(57)【要約】    【構成】  健康的な検体から得られた試料と比較して、神経系損傷に罹患した検体に選択的に活性化するプロテアーゼの発見に関連する細胞障害を検出する方法。スペクトリンを分解するプロテアーゼの活性を示す分解産物が産出される。検体から得た生物学的試料を準備し、複数のプロテアーゼによって生成された分解産物の存在下で試料を検出し、分解産物の存在を細胞障害の存在又は型と相関させることによって、細胞障害を検出する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト検体における神経細胞損傷の分析方法であって、
損傷した神経細胞を有する可能性のある検体から分離した生物学的試料であり、前記検体から分離される前に前記検体の神経系と接している液体である生物学的試料を準備するステップ（ａ）と、
前記試料における、αＩＩスペクトリン、並びにカスパーゼ−３及びカルパインからなるグループから選択される少なくとも一つのプロテアーゼによってαＩＩスペクトリンのタンパク質分解切断から生じたαＩＩスペクトリン分解産物（ＳＢＤＰ）から選択される少なくとも一つのマーカーの存在又は量を検出するステップ（ｂ）と、
前記マーカーの存在又は量を、前記検体における神経細胞損傷の存在又は型と相関させるステップ（ｃ）と、を含むことを特徴とするヒト検体における神経細胞損傷の分析方法。
【請求項２】
前記生物学的試料は、脳脊髄液を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記検体は、持続性外傷を有することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記マーカーが、αＩＩスペクトリンであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記マーカーが、ＳＢＤＰ１５０ｉであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記マーカーが、ＳＢＤＰ１５０であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記マーカーが、ＳＢＤＰ１４５であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記マーカーが、ＳＢＤＰ１２０であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記ステップ（ｂ）は、αＩＩスペクトリン，ＳＢＤＰ１５０ｉ，ＳＢＤＰ１５０，ＳＢＤＰ１４５，及びＳＢＤＰ１２０から選択される少なくとも二つのマーカーの存在又は量を前記試料から検出することを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記ステップ（ｂ）は、αＩＩスペクトリン，ＳＢＤＰ１５０ｉ，ＳＢＤＰ１５０，ＳＢＤＰ１４５，及びＳＢＤＰ１２０から選択される少なくとも三つのマーカーの存在又は量を前記試料から検出することを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記ステップ（ｂ）は、αＩＩスペクトリン，ＳＢＤＰ１５０ｉ，ＳＢＤＰ１５０，ＳＢＤＰ１４５，及びＳＢＤＰ１２０から選択される少なくとも四つのマーカーの存在又は量を前記試料から検出することを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記ステップ（ｂ）は、αＩＩスペクトリン，ＳＢＤＰ１５０ｉ，ＳＢＤＰ１５０，ＳＢＤＰ１４５，及びＳＢＤＰ１２０の存在又は量を前記試料から検出することを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記ステップ（ｂ）は、前記試料又は前記試料の一部を、前記マーカーを特異的に結合する作用剤と接触させることを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記作用剤が、αＩＩスペクトリン，ＳＢＤＰ１５０ｉ，ＳＢＤＰ１５０，ＳＢＤＰ１４５，及びＳＢＤＰ１２０の少なくとも一つを特異的に結合しないことを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記作用剤が、αＩＩスペクトリン，ＳＢＤＰ１５０ｉ，ＳＢＤＰ１５０，ＳＢＤＰ１４５，及びＳＢＤＰ１２０からなるグループの一つのみを特異的に結合することを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記作用剤が抗体であることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
前記ステップ（ｂ）は、前記生物学的試料又は前記試料の一部を基質上に固定化させることを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１８】
前記ステップ（ｂ）は、さらに前記基質を、前記マーカーを特異的に結合する作用剤と接触させることを含むことを特徴とする請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記マーカーの存在又は量を、前記検体における細胞損傷の存在又は型と相関させるステップ（Ｃ）は、前記試料におけるマーカーの存在又は量を、マーカーを含まないことが知られている標準試料におけるマーカーの存在又は量と比較することを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２０】
前記マーカーの存在又は量を、前記検体における細胞損傷の存在又は型と相関させるステップ（Ｃ）は、前記試料中におけるマーカーの存在又は量を、既知の量のマーカーを含むことが知られている標準試料におけるマーカーの存在又は量と比較することを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２１】
損傷した神経細胞を有する可能性のあるヒト検体から分離された生物学的試料であって、前記検体から分離される前、前記検体の神経系と接している液体である生物学的試料（ａ）と、
αＩＩスペクトリン、並びにカスパーゼ−３及びカルパインからなるグループから選択される少なくとも一つのプロテアーゼによってαＩＩスペクトリンのタンパク質分解切断から生じたαＩＩスペクトリン分解産物（ＳＢＤＰ）から選択される少なくとも一つのマーカーを特異的に結合する作用剤（ｂ）と、を含むことを特徴とする混合物。
【請求項２２】
前記マーカーが、αＩＩスペクトリン，ＳＢＤＰ１５０ｉ，ＳＢＤＰ１５０，ＳＢＤＰ１４５，及びＳＢＤＰ１２０からなるグループから選択されることを特徴とする請求項２１記載の混合物。
【請求項２３】
前記作用剤が、αＩＩスペクトリン，ＳＢＤＰ１５０ｉ，ＳＢＤＰ１５０，ＳＢＤＰ１４５，及びＳＢＤＰ１２０の少なくとも一つを特異的に結合しないことを特徴とする請求項２２記載の混合物。
【請求項２４】
前記作用剤が、αＩＩスペクトリン，ＳＢＤＰ１５０ｉ，ＳＢＤＰ１５０，ＳＢＤＰ１４５，及びＳＢＤＰ１２０からなるグループの一つのみを特異的に結合することを特徴とする請求項２３記載の混合物。
【請求項２５】
前記作用剤が抗体であることを特徴とする請求項２１記載の混合物。
【請求項２６】
前記混合物が、基質上に固定化されていることを特徴とする請求項２１記載の混合物。
【請求項２７】
検出可能な標識をさらに含むことを特徴とする請求項２１記載の混合物。
【請求項２８】
前記検出可能な標識が、前記作用剤と結合することを特徴とする請求項２７記載の混合物。
【請求項２９】
前記検出可能な標識が、前記作用剤と特異的に結合する基質と結合することを特徴とする請求項２８記載の混合物。
【請求項３０】
検体における細胞損傷を分析するためのキットであって、
損傷した神経細胞を有する可能性のあるヒト検体から分離した生物学的試料であり、前記検体から分離される前、前記検体の神経系と接している液体である生物学的試料を保持する基質（ａ）と、
αＩＩスペクトリン、並びにカスパーゼ−３及びカルパインからなるグループから選択される少なくとも一つのプロテアーゼによってαＩＩスペクトリンのタンパク質分解切断から生じたαＩＩスペクトリン分解産物（ＳＢＤＰ）から選択される少なくとも一つのマーカーを特異的に結合する作用剤（ｂ）と、
前記作用剤を、前記生物学的試料又は前記生物学的試料の一部分と反応させて、前記生物学的試料における少なくとも一つのマーカーの存在又は量を検出するための印刷された説明書（ｃ）と、を含むことを特徴とするキット。
【請求項３１】
前記マーカーは、αＩＩスペクトリン，ＳＢＤＰ１５０ｉ，ＳＢＤＰ１５０，ＳＢＤＰ１４５，及びＳＢＤＰ１２０からなるグループから選択されることを特徴とする請求項３０記載のキット。
【請求項３２】
前記作用剤が、αＩＩスペクトリン，ＳＢＤＰ１５０ｉ，ＳＢＤＰ１５０，ＳＢＤＰ１４５，及びＳＢＤＰ１２０の少なくとも一つを特異的に結合しないことを特徴とする請求項３１記載のキット。
【請求項３３】
前記作用剤が、αＩＩスペクトリン，ＳＢＤＰ１５０ｉ，ＳＢＤＰ１５０，ＳＢＤＰ１４５，及びＳＢＤＰ１２０からなるグループの一つのみを特異的に結合することを特徴とする請求項３２記載のキット。
【請求項３４】
前記作用剤が抗体であることを特徴とする請求項３０記載のキット。
【請求項３５】
検出可能な標識をさらに含むことを特徴とする請求項３０記載のキット。
【請求項３６】
前記検出可能な標識が、前記作用剤と結合することを特徴とする請求項３５記載のキット。
【請求項３７】
前記検出可能な標識が、前記作用剤と特異的に結合する基質と結合することを特徴とする請求項３６記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連特許）
