(57)【要約】  本発明は、リポペプチド生合成に関与する単離されたポリペプチド、及びかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。詳しくは、単離されたポリペプチドは、アシル特異的Ｃドメイン、アデニル化酵素、又はアシルキャリアであり得る。さらに、本発明は、リポペプチド生合成に関与するポリペプチド、又はかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出する方法、並びに関連する有用なコンピュータ解読可能媒体及びコンピュータシステムに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１及び２から選択される少なくとも１つの配列に少なくとも４５％の配列同一性を含むポリペプチドをコードし、アシル特異的Ｃドメインをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
（ａ）配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９からなる群から選択される配列；
（ｂ）（ａ）に相補的な配列；
（ｃ）高ストリンジェンシーな条件下で前記の（ａ）又は（ｂ）の配列にハイブリダイズする配列；及び、
（ｄ）前記の（ａ）（ｂ）又は（ｃ）の配列に少なくとも７０％以上の相同性を有する配列
からなる群から選択される配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記アシル特異的Ｃドメインがリポペプチドアシルキャッピングに関与する、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記の単離されたポリヌクレオチドが、
（ａ）アクチノプラネス菌種（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｓｐ．）ＡＴＣＣ  ３３０７６由来のラモプラニン（ｒａｍｏｐｌａｎｉｎ）の生合成遺伝子座；
（ｂ）ストレプトマイセス・ロゼオスポルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ）ＮＲＲＬ  １１３７９由来のＡ２１９７８Ｃの生合成遺伝子座；
（ｃ）ストレプトマイセス・フラディエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｄｉａｅ）ＡＴＣＣ  １８１５８由来のＡ５４１４５の生合成遺伝子座；
（ｄ）ストレプトマイセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）由来のカルシウム依存性抗生物質の生合成遺伝子座；
（ｅ）ストレプトマイセス・ガナエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−１２１０４由来のリポペプチド天然産物の生合成遺伝子座；
（ｆ）ストレプトマイセス・レフイノウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｅｆｕｉｎｅｕｓ）ＮＲＲＬ  ３１４３由来のリポペプチド天然産物の生合成遺伝子座；
（ｇ）ストレプトマイセス・アイズネンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｉｚｕｎｅｎｓｉｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−１１２７７由来のリポペプチド天然産物の生合成遺伝子座；
（ｈ）アクチノプラネス・ニポネンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｎｉｐｐｏｎｅｎｓｉｓ）ＦＤ  ２４８３４  ＡＴＣＣ  ３１１４５由来のリポペプチド天然産物の生合成遺伝子座；及び
（ｉ）ストレプトマイセス菌種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）微生物由来のリポペプチド天然産物の生合成遺伝子座
からなる群から選択される遺伝子座に存在する、請求項３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
第１のポリヌクレオチドが請求項１に記載のポリヌクレオチドであり、かつ第２のポリヌクレオチドが、
（ｊ）配列番号３に少なくとも５５％の配列同一性を有するポリペプチド、及び
（ｋ）配列番号４に少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド
からなる群から選択されるポリペプチドをコードするものである、単離された２つ以上のポリヌクレオチド。
【請求項６】
（ａ）配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５及び４７からなる群から選択される配列；
（ｂ）（ａ）に相補的な配列；
（ｃ）高ストリンジェンシーな条件下で前記の（ａ）又は（ｂ）の配列にハイブリダイズする配列、及び
（ｄ）前記の（ａ）（ｂ）又は（ｃ）の配列に少なくとも７０％以上の相同性を有する配列
からなる群から選択される配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記の単離されたポリヌクレオチドが、
（ａ）アクチノプラネス菌種（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｓｐ．）ＡＴＣＣ  ３３０７６由来のラモプラニン（ｒａｍｏｐｌａｎｉｎ）の生合成遺伝子座；
（ｂ）ストレプトマイセス・ロゼオスポルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ）ＮＲＲＬ  １１３７９由来のＡ２１９７８Ｃの生合成遺伝子座；
（ｃ）ストレプトマイセス・フラディエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｄｉａｅ）ＡＴＣＣ  １８１５８由来のＡ５４１４５の生合成遺伝子座；
（ｄ）ストレプトマイセス・ガナエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−１２１０４由来のリポペプチド天然産物の生合成遺伝子座；
（ｅ）ストレプトマイセス・レフイノウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｅｆｕｉｎｅｕｓ）ＮＲＲＬ  ３１４３由来のリポペプチド天然産物の生合成遺伝子座；
（ｆ）ストレプトマイセス・アイズネンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｉｚｕｎｅｎｓｉｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−１１２７７由来のリポペプチド天然産物の生合成遺伝子座；
（ｇ）アクチノプラネス・ニポネンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｎｉｐｐｏｎｅｎｓｉｓ）ＦＤ  ２４８３４  ＡＴＣＣ  ３１１４５由来のリポペプチド天然産物の生合成遺伝子座；及び
（ｈ）ストレプトマイセス菌種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）微生物由来のリポペプチド天然産物の生合成遺伝子座
からなる群から選択される生合成遺伝子座に存在する、請求項６に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８】
（ａ）配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９からなる群から選択される配列；及び
（ｂ）（ａ）に相補的な配列；
（ｃ）高ストリンジェンシーな条件下で前記の（ａ）又は（ｂ）の配列にハイブリダイズする配列；及び
（ｄ）前記の（ａ）（ｂ）又は（ｃ）の配列に少なくとも７０％以上の相同性を有している配列
からなる群から選択される配列を含むポリヌクレオチドによってコードされている、単離されたアシル特異的Ｃドメイン。
【請求項９】
配列番号１及び配列番号２から選択される少なくとも１つの配列に少なくとも４５％の配列相同性を有する、単離されたアシル特異的Ｃドメイン。
【請求項１０】
（ａ）配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０及び２２からなる群から選択される配列；並びに、
（ｂ）前記の（ａ）の配列に少なくとも７０％以上の相同性を有する配列
からなる群から選択されるポリペプチド配列を含む、単離されたアシル特異的Ｃドメイン。
【請求項１１】
第１の単離されたポリペプチドが、請求項９に記載のアシル特異的Ｃドメインであり、かつ第２の単離されたポリペプチドが、
（ａ）配列番号３に少なくとも５５％の相同性を有するポリペプチド、及び
（ｂ）配列番号４に少なくとも５０％の相同性を有するポリペプチド
からなる群から選択されるものである、単離された２つ以上のポリペプチド。
【請求項１２】
（ａ）配列番号２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６及び４８；並びに、
（ｂ）前記の（ａ）の配列に少なくとも７０％以上の相同性を有する配列
からなる群から選択されるポリペプチドを含む、単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
少なくとも１つのアシル特異的Ｃドメインポリペプチドと、アデニル化タンパク質及びアシルキャリアタンパク質からなる群から選択される別のポリペプチドとを含む、Ｎ−アシルキャッピングカセット。
【請求項１４】
（ａ）ポリヌクレオチド若しくはポリペプチド配列の同定、分析又は表示のモデル化を行う方法を実行するのに十分な命令を含んでいる媒体上に格納されているコンピュータプログラムと；
（ｂ）ｉ）配列番号１又は配列番号２のいずれかと少なくとも４５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードし、アシル特異的Ｃドメインをコードするポリヌクレオチド；
ｉｉ）配列番号３と少なくとも５５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；及び、
ｉｉｉ）配列番号４と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を示す前記媒体上に格納されているデータと；
（ｃ）配列の論理的サブコンポーネントに対応するデータ要素へ前記コンピュータプログラムがアクセスするのを容易にするための前記データの基本的な構成及び構造を反映し、前記データ構造が、前記プログラムに、かつコンピュータプログラムが前記データを系統化しアクセスする方法に固有のものであるデータ構造と
を含むコンピュータ解読可能媒体。
【請求項１５】
（ａ）ポリペプチド配列の同定、分析又は表示のモデル化を行う方法を実行するのに十分な命令を含んでいる媒体上に格納されているコンピュータプログラムと；
（ｂ）ｉ）アシル特異的Ｃドメインを示し、かつ配列番号１又は配列番号２のいずれかと少なくとも４５％の配列同一性を有するポリペプチド；
ｉｉ）配列番号３と少なくとも５５％の配列同一性を有するポリペプチド；及び、
ｉｉｉ）配列番号４と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド
からなる群から選択されるポリペプチドの配列を示す媒体上に格納されているデータと；
（ｃ）配列の論理的サブコンポーネントに対応するデータ要素へ前記コンピュータプログラムがアクセスするのを容易にするための前記データの基本的な構成及び構造を反映し、前記データ構造が、前記プログラムに、かつコンピュータプログラムが前記データを系統化しアクセスする方法に固有なものであるデータ構造と
を含むコンピュータ解読可能媒体。
【請求項１６】
（ａ）配列番号１又は配列番号２のいずれかと少なくとも４５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、アシル特異的Ｃドメインをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号３と少なくとも５５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；及び、
（ｃ）配列番号４と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
からなる群から選択されるポリヌクレオチドを示すデータを含む、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列の同定、分析又はモデル化を行う方法を実行するようにプログラムされたコンピュータによってアクセス可能なデータを格納するためのメモリ。
【請求項１７】
（ａ）配列番号１又は配列番号２のいずれかと少なくとも４５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号３と少なくとも５５％の配列同一性を有するポリペプチド；及び、
（ｃ）配列番号４と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド
からなる群から選択されるポリペプチドを示すデータを含む、ポリペプチド配列の同定、分析又はモデル化を行う方法を実行するようにプログラムされたコンピュータによってアクセス可能なデータを格納するためのメモリ。
【請求項１８】
（ａ）配列番号１又は配列番号２のいずれかと少なくとも４５％の配列同一性を有するポリペプチド、あるいは、
（ｂ）配列番号１又は配列番号２に少なくとも４５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を同定するステップを含む、リポペプチド生合成に関与するポリペプチド又はかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出する方法であって、
前記の少なくとも４５％の配列同一性が、リポペプチド生合成に関与するポリペプチドを示す、前記方法。
【請求項１９】
前記同定ステップが、
（ａ）アシル特異的ドメインを示すポリヌクレオチド又はポリペプチド配列からなる群から選択される基準ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列を提供するステップと；
（ｂ）前記基準配列を、コンピュータ解読可能媒体上に格納された１つ以上の候補ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列と比較するステップと；
（ｃ）前記基準配列と前記の１つ以上の候補配列との間の相同性レベルを検出するステップと；
（ｄ）基準配列と少なくとも７０％の相同性を有する候補配列を同定するステップとを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記基準配列が、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２のポリペプチド、又は配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０若しくは２２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記候補配列及び前記基準配列に共通する構造モチーフを決定するステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも、ａ）のポリペプチド又はｂ）のポリヌクレオチドに近接している、
ｃ）配列番号３に少なくとも５５％の配列同一性を有する１つのポリペプチド、若しくは配列番号３に少なくとも５５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする１つのポリヌクレオチド配列；又は、
ｄ）配列番号４に少なくとも５０％の配列同一性を有する１つのポリペプチド、若しくは配列番号４に少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする１つのポリヌクレオチド配列
を同定するステップをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
（ａ）ｃ）又はｄ）のポリペプチドが、配列番号２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８若しくは４０のポリペプチド、又は配列番号２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８若しくは４０のポリペプチドに少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドである、あるいは、
（ｂ）ｃ）又はｄ）のヌクレオチドが、配列番号２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８若しくは４０のポリペプチドをコードするヌクレオチド、又は配列番号２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８若しくは４０のポリペプチドに少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチドである、
請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
（ａ）脂質生合成に関与するタンパク質をコードし、かつ、
