(57)【要約】  本発明は、改変された脂質連結オリゴ糖を有する宿主細胞に関する。この脂質連結オリゴ糖は、グリコシルトランスフェラーゼ、糖トランスポーターおよびマンノシダーゼのセットの異種発現によってさらに改変されて、哺乳動物（例えば、ヒト）の治療用糖タンパク質の産生のための宿主系となり得る。このプロセスは、操作された宿主細胞を提供し、この宿主細胞を使用して、グリコシル化に関与する任意の望ましい遺伝子を発現させ得、標的化し得る。改変された脂質連結オリゴ糖を有する宿主細胞が、産生または選択される。この操作された宿主細胞において作製されるＮ−グリカンは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２コア構造を有する。次いで、この構造は、１種以上の酵素（例えば、グリコシル−トランスフェラーゼ、糖トランスポーターおよびマンノシダーゼ）の異種発現によってさらに改変され、ヒト様糖タンパク質を生じる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒト真核生物宿主細胞においてヒト様糖タンパク質を産生するための方法であって、該方法は、糖残基を脂質連結オリゴ糖構造の１，６アームに移動させる宿主細胞において、１種以上の酵素の活性を減退させるかまたは減少させる工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記宿主細胞に少なくとも１つのグリコシダーゼ活性を導入する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つのグリコシダーゼ活性は、マンノシダーゼ活性である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
Ｎ−グリカンを産生する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｎ−グリカンは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎｘＧｌｃＮＡｃ２構造を有し、ここでＸは、３、４または５である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、前記宿主細胞内で１種以上の酵素活性を発現させて、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造を作製する工程をさらに包含し、該酵素活性は、グリコシダーゼ活性およびグリコシルトランスフェラーゼ活性から選択される、方法。
【請求項７】
前記活性は、α−１，２マンノシダーゼ活性、α−１，３マンノシダーゼ活性およびＧｎＴＩＩ活性から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、少なくとも１種の減退または減少された酵素は、ドリチル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリチルα−１，３マンノシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素；ドリチル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリチルα−１，２マンノシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素、およびドリチル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリチルα−１，６マンノシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素からなる群より選択される、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、前記減退または減少された酵素は、ドリチル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリチルα−１，３マンノシルトランスフェラーゼ活性を有する、方法。
【請求項１０】
前記酵素は、該酵素活性をコードする宿主細胞遺伝子の変異によって減退されるかまたは減少される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記変異は、前記酵素活性をコードする宿主細胞遺伝子の部分的な欠損または全体的な欠損である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記糖タンパク質は、７個またはそれより少ないマンノース残基を有するＮ−グリカンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記糖タンパク質は、３個またはそれより少ないマンノース残基を有するＮ−グリカンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記糖タンパク質は、ガラクトース、ＧｌｃＮＡｃ、シアル酸、およびフコースからなる群より選択される１種以上の糖を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記糖タンパク質は、構造ＮｅｕＮＡｃ−Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎを含む少なくとも１つのオリゴ糖分枝を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記宿主は、下等真核生物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の方法であって、前記宿主細胞は、以下：Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍおよびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａからなる群より選択される、方法。
【請求項１８】
前記宿主細胞は、開始α−１，６マンノシルトランスフェラーゼ活性の発現をさらに欠損している、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記宿主細胞は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＯＣＨ１変異体である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記宿主細胞は、ＧｎＴＩおよびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター活性を発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記宿主細胞は、ＵＤＰ特異的ジホスファターゼジホスファターゼ活性またはＧＤＰ特異的ジホスファターゼジホスファターゼ活性を発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記宿主から前記糖タンパク質を単離する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法であって、インビトロにおいて、前記単離された糖タンパク質を、少なくとも１種のさらなるグリコシル化反応に供し、続いて前記宿主からの単離に供する工程をさらに包含する、方法。
【請求項２４】
請求項１に記載の方法であって、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２またはＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の産生に関与する１種以上の酵素をコードする核酸分子を、前記宿主に導入する工程をさらに包含する、方法。
【請求項２５】
前記少なくとも１種の酵素は、マンノシダーゼ活性を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法であって、前記酵素は、α−１，２−マンノシダーゼ活性を有し、かつマウス、ヒト、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、またはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．に由来する、方法。
【請求項２７】
前記酵素は、α−１，３−マンノシダーゼ活性を有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記少なくとも１種の酵素は、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記グリコシルトランスフェラーゼ活性は、ＧｎＴＩおよびＧｎＴＩＩからなる群より選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
少なくとも１種の酵素は、該酵素の触媒ドメインと細胞標的シグナルペプチドとの間で融合ペプチドを形成することによって局在化される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
請求項３０に記載の方法であって、前記融合ペプチドは、少なくとも１つの遺伝子構築物によってコードされ、該遺伝子構築物は、細胞標的シグナルペプチドをコードするＤＮＡフラグメントと、グリコシル化酵素またはその触媒活性フラグメントをコードするＤＮＡフラグメントとのインフレームでの結合によって形成される、方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法であって、前記コードされた標的シグナルペプチドは、マンノシルトランスフェラーゼ、ジホスファターゼ、プロテアーゼ、ＧｎＴ  Ｉ、ＧｎＴ  ＩＩ、ＧｎＴ  ＩＩＩ、ＧｎＴ  ＩＶ、ＧｎＴ  Ｖ、ＧｎＴ  ＶＩ、ＧａｌＴ、ＦＴ、およびＳＴからなる群のメンバーに由来する、方法。
【請求項３３】
請求項３１に記載の方法であって、前記触媒ドメインは、ＧｎＴ  Ｉ、ＧｎＴ  ＩＩ、ＧｎＴ  ＩＩＩ、ＧｎＴ  ＩＶ、ＧｎＴ  Ｖ、ＧｎＴ  ＶＩ、ＧａｌＴ、ＦｕｃｏｓｙｌトランスフェラーゼおよびＳＴからなる群のメンバーに由来する、グリコシダーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼをコードし、かつ該触媒ドメインは、小器官内の他の代表的な酵素の平均最適ｐＨの、１．４ｐＨ単位内に最適ｐＨを有し、該小器官おいて、該酵素は、局在化されるかまたは５．１と８．０との間のｐＨにて最適な活性を有する、方法。
【請求項３４】
請求項３１に記載の方法であって、前記核酸分子は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ−フコシルトランスフェラーゼ、ＣＭＰ−シアリルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター、ＵＤＰ−ガラクトーストランスポーター、ＧＤＰ−フコーストランスポーター、ＣＭＰ−シアル酸トランスポーター、およびヌクレオチドジホスファターゼからなる群より選択される１種以上の酵素をコードする、方法。
【請求項３５】
前記宿主は、ＧｎＴＩおよびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター活性を発現する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記宿主は、ＵＤＰ特異的ジホスファターゼ活性またはＧＤＰ特異的ジホスファターゼ活性を発現する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
請求項１に記載の方法であって、ドリチル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリチルα−１，３マンノシルトランスフェラーゼ活性を欠損している宿主に、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２糖質構造を作製するための１種以上の酵素をコードする核酸分子を導入する工程をさらに包含する、方法。
【請求項３８】
請求項１に記載の方法であって、ドリチル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリチルα−１，２マンノシルトランスフェラーゼまたはドリチル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリチルα−１，６マンノシルトランスフェラーゼ活性を欠損している宿主に、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２糖質構造を作製するための１種以上の酵素をコードする核酸分子を導入する工程をさらに包含する、方法。
【請求項３９】
前記核酸分子は、α−１，２マンノシダーゼ、ＵＤＰ  ＧｌｃＮＡｃトランスポーターおよびＧｎＴｌからなる群より選択される少なくとも１種の酵素をコードする、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
請求項３９に記載の方法であって、前記欠損している宿主細胞に、ＧｌｃＮＡｃｌＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２構造をＧｌｃＮＡｃｌＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造に転換するためのα−１，３マンノシダーゼ活性またはα−１，２／α−１，３マンノシダーゼ活性をコードする核酸分子を導入する工程をさらに包含する、方法。
【請求項４１】
請求項１に記載の方法であって、前記宿主に、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２糖質構造を作製するための１種以上の酵素をコードする核酸分子を導入する工程をさらに包含する、方法。
【請求項４２】
前記少なくとも１種の酵素は、ＧｎＴＩＩである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
請求項１に記載の方法であって、前記宿主細胞に、グリコシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグリコサミニルトランスフェラーゼおよびスルホトランスフェラーゼからなる群より選択される少なくとも１種の哺乳動物グリコシル化酵素をコードする少なくとも１種の核酸分子を導入する工程をさらに包含する、方法。
【請求項４４】
請求項１に記載の方法であって、宿主細胞をＤＮＡライブラリーで形質転換して、該ライブラリーから誘導された少なくとも１種のグルコシル化酵素を発現する、遺伝学的に混合された細胞集団を作製する工程をさらに包含し、該ライブラリーは、少なくとも２つの異なる遺伝子構築物を含み、該構築物のうちの少なくとも一方は、細胞標的シグナルペプチドをコードするＤＮＡフラグメントを含み、該細胞標的シグナルペプチドは、グリコシル化酵素またはその触媒活性フラグメントをコードするＤＮＡフラグメントと、インフレームで結合される、方法。
【請求項４５】
請求項１または４４に記載の方法によって産生される、宿主細胞。
【請求項４６】
請求項１または４４に記載の方法によって産生される、ヒト様糖タンパク質。
【請求項４７】
図６（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＡＬＧ  ３遺伝子）の少なくとも４５個連続するヌクレオチド残基を含むかまたはそれらからなる、核酸分子。
【請求項４８】
請求項４７に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項４９】
請求項４７に記載の核酸分子を含む、宿主細胞。
【請求項５０】
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞であって、ここで、図６（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＡＬＧ  ３遺伝子）の配列は変異しており、それによって、該細胞のグリコシル化が変更される、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞。
【請求項５１】
脂質連結オリゴ糖のグリコシル化の程度を高めるための方法であって、該方法は、宿主細胞においてα−１，３グリコシルトランスフェラーゼ活性を増加させる工程を包含する、方法。
【請求項５２】
脂質連結オリゴ糖のグリコシル化の程度を高めるための方法であって、
該方法は、宿主細胞においてオリゴ糖トランスフェラーゼ活性の基質特異性を減退させる工程を包含する、方法。
【請求項５３】
非哺乳動物宿主細胞において、分岐したＧｌｃＮＡｃを含むＮ−グリカンを有する免疫グロブリンポリペプチドを産生するための方法であって、該方法は、該宿主細胞においてＧｎＴＩＩＩ活性を発現させる工程を包含する、方法。
【請求項５４】
分岐したＧｌｃＮＡｃを含むＮ−グリカンを有する免疫グロブリンを産生する、非哺乳動物宿主細胞。
【請求項５５】
請求項５４に記載の宿主細胞によって産生される、免疫グロブリン。
【請求項５６】
非哺乳動物宿主細胞において、分岐したＧｌｃＮＡｃを含むＮ−グリカンを有するポリペプチドを産生するための方法であって、該方法は、該宿主細胞においてＧｎＴＩＩＩ活性を発現させる工程を包含する、方法。
【請求項５７】
分岐したＧｌｃＮＡｃを含むＮ−グリカンを有するポリペプチドを産生する、非ヒト宿主細胞。
【請求項５８】
請求項５７に記載の宿主細胞によって産生される、ポリペプチド。
【請求項５９】
非ヒト真核生物宿主細胞においてヒト様糖タンパク質を産生するための方法であって、該方法は、該宿主細胞から、ａｌｇ遺伝子活性を減退または減少させる工程、および該宿主細胞に少なくとも１種のグリコシダーゼ活性を導入する工程を包含する、方法。
【請求項６０】
トリマンノースコアに結合した少なくとも２つのＧｌｃＮＡｃを含むＮ−グリカンを有するヒト様糖タンパク質を産生するための、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国仮出願番号６０／３４４，１６９（２００１年１２月２７日）（本明細書中に参考としてその全体を援用する）に優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般的に、真菌または他の低級真核生物において発現される組換えタンパク質のグリコシル化構造（より詳細には高等哺乳動物（特にヒト）のタンパク質のグリコシル化）の改変に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
ＤＮＡが転写されそしてタンパク質へと翻訳された後の、さらなる翻訳後プロセッシングは、リコシル化として公知のプロセスである糖残基の結合を含む。異なる生物は、異なるグリコシル化酵素（グリコシルトランスフェラーゼおよびグリコシダーゼ）を生産し、そして利用可能な異なる基質（ヌクレオチド糖）を有し、その結果、個々のオリゴ糖のグリコシル化パターンならびに組成物は、１つでも同じタンパク質でさえも、特定のタンパク質が発現される宿主系に依存して異なる。細菌は、代表的に、タンパク質をグリコシル化せず、そうであれば、非常に非特異的な様式である（Ｍｏｅｎｓ，１９９７）。低級真核生物（例えば、糸状菌および酵母）は、主なマンノースおよびリン酸マンノシル（ｍａｎｎｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ）糖を添加するのに対して、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）は、さらなる別の方法でタンパク質をグリコシル化する。例えば、（Ｂｒｅｔｔｈａｕｅｒ，１９９９；Ｍａｒｔｉｎｅｔ，１９９８；Ｗｅｉｋｅｒｔ，１９９９；Ｍａｌｉｓｓａｒｄ，２０００；Ｊａｒｖｉｓ，１９９８；およびＴａｋｅｕｃｈｉ，１９９７）を参照のこと。
【０００４】
一連の反応からなる哺乳動物型オリゴ糖構造の合成は、その過程において、糖残基が、タンパク質が、宿主生物における分泌経路に沿って移動する間に、添加されそして除去される。宿主生物または細胞のグリコシル化経路に沿って存在する酵素は、分泌されたタンパク質の得られたグリコシル化パターンを決定する。あいにく、低級真核生物宿主細胞で発現されるタンパク質の得られたグリコシル化パターンは、高級真核生物（例えば、ヒトおよび他の哺乳動物）において見られるグリコシル化とは実質的に異なる（Ｂｒｅｔｔｈａｕｅｒ，１９９９）。さらに、非常に異なるグリコシル化パターンは、いくつかの場合において、ヒトにおけるこれらのタンパク質の免疫原性の増加およびそれらの半減期の減少を示している（Ｔａｋｅｕｃｈｉ，１９９７）。非ヒト宿主細胞（特に、低級真核生物細胞）中でヒト様糖タンパク質を生産することが所望される。
【０００５】
ヒトグリコシル化の初期段階は、２つの異なる相に分けられ得る：（ｉ）脂質連結Ｇｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２オリゴ糖は、小胞体（ＥＲ）の膜で反応の経時的なセットによってアセンブリされ、そして（ｉｉ）脂質アンカードリコール（ｄｏｌｉｃｈｙｌ）ピロリン酸から新規に合成されたタンパク質上へのこのオリゴ糖の移動。特異的な移動部位は、配列Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（図１を参照のこと）中のアスパラギン（Ａｓｎ）残基によって規定され、Ｘａａは、プロリンを除く任意のアミノ酸であり得る（Ｇａｖｅｌ，１９９０）。グルコシダーゼおよびマンノシダーゼによるさらにプロセッシングは、ＥＲ中で生じ、その後、新生の糖タンパク質が、初期のゴルジ装置に移動され、さらなるマンノース残基は、ゴルジ特異的α（α）−１，２−マンノシダーゼによって除去される。プロセッシングは、ゴルジを通って進むタンパク質として続く。内側のゴルジにおいて、多くの改変酵素（Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＧｎＴ  Ｉ、ＧｎＴ  ＩＩ、ＧｎＴ  ＩＩＩ、ＧｎＴ  ＩＶ  ＧｎＴ  Ｖ  ＧｎＴ  ＶＩ）、マンノシダーゼＩＩおよびフコシルトランスフェラーゼを含む）は、特定の糖残基を付加し、そして除去する（例えば、図２および図３を参照のこと）。最後に、ｔｒａｎｓ−ゴルジにおいて、ガラクトシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼは、ゴルジから放出される糖タンパク質構造を生産する。これらの構造において、ジアンテナ構造（ａｎｔｅｎｎａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）、トリアンテナ構造およびテトラアンテナ構造（ガラクトース、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミンおよび糖タンパク質にそれらのヒト特徴付けを与える末端シアル酸の高い程度を含む）によって特徴付けされる。
【０００６】
ほとんど全ての真核生物において、糖タンパク質は、一般的なコアオリゴ糖前駆体Ｇｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−Ｄｏｌから誘導され、このＰＰ−Ｄｏｌは、ドリコール−ピロリン酸を意味する（図１）。小胞体において、オリゴ糖に結合するドリコールピロリン酸の合成およびプロセッシングは、周知の真核生物の間で同一である。しかし、酵母によるコアオリゴ糖のさらなるプロセッシングは、一旦ＥＲを離れそしてゴルジに侵入するペプチドに移動されると、分泌経路に沿って移動し、そしていくつかのマンノース糖の添加に関与するので、ヒトと有意に異なる。
【０００７】
酵母において、これらの工程は、Ｏｃｈｌｐ、ＭｎｔｌｐおよびＭｎｎｌｐのようなマンノシルトランスフェラーゼに存在するゴルジによって触媒され、コアオリゴ糖にマンノース糖を連続して添加する。得られた構造は、ヒューマノイドタンパク質の生産を所望せず、従って、マンノシルトランスフェラーゼ活性を減少するか除去することを所望する。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの変異体（マンノシルトランスフェラーゼ活性を欠損する）（例えば、ｏｃｈ１変異体またはｍｎｎ９変異体）は、非致死であり、そして酵母糖タンパク質のオリゴ糖中の減少したマンノース含量を提示することを示す。他のオリゴ糖プロセッシング酵素（例えば、リン酸マンノシルトランスフェラーゼ）はまた、宿主の特定の内因的なグリコシル化パターンに依存して除去され得る。
【０００８】
（脂質連結オリゴ糖前駆体）
本発明の特定の興味深いことは、Ｎ−グリコシル化の初期段階である（図１および図２）。Ｇｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−Ｄｏｌの生合成が不完全であるａｌｇ（アスパラギン連結グリコシル化）変異体の研究は、Ｎ−グリコシル化の開始段階を明らかにすることを助ける。
【０００９】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡＬＧ３遺伝子は、首尾よくクローン化され、そして欠失によってノックアウトされている（Ａｅｂｉ，１９９６）。ＡＬＧ３は、酵素Ｄｏｌ−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−Ｄｏｌマンノシルトランスフェラーゼをコードすることが示され、これは、ＥＲの管腔側で、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ＤｏｌからＭａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−Ｄｏｌまでの第１のＤｏｌ−Ｐ−Ｍａｎ依存性マンノシル化工程に関与する（Ｓｈａｒｍａ，２００１）（図１および２）。漏出ａｌｇ３−１変異を有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−Ｄｏｌ（構造Ｉ）を集積する（Ｈｕｆｆａｋｅｒ，１９８３）。
【００１０】
【化１】
2005514021.tif 000002
Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（構造Ｉ）およびＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２は、ｏｃｈ１  ｍｎｎ１  ａｌｇ３変異体の全細胞マンノタンパク質を集積する（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ−Ｓｈｉｎｄｏ，１９９３）。このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｏｃｈ１、ｍｎｎ１、ａｌｇ３変異体は、生存可能であるが、温度感受性であり、そしてα−１，６ポリマンノース外鎖（ｏｕｔｅｒ  ｃｈａｉｎ）を欠損することが示された。
【００１１】
別の研究において、ａｌｇ３を欠損した株（Δａｌｇ３バックグラウンド）中で発現された分泌タンパク質は、Ｅｎｄｏ−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ  Ｈ（Ｅｎｄｏ  Ｈ）に対する耐性について研究された（Ａｅｂｉ，１９９６）。以前の観察は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２より長いこれらのオリゴ糖のみが、Ｅｎｄｏ  Ｈによって切断されやすいことを示している（Ｈｕｂｂａｒｄ，１９８０）。ａｌｇ３−１表現型において、いくつかのグリコフォームは、その漏出（ｌｅａｋｉｎｅｓｓ）を確認するＥｎｄｏ  Ｈ切断に感受性であるが、Δａｌｇ３変異体において、全てのグリコフォームは耐性であるようであり、かつＭａｎ５−型であり（Ａｅｂｉ，１９９６）、密接な表現型および発生期のポリペプチド鎖上にＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２オリゴ糖構造の移動を示唆する。明らかな表現型は、ＡＬＧ３遺伝子の不活性化と関係しない（Ａｅｂｉ，１９９６）。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ａｌｇ３変異体中で生産された、分泌エクソグルコナーゼ（ｅｘｏｇｌｕｃｏｎａｓｅ）は、３５〜４４％の間で過小グリコシル化（ｕｎｄｅｒｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅ）形態および非グリコシル化形態ならびＥｎｄｏ  Ｈ処理に耐性のままである約５０％のみの移動オリゴ糖を含むことが見出された（Ｃｕｅｖａ，１９９６）。エキソグルカナーゼ（Ｅｘｇ）（Ａｓｎ１６５およびＡｓｎ３２５での２つの潜在的なＮ−グリコシル化部位を含む酵素）は、より詳細に分析された。２つのオリゴ糖を受け取るＥｘｇ分子について、これは、第１のＮ−グリコシル化部位（Ａｓｎ１６５）が、短縮型残基中で富化されたが、第２（Ａｓｎ３２５）は、規則的なオリゴ糖中で富化されたことが示された。３５〜４４％の分泌エキソグルカナーゼは、非グリコシル化または過小グルコシル化され、そして約７３〜７８％の全ての利用可能なＮ−グリコシル化部位は、短縮型オリゴ糖または規則的なオリゴ糖のいずれかで占められた（Ｃｕｅｖａ，１９９６）。
【００１２】
（グルコシル化脂質連結オリゴ糖の移動）
