(57)【要約】  本発明は以下の工程を含む、少なくともペプチドの分析方法である；少なくとも１セットの細胞からタンパク質を抽出する工程；抽出したタンパク質を消化する工程；タンパク質断片混合物を同位体標識した試薬分子で誘導体化する工程；多次元クロマトグラフィーによってタンパク質断片混合物を分離する工程；および、親イオン・スキャニング・モードまたはニュートラル・ロス・スキャニング・モードにおいて質量分析（ＭＳ）によってタンパク質断片混合物を分析し、それによって標識タンパク質断片の量を検出または測定する工程。好適な態様において、２セットの細胞を２つの異なる状態の発現レベルを比較するために本方法において混合する。さらに、本発明は、本発明の標識方法に使用するためのキットに関する。
2005513507.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む少なくとも１つのタンパク質またはポリペプチドを標識し、標識タンパク質／ポリペプチドの量を測定する方法：
（ａ）少なくとも１セットの細胞から少なくとも１つのタンパク質またはポリペプチドを抽出する工程；
（ｂ）抽出したタンパク質／ポリペプチドを消化し、ペプチドまたはタンパク質断片の混合物を得る工程；
（ｃ）得られたペプチド混合物を同位体標識した試薬分子で誘導体化する工程（ここで試薬はタンパク質断片の特定の部位に結合する）；
（ｄ）ペプチド混合物を多次元クロマトグラフィーによって分離する工程；
（ｅ）質量分析（ＭＳ）によってペプチド混合物を分析する工程（ここで各ペプチドに特異的なサイン・イオンが生成し、標識化ペプチドの量が親イオンスキャニング・モードまたはニュートラル・ロス・スキャニング・モードで検出される）。
【請求項２】
抽出がドデシル硫酸ナトリウム（例えば、約１％ＳＤＳ）を含むバッファーを用いて行われる請求項１の方法。
【請求項３】
抽出したタンパク質／ポリペプチドを消化の前にスクシニル化する請求項１または２の方法。
【請求項４】
抽出したタンパク質／ポリペプチドが膜タンパク質および／または膜結合性タンパク質を含む請求項１から３のいずれかの方法。
【請求項５】
工程（ｅ）において、標識化されたタンパク質／ポリペプチドの発現レベルが測定される請求項１から４のいずれかの方法。
【請求項６】
消化がまず臭化シアンを用いて行われ、次いでｐＨ４から５にてＶ８プロテアーゼを用いて行われるかあるいは、ｐＨ７から９にてＬｙｓＣプロテアーゼを用いて行われる請求項１から５のいずれかの方法。
【請求項７】
試薬分子が少なくとも結合部分、架橋部分および標識部分を含み、架橋部分がチオエーテル架橋である請求項１から６のいずれかの方法。
【請求項８】
試薬分子の結合部分がアミン誘導体である請求項７の方法。
【請求項９】
アミン誘導体試薬が塩基性部分を有するペプチドのＮ−末端を共有結合により修飾する能力を有する請求項８の方法。
【請求項１０】
標識が質量に基づいて識別され、同位体標識がＣ１２／Ｃ１４、Ｈ／ＤおよびＣ１３５／Ｃ１３７からなる群から選択される少なくとも１つの原子である請求項７から９のいずれかの方法。
【請求項１１】
試薬がＮ−スクシニミジル−２−（４−ピリジルメチルチオ）−アセテート、および／またはＮ−スクシニミジル−２−［４−（２，３，５，６−テトラジュウテリオ−ピリジル）］−メチルチオアセテートである請求項７から１０のいずれかの方法。
【請求項１２】
混合物が工程（ｃ）の後にヒドロキシルアミンで処理される請求項１から１１のいずれかの方法。
【請求項１３】
工程（ｄ）が二次元クロマトグラフィーを含み、第一次元がアニオン交換クロマトグラフィーを用い、第二次元が逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）を用いる請求項１から１２のいずれかの方法。
【請求項１４】
第一次元の流速が１から１００μｌ／分であり第二次元の流速が１から２００ｎｌ／分である請求項１３の方法。
【請求項１５】
検出される標識がシステイン含有ペプチド上に存在する請求項１から１４のいずれかの方法。
【請求項１６】
質量分析が１０６および／または１１０ｍ／ｚにて行われる請求項１から１５のいずれかの方法。
【請求項１７】
工程（ｅ）においてサンプルが２つの画分に分割され、一方がＭＳ用であり、一方がフラクションコレクター用である請求項１から１６のいずれかの方法。
【請求項１８】
２セットの細胞からタンパク質／ポリペプチドが抽出され、各細胞のセットが異なる試薬によって標識化されることにより、２セットの細胞のタンパク質発現の比較が可能となる請求項１から１７のいずれかの方法。
【請求項１９】
異なる試薬が質量に基づいて識別される請求項１８の方法。
【請求項２０】
第一のセットが軽い同位体標識によって標識化され、第二のセットが重い同位体標識によって標識化されるか、あるいはその逆である、請求項１９の方法。
【請求項２１】
第一の細胞のセットがＮ−スクシニミジル−２−（４−ピリジルメチルチオ）−アセテートで標識化され、第二の細胞のセットがＮ−スクシニミジル−２−［４−（２，３，５，６−テトラジュウテリオ−ピリジル）］−メチルチオアセテートで標識化される請求項２０の方法。
【請求項２２】
２セットの細胞が工程（ｄ）の前に混合される請求項１９から２１のいずれかの方法。
【請求項２３】
以下の工程によってタンパク質断片混合物が分析される請求項１９から２２のいずれかの方法：
（ｉ）１０６ｍ／ｚでのスキャニングによって、第一の細胞のセットのスペクトルを得る工程、
（ｉｉ）１１０ｍ／ｚでのスキャニングによって、第二の細胞のセットのスペクトルを得る工程、
（ｉｉｉ）１１０ｍ／ｚスキャンの強度値を反転し、これを１０６ｍ／ｚスキャンに加え、示差スペクトルを得る工程。
【請求項２４】
以下の工程によってタンパク質断片混合物が分析される請求項１９から２２のいずれかの方法：
（ｉ）１０５ｍ／ｚでのニュートラル・ロス・スキャニングにより第一の細胞のセットのスペクトルを得る工程、
（ｉｉ）１０９ｍ／ｚでのニュートラル・ロス・スキャニングにより第二の細胞のセットのスペクトルを得る工程、
（ｉｉｉ）１０９ｍ／ｚのロス・スキャンの強度値を反転し、これを１０５ｍ／ｚスキャンに加え、示差スペクトルを得る工程。
【請求項２５】
ＭＳ／ＭＳ−分析を示差スペクトルから選択されるタンパク質／ポリペプチドからのペプチドに対して行う請求項２３または２４の方法。
【請求項２６】
アミノ酸配列を少なくとも１つの標識化ペプチドについて同定する請求項２５の方法。
【請求項２７】
イオン捕捉質量分析計を用いる請求項２５または２６の方法。
【請求項２８】
