(57)【要約】本発明により、環式アミノアルキル基（アグリコン基）にグリコシド結合した2-デオキシ-2-アミノ-β-D-グルコピラノース（グルコサミン）を含む化合物が提供される。本発明により、抗原の存在下または不在下で本発明の化合物を用いて免疫応答を誘導する方法がさらに提供される。それに加え、本発明の化合物を抗原ととともに、あるいは抗原なしで用いて疾患を治療する方法も本発明によって提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式：
【化１】
2005516980.tif 000015
を有する化合物と、その薬理学的に許容可能な塩（ただし、
Xは、-O-と-NH-からなるグループの中から選択し；
Yは、-O-と-S-からなるグループの中から選択し；
R1、R2、R3は、それぞれ独立に、(C9〜C13)アシルからなるグループの中から選択し；
R4は、-Hと-PO3R7R8（ただしR7とR8は、それぞれ独立に、-Hと(C1〜C4)脂肪族基からなるグループの中から選択する）からなるグループの中から選択し；
R5は、-H、-CH3、-PO3R9R10（ただしR9とR10は、それぞれ独立に、-Hと(C1〜C4)脂肪族基からなるグループの中から選択する）からなるグループの中から選択し；
R6は、H、OH、(C1〜C4)オキシ脂肪族基、-PO3R11R12、-OPO3R11R12、-SO3R11、-OSO3R11、-NR11R12、-SR11、-CN、-NO2、-CHO、-CO2R11、-CONR11R12（ただしR11とR12は、それぞれ独立に、Hと(C1〜C4)脂肪族基からなるグループの中から選択する）からなるグループの中から選択し、ただしR4とR5の一方はリン含有基であって、R4が-PO3R7R8である場合には、R5は-PO3R9R10以外であり； 
“*1”、“*2”、“*3”、“**”は、キラル中心を表わし；
n、m、p、qは、それぞれ独立に、0〜6の整数を表わすが、pとmの和は0〜6である）。
【請求項２】
XとYが-O-であり、R4がPO3R7R8であり、R5とR6がHであり、n、m、p、qが0〜2の整数である、請求項1に記載の化合物。
【請求項３】
R7とR8が-Hである、請求項2に記載の化合物。
【請求項４】
nが1であり、mが2であり、pとqが0である、請求項3に記載の化合物。
【請求項５】
R1、R2、R3が、それぞれ(C10〜C12)アシルである、請求項1に記載の化合物。
【請求項６】
R1、R2、R3が、それぞれデカノイル残基である、請求項4に記載の化合物。
【請求項７】
R1、R2、R3が、それぞれドデカノイル残基である、請求項4に記載の化合物。
【請求項８】
*1、*2、*3が、R配置である、請求項4に記載の化合物。
【請求項９】
薬理学的に許容可能な基剤と、請求項1〜8のいずれか1項に記載の化合物とを含む医薬組成物。
【請求項１０】
請求項1〜8のいずれか1項に記載の化合物を治療に有効な量含む、請求項9に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
少なくとも1種類の抗原をさらに含む、請求項9または10に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
上記抗原が、単純ヘルペスウイルス・タイプ1、単純ヘルペスウイルス・タイプ2、ヒトサイトメガロウイルス、HIV、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス、RS(Respiratory Syncytial)ウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、インフルエンザウイルス、結核菌、リーシュマニア属、クルーズトリパノソーマ、エールリヒア属、カンジダ属、サルモネラ属、ナイセリア属、ボレリア属、クラミジア属、ボルデテラ属、プラスモジウム属、トキソプラズマ属からなるグループに由来する、請求項11に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
上記抗原がヒト腫瘍抗原である、請求項11に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
上記腫瘍抗原が、前立腺がん、大腸がん、乳がん、卵巣がん、膵臓がん、脳腫瘍、頭および首のがん、黒色腫、白血病、リンパ腫のいずれかに由来する、請求項13に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
上記抗原が自己抗原である、請求項13に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
上記自己抗原が、自己免疫疾患に関係する抗原である、請求項15に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
上記自己免疫疾患が、1型糖尿病、多発性硬化症、重症筋無力症、関節リウマチ、乾癬のいずれかである、請求項16に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
水性製剤の形態である、請求項10〜17のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
上記水性製剤が1種類以上の界面活性剤を含む、請求項18に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
エマルジョン製剤の形態である、請求項10〜17のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
固形製剤の形態である、請求項10〜17のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
患者に免疫応答を誘導する方法であって、その患者に対し、請求項1〜8のいずれか1項に記載の化合物または請求項9〜21のいずれか1項に記載の組成物を治療に有効な量投与する操作を含む方法。
【請求項２３】
病原菌性感染症、がん、自己免疫疾患のいずれかを患っているか、あるいはこれら疾患にかかりやすい哺乳動物の治療方法であって、その哺乳動物に対し、請求項1〜8のいずれか1項に記載の化合物または請求項9〜21のいずれか1項に記載の組成物を治療に有効な量投与する操作を含む方法。
【請求項２４】
患者の体内で一酸化窒素が生成することによって改善する疾患または症状を治療する方法であって、その患者を、請求項1〜8のいずれか1項に記載の化合物または請求項9〜21のいずれか1項に記載の組成物の有効な量と接触させる操作を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全体として、免疫エフェクター化合物、その医薬組成物としての利用法、その製造方法、その予防用および／または治療用のワクチンとしての利用法に関する。さらに詳細には、本発明は、環式アミノアルキル基（アグリコン基）にグリコシド結合した2-デオキシ-2-アミノ-β-D-グルコピラノース（グルコサミン）を含む化合物と、その化合物を医薬用アジュバント系として利用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
体液性免疫と細胞媒介性免疫は、哺乳類の主要な2つの免疫応答機構である。体液性免疫には、外来性抗原に対する抗体の産生が含まれる。抗体は、Bリンパ球によって産生される。細胞媒介性免疫には、Tリンパ球の活性化が含まれる。Tリンパ球は、外来性抗原を伴った感染細胞に対して作用を及ぼすか、あるいは他の細胞を刺激して感染細胞に作用を及ぼすよう仕向ける。哺乳類の免疫系では、病気と闘う上でどちらの免疫機構も重要である。体液性免疫は、病原性細菌から防御する際の主要な機構である。ウイルス性疾患の場合には、細胞傷害性Tリンパ球（CTL）が防御免疫にとって極めて重要であるように見える。したがって効果的なワクチンは、疾患から防御するため、免疫系の両方の機構を刺激することが好ましい。
【０００３】
ワクチンは、疾患を引き起こす病原体からの外来性抗原を宿主に提示し、その宿主が防御免疫応答を起こせるようにする。ワクチン抗原は、疾患を引き起こす微生物を不活化した形態または弱毒化した形態になっていることがしばしばある。不活化ワクチンまたは弱毒化ワクチンには重要でない成分と抗原が存在しているため、ワクチン成分を洗練するために大きな努力が払われてきた。そのような努力の1つとして、化学的方法と組み換え法を利用してよくわかった合成抗原を開発するということが挙げられる。しかし微生物ワクチンを精製し単純化することで、性能も同時に低下することになった。低分子量の合成抗原は、潜在的に有害な汚染成分を含んでいないが、それ自体では十分な免疫原性を持たないことがしばしばある。研究者は、このような知見に基づき、ワクチン成分の活性を強化するため、アジュバントとして知られている免疫系刺激因子をワクチン組成物に添加するに至った。
【０００４】
免疫アジュバントは、個々の人に投与したり試験管内でテストしたりするとき、抗原を投与した患者の体内で抗原に対する免疫応答を増大させたり、免疫系からの細胞のある種の活性を増大させたりする化合物である。さまざまな程度のアジュバント活性を示す多数の化合物が調製され、テストされている（例えばシミズ他、1985年；Bulusu他、1992年；イケダ他、1993年；シミズ他、1994年；シミズ他、1995年、ミヤジマ他、1996年を参照のこと）。しかしこれらのアジュバント系ならびに従来からある他のアジュバント系は毒性を示すこと、および／または不安定であること、および／または免疫促進効果が許容できなくくらい低いことがしばしばある。
【０００５】
現在のところ、アメリカ合衆国でヒトに使用することが許可されている唯一のアジュバントは、ミョウバン（一群のアルミニウム塩であり、具体的には水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムなどである）である。ワクチン抗原は、このミョウバンの中で製剤となる。ミョウバンなどの粒子状担体は、マクロファージが可溶性抗原を取り込み、処理し、提示するのを促進することが報告されている。しかしミョウバンは、副作用がないわけではなく、残念なことに体液性（抗体）免疫に限定されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
効果的なアジュバント系の発見と開発は、既存のワクチンならびに将来のワクチンの効果と安全性を向上させる上で極めて重要である。したがって、次世代の合成ワクチンをより容易に開発できるようにする新しくかつ改善されたアジュバント系、中でも免疫系の両方の機構を作動させるアジュバント系が相変わらず必要とされている。本発明は、このような必要性ならびに他の必要性に応えるものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の化合物は、抗原に対するワクチンの体液性免疫応答と細胞媒介性免疫応答を促進する免疫エフェクター分子である。この化合物は、一般に、環式AGP化合物のクラスに属すると言える。なおAGPは、アミノアルキルグルコサミニドリン酸を表わす。“環式AGP”という用語は、アザシクロアルキルグルコサミニドリン酸または(アザシクロアルキル)アルキルグルコサミニドリン酸において、2-デオキシ-2-アミノ-β-D-グルコピラノース（グルコサミン）がアザシクロアルキル基または(アザシクロアルキル)アルキル基（アグリコン基）にグリコシド結合しているものを意味する。
【０００８】
本発明の化合物は、環式アミノアルキル基（アグリコン基）にグリコシド結合した2-デオキシ-2-アミノ-β-D-グルコピラノース（グルコサミン）を含んでいる。この化合物は、グルコサミン環の4位と6位がリン酸化されるとともに、アグリコンの窒素とグルコサミン環の2位および3位がアルカノイルオキシテトラデカノイル残基でアシル化されている。本発明の化合物は、一般に、一般式（I）：
【化１】
2005516980.tif 000002
で表わされる化合物と、その薬理学的に許容可能な塩である（ただし、Xは、-O-または-NH-であり；Yは、-O-または-S-であり；R1、R2、R3は、それぞれ独立に、(C9〜C14)アシル基（飽和したアシル基、不飽和のアシル基、分枝状のアシル基が含まれる）であり；、R4は、-Hまたは-PO3R7R8（ただしR7とR8は、それぞれ独立に、-Hまたは(C1〜C4)脂肪族基である）であり；R5は、-H、-CH3、-PO3R9R10（ただしR9とR10は、それぞれ独立に、-Hと(C1〜C4)脂肪族基の中から選択する）のいずれかであり；R6は、H、OH、(C1〜C4)オキシ脂肪族基、-PO3R11R12、-OPO3R11R12、-SO3R11、-OSO3R11、-NR11R12、-SR11、-CN、-NO2、-CHO、-CO2R11、-CONR11R12-（ただしR11とR12は、それぞれ独立に、-Hと(C1〜C4)脂肪族基の中から選択する）のいずれかであり；ただしR4とR5の一方はリン含有基であって、R4が-PO3R7R8である場合には、R5は-PO3R9R10以外であり； “*1〜3”と“**”は、キラル中心を表わし；
n、m、p、qは、それぞれ独立に、0〜6の整数を表わすが、pとmの和は0〜6である）。
【０００９】
本発明による化合物のいくつかの実施態様では、XとYはそれぞれ酸素であり、R4はPO3R7R8であり、R5とR6はHであり、n、m、p、qは0〜3の整数である。さらに好ましい一実施態様では、R7とR8は-Hである。より一層好ましい一実施態様では、nは1であり、mは2であり、pとqは0である。それ以上に好ましい実施態様では、R1、R2、R3は(C9〜C13)アシル基である（最も好ましいのは(C10〜C12)アシル基である）。さらに好ましい実施態様では、*1〜3は、R配置であり、Yは赤道配座にあり、**はS配置である。特に好ましいのは、N-[(R)-3-テトラデカノイルオキシテトラデカノイル]-(S)-2-ピロリジニルメチル 2-デオキシ-4-O-ホスホノ-2-[(R)-3-テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-3-O-[(R)-3-テトラデカノイルオキシテトラデカノイル]-β-D-グルコピラノシド（一般式II）：