本出願は、２００２年９月１０日に出願された、発明の名称を「中枢神経系の損傷の分析」とする米国仮特許出願第６０／４０９，９２０号の利益を主張する。
【０００２】
（連邦政府委託研究に関する宣言）
本発明は、米陸軍(United States Army) により付与された助成番号ＤＡＭＤ１７−９９−１−９５６５及びＤＡＭＤ１７−０１−１−０７６５の下、ならびに国立衛生研究所 (National Institutes of Health) により付与された助成番号Ｒ０１  ＮＳ３９０９１及びＲ０１  ＮＳ４０１８２の下、合衆国政府の支援によってなされた。合衆国政府は、本発明における特定の権利を有する。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、概して生物学と薬学の分野に関する。さらに詳しくは、本発明は、検体から取り出された、特定のプロテアーゼの活性化に反応して生産されたタンパク質のフラグメントである生物学的試料を分析することによって、検体における神経細胞の損傷を検出することに関する。
【０００４】
（発明の背景）
外傷性，虚血性，及び／又は化学的な病因から生じる脳損傷は、世界中で重要な健康問題であり、長期の予後不良とともに大惨事になり得る医学的緊急事態を悪化させる可能性を示す。組織に基づく多くの病気に関し、代替バイオマーカー（通常、血液検査を含む）による迅速な診断は、どのように病気を処置するかを決定する上で重宝される。しかしながら、外傷性又は虚血性脳損傷を評価するためのそのような検査は最適化されていない。従って、現在、利用できる最も有用な診断学は、コンピュータ トモグラフィ（ＣＴ）及び磁気共鳴画像（ＭＲＩ）である。これらは両方とも高価であり、緊急救命室の環境において容易に利用できず、軽度から中程度の脳損傷の診断のために有益ではない。つまり、脳損傷の重症度を評価するための改善された方法及び診断装置の必要性が存在する。特に、損傷の重症度，損傷の解剖学的病理及び細胞学的病理，並びに適当な医療における管理及び治療の実施の決定を助けるための定量可能な神経化学マーカーを医者に提供できるものは有用である。
【発明の開示】
【０００５】
（要約）
本発明は、外傷性の又は虚血性の神経細胞損傷の齧歯目のモデル中だけでなく、外傷性脳損傷を有するヒト検体の脳脊髄液（ＣＳＦ）中の非赤血球系αＩＩスペクトリン並びにそのカルパイン−特異的分解産物及びカスパーゼ−３−特異的分解産物（ＳＢＤＰ）の蓄積の発見に関する。神経系への損傷後、カルパイン及びカスパーゼ−３を共に検出し、モニターする能力は、（１）神経損傷の存在及び／又は重症度を決定する、（２）神経損傷を有すると推測される検体のための最適な治療方針を選択する、（３）神経損傷のための治療効果を分析することを容易にする。
【０００６】
つまり、本発明は、検体中の神経細胞損傷を分析するための方法を特徴とする。本発明の方法は、以下のステップを含む：（ａ）損傷した神経細胞を有する可能性のある検体から分離した生物学的試料であって、検体から分離される前、検体の神経系と接している液体（例えば、脳脊髄液，血液，血漿，及び血清）である生物学的試料を準備し、（ｂ）前記試料における、αＩＩスペクトリン、並びにカスパーゼ−３及びカルパインからなるグループから選択される少なくとも一つのプロテアーゼによってαＩＩスペクトリンのタンパク質の分解切断から生じたαＩＩＳＢＤＰから選択される少なくとも一つのマーカーの存在又は量を検出し、（ｃ）前記試料における、マーカーの存在又は量と、神経細胞の損傷の存在又は型とを相関させる。
【０００７】
典型的には、検体は、損傷した神経細胞を有する可能性のあるヒト患者である。例えば、外傷（例えば、頭への強打）を保持するヒト検体又は脳のような神経系組織の強い虚血の症状を呈するヒト検体（例えば、脳血管の事故を患うような患者）に、本方法を適用できる。判断されるマーカーは、αＩＩスペクトリン，ＳＢＤＰ１５０ｉ，ＳＢＤＰ１５０，ＳＢＤＰ１４５，又はＳＢＤＰ１２０のうちの一つ，二つ，三つ，四つ又は全てであってもよい。
【０００８】
試料における、αＩＩスペクトリン、並びにカスパーゼ−３及びカルパインからなるグループから選択される少なくとも一つのプロテアーゼによってαＩＩスペクトリンのタンパク質分解切断から生じたαＩＩＳＢＤＰから選択される少なくとも一つのマーカーの存在又は量を検出するというステップ（ｂ）は、試料又は試料の一部分を、マーカーに特異的に結合する作用剤（例えば、抗体）と接触させることを含む。作用剤は、αＩＩスペクトリン，ＳＢＤＰ１５０ｉ，ＳＢＤＰ１５０，ＳＢＤＰ１４５，及びＳＢＤＰ１２０の少なくとも一つに特異的に結合しないもの（つまり、このグループの部分のみに結合するもの）であってもよく、又は、αＩＩスペクトリン，ＳＢＤＰ１５０ｉ，ＳＢＤＰ１５０，ＳＢＤＰ１４５，及びＳＢＤＰ１２０の一つのみに特異的に結合するもの（つまり、モノ特異的作用剤）であってもよい。本発明の方法のいくつかの変形例において、ステップ（ｂ）は、生物学的試料又は生物学的試料の一部を基質上に固定化すること、及び／又は前記基質をマーカーに特異的に結合する作用剤と接触させることを含む。
【０００９】
検体における、マーカーの存在又は量と、神経細胞の損傷の存在又は型とを相関させるというステップ（ｃ）は、試料中におけるマーカーの存在又は量と、マーカーを含まないことが知られている標準試料（例えば、ネガティブコントロール）におけるマーカーの存在又は量とを比較すること、及び／又は試料中におけるマーカーの存在又は量と、既知の量のマーカーを含むことが知られている標準試料（例えば、ポジィティブコントロール又は試料におけるマーカーの量を定量するための比較コントロール）におけるマーカーの存在又は量とを比較することを含む。
【００１０】
別の側面では、本発明は、以下を含む混合物であることを特徴とする：（ａ）損傷した神経細胞を有する可能性のあるヒト検体から分離された生物学的試料であって、前記検体から分離される前、前記検体の神経系と接している液体である生物学的試料；及び（ｂ）αＩＩスペクトリン、並びにカスパーゼ−３及びカルパインからなるグループから選択される少なくとも一つのプロテアーゼによってαＩＩスペクトリンのタンパク質分解切断から生じたαＩＩスペクトリン分解産物（ＳＢＤＰ）から選択される少なくとも一つのマーカーに特異的に結合する作用剤（例えば、抗体）。判断されるマーカーは、一つ以上のαＩＩスペクトリン，ＳＢＤＰ１５０ｉ，ＳＢＤＰ１５０，ＳＢＤＰ１４５，及びＳＢＤＰ１２０であってもよい。作用剤は、αＩＩスペクトリン，ＳＢＤＰ１５０ｉ，ＳＢＤＰ１５０，ＳＢＤＰ１４５，及びＳＢＤＰ１２０の少なくとも一つに特異的に結合しないもの、又はαＩＩスペクトリン，ＳＢＤＰ１５０ｉ，ＳＢＤＰ１５０，ＳＢＤＰ１４５，及びＳＢＤＰ１２０の一つのみに特異的に結合するものであってもよい。
【００１１】
例えば、イムノブロット法又は同様の分析法で、マーカーの検出を促進するために、本発明の混合物を基質上に固定化してもよい。さらに、混合物は、作用剤に結合した標識、又は作用剤に特異的に結合する物質に結合した標識（例えば、検出可能な標識化された二次抗体）などの検出可能な標識を含み得る。
【００１２】
さらに、本発明は、検体における細胞損傷を分析するためのキットを含む。キットは、（ａ）損傷した神経細胞を有する可能性のあるヒト検体から分離した生物学的試料であって、検体から分離される前、検体の神経系と接している液体である生物学的試料を保持する基質と、（ｂ）αＩＩスペクトリン、並びにカスパーゼ−３及びカルパインからなるグループから選択される少なくとも一つのプロテアーゼによってαＩＩスペクトリンのタンパク質分解切断から生じたαＩＩＳＢＤＰから選択される少なくとも一つのマーカーに特異的に結合する作用剤と、（ｃ）作用剤を、生物学的試料又は生物学的試料の一部分と反応させて、生物学的試料における少なくとも一つのマーカーの存在又は量を検出するための印刷された説明書とを含む。
【００１３】
キットにおいて、判断されるマーカーは、αＩＩスペクトリン，ＳＢＤＰ１５０ｉ，ＳＢＤＰ１５０，ＳＢＤＰ１４５，及びＳＢＤＰ１２０の一つ以上であってもよい。作用剤は、αＩＩスペクトリン，ＳＢＤＰ１５０ｉ，ＳＢＤＰ１５０，ＳＢＤＰ１４５，及びＳＢＤＰ１２０の少なくとも一つに特異的に結合しないもの、又はαＩＩスペクトリン，ＳＢＤＰ１５０ｉ，ＳＢＤＰ１５０，ＳＢＤＰ１４５，及びＳＢＤＰ１２０の一つのみに特異的に結合するものであってもよい。また、キットは、作用剤に結合した標識、又は作用剤に特異的に結合する物質に結合した標識などの検出可能な標識を含み得る。
【００１４】
ここで述べるように、「結合する（ｂｉｎｄ）」、「結合する（ｂｉｎｄｓ）」又は「相互作用する」は、試料中で一分子が特定の第二分子を認識し付着するが、その試料中に存在する別の分子に実質的に認識又は付着しないことを意味する。一般的に、第二の分子に「特異的に結合する」第一の分子は、第二の分子との結合に関し、約１０5から１０6モル／リットルより大きな結合親和性を有する。
【００１５】
別の分子に「特異的に結合する作用剤」との言及は、別の分子に結合し、別の分子と同じ抗原決定基を共有するタンパク質以外の物質であって、自発的に生じるタンパク質と実質的な結合を示さない任意の物質を意味する。そのような作用剤の例として、抗体及びアプタマーが挙げられる。
【００１６】
ここで用いる語句「抗体」は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体だけでなく、無傷の抗体分子と同じ抗原に特異的に結合できる抗体フラグメント又は免疫グロブリン分子の一部を含む。
【００１７】
ここで述べるように、「検出可能な標識」とは、直接的に又は間接的に検出可能な任意の物質を意味する。
【００１８】
