(57)【要約】本発明は、Ｓｇｋ、特にＳｇｋ１および／またはＳｇｋ３、ならびに／あるいはＰＫＢ、ならびに／あるいはＮｅｄｄ、特にＮｅｄｄ４−２を診断目的で検出するための物質の使用、および、グルコース輸送の妨害に関連する疾患を治療し、また動物を肥育するためにグルコース輸送に影響を及ぼす活性成分の使用に関する。本発明はまた、診断キット、およびグルコース輸送に影響を及ぼす有効量の少なくとも１種の活性成分を含む薬剤組成物に関する。本発明はさらに、遺伝子組み換え動物の産生方法に関する。
2005528113.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコース輸送の妨害に関連する疾患を診断することを目的とする、活性化Ｓｇｋおよび／または不活化Ｓｇｋ、特にＳｇｋ１および／またはＳｇｋ３、ならびに／あるいはＰＫＢ、ならびに／あるいはＮｅｄｄ、特にＮｅｄｄ４−２の発現および／または機能を検出するための少なくとも１種の物質の使用。
【請求項２】
前記物質が抗体およびヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１種の物質であることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
Ｓｇｋ、特にＳｇｋ１および／またはＳｇｋ３、ＰＫＢ、ならびに／あるいはＮｅｄｄ、特にＮｅｄｄ４−２において、リン酸化および／または非リン酸化配列に対する抗体を使用する、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
Ｎｅｄｄタンパク質、特にＮｅｄｄ４−２タンパク質において、少なくとも１つのリン酸化および／または非リン酸化キナーゼコンセンサス配列、特にＳｇｋ１コンセンサス配列に対する抗体を使用する、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
少なくとも１つの変異、特に不活化変異を、生物学的サンプル、特に患者からのサンプルのＤＮＡ、ＲＮＡ、および／またはＮｅｄｄタンパク質中のＮｅｄｄ、特にｎｅｄｄ４−２において検出し、前記変異が前記Ｎｅｄｄタンパク質中のＳｇｋ１コンセンサス配列をコードするｎｅｄｄの断片中に存在することが好ましい、請求項１から４の一項に記載の使用。
【請求項６】
前記変異がS338DＮｅｄｄ４−２および／またはS444DＮｅｄｄ４−２であることを特徴とする、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
少なくとも１つの変異、特に活性化変異を、生物学的サンプル、特に患者からのサンプルのＤＮＡ、ＲＮＡ、ならびに／あるいはＳｇｋタンパク質および／またはＰＫＢタンパク質中のｓｇｋ、特にｓｇｋ１および／またはｓｇｋ３、ならびに／あるいはＰＫＢの遺伝子において検出することを特徴とする、請求項１から６の一項に記載の使用。
【請求項８】
前記変異がS422DＳｇｋ１および／またはT308D,S473DＰＫＢであることを特徴とする、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記疾患が代謝症候群、特に肥満であることを特徴とする、請求項１から８の一項に記載の使用。
【請求項１０】
少なくとも１つの多型をｓｇｋ、特にｓｇｋ１および／またはｓｇｋ３、ＰＫＢの遺伝子、ｎｅｄｄ、特にｎｅｄｄ４−２、ならびに／あるいはｓｇｌｔ、特にｓｇｌｔ１の遺伝子において検出することを特徴とする、肥満の素因の診断方法。
【請求項１１】
前記多型が一塩基多型(ＳＮＰ)であることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記多型がｓｇｋ１中のＥ８ＣＣ／ＣＴ；Ｉ６ＣＣであることを特徴とする、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
グルコース輸送、特に腸および／または腎臓でのグルコース輸送に影響を及ぼすための少なくとも１種の活性化合物の使用。
【請求項１４】
前記活性化合物が少なくとも１種のＳｇｋ、特にＳｇｋおよび／またはＳｇｋ３、ならびに／あるいはＰＫＢに影響を与え、かつ／または少なくとも１種のＮｅｄｄ、特にＮｅｄｄ４−２に影響を与えることを特徴とする、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記化合物がＳｇｋ、特にＳｇｋ１および／またはＳｇｋ３、ならびに／あるいはＮｅｄｄ、特にＮｅｄｄ４−２に対して向けられることを特徴とする、請求項１３または１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記活性化合物がＳｇｋ、特にＳｇｋ１および／またはＳｇｋ３、ならびに／あるいはＰＫＢ、ならびに／あるいはＮｅｄｄ、特にＮｅｄｄ４−２の活性化剤、阻害剤、調節剤、および／または生物学的前駆物質に対して向けられることを特徴とする、請求項１３から１５の一項に記載の使用。
【請求項１７】
前記活性化合物が好ましくはペプチド、特にポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１３から１６の一項に記載の使用。
【請求項１８】
前記活性化合物がペプチド、好ましくはポリペプチドであることを特徴とする、請求項１３から１７の一項に記載の使用。
【請求項１９】
前記ペプチドがＳｇｋ、特にＳｇｋ１および／またはＳｇｋ３、ならびに／あるいはＰＫＢ、ならびに／あるいはＮｅｄｄ、特にＮｅｄｄ４−２の発現および／または機能に影響を与えることを特徴とする、請求項１７または１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記活性化合物が「低分子化合物」、好ましくは分子量(ＭＷ)が１，０００未満の「低分子化合物」であることを特徴とする、請求項１３から１９の一項に記載の使用。
【請求項２１】
特にグルコース輸送の妨害に関係がある疾患を予防または治療することを目的として、前記活性化合物が少なくとも１種のＳｇｋ、特にＳｇｋ１および／またはＳｇｋ３、ならびに／あるいはＰＫＢを阻害し、かつ／または少なくとも１種のＮｅｄｄ、特にＮｅｄｄ４−２を刺激することを特徴とする、請求項１３から２０の一項に記載の使用。
【請求項２２】
前記活性化合物が少なくとも１種のキナーゼ阻害剤、好ましくはスタウロスポリンおよび／またはケレリスリンやそれらの類似体の１種、ならびに／あるいは１種のリガーゼ活性化剤であることを特徴とする、請求項１３から２１の一項に記載の使用。
【請求項２３】
グルコース輸送の妨害に関係する疾患を治療するための薬物または薬剤組成物を製造することを目的とする、少なくとも１種のＳｇｋおよび／またはＰＫＢに影響を与え、特にそれを阻害し、かつ／または少なくとも１種のＮｅｄｄに影響を与え、特にそれを刺激するための少なくとも１種の活性化合物の使用。
【請求項２４】
前記疾患が代謝症候群、特に肥満であることを特徴とする、請求項２１から２３の一項に記載の使用。
【請求項２５】
グルコース輸送を増大させ、特に動物の体重を増加させることを目的として、前記活性化合物が少なくとも１種のＳｇｋ、特にＳｇｋ１および／またはＳｇｋ３、ならびに／あるいはＰＫＢを刺激し、かつ／または少なくとも１種のＮｅｄｄ、特にＮｅｄｄ４−２を阻害することを特徴とする、請求項１３から２０の一項に記載の使用。
【請求項２６】
前記活性化合物が少なくとも１種のＳｇｋ活性化剤および／またはＰＫＢ活性化剤、特に成長因子、好ましくはＩＧＦ１および／またはインシュリンであることを特徴とする、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
前記活性化合物がｓｇｋ１および／またはｓｇｋ３、ならびに／あるいはＰＫＢの遺伝子の少なくとも１種の転写刺激剤、好ましくは少なくとも１種のグルココルチコイド、鉱物コルチコイド、性腺刺激ホルモン、および／またはサイトカイン、特にＴＧＦβであることを特徴とする、請求項２５または２６に記載の使用。