【化２】
2005516980.tif 000003
、
N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-(S)-2-ピロリジニルメチル 2-デオキシ-4-O-ホスホノ-2-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-3-O-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-β-D-グルコピラノシド（一般式III）：
【化３】
2005516980.tif 000004
、
N-[(R)-3-デカノイルオキシテトラデカノイル]-(S)-2-ピロリジニルメチル 2-デオキシ-4-O-ホスホノ-2-[(R)-3-デカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-3-O-[(R)-3-デカノイルオキシテトラデカノイル]-β-D-グルコピラノシド（一般式IV）：
【化４】
2005516980.tif 000005
、
ならびにその薬理学的に許容可能な塩である。
【００１０】
本発明により、上記の一般式ならびに特別式で表わされる化合物を含む医薬組成物も提供される。この医薬組成物は、さまざまな抗原と組み合わせることができ、当業者に知られているさまざまな製剤にすることができる。
【００１１】
本発明の化合物は、患者に免疫応答を誘導する方法においても有効である。この方法は、患者に対し、本発明による1種類以上の化合物を、好ましくは薬理学的に許容可能な基剤も含む医薬組成物の形態にして、治療に有効な量投与する操作を含んでいる。
【００１２】
本発明には、病原菌性感染症、がん、自己免疫疾患のいずれかを患っているか、あるいはこれら疾患にかかりやすい哺乳動物の治療方法も含まれる。この方法は、哺乳動物に対し、本発明による1種類以上の化合物を、好ましくは薬理学的に許容可能な基剤も含む医薬組成物の形態にして、治療に有効な量投与する操作を含んでいる。
【００１３】
さらに、本発明には、患者の体内に一酸化窒素が生成することによって改善する疾患または症状を治療する方法も含まれる。この方法は、患者に対し、本発明による1種類以上の化合物の有効な量、または本発明による1種類以上の化合物と薬理学的に許容可能な基剤を含む組成物の有効な量を接触させる操作を含んでいる。いくつかの実施態様では、本発明の化合物を、虚血の48時間前に投与すること、虚血の48時間後までにに投与すること、虚血の間に投与することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
定義
【００１５】
“アシル”という用語は、有機酸のヒドロキシ部分を除去した基を意味する。したがってアシルには、例えばアセチル、プロピオニル、ブチリル、デカノイル、ピバロイルが含まれる。例えば“(C9〜C14)アシル”は、9〜14個の炭素原子を有するアシル基を意味する。
【００１６】
単独で、あるいは他の置換基の一部として使用される“脂肪族”という用語は、特に断わらない限り、指定された数の炭素原子を有する（すなわちC1〜C4は1〜4個の炭素原子を意味する）直鎖、または分岐鎖、または環式の炭化水素部分を意味する。そのような炭化水素部分には、環式要素と鎖要素の両方を有する部分も含まれる。なお環と鎖は、完全に飽和していてもよく、一箇所または複数箇所が不飽和でもよい。飽和炭化水素基の具体例としては、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、t-ブチル、イソブチル、s-ブチル、シクロプロピル、シクロプロピルメチル、メチレン、エチレン、n-ブチレンなどが挙げられる。不飽和アルキル基は、二重結合および／または三重結合を1つ以上有するアルキル基である。不飽和脂肪族基の具体例として、ビニル、2-プロペニル、クロチル、-2-(ブタジエニル)、1-プロピニル、3-プロピニルなどが挙げられる。
【００１７】
“オキシ脂肪族”という用語は、脂肪族基が分子の残部に酸素原子を通じて結合している基を意味する。
【００１８】
上記用語のそれぞれ（例えば“アルキル”、“アシル”）には、その部分が置換された形態と置換されていない形態の両方が含まれるものとする。
【００１９】
脂肪族基に対する置換基は、多彩なものを0個から(2m'+1)個（ただしm'はその置換基に含まれる炭素原子の総数である）の範囲で選択することができる。選択の対象となる置換基としては、-OR'、=O、=S、=NR'、=N-OR'、-NR'R"、-SR'、-ハロゲン、-SiR'R"R"'、-OC(O)R'、-C(O)R'、-CO2R'、-CONR'R"、-OC(O)NR'R"、-NR"C(O)R'、-NR'-C(O)NR"R"'、-NR"C(O)2R'、-NH-C(NH2)=NH、-NR'C(NH2)=NH、-NH-C(NH2)=NR'、-S(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R"、-CN、-NO2などが挙げられる。R'、R"、R"'は、それぞれ独立に、水素、または置換されていない(C1〜C4)脂肪族基を意味する。当業者であれば、置換基に関する上記の説明から、“アルキル”という用語にハロアルキル（例えば-CF3や-CH2CF3）などの基が含まれることが理解できよう。
【００２０】
単独で、あるいは他の置換基の一部として使用される“ハロ”または“ハロゲン”という用語は、特に断わらない限り、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子を意味する。複数のハロゲン置換基を有する化合物では、ハロゲンは互いに同じでも異なっていてもよい。
【００２１】
“薬理学的に許容可能な塩”という用語は、この明細書に記載した化合物に見られる個々の置換基が何であるかに応じて選択した比較的毒性のない酸または塩基を用いて調製した活性化合物の塩を含むことを意味する。本発明の化合物が比較的酸性の官能基を含んでいる場合には、望む塩基をそのままで添加することにより、あるいは適切な不活性溶媒中で添加することにより、塩基添加塩を得ることができる。薬理学的に許容可能な塩基添加塩の具体例としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、有機アミノ塩、マグネシウム塩などが挙げられる。本発明の化合物が比較的塩基性の官能基を含んでいる場合には、望む酸をそのままで添加することにより、あるいは適切な不活性溶媒中で添加することにより、酸添加塩を得ることができる。薬理学的に許容可能な酸添加塩の具体例としては、無機酸（例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、一水素炭酸、リン酸、一水素リン酸、二水素リン酸、硫酸、一水素硫酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸）に由来する塩や、比較的毒性のない有機酸（酢酸、プロピオン酸、イソブチル酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、p-トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸など）に由来する塩が挙げられる。アミノ酸の塩（例えばアルギン酸塩など）や、有機酸（例えばグルクロン酸やガラクツロン酸）の塩も挙げられる（例えばBerge, S.M.他、「医薬用の塩」、Journal of Pharmaceutical Science、1977年、第66巻、1〜19ページを参照のこと）。本発明によるいくつかの特別な化合物は、塩基官能基と酸官能基の両方を含んでいるため、その化合物を塩基添加塩にも酸添加塩にも変換することができる。
【００２２】
本発明による化合物の中性形態は、塩を塩基または酸と接触させ、親化合物を従来法で単離することによって生成させることができる。この化合物の親の形態は、いくつかの物理的特性（例えば極性溶媒に対する溶解度）がさまざまな塩の形態とは異なっているが、他の点では、本発明の目的に関する限り、塩はこの化合物の親の形態と同等である。
【００２３】
本発明により、塩に加え、プロドラッグの形態になった化合物も提供される。この明細書に記載した化合物のプロドラッグは、生理学的条件のもとで容易に化学変化して本発明の化合物になる化合物である。さらに、プロドラッグは、生体外環境において、化学的方法または生化学的方法によって本発明の化合物に変換することができる。例えばプロドラッグは、適切な酵素または化学試薬とともに経皮パッチの中に配置すると、本発明の化合物へとゆっくりと変換させることができる。
【００２４】
本発明によるいくつかの化合物は、非溶和物の形態と溶和物の形態（水和物の形態を含む）で存在することができる。一般に、溶和物の形態は非溶和物の形態と同等であり、本発明の範囲に含まれるものとする。本発明によるいくつかの化合物は、多結晶の形態またはアモルファスの形態で存在することができる。一般に、あらゆる物理的形態は、本発明で考慮する用途においては同等であり、本発明の範囲に含まれるものとする。
【００２５】
本発明によるいくつかの化合物は、不斉炭素原子（光学中心）または二重結合を含んでいる。ラセミ化合物、ジアステレオマー、幾何異性体、個々の異性体は、すべて、本発明の範囲に含まれるものとする。
【００２６】
本発明の化合物は、そのような化合物を構成する1種類以上の原子に関し、自然とは異なる割合の同位体を含むこともできる。例えばこの化合物を、三重水素（3H）、ヨウ素-125（125I）、炭素-14（14C）などの放射性同位体で標識することができる。本発明による化合物を同位体で置換したあらゆるバリエーションは、その同位体が放射性であるかどうかに関係なく、本発明の範囲に含まれるものとする。
【００２７】
はじめに
ワクチンの安全性を向上させるため、製造業者は、細胞全体を不活化したワクチンを避け、組み換えワクチンまたはサブユニット・ワクチンを製造している。こうしたより安全なワクチンの調製では、外来の細菌成分またはウイルス成分を除去し、防御免疫に必要と考えられる最少構造またはエピトープを残す。毒性があり発熱性を持つことがしばしば明らかになる外来の細菌成分またはウイルス成分を除去してあるため、このようなワクチンでは安全性が向上している。しかし毒性のある同じ成分が非特異的免疫刺激を提供するため、全細胞ワクチンには非常に効果的がある。追加の免疫刺激がなければ、最少構造またはエピトープを含む組み換えワクチンまたはサブユニット・ワクチンの免疫原性はしばしば非常に弱いものになる。
【００２８】
サルモネラ・ミネソタR595のLPSに由来する二糖分子であるMPL（登録商標）免疫刺激剤（コリクサ社）は、免疫刺激特性を有する。MPL（登録商標）免疫刺激剤（モノホスホリル脂質A）は脂質Aの構造誘導体（すなわちLPS）であり、脂質Aと比べて治療指数が向上している（モノホスホリル脂質Aの構造に関してはアメリカ合衆国特許第4,987,237号；モノホスホリル脂質Aの調製法に関してはアメリカ合衆国特許第4,436,727号と第4,436,728号を参照のこと）。他の有効な免疫促進剤としては、3-デ-O-アシル化モノホスホリル脂質A（3D-MPL）が挙げられる。これに関しては、アメリカ合衆国特許第4,912,094号に記載されている。この化合物は、少なくとも20μg/kgの投与量まではヒトに投与しても安全である。しかし患者によっては、10μg/kg以下の投与量でも、体温の上昇、インフルエンザ様の症状、心拍数の増大、血圧のわずかな低下が起こる可能性がある。細胞培養物と動物を評価することにより、MPL（登録商標）免疫刺激剤は、発熱性と炎症性サイトカイン（例えばTNF-α、IL-8）を誘導する能力を残しているという点で、親LPSの免疫刺激活性を幾分か保持していることが確認できる（ただしこのような性質は、親LPSよりも大きな投与量にしないと見られない）。したがって効果的なワクチン・アジュバントの必要性がよくわかる。理想的には、このようなアジュバントにより、望ましくない毒性と発熱性なしに防御免疫応答が促進されることになろう。
【００２９】
発熱性が小さい免疫刺激剤を得るため、MPL（登録商標）免疫刺激剤と構造が似た合成分子が調製されている。まとめてアミノアルキルグルコサミニドリン酸（APG）と呼ばれるこのような新規な分子は、アシル化されたアミノアルキル基に結合した、アシル化されたグルコース部分からなる（Johnson他、1999年、Bioorg. Med. Chem. Lett.、第9巻、2273〜2278ページ；PCT出願WO 98/50399とその中に引用されている参考文献）。それぞれの分子は6個の脂肪酸尾部を備えている。この6個が、アジュバントの活性が最大になる最適な数であると考えられている。安定性と溶解性が最適になるようにアミノアルキル構造内のさまざまな部分の置換を設計し、AGPに組み込む。したがってAGPは、アミノアルキル基の構造に基づき、いくつかのファミリーに大まかに分けることができる。最初に生物学的評価を行なうことにより、アミノアルキル・モチーフがAGPの発熱特性に劇的に影響を与えうることが明らかになった（1998年5月7日に出願されたアメリカ合衆国特許出願シリアル番号第09/074,720号と、アメリカ合衆国特許第6,113,918号、第6,303,347号を参照のこと）。合成アジュバント化合物に関する最初のスクリーニング・プロセスの一部として、ウサギの発熱性データが明らかになった。10μg/kgの割合で静脈内投与したとき、いくつかの化合物は発熱応答を引き起こさないことがわかった。一般に言えることだが、この同じ化合物は、ヒト末梢血に関する生体外サイトカイン誘導アッセイにおいて、炎症性サイトカインであるTNF-αまたはIL-1βを検出可能なレベルまで誘導することができなかった。この明細書では、ウサギの発熱物質テストと生体外サイトカイン・アッセイの両方において最低限の活性を誘導する1つのクラスのAGPのアジュバント特性に関する研究を報告する。
【００３０】
化合物と組成物
本発明により、一般に一般式（I）：
【化５】