証拠は、哺乳動物細胞において、グルコシル化脂質連結オリゴ糖のみが、新生タンパク質に移動される（Ｔｕｒｃｏ，１９７７）が、酵母ａｌｇ５変異体、ａｌｇ６変異体、およびｄｐｇ１変異体においては、非グルコシル化オリゴ糖が移動され得る（Ｂａｌｌｏｕ，１９８６；Ｒｕｎｇｅ，１９８４）ことを示唆する。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ａｌｇ８変異体において、過小グリコシル化のＧｌｃＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２が移動される（Ｒｕｎｇｅ，１９８６）。Ｖｅｒｏｓｔｅｋおよび共同研究者らは、ａｌｇ３変異体、ｓｅｃｌ８変異体、ｇｌｓｌ変異体を研究し、そしてＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造（構造Ｉ、上記）のグルコシル化は、脂質連結Ｍａｎ９構造のグルコシル化と比較して、比較的遅いことを提案する。さらに、このＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造のタンパク質への移動は、Ｇｌｃ３Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２へのグルコシル化よりも約５倍効率的であるようである。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グルコシル化の減少した速度は、比較的早い速度のＭａｎ５構造と組み合わせて、ａｌｇ３変異体酵母中で観察された非グルコシル化Ｍａｎ５構造の蓄積の原因であると考えられる新生タンパク質上に移動する（Ｖｅｒｏｓｔｅｋ−ａ，１９９３；Ｖｅｒｏｓｔｅｋ−ｂ，１９９３）。
【００１３】
上記の研究に先行する研究は、グルコシル化オリゴ糖が、その非グルコシル化対応物よりも非常に早い速度で移動され、従って、単離するのがより困難であるという結果を認める、任意の脂質連結グルコシル化オリゴ糖を明らかにしなかった（Ｏｒｌｅａｎ，１９９０；Ｈｕｆｆａｋｅｒ，１９８３）。最近の研究は、非グルコシル化オリゴ糖および低グルコシル化オリゴ糖を有する酵母株の作製および研究を可能にし、そしてオリゴサッカリルトランスフェラーゼ複合体による基質認識のための脂質連結オリゴ糖のアンテナに対するグルコースの付加の重要性をさらに確認した（Ｒｅｉｓｓ，１９９６；Ｓｔａｇｌｊａｒ，１９９４；Ｂｕｒｄａ，１９９８）。ａｌｇ３変異体における脂質連結Ｍａｎ５オリゴ糖のグルコシル化の減少程度は、新生タンパク質上の脂質連結オリゴ糖の移動の動力学にネガティブに影響し、そしてこれは、ａｌｇ３ノックアウト株中の分泌タンパク質の強い過小グリコシル化を引き起こすと考えられる（Ａｅｂｉ，１９９６）。
【００１４】
上記のように、脂質連結核オリゴ糖Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２のアセンブリは、小胞体（ｅｎｄｏｐｌａｓｍａｔｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）の膜で生じる。３つのグルコース単位の、脂質連結オリゴ糖のα−１，３−アンテナへの付加は、オリゴ糖アセンブリの最終反応である。最初のα−１，４グルコース残基が付加され、その後別のα−１，３グルコース残基および末端α−１，２グルコース残基を付加される。ドリコール連結Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２を蓄積する変異体は、ＡＬＧ６座中で欠損していることが示され、そしてＡｌｇ６ｐは、Ａｌｇ８ｐに対して類似性を有し、α−１，３−グルコシルトランスフェラーゼは、第２のα−１，３−連結グルコースの付加を触媒する（Ｒｅｉｓｓ，１９９６）。欠損ＡＬＧ８座を有する細胞は、ドリコール連結Ｇｌｃ１Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２を蓄積する（Ｒｕｎｇｅ，１９８６；Ｓｔａｇｌｊａｒ，１９９４）。このＡＬＧ１０座は、Ｇｌｃ２Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−Ｄｏｌへの単一の末端グルコースの付加に応答性であるα−１，２グルコシルトランスフェラーゼをコードする（Ｂｕｒｄａ，１９９８）。
【００１５】
（局在化した酵素活性の連続的なＮ−グリカンのプロセシング）
糖トランスフェラーゼおよびマンノシダーゼは、ＥＲおよびゴルジ装置の内側（管腔）表面に並び、それによって糖タンパク質の連続的なプロセシングを可能にする「触媒」表面を提供する。なぜなら、糖タンパク質は、ＥＲおよびゴルジのネットワークを介して進むからである。実際、これらのシス、中間、およびトランスのゴルジならびにトランス−ゴルジネットワーク（ＴＧＮ）の複数の区画は、順番に並べられたグリコシル化反応が起こり得る、異なる局所性を提供する。糖タンパク質は、ＥＲ中の合成から、後期のゴルジまたはＴＧＮにおける完全な成熟まで進められるので、異なるグリコシダーゼ、マンノシダーゼおよびグリコシルトランスフェラーゼに順番に曝され、その結果、特異的糖質構造が合成され得る。多くの研究は、これらの酵素がそれぞれのオルガネラに保持およびアンカーされる、正確な機構を明らかにすることに奉げられていつ。画像を展開することは複雑であるが、証拠は、幹領域、膜貫通領域および細胞質テイルが、個々にかまたは協力して、個々のオルガネラの膜に酵素を指向し、それによって関連する触媒ドメインをその座に局在化する。
【００１６】
いくつかの場合において、これらの特異的な相互作用は、種をまたいで機能することが見出された。例えば、ラット由来のα２，６−ＳＴの膜貫通ドメインは、動物のトランス−ゴルジに局在化されることが知られている酵素であり、酵母ゴルジ中のレポーター遺伝子（インベルターゼ）も局在化することが示された（Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋ，１９９５）。しかし、全長α２，６ＳＴの一部と非常に同じ膜貫通ドメインは、ＥＲ中に保持され、そして酵母のゴルジにさらに輸送されない（Ｋｒｅｚｄｏｒｎ，１９９４）。ヒト由来の全長Ｇａｌ−Ｔｒは、明らかに高い転写レベルにも関わらず、酵母中でさえも合成されない。一方で、インベルターゼレポーターに融合されるＧａｌＴと同じヒトの膜貫通領域は、低い生成レベルにも関わらず、酵母ゴルジに直接局在化され得た。Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋおよび共同研究者は、ヒトＧａｌＴの触媒ドメインに対する酵母マンノシルトランスフェラーゼ（Ｍｎｔ１）、細胞質テイルを含む領域、膜貫通領域の２８個のアミノ酸および幹領域の８個のアミノ酸が、活性ＧａｌＴのゴルジ局在化のために十分であることを示している。他のガラクトシルトランスフェラーゼは、酵素残基（特に、オルガネラ）との相互作用に依存するようである。なぜなら、これらの膜貫通領域の除去後、これらは、適切に局在化され得るからである。現在、より低級真核生物中で特定の非相同的に発現されたグリコシルトランスフェラーゼまたはマンノシダーゼが、（１）十分に翻訳されているか、（２）触媒的に活性か、または（３）分泌経路内の適切なオルガネラに位置しているかどうかを予測する信頼性の高い方法は存在しない。これらの３つ全てが、低級真核生物中のグリコシル化パターンに影響するのに必要であり、所望の触媒機能および予測ツールの非存在下での酵素の適切な保持を達成するための全体的なスキームは、現在利用可能ではなく、設計段階である。
【００１７】
（治療用糖タンパク質の製造）
ヒトまたは動物から単離される有意な数のタンパク質は、最も有意な改変の１つであるグリコシル化によって翻訳後に改変される。全ての治療用タンパク質の推定で７０％がグリコシル化され、従って、ヒトと類似の様式でグリコシル化し得る産生系（すなわち、宿主細胞）に依存している。現在、多くの糖タンパク質は、哺乳動物宿主系で作製される。いくつかの研究は、グリコシル化は、（１）免疫原性、（２）薬物動態学特性、（３）トラフィック、および（４）治療用タンパク質の効果を決定するのに重要な役割を果たすことが示されている。従って、製薬産業の実質的な労力は、可能であれば「ヒューマノイド」または「ヒト様」のようなプロセスを開発し、糖タンパク質を得ることに向けられている。これは、このような哺乳動物細胞を遺伝子操作して、細胞によって発現されたタンパク質のシアリル化（すなわち、シアル酸の末端付加）（これは、このようなタンパク質の薬物動態学特性を改善することが知られている）の程度を増加することを含み得る。あるいは、公知のグリコシルトランスフェラーゼおよびそれぞれのヌクレオチド糖（例えば、２，３シアリルトランスフェラーゼおよびＣＭＰ−シアル酸）を使用する、このような糖のインビトロでの付加によってシアリル化の程度を改善し得る。
【００１８】
さらなる調査は、特定の糖形態の生物学的有意性および治療的有意性を明らかにし得、従って、そのような望ましい特定の糖形態を生成するための能力を与える。現在までに、十分に特徴付けられた糖化パターンを有するタンパク質を生成すること、および以下の高等真核生物のタンパク質発現系の１つにおいて、そのようなタンパク質をコードするｃＤＮＡを発現することに、努力が費やされている。：
１．高等真核生物（例えば、チャイニーズハムスターの卵細胞（ＣＨＯ）、マウス線維芽細胞およびマウス骨髄腫細胞（Ｗｅｒｎｅｒ、１９９８）；
２．トランスジェニック動物（例えば、ヤギ、ヒツジ、マウスおよその他（Ｄｅｎｔｅ、１９８８）；（Ｃｏｌｅ、１９９４）；（ＭｃＧａｒｖｅｙ、１９９５）；（Ｂａｒｄｏｒ、１９９９）；
３．植物（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、ｔｈａｌｉａｎａ，ｔｏｂａｃｃｏなど）（Ｓｔａｕｂ、２０００）；（ＭｃＧａｒｖｅｙ、１９９５）；（Ｂａｒｄｏｒ、１９９９）；
４．昆虫細胞（組換えバキュロウイルス（例えば、鱗翅目細胞に感染するＡｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ多核ポリヒドローシスウイルス（Ａｌｔｍａｎｎ，１９９９））との組み合わせで、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  Ｓｆ９，Ｓｆ２１，Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉなど）。
【００１９】
最も高等な真核生物が、ヒトにおいて認められる糖化反応に類似する糖化反応を起こす一方、上述の宿主系において発現される組換えヒトタンパク質は、不変的にそれらの「天然の」ヒトの対応部分と異なる（Ｒａｊｕ、２０００）。従って、さらなる開発研究が、これらの発現系において生成されるタンパク質の「ヒト特徴」を改善する方法を発見することに向けられている。これは、発酵条件の最適化および、ヒト様糖形態の形成に関する酵素をコードする遺伝子を導入することによる、タンパク質発現宿主の遺伝的改変を含む（Ｗｅｒｎｅｒ、１９９８）；（Ｗｅｉｋｅｒｔ、１９９９）；（Ａｎｄｅｒｓｅｎ、１９９４）；（Ｙａｎｇ、２０００）。全ての哺乳動物の発現系に関連する固有の問題は、解決されていない。
【００２０】
例えば、哺乳動物の細胞培養に基づく発酵プロセス（例えば、ＣＨＯ細胞、マウス細胞、またはヒト細胞）は、非常に遅い傾向があり（１週間を越える発酵時間は、まれではない）、しばしば、低い生成価を生じ、高価な栄養および補因子（例えば、ウシ胎児血清）を要求し、プログラムされた細胞死（アポトーシス）によって制限され、しばしば、特定の治療的価値のあるタンパク質の発現を不可能にする。より重要なことには、哺乳動物細胞は、ヒト病原体となる能力を有するウイルスに感受性でありまた、厳密な質の制御が、生成物安全を保証するために要求される。これは、多くのそのようなプロセスが、動物（例えば、ウシ血清）由来の、複雑かつ温度感受性な培地成分の添加を必要とするので、特定の関心事の内であり、ヒトに対する病原性因子（例えば、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）プリオンまたはウイルス）を保有し得る。さらに、治療的化合物の生成は、好ましくは、十分に制御された滅菌環境において、実施される。動物飼育は、（どんなに清潔を保っていても）そのような環境を構築せず、従って、多量の治療的タンパク質を製造するためのトランスジェニック動物の使用におけるさらなる問題を与える。
【００２１】
そのため、全てではないにしても、最近産生された治療的糖タンパク質は、哺乳動物細胞において発現され、また、これらの組換えタンパク質の糖化パターンを改善すること（すなわち。「ヒト化」すること）に多くの努力が、向けられている。培地組成物における変化ならびにヒト糖化に関する酵素をコードする遺伝子の共発現が、継続的に行われている（例えば、Ｗｅｉｋｅｒｔ、１９９９を参照のこと）。
【００２２】
ヒト対応部分に類似する組換えタンパク質が、哺乳動物発現系において作製され得、下等真核生物（菌類および酵母）におけるヒト様糖化パターンを有するタンパク質を作製することは、近年不可能である。小包体中で、タンパク質に移行される、核となるオリゴ糖構造は、基本的には、哺乳動物および下等な真核生物において、同一であり、実質的な差異は、次のプロセッシング反応において認められ、それは、菌類および哺乳動物のゴルジ体において起こる。実際、異なる下等な真核生物間でさえ、多くの種々の糖化構造が、存在する。これは、以下の哺乳動物発現系にわたって別に留意すべき利点を除いて、組換えヒト糖タンパク質の生成のための宿主として、下等真核生物の使用を妨げている。例えば、：（１）一般的に高い産生力価、（２）短い発酵時間、（３）哺乳動物細胞において乏しく発現されるタンパク質のための代替を有すること、（４）化学的に規定された無タンパク質培地中での増殖し、従って、複雑な動物由来の培地成分を要求しない能力、（５）およびウイルスの非存在（特に、そのような宿主のロタウイルス感染の非存在）。
【００２３】
種々のメチル栄養性酵母（例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａおよびＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａは、真核生物発現系として、特に重要な役割を果たす。なぜなら、それらは、高い細胞密度まで増殖し得、大量の組換えタンパク質を分泌するためである。しかし、上記のように、下等真核生物（例えば、酵母）は、高等動物のように、タンパク質を糖化しない。例えば、小包体（ＥＲ）中の異種性マンノシダーゼを開示するＭａｒｔｉｎｅｔら、（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｌｅｔ．２０巻、１２号を参照のこと。
【００２４】
Ｃｈｉｂａら、（１９９８）は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが、１，６マンノシルトランスフェラーゼ（ＯＣＨ１）、１，３マンノシルトランスフェラーゼ（ＭＮＮ１）およびマンノシルトランスフェラーゼ（ＭＮＮ４）の調節因子を取り除くことによって、ならびに、ＥＲ検索配列（Ｃｈｉｂａ，１９９８）を用いてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＥＲにＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓａｉｔｏｉ由来のα−１，２−マンノシダーゼＩの酵素作用ドメインを標的することによって、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２構造からＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造の範囲の構造を提供するために操作され得ることを示した。しかし、この試みは、所望のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（例えば、インビボで生成され、また、ＧｎＴ１についての基質（ヒト様グリカン構造を作製する上での次の工程）として働き得るもの）。のわずかな生成か、または全く生成しないことを生じる。Ｃｈｉｂａら、（１９９８）は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓが、内在的に有用な量（５％より多くの）の、炭化水素を受け取るＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩを生成し得えない。
【００２５】
Ｍａｒａｓおよび同僚は、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉにおいて、「十分な濃度のアクセプター基質（すなわち、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２）が存在する」ことを主張するが、このアクセプター基質をＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に、インビボで２％未満で転換することを試みる場合、従って複合体Ｎグリカン形態のための適切な前駆体でないＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造の存在を示しことで変換された（Ｍａｒａｓ，１９９７；Ｍａｒａｓ，１９９９）。現在まで、下等真核生物において、商業的に十分な量のＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の生成が可能である開示は存在しない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
このため、非ヒト宿主細胞において発現される組換え糖タンパク質の糖化をヒト化するためのシステムおよび方法を提供することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
（発明の要旨）
本発明は、改変された脂質連結オリゴ糖を有する菌株のような宿主細胞に関し、この宿主細胞は、グリコシルトランスフェラーゼのセット、糖輸送体、およびマンノシダーゼの異種発現によってされに改変され、哺乳動物の生成物（例えば、ヒト治療的糖タンパク質）についての宿主株とされ得る。タンパク質生成方法は、以下を用いて開発されている；（１）下等な真核生物宿主（例えば、単細胞または糸状菌）または（２）ヒト由来の異なる糖化パターンを有する、あらゆる非ヒト真核生物（ヒトタンパク質中に見出される炭化水素構造により類似するように、宿主生物（「宿主細胞」）中で生成される糖化の組成およびタンパク質の構造が改変される。このプロセスは、科学文献およびタンパク質発現の当業者に公知の、十分確立された方法によって、糖化に関する任意の所望の遺伝子を発現および標的化するために使用され得る、操作された宿主細胞を得ることを可能にする。本明細書に記載のように、改変された脂質連結オリゴ糖を有する宿主細胞は、作成または選択される。操作された宿主細胞中のＮ−グリカンは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２コア構造を有し、次いで、これは１つ以上の酵素（例えば、グリコシルトランスフェラーゼ、糖輸送体およびマンノシダーゼ）の異種発現によって、さらに改変され、ヒト様糖タンパク質を産生し得る。治療的タンパク質の生成のために、この方法が、あらゆる所望の糖化構造を得る操作細胞株に適合され得る。
【００２８】
（発明の詳細な説明）
本明細書中で他に規定されない限り、本発明に関連して使用される科学的用語および技術用語は、当業者により一般的に理解される意味を有する。さらに、文脈により他に必要とされなければ、単数形の用語は、複数形を含み、そして複数形の用語は、単数形を含む。本発明の方法および技術は、当該分野において周知の従来の方法に従って一般的に実施される。一般的に、本明細書中に記載される生化学、酵素学、分子生物学および細胞生物学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質化学および核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションに関連して使用される名称、およびこれらの技術は、周知のものであり、そして当該分野で一般的に使用される。本発明の方法および技術は、他に示されなければ、一般的に、当該分野で周知の従来の方法に従って、そして本明細書の全体にわたって引用されそして考察される種々の一般的な参考文献およびより具体的な参考文献に記載されるとおりに実施される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２および２００２までの補遺）；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍａｕｒｅｅｎ  Ｅ．Ｔａｙｌｏｒ，ＫｕｒｔＤｒｉｃｋａｍｅｒ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ  （２００３）；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，ＮＪ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ＶｏｌＩ  １９７６  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｖｏｌ  ＩＩ  １９７６  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９９）を参照のこと。本明細書中に記載される生化学および分子生物学に関連して使用される名称、ならびにこれらの研究室手順および技術は、当該分野で周知でありかつ一般的に使用されるものである。
【００２９】
本明細書中に記述される全ての刊行物、特許および他の参考文献は、参考として援用される。
【００３０】
以下の用語は、他に示されなければ、以下の意味を有すると解釈される。
【００３１】
本明細書中において使用される場合、用語「Ｎ−グリカン」とは、Ｎ−連結オリゴ糖をいい、例えば、アスパラギン−Ｎ−アセチルグルコサミン結合でポリペプチドのアスパラギン残基に結合されるものである。Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍａｎ」は、マンノースを指し；「Ｇｌｃ」は、グルコースを指し；そして「ＮＡｃ」は、Ｎ−アセチルを指し；ＧｌｃＮＡｃは、Ｎ−アセチルグルコサミンを指す）の共通のペンタサッカリドコアを有する。Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍａｎ３」）コア構造に付加される抹消糖（例えば、フコースおよびシアル酸）を含む分枝（アンテナ）の数に関して異なる。Ｎ−グリカンは、それらの分枝構造（高マンノース、複合（ｃｏｍｐｌｅｘ）またはハイブリッド）に従って分類される。「高マンノース」型Ｎ−グリカンは、５個以上のマンノース残基を有する。「複合」型Ｎ−グリカンは、代表的には、１，３マンノースアームに結合した少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃ、および「トリマンノース」コアの１，６マンノースアームに結合した少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃを有する。「トリマンノースコア」は、Ｍａｎ３構造を有するペンタサッカリドコアである。複合Ｎ−グリカンはまた、必要に応じてシアル酸または誘導体（「ＮｅｕＡｃ」、ここで「Ｎｅｕ」は、ノイラミン酸を指し、「Ａｃ」は、アセチルを指す）で改変されたガラクトース（「Ｇａｌ」）残基を有し得る。複合Ｎ−グリカンはまた、「分岐する（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）」ＧｌｃＮＡｃおよびコアフコース（「Ｆｕｃ」）を含む鎖内置換を有し得る。「ハイブリッド」Ｎ−グリカンは、トリマンノースコアの１，３マンノースアームの末端に少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃ、およびトリマンノースコアの１，６マンノースアームの０以上のマンノースを有する。
【００３２】
本明細書中で使用される略語は、当該分野で共通して利用される。例えば、上記の糖の略語を参照のこと。他の共通の略語としては、以下が挙げられる：「ＰＮＧａｓｅ」、これは、ペプチドＮ−グリコシダーゼＦ（ＥＣ  ３．２．２．１８）を指す；「ＧｌｃＮＡｃ  Ｔｒ（Ｉ−ＩＩＩ）」、３つのＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ酵素のうちの１つを指す；「ＮＡＮＡ」は、Ｎ−アセチルノイラミン酸を指す。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、用語「分泌経路」とは、細胞質から小胞体および（ＥＲ）およびゴルジ装置の区画への発生期ポリペプチド鎖の分子フローに沿って、脂質連結オリゴ糖前駆体およびＮ−グリカン基質が、連続的に暴露される、種々のグリコシル化酵素の集合ラインをいう。酵素は、この経路に沿って局在化されるといわれる。酵素Ｙの前に、脂質連結グリカンまたはＮ−グリカンに対して作用する酵素Ｘは、酵素Ｙの「上流」にある、または「上流」で作用するといわれる；同様に、酵素Ｙは、酵素Ｘから「下流」で作用する。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、用語「ａｌｇ  Ｘ活性」とは、「ａｌｇ  Ｘ」遺伝子によりコードされる酵素活性、および相同遺伝子もしくは遺伝子産物（以下を参照のこと）または非関連遺伝子もしくは遺伝子産物によりコードされる酵素活性を有する酵素をいう。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは、完全な抗体（２つの重鎖および２つの軽鎖からなる）またはそのフラグメントをいう。このようなフラグメントとしては、種々のプロテアーゼで消化することにより産生されるフラグメント、化学的切断および／または化学的解離、ならびにそのフラグメントが抗原に特異的に結合し得るままである限り、組み換えにより産生されるフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。これらのフラグメントには、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントおよび単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントがある。用語「抗体」の範囲内には、配列を改変されているが、抗原に特異的に結合し得るままである抗体もある。改変された抗体の例は、種間キメラ抗体およびヒト化抗体；抗体融合物；およびヘテロマー抗体複合体（例えば、二価抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）（二重特異性抗体）、単鎖二価抗体、および細胞内発現抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ））（例えば、Ｍａｒａｓｃｏ（編），Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｉｎｃ．（１９９８）（ＩＳＢＮ：３５４０６４１５１３）（その開示は、本明細書中にその全体が参考として援用される）を参照のこと）。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、用語「変異」とは、遺伝子産物（例えば、グリコシル化関連酵素）の核酸配列またはアミノ酸配列における任意の変化をいう。
【００３７】
用語「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」とは、少なくとも１０塩基長のヌクレオチドのポリマー形態をいう。この用語は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡもしくは合成ＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡまたは合成ＲＮＡ）、ならびにＤＮＡまたはＲＮＡ含有非天然ヌクレオチドアナログ、非ネイティブヌクレオシド間結合、またはその両方を含む。核酸は、任意のトポロジー的コンホメーションである得る。例えば、核酸は、一本鎖、二本鎖、三本鎖、四重、部分的に二本鎖、分枝、ヘアピン、環状または南京錠型のコンホメーションであり得る。この用語は、ＤＮＡの一本鎖形態および二本鎖形態を含む。
【００３８】
他に示さなければ、「配列番号Ｘを含む核酸」とは、その核酸の少なくとも一部が、（ｉ）配列番号Ｘの配列、または（ｉｉ）配列番号Ｘに相補的な配列のいずれかを有する核酸をいう。これら２つの間の選択は、状況により必然的に決められる。例えば、核酸がプローブとして使用される場合、２つの間の選択は、そのプローブが所望の標的に相補的である必要性により必然的に決められる。
【００３９】
