(57)【要約】グルココルチコイド作用を増強し、そしてグルココルチコイド−誘発された副腎皮質抑制を低めるためへのコルチコトロフ−由来の糖タンパク質ホルモン（CGH）の使用が記載される。CGHは、使用されるグルココルチコイドの低い用量を可能にし、そしてグルココルチコイド−誘発性副作用を妨げるか又は低めるために、グルココルチコイドと同時投与され得る。さらに、本発明は、グルココルチコイドの置換体としてのCGHの使用方法、又は広範囲の炎症状態の処理方法を提供する。組換えCGHの精製方法がさらに提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療的に十分な量のコルチコトロフ（corticotroph）−由来の糖タンパク質ホルモン（CGH）ポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る、炎症を処理するための方法であって、前記ポリペプチドの投与が前記哺乳類の炎症状態の臨床的に有意な改良をもたらすことを特徴とする方法。
【請求項２】
治療的に十分な量のCGHポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る、炎症を軽減するための方法であって、前記ポリペプチドの投与が前記哺乳類の炎症状態の臨床的に有意な改良をもたらすことを特徴とする方法。
【請求項３】
治療的に十分な量のCGHポリペプチド、及び１又は複数のグルココルチコイドを哺乳類に投与することを含んで成る、炎症を処理するための方法であって、前記ポリペプチドの投与が前記哺乳類の炎症状態の臨床的に有意な改良をもたらすことを特徴とする方法。
【請求項４】
治療的に十分な量のCGHポリペプチド、及び１又は複数のグルココルチコイドを哺乳類に投与することを含んで成る、炎症を軽減するための方法であって、前記ポリペプチドの投与が前記哺乳類の炎症状態の臨床的に有意な改良をもたらすことを特徴とする方法。
【請求項５】
治療的に十分な量のCGHポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る、炎症を処理するための方法であって、前記ポリペプチドの投与がグルココルチコイド処理の代替として使用され、そして前記ポリペプチドの投与が前記哺乳類の炎症状態の臨床的に有意な改良をもたらし、又はグルココルチコイド−誘発された副作用の予防又は軽減をもたらすことを特徴とする方法。
【請求項６】
前記CGHポリペプチドが、配列番号３で示されるようなアミノ酸配列、及び配列番号６で示されるようなアミノ酸配列を含んで成るヘテロダイマーを形成する請求項1, 2, 3, 4又は5記載の方法。
【請求項７】
前記炎症状態の臨床学的に有意な改良が、
ａ）痛みの軽減又は阻害；
ｂ）腫張の軽減又は阻害；
ｃ）赤みの軽減又は阻害；
ｄ）発熱の軽減又は阻害；及び
ｅ）機能の損失の軽減又は阻害から成る群から選択される請求項1, 2, 3, 4又は5記載の方法。
【請求項８】
前記炎症が急性又は慢性である請求項1, 2, 3, 4又は5記載の方法。
【請求項９】
前記哺乳類が、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、結節性多発性動脈炎、ヴェーゲナー肉芽腫、側頭動脈炎、腎臓疾患、アレルギー疾患、喘息、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支炎、肺気腫、乾癬、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン疾病、慢性活性肝炎、アルコール性肝障害、肝障害、非アルコール性脂肪肝病、急性リンパ性白血病、リンパ腫、類肉腫症、血小板減少症、自己免疫溶血性貧血、臓器移植、卒中、脊髄損傷、薬物反応、蕁麻疹、亜急性肝壊死、多発性骨髄腫、特発性血小板減少性紫斑病、後天性溶血性貧血、及び悪性高熱から成る群から選択された疾病を有する請求項1, 2, 3, 4又は5記載の方法。
【請求項１０】
前記炎症が、呼吸器官、表皮、胃腸管又は肝臓に位置する請求項1, 2, 3, 4又は5記載の方法。
【請求項１１】
前記CGHポリペプチドによる処理が、グルココルチコイド−誘発性副作用を妨げるか又は軽減する請求項２又は４記載の方法。
【請求項１２】
前記グルココルチコイド−誘発性副作用が、副腎皮質の抑圧、骨粗鬆症、骨壊死、ステロイド誘発性カタラクタ、ステロイド誘発性肥満治療、コルチコイド誘発性精神病、消化管出血、胸腺萎縮、及び良性頭蓋内圧亢進症から成る群から選択される請求項10記載の方法。
【請求項１３】
記載CGH及びグルココルチコイドが、同時に又は連続的に投与される請求項２又は４記載の方法。
【請求項１４】
前記グルココルチコイドが、短期作用性、中期作用性又は長期作用性である請求項２又は４記載の方法。
【請求項１５】
前記グルココルチコイドが、アルクロメタゾンジプロピオネート、アムシノニド、ベクロメタゾンジプロピオネート、ベタメタゾン、安息香酸ベタメタゾン、ベタメタゾンジプロピオネート、ベタメタゾンナトリウム、吉草酸ベタメタゾン、プロピオン酸クロベタゾール、クロコルトロンピバレート、ヒドロコルチゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン酪酸塩、ヒドロコルチゾンシピオネート、リン酸ナトリウム・ヒドロコルチゾン、コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム、ヒドロコルチゾン吉草酸塩、酢酸コルチゾン、デソニド、デソキシメタゾン、デキサメタゾン、酢酸デキサメタゾン、 デキサメタゾンナトリウム、酢酸ジフロラゾン、酢酸フルドロコルチゾン、フルニソリド、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルオロメトロン、フルランドレノイド、ハルシノニド、メドリゾン、メチルプレドニゾロン、酢酸メチルプレドニゾロン、メチルプレドニゾロンナトリウム、モメタゾンフルオエート、酢酸パラメタゾン、プレドニゾロン、酢酸プレドニゾロン、プレドニゾロンリン酸ナトリウム、プレドニゾロンテブテート、プレドニソン、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、二酢酸トリアムシノロン、及びトリアムシノロンヘキサセトニドから成る群から選択される請求項２又は４記載の方法。
【請求項１６】
前記ポリペプチドの投与が、前炎症性指標の低下をもたらす請求項1, 2, 3又は4記載の方法。
【請求項１７】
前記炎症性指標が、前炎症性サイトカイン又は炎症関連好中球浸潤の血清レベルにより測定される請求項15記載の方法。
【請求項１８】
ペプチド−受容体複合体の形成方法であって、
固定された受容体を供給し；そして
前記受容体とペプチドとを接触せしめ、ここで前記ペプチドが配列番号３で示されるようなアミノ酸配列を含んで成り、そして前記受容体がTSHRであり；
それにより、前記受容体が前記ペプチドを結合することを含んで成る方法。
【請求項１９】
細胞培養上清液内に含まれるCGHの精製方法であって、
前記CGH含有上清液を、カチオン交換樹脂を含むクロマトグラフィーカラムに、前記CGHが前記カチオン交換樹脂に結合する条件下で適用し；
前記カチオン交換樹脂からCGHを溶出し、そしてCGH−含有プールを捕獲し；
前記CGH−含有プールを、疎水性相互作用樹脂を含むクロマトグラフィーカラムに、前記CGHが前記疎水性相互作用樹脂に結合する条件下で適用し；
前記疎水性相互作用樹脂からCGHを溶出し、そしてCGH−含有プールを捕獲し；
前記CGH−含有プールをサイズ排除カラムに適用し、そして前記サイズ排除樹脂からCGHを溶出し、そしてCGH−含有プールにおけるCGHを捕獲することを含んで成る方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景：
炎症は通常、有害な剤及び損傷された組織を破壊し、希釈し、又は隔てる外傷又は微生物侵入に対する局在化された保護応答である。炎症により特徴づけられる炎症は、ヒトにおける羅病率及び死亡率の有意な原因である。炎症は通常、外来性材料による宿主の侵入に対する防御応答として生じるが、それはまた、機械的外傷、毒素及び新形成に対する応答により誘発される。外来物として宿主組織の異常認識により引き起こされる過剰炎症、又は炎症工程の延長はまた、炎症性疾患、例えば糖尿病、喘息、アテローム性硬化症、白内障、再灌流性損傷、癌、後−感染性症状、例えば感染性髄膜炎及びリウマチ性発熱及びリウマチ性疾患、例えば全身性エリテマトーデス及びリウマチ様関節炎を導く。従って、多くのそのような疾患において炎症を阻害する剤を生成する必要がある。
【０００２】
グルココルチコイドは、視床下部、下垂体前葉又は副腎皮質における病理学的のために、副腎不全を有する個人のための置換療法として治療的に使用される。グルココルチコイドはまた、種々の数の非内分泌性疾患の処理のためにも使用される。置換療法を受ける患者におけるのを除いて、グルココルチコイドは特異的でも又は治療的でもなく：それらはそれらの抗炎症及び免疫抑制性質により症状の軽減を提供する。グルココルチコイドは、リウマチ性疾患、例えばリウマチ様関節炎、全身性エリテマトーデス及び種々の脈管炎、例えば結節性多発性動脈炎、ヴェーゲナー肉芽腫症及び巨細胞動脈炎を処理するために使用される。非炎症性変性関節疾患（例えば、変形性関節炎）において、又は種々の局部痛み症候群（例えば、腱炎又は滑液包炎）においては、グルココルチコイドは一時的な疾病再発の処理のために、局部注射により投与される。
【０００３】
グルココルチコイドは、腎疾患、アレルギー性疾患、例えば枯草熱、血清病、蕁麻疹、接触性皮膚炎、薬物反応、ハチ刺痛、アレルギー性鼻炎及び血管神経性水腫を処理するために使用される。
グルココルチコイドはまた、気管支喘息、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支炎及び気腫を処理するためにも使用される。典型的には、剤、例えばメチルプレドニゾロン又はプレドニゾンが使用される。また、吸入されるグルココルチコイド、例えばベクロメタゾンジプロピオネート、トリアミシノロンアセトニド、フルニソリド又はブデソニドが使用され得る。
【０００４】
グルココルチコイド又は広範囲の皮膚疾患、例えば乾癬、皮膚炎、汗腺炎性化膿、疥癬、バラ色粃糠疹、扁平苔癬、及び毛孔性紅色粃糠疹を処理するために使用される。グルココルチコイドが有用である他の炎症状態は、毒性表皮壊死融解症、多型紅斑、及び日焼けである。
IBD、潰瘍性大腸炎、及びクローン病は、グルココルチコイドにより処理され得る。グルココルチコイドはまた、慢性活性肝炎、アルコール症肝疾患及び重症性肝疾患を処理するためにも有用である。グルココルチコイドは、それらの抗リンパ球効果のために、急性リンパ性白血病及びリンパ腫の化学療法に使用される。グルココルチコイドはまた、類肉腫症、血小板減少症、赤血球の自己免疫性破壊、臓器移植、発作及び脊髄損傷の処理において有用である。
【０００５】
しかしながら、グルココルチコイドが有用なほど、それらは重度の副作用を有する。次の２種のカテゴリーの毒性効果がグルココルチコイドの治療使用に起因する：グルココルチコイド療法の欠点に起因するそれら及び超生理学的用量の連続使用に起因するそれら。グルココルチコイド処理の停止の最も重度の合併症は、視床下部/下垂体/副腎（HPA）軸が抑制されている長期の治療の後、急速すぎるグルココルチコイドの中止に起因する急性副腎不足である。HPAシステムの抑制に起因する結果の他に、長期のグルココルチコイド療法に起因する多くの他の合併症、例えば体液及び電解質代謝異常、高血圧症、高血糖、感染に対して高められた感受性、カタラクタ、増殖停止、脂肪再分配、皮膚線条、皮下溢血、アクネ、多毛、及び胸腺萎縮が存在する。
【０００６】
従って、炎症を処理するための新規の療法、例えばグルココルチコイド処理の副作用を低めるグルココルチコイド療法に関して投与される療法を提供する必要がある。
本発明は、当業者に明らかであるそれら及び他の使用のためのそのようなポリペプチドを提供する。
【発明の開示】
【０００７】
本発明の観点においては、治療的に十分な量のCGHポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る、炎症を処理するための方法が提供され、ここで前記ポリペプチドの投与が前記哺乳類の炎症状態の臨床的に有意な改良をもたらすことを特徴とする。１つの態様においては、前記CGHポリペプチドは、配列番号３で示されるようなアミノ酸配列、及び配列番号６で示されるようなアミノ酸配列を含んで成るヘテロダイマーを形成する。もう１つの態様においては、前記炎症状態の臨床学的に有意な改良は、痛みの軽減又は阻害；腫張の軽減又は阻害；赤みの軽減又は阻害；発熱の軽減又は阻害；及び機能の損失の軽減又は阻害から成る群から選択される。
【０００８】
本発明のもう１つの観点においては、治療的に十分な量のCGHポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る、急性又は慢性炎症の処理方法が提供される。１つの態様において、前記炎症又は炎症状態は、自己免疫疾患に関連している。
本発明のもう１つの観点においては、治療的に十分な量のCGHポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る炎症の処理方法が提供され、ここで前記炎症はリウマチ性疾患に関連する。前記リウマチ性疾患は、リウマチ様関節炎、全身性エリテマトーデス、脈管炎疾患又は他のリウマチ性疾患であり得る。
【０００９】
本発明のもう１つの観点においては、治療的に十分な量のCGHポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る炎症の処理方法が提供され、ここで前記炎症はアレルギー性応答に関連する。
本発明のもう１つの観点においては、治療的に十分な量のCGHポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る炎症の処理方法が提供され、ここで前記炎症は呼吸器管に位置する。１つの観点においては、前記炎症は、肺又は洞に位置する。もう１つの態様においては、炎症は、喘息、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支炎又は気腫に関連する。
【００１０】
本発明のもう１つの観点においては、治療的に十分な量のCGHポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る炎症の処理方法が提供され、ここで前記炎症は表皮に位置する。１つの態様においては、炎症は乾癬又は皮膚炎に関連する。
本発明のもう１つの観点においては、治療的に十分な量のCGHポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る炎症の処理方法が提供され、ここで前記炎症は胃腸管に位置する。１つの態様においては、炎症は炎症性腫疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、又は炎症関連の下痢に関連する。
【００１１】
本発明のもう１つの観点においては、治療的に十分な量のCGHポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る炎症の処理方法が提供され、ここで前記炎症は対宿主性移植片病に関連する。１つの態様においては、炎症は単一器官又は多器官不全に関連する。
本発明のもう１つの観点においては、治療的に十分な量のCGHポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る炎症の処理方法が提供され、ここで前記炎症は敗血症に関連する。
【００１２】
本発明のもう１つの観点においては、治療的に十分な量のCGHポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る炎症の処理方法が提供され、ここで前記炎症は肝臓に位置する。１つの態様においては、炎症は慢性急性肝炎、アルコール症肝疾患又は非アルコール性脂肪肝疾患に関連する。
【００１３】
本発明のもう１つの観点においては、治療的に十分な量のCGHポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る炎症の処理方法が提供され、ここで前記哺乳類は、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、結節性多発性動脈炎、ヴェーゲナー肉芽腫、側頭動脈炎、腎臓疾患、アレルギー疾患、喘息、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支炎、肺気腫、乾癬、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン疾病、慢性活性肝炎、アルコール性肝障害、肝障害、非アルコール性脂肪肝病、急性リンパ性白血病、リンパ腫、類肉腫症、血小板減少症、自己免疫溶血性貧血、臓器移植、卒中、脊髄損傷、薬物反応、蕁麻疹、亜急性肝壊死、多発性骨髄腫、特発性血小板減少性紫斑病、後天性溶血性貧血、及び悪性高熱から成る群から選択された疾病を有する。
