、１以上の時点でカルシウム指示薬分子によって生成される検出可能なシグナルについてアッセイし、そして候補因子の存在下で各サンプルから生成されたシグナルを、その因子の非存在下で生成されたシグナルと比較する。ミトコンドリアの機能に影響（例えば、ＭＣＡ活性の変更）を与え得ると同定された化合物は、治療目的および／または診断目的に有用である。なぜなら、これらは、真性糖尿病の処置および／または検出を可能にするからである。このような化合物はまた、ＭＣＡを含む分子シグナル伝達機構に関する研究、ならびにより大きな特異性を示す、将来のＭＣＡ特異的化合物の発見および開発の精密化に関する研究において有用である。
【００８５】
候補因子はさらに、コンビナトリアルライブラリーのメンバーとして提供され得、これとしては好ましくは、複数の反応容器において行われる複数の所定の化学反応に従って調製された合成因子が挙げられる。例えば、種々の出発化合物は、所定の構成要素が、反応条件の複数の置換および／または組み合わせを追跡可能にうけることを可能にする、固相合成、記録されたランダム混合方法論および記録された反応分割技術のうちの１以上を用いて調製され得る。得られた生成物は、スクリーニングされた後に反復選択および合成手順が行われ得るライブラリー（例えば、ペプチドの合成コンビナトリアルライブラリー（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９１／０８６９４およびＰＣＴ／ＵＳ９１／０４６６６を参照のこと）または本明細書中に提供されるような低分子を含み得る他の組成物（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０８５４２、ＥＰ  ０７７４４６４、Ｕ．Ｓ．５，７９８，０３５、Ｕ．Ｓ．５，７８９，１７２、Ｕ．Ｓ．５，７５１，６２９を参照のこと））を構成する。当業者は、このような多様な各種ライブラリーが、確立された手順に従って調製され得、そして本開示に従って生物学的サンプルを用いて試験され得ることを認識する。
【００８６】
ＭＣＡ機能を選択的に損なう（例えば、統計学的に有意な様式で選択的に減少させる）と同定された因子は好ましくは、本発明の方法において用いられる場合、薬学的組成物の一部である。薬学的組成物は、ミトコンドリアの機能、そして必要に応じて他の成分を変更する１以上の選択される因子に加えて、薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤のうちの少なくとも１つを含む。本明細書中で提供される場合、ＭＣＡ活性を選択的に損なう因子とは、他の正常な細胞性の生理学的カルシウムトランスポーターに有意に影響を与えることなく、ＭＣＡ機能を減少させる因子をいう。従って、例えば、ＭＣＡ活性を選択的に損なう因子は、原形質膜カルシウムチャネルの活性も、上記のミトコンドリアのカルシウムユニポーターの活性も、他のミトコンドリア外カルシウム輸送分子の活性も変更しない。
【００８７】
本明細書中で提供される場合、ＭＣＡ活性を選択的に損なう因子もまた、ＭＣＡリガンドとして有用であり得、この用語は、上記のように、ＭＣＡ活性に寄与するミトコンドリア分子成分と特異的に結合相互作用し得る、本明細書中に提供されるような任意の因子を包含する。特定の実施形態では、従って、本発明は、サンプル中のＭＣＡポリペプチドの存在を決定する方法のためのＭＣＡリガンドの使用を意図し、そして他の特定の実施形態では、本発明は、上記の標準的なアフィニティー方法論に従って生物学的サンプルからＭＣＡポリペプチドを単離するための方法を意図する。
【００８８】
上記のアッセイを用いて同定された因子は、糖尿病ならびにミトコンドリア機能における変更に関連した関連の疾患および障害に罹患しているかまたはそれらを発病する潜在的素因がある患者に対して治効的、治療的、待機的、リハビリテーション的、予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）および／または予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）効果を有し得る。このような疾患は、異常な、過正常な、不充分な、非効率的なまたは有害な、カルシウム調節活性（例えば、カルシウムおよび／または直接的もしくは間接的にカルシウム依存性の生物学的分子および高分子（例えば、タンパク質およびペプチドならびにそれらの誘導体、炭水化物およびオリゴ糖ならびにそれらの誘導体（糖タンパク質および糖脂質のような糖結合体（ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を含む）、脂質、核酸および補因子（イオン、メディエーター、前駆体、異化産物などを含む）の取り込み、放出、活性、隔離、輸送、代謝、異化、合成、保存または処理における欠損）によって特徴付けられ得る。
【００８９】
理論によって束縛されることを望まないが、糖尿病についての好ましい因子は、ミトコンドリアのカルシウム流出を低下または減少させ、それによってミトコンドリア内の酸化的ＡＴＰ合成を促進して、増強されたインスリン分泌を最終的に促進する因子であり得る。このような因子は、真性糖尿病を有するかまたは真性糖尿病の素因を有すると考えられる患者に対して、治効的、治療的、待機的、リハビリテーション的、予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）、予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）または疾患妨害効果を有すると予想される。例えば、カルシウム調節活性に関してミトコンドリアの機能を変更する因子の所望の特性は、ミトコンドリアからのカルシウム流出の阻害であり得る。従って、例えば、ＭＣＡ活性を選択的に損なうことによってカルシウムのミトコンドリア保持を促進する、本発明による因子の同定は、それゆえ、有益な治療因子を提供し得る。同様に、多数の他の疾患モデル、細胞系または他の生物学的状況において（例えば、グルコース刺激に応じた不適切なカルシウム管理（例えば、血液グルコースレベルを基底レベルに戻すに適切なインスリン分泌を支持し得るに充分な量のＡＴＰを合成することができないこと）からのストレスに特に感受性である細胞が同定される系において）、本発明は、ミトコンドリアのカルシウム調節を変更することによって異常なミトコンドリアの機能を変更する因子を同定する機会を提供する。
【００９０】
