(57)【要約】本発明は、遺伝性または後天性の増殖性眼疾患についてのヒト遺伝子治療において有用であるレンチウイルスベクターを提供する。それは、眼疾患が治療されうるように、有糸分裂活性および不活性の両方の細胞を形質導入するレンチウイルスベクターの能力を活用する方法を与える。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、眼疾患をもつ個体において眼内細胞増殖を阻害する方法：
眼内細胞増殖を阻害する治療的遺伝子を含むレンチウイルスベクターの薬理学的有効量を該個体へ投与する段階。
【請求項２】
眼疾患が加齢性黄斑変性症、増殖性糖尿病網膜症、未熟児網膜症、緑内障および増殖性硝子体網膜症からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
治療的遺伝子が網膜芽細胞腫遺伝子または他の増殖抑制遺伝子(記載されているようなp53、p21、p16、p27)の恒常的活性型からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項４】
レンチウイルスベクターが、角膜、嚢腔、硝子体腔または網膜下腔へ約106個から109個までの形質導入粒子の用量で投与される、請求項1記載の方法。
【請求項５】
以下の段階を含む、眼疾患をもつ個体において眼内血管新生を阻害する方法：
眼内血管新生を阻害する治療的遺伝子を含むレンチウイルスベクターの薬理学的有効量を該個体へ投与する段階。
【請求項６】
眼疾患が加齢性黄斑変性症、増殖性糖尿病網膜症、未熟児網膜症、緑内障および増殖性硝子体網膜症からなる群より選択される、請求項5記載の方法。
【請求項７】
治療的遺伝子が、血管新生を制御する遺伝子およびアポトーシスを制御する遺伝子からなる群より選択される、請求項5記載の方法。
【請求項８】
血管新生を制御する遺伝子が、メタロプロテイナーゼの組織阻害因子(TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4)、エンドスタチン、アンギオスタチン、エンドスタチンXVIII、エンドスタチンXV、マトリックスメタロプロテイナーゼ-2のC末端ヘモペキシンドメイン、ヒトプラスミノーゲンのクリングル5ドメイン、エンドスタチンおよびアンギオスタチンの融合タンパク質、エンドスタチンおよびヒトプラスミノーゲンのクリングル5ドメインの融合タンパク質、インターフェロン-ガンマ誘導モノカイン(Mig)、インターフェロン-アルファ誘導タンパク質10(IP10)、MigおよびIP10の融合タンパク質、可溶性FLT-1(fms様チロシンキナーゼ1受容体)、ならびにキナーゼ挿入ドメイン受容体(KDR)からなる群より選択されるタンパク質またはポリペプチドをコードする、請求項7記載の方法。
【請求項９】
アポトーシスを制御する遺伝子が、Bcl-2、Bad、Bak、Bax、Bik、Bcl-X短いアイソフォームおよびGaxからなる群より選択されるタンパク質またはポリペプチドをコードする、請求項7記載の方法。
【請求項１０】
レンチウイルスベクターが、嚢腔、硝子体腔または網膜下腔へ約106個から109個までの形質導入粒子の用量で投与される、請求項5記載の方法。
【請求項１１】
以下の段階を含む、血管新生および角膜移植失敗を阻害する方法：
血管新生を阻害する治療的遺伝子を含むレンチウイルスベクターでエキソビボにおいて角膜組織を形質導入する段階；ならびに
該角膜組織を個体へ移植する段階であって、血管新生および角膜移植失敗が該レンチウイルスベクターでの処理の結果として阻害される、段階。
【請求項１２】
治療的遺伝子が血管新生を制御する、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
血管新生を制御する遺伝子が、メタロプロテイナーゼの組織阻害因子(TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4)、エンドスタチン、アンギオスタチン、エンドスタチンXVIII、エンドスタチンXV、マトリックスメタロプロテイナーゼ-2のC末端ヘモペキシンドメイン、ヒトプラスミノーゲンのクリングル5ドメイン、エンドスタチンおよびアンギオスタチンの融合タンパク質、エンドスタチンおよびヒトプラスミノーゲンのクリングル5ドメインの融合タンパク質、インターフェロン-ガンマ誘導モノカイン(Mig)、インターフェロン-アルファ誘導タンパク質10(IP10)、MigおよびIP10の融合タンパク質、可溶性FLT-1(fms様チロシンキナーゼ1受容体)、ならびにキナーゼ挿入ドメイン受容体(KDR)からなる群より選択されるタンパク質またはポリペプチドをコードする、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
以下のものを含む組換えレンチウイルスベクター：
2つの異なるタンパク質が単一の転写物から産生されるための2つのクローニング部位間のIRES(内部リボソーム侵入部位)エレメント；
マーカー遺伝子；および
治療的遺伝子。
【請求項１５】
マーカー遺伝子が強化型緑色蛍光タンパク質遺伝子である、請求項14記載の組換えレンチウイルスベクター。
【請求項１６】
治療的遺伝子が、腫瘍増殖、血管新生およびアポトーシスからなる群より選択される表現型を制御する、請求項14記載の組換えレンチウイルスベクター。
【請求項１７】
腫瘍増殖を制御する治療的遺伝子がp16、p21、p27、p53およびPTENからなる群より選択される、請求項16記載の組換えレンチウイルスベクター。
【請求項１８】
レンチウイルスベクターが、pHR-CMV-P16-ires-eGFP、pHR-CMV-P21-ires-eGFPおよびpHR-EF1/HTLV-P21-ires-eGFPからなる群より選択される、請求項17記載の組換えレンチウイルスベクター。
【請求項１９】
アポトーシスを制御する治療的遺伝子が、Bik、Bad、Bak、Bax、Bcl-2、Bcl-XLおよびGaxからなる群より選択される、請求項16記載の組換えレンチウイルスベクター。
【請求項２０】
レンチウイルスベクターがpHR-CMV-BIK-ires-eGFPである、請求項19記載の組換えレンチウイルスベクター。
【請求項２１】
血管新生を制御する治療的遺伝子が、メタロプロテイナーゼの組織阻害因子(TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4)、エンドスタチン、アンギオスタチン、エンドスタチンXVIII、エンドスタチンXV、マトリックスメタロプロテイナーゼ-2のC末端ヘモペキシンドメイン、ヒトプラスミノーゲンのクリングル5ドメイン、FLT-1(fms様チロシンキナーゼ1受容体)、KDR(キナーゼ挿入ドメイン受容体)、IP-10(インターフェロン-アルファ誘導タンパク質10)およびMIG(インターフェロン-ガンマ誘導モノカイン)からなる群より選択されるタンパク質またはポリペプチドをコードする、請求項16記載の組換えレンチウイルスベクター。
【請求項２２】
レンチウイルスベクターが、pHR-CMV-KDR-ires-eGFP、pHR-CMV-Timp1-ires-eGFP、pHR-EF1/HTLV-Ang-ires-eGFP、pHR-EF1/HTLV-Endo XV-ires-eGFP、pHR-EF1/HTLV-Kringle 1-5-ires-eGFP、pHR-EF1/HTLV-Timp1-ires-eGFP、pHR-EF1/HTLV-Timp4-ires-eGFPおよびpHR-EF1/HTLV-Endo XVIII-ires-eGFPからなる群より選択される、請求項21記載の組換えレンチウイルスベクター。
【請求項２３】
血管新生を制御する治療的遺伝子が、エンドスタチンおよびアンギオスタチンの融合タンパク質、エンドスタチンおよびヒトプラスミノーゲンのクリングル5ドメインの融合タンパク質、Mig(インターフェロン-ガンマ誘導モノカイン)およびIP10(インターフェロン-アルファ誘導タンパク質10)の融合タンパク質からなる群より選択される融合タンパク質をコードする、請求項16記載の組換えレンチウイルスベクター。
【請求項２４】
レンチウイルスベクターが、pHR-CMV-Endo/Ang-ires-eGFP、pHR-CMV-Endo/Kringle-ires-eGFP、pHR-EF1/HTLV-EndoAng-ires-eGFP、pHR-EF1/HTLV-EndoKringle-ires-eGFPおよびpHR-EF1/HTLV-MigIP10-ires-eGFPからなる群より選択される、請求項23記載の組換えレンチウイルスベクター。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
これは、2000年12月19日に出願され、現在放棄された、米国仮特許出願第60/256,701号の恩典を主張する、2001年12月19日出願された米国特許出願第10/025,264号の一部継続出願である。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明は、一般的に、遺伝子送達ベクターおよび遺伝子治療の分野に関する。より具体的には、本発明は、遺伝性および増殖性眼疾患についてのヒト遺伝子治療において有用なレンチウイルスに関する。
【０００３】
関連技術の説明
ヒト失明の最もよくある原因の一つは、しばしば、結果として、視線の明澄性の喪失、または網膜表面に直接的にかかる牽引力による網膜色素上皮からの網膜剥離を生じる、異常な眼内の細胞増殖である。増殖性網膜剥離は、それが増殖性糖尿病疾患か、未熟児網膜症か、増殖性硝子体網膜症か、または血管新生の加齢性筋性変性症かのいずれに関連してようが、治療せずにほっておく場合には、最終的に、視力の永久喪失を生じるであろう。
【０００４】
眼の内の新しい血管の異常な増殖、眼血管新生が、先進国における永久失明の最もよくある原因である。3つの疾患、すなわち、糖尿病、未熟児網膜症および加齢性筋性変性症、は眼内の血管新生のすべての症例の大部分に関連している。これらの3つの臨床的実体は別個であり、患者の異なる群に影響を及ぼすが、それらは、最終的に網膜機能を危うくする新しい血管の形成へと導く内皮細胞の無制御の分裂を含む最終共通経路を共有する。眼の増殖性疾患は、米国人口の7%に影響を与えており、米国において、毎年25,000の失明の新症例へと導く。米国における65歳を超える人々については、30%がその疾患に冒されている。
【０００５】
網膜内の血管内皮細胞の増殖は、増殖性糖尿病網膜症(PDR)の過程を惹起する。治療されない場合には、これらの内皮細胞は、分裂し続け、最終的には、網膜内面に沿って、または硝子体腔へと広がる線維性血管膜を形成する。後部硝子体表面の収縮は、結果として、硝子体-線維性血管の接着の部位に牽引を生じ、最終的には、網膜を引き離す。1型糖尿病の約50%が、糖尿病診断から20年以内にPDRを発現させるが、2型糖尿病をもつ患者の10%が、同様の時間枠内でPDRを明示する。
【０００６】
血管は、通常、2つの過程：血管発生(vasculogenesis)または血管新生(angiogenesis)、のうちの1つにより発生する。血管発生の間、毛細血管の原始ネットワークが、多能性間葉性前駆体の成熟により胚形成中に確立される。対照的に、血管新生は、既存の血管を含む過程を再構築することを指す。血管新生において、新しい血管芽は、より古い、確立された血管から発し、周囲の組織に侵入する。網膜において、いったん正常な血管ネットワークが確立されたならば、このネットワークの再構築は、主として、組織酸素濃度の影響下にある。低酸素状態(酸素欠乏)は、血管新生を刺激する。それが、結果として、我々の社会において何百万人という糖尿病患者、早産児または老人における失明を生じるこの過程である。
【０００７】
眼内血管新生性疾患についての現在の治療は、侵襲性かつ破壊的である。治療は、しばしば、いくらかの組織の死を伴う眼内手術を必要とする。このように、これらの疾患を治療するための新しいアプローチについての必要性があり、血管新生を調節する遺伝子が眼へ導入され増殖性疾患を制御することができるかどうかを決定することが対象となる。現在、大きな効果を以て哺乳動物細胞において遺伝子導入を行うことは困難である。アデノウイルスベクター、リポソームおよびデンドリマーに基づく試薬のような伝統的なベクターで見られる結果は、全く、一過性である。強い炎症性応答の誘発なしにこれらのベクターを眼へ導入することもまた問題がある。
