(57)【要約】本発明は、ヒトゲノム中の遺伝子によりコード化されている、本発明の分泌ペプチドのアミノ酸配列を提供するものである。本発明は特に、単離ペプチド及び核酸分子、分泌ペプチドのオルトログ及びパラログの同定方法、及び分泌ペプチドのモジュレータの同定方法を提供するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記グループから選択されるアミノ酸配列から成る単離ペプチド。
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７〜１２に示される配列から選択されるアミノ酸配列；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７〜１２に示される配列から選択されるアミノ酸配列の対立変異体のアミノ酸配列であって、該対立変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１又は３に示される核酸分子の対向鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコード化されていることを特徴とするアミノ酸配列；（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７〜１２に示される配列から選択されるアミノ酸配列のオルトログのアミノ酸配列であって、該オルトログは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１、又は３に示される核酸分子の対向鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコード化されていることを特徴とするアミノ酸配列；及び
（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７〜１２に示される配列から選択されるアミノ酸配列のフラグメントであって、該フラグメントは、少なくとも１０の隣接するアミノ酸を含むことを特徴とするアミノ酸配列。
【請求項２】
下記グループから選択されるアミノ酸配列を含む単離ペプチド。
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７〜１２に示される配列から選択されるアミノ酸配列；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７〜１２に示される配列から選択されるアミノ酸配列の対立変異体のアミノ酸配列であって、該対立変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１又は３に示される核酸分子の対向鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコード化されていることを特徴とするアミノ酸配列；（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７〜１２に示される配列から選択されるアミノ酸配列のオルトログのアミノ酸配列であって、該オルトログは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１又は３に示される核酸分子の対向鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコード化されていることを特徴とするアミノ酸配列；及び
（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７〜１２に示される配列から選択されるアミノ酸配列のフラグメントであって、該フラグメントは、少なくとも１０の隣接するアミノ酸を含むことを特徴とするアミノ酸配列。
【請求項３】
請求項２記載のペプチドに選択的に結合する単離抗体。
【請求項４】
下記グループから選択されるヌクレオチド配列から成る単離核酸分子。
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７〜１２に示される配列から選択されるアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７〜１２に示される配列から選択されるアミノ酸配列の対立変異体をコード化するヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１又は３に示される核酸分子の対向鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とするヌクレオチド配列；
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７〜１２に示される配列から選択されるアミノ酸配列のオルトログをコード化するヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１又は３に示される核酸分子の対向鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とするヌクレオチド配列；及び
（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７〜１２に示される配列から選択されるアミノ酸配列のフラグメントをコード化するヌクレオチド配列であって、該フラグメントは、少なくとも１０の隣接するアミノ酸を含むことを特徴とするヌクレオチド配列。（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列。
【請求項５】
下記グループから選択されるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７〜１２に示されるアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７〜１２に示される配列から選択されるアミノ酸配列の対立変異体をコード化するヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１又は３に示される核酸分子の対向鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とするヌクレオチド配列；
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７〜１２に示される配列から選択されるアミノ酸配列のオルトログをコード化するヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１又は３に示される核酸分子の対向鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とするヌクレオチド配列；及び
（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７〜１２に示される配列から選択されるアミノ酸配列のフラグメントをコード化するヌクレオチド配列であって、該フラグメントは、少なくとも１０の隣接するアミノ酸を含むことを特徴とするヌクレオチド配列。（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列。
【請求項６】
請求項５記載の核酸分子を含む遺伝子チップ。
【請求項７】
請求項５記載の核酸分子を含むヒト以外の遺伝子組み換え動物。
【請求項８】
請求項５記載の核酸分子を含む核酸ベクター。
【請求項９】
請求項８記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１記載の何れかのペプチドを製造する方法であって、（ａ）〜（ｄ）の何れかのアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列を宿主細胞内に導入し、ペプチドがヌクレオチド配列から発現される条件下で宿主細胞を培養する方法。
【請求項１１】
請求項２記載の何れかのペプチドを製造する方法であって、（ａ）〜（ｄ）の何れかのアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列を宿主細胞内に導入し、ペプチドがヌクレオチド配列から発現される条件下で宿主細胞を培養する方法。
【請求項１２】
サンプル中における請求項２記載の何れかのペプチドの存在を検出する方法であって、サンプル中の該ペプチドの存在を特異的に検出する試薬とサンプルとを接触させ、該ペプチドの存在を検出する方法。
【請求項１３】
サンプル中における請求項５記載の核酸分子の存在を検出する方法であって、ストリンジェントな条件下で該核酸分子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとサンプルとを接触させ、サンプル中の該核酸分子とオリゴヌクレオチドが結合するかどうかを判定する方法。
【請求項１４】
請求項２記載のペプチドのモジュレータを同定する方法であって、該ペプチドと試薬とを接触させ、該試薬が該ペプチドの機能又は活性を変調したかどうかを判定する方法。
【請求項１５】
請求項１４記載の方法において、前記試薬は前記ペプチドを発現する発現ベクターを含む宿主細胞に対して与えられる方法。
【請求項１６】
請求項２記載の何れかのペプチドに結合する試薬を同定する方法であって、ペプチドと試薬とを接触させ、接触混合物中にペプチドと試薬とが結合した複合体が形成されるかどうかをアッセイする方法。
【請求項１７】
請求項１６記載の方法により同定された試薬と、薬学的に許容可能なそれらの担体とを含む薬剤組成物。
【請求項１８】
ヒト分泌タンパク質により媒介される疾患又は症状を治療する方法であって、請求項１６記載の方法で同定された試薬を薬学的に有効な量、患者に投与する方法。
【請求項１９】
請求項２記載のペプチドの発現のモジュレータを同定する方法であって、該ペプチドを発現する細胞と試薬とを接触させ、該試薬が該ペプチドの発現を変調したかどうかを測定する方法。
【請求項２０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７〜１２に示される配列から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性を持つアミノ酸配列を有する単離ヒト分泌ペプチド。
【請求項２１】
請求項２０記載のペプチドにおいて、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７〜１２に示される配列から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を持つアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項２２】
ヒト分泌ペプチドをコード化している単離核酸分子であって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１又は３に示される核酸分子と少なくとも８０％の相同性を有している核酸分子。
【請求項２３】
請求項２２記載の核酸分子において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１又は３に示される核酸分子と少なくとも９０％の相同性を有している核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、分泌タンパク質の分野に属し、Ｗｎｔ、乳酸デヒドロゲナーゼ、カルギザリン、レチノイン酸受容体応答物、ＭＡＰ、及びフェリチンサブファミリー、組み換えＤＮＡ分子、及びタンパク質生成に関連するものである。本発明は特に、新規な分泌ペプチド及びタンパク質、及びこのようなペプチド及びタンパク質分子をコード化する核酸分子を提供するものであり、これら全てはヒトの治療及び診断用の化合物、方法の開発において有用である。
【０００２】
背景技術
分泌タンパク質
多くのヒトタンパク質は、薬学的に活性な化合物として働く。このような活性化合物として働くヒトタンパク質のうちのいくつかのクラスには、ホルモン、サイトカイン、細胞成長因子、細胞分化因子が含まれる。したがって、種々の動物モデルにおいて活性をテストすることのできる分泌タンパク質を同定することは、新しい製薬化合物の開発において重要である。本発明は、多くの新規な分泌タンパク質を提供することにより、当該技術の進展に寄与するものである。
【０００３】
分泌タンパク質は、一般的に、粗面小胞体において生産され、ゴルジ複合体へと輸送され、その後、分泌性小胞又は細粒へと移り、そこで、エキサイトーシスを経て細胞の外へと分泌される。
【０００４】
分泌タンパク質は、特に診断用のマーカーとして有用である。多くの分泌タンパク質は、血清において見出され、容易に測定することができる。特定の分泌乳癌タンパク質のような多くの分泌タンパク質が、細胞輸送の分子信号配列を含んでいるため、例えば、「信号配列トラップ」技術がしばしば用いられることができる。さらに、特定の分泌血清タンパク質に対する抗体は、例えば、癌診断用の潜在的な診断用薬剤として働くことができる。
【０００５】
分泌タンパク質は、ヒトの重要な生物学的プロセスの広い配列において重要な役割を演じ、多くの有用性を持つ；例えば、線維芽細胞分泌タンパク質は、細胞外マトリックス形成に関連する。細胞外マトリックスは、成長因子作用、細胞接着、及び細胞成長に影響を及ぼす。線維芽細胞分泌タンパク質の構造的、及び量的な特性は、細胞老化過程の間に変更され、このような老化に関連した修正は、細胞接着の阻害、阻害された成長因子による細胞刺激、阻害された細胞増殖能力に至るかもしれない（Ｅｌｅｆｔｈｅｒｉｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ｍｕｔａｔ Ｒｅｓ １９９１ Ｍａｒ−Ｎｏｖ；２５６（２−６）：１２７−３８）。
【０００６】
アミロイドβ／Ａ４タンパク質前駆体（ＡＰＰ）の分泌形態は、成長及び／又は分化の因子として機能する。ＡＰＰの分泌形態は、培養された神経芽腫細胞の神経突起拡張を促進することができ、おそらく、細胞表面受容体と結合を経て、それにより細胞内伝達機構のきっかけとなる（Ｒｏｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １９９３ Ｓｅｐ ２４；６９５：１４９−５７）。分泌ＡＰＰは、神経細胞の興奮性を変調し、成長円錐挙動に関するグルタミン酸塩の影響を打ち消し、シナプスの複雑さを増大する。シナプス形成及び神経細胞の生存に関する分泌ＡＰＰの顕著な影響は、分泌ＡＰＰが自然細胞死のプロセスにおいて主要な役割を演じ、さらに例えば発作、癲癇、及びアルツハイマー病等の多様な神経病学的障害の発達において役割を果たしているかもしれないことが示唆される（Ｍａｔｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｄｅｖ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ １９９８； ５（４）：３３７−５２）。
【０００７】
乳癌細胞は、５２Ｋのエストロゲン−調節タンパク質を分泌する（Ｒｏｃｈｅｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １９８６；４６４：１９０−２０１参照）。このため、この分泌タンパク質は乳癌の診断に有用である。
【０００８】
血小板、血小板因子４（ＰＦ４）、及びβ−トロンボグロブリン（βＴＧ）により放出される２つの分泌タンパク質は、止血、及び血栓症に関連する血小板の的確なインジケータであり、これらの分泌タンパク質を測定するアッセイは、血栓障害の発病及び進行の研究において有用である（Ｋａｐｌａｎ， Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ １９７８；１０２：１０５−１９）。
【０００９】
脈管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、自然に分泌されるタンパク質のもう一つの例である。細胞表面ヘパラン硫酸に結合するＶＥＧＦは、酸素欠乏内皮細胞により生成され、アポトーシスを減少し、低酸素により上方−調整される高親和性受容体と結合する（Ａｓａｈａｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｍｉｎ Ｉｎｔｅｒｖ Ｃａｒｄｉｏｌ １９９６ Ｓｅｐ；１（３）：２２５−３２）。
【００１０】
免疫系の多くの重要な構成成分は、抗体のような分泌タンパク質であり、免疫系の多くの重要な機能は、分泌タンパクの作用に依存している。例えば、Ｓａｘｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ １９９７ Ｍａｙ；２５（２）：３８３−７では，分泌ＩｇＥタンパク質について議論している。
【００１１】
分泌タンパク質についての更なる説明については、Ｎｉｌｓｅｎ−Ｈａｍｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ Ｉｎｔ Ｒｅｐ １９８２ Ｓｅｐ；６（９）：８１５−３６を参照されたい。
【００１２】
分泌、システイン−リッチグリコプロテインのＷｎｔファミリーは、細胞死、細胞増殖、細胞極性、細胞移動、上皮−間葉系相互作用を含む、各種発達プロセスを調節する細胞間タンパク質／リガンド信号を高度に保持したファミリーである。これらの細胞プロセスの制御を経て、Ｗｎｔは、四肢、脳、生殖管、及び腎臓のような組織及び器官の発達に寄与する。Ｗｎｔ信号経路は、線虫、ハエ、カエル、ヒトといった異なる種において、細胞増殖、分化を調節する。このような異種間における経路の高度の保持は、そのＷｎｔ信号伝達が、動物の胚形成の間の、多様な細胞の生成のための基本的メカニズムを示し、発達、細胞の増殖及び分化において、重要な役割を演じていることを示唆している。Ｗｎｔ信号の非−調節は、発達上の欠陥を引き起こす場合があり、いくつかのヒトの癌の発端に関連している。さらに、Ｗｎｔは、分裂、ＣＮＳパターン、及び非対称細胞分裂の制御といった多様なプロセスに関連している。
【００１３】
Ｗｎｔリガンドは、信号伝達カスケードを開始するために、細胞表面においてちぢれた受容体のファミリーと結合する。Ｗｎｔのちぢれた受容体との結合は、βカテニン代謝回転複合体の活性を下方調整することにより、細胞質ないのβ−カテニンを安定化する信号を送る。β−カテニンは、その後細胞核へと移動し、そこで転写活性剤として機能し、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｊｕｎ、ｆｒａ−１、及びｃｙｃｌｉｎＤ１を含むＷｎｔターゲット遺伝子の発現を促進する。ｃ−ｍｙｃ、及びｃｙｃｌｉｎＤ１のような、いくつかのＷｎｔターゲット遺伝子は、発癌性遺伝子である。Ａｘｉｎ及びその相同体であるＡｘｉｌは、最近、Ｗｎｔ信号経路の構成成分として確認され、この経路を負の方向に調節する。
【００１４】
Ｗｎｔ信号経路の不適当な活性化は、ヒトの腫瘍形成の発達における主な因子として関係している。このようなＷｎｔ信号経路の発癌性の活性化は、多くのレベルで起こり得る。例えば、Ｗｎｔリガンド及びＷｎｔ結合タンパク質の不適当な発現は、多くのヒトの腫瘍において観察されている。β−カテニンの活性化変異を経たような、β−カテニン代謝回転複合体の調節の欠質は、置くの腫瘍において観察され、腫瘍形成の進行において鍵となる寄与因子であるかもしれない。したがって、様々な手段によるＷｎｔ信号経路の活性化は、例えば、細胞増殖、形態、及び接触阻害に影響することによって、腫瘍形成の主な原因となり得る。さらに、Ｗｎｔ信号経路は、多段階の癌進行において他の発癌遺伝子と協同し得る。
【００１５】
癌及び発達上の障害に加えて、Ｗｎｔ信号経路は、脳の発達において重要な役割を演じ、アルツハイマー病に関連しているかもしれない。Ｗｎｔ信号構成成分の機能連続的な欠失は、一連の誤認識活動を引き起こすかもしれず、これによってアルツハイマー病の発病及び発展に関連するかもしれない。
【００１６】
Ｗｎｔ遺伝子ファミリーは、癌を含む、種々の生殖間病理学において、重要な役割を演ずるかもしれない。例えば、Ｗｎｔ遺伝子ファミリー（Ｗｎｔ−７ａ）のメンバーの１つは、子宮の発達と生体の子宮機能において、決定的な役割を演ずる。さらに、Ｗｎｔ−７ａは、出生前、合成エストロゲン化合物、ＤＥＳへの暴露に応答して調節不能となる。
【００１７】
Ｗｎｔの更なる説明については、Ｄｅ Ｆｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｒｅｖ ２０００ Ａｕｇ；３３（１）：１−１２； Ｓｍａｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ １９９９；１８（２）：２１５−３０； Ｋｉｋｕｃｈｉ， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２０００ Ｆｅｂ １６；２６８（２）：２４３−８； Ｓｅｉｄｅｎｓｔｉｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ２０００ Ｆｅｂ ２；１４９５（２）：１６８−８２； Ｋｉｋｕｃｈｉ， Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ １９９９ Ｓｅｐ−Ｄｅｃ；１０（３−４）：２５５−６５； Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９９９ Ｄｅｃ ２０；１８（５５）：７８６０−７２； Ｓａｓｓｏｏｎ， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １９９９ Ｄｅｃ ２０；１５８（１−２）：１−５； Ｄｉｅｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １９９９；４３：１５３−９０； ａｎｄ Ｗｏｄａｒｚ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １９９８；１４：５９−８８を参照されたい。
【００１８】
乳酸デヒドロゲナーゼ
乳酸デヒドロゲナーゼ：Ｌａｃｔａｔｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＬＤＨ）（しばしばＬａｃｔｉｃ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅと呼ばれる）は、ヒトの血清中に生じている、最も臨床的に重要なデヒドロゲナーゼである。ＬＤＨは、特定のアイソザイムの血清濃度が特定の組織における病的状態を反映することから、臨床的に重要である。したがって、ＬＤＨは、組織の損傷の存在を評価するために、しばしば測定される。ＬＤＨは、病的状態によって引き起こされる無傷の細胞への損傷を示唆するインジケータとして用いられる。ＬＤＨが、全ての主な組織系において必須に存在することから、多数の障害において血清ＬＤＨ活性は異常を示す。
【００１９】
ＬＤＨは、細胞の細胞質において見出され、以下のピルビン酸及び乳酸の相互転換の可逆反応に対して触媒的作用を及ぼす：ピルビン酸＋ＮＡＤＨ←→乳酸＋ＮＡＤ。
【００２０】
この双方向性の反応は、乳酸→ピルビン酸反応において生じる３４０ｎｍのＮＡＤＨの増加、又はピルビン酸→乳酸反応において生じる３４０ｎｍのＮＡＤＨの減少のどちらかが測定されることにより、分光測光法でモニターされることができる。
【００２１】
哺乳類のＬＤＨは、四量体につき１３６，７００±２，１００ダルトンの分子量で、２つの異なるポリペプチドサブユニットの組合せから成る５つの四量体アイソザイムとして存在する。これらの四量体アイソザイムは、それぞれ、触媒的、物理学的、免疫学的特性において異なっている。Ｃａｈｎら（１９６２）は、２つの純粋なアイソザイムＨ４及びＭ４、及び３つのハイブリッドＨ３Ｍ、Ｈ２Ｍ２、及びＨＭ３、と結合する２つのポリペプチドサブユニットを、Ｈ（心臓）、Ｍ（筋肉）として設計した。Ｈ４タイプは、ｐＨ７で最も負に荷電され、ゾーン電気泳動において最もアノードに近接して見える。サブユニットＨは、心筋において優勢であり、ピルビン酸の好気性酸化を促進する。Ｍサブユニットは、骨格筋と肝臓において優勢であり、主に嫌気性代謝とピルビン酸還元と関係している。
【００２２】
ヨウ化物はＬＤＨを阻害する；ｐ−メルクリ安息香酸もまた、ＬＤＨを阻害するが、より遅い速度である。ジメチルスルホキシド、エタノール、及びメタノールのような、酵素を安定化させる多くの有機化合物によって、ＬＤＨは活性化される。ジエチルスチルベストロール、及びその誘導体も酵素を安定化する。
【００２３】
通常の総ＬＤＨのレベルは、約１０５〜３３３ＩＵ／Ｌである（／Ｌ国際単位）。通常のＬＤＨレベルより高い場合、脳血管発作（例えば、ＣＶＡ、発作）、心筋梗塞、溶血性貧血（同様に貧血症の他の形態）、低血圧、感染性単核症、腸乏血症及び梗塞、肝臓障害（例えば、肝炎）、筋肉傷害、筋ジストロフィー、腫瘍性症状、膵臓炎、肺梗塞のような症状を示すかもしれない。総ＬＤＨレベルが高くなる場合、特定の血清ＬＤＨアイソザイムは、診断法の正確性を増すために測定され得る。
【００２４】
ＬＤＨアイソザイム分析が最もよく使用されるのは、心筋梗塞、及び他の心筋性疾患の診断のためである。血清ＬＤＨレベルは、各種の心筋性疾患において高められ、心筋性疾患において特定のＬＤＨアイソザイム上昇パターンが生じる。溶血が無い場合では、ＬＤＨ−１／ＬＤＨ−２の比率が１以上（“フリップ”比率と呼ばれる）では、通常、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）を示す。このフリップ比率は、約８０％ＡＭＩ患者において観察される。通常の比率は、ＡＭＩでない場合には、めったに０．８０を上回ることはない。ＬＤＨ活性は、胸の痛みの兆候の８〜１２時間の後に上昇し始め、２４〜２８時間でピークに達し、上昇したレベルは１週間以上持続し得る。
【００２５】
ＬＤＨの活性、及びそのアイソザイムのパターンはまた、細胞損傷又は炎症のような、肺の病的症状のインジケータとして有用である。肋膜の流出、及び気管支胞の洗浄流体におけるＬＤＨ活性レベル、及びそのアイソザイムパターンの測定は、肺、及び肺内皮細胞の損傷に関する本質的な情報を提供するかもしれない。
【００２６】
ＬＤＨアイソザイムは、また、他の生理的状態、及び筋肉外傷、肝臓損害、及び各種悪性腫瘍のような障害を評価することに有用である。これらの場合、各種のアイソザイムの分布は、診断上のインジケータとして有用である。血清ＬＤＨレベルは、また、卵巣の未分化胚細胞腫、及び睾丸の性細胞腫瘍の診断において有用である。さらに、ＬＤＨはまた、ホジキン病と非−ホジキンのリンパ腫、及び卵巣の未分化胚細胞腫の追跡調査における、生存期間及び比率の立証において有用である。加えて、ＬＤＨはまた、ＮＡＤ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰ、及びＮＡＤＰＨに関連した各種の研究において有用である。
【００２７】
乳酸デヒドロゲナーゼの更なる説明については、Ｌｉ， Ｐｒｏｇ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｌ Ｒｅｓ １９９０；３４４：７５−９９； Ｍａｒｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｆｕｎｃｔ １９８４ Ｊｕｌ；２（３）：１３１−４；Ｈｕｉｊｇｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９９７ Ａｕｇ；３５（８）：５６９−７９；Ｄｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ １９９６ Ａｕｇ；９（８）：１７３６−４２；Ｖａｎｄｅｒｌｉｎｄｅ， Ａｎｎ Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｓｃｉ １９８５ Ｊａｎ−Ｆｅｂ；１５（１）：１３−３１；ａｎｄ Ｗｏｌｆ， Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｍｅｄ １９８９ Ｄｅｃ；９（４）：６５５−６５を参照されたい。
