(57)【要約】本発明は、Ｇタンパク質共役ｍａｓ様１受容体の活性を刺激または減少する化合物を同定する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇタンパク質共役受容体ｍａｓ様１に特異的に結合する化学物質を同定する方法であって、
ａ］受容体ｍａｓ様１をその表面で発現する少なくとも１種の細胞を用意する、
ｂ］少なくとも１種の化学物質を用意する、
ｃ］上記受容体への結合を可能にする条件下で、ａ］に記載の細胞と、ｂ］に記載の化学物質とを接触させる、
ｄ］上記化学物質と上記受容体ｍａｓ様１との結合を確立する、
上記方法。
【請求項２】
Ｇタンパク質共役受容体ｍａｓ様１に特異的に結合する化学物質を同定する方法であって、
ａ］受容体ｍａｓ様１をそれらの表面で発現する細胞試料（その中にこの受容体が存在する）を用意する、
ｂ］少なくとも１種の化学物質を用意する、
ｃ］上記受容体への結合を可能にする条件下で、ａ］に記載の細胞と、ｂ］に記載の化学物質とを接触させる、
ｄ］上記化学物質と上記受容体ｍａｓ様１との結合を確立する、
上記方法。
【請求項３】
細胞試料は、細胞抽出物の膜分画を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
Ｇタンパク質共役受容体ｍａｓ様１に、特異的な方法で、第一の化学物質に対して競合的に結合する化学物質を同定する方法であって、
ａ］受容体ｍａｓ様１をその表面で発現する少なくとも１種の細胞を用意する、
ｂ］受容体ｍａｓ様１に結合する少なくとも１種の第一の化学物質を用意する、
ｃ］第一の化学物質と異なる少なくとも１種の第二の化学物質を用意する、
ｄ］上記受容体への結合を可能にする条件下で、ａ］に記載の細胞を、ｂ］に記載の第一の化学物質、および、ｃ］に記載の第二の化学物質と同時または連続的に接触させる、
ｅ］第一の化学物質の上記受容体への結合、または、第二の化学物質の上記受容体への結合、または、第一および第二の化学物質の上記受容体への結合を測定する、
上記方法。
【請求項５】
第一の化学物質は、サブスタンスＰ、または、サブスタンスＰの切断産物、または、神経ペプチドＦＦである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
Ｇタンパク質共役受容体ｍａｓ様１に、特異的な方法で、第一の化学物質に対して競合的に結合する化学物質を同定する方法であって、
ａ］受容体ｍａｓ様１をそれらの表面で発現する細胞試料（その中にこの受容体が存在する）を用意する、
ｂ］受容体ｍａｓ様１に結合する少なくとも１種の第一の化学物質を用意する、
ｃ］第一の化学物質と異なる少なくとも１種の第二の化学物質を用意する、
ｄ］上記受容体への結合を可能にする条件下で、ａ］に記載の細胞を、ｂ］に記載の第一の化学物質、および、ｃ］に記載の第二の化学物質と同時または連続的に接触させる、
ｅ］第一の化学物質の上記受容体への結合、または、第二の化学物質の上記受容体への結合、または、第一および第二の化学物質の上記受容体への結合を測定する、
上記方法。
【請求項７】
細胞試料は、細胞抽出物の膜分画を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
第一の化学物質は、サブスタンスＰ、または、サブスタンスＰの切断産物、または、神経ペプチドＦＦである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
Ｇタンパク質共役受容体ｍａｓ様１に特異的に結合し、そして、Ｇタンパク質共役受容体ｍａｓ様１を活性化する化学物質を同定する方法であって、
ａ］受容体ｍａｓ様１をその表面で発現し、受容体ｍａｓ様１により第２メッセンジャーシグナルカスケードを開始させることができる少なくとも１種の細胞を用意する、
ｂ］少なくとも１種の化学物質を用意する、
ｃ］上記受容体への結合および上記受容体の活性化を可能にする条件下で、ａ］に記載の細胞と、ｂ］に記載の化学物質とを接触させる、
ｄ］上記化学物質の存在および非存在下で、上記化学物質の存在下での変化が、受容体ｍａｓ様１の活性化を示す上記細胞中の第２メッセンジャーの濃度の変化を測定する
上記方法。
【請求項１０】
Ｇタンパク質共役受容体ｍａｓ様１に特異的に結合し、そして、Ｇタンパク質共役受容体ｍａｓ様１を活性化する化学物質を同定する方法であって、
ａ］受容体ｍａｓ様１をその表面で発現する細胞試料を用意する（この試料中で第２メッセンジャーシグナルカスケードを開始させることが可能である）、
ｂ］少なくとも１種の化学物質を用意する、
ｃ］上記受容体への結合および上記受容体の活性化を可能にする条件下で、ａ］に記載の細胞試料と、ｂ］に記載の化学物質とを接触させる、
ｄ］上記化学物質の存在または非存在下で、上記化学物質の存在下での変化が、受容体ｍａｓ様１の活性化を示す上記細胞試料中の第２メッセンジャーの濃度の変化を測定する上記方法。
【請求項１１】
細胞試料は、細胞抽出物の膜分画を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
Ｇタンパク質共役受容体ｍａｓ様１に特異的に結合し、そして、Ｇタンパク質共役受容体ｍａｓ様１を阻害する化学物質を同定する方法であって、
ａ］受容体ｍａｓ様１をその表面で発現し、受容体ｍａｓ様１により第２メッセンジャーシグナルカスケードを開始させることができる少なくとも１種の細胞を用意する、
ｂ］少なくとも１種の化学物質を用意する、
ｃ］上記受容体への結合および上記受容体の不活性化を可能にする条件下で、ａ］に記載の細胞と、ｂ］に記載の化学物質とを接触させる、
ｄ］上記化学物質の存在または非存在下で、上記化学物質の存在下での変化が、受容体ｍａｓ様１の不活性化を示す上記細胞中の第２メッセンジャーの濃度の変化を測定する上記方法。
【請求項１３】
Ｇタンパク質共役受容体ｍａｓ様１に特異的に結合し、そして、Ｇタンパク質共役受容体ｍａｓ様１を阻害する化学物質を同定する方法であって、
ａ］受容体ｍａｓ様１をその表面で発現する細胞試料を用意する（この試料中で第２メッセンジャーシグナルカスケードを開始させることが可能である）、