【０００８】
眼の細胞および組織への遺伝子移入を媒介するために、理想的な遺伝子送達ベクターは、幅広い親和性をもち、かつ静止細胞を形質導入することができるべきである。ベクターはまた、慢性疾患の治療のために持続性および強靱な導入遺伝子発現を維持する必要がある。現在、眼の内のまたは眼由来の最終分化または増殖性ヒト細胞を形質導入する手段を欠いている。本発明は、当技術分野におけるこの長年に渡る必要性および欲求を満たす。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
レンチウイルスベクター、ならびに遺伝性および増殖性眼疾患についてのヒト遺伝子治療においてこれらのベクターを使用する方法を開発することが本発明の目的である。レンチウイルスベクターの有用性は、ヒト網膜の、角膜の、血管内皮の、増殖性硝子体網膜症のおよび網膜色素上皮の細胞の形質導入について記載されている。
【００１０】
レンチウイルスに送達された恒常的活性(突然変異体(mutant)または変異体(variant))網膜芽細胞腫(CA-rb)遺伝子により眼内細胞分裂を抑制するという可能性が実証された。ヒト眼細胞は、インビトロで試験され、眼内増殖性疾患の2つのモデル(増殖性硝子体網膜症および水晶体摘出後の後嚢混濁)は、インビボで試験された。インビトロでの細胞分裂の有意かつ長寿命の阻害は、多くの異なる細胞型において観察された。増殖性硝子体網膜症および水晶体摘出後の後嚢混濁の重症度における低下が、インビボで観察された。
【００１１】
新しい血管の増殖(血管新生)または前もってプログラムされた細胞死(アポトーシス)の発生および阻害において重要であることが知られた遺伝子のレンチウイルス媒介型移入が、病的な眼血管新生(例えば、糖尿病性網膜症または「湿性」加齢性黄斑変性症)または病的な細胞死(例えば、「乾性」加齢性黄斑変性症)の治療において有用でありうることがさらに実証されている。これらの遺伝子は、ヒト網膜の、角膜の、および網膜色素上皮の細胞において活性があることが知られた2つの別々の強いプロモーターのそれぞれの1つの制御下に置かれた。角膜血管新生の阻害は、ウサギモデルにおいて実証された。この角膜血管新生の阻害は、角膜移植のモデルにおいて移植片失敗の防止と関連していることが示された。
【００１２】
さらに、本発明のレンチウイルスベクターは、遺伝性眼疾患をもつヒト患者において欠損していることが知られた遺伝子を送達するにおいて有用である。本明細書に開示されたベクターによるこれらの遺伝子の移入は、眼疾患をもつ患者に有用な治療としての基盤を形成する。
【００１３】
本発明は、以下の段階を含む、眼疾患をもつ個体において眼内細胞増殖を阻害する方法へと引き出される：眼内細胞増殖を阻害する治療的遺伝子を含むレンチウイルスベクターの薬理学的有効量をその個体に投与する段階。
【００１４】
本発明はまた、以下の段階を含む、眼疾患をもつ個体において眼内血管新生を阻害する方法へと引き出される：眼内血管新生を阻害する治療的遺伝子を含むレンチウイルスベクターの薬理学的有効量をその個体に投与する段階。
【００１５】
本発明はまた、血管新生を阻害する治療的遺伝子を含むレンチウイルスベクターをエキソビボで角膜組織に形質導入することにより血管新生および角膜移植失敗を防止する方法を提供する。
【００１６】
本発明の他およびさらなる局面、特徴ならびに利点は、本発明の現在好ましい態様の以下の説明から明らかであると思われる。これらの態様は、開示を目的として与えられる。
【００１７】
発明の詳細な説明
レンチウイルスは、自然病原性が何ヶ月から何年かの期間を越えて起こるスローウイルスである。このウイルス属は、HIVのようなレトロウイルスを含む。これらのウイルスは、最終分化した、有糸分裂活性のまたは不活性のヒト細胞型の幅広い種類を感染させかつ形質導入することが知られている。それらの形質導入効率は非常に高く、ヒト網膜の、角膜の、小柱の、水晶体の、網膜色素上皮の、増殖性硝子体網膜症の、および血管内皮の細胞のような遺伝子移入に対して伝統的に非常に抵抗性である細胞系でさえもこのベクターを用いて形質導入されうる。
【００１８】
レンチウイルスでの感染において、ウイルスの遺伝物質は自ら宿主ゲノム内に組み込む。このように、ウイルス遺伝子は、宿主細胞の遺伝物質の永久的部分になり、遺伝子発現は、細胞の生活として恒常的である。レンチウイルスに形質導入された各細胞は、子孫にその遺伝情報を伝える。感染の自然条件下において、レンチウイルスは、炎症性応答を引き起こさない眼内病原体である。それゆえに、レンチウイルスは、眼内疾患についての遺伝子治療におけるベクターとして良い候補である。このウイルスでの以前の研究は、神経細胞および網膜細胞の両方の形質導入におけるそれの使用の成功を実証した(Naldiniら、1996；Miyoshiら、1997)。
【００１９】
本発明は、2つのクローニング部位の間にIRES(内部リボソーム侵入部位)エレメントを組み入れた新規のレンチウイルスベクターを提供する。IRESエレメントは、mRNA-リボソーム結合およびタンパク質合成を可能にする。このバックボーンは、2つの異なる発現可能な遺伝子を収容しうる。単一のメッセージが形質導入された細胞において生じる；しかしながら、このメッセージは、IRESエレメントのために、機能的に二シストロン性であり、2つの異なるタンパク質の合成を作動させることができる。これらの2つの遺伝子は、CMVまたはHTLVプロモーターのような強いプロモーターの制御下に置かれうる。または、当業者は、ヒト網膜の、角膜のまたは網膜色素上皮の細胞において活性があることが知られた他のプロモーターを容易に用いるものと思われる。この様式において、下で考察された治療的可能性のある遺伝子のそれぞれは、形質導入された細胞が同時に標識されかつ対象となる治療的遺伝子を発現させうるように、マーカー遺伝子(例えば、強化型緑色蛍光遺伝子、eGFP遺伝子)に連結されうる。標識された細胞は、容易に、インビトロで単離されかつインビボで観察されうる。
【００２０】
強化型緑色蛍光タンパク質遺伝子以外の他のマーカー遺伝子がレンチウイルスベクターへ組み入れられうることは、当業者にとって明らかであると思われる。当業者はまた、本明細書に開示されたものに加えて、対象となる他の治療的遺伝子を含むレンチウイルスベクターを構築することを容易にできると思われる。さらになお、本明細書に開示されたレンチウイルスベクター系は、遺伝性眼疾患または他の疾患をもつヒト患者において欠損していることが知られた遺伝子を移入することができる。この系によるこれらの遺伝子のヒト眼細胞または他の組織への移入は、様々な疾患をもつ患者に有用な治療としての基盤を形成する。
【００２１】
本明細書に詳述された基本的発見は、レンチウイルスベクターが様々な遺伝子を移入して、異常な眼内増殖を改変し、このゆえに、血管新生疾患、網膜剥離または白内障摘出後の後嚢混濁の発生を減少させることができることを実証している。多数の治療的遺伝子が、眼内細胞分裂のインビボ阻害のための臨床的環境において有用でありうる。これらの遺伝子は、新しい血管の増殖(血管新生)またはアポトーシスの過程について最近同定された様々なモジュレータを含む。レンチウイルス媒介型遺伝子移入によるこれらのモジュレータの発現の遺伝子制御は、加齢性黄斑変性症(AMD)、未熟児網膜症(ROP)および増殖性糖尿病網膜症(PDR)のような眼内血管新生疾患の治療において有用であると判明するものと考えられる。
【００２２】
血管内皮細胞は、血管発生および血管新生の両方において中心的な役割を果たす。これらの細胞は、様々なタンパク質サイトカインに分裂促進的に応答する(細胞分裂または遊走に関して活性になる)。例えば、血管内皮細胞成長因子(VEGF)、アンギオゲニン、アンギオポエチン-1(Ang1)およびアンギオトロピンは、内皮細胞分裂、遊走または細胞-細胞接着を刺激し、それに従って、血管新生の過程を助けるサイトカインである。エンドスタチン、可溶性(デコイ)VEGF受容体(sflt)、およびトロンボスポンジンは、血管新生を阻害するように思われる内因性タンパク質サイトカインである。本発明は、レンチウイルスベクターにより送達されたこれらの阻害性タンパク質の多数が、眼内血管新生の治療において有用であることを実証している。本発明のレンチウイルスベクターへ組み入れられうる遺伝子の例は、限定されるものではないが、以下の遺伝子を含む：
【００２３】
メタロプロテイナーゼの組織阻害因子
メタロプロテイナーゼの組織阻害因子(TIMP)は、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)の天然阻害剤である遍在性タンパク質のファミリーを代表する。マトリックスメタロプロテイナーゼは、結合組織マトリックス再構築および細胞外マトリックス(ECM)の分解、腫瘍浸潤、血管新生、および転移における必須の段階、に関与する亜鉛結合エンドペプチダーゼのグループである。マトリックスメタロプロテイナーゼはそれぞれ、細胞外マトリックス内で異なる基質特異性をもち、それの分解に重要である。ヒト乳房病理学におけるマトリックスメタロプロテイナーゼの分析により、いくつかのマトリックスメタロプロテイナーゼが、細胞外マトリックスの分解に関与していることが示された；コラゲナーゼ(MMP1)は、原線維間質性コラーゲンを分解する；ゼラチナーゼ(MMP2)は、主としてIV型コラーゲンを分解する；およびストロメリシン(MMP3)はより広い範囲の作用をもつ。
【００２４】
TIMPファミリーの4つのメンバーがある。TIMP-1およびTIMP-2は、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害活性に関連した腫瘍増殖、浸潤および転移を阻害することができる。さらになお、TIMP-1およびTIMP-2の両方は、血管新生の阻害に関与している。TIMPファミリーの他のメンバーとは違って、TIMP-3は、ECMにおいてのみ見出され、最終分化についてのマーカーとして機能しうる。最後に、TIMP-4は、細胞外マトリックス止血において組織特異的様式で機能すると考えられる(Gomezら、1997)。
【００２５】
TIMP-1
メタロプロテイナーゼ-1の組織阻害因子(TIMP-1)は、メタロプロテイナーゼ阻害因子1、線維芽細胞コラゲナーゼ阻害因子、コラゲナーゼ阻害因子および赤血球増強活性(EPA)としても知られている23 kDタンパク質である。TIMP-1をコードする遺伝子は、Dochertyら(1985)により記載された。TIMP-1は、メタロプロテイナーゼ(コラゲナーゼのような)と複合体を形成し、不可逆的不活性化を引き起こす。TIMP-1の効果は、トランスジェニックマウスモデル：肝臓にTIMP-1を過剰発現させた一つ、および肝細胞癌の遺伝性発生へと導くウイルスの癌遺伝子シミアンウイルス40/T抗原(TAg)を発現させたもう一つ、において調べられた。TIMP-1系がTAgトランスジェニック系と交雑した二重トランスジェニック実験において、肝臓TIMP-1の過剰発現が、増殖および血管新生を阻害することによりTAg誘導性肝細胞癌の発生を遮断することが報告された(Martinら、1996)。
【００２６】
TIMP-2
メタロプロテイナーゼ-2の組織阻害因子(TIMP-2)は、メタロプロテイナーゼ阻害因子2としても知られている24 kDタンパク質である。TIMP-2をコードする遺伝子は、Stetler-Stevensonら(1990)により記載された。腫瘍浸潤において重要な役割を果たすメタロプロテイナーゼ(MMP2)は、TIMP-2により、複合体化されて、阻害される。このように、TIMP-2は、癌転移を阻害するために有用でありうるように思われる(Mussoら、1997)。B16F10、マウスメラノーマ細胞、高い侵襲性および転移性細胞系、がヒトTIMP-2をコードするプラスミドでトランスフェクションされ、マウスに皮下注射された場合、TIMP-2過剰発現が、インビボでの腫瘍増殖および新血管新生を制限した(Valenteら、1998)。
【００２７】
TIMP-3