【請求項２８】
グルコース輸送の妨害に関連する疾患を診断することを目的とする、活性化Ｓｇｋおよび／または不活化Ｓｇｋ、特にＳｇｋ１および／またはＳｇｋ３、ならびに／あるいはＰＫＢ、ならびに／あるいはＮｅｄｄ、特にＮｅｄｄ４−２の発現および／または機能を検出するための少なくとも１種の物質を含む診断キット。
【請求項２９】
前記疾患が代謝症候群、特に肥満であることを特徴とする、請求項２８に記載の診断キット。
【請求項３０】
Ｎｅｄｄタンパク質、特にＮｅｄｄ４−２タンパク質中の少なくとも１つのリン酸化キナーゼコンセンサス配列、特にＳｇｋ１コンセンサス配列に対して向けられることを特徴とする抗体。
【請求項３１】
Ｎｅｄｄタンパク質、特にＮｅｄｄ４−２タンパク質中の少なくとも１つの非リン酸化キナーゼコンセンサス配列、特にＳｇｋ１コンセンサス配列に対して向けられることを特徴とする抗体。
【請求項３２】
Ｎｅｄｄタンパク質、特にＮｅｄｄ４−２タンパク質中の少なくとも１つの変異キナーゼコンセンサス配列、特にＳｇｋ１コンセンサス配列に対して向けられることを特徴とする抗体。
【請求項３３】
変異キナーゼコンセンサス配列を有する前記Ｎｅｄｄタンパク質がS338DＮｅｄｄ４−２および／またはS444DＮｅｄｄ４−２であることを特徴とする、請求項３２に記載の抗体。
【請求項３４】
グルコース輸送、特に腸および／または腎臓でのグルコース輸送に影響を及ぼす有効量の少なくとも１種の活性化合物、および適切な場合には、製薬的に許容される賦形剤を含む組成物、特に薬剤組成物。
【請求項３５】
前記活性化合物が少なくとも１種のＳｇｋおよび／またはＰＫＢ、ならびに／あるいは少なくとも１種のＮｅｄｄに影響を及ぼすことを特徴とする、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
前記活性化合物がＳｇｋ、特にＳｇｋ１および／またはＳｇｋ３、ならびに／あるいはＰＫＢ、ならびに／あるいはＮｅｄｄ、特にＮｅｄｄ４−２の活性化剤、阻害剤、調節剤、および／または生物学的前駆物質に対して向けられることを特徴とする、請求項３４または３５に記載の組成物。
【請求項３７】
前記活性化合物が好ましくはペプチド、特にポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであることを特徴とする、請求項３４から３６の一項に記載の組成物。
【請求項３８】
前記活性化合物がペプチド、好ましくはポリペプチドであることを特徴とする、請求項３４から３７の一項に記載の組成物。
【請求項３９】
前記ペプチドがＳｇｋ、特にＳｇｋ１および／またはＳｇｋ３、ならびに／あるいはＰＫＢ、ならびに／あるいはＮｅｄｄ、特にＮｅｄｄ４−２の発現および／または機能に影響を与えることを特徴とする、請求項３７または３８に記載の組成物。
【請求項４０】
前記活性化合物が「低分子化合物」、好ましくは分子量(ＭＷ)が１，０００未満の「低分子化合物」であることを特徴とする、請求項３４から３９の一項に記載の組成物。
【請求項４１】
前記活性化合物が少なくとも１種のＳｇｋおよび／またはＰＫＢを阻害し、かつ／または少なくとも１種のＮｅｄｄを刺激することを特徴とする、請求項３４から４０の一項に記載の組成物。
【請求項４２】
前記活性化合物が少なくとも１種のキナーゼ阻害剤、好ましくはスタウロスポリンおよび／またはケレリスリンやそれらの類似体の１種、ならびに／あるいは１種のリガーゼ活性化剤であることを特徴とする、請求項３４から４１の一項に記載の組成物。
【請求項４３】
前記活性化合物が少なくとも１種のＳｇｋおよび／またはＰＫＢを刺激し、かつ／または少なくとも１種のＮｅｄｄを阻害することを特徴とする、請求項３４から４２の一項に記載の組成物。
【請求項４４】
前記活性化合物が少なくとも１種のＳｇｋ活性化剤および／またはＰＫＢ活性化剤、特に成長因子、好ましくはＩＧＦ１および／またはインシュリンであることを特徴とする、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
前記活性化合物がｓｇｋ１および／またはｓｇｋ３、ならびに／あるいはＰＫＢの遺伝子の少なくとも１種の転写刺激剤、好ましくは少なくとも１種のグルココルチコイド、鉱物コルチコイド、性腺刺激ホルモン、および／またはサイトカイン、特にＴＧＦβであることを特徴とする、請求項４３または４４に記載の組成物。
【請求項４６】
Ｓｇｌｔ、特にＳｇｌｔ１の発現および／または機能を増強することを特徴とする、脂肪組織内の脂質沈着の増大を示すヒトを除く遺伝子組み換え動物の産生方法。
【請求項４７】
Ｓｇｌｔ、特にＳｇｌｔ１を過剰発現させることを特徴とする、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
少なくとも１種のＳｇｋ、特にＳｇｋ１および／またはＳｇｋ３、ならびに／あるいはＰＫＢの発現および／または機能を増強する、請求項４６または４７に記載の方法。
【請求項４９】
少なくとも１種のｓｇｋ、特にｓｇｋ１および／またはｓｇｋ３、ならびに／あるいは１種のＰＫＢの遺伝子を過剰発現させることを特徴とする請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
ｓｇｋ、特にｓｇｋ１および／またはｓｇｋ３、ならびに／あるいはＰＫＢの少なくとも１つの活性化変異、特にS422Dｓｇｋ１および／またはT308D,S473DＰＫＢを使用することを特徴とする、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項５１】
少なくとも１種のＮｅｄｄ、特にＮｅｄｄ４−２の発現および／または機能を低下させることを特徴とする、請求項４６から５０の一項に記載の方法。
【請求項５２】
少なくとも１種のｎｅｄｄの不活化変異、特にｎｅｄｄ４−２、特にS338Dｎｅｄｄ４−２および／またはS444Dｎｅｄｄ４−２を使用することを特徴とする、請求項５１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｓｇｋ(血漿およびグルココルチコイド依存性キナーゼ)、特にＳｇｋ１および／またはＳｇｋ３、ならびに／あるいはタンパク質キナーゼＢ(ＰＫＢ)、ならびに／あるいはＮｅｄｄ(神経前駆細胞で発現する発達的に下方制御された遺伝子)、特にＮｅｄｄ４−２を診断目的で検出するための物質の使用に関する。本発明はさらにグルコース輸送に影響を与えるための活性化合物の使用に関し、特にグルコース吸収の妨害に関係がある疾患を治療し、また肥育中の動物の体重を増加させるための活性化合物の使用に関する。本発明はまた、診断キットに関する。
【０００２】
上皮細胞の頂端膜におけるＮａ+結合輸送体Ｓｇｌｔ１(ナトリウム・グルコース輸送体)が、腸および腎臓でのグルコース輸送の役割を果たしている。このグルコース輸送が妨害されると、肥満や糖尿病などの様々な疾患が生じ得る。
【０００３】
これまで、Ｓｇｌｔ１の調節についてはほとんど知られていない。腎臓上皮のＮａ+チャンネルＥＮａＣを調節する新規の機序が最近発見された。このチャンネルは、ユビキチンリガーゼＮｅｄｄ４−２によりユビキチン化し、それにより内部移行および分解用に調製される(Debonneville, C., Flores, S.Y., Kamynina, E., Plant, P.J., Tauxe, C., Thomas, M.A., Munster, C., Chraibi, A., Pratt, J.H., Horisberger, J.D., Pearce, D., Loffing, J., Staub, O. "Phosphorylation of Nedd4-2 by Sgk1 regulates epithelial Na(+) channel cell surface expression." EMBO J., 2001; 20: 7052-7059)。Ｎｅｄｄ４−２は、血漿およびグルココルチコイド誘導性キナーゼ１(Ｓｇｋ１)によりリン酸化し、それにより不活化される。したがって、Ｓｇｋ１は腎臓上皮のＮａ+チャンネルの強力な刺激物質である。(De la Rosa et al. 1999, Boehmer et al. 2000, Chen et al. 1999, Naray-Fejes-Toth et al. 1999, Lang et al. 2000, Chigaev et al. 2000, Wagner et al. 2001）。