【００２８】
カルギザリン
カルギザリン（Ｓ１００Ｃ、及びＳ１００Ａ１１タンパク質とも呼ばれる）は、Ｓ１００カルシウム−結合タンパク質グループのメンバーである。Ｓ１００タンパク質は、少なくとも１９のメンバーからなり、カルシウム−結合タンパク質のＥＦ−ハンドファミリーの大きなサブクラスを構成し、多様な機能を示すものである。Ｓ１００タンパク質は、柔軟性を持ったループにより連結された２つのＥＦ−ハンドカルシウム−結合モチーフからなっている。多くのＳ１００タンパク質はアネキシンとの複合体を形成し、もう１種のカルシウム−結合タンパク質ファミリーもまた、リン脂質と結合する。Ｓ１００タンパク質は細胞内カルシウム代謝において重要であり、Ｓ１００タンパク質の発現の変更は、癌、神経変性疾患、心筋症、炎症障害、糖尿病、アレルギーのような、いくつかのヒトの障害に関連している。特に、カルギザリンは、細胞骨格の構築及び力学においても機能するかもしれない。
【００２９】
Ｓ１００タンパク質ファミリーのメンバーは、各種の細胞内活性のカルシウム−依存性（及び、例えば、Ｚｎ２＋−、又はＣｕ２＋−依存性）調節に関連し、タンパク質リン酸化、各種酵素活性、細胞増殖及び分化（腫瘍形成を含む）、細胞骨格の構築及び力学、膜の構造組織、細胞内カルシウムホメオスタシス、炎症、及び酸化的細胞損傷からの保護が含まれるが、これに限定されるものではない。Ｓ１００のメンバーのいくつかは、細胞外空間に放出又は分泌され、そこで濃度に依存した栄養性又は毒性の作用を及ぼすか、白血球の化学誘因性物質として作用するか、細胞増殖を変調するか、又はマクロファージの活性化を調節し得る（Ｄｏｎａｔｏ， Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １９９９ Ｊｕｌ ８；１４５０（３）：１９１−２３１）。
【００３０】
構造データは、多くのＳ１００メンバーが二量体として細胞中に存在し、２つのモノマーが回転軸の２倍の関係にあり、カルシウム結合は個々のモノマーの結合表面の露出を引き起こすことが示唆され、Ｓ１００二量体はターゲットタンパク質と相互作用すると考えられる。このため、Ｓ１００二量体は、反対側で２つの結合表面を露出し得る。したがって、ホモ二量体Ｓ１００タンパク質は、２つの同種又は異種のターゲットタンパク質を架橋するために理想的である（Ｄｏｎａｔｏ， Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １９９９ Ｊｕｌ ８；１４５０（３）：１９１−２３１）。
【００３１】
Ｓ１００Ｃは、ファミリーの他のメンバーと同様に、ホモ二量体を形成する。Ｓ１００Ｃ単量体につき１つのペプチド、Ｓ１００Ｃ二量体につき２つのペプチドの完全複合体構造の化学量論が観察された。それぞれのペプチドは、Ｓ１００Ｃ二量体の両者のモノマーと相互作用する。二量体の２つのＳ１００Ｃ分子は、ジスルフィド架橋により結合している（Ｒｅｔｙ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｆｏｌｄ Ｄｅｓ ２０００ Ｆｅｂ １５；８（２）：１７５−８４）。
【００３２】
ブタＳ１００Ｃ遺伝子において、特有にエキソン−イントロン構造が観察され、Ｓ１００Ｃ遺伝子とカルモジュリン遺伝子の近い進化の関係が示唆された。特に、ブタＳ１００Ｃ遺伝子において観察されるエキソン−イントロン構造は、他のいずれのＳ１００遺伝子にもおいても見出されていないが、ほぼ全てのカルモジュリン遺伝子において見出されている（Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １９９８ Ｆｅｂ ２４；２４３（３）：６４７−５２）。Ｓ１００Ｃタンパク質の相互作用及び活性化の様式は、カルモジュリンのそれに対して構造上の類似性を持っている。
【００３３】
Ｓ１００タンパク質は、多くの細胞タイプにおいて特異的に発現され、Ｓ１００ファミリーのそれぞれのメンバーは、組織／細胞タイプに特定に発現する特異的なパターンを示す。例えば、このファミリーのいくつかのメンバーは、脊椎動物の中枢神経系に広く分布し、中枢神経系の発達、機能、及び障害に関連している。Ｓ１００タンパク質は、グリア細胞増殖及び神経細胞分化の調節の役割を果たしているかもしれず（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ １９９０ Ａｕｇ；１２（８）：３８１−３）、また、ダウン症の発展に関連しているかもしれない。発達の臨界期におけるＳ１００タンパク質遺伝子投与での異常が、ダウン症と関連するいくつかの神経病学的異常を引き起こすかもしれないことが示唆された（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ １９９０ Ａｕｇ；１２（８）：３８１−３）。
【００３４】
ノーザンブロット分析を用いた研究では、Ｓ１００ＣのＲＮＡレベルは、胎盤において高く、心臓、肺、腎臓、及び大部分の筋肉サンプルでは中間であり、脳ではわずかに検出されるのみと、多様であることを示した。Ｓ１００Ｃは主として細胞核に局在していることが見出され、これは他のＳ１００タンパク質とは異なり、種々の神経グリア芽腫細胞タイプにおいてわずかに変化している（Ｉｎａｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １９９９ Ｓｅｐ １６；２６３（１）：１３５−８）。
【００３５】
カルシウム−結合タンパク質は、腫瘍細胞に対して、悪性及び転移性の表現型に関連した特性を与えるかもしれない。例えば、Ｓ１００Ｃは、成人の主な眼腫瘍であるブドウ膜黒色腫と関連していることが見出された（Ｖａｎ Ｇｉｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １９９８ Ｄｅｃ １０；１４４８（２）：２９０−７）。Ｓ１００タンパク質に反応する抗体は、皮膚腫瘍の診断マーカーとして有用である。
【００３６】
Ｓ１００Ｃは、不死性のヒト線維芽細胞では、通常の場合と比較して、劇的に下方−調節され（Ｓａｋａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２０００ Ｊｕｎ １２； １４９（６）：１１９３−２０６）、細胞成長の接触阻害において、核Ｓ１００Ｃが関連しているかもしれないことが示唆される。
【００３７】
Ｓ１００Ｃ、同様にＳ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ８の２つのイソ型、及びＳ１００Ａ６の発現は、変質した結腸粘膜において、著しく上方−調節され（Ｓｔｕｌｉｋ ｅｔ ａｌ．， Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １９９９ Ｄｅｃ；２０（１８）：３６３８−４６）、結腸直腸腫瘍形成におけるＳ１００Ｃの役割が示唆される。Ｓ１００Ｃの発現はまた、通常の結腸直腸粘膜と比較して、結腸直腸癌の場合に著しく上昇する（Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ １９９５ Ｍａｒ ２；８９（２）：１９５−２００）。
【００３８】
Ｓ１００Ａ７（ｐｓｏｒｉａｓｉｎとも呼ばれる）は、乳癌細胞系、及びいくつかの乳癌の癌細胞において発現しているが、皮膚の例外を除いて、非−癌性組織においては発現しないことが見出され、さらにＳ１００遺伝子は、細胞転換及び／又は分化の調節に関連しているかもしれないことが示唆される（Ｍｏｏｇ−Ｌｕｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １９９５ Ｏｃｔ ９；６３（２）：２９７−３０３）。
【００３９】
Ｓ１００タンパク質は、脳損傷の初期のマーカーであって、心臓手術後における脳損傷の診断のマーカーとして有用である。心肺バイパス（ＣＰＢ）の心臓手術が行われた後、Ｓ１００は放出され、脳損傷の程度のインジケータとなる。Ｓ１００のレベルは、ＣＰＢの持続、深度の循環停止、大動脈遮断と相関している。Ｓ１００タンパク質のレベルの増大は、特に大動脈カニューレ挿入の間の、患者の年齢、微小塞栓の数に相関している。発作、覚醒遅延、及び錯乱のような、手術における大脳の合併症は、バイパス直後の１５〜４８時間語のＳ１００タンパク質レベルに関連している。さらに、Ｓ１００レベルの増大は、心臓手術後の神経心理学的な機能障害と関連している。心臓内部の手術（冠状動脈バイパスをつなぐ手術）を受けた患者は、脳損傷を受けやすく、ＣＰＢの後、高いＳ１００レベルを示す。さらに、深度の循環停止開放を受けた成人及び子供もまた、ＣＰＢの後、高度のＳ１００レベルを示し、したがって、脳損傷を受けやすい（Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ Ｊ Ａｎａｅｓｔｈ ２０００ Ａｕｇ；８５（２）：２８７−９８）。
【００４０】
さらに、Ｓ１００Ｃ、及びＳ１００Ａ４の発現は、通常の心筋症と比較して、イソプロテレノール−処方ラットの心臓において高められていることが観察され、さらにＳ１００Ｃ、及びＳ１００Ａ４が心筋損傷と関連している可能性が示唆された（Ｉｎａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｐａｔｈｏｌ Ｉｎｔ ２０００ Ｊｕｎ；５０（６）：４８０−５）。
【００４１】
カルギザリン、及びＳ１００タンパク質ファミリーの他の関連したメンバー、これらのタンパク質の有用性の説明については、Ｉｎａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｐａｔｈｏｌ Ｉｎｔ ２０００ Ｊｕｎ；５０（６）：４８０−５；Ｓａｋａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２０００ Ｊｕｎ １２；１４９（６）：１１９３−２０６；Ｒｅｔｙ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｆｏｌｄ Ｄｅｓ ２０００ Ｆｅｂ １５；８（２）：１７５−８４；Ｉｎａｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １９９９ Ｓｅｐ １６；２６３（１）：１３５−８；Ｖａｎ Ｇｉｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １９９８ Ｄｅｃ １０；１４４８（２）：２９０−７；Ｓｃｈｏｎｅｋｅｓｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９７；７５（６）：７７１−５；Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １９９８ Ｆｅｂ ２４；２４３（３）：６４７−５２；Ｗｉｃｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｃａｌｃｉｕｍ １９９６ Ｄｅｃ；２０（６）：４５９−６４；Ｍａｉｌｌｉａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９６ Ｊａｎ １２；２７１（２）：７１９−２５；Ｍｏｏｇ−Ｌｕｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １９９５ Ｏｃｔ ９；６３（２）：２９７−３０３；Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ １９９５ Ｍａｒ ２；８９（２）：１９５−２００；Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ Ｊ Ａｎａｅｓｔｈ ２０００ Ａｕｇ；８５（２）：２８７−９８；Ｈｅｉｚｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ Ｒｅｓ １９９９ Ｓｅｐ；２４（９）：１０９７−１００；Ｄｏｎａｔｏ， Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １９９９ Ｊｕｌ ８；１４５０（３）：１９１−２３１；Ｈｅｉｚｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｍｅｔａｌｓ １９９８ Ｄｅｃ；１１（４）：３８３−９７；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９８；７６（２−３）：３２４−３３；ＭｃＮｕｔｔ， Ｊ Ｃｕｔａｎ Ｐａｔｈｏｌ １９９８ Ｎｏｖ；２５（１０）：５２１−９；Ｚｉｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｂｕｌｌ １９９５；３７（４）：４１７−２９；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ １９９０ Ａｕｇ；１２（８）：３８１−３；Ａｚｍｉｔｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｇ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ １９９２；９４：４５９−７３；ａｎｄ Ｓｔｕｌｉｋ ｅｔ ａｌ．， Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １９９９ Ｄｅｃ；２０（１８）：３６３８−４６を参照されたい。
【００４２】
レチノイン酸及びレチノイン酸受容体
レチノイド、又はビタミンＡ代謝産物／誘導体は、脊椎動物の発達、代謝、再生における多くの面で、不可欠な役割を果たすことが判明している（例えば、， Ｔｈｅ Ｒｅｔｉｎｏｉｄｓ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｓｐｏｒｎ ｅｔ ａｌ． （Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９４）参照）。レチノイド受容体には２つの種類がある；全−トランスレチノイン酸（ａｔＲＡ）、及び９−ｃｉｓレチノイン酸（９ｃＲＡ）の双方と結合するレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）、及び９ｃＲＡのみと結合するレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）。これらの受容体は、ホルモン応答因子として知られている特定のターゲット遺伝子ＤＮＡ配列に、ＲＸＲ／ＲＡＲヘテロ二量体又はＲＸＲホモ二量体として相互作用することによって、リガンド依存性の遺伝子発現を変調する。これらのレチノイド信号における役割に加えて、ＲＸＲは、ビタミンＤ、甲状腺ホルモン、及びペルオキシゾーム増殖因子の核受容体のヘテロ二量体化したパートナーとして作用する（ｒｅｖｉｅｗｅｄ ｂｙ Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ ｅｔ ａｌ．， ａｔ ｐａｇｅｓ ３１９−３４９ ｏｆ Ｔｈｅ Ｒｅｔｉｎｏｉｄｓ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｓｐｏｒｎ ｅｔ ａｌ． （Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９４））。
【００４３】
レチノイドが通常の成長、視覚、組織ホメオスタシス、再生、及び生存の全般において不可欠であることが多くの研究により証明された（Ｓｐｏｒｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｒｅｔｉｎｏｉｄｓ， Ｖｏｌｓ． １ ａｎｄ ２， Ｓｐｏｒｎ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｒｌａｎｄｏ， Ｆｌａ．（１９８４）参照）。例えば、レチノイドは、哺乳類における皮膚のホメオスタシス及びバリア機能の維持において不可欠であることが示されている（Ｆｉｓｈｅｒ， Ｇ． Ｊ．， ａｎｄ Ｖｏｏｒｈｅｅｓ， Ｊ． Ｊ．， ＦＡＳＥＢ Ｊ． １０：１００２−１０１３ （１９９６）。ビタミンＡ欠乏症（ＶＡＤ）の母親の子孫が多くの発育欠陥を示していることから、レチノイドは胚形成においても重要である（Ｆｉｓｈｅｒ， Ｇ． Ｊ．， ａｎｄ Ｖｏｏｒｈｅｅｓ， Ｊ． Ｊ．， ＦＡＳＥＢ Ｊ． １０：１００２−１０１３ （１９９６）； Ｍｏｒｒｉｓｓ−Ｋａｙ， Ｇ． Ｍ．， ａｎｄ Ｓｏｋｏｌｏｖａ， Ｎ．， ＦＡＳＥＢ Ｊ． １０：９６１−９６８ （１９９６））。視覚（Ｗａｌｄ， Ｇ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ １６２：２３０−２３９ （１９６８））、及び哺乳類の精子形成（ｖａｎ Ｐｅｌｔ， Ｈ． Ｍ． Ｍ．， ａｎｄ Ｄｅ Ｒｏｏｉｊ， Ｄ． Ｇ．， ｏｙｏｂｉ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２８：６９７−７０４ （１９９１））を除いて、動物及びそれらの胎児におけるＶＡＤにより生じる影響の殆どは、レチノイン酸（ＲＡ）の投与によって予防及び／又は反転することができる（Ｗｉｌｓｏｎ， Ｊ． Ｇ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ａｎａｔ． ９２：１８９−２１７ （１９５３）； Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃ． １５９：５１０−５３５ （１９６４）； Ｍｏｒｒｉｓｓ−Ｋａｙ， Ｇ． Ｍ．， ａｎｄ Ｓｏｋｏｌｏｖａ， Ｎ．， ＦＡＳＥＢ Ｊ． １０：９６１−９６８ （１９９６））。哺乳類胎児の母のＲＡ投与による劇的な奇形への影響（Ｓｈｅｎｅｆｅｌｔ， Ｒ． Ｅ．， Ｔｅｒａｔｏｌｏｇｙ ５， １０３−１０８ （１９７２）； Ｋｅｓｓｅｌ， Ｍ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１５：４８７−５０１ （１９９２）； Ｃｒｅｅｃｈ Ｋｒａｆｔ， Ｊ．， Ｉｎ Ｒｅｔｉｎｏｉｄｓ ｉｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｔｅｒａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ， Ｇ． Ｍ． Ｍｏｒｒｉｓｓ−Ｋａｙ， ｅｄ．， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， ＵＫ， ｐｐ． ２６７−２８０ （１９９２））、及び、脊椎動物の胚発達及び両生類の肢再生ににおけるレチノイドの局所的投与の著しい影響（Ｍｏｈａｎｔｙ−Ｈｅｊｍａｄｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３５５：３５２−３５３ （１９９２）； Ｔａｂｉｎ， Ｃ． Ｊ．， Ｃｅｌｌ ６６：１９９−２１７ （１９９１））は、ＲＡが形態形成、及び器官形成において重要な役割を持つかもしれないという理論を裏付けている。
【００４４】
一般に“レチノイド”と呼ばれる、全−トランスレチノイン酸又は９−シスレチノイン酸の多くの構造上の類似化合物が、現在までに論文に記述されてきた。これらの分子のうちのいくつかは、ＲＡＲ、又はＲＸＲに結合する、すなわち活性化することができる。さらに、いくつかの類似体は、特定のＲＡＲ受容体サブタイプ（α、β、γ）に結合し、活性化することができる。最後に、他の類似体は、これらの異なる受容体に関して、いかなる特定の選択的な活性をも示さない。この点で、及びこの例として、９−シスレチノイン酸は、ＲＡＲ及びＲＸＲを、これらの受容体（非特異性アゴニストリガンド）の両者に対して著しい選択性を示すことなく、一度に、また同時に活性化するのに対して、全−トランスレチノイン酸は、ＲＡＲ（ＲＡＲ−特異性アゴニストリガンド）の全てのサブタイプを含め、選択的に活性化する。一般的な方法、及び定性的な方法では、与えられた物質（またはリガンド）が、このファミリーの全ての受容体（又は、このファミリーの特定の受容体のそれぞれ）に対する親和性を示し、これが他のファミリーの全ての受容体（又は、これと同一又は他のファミリーの全ての他の受容体のそれぞれ）で示されるよりも強い場合に、与えられた受容体のファミリー（又は、このファミリーの特定の受容体のそれぞれ）に対して特異的であるとされる。
【００４５】
ＲＡ信号の遺伝子活性は、ステロイド／甲状腺ホルモン、及びビタミンＤ３受容体を含むリガンド誘導性の転写調節因子に属する、ＲＡＲファミリー及びＲＸＲファミリーの２つの受容体のファミリーを通じて媒介される（Ｌｅｉｄ ｅｔ ａｌ．， ＴＩＢＳ １７：４２７−４３３ （１９９２）； Ｃｈａｍｂｏｎ， Ｐ．， Ｓｅｍｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ５：１１５−１２５ （１９９４）；Ｃｈａｍｂｏｎ， Ｐ．， ＦＡＳＥＢ Ｊ． １０：９４０−９５４ （１９９６）；Ｇｉｇｕｅｒｅ， Ｖ．， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｒｅｖ． １５：６１−７９ （１９９４）；Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ， Ｄ． Ｊ．， ａｎｄ Ｅｖａｎｓ， Ｒ． Ｍ．， Ｃｅｌｌ ８３：８４１−８５０ （１９９５）；Ｇｒｏｎｅｍｅｙｅｒ， Ｈ．， ａｎｄ Ｌａｕｄｅｔ， Ｖ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｆｉｌｅ ２：１１７３−１２３６ （１９９５）参照）。
【００４６】
ＲＡＲは、組織の分化と発達における重要な因子である。これらは、急速に分裂する細胞及び腫瘍を上方−調節する。ＲＡＲは、リンパ球の活性化において、重要な役割を演ずる。レチノイン酸の合成アンタゴニストは、遅延型過敏症（ＤＴＨ）を阻害することができる。成長因子及びカロチンは、ＲＸＲ発現レベルを調節する。例えば、顆粒白血球マクロファージコロニー刺激性因子は、骨髄性白血病細胞中においてレチノイン酸受容体を誘導する。
【００４７】
レチノイン酸受容体は、他の核受容体とともに、ヘテロ二量体を形成することができる。本発明により提供されるタンパク質は、２−ハイブリッドアッセイにおける相互作用を検出可能なプローブとして用いることができる。二量体化表面を擬態した合成ペプチドは、これらの受容体の分子間相互作用を断絶することができる。ＲＡＲの遺伝子再配置は、いくつかのタイプの白血病の主要な原因であって、悪性細胞系の遺伝子マーカーを与える。多くのレチノイン酸誘導体が、脊椎形成異常障害の治療に用いられている。それらは活性化ＲＸＲと結合するように設計されている。β−カロチンは、マウスモデルにおいて皮膚の腫瘍形成を防ぐことが可能である。Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）レチンアミドは、気管支における異形成の発症を遅らせることができる。個々のレチノイン受容体をターゲットとして、異なる化学予防薬剤を設計することができる。本発明により提供される配列は、高い親和性を持つ化学予防薬剤化合物の設計に用いることができるかもしれない。
【００４８】
ＲＡＲ及びＲＸＲの両者は生体内で全トランスレチノイン酸に応答するものの、これらの受容体はいくつかの重要な面で異なっている。最初に、ＲＡＲとＲＸＲは基本構造が明確に異なる（例えば、ＲＡＲαとＲＸＲαのリガンド結合ドメインは、わずか２７％のアミノ酸同一性を持つ）。これらの構造上の相違は、種々のビタミンＡ代謝産物及び合成レチノイドに対するＲＡＲ及びＲＸＲの応答性の程度に関する相違に反映される。さらに、明確に異なる組織分布のパターンがＲＡＲ及びＲＸＲにおいて見られる。例えば、一般的に内臓組織においては高いレベルで発現されないＲＡＲとは対照的に、ＲＸＲαｍＲＮＡは、肝臓、腎臓、肺、筋肉、腸において最も豊富にあることが示された。最後に、ＲＡＲとＲＸＲは、異なるターゲット遺伝子特異性を持つ。例えば、最近、ＲＸＲに対して応答性があり、ＲＡＲに対して応答性の無い、細胞網膜結合タンパクタイプＩＩ（ＣＲＢＰＩＩ）及びアポリポタンパクＡ１遺伝子において、応答因子が確認された。さらに、最近、ＲＡＲが、ＣＲＢＰＩＩＲＸＲ応答因子を通じたＲＸＲ−媒介活性化を抑制することが示された。これらのデータは、２つのレチノイン酸応答経路が、単に重複するものではないどころか、複雑な相互作用を持つものであることが示された。最近、Ｈｅｙｍａｎら（Ｃｅｌｌ， ６８：３９７−４０６ （１９９２））、及びＬｅｖｉｎら（Ｎａｔｕｒｅ， ３５５：３５９−６１ （１９９２））は、）は、９−シスレチノイン酸が天然に存在するＲＸＲのリガンドであることを証明した。９−シスレチノイン酸は、ＲＸＲと同様に、ＲＡＲと結合、活性化し、このため、“二機能性”リガンドとして作用するように見える。
【００４９】
ＲＡＲ受容体
ＲＡＲ受容体ファミリー（ＲＡＲα、β、γ、及びこれらのイソ型）に属する受容体は、全−トランス、及び９−シスＲＡの両者によって活性化される（Ｌｅｉｄ ｅｔ ａｌ．， ＴＩＢＳ １７：４２７−４３３ （１９９２）； Ｃｈａｍｂｏｎ， Ｐ．， Ｓｅｍｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ５：１１５−１２５ （１９９４）；Ｄｏｌｌｅ， Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ． ４５：９１−１０４ （１９９４）；Ｃｈａｍｂｏｎ， Ｐ．， ＦＡＳＥＢ Ｊ． １０：９４０−９５４ （１９９６））。種の中では、３つのＲＡＲタイプのＤＮＡ結合ドメイン（Ｃ）、及びリガンド結合ドメイン（Ｅ）は高度に類似しているが、Ｃ−末端ドメインＦ、及び中間ドメインＤにおいては類似性が無いか又は低い。３つのＲＡＲタイプのアミノ酸配列も、Ｂリジョンにおいて著しく相違しており、またさらに、主要なイソ型（α１、α２、β１〜β４、γ１、γ２）はＮ−末端Ａリジョンにおいて相違する（Ｌｅｉｄ ｅｔ ａｌ．， ＴＩＢＳ １７：４２７−４３３ （１９９２））。アミノ酸配列比較では、ＲＡＲタイプの異種間保存が、種の中の３つのＲＡＲタイプの間で見出された類似性よりも大きいことが明らかとなった（Ｌｅｉｄ ｅｔ ａｌ．， ＴＩＢＳ １７：４２７−４３３ （１９９２））。この異種間保存は、特にＡリジョンアミノ酸配列がまったく異なっている、各種のＲＡＲα、β、γ、イソ型のＮ−末端Ａリジョンにおいて著しい。発達中の胎児、及び各種の成体マウス組織におけるＲＡＲ及びＲＸＲタイプのそれぞれの転写のために観察された個別の時−空間発現パターンが共に得られ（Ｚｅｌｅｎｔ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３９：７１４−７１７ （１９８９）； Ｄｏｌｌｅ， Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３４２：７０２−７０５ （１９８９）； Ｄｏｌｌｅｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１０：１１３３−１１５１ （１９９０）； Ｒｕｂｅｒｔｅ ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １０８：２１３−２２２ （１９９０）； Ｒｕｂｅｒｔｅ ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１１：４５−６０ （１９９１）； Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ． ６：３２９−３４４ （１９９２））、この異種間保存は、各々のＲＡＲタイプ（及びイソ型）が特異な機能を果たし得ることを示唆した。この仮説は、さらに、Ｎ−末端Ａ／Ｂリジョン（ＡＦ−１）、及びＣ−末端Ｅリジョン（ＡＦ−２）に位置し、共同し、ある程度異なって、各種ＲＡ応答性プロモーターを活性化することのできる、２つの転写活性化機能を含んだ各種のＲＡＲイソ型が見出されたことによって支持される（Ｌｅｉｄ ｅｔ ａｌ．， ＴＩＢＳ １７：４２７−４３３ （１９９２）； Ｎａｇｐａｌ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ７０：１００７−１０１９ （１９９２）；Ｎａｇｐａｌ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． １２：２３４９−２３６０ （１９９３））。
