(57)【要約】  免疫系細胞の異常のため、療法の必要がある患者を治療する方法であって、ＣＢ２カンナビノイド受容体活性を有する化合物の療法的有効用量を投与することを含んでなる、前記方法を提供する。異常は、特に、白血病またはリンパ腫などの悪性腫瘍である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫系細胞の異常のため、療法の必要がある患者を治療する方法であって、ＣＢ２カンナビノイド受容体活性を有する化合物の療法的有効用量を投与することを含んでなる、前記方法。
【請求項２】
異常が、免疫系の悪性腫瘍、自己免疫疾患、敗血症ショック、移植反応およびアレルギーからなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
異常が、白血病およびリンパ腫からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項４】
異常が原発性急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
化合物が、ＴＨＣと比較した際に、減少した向精神活性を有するＣＢ２アゴニストである、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
選択的ＣＢ２アゴニストが、ＣＢ２受容体に対して、ＣＢ１受容体に対する親和性の少なくとも５倍の親和性を有するものから選択される、先行する請求項のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
選択的ＣＢ２アゴニストが、ＣＢ２受容体に対して、ＣＢ１受容体に対する親和性の少なくとも１０倍の親和性を有するものから選択される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
選択的ＣＢ２アゴニストが、ＣＢ２受容体に対して、ＣＢ１受容体に対する親和性の少なくとも２０倍の親和性を有するものから選択される、請求項６記載の方法。
【請求項９】
選択的ＣＢ２アゴニストが、ＣＢ２受容体に対して、ＣＢ１受容体に対する親和性の少なくとも１００倍の親和性を有するものから選択される、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
免疫系の異常、特に白血病およびリンパ腫などの免疫系の悪性腫瘍を治療するための医薬品製造のための、本発明の第一の側面の化合物の使用。
【請求項１１】
活性剤としてＣＢ２アゴニストを含んでなる、免疫系の異常を治療するための薬剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、悪性リンパ芽球疾患を治療する新規療法としての、ＣＢ２カンナビノイド受容体のターゲティングであって、特に、こうした疾患を患う患者に、少なくとも何らかの有効なＣＢ２受容体アゴニスト活性を所持する活性分子を投与することによる、前記ターゲティングに関する。
【０００２】
マリファナは、最も古くから乱用されている薬剤の１つであるが、その医学的価値も数世紀に渡って知られている。デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）がマリファナの主要な精神活性構成要素である（参考文献１を参照されたい）。ＴＨＣおよび他の合成カンナビノイドが、緑内障の眼内圧、悪疫質、吐き気、および疼痛などの合併症を軽減する可能性がある療法剤として使用されてきている（参考文献２を参照されたい）。近年、２つのカンナビノイド受容体、ＣＢ１およびＣＢ２が発見されたことから、カンナビノイドの潜在的な医学的使用にますます興味が持たれている（参考文献３および４、本明細書に援用される）。ＣＢ１受容体は主に脳で発現され、一方、ＣＢ２受容体は主に免疫系の細胞で見られる。さらに、ＴＨＣの薬理学的活性を模倣可能な、これらの受容体の内因性リガンドもまた、発見されている。こうしたリガンドはエンドカンナビノイドと称され、そしてこれらにはアナンダミドおよび２−アラキドノイルグリセロールが含まれる（参考文献５〜７）。エンドカンナビノイド類およびカンナビノイド受容体類の生理学的機能は不明なままである。
【０００３】
近年、アナンダミドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒト乳癌細胞株ＭＣＦ−７およびＥＦＭ−１９の増殖を阻害することが示された（参考文献８）。また、ＴＨＣは、培養中のヒト前立腺ＰＣ−３細胞およびＣ６神経膠腫細胞においてアポトーシスを誘導することが示された（参考文献９および１０）。ＴＨＣが誘導するアポトーシスは、カンナビノイド受容体依存経路（参考文献８、１１）、またはカンナビノイド受容体非依存経路（参考文献９、１０）を伴った。こうした研究から、ｉｎ  ｖｉｖｏで形質転換細胞においてアポトーシスを誘導するためにカンナビノイド受容体をターゲティングすることに関して興味が引き起こされてきた。この目的に向けて、カンナビノイドは、最近、ｉｎ  ｖｉｖｏでＣ６神経膠腫細胞の増殖を阻害することが示された（参考文献１２、１３）。
【０００４】
本発明の発明者らは、正常または形質転換免疫細胞におけるアポトーシスの誘導に関与しうるとみなされるＣＢ２受容体を、免疫系の細胞が高レベルで発現することに注目してきた。ネズミおよびヒト白血病およびリンパ腫株、並びに、初代急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）細胞を用いることによって、本発明の発明者らは、ＣＢ２受容体を連結すると、広い範囲の免疫細胞起源の癌においてアポトーシスが誘導されうることを立証した。さらに、本発明の発明者らは、ＴＨＣは、アポトーシスを誘導することによって、ｉｎ  ｖｉｖｏで、ネズミリンパ腫細胞の増殖を阻害可能であり、そして試験実験において、その腫瘍を持つマウスのおよそ２５％が完全に治癒可能であることを立証する。本研究のデータによって、向精神効果を欠くＣＢ２アゴニストは、免疫系の悪性腫瘍を治療する、新規のそして有効な様式を構成しうることが示唆される。
【０００５】
本発明の発明者らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ネズミ腫瘍ＥＬ−４、ＬＳＡ、およびＰ８１５をデルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）に曝露すると、細胞生存度の有意な減少およびアポトーシスの増加が導かれることを特に見出した。ＥＬ−４腫瘍細胞を合成カンナビノイドＨＵ−２１０および内因性カンナビノイド、アナンダミドに曝露すると、アポトーシスの有意な誘導が導かれ、一方、ＷＩＮ５５２１２に曝露しても無効であった。ＥＬ−４腫瘍を持つマウスをｉｎ  ｖｉｖｏでＴＨＣを用いて処置すると、腫瘍負荷の有意な減少、腫瘍細胞アポトーシスの増加、および腫瘍を持つマウスの生存の増加が導かれた。
【０００６】
本発明の発明者らは、Ｊｕｒｋａｔ、Ｍｏｌｔ−４、およびＳｕｐ−Ｔ１を含む、いくつかのヒト白血病およびリンパ腫細胞株を調べ、そしてこれらがＣＢ２受容体を発現するが、ＣＢ１受容体を発現しないことを決定した。これらのヒト腫瘍細胞はまた、ＴＨＣ、ＨＵ−２１０、アナンダミド、およびＣＢ２選択的アゴニスト、ＪＷＨ−０１５が誘導するアポトーシスも受けやすかった。ＣＢ２アンタゴニスト、ＳＲ１４４５２８で前処理すると、ＴＨＣが誘導するアポトーシスが部分的に逆転するため、この効果は、少なくとも部分的に、ＣＢ２受容体を通じて仲介された。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、初代急性リンパ芽球性白血病細胞をＴＨＣとともに培養すると、細胞生存度が減少し、そしてアポトーシスが誘導された。したがって、免疫系の悪性腫瘍上に発現されるＣＢ２カンナビノイド受容体は、アポトーシス誘導の潜在的なターゲットとして役立つことが可能である。ＣＢ２アゴニストは、向精神効果を欠いており、免疫起源の腫瘍を選択的にターゲティングしそして殺す、新規抗癌剤として役立ちうる。