少なくとも結合部分、架橋部分および標識部分を含み、架橋部分がチオエーテル架橋である試薬分子による分析の、請求項１から２７のいずれかのタンパク質断片の混合物の標識のための使用。
【請求項２９】
別々の区画において、Ｎ−スクシニミジル−２−（４−ピリジルメチルチオ）−アセテートおよびＮ−スクシニミジル−２−［４−（２、３，５，６−テトラジュウテリオ−ピリジル）］−メチルチオアセテートを含む請求項１から２７のいずれかの方法において使用するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全細胞消化物の同位体標識、次いで多次元クロマトグラフィーおよび／または質量分析に連動した電気泳動および所望によりデータベース検索による分析を用いるタンパク質発現分析の完全に自動化できるシステムの開発方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
２００１年の冒頭に、ヒトゲノムの配列決定が完了したと宣言された。これは生物学研究における新時代の始まりを示すものであった。実質的に何がなされたかというと、染色体とよばれるＤＮＡ鎖の対を形成するよう連結している４つの構成単位（ヌクレオチド）の順序が決定されたのである。ヒトは４６の染色体を有し、その半分は母親由来であり、もう半分は父親由来である。ヒトゲノムの配列決定は「簡単」であった。というのは４構成単位、即ち４文字からなる４６分子（巨大ではあるが）が存在するのみだからである。タンパク質は２０の構成単位を有し、そのそれぞれはタンパク質が構築されてから改変または修飾されうる。したがって、ゲノムのタンパク質版の研究である「プロテオミクス」では４０，０００以上の遺伝子を扱わなくてはならない。遺伝子から８００，０００のタンパク質（数１０７ほどのトリプシン消化（tryptic）ペプチドに対応する）が生じ、タンパク質はさらに３００種を超える化学物質によって修飾されうる。それだけでなく、プロテオミクスでは、ある特定の時間に特定のタイプの細胞においてどのタンパク質が産生され、それらがどのように修飾され、細胞内のどこに位置し、何と接触し、そしてより難しいことに、タンパク質の機能が何であるかを決定しなければならない。
【０００３】
今日、かかる分析および決定に利用できる方法はいくらかある。例えば、国際特許出願第ＷＯ００／１１２０８号は、タンパク質が同位体標識した分子によって誘導体化される方法を開示する。標識タンパク質は捕捉され、消化され、遊離して質量分析により分析される。
【０００４】
国際特許出願第ＷＯ０１／７４８４２号（Proteome Systems）に教示される所望のタンパク質サンプルを２次元電気泳動分離（２Ｄ−ＳＤＳ）にかける方法では、特定の残基が消化前に保護され、標識試薬によって誘導体化され、そして質量分析によって分析される。しかし、かかる方法には２次元電気泳動であることによる制限があり、すべてのタンパク質が可視化されるような分離が達成されない。多くのタンパク質は小さすぎるか、大きすぎるか、あるいは酸性またはアルカリ性が強すぎるため、もしくは不溶性度が大きいためこの方法に適さない。膜タンパク質は生理的および医学的にもっとも重要なタンパク質群の１つであるが、２次元電気泳動の様々な段階において凝集して沈殿する傾向があるために完全には表示されない。それゆえ、かかるタンパク質は標識されない傾向にあり、したがってまた分析もされない。さらに、国際特許出願第ＷＯ０１／７４８４２号に開示される方法は親イオンスキャニング・モードのＭＳには用いることができない。というのは、そこに記載された試薬はサイン（signature）・イオンを発生させることができないからである。
【０００５】
さらに、国際特許出願第ＷＯ０１／８６３０６号（Purdue Research）は、タンパク質分析物に特有の成分であるタンパク分解ペプチド断片のアフィニティー選抜を利用する複雑な混合物におけるタンパク質同定方法に関する。ＣｙｓまたはＭｅｔなどの豊富でないアミノ酸である、かかる「サイン（signature）・ペプチド」は、試薬の化学的捕捉のための分析用の代理として作用する。タンパク分解された混合物の質量分析によりタンパク質を精製したりその成分であるサインを得たりすることなく複雑なサンプル中のタンパク質の同定が可能となる。というのは「サイン・ペプチド」の使用により分析の複雑さが低減されるからである。しかし、かかる「サイン・ペプチド」は親イオン・モードのＭＳに必要であるサイン・イオンと混同してはならず、これは国際特許出願第ＷＯ０１／８６３０６号に開示の方法では達成されない。
【０００６】
Aebersold et al (American Genomic/Proteomic Technology (Aug.2001)、Vol. 1 (1)、p. 22-27)は、定量的プロテオミクスのための同位体コード化アフィニティー・タグ試薬を開示する。しかしこの方法では、ペプチドの複雑性の軽減が親イオン-スキャニング・モードのＭＳによってではなくアフィニティー精製によって達成されなければならない。同様に、Goodlet et al (Rapid Communications in MS、2001,15,1214-1221)は、ＡｓｐおよびＧｌｕに特異的なタンパク質の化学的タグ付加を開示する。試薬はＭＳ／ＭＳ安定であり、親イオン−スキャニング・モードのＭＳに必要な特定のフラグメント・サイン・イオンを発生させることができない。その他の方法も同じ理由により親イオン−スキャニング・モードでの使用には適さない。その他の方法は例えばWang et al (Journal of Chromatography A、924 (2001) 345-357)に開示されており、その方法では化学的アフィニティークロマトグラフィーを用いてサンプルの複雑性を低減する。
【０００７】
国際特許出願第ＷＯ０２／４８７１７号は、酸不安定性同位体コード化抽出溶媒およびそのタンパク質混合物の定量的質量分析における使用に関する。かかる方法に用いられる試薬はチオール特異的かつＭＳ／ＭＳ安定でなければならない。したがってこの方法ではサイン・フラグメント・イオンが発生せず、それゆえ親イオン−スキャニング・モードのＭＳに有用ではない。
【０００８】
最後に、Carr et al はホスホペプチドからのリン酸の消失を追跡する方法を記載している (Selective detection and sequencing of phpsphopeptide at the femto- mole level by mass spectrometry、Anal. Biochem. 239 (2): 180-92,1996)。この方法はリン酸の消失によるニュートラル・サイン・イオン−７９ｍ／ｚの生成に依存する。リン酸の生成もニュートラル・ロス・スキャニング・モードを用いてニュートラル分子としてのリン酸の消失により追跡することができる。