治療的用途に関して「薬学的に受容可能なキャリア」は、製薬分野で周知であり、そして例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編．１９８５）に記載される。例えば、生理学的ｐＨの、無菌の生理食塩水およびリン酸緩衝化生理食塩水が用いられ得る。保存剤、安定剤、染料および矯味矯臭剤でさえも、薬学的組成物中に提供され得る。例えば、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸およびｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルは、保存剤として添加され得る。同書、１４４９。さらに、抗酸化剤および懸濁化剤もまた用いられ得る。同書。
【００９１】
本明細書中に提供されるような、ＭＣＡ活性を損なう１以上の因子を含む薬学的組成物はまた、組成物が患者に投与されるのを可能にする任意の形態であり得る。例えば、組成物は、固体、液体または気体（エアゾール）の形態であり得る。代表的投与経路としては、経口、局所、非経口（例えば、舌下または頬内）、舌下、直腸、腟内および鼻腔内が挙げられるがこれらに限定されない。用語「非経口」は、本明細書中で使用される場合、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内（ｉｎｔｒａｓｔｅｒｎａｌ）、海綿内、道内（ｉｎｔｒａｍｅａｔａｌ）、尿道内（ｉｎｔｒａｕｒｅｔｈｒａｌ）の注射または注入技術を包含する。薬学的組成物は、その中に含まれる活性成分が、患者への組成物の投与された際に、生体活性があるのを可能にするように処方される。患者へと投与される組成物は、１以上の投薬量単位の形態をとり、ここで、例えば、錠剤は、単一の投薬量形態であり得、そしてエアゾール形態の本発明の１以上の化合物の容器は、複数の投薬量単位を保持し得る。
【００９２】
経口投与は、好ましい実施形態における投薬経路であり、これについては、賦形剤および／または結合剤が存在し得る。例は、スクロース、カオリン、グリセリン、デンプンデキストリン、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースおよびエチルセルロースである。着色剤および／または矯味矯臭剤が存在し得る。コーティングシェルが用いられ得る。
【００９３】
組成物は、液体（例えば、エリキシル剤、シロップ剤、液剤、乳剤または懸濁剤）の形態であり得る。液体は、２つ例を挙げると、経口投与のためまたは注射による送達のためであり得る。経口投与が意図される場合、好ましい組成物は、ＭＣＡ活性を損なう因子のうちの１以上に加えて、甘味剤、保存剤、染料／着色剤および風味相乗剤のうちの１以上を含む。注射によって投与されることが意図される組成物では、界面活性剤、保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定剤および等張剤のうちの１以上が含まれ得る。
【００９４】
本明細書中で用いられる場合、液体の薬学的組成物は、液剤、懸濁剤などの形態であろうと、以下のアジュバントのうちの１以上を含み得る：無菌の希釈剤（例えば、注射用水、生理食塩水溶液（好ましくは生理学的食塩水）、リンゲル溶液、等張性塩化ナトリウム、固定油（例えば、溶媒または懸濁媒体として作用し得る、合成のモノグリセリドまたはジグリセリド）、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の溶媒）；抗菌剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸）；緩衝剤（例えば、アセテート、シトレートまたはホスフェートおよび張度の調整のための薬剤（例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース）。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製の、アンプル、使い捨てシリンジまたは複数用量バイアルに封入され得る。生理学的食塩水は、好ましいアジュバントである。注射可能な薬学的組成物は、好ましくは無菌である。
【００９５】
非経口投与または経口投与のいずれかが意図される液体組成物は、適切な投薬量が得られるような量の、本明細書中に提供されるようなＭＣＡ活性を損なう因子を含むべきである。代表的に、この量は、組成物中の少なくとも０．０１ｗｔ％の因子である。経口投与が意図される場合、この量は、組成物の重量の０．１％と約７０％との間であるように変動し得る。好ましい経口組成物は、約４％と約５０％との間の、ミトコンドリアの機能を変化させる因子を含む。好ましい組成物および調製物は、非経口投薬量単位が０．０１重量％と１重量％との間の活性な化合物を含むように調製される。
【００９６】
薬学的組成物は、局所投与が意図され得、この場合、キャリアは、溶液、乳剤、軟膏またはゲルの基剤を適切に含み得る。基剤は、例えば、以下のうちの１以上を含み得る：ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、蜜蝋、鉱油、希釈剤（例えば、水およびアルコール）ならびに乳化剤および安定剤。粘稠剤は、局所投与のために薬学的組成物中に存在し得る。経皮投与が意図される場合、組成物は、経皮パッチまたはイオン導入デバイスを含み得る。局所処方物は、約０．１％  ｗ／ｖ〜約１０％  ｗ／ｖ（単位容積あたりの重量）という濃度の、ＭＣＡ活性を損なう因子を含み得る。
【００９７】
組成物は、例えば、直腸において融解して薬物を放出する、坐剤の形態での、直腸投与が意図され得る。直腸投与のための組成物は、油性基剤を適切な非刺激賦形剤として含み得る。このような基剤としては、ラノリン、ココアバターおよびポリエチレングリコールが挙げられるがこれらに限定されない。本発明の方法では、本明細書中に記載されるように同定された、ミトコンドリアの機能を変更する因子は、インサート、ビーズ、時限放出処方物、パッチまたは迅速放出処方物の使用を介して投与され得る。
【００９８】
ミトコンドリアの機能を変更する因子の最適な投薬量は、患者の体重および身体的状態；処置されるべき身体状態の重篤度および寿命；活性成分の特定の形態、投与様式および用いられる組成に依存し得ることが当業者に明らかである。有効な治療を提供するに充分な最小投薬量の使用が通常好ましい。患者は一般に、治療的または予防的有効性について、処置または予防される状態について適切なアッセイ（当業者はこのアッセイに精通しており、そして上記のように、代表的に、循環インスリンおよび／またはグルコース濃度が、周知の技術によって受容可能なパラメーターの範囲内に入るか否かの決定を含む）を用いてモニタリングされ得る。適切な用量の大きさは、患者の大きさ、状態および代謝によって変動するが、代表的は、１０ｋｇ〜６０ｋｇの個体について約１０ｍＬ〜約５００ｍＬの範囲にわたる。特定の実施形態によれば、因子は、膜透過性であり得、好ましくは原形質膜ならびに／またはミトコンドリア外膜および／もしくは内膜に透過性であり得ることが理解されるべきである。特定の他の実施形態によれば、本明細書中に開示されるような、ＭＣＡ活性を損なう因子の、化学療法組成物における使用は、この因子の送達を補助する別の化合物に結合したような因子（例えば、モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体、タンパク質またはリポソーム）を含み得る。