【００５０】
ＲＸＲ受容体
ＲＡＲと異なり、レチノイドＸ受容体ファミリー（ＲＸＲα、β、γ）のメンバーは、９−シス−ＲＡのみを活性化する（Ｃｈａｍｂｏｎ， Ｐ．， ＦＡＳＥＢ Ｊ． １０：９４０−９５４ （１９９６）； Ｃｈａｍｂｏｎ， Ｐ．， Ｓｅｍｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ５：１１５−１２５ （１９９４）；Ｄｏｌｌｅ， Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ． ４５：９１−１０４ （１９９４）；Ｌｉｎｎｅｙ， Ｅ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ． ２７：３０９−３５０ （１９９２）；Ｌｅｉｄ ｅｔ ａｌ．， ＴＩＢＳ １７：４２７−４３３ （１９９２）；Ｋａｓｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ Ｖｉｔａｍｉｎ Ａ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ， Ｒ． Ｂｌｏｍｈｏｆｆ， ｅｄ．， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９３））。しかしながら、ＲＸＲは、異なるＲＸＲタイプにおいてＮ−末端Ａ／Ｂリジョンで著しく相違するという点でＲＡＲと同様であり（Ｌｅｉｄ ｅｔ ａｌ．， ＴＩＢＳ １７：４２７−４３３ （１９９２）； Ｌｅｉｄ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ６８：３７７−３９５ （１９９２）； Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖ． ６：３２９−３４４ （１９９２））、これらのＮ−末端Ａ／Ｂリジョン及びＣ末端Ｅリジョンにおいて同一の転写活性化機能が含まれているということが、現在までに特徴付けられている（Ｌｅｉｄ ｅｔ ａｌ．， ＴＩＢＳ １７：４２７−４３３ （１９９２）； Ｎａｇｐａｌ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ７０：１００７−１０１９ （１９９２）； Ｎａｇｐａｌ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． １２：２３４９−２３６０ （１９９３））。
【００５１】
ＲＸＲαとＲＸＲβは、マウスの発達間及び成体動物中において、広範囲にわたる（偏在しているかもしれない）発現パターンを有しており、全ての胎児及び成人の組織中で見出されたところまでが調査されている（Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ， Ｄ． Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌ． ６：３２９−３４４ （１９９２）； Ｄｏｌｌｅ， Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖｅｌ． ４５：９１−１０４ （１９９４）；Ｎａｇａｔａ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ １４２：１８３−１８９ （１９９４））。しかしながら、ＲＸＲγ転写産物は、より限定された分布を持つと考えられ、胎児の発達中の骨格筋（これらの発現は生存の間存続する）、心臓（誕生後）、視覚、聴覚器官の知覚上皮、中枢神経系の特定構造、及び甲状腺、脳下垂体中の甲状腺刺激細胞のような、甲状腺ホルモンホメオスタシスに関連した組織において発現されている（Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ， Ｄ． Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌ． ６：３２９−３４４ （１９９２）； Ｄｏｌｌｅ， Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖｅｌ． ４５：９１−１０４ （１９９４）；Ｓｕｇａｗａｒａ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３６：１７６６−１７７４ （１９９５）；Ｌｉｕ， Ｑ．， ａｎｄ Ｌｉｎｎｅｙ， Ｅ．， Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ７：６５１−６５８ （１９９３））。
【００５２】
現在、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて特徴付けられるＲＸＲの全ての特性が、それらのｉｎ ｖｉｖｏの生理的機能に関連しているかどうかは明らかになっていない。特に、これらの受容体が、９−シス−ＲＡ依存性転写調節器として働く条件については知られていない（Ｃｈａｍｂｏｎ， Ｐ．， Ｓｅｍｉｎ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ５：１１５−１２５ （１９９４））。マウスにおけるＲＸＲα、及びＲＸＲβのノックアウトは、これらの受容体の生理的機能に関するいくつかの知見を与えた。例えば、ＲＸＲα．ｓｕｐ．−／−の胎児において観察された目及び心臓の奇形（Ｋａｓｔｎｅｒ， Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ７８：９８７−１００３ （１９９４）； Ｓｕｃｏｖ， Ｈ． Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌ． ８：１００７−１０１８ （１９９４））は、胎児のＶＡＤ症候群において見出されるものと類似しており、このため、発達中のレチノイド伝達におけるＲＸＲαの重要な機能が示唆される。さらに、レチノイド信号におけるＲＸＲの関与は、混合ＲＸＲα／ＲＡＲ突然変異体の研究において、単一の変異体にどちらか一方が無いか又は少ない場合に欠陥が生じることにより支持されている（Ｋａｓｔｎｅｒ， Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ７８：９８７−１００３ （１９９４）； Ｋａｓｔｎｅｒ， Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ８３：８５９−８６９ （１９９５））。しかしながら、興味深いことに、マウスにおけるＲＸＲγのノックアウトでは明らかに有害な影響を示さず、またＲＸＲγｓｕｐ．−／−の、ＲＸＲαｓｕｐ．−／−、又はＲＸＲβｓｕｐ．−／−との同型接合体は、ＲＸＲαｓｕｐ．−／−、ＲＸＲβｓｕｐ．−／−、及び胎児のＶＡＤ症候群特性を超えた付加的な異常は示さず（Ｋｒｅｚｅｌ， Ｗ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３（１７）：９０１０−９０１４ （１９９６））、ＲＸＲγは、発達中の胎児における高度の組織−特異性発現パターンにもかかわらず、マウスにおける胎児の発達、及び出生後において、必ずしも必要でないことが示唆される。生産ＲＸＲ．γ．ｓｕｐ．−／−／ＲＸＲ．β．ｓｕｐ．−／−／ＲＸＲ．α．ｓｕｐ．−／−変異体は、成体に至る年齢まで成長することができ（Ｋｒｅｚｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３（１７）：９０１０−９０１４ （１９９６））、単一のＲＸＲα対立遺伝子は、受容体の全てのＲＸＲファミリーにおける生命の発達及び出産後の機能、特にＲＡＲに依存しＲＸＲの協力が必要とされる発達上の機能を実行するために十分であることが示唆される（Ｄｏｌｌｅ， Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｃｈ． Ｄｅｖ． ４５：９１−１０４ （１９９４）；Ｋａｓｔｎｅｒ， Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ８３：８５９−８６９ （１９９５））。さらに、胎児のＲＸＲ．α．ｓｕｐ．−／−／ＲＸＲ．γ．ｓｕｐ．−／−二重変異体は、単一のＲＸＲ．α．ｓｕｐ．−／−のそれよりも影響を受けないことが見出され（Ｋｒｅｚｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３（１７）：９０１０−９０１４ （１９９６））、ＲＸＲβが単独でこれらの機能のいくつかを行うことが明確に示された。したがって、ＲＸＲα単独で、及びある程度はＲＸＲβ単独で、多くの発達におけるＲＸＲの機能を遂行するために十分であるという事実により、ＲＸＲに関して大部分の機能重複が存在していることが明確に示される。全てのタイプのＲＡＲ二重変異体が単一変異体よりも広範にわたる欠陥を示していることから、ＲＸＲ位置はＲＡＲのそれと異なっている（Ｒｏｗｅ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖｅｌｏｐ． １１１：７７１−７７８ （１９９１）； Ｌｏｈｎｅｓ， Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖｅｌｏｐ． １２０：２７２３−２７４８ （１９９４）；Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ， Ｃ．， Ｄｅｖｅｌｏｐ． １２０：２７４９−２７７１ （１９９４））。
【００５３】
ＲＡＲ及びＲＸＲと結合するレチノイド
ＲＡＲ及びＲＸＲのリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）の結晶構造は、最近になって解明された（Ｂｏｕｒｇｅｔ， Ｗ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３７５：３７７−３８２ （１９９５）； Ｒｅｎａｕｄ， Ｊ． Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３７８：６８１−６８９ （１９９５）；Ｗｕｒｔｚ， Ｊ． Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ． ３：８７−９４ （１９９６））。種々のＲＡＲタイプの間で、これらのドメイン中で実質的なアミノ酸配列同一性が観察された：ＲＡＲα、ＲＡＲβ、ＲＡＲγのＬＢＤの比較では、これらの受容体中のリガンド−結合ポケットにおいて、わずか３つのアミノ酸残基の変異が確認された。これらの残基は、各種ＲＡＲタイプが特定の合成レチノイドと結合する際に選択性を示すことの事実を明らかに説明し（Ｃｈｅｎ， Ｊ． −Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． １４（６）：１１８７−１１９７ （１９９５）； Ｒｅｎａｕｄ， Ｊ． Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３７８：６８１−６８９ （１９９５））、これらの残基の相違について考察することにより、アゴニスト又はアンタゴニストとなり得るＲＡＲタイプ−特異性のレチノイドの設計に用いることができる（Ｃｈａｍｂｏｎ， Ｐ．， ＦＡＳＥＢ Ｊ． １０：９４０−９５４ （１９９６））。この設計のアプローチは、甲状腺受容体αのような他の核受容体に拡張することができるかもしれず（Ｗａｇｎｅｒ， Ｒ． Ｌ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３７８：６９０−６９７ （１９９５））、これらのリガンド−結合ポケットはＲＡＲのそれと化学的、構造的に類似している（Ｃｈａｍｂｏｎ， Ｐ．， ＦＡＳＥＢ Ｊ． １０：９４０−９５４ （１９９６））。対照的に、ＲＸＲのリガンド−結合ポケットの分子モデルでは、ＲＸＲα、ＲＸＲβと、ＲＸＲγの間で、アミノ酸組成に明確な相違が無いことを証明し（Ｂｏｕｒｇｕｅｔ， Ｗ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３７５：３７７−３８２ （１９９５）；Ｗｕｒｔｚ， Ｊ． Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ３：８７−９４ （１９９６））、ＲＸＲのためのタイプ−特異性合成リガンドの設計は、ＲＡＲに比べて困難であることが示唆される（Ｃｈａｍｂｏｎ， Ｐ．， ＦＡＳＥＢ Ｊ． １０：９４０−９５４ （１９９６））。
【００５４】
ＲＡＲ：ＲＸＲヘテロ二量体を経たレチノイド信号
核受容体（ＮＲ）は、ステロイドホルモン、甲状腺ホルモン、ビタミンＤ３、及びレチノイドの受容体を含むリガンド−誘導性転写調節因子のスーパーファミリーのメンバーである（Ｌｅｉｄ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． １７：４２７−４３３ （１９９２）；Ｌｅｉｄ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ６８：３７７−３９５ （１９９２）；ａｎｄ Ｌｉｎｎｅｙ， Ｅ． Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ． Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．， ２７：３０９−３５０ （１９９２））。ＮＲは、いくつかの自主的な機能ドメインの存在を反映したモジュラー構造を示す。鶏エストロゲン受容体、ヒトエストロゲン受容体、グルココルチコイド受容体、及びｖ−ｅｒｂ−Ａ発ガン遺伝子の間のアミノ酸配列同一性に基づいて（Ｋｒｕｓｔ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ５：８９１−８９７ （１９８６））、核受容体スーパーファミリーの各種メンバー間の進化的保存の程度の異なる、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、及びＦの６つのリジョンが定義された。高度に保存されたリジョンＣは、２つのジンクフィンガーを含んでおり、同種の反応要素の特定の認識を司るＤＮＡ結合領域（ＤＢＤ）の中心に相当する。リジョンＥは、さらに、リガンド−結合ドメイン（ＬＢＤ）が、リガンド−依存活性化機能（ＡＦ−２）及び二量体化界面を含んでいることから、機能的に複雑である。自発的な転写活性化機能（ＡＦ−１）は、ステロイド受容体の非−保存Ｎ−末端Ａ／Ｂリジョンに存在している。興味深いことに、ステロイド受容体のＡＦ−１とＡＦ−２の両者は、異なる転写活性化特性を示し、細胞タイプ及びプロモーターの両者が特異的な環境にあると考えられる（Ｇｒｏｎｅｍｅｙｅｒ， Ｈ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ． ２５：８９−１２３ （１９９１））。
【００５５】
上で述べたように、全−トランス（Ｔ−ＲＡ）、及び９−シス（９Ｃ−ＲＡ）レチノイン酸信号は、核受容体の２つのファミリーにより変換され、ＲＡＲα、β、γ（及びこれらのイソ型）は、Ｔ−ＲＡ及び９Ｃ−ＲＡの両者により活性化されるのに対して、ＲＸＲα、β、γは９Ｃ−ＲＡのみによって活性化される（Ａｌｌｅｎｂｙ， Ｇ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：３０−３４ （１９９３））。３つのＲＡＲタイプはＢリジョンにおいて異なり、それらの主要なイソ型（α１、α２、β１〜４、γ１、γ２）は異なるＮ−末端Ａリジョンを持つ（Ｌｅｉｄ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． １７：４２７−４３３ （１９９２））。同様に、ＲＸＲタイプもＡ／Ｂリジョンにおいて異なる（Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ， Ｄ． Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ６：３２９−３４４ （１９９２））。
【００５６】
ＲＡＲ及びＲＸＲのＥリジョンはまた、二量化界面を含むことが示された（Ｙｕ， Ｖ． Ｃ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３：５９７−６０２ （１９９２））。最も興味深いことには、ＲＡＲ／ＲＸＲヘテロ二量体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで多くのＲＡ応答因子（ＲＡＲＥ）に対して、ホモ二量体よりも効率的に結合することが実証された（Ｙｕ， Ｖ． Ｃ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ６７：１２５１−１２６６ （１９９１）； Ｂｅｒｒｏｄｉｎ， Ｔ． Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ６：１４６８−１４７８ （１９９２）；Ｂｕｇｇｅ， Ｔ． Ｈ． ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． １１：１４０９−１４１８ （１９９２）；Ｈａｌｌ， Ｒ． Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． １２：５５２７−５５３５ （１９９２）；Ｈａｌｌｅｎｂｅｃｋ Ｐ． Ｌ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５５７２−５５７６ （１９９２）；Ｈｕｓｍａｎｎ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ． １８７：１５５８−１５６４ （１９９２）；Ｋｌｉｅｗｅｒ， Ｓ． Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３５５：４４６−４４９ （１９９２）；Ｌｅｉｄ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ６８：３７７−３９５ （１９９２）；Ｍａｒｋｓ， Ｍ． Ｓ． ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． １１：１４１９−１４３５ （１９９２）；Ｚｈａｎｇ， Ｘ． Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３５５：４４１−４４６ （１９９２））。ＲＡＲ及びＲＸＲのヘテロ二量体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの溶液中で優先的に形成される（Ｙｕ， Ｖ． Ｃ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ６７：１２５１−１２６６ （１９９１）； Ｌｅｉｄ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ６８：３７７−３９５ （１９９２）； Ｍａｒｋｓ， Ｍ． Ｓ． ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． １１：１４１９−１４３５ （１９９２））が、９Ｃ−ＲＡの添加は、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＲＸＲホモ二量体の形成を増大させるものと考えられる（Ｌｅｈｍａｎ， Ｊ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８：１９４４−１９４６ （１９９２）； Ｚｈａｎｇ， Ｘ． Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３５８：５８７−５９１ （１９９２ｂ））。
【００５７】
ＲＡ−応答性プロモーターの活性化は、ホモ二量体よりもむしろ、ＲＡＲ：ＲＸＲヘテロ二量体を通じて起こり得ることが示された（Ｙｕ， Ｖ． Ｃ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ６７：１２５１−１２６６ （１９９１）； Ｌｅｉｄ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ６８：３７７−３９５ （１９９２ｂ）； Ｄｕｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ７１：７３−８５ （１９９２）；Ｎａｇｐａｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ７０：１００７−１０１９ （１９９２）；Ｚｈａｎｇ， Ｘ． Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３５５， ４４１−４４６ （１９９２）；Ｋｌｉｅｗｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３５５：４４６−４４９ （１９９２）；Ｂｕｇｇｅ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． １１：１４０９−１４１８ （１９９２）；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． １１：１４１９−１４３５ （１９９２）；Ｙｕ， Ｖ． Ｃ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒ．Ｏｐ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ３：５９７−６０２ （１９９２）；Ｌｅｉｄ ｅｔ ａｌ．， ＴＩＢＳ １７：４２７−４３３ （１９９２）；Ｌａｕｄｅｔ ａｎｄ Ｓｔｅｈｅｌｉｎ， Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ． ２：２９３−２９５ （１９９２）；Ｇｒｅｅｎ， Ｓ．， Ｎａｔｕｒｅ ３６１：５９０−５９１ （１９９３））。これらのヘテロ二量体のＲＸＲ部分は、レチノイド−誘導性信号において不活性であることが提案されている（Ｋｕｒｏｋａｗａ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３７１：５２８−５３１ （１９９４）； Ｆｏｒｍａｎ， Ｂ． Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ８１：５４１−５５０ （１９９５）； Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ， Ｄ． Ｊ．， ａｎｄ Ｅｖａｎｓ， Ｒ． Ｍ．， Ｃｅｌｌ ８３：８３５−８５０ （１９９５））が、この文献では、矛盾する結果が報告されている（Ａｐｆｅｌ， Ｃ． Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０（５１）：３０７６５−３０７７２ （１９９５）； ｓｅｅ Ｃｈａｍｂｏｎ， Ｐ．， ＦＡＳＥＢ Ｊ． １０：９４０−９５４ （１９９６）参照）。これらの研究結果は、ヘテロ二量体が実際にｉｎ ｖｉｖｏでＲＡ信号を変換するユニットであることを強く示唆しているが、ｉｎ ｖｉｖｏで提案されているヘテロ二量体結合が起こっているかどうかは明らかになっていない（Ｃｈａｍｂｏｎ， Ｐ．， Ｓｅｍｉｎ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ５：１１５−１２５ （１９９４））。このように、高度で多面的なレチノイドの影響の原理は、少なくとも部分的には、細胞−特異的に発現されたＲＡＲ：ＲＸＲタイプ（及びイソ型）のヘテロ二量体結合による、レチノイド−応答性プロモーターの異なるサブセットの制御に帰属し、これらの活性は全−トランス、及び９−ｃｉｓ−ＲＡの細胞−特異的レベルを順番に調節し得る（Ｌｅｉｄ ｅｔ ａｌ．， ＴＩＢＳ １７：４２７−４３３ （１９９２））。
【００５８】
ＲＸＲ受容体はまた、ＲＡ−独立信号にも関連しているかもしれない。例えば、ＲＸＲ．β．ｓｕｐ．−／−変異体動物のセルトリ細胞における異常な脂質代謝の観察は、機能的な相互作用が、ＲＸＲβとペルオキシソーム増殖剤−活性化受容体信号経路との間で起こり得ることを示唆している（ＷＯ ９４／２６１００； Ｋａｓｔｎｅｒ， Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌ． １０：８０−９２ （１９９６））。
【００５９】
レチノイン酸受容体の更なる説明については、Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０００ Ａｕｇ １５；６０（１６）：４５４４−９；Ｐｏｎｎａｍｐｅｒｕｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｔｒ Ｃａｎｃｅｒ ２０００；３７（１）：８２−８；Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ２０００ Ｊｕｌ ２７；４３（１５）：２９２９−３７；Ｋｕｒｉｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０００ Ａｕｇ；６（８）：２９７３−９；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２０００ Ａｕｇ １７；ａｎｄ Ｓａｉｎｔｙ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ２０００ Ａｕｇ １５；９６（４）：１２８７−９６を参照されたい。
【００６０】
微小管−関連タンパク質１Ａ／１Ｂ軽鎖３
微小管−関連タンパク質（ＭＡＰ）は、微小管の安定性を調節し、神経細胞の発達、及び神経細胞の柔軟性と剛性のバランスにおいて、重要な役割を果たしている。微小管−関連タンパク質１Ａ（ＭＡＰ１Ａ）、及びＭＡＰ１Ｂは、豊富に存在する神経細胞ＭＡＰであり、神経突起の形成及び安定化に関連していると考えられている。ＭＡＰ１Ａ及びＭＡＰ１Ｂは、発達中及び成熟神経細胞において高いレベルで発現している２つの微小管−関連タンパク質である。これらのＭＡＰは、タンパク質加水分解処理により、重鎖（〜２５０ｋＤａ）及び軽鎖（〜３０ｋＤａ）を形成するポリタンパク質として合成される。軽鎖３（“ＬＣ３”）は、ＭＡＰ１Ａ及びＭＡＰ１Ｂの両者のサブユニットである。
【００６１】
実験データでは、ＭＡＰ１Ａが出生後の軸索において微小管を安定化することが示されている。ＭＡＰ１Ｂは、神経細胞及びグリア細胞において、脳の発達中の神経突起伸張の間に優先的に発現され、神経突起形成及び軸索誘導の間のＭＡＰ１Ｂの重要な役割が示唆される。ＭＡＰ１ＡとＭＡＰ１Ｂの相対的なレベルは発達の間に劇的に変化し、ＭＡＰ１Ｂは形成性神経細胞において最大に発現され、ＭＡＰ１Ａは成熟神経細胞において最大に発現される。
【００６２】
軽鎖３（ＬＣ３）は、神経細胞の微小管−関連タンパク質（ＭＡＰ）、ＭＡＰ１ＡとＭＡＰ１Ｂのサブユニットである。最近の調査では、ＭＡＰ１Ａ及びＭＡＰ１ＢのｃＤＮＡが、ＭＡＰ１Ａ又はＭＡＰ１Ｂの重鎖、及びＬＣ２又はＬＣ１のサブユニットをそれぞれ含んだポリタンパク質をコード化していることが示された。ラットＬＣ３をコード化しているｃＤＮＡが配列解析され、その配列中には、ＭＡＰ１Ａ／ＬＣ２、ＭＡＰ１Ｂ／ＬＣ１ポリタンパク質ｃＤＮＡは見出されなかった。ＬＣ３の推測アミノ酸配列は、ラットとマウスの間で高度に保持されている。ラットＬＣ３は、９．２の予測ｐＩを持つ１６．４ｋＤａのタンパク質である。これは１．７キロベースのｍＲＮＡによってコード化される。精製された組み換えラットＬＣ３は、脳ＭＡＰの存在下で構築された微小管、及び精製チュービュリンにより構築された微小管に関連した能力を保持している。
【００６３】
