(57)【要約】本発明は、引き続く高性能分析用に生体材料から特定の生体分子の選択的な回収および濃縮、目標タンパク質の定量、目標生体分子の変異体（例えば、スプライス変異体、点突然変異および翻訳後修飾）の認識、それらの性質の解明、標的生体分子と相互作用するリガンドの分析と同定、並びに単一の統一化された、経済的な、多重並行処理プラットフォームを用いた大量サンプルのハイ・スループット・スクリーニングのできる統合システムを提供する。該統合システムの好適な実施態様は、アフィニティー・マイクロカラムのような分子トラップと、質量分析計用誘導体化ターゲットと、複数サンプル注入可能な質量分析計並びに処理／データ解析相互作用データベースを備えた自動装置とを含む。本発明はまた、個々の要素を使用するための方法とプロセス並びに生物学的適用における統合システムを含む。さらに本発明の好ましい実施態様では、複数の別々のデバイスおよび／またはサンプル調製および／または処理のためのハイ・スループット分析を達成する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
定性的かつ定量的な生体分子分析のためのハイ・スループット統合システムであって、
ａ）空間的に配列された複数のアフィニティー・マイクロカラムを取り付けたロボティック・プラットフォームと、
ｂ）アフィニティー・マイクロカラムと同じ空間的配列に対応する空間的配列を有する質量分析計のターゲットと、
ｃ）前記空間的配列を有するターゲットを受け容れられる質量分析計と、を含むシステム。
【請求項２】
前記空間的配列が、４から１，５３６の要素を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記ロボティック・プラットフォームが、複数の処理ステージをさらに含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
前記アフィニティー・マイクロカラムが、生体材料中の特定の生体分子を受容すると、前記特定の生体分子がアフィニティー相互作用により回収される、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
前記質量分析計のターゲットが酵素活性を有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
前記質量分析計が、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型質量分析計である、請求項１に記載のシステム。
【請求項７】
前記複数の処理ステージのうちの少なくとも１つが、アフィニティー・マイクロカラムを用いて、生体材料中に存在する特定の生体分子を選択的に単離するためのものである、請求項３に記載のシステム。
【請求項８】
前記複数の処理ステージのうちの少なくとも１つが、非特異的に保持された化合物を除去するために前記アフィニティー・マイクロカラムをリンスするためのものである、請求項３に記載のシステム。
【請求項９】
前記複数の処理ステージのうちの少なくとも１つが、選択的に保持された生体分子を質量分析計のターゲット上に置くためのものである、請求項３に記載のシステム。
【請求項１０】
生体材料のサンプルが複数種類存在する場合、空間的に配列された複数のアフィニティー・マイクロカラムと、該アフィニティー・マイクロカラムと同じ空間的配列に対応する空間的配列を有する質量分析計のターゲットとを用いて実質的に同時にかつ並行して前記サンプルが処理される、請求項１に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００１年１月１７日に出願された係属仮出願６０／２６２，５３０および６０／２６２，８５２双方の一部継続である。
発明の分野
本発明は、プロテオミクスの分野に関連する。より具体的には、本発明は生体材料から回収された生体分子の迅速な同定、並びに特性評価のための方法および装置である。さらに、本発明は、多数の異種サンプルを同時に処理する能力（ハイ・スループット分析）を含む。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ヒトゲノムの塩基配列決定法における最近の進歩は、生物科学をいくつかの新規で興味深い研究活動舞台に駆り立てた。これら活動舞台の１つであるプロテオミクスは、世界的に協調して行われる生物学研究の次なる波であると広く考えられている。プロテオミクスは、遺伝子産物（タンパク質）、それらの多様な形態と相互作用のパートナー、およびそれらの調節と処理の動態（時間）の研究である。つまり、プロテオミクスは、自然環境で機能するタンパク質研究であり、完全ではないとしても、それらの生物学的機能についての理解をさらに深めることを全体的意図としているものである。このような研究は、遺伝的障害の背後にある機構または薬物介在療法の影響を理解するのに必須であると同時に、臨床分析および診断分析にとって根本的な基礎となる可能性がある。
【０００３】
タンパク質の分析には幾つか固有の難題がある。何よりも先ず、分析に十分関連すると考えられるいずれのタンパク質も、ｉｎ  ｖｉｖｏの複雑な生物学的環境または生物学的材料に存在する。これらの生物学的材料の複雑性が、一つの難題、すなわち、興味のあるタンパク質は多くの場合比較的低濃度で材料中に存在し、他の大量の生体分子、例えばタンパク質、核酸、炭水化物、脂質などによってどうしても隠されてしまう、という問題を提供する。この根本的な問題を解決するために、現在プロテオミクスに用いられている技術は、比較的旧式の技術である二次元（２Ｄ）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、すなわち、多数のタンパク質を、等電点と分子サイズの関数として二次元的にゲル媒体を用いて同時に移動させる技術によって、まず全生体材料を分画することのみである。予測できる挙動で移動させるために、タンパク質をまず還元して変性させるが、この工程は、タンパク質の全体構造を破壊し、それらの機能を喪失させる。
【０００４】
現状では、最新のプロテオミクス技術も、２Ｄ−ＰＡＧＥを用いて分離されたタンパク質の同定を伴う。この方法では、分離されたタンパク質を含有するゲルスポットを、ゲル媒体から切り出し、高特異性酵素（普通はトリプシン）で処理してタンパク質をフラグメントにする。次に得られたフラグメントは、エレクトロスプレイ・イオン化法（ＥＳＩ）或いはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（matrix-assisted laser desorption/ionizationtime-of-flight）型質量分析計（ＭＳ）を用いた高精度質量分析に供される。フラグメントの絶対分子量の形で得られたデータ並びに酵素の特異性についての知識が、フラグメントの経験的データに関連する情報のゲノムまたはタンパク質データベースのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ検索に用いられる。過去７年に亘って改良された分析法および検索プロトコルによれば、ゲル分離タンパク質がある遺伝子に由来するものであると同定するためには、高精度に質量が測定された２、３のタンパク質分解フラグメントだけしか必要ないという点まで発展した。
【０００５】
しかしながら、興味の対象のタンパク質を産生する遺伝子の同定は、タンパク質の構造／機能を決定するずっと多くのプロセス全体の中の第１工程にすぎない。発生する多数の問題に対して、２Ｄ−ＰＡＧＥ／ＭＳ法では答えることができない。１つの主要な問題は、タンパク質の一次構造と関係する。通常行われる同定プロセスの中では、タンパク質の配列の多くて５０パーセントは調べられるが、少なくともタンパク質の５０パーセントが分析されないままである。どのタンパク質にも、潜在的に多数のスプライス変異体（splice variants）、点突然変異および翻訳後修飾が存在するとすれば、タンパク質内に存在し、その多くが疾患状態の原因となる多数の変異体および修飾が、結局同定プロセス中で見逃されることになる。このように、タンパク質は、（正常な）機能を有する変異体を（疾患の原因となる）異常な機能を有する変異体から識別するのに必要とされる十分な細部構造が見られていない。
【０００６】
さらに、現在の同定プロセスは、タンパク質の定量法を何ら提供しない。疾患状態の多くに関して、特定タンパク質および／またはそれらの変異体濃度の増加若しくは減少は、原因となったり、指標とされたりするため、タンパク質の定量は、プロテオミクスの極めて重要な構成要素である。現在、ゲルからのタンパク質定量は、もともと比較的変動しやすい染色法を用いて行われているため、不正確である。染色法は、２Ｄ−ＰＡＧＥで得られたタンパク質フラグメントの質量分析による定量に、ＩＣＡＴ（isotope-coded affinity tags）を組み合わせる方法によって代替できる。しかしながら、該ＩＣＡＴ法は、前記タンパク質変異体に対しては依然として現実性に乏しい。というのは、タンパク質変異体は、質量の変化したタンパク質フラグメントを生じ、それらは定量プロセスから除外されるからである。同様に、ＥＬＩＳＡ（enzyme-linkedimmunosorbent assay）およびＲＩＡ（radioimmunoassay）などの他の方法も、変異体が存在する場合に特定のタンパク質を定量するのは同じように複雑である。変異体から目標タンパク質を分離する能力を欠くことから、これらの方法は、本質的に全てのタンパク質変異体を単一の化合物としてモニターすることとなる。疾患は、全ての変異体の累積濃度ではなくて、単一変異体のみの濃度上昇により引き起こされ／兆候となる可能性があるので、しばしば誤りを招く方法となる。
【０００７】
さらに、２Ｄ−ＰＡＧＥ／ＭＳ法は、タンパク質−リガンド（例えば、他のタンパク質、核酸または生体関連化合物）相互作用の探索を何ら提供しない。タンパク質分離の際、変性する条件を用いるので、全てのタンパク質−リガンド相互作用は撹乱され、同定方法を用いた研究の対象範囲外となる。別の他の方法は、タンパク質−リガンド相互作用の分析に特に焦点を合わせている。これらの中で最も頻繁に用いられるものには、酵母２ハイブリッド法（Ｙ２Ｈ）およびファージディスプレイ法があり、それぞれ、生体分子相互作用を示すレポータータンパク質を産生する遺伝子発現を誘導するｉｎ  ｖｉｖｏの分子認識現象を用いるか、または高いアフィニティーを有する結合パートナーを選択的に増幅する。他の機械的方法は、検出方法として普遍的な物性またはタグ（例えば、表面プラズモン共鳴または蛍光）を利用するバイオセンサに依存する。これらの方法には、一般に時間がかかり、生体材料から引き出された相互作用するパートナーが間接的に検出されて、結合パートナーについての特定情報または同定情報をもたらさないという２つの主たる限界がある。
【０００８】
最後に、前記方法のいずれも、実験材料の大きな母集団における特定のタンパク質、それらの変異体、およびそれらの相互作用パートナーを大量かつハイ・スループットに分析するのに好ましくない。前記の全ての方法は、単一サンプルに実施するのに、数時間（２Ｄ−ＰＡＧＥ）から数週間（Ｙ２Ｈ）必要とする。この様に、時間と費用を費やすため、プロテオミクス、臨床および診断への応用に必要な数百から数千のサンプル（数百から数千の個体由来）への適用は不可能となる。
【０００９】
現在までに、前記全ての理由のためタンパク質のハイ・スループット分析が可能な普遍的統合システムは存在してない。したがって、天然の環境に存在するネイティブなタンパク質を分析できる新しく新規な技術が早急に必要とされる。これらの技術は以下の項目、すなわち１）続く高速分析のために、生体材料から特定のタンパク質を選択的に回収し、濃縮する能力、２）標的タンパク質を定量する能力、３）標的タンパク質の変異体（例えば、スプライス変異体、点突然変異および翻訳後修飾）を認識する能力およびそれらの性質を解明する能力、４）標的タンパク質と相互作用するリガンドを分析し、同定する能力、５）単一の経済的なプラットフォームを用いて大量サンプルのハイ・スループット・スクリーニングを行うことができる能力、を包含する。
【００１０】
個々の公表物または特許出願が具体的かつ個々に参照のために組み入れられているのと同程度に、全ての公表物および特許出願が、ここに参照のために組み入れられている。本発明は、明快さと理解を目的として図面および実施例によりある程度詳細に説明されたが、ある一定の変更並びに修飾が、添付の特許請求の範囲内で実施可能であることは明らかである。
発明の概要
本発明の目的は、後に続く高性能分析のために行われる生体材料からの特定の生体分子の選択的な回収および濃縮、標的タンパク質の定量、標的生体分子の変異体（例えば、スプライス変異体、点突然変異および翻訳後修飾）の認識、それらの性質解明、標的生体分子と相互作用するリガンドの分析と同定、単一で統一され経済的で多重かつ並列処理プラットフォームを用いた大量サンプルのハイ・スループット・スクリーニングのできる統合システムを提供することである。
【００１１】
本発明の他の実施態様は、アフィニティー・マイクロカラムのような分子トラップと、誘導体化された質量分析計ターゲットと、複数サンプルの注入が可能な質量分析計並びにハイ・スループット分析を達成する処理／データ解析相互作用データベースソフトウェアを備えた自動装置を提供することである。
【００１２】
本発明の他の目的は、分子トラップ、誘導体化ターゲットなどの統合システム用の個々の要素を提供することである。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、連続調製並びに大量サンプルを同時に並列処理するために自動装置を用いる本発明のハイ・スループット実施態様を提供することである。
【００１４】
本発明のさらなる他の目的は、生物学的適用において個々の要素および統合システムを利用する方法およびプロセスを提供することである。
【００１５】
本発明のよりさらなる他の目的は、ハイ・スループット分析を使う統合システムを用いた分析対象物の点突然変異および変異体の同定装置および同定方法を提供することである。
【００１６】
本発明の特徴とみなされる新規な面は、特に添付の請求の範囲に記載される。しかしながら、発明自体は、その構造および操作の双方に関してさらなる目的とその利点と共に添付の図面と併せて読むと本発明の好適な実施態様について以下の説明から最良に理解されるであろう。特記しないかぎり、明細書および請求の範囲中の単語および語句は、通常の意味および慣用的意味を通常の適用可能な業界の通常の当業者に与えるように意図している。他の意味が意図される場合、本明細書は、特別な意味が単語または語句に適用されていることを具体的に述べる。同様に、「好適な実施態様の説明」中の単語「機能（ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」または「手段（ｍｅａｎｓ）」の使用は、発明を定義する米国特許法、第１１２条第６節の特記条項の実施を望む意図はない。逆に、米国特許法、第１１２条第６節の条項が、発明を定義するために実施が求められている場合、請求の範囲は、語句「ための手段（ｍｅａｎｓ  ｆｏｒ）」または「ための工程（ｓｔｅｐ  ｆｏｒ）」および機能を具体的に記載して、このような語句において、その機能を支持するいかなる構造、物質または行為をも列挙しない。請求の範囲が、機能を実施する「のための手段」または「ための工程」を列挙する場合でも、工程の手段を支持する如何なる構造、物質または行為もまた列挙するならば、その意図は、米国特許法、第１１２条第６節の条項を実施することではない。さらに、米国特許法、第１１２条第６節の条項が、発明を定義するために実施されるとしても、その発明は、好適な実施態様に記載される特定の構造、物質または行為にのみ限定されず、請求された機能を実施するために、いずれかの、また全ての知られた、または後に開発された等価構造、物質または行為に加え、さらに請求された機能を実施するいずれかの、ならびに全ての構造、物質または行為を含むことが意図される。
好適な実施態様の説明
後に続く高速分析用のために行う、生体材料からの特定の生体分子の選択的な回収および濃縮、目標タンパク質の定量、目標生体分子の変異体（例えば、スプライス変異体、点突然変異および翻訳後修飾）の認識、それらの性質の解明、標的生体分子と相互作用するリガンドの分析と同定、並びに単一で統一され経済的で多重かつ並行処理プラットフォームを用いた大量サンプルの高速スクリーニングが可能な統合システムを提供する。
【００１７】
該統合システムの好適な実施態様は、アフィニティー・マイクロカラムのような分子トラップと、処理ステーションと、非好適な実施態様では削除されることもある誘導体化された質量分析計ターゲット・アレイとを含み、該統合システムは、単独または複数のサンプルを注入でき、処理／データ分析相互作用のデータベースを用いることができる質量分析計により作業する。本発明はまた、生物学的適用において個々の要素および統合システムを使用する方法およびプロセスを含む。さらに、本発明の好適な実施態様は、ハイ・スループット分析を達成するために、複数の個々の装置および／またはサンプル調製および／または処理を提供する。
【００１８】
本発明のシステムの主要な要素は、生体サンプルにおいて周囲の生体材料から特定の分析対象物を単離または回収することである。これは、分子トラップを用いて達成される。分子トラップの好適な実施態様における回収プロセスでは、生物学的サンプルを、広い表面積を有する表面に親和性レセプターを有する装置を通すよう反復的に流すことが必要となる。該親和性レセプターは、特定の分析対象物を捕捉するように選択される。ハイ・スループットの実施態様において、これらの分子トラップは、小型カラムであるアフィニティー・マイクロカラム内に形成され、それにより多数の分子トラップを並列に配置させて最小物理量を取り込む。並列配置した実施態様の好ましい形態においては、多数の分子トラップは、多岐管（manifold）や材料のブロックのような単位成分内に含まれる。このような形態では、多岐管は多数のマイクロチャネルを有し、この中に分子トラップが収容されている。
【００１９】
分子トラッププロセスは、分子トラップ上に配置される親和性レセプターと、生体サンプルに含まれる分析対象物とに、十分な物理的接触をさせることにより達成される。親和性レセプターは、親和性レセプターと特定の分析対象物との間の親和性相互作用を用いて特定の分析対象物を捕捉、または単離する。特定の分析対象物を捕捉後、残りの化合物または捕捉されなかった化合物を、分子トラップから遊離させるために一連のリンスを用いて洗浄する。捕捉およびリンスプロセスは、特定の分析対象物を濃縮し、アフィニティー・マイクロカラムのデッドボリュームを少なくする。
【００２０】
特定の分析対象物が捕捉された後、それらを、アフィニティー相互作用を妨害できる少量の試薬を用いて分子トラップから溶出させる。次いで溶出された特定分析対象物を、質量分析のために、またはさらなる処理、例えば、後で行う質量分析の準備のために行われる、生反応性ＭＳターゲット・アレイを利用した酵素的／化学的修飾などの処理ために、質量分析のターゲットプラットフォームに直接スタンプされる。次に、特定の分析対象物または高精度で検出された修飾フラグメントに対して、自動化質量分析が行われる。サンプル間の相違または標準との相違を認識できるソフトウェアが、データベース基づく多数のサンプルの分析および構成を補助するために用いられる。また、溶出された特定の分析対象物を質量分析のターゲット上にスタンプする替りに、エレクトロスプレイ質量分析計の針などのサンプル導入装置の構成要素として分子トラップを用いることにより、特定の分析対象物をエレクトロスプレ・イオン化質量分析計に直接溶出できる。
