(57)【要約】本発明は、新規SNPsを含み、かつ、EPO遺伝子のヌクレオチド配列由来の新規ポリヌクレオチド、本発明のSNPにより引き起こされる少なくとも1つの変異を含み、かつ、天然の野生型EPOタンパク質由来の新規ポリペプチド、並びにそれらの治療のための使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の：
a)  ヌクレオチド配列、配列番号1、
ただし、上記ヌクレオチド配列は、465-486(欠失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、g1644a、g2228a、g2357a、c2502t、c2621g、g2634aから成る群から選ばれる少なくとも1つのSNPを含む；又は
b)  a)によるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
の全部又は一部を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号1の第615〜第2763ヌクレオチドを含む、請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、
ただし、上記ヌクレオチド配列は、g1644a、g2357a及びc2621gから成る群から選ばれる少なくとも1つのコーディングSNPを含む、上記単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドが、少なくとも10のヌクレオチドから構成される、請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
アミノ酸配列、配列番号2の全部又は一部を含み、かつ、D70N、G104S及びS147Cから成る群から選ばれる少なくとも1つのコーディングSNPを有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
アミノ酸配列、配列番号2の全部又は一部を含み、かつ、上記ポロペプチドがSNP G104Sを有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
ヌクレオチド配列、配列番号1に80〜100%の同一性をもつポリヌクレオチドの全部又は一部の同定又は増幅方法であって、適当なハイブリダイゼーション条件下、請求項1に記載のポリヌクレオチドと、上記ポリヌクレオチドとをハイブリダイズさせることを含む上記方法。
【請求項７】
ヌクレオチド配列、配列番号1に80〜100%の同一性をもつポリヌクレオチドの全部又は一部の遺伝子型解析方法であって、患者又は患者集団のゲノムDNA内の着目の領域を増幅し、そしてヌクレオチド配列、配列番号1内の、以下の：465-486(欠失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、g1644a、g2228a、g2357a、c2502t、c2621g、g2634aの少なくとも1ヶ所の対立遺伝子を測定するステップを含む。
【請求項８】
前記遺伝子型解析がミニ配列決定法によって実行される、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
請求項1に記載のポリヌクレオチドを含む組み換えベクター。
【請求項１０】
請求項9に記載の組み換えベクターを含む宿主細胞。
【請求項１１】
ポリペプチドの分離方法であって、培地中で請求項10に記載の宿主細胞を培養し、上記培地から上記ポリペプチドを分離することを含む上記方法。
【請求項１２】
請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド。
【請求項１３】
アミノ酸配列、配列番号2の全部又は一部を含み、かつ、D70N、G104S及びS147Cから成る群から選ばれる少なくとも1つのコーディングSNPを有する単離されたポリペプチド。
【請求項１４】
アミノ酸配列、配列番号2の第28〜第193アミノ酸を含み、かつ、D70N、G104S及びS147Cから成る群から選ばれる少なくとも1つのコーディングSNPを有する、請求項12に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
アミノ酸配列、配列番号2の第28〜第193アミノ酸を含み、かつ、SNP G104Sを有する、請求項12に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
アミノ酸配列、配列番号2の第28〜第193アミノ酸を含み、かつ、SNP G104Sを有するポリペプチドの高グリコシル化アナログ。
【請求項１７】
免疫特異的抗体の獲得方法であって、請求項12に記載のポリペプチドにより動物を免疫し、そして上記抗体を上記動物から回収することを含む上記方法。
【請求項１８】
請求項17に記載の方法によって生じる免疫特異的抗体。
【請求項１９】
アミノ酸配列、配列番号2の全部又は一部を含み、かつ、D70N、G104S及びS147Cから成る群から選ばれる少なくとも1つのコーディングSNPを有する単離されたポリペプチドの活性を活性化又は抑制する、1以上の試験すべき化合物の中の作用物質の同定方法であって、以下のステップ：
a)  請求項9に記載の組み換えベクターを含む宿主細胞を準備し；
b)  上記宿主細胞と、上記試験すべき化合物とを接触させ；そして
c)  上記ポリペプチドの活性に対する活性化又は抑制効果を測定し、それにより上記活性化又は抑制作用物質を同定する、
を含む上記方法。
【請求項２０】
アミノ酸配列、配列番号2の全部又は一部を含み、かつ、D70N、G104S及びS147Cから成る群から選ばれる少なくとも1つのコーディングSNPを有する単離されたポリペプチドによりその活性が増強又は抑制される、1以上の試験すべき化合物の中の作用物質の同定方法であって、以下のステップ：
a)  請求項9に記載の組み換えベクターを含む宿主細胞を準備し；
b)  上記宿主細胞と、上記試験すべき化合物とを接触させ；そして
c)  上記作用物質の活性に対する増強又は抑制効果を測定し、それにより上記増強又は抑制される作用物質を同定する、
を含む上記方法。
【請求項２１】
患者の生物学的特徴の分析方法であって、以下のステップ：
a)  患者のゲノム内の請求項1に記載のポリヌクレオチドの存在又は不存在を測定すること；
b)  患者の請求項1に記載のポリヌクレオチドの発現レベルを測定すること；
c)  患者の請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドの存在又は不存在を測定すること；
d)  患者の請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドの濃度を測定すること；又は
e)  患者の請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドの機能性を測定すること、
の少なくとも1つを実施することを含む上記方法。
【請求項２２】
以下の：
−  ヌクレオチド配列、配列番号1の全部又は一部を含む単離されたポリヌクレオチド(ただし、上記ヌクレオチド配列は、465-486(欠失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、g1644a、g2228a、g2357a、c2502t、c2621g及びg2634aから成る群から選ばれる少なくとも1つのSNPを含む)又は上記ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列；
−  上記ポリヌクレオチドを含む組み換えベクター；
−  上記組み換えベクターを含む宿主細胞；
−  アミノ酸配列、配列番号2の全部又は一部を含み、かつ、D70N、G104S及びS147Cから成る群から選ばれる少なくとも1つのコーディングSNPを有する単離されたポリペプチド；
−  アミノ酸配列、配列番号2の第28〜第193アミノ酸を含み、かつ、SNP G104Sを有するポリペプチドの高グリコシル化アナログ；
−  上記ポリペプチドに特異的な抗体、
から成る群から選ばれる1以上の化合物を含む治療薬。
【請求項２３】
癌及び腫瘍、感染症、性病、免疫学的に関連する病気及び/又は自己免疫疾患及び障害、心血管系の病気、代謝系の病気、中枢神経系の病気、胃腸疾患、並びに化学療法治療に関係した障害から成る群から選ばれる病気の個体における予防又は治療方法であって、治療として有効量の請求項22に記載の作用物質及び医薬として許容される賦形剤を上記個体に投与することを含む上記方法。
【請求項２４】
前記癌及び腫瘍が、転移性腎癌、メラノーマ、濾胞性リンパ腫及び皮膚T細胞型リンパ腫を含むリンパ腫、慢性リンパ球性白血病及び慢性骨髄性白血病を含む白血病、肝臓、頸部、頭部及び腎臓の癌、多発性骨髄腫、カルチノイド腫瘍、並びにAIDSの場合のカポジ肉腫を含む、免疫欠陥に続いて現れる腫瘍を含む、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
前記代謝系の病気が、肥満症のような免疫に関係しない病気を含む、請求項23に記載の方法。
【請求項２６】
前記感染症が、慢性B及びC型肝炎、並びにHIV/AIDSを含むウイルス感染症、感染性肺炎、そして性病、例えば陰部疣贅を含む、請求項23に記載の方法。
【請求項２７】
前記中枢神経系の病気が、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症、及びうつ病を含む、請求項23に記載の方法。
【請求項２８】
前記の免疫学的及び自己免疫学的に関連する病気が、組織又は臓器移植片の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病、並びに潰瘍性大腸炎を含む、請求項23に記載の方法。
【請求項２９】
前記心血管系の病気が、脳損傷、そして腎不全により透析下にある患者の貧血、並びに慢性の感染症、炎症過程、放射線療法及び化学療法に起因する貧血を含めた貧血を含む、請求項23に記載の方法。
【請求項３０】
外傷の治癒及び/又は骨粗鬆症から成る群から選ばれる病気の個体における予防又は治療方法であって、治療として有効量の請求項22に記載の作用物質及び医薬として許容される賦形剤を上記個体に投与することを含む上記方法。
【請求項３１】
特に、様々な自家移植血液採取プログラムに参加する患者の自家移植血液の産生を増加させる方法であって、治療として有効量の請求項22に記載の作用物質及び医薬として許容される賦形剤を上記個体に投与することを含む上記方法。
【請求項３２】
患者の請求項12に記載のポリペプチドの活性を増加又は減少させる方法であって、治療として有効量の：ヌクレオチド配列、配列番号1の全部又は一部を含む単離されたポリヌクレオチド(ただし、上記ヌクレオチド配列は、465-486(欠失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、g1644a、g2228a、g2357a、c2502t、c2621g及びg2634aから成る群から選ばれる少なくとも1つのSNPを含む)又は上記ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列；上記ポリヌクレオチドを含む組み換えベクター；上記組み換えベクターを含む宿主細胞、ここで、上記宿主細胞は上記治療すべき患者から得られる；アミノ酸配列、配列番号2の全部又は一部を含み、かつ、D70N、G104S及びS147Cから成る群から選ばれる少なくとも1つのコーディングSNPを有する単離されたポリペプチド；アミノ酸配列、配列番号2の第28〜第193アミノ酸を含み、かつ、SNP G104Sを有するポリペプチドの高グリコシル化アナログ；上記ポリペプチドに特異的な抗体；並びに医薬として許容される賦形剤の1以上を投与することを含む上記方法。
【請求項３３】
個体のゲノム内における請求項1に記載のポリヌクレオチドの存在に関係した上記個体の障害又は病気の予防又は治療方法であって、治療として有効量の：ヌクレオチド配列、配列番号1の全部又は一部を含み、かつ、465-486(欠失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、g1644a、g2228a、g2357a、c2502t、c2621g及びg2634aから成る群から選ばれる少なくとも1つのSNPを有する単離されたポリヌクレオチド又は上記ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列；上記ポリヌクレオチドの1つを含む組み換えベクター；上記組み換えベクターを含む宿主細胞；アミノ酸配列、配列番号2の全部又は一部を含み、かつ、D70N、G104S及びS147Cから成る群から選ばれる少なくとも1つのコーディングSNPを有する単離されたポリペプチド；アミノ酸配列、配列番号2の第28〜第193アミノ酸を含み、かつ、SNP G104Sを有するポリペプチドの高グリコシル化アナログ；上記ポリペプチドの1つに特異的な抗体；並びに医薬として許容される賦形剤の1以上を投与することを含む上記方法。
【請求項３４】
EPO遺伝子内の465-486(欠失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、g1644a、g2228a、g2357a、c2502t、c2621g及びg2634aから成る群から選ばれる少なくとも1つのSNPと、病気又は病気に対する耐性の間の統計的に関連性のある組み合わせの決定方法であって、以下のステップ：
a)  個体群を遺伝子型解析し；
b)  上記個体群内の病気又は病気に対する耐性の分布を測定し；
c)  上記遺伝子型データを病気又は病気に対する耐性の分布と比較し；そして
d)  統計的に関連性のある組み合わせについて上記比較を分析する、
を含む上記方法。
【請求項３５】
EPO遺伝子内の465-486(欠失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、g1644a、g2228a、g2357a、c2502t、c2621g及びg2634aから成る群から選ばれる少なくとも1のSNPを検出することを含む、病気又は病気に対する耐性の診断又は予後徴候の決定方法。
【請求項３６】
G104S変異EPO遺伝子産物の活性と実質的に類似するか又はそれより高い生物活性を有する、試験すべき1以上の化合物の中の化合物の同定方法であって、以下のステップ：
a)  上記化合物の生物活性、例えばヒトEPO受容体を過剰発現する32D細胞系の細胞増殖に対する促進効果、赤血球のコロニー形成及び/又はヒトEPO受容体への結合能力に対する促進効果を測定し、
b)  上記化合物のステップa)で測定された活性と、G104S変異EPO遺伝子産物の活性を比較し；そして
c)  ステップb)で実行された比較を基準として、上記化合物が、G104S変異EPO遺伝子産物のそれと比較して実質的に類似するか又は高い活性を有するかどうかを決定する、
を含む上記方法。
【請求項３７】
前記試験すべき化合物が、配列番号2のポリペプチド、又はアミノ酸配列、配列番号2の28位と193位の間に包含されるアミノ酸を含むアミノ酸配列のそれと同じ3次元構造をもつように、合成ペプチド・コンビナトリアル・ライブラリー、高性能スクリーニングから同定されるか、あるいはコンピューターを用いたドラッグデザインによって設計される、ただし、上記アミノ酸配列はG104S SNPを含む、請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
請求項36に記載の方法によって同定された化合物。
【請求項３９】
癌及び腫瘍、感染症、性病、免疫学的に関連する病気及び/又は自己免疫疾患及び障害、心血管系の病気、代謝系の病気、中枢神経系の病気、胃腸疾患、並びに化学療法治療に関係した障害から成る群から選ばれる病気の個体における予防又は治療方法であって、治療として有効量の請求項38に記載の作用物質及び医薬として許容される賦形剤を上記個体に投与することを含む上記方法。
【請求項４０】
前記癌及び腫瘍が、転移性腎癌、メラノーマ、濾胞性リンパ腫及び皮膚T細胞型リンパ腫を含むリンパ腫、慢性リンパ球性白血病及び慢性骨髄性白血病を含む白血病、肝臓、頸部、頭部及び腎臓の癌、多発性骨髄腫、カルチノイド腫瘍、並びにAIDSの場合のカポジ肉腫を含む、免疫欠陥に続いて現れる腫瘍を含む、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
前記代謝系の病気が、肥満症のような免疫に関係しない病気を含む、請求項39に記載の方法。
【請求項４２】
前記感染症が、慢性B及びC型肝炎、並びにHIV/AIDSを含むウイルス感染症、感染性肺炎、そして性病、例えば陰部疣贅を含む、請求項39に記載の方法。
【請求項４３】
前記中枢神経系の病気が、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症、及びうつ病を含む、請求項39に記載の方法。
【請求項４４】
前記の免疫学的及び自己免疫学的に関連する病気が、組織又は臓器移植片の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病、並びに潰瘍性大腸炎を含む、請求項39に記載の方法。
【請求項４５】
前記心血管系の病気が、脳損傷、そして腎不全により透析下にある患者の貧血、並びに慢性の感染症、炎症過程、放射線療法及び化学療法に起因する貧血を含めた貧血を含む、請求項39に記載の方法。
【請求項４６】
外傷の治癒及び骨粗鬆症から成る群から選ばれる病気の個体の予防又は治療方法であって、治療として有効量の請求項38に記載の作用物質及び医薬として許容される賦形剤を上記個体に投与することを含む上記方法。
【請求項４７】
特に、様々な自家移植血液採取プログラムに参加する患者の自家移植血液の産生を増加させる方法であって、治療として有効量の請求項38に記載の作用物質及び医薬として許容される賦形剤を上記個体に投与することを含む上記方法。
【請求項４８】