2005516980.tif 000006
で表わされる化合物と、その薬理学的に許容可能な塩が提供される（ただし、Xは、-O-または-NH-であり；Yは、-O-または-S-であり；R1、R2、R3は、それぞれ独立に、(C9〜C14)アシル基（飽和したアシル基、不飽和のアシル基、分枝状のアシル基が含まれる）であり；、R4は、-Hまたは-PO3R7R8（ただしR7とR8は、それぞれ独立に、-Hまたは(C1〜C4)脂肪族基である）であり；R5は、-H、-CH3、-PO3R9R10（ただしR9とR10は、それぞれ独立に、-Hと(C1〜C4)脂肪族基の中から選択する）のいずれかであり；R6は、H、OH、(C1〜C4)オキシ脂肪族基、-PO3R11R12、-OPO3R11R12、-SO3R11、-OSO3R11、-NR11R12、-SR11、-CN、-NO2、-CHO、-CO2R11、-CONR11R12-（ただしR11とR12は、それぞれ独立に、-Hと(C1〜C4)脂肪族基の中から選択する）のいずれかであり；ただしR4とR5の一方はリン含有基であって、R4が-PO3R7R8である場合には、R5は-PO3R9R10以外であり； “*1〜3”と“**”は、キラル中心を表わし；
n、m、p、qは、それぞれ独立に、0〜6の整数を表わすが、pとmの和は0〜6である）。
【００３１】
一般式（I）のヘキソピラノシドはグルコ配置で示してあるが、他のグリコシドも本発明の範囲に含まれる。例えばグリコピラノシドは、他のヘキソピラノシド（例えばアロ、アルトロ、マンノ、グロ、イド、ガラクト、タロ）も含め、本発明の範囲に含まれる。
【００３２】
上記の一般式では、ノルマル脂肪アシル残基が結合する3'ステレオジェン中心（“*1”、“*2”、“*3”と表記）の立体配置は、R配置またはS配置であるが、R配置であることが好ましい。R6とグルコサミン単位が直接または間接に結合する環式アグリコン単位の炭素原子（“**と表記”）の絶対立体化学構造としては、R配置またはS配置が可能である。上記の一般式では、Yは赤道配座または軸配座が可能であるが、赤道配座が好ましい。すべての立体異性体、エナンチオマー、ジアステレオマー、ならびにその混合物は、本発明の範囲に含まれるものとする。
【００３３】
本発明の好ましい実施態様では、XとYは-Oであり；R4はホスホノであり；R5とR6はHであり；n、m、p、qは0〜3の整数であり、好ましくは0〜2である。最も好ましいのは、整数nが1であり、整数mが2であり、整数pとqが0になっていることである。この好ましい実施態様では、本発明の化合物は、一般式（V）：
【化６】
2005516980.tif 000007
を有するβ-D-グルコサミニド 4-リン酸2-ピロリジニルメチルである。
【００３４】
本発明の好ましい一実施態様では、ノルマル脂肪酸アシルが結合する3'ステレオジェン中心の立体配置（“*1〜3”）はR配置であり、Yは赤道配座であり、ピロリジンのステレオジェン中心（“**”）の絶対立体化学構造はS配置である。
【００３５】
特に好ましい実施態様は、一般式（II）：
【化７】
2005516980.tif 000008
で表わされるN-[(R)-3-テトラデカノイルオキシテトラデカノイル]-(S)-2-ピロリジニルメチル 2-デオキシ-4-O-ホスホノ-2-[(R)-3-テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-3-O-[(R)-3-テトラデカノイルオキシテトラデカノイル]-β-D-グルコピラノシドとその薬理学的に許容可能な塩、一般式（III）：
【化８】
2005516980.tif 000009
で表わされるN-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-(S)-2-ピロリジニルメチル 2-デオキシ-4-O-ホスホノ-2-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-3-O-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-β-D-グルコピラノシドとその薬理学的に許容可能な塩、一般式（IV）：
【化９】
2005516980.tif 000010
で表わされるN-[(R)-3-デカノイルオキシテトラデカノイル]-(S)-2-ピロリジニルメチル 2-デオキシ-4-O-ホスホノ-2-[(R)-3-デカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-3-O-[(R)-3-デカノイルオキシテトラデカノイル]-β-D-グルコピラノシドとその薬理学的に許容可能な塩である。
【００３６】
化合物の調製
本発明の化合物は、Johnson他、1999年、Bioorg. Med. Chem. Lett.、第9巻、2273〜2278ページ、ならびにPCT出願WO 98/50399とその中に引用されている参考文献に概略が示してある方法を利用して調製することができる。一般に、上記の参考文献に記載されている合成法は、さまざまなアシル基および置換基を有する化合物の調製に広く応用することができる。当業者であれば、その中に記載されている方法を改変して別のアシル化剤を使用できるようにすることや、適切なアシル基が結合している市販の材料を用いてこの方法を開始できることが理解されよう。
【００３７】
化合物の評価
この明細書に記載した化合物を多彩なアッセイで評価し、適切な薬剤輸送プロファイルを有する化合物を選択することができる。例えばアメリカ合衆国特許第6,013,640号には、この明細書に記載した化合物の心臓保護効果を評価するのに適したモデル動物が記載されている。後出の実施例では、本発明の化合物の発熱性を評価するためのアッセイと、この化合物の炎症促進効果を評価するためのアッセイも提示する。
【００３８】
本発明により、この明細書において提供される化合物に1種類以上の薬理学的に許容可能な基剤を混合した医薬組成物がさらに提供される。適切な基剤は、治療する疾患と投与経路によって異なる。したがって基剤に関する説明は、利用方法との関連で後述する。
【００３９】
医薬組成物とその利用法
本発明の一実施態様により、本発明の化合物と薬理学的に許容可能な基剤とを含む医薬組成物が提供される。この化合物は、治療に有効な量が存在している。それは、疾患や症状の治療に関して望む効果を実現するのに必要な量、すなわち生物学的事象の実現に必要な量の化合物である。この医薬組成物は、抗原と同時に投与したときにアジュバントとして機能する。
【００４０】
本発明の組成物には2通りある。一方は、活性化合物を希釈せずに患者に直接に投与するため、ワクチンまたは他の活性な薬剤とともに、あるいは単独で製剤化した組成物であり、もう一方は、大量の希釈剤（例えば水、生理食塩水、水性物質）を運搬および／または保管せずに済むようにするため、後で希釈できるように製剤化したより濃縮された組成物である。一般に、患者に直接に（すなわち希釈せずに）投与するための本発明の医薬組成物は、1種類以上の上記化合物を治療に有効な量含むことになる。この量は、治療用の個々の化合物が何であるかと、どのような治療効果を望むかの両方に応じて異なることになる。より濃縮された組成物は、本発明による化合物を、そのような組成物において適切な量だけ含むことになろう。
【００４１】
医薬組成物を調製するための薬理学的に許容可能な基剤として、固体または液体が可能である。固形調製物としては、粉末、錠剤、ピル、カプセル、カシェ剤、坐薬、分散可能な粒子などが挙げられる。固体基剤としては、希釈剤、着香剤、バインダ、保存剤、錠剤分解剤、カプセル用材料としても機能する1種類以上の物質が可能である。
【００４２】
粉末の場合には、基剤は細かく分割された固体であり、それが、細かく分割された活性成分と混合される。錠剤の場合には、活性成分を、必要な結合特性を有する基剤と適切な割合で混合し、望む形状およびサイズに圧縮する。
【００４３】
固体形態の組成物は、（例えば塩の形態になった）活性なアジュバントの水性製剤をスプレー乾燥させることによって、あるいは凍結乾燥させた後に賦形剤とともにすりつぶすことによって調製することもできる。
【００４４】
本発明による固形組成物に適した基剤としては、例えば、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点のろう、カカオバターなどが挙げられる。“調製物”という用語には、活性化合物と、カプセルにするための基剤としてのカプセル材料とからなる製剤が含まれる。カプセル内では活性成分が基剤に取り囲まれているため（他の基剤が含まれている場合と含まれていない場合がある）、基剤は活性成分と一体化している。同様に、カシェ剤やロゼンジも調製物という用語に含まれる。錠剤、粉末、カプセル、ピル、カシェ剤、ロゼンジは、経口投与に適した固体投与形態で使用することができる。
【００４５】
坐薬を調製するには、まず最初に低融点のろう（例えば脂肪酸グリセリドまたはカカオバター）を融かし、撹拌しながら活性成分をその中に均一に分散させる。次に、この融けた均一な混合物を適切なサイズの鋳型に注ぎ、放置して冷却することによって固化させる。
【００４６】
液体形態の調製物としては、溶液、懸濁液、エマルジョンなどがあり、具体的には水溶液または水／プロピレングリコール溶液が挙げられる。非経口の注射用として、液体調製物をポリエチレングリコール水溶液に溶かした溶液にすることができる。いくつかの実施態様では、医薬組成物を、安定なエマルジョン製剤（例えば油中水エマルジョンまたは水中油エマルジョン）または水性製剤にする。なおこのような製剤の中には、1種類以上の界面活性剤が含まれていることが好ましい。このようなエマルジョンでは、当業者によく知られている適切な界面活性剤を使用することができる。一実施態様では、組成物は、少なくとも1種類の界面活性剤を含むミセル分散液の形態である。そのようなミセル分散液において有効な界面活性剤として、リン脂質が挙げられる。リン脂質の具体例としては、ジアシルホスファチジルグリセロール（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（DPMG）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（DPPG）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（DSPG））；ジアシルホスファチジルコリン（例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（DPMC）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）、ジステアロイルホスファチジルコリン（DSPC）；ジアシルホスファチジン酸（例えば、ジミリストイルホスファチジン酸（DPMA）、ジパルミトイルホスファチジン酸（DPPA）、ジステアロイルホスファチジン酸（DSPA）；ジアシルホスファチジルエタノールアミン（例えば、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（DPME）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（DPPE）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（DSPE）などが挙げられる。他の具体例としては、エタノールアミンの誘導体（例えば上記のホスファチジルエタノールアミンまたはセファリン）、セリン（例えばホスファチジルセリン）、3'-O-リシルグリセロール（例えば3'-O-リシルホスファチジルグリセロール）などが挙げられるが、これだけに限られるわけではない。
【００４７】
経口投与に適した水溶液は、活性成分を水に溶かし、要望に応じて適切な着色剤、香料、安定剤、増粘剤を添加することによって調製できる。経口投与に適した水性懸濁液は、細かく分割した活性成分を、粘性材料（例えば天然ゴムまたは合成ゴム、樹脂、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム）および他のよく知られた懸濁剤とともに水に分散させることによって調製できる。
【００４８】
使用する少し前に経口投与用液体調製物の形態に変換する固体形態の調製物もある。そのような液体形態としては、溶液、懸濁液、エマルジョンなどが挙げられる。このような調製物は、活性成分に加え、着色剤、香料、安定剤、バッファ、人工甘味料、天然甘味料、分散剤、増粘剤、可溶化剤などを含むことができる。
【００４９】
医薬調製物は、単位投与量の形態であることが好ましい。そのような形態では、調製物は、適切な量の活性成分を含む単位投与量に分割されている。単位投与量の形態としては、パッケージされた調製物が可能である。このパッケージには、パックされた錠剤、カプセル、瓶またはアンプルに入った粉末など、分割された量の調製物が含まれている。単位投与量の形態としては、カプセル、錠剤、カシェ剤、ロゼンジをそのまま利用することも可能である。あるいはこれらのうちの任意のものが適切な数だけパッケージされた形態にすることもできる。
【００５０】
したがって本発明のアジュバント系は、例えば抗原に対する活発な免疫を誘導するなどして哺乳類、好ましくはヒトにおける疾患を治療または予防するためにワクチンおよび他の免疫促進組成物を製造して使用するのに特に適している。ワクチンの調製は十分に確立した技術であり、ワクチンの調製および製剤化に関する一般的な情報は、さまざまな文献から容易に入手することができる。一例として、Vollerらが編集した『New Trends and Developmencs in Vaccines展』、ユニバーシティ・パーク・プレス社、バルチモア、メリーランド州、アメリカ合衆国、1978年がある。
【００５１】
一実施態様では、本発明のワクチン組成物に含まれる抗原は、ペプチド、ポリペプチド、あるいはその免疫原性部である。この明細書における“免疫原性部”は、タンパク質のうちでB細胞および／またはT細胞の表面抗原受容体によって認識される（すなわち特異的に結合する）部分である。そのような免疫原性部は、一般に、抗原タンパク質またはその変異体の少なくとも5個のアミノ酸残基を含んでいる。なおアミノ酸残基の数は、少なくとも10個であることがより好ましく、少なくとも20個であることがさらに好ましい。