ｂ］少なくとも１種の化学物質を用意する、
ｃ］上記受容体への結合および上記受容体の活性化を可能にする条件下で、ａ］に記載の細胞試料と、ｂ］に記載の化学物質とを接触させる、
ｄ］上記化学物質の存在または非存在下で、上記細胞試料中の第２メッセンジャーの濃度の変化を測定するが、上記化学物質の存在下での変化が、受容体ｍａｓ様１の不活性化を示すものとする、
上記方法。
【請求項１４】
細胞試料は、細胞抽出物の膜分画を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
細胞は、ＣＨＯ、ＣＨＯ−Ｋ１、または、ＨＥＫ細胞である、請求項１、４、５、９、１０に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法で同定された化合物、および、医薬品を製剤化するための添加剤を含む医薬製剤。
【請求項１７】
サブスタンスＰ、または、サブスタンスＰの切断産物、または、神経ペプチドＦＦを含む、請求項１５に記載の医薬製剤。
【請求項１８】
受容体ｍａｓ様１の機能障害により生じる病気を治療するための医薬品製造のためのサブスタンスＰの使用。
【請求項１９】
受容体ｍａｓ様１の機能障害により生じる病気を治療するための医薬品製造のためのサブスタンスＰの切断産物の使用。
【請求項２０】
受容体ｍａｓ様１の機能障害により生じる病気を治療するための医薬品製造のための神経ペプチドＦＦの使用。
【請求項２１】
受容体ｍａｓ様１と化合物との複合体を製造するための、サブスタンスＰ、または、サブスタンスＰの切断産物、または、神経ペプチドＦＦの使用。
【請求項２２】
サブスタンスＰ、または、サブスタンスＰの切断産物、または、神経ペプチドＦＦが、受容体ｍａｓ様１に特異的に結合する、受容体ｍａｓ様１を含むタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｇタンパク質共役受容体ｍａｓ様１（G protein-coupled receptor mas like 1）の活性を改変する化合物を同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｇタンパク質共役受容体は、例えばホルモン、神経伝達物質、光、または臭気物質から、Ｇタンパク質を介して細胞内部へ細胞外シグナルを媒介し、細胞内シグナルカスケードを介して様々な効果を開始させることができる。Ｇタンパク質は通常、３種の異なるサブユニット（α、β、γ）からなる。受容体特異性と効果が異なる様々なヘテロダイマーＧタンパク質が知られている。Ｇタンパク質は、ＧＴＰによって活性化される。周知のＧタンパク質は、視覚プロセスからのトランスデューシンである。
【０００３】
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、多数の生理学的なプロセスにおいて重要な役割を果たす。これは、既知の最大のタンパク質ファミリーの１つである。現在、ヒトゲノムにおいて、約１０００種の遺伝子がこの受容体クラスをコード化していることが推測されている。ＧＰＣＲは、７個の膜貫通αへリックスを有する膜タンパク質である。多数の医薬品が、ＧＰＣＲを介してその効果を示している。
【０００４】
ＧＰＣＲは、特に生物のシグナルプロセシングと制御に関与するため、完全な生物の機能の維持において上位で作用する。
【０００５】
細胞外リガンドの結合により、関連ＧＰＣＲでコンフォメーション変化が起こる。コンフォメーション変化により、それぞれ結合したＧタンパク質との相互作用のための前提条件がつくられる。続いて、Ｇタンパク質は、関連する細胞型に特徴的な細胞内シグナルカスケードを開始させる。いわゆる第２メッセンジャーは、細胞内シグナルカスケードに特徴的である。第２メッセンジャーは、低分子量化合物であり、例えば、ｃＡＭＰ（サイクリックアデノシン一リン酸）、ｃＧＭＰ（サイクリックグアノシン一リン酸）、または、Ｃａ2+がある。細胞内シグナル伝達は、第２メッセンジャーの濃度変化により制御される。この目的のために、Ｇタンパク質およびそれらのサブユニットは、アデニレートシクラーゼ、ホスホリパーゼＣなどのタンパク質、または、イオンチャンネルと相互作用する。続いて、第２メッセンジャーの濃度の変化により、その他のタンパク質、特にキナーゼやホスファターゼの活性化または不活性化が起こる。最終的に、シグナルは、特定の細胞アセンブリに特有の反応（例えばタンパク質発現）を終結させる。
【０００６】
ヘテロ三量体Ｇタンパク質は、プラス膜内部に位置する。活性化受容体はＧタンパク質ヘテロ三量体（G protein heterotrimer）と接触し、続いてαサブユニットとβγ複合体とを解離する。活性化αサブユニットとβγ複合体とはいずれも、細胞内効果タンパク質に影響を与えることができる。Ｇタンパク質αサブユニットファミリーは、様々なクラスに分けることができる。既知の例としては、Ｇαs、Ｇαi、Ｇαqおよび  Ｇα12クラスがある。ＧＰＣＲは、活性化Ｇタンパク質により分類される。
【０００７】
ＧsクラスのＧＰＣＲは、Ｇαs活性化を介してアデニルシクラーゼの刺激を仲介し、細胞内ｃＡＭＰ濃度を増加させる。ＧiクラスのＧＰＣＲは、Ｇαiの活性化を介してアデニレートシクラーゼの阻害を起こし、細胞内ｃＡＭＰを減少させる。
【０００８】
ＧqクラスのＧＰＣＲは、順に、Ｇαqの活性化を介して、様々なＰＬＣβアイソフォー
ムの刺激を起こし、膜結合型ホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸の加水分解を介して、ジアシルグリセロールとイノシトール三リン酸（ＩＰ３）を生じさせる。ＩＰ３は、細胞内の備蓄よりＣａ2+を放出させる。ほとんどのＧＰＣＲは、１つのＧタンパク質βサブユニットファミリーとしか接触することができないため、ＧＰＣＲは、特定のシグナル変換経路に関して選択的である。
【０００９】