【０００４】
最近、双子に関するある研究で、ｓｇｋ１遺伝子におけるある一塩基多型(ＳＮＰ)(Ｅ８ＣＣ／ＣＴ；Ｉ６ＣＣ)が血圧上昇に関連していることが示された(Busjahn, A., Aydin, A., Uhlmann, R. et al., "Serum- and glucocorticoid-regulated kinase (SGK1) gene and blood pressure." Hypertension 2002; 40: 256-260)。
【０００５】
一般に、キナーゼはリン酸基をそれぞれの基質に導入するタンパク質である。血漿およびグルココルチコイド依存性キナーゼ(Ｓｇｋ)は元々、ラット乳ガン細胞からクローニングされた(Webster, M.K., Goya, L., Firestone, G.L., Y. Biol. Chem. 268 (16): 11482-11485, 1993; Webster, M.K., Goya, L., Ge, Y., Maiyar, A.C., Firestone, G.L., Mol. Cell. Biol., 13 (4): 2031-2040, 1993)。
【０００６】
Ｓｇｋ１は元々、グルココルチコイド感受性遺伝子としてクローニングされた(Webster, M.K., Goya, L., Ge, Y., Maiyar, A.C., Firestone, G.L.: "Characterization of Sgk, a novel member of the serine/threonine protein kinase gene family which is transcriptionally induced by glucocorticoids and serum." Mol. Cell. Biol. 1993; 13: 2031-2040)。いくつかの研究は、Ｓｇｋ１が大量の刺激の影響下にあること(Lang, F., Cohen, P., "Regulation and physiological roles of serum- and glucocorticoid-induced protein kinase isoforms," Science STKE, 2001 Nov 13; 2001 (108): RE17)、とりわけ、鉱質コルチコイドなどの影響下にあること(Chen, S.Y., Bhargava, A., Mastroberardino, L., Meijer, O.C., Wang, J., Buse, P., Firestone, G.L., Verrey, F., Pearce, D.: "Epithelial sodium channel regulated by aldosterone-induced protein Sgk." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999; 96: 2514-2519; Naray-Fejes-Toth, A., Canessa, C., Cleaveland, E.S., Aldrich, G., Fejes-Toth, G.: "Sgk is an aldosterone-induced kinase in the renal collecting duct. Effects on epithelial Na+ channels." J. Biol. Chem. 1999; 274: 16973-16978; Park, J., Leong, M.L., Buse, P., Maiyar, A.C., Firestone, G.L., Hemmings, B.A.: "Serum and glucocorticoid-inducible kinase (Sgk) is a target of the PI 3-kinase-stimulated signaling pathway." EMBO J. 1999; 18: 3024-3033; Brenan, F.E., Fuller, P.J.: "Rapid upregulation of serum and glucocorticoid-regulated kinase (Sgk) gene expression by corticosteroids in vivo." Mol. Cell. Endocrinol. 2000; 30: 166: 129-36; Cowling, R.T., Birnboim, H.C.: "Expression of serum- and glucocorticoid-regulated kinase (Sgk) mRNA is up-regulated by GM-CSF and other proinflammatory mediators in human granulocytes." J. Leukoc. Biol. 2000; 67: 240-248) を明らかにした。Ｓｇｋ１は、インシュリン様成長因子ＩＧＦ１により、インシュリンおよびシグナルカスケードとしての酸化ストレスにより、またホスホイノシトール−３−キナーゼ(ＰＩ３−キナーゼ)およびホスホイノシトール依存性キナーゼ(Ｐｄｋ１)により刺激を受ける(Kobayashi, T., Cohen, P. "Activation of serum- and glucocorticoid-regulated protein kinase by agonists that activate phosphatidylinositide 3-kinase is mediated by 3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1 (Pdk1) and pdk2." Biochem. J. 1999; 339: 319-328; Park, J., Leong, M.L., Buse, P., Maiyar, A.C., Firestone, G.L., Hemmings, B.A.: "Serum and glucocorticoid-inducible kinase (Sgk) is a target of the PI 3-kinase-stimulated signaling pathway." EMBO J. 1999; 18: 3024-3033; Kobayashi, T., Deak, M., Morrice, N., Cohen, P. "Characterization of the structure and regulation of two novel isoforms of serum- and glucocorticoid-induced protein kinase." Biochem. J. 1999; 344: 189-197)。Ｐｄｋ１によるＳｇｋ１の活性化には、422番目のセリンのリン酸化を含む。このセリンがアスパラギン酸(S422DＳｇｋ１)に変異すると、構成的に活性なキナーゼが生じる(Kobayashi, T., Cohen, P.: "Activation of serum- and glucocorticoid-regulated protein kinase by agonists that activate phosphatidylinositide 3-kinase is mediated by 3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1 (Pdk1) and pdk2." Biochem. J. 1999; 339: 319-328)。