【０００７】
ＣＢ２特異的アゴニストの一例、ＪＷＨ−０１５は、式、（２−メチル−１−プロピル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１−ナフタレニルメタノンを有し、分子量は３２７．４３である。ＪＷＨ−０１５は、ＤＭＳＯ中で１０ｍＭまで、そしてエタノール中で２５ｍＭまで溶解する。ＪＷＨ−０１５は選択的ＣＢ２アゴニストである（ＣＨＯ細胞において、ヒト・クローン化ＣＢ２受容体およびＣＢ１受容体で測定した際、Ｋ１値は１３．８ｎＭおよび３８３ｎＭである）。Ｇｒｉｆｆｉｎら（１９９９）Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ＣＢ２−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｏｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｎｅｒｖｅ  ｔｅｒｍｉｎａｌｓ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ３３９  ５３．  Ｐｅｒｔｗｅｅら（１９９９）Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｌｉｇａｎｄｓ．  Ｃｕｒｒ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ６  ６３５．  Ｃｈｉｎら（１９９９）Ｔｈｅ  ｔｈｉｒｄ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｈｅｌｉｘ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｌａｙｓ  ａ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａｍｉｎｏａｌｋｙｌｉｎｄｏｌｅｓ  ｆｏｒ  ＣＢ２，  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｔｈｅｒ．  ２９１  ８３７を参照されたい。これらの参考文献はすべて、本明細書に援用される。
【０００８】
他の選択的ＣＢ２アゴニスト、特にレゾルシノールである化合物が、Ｗｉｌｅｙら（本明細書に援用される、Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ２００２  ３０１：６７９−６８９）に解説される。本発明で使用するのに好ましい選択的ＣＢ２アゴニストは、ＣＢ２受容体に対して、ＣＢ１受容体に対する親和性の少なくとも５倍、より好ましくは少なくとも１０倍、さらにより好ましくは少なくとも２０倍、そして最も都合よくは１００倍以上の親和性を有する。
【０００９】
したがって、本発明の第一の側面は、免疫系細胞の異常のため、療法の必要がある患者を治療する方法であって、ＣＢ２カンナビノイド受容体活性を有する化合物の療法的有効用量を投与することを含んでなる、前記方法を提供する。
【００１０】
好ましくは、異常は、免疫系の悪性腫瘍、自己免疫疾患、敗血症ショック、移植反応およびアレルギーである。最も好ましくは、異常は、白血病またはリンパ腫であり、特に、原発性（ｐｒｉｍａｒｙ）急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）である。
【００１１】
都合よくは、化合物は、ＴＨＣなどの古典的なＣＢ１受容体アゴニストに比較した際に、減少した向精神活性を有するＣＢ２アゴニストである。
前述のＣＢアゴニスト化合物またはその配合物の投与には、経路を限定する必要はない。オプションには、経腸（例えば経口および直腸）または非経口（例えば鼻または肺への搬送、あるいは静脈、動脈、脳、脊椎、膀胱、腹膜、筋肉または皮下領域への注射）が含まれる。治療は、単回用量またはある期間に渡る複数用量からなることが可能である。投薬量は、好ましくは、医師によって決定されるであろうが、０．０１ｍｇ〜１．０ｇ／ｋｇ／日、例えば０．１〜５００ｍｇ／ｋｇ／日であることが可能である。体表平方メートルあたりの用量で表すと、化合物は、１．０ｍｇ〜１．５ｇ／ｍ２／日、例えば、３．０〜２００．０ｍｇ／ｍ２／日で投与可能である。
【００１２】
本発明の化合物を単独で投与することが可能であるが、薬剤配合物として、１以上の許容しうるキャリアーおよび／または賦形剤とともに、提示することが好ましい。キャリアー（類）および／または賦形剤類は、本発明の化合物と適合するという意味で「許容しうる」ものでなければならないし、そしてそのレシピエントに有害であってはならない。
【００１３】
配合物（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）は、単位用量型で好適に提示可能であり、そして薬学技術分野に周知の方法のいずれによって調製することも可能である。単位用量型は、２．０ｍｇ〜２．０ｇ、例えば５．０ｍｇ〜３００．０ｍｇの活性成分を含んでなることが可能である。こうした方法には、活性成分、すなわち本発明の化合物を、キャリアーおよび／または１以上の付属成分を構成する賦形剤と会合させる工程が含まれる。一般的に、配合物は、活性成分と液体キャリアーまたは細かく分割した固形キャリアーおよび／または賦形剤および／またはこれらの２つまたはすべてを、均一に、そして緊密に会合させて、そしてその後、必要であれば産物を形作る（ｓｈａｐｅ）ことによって、調製される。
【００１４】
本発明にしたがった、経口投与に適した配合物は、各々、あらかじめ決定した量の活性成分を含有する、カプセル、カシェ剤または錠剤などの別個の単位として；粉末または顆粒として；水性液体または非水性液体中の溶液または懸濁物として；あるいは水中油液体エマルジョンまたは油中水液体エマルジョンとして、提示可能である。活性成分はまた、巨丸剤（ｂｏｌｕｓ）、舐剤またはペースト剤としても提示可能である。
【００１５】
錠剤は、場合によって１以上の付属成分とともに、圧縮（ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ）または成形（ｍｏｕｌｄｉｎｇ）によって作成可能である。圧縮錠剤は、粉末または顆粒などの自由に流れる型の活性成分を、場合によって結合剤（例えばポビドン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、潤滑剤、不活性希釈剤、保存剤、崩壊剤（例えばデンプングリコール酸ナトリウム、ＰＶＰ、架橋ポビドン、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤または分散剤と混合して、適切な機械の中で圧縮することによって調製可能である。成形錠剤（ｍｏｕｌｄｅｄ  ｔａｂｌｅｔ）は、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末化合物の混合物を、適切な機械の中で成形することによって作成可能である。場合によって、錠剤をコーティングするか、または錠剤に刻み目を付ける（ｓｃｏｒｅｄ）ことが可能であり、そして例えば多様な比率のヒドロキシプロピルメチルセルロースを用いて、望ましい放出プロフィールを提供して、中の活性成分の遅延放出または徐放を提供するように配合することが可能である。
【００１６】