改変された受容体特異性を有し、様々なシグナル変換経路への連結部を有するＧタンパク質は、分子生物学的および生化学的な方法によって異なるＧタンパク質からのコンポーネントを合体することによって構築され、ハイブリッドＧタンパク質を得ることができる。
【００１０】
ハイブリッドＧタンパク質は、異なるＧαサブユニットの１つのタンパク質配列に統合された融合コンストラクトである。従って、例えば、Ｇαiの受容体認識領域と、Ｇαqのエフェクター活性化領域とを融合させ、Ｇｉ共役受容体のシグナルを受け、ＧαqのＰＬＣβシグナル変換経路のスイッチを入れるＧαq/iハイブリッドを生産することができる。このようなＧαqのＣ末端５−アミノ酸が対応するＧαi配列で置換されたハイブリッド（Ｇαiq5）は、Ｃｏｎｋｌｉｎ等Ｎａｔｕｒｅ  ３６３，２７４〜２７６（１９９３年）で初めて説明された。この受容体の「経路再選択」は、分析の終点（アデニレートシクラーゼの阻害と比較した場合の細胞内Ｃａ2+濃度の増加）が、測定技術でより簡単に認識することができ、さらに、ハイスループットスクリーニングで用いることができるという利点を有する。
【００１１】
サブスタンスＰは、中枢神経と一次求心ニューロンの末梢神経の末端の両方によって放出される神経伝達物質である。サブスタンスＰの生物学的な効果は、Ｇタンパク質共役受容体のグループに属するタキキニン受容体（＝ニューロキニン受容体）によって仲介される。現在、３種のタキキニン受容体、ＮＫ１、ＮＫ２、および、ＮＫ３が知られている。ＮＫ１は、サブスタンスＰと優先的に結合し、ＮＫ２は、ニューロキニンＡと優先的に結合し、ＮＫ３は、ニューロキニンＢと優先的に結合する。しかしながら、内因性タキキニンは、それぞれの受容体サブタイプに対して特に選択的ではなく、原則的に、サブスタンスＰ、ＮＫＡおよびＮＫＢは、３種全てのＮＫ受容体サブタイプを活性化する。既知のニューロキニン受容体サブタイプに加えて、さらなるサブタイプであるＮＫ４受容体が提唱されている。
【００１２】
サブスタンスＰは、例えば、喘息、慢性気管支炎、炎症性胃腸障害、膀胱の炎症などの慢性炎症や痛みが関与する多数の障害に関連し、さらに、片頭痛、うつ、嘔吐、および、てんかん障害にも関連すると考えられている。サブスタンスＰは、特に心臓血管の領域において重要な役割を果たす。サブスタンスＰは、極めて強い血管拡張薬である。血管拡張や血圧の低下は、大血管内皮からのＮＯ放出により生じる（ＮＫ１受容体が介在）。加えて、サブスタンスＰは、ニューロキニン受容体を介して作用するが、神経性の血漿漏出の重要な媒介物質である：後毛細管小静脈の内皮細胞におけるＮＫ１受容体の活性化により、強固な作用（細胞と細胞との接触）が浸透性になり、それによって血漿タンパク質の血管内腔から間質腔への放出が可能になる。
【００１３】
タキキニン（サブスタンスＰ、ニューロキニンＡ、および、ニューロキニンＢ）の役割はある程度調査されているが、サブスタンスＰ分解産物の生理学的および病理生理学的な効果についてはほとんど知られていない。サブスタンスＰは、代謝されて、Ｎ末端フラグメント（１〜９、１〜７、１〜４）、および、Ｃ末端フラグメント（２〜１１、３〜１１）になる。既知のニューロキニン受容体におけるサブスタンスＰ切断産物の効果は、一部説明されているが、今のところ、これら切断産物それ自体も受容体に結合してシグナル効果を開始させることができるのかどうか、すなわち天然リガンドとして作用できるのかどうかわかっていない。リガンドとは、可逆的にＧタンパク質共役受容体に結合し、この結合を介して受容体に対する効果（安定化、不活性化、刺激）を発揮する分子を意味する。一般的に、この効果は、下流の細胞内シグナルカスケードに関し、シグナルカスケードに対する効果から検出することができる。リガンドは、生物学的システムで生産される場合は天然である。
【００１４】
Ｇタンパク質共役受容体ｍａｓ様１のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は既知であり、公に利用可能である（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＣ０２７０２６）。ｍａｓ様１のヌクレオチド配列は、配列番号１に再現されており、ｍａｓ様１のアミノ酸配列は、配列番号２に再現されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
これまで受容体ｍａｓ様１の天然リガンドは知られていない。そのため、この受容体のアゴニストまたはアンタゴニストが、同定できないという不利益があった。アゴニストおよびアンタゴニストは、その正常な活性または病理学的に改変された活性に関する受容体の機能を研究するための極めて有用な手段である。その上、アゴニストおよびアンタゴニストは、特に異常に減少または増加した活性により示され得る病理学的に改変された受容体活性を回復させるという利点を有する。従って、本発明の目的は、受容体ｍａｓ様１に対してアゴニストまたはアンタゴニスト的な効果を有する化合物を同定する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、Ｇタンパク質共役受容体ｍａｓ様１に特異的に結合する化学物質を同定する方法に関し、本方法において、
ａ］受容体ｍａｓ様１をその表面で発現する少なくとも１種の細胞を用意する、
ｂ］少なくとも１種の化学物質を用意する、
ｃ］前記受容体への結合を可能にする条件下で、ａ］に記載の細胞と、ｂ］に記載の化学物質とを接触させる、
ｄ］前記化学物質と前記受容体ｍａｓ様１との結合を確立する。
【００１７】
化学物質の受容体への結合を可能にする条件を得るのに特に重要なことは、温度またはｐＨである。選択された温度は、好ましくは室温〜４０℃の範囲、特に好ましくは３６℃〜３８℃の範囲、より特に好ましくは３７℃である。ｐＨは、好ましくは６〜８の範囲、特に好ましくはｐＨ７.０である。
【００１８】
本発明はさらに、Ｇタンパク質共役受容体ｍａｓ様１に特異的に結合する化学物質を同定する方法に関し、本方法において、
ａ］受容体ｍａｓ様１をそれらの表面で発現する細胞試料（この受容体が存在する）を用意する、
ｂ］少なくとも１種の化学物質を用意する、