【００５２】
抗原ポリペプチドの免疫原性部は、一般に、よく知られた方法を利用して同定することができる。そのような方法は、例えばPaul、『Fundamental Immunology』、第3版、243〜247ページ（レイヴン・プレス社、1993年）とその中で引用されている参考文献にまとめられている。そのような方法として、ポリペプチドが、抗原特異的抗体、抗血清、T細胞系、T細胞クローンと反応する能力を有するかどうかをスクリーニングする方法がある。この明細書では、抗血清および抗体は、ある抗原と特異的に結合する（すなわちELISAまたは他のイムノアッセイにおいてそのタンパク質と反応するが、関係のないタンパク質とは検出可能な反応を起こさない）場合に“抗原特異的”と表現する。そのような抗血清および抗体は、よく知られた方法を利用し、この明細書に記載したようにして調製することができる。タンパク質の免疫原性部は、（例えばELISAおよび／またはT細胞反応アッセイにおいて）そのような抗血清および／またはT細胞と、完全長ポリペプチドの反応性よりも実質的に低くはないレベルで反応する部分である。この免疫原性部は、そのようなアッセイにおいて、完全長ポリペプチドの反応性と同程度またはそれ以上のレベルで反応することができる。このようなスクリーニングは、一般に、当業者によく知られた方法で行なうことができる。そのような方法は、例えばHarlowとLane、『Antibodies:A Labratory Manual』、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、1988年に記載されている。例えばポリペプチドを固体支持体に固定化し、患者の血清と接触させ、血清内の抗体を、固定化されたポリペプチドと結合させる。次に、結合しなかった血清を除去し、結合した抗体を、例えば125Iで標識したプロテインAを用いて検出する。
【００５３】
ペプチド抗体およびポリペプチド抗体は、よく知られた多彩な方法のうちの任意の方法を利用して調製される。DNA配列によってコードされる組み換えポリペプチドは、当業者に知られている多彩な発現ベクターのうちの任意のものを用い、単離したDNA配列から容易に調製することができる。発現は、組み換えポリペプチドをコードするDNA分子を含む発現ベクターで形質転換した適切な任意の宿主細胞、またはそのような発現ベクターをトランスフェクトした適切な任意の宿主細胞の中で実現することができる。適切な宿主細胞としては、原核細胞、酵母、進化した真核細胞（例えば哺乳類の細胞や植物細胞）などが挙げられる。使用する宿主細胞は、大腸菌、酵母、哺乳類の細胞系（例えばCOSやCHO）であることが好ましい。
【００５４】
約100個未満（より一般的には約50個未満）のアミノ酸を有するタンパク質抗原の一部および変異体は、当業者によく知られている合成手段で製造することもできる。例えばそのようなポリペプチドは、利用可能な固相法のうちの任意の方法（例えば成長しているアミノ酸鎖にアミノ酸が順番に付加されるというメリフィールド固相合成法）を利用して合成することができる。Merrifield、J Am. Chem. Soc.、第85巻、2146〜2149ページ、1963年を参照のこと。ポリペプチドの自動合成装置は、パーキン・エルマー／アプライド・バイオシステムズ・ディビジョン（フォスター・シティ、カリフォルニア州）などの製造業者から入手でき、その製造業者の指示に従って操作することができる。
【００５５】
いくつかの特別な実施態様では、本発明のワクチン組成物で使用するポリペプチド抗原を、2つ以上の異なるポリペプチドを含む融合タンパク質にすることができる。融合パートナーは、例えばTヘルパー・エピトープ（免疫融合パートナー）、好ましくはヒトによって認識されるTヘルパー・エピトープの提供を支援すること、あるいはタンパク質が生の組み換えタンパク質よりも高いレベルで発現するのを支援すること（発現エンハンサー）ができる。好ましいいくつかの融合パートナーは、免疫性があり発現を促進するという両方の性質を有する融合パートナーである。他の融合パートナーは、タンパク質の溶解度を増大させるように選択すること、あるいはタンパク質が望む細胞内区画を標的とするように選択することができる。さらに別の融合パートナーとしては、タンパク質の精製を容易にするアフィニティ・タグが挙げられる。
【００５６】
融合タンパク質は、一般に、標準的な方法（例えば化学的共役法）を利用して調製することができる。融合タンパク質は、組み換えタンパク質として発現し、発現系において非融合タンパク質よりも高いレベルで産生されることが好ましい。要するに、ポリペプチド要素をコードするDNA配列を別々に組み立てて連結し、適切な発現ベクターにすることができる。1つのポリペプチド要素をコードするDNA配列の3'末端を、ペプチド・リンカーを用いて、あるいは用いずに、第2のポリペプチド要素をコードするDNA配列の5'末端に連結し、配列のリーディング・フレームが互いに整合しているようにする。こうすることにより、両方のポリペプチド要素の生物活性を保持した単一の融合タンパク質に翻訳することができる。
【００５７】
ペプチド・リンカー配列を利用して第1と第2のポリペプチド要素を十分な距離離し、それぞれのポリペプチドが折り畳まれて二次構造および三次構造を取れるようにすることができる。そのようなペプチド・リンカー配列は、従来技術でよく知られた方法を利用して融合タンパク質に組み込む。適切なペプチド・リンカー配列は、以下の点を考慮して選択するとよい：（1）柔軟な伸長配置を取れること；（2）第1のポリペプチドまたは第2のポリペプチド上で機能性エピトープと相互作用する可能性のある二次構造を取れないこと；（3）ポリペプチド機能性エピトープと相互作用する可能性のある疎水性残基または荷電残基がないこと。好ましいペプチド・リンカー配列は、グリシン残基、アスパラギン残基、セリン残基を含んでいる。他のほぼ中性なアミノ酸（例えばトレオニンやアラニン）もリンカー配列で使用することができる。リンカーとして使用できる可能性のあるアミノ酸配列としては、Maratea他、Gene、第40巻、39〜46ページ、1985年；Murphy他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第83巻、8258〜8262ページ、1986年；アメリカ合衆国特許第4,935,233号と第4,751,180号に記載されているものが挙げられる。リンカー配列は、一般に長さがアミノ酸1個〜約50個である。第1と第2のポリペプチドが、機能的ドメインを分離して立体障害を防ぐのに使用できる重要でないN末端アミノ酸領域を有する場合には、リンカー配列は不要である。
【００５８】
好ましい一実施態様では、免疫融合パートナーは、グラム陰性細菌であるヘモフィルス・インフルエンザBの表面タンパク質であるプロテインDに由来する（WO 91/18926）。プロテインD誘導体は、このタンパク質の最初の約1/3（例えばN末端から100〜110個のアミノ酸）を含んでいることが好ましい。プロテインD誘導体は、脂質化することができる。好ましいいくつかの実施態様では、リポプロテインD融合パートナーの最初の109残基がN末端に含まれているため、ポリペプチドに追加の外来性T細胞エピトープを提供して大腸菌内での発現レベルを増大させる（したがって発現エンハンサとして機能する）。脂質尾部により、抗原提示細胞に対して抗原が最適状態で提示される。他の融合パートナーとしては、インフルエンザウイルスNS1（赤血球凝集素）からの非構造タンパク質が挙げられる。一般にN末端の81個のアミノ酸が使用されるが、Tヘルパー・エピトープを含む別のフラグメントを使用することもできる。
【００５９】
別の実施態様では、免疫融合パートナーは、LYTAとして知られるタンパク質、またはその一部（C末端部分であることが好ましい）である。LYTAは、肺炎連鎖球菌に由来する。肺炎連鎖球菌は、（LytA遺伝子によってコードされている）アミダーゼLYTA（Gene、第43巻、265〜292ページ、1986年）として知られるN-アセチル-L-アラニン・アミダーゼを合成する。LYTAはペプチドグリカン骨格に存在するある種の結合を特異的に分解する自己溶菌酵素である。LYTAタンパク質のC末端ドメインは、コリンまたはある種のコリン・アナログ（例えばDEAE）に対する親和性にとって重要である。この性質は、融合タンパク質の発現に役立つ大腸菌のC-LYTA発現プラスミドを作るために開発された。アミノ末端にC-LYTAフラグメントを含むハイブリッドタンパク質の精製については、すでに報告されている（Biotechnology、第10巻、795〜798ページ、1992年を参照のこと）。好ましい一実施態様では、LYTAの繰り返し部分を融合タンパク質に組み込むことができる。1つの繰り返し部分が、C末端領域の178番目の残基から始まる部分に見いだされる。特に好ましい繰り返し部分は、残基188〜305を含んでいる。
【００６０】
本発明の別の実施態様では、この明細書に記述したアジュバント系を使用して、DNAをベースとしたワクチン組成物を調製する。このタイプの代表的なワクチンは1つ以上のポリペプチド抗原をコードするDNAを含んでいるため、抗原がその場で生成される。DNAは、当業者に知られている核酸発現系、細菌発現系、ウイルス発現系などの多彩なデリバリー系のうちのどの中に存在していてもよい。多数の遺伝子デリバリー法が従来技術として知られている。例えば、Rolland、Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems、第15巻、143〜198ページ、1998年や、その中で引用されている参考文献に記載されている方法がある。適切な核酸発現系は、患者の体内で発現させるのに必要なDNA配列（例えば適切なプロモータや終止シグナル）を含んでいる。細菌デリバリー系には、細胞表面にポリペプチドの免疫原性部を発現したり、そのようなエピトープを分泌したりする細菌（例えばカルメット-ゲラン菌）の投与も含まれる。好ましい一実施態様では、ウイルス発現系（例えば、ワクシニアウイルスなどのポックスウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス）を用いてDNAを導入する。ウイルス発現系では、一般に、非病原性で（欠陥のある）複製可能なウイルスを用いる。発現系の具体例が開示されているのは、例えばFisher-Hoch他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第86巻、317〜321ページ、1989年；Flexner他、Ann. N.Y. Acad. Sci.、第569巻、86〜103ページ、1989年；Flexner他、Vaccine、第8巻、17〜21ページ、1990年；アメリカ合衆国特許第4,603,112号、第4,769,330号、第5,017,487号；WO 89/01973；アメリカ合衆国特許第4,777,127号；イギリス特許第2,200,651；ヨーロッパ特許0,345,242号；WO 91/02805；Berkner、Biotechniques、第6巻、616〜627ページ、1988年；Rosenfeld他、Science、第252巻、431〜434ページ、1991年；Kolls他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第91巻、215〜219ページ、1994年；Kass-Eisler他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第90巻、11498〜11502ページ、1993年；Guzman他、Circulation、第88巻、2838〜2848ページ、1993年；Guzman他、Cir. Res.、第73巻、1202〜1207ページ、1993年である。DNAをこのような発現系に組み込む方法は、当業者には周知である。
【００６１】
別の方法として、DNAは“裸”であってもよい。そのことについては、例えばUlmer他、Science、第259巻、1745〜1749ページ、1993年に記載されており、Cohen、Science、第259巻、1691〜1692ページ、1993年に概説されている。裸のDNAの取り込みを増大させるには、細胞内に効果的に運び込まれる生物分解性ビーズの表面にそのDNAをコーティングするとよい。望むのであればワクチンがポリヌクレオチド成分とポリペプチド成分の両方を含んでいてもよいことは明らかであろう。
【００６２】
さらに、ワクチンが、望むポリヌクレオチド抗原、および／またはポリペプチド抗原、および／または炭水化物抗原の薬理学的に許容可能な塩を含んでいてもよいことも明らかであろう。例えばそのような塩は、薬理学的に許容可能な非毒性塩基から調製することができる。非毒性塩基としては、有機塩（例えば第一級アミンの塩、第二級アミンの塩、第三級アミンの塩、塩基性アミノ酸）または無機塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩）が挙げられる。
【００６３】
本発明のアジュバント系は、投与したとき、広範な投与量ならびに広範な比で強力なアジュバント効果を示す。
【００６４】
それぞれのワクチン投与量に含まれる抗原の量は、一般に、典型的なワクチンにおける好ましからぬ副作用が顕著に現われることなしに防御免疫応答を誘導するような量にする。そのような量は、具体的にどのような免疫原を使用するかと、その免疫原をどのように提示するかによって異なることになろう。一般に、それぞれの投与量には、タンパク質が、約1〜1000μg、より典型的には約2〜100μg、好ましくは5〜50μg含まれることになると考えられる。もちろん投与量は、年齢、体重、現在行なっている治療のタイプ（もし行なっているのであれば）、投与する抗原の性質によって異なる可能性がある。
【００６５】