「結合した」という語句は、共有結合もしくは非共有結合した、又は他の手段で物理的に結合したことを意味する。
【００１９】
他に定義しなければ、ここで用いる全ての技術用語は、本発明の属する分野の通常の知識を有するものによって理解されるものと同様な意味を有する。ここで説明することと類似又は同等の方法と物質は、本発明の実施や試験で使用可能であるが、適した方法と物質は以下で説明される。すべての出版物、特許出願、特許、及びここで言及された参考文献は、引用して完全に援用される。抵触の場合は、定義を含む本明細書が法的に規制するであろう。さらに、以下に論じた特定の実施形態は、一実施例であって、これに制限されるものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
（詳細な発明）
本発明は、神経細胞の損傷を検出し、損傷の重症度を決定し、損傷の解剖学的及び細胞学的病理学を決定し、及び適切な損傷の治療を助けるための神経化学的なマーカーを定量するための方法、組成物並びにキットに関する。本発明は、神経細胞の損傷に反応して生じる、細胞内のプロテアーゼ（つまり、カルパイン及びカスパーゼ−３）の活性化の特性に基づいている。
【００２１】
複雑な一連のシグナル伝達の現象の中で、神経損傷は、カルパイン及びカスパーゼ−３を介した、非赤血球αＩＩスペクトリン（神経細胞に特に豊富な細胞骨格タンパク質）を含む様々な細胞内基質のタンパク質分解を規制する。図１Ａを参照すると、活性化カルパイン及びカスパーゼ−３は両方ともαＩＩスペクトリンに結合し、異なる部位で切断し、別個のＳＢＤＰを生産する。特に、カルパインは最初、αＩＩスペクトリンのＴｙｒ1176とＧｌｙ1177の間を切断し、その結果、１５０ｋＤａのカルパインを特徴としたＳＢＤＰ（ＳＢＤＰ１５０）を形成する。Ｇｌｙ1230とＳｅｒ1231の間の第二の切断は、結果として、１４５ｋＤａのカルパインを特徴とした第二のＳＢＤＰ（ＳＢＤＰ１４５）を形成する。同様の方法で、カスパーゼ−３は、Ａｓｐ1185とＳｅｒ1186の間と、Ａｓｐ1478とＳｅｒ1479の間でαＩＩスペクトリンを切断し、それぞれカスパーゼ−３を特徴とした１５０ｋＤａのＳＢＤＰ（ＳＢＤＰ１５０ｉ）及び１２０ｋＤａのＳＢＤＰ（ＳＢＤＰ１２０）を得る。用いられた残基番号は、ヒトαＩＩスペクトリン（ホモ・サピエンス；受入番号  Ｕ８３８６７．１、タンパク質番号  ＡＡＢ４１４９８）に基づいている。しかし、カルパイン及びカスパーゼ−３の切断部位は、異なる哺乳動物種間でかなり保存されており、他の種においても神経細胞の損傷に反応して、同様のＳＢＤＰが生じる。
【００２２】
このため、ＳＢＤＰ１５０，ＳＢＤＰ１４５，ＳＢＤＰ１５０ｉ及び又はＳＢＤＰ１２０等のＳＢＤＰの検出及び定量を用いて、神経細胞の損傷を検出し、特徴付けることができる。例えば、図１Ｂに示すように、全長のαＩＩスペクトリン（２８０ｋＤａ）、カルパイン及びカスパーゼ−３で生じたＳＢＤＰを同時に検出するため、ウエスタンブロットを用いることができる。カルパイン及びカスパーゼ−３の活性が欠如する場合、全長のαＩＩスペクトリンのみを検出する（レーン１）。カスパーゼ−３のみの活性は、１５０ｋＤａと１２０ｋＤａの追加のバンドを生じさせる（レーン２）のに対して、カルパインのみの活性は、追加の１５０ｋＤａと１４５ｋＤａのバンドを生じさせる。カスパーゼ−３及びカルパインの両方の活性は、純２８０ｋＤａのαＩＩスペクトリン，１５０ｋＤａのフラグメント，１４５ｋＤａのフラグメント，１２０ｋＤａのフラグメント（レーン３及び４）に相当する４つのバンドを発生させる。以下に述べられるように、例えば、各々異なるフラグメントの独自のＮ末端領域を特異的に認識する抗体を用いて、２つの異なる１５０ｋＤａのフラグメント（つまり、ＳＢＤＰ１５０及びＳＢＤＰ１５０ｉ）を互いに区別することができる。
【００２３】
（一般的な生物学的方法）
従来の生物的手法を含む方法をここで述べる。そのような手法は、当技術分野でよく知られており、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. , vol.
1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. , 1989及びCurrent Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1992（定期的な最新版）等の方法に関する専門書に詳細に述べられている。免疫学的方法（例えば、抗原特異的な抗体の準備、免疫沈降及びイムノブロッティング）は、例えば、in Current Protocols in Immunology, ed. Coligan et al. , John Wiley & Sons, New York, 1991及びMethods of Immunological Analysis, ed. Masseyeff et al. , John Wiley & Sons, New York, 1992に述べられている。
【００２４】
（神経細胞損傷の検出）
（ａ）損傷した神経細胞を有する可能性のある検体から分離した生物学的試料を準備し、（ｂ）前記試料における、カスパーゼ−３及びカルパインからなるグループから選択される少なくとも一つのプロテアーゼによって、αＩＩスペクトリン及びαＩＩスペクトリンのタンパク質分解切断から生じたαＩＩＳＢＤＰから選択される少なくとも一つのマーカーの存在又は量を検出し、（ｃ）マーカーの存在又は量を、前記検体における神経細胞損傷の存在又は型と相関させることによって、検体における神経細胞の損傷を分析する。
【００２５】
（生物学的試料）
試験管内（in  vitro）の培養における又は生体内原位置（in  situ）の動物検体における損傷後の神経細胞は、損傷を受けていない細胞よりαＩＩスペクトリン，ＳＢＤＰ１５０，ＳＢＤＰ１４５，ＳＢＤＰ１５０ｉ及び／又はＳＢＤＰ１２０を高いレベルで発現する。このため、神経細胞（例えば、中枢神経系組織又は末梢神経系組織のバイオプシー）を含む試料は、本発明の実施のための適当な生物学的試料である。しかし、神経細胞に加えて、例えば、心筋細胞，骨格筋細胞，肝細胞，腎臓細胞及び精巣中の細胞といった他の細胞は、αＩＩスペクトリンを発現する。また、そのような非神経細胞の損傷を決定及び／又は特徴付けるために、上記の方法の適用において、これらの細胞から選択される、そのような細胞又は液体を含む生物学的試料を用いてもよい。
【００２６】
細胞発現の増加に加えて、αＩＩスペクトリン，ＳＢＤＰ１５０，ＳＢＤＰ１４５，ＳＢＤＰ１５０ｉ及び／又はＳＢＤＰ１２０は、損傷細胞と接している生物学的液体中にも現れる。検体から脳脊髄液，血液，血漿，血清，だ液及び尿等の生物学的液体を得ることは、固体組織の生体組織検査試料を得ることより、一般的にあまり侵襲的ではなく、損傷を与えることもない。このため、生物学的液体である試料は、本発明の実施のために好まれる。神経系と直接相互作用し、容易に得ることができるので、検体における神経損傷を検出するため、特にＣＳＦが好まれる。
【００２７】
従来の方法によって、検体から生物学的試料を得ることができる。例えば、腰椎穿刺によってＣＳＦを得てもよい。静脈穿刺によって、血液を得てもよい。一方、既知の方法に従って、全血液を分画することにより、血漿及び血清を得てもよい。固体組織試料を得るための外科的な手法は、当技術分野でよく知られている。例えば、Atlas of Neurosurgery: Basic Approaches to Cranial and Vascular Procedures, by F. Meyer, Churchill Livingstone, 1999、Stereotactic and Image Directed Surgery of Brain Tumors, 1st ed. , by David G. T. Thomas, WB Saunders Co., 1993 及び Cranial Microsurgery: Approaches and Techniques, by L. N. Sekhar and E. De Oliveira,1st ed. , Thieme Medical Publishing, 1999等の標準的な神経外科手術の教科書に、神経系組織試料を得るための方法が述べられている。また、脳組織を得て、分析するための方法が、Belay et al., Arch. Neurol. 58: 1673-1678 (2001)及びSeijo et al. , J. Clin. Microbiol. 38: 3892-3895 (2000)に述べられている。
【００２８】
生物学的試料が得られるための検体として、αＩＩスペクトリンを発現する全ての動物を利用してもよい。例えば、犬，猫，馬，牛，豚，羊，山羊，ニワトリ，霊長類，ラット又はマウス等の哺乳動物を検体としてもよい。ここで提示された実験は、ヒトの検体に関するものなので、本発明の方法で好ましい検体は人間である。外傷性の発作（例えば、銃による傷，車の事故，スポーツの事故，揺さぶられっ子症候群）、虚血性発作（例えば、脳梗塞，脳卒中，心不全）、神経変性病（アルツハイマー病，ハンチントン病，パーキソン病，プリオン関連病，他の形の痴呆等）、てんかん、薬物乱用（例えば、アンフェタミン，エクスタシー／ＭＤＭＡ，又はエタノール）、糖尿病性の神経障害、化学療法による神経障害、神経障害性の痛み等の末梢神経系病理を原因とする脳損傷の被害者等の外傷性もしくは非外傷性の神経系損傷を有する又は発現する恐れがあると考えられる検体が特に好ましい。
【００２９】
（カルパイン及びカスパーゼ−３の活性化マーカー）