【００９９】
本明細書中に引用した全ての刊行物および特許出願は、あたかも各個々の刊行物または特許出願が具体的かつ個々に、参考として援用されることが示されたかのように、本明細書中に参考として援用される。上記の発明は、理解を明快にするという目的で例示および例によっていくらか詳細に記載されたが、本発明の教示を考慮すれば、特定の変更および改変が、添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなく、それらに行われ得ることが当業者に容易に明らかである。
【０１００】
以下の実施例は、本発明を例示し、そして本発明を限定することは意図されない。当業者は、慣用実験、本明細書中に記載される特定の物質および手順に対する多数の等価物を通して、認識するかまたは確認し得る。このような等価物は、本発明の範囲内にあることが意図される。
【０１０１】
（実施例）
（実施例１：構造（Ｉ）の代表的な化合物の合成）
【０１０２】
【化１３】
2005503993.tif 000013
化合物番号１（「化合物１」）を、Ｈｉｒａｉら、米国特許第４，２９７，２８０号および同第４，３４１，７０４号、特に米国特許第第４，２９７，２８０号の実施例３に開示される手順に従って作製した。
【０１０３】
（実施例２：構造（Ｉ）の代表的な化合物の代替的な合成）
【０１０４】
【化１４】
2005503993.tif 000014
（アルコールｉｉ）
０℃に冷却した窒素雰囲気下の、ＴＨＦ（５ｍＬ）中に溶解した出発ケトンｉ（０．３８ｍｍｏｌ）に対して、水素化アルミニウムリチウム（０．３ｍＬ、ジエチルエーテル中の１．０Ｍ溶液）を添加した。ＴＬＣによる分析は、この反応が完了したことを示し、飽和重炭酸ナトリウム（２０ｍＬ）を注意深く添加し、そして得られた溶液を酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、そして減圧下で溶媒を除去してアルコールｉｉを褐色オイルとして得て、このアルコールｉｉを次の工程で直ちに使用した。
【０１０５】
（チオエーテルｉｉｉ）
室温で、ＴＦＡ（４０ｍＬ）中のアルコールｉｉ（２．００ｇ、７．４５ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、メチルチオグリコレート（２．６７ｍＬ、２９．８ｍｍｏｌ、４当量）を添加した。９６時間攪拌した後、ＴＦＡをエバポレートし、そして残渣をジクロロメタンとＮａＯＨ（１０％）水溶液との間で分配した。水相を、ジクロロメタンで逆抽出し、そして合わせた有機物をブラインおよび硫酸ナトリウムで乾燥させ、次いで濾過およびエバポレートした。粗製物質（１．５５ｇ）をシリカ（１２ｇ）に吸着させ、そしてシリカ（１２０ｇ）でのフラッシュクロマトグラフィーによって、石油エーテル：酢酸エチル（５：１、次いで２：１）を用いて精製して、チオールエーテル３ａ（１．２４ｇ、３．４９ｍｍｏｌ、４７％収率）を淡黄色固体として得た。（Ｒｆ（石油エーテル：酢酸エチル（５：１））＝０．４０）。ＭＳ：Ｃ１６Ｈ１５Ｃｌ２ＮＯ２Ｓについての計算値：３５５．０２；実測値：３５６．０（Ｍ＋１）＋。（あるいは、チオエーテル形成は、ＤＣＭ中２〜４当量のＴＦＡを用いてもたらされ得る）。
【０１０６】
（カルボン酸ｉｖ）
室温で、ＴＨＦ（６３ｍＬ）およびメタノール（６３ｍＬ）中のチオエーテルｉｉｉ（１．１２ｇ、３．１５ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、水酸化ナトリウム溶液（１ｍｏｌ／Ｌ、６３ｍＬ、６３ｍｍｏｌ、２０当量）を添加した。１時間にわたって攪拌した後、溶媒をエバポレートし、そして残渣をブラインとジクロロメタンとの間で分配した。水相を、塩酸（１０％）で正確にｐＨ７．０になるように滴定し、次いで、さらなるジクロロメタンを用いて２回、逆抽出した。合わせた有機物を、ブラインおよび硫酸ナトリウムで乾燥し、次いで濾過し、そしてエバポレートして粗製カルボン酸ｉｖ（１．０４ｇ、９２％粗製収率）を白色固体として得た。
【０１０７】
（化合物番号１）
室温で、ＴＨＦ（３０３ｍＬ、約１０ｍｍｏｌ／Ｌの全体濃度を与える）中の粗製カルボン酸ｉｖ（１．０４ｇ、約３．０３ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、ＤＩＥＡ（０．７９１ｍＬ、４．５４ｍｍｏｌ、１．５当量）、ＥＤＣ（０．８７１ｇ、４．５４ｍｍｏｌ、１．５当量）およびＤＭＡＰ（３７ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ、０．１当量）を添加した。２０時間にわたる攪拌の後、ＴＨＦをエバポレートし、次いで、残渣をジクロロメタン中に溶解し、そしてクエン酸（１０％）および重炭酸ナトリウム（飽和水溶液）に対して分配し、ブラインおよび硫酸ナトリウムで乾燥し、次いで濾過し、そしてエバポレートした。粗製物質（２．３８ｇ）をシリカ（７．５ｇ）に吸着させ、そしてシリカ（７５ｇ）でのフラッシュクロマトグラフィーによって、石油エーテル：酢酸エチル（５：１、次いで２：１）を用いて精製して、化合物番号１（７−クロロ−５−（２−クロロフェニル）−１，５−ジヒドロ−４，１−ベンゾチアゼピン−２−オン）（０．４６２ｇ、１．４２ｍｏｌ、２つの工程について４５％収率）を白色固体として得た。（Ｒｆ（石油エーテル：酢酸エチル（２：１）＝０．３０）。ＭＳ：Ｃ１５Ｈ１１Ｃｌ２ＮＯＳについての計算値：３２２．９９；実測値：３２３．８（Ｍ＋１）＋。
【０１０８】
（実施例３：さらなる代表的な化合物の合成）
化合物番号１を出発材料として用いて、以下のさらなる化合物を作製した。
【０１０９】
【化１５】
2005503993.tif 000015
（化合物番号３）