「単離された」または「実質的に純粋な」核酸またはポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡまたは混合ポリマー）は、天然の宿主細胞においてネイティブポリヌクレオチドに自然に付随する他の細胞成分（例えば、リポソーム、ポリメラーゼ、およびそれが天然で関連するゲノム配列）から実質的に分離された、核酸またはポリヌクレオチドをいう。この用語は、（１）その天然に存在する環境から除去されたか、（２）その「単離されたポリヌクレオチド」が天然に見出されないポリヌクレオチドの全てまたは一部を伴わないか、（３）天然では連結されていないポリヌクレオチドに作動可能に連結されているか、または（４）天然には存在しない、核酸またはポリヌクレオチドを包含する。用語「単離された」または「実質的に純粋な」はまた、組み換え体もしくはクローン化されたＤＮＡ単離物、化学的に合成されたポリヌクレオチドアナログ、または異種系により生物学的に合成されたポリヌクレオチドアナログを言及する際に使用され得る。
【００４０】
しかし、「単離された」は、そのように記載される核酸またはポリヌクレオチド自体が、そのネイティブ環境から物理的に除去されたことを必ずしも必要とするわけではない。例えば、生物のゲノム中の内因性核酸配列は、異種配列（すなわち、この内因性核酸配列に天然では隣接していない配列）が、内因性核酸配列に隣接して配置されて、その結果この内因性核酸配列の発現が変更される場合に、本明細書中で「単離された」とみなされる。例として、非ネイティブプロモーター配列は、ヒト細胞のゲノムにおいて遺伝子のネイティブプロモーターと（例えば、相同組み換えにより）置換され得、その結果、この遺伝子が変更された発現パターンを有する。この遺伝子は、ここで「単離された」となる。なぜなら、これは、天然で隣接する配列の少なくとも一部から分離されているからである。
【００４１】
核酸はまた、ゲノム中の対応する核酸に対する、天然に存在しない任意の改変を含む場合に「単離された」とみなされる。例えば、内因性コード配列は、例えばヒトの介入により人工的に導入された、挿入、欠失または点変異を含む場合に、「単離された」とみなされる。「単離された核酸」はまた、異種部位において宿主細胞染色体に組み込まれた核酸、エピソームとして存在する核酸構築物を含む。さらに、「単離された核酸」は、他の細胞物質を実質的に含み得ないか、または組み換え技術により産生された場合に培養培地を実質的に含み得ないか、または化学的に合成された場合に化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含み得ない。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、用語、参照核酸配列の「縮重改変体」は、標準の遺伝子コードに従って翻訳され得、参照核酸配列から翻訳されるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を提供する核酸配列を包含する。
【００４３】
核酸配列の関係で、用語「パーセント配列同一性」または「同一な」は、最大一致で整列された場合に同一である２つの配列中の残基をいう。配列同一性比較の長さは、少なくとも約９ヌクレオチド、通常は少なくとも約２０ヌクレオチド、より通常は少なくとも約２４ヌクレオチド、代表的には少なくとも約２８ヌクレオチド、より代表的には少なくとも約３２ヌクレオチド、および好ましくは少なくとも約３６以上のヌクレオチドのストレッチにわたり得る。ヌクレオチド配列同一性を測定するのに使用され得る多くの異なるアルゴリズムが、当該分野で公知である。例えば、ポリヌクレオチド配列は、ＦＡＳＴＡ、Ｇａｐ、またはＢｅｓｔｆｉｔを用いて比較され得、これらは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎのプログラムである。ＦＡＳＴＡは、問い合わせ（ｑｕｅｒｙ）配列と検索（ｓｅａｒｃｈ）配列との間の最良の重複領域のアラインメントおよびパーセント配列同一性を提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ，１９９０（本明細書中で参考として援用される））。例えば、核酸配列間のパーセント配列同一性は、本明細書中で参考として援用される、ＧＣＧバージョン６．１に提供されるように、ＦＡＳＴＡを用いて（そのデフォルトパラメーター（ワードサイズ６およびスコアリングマトリクスについてのＮＯＰＡＭ因子）を用いて）決定され得るかまたはＧａｐを用いて（そのデフォルトパラメーターを用いて）決定され得る。
【００４４】
用語「実質的に相同」または「実質的に同一」は、上記のような任意の周知の配列同一性アルゴリズム（例えば、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、またはＧａｐ）により測定される場合、核酸またはそのフラグメントを参照する場合、別の核酸（またはその相補鎖）と、適切なヌクレオチド挿入または欠失と共に最適に整列される場合、少なくとも約５０％、より好ましくは６０％のヌクレオチド塩基、通常は少なくとも約７０％、より通常は少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、およびより好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のヌクレオチド塩基においてヌクレオチド配列同一性が存在することを示す。
【００４５】
あるいは、実質的な相同性または類似性は、核酸またはそのフラグメントが、別の核酸、別の核酸の鎖、またはその相補鎖に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする場合に存在する。核酸のハイブリダイゼーション実験の文脈における、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」および「ストリンジェントな洗浄条件」は、多数の異なる物理的パラメーターに依存する。核酸ハイブリダイゼーションは、当業者によって容易に理解されるように、塩濃度、温度、溶媒、ハイブリダイズする種の塩基組成、相補領域の長さ、およびハイブリダイズする核酸の間のヌクレオチド塩基のミスマッチの数のような条件によって、影響を受ける。当業者は、どのようにこのようなパラメーターを変更して、特定のストリンジェンシーのハイブリダイゼーションを達成するかを知っている。
【００４６】
一般に、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、特定のＤＮＡハイブリッドについての熱的融点（Ｔｍ）より約２５℃低い温度で、特定のセットの条件下で実施される。「ストリンジェントな洗浄」は、特定のＤＮＡハイブリッドについてのＴｍより約５℃低い温度で、特定のセットの条件下で実施される。Ｔｍとは、標的配列の５０％が、完全にマッチするプローブにハイブリダイズする温度である。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）、９．５１頁（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。本明細書中での目的のために、「高ストリンジェンシーの条件」とは、溶液相でのハイブリダイゼーションについて、６×ＳＳＣ（ここで、２０×ＳＳＣは、３．０Ｍ  ＮａＣｌおよび０．３Ｍクエン酸ナトリウムを含有する）、１％ＳＤＳ中６５℃で８〜１２時間の水性ハイブリダイゼーション（すなわち、ホルムアミドを含まない）、続いて０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中６５℃で２０分間の２回の洗浄と定義される。６５℃でのハイブリダイゼーションは、ハイブリダイズする配列の長さおよび同一性の百分率を含む、多数の要因に依存して、異なる速度で起こることが、当業者によって理解される。
【００４７】
本発明の核酸（ポリヌクレオチドともまた称される）は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ならびに上記のものの合成形態および混合ポリマーの、センス鎖とアンチセンス鎖との両方を包含し得る。これらは、当業者によって容易に理解されるように、化学的にかもしくは生化学的に改変され得るか、または非天然もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含み得る。このような改変としては、例えば、標識、メチル化、１つ以上の天然に存在するヌクレオチドのアナログでの置換、ヌクレオチド間改変（例えば、非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバミドなど）、荷電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、ペンダント部分（例えば、ポリペプチド）、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレーター、アルキレーター、および改変された結合（例えば、αアノマー核酸など））が挙げられる。水素結合および他の化学的相互作用を介して、指定された配列に結合する能力において、ポリヌクレオチドを模倣する合成分子もまた含まれる。このような分子は、当該分野において公知であり、そして例えば、分子の骨格においてペプチド結合がホスフェート結合を置換する分子が挙げられる。
【００４８】
用語「変異した」とは、核酸配列に対して適用される場合、核酸配列におけるヌクレオチドが、参照核酸配列と比較して、挿入、欠失、または変化し得ることを意味する。単一の変化が、遺伝子座においてなされ得るか（点変異）、または複数のヌクレオチドが、単一の遺伝子座において、挿入、欠失、または変化され得る。さらに、１つ以上の変更が、核酸配列における任意の数の遺伝子座においてなされ得る。核酸配列は、当該分野において公知の任意の方法によって変異され得、この方法としては、変異誘発技術（例えば、「誤りやすいＰＣＲ」（ＤＮＡポリメラーゼのコピーの忠実度が低く、その結果、高い割合の点変異が、ＰＣＲ産物の全長に沿って得られる条件下でＰＣＲを実施するためのプロセス、例えば、Ｌｅｕｎｇ，Ｄ．Ｗ．ら，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１，１１−１５頁（１９８９）およびＣａｌｄｗｅｌｌ，Ｒ．Ｃ．およびＪｏｙｃｅ  Ｇ．Ｆ．，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌｉｃ．，２，２８−３３頁（１９９２）を参照のこと）；および「オリゴヌクレオチド特異的変異誘発」（目的の任意のクローニングされたＤＮＡセグメントにおける部位特異的変異の発生を可能にするプロセス。例えば、Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ，Ｊ．Ｆ．およびＳａｕｅｒ，Ｒ．Ｔ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１，５３−５７頁（１９８８）を参照のこと））が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
用語「ベクター」とは、本明細書中で使用される場合、核酸分子が結合していた別の核酸を移動し得る核酸分子をいうことが意図される。１つの型のベクターは、「プラスミド」であり、これは、内部にさらなるＤＮＡセグメントが連結され得る、環状の二重鎖ＤＮＡループをいう。他のベクターとしては、コスミド細菌性人工染色体（ＢＡＣ）および酵母人工染色体（ＹＡＣ）が挙げられる。別の型のベクターは、ウイルスベクターであり、ここで、さらなるＤＮＡセグメントが、ウイルスゲノム内に連結され得る（以下にさらに詳細に議論される）。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において、自律的に複製し得る（例えば、宿主細胞において機能する複製起点を有するベクター）。他のベクターは、宿主細胞への導入の際に、宿主細胞のゲノムに統合され得、そしてこれによって、宿主ゲノムとともに複製され得る。さらに、特定の好ましいベクターは、それらが作動可能に連結した遺伝子の発現を導き得る。このようなベクターは、本明細書中で、「組換え発現ベクター」（または単に、「発現ベクター」）と称される。
【００５０】
「作動可能に連結された」発現制御配列とは、発現制御配列が、目的の遺伝子を制御するために、この目的の遺伝子と連続的である結合、およびこの目的の遺伝子を制御するために、トランスでかまたはある距離で働く発現制御配列をいう。
【００５１】
用語「発現制御配列」とは、本明細書中で使用される場合、それらが作動可能に連結したコード配列の発現に影響を与えるために必要な、ポリヌクレオチド配列をいう。発現制御配列とは、核酸配列の転写、転写後事象および翻訳を制御する配列をいう。発現制御配列は、適切な転写開始配列、終結配列、プロモーター配列およびエンハンサー配列；スプライシングおよびポリアデニル化シグナルのような、効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を増強する配列（例えば、リボソーム結合部位）；タンパク質安定性を増強する配列；ならびに望ましい場合、タンパク質分泌を増強する配列を含む。このような制御配列の性質は、宿主生物に依存して異なる；原核生物においては、このような制御配列は、一般に、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列を含む。用語「制御配列」は、最低でも、その存在が発現のために必須である全ての成分を含むことを意図され、そしてまた、その存在が有利であるさらなる成分（例えば、リーダー配列および融合パートナー配列）を含み得る。
【００５２】
用語「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）とは、本明細書中で使用される場合、組換えベクターが導入された細胞をいうことが意図される。このような用語は、特定の被験体細胞のみでなく、そのような細胞の子孫をもまたいうことが意図されることが、理解されるべきである。特定の改変が、変異または環境の影響のいずれかに起因して、引き続く世代において起こり得るので、このような子孫は、実際に、親細胞と同一ではないかもしれないが、本明細書中において使用される場合の用語「宿主細胞」の範囲内に依然として含まれる。組換え宿主細胞は、培養中で増殖された、単離された細胞または細胞株であり得か、あるいは生存組織または器官内に存在する細胞であり得る。
【００５３】
用語「ペプチド」とは、本明細書中で使用される場合、短いポリペプチド（例えば、代表的に約５０アミノ酸長未満、そしてより代表的には約３０アミノ酸長未満のポリペプチド）をいう。この用語は、本明細書中において使用される場合、構造および従って生物学的機能を模倣する、アナログおよび模倣物を包含する。
【００５４】
用語「ポリペプチド」は、天然に存在するタンパク質および天然には存在しないタンパク質の両方、ならびにそのフラグメント、変異体、誘導体およびアナログを包含する。ポリペプチドは、モノマーであってもポリマーであってもよい。さらに、ポリペプチドは、多数の異なるドメインを含み得、これらのドメインの各々は、１つ以上の異なる活性を有する。
【００５５】
用語「単離されたタンパク質」または「単離されたポリペプチド」とは、その誘導の起源または供給源のおかげで、（１）ネイティブな状態で付随する天然に会合する成分と会合していないか、（２）天然には見出されない純度で存在する場合、純度が他の細胞材料の存在に関して調節され得る（例えば、同じ種由来の他のタンパク質を含まない）か、（３）異なる種由来の細胞によって発現されるか、あるいは（４）天然には存在しない（例えば、天然に見出されるポリペプチドのフラグメントであるか、または天然には見出されないアミノ酸のアナログもしくは誘導体または標準的なペプチド結合以外の結合を含む）タンパク質またはポリペプチドである。従って、化学的に合成されるかまたは天然に起源とする細胞とは異なる細胞系において合成されるポリペプチドは、その天然に会合する成分から「単離される」。ポリペプチドまたはタンパク質はまた、当該分野において周知のタンパク質精製技術を使用する単離によって、天然に会合する成分を実質的に含まなくされ得る。このように定義される場合、「単離された」とは、このように記載されるタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたはオリゴペプチドが、そのネイティブの環境から物理的に取り出されていることを、必ずしも必要としない。
【００５６】
用語「ポリペプチドフラグメント」とは、本明細書中において使用される場合、全長ポリペプチドと比較して、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失を有するポリペプチドをいう。好ましい実施形態において、ポリペプチドフラグメントとは、そのフラグメントのアミノ酸配列が、天然に存在する配列における対応する部分と同一である、連続的な配列である。フラグメントは、代表的に、少なくとも５アミノ酸長、６アミノ酸長、７アミノ酸長、８アミノ酸長、９アミノ酸長、または１０アミノ酸長であり、好ましくは、少なくとも１２アミノ酸長、１４アミノ酸長、１６アミノ酸長または１８アミノ酸長であり、最も好ましくは、少なくとも２０アミノ酸長であり、より好ましくは、少なくとも２５アミノ酸長、３０アミノ酸長、３５アミノ酸長、４０アミノ酸長または４５アミノ酸長であり、なおより好ましくは、少なくとも５０アミノ酸長または６０アミノ酸長であり、そしてなおより好ましくは、少なくとも７０アミノ酸長である。
【００５７】
「改変された誘導体」とは、一次構造の配列において実質的に相同であるが、例えば、インビボまたはインビトロで、化学的改変および性化学的改変を含む、ポリペプチドまたはそのフラグメント、あるいはネイティブなポリペプチドにおいては見出されないアミノ酸を組み込むポリペプチドまたはそのフラグメントをいう。このような改変としては、例えば、当業者によって容易に理解されるような、アセチル化、カルボキシル化、ホスホリル化、グリコシル化、ユビキチン化、標識（例えば、放射性核種を用いる）、および種々の酵素的改変が挙げられる。ポリペプチドを標識するための種々の方法、およびこのような目的に有用な置換基または標識は、当該分野において周知であり、そして放射性同位体（例えば、１２５Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、および３Ｈ）、標識された抗リガンドに結合するリガンド（例えば、抗体）、発蛍光団、化学発光剤、酵素、および標識されたリガンドに対する特異的結合対メンバーとして働き得る抗リガンドが挙げられる。標識の選択は、必要とされる感度、プライマーとの結合体化の容易さ、安定性の要件、および利用可能な機器に依存する。ポリペプチドを標識するための方法は、当該分野において周知である。Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９２（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【００５８】
用語「融合タンパク質」とは、相同なアミノ酸配列に結合したポリペプチドまたはフラグメントを含む、ポリペプチドをいう。融合タンパク質は、有用である。なぜなら、これらは、２つ以上の異なるタンパク質由来の２つ以上の所望の機能的エレメントを含むように構築され得るからである。融合タンパク質は、目的のポリペプチド由来の少なくとも１０個の連続したアミノ酸、より好ましくは、少なくとも２０個または３０個のアミノ酸、なおより好ましくは、少なくとも４０個、５０個、または６０個のアミノ酸、なおより好ましくは、少なくとも７５個、１００個、または１２５個のアミノ酸を含む。融合タンパク質は、ポリペプチドまたはそのフラグメントを、異なるタンパク質またはペプチドをコードする核酸配列とインフレームでコードする核酸配列を構築し、次いで、融合タンパク質を発現させることによって、組換え的に産生され得る。あるいは、融合タンパク質は、ポリペプチドまたはそのフラグメントを、別のタンパク質に架橋させることによって、化学的に産生され得る。
【００５９】
用語「非ペプチドアナログ」とは、参照ポリペプチドの特性に類似の特性を有する化合物をいう。非ペプチド化合物はまた、「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｅｔｉｃ）」または「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）」と称され得る。例えば、Ｊｏｎｅｓ（１９９２）Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｊｕｎｇ（１９９７）Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｎｏｎｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ；Ｂａｄａｎｓｚｋｙら（１９９３）Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−−Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ；「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒｓ  Ｇｕｉｄｅ」、Ｇ．Ａ．Ｇｒａｎｔ編、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，１９９２；Ｅｖａｎｓら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９（１９８７）；Ｆａｕｃｈｅｒｅ，Ｊ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．１５：２９（１９８６）；ＶｅｂｅｒおよびＦｒｅｉｄｉｎｇｅｒ  ＴＩＮＳ  ３９２頁（１９８５）；ならびに上記のものの各々において引用される参考文献（これらは、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。このような化合物は、しばしば、コンピュータ化された分子モデリングの補助によって開発される。本発明の有用なペプチドに構造的に類似のペプチド模倣物を使用して、等価な効果を生じ得、従って、これらのペプチド模倣物は、本発明の一部であると意図される。
【００６０】
「ポリペプチド変異型」または「ムテイン」は、ネイティブタンパク質または野生型タンパク質のアミノ酸配列に比べて、１つ以上のアミノ酸の挿入、重複、欠失、再配置または置換を含むポリペプチド配列をいう。ムテインは、アミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかまたは両方で、天然に存在するタンパク質および／またはアミノ酸配列の短縮型の配列において、１つの位置で単一アミノ酸が、別のアミノ酸に変化される１つ以上のアミノ酸点変異を有し得、１つ以上のアミノ酸が、それぞれ、挿入されるか、もしくは欠失される１つ以上の挿入および／または欠失を有し得る。ムテインは、天然に存在するタンパク質に比べて、同じ生物学的活性を有し得るが、おそらく異なる生物学的活性を有し得る。例えば、ムテインは、増加したニューロン結合活性もしくは減少したニューロン結合活性またはＮｇＲ結合活性を有し得る。本発明の好ましい実施形態において、（例えば、ＭＡＧ  Ｉｇ様ドメイン５中の）ムテインであるＭＡＧ誘導体は、内因性ＭＡＧまたは可溶性野生型ＭＡＧに比べて、減少したニューロン成長阻害活性を有する。
【００６１】
ムテインは、その野生型対応物に対して少なくとも７０％の全配列相同性を有する。野生型タンパク質に対して８０％、８５％または９０％の全配列相同性を有するムテインは、さらにより好ましい。さらにより好ましい実施形態において、ムテインは、９５％の配列同一性、なおより好ましくは９７％の、さらにより好ましくは９８％の、およびさらにより好ましくは９９％の全配列同一性を示す。配列相同性は、任意の共通配列分析アルゴリズム（例えば、ＧａｐまたはＢｅｓｔｆｉｔ）によって測定され得る。
【００６２】
好ましいアミノ酸置換は、以下のものである：（１）タンパク質に対する感受性を減少する置換、（２）酸化に対する感受性を減少する置換、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変更する置換、（４）結合親和性または酵素活性を変更する置換、および（５）このようなアナログの他の物理化学的特徴または機能的特徴を付与するかまたは改変する置換。
【００６３】
本明細書中で使用する場合、２０の従来のアミノ酸およびこれらの省略形は、従来の慣例に従う。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第２版，Ｅ．Ｓ．ＧｏｌｕｂおよびＤ．Ｒ．Ｇｒｅｎ編，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．（１９９１））（これは、参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。２０の従来のアミノ酸、非天然アミノ酸（例えば、α−，α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸）、および他の非従来的なアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）はまた、本発明のポリペプチドのための適切な成分であり得る。非従来的なアミノ酸の例としては、以下：４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、ｓ−Ｎ−メチルアルギニン、および他の類似のアミノ酸およびイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明細書中で使用されるポリペプチド表記において、標準的な使用および慣例に従って、左手方向は、アミノ末端方向であり、右手方向は、カルボキシ末端方向である。
【００６４】
タンパク質は、このタンパク質をコードする核酸配列が、第２のタンパク質をコードする核酸配列に類似する配列を有する場合、「相同性」を有するか、または第２のタンパク質に対して「相同」である。あるいは、タンパク質は、２つのタンパク質が、「類似する」アミノ酸配列を有する場合、第２のタンパク質に対して相同性を有する。（従って、用語「相同性タンパク質」は、２つのタンパク質が、類似するアミノ酸配列を有することを意味するように規定される）。好ましい実施形態において、相同タンパク質は、野生型タンパク質に対して６０％の配列相同性を示し、より好ましくは、７０％の配列相同性を示す。野生型タンパク質に対して８０％、８５％または９０％の配列相同性を示す相同タンパク質が、さらにより好ましい。さらにより好ましい実施形態において、相同タンパク質は、９５％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を示す。本明細書中で使用される場合、アミノ酸配列の２つの領域の間の相同性（特に予測された構造類似性に関して）は、機能が類似することを意味するとして解釈される。
【００６５】
「相同」が、タンパク質またはペプチドに関して使用される場合、同一ではない残基位置が、保存的アミノ酸置換によってしばしば異なることが理解される。「保存的アミノ酸置換」は、類似する化学的特性（例えば、電荷または疎水性度）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換される置換である。一般的に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能特性を実質的には変更しない。２つ以上のアミノ酸配列が、保存的置換によって互いに異なる場合において、パーセント配列同一性または相同性の程度は、置換の保存的性質を修正するように上方に調整され得る。この調整をするための手段は、当業者に周知である（例えば、Ｐｅａｒｓｏｎら、１９９４（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。
【００６６】
以下の６つの群は、各々互いに対して保存的な置換であるアミノ酸を含む：１）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【００６７】
ポリペプチドに対する配列相同性（パーセント配列同一性としても参照される）は、代表的に、配列分析ソフトウェアを使用して決定される。例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，９１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ５３７０５を参照のこと。タンパク質分析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む、種々の置換、欠失および他の改変に対して割り当てられる相同性の尺度を使用して類似の配列を符合させる。例えば、ＧＣＧは、「Ｇａｐ」および「Ｂｅｓｔｆｉｔ」のようなプログラムを備え、これは、デフォルトパラメーターと共に使用され、密接に関連するポリペプチド（例えば、異なる生物種からの相同性ポリペプチド）の間、あるいは野生型タンパク質とその変異型との間の配列相同性または配列同一性を決定し得る。例えば、ＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１を参照のこと。
【００６８】