メタロプロテイナーゼ-3の組織阻害因子(TIMP-3)は、メタロプロテイナーゼ阻害因子3としても知られている。乳癌および悪性メラノーマ細胞系がTIMP-3プラスミドでトランスフェクションされ、ヌードマウスへ皮下注射された場合、腫瘍増殖の抑制が観察された(Anand-Apteら、1996)。しかしながら、TIMP-3過剰発現は、インビトロでの2つの腫瘍細胞系の増殖に効果を生じなかった。このように、腫瘍細胞により隣接した細胞外マトリックスへ放出されたTIMP-3が、細胞外マトリックスに隔離された成長因子の放出を抑制することにより、または血管新生を阻害することにより腫瘍増殖を阻害したことが示唆された(Anand-Apteら、1996)。
【００２８】
TIMP-4
メタロプロテイナーゼ-4の組織阻害因子(TIMP-4)は、メタロプロテイナーゼ阻害因子4としても知られている。TIMP-4遺伝子および組織局在化は、Greeneら(1996)により記載された。生化学的研究により、TIMP-4が、TIMP-2のと同様に、ヒトゼラチナーゼAを結合する(Biggら、1997)。インビボでのヒト乳癌の増殖へのTIMP-4調節の効果は、Wangら(1997)により調べられた。インビトロで、TIMP-4の過剰発現は、細胞侵襲性を阻害することが見出され、インビボで、ヌードマウスのTIMP-4腫瘍細胞トランスフェクタントでの注射後、腫瘍増殖は、有意に低下した(Wangら、1997)。
【００２９】
エンドスタチン、アンギオスタチン、PEX、クリングル-5および融合遺伝子
J. Folkmanおよび彼の同僚(Boehmら、1997)は、ルイス(Lewis)肺癌をもつマウスのエンドスタチン＋アンギオスタチンタンパク質の組み合わせでの治療が腫瘍の完全な退縮を誘導したこと、およびマウスは残りの生涯をずっと健康のままであったことを示した。この効果は、エンドスタチン＋アンギオスタチン治療の1サイクル(25日間)後だけで得られたが、エンドスタチン単独は、腫瘍休眠を誘導するために6サイクルを必要とした。
【００３０】
D. Hanahanおよび同僚(Bergersら、1999)は、膵島癌についてのマウスモデルにおいてエンドスタチン＋アンギオスタチンタンパク質の組み合わせの優れた抗腫瘍効果を実証した。エンドスタチン＋アンギオスタチンの組み合わせは、結果として、腫瘍の有意な退縮を生じたが、エンドスタチンまたはアンギオスタチン単独は効果を生じなかった。
【００３１】
エンドスタチンXVIII
エンドスタチン、血管内皮腫により産生される血管新生阻害因子、は最初、O'Reillyら(1997)により同定された。エンドスタチンは、血管内膜増殖を特異的に阻害し、かつ血管新生および腫瘍増殖を強く阻害するコラーゲンXVIIIの20 kD C末端断片である。実際、原発腫瘍は、組換えエンドスタチンの投与後、休眠の顕微鏡的病変まで退縮することが示された(O'Reillyら、1997)。エンドスタチンは、成長因子シグナル伝達に関与するヘパリン硫酸プロテオグリカンに結合することにより血管新生を阻害することが報告されている(Zetter、1998)。
【００３２】
エンドスタチンXV
最近、コラーゲンXVのC末端断片(エンドスタチンXV)は、エンドスタチンXVIIIのようにだが、いくつかの機能的差異を有して、血管新生を阻害することが示された(Sasakiら、2000)。
【００３３】
アンギオスタチン
アンギオスタチン、最初の4つのクリングル構造を含むプラスミノーゲンの内部断片、は今まで記載された最も強力な内因性血管新生阻害因子の1つである。アンギオスタチンの全身投与は、インビボで悪性神経膠腫増殖を効率的に抑制することが示された(Kirschら、1998)。アンギオスタチンはまた、通常の放射線治療と併用されて、結果として、インビボで、毒性作用を増加させることなく、腫瘍根絶の増加を生じた(Mauceriら、1998)。他の研究より、アンギオスタチンcDNAのレトロウイルスおよびアデノウイルス媒介型遺伝子移入が結果として、インビトロでの内皮細胞増殖およびインビボでの血管新生の阻害を生じたことが実証された。腫瘍誘導性血管新生の阻害は、腫瘍細胞死における増加を生じた(Tanakaら、1998)。マウスアンギオスタチンをコードするcDNAのマウスT241線維肉腫細胞への遺伝子移入は、インビボで原発および転移性腫瘍増殖を抑制することが示された(Caoら、1998)。
【００３４】
PEX
PEXは、MMP-2のインテグリンαVβ3への結合を阻害し、血管新生および腫瘍増殖に必要とされる細胞表面コラーゲン分解性活性を遮断するMMP-2のC末端ヘモペキシンドメインである。それは、Brooksら(1998)によりクローニングされ、記載された。
【００３５】
クリングル-5
アンギオスタチンの4つのクリングルと高い配列相同性を共有する、ヒトプラスミノーゲンのクリングル-5ドメインは、内皮細胞増殖に特異的な阻害因子であることが示された。クリングル-5は、塩基性線維芽細胞成長因子刺激性毛細管内皮細胞増殖の阻害に対してアンギオスタチンより強力であるようにみえる(Caoら、1997)。それの抗増殖性性質に加えて、クリングル-5はまた、内皮細胞に選択的に影響を及ぼすアンギオスタチンのと類似した抗遊走活性を示す(Jiら、1998)。
【００３６】
止血性融合遺伝子
新規な止血性融合遺伝子は、リンカーとしてエラスチンペプチドモチーフ(Val-Pro-Gly-Val-Gly)を用いてクローニングされうる。これらの融合体は、腫瘍血管新生の抑制を増加させるために2つの強力な止血性遺伝子を結合している。これらの分子は異なる機構を通して作動するため、それらの組み合わせは、結果として、相乗効果を生じうる。止血性融合タンパク質の例は、限定されるものではないが、エンドスタチン18およびアンギオスタチン(endo/ang)、エンドスタチン18およびプラスミノーゲンのクリングル-5モチーフ(endo/K5)、加えてインターフェロン-ガンマ誘導モノカインおよびインターフェロン-アルファ誘導タンパク質10(MIG/IP10)の融合を含む。
【００３７】
ケモカイン
ケモカインは、白血球の遊走を誘発する能力がある低分子量炎症誘発性サイトカインである。考慮されるケモカインに依存して、化学誘引は、特定の白血球細胞型に特異的である。ケモカイン遺伝子を腫瘍へ発現させることは、抗腫瘍活性の能力がある白血球のより効率的な補充へ導きうる。さらに、それらの走化性活性に加えて、いくつかのケモカインは、抗血管新生性活性を有する、すなわち、それらは、腫瘍を養う血管の形成を阻害する。こういう訳で、これらのケモカインは癌治療において有用である。
【００３８】
インターフェロン-ガンマ誘導モノカイン(MIG)
MIG、インターフェロン-ガンマ誘導モノカイン、はIP-10に関連したCXCケモカインであり、単球により産生される。MIGは活性化T細胞に対して化学誘引性であり、また、強い止血性性質をもつ。MIGの腫瘍内注入は腫瘍壊死を引き起こした(Sgadariら、1997)。
【００３９】
インターフェロン-アルファ誘導タンパク質10(IP-10)
IP-10、インターフェロン-アルファ誘導タンパク質10、はCXCケモカインファミリーのメンバーである。IP-10は、主として単球によるが、T細胞、線維芽細胞および内皮細胞によっても産生される。IP-10は、T細胞、単球およびNK細胞のようなリンパ球に対して走化性活性を発揮する。IP-10はまた、血管新生の強い阻害因子である。それは、内皮細胞分化を抑制することにより血管新生を阻害する。免疫細胞の方へのそれの走行性活性のために、IP-10は、抗腫瘍免疫応答を促進するための良い候補と考えられた。IP-10の腫瘍細胞への遺伝子移入は、それらの腫瘍形成性を低下させ、長期防御免疫応答を誘発した(LusterおよびLeder、1993)。IP-10の止血性活性はまた、腫瘍退縮を仲介することが示された。IP-10を発現させる腫瘍細胞は、インビボで壊死性になった(Sgadariら、1996)。IP-10はまた、腫瘍退縮へ導くIL-12の止血性効果を仲介することが示された(Tannenbaumら、1998)。
【００４０】
可溶性VEGF受容体
FLT-1(fms様チロシンキナーゼ1受容体)は、VEGFの膜結合型受容体(VEGF受容体1)である。FLT-1の可溶性断片(sFLT-1)が、VEGFに対するそれのアンタゴニスト活性として止血性性質をもつことが示された。可溶性FLT-1は、VEGFに結合することにより作用するが、それが膜結合型FLT-1の外部ドメインを結合かつ遮断するためでもある。sFLT-1の1つの例は、FLT-1の外部部分の7つの免疫グロブリン様ドメインに及ぶヒトsFLT-1である。
【００４１】
sFLK-1/KDR
FLK-1またはKDR(キナーゼ挿入ドメイン受容体)は、VEGFの膜結合型受容体(VEGF受容体2)である。KDRの可溶性断片(sKDR)は、VEGFに対するそれのアンタゴニスト活性として止血性性質をもつことが示された。sKDRはまた、膜結合型KDRの外部ドメインを結合かつ遮断する。sKDRの1つの例は、KDRの外部部分の7つの免疫グロブリン様ドメインに及ぶヒトsKDRである。
【００４２】
血管内皮細胞成長因子(VEGF)および塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)
VEGFは、血管新生および内皮細胞増殖において活性のある成長因子である。それは、血管内膜増殖および血管透過性を誘導する。bFGFは、アテローム性動脈硬化症治療のような多くの可能性のある遺伝子治療用途をもつ血管新生剤である。VEGFおよびbFGFは、新しい血管の増殖を促進するために設計される新規な遺伝子移入プロトコールのための理想的な候補である。遺伝子移入アプローチにより血管新生を刺激することは、現在治療不能である組織虚血を治療する希望を与える。
【００４３】
アポトーシス
アポトーシスは、プログラム細胞死または細胞自殺の過程を記載するために用いられる用語である。この過程は、多細胞生物の発育および健康の正常な構成要素である。アポトーシスの異常な制御は、癌から自己免疫疾患までの様々な病的な疾患に結びつけられてきた。
【００４４】
Bcl-2相互作用キラー(BIK)
Bikは、18 kD(160個のアミノ酸)の強力なアポトーシス促進性タンパク質であり、アポトーシス誘発剤、NBK、BP4およびBIP1としても知られている。Bikは、遺伝子bik(またはnbk)によりコードされる。Bikの機能は、Bcl-XL、BHRF1、Bcl-2またはそれのアデノウイルス相同体E1Bタンパク質のような様々なアポトーシスリプレッサーと複合体を形成することによりプログラム細胞死を促進することである。一過性トランスフェクション研究において、Bikは、Bcl-2ファミリーのアポトーシス促進性メンバー、BaxおよびBak、に類似した様式において細胞死を促進した。
【００４５】
BAK
Bak、Bcl-2相同体は、Bikについて前に記載されているように、Bcl-2およびBcl-XLを含む抗アポトーシス性のファミリーを結合し、それらの活性を阻害することによりアポトーシスを促進するアポトーシス促進性タンパク質である(Chittendenら、1995)。
【００４６】
BAX
Baxは、アポトーシス制御因子として機能する21 kDのタンパク質である。Baxは、アポトーシスリプレッサーBcl-2と二量体化し、アンタゴナイズすることによりプログラム細胞死を促進する。K562赤白血病細胞における組換えBax発現の効果は、Kobayashiら(1998)により調べられた。BaxベクターのK562細胞へのトランスフェクションは、結果として、アポトーシスの誘導を生じた。さらになお、Baxで安定的にトランスフェクションされた細胞は、化学療法剤ara-X、ドキソルビシンおよびSN-38に感受性がより高いことが見出された(Kobayashiら、1998)。
【００４７】
BAD
Badタンパク質(Bcl-2結合成分6、bad遺伝子またはbbc6またはbcl218)は、細胞死を促進する低分子タンパク質(168個のアミノ酸、18 kDa)である。それは、Bcl-XLおよびBcl-2への結合においてうまく競合し、それにより両方のこれらのタンパク質のBaxとのヘテロ二量体化のレベルに影響を及ぼす。それは、Bcl-XLの死リプレッサー活性を逆転させうるが、Bcl-2のそれを逆転させることはできない。
【００４８】
BCL-2