本発明による所定量のワクチン組成物の免疫活性は、例えばワクチン組成物で使用する抗原に対する抗体の力価をモニターすることによって容易に明らかにすることができる（Dalsgaard, K.、Acta Veterinia Scandinavica、第69巻、1〜40ページ、1978年）。別の一般的な方法は、CD-1マウスの皮膚内にさまざまな量のワクチン組成物を注射し、後でそのマウスから血清を回収して抗免疫原抗体を（例えばELISAによって）調べる操作を含んでいる。これらの方法や他の似た方法は、当業者には明らかであろう。
【００６６】
抗原は、感染性疾患であるか、自己免疫疾患であるか、どのような症状であるか、がんであるか、病原体が何であるか、どのワクチン組成物で治療すべき疾患であるかに応じ、望ましいほぼ任意の供給源から取り出すことおよび／または単離することができる。抗原は、いろいろなウイルスから取り出すことができる。ウイルスとしては、例えばインフルエンザウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ヒトHIV-1、ヒトHIV-2、単純ヘルペスウイルス・タイプ2、ヒトサイトメガロウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス、RSウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、狂犬病ウイルス、はしかウイルス、口蹄疫ウイルスなどがある。代表的な抗原は、いろいろな細菌からも取り出すことができる。細菌としては、例えば炭疸菌、ジフテリア菌、ライム病を起こす細菌、マラリア菌、結核菌、リーシュマニア属、クルーズトリパノソーマ、エールリヒア属、カンジダ属などのほか、原生動物（例えばバベシア・ボビスやプラスモジウム）などがある。抗原は、一般に、例えばペプチド、ポリペプチド、タンパク質の形態をした天然または合成のアミノ酸で構成されているが、多糖で構成することや、アミノ酸と多糖の混合物で構成することもできる。代表的な抗原は、天然の供給源から単離すること、固相合成によって合成すること、組み換えDNA法によって得ることができる。
【００６７】
別の実施態様では、本発明のワクチン組成物において腫瘍抗原を利用し、がんの予防および／または治療を行なう。がん細胞は、その表面にはっきりと区別できる抗原を有することがしばしばある。抗原としては例えば切断された上皮増殖因子、葉酸結合タンパク質、上皮ムチン、メラノフェリン、癌胎児性抗原、前立腺特異的膜抗原、HER2-neuがあり、これらはがん治療用ワクチンで使用するための候補である。腫瘍抗原は身体の正常な要素であるか、正常な要素と関係があるため、免疫系は、これら抗原に対して効果的な免疫応答を行なって腫瘍細胞を破壊するのに失敗することがしばしばある。このような応答を実現するためには、この明細書に記載したアジュバント系を用いることができる。その結果、外来性タンパク質が内在性抗原の処理経路に入ることができ、細胞溶解性または細胞傷害性のあるT細胞（CTL）が産生される。このアジュバント効果により、免疫感作に使用される腫瘍抗原を表面に有する腫瘍細胞を探して破壊する抗原特異的CTLの産生が促進される。この方法を利用できる代表的ながんの種類は、前立腺がん、大腸がん、乳がん、卵巣がん、膵臓がん、脳腫瘍、頭および首のがん、黒色腫、白血病、リンパ腫などである。
【００６８】
本発明の別の実施態様では、特に免疫が弱っている患者の慢性感染性疾患の治療を目的として免疫系を強化するため、本発明のアジュバント系を単独で（すなわち抗原を同時に投与することなく）投与することができる。この方法を治療または予防に用いることのできる可能性のある感染性疾患の代表例は、アメリカ合衆国特許第5,508,310号に見いだすことができる。このようにして免疫系を強化することは、院内感染および／または手術後感染のリスクを小さくするための予防的手段としても有効である。
【００６９】
別の実施態様では、ワクチン組成物の中に存在する抗原は外来性抗原ではなくて自己抗原であるため、例えばワクチン組成物は、自己免疫疾患用である。自己免疫疾患としては、例えば1型糖尿病、従来型の臓器特異的自己免疫疾患、神経性疾患、リウマチ疾患、乾癬、結合組織疾患、自己免疫性血球減少症や、これら以外の自己免疫疾患がある。従来型の臓器特異的自己免疫疾患としては、甲状腺炎（グレーブス+橋本甲状腺炎）、胃炎、副腎炎（アディソン副腎炎）、卵巣炎、原発性胆汁性肝硬変、重症筋無力症、生殖腺不全、副甲状腺機能低下症、脱毛症、吸収不良症候群、悪性貧血、肝炎、抗受容体抗体疾患、白斑などがある。神経性疾患としては、統合失調症、アルツハイマー病、鬱、下垂体機能低下症、尿崩症、乾燥症候群、多発性硬化症などがある。リウマチ疾患／結合組織疾患としては、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（SLE）またはループス、強皮症、多発性筋炎、炎症性腸疾患、皮膚筋炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、脈管炎、乾癬性関節炎、剥脱性乾癬性皮膚炎、尋常性天疱瘡、シェーグレン症候群などがある。他の自己免疫関連疾患としては、自己免疫性ぶどう膜網膜炎、糸球体腎炎、心筋梗塞心臓切開後症候群、肺ヘモジデリン沈着症、アミロイド症、サルコイドーシス、アフタ性口内炎や、この明細書に提示した他の免疫関連疾患、関連分野で知られている他の免疫関連疾患などがある。
【００７０】
当業者に知られている適切な任意の基剤を本発明のワクチン組成物で使用できるが、基剤のタイプは、一般に望む投与方法が何であるかに応じて異なることになろう。本発明のワクチン組成物は、適切などのような投与方法（例えば局所投与、経口投与、鼻腔内投与、静脈内投与、頭蓋内投与、腹腔内投与、皮膚内投与、皮下投与、筋肉内投与）にも合うように製剤化することができる。非経口投与（例えば皮下注射）用として、基剤は、水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ろう、バッファのいずれかを含んでいることがしばしばある。経口投与のためには、上記の基剤がしばしば使用される。あるいは固体基剤として、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムも使用することができる。生物分解性マイクロスフェア（例えばポリグリコラート・ポリラクタート）も、本発明による組成物のための基剤として使用することができる。適切な生物分解性マイクロスフェアは、例えばアメリカ合衆国特許第4,897,268号、第5,075,109号、第5,928,647号、第5,811,128号、第5,820,883号、第5,853,763号、第5,814,344号、第5,942,252号に開示されている。なおこれら特許文献の内容は、参考としてその全体がこの明細書に組み込まれているものとする。修飾したB型肝炎のコア・タンパク質基剤系も基剤として適している。これについては、WO 99/40934と、その中で引用されている参考文献に記載されており、参考としてその全体がこの明細書に組み込まれているものとする。クラスIに制限された細胞傷害性Tリンパ球応答を宿主に誘導することができる粒子状タンパク質複合体（例えばアメリカ合衆国特許第5,928,647号に記載されているもの、なおこの特許文献の内容は、参考としてこの明細書にその全体が組み込まれているものとする）を含む基剤も使用することができる。
【００７１】
代表的な一実施態様では、ワクチン製剤は、免疫応答を引き出すために粘膜に投与するが、中でも口蓋、特に舌下部位に投与することが好ましい。口蓋への投与は、非侵襲的投与法であるために簡便であるという理由で、伝統的な非経口供給よりも多くの場合に好ましかろう。さらに、この方法により、粘膜の免疫を引き出す手段が提供される。これは、伝統的な非経口供給では実現が難しいことがしばしばある。また、粘膜の免疫により、空気によって運ばれる病原体および／またはアレルゲンから保護することができる。口蓋投与の別の利点は、舌下にワクチンを供給することで、特に小児科や、アレルギー感作療法などのように長期にわたって多数回の注射を一般に必要とするような分野において、患者のコンプライアンスが改善する可能性があることである。
【００７２】
ワクチン組成物にさらに含まれていてよいものは、バッファ（例えば中性の緩衝生理食塩水、リン酸緩衝溶液、リン酸バッファw/o生理食塩水）、炭水化物（例えばグルコース、マンノース、スクロース、デキストラン）、マンニトール、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸（例えばグリシン）、酸化防止剤、静菌剤、キレート剤（EDTAやグルタチオン）、アジュバント（例えば水酸化アルミニウム）、製剤を患者の血液と等張、低張、わずかに高張のいずれかにする溶質、懸濁剤、増粘剤、保存剤である。本発明のワクチン組成物は、よく知られた方法を利用してリポソームの中に封じ込めることもできる。
【００７３】
したがって一実施態様では、ワクチン組成物は、1種類以上の界面活性剤を有効量含む水性製剤である。例えばこの組成物は、少なくとも1種類の適切な界面活性剤（例えばリン脂質界面活性剤）を含むミセル分散液の形態にすることができる。リン脂質の具体例としては、ジアシルホスファチジルグリセロール（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（DPMG）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（DPPG）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（DSPG））；ジアシルホスファチジルコリン（例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（DPMC）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）、ジステアロイルホスファチジルコリン（DSPC）；ジアシルホスファチジン酸（例えば、ジミリストイルホスファチジン酸（DPMA）、ジパルミトイルホスファチジン酸（DPPA）、ジステアロイルホスファチジン酸（DSPA）；ジアシルホスファチジルエタノールアミン（例えば、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（DPME）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（DPPE）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（DSPE）などが挙げられる。
【００７４】
一般に、水性製剤中の界面活性剤：アジュバントのモル比は約10：1〜約1：10であるが、より一般的なのは約5：1〜約1：5である。しかし、特定の目的に最適となるよう、効果的な任意の量の界面活性剤を水性製剤で使用することができる。
【００７５】
別の実施態様では、組成物はエマルジョン（例えば油中水エマルジョンまたは水中油エマルジョン）である。このようなエマルジョンは、一般に当業者によく知られている。
【００７６】
本発明のアジュバント系は、唯一のアジュバント系として使用すること、あるいは他のアジュバントまたは免疫エフェクターと合わせて投与することが可能である。例えばアジュバントとしては、特に、油をベースとしたアジュバント（例えばフロイント完全アジュバントやフロイント不完全アジュバント）、リポソーム、無機塩（例えばAlK(SO4)2、AlNa(SO4)2、AlNH4(SO4)、シリカ、ミョウバン、Al(OH)3、Ca3(PO4)2、カオリン、炭素）、ポリヌクレオチド（例えばポリIC酸、ポリAU酸）、ポリマー（例えば非イオン性ブロックポリマー、ポリホスファゼン、シアノアクリレート、ポリメラーゼ-(DL-ラクチド-コ-グリコシド)が挙げられる。アジュバントとしてはさらに、ある種の天然物質（例えば脂質Aとその誘導体、ヒト型結核菌からのろうDのほか、コリネバクテリウムパルブム、百日咳菌、ブルセラ属のメンバーで見いだされる物質）、ウシ血清アルブミン、ジフテリア・トキソイド、破傷風トキソイド、エデスチン、スカシガイのヘモシアニン、シュードモナス属のトキシンA、コレラゲノイド、コレラ毒素、百日咳毒素、ウイルス・タンパク質、真核生物のタンパク質（例えばインターフェロン、インターロイキン、腫瘍壊死因子）なども挙げられる。このようなタンパク質は、当業者によく知られた方法に従い、天然の供給源または組み換え供給源から得ることができる。組み換え供給源から得られるアジュバントは、タンパク質のうちの少なくとも免疫刺激部分を含むフラグメントを含んでいるとよい。本発明を実施する際に使用できる公知の他の免疫刺激巨大分子としては、多糖、tRNA、代謝不能な合成ポリマー（例えばポリビニルアミン、ポリメタクリル酸、ポリビニルピロリドン、4',4-ジアミノジフェニルメタン-3,3'-ジカルボン酸と4-ニトロ-2-アミノ安息香酸の（分子量の比較的大きな）重縮合混合物（Sela, M.、Science、第166巻、1365〜1374ページ、1969年を参照のこと））、糖脂質、脂質、炭水化物などが挙げられる。
【００７７】
一実施態様では、アジュバント系は、Th1タイプの免疫応答を優勢に誘導するよう設計することが好ましい。Th1タイプのサイトカイン（例えばIFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-12）が高レベルだと、投与された抗原に対して細胞媒介性免疫応答を誘導する傾向がある。逆に、Th2タイプのサイトカイン（例えばIL-4、IL-5、IL-6、IL-10）が高レベルだと、体液性免疫を誘導する傾向がある。この明細書に記載したワクチンを適用すると、患者はTh1タイプとTh2タイプの応答を含む免疫応答を支援することになる。Th1タイプの応答が優勢である好ましい一実施態様では、Th1タイプのサイトカインのレベルが、Th2タイプのサイトカインのレベルよりも増大することになる。これらサイトカインのレベルは、標準的なアッセイを利用して容易に評価することができる。サイトカイン・ファミリーの概説に関しては、MosmannとCoffman、Ann. Rev. Immunol.、第7巻、145〜173ページ、1989年を参照のこと。
【００７８】
