(57)【要約】本発明は、細胞においてアポトーシス（プログラム細胞死の形態）を誘導するための突然変異Ｅ２ポリペプチドの使用に関する。突然変異Ｅ２由来のポリペプチドはｐ５３結合欠損性である。好ましくは、上記ポリペプチドはｐ５３を結合することが不可能であるか、またはｐ５３を結合することが可能であるが、ｐ５３依存性アポトーシスを誘導することが不可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＰＶ  ＤＮＡを含有する細胞を死滅させる方法であって、前記細胞をｐ５３結合欠陥ＰＶ  Ｅ２由来のポリペプチドと接触させることを含む方法。
【請求項２】
前記細胞は、ＰＶで形質転換されているか、またはＰＶに感染している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＨＰＶ  ＤＮＡは前記細胞ゲノムに組み込まれる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＨＰＶ  ＤＮＡはエピソームとして前記細胞中に存在する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記ＨＰＶ  ＤＮＡは、エピソームおよびゲノムに組み込まれたＤＮＡの両方として前記細胞中に存在する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
ＰＶ形質転換細胞および／またはＰＶ感染細胞においてアポトーシスを誘導する方法であって、前記細胞をｐ５３結合欠陥ＰＶ  Ｅ２由来のポリペプチドと接触させることを含む方法。
【請求項７】
ＰＶ形質転換細胞および／またはＰＶ感染細胞を死滅させる方法であって、前記細胞を、ｐ５３結合欠陥ＰＶ  Ｅ２由来のポリペプチドをコードするｐ５３結合欠陥ＤＮＡ配列と接触させることを含む方法。
【請求項８】
ＰＶ形質転換細胞およびＰＶ感染細胞を死滅させる方法であって、前記細胞を、ｐ５３結合欠陥ＰＶ  Ｅ２由来のポリペプチドと接触させることを含む方法。
【請求項９】
ＰＶ形質転換細胞およびＰＶ感染細胞を死滅させる方法であって、前記細胞を、ｐ５３結合欠陥ＰＶ  Ｅ２由来のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と接触させることを含む方法。
【請求項１０】
前記ヌクレオチド配列は、ＶＰ２２に融合したｐ５３結合欠陥ＰＶ  Ｅ２由来のポリペプチドをコードする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｐ５３結合欠陥Ｅ２由来のポリペプチドは、ヒスチジンタグ付きＶＰ２２融合タンパク質として送達される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ヌクレオチドは、ヒスチジンタグ付きＶＰ２２に融合されたｐ５３を結合することが不可能なＰＶ  Ｅ２由来のポリペプチドをコードする、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
５０％を上回る前記細胞を死滅させる、先行の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
８０％を上回る前記細胞を死滅させる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
９０％を上回る前記細胞を死滅させる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
アポトーシスが誘導される前記細胞は腫瘍形成性である、先行の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞は癌性であり、前記癌は、子宮頸癌、外陰部癌、口腔癌または食道癌から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞は哺乳動物である、先行の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞はヒト細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞は哺乳動物被験体である、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ｐ５３結合欠陥Ｅ２由来のポリペプチドは、ｐ５３を結合することが可能であるが、ｐ５３依存性アポトーシスを誘導することが不可能である、先行の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
子宮頸癌の治療または改善のための薬学的組成物におけるｐ５３結合欠陥ＰＶ  Ｅ２由来のポリペプチドの使用。
【請求項２３】
性器いぼの治療または改善のための薬学的組成物におけるｐ５３結合欠陥Ｅ２由来のポリペプチドの使用。
【請求項２４】
子宮頸癌の治療または改善のための薬学的組成物におけるｐ５３結合欠陥Ｅ２由来のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の使用。
【請求項２５】
性器いぼの治療または改善のための薬学的組成物におけるｐ５３結合欠陥Ｅ２由来のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の使用。
【請求項２６】
ｐ５３結合欠陥Ｅ２由来のポリペプチド。
【請求項２７】
前記ポリペプチドは、自然ＨＰＶ１６タンパク質アミノ酸配列のＡｓｐ３３８、Ｇｌｕ３４０、Ｔｒｐ３４１、Ｇｌｕ３４２、Ａｒｇ３４３、Ａｓｐ３４４およびＧｌｕ３４５位の少なくとも１つで突然変異される、請求項２５に記載のｐ５３結合欠陥Ｅ２由来のポリペプチド。
【請求項２８】
ｐ５３を結合することが不可能である、請求項２５または２６に記載のｐ５３結合欠陥Ｅ２由来のポリペプチド。
【請求項２９】
ＨＰＶ  タイプ１６、１８、３３、３１、６、１１、２、４、１または７タンパク質に由来するｐ５３結合欠陥ポリペプチド。
【請求項３０】