【０００７】
それから、Ｓｇｋ１の２つのアイソフォーム、すなわちＳｇｋ２およびＳｇｋ３がクローンされた(Kobayashi, T., Deak, M., Morrice, N., and Cohen, P. 1999. "Characterization of the structure and regulation of two novel isoforms of serum- and glucocorticoid-induced protein kinase." Biochem J. 344: 189-197)。Ｓｇｋの３つのアイソフォームのすべて、およびタンパク質キナーゼＢ(ＰＫＢ)は、ＰＩ３キナーゼとＰｄｋ１により活性化する(Kobayashi, T., and Cohen, P. 1999. "Activation of serum- and glucocorticoid-regulated protein kinase by agonists that activate phosphatidylinositide 3-kinase is mediated by 3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1 (PDK1) and PDK2." Biochem J. 339: 319-328）。
【０００８】
本発明の目的は、グルコースの取り込みを調節するための新規の診断および治療用途を提供することにある。さらに、本発明の目的は、グルコースの取り込みを調節することにより動物の体重を増加させる用途を提供することにある。
【０００９】
驚くべきことに、２つの電極電位固定実験では、Ｎｅｄｄ４−２もまた、腎臓および腸Ｎａ+グルコース輸送体Ｓｇｌｔを不活化させ、この効果がＳｇｋ１および／またはＳｇｋ３ならびに／あるいはＰＫＢにより抑制されることが示された。例えば、グルコース吸収が促進されることで肥満の進行が促進されるため、Ｎｅｄｄ４−２、Ｓｇｋ１、Ｓｇｋ３、およびＰＫＢが肥満の進行の原因ということになる。Ｎｅｄｄ４−２、ならびに／あるいはＳｇｋ１および／またはＳｇｋ３、ならびに／あるいはＰＫＢを検出することにより、例えば肥満の原因を特定し、肥満を適切な治療および予防手段により治療または予防することができる。腸でグルコース吸収が促進されることによって誘発される肥満および高血糖はまた、糖尿病の進行をも促進する。最後に、腎臓のＮａ+チャンネルの調節不全の併発は、高血圧の進行をもたらす。肥満、高血圧、および糖尿病の進行は、いわゆる代謝症候群の主な特徴である。
【００１０】
逆に、Ｓｇｋ１および／またはＳｇｋ３ならびに／あるいはＰＫＢの阻害もまた、腎臓および腸Ｎａ+グルコース輸送体Ｓｇｌｔの阻害をもたらすことになる。
【００１１】
したがって、本発明の目的は、独立請求項１、10、13、23、28、30、31、32、34、および46によって達成される。好ましい実施形態は従属請求項で定義されている。すべての請求項の文言は、参照により本明細書に組み込む。
【００１２】
本発明は、活性化および／または不活化したＳｇｋ、特にＳｇｋ１および／またはＳｇｋ３、ならびに／あるいはＰＫＢ、ならびに／あるいはＮｅｄｄ、特にＮｅｄｄ４−２の発現および／または機能を検出するための少なくとも１種の物質の使用を特許請求する。これにより、具体的にはグルコース輸送の妨害に関連する疾患を診断することが可能になる。この物質は、抗体および／またはヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１種の物質であることが好ましい。例えば、この物質はＳｇｋ１、Ｓｇｋ３、ＰＫＢ、および／またはＮｅｄｄ４−２に対する抗体でよく、ELISA(酵素結合免疫吸着検定法)など当業者に公知の検出方法で使用することができる。これらの免疫検定法では、測定対象の抗原(例えば、Ｓｇｋ１、Ｓｇｋ３、および／またはＰＫＢ)に対する特異的な抗体(または、抗体測定の場合は相同性の試験抗原)を支持物質(例えば、セルロースまたはポリスチレン)に結合させ、サンプルと一緒にインキュベーションした後にその上に免疫複合体を形成させる。次の段階では、これらの免疫複合体に標識抗体を供給する。発色基質を反応混合物に加えることにより、免疫複合体に結合した酵素／基質複合体を可視化することができ、あるいは免疫複合体に結合した標識酵素を測光法で、公知の酵素活性の基準との比較によって測定することにより、サンプル中の抗原濃度を確認することができる。既に上述のように、診断目的での検出には、例えばポリメラーゼ連鎖反応法を用いて、特定のＤＮＡ断片を選択的に増幅する分子遺伝学的方法により、例えばＳｇｋ１を定量的に検出するのに適した塩基、特にオリゴヌクレオチドを使用することも可能である。
【００１３】
Ｎｅｄｄタンパク質中の少なくとも１つのリン酸化および／または非リン酸化キナーゼコンセンサス配列に対する抗体を使用することが好ましい。なお、「コンセンサス配列」とは、キナーゼの基質部位、すなわち１つまたは複数のリン酸化部位を形成するアミノ酸配列を意味するものと理解すべきである。この文脈では、Ｎｅｄｄタンパク質中のＳｇｋ１コンセンサス配列が特に好ましい。
【００１４】
また、Ｎｅｄｄタンパク質中、特にキナーゼコンセンサス配列(例えば、S338DＮｅｄｄ４−２またはS444DＮｅｄｄ４−２)中の不活化変異を検出することも可能である。さらに、活性化変異、例えばS422DＳｇｋ１および／またはT308D,S473DＰＫＢを、患者のＤＮＡ中で検出する。また、対応する変異を患者のＲＮＡ中で検出する。最後に、対応する変異を患者のＳｇｋ、特にＳｇｋ１および／またはＳｇｋ３、ＰＫＢ、ならびに／あるいはＮｅｄｄタンパク質、特にＮｅｄｄ４−２タンパク質中で検出する。これらの検出用のプローブとして、適切な抗体および／または適切な塩基、特にオリゴヌクレオチドを使用することが好ましい。
【００１５】
グルコース輸送の妨害に関連している診断対象の疾患は、具体的には代謝症候群や肥満である。
【００１６】
本発明はさらに、肥満の素因を診断する方法を含む。この診断方法は、少なくとも１つの多型を、ｓｇｋ、特にｓｇｋ１および／またはｓｇｋ３、ＰＫＢの遺伝子、ｎｅｄｄ、特にｎｅｄｄ４−２、ならびに／あるいはｓｇｌｔ、特にｓｇｌｔ１中で検出することを特徴とする。なお、ｓｇｋ１中でＥ８ＣＣ／ＣＴ；Ｉ６ＣＣ多型を検出することが特に好ましい。この多型は、肥満度指数と直接相関しており、したがって肥満の素因を明示するための特に好ましいマーカーである。この略語は、エキソン８中のＳＮＰ(Ｃ→Ｔ)、およびエキソン７の供与部位(イントロン６)から551塩基対の距離に位置する第２のＳＮＰ(Ｔ→Ｃ)を意味する。対応する多型を検出するには、適切な実験動物または患者から血液を除去し、血液に含まれる遺伝物質を使用して、適切なシークエンシングを行うか、または当業者に公知の他の方法を用いることによって、対応部位の配列を決定することが好ましい。血液以外では、遺伝物質をそこから分離することができるすべての他の生物学的サンプルが、原則として適切である。
【００１７】
本発明はさらに、グルコース輸送、特に腸および／または腎臓でのグルコース輸送に影響を及ぼすための少なくとも１種の活性化合物の使用を特許請求する。グルコース輸送体Ｓｇｌｔ、特にＳｇｌｔ１が、このグルコース輸送において少なくとも一部の役割を果たすことが好ましい。本発明によれば、Ｓｇｌｔ、特にＳｇｌｔ１の発現および／または活性に影響を与えることで、グルコース輸送に影響を与えることができる。この活性化合物は、少なくとも１種のＳｇｋ、特にＳｇｋ１および／またはＳｇｋ３、ならびに／あるいはＰＫＢに影響を与え、かつ／または少なくとも１種のＮｅｄｄ、特にＮｅｄｄ４−２に影響を与えることが好ましい。この活性化合物は、Ｓｇｋ、特にＳｇｋ１および／またはＳｇｋ３、ならびに／あるいはＰＫＢ、ならびに／あるいはＮｅｄｄ、特にＮｅｄｄ４−２に対して向けられることが好ましい。本発明の別の好ましい一実施形態では、この活性化合物は、Ｓｇｋ、特にＳｇｋ１および／またはＳｇｋ３、ならびに／あるいはＰＫＢ、ならびに／あるいはＮｅｄｄ、特にＮｅｄｄ４−２の活性化剤、阻害剤、調節剤、および／または生物学的前駆物質に対して向けられる。