（ｉ）アシル特異的Ｃドメイン、又はアシル特異的Ｃドメインをコードするポリヌクレオチドを示すポリペプチド配列の１つ又は複数を含む、
基準配列のデータベースと、
（ｂ）（ｉ）データベース中の各基準配列に対して比較するための試験配列を受け取ることと；
（ｉｉ）比較の結果を表示することと、
が可能であるユーザインターフェースと
を含むコンピュータシステム。
【請求項２５】
基準配列が、
（ｉｖ）アデニル化酵素を示すポリペプチド配列、又はアデニル化酵素をコードするポリヌクレオチド；及び、
（ｖ）アシルキャリアタンパク質を示すポリペプチド配列、又はアシルキャリアタンパク質をコードするポリヌクレオチド
の１つ又は複数をさらに含む、請求項２４に記載のコンピュータシステム。
【請求項２６】
（ａ）（ｉ）の基準配列が、配列番号１、２、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１及び２２から選択され；
（ｂ）（ｉｖ）の基準配列が、配列番号３、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３及び３４から選択され；かつ、
（ｃ）（ｖ）の基準配列が、配列番号４、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７及び４８から選択される、
請求項２５のコンピュータシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リポペプチドの生合成に関与する遺伝子及びタンパク質、並びに関連化合物と、新規リポペプチド生合成遺伝子座を見出し操作するための方法、システム及び組成物、並びに新規リポペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願は、２００１年１２月２６日に出願した米国仮出願第６０／３４２，１３３号、２００２年４月１７日に出願した米国仮出願第第６０／３７２，７８９号の利益を主張するものである。本出願は、２００１年１０月１５日に出願した米国出願第０９／９７６，０５９号、及び２００２年９月３日に出願した米国出願第１０／２３２，３７０号（米国出願第０９／９１０，８１３号の一部継続出願）の一部継続出願である。上記出願の教示内容は、それら全体を参照により本明細書に組み入れるものとする。
【０００３】
リポペプチドは、抗生物質、抗真菌剤又は抗ウィルス剤として生物工学用途及び医薬用途において可能性が高い、効果のある広域抗生物質活性を示す天然産物である。例としては、リケニシン（ｌｉｃｈｅｎｙｓｉｎ）、フェンギシン（ｆｅｎｇｙｃｉｎ）、スルファクチン（ｓｕｒｆａｃｔｉｎ）、シリンゴマイシン（ｓｙｒｉｎｇｏｍｙｃｉｎ）、セラウェッチン（ｓｅｒｒａｗｅｔｔｉｎ）、ラモプラニン（ｒａｍｏｐｌａｎｉｎ）、ダプトマイシン（ｄａｐｔｏｍｙｃｉｎ）、Ａ５４１４５、ストレプトマイセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）由来の「カルシウム依存性抗生物質」、エチノカンジン（ｅｃｈｉｎｏｃａｎｄｉｎ）、プネウモカンジン（ｐｎｅｕｍｏｃａｎｄｉｎ）、アクレアシン（ａｃｕｌｅａｃｉｎ）などの化合物が挙げられる。近縁種の一連の放線菌リポペプチド産生菌体の群であっても、リポペプチド天然産物は構造上異なっている可能性があり、それら天然産物の化学的特徴に基づいて異なる亜群に分類することができる。リポグリコペプチドはリポペプチド天然産物であるが、それは例えばグリコシル化されたラモプラニンである。酸性リポペプチドは、リポペプチド（例えば、ダプトマイシン、Ａ５４１４５及びストレプトマイセス・コエリカラー由来のカルシウム依存性抗生物質）のペプチド鎖部位に組み込まれている酸性アミノ酸残基を有することを特徴とするリポペプチド天然産物である。
【０００４】
一つの微生物は、遊離アミン（通常、ペプチドコアのＮ末端アミン）を介してペプチドコアに結合されている脂質成分が異なる一連のリポペプチド類の混合物を産生し得る。この脂質成分は、リポペプチド天然産物の生物学上の特性に重大な影響を有し得る。例えば、Ｓ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓによって産生されるリポペプチド抗生物質Ａ２１９７８Ｃ複合体は、少なくとも一連の６種類の微生物学的活性因子Ｃ０、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４及びＣ５を含んでいる。リポペプチド抗生物質Ａ２１９７８Ｃ複合体のすべての因子は、同一の１３個のアミノ酸からなる環状酸性ポリペプチドコアを有するが、末端アミノ基の脂肪アシル基の同一性が互いに異なる。その異なる複数のＡ２１９７８Ｃ因子における生物学的特性（例えば抗菌作用、毒性、溶解度）は多様である。また、Ａ２１９７８Ｃ複合体の一部として同定されているその６つの因子のうちの１つであるＡ２１９７８Ｃ因子Ｃ０は、ダプトマイシンとして知られている。同様に、Ｓ．ｆｒａｄｉａｅによって産生されるＡ５４１４５抗生物質は、Ａ２１９７８Ｃ複合体に関連するリポペプチドの一群である。Ａ２１９７８Ｃ複合体と同様に、Ａ５４１４５抗生物質は、少なくとも８つの一連の微生物学的活性因子、Ａ、Ａ１、Ｂ、Ｂ１、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦを含んでいる。Ａ５４１４５の各因子は、環状の１３個からなるアミノ酸、酸性ポリペプチドコア、及びＮ末端アミンに結合している脂肪アシル基を有する。Ａ５４１４５のその８つの因子は、ペプチドコアの位置１２及び位置１３のアミノ酸残基の同一性、並びに、位置１のアミノ酸残基の末端アミノ基に結合している脂肪アシル基の同一性が異なる。依然として、リポペプチド天然産物及び関連化合物の発見に有用な組成物、方法及びシステムが必要とされている。
【０００５】
天然産物を見出すための方法は多くの課題に直面してきている。微生物由来の天然産物に焦点をあてて見つけ出そうとする努力は、微生物の培養が困難であることによって阻まれ、実際、大部分の微生物が未だｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養されてはいない。さらに、多数の培養微生物は発酵の影響を受けやすい。さらに、２次代謝産物の多くは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下では、検出可能な濃度まで発現されない。また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下で産生される天然産物は、増殖条件（例えば、供給する栄養源）により変動することが多く、微生物の生合成に関する可能性を最大限に示すとは限らない。このため、リポペプチドを見出すためのゲノミクスベースの組成物、方法及びシステムは、これらの１つ以上の欠点を回避し、あるいは軽減することができるであろう。
【０００６】
微生物により産生されるリポペプチドは、非リボソーム型ペプチド合成酵素（ＮＲＰＳ）と称する大型の多機能タンパク質上でリボソームとは無関係に合成される（Ｄｏｅｋｅｌ  ａｎｄ  Ｍａｒａｈｉｅｌ、２００１、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｖｏｌ．３、ｐｐ．６４−７７）。ＮＲＰＳ類は、各々がモジュールから構成されている、１個又は複数の多官能性ポリペプチドからなるモジュールタンパク質である。各モジュールのアミノ末端からカルボキシ末端までの順序と特性は、ペプチド産物のアミノ酸残基の配列順序と相同性に一致する。各ＮＲＰＳモジュールは、特定のアミノ酸基質を認識し、段階的な縮合を触媒して伸長するペプチド鎖を形成する。ある特定の単位が認識するアミノ酸の相同性は、すでに判明している他の単位の特性と比較することによって決定することができる（Ｃｈａｌｌｉｓ  ａｎｄ  Ｒａｖｅｌ、２０００、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、Ｖｏｌ．１８７、ｐｐ．１１１−１１４）。結核菌ゲノム由来のミコバクチン生合成遺伝子クラスタの同定によって示されているように、多くのペプチド合成酵素では、ペプチド合成酵素中の繰り返し単位の順序と、各アミノ酸がペプチド産物中に出現する順序の間に厳密な相関があり、それにより、構造が知られているペプチドとそれらの合成をコードする推定遺伝子とを相関させることが可能である（Ｑｕａｄｒｉ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．５、ｐｐ．６３１−６４５）。
【０００７】
ペプチド合成酵素のモジュールは、ペプチド産物を形成するための認識、活性化、修飾及びアミノ酸前駆体の結合においてそれぞれが特定の役割を互いに果たす、さらに小型の単位又は「ドメイン」からなる。ドメインの１つのタイプであるアデニル化（Ａ）ドメインは、ペプチド合成酵素のある特定の単位により組み込まれるアミノ酸を選択的に認識し、活性化することができる。この活性化ステップはＡＴＰ依存性であり、アミノアシルアデニレートの一時的な形成が関与する。かかる活性化アミノ酸は、別のタイプのドメインであるチオール化（Ｔ）ドメイン（通常は、Ａドメインに隣接して位置している）を通じてペプチド合成酵素に共有結合する。このＴドメインは、保存されているセリン残基にホスホパンテテイン補欠分子族が共有結合することにより翻訳後修飾される。かかる活性化アミノ酸基質は、各Ｔドメインのホスホパンテテイン補欠分子族に対するチオエステル結合を介して非リボソーム型ペプチド合成酵素上に結合される。このペプチド合成酵素の連続単位に結合したアミノ酸は、その後、別のタイプのドメイン、すなわち縮合（Ｃ）ドメインが触媒となるアミド結合の形成によって共有結合する。
【０００８】
ペプチドコアへの脂質成分の結合に関する機構についてはほとんど解明されていない。リポペプチド天然産物にアシル基が付加される酵素的機構又はタイミングに関する文献はほとんどない。特に、ペプチド天然産物のＮ−アシル化に関与する酵素は同定されておらず、アシル化が、ペプチドコアの形成前に、形成と同時に、あるいは形成後に起こるかどうかについては未だ知られていない。Ｄｏｅｋｅｌ及びＭａｒａｈｉｅｌ（２００１、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、３、６４−７７）は、ペプチド合成酵素中の触媒ドメインを調査し、縮合ドメイン配列がＮＲＰＳのドメインアレンジメントにより変化していることを報告し、Ｃ末端からエピマー化ドメインに位置する縮合ドメイン、Ｃ末端からチオール化ドメインに位置する縮合ドメイン、及びリポペプチドの構築時のアシル移転の開始に関与している縮合ドメインについて言及している。脂質成分がペプチドコアに共有結合される機構が理解されれば、組換ＤＮＡ技術により所与のペプチドコア上に脂肪アシル成分を選択的に導入することが可能となり、あるいは組換ＤＮＡ技術により所望の１種又は複数の脂肪アシル成分を含有する産物の収率を高めることができるであろう。
【０００９】
選択的な栄養源供給実験によれば、増殖栄養源がリポペプチド産物の相対量に影響を及ぼし得ることが明らかになっている。ある特定の脂質前駆体の合成を促進する増殖条件では、その脂質成分を含む対応するリポペプチドが主に合成される。例えば、ダプトマイシンは、通常、Ｓ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓによりごく微量産生される。このため、適当量の生物学的に純粋なダプトマイシンを生成するには多大なる努力が必要となっている。オレイン酸メチル中１：１（ｖ：ｖ）混合されたカプロン酸又はカプリン酸を含む発酵培地を連続供給すると、ダプトマイシンの収率が上昇することが示唆されている（Ｒ．Ｈ．Ｂａｌｔｚ、Ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  Ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｄｉａｅ、ｉｎ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐｐ．４１５−４３５、ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｗ．Ｒ．Ｓｔｒｏｈｌ）。あるいは、Ａ２１９７８Ｃ因子の酵素的脱アシル化に必要とされる化学工程、化合物のペプチド部分に存在するある種の反応性側鎖の保護、脂肪アシル基の合成的付加、及び所望のダプトマイシン産物を産出するための最終的な脱保護が開発されている。しかし、これらの方法は、化合物特異的であり、煩雑かつ非能率的である。
【特許文献１】米国仮出願第６０／３４２，１３３号
【特許文献２】米国仮出願第第６０／３７２，７８９号
【特許文献３】米国出願第０９／９７６，０５９号
【特許文献４】米国出願第１０／２３２，３７０号
【特許文献５】米国出願第０９／９１０，８１３号
【特許文献６】米国特許第４，３０３，６４６号
【特許文献７】米国特許第４，４２７，６５６号
【特許文献８】ＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＣＡ０１／０１４６２号
【特許文献９】米国特許出願第１０／ＸＸＸ，ＸＸＸ号
【特許文献１０】米国特許出願第６０／３７２，７８９号
【特許文献１１】米国特許第４，９７７，０８３号
【非特許文献１】Ｄｏｅｋｅｌ  ａｎｄ  Ｍａｒａｈｉｅｌ、２００１、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｖｏｌ．３、ｐｐ．６４−７７
【非特許文献２】Ｃｈａｌｌｉｓ  ａｎｄ  Ｒａｖｅｌ、２０００、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、Ｖｏｌ．１８７、ｐｐ．１１１−１１４
【非特許文献３】Ｑｕａｄｒｉ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．５、ｐｐ．６３１−６４５
【非特許文献４】Ｄｏｅｋｅｌ  ａｎｄ  Ｍａｒａｈｉｅｌ（２００１、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、３、６４−７７）
【非特許文献５】Ｒ．Ｈ．Ｂａｌｔｚ、Ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  Ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｄｉａｅ、ｉｎ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐｐ．４１５−４３５、ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｗ．Ｒ．Ｓｔｒｏｈｌ
【非特許文献６】Ｂｅｎｔｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００２、Ｎａｔｕｒｅ、ｖｏｌ．４１７、ｐｐ  １４１−１４７
【非特許文献７】Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−４１０；Ｇｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：２６６−２７２
【非特許文献８】ＭｃＨｅｎｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｂａｃｔ．Ｖｏｌ．１８０  ｐｐ．１４３−１５１
【非特許文献９】Ｌｉｎｎｅ  ａｎｄ  Ｍａｒａｈｉｅｌ、２０００、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ．３９、ｐｐ．１０４３９−１０４４７
【非特許文献１０】Ｇｕｅｎｚｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２７３、ｐｐ．３２８５７−３２８６３
【非特許文献１１】Ｌｉｎｄｕｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｖｏｌ．１８０、ｐｐ．６３８４−６３８８
【非特許文献１２】Ｓｔｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．６、ｐｐ．３１−４１
【非特許文献１３】Ｋｏｎｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂａｃｔ．Ｖｏｌ．１８１、ｐｐ．１３３−１４０
【非特許文献１４】Ｈａｊａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．９、ｐｐ．１１７５−１１８７
【非特許文献１５】Ｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．２７、ｐｐ．１５７−１６２
【非特許文献１６】Ｄｕｉｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ．Ｖｏｌ．９６、ｐｐ．１３２９４−１３２９９
【非特許文献１７】Ｔｓｕｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂａｃｔ、Ｖｏｌ．１８３、ｐｐ．６２６５−６２７３
【非特許文献１８】Ｅｃｏｐｉａ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ；ＣＡ  ２，３５２，４５１