化合物番号１（２００ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）を無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ、１０ｍｌ）中に溶解し、そして窒素雰囲気下で無水ＴＨＦ（５ｍｌ）中のＮａＨ（７５ｍｇ、３．１３ｍｍｏｌ）の懸濁物に添加した。この混合物を、室温で１時間にわたって攪拌し、それに続いて、ｔｅｒｔ−ブチルブロモアセテート（０．４６ｍｌ、３．１３ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を室温でさらに６時間にわたって攪拌した。反応を水（１ｍｌ）でクエンチし、そして溶媒を減圧下で除去した。残渣を酢酸エチル（５０ｍｌ）中に溶解し、そして水（１×５０ｍｌ）およびブライン（１×５０ｍｌ）で洗浄し、そして無水硫酸ナトリウムで乾燥した。硫酸ナトリウムを濾別し、そして溶媒を減圧下で除去して化合物番号３を得た。ＬＣ−ＭＳは、粗製生成物（２４３ｍｇ、８９％）が分析的に純粋であることを示した。（保持時間：８．７８分；Ｃ２１Ｈ２１Ｃｌ２ＮＯ３Ｓについての計算値：４３７．０６、実測値：３８２．０［（Ｍ＋１）−５６（ｔ−ブチル）］。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）□１．５２（ｄ，９Ｈ），３．０８（ｄ，１Ｈ），３．３１（ｄ，１Ｈ），４．１６（ｄ，１Ｈ），４．６０（ｄ，１Ｈ），６．２９（ｓ，１Ｈ），６．６１（ｓ，１Ｈ），７．３２（ｍ，２Ｈ），７．３７（ｍ，１Ｈ），７．４３（ｍ，２Ｈ），７．７８（ｄ，１Ｈ）。
【０１１０】
（化合物番号２）
化合物番号３（２４３ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（１０ｍｌ）に溶解した。チオアニソール（０．２ｍｌ）およびトリフルオロ酢酸（１０ｍｌ）を添加し、そして混合物を室温で３０分間にわたって攪拌した。溶媒をロータリーエバポレーションによって除去し、そして残渣を高減圧下で乾燥して、化合物番号２を定量的収率で得た。ＬＣ−ＭＳは、粗製生成物が分析的に純粋であることを示した［保持時間：７．０５分；Ｃ１７Ｈ１３Ｃｌ２ＮＯ３Ｓについての計算値：３８１．００、実測値３８２．０（Ｍ＋１）］。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）□３．１３（ｄ，１Ｈ），３．３２（ｄ，１Ｈ），４．３６（ｄ，１Ｈ），４．７４（ｄ，１Ｈ），５．２５（ｂ，１Ｈ），６．２７（ｓ，１Ｈ），６．６４（ｓ，１Ｈ），７．３０（ｍ，４Ｈ），７．４０（ｍ，２Ｈ），７．７８（ｄ，１Ｈ）。
【０１１１】
（化合物番号４）
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、１ｍｌ）中の化合物番号２（１０ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ）の溶液に、メトキシエチルアミン（０．１ｍｌ、１．１５ｍｍｏｌ）、ジジソプロピルカルボジイミド（０．０８１ｍｌ、０．５２ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン（５ｍｇ）を添加した。混合物を、６０℃で３日間にわたって攪拌した。反応を水（１．０ｍｌ）でクエンチした。混合物を、ＲＰ−ＨＰＬＣを用い、３０分間の、水中５％〜９５％アセトニトリルの線形勾配で精製した。画分をＬＣ−ＭＳで分析した。化合物番号４を含む画分を合わせて凍結乾燥して、表題化合物（２．７ｍｇ、２４％）を得た。ＬＣ−ＭＳ：保持時間：６．８３分；Ｃ２０Ｈ２０Ｃｌ２Ｎ２Ｏ３Ｓについての計算値：４３８．０６、実測値：４３８．９．１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３／ＣＤ３ＯＤ）□３．１０（ｄ，１Ｈ），３．３２（ｄ，１Ｈ），３．３８（ｓ，３Ｈ），３．５２（ｍ，４Ｈ），４．０２（ｄ，１Ｈ），４．７７（ｄ，１Ｈ），６．０４（ｓ，１Ｈ），６．６１（ｓ，１Ｈ），７．３１（ｍ，１Ｈ），７．３７（ｍ，１Ｈ），７．４２（ｍ，２Ｈ），７．４８（ｄ，２Ｈ），７．７６（ｄ，１Ｈ）。
【０１１２】
（化合物番号５）
ＮＭＰ（５ｍｌ）中の化合物番号２（２１０ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、０．５４ｍｌ、１．８６ｍｍｏｌ）およびイソブチルクロロホルメート（０．２４ｍｌ、１．８６ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を、室温で１時間にわたって攪拌した。２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（１．８ｍｌ、１２．４ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で一晩攪拌した。反応を水（２ｍｌ）でクエンチした。混合物をＲＰ−ＨＰＬＣを用い、３０分の、水中の５％〜９５％アセトニトリルの線形勾配で３つの部分に精製した。画分をＬＣ−ＭＳで分析した。化合物番号５を含有する画分を合わせて凍結乾燥して、表題化合物（６７ｍｇ、２４％）を得た。ＬＣ−ＭＳ、保持時間：５．４８分；Ｃ２３Ｈ２７Ｃｌ２Ｎ３Ｏ４Ｓについての計算値：５１１．１１、実測値：５１２．２．１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）□３．０７（ｄ，１Ｈ），３．３６（ｄ，１Ｈ），３．７１（ｍ，６Ｈ），３．８６（ｍ，６Ｈ），４．０３（ｄ，１Ｈ），４．８２（ｄ，１Ｈ），６．０７（ｓ，１Ｈ），６．５９（ｄ，１Ｈ），７．２８（ｍ，１Ｈ），７．３７（ｍ，１Ｈ），７．４３（ｍ，１Ｈ），７．５４（ｍ，１Ｈ），７．６１（ｍ，１Ｈ），７．７１（ｍ，１Ｈ），７．７５（ｄ，１Ｈ）。
【０１１３】
全てのＬＣ−ＭＳデータを、ＴｈｅｒｍｏＱｕｅｓｔ  ＬＣＱ−ｄｅｃａ  ＬＣ／ＭＳシステム（Ｔｈｅｒｍｏｑｕｅｓｔ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＵＳＡ）で、ＥＳＩ条件下で得た。サンプルを、Ｋｅｙｓｔｏｎｅ  ｂｅｔａｓｉｌ  Ｃ−８カラム（１００ｍｍ×２ｍｍ、粒径５μｍ、孔径１００Å）に、５分間の水中の５％〜９５％アセトニトリルの線形勾配、続いて３分間にわたって水中の９５％アセトニトリルおよび２分間にわたって水中の５％アセトニトリルを、０．３ｍｌ／分の流速で用いて溶出させた。アセトニトリルおよび水の両方とも、０．０１％  ＴＦＡを含んでいた。
【０１１４】
全てのＲＰ−ＨＰＬＣ精製を、Ｋｅｙｓｔｏｎｅ  Ｃ−８カラム（１５０ｍｍ×２０ｍｍ、粒径５μｍ、孔径１００Å）で行った。
【０１１５】
（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂での化合物番号５の固定化）