【００１８】
本発明の好ましい一実施形態では、この活性化合物はポリヌクレオチドである。このポリヌクレオチドは、例えば、これらのタンパク質のうちの少なくとも１種の発現の減少または阻害をもたらすアンチセンス配列を含むことができる。別の一実施形態では、このポリヌクレオチドは、ペプチド、好ましくはポリペプチドをコードし、このペプチドがＳｇｋ、特にＳｇｋ１および／またはＳｇｋ３、ならびに／あるいはＰＫＢ、ならびに／あるいはＮｅｄｄ、特にＮｅｄｄ４−２の発現および／または機能に影響を与える。さらに、この活性化合物自体が、これらのタンパク質の発現および／または機能に影響を与えるペプチドまたはポリペプチドであることが好ましい。この活性化合物は、「低分子化合物」、好ましくは分子量が１，０００未満の「低分子化合物」であればよい。
【００１９】
グルコース輸送の妨害に関連する疾患の治療と、肥育に関係する動物の体重増加のどちらを目的とするかに応じて、それぞれの酵素に異なるやり方で影響を与えなければならない。グルコース吸収の妨害に関係する疾患を予防または治療するには、この活性化合物は少なくとも１種のＳｇｋ、特にＳｇｋ１および／またはＳｇｋ３、ならびに／あるいはＰＫＢを阻害し、かつ／または少なくとも１種のＮｅｄｄ、特にＮｅｄｄ４−２を刺激しなければならない。ＳｇｋおよびＰＫＢはキナーゼであるため、スタウロスポリンおよび／またはケレリスリンなどの当業者に公知のキナーゼ阻害剤、またはそれらの類似体の少なくとも１つが特に適切である。Ｎｅｄｄはリガーゼであるため、それらを刺激するにはリガーゼ活性化剤が適切である。これらの活性化合物を薬物または薬剤組成物の製造に使用することが好ましい。治療対象の疾患は、代謝症候群、特に肥満であることが好ましい。
【００２０】
他方、グルコース輸送の低下を目的とする上述の疾患予防または治療とは違って、例えば肥育に関係する動物の体重増加を目的とするグルコース輸送の増大を実現すべき場合には、この活性化合物は少なくとも１種のＳｇｋ、特にＳｇｋ１および／またはＳｇｋ３、ならびに／あるいはＰＫＢを刺激し、かつ／または少なくとも１種のＮｅｄｄ、特にＮｅｄｄ４−２を阻害することが好ましい。例えばＳｇｋ１を刺激することにより、例えばＮｅｄｄ４−２が阻害され、これによりグルコース輸送体Ｓｇｌｔ１の分解も遅延する。これによりグルコース輸送も増大する。本発明の好ましい一実施形態では、この活性化合物は少なくとも１種のＳｇｋ活性化剤および／またはＰＫＢ活性化剤、特に成長因子、好ましくはＩＧＦ１および／またはインシュリンである。
【００２１】
本発明の別の好ましい一実施形態では、この活性化合物は、ｓｇｋ１および／またはｓｇｋ３、ならびに／あるいはＰＫＢの遺伝子の少なくとも１種の転写刺激剤、好ましくは少なくとも１種のグルココルチコイド、鉱質コルチコイド、性腺刺激ホルモン、および／またはサイトカイン、特にＴＧＦβである。
【００２２】
本発明はさらに診断キットに関する。このキットは、グルコース輸送の妨害に関連する疾患を診断するために活性化および／または不活化Ｓｇｋ、特にＳｇｋ１および／またはＳｇｋ３、ならびに／あるいはＰＫＢ、ならびに／あるいはＮｅｄｄ、特にＮｅｄｄ４−２の発現および／または機能を検出するための少なくとも１種の物質を含む。これらの疾患は代謝症候群、特に肥満であることが好ましい。このキットは、具体的には、対応するタンパク質および／またはヌクレオチドを検出するための抗体および／またはオリゴヌクレオチドを含むことができる。例えば、これらの抗体および／またはオリゴヌクレオチドは、異なるタンパク質または酵素の量および／または活性を分析するために使用することができる。さらに、遺伝子の対応する変異を検出することも可能である。このキットのさらなる特徴については、残りの説明を参照されたい。
【００２３】
本発明はさらに、Ｎｅｄｄタンパク質中の少なくとも１つのリン酸化キナーゼコンセンサス配列に対する抗体を含む。このキナーゼコンセンサス配列は、対応するキナーゼ、特にＳｇｋ１でリン酸化された配列である。この抗体がＮｅｄｄ４−２タンパク質中のキナーゼコンセンサス配列を認識することが好ましい。このような抗体を用いて、Ｎｅｄｄ４−２がＳｇｋ１でリン酸化され、それにより不活化したか否かを分析することが可能である。したがって、Ｎｅｄｄ４−２の活性状態を調査することが可能になる。本発明はさらに、Ｎｅｄｄタンパク質中の対応する非リン酸化キナーゼコンセンサス配列に対する抗体を含む。本発明のこれら２種の抗体を１つの試験セットアップ内で組み合わせて、これによりＮｅｄｄの活性状態に関して非常に有益な結果を得ることが可能になることが特に好ましい。
【００２４】
本発明はまた、Ｎｅｄｄタンパク質中の少なくとも１つの変異キナーゼコンセンサス配列に対する抗体を含む。このコンセンサス配列もまた、対応して変異したＳｇｋ１コンセンサス配列であることが好ましい。このキナーゼコンセンサス配列は、Ｎｅｄｄ４−２タンパク質中に存在することが好ましい。なお、特に好ましい変異体はS338DＮｅｄｄ４−２および／またはS444DＮｅｄｄ４−２である。対応する変異の効果は、Ｎｅｄｄがもはや対応するキナーゼ、特にＳｇｋ１でリン酸化されないことである。このような抗体は、対応する変異体を調査するための有用なツールとして使用することができる。
【００２５】
本発明の抗体は、当業者に公知の方法で調製される。具体的には、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を調製することが可能であるが、モノクローナル抗体が、全般的に高い特異性を有するので好ましい。
【００２６】
前述の抗体は、本発明の診断キット内で特に有利に使用することができる。さらに、前述の抗体はまた、Ｓｇｋ、ＰＫＢ、および／またはＮｅｄｄの発現および／または機能を検出するための本発明に係る使用にも非常に有利である。このような背景では、これらの抗体は通常の免疫学的方法に従って使用することができる。具体的には、これらの抗体を用いて、先に言及したELISA法を行うことが可能である。
【００２７】
本発明はさらに、グルコース輸送、特に腸および／または腎臓でのグルコース輸送に影響を及ぼす少なくとも１種の活性化合物、および適切な場合には、製薬上許容される賦形剤を含む組成物、好ましくは薬剤組成物を含む。この活性化合物が、少なくとも１種のＳｇｋおよび／またはＰＫＢ、ならびに／あるいは少なくとも１種のＮｅｄｄに影響を及ぼすことが特に好ましい。別の好ましい一実施形態では、この活性化合物は、Ｓｇｋ、特にＳｇｋ１および／またはＳｇｋ３、ならびに／あるいはＰＫＢ、ならびに／あるいはＮｅｄｄ、特にＮｅｄｄ４−２の活性化剤、阻害剤、調節剤、および／または生物学的前駆物質に対して影響を及ぼす。
【００２８】
この活性化合物がポリヌクレオチドであることが有利である。このポリヌクレオチドは、対応する遺伝子の発現を減少させるか阻害するアンチセンス配列を含むか形成することができる。さらに、対応するポリヌクレオチドを選択して、当業者に公知の優勢阻害型のアプローチによりそれぞれの１つまたは複数の遺伝子の発現を阻害し、あるいは対応する遺伝子産物の機能を制限することが可能である。さらに、このポリヌクレオチドはペプチド、好ましくはポリペプチドをコードすることができ、このペプチドはＳｇｋ、特にＳｇｋ１および／またはＳｇｋ３、ならびに／あるいはＰＫＢ、ならびに／あるいはＮｅｄｄ、特にＮｅｄｄ４−２の発現および／または機能に影響を与える。これらのアプローチに必要な対応する分子生物学的手法は、当業者に利用可能である。別の好ましい一実施形態では、この活性化合物は前述のペプチド自体である。この活性化合物は、「低分子化合物」、好ましくは分子量が１，０００未満の「低分子化合物」であることが好ましい。