坑−ＬＣ３免疫組織化学では、ラット脳におけるＬＣ３は、ＭＡＰ１Ａ及びＭＡＰ１Ｂの両者の重鎖を発現している神経細胞に限定されることが明らかにされた。ＬＣ３は重鎖を発現している細胞においてのみ発現されるものの、ＬＣ３タンパク質の総量の発達上の変化は、ＭＡＰ１Ａ及びＭＡＰ１Ｂの両者の重鎖の量の変化と比例してはいない。定量的イムノブロッティングにより測定されたＬＣ３タンパク質発現は、出世後の脳においては、胚及び成人の脳の２倍である。ヒト染色体２０ｃｅｎ−ｑ１３へのＬＣ３遺伝子の局所化は、ＬＣ３が重鎖遺伝子と結合しない唯一のＭＡＰ１サブユニットであることを立証する。ＬＣ３はＭＡＰ１Ａ及びＭＡＰ１Ｂ微小管−結合ドメインの両者の構成成分であることから、ＬＣ３発現の重鎖独立調節は、発達の間にＭＡＰ微小管−結合活性を変更し得る。
【００６４】
ＭＡＰ１Ａ／１Ｂ軽鎖３の更なる情報については、Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ １９９６ Ｍａｒ １；４３（５）：５３５−４４；ａｎｄ Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９４ Ａｐｒ １５；２６９（１５）：１１４９２−７を参照されたい。
【００６５】
フェリチン
鉄は、代謝において不可欠な成分であるが、過剰量の場合には有毒であり得る。したがって、鉄ホメオスタシス−制御された、鉄の貯蔵・放出能力−が必須とされる。主に肝臓と脾臓においては、過剰な鉄は、フェリチンとして貯蔵される。フェリチンは、鉱物フェリハイドライトと構造の類似した水和酸化鉄−リン酸塩として、鉄をタンパク質の内側に隔離する、高度に保持された鉄貯蔵タンパク質のファミリーである。
【００６６】
典型的なフェリチンは、非共有結合性の相互作用を持つ２４のサブユニットからなり、球形のシェルを形成する。２４のサブユニットは、重（“Ｈ”）、又は軽（“Ｌ”）鎖の両者のペプチドである。Ｈサブユニットは、フェロキシダーゼ活性を持ち、可溶性（Ｆｅ２＋）鉄から貯蔵（Ｆｅ３＋）形態への変換を担っている。Ｌサブユニットがフェリチン核において鉄の鉱化作用を促進することが提案されている。フェリチンにおけるＨ／Ｌサブユニットの比率は、器官−特異的である。例えば、肝臓には主にＬサブユニットからなるフェリチンが含まれているのに対して、心臓には主にＨ−フェリチンが含まれている。
【００６７】
成人の脳においては、Ｈ−フェリチンサブユニットはＬ−サブユニットのほぼ２倍量豊富にあることが観察された。脳におけるＨ／Ｌフェリチン比もまた、細胞タイプによって異なる。神経細胞には主にＨ−フェリチンが含まれ、小グリア細胞には主にＬ−フェリチンが含まれ、乏突起神経こう細胞には両者のフェリチンサブユニットの混合物が含まれる。神経こう星状細胞では、マウス、ヒトの線条体（鉄−リッチ領域）を除いて、一般的にフェリチンは含まれておらず、神経こう星状細胞は、Ｌ−フェリチンサブユニットに強力に免疫染色する。Ｈ−、及びＬ−フェリチンの異なる細胞分布は、神経細胞はわずかな鉄貯蔵容量に対して高い鉄要求量を示す一方で、小グリア細胞におけるＬ−フェリチンの優位性はスカベンジャー細胞としての役割と一致している。
【００６８】
遺伝性の鉄ホメオスタシス障害の例としては、ヘモクロマローシス及びサラセミアが含まれる。鉄ホメオスタシスの調整不全はまた、アルツハイマー病にも関係する。
【００６９】
分泌タンパク質、特にＷｎｔ、乳酸デヒドロゲナーゼ、カルギザリン、レチノイン酸受容体応答物、ＭＡＰ、及びフェリチン分泌タンパク質サブファミリーに関連するメンバーは、薬剤の作用及び開発の主要なターゲットである。したがって、従来未知の分泌タンパク質のこのサブファミリーのメンバーを同定し、特徴付けることは薬剤開発の分野において有用である。本発明は、Ｗｎｔ、乳酸デヒドロゲナーゼ、カルギザリン、レチノイン酸受容体応答物、ＭＡＰ、及びフェリチン分泌タンパク質サブファミリーのメンバーとの相同性を持った、従来未確認のヒト分泌タンパク質を提供することによって、これらの技術の進展に寄与するものである。
【００７０】
発明の要約
本発明は、ヒト分泌ペプチド及びタンパク質のアミノ酸配列の同定に部分的に基づいているものであり、Ｗｎｔ、乳酸デヒドロゲナーゼ、カルギザリン、レチノイン酸受容体応答物、ＭＡＰ、及びフェリチン分泌タンパク質サブファミリー、及びそれらの対立変異体、他の哺乳類のオルトログに関連するものである。これらの特異なペプチド配列、及びこのペプチドをコード化している核酸配列は、ヒト治療ターゲットの開発に用いることができ、治療タンパク質の同定に有用であり、分泌タンパク質を発現している細胞及び組織における分泌タンパク質の活性を変調するヒト治療薬剤の開発のターゲットとなり得る。
【００７１】
発明の詳細な説明
概論
本発明は、ヒトゲノムの配列解析に基づいている。ヒトゲノムの配列解析及び構築に際して、配列情報を解析することによって、当該分野において、分泌タンパク質又はその一部であると同定及び特徴付けられ、Ｗｎｔ、乳酸デヒドロゲナーゼ、カルギザリン、レチノイン酸受容体応答物、ＭＡＰ、及びフェリチン分泌タンパク質サブファミリーに関連付けられるタンパク質／ペプチド／ドメインに対して、構造及び／又は配列の相同性を有するペプチドをコード化している、ヒトゲノムの従来未確認のフラグメントが明らかとなった。これらの配列を用いて、付加的なゲノム配列を構築し、転写及び／又はｃＤＮＡ配列を単離し、特徴付けた。この解析に基づいて、本発明は、Ｗｎｔ、乳酸デヒドロゲナーゼ、カルギザリン、レチノイン酸受容体応答物、ＭＡＰ、及びフェリチン分泌タンパク質サブファミリーに関連する分泌ペプチド及びタンパク質のアミノ酸配列、これらの分泌ペプチド及びタンパク質をコード化する転写形態の核酸配列、ｃＤＮＡ配列及び／又はゲノム配列、核酸変異（対立遺伝子情報）、発現の組織分布、及び本発明の分泌タンパク質に対して構造又は配列の相同性を有する、最も関連性の高い既知のタンパク質／ペプチド／ドメインに関する情報を提供するものである。
【００７２】
本発明において提供されるペプチドは、従来未知であることに加えて、商業的に重要な製品及びサービスの開発において有用であるという点に基づいて選択され得るものである。特に、本発明のペプチドは、Ｗｎｔ、乳酸デヒドロゲナーゼ、カルギザリン、レチノイン酸受容体応答物、ＭＡＰ、及びフェリチン分泌タンパク質サブファミリーにおける既知の分泌タンパク質、及びその発現パターンに対して相同性及び／又は構造上の相関性を有していることに基づいて選択される。この技術は、本発明の遺伝子と類似した発現パターンを有するこのファミリーのタンパク質及びペプチドにおける商業的重要性を確立するものである。本発明のペプチドのより具体的な性質及びその使用に関しては、本明細書、特に背景技術、図面の注釈に記載され、及び／又は既知のＷｎｔ、乳酸デヒドロゲナーゼ、カルギザリン、レチノイン酸受容体応答物、ＭＡＰ、及びフェリチン分泌タンパク質サブファミリーのそれぞれにおいて周知である。
【００７３】
【実施例の詳細】
ペプチド分子
本発明は、分泌タンパク質ファミリーのタンパク質のメンバーであると同定されるタンパク質分子をコード化する核酸配列を提供するものであり、これらはＷｎｔ、乳酸デヒドロゲナーゼ、カルギザリン、レチノイン酸受容体応答物、ＭＡＰ、及びフェリチン分泌タンパク質サブファミリーに関連付けられる（図２にタンパク質配列、図１に転写／ｃＤＮＡ配列、図３にゲノム配列を示す）。図２に示されるペプチド配列、同様に本明細書に記載される対立変異体、特に本明細書及び図３の情報を用いて同定される対立変異体のような明らかな変異体は、ここでは本発明の分泌ペプチド、分泌ペプチド、又は本発明のペプチド／タンパク質と呼ばれる。
【００７４】
本発明は、図２に示される分泌ペプチドのアミノ酸配列から成る、あるいは実質的に成る、あるいはこれを含む単離ペプチド及びタンパク質分子を提供する（図１に示される核酸分子である転写／ｃＤＮＡ、又は図３に示されるゲノム配列によりコード化される）とともに、本技術により調製、使用されるこれらのペプチドの明らかな変異体を提供するものである。これらの変異体については以下で詳述する。
【００７５】
ここで用いられる場合、ペプチドが細胞物質を実質的に含まない、又は化学前駆物質あるいは他の化学物質を含まない場合に、ペプチドは「単離」又は「精製」されたという。本発明のペプチドは、同質又は他の純度になるまで精製することができる。精製のレベルは使用目的に基づく。重要な性質としては、調製物中に他の成分が多量に存在していたとしても、要求されるペプチドの機能を発揮できるということである（単離核酸分子の性質については後述する）。
【００７６】
いくつかの使用では、「実質的に細胞物質を含まない」とは、他のタンパク質（すなわち汚染タンパク質）を約３０％（乾燥重量）未満、他のタンパク質を約２０％未満、他のタンパク質を約１０％未満、又は、他のタンパク質を約５％未満有するペプチド調製物を含む。ペプチドが組み換えにより製造される場合、培地がタンパク質調製物の容量に対して２０％未満のときには、実質的に培地は存在しないとすることもできる。
【００７７】
「実質的に化学前駆物質又は他の化学物質を含まない」という用語は、合成に関与した化学前駆物質又は他の化学物質から分離されたペプチド調製物をいう。ある例においては、「実質的に化学前駆物質又は他の化学物質を含まない」とは、化学前駆物質又は他の化学物質を約３０％（乾燥重量）未満、化学前駆物質又は他の化学物質を約２０％未満、化学前駆物質又は他の化学物質を約１０％未満、又は、化学前駆物質又は他の化学物質を約５％未満有する分泌ペプチド調製物を含む。
【００７８】
単離分泌ペプチドは、自然に発現する細胞、発現のために変形された（組み換え）細胞から精製するか、又は、既知のタンパク質合成方法を用いて合成することができる。例えば、分泌ペプチドをコード化している核酸分子は、発現ベクター中にクローニングされ、さらにこの発現ベクターは宿主細胞に導入されて、タンパク質が宿主細胞内で発現する。そして、タンパク質は標準のタンパク質精製技術を用いた適当な精製スキームによって、細胞から単離することができる。これら多くの技術については、以下で詳述する。
【００７９】
したがって、本発明は、図２に示されるアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７〜１２）から成るタンパク質、例えば、図１に示される転写／ｃＤＮＡ核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１〜６）、及び図３に示されるゲノム配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３〜１８）によりコード化されるタンパク質を提供するものである。このようなタンパク質のアミノ酸配列を図２に示す。このアミノ酸配列がタンパク質の最終的なアミノ酸配列であるとき、タンパク質はアミノ酸配列から成る。
【００８０】
本発明はさらに、図２に示されるアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７〜１２）から実質的に成るタンパク質、例えば、図１に示される転写／ｃＤＮＡ核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１〜６）、及び図３に示されるゲノム配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３〜１８）によりコード化されるタンパク質を提供するものである。このようなアミノ酸配列に微量の付加アミノ酸残基、例えば、最終的にタンパク質中に約１〜１００程度の付加残基、典型的には１〜２０の付加残基が存在する場合、タンパク質はアミノ酸配列から実質的に成る。
【００８１】
本発明はさらに、図２に示されるアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７〜１２）を含むタンパク質、例えば図１に示される転写／ｃＤＮＡ核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１〜６）、及び図３に示されるゲノム配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３〜１８）によりコード化されるタンパク質を提供するものである。このアミノ酸配列が、タンパク質の最終的なアミノ酸配列の少なくとも一部である場合、タンパク質はアミノ酸配列を含む。このような場合、タンパク質はペプチドのみであるか、又はタンパク質と自然に結びついているアミノ酸残基、あるいはアミノ酸残基／ペプチド配列に非相同のアミノ酸残基のような、付加的なアミノ酸分子（コード化された配列と隣接する）を有することができる。このようなタンパク質は、少量の付加的アミノ酸残基を有するか、又は数百あるいはそれ以上の付加的アミノ酸を含むことができる。本発明の分泌ペプチドが含まれるタンパク質の好適な種として、天然の成熟タンパク質がある。これらの各種タンパク質を調製／単離する方法については、以下に簡単に述べる。
【００８２】
本発明の分泌ペプチドは、キメラ又は融合タンパク質を形成するために、非相同性の配列に結合することができる。このようなキメラ及び融合タンパク質は、分泌ペプチドに対して実質的に相同性のないアミノ酸配列を有する非相同タンパク質に、有効に結合される分泌ペプチドを含む。「有効に結合される」とは、分泌ペプチドと非相同タンパク質がフレーム中で融合していることを示す。非相同タンパク質は、分泌ペプチドのＮ末端又はＣ末端に融合されることができる。
【００８３】
いくつかの使用では、融合タンパク質は、分泌ペプチド自体の活性に影響を及ぼさない。融合タンパク質には、例えば、βガラクトシダーゼ融合、イースト２−ハイブリッドＧＡＬ融合、ポリＨｉｓ融合、ＭＹＣ標識、ＨＩ標識及びＩｇ融合といった酵素融合タンパク質が含まれるが、これに限られるものではない。このような融合タンパク質、特にポリＨｉｓ融合は、組み換え分泌ペプチドの精製に有用である。ある種の宿主細胞（例えば哺乳類の宿主細胞）においては、タンパク質の発現及び／又は分泌は、非相同信号配列を用いることにより増加させることができる。
【００８４】
キメラ又は融合タンパク質は、標準の組み換えＤＮＡ技術により製造することができる。例えば、異なるタンパク質配列をコードしているＤＮＡフラグメントは、従来技術に従ってフレーム中に共に配置される。他の例では、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成機を含む従来技術により合成することが可能である。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅にアンカープライマーを用い、２つの連続的な遺伝子フラグメント間に相補的な突出部を形成し、その後、アニールすることにより、キメラ遺伝子配列を再増幅することができる（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １９９２参照）。さらに、発現ベクターとしては、既に融合部分（例えばＧＳＴタンパク質）をコード化した多くのものを、商業的に入手することができる。分泌ペプチドをコード化した核酸は、融合部がフレーム中で分泌ペプチドに結合するようにして、このような発現ベクター中にクローニングされることができる。
【００８５】
以上説明したように、本発明はまた、天然のペプチド成熟形態、ペプチドの対立遺伝子／配列変異体、非天然の組換え誘導変異体、ペプチドのオルトログ及びパラログなど、本発明のタンパク質のアミノ酸配列における明らかな変異体を提供、及び実施可能にするものである。このような変異体は、核酸組み換え技術やタンパク質生化学の分野で公知の技術を用いることにより、容易に生成することができる。しかしながら、この変異体には、本発明以前に公開されている何れのアミノ酸配列も含まれないものであると理解される。
【００８６】
このような変異体は、ここに示される分子技術や配列情報を用いることにより、容易に同定／製造することが可能である。さらに、このような変異体は、本発明の分泌ペプチドに対する配列及び／又は構造上の相同性に基づいて、他のペプチドと容易に区別することができる。相同性／同一性の程度は、主に、ペプチドが機能的変異体であるか又は非機能的変異体であるか、パラログファミリー中に存在する分化量、オルトログ間の進化的相違に基づいている。
【００８７】
２つのアミノ酸配列、又は２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するために、最適な比較を行う目的で、配列はアラインされる（例えば、最適なアラインメントのために、ギャップが第一及び第二アミノ酸又は核酸配列の一方又は両方に導入されることができ、非相同性配列は比較を行うために無視することができる）。好適な例としては、対象配列の長さの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上が、比較目的に応じてアラインされる。そして、対応するアミノ酸配置又はヌクレオチド配置上の、アミノ酸残基又はヌクレオチドが比較される。第一配列での配置が、第二配列において対応する配置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドによって占められているとき、分子はその配置上で同一である（ここで用いられているアミノ酸又は核酸の「同一性」は、アミノ酸又は核酸の「相同性」と同意義である）。２つの配列間の同一性パーセントは、配列において共有される同一配置数の関数であり、ギャップ数及び各ギャップ長さを考慮し、２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要がある。
【００８８】
配列の比較、及び２つの配列間における同一性、類似性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて行うことができる（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｌｅｓｋ， Ａ．Ｍ．， ｅｄ．， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８８； Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ： Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ， Ｓｍｉｔｈ， Ｄ．Ｗ．， ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９３； Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ， Ｐａｒｔ １， Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ａ．Ｍ．， ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ｈ．Ｇ．， ｅｄｓ．， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， １９９４； Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ， Ｇ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８７； ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ， Ｇｒｉｂｓｋｏｖ， Ｍ． ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．， ｅｄｓ．， Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９１）。好適な例としては、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎ・Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． （４８）：４４４−４５３ （１９７０））を用い、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２マトリックス、又はＰＡＭ２５０マトリックス、及びギャップ重量１６、１４、１２、１０、８、６、４、長さ重量１、２、３、４、５、６を用いて決定される。他の好適な例としては、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）のＧＡＰプログラム（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２（１）：３８７（１９８４））を用い、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス、ギャップ重量４０、５０、６０、７０、８０、長さ重量１、２、３、４、５、６を用いて決定される。さらに他の一例としては、２つのアミノ酸又はヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたＥ．Ｍｙｅｒｓ・Ｗ． Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（ＣＡＢＩＯＳ， ４：１１−１７ （１９８９））を用い、ＰＡＭ１２０重量残基表、ギャップ長ペナルティ１２、ギャップペナルティ４を用いて決定される。
【００８９】
本発明の核酸及びタンパク質配列は、例えば他のファミリー又は関連した配列を発見するために、配列データベースに対して検索を行う「クエリー配列」として用いられることができる。このような検索は、ＡｌｔｓｃｈｕｌらのＮＢＬＡＳＴ、及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−１０ （１９９０）） を用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子に相同性のあるヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラムを用い、ｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２で行うことができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のタンパク質に相同性のあるアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラムを用い、ｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３で行うことができる。比較目的のギャップアラインメントを得るために、ＡｌｔｓｃｈｕｌらのＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５（１７）：３３８９−３４０２ （１９９７））を用いることができる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴプログラムを用いる際には、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴやＮＢＬＡＳＴ）の既定のパラメータを用いることができる。
【００９０】
本発明のペプチドのうちの一つを含むタンパク質において、プロセシングを受ける前の全長形態と同様に、成熟プロセス形態は、本発明の分泌ペプチドのうちの１つに対して完全な配列同一性を有し、本発明の分泌ペプチドと同じ遺伝子位置によりコード化されているものとして、容易に同定することができる。図３Ａのデータにより示されるように、本発明により提供されるＷｎｔ遺伝子のマップ位置は、染色体位置１７ｑ２１であることがｅＰＣＲにより決定された。図３Ｂのデータにより示されるように、本発明により提供される乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のマップ位置は、染色体位置１５上にあることがｅＰＣＲにより決定された。図３Ｃのデータにより示されるように、本発明により提供されるカルギザリン遺伝子のマップ位置は、染色体７上にあることがｅＰＣＲにより決定された。図３Ｄのデータにより示されるように、本発明により提供されるレチノイン酸受容体応答物遺伝子のマップ位置は、染色体１６上にあることがｅＰＣＲにより決定された。図３Ｅのデータにより示されるように、本発明により提供されるＭＡＰ遺伝子のマップ位置は、染色体１２上にあることがｅＰＣＲにより決定された。図３Ｆのデータにより示されるように、本発明により提供されるフェリチン遺伝子は、公知のＢＡＣＡＣ０１１１８１にマップされた。
【００９１】
分泌ペプチドの対立遺伝子変異体は、分泌ペプチドの少なくとも一部に対して高度の（著しい）配列相同性／同一性を有するヒトタンパク質であることと同様に、本発明の分泌ペプチドと同じ遺伝子位置においてコード化されているものとして、容易に同定することができる。図３Ａのデータにより示されるように、本発明により提供されるＷｎｔ遺伝子のマップ位置は、染色体位置１７ｑ２１であることがｅＰＣＲにより決定された。図３Ｂのデータにより示されるように、本発明により提供される乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のマップ位置は、染色体位置１５上にあることがｅＰＣＲにより決定された。図３Ｃのデータにより示されるように、本発明により提供されるカルギザリン遺伝子のマップ位置は、染色体７上にあることがｅＰＣＲにより決定された。図３Ｄのデータにより示されるように、本発明により提供されるレチノイン酸受容体応答物遺伝子のマップ位置は、染色体１６上にあることがｅＰＣＲにより決定された。図３Ｅのデータにより示されるように、本発明により提供されるＭＡＰ遺伝子のマップ位置は、染色体１２上にあることがｅＰＣＲにより決定された。図３Ｆのデータにより示されるように、本発明により提供されるフェリチン遺伝子は、公知のＢＡＣＡＣ０１１１８１にマップされた。ここで用いられる場合、アミノ酸配列において、典型的には少なくとも約７０〜８０％、８０〜９０％、さらに典型的には少なくとも約９０〜９５％、又はそれ以上の相同性を有する場合には、２つのタンパク質（又はタンパク質の一領域）は著しい相同性を有している。本発明によれば、著しい相同性を有するアミノ酸配列は、より詳細には以下に述べられるようなストリンジェントな条件の下で、分泌ペプチドをコード化する核酸分子とハイブリダイズする核酸配列によりコード化される。
【００９２】
図３Ａには、本発明のＷｎｔタンパク質をコード化している遺伝子において確認されたＳＮＰ情報を示す。１つのｉｎｄｅｌ（“−”により示す）、及び２つのエキソン中のＳＮＰを含む９つのＳＮＰ変異体が確認され、これらのうちの１つはアミノ酸配列の変化を引き起こす（すなわち、非同義ＳＮＰ）。図３Ｃには、本発明のカルギザリンタンパク質をコード化している遺伝子において確認されたＳＮＰ情報を示す。４つのＳＮＰ変異体が確認された。図３Ｄには、本発明のレチノイン酸受容体応答物タンパク質をコード化している遺伝子において確認されたＳＮＰ情報を示す。４つのｉｎｄｅｌ（“−”により示す）を含む３０のＳＮＰ変異体が確認された。図３Ｅには、本発明のＭＡＰタンパク質をコード化している遺伝子において確認されたＳＮＰ情報を示す。８つのＳＮＰ変異体が確認された。図３Ｆには、本発明のフェリチンタンパク質をコード化している遺伝子において確認されたＳＮＰ情報を示す。１つのＳＮＰ変異体が確認された。これらのＳＮＰにより起こるアミノ酸配列の変化は図３Ａ〜Ｆに示され、ユニバーサル遺伝子コード、及び図２Ａ〜Ｆに示されるタンパク質配列を用いて容易に確認することができる。
【００９３】
分泌ペプチドのパラログは、分泌ペプチドの少なくとも一部に対して、ある程度の著しい配列相同性／同一性を有し、ヒトの遺伝子によってコード化され、また同様の活性又は機能を有しているものとして、容易に同定することができる。アミノ酸配列が、与えられた領域又はドメインを通じて、典型的には少なくとも約６０％以上、さらに典型的には約７０％以上の相同性を有する場合、２つのタンパク質は典型的なパラログであると考えられる。このようなパラログは、より詳細には以下に述べられるような、モデレートからストリンジェントな条件の下で、分泌ペプチドをコード化する核酸分子とハイブリダイズする核酸配列によりコード化される。