【０００９】
しかし、タンパク質レベルの相違を調べるために２つの異なった状態にある細胞を比較することが望まれることがよくある。かかる場合における問題は、目的のタンパク質に焦点をしぼるために今日用いられている方法により得られたデータの量を低減することである。したがって、異なる細胞状態からの目的のタンパク質をよりよく研究および比較することができる方法が提供されることが望まれている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、本発明の目的は上記の問題を解決する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の概要）
本発明者らはプロテオミクス研究分野の要求を満たす新規な方法を開発した。したがって、本発明の第１の態様は、細胞のセットから抽出したタンパク質またはポリペプチド混合物を同位体標識した試薬分子で標識し、それをＭＳ親イオン−スキャニングにより分析する、請求項１記載の方法に関する。別の好適な態様において、２つの異なる状態を表す２種類のセットの細胞が該方法によって分析され、ここで各セットの細胞が異なる試薬分子によって標識化され、サブトラクティブ親イオン・スキャニングまたはニュートラル・ロス・スキャニングが可能となる。別の態様において、本発明は、標識化試薬分子に関し、さらに別の態様において本発明は、標識化試薬分子を含む本発明の方法に用いるキットに関する。
【００１２】
したがって本出願は、二次元電気泳動ゲルに基づかないプロテオーム分析方法の開発について記載する。本質的に、同位体標識方法を用いて全細胞抽出物の消化産物から得られたすべてのペプチドのＮ−末端を特異的に標識する。１つの態様において、第一の細胞サンプルが試薬により標識化され、第二の細胞サンプルは重水素化バリアントにより標識化される。非常に複雑なペプチド混合物（１０７ペプチド）を部分的に二次元クロマトグラフィー／キャピラリーゾーン電気泳動によって分離し、次いでナノ−エレクトロスプレー質量分析によって直接オンラインで分析する。あるいは混合物をＭＡＬＤＩ質量分析などのオフライン分析を後で行えるように収集してもよい。それゆえ、本発明者らは同位体標識したアミン部分に結合するチオエーテル架橋を有する試薬を合成した。チオエーテル架橋は化学的に非常に安定であるが、気相においては容易に断片化して固有の質量の娘イオンが生じる。親イオン−スキャニングにより、特有の質量標識を含むペプチドのみを検出することができる。２つの質量、即ち重水素化試薬および非重水素化試薬からの軽い質量と重い質量が存在するため、質量分析計を設置して設定因子によって発現レベルが変化したペプチドのみを配列決定することができる。この方法を改変して離脱基の塩基性の低減によりニュートラル・ロス・スキャニングによってペプチドを検出することもできる。したがって分析されるペプチド数は系に応じて１０７から約１０３となる。２Ｄ  ＰＡＧＥ技術とは対照的に、膜タンパク質、大小のタンパク質および極端なｐＩのタンパク質を含むすべてのタンパク質が表示される。この方法は容易に自動化することができ、今日用いられている遅く、制限された方法に取って代わる価値あるものである。
【００１３】
１つの態様において、本発明は標識化されたタンパク質またはポリペプチドの発現レベルの測定を提供する。この目的のために本発明は特に有利である。というのは本発明の方法により初めて発現レベルが変化しない数千のタンパク質を除くことが可能となったからである。
【００１４】
したがって、細胞における全タンパク質を分析する新規な方法の基礎およびその改変を本出願において記載する。まず電荷によって、次いでサイズによってタンパク質を分離する従来の方法と異なり、本方法は細胞中のすべてのタンパク質を小さい断片(ペプチド)へと切断した後、それらを電荷および脂溶性によって分離する。膜タンパク質、非常に大きいまたは小さいあるいは高度に荷電したタンパク質などの従来の技術によっては容易に見いだすことのできなかったすべてのタンパク質の分析が本発明により可能となる。その結果、これまでの面倒な方法に代わって、単純かつ簡便な自動化およびコンピュータ化された方法を用いることができるようになり、多くの科学者、より重要なことに多くの医者が非常に強力な研究手段を手にすることができるようになった。
【００１５】
本発明のその他の目的および利点は以下の詳細な説明によって明らかであろう。
【００１６】
（定義）
「生体分子」とは、ヒトなどの生物体内の種々の起源の生体分子を意味し、例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸、脂肪酸、炭水化物が含まれる。
【００１７】
「細胞のセット」とは、ヒトなどの関連する生物体から特定の状態にて単離された一定数の細胞、例えば、１細胞のみ、あるいは多数の細胞のことを意味する。
【００１８】
「試薬分子」とは、タンパク質における特定の部位に共有結合することのできる分子であり、標識化された場合、分析において結合したタンパク質の検出に用いられるものを意味する。
【００１９】
「結合部分」とは、所望のタンパク質上の特定の部位に結合することのできる試薬分子の部分を意味する。
【００２０】
「標識部分」とは、標識を含む試薬分子の部分であって、質量分析などの分析によって後で検出することができる部分を意味する。
【００２１】
「架橋部分」とは、標識部分と結合部分をつなぐ試薬分子の部分を意味し、架橋部分の切断後、質量分析などの分析において特有の標識化質量マーカーの検出が可能となる。
【００２２】
タンパク質断片の混合物を試薬分子によって「誘導体化する」とは、タンパク質断片の特定の部位に試薬を共有結合させることを意味する。
【００２３】
（発明の詳細な説明）
したがって、本発明の第１の態様は、以下の工程を含むタンパク質の分析方法である:
（ａ）少なくとも１セットの細胞から少なくとも１つのタンパク質またはポリペプチドを抽出する工程；
（ｂ）抽出したタンパク質／ポリペプチドを消化し、それによってペプチドまたはタンパク質断片の混合物を得る工程；
（ｃ）ペプチド混合物を同位体標識した試薬分子で誘導体化する工程（ここで試薬はタンパク質断片の特定の部位に結合する）；
（ｄ）ペプチド混合物を多次元クロマトグラフィーによって分離する工程；