少なくとも野生型ヒト・エリスロポエチンのそれと等しい細胞増殖性の機能特性を有するヘリックスA、B、C及びDを特徴とし、かつ、ヘリックスBのアミノ酸配列に少なくとも1つの変更をもつことにより野生型ヒト・エリスロポエチンのそれより高い親和性でのエリスロポエチン受容体への結合がもたらされる、エリスロポエチン受容体に結合する能力を有する分子。
【請求項４９】
野生型エリスロポエチンのヘリックスBの部分に相当する部分をもち、かつ、エリスロポエチン受容体に結合する能力を有するエリスロポエチン様分子の細胞増殖機能性の改善方法であって、野生型エリスロポエチンのヘリックスBに相当するエリスロポエチン様分子の部分のアミノ酸配列を修飾することを含む上記方法。
【請求項５０】
請求項48に記載の分子及び医薬として許容される賦形剤を含む治療用化合物。
【請求項５１】
治療として有効量の請求項50に記載の化合物を患者に投与することを含む治療方法。
【請求項５２】
ヘリックスA、B、C及びDをもつヒト野生型エリスロポエチン分子の機能性の改善方法であって、結果としてエリスロポエチン受容体に対する上記分子の結合親和性を改善するようにヘリックスBのアミノ酸配列が変更される、上記分子又は上記分子をコードする遺伝子を修飾することを含む上記方法。
【請求項５３】
配列番号2の104位のグリシンに相当するアミノ酸が変更される、請求項52に記載の方法。
【請求項５４】
配列番号2の104位のグリシンに相当するアミノ酸がセリンにより置き換えられる、請求項53に記載の方法。
【請求項５５】
請求項52に記載の方法によって製造された化合物。
【請求項５６】
請求項53に記載の方法によって製造された化合物。
【請求項５７】
請求項54に記載の方法によって製造された化合物。
【請求項５８】
配列番号2の104位のグリシンに相当するアミノ酸が変更される、請求項49に記載の方法によって製造された化合物。
【請求項５９】
配列番号2の104位のグリシンに相当するアミノ酸がセリンにより置き換えられる、請求項49に記載の方法によって製造された化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願：
本発明の一部は、≪Nouveaux polynucleotides comportant des polymorphismes de type SNP fonctionnels dans la sequence nucleique du gene erythropoietine (EPO) ainsi que de nouveaux polypeptides codes par ces polynucleotides et leurs utilisations therapeutiques.≫と題した2001年4月4日に出願されたフランス特許出願番号第0104603号；エリスロポエチン関連分子及び一塩基多型と題した2001年12月21日に出願された米国特許仮出願番号第60/343163号；修飾されたエリスロポエチン関連分子及び一塩基多型と題した2002年1月4日に出願された米国特許仮出願番号第60/345,440号；及びEPO遺伝子の新規ポリヌクレオチド及びポリペプチドと題した2002年2月21日に出願された米国特許仮出願番号第60/358,598号に対する優先権を主張する。
【０００２】
本発明の分野
本発明は、新規SNPsを含むエリスロポエチン遺伝子(EPO)のヌクレオチド配列由来の新規ポリヌクレオチド、及びこれらのSNPsによって引き起こされた変異を含む天然のエリスロポエチン・タンパク質由来の新規ポリペプチド、並びにそれらの、治療のための使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
本発明の背景
関連技術
エリスロポエチン遺伝子(以下EPOと呼ぶ)は、刊行物、Jacobs K. et al. (1985) "Isolation and characterization of genomic and cDNA clones of human erythropoietin"; Nature 313 (6005), 806-810中に記載されている。
この遺伝子のヌクレオチド配列は、ジーンバンク・データベースの登録番号X02158の下で入手可能である。
【０００４】
エリスロポエチン・タンパク質は、赤血球形成の前駆細胞の増殖、分化、及び成熟に作用することが知られている。それは、それらの分化及び赤血球への成熟を左右する。
EPOは、特定の赤白血病細胞の自己分泌因子として作用すること、並びに内皮細胞に対する分裂誘発因子及び化学遊走物質であることも知られている。
【０００５】
EPOは、活性化及び分化したB細胞を刺激すること、並びにB細胞免疫グロブリンの産生と増殖を高めることも知られている。
EPO合成は、フィードバックループにより腎臓と骨髄に関連する複合制御回路に制約される。合成は、静脈の酸素分圧に依存して、低酸素条件下で高められる。
EPO産生は、種々の他の体液性因子、例えばテストステロン、甲状腺ホルモン、成長ホルモン及びカテコールアミンによっても影響される。対照的に、いくつかのサイトカイン、例えばIL-1、IL-6及びTNF-αは、EPO合成を減少させる。
【０００６】
細胞において、その受容体へのEPOの結合は、以下の：
−  膜リン脂質の放出、
−  ジアシルグリセロールの合成、
−  細胞内カルシウム・レベルの上昇、
−  細胞内pHの上昇、及び
−  細胞内ホスホリパーゼA2とホスホリパーゼCの増加（後者は、fos及びmycオンコジーンを誘発する）、
を誘発する
EPO過剰が赤血球増加をもたらすことが知られている。これは、血液粘性度及び心拍出量の増加を伴い、そして心不全と肺高血圧症をも引き起こす。血小板の顕著な減少も観察される。
【０００７】
血栓症は、EPO過剰のもう1つの副作用である。
肺及び脳塞栓症、すなわち血塊又は血液によって運ばれた外来の化合物による血管の突然の閉塞もEPO消費と関係がある深刻な副作用を構成する。
しかし、それが重度の腎臓機能障害の場合のように合成されたEPO量が低すぎるとき、貧血がしばしば観察される。このように、EPOは、しばしば0.3未満のヘマトクリットを有する重度の腎臓機能障害の患者、特に透析患者に投与される。
【０００８】
EPOによる治療において最も重要な合併症は、高血圧症(hypertony)、尿素、カリウム及びリン酸レベルの上昇、血液粘性度の上昇、血小板新生前駆細胞と循環している血小板の増殖である。
EPOは、自家移植のドナー血液の採取を可能にする、赤血球形成の活性化のために使用される。
さらに、EPOの使用は、例えば慢性感染症、炎症過程、放射線治療及び細胞増殖抑制性薬物療法により誘発された腎外性様式の貧血のためにも勧められた。
【０００９】
特定の範囲に関してEPOは、巨核球形成の活性化因子でもある。EPOの活性はIL-4によって相乗作用を示す。
おそらくフリーラジカルを減少させ、そして酸化ストレス効果を軽減させることことによって、EPOが虚血によって誘発された細胞死に対抗してニューロンを保護することが証明されたので、EPOが神経保護能力を有すると考えられる。
【００１０】
EPO遺伝子は、様々なヒトの障害及び/又は病気、例えば異なる癌の類(癌腫、メラノーマ、ミエローマ、腫瘍、白血病、並びに肝臓、頸部、頭部及び腎臓の癌)、心血管系の病気(例えば脳損傷)、代謝系の病気(例えば免疫系の類と関連しないもの、肥満症)、感染症、特にウイルス感染症(例えば、B及びC型肝炎並びにAIDS)、肺炎、潰瘍性大腸炎の類、中枢神経系の病気(例えば、アルツハイマー病、統合失調症及びうつ病)、組織又は臓器移植片の拒絶、外傷の治癒、貧血、アレルギー、喘息、多発性硬化症、骨粗鬆症、乾癬、関節リウマチ、クローン病、自己免疫疾患及び障害、陰部疣贅又は性病性疣贅、胃腸の障害、並びに化学療法の治療に関連した障害に係わっていることが知られている。
本発明者は、天然の野生型EPOと異なる機能性をもつことが可能なEPO遺伝子に対する新規ポリペプチド及び新規ポリヌクレオチド・アナログを発見した。
【００１１】
これらの新しいポリペプチド及びポリヌクレオチドは、とりわけ、先に触れた障害又は病気を治療又は予防するため使用することができて、それらに密接に結び付けられる問題点の全て又は一部を回避することができる。
【発明の開示】
【００１２】
本発明の簡単な概要
本発明は、その最初の目的として、1つ又は複数のSNPs(一塩基多型)を含む基準野生型EPO遺伝子のヌクレオチド配列と異なる新規ポリヌクレオチドを有する。
【００１３】
ヒトの基準野生型EPO遺伝子のヌクレオチド配列、配列番号1は、3398のヌクレオチドから構成されて、第615ヌクレオチド(開始コドン)から第2763ヌクレオチド(停止コドン)までの2149のヌクレオチドから成るコード配列を含む。
EPO遺伝子は、5つのエクソンから構成され、ヌクレオチド配列、配列番号1上のその位置は、以下のとおりである：
エクソン1：第397ヌクレオチド〜第627ヌクレオチド(615位の開始コドンを含む)。
エクソン2：第1194ヌクレオチド〜第1339ヌクレオチド。
エクソン3：第1596ヌクレオチド〜第1682ヌクレオチド。
エクソン4：第2294ヌクレオチド〜第2473ヌクレオチド。
エクソン5：第2608ヌクレオチド〜第3327ヌクレオチド(2763位の停止コドンを含む)。
【００１４】
当該出願人は、基準野生型EPO遺伝子のヌクレオチド配列中に12のSNPsを同定した。
これらの12のSNPsは、以下の：465-486(欠失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、g1644a、g2228a、g2357a、c2502t、c2621g、g2634aである。
本発明の意味において、先に定義されたSNPの位置付けに対応する番号付けは、ヌクレオチド配列、配列番号1の番号付けと関連することが理解される。
【００１５】
文字a、t、c及びgは、それぞれ窒素含有塩基、アデニン、チミン、シトシン及びグアニンに対応する。
最初の文字は野生型ヌクレオチドに相当し、一方最後の文字は、変異ヌクレオチドに相当する。
【００１６】
よって、例えば、SNP g1644aは、基準野生型EPO遺伝子のヌクレオチド配列、配列番号1の1644位で、ヌクレオチド、g(グアニン)の、ヌクレオチド、a(アデニン)への変異に相当する。SNP 465-486(欠失)は、基準野生型EPO遺伝子のヌクレオチド配列、配列番号1の465位〜486位の22のヌクレオチドが欠失された変異に相当する。
これらのSNPsは、「前もって選ばれた機能的候補遺伝子のヌクレオチド配列中の1つ又は複数の機能的多型性の同定方法並びにその適用」と題された、そして2000年12月6日に出願された、当該出願人の特許出願FR 00 22894に記載された測定方法を使って出願人によって同定された、ここで上記文献を本明細書中に援用する。
【００１７】
当該特許出願に記載された方法は、個体のランダム集団からの少なくとも1の個体における1つの(又はいくつかの)先在するSNP(s)の同定を可能にする。
【００１８】
本発明の範囲で、例えばコード配列を含んでいるEPO遺伝子のヌクレオチド配列の断片は、ランダムなやり方で選ばれた個体集団内の異なる個体から単離された。
次に、これらの断片の配列決定を、DHPLC(「変性−高速液体クロマトグラフィー」)による解析後に、ヘテロ２本鎖特性(すなわち、基準野生型EPO遺伝子配列のそれと異なる特性)を有するこれらのサンプルを確認するために実行した。
次に、この方法により配列決定された断片を、基準野生型EPO遺伝子の断片のヌクレオチド配列と比べて、本発明に従ってSNPsを同定した。
このように、SNPsは天然のものであり、それらの各々が世界人口の特定の個体に存在する。
【００１９】
天然の野生型EPOタンパク質の構造は、A、B、C及びDと呼ばれる4つのヘリックスを含む。EPO受容体と複合体を形成したEPOの結晶構造は、3つのヘリックス、A、C及びDだけがその受容体へのEPOの結合に関与していることを示す(Syed et al. (1998). Efficiency of signaling through cytokine receptors depends critically on receptor orientation. Nature 395:511-516)。さらに、EPOの活性部位を検討する部位特異的変異誘発が、ヘリックスBに位置するアミノ酸の変更がEPO活性に対する効果を制限することを証明する(Eliott et al. (1997). Mapping of the active site of recombinant human erythropoietin. Blood. 89: 493-502; Wen et al. (1994). Erythropoietin structure-function relationships. Identification of functionally important domains. J. Biol. Chem. 269:22839-22846)。
本発明のコーディングSNPs、すなわち：g1644a、g2357a、c2621gの各々は、EPO遺伝子のヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列のレベルでの変更を引き起こす。
【００２０】
アミノ酸配列のこれらの変更は、以下のとおりである：
コーディングSNP g1644aは、アミノ酸配列、配列番号2に相当するEPO遺伝子の未成熟型タンパク質の70位、かつ、成熟型タンパク質の43位でのアミノ酸、アスパラギン酸(D)のアスパラギン(N)への変異を引き起こす。本発明の記載において、当業者は、成熟型タンパク質を参照するか又は未成熟型タンパク質を参照するかにより、このSNPによってコードされた変異をそれぞれ、D43N又はD70Nと呼ぶ。
【００２１】
コーディングSNP g2357aは、アミノ酸配列、配列番号2に相当するEPO遺伝子の未成熟型タンパク質の104位、かつ、成熟型タンパク質の77位でのアミノ酸、グリシン(G)のセリン(S)への変異を引き起こす。本発明の記載において、当業者は、成熟型タンパク質を参照するか又は未成熟型タンパク質を参照するかにより、このSNPによってコードされた変異をそれぞれ、G77S又はG104Sと呼ぶ。
コーディングSNP c2621gは、アミノ酸配列、配列番号2に相当するEPO遺伝子の未成熟型タンパク質の147位、かつ、成熟型タンパク質の120位でのアミノ酸、セリン(S)のシステイン(C)への変異を引き起こす。本発明の記載において、当業者は、成熟型タンパク質を参照するか又は未成熟型タンパク質を参照するかにより、このSNPによってコードされた変異をそれぞれ、S120C又はS147Cと呼ぶ。
SNPs g1644a、g2357a及びc2621gは、野生型基準EPO遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドと比べて、本発明に従ってポリペプチド空間的構造の変更を引き起こす。
【００２２】
これらの変更は、例えば、デノボ・モデリング・ツール(例えば、SEQFOLD/MSI)、相同性(例えば、MODELER/MSI)、力場の最小化(例えば、DISCOVER、Delphi/MSI)、及び/又は分子力学(例えば、CFF/MSI)を使用する、当業者に周知の方法に従い、コンピューターを利用した分子モデリングによって観察される。
【００２３】
そのようなモデルの例を、以下の実験の項で挙げる。
1/  コンピューターを用いた分子モデリングは、変異成熟型タンパク質上の変異D43Nが、EPOタンパク質のヘリックスAとヘリックスBの間に位置するループループの構造的な変更、並びにP129〜I133アミノ酸の領域内のEPOタンパク質のヘリックスC及びDに接続するロングループの構造の変化を伴うことを示す。それらの残基は、変更されたアミノ酸N43の前に位置する。この変異がEPO受容体への結合に関与する短いヘリックスF48-R53の近くに位置するので、その受容体とEPOタンパク質の相互作用に影響があるかもしれない。D43残基は全てのEPOオルソログにおいて高度に保存されている。それは、EPOオルソログにおいて同様に保存されている陽性荷電残基(K45、R131)と塩橋を形成することができた。
このように、前記変異タンパク質は、野生型EPO遺伝子によってコードされた天然の野生型EPOタンパク質と異なる3次元構造を有する。
コンピューターを用いた分子モデリングは、43位のアミノ酸であるアスパラギンの存在が天然の野生型EPOタンパク質の構造及び機能の著しい変化に関係することをも予測する。
【００２４】
2/  コンピューターを用いた分子モデリングは、  成熟型変異タンパク質上の変異G77Sが、ヘリックスD上の183位のフェニルアラニン残基による立体障害によって、並びにヘリックスAとヘリックスBの間のループ上の親水性(77位のセリン) アミノ酸と疎水性(35位のロイシン)アミノ酸の間の好ましくない相互作用によって引き起こされたヘリックスBのC末端の完全な変性を伴うことを示す。このG77残基は、野生型タンパク質構造に埋もれる。
このように、前記変異タンパク質は、野生型EPO遺伝子によってコードされた天然の野生型EPOタンパク質と異なる3次元構造を有する。
コンピューターを用いた分子モデリングは、77位のアミノ酸であるセリンの存在が、特にその受容体に対するEPOの親和性を変えることによって、天然の野生型EPOタンパク質の構造及び機能の著しい変化に関係することをも予測する。
【００２５】
3/  コンピューターを用いた分子モデリングは、成熟型変異タンパク質上の変異S120Cが、ヘリックスCとヘリックスDの間のループ、特に116位のリジンと125位のアラニンの間に位置する構造的な変化を伴うことを示す。野生型EPOタンパク質構造内のS120とK116残基の間の水素結合は、変異タンパク質構造において破壊される。
このように、前記変異タンパク質は、野生型EPO遺伝子によってコードされた天然の野生型EPOタンパク質と異なる3次元構造を有する。
コンピューターを用いた分子モデリングは、120位のアミノ酸であるシステインの存在が天然の野生型EPOタンパク質の構造及び機能の著しい変化に関係することをも予測する。
【００２６】
本発明による他のSNPs、すなわち：465-486(欠失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、g2228a、c2502t、g2634aは、アミノ酸配列、配列番号2のレベルでのEPO遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされたタンパク質の変更を伴わない。