【００２９】
特に、グルコース輸送の妨害に関連する疾患を治療するには、この活性化合物は少なくとも１種のＳｇｋおよび／またはＰＫＢを阻害し、かつ／または少なくとも１種のＮｅｄｄを刺激する。これらの疾患を治療するには、この活性化合物は、少なくとも１種のキナーゼ阻害剤、好ましくはスタウロスポリンおよび／またはケレリスリンやそれらの類似体の１種、ならびに／あるいは少なくとも１種のリガーゼ活性化剤であることが特に好ましい。
【００３０】
特に動物肥育に関連するグルコース輸送を増大させるには、この活性化合物が少なくとも１種のＳｇｋおよび／またはＰＫＢを刺激し、かつ／または少なくとも１種のＮｅｄｄを阻害することが好ましい。グルコース輸送を増大させるには、この活性化合物がＳｇｋ１活性化剤、特に成長因子、好ましくはＩＧＦ１および／またはインシュリンであることが有利である。本発明の別の好ましい一実施形態では、この活性化合物は、Ｓｇｋ１および／またはＳｇｋ３、ならびに／あるいはＰＫＢの遺伝子の転写刺激剤、好ましくは少なくとも１種のグルココルチコイド、鉱質コルチコイド、性腺刺激ホルモン、および／またはサイトカイン、特にＴＧＦβである。
【００３１】
これまで述べてきた異なる方法を、互いに組み合わせることもできる。
【００３２】
本発明はさらに、脂肪組織内の脂質沈着の増大を示す遺伝子組み換え動物の産生方法を含む。ヒトは本発明のこの態様から除外される。これらの動物は、他と比べて迅速に体重が増加するため、特に食糧生産にとって非常に重要である。肥育は、これらの動物を用いれば、はるかに急速に、より効率的に行うことができる。これらの動物の産生方法は、Ｓｇｌｔ、特にＳｇｌｔ１の発現および／または機能をこれらの動物中で増強することを特徴とする。これによりグルコースの腸吸収が促進されるため、血漿中のグルコース濃度がより急速に上昇する。これにより、分泌されるインシュリンのレベルが高くなるため、最終的に脂肪組織内の脂質沈着が刺激される。
【００３３】
本発明のこの態様の特に好ましい一実施形態では、ｓｇｌｔ、特にｓｇｌｔ１をこの目的で動物内で過剰発現させる。これは例えば、適切なｓｇｌｔ配列の上流に機能的に位置する適切に強力なプロモータを有する適度な遺伝子構築物、特にベクターを導入することにより行う。ｓｇｌｔ、特にｓｇｌｔ１の適度に強力な発現を示す動物をクローニングすることも好ましい。これを行うための方法論的手法は当業者に利用可能である。
【００３４】
別の好ましい一実施形態では、Ｓｇｋ、特にＳｇｋ１および／またはＳｇｋ３、ならびに／あるいはＰＫＢの発現および／または機能を増強する。最終的には、これによりＳｇｌｔ、特にＳｇｌｔ１の活性またはタンパク質の量も増大し、したがってグルコース輸送が増大する。これを行うには、対応する遺伝子を、通常の分子生物学的方法を用いて過剰発現させればよい。他方では、適切で構成的に活性な変異体を発現する遺伝子構築物をこの生物に導入するか、組み込むこともできる。なお、変異体S422Dｓｇｋ１および／またはT308D,S473DＰＫＢが特に好ましい。これらの変異体の活性は他の活性化酵素、特にキナーゼとは関係がなく、したがってこれらの変異体は常に活性がある。これらは、ユビキチンリガーゼＮｅｄｄ、特にＮｅｄｄ４−２により行われるＳｇｌｔ、特にＳｇｌｔ１の分解を阻害し、これによりグルコース輸送が増大する。
【００３５】
別の好ましい一実施形態では、ユビキチンリガーゼＮｅｄｄ、特にＮｅｄｄ４−２の発現および／または機能を低下させる。これには、Ｓｇｌｔ、特にＳｇｌｔ１が分解する程度が小さくなる結果としてグルコース輸送が増大する効果もある。Ｎｅｄｄの発現および／または機能の適切な低下も、アンチセンス型または優性阻害型のアプローチなどの通常の分子生物学的方法を用いて実現することができる。このように、この酵素の発現を長期間低下させるか阻害するには、ｎｅｄｄ、特にｎｅｄｄ４−２の適当な変異体をこの生物体に組み込むか、Ｎｅｄｄの負の遺伝子を転換することが特に好ましい。適当な手法は当業者に公知である。なお、少なくとも１種の不活化変異体をＮｅｄｄ、特にＮｅｄｄ４−２に挿入することが特に好ましい。この状況では、変異S338Dｎｅｄｄ４−２および／またはS444Dｎｅｄｄ４−２を非常に有利に用いることができる。本発明はまた、本発明の方法により産生することができる動物を含む。
【００３６】
これまで述べてきた特徴、および本発明の他の特徴は、以下の好ましい実施形態の説明と従属請求項および図との組み合わせの帰結として得られる。なお、いずれの場合でも、これらのそれぞれの特徴は単独で、またはいくつかを互いに組み合わせて実現することができる。
【００３７】
図示した場合、
図１に、Ｎｅｄｄ４−２およびＳｇｋ１による、Ｎａ+結合グルコース輸送体Ｓｇｌｔ１の調節を示す。
【００３８】
上部：オリジナル測定データ；下部：算術平均値±ＳＥＭ(ｎ＝６〜15)。アフリカツメガエルの卵母細胞にｓｇｌｔ１、ｎｅｄｄ４−２、および／またはｓｇｋ１ ｃＲＮＡを注入した。Ｎｅｄｄ４−２は、Ｓｇｌｔ１を発現した卵母細胞で20ｍＭグルコースによって誘起される電流を下方制御し、Ｓｇｋ１はこれらの電流を刺激し、Ｎｅｄｄ４−２の効果を逆転させた。
【００３９】
＊は、Ｓｇｌｔ１のみを発現した卵母細胞で測定した電流と比較して有意であった差を示す。
【００４０】
＃は、Ｓｇｌｔ１およびＮｅｄｄ４−２を発現した卵母細胞での対応値と比較して有意であった差を示す。
【００４１】
図２に、Ｎｅｄｄ４−２、構成的に活性なS422DＳｇｋ１、および不活性K127NＳｇｋ１による、Ｎａ+結合グルコース輸送体Ｓｇｌｔ１の調節を示す。
【００４２】
上部：オリジナル測定曲線；下部：算術平均値±ＳＥＭ(ｎ＝８〜71)。アフリカツメガエルの卵母細胞にｓｇｌｔ１、ｎｅｄｄ４−２、および／またはS422Dｓｇｋ１もしくはK127Nｓｇｋ１ ｃＲＮＡを注入した。Ｎｅｄｄ４−２は、Ｓｇｌｔ１を発現した卵母細胞で20ｍＭグルコースにより誘起された電流を著しく下方制御し、K127NＳｇｋ１ではなく、S422DＳｇｋ１は、これらの電流を刺激し、Ｎｅｄｄ４−２の効果を逆転させた。
【００４３】
＊は、Ｓｇｌｔ１のみを発現した卵母細胞で測定した電流と比較して有意であった差を示す。
【００４４】
＃は、Ｓｇｌｔ１およびＮｅｄｄ４−２を発現した卵母細胞での対応値と比較して有意であった差を示す。
【００４５】
図３に、Ｎｅｄｄ４−２、T308D,S473DＰＫＢ、およびＳｇｋ３による、Ｎａ+結合グルコース輸送体Ｓｇｌｔ１の調節を示す。
【００４６】
上部：オリジナル測定曲線；下部：算術平均値±ＳＥＭ。アフリカツメガエルの卵母細胞にｓｇｌｔ１、ｎｅｄｄ４−２、T308D,S473DＰＫＢ、およびＳｇｋ３ ｃＲＮＡを注入した。Ｎｅｄｄ４−２は、Ｓｇｌｔ１を発現した卵母細胞で20ｍＭグルコースにより誘起された電流を著しく下方制御した。T308D,S473DＰＫＢおよびＳｇｋ３は、これらの電流を刺激し、Ｎｅｄｄ４−２の効果を逆転させた。
【００４７】
＊は、Ｓｇｌｔ１のみを発現した卵母細胞で測定した電流と比較して有意であった差を示す。
【００４８】
＃は、Ｓｇｌｔ１およびＮｅｄｄ４−２を発現した卵母細胞での対応値と比較して有意であった差を示す。
【００４９】
図４に、Ｎｅｄｄ４−２およびＳｇｋ１による、Ｎａ+結合グルコース輸送体Ｓｇｌｔ１の調節を示す。算術平均値±ＳＥＭ(ｎ＝18)。アフリカツメガエルの卵母細胞にｓｇｌｔ１、ｎｅｄｄ４−２、および／またはS422DＳｇｋ１(ＳＤ)ｃＲＮＡを注入した。Ｎｅｄｄ４−２の共発現により５ｍｍｏｌグルコースを加えることで誘起された電流が低下し、これらの電流は構成的に活性なキナーゼS422Dｓｇｋ１の共発現により著しく増大した。
【００５０】
図５に、Ｎｅｄｄ４−２、Ｓｇｋ３、およびＰＫＢによる、Ｎａ+結合グルコース輸送体Ｓｇｌｔ１の調節を示す。算術平均値±ＳＥＭ(実験手法は図４の通り)。
