(57)【要約】  本発明は、必須細胞分子に相当する、病原体特異的および金属結合構造／ドメインのモデルを用いて、新規病原体阻害剤を検出する方法に関する。該方法は、細胞成長、増殖および分化に必須の特定のＲＮＡ分子またはタンパク質いずれかに結合する阻害剤の同定を可能にする。本発明はまた、該方法で使用するためのキットにも関する。さらに、本発明は、新規薬剤開発におけるアミノグリコシドの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
新規病原体阻害剤の検出法であって：
ａ）必須の細胞巨大分子の、少なくとも１つの機能的に重要な病原体特有および金属結合領域／ドメインを含んでなるモデル分子を提供し；そして
ｂ）前記モデル分子と相互作用／結合する化合物に関してスクリーニングする
工程によって特徴付けられる、前記方法。
【請求項２】
工程ａ）で提供するモデル分子がＲＮＡである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＲＮＡが機能的に重要なＲＮＡ領域／ドメインに相当する小さいモデルＲＮＡ分子である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
工程ａ）のモデル分子がタンパク質／金属酵素である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
請求項１または４記載の方法であって
ｃ）ヒト金属依存性（ハウスキーピング）酵素の阻害に関して前記化合物を試験して、そして前記酵素を阻害しない化合物を選択する
ことをさらに含んでなる、前記方法。
【請求項６】
工程ａ）で提供するモデル分子が固体支持体に連結されている、上述の請求項いずれかに記載の方法。
【請求項７】
工程ｂ）がｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＲＮＡまたはタンパク質切断の検出によるものであり、阻害化合物の相互作用／結合がＲＮＡ／タンパク質切断を防止する、上述の請求項いずれかに記載の方法。
【請求項８】
ＲＮＡ／タンパク質切断がＰｂ2+によって誘導される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
工程ｂ）が化合物の相互作用／結合による分光シフトの検出による、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれかに記載の方法であって、工程ｂ）がｉｎ  ｖｉｖｏでの細菌増殖の検出によるものであり、推測される阻害剤の存在下で以下の細菌：
ｉ）いかなるモデルＲＮＡ／タンパク質もコードしないプラスミドで形質転換した細菌または未形質転換細菌
ｉｉ）工程ａ）記載のモデルＲＮＡ分子をコードする遺伝子および自己切断ＲＮＡ構造領域を含んでなるベクターで形質転換した細菌；
を培養し、工程ｉ）の増殖が阻害され、そして工程ｉｉ）の細胞が増殖することが、阻害剤の存在の指標となる、前記方法。
【請求項１１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで同定した阻害剤を、請求項１０に定義するようなｉｎ  ｖｉｖｏ条件下で試験する、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜３、６〜１１のいずれかに記載の方法であって
ｄ）対応する全長病原性ＲＮＡ分子の阻害に関して、該ＲＮＡ分子単独で、そして対応するタンパク質の存在下での両方で、前記化合物を試験して、そして阻害特性を持つ化合物を選択する
ことをさらに含んでなる、前記方法。
【請求項１３】
ｅ）阻害剤の存在下で、対応する病原体を培養する
ことをさらに含んでなる、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
新規病原体阻害剤を検出するキットであって
ａ）金属結合および病原体特有モデルＲＮＡまたはタンパク質分子；および場合によって
ｂ）１以上のヒト金属依存性酵素
に特徴付けられる、前記キット。
【請求項１５】
ｃ）Ｐｂ2+
もまた含んでなる、請求項１４記載のキット。
【請求項１６】
合成的に産生した分子としてモデル分子を提供する、請求項１４または１５記載のキット。
【請求項１７】
モデル分子が、必須の細胞ＲＮＡ分子の機能的に重要なドメインをコードする配列を宿する前記モデル分子をコードする遺伝子を所持するベクター中に提供され、該ドメインが、モデル分子の組換え産生のための自律（ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ）二価金属イオン結合部位である、請求項１４または１５記載のキット。
【請求項１８】
モデルＲＮＡ遺伝子配列が、細菌起源のＲＮアーゼＰ  ＲＮＡのＰ１５、Ｐ１５／Ｐ１６ループ、Ｐ１６またはＰ１７をコードする、請求項１７記載のキット。
【請求項１９】
細菌起源がヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来である、請求項１８記載のキット。
【請求項２０】
モデルＲＮＡ遺伝子配列が、細菌起源のＲＮアーゼＰ  ＲＮＡのＰ７、Ｐ８、Ｐ９、Ｐ１０およびＰ１１をコードする、請求項１４〜１７のいずれかに記載のキット。
【請求項２１】
自己切断ＲＮＡ構造をさらに含んでなる、請求項１４〜２０のいずれかに記載のキット。
【請求項２２】
薬剤開発用の出発化合物としてのアミノグリコシドの使用。
【請求項２３】
体系的スクリーニング法において、金属結合タンパク質を同定するための、請求項２２記載の使用。
【請求項２４】
病原性金属酵素の阻害用の薬剤産生のためのアミノグリコシドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、分子生物学の分野内にある。より厳密には、本発明は、必須の細胞ＲＮＡ分子に相当する、病原体特異的および金属結合ＲＮＡ構造／ドメインのモデルを用いて、新規病原体阻害剤を検出する方法およびキットに関する。該方法は、細胞成長、増殖および分化に必須の特定のＲＮＡ分子またはタンパク質いずれかに結合する阻害剤の同定を可能にする。さらに、本発明は、薬剤開発用の出発化合物としてのアミノグリコシドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ＲＮＡ分子は細胞の必須構成要素であり、そしてその一次構造はフォールディングを決定付ける。続いて、ＲＮＡの機能が構造に決定付けられる。ＲＮＡ分子の全体の構造は、ともにＲＮＡ構造を構築する、小さい構造領域／ドメインからなる。その結果、ＫｕｆｅｌおよびＫｉｒｓｅｂｏｍ、１９９８に例示されるように、小さい安定なＲＮＡ構造領域／ドメインを同定し、そしてコンホメーションを保持したまま、別個に産生することが可能である。