前記SNPs c1288t、t1607c、g2634aはサイレントであり、SNPs 465-486(欠失)、c577t、g602c、c1347t、g2228a、c2502tは、非コーディングである。
【００２７】
本発明によるポリヌクレオチドの遺伝子型解析は、集団中のこれらのポリヌクレオチドの対立遺伝子頻度を測定するといったやり方で実行されることができる。以下の実験の項で、SNPs g1644a及びc2621gに関する、遺伝子型解析の2つの例を挙げる。
【００２８】
本発明のポリペプチドの機能性の測定は、以下の刊行物：
−  Bittorf et al.; "Rapid activation of the MAP kinase pathway in hematopoietic cells by erythropoietin, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and interleukin-3"; Cell Signal; 1994; Mar; 6(3): 305-11、
−  Chretien et al.; "Erythropoietin-induced erythroid differentiation of the human erythroleukemia cell line TF-1 correlates with impaired STATS activation"; EMBO J.; 1996 Aug 15; 15(16): 4174-81、
【００２９】
−  Porteu et al.; "Functional regions of the mouse thrombopoietin receptor cytoplasmic domain: evidence for a critical region which is involved in differentiation and can be complemented by erythropoietin"; Mol. Cell. Biol.; 1996 May; 16(5): 2473-82、
−  Pallard et al.; "Thrombopoietin activates a STAT5-like factor in hematopoietic cells"; EMBO J.; 1995 Jun 15; 14(12): 2847-56、
に記載のプロトコールによるそれらの生物活性の試験によって一様に実行されることができる。
本発明は、目的のために、特に特定のヒトの障害及び/又は病気の予防及び治療のための、本発明によるポリペプチド及びポリヌクレオチドの使用、並びにこれらのポリヌクレオチド及びポリペプチドから開始して得られた及び/又は同定された治療のための分子をも使用する。
【００３０】
そのような分子は、特に腎不全により透析下にある患者の貧血、並びに慢性の感染症、炎症過程、放射線療法、化学療法に起因する貧血を予防又は治療する、そして脳損傷を予防するために特に有用である。
そのような分子は、とりわけ、特に他人からの血液の使用を避けるために様々な自家移植血液採取プログラムに参加する患者の自家移植血液の産生増加のために特に有用である。
【００３１】
本発明の詳細な説明
定義
「基準野生型遺伝子のヌクレオチド配列」は、ヒトEPO遺伝子のヌクレオチド配列、配列番号1と理解され、この配列は、登録番号X02158下、ジーンバンクで入手可能であり、かつ、Jacobs K. et al.; "Isolation and characterization of genomic and cDNA clones of human erythropoietin"; Nature 313 (6005), 806-810 (1985)中に記載されている。
【００３２】
「天然の野生型エリスロポエチン・タンパク質」は、基準野生型EPO遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされた成熟型タンパク質と理解されている。天然の野生型の未成熟型EPOタンパク質はペプチド配列、配列番号2に相当する。
【００３３】
「ポリヌクレオチド」は、修飾又は非修飾DNA又はRNAであるかもしれないポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドと理解されている。
用語ポリヌクレオチドは、例えば1本鎖又は2本鎖DNA、1又はいくつかの1本鎖領域及び1又はいくつかの2本鎖領域の混合物から構成されたDNA、1本鎖又は2本鎖RNA、1又はいくつかの1本鎖領域及び1又はいくつかの2本鎖領域の混合物から構成されたRNAを含む。用語ポリヌクレオチドは、1つ又はいくつかの3本鎖領域を含むRNA及び/又はDNAをも含むことができる。ポリヌクレオチドに関しては、同様に、安定性の理由のために又は他の理由のために修飾された骨格をもつように修飾された1つ又はいくつかの塩基を含むDNA及びRNAと理解される。修飾された塩基に関しては、例えばイノシンのような例外的な塩基と理解される。
【００３４】
「ポリペプチド」は、例えば等配電子ペプチドの場合、通常の又は修飾されたペプチド結合によって互いに結合された少なくとも2つのアミノ酸を含むペプチド、オリゴペプチド、オリゴマー又はタンパク質と理解される。
ポリペプチドは遺伝コードによって定義された20のアミノ酸以外のアミノ酸から構成されることができる。同様に、ポリペプチドは、天然の方法、例えば翻訳後成熟過程によって、又は当業者に周知の化学過程により修飾されたアミノ酸からも構成される。そのような修飾が、文献に十分に詳細に説明されている。これらの修飾は、ポリペプチド内：ペプチド骨格内、アミノ酸鎖内のどこででも、あるいはカルボキシ−又はアミノ−末端にさえ現れうる。
【００３５】
ポリペプチドは、ユビキチン化を受けて分岐するか、又は分岐の有無に係わらず環状になるかもしれない。この種の修飾は、当業者に周知の自然又は人工の翻訳後過程の結果であるかもしれない。
【００３６】
例えば、ポリペプチドの修飾は、アセチル化、アシル化、ADP−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合性固定、ヘムの共有結合性固定、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体、脂質又は脂質誘導体の共有結合性固定、ホスファチジルイノシトールの共有結合性又は非共有結合性架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル基、システイン形成、ピログルタミン酸形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシ化、ペグ化を含むグリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ化、メチル化、ミリスチル化、酸化、タンパク質分解過程、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セネロイル化(seneloylation)、硫酸化、アルギニン化又はユビキチン化のようにアミノ酸付加を含んでいると理解される。そのような修飾は、文献中に十分に詳細に記載されている：PROTEINS−STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T. E. Creighton, New York, 1993, POST−TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, 1983, Seifter et al. "Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors", Meth. Enzymol. (1990) 182:626−646、及びRattan et al. "Protein Synthesis: Post−translational Modifications and Aging", Ann NY Acad Sci (1992) 663: 48−62。
「高グリコシル化ポリペプチド(hyperglycosylated polypeptide)」又は「ポリペプチドの高グリコシル化アナログ」は、そのアミノ酸配列が少なくとも1以上の追加のグリコシド化部位をもつように変更されたポリペプチド、あるいは同じアミノ酸配列をもつが、そのグリコシド化レベルが高められたポリペプチドと理解される。
【００３７】
「単離されたポリヌクレオチド」又は「単離されたポリペプチド」は、例えば人体から単離された、又は専門的な方法によって別な方法で製造された先に定義された、ポリペプチド又はポリヌクレオチドと理解される。
【００３８】
「同一性」は、ヌクレオチド又はポリペプチド配列の同一性の測定値と理解される。同一性は、当業者に周知であり、文献中によく記載される用語である。COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, A.M., Ed., Oxford University Press, New York, 1998; BIOCOMPUTING INFORMATICS AND GENOME PROJECT, Smith, D.W., Ed., Academic Press, New York, 1993; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PART I, Griffin, A.M. and Griffin H.G., Ed, Humana Press, New Jersey, 1994;及びSEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, von Heinje, G., Academic Press, 1987を参照のこと。
【００３９】
同様に、2つの配列間の同一性及び類似性を測定するために一般に使われる方法は、文献中に十分記載されている。GUIDE TO HUGE COMPUTER, Martin J. Bishop, Ed, Academic Press, San Diego, 1994, and Carillo H. and Lipton D., Siam J Applied Math (1988) 48: 1073を参照のこと。
【００４０】
例えば、ヌクレオチド配列、配列番号1に少なくとも95%の同一性をもつポリヌクレオチドは、上記配列と比べて100のヌクレオチド上に多くとも5点の変異を含んでいるポリヌクレオチドである。
これらの変異点は、1つ(又はいくつかの)置換、付加及び/又は1つ(又はいくつかの)ヌクレオチドの欠失であるかもしれない。
【００４１】
同様に、例えば、アミノ酸配列、配列番号1に少なくとも95%の同一性をもつポリペプチドは、上記配列と比べて100のアミノ酸上に多くとも5点の変異を含んでいるポリペプチドである。
これらの変異点は、1つ(又はいくつかの)置換、付加及び/又は1つ(又はいくつかの)アミノ酸の欠失であるかもしれない。
【００４２】
これらの配列が少なくとも1つの本発明のSNPsを含んでいることが理解される、それぞれ、ヌクレオチド配列、配列番号1又はアミノ酸配列、配列番号2と完全に同一でない本発明によるポリヌクレオチド及びポリペプチドが、これらの配列の変異型と考えられる。
通常、本発明によるポリヌクレオチドは、本発明のSNPsの少なくとも1つを含み、ヌクレオチド配列、配列番号1と同じか又は実質的に同じものは同じ生物活性を有する。
同様に、通常、本発明によるポリペプチドは、本発明のコーディングSNPsの少なくとも1つを含み、アミノ酸配列、配列番号2と同じか又は実質的に同じものは同じ生物活性を有する。
本発明による変異型は、例えば部位特異的変異誘発法又は直接的な合成によって得ることができる。
【００４３】
「SNP」は、ヌクレオチド配列内の塩基のいずれかの天然の変化と理解される。ヌクレオチド配列上のSNPは、コーディング、サイレント又は非コーディングであるかもしれない。
コーディングSNPは、このヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列中のアミノ酸の変更を伴うヌクレオチド配列のコード配列に含まれる多型性である。この場合、用語SNPは、意味が拡大されて、アミノ酸配列の変異に同様に使用される。
【００４４】
サイレントSNPは、このヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列中のアミノ酸の変更を伴わないヌクレオチド配列のコード配列に含まれる多型性である。
非コーディングSNPは、ヌクレオチド配列の非コード配列に含まれている多型性である。この多型性は、特にイントロン、スプライシング領域、転写プロモーター又は部位エンハンサー配列中に見ることができる。
【００４５】
「機能的SNP」は、機能性をもっているヌクレオチド配列又はアミノ酸配列に含まれる、例えば先に定義のSNPと理解される。
「機能性」は、ポリペプチド又はポリヌクレオチドの生物活性と理解される。
本発明によるポリペプチド又はポリヌクレオチドの機能性は、野生型基準遺伝子のヌクレオチド配列又はこの後者のヌクレオチド配列よってコードされたポリペプチドの生物活性の保存、増加、削減又は抑制にある。
【００４６】
同様に、本発明によるポリペプチド又はポリヌクレオチドの機能性は、基準野生型遺伝子のヌクレオチド配列又はこの後者のヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドの生物活性の性質の変化にある。
生物活性は、特に受容体と、本発明によるポリペプチドの親和性又は親和性の不存在に関連する可能性がある。
【００４７】
ポリヌクレオチド
本発明は、最初の目的のために、以下の：
a)  配列、配列番号1又はそのコード配列(第615ヌクレオチドから第2763ヌクレオチドから成る)と、少なくとも80%の同一性、好ましくは少なくとも90%の同一性、より好ましくは少なくとも95%の同一性、さらにより好ましくは少なくとも99%の同一性をもつヌクレオチド配列、ここで、このヌクレオチド配列が以下のコーディングSNPs g1644a、g2357a、c2621gの少なくとも1つを含むことは理解される、あるいは
【００４８】
b)  a)下のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
を含む単離されたポリヌクレオチドを含む。
【００４９】
同様に、本発明は以下の：
a)  ヌクレオチド配列、配列番号1又はそのコード配列、ここで、これらのヌクレオチド配列が以下のコーディングSNPs g1644a、g2357a、c2621gの少なくとも1つを含むことは理解される、あるいは
b)  a)下のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
を含む単離されたポリヌクレオチドに関する。
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、配列、配列番号1又はそのコード配列から成り、ここで、これらのヌクレオチド配列の各々が以下のコーディングSNPs：g1644a、g2357a、c2621gの少なくとも1つを含むことが理解される。
【００５０】
本発明によると、先に定義されたポリヌクレオチドは、以下のg1644a、g2357a及びc2621gから成る群から選ばれる1つのコーディングSNPを含む。
同様に、例えば、先に定義されたポリヌクレオチドは、以下の非コーディング及びサイレントSNPs：465-486(欠失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、g2228a、c2502t、g2634aの少なくとも1つを含みうる。
【００５１】
同様に、本発明は、その目的のために、以下の：
a)  ヌクレオチド配列、配列番号1又は必要に応じて、そのコード配列、ここで、これらの配列の各々が以下の非コーディング又はサイレントSNPs：465-486(欠失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、g2228a、c2502t、g2634aの少なくとも1つを含むことは理解される、あるいは
b)  a)下のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
を含む又はそれらから成る単離されたポリヌクレオチドを有する。
以下のサイレントSNPs c1288t、t1607c、g2634aがヌクレオチド配列、配列番号1のコード配列内に位置することは理解される。
【００５２】
本発明は、以下の：
a)  ヌクレオチド配列、配列番号1又は必要に応じて、そのコード配列、ここで、これらの配列の各々が以下のSNPs：465-486(欠失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、1644a、g2228a、g2357a、c2502t、c2621g、g2634aの少なくとも1つを含むことは理解される、あるいは
b)  a)下のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
の一部から成る単離されたポリヌクレオチドに関係し、上記単離されたポリヌクレオチドは、少なくとも10のヌクレオチドから構成される。
【００５３】
本発明は、その目的のために、以下の：
a)  アミノ酸配列、配列番号2、又は
b)  アミノ酸配列、配列番号2の28位と193位の間に包含されるアミノ酸を含むアミノ酸配列、
ここで、a)及びb)下のアミノ酸配列の各々がコーディングSNPs：D70N、G104S、S147Cの少なくとも1つを含むことは理解される、
を含むポリペプチドをコードするための単離されたポリヌクレオチドをも有する。
本発明の意味において、D70N、G104S、S147C SNPsの位置付けに対応する番号付けが、アミノ酸配列、配列番号2の番号付けと関連することは理解される。
【００５４】