ｃ］前記受容体への結合を可能にする条件下で、ａ］に記載の細胞と、ｂ］に記載の化学物質とを接触させる、
ｄ］前記化学物質と前記受容体ｍａｓ様１との結合を確立する。
【００１９】
好ましい実施形態において、前記細胞試料は、細胞抽出物の膜分画を含む。
【００２０】
本発明はまた、Ｇタンパク質共役受容体ｍａｓ様１に、特異的な方法で、第一の化学物質に対して競合的に結合する化学物質を同定する方法に関し、本方法において、
ａ］受容体ｍａｓ様１をその表面で発現する少なくとも１種の細胞を用意する、
ｂ］受容体ｍａｓ様１に結合する少なくとも１種の第一の化学物質を用意する、
ｃ］第一の化学物質と異なる少なくとも１種の第二の化学物質を用意する、
ｄ］前記受容体への結合を可能にする条件下で、ａ］に記載の細胞を、ｂ］に記載の第一の化学物質、および、ｃ］に記載の第二の化学物質と同時または連続的に接触させる、
ｅ］第一の化学物質の前記受容体への結合、または、第二の化学物質の前記受容体への結合、または、第一および第二の化学物質の前記受容体への結合を測定する。
【００２１】
それらの好ましい実施形態において、第一の化学物質は、サブスタンスＰ、または、サブスタンスＰの切断産物、または、神経ペプチドＦＦからなる。
【００２２】
本発明の上述の方法およびその他の方法において、第一の化学物質の結合および／または第二の化学物質の結合を測定するためには、キャリブレーションプロットの作製が必要な場合もある。
【００２３】
本発明はさらに、Ｇタンパク質共役受容体ｍａｓ様１に、特異的な方法で、第一の化学物質に対して競合的に結合する化学物質を同定する方法に関し、本方法において、
ａ］受容体ｍａｓ様１をそれらの表面で発現する細胞試料を用意する（その中にこの受容体が存在する）、
ｂ］受容体ｍａｓ様１に結合する少なくとも１種の第一の化学物質を用意する、
ｃ］第一の化学物質と異なる少なくとも１種の第二の化学物質を用意する、
ｄ］前記受容体への結合を可能にする条件下で、ａ］に記載の細胞を、ｂ］に記載の第一の化学物質、および、ｃ］に記載の第二の化学物質と同時または連続的に接触させる、
ｅ］第一の化学物質の前記受容体への結合、または、第二の化学物質の前記受容体への結合、または、第一および第二の化学物質の前記受容体への結合を測定する。それらの好ましい実施形態において、前記細胞試料は、細胞抽出物の膜分画を含む。さらに好ましい実施形態において、第一の化学物質は、サブスタンスＰ、または、サブスタンスＰの切断産物、または、神経ペプチドＦＦからなる。
【００２４】
本発明はまた、Ｇタンパク質共役受容体ｍａｓ様１に特異的に結合する、および、Ｇタンパク質共役受容体ｍａｓ様１を活性化する化学物質を同定する方法に関し、本方法において、
ａ］受容体ｍａｓ様１をその表面で発現し、受容体ｍａｓ様１により第２メッセンジャーシグナルカスケードを開始させることができる少なくとも１種の細胞を用意する、
ｂ］少なくとも１種の化学物質を用意する、
ｃ］前記受容体への結合および前記受容体の活性化を可能にする条件下で、ａ］に記載の細胞と、ｂ］に記載の化学物質とを接触させる、
ｄ］前記化学物質の存在および非存在下で、前記化学物質の存在下での変化が、前記受容体の活性化を示す前記細胞中の第２メッセンジャーの濃度の変化を測定する。
【００２５】
本発明はさらに、Ｇタンパク質共役受容体ｍａｓ様１に特異的に結合する、および、Ｇタンパク質共役受容体ｍａｓ様１を活性化する化学物質を同定する方法に関し、本方法において、
ａ］受容体ｍａｓ様１をその表面で発現する細胞試料を用意するが、この試料中で第２メッセンジャーシグナルカスケードを開始させることが可能であるものとし、
ｂ］少なくとも１種の化学物質を用意する、
ｃ］前記受容体への結合および前記受容体の活性化を可能にする条件下で、ａ］に記載の細胞試料と、ｂ］に記載の化学物質とを接触させる、
ｄ］前記化学物質の存在および非存在下で、前記化学物質の存在下での変化が、受容体ｍａｓ様１の活性化を示す前記細胞試料中の第２メッセンジャーの濃度の変化を測定する。
【００２６】
それらの好ましい実施形態において、前記細胞試料は、細胞抽出物の膜分画を含む。
【００２７】
本発明はさらに、Ｇタンパク質共役受容体ｍａｓ様１に特異的に結合する、および、Ｇタンパク質共役受容体ｍａｓ様１を阻害する化学物質を同定する方法に関し、本方法において、
ａ］受容体ｍａｓ様１をその表面で発現し、受容体ｍａｓ様１により第２メッセンジャーシグナルカスケードを開始させることができる少なくとも１種の細胞を用意する、
ｂ］少なくとも１種の化学物質を用意する、
ｃ］前記受容体への結合および前記受容体の不活性化を可能にする条件下で、ａ］に記載の細胞と、ｂ］に記載の化学物質とを接触させる、
ｄ］前記化学物質の存在および非存在下で、前記化学物質の存在下での変化が、受容体ｍａｓ様１の不活性化を示す前記細胞中の第２メッセンジャーの濃度の変化を測定する。
【００２８】
本発明はさらに、Ｇタンパク質共役受容体ｍａｓ様１に特異的に結合する、および、Ｇタンパク質共役受容体ｍａｓ様１を阻害する化学物質を同定する方法に関し、本方法において、
ａ］受容体ｍａｓ様１をその表面で発現する細胞試料を用意するが、この試料中で第２メッセンジャーシグナルカスケードを開始させることが可能であるものとし、
ｂ］少なくとも１種の化学物質を用意する、
ｃ］前記受容体への結合および前記受容体の活性化を可能にする条件下で、ａ］に記載の細胞試料と、ｂ］に記載の化学物質とを接触させる、
ｄ］前記化学物質の存在および非存在下で、前記化学物質の存在下での変化が、受容体ｍａｓ様１の不活性化を示す前記細胞試料中の第２メッセンジャーの濃度の変化を測定する。
【００２９】
それらの好ましい実施形態において、前記細胞試料は、細胞抽出物の膜分画を含む。
【００３０】
本発明はまた、上述の方法のいずれか１つで同定された化合物、さらに、医薬品を製剤化するための添加剤を含む医薬製剤に関する。
【００３１】
好ましい実施形態において、医薬製剤は、サブスタンスＰ、または、サブスタンスＰの切断産物を含む。
【００３２】