【００１４】
本発明のもう１つの観点においては、治療的に十分な量のCGHポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る炎症の処理方法が提供され、ここでCGHポリペプチドによる処理は、グルココルチコイド処理の代潜体として使用される。
本発明のもう１つの観点においては、治療的に十分な量のCGHポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る炎症の処理方法が提供され、ここでCGHポリペプチドによる処理は、グルココルチコイド誘発性副作用を妨げるか又は軽減する。１つの態様においては、前記グルココルチコイド−誘発性副作用が、副腎皮質の抑圧、骨粗鬆症、骨壊死、ステロイド誘発性カタラクタ、ステロイド誘発性肥満治療、コルチコイド誘発性精神病、消化管出血、胸腺萎縮、及び良性頭蓋内圧亢進症から成る群から選択される。
【００１５】
本発明の観点においては、治療的に十分な量のCGHポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る、炎症を軽減するための方法が提供され、ここで前記ポリペプチドの投与が前記哺乳類の炎症状態の臨床的に有意な改良をもたらすことを特徴とする。１つの態様においては、前記CGHポリペプチドは、配列番号３で示されるようなアミノ酸配列、及び配列番号６で示されるようなアミノ酸配列を含んで成るヘテロダイマーを形成する。もう１つの態様においては、前記炎症状態の臨床学的に有意な改良は、痛みの軽減又は阻害；腫張の軽減又は阻害；赤みの軽減又は阻害；発熱の軽減又は阻害；及び機能の損失の軽減又は阻害から成る群から選択される。
【００１６】
本発明のもう１つの観点においては、治療的に十分な量のCGHポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る、急性又は慢性炎症の軽減方法が提供される。１つの態様において、前記炎症又は炎症状態は、自己免疫疾患に関連している。
本発明のもう１つの観点においては、治療的に十分な量のCGHポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る炎症の軽減方法が提供され、ここで前記炎症はリウマチ性疾患に関連する。前記リウマチ性疾患は、リウマチ様関節炎、全身性エリテマトーデス、脈管炎疾患又は他のリウマチ性疾患であり得る。
【００１７】
本発明のもう１つの観点においては、治療的に十分な量のCGHポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る炎症の軽減方法が提供され、ここで前記炎症はアレルギー性応答に関連する。
本発明のもう１つの観点においては、治療的に十分な量のCGHポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る炎症の軽減方法が提供され、ここで前記炎症は呼吸器管に位置する。１つの観点においては、前記炎症は、肺又は洞に位置する。もう１つの態様においては、炎症は、喘息、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支炎又は気腫に関連する。
【００１８】
本発明のもう１つの観点においては、治療的に十分な量のCGHポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る炎症の軽減方法が提供され、ここで前記炎症は表皮に位置する。１つの態様においては、炎症は乾癬又は皮膚炎に関連する。
本発明のもう１つの観点においては、治療的に十分な量のCGHポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る炎症の軽減方法が提供され、ここで前記炎症は胃腸管に位置する。１つの態様においては、炎症は炎症性腫疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、又は炎症関連の下痢に関連する。
【００１９】
本発明のもう１つの観点においては、治療的に十分な量のCGHポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る炎症の軽減方法が提供され、ここで前記炎症は対宿主性移植片病に関連する。１つの態様においては、炎症は単一器官又は多器官不全に関連する。
本発明のもう１つの観点においては、治療的に十分な量のCGHポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る炎症の軽減方法が提供され、ここで前記炎症は敗血症に関連する。
本発明のもう１つの観点においては、治療的に十分な量のCGHポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る炎症の軽減方法が提供され、ここで前記炎症は肝臓に位置する。１つの態様においては、炎症は慢性急性肝炎、アルコール症肝疾患又は非アルコール性脂肪肝疾患に関連する。
【００２０】
本発明のもう１つの観点においては、治療的に十分な量のCGHポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る炎症の軽減方法が提供され、ここで前記哺乳類は、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、結節性多発性動脈炎、ヴェーゲナー肉芽腫、側頭動脈炎、腎臓疾患、アレルギー疾患、喘息、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支炎、肺気腫、乾癬、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン疾病、慢性活性肝炎、アルコール性肝障害、肝障害、非アルコール性脂肪肝病、急性リンパ性白血病、リンパ腫、類肉腫症、血小板減少症、自己免疫溶血性貧血、臓器移植、卒中、脊髄損傷、薬物反応、蕁麻疹、亜急性肝壊死、多発性骨髄腫、特発性血小板減少性紫斑病、後天性溶血性貧血、及び悪性高熱から成る群から選択された疾病を有する。
【００２１】
本発明のもう１つの観点においては、治療的に十分な量のCGHポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る炎症の軽減方法が提供され、ここでCGHポリペプチドによる処理は、グルココルチコイド処理の代潜体として使用される。
本発明のもう１つの観点においては、治療的に十分な量のCGHポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る炎症の軽減方法が提供され、ここでCGHポリペプチドによる処理は、グルココルチコイド誘発性副作用を妨げるか又は軽減する。１つの態様においては、前記グルココルチコイド−誘発性副作用が、副腎皮質の抑圧、骨粗鬆症、骨壊死、ステロイド誘発性カタラクタ、ステロイド誘発性肥満治療、コルチコイド誘発性精神病、消化管出血、胸腺萎縮、及び良性頭蓋内圧亢進症から成る群から選択される。
【００２２】
本発明の観点においては、治療的に十分な量のCGHポリペプチド、及び１又は複数のグルココルチコイドを哺乳類に投与することを含んで成る、炎症を処理するための方法が提供され、ここで前記ポリペプチドの投与が前記哺乳類の炎症状態の臨床的に有意な改良をもたらすことを特徴とする。１つの態様においては、前記CGHポリペプチドは、配列番号３で示されるようなアミノ酸配列、及び配列番号６で示されるようなアミノ酸配列を含んで成るヘテロダイマーを形成する。もう１つの態様においては、前記炎症状態の臨床学的に有意な改良は、痛みの軽減又は阻害；腫張の軽減又は阻害；赤みの軽減又は阻害；発熱の軽減又は阻害；及び機能の損失の軽減又は阻害から成る群から選択される。
【００２３】
本発明のもう１つの観点においては、治療的に十分な量のCGHポリペプチド、及び１又は複数のグルココルチコイドを哺乳類に投与することを含んで成る、急性又は慢性炎症の処理方法が提供される。１つの態様において、前記炎症又は炎症状態は、自己免疫疾患に関連している。
本発明のもう１つの観点においては、治療的に十分な量のCGHポリペプチド、及び１又は複数のグルココルチコイドを哺乳類に投与することを含んで成る炎症の処理方法が提供され、ここで前記炎症はリウマチ性疾患に関連する。前記リウマチ性疾患は、リウマチ様関節炎、全身性エリテマトーデス、脈管炎疾患又は他のリウマチ性疾患であり得る。
【００２４】
本発明のもう１つの観点においては、治療的に十分な量のCGHポリペプチド、及び１又は複数のグルココルチコイドを哺乳類に投与することを含んで成る炎症の処理方法が提供され、ここで前記炎症はアレルギー性応答に関連する。
本発明のもう１つの観点においては、治療的に十分な量のCGHポリペプチド、及び１又は複数のグルココルチコイドを哺乳類に投与することを含んで成る炎症の処理方法が提供され、ここで前記炎症は呼吸器管に位置する。１つの観点においては、前記炎症は、肺又は洞に位置する。もう１つの態様においては、炎症は、喘息、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支炎又は気腫に関連する。
【００２５】
本発明のもう１つの観点においては、治療的に十分な量のCGHポリペプチド、及び１又は複数のグルココルチコイドを哺乳類に投与することを含んで成る炎症の処理方法が提供され、ここで前記炎症は表皮に位置する。１つの態様においては、炎症は乾癬又は皮膚炎に関連する。
本発明のもう１つの観点においては、治療的に十分な量のCGHポリペプチド、及び１又は複数のグルココルチコイドを哺乳類に投与することを含んで成る炎症の処理方法が提供され、ここで前記炎症は胃腸管に位置する。１つの態様においては、炎症は炎症性腫疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、又は炎症関連の下痢に関連する。
【００２６】
本発明のもう１つの観点においては、治療的に十分な量のCGHポリペプチド、及び１又は複数のグルココルチコイドを哺乳類に投与することを含んで成る炎症の処理方法が提供され、ここで前記炎症は対宿主性移植片病に関連する。１つの態様においては、炎症は単一器官又は多器官不全に関連する。
本発明のもう１つの観点においては、治療的に十分な量のCGHポリペプチド、及び１又は複数のグルココルチコイドを哺乳類に投与することを含んで成る炎症の処理方法が提供され、ここで前記炎症は敗血症に関連する。
【００２７】
本発明のもう１つの観点においては、治療的に十分な量のCGHポリペプチド、及び１又は複数のグルココルチコイドを哺乳類に投与することを含んで成る炎症の処理方法が提供され、ここで前記炎症は肝臓に位置する。１つの態様においては、炎症は慢性急性肝炎、アルコール症肝疾患又は非アルコール性脂肪肝疾患に関連する。
【００２８】
本発明のもう１つの観点においては、治療的に十分な量のCGHポリペプチド、及び１又は複数のグルココルチコイドを哺乳類に投与することを含んで成る炎症の処理方法が提供され、ここで前記哺乳類は、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、結節性多発性動脈炎、ヴェーゲナー肉芽腫、側頭動脈炎、腎臓疾患、アレルギー疾患、喘息、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支炎、肺気腫、乾癬、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン疾病、慢性活性肝炎、アルコール性肝障害、肝障害、非アルコール性脂肪肝病、急性リンパ性白血病、リンパ腫、類肉腫症、血小板減少症、自己免疫溶血性貧血、臓器移植、卒中、脊髄損傷、薬物反応、蕁麻疹、亜急性肝壊死、多発性骨髄腫、特発性血小板減少性紫斑病、後天性溶血性貧血、及び悪性高熱から成る群から選択された疾病を有する。
【００２９】
本発明のもう１つの観点においては、治療的に十分な量のCGHポリペプチド、及び１又は複数のグルココルチコイドを哺乳類に投与することを含んで成る炎症の処理方法が提供され、ここでCGHポリペプチドによる処理は、グルココルチコイド誘発性副作用を妨げるか又は軽減する。１つの態様においては、前記グルココルチコイド−誘発性副作用が、副腎皮質の抑圧、骨粗鬆症、骨壊死、ステロイド誘発性カタラクタ、ステロイド誘発性肥満治療、コルチコイド誘発性精神病、消化管出血、胸腺萎縮、及び良性頭蓋内圧亢進症から成る群から選択される。
【００３０】
本発明のもう１つの観点においては、治療的に十分な量のCGHポリペプチド、及び１又は複数のグルココルチコイドを哺乳類に投与することを含んで成る、炎症を軽減するための方法が提供され、ここで前記ポリペプチドの投与が前記哺乳類の炎症状態の臨床的に有意な改良をもたらす。１つの態様においては、前記CGHポリペプチドは、配列番号３で示されるようなアミノ酸配列、及び配列番号６で示されるようなアミノ酸配列を含んで成るヘテロダイマーを形成する。もう１つの態様においては、前記炎症状態の臨床学的に有意な改良は、痛みの軽減又は阻害；腫張の軽減又は阻害；赤みの軽減又は阻害；発熱の軽減又は阻害；及び機能の損失の軽減又は阻害から成る群から選択される。
【００３１】
もう１つの観点においては、本発明は、CGHポリペプチド及びグルココルチコイドを同時に投与することを含んで成る、炎症の処理方法を提供する。もう１つの観点においては、本発明は、CGHポリペプチド及びグルココルチコイドを連続的に投与することを含んで成る、炎症の処理方法を提供する。もう１つの観点においては、本発明は、CGHポリペプチド及び短期作用性のグルココルチコイドを投与することを含んで成る、炎症の処理方法を提供する。１つの態様においては、グルココルチコイドは、コルチゾン、プレドニゾン、プレドニソロン又はメチルプレドニゾロンである。もう１つの観点において、本発明は、CGHポリペプチド及び中期作用性グルココルチコイドを投与することを含んで成る、炎症の処理方法を提供する。１つの態様においては、グルココルチコイドはトリアムシノロンである。もう１つの観点においては、本発明は、CGHポリペプチド及び長期作用性グルココルチコイドを投与することを含んで成る、炎症の処理方法を提供する。もう１つの態様においては、グルココルチコイドはデキサメタゾン又はβ−メタゾンである。
【００３２】
本発明のもう１つの観点においては、治療的に十分な量のCGHポリペプチド、及び１又は複数のグルココルチコイドを哺乳類に投与することを含んで成る、炎症を処理するための方法が提供され、ここで前記グルココルチコイドは、アルクロメタゾンジプロピオネート、アムシノニド、ベクロメタゾンジプロピオネート、ベタメサゾン、安息香酸ベタメタゾン、ベタメサゾンジプロピオネート、ベタメサゾンナトリウム、吉草酸ベタメタゾン、プロピオン酸クロベタゾール、クロコルトロンピバレート、ヒドロコルチゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン酪酸塩、ヒドロコルチゾンシピオネート、リン酸ナトリウム・ヒドロコルチゾン、コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム、ヒドロコルチゾン吉草酸塩、酢酸コルチゾン、デソニド、デソキシメタゾン、デキサメサゾン、酢酸デキサメタゾン、 デキサメサゾンナトリウム、酢酸ジフロラゾン、酢酸フルドロコルチゾン、フルニソリド、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルオロメトロン、フルランドレノイド、ハルシノニド、メドリゾン、メチルプレドニゾロン、酢酸メチルプレドニゾロン、
【００３３】
メチルプレドニゾロンナトリウム、モメタゾンフルオエート、酢酸パラメタゾン、プレドニゾロン、酢酸プレドニゾロン、プレドニゾロンリン酸ナトリウム、プレドニゾロンテブテート、プレドニソン、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、二酢酸トリアムシノロン、及びトリアムシノロンヘキサセトニドから成る群から選択される。１つの態様においては、前記グルココルチコイドは、アルクロメタゾンジプロピオネート、アムシノニド、ベクロメタゾンジプロピオネート、ベタメサゾン、安息香酸ベタメタゾン、ベタメサゾンジプロピオネート、ベタメサゾンナトリウム、吉草酸ベタメタゾン、プロピオン酸クロベタゾール、クロコルトロンピバレート、ヒドロコルチゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン酪酸塩、ヒドロコルチゾンシピオネート、リン酸ナトリウム・ヒドロコルチゾン、コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム、ヒドロコルチゾン吉草酸塩、酢酸コルチゾン、デソニド、デソキシメタゾン、デキサメサゾン、酢酸デキサメタゾン、