本発明の好ましい目的によると、先に定義されたポリペプチドは、1つの、先に定義されたようなコーディングSNPを含む。
より好ましくは、本発明は、その目的のために、アミノ酸配列、配列番号2の全部又は一部を含み、そしてSNP G104Sを有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドをも有する。
好ましくは、本発明によるポリヌクレオチドは、DNA又はRNA分子から構成される。
本発明によるポリヌクレオチドは、標準的なDNA又はRNA合成法によって得ることができる。
同様に、本発明によるポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列、配列番号1上の各々のSNPに関する変異ヌクレオチドにより野生型ヌクレオチドを修飾することによってEPO遺伝子のヌクレオチド配列から開始した部位特異的変異誘発法によって得ることができる。
【００５５】
例えば、SNP g2357aを含む本発明によるポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列、配列番号1上の2357位でヌクレオチドaによりヌクレオチドgを変更することによってEPO遺伝子のヌクレオチド配列から開始した部位特異的変異誘発法によって得ることができる。
【００５６】
この方法により実行されうる部位特異的変異誘発法の方法は、当業者に周知である。1985年の「Proc. Natl. Acad. Sci. USA」82: 488中のTA Kunkelの発表を特に記載する。
同様に、単離されたポリヌクレオチドは、例えばプレ−、プロ−又はプレ−プロ−タンパク質アミノ酸配列又はヘキサ−ヒスチジン・ペプチドのようなマーカー・アミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列を含むことができる。
同様に、本発明のポリヌクレオチドは、融合タンパク質又は他の精製産物を得るために他のタンパク質又はタンパク質断片をコードするヌクレオチド配列に関係しうる。
【００５７】
同様に、本発明によるとポリヌクレオチドは、例えば5'及び/又は3'非コード配列、例えば転写又は非転写配列、翻訳又は非翻訳配列、スプライシング・シグナル配列、ポリアデニル化配列、リボソーム結合配列、あるいはメッセンジャーRNAを安定化する配列を含みうる。
【００５８】
ヌクレオチド又はポリヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列は、ストリンジェント条件下で、このヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができるものと定義される。ヌクレオチド配列を含むことができる。
【００５９】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、一般的に、しかし必ずしもそうではなく、ヌクレオチド配列が少なくとも80%、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上、そして最も好ましくは97%以上の同一性をもつときにハイブリダイゼーションを可能にする化学的条件と理解される。
【００６０】
ストリンジェント条件は、当業者に周知の方法に従い、そして、例えばポリヌクレオチドを50%のホルムアミド、5xSSC(150 mMのNaCl、15 mMのクエン酸3ナトリウム)、50mMのリン酸ナトリウム(pH7.6)、5xのデンハート溶液、10%の硫酸デキストラン、20 μgの変性サケ精子DNAを含む溶液中、42℃でインキュベートし、続いて65℃で、O.1xSSCによりフィルターを洗浄することにより得ることができる。
【００６１】
本発明の範囲内において、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が100%に匹敵する同一性をもつヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを可能にするとき、そのヌクレオチド配列は、例えばa)の下で記載されたヌクレオチド配列に対し厳密に相補的であるとみなされる。
ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列が本発明によるアンチセンスSNPの少なくとも1つを含むことは、本発明の意味の範囲内において理解される。
【００６２】
よって、例えばヌクレオチド配列がSNP g1644aを含む場合、その相補的なヌクレオチド配列は1644位に相当する位置にヌクレオチド、tを含む。
【００６３】
SNPを含むポリヌクレオチドの同定、ハイブリダイゼーション及び/又は増幅
本発明は、その目的のために、ヌクレオチド配列、配列番号1、あるいは必要に応じてそのコード配列から成るポリヌクレオチドの全部又は一部の同定、ハイブリダイズ及び/又は増幅のための、先に規定されたポリヌクレオチドの全部又は一部の使用をも有し、ここで、これらの配列の各々が以下のSNPs：465-486(欠失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、g1644a、g2228a、g2357a、c2502t、c2621g、g2634aの少なくとも1つを含むことは理解される。
【００６４】
遺伝子型解析及びSNP頻度の測定
同様に、本発明は、その目的のために、EPO遺伝子のヌクレオチド配列と90〜100%の同一性をもち、以下のSNPs：465-486(欠失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、g1644a、g2228a、g2357a、c2502t、c2621g、g2634aの少なくとも1つを含むヌクレオチド配列の遺伝子型解析のための、本発明によるポリヌクレオチドの全部又は一部の使用をも有する。
【００６５】
本発明により、遺伝子型解析は、個体又は個体集団において実行されうる。
本発明の意味の範囲内において、遺伝子型解析は、個体又は個体集団の遺伝子型の測定方法と定義される。遺伝子型は、1以上の特定座位に存在する対立因子から成る。
【００６６】
「個体集団」は、ランダムな又は非ランダムな方法で選ばれた、確定された個体の群と理解される。これらの個体は、ヒト、動物、微生物又は植物であるかもしれない。
【００６７】
通常、前記個体群は、少なくとも10人、好ましくは100〜300人を含む。
個体は、それらの民族性によるか又はそれらの表現型により、特に以下の障害及び/又は病気：癌及び腫瘍、感染症、性病、免疫に関連する病気及び/又は自己免疫疾患及び障害、心血管系の病気、代謝系の病気、中枢神経系の病気、胃腸疾患、並びに化学療法治療に関係した障害に影響を受けるヒトが選ばれる。
【００６８】
前記癌及び腫瘍は、転移性腎癌を含む癌腫、メラノーマ、濾胞性リンパ腫及び皮膚T細胞型リンパ腫を含むリンパ腫、慢性リンパ球性白血病及び慢性骨髄性白血病を含む白血病、肝臓、頸部、頭部及び腎臓の癌、多発性骨髄腫、カルチノイド腫瘍、並びにAIDSの場合のカポジ肉腫を含む、免疫欠陥に続いて現れる腫瘍を含む。
【００６９】
前記感染症は、慢性B及びC型肝炎及びHIV/AIDSを含むウイルス感染症、感染性肺炎、並びに、例えば陰部疣贅のような性病を含む。
前記の免疫学的及び自己免疫学的に関連する病気は、組織又は臓器移植片の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病、並びに潰瘍性大腸炎を含む。
【００７０】
前記心血管系の病気は、脳損傷、そして腎不全により透析下にある患者の貧血、並びに慢性の感染症、炎症過程、放射線療法及び化学療法に起因する貧血を含めた貧血を含む。
前記代謝系の病気は、肥満症のような免疫に関係しない病気を含む。
前記中枢神経系の病気は、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症及びうつ病を含む。
【００７１】
前記の病気及び障害は、外傷の治癒及び骨粗鬆症をも含む。
好ましくは、本発明の化合物は、特に他人からの血液の使用を避けるために様々な自家移植血液採取プログラムに参加する患者の自家移植血液の産生増加を対象とした治療用化合物の製造のために使用される。
【００７２】
本発明による機能的なSNPは、好ましくは個体集団で遺伝子型解析される。
SNPs遺伝子型を同定するために実行されることができる多くの技術が存在する(特に、Kwok Pharmacogenomics, 2000, vol 1, pp 95-100. "High-throughput genotyping assay approaches"を参照のこと)。これらの技術は、以下の4つの原理：対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド・ハイブリダイゼーション、場合によりデオキシヌクレオチドの存在下で、ジデオキシヌクレオチドによるオリゴヌクレオチド伸長、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドの連結又は対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド切断、のいずれかに基づく。これらの技術の各々は、直接的であるか、又は蛍光偏光、若しくは質量分析法のような検出システムと組み合わせることができる。
【００７３】
遺伝子型解析は、蛍光偏光スキャナーと組み合わせて、ホットddNTPs(異なるフルオロフォアによって標識された2つの異なるddNTPs)とコールドddNTPs(2つの異なる非標識ddNTPs)を用いたミニ配列決定によって特に実行することができる。蛍光偏光(FPTDI技術又は蛍光偏光鋳型に対する染料−ターミネーターの取り込み)の読取値によるミニ配列決定プロトコールが、当業者に周知である。
【００７４】
それは、各々の個体からのDNAのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による増幅後に得られた産物において実行することができる。このPCR産物は、検討されるSNPを含むポリヌクレオチド遺伝子領域をカバーするように選ばれる。PCRサーモサイクラーの最終ステップの後、フルオロフォアの特異的励起と放射フィルター使うことによって標識された塩基の読取のために、プレートを蛍光偏光スキャナー上に置く。標識された塩基の強度の値はグラフで記録される。
【００７５】
PCR増幅のために、本発明のSNPの場合、センス及びアンチセンス・プライマーは、それぞれ、本発明のSNPsの位置に従って当業者によって容易に選択されることができる。
【００７６】
例えば、その配列がSNPs g2228a、g2357a、c2502t、c2621g及び／又はg2634aを含む断片のPCR増幅のためのセンス及びアンチセンス・ヌクレオチド配列は、それぞれ：
配列番号3：センス・プライマー(A)：TTGCATACCTTCTGTTTGCT
配列番号4：アンチセンス・プライマー(B)：CACAAGCAATGTTGGTGAG、
である。
これらのヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列、配列番号1の第2192ヌクレオチドから第2817ヌクレオチドの、626ヌクレオチドの長さがある断片の増幅を可能にする。
【００７７】
次に、個体集団内のSNPを含む遺伝子によってコードされる各々の対立遺伝子の頻度(対立遺伝子頻度)の統計分析が得られ、それは、異なる亜群、そして特に、必要ならば、この個体集団を構成する様々な民族群におけるそれらの影響とそれらの分布の重要性の決定を可能にする。
【００７８】
遺伝子型解析データは、検討された集団において観察した異なる対立遺伝子の分布度数を評価するために分析される。対立遺伝子頻度の計算は、SAS−suite(登録商標)(SAS)又はSPLUS(登録商標)(MathSoft)のようなソフトウェアを用いて実行することができる。個体集団の異なる民族群にまたがる本発明のSNPの対立遺伝子分布の比較は、ソフトウェアARLEQUIN(登録商標)とSAS−suite(登録商標)によって実行することができる。
本発明は、ある個体のEPOヌクレオチド配列のある変更を調査するための、本発明によるポリヌクレオチドの使用にも関係する。
【００７９】
遺伝子標識としての本発明のSNPs
遺伝子の機能的配列(例えば、プロモーター、スプライシング部位、コード領域)を修飾しているSNPsは、病気の感受性又は耐性に直接的に関係している可能性があるが、(機能的な又は機能的でない)全てのSNPsがこれらの病状に関与する1つ又はいくつかの遺伝子の同定のために有用なマーカーを提供し、その結果、これらの病状と間接的に関係があるかもしれない(Cargill et al. (1999). Nature Genetics 22:231-238; Riley et al. (2000). Pharmacogenomics 1:39-47; Roberts L. (2000). Science 287: 1898-1899を参照のこと)。
【００８０】
このように、本発明は、EPO遺伝子のポリヌクレオチド中に以下のSNPs： 465-486(欠失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、g1644a、g2228a、g2357a、c2502t、c2621g、g2634aの少なくとも1つを含むデータバンクにも関する。
前記SNPsがヌクレオチド配列、配列番号1に従って番号付けされることは、理解される。
【００８１】
このデータバンクは、以下の：
(i)EPO遺伝子のポリヌクレオチド中の以下のSNPs：465-486(欠失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、g1644a、g2228a、g2357a、c2502t、c2621g、g2634aの少なくとも1つ、と
(ii)病気又は病気への耐性、
の間の統計的に関係性のある組み合わせを測定するために分析されうる。
本発明は、病気又は病気への耐性に関する診断/予後診断キットの開発のために、EPO遺伝子のポリヌクレオチド中の以下のSNPs：465-486(欠失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、g1644a、g2228a、g2357a、c2502t、c2621g、g2634aの少なくとも1つの使用にも関する。
【００８２】
例えば、先に定義されている、本発明のSNPは、病気又は病気への耐性に直接的に又は間接的に関係する。
好ましくは、これらの病気は、先に触れたとおり定義されたものである。
【００８３】
発現ベクター及び宿主細胞
本発明は、その目的のために、本発明による少なくとも1つのポリヌクレオチドを含む組み換えベクターをも有する。
【００８４】
例えば、染色体、エピソーム、及び誘導ウイルス(derived viruses)のような多数の発現システムを使用することができる。より特に、使用される組み換えベクターは、細菌プラスミド、トランスポゾン、酵母のエピソーム、挿入要素、酵母染色体要素、ウイルス、例えばバキュロウイルス、SV40のようなパピローマウイルス、ワクチニアウイルス、アデノウイルス、キツネ疱瘡ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス由来でありうる。
【００８５】
同様に、これらの組み換えベクターは、コスミド又はファージミド誘導体であるかもしれない。ヌクレオチド配列は、当業者に周知の方法、MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Sambrook et al, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.,(1989)中に記載の方法による組み換え発現ベクター内に挿入されることができる。
【００８６】
組み換えベクターは、ポリヌクレオチド発現の調節を制御するヌクレオチド配列、並びに本発明のポリヌクレオチドの発現と転写、及び本発明のポリペプチドの翻訳を可能にするヌクレオチド配列を含むことができ、これらの配列は、使用される宿主細胞に従って選ばれる。
【００８７】
このように、例えば、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが、小胞体の管腔に、膜上の細胞膜周辺腔に又は細胞外環境に向けられるように、適切な分泌シグナルが組み換えのベクター内に統合されることができる。
【００８８】
本発明は、その目的のために、本発明による組み換えベクターを含む宿主細胞をも有する。
宿主細胞への組み換えベクターの導入は、当業者に周知の方法、例えばBASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Davis et al, 1986、及びMOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL、前記、の中に記載される方法、例えばリン酸カルシウムによるトランスフェクション、DEAEデキストランによるトランスフェクション、マイクロインジェクション、カチオン性脂質によるトランスフェクション、電気穿孔法、形質導入、又は注入に従って実行されうる。
【００８９】
宿主細胞は、例えば連鎖球菌(streptococci)、ブドウ球菌(staphylococci)、E.コリ(E.coli)又はバシルス・サブチリス(Bacillus subtilis)の細胞のような細菌の細胞、酵母細胞及びアスペルギルス属(Aspergillus)、ストレプトマイセス属(Streptomyces)の細胞のような真菌の細胞、ショウジョウバエS2(Drosophila S2)及びヤトウガSf9(Spodoptera Sf9)の細胞のような昆虫の細胞、CHO、COS、HeLa、C127、BHK、HEK293細胞のような動物細胞及び治療対象のヒト細胞、あるいはさらに植物細胞でありうる。
宿主細胞は、例えば、以下に見られるように、本発明のポリペプチド又は医薬組成物中の活性な産物の発現のために使用されうる。
【００９０】
ポリペプチド
本発明は、その目的のために、以下の：
a)  アミノ酸配列、配列番号2、又は
b)  アミノ酸配列、配列番号2の28位と193位の間に包含されるアミノ酸を含むアミノ酸配列、