前記ＰＶは動物ＰＶである、請求項２５、２６、２７または２８に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
前記ＰＶは哺乳動物ＰＶである、請求項２９に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
自然Ｅ２タンパク質と同じかまたは類似した長さを有する、請求項２５ないし３０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
自然Ｅ２タンパク質より実質的に短いかまたは長い、請求項２５ないし３０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
図２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項３５】
ｐ５３結合欠陥ＰＶ  Ｅ２由来のポリペプチドおよびＶＰ２２融合配列を含む融合タンパク質。
【請求項３６】
請求項２５ないし３３のいずれか１項に記載のｐ５３結合欠陥Ｅ２由来のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３７】
図２に示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド。
【請求項３８】
自然配列のＡｓｐ３３８、Ｇｌｕ３４０、Ｔｒｐ３４１、Ｇｌｕ３４２、Ａｒｇ３４３、およびＡｓｐ３４４およびＧｌｕ３４５位、またはＥ２−ｐ５３相互作用にとって重要である任意の他の位置で突然変異されるＨＰＶ  １６  Ｅ２由来のポリペプチドをコードするヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、突然変異パピローマウイルスＥ２タンパク質を用いて、特にパピローマウイルスＤＮＡを含有する細胞において、アポトーシス（プログラム細胞死の形態）を誘導する方法、かかる突然変異タンパク質を用いて細胞を死滅させる方法、およびＥ２由来のポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
［背景］
パピローマウイルス（ＰＶ）は、Ｅ６、Ｅ７およびＥ２タンパク質を含む産物をコードする幾つかのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有する二重鎖環状ゲノムを有するＤＮＡウイルスである(Meyers, G., et al. (1995) Human papillomaviruses, 1995 compendium. Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, N. Mex., USA)。これらのウイルスは上皮細胞を感染して、過剰増殖病変の形成を誘導し、そこではウイルスＤＮＡは通常、エピソーム、すなわち「自立的な自己複製ＤＮＡ」として存在する(Lorincz A.T. et al. (1992) Obstet. Gynecol. 79, 328-337)。少なくとも９５種の異なる型のヒトＰＶ（ＨＰＶ）が同定されており、その多くが生殖管を感染して、性器いぼを生じる(Van Ranst M., et al. (1992) J. Gen. Virol. 73, 2653-2660)。他のＨＰＶ型は癌と関連している。例えば、ＨＰＶ  ＤＮＡは、事実上すべての子宮頸癌（９９．７％）で検出することができ、これらのウイルスは概して、この疾患の原因作用物質であると認識されている(Walboomers J.M., et al. (1999) J. Pathol. 189, 12-19)。ＨＰＶはまた、外陰部癌、口腔癌、皮膚癌および食道癌を含む各種他の疾患に関与すると考えられている(Basta A., et al (1999) Eur. J. Gynaecol. Oncol. 20, 111-114: Miller C.S., & Johnstone B.M. (2001) Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod. 91, 622-635: Biliris K. A., et al. (2000) Cancer Lett. 161, 83-88: Lavergne D., & de Villiers E.M. (1999) Int. J. Cancer 80, 681-684)。
【０００３】
ＨＰＶ感染細胞中に存在するエピソームＨＰＶ  ＤＮＡに対比して、ＨＰＶ形質転換癌細胞中に存在するＨＰＶ  ＤＮＡは、宿主ゲノムに組み込まれる場合が多い(Durst M., et al. (1985) J. Gen. Virol. 66, 1515-1522: Kalantari M., et al. (2001) Diagn. Mol. Pathol. 10, 46-54)。しかしながら、子宮頸癌細胞は、ＨＰＶ  Ｅ６およびＥ７  ＯＲＦを発現し続け、これらの癌遺伝子の産物は、細胞増殖を増大させ、かつ腫瘍形成における必須の初期工程である細胞の不死化を促進するように作用する(Hawley-Nelson, P., et al. (1989) EMBO J. 8, 3905-3910: Scheffner, M., et al. (1990) Cell 63, 1129-1136: Dyson, N., et al. (1989) Science 243, 934-936)。
【０００４】