【００２１】
本発明のハイ・スループットの実施態様は、多数のサンプルの連続調製および並行処理を行う自動装置（ロボティックス）を用いる。特定の分析対象物を捕捉するためのマイクロカラムの使用により、上記の配列形式が可能となる。これは、マイクロカラムアレイの占める物理量および／または面積を最少にすることから、このようなハイ・スループットに理想的である。適切に配列された自動装置を備えたアフィニティー・マイクロカラムの使用は、統合されたプラットフォーム上で開始から終了まで複数サンプルを同時に調製して処理でき、それによってサンプルのハイ・スループットを可能にする。具体的には、捕捉、分離および溶出の全工程は、自動装置システムまたはシステムにより管理されたマイクロカラム内で実施される。これは、生体液から特定の分析対象物を分離するために機械的／物理的手段（例えば、遠心分離、磁気または真空分離）を用い、緩衝剤でリンスする他のアフィニティー捕捉方法（例えば、ビーズ媒体を用いる）とは対照的である。多くの場合、この物理的分離は、単独に実施される必要があり、しばしば配列の秩序を撹乱すると共に並行処理配列を撹乱させる。これらの機械的／物理的手段は、マイクロカラムを使用する場合には必要ないことから、並行処理配列が撹乱されることなく使用でき、順序付けられた空間的配列は、全プロセスの間無傷のままである。最も都合のよいことには、複数の調製／分析は、通常使用される空間的アレイ、例えば、４−、８−、１６−、４８−、９６−、３８４または１５３６ウェルのマイクロタイタープレートのフォーマットに適合させられた自動装置を用いて連続的かつ並行して実施されることである。
個々の構成要素
サンプルの修飾／調製
下記の実施態様の全てにおいて、生体材料または標的分析対象物は、アフィニティー反応前かアフィニティー捕捉後のいずれかで、ただしターゲットまたはターゲット・アレイ上への溶出前に修飾または調製されることが望ましい。修飾または調製の例としては、還元、ラベルまたはタグの付加、ｉｎ  ｓｉｔｕ消化、表面上での部分的消化／修飾、ｐＨ調整などが挙げられるが、これらに限定されない。
分子トラップ
本発明の１実施態様における分子トラップは、親和性レセプターを結合させたマイクロカラム装置である。分子トラップを、アミノシラン化試薬などでの処理により化学的に修飾してから、多くの誘導化スキームのいずれか１つを用いて親和性レセプター結合を活性化させる。アフィニティー・マイクロカラムの使用は、他の手段によりアフィニティー捕捉を実施する場合に伴う不利な点を克服する。具体的には、ここに記載されているように、アフィニティー・マイクロカラムは、この１０年間で入手できるようになった質量分析計に合わせて調整する。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦおよびＥＳＩ質量分析計が出る前は、ポリペプチド類の質量分析（実施できる場合）は、ナノモル単位の分析対象物量を必要とし、アフィニティー捕捉により単離された場合、結合レセプターを含有する試薬をミリリットル単位必要とし、生体材料をリットル単位必要とすることが多かった。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦおよびＥＳＩ質量分析計は低感度のものからｆｅｍｔｏｍｏｌｅ以上の感度のものまであり、装置を含む全アフィニティー単離の規模は、数段階に縮小できる。したがって、ここに記載されたアフィニティー・マイクロカラムは、最近の可能になった質量分析技術の感度特性を十分に利用するために考案され、製造されている。
【００２２】
本発明のさらなる実施態様は、図６に例示するように、与えられた生体材料に特異的に好適な種々のアフィニティー・マイクロカラムを提供することである。全ての生体材料は、生体分子の組成と条件に関して全く同一ではないので、アフィニティー試薬の誘導スキームは、各生体材料中でそれぞれ異なった挙動を示す。例えば、血漿中に存在する特定のタンパク質分析対象物を回収するように適合させたアフィニティー試薬は、同じ分析対象物が異なる生体材料中に存在する場合には理想的な挙動を示さない。さらに、各生体材料により異なる緩衝剤組成および条件を用いると、目的の分析対象物と共に多数の低分子有機化合物が保持され続いて溶出されることがあり、該有機化合物は質量分析プロセスを阻止しうる。したがって、目的の分析物に対する特異性が高く、分析対象物の特性評価を妨げる可能性のある他の大分子に対する非特異的結合性が低いだけでなく、質量分析プロセス、例えばＭＡＬＤＩまたはＥＳＩの基礎となる物理現象を妨害する可能性のある低分子化合物の保持を最小にもするような、各生体液についてのアフィニティー・マイクロカラムを構築することが必要となる。
ターゲット
分析対象物は、各生体材料から回収後、本質的に微小溶出され、アフィニティー・マイクロカラムから、質量分析計に挿入されるターゲットまたはターゲット・アレイ上へ直接「スタンプ」される。この様式では、例えばタイタープレートなどの空間的アレイは、最初の複数サンプル容器からアフィニティー捕捉工程と洗浄工程、質量分析計のターゲット上に至るまでの間を通してそのまま維持される。
【００２３】
さらに本発明は、アフィニティー・マイクロカラムを用いて回収されたタンパク質の自動調製および分析において、質量分析計に特別に適合させたターゲットを利用することを包含する。自動装置をハイ・スループットに組み入れるには、核サンプル間において並行プロセスの再現性が良く、且つ該並行プロセスにおいて、質量分析計のターゲット上にサンプルを堆積する位置を制御できることが必須である。これらの点が、自動プロセスに組み入れられていることを確実にするため、分析対象物の堆積領域を制御できるよう、質量分析計のターゲット上に自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）を作製する。例えば、性質が疎水性または親水性であるチオール化合物またはメルカプタン化合物を使用して、金メッキしたターゲット上に対照領域を作製する。疎水性ＳＡＭで親水性ＳＡＭを囲むことにより、ターゲット上の明確に限定された領域に水溶性サンプル（アフィニティー・マイクロカラムより）を閉じ込めるための明確な境界が造られる。この様に、並行自動装置により規定された空間的配列は、複数のアフィニティー・マイクロカラムから、自動装置による処理中ずっと用いられる空間的配列と同一にパターン化された質量分析計のターゲット上へ、（自動装置を用いて）同時に複数サンプルを溶出することにより維持できる。
【００２４】
他の応用において、質量分析計のターゲットはさらに、分析対象物を処理できる反応性表面を含むように作られている。質量分析を用いる生体分子を研究する場合、分析対象物の構造に関するさらなる詳細を得るためには、しばしば化学および／または酵素学で解明する必要がある。同一試料中の分析対象物、分析対象物の変異体および修飾体を見分ける目的で、質量分析と組み合わせて特異的化学修飾または酵素化学修飾を用いる分析が特に重要である。さらに、目的の分析対象物は分析できるように残しながら、妨害物を除去するように設計された除去用相互作用を用いて溶液から妨害の可能性のある種類のものを除去することでほとんど精製する質量分析のための前処理には大きな価値があることが多い。これらの操作を実施する最も効率的な手段は、特別な処理機能に関して試薬または酵素で誘導化された質量分析計のターゲットを用いることである。
【００２５】
好適な実施態様において、ターゲットまたはターゲット・アレイは、フォトレジスト技術を用いて、まず指定ターゲット領域の周囲にチャネルをエッチングすることにより作製される。従来の電気メッキ技術またはプラズマ堆積などによって、エッチング化基板に金膜を堆積させる。この金膜は、エッチングされた輪郭に自然に沿って形成される。基板によっては、表面の金膜を堆積する際、１層以上の中間層、例えばニッケル中間層などのような層が必要とされる。次に、修飾基板表面に対し化学結合を形成または吸着できるジチオビス（スクシンイミジルプロプリオネート）（ＤＳＰ）またはその誘導体などの活性化されたまたは活性化可能な試薬を、ターゲット領域に、ターゲット領域以外には結合しないように、結合する。輸送溶媒はいずれも蒸発させるかまたは除去して、活性化されたまたは活性化可能な試薬の乾燥自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）を生成する。保護層として、目的のＳＡＭ上に適当な溶媒に溶解されたデキストランなどを堆積させる。その溶媒がＤＭＳＯの場合、該ＤＭＳＯはターゲットを真空中に置くことにより除去される。次いで、ターゲット（アレイ）は、保護層を溶かさない溶媒中に溶解されたオクタデシルメルカプタンなどの疎水性試薬で被覆される。デキストランが保護層である場合、イソプロパノールが疎水性試薬を溶解するために使用できる。ターゲットをリンスすると、非結合の疎水性試薬はいずれも除去される。活性化試薬がターゲットの領域に結合されている例においては、単にＤＭＳＯでリンスすることなどにより保護層を除去することによって、該活性化試薬を使用できるようになり、これはまた保護層中または保護層上に存在するすべての疎水性試薬をも除去することになる。活性化可能な試薬がターゲット領域に結合される例においては、保護層を除去してから活性化試薬を用いて活性化するか、または活性化試薬を輸送する溶媒を保護層の溶解にも用いることで直接活性化するかのいずれかによって、該試薬を活性化して使用できる。第２の場合において、溶解された保護層は、続くリンスにより除去される。最後に、ポリマー、タンパク質、ペプチド、または酵素などの生体試薬または生物学的試薬が、ターゲット領域の表面に結合する。生体試薬の結合は、ターゲット領域に既に結合した活性化試薬により促進される。保護層により被覆された活性化試薬がある場合、保護層を除去してからターゲット領域に生体試薬を添加するか、または生体試薬を輸送させる溶媒を保護層の溶解にも用いて直接結合させるかのいずれかにより、生体試薬を表面に添加できる。
【００２６】
上記ターゲットまたはターゲット・アレイの製造プロセスの利点は、保護層で一度被覆されたターゲットはより長い期間保存でき、消費者の裁量で使用できることである。該ターゲット・アレイの他の利点は、分析対象物処理並びに不純物の取扱いのための画定された反応性表面を提供することである。
【００２７】
さらに他の同様な実施態様においては、一または複数の質量分析計のターゲットの表面を、ＭＡＬＤＩの実施に使用されるマトリックスの結晶形成を促進してサンプル調製の質を高めることが判った試薬で誘導体化する。このようなマトリックス結晶の”シーディング（ｓｅｅｄｉｎｇ）”は、全サンプル調製プロセスの自動化において非常に貴重なことが判り、ターゲットの全領域に亘り再現性の高いサンプルの生産を可能にする。
ハイ・スループット装置
ここに記載された個々の構成要素は、生体材料から回収された分析対象物のハイ・スループット分析を可能にする単一の統合システムを、一緒になって形成する。基礎的分析は、一次構造、すなわち分析物の配列を立証することから始める。分子量の単独高精度決定が、分析対象物の一次構造を立証するのに十分であることが多い。分析対象物の一次構造を立証するのにより高い精度が要求される場合は、化学的／酵素的に活性な質量分析計のターゲットを用いて、分析対象物（回収後）の質量マップを作製すると便利である。このようなマッピング手法中、分析物は、高特異性切断試薬を用いて消化されて、質量分析法を用いて分析された際に多数のシグナルが生じる。群として見た場合、これらのシグナルは、単独質量測定よりもより大きな精度と信頼性で一次構造を立証できる。また、これらのデータは、正常な分析対象物として予想されるものとは大きく異なる被検変異体、たとえばスプライス変異体などをデータベースから検索するのに用いることができる。
【００２８】
同様な実施態様において、分析対象物の他の変異体は、変異の性質、位置および起源を明瞭にするためにマッピングされる。単一サンプルに存在する分析対象物と変異体は、マイクロカラムに局在化した通常のアフィニティー試薬を用いて生体材料から共に抽出され、同時に質量分析計の活性化されたターゲットまたはターゲット・アレイによるマッピングに供される。被検変異体の多くは、正常な分析対象物と高い相同性を共有することから、マッピングシグナルの多くは、分析対象物と変異体の間で共通となる。しかしながら、異常または質量シフトしたシグナルもマッピングデータ内に存在する。これらの異なるデータを用いて、切断試薬の知識と正常分析物の一次構造、三次構造、四級構造の情報とを組み合わせて、変異位置を解明することが可能である。さらに、分析物のコンポーネント残基間の質量差の知識（例えば、タンパク質中のアミノ酸、またはＤＮＡ／ＲＮＡ中の核酸間の質量差）と質量シフトの正確な決定を用いて、変異体を生成した転移を決定することが可能である。このような分析は、例えば、タンパク質中に存在する点突然変異または核酸中に存在する多型現象を解明する上で大きな価値がある。同様に、可能性のある修飾基（例えば、グリカン、リン酸塩、メチル、ホルミルなど）の分子量の知識を、分析対象物の化学修飾の部位および性質を解明するためにマッピングデータと組み合わせて使用できる。最後に、特異的修飾を扱うためにデザインされた反応性ターゲットは、統合システムにおいて、分析対象物から該修飾部分を切断し、質量スペクトル中のその後の質量シフトを見ることにより修飾部分の量（数）を決定するために使用できる。
【００２９】
他の実施態様において、本発明は、生体材料中に存在する特定分析対象物のハイ・スループット定量に用いられる。このプロセスを用いて、分析対象物と内部照合（分析対象物様種）を、生体材料から回収し、質量分析を通して処理する。同一の並行処理操作において、標準サンプルを分析して、分析対象物シグナルを生体材料中に存在する分析対象物量と同等視して検量線を作製する。次いで検量線を用いて各サンプル中に存在する分析対象物量が、他のサンプルに対して相対的に増加したと判定できるか、または絶対的に決定できる。
【００３０】
さらなる実施態様において、本発明は、タンパク質−リガンド相互作用に関連する相互作用パートナーを決定するのに用いられる。本質的に、アフィニティー・マイクロカラムは、生体材料を相互作用パートナーについてスクリーニングしようとする意図で、興味対象のリガンドで誘導される。このリガンドは、生体材料から分析対象物を選択的に単離できる親和性レセプターとして作用する。単離した分析対象物は、同定のために質量分析に供する。しばしば、質量分析と生体材料中に存在する化合物の知識とから、直接的な分子量決定を介して、保持された分析物は十分に同定される。代わりの方法として、未知の分析対象物を、化学的／酵素的に活性化ターゲットを用いて消化し、生じたフラグメント（例えば、タンパク質分解フラグメント）を質量分析に供する方法を提供する。次に、正確に決定されたフラグメントの分子量（および切断特異性の知識）は、分析物を同定するためのゲノムまたはタンパク質データベースを検索するのに用いられる。
【００３１】
同様の実施態様において、タンパク質−リガンド相互作用は、それ自体他の分析対象物を保持する特定のタンパク質を標的にするアフィニティー試薬をデザインすることにより調べられる。この様式で、タンパク質複合体を、それらの構成要素の１つを標的にすることにより生体材料から回収する。次いで前述の分析法を用いて、複合体の構成要素が何であるかと性質の詳細を明らかにする。
【００３２】
本発明による具体的な実施態様を、ここで詳細に説明する。これらの実施例は、例示のためのものであり、本発明は、これらの実施態様に記載された物質、方法または装置に限定されるものではない。
【００３３】
アフィニティー・マイクロカラムの製造
特異的または非特異的標的分析対象物について、効率的なアフィニティー捕捉、遊離、および迅速、高感度かつ正確な質量分析によりハイ・スループットが可能である生物学的に高感度なアフィニティー−リガンドマイクロカラムの好適な実施態様の指示された形成について以下に記載する。下記の実施例では、生物学的に富んだ環境において安定な構成を提供するために、多数の方法、構成およびデバイスの納入について記載する。
【実施例１】
【００３４】
金型を用いる多孔性ガラス分子トラップの調製−グラファイトスプレイ剥離
多孔性ガラス分子トラップは、ステンレススチール製のアニーリング用鋳型を用いた市販の広穿孔Ｐ−２００ピペッタチップの仕様書に規格化されている（１成形あたり０．０７１インチ（入口）の１００〜１０００個の孔；２度のテーパー、グラファイト剥離剤で磨き処理）。鋳型に、ソーダ石灰ガラスの球面ビーズ（１５０〜２００μｍ；７５％ＳｉＯ２、１５％Ｎａ２Ｏおよび１０％ＣａＯ）を充填し、アニーリングは、アルゴン−後部充填炉中、７７２℃（平衡、ｔ＝０）から８００℃（ｔ＝３分、１分の平衡）の温度をランピングすることにより達成される。ランプ−アニーリング終了時に、鋳型をオーブンから直ちに取り去り、多孔性ガラス分子トラップを鋳型から抜き取る。このプロセスは典型的に、高流動特性および広穿孔Ｐ−２００ピペットチップの入口に取り付けるための適切な穿孔とテーパーを有する多孔性ガラス分子トラップ（室温での多孔性ガラス分子トラップの寸法：０．０６１インチ（入口）、０．０９２インチ（長さ）、２度のテーパー）を生産する。
【００３５】
好適な実施態様において、次に分子トラップを、ピペットチップの先端に挿入し、底部（狭い部分）に配置させる。分子トラップを、先端からの十分な加圧量を適用することにより固定する。ピペットチップは、固定プロセスを補助するために分子トラップの挿入前に加熱できる。
【００３６】
この実施例に従って調製されたアフィニティー・マイクロカラムを用いたサンプルの質量スペクトルを図２〜５に例示する。
【実施例２】
【００３７】
セラミック鋳型を用いる多孔性ガラス分子トラップの製造−パイレックス
多孔性パイレックスガラス分子トラップを製造するために、セラミック鋳型を記載する。多孔性ガラス分子トラップは、セラミックの焼もどし鋳型を用いた、市販の広穿孔Ｐ−２００ピペッタチップの仕様書に規格化されている。ジルカー（Ｚｉｒｃａｒ）タイプのＲプレート（４×６×１−１／４インチ）を、ジルカー社（ニューヨーク州フロリダ）から購入し、最大の平坦部にエンドミルで表面化し、ＣＮＣ機械により仕上げた（２１００個の孔、０．０６２５インチの底部カット、２度のテーパー）。ボールミル化粉末状ホウケイ酸「パイレックス」（４μｍから３００μｍのサイズ：８１％ＳｉＯ２、４％Ｎａ２Ｏ、０．５％Ｋ２Ｏ、１３％Ｂ２Ｏ３、および２％Ａｌ２Ｏ３）で充填された４個のセラミック鋳型を炉に積重ね、パイレックス軟化点（８１６℃）以下までの緩やかな温度上昇ランプ（６０分）を用いて最初の温度平衡を受けた。次に、該鋳型を、約パイレックス軟化点（８２１℃）にランプする前に３０分間平衡にしてから、これを約３０分間維持して多孔性ガラス分子トラップを形成した。協奏的加熱処理のために（高質シリカガラスを用いて）、鋳型を７０８℃までダウンランプさせ、その温度で、抜き取りのために緩やかな最終温度低下ランプ前に２〜２０時間（所望のエッチング量に依り）維持した。即時使用が必要の場合、ガラスクラッキングを避けるために、鋳型を適切な回収温度（一般に３００℃）まで緩やかな温度低下ランプさせる。このプロセスは典型的に、高流動特性および広穿孔Ｐ−２００ピペットチップの入口に取り付けるための適切な穿孔とテーパーを有する多孔性パイレックスガラス分子トラップ（室温での多孔性ガラス分子トラップの寸法：０．０６２５インチ（入口）、０．１３０インチ（長さ）、２度のテーパー）を生産する。