B細胞白血病/リンパ腫-2(Bcl-2)は、細胞死制御タンパク質のファミリーの原型メンバーである。Bcl-2は、主としてミトコンドリアに見出され、カスパーゼの活性化に干渉することによりアポトーシスを遮断する。Bcl-2の腫瘍細胞への遺伝子移入は、それらの転移性潜在能力を促進することが示された(Miyakeら、1999)。Bcl-2は照射されたレシピエントの再構成後の造血幹細胞の生存を促進するため、Bcl-2遺伝子移入は、骨髄移植へ適用されうる(Innesら、1999)。また、神経細胞におけるBcl-2の発現はアポトーシスからそれらを保護するため、Bcl-2遺伝子移入は、神経変性疾患に対して有用でありうるように思われる(Sailleら、1999)。
【００４９】
BCL-XS
Bcl-XS(短いアイソフォーム)は、Bcl-2およびBcl-XLのドミナントネガティブなリプレッサーである。それは、Bcl-2およびBcl-XLを発現させる腫瘍にアポトーシスを惹起するための遺伝子治療実験に用いられた。Bcl-XSの発現は、腫瘍サイズを減少させ(Ealovegaら、1996)、腫瘍細胞を化学療法剤に対して感受性を増加させ(Sumatranら、1995)、Bcl-2およびBcl-XLを発現させる腫瘍に細胞死を惹起することにおけるBcl-XSについての役割を示唆している(Doleら、1996)。
【００５０】
GAX
Gaxは、p21依存性様式において細胞増殖を阻害する転写因子をコードするホメオボックス遺伝子である。Gaxは、細胞が増殖するように刺激される場合、下方制御される。Gax過剰発現は、マイトジェン活性化細胞において、Bcl-2下方制御およびBax上方制御へ導く(Perlmanら、1998)。このように、Gaxは、特定の癌細胞の増殖を阻害するために有用でありうる。さらに、血管平滑筋細胞におけるGax過剰発現は、それらの増殖を阻害する(Perlmanら、1999)。このゆえに、Gax遺伝子移入は、血管外傷後の血管狭窄を制限しうるものと思われる。
【００５１】
腫瘍抑制遺伝子
腫瘍抑制遺伝子の様々な突然変異は、癌の異なる型と関連していた。これらの場合、腫瘍抑制遺伝子の野生型バージョンでの体細胞遺伝子治療が、抗癌治療のアプローチとして企図された。p16、p21、p27およびp53は、サイクリン依存性キナーゼに作用することにより細胞周期を阻害する。
【００５２】
P16
P16、15 kDのタンパク質(148個のアミノ酸)、はCDK4I、P16-INK4、P16-INK4Aまたは多発性腫瘍抑制因子1(MTS1)としても知られている。P16は、遺伝子cdkn2aまたはcdkn2によりコードされる。P16は、サイクリン依存性キナーゼ4および6とヘテロ二量体を形成し、それにより、インビトロおよびインビボの両方において、サイクリンDとのそれらの相互作用を妨げる。このように、P16は、正常細胞の増殖の負の制御因子として作用する。
【００５３】
P16(cdkn2)突然変異は、広範な組織における腫瘍形成に関与している。cdkn2aは、メラノーマならびに胆道、膵臓および胃の癌を含む、腫瘍細胞系およびいくつかの原発腫瘍の大部分においてホモ接合性に欠失、突然変異または別なふうに不活性化している。p16IKN4a遺伝子発現の欠損は、一般に、中皮腫腫瘍および他の細胞系において観察される。中皮腫細胞における発現アデノウイルスでのp16INK4A形質導入は結果として、細胞増殖の減少および形質導入された細胞の死を生じたことが示された(Frizelleら、1998)。さらになお、内因性p16/CDKN2遺伝子を発現されていない3つのヒト神経膠腫細胞系(U251 MG、U-87 MGおよびD54 MG)への野生型p16のアデノウイルス媒介型遺伝子移入が結果として、G0およびG1期において細胞増殖の停止を生じた(Fueyoら、1996)。さらに、p16-INK4Aを発現させていない肺癌細胞系への野生型p16-INK4Aのアデノウイルス媒介型遺伝子移入は、インビトロおよびインビボの両方において腫瘍増殖を阻害した(Jinら、1995)。このように、腫瘍細胞における野生型P16タンパク質の修復は、癌治療的有用性をもちえるものと思われる。
【００５４】
P21
p21は、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子1(CDKN1)、メラノーマ分化関連タンパク質6(MDA-6)およびCDK相互作用タンパク質1としても知られた18 kDのタンパク質(164個のアミノ酸)である。p21は、CIP1およびWAF1としても知られた、遺伝子CDKN1によりコードされる。p21は、それによりp53がDNA損傷に応答して細胞増殖の阻害因子としての役割を仲介する、重要な中間体でありうる。p21は、サイクリン依存性キナーゼ活性に結合して阻害し、重要なサイクリン依存性キナーゼ基質のリン酸化を妨げ、細胞周期進行および増殖を遮断しうる。p21はすべての成体ヒト組織において発現される。腫瘍細胞へのp21遺伝子移入は、腫瘍増殖を阻害するために有用でありうるものと思われる。
【００５５】
2つのヒト非小細胞肺癌(NSCLC)細胞系における組換えアデノウイルス媒介型p21遺伝子移入は、結果として、用量依存性p21誘導およびG0/G1細胞周期停止による随伴性細胞増殖阻害を生じた。さらに、マウスにおけるNSCLC事前準備された腫瘍へのp21を有するアデノウイルスの注入は、腫瘍増殖を低下させ、動物の生存を伸ばした(Joshiら、1998)。これらの結果は、癌遺伝子治療としてのp21の使用を支持する。
【００５６】
本発明に従って、当分野の技術内における通常の分子生物学、微生物学および組換えDNA技術が用いられうる。そのような技術は、文献において十分に説明されている。例えば、
2005538736.tif 000002
を参照されたい。
【００５７】
「ベクター」とは、プラスミド、ファージまたはコスミドのようなレプリコンであり、それにもう一つのDNAセグメントが付着して、その付着したセグメントの複製を引き起こしうる。
【００５８】
「プロモーター配列」とは、細胞においてRNAポリメラーゼを結合し、かつ下流(3'方向)コード配列の転写を開始する能力があるDNA制御領域である。本発明を定義する目的として、プロモーター配列は、転写開始部位に対してそれの3'末端に結合しており、バックグラウンドより上の検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基またはエレメントを含めて上流へ(5'方向)伸長する。プロモーター配列内には、転写開始部位(ヌクレアーゼS1でのマッピングにより便宜上定義される)、加えてRNAポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン(共通配列)が見出される。真核生物のプロモーターは、しばしば、しかし常にとは限らないが、「TATA」ボックスおよび「CAT」ボックスを含む。様々なプロモーターがベクターを作動させるために用いられうる。
【００５９】
細胞が外因性または異種性のDNAにより「形質導入」されたとは、そのようなDNAが、通常ウイルスベクターにより、細胞の内側へ導入された場合である。形質導入DNAは、細胞のゲノムへ組み込まれる(共有結合されて)場合もあるし(レンチウイルスベクターの場合のように)、組み込まれない場合もある。例えば、原核生物、酵母および哺乳動物細胞において、DNAは、プラスミドのようなエピソームのエレメント上に維持されうる。真核生物に関して、安定的に形質転換された細胞は、形質転換するDNAが、それが染色体複製を通して娘細胞に遺伝するように、染色体に統合したものである。この安定性は、形質転換DNAを含む娘細胞の集団から構成される細胞系またはクローンを確立する真核生物の能力により実証される。「クローン」とは、単細胞または有糸分裂による共通祖先に由来する細胞の集団である。「細胞系」とは、多世代に渡ってインビトロで安定的増殖の能力がある一次細胞のクローンである。
【００６０】
「治療的遺伝子」とは、所望の表現型を与える遺伝子を指す。例えば、恒常的に活性のある網膜芽細胞腫(CA-rb)遺伝子は、眼内増殖を防止するために用いられる、または遺伝的欠損は、ペリフェリン遺伝子の移入により修復される。他の望ましい表現型は、腫瘍増殖の阻害、血管新生の阻害または制御、およびアポトーシスの制御を含む。
【００６１】
本明細書に用いられる場合、用語「マーカー遺伝子」は、異種性プロモーターまたはエンハンサーエレメントに付着したコード配列を指し、その産物が、構築物が組織または細胞へ導入された場合、容易かつ定量化的にアッセイされる。一般に用いられるマーカーは、放射性エレメント、酵素、タンパク質(強化型緑色蛍光タンパク質のような)、または紫外線に曝された場合蛍光を発する化学物質などを含む。
【００６２】
本発明は、レンチウイルスの遺伝子移入を使って、遺伝性または増殖性の失明に至る疾患を治療する新規な手段に向けられる。眼疾患をもつ個体において、眼内細胞増殖を阻害する治療的遺伝子を含むレンチウイルスベクターの薬理学的有効量をその個体に投与する段階を含む、眼内細胞増殖を阻害する方法が提供される。本発明のこの方法を用いて治療されうる眼疾患の代表的例は、加齢性黄斑変性症、増殖性糖尿病網膜症、未熟児網膜症、緑内障および増殖性硝子体網膜症を含む。治療的遺伝子は、網膜芽細胞腫遺伝子、p16遺伝子またはp21遺伝子、の恒常的活性型でありうる。好ましくは、レンチウイルスベクターは、約106から109の形質導入単位の用量で嚢腔、硝子体腔または網膜下腔へ投与される。
【００６３】
本発明はまた、眼疾患をもつ個体において、眼内血管新生を阻害する治療的遺伝子を含むレンチウイルスベクターの薬理学的有効量をその個体に投与する段階を含む、眼内血管新生を阻害する方法へ引き出される。本発明のこの方法を用いて治療されうる眼疾患の代表的例は、加齢性黄斑変性症、増殖性糖尿病網膜症、未熟児網膜症、緑内障および増殖性硝子体網膜症を含む。治療的遺伝子は、血管新生またはアポトーシスを制御する遺伝子でありうる。一般的に、血管新生を制御する遺伝子は、メタロプロテイナーゼの組織阻害因子(TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4)、エンドスタチン、アンギオスタチン、エンドスタチンXVIII、エンドスタチンXV、マトリックスメタロプロテイナーゼ-2のC末端ヘモペキシンドメイン、ヒトプラスミノーゲンのクリングル5ドメイン、エンドスタチンおよびアンギオスタチンの融合タンパク質、エンドスタチンおよびヒトプラスミノーゲンのクリングル5ドメインの融合タンパク質、インターフェロン-ガンマ誘導モノカイン(Mig)、インターフェロン-アルファ誘導タンパク質10(IP10)、MigおよびIP10の融合タンパク質、可溶性FLT-1(fms様チロシンキナーゼ1受容体)、ならびにキナーゼ挿入ドメイン受容体(KDR)をコードする遺伝子を含み、一方、アポトーシスを制御する遺伝子は、Bcl-2、Bad、Bak、Bax、Bik、Bcl-X短いアイソフォーム、およびGaxをコードする遺伝子を含む。好ましくは、レンチウイルスベクターは、約106から109の形質導入単位の用量で嚢腔、硝子体腔または網膜下腔へ投与される。
【００６４】
本発明はまた、血管新生および角膜移植失敗を防止する方法を提供する。角膜ボタンは、エキソビボで移植前に、血管新生を阻害する治療的遺伝子を含むレンチウイルスベクターで形質導入される。治療的遺伝子は、血管新生を制御する遺伝子であり、そのような代表的例は上で列挙された。
【００６５】
本発明のもう一つの局面において、多数の細胞型へ遺伝子移入を媒介する能力があるレンチウイルスベクターが提供される。組換えレンチウイルスベクターは、(i)2つの異なるタンパク質が単一の転写物から産生されるための2つのクローニング部位間のIRES(内部リボソーム侵入部位)エレメント；(ii)強化型緑色蛍光タンパク質遺伝子のようなマーカー遺伝子；および(iii)治療的遺伝子を含む。一般的に、治療的遺伝子は、腫瘍増殖、血管新生またはアポトーシスを制御できる。一つの態様において、腫瘍増殖を制御する治療的遺伝子は、p16、p21、p27、p53およびPTENを含み、代表的レンチウイルスベクターは、pHR-CMV-P16-ires-eGFP(図19)、pHR-CMV-P21-ires-eGFP(図20)およびpHR-EF1/HTLV-P21-ires-eGFP(図30)である。