阻害性分子配列を異なる生物由来の膨大な配列を含むデータベースと比較する場合、好ましいアルゴリズムは、コンピュータープログラムＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；ＧｉｓｈおよびＳｔａｔｅｓ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２；Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．ら（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．およびＭａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：６４９−６５６）、特に、ｂｌａｓｔｐまたはｔｂｌａｔｎ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７）である。ＢＬＡＳＴｐについての好ましいパラメーターは、
期待値：１０（デフォルト）
フィルター：ｓｅｇ（デフォルト）
ギャップを開くためのコスト：１１（デフォルト）
ギャップを伸長するためのコスト：１（デフォルト）
最大整列：１００（デフォルト）
ワードサイズ：１１（デフォルト）
記述の数：１００（デフォルト）
ペナルティーマトリクス：ＢＬＯＷＳＵＭ６２
である。
【００６９】
相同性について比較されるポリペプチド配列の長さは、一般的に、少なくとも約１６アミノ酸残基であり、通常には、少なくとも約２０残基であり、より通常には、少なくとも約２４残基であり、代表的には、少なくとも約２８残基であり、好ましくは、約３５残基を超える。膨大な数の異なる生物由来の配列を含むデータベースを検索する場合、アミノ酸配列を比較することが好ましい。使用するアミノ酸配列を検索するデータベースは、当該分野で公知のｂｌａｓｔｐ以外のアルゴリズムによって決定され得る。例えば、ポリペプチド配列は、ＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１中のプログラムＦＡＳＴＡを使用して比較され得る。ＦＡＳＴＡは、アライメントおよび質問配列と検索配列との間の最良の重複の領域のアライメントおよびパーセント配列同一性を提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ，１９９０（参考として本明細書中に援用される））。例えば、アミノ酸配列間の間のパーセント配列同一性は、ＧＣＧ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１（本明細書中に参考として援用される）に提供されるようなそのデフォルトパラメーター（２のワードサイズおよびＰＡＭ２５０スコアリングマトリクス）を用いてＦＡＳＴＡを使用して決定され得る。
【００７０】
「特異的な結合」は、その環境における他の分子に対する結合に優先して、互いに結合する２つの分子の能力をいう。代表的には、「特異的結合」は、少なくとも２倍、より代表的には少なくとも１０倍、しばしば少なくとも１００倍、反応中の偶然の結合に対して区別する。代表的には、特異的な結合反応の親和性または親和力は、少なくとも約１０−７Ｍ（例えば、少なくとも約１０−８Ｍまたは１０−９Ｍ）である。
【００７１】
用語「領域」は、本明細書中で使用される場合、生体分子の一次構造の物理的に連続した部分をいう。タンパク質の場合において、領域は、このタンパク質のアミノ酸配列の連続的領域によって規定される。
【００７２】
用語「ドメイン」は、本明細書中で使用される場合、生体分子の公知の機能または推測の機能に寄与する生体分子の構造をいう。ドメインは、その領域または部分と同程度に広がり得；ドメインはまた、生体分子の別個の非連続的な領域を含み得る。タンパク質ドメインの例としては、Ｉｇドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインが挙げられるがこれらに限定されない。
【００７３】
本明細書中で使用される場合、用語「分子」は、任意の化合物を意味し、これとしては、低分子、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチド、核酸、脂質などが挙げられるがこれらに限定されず、このような化合物は、天然であっても合成であってもよい。
【００７４】
他に定義されない場合、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明に関する分野の当業者によって通常理解される意味と同じ意味を有する。例示的な方法および材料は、以下に示されるが、本明細書中に記載される方法および材料と類似するかまたは等価な方法および材料はまた、本発明の実施において使用され得、そして、これらは、当業者に明らかである。全ての刊行物および本明細書中に記載される他の参考は、その全体を参考として援用される。矛盾する場合、定義を含む本明細書は、制御する。材料、方法、および実施例は、例示のみであり、そして、限定を意図されない。
【００７５】
本明細書および特許請求の範囲の全体にわたって、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」またはバリエーション（例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」）は、示された整数または整数の群の含入を意味するが、任意の他の整数または整数の群の排除を意図されないことが理解される。
【００７６】
（ヒト様Ｎ−グリカンの生成に対して改変された脂質連結オリゴ糖を有する宿主の操作または選択）
本発明は、非ヒト真核生物宿主細胞において、ヒト様糖タンパク質を産生するための方法を提供する。本発明は、ａｌｇ遺伝子活性（すなわち、ａｌｇ活性（非真菌宿主細胞中の等価な酵素活性を含む））を低下するかまたは激減する非ヒト宿舎細胞を作製する工程または使用する工程、および宿主細胞に少なくとも１つのグリコシダーゼ活性を導入する。好ましい実施例において、グリコオシダーゼ活性は、宿主細胞内の１つ以上のマンノシダーゼ活性の発現によって、例えば、マンノシダーゼ活性の活性化によって、または宿主細胞におけるマンノシダーゼ活性の核酸分子からの発現によって、導入される。
【００７７】
別の実施形態において、本方法は、糖残基を、脂質連結オリゴ糖前駆体の１，６アームに転位する１つ以上の酵素の活性を低下されたか、または激減された宿主細胞を作製する工程またはそれを使用する工程を包含する（図１）。本発明の宿主細胞は、糖残基（例えば、マンノシレート）を、脂質連結オリゴ糖前駆体の１，６アームに転位する酵素をコードする１つ以上の遺伝子中に変異を導入することについて選択されるかまたはそのことによって操作される。糖残基は、より好ましくはマンノースであり、好ましくはグルコース、ＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース、シアル酸、フコースまたはＧｌｃＮＡｃリン酸残基である。好ましい実施形態において、脂質連結オリゴ糖前駆体の１，６アームをマンノシル化する１つ以上の酵素の活性は、低下するかまたは激減する。本方法は、少なくとも１つのグリコシダーゼ活性を宿主細胞に導入する工程をさらに包含し得る（以下を参照のこと）。
【００７８】
なお別の実施形態において、本発明は、非ヒト宿主においてヒト様糖タンパク質を産生するための方法を提供し、ここで、糖タンパク質は、トリマンノースコア構造に結合される少なくとも２つのＧｌｃＮＡｃを有するＮ−グリカンを含む。
【００７９】
上記の各々の実施形態において、本方法は、宿主細胞を作製する工程に関し、ここで、脂質連結オリゴ糖前駆体は、ＮａｎＸＧｌｃＮＡｃ２構造中で濃縮され、ここで、Ｘは、３、４、または５である（図２）。これらの構造は、宿主細胞のＥＲ中で、オリゴサッカリルトランスフェラーゼによって新生ポリペプチド鎖上に転位され、次いで、グリコシダーゼ（例えば、α−マンノシダーゼ）およびグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ＧｎＴ１）での処理によってプロセスされ、ＧｌｃＮＡｃＭａｎＸＧｌｃＮＡｃ２コア構造を有するＮ−グリカンを生成し、ここで、Ｘは、３、４または５であり、そして好ましくは３である（図２および図３）。図２に示されるように、ＧｌｃＮＡｃＭａｎＸＧｌｃＮＡｃ２コア構造を有し、Ｘが３を超えるＮ−グリカンは、適用可能な場合、例えば、α−１，３マンノシダーゼ活性および／またはα−１，２−１，３マンノシダーゼ活性で処理することによって、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に転換され得る。
【００８０】
グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ＧｎＴＩＩ）での処理によるＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２のさらなるプロセシングは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２コア構造を生成し、これは次いで、所望の場合、例えば、エキソビボ処理によって、または一連のグリコシル化酵素（グリコシルトランスフェラーゼ、糖トランスポーターおよびマンノシダーゼを含む（以下を参照のこと））によって、改変されて、ヒト様Ｎ−グリカンになり得る。本発明に従って生成され得る好ましいヒト様糖タンパク質であって、７個以下、または３個以下のマンノース残基を有するＮ−グリカンを含む糖タンパク質は、ガラクトース、ＧｌｃＮＡｃ、シアル酸およびフコースからなる群から選択される１つ以上の糖を含み；そしてＮｅｕＮＡｃ−Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎを含む少なくとも１つのオリゴ糖分枝を含む。
【００８１】
一実施形態において、宿主細胞は、減退されたかまたは減少されたＤｏｌ−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−Ｄｏｌマンノシルトランスフェラーゼ活性を有し、この活性は、ＥＲのルミナル（ｌｕｍｉｎａｌ）側におけるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ＤｏｌからＭａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−Ｄｏｌへの第１のマンノシル化工程に関与する（例えば、ＡＬＧ３  図１；図２）。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、この酵素は、ＡＬＧ３遺伝子によってコードされる。上記のように、漏出ａｌｇ３−１変異を有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−Ｄｏｌを蓄積し、そしてａｌｇ３における欠失を有するＳ．ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造をＥＲ内の新生ポリペプチド鎖上に移動させるようである。従って、この実施形態において、宿主細胞は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造に富化されたＮ−グリカンを蓄積し、これは次いで、グリコシダーゼを用いる（例えば、α−１，２−マンノシダーゼ、α−１，３マンノシダーゼ、またはα−１，２−１，３マンノシダーゼ活性を用いる）処理によってＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に変換され得る（図２）
実施例１に記載されるように、縮重プライマーを、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒおよびヒト（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）由来のＡｌｇ３タンパク質配列の整列に基づいて設計し（図４および５）、そしてこれを使用して、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムＤＮＡ由来の産物を増幅した。得られたＰＣＲ産物を、プローブとして使用して、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＡＬＧ３遺伝子に対して３５％の全配列同一性および５３％の配列類似性を有するタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムクローンを同定しそして単離した（図６および７）。このＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ遺伝子を、本明細書中で、「ＰｐＡＬＧ３」と呼ぶ。ＡＬＧ３遺伝子を、同様に同定し、そしてＫ．ｌａｃｔｉｓから単離した（実施例１；図８および９）。
【００８２】
従って、別の実施形態において、本発明は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＡＬＧ３遺伝子（図６）およびＫ．ｌａｃｔｉｓ  ＡＬＧ３遺伝子（図８）ならびにそれらのホモログ、改変体および誘導体の、少なくとも４５、好ましくは少なくとも５０、より好ましくは少なくとも６０、最も好ましくは７５以上のヌクレオチド残基を含むか、これらからなる核酸配列を有する単離された核酸分子を提供する。本発明はまた、ストリンジェントな条件下で、上記の核酸分子にハイブリダイズする核酸分子を提供する。同様に、本発明の核酸分子によってコードされる単離されたポリペプチド（ムテイン、対立遺伝子改変体、フラグメント、誘導体およびアナログを含む）が、提供される（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓおよびＫ．ｌａｃｔｉｓのＡＬＧ３遺伝子産物は、図６および８に示される）。さらに、本明細書中にさらに記載されるように、本発明の核酸分子を含むベクター（発現ベクターを含む）もまた提供される。
【００８３】
遺伝子特異的プライマーを使用して、構築物を作製して、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのゲノムからＰｐＡＬＧ３遺伝子を欠失させた（実施例１）。この株を使用して、Ｄｏｌ−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−Ｄｏｌマンノシルトランスフェラーゼ活性を欠失した宿主細胞を作製し、そして脂質連結Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−Ｄｏｌ前駆体を生成した。この脂質連結Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−Ｄｏｌ前駆体は、新生ポリペプチド鎖上に移動され、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２糖質構造を有するＮ−グリカンを生成する。
【００８４】
実施例２に記載されるように、このような宿主細胞は、所望のＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２コア糖質構造を有するＮ−グリカンを生成するように、適切なマンノシダーゼの発現によって操作され得る。宿主細胞におけるＧｎＴの発現（例えば、下記のように、核酸分子または核酸分子のライブラリーを標的化することによって）により、改変された宿主細胞は、Ｍａｎ３コア構造（すなわち、ＧｌｃＮＡｃ１Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２またはＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；図３を参照のこと）の各アームに結合した１つまたは２つのＧｌｃＮＡｃ構造を有するＮ−グリカンを生成し得る。これらの構造は、本発明の方法を使用してさらに処理されて、宿主細胞の分泌経路に入るヒト様Ｎ−グリカンまたはタンパク質を生成し得る。
【００８５】
別の実施形態において、宿主細胞は、減退されたかまたは欠失されたドリチル（ｄｏｌｉｃｈｙｌ）−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリチルα１，２−マンノシルトランスフェラーゼ活性を有し、この活性は、ＥＲのルミナル側においてＭａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ＤｏｌをＭａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−Ｄｏｌへ変換するマンノシル化工程に関与する（上記ならびに図１および図２を参照のこと）。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、この酵素は、ＡＬＧ９遺伝子によってコードされる。ａｌｇ９変異を有する細胞は、Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−Ｄｏｌを蓄積し（図２）、そしてＭａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２構造をＥＲ内の新生ポリペプチド鎖上に移動させる。従って、この実施形態において、宿主細胞は、Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２構造に富化されたＮ−グリカンを蓄積し、これは次いで、α−１，２−マンノシダーゼおよびα−１，３マンノシダーゼを用いる処理によってコアＭａｎ３構造にプロセスダウンされ得る（図３ならびに実施例３および４を参照のこと）。
【００８６】
ａｌｇ９遺伝子（または等価な活性をコードする遺伝子）が欠失された宿主細胞を構築する（実施例３を参照のこと）。ＡＬＧ９（または、ＡＬＧ１２；以下を参照のこと）の欠失は、１，６アーム上の、それぞれ、１つまたは２つのさらなるマンノースを有するＮ−グリカンを生成する（図２）。Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ（Ｇｎ  ＴＩＩ）に接近可能な１，６−コアマンノースを作製するために、これらのマンノースは、グリコシダーゼによって除去される必要がある。ＥＲマンノシダーゼは、代表的に、１，６アーム上の末端１，２マンノースを除去し、続いてマンノシダーゼＩＩ（α１−３，６マンノシダーゼ）または他のマンノシダーゼ（例えば、α１，２マンノシダーゼ、α１，３マンノシダーゼまたはα１−２，３マンノシダーゼ（例えば、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｎｉｈｏｔｉｓ由来；実施例４を参照のこと））が、１，６アームに作用し得、続いて、ＧｎＴＩＩが、Ｎ−アセチルグルコサミンを移動させて、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３を生成する（図２）。
【００８７】
ａｌｇ９ｐ活性を欠く得られた宿主細胞を、１つ以上の酵素由来のα１，２−マンノシダーゼ活性およびα１，３マンノシダーゼ活性を発現するように、好ましくは、宿主細胞に導入される核酸分子からの発現によって、操作され、そしてこれは、好ましい細胞成分に標的化される酵素を発現する（以下を参照のこと）。実施例４は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｎｉｈｏｔｉｓ由来のこのような酵素のクローニングおよび発現を記載する。
【００８８】
別の実施形態において、宿主細胞は、減退されたかまたは欠失されたドリチル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリチルα１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性を有し、この活性は、ＥＲのルミナル側においてＭａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ＤｏｌをＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−Ｄｏｌ（これはコアマンノース構造の１，６アーム上のα−１，６マンノースをマンノシル化する）へ変換するマンノシル化工程に関与する（上記ならびに図１および図２を参照のこと）。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、この酵素は、ＡＬＧ１２遺伝子によってコードされる。ａｌｇ１２変異を有する細胞は、Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−Ｄｏｌを蓄積し（図２）、そしてＭａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２構造をＥＲ内の新生ポリペプチド鎖上に移動させる。従って、この実施形態において、宿主細胞は、Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２構造に富化されたＮ−グリカンを蓄積し、これは次いで、α−１，２−マンノシダーゼおよびα−１，３マンノシダーゼを用いる処理によってコアＭａｎ３構造にプロセスダウンされ得る（図３ならびに実施例３および４を参照のこと）。
【００８９】
ａｌｇ９変異体宿主について上で記載されるように、ａｌｇ１２ｐ活性を欠く得られた宿主細胞を、（例えば、１つ以上の酵素由来の）α１，２−マンノシダーゼ活性およびα１，３マンノシダーゼ活性を発現するように、好ましくは、宿主細胞に導入される１つ以上の核酸分子からの発現によって、操作され、そしてこれは、好ましい細胞成分に標的化される酵素活性を発現する（以下を参照のこと）。
【００９０】
（必要に応じて減少した開始α−１，６マンノシルトランスフェラーゼ活性を有する宿主の操作または選択）
好ましい実施形態において、本発明の方法は、（ａ）ａｌｇ遺伝子の活性またはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍａｎ３」）コア糖質構造上のＮ−グリカンをマンノシル化する１つ以上の活性が減退または減少しており、かつ（ｂ）（Ｍａｎ３コア構造のα−１，３アーム上の）開始α−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ（すなわち、外側鎖マンノシル化を開始する開始特異的酵素）の活性が減退または欠失している、宿主細胞を作製または使用することを包含する。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、この酵素は、ＯＣＨ１遺伝子によってコードされる。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるｏｃｈ１遺伝子の破壊は、Ｎ連結糖がポリマンノース外側鎖を完全に欠く表現型を生じる。真菌鎖における哺乳動物型グリコシル化を得るための以前のアプローチは、ＯＣＨ１の不活性化を必要とした（例えば、Ｃｈｉｂａ，１９９８を参照のこと）。しかし、Ｏｃｈ１ｐ酵素が、有効なマンノース外側鎖開始についてインタクトなＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃを必要とする場合、本発明の宿主細胞における開始α−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性の破壊は、任意である（選択された宿主細胞に依存して）。従って、本発明に従って選択または生成された宿主細胞（これは、７個以下のマンノース残基を有する脂質連結オリゴ糖を蓄積する）は、移動の後、Ｏｃｈ１ｐに対する乏しい基質の可能性のある低グリコシル化Ｎ−グリカンを生成する（例えば、Ｎａｋａｙａｍａ，１９９７を参照のこと）。
【００９１】
（増加したグリコシルトランスフェラーゼ活性を有する宿主の操作または選択）
上記のように、グリコシル化オリゴ糖は、それらの非グリコシル化対応物よりもはるかに高い割合で新生ポリペプチド鎖に移動されると考えられる。オリゴ糖トランスフェラーゼ複合体による基質認識は、脂質連結オリゴ糖のアンテナへのグルコースの付加によって増大するようである。従って、脂質連結オリゴ糖を最適にグリコシル化し得る宿主細胞を作製または選択することが望まれる。このような宿主細胞において、過小グリコシル化（ｕｎｄｅｒｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）は、グリコシル化Ｍａｎ５構造の新生ポリペプチド鎖上へのより速くより効率的な移動に起因して、実質的に減少されるかまたは消滅されさえする。
【００９２】
従って、本発明の別の実施形態において、この方法は、脂質連結Ｎグリカン前駆体がＥＲ中の新生ポリペプチド鎖に効率的に移動される宿主細胞を作製することに関する。好ましい実施形態において、移動は、脂質連結オリゴ糖の分枝上のグリコシル化レベルを増加することによって増大され、このことにより、このオリゴ糖は、オリゴサッカリルトランスフェラーゼに対するより良い基質となる。
【００９３】
１つの好ましい実施形態において、本発明は、ヒト様糖タンパク質を作製するための方法を提供し、この方法は、ＥＲ中の脂質連結オリゴ糖のグリコシル化を担う１つ以上の酵素が増加した活性を有する宿主細胞を使用する。脂質連結オリゴ糖のグリコシル化の程度を増大するための１つの方法は、脂質連結オリゴ糖のアンテナ上へのグルコース残基の移動を担う１つ以上の酵素を過剰発現させることである。特に、α−１，３グルコシルトランスフェラーゼ活性の増加により、グルコシル化脂質連結Ｍａｎ５構造の量が増加し、そして分泌タンパク質の過小グリコシル化を減少させるかまたは排除する。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、この酵素は、ＡＬＧ６遺伝子によってコードされる。
【００９４】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＡＬＧ６およびそのヒト対応物は、クローニングされている（Ｉｍｂａｃｈ，１９９９；Ｒｅｉｓｓ，１９９６）。グリコシル化の初期工程の進化的保存に起因して、ＡＬＧ６座は、種間で相同であると予測され、そして当業者によって、配列類似性に基づいてクローニングされ得る（同じことが、異なる種由来のＡＬＧ８およびＡＬＧ１０座のクローニングおよび同定にあてはまる）。さらに、異なる種由来の異なるグルコシルトランスフェラーゼが、次いで、最適な活性を有するグルコシルトランスフェラーゼを同定するために試験され得る。
【００９５】
強力なプロモーター（例えば、ＧＡＰＤＨプロモーター）の制御下でのＡＬＧ６遺伝子のさらなるコピーの導入および／またはＡＬＧ６の発現は、グルコシル化脂質連結オリゴ糖の程度を増加するためのいくつかの方法の１つである。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ由来のＡＬＧ６遺伝子を、クローニングしそして発現する（実施例５）。ＡＬＧ６核酸およびアミノ酸配列を、図２５（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）および図２６（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）について示す。これらの配列を、図２７の他の真核生物ＡＬＧ６配列と比較する。
【００９６】
従って、本発明の別の実施形態は、脂質連結オリゴ糖のグリコシル化の程度を増大する方法を提供し、この方法は、宿主細胞におけるα−１，３グルコシルトランスフェラーゼ活性を増大する工程を包含する。この活性の増加は、例えば、この活性をコードする核酸を１つ以上の異種発現制御配列と作動可能に連結することによって、この活性をコードする核酸配列を過剰発現することによって、達成され得る。好ましい発現制御配列としては、転写開始プロモーターおよびエンハンサー、転写終結プロモーターおよびエンハンサー；ＲＮＡスプライスドナーおよびポリアデニル化シグナル；ｍＲＮＡ安定化配列；リボソーム結合部位；タンパク質安定化配列；ならびにタンパク質分泌配列が挙げられる。
【００９７】
別の実施形態において、α−１，３−グルコシルトランスフェラーゼ活性の増加は、当業者に周知の技術を使用して、マルチコピープラスミド上に、活性をコードする核酸分子を導入することによって達成される。さらに別の実施形態において、脂質連結オリゴ糖のグルコシル化の程度は、宿主細胞中のオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）活性の基質特異性を低下することを含む。このことは、例えば、活性をコードする少なくとも１つの核酸を、遺伝子シャッフリング、インビトロ変異誘発、および誤りがちのポリメラーゼ連鎖反応のような技術（これらの全ては、当業者に周知である）に供することによって達成される。当然、ＡＬＧ８およびＡＬＧ１０は、宿主細胞中で過剰発現され、同様の様式で試験され得る。
【００９８】
従って、好ましい実施形態において、本発明は、ＥＲ中の脂質連結オリゴ糖のグリコシル化を担う１つ以上の酵素が、活性を増加するように操作されたかまたは選択された宿主細胞を使用してヒト様糖タンパク質を作製するための方法を提供する。より好ましい実施形態において、本発明は、以下：
（ａ）１つ以上のａｌｇ遺伝子活性またはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍａｎ３」）コア糖質構造のα−１，６アームで、Ｎ−グリカンをマンノシル化する活性の活性が低下または激減した宿主細胞および（ｂ）ＥＲ中での脂質連結オリゴ糖のグリコシル化を担う１つ以上の酵素が活性を増加するように操作されるかまたは選択された宿主細胞