【非特許文献１９】Ｍｏｏｔｚ  ｅｔ  ａｔ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．Ｖｏｌ．９７  ｐｐ．５８４８−５８５３
【非特許文献２０】Ｃｈｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  Ｖｏｌ．９８  ｐｐ．８５４８−８５５３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
このため、リポペプチド及びその誘導体を産生する改良された方法が強く求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
一態様では、本発明は、単離されたポリヌクレオチドが、配列番号１及び２から選択される少なくとも１つの配列に少なくとも４５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、アシル特異的Ｃドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。ある実施形態では、１つ又は複数の配列、特に、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＢ３８５１８のＮＲＰＳタンパク質のＣドメインに対応するヌクレオチド配列（すなわち、Ｇｅｎｂａｎｋヌクレオチドアクセッション番号ＡＬ９３９１１５の１９５１３５〜２１７５２６、及び配列番号２１と同じである）を特に除く。他の実施形態では、放線菌（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）分類群の微生物以外の微生物に由来する核酸配列を除く。他の配列は、本発明の範囲から逸脱することなく除外され得る。関連の態様では、本発明は、（ａ）配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９からなる群から選択される配列；（ｂ）（ａ）に相補的な配列；（ｃ）高ストリンジェンシーな条件下で前記の（ａ）又は（ｂ）の配列にハイブリダイズする配列；及び、（ｄ）前記の（ａ）（ｂ）又は（ｃ）の配列に少なくとも７０％以上の相同性を有する配列、からなる群から選択される配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。ある実施形態では、１つ又は複数の配列、特に、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＢ３８５１８のＮＲＰＳタンパク質のＣドメインに対応するヌクレオチド配列（すなわち、Ｇｅｎｂａｎｋヌクレオチドアクセッション番号ＡＬ９３９１１５の１９５１３５〜２１７５２６、及び配列番号２１と同じである）を特に除く。他の実施形態では、放線菌分類群の微生物以外の微生物に由来する核酸配列を除く。他の配列は、本発明の範囲から逸脱することなく除外され得る。本発明の一実施形態では、単離されたポリヌクレオチドによってコードされているアシル特異的Ｃドメインは、リポペプチドアシルキャッピングを含む。一実施形態では、アシル特異的Ｃドメインは、アクセッション番号ＩＤＡＣ  １９０９０１−２、ＩＤＡＣ  ２６０２０２−１、及びＩＤＡＣ  ２６０２０２−５を各々有するコスミド００８ＣＨ、１８４ＣＭ、及び０２４ＣＫ中に存在する。
【００１２】
さらなる実施形態では、アシル特異的Ｃドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドは、アクチノプラネス菌種（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｓｐ．）ＡＴＣＣ  ３３０７６由来のラモプラニン（ｒａｍｏｐｌａｎｉｎ）の生合成遺伝子座；ストレプトマイセス・ロゼオスポルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ）ＮＲＲＬ  １１３７９由来のＡ２１９７８Ｃの生合成遺伝子座；ストレプトマイセス・フラディエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｄｉａｅ）ＡＴＣＣ  １８１５８由来のＡ５４１４５の生合成遺伝子座；ストレプトマイセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）由来のカルシウム依存性抗生物質の生合成遺伝子座；ストレプトマイセス・ガナエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−１２１０４由来のリポペプチド天然産物の生合成遺伝子座；ストレプトマイセス・レフイノウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｅｆｕｉｎｅｕｓ）ＮＲＲＬ  ３１４３由来のリポペプチド天然産物の生合成遺伝子座；ストレプトマイセス・アイズネンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｉｚｕｎｅｎｓｉｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−１１２７７由来のリポペプチド天然産物の生合成遺伝子座；アクチノプラネスニポネンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｎｉｐｐｏｎｅｎｓｉｓ）ＦＤ  ２４８３４  ＡＴＣＣ  ３１１４５由来のリポペプチド天然産物の生合成遺伝子座；及び、ストレプトマイセス菌種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）微生物由来のリポペプチド天然産物の生合成遺伝子座、からなる群から選択された遺伝子座に存在する。
【００１３】
別の実施形態では、アシル特異的Ｃドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）（ＣＡＤＡ）由来のカルシウム依存性抗生物質の生合成遺伝子座には存在しない。
【００１４】
また、本発明は、第１のポリヌクレオチドが配列番号１及び２から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドに少なくとも４５％の相同性を有するポリペプチドをコードし、かつ第２のポリヌクレオチドが、配列番号３に少なくとも５５％の配列同一性を有するポリペプチドと配列番号４に少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドをコードするものである、単離された２つ以上のポリヌクレオチドを提供する。関連する態様では、本発明は、第１のポリヌクレオチドがアシル特異的Ｃドメインをコードし、かつ第２のポリヌクレオチドがアデニル化酵素、アシルキャリアタンパク質、又はアデニル化酵素とアシルキャリアタンパク質の融合物をコードするものである、２つ以上の単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１５】
また、本発明は、（ａ）配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５及び４７からなる群から選択される配列；（ｂ）（ａ）に相補的な配列；（ｃ）高ストリンジェンシーな条件下で前記の（ａ）又は（ｂ）の配列にハイブリダイズする配列、及び、（ｄ）前記の（ａ）（ｂ）、又は（ｃ）の配列に少なくとも７０％以上の相同性を有する配列、からなる群から選択される配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号３に少なくとも５５％の配列同一性を有するポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドをコードする。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４に少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする。
【００１６】
一実施形態では、ポリヌクレオチドはアデニル化酵素をコードする。別の実施形態では、ポリヌクレオチドはアシルキャリアタンパク質をコードする。さらなる実施形態では、ポリヌクレオチドは、アデニル化酵素及びアシルキャリアタンパク質の融合物をコードする。別の実施形態では、アデニル化酵素、アシルキャリアタンパク質、又は前記２つの融合物をコードするポリペプチドは、アクチノプラネス菌種（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｓｐ．）ＡＴＣＣ  ３３０７６由来のラモプラニン（ｒａｍｏｐｌａｎｉｎ）の生合成遺伝子座；ストレプトマイセス・ロゼオスポルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ）ＮＲＲＬ  １１３７９由来のＡ２１９７８Ｃの生合成遺伝子座；ストレプトマイセス・フラディエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｄｉａｅ）ＡＴＣＣ  １８１５８由来のＡ５４１４５の生合成遺伝子座；ストレプトマイセス・ガナエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−１２１０４由来のリポペプチド天然産物の生合成遺伝子座；ストレプトマイセス・レフイノウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｅｆｕｉｎｅｕｓ）ＮＲＲＬ  ３１４３由来のリポペプチド天然産物の生合成遺伝子座；ストレプトマイセス・アイズネンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｉｚｕｎｅｎｓｉｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−１１２７７由来のリポペプチド天然産物の生合成遺伝子座；アクチノプラネスニポネンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｎｉｐｐｏｎｅｎｓｉｓ）ＦＤ  ２４８３４  ＡＴＣＣ  ３１１４５由来のリポペプチド天然産物の生合成遺伝子座；及び、ストレプトマイセス菌種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）微生物由来のリポペプチド天然産物の生合成遺伝子座、からなる群から選択される生合成遺伝子座に由来している。一実施形態では、アデニル化酵素は、各々アクセッション番号ＩＤＡＣ  １９０９０１−２及びＩＤＡＣ  ２６０２０２−５を有するコスミド００８ＣＯ及び０２４ＣＫ由来である。別の実施形態では、アシルキャリアタンパク質は、各々アクセッション番号ＩＤＡＣ  １９０９０１−３及びＩＤＡＣ  ２６０２０２−５を有するコスミド００８ＣＨ及び０２４ＣＫ由来である。一実施形態では、アデニル化酵素及びアシルキャリアタンパク質を含有する融合タンパク質は、アクセッション番号ＩＤＡＣ  ２６０２０２−１を有するコスミド１８４ＣＭ由来である。
【００１７】
また、本発明は、配列番号１及び配列番号２から選択される少なくとも１つの配列に少なくとも４５％の配列相同性を有する単離されたアシル特異的Ｃドメインを提供する。ある実施形態では、１つ又は複数の配列、特に、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＢ３８５１８及び配列番号２２のＮＲＰＳタンパク質のＣドメインに対応するポリペプチド配列を特に除く。他の実施形態では、放線菌分類群の微生物以外の微生物に由来するポリペプチド配列を除く。本発明の範囲から逸脱しない限り、他の配列が除外し得る。関連する態様では、本発明は、（ａ）配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０及び２２からなる群から選択される配列；並びに（ｂ）前記の（ａ）の配列に少なくとも７０％以上の相同性を有する配列、からなる群から選択されるポリペプチド配列を含む、単離されたアシル特異的Ｃドメインを提供する。ある実施形態では、１つ又は複数の配列、特に、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＢ３８５１８及び配列番号２２のＮＲＰＳタンパク質のＣドメインに対応するポリペプチド配列を特に除く。他の実施形態では、放線菌分類群の微生物以外の微生物に由来するポリペプチド配列を除く。本発明の範囲から逸脱しない限り、他の配列が除外し得る。
【００１８】
さらに、本発明は、第１の単離されたポリペプチドが、配列番号１及び配列番号２から選択される少なくとも１つの配列に少なくとも４５％の相同性を有するアシル特異的Ｃドメインであり、かつ第２の単離されたポリペプチドが、配列番号３に少なくとも５５％の同一性を有するポリペプチドと配列番号４に少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドからなる群から選択されるものである、２つ以上の単離されたポリペプチドを提供する。また、さらなる態様では、本発明は、少なくとも１つのアシル特異的Ｃドメインポリペプチドと、アデニル化タンパク質及びアシルキャリアタンパク質からなる群から選択される別のポリペプチドとを含む、Ｎ−アシルキャッピングカセットを提供する。
【００１９】
一実施形態では、単離されたアシル特異的Ｃドメインがストレプトマイセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）（ＣＡＤＡ）由来のカルシウム依存性抗生物質の生合成遺伝子座由来ではない。
【００２０】
また、本発明は、（ａ）配列番号２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６及び４８；並びに、（ｂ）前記の（ａ）の配列に少なくとも７０％以上の相同性を有している配列、からなる群から選択されるポリペプチドを含む、単離されたポリペプチドを提供する。一実施形態では、かかる単離されたポリペプチドは、ストレプトマイセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）（ＣＡＤＡ）由来のカルシウム依存性抗生物質の生合成遺伝子座由来ではない。
【００２１】
さらに、本発明は、（ａ）ポリヌクレオチド若しくはポリペプチド配列の同定、分析又は表示のモデル化を行う方法を実行するのに十分な命令を含んでいる媒体上に格納されているコンピュータプログラムと；（ｂ）ｉ）配列番号１又は配列番号２のいずれかと少なくとも４５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、アシル特異的Ｃドメインをコードするポリヌクレオチド；ｉｉ）配列番号３と少なくとも５５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；及び、ｉｉｉ）配列番号４と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択されるポリヌクレオチドの配列を示す前記媒体上に格納されているデータと；（ｃ）配列の論理的なサブコンポーネントに対応するデータ要素へ前記コンピュータプログラムがアクセスするのを容易にするための前記データの基本的な構成及び構造を反映し、前記データ構造が、前記プログラムに、かつコンピュータプログラムが前記データを系統化しアクセスする方法に固有のものであるデータ構造とを含むコンピュータ解読可能媒体を提供する。関連する態様では、本発明は、（ａ）ポリペプチド配列の同定、分析又は表示のモデル化を行う方法を実行するのに十分な命令を含んでいる媒体上に格納されているコンピュータプログラムと；（ｂ）ｉ）アシル特異的Ｃドメインを示し（representing）、かつ配列番号１又は配列番号２のいずれかと少なくとも４５％の配列相同性を有するポリペプチド；ｉｉ）配列番号３と少なくとも５５％の配列同一性を有するポリペプチド；及び、ｉｉｉ）配列番号４と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド、からなる群から選択されるポリペプチドの配列を示す媒体上に格納されているデータと；（ｃ）配列の論理的サブコンポーネントに対応するデータ要素へ前記コンピュータプログラムがアクセスするのを容易にするための前記データの基本的な構成及び構造を反映し、前記データ構造が、前記プログラムに、かつコンピュータプログラムが前記データを系統化しアクセスする方法に固有のものであるデータ構造とを含むコンピュータ解読可能媒体を提供する。
【００２２】
また、本発明は、（ａ）配列番号１又は配列番号２のいずれかと少なくとも４５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、アシル特異的Ｃドメインをコードするポリヌクレオチド；（ｂ）配列番号３と少なくとも５５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；及び、（ｃ）配列番号４と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択されるポリヌクレオチドを示すデータを含む、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列の同定、分析又はモデル化を行う方法を実行するようにプログラムされたコンピュータによってアクセス可能なデータを格納するためのメモリを提供する。関連する態様では、本発明は、（ａ）配列番号１又は配列番号２のいずれかと少なくとも４５％の配列同一性を有するポリペプチド；（ｂ）配列番号３と少なくとも５５％の配列相同性を有するポリペプチド；及び、（ｃ）配列番号４と少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチド、からなる群から選択されるポリペプチドを示すデータを含む、ポリペプチドの配列の同定、分析又はモデリングを行う方法を実行するようにプログラムされたコンピュータによってアクセス可能なデータを格納するためのメモリを提供する。