例えば優勢なTh1タイプの応答を引き出すのに用いる追加のアジュバントとしては、例えばモノホスホリル脂質A（例えば3-デ-O-アクリル化モノホスホリル脂質A（3D-MPL）とアルミニウム塩の組み合わせが挙げられる。MPLアジュバントは、コリクサ社（シアトル、ワシントン州；アメリカ合衆国特許第4,436,727号、第4,877,611号、第4,866,034号、第4,912,094号を参照のこと）から入手できる。（CpGジヌクレオチドがメチル化されていない）CpG含有オリゴヌクレオチドも、Th1タイプが優勢な応答を誘導する。このようなオリゴヌクレオチドは周知であり、例えばWO 96/02555、WO 99/33488、アメリカ合衆国特許第6,008,200号と第5,856,462号に記載されている。免疫促進DNA配列は、例えばSato他、Science、第273巻、352ページ、1996年にも記載されている。ワクチン組成物に含めることのできる他の代表的なアジュバントとしては、ISA 720（セピック社、フランス）、SAF（カイロン社、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）、ISCOMS（CSL社）、MF-59（カイロン社）、デトックス（登録商標）アジュバント（コリクサ社、ハミルトン、マサチューセッツ州）などがある。
【００７９】
この明細書に記載した組成物は、持続放出製剤（すなわち投与後に化合物をゆっくりと放出する（例えば多糖で構成された）カプセル、スポンジ、ゲルなどの製剤）の一部として投与することができる。このような製剤は、一般に、よく知られた方法（例えばCoombes他、Vaccine、第14巻、1429〜1438ページ、1996年を参照のこと）を利用して調製することができ、例えば経口、直腸、皮下埋め込みによる投与や、望む標的部位に埋め込むことによる投与が可能である。持続放出製剤は、基剤マトリックスに分散させたポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、および／または速度制御膜で取り囲んだリザーバに含まれたポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体を含むことができる。このような製剤で使用される基剤は、生体適合性があり、さらに生物分解性であってもよい。この製剤は、活性成分の放出レベルが比較的一定であることが好ましい。基剤としては、ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)、ポリアクリレート、ラテックス、デンプン、セルロース、デキストランなどの微粒子が挙げられる。他の遅延放出用基剤としては、非液体親水性コア（例えば架橋した多糖またはオリゴ糖）を含み、両親媒性化合物（例えばリン脂質）を含む外側層を必要に応じてさらに含む超分子バイオベクターが挙げられる（例えばアメリカ合衆国特許第5,151,254号、PCT出願WO 94/20078、WO 94/23701、WO 96/06638を参照のこと）。持続放出製剤に含まれる活性化合物の量は、埋め込み部位、放出速度、放出の予測持続期間、治療または予防しようとする症状の性質に応じて異なるであろう。
【００８０】
細胞を標的とした抗原特異的免疫応答が容易に起こるようにするため、多数ある公知のデリバリー用ビヒクルのうちの任意のものを医薬組成物とワクチンで使用することができる。デリバリー用ビヒクルとして抗原提示細胞（APC）がある。具体的には、樹状細胞、マクロファージ、B細胞、単球のほか、効果的なAPCにすることのできる可能性のある他の細胞である。このような細胞は、遺伝子を改変して抗原提示能力を増大させ、および／またはT細胞の応答の活性化および／または維持を改善し、および／または抗標的効果そのものを持たせ、および／または受容者（すなわちHLAハプロタイプが一致した人）と免疫適合性であるようにすることができるが、必ずしもそうする必要はない。APCは、一般に、さまざまな体液および器官（腫瘍組織、腫瘍周辺組織を含む）のうちの任意のものから単離することができる。APCとしては、自己細胞、同種異系細胞、同系細胞、異種細胞のいずれも可能である。
【００８１】
本発明の好ましいいくつかの実施態様では、抗原提示細胞として樹状細胞またはその前駆細胞を使用する。樹状細胞は非常に強力なAPCであり（BanchereauとSteinman、Nature、第392巻、245〜251ページ、1998年）、予防または治療を目的として抗腫瘍免疫を引き出すための生理学的アジュバントとして効果的であることがわかっている（TimmermanとLevy、Ann. Rev. Med.、第50巻、507〜529ページ、1999年を参照のこと）。一般に、樹状細胞は、典型的な形状（その場では星型で、試験管内ではよく目立つ細胞質プロセス（樹状突起）が見られる）と、抗原を高効率で取り込み、処理し、提示する能力と、ナイーブT細胞の応答を活性化する能力とに基づいて同定することができる。樹状細胞は、もちろん、遺伝子工学により、生体内または生体外にある樹状細胞には一般に見られない特別な細胞表面受容体またはリガンドを発現するようにできる。本発明では、そのように改変された樹状細胞を考える。樹状細胞の代わりに、分泌された小胞抗原を伴った樹状細胞（エキソソームと呼ばれる）をワクチンで使用することもできる（Zitvogel他、Nature Med.、第4巻、594〜600ページ、1998年を参照のこと）。
【００８２】
樹状細胞とその前駆細胞は、末梢血、骨髄、腫瘍浸潤細胞、腫瘍周辺組織浸潤細胞、リンパ節、脾臓、皮膚、臍帯血や、他の適切な任意の組織または体液から取得することができる。例えば樹状細胞は、末梢血から回収した単球の培養物にサイトカイン（例えばGM-CSF、IL-4、IL-13、TNF-α）の組み合わせを添加することにより、生体外で分化させることができる。別の方法として、末梢血、臍帯血、骨髄から回収したCD34陽性細胞は、GM-CSF、IL-3、TNF-α、CD40リガンド、LPS、flt3リガンド、および／または樹状細胞の分化、成熟、増殖を誘導する他の化合物の組み合わせを培地に対して添加することにより、樹状細胞に分化させることができる。
【００８３】
樹状細胞は、便宜上“未熟”細胞と“成熟”細胞に分類される。これは、2つのよく特徴づけられた表現型を区別する簡単な方法である。しかしこの名づけ方で分化に関する可能な中間段階がすべて網羅されると考えてはならない。未熟な樹状細胞は、抗原の取り込みと処理に関して高い能力を有するAPCであるという特徴がある。これは、Fcγ受容体とマンノース受容体の高い発現と関係している。成熟表現型は、一般に、これらマーカーの発現に関してはより少ないが、T細胞の活性化にとって重要な細胞表面分子（クラスIとクラスIIのMHC、接着分子（例えばCD54、CD11）、共刺激分子（例えばCD40、CD80、CD86、4-1BB））が多く発現するという特徴を有する。
【００８４】
一般に、APCには抗原ポリペプチド（またはその一部、または変異体）をコードするポリヌクレオチドをトランスフェクトし、この抗原ポリペプチドまたはその免疫部分が細胞表面に発現するようにする。このようなトランスフェクションは生体外で行なうことができる。このようにトランスフェクションを行なった細胞とこの明細書に記載したアジュバントを含む組成物またはワクチンは、治療を目的として使用することができる。別の方法として、樹状細胞または他の抗原提示細胞を標的とする遺伝子デリバリー用ビヒクルを患者に投与し、生体内でトランスフェクションが起こるようにすることもできる。例えば生体内および生体外における樹状細胞のトランスフェクションは、一般に、従来技術で知られている任意の方法（例えばWO 97/24447に記載されている方法）、あるいはMahvi他（Immunology and Cell Biology、第75巻、456〜460ページ、1997年）によって記載されている遺伝子銃法を用いて行なうことができる。抗原を伴った樹状細胞にするには、樹状細胞またはその前駆細胞を、抗原ポリペプチド、DNA（裸のもの、またはプラスミド・ベクターに含まれているもの）、RNAのいずれかとともにインキュベートするか、あるいは抗原を発現する組み換え細菌または組み換えウイルス（例えばワクシニア・ベクター、禽痘ベクター、アデノウイルス・ベクター、レンチウイルス・ベクター）とともにインキュベートするとよい。樹状細胞に抗原を伴った状態にする前に、ポリペプチドを、T細胞の支援役（例えば担体分子）となる免疫パートナーと共有結合させておくとよい。別の方法として、ポリペプチドとは別に、あるいはポリペプチドの存在下で、樹状細胞に非結合免疫パートナーをパルス状に与えることもできる。
【００８５】
一酸化窒素関連疾患の治療
本発明の一態様により、一酸化窒素による疾患または症状、中でも虚血や再灌流傷害を治療する方法が提供される。この方法は、そのような治療を必要としている患者に対して本発明の化合物を効果的な量投与する操作を含んでいる。iNOS遺伝子に関する転写とタンパク質合成の誘導因子は、炎症を促進するために幾分か毒性があり、動物およびヒトに対する許容性がほとんどないことが一般に認められている。エンドトキシン（LPS）と炎症性サイトカイン（例えばIL-1、TNF-α、IFN-γ）は、iNOSの誘導因子であることが知られている。そのすべてが元々毒性を持ち、動物に投与したとき、全身炎症応答、成人呼吸促進症候群、多臓器不全、心臓血管崩壊を誘導することができる。
【００８６】
MPL（登録商標）免疫促進剤の心臓保護活性を調べることにより、一酸化窒素シンターゼ（iNOS）の誘導が、本発明の化合物による遅延心臓保護効果において重要であることがわかった。さらに、おそらくNOSの構成的プールを通じて起こる一酸化窒素（NO）シグナルの伝達は、本発明の化合物による急性心臓保護効果において重要である。MPL（登録商標）免疫促進剤の残留エンドトキシン様活性を考慮すると、本発明の化合物が一酸化窒素のシグナル伝達を誘導できる可能性のあることは、驚くにあたらない。さらに、一酸化窒素シグナルの伝達は、虚血をあらかじめ制御して心臓保護を引き出すための潜在的経路であることが示唆されている。この所見と一酸化窒素のドナーが心臓保護効果を有するという事実が組み合わさり、NOS/NO経路が、MPL（登録商標）免疫促進剤が心臓を保護する経路となっていることがさらに支持される。
【００８７】
本発明の化合物は、一酸化窒素によって変化または改善が生じる疾患または症状、中でも虚血や再灌流傷害を治療する方法において役に立つ（アミノアルキルグルコサミニドリン酸の心臓保護効果と、心臓保護特性のアッセイ法に関しては、2001年3月14日に出願されたアメリカ合衆国特許出願シリアル番号第09/808669号を参照のこと）。
【実施例】
【００８８】
以下の実施例は説明のためのものであり、本発明の範囲がこれら実施例に限定されることはない。
実施例１
N-[(R)-3-テトラデカノイルオキシテトラデカノイル]-(S)-2-ピロリジニルメチル 2-デオキシ-4-O-ホスホノ-2-[(R)-3-テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-3-O-[(R)-3-テトラデカノイルオキシテトラデカノイル]-β-D-グルコピラノシドトリエチルアンモニウム塩；一般式（II）で表わされる化合物のトリエチルアンモニウム塩の調製
【００８９】
（1a）乾燥1,2-ジクロロエタン（10ml）に2-デオキシ-4-O-ジフェニルホスホノ-3-O-[(R)-3-テトラデカノイルオキシテトラデカノイル]-6-O-(2,2,2-トリクロロ-1,1-ジメチルエトキシカルボニル)-2-(2,2,2-トリクロロエトキシカルボニルアミノ)-β-D-グルコピラノシルブロミド（1.05g、0.81ミリモル）を溶かした溶液に、4オングストロームの分子篩（0.5g）、無水CaSO4（2.2g、16ミリオル）、N-[(R)-3-テトラデカノイルオキシテトラデカノイル]-(S)-2-ピロリジンメタノール（0.40g、0.75ミリモル）を添加した。得られた混合物を室温にて1時間にわたって撹拌し、Hg(CN)2（1.02g、4.05ミリモル）で処理し、加熱して暗所で16時間にわたって還流させた。この反応混合物を冷却し、CH2Cl2で希釈し、濾過した。濾液を1NのKI水溶液で洗浄し、乾燥させ（Na2SO4）、濃縮した。シリカゲル上でのフラッシュ・クロマトグラフィ（勾配溶離液、15→20％EtOAc／ヘキサン）により、N-[(R)-3-テトラデカノイルオキシテトラデカノイル]-(S)-2-ピロリジニルメチル 2-デオキシ-4-O-ジフェニルホスホノ-3-O-[(R)-3-テトラデカノイルオキシテトラデカノイル]-6-O-(2,2,2-トリクロロ-1,1-ジメチルエトキシカルボニル)-2-(2,2,2-トリクロロエトキシカルボニルアミノ)-β-D-グルコピラノシドがアモルファスな固形物として0.605g（43％）得られた。
【００９０】
（1b）AcOH（10ml）に上の（1a）で調製した化合物（0.50g、0.29ミリモル）を溶かした60℃の溶液を、三等分した亜鉛ダスト（0.98g、15ミリモル）で1時間にわたって処理した。この反応混合物を冷却し、超音波処理し、セライト・パッドで濾過し、濃縮した。得られた残留物をCH2Cl2と飽和NaHCO3水溶液に分配すると層に分離した。有機層を乾燥させ（Na2SO4）、濃縮した。得られた粗アミノアルコールと(R)-3-テトラデカノイルオキシテトラデカン酸（0.155g、0.34ミリモル）をCH2Cl2（3.5ml）に溶かした溶液を、粉末にした4オングストロームの分子篩（0.25g）とともに0.5時間にわたって撹拌した後、2-エトキシ-1-エトキシカルボニル-1,2-ジヒドロキノリン（0.11g、0.44ミリモル）で処理した。得られた混合物を室温にて8時間にわたって撹拌し、セライトで濾過し、濃縮した。50％EtOAc/ヘキサンを用いてシリカゲル上のフラッシュ・クロマトグラフィを行なうと、N-[(R)-3-テトラデカノイルオキシテトラデカノイル]-(S)-2-ピロリジニルメチル 2-デオキシ-4-O-ジフェニルホスホノ-2-[(R)-3-テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-3-O-[(R)-3-テトラデカノイルオキシテトラデカノイル]-β-D-グルコピラノシドが無色のシロップとして0.355g（68％）得られた。