【０００３】
ＲＮアーゼＰは、すべての生存細胞に存在するリボ核タンパク質複合体である（ＡｌｔｍａｎおよびＫｉｒｓｅｂｏｍ、１９９９）。該酵素は、ｔＲＮＡ前駆体および類似の分子からの５’リーダー配列の除去を触媒する。細菌において、ＲＮアーゼＰは１つのＲＮＡサブユニットおよび小さい基本的タンパク質からなり、そして触媒活性は、そのＲＮＡサブユニットに関連することが示されている。細菌由来のＲＮＡは、タンパク質の非存在下、単独で、いくつかの基質をｉｎ  ｖｉｔｒｏで正しく、そして効率的に切断可能である（Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａら、１９８３）。ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡに触媒される反応は、該ＲＮＡ単独の場合も、それとともにＲＮアーゼＰタンパク質が存在する場合も、Ｍｇ２＋のような二価金属イオンを必要とする。切断が三角両錐遷移状態（ｔｒｉｇｏｎａｌ  ｂｉｐｙｒａｍｉｄａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｓｔａｔｅ）（ＳＮ２）を通じて進行し、ここで２つのＭｇ２＋イオンが切断化学反応に関与すると提唱されてきており（Ｗａｒｎｅｃｋｅら、１９９６）、２金属イオンの切断機構と定義されている。さらに、Ｍｇ２＋イオンはＲＮアーゼＰ  ＲＮＡの正しいフォールディング、並びにＲＮアーゼＰおよびその基質間の相互作用に重要である（ＡｌｔｍａｎおよびＫｉｒｓｅｂｏｍ、１９９９）。
【０００４】
２金属イオンの切断機構は、ホスホジエステル結合の切断および形成における触媒反応の一般的な機構とみなされる。ＲＮＡが仲介するホスホジエステル結合の切断を触媒する際に重要であるのに加えて、該機構が同じ目的でタンパク質酵素によっても用いられていることが周知である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩの重合活性およびヌクレオチド鎖分解（ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）活性が、２金属イオンが仲介する触媒反応のパラダイムである（ＳｔｅｉｔｚおよびＳｔｅｉｔｚ、１９９３）。他のタンパク質酵素活性が２金属イオンの触媒反応機構を通じて進行する：多様な原核生物および真核生物ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、デオキシリボおよびリボヌクレアーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ等。
【０００５】
いくつかのアミノグリコシドがＲＮＡと相互作用し、その機能に干渉することが知られる。例えば、ネオマイシンＢはリボソームＲＮＡに結合することによってタンパク質生合成に干渉し、ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡを含む、ＲＮＡに基づくいくつかの生体触媒（既知のリボザイム）の活性を阻害する（Ｗａｌｔｅｒら、１９９９；Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎら、１９９９）。ネオマイシンに引き起こされる阻害効果は、必須の二価金属イオンの置換のためであると示唆されている（ＨｅｒｒｍａｎおよびＷｅｓｔｈｏｆ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ｖｏｌ．２７６，  ９０３−９１２，  １９９８）。二価金属置換の直接証拠が得られている（Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎら、２００１）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
発明の概要
本発明の発明者らは、現在、アミノグリコシドがまた、触媒活性に関して金属イオンに依存している酵素の強力な阻害剤でもあることを見出している。本発明の発明者らは、モデル酵素として大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）クレノウポリメラーゼ（ｐｏｌ）および哺乳動物ポリ（Ａ）特異的リボヌクレアーゼ（ＰＡＲＮ）を用いた。いくつかのアミノグリコシドの阻害能力を試験し、そしてネオマイシンＢが強力な阻害剤であることを見出した（表１）。ネオマイシンＢ阻害はｐＨ依存性であり、相互作用の性質が静電性であることが示唆される。酵素動力学解析によって、ネオマイシンＢが混合非競合性阻害剤として振る舞うことが示される。鉄が仲介するヒドロキシルラジカル（ｒａｄｉｃａｌ）切断を用いて、両酵素の機能的に重要な金属イオンの位置を決定し、そしてネオマイシンＢがクレノウｐｏｌおよびＰＡＲＮの活性部位で、鉄が仲介する切断に干渉することを立証した。本発明の発明者らは、アミノグリコシドが酵素の活性部位に結合し、そしてそれによってアミノグリコシドによるＲＮＡ活性の阻害と同様に、触媒的に重要な二価金属イオンを置換するという阻害機構を見出した。したがって、本発明の発明者らは、アミノグリコシドが、触媒活性に関して金属イオンに依存する酵素の強力な阻害剤であり、そしてこうしたものとして、これらを用いて、酵素上の金属イオン結合部位を探査（ｐｒｏｂｅ）可能であることを見出した。
【０００７】
表１．ＰＡＲＮおよびクレノウｐｏｌに対するアミノグリコシドの阻害効果
【０００８】
【表１】
2005509443.tif 000002
【０００９】
我々は、先に、アミノグリコシドがＲＮＡ分子の金属イオン結合部位に結合し、そして機能的／構造的に重要な二価金属イオンを置換することによってＲＮＡの機能に干渉するため、アミノグリコシドを「金属模倣体（ｍｉｍｉｃｓ）」（Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎら、２００１）とみなしうると示唆した。本発明の発明者らは、現在、アミノグリコシドがまた、タンパク質酵素の金属イオン結合部位にも干渉することを立証し、アミノグリコシドの「金属模倣体」特性がアミノグリコシドおよびＲＮＡ間の相互作用に限定されないことを示している。したがって、「金属模倣体」としてのアミノグリコシドを機能プローブとして用いて、リボザイムおよび金属酵素両方の触媒活性を混乱させることが可能であり、そしてアミノグリコシドを機能／構造プローブとして用いて、こうした触媒活性の活性部位をマッピングし、そして性質決定することが可能である。