【００３４】
デキサメサゾンナトリウム、酢酸ジフロラゾン、酢酸フルドロコルチゾン、フルニソリド、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルオロメトロン、フルドロキシコルチド、ハルシノニド、メドリゾン、メチルプレドニゾロン、酢酸メチルプレドニゾロン、メチルプレドニゾロンナトリウム、モメタゾンフルオエート、酢酸パラメタゾン、プレドニゾロン、酢酸プレドニゾロン、プレドニゾロンリン酸ナトリウム、プレドニゾロンテブテート、プレドニソン、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、二酢酸トリアムシノロン、又はトリアムシノロンヘキサセトニドの誘導体として投与される。
【００３５】
本発明の観点においては、治療的に十分な量のコルチコトロフ−由来の糖タンパク質ホルモン（CGH）ポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る、炎症を処理するための方法が提供され、ここで前記ポリペプチドの投与が前炎症指標の低下をもたらす。１つの態様においては、前記前炎症指標は、血清レベル又は前炎症性サイトカインにより測定される。１つの態様においては、前記前炎症性サイトカインはTNFαである。もう１つの態様においては、前記前炎症指標は、炎症関連の好中球浸潤の低下により測定される。
もう１つの観点においては、本発明は、ペプチド−受容体複合体の形成方法提供し、ここで固定された受容体を供給し；そして前記受容体とペプチドとを接触せしめ、ここで前記ペプチドが配列番号３で示されるようなアミノ酸配列を含んで成り、そして前記受容体がTSHRであり；それにより、前記受容体が前記ペプチドを結合することを含んで成る。
【００３６】
もう１つの観点においては、本発明は、細胞培養上清液内に含まれるCGHの精製方法を提供し、ここで前記CGH含有上清液を、カチオン交換樹脂を含むクロマトグラフィーカラムに、前記CGHが前記カチオン交換樹脂に結合する条件下で適用し；前記カチオン交換樹脂からCGHを溶出し、そしてCGH−含有プールを捕獲し；前記CGH−含有プールを、疎水性相互作用樹脂を含むクロマトグラフィーカラムに、前記CGHが前記疎水性相互作用樹脂に結合する条件下で適用し；前記疎水性相互作用樹脂からCGHを溶出し、そしてCGH−含有プールを捕獲し；前記CGH−含有プールをサイズ排除カラムに適用し、そして前記サイズ排除樹脂からCGHを溶出し、そしてCGH−含有プールにおけるCGHを捕獲することを含んで成る。
本発明のそれらの及び他の観点は、本発明の次の特定の記載により明らかに成るであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
本発明は、グルココルチコイドが投与される疾病を処理するための新規療法を提供する。従って、本発明は、グルココルチコイドが投与される疾病を有する個人に、コルチコトロフ由来の糖タンパク質ホルモンを、単独で又はグルココルチコイドと共に投与する方法を含んで成る。
本明細書に引用されるすべての引例の教授は、引用により本明細書に組みこまれる。
【００３８】
コルチコトロフ−由来の糖タンパク質ホルモン（CGH）は、下垂体前葉体におけるコルチコトロフ細胞から放されるヘテロダイマータンパク質ホルモンである。CGHは、国際特許出願番号PCT/US01/09999号（公開番号01/73034号）に開示される。それは、αサブユニット、すなわち糖タンパク質ホルモンα2（GPHA2）、及びβサブユニット、すなわち糖タンパク質ホルモンβ5（GPHB5）から構成される。GPHA2は、これまでZsig51（国際特許出願番号PCT/US99/03104号、1999年8月19日に公開された公開番号WO99/41377号；アメリカ特許第6,573,363号）として呼ばれている。
【００３９】
配列番号１は、十分な長さのポリペプチドGPHA2をコードするヒトcDNA配列であり、そして配列番号２は、ヒトGPHA2の十分な長さのポリペプチドである。配列番号３は、シグナル配列を有さない成熟GPHA2ポリペプチド配列である。配列番号４は、十分な長さのGPHB5ポリペプチドをコードするヒトcDNA配列である。配列番号５は、十分な長さのGPHB5ポリペプチドである。配列番号６は、シグナル配列を有さない成熟GPHB5ポリペプチドである。配列番号７は、十分な長さのGPHB5ポリペプチドをコードするヒトゲノムDNA配列である。本発明はまた、配列番号１，２，３，４，５，６及び７に対して実質的に相同であるCGHポリペプチド及びポリヌクレオチドも包含する。
【００４０】
CGHは、副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）、すなわち副腎皮質の下垂体調節物を生成する同じ細胞から放される。ACTHは、副腎皮質からのグルココルチコイド（GC）及び男性ホルモンの合成及び放出を刺激する。CGHは、副腎皮質、及びグルココルチコイドに対して応答する組織、例えば免疫系の細胞を標的化する。コルチコトロフホルモンとしてのCGH及びACTHの作用は、ステロイド−介在性ストレス応答の調節のための新規範例を表す。グルココルチコイドの作用を強化し、そして副腎皮質抑制を軽減するためへのCGHの使用が記載される。
【００４１】
CGHと共に投与され得るグルココルチコイドステロイドの例は、アルクロメタゾンジプロピオネート、アムシノニド、ベクロメタゾンジプロピオネート、ベタメサゾン、安息香酸ベタメタゾン、ベタメサゾンジプロピオネート、ベタメサゾンナトリウム、吉草酸ベタメタゾン、プロピオン酸クロベタゾール、クロコルトロンピバレート、ヒドロコルチゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン酪酸塩、ヒドロコルチゾンシピオネート、リン酸ナトリウム・ヒドロコルチゾン、コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム、ヒドロコルチゾン吉草酸塩、酢酸コルチゾン、デソニド、デソキシメタゾン、デキサメサゾン、酢酸デキサメタゾン、 デキサメサゾンナトリウム、
【００４２】
酢酸ジフロラゾン、酢酸フルドロコルチゾン、フルニソリド、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルオロメトロン、フルドロキシコルチド、ハルシノニド、メドリゾン、メチルプレドニゾロン、酢酸メチルプレドニゾロン、メチルプレドニゾロンナトリウム、モメタゾンフルオエート、酢酸パラメタゾン、プレドニゾロン、酢酸プレドニゾロン、プレドニゾロンリン酸ナトリウム、プレドニゾロンテブテート、プレドニソン、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、二酢酸トリアムシノロン、及びトリアムシノロンヘキサセトニドを包含する。
【００４３】
CGH構造及び局在性：
GPHA2は、既知の糖タンパク質ホルモンのαサブユニットに対して25％の配列同一性を有し、そして類似する構造モチーフを有することが予測される。GPHB5は、ヒト柔毛性ゴナドトロピン、甲状腺刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、及び黄体形成ホルモンのβサブユニットに対して約30％の配列同一性を有し、そしてまた、構造的に保存されることが予測される。GPHA2は他の糖タンパク質ホルモンのβサブユニットのいずれとも二量体化せず、またGPHB5も通常のαサブユニットと二量体化しない。例５に示されるように、同じ細胞において同時発現される場合、GPHA2及びGPHB5は、GPHA2サブユニット上の２つのN−結合されたグルコシル化及びGPHB5サブユニット上の１つのN−結合されたグリコシル化を含む非共有ヘテロダイマーCGHを形成する。
【００４４】
CGHは下垂体前葉体におけるコルチコトロフ細胞において生成され、そして貯蔵される。例１を参照のこと。コルチコトロフは、分布、組織学、構造及びホルモン含有率により特徴づけられるように、下垂体前葉体における６種の異なった細胞型の１つである。Molitch, in Endocrinology and Metabolism (Felig and Frohman, eds), pp. 111-171, McGraw-Hill, (2001) 及び Asa など. , in Endocrinology (DeGroot and Jameson, eds) Vol. 1, pp. 167-182, W. B. Saunders, (2001)を参照のこと。
【００４５】
コルチコトロフ又はACTH−生成細胞は、下垂体前葉体細胞の約20％を構成し、そして好塩基性及び過ヨウ素酸Schiff（PAS）−陽性である。コルチコトロフはまた、ACTHに対する特異的抗血清により免疫染色することにより同定され得る。CGH及びACTHは、それらの細胞における多数の分泌顆粒内に含まれ、そしてコルチコトロフィン−放出ホルモン（CRH）により、細胞の刺激に基づいて放出される。さらに、AVP（抗利尿ホルモン）は、コルチコトロフに対してCRHにより添加形式で作用する。
【００４６】
下垂体からのACTH及びCGH放出の調節：
血液における種々の物質がACTH及びCGH分泌に影響を及ぼすが、CRHは、下垂体前葉体からのそれらのホルモンの放出の主要制御を発揮する。CRHは、拍動性及び位相性パターンで視床下部の室傍核（PVN）におけるニューロンから放出される。コリン作用性伝達及び刺激的アミノ酸神経伝達物質の刺激は、CRH放出の重要な活性化因子であると思われる。酸化窒素はまた、CRH放出の調節に親密に関与し、そして酸化窒素シンターゼ（NOS）はPVNにおけるニューロンにおいてCRHと同時局在される。サイトカインは、NOSの活性化によりCRH放出を刺激することができる。オピオイドは、PVNからのCRH放出を阻害する。
【００４７】
CRH放出の日周期リズムは、パルス振幅の変動により生成される。ピークレベルは、約6a.m.で達し、4p.m.までの間、低下し、次にさらに、11p.m.〜3a.m.の間、最低まで低下する。Snyder, in Endocrinology and Metabolism (Felig and Frohman, eds), pp. 173-216, McGraw-Hill, (2001)を参照のこと。ACTHレベルはCRHに対して同時に応答し；GCレベルはまた、同時に応答するが、しかし約30分まで遅延する。
【００４８】
CRHは、持続される二相性態様で下垂体からのACTH分泌を刺激する。最初に、予備形成されたペプチドが放出され、そして次に、新規ACTHの合成が、高められた放出速度を維持するために刺激される。ストレスに応答して、末梢及び中枢シグナルが、ACTH及びCGH放出を調節するために下垂体により統合される。末梢サイトカインカスケード、視床下部放出因子、及び下垂体内サイトカインは、コルチコトロフホルモンの放出を調節するために同等の態様で作用する。それらのサイトカインは、白血病阻害因子（LIF）及びインターロイキン (IL)-6を包含し、そしてまた、CRH放出を調節するために視床下部に対して作用する。White and Ray, in Endocrinology (DeGroot and Jameson, eds) Vol. 1, pp. 221-233, W. B. Saunders, (2001)を参照のこと。
【００４９】
副腎皮質のコルチコトロフホルモン調節：
副腎皮質は、３種の主要カテゴリーのステロイドホルモンを生成する。そのアルドステロンが最も重要である鉱物コルチコイドは、球状帯、すなわち皮質の約15％を占める、副腎皮質の最も外側の層において生成される。球状帯のすぐ下部は、皮質の約75％を供に占める、束状帯及び次の網状帯である。束状帯の細胞はコレステロールに富んでおり、そして循環系中に放出されるグルココルチコイドコルチゾールのほとんどを生成する。網状帯はまた、コルチゾールを生成するが、しかし主に、アンドロゲン、例えばデヒドロエピアンドロステロンを生成する。
【００５０】
ACTHは、副腎機能及び構造に対して劇的な効果を有する。コルチゾールは、ACTHの投与の数分後に放出され、そして１時間以内に、副腎重量は高められる。延長されたコルチコトロフ刺激は、皮質の肥大及び肥厚を引き起こす。コルチゾールは刺激の数分後に放されるが、ステロイドホルモン分泌の主要調節は、ステロイドホルモン合成のレベルで存在する。皮質のGC−生成細胞においては、ACTH受容体活性化にカップリングされる受容体−介在性環状アデノシン一リン酸（cAMP）は、コルチゾール合成の第１段階である、コレステロールをプレグネノロンに転換する酵素の活性化をもたらす。コルチゾール合成のための速度制限酵素は、高められたcAMPを通して転写レベルで調節され、ホルモン刺激に続く合成機構の維持された活性化がもたらされる。例２は、CGHによる副腎の処理に続いてcAMP生成の刺激を通して、培養された副腎細胞系におけるCGH受容体の存在を示す。従って、副腎におけるCGH作用は、副腎細胞機能のために重要な経路の活性化を高める。
【００５１】
逆に言えば、コルチコトロフホルモン濃度が臨床学的に低い場合、延長された又は高い用量のGC治療、副腎質量及びステロイド作用活性により生まれる情況は実質的に低下する。副腎抑制として知られているこの状態は、GC治療に続く数週〜数ヶ月間、持続する重度の副作用である。この延長された回復期間、副腎は、多くの環境下で適切なストレス応答を開始することができない。例４に記載されるように、CGH及びグルココルチコイドデキサメタゾンによる処理は、延長されたグルココルチコイド療法の副腎萎縮を妨げる。グルココルチコイド療法と供に使用されるCGHは、延長されたグルココルチコイド療法のために、副腎の延長された抑制を低めることが予測される。
【００５２】
視床下部−下垂体−副腎（HPA）軸の調節：
視床下部−下垂体及び副腎は、神経内分泌回路を形成し、この主要機能はコルチゾール生成の調節である。コルチゾールは、CRH及びACTHの生成を低めることにより、この軸に対する従来のフィードバック調節を発揮する。CGHレベルは、それらの同時局在化のために、ACTHと同時に、たぶん低下する。高められたコルチゾールによるACTH分泌のフィイードバック調節は、早い、中間の早さの及び遅い成分を有するものとして記載されている。
【００５３】
早い及び中間の早さのフィードバックは、それらの合成の阻害によるよりもむしろ、存在するCRHの開放の阻害により仲介されると思われる。早いフィードバックは弱い刺激に対するACTH応答を鈍くするが、しかし強い刺激、例えば内毒素及び手術に対する応答を可能にする。グルココルチコイド濃度が特に延長されたグルココルチコイド療法により上昇するにつれて、遅いフィードバックはACTHの低められた又は不在の合成を可能にし、そして結果的に、CRHの投与に対する下垂体の非応答性を生成する。Miller and Chrousos, in Endocrinology and Metabolism (Felig and Frohman, eds), pp. 387-524, McGraw-Hill, (2001)を参照のこと。
【００５４】
グルココルチコイド作用の分子機構：
グルココルチコイドは、炎症及び免疫応答のほぼすべての要素に影響を及ぼすことができる。一般的に、GCは一次応答を刺激する状態又は損傷に影響を及ぼさないが、しかし変わりに、開始ストレッサーに対する応答の出現を改良する。基本的GCレベルがストレス応答を可能にし、そしてそれを増強することができることは一般的に許容されているが、高められたレベルは応答を制限するよう作用し、従って、回復に寄与する。Sapolskyなど., Endocr. Rev. 21: 55-89 (2000) を参照のこと。そのような相互作用は免疫応答の大きさ及び期間を調節し、そして恒常性に影響を及ぼすサイトカインの過剰生成を妨げるよう作用することができる。
【００５５】