【００９１】
（1c）AcOH（1ml）とテトラヒドロフラン（9ml）の混合物に上の（1b）で調製した化合物（0.300g、0.166ミリモル）を溶かした溶液を、PtO2（0.15g）の存在下で室温にて70psigで18時間にわたって水素化した。この反応混合物をCHCl3-MeOH（2：1、50ml）で希釈し、超音波処理を短時間行なった。触媒を回収し、CHCl3-MeOH（2：1）で洗浄し、1つにまとめた濾液と洗浄液を濃縮した。CHCl3-MeOH-H2O-Et3N（90：10：0.5：0.5）を用いてシリカゲル上のフラッシュ・クロマトグラフィを行なうと、部分的に精製された生成物が得られたため、それを氷で冷やしたCHCl3-MeOH（2：1、30ml）に溶かし、氷で冷やした0.1NのHCl水溶液（12ml）で洗浄した。有機相を濾過し、2％Et3N水溶液（5ml、発熱物質なし）から凍結乾燥させると、N-[(R)-3-テトラデカノイルオキシテトラデカノイル]-(S)-2-ピロリジニルメチル 2-デオキシ-4-O-ホスホノ-2-[(R)-3-テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-3-O-[(R)-3-テトラデカノイルオキシテトラデカノイル]-β-D-グルコピラノシドトリエチルアンモニウム塩が無色の粉末として0.228g（79％）得られた：融点67−70℃；IR（フィルム）3306、2955、2923、2853、1736、1732、1644、1548、1466、1378、1245、1177、1110、1053、844 cm-1；1H NMR (CDCl3-CD3OD)δ0.88 (m, 18H)、1.0−2.05 (mH)、2.20−2.70 (m, 12H)、3.06 (q, 6H, J=7.2Hz)、3.3−3.25 (mH)、4.52 (d, 1H, J=8Hz)、5.05−5.28 (m, 4H)、7.44 (d, 1H, J=9Hz)；13C NMR (CDCl3)δ173.3、173.0、170.3、169.6、168.6、101.8、100.4、75.8、72.5、72.4、70.9、70.8、70.3、70.2、69.9、69.3、67.9、66.6、56.5、56.3、54.5、47.4、45.8、44.6、41.4、41.0、39.7、39.2、39.0、34.5、34.3、34.1、32.0、29.7、29.4、28.1、27.3、25.7、25.3、25.2、25.1、24.0、22.7、21.6、14.1、8.6。
【００９２】
C101H194N3O17P・H2Oについての計算値：C、68.47；H、11.15；N、2.37；P、1.75。実際の分析値：C、68.79；H、11.00；N、2.24；P、1.97。
【００９３】
実施例２
N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-(S)-2-ピロリジニルメチル 2-デオキシ-4-O-ホスホノ-2-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-3-O-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-β-D-グルコピラノシドトリエチルアンモニウム塩；一般式（III）で表わされる化合物のトリエチルアンモニウム塩の調製
【００９４】
（2a）乾燥1,2-ジクロロエタン（3.2ml）に2-デオキシ-4-O-ジフェニルホスホノ-3-O-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-6-O-(2,2,2-トリクロロ-1,1-ジメチルエトキシカルボニル)-2-(2,2,2-トリクロロエトキシカルボニルアミノ)-α-D-グルコピラノシルブロミド（1.60g、1.27ミリモル）を溶かした溶液に、4オングストロームの分子篩（0.6g）、無水CaSO4（1.0g、7.3ミリモル）、N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-(S)-2-ピロリジンメタノール（0.58g、1.14ミリモル）を添加した。得られた混合物を室温にて1時間にわたって撹拌し、Hg(CN)2（0.58g、2.3ミリモル）で処理し、加熱して暗所で6時間にわたって還流させた。この反応混合物を冷却し、CH2Cl2で希釈し、セライト床で濾過した。濾液を1NのKI水溶液で洗浄し、乾燥させ（Na2SO4）、濃縮した。シリカゲル上でのフラッシュ・クロマトグラフィ（勾配溶離液、25→35％EtOAc／ヘキサン）により、N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-(S)-2-ピロリジニルメチル 2-デオキシ-4-O-ジフェニルホスホノ-3-O-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-6-O-(2,2,2-トリクロロ-1,1-ジメチルエトキシカルボニル)-2-(2,2,2-トリクロロエトキシカルボニルアミノ)-β-D-グルコピラノシドが無色の油として1.72g（82％）得られた。
【００９５】
（2b）AcOH（40ml）に上の（2a）で調製した化合物（1.58g、0.806ミリモル）を溶かした60℃の溶液を、三等分した亜鉛ダスト（2.6g、40ミリモル）で1時間にわたって処理した。この反応混合物を冷却し、超音波処理し、セライト・パッドで濾過し、濃縮した。得られた残留物をEtOAcと飽和NaHCO3水溶液に分配すると層に分離した。有機層をブラインで洗浄し、乾燥させ（Na2SO4）、濃縮すると、白色の固形物が1.3g得られた。得られた粗アミノアルコールと(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカン酸（0.45g、1.05ミリモル）をCH2Cl2に溶かした溶液を、2-エトキシ-1-エトキシカルボニル-1,2-ジヒドロキノリン（0.30g、1.21ミリモル）で処理した。得られた混合物を室温にて18時間にわたって撹拌し、濃縮した。40→50％EtOAc/ヘキサンを用いてシリカゲル上のフラッシュ・クロマトグラフィを行なうと、N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-(S)-2-ピロリジニルメチル 2-デオキシ-4-O-ジフェニルホスホノ-2-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-3-O-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-β-D-グルコピラノシドが白色の泡として0.89g（56％）得られた。
【００９６】
（2c）AcOH（4.5ml）とテトラヒドロフラン（45ml）の混合物に上の（2b）で調製した化合物（0.75g、0.44ミリモル）を溶かした溶液を、PtO2（0.45g）の存在下で室温にて70psigで18時間にわたって水素化した。この反応混合物をCHCl3-MeOH（2：1、50ml）で希釈し、超音波処理を短時間行なった。触媒を回収し、CHCl3-MeOH（2：1）で洗浄し、1つにまとめた濾液と洗浄液を濃縮した。CHCl3-MeOH-H2O-Et3N（勾配溶離液；96：4：0.3：0.3→90：10：0.5：0.5）を用いてシリカゲル上のフラッシュ・クロマトグラフィを行なうと、部分的に精製された生成物が得られたため（0.51g）、それを氷で冷やしたCHCl3-MeOH（2：1、50ml）に溶かし、氷で冷やした0.1NのHCl水溶液（20ml）で洗浄した。有機相を濾過し、濃縮した。得られた白色のろうを2％Et3N水溶液（70ml、発熱物質なし）から凍結乾燥させると、N-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-(S)-2-ピロリジニルメチル 2-デオキシ-4-O-ホスホノ-2-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-3-O-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラデカノイル]-β-D-グルコピラノシドトリエチルアンモニウム塩が白色の粉末として0.54g（78％）得られた：融点146−151℃；IR（フィルム）3292、3100、2958、2922、2852、1739、1731、1659、1651、1644、1562、1555、1468、1455、1433、1377、1339、1310、1253、1238、1183、1160、1107、1080、1047、960、856、722 cm-1；1H NMR (CDCl3-CD3OD)δ0.88 (m, 18H)、1.0−2.10 (mH)、2.20−2.75 (m, 12H)、3.04 (q, 6H, J=7.2Hz)、3.3−4.3 (mH)、4.45 (d, 1H, J=8.5Hz)、5.0−5.28 (m, 4H)；13C NMR (CDCl3)δ173.9、173.4、173.2、170.6、170.1、169.2、101.4、75.5、74.0、70.8、70.7、70.2、68.5、60.5、56.6、53.6、47.4、45.6、40.9、39.6、38.8、34.5、34.3、34.2、34.1、31.9、29.7、29.6、29.5、29.4、29.4、29.3、29.2、27.3、25.2、25.0、23.6、22.7、21.6、14.0、8.3。
【００９７】
[M+Na]+に関するMALDI-MSの計算値は1590.1900であり、実測値は1590.1866であった。C95H182N3O17P・3H2Oについての計算値：C、66.20；H、10.99；N、2.44。実際の分析値：C、66.36；H、10.69；N、2.15。
【００９８】
実施例３
N-[(R)-3-デカノイルオキシテトラデカノイル]-(S)-2-ピロリジニルメチル 2-デオキシ-4-O-ホスホノ-2-[(R)-3-デカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-3-O-[(R)-3-デカノイルオキシテトラデカノイル]-β-D-グルコピラノシドトリエチルアンモニウム塩；一般式（IV）で表わされる化合物のトリエチルアンモニウム塩の調製
【００９９】
（3a）乾燥1,2-ジクロロエタン（3.5ml）に2-デオキシ-4-O-ジフェニルホスホノ-3-O-[(R)-3-デカノイルオキシテトラデカノイル]-6-O-(2,2,2-トリクロロ-1,1-ジメチルエトキシカルボニル)-2-(2,2,2-トリクロロエトキシカルボニルアミノ)-α-D-グルコピラノシルブロミド（1.70g、1.38ミリモル）を溶かした溶液に、4オングストロームの分子篩（0.6g）、無水CaSO4（1.2g、8.8ミリモル）、N-[(R)-3-デカノイルオキシテトラデカノイル]-(S)-2-ピロリジンメタノール（0.60g、1.24ミリモル）を添加した。得られた混合物を室温にて1時間にわたって撹拌し、Hg(CN)2（0.63g、2.5ミリモル）で処理し、加熱して暗所で6時間にわたって還流させた。この反応混合物を冷却し、CH2Cl2で希釈し、セライト床で濾過した。濾液を1NのKI水溶液で洗浄し、乾燥させ（Na2SO4）、濃縮した。シリカゲル上でのフラッシュ・クロマトグラフィ（勾配溶離液、25→40％EtOAc／ヘキサン）により、N-[(R)-3-デカノイルオキシテトラデカノイル]-(S)-2-ピロリジニルメチル 2-デオキシ-4-O-ジフェニルホスホノ-3-O-[(R)-3-デカノイルオキシテトラデカノイル]-6-O-(2,2,2-トリクロロ-1,1-ジメチルエトキシカルボニル)-2-(2,2,2-トリクロロエトキシカルボニルアミノ)-β-D-グルコピラノシドが無色の油として1.82g（80％）得られた。
【０１００】
（3b）AcOH（50ml）に上の（3a）で調製した化合物（1.67g、1.02ミリモル）を溶かした60℃の溶液を、三等分した亜鉛ダスト（3.33g、51ミリモル）で1時間にわたって処理した。この反応混合物を冷却し、超音波処理し、セライト・パッドで濾過し、濃縮した。得られた残留物をEtOAcと飽和NaHCO3水溶液に分配すると層に分離した。有機層をブラインで洗浄し、乾燥させ（Na2SO4）、濃縮すると、白色の固形物が1.25g得られた。得られた粗アミノアルコールと(R)-3-デカノイルオキシテトラデカン酸（0.53g、1.33ミリモル）をCH2Cl2に溶かした溶液を、2-エトキシ-1-エトキシカルボニル-1,2-ジヒドロキノリン（0.38g、1.53ミリモル）で処理した。得られた混合物を室温にて18時間にわたって撹拌し、濃縮した。40→50％EtOAc/ヘキサンを用いてシリカゲル上のフラッシュ・クロマトグラフィを行なうと、N-[(R)-3-デカノイルオキシテトラデカノイル]-(S)-2-ピロリジニルメチル 2-デオキシ-4-O-ジフェニルホスホノ-2-[(R)-3-デカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-3-O-[(R)-3-デカノイルオキシテトラデカノイル]-β-D-グルコピラノシドが白色の泡として1.23g（74％）得られた。
【０１０１】