「金属模倣体」としてのアミノグリコシドが、新規薬剤（例えば抗生物質）開発用の出発化合物として役立つ可能性があり、そしてＭａｃＢｅａｔｈおよびＳｃｈｒｅｉｂｅｒによって最近開発されたタンパク質マイクロアレイ技術（ＭａｃＢｅａｔｈおよびＳｃｈｒｅｉｂｅｒ  ２０００）を用いた体系的スクリーニング法において、アミノグリコシドまたはその誘導体をリガンドとして用いて、金属結合タンパク質を同定することが可能であると予期される。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ウイルスを含む微生物に対して向けられる、新規抗生物質／リード化合物の同定法に関する。該方法は、標的分子／微生物に高い特異性を持ち、そして毒性が低い、すなわち治療する患者／宿主に対する副作用が少ない、新規抗生物質／リード化合物を選択するのに特に適している。本発明の戦略／方法は、選択した微生物の成長、増殖および／または分化に必須のＲＮＡまたはタンパク質分子に、新規抗生物質／リード化合物を標的化することに依存する。選択したＲＮＡまたはタンパク質分子は、金属結合しなければならず、そして真核生物の対応物と比較して別個の構造的相異を示さなければならないか、または治療する宿主には存在してはならない。
【００１１】
本発明は、特異的標的（ＲＮＡおよび／またはタンパク質）と相互作用し、そして望ましくない副作用を制限する新規抗生物質を選択する、改善法を提供する。さらに、本発明には、選択した化合物の毒性副作用を同定する、差別的スクリーニング法であって、活性に関して金属イオンに依存する特定のタンパク質酵素を用いるものが含まれる。したがって、主な利点は、この戦略／方法が、動物実験モデル系の使用を最小限にすることである。
【００１２】
本発明の戦略／方法は、原則として、二価金属イオンを置換することによって阻害活性を与える化合物いずれかを同定するのに、例えば新規金属模倣体を同定するのに使用可能である。したがって、本発明はまた、活性に関して二価金属イオンに依存するタンパク質酵素を阻害し、そして毒性副作用が減少している阻害剤を選択し、そしてスクリーニングするのにも使用可能である。例は、病原性／腫瘍ウイルスおよび病原性微生物にコードされる必須酵素の阻害であることが可能である。本発明にしたがって、用語、病原体には、動物病原体、植物病原体およびヒト病原体が含まれると意図される。病原体は、原核生物または真核生物、あるいはそれらのウイルスであることが可能である。
【００１３】
典型的な戦略
１．例えば細菌ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡに特有のＲＮアーゼＰ  ＲＮＡの特定の領域／ドメインを選択する。これらの領域／ドメインを小さいモデルＲＮＡ分子として産生し、そしてこれらの領域／ドメインに特異的に結合する化合物を選択するのに用いる。
【００１４】
２．ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡを単独で用いて、そしてＲＮアーゼＰタンパク質（細菌において、Ｃ５タンパク質と称される）の存在下でＲＮアーゼＰ  ＲＮＡを用いて、選択した化合物を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの阻害活性に関して試験する。真核ＲＮアーゼＰ活性に影響を及ぼさない阻害性化合物を選択する。
【００１５】
３．活性に関して金属イオンに依存する、多様なタンパク質酵素活性の阻害に関して、選択した化合物を試験する。
４．続いて、細菌ＲＮアーゼＰ活性を特異的に阻害する基準を満たす化合物を、細菌に感染した細胞培養において試験するであろう。基準は、細菌増殖が、特異的に阻害されることであろう。
【００１６】
５．場合によって、動物モデルにおいて工程４を反復する。
第一の側面において、本発明は、新規病原体阻害剤の検出法であって：
ａ）必須の細胞巨大分子の、少なくとも１つの機能的に重要な病原体特有および金属結合領域／ドメインを含んでなるモデル分子（ＲＮＡまたはタンパク質であることが可能であり、そして化学的にまたは組換え的に産生可能であり、そしてまた化学的または酵素的に修飾し、そして突然変異させた変異体も含んでなる）を提供し、ここで病原体特有はいかなる供給源でもよい病原体微生物およびウイルス由来であることを意味し；そして
ｂ）前記モデル分子と相互作用／結合する化合物に関してスクリーニングする
工程によって特徴付けられる、前記方法に関する。結合は、分光光度的に、表面プラズモン共鳴によって、ゲル電気泳動によって、またはクロマトグラフィー法によって（タンパク質の場合）検出可能である。
【００１７】
場合によって、該方法は、
ｃ）ヒト金属依存性（ハウスキーピング）酵素の阻害に関して前記化合物を試験して、そして前記酵素を阻害しない化合物を選択する
ことを含んでなる。この工程は、治療する患者において、病原体阻害剤の副作用を減少させるのに非常に有益である。
【００１８】
該方法において、場合によるさらなる工程は：
ｄ）対応する全長病原性ＲＮＡ分子の阻害に関して、該ＲＮＡ分子単独で、そして対応するタンパク質の存在下での両方で、前記化合物を試験して、そして阻害特性を持つ化合物を選択すること、ここで強い、または弱い阻害特性が望ましい可能性がある；および
ｅ）阻害剤の存在下で、対応する病原体を培養すること、ここで細菌増殖が実質的に阻害されるものとする
である。
【００１９】
工程ａ）で提供するモデル分子はＲＮＡまたはタンパク質である。
好ましい態様において、工程ａ）で提供するモデル分子は、ストリップまたはビーズなどの固体支持体に連結されており、例えばストレプトアビジンビーズに結合したビオチン化ＲＮＡである。
【００２０】
工程ｂ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＲＮＡまたはタンパク質切断の検出によることが可能であり、ここで、阻害性化合物の相互作用／結合が、ＲＮＡ／タンパク質切断を防止する。
【００２１】
あり得る切断は、例えば、放射能標識または蛍光標識を用いて電気泳動で検出可能である。
好ましくは、ＲＮＡ／タンパク質切断は、Ｐｂ2+またはＦｅ2+が仲介するヒドロキシルラジカル切断によって誘導される。
【００２２】
あるいは、工程ｂ）は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細菌増殖の検出によるものであり、推測される阻害剤の存在下で以下の細菌：
ｉ）いかなるモデルＲＮＡ／タンパク質もコードしないプラスミドで形質転換した細菌または未形質転換細菌
ｉｉ）工程ａ）記載のモデルＲＮＡ分子をコードする遺伝子および自己切断ＲＮＡ構造領域を含んでなるベクターで形質転換した細菌；
を培養し、工程ｉ）の増殖が阻害され、そして工程ｉｉ）の細胞が増殖することが、阻害剤の存在の指標となる。
【００２３】
これを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで同定した阻害剤を試験することもまた可能である。