の両方の宿主細胞を使用する。しかし、ａｌｇ３変異型バックグラウンドにおいて見出される脂質連結Ｍａｎ５構造は、Ａｌｇ６ｐに対する好ましい基質ではない。従って、当業者は、例えば、当業者に周知の分子生物学および遺伝子選択技術を使用して、基質特異性が増加した酵素をコードする核酸を、１以上のラウンドの遺伝子シャッフリング、誤りがちのＰＣＲ、またはインビトロ変異誘発アプローチに供することによって、そして目的の宿主細胞中で基質特異性の上昇について選択することによって、基質特異性が上昇したＡｌｇ６ｐ、Ａｌｇ８ｐおよびＡｌｇ１０ｐを同定し得る（Ｇｉｂｂｓ，２００１）。選択された宿主株において酵素基質特異性を改善するためのこのような技術が、本発明のこの特定の実施形態に限定されないが、非ヒト宿主細胞においてヒト様Ｎ−グリカンの産生をさらに最適化する任意の実施形態において使用され得ることは、当業者に理解される。
【００９９】
記載されるように、Ｍａｎ５は、新生ポリペプチド鎖に移されると、適切なα−１，２−マンノシダーゼの発現は、本発明によって提供されるように、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造をさらに小さくし、所望のコアＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造を生じる。α−１，２−マンノシダーゼは、末端α−１，２−結合マンノース残基のみを除去し、ａｌｇ３、ａｌｇ９およびａｌｇ１２変異型宿主細胞およびこれらの遺伝子に対するホモログが変異された宿主細胞中で作られたＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２特異的構造を認識すると予想される。
【０１００】
図３に概略的に示されるように、適切なＵＤＰ−糖−輸送体およびＵＤＰ−糖−トランスフェラーゼの共発現は、末端α−１，６残基およびα−１，３残基をＧｌｃＮＡｃでキャップし、このことは、哺乳動物型複合体およびハイブリッドＮ−グリコシル化に必要な前駆体（ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２）を生じる。次いで、ペプチドが結合したＮ−連結オリゴ糖鎖（ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（図３）は、哺乳動物型オリゴ糖構造へのさらなる改変のための前駆体として働く。続いてのガラクトシルトランスフェラーゼの発現およびシアル酸（ｓｉａｌｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）を転位する能力を遺伝子操作することは、哺乳動物型（例えば、ヒト様）Ｎ−グリカン構造を生じる。
【０１０１】
本発明に従う所望の宿主細胞は、１つの酵素または１つを超える酵素を同時に操作し得る。さらに、潜在的に有用な酵素をコードする遺伝子のライブラリーが、作製され得、最適な活性を有する１つ以上の酵素を有する株または最も「ヒト様」糖タンパク質を産生する株は、ライブラリーの１つ以上のメンバーを用いて標的宿主細胞を形質転換することによって選択される。コアＮ−グリカンＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を有する糖タンパク質を産生し得る下等真核生物は、遺伝子操作の実施の容易さ、ならびに安全性および効率特性に起因して、特に有用である。好ましい実施形態において、少なくとも１つのさらなるグリコシル化反応が、エキソビボまたはインビボで実施され、ヒト様Ｎ−グリカンを産生する。より好ましい実施形態において、グリコシル化酵素の活性型は、宿主細胞の小胞体および／またはゴルジ装置において発現され、所望のヒト様糖タンパク質を産生する。
【０１０２】
（宿主細胞）
本発明の好ましい非ヒト宿主細胞は、下等真核生物細胞（例えば、単細胞真菌または線維状真菌）であり、これは、１つ以上のａｌｇ遺伝子活性（ａｌｇ活性に対して相同であるか、または等価である酵素活性を含む）が減少しているか、または激減している。本発明の別の好ましい宿主細胞は、脂質連結オリゴ糖構造のα−１，６アームをマンノシル化する１つ以上の酵素の活性（ａｌｇ活性以外）が低下されるか、または激減する。
【０１０３】
下等真核生物宿主細胞が、好ましくある、一方で、前述の特徴を有する広く種々の宿主細胞は、本発明の方法において有用であるとして構想される。例えば、植物細胞は、本発明に従って、ヒト様糖タンパク質を発現するように操作され得る。同様に、種々の非ヒト哺乳動物宿主細胞は、本発明の方法を使用して、よりヒト様の糖タンパク質を発現するように変更され得る。適切な宿主細胞が、操作され得るか、または酵母において既に記載される多くのこのような変異型の１つが、使用され得る。本明細書中に例示される場合、本発明の好ましい宿主細胞は、Ｐｉｃｈｉａ  Ｐａｓｔｏｒｉｓ中の過剰マンノシル化欠損（ＯＣＨ１）変異型であり、この変異型は、ａｌｇ３遺伝子をさらに改変し、欠失する。他の好ましい宿主は、ｏｃｈ１変異およびａｌｇ９変異またはａｌｇ１２変異を有するＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ変異型である。
【０１０４】
（複雑なＮ−グリカンの形成）
改変された、新生Ｎ−グリカン構造に糖を連続的に添加することは、グルコシルトランスフェラーゼのゴルジ装置への首尾よい標的化および首尾よい発現を含む。このプロセスは、例えば、機能的発現（例えば、初期ゴルジ装置または中期ゴルジ装置におけるＧｎＴＩの機能的発現）を必要とし、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（例えば、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体の発現による）の十分な供給を保証する。
【０１０５】
糖タンパク質を特徴づけ、そして所望されるグリコシル化を確認するために、糖タンパク質を精製し、Ｎ−グリカンを、ＰＮＧａｓｅ−Ｆ放出し、次いで、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって分析した（実施例２）。ヒトプラスミノゲンのクリングル３ドメインを、レポータータンパク質として使用した。この可溶性糖タンパク質を、ａｌｇ３、ｏｃｈ１ノックアウトのバックグラウンドで、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ中で産生した（実施例２）。
【０１０６】
ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を、ヒトＧｎＴＩおよび図１６のＫ．ｌａｃｔｉｓ  ＵＤＰ−ＧｌｃＮａｃ輸送体の添加後、優勢なＮ−グリカンとして提供した（図２）。このＮ−グリカンの質量は、１４６３（ｍ／ｚ）であるＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２質量と一致する。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２へのＧｌｃＮＡｃの付加を確認するために、β−Ｎ−ヘキソサミニダーゼ消化を実施し、これは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の質量と一致する１２６０（ｍ／ｚ）のピークを明らかにした（図１７）。
【０１０７】
１つの株ＰＢＰ３（実施例２）中のａｌｇ３  ｏｃｈ１欠失由来のＮ−グリカンは、１１３８（ｍ／ｚ）および１３００（ｍ／ｚ）に、２つの異なるピークを提供した。これは、構造（ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＧｌｃＮＡｃＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２）に一致する（図１８）。多くのマンノースに対するインビトロα１，２−マンノシダーゼ消化の後、ピークは、１１３８（ｍ／ｚ）に溶出された。これは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２と一致する（図１９）。ＧｌｃＮＡｃのＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造に対する付加を確認するために、β−Ｎ−ヘキソサミニダーゼ消化を実施し、これは、９３４（ｍ／ｚ）にピークを示し、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の質量と一致した（図２０）。
【０１０８】
ＧｌｃＮＡｃのＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造に対する第２の付加を、図２１に示す。１３５７（ｍ／ｚ）のピークは、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に対応する。コアマンノース構造（Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）への２つのＧｌｃＮＡｃの付加を確認するために、別のβ−Ｎ−ヘキソサミニダーゼ消化を、実施し、これは、９３４（ｍ／ｚ）にピークを示し、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の質量と一致した（図２２）。これは、酵母細胞中で作られる複合型糖タンパク質を示す決定的なデータである。
【０１０９】
ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に対するＵＤＰ−ガラクトースおよびβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼのインビトロ付加は、１６６４（ｍ／ｚ）にピークを生じた。これは、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の質量と一致する（図２３）。最終的に、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸およびシアリルトランスフェラーゼのインビトロ付加は、２２４８（ｍ／ｚ）にピークを生じた。これは、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の質量と一致する（図２４）。上記のデータは、複雑なヒト様糖タンパク質を産生し得る非哺乳動物宿主細胞の使用を支持する。
【０１１０】
（グルコシルトランスフェラーゼおよびガラクトシルトランスフェラーゼの特定の細胞小器官への標的化）
多くの研究が、これらの酵素が、これらのそれぞれの細胞小器官に保持され、そして固定される正確な機構を示すために、提供されてきた。複雑ではあるが、証拠は、幹領域、膜貫通領域、および細胞質テイルが、個々にまたは一斉に、酵素を個々の細胞小器官の膜に指向し、それによって、結合する触媒領域が、その位置に局在化することを示唆する。
【０１１１】
活性なグリコシルトランスフェラーゼが、発現され得、そして適切な細胞小器官に指向され得、その結果、連続した順番の反応が生じ得、複雑なＮ−グリカン形成を導く方法は、以下の通りである：
（Ａ）分泌経路中の特定の位置（ＥＲ、ゴルジおよびトランスゴルジネットワーク）への局在化を媒介するタンパク質／ペプチドをコードすることが既知である領域のＤＮＡライブラリーを確立すること。これらの酵素の限られた選択物およびこれらのそれぞれの位置を、表１に示す。これらの配列は、操作される宿主および他の関連する生物または関連しない生物から選択され得る。一般的に、このような配列は、以下の３つの範疇に分類される：
（１）細胞質テイル（ｃｔ）、膜貫通ドメイン（ｔｍｄ）およびいくらかよりあいまいに規定された幹領域（ｓｒ）の一部をコードするＮ−末端配列。これらは、一緒にかまたは個々にタンパク質をゴルジの内（内腔）膜に固定する、
（２）一般的にＣ−末端で見出される回収シグナル（例えば、ＨＤＥＬまたはＫＤＥＬテトラペプチド）、および
（３）膜貫通ヌクレオチド糖輸送体（これは、ゴルジに局在化することが公知である）。
第１の場合において、局在化領域が種々の要素（ｃｔ、ｔｍｄおよびｓｒ）からなる場合、ライブラリーは、ｃｔ、ｔｍｄおよび幹領域の種々の部分が示されるように設計される。これは、細胞質領域をコードするＤＮＡの５’末端に結合するＰＣＲプライマーを使用すること、および幹領域の種々の部分に結合する対向する一連のプライマーを使用することによって達成され得る。さらに、糖ヌクレオチド輸送体および公知の回収シグナルをコードする融合タンパク質構築物を作製する。
（Ｂ）第２工程は、一連の融合タンパク質構築物の作製を包含し、この構築物は、上記の局在化配列およびこのような局在化配列にインフレームでクローン化された特定のグリコシルトランスフェラーゼの触媒ドメインをコードする（例えば、ＧｎＴＩ、ＧａｌＴ、フコシルトランスフェラーゼまたはＳＴ）。触媒ドメインに融合された糖ヌクレオチド輸送体の場合において、このような構築物を設計し、その結果、触媒ドメイン（例えば、ＧｎＴＩ）が、得られたポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端のいずれかに存在し得る。局在化配列と同様に、触媒ドメインは、種々の異なる供給源に由来し得る。このような触媒ドメインの選択は、触媒ドメインが活性である特定の環境の知見によって左右される。例えば、特定のグリコシルトランスフェラーゼが、後期ゴルジにおいて活性である場合、宿主生物の後期ゴルジ中の全ての公知の酵素が、７．０の最適ｐＨを有する場合、または後期ゴルジが、特定のｐＨを有することが公知である場合、そのｐＨで最適の活性を有する触媒ドメインを選択することを試行する。特定の宿主において、このような酵素の活性に対する現存するインビボデータはまた、有用であり得る。例えば、Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋおよび共同研究者らは、ＧａｌＴ活性をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのゴルジに操作し得ることを示し、そしてこのような活性が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのａｌｇ変異型において、いくつかのＧａｌの存在するＧｌｃＮＡｃ２への転位を示すことによって存在したことを示した。さらに、数ラウンドの遺伝子シャッフリングまたは誤りがちのＰＣＲを実施し、融合構築物のプール内に大きな多様性を得る。なぜなら、単一アミノ酸変異は、糖タンパク質保有酵素の活性を劇的に変更し得ることが示されたからである（Ｒｏｍｅｒｏら、２０００）。グリコシルトランスフェラーゼおよびこれらの内因性固定配列（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の全長配列がまた、使用され得る。好ましい実施形態において、このような局在化／触媒ドメインライブラリーは、より高等な真核生物におけるグリコシル化反応の一連の性質に対する現存する情報を組込むように設計される。言い換えると、糖タンパク質のプロセシングの過程の初期に起こることが公知である反応は、このような反応を触媒する酵素の、ゴルジまたはＥＲの初期部分への標的化を必要とする。例えば、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２からＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２へのトリミングは、複雑なＮ−グリカンの形成における初期段階である。タンパク質プロセシングが、ＥＲにおいて開始し、次いで、初期ゴルジ、中期ゴルジおよび後期ゴルジの間進行するので、ＥＲまたは初期ゴルジにおいて起こるこのトリミング反応を有することが、所望される。マンノシダーゼＩ局在化についてのライブラリーを設計する場合、マンノシダーゼＩの触媒ドメインを有するＥＲ標的化シグナルと初期ゴルジ標的化シグナルとを一致することを試行する。
【０１１２】
融合構築物ライブラリーを用いて宿主株を形質転換する際に、選択プロセスを使用して、どの特定の局在化配列と触媒ドメインとの組み合わせが、実際に、そのような宿主株において見出される糖質構造に対して最大の効果を有するかを、同定する。そのような選択は、多数のアッセイ方法または検出方法に基づき得る。それらの方法は、手動により行われ得るか、または高スループットスクリーニング機器を使用することを介して自動化され得る。
【０１１３】
別の例において、ＧｎＴＩ活性が、複合Ｎ−グリカンの成熟のために必要である。なぜなら、末端α１，３マンノース残基へのＧｌｃＮＡｃの付加後のみ、そのような構造から続く中間体ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造へのさらなる調整が生じ得るからである。マンノシダーゼＩＩは、末端β１，２−ＧｌｃＮＡｃの非存在下で末端α１，３−マンノース残基およびα１，６−マンノース残基を多分除去することができず、従って、複合Ｎ−グリカンの形成は、ＧｎＴＩ活性の非存在下では進行しない（Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ，１９９１）。あるいは、充分な量の本発明に記載されるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を生じる株を、Ａｌｇ３Ｐ活性が欠損した株を操作または選択することにより、まず操作または選択し得る。十分なＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター活性の存在下で、このようなＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター活性を有する株を操作または選択することにより達成し得るように、ＧｌｃＮＡｃが、ＧｎＴＩにより末端α−１，３残基に付加され得る。なぜなら、インビトロでのＭａｎ３構造は、ラット肝臓ＧｎＴＩにより認識されるからである（Ｍｏｌｌｅｒ，１９９２）。
【０１１４】
別のアプローチにおいて、上記のライブラリー中にＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターの発現を組込み得、望ましい構築物が、以下を含むようにする：（１）形質転換構築物が細胞中に維持される領域（例えば、複製起点、または染色体組み込みを媒介する領域）、（２）形質転換された細胞の選択を可能にするマーカー遺伝子（対比選択可能で再利用可能なマーカー（例えば、ｕｒａ３もしくはＴ−ｕｒｆ１３（Ｓｏｄｅｒｈｏｌｍ，２００１）、または充分に特徴付けられた他の選択マーカー（例えば、ｈｉｓ４、ｂｌａ、Ｓｈ  ｂｌｅなど）を含む）、（３）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターをコードする遺伝子（例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ由来（Ａｂｅｉｊｏｎ，１９９６）またはＨ．ｓａｐｉｅｎｓ由来（Ｉｓｈｉｄａ，１９９６）、および（４）上記局在化ドメイン／触媒ドメイン融合構築物ライブラリーの発現を活性化するプロモーター。
【０１１５】
上記の融合構築物のライブラリーを用いる宿主の形質転換の後、細胞表面上に最高濃度の末端ＧｌｃＮＡｃを有する細胞、または最高の末端ＧｌｃＮＡｃ含量を有するタンパク質を分泌する細胞について、スクリーニングし得る。そのようなスクリーニングは、視覚的方法（染色手順など）、特異的末端ＧｌｃＮＡｃ結合抗体に結合する能力、またはマーカーに結合体化したレクチンに結合する能力（そのようなレクチンは、Ｅ．Ｙ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｍａｔｅｏ，ＣＡから入手可能である）、特定のレクチンが末端マンノース残基に結合する能力の減少、インビトロで放射性標識糖を組込む能力、色素もしくは荷電表面への結合の変化に基づき得るか、または発蛍光団標識レクチンもしくは抗体と組み合わせて蛍光補助細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）デバイスを使用することにより達成され得る（Ｇｕｉｌｌｅｎ，１９９８）。形質転換集団内の特定の表現型を、細胞傷害性レクチンを用いて富化することは、有利であり得る。米国特許第５，５９５，９００号は、望ましい細胞外糖質構造を有する細胞が同定され得るいくつかの方法を教示する。このストラテジーを繰返し実行することにより、下等真核生物においてますます複雑なグリカンを連続して操作することが可能である。
【０１１６】
形質転換後、インビトロアッセイにおいて、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩによるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからのＧｌｃＮＡｃの最も効率的な移動を可能にする形質転換体について、選択し得る。このスクリーニングは、上記形質転換ライブラリーを保有する細胞を、寒天プレート上にて選択圧下で増殖させること、そして個々のコロニーを９６ウェルマイクロタイタープレートへと移すことによって、実行され得る。細胞を増殖させた後、その細胞を遠心分離し、その細胞を緩衝液中に再懸濁し、そしてＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃおよびＧｎＴ  Ｖを添加した後、ＵＤＰの放出を、ＨＰＬＣか、またはＵＤＰについての酵素結合アッセイのいずれかによって、測定する。あるいは、放射性標識したＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃおよびＧｎＴ  Ｖを使用し、その細胞を洗浄し、その後、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼによる放射性ＧｌｃＮＡｃの放出を探索し得る。これはすべて、手動により行われ得るか、または高スループットスクリーニング機器の使用を介して自動化され得る。
【０１１７】
第１のアッセイにおいてより多くのＵＤＰを放出するかまたは第２のアッセイにおいてより多くの放射標識ＧｌｃＮＡｃを放出する形質転換体は、その表面上により高い程度のＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を有し（図３）、従って、望ましい表現型を構成すると、予測される。あるいは、形質転換細胞の表面上の変化したグリコシル化パターンを明らかにし得る、レクチン結合アッセイのような他の任意の適切なスクリーニングを使用し得る。この場合、末端マンノースに特異的なレクチンの結合の減少が、適切な選択ツールであり得る。Ｇａｌａｎｔｕｓ  ｎｉｖａｌｉｓレクチンは、末端α−１，３マンノースに特異的に結合し、このことは、ゴルジ装置中に充分なマンノシダーゼＩＩ活性が存在する場合には、減少すると予期される。高末端マンノース含量を含む細胞の除去を可能にするクロマトグラフィー分離工程を実行することによってもまた、望ましい形質転換体を富化し得る。この分離工程は、低末端マンノース含量を有する細胞よりも、高末端マンノース含量を有する細胞に特異的に結合するレクチンカラム（例えば、アガロースに結合したＧａｌａｎｔｕｓ  ｎｉｖａｌｉｓレクチン、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて、実行される。さらに、このような融合タンパク質構築物を直接作製し得る。なぜなら、種々の下等真核生物宿主における活性糖質改変酵素の局在化に関するさらなる情報が、科学文献にて利用可能であるからである。例えば、先行技術は、ヒトβ１，４−ＧａｌＴｒが、ＭＮＴ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のマンノシルトランスフェラーゼ）の膜ドメインに融合され得、かつその触媒活性を保持しながらゴルジ装置へと局在化され得ることを、本発明者らに教示する（Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋら、１９９５）。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたは関連生物が、操作されるべき宿主である場合、そのような宿主由来の複合Ｎ−グリカンを得るために、全体的ストラテジーにこのような知見を直接組込み得る。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中のグリコシルトランスフェラーゼに関連する、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ中のいくつかのそのような遺伝子フラグメントが、同定されており、従って、その目的のために使用され得る。
【０１１８】
（表１）
【０１１９】
【表１】
2005514021.tif 000003
（組み込み部位）
この遺伝子操作の試みの１つの最終的な目的は、工業的発酵プロセスにおいて充分に実施可能である頑丈なタンパク質産生株であるので、宿主（例えば、真菌）染色体中に複数の遺伝子を組込むことは、注意深い計画を伴う。操作された株は、多分、一定範囲の異なる遺伝子で形質転換される必要があり、これらの遺伝子は、望ましい活性が発酵プロセス全体にわたり維持されるのを確保するために、安定な様式で形質転換される必要がある。以下の酵素活性の任意の組み合わせが、タンパク質発現真菌宿主中に操作される必要がある：シアリルトランスフェラーゼ、マンノシダーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、ＥＲおよびゴルジ特異的トランスポーター（例えば、ＵＰＤ−ガラクトースおよび他の前駆体についての共輸送トランスポーターおよび対向輸送トランスポーター）、オリゴ糖のプロセシングに関与する他の酵素、ならびに活性化オリゴ糖前駆体（例えば、ＵＤＰ−ガラクトース、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸）の合成に関与する酵素。同時に、非ヒトグリコシル化反応の特徴であることが公知である酵素をコードする多数の遺伝子が、欠失されなければならない。そのような遺伝子および対応するタンパク質は、多数の下等真核生物（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓなど）において広範に特徴付けられており、それにより、下等真核生物における公知のグリコシルトランスフェラーゼ、その活性、およびその個々の遺伝子配列のリストが提供される。これらの遺伝子は、マンノシルトランスフェラーゼの群（例えば、１，３−マンノシルトランスフェラーゼ（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中のＭＮＮ１）（Ｇｒａｈａｍ，１９９１）、１，２−マンノシルトランスフェラーゼ（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＫＴＲ／ＫＲＥファミリー）、１，６−マンノシルトランスフェラーゼ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＯＣＨ１）、マンノシルホスフェートトランスフェラーゼ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＭＮＮ４およびＭＮＮ６）、および異所性（すなわち、非ヒト）グリコシル化反応に関与するさらなる酵素）から選択される。これらの遺伝子の多くは、実際に、欠失されており、変化したグリコシル化プロフィールを有する生存可能な表現型を個別に生じる。例が、表２に示される。
【０１２０】
（表２）
【０１２１】
【表２】
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下等真核生物中への複合Ｎ−グリカンの形成を操作するためのどのストラテジーも、グリコシルトランスフェラーゼ活性の排除および付加の両方を包含するので、包括的スキームは、両方の要件を協調することを試みる。望ましくない酵素をコードする遺伝子は、望ましい遺伝子について可能な組み込み部位として役立つ。例えば、１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性は、公知の多くの下等真核生物におけるグリコシル化の特徴である。α−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ（ＯＣＨ１）をコードする遺伝子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからクローン化されており、その遺伝子中の変異は、マンノシル化が減少した生存可能な表現型を生じる。そのα−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性をコードする遺伝子座は、グリコシルトランスフェラーゼ活性をコードする遺伝子を組込むための主要な標的である。同様な様式で、その座における遺伝子破壊事象に基づいて、（１）よりヒトと類似する様式でグリコシル化する細胞能力を改善し、（２）タンパク質を分泌する細胞能力を改善し、（３）外来タンパク質のタンパク質分解を減少し、そして（４）精製または発酵プロセス自体を促進するプロセスの他の特徴を改善することが予測される、他の染色体組み込み部位の範囲を選択し得る。
【０１２２】
（糖ヌクレオチド前駆体の提供）