【実施例３】
【００３８】
セラミック鋳型を用いる多孔性シリカガラス分子トラップの製造−バイコール
多孔性バイコールガラス分子トラップを製造するために、実施例２に記載されたセラミック鋳型を用いる。ジルカータイプ−Ｒセラミック鋳型に、粉末状「バイコール」（コーニング社）、多孔性バイコール（コーニング社）、制御多孔性ガラス（コントロールド  ポーラス  グラス社、ニュージャージー州）、（所望のフロースルー特性に依り４μｍから３００μｍのサイズ幅：９６％ＳｉＯ２）で充填して炉に積重ね、バイコール軟化点（１５００℃）以下までの緩やかな温度上昇勾配で（９０分）最初の温度平衡を受けてから、該鋳型を、約バイコール軟化点（１５３０℃）にランプする前に３０分間平衡にして維持し、多孔性ガラス分子トラップを形成した。ガラスクラッキングを避けるために、鋳型を適切な回収温度（一般に約３００℃）まで緩やかな勾配で温度低下させる。このプロセスは典型的に、高フロー特性および広穿孔Ｐ−２００ピペットチップの入口に取り付けるための適切な穿孔とテーパーを有する多孔性バイコールガラス分子トラップを生産する。
【実施例４】
【００３９】
セラミック鋳型を用いる多孔性シリカガラス分子トラップの製造−シリカゲルまたは石英ガラス
シリカゲルまたは石英ガラスを用いて多孔性ガラス分子トラップを製造するために実施例２に記載されたセラミック鋳型を用いる。ジルカータイプ−Ｒセラミック鋳型に、粉末状多孔性シリカゲル（シグマケミカル社）または石英ガラス（コーニング社）（所望のフロースルー特性に依り４μｍから３００μｍのサイズ幅：１００％ＳｉＯ２）で充填して炉に積重ね、シリカ軟化点（１５５０℃）以下までの緩やかな温度上昇勾配（９０分）で最初の温度平衡を受けてから、３０分間平衡に維持してから該鋳型を、約バイコール軟化点（１５８５℃）に上昇させ、多孔性ガラス分子トラップを形成した。ガラスクラッキングを避けるために、鋳型を適切な回収温度（一般に約３００℃）まで緩やかな勾配で温度低下させる。このプロセスは典型的に、高流動特性および広穿孔Ｐ−２００ピペットチップの入口に取り付けるために適切な穿孔とテーパーを有する多孔性バイコールガラス分子トラップを生産する。
【実施例５】
【００４０】
エッチング化多孔性シリカ分子トラップ
高多孔性シリカ分子トラップ形成は、実施例４で形成された多孔性シリカ分子トラップを種々の電気化学エッチング条件に曝露することにより達成される。例えば、多孔性シリカ分子トラップを無水エタノール中、水性ＨＦ（２５〜５０％）溶液中に入れて、エッチング電流（１２０〜２００ｍＡ／ｃｍ２）および照射（１５０ｍＷ／ｃｍ２）を１分から２０分間かけることにより、水素化ケイ素表面が作成される。
【実施例６】
【００４１】
金型を用いる多孔性粉末状金属分子トラップの製造
多孔性金属分子トラップは、市販の広穿孔Ｐ−２００ピペッタチップの仕様書に規格化されている。逆の傾斜（すなわち、前述の鋳型と比べて先端が狭い）または同じ方向のテーパーを有し、鋳型の底部（プッシュピンによる多孔性金属出口用）に位置する開口の周囲に僅かに隆起したリップ（満タン以上が必要のため）を含む金型が機械作製される。鋳型は除去できる底部プレートに支えられており、粉末状金属（例えば、真ちゅう、銅、銀、金）で充填され、各孔に補足的なプッシュピンを具備したアーバー（Ａｒｂｏｒ）プレスにより、溝のある／隆起した粉末状金属面に圧（金属粒子間に個々の接合部を形成するのにふさわしい）をかける。粉末状金属分子トラップを形成後、低部プレートを外し、プッシュピンを孔の狭い末端に入れて、鋳型から多孔性粉末状金属分子トラップを離す。多孔性粉末状金属分子トラップは、オーブンでアニーリングすると、構造安定性を増して有機官能基化のための金属酸化物を形成する。
【００４２】
分子トラップは、種々の各種材料およびまたは各種材料の各種組合せから作製でき、依然として本発明の範囲内にあることを認識する必要がある。材料が、それらの表面に対しアフィニティー試薬と結合できなければならない。またはアフィニティー試薬と結合するために化学的に修飾できなければならないことのみが限定要件である。最も好ましい材料または材料の組合せは、表面積が広くまたは表面積を広くするために修飾できることである。
【００４３】
上記実施例は、マイクロカラムのテーパー化プロフィルを利用するが、非テーパー化または円筒カラムなどの形体を用いることができ、依然として本発明の範囲内にある。実際、ハイ・スループット実施態様において、テーパー体が製造プロセスを遅らせることから、非テーパー化体が好ましい。
分子トラップの化学活性
【実施例７】
【００４４】
多孔性ガラス分子トラップのシラン被覆／機能
実施例１〜６または他の等しいプロセスにより形成された多孔性分子トラップは、化学的誘導体化（シラン化）前に種々の水、鉱酸処理、付随する水によるリンス、乾燥を組み合わせた前処理調整を受けることができる。例えば、多孔性ガラス分子トラップは、上昇温度下（典型的には水の沸点以下）で蒸留水または精製水（一般に１０倍の体積）中に懸濁し、新鮮水を２回または３回交換して（または交換しないで）１〜２４時間軌道振とうすることにより浸出させる。次いで全ての水を除去し、次の２種の酸処理に供する。最初に、水中の１Ｎ塩酸を、上昇温度で１時間から２時間の時間で多孔性ガラス分子トラップにかけて（１０倍）、中性（または中性近く）のｐＨが得られるまで水でリンスする。次いで、水中１Ｎ硝酸を、最初の酸処理で実施したとおり実施する。多孔性ガラス分子トラップを、室温、または真空オーブン中（１００℃、１気圧、一晩）のいずれかで乾燥する。
【００４５】
次に乾燥／前処理多孔性ガラス分子トラップを、無水トルエン中、軌道振とうしながら一晩灌流下、シラン化試薬、例えば、１０％シラン化試薬のＮ−[３−（トリメトキシシリル）プロピル]エチレンジアミンで被覆させることにより化学的に活性化して、官能基化多孔性分子トラップを生成する。シラン被覆多孔性分子トラップを、室温まで冷却させ、次いで上澄液が、ニンヒドリンおよび／またはトリニトロ安息香酸（ｔｎｂａ）に陰性になるまで室温でリンスする。その他、有用なシラン化試薬としては、限定しないが、アクリル酸３−（トリメトキシシリル）プロピル、３−（トリメトキシシリル）プロピルアミン、Ｎ−[３−（トリメトキシシリル）プロピル]アニリン、Ｎ１−[３−（トリメトキシシリル）プロピル]ジエチレントリアミン、Ｎ−[３−（トリメトキシシリル）プロピル]エチレンジアミン、メタアクリル酸３−（トリメトキシシリル）プロピル、塩化[３−（トリメトキシシリル）プロピル]オクタデシルジメチルアンモニウム、Ｎ−[３−（トリメトキシシリル）プロピル]ポリエチレンイミン、Ｎ１−[３−（トリメトキシシリル）プロピル]カルボン酸、アミノプロピルトリエトキシシラン、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、チオールプロピルトリメトキシシラン、クロロプロピルトリメトキシシラン、オクタデシルトリメトキシシラン、オクタデシルトリクロロシラン、Ｏ−[２−（トリメトキシシリル）エチル]Ｏ’−メチルポリエチレングリコール、シリルアルデドなどが挙げられる。
【００４６】
これらの反応は、反応に添加されるトリエチルアミン（ＴＥＡ）を用いるなど塩基触媒により、または減圧適用下（約１気圧）で実施することにより促進できる。
マイクロカラムハウジング（ピペット）の製造
好適な実施態様において、非テーパー化分子トラップが用いられる場合、マイクロカラムハウジングとして用いられるマイクロピペットは、次のように修飾される：
マイクロピペットチップなどのマイクロカラムハウジングは、注入成形または当業界によく知られた他の手段などによって形成される。該ハウジングの末端部は、通常のマイクロピペットに、棚のような少なくとも１個の差し込み突起を与えるよう修飾されている。一実施態様において、該突起は、ハウジング末端の内径にしたがった連続棚である。しかしながら、より好適な実施態様において、該少なくとも１個の差し込み突起は、一つの突起物または三角形の突起物であり、より好ましくは３個の突起物、さらにより好ましくは６個の突起物である。したがって、分子トラップが、ハウジングに装填される場合、各々は、少なくとも１個の挿入突起に支えられている。分子トラップがハウジングに充填された後、分子トラップに直接隣接したハウジングの両側の一部は、分子トラップとわずかに摩擦接触がある程度まで内側に押し付けられる。内部に含まれる分子トラップを破壊しないようにするために、過剰に押し付けないように注意を払わなければならない。好適な実施態様において、押し付ける工程は、冷却ガス（不活性ガスが好ましい）のフローによって内部の分子トラップを冷却しながら、ハウジングの外面を加熱することにより達成される。次いで、加熱されたハウジングは、加熱された鋳型内におけるゆるやかなテーパーを用いて内側に力をかけられ、これによって分子トラップにハウジングが押し付けられる。
【実施例８】
【００４７】
バッチの官能基化
官能基化多孔性分子トラップの直接的バッチ活性化／誘導体化
マイクロカラムの直接的バッチ活性化／誘導体化は、代表的なアフィニティーリガンドに結合し、環境的に安定な結合を提供する任意の反応性化学基を対象とする。バッチの活性化／誘導体化法は、非常に多くの方法で進行し、有機試薬並びに無機試薬、例えば、ホモ二官能性、ヘテロ官能性またはポリマー試薬により活性化できる一級アミン類、カルボン酸類、チオール基、スルフヒドリル、ヒドロキシル、アリル基、アジド、アルデヒド、ヒドラジド、マレイミド、トリアジンなどにより生物学的修飾のために活性化／共役化学を目標に定める。
【００４８】
本例として、グルタルアルデヒド活性化、次いで一級アミン基と、グルタルアルデヒド−多孔性分子トラップ上のアルデヒド基とのリガンドカップリングによるこれらの方法の１つを例示する。最初に、アミン官能基化分子トラップを、シアノボロヒドリドナトリウム（１０ｍｇ／ｍＬ）媒介カップリング（１時間から一晩の範囲の反応時間）を用いて、グルタルアルデヒド（０．１０Ｍリン酸ナトリウム中２５％溶液、ｐＨ７．８、１００ｍＭＮａＣｌ緩衝液）とカップリングさせる。リン酸緩衝液で数回リンス後、グルタルアルデヒド・マトリックス上の活性アルデヒド基を、タンパク質抗体のような対象となるリガンドと共にインキュベートする。カップリングしなかった（過剰の）リガンドを、ＨＢＳ緩衝液（１０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５ＭＮａＣｌ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０）で広範囲にわたってリンスすることにより除去する。この誘導体化プロセスは、高い分析対象物結合力を有する分子トラップを生成する。次に該分子トラップはＰ−２００ピペッタチップに詰められる。
【実施例９】
【００４９】
官能基化多孔性分子トラップのバッチアミン活性化、増幅、再活性化および誘導体化
アミン→ＣＨＯ→ポリ−アミン→ＣＨＯ→Ａｂ
増幅によるマイクロカラムの活性化は、取扱い可能なリガンドカップリングに係る他の方法を可能にする。増幅アミン表面を作成するために、ポリリジン、アミノデキストランまたはアミン修飾スターバーストデンドリマーなどの中〜高分子量アミンポリマー類を、種々の適切な化学により、官能基化／活性化多孔性分子トラップ表面に架橋させる。グルタルアルデヒド活性アミンマイクロカラムを、シアノボロハイドレートナトリウム介在カップリングにおいてポリリジンとインキュベートする。次に、このポリアミンマイクロカラムを、グルタルアルデヒドを用いて再度活性化し、水でリンスし、タンパク質リガンドをコンジュゲートさせる。
【実施例１０】
【００５０】
官能基化多孔性分子トラップのバッチ表面アミン修飾活性化／誘導体化による非特異的結合の抑制
アミン→ＣＨＯ→ポリ−アミン→ＮＨＳ／ＥＤＣ→ポリＣＯＯＨ→ＮＨＳ／ＥＤＣ→＞リガンド
リガンド固定のための他のアプローチとして、表面アミンに対するリガンド由来カルボキシル基のカップリングを介するものがある。増幅アミン表面を作成する有効な方法は、高分子量のポリリジン、アミノデキストラン、アミン修飾スターバーストデンドリマーまたはポリアクリルヒドラジドを、官能基化多孔性分子トラップ表面に架橋させ、次いでカルボキシル末端クロスリンカー（例えば、無水コハク酸または無水グルタル酸）のＥＤＣ仲介性結合またはビスオキシラン活性化（エポキシド活性化表面になる）などの種々の化学による末端カルボキシル生成による。これらのカルボキシルマイクロカラムは、ＥＤＣ／ＮＨＳ仲介性の活性化／カップリングを経て低ｐＩタンパク質リガンドを固定化するのに用いられる。具体的には、ポリリジンマイクロカラムを、無水コハク酸（またはグルタル酸）（０．２Ｍ酢酸ナトリウム中１００ｍｇ／ｍＬ無水物、ｐＨ４〜５）のバルク中インキュベートして、ｐＨを希塩酸の添加により維持しながら、一般に２時間から４時間で反応を完了（すなわち、ｔｎｂｓとニンヒドリンアミン試験陰性）させる。次にカルボキシマイクロカラムを、水中１００ｍＭ  ＮＨＳと１００ｍＭ  ＥＤＣとで室温で１０〜２０分間活性化し、水でリンスし、僅かな真空をかけてからタンパク質リガンドのカップリングを行う（抗体１〜１０ｍｇ／ｍＬ、ＨＢＳ緩衝液ｐＨ７．５、４℃で一晩、シェーカ）。
【実施例１１】
【００５１】
官能基化多孔性分子トラップのバッチ中ポリマー修飾カルボン酸の活性化／誘導体化
他の方法は、カルボキシメチルデキストランのような水溶性カルボキシル含有ポリマー類（カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルアガロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルアミロース、ポリグルタミン酸、ポリアクリル酸、カルボキシル修飾スターバーストデンドリマー）により表面増幅に次いで、第一級アミン基とデキストランマトリックス上のカルボキシル基との相互作用を経るようなリガンドのカップリングを伴う。最初に、アミン官能基化マイクロカラムを、ＥＤＣ（１−エチル−３−（３ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）介在カップリングを経て１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ４．８、１００ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液中で実施された１５ｋＤａカルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）にカップリングさせる。リン酸緩衝液で数回のリンス後、デキストランマトリックス上のカルボキシル基を、ＥＤＣ／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ；水中各１００ｍＭ）で活性化し、タンパク質抗体などの興味あるリガンドとインキュベートする。結合しなかった（過剰）抗体をＨＢＳ緩衝液（１０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０）で広範囲にわたってリンスすることにより除去し、その後、分子トラップをＰ−２００ピペッタチップに詰める。この誘導体化プロセスは、増幅層（ＣＭＤマトリックス）が使用されないマイクロカラムと比較して、より高い結合力のあるマイクロカラムを生成する。最初のアミノシラン化の活性化工程は、アミン表面（事実上の官能基化表面）に結果として生じるが、結合面から離れて充填力を増すため、また、全マイクロカラムのすみずみまで均一な（均質的な）表面コーティングを保証するために表面を増幅することが好ましい（それによって、ガラス基板に発生して非特異的結合を生じる可能性がある潜在的相互作用を減じる）。
【実施例１２】
【００５２】
バッチにおけるカルボキシメチルデキストランカルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）による官能基化多孔性分子トラップの活性化／誘導体化
リガンド固定化のための他のアプローチとして、ＣＭＤ層のＥＤＣ／ＮＨＳ活性化法を、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）の活性化に替える。この活性化法は結果として、ＣＭＤに存在するカルボキシル基とヒドロキシル基を、アフィニティーリガンドに存在する一級アミンまたはスルフヒドリルと反応できるイミダゾリルカルバマート中間体に変換する。例えば、ＣＭＤマイクロカラムを、アセトンに続いてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）でリンスする。次にＣＤＩの１００ｍｇ／ｍＬＤＭＳＯ溶液を、ＣＭＤマイクロカラム上にのせ、真空にし、この活性化を軌道シェーカ上で２時間から一晩進行させる。ＣＤＩ活性化アフィニティー・ピペットを、ＤＭＳＯに次いでアセトンで広範囲にわたってリンスしてＣＤＩ活性化ＣＭＤマイクロカラムを形成する。重要なことは、ＣＤＩ活性化媒体は、正しい保存条件（すなわち、（湿った）イソプロパノールまたは（乾燥）不活性ガスまたは真空）を与えると月単位の貯蔵が可能なほど安定であることが知られていることである。したがって、ＣＤＩは、マイクロカラムの安定なアクチベータとして作用でき、予め活性を与えて長期間供給することができる。あるいは、ＣＤＩ活性化マトリックスを、興味のあるタンパク質抗体と共にインキュベートする。結合しなかった（過剰）抗体をＨＢＳ緩衝液（１０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５ＭＮａＣｌ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０）で広範囲にわたってリンスすることにより除去し、その後、分子トラップをＰ−２００ピペッタチップに詰める。
【実施例１３】
【００５３】
有機官能基化多孔性ガラス分子トラップの表面重合によるバッチｉｎ  ｓｉｔｕ重合または共重合
本実施例において、有機官能基化多孔性ガラス分子トラップ（すなわち、メタクリルトリメトキシシラン化）を、フリーラジカル開始によってｉｎ  ｓｉｔｕで重合する。使用される典型的な共重合化モノマー類は、限定しないが、アリルデキストラン、アリルアミンアリルグリシジルエーテル、アクリル酸、ビニルジメチルアズラクトンが挙げられ、それらは、水中のテトラメチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）またはＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−１，２−ジアミノエタンおよび過流酸アンモニウムなどの典型的な開始剤を用いて、メチレン−ビス（アクリルアミン）などの架橋剤に組み入れることができる。架橋およびポリマーサイズの程度は、開始剤の量、重合時間、終了用に利用できるモノマー類により制御される。この表面反応は、分子トラップ表面を覆うポリマーマトリックス内に多く存在する官能基で生じる。次にこれらの基は、リガンドに対する活性化／共役化に利用できるか、または活性化およびリガンドカップリング前に、さらなる活性化および増幅に供される。
【実施例１４】
【００５４】
金属キレータ修飾多孔性ガラス分子トラップ