ＮＨＳ活性化ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂（２０ｍｌ、１６〜２０μｍｏｌ／ｍｌ）を、ポリプロピレンフリットを適合させた５０ｍｌシリンジに配置し、Ｎ−メチルピロリジノン（Ｎ−ｍｅｔｈｙｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏｎｅ）（ＮＭＰ、３×３０ｍｌ）で洗浄し、そして減圧濾過によって乾燥した。化合物番号５（３３ｍｇ、６４．４μｍｏｌ）を、ＮＭＰ（２０ｍｌ）中の１０％  ＤＩＥＡに溶解した。この溶液のアリコート（２００μｌ）を保存して、最初の時点（ｔ＝０）を確立した。この溶液の残りをｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂に添加し、そしてスラリーを室温で穏やかに振盪した。反応の進行をモニタリングするために、この反応混合物の３０μｌのアリコートを種々の時点で採取し、そして化合物番号１（１０μｌの１０ｍＭ溶液）でスパイクして内部標準として役立てた。この混合物を２００μｌになるまで希釈し、そしてＬＣ−ＭＳを用いて分析した。化合物番号５の完全な消失は、２．５時間後に観察された。この樹脂懸濁物を濾過し、この樹脂をＮＭＰ（３×３０ｍｌ）で洗浄し、ＮＭＰ（２０ｍｌ）中の２０％エタノールアミンで一晩、穏やかに振盪した。その後、樹脂をＮＭＰ（３×３０ｍｌ）およびメタノール（３×３０ｍｌ）で洗浄した。次いで、樹脂をＴｒｉｓ緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ８．５、１００ｍｌ）、酢酸ナトリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ３．５、１００ｍｌ）、２０％エタノール水溶液（２００ｍｌ）で洗浄し、そして２０％エタノール水溶液で保存した。
【０１１６】
（実施例４：さらなる代表的な化合物の合成）
実施例２に示される手順によって、以下の表１に列挙される化合物もまた調製した。
【０１１７】
【表１】
2005503993.tif 000016
上記の代表的な化合物についての分析データを以下の表２に表す。
【０１１８】
【表２】
2005503993.tif 000017
（実施例５：ミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーターインヒビターは、インスリン分泌細胞による増強されたインスリン分泌を促進する）
ＩＮＳ−１ラットインスリノーマ細胞は、Ｃｌａｅｓ  Ｗｏｌｌｈｅｉｍ教授，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｒｅ，Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄによって提供され、そして３７℃で、加湿された５％  ＣＯ２環境において、１０％ウシ胎仔血清（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび５０μＭ  β−メルカプトエタノール（全ての試薬は、他に示さない限り、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を補充したＲＰＭＩ細胞培養培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）中で培養された。
【０１１９】
ＩＮＳ−１細胞を、記載されたとおりに補充されたＲＰＭＩ培地を含有する２４ウェルプレートに、０．５×１０６細胞／ウェルで播種し、そして３７℃、５％  ＣＯ２で２日間にわたって培養した。コンフルエンス（０．７×１０６細胞／ウェル）またはその付近の細胞をグルコースを含まないＫＲＨ緩衝液（１３４ｍＭ  ＮａＣｌ、４．７ｍＭ  ＫＣｌ、１．２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１．０ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−Ｐｈ７．４、２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、０．５％  ＢＳＡ）でリンスし、次いで同じ緩衝液中で１時間にわたって３７℃で、加湿５％  ＣＯ２／９５％空気雰囲気中でインキュベートした。次いで、グルコース（基本）を添加しないかまたは８ｍＭグルコースを含有するかのいずれかの新鮮なＫＲＨ緩衝液を、ＭＣＡインヒビター化合物番号１（ＣＧＰ３７１５７；７−クロロ−５−（２−クロロフェニル）−１，５−ジヒドロ−４，１−ベンゾチアゼピン−２（３Ｈ）−オン（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｃｏｏｋｓｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｂａｌｌｗｉｎ，ＭＯ）の非存在下または存在下で添加した；例えば、Ｃｏｘら，１９９３  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１４：４０８；Ｍａｅｃｈｌｅｒら、１９９７  ＥＭＢＯ  Ｊ．１６：３８３３；Ｃｏｘら、１９９３  Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２１：５９５；Ｗｈｉｔｅら，１９９７  Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．４９８：３１；Ｂａｒｏｎら，１９９７  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３４０．２９５を参照のこと；関連化合物については、例えば、Ｃｈｉｅｓｉら，１９８８  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３７：４３９９を参照のこと）。３７℃、５％  ＣＯ２での１５分間、３０分間または６０分間のさらなるインキュベーション後、培養上清を収集した。上清中のインスリン濃度を測定し、そしてインスリン特異的ラジオイムノアッセイキット（ＩＣＮ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を製造業者の指示に従って用いて細胞数に対して正規化した。結果を図２に示す。図２は、化合物番号１に曝露された場合の、ＩＮＳ−１細胞による増強されたグルコース刺激インスリン分泌を例示する。図３は、ラット膵島細胞を、「基底」（５ｍＭ）または超生理学的（８ｍＭ）グルコースの存在下で、そして種々の濃度の化合物番号１の存在下または非存在下で、同様の条件下で培養した場合に得られた結果を示す（図３）。