高等真核生物グリコシル化の特徴は、糖タンパク質におけるガラクトース、フコース、および高い程度の末端シアル酸の存在である。これらの糖は、酵母および繊維状真菌において生成される糖タンパク質においては一般的に見出されず、上記の方法により、望ましいオルガネラにおいてグリコシルトランスフェラーゼが局在化する株の操作が可能である。複合Ｎ−グリカン合成の形成は、特定の糖残基が除去されそしてコアオリゴ糖構造に結合される、連続的プロセスである。高等真核生物において、これは、基質を、種々の処理酵素に連続的に曝露させることによって達成される。これらの酵素は、処理カスケード全体における特定の位置に依存して、特定の反応を行う。この「アセンブリライン」は、ＥＲ、初期ゴルジ、中期ゴルジ、および後期ゴルジ、ならびにトランスゴルジネットワークすべてと、その特定の処理環境からなる。下等真核生物のゴルジおよびＥＲにおいてヒト糖タンパク質の処理を再生するために、多数の酵素（例えば、グリコシルトランスフェラーゼ、グリコシダーゼ、ホスファターゼ、およびトランスポーター）が、発現され、これらのオルガネラに特異的に標的付けられなければならず、好ましくは、それらがその環境およびその経路中の他の酵素と関連して最も効率的に機能するような位置に、標的付けられなければならない。いくつかの個々のグリコシルトランスフェラーゼが、クローン化され、そしてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＧａｌＴ、ＧｎＴ  Ｉ）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ（ＧｎＴ  Ｉ）および他の真菌において発現されているが、その生物のグリコシル化パターンにおける望ましい「ヒト化」の結果は示さない（Ｙｏｓｈｉｄａ，１９９５；Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋ，１９９５；Ｋａｌｓｎｅｒ，１９９５）。このようなグリコシルトランスフェラーゼの作用により糖を受容するのに必要な糖質構造は、充分な量存在しないと、推測された。このことは、おそらく、複合Ｎ−グリカン形成の欠如に寄与し、一方、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を供給し、ＧｎＴ  Ｉ活性を有し、そして真菌注に操作されたＵＤＰ−Ｇｎトランスポーター活性を有する真菌についての報告は現在存在しない。ハイブリッドな複合Ｎ−グリカン形成のために必要なのは、これらの３つの生化学的事象の組み合わせである。
【０１２３】
ヒトにおいて、ヌクレオチド糖前駆体（例えば、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸、ＵＤＰ−ガラクトースなど）の全範囲は、一般的に、サイトゾルにおいて合成され、そしてゴルジに輸送され、このゴルジにおいて、これらは、グリコシルトランスフェラーゼによりコアオリゴ糖に結合される。下等真核生物においてこのプロセスを繰り返すために、糖ヌクレオシドに特異的な輸送体は、適切なレベルのヌクレオシド糖前駆体を確実にするために、ゴルジにおいて発現されなければならない（Ｓｏｍｍｅｒｓ，１９８１；Ｓｏｍｍｅｒｓ，１９８２；Ｐｅｒｅｚ，１９８７）。この反応の副生成物は、ヌクレオシドジホスフェートまたはヌクレオシドモノホスフェートのいずれかである。モノホスフェートが、交互輸送機構によるヌクレオシドトリホスフェート糖の交換において直接的に輸送され得るが、ジホスホヌクレオシド（例えば、ＧＤＰ）は、輸送される前に、ヌクレオシドモノホスフェートおよび無機ホスフェートを生じるために、ホスファターゼ（例えば、ＧＤＰａｓｅ）によって切断されなければならない。この反応は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＧＤＰａｓｅが、マンノシル化に必要であることが見出されているので、効率的なグリコシル化に重要であるようである。しかし、酵素のみが、ＵＤＰに対して１０％の活性を有する（Ｂｅｒｎｉｎｓｏｎｅ，１９９４）。下等真核生物は、しばしば、ゴルジにおいてＵＤＰ特異的ジホスファターゼ活性を有さない。なぜなら、これらは、ゴルジにおける糖タンパク質合成のためにＵＤＰ−糖前駆体を利用しないからである。
【０１２４】
Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ（細胞壁多糖類へガラクトース残基を付加することが見出された酵母（ＵＤＰ−ガラクトース由来））は、このような酵素に対する要件をさらに示唆する特異的なＵＤＰａｓｅ活性を有することを見出した（Ｂｅｍｉｎｓｏｎｅら、１９９４）。ＵＤＰは、グリコシルトランスフェラーゼの強力なインヒビターであることが公知であり、このグリコシル化副産物の除去は、ゴルジの内腔におけるグリコシルトランスフェラーゼ阻害を妨げるために重要である。（Ｋｈａｔａｒａら，１９７４）。従って、ＵＤＰの除去を提供する必要があり得、これは、このような操作された株のゴルジにおいて蓄積することが予期される（Ｂｅｒｎｉｎｓｏｎｅ，１９９５；Ｂｅａｕｄｅｔ，１９９８）。
【０１２５】
別の例において、２，３シアリルトランスフェラーゼおよび２，６シアリルトランスフェラーゼは、ヒトのトランス−ゴルジおよびＴＧＮにおいてシアル酸でガラクトース残基をキャップし、糖タンパク質の成熟形態を導く。代謝的に操作された酵母または真菌に、このプロセシング工程を再操作することは、（１）２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性および（２）酵母の後期（ｌａｔｅ）ゴルジにおけるＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の十分な供給を必要とする。ゴルジにおける十分な２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性を得るために、公知のシアリルトランスフェラーゼ（例えば、ヒト由来）の触媒性ドメインは、真菌において後期ゴルジに指向されなければならない（上記を参照のこと）。同様に、輸送体は、後期ゴルジへのＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の輸送を可能にするように操作されなければならない。現在、真菌が、十分な量のＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を合成することを指摘するものはなく、このような糖−ヌクレオチドのゴルジへの輸送を言及しない。結果として、対応するグリコシルトランスフェラーゼに対する基質の適切な供給を確実にするために、真菌に対してＣＭＰ−シアル酸の産生を代謝的に操作しなければならない。
【０１２６】
（ゴルジ装置に糖ヌクレオチド前駆体を提供するための方法）
（ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−グルコサミン）
ヒトＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン輸送体のｃＤＮＡ（これは、発現配列タグデータベース（ｄｂＥＳＴ）における相同性検索によって認識された）は、Ｉｓｈｉｄａおよび共同研究者（Ｉｓｈｉｄａ，１９９９）によってクローニングされた。Ｇｕｉｌｌｅｎおよび共同研究者は、上記ヌクレオチド糖のゴルジ輸送体において欠損した、最近特徴付けられたＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ変異体のイヌ腎細胞（ＭＤＣＫ）由来のｃＤＮＡとの表現型相関によって、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンに対する哺乳動物ゴルジ膜輸送体をクローニングした（Ｇｕｉｌｌｅｎ、１９９８）。それらの結果は、哺乳動物ゴルジ  ＵＤＰ−Ｎ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体遺伝子が、このタンパク質が、発現しそして酵母のゴルジ装置に機能的に標的化されるのに必要な情報の全てを有すること、および非常に異なるアミノ酸配列を有する２つのタンパク質が、同じゴルジ膜内に同じ溶質を輸送し得ることを実証する。（（Ｇｕｉｌｌｅｎ、１９９８）。
【０１２７】
（ＧＤＰ−フコース）
ラット肝臓ゴルジ膜ＧＤＰ−フコース輸送体が、Ｐｕｇｌｉｅｌｌｉ，Ｌ．およびＣ．Ｂ．Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ（Ｐｕｇｌｉｅｌｌｉ，１９９９）によって同定および精製された。対応する遺伝子は、同定されていないが、Ｎ−末端配列決定を、対応する遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドの設計のために使用し得る。これらのオリゴヌクレオチドをプローブとして使用して、ＧＤＰ−フコース輸送体をコードする遺伝子をクローニングし得る。
【０１２８】
（ＵＤＰ−ガラクトース）
２つの異種遺伝子（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ由来のα１，２−ガラクトシルトランスフェラーゼ（α１，２  ＧａｌＴ）をコードするｇｍａｌ２（＋）およびヒトＵＤＰ−ガラクトース（ＵＤＰ−Ｇａｌ）輸送体をコードする（ｈＵＧＴ２））は、ガラクトシル化に必要とされる細胞内条件を調べるために、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて機能的に発現された。タンパク質ガラクトシル化とＵＤＰ−ガラクトース輸送体活性との間の相関は、α１，２−ＧａｌＴよりも、ＵＤＰ−Ｇａｌ輸送体の外因的な供給が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける効率的なガラクトシル化に重要な役割を果たすことを示した（Ｋａｉｎｕｍａ，１９９９）。同様に、Ｓ．ｐｏｍｂｅ由来のＵＤＰ−ガラクトース輸送体は、クローニングされた（Ａｏｋｉ，１９９９；Ｓｅｇａｗａ，１９９９）。
【０１２９】
（ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−シアル酸））
ヒトＣＭＰ−シアル酸輸送体（ｈＣＳＴ）をクローニングし、そしてＬｅｃ  ８  ＣＨＯ細胞において発現させた（Ａｏｋｉ，１９９９；Ｅｃｋｈａｒｄｔ，１９９７）。マウスＣＭＰ−シアル酸輸送体の機能的発現は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて達成された（Ｂｅｒｎｉｎｓｏｎｅ，１９９７）。シアル酸は、いくらかの真菌において見出されたが、選択された宿主系が、十分なレベルのＣＭＰ−シアル酸を供給し得るか否かは、明確でない。シアル酸は、培地において供給され得るか、あるいは、シアル酸合成に関係する真菌経路がまた宿主ゲノム内に組み込まれ得るかのいずれかである。
【０１３０】
（ジホスファターゼ）
糖が糖タンパク質上に輸送される場合、ヌクレオシドジホスフェートまたはヌクレオシドモノホスフェートのいずれかが、糖ヌクレオチド前駆体から放出される。モノホスフェートが交互輸送機構によるヌクレオシドトリホスフェート糖の交換において直接的に輸送され得るが、ジホスホノモノヌクレオシド（例えば、ＧＤＰ）は、輸送される前に、ヌクレオシドモノホスフェートおよび無機ホスフェートを生じるために、ホスファターゼ（例えば、ＧＤＰａｓｅ）によって切断されなければならない。この反応は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＧＤＰａｓｅが、マンノシル化に必要であることが見出されているので、効率的なグリコシル化に重要であるようである。しかし、酵素のみが、ＵＤＰに対して１０％の活性を有する（Ｂｅｒｎｉｎｓｏｎｅ，１９９４）。下等真核生物は、しばしば、ゴルジにおいてＵＤＰ特異的ジホスファターゼ活性を有さない。なぜなら、これらは、ゴルジにおける糖タンパク質合成のためにＵＤＰ−糖前駆体を利用しないからである。Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ（細胞壁多糖類へガラクトース残基を付加することが見出された酵母（ＵＤＰ−ガラクトース由来））は、このような酵素に対する要件をさらに示唆する特異的なＵＤＰａｓｅ活性を有することを見出した（Ｂｅｍｉｎｓｏｎｅら、１９９４）。ＵＤＰは、グリコシルトランスフェラーゼの強力なインヒビターであることが公知であり、このグリコシル化副産物の除去は、ゴルジの内腔におけるグリコシルトランスフェラーゼ阻害を妨げるために重要である。（Ｋｈａｔａｒａら，１９７４）。
【０１３１】
（複合体Ｎ−グリカンを産生するためのＧｎＴの発現）
（抗体機能をブーストするためのＧｎＴ−ＩＩＩの発現）
Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩおよびＩＩＩによるＧｌｃＮＡｃ１Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造へのＮ−アセチルグルコサミンの付加は、いわゆる分岐したＮ−グリカンＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を生じる（図３）。この構造は、より大きな抗体依存性の細胞性の細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関係している（Ｕｍａｎａら、１９９９）。哺乳動物細胞によって発現される免疫グロブリンの糖形態を再操作することは、冗漫で厄介な作業である。特に、ＧｎＴ  ＩＩＩ（この酵素の過剰発現は、増殖阻害に関係している）の場合、調節された（誘導性の）遺伝子の発現を含む方法が、分岐したＮ−グリカンを有する免疫グロブリンを作製するために使用されなければならい（Ｕｍａｎａら、１９９９ａ、１９９９ｂ）。
【０１３２】
従って、別の実施形態において、本発明は、コアマンノース構造上に、分岐したＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を有するヒト様Ｎ−グリカンを作製するためのシステムおよび方法を提供する。好ましい実施形態において、本発明は、分岐したＮ−グリカンを有する免疫グロブリンを産生するためのシステムおよび方法を提供する。本明細書中に記載されるシステムおよび方法は、先の問題（例えば、ＧｎＴ  ＩＩＩまたはＡＤＣＣの過剰発現に関連する細胞傷害性）を被らない。なぜなら、本発明の宿主細胞は、実質的に改変されたヒト型糖形態（例えば、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）を有するＮ−グリカンを産生する、生存可能であり好ましくは、頑強な細胞であるように操作および選択されるからである。従って、本発明の宿主細胞における分岐したＮ−アセチルグルコサミンの付加は、増殖−表現型またはそれらの宿主細胞の生存能力に対して、無視し得る効果を有する。
【０１３３】
さらに、以前の研究（Ｕｍａｎａ）は、ＧｎＴ  ＩＩＩレベルとＡＤＣＣの程度との間に直線的な関係がないことを示した。哺乳動物細胞における最適な発現レベルを見つけ出すこと、およびＦＤＡが許可した発酵プロセス全体にわたってそれを維持することは、挑戦であるようである。しかし、本発明の細胞（例えば、真菌細胞）において、頑強で、信頼性があり、かつ最適なＧｎＴ  ＩＩ発現レベルを確立するための適切な強度のプロモーターを発見することは、当業者には比較的簡単な作業である。
【０１３４】
分岐したＮ−グリカンを用いて糖タンパク質を産生し得る酵母菌株のような宿主細胞は、宿主細胞内にＧｎＴ  ＩＩＩ活性を導入することによって、本発明に従って操作される（実施例６）。好ましくは、宿主細胞は、ＧｎＴ  ＩＩＩ（例えば、図３２を参照のこと）をコードする核酸または酵素活性を有するそのドメイン（（例えば、本発明のライブラリーおよび関連する方法を使用して）必要に応じて、異種細胞標的化ペプチドに融合される）を用いて形質転換される。ＧｎＴ  ＩＩＩを発現するように操作された宿主細胞は、哺乳動物細胞が可能であるよりも高い抗体力価を生じる。これらはまた、ＡＤＣＣに関してより高い効力を有する抗体を産生する。
【０１３５】
ＧｎＴ  ＩＩＩをトランスフェクトされた哺乳動物細胞株によって産生された抗体は、非トランスフェクト細胞株によって産生された工程と同様に効果的であるが、１０〜２０
倍低い濃度であることが示された（Ｄａｖｉｅｓら、２００１）。本発明の産生ビヒクルの生産性の、哺乳動物系に対する２０倍の増加、および１０倍の効力の増加は、２００倍の正味の生産性の改善を生じる。従って、本発明は、高い効力（例えば、現在生産され得るものよりも７桁より強力）を有する高い力価の抗体を作製するための系および方法を提供する。この系および方法は、安全であり、高い効力の抗体を短い時間で提供する。本発明に従って、ＧｎＴ  ＩＩＩを発現するように操作された宿主細胞は、少なくとも５０ｍｇ／リットル／日〜少なくとも５００ｍｇ／リットル／日の速度でｂｉｓｅｃｔｅｄ  Ｎ−グリカンを発現するように操作された。さらに、各免疫グロブリン（Ｉｇ）分子（分岐したＧｌｃＮＡｃを含む）は、分岐したＧｌｃＮＡｃを含まないで産生された同じＩｇ分子よりも強力である。
【０１３６】
（ＧｎＴ−ＩＶおよびＧｎＴ−Ｖのクローニングおよび発現）
複合体Ｎ−グリカンの全ての分枝構造を、Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼ（ＧｎＴ）−Ｉ〜−ＶＩにより、共通のコア五糖（Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２またはＭａｎα−６（Ｍａｎ  α１−３）Ｍａｎ  β１−４  ＧｌｃＮＡｃ  β１−４  ＧｌｃＮＡｃ  β１−４またはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）上に合成した（Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ  Ｈら（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｅ；１７９：３５１−９７）。より高度に分枝したＮ−グリカンの生合成ついての現在の理解は、ＧｎＴ  ＩＩの作用（ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造）の後に、ＧｎＴＩＶが、Ｇｌｃを、β１，４−連結のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンのＭａｎ  α１，３  Ｍａｎ  β１，４アームに移動させ（Ａｌｌｅｎ  ＳＤら（１９８４）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃ１１ｅｍ．Ｊｕｎ  １０；２５９（１１）：６９８４−９０；ならびにＧｌｅｅｓｏｎ  ＰＡおよびＳｃｈａｃｈｔｅｒ  Ｈ．Ｊ（１９８３）；Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５；２５８  （１０）：６１６２−７３）、トリアンテナリアガラクト（ｔｒｉａｎｔｅｎｎａｒｙ  ａｇａｌａｃｔｏ）糖鎖を生じることを示唆する。このＮ−グリカン（ＧｌｃＮＡｃ  β１−２  Ｍａｎ  α１−６（ＧｌｃＮＡｃ  β１−２  Ｍａｎ  α１−３）Ｍａｎ  β１−４  ＧｌｃＮＡｃ  β１−４  ＧｌｃＮＡｃ  β１，４  Ａｓｎ）は、ＧｎＴ−ＩＩＩおよびＧｎＴ−Ｖに対する共通の基質であり、分岐したトリアテナリー構造およびテトラアテナリー構造を導く。ＧｎＴ  ＩＩＩの作用が、分岐したＮ−グリカンを生じる場合、およびＧｎＴＶが、β１−６ＧｌｃＮＡｃのα１−６マンノシルコアへの付加を触媒する場合、β１−６分枝を生じる。ガラクトースおよびシアル酸のこれらの分枝への付加は、完全にシアル化された複合Ｎ−グリカンの生成を導く。
【０１３７】
分枝した複合型Ｎ−グリカンは、治療タンパク質の生理学的活性に関連している（例えば、ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ））。バイアンテナリー構造を有するヒトＥＰＯは、低い活性を有することが示されているのに対し、テトラアンテナリー構造を有するｈＥＰＯは、血流からのよりゆっくりとしたクリアランスを生じ、従って、より高い活性を生じた（Ｍｉｓａｉｚｕ  Ｔら（１９９５）Ｂｌｏｏｄ  Ｄｅｃ  １；８６（１１）：４０９７−１０４）。
【０１３８】
ＤＮＡ配列情報を用いて、当業者は、ＧｎＴ  ＩＶおよび／またはＧｎＴ  Ｖ活性をコードするＤＮＡ分子をクローニングし得る（実施例６；図３３および３４）。当業者に周知の標準的な技術を使用して、ＧｎＴ  ＩＶまたはＧｎＴ  Ｖをコードする（または触媒的に活性なそのフラグメントをコードする）核酸分子は、本発明の選択された宿主細胞（例えば、本明細書中に記載のＰｉｃｈｉａ  ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．のような真菌宿主）において転写を駆動し得るプロモーターおよび他の発現制御配列の転写制御下にある適切な発現ベクターに挿入され得、その結果、これらの哺乳動物ＧｎＴ酵素のうちの１つ以上が、ヒト様複合型糖タンパク質の生成のために選択された宿主細胞において活性に発現され得る。
【０１３９】
以下は、本発明の組成物および方法を例示する実施例である。これらの実施例は、限定として解釈されるべきではなく、この実施例は、単に例示目的で含まれる。
【実施例】
【０１４０】
（実施例１：Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓおよびＫ．ｌａｃｔｉｓにおけるＡＬＧ３遺伝子の同定、クローニングおよび欠失）
縮重プライマーを、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ、およびＤ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ由来のＡｌｇ３タンパク質配列のアラインメントに基づいて作製し、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムＤＮＡ由来の８３ｂｐ産物を増幅するために使用した：
５’−ＧＧＴＧＴＴＴＴＧＴＴＴＴＣＴＡＧＡＴＣＴＴＴＧＣＡＹＴＡＹＣＡＲＴＴ−３’および
５’−ＡＧＡＡＴＴＴＧＧＴＧＧＧＴＡＡＧＡＡＴＴＣＣＡＲＣＡＣＣＡＹＴＣＲＴＧ−３’。得られたＰＣＲ産物を、ｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングしたところ、配列分析により、公知のＡＬＧ３／ＲＨＫ１／ＮＯＴ５６ホモログ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＮＣ＿００１１３４．２、ＡＦ３０９６８９、ＮＣ＿００３４２４．１）に対する相同性が示された。その後、始めのＰＣＲ産物の１９２９ｂｐ上流および２７３８ｂｐ下流を、以下の内部オリゴヌクレオチド：
【０１４１】
【化２】
2005514021.tif 000006
を使用して、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムＤＮＡライブラリーから増幅した（Ｂｏｅｈｍ，Ｔ．Ｙｅａｓｔ  １９９９  Ｍａｙ；１５（７）：５６３−７２）。得られたフラグメントを、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、配列決定した。この配列から、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＡＬＧ３遺伝子に対して３５％同一性および５３％類似性を有するタンパク質をコードする１３９５ｂｐ  ＯＲＦを、（ＢＬＡＳＴプログラムを使用して）同定した。この遺伝子を、ＰｐＡＬＧ３と名付けた。
【０１４２】
ＰｐＡＬＧ３の配列を使用して、プライマーのセットを作製し、ＰｐＡＬＧ３遺伝子の欠失構築物を、ＰＣＲ重複（Ｄａｖｉｄｓｏｎら，２００２  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４８（Ｐｔ  ８）：２６０７−１５）により生成した。以下のプライマーを使用して、ＰｐＡＬＧ３  ＯＲＦおよびＫＡＮＲ遺伝子の５’側および３’側の１ｋｂ領域を、それぞれ増幅した：
【０１４３】
【化３】
2005514021.tif 000007
引き続いて、プライマーＲＣＤ１４２およびＲＣＤ１４７を使用して、３つの得られたＰＣＲ産物を、単一の３．６ｋｂ  ａｌｇ３：：ＫＡＮＲの欠失対立遺伝子に重ねた。
【０１４４】
（Ｋ．ｌａｃｔｉｓにおけるＡＬＧ３遺伝子の同定、クローニングおよび欠失）
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓなどに由来するＡＬＧ３ｐ配列を、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ配列（ＰＥＮＤＡＮＴ  ＥＳＴデータベース）と整列させた。共通ホモログ中に存在するが、それらのホモログにおいて正確な配列は異なる、高い相同性の領域を使用して、株ＭＧ１／２（Ｂｉａｎｃｈｉら，１９８７）に由来するゲノムＤＮＡに対して指向する縮重プライマーの対を作製した。ＡＬＧ３の場合において、プライマー：
【０１４５】
【化４】
2005514021.tif 000008
を用いるＰＣＲ増幅は、クローニングされ、配列決定された産物を生じ、推定翻訳産物は、Ａｌｇ３ｐタンパク質（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ａｌｇ３ｐに対して＞５０％）に対して高い程度の相同性を有することが示された。
【０１４６】
そのＰＣＲ産物を使用して、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ株（ＭＧ１／２）由来のゲノムＤＮＡのサザンブロットを、高いストリンジェンシー下でプローブした（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）。ハイブリダイゼーションは、単一の遺伝子と一致したパターンで観察された。このサザンブロットを使用して、ゲノム遺伝子座をマッピングした。ゲノムフラグメントを、ゲノムＤＮＡを消化し、適切なサイズ範囲にあるこれらのフラグメントをｐＵＣｌ９に連結することによってクローニングして、Ｋ．ｌａｃｔｉｓサブゲノムライブラリーを作製した。このサブゲノムライブラリーを、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換し、数百のクローンを、プライマーＫＡＬ−１およびＫＡＬ−２を使用するコロニーＰＣＲによって試験した。推定ＫｌＡＬＧ３遺伝子および推定ＫｌＡＬＧ６１遺伝子を含むクローンを、配列決定し、オープンリーディングフレームを同定した。
【０１４７】
ＰＣＲ重複法（Ｄａｖｉｄｓｏｎら，２００２）を使用する、ａｌｇ３：：ＮＡＴＲ欠失対立遺伝子の構築物のためのプライマーを設計し、得られた欠失対立遺伝子を、２つのＫ．ｌａｃｔｉｓ株に形質転換し、ＮＡＴ耐性コロニーを選択した。これらのコロニーを、ＰＣＲによってスクリーニングし、ＡＬＧ３  ＯＲＦがｏｃｈ１：：ＮＡＴＲ変異対立遺伝子で置換された形質転換体を得た。
【０１４８】
（実施例２：ヒト様糖タンパク質の生成のための、α−１，２−マンノシダーゼ、ＧｎＴＩおよびＧｎＴＩＩを発現するａｌｇ３／ｏｃｈｌ変異株の生成）
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＯＣＨ１遺伝子の１２１５ｂｐオープンリーディングフレーム、ならびに２６８５ｂｐ上流および１１７５ｂｐ下流を、ＰＣＲによって増幅し（Ｂ．Ｋ．Ｃｈｏｉら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００２に投稿）；ＷＯ０２／００８７９もまた参照のこと；これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、ｐＢＫ９と名付けた。複数の栄養要求マーカーを含むｏｃｈ１ノックアウト株を作製するために、１００μｇのｐＪＮ３２９（ＳｆｉＩ制限部位と隣接したｏｃｈ１：：ＵＲＡ３変異対立遺伝子を含むプラスミド）を、ＳｆｉＩで消化し、これを使用して、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＪＣ３０８（Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏら、Ｇｅｎｅ  ２６３（２００１）１５９−１６９）をエレクトロポレーションにより形質転換した。ウラシルを欠く規定の培地上で１０日間室温でインキュベートした後、１０００個のコロニーを拾い上げ、再び画線した。３７℃で増殖できないが、室温では増殖するＵＲＡ＋クローンを、コロニーＰＣＲに供して、ｏｃｈ１：：ＵＲＡ３変異対立遺伝子の正確な組み込みについて試験した。予測されるＰＣＲパターンを示した１つのクローンを、ＹＪＮ１５３と名付けた。ヒトプラスミノゲンのＫｒｉｎｇｌｅ  ３ドメイン（Ｋ３）を、モデルタンパク質として使用した。Ｋ３遺伝子を含むＮｅｏＲマーカーを挿入した（ＮｅｏＲ  ｍａｒｋｅｄ）プラスミドを、ＹＪＮ１５３株に形質転換し、Ｋ３を発現する得られた株を、ＢＫ６４−１と名付けた（Ｂ．Ｋ．Ｃｈｏｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００２に投稿）。