金属キレータの多孔性ガラス分子トラップへの組み入れは、金属結合性の生体分子回収に有用である。前述の実施例で調製されたアミンまたはポリアミンマイクロカラムを、ｐＨ７の０．１Ｍリン酸塩に入れてロータリーエバポレータを用いて排気させる。次いで第一級アミンの表面を、エチレンジアミン四酢酸二無水物（ＥＤＴＡ−ＤＡ）およびジエチレントリアミン五酢酸二無水物（ＤＴＰＡ−ＤＡ）などの二官能性キレート化剤に２０〜１００ｍｇ／ｍＬで直接結合させて、生体分子を捕捉するための複合体の配位において金属をしっかりと結合できる金属キレートアーム（それぞれＴＥＤおよびＥＤＴＡ）を形成する。
【００５５】
代替方法として、エチレンジアミン四リン酸（ＥＤＴＰＡ）、１，４，７，１０−テトラシクロノナン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−三酢酸（ＮＯＴＡ）、１，４，７，１０−テトラシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＴＥＴＡ）、１，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、Ｎ，Ｎ（ビスカルボキシメチル）Ｌ−リジンなどの金属キレータ溶液を、例えば、ＮＨＳ／ＥＤＣ（各１００ｍＭ、０．１Ｍリン酸塩、ｐＨ７）仲介を用いて活性化し、カルボキシル基を局在化した表面第一級アミンに結合させる。
【実施例１５】
【００５６】
擬生体リガンド形成、バッチ染料官能基化多孔性ガラス分子トラップの調製
合成染料は、多種多様な生体物質との反応性という長所により有用なアフィニティーリガンドである。限定しないが、トリアジン染料を包含する反応性染料（すなわち、反応性黒色、反応性青色、反応性褐色、反応性緑色、反応性橙色、反応性赤色、反応性黄色など）は、例えば、簡便法を用いてアミノマイクロカラムに結合させた。対象となるトリアジン染料、シバクロン（Ｃｉｂａｃｒｏｎ）ブルーの５０ｍｇ／ｍＬを蒸留水に溶解し、丸底フラスコ中のアミノマイクロカラムに加えて緩和な還流下、一晩反応させた。リガンドカップリング後、擬生体マイクロカラムを水でリンスし、１Ｎ塩溶液と緩和な還流下、３０分間インキュベートした。広範囲に亘る水リンス後、擬生体マイクロカラムを、空気中または９０℃減圧下のいずれかで乾燥した。
【実施例１６】
【００５７】
バッチイオン交換官能基化多孔性ガラス分子トラップの作製
イオン交換媒体の多孔性ガラス分子トラップへの組み入れは、生体分子結合、回収と分析またはサンプル中の脱塩界面活性剤としての洗浄（ＳＤＳ除去）にとって有用である。この場合、アミンまたはポリアミンマイクロカラムは、例えば、デキストランイオン交換媒体（例えば、硫酸デキストラン、ジエチルアミノエチルデキストラン（ＤＥＡＥ−デキストラン）、硫酸ヘパリン、カルボキシメチルデキストラン（実施例１０に前述された生成）内に含まれる炭水化物の水酸基を目的に活性化される。デキストランイオン交換担体カップリング前に、第一級アミンの表面を、トリアジン、ジグリシドキシエーテル（オキシラニン類またはエポキシド類）などの二官能性（または活性）剤で活性化する。同様に、最初のシラン化反応または共重合化から生成されたエポキシド官能基化マイクロカラムを、誘導体化用に使用する。
【００５８】
あるいは、アミンマイクロカラムを、活性化デキストラン担体とインキュベート／カップリングする。さらなる実施例は、デキストラン（近接ジオール）イオン交換担体のメタ過ヨウ素酸ナトリウム酸化により生成されたデキストラン担体上のアルデヒド基の使用である。具体的には、デキストランイオン交換媒体（１０〜１００ｍｇ／ｍＬ）を、１Ｍメタ過ヨウ素酸ナトリウム（水中）中暗所で２時間インキュベートし、その後、酸化デキストランイオン交換媒体を、有機溶媒（エタノール／エーテル）中で沈殿させるか、または水中で一晩透析する。次に酸化デキストランイオン交換媒体を、アミンまたはポリアミンマイクロカラム（０．１Ｍリン酸塩、ｐＨ７．５）とインキュベートする。
【実施例１７】
【００５９】
マイクロカラムへのタンパク質固定
結合特異性を有するタンパク質は、免疫化学のレセプターおよびリガンドとして専門的に扱われている。これらのアフィニティータンパク質としては、プロテインＡ、プロテインＧ、アビジン試薬およびストレプトアビジン試薬が挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質リガンド、具体的にはプロテインＡまたはＧは、生体分子回収剤として使用される前の、抗体の末端の定常部（Ｆｃ）の捕捉、または続く架橋に伴う捕捉／コンジュゲートのために多孔性ガラス分子トラップに組み入れられる。アビジン／ビオチンシステムは、抗体または分析対象物に結合される際に、強力な結合性のみならず増幅モチーフを有する共役剤を作製する代替連結剤として用いられる。
【００６０】
例えば、前述の実施例で調製されたアミンまたはポリアミンマイクロカラムを、ｐＨ７の０．１Ｍリン酸塩に入れてロータリーエバポレータを用いて排気させる。次いで第一級アミンの表面を、グルタルアルデヒドで活性化し（２５％、４時間から２４時間）、リンスし、シアノボロヒドリドナトリウム（０．１ｍｇ／ｍＬ）仲介カップリングにおける機能的タンパク質試薬（またはアミンまたはヒドラジド修飾ビオチン）（ＨＢＳ−ＥＰ中１〜１０ｍｇ／ｍＬ）に直接カップリングする。
【実施例１８】
【００６１】
マイクロカラムを用いるタンパク質修飾／消化
特異的修飾または消化性を有する生体分子は、生化学におけるレセプターまたはリガンドとして用いられる。これらの生体分子としては、タンパク質、ペプチド、酵素、触媒的抗体などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
例えば、トリプシン修飾マイクロカラムは、前述の実施例で調製される。トリプシンは活性化されると、目的の分析対象物タンパク質など、タンパク質のアミノ酸配列におけるアルギニン点、またはリジン点のいずれかで特異的に消化する。
【００６３】
代わりに、他のレセプターは、固定キナーゼによる分析対象物のリン酸化のように、２種の生体分子を単一体に共同させるのに使用できる。
ターゲットの製造
現在、商業的な製造に用いられているターゲットのデザインは、アレイ化されたおよび／または生体反応性のターゲットの精密で首尾一貫した使用を十分に支持していない。サンプル間での高度の再現性を達成することは、これらターゲットにとって大いに重要である。
【００６４】
現在のデザインターゲットを利用すると遭遇する問題を修正できる少なくとも３つのターゲットデザインがある。これらデザインは次のとおりである。
台状ターゲット
本発明によるターゲットの第１の実施態様においては、分析対象物量を限定された領域に厳密に適用でき、ターゲットの活性領域を越えて広がる心配のない、「マッチドセット」のターゲットがある。一定量の分析対象物量は、ターゲットに形成された台の上部にメニスカスを形成し、正しく設計されていれば台の両側にしみ出ない。このメニスカス作用のため、分析対象物は、一般に約２〜３μＬの分割容量となる。この容量は、酵素的活性領域からあふれる心配は殆どなく、約４ｍｍ２のターゲット領域を十分かつ完全に保護する。したがって、分析対象物を酵素量の種々の変化に曝すことによる不規則な消化は、ターゲットの活性面を完全に保護すること（のみ）により解消される。さらに、ターゲットを適当に湿らせたインキュベータに入れれば、約２〜３μＬの体積は蒸発しない。したがって、サンプル乾燥による不規則な消化は、台上で一定のサンプル容量を維持することにより除外される。
【００６５】
製造において、台は、最終的に装置に導入されるより大きなターゲット（ステンレススチール製）に取り付ける金属下地のターゲット中に加工される。台の高さは、分析物拡散を避けるために必要最小限の高さと見られる基準により経験的に決められる。約０．５ミリメートルの高さで通常十分である；全てのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ装置の促進領域に容易に導入できる高さ（最小許容約２ｍｍ）。このように台の全寸法は、分析に、装置に由来する誤差を導入することなく、分析対象物を十分に限定するような寸法である。
【００６６】
第２の実施態様は、さねはぎ継ぎ（ｔｏｎｇｕｅ−ｉｎ−ｇｒｏｏｖｅ）設計により装置に取り付けられる薄手の寸法の金属ターゲットを用いる。ターゲットの薄手の寸法と溝付き据え付けブラケットを有する必要性により、これらのターゲットを機械製作（機械仕上げ）することは実行不可能である。したがって、プレス法が、台を作成するために用いられる（背部からターゲットをプレスする）。プレス法は、適切な打ち抜き型の機械製作を必要とすることを特記する。
【００６７】
適切な基材は、製造中に使用される溶媒適合性、金被覆並びに真空適合性のために経験的に決められる。最初に、基材ターゲットは、製造溶媒に適合し、高均一性のスパッター被覆ができ、ガス放出性の低いポリスチレンから作製される。しかしながら、他の重合材料を使用できる。ポリマー基材ターゲットの利点は、大量に安価に製造できることである。
【００６８】
このタイプのターゲットの成功基準は、１）正確な表面領域に対してサンプル容量を正確に制限し、２）装置の性能を減じない、３）容易で、大量生産でき費用的に効果があるという最適の台幾何学を決定することである。
ターゲットまたはターゲット・アレイの疎水性／親水性の対比
高再現性の生体反応性ターゲットに関する第２の実施態様デザインは、活性領域のみに分析量を限定できる疎水性媒体で酵素的活性部位を対照化することである。この方法において、酵素は、一般に疎水性標的の上部に位置する金／ＤＳＰ／酵素点に固定される。対照装置を製造する最も簡便な方法は、テフロンのような疎水性材料から構築することである。金サンプル領域は、マスキング／スパッター被覆プロセスによりターゲット上に置かれる。次に金領域を、我々の通常の活性化法／固定化法を用いて誘導化する。テフロン装置に関係する１つの懸念は、質量分析計内で変化することである。このような効果（イオンの除去によるサンプル段階での変化）は、質量分析デザインにおいて常に懸念されることである。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析は、非伝導性材料（例えば、石英ターゲットまたはゲル）から作られたサンプルターゲットより行われたが、サンプル充填による影響がわずかだった。これらの影響は、市販の全てのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ装置使用において利用できる遅延抽出法を用いてさらに最小化される。しかしながら、ターゲットによる質量分析の性能に対するいずれの混乱も、マスキング／金被覆プロセスにおける酵素的活性表面の電気的結合を含むような方法により除去できる。
【００６９】
対照装置の他の可能性は、親水性酵素活性領域が構築される疎水性表面を作成するために金属基材ターゲットを誘導体化することである。この方法の製造プロトコルは、前の方法よりも関連性が大きい。疎水性媒体でターゲットを最初に被覆してから、マスキングプロセスを用いて、サンプル点のパターンを疎水性被覆に金被覆をする複数工程プロトコルに従う必要がある。このプロセスは、１）金による全ターゲットのスパッター被覆、２）（必要なら）ＤＳＰによる活性化、３）疎水性化合物の固定化、４）パターンマスクを用いてターゲットを再度スパッター、５）新鮮な金の活性化と酵素固定、を伴う。このプロセスを用いる１つの実施例は、ターゲットを金被覆し、１−オクタデカンチオールで誘導体化することである（ＤＳＰ活性化プロセスを省く）。このプロセスは、Ｃ−１８誘導体化表面を作成するのに用いられた。これらの表面は、水玉により容易に観察できるように疎水性が大きい。ターゲットを疎水性化合物で誘導体化したら、新鮮な金のパターンは、マスキングおよびスパッター被覆により塗布される。次に新鮮な金を活性化し、例えば、ＤＳＰ／デキストラン／酵素固定化法を用いて誘導体化される。このプロセスにより、疎水性媒体によって囲まれた親水性の酵素活性スポットを生じる。活性かつ疎水性領域間の視覚による対比を強調するために、単一の第一級アミンを含有し、他の化学的反応性基を含まない疎水性染料（例えば、ファストバイオレットＢ、メチレンバイオレット３ＲＡＸ）を、Ｃ−１８層の場所に使用できる。同様に、他のクラスの染料または色素系疎水性化合物を、ターゲットの活性かつ疎水性領域間の視覚による対比をさらに作るために使用できる。好適な実施態様において、イソプロパノールに溶解した親水性メルカプトウンデカン酸を、アレイ化ターゲット上にフラッシュにより微小堆積させ、乾燥し、オクタデシルメルカプタンで素早く覆って、対比させたターゲット・アレイを形成する。混合ＳＡＭ適用を含んで、疎水性分析対象物またはそのいずれかの組合せのために、対比を逆転させることができる。
【００７０】
このタイプのターゲットでの成功基準は、労力がきつすぎなく、または大スケール製造を禁じるようなコスト高ではない、一般誘導体化法（高コントラスト標的用）を見出すことである。
個々のターゲット（挿入物）
第３の標的実施態様のデザインは、消化後、市販の質量分析計に取り付ける基体に挿入できる個々の領域（挿入物）の使用である。この方法は、上記の「マッチドセット」に習うものである。挿入物は、台またはコントラストデザインであり、より高いコストの酵素を用いた誘導体化に経済的なものとなる（より高濃度の試薬のより少量を用いることによる）。これらのターゲット（低コスト酵素で誘導化した場合でも）は、１つずつ使用できる研究適用においてコストの点から極めて経済的である。
【００７１】
このタイプのターゲットでの成功のためには、市販の装置に受け入れられるターゲットに取り付ける挿入物として「マッチドセット」デザインターゲットを作製する必要がある。
バイオチップおよび小型アレイターゲット
ターゲット・アレイの他の実施態様は、生体反応性表面を既存のチップ型生体分析プラットフォーム内／上に組み入れることである。マイクロチャネルデバイス（チップ）は、現在タンパク質分析用に用いられ、生体分子の分離（１つの面積内で）に続いて酵素処理（酵素的活性領域上の第２の面積内で生体分子を分離させることによる）並びにチップから直接ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析にとって理想的なプラットフォームである。
他の活性表面、誘導体化法およびアッセイ
増幅媒体
別の実施態様において、表面増幅媒体は、ターゲット・アレイまたは酵素活性ターゲットの活性を増加させるために用いられる。増幅の１例としては、溶液ベースの重合増幅法、一工程の活性化カップリング、ｉｎ  ｓｉｔｕ誘導重合化事象を用いて実施される。これらの修飾表面は、カルボン酸またはアミン増幅剤（それ自体活性または活性化可能）を用いて一定の電荷の差を示す。
一般的酵素固定化キット
本発明による重要な生成物は、十分に活性化された一般的酵素固定化キットである。該キットは、アフィニティー・マイクロカラム、活性化されたまたは活性化可能なターゲットまたはターゲット・アレイ（増幅または増幅なし）および予め調製の緩衝液を含む、多くのアフィニティーマイクロピペットを包含する。該キットの目的は、エンドユーザーが、固有の酵素を用いてイン・ハウスでターゲットを誘導体化することにより、試薬を固定化するため製造元に送る必要をなくすことである。
イオン交換表面
さらに他の実施態様において、ターゲットまたはターゲット・アレイは、陽イオン交換プロセスを実施できるカルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）により誘導体化でき、これによって最後に、ナトリウムおよびカリウム緩衝液の存在下、タンパク質分析中、より高品質のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルに導く。ＣＭＤターゲットを用いて、不必要な陽イオンは、溶液から除かれ、ターゲットを予めチャージさせるのに用いられる陽イオンに依存してプロトンまたはアンモニウムイオンと置き換わる。
陽イオン交換（ＣＥ）ターゲット
ＣＥ表面の値については、既に記載した；緩衝液中の不必要な陽イオン類の減少は、異成分シグナルを減少させることであり、これにより質量スペクトルの感度が増す（シグナルの均質化）。ＣＥ表面を用いることによるアルカリ陽イオン類の減少はまた、サンプル調製中マトリックスの均質性を改良できる。これらの特性は、タンパク質および核酸双方のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析に有用である。ＣＥ表面の１実施態様において、５００ｋＤａＣＭＤの増幅表面を用いる。５００ｋＤａＣＭＤは、低分子量ＣＭＤよりも高い交換力を持つため選択される。ＣＭＤの約１０ピコモルは、４ｍｍ２ターゲットの表面に固定化できると推定される。ＣＭＤの各成分は、交換のための約１、０００個の原子価部位を有する（約３０％のモノマーデキストランがＣＭＤに変換）ことを考慮すると、１０ナノモルの交換力は、ターゲットにとって１０ｍＭアルカリ塩の１μＬ一定分量と等しいと推定される。しかしながら、ＣＭＤターゲットの交換性は、純粋なサンプルにおける全有効性を決定するために評価されなければならないであろう。それらは、緩衝液塩の種々の濃度（０．１〜１０ｍＭ）下で混合した１本短鎖ＤＮＡ分子（例えば、ｄ（Ｔ）８）を用いてアルカリ金属除去において効果的である。ＤＮＡは、陰電荷のリン酸塩バックボーンに対するカウンターイオンとしてアルカリ金属を維持する高い傾向のため、試験アッセイに選択される。
【００７２】
標準ＣＭＤターゲットを用いると、多くの生体適用に用いられる緩衝液の濃度範囲以下で交換限界に到達し易い。より強いＣＥ機能（例えば、デキストランのクロロスリホン酸処理により生成するスルホナート基）と表面増幅をより大きくできる方法（巨視的表面（１０〜１００マイクロメーター）を生み出す重合樹脂の適用）は、ターゲットの交換能力を、中等度から高強度の緩衝液中に存在する生体分子の分析中に経験する有害な作用を減少できるレベルに上げるために使用できる。
陰イオン交換（ＡＥ）ターゲットまたはターゲット・アレイ
陰イオン交換（ＡＥ）ターゲットまたはターゲット・アレイは、溶液から種々の陰イオン系界面活性剤を除くことによりサンプル精製にとって有用な、さらなる実施態様である。具体的には、タンパク質溶液におけるドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の存在は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析中に常に懸念されるものである。ＳＤＳは一般に、多くのＭＡＬＤＩマトリックスの機能に必要な結晶形成を撹乱し、したがって、サンプル調製の一部として溶液から除去する必要がある。ＭＡＬＤＩプロセスに有害な作用を有する可能性のある他の陰イオンは、リン酸イオンである。
【００７３】