口中の局所投与に適した配合物には、フレーバー化基剤、通常スクロースおよびアカシアまたはトラガカント中に活性成分を含んでなるロゼンジ；ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシアなどの不活性基剤中に活性成分を含んでなる香錠；および適切な液体キャリアー中に活性成分を含んでなる、うがい薬が含まれる。
【００１７】
非経口投与に適した配合物には、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、および意図するレシピエントの血液と配合物を等張にすることが可能な溶質を含有することが可能な、水性および非水性無菌注射溶液；並びに懸濁剤および粘稠化剤を含むことが可能な、水性および非水性無菌懸濁物が含まれる。配合物（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ）は、単位用量または多数用量容器、例えば密封アンプルおよびバイアル中に提示可能であり、そして使用直前に、無菌液体キャリアー、例えば注射用の水を添加することしか必要としない、フリーズドライ（凍結乾燥）状態で保管することが可能である。先に記載した種類の、無菌粉末、顆粒および錠剤から、即席の注射溶液および懸濁物を調製することが可能である。
【００１８】
好ましい単位用量配合物は、活性成分の一日用量または単位、一日下位用量またはその適切な部分を含有するものである。
上に特に言及する成分に加えて、本発明の配合物は、問題の配合物の種類を考慮して、当該技術分野において慣用的である他の剤を含むことが可能であり、例えば経口投与に適したものは、フレーバー剤を含むことが可能である。
【００１９】
本発明の第二の側面において、免疫系の異常、特に白血病およびリンパ腫などの免疫系の悪性腫瘍を治療するための医薬品製造のための、本発明の第一の側面の化合物の使用を提供する。
【００２０】
本発明の発明者らは、ＴＨＣおよび他のカンナビノイドが、ネズミおよびヒト白血病およびリンパ腫細胞株とともに、初代ＡＬＬ細胞においてアポトーシスを誘導可能であることを立証した。スクリーニングしたヒト腫瘍細胞株は、ＣＢ２受容体を発現したが、ＣＢ１受容体を発現せず、一方、ネズミ腫瘍は、ＣＢ１受容体およびＣＢ２受容体両方を発現した。
【００２１】
ＣＢ２選択的アゴニストが腫瘍細胞でアポトーシスを誘導可能である限り、アポトーシスを誘導するには、ＣＢ２受容体を連結すれば十分である。ヒト腫瘍細胞株におけるＴＨＣ誘導アポトーシスは、今や、ＣＢ２アンタゴニストによって逆転されることが示されている。アポトーシスを誘導し、そして腫瘍負荷を減少させる能力によって立証されるように、ＴＨＣは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏだけでなく、ｉｎ  ｖｉｖｏでも有効であった。さらに、ＴＨＣ処置は、同系腫瘍を持つマウスのおよそ２５％を治癒させることが可能であった。したがって、免疫起源の腫瘍細胞上のＣＢ２受容体をターゲティングすると、こうした癌を治療する新規の、そして比較的非毒性のアプローチが提供される。
【００２２】
神経行動学的機能を制御する際のカンナビノイドおよびその受容体間の相互作用が、徹底的に研究されてきている。カンナビノイドはまた、免疫機構を改変することも示されてきているが、正確な機構は不明なままである。また、免疫細胞上のカンナビノイド受容体の生理学的機能、および免疫細胞制御においてエンドカンナビノイドが果たす役割も、未解明のままである。本発明の発明者らは、ＴＨＣをＣ５７ＢＬ／６マウスに投与すると、胸腺および脾臓の細胞性の顕著な減少につながり、これが免疫細胞におけるアポトーシスの誘導に起因することも立証した。
【００２３】
最近、カンナビノイドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導することが示されてきている（参考文献９、１０、１２、１８、１９を参照されたい）。総合すると、こうした研究によって、カンナビノイドを抗癌剤として使用しうることが示唆される。ＴＨＣが正常リンパ球および形質転換リンパ球においてアポトーシスを誘導する正確な機構は不明なままである。ＴＨＣおよび他のカンナビノイドは、２つの別個の機構によって作用しうると考えられる。その親油特性から、ＴＨＣは細胞膜に直接挿入されることによって作用すると考えられた。しかし、まもなく、カンナビノイドの活性が非常に立体特異的であることがわかり、このことから、親油特性のみが、カンナビノイドの活性に関与しているのではないことが示唆された。それ以来、カンナビノイドの受容体が性質決定されてきている。これらの受容体は、４４％の相同性しか共有しないが、試験したカンナビノイドの大部分は、どちらの受容体にも同様の結合親和性を示す（参考文献２０）。
【００２４】
どちらの受容体もＧタンパク質にカップリングしており、このことから、内因性カンナビノイドが細胞シグナル伝達に役割を果たしうることが示唆される（参考文献１）。したがって、免疫反応に対するＴＨＣの観察される影響は、アポトーシスの誘導も含めて、これらの受容体を通じて開始されるシグナルによって仲介されうる可能性がある。例えば、Ｇａｌｖｅ−Ｒｏｐｅｒｈら（参考文献１２）は、Ｃ６神経膠腫細胞において、ｉｎ  ｖｉｖｏでＴＨＣが誘導するアポトーシスが、カンナビノイド受容体依存経路を伴うことを立証した。
【００２５】
対照的に、他の研究者らは、Ｃ６神経膠腫または前立腺癌細胞モデルにおいて、ＴＨＣが誘導するアポトーシスが、ＣＢ１受容体およびＣＢ２受容体の関与と独立であることを示している。本研究において、いくつかの観察により、ＣＢ２受容体を連結すると、免疫起源の腫瘍においてアポトーシスを誘導可能であることが示唆された。例えば、ＪｕｒｋａｔおよびＳｕｐ−Ｔ１などのヒト腫瘍細胞は、ＣＢ２受容体しか発現せず、そしてＴＨＣが誘導するアポトーシスは、これらの腫瘍細胞において、ＣＢ２アンタゴニストによって、少なくとも部分的に阻害された。しかし、これらの研究は、免疫起源のネズミ腫瘍上のＣＢ１受容体を連結してもまた、アポトーシスが誘導されるという可能性を除外しなかった。実際、本発明の発明者らは、ＥＬ−４腫瘍細胞にＣＢ１アンタゴニストを添加してもまた、アポトーシスが阻害されうることも観察した。しかし、カンナビノイド受容体アンタゴニストが、逆アゴニストとして作用する可能性があり（参考文献２１、２２）、そしてそれによって代替経路を通じてアポトーシスを防止する可能性があることに注目しなければならない。このため、本発明の発明者らは、ＣＢ２受容体のみを発現するヒト細胞株を用い、そしてＣＢ２アンタゴニストを用いてアポトーシスを誘導するには、ＣＢ２受容体の連結のみで十分であることを示した。
【００２６】
ＴＨＣがサイトカインネットワークに影響を有することは周知である（参考文献２３）。例えば、ＴＨＣの存在またはＣＢ１／ＣＢ２受容体の活性化は、フォルスコリンが誘導する環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）の集積を遮断可能であり（参考文献２４〜２６）、そしてｃＡＭＰレベルの減少は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）転写および分泌の抑制と相関する（参考文献２７）。ＩＬ−２はアポトーシスの制御に重要な役割を果たす（参考文献２８〜３０）。したがって、ＴＨＣに曝露された後、ＩＬ−２または他のサイトカインのレベルが減少することが、部分的にアポトーシス増加の原因となっている可能性がある。本発明の発明者らは、ＩＬ−２が、形質転換Ｔ細胞の自律増殖において、自己分泌増殖因子として作用しうることを立証した（参考文献３１、３２）。したがって、ＴＨＣによるＩＬ−２産生の阻害は、増殖減少およびアポトーシス性細胞死を導きうる。
【００２７】