【００５１】
実施例
方法
１．アフリカツメガエルの卵母細胞における発現と２電極電位固定法
野生型Ｓｇｋ１をコードするｃＲＮＡ（Waldegger, S., Barth, P., Raber, G., Lang, F.: "Cloning and characterization of a putative human serine/threonine protein kinase transcriptionally modified during anisotonic and isotonic alterations of cell volume." Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94: 4440-4445）、構成的に活性なＳｇｋ１(S422DＳｇｋ１)および不活性Ｓｇｋ１(K127NＳｇｋ１)をコードするｃＲＮＡ(Kobayashi, T., Cohen, P. "Activation of serum- and glucocorticoid-regulated protein kinase by agonists that activate phosphatidylinositide 3-kinase is mediated by 3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1 (PDK1) and PDK2." Biochem J. 1999; 339: 319-28)、野生型Ｓｇｋ３およびＰＫＢをコードするｃＲＮＡ(Kobayashi, T., Deak, M., Morrice, N., Cohen, P. "Characterization of the structure and regulation of two novel isoforms of serum- and glucocorticoid-induced protein kinase." Biochem J. 1999; 334: 189-97)、構成的に活性なT308D,S473DＰＫＢをコードするｃＲＮＡ(Alessi, D.R., Cohen, P. "Mechanism of activation and function of protein kinase B." Curr. Opin Genet Dev. 1998; 8: 55-62)、野生型Ｎｅｄｄ４−２をコードするｃＲＮＡ（Debonneville, C., Flores, S.Y., Kamynina, E., Plant, P.J., Tauxe, C., Thomas, M.A., Munster, C., Chraibi, A., Pratt, J.H., Horisberger, J.D., Pearce, D., Loffing, J., Staub, O. "Phosphorylation of Nedd4-2 by Sgk1 regulates epithelial Na(+) channel cell surface expression." EMBO J. 2001; 20: 7052-7059）、および野生型Ｓｇｌｔ１をコードするｃＲＮＡ(Hediger, M.A., Coady, M.J., Ikeda, T.S., Wright, E.M. "Expression cloning and cDNA sequencing of the Na+/glucose co-transporter." Nature. 1987; 330: 379-381)をin vitroで合成した(Wagner, C.A., Friedrich, B., Setiawan, I., Lang, F., Broer, S.: "The use of Xenopus laevis oocytes for the functional characterization of heterologously expressed membrane proteins." Cell Physiol Biochem 2000; 10: 1-12)。アフリカツメガエルの卵巣の切開、ならびに卵母細胞の収集および治療は、既に詳述されている(Wagner, C.A., Friedrich, B., Setiawan, I., Lang, F., Broer, S.: "The use of Xenopus laevis oocytes for the functional characterization of heterologously expressed membrane proteins." Cell Physiol Biochem 2000; 10: 1-12)。これらの卵母細胞に、５ｎｇのヒトｓｇｌｔ１、7.5ｎｇのヒトｓｇｋ１、K127Nｓｇｋ１、S422Dｓｇｋ１、ｓｇｋ３、ＰＫＢ、もしくはT308D,S473DＰＫＢ、および／または５ｎｇのアフリカツメガエルのｎｅｄｄ４−２を注入した。対照卵母細胞に水を注入した。これらの各ｃＲＮＡの注入後、電気生理実験を室温で３日間行った。20ｍＭまたは５ｍＭのグルコースの細胞外投与で誘起された電流を、２電極電位固定法を用いて測定し(Wagner, C.A., Friedrich, B., Setiawan, I., Lang, F., Broer, S.: "The use of Xenopus laevis oocytes for the functional characterization of heterologously expressed membrane proteins." Cell Physiol Biochem 2000; 10: 1-12）、グルコース輸送の基準とした。このデータを10Ｈｚでフィルタリングし、ＭａｃＬａｂデジタル−アナログ変換器およびそれに対応するソフトウェア(AD Instruments、Castle Hill、オーストラリア)を用いて分析した。対照浴溶液(ＮＤ96)は、96ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＫＣｌ、1.8ｍＭのＣａＣｌ2、１ｍＭのＭｇＣｌ2、および５ｍＭのＨＥＰＥＳを含んでおり、そのｐＨは7.4であった。これらのすべての物質を上述の濃度で使用した。最終溶液をＨＣｌまたはＮａＯＨで滴定して、上述のｐＨまたはｐＨ7.4にした。この灌流溶液の流量は20ｍｌ／分であり、これにより溶液の変化が10秒以内に完了した。
【００５２】
計算では、このデータを算術平均値±ＳＥＭとして示した。ｎは調査対象の卵母細胞の数である。すべての実験は、少なくとも３つの異なる卵母細胞の群について行った。すべての群について同質のデータが得られた。これらの結果の有意差を、スチューデント−ｔ検定を用いて検定した。Ｐが0.05未満の結果のみを、統計的に有意であるものとして使用した。
【００５３】
２．双子を用いた研究
血圧調節および心血管性表現型に関する研究用に、126組の一卵性双子および70組の二卵性双子を募集した。二卵性双子の親も含めた。すべての参加者は、ドイツの異なる地域の出身のドイツ系白人であった。接合性を測定し、他の分子遺伝学的研究を行う目的で、すべての双子、および二卵性双子の親から血液を採取した。各参加者について健康診断を行った。慢性的な医学疾患の家族歴を有する参加者はいなかった。一塩基多型(ＳＮＰ)がエキソン８(Ｃ→Ｔ)で同定され、第２のＳＮＰがそこから551塩基対だけ離れたエキソン７(Ｔ→Ｃ)の供与部位(イントロン６)で同定された(Busjahn, A., Aydin, A., Uhlmann, R. et al., "Serum- and glucocorticoid-regulated kinase (SGK1) gene and blood pressure." Hypertension 2002; 40: 256-260)。これら２つのそれぞれのＳＮＰ、すなわちイントロン６(Ｔ→Ｃ)およびエキソン８(Ｃ→Ｔ)を分析した。
【００５４】