【００９４】
分泌ペプチドのオルトログは、分泌ペプチドの少なくとも一部に対してある程度の著しい配列相同性／同一性を有し、他の生体の遺伝子によってコード化されているものとして、容易に同定することができる。オルトログは、好適には、哺乳類、さらに好適には霊長類から単離され、ヒトの治療ターゲット及び治療薬剤の開発のために用いられる。このようなオルトログは、より詳細には以下に述べられるような、モデレートからストリンジェントな条件の下で、分泌ペプチドをコード化する核酸分子とハイブリダイズするような核酸配列によりコード化され、これはタンパク質を生成する２つの生体の関連性に依存している。
【００９５】
本発明の分泌ペプチドの非天然の変異体は、組み換え技術を用いて容易に生成することができる。このような変異体には、分泌ペプチドのアミノ酸配列中における欠失、付加、置換によるものが含まれるが、これに限定されるものではない。例えば、置換の１種として、保存的アミノ酸置換が挙げられる。この置換は、分泌ペプチドにおける特定のアミノ酸が、同様の特徴をもつ他のアミノ酸によって置換されるものである。保存的置換においては、脂肪族のアミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅの中の一つが他の一つに置換、ヒドロキシル残基ＳｅｒとＴｈｒとの交換、酸性残基ＡｓｐとＧｌｕとの交換、アミド残基ＡｓｎとＧｌｎ間の置換、塩基性残基ＬｙｓとＡｒｇとの交換、芳香族残基ＰｈｅとＴｙｌとの置換がある。表現型に現れないアミノ酸置換に関する指針については、Ｂｏｗｉｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０ （１９９０）に述べられている。
【００９６】
変異分泌ペプチドは、完全に機能しているか、又は、例えば基質結合能、基質リン酸化能、信号伝達媒介能等のような活性の一つ以上において機能が欠落していることがある。完全機能的な変異体には、典型的には、保存的な変異、又は致命的でない残基あるいは領域内での変異体のみが含まれる。図２には、タンパク質解析の結果が示されており、致命的なドメイン／領域を特定するのに使用することができる。機能性変異体には、機能が変化しない、又は著しい機能変化の無い類似アミノ酸の置換も含まれる。他方、このような置換は、機能に対してある程度プラス又はマイナスの影響を及ぼすことがある。
【００９７】
非機能性変異体には、典型的には、一つ以上の非保存的なアミノ酸の置換、欠失、導入、反転、切断、又は致命的な残基あるいは領域での置換、欠失、導入、反転が含まれる。
【００９８】
機能において必須のアミノ酸は、例えば、特定部位の突然変異誘発、又はアラニンスキャニング突然変異誘発（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５ （１９８９））等の当該分野において既知の方法により、特に図２に示す結果を用いて確認することができる。後者の手順では、分子内の全ての残基において、単独のアラニン突然変異を導入する。この結果生じた変異体分子は、その後、分泌タンパク質活性のような生物活性、又はｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖活性分析のようなアッセイのために試験される。結合対象／基質結合にとって重要な部位は、結晶化、核磁気共鳴、光学親和性ラベル等の構造解析によって決定される（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２４：８９９−９０４ （１９９２）； ｄｅ Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６−３１２（１９９２））。
【００９９】
本発明は分泌ペプチドのフラグメントを提供し、さらにこれに加えて、該フラグメント、特に図２に特定された残基を含むフラグメントを含む、及びから成るタンパク質及びペプチドを提供するものである。しかしながら、本発明に関連するフラグメントは、本発明より以前に公開されているフラグメントを含むものとは見なされない。
【０１００】
フラグメントは、ここで用いられる場合、分泌ペプチドに隣接するアミノ酸残基を、少なくとも８、１０、１２、１４、１６又はそれ以上含んでいる。このようなフラグメントは、１以上の分泌ペプチドの生物活性を保持する能力によって選択されるか、あるいは例えば、基質との結合又は抗原としての作用等の機能を果たす能力によって選択され得る。特に重要なフラグメントは生物活性フラグメントであり、これは例えば、８又はそれ以上のアミノ酸のペプチドである。このようなフラグメントは、典型的には、例えば活性部位、又は基質結合ドメインのような、分泌ペプチドのドメイン又はモチーフを含んでいる。さらに、可能なフラグメントとしては、ドメイン又はモチーフ含有フラグメント、溶解性ペプチドフラグメント、抗原性構造含有フラグメントを含むが、これに限定されるものではない。予想されるドメイン及び機能性部位は、当業者にとって容易に入手可能な公知のコンピュータプログラム（例えばＰＲＯＳＩＴＥ分析）により、容易に確認することができる。このような分析結果の１つを図２に示す。
【０１０１】
ポリペプチドは、一般に２０天然アミノ酸と呼ばれている２０種のアミノ酸以外のアミノ酸をしばしば含むことがある。さらに、末端アミノ酸を含む多くのアミノ酸は、プロセシング及び翻訳後修飾等の自然の過程、又は当該分野において公知の化学修飾技術によって修飾され得る。分泌ペプチドにおいて自然に生じる一般的な修飾については、基本的なテキスト、詳細な研究論文及び文献に記述されており、これは当業者においては周知である（これらの特性のいくつかは図２において確認される）。
【０１０２】
既知の修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合付加、ヘム部分の共有結合付加、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合付加、脂質又は脂質誘導体の共有結合付加、ホスファチジルイノシトールの共有結合付加、架橋結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸塩の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化などのタンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ媒介付加、ユビキチン化を含むが、修飾はこれに限定されるものではない。
【０１０３】
このような修飾は当業者には周知であり、科学文献において非常に詳細に記述されてきた。グリコシル化、脂質付加、硫酸化、グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化、ヒドロキシル化、ＡＤＰリボシル化など、特に一般的な修飾は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ − Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｔ．Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９３）のような、殆どの基本テキストにおいて記述されている。この点に関する詳細な文献としては、Ｗｏｌｄ， Ｆ．， Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｂ．Ｃ． Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １−１２ （１９８３）； Ｓｅｉｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ． （Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２： ６２６−６４６ （１９９０）） ａｎｄ Ｒａｔｔａｎ ｅｔ ａｌ． （Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ６６３：４８−６２ （１９９２） のような多くの文献を利用することができる。
【０１０４】
したがって、本発明の分泌ペプチドは、置換されたアミノ酸残基が遺伝子コードによってコード化されていない、置換基が含まれている、成熟分泌ペプチドが、例えば分泌ペプチドの半減期を長くする化合物のような他の化合物（例えば、ポリエチレングリコール）と融合しているか、又は付加アミノ酸が、例えば成熟分泌ペプチドの主、副配列、又は精製配列、あるいは前タンパク質配列のような、成熟分泌ペプチドと融合しているといった、誘導体又は類似体をも包含するものである。
【０１０５】
タンパク質／ペプチドの使用
本発明のタンパク質は、図面及び背景技術に示される機能情報に関連した、実質的及び特異的なアッセイにおいて、例えば、抗体を高める、又は他の免疫反応を誘発させるため、生物液中でのタンパク質（又はその結合対象、又はリガンド）レベルの定量のためのアッセイに用いる試薬（ラベル化試薬を含む）として、あるいは、対応するタンパク質を選択的に発現する組織のマーカー（組織の分化又は発達のある特定段階、あるいは疾患の状態）として使用することができる。タンパク質が、他のタンパク質と結合しているか又は結合し得る場合（例えば、分泌タンパク質−効果器タンパク質相互作用、分泌タンパク質−リガンド間相互作用）、このタンパク質を用いて結合相手を同定し、結合相互作用の阻害剤を同定するシステムを開発することができる。これらの一部又は全てを使用することにより、試薬グレード、又は商業製品としてのキットフォーマットへの開発が可能となる。
【０１０６】
上に列記した使用を実際に行う方法は、当業者にとって周知のことである。このような方法を開示している参考文献としては、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”２ｄ ｅｄ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｅ． Ｆ． Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｄｓ．， （１９８９） “Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ： Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｅｒｇｅｒ， Ｓ． Ｌ． ａｎｄ Ａ． Ｒ． Ｋｉｍｍｅｌ ｅｄｓ．， （１９８７）がある。
【０１０７】
本発明のペプチドの潜在的な用途は、主にタンパク質の起源に基づいており、同様にタンパク質の分類／作用に基づいている。例えば、ヒトから単離した分泌タンパク質、及びそれらのヒト／哺乳類オルトログは、哺乳類の治療用医薬、例えば、ヒト用の医薬、特に、分泌タンパク質を発現する細胞又は組織中での生物反応又は病理学的反応の変調に用いられる医薬を発見するためのターゲットとして有用である。医薬製剤のうちの多くの割合のものが、分泌タンパク質、特にＷｎｔ、乳酸デヒドロゲナーゼ、カルギザリン、レチノイン酸受容体応答物、ＭＡＰ、及びフェリチン分泌タンパク質サブファミリーのメンバーの活性を変調するものとして開発されている（背景技術参照）。背景技術及び図面に記載されている構造情報及び機能情報、特に図１の発現情報と組み合わせることによって、本発明の分子の特異的及び本質的な使用が提供される。このような使用は、ここに示されている情報と、当業者において既知の情報、及びルーチン実験を用いて、容易に決定することができる。
【０１０８】
本発明のタンパク質（本発明以前に開示されている変異体及びフラグメントを含む）は、Ｗｎｔ、乳酸デヒドロゲナーゼ、カルギザリン、レチノイン酸受容体応答物、ＭＡＰ、及びフェリチン分泌タンパク質サブファミリーに関連付けられる分泌タンパク質に関連する生物学的アッセイに有用である。このようなアッセイは、特にこの分泌タンパク質を発現する細胞及び組織において、本発明の一つが属する分泌タンパク質サブファミリーに特異的な分泌タンパク質関連症状の診断及び治療に有用な、公知の分泌タンパク質の機能、活性、あるいは性質の何れかに関係している。
【０１０９】
本発明のタンパク質は、細胞系、又は無細胞系における薬剤スクリーニングアッセイにおいても有用である（Ｈｏｄｇｓｏｎ， Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １９９２， Ｓｅｐｔ １０（９）；９７３−８０）。細胞系では、天然型、すなわち分泌タンパク質を正常に発現する細胞であり、生体組織検査、又は細胞培地中で増殖することができる。
【０１１０】
ポリペプチドは、自然状態又は変異型で分泌タンパク質に関連する特定の疾患又は症状を引き起こすタンパク質の分泌タンパク質活性を変調する化合物を同定するために用いることができる。本発明の分泌タンパク質と、適切な変異体及びフラグメントの両者は、分泌タンパク質への結合能力を持つ候補化合物をアッセイするための高効率スクリーンにおいて使用することができる。これらの化合物は、さらにこれらの分泌タンパク質活性に対する影響を判定するために、機能性分泌タンパク質に対してスクリーニングを行うことができる。さらにこれらの化合物は、動物又は無脊椎動物系における、活性／効果を判定するために試験することができる。化合物は、分泌タンパク質を望ましい程度までに活性化（アゴニスト）又は不活性化（アンタゴニスト）するかどうか判定される。
【０１１１】
さらに、本発明のタンパク質は、分泌タンパク質と、分泌タンパク質と通常相互作用する分子、例えば、分泌タンパク質が通常相互作用する信号経路の基質又は構成成分との間での相互作用を促進又は阻害する能力を持つ化合物（例えば、他の分泌タンパク質）をスクリーニングするのに用いることができる。このようなアッセイでは、一般的には、分泌タンパク質又はフラグメントが、ターゲット分子と相互作用し、タンパク質とターゲットとの複合物を検出するか、分泌タンパク質とターゲットとの間の相互作用の生化学的結果を検出することのできる条件で、分泌タンパク質と候補化合物とが結合される工程が含まれる。
【０１１２】
候補化合物としては、例えば、１）最後部がＩｇの融合ペプチド、及びランダムペプチドライブラリを含む可溶性ペプチド（例えば、Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４ （１９９１）； Ｈｏｕｇｈｔｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８４−８６ （１９９１）参照）、及びＤ−及び／又はＬ−型アミノ酸からできている組み合わせ化学誘導分子ライブラリを含むペプチド、２）ホスホペプチド（例えば、ランダム、又は部分的に変質したホスホペプチドライブラリ。例えば、Ｓｏｎｇｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ７２：７６７−７７８ （１９９３）参照）、３）抗体（例えば、ポリクローン抗体、モノクローン抗体、ヒト化抗体、抗イディオタイプ抗体、キメラ抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ発現ライブラリフラグメントを含む単鎖抗体、及び抗体のエピトープ結合フラグメント）、４）小さな有機及び無機分子（例えば、組み合わせ及び天然生成物ライブラリから得られる分子）が含まれる。
【０１１３】
ある候補化合物は、基質結合と競合する受容体の可溶性フラグメントである。他の候補化合物には、変異分泌タンパク質、又は分泌タンパク質機能に影響を及ぼす変異体を含む適切なフラグメントがあり、このために基質との競合が起こる。したがって、例えば、高い親和性を有するか、又はフラグメントが基質と結合し解離しないような、基質と競合するフラグメントが本発明に含まれる。
【０１１４】
本発明はさらに、分泌タンパク質により活性を変調（促進又は阻害）される化合物を同定するための、他のエンドポイントアッセイを含む。これらは、ここに記載されている全ての生化学的又は生化学的／生物学的挙動を含み、ここに引用される文献にはこれらのエンドポイントアッセイのターゲットが折り込まれており、また、他の機能については、当業者において公知であるか、又は図面、特に図２の情報を用いて、容易に確認することができる。特に、分泌タンパク質を発現する細胞又は組織の生物学的機能についてのアッセイを行うことができる。
【０１１５】
結合及び／又は活性化化合物は、キメラ分泌タンパク質を用いることによりスクリーニングを行うこともでき、アミノ末端細胞外ドメイン又はその一部、あるいは、７つの膜貫通セグメントの何れか又は細胞内又は細胞外ループの何れか、及びカルボキシ末端細胞内ドメインのような膜貫通ドメイン全体あるいはサブリジョン又はその一部は、異種ドメイン又はサブリジョンにより置換され得る。例えば、基質結合領域は、異なる基質と相互作用するものとして用いられることができ、この場合、天然の分泌タンパク質によって認識される。したがって、異なる一組の信号伝達成分を、活性化のエンドポイントアッセイとして利用することができる。これにより、分泌タンパク質の由来する特定の宿主細胞以外のものにおいてアッセイを行うことが可能となる。
【０１１６】
本発明のタンパク質はまた、分泌タンパク質と相互作用する化合物（例えば、結合相手及び／又はリガンド）を発見するため設計される方法である競争結合アッセイにも有用である。このために、化合物がポリペプチドと結合又は相互作用できる条件下で、化合物を分泌タンパク質ポリペプチドと接触させる。分泌タンパク質ポリペプチドもまた混合物中に加えられる。テスト化合物が分泌タンパク質ポリペプチドと相互作用する場合、分泌タンパク質ターゲットから形成される複合体の量、又は活性は減少する。このタイプのアッセイは、特に分泌タンパク質の特定領域と相互作用する化合物を模索する場合に有用である。このため、ターゲットとなる分泌タンパク質領域と競合する可溶性ポリペプチドは、対象となる領域に対応したペプチド配列を含むように設計されている。
【０１１７】
無細胞系薬剤のスクリーニングアッセイを行うためには、タンパク質の一方又は両方の非複合化形態からの複合化形態の分離を効率化し、アッセイを自動化するために、分泌タンパク質又はフラグメント、そのターゲット分子の何れかを固定化するのが望ましい場合がある。
【０１１８】
薬剤スクリーニングアッセイにおいては、マトリックスにタンパク質を固定化する技術を使用することができる。ある例では、タンパク質にマトリックスに結合することのできるドメインを付加した融合タンパク質を得ることができる。例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク質は、グルタチオンセファローズビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）又はグルタチオン誘導マイクロタイタープレート上に吸着され、細胞溶解物（例えば、３５Ｓ−ｌａｂｅｌｅｄ）と候補化合物とが結合され、複合体形成条件（例えば、塩及びｐＨの生理学的条件）の下で混合物がインキュベートされる。インキュベートの後、非結合ラベルの除去のためにビーズは洗浄され、マトリックスを固定化して、放射性ラベルを直接、又は複合体を分離した後の上澄みを測定することにより定量される。あるいは、複合体はＳＤＳ−ＰＡＧＥによりマトリックスから分離することができ、標準の電気泳動技術を用いることによって、ゲルからビーズフラクション中の分泌タンパク質結合タンパク質のレベルを定量することができる。例えば、ポリペプチド又はそのターゲット分子のどちらかが、当業者に周知の技術を利用して、ビオチン及びストレプトアビジンの結合を用いて固定化される。あるいは、タンパク質と反応し、タンパク質とターゲット分子との結合を妨げない抗体は、プレートのウェルに誘導化され、このタンパク質は抗体との結合によりそのウェルの中に捕らえられる。分泌タンパク質結合タンパク質の組成物と候補化合物は、分泌タンパク質存在ウェル中でインキュベートされ、ウェルに捕らえられた複合体の量を測定する。このような複合体を検出する方法としては、ＧＳＴ固定複合体による前述の方法に加えて、分泌タンパク質ターゲット分子に反応性のある抗体、又は、分泌タンパク質に反応性がありターゲット分子と競合する抗体を用いた複合体の免疫検出法、及びターゲット分子と関連する酵素活性の検出に基づく酵素結合アッセイが含まれる。
【０１１９】
本発明の分泌タンパク質のうちの１つを変調する薬剤は、上述の分析方法を単独あるいは組み合わせて用いることにより同定することができる。一般的には、最初と最後に細胞系又は無細胞系のシステムを用いて、動物又は他のモデルシステムにおける活性を確認することが好ましい。このようなモデルシステムは、当業者に周知であり、本記載において容易に用いることができる。
【０１２０】
これらの薬剤スクリーニングアッセイによって同定される分泌タンパク質活性のモジュレータは、分泌タンパク質を発現する細胞又は組織に処置することにより、分泌タンパク質経路により媒介される疾患を患う患者の治療に用いることができる。これらの治療方法には、薬剤組成物中の分泌タンパク質活性のモジュレータを患者の治療に必要な量投与する工程が含まれており、このモジュレータはここに記載されるようにして同定される。
【０１２１】
本発明の他の観点では、分泌タンパク質と結合又は相互作用する、又は分泌タンパク質活性に関連している他のタンパク質を同定するために、２−ハイブリッドアッセイ又は３−ハイブリッドアッセイ（Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，２８３，３１７； Ｚｅｒｖｏｓ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｃｅｌｌ ７２：２２３−２３２； Ｍａｄｕｒａ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：１２０４６−１２０５４； Ｂａｒｔｅｌ ｅｔ ａｌ． （１９９３）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：９２０−９２４； Ｉｗａｂｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：１６９３−１６９６； ａｎｄ Ｂｒｅｎｔ ＷＯ９４／１０３００参照）において、分泌タンパク質を「ｂａｉｔタンパク質」として使用することができる。
【０１２２】
２−ハイブリッドシステムは、分離可能なＤＮＡ結合ドメイン及び活性化ドメインから成る、大部分の転写調節因子のモジュラー性に基づいている。簡単に言うと、このアッセイでは２つの異なるＤＮＡ構造を利用する。一方の構造においては、分泌タンパク質をコードしている遺伝子は、既知の転写調節因子（例えばＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコード化している遺伝子に融合される。他方の構造においては、ＤＮＡ配列ライブラリから得られ、未確認のタンパク質（「ｐｒｅｙ」又は「ｓａｍｐｌｅ」）をコード化しているＤＮＡ配列が、既知の転写調節因子の活性化ドメインをコード化している遺伝子に融合される。「ｂａｉｔタンパク質」及び「ｐｒｅｙタンパク質」が生体内で相互作用することができ、分泌タンパク質依存複合体を形成する場合、転写調節因子のＤＮＡ結合ドメイン及び活性化ドメインは近接する。この近接により、転写調節因子に反応する転写調節部位に結合可能なリポーター遺伝子（例えばＬａｃＺ）の転写を行うことができる。リポーター遺伝子の発現は検出することが可能であり、機能的転写調節因子を含んでいる細胞コロニーを単離及び使用して、分泌タンパク質と相互作用するタンパク質をコード化するクローン遺伝子を得ることができる。
【０１２３】
本発明はさらに、前述のスクリーニングアッセイによって同定される新規な薬剤に関する。したがって、ここに記載されるようにして同定された薬剤を適当な動物のモデルに使用することも本発明の範囲内である。例えば、本発明で同定された薬剤（例えば分泌タンパク質変調薬剤、アンチセンス分泌タンパク質核酸分子、分泌タンパク質特異抗体、又は分泌タンパク質結合対象）は、これらの薬剤の処方における有効性、毒性、副作用を判定するために、動物、又は他のモデルで用いることができる。あるいは、本発明で同定された薬剤は、このような薬剤の作用のメカニズムを決定するために、動物又は他のモデルで使われることができる。さらに、本発明は、ここに記載される治療のためのスクリーニングアッセイにより同定された新規な薬剤の使用に関する。
【０１２４】
本発明の分泌タンパク質は、ペプチドにより媒介される疾患又は疾患素質の診断のためのターゲットを提供するのに有用である。したがって、本発明は、細胞、組織、又は生体中におけるタンパク質（又はコード化したｍＲＮＡ）の存在、あるいはそのレベルを検出する方法を提供するものである。この方法は、生物サンプルと、分泌タンパク質との相互作用能力を有する化合物との接触に関係しており、ここでは相互作用について検出することができる。このようなアッセイは、単検出形態、又は抗体チップアレイのような多検出形態で与えられる。
【０１２５】
サンプル中のタンパク質を検出する１つの薬剤は、タンパク質に選択的に結合することのできる抗体である。生物サンプルには、被験者から単離されるか、又は被験者の内部に存在する組織、細胞、生物液体が含まれる。
【０１２６】
本発明のペプチドは、ペプチド変異体を持つ患者のタンパク質の活性、疾患又は疾患素質の診断に用いるためのターゲット、特に現存するタンパク質ファミリー以外のものとして知られる活性、及び症状のターゲットを提供するものである。したがって、ペプチドは生物学的サンプルから単離されることができ、また、異常ペプチドを生じる遺伝子突然変異の存在についてアッセイを行うことができる。これは、アミノ酸置換、欠失、挿入、再配置（異常なスプライシング挙動の結果生じる）、及び不適当な翻訳後の修飾を含む。分析方法としては、変容電気泳動移動度、変容トリプシンペプチド消化、細胞系又は無細胞系アッセイによる変容分泌タンパク質活性、基質又は抗体の変容結合パターン、変容等電点、直接アミノ酸配列、及びタンパク質の変異の検出に有用な他の公知のアッセイ技術を含む。このようなアッセイは、単検出形態、又は抗体チップアレイのような多検出形態で与えられる。
【０１２７】
ペプチドのＩｎ ｖｉｔｒｏ検出技術としては、酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡｓ）、ウェスタンブロット、抗体、又はタンパク質結合剤のような検出試薬を用いた免疫沈降、免疫蛍光検査法を含む。あるいは、ラベルされた抗ペプチド抗体、又は他のタイプの検出試薬を被験者に導入することにより、被験者のｉｎ ｖｉｖｏ検出を行うことができる。例えば、被験者中のこのマーカーの存在及び位置を標準のイメージング技術によって検出することができる放射性マーカーを、抗体にラベルすることができる。被験者において発現されたペプチドの対立変異体を検出する方法、及びサンプル中のペプチドのフラグメントを検出する方法は、特に有用である。
【０１２８】
ペプチドはまた、ゲノム薬理学分析においても有用である。ゲノム薬理学では、薬剤の変化の傾向と、影響を受けたヒトの異常挙動に従って、薬剤に対しての応答における著しい遺伝的変異について臨床的に取り扱う。例えば、Ｅｉｃｈｅｌｂａｕｍ， Ｍ． （Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２３（１０−１１）： ９８３−９８５ （１９９６））、及びＬｉｎｄｅｒ， Ｍ．Ｗ． （Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ４３（２）：２５４−２６６ （１９９７））を参照されたい。これらの変異の臨床的な結果、個人の代謝変異の結果として、ある個人に対しては治療薬剤が重い毒性となり、又はある個人に対しては治療の失敗に終わる。このように、個人の遺伝子型は、体内で治療化合物を作用させる方法、又は体が化合物を代謝する方法を決定することができる。さらに、酵素を代謝させる薬剤の活性は、薬剤の作用の強度と期間に影響する。このように、個人のゲノム薬理学は、個人の遺伝子型に基づいた予防、又は治療的な処置において、効果的な化合物、又はこのような化合物の効果的な投与量の選択を可能とする。遺伝子多形性の発見により、酵素代謝性の薬剤において、患者が期待される薬効を得られない、不自然な薬効を示す、又は標準の投薬量から重大な毒性を被るといったことの理由を説明することができる。多形性は、強い代謝系の表現型と弱い代謝系の表現型で表されることができる。したがって、遺伝子の多形性は、ある集団の分泌タンパク質機能の１つ以上が他の集団のそれと異なるような、分泌タンパク質の対立タンパク質変異に至るかもしれない。このように、ペプチドは治療法に影響する遺伝子の素因を確認するためのターゲットとなり得る。このため、リガンドベースの治療において、多形性は、末端アミノ基の細胞外ドメイン及び／又は他の基質結合領域における基質結合活性、及び分泌タンパク質活性が、より高い、又はより低いことを引き起こし得る。したがって、多形性を含む集団においては、治療効果を最大にするように、基質投薬量は必然的に修正される。遺伝子型に代わるものとしては、特定の多形性のペプチドを同定することができる。