ポリリジン増幅表面は、固有の弱い陰イオン交換性を有する。それらは、種々の濃度のＳＤＳの存在下、約５種のタンパク質から構成される被験混合物を分析することによる陰イオン除去に用いられる。ポリリジン表面は、関連する濃度（１０ミリモル）で溶液からＳＤＳの除去に必要な交換能力または強度を提供できない。ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）交換基は、ポリリジンの替りとして使用できる。ＤＥＡＥを作成するのに３種の誘導体化スキームが可能である。第１の可能性は、ジエチルアミノエチルアミンをＥＤＣ媒介化学またはＣＤＩ活性化を用いて５００ｋＤａＣＭＤに結合させることである。この方法の必然的な限界は、カルボン酸基のＤＥＡＥによる完全な飽和が必要なことである。全部の基が、ＤＥＡＥに変換されない場合、該表面は、（予想できない）陽イオンおよび陰イオンの双方の特徴を持つこととなる。第２の方法は、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンを用いてポリリジン表面を活性化し、ベンジルハロゲン化物を介してＤＥＡＥを該表面に結合させることである。これは、それらのＮ−末端を経るペプチドを選択的に固定化するために、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン法を用いて首尾良くなされた。しかしながら、本法が失敗する可能性がある原因は、活性化工程中、ポリリジンが重度に架橋する可能性があり、本質的にさらなる誘導化に対して不活性表面を形成することである。第３の化学は、ジエチルアミノエチルアミンをＣＤＩ活性化デキストランで増幅された表面に結合させることである。本法は、ＣＤＩ−ＣＭＤ誘導体化の変法であり、不均一な陽イオン／陰イオン交換性を減じると共に大きな交換能力を有するはずである。これらの調製法の全ては、ＳＤＳの存在下、被験ペプチド混合物を用いて試み、評価された。
酵素、アッセイ、インキュベータ
酵素
他の実施態様は、組み合わせた多機能操作を達成するために生体分子の組合せを使用する。例えば、組み合わせるプロフィルは、生体分子のマッピングに続いて脱リン酸化が可能な、アルカリホスファターゼとエンドプロテアーゼのような２種の酵素の組合せである。このような適用は、例えば調節タンパク質中に存在する特定のリン酸化部位を解明する際に有用である。ホスファターゼを種々のエンドプロテアーゼと共に固定化すれば、ｐＨ依存の操作ができる表面を生成する究極の目的が達成される。活性は、商業的供給者から入手できる小さなホスホペプチドをアッセイすることにより評価できる。
【００７４】
さらに他の実施態様は、蛇毒ホスホジエステラーゼ（ＰＤ）を用いるものである。部分的配列決定により、ＰＤでうまく誘導されたターゲットは、マイクロサテライトＤＮＡに存在する変異を含む短鎖ＤＮＡフラグメントの分析に用いられるＰＣＲによるプライマー伸長法の特異性を、特別な次元を与える。ＰＤの生体反応性ターゲットへの固定は、小さなオリゴヌクレオチドを用いて活性を評価することにより達成できる。ＡＰおよびＰＤの双方に関連する研究は、本発明に従って一般誘導体プロトコルに依存する。
インキュベータ
アフィニティー・マイクロカラムと組み合わせて生体反応性ターゲットを用いるタンパク質分解消化中によく発生するのは、消化過程中、サンプルが（ターゲットまたはターゲット・アレイ上で）乾燥しやすいことである。温度範囲（２５〜６０℃）を超えた消化を実施できる修飾オーブン／インキュベータは、一定の湿度環境で生体反応性ターゲットを囲むように作製された。消化を、サンプル量のロスの殆どないこのインキュベータを用いて１時間を超える時間で実施した。装置は小さく、また携帯でき（寸法：４インチ×６インチ×１インチ；約０．５ポンドの重量；１２０Ｖ）、単一温度で操作され（生体反応性アレイの大抵の適用に十分な４０℃）、”マッチドセット”ターゲットを用いて１時間限りの時間で１〜２μＬのサンプル量を維持でき、ロボットステーションで使用できる。
【実施例１９】
【００７５】
生体分子の適用
尿のベータ−２−ミクログロブリン（β２ｍ）分析
アフィニティー・ピペットを形成するピペッタチップに詰める前に、上記実施例１に従って製造された多孔性ガラス分子トラップを、バッチ（１バッチ当たり３０〜５０）中で活性化し、誘導体化した。酸調整後（０．０５ＭＨＣｌで１時間、風乾）、多孔性ガラス分子トラップを、無水トルエン中１０％アミノプロピルトリエトキシシラン（アルドリッチ社、ウィスコンシン州ミルウォーキー）で１２時間還流処理した。次にアミン官能基化多孔性ガラス分子トラップを反応容器に入れて反応緩衝液（１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ４．８、１００ｍＭＮａＣｌ）中、僅かな減圧下で１５分間平衡を保った。平衡後、緩衝液を、１５ｋＤａ分子質量のカルボキシル化デキストラン（ＣＭＤ，フルカ社、ウィスコンシン州ミルウォーキー）および１−エチル−３−（３ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ、シグマ社、ミズーリ州セントルイス）（反応緩衝液中、各１０ｍｇ／ｍＬ）の混合物で置換し、空気を反応容器から再度排気した。反応を１時間進行（約２０分と４０分に反応混合液にＥＤＣの２回連続添加により）させてから、終了し、リンスした。抗体カップリング前に、ＣＭＤ−多孔性ガラス分子トラップを、１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０、０．５Ｍ  ＮａＣｌで激しくリンスした。次いで多孔性ガラス分子トラップを、ＥＤＣ／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、シグマ社、ミズーリ州セントルイス）（水中、各１００ｍＭ）で１０分間活性化し、アフィニティー精製ウサギ抗ヒトβ２ｍＩｇＧ（ＤＡＫＯ社、カリフォルニア州カルピンテリア）（２０ｍＭ酢酸ナトリウム中０．１ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ４．７）と共にインキュベートした。未結合抗体を、ＨＢＳ緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０）で広範囲でリンスすることにより除去した。この製造プロセスにより、約１．５μＬのデッドボリュームをもちながら１０〜１００ｐｍｏｌに推定された結合力のアフィニティー・ピペットを得た。抗β２ｍアフィニティー・ピペットは、安定で、抗体固定後、（ＨＢＳ緩衝液中４℃で保存することにより）少なくとも３ヵ月の期間活性であることが判った。
生体液
全ての体液は、使用直前に入手した；プロテアーゼ阻害剤カクテル（PIC, Protease Inhibitor Cocktail Set III, Calbiochem,La Jolla, CA）は、β２ｍのタンパク質分解の可能性を最少にするために直ちに加えられた。
涙液：ヒト涙液を、目を二重の蒸留水（ｄｄＨ２Ｏ）で洗浄することにより採取し、そのリンス液を集めた。目のリンス液の２０μＬ量を、ＨＢＳ緩衝液１８０μＬと混合し、保存涙液溶液として用いた。この保存液を、さらに水（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析用）またはＨＢＳ緩衝液（質量分析イムノアッセイ（ＭＳＩＡ）分析用）で１０倍に希釈した。
血漿：４４．７μＬのヒト全血を、無菌条件下、ヘパリン化マイクロカラム（Drummond Scientific Co., Broomall, PA）を用いてランセット穿刺指から採血し、２０５μＬのＨＢＳ緩衝液と混合し、３０秒間遠心分離（７，０００ｘｇにて）して赤血球をペレット状にした。５０μＬ一定分量の上清を、２００μＬのＨＢＳと混合し、生じた溶液をＭＳＩＡ用に用いた；一定分量を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ用にｄｄＨ２Ｏでさらに希釈（１０倍）した。
唾液：ヒト全唾液を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ用またはＭＳＩＡ用の調製にｄｄＨ２ＯまたはＨＢＳ緩衝液でそれぞれ１００倍に希釈した。
尿：ヒト尿を、ｄｄＨ２Ｏで１００倍希釈によりＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ用に調製し；ＨＢＳ緩衝液での２倍希釈はＭＳＩＡ用に用いられた。
質量分析免疫学的測定法（ＭＳＩＡ）
ＭＳＩＡは、手動式Ｐ−２００マイクロピペッタを用いて抗β２ｍアフィニティー・ピペットを通して液を反復して（約２０回）吸い取ることにより生体液について実施された。反復フローインキュベーション後、アフィニティー・ピペットを２ｍＬのＨＢＳ緩衝液（２００μＬの一定分量でＨＢＳを吸い取ってから捨てることにより）でリンスし、次いでｄｄＨ２Ｏ（同じ洗浄と廃棄法を用いて）の１ｍＬでリンスした。水リンスの最終廃液において、全ての残留水がアフィニティー・ピペットから追い出されたことを確認した。３μＬ一定分量のマトリックス溶液（１：２、アセトニトリル：ｄｄＨ２Ｏ、０．２％ＴＦＡ中のα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ACCA; Aldrich, Milwaukee, WI）を、（マイクロカラムを覆うのに十分な）アフィニティー・ピペット中に吸い取ることによって、保持化合物をアフィニティー・ピペットから溶出し、その時点で、マトリックス／溶出液混合物は、直接ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦターゲット上に堆積された。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を、質量分析計を用いて実施した。要約すると、装置は、２ステージ３０ｋＶ（２×１ｃｍ；１５ｋＶ／ステージ）連続抽出源を用いて、イオンが、イオンガイド・ケーブルを含む１．４ｍのフライト管の入口に加速される。パルス化Ｎ２レーザー（３３７ｎｍ）を用いて発生したイオンを、ハイブリッドシングルチャネル・プレート／−３．８ｋＶバイアス・のディスクリートダイノード・マルチプライアを用いて検出した。スペクトルは、分離のオシロスコープを用いて個々のレーザーショットをモニタリングし、捕獲中のレーザー強度（測定時）を弱めながら、平均の過渡的レコーダを用いて記録された。
定量
内部基準：ウマβ２ｍ（Ｅβ２ｍ）は、ヒトβ２ｍ（Ｈβ２ｍ）と類似性が高く（約７５％配列相同性）、Ｈβ２ｍとの質量差（ＭＷＥβ２ｍ＝１１４０２．９；ＭＷＨβ２ｍ＝１１７２９．７）が分解可能であり、容易に入手できることから、定量用内部基準として選ばれた。（ある地方の厩舎にて）新鮮馬尿を採取し、プロテアーゼ阻害剤カクテルで直ちに処理した。溶解度の低い化合物を、一晩冷却（４℃で）することにより尿から除き、次いで５，０００ｘｇで５分間遠心分離にかけた。次に尿を、１０−ｋＤａＭＷカットオフ・フィルタで２０倍濃縮し、数回フィルタ交換（４枚のフィルタ／２００ｍＬ尿）をしてＨＢＳと水とで反復リンスした。２００ｍＬの新鮮な尿の処理により、１０ｍＬのβ２ｍに富むウマ尿が得られ、約１００回の分析用内部基準液の保存液とした。
検量線：Ｈβ２ｍの定量を実施した。要約すると、標品を、１．０ｍｇ／Ｌ保存Ｈβ２ｍ溶液の０．１ｍｇ／Ｌの濃度への段階的希釈（すなわち、ＨＢＳ中×０．８、０．６、０．４、０．２、０．１）により調製した；０．１ｍｇ／Ｌ溶液は、小数点第２位の濃度（０．０１〜０．１ｍｇ／Ｌ）に及ぶ同一の段階的希釈の保存液とした。また、Ｈβ２ｍを含有しないブランク溶液を調製した。ＭＳＩＡ用のサンプルを、標品の各１００μＬを、１００μＬの保存ウマ尿と２００μＬのＨＢＳ緩衝液とに混合することにより調製した。ＭＳＩＡは、上記のとおり各々実施して、Ｅβ２ｍおよびＨβ２ｍ双方の同時抽出した。１０種の６５レーザーショットＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを各サンプルからとり、各スペクトルは標的上の異なる位置からとられた。ｙ軸幅の上部５０〜８０％のイオンシグナルを維持し、個々のレーザーショットを飽和させることを避けるために、データ獲得中は注意を払った。スペクトルを、ベースライン積分によりＥβ２ｍシグナルに標準化し、Ｈβ２ｍシグナルを決定した。各検定標準用にとられた１０種のスペクトルの積分を平均化し、標準偏差を算出した。Ｈβ２ｍ濃度に対する各標品の標準化積分の平均値をプロットすることにより、検量線を作図した。
スクリーニング：尿サンプルを各人から採取して、プロテアーゼ阻害剤カクテルで処理し、４℃に冷却した。該尿サンプルを、分析前に直ちに５分間（５，０００ｘｇにて）遠心分離して、沈殿物質を除去した。ＭＳＩＡ用の調製において、尿サンプルの各１００μＬを、１００μＬの保存ウマ尿と２００μＬのＨＢＳとに混合した。この処理は、標品をヒト尿サンプルに替えること以外、検量線の作成に用いられた処理と同一である。ＭＳＩＡは、検量線の節で記載されたとおり実施した。
アフィニティー・ピぺット評価／生体液スクリーニング
アフィニティー・ピぺットを、多数容易に得られる生体液をスクリーニングすることにより評価した。スクリーンの意図は、各体液に対する非特異的結合度を測定し、非特異的結合への寄与を減じさせる他のリンス用プロトコルを簡単に調べることであった。図２ａは、希釈ヒト涙液のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示し、スペクトルはＭＳＩＡ中に保持された化合物を示す。涙液に存在する高濃度のタンパク質は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを支配する：リゾチーム（ＭＷｃａｌｃ＝１４，６９６；ＭＷｏｂｓ＝１４，６９１）および涙液リポカリン（ＭＷｃａｌｃ＝１７，４４４；ＭＷｏｂｓ＝１７，４４０）。他のポリペプチドシグナルは、２〜５ｋＤａ範囲と同時に、恐らくβ２ｍによるｍ／ｚ＝１１，７２７Ｄａに低強度シグナルが観測される。ＭＳＩＡスペクトルは、選択的に保持されたβ２ｍ（ＭＷｃａｌｃ＝１１，７２９；ＭＷｏｂｓ＝１１，７３１）によるシグナルを示し、リゾチームおよび他の非特異的化合物に係るシグナルが弱められている。図２ｂは、希釈ヒト血漿のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦおよびＭＳＩＡスペクトルを示す。血清または血漿の直接分析中に通常観測されるように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルは、アルブミン由来のシグナルにより支配される。他のより低いｍ／ｚシグナルも存在するが、β２ｍシグナルは観測されない。ＭＳＩＡスペクトルは、選択的に保持されたβ２ｍによる強いシグナルを示し、非特異的化合物による２、３の他のシグナルを示す。図２ｃは、希釈唾液（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）およびＭＳＩＡ中保持された唾液のタンパク質を示す。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルは、ペプチド領域が最も目立つ、１〜１８ｋＤａ範囲の多数のシグナルを示し；β２ｍに対応するシグナルは観測されない。正常なリンスプロトコルを用いて得られたＭＳＩＡスペクトルは、選択的に保持されたβ２ｍおよび多数の低分子質量範囲の非特異的化合物によるシグナルを示す。０．０５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）での追加のリンスにより、ＨＢＳリンスとｄｄＨ２Ｏリンスとの間に含まれる第２のＭＳＩＡ分析を実施した（図２ｃ）。ＳＤＳリンスは、低質量シグナルを完全に除去しなかったけれども、β２ｍシグナルの比例した減少なしに質量スペクトルに対するそれらの寄与を大きく減じた。図２ｄは、ヒト尿の分析から生じるスペクトルを示す。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルは、ペプチド領域に多数のシグナルを示し、β２ｍシグナルは存在しない。ＭＳＩＡスペクトルは、非特異的化合物の２、３の追加シグナルと共にβ２ｍシグナルが支配する。
【００７６】
アフィニティー・ピペットに使用される多孔性ガラス分子トラップは、生体液のスクリーニングにおいてうまく機能した。アミン官能基化多孔性ガラス分子トラップの中間体ＣＭＤ増幅は、抗体のカップリング用に複数の取り付け点（カルボン酸基）を有する大きな親水性表面を提供した。その結果、各アフィニティー・ピペットの抗体装填は、抗体の飽和なしにβ２ｍの低濃度を捕捉するのに十分すぎるくらいである。また、親水性表面を、水性イオン性緩衝液でのリンスにより、たいていの非特異的結合化合物を含まないように洗浄できる。唾液サンプルを除いて、ＭＳＩＡは、β２ｍ由来のシグナルを圧倒的に示しながら、ほどよく明瞭な質量スペクトルを示した。唾液スクリーンのＳＤＳ洗浄は、スペクトルの品質を改善するが、非特異的化合物の全てを完全に除去しなかった。類似の調査において、これらの化合物（リゾチーム、α−デフェンシン、ヒスタチンとして質量により同定された）は、約１０のｐＩを有することが判り、ＨＢＳ緩衝液の中等度のｐＨ（７．８）および塩含量（１５０ｍＭＮａＣｌ）により破壊されない電荷相互作用（遊離カルボキシル基との）による保持を示唆する。したがって、唾液スクリーンが、生物学的に重要と思われる場合、他のリンスの組合せ（例えば、高度塩または各種界面活性剤）を調べる必要がある。しかしながら、非特異的化合物の存在（サンプルのいずれかに）がβ２ｍの明瞭な決定を妨害することなく、特徴的な分子質量における直接検出によって同定されたことは特記に値する。
定量
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを用いるタンパク質の定量は、多様なレーザー強度および分析対象物イオンシグナルの変動を引き起こすサンプル組成のスポット−スポットの相違を償うために内部基準の使用を必要とする。分析対象物のタンパク質と違った特徴を有するタンパク質は、内部基準（混合物から直接的タンパク質定量中、またはビーズ・アフィニティー媒体から溶出されたペプチドに対する内部基準標準の添加によりアフィニティー回収種のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ定量中に示されるような）として使用できるが、レーザー脱離／イオン化中に分析対象物と類似の挙動をする内部基準が一般に好ましい。この必要条件は、標的タンパク質と配列相同性を有する内部基準を選択することによりＭＳＩＡ中に満たされる：標的タンパク質の酵素的／化学的修飾による改造、標的タンパク質の切断／伸長組換え体、同位元素に富んだ媒体（例えば、１５Ｎまたは１８Ｏ）に組換え的に発現された（同じ）標的タンパク質、各種生体種と同じタンパク質。レセプターが、標的タンパク質および内部基準の両方を捕捉できると、ＭＳＩＡは、単独レセプター系の周囲をデザインできる。別途に、１種のレセプターが標的タンパク質を回収するのに用いられ、別種のレセプターが内部基準を回収するのに用いられる２種のレセプター系を想定することができる。
【００７７】
ここで選ばれた内部基準は、ウマβ２ｍ（Ｅβ２ｍ）であり、これはヒトの対応物と７５％の相同性を有し、Ｈβ２ｍよりも約３００Ｄａ低い（したがって、両種は、類似の特徴を分け合い、質量スペクトルにおいて容易に分析される）。例えポリクローナル抗β２ｍＩｇＧとＨβ２ｍまたはＥβ２ｍとの間の相対解離定数のデータが判らなくても、予備的研究により、抗体が、両種を保持するのに十分な交差反応性を表すことが示された。図３ａは、０．０１〜１．０ｍｇ／Ｌの濃度範囲でＨβ２ｍ標品のＭＳＩＡ分析を表すスペクトルを示す。Ｅβ２ｍシグナルに標準化された各スペクトルは、各検定点にとられた１０種の６５レーザーショットスペクトルの１つである。Ｈβ２ｍ濃度に対する各標品の１０回の標準化Ｈβ２ｍ積分値平均をプロットして、図３ｂに示された検量線となる。データの一次回帰フィッティングにより、Ｓ／Ｎ＞３の０．００２５ｍｇ／Ｌ（２１０ｐＭ）の検出作業限界および０．０１ｍｇ／Ｌ（８５０ｐＭ）の定量限界で、ＩＨβ２ｍ／ＩＥβ２ｍ＝４．０９[ｍｇ／Ｌ中のＨβ２ｍ]＋０．０２１（Ｒ２＝０．９８３）を得る。検量線上のすべての点において、標準誤差は約５％であった。