本発明の方法は、生物学的試料における、αＩＩスペクトリンと、カスパーゼ−３及びカルパインからなるグループから選択される少なくとも一つのプロテアーゼによってαＩＩスペクトリンのタンパク質分解切断から生じたαＩＩスペクトリン分解産物（ＳＢＤＰ）とから選択される少なくとも一つのマーカーの存在又は量を検出するステップを特徴とする。カスパーゼ−３によって、αＩＩスペクトリンのタンパク質分解切断から生じたＳＢＤＰは、ＳＢＤＰ１５０ｉ及びＳＢＤＰ１２０を含む。カルパインによって、αＩＩスペクトリンのタンパク質分解切断から生じたＳＢＤＰは、ＳＢＤＰ１５０及びＳＢＤＰ１４５を含む。分析される動物検体の種によって、カスパーゼ−３及びカルパインによるαＩＩスペクトリンのタンパク質分解切断から生じたＳＢＤＰの泳動パターンは幾分異なる。ここで教示した方法を用いて、実験的にこれらを決定してもよい。
【００３０】
（αＩＩスペクトリン及びＳＢＤＰの検出）
本発明は、生物学的試料における、αＩＩスペクトリン又はそのＳＢＤＰ（例えば、ＳＢＤＰ１５０，ＳＢＤＰ１４５，ＳＢＤＰ１５０ｉ，ＳＢＤＰ１２０）の一つのマーカーの存在を検出する方法だけでなく、生物学的試料におけるそのようなマーカーのレベルを測定する方法を含む。生物学的試料における、αＩＩスペクトリン又はそのＳＢＤＰの一つの存在又は不在を検出するための典型的な方法は、検体（例えば、人間の患者）から生物学的試料を得て、分析されるマーカーを検出できる化合物又は作用剤（例えば、抗体又はアプタマー）と生物学的試料を相互作用させ、洗浄後、化合物又は作用剤の試料への結合を分析することを含む。特異的に化合物又は作用剤に結合したこれらの試料は、分析されるマーカーを発現している。
【００３１】
本発明の方法は、試験管内（in  vitro）及び生体内（in  vivo）の生物学的試料におけるαＩＩスペクトリン又は一つのそのＳＢＤＰを検出するために用いてもよい。試料におけるαＩＩスペクトリン又はそのＳＢＤＰの一つの発現量を、適当なコントロール、例えば、分析されるマーカーの検出可能なレベルを発現することが知られている第一の試料（すなわち、ポジティブコントロール）及び分析されるマーカーの検出可能なレベルを発現しないことが知られている第二の試料（すなわち、ネガティブコントロール）と比較してもよい。例えば、マーカーの検出に関する試験管内（in  vitro）の技法としては、酵素結合免疫吸着結合法（ＥＬＩＳＡ），ウエスタンブロット法，免疫沈降法，免疫蛍光法が挙げられる。さらに、マーカーの検出に関する生体内（in  vivo）の技法としては、マーカーを生物学的試料又は試験検体へ特異的に結合する標識化された作用剤を導入することが挙げられる。例えば、生物学的試料又は試験検体内における放射性マーカーの存在及び位置で標識化可能なその作用剤を、標準的な画像技法によって検出してもよい。
【００３２】
αＩＩスペクトリン及び／又は一つ以上のそのＳＢＤＰを特異的に結合することが可能な任意の適当な分子を、本発明で用いてもよい。αＩＩスペクトリン又はそのＳＢＤＰの一つを検出するための好ましい作用剤は、分析されるマーカーに結合可能な抗体であり、好ましくは検出可能な標識と結合した抗体である。そのような抗体は、ポリクローナル、又はモノクローナルであってもよい。また、未処理の抗体，そのフラグメント（例えば、ＦａｂやＦ（ａｂ´）2），又はその改変された変異体（例えば、ｓＦｖ）を用いてもよい。そのような抗体は、ＩｇＧ，ＩｇＭ，ＩｇＥ，ＩｇＡ，ＩｇＤを含む任意の免疫グロブリンクラス及びその任意のサブクラスであってもよい。
【００３３】
特に有用な抗体としては、αＩＩスペクトリン及び／又は一つ以上のそのＳＢＤＰの区別が可能なものが挙げられる。特定のマーカー或いはマーカーの一部のみに結合する抗体を、既知の方法に従って作製してもよい。参照、Coliganら、前出。以下に記載のように、αＩＩスペクトリンＳＢＤＰの一つ又は一部を特異的に結合する抗体は、動物を個々のＳＢＤＰのＮ末端に対応するペプチドで免疫化することによって、そのようなＮ末端に対して作られる。
【００３４】
αＩＩスペクトリン及び／又は一つ以上のそのＳＢＤＰの存在に関して生物学的試料を分析するためには、抗体に基づく分析が好ましい。適当なウエスタンブロット法を、以下の実施例の欄で記載する。さらに迅速な分析法（医学的緊急事態で重要性があるかもしれない場合）として、免疫吸着法（例えば、ＥＬＩＳＡ及びＲＩＡ）及び免疫沈降法を用いてもよい。参照、Coliganら、前出。一例として、生物学的試料又はその一部を基質（例えば、ニトロセルロースやＰＶＤＦで作られた膜、又は、ポリスチレンやマイクロタイタープレートなどの他のプラスチックポリマーで作られた剛性基質）上に固定化し、分析されるマーカーと抗体を結合させる条件下で、αＩＩスペクトリン及び／又は一つ以上のそのＳＢＤＰを特異的に結合する抗体とその基質を接触させる。洗浄後、基質上の抗体の存在は、試料が分析されるマーカーを含んだことを示す。抗体を検出可能な標識（例えば、酵素，蛍光プローブ，放射性同位体）と直に結合させた場合、その存在を検出可能な標識に対する基質を検査することによって検出してもよい。或いは、マーカー特異的抗体を結合する検出可能な標識化された第二の抗体を基質に添加してもよい。洗浄後、基質上の検出可能な標識の存在は、試料がマーカーを含んでいたことを示す。
【００３５】
また、これらの基本的な免疫分析法の多数の組合せを本発明で用いてもよい。例えば、（生物学的試料よりはむしろ）マーカー特異的抗体を基質上に固定化し、その基質を、標識化されたマーカーへの抗体の結合を生じさせる条件下で、検出可能な標識と結合したマーカー（例えば、一つ以上のαＩＩスペクトリン及び／又は一つ以上のそのＳＢＤＰ）と接触させる。その後、分析されるマーカーを抗体へ結合させる条件下で、この基質を生物学的試料と接触させる。洗浄後、基質上の検出可能な標識の量の減少は、試料がマーカーを含んでいたことを示す。
【００３６】
抗体の多数の特性のため本発明において抗体を用いることが好ましいが、αＩＩスペクトリン及び／又は一つ以上のそのＳＢＤＰを特異的に結合する他の適当な作用剤（例えば、ペプチド，アプタマー，又は小さな有機分子）を、上述の免疫分析法において抗体の代わりに用いてもよい。例えば、αＩＩスペクトリン及び／又は一つ以上のそのＳＢＤＰを特異的に結合するアプタマーを用いてもよい。アプタマーは、特定のリガンドを結合する核酸基の分子である。特定の結合特異性を有するアプタマーの製造方法は公知である。例えば、米国特許番号第5,475,096号；第5,670,637号；第5,696,249号；第5,270,163号；第5,707,796号；第5,595,877号；第5,660,985号；第5,567,588号；第5,683,867号；第5,637,459号；及び第6,011,020号を参照。
【００３７】
マーカーの発現に関する診断上の分析において用いられる種々の検出可能な標識が当技術分野で知られている。αＩＩスペクトリン及び／又は一つ以上のそのＳＢＤＰを検出するための方法において用いられる作用剤を、例えば、ワサビペルオキシダーゼ等の酵素などの検出可能な標識に結合させてもよい。ワサビペルオキシダーゼの存在下で色の変化を引き起こす適当な基質を加えることによって、ワサビペルオキシダーゼで標識した作用剤を検出してもよい。使用され得るいくつかの他の検出可能な標識が知られている。これらの一般的な例は、アルカリフォスファターゼ，ワサビペルオキシダーゼ，蛍光性化合物，発色性化合物，金コロイド，磁性粒子，ビオチン，ラジオアイソトープ及び他の酵素を含む。
【００３８】
（神経細胞損傷とマーカー発現との相関）
本発明は、生物学的試料における、αＩＩスペクトリン及び／又は一つ以上のそのＳＢＤＰの存在又は量を、神経細胞損傷（又は他のαＩＩスペクトリン発現細胞の損傷）の重症度及び／又は型と相関させるステップを採用する。より重症である損傷は、より多くの神経細胞にダメージを与え、次々に大量のαＩＩスペクトリン及び／又はそのＳＢＤＰを生物学的試料（例えば、ＣＳＦ）に蓄積させるので、生物学的試料における、スペクトリン及び／又はそのＳＢＤＰの量は、神経組織の損傷と直接相関する。また、生物学的試料におけるＳＢＤＰの存在を調べることによって、神経細胞損傷がアポトーシス又はネクローシス型の細胞死を引き起こしているかどうかを決定できる。ネクローシス型の細胞死は選択的にカルパインを活性化させるのに対して、アポトーシス型の細胞死は選択的にカスパーゼ−３を活性化させる。カルパインとカスパーゼ−３によるＳＢＤＰを区別することができるので、これらのマーカーの測定は検体における細胞損傷の型を示す。例えば、ネクローシスで誘発されたカルパインの活性化は、ＳＢＤＰ１５０とＳＢＤＰ１４５の産出をもたらし、アポトーシスで誘発されたカスパーゼ−３の活性化は、ＳＢＤＰ１５０ｉとＳＢＤＰ１２０の産出をもたらし、両方の経路の活性化は、４つの全マーカーの産出をもたらす。そのような試験の結果は、カルパイン及び／又はカスパーゼの阻害剤の投与が患者に有益であるかどうかに関する医師の決定を補助することができる。本発明は、同一の生物学的試料からアポトーシス及びネクローシスによる細胞死の相対規模を同時に検出するための利用可能な唯一のアプローチであると考えられる。この適用は、細胞死のメカニズムにおいて、年齢及び性別の違いを検出できる点で特に重要であり得る。
【００３９】
（キット）
本発明は、検体における細胞損傷を分析するためのキットも提供する。本キットは、（ａ）損傷した神経細胞を有する可能性のあるヒト検体から分離した生物学的試料であり、検体から分離される前、検体の神経系と接している液体である生物学的試料を保持する基質と、（ｂ）αＩＩスペクトリン、並びにカスパーゼ−３及びカルパインからなるグループから選択される少なくとも一つのプロテアーゼによってαＩＩスペクトリンのタンパク質分解切断から生じたαＩＩＳＢＤＰから選択される少なくとも一つのマーカーに特異的に結合する作用剤と、（ｃ）作用剤を、生物学的試料又は生物学的試料の一部分と反応させて、生物学的試料における少なくとも一つのマーカーの存在又は量を検出するための印刷された説明書とを含む。