【０１２９】
ペプチドはまた、タンパク質の発現がない、発現が不適当、又は発現が不必要であることによって特徴づけられる障害の治療に有用である。したがって、治療方法としては、分泌タンパク質又はフラグメントの使用が含まれる。
【０１３０】
抗体
本発明は、本発明のペプチド、このようなペプチドを含むタンパク質、それらの変異体及びフラグメントの１つに選択的に結合する抗体を提供するものである。ここで用いられている場合、抗体がターゲットペプチドと結合し、無関係なタンパク質と強く結合しないような場合、抗体は選択的にターゲットペプチドと結合している。抗体がターゲットペプチドと実質的に相同性の無い他のタンパク質と結合していても、そのペプチドが抗体のターゲットとなるペプチドに対してフラグメント又はドメインにおける相同性を有している限り、抗体は選択的にペプチドを結びつけると考えられる。この場合、ペプチドに結合している抗体は、ある程度の交差反応性を持つにも関わらず、選択的であると理解される。
【０１３１】
ここで用いられる場合、抗体は当該分野で認められているものと同じ用語で定義され、これらは、哺乳類生体により生成され、抗原の攻撃に対して応答するマルチサブユニットタンパク質である。本発明の抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及びＦａｂ又はＦ（ａｂ’）２、及びＦｖのような抗体のフラグメントが含まれるが、これに限定されるものではない。
【０１３２】
ターゲットペプチドを得るための、抗体の生成及び／又は同定について、多くの方法が知られている。このような方法のいくつかは、Ｈａｒｌｏｗ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）に記載されている。
【０１３３】
一般に、抗体を生成するためには、単離ペプチドを免疫原として用い、例えばラット、ウサギ又はマウスのような哺乳類生体に投与される。全長タンパク質、抗原性ペプチドフラグメント又は融合タンパク質が用いられる。特に重要なフラグメントは、図２に特定されているような機能性ドメインをカバーするものであり、また、タンパク質アラインメント法を使用し、図面に示されているようにして、容易に確認することができるファミリーと配列相同性又は相違性を持つドメインである。
【０１３４】
抗体は、分泌タンパク質の領域、又は単離されたフラグメントから好適に調製される。抗体は、ここに記載されるペプチドの何れの領域からも調製することができる。しかしながら、好適な領域としては、機能／活性及び／又は分泌タンパク質／結合対象相互作用に関係している領域が含まれる。図２は特に重要な領域を特定するのに用いることができ、配列アラインメントは保持された特異な配列フラグメントを特定するのに用いることができる。
【０１３５】
抗原性フラグメントは、一般的に、少なくとも８つの隣接するアミノ酸残基を含んでいる。しかしながら、抗原性ペプチドは、少なくとも１０、１２、１４、１６以上のアミノ酸残基を含むことができる。このようなフラグメントは、例えば、タンパク質の表面上に位置する領域、例えば、親水性領域に対応するフラグメントのような物理的な性質、あるいは配列の特異性（図２参照）に基づいて選択することができる。
【０１３６】
本発明の抗体の検出は、検出可能物質と抗体とのカップリング（すなわち、物理的な結合）によって容易にすることができる。検出可能物質の例としては、例えば、種々の酵素、補欠分子族、蛍光性物質、発光性物質、生物発光性物質、及び放射性物質が含まれる。好適な酵素の例としては、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが含まれ、好適な補欠分子族の例としては、ストレプトアビジン／ビオチン、アビジン／ビオチンが含まれ、好適な蛍光性物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセイン・イソチオシアン酸塩、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロライド、又はフィコエリトリンが含まれ、発光性物質の例としては、ルミノールが含まれ、生物発光性物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンが含まれ、そして、適切な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、又は３Ｈが含まれる。
【０１３７】
抗体の使用
抗体は、アフィニティクロマトグラフィ、又は免疫沈降のような標準の技術によって、本発明のタンパク質の１つを単離するために用いることができる。抗体は、細胞からの天然タンパク質、及び宿主細胞に表現される組換えによって生成されたタンパク質の精製を容易にすることができる。さらに、このような抗体は、組織や生体内のタンパク質の発現パターンを決定するため、細胞や組織内における本発明のタンパク質の存在の検出に、通常の開発段階を経ずに用いることができる。さらに、このような抗体は、発現の量及びパターンを評価することによって、ｉｎ ｓｉｔｕ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、細胞溶解物中、及び上澄み中でのタンパク質の検出に用いることができる。また、このような抗体は、生物学的症状の発展又は進行間における、異常な組織分布、又は異常な発現を評価するのに用いることができる。全長タンパク質の循環フラグメントにおける抗体検出は、代謝回転を確認するのに用いることができる。
【０１３８】
さらに、抗体は、タンパク質機能に関連した疾患の活発な段階、又は該疾患素因を持つ個人といった、疾患の症状発現を評価するのに用いることができる。障害が不適当な組織分布、発展性の発現、タンパク質の発現レベル、又は発現／進行状態に起因する場合、抗体を通常のタンパク質に対して調製することができる。障害がタンパク質の特定の変異により特徴づけられる場合、この変異タンパク質に特異的な抗体を、特定の変異タンパク質の存在のアッセイを行うために用いることができる。
【０１３９】
抗体はまた、生体内の各種組織における、細胞の正常又は異常な細胞小器官の位置を評価するのに用いることができる。診断としての使用は、遺伝子のテストだけでなく、治療法をモニターすることにも適用することができる。したがって、治療が最終的に、発現レベル、又は異常配列及び異常組織配布の存在、又は発展性の発現を修正することを目指すものである場合、タンパク質又は関連するフラグメントに直接的に対する抗体を、治療の有効性をモニターするために用いることができる。
【０１４０】
さらに、抗体はゲノム薬理学分析において有用である。したがって、多形タンパク質に対して調製される抗体は、治療法の修正を必要とする個人を特定するために用いることができる。抗体はまた、電気泳動、等電点、トリプシンペプチド消化、当該分野において周知な他の物理的なアッセイによって分析される、異常タンパク質の免疫学的マーカーのような診断上のツールとしても有用である。
【０１４１】
抗体はまた、組織型の分類にも有用である。このように、特定のタンパク質が特定の組織中の発現と相関していた場合、このタンパク質に特異な抗体を、組織型を同定するために用いることができる。
【０１４２】
抗体はまた、タンパク質機能を阻害するのに有用であり、例えば、基質やタンパク質結合相手のような結合対象への分泌ペプチドの結合をブロックする。これらの使用は、タンパク質の機能阻害に関連する治療法における、治療環境において適用されることができる。抗体は、例えば、結合をブロックすることにより、ペプチド活性の変調（アゴナイズ又はアンタゴナイズ）を阻害することに用いることができる。抗体は、機能のために必要な部位を含む特定のフラグメントに対して、又は細胞又は細胞膜と関係している完全タンパク質に対して調製される。図２に、本発明のタンパク質に関する構造情報を示す。
【０１４３】
本発明は、生物学的サンプル中のタンパク質の存在を検出するために抗体を用いたキットを包含する。キットには、ラベル化された、又はラベル化可能な抗体と、生物学的サンプル中でタンパク質を検出するための化合物又は試薬を含み、；サンプル中のタンパク質量を決定する手段；標準サンプルのタンパク質量と比較する手段；及び使用の説明、とを含む。このようなキットは、単一のタンパク質、又はエピトープを検出するために提供されるか、又は抗体検出アレイのように、多数のエピトープのうちの１つを検出するように設定されることができる。アレイとしては、核酸アレイが後述され、また抗体アレイのための同様の方法も開発されている。
【０１４４】
核酸分子
本発明は、さらに本発明の分泌ペプチド又はタンパク質をコード化する単離核酸分子（ｃＤＮＡ、転写及びゲノム配列）を提供するものである。このような核酸分子は、本発明の分泌ペプチドの１つ、又はこれらの対立変異体、又はこれらのオルトログ又はパラログをコード化する核酸分子から成る、実質的に成る、又は含んでいる。
【０１４５】
ここで用いられる場合、「単離」核酸分子とは、核酸の天然起源における他の核酸の存在から分離されたものである。好ましくは、「単離」核酸は、その核酸の由来となる生物のゲノムＤＮＡにおいて、核酸のフランキング配列（すなわち、５’、及び３’末端に位置する配列）は含まない。しかしながら、例えば、約５ＫＢ、４ＫＢ、３ＫＢ、２ＫＢ又は特に１ＫＢ以上又はこれ以下、特に配列によりコード化された隣接ペプチドのように、いくつかのフランキングヌクレオチド配列があるが、同一の遺伝子の配列によりコード化されたペプチドは、ゲノム配列中のイントロンにより分離されている。重要な点は、核酸が、ここに記載されているような特定の操作、例えば、組み換え発現、プローブやプライマーの調製、核酸配列のための他の使用等に取り扱うことができるように、遠くの重要でないフランキング配列から分離されているということである。
【０１４６】
さらに、例えば、転写／ｃＤＮＡ分子のような「単離」核酸分子は、組み換え技術により製造される場合には、他の細胞物質、又は培地、また化学的に合成される場合には前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない。しかしながら、この核酸分子は、他のコード化又は調整配列に融合されることができるが、これは単離されたものとして考えられる。
【０１４７】
例えば、ベクターに含まれる組み換えＤＮＡ分子は、単離されたものとして考えられる。さらに、単離したＤＮＡ分子の例としては、非相同的な宿主細胞に保持された組み換えＤＮＡ分子、又は溶液中で精製（部分的又は実質的に）されたＤＮＡ分子が含まれる。単離されたＲＮＡ分子としては、本発明の単離したＤＮＡ分子の、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏＲＮＡ転写物が含まれる。本発明により単離された核酸分子としてはさらに、合成的に製造された分子が含まれる。
【０１４８】
したがって、本発明は、図１又は３ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１〜６（転写配列）、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３〜１８（ゲノム配列）］において示されるヌクレオチド配列から成る核酸分子、又は図２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７〜１２）に示されるタンパク質をコード化する核酸分子を提供するものである。ヌクレオチド配列がこの核酸分子の完全なヌクレオチド配列であるとき、核酸分子はヌクレオチド配列から成る。
【０１４９】
本発明はさらに、図１又は３［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１〜６（転写配列）、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３〜１８（ゲノム配列）］において示されるヌクレオチド配列から実質的に成る核酸分子、又は図２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７〜１２）に示されるタンパク質をコード化する核酸分子を提供するものである。核酸分子において、最終的にこのようなヌクレオチド配列がごくわずかの付加核酸残基とともに存在するとき、核酸分子はヌクレオチド配列から実質的に成る。
【０１５０】
本発明はさらに、図１又は３ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１〜６（転写配列）及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３〜１８（ゲノム配列）］において示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子、又は図２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７〜１２）に示されるタンパク質をコード化する核酸分子を提供するものである。核酸分子の最終的な核酸配列の少なくとも一部がこの核酸配列である場合、核酸分子はヌクレオチド配列を含む。これによると、核酸分子は、そのヌクレオチド配列だけであるか、又は付加的な核酸残基、例えば、自然に関する核酸配列、又は非相同的な核酸配列を有することもできる。このような核酸分子は、ごくわずかの付加的なヌクレオチドを有するか、又は数百又はそれ以上の付加的なヌクレオチドを含むこともできる。これらの種々のタイプの核酸分子を容易に生成／単離する方法については、以下に簡単に述べる。
【０１５１】
図１及び３には、コード及び非コードの配列の両者が提供される。本発明のヒトゲノム配列（図３）、及びｃＤＮＡ／転写配列（図１）より、図中の核酸分子は、ゲノムイントロン配列、５’と３’の非コード配列、遺伝子調節領域、及び非コード遺伝子間配列を含んでいる。一般に、図１と図３の両者に記載されているこのような配列の特徴は、当該分野において公知の計算ツールを用いて容易に特定することができる。以下で議論されるように、いくつかの非コーディング部位、特にプロモーターのような遺伝子の調節因子は、例えば、非相同的な遺伝子発現の制御、遺伝子活性を変調する化合物同定のターゲット等の種々の目的にとって有用であり、ここに提供されるゲノム配列のフラグメントとして特別にクレームされている。
【０１５２】
単離した核酸分子は、成熟したタンパク質に加えて付加的アミノ末端あるいはカルボキシ末端アミノ酸、又は成熟ペプチド内のアミノ酸（例えば、成熟形態が１以上のペプチド鎖を有する場合）をコード化することができる。このような配列は、前駆体から成熟した形態へのタンパク質のプロセシングにおいて、タンパク質搬送の促進、タンパク質半減期の延長あるいは短縮、又はタンパク質のアッセイ又は製造の際の操作の効率化、又は他の事象における役割を果たし得る。一般に、ｉｎ ｓｉｔｕの場合、付加アミノ酸は細胞酵素によって成熟したタンパク質へとプロセシングされる。
【０１５３】
上述したように、単離した核酸分子は、単独で分泌ペプチドをコード化している配列、成熟したペプチドをコード化している配列、そして、主、又は副配列（例えば、ｐｒｅ−ｐｒｏ、ｐｒｏ−ｐｒｏｔｅｉｎ配列）のような付加的なコード配列を含むが、これに限定されるものではなく、付加的なコード配列に加えて、付加的な非コード配列、例えば、イントロンと非コード５´及び３´配列のような、転写されるものの翻訳はされずに、転写、ｍＲＮＡプロセシング（スプライシング及びポリアデニル化を含む）、リボソームの結合、及びｍＲＮＡの安定性の役割を果たすものを、含んでも含まなくても良い。加えて、核酸分子は、例えば、精製を容易にするようなペプチドをコード化した配列のマーカーと融合されることもできる。
【０１５４】
単離した核酸分子は、ｍＲＮＡのようなＲＮＡの形態、あるいはクローニング、化学合成技術又はその組み合わせによって生成するｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを含むＤＮＡの形態をとり得る。核酸、特にＤＮＡは、二重鎖、又は単鎖であり得る。単鎖の核酸は、コード鎖（センス鎖）、又は非コード鎖（アンチセンス鎖）であり得る。
【０１５５】
本発明はさらに、本発明のペプチドのフラグメントをコード化する核酸分子と同様に、上記したような本発明の分泌タンパク質の明らかな変異体をコード化する核酸分子を提供するものである。このような核酸分子は、対立変異体（同一位置）、パラログ（異なる位置）とオルトログ（異なる生体）のように自然に発生するか、あるいは組み換えＤＮＡ法又は化学合成によって生成され得る。このような非自然に発生する変異体は、核酸分子、細胞又は生体に適用されるものを含む突然変異生成技術によって生成され得る。したがって、上述したように、変異体にはヌクレオチドの置換、欠失、倒置、挿入が含まれる。変異は、コード、非コード領域のどちらか、又は両方で起こることができる。変異は、保持及び非保持アミノ酸置換の両方で生じることができる。
【０１５６】
本発明はさらに、図１及び３に示される核酸分子の非コードのフラグメントを提供するものである。好適な非コードのフラグメントとしては、プロモーター配列、エンハンサ配列、遺伝子変調配列、遺伝子終止配列が含まれるが、これに限定されるものではない。このようなフラグメントは、非相同的な遺伝子発現の制御、及び遺伝子変調薬剤の同定を行うためのスクリーニングの開発において有用である。プロモーターは、図３のゲノム配列における５’からＡＴＧ開始部位において容易に確認される。
【０１５７】
フラグメントは、１２又はそれ以上の隣接するヌクレオチド配列を含む。さらに、フラグメントは少なくとも３０、４０、５０、１００、２５０、又は５００のヌクレオチド長であり得る。フラグメントの長さは使用目的に基づく。例えば、フラグメントは、ペプチドのエピトープ結果領域をコード化することができるか、又はＤＮＡプローブ及びＤＮＡプライマーとして有用である。このようなフラグメントは、オリゴヌクレオチドプローブを合成するための既知のヌクレオチド配列を用いて単離することができる。ラベル化されたプローブは、コード化領域と対応する核酸を単離するため、ｃＤＮＡライブラリ、ゲノムＤＮＡライブラリ、又はｍＲＮＡのスクリーニングに用いることができる。さらに、プライマーは、遺伝子の特定領域をクローンするためのＰＣＲ反応に用いることができる。
【０１５８】
プローブ／プライマーは、典型的には、実質的に精製されたオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドペアを含む。オリゴヌクレオチドは、典型的には、少なくとも１２、２０、２５、４０、５０又はそれ以上の連続的ヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズされたヌクレオチド配列領域を含む。
【０１５９】
オルトログ、ホモログ、及び対立変異体は、当該技術分野において周知の方法を用いて同定することができる。ペプチドの項で述べたように、これらの変異体は、ペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含み、図面に示されるヌクレオチド配列、又はこの配列のフラグメントに対して、典型的には、６０−７０％、７０−８０％、８０−９０％、より典型的には、少なくとも９０−９５％以上の相同性を有するものである。このような核酸分子は、図面に示されるヌクレオチド配列、又はこの配列のフラグメントに対して、モデレートな条件からストリンジェントな条件の下でハイブリダイズが可能なものとして、容易に同定することができる。対立変異体は、コード化している遺伝子の遺伝子位置により、容易に決定されることができる。図３Ａのデータにより示されるように、本発明により提供されるＷｎｔ遺伝子のマップ位置は、染色体位置１７ｑ２１であることがｅＰＣＲにより決定された。図３Ｂのデータにより示されるように、本発明により提供される乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のマップ位置は、染色体位置１５上にあることがｅＰＣＲにより決定された。図３Ｃのデータにより示されるように、本発明により提供されるカルギザリン遺伝子のマップ位置は、染色体７上にあることがｅＰＣＲにより決定された。図３Ｄのデータにより示されるように、本発明により提供されるレチノイン酸受容体応答物遺伝子のマップ位置は、染色体１６上にあることがｅＰＣＲにより決定された。図３Ｅのデータにより示されるように、本発明により提供されるＭＡＰ遺伝子のマップ位置は、染色体１２上にあることがｅＰＣＲにより決定された。図３Ｆのデータにより示されるように、本発明により提供されるフェリチン遺伝子は、公知のＢＡＣＡＣ０１１１８１にマップされた。
【０１６０】
図３Ａには、本発明のＷｎｔタンパク質をコード化している遺伝子において確認されたＳＮＰ情報を示す。１つのｉｎｄｅｌ（“−”により示す）、及び２つのエキソン中のＳＮＰを含む９つのＳＮＰ変異体が確認され、これらのうちの１つはアミノ酸配列の変化を引き起こす（すなわち、非同義ＳＮＰ）。図３Ｃには、本発明のカルギザリンタンパク質をコード化している遺伝子において確認されたＳＮＰ情報を示す。４つのＳＮＰ変異体が確認された。図３Ｄには、本発明のレチノイン酸受容体応答物タンパク質をコード化している遺伝子において確認されたＳＮＰ情報を示す。４つのｉｎｄｅｌ（“−”により示す）を含む３０のＳＮＰ変異体が確認された。図３Ｅには、本発明のＭＡＰタンパク質をコード化している遺伝子において確認されたＳＮＰ情報を示す。８つのＳＮＰ変異体が確認された。図３Ｆには、本発明のフェリチンタンパク質をコード化している遺伝子において確認されたＳＮＰ情報を示す。１つのＳＮＰ変異体が確認された。これらのＳＮＰにより起こるアミノ酸配列の変化は図３Ａ〜Ｆに示され、ユニバーサル遺伝子コード、及び図２Ａ〜Ｆに示されるタンパク質配列を用いて容易に確認することができる。
【０１６１】
「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という用語は、ここで用いられる場合、互いにハイブリダイズして残存する、ペプチドをコード化しているヌクレオチド配列が、互いに少なくとも６０−７０％の相同性を有する程度にハイブリダイズ、及び洗浄が行われる条件を意味している。この条件では、ハイブリダイズして残る配列が、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又はそれ以上となる。このようなストリンジェントな条件は、当業者においては周知であり、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎ．Ｙ． （１９８９）， ６．３．１−６．３．６に記載されている。ストリンジェントなハイブリダイズ条件の１つの例では、６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、約４５℃でハイブリダイズし、その後、０．２ＸＳＳＣ０．１％ＳＤＳ中、５０〜６５℃で洗浄する。低ストリンジェンシーのモデレートなハイブリダイズ条件の例は、当業者において周知である。
【０１６２】
核酸分子の使用
本発明の核酸分子は、プローブ、プライマー、化学合成中間体、及び生物学アッセイにおいて有用である。核酸分子は、図２に示されているペプチドをコード化する全長ｃＤＮＡ及びゲノムクローンを単離するため、及び図２に示すペプチドと同一又は関連したペプチドを生成する変異体（対立遺伝子、オルトログ等）に対応するゲノムクローンを単離するための、メッセンジャーＲＮＡ、転写／ｃＤＮＡ、及びゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションプローブとして有用である。図３Ａに示すように、本発明により提供されるＷｎｔタンパク質をコード化している遺伝子において、１つのｉｎｄｅｌを含む９つのＳＮＰが確認された。図３Ｃに示すように、本発明により提供されるカルギザリンタンパク質をコード化している遺伝子において、４つのＳＮＰが確認された。図３Ｄに示すように、本発明により提供されるレチノイン酸受容体応答物タンパク質をコード化している遺伝子において、４つのｉｎｄｅｌを含む３０のＳＮＰが確認された。図３Ｅに示すように、本発明により提供されるＭＡＰタンパク質をコード化している遺伝子において、８つのＳＮＰが確認された。図３Ｆに示されるように、本発明により提供されるフェリチンタンパク質をコード化している遺伝子において、１つのＳＮＰが確認された。
【０１６３】
プローブは、図に示されている核酸分子の全長における、何れの配列とも対応することができる。したがって、それは５’非コード領域、コード領域、及び３’非コード領域から誘導することができる。しかしながら、すでに述べたたように、フラグメントは本発明以前に公開されたフラグメントを含まないものと見なされる。
【０１６４】
核酸分子はまた、核酸分子の何れかの領域を増幅するＰＣＲのプライマーとしても有用であり、必要な長さ及び配列のアンチセンス分子の合成においても有用である。
【０１６５】
核酸分子はまた、組み換えベクターの製造にも有用である。このようなベクターとしては、ペプチド配列の一部、又は全部を発現する発現ベクターが含まれる。ベクターはまた、挿入ベクターも含み、これは他の核酸分子中に統合され、例えば、細胞ゲノム中で遺伝子及び／又は遺伝子生成物のｉｎ ｓｉｔｕ発現を変化させるために用いられる。例えば、内生コード配列では、１つ以上の特異的に導入された変異を含むコード領域の一部、又は全部との相同的な組み換えを経て置換され得る。
【０１６６】
核酸分子はまた、タンパク質の抗原部分を発現することにも有用である。
【０１６７】
核酸分子はまた、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法により、核酸分子の染色体の位置を決定するためのプローブとしても有用である。図３Ａのデータにより示されるように、本発明により提供されるＷｎｔ遺伝子のマップ位置は、染色体位置１７ｑ２１であることがｅＰＣＲにより決定された。図３Ｂのデータにより示されるように、本発明により提供される乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のマップ位置は、染色体位置１５上にあることがｅＰＣＲにより決定された。図３Ｃのデータにより示されるように、本発明により提供されるカルギザリン遺伝子のマップ位置は、染色体７上にあることがｅＰＣＲにより決定された。図３Ｄのデータにより示されるように、本発明により提供されるレチノイン酸受容体応答物遺伝子のマップ位置は、染色体１６上にあることがｅＰＣＲにより決定された。図３Ｅのデータにより示されるように、本発明により提供されるＭＡＰ遺伝子のマップ位置は、染色体１２上にあることがｅＰＣＲにより決定された。図３Ｆのデータにより示されるように、本発明により提供されるフェリチン遺伝子は、公知のＢＡＣＡＣ０１１１８１にマップされた。
【０１６８】
核酸分子はまた、本発明の核酸分子の遺伝子調節領域を含むベクターの製造にも有用である。
【０１６９】
核酸分子はまた、ここに記載される核酸分子から生成されるｍＲＮＡの一部又は全部と対応しているリボザイムの設計にも有用である。
【０１７０】
核酸分子はまた、ペプチドの一部又は全部を発現しているベクターの製造にも有用である。