尿サンプル中のβ２ｍの定量決定
１０検体のサンプルを、４人から採取した：女性（３１才、妊娠；サンプル１検体（Ｆ３１））、男性（３０才；２日にわたりサンプル４検体（Ｍ３０））、男性（３６才；２日にわたりサンプル２検体（Ｍ３６））、男性（４４才；２日にわたりサンプル３検体（Ｍ４４））。サンプルを採取した時、各人全て良好な健康状態であった。１０検体の尿サンプルのＭＳＩＡによる結果を図４に示す。棒線は、各サンプルで決定されたβ２ｍ濃度を示し、各棒線上の挿入スペクトルは、Ｅβ２ｍに標準化されたそれぞれのＨβ２ｍシグナルを示す。１０検体のサンプルに関するデータは、０．１００±０．０２１ｍｇ／Ｌ（High＝０．１２７ｍｇ／Ｌ；Low＝０．０５８ｍｇ／Ｌ）のβ２ｍの平均濃度と著しい一致を示す。追加分析を、最近腎感染を受けた８６才の高齢女性（Ｆ８６）から得た尿サンプルに対して実施した。このサンプルに見出されたβ２ｍの著しく高い濃度のために（挿入スペクトルを参照）、検量線の動的範囲内のβ２ｍシグナルを維持するために、またＦ８６のβ２ｍ濃度（３．２３±０．０２ｍｇ／Ｌ）を正確に確立するために尿を定量的に１０倍希釈する必要があった。
翻訳後修飾
ＭＳＩＡの質量選択的検出は、尿中に存在し得るβ２ｍの変異体の発見と定量を可能にする。第２に、尿サンプルの定量的スクリーニング中、より高い分子質量種（Δｍ＝＋１６１Ｄａ）が、β２ｍと共に抽出された。この種は、恐らくβ２ｍのグリコシル化体（１つはヘキソ−ス）であり、Ｆ８６に最も顕著に観察される。図５は、Ｆ８６（２０倍希釈）およびＭ３６（希釈なし；比較用）の尿からとられた２種のＭＳＩＡスペクトルの重なりを示す。グリコシル化β２ｍの濃度は、Ｍ３６よりもＦ８６において非常に大きい。グリコ−β２ｍの上昇濃度の具体的な原因は、現在のところ確かでない。
【００７８】
以前の研究では、グリコシル化Ｈβ２ｍを、妥当な高濃度でドープした血清の直接ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析によりグリコシル化Ｈβ２ｍの定量を報告した。不十分な質量スペクトルの分解能および血清の妨害により、曲線フィッティング作業（ｆｉｔｔｉｎｇ  ｒｏｕｔｉｎｅ）は、複数のＨβ２ｍグリコ体のシグナルがもつれないために用いられ、次にその積分を、妥当な線形性（Ｒ２＝０．８８）の検量線の作図に使用するために、野生型β２ｍに標準化していた。しかしながら、本明細書に示されたデータは、著しく良好で、フィッティング作業の補助なしで厳密な定量を明確にサポートできるが、未修飾のβ２ｍに関して作図された検量線が、グリコシル化β２ｍの厳密な定量に直接利用できるかは確かでない。このような相関性には、両方のβ２ｍ体のアフィニティー定数および脱離／イオン化効率が等しいことが必要である。アフィニティー定数に関しては、ここに用いられるアフィニティー精製ポリクローナル抗体は、幅広い交差反応性（Ｈβ２ｍとＥβ２ｍの共抽出により例示されるように）を示し、それで、双方のＨβ２ｍ体は、類似効率で抽出される確立が高い。同様に、単独の炭水化物部分の添加は、相対的脱離／イオン化効率を厳密に減ずることはないはずだ。その結果、グリコシル化β２ｍ体の濃度は、健康な各人からの尿サンプル中の野生型β２ｍと概略的に同じ濃度の０．０７２ｍｇ／Ｌにおけるβ２ｍ検量線を用いて推定され得る。
【００７９】
野生型とグリコシル化β２ｍの両者が、単一の検量線を用いて定量できるかということにかかわらず、ＭＳＩＡにおいて決定された野生型β２ｍの濃度は、厳密に野生型β２ｍの濃度のみを表していて、両種を合わせたものではないということが特に重要である。したがって、ＭＳＩＡは、標的分析対象物の類似形体間を識別できない他の方法に優る特別の利点を有している。そこで、上昇したβ２ｍ濃度は、免疫系活性の一般的な指標として用いられ、一方、β２ｍグリコシル化は、より特定の疾患（例えば、透析関連のアミロイドシスに関連する進行性グリコシル化最終生成物（advanced glycosylated end-products））と関連し、ＭＳＩＡは、これらの独立の寄与因子を巻き込むことがないようにし、特定のバイオマーカーを特定の疾患に、より正確につなげる結果となる。
【００８０】
本報告に用いられ製造プロセスは、１０〜１００ｐモルの推測結合力を有し、一方、約１．５μＬのデッドボリュームを有するアフィニティー・ピペットを生成した。この結合／溶出比は、生体液に見られるβ２ｍ濃度と十分に見合うことが判った。さらに、アフィニティー・ピペットを用いるβ２ｍの効率的な捕捉は、サンプリング量を減少させた（生体液１００μＬ未満）。さらに、ここで用いられるアフィニティー・ピペットの化学は、４種の生体液のうち３種が非特異的結合を殆ど示さず、４番目｛唾液）でさえも分析上の妨害を分析に導入しなかった。
【００８１】
ＭＳＩＡの定量能力は、本発明に明確に例示される。ここで調べられたβ２ｍの濃度範囲（０．０１０〜１．０ｍｇ／Ｌ）は、全ての体液のβ２ｍ濃度を扱うのに十分である。良好な線形性が、約５％の総誤差で２つの１０単位の幅（Ｒ２＝０．９８３）以上で観察される。適切な基準標品の選択は、正確な定量にとって重要であり、本実施例において、β２ｍに富んだウマ尿の使用により満たされた。しかしながら、例えウマ尿が理想的なバックグラウンド媒体と見られても（緩衝液よりも真の分析材料をより近く模倣するため）、大多数のサンプルを長時間に亘って分析する場合、将来の分析において首尾一貫性を保証するためにも精製したＥβ２ｍに置き換える必要がある。
【００８２】
ここに示したスクリーニング研究は、臨床試験とみなされるほどには十分に広範囲にわたっていないが、尿サンプルのような生体サンプルで直接β２ｍを正確に同定並びに定量する上でのＭＳＩＡの有用性を例示している。このプロジェクトに尿を提供したベースラインの４人は、β２ｍと関連する知られた遺伝的疾病を有さず、または分析に先立つ１ヵ月以内に如何なる病気にも罹っていないことから健康であると考えられた。サンプルから保持されたβ２ｍの定量評価により、タンパク質の野生型配列に対応する分子質量を持つβ２ｍの単一シグナルが明らかとなった（０．０２％以内の実験誤差、Ｅβ２ｍシグナルを用いることにより内部で補正されたスペクトル；図４参照）。群内の定量分析は、他の研究の対照群で見出されたものと一致し、著しく一定したβ２ｍ濃度を示した。対照として、健康状態の良くない老人から得られた尿サンプルは、尿中β２ｍ濃度が著しい増加（約３０倍大きい）を示した。この推定は、質量スペクトルで容易に検出できるβ２ｍの高質量変異体からの妨害なしでなされたことを特記する必要がある（図５）。質量スペクトル中の２本の質量シフト（依然として関連する）シグナルの観測に関する最も妥当な説明は：１）野性型タンパク質、２）遺伝的多型または翻訳後修飾により存在する変異体、の存在である。この具体的な場合において、変異体は、β２ｍのグリコシル化体として＋１６１Ｄａの質量シフトにより最も容易に同定される；遺伝的多型による変異体は、質量シフトがいずれの一塩基多型（すなわち、[ＴＧＧ]−[ＧＧＧ]、結果Ｔｒｐ−Ｇｌｙ；ｄｍ＝１２９．１５Ｄａ）から生じる質量シフトよりも大きいので本質的に除外される。しかしながら、遺伝的多型の結果として有意な質量シフト（＞１５Ｄａ）を所有する変異体がサンプルに存在したなら、それらはグリコシル化β２ｍとして認識されたであろう。
【００８３】
最後に、そのＭＳＩＡでは、分析はかなり迅速に、比較的容易に実施されるので、この方法は分析法の迅速な開発や多数のサンプル分析に特に役立つ。分析の迅速さにより、完了したばかりの実験結果を分析する際、インキュベーションやリンスのプロトコルにおける変更が容易に実施できるリアルタイム法開発の可能性が開かれる。ひとたびこれらの方法が開発され、最適化されると、それらは、生体液のスクリーニングに容易に応用することができた。ここでサンプルは、約３種／時間の速度で分析され、所与の個人における数回の分析実施が１日以内で可能となった（図４、Ｍ３０に示す）。この分析速度は、複数サンプルの処理に適合するように設計されていない機器により本質的に制限されていた−今回は、サンプル調整から分析までが個別に行われたのである。しかし、複数サンプルを１つのアレイ化フォーマットに受け入れる並列ピペットステーションと質量分析計の使用により、この分析速度を１日数百回に増加させることが可能である。ここで、この様式で複合アフィニティー・ピペットを用いて、複数のサンプルを同時に調製、修飾、インキュベート、捕捉およびリンスするための、９６ウェルフォーマットタイタープレートを処理するピペットステーションについて説明する。サンプルはその後、同一フォーマットの質量分析計ターゲット・アレイ上へ溶出される。
統合自動装置
図７ａの質量アッセイシステムは、１つ以上の機能的プレステーション、使用ステーション、分析ステーションおよびポストステーションを含むコンジットシステム内にあるアフィニティー・マイクロカラムによる新しい生体（ｎａｓｃｅｎｔ）液分析対象物のハイ・スループット抽出用システムである。プレステーションは、サンプル情報を開始し、プレワークステーションおよび分析ワークステーション使用のために成分サンプルアレイおよびターゲットの組織化、調製、調合を行う。入ってくる生体液について、サンプル同定を行うが、これにより生体サンプルタイプ（血液、尿、細胞培養液など）などの最初のサンプルパラメータ、患者の病歴、病態、化学的パラメータプロフィル（ｐＨ、濁度など）などが確認され、最終出力分析データによる統合化のためのサンプル分類データベースがもたらされ、適合とフィードバックのデータベースを促進する。プレステーション高速液体操作およびそれに続く標識化と追跡により、サンプル源からの同定された生体液は区分された個々のサンプル採取アレイへと分配され、追跡のため標識化（例えばバーコード／レーザー読取）され、さらに適切な希釈または修飾（ｐＨ、界面活性剤の添加など）などのインライン操作が行われる。プレステーション、のもう１つの機能は、アレイ成分の調合および装填である。ここで、限定しないが、固体成分（プラスティック、ガラス、金属など）、液体試薬、ターゲットなどの成分アレイが形成され、および／または適切なアレイへと分配され、初期ワークステーションへと装填される。プレステーションから分子トラップのアレイは開始／貯蔵／サンプルステーション、初期ステーションによってアクセスされるか、またはサンプル処理のための使用ステーションへと再配置される。
【００８４】
プレステーションで行われる処理の例としては、限定しないが、多孔性分子トラップをアフィニティー・ピペットへと組み立てること、アレイ標識化、サンプル調製、サンプル修飾が挙げられる。これらの処理は、個体サンプルアレイ（プラスチックマイクロタイターなど）、アレイ標識、化学的／修飾試薬（例えば、貯蔵試薬、活性化試薬、緩衝剤、界面活性剤、還元剤など）、リンス液（緩衝液、超純水など）、脱離液（ＭＡＬＤＩマトリックス、酸、塩基、界面活性剤など）および分析ターゲットを用いて行われる。
【００８５】
プレステーションは、リガンドと分析対象物の別々のマイクロカラムによる活性化機能、サンプル回収／分離機能、およびサンプル移送／溶出機能が組み合わせられている。好ましくは、複数サンプルがプレステーションに装填され、サンプル１検体が分子トラップ配列中の一分子トラップに対応するよう、該複数サンプルは分子トラップアレイに一致させて空間的に配置される。
【００８６】
サンプルの配列は、プレステーションから自動的に使用ステーションへと再配置される。使用ステーションは、そこに含まれるサンプルおよび特定の分析対象物が処理されるところである。一実施形態において、分子トラップアレイの一端はサンプルまで下げられ、この同じサンプルが各分子トラップ内へと引き込まれる。各分子トラップは、分子トラップの表面に配置された親和性レセプターを有するので、サンプルを分子トラップに引き込むと、親和性レセプターにより探索された特定の分析対象物のいずれかに接触する。アレイ内の各分子トラップは、アレイ内の他の分子トラップの親和性レセプターとは異なった親和性レセプターを有し得るため、同一のまたは異なった媒体からの種々の特定分析対象物を標的にすることが可能となる。サンプル物質は、分子トラップ内へ１回、または数回引き込まれ得る。十分な特定分析対象物をアレイ内の分子トラップにより捕捉した後、残りの、すなわち捕捉されなかった媒体を少なくとも１回リンスで洗い落とす（しかし、他の実施態様ではリンス工程を必要としないこともある）。非標的化合物を洗い落した後、アフィニティー相互作用を阻止するために選ばれた溶液に、捕捉された特定の分析対象物を接触させることにより、それらを分子トラップから溶出する。溶出した特定の分析対象物は次に質量分析のため、直接調製するか、またはさらに、例えば、酵素的／化学的修飾などの処理のために調製してから、引き続いて質量分析のために調製する。プレステーションは、化学的修飾、分子トラップ、官能基化、生体液分析および／または移送のために複数の箇所から成り得る。最後に溶出した特定の分析対象物は、それらをターゲット・アレイにスタンプすることによりターゲット・アレイへと再配置される。
【００８７】
図７ｂを参照して、使用ステーションの好適な実施態様はさらに、分子トラップのアレイが取り付けられたマイクロカラムのマニフォールドを含む。該マイクロカラムマニフォールドは、自動装置のヘッドに取り付けられ、これが各処理ステーションの間、分子トラップのアレイを物理的に動かす。マイクロカラムマニフォールドの物理的運動は、直角（ｘｙ）または円形（回転）の挙動と成り得る。あるいは、使用ステーション内のマイクロカラムマニフォールドは静止し、処理ステーションは分子トラップのアレイの下に再配置されていてもよい。上述したマイクロカラムアレイの物理的運動と同様に、処理ステーションの物理的運動は、直角（ｘｙ）または円形（回転）の挙動と成り得る。さらなる実施態様では、マイクロカラムマニフォールドと処理ステーション双方が、共に物理的運動をすることが考慮されている。
【００８８】
好適な実施態様では、ターゲット・アレイは、少なくとも１個のターゲット・アレイを含有できる貯蔵／装填ステーションへと自動的に再配置される。貯蔵／装填ステーションから、ターゲット・アレイは、相互作用データベースを用いて、複数サンプルの入力と自動的処理／データ解析のできる自動化質量分析計へと移送される。
【００８９】
自動化質量分析計は、特定の分析対象物、または、高精度で検出された修飾フラグメントで実施される。サンプル間の、または標準からの差異を認識できるソフトウェアが、多数のサンプル分析に役立てるために使用され、新規情報システム、すなわち構造機能システム、臨床システム、診断システムおよび生化学的システムを確立する土台となる適切なデータベースを生み出す。生化学的システムとは一般的に生物器官内に見出されるタイプの分子に関与し、酵素的反応、結合反応、シグナル反応、その他の反応などの生体系に生じる異化反応およびタンパク質同化反応の全範囲を含む。他に生化学的システムは、具体的な生化学的相互作用を模倣したモデル系を含む。本発明の実用において、興味ある本発明の文脈内に示される例としては、例えば、レセプターリガンド相互作用、タンパク質−タンパク質相互作用、酵素−基質相互作用、細胞信号経路、輸送反応、遺伝子型分類、表現型分類が挙げられる。
【００９０】
質量分析による分析後、ターゲット・アレイは質量分析に続くサンプル処理、またはさらなる分析のためにポストステーションヘ移送できる。
【００９１】
したがって、一態様では、本発明はレセプター分子とそのリガンドとの間の相互作用に影響を及ぼすリガンドまたは化合物のスクリーニングに有用であろう。
インロボット官能性
【実施例２０】
【００９２】
官能基化多孔性分子トラップの自動装置におけるアミン活性化／誘導体化
別の方法は、上述したフォーマットの自動装置統合化を伴い、その過程で、自動装置における協調された活性化／誘導化に、グルタルアルデヒド活性化およびリガンドカップリングなどのプロトコルが使用される。ここでアミン官能基化多孔性ガラス分子トラップは、乾燥装填／据え付け（手動または機械補助で）され、温式Ｐ−２００幅口径ピペット・アフィニティー・ピペット（Roggins Corp.）となり、プラスティック９６ラックに装填される。このラックは６ステージ自動装置のステージ１上へと組み込まれ、種々のカップリング溶液およびリンス溶液を含有するマイクロタイタープレートを装填し、これをパーソナルコンピュータにつなぎ、ソフトウェアで制御する。グルタルアルデヒドのアミンマイクロカラムへのカップリングは、１ウェルにつき０．１０Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．８中の２５％グルタルアルデヒド溶液１１０μＬを含有する位置２にある９６ウェルのマイクロタイタープレートからの、１００回の反復吸引を用いて生じる。この最初のカップリングは、ステーション３（第２の９６ウェルのマイクロタイタープレートを含有、５０回の反復吸引）で達成される広範囲のＨＢＳ緩衝液リンス（１１０μＬ／ウェル）を必要とし、これにより迅速な自動装置媒介活性化カップリング（反応時間１０〜２０分）を生じる。ステーション４（約５０回の反復吸引）での最終の水リンス後、グルタルアルデヒド・マトリックス上の活性化アルデヒド基は、ステーション５（０．１〜１ｍｇ／ｍＬ、５５μＬ／ウェル、約２００回吸引）で、興味のあるタンパク質抗体とインキュベートされる。カップリングしなかった（過剰）抗体は、ステーション６でＨＢＳ緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０、５０回の反復吸引）を用いた徹底的なリンスにより除去する。
【実施例２１】
【００９３】
自動装置におけるアミンマイクロカラムのアミン活性化、増幅、再活性化および誘導体化
上に示した方法の拡張の１つは、グルタルアルデヒドの活性化に、続く自動装置における増幅と、リガンドカップリングに先立つ再活性化とを自動装置統合化するもので、自動装置にける協調した活性化／増幅／誘導体かを行うものである。本実施例では、アルデヒド官能基化多孔性ガラス分子トラップ（アルデヒド・マイクロカラム）を調製し、位置１に装填する。次に、グルタルアルデヒド・マイクロカラム上の活性化されたアルデヒド基を、自動装置ステージの位置２に装填したポリリジン（３０〜３００ｋＤａ）（１１０μＬ、ＨＢＳ中１ｍｇ／ｍＬ）と共にインキュベートすると、１つの重合骨格が形成され、そこから新たにグルタルアルデヒドに媒介された活性化が行われ、増幅マイクロトップ表面に抗体が結合する。
【００９４】
この最初のカップリング工程に続いて、ステーション３での徹底的なリンス、ＨＢＳ緩衝液の５０回反復吸引を行うと、急速な自動装置媒介活性化カップリングが生じる（反応時間３０分）。ステーション４での最終の水リンス（約５０回反復吸引）後、グルタルアルデヒド・マトリックス上の活性化アルデヒド基を、ステーション５（０．１〜１ｍｇ／ｍＬ、５５μＬ／ウェル、２００回反復吸引）で興味あるタンパク質抗体と共にインキュベートすると、ＭＡＳＳＡＹマイクロカラムはアフィニティー・ピペットとなる。カップリングしなかった（過剰）抗体は、ステーション６でＨＢＳ緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０）で完全にリンスして除去する。
【実施例２２】
【００９５】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ用の化学的にマスクされたターゲットとマイクロカラム溶出の準備