（ｅ）ペプチド混合物を質量分析（ＭＳ）によって分析する工程（ここで、各ペプチドに特異的なサイン・イオンが生成し、標識化ペプチドの量が親イオン−スキャニング・モードまたはニュートラル・ロス・スキャニング・モードによって検出される）。ニュートラル・ロス・スキャニングの場合、親イオン−スキャニングと比べて塩基性度の低い離脱基を選択する。
【００２４】
本発明の方法はタンパク質分析に関するものであるが、当業者であれば本方法を、本明細書に記載する手順に好適なようにその性質が変えられるその他の生体分子の分析に容易に適用することができよう。したがって、本発明は少なくとも１つの生体分子を標識し、その量を測定する上記方法を含む。当業者であれば理解するように、親イオン・スキャニング・モードまたはニュートラル・ロス・スキャニング・モードのＭＳに有用であるためには、本発明の標識試薬はＭＳ／ＭＳ不安定性のものとする。現時点で最適な態様において、標識試薬は、結合部分、架橋部分および標識部分を含み、ここで架橋部分はチオエーテル架橋である。
【００２５】
したがって本発明による方法は、上記の従来技術の方法におけるように、アフィニティー工程や化学的捕捉を用いる精製を必要としない。さらに、本方法は親イオン・スキャニング・モードまたはニュートラル・ロス・スキャニング・モードのＭＳを用いるため、質量分析計を、その発現レベルが変化しているタンパク質から生じるペプチドイオンのみが検出できるように設定することができる。各タンパク質は複数のペプチドによって表されるため、タンパク質の消失や翻訳後修飾による危険が大幅に削減される。タンパク質を表すのに１つのペプチドのみに依存する従来技術の方法においては、アフィニティー精製または珍しいアミノ酸の標識を用いる標識の場合と同様に、多数のその他のペプチドとの共溶出による目的のペプチドの消失が起こることが多い。
【００２６】
本発明のさらに別の好適な態様において、タンパク質またはペプチドを２セットの細胞から抽出し、各細胞のセットを異なる試薬で標識化する。それにより、２つのサンプルが混合され、サブトラクティブ・親イオン-スキャニングにかけられると、２つの異なる状態の比較および／またはそれらの発現レベルの決定が行われる。これは２つの異なる状態の比較を可能にする好適な態様である。
【００２７】
特別の態様において、標識化ペプチド混合物は工程（ｄ）の前に混合される。
【００２８】
１つの態様において、工程（ａ）で提供されるサンプルは、機械的または化学的細胞分解および遠心分離によって得られたものである。別の態様において、工程（ａ）で提供されるサンプルは膜タンパク質または膜結合性タンパク質を含む。この態様は特に有用である。というのは、かかるタンパク質は従来技術においては標識するのが非常に困難であることが示されているからである。上述のように、かかるタンパク質の親水性と疎水性という２つの機能の結果、しばしばその自己凝集が起こり、それによってさらに分析することができなくなる。本発明の特定の態様において、最初の消化は一般にギ酸中で行われ、ギ酸は実質的にすべてのタンパク質を溶解する。消化の後、酸を除き、小さくなったペプチドはすべて尿素などのカオトロープ溶液に可溶性となり、かかる溶液中で容易かつ効率的に酵素により消化されて小さいペプチドとなる。それらのほとんどは、インタクトなタンパク質のような凝集する傾向を示さない。したがって本発明によると、タンパク質由来の小数のペプチドは凝集してしまうかもしれないが、少なくとも最小で５０％は凝集しない。したがって、本方法は膜タンパク質および／または膜結合性タンパク質に関して従来技術の方法よりもより有利であることが示される。
【００２９】
上記工程（ｃ）に用いる標識試薬は例えば遊離アミノ基との反応に基づくＮ−末端アミノ酸の標識である。したがって、内部アミノ酸残基、特にリジンに存在するアミノ基への標識試薬の結合をブロックするようにタンパク質を予め処理することが必要である。リジンのイプシロン基がブロックされなければ、標識試薬はリジンのすべての遊離アミノ基に結合してしまい、標識化ペプチドのアミノ酸配列の解読が困難となる。したがって、１つの態様において、タンパク質のスクシニル化を工程（ｂ）の前に行う。特定の態様において、工程（ｂ）に用いる保護試薬は無水コハク酸であるが、保護試薬は上記の機能を満たすものであればいずれの好適な保護試薬であってもよい。例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドを例えばｐＨ約８で添加する。しかし、この保護試薬はリジン残基だけでなくチロシンおよびセリン／スレオニンにも付加する。したがってかかる試薬を用いるには、このような副反応を除くためのさらなる工程が必要である。このさらなる工程は誘導体化工程（ｃ）の後、ペプチド分離工程（ｄ）の前に行わなくてはならず、例えばヒドロキシルアミン（０．２Ｍ）、ｐＨ８、約３０分間の添加による。当業者であればアミノ酸の保護および脱保護に精通しているであろうし、各状況に好適な条件を選択することができよう。
【００３０】
工程（ｂ）における切断は、酵素例えば、プロテアーゼ（例えば、トリプシン、Ｖ８プロテアーゼ、（黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）Ｖ８プロテアーゼ、ＬｙｓＣ、ＡｓｐＮ等））またはグリコシダーゼなどによる酵素的消化であってもよいし、臭化シアンなどによる化学的消化であってもよい。しかし、膜タンパク質および／または膜結合性タンパク質に関しては、その構造がコンパクトであり、変性した場合に凝集する傾向があることから、酵素による消化は有効でないことが判明した。膜タンパク質および／または膜結合性タンパク質に特に有利な１つの態様において、工程（ｂ）の切断は、臭化シアンなどの消化作用のある化学物質を添加した後、酵素による消化を行う。より具体的には、本発明者らは、タンパク質をまず強力な溶媒（例えば７０％ギ酸またはトリフルオロ酢酸）中、ヘキサフルオロプロパノールの存在下または不在下で臭化シアンにより消化するスキームを用いた。これによって中程度の断片が生じ、かかる断片は従来からの方法（例えば、１％ＳＤＳを約０．０１％に希釈し、ＬｙｓＣプロテアーゼにより消化する方法）によって容易に可溶化される。別の態様においては、Tsugita (Kamo et al. 1998 and Kawakami et al. 1997)らのグループによって報告されているように、酸による切断を用いてもよい。したがって、１つの態様において、工程（ｂ）の切断はフッ酸によるセリン／スレオニン切断である。詳細な態様において、ペプチドおよびタンパク質におけるセリンおよびスレオニンでの部位特異的切断は、Ｓ−エチルトリフルオロチオアセテート蒸気によって、同様にアスパラギン酸残基での切断は０．２％ヘプタフルオロ酪酸蒸気に９０℃にて曝すことによって行われる。