【００４０】
キットにおいて、生物学的試料はＣＳＦ又は血液であってもよく、作用剤は抗体、アプタマー、又はαＩＩスペクトリン，ＳＢＤＰ１５０ｉ，ＳＢＤＰ１５０，ＳＢＤＰ１４５，ＳＢＤＰ１２０の少なくとも一つに特異的に結合する他の分子であってもよい。適当な作用剤は上記で述べられている。また、キットには、作用剤に結合した標識、作用剤に特異的に結合する基質に結合した標識等の検出できる標識が含まれていでもよい。
【００４１】
（実施例）
以下の実施例は本発明を説明するために用い、本発明の範囲が何ら制限されるものではない。本発明の精神及び範囲から逸脱することなく変形又は変更の形態をとってもよいことを理解できるであろう。
【実施例１】
【００４２】
（材料及び方法）
略語：ＡＥＢＳＦ、フッ化 ４−(２−アミノエチル)ベンゼンスルホニル；ＥＤＴＡ、エチレンジアミン四酢酸；ＥＧＴＡ、エチレンビス（オキシエチレンニトリロ）四酢酸；ＤＭＥＭ、ダルベッコ変法イーグル培地；ＢＳＡ、牛血清アルブミン；ＤＰＢＳ、ダルベッコリン酸緩衝食塩水；ＤＴＴ、ジチオトレイトール；ＦＤＡ、フルオレセイン二酢酸；ＧＦＡＰ、グリア線維細胞酸性タンパク質；ＨＢＳＳ、ハンクスの平衡塩溶液；ＭＡＰ−２、微小管結合タンパク質−２；ＰＩ、ヨウ化プロピジウム；ＰＭＳＦ、フェニルメチルスルホニルフルオライド；ＳＤＳ、ドデシル硫酸ナトリウム；ＴＥＭＥＤ、Ｎ,Ｎ,Ｎ´, Ｎ´−テトラメチルエチレンジアミン；ＣａｌｐＩｎｈ−ＩＩ、カルパイン阻害剤（calpain inhibitor）ＩＩ（Ｎ−acetyl−Leu−Leu−methioninal）；Ｚ−Ｄ−ＤＣＢ、パン−カスパーゼ阻害剤（pan-caspase inhibitor）（carbobenzoxy−Asp−CH2−OC（O）−２−６−dichlorobenzene）；ＰＢＳ、リン酸緩衝食塩水；ＴＬＣＫ、Ｎα−ｐ−トシル−Ｌ−リジンクロロメチル；ＴＰＣＫ、Ｎ−トシル−Ｌ−フェニルアラニンクロロメチルケトン。
【００４３】
（細胞培養技法）
中隔海馬の培養。胎児齢１８日目のラットを、深い麻酔下の母体から取り出した。中隔と海馬を解離緩衝液（４．２ｍＭの重炭酸塩と、１ｍＭのピルビン酸塩と、２０ｍＭのＨＥＰＥＳと、３ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含むＨＢＳＳ、ｐＨ７．２５）の中で切り裂いた。ＤＭＥＭ−ＤＭで洗浄後、炎で引き伸ばされた（flame-constricted）パスツールピペットの微細孔を通して粉砕することによって組織を分離した。分離した細胞を、１０％のウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ−１０Ｓ）で再懸濁し、４．３６×１０5cells／ｍLの濃度で、２４ウェルのポリ−Ｌ−リジンを被覆したプラスチックプレート又は１２ｍｍのドイツガラス（German glass）（Erie Scientific社製）上で培養した。５％ＣＯ2、３７℃の雰囲気下の加湿したインキュベーターの中で培養物を保持した。培養５日後、培地をＤＭＥＭ−ＤＭに交換した。５日目に、ウシ胎仔血清を除いたが、次の８日間で細胞死は増加しなかった。次の培地交換を、１週間に３回行った。試験管内で１０日まで、神経膠星状細胞が、形態学的に成熟した神経細胞下にコンフルエントの単層を形成した。
【００４４】
マイトトキシンを用いた中隔海馬細胞の薬学的処理。１０日齢の中隔海馬の培養物を、ＤＭＥＭ−ＤＭの中で０．０１〜２．０ｎＭのマイトトキシン（和光製品、リッチモンド、ＶＡ、Ca t.＃131-10731）で処理し、細胞の生存度を損傷後の時点で監視した。各実験の全継続期間中、培養物をマイトトキシンに曝した。マイトトキシン処理後、細胞を染色するために固定するか、或いはタンパク質又はＤＮＡの抽出を行った。
【００４５】
カルパイン，カスパーゼ，及びタンパク質合成阻害剤を用いた中隔海馬培養物の処理。マイトトキシン処理前の１時間、３７．５μMのカルパイン阻害剤ＩＩ（ＣａｌｐＩｎｈ−ＩＩ）（Boehringer Mannheim社製）,３０μＭのパン−カスパーゼ阻害剤Ｚ−Ｄ−ＤＣＢ（Biochem社より入手）,又は１μｇ／ｍＬのタンパク質合成阻害剤シクロヘキシミド（ＣＨＸ）（Sigma社製）の何れかで前処理した。その阻害剤の濃度は、カルパイン，カスパーゼ−３（ＣＰＰ３２）プロテアーゼ，及びタンパク質合成の最適な阻害作用をもたらす。加えて、ＣａｌｐＩｎｈ−ＩＩとＺ−Ｄ−ＤＣＢのこれらの投与量は、中隔海馬の培養において、スタウロスポリンにより誘発されるアポトーシスを伴うカルパイン及びカスパーゼ−３の活性化を弱めることができるということを別の実験で確認した。また、この研究では、本研究で使用したＣａｌｐＩｎｈ−ＩＩ及びＺ−Ｄ−ＤＣＢの濃度がカルパイン及びカスパーゼ−３のプロテアーゼを阻害するという独自の確証を提供するためにαＩＩスペクトリンの分解を行った。さらに、１μｇ／ｍＬのシクロヘキシミドは、この系におけるアポトーシスの細胞死のみならず、カルパイン及びカスパーゼの活性化もブロックした。各実験後、細胞を染色するために固定するか、或いはタンパク質又はＤＮＡの抽出を行った。
【００４６】
スタウロスポリンを用いた培養物の処理。１０日齢の中隔海馬の培養物を、ＤＭＥＭ−ＤＭの中で０．０５〜２．０μＭのスタウロスポリン（Calbiochem社、La Jolla、CＡ、Ca t.＃5693397）で処理し、細胞の生存度を損傷後の時点で監視した。実験の全継続期間中、スタウロスポリンを培地に直に添加した。スタウロスポリン処理後、細胞を染色するために固定するか、或いはタンパク質又はＤＮＡの抽出を行った。
【００４７】
（細胞損傷の形態学的な評価）
フルオレセイン二酢酸及びヨウ化プロピジウムによる細胞の生存の測定。フルオレセイン二酢酸（ＦＤＡ）及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）色素を用いて、マイトトキシンによるインキュベーション後の細胞の生存を測定した。ＦＤＡは普通の細胞へ入りこみ、エステラーゼにより切断された場合、緑の蛍光を発する。一度切断されると、ＦＤＡはもはや細胞膜を浸透できない。ヨウ化プロピジウムは、普通、細胞から排出される生体染色である。損傷後、ＰＩは細胞に浸透し、細胞核のＤＮＡに結合し、赤色の蛍光を発する。ＦＤＡ（２０ｍｇ／ｍＬ）の原液をアセトン中に溶解させた。５ｍｇ／ｍＬをＰＢＳ中に溶解させることによって、ＰＩの原液を調製した。１０μＬのＦＤＡの原液と３μＬのＰＩの原液を１０ｍＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に加えることによって、ＦＤＡとＰＩの希釈標準溶液を新たに調製した。１ウェルにつき２００μＬのＦＤＡ／ＰＩの希釈標準溶液を細胞へ直接加えた。細胞を室温で３分間染色し、氷上に置いた。４５０〜４９０ｎＭの励起フィルタ（バンドパスフィルタ）と、５１０ｎＭの色ビームスプリッタと、５２０ｎＭの吸収フィルタ（ロングパスフィルタ）とを備えた落射（epi-illumination)蛍光顕微鏡を用いて、染色された細胞を調べた。このフィルタの結合により、緑と赤の両方の蛍光を発する細胞を同時に視覚化できた。
【００４８】
コントロールの培地と、異なる時点におけるマイトトキシンによる（プロテアーゼとタンパク質合成阻害剤の有無での）損傷後との生存細胞の割合を、ＦＤＡ／ＰＩを用いた３の独立した実験から決定した。この手法により、死細胞の核が赤の蛍光を発するのに対して、生細胞の細胞質では緑の蛍光を発するため、細胞の生存を決定できる。各々の実験において３ウェルに関して、１００倍の領域（５の連続した１００倍の領域を計測し、ウェル毎に平均した）で計測された細胞の損失を、全細胞数の割合として計測した。
【００４９】
アポトーシスの核のヘキスト染色。Ａ−Ｔ塩基対に特異的な色素、ヘキスト３３２５８（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８）（ビス-ベンズイミド、Sigma社）を用いて、細胞核を染色した。４％パラホルムアルデヒドにより一晩４℃で固定した後、ドイツガラス（German glass）上で培養した細胞をＰＢＳで３回洗浄し、細胞を完全に覆うために十分な溶液を用いて、ＰＢＳ中で５〜１０分間、室温で１μｇ／ｍＬのＤＮＡ染料ヘキスト３３２５８で標識化した。細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、その後クリスタルマウント培地（Biomedia社）を用いてマウントした。ＵＶ２Ａフィルタを備えた位相差顕微鏡及び蛍光顕微鏡上で、細胞を観察し撮影した。
【００５０】
ＤＮＡフラグメンテーション分析。イムノブロッティングと同じ方法で、細胞を採集した。それぞれの処理条件において、細胞を遠心分離によって採集し、７０％の冷エタノール中の懸濁液で固定し、固定液中で（２４〜７２時間）−２０℃で保存した。その後、細胞を８００×ｇで５分間遠心分離し、エタノールを徹底的に除去した。細胞のペレットを、室温で１時間、０．２ＭのＮａ2ＨＰ０4が１９２と０．１Ｍのクエン酸（ｐＨ ７．８) が８の割合から構成されるリン酸―クエン酸（ＰＣ）緩衝液４０μＬ中で再懸濁した。１０００×ｇで５分間遠心分離の後、上清を新しい試験管に移し、SpeedVacコンセントレータで１５〜３０分間、真空によって濃縮した。そして、３μＬの蒸留水中の０．２５％のＮｏｎｉｄｅｔ ＮＰ−４０を加えて、その後、３μＬのＤＮａｓｅが含まれないＲＮａｓｅ（１ｍｇ／ｍＬ）の溶液を加えた。３７℃でのインキュベーション３０分間後、３μＬのプロテナーゼＫ溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を加え、さらに３７℃で３０分間、その抽出物をインキュベートした。インキュベートした後、６×ローディングバッファー（水中の、０．２５％のブロモフェノールブルー、０．２５％のキシレンシアノールＦＦ、３０％のグリセロール)を１μＬ加え、試験管の全内容物を１．５％アガロースゲルへ移し、１×ＴＢＥ（０．１ＭのＴｒｉｓ、０．０９Ｍのホウ酸、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ ８．４）中で電気泳動を２時間、４０Ｖで行った。ゲル中のＤＮＡを、５μｇ／ｍＬの臭化エチジウムで染色後、紫外線下で視覚化し撮影した。