ＣＢ１受容体は、中枢神経系とともに脳下垂体、免疫細胞、生殖組織、胃腸組織、心臓、肺、膀胱、および副腎で発現される（Ｂｅｒｄｙｓｈｅｖによって概説される、参考文献１）。対照的に、ＣＢ２受容体は、主に、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、およびマスト細胞を含む、免疫細胞に見られる（参考文献３３、３４）。
【００２８】
したがって、免疫細胞上のＣＢ２受容体の選択的発現は、ＣＢ２アゴニストを用いてアポトーシスを誘導し、そしてそれによって免疫系の癌を治療する、新たな手段を提供することによって、免疫系の悪性腫瘍をターゲティングするユニークな機会を提供する。ＣＢ２選択的アゴニストを用いる利点はまた、こうした治療が、ＣＢ１アゴニストに特徴的な向精神効果を欠くという事実に基づいている。本研究において、すべて、カンナビノイドが誘導するアポトーシスに感受性であることが示された、免疫起源のいくつかのネズミおよびヒト腫瘍細胞株を無作為に選択したことに注目しなければならない。
【００２９】
本研究において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでアポトーシスを誘導したＴＨＣの用量は、血清含有培地を用いると、１０μＭ以上、そして血清不含培地中では３μＭ以上であることが見出された。同様の観察が他の研究者によってもなされ、彼らもまた、血清が存在すると、細胞死を誘導するのにＴＨＣがより有効でないことに気付いた（参考文献１７）。これは、アルブミンなどの血清タンパク質およびカンナビノイド間の直接の相互作用の結果であると考えられる（参考文献１６）。初期の研究で、５０ｍｇ／ｋｇのＴＨＣを注射したラットが、投与１０時間以内に、血清中、１０μＭ  ＴＨＣを示すことが示されたため（参考文献３５）、本研究において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで用いたＴＨＣの用量は、薬理学的に適切であった。また、これらの研究において、マウスには、２年間に渡って、５００ｍｇ／ｋｇを週５回という高用量が投与された。興味深いことに、こうした高用量にもかかわらず、投与ラットの生存率は対照ラットより高かった。また、ＴＨＣで処置したマウスおよびラットにおいて、広い範囲の癌の発生率が用量依存方式で減少した（参考文献３５）。
【００３０】
大部分の先の研究において、非リンパ腫瘍細胞株においてアポトーシスを誘導する際のＴＨＣまたは他のカンナビノイドの効果は、曝露２日以上後でしか見られなかった（参考文献９、１０、１２、１３）。対照的に、本研究において、我々は、早くも、ＴＨＣとの培養４時間後に、リンパ腫瘍において、顕著なアポトーシス誘導を示すことが可能であった。これらのデータによって、リンパ腫瘍は、ＴＨＣが誘導するアポトーシスに非常に感受性でありうることが示唆される。最近、アナンダミドが、ヒト神経芽細胞腫（ＣＨＰ１００）およびリンパ腫（Ｕ９３７）細胞においてアポトーシスを誘導することが示された（参考文献１８、本明細書に援用される）。これらの著者らは、アナンダミドが誘導するアポトーシスが、カンナビノイド受容体と独立であり、そしてバニロイド受容体を通じて誘導されることを立証した。本研究において、我々もまた、アナンダミドは、スクリーニングしたリンパ細胞株においてアポトーシスを誘導するのに有効であることを観察した。
【００３１】
本研究において、我々は、ＴＨＣが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏだけでなく、ｉｎ  ｖｉｖｏでも、腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導可能であることを観察した。さらに、ＴＨＣは腫瘍負荷を減少させ、腫瘍を持つマウスの平均生存時間を延長するとともに、こうしたマウスの有意な比率を治癒させるのにも有効であった。ＴＨＣは免疫抑制性であり、そしてＥＬ−４は免疫原性腫瘍であるため（参考文献３６）、ＴＨＣの免疫抑制効果が宿主の抗腫瘍免疫と干渉した可能性があり、これが治癒の割合がより低かった原因である可能性がある。したがって、さらに操作して、抗腫瘍免疫の有意な抑制を引き起こすことなく、有意なアポトーシスを誘導するＴＨＣ用量にして、治癒率をさらに改善する治療措置の開発を提供する。
【００３２】
本研究は、アポトーシスを誘導するため、ＣＢ２受容体をターゲティングすることによって、免疫系の悪性腫瘍を治療する新規アプローチが提供されることを立証する。ＣＢ２受容体アゴニストを用いる利点は、これらが、精神活性特性を示さないことである。したがって、該方法で使用するのに好ましい化合物は、比較的低いＣＢ１活性を有し、そしてより好ましくは、比較的低いバニロイド受容体活性を有する（例えばバニロイド活性より５倍高いＣＢ２活性を有する）。ＣＢ２受容体は、もっぱら免疫細胞上にのみ発現されるため、ＣＢ２受容体アゴニストの使用は、非免疫細胞には毒性でないであろう。
【００３３】
本発明は、ここで、例示目的のみのため、以下の限定されない実施例、図および配列に言及して記載されるであろう。これらを踏まえて、本発明の範囲内に属するさらなる態様が、当業者には思い浮かぶであろう。
【００３４】
実験
材料および方法
マウス：成体（６〜８週齢）メスＣ５７ＢＬ／６マウスを米国国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダから購入した。マウスをポリエチレンケージで飼育し、そしてげっ歯類飼料および水を自由に与えた。７４±２°Ｆの温度に維持し、そして１２時間の明／暗周期に維持した部屋でマウスを飼育した。
【００３５】
試薬：米国国立薬物乱用研究所（メリーランド州ロックビル）からＴＨＣを得て、そしてまず、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）に溶解して、２０ｍＭの濃度とし、そして−２０℃で保管した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究用には組織培地に、そしてｉｎ  ｖｉｖｏ研究にはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に、ＴＨＣをさらに希釈した。Ｓａｎｏｆｉ  Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ（フランス・モンペリエ）からＳＲ１４１７１６ＡおよびＳＲ１４４５２８を得た。Ｔｏｃｒｉｓ  Ｃｏｏｋｓｏｎ（ミズーリ州エリスビル）からＨＵ−２１０、アナンダミド、ＷＩＮ５５２１２、およびＪＷＨ−０１５を得た。
【００３６】
細胞株：ネズミリンパ腫（ＥＬ−４およびＬＳＡ）、ネズミ肥満細胞腫（Ｐ８１５）、ネズミ黒色腫（Ｂ１６Ｆ１０）、８歳の男性から発展させたＴリンパ芽球性白血病細胞株、Ｓｕｐ−Ｔ１、１４歳の男性から生成された急性Ｔリンパ芽球性白血病細胞株、Ｊｕｒｋａｔ、１９歳の男性から樹立された急性Ｔリンパ芽球性白血病細胞株、Ｍｏｌｔ−４、およびヒト神経膠腫Ｕ２５１細胞株をすべて、５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭグルタミン、４０μｇ／ｍｌ硫酸ゲンタマイシン、および５０μＭ  ２−メルカプトエタノールを補ったＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ニューヨーク州グランドアイランド）中で維持した。腫瘍細胞生存度およびアポトーシスに対するカンナビノイドアゴニストの影響を調べるアッセイでは、ＦＣＳの濃度は０％〜５％の範囲であった。
【００３７】
初代白血病細胞：ＡＬＬと診断された２人の患者から、末梢血試料を得た。試料をＡＬＬ１およびＡＬＬ２と称した。ＡＬＬ１は、急性リンパ芽球性白血病共通抗原（ＣＡＬＬＡ）（ＣＤ１０）陽性非Ｂ非Ｔ  ＡＬＬと新規に診断された男性患者から得られた。ＡＬＬ２は、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）陽性Ｔ細胞ＡＬＬと新規に診断された女性患者から得られた。研究所のガイドラインにしたがってインフォームドコンセントを得て、そしてバージニア・コモンウェルス大学の研究所審査委員会から認可を得た。ヘルシンキ宣言にしたがって、コンセントを提供した。