上記のセリン／スレオニン切断方法は、Ｓｅｒおよび特にＴｈｒが膜貫通領域に多くみられることから有用である。要約すると、当業者であればサンプルの起源、標識目的などの因子に応じてサンプル中のタンパク質を切断するもっとも適当な方法を選択することができよう。本発明によって得られた消化されたタンパク質は物理化学的により単純であることから扱いやすい。したがって、本発明の重要な利点は、本発明の消化産物は実質的に全消化産物であることにより、本発明により得られたペプチドの分離方法を、元のサンプル中にタンパク質として存在する１または複数の実質的にあらゆるペプチドを選び出すために選択することができることである。したがって、分離およびその後の標識工程において、以下により詳細に記載するようにたとえシステイン含有ペプチドであっても、いずれのペプチド（タンパク質の断片）を扱うことも可能である。このことをタンパク質が例えば自己凝集により隠れてしまったり、表れなくなってしまう従来技術の方法と比較されたい。従来の方法ではインタクトなタンパク質を分離することが必要であり、定量的側面を損なわずにペプチド消化物を扱うことができなかった。本発明の切断方法では均質なペプチドが提供され、かかるペプチドはタンパク質が複数の位置に泳動される原因である、複数のドメイン（疎水性および親水性）を有することに固有の問題が生じることなく分離することができる。本発明の消化方法によって、本発明を用いなければ完全に不溶性であるか、大きな複合体の一部であるため容易に分離することができなかったタンパク質（特に細胞骨格凝集体またはプロテオグリカン）の分析が可能となる。
【００３１】
１つの態様によると本発明の試薬分子はアミン誘導体である。別の態様において本発明の試薬分子は塩基性部分を有するペプチドのＮ−末端を共有結合により修飾できるように構成される。したがって好適な態様において標識試薬の結合部分はＮ−末端アミノ基と反応できるいずれの部分であってもよい。さらに、好適な態様において、標識試薬は非常に安定な化学基であるが、気相（ＭＳにおける場合など）においては容易に開裂しうるチオエーテル架橋を有する。
【００３２】
好ましくは、本発明は標識試薬およびそれらが結合するペプチドの異なる形態を質量に基づいて区別できるように２以上の形態で提供されうる標識を利用する。しかしかかる２以上の形態は重要なことに、質量分析にかけられた際に標識試薬が結合するペプチドのイオン化効率に影響を与えるものであってはならない。本発明の方法の１つの態様において、工程（ｃ）は質量に基づいて区別できる異なる形態で提供される試薬での処理である。したがって試薬は、以下からなる群から選択される：Ｃ１２／Ｃ１４；Ｈ／Ｄ；Ｃ１３５／３７；正に荷電した芳香族アミン；正に荷電した三級四級アミン；およびリンに基づく化合物。
【００３３】
好ましい例示的な態様において、工程（ａ）において提供される２つのサンプルのうち一方はＨ４Ｓで処理し、他方はＤ４Ｓで処理する。
【００３４】
Ｈ４ＳおよびＤ４Ｓの前駆体の調製および本発明のＨ４Ｓ／Ｄ４Ｓ−試薬の調製については、本出願の実施例を参照されたい。
【００３５】
これによって、Ｈ４ＳはＭＳスペクトルにおいて１０６ｍ／ｚに対応するピークを生じさせ、Ｄ４Ｓは１１０ｍ／ｚに対応するピークを生じさせることから、独特の質量マーカーが提供される。当業者であれば容易に理解するように、サブトラクティブ親イオン−スキャニングの使用を可能とする独特の質量マーカーが提供される限り、実質的にその他のいずれの重／軽同位体対をこの目的に用いることができる。
【００３６】
本発明の方法の１つの態様において、工程（ｄ）の分離は多次元クロマトグラフィーによる。本発明の方法の別の態様においては標準的逆相ＨＰＬＣを用いて大部分のペプチドを分離する。非常に疎水性のペプチドが望まれる場合に効率的である１つの特定の態様においては、親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）アプローチを用いる。あるいは、以前に記載されているように(James P、Inui M、Tada M、Chiesi M,Carafoli E. The nature and site of phospholamban regulation of the Ca2+ pump of sarcoplasmic reticulum. Nature. 1989 Nov 2 ; 342 (6245): 90-2)、第一次元の分離は界面活性剤（例えばオクチルグルコシド）の存在下でのイオン交換によって行う。界面活性剤は順相プレカラムを用いることによりＲＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳ分析の前に容易に除去することができる。あるいは以下の様々な形態の組み合わせも含まれる：キャピラリーゾーン電気泳動、サイズ排除クロマトグラフィーまたは特異的アフィニティー精製工程。
【００３７】
細胞におけるすべてのペプチドの観察に必要なタンパク質の総量および必要な分離程度は見いだすべき重要なパラメーターである。したがって、ペプチド検出およびＭＳ／ＭＳの最大感受性レベルを１ｆｍｏｌとすれば、細胞あたりタンパク質が６ｘ１０−２３モル存在することとなり、０．２５ｍｇのタンパク質に相当する数を想定すると１．６ｘ１０７細胞が必要である。したがって第一次元分離は分析レベルで１ｍｍのカラムで行わなければならない。第二次元クロマトグラフィーは１５０μｍのカラムで行えばよい。ヒトゲノムには３０，０００遺伝子が存在し、その１０％が所与の時間にいずれかの細胞系で発現しているとし、そして選択的スプライシング、翻訳後修飾などで各タンパク質につき平均で２０のバリアントが存在し、タンパク質分子量が平均５０ｋＤａであるとすれば、細胞あたりおよそ２００，０００のトリプシン消化ペプチドが必要である。シグナル抑制が過剰となるのを避けるために、個々のスペクトルが１０以下のペプチドを含有するような分離方法を採用する必要がある。流速２００ｎｌ／分の第一次元および第二次元から１０フラクションが生じるとするとピーク幅は約５秒となる。したがって平均で１スキャンあたり最大１０ペプチドを観察する必要があるとすれば、一つのグラジエントは約２．７時間でなければならず、分析総時間は２７時間となる。
【００３８】