本発明はさらに、受容体ｍａｓ様１の機能障害により生じる病気を治療するための医薬品製造のための、サブスタンスＰ、または、サブスタンスＰの切断産物、または、神経ペプチドＦＦの使用を包含する。
【００３３】
本発明はさらに、受容体ｍａｓ様１と、本発明の方法によって同定された化合物との複合体を製造するための、本発明の方法によって同定された化合物の使用に関する。このような複合体を製造するのに適切な化合物は、例えば、サブスタンスＰ、サブスタンスＰの切断産物、または、神経ペプチドＦＦである。本発明はまた、受容体ｍａｓ様１と、サブスタンスＰ、サブスタンスＰの切断産物、または、神経ペプチドＦＦとの複合体に関する。これに関して、複合体は、サブスタンスＰ、サブスタンスＰの切断産物、または、神経ペプチドＦＦと少なくとも特異的に結合した１またはそれ以上の受容体のタンパク質、および、受容体または受容体／リガンド複合体を安定化する可能な膜成分または界面活性剤で構成される化合物を意味する。結合定数が１００μＭ未満またはそれと同値の場合、その結合は特異的である。
【００３４】
生物学的材料または生物学的材料試料に天然リガンドがすでに存在している可能性があ
る。しかしながら、このようなリガンドを外部から加えてもよい。この目的のために、リガンドは、それらの受容体への結合および受容体シグナルの開始が生じるような量、濃度および純度で存在すべきである。
【００３５】
生物学的材料または生物学的材料試料は、それぞれＧタンパク質共役受容体ｍａｓ様１を含み、これらが適切な状態（試料／量）で利用可能にした後に天然リガンドを添加する。
【００３６】
このような天然リガンドは、好ましくはサブスタンスＰ、サブスタンスＰの切断産物、または、神経ペプチドＦＦである。本発明の方法で使用する場合、天然リガンド、特にサブスタンスＰ、サブスタンスＰの切断産物または神経ペプチドＦＦは、適切な検出方法で検出可能な標識を含んでもよい。このような標識は、例えば、放射活性標識、または、蛍光分析で検出可能な標識である。
【００３７】
好ましくは、本発明の方法は、同定された化合物が、天然リガンドに対してアゴニストまたはアンタゴニストとして作用するような方法で用いられる。
【００３８】
本発明はまた、上述の方法で同定された、Ｇタンパク質共役受容体ｍａｓ様１の活性を改変する化合物に関する。
【００３９】
このような化合物は、質量が、好ましくは０.１〜５０ｋＤａ、特に好ましくは０.１〜５ｋＤａ、より特に好ましくは０.１〜３ｋＤａであることを特徴とする。
【００４０】
このような本発明の方法によって同定された化合物は、タンパク質、アミノ酸、多糖類、糖、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド、脂肪酸含有化合物、脂肪、脂肪酸、脂肪酸誘導体、または、芳香族炭化水素化合物であり得る。
【００４１】
本発明はさらに、本発明の方法によって同定された化合物、および、さらに医薬製剤用添加剤および／またはその他の添加物を含む医薬品に関する。このような医薬品は、特に心臓血管障害の治療に適切である。
【００４２】
本発明の方法によって同定された化合物は、心臓血管障害を治療するための医薬品を製造するのに用いてもよい。
【００４３】
本発明の方法を実施するためのＧタンパク質共役受容体ｍａｓ様１は、原核生物または真核生物における外因性ＤＮＡ配列の発現によって製造できる。原則的に、あらゆる原核性のまたは真核性のプラスミドベクター、バクテリオファージベクター、または、酵母プラスミドベクターがタンパク質生産に適している。このようなベクターの例としては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８，１９、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ、ｐｃＤＮＡ３．１などが挙げられる。発現は一時的でもよいし、永続的でもよい。
【００４４】
組換えベクターの構築は、関連の専門知識に従って製造することができ、例えば、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ等の「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」，ワイリー＆サンズ，ニューヨーク（ＩＳＢＮ０−４７１−５０３３８−Ｘ）、または、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｍｉａｔｉｓの「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」，第二版，コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（ＩＳＢＮ０−８７９６９−３０９−６）で説明されたようなものが挙げられる。これは、記載された配列情報（配列番号１）のいずれか１つで示されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、または、基礎となるベクターに組み込まれた記載された配列情報（配列番号２）のいずれか１つで示されたポリヌクレオチド配列を伴う。基礎となるベクターは、ポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列を分子生物学的な方法によって組込み可能であり、微生物、例えば細菌、真菌または細胞培養した細胞にクローニング可能なベクターを意味するものとする。基礎となるベクターは、例えば、抗生物質耐性マーカー、細菌または細胞培養においてプラスミド複製に適した複製起源、および、タンパク質発現に適したプロモーターを有するプラスミドからなる。また、基礎となるベクターは、例えばファージベクター、ファージミドベクター、ファスミドベクター、コスミドベクター、ウイルスベクター、ＹＡＣベクターまたはその他のタイプのベクターで構成されていてもよい。基礎となるベクターの例は、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＫＳ、ｐＳＫなどである。取り込もうとするポリヌクレオチドの取り込みは、適切な制限酵素を用いて適切な制限切断部位を介して起こり、このような酵素は、バイオラボ（ＢｉｏＬａｂｓ）、ロシュ・ダイアグノスティックス、ストラタジーンなどの会社で市販されている。このような制限切断部位は、例えば、制限酵素ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ、ＥｃｏＲＶなどの認識部位が可能である。