【００３８】
リンパ芽球の含有量は、フローサイトメトリー解析によって決定した際、７０％より多かった。フィコール・パック密度勾配遠心分離によって、単核細胞を単離した。本研究では、使用前に、試料を凍結保存して、そして液体窒素中で保管した。融解後の生存度を、トリパンブルー色素排除によって決定し、そしてこれは９０％より高かった。
【００３９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの腫瘍細胞生存度に対するカンナビノイド受容体アゴニストの影響の測定：５％ＦＣＳを含有する培地または血清不含培地中で、腫瘍細胞を１ｘ１０６細胞／ｍｌに調整した。多様な濃度のカンナビノイド受容体アゴニストの存在下または非存在下で、２ｍｌ培地中、２４ウェルプレート中で、細胞（１ｘ１０６）を２〜２４時間培養した。最後に、細胞を採取し、そしてＰＢＳ中で２回洗浄し、そしてトリパンブルー色素排除によって生存細胞数を決定した。
【００４０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでカンナビノイドが誘導するアポトーシスの検出：上述のように、多様な濃度のＴＨＣまたは他のカンナビノイド受容体アゴニストの存在下または非存在下で、２４ウェルプレート中で、腫瘍細胞（１ｘ１０６細胞／ウェル）を２〜２４時間培養した。次に、細胞を採取し、ＰＢＳ中で２回洗浄し、そして別の箇所に記載されるように、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼが仲介する末端標識（ＴＵＮＥＬ）法またはアネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）法いずれかを用いて、アポトーシス誘導に関して解析した（参考文献１４、１５、本明細書に援用される）。ＴＵＮＥＬ法を用いてアポトーシスを検出するため、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、そして室温で、４％ｐ−ホルムアルデヒドで３０分間固定した。細胞を次にＰＢＳで洗浄し、氷上で２分間、透過処理し、そしてフルオレセインイソチオシアネート−ｄＵＴＰおよびＴｄＴ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、インディアナ州インディアナポリス）と３７℃および５％ＣＯ２で１時間インキュベーションした。アネキシンＶ／ＰＩ法を用いてアポトーシスを検出するため、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、そしてアネキシンＶおよびＰＩで、室温で２０分間染色した。細胞をＰＢＳで２回洗浄した。ＴＵＮＥＬアッセイおよびアネキシン／ＰＩアッセイ両方において、フローサイトメトリー解析により細胞の蛍光を測定することによって、アポトーシスレベルを決定した。１試料あたり５０００の細胞を解析した。
【００４１】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍細胞生存度およびアポトーシス誘導の測定：５匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの群に、０．２ｍｌ  ＰＢＳ中に懸濁した１ｘ１０６  ＥＬ−４腫瘍細胞を腹腔内（ＩＰ）注射した。対照マウスには、ＰＢＳのみを投与した。１０日後、マウスに多様な濃度のＴＨＣ（０、１、３、または５ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ）を注射した。マウスを２４時間後に殺し、そして５．０ｍｌ  ＰＢＳを注射し、その後、腹腔から腹腔液を吸引することによって、腹腔からＥＬ−４腫瘍細胞を採取した。赤血球溶解溶液（Ｓｉｇｍａ）を用いて、混入した赤血球を除去し、そして腫瘍細胞をＰＢＳで２回洗浄した。トリパンブルー色素排除によって、生存細胞数を決定し、そしてＴＵＮＥＬアッセイを用いて、アポトーシスを決定した。細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖する能力によって、そしてその表現型（Ｔｈｙ１−、ＣＤ４−、ＣＤ８−）によって、腹腔中に腫瘍細胞が存在することを確認した。
【００４２】
ＥＬ−４に曝露したマウスの生存に対するＴＨＣの影響：８匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの群に、体積１００μｌのＰＢＳ中の１ｘ１０６  ＥＬ−４腫瘍細胞をＩＰ注射した。腫瘍注射１日後、体積５００μｌのＰＢＳ中の５ｍｇ／ｋｇ  ＴＨＣを、１４日間、毎日、マウスにＩＰ注射した。対照マウスには、ビヒクル対照を注射した。病的状態の徴候に関して、マウスを毎日観察し、そして安楽死させた。６０日より長く生き残ったマウスは、生存ＥＬ−４細胞（１ｘ１０６）に再曝露し、そして腫瘍を拒絶しそして生き残る能力に関して試験した。
【００４３】
ＲＮＡ単離および逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）：ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）を用いて、およそ１ｘ１０７細胞からＲＮＡを単離した。ＣＢ１およびＣＢ２は、単一のエクソンにコードされるため、単離法にＤＮアーゼ消化を含んで、ゲノムＤＮＡからＣＢ１およびＣＢ２がＰＣＲ増幅される可能性を制限した。第一鎖合成のテンプレートとして１μｇ  ＲＮＡを用いて、Ｑｉａｇｅｎ  ＯｍｎｉＳｃｒｉｐｔ  ＲＴキットでｃＤＮＡを調製した。プライマーＨ  ＣＢ１  Ｕ（５’−ＣＧＴＧＧＧＣＡＧＣＣＴＧＴＴＣＣＴＣＡ−３’）およびＨ  ＣＢ１  Ｌ（５’−ＣＡＴＧＣＧＧＧＣＴＴＧＧＴＣＴＧＧ−３’）を用いてマウスおよびヒトＣＢ１を増幅して、４０３ｂｐの産物を得た。プライマーＨ  ＣＢ２  Ｕ（５’−ＣＧＣＣＧ−ＧＡＡＧＣＣＣＴＣＡＴＡＣＣ−３’）およびＨ  ＣＢ２  Ｌ（５’−ＣＣＴＣＡＴＴＣＧＧＧＣＣＡＴＴＣ−ＣＴＧ−３’）を用いてヒトＣＢ２を増幅して、５２２ｂｐの産物を得た。Ｍ  ＣＢ２  Ｕ（５’−ＣＣＧＧＡＡＡＡＧＡＧＧＡＴＧＧＣＡＡＴＧＡＡＴ−３’）およびＭ  ＣＢ２  Ｌ（５’−ＣＴＧＣＴＧＡＧＣＧＣＣＣＴＧＧＡＧＡＡＣ−３’）を用いてマウスＣＢ２を増幅して、４７９ｂｐの産物を得た。プライマーＭ  ＢＡ  Ｕ（５’−ＡＡＧＧＣＣＡＡＣＣＧＴＧＡＡＡＡＧＡＴＧＡＣＣ−３’）およびＭ  ＢＡＬ（５’−ＡＣＣＧＣＴＣＧＴＴＧＣＣＡＡＴＡＧＴＧＡＴＧＡ−３’）、産物サイズ４２７ｂｐのβ−アクチンを陽性対照として用いた。以下のパラメーターを用いて、ＰＣＲ反応を行った：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＧｅｎｅＡｍｐ  ９７００（カリフォルニア州フォスターシティー）中、９５℃１５秒間、５８℃１５秒間、および７２℃３０秒間を３５周期；その後、最後に７２℃５分間。生じたＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で分離した。
【００４４】
結果：
ＥＬ−４、ＬＳＡ、およびＰ８１５ネズミ腫瘍細胞におけるＣＢ１受容体およびＣＢ２受容体の発現：ＲＴ−ＰＣＲによって、ＣＢ１およびＣＢ２カンナビノイド受容体ｍＲＮＡの発現を決定した（図１）。この解析によって、３つのネズミ腫瘍細胞株がすべて、ＣＢ１  ｍＲＮＡおよびＣＢ２  ｍＲＮＡ両方を発現することが明らかになった。