グルココルチコイドは、ホルモンの結果に基づいて、細胞の核にトランスロケートし、そして標的遺伝子の転写の変更された速度を引き起こす、従来のステロイドホルモン受容体に結合することにより、応答性細胞に対するそれらの効果を発揮する。GC受容体（GR）は、身体じゅうで発現され、そして非常に低いフィードバック調節を受けやすい。炎症応答において、GCは、遺伝子転写を抑制することにより、免疫応答の急性相メディエーターの生成を阻害するよう作用する。GCの最も一般的な効果は、サイトカイン、及び免疫及び炎症反応を促進する他の炎症メディエーターの合成及び放出を阻害することである。それらは、IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-8, IL-12, TNFα（主要壊死因子α）、IFNγ（インターフェロンγ）、RANTES（活性化に基づいて調節され、発現され、そして正常T細胞により分泌される）、酸化窒素、エイコサノイド、コラゲナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子、ヒスタミン及びエラスターゼを包含するが、但しそれらだけには限定されたない。Sapolskyなど., Endocy Rev 21: 55-89 (2000) を参照のこと。
【００５６】
GR−介在性遺伝子抑制は、核因子NF−κB（前炎症シグナル化経路の十分に特徴づけられた成分）の阻害に起因する。Rothwarf and Karin, Sci STKE 1999: RE1 (1999)を参照のこと。NF−κB複合体は、Rolタンパク質に関連する転写因子ファミリーから製造される。刺激に続いて、NF−κB複合体は、阻害IκBサブユニットのリン酸化及び続く分解により細胞質において活性化される。機能的p65-p50ダイマーは、核にトランスローケートされ、そしてNF−κB標的遺伝子の調節領域における特定の配列を結合する。NF−κBを通してサイトカインシグナル化のGR−介在性阻害は、GCの抗炎症及び免疫抑制効果の原因であると思われる。Miesfeld, in Endocrinology (DeGroot and Jameson, eds) Vol. 2, pp. 1647-1654, W. B. Saunders, (2001)を参照のこと。
【００５７】
治療応答の誘発におけるGCの相対的能力は、受容体−結合活性、及び全身性循環における作用の期間と相互関係する。通常使用されるグルココルチコイドは、短期作用性、中期作用性及び長期作用性として分類される。コルチゾール、すなわち副腎皮質において生成される天然のヒトグルココルチコイドは、短期作用性グルココルチコイドである。他の例は、コルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン及びメチルプレドニゾロンを包含する。トリアムシノロンは、中期作用性コルチコイドの例である。Axelrod, in Endocrinology (DeGroot and Jameson, eds) Vol. 2, pp. 1671-1682, W. B. Saunders, (2001)を参照のこと。
【００５８】
CGH受容体：
CGHは、甲状腺−刺激ホルモン（TSH）又は甲状腺刺激ホルモン受容体との相互作用を通してその効果を発揮する。TSH受容体（TSHR）は、G−タンパク質結合された、７−トランスメンブラン受容体スーパーファミリーのメンバーである。TSH受容体の活性化は、下流の細胞効果を引き起こす、ヘテロトリマーGタンパク質との結合を導く。TSH授与体は、サブタイプGs, Gq, G12及びGiのGタンパク質と相互作用することが示されている。特に、Gsとの相互作用は、アデニルシクラーゼの活性化及び高められたレベルのcAMPを導く。Laugwitz など. , Proc Natl Acad Sci U SA 93: 116-20 (1996)を参照のこと。cAMPレベルの上昇は、タンパク質キナーゼA、多能タンパク質キナーゼ、及び種々の細胞効果を誘発する転写因子の活性化を導く。Bourneなど., Nature 349: 117-27 (1991) を参照のこと。
【００５９】
TSHRは、糖タンパク質ホルモンTSHへの暴露に続いて、甲状腺の主要活性化因子として甲状腺において最初に同定された。下垂体前葉体からのTSH開放は、甲状腺ホルモンの分泌、甲状腺ホルモン合成の刺激及び細胞増殖をもたらすTSHRを刺激する。TSH開放は甲状腺ホルモンレベルにより調節され、そして高められたグルココルチコイドレベルにより阻害される。Utiger, in E7ldocrinology aizd Metabolism (Felig and Frohman, eds), pp. 261-347, McGraw-Hill, (2001)を参照のこと。
【００６０】
最近、TSHRは、これまで認識されていない多くの細胞型、例えば免疫系、脳、脂肪及び生殖器官の細胞において同定されている。例３を参照のこと。それらの組織はまた、副腎機能のエフェクターとしてCGH及びGCについての同等役割を示唆する、グルココルチコイド作用の標的物である。
CGHは、TSHRの有能な活性化因子である。脂肪細胞においては、ナノモル以下のレベルのCGHが遊離脂肪酸（FFA）の放出を刺激する。TSHに比較して、CGHは10倍低いモル濃度でFFAの開放を刺激する。
【００６１】
免疫応答におけるCGHの作用：
炎症は、痛み、腫脹、赤み、発熱及び機能の損失により従来、特徴づけられて来た。炎症性疾患は、慢性又は急性現象、例えば外傷、損傷及びストレス、及び自己免疫状態に起因し、そして例えば手術、感染、アレルギー、自己免疫性の結果であり得る。
【００６２】
TSH受容体は、免疫系、例えばグルココルチコイド作用の標的物における多くの細胞に見出される。それらは、単球/マクロファージ、T−細胞、B−細胞、樹状突起細胞及び多型核白血球細胞を包含する。例３を参照のこと。また、Bagriacik and Klein, J Iinmunol 164: 6158-65 (2000), and Kiss など., Iinmunol Lett 55: 173-7 (1997)を参照のこと。ビオチニル化されたCGH又はTSHを用いての流動細胞計測法が、それらの免疫細胞型の表面上でのTSHRの発現を確めるために使用されて来た（例６を参照のこと；また、Bagriacik and Klein, J. Immunol. 164: 6158-65, (2000) を参照のこと）。
【００６３】
TSHRの活性化は、それらの受容体が機能的であることを示唆する、樹状突起細胞及びT−細胞における高められたcAMPを導くことが示されている。多くのそれらの細胞型におけるcAMPレベルの上昇は、いくつかの炎症性サイトカイン、例えばIL-1, IL-6, IL-12, TNFα及びIFNγの合成分泌を阻害することが示されている。Delgado and Ganea, J Biol Chenz 274: 31930-40 (1999)を参照のこと。さらに、炎症メディエーター、例えば酸化窒素の生成は、マクロファージにおける高められたcAMPにより抑制される。Delgado など., Ann N Y Acad Sci 897: 401-14 (1999)を参照のこと。それらの作用は、免疫系におけるグルココルチコイド作用について上記に記載される生物学的現象に匹敵する。
【００６４】
免疫細胞によるTNFαの生成は、炎症現象の有意な成分である。グルココルチコイドは、上記のように、NF−κBの阻害を通してTNFαを抑制するよう作用する。TSHRの活性化及びcAMPの上昇はまた、JNKキナーゼによりリン酸化される、転写因子c−Junのリン酸化の阻害によるTNFα発現の阻害をもたらす。Delgadoなど., J. Biol. Chem. 273: 31427-36 (1998) を参照のこと。c-Junリン酸化は、TNFαプロモーター領域におけるDNA配列との高い親和性相互作用のために必要とされる。刺激の不在下で、それらのDNA配列は、転写の負のレギュレーターとして作用することができる、cAMP応答性要素結合タンパク質（CREB）転写因子により支配される。
【００６５】
CREB転写因子は、TNFα発現に対して負の調節を発揮することが知られている、高められたcAMPの下流のタンパク質キナーゼAによるリン酸化により活性化される。Delgado など., J Biol Chezn 273: 31427-36 (1998)を参照のこと。従って、CGHは、単独で、又はGCによる補助治療において、重要な炎症メディエーターであるTNFαを抑制するよう作用することができる。下記例７に見出されるように、インビボでのCGH処理は実際、致死量以下の内毒素により処理されたマウスにおけるTNFαの生成を阻害することができる。
【００６６】
免疫細胞に結合するCGHの下流の高められたcAMPは、ets-2転写因子複合体の重要な成分であるIRF-1の転写を抑制する。ets-2は、T細胞介在性炎症応答の重要な刺激物であるIL-12の高レベル発現のために必要とされる。Maなど., J. Biol. Chem. 272: 10389-95 (1997) を参照のこと。IL-12は、T細胞活性化及び細胞毒性リンパ球機能に関係し、そしてTH1サブセットへのヘルパー（TH）細胞の分化を促進する。Trinchierri, Int. Rev. Immunol. 16: 365-96 (1998) を参照のこと。グルココルチコイドは、主に転写因子NF-κBの阻害を通してIL-12合成を阻害する。従って、CGHは、単独で、又はグルココルチコイドと供にCGHを投与することにより、哺乳類における炎症応答を軽減するために使用され得る。この投与の効果は、IL-12の低下により測定され得る。IL-12レベルを測定するための方法は、当業者に通常知られており、そして市販されている。
【００６７】
胸腺細胞及びT細胞においては、cAMP上昇は、IκBαの安定化及びNF-κBトランスロケーションの続く欠陥を生む。Manna and Aggarwal, J Ininmunol 161: 2873-80 (1998)を参照のこと。他の研究は、競争機構を通して、高められたcAMPによるNF-κB転写活性の阻害を報告している。リン酸化されたCREBとNF-κBとの間の限定量の補活性化因子CREB結合タンパク質（CREBP）についての競争は、低レベルのNF-κB転写活性をもたらすことが示唆されている。Ollivier など., Bio chez 271: 20828-35 (1996)を参照のこと。
【００６８】
IL-10は、IL-12及びTNFα生成をダウンレギュレートする抗炎症性サイトカインである。GCへの末梢血液リンパ球の適度な暴露は、IL-10生成を高める。Franchimont など., J Clin Endocrinol Metab 84: 2834-9 (1999)を参照のこと。IL-10開放は、最高濃度のGCでのみ阻害される。IL-10合成は、高められたcAMPにより高められる。Platzer など., Eur J Imrnunol 29: 3098- 104 (1999)を参照のこと。これは、免疫抑制において、単独で又はグルココルチコイドを組合してのCGHの役割を示唆する。
【００６９】
本明細書に教授されるように、炎症及び免疫疾患を処理するためにCGHを用いる新規方法は免疫系の複数成分を標的化するために使用され得る。例えば、例８に示されるように、インビボでのCGH処理は、感作化で、又はDTH応答の攻撃期で投与される場合、遅延された型の過敏性（DTH）反応を抑制することができる。CGHの抗炎症作用は、DTHモデルの炎症におけるグルココルチコイドデキサメタゾンにより生成されるその作用に類似する。例７及び８は、単独で投与されるCGHの有能な抗炎症作用を示し、そしてグルココルチコイドと供にCGHの同時投与が低下するグルココルチコイド投与量の手段を提供することを示唆する。
【００７０】
グルココルチコイドを強化するか又は置換するためへのCGHの使用：
HPA軸の機能的成分として、CGHは、グルココルチコイドが有益であるすべての臨床指標においてグルココルチコイド治療の置換のための、又はその治療と供に治療剤として使用されるであろう。
【００７１】
グルココルチコイドは、中でも最も通常使用される薬物である。それらは、マイナーな皮膚状態から生命脅威の問題、例えば白血病及び器官移植片拒絶までの多くの医薬問題を処理するために使用される。単独での又はGC治療と供にCGHの臨床的使用は、アレルギー性疾患、例えば喘息、薬物反応及び蕁麻疹を包含するが、但しそれらだけには限定されない。関節炎、特にリウマチ様関節炎もまた包含される。他の使用は、炎症性胃腸疾患、例えば炎症性大腸炎及び潰瘍性結腸炎、亜急性肝壊死及び限局性回腸炎を包含する。
【００７２】
自己免疫疾患、例えば紅斑性狼瘡、クローン病、および自己免疫溶血性貧血はまた、CGHのみ又はグルココルチコイドと組合しての処理のための指標として包含される。CGHは特に移植片拒絶、例えば腎臓、肝臓、心臓及び肺移植片の処理のために有益である。CGHは、血液疾患、例えば白血病、多発性骨髄腫、特発性血小板減少性紫斑病、及び後天性溶血性貧血の処理のために特に有益である。CGHから有益である他の疾病は、類肉腫症、グルココルチコイドにより処理される眼病、神経疾患、腎臓疾患、及び悪性高熱を包含する。さらに、CGHはまた、敗血症及び多臓器不全を処理するためにも使用され得る。
【００７３】
さらに、本発明のポリペプチドは、炎症性疾患の診断においても使用され得る。そのような診断は、ペプチド−受容体複合体の形成を提供するキットにより行われ得、ここでCGHはペプチドであり、そしてTSHRは受容体であり、そして炎症は、前炎症性指標の低下を測定することにより検出される。
【００７４】
CGHの配合及び投与：
CGHは、グルココルチコイド処理と供に、又はそれに代わるものとして投与され得る。これは、CGHがステロイドの投与の前、その間又はその後に投与され、そして独立型療法であることを意味する。投与方法は、静脈内、腹膜内、筋肉内及び局部的投与を包含する。医薬的に許容できる担体は、水、塩溶液及び緩衝液を包含するが、但しそれらだけには限定されない。用量範囲は通常、0.1μg〜0.1mg/kg体重/日であることが予測され、そして正確な用量は、処理される病状の性質及び重症度、患者の形質、等を考慮して、許容される基準に従って臨床医により決定される。
【００７５】
この用量範囲内で、5μg/kg/日の用量が使用され得る。またこの範囲内で、５〜100μg/kg/日の範囲がまた使用され得る。最初に試みる有用な用量は、40〜50μg/kg/日である。しかしながら、その用量は、医者により決定されるように、高くても又は低くても良い。薬物配合及び用量範囲の完全な論議については、Renzingtozz's Plaar7naceutical Sciences, 17th Ed. , (Mack Publishing Co. , Easton, Penn. , 1990),及び Goodman and Gilman's : The Pharmacological Bases of Therapeutics, 9h Ed. (Pergamon Press 1996)を参照のこと。
【００７６】
医薬使用に関しては、本発明のタンパク質は、経口的に、直腸的に、非経口的に（特に、静脈内又は皮下）、槽内、膣内、腹腔内、局部的（粉末、軟膏、ドロップ又は経皮内パッチ）、頬内、又は肺又は鼻腔内吸入剤として、投与され得る。静脈内投与は、ボーラス注射、又は１〜数時間の典型的な期間にわたっての注入によるであろう。一般的に、医薬配合物は、CGHは、CGHタンパク質、及び医薬的に許容できるビークル、例えば塩溶液、緩衝溶液、水中、５％デキストロース又は同様のものを含むであろう。配合はさらに、１又は複数の賦形剤、保存剤、安定剤、緩衝剤、表面上でのタンパク質損失を妨げるためのアルブミン、等を含むことができる。
【００７７】
配合方法は、当業界において良く知られており、そして例えば、Remington : The Science and Practice of Phar77lacy, Gennaro, ed., Mack Publishing Co. , Easton, PA, 19th ed. , 1995に開示される。CGHポリペプチドの用量は、一般的に毎日〜毎週のスケジュールで投与されるであろう。用量の決定は、当業者のレベル内である。タンパク質は、数日〜数ヶ月又は数年にわたって、急性又は慢性処理のために投与され得る。一般的に、治療的有効量のCGHは、炎症状態において臨床学的に有意な変化を生成するために十分な量である。
【００７８】
CGH投与の利点：
GCは効果的な遍在する生物学的調節であるが、GC療法は重度の副作用を有する。従って、いずれかの治療プロトコールにおいて有効用量のGCを低めることが高く所望される。グルココルチコイド作用を強化するか又は増強し、又はさらに置換する補助療法は、より低い用量のGCの使用を可能にするであろう。免疫抑制のメディエーターとしてのCGHの発現は、GCを伴って又はそれを伴わないで、CGHを投与し、又は/それに従って、低いGC用量を伴って、同等の治療効果を生成する能力を導く。