第二の側面において、本発明は、新規病原体阻害剤を検出するキットであって
ｉ）上述の方法の工程ａ）で使用するための、金属結合および病原体特有モデル分子；および場合によって
ｉｉ）上述の方法の工程ｃ）で使用するための、１以上のヒト金属依存性酵素；および場合によって
ｉｉｉ）上述の方法の工程ｂ）で使用するための、Ｐｂ2+
に特徴付けられる、前記キットに関する。
【００２４】
モデル分子は、合成的に産生した分子として提供可能である。
あるいは、モデル分子は、必須の細胞ＲＮＡ分子の機能的に重要なドメインをコードする配列を宿する前記モデル分子をコードする遺伝子を所持するベクター中に提供され、該ドメインは、モデル分子の組換え産生のための自律（ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ）二価金属イオン結合部位である。
【００２５】
モデル分子はＲＮＡまたはタンパク質に由来する。
好ましい態様において、モデルＲＮＡ遺伝子配列は、細菌起源の、例えばヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来のＲＮアーゼＰ  ＲＮＡのＰ１５、Ｐ１５／Ｐ１６ループ、Ｐ１６またはＰ１７をコードする。
【００２６】
第三の側面において、本発明は、薬剤開発用の出発化合物としてのアミノグリコシドの使用に関する。
第四の側面において、本発明は、病原性メタ１１０酵素の阻害、すなわちこうした酵素を伴う病原性状態の治療用の薬剤産生のためのアミノグリコシドの使用に関する。
【００２７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法
Ａ．標的ＲＮＡの構造的相異
ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡは、細菌において、それとともに真核生物（例えば哺乳動物）細胞において、ｔＲＮＡ前駆体をプロセシングするのに必須である（ＡｌｔｍａｎおよびＫｉｒｓｅｂｏｍ、１９９９）。細菌由来のＲＮアーゼＰ  ＲＮＡの二次構造をヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡと比較すると、重要な構造的相異が明らかになる（大腸菌およびヒトＲＮアーゼＰ  ＲＮＡを比較する、図１を参照されたい）。Ｐ１５ループは、細菌ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡの機能的に重要なドメインであり、ヒトＲＮアーゼＰ  ＲＮＡおよび真核生物ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡには一般に欠けている（図１の囲み）。細菌ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡのＰ１５ループは、塩基対形成を通じてＲＮアーゼＰ基質と相互作用し、「ＧＧＵモチーフ」が基質の３’端に位置するＲＣＣＡと塩基対を形成する（相互作用する残基を下線で示す）（ＡｌｔｍａｎおよびＫｉｒｓｅｂｏｍ、１９９９；ＫｉｒｓｅｂｏｍおよびＶｉｒｔａｎｅｎ、２０００）。これは、細菌において、ｔＲＮＡ遺伝子の大部分が３’ＣＣＡモチーフをコードし、一方、真核生物においては、いずれのｔＲＮＡもこの配列モチーフをコードしないという事実によって理論的に説明される。
【００２８】
この例は、ＲＮＡレベルでの構造的相異を用いて、病原体および宿主間を区別可能であるという状況を確立する。したがって、これは、病原体中（ここでは細菌、大腸菌を用いて例示）の、選択した標的ＲＮＡが、機能的に重要な役割を果たすＲＮＡ領域において、宿主（我々の例ではヒト）の対応物に比較して、構造的相異を示さなければならないという基準を満たす。
【００２９】
Ｂ．機能的に重要なドメインに相当する小さいモデルＲＮＡの同定
ＲＮＡの機能はその構造に決定される。ＲＮＡ分子の全体の構造は、ともにＲＮＡ構造を構築する、小さい構造領域／ドメインからなる。したがって、巨大ＲＮＡ分子中の天然の背景から分離された際、最終構造にフォールディングする、小さい安定なＲＮＡ構造領域／ドメインを同定することが可能である。したがって、機能的に重要なＲＮＡ領域／ドメインに相当する、小さいモデルＲＮＡ分子を、コンホメーションを保持したまま、別個に産生することが可能である。これは、大腸菌Ｐ１５ループの構造が、小さいモデル３１量体ＲＮＡに存在する場合に維持されるという知見から、明らかに例示される（ＫｕｆｅｌおよびＫｉｒｓｅｂｏｍ、１９９８）。異なる細菌で同定されているＰ１５ループ構造のいくつかの変異体のライブラリーを、小さいモデル３１量体ＲＮＡとともに、図２に示す。
【００３０】
これは、天然背景から取り出した際に、構造を変化させずに、機能的に重要なドメイン／領域を宿する小さいモデルＲＮＡを産生可能でなければならないという基準を満たす。
Ｃ．「金属模倣体」の同定のためのツール
細菌ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡは、単独で、またはタンパク質サブユニット（Ｃ５タンパク質と称される）の存在下で、基質をｉｎ  ｖｉｔｒｏで正しく、そして効率的に切断し、そしてこの切断活性は、多様なアミノグリコシドによって阻害可能である（Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎら、１９９９）。ＲＮアーゼＰ切断を阻害するいくつかのアミノグリコシドの構造を図３に示す。アミノグリコシドはＲＮＡに結合し、そして機能的に重要な二価金属イオンを置換する。したがって、アミノグリコシドは金属模倣体として機能する（Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎら、２００１）。
【００３１】
全長大腸菌ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡは、Ｐｂ２＋によって、特定の位で切断される。Ｐｂ２＋が誘導する大腸菌ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡの切断は、例えばアミノグリコシド、ネオマイシンＢの添加によって阻害される（Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎら、１９９９）。上に論じる、大腸菌Ｐ１５ループを宿する小さいモデル３１量体ＲＮＡもまた、Ｐｂ２＋の存在下で、特定の位で切断される（ＫｕｆｅｌおよびＫｉｒｓｅｂｏｍ、１９９８）。驚くべきことに、Ｐｂ２＋が誘導する３１量体ＲＮＡの切断は、表２に示すように、多様なアミノグリコシドの添加の結果、阻害される。これは、機能的に重要なＰ１５ドメインを含んでなる小さい３１量体モデルＲＮＡが、アミノグリコシドの結合部位であることを明らかに立証する。