パピローマウイルスＥ２  ＯＲＦは、ウイルス遺伝子発現を調節し、また効率的なウイルスＤＮＡ複製に必要とされる配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質をコードする(Bouvard V., et al. (1994) EMBO J. 13, 5451-5459: Frattini M.G. & Laimins L.A. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 12398-12402: Berg M. & Stenlund A. (1997) J. Virol. 71, 3853-3863)。Ｅ２タンパク質は、Ｅ６およびＥ７癌遺伝子の転写を調節し、それにより細胞増殖に影響を及ぼすことができる(Dowhanick J.J., et al. (1995) J. Virol. 69, 7791-7799: Sanchez-Perez A.M., et al. (1997) J. Gen. Virol. 78, 3009-3018: Desaintes C., et al. (1999) Oncogene 18, 4538-4545)。宿主ゲノムへのＨＰＶ  ＤＮＡの組込みは、多くの場合Ｅ２  ＯＲＦを崩壊し、かつ／またはＥ２の正確な発現を阻止する(Drest M., et al. (1985) J. Gen. Virol. 66, 1515-1522: Rose B.R., et al. (1997) Gynecol. Oncol. 66, 282-289)。これがＥ６およびＥ７の過剰発現を引き起こすと考えられ、続いて腫瘍形成を引き起こす。この見解と一致して、子宮頸癌細胞におけるＥ２タンパク質の過剰発現はＥ６およびＥ７発現を抑制することができ、その結果アポトーシス細胞死および成長抑止をもたらす(Dowhanick J.J., et al. (1995) J. Virol. 69, 7791-7799: Francis D.A., et al. (2000) J. Virol. 74, 2679-2686: Nishimura A., et al. (2000) J. Virol. 74, 3752-3760)。この知見により、Ｅ２が子宮頸癌および他のＨＰＶ誘導性疾患の治療に有用であり得るという提案が生じた。しかしながら、Ｅ２タンパク質はまた、ＨＰＶ  ＤＮＡを含有しない細胞においてもアポトーシスを誘導することができる(Webster K., et al. (2000) J. Biol. Chem. 275, 87-94)。
【０００５】
ｐ５３は、すべてのヒト腫瘍の約半数において突然変異により不活性化される細胞腫瘍サプレッサータンパク質である（Cox L.S. & Lane D.P. (1995) Bioessays 17, 501-508で概説）。電離放射線、細胞ストレスまたはウイルス感染を含む多数の刺激に応答して、ｐ５３タンパク質は、細胞周期停止またはアポトーシスのいずれかを媒介することができる。ＨＰＶ誘導性腫瘍由来の細胞は通常、野生型ｐ５３を含有し、ｐ５３活性を誘導するシグナルに応答することができる(Butz K., et al. (1995) Oncogene 10, 927-936: Webster K., et al. (2000) J. Biol. Chem. 275, 87-94)。少なくとも１種のＨＰＶ型由来のＥ２タンパク質はｐ５３に結合し(Massimi P., et al. (1999) Oncogene 18, 7748-7754)、このＥ２タンパク質はまたｐ５３依存性アポトーシスを誘導することができる(Webster K., et al. (2000) J. Biol. Chem. 275, 87-94)。したがって、本発明者等は、ｐ５３に弱く結合するＥ２タンパク質の突然変異体は、ＨＰＶ形質転換細胞においてアポトーシスを誘導することが可能であるが、非ＨＰＶ形質転換細胞においてはアポトーシスを誘導することが不可能であることを示す。Ｅ２のこの新規突然変異体は、癌療法において、前癌性病変の治療において、およびＨＰＶ感染の治療において有用であり得る。特に、本発明は、ＨＰＶ感染、特に頸部上皮内癌として知られる前癌性状態の治療を提供する。現在、この状態であると診断された女性の多くは直ちに治療されず、感染の進行に関して定期的にモニタリングされる。本発明の方法を用いた初期治療は、かなりのストレスを軽減し、ならびに頸癌への発達のより高い危険性を有することにより重篤形態の前癌性状態への悪化の可能性を低減する。かかる積極的治療に対比して、上記方法および組成物は、子宮頸癌に対して予防的に使用することができる。
【０００６】
ＷＯ００／０２６９３号(The University of Bristol)は、Ｅ２ポリペプチドを用いてＨＰＶ形質転換細胞および非ＨＰＶ形質転換細胞において細胞死を誘導する方法ならびに組成物を開示している。ＨＰＶ形質転換細胞またはＨＰＶ感染細胞に対するＥ２誘導性アポトーシスを標的とすることができる方法あるいは突然変異は開示されていない。
【０００７】
ＷＯ９８／０１１４８号(Harvard)は、ＰＶに感染し、そして／またはＰＶにより形質転換された細胞の増殖を妨害する方法および組成物を開示している。細胞のｐ５３状態、処理細胞におけるアポトーシスの誘導、またはＨＰＶ陰性細胞に対するＥ２の影響は開示されていない。
【０００８】
ＷＯ９４／０４６８６号(Biogen)は、ＨＩＶ  ＴＡＴタンパク質に基づいて細胞にＨＰＶ  Ｅ２ポリペプチドを含むタンパク質を送達する方法について記載している。細胞のｐ５３状態、処理細胞におけるアポトーシスの誘導、またはＨＰＶ陰性細胞に対するＥ２の影響は開示されていない。
【０００９】
ＷＯ９２／１２７２８号(Biogen)は、非機能性Ｅ２由来のポリペプチド、具体的にはＨＰＶ感染細胞において正常なＥ２とヘテロ二量体を形成し、その機能を阻止するＥ２トランス活性化リプレッサーを開示している。細胞のｐ５３状態、処理細胞におけるアポトーシスの誘導、またはＨＰＶ陰性細胞に対するＥ２の影響は開示されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
［発明の開示］
本発明の一態様によれば、ＨＰＶ  ＤＮＡを含有する細胞を死滅させる方法であって、上記細胞をｐ５３結合欠陥ＰＶ  Ｅ２由来のポリペプチドと接触させることを含む方法が提供される。かかるポリペプチドは、野生型または自然ＨＰＶ  １６  Ｅ２タンパク質よりも（存在したとしても）低親和性でｐ５３に結合する。細胞はＰＶで形質転換され得るか、またはＰＶに感染し得る。本発明はすべてのＨＰＶ型に当てはまる。
【００１１】