と少なくとも80%の同一性、好ましくは少なくとも90%の同一性、より好ましくは少なくとも95%の同一性、さらにより好ましくは少なくとも99%の同一性をもつアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドをも有し、ここで、a)及びb)下のアミノ酸配列の各々がコーディングSNPs：D70N、G104S、S147Cの少なくとも1つを含むことは理解される。
【００９１】
同様に、本発明のポリペプチドは以下の：
a)  アミノ酸配列、配列番号2、又は
b)  アミノ酸配列、配列番号2の28位と193位の間に包含されるアミノ酸を含むアミノ酸配列、
を含むことができ、ここで、a)及びb)下のアミノ酸配列の各々がコーディングSNPs：D70N、G104S、S147Cの少なくとも1つを含むことは理解される。
【００９２】
より好ましくは、本発明のポリペプチドは以下の：
a)  アミノ酸配列、配列番号2、又は
b)  アミノ酸配列、配列番号2の28位と193位の間に包含されるアミノ酸を含むアミノ酸配列、
から成ることができ、ここで、a)及びb)下のアミノ酸配列の各々がコーディングSNPs：D70N、G104S、S147Cの少なくとも1つを含むことは理解される。
【００９３】
好ましくは、本発明によるポリペプチドは、以下の：D70N、G104S及びS147Cから成る群から選ばれる1つのコーディングSNPを含む。
より好ましくは、本発明によるポリペプチドは、アミノ酸配列、配列番号2の第28〜第193アミノ酸を含み、かつ、SNP G104Sを有する。
本発明は、その治療特性を改善するために本発明によるポリペプチドの高グリコシル化アナログに関係する。
【００９４】
好ましくは、本発明は、アミノ酸配列、配列番号2の第28〜第193アミノ酸を含み、かつ、SNP G104Sを有するポリペプチドの高グリコシル化アナログに関係する。
より好ましくは、本発明は、アミノ酸配列、配列番号2の第28〜第193アミノ酸を含み、かつ、SNP G104Sを有するポリペプチドのペグ化アナログに関係する。
【００９５】
確かに、多糖成分が物理的な安定性、プロテアーゼ攻撃に対する耐性、免疫系との相互作用、薬物動態、及び特定の生物活性を含む治療用糖タンパク質の効能に関係する特徴に大きく影響することは本技術分野で知られている(例えば、Dube et al. J. Biol. Chem. 263, 17516 (1988);Delorme et al. Biochemistry 31, 9871-9876 (1992)を参照のこと)。ヒト野生型尿由来EPO及び組み換え野生型ヒトEPOは、その糖タンパク質の総分子量の約40%を一緒に含む、3つのN−連結及び1つO−連結オリゴ糖を含むが、このタンパク質上の炭水化物鎖の数を増やすことはまだ可能である。タンパク質上の炭水化物鎖数の増加を可能にする技術は、当業者に周知であり、以下の：
−  アミノ酸残基の置換又は付加を作り出す部位特異的変異誘発法を使ったグリコシド化に利用可能な新しい部位の導入(例えば、EP0640619及び公開番号第20020037841号として公開された米国特許出願番号第09/853731号を参照のこと)。
−  着目のタンパク質をコードする核酸、及びWO9954342の出願によって示される糖タンパク質を修飾するグリコシル・トランスフェラーゼをコードする少なくとも1つの核酸をもつ宿主細胞を使用することによるタンパク質のグリコシド化エンジニアリング、
を含む。
【００９６】
同様に、本発明は、その目的のために、先に定義された宿主細胞を培地中で培養し、そして上記ポリペプチドを培地から単離する、先に記載されたポリペプチドの製造方法を有する。
【００９７】
前記ポリペプチドは、当業者に周知の方法、例えばカオトロピック剤、例えば塩、特に硫酸アンモニウム、エタノールアセトン又はトリクロロ酢酸を用いた沈殿；酸性抽出；イオン交換クロマトグラフィー；リン酸セルロース・クロマトグラフィー；疎水性相互作用クロマトグラフィー；アフィニティー・クロマトグラフィー；ヒドロキシアパタイト・クロマトグラフィー、あるいは圧排クロマトグラフィーにより、宿主細胞の培地から精製することができる。
【００９８】
「培地」は、本発明のポリペプチドを単離又は精製する培地と理解される。この培地は、細胞外培地及び/又は細胞ライセートから構成されうる。同様に、前記ポリペプチドの立体構造が単離又は精製中に変わったとき、当業者に周知の技術は、彼らが活性な立体構造をポリペプチドに取り戻すことを可能にする。
【００９９】
抗体
本発明は、その目的のために、免疫特異的抗体を得る方法をも有する。
「抗体」は、モノクローナル、ポリクローナル、キメラ、1本鎖及びヒト化抗体、並びにFab又は免疫グロブリン発現産物ライブラリ−を含むFab断片と理解される。
【０１００】
免疫特異的抗体は、本発明によるポリペプチドを用いた動物の免疫処置によって得ることができる。
【０１０１】
本発明は、先に定義されたような本発明によるポリペプチドに対する免疫特異的抗体にも関する。
【０１０２】
本発明によるポリペプチド、その断片の1つ、アナログ、その変異型の1つ、又はこのポリペプチドを発現する細胞を、免疫特異的抗体を産生するために使用することもできる。
【０１０３】
用語「免疫特異的」は、抗体が本発明のポリペプチドに対して先行技術で知られている他のポリペプチドより優れた親和性を有することを意味する。
免疫特異的抗体は、当業者に周知の方法に従って、本発明のポリペプチド、その断片の1つ、アナログ又はエピトープ断片、あるいは哺乳動物の、好ましくは非ヒトの細胞内にこのポリヌクレオチドを発現する細胞を投与することによって得ることができる。
【０１０４】
モノクローナル抗体の準備のために、細胞系から始まる、抗体産生の典型的な方法、例えばハイブリドーマ技術(Kohler et al.5 Nature (1975) 256: 495-497)、トリオーマ(trioma)技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor et al., Immunology Today (1983) 4:72)、そしてEBVハイブリドーマ技術(Cole et al., MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY pp. 77-96, Alan R. Liss, 1985)を使用することができる。
【０１０５】
同様に、例えば、米国特許番号第4,946,778号に記載の単一鎖抗体産生の技術を使用することができる。
同様に、トランスジェニック動物、例えばマウスを、例えばヒト化抗体を産生するために使用することができる。
【０１０６】
本発明のポリペプチドと相互作用する作用物質
同様に、本発明は、その目的のために、以下の：
a)  少なくとも1のコーディングSNPを包含する本発明によるポリヌクレオチドを含む組み換えベクターを準備し、
b)  a)による組み換えベクターを含む宿主細胞を準備し、
c)  b)による宿主細胞と、試験すべき作用物質とを接触させ、そして
d)  上記試験すべき作用物質によって引き起こされた活性化又は抑制効果を測定する、
を含む、本発明によるポリペプチドを活性化するか又は抑制する作用物質の同定方法を有する。
【０１０７】
本発明によるポリペプチドは、それと相互作用する化合物のスクリーニング方法のために使用されることもできる。
【０１０８】
これらの化合物は、本発明によるポリペプチドの内因活性を活性化する(アゴニスト)又は抑制する作用物質(アンタゴニスト)でありうる。同様に、これらの化合物は、本発明のポリペプチドのリガンド又は基質であるかもしれない。Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1 (2), Chapter 5 (1991)を参照のこと。
【０１０９】
一般的に、そのような方法を実行するために、本発明によるポリペプチドを発現する適当な宿主細胞を産生することが何よりも望ましい。
そのような細胞は、例えば哺乳動物の細胞、酵母細胞、ショウジョウバエのような昆虫の細胞、又はE.コリのような細菌の細胞であるかもしれない。次に、これらの細胞又はこれらの細胞の膜抽出物を、試験すべき化合物の存在下に加える。
【０１１０】
次に、本発明のポリペプチドと、検討された化合物の結合能力、及び機能的応答の抑制又は活性化を、観察することができる。
【０１１１】
前記方法のステップd)は、直接的に又は間接的に標識された、試験すべき作用物質を使うことによって実行することができる。それは、標識又は無標識作用物質と標識拮抗物質を使用することによる競合試験を含むこともできる。
【０１１２】
検討すべき作用物質が本発明のポリペプチドを発現する細胞の活性化又は抑制シグナルを生じる場合、検出すべきシグナルに従って選ばれる検出手段を使用することによって、同様に測定される。
【０１１３】
そのような活性化又は抑制作用物質は、ポリヌクレオチド、そして特定の場合において、例えばオリゴヌクレオチド又はポリペプチド、例えばタンパク質若しくは抗体であるかもしれない。
【０１１４】
本発明は、その目的のために、以下の：
a)  少なくとも1のコーディングSNPを包含する本発明によるポリヌクレオチドを含む組み換えベクターの準備、
b)  a)による組み換えベクターを含む宿主細胞の準備、
c)  b)による宿主細胞の、試験すべき作用物質の存在下への添加、そして
d)  上記試験すべき作用物質に対する上記ポリペプチドによって引き起こされた活性化又は抑制効果の測定、
を含む、本発明によるポリペプチドにより活性化するか又は抑制される作用物質の同定方法をも有する。
【０１１５】
本発明のポリペプチドによって活性化又は抑制される作用物質は、それぞれ、このポリペプチドの存在下で活性化又は抑制により応答する作用物質である。本発明のポリペプチドによって直接的に又は間接的に活性化又は抑制される作用物質は、ポリペプチド、例えば、膜又は核内の受容体、キナーゼ、より好ましくはチロシンキナーゼ、転写因子、又はポリヌクレオチドから成る可能性がある。
【０１１６】
病気の検出
本発明は、目的のために、以下の：
a)  患者のゲノム中の本発明によるポリヌクレオチドの存在又は不存在の測定；
b)  患者における本発明によるポリヌクレオチドの発現レベルの測定；
c)  患者における本発明によるポリペプチドの存在又は不存在の測定；
d)  患者における本発明によるポリペプチドの濃度の測定；及び/又は
e)  患者における本発明によるポリペプチドの機能性の測定、
の少なくとも1つを含む、患者のにおける本発明によるポリヌクレオチド及び/又は本発明によるポリペプチドの生物学的な特性の分析方法をも有する。
【０１１７】
これらの生物学的な特性は、患者又は患者由来のサンプルにおいて分析されうる。
これらの生物学的な特性は、遺伝子診断、及び患者が病気に冒されるか又冒される危険にさらされているかどうかの判断、あるいは、逆に、本発明によるポリヌクレオチド及び/又は本発明によるポリペプチドの存在と結び付いた病気、軽い病気又は障害の進行に対する部分的な耐性の付与を可能にするかもしれない。
【０１１８】
これらの病気は、障害及び/又はヒトの病気、例えば癌及び腫瘍、感染症、性病、免疫に関連する病気及び/又は自己免疫疾患及び障害、心血管系の病気、代謝系の病気、中枢神経系の病気、胃腸疾患、並びに化学療法治療に関係した障害であるかもしれない。
【０１１９】
前記癌及び腫瘍は、転移性腎癌を含む癌腫、メラノーマ、濾胞性リンパ腫及び皮膚T細胞型リンパ腫を含むリンパ腫、慢性リンパ球性白血病及び慢性骨髄性白血病を含む白血病、肝臓、頸部、頭部及び腎臓の癌、多発性骨髄腫、カルチノイド腫瘍、並びにAIDSの場合のカポジ肉腫を含む、免疫欠陥に続いて現れる腫瘍を含む。
【０１２０】
前記感染症は、慢性B及びC型肝炎及びHIV/AIDSを含むウイルス感染症、感染性肺炎、並びに、例えば陰部疣贅のような性病を含む。
前記の免疫学的及び自己免疫学的に関連する病気は、組織又は臓器移植片の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病、並びに潰瘍性大腸炎を含む。
【０１２１】
前記心血管系の病気は、脳損傷、そして腎不全により透析下にある患者の貧血、並びに慢性の感染症、炎症過程、放射線療法及び化学療法に起因する貧血を含めた貧血を含む。
前記代謝系の病気は、肥満症のような免疫に関係しない病気を含む。
前記中枢神経系の病気は、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症及びうつ病を含む。
【０１２２】
前記の病気及び障害は、外傷の治癒及び骨粗鬆症をも含む。
当該方法は、患者における本発明によるSNPによってコードされた変異型対立遺伝子の存在と関連する病気又はその病気への耐性に対する遺伝子診断をも可能にする。
好ましくは、ステップa)において、例えば先に定義したコーディングSNPの少なくとも1つを含むポリヌクレオチドの存在又は不存在が検出されるはずである。
【０１２３】
前記ポリヌクレオチドの検出は、検討すべき患者からの生物学的サンプル、例えば細胞、血液、尿、唾液から、あるいは検討すべき患者の生検又は検死解剖から開始して実行される。例えば、ゲノムDNAは、検出のために直接的に又はPCR増幅後に使用されうる。同様に、RNA又はcDNAも類似した方法で使用されうる。
【０１２４】
次に、本発明によるポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を、患者のゲノムで検出されたヌクレオチド配列と比較することが可能である。
ヌクレオチド配列の比較は、配列決定、DNAハイブリダイゼーション法、変性剤あり又はなしでの電気泳動ゲル上DNA断片の移動度の相違、あるいは融解温度の相違により実行することができる。Myers et al, Science (1985) 230: 1242を参照のこと。同様に、明確な位置でのヌクレオチド配列の構造のそのような変更は、ヌクレアーゼ・プロテクション試験、例えばRNaseとS1ヌクレアーゼにより、あるいは化学的切断剤によっても明らかにされることができる。Cotton et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1985) 85:4397−4401を参照のこと。同様に、本発明のポリヌクレオチド断片を含むオリゴヌクレオチド・プローブは、スクリーニングを行うために使用することができる。
【０１２５】
当業者に周知の多くの方法が、本発明のポリヌクレオチドの発現を測定するために、そして当該ポリヌクレオチドの遺伝子の変異性の同定のために使用されることができる(Chee et al., Science(1996), Vol 274, pp610−613を参照のこと)。
【０１２６】
ステップb)において、ポリヌクレオチドの発現レベルは、当業者に周知の方法、例えばPCR、RT−PCR、RNaseプロテクション、ノーザンブロット及び他のハイブリダイゼーション法に従って、ポリヌクレオチドによってコードされた(そしてポリペプチドをコードする)RNAレベルを定量することにより計測されうる。
【０１２７】
ステップc)及びd)において、患者又は患者由来のサンプル中の本発明によるポリペプチドの存在又は不存在は、周知の方法、例えばラジオイムノアッセイ、拮抗結合試験、ウェスタンブロット及びELISA試験により実行されうる。
ステップd)に続いて、本発明によるポリペプチドの測定された濃度は、患者で通常見られている天然の野生型タンパク質濃度と比較されるかもしれない。
【０１２８】
当業者は、先行技術刊行物の助けを借りるか又は慣例の試験若しくはアッセイ、例えば先に触れた方法により、先に示された感受性又は、反対に、病気、軽い病気若しくは障害に対する耐性を確認できる、閾値超又は未満を確認することができる。
【０１２９】
ステップe)において、本発明によるポリペプチドの機能性の測定は、当業者に周知の方法、例えば先に触れたインビトロ検査によるか、又は上記ポリペプチドを発現する宿主細胞の使用により実行されうる。
【０１３０】
治療用化合物及び病気の治療
本発明は、その目的のために、活性な作用物質として本発明によるポリペプチド、及び/又はアミノ酸配列、配列番号2の第28〜第193アミノ酸を含み、かつ、SNP G104Sを有するポリペプチドの高グリコシル化アナログを含む治療用化合物をも有する。
【０１３１】
本発明は、様々なヒトの障害及び/又は病気の予防又は治療を対象とした、治療用化合物の製造のための本発明によるポリペプチド、及び/又はアミノ酸配列、配列番号2の第28〜第193アミノ酸を含み、かつ、SNP G104Sを有するポリペプチドの高グリコシル化アナログの使用にも関する。これらの病気は、障害及び/又はヒトの病気、例えば癌及び腫瘍、感染症、性病、免疫に関連する病気及び/又は自己免疫疾患及び障害、心血管系の病気、代謝系の病気、中枢神経系の病気、胃腸疾患、並びに化学療法治療に関係した障害であるかもしれない。
【０１３２】
前記癌及び腫瘍は、転移性腎癌を含む癌腫、メラノーマ、濾胞性リンパ腫及び皮膚T細胞型リンパ腫を含むリンパ腫、慢性リンパ球性白血病及び慢性骨髄性白血病を含む白血病、肝臓、頸部、頭部及び腎臓の癌、多発性骨髄腫、カルチノイド腫瘍、並びにAIDSの場合のカポジ肉腫を含む、免疫欠陥に続いて現れる腫瘍を含む。
【０１３３】
前記感染症は、慢性B及びC型肝炎及びHIV/AIDSを含むウイルス感染症、感染性肺炎、並びに、例えば陰部疣贅のような性病を含む。
前記の免疫学的及び自己免疫学的に関連する病気は、組織又は臓器移植片の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病、並びに潰瘍性大腸炎を含む。
【０１３４】
前記心血管系の病気は、脳損傷、そして腎不全により透析下にある患者の貧血、並びに慢性の感染症、炎症過程、放射線療法及び化学療法に起因する貧血を含めた貧血を含む。
前記代謝系の病気は、肥満症のような免疫に関係しない病気を含む。
前記中枢神経系の病気は、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症及びうつ病を含む。
【０１３５】
前記の病気及び障害は、外傷の治癒及び骨粗鬆症をも含む。