本発明者らはStahl et al. 1999 (Anal Chem 1995 Dec 15; 67 (24): 4549-56. A microscale electrospray interface for on-line、capillary liquid chromatography/tandem mass spectrometry of complex peptide mixtures. Davis MT、Stahl DC、Hefta SA、Lee TD. )のグループによって記載されたシステムに基づいて二次元ＨＰＬＣシステムを構築した。フロー開裂なくして低ナノリットル／分の範囲において作動できる市販の実行できる装置がないため、本発明者らはチューリッヒ(Zurich)において構築された設計に基づいてナノフロー(nanoflowed)ＨＰＬＣを構築した。第一次元は中程度の流速（５０μｌ／分）で市販の装置を用いて行い、第二次元は本発明者らのナノフロー設計を用いて１−２００ｎｌ／分で溶出するペプチドの数に応じてダイナミック様式にて実行する。第一次元には、ｐＨ３での強アニオン交換クロマトグラフィーを用いてればよく、これによって１０−２０のフラクションが生じ、これらは自動サンプル収集器で収集され、質量分析計に連結した逆相Ｃ−１８ベース・クロマトグラフィーによって分離される。
【００３９】
本発明によると、検出または測定は質量分析（ＭＳ）による。より具体的には、親イオン-スキャニング(Anal Chem 1996 Feb 1; 68 (3): 527-33. Parent ion scans of unseparated peptide mixtures. Wilm M、Neubauer G、Mann M. and Carr et al. 1993、Anal Chem 1993 Apr 1; 65 (7): 877-84 Collisional fractionation of glycopeptide by electrospray ionisation LC/MS and LC/MS/MS: methods for selective detection of glycopeptide in protein digest. Huddleston MJ、BeanMF、Carr SA. )を用いて本発明の独特の質量マーカー標識を検出する。
【００４０】
本発明の方法の別の態様において、検出される標識はシステイン-含有ペプチドにおいて存在する。したがって、Gygi SP、Rist B、Gerber SA、Turecek F、Gelb MH、Aebersold R. Related Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affnity tags. Nat Biotechnol. 1999 Oct; 17(10) : 994-9などの従来技術と異なり、本発明はそのシステイン含量にかかわりなくあらゆるペプチドまたはタンパク質に有用な方法を提供する。ヒトゲノムのタンパク質の約２０−３０％はアミノ酸システインを含有するため、これは、以前に開示された方法の用途をより広くし、より普遍的とする本発明の重要な利点である。また、システイン標識タンパク質から得られる標識化ペプチドの数は１〜２程度である。もし質量分析計が他のペプチドが溶出している際に他のペプチドからの共溶出ペプチドを分析するとすれば、１つのタンパク質は分析から除外されるであろう。本発明においては、タンパク質から典型的には１０〜２００のペプチドが生じるため、そのタンパク質から生じるペプチドを分析する可能性は非常に大きく、したがってそれが失われてしまう機会は無視できるほどに小さい。
【００４１】
さらに別の態様において、本発明の方法は少なくとも１つの標識化ペプチドのアミノ酸配列を同定する工程をさらに含む上記の方法を含む。
【００４２】
１つの態様において、アミノ酸配列同定工程はイオン・トラップ・スペクトロメーターまたは四重極飛行時間（ＴＯＦ）装置を用いた質量スペクトル分析による。しかし、当業者が認識しているように、ペプチドフラグメンテーションスペクトルを実行および測定することができるあらゆるＭＳ装置をこの目的のために使用することができる。
【００４３】
さらに、アミノ酸同定の後に、同定された配列に対するデータベースサーチを行ってホモログまたはその他の関連情報を見いだすこともできる。これは同定した配列の推定機能を予測するために行う。
【００４４】
データを蓄積するための２つのアプローチが存在する。フロー・スプリッターをＭＳの前に導入して半分をＭＳに、半分をフラクションコレクターへ導いてもよい。この第１の方法である、加工後方法では、ＭＳスペクトルは実行後に分析され、その発現レベルが変化したペプチドはＭＳ／ＭＳ分析用に適当なフラクションから回収される。第２の方法であるダイナミック・データ依存分析 (Davis et al. 1995)方法では、オンザフライでＨ４ＳＤ４Ｓ比が評価され、直接スペクトルを加工し、次いで比が適当な変化を示した場合は自動的にＭＳ／ＭＳが行われる。フィニガン（Finnigan）三連四重極質量分析計および自己プログラム装置制御言語プログラム（self-programmed Instrument Control Language program ）を用いた最初の実験ではこれが可能であることが示された。
【００４５】
二次元からの単一のスポットにおける複数のタンパク質の定量を可能にするために開発された別の方法が記載されているが(Munchbach M、Quadroni M,Miotto G、James P. Quantitation and facilitated de novo sequencing of proteins by isotopic N-terminal labelling of peptide with a fractionation-directing moiety. Anal Chem. 2000 Sep 1; 72 (17): 4047-57)、これは全細胞タンパク質抽出物の消化産物から遊離するペプチドの直接標識に拡張できる。同位体標識によってタンパク質発現レベルの定量的分析が可能となると同時に、生成したペプチドの同定が容易となる(図２を参照されたい)。
【００４６】
好適な態様において、第一の標識試薬は軽い同位体標識を含み、第二の標識試薬は重い同位体標識を含む。あるいはその逆でもよい。標識試薬は本発明の第一の態様に関連する上記の群から選択すればよい。したがって特別の態様において、第一および第二の標識試薬はＨ４ＳおよびＤ４Ｓである。
【００４７】
本発明の別の態様は、少なくとも結合部分、架橋部分および標識部分を含む、発現分析用のペプチドまたはタンパク質の標識に使用するための試薬分子である。１つの態様において、結合部分は塩基性部分を有するペプチドのＮ−末端を共有結合により修飾する能力を有する。別の態様において、架橋部分はチオエーテル架橋である。さらに別の態様において標識部分は、少なくとも１つの水素/重水素原子を含む。さらに別の好適な態様において、該分子は、Ｎ−スクシニミジル−２−（４−ピリジルメチルチオ）−アセテート（Ｈ４Ｓと称する）であり、その重水素化バリアントは、Ｎ−スクシニミジル−２−［４−（２，３，５，６−テトラジュウテリオ−ピリジル）］−メチルチオアセテート（Ｄ４Ｓと称する）である。