【０１２０】
（実施例６：ミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーターインヒビターによる膜をまたがるカルシウム輸送の損傷）
ラットの心臓ミトコンドリアを、Ｓｏｒｄａｈｌ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｓｔｕｄｙｉｎｇ  Ｃａｒｄｉａｃ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（１９８４），６５−７４頁）によって本質的に記載されたとおりの改変分画遠心分離プロトコルを用いて単離した。ミトコンドリア膜を経るカルシウム輸送に対する影響を評価する実験を、Ｃａ２＋依存性透過性遷移孔（ＰＴＰ）からの妨害を妨げる、１μＭシクロスポリンＡを補充して２５０ｍＭスクロース、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  Ｐｉ、５ｍＭスクシネート、１μＭロテノンからなる緩衝液中で２５℃で実施した。Ｃａ２＋取り込みおよび放出を、光散乱における変化を介してミトコンドリアの膨潤をモニタリングするためにさらに備え付けられた注文構築チャンバ（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｒａｓｏｔａ，ＦＬ）中でＣａ２＋選択的電極を用いて測定した。あるいは、Ｃａ２＋流出を、Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｇｒｅｅｎ  ５ＮＴＭ指示薬を供給者（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）の推奨に従って用いて蛍光分析によって追跡した。
【０１２１】
スクシネートの存在によって電圧が加えられたミトコンドリア（０．５ｍｇ／ｍｌ）は、培地からの内因性Ｃａ２＋（水供給源からの微量のカルシウム）を蓄積した。さらなるＣａ２＋（２０μＭ）を、カルシウム電極での測定の開始から２〜３分後に反応緩衝液に添加した。このＣａ２＋ローディング工程（Ｃａ２＋蓄積）に続いて、ルテニウムレッド（ＲＲ）を添加し、続いてＣａ２＋／Ｈ＋交換（すなわち、ＭＣＡ以外を含む機構を介する）を反映すると考えられる非限定的な理論に従う、ゆっくりとしたＣａ２＋流出が生じた。その後のＮａ＋添加は、２０μＭ  化合物番号１（化合物１）（ミトコンドリアのＮａ＋／Ｃａ２＋交換体の強力なインヒビター）によって完全に阻害される迅速なＣａ２＋放出を誘導した（図４）。２０μＭ  化合物１での約５０％の阻害が注目された。用いた実験条件下でＰＴＰ活性化（膨潤）は検出されなかった。図５は、Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｇｒｅｅｎ  ５ＮＴＭ（０．１μＭ）を用いて測定したＮａ＋誘導性Ｃ２＋放出および化合物番号５（化合物５）によるその阻害（ＩＣ５０  約３０μＭ）を実証する。化合物番号２（化合物２）による阻害は、１００μＭ以上の濃度で観察された。
【０１２２】
（実施例７：インスリン分泌に対する化合物番号１および他の分泌促進剤の影響）
上記のように、ＭＣＡ活性を選択的に損なう因子および２型ＤＭを処置するために用いられ得る他の因子としては、分泌促進剤とも呼ばれ得る、インスリン分泌を増強する因子が挙げられる。この実施例は、分泌促進剤と同時に投与したＭＣＡインヒビターがインスリン分泌に対する影響を記載する。
【０１２３】
膵島を、標準的な手順に従って単離した。手短に述べると、ラットを屠殺し、膵管にカニューレ挿入し、そして膵臓に、０．１８ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼを含有する７〜８ｍｌのＨａｎｋｓ平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）（全ての試薬は、他に示されない限り、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから）を注入した。次いで、膵臓組織を切り出し、はさみで細切れにし、そして１０ｍｌのＨＢＳＳ／コラゲナーゼ溶液中で２０分間、３７℃でインキュベートした。組織片を、１×Ｋｒｅｂｓ緩衝液（３４．７ｇ／ｌ  ＮａＣｌ、１．７７ｇ／ｌ  ＫＣｌ、０．８１ｇ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、１．４６３ｇ／ｌ  ＭｇＳＯ４、１．８７ｇ／ｌ  ＣａＣｌ２、１０．４ｇ／ｌ  ＮａＨＣＯ３、１．３５ｇ／ｌ  グルコース、１０ｇ／ｌウシ血清アルブミンを含有する５倍水性ストックから希釈した）で２回洗浄し、そして島を、鉗子および解剖顕微鏡を用いて手で収集して、２ｍＭグルコースを含む１×Ｋｒｅｂｓ緩衝液を含有する清浄なチューブに入れた（チューブ１本あたり１０個の島）。３０分間の平衡期間の後、試験化合物を４０分間添加し、その後、培地を、高感度ＥＬＩＳＡキット（Ａｌｐｃｏ，Ｗｉｎｄｈａｍ，ＮＨ）を供給者の指示に従って用いるインスリンの決定のために収集した。試験化合物濃度は、図６に示すとおりであった：グルコース（５．５ｍＭまたは８ｍＭ）；化合物１（実施例１、１００ｎＭ）；トルブタミド（０．１ｍＭ）；α−ケトイソカプロン酸（α−ＫＩＣ、１ｍＭ）。図６はまた、これらの化合物単独、または示した組み合わせでのインスリン分泌に対する影響を示す。
【０１２４】
（実施例８：ＭＣＡの単離のための、固定化した化合物番号５の、親和性リガンドとしての使用）
化合物番号５の固定化を、上記の実施例３に記載した。ウシ心臓ミトコンドリアを、本質的に上記に記載されたとおりに調製し、そしてＩＢ緩衝液（２５０ｍＭスクロース、０．２ｍＭ  Ｋ＋ＥＧＴＡ、１ｍＭコハク酸ナトリウム、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．８）に２５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で懸濁し、そして使用前に−８０℃で保存した。ＮＨＳ活性化ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭビーズに固定化した化合物番号５の２ｍｌのスラリーに、２ｍｌの解凍ウシ心臓ミトコンドリア調製物および５ｍｌの２×カラム緩衝液（標準のプロテアーゼインヒビターカクテルを補充した、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００ＴＭ、２Ｍグリセロール、１ｍＭジチオトレイトール、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、４０ｍＭスクロース、１ｍＭ  ＴＥＡ／ＥＧＴＡおよび２５ｍＭ  ＴＥＡ／ＴＥＳ、ｐＨ７．