好ましくは、本発明の化合物は、特に他人からの血液の使用を避けるために様々な自家移植血液採取プログラムに参加する患者の自家移植血液の産生増加を対象とした治療用化合物の製造のために使用される。
好ましくは、本発明によるポリペプチド、及び/又はアミノ酸配列、配列番号2の第28〜第193アミノ酸を含み、かつ、SNP G104Sを有するポリペプチドの高グリコシル化アナログは、以下の：
−  特に腎不全により透析下にある患者の貧血、並びに慢性の感染症、炎症過程、放射線療法、化学療法に起因する貧血を予防又は治療すること、及び/又は
−  特に他人からの血液の使用を避けるために様々な自家移植血液採取プログラムに参加する患者の自家移植血液の産生を増加させること、及び/又は
−  脳損傷を予防すること、
を対象とした治療用化合物の製造のための使用にも関する。
【０１３６】
本発明によるポリペプチドを得ることを可能にする特定の化合物、並びに当該ポリペプチドから得られる又はそれにより同定される化合物は、同じく、すなわち治療用化合物として、人体の治療のための処置に使用することができる。
【０１３７】
こういうわけで、本発明は、目的のために、活性作用物質として先に定義されたSNPの少なくとも1つを含む本発明によるポリヌクレオチド、先に定義された組み換えベクター、先に定義された宿主細胞、及び/又は先に定義された抗体を含む治療用化合物をも有する。
【０１３８】
本発明は、様々なヒトの障害及び/又は病気の予防又は治療を対象とした治療用化合物の製造のための、先に定義されたSNPの少なくとも1つを含む本発明によるポリヌクレオチド、先に定義された組み換えベクター、先に定義された宿主細胞、及び/又は先に定義された抗体の使用にも関する。これらの病気は、障害及び/又はヒトの病気、例えば癌及び腫瘍、感染症、性病、免疫に関連する病気及び/又は自己免疫疾患及び障害、心血管系の病気、代謝系の病気、中枢神経系の病気、胃腸疾患、並びに化学療法治療に関係した障害であるかもしれない。
【０１３９】
前記癌及び腫瘍は、転移性腎癌を含む癌腫、メラノーマ、濾胞性リンパ腫及び皮膚T細胞型リンパ腫を含むリンパ腫、慢性リンパ球性白血病及び慢性骨髄性白血病を含む白血病、肝臓、頸部、頭部及び腎臓の癌、多発性骨髄腫、カルチノイド腫瘍、並びにAIDSの場合のカポジ肉腫を含む、免疫欠陥に続いて現れる腫瘍を含む。
【０１４０】
前記感染症は、慢性B及びC型肝炎及びHIV/AIDSを含むウイルス感染症、感染性肺炎、並びに、例えば陰部疣贅のような性病を含む。
前記の免疫学的及び自己免疫学的に関連する病気は、組織又は臓器移植片の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病、並びに潰瘍性大腸炎を含む。
【０１４１】
前記心血管系の病気は、脳損傷、そして腎不全により透析下にある患者の貧血、並びに慢性の感染症、炎症過程、放射線療法及び化学療法に起因する貧血を含めた貧血を含む。
前記代謝系の病気は、肥満症のような免疫に関係しない病気を含む。
前記中枢神経系の病気は、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症及びうつ病を含む。
【０１４２】
前記の病気及び障害は、外傷の治癒及び骨粗鬆症をも含む。
好ましくは、本発明の化合物は、特に他人からの血液の使用を避けるために様々な自家移植血液採取プログラムに参加する患者の自家移植血液の産生増加を対象とした治療用化合物の製造のために使用される。
好ましくは、本発明は、以下の：
−  特に腎不全により透析下にある患者の貧血、並びに慢性の感染症、炎症過程、放射線療法、化学療法に起因する貧血を予防又は治療すること、及び/又は
−  特に他人からの血液の使用を避けるために様々な自家移植血液採取プログラムに参加する患者の自家移植血液の産生を増加させること、及び/又は
−  脳損傷を予防すること、
を対象とした治療用化合物を製造するための、先に規定したSNPの少なくとも1つを含む本発明によるポリヌクレオチド、先に規定した組み換えベクター、先に規定した宿主細胞、及び/又は先に規定した抗体の使用に関する。
【０１４３】
活性な作用物質として有用な、本発明のポリペプチド及び他の化合物の投与量は、化合物の選択、治療のための適応、投与方式、製剤の性質、患者の性質及び医者の判断に依存する。
【０１４４】
活性な作用物質として使用される時、本発明によるポリペプチドは、一般に1〜300単位/kg患者の範囲の服用量で投与される。
【０１４５】
本発明は、目的として、活性な作用物質として、先に触れた化合物、例えば本発明によるポリペプチド；アミノ酸配列、配列番号2の第28〜第193アミノ酸を含み、かつ、SNP G104Sを有するポリペプチドの高グリコシル化アナログ；先に定義されたSNPの少なくとも1つを含む本発明によるポリヌクレオチド、先に定義された組み換えベクター、先に定義された宿主細胞、及び/又は先に定義された抗体の少なくとも1つ、並びに医薬として許容される賦形剤を含む医薬組成物をも有する。
【０１４６】
これらの医薬組成物において、活性な作用物質は、有利には生理学的に有効な服用量で存在する。
【０１４７】
これらの医薬組成物は、例えば固体又は液体でありことができ、そしてヒトの薬剤に現在使用されている医薬形態、例えば単純な又は表面を覆われている錠剤、ゲルカプセル、顆粒剤、カラメル、坐剤、及び、好ましくは注射可能な製剤及び注射可能な粉末であることができる。これらの医薬形態は、通常の方法に従って調製されることができる。
【０１４８】
活性な作用物質は、通常医薬組成物に使用される賦形剤、例えば滑石、アラビアゴム、ラクトース、スターチ、デキストロース、グリセロール、エタノール、ステアリン酸マグネシウム、ココアバター、水性又は非水性溶媒、動物又は野菜起源の脂肪質物質、パラフィン系誘導体、グリコール、様々な湿潤剤、分散剤又は乳化剤、保存剤に組み込むことができる。
【０１４９】
本発明による活性な作用物質は、単独で、あるいは、例えば治療用化合物、例えば他のサイトカイン、例えばインターロイキン又はインターフェロンのような他の化合物との組み合わせ物として使用することができる。
【０１５０】
医薬組成物の様々な製剤が、投与の方式に従って適合させられる。
医薬組成物は、当業者に知られる様々な投与経路によって投与されうる。
同様に、本発明は、目的のために、活性な作用物質として、先に触れた化合物、例えば本発明によるポリヌクレオチド、本発明によるポリペプチドの全体又は一部、先に定義された組み換えベクター、先に定義された宿主細胞、及び/又は先に定義された抗体の少なくとも1つ、並びに好適な医薬として許容される賦形剤を含む診断用組成物を有する。
【０１５１】
当該診断用組成物は、例えば診断用組成物で一般に使用されるもの、例えば緩衝剤及び保存剤のような好適な賦形剤を含むかもしれない。
【０１５２】
同様に、本発明は、目的のために、患者における本発明によるポリペプチドの発現又は活性の増加を意図した治療用化合物を調製するための、以下の：
a)  治療として有効な量の本発明によるポリペプチド、及び/又は
b)  本発明によるポリヌクレオチド、及び/又は
c)  先に定義された治療すべき患者からの宿主細胞、
の使用を有する。
よって、本発明のポリペプチドの発現又は活性の増加を必要としている患者を治療するために、いくつかの方法が可能である。
【０１５３】
もしかすると医薬として許容される賦形剤との組み合わせ物で、本発明のポリペプチド；アミノ酸配列、配列番号2の第28〜第193アミノ酸を含み、かつ、SNP G104Sを有するポリペプチドの高グリコシル化アナログ；並びに/あるいは例えば先に規定された活性化物質及び/又は活性化される物質の治療としての有効量を患者に投与することが可能である。
【０１５４】
患者への本発明によるポリヌクレオチドの投与によって、本発明のポリペプチドの内性産生を増やすことが同様に可能である。例えば、このポリヌクレオチドは、レトロウイルス発現ベクターに挿入することができる。形質導入された細胞が着目の遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する方法により、本発明のポリペプチドをコードするRNAを含むレトロウイルス・プラスミドベクターに感染した細胞から、そのようなベクターを単離されることができる。Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches, Chapter 20, in Human Molecular Genetics, Strachan and Read, BIOS Scientifics Publishers Ltd (1996)を参照のこと。
【０１５５】
本発明において、好ましくは、例えば先に定義されたコーディングSNPの少なくとも1つを含むポリヌクレオチドが使用されるであろう。
【０１５６】
あらかじめ採取され、そして先に記載される本発明によるポリペプチドを発現するために修飾された、彼に帰属するこれらの宿主細胞(自家細胞)を、患者に投与することが同様に可能である。
【０１５７】
同様に、本発明は、目的のために、患者における本発明によるポリペプチドの発現又は活性の減少を意図した治療用化合物を調製するための、以下の：
a)  治療として有効量の先に定義された免疫特異的抗体、及び/又は
b)  本発明によるポリペプチドの発現の抑制を可能にするポリヌクレオチド、及び/又は
c)  先に規定のとおり、治療すべき患者由来の宿主細胞、
の使用に関する。
【０１５８】
このように、あるいは医薬として許容される賦形剤との組み合わせ物として、治療として有効量の抑制作用物質及び/又は例えば先に定義された抗体を患者に投与することが可能である。
【０１５９】
同様に、患者への、本発明のポリヌクレオチドの発現を抑制することができる本発明による相補的なポリヌクレオチドの投与によって、本発明のポリペプチドの内性産生を減少させることが可能である。
【０１６０】
好ましくは、例えば先に定義されたコーディングSNPの少なくとも1つを含む相補的なポリヌクレオチドを使用することができる。
【０１６１】
本発明は、患者の予防又は治療向けの治療用化合物の製造のためのエリスロポエチン・タンパク質及び/又は高グリコシル化アナログの使用にも関係し、上記患者は、上記患者のゲノム中の、ヌクレオチド配列、配列番号1と少なくとも95%の同一性(好ましくは、97%の同一性、より好ましくは99%の同一性、そして特に100%の同一性)をもち、以下のSNPs：465-486(欠失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、g1644a、g2228a、g2357a、c2502t、c2621g、g2634aの1つを含む上記ヌクレオチド配列を提供するヌクレオチド配列の存在に結び付いたEPO変異型によって引き起こされた障害又は病気を患っている。
【０１６２】
好ましくは、前記治療用化合物は、癌及び腫瘍、感染症、性病、免疫に関連する病気及び/又は自己免疫疾患及び障害、心血管系の病気、代謝系の病気、中枢神経系の病気、胃腸疾患、並びに化学療法治療に関係した障害から成る群から選ばれる病気の1つを予防又は治療するために使用される。
【０１６３】
前記癌及び腫瘍は、転移性腎癌を含む癌腫、メラノーマ、濾胞性リンパ腫及び皮膚T細胞型リンパ腫を含むリンパ腫、慢性リンパ球性白血病及び慢性骨髄性白血病を含む白血病、肝臓、頸部、頭部及び腎臓の癌、多発性骨髄腫、カルチノイド腫瘍、並びにAIDSの場合のカポジ肉腫を含む、免疫欠陥に続いて現れる腫瘍を含む。
【０１６４】
前記感染症は、慢性B及びC型肝炎及びHIV/AIDSを含むウイルス感染症、感染性肺炎、並びに、例えば陰部疣贅のような性病を含む。
【０１６５】
前記の免疫学的及び自己免疫学的に関連する病気は、組織又は臓器移植片の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病、並びに潰瘍性大腸炎を含む。
【０１６６】
前記心血管系の病気は、脳損傷、そして腎不全により透析下にある患者の貧血、並びに慢性の感染症、炎症過程、放射線療法及び化学療法に起因する貧血を含めた貧血を含む。
前記代謝系の病気は、肥満症のような免疫に関係しない病気を含む。
前記中枢神経系の病気は、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症及びうつ病を含む。
前記の病気及び障害は、外傷の治癒及び骨粗鬆症をも含む。
好ましくは、本発明の化合物は、特に他人からの血液の使用を避けるために様々な自家移植血液採取プログラムに参加する患者の自家移植血液の産生増加を対象とした治療用化合物の製造のために使用される。
【０１６７】
SNP G104Sを含む、EPOポリペプチドの模倣化合物
本発明は、以下のポリペプチド：
a)  アミノ酸配列、配列番号2、又は
b)  アミノ酸配列、配列番号2の28位と193位の間に包含されるアミノ酸を含むアミノ酸配列；
のそれと比較して実質的に類似か又は高い生物活性をもつ新しい化合物とも関係する、
ただし、a)及びb)下のアミノ酸配列はG104S SNPを含む。
前記生物活性は、例えばEPO受容体を過剰発現しているマウス32D細胞系由来の細胞における増殖活性、赤血球のコロニー形成、又はEPO受容体への結合能力を計測することによって評価される。
【０１６８】
実験の項で言及されるように、G104S変異EPOは、EPO受容体を過剰発現する32Dマウス細胞系の細胞増殖を野生型EPOより2〜5倍超増加させた。
実験の項で言及されるように、G104S変異EPOは、野生型EPOより高い赤血球のコロニー形成を促進する能力をもつ。
実験の項で言及されるように、G104S変異EPOのEPO受容体に対する結合能力は、天然の野生型EPOで計測されたものより高い。
例えば先に定義されるような本発明の新しい化合物は、G104S変異EPOのそれと実質的に類似した、すなわち、それは野生型EPOのそれより高い生物活性を有する。
【０１６９】
前記化合物は、G104S変異EPOのそれよりさらに高い生物活性をも有する。
本発明による化合物は、EPO受容体に作用するEPOに関係した機能の少なくとも1つ、及びG104S SNPを含むアミノ酸配列、配列番号2のポリペプチドのそれと実質的に類似した活性をもつ。
前記化合物は、G104S SNPを含むアミノ酸配列、配列番号2のポリペプチドにより誘発される前記EPO受容体への効果と実質的に類似した、上記EPO受容体の変化をもたらすことによって誘発される活性に基づくEPO受容体に作用するEPOに関係した機能の少なくとも1つをも有する。
例えば、前記化合物は、生化学的化合物、例えばポリペプチド又はペプチド、例えば有機化合物、例えば合成ペプチド模倣体である。
【０１７０】
本発明は、EPO受容体を過剰発現する32Dマウス細胞系由来の細胞に対して、野生型EPOのそれより2〜5倍高い細胞増殖活性を有する新規化合物を提供しもする。
本発明は、野生型EPOのそれより高い赤血球のコロニー形成を促進する能力を有する新規化合物を提供しもする。
本発明は、野生型EPOのそれよりEPO受容体への結合能力を有する新規化合物を提供しもする。
本発明は、先に定義された化合物の同定のための、G104S SNPを含む本発明のポリペプチドの使用にも関係する。
【０１７１】
本発明は、以下のステップ：
a)  例えば、生物活性、例えばヒトEPO受容体を過剰発現する32D細胞系の細胞増殖、赤血球のコロニー形成及び/又はEPO受容体への結合能力に対する促進を測定し、
b)  以下の：
i)  試験すべき化合物のステップa)で測定された活性、と
ii)  アミノ酸配列、配列番号2又はアミノ酸配列、配列番号2の28位と193位の間に包含されるアミノ酸を含むアミノ酸配列のポリペプチドの活性；
ただし、上記アミノ酸配列はG104S SNPを含む；
を比較し、そして
c)  ステップb)で実行された比較を基礎として、試験すべき化合物が、アミノ酸配列、配列番号2のポリペプチド又はアミノ酸配列、配列番号2の28位と193位の間に包含されるアミノ酸を含むアミノ酸配列のそれと比較して実質的に類似するか又は高い活性を有するかどうかを決定する；
ただし、上記アミノ酸配列はG104S SNPを含む、
を含む本発明の化合物の同定方法にも関係する。
【０１７２】
好ましくは、試験すべき化合物は、アミノ酸配列、配列番号2のポリペプチド、又はアミノ酸配列、配列番号2の28位と193位の間に包含されるアミノ酸を含むアミノ酸配列のそれと同じ3次元構造及び/又は化学的効果をもつように、合成ペプチド・コンビナトリアル・ライブラリー、高性能スクリーニングから前もって同定されるか、あるいはコンピューターを用いたドラッグデザインによって設計される；ただし、上記アミノ酸配列はG104S SNPを含む。
【０１７３】
これらの方法に言及する刊行物は、例えば以下のものである：
−  Silverman R.B. (1992). "Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action" Academic Press, 1st edition (January 15,1992).
−  Anderson S and Chiplin J. (2002). "Structural genomics; shaping the future of drug design" Drug Discov. Today. 7(2): 105-107.
−  Selick HE, Beresford AP, Tarbit MH. (2002). "The emerging importance of predictive ADME simulation in drug discovery". Drug Discov. Today. 7(2): 109-116.
−  Burbidge R, Trotter M, Buxton B, Holden S. (2001). "Drug design by machine learning: support vector machines for pharmaceutical data analysis". Comput. Chem. 26(1): 5-14.
−  Kauvar L.M. (1996). "Peptide mimetic drugs: a comment on progress and prospects" 14(6): 709.