（3c）AcOH（6.5ml）とテトラヒドロフラン（65ml）の混合物に上の（3b）で調製した化合物（1.07g、0.654ミリモル）を溶かした溶液を、PtO2（0.66g）の存在下で室温にて70psigで18時間にわたって水素化した。この反応混合物をCHCl3-MeOH（2：1、50ml）で希釈し、超音波処理を短時間行なった。触媒を回収し、CHCl3-MeOH（2：1）で洗浄し、1つにまとめた濾液と洗浄液を濃縮した。得られたろう状の固形物を2％トリエチルアミン水溶液から凍結乾燥させると、粗トリエチルアンモニウム塩が白色の粉末として約1g得られた。CHCl3-MeOH-H2O-Et3N（勾配溶離液；96：4：0.3：0.3→88：12：1：0.6）を用いてシリカゲル上のフラッシュ・クロマトグラフィを行なうと、部分的に精製された生成物が得られたため（0.84g）、それを氷で冷やしたCHCl3-MeOH（2：1、168ml）に溶かし、氷で冷やした0.1NのHCl水溶液（67ml）で洗浄した。有機相を濾過し、濃縮した。得られた白色のろう（約0.7g）を2％Et3N水溶液（70ml、発熱物質なし）から凍結乾燥させると、N-[(R)-3-デカノイルオキシテトラデカノイル]-(S)-2-ピロリジニルメチル 2-デオキシ-4-O-ホスホノ-2-[(R)-3-デカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-3-O-[(R)-3-デカノイルオキシテトラデカノイル]-β-D-グルコピラノシドトリエチルアンモニウム塩が白色の粉末として0.79g（79％）得られた：融点121−122℃；IR（フィルム）3287、3093、2961、2913、2850、1745、1738、1732、1716、1666、1660、1651、1644、1635、1565、1556、1538、1470、1455、1434、1416、1378、1337、1311、1248、1184、1104、1081、1021、964、721 cm-1；1H NMR (CDCl3-CD3OD)δ0.88 (m, 18H)、1.0−2.05 (mH)、2.20−2.75 (m, 12H)、3.04 (q, 6H, J=7.2Hz)、3.3−4.3 (mH)、4.45 (d, 1H, J=8.5Hz)、5.0−5.28 (m, 4H)；13C NMR (CDCl3)δ173.7、173.4、173.2、170.5、170.1、169.1、101.4、75.6、74.0、70.8、70.2、68.7、60.4、56.6、53.8、47.4、45.6、41.0、39.6、38.9、34.5、34.3、34.2、34.1、31.9、29.7、29.6、29.5、29.4、29.4、29.3、29.2、27.3、25.3、25.0、23.7、22.7、21.6、14.1、8.4。
【０１０２】
[M+Na]+に関するMALDI-MSの計算値は1506.0961であり、実測値は1506.1008であった。C89H170N3O17Pについての計算値：C、67.43；H、10.81；N、2.65。実際の分析値：C、67.26；H、10.85；N、2.47。
【０１０３】
実施例4〜8
実施例4〜8の主な目的は、実施例1で（トリエチルアミン塩として）調製した一般式（II）の化合物（今後は“化合物II”と呼ぶ）がワクチン抗原とともに製剤にされたとき、発熱をできるだけ少なくしてアジュバントの活性を伝えられるかどうかを明らかにすることであった。
【０１０４】
実施例４
HBsAg（B型肝炎表面抗原）に対するアジュバントの活性
年齢が6〜8週の複数グループのBALB/cマウス（ジャクソン・ラボラトリーズ社、バー・ハーバー、メーン州）に、2μgのHBsAg（ラボラトリオ・パブロ・カッサーラ社）±20μgのアジュバント（MPL（登録商標）免疫促進剤または化合物II）を0日目と21日目に皮下注射した。アジュバントを含むTEoA（トリエタノールアミン）製剤に組み換えHBsAgを混合してワクチンを調製した。2回目のワクチン接種から21日目に回収してプールした血清（1つのグループにつきマウス5匹）から、ELISAにより、HBsAgに対する力価を明らかにした（表1）。対照となる非免疫群にはワクチン接種を行なわなかった。
【０１０５】
化合物IIを投与したマウスからの血清は、抗原のみを投与した対照の血清よりも抗HBsAg応答が有意に大きかった（表1）。特に注目すべきなのは、IgG2aアイソタイプとIgG2bアイソタイプについての力価の増加であった。これらの力価は、MPL（登録商標）免疫促進剤を投与した対照群が発現する力価と同等であった。
【０１０６】
【表１】
2005516980.tif 000011
【０１０７】
実施例５
FluZoneインフルエンザ・ワクチン中の赤血球凝集素タンパク質に対するアジュバントの活性
年齢が6〜8週の複数グループのBALB/cマウス（ジャクソン・ラボラトリーズ社、バー・ハーバー、メーン州）に、FluZoneインフルエンザ・ワクチン（コンノート・ラボラトリーズ社、スウィフトウォーター、ペンシルヴェニア州）中の0.2μgの赤血球凝集素タンパク質±20μgのアジュバント（MPL（登録商標）免疫促進剤または化合物II）を0日目と14日目に皮下注射した。2回目のワクチン接種から14日目に5匹のマウスから回収してプールした血清から、FluZoneのELISAにより、FluZoneに対する力価を明らかにした（表2）。対照となる非免疫群にはワクチン接種を行なわなかった。テスト群からの血清に対して最初に使用した希釈率は1：1600であった。
【０１０８】
結果は、上記の実施例と同様であった。ここでも化合物IIの力価は、抗原のみを投与した対照の血清よりも有意に大きかった（表2）。力価の増加は、IgG2aとIgG2bの応答が増大したことにも反映していた。これらの力価は、MPL（登録商標）免疫促進剤を投与した対照群が発現する力価と同等であった。
【０１０９】
【表２】
2005516980.tif 000012
【０１１０】
実施例６
HBsAgに対するアジュバントの活性
複数グループのBALB/cマウスに、2.0μgのHBsAg（ライン・アメリカーナ社とライン・バイオテク社）±25μgのアジュバント（MPL（登録商標）免疫促進剤または化合物II）を0日目と21日目に皮下注射した。2回目のワクチン接種から21日目に回収してプールした血清から、ELISAにより、HBsAgに対するIgG1アイソタイプとIgG2aアイソタイプの力価を明らかにした（表3）。対照となる非免疫群にはワクチン接種を行なわなかった。この実験では、化合物IIの場合に、抗原を含むPBSを投与した対照群と比べて力価が増加していた。RC-553は、正の対照であるMPL（登録商標）免疫促進剤と同程度の力価を示した（表3）。
【０１１１】
【表３】
2005516980.tif 000013
【０１１２】
実施例７
化合物IIにより、HBsAgで免疫したマウスに対するCTL活性が増大する
実施例4の各グループに属する何匹かのマウスを脾臓細胞のドナーとしても使用し、CTL活性を評価した。HBsAg指向性特異的溶解を、標準的な4時間の51Cr放出アッセイ（Moore他、1988年、Cell、第55巻、777〜785ページ）で評価した。ワクチン接種から9日目のマウスの脾臓から単一細胞懸濁液を調製した。脾臓細胞をトリス緩衝NH4Cl溶液で処理して赤血球を除去した後、5mMのHEPES、4mMのL-グルタミン、0.05mMの2-メルカプトエタノール、抗生物質を補足したRPMI/10%FCSの中に7.5×106個/mlの濃度で再び分散させた。MHCクラスIの代表的なLd拘束CTLエピトープ（IPQSLDSWWTSL）として知られる合成ペプチドをこれら細胞に添加し、最終濃度を75nMにした。4日間にわたってインキュベートした後、細胞を回収し、CTL活性を評価した。上記のLd拘束CTLエピトープを発現する、トランスフェクトされた51Cr標識P815S細胞に対する特異的殺傷力を測定した。標的細胞は、Ld拘束CTLエピトープを発現する、トランスフェクトされたP815細胞系（P815S）であった。P815標的に対する非特異的溶解は、エフェクター：標的の比が50：1のとき10％未満であった（表4）。抗体応答とは異なり、RC553は、抗原のみの対照と比べてCTL活性のレベルを有意に上昇させた（表4）。
【０１１３】
【表４】
2005516980.tif 000014
【０１１４】
実施例８
化合物IIによる生体外でのサイトカイン誘導
化合物IIがTNF-αおよびIL-1βの産生に及ぼす効果を、生体外条件にあるヒト末梢血の単核細胞で測定した。MPL（登録商標）免疫促進剤と化合物IIを0.2％TEoA/WFI水溶液に溶かして製剤にした。
【０１１５】
ヒト全血を用いて糖脂質（AGP）が炎症性サイトカインを誘導する能力を評価した。ヘパリン処理した試験管にヒト全血を回収し、0.45mlの全血を、糖脂質（すなわちテスト化合物）を含む0.05mlのリン酸緩衝溶液（PBS、pH7.4）と混合した。試験管を振盪装置の上で37℃にて4時間にわたってインキュベートした。次にサンプルを1.5mlの減菌PBSで希釈し、遠心分離した。上清を取り出し、ヒトのTNF-αとIL-1βを探すためのR&Dシステムズ社のクウォンティキン・イムノアッセイ・キットを用いてサンドイッチELISAを行なうことにより、細胞に関係したTNF-αとIL-1βが存在しているかどうかを分析した。
【０１１６】
アッセイにおいて、1μg/ml、5μg/ml、10μg/mlでは、化合物IIは、アッセイ条件下で検出できるレベルのTNF-αを産生させることはなかった。逆に、正の対照であるMPL（登録商標）免疫促進剤は、100〜10,000ng/mlの濃度範囲でTNF-αを誘導することができた。
【０１１７】
同様に、（1μg/ml、5μg/ml、10μg/mlの）化合物IIは、検出可能なレベルのIL-1βを産生させることはなかった。この化合物の効果を比較するための基準としてMPL（登録商標）免疫促進剤を用いて誘導されるIL-1βのレベルを1とすると、化合物IIによるサイトカインの相対誘導度は0.05以下であった。
【０１１８】
実施例4〜8に関する議論
これらの研究によるデータは、化合物IIがワクチン抗原に対する免疫を増大させうることを示している。この化合物は、2つの異なるワクチン抗原、すなわちインフルエンザ抗原と肝炎表面抗原に対する血清力価を増大させた。MPL（登録商標）免疫促進剤と同様、この化合物は、IgG1アイソタイプが優勢な応答からIgG2a抗体が高レベルである応答へと抗体のプロファイルをシフトさせた。この化合物は、抗体応答を増大させることに加え、CTL活性を誘導するためのよいアジュバントでもある。
【０１１９】
この研究における結果で注目すべき点は、化合物IIが、炎症性サイトカインであるTNF-αとIL-1βを検証可能なレベルまで誘導することなしに応答に影響を与えているように見えることである。これらサイトカインは両方とも、細菌の細胞壁産物（脂質Aを含む）に応答し、本来備わっている免疫系の細胞によって産生される。化合物IIは構造が脂質Aと似ているため、TNF-αまたはIL-1βも刺激すると考えられ、実際に多数のAGP分子がTNF-αまたはIL-1βを刺激している。TNF-αとIL-1βは、炎症性サイトカインとして食細胞の活性化や特異的免疫の発動にとって重要な他のサイトカイン・メディエータを刺激し、カスケードを始動させる。IL1は、発熱応答を誘導するため、最初は内因性発熱物質と呼ばれていた。したがって化合物IIを投与した後に検出可能なIL-1が見られないと、ウサギの発熱物質テストでも発熱が起こらない。
【０１２０】
これらの研究において、この化合物が、特異的免疫の活性化を起こすのに十分なレベルのTNF-αとIL-1βの分泌を実際に促進しているが、その分泌レベルは、生体外サイトカイン・アッセイで検出するには低すぎると考えることが可能である。別の考え方は、この化合物がTNF-αとIL-1β以外のサイトカイン・メディエータを刺激し、その結果として、同時に投与するワクチン抗体に対する特異的免疫応答が起こるというものであろう。IFN-γが産生されているように思われる。このサイトカインは、アイソタイプの切り換えを誘導し、IgG2aサブクラスの抗体へと切り換えさせることと、Th-1型のCTL応答のプロモータであることに関係していると考えられている。したがってIgG2aの力価増大と活性なCTLの集合は、両方ともIFN-γの産生を反映している。
【０１２１】
実施例９
化合物IIによって誘導可能な一酸化炭素シンターゼ（iNOS）の刺激
この実施例は、J774ネズミ・マクロファージにおいてさまざまな糖脂質がiNOSの誘導に及ぼす効果を示している。ネズミ・マクロファージ細胞系J774は、試験管内でIFN-γを用いて感作状態にすることができ、それに続けて行なうLPSを用いた刺激によるiNOSの上方調節に非常によく応答する。なおこの応答は、標準的なグライス試薬ELISAアッセイ法で測定される。このアッセイでは、30mlのフラスコにJ774細胞を1×106個/mlの割合で入れ、IFN-γを100単位/mlの割合で16〜24時間かけて添加する。次に細胞を回収し、洗浄し、96ウエルのプレートに2×105個/ウエルの割合で再び分散させ、放置して付着させる。糖脂質化合物を順番に希釈してテスト群のためのウエルに入れ、得られた培養物をさらに36〜40時間にわたってインキュベートした後、培養物の上清を回収し、亜硝酸塩の放出に関してグライス試薬分析を行なう（Green他、1982年、Anal. Biochem.、第126巻、131〜138ページ）。亜硝酸塩の含有量は、iNOSの機能と密接に関係している。
【０１２２】
効力は、培養物中で誘導される亜硝酸塩の最大値の50％を誘導することのできる糖脂質の濃度（ng/ml）と決めた（ED50）。ED50の値が小さくなるほど、iNOSを誘導する効力が大きくなる。ED50は、Johnson他、J. Med. Chem.、第42巻、4640〜4649ページ、1999年に記載されている方法に従って計算した。
【０１２３】
MPL（登録商標）免疫促進剤は、ED50が約2ng/mlであることがわかった。そのため高レベルの亜硝酸塩が産生される。それに対して化合物IIはED50が約3000（ng/ml）以上であった。
【０１２４】
この化合物ではiNOSの最大活性が非常に低いという観察結果は、この系ではこの化合物がiNOSの誘導に関して本質的に不活性であることを示唆している。
【０１２５】
この明細書に記載した実施例と実施態様は説明を目的としたものであり、それをもとにして当業者に対してさまざまな改変や変更を提案することができよう。そのためそのような改変や変更は、この明細書の精神および範囲と、添付の請求項の範囲に含まれるものと考えられる。この明細書で引用したすべての出版物、特許、特許出願は、参考のためその全体が、実際にこの明細書に組み込まれているものとする。
【国際調査報告】
2005516980.tif 000016
2005516980.tif 000017