３）を添加した。蒸留水の添加によって容積を１０ｍｌにし、そして混合物を、穏やかに攪拌しながら４℃で３時間にわたってインキュベートした。ビーズを遠心分離によってペレット化し、そして上清をカラム通過物質画分としてとっておいた（図７、レーン３）。ビーズを２×カラム緩衝液で２回洗浄し、次いで使い捨ての１０ｍｌカラムに充填し、その後、３０ｍｌの２×カラム緩衝液（図７、レーン４）、１００ｍＭ  ＴＥＡ／ＴＥＳを含むように改変した５０ｍｌの２×カラム緩衝液（図７、レーン５）、１０ｍＭ  ＴＰＰを含有する１０ｍｌの１００ｍＭ  ＴＥＡ／ＴＥＳ緩衝液（図７、レーン６）および１Ｍ  ＮａＣｌを含有する５０ｍｌの２×カラム緩衝液（図７、レーン７）で順次洗浄した。次いで、このカラムを、１０ｍＭ  化合物１／４０％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ  ４００／１０％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨ溶出液および５０％（ｖ／ｖ）２×カラム緩衝液を含有する１０ｍｌの溶液中にこのビーズを再懸濁し、この懸濁物をチューブに取り出し、そして４℃で１時間にわたって穏やかに攪拌しながらビーズをインキュベートすることによって溶出した。ビーズをペレット化し、そして上清をとっておいた；次いで、この溶出工程を繰り返した（図７、レーン８）。収集したカラム洗浄液および溶出画分をタンパク質含量について標準化し、そして４％〜１２％ポリアクリルアミド−ＳＤＳ  ＮＵ−ＰＡＧＥＴＭ  Ｔｒｉｓ−グリシンゲルで、ＭＥＳ緩衝化系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を供給者の指示に従って用いて電気泳動した。ゲルをＳｅｅＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ２ＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、そして写真撮影した。結果を図７に示す。図７は、特異的に（化合物１）溶出した物質において、約２００ｋＤａ種、約１００ｋＤａ種および約５０ｋＤａ種（二重）として移動する顕著なバンドを含む（図７、レーン８）。
【０１２５】
ウシ心臓ミトコンドリアの別の調製物から、ＭＣＡのアフィニティー単離を、最初の可溶化において１％  ＣＨＡＰＳで１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を置換したこと、およびカラム洗浄工程に続いて、保持された成分（アフィニティーマトリクスに結合したタンパク質を含む）を５０ｍＭジルチアゼムで溶出したこと以外は、まさに記載したとおりに行った。タンパク質を含有するカラム溶出液を、本質的に、Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｇｒｅｅｎ  ５Ｎを内部蛍光プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）として用いて、Ｌｉら（１９９２  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１７９８３−１７９８９）によって記載されるとおりにプロテオリポソーム（ｐｒｏｔｅｏｌｉｐｏｓｏｍｅ）に組み込み、そしてＭＣＡのカルシウム輸送活性を本質的にＬｉら（１９９２）によって記載されるとおりに測定した。手短には、塩化カルシウム（１００μＭ）を、Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｇｒｅｅｎ  ５Ｎをローディングしたプロテオリポソームの懸濁物に添加して、ナトリウム−カルシウム交換を開始し、ナトリウム−カルシウム交換を、Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｇｒｅｅｎ  ５Ｎを含むカルシウムが小胞に入るときの蛍光の増加として測定した。ＭＣＡインヒビター（化合物番号１（ＣＧＰ３７１５７；７−クロロ−５−（２−クロロフェニル）−１，５−ジヒドロ−４，１−ベンゾチアゼピン−２（３Ｈ）−オン、Ｔｏｃｒｉｓ  Ｃｏｏｋｓｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｂａｌｌｗｉｎ，ＭＯ）の、プロテオリポソーム系におけるナトリウム−カルシウム交換に対する影響を試験して、プロテオリポソームに構築された、アフィニティー単離された成分が、ＭＣＡ活性を保有することを確認した。図８に示すように、ナトリウム−カルシウム交換活性は、化合物番号１の添加によって用量依存性様式で阻害された。図８におけるデータ点は、２つの独立した実験からの、各濃度での平均値をあらわす。
【０１２６】
（実施例９：ミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーター活性の阻害）
ＩＮＳ−１ラットインスリノーマ細胞（実施例３を参照のこと）を、トリプシン処理によって収集し、洗浄し、そして０．００７％ジギトニン、６０μＭ  ＣａＣｌ２および０．０５μＭカルシウムグリーン５Ｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を含有するアッセイ緩衝液（２５０ｍＭスクロース、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２．５ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、５ｍＭスクシネート、ｐＨ７．４）中に１０×１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。５分間のカルシウムローディングインキュベーション後、ルテニウムレッド（１μＭ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加して、ミトコンドリアによるさらなるカルシウム取り込みをブロックした。細胞懸濁物を９６ウェルプレート（１ウェルあたり１００μｌ、１ウェルあたり１×１０６細胞）に分配し、そして候補因子（すなわち、候補のミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーターインヒビター）をいくつかのセットの三連ウェルに１μＭ、１０μＭまたは１００μＭの濃度で添加し、一方、他のセットのウェルには、適切なコントロール条件を提供した（例えば、緩衝液およびビヒクルのコントロール）。