【００７９】
例９は、正常マウスの４週間の毎日のCGH処理は、リンパ細胞集団においていずれの測定できる変更も導かなかったことを示す。GCによる類似する処理は、いくつかのリンパ細胞集団において、特に胸腺において、T−リンパ球成熟の部位の劇的な低下を導く。結果として、GCによる処理は、感染、例えば細菌、ウィルス、菌類及び寄生体感染の危険性を高める。Chrousos, in Endocrinology and Metabolism (Felig and Frohman, eds), pp. 609-632, McGraw-Hill (2001)を参照のこと。GC用量を低めるか、又は治療をCGHのみにより置換するためへのCGHの同時投与は、それらの感染の危険性を低めることが予測される。
【００８０】
GC治療のいくつかの有害な結果は、処理の期間よりも用量により関連する。骨の無血管又は虚血性壊死は、GC治療の共通する副作用であり、そして用量の結果であると思われる。Chrousos, in Endocrit2ology and Metabolism (Felig and Frohman, eds), pp. 609-632, McGraw-Hill (2001)を参照のこと。ステロイド−誘発性白内障、すなわちGC処理された患者における有意な危険性がそれらの個人におけるグルココルチコイドの高い局部濃度のためである証拠が存在する。炎症のモデュレーターとしてのCGHの発見は、GC投与の副作用の同時低下を伴って、GC用量の低下を可能にする。
【００８１】
GC治療の他の有害な結果は、CGHの同時投与により改善され得る。オステオポローシスは、長期グルココルチコイド治療における主要制限因子である。グルココルチコイドは、一部、アポプトシスを生成することにより、骨−形成細胞に対して、及び骨吸収を刺激することにより、破骨細胞に対して作用すると思われる。高い用量のGCは、腸カルシウム吸収を阻害することが知られている。Singer, in Endocrinology and Metabolism (Felig and Frohman, eds), pp. 1179-1219, McGraw-Hill (2001)を参照のこと。GC用量の低下は、長期GC使用の骨においては有害な結果を最少にする手段として研究されており、そして最少の可能な治療用量の使用は強く促進される。
【００８２】
Chrousos, in Endocrinology and Metabolism (Felig and Frohman, eds), pp. 609-632, McGraw-Hill (2001)を参照のこと。骨芽細胞（例３）、すなわち骨形成細胞におけるCGH受容体の存在はまた、CGHが骨形成のGC−介在性阻害に対して保護的であることを示唆する。従って、骨において、CGH受容体の活性化は、骨細胞における分化された機能を刺激し、従って、グルココルチコイドの前アポプトシス効果を阻害するcAMPを高める。Siddhanti and Quarles, J Cell Biocheni 55: 310-20 (1994)を参照のこと。
【００８３】
CGH同時投与により減じるグルココルチコイド投与の追加の副作用は、肥満、コルチコステロイド誘発性精神病、消化管出血、及び良性頭蓋内圧亢進症を包含する。
さらに、上記に示され、そして本明細書において教授されるように、CGHの抗−炎症効果は、CGH投与によるグルココルチコイド治療の完全な置換を可能にする。
CGHはまた、単独型治療として、又はグルココルチコイド、例えばデキサメタゾン又はプレドニゾンと供に関節炎を処理するためにも使用され得る。CGHの効果は、コラーゲン誘発された関節炎についてのインビボモデルにおいて測定され得る。Tanaka, Y. など., Zm/M. Res. 45: 283-88,1996を参照のこと。
【００８４】
HPA抑制を低めるためへのCGHの使用：
HPA軸のフィードバック調節は上記に記載されている。GC治療の間、副腎皮質機能は有意に抑制されるようになる。延長された抑制は、ACTH及びその成長−刺激活性の欠失のために、副腎皮質の極端な萎縮を引き起こす。そのようなフィードバック抑制からの回復は、遅く生じ、そしてグルココルチコイド療法の中断に続いて、常に重要な考慮である。患者が慢性GC処理に続く適切なストレス応答を開始できる程度への副腎皮質の機能的回復は、１〜12ヶ月かかる。結果として、グルココルチコイド投与は典型的には、治療処理の最後まで、数ヶ月間、維持レベルで続けられる。Chrousos, in Endocrinology and Metabolis7n (Felig and Frohman, eds), pp. 609-632, McGraw-Hill (2001)を参照のこと。
【００８５】
副腎皮質の回復の時間は、前のGC治療の合計持続期間、及び合計のグルココルチコイド用量に相互関係する。回復速度はまた、GCが低められる場合に与えられる用量、及び処理の初期相の間に投与される用量により決定される。副腎皮質の回復は一般的に、副腎抑制に関連する萎縮を逆転するために、正常な生理学的範囲以上のACTHレベルを必要とする。高められたACTHレベルは典型的には、十分な基本的コルチゾールレベルがフィードバック阻害を通してACTHレベルを低める前、GC治療の中止に続いて数ヶ月間、見出される。しかしながら、ACTHレベルが正常範囲に戻った後でさえ、有意なストレッサーに続いて高められたATCHへの副腎の暴露は、不鮮明な応答をもたらす。このために、低い用量のGC投与が、患者が適切なストレス応答を開始できることを確めるために、続けられる。
【００８６】
外因性GC投与のための置換体として内因性GC生成を刺激するためへのACTHの使用は集中的に研究されて来た。Axelrod, in Textbook of Rheumatology (Kelley など. , eds), WB Saunders (1993)を参照のこと。ACTHの使用は、副腎皮質抑制を劇的に低め、そして多くの場合、過反応性及び過形成状態をもたらす。しかしながら、ACTH投与の同時鉱物コルチコイド及びアンドロゲン刺激性室のために、ACTHは好ましい処理方法ではない。外因性GC処理の停止に続く副腎抑制を逆転するためへのACTHの使用がまた研究されて来た。ACTHの投与は、副腎不足の進行又は推移を逆転しない。Chrousos, in Endocrinology and Metabolism (Felig and Frohman, eds), pp. 609-632, McGraw-Hill (2001)を参照のこと。今日まで、阻害がグルココルチコイド治療に起因すると、正常なHPA機能への戻りを促進するための方法は存在しない。
【００８７】
副腎抑制は標準の実施により臨床的に評価される。Axelrod, in Textbook of Rheumatology (Kelley など. , eds) WB Saunders (1993)を参照のこと。グルココルチコイドが約24時間、回収され、そして測定される用量のACTHが与えられる。基線からのコルチゾールの相対的上昇が、有意なストレス関連現象に対して適切に応答する副腎の能力を評価するために、ACTH投与に続いて特定の時間で測定される。基本的コルチゾールレベルにおける変動のために、副腎欠失は、絶対的な測定されるレベルによってではなく、コルチゾール生成の上昇により決定される。
【００８８】
CGHのコルチコトロフ性質の発見は、副腎抑制を妨げるための新規方法を提供する。グルココルチコイド治療におけるCGHの同時投与は、副腎萎縮及び従って、副腎抑制を低めるか又は妨げることができる。CGHは、副腎皮質におけるTSH受容体の活性化を通して副腎皮質に対して作用する。これは、正常な皮質機能の維持のために必要である、皮質におけるcAMPの生成を刺激する。
【００８９】
例４は、CGHにより生成される皮質刺激の能力を示す。根深い副腎肥大が、それらの動物の肝臓からのCGHの過剰発現及び分泌を導く、CGHを発現する副腎ベクターの導入に続いてマウスにおいて観察された。肥大は、内部皮質層、束状帯及び網状帯において明らかであった。上記記載されるように、皮質のそれらの帯は、副腎からのコルチゾールの合成及び放出を担当している。例４はまた、CGHタンパク質の慢性注入により皮質刺激の能力を記載する。副腎重量の有意な上昇が、正常な雌マウスへの組換えCGHの２週間の毎日の注入の後に示された。それらの２種の実験は、副腎皮質のCGH刺激がHPA軸調節の成分であることを示唆する。さらに、ACTHの不在下で、導入されたCGHは、皮質機能の維持のために副腎皮質により必要とされる刺激性シグナルを提供するであろう。
【００９０】
例４において教授されるように、グルココルチコイドと供に使用されるCGHは、グルココルチコイドのみによる処理に続いて見出される副腎重量の損失の防止により示されるように、副腎萎縮を妨げる。グルココルチコイドと供にCGHの使用は、２種の機構により副腎抑制を低めることができる。第１に、CGHの同時投与は、上記に記載されるように、低い重度の抑制をもたらすことができる、低い合計用量のグルココルチコイドの使用を可能にすることができる。第２に、副腎皮質に対するCGHの刺激性効果は、皮質の萎縮を改善し、副腎の長期抑制を妨げ、そして有意なストレッサーに対するHPA軸応答を回復する。
本発明は次の非制限的例によりさらに例示される。
【実施例】
【００９１】
例１：CGHはコルチコトロフにおいて発現される：
要約：下垂体前葉体におけるCGH発現の細胞特異的局在化を、２つの段階において評価した。第１に、二重現場ハイブリダイゼーションを、下垂体前葉体における同じサブセットの細胞におけるGPHA2及びGPHB5 mRNAの同時発現を示すために使用した。次に、それらの細胞の識別を、下垂体前葉体における異なった細胞集団のためのタンパク質マーカーに対して、GPHB5タンパク質の局在化について染色するために二重免疫組織化学方法を用いて評価した。
【００９２】
それらのマーカーは、次のものを包含した：生長ホルモン(成長ホルモン分泌細胞のためのマーカー)、卵胞刺激ホルモン(性腺刺激ホルモン細胞)、黄体形成ホルモン(性腺刺激ホルモン細胞)、甲状腺刺激ホルモン(甲状腺刺激ホルモン細胞)、副腎皮質刺激ホルモン(コルチコトロフ)、乳腺刺激ホルモン(乳腺刺激ホルモン産生細胞)、及びS-100タンパク質(小胞性星状体及び樹枝突起細胞)。GPHB5タンパク質は、副腎皮質刺激ホルモンと供に同時局在化することが見出されており、これは、それがコルチコトロフにより生成されたことを示す。GPHB5は、他のいずれのマーカーとも同時局在化することは見出されなかった。結果的に、上記に記載される免疫組織化学データ及び現場データは、ヘテロダイマー糖タンパク質ホルモンCGHがコルチコトロフにより生成することを示す。
【００９３】
A. 現場ハイブリダイゼーションを用いてのGPHA2及びGPHB5を発現する細胞の同定：
ヒト下垂体を、現場ハイブリダイゼーションにより、GPHA2及びGPHB5発現についてスクリーンした。組織を、10％緩衝されたホルマリンに固定し、そして標準技法を用いて、パラフィンブロックに埋封した。組織を４〜８ミクロンで切断し、そして断片を標準プロトコールを用いて調製した。手短には、組織断片を、Histoclear (National Diagnostics, Atlanta, GA) によりパラフィン除去し、そして次に、エタノールにより脱水した。次に、それらをプロテイナーゼK（50μg/ml）（Boehringer Diagrostic, Indianapolis, IN）により37℃で３〜10分間、消化した。この段階に続いて、組織をアセチル化し、そして再水和化した。
【００９４】
GPHB5配列に対して特異的なオリゴヌクレオチドを用いて、ポリメラーゼ鎖反応に基づく現場方法を、緑色シグナルを付与するFTTC検出システムによりGPHB5 mRNAを可視化するために使用した。この反応に続いて、同じスライドを、ヒトGPHA2配列に対して企画されたプローブを用いて、標準現場ハイブリダイゼーションプロトコールにゆだねた。T7 RNAポリメラーゼを、アンチセンスプローブを生成するために、全コードドメイン及びGPHA2の3’UTRを含む線状化されたプラスミド鋳型と供に使用した。
【００９５】
前記プローブを、In Vitro Transcription System キット(Promega, Madison, WI)を用いて、その製造業者の説明書に従ってジゴキシゲニン（Boehringer, Ingelheim, German）によりリラベルした。ジコキシゲニン−ラベルされたGPHA2プローブを、１〜５pモル/mlの濃度で60℃で12〜16時間、スライドに付加した。スライドを、２×SSC及び0.1×SSCにより55℃で連続的に洗浄した。シグナルを、チラミドシグナル増幅（TSA, 現場間接的キット; NEN, PerkinElmer Life Sciences, Boston, MA）を用いて増幅し、そしてTexas Redにより、製造業者の説明書に従って可視化した。次に、スライドをヘマトキシリン（Vector Laboratories, Burlingame, CA）により対比染色し、そして顕微鏡により評価した。
【００９６】
結果：下垂体前葉体における拡散された細胞は、緑色及び赤色シグナルの両者を示し、このことは、それらがGPHB5及びGPHA2 mRNA発現に対して陽性であることを示唆する。２種の情報の１つのみを発現する細胞はほとんど存在しないか又はまったく存在しない。
【００９７】
B. 下垂体前葉体細胞型についてのマーカーに対するGPHB5の免疫組織化学的二重染色：
ヒト下垂体前葉体を、この細胞型がGPHB5タンパク質を発現するかどうかを決定するために、GPHB5に対する抗体及び種々の細胞型−特異的マーカーを用いてスクリーンした。二重免疫染色を、生長ホルモン(GH;成長ホルモンのためのマーカー)、卵胞刺激ホルモン(TSH;性腺刺激ホルモン)、黄体形成ホルモン(LH;性腺刺激ホルモン細胞)、甲状腺刺激ホルモン(TSH;甲状腺刺激ホルモン)、副腎皮質刺激ホルモン(ACTH;コルチコトロフ)、乳腺刺激ホルモン(PRL;乳腺刺激ホルモン産生細胞)、及びS-100タンパク質(小胞性星状体及び樹枝突起細胞)に対するGPHB5について行った。
【００９８】
サンドイッチ技法免疫組織化学を、２種の一次抗体（抗−GPHB5、及びマーカータンパク質の１つに対する抗体）、及び２種の検出システム：GPHB5の存在を示す褐色シグナルに導く、イムノペルオキシダーゼ（IP）及びDiaminobenzidine (DAB) (Ventana Bio Tek, Tucson, Arizona)、及び問題のマーカータンパク質の存在を示す赤色シグナルに導く、アルカリホスファターゼ（AP）及びBioTek Red (Ventana BioTech)を用いて、この研究に適用した。
【００９９】
この実験を、銃弾損傷で死亡した24歳の男性から採取されたヒト下垂体の断片（組織ブロック内部参照番号H01.2075）に対して行った。組織を10％緩衝されたホルマリンに固定し、そして標準技法を用いてパラフィンブロックに埋封した。組織を４〜８ミクロンに断片化し、そしてその断片を標準のプロトコールを用いて調製した。
【０１００】
試薬及びプロトコール：
正常なヤギブロッキング血清（ChemMate, CMS/Fisher: カタログ番号028-337）。一次抗体：ａ）ウサギ抗−ヒトGPHB5タンパク質（実験室内で生成された、内部参照番号E3039）、作用希釈度：１：3200。ｂ）ウサギ抗−ヒトGH（Zymed Laboratories, South San Francisco, CA、カタログ番号18−0090）、作用希釈度：１：25。ｃ）マウス抗−ヒトFSH（Zymed, カタログ番号18−0020）、作用希釈度：１：50。ｄ）マウス抗−ヒトLH（Zymed, カタログ番号18−0037）、作用希釈度：１：50。ｅ）マウス抗−ヒトTSH（Zymed, カタログ番号18−0051）、作用希釈度：1：50。ｆ）ウサギ抗−ヒトACTH（Zymed, カタログ番号18−0051）、作用希釈度：１：50。ｆ）ウサギ抗−ヒトACTH（Zymed, カタログ番号18−0087）、作用希釈度：1：50。ｇ）ウサギ抗−PRL（Zymed, カタログ番号18−0086）、作用希釈度：１：50。ｈ）ウサギ抗−S−100タンパク質（Zymed, カタログ番号18−0046）、作用希釈度：１：1000及び１：2000．
【０１０１】
二次抗体：ａ）ビオチニル化されたヤギ抗ウサギIgG（Vector, カタログ番号BA−1000）、作用溶液：7.5μg/l、2％正常ヤギ血清と供にPBSにより希釈された。ｂ）ビオチニル化されたヤギ抗マウスIgG（Vector, カタログ番号BA−9200）、作用溶液：7.5μg/l、2％正常ヤギ血清及び２％非脱脂粉乳と供にPBSにより希釈された。