【００２３】
また、本発明は、（ａ）配列番号１又は配列番号２のいずれかと少なくとも４５％の配列相同性を有するポリペプチド、あるいは（ｂ）配列番号１又は配列番号２に少なくとも４５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、同定するステップを含む、リポペプチド生合成に関与するポリペプチド又はかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出する方法であって、前記の少なくとも４５％の配列同一性が、リポペプチド生合成に関与するポリペプチドを示す、前記方法を提供する。一実施形態では、本方法は、（ａ）アシル特異的ドメインを示すポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列からなる群から選択される基準ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列を提供するステップと；（ｂ）前記基準配列を、コンピュータ解読可能媒体上に格納された１つ以上の候補ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列と比較するステップと；（ｃ）前記基準配列と前記の１つ以上の候補配列との間の相同性レベルを検出するステップと；（ｄ）基準配列と少なくとも７０％の相同性を有する候補配列を同定するステップとを含む。一実施形態では、本方法は、さらに、少なくとも、ａ）のポリペプチド又はｂ）のポリヌクレオチドに近接している、ｃ）配列番号３に少なくとも５５％の配列同一性を有する１つのポリペプチド、若しくは配列番号３に少なくとも５５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする１つのポリヌクレオチド配列；又は、ｄ）配列番号４に少なくとも５０％の配列同一性を有する１つのポリペプチド、若しくは配列番号４に少なくとも５０％の配列相同性を有するポリペプチドをコードする１つのポリヌクレオチド配列を同定するステップを含む。本方法の別の実施形態では、ｃ）のポリペプチドが、配列番号２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８若しくは４０のポリペプチド、又は配列番号２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８若しくは４０のポリペプチドに少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドであるか；あるいは、ｄ）のヌクレオチドが、配列番号２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８若しくは４０のポリペプチドをコードするヌクレオチド、又は配列番号２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８若しくは４０のポリペプチドに少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチドである。
【００２４】
また、本発明は、（ａ）脂質生合成に関与するタンパク質をコードし、かつ（ｉ）アシル特異的Ｃドメイン、又はアシル特異的Ｃドメインをコードするポリヌクレオチドを示すポリペプチド配列の１つ以上を含む基準配列のデータベースと、（ｂ）（ｉｉ）データベース中の各基準配列に対して比較するための試験配列を受け取ることと；（ｉｉｉ）比較の結果を示すことと、が可能であるユーザインターフェースとを含むコンピュータシステムを提供する。一実施形態では、コンピュータシステムの基準配列が、（ｉｖ）アデニル化酵素を示すポリペプチド配列、又はアデニル化酵素をコードするポリヌクレオチド；及び（ｖ）アシルキャリアタンパク質を示すポリペプチド配列、又はアシルキャリアタンパク質をコードするポリヌクレオチド、の１つ以上をさらに含む。別の実施形態では、（ｉ）の基準配列は、配列番号１、２、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１及び２２から選択され、（ｉｖ）の基準配列が、配列番号３、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３及び３４から選択され；（ｖ）の基準配列が、配列番号４、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７及び４８から選択される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明は、リポペプチド及び関連化合物を見出すこと、遺伝子操作に有用な組成物、方法及びシステムを提供する。本組成物は、リポペプチド天然産物、リポペプチド遺伝子、リポペプチド遺伝子群及びリポペプチド産生微生物を同定するのに用いることができる。
【００２６】
種々の微生物由来のリポペプチドの生合成遺伝子座を見出し、分析した。便宜上、リポペプチドの生合成遺伝子座とその座が見出されている微生物は、供給元の呼称を参照することにより示すことがある。その場合、「ＲＡＭＯ」はＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｓｐ．ＡＴＣＣ  ３３０７６由来のラモプラニンの生合成遺伝子座を表し、「ＤＡＰＴ」はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ  ＮＲＲＬ  １１３７９由来のＡ２１９７８Ｃの生合成遺伝子座を表し、「Ａ５４１」はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｄｉａｅ  ＡＴＣＣ  １８１５８由来のＡ５４１４５の生合成遺伝子座を表し、「ＣＡＤＡ」は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）由来のカルシウム依存性抗生物質の生合成遺伝子座を表し（Ｂｅｎｔｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００２、Ｎａｔｕｒｅ、ｖｏｌ．４１７、ｐｐ  １４１−１４７）、「００９Ｈ」は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ  ＮＲＲＬ  Ｂ−１２１０４由来のリポペプチド天然産物の生合成遺伝子座を表し、「０２４Ａ」は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｅｆｕｉｎｅｕｓ  ＮＲＲＬ  ３１４３由来のリポペプチド天然産物の生合成遺伝子座を表し、「０２３Ｃ」は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｉｚｕｎｅｎｓｉｓ  ＮＲＲＬ  Ｂ−１１２７７由来のリポペプチド天然産物の生合成遺伝子座を表し、「Ａ４１０」は、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｎｉｐｐｏｎｅｎｓｉｓ  ＦＤ  ２４８３４  ＡＴＣＣ  ３１１４５由来のリポペプチド天然産物の生合成遺伝子座を表し、かつ「０７０Ｂ」は、Ｅｃｏｐｉａ’ｓ  ｐｒｉｖａｔｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．微生物由来のリポペプチド天然産物の生合成遺伝子座を表す。
【００２７】
驚いたことに、リポペプチド生合成遺伝子座に共通の保存された遺伝子ドメイン及び保存された遺伝子が発見された。この保存されたドメインは「アシル特異的Ｃドメイン（特異Ｃドメイン）」と呼ばれ、リポペプチド生合成のためのＮ−アシルキャッピングに関与する縮合ドメイン（Ｃドメイン）を意味する。「アシル特異的Ｃドメイン」は、リポペプチド中の脂質成分とペプチドコアの第１のアミノ酸残基の間で確認されているＮ−アシル化ペプチド結合に必要とされるものである。本発明のアシル特異的Ｃドメインの代表的な例としては、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｓｐ．ＡＴＣＣ  ３３０７６（配列番号６）由来のラモプラニン生合成遺伝子座に存在するアシル特異的Ｃドメイン、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ  ＮＲＲＬ  １１３７９（配列番号８）由来のＡ２１９７８Ｃ座に存在するアシル特異的Ｃドメイン、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｄｉａｅ  ＡＴＣＣ  １８１５８（配列番号１０）由来のＡ５４１４５座に存在するアシル特異的Ｃドメイン、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ  ＮＲＲＬ  Ｂ−１２１０４（配列番号１２）由来のリポペプチド生合成遺伝子座に存在するアシル特異的Ｃドメイン、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｅｆｕｉｎｅｕｓ  ＮＲＲＬ  ３１４３（配列番号１４）由来のリポペプチド生合成遺伝子座に存在するアシル特異的Ｃドメイン、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｉｚｕｎｅｎｓｉｓ  ＮＲＲＬ  Ｂ−１１２７７（配列番号１６）由来のリポペプチド生合成遺伝子座に存在するアシル特異的Ｃドメイン、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｎｉｐｐｏｎｅｎｓｉｓ  ＦＤ  ２４８３４（配列番号１８）ＡＴＣＣ  ３１１４５由来のＡ４１，０１２リポペプチド生合成遺伝子座に存在するアシル特異的Ｃドメイン、Ｅｃｏｐｉａ’ｓ  ｐｒｉｖａｔｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎの中のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ｏｒｇａｎｉｓｍ  ０７０（配列番号２０）由来の推定上のリポペプチド生合成遺伝子座に存在するアシル特異的Ｃドメイン、及び、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）（配列番号２２）由来のカルシウム依存性抗生物質の生合成遺伝子座に存在するアシル特異的Ｃドメインが挙げられる。ある実施形態では、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）由来のカルシウム依存性抗生物質生合成遺伝子座に存在するアシル特異的Ｃドメイン（配列番号２２）、及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＢ  ３８５１８のＮＲＰＳタンパク質のＣドメインに対応するポリペプチド配列を特に除外する。他の実施形態では、放線菌分類群の微生物以外の微生物から得られるポリペプチド配列は、特定して除く。
【００２８】
本発明の「アシル特異的Ｃドメイン」は、ＢＬＡＳＴＰ  ２．０．１０アルゴリズムを用いて、以下の２つのコンセンサス配列のうちの１つに少なくとも４５％の同一性を有する配列が得られるポリペプチド配列として構造上定義される（ｆｉｌｔｅｒ  ｏｐｔｉｏｎ  −Ｆ：ｆａｌｓｅ、ｇａｐ  ｏｐｅｎｉｎｇ  ｐｅｎａｌｔｙ  −Ｇ：１１、ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ  −Ｅ：１、かつ残りのすべてのオプションはデフォルト値）：
＞コンセンサス配列１
2005514067.tif 000002
＞コンセンサス配列２
2005514067.tif 000003
この場合、コンセンサス配列１は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）のカルシウム依存性抗生物質（ＣＡＤＡ）座、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ（ＮＲＲＬ  １１３７９）のＡ２１９７８Ｃ（ＤＡＰＴ）座、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｄｉａｅ（ＡＴＣＣ  １８１５８）のＡ５４１４５座、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｎｉｐｐｏｎｅｎｓｉｓのＡ４１０座、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１２１０４）の００９Ｈ座、及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｅｆｕｉｎｅｕｓ（ＮＲＲＬ  ３１４３）の０２４Ａ座からのアシル特異的縮合ドメインの配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号、ＣＡＢ３８５１７、ＣＡＢ３８５１８；ＣＡＢ３８５１６及びＣＡＢ３８８７６）に基づき、また、コンセンサス配列２は、ラモプラニン（ＲＡＭＯ）座（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｓｐ．ＡＴＣＣ  ３３０７６）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｉｚｕｎｅｎｓｉｓ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１２７７）由来の０２３Ｃ座、及び０７０Ｂ（Ｅｃｏｐｉａ’ｓ  ｐｒｉｖａｔｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから発見された推定上のリポペプチド座）からのアシル特効薬縮合ドメインの配列に基づいている。
【００２９】
これらのコンセンサス配列は、以下のように調製した。まず、これらの列記した配列は、デフォルト設定を用いて、ＣｌｕｓｔａｌＸ  １．８１プログラムによりアライメントをとった。次いでプロファイル隠れマルコフモデル（ｈｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖ  ｍｏｄｅｌ）（ＨＭＭ）をＨＭＭＥＲ２．２パッケージのｈｍｍｂｕｉｌｄプログラム（Ｓｅａｎ  Ｅｄｄｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ；ｗｏｒｌｄ−ｗｉｄｅ−ｗｅｂ  ｈｍｍｅｒ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／）を用いてアラインメントファイルから作製し、ともにデフォルト設定を用いて、ＨＭＭＥＲパッケージのｈｍｍｃａｌｉｂｒａｔｅプログラムにより調整した。簡単に言えば、隠れマルコフモデルプロファイルはファミリーコンセンサス配列の統計学的記述である。ＨＭＭＥＲは、フリーで分配され得るタンパク質配列分析用のＨＭＭプロファイルソフトウェアの実装であり、上記のウェブサイトから利用可能である。最後に、−ｃオプションを用いてＨＭＭＥＲパッケージのｈｍｍｅｍｉｔプログラムによりＨＭＭからコンセンサス配列を作製し、ＨＭＭの確率分布から１つの多数決原理コンセンサス配列を予測した。高度に保存されたアミノ酸残基（ｐ＞＝０．５）は、このコンセンサス配列中、大文字で示し、それ以外は小文字で示している。
【００３０】