【００４５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＥＬ−４、ＬＳＡ、およびＰ８１５腫瘍細胞をＴＨＣに曝露すると、生存度減少およびアポトーシス誘導が導かれる：ＴＨＣ曝露が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＥＬ−４、ＬＳＡ、およびＰ８１５腫瘍細胞の生存度に影響を有するかどうかを調べた。この目的に向けて、５％ＦＣＳを含有する培地中で、腫瘍細胞を培養し、そして多様な濃度のＴＨＣ（０、１、１０、および２０μＭ）に２４時間曝露し、そしてトリパンブルー色素排除によって、生存度を決定した（図２Ａ）。結果は、１０μＭ以上の濃度のＴＨＣに曝露すると、生存細胞数の有意な減少が導かれることを示した。次に、ＴＵＮＥＬ染色により、ＴＨＣで処理した腫瘍細胞を、アポトーシスの誘導に関して解析した（図２Ｂ）。
【００４６】
結果によって、ＴＨＣが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、３つの細胞株すべてにおいて、有意なアポトーシスを誘導することが立証された。総合すると、これらの結果によって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＥＬ−４、ＬＳＡ、およびＰ８１５腫瘍細胞をＴＨＣに曝露すると、アポトーシスの誘導によって、有意な細胞殺傷が導かれることが示唆される。
【００４７】
ＴＨＣが誘導する、細胞性に対する影響は、曝露時間および血清濃度に依存する：先の研究によって、ＴＨＣの効力は、血清中の濃度に直接関連しうることが示唆された（参考文献１６、１７）。したがって、本発明の発明者らは、血清不含培地中で腫瘍細胞を培養すると、ＴＨＣが誘導する腫瘍細胞の殺傷に影響があるかどうかを調べた。ＥＬ−４腫瘍細胞を多様な濃度のＴＨＣ（１、３、および５μＭ）またはビヒクルに、血清不含培地中で、４、８、または１２時間曝露し、そして細胞生存度を決定することによって、これを達成した。結果は、血清不含培地中で細胞を培養することによって、腫瘍細胞生存度を減少させるのに必要なＴＨＣ濃度が、劇的に減少することを示した（図３Ａ）。例えば、５μＭという低濃度のＴＨＣに、ＥＬ−４腫瘍細胞を４時間曝露すると、腫瘍細胞生存度の有意な減少（図３Ａ）およびアポトーシス誘導の増加（図３Ｂ、Ｃ）が導かれた。また、１２時間の時点で、３μＭの濃度のＴＨＣは、腫瘍細胞生存度の有意な減少を引き起こすことが可能であった（図３Ａ）。図３Ｂおよび図３Ｃに示すデータは、ＴＵＮＥＬ法およびアネキシン／ＰＩ法両方を用いて、ＴＨＣが誘導するアポトーシスが明らかであったことを立証する。先の研究によって、アネキシンのみに関して陽性である細胞は、初期アポトーシス細胞に相当し、一方、アネキシンおよびＰＩ両方に関して陽性である細胞は、後期アポトーシス／壊死細胞に相当し、そしてＰＩのみに関して陽性である細胞は、壊死細胞であることが示されてきている（参考文献１５を参照されたい）。したがって、ＴＨＣで処理した細胞の大部分は、死の初期または後期アポトーシス段階にあるようであった（図３Ｃ）。血清不含培地において、５μＭの濃度のＴＨＣで、腫瘍細胞殺傷を誘導するのに必要な時間が、４時間に有意に減少することにも注目した（図３Ａ）。血清は、ＴＨＣが誘導するアポトーシスに干渉するため、以下に続く実験はすべて、血清不含培地中で行った。
【００４８】
ＨＵ−２１０およびアナンダミドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＥＬ−４腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導するが、ＷＩＮ−５５２１２は誘導しない：ＥＬ−４腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導する能力に関して、３つのさらなるカンナビノイド受容体アゴニストを試験した。図４Ａにおいて、ＥＬ−４腫瘍細胞を３μＭ  ＴＨＣ、ＷＩＮ５５２１２、およびＨＵ−２１０に４時間曝露した。その後、アネキシン／ＰＩ法を用いて、アポトーシスに関して細胞を解析した（図４Ａ）。結果は、ＴＨＣまたはＨＵ−２１０に曝露すると、対照に比較して、アポトーシスの有意な増加が導かれることを示した。対照的に、３μＭ  ＷＩＮ５５２１２に曝露すると、アポトーシスの誘導には有意な影響がなかった。さらに、アポトーシス誘導に対するアナンダミド曝露の影響を調べた（図４Ｂ）。ＥＬ−４腫瘍細胞を５μＭおよび１０μＭのアナンダミドに４時間曝露した。ＴＵＮＥＬアッセイを用いて、アポトーシスに関して細胞を解析した。結果は、５μＭに曝露すると、アポトーシスのわずかな増加が導かれることを示した。
【００４９】
図１。ＥＬ−４、ＬＳＡ、およびＰ８１５腫瘍細胞における、ＣＢ１  ｍＲＮＡおよびＣＢ２  ｍＲＮＡの発現。ＲＴ−ＰＣＲ解析によって、ＣＢ１  ｍＲＮＡおよびＣＢ２  ｍＲＮＡの発現を決定した。ＥＬ−４、ＬＳＡ、およびＰ８１５腫瘍細胞から、総ＲＮＡを単離した。ｍＲＮＡを逆転写し、そしてＣＢ１およびＣＢ２に特異的なプライマーを用いたＰＣＲによって増幅した。エチジウムブロミドで染色した単位複製配列の写真を示す。
【００５０】
図２。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、免疫起源のネズミ腫瘍細胞をＴＨＣに曝露すると、細胞生存度の減少およびアポトーシスの誘導が導かれる。（Ａ）多様な濃度のＴＨＣ（１、１０、および２０μＭ）またはビヒクルの存在下で、５％ＦＣＳを含有する培地中、ＥＬ−４、ＬＳＡ、およびＰ８１５腫瘍細胞を２４時間培養することによって、腫瘍細胞生存度に対するＴＨＣの影響を決定した。トリパンブルー色素排除によって生存細胞数を決定した。データを、対照生存細胞数の割合として表した。（Ｂ）２０μＭ  ＴＨＣ（黒塗りのヒストグラム）またはビヒクル（白抜きのヒストグラム）の存在下で、５％ＦＣＳを含有する培地中、腫瘍細胞を２４時間培養することによって、ＥＬ−４、ＬＳＡ、およびＰ８１５腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘導に対するＴＨＣの影響を決定した。ＴＵＮＥＬ法を用いて、アポトーシスを定量化し、そしてフローサイトメーターを用いて、細胞を解析した。１０μＭアナンダミドに曝露すると、有意なレベルのアポトーシスが導かれた。
【００５１】
ＴＨＣ処置によって、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍負荷減少およびアポトーシスが導かれる：ｉｎ  ｖｉｖｏで、腫瘍を持つマウスをＴＨＣで処置すると、腫瘍細胞を殺すのに有効であるかどうかを調べた。この目的に向けて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＥＬ−４腫瘍細胞（１ｘ１０６）を注射した。腫瘍増殖第１０日、マウスに多様な用量のＴＨＣ（１、３、または５ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルをＩＰ注射した。１日後、マウスを殺し、そして腹腔に５ｍｌ  ＰＢＳを注射した。腹腔液を吸引し、そして生存腫瘍細胞およびアポトーシスに関して解析した。データによって、ＴＨＣが、腹腔に見られる生存腫瘍細胞数に、用量依存性の減少を引き起こすことが立証された（図５Ａ）。ＴＨＣは、１ｍｇ／ｋｇで細胞性に減少を引き起こすのに失敗したが、３ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇでは有効であった。
【００５２】