【０１４９】
ゴルジＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン輸送体をコードするプラスミドｐＰＢ１０３（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＭＮＮ２−２遺伝子を含む）を、ベクターｐＤＬ０２（Ａｂｅｉｊｏｎら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：５９６３−５９６８）由来の平滑ＢｇｌＩＩ−ＨｉｄＩＩＩフラグメントを、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＡＤＥ１遺伝子を含む、ＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩ消化した平滑末端のｐＢＬＡＤＥ−ＳＸ（Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏら（２００１）Ｇｅｎｅ  ２６３：１５９−１６９）にクローニングすることによって構築した。このプラスミドをＥｃｏＮＩで線状にし、エレクトロポレーションによりＢＫ６４−１株に形質転換し、ＰＣＲ分析によりＭＮＮ２−２を含むことが確認された１つの株を、ＰＢＰ１と名付けた。
【０１５０】
ヒト、マウス、ハエ、線虫（worm）および酵母供給源由来のいくつかのα−１，２−マンノシダーゼ遺伝子の触媒ドメインと融合した、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ由来のいくつかのＩ型またはＩＩ型膜タンパク質のリーダードメインのインフレーム融合物を含むマンノシダーゼ構築物のライブラリーを、作製した（例えば、ＷＯ０２／００８７９（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。このライブラリーを、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＨＩＳ４組み込みベクター中に作製し、ＳａｌＩで線状にし、ＰＢＰ１株にエレクトロポレーションにより形質転換し、Ｋ３レポータータンパク質から放出されたグリカンを分析することにより、スクリーニングした。選択した１つの活性な構築物は、マウスα−１，２−マンノシダーゼＩＡ（ＭｍＭａｎｎＩＡ）遺伝子のＮ末端欠失物（これは、１８７個のヌクレオチドを欠いている）と融合した、酵母ＳＥＣ１２遺伝子の９８８〜１２９６のヌクレオチド（Ｃ末端）のキメラであった。この構築物を発現するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株を、ＰＢＰ２と名付けた。
【０１５１】
ヒト、線虫、カエルおよびハエ供給源由来のＧｎＴＩ遺伝子の触媒ドメインを有する同じリーダーライブラリーのインフレーム融合物を含むＧｎＴＩ構築物のライブラリーを作製した（ＷＯ０２／００８７９）。このライブラリーを、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＡＲＧ４組み込みベクター中に作製し、ＡａｔＩＩで線状にし、ＰＢＰ２株へのエレクトロポレーションにより形質転換し、Ｋ３から放出されたグリカンを分析することによって、スクリーニングした。選択した１つの活性な構築物は、ヒトＧｎＴＩ遺伝子の欠失物（これは、最初の１５４ｂｐを欠いている）に融合したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＭＮＮ９遺伝子の最初の１２０ｂｐのキメラであった。この構築物を発現するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株を、ＰＢＰ３と名付けた。
【０１５２】
引き続いて、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ａｌｇ３：：ＫＡＮＲ欠失構築物を、上記のように作製した。得られたＰＣＲ産物の約５μｇを、ＰＢＰ３株に形質転換し、コロニーを、２００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を含むＹＰＤ培地上で選択した。ＰＣＲによってスクリーニングした２０株のうちの１株が、ａｌｇ３：：ＫＡＮＲ変異対立遺伝子の正確な組み込みを含み、野生型対立遺伝子を欠くことを確認した。この株を、ＲＤＰ２７と名付けた。
【０１５３】
最後に、ヒトおよびラット供給源由来のＧｎＴＩＩ遺伝子の触媒ドメインを有するリーダーライブラリーのインフレーム融合物から構成されるＧｎＴＩＩ構築物のライブラリーを作製した（ＷＯ０２／００８７９）。このライブラリーを、薬物ノールセオスリシン（ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）に対する耐性を付与するＮＳＴＲ遺伝子を含むＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ組み込みベクター中に作製した。このライブラリープラスミドを、ＥｃｏＲＩで線状にし、ＲＤＰ２７株にエレクトロポレーションにより形質転換し、得られた株を、精製Ｋ３から放出されたグリカンの分析によりスクリーニングした。
【０１５４】
（材料）
ＭＯＰＳ（カコジル酸ナトリウム）、塩化マンガン、ＵＤＰ−ガラクトースおよびＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸は、シグマ製であった。ＴＦＡは、Ａｌｄｒｉｃｈ製であった。Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来の組換えラットα２，６−シアリルトランスフェラーゼおよびウシ乳汁由来のβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ製であった。タンパク質Ｎ−グリコシダーゼＦ、マンノシダーゼ、およびオリゴ糖は、Ｇｌｙｋｏ（Ｓａｎ  Ｒａｆａｅｌ，ＣＡ）製であった。ＤＥＡＥ  ＴｏｙｏＰｅａｒｌ樹脂は、ＴｏｓｏＨａａｓ製であった。金属キレート「ＨｉｓＢｉｎｄ」樹脂は、Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）製であった。９６ウェル溶解液除去プレートは、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）製であった。タンパク質結合９６ウェルプレートは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）製であった。塩および緩衝剤は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）製であった。ＭＡＬＤＩマトリクスは、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）製であった。
【０１５５】
（タンパク質精製）
Ｋｒｉｎｇｌｅ３を、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＢｉｏＭｅｋ  ２０００サンプル処理ロボット（Ｂｅｃｋｍａｎ／Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｒａｎｃｈ  Ｃｕｃａｍｏｎｇａ，ＣＡ）で、９６ウェル形式を使用して精製した。Ｋｒｉｎｇｌｅ３を、Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグを使用して、発現培地から精製した。このロボット精製は、そのＨｉｓＢｉｎｄ樹脂についてＮｏｖａｇｅｎによって提供されたプロトコルの適応である。簡潔には、１５０ｕＬ（μＬ）の固定容積の樹脂を、９６ウェルの溶解物結合プレートのウェル中に注ぎ、３容積の水で洗浄し、そして５容積の５０ｍＭ  ＮｉＳＯ４を充填し、そして３容積の結合緩衝液（５ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．９））で洗浄する。タンパク質発現培地を、培地／ＰＢＳ（６０ｍＭ  ＰＯ４、１６ｍＭ  ＫＣ１、８２２ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４））で３：２希釈し、そしてカラムに充填した。吸引後、カラムを１０容積の結合緩衝液および６容積の洗浄緩衝液（３０ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９））で洗浄し、そしてタンパク質を、６容積の溶出緩衝液（１Ｍイミダゾール、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９））で溶出する。溶出された糖タンパク質を、凍結乾燥によって、乾燥するまでエバポレートする。
【０１５６】
（Ｎ連結グリカンの放出）
グリカンを、以前に報告された方法（Ｐａｐａｃら、Ａ．Ｊ．Ｓ．（１９９８）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ８，４４５−４５４）の改変によって、糖タンパク質から放出および分離する。９６ウェルのＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ  ＩＰ（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐメンブレン）プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）のウェルを、１００ｕＬのメタノールで湿らせ、３×１５０ｕＬの水および５０ｕＬのＲＣＭ緩衝液（８Ｍ尿素、３６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、３．２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．６））で洗浄し、各添加後に、穏やかな減圧で吸引する。乾燥したタンパク質サンプルを、３０ｕＬのＲＣＭ緩衝液中に溶解し、そして１０ｕＬのＲＣＭ緩衝液を含むウェルに移す。ウェルを吸引し、そしてＲＣＭ緩衝液で２回洗浄する。タンパク質を、６０ｕＬの、ＲＣＭ緩衝液中の０．１Ｍ  ＤＴＴを、３７℃で１時間に亘って添加して、還元した。ウェルを、３００ｕＬの水で３回洗浄し、そして６０ｕＬの０．１Ｍヨード酢酸を、暗中での室温にて３０分間で添加して、カルボキシメチル化する。ウェルを、水で再度３回洗浄し、そしてメンブレンを、１００ｕＬの水中１％ＰＶＰ  ３６０の、室温で１時間の添加によって、ブロッキングする。ウェルを吸引し、そして３００ｕＬの水で３回洗浄し、そして３０ｕＬの１０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ８．３）（１ミリ単位のＮ−グリカン（Ｇｌｙｋｏ）を含む）の添加によって、脱グリコシル化する。３７℃１６時間の後、グリカンを含む溶液を、遠心分離によって取り出し、そして乾燥するまで蒸発させる。
【０１５７】
（飛行質量分析の、マトリクス補助レーザー脱離イオン化時間）
グリカンの分子量を、遅延抽出を使用して、Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ  ＰＲＯ線形ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）質量分析機を用いて決定した。各ウェル由来の乾燥グリカンを、１５ｕＬの水中に溶解し、そして０．５ｕＬを、ステンレス鋼サンプルプレート上にスポットし、そして０．５ｕＬのＳ−ＤＨＢマトリクス（９ｍｇ／ｍＬのジヒドロキシ安息香酸、１ｍｇ／ｍＬの５−メトキシサリチル酸（１：１の水／アセトニトリル  ０．１％  ＴＦＡ中））と混合し、そして乾燥させた。
【０１５８】
パルス窒素レーザー（３３７ｎｍ）を、４ｎｓのパルス時間で照射することによって、イオンを発生させた。この機器を、１２５ｎｓの遅延を用いる遅延抽出モードおよび２０ｋＶの加速電圧で操作した。格子電圧は、９３．００％であり、ガイドワイヤ電圧は、０．１０％であり、内部圧力は、５×１０−７トル未満であり、そして低質量ゲートは、８７５Ｄａであった。スペクトルを、合計１００〜２００のレーザーパルスから発生させ、そして２ＧＨｚのディジタイザーを用いて獲得した。Ｍａｎ５オリゴ糖を、外部分子量標準として使用した。全てのスペクトルを、陽イオンモードでこの機器を用いて発生させた。このスペクトルの概算の質量精度は、０．５％であった。
【０１５９】
（材料）
ＭＯＰＳ、カコジル酸ナトリウム、塩化マグネシウム、ＵＤＰ−ガラクトースおよびＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸は、Ｓｉｇｍａ，Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ製であった。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）は、Ｓｉｇｍａ／Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ製であった。Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来の組換えラットα−２，６−シアリルトランスフェラーゼおよびウシ乳汁由来のβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ製であった。
【０１６０】
（β−Ｎ−アセチルヘキソサミニナーゼ設計）
グリカンを、以前に報告された方法（Ｐａｐａｃら、Ａ．Ｊ．Ｓ．（１９９８）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ８，４４５−４５４）の改変によって、糖タンパク質から放出および分離した。タンパク質を還元およびカルボキシメチル化し、そしてメンブレンをブロッキングした後、ウェルを、水で３回洗浄した。タンパク質を、３０μｌの１０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ８．３）（１ミリ単位のＮ−グリカン（Ｇｌｙｋｏ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）を含む）の添加によって、脱グリコシル化した。３７℃１６時間の後、グリカンを含む溶液を、遠心分離によって取り出し、そして乾燥するまでエバポレートした。次いで、グリカンを、ＳＣ２１０Ａスピード減圧（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓａｖａｎｔ，Ｈａｌｂｒｏｏｋ，ＮＹ）中で乾燥させた。乾燥したグリカンを、５０ｍＭ  ＮＨ４Ａｃ（ｐＨ５．０）中に３７℃で一晩置き、そして１ｍＵのヘキソース（ｈｅｘｏｓ）（Ｇｌｙｋｏ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）を添加した。
【０１６１】
（ガラクトシルトランスフェラーゼ反応）
約２ｍｇのタンパク質（ｒ−Ｋ３：ｈＰｇ［ＰＢＰ６−５］）を、ニッケル親和性クロマトグラフィーによって精製し、０．１％  ＴＦＡに対して広範に透析し、そして乾燥するまで凍結乾燥した。このタンパク質を、１５０μｌの５０ｍＭ  ＭＯＰＳ、２０ｍＭ  ＭｎＣ１２（ｐＨ７．４）中に再溶解した。３２．５μｇ（５３３ｎｍｏｌ）のＵＤＰ−ガラクトースおよび４ｍＵのβ  １，４−ガラクトシルトランスフェラーゼの添加後、サンプルを、３７℃で１８時間インキュベートした。次いで、これらのサンプルを、ＭＡＬＤＩＴＯＦ質量分析による分析のために、０．１％  ＴＦＡに対して透析した。
【０１６２】
ガラクトシルトランスフェラーゼと反応したタンパク質のスペクトルは、酵素なしでインキュベートした類似のタンパク質サンプルのスペクトルと比較して、２つのガラクトース部分の付加と一致する、質量の増加を示した。次に、タンパク質サンプルを還元し、カルボキシメチル化し、そしてＰＮＧａｓｅ  Ｆで脱グリコシル化した。回収したＮ−グリカンを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって分析した。タンパク質と反応したガラクトシルトランスフェラーゼ由来の優勢なグリカンの質量は、２つのガラクトース部分の付加と一致する質量分（３２５．４Ｄａ）だけ、コントロールグリカンの質量より多かった。
【０１６３】
（シアリルトランスフェラーゼ反応）
（ガラクトシルトランスフェラーゼ反応した）タンパク質を、１０μｌの５０ｍＭ  カコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中に再懸濁した後、１５μＬの同じ緩衝液中に溶解された３００μｇ（４８８ｎｍｏｌ）のＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮＡＮＡ）および５μｌ（２ｍＵ）の組換えα−２，６  シアリルトランスフェラーゼを添加した。３７℃で１５時間のインキュベート後、さらに２００μｇのＣＭＰ−ＮＡＮＡおよび１ｍＵのシアリルトランスフェラーゼを添加した。これらのタンパク質サンプルを、さらに８時間インキュベートし、次いで、透析し、上記のようにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって分析した。
【０１６４】
シアリルトランスフェラーゼと反応した糖タンパク質のスペクトルは、出発物質（ガラクトシルトランスフェラーゼ反応後のタンパク質）の質量と比較して、質量の増加を示した。Ｎ−グリカンを、上記のように放出および分析した。優勢なグリカンの２つのイオン付加物の質量の増加は、２つのシアル酸残基の付加と一致した（５８０Ｄａおよび５８３Ｄａ）。
【０１６５】
（実施例３）
（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＡＬＧ９遺伝子およびＡＬＧ１２遺伝子の同定、クローニングおよび欠失）
実施例１と同様に、ＡＬＧ９ｐ配列およびＡＬＧ１２配列（それぞれ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓなどに由来する）を整列し、そして高い相同性の領域を、縮重プライマーを設計するために使用する。これらのプライマーを、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ由来のゲノムＤＮＡに対するＰＣＲ反応において使用する。得られた最初のＰＣＲ産物をサブクローニングし、配列決定し、そして高いストリンジェンシーで、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ由来のゲノムＤＮＡのサザンブロットをプローブするために使用した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）。ハイブリダイゼーションを観察する。このサザンブロットを使用して、遺伝子座位のマッピングを行った。ゲノムフラグメントを、ゲノムＤＮＡを消化し、そして適切なサイズ範囲のフラグメントをｐＵＣｌ９に連結して、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓサブゲノムライブラリーを作製することによって、クローニングした。このサブゲノムライブラリーを、Ｅ．ｃｏｌｉ中に形質転換し、そして数百個のクローンを、最初のＰＣＲ産物の配列に基づいて設計されたプライマーを使用して、コロニーＰＣＲによって試験する。予測された遺伝子を含むクローンを配列決定し、そしてオープンリーディングフレームを同定する。ａｌｇ９：：ＮＡＩＲ欠失対立遺伝子の構築のためのプライマーを、ＰＣＲ重複法（Ｄａｖｉｄｓｏｎら、２００２）を使用して設計する。得られた欠失対立遺伝子を、２つのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株に形質転換し、そしてＮＡＴ耐性コロニーを選択する。これらのコロニーを、ＰＣＲによってスクリーニングし、そしてＡＬＧ９  ＯＲＦがｏｃｈｌ：：ＮＡＴＲ変異体対立遺伝子で置換された形質転換体を得る。一般に、以下を参照のこと：Ｃｉｐｏｌｌｏら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２００２（１２）１１：７４９−７６２；Ｃｈａｎｔｒｅｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｊｕｌ．１２，２００２（２７７）２８：２５８１５−２５８２２；Ｃｉｐｏｌｌｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｆｅｂ．１１，２０００（２７５）６：４２６７−４２７７；Ｂｕｒｄａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｊｕｌｙ  １９９６（９３）：７１６０−７１６５；Ｋａｒａｏｇｌｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙｙ  ２００１，４０，１２１９３−１２２０６；Ｇｒｉｍｍｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｊｕｌｙ  ２０，２００１（２７６）２９：２７７３１−２７７３９；Ｖｅｒｏｓｔｅｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｊｕｎｅ  ５，１９９３（２６８）１６：１２０９５−１２１０３；Ｈｕｆｆａｋｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｄｅｃ．１９８３（８０）：７４６６−７４７０。
【０１６６】
（実施例４）
（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  Ｍａｎｉｈｏｔｉｓ由来のα１，２−３マンノシダーゼの同定、クローニングおよび発現）
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  Ｍａｎｉｈｏｔｉｓ由来のα１，２−３マンノシダーゼは、２つの活性（α−１，２マンノシダーゼおよびα−１，３  マンノシダーゼ）を有する。本発明の方法はまた、これらの活性を有する２つの独立したマンノシダーゼを使用し得、これらは、選択された目的の生物から同様に同定およびクローニングされ得る。
【０１６７】
Ｌａｎｄｒｙら、によって記載されるように、α−マンノシダーゼは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．（例えば、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｎｉｈｏｔｉｓ）から精製され得る。Ｘ．ｍａｎｉｈｏｔｉｓは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣカタログ番号４９７６４）（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ  ＳｔａｒｒおよびＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｎｉｈｏｔｉｓ  （Ａｒｔｈａｕｄ−Ｂｅｒｔｈｅｔ）Ｓｔａｒｒとして寄託されたＧａｒｃｅｓ  ｐａｔｈｏｖａｒ  ｍａｎｉｈｏｔｉｓ）から購入され得る。酵素を、粗細胞抽出物から、以前に記載されたように精製する（Ｗｏｎｇ−Ｍａｄｄｅｎ，Ｓ．Ｔ．およびＬａｎｄｒｙ，Ｄ．（１９９５）Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｇｅｎｕｓ  Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ；およびＬａｎｄｒｙ，Ｄ．米国特許第６，３００，１１３  Ｂ１号、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  Ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅｓ）。マンノシダーゼの精製後、いくつかの方法のうちの１つを使用して、ペプチド配列タグを得る（例えば、Ｗ．Ｑｕａｄｒｏｎｉ  Ｍら、（２０００）．Ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇｓ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ（２０００）Ｍａｒ  １；７２（５）：１００６−１４；Ｗｉｌｋｉｎｓ  ＭＲら、Ｒａｐｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ”ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇ”ａｎｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９６）Ａｐｒ  ２５；２２１（３）：６０９−１３；およびＴｓｕｇｉｔａ  Ａ．（１９８７）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｉｃｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ａｄｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ（１９８７）２３：８１−１１３を参照のこと）。
【０１６８】
次いで、上記方法を使用して作製された配列タグを使用して、当業者に周知の方法を使用して、縮重プライマーのセットを作製する。縮重プライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（例えば、Ｔａｑポリメラーゼキットを、製造者の指示に従って使用する）においてＤＮＡ増幅をプライムして、ＤＮＡフラグメントを増幅する。増幅されたＤＮＡフラグメントをプローブとして使用して、例えば、目的の酵素をコードするゲノム片を同定および単離（クローニング）するための、標準的なサザンＤＮＡハイブリダイゼーション技術を使用して、所望のマンノシダーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ分子を単離する。ゲノムＤＮＡ分子を配列決定し、推定オープンリーディングフレームおよびコード配列を同定する。次いで、目的のグリコシダーゼをコードする適切な発現構築物を、本明細書中に記載される方法および当該分野で周知の方法を使用して、作製し得る。
【０１６９】
α１，２−３  マンノシダーゼ活性（またはその触媒的に活性なフラグメント）をコードする配列を含む核酸フラグメントを、本明細書中に示される方法に従って、適切な宿主細胞でのこれらの活性の発現（好ましくは、標的化された発現）のために、適切な発現ベクター中にクローニングする。
【０１７０】
（実施例５）
（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＡＬＧ６遺伝子の同定、クローニング、および発現）
実施例１と同様に、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓなどに由来するＡＬＧ６ｐ配列を整列し、、そして高い相同性の領域を変性プライマーを産生するために使用する。これらのプライマーは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ由来のゲノムＤＮＡにおけるＰＣＲ反応に用いられる。得られた初めのＰＣＲ産物をサブクローン化し、配列を決定して、そして高ストリンジェンシーを有するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ由来のゲノムＤＮＡのサザンブロットのプローブとして使用する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）。ハイブリダイゼーションが観察される。このサザンブロットを、ゲノム座位をマップするために使用する。ゲノムＤＮＡを消化し、そしてそれらのフラグメントを、適切なサイズ範囲で、ｐＵＣ１９中にライゲーションして、ゲノムフラグメントをクローン化することで、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓサブゲノムライブラリーを産生する。このサブゲノムライブラリーを、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換し、そして、初めのＰＣＲ産物の配列に基づいて設計されたプライマーを用いて、コロニーＰＣＲによって、数百クローンをテストする。予想した遺伝子を含むクローンの配列を決定し、そしてオープンリーディングフレームを同定する。ＰＣＲ重複法（Ｄａｖｉｄｓｏｎら、２００２）を用いて、ａｌｇ６：：ＮＡＴＲ欠失アレルの構築のためのプライマーを設計し、その結果得られた欠失対立遺伝子を２つのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株および選択されたＮＡＴ抵抗性コロニー中に形質転換した。これらのコロニーを、ＰＣＲによってスクリーニングし、ＡＬＧ６  ＯＲＦが，ｏｃｈ１：：ＮＡＴＲ変異対立遺伝子に置換される形質転換体を得る。例えば、Ｉｍｂａｃｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  Ｊｕｎｅ  １９９９（９６）６９８２−６９８を参照のこと。
【０１７１】