これら２つのＳＮＰの記述統計により、劣性の作用様式が明らかになった。したがってこの連関分析は、２つのグループ間の比較、すなわちこの変異体のホモ接合性のキャリアとヘテロ接合性のキャリアおよび非キャリアとの比較に基づいて行った。これら２つのＳＮＰが互いに独立であることは、カイ２乗検定を用いて検定した。これらのＳＮＰとこれらの表現型の関係を一次元ＡＮＯＶＡ法により検定し、これら２つの多型を同時に組み込んだ。この分析では、二卵性双子の両方の部分と、一卵性双子のランダムに選択された一部を対象とした。この検定はｔ検定よりも信頼度が高く、これら２つの多型を同時に、それらの相互作用を含めて検討することが可能であった。また、このようにすることで、調査回数を減らすことも可能であった。二卵性双子のこれら２つの部分は互いに無関係ではないため、このＡＮＯＶＡ検定では、家族性による効果ならびに年齢および性別を共変数として含めた。有意水準は0.05に設定した。確認群では、この連関効果をこれら２つのＳＮＰを同時に用いる一次元ＡＮＯＶＡ法によって検定した。
【００５５】
結果
Ｓｇｌｔ１ ｍＲＮＡを注入したアフリカツメガエルの卵母細胞に20ｍｍのグルコースを投与すると、48.6±11.5ｎＡ(ｎ＝18)の内向き電流(Ｉglc)が生じたが、水を注入した卵母細胞に同じグルコースを投与してもこの電流は生じなかった。ちなみに、水を注入した卵母細胞をグルコース処理した場合、1.3±0.7ｎＡ(ｎ＝６)の電流が生じた。Ｓｇｌｔ１ ｍＲＮＡおよびＮｅｄｄ４−２(共発現)を注入したアフリカツメガエルの卵母細胞では、Ｉglcは49.2±6.8％(ｎ＝15)も有意に低下した。したがって、Ｓｇｌｔ１はユビキチンリガーゼＮｅｄｄ４−２により下方制御される(図１)。
【００５６】
野生型Ｓｇｋ１の共発現により、グルコースで誘起された電流が81.3±19.0％(ｎ＝15)上方制御され、Ｎｅｄｄ４−２の効果が逆転した。Ｓｇｌｔ１をＳｇｋ１およびＮｅｄｄ４−２と共に発現した卵母細胞では、グルコースで誘起された電流が、Ｓｇｌｔ１のみを発現した卵母細胞で観察された値より34.8±11.8％(ｎ＝14)大きかった(図１)。
【００５７】
構成的に活性なS422DＳｇｋ１は、野生型Ｓｇｋ１と同様の効果を有していた(図２)。S422DＳｇｋ１の共発現により、グルコースで誘起された電流が72.4±9.1％(ｎ＝57)増大した。この一連の実験では、Ｎｅｄｄ４−２の共発現によりこの電流が35.3±4.4％(ｎ＝46)低下した。この効果は、S422DＳｇｋ１を追加で共発現することにより逆転した。Ｎｅｄｄ４−２およびS422DＳｇｋ１を共発現した卵母細胞では、この電流はＳｇｌｔ１のみを発現した卵母細胞より59.2±19.8％(ｎ＝16)大きかった(図２)。野生型のまたは構成的に活性なＳｇｋ１とは反対に、不活性変異体K127NＳｇｋ１は、基質により誘起された電流を著しくは変化させず(-2.0±5.3％、ｎ＝14)、Ｎｅｄｄ４−２の効果を逆転させなかった。Ｓｇｌｔ１をK127NＳｇｋ１およびＮｅｄｄ４−２と共に発現した卵母細胞では、グルコースで誘起された電流が、Ｓｇｌｔ１のみを発現した卵母細胞で観察された値より54.9±9.7％(ｎ＝８)小さかった(図２)。
【００５８】
Ｓｇｋ１の効果は、T308D,S473DＰＫＢにより模倣された(図３)。この一連の実験では、Ｎｅｄｄ４−２の共発現によりこの電流が26.5±5.5％(ｎ＝42)低下した。構成的に活性なT308D,S473DＰＫＢの共発現により、Ｓｇｌｔ１を発現した卵母細胞中のグルコースで誘起された電流が117.4±15.8％(ｎ＝31)も著しく増大し、Ｎｅｄｄ４−２の効果が逆転した。T308D,S473DＰＫＢおよびＮｅｄｄ４−２をＳｇｌｔ１と共に発現したアフリカツメガエルの卵母細胞では、グルコースで誘起された電流が、Ｓｇｌｔ１のみを発現した卵母細胞中の電流より106.5±18.2％(ｎ＝27)大きかった(図３）。
【００５９】
T308D,S473DＰＫＢおよびＳｇｋ１と同様に、Ｓｇｋ３もグルコースで誘起された電流を刺激し、Ｎｅｄｄ４−２の効果を逆転させた。ＳｇｌｔおよびＳｇｋ３を発現した卵母細胞中のグルコースで誘起された電流は、Ｓｇｌｔ１のみを発現したアフリカツメガエルの卵母細胞中のグルコースで誘起された電流より123.6±15.0％(ｎ＝22)大きく、Ｓｇｌｔ１、Ｎｅｄｄ４−２、およびＳｇｋ３を発現した卵母細胞中のグルコースで誘起された電流は、Ｓｇｌｔ１のみを発現したアフリカツメガエルの卵母細胞中のグルコースで誘起された電流より112.4±19.4％(ｎ＝22)大きかった。
【００６０】
図４は、Ｓｇｌｔ１およびS442DＳｇｋ１(ＳＤ)の共発現により、Ｉglcが77±23％増大して65.4±10.6ｎＡ(ｎ＝18)になることを示す。Ｓｇｌｔ１をＳｇｋ１およびＮｅｄｄ４−２と共に発現した卵母細胞では、グルコースで誘起された電流が60.5±9.9ｎＡ(ｎ＝18)に達し、これはＳｇｌｔ１のみを注入した卵母細胞での対応値より61±21％大きく、Ｓｇｌｔ１およびＮｅｄｄ４−２ ｍＲＮＡを注入した卵母細胞での対応値より126±23％大きかった。これらの実験では、電流は５ｍＭのグルコースで誘起された。
【００６１】
さらなる一連の実験では、構成的に活性なS422DＳｇｋ１(ＳＤ)に加えて、Ｓｇｋのアイソフォーム、すなわちＳｇｋ２およびＳｇｋ３、ならびにタンパク質キナーゼＢ(ＰＫＢ)を検定した。グルコースで誘起した電流は、S422DＳｇｋ１の共発現により55±12％(ｎ＝44)、Ｓｇｋ３の共発現により117±16％(ｎ＝16)、ＰＫＢの共発現により101±18％(ｎ＝24)増大したが、Ｓｇｋは統計上有意な効果を示さなかった。Ｎｅｄｄ４−２の共発現によりグルコース輸送は23±4％(ｎ＝79)低下したが、S422DＳｇｋ１(＋48±11％、ｎ＝48)、Ｓｇｋ３(＋114±26％、ｎ＝16)、およびＰＫＢ(＋107±20％、ｎ＝24)の追加の共発現による刺激は妨害されなかった。この場合も、Ｓｇｋ２は有意な効果を示さなかった。
【００６２】
Ｓｇｌｔ１を調節するＳｇｋ１と体重の機能的関連性を調査するために、Ｓｇｋ１遺伝子の多型を有する双子の肥満度指数を調べた。多型Ｅ８ＣＣ／ＣＴ；Ｉ６ＣＣを保有していた双子の平均体重は26.7±1.4ｋｇ／ｍ2(ｎ＝13)であった。この値は、これら双子全体の対応する平均値(23.3±0.2ｋｇ／ｍ2、ｎ＝263)より著しく高い(Ｐ＜0.008）。
【００６３】
全般的に、これらの実験ではＳｇｋ１、Ｓｇｋ３、およびＰＫＢがＳｇｌｔ１に対して強力な刺激効果を有することが示されている。Ｓｇｌｔ１の活性が増大することにより、グルコースの腸吸収が促進され、したがって血漿中のグルコース濃度がより急速に上昇する。このためインシュリンの放出量が増大し、これにより脂肪組織内の脂質沈着が刺激される。他方で、Ｓｇｌｔ１の阻害剤は肥満に対して反対に作用する。
【００６４】
この双子を用いた研究では、血圧上昇に関連する同一の多型が、より高い肥満度指数とも関係があることが示されている。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】Ｎｅｄｄ４−２およびＳｇｋ１による、Ｎａ+結合グルコース輸送体Ｓｇｌｔ１の調節を示す。
【図２】Ｎｅｄｄ４−２、構成的に活性なS422DＳｇｋ１、および不活性K127NＳｇｋ１による、Ｎａ+結合グルコース輸送体Ｓｇｌｔ１の調節を示す。
【図３】Ｎｅｄｄ４−２、T308D,S473DＰＫＢ、およびＳｇｋ３による、Ｎａ+結合グルコース輸送体Ｓｇｌｔ１の調節を示す。
【図４】Ｎｅｄｄ４−２およびＳｇｋ１による、Ｎａ+結合グルコース輸送体Ｓｇｌｔ１の調節を示す。
【図５】Ｎｅｄｄ４−２、Ｓｇｋ３、およびＰＫＢによる、Ｎａ+結合グルコース輸送体Ｓｇｌｔ１の調節を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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