【００３２】
表２．Ｐｂ２＋が誘導する３１量体ＲＮＡの切断の、多様なアミノグリコシドによる阻害に関するａｐｐＫｉ値の要約。Ｐ１５ループは大腸菌ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡに由来する。ａｐｐＫｉは、切断活性の５０％阻害を生じるアミノグリコシド濃度と定義される。
【００３３】
【表２】
2005509443.tif 000003
【００３４】
*Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎら、１９９９より、比較のために価を含める。
表２に提供する、観察されるａｐｐＫｉは、ＲＮアーゼＰ切断活性を阻害する範囲と同じ濃度範囲にある。ａｐｐＫｉは、Ｐｂ２＋が誘導する切断活性の５０％阻害を生じるアミノグリコシド濃度と定義される。ヒト型結核菌由来のＰ１５ループ（図２に示す）を含んでなるモデルＲＮＡもまた、驚くべきことに、Ｐｂ２＋によって、特定の位で切断され、そしてこの特定のモデルＲＮＡのＰｂ２＋が誘導する切断は、いくつかのアミノグリコシドに阻害され、図３にそのうちいくつかを示す。これは、天然存在配列上に構築されるモデルＲＮＡ分子（機能的に重要なドメインを含んでなる）もまた、使用可能であることを立証する。
【００３５】
本発明は現在、驚くべきことに、Ｐｂ２＋が誘導する切断をツールとして用いて、機能的に重要なＲＮＡの特定のドメインに結合する小リガンドを同定可能であることを見出した。すべてのＲＮＡ分子が二価金属イオンに結合し、そして特定の方式で配置されていたならば、二価金属イオンＰｂ２＋の結合が、ＲＮＡの切断を生じることに注目されたい（Ｂｒｏｗｎら、１９８５）。したがって、このアプローチは一般的であり、そしてその結果、いかなるＲＮＡ分子も標的として選択可能である。これは、必須ＲＮＡ分子の機能的に重要なドメインに相当する小さいＲＮＡ分子に結合する小リガンドを同定する方法を有するという基準を満たす。該方法は、ＲＮＡ切断が小リガンドによって阻害されるという発想に依存する。ＲＮＡ切断は、Ｐｂ２＋および多様な他の金属イオン、並びに酵素によって実行可能である。Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋などの他の二価金属イオンをＰｂ２＋の代わりに使用可能であるが、Ｐｂ２＋を使用する利点は、Ｐｂ２＋が誘導する切断が、生理学的ｐＨで、他の二価金属イオンによる切断に比較して、はるかにより速いことである。高いｐＨでは、ＲＮＡの構造が変化し、そしてまた、ＲＮＡが分解されることから、およそ７のｐＨを維持することが好ましい。
【００３６】
小リガンドの結合の検出はまた、多様なリボヌクレアーゼ、すなわち特定の位でＲＮＡを切断する酵素を用いても、達成可能である。例えば、ＲＮアーゼＴ１は、一本鎖グアノシン残基の３’を優先的に切断する。したがって、小リガンド（すなわち阻害剤）の添加は、一本鎖グアノシン残基のアクセス可能性を変化させることが可能であり、そしてしたがって小リガンドの結合は、小リガンド結合部位で、ＲＮアーゼＴ１切断を阻害するであろう。
【００３７】
ＲＮＡへの小リガンドの結合の検出は、多様な手段によるＲＮＡ切断の検出に限定されない。結合の検出はまた、多様な分光法または表面プラズモン共鳴法によることも可能である。分光法の例として、小リガンドの結合は、例えばｉ）リガンド結合によるスペクトルのシフトとして、ｉｉ）例えば温度の関数としての吸光度として測定される、小リガンドが結合した結果のＲＮＡ構造安定性の増加または減少として、検出可能である。表面プラズモン共鳴を以下のように使用可能である。標準的なプロトコルを用いて、機能的に重要な領域／ドメインを含んでなるモデルＲＮＡを、表面にカップリングする。潜在的な阻害剤を含有する溶液をこの表面上に通過させ、そして表面プラズモン共鳴技術にしたがって、反射によって阻害剤（小リガンド）の結合を検出する。
【００３８】
目的が、異なる物質の混合物（例えばコンビナトリアルライブラリー）を用いてＲＮＡに結合する物質に関してスクリーニングすることである場合、小さいモデルＲＮＡ分子を固体表面に連結して、そして選択したツール、例えば上に論じるような、Ｐｂ２＋が誘導する切断あるいは特異的リボヌクレアーゼまたは分光法を用いて、ＲＮＡに結合する物質を同定する。
【００３９】
固体表面へのＲＮＡの連結は、ＲＮＡの５’端または３’端をビオチン化することによって達成可能である。こうして得たＲＮＡを続いてストレプトアビジンビーズまたはストレプトアビジンでコーティングしたチューブに結合させる。あるいは、５’または３’一本鎖領域を所持するモデルＲＮＡ（機能的に重要な領域／ドメインを含んでなる）を、固体支持体に係留したオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせる。ここで、５’または３’は固体支持体に係留したオリゴヌクレオチドに相補的である。
【００４０】
Ｄ．毒性副作用の抑制および耐性の出現
既定の病原体に存在するＲＮＡの機能的に重要なドメインに相当する小さいモデルＲＮＡを用いて、標的とするＲＮＡの特異的阻害剤が同定されたら、標的としてより大きいＲＮＡを用い、そして適切なアッセイ系を用いて、阻害作用に関して、この阻害剤を試験することが可能である。上に論じるような例示において、例えばヒト型結核菌に由来する、Ｐ１５ループに結合する新規小化合物を、全長ヒト型結核菌ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡの阻害活性に関して、該ＲＮＡ単独で、そしてＲＮアーゼＰタンパク質Ｃ５の存在下での両方で、試験する。Ｃ５はｉｎ  ｖｉｖｏでの活性に必須であるため、阻害剤がＣ５の存在下でＲＮアーゼＰ  ＲＮＡ切断を阻害すると立証することが必要である。重要な基準は、阻害剤が、標的とするＲＮＡの活性を高い特異性で阻害することである。これは、この例では、阻害剤がヒト型結核菌ＲＮアーゼＰを高い特異性で阻害しなければならず、そしてヒトＲＮアーゼＰ活性を阻害してはならないことを意味する。したがって、ヒトＲＮアーゼＰを用いた阻害研究を行って、阻害剤がその活性を阻害しないことを確実にする。
【００４１】
さらに、該方法を用いて、非常に特異的であるか、またはより特異的でない阻害剤を調べ、そして同定することが可能である。これは、例えば、異なる細菌供給源に由来するＲＮアーゼＰを用いて、そして選択した阻害剤の存在下での触媒作用能力を研究することによって達成される。高い特異性の阻害剤を同定しようとするならば、阻害剤（提供する例ではヒト型結核菌ＲＮアーゼＰ）は大腸菌および他の細菌ＲＮアーゼＰ変異体の活性を阻害してはならない。この主な利点は：ｉ）「ハウスキーピング」細菌の増殖が、阻害剤の存在下で阻害されず、その結果、望ましくない副作用が抑制されるであろうこと、およびｉｉ）水平遺伝子移動を介して伝播する、阻害剤に対する耐性出現が抑制されうることである。広い範囲の抗生物質などの、広い範囲の阻害剤を同定しようとするならば、該方法を用いて、多数の異なる細菌種または細菌綱を阻害する阻害剤を同定可能である。