さらに、５ｍｇ／ｋｇで処置したマウスから収集した細胞を、アポトーシスに関して解析すると、有意な比率（７７．３％）の腫瘍細胞がアポトーシスを示した（図５Ｂ）。これらのデータによって、ＴＨＣがｉｎ  ｖｉｖｏでアポトーシスを誘導し、そしてＥＬ−４腫瘍細胞を殺すのに有効であったことが示唆される。
【００５３】
ＴＨＣ処置は、腫瘍を持つマウスを治癒させうる：次に、ＴＨＣ処置が、ＥＬ−４腫瘍を持つマウスを治癒させうるかどうかを試験した。この目的に向けて、マウスにＥＬ−４腫瘍細胞（１ｘ１０６）を注射し、そしてその後、５ｍｇ／ｋｇのＴＨＣを１４日間、毎日、注射した。生存に関してマウスを観察し、そして病的状態の徴候が示されたら、直ちに安楽死させた。結果は、ＴＨＣで処置すると、生存の有意な増加が導かれることを示した（図６）。興味深いことに、２５％のマウスは、腫瘍曝露を生き抜いた（図６）。また、これらのマウスは、特定の腫瘍への再曝露に対して抵抗性である限り、完全に治癒した（データ未提示）。総合すると、これらの結果によって、ＴＨＣがｉｎ  ｖｉｖｏで抗癌特性を発揮しうることが示唆される。
【００５４】
ヒトＭｏｌｔ−４、Ｊｕｒｋａｔ、およびＳｕｐ−Ｔ１腫瘍細胞株上のＣＢ１およびＣＢ２カンナビノイド受容体の発現：次に、ヒト白血病／リンパ腫細胞株が、カンナビノイド受容体を発現するかどうかを試験した。ＲＴ−ＰＣＲ解析を用いて、ＣＢ１およびＣＢ２カンナビノイド受容体ｍＲＮＡの発現を測定した（図７）。結果は、スクリーニングした３つの細胞株がすべて、有意なレベルのＣＢ２  ｍＲＮＡを発現することを示した。しかし、ネズミ腫瘍細胞株と異なり、ＣＢ１  ｍＲＮＡは、これらの３つの細胞株では検出されなかった。これらの実験において、ＣＢ１発現の陽性対照として、ヒト神経膠腫細胞株Ｕ２５１を用いた。
【００５５】
ＴＨＣ、ＨＵ−２１０、およびアナンダミドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ヒト白血病およびリンパ腫細胞株においてアポトーシスを誘導する：次に、ＴＨＣまたはＨＵ−２１０にヒト白血病およびリンパ腫細胞株を曝露すると、アポトーシス誘導が導かれるかどうかを調べた。この目的に向けて、ヒト腫瘍細胞株Ｊｕｒｋａｔ、Ｍｏｌｔ−４、およびＳｕｐ−Ｔ１を、多様な濃度のＴＨＣ、ＨＵ−２１０（２．５、５、および１０μＭ）、またはビヒクルに、４時間曝露し、そしてＴＵＮＥＬ法を用いて、アポトーシス誘導を決定した。結果は、Ｊｕｒｋａｔ、Ｍｏｌｔ−４、およびＳｕｐ−Ｔ１細胞株の曝露を示した（図３）。
【００５６】
ＴＨＣは、血清不含培地中でより有効である：（Ａ）多様な濃度のＴＨＣ（１、３、および５μＭ）またはビヒクルの存在下で、血清不含培地中、ＥＬ−４腫瘍細胞を、４、８、または１２時間培養した。トリパンブルー色素排除によって、生存細胞数を決定した。データは、二つ組ウェルの平均±ＳＥＭを意味する。（Ｂ）ビヒクル対照（ＤＭＳＯ）またはＴＨＣ（５μＭ）の存在下で、血清不含培地中、ＥＬ−４腫瘍細胞を４時間培養した。ＴＵＮＥＬ法を用いて、アポトーシス誘導レベルを決定した。（Ｃ）上述のように、ＴＨＣと培養したＥＬ−４細胞を、アネキシンＶ／ＰＩで染色し、そしてフローサイトメーターを用いて解析した。図４。
【００５７】
ＴＨＣ、ＨＵ−２１０、およびアナンダミドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＥＬ−４腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導するが、ＷＩＮ５５２１２は誘導しない：（Ａ）ビヒクル、ＴＨＣ（３μＭ）、ＷＩＮ５５２１２（３μＭ）、およびＨＵ−２１０（３μＭ）の存在下で、血清不含培地中、ＥＬ−４腫瘍細胞を４時間培養した。図３に記載するように、アネキシン／ＰＩ染色によって、アポトーシスレベルを定量化した。（Ｂ）ビヒクルまたはアナンダミド（５μＭおよび１０μＭ）の存在下で、血清不含培地中、ＥＬ−４腫瘍細胞を４時間培養した。ＴＵＮＥＬアッセイによって、アポトーシスレベルを定量化した。５μＭ以上のＴＨＣまたはＨＵ−２１０は、有意なレベルのアポトーシスを導いた（図８Ａ）。１０μＭの濃度のＴＨＣおよび５μＭの濃度のＨＵ−２１０は、８０％より高いアポトーシスを引き起こした（図８Ａ）。
【００５８】
図８Ｂは、ＴＵＮＥＬアッセイを用いた代表的な実験を示す。さらに、Ｍｏｌｔ−４腫瘍細胞におけるアポトーシス誘導に対する、アナンダミド曝露の影響を調べた。多様な濃度のアナンダミド（５、１０、２０、および４０μＭ）の非存在下または存在下で、Ｍｏｌｔ−４腫瘍細胞を４時間培養した。ＴＵＮＥＬ法を用いて、アポトーシスレベルを定量化した（図９）。結果は、２０μＭ以上の濃度のアナンダミドが、Ｍｏｌｔ−４腫瘍細胞において、有意なレベルのアポトーシスを誘導することを示した。総合すると、これらのデータによって、ＴＨＣ、ＨＵ−２１０、およびアナンダミドが、多様なヒト白血病およびリンパ腫細胞株においてアポトーシスを誘導可能であることが示唆される。
【００５９】
ＴＨＣが誘導する、生存細胞数の減少は、ＣＢ１およびＣＢ２カンナビノイド受容体を通じて仲介される：スクリーニングされたヒト腫瘍細胞株は、ＣＢ２受容体を提示するが、ＣＢ１受容体を提示しないため、ＴＨＣがアポトーシスを誘導するのに、ＣＢ２受容体を通じて作用するかどうかを試験した。この目的に向けて、ＣＢ２アンタゴニストまたはビヒクルの存在下で、ＪｕｒｋａｔおよびＳｕｐ−Ｔ１細胞を５μＭ  ＴＨＣとともにインキュベーションした。４時間後、トリパンブルー色素排除によって、生存細胞数を決定した（図１０）。結果は、ＴＨＣに曝露すると、生存腫瘍細胞数に劇的な減少が導かれることを示した。しかし、細胞をＣＢ２アンタゴニストとともに培養した場合、生存細胞数は有意に増加し、それによって、ＴＨＣの影響は逆転された。総合すると、これらの結果によって、ＴＨＣが誘導する、生存細胞数の減少およびアポトーシス誘導の増加が、ＣＢ２カンナビノイド受容体を通じて仲介されたことが示唆される。
【００６０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＪｕｒｋａｔおよびＭｏｌｔ−４腫瘍細胞をＣＢ２受容体アゴニスト、ＪＷＨ−０１５に曝露すると、生存度の減少およびアポトーシスの誘導が導かれる：次に、ＣＢ２選択的アゴニストに曝露すると、腫瘍細胞死およびアポトーシス誘導が導かれるかどうかを調べた。多様な濃度のＣＢ２選択的アゴニスト、ＪＷＨ−０１５（１、５、１０、および２０μＭ）またはビヒクルに、血清不含培地中、ＪｕｒｋａｔおよびＭｏｌｔ−４腫瘍細胞を２４時間曝露した。結果は、Ｍｏｌｔ−４およびＪｕｒｋａｔ腫瘍細胞を５μＭ以上の濃度のＪＷＨ−０１５に曝露すると、生存腫瘍細胞数の有意な減少が導かれることを示した（図１１Ａ）。次に、ＪＷＨ−０１５に曝露すると、アポトーシス誘導が導かれるかどうかを調べた。ＪｕｒｋａｔおよびＭｏｌｔ−４腫瘍細胞をＪＷＨ−０１５に２４時間曝露し、そしてＴＵＮＥＬアッセイによって、アポトーシスを決定した（図１１Ｂ）。結果は、ＪｕｒｋａｔおよびＭｏｌｔ−４腫瘍細胞を５μＭ  ＪＷＨ−０１５に曝露すると、アポトーシスの有意な誘導が導かれることを示した。総合すると、これらの結果によって、ＪｕｒｋａｔおよびＭｏｌｔ−４腫瘍細胞をＣＢ２選択的アゴニストで処理すると、細胞生存度の有意な減少およびアポトーシスの誘導が導かれうることが示唆される。
【００６１】