【００５１】
（αＩＩスペクトリン分解の評価）
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動及びイムノブロッティング。実験の終わりに、細胞を５つの同一の培養ウェルから採取し、１５ｍｌの遠心分離管に採集し、３０００×ｇで５分間遠心分離した。培地を取り除き、ペレット細胞を１×ＤＰＢＳで洗浄した。細胞を、非常に冷たい均質化緩衝液［２０ｍＭのＰＩＰＥＳ（ｐＨ ７．６）、１ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのＰＭＳＦ、５０μｇ／ｍＬのロイペプチン及び１０μｇ／ｍＬのＡＥＢＳＦ，アプロチニン，ペプスタチン，ＴＬＣＫ及びＴＰＣＫ］中で３０分間溶解させ、２５標準規格注射針をつけた１．０ｍＬの注射器に通して１５回剪断した。試料中のタンパク質含有量を、マイクロＢＣＡ法(Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、米国)によって測定した。
【００５２】
タンパク質電気泳動に関しては、等量の全タンパク質（３０μｇ）を、０．２５ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ６．８）、０．２ＭのＤＴＴ、８％のＳＤＳ、０．０２％のブロモフェノールブルー及び２０％のグリセロールを含む２倍量のローディングバッファー中に調製し、９５℃で１０分間熱した。７％のアクリルアミド分離ゲル上に４％の濃縮用ゲルを用いた縦型電気泳動槽において、試料を２００Ｖで１時間分解した。イムノブロッティングに関しては、１０％のメタノールと共に０．１９２Ｍのグリシン、０．０２５ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ ８．３）からなる転写バッファーを用いて、４℃で１時間、定電圧（１００Ｖ）で、分離したタンパク質を、ニトロセルロース膜に横方向に転写した。２０ｍＭのＴｒｉｓ中の５％の無脂肪ミルク、０．１５ＭのＮａＣＩ及び０．００５％のＴｗｅｅｎ−２０中で、ブロットを４℃で一晩中ブロッキングした。クマシーブルー及びパンセアウレッド（Panceau red）（Sigma社，St．Louis、MO）を用いて、ゲル及びニトロセルロース膜を(それぞれ)染色し、等量のタンパク質が各レーンに載せられたことを確認した。
【００５３】
以下に述べるように、無傷のαＩＩスペクトリン（２８０ｋＤａ）並びに１５０、１４５及び１２０ｋＤａのＳＢＤＰを検出する抗αＩＩスペクトリンモノクローナル抗体（Affiniti  Research製品、英国、カタログ番号：ＦＧ ６０９０、クローンＡＡ６）で、イムノブロットを探索した。室温で２時間、一次抗体（１： ４０００）とのインキュベーション後、ブロットを、ペルオキシダーゼが結合した羊の抗マウスＩｇＧ中（１： １０，０００）で１時間インキュベートした。増強された化学発光試薬（ＥＣＬ、Amersham社）を用いて、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ（Ｈｙｐｅｒｆｉｈｎ ＥＣＬ、Amersham社）上で、イムノラベリングを視覚化した。
【００５４】
神経膠細胞又はニューロン細胞型におけるヘキスト３３２５８染色。星状膠細胞及びニューロン細胞型のマイトトキシンの効果を決定するため、星状膠細胞に関しては、培養物をＧＦＡＰ（ポリクローナル、Sigma社）で免疫細胞化学的に標識化し、又はニューロン細胞に関しては、培養物をＭＡＰ−２（Sternberger社）及びＮｅｕＮ（Chemicon社）で二重に標識化し、次いで、ＡＴ塩基対に特異的な色素であるヘキスト３３２５８で対比染色した。培養物を、４℃で１時間、４％パラホルムアルデヒド中で固定化し、洗浄し、ＰＢＳ中に保存した。培養物を、０．３％のトリトンＸ−１００で３０分間透過処理し、室温１時間、通常の１％ウマ又はヤギ血清でブロッキングした。その後、ＧＦＡＰ（１： １０００）、ＭＡＰ−２（１： １０００）及びＮｅｕＮ（１： １０００）抗体と４℃で一晩中インキュベートした。培養物を、ＰＢＳ中で３回洗浄し、ワサビペルオキシダーゼを結合したヤギの抗ウサギＩｇＧ（ＧＦＡＰ）又はヒツジの抗マウスＩｇＧ（ＭＡＰ−２及びＮｅｕＮ）(Ｃａｐｐｅｌ、１： １０００)中で1時間インキュベートした。培養物を、ＰＢＳ中で３回洗浄し、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ、Ｖｅｃｔｏｒ）を用いて、反応を視覚化した。ＤＡＢ中でのインキュベーション後、水道水中で反応を止めて、培養物をヘキスト３３２５８で５分間対比染色した。最終の洗浄後、細胞をCytoseal 280 mounting  medium（Stephens社）でマウントし、カバースリップを載せた。(免疫標識された細胞に関しては)光学顕微鏡、及び(ヘキスト３３２５８で標識された細胞に関しては)蛍光顕微鏡を用いて、同じ領域でそれぞれのスライドを観察し、撮影した。位相差顕微鏡（Zeiss Axiovert 135）を用いて、神経膠細胞層とニューロン細胞層を識別した。
【００５５】
（統計分析）
分析はそれぞれ３回行ない、分散分析（ＡＮＯＶＡ）によってpost-hoc Tukeyテストでデータを評価した。値は平均±標準偏差として与えられる。Ｐ≦０．０５の場合、有意差があるとみなした。
【００５６】
（外科的処置）
調節された皮質衝撃外傷性の脳損傷。皮質の衝撃損傷装置を用いて、齧歯動物に外傷性脳損傷（ＴＢＩ）を引き起こした。皮質の衝撃ＴＢＩは、挫傷を起こすインパクター・チップの近辺内に皮質の変形をもたらし、また損傷部位と同側の半球に強いられるニューロン及び軸索の損傷をもたらす。Ｏ2 ／Ｎ2Ｏが１：１であるキャリヤーガス中の４％のイソフルランで成体オス（２８０−３００ｇ）Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙネズミ（Harlan； Indianapolis、IN）を最初に（４分間）麻酔をかけた。その後、同じキャリヤーガス中の２．５％のイソフルランの維持によって麻酔をかけた。直腸サーミスター・プローブによって、中核体温を連続してモニターし、ラットの下に調整可能な温度制御加熱パッドを置くことによって、３７℃±１℃に維持した。動物を腹臥位で定位固定のフレームにマウントし、両外耳道に挿入する鋼鉄の棒（ear bar）と切歯棒（incisor bar）によって安定させた。
【００５７】
頭蓋の中線上を切開し、軟組織を折り曲げ、ブレグマとラムダの間の中間の中央の縫合線付近で、一方側の(衝撃部位と同側の)頭骨切開（直径７ｍｍ）を行った。硬膜を、皮質上で無傷の状態に保った。（空気圧式シリンダーに収容された）直径５ｍｍのアルミニウム製インパクター・チップを用いて、２．０ｍｍの圧縮、１５０ｍｓのドウェル時間（圧縮持続時間）、３．５ｍ／ｓの速度で、表面の皮質（同側の皮質）に衝撃を与えることにより、ネズミの脳損傷を作り出した。空気圧式シリンダーに供給された圧力(圧縮したＮ2)を調節することにより、速度を制御した。記憶装置トレース・オシロスコープ（BK  Precision、model 2522B； Placentia、CA）で記録されたアナログ信号を作り出す線形速度置換変換器（Lucas  ShaevitzTM  model  500 HR； Detroit、MI)によって、速度とドウェル時間を測定した。偽損傷動物に同一の外科的手法を施したが、衝撃による損傷は与えなかった。損傷前と損傷後の適切な管理を続けた。
【００５８】
中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）。非侵襲性のフィラメントのＭＣＡＯ閉塞法を用いた。この方法は、骨切除開頭術を行なう必要がないので、脳波（ＥＥＧ）電極の恒久的な定位配置のために無傷な頭骨を保つ。Longaら(Stroke, 20:84-91, 1989)によって述べられ、その後、Brittonら（Life Science, 60:1729-1740, 1997）によって修正された、基本的な方法を使用した。基本的な手法は、外頚動脈（ＥＣＡ）に切開部から導入された丸いチップを備えた、管内モノフィラメントの３−０ナイロンの無菌縫合を用いて、ＭＣＡへの血流の流れを閉塞することからなる。
【００５９】
ハロセン麻酔（５%のハロセンを吸入器で吸引させ、その後２%のハロセンをノイズコーンによって吸引させる）下で、頚部の中線上に切開部を有する外頚動脈と内頚動脈の分岐部の位置で、総頚動脈（ＣＣＡ）を露出した。内頚動脈（ＩＣＡ）を翼口蓋枝まで吻方へ沿わせ、外頚動脈（ＥＣＡ）を結紮し、その舌枝と上顎枝のところで切った。
【００６０】
縫合を挿入している間出血を防ぐため、ＣＣＡとＩＣＡをマイクロ動脈瘤クリップで、一時的に留めた。その後、ＥＣＡ断端（縫合の経路を血管壁を介して視覚的に監視した）上の切開部から、ナイロン縫合をＩＣＡに導入した。そして、ナイロン縫合が前大脳動脈の狭窄に詰まるまで、ナイロン縫合を動脈分岐から約２０ｍｍ頚動脈管の中を挿入させ、このようにＭＣＡの起始部を閉塞した。その後、殺菌したオートクリップを用いて切開した皮膚を閉じた。ラットを簡単に再麻酔し、再潅流させるためにフィラメント縫合を引き抜く２時間、血管内縫合をそのままの状態にした。