【０１７１】
核酸分子はまた、核酸分子及びペプチドの一部又は全部を発現している宿主細胞の製造にも有用である。
【０１７２】
核酸分子はまた、核酸分子及びペプチドの一部又は全部を発現している遺伝子組み換え動物の製造にも有用である。
【０１７３】
核酸分子はまた、核酸発現の存在、レベル、形態、分布を決定するためのハイブリダイゼーションプローブとしても有用である。したがって、プローブは、細胞、組織、生体中での核酸分子の存在の検出、又はレベルの決定に用いることができる。レベルを決定される核酸はＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。したがって、ここに記載されるペプチドに対応するプローブは、与えられた細胞、組織、生体中での発現及び／又は遺伝子コピー数の評価に用いることができる。これらの使用は、正常の場合と比較して、分泌タンパク質が増加又は減少していることに関係する障害の診断に適している。
【０１７４】
ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ検出技術には、ノーザンハイブリダイゼーション、及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが含まれる。ＤＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ検出技術には、サザンハイブリダイゼーション、及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが含まれる。
【０１７５】
プローブは、分泌タンパク質を発現する細胞又は組織の判定を行う診断テストキットの一部として用いることができる。これは、例えば、被験者の細胞サンプル中の、分泌タンパク質をコード化した核酸分子、例えば、ｍＲＮＡ、又はゲノムＤＮＡのレベルを測定するか、又は分泌タンパク質遺伝子が変異していないか判定するものである。
【０１７６】
核酸発現アッセイは、分泌タンパク質核酸発現を変調する化合物を同定するための薬剤スクリーニングにおいて有用である。
【０１７７】
本発明は、分泌タンパク質遺伝子の核酸発現、特に、細胞及び組織において分泌タンパク質を媒介する生物学的、病理学的プロセスに関連した障害の治療に用いる化合物を同定する方法を提供するものである。この方法には、典型的には、分泌タンパク質核酸の発現を変調する化合物の能力についてアッセイを行うこと、及びその後、不必要な分泌タンパク質核酸発現により特徴づけられる障害を治療するのに用いることができる化合物を同定することが含まれる。このアッセイは、細胞系及び無細胞系において行われることができる。細胞系のアッセイには、天然に分泌タンパク質核酸を発現している細胞、又は特定の核酸配列を表現するために設計された組み換え細胞が含まれる。
【０１７８】
したがって、分泌タンパク質遺伝子発現のモジュレータは、細胞と候補化合物とを接触させ、ｍＲＮＡの発現を判定する方法により同定することができる。候補化合物の存在下での分泌タンパク質ｍＲＮＡの発現レベルは、候補化合物非存在下での分泌タンパク質ｍＲＮＡの発現レベルと比較される。この比較に基づいて、候補化合物は核酸発現のモジュレータとして同定され、例えば、異常核酸発現により特徴付けられる障害の治療に用いることができる。候補化合物存在下でのｍＲＮＡの発現が、非存在下のものと比較して統計的に著しく大きい場合、候補化合物は核酸発現の促進剤として同定される。候補化合物存在下でのｍＲＮＡの発現が、非存在下のものと比較して統計的に著しく小さい場合、候補化合物は核酸発現の阻害剤として同定される。
【０１７９】
本発明はさらに、分泌タンパク質を発現する細胞及び組織における分泌タンパク質核酸発現を変調する遺伝子モジュレータとしての薬剤スクリーニングを経て同定された化合物をターゲットとして用いる治療方法を提供するものである。変調には、上方調整（例えば、活性化又はアゴニゼーション）、下方調整（抑制又はアンタゴニゼーション）の両者、又は核酸発現が含まれる。
【０１８０】
あるいは、薬剤又は小分子がタンパク質を発現している細胞又は組織中で分泌タンパク質発現を阻害するものである限りは、分泌タンパク質核酸発現のモジュレータは、ここに記載されるスクリーニングアッセイを用いて同定される薬剤又は小分子であり得る。
【０１８１】
核酸分子はまた、臨床試験又は治療方法において、分泌タンパク質遺伝子の発現及び活性に対する変調化合物の効果をモニターするのに有用である。したがって、遺伝子発現パターンは、化合物、特に患者の耐性を向上させる化合物を用いた治療における、継続的効果のバロメータとなり得る。遺伝子発現パターンはまた、化合物に対する細胞の生理的反応を示すマーカーとなり得る。したがって、このようなモニタリングにより、化合物の投与量の増加、又は患者が耐性を示さない代替化合物の投与を行うことができる。同様に、核酸発現のレベルが望ましいレベルまで低下したならば、化合物の投与をこれに比例して減少することができる。
【０１８２】
核酸分子はまた、分泌タンパク質核酸発現の質的変化、特に疾患に至る質的変化の診断アッセイにも有用である。核酸分子は、ｍＲＮＡのような分泌タンパク質遺伝子、及び遺伝子発現生成物における突然変異の検出に用いることができる。核酸分子は、分泌タンパク質遺伝子において自然発生した遺伝子突然変異を検出し、その変異を持つ被験者が変異により生じる障害の危険性を有しているかどうかを判定するためのハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。突然変異には、欠失、付加、又は遺伝子中の１以上のヌクレオチドの置換、倒置又は転移のような染色体の組み換え、異常メチル化パターンのようなゲノムＤＮＡの修飾、又は増幅のような遺伝子コピー数の変化が含まれる。機能障害に関連する分泌タンパク質遺伝子の変異体の検出は、疾患が分泌タンパク質の過剰発現、過小発現、変異発現の結果生じる場合に、活性又は感受性の診断ツールを提供するものである。
【０１８３】
分泌タンパク質遺伝子における突然変異をもたらしている個体は、種々の技術によって核酸レベルにおいて検出されることができる。図３Ａには、本発明のＷｎｔタンパク質をコード化している遺伝子において確認されたＳＮＰ情報を示す。１つのｉｎｄｅｌ（“−”により示す）、及び２つのエキソン中のＳＮＰを含む９つのＳＮＰ変異体が確認され、これらのうちの１つはアミノ酸配列の変化を引き起こす（すなわち、非同義ＳＮＰ）。図３Ｃには、本発明のカルギザリンタンパク質をコード化している遺伝子において確認されたＳＮＰ情報を示す。４つのＳＮＰ変異体が確認された。図３Ｄには、本発明のレチノイン酸受容体応答物タンパク質をコード化している遺伝子において確認されたＳＮＰ情報を示す。４つのｉｎｄｅｌ（“−”により示す）を含む３０のＳＮＰ変異体が確認された。図３Ｅには、本発明のＭＡＰタンパク質をコード化している遺伝子において確認されたＳＮＰ情報を示す。８つのＳＮＰ変異体が確認された。図３Ｆには、本発明のフェリチンタンパク質をコード化している遺伝子において確認されたＳＮＰ情報を示す。１つのＳＮＰ変異体が確認された。これらのＳＮＰにより起こるアミノ酸配列の変化は図３Ａ〜Ｆに示され、ユニバーサル遺伝子コード、及び図２Ａ〜Ｆに示されるタンパク質配列を用いて容易に確認することができる。図３Ａのデータにより示されるように、本発明により提供されるＷｎｔ遺伝子のマップ位置は、染色体位置１７ｑ２１であることがｅＰＣＲにより決定された。図３Ｂのデータにより示されるように、本発明により提供される乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のマップ位置は、染色体位置１５上にあることがｅＰＣＲにより決定された。図３Ｃのデータにより示されるように、本発明により提供されるカルギザリン遺伝子のマップ位置は、染色体７上にあることがｅＰＣＲにより決定された。図３Ｄのデータにより示されるように、本発明により提供されるレチノイン酸受容体応答物遺伝子のマップ位置は、染色体１６上にあることがｅＰＣＲにより決定された。図３Ｅのデータにより示されるように、本発明により提供されるＭＡＰ遺伝子のマップ位置は、染色体１２上にあることがｅＰＣＲにより決定された。図３Ｆのデータにより示されるように、本発明により提供されるフェリチン遺伝子は、公知のＢＡＣＡＣ０１１１８１にマップされた。ゲノムＤＮＡは、直接又は予めＰＣＲを用いて増幅した後で分析されることができる。ＲＮＡ又はｃＤＮＡも、同様にして用いることができる。ある使用においては、突然変異の検出は、例えば、アンカーＰＣＲ、ＲＡＣＥＰＣＲのような、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ４，６８３，１９５， 及び ４，６８３，２０２参照）、又は他のものとして、リゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７−１０８０ （１９８８）； 及び Ｎａｋａｚａｗａ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ９１：３６０−３６４ （１９９４）参照）において、プローブ／プライマーの使用に関連し、特に後者は遺伝子中の変異位置の同定に有用である（Ａｂｒａｖａｙａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３：６７５���６８２ （１９９５）参照）。この方法には、患者から細胞サンプルを収集する工程と、サンプルの細胞から核酸（例えば、ゲノム、ｍＲＮＡ又はその両方）を単離する工程と、遺伝子（もし存在すれば）のハイブリダイズ及び増幅が起こりうる条件下で遺伝子に特異的にハイブリダイズする１以上のプライマーと核酸とを接触させる工程と、増幅生成物の存在又は非存在を検出するか、又は増幅生成物のサイズを検出し、コントロールサンプルの長さと比較する工程を含む。欠失及び挿入は、増幅生成物のサイズの変化を、正常な遺伝子型と比較することにより検出することができる。点突然変異は、増幅ＤＮＡと正常なＲＮＡ、又はアンチセンスのＤＮＡ配列とハイブリダイズすることによって確認することができる。
【０１８４】
あるいは、分泌タンパク質遺伝子の突然変異は、例えば、ゲル電気泳動により決定される制限酵素消化パターンの変更により、直接的に確認することができる。
【０１８５】
さらに、配列特定リボザイム（Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，４９８，５３１）は、リボザイム開裂部位の成長又は減少により、特定の変異の存在の評点のために用いることができる。完全に一致する配列は、ヌクレアーゼ開裂消化分析評価、又は融点の違いによって、不一致の配列から分離することができる。
【０１８６】
特定位置での配列変化は、ＲＮａｓｅ及びＳ１保護、又は化学開裂法のようなヌクレアーゼ保護アッセイによって評価することができる。さらに、分泌タンパク質遺伝子と野生型遺伝子との配列の相違は、直接ＤＮＡ配列解析によって決定することができる。種々の自動化された配列解析手段は、診断アッセイ（Ｎａｅｖｅ， Ｃ．Ｗ．， （１９９５） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９：４４８）の実行において有用であり、これらには、マススペクトルによる配列解析（例えば、ＰＣＴ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ＷＯ ９４／１６１０１； Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． ３６：１２７−１６２ （１９９６）， ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３８：１４７−１５９ （１９９３）参照）も含まれる。
【０１８７】
遺伝子中の突然変異を検出する他の技術の例としては、ＲＮＡ／ＲＮＡ、又はＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖から、不一致の塩基を検出するために、開裂試薬から保護する方法（Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１２４２ （１９８５）， Ｃｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ８５：４３９７ （１９８８）， Ｓａｌｅｅｂａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２１７：２８６−２９５ （１９９２））、変異体と野生型の核酸の電気泳動移動度を比較する方法（Ｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ８６：２７６６ （１９８９）； Ｃｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｕｔａｔ． Ｒｅｓ． ２８５：１２５−１４４ （１９９３）； ａｎｄ Ｈａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｔ． Ａｎａｌ． Ｔｅｃｈ． Ａｐｐｌ． ９：７３−７９ （１９９２））、及び変性剤の勾配を含んだポリアクリルアミドゲル中での変異体又は野生型のフラグメントの動きを、勾配ゲル電気泳動を用いてアッセイする方法（Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１３：４９５ （１９８５））が含まれる。点突然変異を検出する他の技術の例としては、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、及び選択的プライマー伸長が含まれる。
【０１８８】
核酸分子は、治療方法としての効果を持つにも関わらず、必ずしも疾患を引き起こすわけではない遺伝子型のための、個人テストにおいても有用である。このため、核酸分子は、個人の遺伝子型と、治療に用いられる化合物に対する個人の応答との相関（薬理ゲノム相関）についての研究に用いることができる。したがって、ここに記載されている核酸分子は、治療のための適切な化合物及び投与量を選択するために、個人の分泌タンパク質遺伝子の変異についての評価に用いることができる。図３Ａには、本発明のＷｎｔタンパク質をコード化している遺伝子において確認されたＳＮＰ情報を示す。１つのｉｎｄｅｌ（“−”により示す）、及び２つのエキソン中のＳＮＰを含む９つのＳＮＰ変異体が確認され、これらのうちの１つはアミノ酸配列の変化を引き起こす（すなわち、非同義ＳＮＰ）。図３Ｃには、本発明のカルギザリンタンパク質をコード化している遺伝子において確認されたＳＮＰ情報を示す。４つのＳＮＰ変異体が確認された。図３Ｄには、本発明のレチノイン酸受容体応答物タンパク質をコード化している遺伝子において確認されたＳＮＰ情報を示す。４つのｉｎｄｅｌ（“−”により示す）を含む３０のＳＮＰ変異体が確認された。図３Ｅには、本発明のＭＡＰタンパク質をコード化している遺伝子において確認されたＳＮＰ情報を示す。８つのＳＮＰ変異体が確認された。図３Ｆには、本発明のフェリチンタンパク質をコード化している遺伝子において確認されたＳＮＰ情報を示す。１つのＳＮＰ変異体が確認された。これらのＳＮＰにより起こるアミノ酸配列の変化は図３Ａ〜Ｆに示され、ユニバーサル遺伝子コード、及び図２Ａ〜Ｆに示されるタンパク質配列を用いて容易に確認することができる。
【０１８９】
このように、治療に影響する遺伝子変異を示す核酸分子は、個人におけるテイラー治療に用いることのできる診断ターゲットを提供するものである。したがって、これらの多形性を含んだ組み換え細胞及び組み換え動物の製造は、治療化合物及び薬剤投与についての効果的な臨床設計を可能とする。
【０１９０】
核酸分子は、細胞、組織、及び生体における分泌タンパク質遺伝子発現を制御するためのアンチセンス構成物として有用である。ＤＮＡアンチセンスの核酸分子は、転写に関連する遺伝子の部位に対して相補的になるよう設計され、それ故に、分泌タンパク質の生成と転写が防がれる。アンチセンスのＲＮＡ又はＤＮＡ核酸分子はｍＲＮＡへとハイブリダイズされ、これにより分泌タンパク質中でのｍＲＮＡの翻訳がブロックされる。
【０１９１】
あるいは、ある種のアンチセンス分子は、分泌タンパク質核酸の発現を減少させる不活性化ｍＲＮＡに用いることができる。したがって、これらの分子は、異常、又は不必要な分泌タンパク質核酸の発現により特徴づけられる障害の治療に用いることができる。この技術は、翻訳されるｍＲＮＡの能力が減少したｍＲＮＡの１以上の領域に相補的なヌクレオチド配列を含んだリボザイムによる開裂に関連している。可能な領域としては、コード領域、特に、基質結合のような、分泌タンパク質の触媒活性及び他の機能活性に対応したコード領域が含まれる。
【０１９２】
核酸分子はまた、分泌タンパク質遺伝子発現において異常な細胞を持つ患者の遺伝子治療のためのベクターを提供するものである。このため、組み換え細胞には、ｅｘ ｖｉｖｏで調製され患者に戻される細胞が含まれ、個人の体内に導入されてそこで個人の治療のために必要とされる分泌タンパク質を生成する。
【０１９３】
本発明は、生物学的サンプル中の分泌タンパク質核酸の存在を検出するために抗体を用いたキットも包含する。例えば、キットは、ラベル化された、又はラベル化可能な核酸、又は生物学的サンプル中で分泌タンパク質核酸を検出することのできる試薬を含み、；サンプル中の分泌タンパク質核酸量を決定する手段；標準サンプルの分泌タンパク質核酸量と比較する手段、とを含むことができる。この化合物又は試薬は適当な容器に封入することができる。このキットは、さらに分泌タンパク質ｍＲＮＡ又はＤＮＡの検出キットとして使用するための説明を含むことができる。
【０１９４】
核酸アレイ
本発明はさらに、核酸検出キットを提供するものであり、これらは、例えば、図１及び３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１及び３）に示される配列情報に基づいた核酸分子のアレイ又はマイクロアレイである。
【０１９５】
ここで用いられている、「アレイ」又は「マイクロアレイ」は、紙、ナイロン又は他の膜、フィルタ、チップ、ガラススライド、又は他の適当な固形支持体のような基盤の上に合成された、別個のポリヌクレオチド、又はオリゴヌクレオチドのアレイのことである。１つの例として、マイクロアレイは、ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ ５，８３７，８３２， Ｃｈｅｅ ｅｔ ａｌ．， ＰＣＴ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｗ０９５／１１９９５ （Ｃｈｅｅ ｅｔ ａｌ．）， Ｌｏｃｋｈａｒｔ， Ｄ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． （１９９６； Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． １４： １６７５−１６８０） 及び Ｓｃｈｅｎａ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． （１９９６； Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９３： １０６１４−１０６１９）に記載される方法にしたがって調製、使用され、これらの全ては参考としてここに折り込まれる。あるいは、このようなアレイは、Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．， ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，８０７，５２２．に記載される方法により製造される。
【０１９６】
マイクロアレイ又は検出キットは、好適には、多数の特異的な単鎖の核酸配列を構成し、通常は合成アンチセンスのオリゴヌクレオチドか、又はｃＤＮＡのフラグメントのどちらかが固体支持体上に固定される。オリゴヌクレオチドは、好適には約６〜６０のヌクレオチド長、より好適には１５〜３０のヌクレオチド長、最も好適には２０〜２５のヌクレオチド長である。あるタイプのマイクロアレイ又は検出キットには、７〜２０のヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドのみを使うことが好適であり得る。マイクロアレイ又は検出キットは、既知の５’又は３’配列を含んだオリゴヌクレオチド、全長配列を含んだオリゴヌクレオチド、又は配列長さの特定領域から選択された特異なオリゴヌクレオチドを含むものであり得る。マイクロアレイ又は検出キットにおいて用いられるポリヌクレオチドは、遺伝子又は対象となる遺伝子において特異的なオリゴヌクレオチドであり得る。
【０１９７】
マイクロアレイ又は検出キットにおいて、既知の配列のオリゴヌクレオチドを製造するために、対象となる遺伝子（又は、本発明により確認されたＯＲＦ）は、典型的には、核酸配列の５’から開始、又は３’で終了するコンピュータアルゴリズムを用いて試験される。典型的なアルゴリズムでは、遺伝子に特異的な長さに規定されたオリゴマーが同定され、ハイブリダイゼーションに好適な範囲にＧＣ成分を持ち、ハイブリダイゼーションの妨害となると予測される二次構造を持たない。ある条件では、マイクロアレイ又は検出キットにおいて、オリゴヌクレオチドのペアを用いることが好適であり得る。オリゴヌクレオチドの「ペア」は、好適には配列の中央に位置している１つのヌクレオチドを除いては、同一である。ペアの２つ目のオリゴヌクレオチド（一方とは不一致）はコントロールとして用いられる。オリゴヌクレオチドペアの数は、２から１００万の間である。オリゴマーは、光誘導化学プロセスを用いて、基盤上の指定領域で合成される。基盤は、紙、ナイロン又は他の膜、フィルタ、チップ、ガラススライド、又は他の適当な固形支持体である。
【０１９８】
他方、オリゴヌクレオチドは、ＰＣＴ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｗ０９５／２５１１１６ （Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒ ｅｔ ａｌ．）に記載されているように、化学カップリング手段、及びインクジェットアプリケーション装置を用いて基盤の表面上で合成され、これらの全ては参考としてここに折り込まれる。他の観点では、ドット（又はスロット）ブロットに似た「格子」アレイでは、真空システム、加熱、ＵＶ、機械的又は化学的結合工程を用いて、ｃＤＮＡ、又はオリゴヌクレオチドを基板の表面上に配置、結合させることができる。上記のようなアレイは、手工、又は利用可能な装置（スロットブロット、又はドットブロット装置）、材料（適当な固形支持体）、及び機械（ロボット装置を含む）を用いて製造され、また、８、２４、９６、３８４、１５３６、６１４４又はこれ以上、又は商業的に用いられる装置に効果的に使用される２から１００万の間の他の数のオリゴヌクレオチドを含んでもいても良い。
【０１９９】
マイクロアレイ又は検出キットを用いてサンプルの分析を行うために、生物サンプルから得られたＲＮＡ又はＤＮＡは、ハイブリダイゼーションプローブ中に調製される。ｍＲＮＡが単離され、そしてｃＤＮＡが調製され、アンチセンスのＲＮＡ（ａＲＮＡ）を調製するためのテンプレートとして用いられる。ａＲＮＡは蛍光性ヌクレオチドの存在化で増幅し、ラベル化されたプローブがマイクロアレイ又は検出キットにおいてインキュベートされ、そして、プローブの配列がマイクロアレイ又は検出キット中の相補的なオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされる。インキュベート条件は、正確に相補的に一致しているか、又は各種程度の相補性でハイブリダイゼーションが起こるように調節される。ハイブリダイズしていないプローブを除去した後、蛍光のレベルとパターンを判定するためにスキャナが用いられる。スキャンされたイメージは、マイクロアレイ又は検出キット上の、相補性の程度、及び各々のオリゴヌクレオチド配列の相対的な量を決定するために試験される。生物学的サンプルは、体液（例えば血、尿、唾液、痰、胃液、その他）、培養細胞、生体組織検査、又は他の組織調製品から得られる。検出システムでは、全ての異なる配列において、ハイブリダイゼーションの存在、非存在、及び量を、同時に計測するのに用いられる。このデータは、サンプル中での、配列、発現パターン、変異、変異体、又は多形性といった、大規模な相関性の研究に用いられる。
【０２００】
本発明は、このようなアレイを用いて、本発明の分泌タンパク質／ペプチドの発現を同定するための方法を提供するものである。詳細には、このような方法は、テストサンプルと一つ以上の核酸分子とのインキュベートと、テストサンプル中の成分と核酸分子との結合についてのアッセイとが含まれる。このようなアッセイは、少なくとも遺伝子の一つが本発明の遺伝子及び／又は本発明の分泌タンパク質遺伝子の対立変異体である、多くの遺伝子を含むアレイに関連している。図３Ａには、本発明のＷｎｔタンパク質をコード化している遺伝子において確認されたＳＮＰ情報を示す。１つのｉｎｄｅｌ（“−”により示す）、及び２つのエキソン中のＳＮＰを含む９つのＳＮＰ変異体が確認され、これらのうちの１つはアミノ酸配列の変化を引き起こす（すなわち、非同義ＳＮＰ）。図３Ｃには、本発明のカルギザリンタンパク質をコード化している遺伝子において確認されたＳＮＰ情報を示す。４つのＳＮＰ変異体が確認された。図３Ｄには、本発明のレチノイン酸受容体応答物タンパク質をコード化している遺伝子において確認されたＳＮＰ情報を示す。４つのｉｎｄｅｌ（“−”により示す）を含む３０のＳＮＰ変異体が確認された。図３Ｅには、本発明のＭＡＰタンパク質をコード化している遺伝子において確認されたＳＮＰ情報を示す。８つのＳＮＰ変異体が確認された。図３Ｆには、本発明のフェリチンタンパク質をコード化している遺伝子において確認されたＳＮＰ情報を示す。１つのＳＮＰ変異体が確認された。これらのＳＮＰにより起こるアミノ酸配列の変化は図３Ａ〜Ｆに示され、ユニバーサル遺伝子コード、及び図２Ａ〜Ｆに示されるタンパク質配列を用いて容易に確認することができる。
【０２０１】
テストサンプルと核酸分子のインキュベートの条件は様々である。インキュベーション条件は、使用されるアッセイの形式、使用される検出方法、及びアッセイに用いられる核酸分子のタイプ及び性質に依存する。一般的に入手可能なハイブリダイゼーション、増幅、又はアレイアッセイの形式の何れかを認識している当業者は、ここに記載されるヒトゲノムの新規フラグメントを用いるに当って、容易に適用を行うことができる。このようなアッセイの例は、Ｃｈａｒｄ， Ｔ， Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ （１９８６）； Ｂｕｌｌｏｃｋ， Ｇ． Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｒｌａｎｄｏ， ＦＬ Ｖｏｌ． １ （１ ９８２）， Ｖｏｌ． ２ （１９８３）， Ｖｏｌ． ３ （１９８５）； Ｔｉｊｓｓｅｎ， Ｐ．， Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ： Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ （１９８５）に記載されている。
【０２０２】
本発明のテストサンプルには、細胞、タンパク質、細胞からの膜抽出物が含まれる。上記の方法に用いられるテストサンプルは、アッセイの形式、検出方法の性質、及びアッセイのサンプルとして用いられる組織、細胞、又はその抽出物に基づいて変化する。核酸抽出物又は細胞抽出物の調製は、当業者において周知であり、用いられるシステムと調和するサンプルを得ることにより、容易に適用することができる。
【０２０３】
本発明の他の例としては、本発明のアッセイを行うために必要な試薬を含むキットが提供される。
【０２０４】
特に本発明は、（ａ）ここに記載されるヒトゲノムのフラグメントと結合することのできる１以上の核酸分子を含む第一の容器、（ｂ）１以上の洗浄試薬、結合核酸を検出することのできる試薬を含む他の１以上の容器、とを含む１以上の容器に区分され、封入されたキットを提供するものである。