ＴＨＣは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、初代ＡＬＬ細胞においてアポトーシスを誘導する：次に、初代（ｐｒｉｍａｒｙ）ＡＬＬ細胞をＴＨＣに曝露すると、腫瘍細胞生存度またはアポトーシス誘導に影響があるかどうかを調べた。この目的に向けて、ＡＬＬの２人の患者の末梢血から単離したリンパ芽球（ＡＬＬ１およびＡＬＬ２）を、多様な濃度のＴＨＣ（１、５、および１０μＭ）またはビヒクル（ＤＭＳＯ）の存在下で、２時間培養した。トリパンブルー色素排除によって、生存細胞性を決定した。結果は、ＡＬＬ試料を、５μＭ以上の濃度のＴＨＣに曝露すると、生存度の有意な減少が生じることを示した（図１２Ａ）。さらに、ＴＵＮＥＬ法を用いて、アポトーシスの誘導に対するＴＨＣ曝露の影響を調べ、そしてどちらのＡＬＬ患者由来の細胞も５μＭ以上の濃度のＴＨＣに曝露すると、アポトーシスの有意な誘導が導かれることを観察した（図１２Ｂ）。
【００６２】
図５。ＴＨＣ処置は、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍負荷減少および腫瘍細胞アポトーシスを導く。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、第０日、１ｘ１０６  ＥＬ−４腫瘍細胞をＩＰ注射した。第１０日、マウスを多様な用量のＴＨＣ（１、３、または５ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ）またはビヒクルで処置した。１日後、腹腔を５ｍｌ  ＰＢＳで勢いよく洗浄し、そして吸引によって腫瘍細胞を収集した。（Ａ）トリパンブルー色素排除によって、細胞数を決定した。データは３匹のマウス群からの平均±ＳＥＭに相当する。（Ｂ）ＴＵＮＥＬ法を用い、アポトーシスに関して、腹腔から回収した腫瘍細胞を試験した。黒塗りのヒストグラムは、ＴＨＣに曝露した腫瘍細胞を示し、そして白抜きのヒストグラムはビヒクルに曝露した細胞を示す。
【００６３】
図６。ＴＨＣで処置すると、ＥＬ−４腫瘍を持つマウスの生存が増加する：Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群あたり８匹）に、第０日、１ｘ１０６  ＥＬ−４腫瘍細胞をＩＰ注射した。第１日以降、ＩＰ経路によって、ＴＨＣ（５ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル対照で、マウスを毎日、１４日間、処置した。生存および病的状態の徴候に関して、マウスを毎日観察した。示すデータは、３つの別個の実験の代表である。
【００６４】
図７。Ｍｏｌｔ−４、Ｊｕｒｋａｔ、Ｓｕｐ−Ｔ１、およびＵ２５１ヒト腫瘍細胞におけるＣＢ１  ｍＲＮＡおよびＣＢ２  ｍＲＮＡの発現。ＲＴ−ＰＣＲ解析によって、ＣＢ１およびＣＢ２の発現を決定した。Ｍｏｌｔ−４、Ｊｕｒｋａｔ、Ｓｕｐ−Ｔ１、およびＵ２５１腫瘍細胞から総ＲＮＡを単離した。ｍＲＮＡを逆転写し、そしてＣＢ１およびＣＢ２に特異的なプライマーを用いたＰＣＲによって増幅した。エチジウムブロミドで染色した単位複製配列の写真を示す。ＡＬＬ細胞をアネキシンＶおよびＰＩで染色することによって、これらの結果をさらに裏付けた。総合すると、これらの結果によって、初代ＡＬＬ細胞をＴＨＣに曝露すると、アポトーシス誘導に仲介される有意な腫瘍殺傷が導かれうることが示唆される。
【００６５】
図８。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＴＨＣおよびＨＵ−２１０に曝露すると、ヒトリンパ腫瘍においてアポトーシス誘導が導かれる。多様な濃度のＴＨＣ、ＨＵ−２１０（２．５、５、および１０μＭ）またはビヒクルの存在下または非存在下で、血清不含培地中、ヒト腫瘍Ｍｏｌｔ−４、Ｊｕｒｋａｔ、およびＳｕｐ−Ｔ１を４時間培養した。（Ａ）ＴＵＮＥＬ法によってアポトーシス誘導を決定し、そしてアポトーシス細胞の割合をプロットした。（Ｂ）１０μＭのＴＨＣまたはＨＵ−２１０（黒塗りヒストグラム）またはビヒクル（白抜きヒストグラム）と培養したヒト腫瘍細胞を、ＴＵＮＥＬアッセイを用いて、アポトーシスに関して解析した、代表的実験。
【００６６】
図９。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、アナンダミドに曝露すると、Ｍｏｌｔ−４腫瘍細胞においてアポトーシス誘導が導かれる。多様な濃度のアナンダミド（５、１０、２０、および４０μＭ）またはビヒクルの存在下または非存在下で、血清不含培地中、Ｍｏｌｔ−４腫瘍細胞を４時間培養した。ＴＵＮＥＬ法によって、アポトーシス誘導を決定した。Ｍｏｌｔ−４腫瘍細胞をアナンダミド（黒塗りヒストグラム）またはビヒクル（白抜きヒストグラム）と培養した、代表的な実験を示す。
【００６７】
図１０。ＣＢ２受容体アンタゴニストは、ＴＨＣの毒性を逆転させうる：ＴＨＣ（５μＭ）またはビヒクルの存在下、ＪｕｒｋａｔおよびＳｕｐ−Ｔ１ヒト腫瘍細胞を４時間培養した。さらに、培養にＣＢ２アンタゴニスト（５μＭ）を添加した。トリパンブルー色素排除によって、生存細胞数を決定した。データは、３つ組培養の平均±ＳＥＭに相当する。
【００６８】
図１１。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＣＢ２選択的アゴニスト、ＪＷＨ−０１５に曝露すると、ＪｕｒｋａｔおよびＭｏｌｔ−４腫瘍細胞において、細胞生存度の減少およびアポトーシスの誘導が導かれる。（Ａ）多様な濃度のＪＷＨ−０１５（１、５、１０、および２０μＭ）またはビヒクルの存在下で、血清不含培地中、ＪｕｒｋａｔおよびＭｏｌｔ−４腫瘍細胞を２４時間培養することによって、腫瘍細胞生存度に対するＪＷＨ−０１５の影響を決定した。トリパンブルー色素排除によって、生存細胞数を決定した。（Ｂ）５μＭ  ＪＷＨ−０１５（黒塗りヒストグラム）またはビヒクル（白抜きヒストグラム）の存在下で、血清不含培地中、腫瘍細胞を２４時間培養することによって、ＪｕｒｋａｔおよびＭｏｌｔ−４腫瘍細胞におけるアポトーシス誘導に対する、ＪＷＨ−０１５の影響を決定した。ＴＵＮＥＬ法を用いてアポトーシスを定量化し、そしてフローサイトメーターを用いて、細胞を解析した。
【００６９】
図１２。ＴＨＣは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、初代ＡＬＬ細胞においてアポトーシスを誘導する。（Ａ）多様な濃度のＴＨＣ（１、５、および１０μＭ）またはビヒクルの存在下で、血清不含培地中、細胞を２時間培養することによって、初代ＡＬＬ細胞生存度に対するＴＨＣの影響を決定した。トリパンブルー色素排除によって、生存細胞数を決定した。（Ｂ）図２に記載するように、初代ＡＬＬ細胞におけるアポトーシス誘導に対するＴＨＣの影響を、ＴＵＮＥＬアッセイによって決定した。上述のように、腫瘍細胞をＴＨＣ（黒塗りヒストグラム）またはビヒクル（白抜きヒストグラム）と培養した。
【００７０】
ＴＵＮＥＬ法を用いてアポトーシスを定量化し、そしてフローサイトメーターを用いて、細胞を解析した。ＴＨＣ曝露後のアポトーシス細胞の割合を、各ヒストグラムに示す。
参考文献
【００７１】
【表１ａ】
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【００７２】
【表１ｂ】
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【００７３】
【表１ｃ】
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【００７４】
【表１ｄ】
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【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図２】 
【図３】 
【図４】 
【図５】 
【図６】 
【図８】 
【図９】 
【図１０】 
【図１１】 
【図１２】 
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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