【００４２】
今日用いられる多くの抗生物質は、重症の副作用を引き起こす。さらに、今日現在、薬剤開発において、必要で、時間がかかり、重要で、そして高価な工程は、低レベルの毒性副作用しか持たない新規薬剤を同定するプロセスにおける、実験動物系の使用である。
【００４３】
毒性および重症の副作用の背後にある機構は、理解されておらず、そして文献には、いくつかの潜在的な原因が論じられている。アミノグリコシドがクレノウｐｏｌおよびＰＡＲＮを阻害するという本発明の発明者らによる発見によって、核酸代謝酵素の阻害は、アミノグリコシドが望ましくない副作用を引き起こす際の、一般的な機構である可能性があることが示唆される。これを支持して、我々は、ＢａｍＨＩ制限酵素、ＨＩＶ逆転写酵素、細菌ＲＮアーゼＨ、哺乳動物ポリ（Ａ）ポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを含む、いくつかの他の核酸代謝酵素を、０．１〜５ｍＭのネオマイシンＢを添加することによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻害可能であることを示した。これは、ホスホジエステル結合の分解および形成に関与する金属酵素への結合および該酵素の阻害が、アミノグリコシドの一般的な特徴であることを示す。
【００４４】
本発明の重要な利点は、標的ＲＮＡに結合する阻害剤を、遺伝子発現中に重要な役割を果たすタンパク質への結合に関して試験するのに、本発明を使用可能なことである。この理由は以下のとおりである：ｉ）我々は、機能に重要な二価金属イオンに結合する、ＲＮＡ上のポケットに結合する阻害剤に関してスクリーニングする。ｉｉ）多くのタンパク質酵素もまた、二価金属イオンに結合し、これらは機能に重要である。ｉｉｉ）したがって、ＲＮＡに結合し、そして二価金属イオンを置換する阻害剤はまた、タンパク質酵素に結合し、そしてそれによってこうしたタンパク質の機能に重要な二価金属イオンを置換する潜在能力も有する。本発明の発明者らは、いくつかの金属酵素が、多様なアミノグリコシドの添加によって阻害されることも立証した。したがって、小リガンドは、ＲＮＡおよびタンパク質酵素両方に結合し、そして機能的に重要な二価金属イオンを置換することによって、その機能を不活性化する潜在能力を有する可能性がある。これは、重症の毒性副作用を引き起こしうる。宿主の必須金属酵素に阻害剤が結合する問題を回避するためには、ＲＮＡに結合すると同定された阻害剤は、活性に関して二価金属イオンに依存性であるタンパク質酵素に相互作用／結合してはならないことが基準である。したがって本発明は、「逆スクリーニング（ｃｏｕｎｔｅｒ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）」工程を可能にし、この工程において、特定のハウスキーピングタンパク質酵素セットの阻害を試験する。したがって、この工程は、薬剤開発の初期段階で、毒性副作用を同定し、そしてそれによって、時間および実験動物系の使用を減少させる潜在能力を有する。
【００４５】
Ｅ．薬剤開発のプロセスにおけるさらなる工程
新規ＲＮＡ結合化合物に関する、概略を説明したｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング、阻害研究および「逆スクリーニング」研究を行った後、同定された阻害剤を、細菌培養および細胞培養において、一連のｉｎ  ｖｉｖｏ阻害研究に供することが可能である。ここで、目的は、同定された阻害剤（単数または複数）を、薬剤開発の潜在的なリード化合物（単数または複数）としてさらに確立することである。
【実施例】
【００４６】
材料および方法
ＲＮＡ調製、ＲＮアーゼＰおよびＰｂ２＋が誘導する切断
モデルＲＮＡの調製
異なる遺伝子構築物をＴ７プロモーターの後ろに配置し、そして標準的プロトコルにしたがって、Ｔ７  ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（またはその同等物）を用いて、ＲＮＡを生成した。より短いＲＮＡ分子を化学的に合成することが可能であるが、この場合、ＲＮＡのサイズが非常に重要であり、すなわち、大きすぎるＲＮＡは不可である。必要な場合、ＲＮＡの内部、５’端または３’端を32Ｐで標識した。あるいは、3Ｈもしくは14Ｃ、または例えば蛍光標識を用いて、ＲＮＡを標識することが可能である。
【００４７】
ＲＮアーゼＰ切断およびＰｂ２＋が誘導する切断
ＫｕｆｅｌおよびＫｉｒｓｅｂｏｍ（１９９８）により記載されるような、標準的プロトコルにしたがって、ＲＮアーゼＰ切断およびＰｂ２＋が誘導する切断を行い、そして監視した。既定の物質に関してａｐｐＫｉ値を決定するため、切断反応の動力学曲線の直線部分で測定を行う方式で、ＲＮアーゼＰ切断またはＰｂ２＋が誘導する切断条件を調整した。研究中の化合物Ｘの濃度の関数として切断効率をプロットし、そしてａｐｐＫｉは、切断活性の５０％阻害を生じる濃度として定義される。
【００４８】
逆スクリーニングに必須のタンパク質関連法
活性に関して金属イオンに依存する、いくつかの酵素が、本発明で特に適切である。これらの酵素の多くは、細胞生存に必須であり、例えばいわゆるハウスキーピング酵素である。こうした酵素の例は：哺乳動物ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（ＰＡＰ）、哺乳動物ポリ（Ａ）特異的リボヌクレアーゼ（ＰＡＲＮ）および大腸菌クレノウＤＮＡポリメラーゼ（ＰＯＬ  Ｉ）、ホスホリパーゼＣ、ＲＮアーゼＨ、Ｔ７  ＤＮＡ依存性ポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、ＢａｍＨＩおよび逆転写酵素である。
【００４９】
クレノウおよびＰＡＲＮ活性のアッセイおよび定量化