【０１７４】
本発明の化合物は、癌及び腫瘍、感染症、性病、免疫に関連する病気及び/又は自己免疫疾患及び障害、心血管系の病気、代謝系の病気、中枢神経系の病気、胃腸疾患、並びに化学療法治療に関係した障害から成る群から選ばれる病気の1つの予防又は治療を対象とした治療用化合物の製造のために使用される。
【０１７５】
前記癌及び腫瘍は、転移性腎癌を含む癌腫、メラノーマ、濾胞性リンパ腫及び皮膚T細胞型リンパ腫を含むリンパ腫、慢性リンパ球性白血病及び慢性骨髄性白血病を含む白血病、肝臓、頸部、頭部及び腎臓の癌、多発性骨髄腫、カルチノイド腫瘍、並びにAIDSの場合のカポジ肉腫を含む、免疫欠陥に続いて現れる腫瘍を含む。
【０１７６】
前記感染症は、慢性B及びC型肝炎及びHIV/AIDSを含むウイルス感染症、感染性肺炎、並びに、例えば陰部疣贅のような性病を含む。
【０１７７】
前記の免疫学的及び自己免疫学的に関連する病気は、組織又は臓器移植片の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病、並びに潰瘍性大腸炎を含む。
【０１７８】
前記心血管系の病気は、脳損傷、そして腎不全により透析下にある患者の貧血、並びに慢性の感染症、炎症過程、放射線療法及び化学療法に起因する貧血を含めた貧血を含む。
前記代謝系の病気は、肥満症のような免疫に関係しない病気を含む。
前記中枢神経系の病気は、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症及びうつ病を含む。
【０１７９】
前記の病気及び障害は、外傷の治癒及び骨粗鬆症をも含む。
好ましくは、本発明の化合物は、特に他人からの血液の使用を避けるために様々な自家移植血液採取プログラムに参加する患者の自家移植血液の産生増加を対象とした治療薬の製造のために使用される。
【実施例】
【０１８０】
実験の項
実施例1：SNP g1644a、g2357a、c2621gを含むヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチドによってコードされたタンパク質、及び野生型基準遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされたタンパク質のモデリング
【０１８１】
最初のステップにおいて、エリスロポエチンの3次元構造を、PDBデータベース(コード1EER)で入手可能なものから開始し、そしてソフトウェアModeler(MSI, San Diego, CA)を使用することによって構築した。次に、成熟ポリペプチド断片を、変異D70N、G104S又はS147Cを再現するようなやり方で変更した。プログラムAMBER及びDISCOVER(MSI：Molecular Simulations 社)を使用することによってこの変異断片に対して1000分子の最小化ステップを行った。2分子の動力的計算の実行を同じプログラム及び同じ力場を用いて実行した。各々のケースにおいて、50,000のステップを300 °Kで計算し、そして300の平衡ステップで終わらせた。このモデリングの結果を図1、2及び3に示す。
【０１８２】
実施例2：個体集団内のSNPs g1644a及びc2621gの遺伝子型解析
SNPsの遺伝子型解析は、産物を蛍光偏光の読み取りによって検出するミニ配列決定の原理に基づく。この技術は、蛍光性ミニ配列決定(FP-TDI Technology又はFluorescence Polarization Template-direct Dye-terminator Incorporation)から成る。ミニ配列決定を、集団の各々の個体のゲノムDNAからPCRによって増幅された産物に対して実施する。このPCR産物を、それが遺伝子型解析すべきSNPを含む遺伝子領域を網羅するようなやり方で選ぶ。PCRプライマー及び取り込まれなかったdNTPsの除去後に、ミニ配列決定を実行する。ミニ配列決定は、ポリメラーゼ酵素及び蛍光標識ジデオキシヌクレオチドを使用することによって、SNP部位のすぐ上流に配置されたオリゴヌクレオチド・プライマーを伸長することから成る。この伸長過程から得られた産物を、蛍光偏光の読み取りによって直接的に分析する。これらのステップの全て、並びに読み取りは、同じPCRプレート内で実行される。
【０１８３】
このように、遺伝子型解析は、以下の5ステップ：
1)PCRによる増幅
2)酸素の消化によるPCR産物の精製
3)オリゴヌクレオチド・プライマーの伸長
4)読み取り
5)読み取りの解釈
を必要とする。
【０１８４】
ステップ1)PCRによる増幅
EPO遺伝子のヌクレオチド配列のPCR増幅を、民族的に様々な出身の268個体由来のゲノムDNAから開始し実行される。これらのゲノムDNAは、アメリカ合衆国のCoriell Instituteによって提供された。268の個体は、以下のとおり分類される：
【０１８５】
【表１】
2005503127.tif 000002
【０１８６】
これらの個体の各々から生じるゲノムDNAがサンプルを構成する。
PCR増幅を、ヌクレオチド配列、配列番号1に基づき当業者によって容易に設計することができるプライマーから実行する。
g1644aの遺伝子型解析のために、以下のプライマー：
配列番号5：センス・プライマー：TTCAGGGACCCTTGACTC
配列番号6：アンチセンス・プライマー：GATCATTCTCCCTTTCATCC、
を使って、PCR増幅を実行する。
【０１８７】
これらのヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列、配列番号1の第1557ヌクレオチドから第1764ヌクレオチドの、208ヌクレオチドの長さの断片の増幅を可能にする。
c2621gの遺伝子型解析のために、以下のプライマー：
配列番号7：センス・プライマー：TTGCATACCTTCTGTTTGCT
配列番号8：アンチセンス・プライマー：CACAAGCAATGTTGGTGAG、
を使って、PCR増幅を実行する。
【０１８８】
これらのヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列、配列番号1の第2192ヌクレオチドから第2817ヌクレオチドの、626ヌクレオチドの長さの断片の増幅を可能にする。
遺伝子型解析すべき各々のSNPについて、PCR産物をミニ配列決定(minisequencing)のための鋳型の役割をする。
PCR反応の総反応量は、1点のサンプルにつき5 μlである。
この反応量は、以下の表に示された試薬から構成される：
【０１８９】
【表２】
2005503127.tif 000003
【０１９０】
これらの試薬を、ABGene製の384ウェルをもつ黒いPCRプレート(ref：TF−0384−k)中に分配する。このプレートを、シールし、遠心分離し、次に384ウェルプレートをサーモサイクラー(MJ ResearchのTetrad)に配置し、そして以下のインキュベーション：PCRサイクル：94℃で1分、続いて3ステップ(94℃で15秒、56℃で30秒、、68℃で1分)から成るサイクルを36サイクル、を受ける。
【０１９１】
ステップ2)酵素消化によるPCR産物の精製
次に、PCR増幅産物を、2つの酵素る：エビ・アルカリホスファターゼ(SAP)及びエキソヌクレアーゼI(Exo I) を使って精製す。最初の酵素は、PCR増幅中に取り込まれなかったdNTPsの脱リン酸化をもたらすのに対し、2番目のものは、残存する1本鎖DNA、特にPCR中に使用されなかったプライマーを除去する。
この消化を、PCRプレートの各々のウェルにサンプルにつき5 μlの反応混合物を加えることよって行う。この反応混合物は、以下の試薬から構成される：
【０１９２】
【表３】
2005503127.tif 000004
【０１９３】
添加後、プレートをシールし、遠心分離し、次に384ウェルプレートをサーモサイクラー(MJ ResearchのTetrad)に配置し、以下のインキュベーション：消化SAP−EXO：37℃で45分、80℃で15分、を受ける。
ステップ3)オリゴヌクレオチド・プライマーの伸長
次に、伸長及びミニ配列決定のステップを、以下の表に示す調製サンプルあたり5μlの反応混合物の添加によりこの消化されたPCR産物において実行する：
【０１９４】
【表４】
2005503127.tif 000005
【０１９５】
遺伝子型解析に必要な2つのミニ配列決定プライマーの配列を、本発明によるSNP部位の上流に位置するヌクレオチド配列に相当するという手段により決定する。従って、2本鎖DNA産物である、SNPを含むPCR産物をの遺伝子型解析は、センス鎖又はアンチセンス鎖において行われる。選ばれたプライマーは、Life Technologies 社により製造される。
SNP g1644aについて、試験されたミニ配列決定プライマーが以下の：
配列番号9：センス・プライマー(A)：tgcagcttgaatgagaatatcactgtccca
配列番号10：アンチセンス・プライマー(B)：cctcttccaggcatagaaattaactttggtgt、
である。
【０１９６】
SNP g1644aのミニ配列決定を、まず48サンプルについて正当性を立証し、次に、268の個体及び11の負の対照から構成された個体集団の組について遺伝子型解析を行った。g1644aの遺伝子型解析について、いくつかのミニ配列決定条件を試験し、以下の最適条件：
アンチセンス・プライマー＋ddCTP−R110＋ddTTP−Tamra、
を維持した。
SNP c2621gについて、試験されたミニ配列決定プライマーが以下の：
配列番号11：センス・プライマー(A)：ttggcagaaggaagccatct
配列番号12：アンチセンス・プライマー(B)：ctgaggccgcatctggaggg、
である。
【０１９７】
SNP c2621gのミニ配列決定を、まず48サンプルについて正当性を立証し、次に、268の個体及び10の負の対照から構成された個体集団の組について遺伝子型解析を行った。c2621gの遺伝子型解析について、いくつかのミニ配列決定条件を試験し、以下の最適条件：
センス・プライマー＋ddCTP−R110＋ddGTP−Tamra、
を維持した。
添加後、プレートをシールし、遠心分離し、次に384ウェルプレートをサーモサイクラー(MJ ResearchのTetrad)に配置し、以下のインキュベーション：伸長サイクル：93℃で1分、続く2ステップ(93℃で10秒、55℃で30秒)から成るサイクルを35サイクル、を受ける。
【０１９８】
サーモサイクラーの最後のステップ後に、LJL Biosystems 社製のAnalyst(登録商標)HT型の蛍光偏光リーダー上に、このプレートを直接置く。2つの方法を使用することによってCriterion Host(登録商標)ソフトウェアを使ってプレートを読み取る。最初のものは、このフルオロフォア(励起550−10nm、発光580−10nm)に特有の発光及び励起フィルターを使用することによってTamra標識塩基の読み取りを可能にし、そして第2のものは、このフルオロフォア(励起490−10nm、発光520−10nm)に特有の励起及び発光フィルターを使用することによってR110標識塩基の読み取りを可能にする。2つの場合において、二色性ダブル・ミラー(R110/Tamra)が使用されて、他の読み取りパラメーターは以下のとおりである：
【０１９９】
Z−高：1.5 mm
アテニュエーター：アウト
積分時間：100,000 μsec.
未加工データ単位：カウント/秒
スイッチ偏光：ウェル単位
プレート修正時間：0 msec.
PMT設定：Smart Read(＋)、感度2
動的偏光子：発光
静的偏光子：S
【０２００】
こうして、Tamraフィルター及びR110フィルターに関するmP(ミリ偏光)の計算値を含むファイル結果を得る。これらのmP値を、以下の公式：
MP＝1000(//−g⊥)/(//＋g⊥)
に従い、平行面(//)及び垂直面(⊥)において得られた強度値から計算する。
この計算において、値⊥は、因子gによって加重される。あらかじめ実験的に測定されなければならない設備パラメーターである。
【０２０１】
ステップ4)及び5)読み取りの解釈及び遺伝子型の決定
mP値を、マイクロソフト社のExcelソフトウェア及び/又はLJL Biosystems社によって開発されたAllele Caller(登録商標)ソフトウェアを使ってグラフにより報告する。
【０２０２】
横軸によりTamra標識塩基のmP値を示し、縦軸によりR110標識塩基のmP値を示す。強いmP値は、このフルオロフォアにより標識された塩基が組み込まれていることを示して、逆に、弱いmP値は、この塩基の取り込みの不存在を明らかにする。
【０２０３】
異なる遺伝子型を有する3つまでの同構造群のヌクレオチド配列が得られる。
Allele Caller(登録商標)ソフトウェアの使用は、表の形式に各々の個体について定義された遺伝子型を直接抽出するために、一旦、様々な群の同定を実行することを可能にする。
【０２０４】
SNPs g1644a及びc2621gについてのミニ配列決定の結果
遺伝子型解析過程の完了後に、ここで検討された2つの機能的SNPsについて個体集団からの個体の遺伝子型の決定を、先に記載のグラフを使って実行した。
【０２０５】
SNP g1644aについて、検討された個体において、遺伝子型は、理論上はホモ接合体GG、又はヘテロ接合体GA、又はホモ接合体AAのいずれかである。実際には、また以下に示すとおり、ホモ接合体遺伝子型AAは個体集団内で検出されない。
【０２０６】
同様に、SNP c2621gついて、検討された個体において、遺伝子型は、理論上はホモ接合体CC、又はヘテロ接合体CG、又はホモ接合体GGのいずれかである。実際には、また以下に示すとおり、ホモ接合体遺伝子型GGは個体集団内で検出されない。
【０２０７】
負の対照、個体集団内の測定された遺伝子型分布、及びこれらの2つの機能的SNPsについての異なる対立遺伝子頻度の計算の結果を、以下の表に示す：
【０２０８】
【表５】
2005503127.tif 000006
【０２０９】
【表６】
2005503127.tif 000007
【０２１０】
前述の表において、
−  Nは、個体数を表し、
−  %は、特定の小集団の個体の割合を表し、
−  対立遺伝子頻度は、特定の小集団の変異対立遺伝子の割合を表し、
−  95%ICは、信頼度95%の最小及び最大区間を表す。
【０２１１】
集団による結果を検討することによって、SNP g1644aの場合、唯一のヘテロ接合体個体GAが、小集団、ヨーロッパ系白人の個体集団の出身であることが観察された。
同様に、集団による結果を検討することによって、SNP c2621gの場合、唯一のヘテロ接合体個体CGが、小集団、ヨーロッパ系白人の個体集団の出身であることが観察された。
【０２１２】
実施例3：天然の野生型エリスロポエチンのそれと比較したG104S変異エリスロポエチンの生物学的機能の検討
最初のステップは、変異又は野生型EPOタンパク質の準備から成る。
a)  ジェネテシン耐性遺伝子を担持する真核生物の発現ベクターpcDNA3.1/His-Topo内への天然の野生型エリスロポエチン及び変異エリスロポエチン(g2357a)のクローニング
【０２１３】
SwissProtで公開されたエリスロポエチン・タンパク質の配列と比較して、K143E(G427AG)変異(添字の数がcDNA配列のヌクレオチド見解と一致する)をもつGenestorm clone(H-X02158M−Invitrogen)からのEPO cDNAにポリヒスチジンのタグを付けた。このように、我々は、Exsite PCRキット(Stratagene)と以下のプライマー：
配列番号13：センス・プライマー：CCAGAAGGAAGCCATCTCCCCT
配列番号14：アンチセンス・プライマー(5'末端でリン酸化)：
GCTCCCAGAGCCCGAAGCAG、
を使って、まず天然の野生型E143(A427AG)配列を復元した。
【０２１４】
同時に、Exsite PCRキット(Stratagene corp.)と以下のプライマー：
配列番号15：センス・プライマー：CGGAGCCAAGCCCTGTTGGTCA
配列番号16：アンチセンス・プライマー(5'末端でリン酸化)：
CAGGACAGCTTCCGACAGCA、
を使って、G104S(G310GC ＝＞ AGC)変異エリスロポエチンを得た。
【０２１５】
ポリヒスチジン・テールを取り除き、そして変異又は野生型形態の完全なEPOタンパク質(すなわち、天然のシグナルペプチド及び成熟型タンパク質)に相当するヌクレオチド配列を単離するために、以下のプライマー：
配列番号17：センス・プライマー：ATGGGGGTGCACGAATGTCC
配列番号18：アンチセンス・プライマー：TCATCTGTCCCCTGTCCTGC、
を使ってPCR増幅を実行した。
【０２１６】
このPCR産物を、CMVプロモーター制御下の真核生物の発現ベクターpcDNA3.1/GS/HisTopo(TOPO(商標)-cloning; Invitrogen Corp.)に挿入する。このベクターは、真核生物の細胞系におけるタンパク質の構成的な表現を可能にする。