配列されたターゲットは、溶出条件下でマイクロカラムから送られる分析対象物サンプルを局在化する働きをする親水性ターゲットを提供する。これらの溶出条件は、分析の目的によって変わり、一般的に使用されるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマトリックス（アセトニトリル：０．２％ＴＦＡ水溶液が約１：２の比率の溶液中におけるアルファシアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸）、希釈酸、希釈塩基、カオトロピック剤などに亘る。
【００９６】
本実施例では、ターゲット表面は、興味のあるアッセイに用いられる生体材料の種類に応じて、目的の分析用に調製された化学的マスク内で、親水性ターゲットが疎水性バックグラウンドと協調して働くコントラストのある配列から成り立っている。目的にかかわらず、第１に必要なことは、リンスとインキュベーションの一連の表面洗浄である。最初にターゲット表面を界面活性剤で洗浄し、水リンスし、メタノールリンスし、次に、１０〜１５％過酸化水素水溶液中、室温（または昇温）で３０分から１時間インキュベートする。その後、洗浄表面を水リンス、メタノールリンスし、窒素乾燥し、ターゲット領域を興味あるアルキルメルカプタンによって誘導化する。陽イオン交換表面には、有機溶媒（イソプロパノールなど）中の飽和溶液として、１１−メルカプトウンデカン酸または３−メルカプト−１−プロパンスルホン酸が用いられる。この表面を直ちにオクタデシルメルカプタンの飽和溶液で被覆するか、またはイソプロパノール、続いてメタノールでリンスし、引き続きオクタデシルメルカプタンの飽和溶液で被覆する。化学的にコントラストを付けられた、すなわちマスク化された表面は、マイクロカラム分析対象物の局在化および質量分析によるサンプル分析用となる。これらの陽イオン交換表面は、一般的な生物学的材料での操作用に設計され、特に尿由来材料のアッセイの際に有用である。また、マスク化ターゲットは、正に荷電した官能基を用いて作製され、陰イオン交換体として使用されることもある。
【実施例２３】
【００９７】
生体サンプルのハイ・スループット統合システムＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析
本実施例では、ハイ・スループット統合システムの能力を示しながら新しい（ｎａｓｃｅｎｔ）生体液由来生体関連生体分子の並列処理と分析の統合システムを例示する。図８に示したのは、本発明の統合化されたシステムと方法を用いて行われる、ヒト血漿サンプル由来のベータ−２−ミクログロブリン（β２ｍ）のハイ・スループット半定量的分析である。６人から採取された希釈（５倍）ヒト血漿サンプルの一定分量を９６ウェルのサンプルプレート上に並行スクリーニング用に調製した。各ウェルに１５μＬの血漿一定分量（６人のサンプルは、９６ウェルプレート上に無作為化された）、７．５μＬのウマ血漿（未希釈、ウマβ２ｍを含み、ＭＷｅｑ．β２ｍ＝１１３９６．６，ＭＷｈｕｍ．β２ｍ＝１１７２９．２）および１２８μＬのＨＢＳ（０．０１ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．００５％（ｖ／ｖ）ポリソルビン酸塩２０、３ｍＭ  ＥＤＴＡ）緩衝液を入れた。９６個のサンプルから８個を任意に選び、その内の４個のウェルにβ２ｍの１０−２ｍｇ／ｍＬ溶液０．５μＬを加え、他の４個のウェルには、同じβ２ｍ溶液１μＬを加えた。並列サンプル処理は、９６本の抗β２ｍ誘導化マイクロカラム上、９６個のサンプルの同時インキュベーション／捕捉を伴う。アミノ被覆／修飾マイクロカラムに対するカルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）−ＥＤＣに媒介された抗体のカップリングにより、ポリクローナル抗β２ｍマイクロカラムが作製された。捕捉されたタンパク質は、少量のＭＡＬＤＩマトリックス（３３％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、０．２％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸中のαーシアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＡＣＣＡ）飽和溶液）により、マイクロカラムから溶出し、化学的にマスクされた自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）から構成されるＭＡＬＤＩターゲット・アレイ表面にスタンプされ、親水性／疎水性コントラストを有するターゲット・アレイとなる。ターゲット・アレイ上の各サンプルスポットは、質量分析を用いて分析され、相対的β２ｍ量は、自動ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析ソウフトウェアルーチンにより決定される。９６個のサンプルの高効率分析から得られた質量スペクトルを図８に示す。β２ｍ標準溶液を加えたサンプルからとられたスペクトルは黒塗りしてある。
【００９８】
図９の棒グラフによる表示で、図８で示されたハイ・スループットシステムにより生成された半定量データを説明する。図８で示された各スペクトルを、ベースライン積分により、ウマβ２ｍシグナルへと標準化し、ヒトβ２ｍシグナルに関する標準化積分を決定した。同一個体のサンプルから得られたスペクトルの全β２ｍ積分値を平均化し、標準偏差を計算した。同様に、１０−２ｍｇ／ｍＬのβ２ｍ溶液を０．５μＬおよび１．０μＬを加えたサンプルに関する積分値を計算し、平均化した。この図に描かれたものは、６人の個人サンプル、および該溶液を加えたサンプルに関する標準化ヒトβ２ｍ積分の平均値である。この棒グラフは、該溶液を加えたサンプルにおけるβ２ｍ濃度の増加を明らかに示しており、ヒト血液におけるβ２ｍ濃度の増加が種々の病態に関連していることを事実として確認した点で、本発明に記載されたシステムと方法を用いて実施されるハイ・スループット半定量的分析の価値を示している。
【００９９】
本発明内に述べられた統合システムおよび方法は、他に図１０のヒト血液のβ２ｍハイ・スループット定量分析に示されている。６人の血漿サンプルが、図８に記載されたとおり調製された。９６ウェルサンプルプレートのうち、８８個のウェルに１５μＬの血漿一定分量（６人のサンプルは、９６ウェルプレート上に無作為化された）。７．５μＬのウマ血漿（未希釈）および１２８μＬのＨＢＳ緩衝液を入れた。精製ヒトβ２ｍの７．６×１０−４ｍｇ／ｍＬ標準溶液の一連の希釈物を調製し（濃度は７．７×１０−４ｍｇ／ｍＬから１．１４×１０−４ｍｇ／ｍＬに亘る）、９６ウェルプレート上での最後の列（８ウェル）におけるサンプル（各１５μＬ）として用いた。並列サンプリング処理およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ分析は、ポリクローナル抗β２ｍマイクロカラムを用いて図８に記載されているとおり行った。８８個のサンプルおよび８個の標品のハイ・スループット分析から得られた質量スペクトルをこの図に示す。標準サンプルから得られたスペクトルは黒塗りしてある。
【０１００】
図１１ｂは、図１０に示された標準サンプルに関する図１１ａのデータから作図された検量線である。この検量線は、本発明で記載された統合システムおよび方法を用いたハイ・スループット分析によりスクリーニングされたヒト血漿サンプルにおけるβ２ｍ濃度を決定するために作製されている。検量線を作成するために用いられる各標品に関するデータの代表的なスペクトルを図１１ａに重ねて表している。各スペクトルを、ベースライン積分により、ウマβ２ｍシグナルへと標準化し、ヒトβ２ｍシグナルに関する標準化積分値を決定した。各検量標準に関してとられた５本のスペクトルの積分値が平均化され、標準偏差が計算された。検量（標準）線は、標準サンプル（ヒト血漿の希釈率によって調整されている）におけるヒトβ２ｍ濃度に対する、各標準の標準化積分値の平均をプロットすることにより作図した。作成された検量線を図１１ｂに示す。濃度範囲は、線全体において標準偏差＜２％で良好な直線性（Ｒ２＝０．９９９）を有して広がっている。
【０１０１】
図１２は、図１１ｂで作図された標準曲線を用いて、図１０で示されたデータを棒線解析したものを示す。図１０の８８個のサンプルに関し、各スペクルをベースライン積分によりウマβ２ｍシグナルへと標準化し、ヒトβ２ｍシグナルに関する標準化積分を決定した。同一個体に関するヒトβ２ｍ積分を平均化し、標準偏差を計算した。平均積分値を標準曲線から導いた等式で変換し、各個体に関してヒトβ２ｍ濃度を計算した。決定された濃度範囲は０．７５ｍｇ／ｍＬから１．２５ｍｇ／ｍＬであった。
【実施例２４】
【０１０２】
点突然変異に関するハイ・スループット・アフィニティ回収と生体反応性アレイＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析とを組み入れた組合せ統合システム法
図１３は、翻訳後修飾（ＰＴＭ）に関するトランスチレチン（ＴＴＲ）の定量的ハイ・スループット・スクリーニングであり、ここで記載されている統合システムと方法とを用いて点突然変異（ＰＭ）を実施した。６人から採取した希釈（５倍）ヒト血漿サンプルの一定分量を並行スクリーニングのために９６ウェルプレートに調製した。各ウェルに１５μＬの血漿分量（６人のサンプルは、９６ウェルプレート上に無作為化された）、および１３５μＬのＨＢＳ緩衝液を入れた。並列サンプル処理は、９６本の抗ＴＴＲ誘導化マイクロカラム上、９６個のサンプルの同時インキュベーション／捕捉を伴う。アミノ被覆／修飾マイクロカラムに対するグルタルアルデヒドに媒介された抗体のカップリングにより、ポリクローナル抗β２ｍマイクロカラムが作製された。捕捉されたタンパク質は少量のＭＡＬＤＩマトリックス（飽和ＡＣＣＡ溶液）により、マイクロカラムから溶出し、親水性／疎水性コントラスト・ターゲットとなるよう化学的にマスクされた自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）から構成されるＭＡＬＤＩターゲット・アレイ表面にスタンプされる。ターゲット・アレイ上の各サンプルスポットは、質量分析を用いて分析され、相対的ＴＴＲ量は、自動ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析ソウフトウェアルーチンにより決定される。９６個のサンプルのハイ・スループット分析から得られた質量スペクトルを図１３に示す。スペクトルの全てにおいて、ＴＴＲシグナルは、翻訳後プロセスを受けたＴＴＲを示す、より質量の大きいもう一つのシグナルを伴っている。また、ある血漿サンプルの分析から得られたスペクトル全ては、２本の「オリジナル」のＴＴＲシグナルから、約３０Ｄａ高い位置に、さらに２本のシグナルを示した。これらのピークの同定に関しては図１５および図１６を参照のこと。
【０１０３】
図１４は、ハイ・スループットＴＴＲ分析で観測された翻訳後修飾と点突然変異を、ここに記載されている統合システムと方法とを用いて同定したものである。２人のサンプル分析から得られた代表的スペクトルを示したが、それぞれ２本および４本のシグナルの存在が示されている。上のスペクトルでは、ＴＴＲに帰属する２本のシグナルが認められる。シグナルは、ＴＴＲの理論的に計算された質量（ＭＷＴＴＲ＝１３，７６２）およびＣｙｓ１０でのシステイン化（＋１１９Ｄａの質量シフトを導く）から生じる酸化ＴＴＲ変異体（ＴＴＲｏｘ）のそれによく対応している。下のスペクトルでは、上述した２本のＴＴＲシグナルに加えて、この２本の「原」ＴＴＲシグナルより約３０Ｄａ高い質量に、さらに２本のピークが見られる。これら２本のピークの同定に関しては図１５および図１６を参照のこと。
【０１０４】
引き続き行われたＴＴＲ点突然変異の分析は、図１５に示すように、本発明に記載されたシステムプラットフォームと方法における、誘導体化質量分析計ターゲット・アレイとハイ・スループットのアフィニティー回収との組合せを用いて明らかにされる。用いられたサンプルは、図１４で使用されたものと同じである。希釈した（ＨＢＳ中５０倍）ヒト血漿のＴＴＲは、図１３に記載されたとおり、ポリクローナル抗ＴＴＲマイクロカラムにより捕捉された。捕捉タンパク質は、マトリックス溶出の代わりに、サンプルのｐＨ調整（緩衝液交換）のための緩衝液含有ターゲットスポット（５０ｍＭ  ＴＲＩＳ緩衝液、ｐＨ９．５）を含むトリプシン結合ターゲット上に、少量の１０ｍＭＨＣｌで溶出した。この図に示されているのは、抗ＴＴＲマイクロカラムから溶出したタンパク質を４０℃でトリプシンにより２０分消化したものから得られた質量スペクトルである。得られた２枚のトリプシン消化によるペプチド・マップは、１０４〜１２７残基を含むトリプシン・フラグメント−１２（Ｔ１２）に変異があることを突き止めている。データベース検索により、この領域の配列における２つの可能なＴＴＲ変異が挙げられる：Ａｌａ１０９→Ｔｈｒ[ＤＮＡの塩基変化はＧＣＣ→ＡＣＣ]、Δｍ＝３０．０１１Ｄａ，Ｔｈｒ１１９→Ｍｅｔ[ＤＮＡの塩基変化はＡＣＧ→ＡＴＧ]、Δｍ＝２９．９９２Ｄａ。正しい変異の同定を図１６に示す。
【０１０５】
図１６は、図１５に示された血漿サンプル分析で検出された点突然変異の正体を決定するために用いられた高分解能リフレクトロン型質量分析法であり、本発明に記載された統合システムおよび方法に組み込まれている。標準（天然）ＴＴＲにおけるトリプシン消化フラグメントＴ１２（１０４〜１２７）のモノアイソトピック・シグナルは、ｍ／ｚ＝２６４４．９２２であり、変異ＴＴＲのモノアイソトピック・シグナルと、Δｍ＝２９．９８８Ｄａの差を示す。したがって、点突然変異は、Ｔｈｒ１１９→Ｍｅｔ、Δｍ＝２９．９９２Ｄａに帰着する。このＴＴＲ点突然変異は、いわゆる非アミロイド変異である「シカゴプレアルブミン」変異となる。図１３、図１４、図１５、図１６に合わせて示された結果は、生体サンプルの協奏的ハイ・スループット・スクリーニング分析による翻訳後修飾および点突然変異の同定に関する、本明細書に記載されたシステムと方法の使用を説明している。
【実施例２５】
【０１０６】
翻訳語修飾（ＰＴＭ）の解析のための、ハイ・スループット・アフィニティ回収と生体反応性アレイＭＡＬＤＩ−ＴＯＦとを組み入れた統合組合せ法
図１７ａは、本明細書に記載された統合システムと方法とを用いて実施された、生体液に存在する翻訳後修飾に関する定量的ハイ・スループット・スクリーニングの代表例である。協奏的な生体液リン酸塩分析が、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）官能基化ターゲット・アレイと共にキレータ・アフィニティー・ピペットを用いて実施された。ここでキレータ・アフィニティー・ピペットは、実施例１４に従って以前開示されたとおり調製した。遠心分離し、１０倍に希釈したヒト全唾液をサンプル内で金属キレータ・アフィニティー・ピペットによるインキュベーション後に分析した。金属キレータ・アフィニティー・ピペットから捕捉された分析対象物は、キレータ／金属／分析対象物の相互作用を撹乱させるため希釈酸の添加により溶出して親水性／疎水性コントラスト・ターゲット・アレイ、またはアルカリホスファターゼ消化のために緩衝液交換を組み込んだ。希釈ヒト唾液の直接分析では、プロリンに富む興味あるタンパク質に著しく欠ける。図１７ｂ（２）のスペクトルは、２つのリン酸塩に富むタンパク質、ＰＲＰ−１およびＰＲＰ−３として示された金属キレータ・アフィニティー・ピペットの捕捉を示している。脱リン酸化の質量シグナルとして、図１７ｂ（３）で小さなスペクトルが見られ、図１７ｂ（４）では完全な形で見られる。リン酸化現象などの翻訳後分析のために生体液から捕捉／消化されたリンタンパク質の部分的および完全リン酸化を伴う複数分析対象物の検出が示されている。
【実施例２６】
【０１０７】
新しい（ｎａｓｃｅｎｔ）タンパク質複合体の回収に必要なアフィニティー複数タンパク質相互作用に関するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析による統合システム法
本実施例では、生体材料または生体サンプル中に存在する天然の複数タンパク質複合体の回収を可能にするタンパク質間相互作用が示される。図１８で示されるのは、本発明の統合システムと方法を用いて実施されたヒト血漿サンプルのレチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）とトランスチレチン（ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ）（ＴＴＲ）との間の複数タンパク質複合体である。グルタルアルデヒド仲介性のアミン塩基支持表面カップリングを用いてポリクローナル抗ＲＢＰアフィニティー・ピペットが形成された。上記実施例で記載したとおり、ヒト血漿が調製され、使用された。ＭＳＩＡは、ＲＢＰおよび複合ＴＴＲのｉｎ  ｖｉｖｏアフィニティー回収を示している。レチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）とトランスチレチン（ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ）（ＴＴＲ）との間の複数タンパク質複合体は、天然のタンパク質複合体の中にタンパク質相互作用が存在することを示している。
【実施例２７】
【０１０８】
ハイ・スループット複数分析対象物回収とＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析とを組み入れた統合システム法
本実施例では、本発明に係る統合システムと方法を用いた迅速な定性化と半定量のために実施されたヒト血漿サンプルの複数分析対象物分析を例示するために、複数レセプター・アフィニティー・マイクロカラムによるハイ・スループット法を記載する。図１９に、相対量の複数分析対象物の同時迅速モニタリングを示す。ヒト血漿からそれぞれの分析対象物を迅速に捕捉するために、アミン活性化ポリクーナル抗ｂ２ｍ／ＣｙｓＣ／ＴＴＲアフィニティー・ピペットを、前述のとおり使用した。次にこれは、生体液濃度調整を迅速にモニターするため、また、それらの標準化相対量からの調整化されたタンパク質事象を定量化するための、β２ｍ、ＣｙｓＣおよびＴＴＲに対する複数抗体アフィニティー・ピペットの使用例を例示している。さらに、ウィルス感染の急性期またはβ２ｍまたはＴＴＲからのフィブリル形成における潜在的β２ｍ／ＣｙｓＣ濃度のモニタリングに関する本発明の統合システムと方法におけるアフィニティー・ピペットの使用法を例示している。
【０１０９】
図２０には、本発明の統合システムと方法における完全な複数分析対象物アフィニティー・ピペットの迅速モニタリングを示す。ヒト血漿（前例で述べたとおりに得）からのそれぞれの分析対象物を捕捉するために、β２ｍ、ＴＴＲ、ＲＢＰ、シスタチンＣまたはＣＲＰを組み入れた個々のポリクローナル抗体アフィニティー・ピペットと同様にその組合せもまた用いられた。生体液濃度調整を、迅速にモニターするため、また、場合によってはそれらの標準化相対量からの調整タンパク質事象を定量するために、β２ｍ、ＣｙｓＣおよびＴＴＲまたはＣＲＰに対する複数／単一抗体アフィニティー・ピペットのもう１つの使用法を例示している。さらに、ウィルス感染（エイズなど）の急性期またはβ２ｍまたはＴＴＲからのフィブリル形成における潜在的β２ｍ／ＣｙｓＣ濃度のモニタリングに関するアフィニティー・ピペットのもう１つの使用法を例示している。
【０１１０】