ベースラインの蛍光測定を、マルチウェルプレート蛍光分析機（Ｆ−ＭＡＸＴＭ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ；またはＰｏｌａｒＳｔａｒＴＭ，ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）を製造業者の指示に従って用いて行った。次いで、ミトコンドリアからのカルシウム流出を、ＮａＣｌを全てのウェルに添加して２０ｍＭの最終濃度を達成することによって誘導し、そして各ウェルにおける蛍光の変化率を２分間にわたってモニタリングし、そしてプレートリーダーに含まれるソフトウェアを用いて定量した。コントロールウェルと比較して顕著に減少した経時的な蛍光変化を示すウェルは、候補ＭＣＡインヒビターである因子の存在を示し、そしてＩＣ５０値をこれらの化合物について計算した。
【０１２７】
本発明の好ましい化合物は、１００μＭ未満のＩＣ５０値を有する。このために、好ましい化合物としては、化合物番号１０、２１、２３および２４が挙げられる。
【０１２８】
（実施例１０：グルコース刺激インスリン分泌の刺激）
ランゲルハンス膵島を、実施例５に記載されるとおりの標準的なコラゲナーゼ注入および消化の手順を用いて、成体雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットから単離した。島を、５．５ｍＭグルコース、１０％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＣＭＲＬ−１０６６培地中で、５％  ＣＯ２を含有する加湿雰囲気下で、３７℃で１〜２日間にわたって培養した。島を手で拾い、そしてグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）の測定のための調製物において、Ｋｒｅｂｓ  Ｒｉｎｇｅｒ  Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ緩衝液（ＫＲＢ：１３４ｍＭ  ＮａＣｌ、４．７ｍＭ  ＫＣｌ、１．２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ７．４）中で洗浄した。洗浄した島のアリコートを、１６ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．０１％ウシ胎仔血清および５．５ｍＭグルコースを補充した酸素化ＫＲＢ中で、６０分間にわたって３７℃であらかじめインキュベートした。試験すべき化合物（例えば、候補ミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーターインヒビター）を、１０分間にわたって種々の濃度で添加し、その後、さらなるグルコースを、異なる島培養物に添加して、５．５ｍＭ、８ｍＭ、１１ｍＭまたは２０ｍＭの最終グルコース濃度を達成し、そしてインキュベーションをさらに２０分間進行させた。次いで、細胞を馴化した培地サンプルを遠心分離によって収集し、そしてそれらのインスリン含量を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キット（ＣｒｙｓｔａｌＣｈｅｍまたはＡＬＰＣＯラットインスリンＥＬＩＳＡ）をキットの供給者の指示に従って用いて決定した。好ましい化合物での処置の後、島で馴化した培地中で検出されたインスリンの濃度は、８ｍＭグルコースに曝露された島によって馴化された培地中に検出されたインスリン濃度の少なくとも１．５倍であった。１μＭの濃度で、ＣＧＰ３７１５７（７−クロロ−５−（２−クロロフェニル）−１，５−ジヒドロ−４，１−ベンゾチアゼピン−２（３Ｈ）−オン、Ｔｏｃｒｉｓ  Ｃｏｏｋｓｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｂａｌｌｗｉｎ，ＭＯ）は、島のＧＳＩＳを、８ｍＭグルコースで検出されたＧＳＩＳと比較して２２２（±４８）％刺激した；同じ濃度（１μＭ）では、化合物番号２４はＧＳＩＳを１７８％刺激し、そして化合物番号１８はＧＳＩＳを１６５％刺激した。
【０１２９】
上記から、本発明の特定の実施形態を例示の目的のために本明細書中に記載してきたが、種々の改変は、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく行われ得ることが認識される。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲によって以外には限定されない。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、膵臓β細胞におけるグルコース媒介インスリン分泌のモデルを示す。
【図２】
図２は、化合物番号１に曝露されたＩＮＳ−１細胞によるグルコース刺激インスリン分泌の増強を示す。
【図３】
図３は、化合物番号１に曝露されたラット島によるグルコース刺激インスリン分泌の増強を示す。
【図４】
図４は、カルシウム電極を用いて検出された、化合物番号５による、ラットの心臓ミトコンドリアにおけるＭＣＡ活性の阻害を示す。
【図５】
図５は、カルシウムグリーン５Ｎ蛍光によって検出された、化合物番号４による、ミトコンドリアにおけるＭＣＡ活性の阻害を示す。
【図６】
図６は、単独または他の分泌促進剤と組み合わされた化合物番号１に曝露されたラット島によるインスリン分泌を示す。
【図７】
図７は、固定化された化合物番号５を用いた、ミトコンドリアのカルシウム／ナトリウムアンチポーターのアフィニティー単離を示す。レーン１および９、分子量マーカー；レーン２、ウシ心臓ミトコンドリア総タンパク質抽出物；レーン３、化合物番号５のカラムを通過した物質；レーン４、２５ｍＭ  ＴＥＡ／ＴＥＳ洗浄液；レーン５、１００ｍＭ  ＴＥＡ／ＴＥＳ洗浄液；レーン６、１０ｍＭ  ＴＰＰ溶出液；レーン７、１Ｍ  ＮａＣｌ洗浄液；レーン８、１０ｍＭ化合物１／４０％  ＰＥＧ  ４００／１０％  ＥｔＯＨ溶出液。
【図８】
図８は、固定化された化合物番号５で単離したＭＣＡ活性親和性を用いて再構成されたタンパク質リポソーム（ｐｒｏｔｅｏｌｉｐｏｓｏｍｅ）中の、化合物番号１による、ナトリウム−カルシウム交換の阻害を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2005503993.tif 000096
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