「アシル特異的縮合ドメイン（Ｃドメイン）をコードするポリヌクレオチド」とは、アシル特異的Ｃドメインをコードするポリヌクレオチドを意味する。本発明のアシル特異的Ｃドメインをコードするポリヌクレオチドの代表的な例としては、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｓｐ．ＡＴＣＣ  ３３０７６由来のラモプラニン生合成遺伝子座に存在するアシル特異的Ｃドメインをコードするポリヌクレオチド（配列番号５）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ  ＮＲＲＬ  １１３７９のＡ２１９７８Ｃ座に存在するアシル特異的Ｃドメインをコードするポリヌクレオチド（配列番号７）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｄｉａｅ  ＡＴＣＣ  １８１５８のＡ５４１４５座に存在するアシル特異的Ｃドメインをコードするポリヌクレオチド（配列番号９）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ  ＮＲＲＬ  Ｂ−１２１０４のリポペプチド生合成遺伝子座に存在するアシル特異的Ｃドメインをコードするポリヌクレオチド（配列番号１１）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｅｆｕｉｎｅｕｓ  ＮＲＲＬ  ３１４３のリポペプチド生合成遺伝子座に存在するアシル特異的Ｃドメインをコードするポリヌクレオチド（配列番号１３）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｉｚｕｎｅｎｓｉｓ  ＮＲＲＬ  Ｂ−１１２７７のリポペプチド生合成遺伝子座に存在するアシル特異的Ｃドメインをコードするポリヌクレオチド（配列番号１５）、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｎｉｐｐｏｎｅｎｓｉｓ  ＦＤ  ２４８３４  ＡＴＣＣ  ３１１４５のリポペプチド生合成遺伝子座に存在するアシル特異的Ｃドメインをコードするポリヌクレオチド（配列番号１７）、Ｅｃｏｐｉａ’ｓ  ｐｒｉｖａｔｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．の生合成遺伝子座に存在するアシル特異的Ｃドメインをコードするポリヌクレオチド（配列番号１９）、及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）由来のカルシウム依存性抗生物質生合成遺伝子座に存在するアシル特異的Ｃドメインをコードするポリヌクレオチド（配列番号２１）を挙げることができる。ある実施形態では、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）由来のカルシウム依存性抗生物質生合成遺伝子座に存在するアシル特異的Ｃドメインをコードするポリヌクレオチド（配列番号２１）と、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＢ  ３８５１８のＮＲＰＳタンパク質のＣドメインのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列（すなわち、ＣＡＢ３８５１８のＮＲＰＳのヌクレオチド配列を示すヌクレオチドアクセッション番号ＡＬ９３９１１５の座１９５１３５〜２１７５２６に等しい）を特に除く。他の実施形態では、放線菌分類群の微生物以外の微生物から得られるポリペプチド配列を除く。
【００３１】
配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８及び２０のアシル特異的Ｃドメインは、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）非冗長タンパク質データベースに対するＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒの配列と、微生物の遺伝子、経路及び天然産物のＤＥＣＩＰＨＥＲ（登録商標）データベースの配列（Ｅｃｏｐｉａ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｓｔ−Ｌａｕｒｅｎｔ、Ｃａｎａｄａ）について、デフォルトパラメーター設定のＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いて比較した。このＢＬＡＳＴ解析のトップＧｅｎＢａｎｋヒットのアクセッション番号は、対応するＥ値と共に表１に示している。Ｅ値は、２つの配列が十分な類似性を示すかどうかの検出を促進し、相同性の推論を証明するものである。Ｅ値は、確認されたアラインメントスコアに少なくとも等しいアラインメントスコアを有する見込みアラインメントの予測値を意味する。Ｅ値０．００は、完全な相同体を示す。Ｅ値は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−４１０；Ｇｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：２６６−２７２に記載されているようにして計算する。
【００３２】
【表１】
2005514067.tif 000004
2005514067.tif 000005
【００３３】
本明細書では、「アデニル化酵素」又はＡＤＬＥは、リポペプチド生合成のＮ−アシルキャッピングに関与するタンパク質ファミリーのメンバーを意味する。本発明の代表的なアデニル化酵素としては、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｓｐ．ＡＴＣＣ  ３３０７６のラモプラニン生合成遺伝子座に存在するアデニル化酵素（配列番号２２）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ  ＮＲＲＬ  １１３７９のＡ２１９７８Ｃ座に存在するアデニル化酵素（配列番号２４）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ  ＮＲＲＬ  Ｂ−１２１０４のリポペプチドの生合成遺伝子座に存在するアデニル化酵素（配列番号２６）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｅｆｕｉｎｅｕｓ  ＮＲＲＬ  ３１４３のリポペプチド生合成遺伝子座に存在するアデニル化酵素（配列番号２８）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｉｚｕｎｅｎｓｉｓ  ＮＲＲＬ  Ｂ−１１２７７のリポペプチド生合成遺伝子座に存在するアデニル化酵素（配列番号３０）、及びＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｎｉｐｐｏｎｅｎｓｉｓ  ＦＤ  ２４８３４  ＡＴＣＣ  ３１１４５のリポペプチド生合成遺伝子座に存在するアデニル化酵素（配列番号３２）が挙げられる。アデニル化酵素は融合タンパク質の一部であってもよい。例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｄｉａｅ  ＡＴＣＣ  １８１５８のＡ５４１４５座に存在するアデニル化酵素は、ＡＤＬＦと呼ばれる融合タンパク質の残基１〜６４８である（配列番号３４）。
【００３４】
アデニル化酵素は、ＢＬＡＳＴＰ  ２．０．１０アルゴリズムを用いて、以下のコンセンサス配列に少なくとも５５％の同一性を有する配列が得られるポリペプチド配列として構造上定義される（ｆｉｌｔｅｒ  ｏｐｔｉｏｎ  −Ｆ：ｆａｌｓｅ、ｇａｐ  ｏｐｅｎｉｎｇ  ｐｅｎａｌｔｙ  −Ｇ：１１、ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ  −Ｅ：１、かつ残りのすべてのオプションはデフォルト値）：
＞コンセンサス配列３
2005514067.tif 000006
この場合、コンセンサス配列３は、本明細書に記載されているＤＡＰＴ、Ａ４１０、００９Ｈ、０２４Ａ、ＲＡＭＯ及び０２３Ｃリポペプチド座のＡＤＬＥポリペプチド配列、並びにＡ５４１リポペプチド座のＡＤＬＦ（下記に定義されているとおり）ポリペプチド配列の残基１〜６４８に基づいている。コンセンサス配列３は、コンセンサス配列１及び２に関して上に記載されているようにして得られた。
【００３５】
「アデニル化酵素をコードするポリヌクレオチド」又は「ポリＡＤＬＥをコードするヌクレオチド」は、リポペプチド生合成のＮ−アシルキャッピングに関与するタンパク質のＡＤＬＥファミリーのメンバーをコードするポリヌクレオチドを意味する。本発明のアデニル化酵素をコードする代表的なポリヌクレオチドとしては、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｓｐ．ＡＴＣＣ  ３３０７６のラモプラニン生合成遺伝子座に存在するアデニル化酵素をコードするポリヌクレオチド（配列番号２１）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ  ＮＲＲＬ  １１３７９のＡ２１９７８Ｃ座に存在するアデニル化酵素をコードするポリヌクレオチド（配列番号２３）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ  ＮＲＲＬ  Ｂ−１２１０４のリポペプチド生合成遺伝子座に存在するアデニル化酵素をコードするポリヌクレオチド（配列番号２５）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｅｆｕｉｎｅｕｓ  ＮＲＲＬ  ３１４３のリポペプチド生合成遺伝子座に存在するアデニル化酵素をコードするポリヌクレオチド（配列番号２７）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｉｚｕｎｅｎｓｉｓ  ＮＲＲＬ  Ｂ−１１２７７のリポペプチド生合成遺伝子座に存在するアデニル化酵素をコードするポリヌクレオチド（配列番号２９）、及びＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｎｉｐｐｏｎｅｎｓｉｓ  ＦＤ  ２４８３４  ＡＴＣＣ  ３１１４５のリポペプチド生合成遺伝子座に存在するアデニル化酵素をコードするポリヌクレオチド（配列番号３１）が挙げられる。アデニル化酵素をコードするヌクレオチドは、融合タンパク質をコードする遺伝子の一部であってもよい。例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｄｉａｅ  ＡＴＣＣ  １８１５８のＡ５４１４５座に存在するアデニル化酵素をコードするヌクレオチドは、ＡＤＬＦと呼ばれる融合タンパク質をコードするヌクレオチドの残基１〜１９４４である（配列番号３３）。ＡＤＬＦ融合タンパク質のＡＤＬＥ部分は、図中で星印「＊」を付けて明示している場合がある。
【００３６】
配列番号２４、２６、２８、３０、３１、３２、及び配列番号３４の残基１〜６４８のＡＤＬＥポリペプチド、（すなわちＡＤＬＥタンパク質を表わすＡＤＬＦ融合タンパク質の一部分）は、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）非冗長タンパク質データベースに対するＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒの配列と、微生物の遺伝子、経路及び天然産物のＤＥＣＩＰＨＥＲ（登録商標）データベースの配列（Ｅｃｏｐｉａ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｓｔ−Ｌａｕｒｅｎｔ、Ｃａｎａｄａ）について、デフォルトパラメーター設定のＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いて比較した。このＢＬＡＳＴ解析のトップＧｅｎＢａｎｋヒットのアクセッション番号は、対応するＥ値と共に表２に示している。
【００３７】
【表２】
2005514067.tif 000007
2005514067.tif 000008
【００３８】
本明細書では、アシルキャリアタンパク質又はＡＣＰＨという用語は、リポペプチド生合成のＮ−アシルキャッピングに関与するタンパク質のファミリーのメンバーを意味する。本発明の代表的なアシルキャリアタンパク質としては、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｓｐ．ＡＴＣＣ  ３３０７６のラモプラニン生合成遺伝子座に存在するアシルキャリアタンパク質、（配列番号３６）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ  ＮＲＲＬ  １１３７９のＡ２１９７８Ｃ座に存在するアシルキャリアタンパク質（配列番号３８）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ  ＮＲＲＬ  Ｂ−１２１０４のリポペプチド生合成遺伝子座に存在するアシルキャリアタンパク質（配列番号４０）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｅｆｕｉｎｅｕｓ  ＮＲＲＬ  ３１４３のリポペプチド生合成遺伝子座に存在するアシルキャリアタンパク質（配列番号４２）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｉｚｕｎｅｎｓｉｓ  ＮＲＲＬ  Ｂ−１１２７７のリポペプチド生合成遺伝子座に存在するアシルキャリアタンパク質（配列番号４４）、及びＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｎｉｐｐｏｎｅｎｓｉｓ  ＦＤ  ２４８３４  ＡＴＣＣ  ３１１４５のリポペプチド生合成遺伝子座に存在するアシルキャリアタンパク質（配列番号４６）が挙げられる。アシルキャリアタンパク質は、融合タンパク質の一部であってもよい。例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｄｉａｅ  ＡＴＣＣ  １８１５８のＡ５４１４５座に存在するアシルキャリアタンパク質は、ＡＤＬＦと呼ばれる融合タンパク質の残基６４９〜７４３である（配列番号３４）。ＡＤＬＦ融合タンパク質のＡＣＰＨ部分は、図中で２個の星印「＊＊」を付けて明示している場合がある。
【００３９】
アシルキャリアタンパク質（ＡＣＰＨ）は、ＢＬＡＳＴＰ  ２．０．１０アルゴリズムを用いて、以下のコンセンサス配列に少なくとも５０％の同一性を有する配列が得られるポリペプチド配列として構造上定義される（ｆｉｌｔｅｒ  ｏｐｔｉｏｎ  −Ｆ：ｆａｌｓｅ、ｇａｐ  ｏｐｅｎｉｎｇ  ｐｅｎａｌｔｙ  −Ｇ：１１、ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ  −Ｅ：１、かつ残りのすべてのオプションはデフォルト値）：
＞コンセンサス配列４
2005514067.tif 000009
この場合、コンセンサス配列４は、ＤＡＰＴ、Ａ４１０、００９Ｈ、０２４Ａ、ＲＡＭＯ及び０２３Ｃリポペプチド座のＡＣＰＨポリペプチド配列、並びにＡ５４１リポペプチド座のＡＤＬＦポリペプチド配列の残基６４９〜７４３に基づいている。「ＡＣＰＨをコードするポリヌクレオチド」は、上に定義したアシルキャリアタンパク質をコードするヌクレオチド配列として定義する。コンセンサス配列４は、コンセンサス配列１及び２について上に記載したのと同じようにして作製した。
【００４０】
「アシルキャリアタンパク質をコードするポリヌクレオチド」又は「ＡＣＰＨをコードするポリヌクレオチド」とは、リポペプチド生合成のＮ−アシルキャッピングに関与するタンパク質のＡＣＰＨファミリーのメンバーをコードするポリヌクレオチドを意味する。本発明のアシルキャリアタンパク質をコードする代表的なポリヌクレオチドとしては、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｓｐ．ＡＴＣＣ  ３３０７６  のラモプラニン生合成遺伝子座に存在するアシルキャリアタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号３５）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ  ＮＲＲＬ  １１３７９のＡ２１９７８Ｃ座に存在するアシルキャリアタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号３７）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ  ＮＲＲＬ  Ｂ−１２１０４のリポペプチド生合成遺伝子座に存在するアシルキャリアタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号３９）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｅｆｕｉｎｅｕｓ  ＮＲＲＬ  ３１４３のリポペプチド生合成遺伝子座に存在するアシルキャリアタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号４１）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｉｚｕｎｅｎｓｉｓ  ＮＲＲＬ  Ｂ−１１２７７のリポペプチド生合成遺伝子座に存在するアシルキャリアタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号４３）、及びＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｎｉｐｐｏｎｅｎｓｉｓ  ＦＤ  ２４８３４  ＡＴＣＣ  ３１１４５のリポペプチド生合成遺伝子座に存在するアシルキャリアタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号４５）が挙げられる。アシルキャリアタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、融合タンパク質をコードする遺伝子の一部であってもよい。  例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｄｉａｅ  ＡＴＣＣ  １８１５８のＡ５４１４５座に存在するアシルキャリアタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＡＤＬＦと呼ばれる融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの残基１９４５〜２２２９である（配列番号３３）。
【００４１】