本発明の別の態様によれば、ＰＶ形質転換細胞および／またはＰＶ感染細胞においてアポトーシスを誘導する方法であって、細胞をｐ５３結合欠陥ＰＶ  Ｅ２由来のポリペプチドと接触させることを含む方法が提供される。
【００１２】
本発明の別の態様によれば、ＰＶ形質転換細胞および／またはＰＶ感染細胞を死滅させる方法であって、細胞を、ｐ５３結合欠陥ＰＶ  Ｅ２由来のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と接触させることを含む方法が提供される。
【００１３】
本発明の別の態様によれば、ＰＶ形質転換細胞およびＰＶ感染細胞を死滅させる方法であって、細胞を、ｐ５３またはその機能部分と結合不可能なｐ５３結合欠陥ＰＶ  Ｅ２由来のタンパク質と接触させることを含む方法が提供される。
【００１４】
本発明のさらなる態様によれば、ＰＶ形質転換細胞およびＰＶ感染細胞を死滅させる方法であって、上記細胞をＶＰ２２またはその誘導体に融合されたｐ５３結合欠陥ＰＶ  Ｅ２由来のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と接触させることを含む方法が提供される。ＶＰ２２は、哺乳動物細胞に他のポリペプチドを効率的に送達させるのに使用することができる単純ヘルペスウイルス−１タンパク質である（Elliot, G and O'Hare, P. (1997) Cell, 88: 223-233、およびＷＯ００／５３７２２号）。上記方法は、従来の遺伝子療法技法と比較して多数の細胞にＥ２由来のタンパク質を送達させることが可能であるはずであるため好適である。類似の輸送機能を有するＶＰ２２の適切な誘導体またはＶＰ２２に代わる適切な代替物は、当業者により確定され得る。Ｅ２由来のポリペプチドを送達する他の非ウイルス的な方法としては、ペネトラチン(penetratin)またはリポソームが挙げられる。Ｅ２由来のポリペプチドを送達するウイルス的方法としては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスおよびポックスウイルスが挙げられる。好ましくは、ヌクレオチド配列は、ＶＰ２２に融合されたｐ５３結合欠陥ＰＶ  Ｅ２由来のポリペプチドをコードする。より好ましくは、ｐ５３結合欠陥Ｅ２由来のポリペプチドは、ヒスチジンタグ付きＶＰ２２融合タンパク質として送達される。最も好ましくは、ヌクレオチド配列は、ヒスチジンタグ付きＶＰ２２に融合された、ｐ５３を結合することが不可能であるＰＶ  Ｅ２由来のポリペプチドをコードする。
【００１５】
本発明の別の態様によれば、子宮頸癌の積極的もしくは予防的治療あるいは改善のための薬学的組成物におけるｐ５３結合欠陥ＰＶ  Ｅ２由来のポリペプチドの使用が提供される。薬学的組成物は、適切な希釈剤またはキャリアを含む。組成物は、感染領域、特に女性の被験者における頸部領域に直接塗布することができるクリームまたはスプレーの形態であることが好ましい。
【００１６】
本発明の別の態様によれば、性器いぼの積極的もしくは予防的治療または改善のための薬学的組成物におけるｐ５３結合欠陥Ｅ２由来のポリペプチドの使用が提供される。
【００１７】
本発明の別の態様によれば、子宮頸癌の積極的もしくは予防的治療または改善のための薬学的組成物におけるｐ５３結合欠陥Ｅ２由来のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の使用が提供される。
【００１８】
本発明の別の態様によれば、性器いぼの積極的もしくは予防的治療または改善のための薬学的組成物におけるｐ５３結合欠陥Ｅ２由来のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の使用が提供される。
【００１９】
本発明の別の態様によれば、前癌性病変の治療または改善のための薬学的組成物におけるｐ５３結合欠陥Ｅ２由来のポリペプチドの使用が提供される。
【００２０】
本発明の別の態様によれば、前癌性病変の治療または改善のための薬学的組成物におけるｐ５３結合欠陥Ｅ２由来のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の使用が提供される。
【００２１】
好ましくは、相当部分の細胞、例えば５０％を上回る、好ましくは８０％を上回る、最も好ましくは９０％を上回る細胞が、本発明によるアポトーシスを誘導するか、または細胞を死滅させる方法で死滅する。
【００２２】
好ましくは、アポトーシスが誘導される細胞は腫瘍形成性である。細胞が癌性である場合、癌は、子宮頸癌、外陰部癌、口腔癌および食道癌から選択され得る。
【００２３】
ＨＰＶ  ＤＮＡは細胞ゲノムに組み込まれ得るか、またはエピソームとして細胞中に存在し得る。あるいは、ＨＰＶ  ＤＮＡは、エピソームおよび組み込まれたＤＮＡの両方として細胞中に存在してもよい。
【００２４】
細胞は哺乳動物であり得る。細胞は、頸部、外陰部または表皮であり得る。好ましくは、細胞はヒト細胞である。より好ましくは、細胞は哺乳動物被験体、最も好ましくはヒト被験者である。
【００２５】
本発明による方法および使用では、ｐ５３結合欠陥Ｅ２由来のポリペプチドは、ｐ５３を結合することが可能であるが、ｐ５３依存性アポトーシスを誘導することが不可能である。
【００２６】
本発明の別の態様によれば、本発明の方法および使用において使用するためのｐ５３結合欠陥Ｅ２由来のポリペプチドが提供され、ここではポリペプチドは、自然ＨＰＶ１６タンパク質アミノ酸配列のＡｓｐ３３８、Ｅ３４０（Ｇｌｕ３４０）、Ｔｒｐ３４１、およびＡｓｐ３４４位の少なくとも１つで突然変異される９。好ましくは、ｐ５３結合欠陥Ｅ２由来のポリペプチドはｐ５３を結合することが不可能である。ポリペプチドがｐ５３を結合することが可能である場合、ポリペプチドはｐ５３依存性アポトーシスを誘導することが不可能であり得る。ｐ５３結合欠陥ポリペプチドが由来するＰＶは、ＨＰＶ  タイプ１６、１８、３３、３１、６、１１、２、４、１または７であり得る。好ましくは、ＰＶは動物、最も好ましくは哺乳動物ＰＶ、特にヒトＰＶである。ポリペプチドは、自然Ｅ２タンパク質と同じかまたは類似した長さを有してもよく、あるいは実質的により短いかまたはより長くてもよい。より具体的には、ポリペプチドが自然Ｅ２タンパク質より短い場合、Ｅ２タンパク質のＮ末端部分は１０〜２０個のアミノ酸を切断され得るのに対し、Ｃ末端部分では、切断は２０〜４０個のアミノ酸であり得る。ポリペプチドが自然Ｅ２タンパク質よりも長い場合、例えばポリペプチドはヒスチジンタグを含むか、またはＶＰ２２に結合されることから、Ｎ末端でより長い１０個以上のアミノ酸であり得る。