【００６１】
偽ＭＣＡＯ処置に関して、同様な手法を続けたが、内頚動脈と外頚動脈の分岐点を越えたわずか１０ｍｍフィラメントを挿入し、屠殺まで定位置のままとした。全ての処置手法の間、恒温加熱ブラケット（Harvard  Apparatus、Holliston，MA）を用いて、動物を３７℃に保った。
【００６２】
処置後、空気温度を２２℃に保った回復ケージの中に、動物を入れた。２時間の虚血期間中及び４時間の再潅流後期間中、実験の間に体温を正常温度に保つのを補助するため、７５ワットの加温ランプをそれぞれのケージの上部に直接設置した。各々の実験結果で、検視に基づいて網膜下出血の病理学徴候を示すラットの脳を除いた。また、２時間の再還流の直前に、ＭＣＡＯ後のいかなる時でも痙攣行動を示した全てのラットを除いた。
【００６３】
（皮質組織及びＣＳＦの準備）
偽損傷後又はＴＢＩ後の様々な間隔で、ＣＳＦと皮質を動物から採集した。適切な時点で、上記のように、ＴＢＩ又は偽損傷動物に麻酔をかけ、頭が縦軸に沿って自由に移動可能な定位フレームの中で安定させた。頸部の外後頭隆起が突出しているため、頭部を曲げて、頚椎と後頭上の背側中線を切開した。環椎後頭膜を鈍的剥離（blunt dissection）によって露出させ、ポリエチレン管に取り付けられた２５Ｇ針を注意深く大槽へ下げていった。約０．１〜０．１５ｍｌのＣＳＦを各ネズミから採集した。ＣＳＦの採集に続いて、定位フレームから動物を取り出し、すぐに断頭して屠殺した。
【００６４】
その後、（損傷部位に対して）同側及び反対側の皮質を素早く剥離し、氷冷ＰＢＳで洗浄し、液体窒素の中で急激に凍らした。開頭術により、白質のレベルまで皮質を切り取り、横方向に４ｍｍまで、体軸方向に７ｍｍまで広げた。ＣＳＦ試料を、４０００×ｇで４分間４℃で遠心し、汚染している赤血球を除いた。使用されるまで、澄んだＣＳＦ及び凍らされた組織試料を−８０℃で保存した。ガラス管の中において、広範囲のプロテアーゼ阻害剤のカクテル（Roche  Molecular  Biochemicals、Ca t.＃１−８３６−１４５）を含む冷氷の３倍界面活性剤溶解バッファー（２０ｍＭのヘペス、１ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのＥＧＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％ＳＤＳ、１．０％ＩＧＥＰＡＬ４０及び０．５％デオキシコール酸、ｐＨ ７．５）１５容積中でテフロン（登録商標）のｄｏｕｎｃｅ乳棒を用いて、皮質をホモゲナイズした。説明をした上での同意により、ＴＢＩを患うヒト検体、及び水頭症を患うが、ＴＢＩを患わないコントロールである患者から、ＣＳＦ試料を得た。
【００６５】
（ＣＳＦ及び皮質組織のイムノブロット分析）
組織ホモジェネート及びＣＳＦのタンパク質濃度を、アルブミンスタンダードを用いて、ビシンコニン酸のマイクロプロテイン分析（ＰｉｅｒｃｅＩｎｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）によって決定した。硫酸ドデシルナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のため、蒸留水中の０．２５ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ ６．８）、０．２ＭのＤＴＴ、８％のＳＤＳ、０．０２％のブロモフェノールブルー及び２０％のグリセロールを含むローディングバッファーを２倍量とした、タンパク質のバランスのとれた試料を準備した。試料を１００℃で１０分間加熱し、マイクロ遠心機を用いて、外気温度で１０，０００ｒｐｍ、１分間遠心分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、６．５％のＴｒｉｓ/グリシンのゲルで２００Ｖで１時間、１レーン当たりの４０μｇのタンパク質を通常のように分離した。電気泳動後、分離されたタンパク質を、４℃で１時間１００Ｖの定電圧で、１０％のメタノール、０．１９２Ｍのグリシン及び０．０２５ＭのＴｒｉｓ(ｐＨ ８．３)を含む転写緩衝液中で、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に横方向に転写した。ＴＢＳ及び０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０中の５％の脱脂ミルク中で外気温度で１時間ブロットをブロックした。Ｐａｎｃｅａｕ  Ｒｅｄ（Sigma社、St．Louis、MO）を用いて、膜を染色し、タンパク質がうまく転写されていることを確認し、等量のタンパク質が各々のレーンに載せられたことを保証した。
【００６６】
（抗体及び免疫標識化）
脳又はＣＳＦタンパク質を含むイムノブロットを、無傷の非赤血球αＩＩスペクトリン（２８０ｋＤａ）並びに１５０，１４５，１２０ｋＤａのαＩＩスペクトリンの切断フラグメントを検出する抗αＩＩスペクトリンモノクローナル抗体（ＦＧ ６０９０ Ａｂ；ｃｌｏｎｅＡＡ６；Ca t.＃ ＦＧ 6090；Affiniti  Research  Product株式会社、英国）を用いて調査した。また、ＴＢＩ後、ＣＳＦ中のカルパインで切断されたスペクトリンの特異性を確認するため、カルパインで切断した、１５０ｋＤａのαＩＩスペクトリン分解産物（ＳＢＤＰ）のＮ末端領域（ＧＭＭＰＲ）だけを認識する二次抗体(抗ＳＢＤＰ１５０；ウサギポリクローナル)を用いた(Nathら、1996b; Saidoら、1993)。あるイムノブロットを、赤血球αＩ−スペクトリンを認識する抗体（Ca t.＃BYA10881；Accurate  Chemical  ＆  Scientific株式会社、Westbury、NY）で免疫標識した。一次抗体（ＦＧ６０９０  Ａｂ、脳組織に関しては１：４０００、ＣＳＦに関しては１：２０００；ＳＢＤＰ１５０  Ａｂ、１：１０００；ＢＹＡ１０８８１、１：４００）と４℃で一晩中インキュベートした後、ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：１００００希釈）又はヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：３０００）を含む３％脱脂肪ミルク中で外気温度で１時間ブロットをインキュベートした。化学発光強化（ＥＣＬ、Amersham）試薬を用いて、Ｋｏｄａｋ  Ｂｉｏｍａｘ  ＭＬの化学発光フィルム上に免疫標識を視覚化した。
【００６７】
統計分析。コンピュータ濃度測定スキャンニング（AlphaImager２０００デジタル・イメージ・システム、San  Leandro、CA）によって、イムノブロットで検出されるタンパク質のレベルの半定量評価を行った。データは統合された濃度測定の値としてデータを得て、同様にしてブロット上に視覚化された偽損傷動物からのスキャンに基づいて得られた濃度測定のレベルの割合へ変換した。最小二乗法直線回帰後のＡＮＯＶＡによって、データを評価した。ｐ＜０．０５の場合、有意差があるとみなした。
【実施例２】
【００６８】
（試験管内及び生体内の神経細胞損傷後のカルパイン及びカスパーゼ−３のＳＢＤＰの検出）
神経損傷後のＳＢＤＰの発現を調べるため、上記のように中隔海馬の培養物を準備し、マイトトキシン（３０分間、１時間）又はスタウロスポリン（３時間）のいずれかで処理した。上記のように、細胞溶解物を採集し調製した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質を分離し、ナイロン膜に転写し、抗α−スペクトリン（ホドリン）モノクローナル抗体（ＦＧ６０９０）を用いてイムノブロットした。図２Ａ及び図２Ｂは、培養された神経細胞に異なるタイプの損傷を与えた後、カルパイン及びカスパーゼ−３の個別の又は同時の検出を示す典型的なウエスタンブロットである。マイトトキシンに曝された神経細胞培養物は、カスパーゼ−３（１２０ｋＤａ  ＳＢＤＰ）によってではなく、カルパインによって（１４５ｋＤａ  ＳＢＤＰ）媒介されたネクローシス型細胞死によって死んだ。対照として、スタウロスポリンに曝された神経細胞培養物は、カルパイン（１４５ｋＤａ  ＳＢＤＰ）によってではなく、カスパーゼ−３によって（１２０ｋＤａ  ＳＢＤＰ）媒介されたアポトーシス型細胞死によって死んだ。
【００６９】
試験管内で実施された研究において、ラットの脳におけるＴＢＩは、損傷後の時間及び研究される脳の領域に依存し、カルパインのみ（図２Ｃ）、或いはカルパイン及びカスパーゼ−３（図２Ｄ）を活性化することを示した。ＴＢＩに対する皮質と視床における反応の比較では、カルパイン（１４５ｋＤａ）ＳＢＤＰは、ＴＢＩ後６〜７２時間の間で検出され、その後５〜１４日は観察されなかった。同じ動物からの視床において、カルパインＳＤＢＰ及びカスパーゼ−３ＳＢＤＰの両方とも、ＴＢＩ後１５分からＴＢＩ後１４日まで検出された。
【実施例３】
【００７０】
（ＳＢＤＰ１５０ｉ，ＳＢＤＰ１５０，ＳＢＤＰ１４５，及びＳＢＤＰ１２０の分化）