【００６６】
もう一つの態様において、アポトーシスを制御する治療的遺伝子は、Bik、Bad、Bak、Bax、Bcl-2、Bcl-XLおよびGaxを含み、代表的レンチウイルスベクターは、pHR-CMV-BIK-ires-eGFP(図16)である。
【００６７】
さらにもう一つの態様において、血管新生を制御する治療的遺伝子は、メタロプロテイナーゼの組織阻害因子(TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4)、エンドスタチン、アンギオスタチン、エンドスタチンXVIII、エンドスタチンXV、マトリックスメタロプロテイナーゼ-2のC末端ヘモペキシンドメイン、ヒトプラスミノーゲンのクリングル5ドメイン、FLT-1(fms様チロシンキナーゼ1受容体)、KDR(キナーゼ挿入ドメイン受容体)、IP10(インターフェロン-アルファ誘導タンパク質10)およびMIG(インターフェロン-ガンマ誘導モノカイン)をコードする遺伝子を含む。代表的レンチウイルスベクターは、pHR-CMV-KDR-ires-eGFP(図18)、pHR-CMV-Timp1-ires-eGFP(図21)、pHR-EF1/HTLV-Ang-ires-eGFP(図22)、pHR-EF1/HTLV-ENdo SV-ires-eGFP(図23)、pHR-EF1/HTLV-Kringle 1-5-ires-eGFP(図26)、pHR-EF1/HTLV-Timp1-ires-eGFP(図28)、pHR-EF1/HTLV-Timp4-ires-eGFP(図29)およびpHR-EF1/HTLV-Endo XVIII-ires-eGFP(図31)である。
【００６８】
さらにもう一つの態様において、血管新生を制御する治療的遺伝子は、エンドスタチンおよびアンギオスタチン、エンドスタチンおよびヒトプラスミノーゲンのクリングル5ドメイン、ならびにMigおよびIP10の融合タンパク質のような止血性融合タンパク質をコードする。代表的レンチウイルスベクターは、pHR-CMV-Endo/Ang-ires-eGFP(図15)、pHR-CMV-Endo/Kringle-ires-eGFP(図17)、pHR-EF1/HTLV-EndoAng-ires-eGFP(図24)、pHR-EF1/HTLV-EndoKringle-ires-eGFP(図25)およびpHR-EF1/HTLV-MigIP10-ires-eGFP(図27)である。
【００６９】
以下の実施例は、本発明の様々な態様を例証する目的のために与えられ、いかなる様式においても本発明を限定するように意図されていない：
【００７０】
実施例1
細胞および組織
ヒト脈絡膜線維芽細胞(HCF)、ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)およびヒト胎児網膜色素上皮細胞(HRPE)の一次外植片は確立され、有糸分裂活性を促進するかまたはしないかのいずれかの条件において蒔かれた。安定的光受容体由来細胞(Y-79およびWeri-Rb-1)もまた培養された。
【００７１】
網膜芽細胞腫についての摘出の時点で得られたヒト網膜およびRPEが、これらの有糸分裂不活性の細胞を形質導入して、外因性ヒトペリフェリン導入遺伝子の発現を誘導するレンチウイルスベクターの能力を実証するために用いられた。角膜移植手術の時点で得られたヒト角膜は、これらの有糸分裂不活性の細胞をマーカー遺伝子の強化型緑色蛍光タンパク質遺伝子で形質導入するレンチウイルスベクターの能力を実証するために用いられた。
【００７２】
実施例2
レンチウイルスベクター
水疱性口内炎ウイルス(VSV)エンベロープで偽型化された3つのプラスミドに基づくレンチウイルスベクター系で、マーカーとして緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子を含む系が用いられた(図1)。組換えレンチウイルスは、Naldiniらにより記載されているように作製された。サイトメガロウイルス(CMV)最初期遺伝子プロモーターは、プラスミドpHR'-CMV-eGFPにおいてeGFPの発現を作動させた。ウイルス系統は、以下のように作製された。ヒト腎臓293T細胞(5x106個)を10 cm プレートに蒔き、D10増殖培地(10%胎児ウシ血清を含む高グルコースDMEM)および抗生物質において、リン酸カルシウム沈澱により、10 ugのpCMVΔR8.91(パッケージング機能プラスミド)、10 ugのpHR'-CMV-eGFP(マーカー遺伝子プラスミド)および2 ugのpMD.G(VSV-Gエンベロープ含有プラスミド)で次の日、同時形質転換した。37℃で12〜16時間後、培地を除去し、新鮮なD10増殖培地を加えた。細胞をさらに10時間、培養した。10 mM 酪酸ナトリウムおよび20 mM Hepes緩衝液を含む新鮮なD10培地を細胞へ加え、細胞をさらに12時間、培養した。この培地を、20 mM Hepes緩衝液を含む新しいD10培地と交換し、12時間後、ウイルス含有培地を収集した。新鮮な培地を加え、次の4日間、24時間ごとに上清を収集した。ウイルス上清を収集後すぐに-80℃で保存した。
【００７３】
ウイルス系統を室温で140分間、上清の超遠心分離により濃縮し、その結果生じたウイルスペレットを1〜3 mlのリン酸緩衝食塩水に再懸濁した。等分されたウイルス系統を293T細胞で力価測定し、残りの試料を-80℃で保存した。
【００７４】
すべてのレンチウイルスベクター上清を、フィトヘムアグルチニン刺激ヒト末梢血単核細胞の感染により、複製コンピテントレトロウイルス(RCR)の存在についてアッセイし、ELISAによりp24 gagについて培地を引き続き分析した。RCRは、作製されたウイルス上清のいずれにおいても検出されなかった。
【００７５】
実施例3
レンチウイルスベクター形質導入
2x106個の複製欠損レンチウイルス粒子/mlを含む上清は、上記のレンチウイルスベクターでの293T細胞のトランスフェクションにより作製された。細胞をウイルス粒子と24時間、培養し、その後、蛍光活性化細胞選別によるGFP発現の測定の前の4日間、標準培地において回復させた(図2〜3)。
【００７６】
形質導入効率は、感染の多重度の関数として1から1000までの範囲のMOIで測定された。多数のヒト細胞系のインビトロ形質導入の結果は、増加している数のレンチウイルス粒子でより多くの細胞が形質導入されるような、MOIと形質導入効率の間に正の相関を実証している(図2)。
【００７７】
非分裂細胞を形質導入するレンチウイルスベクターの能力が調べられた。ヒト網膜色素上皮細胞は、レンチウイルスまたはマウス白血病ウイルスベクターにより形質導入された。細胞は、ベクターへの曝露の時点において、有糸分裂不活性(集密的)または有糸分裂活性(増殖中)であった。図4に示された結果は、非分裂細胞を形質導入しうる他のレトロウイルスベクターを越えるレンチウイルスベクターの優れた能力を実証している。レンチウイルスベクターはまた、非レンチウイルスのレトロウイルスベクターと比較して、ヒト胎児細胞を形質導入するにおいて効率が高かった(図6)。
【００７８】
eGFP導入遺伝子発現の期間を測定するために、レンチウイルスベクターにより形質導入された細胞が120日の期間に渡って試験された。形質導入された細胞のクローン集団におけるサザンブロット分析の結果より、レンチウイルス-eGFPベクターは宿主ゲノムへ組み込まれたことが示された(図5B)。組み込まれたeGFP導入遺伝子の発現は、120日間に渡って安定しており、形質導入された細胞に有利にもまたは不利にも、選択的優位性を与えない(図5A)。
【００７９】
実施例4
インサイチューでの角膜形質導入
角膜移植手術の時点で得られたヒト角膜ボタンが、これらの有糸分裂不活性細胞をマーカー遺伝子強化型緑色蛍光タンパク質遺伝子で形質導入するレンチウイルスベクターの能力を実証するために用いられた(図7)。デスメ膜に付着した内皮細胞が、形質導入された角膜組織からはがされ、光学および蛍光顕微鏡により検査された。角膜内皮細胞は、eGFPについて陽性であり、効率的な遺伝子移入および発現が達成されたことを示した(図7B)。上皮層における効率的なインサイチュー形質導入およびeGFP発現もまた観察された(図7C)。
【００８０】
結論として、これらの結果は、複製欠損レンチウイルスベクターがヒト角膜内皮および上皮細胞へインサイチューで効率的に導入遺伝子を移入し、かつ長期間導入遺伝子発現を達成することができることを示している。このベクターは、角膜内皮または上皮疾患の治療に有用でありうるものと思われ、同種移植片拒絶の過程を永久に調節するような方法において移植の前にエキソビボでドナー角膜組織の遺伝子構造を改変するために適用されうる。
【００８１】
実施例5
眼増殖性疾患についての増殖抑制因子治療
ヒトペリフェリン遺伝子が治療的遺伝子の1つの例として用いられた。ヒトにおけるペリフェリン遺伝子の遺伝的欠損は、結果として幅広い種類の身体に障害を引き起こす表現型を生じることが知られている。網膜芽細胞腫についての摘出の時点で手術的に切除された正常なヒト網膜または網膜色素上皮(RPE)組織が、治療的遺伝子を欠損しているかまたはヒトペリフェリン遺伝子を含んでいるかのいずれかであるレンチウイルスベクターに曝された。図8における結果は、ペリフェリン遺伝子がレンチウイルスベクターによりヒト網膜組織へ効率的に移入されたことを実証している。
【００８２】
治療的遺伝子移入のもう一つの例として、網膜芽細胞腫遺伝子(CA-rb)の恒常的活性型が用いられた。本明細書に開示されたレンチウイルスベクターは、網膜芽細胞腫遺伝子の恒常的活性型の効率的移入を媒介した(図9)。移入されたCA-rb遺伝子は、ヒト網膜および脈絡膜細胞(図10)ならびにヒト水晶体上皮細胞(図11)の増殖に用量依存性阻害効果を示した。
【００８３】
レンチウイルスベクターにより移入された網膜芽細胞腫遺伝子の恒常的活性型はまた、インビボで眼内細胞増殖を阻害した。眼内増殖性疾患の2つのモデル(増殖性硝子体網膜症および水晶体摘出後の後嚢混濁)は、インビボで試験された。増殖性硝子体網膜症は、3組のウサギにおいて引き起こされた(図12)。1組は処理されず、1組はCA-rb遺伝子を欠くレンチウイルスベクターで処理され、最後の組は硝子体内に送達されたレンチウイルスのCA-rbで処理された。増殖性硝子体網膜症および網膜剥離は、最初の2組において高頻度で観察されたが(>90%)、網膜剥離へ進んだ動物の率は、CA-rbで処理された組において有意により低かった(26%)。
【００８４】
図13に示された結果は、水晶体摘出後の後嚢混濁の過程へのレンチウイルスのCA-rbのインビボの阻害効果を実証している。3組のウサギは、本来の水晶体を除去するために標準的水晶体超音波吸引術を受けた。第一組(群1)は、その後何も処理されず、第二の2つの組は、白内障創傷の閉鎖時点に無傷の水晶体被膜袋へ送達された空のレンチウイルス構築物(治療的遺伝子無し、群2)かまたはレンチウイルスのCA-rb(群3)かのいずれかで処理された。動物は、後嚢混濁の存在について連続的に検査された。混濁の存在は、1〜5の等級によってランク付けされ、1は混濁無しを表し、5は間接的双眼検眼鏡検査で網膜の視覚化を妨げるほど重症の混濁を表した。群1と群2(処理無しおよび空のベクター)の間に得られた統計学的に異なる結果はなかったが、後嚢混濁の発生へのレンチウイルスのCA-rbの著しい阻害効果が観察された。28日目までに、対照動物は、4.4の平均混濁スコアであったが、レンチウイルスのCA-rbで処理された動物は、2.1の平均混濁スコアであった。
【００８５】
実施例6
「2遺伝子」レンチウイルスベクター
2つのクローニング部位の間にIRES(内部リボソーム侵入部位)エレメントを組み入れた新規のレンチウイルスベクターが構築された。IRESエレメントは、mRNA-リボソーム結合およびタンパク質合成を可能にする。このバックボーンは、2つの異なる発現可能遺伝子を収容することができる。単一のメッセージが形質導入された細胞において生じる；しかしながら、IRESエレメントのために、このメッセージは機能的に二シストロン性であり、2つの異なるタンパク質の合成を作動させることができる。この様式において、多数の治療的可能性のある遺伝子(表1)は、形質導入された細胞が同時に標識され、かつ対象となる治療的遺伝子を発現させることができるように、マーカー遺伝子(例えば、強化型緑色蛍光遺伝子  −  eGFP遺伝子)に連結されうる。標識された細胞は、その後、容易に、インビトロで単離され、かつインビボで観察されうる。