クレノウポリメラーゼ活性に関して試験するため、酵素として、部位特異的突然変異誘発によって３’−５’エキソヌクレアーゼ活性部位を不活性化した、クレノウ（Ｄ３５５Ａ、Ｅ３５７Ａ）組換えポリペプチドを用い、そしてテンプレートとして、オリゴヌクレオチド５’−ＴＣＧＣＡＧＣＣＧＴＧＡＧ−３’および５’−ＡＴＣＣＡＡＧＣＴＣＡＣＧＧＣＴＧＣＧＡ−３’のハイブリダイゼーションによって生成した二本鎖ＤＮＡ断片を用いた。記載されるようにＤＮＡテンプレートを調製した（ＥｇｅｒおよびＢｅｎｋｏｖｉｃ  １９９２）。１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．０、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．５マイクログラム／マイクロリットルＢＳＡ、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、４ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭスペルミジン、１マイクロモルＤＮＡテンプレート、０．３マイクロモル（アルファ−32Ｐ）ｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）の存在下、１０マイクロリットル中で反応を行い、そして反応は、示すクレノウｐｏｌ断片を０．２〜１ｎＭ含有した。３０℃で５〜２０分間、反応をインキュベーションし、そしてその後、１０マイクロリットル装填緩衝液（８０％ホルムアミド（ｖ／ｖ）、０．１％キシレンシアノール、０．１％ブロモフェノールブルー、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．９、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を添加することによって反応を停止した。反応させたＤＮＡを１０％ポリアクリルアミド（１９：１アクリルアミド／ビスアクリルアミド３０：０．８）−７Ｍ尿素ゲル電気泳動によって分画した。４００Ｓホスホイメージャー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて、得たゲルをスキャンした。ｄＣＴＰを滴定する場合、ＤＮＡテンプレート濃度は１マイクロモルであり、一方、ＤＮＡテンプレートを滴定する場合、ｄＣＴＰ濃度は５０マイクロモルであった。反応のｐＨは、別に言及しない限り、７．０であった。基質（ｄＣＴＰまたはＤＮＡ）の消費を調節し、その総量の２０％以上が消費されないようにした。
【００５０】
均質に精製されたウシ胸腺ＰＡＲＮ  ５４ｋＤａの活性断片をＰＡＲＮの供給源として用いた（Ｍａｒｔｉｎｅｚら、２０００）。記載されるように組換え全長ヒトＰＡＲＮを発現させ、そして精製した（Ｍａｒｔｉｎｅｚら、２０００）。我々は、基質として、ポリ（Ａ）テールを放射能標識したＬ３（Ａ30）ＲＮＡを用いた（Åｓｔｒｏｅｍら、１９９１）。アッセイ条件および１−Ｄ  ＴＬＣ定量化法は、先に記載されるとおりであった（Åｓｔｒｏｅｍら、１９９２）。脱アデニル化反応のｐＨは、別に言及しない限り、７．０であった。Ｌ３（Ａ30）ＲＮＡ基質の消費を調節し、その２０％以上が消費されないようにした。
【００５１】
アミノグリコシドをＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．より購入し、そして添加した量は示すとおりであった。重合効率または脱アデニル化効率を、研究中のアミノグリコシドの濃度の関数としてプロットした。appＫiを、それぞれ、クレノウｐｏｌまたはＰＡＲＮ活性の５０％阻害を生じる、添加したアミノグリコシドの濃度と定義した。研究中のアミノグリコシド濃度に対して、測定した（ＫM／Ｖmax）値をプロットすることによって、Ｋi値を得た。
【００５２】
Ｆｅ（ＩＩ）が仲介するタンパク質のヒドロキシルラジカル切断
２〜４マイクログラムの精製組換えクレノウｐｏｌ断片またはその突然変異体を、Ｍｉｌｉｐｏｒｅ「Ｖ」シリーズ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上で、緩衝液Ｆ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．０、５ｍＭ  ＮａＣｌ）に対して４℃で３０分間透析し、総体積１０マイクロリットル中、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．０、５ｍＭ  ＮａＣｌ、２０マイクロモルＦｅ（ＮＨ4）2ＳＯ4および１０ｍＭ  ＤＴＴ中で３７℃で３０分間インキュベーションした。１０マイクロリットルの２ｘＳＤＳ装填緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．８、２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、２００ｍＭ  ＤＴＴ、１６％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．０５％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルーおよび５０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を添加することによってインキュベーションを停止した。添加したＭｇ（ＩＩ）イオン、Ｍｎ（ＩＩ）イオンまたはアミノグリコシドの量は、示すとおりであった。反応させたポリペプチドを、１０％  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分画し、そして続いて銀染色によって視覚化した。
【００５３】
大腸菌で発現させた組換えＰＡＲＮポリペプチドを精製し、そしてＮ末端で放射能標識した。Ｆｅ（ＩＩ）が仲介するＰＡＲＮのヒドロキシルラジカル切断を、本質的に上述のように行った。反応させた試料を１０％  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、そして続いて、４００Ｓホスホイメージャー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて、生じたゲルを視覚化し、そして定量化した。Ｍｇ（ＩＩ）およびＭｎ（ＩＩ）イオン競合実験において、示す濃度のＭｇＣｌ2またはＭｎＣｌ2を、２０マイクロモルＦｅ（ＮＨ4）2ＳＯ4の存在下で添加した。
【００５４】
ｉｎ  ｖｉｖｏ法
本発明に記載の新規方法のこの態様では目的は２つである：ｉ）ｉｎ  ｖｉｖｏ条件下で、ウイルスを含む微生物の増殖に必須の、選択したＲＮＡ標的の機能的に重要なドメインと相互作用／結合する新規阻害剤を同定すること、およびｉｉ）ｉｎ  ｖｉｖｏ条件下で、選択した標的への結合に関して、上述のｉｎ  ｖｉｔｒｏ戦略を用いて同定した新規阻害剤を試験すること。ＲＮＡ標的は、パラグラフＡ〜Ｃに記載するのと同じ基準に基づいて選択される。
【００５５】
工程１
誘導性プロモーターの後ろに、選択したＲＮＡドメインをコードする遺伝子を生成する（図４を参照されたい）。この遺伝子構築物は、化学的に合成するか、または選択したＲＮＡドメイン／領域を含んでなるモデルＲＮＡをコードする遺伝子上の特定の領域に相補的な、適切なオリゴデオキシヌクレオチドプライマーを用いて、ＰＣＲ技術（ポリメラーゼ連鎖反応）によって生成する。