配列番号３６、３８、４０、４２、４４及び４６のＡＣＰＨポリペプチドと配列番号３４の残基６４９〜７４３（すなわちＡＤＬＦ融合タンパク質のＡＣＰＨ部分）は、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）非冗長タンパク質データベースに対するＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒの配列と、微生物の遺伝子、経路及び天然産物のＤＥＣＩＰＨＥＲ（登録商標）データベースの配列（Ｅｃｏｐｉａ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｓｔ−Ｌａｕｒｅｎｔ、Ｃａｎａｄａ）について、デフォルトパラメーター設定のＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いて比較した。このＢＬＡＳＴ解析のトップＧｅｎＢａｎｋヒットのアクセッション番号は、対応するＥ値と共に表３に示している。
【００４２】
【表３】
2005514067.tif 000010
2005514067.tif 000011
【００４３】
本明細書では、「ＡＤＬＦ」という用語は、Ａ５４１４５座に位置する１つのオープンリーディングフレーム（配列番号３３）を意味する。この１つのオープンリーディングフレームは、互いに融合したＡＤＬＥ及びＡＣＰＨタンパク質をコードする遺伝子によって形成されている。配列番号３３のオープンリーディングフレームの遺伝子産物は、配列番号３４に記載されているが、配列中、配列番号３４の残基１〜６４８はＡＤＬＥタンパク質を表わし、配列番号３４の残基６４９〜７４３はＡＣＰＨタンパク質を表わす。ＡＤＬＥ及びＡＣＰＨ相同体の同様の融合物が他のリポペプチド生合成遺伝子座でも起こり得ることが予想される。また、本発明のタンパク質ファミリーを含む他の置換融合タンパク質、例えば、ＡＤＬＥ及びＡＣＰＨの融合物、及びアシル特異的Ｃドメイン、又はＡＣＰＨ及びアシル特異的Ｃドメインの融合物がリポペプチド座で発見され得ることも予想される。
【００４４】
本発明の遺伝子を含有するコスミドクローンとタンパク質は、特許手続きの目的のための微生物寄託の国際承認に関するブダペスト条約の条件下において、カナダ国、Ｒ３Ｅ  ３Ｒ２、マニトバ州、ウィニペグ、アーリントンストリート  １０１５のカナダ国保健省微生物局、カナダ国際寄託局（ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｐｏｓｉｔａｒｙ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｎａｄａ、Ｂｕｒｅａｕ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｎａｄａ、１０１５  Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｓｔｒｅｅｔ、Ｗｉｎｎｉｐｅｇ、Ｍａｎｉｔｏｂａ、Ｃａｎａｄａ  Ｒ３Ｅ  ３Ｒ２）に寄託されている。Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｓｐ．ＡＴＣＣ  ３３０７６のラモプラニンに関する生合成遺伝子座にＡＣＰＨ遺伝子とアシル特異的Ｃドメインを含有するコスミドクローン００８ＣＨの宿主である大腸菌ＤＨ１０Ｂ株は、２００１年９月１９日に寄託し、寄託番号ＩＤＡＣ  １９０９０１−３が付与されている。Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｓｐ．ＡＴＣＣ  ３３０７６のラモプラニンに関する生合成遺伝子座にＡＤＬＥ遺伝子を含有するコスミドクローン００８ＣＯの宿主であるＥ．ｃｏｌｌ  ＤＨ１０Ｂ株は、２００１年９月１９日に寄託し、寄託番号ＩＤＡＣ  １９０９０１−２が付与されている。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｅｆｕｉｎｅｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓのリポペプチドに関する生合成遺伝子座にＡＤＬＥ及びＡＣＰＨ遺伝子、並びにアシル特異的Ｃドメインを含有するコスミドクローン０２４ＣＫの宿主である大腸菌ＤＨ１０Ｂ株は２００２年２月２６日に寄託し、寄託番号ＩＤＡＣ  ２６０２０２−５が付与されている。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｄｉａｅのＡ５４１４５リポペプチドに関する生合成遺伝子座にＡＤＬＦ融合タンパク質及びアシル特異的Ｃドメインを含有するコスミドクローン１８４ＣＭの宿主である大腸菌ＤＨ１０Ｂ株は、２００２年２月２６日に寄託し、寄託番号ＩＤＡＣ  ２６０２０２−１が付与されている。大腸菌株の寄託物は、本明細書では「寄託株」と呼称する。
【００４５】
本明細書における配列の任意の記載に矛盾がある場合には、これらの寄託株中に存在するタンパク質ファミリーＡＤＬＥ、ＡＤＬＦ、ＡＣＰＨ及び本発明のアシル特異的Ｃドメインのメンバーをコードするヌクレオチド配列、並びに対応するポリペプチドのアミノ酸配列が優先（ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ）されている。寄託株、寄託株中の核酸、又は寄託株由来の化合物を作製、使用又は販売するには許諾が必要とされているが、かかる許諾は寄託により与えられるものではない。
【００４６】
本明細書では、「リポペプチド合成に関与するポリペプチド」という用語は、アシル特異的Ｃドメイン、アデニル化酵素、又はアシルキャリアタンパク質として本明細書に定義されている任意のポリペプチドを意味する。「リポペプチド合成に関与するポリヌクレオチド」とは、本明細書に定義されているようなリポペプチド合成に関与するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を意味する。
【００４７】
本明細書では、「高ストリンジェンシーな条件」とは、本明細書に記載されているハイブリダイゼーション条件のうちの任意の１つ条件を意味し、かつ当技術分野で知られている他の「高ストリンジェンシーな」条件も含まれる。１つの条件では、まず、固定化した変性核酸を含有する高分子膜を、０．９ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＮａＨ２Ｐ０４（ｐＨ７．０）、５．０ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ、１０×  Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、及び０．５ｍｇ／ｍｌポリリボアデニル酸からなる溶液を用いて、４５℃にて３０分間、プレハイブリダイズする。次いで、約２×１０７ｃｐｍ（比活性４〜９×１０８ｃｐｍ／ｕｇ）の３２Ｐ末端標識化オリゴヌクレオチドプローブを前記溶液に添加する。１２〜１６時間インキュベーションした後、０．５％ＳＤＳを含有する１×ＳＥＴ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス塩酸塩（ｐＨ７．８）、１ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ）で室温にて３０分間前記膜を洗浄し、次いで、オリゴヌクレオチドプローブを、Ｔｍ−１０℃にて新しい１×ＳＥＴ中で３０分間洗浄した。ここで、Ｔｍはプローブの融解温度である。プローブの融解温度より下に変更した温度でハイブリダイゼーションを行うことにより、ストリンジェンシーを変更することができる。プローブの融解温度は次式を用いて計算することができる：１４〜７０個のヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドプローブについては、次式を用いて、摂氏温度の融解温度（Ｔｍ）を計算することができる：Ｔｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（画分Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）（式中、Ｎはオリゴヌクレオチド長である）。ホルムアミドを含有する溶液でハイブリダイゼーションを実施する場合、融解温度は次の式を用いて計算することができる：Ｔｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（画分Ｇ＋Ｃ）−（０．６３％ホルムアミド）−（６００／Ｎ）（式中、Ｎはプローブ長さである）。ヌクレオチド長が２００を超えるプローブについては、ハイブリダイゼーションは１５〜２５℃下方のＴｍで実行することができる。オリゴヌクレオチドプローブなどの短いプローブについては、ハイブリダイゼーションは５〜１０℃下方のＴｍで行うことができる。また、短いプローブについてはハイブリダイゼーションを６×ＳＳＣで行い、長いプローブについては、ハイブリダイゼーションを５０％ホルムアミド含有溶液で行うのが好ましい。
【００４８】
本明細書では、「相同性」という用語は、配列（ヌクレオチド又はアミノ酸のいずれか）の最適アラインメントを意味し、それはアルゴリズムのコンピュータ実装により実施することができる。例えばポリヌクレオチドに関する「相同性」は、デフォルトパラメーター設定のＢＬＡＳＴＮバージョン２．０による解析によって検出することができる。また、ポリペプチド（すなわちアミノ酸）に関する「相同性」は、デフォルトパラメーター設定のＢＬＡＳＴＰバージョン２．２．２などのプログラムにより検出することができる。この場合、比較するポリペプチド又はフラグメントのアライメントをとり、両者間のアミノ酸同一性又は類似性の程度を決定する。アミノ酸「相同性」には、同族置換（すなわち、同様の特性を有する別のアミノ酸によってポリペプチド中の特定のアミノ酸を置換するもの）が含まれることは理解されるであろう。典型的には、以下の置換を同族置換と見なされる：Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅなどの脂肪族アミノ酸の別の脂肪族アミノ酸による置換；ＴｈｒによるＳｅｒの置換又はその逆；Ａｓｐ又はＧｌｕなどの酸性残基の別の酸性残基による置換；アミド基を有する残基（Ａｓｎ又はＧｌｎなど）の別のアミド基を有する残基による置換；Ｌｙｓ又はＡｒｇなどの塩基性残基の別の塩基性残基による置換；Ｐｈｅ又はＴｙｒなどの芳香族残基の別の芳香族残基による置換。「７０％以上の相同性」には、２つ以上のヌクレオチド又はアミノ酸配列の間の、例えば７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％及び最高１００％（同一）の相同性が含まれる。「少なくとも４５％の相同性」には、２つ以上のヌクレオチド又はアミノ酸配列の間の、例えば４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％及び最高１００％（同一）の相同性が含まれる。
【００４９】
本発明は、リポペプチド生合成に関与するポリペプチド又はかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出する方法を提供する。
【００５０】
一実施形態では、本発明の方法は、１つ又は複数の基準配列を提供し、候補配列（特定の１つの候補配列又は候補データベース配列のいずれか）を前記の１つ又は複数の基準配列と比較する。配列相同性は、比較した配列に対して検出される。１つ又は複数の基準配列に少なくとも４５％の相同性を有している候補配列は、候補ポリペプチド又はリポペプチド生合成に関与している候補ポリペプチドをコードする候補ポリヌクレオチドであると考えられる。好ましくは、コンセンサス配列１又は２に４５％の相同性を有する候補ポリペプチド配列をアシル特異的Ｃドメインポリペプチド候補と考え、コンセンサス配列３に５５％の相同性を有する候補ポリペプチド配列をアデニル化酵素候補と考え、コンセンサス配列４に５０％の相同性を有する候補ポリペプチド配列をアシルキャリアタンパク質候補と考える。リポペプチド生合成におけるこれらの同定された配列の関与については、まず、ポリヌクレオチド候補のポリペプチドを発現させ、当技術分野で周知であり、実施例１〜２で本明細書に記載されている方法により機能分析を行うことによって確認することができる。
【００５１】
本発明の別の実施形態では、この主題の方法は、１つ又は複数の基準配列を、特定の微生物の候補データベース内の配列と比較する。本方法は、特定の微生物が、リポペプチド生合成に関与するポリペプチド又はかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有し得るかどうかを検出する。特定の微生物がリポペプチド生合成に関するポリペプチドをコードするかかるポリヌクレオチド配列を含有し得ることが検出された場合、当技術分野で周知であり、かつ実施例１〜２に本明細書に記載されている方法に従って、候補データベース（例えば全体の遺伝子配列の一部）由来のタンパク質を発現させ分析することができる。
【００５２】
好ましい実施形態では、本主題の方法で用いる基準配列は、ＲＡＭＯ、ＤＡＰＴ、Ａ５４１、００９Ｈ、０２４Ａ、０２３Ｃ、Ａ４１０、０７０Ｂ及びＣＡＤＡからなる群から選択される１つ又は複数の生合成遺伝子座のアシル特異的Ｃドメイン、ＡＤＬＥ、ＡＣＰＨ及びＡＤＬＦを表わすポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列からなる群から選択される。
【００５３】
別の好ましい実施形態では、基準配列は、配列番号１又は配列番号２に少なくとも４５％の配列相同性を有する１つ又は複数の基準ポリペプチド、配列番号３に少なくとも５５％の配列相同性を有する１つ又は複数の基準ポリペプチド、配列番号４に少なくとも５０％の配列相同性を有する１つ又は複数の基準ポリペプチド、あるいはかかるポリペプチド配列をコードする１つ又は複数の基準ポリヌクレオチドをさらに含んでいてもよい。
【００５４】
さらに、本発明の範囲内には、コンピュータによりアクセス可能なデータを格納するメモリシステム、コンピュータプログラム及び配列比較用のデータを含むコンピュータ解読可能媒体、並びに本発明の配列比較を行うコンピュータシステムがある。
【００５５】
本発明のコンピュータシステムは、ＲＡＭＯ、ＤＡＰＴ、Ａ５４１、００９Ｈ、０２４Ａ、０２３Ｃ、Ａ４１０、０７０Ｂ及びＣＡＤＡから選択される１つ又は複数の生合成遺伝子座内のアシル特異的Ｃドメイン、アデニル化酵素（ＡＤＬＥ）又はアシルキャリアタンパク質ＡＣＰＨあるいはそれら２つの融合物（ＡＤＬＦ）を表すポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列からなる群から選択される、１つ又は複数の基準ポリヌクレオチド配列又は基準ポリペプチド配列を提供する。
【００５６】
さらに、又はあるいは、本発明のコンピュータシステムは、本発明のコンセンサス配列を含む１つ又は複数の基準ポリペプチド、すなわち、配列番号１又は配列番号２に少なくとも４５％の配列相同性を有する１つ又は複数の基準ポリペプチド、配列番号３に少なくとも５５％の配列相同性を有する１つ又は複数の基準ポリペプチド、配列番号４に少なくとも５０％の配列相同性を有する１つ又は複数の基準ポリペプチド、あるいはかかるポリペプチド配列をコードする１つ又は複数の基準ポリヌクレオチドを提供する。
【００５７】
また、本発明のコンピュータシステムは、候補ポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列を提供することができる。候補ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、特定の一配列として存在してもよく、あるいは、候補データベース（例えば、微生物の全遺伝子配列の一部、又はタンパク質ファミリー配列）であってもよい。
【００５８】
本発明のコンピュータシステムは、１つ又は複数の候補配列と１つ又は複数の基準配列の間の配列比較を行う。また、本コンピュータシステムは、比較した２つ以上の配列の相同性レベルを検出し、配列番号１又は配列番号２と少なくとも４５％の相同性を有する候補配列を同定する。また、ある実施形態では、配列番号３と少なくとも５５％の相同性を有する候補配列、又は配列番号４と少なくとも５０％の相同性を有する候補配列をさらに同定する。
【００５９】
本発明のメモリ及びコンピュータシステムにより、１つ又は複数の基準配列に対する前記配列の相同性について候補データベース及び個別の候補配列を検索する方法を迅速に展開することができる。さらに、本発明のメモリ及びコンピュータシステムにより、ポリヌクレオチド配列からタンパク質配列の予測を、２つ以上のポリペプチド間の相同タンパク質ドメインの予測を、かつ配列データから構造と機能の解析をすることができる。
【００６０】
コンピュータは、ポリペプチド又はポリヌクレオチドの配列の同定、分析又はモデリングを達成する方法を実行するようにプログラムすることができる。一実施形態では、本発明のメモリは、配列番号１、２、３、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６及び４８からなる群から選択される、任意の１つの配列に７０％の配列相同性を有するポリペプチドを表わすデータを含有する。本発明によるソースデータベース用のデータを取得し得る好ましい方法は、図１２及び図１３に説明している。
【００６１】
メモリ及びコンピュータシステムの１つの使用には、微生物のゲノム（例えばデータベース候補配列）を調査し、そのゲノム中のポリヌクレオチド／ポリペプチド配列と１つ又は複数の基準ポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列の間の配列相同性を検出することが含まれる。かかる情報における重要な目的は、微生物がリポペプチド生合成遺伝子座又はリポペプチド生合成に関与する任意のポリヌクレオチド／ポリペプチドを含有しているかどうかを判定することである。
【００６２】