【００２７】
あるいは、自然配列は、Ｅ２−ｐ５３相互作用にとって重要である１つまたは任意の他の位置で変更され得る。突然変異および変更は、挿入、欠失または置換の形態であり得る。自然配列中のアミノ酸は修飾されて、ｐ５３結合の阻害、安定性、免疫原性、発現のような有用な特性を高め得る。本発明によるポリペプチドは、組換え生物により産生され得るか、あるいは化学合成され得る。
【００２８】
本発明による好ましいポリペプチドは、図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃまたは図２Ｄに示すアミノ酸配列を有する。
【００２９】
本発明はまた、本発明のｐ５３結合欠陥Ｅ２由来のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を提供する。好ましいヌクレオチドは、図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃまたは図２Ｄに示すヌクレオチド配列を有する。
【００３０】
ヌクレオチドは、自然配列のＡｓｐ３３８、Ｇｌｕ３４０、Ｔｒｐ３４１、およびＡｓｐ３４４位またはＥ２−ｐ５３相互作用にとって重要である任意の他の位置で突然変異されるＨＰＶ  １６  Ｅ２由来のポリペプチドをコードし得る。
【００３１】
ｐ５３結合欠陥ＰＶ  Ｅ２由来のポリペプチドは、ＶＰ２２融合タンパク質として送達され得る。遺伝子療法および抗体送達のような他の送達方法が意図される。例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスまたはレトロウイルスを使用してもよい。当業者は適切な方法を選択することが可能である。
【００３２】
［定義］
本明細書中では、以下の表現は、説明の手段として付与される以下の非限定的な意味で使用される：
【００３３】
１．「ＰＶ陽性」：ＰＶに感染しているか、またはＰＶにより形質転換されている細胞。「ＰＶ陰性」は反対の意味を有する。
【００３４】
２．「タンパク質」および「ポリペプチド」は交換可能に使用されるが、タンパク質は天然に存在するポリペプチドであるとみなされ得る。
【００３５】
３．「ＨＰＶ  ＤＮＡ」は、天然に存在するＨＰＶゲノム由来の完全オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）または有意量（例えば、約１００ｂｐ）の非コード配列を含むＨＰＶ由来のＤＮＡを意味する。
【００３６】
４．「アポトーシス」は、主として（しかし、排他的ではない）原形質膜小疱形成、クロマチン凝縮およびアポトーシス体（ｓｕｂ−Ｇ０  ＤＮＡ内容物を有する細胞体）の形成を特徴とする細胞死の形態である。
【００３７】
５．「ＰＶ感染」細胞は、ＨＰＶ  ＤＮＡを含有する非悪性（非腫瘍形成性）細胞である。
【００３８】
６．「ＰＶ形質転換」細胞は、ＨＰＶ  ＤＮＡを含有する悪性細胞である。
【００３９】
ここで、単なる例として添付の図面図１〜図８を参照して、本発明による細胞死を誘導する方法および産物について記載する。
【課題を解決するための手段】
【００４０】
１．実験手順−概要
ａ．プラスミド
プラスミドｐＷＥＢ−Ｅ２およびｐＣＭＸ−ＧＦＰ３は、それぞれＨＰＶ  １６  Ｅ２タンパク質および緑色蛍光タンパク質を発現する(Webster K., et al. (2000) J. Biol. Chem. 275, 87-94)。ｐ５３発現ベクターｐＣＢ６−ｐ５３はK.Vousden博士(NCI-FRDC, USA)より提供された。プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ｐ５３は、Ｔ７プロモーターの下流に野生型ｐ５３コード配列を含有する。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ｐ５３は、ｐＣ５３−ＳＮ３（B.Vogelstein博士(Johns Hopkins Oncology Center, USA)により提供）由来のｐ５３  ｃＤＮＡを保有するＢａｍＨＩ断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ(Stratagene)における特有のＢａｍＨＩ部位にクローニングすることにより創出された。プラスミドｐＫＫ−Ｅ２Ｃｔは、細菌細胞においてＨＰＶ  １６  Ｅ２タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン（アミノ酸２８０〜３６５）を発現する(Webster K., et al. (2000) J. Biol. Chem. 275, 87-94)。プラスミドｐＫＫ−Ｅ２ｐ５３ｍＣｔは、ｐＫＫ−Ｅ２Ｃｔにおける特有のＰｓｔＩとＨｉｎｄＩＩＩ部位との間のＥ２配列を、相補末端を有する３つの二重鎖合成オリゴヌクレオチドで置き換えることにより創出された。合成オリゴヌクレオチドは、Ｅ２配列に３つのアミノ酸変化（すなわち、Ａｓｐ３３８をアラニンへ、Ｔｒｐ３４１をアラニンへ、およびＡｓｐ３４４をアラニンへ）を導入した（図１）。意図されるさらなる変化としては、Ｇｌｕ３４０のアラニンへの変化、Ｇｌｎ３４２のアラニンへの変化、Ｇｌｎ３４５のアラニンへの変化、およびＡｒｇ３４３のアラニンへの変化が挙げられる。プラスミドｐＷＥＢ−Ｅ２ｐ５３ｍは、Ｅ２のＣ末端領域をコードするｐＷＥＢ−Ｅ２のＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ領域を、Ｅ２の突然変異Ｃ末端領域をコードするｐＫＫ−Ｅ２ｐ５３ｍの相当する領域で置き換えることにより創出された（図２）。プラスミドｐＶＰ２２(Invitrogen)は、単純ヘルペスウイルス−１  ＶＰ２２タンパク質をコードする。Ｅ２およびＥ２ｐ５３ｍタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、ＶＰ２２コード配列を用いてインフレームでｐＶ２２にクローニングされた。構築物はすべて配列決定して、任意の望ましくない突然変異の存在に関して検査した。