【００４８】
試薬分子はいくつかの必須の特徴を示す限りいかなる分子であってもよい。チオエーテル架橋、またはそれと等価な代替物は、気相において解離を起こらしめるために重要である。さらに分子の標識部分は、気相においてチオエーテル架橋が切断されうるように、好ましくは正に荷電したものであるか、あるいは少なくとも求電子性である。さらに分子の標識部分に所望の化学特性を備えさせるために１または複数の金属原子（例えばＳｎ）を含めてもよい。さらに、それは少なくとも１つの独特の質量マーカーの検出を可能にするものでなければならない。したがってそれは同位体代替物を置換することができる少なくとも１つの原子（例えば、水素／重水素（Ｈ／Ｄ））を含む。好ましくは、標識部分は２から６の同位体的に置換可能な原子を含む。というのは重水素の数が多ければ、オンライン・ダイナミック分析を妨げる、ペプチドの異なる時間での溶出をもたらす修飾ペプチドのクロマトグラフィー挙動に影響を与えることができるからである。さらに様々な量（例えば２つのＨ／Ｄ、３つのＨ／Ｄ、４つのＨ／Ｄ、５つのＨ／Ｄおよび６つのＨ／Ｄ）の同位体的に置換可能な原子を有する試薬分子の混合物を用いて、分析速度を高めてもよい。というのは１回のＭＳ−クロマトグラフィー実行において１、２、３および４またはそれ以上の細胞の分析を可能にする多重化を行うことができるからである。
【００４９】
さらにそれは、所望の生体分子に結合する能力を有さなければならない。例えば、試薬分子は上述のようにペプチドのＮ−末端に結合できるように設計すればよい。
【００５０】
したがって、好適な態様において、本発明の試薬分子は、Ｎ−スクシニミジル−２−（４−ピリジルメチルチオ）−アセテートであり、この試薬を以下、Ｈ４Ｓと称する。その重水素化バリアントである、Ｎ−スクシニミジル−２−［４−（２，３，５，６−テトラジュウテリオ−ピリジル）］−メチルチオアセテートをＤ４Ｓと称する。上述のように、この分子の修飾、特に標識部分および結合部分に関する修飾（例えば、異なる生体分子用の修飾）をその必要な特徴を示す限り行ってもよい。さらに試薬分子の異なる機能の部分（結合部分、標識部分、架橋部分）は分子が所望の特性を示す限り、必ずしも互いに離れていなければならないということはない。
【００５１】
本発明のさらに別の態様は、親イオン−スキャニングのためのタンパク質断片混合物の標識用のキットであり、これは別々の区画において上記のようなＨ４ＳおよびＤ４Ｓを含む。キットはさらにＨ４ＳおよびＤ４Ｓとの組み合わせ使用に必要または好適なその他の成分を含んでいてもよい。かかる成分は本明細書の記載から容易に読み取れるであろう。
【００５２】
本発明のさらに別の態様は上記の少なくとも１つの試薬分子の、次ぎに行う親イオン- スキャニングのためのタンパク質断片混合物の標識のための使用である。
【００５３】
本発明は広範な用途、例えば主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子によって提示されるペプチドの同定などに利用することができる。
【００５４】
本発明の方法が有用であるその他の用途は、体液（例えば脳脊髄液および滑液ならびに尿および血清）中の溶液の周囲または溶液中で行われるペプチドの分析である。したがって、本発明による方法は例えば疾患の診断において利用できる。
【００５５】
上述のように、異なる標識を有する２以上の標識試薬の使用により、２以上の異なるサンプルにおけるタンパク質の相対量の測定が可能となる。特に、本発明の標識技術を用いて２種類の細胞におけるタンパク質発現を比較することができる。２種類の細胞としては、例えば、同じタイプであるが異なる条件下の細胞（または異なる状態のもの）、または異なるタイプの細胞（同じかあるいは異なる条件下のもの）が挙げられる。したがって例えば、第一の細胞をアゴニストで処理し第二の細胞は未処理として各細胞における１または複数のタンパク質の発現を比較することができる。
【００５６】
２つの条件としては、静止状態の細胞と何らかの方法で誘導又は処理された細胞でもよい。異なる条件下の細胞における発現の相違は、細胞の活性に対する有用な情報を提供することがよくある。
【００５７】
したがって本発明の好ましい態様において、タンパク質断片混合物を第一の振動数にて分析し、第一の細胞のセットを生じさせ、次いで第二の振動数により、第二の細胞のセットを生じさせ、第二の振動数の強度値を反転させ第一の振動数の強度値に加え、示差スペクトルを得る。第二の振動数は通常第一の振動数より高く、分析はスキャニング（例えば、親イオン−スキャニングまたはニュートラル・ロススキャニング）である。したがって、特定の態様はタンパク質断片混合物が以下の工程によって分析される方法である。（ｉ）１０６ｍ／ｚにおけるスキャニング、これによって第一の細胞のセットのスペクトルが生じる工程、（ｉｉ）１１０ｍ／ｚにおけるスキャニング、これによって第二の細胞のセットのスペクトルが生じる工程、（ｉｉｉ）１１０ｍ／ｚスキャンの強度値を反転させ、これを１０６ｍ／ｚスキャンに加えて、これによって示差スペクトルを得る工程。別の態様はタンパク質断片混合物が以下の工程によって分析される方法である。（ｉ）１０５ｍ／ｚにおけるニュートラル・ロス・スキャニング、これによって第一の細胞のセットのスペクトルが生じる工程、（ｉｉ）１０９ｍ／ｚにおけるニュートラル・ロス・スキャニング、これによって第二の細胞のセットのスペクトルが生じる工程、（ｉｉｉ）１０９ｍ／ｚのロススキャンの強度値を反転し、これを１０５ｍ／ｚスキャンに加えて、これによって示差スペクトルを得る工程。
【００５８】
１つの特定の態様において、本発明の方法の消化工程はサンプル中のタンパク質および／またはペプチドの濃縮装置において行い、かかる装置は以下を含む電気濃縮手段を含む。幅広端および幅狭端を備える漏斗型空洞；少なくとも２つの電極、（１つの電極は該幅広端の近くに位置し、１つの電極は該幅狭端のより近くに位置する）；そして１または複数のタンパク質および／またはペプチド捕捉手段；ここで該捕捉手段は該幅狭端と該幅狭端の近くに位置する該１つの電極の間に位置する。
【００５９】