メモリ及びコンピュータシステムの別の使用には、１つ又は複数の特定の候補配列を調査し、その特定の候補ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列と１つ又は複数の基準ポリヌクレオチド又は基準ポリペプチド配列の間の配列相同性を検出することが含まれる。かかる情報は、特定の候補配列がリポペプチド生合成に関与するかどうかを決定するのに有用である。
【００６３】
特定のポリヌクレオチド候補配列又はポリヌクレオチドデータベース候補配列が分析されている場合には、メモリ及びコンピュータシステムによって候補配列からオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を予測することができる。ＯＲＦは、ポリペプチドに翻訳され得るヌクレオチド配列に対応する。かかる配列の伸長は停止コドンによって中断されない。完全長タンパク質のコード配列を表わすＯＲＦは、一般にＡＴＧの「開始」コドンから開始され、３種類の「停止」コドンのうちの１つで終了する。この用途の目的においては、ＯＲＦは、開始コドン及び／又は停止コドンを含むか、あるいは含まない、コード配列の任意の部分であってよい。ＯＲＦを正当な細胞タンパク質をコードする良好な候補として考える場合、最小規模の要件として、例えば、５０個以上のアミノ酸からなるタンパク質をコードするＤＮＡの伸長が設定させることが多い。
【００６４】
上記の配列情報操作を容易に実施し理解するためには、精巧なコンピュータデータベースシステムを用いることができる。一実施形態では、基準配列は、公共の配列データベースから入手可能な情報により電子的に記録し、かつ注釈が施される。かかるデータベースの例としては、ＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ）及びｔｈｅ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（Ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）ｄａｔａｂａｓｅが挙げられる。得られた情報は、ゲノム内の及びゲノム中の基準配列及び遺伝子の間の相同性を検出するために使用可能なリレーショナルデータベースに格納する。
【００６５】
配列間の相同性を同定するには、例えば、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）又はＦＡＳＴ（スミスウォーターマンアルゴリズムを使用）などの１つ又は複数の配列アラインメントアルゴリズムを用いることができる。特に好ましい実施形態では、これらの２つのアライメントプロトコルを組み合わせて用いる。これらのアルゴリズムは両方とも２つの配列間の類似領域を検索する；スミスウォーターマンアルゴリズムは、一般にギャップに対する許容が高く、ＢＬＡＳＴ検索による予備マッチを行った後に、より高度な分析マッチを行うために用いられる。これらのアルゴリズムは、（１）２つの配列の類似領域間のアライメントと、（２）配列間の同一性パーセントを検出する。例えば、アライメントは、本質的な類似性の領域をマッチング（各塩基ごと又は各アミノ酸ごと）することにより計算することができる。
【００６６】
図１１は、本発明の一実施形態によるコンピュータシステムのブロック線図である。図１１に示した本発明の配列比較処理の実施に関するシステムは、単独で、又は特定処理コンピュータとの組み合わせで用いられる汎用コンピュータであってよい。かかる処理は、１つのプラットフォームによって、又は分散処理プラットフォームによって実施することができる。さらにかかる処理及び機能性は、特殊目的ハードウェアの形態で、又は汎用コンピュータにより実行されているソフトウェアの形態でインプリメントすることができる。かかる処理で扱われた、又はかかる処理の結果作製された任意のデータは、一時記憶装置に、例えば、一定のコンピュータシステム又はサブシステムのＲＡＭに格納することができる。さらに、又はあるいは、かかるデータは、長期的な記憶装置、例えば磁気ディスク、書換可能な光ディスクなどに格納することができる。本明細書の開示の目的においては、コンピュータ解読可能な媒体は、かかる既存のメモリ技術、並びに、かかる構造の、及びかかるデータのハードウェア表示又は回路表示をはじめとする、データ保存機構のすべての形態を含み得る。
【００６７】
コンピュータシステム４０（図１１）は、リレーショナルデータベースマネジメントシステム、ワールドワイドウェブアプリケーション及びワールドワイドウェブサーバーを実行するオペレーティングシステム（例えばＵＮＩＸ（登録商標））を含んでいてもよい。コンピュータシステム上のソフトウェアは多数の構成をとることができる。例えば、それは一台のマシンで提供されるか、あるいは複数のマシンにわたって分配され得る。
【００６８】
ワールドワイドウェブアプリケーションには、データベース言語ステートメント［例えば、標準照会言語（ＳＱＬ）ステートメント］の作製に必要な実行可能コードが含まれている。一般に、実行ファイルは埋め込みＳＱＬステートメントを含んでいる。さらに、ワールドワイドウェブアプリケーションには、サーバーを含む種々のソフトウェア実体へのポインター及びアドレスを含有するコンフィギュレーションファイル、サービスユーザリクエストにアクセスが可能でなければならない種々の外部及び内部データベースが含まれていてもよい。また、コンフィギュレーションファイルは、適当なハードウェアにサーバーリソースのレクエストを指示する。必要に応じて、２台以上の個別のコンピュータ上にサーバーを分配すべきである。
【００６９】
ワールドワイドウェブブラウザは、ユーザインターフェース１０（図１１）を提供するために用いることができる。ウェブブラウザを介して、ユーザは、配列データベース及び／又はゲノムのデータベースからデータを検索することの検索リクエストを作成することができる。したがって、ユーザは典型的には、グラフィカルユーザインターフェースで慣用のボタン、プルダウンメニュー、スクロールバーなどのユーザインターフェースエレメントを指し示しクリックする。ユーザのウェブブラウザでそのように作成されたリクエストはウェブアプリケーションに送信され、そこでは、配列データベース又はゲノムデータベースから関係のある情報を抽出するために使用可能なクエリーを得るためにそれらをフォーマットする。
【００７０】
ネットワーク４０がワールドワイドウェブサーバーを用いる場合、ＴＣＰ／ＩＰプロトコルをサポートする。このようなローカルネットワークを「イントラネット」と称する場合もある。かかるイントラネットの長所は、イントラネットがワールドワイドウェブ上に存在するパブリックドメインデータベース（例えばＧｅｎＢａｎｋワールドワイドウェブサイト）と容易にコミュニケーションすることができるということである。したがって、本発明の特に好ましい実施形態では、ユーザは、ウェブブラウザ及びウェブサーバーにより提供されるＨＴＭＬインターフェースを用いて、インターネットデータベース上に存在するデータに（例えば、ハイパーテキストリンクを介して）直接アクセスすることができる。
【実施例１】
【００７１】
リポペプチドのＮ−アシル化に関与する保存された遺伝子及びタンパク質
本発明のアシル特異的Ｃドメイン並びにＡＤＬＥ、ＡＤＬＦ及びＡＣＰＨタンパク質ファミリーは、いくつかの完全長の生合成座を同定し、特徴化し、比較することにより発見されており、それぞれ、既知の構造のリポペプチドを産生するとともに、既知の構造のリポペプチドを産生することが報告されている微生物中に存在している。
【００７２】
ＲＡＭＯ：ラモプラニンはＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｓｐ．ＡＴＣＣ  ３３０７６により産生されるリポペプチドである（米国特許第４，３０３，６４６号を参照されたい）。ラモプラニンは既知の構造のグリコシル化リポデプシペプチドである（例えば、米国特許第４，４２７，６５６号を参照されたい）。Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｓｐ．由来のラモプラニンに関する完全長の生合成座（ＲＡＭＯ）をクローン化し、配列決定した（図１ａ）。また、ＲＡＭＯ中のオープンリーディングフレームを同定した。機能はオープンリーディングフレームによりコードされている各タンパク質によるものであった。ＲＡＭＯは、同時係属中の米国出願第０９／９７６，０５９号、及びＷＯ  ０２／３１１５５号として公開されているＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＣＡ０１／０１４６２号に詳細に記載される。
【００７３】
ＤＡＰＴ：Ａ２１９７８ＣはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓにより産生されるリポペプチドである。Ａ２１９７８Ｃの構造は周知である。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ（ＤＡＰＴ）のＡ２１９７８Ｃの産生をもたらす生合成座の解明に向けたいくつかの進捗状況が報告されているが、完全長の遺伝子座は知られていなかった。ＤＡＰＴの位置を確認するためにトランスポゾン突然変異技術が行われており［ＭｃＨｅｎｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｂａｃｔ．Ｖｏｌ．１８０  ｐｐ．１４３−１５１］、ＤＡＰＴ由来のＤＮＡ断片を挿入突然変異試験に用いたところ、Ａ２１９７８Ｃ産生の不活性化が示された。この断片のＤＮＡ配列の解析により、Ａ２１９７８Ｃ生合成に関与するＮＲＰＳ遺伝子の存在が明らかになった。この遺伝子及び生物学上のデータは、紛れもなく、同定された経路がＡ２１９７８Ｃ発現に実際に関与していたことを示していた。しかし、Ａ２１９７８Ｃに関する完全長の生合成座はこれまで報告されていなかった。
【００７４】
ＤＡＰＴのクローン化に用いた方法、すなわち、７つの完全なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）及び１つの部分的オープンリーディングフレーム（図１ａ）から作製された部分的遺伝子座は、米国特許出願第６０／３４２，１３３号に記載されている。Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓは一般にＮＲＰＳタンパク質を用いてリポペプチドを産生し、発見された多くのＯＲＦはＮＲＰＳタンパク質に対応していた。さらに、発見されたＮＲＰＳ  ＯＲＦの１つは、Ａ２１９７８Ｃ座の一部であることが以前に明らかにされていた部分的ＮＲＰＳ配列を含有しており、それによりＤＡＰＴの同一性が確認された。米国特許出願第６０／３４２，１３３号で７〜９と呼称されているＯＲＦのモジュール及びドメイン構成解析は、米国特許出願第６０／３４２，１３３号に詳細に記載されているＡ２１９７８Ｃの生合成が予測されていたものと一致している。ＯＲＦ  ７〜９により指定されているアミノ酸残基の性質及び配列は、Ａ２１９７８Ｃの正確な化学構造と一致する（米国特許出願第６０／３４２，１３３号の表３及び図１を参照されたい）。米国特許出願第６０／３４２，１３３号に詳細に記載されているこの解析は、紛れもなく、ＤＡＰＴが実際にＳ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ由来のＡ２１９７８Ｃの関する生合成座であることを示している。
【００７５】
Ａ５４１：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｄｉａｅ株ＮＲＲＬ  １８１５８は、既知の構造のリポペプチド抗生物質複合体Ａ５４１４５を産生することが周知であった。しかし、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｄｉａｅ（Ａ５４１）のＡ５４１４５に関する生合成座は知られていなかった。本発明者らは、米国特許出願第６０／３４２，１３３号、米国特許出願第６０／３７２，７８９号、及び同時係属中で、かつ米国特許出願第６０／３４２，１３３号及び米国特許出願第６０／３７２，７８９号の優先権を主張している、米国特許出願第１０／ＸＸＸ，ＸＸＸ号（本出願と同時に出願され、タイトルが「Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅｓ」である）に詳細に記載されているようにして、Ａ５４１をクローン化し、配列決定し、注釈を付した。米国特許出願第１０／ＸＸＸ，ＸＸＸ号の内容は、すべての目的のためにその全文を本明細書に組み入れるものとする。
【００７６】
Ａ５４１は３つの完全な遺伝子と１つの部分的ＮＲＰＳ遺伝子を含んでいる（図１ｂ）。ＮＲＰＳ  ＯＲＦの解析によりアミノ酸の認識、活性化、改変及び縮合に関与する、保存されたドメインの存在が明らかになった。１３個のアミノ酸残基の縮合を担っている合計１３個のモジュールは、Ａ５４１４５が１３個のアミノ酸から構成されると考えると、予想通りに同定された。アデニル化ドメインを試験して、活性化し、ＮＲＰＳの同系統のチオール化ドメインに結合するそれらのアミノ酸の特異性を検出した。ＮＲＰＳ  ＯＲＦによって指定されたアミノ酸残基の性質及び配列は、Ａ５４１４５化学構造で発見されたアミノ酸残基の性質及び配列に正確に一致する（米国特許出願第６０／３７２，７８９号の表４及び図２を参照されたい）。ＯＲＦ  ８（アミノ酸のグリシンを指定する米国特許出願第６０／３７２，７８９号に記載されるモジュール５）のメチル化ドメインは、Ｎ−メチル化グリシン（サルコシン）であるＡ５４１４５の第５番目の位置に組み入れられたアミノ酸に一致する。ＮＲＰＳ遺伝子によって指定されたアミノ酸の性質及び配列、並びにアミノ酸のうちの一部の改変に関与するドメインの存在は、Ａ５４１が実際はＳ．ｆｒａｄｉａｅのＡ５４１４５の生合成座であることを確認するものである。
【００７７】
ＲＡＭＯ、ＤＡＰＴ及びＡ５４１を分析し、かつ比較した。３つの遺伝子座はすべて、従来のアデニル化−チオール化ドメインの代わりに縮合ドメインから始まるＮＲＰＳローディングモジュールを含有する（図１ａ及びｂ、各々、配列番号６、８及び１０）。かかるモジュールは、仮定上のペプチド構築を開始することが不可能であり、Ｃドメインが恐らくこの開始プロセスを妨げるであろうということが一般には考えられる（例えば、Ｌｉｎｎｅ  ａｎｄ  Ｍａｒａｈｉｅｌ、２０００、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ．３９、ｐｐ．１０４３９−１０４４７を参照されたい）。ＲＡＭＯ、ＤＡＰＴ及びＡ５４１の特異ＮＲＰＳ  Ｃドメインの保存されたファミリーメンバーのヌクレオチド配列は、各々、配列番号５、７及び９に記載されている。ＲＡＭＯ、ＤＡＰＴ及びＡ５４１の特異ＮＲＰＳ  Ｃドメインの保存されたファミリーメンバーをコードするポリペプチドは、各々、配列番号６、８及び１０に記載されている。
【００７８】
これらのＣドメインは、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．上掲）を用いて、タンパク質配列のＧｅｎＢａｎｋデータベース（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＵＳＡ）で確認されたタンパク質とのコンピュータによる比較により判断し、その結果を表１に示している。アミノ酸配列比較の解析によれば、ＲＡＭＯ、ＤＡＰＴ及びＡ５４１のＣドメインが他のリポペプチドをコードするＮＲＰＳ系で発見された縮合ドメインと関係があることが明らかにされている。
【００７９】
ＲＡＭＯ、ＤＡＰＴ及びＡ５４１  Ｃドメインを、ＧｅｎＢａｎｋから得られたか、本明細書に記載された種々のリポペプチドＮＲＰＳに由来した縮合ドメインのコレクションと比較した。図２にはこれらのＣドメインの進化の関連性を示している。ＲＡＭＯ、ＤＡＰＴ、Ａ５４１とは別に、図２は、４つの文字による呼称を用いて、追加のリポペプチド生合成座を表している。この場合、ＣＡＤＡはカルシウム依存性抗生物質の生合成座であり、ＦＥＮＧはフェンギシン（ｆｅｎｇｙｃｉｎ）の生合成座であり、ＳＵＲＦはスルファクチン（ｓｕｒｆａｃｔｉｎ）の生合成座であり、ＳＹＲＩはシリンゴマイシン（ｓｙｒｉｎｇｏｍｙｃｉｎ）の生合成座であり、ＳＥＲＲはセラウェッチン（ｓｅｒｒａｗｅｔｔｉｎ）の生合成座であり、ＬＩＣＨはリチェニシン（ｌｉｃｈｅｎｙｓｉｎ）の生合成座であり、ＩＴＵＲはイツリン（ｉｔｕｒｉｎ）の生合成座であり、ＭＹＳＵはマイコスブチリン（ｍｙｃｏｓｕｂｔｉｌｉｎ）の生合成座である。この解析に含まれているＣドメインはすべて完全長のＣドメインである。図２のＣドメインを同定し、識別するために用いられた取り決めは以下のとおりである。ＧｅｎＢａｎｋデータベースから得られたＮＲＰＳ  Ｃドメイン配列は、３文字で始まり、数字（通常５桁）が続くアクセッションによって表示されている。各Ｃドメインを同定するこれらの第１の８つの特性は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号に対応する。小文字の「ｎ」は、「ＮＲＰＳドメイン」であることを表し、「ＣＤ」とその後の２桁の数字は、「Ｃドメイン」とポリペプチド配列上に含まれている他のＣドメインと相対するその数字を示す。例えば「ＡＡＣ８０２８５ｎＣＤ０６｜ＳＹＲＩ」は、シリンゴマイシンの生合成座由来のＮＲＰＳについてＧｅｎＢａｎｋエントリーＡＡＣ８０２８５に含有されている６番目のＣドメインに対応するアミノ酸配列を表わす。本出願で、米国仮特許出願第６０／３４２，１３３号で、又は米国特許出願第０９／９７６，０５９号で初めて記載されているＮＲＰＳ  Ｃドメイン配列は、同様の命名法（ｎＣＤ００）に従うが、３桁の数字で始まる９文字のアクセッションによって表示されている。