【００４１】
ｂ．タンパク質精製
Ｅ２ＣｔおよびＥ２ｐ５３ｍＣｔタンパク質は、これまでに記載されるように正確に細菌中で発現および精製された(Webster K., et al. (2000) J. Biol. Chem. 275, 87-94)。
【００４２】
ｃ．タンパク質−タンパク質相互作用
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ｐ５３においてクローニングされたｐ５３のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写および翻訳を、製造業者の説明書に従ってＴＮＴキット(Promega)を用いて実施した。ＨＰＶ  １６  Ｅ２ＣｔおよびＨＰＶ  １６  Ｅ２ｐ５３ｍＣｔタンパク質は、スロットブロッティングによりＰＶＤＦ膜上に固定化した。０．１％ｗ／ｖ  Ｐｏｎｃｅａｕ  Ｓ(Sigma)で染色して、固定化を確認した後、トリス緩衝生理食塩水、０．０２％ｖ／ｖ  ツイーン２０、１０％ｗ／ｖ  乾燥脱脂粉乳中で３回、膜を洗浄した（２２℃で２０分洗浄）。続いて、トリス緩衝生理食塩水、０．０２％ｖ／ｖ  ツイーン２０、１０％ｗ／ｖ  乾燥脱脂粉乳１０ｍｌ中で３５Ｓ標識ｐ５３  ２５μｌとともに膜をインキュベートした（２２℃で９０分間）。続いて、膜をメタノール中に浸した後、Ｗｈａｔｍａｎ紙上で乾燥させた（２２℃で１５分間）。ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒを用いて結合標識ｐ５３を可視化した。
【００４３】
ｐ５３に対する本発明によるＥ２誘導体の親和性は、表面プラズマ共鳴により定量的に評価され得る。より具体的には、ＧＳＴ−ｐ５３融合タンパク質を、アミンカップリングキット(BIACORE)を用いてＧＳＴ抗体ですでにコーティングされたＢＩＡＣＯＲＥセンサチップＣＭ５フローセル表面上に捕捉する。続いて、精製Ｅ２タンパク質およびＥ２突然変異体を表面上に塗布して、表面プラズモン共鳴を用いてそれらの結合をアッセイすることができる(Buckle M., et al (1996) Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 93, 889-894)。
【００４４】
ｄ．細胞培養およびトランスフェクション
ＨｅＬａ（ＨＰＶ１８形質転換子宮頸癌腫細胞）、ＳｉＨａ、ＣａＳｋｉ、ＭＥ１８０、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｓａｏｓ−２およびＭＣＦ−７細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）およびペニシリン（１０５ユニット／Ｌ）およびストレプトマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）で補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に維持した。８６６細胞を、５％ＦＢＳ、インスリン（５μｇ／μｌ）、ヒドロコルチゾン（０．０１μｇ／ｍｌ）、ペニシリン（１０５ユニット／Ｌ）およびストレプトマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）で補充したＤＭＥＭ中に維持した。８０８Ｆおよび８７３Ｆ細胞を、５％ＦＢＳ、インスリン（５μｇ／ｍｌ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）（０．０１μｇ／ｍｌ）、コレラ毒素（０．０１μｇ／ｍｌ）、ヒドロコルチゾン（０．４μｇ／ｍｌ）、ペニシリン（１０５ユニット／Ｌ）およびストレプトマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）で補充したＤＭＥＭ中に維持した。Ｗ１２細胞を、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、コレラ毒素（０．０１ｎＭ）、ヒドロコルチゾン（０．４μｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（０．０１μｇ／ｍｌ）、ペニシリン（１０５ユニット／Ｌ）およびストレプトマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）中に維持した。Ｗ１２細胞は、３Ｔ３細胞フィーダー支持を必要とした。細胞はすべて、加湿雰囲気中にて、３７℃および５％ＣＯ２で維持した。
【００４５】
ＨｅＬａ細胞およびＭＥ１８０細胞は、ＨＰＶ１８形質転換子宮頸癌腫細胞であり、ＳｉＨａおよびＣａＳｋｉ細胞は、ＨＰＶ１６形質転換子宮頸癌腫細胞であり、Ｎｉｈ３Ｔ３、Ｓａｏ５２およびｎｃＦ−７細胞は非ＨＰＶ形質転換細胞株である。
【００４６】
顕微鏡法のために、トランスフェクションの２４時間前に、６ウェルプレート中のカバーガラス上へウェル１つにつき３×１０５個の細胞密度で細胞を播種して、一晩インキュベートした。リポソームベースのトランスフェクション試薬であるＴｆｘ−２０（８６６、Ｓａｏｓ−２およびＣａＳｋｉ細胞用）およびＴｆｘ−５０（ＮＩＨ３Ｔ３およびＳｉＨａ用）(Promega)を、トランスフェクション１回当たり無血清培地１ｍｌ中にて３：１のリポソーム：ＤＮＡ比で使用した。残りの細胞株は、Ｆｕｇｅｎｅ６（Roche)を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションおよび３０時間のインキュベーション後に、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、４％パラホルムアルデヒドを用いて暗所にて３０分間固定した。ＰＢＳでさらに洗浄した後、細胞をビスベンズイミド(ヘキスト３３２５８番、Sigma)で暗所にて３０分間染色した。最終的に、細胞をＰＢＳで洗浄して、ＭＯＷＩＯＬ  １５μｌを用い、顕微鏡スライド上へと反転させた。