【００５６】
さらに、この遺伝子構築物は、ＲＮＡ標的をコードする遺伝子構築物の下流に、自己切断ＲＮＡ構造領域を所持する。転写産物は、選択したＲＮＡドメインに加えて、自己切断ＲＮＡ構造領域を所持する。自己切断後、切断された転写物は、選択したドメイン／領域とともに、３’端に２’，３’−環状リン酸を含んでなる、選択したモデルＲＮＡのみからなる。３’端に２’，３’−環状リン酸を有する利点は、これが３’エキソリボヌクレアーゼの作用を遮断し、そしてそれによって例えば細菌内部で、選択したＲＮＡドメインの分解を遮断することである。さらに、自己切断ＲＮＡが存在することによって、望ましいサイズ／長さである、選択したＲＮＡ標的が生じる。
【００５７】
工程２
続いて、こうした得た遺伝子構築物を適切なプラスミドベクターに導入する。
工程３
上述の概略に続いて、工程１に記載の遺伝子構築物を宿するベクターで、適切な細菌株を形質転換して、そして誘導性プロモーターの誘導によって発現させる。以下は、本発明の背景において、どのように細菌株を使用可能であるかの２例である。
【００５８】
（実施例１）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで同定された阻害剤の試験：２つの細菌株を用いる。株の一方では、選択したＲＮＡが発現されるであろう（図５の下の事例）。選択したＲＮＡ（上述の概略にしたがって、阻害剤を同定するため、選択したＲＮＡドメイン／領域を含んでなる、用いるモデルＲＮＡ）が高い細胞内濃度で存在するため、阻害剤は、主に、選択したＲＮＡに結合するであろう。選択したＲＮＡドメインが必須全長ＲＮＡよりもはるかに過剰であるため、選択したＲＮＡを含んでなる必須全長ＲＮＡは、阻害剤に結合しないであろう。その結果、株は増殖するであろう。もう一方の株では、選択したＲＮＡの遺伝子を抑制した結果、あるいはプラスミドが欠けているか、またはプラスミドが、選択したＲＮＡをコードしないため（図５の上部に示すような場合、プラスミドがＲＮＡ遺伝子をコードしない例）、選択したＲＮＡは産生されない。したがって、阻害剤は、全長ＲＮＡ上の選択したＲＮＡ領域／ドメインに結合し、その結果、ＲＮＡ活性の阻害を生じるであろうため、阻害剤の添加は、増殖阻害を生じるであろう。結論として、このプロトコルは、ｉｎ  ｖｉｖｏ条件下でも機能する阻害剤を同定する。どちらの株も増殖させる阻害剤は、まったく興味を引かない。
【００５９】
（実施例２）
新規阻害剤の選択：上述の概略はまた、直接、選択したドメイン／領域と結合／相互作用する阻害剤に関して選択するのにも使用可能である。ここで再び、ＲＮＡドメイン／領域を含んでなる、選択したモデルＲＮＡが発現されるもの（株Ａ、図５下部）、およびＲＮＡドメイン／領域を含んでなる、選択したモデルＲＮＡが発現されないもの（株Ｂ、図５上部）の２つの株を用いる。ここで、基準は、潜在的な阻害剤である阻害剤またはそのプール（例えばコンビナトリアルライブラリー）の添加が、株Ａでは増殖を可能にするが、株Ｂでは可能にしないことであり（図５）、このことは、増殖が、選択したＲＮＡドメイン／領域を含んでなるモデルＲＮＡが高い細胞内濃度で存在することに依存すると立証する。このセットアップを用いた１つの功績は、この方法が、ｉｎ  ｖｉｖｏ条件下で、細菌／細胞に浸透し、そして選択したＲＮＡドメイン／領域と結合／相互作用する阻害剤の同定を可能にすることである。
【００６０】
図５の上部に例示する例では、阻害剤の添加（黒い省略記号で示す）が増殖阻害を生じる。増殖阻害の理由は、阻害剤が必須ＲＮＡのドメインに結合し（細い矢印）、それによってその機能を不活性化することである。図５の下部では、選択したＲＮＡドメイン／領域（図に示す必須ＲＮＡ分子から得たもの）を含んでなるモデルＲＮＡをコードする遺伝子を、誘導性プロモーター（ここではＴ７プロモーター）の後ろに所持するプラスミドを導入する。その結果、小さい「ヘアピン」で示される、標的とされるＲＮＡモチーフの細胞内濃度が高くなる。これらの小ＲＮＡ分子が阻害剤に結合し、そしてその結果、必須ＲＮＡ分子への阻害剤の結合が打ち負かされるため、細胞の増殖が維持される。
【００６１】
結語
本発明記載の方法の、上記に概略を説明する例は、提供する実施例に限定されず、宿主に存在しないか、または宿主類似体と比較して構造的相異を示す、特有の金属結合ドメインを持つ必須ＲＮＡ分子を宿する、いかなる病原体にも適用可能である。
【００６２】
金属模倣体概念は、阻害剤がＲＮＡまたはタンパク質に結合し、そしてそれによって、機能に重要な二価金属イオン（類）を置換することである。したがって、金属模倣体概念は、概略した方法とともに、巨大分子、すなわちＲＮＡまたはタンパク質いずれかにおいて、機能的に重要な二価金属イオンを置換するリガンドいずれかを同定するのに使用可能である。したがって、本発明の方法を用いて、細胞成長、増殖および分化に必須の特定のＲＮＡ分子またはタンパク質いずれかに結合する阻害剤を同定することが可能である。その結果、該方法を用いて、腫瘍細胞の増殖を抑制する阻害剤を同定することが可能である。同様に、該方法を用いて、抗ウイルス性阻害剤を同定することが可能である。
【００６３】
参考文献
【００６４】
【化１】
2005509443.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１ａ】図１ａは、大腸菌およびヒト由来のＲＮアーゼＰ  ＲＮＡの二次構造を示す。囲みで示した残基は、ヒトＲＮアーゼＰ  ＲＮＡに欠けているＰ１５ループを構成する残基に対応する。
【図１ｂ】図１ｂは、大腸菌およびヒト由来のＲＮアーゼＰ  ＲＮＡの二次構造を示す。囲みで示した残基は、ヒトＲＮアーゼＰ  ＲＮＡに欠けているＰ１５ループを構成する残基に対応する。
【図２】図２は、細菌Ｐ１５ループ変異体の例を示す。図の下部は、大腸菌ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡに由来するＰ１５ループに相当するモデル３１量体ＲＮＡの二次構造の図解である。
【図３】図３は、本発明に用いるアミノグリコシドの例を示す。
【図４】図４は、モデルＲＮＡをコードする遺伝子構築物および自己切断ＲＮＡ領域を示す。
【図５】図５は、本明細書に記載するｉｎ  ｖｉｖｏアプローチの要約を例示する概略図である。
【図１ａ】
2005509443.tif 000005
【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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2005509443.tif 000012