【００４５】
好ましい実施形態において、組換えベクターの構築は、真核生物および／または原核生物で使用可能な発現ベクターからなる。発現ベクターはプロモーターを含み、このプロモーターによって発現ベクターとポリヌクレオチド配列とを機能的に連結させ、例えば細菌、真菌または真核細胞系の細胞などの生物中でこのポリヌクレオチド配列によってコードされたタンパク質を合成させることができる。プロモーターは、例えばトリプトファンによって、または、構成的活性において誘導性であってもよい。発現ベクターの例は、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｃＤＮＡ３．１などである。
【００４６】
生物学的材料は、遺伝情報を含み、生物学的システムにおいてそれ自体が再生可能または繁殖可能なあらゆる材料である。生物学的材料の例は、ヒトまたは動物組織由来の細胞、または、器官であり、特に、脳、脂肪組織、肺、心臓、肝臓、腎臓、脾臓、筋肉などの器官である。生物学的材料の例はまた、細菌または菌類であり、例えば、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、または、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。生物学的材料はまた、細胞培養からの細胞を包含する。
【００４７】
生物学的材料が動物またはヒト組織由来の細胞の場合、生検、外科手術による切除、注射器またはカテーテルを用いた取り出し、またはそれに匹敵する技術によって得ることができる。この方法で取り出された細胞は、深冷凍結して用意してもよいし、または、細胞培養に用いてもよい。細菌および酵母細胞は、従来の微生物学的技術を用いて培養して用意してもよい。
【００４８】
当業者であれば、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ．Ｍ．Ａｎｓｕｂｅｌ等編，随時改訂，２００１年版，ジョン・ワイリー＆サンズ刊）においてそれに関する適切な説明を見出すことができる。
【００４９】
生物学的材料はまた、動物細胞培養細胞で構成されていてもよい。このような細胞の例は、マウス細胞、ラット細胞、または、ハムスター細胞である。細胞培養の細胞は、１次的な細胞型であってもよいし、または、確立された細胞系であってもよい。確立された細胞系の例は、マウス３Ｔ３細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞、または、Ｈｅｌａ細胞である。細胞系の維持、培養および成長は、標準的な教本、例えば「Ｂａｓｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｊ．Ｍ．Ｄａｖｉｓ編，ＩＲＬプレス，オックスフォード（１９９６年））で説明されている。
【００５０】
生物学的材料試料は、例えば生物学的材料の破壊とそれに続く精製工程によって製造される。生物学的材料の破壊方法は、特に、繰り返しの凍結および解凍、超音波処理、フレ
ンチプレスの使用、界面活性剤および酵素またはそれの類似物質の添加が可能である。
【００５１】
その後の精製工程は、例えば、分画遠心分離、硫酸アンモニウムまたは有機溶媒による沈殿、クロマトグラフィー技術の使用などで構成される。クロマトグラフィー技術は、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、マススペクトロメトリーなどである。タンパク質精製に関する上記のもの、および、特に詳細な説明に関して、当業者であれば、特に「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ等編，２００１年版，ジョン・ワイリー＆サンズ刊）のような教本で詳細な説明を知ることができる。
【００５２】
生物学的材料または生物学的材料試料は、例えばエッペンドルフ容器、遠沈管、または、ガラスフラスコのような通常の実験容器中で、化学物質と接触させることができる。ベースとなる水性培地は、例えば、緩衝物質、栄養成分、１価または２価イオン、例えばＮａ+、Ｋ+、Ｃａ2+、Ｃｌ-、ＳＯ42-、ＰＯ32-など、または、タンパク質、グリセロールなどを含む。特定の一定条件、例えば、特に、温度、ｐＨ、イオン条件、タンパク質濃度、体積またはその他のファクターが、接触させるのに有利であり得る。これは、例えば、一定温度に保たれたインキュベート装置中で、緩衝液の存在下で、または、予め正確に量が測定されたイオンまたはタンパク質と共に接触させることにより達成される。特に、水性溶媒は、特定の比率のジメチルスルホキシド、メタノールまたはエタノールなどの有機溶媒を含んでもよい。しかしながら、このような溶媒の含量は、好ましくは混合物の１０体積％以下である。
【００５３】
化学物質は、例えば化学合成によって供給される。当業者であれば、標準的な合成方法に精通している。化学物質は、化学物質コレクションの一部であってもよく、化学物質コレクションとしては、例えば閉鎖系合成プログラム（化学ライブラリーという）から得られた化学物質の蓄積と目録によって製造されたものがある。その他の場合において、化合物はは、微生物（特に細菌）によって生産されたものでもよいし、さらに真菌または植物（天然産物）によって生産されたものでもよい。
【００５４】
適切な医薬化合物は、口腔投与、経口投与、局所投与、非経口投与または直腸投与の形態で、医薬品として投与することができる。個々のケースにおいて最も適切な投与様式は、それぞれの場合において治療しようとする状態の性質および重症度、および、用いられる化合物のタイプに依存する。適切な活性成分濃度は、約１％〜３５％、好ましくは約３％〜１５％である。