サンプルを効率的に増加できる能力が与えられると、生体分子の質量分析に関するハイ・スループットシステムの統合化で、大規模な臨床的、診断的、治療的有効性において、また、生体液からの生物学的に重要な生体分子分析での、例外的な定性分析および定量分析の双方が必要である応用における使用が増える。
【０１１１】
本明細書で用いられる「アフィニティー・マイクロカラム」とは、ハウジング内に含まれる分子トラップを指す。
【０１１２】
ここで用いられる「アフィニティー試薬」とは、分子トラップの表面にあり、化学的に活性化されているか、または活性化可能であって、親和性レセプターが共有結合し得る化学分子種を指す。
【０１１３】
本明細書で用いられる「親和性レセプター」とは、生体材料または生体サンプル中に存在している分析対象物に対し親和性を有する原子種または分子種を指す。親和性レセプターは、天然の有機物、無機物または生体物質であってよく、また広汎な（多数の分析対象物が標的）特異性から狭い（単一分析対象物が標的）特異性を示し得る。親和性レセプターの例としては、抗体、抗体フラグメント、パラトープ、ペプチド、ポリペプチド、酵素、タンパク質、複数サブユニットタンパク質レセプター、ミミック（ｍｉｍｉｃ）、有機分子、ポリマー、無機分子、キレータ、核酸、アプタマー、および後述のレセプターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１４】
本明細書で用いられる「分析対象物」とは、生体サンプル中に存在する興味ある分子を指す。分析対象物としては、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、ペプチド、ホルモン性ペプチド、ホルモン、ポリペプチド、タンパク質、タンパク質複合体、生物学的機能を有する炭水化物または無機低分子または有機低分子などが挙げられるが、これらに限定されない。分析対象物は、当然親和性レセプターにより認識される配列、要素または基を含み得るか、または細胞の、細胞外の、酵素的、化学的処理により、それらの中に導入されたこれらの認識部分を有し得る。
【０１１５】
本明細書で用いられる「生体材料」または「生体サンプル」とは、生体起源の液体または抽出物を指す。生体材料は、限定されないが、細胞抽出物、核抽出物、細胞ライゼート、分泌物、血液、血清、血漿、尿、たん、滑液、脳−脊髄液、涙液、糞便、唾液、膜抽出物などであり得る。
【０１１６】
本明細書で用いられる「化学的活性化」とは、引続く鎖状化リンカーや親和性レセプターを攻撃（光活性化）するために、アフィニティー試薬を化学物質（または光）に曝露する処理を指す。アフィニティー試薬を活性化できる試薬は、限定されないが、有機試薬、無機試薬、または生物学的試薬であり得る。鎖状化リンカーの使用を含む複数の工程を用いて、アフィニティー試薬を活性化することがしばしば有益である。ここで用いられる「鎖状化リンカー」とは、高濃度の親和性レセプターで誘導体化することができ、非特異的化合物とは結合性が低いという望ましい特徴を示すアフィニティー試薬および親和性レセプターとの仲介をする化合物を指す。鎖状化リンカーは、本来活性であり得るか、または付加のために活性化を要してもよい。好適な鎖状化試薬としては、限定はしないが、ホモ／ヘテロ機能有機物、天然ポリマー、合成ポリマー、および生体ポリマーが挙げられる。
【０１１７】
本明細書で用いられる「デッドボリューム」とは、分子トラップ内の空の容積を指す。ここで用いられる「少デッドボリューム」とは、１ナノリットルから１ミリリットルの範囲を指す。
【０１１８】
本明細書で用いられる「高流動性」とは、最低でも１分間に１マイクロリットルの流速を指す。それより高い流速が、高流動性の定義の中に入ると考えられる。
【０１１９】
本明細書で用いられる「質量分析計」とは、分析対象物を揮発／イオン化して気相イオンを形成し、それらの絶対的または相対的分子量を測定することのできるデバイスを指す。揮発化／イオン化の好適な形態は、レーザー／光、熱、電気、噴霧／スプレーなど、またはそれらの組合せである。質量分析の好適な形態は、限定はされないが、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ、エレクトロスプレイ（またはナノスプレー）・イオン化（ＥＳＩ）質量分析、四重極イオントラップ、フーリエ変換イオンサイクロトロン（ＦＴ−ＩＣＲ）、磁気セクターなど、またはそれらを組み合わせた質量分析計が挙げられる。
【０１２０】
本明細書で用いられる「質量分析計のターゲット」または「質量分析計のターゲット・アレイ」とは、その上、またはその中に、連続的質量分析のために、１個以上の分析対象物が置かれる装置を指す。一般にターゲットは、質量分析計の性質によって多くのサンプルに適応し、種々の幾何学的配置をとるが、その質量分析計用にターゲットが選択される。ターゲットを構築するために好適な物質としては、金属、ガラス、プラスティック、ポリマー、多層体など、またはそれらの組合せが挙げられる。
【０１２１】
本明細書で用いられる「分子トラップ」とは、表面に結合したアフィニティー試薬を中に含み、高流動性および少デッドボリュームを有する広表面積物質を指す。広表面積物質の組合せは、限定しないが、結晶、ガラス、プラスティック、ポリマー、金属、またはこれらの物質の何れかの組合せであり得る。例えば、これらのガラスは、石英ガラス、ホウケイ酸、ホウケイ酸ナトリウム、および他の有用な物質であり得る。
【０１２２】
本明細書で用いられる用語「レセプター」とは、一般に特異的に認識し、互いに結合する１対の化合物のうちの一員を指す。対の他方の一員は「リガンド」と呼ばれ、錯体、タンパク質−タンパク質層相互作用、複数分析対象物分析などのようなものを含む。レセプター／リガンド対形成としては、タンパク質レセプター、（膜性）およびその天然リガンド（関連した、または他のタンパク質または低分子）を挙げることができる。レセプター／リガンド対としては、また、抗体／抗原結合対、相補的核酸、核酸関連タンパク質およびアプタマーやそれらのタンパク質などのそれらの核酸リガンド、金属キレータおよび金属結合タンパク質リガンド、擬染料およびそれらのタンパク質リガンド、有機分子およびそれらの相互作用、生体分子状の、または生体分子を有する疎水性パッチのようなもの、生体分子上の、または生体分子を有するイオン交換体およびそれらの静電相互作用などを挙げられる。
【０１２３】
本明細書で用いられる「自動装置」とは、サンプルの非参加処理の可能なデバイスおよび方法を指す。自動装置は、与えられた時間内に処理、分析するサンプルの数を最大化するために、多数のサンプルを並行して操作することが好ましい。
【０１２４】
本発明の好適な実施態様は、図面と好適な実施態様の説明において説明してある。これらの記載は、直接上の実施態様を説明しているが、当業者は、ここに示された特定の実施態様に対する変更および／または変形を考えることができると解される。本記載の範囲に入るそのような修飾または変更はいずれも同様にそこに含まれることが意図される。特に注記しない限り、明細書および特許請求の範囲における語句は、その適用業界における通常の当業者に対して、通常の慣用的意味が与えられることが発明者の意図である。出願時に出願者に知られている発明の好適な実施態様および最善の形態は提示されており、例示と記述の目的が意図されている。徹底性や、本発明を開示されたそのままの形に限定する意図はなく、上記の教示に照らして、多くの修飾や変更が可能である。実施態様は本発明の原理や実用的な応用を最もよく説明し、他の当業者によって考えられる特別な使用法に適合するように種々の実施態様において、また種々の修飾によって本発明を最も良く利用できるように選択し、説明した。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】ＭＳＩＡ法を示す図である。分析対象物は、レセプター誘導体化アフィニティー・ピペットを通して反復フローを行うことにより溶液から選択的に回収される。非特異的に結合した化合物を洗浄した後、保持された分子種は、（好適な実施態様においては）ＭＡＬＤＩマトリックスを用いて質量分析計ターゲットまたはターゲット・アレイ上に溶出される。次にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより、分析対象物の正確なｍ／z値を検出する。分析は、本来定性的であるが、分析対象物の質量シフト変異体を内部基準として使用する手法に組み入れることにより定量もできる。
【図２】生体液のβ２−ミクログロブリンのＭＳＩＡスクリーニングを示す図である。サンプルは、生体液をＨＢＳ（単独のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ用のＨ２Ｏ）で希釈することにより調製した。アフィニティー・ピペットをＨＢＳと水を用いて洗浄してから、ＡＣＣＡ（ＡＣＮ：Ｈ２Ｏ、１：２に飽和；０．２％ＴＦＡ）を用いて質量分析計のターゲット上に直接保持された化合物を溶出する。（Ａ）ヒト涙液。（Ｂ）ヒト血漿。（Ｃ）ヒト唾液−唾液は、非特異的結合を減じるために、０．０５％ＳＤＳ（水中）で追加のリンスを必要とした。（Ｄ）ヒト尿。全ての場合に、β２ｍを、フロー・インキュベート／リンス手法を用いて生体液から効率的に回収した。β２ｍに関して測定された（外部較正を用いて）質量は、計算値（ＭＷｃａｌｃ＝１１，７２９．７；ＭＷｔｅａｒｓ＝１１，７３５；ＭＷｐｌａｓｍａ＝１１，７３４；ＭＷｓａｌｉｖａ＝１１，７４２；ＭＷｕｒｉｎｅ＝１１，７３５）の約０．１％以内であった。方向づけされた、迅速、鋭敏で正確な分析のためのＭＳＩＡによる種々の生体液スクリーニングを例証した。
【図３ａ】β２ｍの定量的ＭＳＩＡ検量線を示す図である。検量線を作成するために用いられたデータの代表的なスペクトル。０．０１〜１．０ｍｇ／Ｌの濃度のヒトβ２ｍについて調べた。ウマのβ２ｍ（ＭＷ＝１１３９６．６）を内部基準として用いた。
【図３ｂ】図３ａに表されるデータを用いて作成された検量線を示す図である。２〜１０の範囲に亘って、良好な直線性（Ｒ２＝０．９８３）を低い標準誤差（〜５％）で得られた。エラーバーは、各サンプルからとられた１０回反復の６５−レーザーショットスペクトルの標準偏差を反映する。これらの図は、β２ｍ−アフィニティー・ピペットにより実施された定量的ＭＳＩＡを例証する。
【図４】β２ｍの定量的ＭＳＩＡスクリーニングを示す図である。５人からのヒト尿サンプルを２日間かけてスクリーニングを行った。健康人（１０サンプル；４人（３人の男性；１人の女性）年齢３０〜４４才）で測定された平均値は、０．１００±０．０２１ｍｇ／Ｌであった。最近尿路感染した８６才の女性で測定された濃度について、β２ｍ濃度が有意に増加したことを示した（３．２３±０．０７２ｍｇ／Ｌ）。
【図５】８６才の女性においてグリコシル化β２ｍの濃度増加を示すＭＳＩＡの図（暗灰色）である。ＭＳＩＡ中、第２のシグナルは、Δｍ＝＋１６１Ｄａに観測され、グリコシル化β２ｍの存在を示した。ＭＳＩＡは、２種のβ２ｍ体を十分に分解でき、発生期（ｎａｓｃｅｎｔ）β２ｍのより正確な定量を得て糖タンパク質の定量を可能にした。このような識別化は、２種のβ２ｍ体が、異なる疾病から由来する（またはマーカーである）ことを考慮する上で重要である。グリコシル化を殆ど示さない健康人のＭＳＩＡを、比較のために示している（明灰色）。
【図６】定義された生体液／β２−ミクログロブリン特異性に関して表面利用型のＭＳＩＡを示す図である。カルボキシメチルデキストラン増幅により結合されたポリクローナル抗β２ｍアフィニティー・ピペットの使用、またはアミン塩基支持化学は、生体液／ＭＳＩＡ中の非特異的結合化合物と特異的結合化合物との識別化を可能にする。サンプルは、生体液から調製され、図２に示すとおり使用した。（Ａ）ヒト血漿。（Ｂ）ＣＭＤ増幅β２ｍアフィニティー・ピペットを通したヒト血漿。（Ｃ）アミン／グルタルアルデヒド結合β２ｍアフィニティー・ピペットを通したヒト血漿。ヒト血漿スペクトルの直接的分析（上段スペクトル）は、β２ｍ質量信号（ＭＷｐｌａｓｍａ＝１１，７３４）を欠く。ＣＭＤは、アフィニティー・ピペット化学標的β２ｍを増幅したが、非特異的結合化合物を示す（中段スペクトル）。最後の場合のみ、β２ｍは、低濃度の非特異的結合化合物を有する生体液から効率的に回収される（下段スペクトル）。これは、特定の質量検出のため注意深くアフィニティー・ピペットを用いて血液由来の生体液バイオマーカーの指向分析における好適な面を例証している。
【図７ａ】生体材料から生体分子のハイ・スループット分析のため統合システムを説明する模式図である。
【図７ｂ】使用されるステーションを示す拡大模式図であり、これは、化学修飾、マイクロカラムの官能基化、生体液分析、移動などのための複数の配置を有するマイクロカラム統合自動装置から構成される。
【図８】β２ｍＭＳＩＡのハイ・スループット半定量分析を示す図である。ヒト血漿サンプルからのβ２ｍは、本発明に記載された統合システムおよび方法を用いた。
【図９】図８に示されたデータの棒グラフ解析を示すグラフである。図８に示された各スペクトルは、ベースラインの積算によりウマのβ２ｍシグナルに標準化し、ヒトβ２ｍシグナルの標準化積分を測定した。同じ個体のサンプルから得られたスペクトルの全β２ｍ積分を平均化し、標準偏差を計算した。同じく、１０−２ｍｇ／ｍＬβ２ｍの０．５μＬおよび１．０μＬでスパイクされたサンプルの積算を計算し、平均化した。６人からのサンプルおよびスパイクされたサンプルの基準化ヒトβ２ｍ積算の平均値を、この図にプロットしている。この棒グラフは、スパイクサンプルにおけるβ２ｍ濃度の上昇が明瞭に確証しており、種々の疾患状態に関連するヒト血液中のβ２ｍ濃度上昇の確証において、本発明に記載されたシステムと方法により実施されたハイ・スループット半定量分析の値を例証している。
【図１０】本発明に記載された統合システムおよび方法を用いたヒト血漿サンプルからのβ２ｍのハイ・スループット定量分析を示す図である。
【図１１ａ】本発明に記載された統合システムおよび方法を用いてハイ・スループット分析によりスクリーンされたヒト血漿サンプル中のβ２ｍ濃度を決定する目的で、図１０に示された標準サンプルのデータから検量線の作図を示す図である。
【図１１ｂ】本発明に記載された統合システムおよび方法を用いてハイ・スループット分析によりスクリーンされたヒト血漿サンプル中のβ２ｍ濃度を決定する目的で、図１０に示された標準サンプルのデータから検量線の作図を示す図である。
【図１２】上記で作図された検量線を用いて上記に示されたデータの棒グラフ解析を示すグラフである。図１０における８８個のサンプルスペクトルの各々を、ベースライン積算によりウマのβ２ｍシグナルに標準化し、ヒトβ２ｍシグナルの標準化積分を測定した。同じ個体のヒトβ２ｍ積分を平均化し、標準偏差を計算した。平均化積分値を図１１ｂの検量線から誘導された式中に置き換えて、ヒトβ２ｍの濃度を、各人に対して計算した。決定された濃度範囲は、０．７５ｍｇ／Ｌから１．２５ｍｇ／Ｌである。
【図１３】本発明に記載された統合システムと方法を用いて、翻訳後修飾（ＰＴＭ）および点突然変異（ＰＭ）に関するトランスチレチン（ｔｒａｎｓｔｈｒｅｔｉｎ）（ＴＴＲ）の定量的ハイ・スループット・スクリーニングを示す図である。
【図１４】本発明に記載された統合システムと方法を用いて、ハイ・スループットＴＴＲ分析に観察される翻訳後修飾および点突然変異の同定を示す図である。
【図１５】本発明に記載されたシステムと方法における誘導体化質量分析計ターゲット・プラットフォームの組み入れよる点突然変異の同定を示す図である。
【図１６】図１５に示された血漿サンプルの分析で検出された点突然変異の同一性を決定するのに、本発明に記載された統合システムと方法の一部として高分解能レフレクトロン質量分析の使用を示す図である。
【図１７ａ】生体液リン酸塩分析−キレータ・アフィニティー・ピペットとアルカリフォスファターゼ官能基化ターゲット・アレイとの協奏を示す図である。（１）ヒト全唾液（１０倍希釈の１０μＬ）。（２）ＥＤＴＡ／Ｃａ２＋アフィニティー・ピペットを通した（１）のサンプル。（３）１０ｍＭＨＣｌ添加により溶出し、５０ｍＭのホウ酸緩衝液とｐＨ＝１０緩衝液交換を組み入れたＡＰ−ＢＲＰ上にスタンプし、１５分間のリン酸塩で消化（５０℃）した（２）のサンプル。（４）３０分間消化を延長した（３）のサンプル。ヒト唾液の１０倍希釈の直接分析は、興味のあるプロリンに富むタンパク質−１（ＰＲＰ−１）とセリン修飾リン酸に富むタンパク質を著しく欠く。
【図１７ｂ】（２）のスペクトルは、２種のリン酸塩に富むタンパク質である、ＰＲＰ−１とＰＲＰ−３のＥＤＴＡ／Ｃａ２＋アフィニティー・ピペット捕捉を示す図である。脱リン酸化の質量信号は、微量スペクトルの（３）に、また完全スペクトルの（４）にはっきりと表われている。翻訳後分析（すなわちリン酸化事象）のために生体液から捕捉され／消化されたリン酸化タンパク質の部分的並びに完全な脱リン酸化により伴う複数の分析物の検出を例示する。
【図１８】レチノール結合タンパク質（ＲＢＰ)とトランスチレチン（ＴＴＲ）との複数タンパク質複合体のＭＳＩＡを示す図である。活性アミン、ポリクローナル抗ＲＢＰアフィニティー・ピペットを、グルタルアルデヒド媒介アミン塩基支持表面カップリングにより形成した。ヒト血漿を調製し、図８の分析に用いた。ＭＳＩＡは、ＲＢＰ（ＭＷ＝２１，０６２Ｄａ）および複合化ＴＴＲ（ＭＷ＝１３，７６０Ｄａ）のｉｎ  ｖｉｖｏ・アフィニティー回収を示す。天然タンパク質複合体に存在するタンパク質相互作用を例示する。
【図１９】相対存在比に係る複数分析対象物を同時かつ迅速なモニタリングを示す図である。活性アミン、ポリクローナル抗β２ｍ／ＣｙｓＣ／ＴＴＲアフィニティー・ピペットを、ヒト血漿（ＨＢＳ中５０倍希釈）から迅速にそれぞれの分析対象物を捕捉するのに用いる。本図は、生体液濃度変調を迅速にモニターするため、また標準化相対存在比から変調タンパク質事象を定量するためにβ２ｍ、ＣｙｓＣおよびＴＴＲに対し複数の抗体アフィニティー・ピペットの１使用例を示す。本図は、ウィルス感染（エイズなど）の急性期、或いはβ２ｍまたはＴＴＲからのフィブリル形成における潜在的β２ｍ／ＣｙｓＣ濃度をモニタリングするためのアフィニティー・ピペットの１使用例を示す。
【図２０】広範囲の複数分析対象物のアフィニティー・ピペットの迅速なモニタリングを示す図である。個々のβ２ｍ、ＴＴＲ、ＲＢＰ、シスタチンＣまたはＣＲＰを組み込んだポリクローナル抗体アフィニティー・ピペット／組合せは、ヒト血漿（ＨＢＳ中５０倍希釈）からのそれぞれの分析対象物を捕捉する。本図は、生体液濃度変調を迅速にモニターするため、また場合によっては標準化相対存在比から変調タンパク質事象を定量するためにβ２ｍ、ＣｙｓＣおよびＴＴＲに対し複数／単独の抗体アフィニティー・ピペットの１使用例を示す。本図は、ウィルス感染（エイズなど）の急性期、或いはβ２ｍまたはＴＴＲからのフィブリル形成における潜在的β２ｍ／ＣｙｓＣ濃度をモニタリングするためのアフィニティー・ピペットの他の使用例を示す。
【図２１】質量分析ターゲット・アレイを示す図である。（Ａ）メニスカス作用によりサンプルを閉じ込めることのできる台状ターゲット。（Ｂ）疎水性／親水性作用によりサンプルを閉じ込めることのできる対照デザイン。（Ｃ）より小さなサンプリング充填、高価な試薬、またはサンプル移送に使用する挿入ターゲット。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図９】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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