好適な態様において、本発明の装置はシールによってともに保持されたアセンブリとして提供される。使用時に、装置全体が好ましくは約２−３バールの加圧容器に収容され、これによって泡の形成が妨げられる。そうでなければ通過のブロッキングから電気泳動時に泡が形成され、電流フローを止めてしまう。したがって、この装置はサンプル中のタンパク質および／またはペプチドを濃縮する以下の工程を含む方法において用いられる：電気泳動装置中にタンパク質および／またはペプチドおよび消化試薬を含むサンプルを提供する工程（ここで、電気溶離浴は実質的に漏斗型空洞として存在する）；電気溶離浴の各側面に位置する少なくとも２つの電極間に電圧をかけて、漏斗型空洞の幅狭端と幅狭端のより近くに位置する電極の間に位置する捕捉手段へとペプチドを移動させる工程；電圧の方向を少なくとも１回変化させて正に荷電したペプチドと負に荷電したペプチドの両方が捕捉手段と接触できるように振動を与える工程；および捕捉手段から濃縮されたペプチドを回収する工程。上記装置はＤｉｇＴａｇ（商標）として提供されている。
【００６０】
本発明の工程（ｂ）による消化は、別の方法で行うこともできる。
【００６１】
本発明を以下の実施例を参照して記載するが、これは単に本発明の例示であって、特許請求の範囲に規定される本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中のすべての参考文献は引用によりその内容が本出願に含まれる。
【実施例１】
【００６２】
前駆体（ピリジルエタンチオール）の調製
ニコチン酸（Nictonic acid）（Ｄ４またはＨ４）を塩化チオニルによって塩化アシルへと変換した。過剰の塩化チオニルを穏やかな加熱によって除去し、溶液を直接Arndt-Eistert反応に用いた。エーテル中のジアゾメタンの氷冷溶液を予め冷却しておいた塩化アシルに添加し、ゆっくりと室温まで昇温させた。溶液を一晩窒素下で激しく振盪しながら放置した後、安息香酸銀を添加した。蒸留により非常に純粋な（＞９０％）ピリジルエタン酸を得た。これを次ぎに水素化リチウムアルミニウムによって還元してピリジルエタノールを得た。これを臭化チオニル、そしてヒドロサルファイドナトリウムで処理してピリジルエタンチオールを得た。これは無期限に保存でき、タンパク質修飾試薬の合成のための出発試薬とした。合成は毎回新たに行った。
【実施例２】
【００６３】
Ｈ４Ｓ／Ｄ４Ｓ試薬の調製
適当な量の実施例１のピリジルエタンチオールを等モル量のヨード酢酸に添加した。その結果得られた溶液を１当量のジシクロヘキシルカルボジイミドと６時間室温で混合した。１当量のＮ−ヒドロキシスクシニミドを溶液に添加し、一晩室温で撹拌した。沈殿をろ過により回収し、酢酸エチルからの再結晶により精製してＤ４ＳまたはＨ４Ｓ（図１）を得た。ニコチン酸（nicotinic acid）からの総収率は低く、約１０％であった。
【実施例３】
【００６４】
同位体標識および親イオン−スキャニングによる検出
同位体標識方法の基礎は、塩基性部分を有するペプチドのＮ−末端を共有結合により修飾するための同位体標識したアミン誘導体の使用であり、この修飾により、２セットのペプチドを識別することが可能となる。本発明者らは予備的な試薬のセットについて記載している(Miinchbach et al. 2000）がこれは、一次元および二次元ゲル電気泳動によって分離された複数のタンパク質の定量および同定のために用いられてきた。本発明者らは新規な試薬のセットを開発し、その構造を図１に示す。
【００６５】
この試薬の基本的な特徴は、本発明者らが既にあまり複雑でない混合物について示したように、全細胞消化物から生じたペプチドのＮ−末端に特異的に結合することができることである。タンパク質を細胞から１％ＳＤＳを用いて抽出し、スクシニル化する。その後タンパク質を臭化シアン、次いでｐＨ４にて黄色ブドウ球菌Ｖ８プロテアーゼで消化する。次ぎにペプチド混合物をＨ４ＳまたはＤ４Ｓ試薬で誘導体化し、混合物を短時間ヒドロキシルアミンで処理してスクシニル化の副反応またはＳｅｒ／ＴｈｒまたはＴｙｒ上の同位体試薬を除く。２種類の細胞状態からのＤ４ＳおよびＨ４Ｓ標識化サンプルを混合し、ペプチド混合物を２次元クロマトグラフィーによって分離する。
【００６６】
Ｎ−末端が誘導体化されたペプチドは化学的に非常に安定である。しかし、気相においては誘導体断片のチオエーテル結合から容易に図２に示すような１０６ｍ／ｚの強いイオンシグナルが生じる。このため親イオン−スキャニングを実施するにはこのシグナルをもたらすペプチドを検出するために１０６のシグナルをモニターするようにＭＳを設定する必要がある。このようにして、細胞状態１からのＨ４Ｓ標識化ぺプチドを選択的に検出することができる（図３を参照）。親イオン−スキャニングはＮ−およびＯ−結合型炭水化物（２０４ｍ／ｚでのイオン、Carr et al. 1993）およびリン酸化セリンまたはスレオニン（−８０および９８ｍ／ｚでのイオン、Carr et al. 1996)の選択的検出に以前から用いられていた。
【００６７】
したがって１０６の親イオン（状態１からのＨ４Ｓ標識化ペプチド）および１１０の親イオン（状態２からのＤ４Ｓ標識化ペプチド）を交互にスキャニングすることにより、各ペプチド対の相対発現レベルを可視化することができる。これはスキャン１においてＨ４Ｓの親イオンを読み、スキャン２においてＤ４Ｓの親イオンを読み、スキャン２の強度値を反転させてこれをスキャン１に加えることによってダイナミックに行うことができ、これによって図４に示す示差スペクトルが得られる。特定の値において増加または減少しているペプチドのみがこの示差スペクトルにおいて観察されるため、データが非常に簡略化される。２００，０００ペプチドではなく、その発現レベルが変化している１０，０００ペプチド（約２００タンパク質）のみが観察され、オンザフライでのＭＳ／ＭＳ分析がダイナミックに計画されうる。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】図１は、チオエーテル−架橋を有する同位体標識であるＨ４ＳおよびＤ４Ｓを示す。
【図２】図２は、Ｎ−末端に共有結合したＨ４Ｓを有するペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。
【図３】図３は、親イオン−スキャニング質量分析計の構成を示す。
【図４】図４は、サブトラクティブ親イオン・スキャニングによるタンパク質発現分析の原理を示す。
【図１】
2005513507.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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2005513507.tif 000008
2005513507.tif 000009