【実施例】
【００５５】
ヒトｍａｓ様１受容体のクローニング
ヒトＧＰＣＲ  ｍａｓ様１の配列は、公けに利用できるデータベースに寄託されている。対応するＧｅｎｂａｎｋ寄託番号は、ＡＣ０２７０２６である。配列番号１は、ｍａｓ様１受容体ヌクレオチド配列を含む。配列番号２は、対応するアミノ酸配列を示す。ヒト遺伝子は、イントロンを含まない。それゆえに、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、ゲノムＤＮＡから開始して本受容体を増幅した。ヒトゲノムＤＮＡは、クロンテック（パロアルト）から購入した。ＰＣＲを行うのに、原則的に、その他の会社から、または自己生産されたヒトゲノムＤＮＡも適切である。ＰＣＲ反応条件は、以下のように選択された：最初に９４℃で１０分間インキュベートし、続いて、１サイクルあたり９４℃で１分間、続いて６０℃で１分間、最後に７２℃で２分間で、３５サイクルインキュベートする。クロンテック社製のＧＣ−メルト（Ｍｅｌｔ）キットを用いて反応を行った。しかしながら、ＰＣＲを行うのに、教本で使用されている、特に緩衝条件および酵素に関するその他のプロトコールも適切である。用いられるプライマーは、配列番号３および４で示されており、これらは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位（配列番号３）、または、ＥｃｏＲＩ切断部位（配列番号４）が含まれるように構築された。形成されたＰＣＲ産物の長さは１２６０塩基対であった。これを発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１にＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ切断部位で取り込んだ。このベクターは、市販されており、特にインビトロジェン社（カールスバッド，カリフォルニア州，米国）のものがある。
【００５６】
Ｔａｑｍａｎを用いたリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）
以下の組織および器官由来の市販のＲＮＡサンプルが利用可能である：副腎、胎児脳、胎児肝臓、小腸、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、胎盤、前立腺、骨格筋、脾臓、精巣、胸腺、骨髄、唾液腺、胸腺、気管および子宮。
【００５７】
初めに、ＲＮＡサンプルを標準的な反応条件下でＤＮアーゼ消化で処理した。ｃＤＮＡを、ＭＭＬＶモロニーマウス白血病ウイルス由来の逆転写酵素を用いてＤＮアーゼ処理ＲＮＡ（約２μｇ）から作製した。この反応混合物をｐＨ７．０に調節し、２５ｍＭ／ＭｇＣｌ2、それぞれ１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、５０μＭランダムヘキサマープライマー、５０μＭオリゴ（ｄＴ）16、および、２０Ｕ／μｌ  ＲＮアーゼ阻害剤を含ませた。体積１００μｌで反応を行い、まず２５℃で１０分間、続いて４２℃で６０分間インキュベートし、続いて、９５℃で５分間不活性化し、最後に氷中で冷却した。
【００５８】
続いて、アプレラ社（ヴァイターシュタット（Ｗｅｉｔｅｒｓｔａｄｔ），ドイツ）のＴａｑＭａｎユニバーサルＰＣＲマスターミックスを用いてＰＣＲ反応を行った。緩衝液、酵素の供給およびその他の試薬に関して、この反応は、当業者既知の一般的な実験プロトコールに準ずる。
【００５９】
以下の配列をプライマーとして用いた：
５’−ＴＧＣ  ＴＴＴ  ＧＴＧ  ＧＣＡ  ＡＧＧ  ＡＧＡ  ＣＣ−３’
（配列番号５；「フォワード」プライマー）
５’−ＴＴＣ  ＣＴＡ  ＣＣＡ  ＧＣＣ  ＣＧＡ  ＣＣＡ  Ｇ−３’
（配列番号６；「リバース」プライマー）。
【００６０】
ＰＣＲのインキュベート条件は、以下のように選択された：５０℃で２分間、続いて９５℃で１０分間、続いて、各サイクル９５℃で１５秒間を４０サイクル、および、６０℃で１分間。プライマーをそれぞれ濃度５０μＭで用いた。
【００６１】
コントロールとしてリボソーム１８Ｓ  ＲＮＡを用いた
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）で定量分析を行った。当業者既知であるが、このタイプの定量測定もＴａｑｍａｎ  ＰＣＲと称する。Ｔａｑｍａｎサンプルは、末端が２種の異なる蛍光団で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドからなる。３’末端の蛍光団（アクセプターという）は、５’末端の蛍光団（ドナーという）の効果を減衰する機能を有する（「クエンチャー」）。
【００６２】
５’末端でのドナーは、鎖伸長反応の最中に、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの５’−エキソヌクレアーゼ活性によって解放される。ドナーは遊離形態では消光できなくなるため、それらの量を蛍光分光計を用いて測定することができる。形成されたドナーの量と蓄積されたＰＣＲ産物とは比例関係を示すため、増幅したＤＮＡを定量することが可能である。Ｔａｑｍａｎサンプルの融解温度が、増幅のためのプライマーの融解温度よりも高くなるように常に注意を払うことが必要である。
【００６３】
用いられる蛍光団は、ドナーとしてはＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）、およ
び、アクセプター（＝クエンチャー）としてはＴＡＭＲＡ（５−カルボキシテトラメチルローダミン）とした。
【００６４】
用いられるＴａｑｍａｎサンプルは、以下のヌクレオチド配列を有していた：
３’−ＴＧＡ  ＴＣＣ  ＣＧＧ  ＴＣＴ  ＴＣＣ  ＴＧＡ  ＴＣＣ  ＴＴＴ  ＴＣＡ−５’（配列番号７）。
【００６５】
ＦＬＩＰＲ分析のための細胞培養およびトランスフェクション
ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、１０％ウシ胎児血清、１００００Ｕ／ｍｌ〜１００００μｇ／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、および、２ｍＭグルタミンを含む基本のＩｓｃｏｖｅ’ｓ培地で培養した。
【００６６】
Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ培地は、特にバイオクロム社（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）（ベルリン）から市販されている。Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ培地の組成は、「Ｉｓｃｏｖｅ，Ｎ．Ｎ．，Ｍｅｌｃｈｅｒｓ，Ｆ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
１４７，９２３〜９３３（１９７８年）」で説明されている。一過性トランスフェクションのために、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、２×１０5細胞の量で、３５ｍｍ培養皿にアプライした。細胞を約２４時間インキュベートした後、または、細胞が密度５０〜８０％に達した後、リポフェクトアミン試薬（特にインビトロジェン・ライフテクノロジーズ社（カールスルーエ）から市販されている）を用いて、ＤＮＡ（２μｇ）で細胞をトランスフェクトした。
【００６７】
トランスフェクションの約１６〜１８時間後、９６ウェルのマイクロタイタープレートに１ウェルあたり約８００００細胞の密度で細胞を移した。次に、インキュベートを１８〜２４時間続けた。その後、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２.５ｍＭプロベネシド、４μＭ  Ｆｌｕｏ４、および、１％ウシ胎児血清を含むＨＢＳＳＣ（ハンクス緩衝生理食塩水）（９５μｌ）を加え、５％ＣＯ2の存在下で、３７℃で１時間インキュベートした。Ｆｌｕｏ４は、Ｃａ2+存在下で蛍光を発する色素である。Ｆｌｕｏ４は、特にモレキュラー・プローブス（欧州現地法人，ライデン）で市販されている。インキュベート後、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび２.５ｍＭプロベネシドを含むＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）で３回細胞を洗浄した。
【００６８】
最後の洗浄工程の後、各ウェル中の細胞に溶液約１００μｌを残した。試験しようとするペプチドを、水またはＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に濃度２ｍＭに溶解させた。このようなストック溶液から開始して、最終濃度（２０ｍＭ）の適切な希釈液を製造した。ＦＬＩＰＲ（蛍光イメージングプレートリーダー；モレキュラーデバイス社（イスマニング））を用いて、最初の１分間は１秒のインターバルで、次の１分とさらにその次の１分間は３秒間のインターバルで、トータル３分間蛍光を測定した。アゴニスト効果を測定するのに、１８秒間〜３７秒間の測定値が用いられた。
【００６９】
受容体ｍａｓ様１リガンドの同定
様々なペプチドが、Ｇタンパク質共役受容体ｍａｓ様１を刺激するそれらの特性に関して試験された。ＦＬＩＰＲ技術を用いて試験を行った。この目的のためにＣＨＯ−Ｋ１細胞で受容体を一時的に発現させた。以下のペプチドを試験した：神経ペプチドＦＦ、神経ペプチドＡＦ、神経ペプチドＳＦ、アンギオテンシン、ブラジキニン、ボンベシン、アドレノメデュリン、サブスタンスＰ、サブスタンスＰ１〜９、サブスタンスＰ２〜１１。
【００７０】
サブスタンスＰ（約５００蛍光強度単位）、サブスタンスＰ２〜１１（約２５００蛍光強度単位）、および、神経ペプチドＦＦ（約２０００蛍光強度単位）の存在下での細胞での蛍光の形成を測定することができた。いずれの場合においても、ゼロ値は約２０蛍光強
度単位である。サブスタンスＰおよびサブスタンスＰ２〜１１の濃度が５×１０-6〜１×１０-5Ｍの範囲において、受容体活性化は、線形の依存性を示した。サブスタンスＰのＥＣ50は、１０.３７μＭであった。
【００７１】
サブスタンスＰ２〜１１は、一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞においてアラキドン酸を放出した。
【００７２】
従って、サブスタンスＰ、サブスタンスＰ２〜１１、および、神経ペプチドＦＦを、Ｇタンパク質共役受容体（ｍａｓ様１という）の天然リガンドとして同定することができた。
【００７３】
検出方法に従って設計された、ｍａｓ様１の活性に関するアゴニストおよびアンタゴニストを発見する試験システムはさらに、サブスタンスＰ、サブスタンスＰ２〜１１、または、神経ペプチドＦＦを含んでいた。特にサブスタンスＰのその他のフラグメント（例えばサブスタンスＰ４〜１１またはサブスタンスＰ１〜９）で、アゴニスト効果が示された。
【００７４】
神経ペプチドＦＦは、以下のアミノ酸配列を有する：
Ｈ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＮＨ2（配列番号８）
サブスタンスＰ２〜１１は、以下のアミノ酸配列を有する：
Ｈ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ2（配列番号９）。
【配列表】
2005528923000001.app
【国際調査報告】
2005528923.tif 000002
2005528923.tif 000003
2005528923.tif 000004
2005528923.tif 000005
2005528923.tif 000006
2005528923.tif 000007
2005528923.tif 000008
2005528923.tif 000009
2005528923.tif 000010
2005528923.tif 000011
2005528923.tif 000012