【００４７】
フローサイトメトリーのために、ＨｅＬａ細胞（２．３×１０６個）を７５ｃｍ３のフラスコ中に播種して、２４時間インキュベートした後、Ｆｕｇｅｎｅ６(Roche)を用いて一過性トランスフェクションを行った。
【００４８】
ｅ．顕微鏡法およびイメージング
ＦＩＴＣおよびＤＡＰＩフィルタセットおよび２０倍エア対物レンズを備えたＬｅｉｃａ  ＤＭ  ＩＲＢＥ倒立エピ蛍光顕微鏡(Leica)を用いて蛍光顕微鏡法を実施した。
【００４９】
ｆ．フローサイトメトリー
トランスフェクションの２４時間後、ＨｅＬａ細胞をトリプシン処理して、遠心分離により回収した。浮遊（死）細胞を培地から回収した。トリプシン処理細胞および浮遊細胞をプールして、続いてＰＢＳで２度洗浄した後、氷冷メタノール１ｍｌ中に再懸濁させて、−２０℃で５分間インキュベートした。遠心分離（ベンチトップ遠心機中で１０分／２５００ｒｐｍ）後、５０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム(Sigma)を含有するＰＢＳ３ｍｌ中に細胞を再懸濁させて、４℃で３０分間インキュベートした。再遠心分離後、細胞をＰＢＳ５００μｌ中に再懸濁させて、フローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ）により解析するまで暗所で保持した。
【００５０】
２．結果
Ｅ２およびｐ５３の相互作用の阻止
ｐ５３は、Ｅ２タンパク質のＣ末端ＤＮＡ結合ドメインに結合する(Massimi P., et al. (1999) Oncogene 18, 7748-7754)。ＤＮＡに結合されるＥ２のこのドメインの構造は、Ｘ線結晶学により確定されている(Hegde R.S. & Androphy E.J. (1998) J. Mol. Biol. 284, 1479-1489)。Ｅ２−ｐ５３相互作用の分子モデルは、参考としてｐ５３およびｐ５３結合タンパク質５３ＢＰ２の共結晶構造を用いて作製された(Gorina S. & Pavletich NP. (1996) Science 274, 1001-1005)。モデリングにより、５３ＢＰ２中に存在するアミノ酸に重ね合わせることができ、かつｐ５３−５３ＢＰ２相互作用に重要であるＥ２タンパク質中のアミノ酸（Ａｓｐ３３８、Ｔｒｐ３４１およびＡｓｐ３４４を含む）が同定された（図３）。Ｅ２Ｃｔ中のＡｓｐ３３８、Ｔｒｐ３４１およびＡｓｐ３４４は、部位特異的突然変異誘発を用いてアラニンに突然変異された。アミノ酸残基のアラニンでの置き換えは、中性的な解決法であるとみなされる。本発明によるＥ２誘導体のｐ５３結合能力は、ｐ５３分子を積極的に拒絶する反対に荷電された残基の導入によりさらに減少され得る。突然変異Ｅ２ｐ５３ｍＣｔタンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏでｐ５３を結合する能力をセクション１ｃに記載するように試験した（図４）。標識ｐ５３は野生型Ｅ２Ｃｔタンパク質に結合するが、標識ｐ５３は、Ｅ２ｐ５３ｍＣｔタンパク質には存在したとしても弱く結合する。
【００５１】
Ｅ２ｐ５３ｍは、ＨＰＶ形質転換細胞においてアポトーシスを誘導するが、非ＨＰＶ形質転換細胞ではアポトーシスを誘導しない
Ｅ２−ｐ５３ｍのアポトーシスを誘導する能力は、完全長Ｅ２タンパク質へＡｓｐ３３８、Ｔｒｐ３４１およびＡｓｐ３４４突然変異を導入し、カバーガラス上で成長している各種ＨＰＶ形質転換細胞株および非ＨＰＶ形質転換細胞株に構築物を一過的にトランスフェクトすることで調査した（図５）（以下のWebster等2000 infraに記載されるように）。トランスフェクションの３０時間後に、細胞を固定して、それらのＤＮＡをビスベンズイミド（ヘキスト染色）で染色した。トランスフェクトした細胞を、フルオレセインイソチオシアネートフィルタセットに通して励起時のそれらの緑色蛍光に基づいて同定した。アポトーシスの２つの特質であるクロマチン凝縮および膜小疱形成に関して、それぞれヘキスト染色およびＧＦＰを用いてこれらの細胞を検査した(Webster K., et al. (2000) J. Biol. Chem. 275, 87-94)。１００個のトランスフェクトした細胞をそれぞれカバーガラス上で計数して、実験を３回繰り返した。細胞株はすべて３〜１２％のアポトーシスのバックグラウンドレベルを示す（空ｐＷＥＢベクターでトランスフェクトした細胞）（図５、欄３）。野生型Ｅ２タンパク質は、試験した細胞株すべてにおいてアポトーシスレベルの有意な増加を誘導する（図５、欄４）。しかしながら、Ｅ２ｐ５３ｍタンパク質は、ＨＰＶ形質転換細胞のみにおいてアポトーシスレベルの有意な増加を誘導する（図５、欄５）。重要なことに、Ｅ２およびＥ２ｐ５３ｍはともに、エピソームＨＰＶ  ＤＮＡを含有する細胞株であるＷ１２細胞においてアポトーシスを誘導する。
【００５２】
ＶＰ２２は、Ｅ２を標的細胞へ送達するのに使用することができる