図３を参照すると、左から２番目のレーンは、ラットの大脳皮質の溶解物を処置しなかった未処理のものを示し、左から３番目のレーンは、室温で３０分間、精製したブタカルパイン２で(プロテアーゼに対する全タンパク質の比率は１／２００)試験管内で分解したものを示し、また、左から４番目のレーンは、室温で２時間、精製したヒト組み換えカスパーゼ−３で(プロテアーゼに対する全タンパク質の比率は１／５０)試験管内で分解したものを示す。αＩＩスペクトリンのフラグメントのパターンは、ＴＢＩ後のラットの海馬において生体内で生成されたフラグメントのパターン（左から５番目のレーン）と比較した。Ｍは、分子マーカーを備えたレーンを示す。全試料を８％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、抗αＩＩスペクトリン抗体（アフィニティ）へ曝す前に、ブロッティング膜にタンパク質を転写した。ＳＢＤＰ１２０及びＳＢＤＰ１４５は、区別できる位置であるため容易に検出できた。カスパーゼ３で生産されたＳＢＰ１５０ｉは、ゲル上で、カルパインによって生産されたＳＢＤＰ１５０より、わずかに高い移動度を有するため、ブロット上で低い位置となった（図３）。したがって、ウエスタンブロットによって、全４つのＳＢＤＰを互いに区別することができた。
【実施例４】
【００７１】
（ＳＢＤＰ１５０ｉ及びＳＢＤＰ１２０に特異的に結合する抗体を用いたウエスタンブロット）
αＩＩスペクトリンは、カルパイン又はカスパーゼ−３が作用する４つの部位を含む：Ｔｙｒ1176とＧｌｙ1177の間、Ｇｌｙ1230とＳｅｒ1231の間、Ａｓｐ1185とＳｅｒ1186の間、Ａｓｐ1478とＳｅｒ1479の間。各部位での切断は、新しいＮ末端及び新しいＣ末端を有するフラグメントを生成する。つまり、ＳＢＤＰ１５０に関しては、ＮＨ2−Ｇll77ＭＭＰＲＤＥＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、ＳＢＤＰ１４５に関してはＮＨ2−Ｓ1l86ＡＨＥＶＱＲＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）、ＳＢＤＰ１５０ｉに関してはＮＨ2−Ｓl23lＫＴＡＳＰＷＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）、及びＮＨ2−Ｓl479ＶＥＡＬＩＫＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）。これらの各ペプチドシークエンス（又は関連したシーケンス）を用いて、フラグメント特異的な抗体を生産することができる。本実施例において、図４を参照すると、ＳＢＤＰ１５０ｉとＳＢＤＰ１２０のＮ末端に対応する化学的に合成されたペプチド（つまり、ＮＨ2−ＳＫＴＡＳＰＷＫＣ−ＯＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）及びＮＨ2−ＳＶＥＡＬＩＫＫＣ-ＯＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６））を用いて、ＳＢＤＰ１５０ｉ及びＳＢＤＰ１２０特異的抗体を作成した。最後のシステイン残基（Ｃ）を加えて、次のＩｍｊｅｃｔマレイミド活性化キャリアータンパク質（Imject Maleimide-Activated Carrier Protein）（キーホール リンペット ヘモシアニン（ＫＬＨ）（Pierce社））への結合を促進させた。その後、ＫＬＨペプチド結合体（１〜２ｍｇ）を３〜５ヶ月間ウサギに注入し、ポリクローナル抗体を生産した。次に、プロテインＡセファロースを用いて、抗体をアフィニティ精製した。処置されなかった（コントロール）又はアポトーシスを引き起こすためにスタウロスポリン（ＳＴＳ、０．５μＭ）に１６時間供したヒトの神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞のウエスタンブロッティング解析中で、このように生産された抗体をプローブとして使用した。全抗スペクトリン抗体（アフィニティ)（左のパネル、ＡとＢ)を用いた探索は、無傷のαＩＩスペクトリン（２８０ｋＤａ），ＳＢＤＰ１５０ｉ及びＳＢＤＰ１２０を検出した。フラグメント特異的抗体を用いた探索は、相当するフラグメントのみを検出した。抗ＳＢＤＰ１５０ｉ抗体は、ＳＢＤＰ１５０ｉ（右のパネル、Ａ）のみを検出し、抗ＳＢＤＰ１２０抗体は、ＳＢＤＰ１２０フラグメントのみを検出した。
【実施例５】
【００７２】
（ＴＢＩ後の齧歯目のＣＳＦにおけるカルパイン及びカスパーゼ−３のＳＢＤＰの検出）
上記のように齧歯動物にＴＢＩを誘発した。ＴＢＩ後又は偽手術後、ＣＳＦの試料を採集し、カルパイン及びカスパーゼ−３特異的ＳＢＤＰの存在に関して分析した。図５に示すように、結果より、ＴＢＩ後、齧歯動物のＣＳＦ中において、カルパイン特異的ＳＢＤＰ及びカスパーゼ−３特異的ＳＢＤＰが個別に又は同時に蓄積することが明らかになった。ＳＢＰＤの蓄積は、偽損傷コントロール中では観察されなかった。ブロット中の各レーンは、異なる動物を表す。ＣＳＦ１とＣＳＦ２は、２つの独立した動物種を由来とするものであり、個々の動物の反応を説明するために示された。この測定の感度により、結果の予測のために重要である、動物内の違いの検出が可能となった。
【００７３】
本研究の結果は、ＴＢＩ後、カルパイン及び／又はカスパーゼ−３が、脳におけるαＩＩスペクトリンを切断し、プロテアーゼ特異的ＳＢＤＰ（１４５ｋＤａ及び１２０ｋＤａ）を生産することを示した。そして、プロテアーゼ特異的ＳＢＤＰは、ウエスタンブロット又はＥＬＩＳＡ等の免疫学的検定で容易に検出できる十分なレベルでＣＳＦに蓄積した。
【実施例６】
【００７４】
（ＭＣＡＯ後の齧歯目のＣＳＦにおけるカルパイン及びカスパーゼ−３のＳＢＤＰの検出）
齧歯動物の脳に対する虚血性の損傷において、ＣＳＦ中のカルパイン特異的ＳＢＤＰ及びカスパーゼ−３特異的ＳＢＤＰの蓄積を調査した。偽損傷動物をコントロールとして用いて、上記のようにＭＣＡＯを行った。抗αスペクトリン（ホドリン）モノクローナル抗体（ＦＧ ６０９０）を用いるウエスタンブロッティングによって、ＭＣＡＯに供された、齧歯動物のＣＳＦ中では、カルパイン特異的ＳＢＤＰ及びカスパーゼ−３特異的ＳＢＤＰが個別に又は同時に蓄積することが示されたが、偽損傷コントロール中では示されなかった（図６）。ＴＢＩと同様に、ＭＣＡＯは、カルパイン特異的１４５ｋＤａＳＢＤＰの顕著な蓄積だけでなく、カスパーゼ−３特異的１２０ｋＤａＳＢＤＰの増加した蓄積を引き起こした。損傷後２４〜７２時間でＭＣＡＯに供された齧歯動物において、カルパイン特異的１４５ｋＤａＳＢＤＰ及びカスパーゼ−３特異的１２０ｋＤａＳＢＤＰと同様に全長のαＩＩスペクトリンを容易にかつ確実に検出したが、偽損傷コントロールのラットでは、検出できなかった。
【実施例７】
【００７５】
（重度のＴＢＩ後のヒト患者のＣＳＦにおけるカルパイン及びカスパーゼ−３のＳＢＤＰの検出）
重度のＴＢＩを患う２人の患者から、様々な間隔（１２時間，２４時間，２，３，４，５及び６日間）をとって、ヒトのＣＳＦ試料中における、αＩＩスペクトリン、カルパイン特異的１４５ｋＤａＳＢＤＰ及びカスパーゼ−３特異的１２０ｋＤａＳＢＤＰの蓄積を分析した。齧歯動物モデルのＴＢＩとＭＣＡＯのように、カルパイン特異的ＳＢＤＰ及びカスパーゼ−３特異的ＳＢＤＰは、ＴＢＩ後６時間、ＣＳＦ試料に顕著に現れた。ＳＢＤＰのレベルは、正常圧水頭症（Ｈｙｄｒｏ）のコントロール患者より、ＴＢＩ患者（患者１）において、かなり高かった（図７）。患者１では、これらのタンパク質のレベルは、損傷の２日後、減少し始めた。また、カルパイン及びカスパーゼ−３のＳＢＤＰは、ＴＢＩの６時間以内に、重度のＴＢＩを患う第２の患者において、非常に顕著に現れた。患者２では、これらのタンパク質のレベルは、損傷後の１２時間までに、減少し始めた。しかし、頭蓋内圧（ＩＣＰ）スパイク（矢印）によって引き起こされた二次性脳損傷は、特にカルパイン特異的１４５ｋＤａＳＢＤＰに関して、ＳＢＤＰレベルの増加をもたらした。これらのデータは、一次性損傷と同様に二次性脳損傷へのＳＢＤＰの感度を示した。
【００７６】
（他の実施形態）
本発明の詳細な説明とともに本発明は記述されている一方、前述の説明は説明することを意図しており、本発明の範囲を限定することを意図していないのを理解するべきである。本発明の範囲は添付された特許請求の範囲の範囲によって定義される。他の側面、利点及び変更は次に述べる特許請求の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】図１は、（Ａ）プロテアーゼ特異的ＳＢＤＰ、すなわち、カルパイン産物の１５０ｋＤａフラグメント（ＳＢＤＰ１５０）と、１４５ｋＤａフラグメント（ＳＢＤＰ１４５）と、カスパーゼ−３産物の１５０ｋＤａフラグメント（ＳＢＤＰ１５０ｉ）と、１２０ｋＤａフラグメント（ＳＢＤＰ１２０）への、非赤血球系αＩＩスペクトリンのカルパイン切断及びカスパーゼ−３切断と、（Ｂ）ウエスタンブロット分析によるαＩＩスペクトリン，カルパインＳＢＤＰとカスパーゼ−３ＳＢＤＰの全長の同時検出の２つの概略図である。
【図２】図２は、培養された神経細胞（Ａ，Ｂ）又は脳（Ｃ，Ｄ）に異なるタイプの損傷を与えた後、カルパインＳＢＤＰ及びカスパーゼ−３ＳＢＤＰの個別の又は同時の検出を示す４つのウエスタンブロットである。
【図３】図３は、ＳＢＤＰ１５０ｉとＳＢＤＰ１２０を、ＳＢＤＰ１５０とＳＢＤＰ１４５から容易に分離できることを示すウエスタンブロットである。
【図４】図４は、ＳＢＤＰ１５０ｉとＳＢＤＰ１２０に対して特異的な抗体を用いて行われた４つのウエスタンブロットである。
【図５】図５は、ＴＢＩ後の齧歯目のＣＳＦにおけるαＩＩスペクトリン，ＳＢＤＰ１４５，ＳＢＤＰ１２０の蓄積を示す３つのウエスタンブロットである。
【図６】図６は、脳虚血後の齧歯目のＣＳＦにおけるαＩＩスペクトリン，ＳＢＤＰ１４５，ＳＢＤＰ１２０の蓄積を示す３つのウエスタンブロットである。
【図７】図７は、重度のＴＢＩ後の二人のヒト患者のＣＳＦにおけるαＩＩスペクトリン，ＳＢＤＰ１４５，ＳＢＤＰ１２０の蓄積を示す２つのウエスタンブロットである。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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