検出試薬：a) DAB Detection Kit (Ventana Bio Tek Systems, Tucson, AZ カタログ番号SDK2502). b) AP Detection Kit (Ventana カタログ番号SDK306)。
方法：TechMate 500自動免疫染色機（Biotech/Ventana）、改良されたIP-APプロトコール。熱−誘発されたエピトープ回収に続くアビジン/ビオチンブロック。
【０１０２】
結果の要約：
陽性染色が、GPHB5及び他のすべての一次抗体について見出された。GPHB5は、ACTHのみと供に同時局在化するが、FSH, GH, LH, PL及びTSHと供には同時局在化しないことが見出された。GPHB5/S-100染色は最適よりも低いが、しかしGPHB5及びS−100同時局在化は示されなかった。GPHB5染色は、ACTH−生成下垂体の大部分おいて見出された。ACTHをまた発現しない、GPHB5生成細胞が少々存在する。
【０１０３】
例２：副腎皮質細胞のCGH活性化がcAMP生成をもたらす：
要約：ヒト副腎皮質細胞系NC1-H295Rを用いて、CGHのシグナルトランスダクションについて研究した。NCI−H295Rを、レポーター構造体、すなわちホタルルシフェラーゼ遺伝子を、cAMP応答要約（CRE）エンハンサー配列の制御下で含む組み換えアデノウィルスにより形質導入した。このアッセイシステムは、G3−カップリングされたGPCR（G−タンパク質カップリングされた受容体）の活性化の下流のcAMP−介在性遺伝子誘発を検出する。精製されたCGHへテロダイマータンパク質によるNCI−H295の処理は、10μMのホルスコリン、すなわちアデニルシクラーゼの構成インジューサーにより誘発された活性に等しいか又はそれよりも高いルシフェラーゼ活性の用量−依存性誘発を生成した。典型的には、CGHは、対照培地よりも15〜40倍高いルシフェラーゼ誘発の最大応答を誘発した。それの結果は、副腎皮質及びcAMPの生成におけるGPCRを通してCGHシグナルを示す。
【０１０４】
実験方法：
NCI−H295R細胞を、ATCC（CRL−1228, Manassas, VA）から入手し、そして次の通りに増殖培地において培養した：25mMのHEPES緩衝液（GIBCO, Invitrogen, Carlsbad, CA, カタログ番号15630-080）、1mMのピルビン酸ナトリウム（GIBCO、カタログ番号11360−070）、１％ITS＋１倍値サプリメント（Sigma St. Louis, MO, カタログ番号12521）及び2.5％Nu−Serum I（BD Biosciences, Lexington, KY カタログ番号355100）を含む、ダルベック変性ケーグル培地及びL−グルタミンを有するHam’s F12培地（D-MEM/F-12; GIBCO、カタログ番号11320−033）の１：１混合物。細胞を、５％CO2を含む、保湿されたインキュベーターにおいて37℃で培養した。
【０１０５】
アッセイの１又は２日前、細胞を、96−ウェルの白色不透明/透明底プレート（BD Biosciences, カタログ番号356650号）におけるウェル当たり20,000個の細胞で接種した。アッセイの１日前、細胞を、KZ55、すなわちCRE駆動のルシフェラーゼレポーターカセットを含むアデノウィルスベクターにより、細胞当たり5000個の粒子で形質導入した。一晩のインキュベーションに続いて、細胞を、アッセイ媒体（0.1％ウシ血清アルブミンにより補充されたD−MEM/F-12、ICN Biomedicals, Inc., Aurora, OH, カタログ番号103700）により１度すすぎ、続いて、試験タンパク質が添加されているアッセイ媒体において37℃で４時間インキュベートした。次に、プレートを、リン酸緩衝溶液（GIBCO、カタログ番号20012−027）により洗浄した。
【０１０６】
Promega's Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI, カタログ番号E1500)を用いて、前記処理された細胞を処理した。25μl/ウェルの細胞溶解緩衝液を、個々のウェルに添加し、そして室温で15分間インキュベートした。ルシフェラーゼ活性を、マイクロプレートルミノメーター（PerkinElmer Life Sciences, Inc. , model LB 96V2R）上で、ルシフェラーゼアッセイ基質の自動注入に従って測定した。
【０１０７】
例３：TSH受容体遺伝子発現の分布：
本発明者は、逆転写酵素ポリメラーゼ鎖反応（RT-PCR）増幅を用いて、TSHR転写体についてRNAサンプルを調べた。標準の方法を用いて、RNAサンプルを組織及び細胞系から単離し、そしてRT−PCRを、２種の別々のプライマー対により行った。第１のプライマー対は、前方向プライマー（5'TCAGAAGAAAATCAGAGGAATC）（配列番号８）及び逆方向プライマー（5'GGGACGTTCAGTAGCGGTTGTAG）（配列番号９）を包含し、それらは487bpの生成物を増幅する。増幅された生成物は、ゲノムDNA汚染から発生するシグナルを制御するためのイントロンに及ぶ。第２プライマー対は、前方向プライマー（5'CTGCCCATGGACACCGAGAC）（配列番号10）及び逆方向プライマー（5'CCGTTTGCATATACTCTTCTGAG）（配列番号11）を包含し、そしてそれらは576bpの生成物を増幅する。さらに、TSHR発現を、公開された文献におけるデータから評価した。結果は下記に記載される。
【０１０８】
A. 免疫関連細胞におけるTSH受容体：
TSH-Rを、ヒトCD14+単球（活性化の後、発現を低める）、ヒト単球細胞系THP-1及びPMA−活性化されたHL60（U937において発現されない）、休止（活性化されない）ヒトNK細胞、ヒト“休止”CD3+（及びCD4+）T細胞及びヒトB細胞及びB細胞系において発現する。マウス免疫細胞サブセットの中で、本発明者は、mTSH-RがCD4+（但し、CD8+T細胞においてではない）（活性化により低下する）、B細胞（活性化によりわずかに低下する）及びTFNγ−活性化されたマウスマクロファージ系J774において発現されることを見出した。
【０１０９】
さらに、TSHR転写体はまた、リンパ球（Szkudlinski M. W. , Fremont V. , Ronin C. , Weintraub B. D. , (2002) Physiol Rev 82 : 473-502）、及び他の免疫関連細胞型（Bagriacik EU, and Klein JR, (2000) J I7nmunol 164: 6158-65）に存在することが示されている。
【０１１０】
B. 副腎におけるTSH受容体：
いくつかの成人ヒト正常副腎から単離されたRNAと供に、副腎皮質癌細胞系H295RからのRNAは、TSHRに関し陽性であることが見出された。公開された文献はまた、副腎におけるTSHR転写体を示している（Dutton C. M., Joba W. , Spitzweg C. , Heufelder A. E. , Bahn R. S. , (1997) Thyroid 6 : 879-84）。
【０１１１】
C. 広範囲の種類の細胞及び組織型におけるTSH受容体：
RNAのパネルをTSHRについてスクリーンし、そして陽性発現が甲状腺、副腎、腎臓、脳、骨格筋、精巣、肝臓、骨芽細胞、大動脈平滑筋、卵巣、脂肪細胞、網膜、唾液腺及び消化管において見出された。同様に、公開された文献は、甲状腺、腎臓、胸腺、副腎、脳、眼球後線維芽細胞、ニューロン細胞及び星状細胞におけるTSHR発現を示す（Szkudlinski M. W. , Fremont V. , Ronin C. , Weintraub B. D. , (2002) Physiol Rev 82 : 473-502 and Dutton C. M. , Joba W. , Spitzweg C. , Heufelder A. E. , Bahn R. S., (1997) Thyroid 6: 879-84)）。
【０１１２】
例４：CGHによる副腎皮質のインビボ刺激：
要約：マウスを、それらの動物の腎臓からのCGHの過剰発現及び分泌に導く、GPHA2及びGPHB5を発現するアデノウィルス粒子による感染を通してCGHに暴露した。強い副腎肥大及び血管形成が、アデノウィルス感染の３週間後に殺害されたマウスにおいて観察された。肥大は、皮質層内部、束状帯及び網状帯において明らかであった。同様に、マウスを、組換えCGHタンパク質のみ、組換えCGHタンパク質及びグルココルチコイドデキサメタゾン（Dex）、Dexのみ又はPBSのみの２週間の毎日の腹腔内注入を通してCGHに暴露した。副腎重量の有意な増加が、CGH又はCGH及びDexによる慢性的処理の後、雌マウスにおいて示された。
【０１１３】
A. 組換えアデノウィルスを発現するGPHB5及びGPHA2の生成：
GPHA2及びGPHB5のタンパク質コード領域を、それぞれ5’及び3’末端でFseI及びAscI制限部位を付与されたプライマーを用いて、PCRにより増幅した。標準のPCR反応において十分な長さのGPHA2及びGPHB5 cDNAを含む鋳型を有するPCRプライマーを使用した。PCR反応生成物を、TAE緩衝液中、1.2％（低い融点）のSeaPlaque GTG (FMC, Rockland, ME)ゲル上に負荷した。生成物をゲルから切除し、そしてQIAquick（商標）;PCR Purification Kitゲルクリーンアップキット（Qiagen, Valencia, CA）を用いて、そのキットの説明書に従って精製した。
【０１１４】
次に、PCR生成物を、FseI−AscIにより消化し、フェノール/クロロホルム抽出し、エタノール沈殿せしめ、そして20μlのTE（トリス/EDTA, pH8）において再水和化した。次に、生成物を、ベクターpMT12-8のFscI-AscI部位中に連結し、そしてエレクトロポレーションによりDH10B細胞を形質転換した。適切な挿入体を含むクローンを、プラスミドDNAミニプレプにより同定し、続いてFseI−AseIにより消化し、そして構造体をDNA配列決定により確めた。DNAを、市販のキット（Qiagen, Inc.）を用いて調製した。GPHA2及びGPHA5 cDNAを、FseI及びAscI酵素を用いて、pMT12-8ベクターから開放した。cDNAを、1.2％低溶融ゲル上で単離し、ゲルスライスを70℃で溶融し、等体積のトリス−緩衝されたフェノールにより２度、抽出し、そしてエタノール沈殿せしめた。DNAを10μlの水に再懸濁した。
【０１１５】
GPHA2及びGPHB5組換えアデノウィルスを、異なったベクターを用いて調製した。GPHA2 cDNAを、ポリリンカーがPseI及びAscI部位を含むよう修飾されたpACCMVシャトルベクター（Microbix Biosystems, Inc. Ontario, Canada）中に連結し、そしてE. コリ宿主細胞（Electromax DH10BTM 細胞; Life Technologies, Inc. , Gaithersburg, MDから得られた）を、エレクトロポレーションにより形成転換した。GPHA2挿入体を含むクローンを、プラスミドDNAミニプレプにより同定し、続いてFseI及びAscIにより消化した。DNAの大規模調製物を、トランスフェクションのために製造した。
【０１１６】
GPHA2−含有シャトルベクターを、アデノウィルスEI遺伝子を発現する293A細胞（Quantum Biotechnologies, Inc. Montreal, QC. Canada）中、E1−欠失アデノウィルスベクターpJM17（Microbix Biosystems, Inc.）と供に同時トランスフェクトした。DNAを、無菌HBS（150mMのHEPES）により、50μlの合計体積に希釈した。別の管において、20μlのDOTAP（Biehringer−Ingelheim, 1mg/ml）を、HBSにより100μlの合計体積に希釈した。DNAをDOTAPに添加し、ピペットを上下することにより軽く混合し、そして室温で15分間、放置した。培地を293A細胞から除去し、そして1mMのピルビン酸ナトリウム、0.1mMのMEM非必須アミノ酸及び25mMのHEPES緩衝液（すべて、Life Technologies, Inc. からである）を含む血清フリーのMEM alpha 5mlにより洗浄した。
【０１１７】
5mlの血清フリーMEMを、293A細胞に添加し、そして37℃で維持した。DNA/脂質混合物を、293A細胞のT25フラスコに滴下し、そして37℃で４時間インキュベートした。４時間後、DNA/脂質混合物を含む培地をアスピレートし、そして5％ウシ胎児血清を含む完全MEM5mlにより置換した。293A細胞を２〜４週間、維持し、その後、内因性ウィルス配列及びトランスフェクトされたウィルスベクターの組換えが感染性ウィルス粒子の生成をもたらした。組換えの5日以内に、感染性ウィルスの増殖は、培養物単層の溶解を生成した。ウィルス溶解物を含む培地を集め、そして残存する損なわれていない細胞を、反復された凍結/融解サイクルにより溶解し、そして細胞残骸遠心分離によりペレット化した。
【０１１８】
ウィルス溶解物を、Becker など., Metli. Cell Biol. 43: 161-189,1994の方法に従って、プラークの精製した。手短には、一連の希釈溶液を、10％ウシ胎児血清及び100U/mlのペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEMにおいて調製し、293細胞の単層に添加し、そして37℃で１時間インキュベートした。溶解された1.3％アガロース/水の溶液を、２×DMEM（４％FBS、200U/mlのペニシリン/ストレプトマイシン、0.5μg/mlのフンギゾン及び30mg/mlのフェノールレッドを含む）と供に混合し、そしてその混合物6mlをウィルス感染された293細胞に添加した。プラークは、７〜10日以内に見出された。単一のプラークを単離した。そしてGPHA2挿入体の存在をPCRにより確めた。予測されるサイズのPCR生成物を有した１つのプラークを用いて、一次増幅を行った。
【０１１９】
GPHB5アデノウィルス構造体を、第２ベクターシステムpAdTrack CMV (He, T-C. など., PNAS 95 : 2509-2514,1998)において生成した。このベクターは、緑色蛍光タンパク質（GFP）マーカー遺伝子を含み、そしてGFP遺伝子のプロモーター及びポリアデニル化配列をSV40及びヒト成長ホルモン配列によりそれぞれ置換することにより、まず修飾した。さらに、生来のポリリンカーを、FseI、EcoRV及びAscI部位により置換した。この修飾された形のpAdTrack CMVを、pZyTrackとして命名した。連結を、Fast-Link（商標）; DNA 連結 及び スクリーニング キット (Epicentre Technologies, Madison, WI)を用いて行った。GPHB5を含むクローンを、FseI-AscIによるミニプレプDNAの消化により同定した。プラスミドを線状化するために、約5μgのpZyTrack GPHB5プラスミドを、PmeIにより消化した。
【０１２０】
約１μgの線状化されたプラスミド及び200ngのスーパーコイルpAdEasy (He など., 前記)を用いて、BJ5183細胞を同時形質転換した。同時形質転換を、2.5kV、200オーム及び25mFaで、Bio-Rad Gene Pulserを用いて行った。完全な同時形質転換物を、25μg/mlのカナマイシンを含む4LBプレート上にプレートした。最小のコロニーを採取し、そしてLB/カナマイシン、及び標準のDNAミニプレプ方法により同定された組換えアデノウィルスにおいて拡張した。FseI−AscIによる組換えアデノウィルスDNAの消化は、GPHB5の存在を確めた。組換えアデノウィルスミニプレプDNAを用いて、DH10Bコンピテント細胞を形質転換し、そしてDNAを、Qiagenマキシプレプキットを用いて、その説明書に従って調製した。
【０１２１】
約5μgの組換えアデノウィルスDNAを、20〜30UのPacIを含む100μlの反応体積において37℃で3時間、PacI酵素（New England Biolabs, Beverly, MA）により消化した。消化されたDNAを、等体積のフェノール/クロロホルムにより２度、抽出し、そしてエタノール沈殿した。DNAペレットを、10μlの蒸留水に再懸濁した。前日に接種され、そして60〜70％の集密性に増殖されたQBI−293A細胞（Quantum Biotechnologies, Inc. Montreal, Qc. Canada）のT25フラスコを、PacI消化されたDNAによりトランスフェクトした。PacI消化されたDNAを、無菌HBS（150mMのNaCl、20mMのHEPES）により50μlの合計体積まで希釈した。