単純ヘルペスウイルス−１  ＶＰ２２タンパク質がＥ２およびＥ２突然変異体を標的細胞へ送達するのに使用することができるかどうかを確定するために、Ｅ２タンパク質をコードするＤＮＡ配列をＶＰ２２発現ベクター(Invitrogen)にインフレームでクローニングした。死細胞が基板から剥離するため、顕微鏡法はアポトーシス細胞の数を過小評価する。対照的に、フローサイトメトリーは、浮遊死細胞を含む細胞すべてを検査し、したがってアポトーシス細胞の数のより良好な概算を付与する。細胞生存に対するＶＰ２２−Ｅ２発現プラスミドの影響を検査するために、プラスミドをＨｅＬａ細胞に一過的にトランスフェクトして、トランスフェクションの２４時間後に、フローサイトメトリーを用いて細胞集団全体を検査した（図７）。ＶＰ２２ベクターでトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞は約１０％のアポトーシス細胞を示す（図７Ａ）。対照的に、ＶＰ２２−Ｅ２発現ベクターでトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞は、約３５％のアポトーシス細胞を示す（図７Ｂ）。これらのデータは、ＶＰ２２−Ｅ２融合タンパク質がこれらの細胞においてアポトーシスを誘導することが可能であることを示す。ＶＰ２２−Ｅ２が、細胞から細胞へと移動して、レシピエント（バイスタンダー）細胞においてアポトーシスを誘導することができるかどうかを確定するために、上述のＶＰ２２−Ｅ２発現ベクターでＣＯＳ−７細胞を一過的にトランスフェクトした。ＨＰＶ  １６  Ｅ２タンパク質はＣＯＳ−７細胞においてアポトーシスを誘導しない(Webster K., et al. (2000) J. Biol. Chem. 275, 87-94)。ＶＰ２２−Ｅ２発現で、あるいはＶＰ２２単独を発現するプラスミドで一過的にトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞を３０時間培養した。続いて、トランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞からの培地を取り出して、ＨｅＬａ細胞の培養物へ添加した。２４時間後、これらの条件培地に暴露されたＨｅＬａ細胞集団をフローサイトメトリーで検査した。ＶＰ２２単独を発現するＣＯＳ−７細胞からの培地は、アポトーシスＨｅＬａ細胞の割合のわずかな増加をもたらす（未処理集団における約８〜１０％から、処理細胞における約１５〜２０％まで）（図８Ａ）。対照的に、ＶＰ２２−Ｅ２を発現するＣＯＳ−７細胞からの培地は、アポトーシス細胞数において劇的な増加をもたらす（未処理細胞における約８〜１０％から、処理細胞における６０％以上まで）（図８Ｂ）。これらのデータは、ＣＯＳ−７細胞中で産生されたＶＰ２２−Ｅ２融合タンパク質が培地へ侵入することができ、そこからＨｅＬａ細胞に侵入し、ＨｅＬａ細胞においてアポトーシスを誘導することが可能であることを示唆する。したがって、細胞−細胞接触は、ＶＰ２２−Ｅ２の非産生細胞への移動には必要とされない。
【００５３】
総合すると、これらのデータは、Ｅ２−ｐ５３相互作用が非ＨＰＶ形質転換細胞におけるＥ２誘導性細胞死に必要であることを示唆する。Ｅ２タンパク質は、Ｅ６およびＥ７の発現を変更させることでＨＰＶ形質転換細胞においてアポトーシスを誘導することができるため、Ｅ２のＰ５３との相互作用を阻止する突然変異は、ＨＰＶ形質転換細胞においてのみアポトーシスを誘導するＥ２突然変異体を生じる。これらのデータはまた、ＶＰ２２がＥ２タンパク質を標的細胞へ送達するのに使用することができること、またある細胞において産生されたＶＰ２２−Ｅ２融合タンパク質はバイスタンダー細胞を死滅させることが可能であることを示す。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】ｐ５３結合欠陥Ｅ２由来のポリペプチドＨＰＶ  １６  Ｅ２ｐ５３ｍＣｔに関するＤＮＡおよびそのアミノ酸配列を示す。突然変異塩基およびアミノ酸は太字で示し、下線を付記した。
【図２Ａ】本発明によるＨＰＶ  １６  Ｅ２ｐ５３ｍのＥ２由来のポリペプチドに関するＤＮＡおよびそれらのアミノ酸配列を示す。突然変異塩基およびアミノ酸は太字で示し、下線を付記した。
【図２Ｂ】本発明によるＨＰＶ  １６  Ｅ２ｐ５３ｍ２のＥ２由来のポリペプチドに関するＤＮＡおよびそれらのアミノ酸配列を示す。突然変異塩基およびアミノ酸は太字で示し、下線を付記した。
【図２Ｃ】本発明によるＨＰＶ  １６  Ｅ２ｐ５３ｍ３のＥ２由来のポリペプチドに関するＤＮＡおよびそれらのアミノ酸配列を示す。突然変異塩基およびアミノ酸は太字で示し、下線を付記した。
【図２Ｄ】本発明によるＨＰＶ  １６  Ｅ２ｐ５３ｍ４のＥ２由来のポリペプチドに関するＤＮＡおよびそれらのアミノ酸配列を示す。突然変異塩基およびアミノ酸は太字で示し、下線を付記した。
【図３】ＨＰＶ  １６  Ｅ２  ＤＮＡ結合ドメイン、ならびにＥ２ｐ５３ｍおよびＥ２ｐ５３ｍＣｔを創出するためにアミノ酸が突然変異された位置を示す。
【図４】Ｅ２Ｃｔタンパク質およびＥ２ｐ５３ｍＣｔタンパク質への標識ｐ５３の結合を示す。
【図５】各種ＨＰＶ形質転換および非ＨＰＶ形質転換細胞株に対するＥ２およびＥ２ｐ５３タンパク質の影響を示す。
【図６】ＨＰＶ１６  Ｅ２のＯＲＦおよびアミノ酸配列を示す。
【図７】ＨＰＶ形質転換細胞に対するＶＰ２２およびＶＰ２２−Ｅ２融合タンパク質の影響を示す。
【図８】ＨＰＶ形質転換細胞に対するＥ２非感受性ＣＯＳ−７細胞で産生されるＶＰ２２−Ｅ２融合タンパク質の影響を示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
2005507243.tif 000013
2005507243.tif 000014
2005507243.tif 000015
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2005507243.tif 000017
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2005507243.tif 000041
2005507243.tif 000042
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005507243.tif 000043
【国際調査報告】
2005507243.tif 000044
2005507243.tif 000045
2005507243.tif 000046
2005507243.tif 000047
2005507243.tif 000048