組み換えタンパク質をコードするベクター領域のヌクレオチド配列を確認した後に、様々な組み換え発現ベクターをSuperfect(QIAgen)を使ってチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)内にトランスフェクトする。
【０２１７】
b)  天然の野生型又は変異EPOを過剰発現するクローンの選定
様々なEPO構築物によるトランスフェクションの2日後に、CHO細胞を、800 μg/mlのジェネテシン(Invitrogen)を含む培地中に移す。これらの培養条件における2週間の増殖の結果として、EPOを過剰発現する安定な細胞が選ばれる。次にこの細胞を、制限希釈法によってクローン化する。野生型又は変異EPOのいずれかによりトランスフェクトされた細胞由来の30のクローンを、EPO ELISA(R&D System)を使ってEPOタンパク質の表現についてスクリーニングする。いくつかのEPOを発現するクローンを選定し、冷凍しておく。それらの間で、野生型又は変異EPOを最も大量に産生しているクローンを、EPO大量産生のために使用した。
【０２１８】
c)  EPOタンパク質の精製
CHO培養におけるEPO発現の後に、この培地を、上清を回収できるように1500 rpmで20分間遠心分離する。前記上清を、Labscale(Millipore膜、5 Kda)を使って10倍に濃縮し、3 Lの緩衝液Tris 50 mM、NaCl 25 mM、pH9に対して透析し、そして陰イオン交換カラム(Pharmacia、HiprepQ)により精製する。200 mM NaClのステップを使ったタンパク質溶出の後に、タンパク質を、緩衝液NaH2P04 50 mM、NaCl 25 mM、pH7に対して脱塩し、そしてヘパリンHP(Pharmacia)により精製する。次に150 mM NaClのステップを使ってタンパク質溶出を実行する。最後に、EPOタンパク質を、SDS PAGEゲル特徴づけ、続く濃度測定(Biorad、デンシトメーターGS800)を使った定量化によって分析する。
第2のステップは、EPO受容体を過剰発現する32Dマウス細胞を準備することから成る。
【０２１９】
d)  ゼオシン(zeocyn)耐性遺伝子を担持する真核生物の発現ベクターpcDNA3.1/GS/HisTopo内への天然のEPO受容体のクローニング：
cDNAをV5エピトープ及びポリヒスチジン・テールをもつフレームにさらに挿入するために、Genestorm clone(H-M60459M−Invitrogen)からの天然のヒトEPO受容体cDNAの完全な配列を、以下のプライマー：
配列番号19：センス・プライマー：ATGGACCACCTCGGGGCGTC
配列番号20：アンチセンス・プライマー：AGAGCAAGCCACATAGCTGGGGG、
を使ってPCRによって増幅する。
【０２２０】
PCR産物を、CMVプロモーター制御下の真核生物の発現ベクターpcDNA3.1/GS/HisTopo(TOPO(商標)-cloning；Invitrogen Corp.)内に挿入する。このベクターは、真核生物の細胞系におけるタンパク質の構造的な発現を可能にする。この場合、EPO受容体は、ポリヒスチジン・テール及びV5エピトープを含む追加のC末端配列によりタグを付けられている。組み換え受容体をコードするベクター領域のヌクレオチド配列を確認した後に、この構築物をマウス32D細胞系(ATCC)内に電気穿孔した。
【０２２１】
e)  EPO受容体を過剰発現する安定した細胞の選定
ヒトEPO受容体を過剰発現する安定な細胞を選定するために、EPO受容体をコードする構築物により電気穿孔された32D細胞系を、200 μg/mlのゼオシン(Invitrogen)の存在下で5週間培養し、その後市販のヒトEPO(R&D system)の存在下でその増殖能力を評価した。
最後に、変異EPO及び野生型EPOの生物学的な効果を、2つの異なる試験：EPO受容体を過剰発現するマウス32細胞の細胞増殖を誘発する様々なEPOタンパク質の能力についての評価によって、並びにEPO受容体への変異EPO及び野生型EPOの直接的な結合の計測によって測定する。
【０２２２】
f)  EPO受容体を過剰発現するマウス32D細胞の細胞増殖を誘発する、野生型及び変異G104S EPOの能力の評価
細胞増殖を誘発する野生型EPOとG104S変異EPOの能力を、EPO受容体を過剰発現するマウス32D細胞(32D-EPOR細胞)により評価する。この試験を、まず先のステップにおいて産生された様々なEPOタンパク質を含むタンパク質抽出物により実施し、第2に先に記載のとおりに得られた精製されたEPOタンパク質により実施した。
原理は以下のとおりである、96ウェルプレート内で10%の胎仔ウシ血清を含む200 μlの最終培地中、2.104細胞/ウェルの細胞密度で32D-EPOR細胞を接種する。32D-EPOR細胞を、野生型又は変異EPO(タンパク質抽出物の場合には0.024〜140 ng/ml、そして精製されたEPOの場合には0.76×10-3〜400 ng/ml)のいずれかの段階希釈物と一緒に37℃でインキュベートし、その5日後に、この培養物にUptiblue(Uptima)を加える。タンパク質抽出物の場合には24時間の、精製されたEPOの場合には4時間のさらなるインキュベーション期間の後に、590 nm(励起 560 nm)で発光する蛍光を計測することによって細胞増殖率を定量化する。
【０２２３】
天然の野生型及び変異EPOの増殖活性は、細胞増殖が50%に達するEPO濃度(ng/ml)に相当するEC50値の測定に基づく。
まず、2つの実験、例えば先に記載のものを、EPOを含むタンパク質抽出物を使って実行され、各々の実験を3回繰り返す。これらの実験の結果を、それぞれ図4Aと図4Bに表す。図4において、各々のタンパク質濃度について、点は3回の計測の平均に当たり、標準偏差は3回の繰り返しの間の変動を表す。
【０２２４】
これらのカーブから得られたEC値は以下のとおりである：
−  最初の実験において：野生型EPOについては24.22 ng/ml、そしてG104S変異EPOについては4.68 ng/ml、
−  2番目の実験において：野生型EPOについては5.24 ng/ml、そしてG104S変異EPOについては3.7 ng/ml。
このように、図4A及び4B、並びにEC50値は、G104S変異EPOの、ヒトEPO受容体を過剰発現する32D細胞系の細胞増殖に対する促進効果は、天然の野生型EPOのそれより2〜5倍高いことを示す。
【０２２５】
第2に、精製されたEPOタンパク質を使って類似の実験を実行した。3つ組で実施した2つの実験の結果を、それぞれ図5Aと図5Bに表す。図5において、各々のタンパク質濃度について、点は3回の計測の平均に当たり、標準偏差は3回の繰り返しの間の変動を表す。
これらのカーブから得られたEC50値は以下のとおりである：
−  最初の実験において：野生型EPOについては2.38 ng/ml、そしてG104S変異EPOについては0.58 ng/ml、
−  2番目の実験において：野生型EPOについては2.57 ng/ml、そしてG104S変異EPOについては1.12 ng/ml。
このように、図5A及び5B、並びにEC50値は、精製されたG104S変異EPOの、ヒトEPO受容体を過剰発現する32D細胞系の細胞増殖に対する促進効果は、精製された天然の野生型EPOのそれより2〜5倍高いことを示す。
【０２２６】
g)  G104S変異エリスロポエチンによる赤血球コロニー形成の促進
赤血球コロニー形成を促進するG104S変異エリスロポエチンの能力を、評価し、そして野生型エリスロポエチンでそれと比較した。
【０２２７】
そのために、健常な個体からヒト骨髄細胞を採取し、ficoll比重分画で分離した。有核細胞(2.5×105細胞)を、半固体メチルセルロース内に蒔いた。次に0.25〜10 ng/mLの範囲で変異又は野生型エリスロポエチンを培地に加えた。10日間の培養後に、赤血球のコロニーをカウントした。
この実験を2度実施し、平均した結果を以下の表にまとめ、かつ、図6に表す。
【０２２８】
【表７】
2005503127.tif 000008
【０２２９】
これらのデータは、G104S変異エリスロポエチンが赤血球のコロニー形成を促進することをはっきりと証明する。特に、G104S変異エリスロポエチンによる赤血球のコロニー形成の促進は、野生型エリスロポエチンを用いて計測されたものより30〜50%高い。
【０２３０】
h)  EPOとEPO受容体の間の相互作用
EPOとその受容体(EPO-R)の間の相互作用を、表面プラズモン共鳴技術(Biacore、SPR)を使って測定した。
G104S変異EPOと野生型EPOの親和性を比較するために、EPOとEPO-Rの細胞外部分の間の結合相互作用の定量的な計測を、センサー・チップ表面上に固定したEPO-Rターゲット・リガンドを使い、次に試験すべきEPOタンパク質から成る、様々な濃度の検体をこのチップ上を通過させることで実行する。
チップのカルボキシメチル化デキストラン層を、ポリヒスチジン・テールの金属キレート化によるリガンドの捕獲を仲介するためのニッケルを結合するように設計する。
【０２３１】
このため、我々は、成熟型ヒト受容体の細胞外部分に相当するEPO受容体(第25〜第247アミノ酸)、続くC末端V5エピトープ及びポリヒスチジン・テール(KGFSFNWGGKPIPNPLLGLDSTGVDHHHHHH-C末端)を設計した。対応するcDNA断片を、以下の特定のオリゴヌクレオチド：
配列番号21：センス・プライマー：GCGCCCCCGCCTAACCTC
配列番号22：アンチセンス・プライマー：GTCGCTAGGCGTCAGCAGCGA、
を使ってピチア・パストリス(Pichia pastoris)ベクターpPICZalpha his-topo(Invitrogen)内に挿入した。
【０２３２】
天然の野生型EPO又はG104S EPOをコードするクローンを含む、50 mLのBMGY培地(2%のペプトン、1%の酵母抽出物、1.34%のYNB、1%のグリセロール、100 mMのリン酸カリウム、0.4 mg/Lのビオチン、pH6.8)から成る2つの飽和した前培養を、200回転/分(rpm)の撹拌の状態で、30℃で24時間実行した。
前記培養が600nmの波長で計測される5.0の吸光度に相当する細胞密度に達したとき、それを1/5で、200 mLのBMMY培地(2%のペプトン、1%の酵母抽出物、1.34%のYNB、0.5%のメタノール、100 mMのリン酸カリウム、0.4 mg/Lのビオチン、pH6.8)の接種に使用する。
【０２３３】
次に、200rpmで培養フラスコを撹拌しながら、30℃で2〜5日間、0.5%の終濃度のメタノールによってタンパク質の発現を誘発する。
約10 mg/mlのEPO-Rを含む上清を、ラボ・スケールの装置での限外濾過(5000 Da排除)によって濃縮し、そしてリン酸ナトリウム50 mM、Tris(Cl) 10 mM、pH8.0、NaCl 150 mM、imidazol 10 mMに対する透析によって緩衝液を交換する。次に、ポリヒスチジンEPO-Rを、硫酸ニッケル(Amersham Pharmacia)によって前もって標識されたHi-Trap上に捕獲する。タンパク質を含む画分を、ゲル濾過カラム(Tris(Cl)、pH9、NaCl 50 mMの緩衝液)を使って脱塩し、次に陰イオン交換クロマトグラフィーにより約95%まで精製した。SDS-PAGEゲルを使って純度と濃度を推定した。
【０２３４】
次に、20 μl/分の流量で500 μMの硫酸ニッケルを通過させて、センサー・チップNTAを作動させる。次に、10 μl/分の流量で、HBS-P緩衝液(10 mMのHEPES、NaCl 150 mM、0.005% P20 EDTA 50 μM)中、50 nMの濃度でEPO-Rをその表面上に捕獲する。次に、0.45〜15 nMの濃度の野生型EPO及びG104S変異EPOを、センサー・チップに通した。HBS-P、EDTA 0.35 Mを使った再生を、各々の濃度試験の後に実施した。自動化された手順は、先に示された範囲における6つの濃度に関する、野生型EPO及びG104S変異EPOの結合相互作用を評価することを可能にした。
【０２３５】
図7は、G104S変異EPOと野生型EPOの2つの濃度(7.5及び15 nM)に関する結合計測の結果を示す。
これらの結果は、G104S変異EPOが野生型EPOより速やかにその受容体に結合することを示し、細胞レベル(3f及び3gに記載の実施例を参照のこと)で観察された効果を支持する。結果として、これは、EPO受容体を過剰発現するマウス32D細胞の増殖に対してG104S変異EPOの強力な正の効果が、少なくとも部分的に、その受容体に対するG104S変異EPOの優れた親和性に関係することを証明する。
【０２３６】
未成熟型EPOタンパク質配列の104位のアミノ酸に影響する変異に関するEPO能力に対するこの効果は、非常に驚異的である。実際、EPO受容体に複合したEPOの結晶構造は、EPOの(4つのヘリックスの中A、B、C及びDから)3つのヘリックスA、C及びDだけがEPO受容体との結合に係わっていることを示す(Syed et al. Efficiency of signaling through cytokine receptors depends critically on receptor orientation. Nature 395:511-516(1998))。さらに、EPOの構造−機能相関を分析する部位特異的変異誘発が、第77残基付近の、ヘリックスBに位置するアミノ酸の変化がEPO活性に対し実質的に影響を与えないことを証明する(Eliott et al. Mapping of the active site of recombinant human erythropoietin. Blood. 89: 493-502 (1997); Wen et al. Erythropoietin structure-function relationships. Identification of functionally important domains. J. Biol. Chem. 269: 22839-22846(1994))。
【０２３７】
EPOの構造/機能についてのそのような新しい情報は、そのヒト受容体に対してEPO活性を模倣する(化学物質かペプチドのいずれかの)新規EPO様物質を同定、設計及び開発するために使用されることもできる。
【図面の簡単な説明】
【０２３８】
【図１】図1Aは、SNP D70N及び天然の野生型エリスロポエチンを含む本発明によるコード・タンパク質のモデリングを表す。図1Bは、変異及び野生型タンパク質の右部についてのモデリングを表す。
図1A及び1Bにおいて、黒リボンは天然の野生型エリスロポエチンの構造を表し、白リボンは変異エリスロポエチン(D70N)の構造を表す。
【図２】図2Aは、SNP G104Sを含む本発明によるコード・タンパク質及び天然の野生型エリスロポエチンのモデリングを表す。図2Bは、変異及び野生型タンパク質の下部についてのモデリングを表す。
図2A及び2Bにおいて、黒リボンは天然の野生型エリスロポエチンの構造を表し、白リボンは変異エリスロポエチン(G104S)の構造を表す。
【図３】図3Aは、SNP S147Cを含む本発明によるコード・タンパク質及び天然の野生型エリスロポエチンのモデリングを表す。図3Bは、変異及び野生型タンパク質の左上部についてのモデリングを表す。
図3A及び3Bにおいて、黒リボンは天然の野生型エリスロポエチンの構造を表し、白リボンは変異エリスロポエチン(S147C)の構造を表す。
【図４】ヒト・エリスロポエチン受容体により安定的にトランスフェクトされた32Dマウス細胞系由来の細胞の増殖に対する、(タンパク質抽出物に含まれる)G104S変異エリスロポエチン及び野生型エリスロポエチンの効果を表す。図4A及び4Bは、それぞれ2つの独立した実験からの結果を表す。
【図５】ヒト・エリスロポエチン受容体により安定的にトランスフェクトされた32Dマウス細胞系由来の細胞の増殖に対する、精製されたG104S変異エリスロポエチン及び精製された野生型エリスロポエチンの効果を表す。図5A及び5Bは、それぞれ2つの独立した実験からの結果を表す。
【図６】G104S変異エリスロポエチン(白三角)又は野生型エリスロポエチン(黒四角)により刺激した後の赤血球のコロニー形成を表す。
【図７】ヒトEPO受容体の細胞外部分へのG104S変異エリスロポエチン(円印)及び野生型エリスロポエチン(星印)の結合能力を表す。2種類の濃度：7.5 nM、白、と15 nM、黒のエリスロポエチンを用いて得られたデータを表す。
【図１】
2005503127.tif 000009
【図２】
2005503127.tif 000010
【図３】
2005503127.tif 000011
【図４】
2005503127.tif 000012
【図５】
2005503127.tif 000013
【図６】
2005503127.tif 000014
【図７】
2005503127.tif 000015
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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