【０１２２】
別の管において、20μlのDOTAP（Biehringer−Ingelheim, 1mg/ml）を、HBSにより100μlの合計体積に希釈した。DNAをDOTAPに添加し、ピペットを上下することにより軽く混合し、そして室温で15分間、放置した。培地を293A細胞から除去し、そして1mMのピルビン酸ナトリウム（Gibco-Invitrogen）、0.1mMのMEM非必須アミノ酸（Gibco-Invitrogen）及び25mMのHEPES緩衝液（Gibco-Invitrogen）を含む血清フリーのMEM alpha（Gibco-Invitrogen） 5mlにより洗浄した。5mlの血清フリーMEMを、293A細胞に添加し、そして37℃で維持した。DNA/脂質混合物を、293A細胞のT25フラスコに滴下し、そして37℃で４時間インキュベートした。４時間後、DNA/脂質混合物を含む培地をアスピレートし、そして5％ウシ胎児血清を含む完全MEM5mlにより置換した。
【０１２３】
トランスフェクトされた細胞を、GFP発現及びプラーク形成についてモニターした。組換えアデノウィルスDNAによる293A細胞のトランスフェクションの7日後、細胞はGFPタンパク質を発現し、そして眼に見えるプラークを形成し始めた。粗ウィルス溶解物を、細胞剥離機を用いることにより集め、293A細胞を集めた。その溶解物を、50mlの円錐形の管に移した。細胞からのウィルス粒子のほとんどを開放するために、３回の凍結/融解サイクルを、ドライアイス/エタノール浴及び37℃の水浴において行った。粗溶解物を増幅し、GPHB5組換えアデノウィルス溶解物の作用ストックを得た。
【０１２４】
B. GPHA2及びGPHB5組換えアデノウィルスの増幅及び精製：
200μlの粗組換えアデノウィルス溶解物を、10のほぼ集密性の10cmプレートの個々に添加した。感染を、白色光顕微鏡下で細胞障害効果（CPE）、又は蛍光顕微鏡下でGFP（GPHB5ウィルス）の発現について48〜72時間、モニターした。293A細胞のすべてがCPEを示した場合、ストック溶解物を集め、そして凍結/融解サイクルを行った。
【０１２５】
組換えアデノウィルスの二次増幅を、80〜90％の集密性で、293A細胞の20の15cm組織培養皿により達成した。培地体積を、5％MEM20mlの減じ、そして個々の皿を、300〜500μlの増幅されたストックウィルス溶解物により接種した。培養物の完全な溶解物を、48時間後に観察し、そして溶解物を250mlのポリプロピレン遠心分離ボトル中に集めた。NP−40界面活性剤を添加し、0.5％の最終濃度にし、完全な細胞溶解を確保した。残骸を、20,000XGでの15分間分離によりペレット化した。上清液を、250mlのポリカーボネート遠心分離ボトルに移し、そして0.5体積の20％PEG8000/2.5MのNaCl溶液を添加した。ボトルを氷上で一晩、振盪した。
【０１２６】
ボトルを20,000×Gで15分間、遠心分離し、そして上清液を捨てた。２つのボトルからのウィルス沈殿物を、2.5mlのPBSに再懸濁した。得られるウィルス溶液を、2mlの超遠心分離管に配置し、そして14,000XGで10分間、遠心分離し、追加の細胞残骸を除去した。2mlの超遠心分離管からの上清液を、15mlのポリプロピレンスナップキャップ管に移し、そして塩化セシウム（CsCl）により、1.34g/mlの密度に調節した。その溶液を、3.2mlのポリカーボネート厚壁遠心分離管（Beckman）に移し、そして348,000×Gで３〜４時間、25℃で回転せしめた。ウィルスは白色バンドを形成した。広い孔のピペット先端を用いて、ウィルスバンドを集めた。
【０１２７】
Sephadex G-25M (Pfizer- Pharmacia, New York, NY)により予備パッケージングされたPharmacia PD-10カラムを用いて、ウィルス調製物を脱塩した。カラムを20mlのPBSにより平衡化した。ウィルスを充填し、そしてカラム中に進行せしめた。5mlのPBSをカラムに添加し、そして８〜10滴の画分を集めた。個々の画分の１：50希釈溶液の光学密度を、分光計上で260nmで決定した。明白な吸光度ピークが、画分７〜17間に存在した。それらの画分をプールし、そして１：10の希釈溶液の光化学密度（OD）を決定した。次の式を用いて、ODをウィルス濃度に転換した：（260nmでのOD）（10）（1.1×1012）＝ビリオン/ml。 GPHB5組換えアデノウィルス濃度は1.99×1012個のビリオン/mlであった。GPHA2組換えアデノウィルス濃度は、6.1×1012個のビリオン/mlであった。グリセロールを、精製されたウィルスに添加し、15％の最終濃度にし、そして−80℃でアリコートで貯蔵した。
【０１２８】
C. マウスのアデノウィルス感染及び処理の結果：
個々のグループは、８匹の雌C57BL6マウスから成った。7.5×1011個のGPHA2−及びGPHB5−発現アデノウィルスを、尾の静脈注射により実験グループに投与し、そして親ベクターのみを発現する、1.5×1011個の粒子のアデノウィルスを、対照グループに投与した。動物を、注射に続いて20日目に殺害し、そして組織を病理学者に評価した。処理関連の効果を、実験グループにおけるすべての８匹のマウスの副腎において観察し；効果は対照グループの副腎には観察されなかった。副腎皮質内部細胞のCGH−誘発された組織形態学的変化は、強い肥大、及び均等に細かく、気泡性の空胞化を包含した。
【０１２９】
組換えCGHの腹腔内注射及び処理の結果：
生後８週での16匹のC57BL/6雌マウスを、４種のグループン分離した。第１のグループは、0.25mg/の組換えCGHタンパク質の毎日の腹腔内注入を受けた。第２のグループは、同じ方法を用いて、PBSの毎日の注入を受けた。第３のグループは、0.25mg/kgのCGH及び0.05mg/kgのDexの毎日の注入を受け、そして最終グループは0.5mg/kgのDexのみを受けた。動物は、15日目で殺害され、そして副腎が単離され、そして計量された。結果は表１に示される。例５は、この実験に使用される組換えCGHタンパク質の発現及び精製を記載する。
【０１３０】
【表１】
2005529171.tif 000002
【０１３１】
例５：組換えCGHの発現及び精製：
要約：CGJのサブユニットである、GPHA2及びGPHB5の両者を過剰発現するチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞系を生成し、そしてCHO180と命名した。CHO180は、活性的なヘテロダイマーCGHを分泌することが見出されている。CGHを、標準の生化学技法を用いて、CHO180の上清液から精製した。
【０１３２】
A. CHO180の生成：
CGH生成細胞系CHO180を２段階で生成した。CMVプロモーターから、GPHA2、GPHB5及び薬物耐性（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）を発現する構造体を、エレクトロポレーションによりタンパク質フリーCHO DG44細胞（PF CHO）に移した。得られるプールを、メトトレキセートを用いて選択し、そして増幅した。初期分析は、高レベルのGPHA2発現及び低レベルのGPHB5発現を示した。従って、CMVプロモーターからのGPHB5及びSV-40プロモーターからのゼオシン耐性を発現する第２構造体を、選択され、増幅されたプール中に、エレクトロポレーションによりトランスフェクトした。ゼオシン選択の後、最終プール（CHO180）は有意なレベルのGPHA2及びGPHB5の両者を発現し；タンパク質は非共有ヘテロダイマーCGHとして分泌される。
【０１３３】
B. CHO培養物上清液からのCGHの精製：
CGHを、CHO培養物上清液から、確立されたクロマトグラフィー方法により、CHO培養物上清液から精製し；最初に、CGHを、強いカチオン交換体POROS HS50上で捕獲し；そして次に、それをTosoHaas Butyl650S樹脂と供にHydrophobic Interaction Chromatographyを用いて精製；そして最終的に、Superdex75サイズ排除クロマトグラフィーによりPBS中に緩衝液−交換した。
【０１３４】
C. カチオン交換クロマトグラフィー：
CHO培養物上清液を、0.2μmのフィルターにより濾過し、そして20mMの２−モルホリノエタンスルホン酸（MES）によりpH6に調節した。調節された上清液におけるCGHを、20mMのMES（pH6）により前もって平衡化されたPOROS HS 50カラム上に、20mMのMES（pH6）による１：２のオンライン希釈を用いて55cm/時で捕獲した。充填の完結の後、カラムを、20カラム体積（CV）の平衡緩衝液により洗浄した。これに続いて、20mMのMES（pH6）中、250mMのNaCl溶液の3CVにより、90cm/時で洗浄した。次に、CGHを、20mMのMES（pH6）中、500mMのNaCl溶液の3CVによりカラムから、同じ流速で溶出した。最終的に、カラムを1M及び2MのNaClの段階で抜き取り、そして次に、20mMのMES（pH6）により再平衡化した。CGHを含む、500mMのNaCl−の溶出されたプールを、室温で（NH4）2SO4により1.0Mに及びNaOHによりpH6.9に、次の段階のために調節した。
【０１３５】
D. Butyl 650S疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）:
HICは、正味疎水性に基づいて生物分子を分離する吸着性液体クロマトグラフィー技法である。サンプルは高い塩においてゲルに結合され、そして次に、低下する塩濃度のグラジエント又は段階的溶出が、サンプルを溶出するために適用される。
カチオン交換クロマトグラフィーからのCGHの調節されたプールを、1.0Mの(NH4)2SO4を含む50mMのNaH2PO4（pH6.9）の溶液により平衡化されたTosoHaas Butyl650S樹脂に、100cm/時で直接的に適用した。充填の後、カラムを、10CVの平衡化緩衝液、及び0.9Mの(NH4)2SO4を含む50mMのNaH2PO4(pH6.9)の溶液10CVにより洗浄した。次に、CGHを、(NH4)2SO4を0.5Mの低め、そして5CVを集めることにより、カラムから200cm/時で溶出した。このCGHプールを、5kDaのカットオフ膜を有するAmicon攪拌セルを用いて限外濾過により濃縮した。
【０１３６】
E. サイズ−排除クロマトグラフィー：
次に、濃縮されたCGHプールを、残存するHMW汚染物の除去及びPBS中への緩衝液交換のために、Superdex75樹脂の適切に分類された層に適用した。約0.65〜0.7CVでSuperdex75カラムから溶出されたCGHを、5kDaのカットオフ限外濾過膜を有するAmicon攪拌セルを用いて、−80℃での貯蔵のために濃縮した。ヘテロダイマータンパク質は、クーマシー染色されたSDS  PAGEによれば、純粋であり、但しNH2末端、正しいアミノ酸組成及び正しい質量を、SEC、MALSによれば有した。RP HPLCアッセイにより評価された全体的な工程の回収率は、50〜60％であった。
【０１３７】
さらに、CGHポリペプチドを、他の宿主システムにおいて発現することができる。培養された哺乳類細胞における組換えポリペプチドの生成は、例えばLevinson など. , アメリカ特許第 4,713, 339号; Hagen など. , アメリカ特許第4,784, 950号; Palmiterなど. , アメリカ特許第4,579, 821号; 及び Ringold, アメリカ特許第4,656, 134号により開示される。適切な培養される哺乳類細胞は、COS-1 (ATCC No. CRL 1650), COS-7 (ATCC No. CRL 1651), BHK (ATCC No. CRL 1632), BHK 570 (ATCC No. CRL 10314), 293 (ATCC No. CRL 1573; Graham など. , J. Gen. Virol. 36: 59-72,1977) 及び チャイニーズハムスター卵巣 (例えば CHO-K1 ; ATCC No. CCL 61) 細胞系を包含する。追加の適切な細胞系は、当業界において知られており、そして公的な寄託機関、例えばAmerican Type Culture Collection, Rockville, Marylandから入手できる。
【０１３８】
一般的に、強い転写プロモーター、例えばアメリカ特許第4,956, 288号からのプロモーターが好ましい。プロモーターは、SV-40又はサイトメガロウィルス、メタロチオネイン遺伝子からのそれらのプロモーター（アメリカ特許4,579,821号及び第4,601,978号）、及びアデノウィルス主要後期プロモーターを包含する。他の態様においては、アデノウィルスベクターが使用され得る。例えばGarnier など., Cytotechnol. 15: 145-55, 1994を参照のこと。
【０１３９】
他の高等真核細胞、例えば昆虫細胞、植物細胞及び鳥類細胞がまた、宿主として使用され得る。植物細胞における遺伝子を発現するためのベクターとしてのアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）の使用は、Sinkar など., J. Biosci. (Bangalore) 11: 47-58, 1987により再考されている。昆虫細胞の形質転換及びそこにおける外来性ポリペプチドの生成が、Guarinoなど., アメリカ特許第5,162,222号及びWIPO公開WO94/06463号に開示される。
【０１４０】
例６：CGH受容体（TSH-R）は末梢免疫系の多くの異なった細胞上で発現される：
完全血液（50ml）を、健康なヒトドナーから集め、そして50mlの円錐上の管においてPBSと供に１：１の比で混合した。次に、15mlのFicoll Paque Plus (Pfizer-Pharmacia)上に、30mlの希釈された血液を積層した。それらのグラジエントを、500gで30分間、遠心分離し、そしてプレーキングしないで停止した。界面でのRBC−消耗された細胞を集め、それにPBSにより３度洗浄した。
【０１４１】
細胞を、FACS 洗浄緩衝液(WB = 1X PBS/1% BSA/10 mM Hepes)に再懸濁し、トリパンブルーにおいて計数し、そして個々のタイプの１×106個の可視細胞を、96−ウェル丸底プレートのウェル中にアリコートした。細胞を洗浄し、そしてペレット化し、次の10μg/mlのCGH−ビオチン、及び特定のヒト免疫細胞サブセットを同定するために使用される種々の細胞表面マーカーを認識する、蛍光ラベルされた（FITC及びCyChrome）モノクローナル抗体（PharMingen, San Diego, CA）のカクテルと供に氷上で20分間インキュベートした。
【０１４２】
それらのマーカーは次のものを包含する（CGH−ビオチン又は培地のみの対照と組合して試験される２種のグループに列挙される）：CD45RA/CD4, CD56/CD16, CD45RA/CD8, CD14/CD16, CD3/CD19。細胞を洗浄し、そして次に、5μg/mlのストレプタビジン−PE（PharMinge）により、さらに20分間、染色し、CGH−ビオチン−結合細胞を染色した。細胞を十分に洗浄し、そしてペレット化し、次に0.4mlのWBに再懸濁し、そしてCellQuestソフトウェア（Becton Dickinson, Mountain View, CA）を用いてFACSCalibur上で分析した。
【０１４３】
表２に示されるように、CGH−ビオチンは明らかかに、単球、B細胞、T細胞（CD4+及びCD8+の両者；示されていない）及びNK細胞に結合した。さらに、生来の（CD45RA+）CD4+ T細胞に対してよりも記憶表現型（CD45RA-）CD4+ T細胞に対してより強く結合するように見えた。それらのデータは一般的に、RT-PCR（例３を参照のこと）により、及び免疫沈澱研究（Bagriacik and Klein, J Immunol. 164: 6158-65,2000を参照のこと）により決定されるTSH-Rの発現パターンと一致する。
【０１４４】
表２：CGH-ビオチンはヒト末梢血液における広範囲の種類の免疫細胞に結合する：
平均蛍光強度（MFI）が、種々の免疫細胞サブセット上でゲート制御される、ヒトPBMCのCGH−ビオチン（続くストレプタビジン−フィコエリトリン[SA-PE]染色について示される。SA-PEはPharmingenから購入され、そして5μg/mlで使用された。それらのデータは、異なった血液ドナーを伴っての３回の独立した実験の代表である。
【０１４５】