【００８６】
レンチウイルスベクターはまた、エラスチンペプチドリンカーを介して異なる止血性タンパク質の機能的モチーフを結合する融合遺伝子を有しうる。これらの融合タンパク質は、腫瘍血管新生の抑制を増加させるために2つの強力な止血性遺伝子を結合する。これらの分子は異なる機構を通して作動するため、それらの組み合わせは、結果として、相加的または相乗的効果を生じうる。止血性融合タンパク質の例は、限定されるものではないが、エンドスタチン18およびアンギオスタチン(endo/ang、図14)、エンドスタチン18およびプラスミノーゲンのクリングル5モチーフ(endo/K5)の融合、エンドスタチン18およびPEXの融合、加えて、インターフェロン-ガンマ誘導モノカインおよびインターフェロン-アルファ誘導タンパク質10(MIG/IP10)の融合を含む。様々な治療的遺伝子を有する多数のレンチウイルスベクターについての遺伝子地図は、図15〜31に示されている。
【００８７】
治療的遺伝子を発現させないことが知られた未処置の細胞は、前記の融合遺伝子の1つを有するレンチウイルスベクターに、24時間、曝された。この曝露から2日後、RNAはこれらの細胞から単離され、逆転写酵素補助型ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)により導入遺伝子発現について検査された。図32は、ヒト皮膚の微小血管内皮細胞から単離されたmRNA由来のエンドスタチン-18/アンギオスタチン融合遺伝子についての陽性RT-PCR産物を示しており、それにより、インビトロでのレンチウイルス媒介型遺伝子移入を実証している。
【００８８】
（表１）
候補治療的遺伝子
2005538736.tif 000003
【００８９】
実施例7
血管新生の動物モデル
上で示されているようにインビトロのレンチウイルス媒介型遺伝子移入の実証に続いて、インビボで血管新生を阻害する能力が、その後、調べられた。血管新生は、以下の様式においてウサギ角膜組織に誘導された：
【００９０】
角膜基質内マイクロポケットの形成およびレンチウイルスに含浸されたナイロンメッシュの挿入
ウサギは、マスクすることによりイソフルラン(4 L/分)および酸素(2 L/分)での全身麻酔を受けた。局所麻酔として1滴のプロパラカインを円蓋に置いた。イソフルランを、2.5 L/分まで低下させた。ベタジン(Betadine)を30秒間、円蓋に置き、BBS(平衡食塩水、Alcon Inc.)で洗浄した。眼瞼反射鏡を眼に置いた。12時に角膜基質に入れるために2.8 mm 微小角膜切開刀を用いた。この基質内切開は、McPherson鉗子およびIris Sweep装置で前後にさっと動かすことにより5x5 mmの基質内ポケットへと展開された。12時切開は、Vannas剪刀で開口が4.5 mmであるように両側に広げられた。10 μLのレンチウイルスに含浸された4x4 mm Amershamハイブリダイゼーションナイロンメッシュ(Amersham Bioscientist RPN 2519)をあらかじめ形成されたポケットへ挿入した。1滴のトブラマイシンを角膜上に置いた。イソフルランを停止し、経鼻酸素を4 L/分へ増加させた。この様式において、ウサギを20分後に全身麻酔から覚醒させることに成功し、正常な生体機能をもってケージに戻した。
【００９１】
ウサギは、鎮痛のために2日間、0.2 ccのブプレネックス(buprenex)(.3 mg/cc)SQビッドを受けた。ウサギはまた、手術後の毛様体筋麻痺および抗菌ケアのために2日間、1滴のアトロピンおよび1滴のトブラマイシンを受けた。手術後初日に、各ウサギは、麻酔のために1滴の局所的プロパラカインを受け、ナイロンメッシュは、.12鉗子で角膜基質内ポケットから除去された。手術後の疼痛管理およびケアは、2週間毎日、モニターされた。
【００９２】
アルカリ誘導血管新生
最初の手術から2週間後、角膜を、20 μlの1.0 M NaOHに染み込ませた6 mm Whatman #3フィルターディスクに曝した。その後、すべての角膜をBSSで豊富に洗浄した。ウサギは、手術後の毛様体筋麻痺および抗菌ケアのために2日間、1滴のアトロピンおよび1滴のトブラマイシンを受けた。新生血管の応答を記録するためにデジタル写真文書化を行った。新生血管の応答は、細隙灯検査により測定され、外傷後1、3、5、7および10日目に時計時間および血管の長さを書き留められた。血管新生は、図33に記載されているように、血管増殖の面積を計算することにより定量化された。共焦点顕微鏡検査は、強化型緑色蛍光タンパク質、レンチウイルスの二シストロン性メッセージに含まれるマーカー遺伝子、の発現を文書化するために行われた。図34は、レンチウイルスベクターで処理された動物における角膜マイクロポケット内のeGFPの存在を実証する顕微鏡写真を示す。
【００９３】
実施例8
Endo/K5融合遺伝子による血管新生の阻害
本例は、エンドスタチン：クリングル-5融合遺伝子のレンチウイルス媒介型発現が血管新生および角膜移植の失敗に阻害効果を生じるかどうかを調べる。
【００９４】
30,000件より多い角膜移植が、米国において毎年、行われている。これは、合わせたすべての心臓、腎臓および肝臓移植よりも多い。角膜移植は、ヒトにおいて最も成功した移植の一つであり、90%を超す成功率をもつ。それでも、毎年、拒絶および移植片失敗を経験するかなりの数の角膜移植がある。失敗した移植を再移植する必要性は、米国での多くのセンターにおいて角膜移植についての上位2つの適応症の1つであり、頻度において偽水晶体の水疱性角膜症に匹敵する。拒絶についての主なリスク因子は、角膜移植前、緑内障、および術後角膜の血管形成である。角膜の血管新生の防止は、移植片失敗および拒絶を抑制するに向けての中枢段階であり、血管新生促進性刺激と戦いうる生物学的因子の開発は、有用なツールであると思われる。
【００９５】
エンドスタチン、コラーゲンXVIIIの20 kDaのC末端断片、はラットでの血管内皮腫モデルにおいて、血管新生および腫瘍増殖の内因性阻害因子であることが示された。エンドスタチンは、内皮細胞内で特異的に細胞増殖、抗アポトーシスおよび血管新生に関与する遺伝子の発現を下方制御することにより増殖および遊走を妨げる。アンギオスタチン、プラスミノーゲンの内部断片のタンパク質分解的切断由来のタンパク質、は4つまでのクリングルドメインを含み、血管新生依存性腫瘍増殖を阻害する。プラスミノーゲンのクリングル-5は、アンギオスタチンの4つのクリングルドメインのそれぞれと46%〜57%のアミノ酸同一性を共有し、アンギオスタチン単独より強力な塩基性線維芽細胞成長因子刺激血管新生の阻害因子である。クリングル-5は、細胞遊走を阻害することにより内皮細胞に特異的に作用する。マウスエンドスタチンおよびマウスアンギオスタチンからなる止血性融合タンパク質は、インビトロの癌モデルにおいて、いずれの遺伝子産物単独よりも強力な生物学的効果を生じることが示された。この例において、ヒトエンドスタチン18およびヒトクリングル-5の生物学的活性ドメインが、内皮細胞増殖および遊走の両方を阻害する能力があるタンパク質を産生する目的として融合タンパク質Endo::K-5を作製するように連結された。
【００９６】
レンチウイルス作製
エンドスタチン-クリングル-5(Endo-Kr5)融合cDNAは、BamH1部位を含むフォワードプライマー
2005538736.tif 000004
およびBamH1部位を含むリバースプライマー
2005538736.tif 000005
を用いてEK-5 pBlastベクター(Invivogen)からPCRにより増幅された。この融合遺伝子は、ヒトインターロイキン-2分泌シグナル由来の20個のアミノ酸、ヒトコラーゲンXVIII遺伝子由来のアミノ酸Ala1333位〜Lys1516位(エンドスタチン)、8個のアミノ酸エラスチンリンカーモチーフ
2005538736.tif 000006
、およびヒトプラスミノーゲン遺伝子由来のアミノ酸Pro466位〜Asp566位をコードする。PCR断片は、BamH1で消化され、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターの転写制御下でレンチウイルスベクターへ連結された(図17)。Endo::K-5融合遺伝子の構築は、導入遺伝子挿入部分の直接的シーケンシングにより確認された。
【００９７】
ウイルスのアッセイ
ウイルス粒子の存在は、p24 GAG抗原ELISAキット(Zeptometrix)を用い、製造会社の使用説明書に従って、確認された。レンチウイルス試薬の感染力を保証するために、10 μl、50 μlおよび100 μlのウイルスを、37℃で20分間、ヒト皮膚微小血管内皮細胞(HDMEC)の6ウェルのプレートへ置いた。その後、メディア131(Media 131)(Cascade Biologicals；Oregon)を加え、細胞を、隔日に培地交換して、37℃、5% CO2で、5日間、インキュベートした。5日目に、RNAをTrizol(Gibco-BRL)を用いて単離し、標準RT-PCRにより分析した。フォワードプライマー
2005538736.tif 000007
およびリバースプライマー
2005538736.tif 000008
は、エラスチンリンカー領域に隣接し、従って、融合転写物を増幅するのみである。
【００９８】
ウサギにおける角膜移植
16個の7 mmの穿孔されたドナー角膜は、8匹のニュージーランドホワイトラビット(New Zealand White Rabbit)から得られた。各ボタンは、50 μl Endo::K-5レンチウイルス、50 μl eGFPレンチウイルス、または50 μl PBSを含む2 mlのオプチゾール(optisol)(CHIRON)において37℃で18時間、インキュベートされた。
【００９９】
全身麻酔は、イソフルランのマスク投与により誘導された。穿刺術を施し、ヘパリンおよび粘弾性を前房(AC)へ徐々に染み込ませた。Hessburg-Barron 7 mm トレフィンが、宿主角膜ボタンを除去するために用いられた。宿主ボタンを、次の日、移植のための、ウイルスまたは対照のサプリメントを含むオプチゾール培地に置いた。Endo::K-5、eGFPまたはPBSで処理された7 mm穿孔された角膜ボタンを、16個の結節7-0ナイロン縫合で縫い込んだ。バイトリル(Baytril)(23 mg/cc)およびケノログ(Kenolog)(40 mg/cc)の0.1 cc 結膜下注射を与えた。手術後、すべての動物は、局所アトロピン(1%)の単一用量および2.5 mg/kg SQでのカルプロフェンの単一用量、加えて5日間1日に2回、トブラマシン1滴、および必要に応じて0.1 mg/kg SQでのブプレネックスを受けた。局所的ステロイド滴剤は、手術後与えられなかった。
【０１００】
血管新生の測定および移植片拒絶の評価
血管新生は、細隙灯検査により、術後5、9、12、14、16、24、28および36日目に経過観察された。血管新生の測定は、一人のマスクした観測者/眼科医により携帯用細隙灯で行われた。澄んだ角膜上への血管増殖は、mmおよび時計時間の数で書き留められた。血管新生は、式：面積=(時計時間/12)πr2で血管増殖のV字型面積を計算することにより定量化された(図33)。たいていの場合、血管増殖は、V字型区画全体には広がらなかった。これについて補正するために、血管増殖の無い区画の面積を総面積から引き算した(図33)。移植片拒絶は、携帯用細隙灯により評価された。移植片失敗は、移植片の100%の混濁をもつ永続性角膜移植片浮腫の存在により判断された。角膜の連続的な写真が撮られた。動物は、術後9、21、30および40日目に屠殺された。新鮮な角膜組織は、RT-PCRためのトリゾール(Gibco-BRL)または組織病理学的研究のためのホルマリンのいずれかに置かれた。
【０１０１】
結果