Ａｌｇ６ｐ（またはその触媒活性フラグメント）をコ−ドする配列を含む核酸フラグメントが、本明細書中に記載された方法で、適切な宿主細胞におけるこれらの活性の発現および、好ましくは標的発現のための適切な発現ベクター中にクローン化する。クローン化ＡＬＧ６遺伝子は、任意の適切なプロモーターの制御で得られ、過剰発現を達成し得る。その遺伝子自体の制御下にある遺伝子の発現さえも可能である。マルチコピープラスミドの発現は、高レベルの発現（「過剰発現」）を生じる。
【０１７２】
（実施例６）
（抗体機能性を高める切断ＧｌｃＮＡｃｓを産生するためのＧｎＴＩＩＩのクローニングおよび発現）
（Ａ．背景）
Ｎ−アセチルグルコサミルトランスフェラーゼＩＩＩによるＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造へのＮ−アセチルグルコサミンの付加によって、いわゆる断片化Ｎグリカンを生じる（図３を参照のこと）。この構造は、より大きな抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）に関係する（Ｕｍａｎａら、１９９９）。
【０１７３】
宿主細胞（例えば、断片化Ｎグリカンを用いて糖タンパク質を産生できる酵母株）は、宿主細胞中にＧｎＴＩＩＩ活性を導入することによって、本発明に従って操作される。好ましくは、宿主細胞は、異種の細胞シグナル標的ペプチドに（例えば、本発明のライブラリーおよび関連した方法を使用して作動可能に融合されたＧｎＴｌｌｌ活性（例えば、図３２に示したマウスＧｎＴＬＬＬのような哺乳動物）またはその酵素活性を有するドメインを用いて、形質転換される。
【０１７４】
ＩｇＧは、３つのジスルフィド架橋を介するヒンジ領域で相互結合した、２つの重鎖（図３０におけるＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）、および２つの軽鎖（図３０におけるＶＬ、ＣＬ）からなる。軽鎖（ドメインＶＬおよびドメインＣＬ）は、別のジスルフィド架橋によって、重鎖のＣＨ１部分に結合し、そしてＣＨ１フラグメントおよびＶＨフラグメントと一緒になって、いわゆるＦａｂ領域を形成する。抗原は、Ｆａｂ領域の末端部分に結合する。ＩｇＧのＦｃ領域は、ＣＨ３、ＣＨ２およびヒンジ領域からなり、いわゆるエフェクター機能の発揮に関連する（下記を参照のこと）。
【０１７５】
抗体の第１機能は抗原との反応である。しかし、抗原との直接の結合が、その抗原を不活化されない限り（例えば、細菌毒素の場合）、いわゆるエフェクター機能が増強されなければ、単なる結合は意味を成さない。ＩｇＧサブクラスの抗体は、以下の２つの主要なエフェクター効果を発揮する：相補性システムの活性化および貪食作用の導入。補体系は、貪食作用の活性化および細胞膜の溶解による破壊において、炎症の制御に関係する血清タンパク質の複雑な群からなる。補体活性化は、Ｃ１複合体の近接した２つのＩｇＧのＦｃ部分との結合で開始する。Ｃ１は、１つの分子（Ｃ１ｑ）および２つの分子（Ｃ１ｒおよびＣ１ｓ）からなる。貪食作用は、ＩｇＧのＦｃフラグメントとＦｃ−γ−レセプター（図３０におけるＦｃγＲＩ、ＩＩおよびＩＩＩ）との間における相互作用を介して起こる。Ｆｃレセプターは、第１に免疫システムのエフェクター細胞表面、特にマクロファージ、単核細胞、骨髄細胞および樹状細胞の表面に、主に発現する。
【０１７６】
ＣＨ２部分は、アスパラギン２９７（Ａｓｐ２９７）における保存されたＮグリコシレーション部位を有する。Ａｓｐ２９７  Ｎグリカンは、高度に異種性であり、Ｆｃレセプター結合および補体活性に影響することが知られている。ＩｇＧの少数のみ（すなわち、約１５％〜２０％）が、ジシアリル化を受け、そしてＩｇＧの３％〜１０％がモノシアリル化したＮグリカンを有する（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ，Ｒ．，Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ＢｉｏＯｈｒａ，２００１の総説を参照のこと）。興味深いことに、補体活性およびＦｃレセプター結合が可能な十分機能的な抗体にとって必要であることが示されたＮグリカン構造は、末端Ｎアセチルグルコサミン残基（ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３）を有する五単糖類である（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ，Ｒ．，Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．  ＢｉｏＰｈａｒｍ，２００１の総説を参照のこと）。ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３Ｎグリカン以下またはＡｓｐ２９７の位置にＮグリコシル化を有さない抗体は、抗原と結合することができず、重要な下流の作用（例えば、貪食作用および補体活性化）を活性化しない可能性がある。さらに、Ａｓｐ２９７に結合した真菌型のＮグリカンを有する抗体は、治療的糖タンパク質として無用に有する哺乳動物における免疫反応を、全ての尤度において誘導する。
【０１７７】
（Ｂ．ＧｎＴＩＩＩのクローニングおよび発現）
ＴＭドメインを欠くマウスＧｎＴＩＩＩタンパク質の一部をコードするＤＮＡフラグメントは、以下のプライマーを用いて、マウス（あるいは他の哺乳動物）のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅される：順方向  ５’−ＴＣＣＴＧＧＣＧＣＧＣＣＴＴＣＣＣＧＡＧＡＧＡＡＣＴＧＧＣＣＴＣＣＣＴＣ−３’および５’−ＡＡＴＴＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＡＧＣＣＣＴＣＣＧＣＴＧＴＡＴＣＣＡＡＣＴＴＧ−３’逆方向プライマー。それらのプライマーは、リーダーライブラリーとの融合に適したベクターへのクローニングに使用されるＡｓｃＩおよびＰａｃＩ制限部位を含む。マウスＧｎＴＩＩＩの核酸配列およびアミノ酸配列を。図３２に示す。
【０１７８】
（Ｃ．免疫グロブリンコード配列のクローニング）
抗体の可変領域（プライマー配列を含む）のクローニングのためのプロトコルは、以前公開されている。抗体およびコ−ド遺伝子の供給源は、とりわけ、インビトロ免疫化ヒトＢ細胞（例えば、Ｂｏｒｒｅｂａｃｋ，Ｃ．Ａ．ら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５，３９９５−３９９９、末梢血リンパ球細胞または単一ヒトＢ細胞（例えば、Ｌａｇｅｒｋｖｉｓｔ，Ａ．Ｃら（１９９５）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １８，８６２−８６９；およびＴｅｒｎｅｓｓ，Ｐ．ら（１９９７）  Ｈｕｍ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．５６，１７−２７を参照のこと）またはハイブリドーマ細胞株の産生を可能にする、ヒト免疫グロブリン部位を含むトランスジェニックマウスであり得る。
【０１７９】
標準的な組み換えＤＮＡ技術を用いて、抗体をコードする核酸配列がクローン化され得る。目的の免疫グロブリンをコードする遺伝情報の供給源は、代表的に、目的の細胞（例えば、血液リンパ球細胞またはハイブリドーマ細胞株）由来の総ＲＮＡ調製物である。例えば、特異的プライマーを用いたプロトコルに基づいたＰＣＲを用いて、可変領域は、ＩｇＧＣＨ１ドメインとハイブリダイズする配列特異的プライマー、およびマウスκ定常領域のアミノ酸１１１〜１１８をコードする第２プライマーから開始される逆転写を解してクローン化され得る。さらに、ＤＮＡをコードするＶＨおよびＶｋは、以前公開された方法で増幅される（例えば、Ｇｒａｚｉａｎｏ，Ｒ．Ｆら、（１９９５）  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５５（１０）：ｐ．４９９６−５００２；Ｗｅｌｓｃｈｏｆ，Ｍら（１９９５）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １７９，２０３−２１４；および  Ｏｒｌａｎｄｉ，Ｒら（１９８８  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：３８３３）を参照のこと）。全免疫グロブリンのクローニング手順（重鎖および軽鎖）もまた公開されている（例えば、Ｂｕｃｋｅｌ，Ｐ．ら（１９８７）  Ｇｅｎｅ  ５１：１３−１９；Ｒｅｃｉｎｏｓ  Ａ３ｒｄら（１９９４）  Ｇｅｎｅ  １４９：３８５−３８６；（１９９５）  ＧｅｎｅＪｕｎ  ９；１５８（２）：３１１−２；および  Ｒｅｃｉｎｏｓ  Ａ３ｒｄら（１９９４）  Ｇｅｎｅ  Ｎｏｖ  １８；１４９（２）３８５−６を参照のこと）。抗体フラグメントおよび抗体発現構築物のクローニングおよび産生のさらなるプロトコルは、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｒ．ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＳ．  Ｄｕｂｅｌ（２００１），Ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ：Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。
【０１８０】
免疫グロブリンの重鎖および軽鎖をコードする真菌発現プラスミドは、記載されている（例えば、Ａｂｄｅｌ−Ｓａｌａｍ，Ｈ．Ａ．ら（２００１）Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ５６：１５７−１６４；および  Ｏｇｕｎｉｊｉｍｉ，Ａ．Ａら（１９９９）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２１：５６１−５６７を参照のこと）。従って、免疫グロブリンの定常領域を有する発現プラスミドを産生し得る。
これらの発現ベクター中への可変領域のクローニングを促進するために、適切な制限部位が可変領域の末端に非常に近い位置に配置され得る。定常領域は、単一制限酵素消化／ライゲーション実験によって定常領域にインフレームで融合するような様式で、可変領域を構築され得る。図３１は、そのような発現構築の体系的概要を示す。その発現構築は、プロモーター、転写ターミネーター、組込み標的ドメイン、および選択マーカーさえも容易に変更できるように、非常に修正可能な方法で設計された。
【０１８１】
図３１に示すように、選択したＶＬドメインおよびＶＨドメインは、それぞれ、ＣＬ領域およびＣＨ領域に、インフレームで容易にクローン化され得る。第１の組込みは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＡＯＸ部位（または別の真菌細胞の相同部位）に標的化され、そしてメタノール誘導性ＡＯＸプロモーターは発現を誘導する。あるいは、任意の他の所望の構成的または誘導的プロモーターカセットが使用され得る。このように、所望の場合、５’ＡＯＸ領域および３’ＡＯＸ領域、ならびに転写ターミネーター（ＴＴ）フラグメントが、異なったＴＴ、プロモーターおよび組込み標的ドメインで容易に置換され、発現を最適化し得る。第１に、標準ＫＥＸプロテアーゼ部位を有するα因子分泌シグナルは、重鎖および軽鎖の分泌を促進するために使用される。さらに、発現ベクターの特性は、標準技術を用いてさらに精製され得る。
【０１８２】
Ｉｇ発現ベクター（例えば、上述のベクター）は、好ましくは宿主細胞のゴルジ装置内にＧｎＴＩＩＩを発現する本発明の宿主細胞中に導入される。そのような宿主細胞において発現されるＩｇ分子は、分断ＧｌｃＮａｃｓを有するＮグリカンを含む。
【０１８３】
（実施例７）
ＧｎＴ−ＩＶ（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ：α−１，３−Ｄ−マンノシドβ−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＶ）およびＧｎＴ−Ｖ（β−１−６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼのクローニングおよび発現）
ＧｎＴＩＶをコードするｃＤＮＡを、ウシおよびヒト細胞から単離した（Ｍｉｎｏｗａ、Ｍ．Ｔ．ら（１９９８）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（１９），１１５５６−１１５６２；）およびＹｏｓｈｉｄａ，Ａ．ら（１９９９）  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ９（３），３０３−３１０）。ＴＭドメインを欠くヒトＧｎＴ−ＩＶタンパク質（図３３）の全長および一部をコードするＤＮＡフラグメントを、各々以下のプライマーを用いて、ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ増幅した：順方向  ５’−ＡＡＴＧＡＧＡＴＧＡＧＧＣＴＣＣＧＣＡＡＴＧＧＡＡＣＴＧ−３’，
５’−ＣＴＧＡＴＴＧＣＴＴＡＴＣＡＡＣＧＡＧＡＡＴＴＣＣＴＴＧ−３’，および逆方向５’−ＴＧＴＴＧＧＴＴＴＣＴＣＡＧＡＴＧＡＴＣＡＧＴＴＧＧＴＧ−３’プライマー。
その結果生じるＰＣＲ産物をクローン化し、配列を決定した。
【０１８４】
同様に、ＧｎＴ−Ｖたんぱく質をコードする遺伝子は、いくつかの哺乳動物（マウスを含む）から単離された（例えば、Ａｌｖｅｒｅｚ，Ｋら  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １２（７），３８９−３９４（２００２）を参照のこと）。ＴＭドメインを欠くマウスＧｎＴ−Ｖたんぱく質（図３４）の全長および一部をコードするＤＮＡフラグメントを、各々以下のプライマーを用いて、ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ増幅した：順方向５’−ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＴＧＧＣＴＴＴＣＴＴＴＴＣＴＣＣＣＴＧＧ−３’，５’−ＡＡＡＴＣＡＡＧＴＧＧＡＴＧＡＡＧＧＡＣＡＴＧＴＧＧＣ−３’、および逆方向
５’−ＡＧＣＧＡＴＧＣＴＡＴＡＧＧＣＡＧＴＣＴＴＴＧＣＡＧＡＧ−３プライマー。’
その結果生じるＰＣＲ産物をクローン化し、配列を決定した。
【０１８５】
ＧｎＴ  ＩＶまたはＶ（またはその触媒活性フラグメント）をコードする配列を含む核酸フラグメントは、本明細書中に記載された方法で、適切な宿主細胞におけるこれらの活性の発現および、好ましくは標的発現のための適切な発現ベクター中にクローン化する。
【０１８６】
【化５】
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。
【図面の簡単な説明】
【０１８７】
【図１】図１は、ドリチルピロホスフェート結合オリゴ糖の構造の概略図を示す。
【図２】図２は、ａｌｇ３活性、ａｌｇ９活性またはａｌｇ１２活性を欠く真菌宿主細胞由来のＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンの生成の概略図を示す。
【図３】図３は、ａｌｇ３、ｏｃｈ１遺伝子型を有する真菌宿主細胞中の哺乳動物型のオリゴ糖を生成するために要求されるプロセッシング反応の概略図を示す。
【図４−１】図４は、Ｓ．ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ａｌｇ３配列比較（Ｂｌａｓｔ）を示す。
【図４−２】図４は、Ｓ．ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ａｌｇ３配列比較（Ｂｌａｓｔ）を示す。
【図４−３】図４は、Ｓ．ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ａｌｇ３配列比較（Ｂｌａｓｔ）を示す。
【図４−４】図４は、Ｓ．ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ａｌｇ３配列比較（Ｂｌａｓｔ）を示す。
【図５】図５は、Ｓ．ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ａｌｇ３およびＡｌｇ３ｐ配列を示す。
【図６】図６は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  Ａｌｇ３およびＡｌｇ３ｐ配列を示す。
【図７−１】図７は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  Ａｌｇ３配列比較（Ｂｌａｓｔ）を示す。
【図７−２】図７は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  Ａｌｇ３配列比較（Ｂｌａｓｔ）を示す。
【図７−３】図７は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  Ａｌｇ３配列比較（Ｂｌａｓｔ）を示す。
【図８】図８は、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  Ａｌｇ３およびＡｌｇ３ｐ配列を示す。
【図９】図９は、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  Ａｌｇ３配列比較（Ｂｌａｓｔ）を示す。
【図１０】図１０は、Ｓ．ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ａｌｇ９およびＡｌｇ９ｐ配列比較（Ｂｌａｓｔ）を示す。
【図１１】図１１は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  Ａｌｇ９およびＡｌｇ９ｐ配列を示す。
【図１２−１】図１２は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  Ａｌｇ９配列比較（Ｂｌａｓｔ）を示す。
【図１２−２】図１２は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  Ａｌｇ９配列比較（Ｂｌａｓｔ）を示す。
【図１３】図１３は、Ｓ．ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ａｌｇ１２およびＡｌｇ１２ｐ配列比較（Ｂｌａｓｔ）を示す。
【図１４】図１４は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  Ａｌｇ１２およびＡｌｇ１２ｐ配列を示す。
【図１５−１】図１５は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  Ａｌｇ１２配列比較（Ｂｌａｓｔ）を示す。
【図１５−２】図１５は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  Ａｌｇ１２配列比較（Ｂｌａｓｔ）を示す。
【図１６】図１６は、優位なＮ−グリカンが、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２であることを示すＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ中に生成されるｋｒｉｎｇｌｅ３糖タンパク質から精製されるＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析である。
【図１７】図１７は、図１６の優位なＮ−グリカンが、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２であること確認するために、β−Ｎ−ヘキサミニダーゼ（Ｍａｎ５ＣｌｃＮＡｃ２に一致するピーク）を用いて処理されるＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（図１６）中に生成されるｋｒｉｎｇｌｅ３糖タンパク質から単離されるＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析である。
【図１８】図１８は、優位なＮ−グリカンが、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＧｌｃＮＡｃＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２であること示すＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ａｌｇ３欠損変異体中に生成されるｋｒｉｎｇｌｅ３糖タンパク質から単離されるＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析である。
【図１９】図１９は、図１８の優位なＧｌｃＮＡｃＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２が、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に変換されることを示す、α１，２マンノシダーゼを用いて処理されるＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ａｌｇ３欠損変異体中に生成されるｋｒｉｎｇｌｅ３糖タンパク質から単離されるＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析である。
【図２０】図２０は、図１９のＮ−グリカンが、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２であること確認するために、β−Ｎ−ヘキサミニダーゼ（Ｍａｎ３ＣｌｃＮＡｃ２に一致するピーク）を用いて処理される図１９のＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析である。
【図２１】図２１は、図１９のＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２が、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に変換されることを示す、α１，２マンノシダーゼおよびＧｎＴＩＩを用いて処理されるＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ａｌｇ３欠損変異体中に生成されるｋｒｉｎｇｌｅ３糖タンパク質から単離されるＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析である。
【図２２】図２２は、図２１のＮ−グリカンが、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２であること確認するために、β−Ｎ−ヘキサミニダーゼ（Ｍａｎ３ＣｌｃＮＡｃ２に一致するピーク）を用いて処理される図２１のＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析である。
【図２３】図２３は、図２１のＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２が、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に変換されることを示す、α１，２マンノシダーゼおよびＧｎＴＩＩを用いて、ＵＤＰ−ガラクトースおよびβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼの存在下で処理されるＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ａｌｇ３欠損変異体中に生成されるｋｒｉｎｇｌｅ３糖タンパク質から単離されるＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析である。
【図２４】図２４は、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２が、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に変換されることを示す、α１，２マンノシダーゼおよびＧｎＴＩＩを用いて、ＵＤＰ−ガラクトースおよびβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼの存在下で処理され、さらにＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸およびシアリルトランスフェラーゼを用いて処理される、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ａｌｇ３欠損変異体中に生成されるｋｒｉｎｇｌｅ３糖タンパク質から単離されるＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析である。
【図２５】図２５は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡｌｇ６配列およびＡｌｇ  ６ｐ配列を示す。
【図２６】図２６は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＡｌｇ６配列およびＡｌｇ  ６ｐ配列を示す。
【図２７−１】図２７は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  Ａｌｇ  ６配列の比較（Ｂｌａｓｔ）を示す。
【図２７−２】図２７は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  Ａｌｇ  ６配列の比較（Ｂｌａｓｔ）を示す。
【図２７−３】図２７は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  Ａｌｇ  ６配列の比較（Ｂｌａｓｔ）を示す。
【図２７−４】図２７は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  Ａｌｇ  ６配列の比較（Ｂｌａｓｔ）を示す。
【図２８】図２８は、Ｋ．ｌａｃｔｉｓのＡｌｇ６配列およびＡｌｇ  ６ｐ配列を示す。
【図２９−１】図２９は、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  Ａｌｇ  ６配列の比較（Ｂｌａｓｔ）を示す。
【図２９−２】図２９は、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  Ａｌｇ  ６配列の比較（Ｂｌａｓｔ）を示す。
【図３０】図３０  ＩｇＧ免疫グロブリンのモデル。重鎖および軽鎖は、類似の二次構造および三次構造に基づいて、ドメインに細分される。２つの重鎖（ドメインＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）は、３つのジスルフィド架橋により連結される。軽鎖（ドメインＶＬおよびＣＬ）は、別のジスルフィド架橋により重鎖のＣＨ１部分に連結され、そしてＣＨ１フラグメントおよびＶＨフラグメントと共に、Ｆａｂ領域を構成する。抗原は、Ｆａｂ領域の末端部分に結合する。エフェクター機能（例えば、Ｆｃ−γ−レセプター結合）は、ヒンジ領域の直ぐ下流のＣＨ２ドメインに局在化し、そして重鎖におけるアスパラギン２９７のＮ−グリコシル化により影響を受ける。
【図３１】図３１は、モジュラーＩｇＧ１発現ベクターの模式図である。
【図３２】図３２は、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｉｓ  ＧｎＴ  ＩＩＩの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。
【図３３】図３３は、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  ＧｎＴ  ＩＶの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。
【図３４】図３４は、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｉｓ  ＧｎＴ  Ｖの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。
【図１】
2005514021.tif 000012
【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
2005514021.tif 000037
【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２７−３】
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【図２７−４】
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【図２８】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３４】
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【国際調査報告】
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