【表２】
2005529171.tif 000003
【０１４６】
例７：CGH処理はLPS−誘発された軽い内毒素血症のマウスモデルにおける炎症性サイトカインの精製を変更する：
LPS−誘発された軽い内毒素血症のマウスモデルにおけるCGHの効果を試験するためのインビボ実験を企画した。このモデルは、低い、非致死性用量の細胞内毒素（リポ多糖、LPS）によりマウスを攻撃することによる急性内毒性血症/敗血症を模倣する。血清を、腹腔内LPS注入の後、種々の時点（１〜８時間）で集め、そして広範囲の種類の前−及び−抗−炎症性サイトカイン、及び炎症応答を仲介する急性相タンパク質の変更された発現について分析した。このモデルは、強い炎症応答の間、治療候補体の有力な抗−炎症効果を評価するための手段を提供する。最初にモデルを評価するために、本発明者は、モデルについての対照データを集めるパイロット実験における前炎症性サイトカインを測定した。
【０１４７】
このパイロット研究においては、生後6ヶ月のBal/c（Charles River Laboratories, Wilmington, MA）雌マウスを、無菌PBS中、25μgのLPS（Sigma）により腹腔内（i.p.）注射した。８匹のマウスのグループからの血清サンプルを、個々の時点で0, 1, 4, 8, 16, 24, 48及び72時間で集めた。血清サンプルを、炎症性サイトカインレベルについてアッセイした。IL-1β、IL-6、INFα及びIL-10レベルを、Biosource International (Camarillo, CA)から購入された市販のELISAキットを用いて測定した。
【０１４８】
TNFαレベルは4000pg/mlまで上昇し、そしてIL-10レベルは１時間の後−LPS注入で341pg/mlであった。４時間の後−LPS注入で、IL-6、IL-1β及びIL−10はそれぞれ、6,100pg/ml、299pg/ml及び229pg/mlであった。それらの結果は、炎症性サイトカインが実際、このモデルにおいて生成されたことを示した。上記に列挙される炎症性メディエーターから、１時間の後−LPSでの血清INFαレベル及び４時間の後−LPSでの血清IL-6レベルが、軽い内毒血症のLPSモデルのための生物学的マーカーとして選択された。
【０１４９】
C57Bl/6マウス（Charles River Laboratories；５匹のマウス/グループ）を、PBS、PBS中、0.2mg/kgのCGH、又はPBS中、2mg/kgのCGHにより、LPS攻撃の1時間前、i.p.処理した。次に、マウスを、25μgのLPSによりi.p.攻撃し、そしてLPS注入の１及び４時間後、放血した。血清を、ELISAにより、TNFα（１時間）及びIL-6（４時間）レベルについて分析した。
【０１５０】
LPS注入の１時間前、2mg/kgのCGHタンパク質の注入は、１時間の時点でTNFα誘発を有意に低め（約60％）、そしてCGHは、４時間の時点で約70％、血清IL-6レベルを高めた（表３、実験１）。統計学的有意性を、不対スチューデントｔ−実験により決定した。類似する傾向が、低い用量のCGH（0.2mg/kg）を用いて観察されたが、但し差異は統計学的に有意ではなかった（表３、ｐ値）。それらの結果は３種の独立した実験において一貫して得られた（表３）。従って、CGHは、IL-6、すなわち前−又は抗−炎症性質のいずれかを有するサイトカインの発現を増強しながら、前−炎症性サイトカインTNFαの生成を抑制することができる。これは、いくつかの炎症性サイトカインの合成及び分泌における変化を導く、TSH-Rを発現する免疫細胞におけるcAMPレベルを高めるCGHの能力にたぶん影響を及ぼす（例３、Bagriacik and Klein, J Immunol 164: 6158-65, 2000, and Delgado and Ganea, J Biol Chem 274: 31930-40,1999を参照のこと）。
【０１５１】
もう１つの実験においては、マウスを、2mg/kgのzlutl又はzgig51のいずれかにより処理し、そしてそれらのモノマーのいずれも血清TNFα又はIL-6レベルン対していずれの効果も有さないことを示し、このことは、CGHの活性が完全なヘテロダイマーを必要とすることを示す（データは示されていない）。CGHが最大以下の用量のグルココルチコイドの効果を強化するかどうかを決定するために、10匹のC57Bl/6マウスのグループを、PBS、0.15又は1.5mg/kgのDex, 2mg/kgのCGH、又はCGH及び低いか又は高い用量のDexの組合せにより、25μgのLPSのi.p.注入の１時間前、i.p.処理した。表３（実験２）に示されるように、2mg/kgのCGH又は1.5mg/kgのDex単独での処理（LPSの１時間前）のいずれかが、前の実験において観察されるように、１時間での血清TNFαレベルで有意な低下を引き起こした。
【０１５２】
TNFα生成の阻害に対する、Dexと供に投与されるCGHの効果は、Dexのみの用量よりも高かった。特に、低い用量のDexと供にCGHの使用は、低い用量のDexのみに比較して、血清TNFαの上昇を実質的に低めた。前記のように、CGH処理は再び、４時間での高められた血清IL-6レベルを高め：しかしながら、血清IL-6レベルは、マウスがDexのみ（1.5mg/kg）、又はCGH及びDexの組合せのいずれかを受ける場合、有意に低下した（表３）。従って、Dex＋CGHsy処理されたマウスにおける血清IL-6レベルは、CGHのみにより処理されたマウスよりもむしろ、Dexのみにより処理されたマウスにおけるそれらのレベルにより密接に類似し、このことは、グルココルチコイドの活性がこの設定において、CGHの活性よりも優勢であったことを示唆する。
【０１５３】
【表３】
2005529171.tif 000004
【０１５４】
例８：CGH−処理されたマウスにおける遅延形の過敏性：
遅延されたタイプの過敏性（DTH）は、特定の抗原に対するT細胞応答の測定である。この応答においては、マウスは、アジュバント（例えば、ニワトリオボアルブミン、OVA）中、特定のタンパク質により免疫化され、そして次に、耳において同じ抗原（アジュバントなシ）により攻撃される。前記攻撃の後、耳の厚さの上昇（カリパスにより測定された）は、抗原に対する特定免疫応答の測定である。DTHは、３種の明確な相、１）T細胞が抗原提供細胞（APC）の表面上に提供される外来性タンパク質抗原を認識する相、２）T細胞がサイトカイン（特に、インターフェロンγ、IFN−γ）を分泌し、そして増殖する活性化/感作化相、及び３）炎症（活性化されたマクロファージ及び好中級の浸潤を包含する）及び感染の究極的な解決の両者を包含するエフェクター相において生じる細胞−介在性免疫性の形である。
【０１５５】
この応答は、細胞内細菌に対する一時防御機構であり、そして可溶性タンパク質抗原又は化学的反応性ヘプテンにより誘発され得る。従来のDTH応答は、ヒト結核菌（TB）からの精製されたタンパク質誘導体（PPD）により攻撃された個人において、それらの注射された個人が一次TBから回復されるか、又はTBに対してワクチン接種されている場合に生じる。硬化、すなわちDTHの顕著な特徴が、抗原の注入の約18時間後までに検出され、そして24〜48時間で最大である。触診できる硬化の開始の遅延は、応答“遅延された型”を命名するための理由である。すべての種において、DTH反応は、DTH, IFN−γに関与する主要開始サイトカインを生成する、抗原−感作されたCD4+（及び少ない程度のCD8+）T細胞の存在に臨床学的に依存する。
【０１５６】
CGHの抗−炎症効果について試験するために、DTH実験を、I)PBS、II）1.5mg/kgのデキサメタゾン（Dex）、III ）0.2mg/kgのCGH、及びIV）2mg/kgのCGHにより処理されたC57Bl/6マウスの４種のグループにより行った。すべてのそれらの処理は、OVA再攻撃の２時間前、腹腔内に行われた。マウス（グループ当たり８匹）を最初に、200μlの合計体積で、Ribiにおいて乳化された、100μgのニワトリオボアルブミン（OVA）により背部に免疫化した。7日後、マウスを10μlのPBS（対照）により左耳に、又はPBS中、10μgのOVA（アジュバントなし）により右耳に、10μlの体積で皮下的に再攻撃した。
【０１５７】
すべてのマウスの耳の厚さを、マウスの耳に注入する前に測定した（O測定）。耳の厚さを、攻撃の24時間後、測定した。0測定と24時間測定との間の耳の厚さの差異が、表４に示される。PBS処理グループにおける対照マウスは、24時間後の攻撃での耳の厚さの上昇により示されるように、強いDTH反応を進行した（表４、実験し）。対照的に、Dex又はCGHにより処理されたマウスは、対照に比較して、低い程度の耳の厚さを有した。それらの差異は、スチューデントｔ−試験により決定される場合、統計学的に有意であった（表４、ｐ値対PBS）。
【０１５８】
【表４】
2005529171.tif 000005
【０１５９】
第２のDTH実験を行い、それらの結果を確めた（表４、実験２）。再び、CGH及びDex−処理されたマウスは、OVA再攻撃に応答して有意に低められた耳の腫張を示した（表４、実験２）。DTH実験３においては、CGHを、反応感作相の間に投与される場合（すなわち、T細胞が抗原に対して応答している場合）、抗−炎症性効果について評価した。マウス（グループ当たり７匹）に、PBS、Dex又はCGHを、０日〜４日目まで、１日当たり１度、腹腔内投与した。次に、マウスを、７日目、OVA又はPBSにより再攻撃し、そして耳の厚さを８日目に測定した。再び、Dex及びCGHの両者は、DTH反応を有意に阻害し（表４、実験３）、このことは、CGHが炎症工程の初期及び後期の両者で、抗−炎症効果を発揮することができることを示唆する。
【０１６０】
DTH実験１におけるマウスの形からの耳を、免疫組織化学により分析し、細胞型がCGH処理により最も影響されたことを評価した。耳を、亜鉛/トリス緩衝液（0.1Mのトリス−HCl緩衝液（pH7.4）中、2.3mMの酢酸カルシウム/31.6mMの酢酸亜鉛/36.7mMの塩化亜鉛）において、室温で24時間、固定し、そしてCD4, CD8, CD11c及びGr-1（好中球）に対して特異的な抗体により染色した。本発明者は、CD4, CD8, 又はｃD11c+細胞の染色を検出しなかったが、抗−Gr-1染色された断片にいくつかの興味ある差異が存在した。耳を、いくらかの改良を伴ってのTechMate500自動免疫染色機（Biotech/Ventana）MIPプロトコールを用いて染色した。
【０１６１】
スライドを60℃で１時間、乾燥した後、断片を、４℃で一晩、ラット抗−マウスG8-1 mAb (クローン7/4, Serotec, イソタイプのラットIgG2a, 1.25μg/mlの最終希釈で使用される)により染色した。この段階の後、洗浄の後、ビオチニル化されたウサギ抗−ラットIgG二次抗体（Dako, ２％正常ウサギ血清及び２％脱脂粉乳を含むPBS中、10μg/mlで使用される）により45分間、染色した。次に、断片を洗浄し、そしてHPブロック（50％メタノール中、1.5％のH2O2）により３度、それぞれ７分、続いて、アビジン−ビオチン複合体により25分、DAB（ジアミンベンジジン）により３度、それぞれ４分、次にメチルグリーンにより10分間、処理した。
【０１６２】
この染色方法から、PBS−処理された対照に比較して、CGH又はDexにより処理したそれらのマウスの耳に浸潤する好中球の数の明確な減少が存在した。組織形態測定を行い、耳サンプルに存在する単位長さ（1mm）当たりの好中球の平均ピクセル密度を得た。それらの分析の結果は、表５に示される。個々のグループ間でのかなりの量の変動性にもかかわらず、Dex及び低用量のCGHグループにおける好中球染色の有意な低下、及び高用量のCGHグループにおけるほぼ有意な（ｐ＝0.0507低下が存在した（表５を参照のこと、ｐ−値）。
【０１６３】
【表５】
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【０１６４】
CGH抗−炎症効果は、副腎皮質によるコルチコイドにおける上昇により介在されるとは思われない。
CGHのための受容体TSH-Rは副腎により発現されるので、観察される抗−炎症効果はCGH−処理されたマウスにおける上昇する内因性コルチコステロイド生成の間接的な効果である関心が存在した。外因性又は内因性コルチコステロイドレベルの上昇の１つの十分に確立された副作用は、成長するT細胞がアポプトシスを受けるよう誘発されるにつれて、胸腺の実質的な肥大である。従って、DTH実験におけるCGH及びDex−処理されたマウスの胸腺を分析した。表６に示されるように、Dex−処理されたマウスは明白な胸腺肥大を示したが、胸腺重量も全体的な胸腺細胞数もCGH処理により有意に影響されなかった。
【０１６５】
胸腺細胞をまた、CD4、CD8及びCD3に対する蛍光ラベルされた抗体により細胞を染色した後、流動細胞計測により分析し（PharMingen, San Diego, CA）、そしてCGH-処理されたマウスにおける個々の胸腺サブセット（CD4単一陽性、CD8単一陽性、CD4＋CD8＋二重陽性及びCD4−CD8−二重陽性）の相対的生成はPBS−処理されたグループのそれとは有意に異ならなかったことが見出された。従って、CGHは、Dexのような外因性グルココルチコイドの態様とはことなった態様でその抗−炎症効果を仲介するように思える。これは、グルココルチコイド処理の副作用の多くはCGH治療により実質的に回避されるので、重要な有益なものであることが判明する。
【０１６６】
【表６】
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【０１６７】
例９：CGHにより慢性的に処理されたマウスにおけるリンパ組織の評価：
上記に記載されるように、グルココルチコイド処理は、感染の高められた危険性をもたらす、免疫細胞集団の低下をもたらす。CGHによるマウスの長期処理が免疫系に対する有害な効果を有するかどうかを決定するために、C57Bl/6マウスを、300μg/kg/日のヒトCGH又はPBS（４匹のマウス/グループ）のいずれかにより、合計４週間、処理した。処理の最後の日、脾臓、末梢リンパ節（プールされた鼡径、頸部、腋窩及び分岐節）及び胸腺を、マウスの個々のグループから集め、そして単一細胞の懸濁液を調製した。
【０１６８】
脾臓を、２枚のすりガラススライド間で押しつぶし、そして胸腺及びリンパ節をピンセットにより細かく裂き、そして開放された細胞をNytex膜（細胞ストレーナー）上に通し、そしてペレット化した。細胞を、FACS洗浄緩衝液（WB＝１Xハンクス液/１％BSA/10mMのヘペス）に再懸濁し、トリパンブルーにおいて計数し、そして個々のタイプの１×106個の生存細胞を、96mウェル丸底プレートのウェル中にアリコートした。細胞を洗浄し、そしてペレット化し、次に特定の免疫細胞サブセットを同定するために使用される種々の細胞表面マーカーを認識する、蛍光的にラベルされた（FITC, PE及びCyChrome）モノクローナル抗体（PharMingen, San Diego, CA）のカクテルと供に氷上に20分間インキュベートした。
【０１６９】
脾臓染色に関しては：CDllb/Grl/B220, CD4/CD44/CD8, DX5/NK1. 1/CD3；リンパ節染色に関しては：CD62L/CD44/CD4, CD62L/CD44/CD8, 及び CDllb/Grl/B220；及び胸腺染色に関しては：CD4/CD3/CD8。細胞を十分に洗浄し、そしてペレット化し、次に0.4mlのWBに再懸濁し、そしてCellQuest ソフトウエアー (Becton Dickinson, Mountain View, CA)を用いて、FACSCalibur上で分析した。表７に示されるように、マウスのPBS対CGH−処理されたグループからのリンパ組織における個々の細胞集団の数（又は百分率；データは示されていない）における有意な差異は存在しなかった（スチューデントｔ−試験により決定される）。
【０１７０】
【表７】
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【０１７１】
それらの結果は、CGHはインビボで有能な抗−炎症活性を有するが、CGHによる処理は、研究された細胞区画における重要な免疫細胞集団の消耗をもたらさないことを示唆する。
前述から、本発明の特定の態様は例示目的のために記載されて来たが、種々の修飾が本発明の範囲内で行われ得ることが理解されるであろう。
【配列表】
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【国際調査報告】
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