16匹のニュージーランドホワイトラビットは、1つの眼に連続的同種全層角膜移植を受けた。10匹のウサギは、オプチゾールおよびエンドスタチン/クリングル5融合遺伝子を有するレンチウイルスベクターに一晩、浸漬された移植片を受けた。3匹のウサギは、オプチゾールおよびeGFPマーカー遺伝子を有するレンチウイルスベクターで浸漬された移植片を受けた。3匹のウサギは、オプチゾールおよびPBSで浸漬された移植片を受けた。
【０１０２】
術後角膜血管新生は、術後5、9、12、14、16、18、24、28および36日目において、レンチウイルスeGFPまたはPBS対照の眼のいずれよりもレンチウイルスEndo::K-5移植された眼において有意に低かった(図35)。すべてのPBS処理された角膜およびすべてのレンチウイルスeGFP処理された角膜は、移植片ベッドへの新生血管の樹枝状分岐を示した。10個のEndo::K-5処理された角膜のいずれも移植片へ新しい血管を生じなかった。3個のPBS処理された角膜のうちの3個、および3個のeGFP処理された角膜のうちの2個は、角膜混濁および移植片失敗を示したが、一方、10個のEndo::K-5移植片のうちのいずれも、術後39日目までに完全に混濁または失敗したということはなかった。
【０１０３】
融合遺伝子転写物の存在についてRT-PCRにより試験された5つの移植片のすべては、術後30日目および40日目において陽性であった。すべての対照および手術していない眼は、融合遺伝子RT-PCRにより陰性であった。移植片の組織病理学により、Endo::K-5処理された眼と比較した場合、対照の眼においてより厚く、より浮腫性の角膜が明らかにされた。連続切片の分析により、Endo::K-5処理された眼または手術されていない眼においてよりも対照の眼において、より多くの血管新生および好塩基性炎症性浸潤が明らかにされた。保持された縫合線の部位、しばしば炎症性浸潤の位置、の組織病理学的研究は、検査されたEndo::K-5角膜において炎症性細胞が無かった。
【０１０４】
角膜移植の成功は、この手術についての適応症を広げ、毎年行われる角膜移植術の数を増加させた。この手術の相対的成功にもかかわらず、多数の理由で移植片拒絶が主な問題のまま残っている。移植片拒絶についての主なリスク因子は、レシピエント角膜ベッド、移植片/宿主界面の、またはその後、移植片自身の、血管新生である。新しい血管の移植片への発達は、移植片内の高レベルの炎症性細胞、血漿タンパク質およびサイトカインと関連し、しばしば、拒絶および失敗への前兆である。血管新生が拒絶を促進すると考えたので、研究者は、角膜血管新生の過程を阻止する内科的または外科的アプローチを長い間、捜し求めてきた。
【０１０５】
本実施例は、ウサギモデルにおいて、全層角膜移植後の血管新生の発生を阻害するのに成功したアプローチを記載する。このアプローチは、腫瘍血管新生の動物モデルにおいて抗血管新生であることが知られた遺伝子で角膜組織をエキソビボで形質導入するレンチウイルスベクターの能力に基づいている。新しい血管増殖の阻害因子として、ヒトエンドスタチン遺伝子およびヒトプラスミノーゲン遺伝子の第五のクリングルエレメントを結合する融合遺伝子が本明細書で試験された。
【０１０６】
レンチウイルスEndo::K-5での角膜ボタンの処理は、すべての処理された角膜においてドナー移植片上への新しい血管増殖を防止することができた。組織学的研究により、Endo::K-5処理された角膜での炎症における著しい減少が明らかにされた。これは、保持された縫合線の周りの領域、一般の炎症性領域を含んだ。さらになお、Endo::K-5処理された角膜において、永続性角膜浮腫および角膜混濁により測定されるような移植片失敗の証拠はなかったが、6個の対照角膜のうちの5個は、混濁および失敗の証拠を示した。これらの結果は、全層角膜移植の前に融合抗血管新生性遺伝子でのドナー角膜組織のエキソビボレンチウイルス形質導入が、長期間移植片生存の見込みを増加させ、有用な外科的補助でありうることを示している。
【０１０７】
実施例9
クリングル1-5遺伝子による血管新生の阻害
アンギオスタチンK1-5は、プラスミノーゲンのすべての5つのクリングルドメインから構成される55 kD タンパク質をコードしているのだが、プラスミノーゲンへのプラスミンのプロテアーゼ作用により生じる。それは、多様なモデルにおいて強力な抗血管新生性因子である。
【０１０８】
角膜ポケットアッセイ法は、眼における血管新生へのクリングル1-5遺伝子の効果を測定するためにニュージーランドホワイトラビットで行われた。ナイロンメッシュを基質内角膜ポケットへスペーサーとして挿入し、続いて、クリングル1-5遺伝子およびマーカー遺伝子eGFPを有するレンチウイルスベクター(図26)、マーカー遺伝子eGFPのみを有するレンチウイルスベクターのいずれかを注入した、またはPBS単独を注入した。24時間後、メッシュを眼から除去し、縫合は、血管新生を刺激するために7日後、眼に適用された。血管新生の程度は、縫合適用後3、5、7および10日目に測定された。角膜もまた、組織病理学的分析および導入遺伝子発現分析のために採取された。図36に示されているように、クリングル1-5遺伝子を有するレンチウイルスベクターで処理された動物において血管新生の有意な阻害があった。
【０１０９】
実施例10
Mig/IP10融合遺伝子による血管新生の阻害
Migは、インターフェロン-ガンマにより誘導されるモノカインであり、IP10は、インターフェロン-アルファ誘導タンパク質10である。それらは、類似した構造および機能をもち、それらは両方とも、CXCファミリーに属するケモカインである。ヒトにおいて、これらの2つのタンパク質は、37%同一であり、それらの遺伝子は、染色体4q21.21上でお互いに隣接して位置している。MigおよびIP10は、CXCR3、記憶および活性化T細胞上で主に発現されたGタンパク質結合型受容体、に結合する。CXCR3はまた、B細胞、NK細胞および単球上に見出される。最近、MigおよびIP10についての第二受容体が内皮細胞上に見出された。機能的には、MigおよびIP10の両方は、活性化T細胞について走化性であり、内皮細胞走化性を阻害することによる血管形成、および成長因子誘導血管新生をもたらすと考えられている。Mig/IP10融合遺伝子の眼における血管新生への効果は、下記のように調べられた。
【０１１０】
角膜基質内マイクロポケットは、実施例7に記載されているように形成され、Mig/IP10融合遺伝子を有するレンチウイルス(図27)、マーカー遺伝子eGFPのみを有するレンチウイルスベクターに含浸されたナイロンメッシュ、またはPBS単独に含浸されたナイロンメッシュがマイクロポケットへ挿入された。メッシュは24時間後に除去された。血管新生を誘導するために、角膜は、20 μlの1.0 M NaOHに染み込まされた6 mm Whatman #3フィルターディスクに曝された。その後、血管新生が10日の時間的経過に渡って測定された。図37〜38に示されているように、Mig/IP10融合遺伝子を有するレンチウイルスベクターで処理された動物において血管新生の有意な阻害があった。
【０１１１】
実施例11
KDR遺伝子による血管新生の阻害
KDR(キナーゼ挿入ドメイン受容体)は、VEGFの膜結合型受容体(VEGF受容体2)である。VEGFは、血管内皮細胞についての分裂促進因子であり、増殖、遊走およびプロテアーゼ産生を誘導する。KDRの可溶性断片(sKDR)は、VEGFに対するアンタゴニスト活性として止血性性質をもつことが示された。sKDRはまた、膜結合型KDRの外部ドメインを結合かつ遮断する。眼においてレンチウイルスベクター(図18)により送達されるsKDRの血管新生への効果が、上記のように動物モデルにおいて調べられた。図39における結果は、sKDR遺伝子を有するレンチウイルスベクターで処理された動物において血管新生の有意な阻害があったことを示している。
【０１１２】
以下の参照文献が本明細書に引用された：
2005538736.tif 000009
2005538736.tif 000010
【０１１３】
本明細書に挙げられているいずれの特許または刊行物は、本発明が属する技術分野における業者のレベルを示している。さらに、これらの特許および刊行物は、あたかも個々の刊行物が具体的かつ個別的に示されて、参照として組み入れられているような同じ程度まで本明細書に参照として組み入れられている。
【０１１４】
本発明が、言及されている、対象を実行しかつ目的および利点を得ること、加えて、本明細書に内在するそれらの対象、目的および利点に、十分適応することを当業者は容易に理解するものと思われる。本明細書に記載された方法、手順、処理および特定の化合物と共に、本実施例は、好ましい態様を代表しており、本発明の範囲への限定として意図されるものではない。特許請求の範囲により定められる本発明の真意内に含まれる本明細書における変化は、当業者にとって思い浮かぶものと思われる。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
本発明の上で列挙された特徴、利点および対象、加えて明らかになるであろう他のものが達成され、詳細に理解されうるように、添付された図面で例証されているそれらの特定の態様に関する参照として、上で簡単に要約された本発明のより具体的な説明が示されうる。これらの図面は、明細書の一部を形成する。しかしながら、添付された図面は本発明の好ましい態様を例証し、それゆえに、それらの範囲における限定とみなされるべきではないことは、留意されるべきである。
【０１１６】
【図１】Dr. Inder Verma(Salk Institute、サンディエゴ、CA)により提供されたベクターを描いている。HIV：ヒト免疫不全症ウイルス、LTR：末端反復配列、GAG：HIV GAG遺伝子、POL：HIV逆転写酵素、ENV：HIVエンベロープ遺伝子、rre：rev-応答配列、CMV：サイトメガロウイルス、VSV：水疱性口内炎ウイルス、ポリA：ポリアデニル化シグナル、特定のプロモーター：治療的遺伝子発現の空間的、時間的または量的な局面を調節するために任意の転写促進プロモーターがここに置かれうる、治療的遺伝子：治療的潜在能力をもつ任意の遺伝子がここに置かれうる  −  例は、限定されるものではないが、CA-rb、欠損が結果として疾患を生じる遺伝子を含む。
【図２】以下のヒト細胞系のインビトロ形質導入を示す：ヒト網膜色素上皮細胞(RPE)、ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)、脈絡膜線維芽細胞(CF)、ヒト網膜芽細胞腫(網膜由来)細胞(Weri-Rb-1およびY79)。これらの細胞系は、マーカー遺伝子(強化型緑色蛍光タンパク質遺伝子)を含むレンチウイルス粒子で形質導入され、マーカー遺伝子を発現させる細胞の画分は、蛍光活性化細胞選別により測定された。用量応答性は、より多くの細胞がより多数のレンチウイルス粒子(感染の多重度  −  MOI)で形質導入されるとして観察される。
【図３】培養された網膜色素上皮細胞のレンチウイルス形質導入を実証している。マーカー遺伝子(eGFP)発現は、結果として緑色の蛍光性細胞を生じる。図3Bは、形質導入効率の蛍光活性化細胞選別分析を示す。第一パネルにおけるR2ゲートの外側のデータは、蛍光の形質導入前の欠如を反映している。第二パネルは、>95%蛍光への形質導入後のシフトを実証している。
【図４】ヒト網膜色素上皮細胞における有糸分裂活性および形質導入効率を例証している。ヒト網膜色素上皮細胞は、レンチウイルスまたはマウス白血病ウイルス(MLV)ベクターにより形質導入された。細胞は、ベクターへの曝露の時点で、有糸分裂不活性(集密的)または有糸分裂活性(増殖中)であった。これらの結果は、他のレトロウイルスベクターを凌ぐ、非分裂細胞を形質導入するレンチウイルスベクターの優れた能力を実証している。
【図５】ヒト網膜色素上皮細胞における発現安定性を描く。細胞は、eGFP含有レンチウイルスベクターに曝され、引き続いて、連続培養で少なくとも120日間、維持された。図5Aは、これらの細胞におけるeGFP発現の安定性、およびレンチウイルスで形質導入細胞に有利の、または不利の選択の欠如(形質導入された細胞の画分は、長期に渡っても不変のままである)を描く。図5Bは、5つのクローン細胞集団についてのサザン分析の結果である。レーン1は、非形質導入親系由来のゲノムDNAを含む。レーン2および3は、ベクターに曝されたが、緑色ではなかった細胞由来のDNAを含む(非形質導入)。レーン4および5は、形質導入された緑色細胞由来のDNAを含む。細胞は、ゲノム組込みの結果としてe-GFP陽性を保持する。