【０２０５】
詳細には、区分されたキットとしては、試薬が別々の容器に含まれているキットが含まれる。このような容器としては、小さいガラスの容器、プラスチック容器、帯状のプラスチック、ガラス又は紙、又はシリカのようなアレイ材料が含まれる。このような容器は、サンプルと試薬が混合して汚染しないように、１つの区分から他の区分へと試薬を効率的に移動することができ、またそれぞれの容器の試薬又は溶液は他の容器へと定量的に添加することができる。このような容器には、テストサンプルを入れる容器、核酸プローブを含む容器、洗浄試薬（例えば、リン酸塩緩衝液、Ｔｒｉｓ−緩衝液等）を含む容器、及び結合プローブを検出に用いられる試薬を含む容器を含む。当業者は、本発明にかかる従来未知の分泌タンパク質遺伝子を認識し、ここに開示されている配列情報を用いて定型的に確認することができ、さらにこれを当業者において周知の確立されたキット形態、特に発現アレイに組み込むことができる。
【０２０６】
ベクター／宿主細胞
本発明はまた、ここに記載される核酸分子を含んだベクターを提供するものである。「ベクター」という用語は、ビヒクルのことを指し、好適には核酸分子であり、核酸分子の輸送をすることができるもののことである。ベクターが核酸分子である場合、核酸分子はベクターの核酸と共有結合している。本発明のこの観点では、ベクターには、プラスミド、単鎖又は二重鎖のファージ、単鎖又は二重鎖のＲＮＡ又はＤＮＡのウイルス性ベクター、又はＢＡＣ、ＰＡＣ、ＹＡＣ、ＯＲＭＡＣのような人工染色体が含まれる。
【０２０７】
ベクターは宿主細胞中に染色体外の成分として保持され、そこで核酸分子の付加的なコピーを複製及び生成する。あるいは、ベクターは宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、宿主細胞の複製の際に核酸分子の付加的なコピーを生成する。
【０２０８】
本発明は、核酸分子の保持のためのベクター（クローニングベクター）、又は核酸分子の発現のためのベクター（発現ベクター）を提供するものである。このベクターは、原核生物細胞又は真核生物細胞、又はその両方で機能することができる（シャトルベクター）。
【０２０９】
発現ベクターは、ベクター中で核酸分子と有効に結合したｃｉｓ作用性調節領域を含み、これにより宿主細胞中での核酸分子の転写が可能となる。この核酸分子は、転写に影響を及ぼす核酸分子と分離されて、宿主細胞に導入されることができる。したがって、第二の核酸分子は、ベクターからの核酸分子の転写を行うｃｉｓ調節制御領域と相互作用するトランス作用性因子を提供し得る。あるいは、トランス作用性因子は宿主細胞により提供され得る。最終的に、トランス作用性因子は、ベクター自身から作り出すことができる。しかしながら、いくつかの例では、核酸分子の転写及び／又は翻訳は無細胞系でも起こり得る。
【０２１０】
ここに記載される核酸分子の調整配列は、目的のｍＲＮＡ転写のためのプロモーターを含んで有効に結合されることができる。これらには、バクテリオファージλからの左部プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉからのｌａｃ、ＴＲＰ及びＴＡＣプロモーター、ＳＶ４０からの初期及び後期のプロモーター、ＣＭＶの極初期のプロモーター、アデノウイルスの初期及び後期のプロモーター、及びレトロウイルスのＬＴＲが含まれるが、これに限定されるものではない。
【０２１１】
転写を促進する制御領域に加えて、発現ベクターはまた、リプレッサー結合部位やエンハンサのような転写を調整する領域を含むものであり得る。この例としては、ＳＶ４０エンハンサ、サイトメガロウイルスの極初期のエンハンサ、ポリオーマエンハンサ、アデノウイルスエンハンサー、レトロウイルスＬＴＲエンハンサが含まれる。
【０２１２】
転写の開始及び制御領域を含む場合に加えて、発現ベクターはまた、転写のためのリボソーム結合部位である転写領域における、転写終了のために必要な配列を含むことができる。他の発現調整制御成分としては、ポリアデニル化信号と同様に、開始及び終止コドンが含まれる。当業者は、発現ベクターに有用な多数の調整配列を知り得る。このような調整配列は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ． ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， （１９８９）に記載されている。
【０２１３】
各種の発現ベクターは、核酸分子の発現に用いることができる。このようなベクターには、染色体、エピソーム、ウイルス由来のベクター、例えば、バクテリアプラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、人工酵母染色体のような酵母染色体成分、バクロウイルス、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、バクシニアウイルス、アデノウイルス、ポクスウイルス、シュードラビスウイルス、及びレトロウイルスのようなウイルス由来のベクターが含まれる。ベクターはまた、これらの起源の組み合わせから誘導することができ、例えば、コスミド及びファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝子成分から誘導することができる。原核及び真核生物の宿主細胞のための適切なクローニングベクター及び発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ． ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， （１９８９）に記載されている。
【０２１４】
調整配列では、１以上の宿主細胞の構成的な発現（すなわち組織特異性）、又は、温度、養分添加、又はホルモンや他のリガンドのような外生の要因による１以上の細胞タイプでの指示的な発現を提供するものである。原核及び真核生物の宿主細胞において構成的、及び指示的に発現する種々のベクターは、当業者において周知である。
【０２１５】
核酸分子は、周知の方法によってベクター核酸内に導入されることができる。通常、最終的に発現するＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列と発現ベクターが１以上の限定酵素により開裂し、その後フラグメントが共に結合することによって、発現ベクターと結合される。制限酵素の消化及び結合の手順は、当業者において周知である。
【０２１６】
適切な核酸分子を含んでいるベクターは、公知の技術を用いて、増殖又は発現のために適切な宿主細胞内へ導入することができる。バクテリア細胞には、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、及び Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍが含まれるがこれに限定されるものではない。真核生物細胞には、酵母、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａのような昆虫細胞、ＣＯＳ及びＣＨＯ細胞のような動物細胞、及び植物細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０２１７】
ここに記載されているように、融合タンパク質としてのペプチドの発現が望ましい。したがって、本発明はペプチドの生成が可能な融合ベクターを提供するものである。融合ベクターは組み換えタンパク質の発現及び溶解性を向上することができ、また、例えば、アフィニティー精製のためのリガンドの作用によって、タンパク質精製を向上することができる。タンパク質分解性開裂部位は融合部分との結合位置に導入され、このために、目的となるペプチドは最終的に融合部分から分離される。タンパク質分解酵素としては、ファクターＸａ、スロンビン、エンテロキナーゼが含まれるが、これに限定されるものではない。典型的な融合発現ベクターとしては、グルタチオンＳ−転移酵素（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、又はタンパク質Ａのそれぞれをターゲット組み換えタンパク質に融合した、ｐＧＥＸ（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０ （１９８８））、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）が含まれるが、これに限定されるものではない。好適な指示的非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５ （１９８８）、ｐＥＴ１１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５：６０−８９ （１９９０））が含まれる。
【０２１８】
組み換えタンパク質の発現は、遺伝子背景を与えることによって、宿主バクテリアにおいて最大化することができ、宿主細胞は組み換えタンパク質のタンパク質分解性の開裂欠損能力を有する（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ， Ｓ．， Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ （１９９０） １１９−１２８）。あるいは、対象となる核酸分子の配列は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのような特定の宿主細胞のために優先的に使用されるコドンとなるように変更されることができる（Ｗａｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０：２１１１−２１１８ （１９９２））。
【０２１９】
核酸分子はまた、酵母において作用する発現ベクターにより発現されることもできる。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような酵母中で発現するベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ， ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ６：２２９−２３４ （１９８７））、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ３０：９３３−９４３（１９８２））、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ５４：１１３−１２３ （１９８７））、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）が含まれる。
【０２２０】
核酸分子はまた、例えば、バクロウイルス発現ベクターを用いて、昆虫細胞内で発現されることもできる。培養昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）中のタンパク質の発現に利用されるベクターには、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ３：２１５６−２１６５ （１９８３））、及びｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９ （１９８９））が含まれる。
【０２２１】
本発明のある例においては、ここに記載されている核酸分子は、哺乳類発現ベクターを用いて哺乳類の細胞内で発現される。哺乳類発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ， Ｂ． Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０（１９８７））、及びｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ６：１８７−１９５ （１９８７））が含まれる。
【０２２２】
ここに列記されている発現ベクターとしては、核酸分子を発現するために有用であり、当業者が利用可能なベクターとして周知のもののみが示されている。ここに記載されている核酸分子の維持増殖、又は発現に好適な他のベクターは、当業者において周知である。これらは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｈ， Ｅ． Ｆ．， ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ， ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９に記載されている。
【０２２３】
ここに記載されている核酸配列がベクター中に逆方向にクローンされたベクターは、アンチセンスＲＮＡの転写を許す調整配列に結合可能であるが、本発明は、また、このようなベクターも包含するものである。このように、アンチセンス転写は、ここに記載され、コード、非コード領域の両方が含まれている核酸分子配列の、全部又は一部を生成することができる。そして、このアンチセンスのＲＮＡの発現は、センスＲＮＡの発現（調整配列、構成的、又は指示的発現、組織特異発現）に関して、前記した各パラメータに対応する。
【０２２４】
本発明はまた、ここに記載されるベクターを含む組み換え宿主細胞に関連するものである。したがって、宿主細胞には、原核生物細胞、酵母のような低真核生物細胞、昆虫細胞のような他の真核生物細胞、及び哺乳類の細胞のような高真核生物細胞が含まれる。
【０２２５】
組み換え宿主細胞は、当業者が容易に利用可能な技術により、ここに記載されるように構成されるベクターを細胞中に導入することにより、調製することができる。これらには、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、トランスダクション、インフェクション、リポフェクション、及びＳａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ． （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ， ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９）に記載されているような他の技術が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０２２６】
宿主細胞は、１以上のベクターを含むことができる。このため、異なるヌクレオチド配列が、同じ細胞の異なるベクター中に導入されることができる。同様に、核酸分子は、単独で、又は発現ベクターのトランス作用因子を与えているような、関連のない他の核酸分子と共に導入されることができる。１以上のベクターが細胞内に導入される場合、ベクターは単独で導入されるか、共に導入されるか、又は核酸分子ベクターに結合されることができる。
【０２２７】
バクテリオファージ及びウィルスベクターの場合、これらは標準的なインフェクション及びトランスダクションの操作により、封入又はカプセル化されたウイルスとして細胞内に導入されることができる。ウィルスベクターは、複製可能、又は複製欠陥であり得る。ウイルスの複製に欠陥がある場合、複製は欠陥を補完する機能が提供される宿主細胞内で起こり得る。
【０２２８】
ベクターは一般に、組み換えベクターの構成物を含む細胞の部分母集団の選択を可能とする選択性マーカーを含む。このマーカーは、ここに記載される核酸分子を含む同一のベクター内か、又は別のベクター中に含まれることができる。マーカーには、原核生物宿主細胞のためのテトラサイクリン又はアンピシリン−抵抗遺伝子、及び真核生物宿主細胞のためのジヒドロフォレート還元酵素又はネオマイシン耐性が含まれる。しかしながら、表現型特性の選択性を提供するマーカーは何れの場合にも有効である。
【０２２９】
成熟タンパク質は、バクテリア、酵母、哺乳類の細胞、及び他の細胞において、適切な調整配列の制御下で生成されることができるが、無細胞系転写及び翻訳システムもまた、ここに記載されるＤＮＡ構成物から誘導されるＲＮＡを用い、これらのタンパク質を生成するために用いることができる。
【０２３０】
ペプチドの分泌が必要とされる場合、これがキナーゼのようなタンパク質を含むマルチ膜貫通ドメイン内で達成されることは難しく、適切な分泌信号がベクター中に組み込まれる。信号配列は、これらのペプチドに内生であるか、又はペプチドに非相同であり得る。
【０２３１】
ペプチドが媒体内で分泌されない場合、典型的にはキナーゼの場合、タンパク質は、凍結融解、超音波処理、機械的破壊、分解試薬等の標準的な破壊操作によって、宿主細胞から単離されることができる。ペプチドは、硫酸アンモニウム沈降、酸抽出、又はアニオン又はカチオン交換クロマトグラフィ、ホスホセルロースクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、レクチンクロマトグラフィ、又は高速液体クロマトグラフィを含む、公知の精製方法によって、回収、精製されることができる。
【０２３２】
また、ここに記載されているペプチドの組み換え製造における宿主細胞に依存して、ペプチドは種々のグリコシル化パターンを持ち、細胞に依存してバクテリア内で製造される際にグリコシル化されないかもしれないことが理解される。さらにペプチドは、ホストを媒介する過程の結果として、いくつかの場合で最初に修飾されたメチオニンを含むものであり得る。
【０２３３】
ベクター及び宿主細胞の使用
ここに記載されているペプチドを発現している組み換え宿主細胞には、種々の使用用途がある。まず、この細胞は分泌タンパク質、又はペプチドの生成に有用であり、分泌タンパク質又はフラグメントを必要量生成するために、さらに精製を行うことができる。このため、発現ベクターを含む宿主細胞は、ペプチドの生成に有用である。
【０２３４】
宿主細胞は、分泌タンパク質、又は分泌タンパク質フラグメントに関連している細胞系のアッセイ、例えば上記したもの、同様に当業者において周知の他の形態のものの実行において有用である。このため、天然の分泌タンパク質を発現している組み換え宿主細胞は、分泌タンパク質機能を促進又は阻害する化合物のアッセイに有用である。
【０２３５】
宿主細胞はまた、機能的な影響を受ける分泌タンパク質変異体を同定するために有用である。変異が自然に生じて病理を引き起こすような場合、突然変異を含む宿主細胞は、天然の分泌タンパク質の効果を示さずに、分泌タンパク質変異体に要求される効果（例えば、機能を促進、又は阻害）を持つ化合物のアッセイに有用である。
【０２３６】
遺伝子的に工作された宿主細胞は、さらにヒト以外の遺伝子組み換え動物を生産するために用いることができる。遺伝子組み換え動物は、好適には哺乳類であり、例えば、１以上の細胞が組み換え遺伝子を含んだ、ラット又はマウスのような齧歯動物である。組み換え遺伝子は、成長中の遺伝子組み換え動物の細胞のゲノムに組み込まれ、１以上の細胞型又は組織において、成熟した動物のゲノム中に残存する外生のＤＮＡである。これらの動物は、分泌タンパク質の機能の研究、及び分泌タンパク質活性のモジュレータの同定及び評価に有用である。遺伝子組み換え動物の他の例としては、ヒト以外の霊長類、羊、犬、牛、ヤギ、鶏、及び両生類が含まれる。
【０２３７】
遺伝子組み換え動物は、例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染によって、受精卵母細胞の雄性前核細胞内に核酸分子を導入し、卵母細胞が偽妊娠性の雌性育成動物中で育成されることにより作製される。何れの分泌タンパク質ヌクレオチド配列も、マウスのようなヒト以外の動物のゲノム中に組み換え遺伝子として導入されることができる。
【０２３８】
発現ベクターに有用な調整配列、又は他の配列は、何れも組み換え遺伝子配列の一部分を形成することができる。イントロン配列及びポリアデニル化信号が、すでに含まれていない場合には、これも含まれる。組織特異性調整配列は、特定の細胞に対し分泌タンパク質が直接発現するために、組み換え遺伝子に有効に結合されることができる。
【０２３９】
受胎操作及びマイクロインジェクションを通して、遺伝子組み換え動物を生産する方法、特にマウスのような動物を用いる方法は、当業界において一般化されており、例えば、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ． ４，７３６，８６６、及び ４，８７０，００９， ｂｙ Ｌｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ４，８７３，１９１ ｂｙ Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ． ａｎｄ ｉｎ Ｈｏｇａｎ， Ｂ．， Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ， （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， １９８６） に記載されている。また、同様の方法が、他の遺伝子組み換え動物の生産のために用いられている。最初の遺伝子組み換え動物は、ゲノム中の組み換え遺伝子の存在及び／又は動物の組織や細胞内での遺伝子組み換えｍＲＮＡの発現に基づいて確認されることができる。最初の遺伝子組み換え動物は、その後、さらに組み換え遺伝子を有する動物を繁殖するために用いられることができる。その上、組み換え遺伝子を有している遺伝子組み換え動物は、さらに他の組み換え遺伝子を有する他の遺伝子組み換え動物へと生育されることができる。遺伝子組み換え動物はまた、ここに記載されている相同的な組み換え宿主細胞を用いて製造された、全ての動物又は動物の組織が含まれる。
【０２４０】
他の例では、ヒト以外の遺伝子組み換え動物は、組み換え遺伝子の調節された発現を行う選択システムを含むものとして生産されることができる。このようなシステムの１つの例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムである。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムについての記載は、例えば、Ｌａｋｓｏ ｅｔ ａｌ． ＰＮＡＳ ８９：６２３２−６２３６ （１９９２）参照。リコンビナーゼシステムのもう一つの例は、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＬＰリコンビナーゼシステムである （Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３５１−１３５５ （１９９１）。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムが組み換え遺伝子の発現の調節に用いられる場合は、動物において、Ｃｒｅリコンビナーゼ及び選択されたタンパク質の両方をコード化している組み換え遺伝子が含まれていることが必要である。このような動物は、例えば、一方は選択されたタンパク質をコード化した組み換え遺伝子を持ち、他方はリコンビナーゼをコード化した組み換え遺伝子を持った２つの組み換え遺伝子動物を交配させることにより、「二重」遺伝子組み換え動物を構成することによって提供される。
【０２４１】
ここに記載されるヒト以外の遺伝子組み換え動物のクローンは、また、Ｗｉｌｍｕｔ， Ｉ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０−８１３ （１９９７）及び、ＰＣＴ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏｓ． ＷＯ ９７／０７６６８ ａｎｄ ＷＯ ９７／０７６６９に記載されている方法に従って生産されることができる。簡単に述べると、遺伝子組み換え動物からの細胞、例えば体細胞は、単離されて、成長サイクルから出てＧ０相に入れられるように誘導することができる。静止細胞は、例えば、電気パルスの使用によって、単離された静止細胞と同種の動物の細胞核を取り除かれた卵母細胞に融合されることができる。再構成された卵母細胞は、桑実胚又は芽細胞に発達するように培養され、その後、偽妊娠性の雌性育成動物中に移される。この雌性育成動物から誕生する子孫は、細胞、例えば体細胞を単離した動物のクローンとなる。
【０２４２】
ここに記載されているペプチドを発現する組み換え細胞を含んだ遺伝子組み換え動物は、ｉｎ ｖｉｖｏの環境で、ここに記載したようなアッセイを行うために有用である。したがって、生体内に存在し、基質結合、分泌タンパク質活性化、信号伝達に影響を与えている各種の生理学的ファクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏの無細胞系又は細胞系のアッセイでは明らかにならないかもしれない。このため、これらは、基質相互作用、分泌タンパク質機能及び基質相互作用に対する特定の分泌タンパク質の影響、及びキメラ分泌タンパク質の影響を含む分泌タンパク質機能を、ｉｎ ｖｉｖｏでアッセイするための、ヒト以外の遺伝子組み換え動物を提供するために有用である。また、実質的に又は完全に一つ以上の分泌タンパク質機能を除去する突然変異である、ｎｕｌｌ変異の影響を評価することも可能である。
【０２４３】
本明細書において、上に記載された全ての刊行物及び特許は、ここに参考として折り込まれている。本発明に記載された方法及びシステムの各種修正及び変形は、本発明の範囲及び精神から外れない限り、当業者において明らかなものである。本発明は、特定の好適な具体例に関連して記述されているが、特許請求の範囲に記載された発明は、このような特定の実施例に不当に限定されないと理解されるべきである。実際に、本発明を実施するための上記方法の各種変形は、分子生物学又は関連分野の当業者において明らかであり、このようなものも特許請求の範囲に含まれるものである。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、本発明の分泌タンパク質をコード化するｃＤＮＡ分子又は転写配列のヌクレオチド配列を示す（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１〜６）。さらに、ここにはＡＴＧ開始、終止、及び組織分布のような構造及び機能情報が示され、この分子配列に基づいた発明の特定用途を容易に決定することができる。
【図２】
図２は、本発明の分泌タンパク質の予測アミノ酸配列を示す（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７〜１２）。さらに、ここにはタンパク質ファミリー、機能、変更部位のような構造及び機能情報が示され、この分子配列に基づいた発明の特定用途を容易に決定することができる。
【図３】
図３は、本発明の分泌タンパク質をコード化している遺伝子領域のゲノム配列を示す（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３〜１８）。さらに、ここにはイントロン／エクソン構造、プロモーター位置のような構造及び機能情報が示され、この分子配列に基づいた発明の特定用途を容易に決定することができる。図３Ａに示すように、本発明により提供されるＷｎｔタンパク質をコード化している遺伝子において、１つのｉｎｄｅｌを含む９つのＳＮＰが確認された。図３Ｃに示すように、本発明により提供されるカルギザリンタンパク質をコード化している遺伝子において、４つのＳＮＰが確認された。図３Ｄに示すように、本発明により提供されるレチノイン酸受容体応答物タンパク質をコード化している遺伝子において、４つのｉｎｄｅｌを含む３０のＳＮＰが確認された。図３Ｅに示すように、本発明により提供されるＭＡＰタンパク質をコード化している遺伝子において、８つのＳＮＰが確認された。図３Ｆに示されるように、本発明により提供されるフェリチンタンパク質をコード化している遺伝子において、１つのＳＮＰが確認された。
【図１】
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【図３】
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