【図６】ヒト胎児細胞導入遺伝子発現を例証している。このグラフは、ヒト胎児細胞において、非レンチウイルスのレトロウイルスベクター(MND-eGFP)またはウイルスベクターを含まない(対照)と比較した場合、レンチウイルスベクターで達成された形質導入の高効率様式を描く。
【図７】角膜形質導入を実証している。図7Aは、ヒト角膜の略図である。図7Bは、e-GFP含有レンチウイルスベクターによるヒト角膜内皮形質導入を実証している。ヒト角膜ボタンは、角膜移植の時点で除去されたものだが、レンチウイルス粒子に曝された。引き続いて、デスメ膜が取り出され、ルームランプにおいて(左)、および蛍光検出に基づいて分析できる条件下において(右)、写真を撮られた。図7Cは、ヒト角膜上皮細胞へのレンチウイルス媒介型eGFP遺伝子移入を実証している。サブパネルAは、人為的に分離した上皮層を有するヒト角膜の光顕微鏡写真である。蛍光顕微鏡法(サブパネルB)は、上皮蛍光を示している。
【図８】欠損が結果としてヒト疾患を生じる遺伝子のレンチウイルス遺伝子移入の例を提供している。正常なヒト網膜または網膜色素上皮(RPE)組織は、網膜芽細胞腫についての摘出の時点で手術的に切除されたのだが、治療的遺伝子を欠損している(偽)かまたはヒトペリフェリン遺伝子を含んでいるかのいずれかであるレンチウイルスベクターに曝された。この遺伝子は、ヒトにおいて遺伝的に欠損している場合、結果として幅広い種類の身体に障害を引き起こす表現型を生じることが知られている。移入されたペリフェリン遺伝子のみを認識するように設計されたプライマーを用いる逆転写酵素補助型ポリメラーゼ連鎖反応(rt-PCR)の結果が示された。ヒト網膜およびRPEにおけるヒトペリフェリンの発現は、明らかに実証された。
【図９】CA-rb mRNAのレンチウイルス媒介型発現を実証している。これは、網膜芽細胞腫遺伝子の恒常的活性型のみを認識するように設計されたプライマーを用いる逆転写酵素補助型ポリメラーゼ連鎖反応(rt-PCR)の結果を示す。レーン1：マーカー、レーン2：レンチウイルス-eGFP形質導入された細胞から単離されたRNAについての反応結果、レーン3：レンチウイルス-CA-rb形質導入された細胞から単離されたRNAについての反応結果。反応産物は、予想されたサイズであった。
【図１０】レンチウイルスCA-rbの、ヒト網膜および角膜細胞分裂への阻害効果を示す。細胞は、単一のレンチウイルス系統の減少性希釈(1:400希釈〜1:50希釈)に曝され、増殖は、CA-rbを含まないレンチウイルスベクターに曝された細胞と比較された。細胞分裂への阻害効果は、時間とともに明らかに見られ、この効果は用量依存性であった。
【図１１】レンチウイルスCA-rbの、ヒト水晶体上皮細胞分裂への阻害効果を示す。白内障摘出の時点でヒト眼から除去された細胞が、単一のレンチウイルス系統の減少性希釈(1:400希釈〜1:50希釈)に曝され、増殖は、CA-rbを含まないレンチウイルスベクターに曝された細胞と比較された。細胞分裂への阻害効果は、時間とともに明らかに見られ、この効果は用量依存性であった。
【図１２】レンチウイルスCA-rbの、失明に至る眼内細胞増殖へのインビボ阻害効果を示す。増殖性硝子体網膜症は、3組のウサギに引き起こされた。1組は処理されず、1組はCA-rb遺伝子を欠くレンチウイルスベクターで処理され、最後の組は、硝子体内に送達されたレンチウイルスCA-rbで処理された。増殖性硝子体網膜症および網膜剥離は、最初の2組において高頻度(>90%)で観察された。網膜剥離へ進んだ動物の割合は、CA-rbで処理された組において有意により低かった(26%)。ここで示されているのは、2枚の網膜の写真である。左側の眼は、完全に付着した網膜を有し、CA-rbで処理された。右側の眼は、完全に剥離した網膜、眼内の硝子体網膜症性細胞増殖の結果、を有しており、CA-rb遺伝子を欠くレンチウイルスベクターで処理された。
【図１３】レンチウイルスCA-rbの、水晶体摘出後の後嚢混濁の過程へのインビボ阻害効果を示す。3組のウサギが、本来の水晶体を除去するために標準的水晶体超音波吸引術を受けた。第一組(群1)は、その後何も処理されず、第二の2つの組は、白内障創傷の閉鎖時点に無傷の水晶体被膜袋へ送達された空のレンチウイルス構築物(治療的遺伝子無し、群2)かまたはレンチウイルスのCA-rb(群3)かのいずれかで処理された。動物は、後嚢混濁の存在について連続的に検査された。混濁の存在は、1〜5の等級によってランク付けされ、1は混濁無しを表し、5は間接的双眼検眼鏡検査で網膜の視覚化を妨げるほど重症の混濁を表した。群1と群2(処理無しおよび空のベクター)の間に得られた統計学的に異なる結果はなかった。ここのグラフは、レンチウイルスCA-rbの、後嚢混濁の発生への著しい阻害効果を示している。28日目までに、対照動物は、4.4の平均混濁スコアであったが、レンチウイルスのCA-rbで処理された動物は、2.1の平均混濁スコアであった。
【図１４】レンチウイルスベクターにより送達されるエンドスタチン-18/アンギオスタチン融合遺伝子についてのマップを示す。
【図１５】エンドスタチン/アンギオスタチン融合遺伝子を有するレンチウイルスベクターpHR-CMV-Endo/Ang-ires-eGFPについてのマップを示す。
【図１６】BIK遺伝子を有するレンチウイルスベクターpHR-CMV-BIK-ires-eGFPについてのマップを示す。
【図１７】エンドスタチン/クリングル融合遺伝子を有するレンチウイルスベクターpHR-CMV-Endo/Kringle-ires-eGFPについてのマップを示す。
【図１８】KDR遺伝子を有するレンチウイルスベクターpHR-CMV-KDR-ires-eGFPについてのマップを示す。
【図１９】p16遺伝子を有するレンチウイルスベクターpHR-CMV-P16-ires-eGFPについてのマップを示す。
【図２０】p21遺伝子を有するレンチウイルスベクターpHR-CMV-P21-ires-eGFPについてのマップを示す。
【図２１】Timp1遺伝子を有するレンチウイルスベクターpHR-CMV-Timp1-ires-eGFPについてのマップを示す。
【図２２】アンギオスタチン遺伝子を有するレンチウイルスベクターpHR-EF1/HTLV-Ang-ires-eGFPについてのマップを示す。
【図２３】エンドスタチンXV遺伝子を有するレンチウイルスベクターpHR-EF1/HTLV-Endo XV-ires-eGFPについてのマップを示す。
【図２４】エンドスタチン/アンギオスタチン融合遺伝子を有するレンチウイルスベクターpHR-EF1/HTLV-EndoAng-ires-eGFPについてのマップを示す。
【図２５】エンドスタチン/クリングル融合遺伝子を有するレンチウイルスベクターpHR-EF1/HTLV-EndoKringle-ires-eGFPについてのマップを示す。
【図２６】クリングル遺伝子を有するレンチウイルスベクターpHR-EF1/HTLV-Kringle 1-5-ires-eGFPについてのマップを示す。
【図２７】Mig/IP10融合遺伝子を有するレンチウイルスベクターpHR-EF1/HTLV-MigIP10-ires-eGFPについてのマップを示す。
【図２８】Timp1遺伝子を有するレンチウイルスベクターpHR-EF1/HTLV-Timp1-ires-eGFPについてのマップを示す。
【図２９】Timp4遺伝子を有するレンチウイルスベクターpHR-EF1/HTLV-Timp4-ires-eGFPについてのマップを示す。
【図３０】p21遺伝子を有するレンチウイルスベクターpHR-EF1/HTLV-P21-ires-eGFPについてのマップを示す。
【図３１】エンドスタチンXVIII遺伝子を有するレンチウイルスベクターpHR-EF1/HTLV-Endo XVIII-ires-eGFPについてのマップを示す。
【図３２】エンドスタチン-18/アンギオスタチン融合遺伝子で形質導入されたヒト皮膚微小血管内皮(hDMVE)細胞から単離されたmRNAのRT-PCRを示す。レーン1：1000/100 bp ラダー混合；レーン2〜5：12ウェルプレートのうちの1つのウェルからのpHR'-eF1α/HTLV-Endo::Ang-IRES-eGFPウイルス上清の1 μl、5 μl、10 μl、および20 μlで形質導入されたhDMVE細胞から単離されたmRNAからのRT-PCR；レーン6：20 μlのPBSでインキュベートされたhDMVE細胞から単離されたmRNAからのRT-PCR；レーン7：陰性対照(RT-PCRについての鋳型としてH2O)；レーン8：100 bp ラダー。
【図３３】アルカリによる火傷後の角膜血管新生についての評価の標準化方法を示す。血管新生の面積についての式は、半径RTにより境界を示された大きい方の扇形の面積を計算し、半径R2により境界を示された小さい方の扇形を引き算することにより導かれる。半径RTにより境界を示された大きい方の扇形の面積は、時計時間の数を12で割って、πRT2を掛ける。半径R2により境界を示された小さい方の扇形の面積は、時計時間の数を12で割って、π(R2)2を掛ける。2つの扇形の引き算から導かれた結果の面積は、血管新生の面積である。
【図３４】処理された動物での角膜マイクロポケットにおけるeGFPの存在を示す。図34Aは、マイクロポケットにおけるeGFP発現の存在を実証する蛍光顕微鏡写真を示す。図34Bは、Aに示されたのと同じ組織の非蛍光顕微鏡写真を示す。図34Cは、未処理の動物由来の同様に加工された組織の蛍光顕微鏡写真を示す。
【図３５】レンチウイルスのEndo/K5ベクターで処理された動物における血管新生の阻害を示す。グラフは、PBS(n=3)、マーカーeGFP遺伝子を有するレンチウイルスベクター(n=3)、またはEndo/K5融合遺伝子を有するレンチウイルスベクター(n=10)で処理された動物における血管新生の平均面積を描く。
【図３６】レンチウイルスのK1-5ベクターで処理された動物における血管新生の阻害を示す。グラフは、PBS(n=3)、マーカーeGFP遺伝子を有するレンチウイルスベクター(n=5)、またはK1-5遺伝子を有するレンチウイルスベクター(n=9)で処理された動物における血管新生の平均面積を描く。
【図３７】Mig/IP10レンチウイルスベクターで処理された動物における血管新生への阻害効果を示す。図37Aは、正常な(未処理の、非誘導の)角膜の写真を示す。図37Bは、Mig/IP10レンチウイルスベクターで処理された動物のアルカリに曝露された角膜の写真を示す。角膜への血管の欠如に注目されたい。図37Cは、治療的抗血管新生性遺伝子を含まない対照レンチウイルスベクターで処理された動物のアルカリに曝露された角膜の写真を示す。角膜への血管の侵入に注目されたい。
【図３８】Mig/IP10レンチウイルスベクターで処理された動物における血管新生の阻害を示す。グラフは、PBS、マーカーeGFP遺伝子を有するレンチウイルスベクターまたはK1-5遺伝子を有するレンチウイルスベクターで処理された動物における血管新生の平均面積を描く。
【図３９】レンチウイルスのKDRベクターで処理された動物における血管新生の阻害を示す。グラフは、PBS(n=3)、マーカーeGFP遺伝子を有するレンチウイルスベクター(n=6)またはKDR遺伝子を有するレンチウイルスベクター(n=9)で処理された動物における血管新生の平均面積を描く。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３７Ｃ】
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【図３７Ｄ】
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【図３８】
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【図３９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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