【００８０】
Ｃドメインのクラスタアライメントの解析によれば、これらのドメインが、数ある中でも（図２）、カルシウム依存性抗生物質（ＣＡＤＡ）（図１ｅ、ドメイン２２）、スルファクチン（ＳＵＲＦ）、シリンゴマイシン（ＳＹＲＩ）及びマイコサブチリン（ＭＹＣＯ）などの既知のＮ−アシル化リポペプチドの開始モジュールで確認されたＣドメインと進化的に関与していることを示唆している。さらに、これらの特定のＣドメインは、隣接した２個のアミノ酸間のアミド結合形成と縮合を触媒するＮＲＰＳで確認された規則的な縮合ドメインから顕著にかつ進化的に遠位である（図２）。これらの特異Ｃドメインのアライメントは、それらの触媒活性にとって重要なモチーフ及び特定のアミノ酸残基の保存を示している（図３）。これらの知見に基づくと、この特異Ｃドメインは、脂肪酸とアミノ酸のアミノ末端基の間のＮ−アシルペプチド結合を触媒するものと考えられる。
【００８１】
Ａ５４１の活性化酵素をコードする遺伝子は、アシルキャリアタンパク質をコードする遺伝子と一緒になって縮合し、１つのＯＲＦ（ＡＤＬＦ）を形成するが、活性化酵素（ＡＤＬＥ）の保存ファミリーがＲＡＭＯ、ＤＡＰＴ及びＡ５４１に共通であることがさらに確認された。ＲＡＭＯ、ＤＡＰＴ及びＡ５４１中の活性化酵素の保存されたファミリーメンバーのヌクレオチド配列は、各々、配列番号２３、２５及び３５として記載されている。また、これらの活性化酵素をコードするポリペプチドは、各々、配列番号２４、２６及び３６として記載されている。ＡＤＬＦ融合タンパク質のＡＤＬＥ活性化酵素部分は、配列番号３６＊として表している。
【００８２】
Ａ５４１のアシルキャリアタンパク質をコードする遺伝子は、活性化酵素をコードする遺伝子と一緒になって縮合し、１つのＯＲＦ（ＡＤＬＦ）を形成するが、アシルキャリアタンパク質（ＡＣＰＨ）の保存されたファミリーがＲＡＭＯ、ＤＡＰＴ及びＡ５４１に共通であることが確認された。ＲＡＭＯ、ＤＡＰＴ及びＡ５４１中のアシルキャリアタンパク質の保存されたファミリーのメンバーのヌクレオチド配列は、各々、配列番号３７、３９及び３５として記載されている。これらのアシルキャリアタンパク質をコードするポリペプチドは、各々、配列番号３８、４０及び３６として記載されている。ＡＤＬＦ融合タンパク質のＡＣＰＨアシルキャリア部分を配列番号３６＊＊として表している。
【００８３】
ＡＤＬＥ、ＡＤＬＦ及びＡＣＰＨのＯＲＦについての生物学上の機能は、アミノ酸配列類似性解析によって評価した。タンパク質のＡＤＬＥファミリーは、各種のアシルＣｏＡリガーゼ酵素との類似性を示した。この場合、タンパク質のＡＣＰＨファミリーは、アシル縮合ポリケチド合成酵素系で確認されたアシルキャリアタンパク質との配列類似性を有している（表２及び表３）。ＡＤＬＥ  ＯＲＦのクラスタアライメントは、それらの酵素機能にとって重要なドメイン及び残基の保存を示している（図４）。ＡＣＰＨ  ＯＲＦのアライメントは、それらの全体の配列保存と、ホスホパンテテイニル化（ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｙｌａｔｉｏｎ）により修飾されて活性ホロ−アシルキャリアタンパク質を形成するセリン残基の絶対的保存を示している（図５）。ＡＤＬＥ及びＡＣＰＨの両タンパク質ファミリーは、他のリポペプチド遺伝子座由来の対応タンパク質ファミリーに進化的かつ密接に関係している（図６）。
【００８４】
ＡＤＬＥ及びＡＣＰＨタンパク質並びに本発明のアシル特異的Ｃドメインは、グリコシル化リポペプチド及び酸性糖タンパク質をはじめとする、構造上異なったリポペプチドの生合成遺伝子座の全体にわたって広く保存されている。ラモプラニン（Ａ２１９７８Ｃ及びＡ５４１４５）に共通の唯一の構造上の特徴は、Ｎ末端アミノ酸残基で脂肪アシル基が付加されているペプチドバックボーンである。これらの相互関係に基づくと、ＡＤＬＥ及びＡＣＰＨのタンパク質、並びに特異Ｃドメインは、脂肪アシル基の活性化及び結合、並びにＮ−アシルペプチド結合の形成の触媒を可能にしているものと考えられる。
【実施例２】
【００８５】
Ｎ−アシル化ペプチドの生合成：
本発明に記載されているリポペプチドを産生する微生物間の有意な全体の進化の距離にかかわらず、それらはすべて密接に関連のある複数のＣドメインを含有しており、前記ドメインはペプチドＮ−アシル化（ペプチド鎖開始ステップの役を兼ねる１つのステップ）に用いられている。任意の特定の生合成スキーム又は作用機構に限定されるものではないが、ＡＤＬＥ、ＡＣＰＨ及び本発明の特異ＮＲＰＳ  Ｃドメインにより、リポペプチドで確認されているＮ−アシルペプチド結合の形成を説明することができる。図７は、脂肪アシル基がＮＲＰＳによるペプチドの合成を準備するＮＲＰＳ連鎖開始の機構を説明している。ＣｏＡ結合脂肪アシル前駆体は、第１の代謝プールからチャネルされ、かつ変性され、その上さらに、一次代謝の遺伝子によって、又は生合成遺伝子座内の遺伝子によってコードされている、オキシドレダクターゼ、エポキシダーゼ、デサチュラーゼなど補助酵素によってＣｏＡに結合される。次いで、成熟脂肪酸アシル−ＣｏＡ中間体は同系統のアデニル化酵素により認識され、遊離のホロ−ＡＣＰのホスホパンテテイン補欠分子族上に転送されるが、その工程ではＣｏＡ−ＳＨの遊離とＡＴＰの利用がある。あるいは、アデニル化酵素が遊離脂肪アシル基質を認識し、工程においてＡＴＰを利用しながら、遊離のホロ−ＡＣＰのホスホパンテテイン補欠分子族上にそれらを移送することが予測される。一度、遊離のホロ−ＡＣＰ上に脂肪アシル基を結合すると、第１モジュールのＣドメインは、活性化脂肪アシルのカルボニル基が、ＮＲＰＳの第１モジュールにより前に活性化されており、結合されていたアミノ酸基質のアミノ基で縮合される反応を行う。このため、ペプチド鎖開始とＮ−アシル化は緊密に結びついている。次いで、その後のペプチド伸長と終結の各ステップは、典型的なＮＲＰＳモジュールによるもののようにして進めることができる。
【００８６】
図８は、既知のリポペプチド生合成経路の特定の例を用いて、上記のアミノ酸Ｎ−アシル化機構を説明する。ラモプラニン生合成では、ＡＤＬＥ酵素が特定の脂肪酸成分を活性化し、続いて、ＡＣＰＨのホスホパンテテイン補欠分子族上にそれら成分を結合する（本明細書では、配列番号２４及び配列番号３８として記載されている）。次いで、活性化された脂肪アシルのカルボニル基は前にＮＲＰＳの第１のモジュールにより活性されており、かつそれに結合されていたアスパラギン残基（Ａｓｎ）のアミノ基に縮合される。この縮合反応は、アシル特異的Ｃドメインにより触媒される（ＮＲＰＳの第１のモジュールのもの、本明細書では配列番号６として記載されている）（図１ａ及び図８）。
【００８７】
別の例では、抗生物質Ａ５４１４５のアシル化ペプチド鎖の生合成は、活性化と、本明細書では配列番号３６として記載されているＡＤＬＦタンパク質のＡＣＰＨ成分上の特定の脂肪酸単位の結合により開始される。ＡＤＬＦは、リポペプチド生合成における脂肪酸の活性化に必要な、２種類のタンパク質ファミリー（ＡＤＬＥ及びＡＣＰＨ）の融合物を表わす。一度、この脂肪酸が活性化されると、第１モジュールのアシル特異的Ｃドメイン（本明細書では配列番号１０として記載されている）は、脂肪アシルのカルボニル基と、ＮＲＰＳの第１モジュールにより前に活性化されており、それに結合されていたトリプトファン残基（Ｔｒｐ）のアミノ基の縮合を触媒する（図１ｂ及び図８）。
【００８８】
ペプチドのＮ−アシル化についての同一機構が他の微生物に存在するかもしれない。この仮説を立証する証拠としては、非常に多様な微生物中で同定された他のリポペプチドＮＲＰＳ酵素が、第１モジュール中の特定化Ｃドメインを含有しているという事実が挙げられる。その例としては、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．ｓｙｒｉｎｇａｅ由来のシリンゴマイシン生合成遺伝子座；（Ｇｕｅｎｚｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２７３、ｐｐ．３２８５７−３２８６３）；Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｌｉｑｕｅｆａｓｃｉｅｎｓ  ＭＧ１由来のセラウェッチンＷ２生合成遺伝子座（Ｌｉｎｄｕｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｖｏｌ．１８０、ｐｐ．６３８４−６３８８）；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｂ２１３及びＡ１／３由来のフェンギシンの生合成遺伝子座（Ｓｔｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．６、ｐｐ．３１−４１）；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｗｏｔｉｌｉｓ由来のスルファクチンの生合成遺伝子座；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のリケニシンの生合成遺伝子座（Ｋｏｎｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂａｃｔ．Ｖｏｌ．１８１、ｐｐ．１３３−１４０）；及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）由来の「カルシウム依存性抗生物質」（ＣＡＤＡ）の生合成遺伝子座（Ｈａｊａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．９、ｐｐ．１１７５−１１８７）が挙げられる。明らかに、ＣＡＤＡの生合成遺伝子座はアデニル化酵素相同体を有していない。しかし、前記遺伝子座は、Ｎ−アシル化機構の第１のＮＲＰＳモジュールの特異Ｃドメインと一緒になって関与し得る遊離アシルキャリアタンパク質を含有している。したがって、ある種の脂肪酸は、アシルキャリアタンパク質上に脂肪アシル成分を移送することを特定の酵素に要求し得る。しかし一度遊離アシルキャリアタンパク質上に結合されると、その機構は図７に概説されているような機構に類似する。また、ＣＤＡの脂肪アシル成分が、それがエポキシ修飾を含有しているという点で特異であることが指摘されていることに注目すべきである。このため、かかる脂肪酸は、他のある特定の酵素によりＡＣＰ上に移送され得る。
【００８９】
本発明のＮ−アシル化機構が、細菌を越えて、さらに異なる微生物（低真核生物及び他の有機体など）まで及んでいる可能性がある。例えば、カビのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ  ｖａｒ．ｒｏｓｅｕｓ、Ｇｌａｒｅａ  ｌｏｚｏｙｅｎｓｉｓ、及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ  ｖａｒ．ａｃｕｌｅａｔｕｓは、各々、抗菌性のリポペプチド類、エキノカンジンＢ、プノイモカンジンＢＯ、及びアクレアシンＡを産生することが周知である（Ｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．２７、ｐｐ．１５７−１６２）。カビの及び細菌のＮＲＰＳ系の間の相対的類似性と、非常に多様なＮＲＰＳ系がＮ−アシル化の同一機構を利用しているという本発明者らが示した事実によれば、本発明に記載されているペプチドＮ−アシル化の機構は、これらの、及び／又は他のリポペプチドを産生する低真核生物において同様に作用しているであろう。
【００９０】
ペプチドのＮ−アシル化について記載されている機構は明らかに非常に多様な微生物にわたって広がっているが、それはリポペプチドを産生することができる唯一の手段ではない。例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＡＴＣＣ及びＲＢ１４によって各々産生されたリポペプチド類のミコスブチリンとイツリンＡは、互いに、融合脂肪酸合成酵素、アミノ転移酵素及びＮＲＰＳ活性を含む多官能価のハイブリッドポリペプチドによって構築されている（Ｄｕｉｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ．Ｖｏｌ．９６、ｐｐ．１３２９４−１３２９９；Ｔｓｕｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂａｃｔ、Ｖｏｌ．１８３、ｐｐ．６２６５−６２７３）。このペプチドＮ−アシル化の代替機構は、我々の知っている限りにおいては、より進化的に制限される可能性があり、その機構はＢａｃｉｌｌｕｓ属のメンバーにおいてのみ同定されている。また、これらの生合成遺伝子座によって産生されたリポペプチドは、ペプチドコアのアミノ末端に結合されているβ−アミノ脂肪アシル成分を含有するリポペプチドの異なる亜属のメンバーである。Ｎ−アシル化のこの機構がＡＤＬＥ及びＡＣＰＨの相同体に関与していないという事実にかかわらず、図２に示したように、ミコスブチリンとイツリン両方の第１アミノ酸にβ−アミノ脂肪アシル成分を縮合するＣドメインが、アシル特異的Ｃドメインの強調した群内のクラスタで確認されている。
【００９１】
ペプチド天然産物についての広範囲なＮ−アシル化機構により、微生物中のリポペプチド生合成遺伝子座を発見及び同定する知識に基づいた手法を得ることができる。アデニル化酵素、アシルキャリアタンパク質、及び／又はＮ−アシル化機構に関与する特定のＣドメインの特性を識別している高度に保存されたヌクレオチド配列は、対象の微生物中のリポペプチド生合成遺伝子座をすばやく同定し、単離し、特徴付けることを目的として、微生物のゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングするプローブとして同定、利用することができる。また、ＡＤＬＥ、ＡＣＰＨタンパク質及びアシル特異的Ｃドメインの各配列は、微生物の大規模なコレクションのコンピュータ内でのスクリーニングに使用することができる。かかる遺伝子に基づいたスクリーニングは、リポペプチド天然産物の煩雑な発酵、分離及び特徴化を行うことなく、リポペプチド天然産物を産生する遺伝学的な可能性を有する有機体を同定することができるという、従来の発酵手法を超える新たな長所を有する。さらに、非常に定量又は検出不可能な量でのみ通常リポペプチドを産生するそれらの有機体、あるいは非常に特殊な増殖条件下でのみリポペプチドを産生するそれらの有機体は、それにもかかわらず、この遺伝学的手法を用いて容易に同定することができる。
【実施例３】
【００９２】
推定上のリポペプチド生合成遺伝子座００９Ｈの同定：
ＡＤＬＥ、ＡＣＰＨ及びアシル特異的Ｃドメインの各配列は、細菌の二次代謝遺伝子座の専用データベースＤＥＣＩＰＨＥＲ（登録商標）をスクリーニングするためにコンピュータ内で用いた（Ｅｃｏｐｉａ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ；ＣＡ  ２，３５２，４５１）。配列比較を容易にするために、ＤＥＣＩＰＨＥＲ（登録商標）データベースの一部であり、かつＮＲＰＳ及びポリケチド合成酵素など多重モジュールのタンパク質由来のドメイン、並びに非モジュール性タンパク質で確認された同等のドメインを含む、タンパク質ドメインデータベースを作製した。
【００９３】
配列番号６、８及び１０として各々記載されている、アシル特異的Ｃドメインに対応する遺伝子座のＲＡＭＯ、ＤＡＰＴ及びＡ５４１由来のタンパク質配列、配列番号２４、２６及び３６＊として記載されている、ＡＤＬＥのＯＲＦ、並びに配列番号３８、４０及び３６＊＊として記載されている、ＡＣＰＨのＯＲＦは、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．、上掲）を用いて、ＤＥＣＩＰＨＥＲ（登録商標）ドメインデータベースと比較した。さらにまた、本明細書に記載されるＨＭＭＥＲソフトウェアパッケージを用いて作製され、かつ配列番号１、２、３及び４として記載されている、アシル特異的Ｃドメイン、ＡＤＬＥ及びＡＣＰＨタンパク質由来のコンセンサス配列もＤＥＣＩＰＨＥＲ（登録商標）ドメインデータベースと比較した。
【００９４】
配列相同性は、相同性の推論を証明するために２種類の配列が十分な類似性を示すかどうかを示すＥ値により決定した。Ｅ値の０．００は完全な相同体を示す。このＥ値は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−４１０；ｉｎ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．、１９９３．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：２２６−２７２に記載されているようにして計算する。
【００９５】
ＤＥＣＩＰＨＥＲ（登録商標）データベース中の４５０を超える遺伝子座由来の配列を用いたアシル特異的Ｃドメイン配列を比較解析したところ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１２１０４）で確認された遺伝子座００９Ｈに含まれている、縮合ドメイン（本明細書では配列番号１２として記載されている）の存在が明らかになった。表４は、ＰＣＴ／ＣＡ０１／０１４６２に詳細に記載されているラモプラニンＯＲＦ１３で確認された第１モジュールのＣドメインにより例示されているように、配列番号１２が、２種類のアミノ酸の結合を触媒する典型的なＮＲＰＳ縮合ドメインよりも、ＲＡＭＯ、ＤＡＰＴ及びＡ５４１のアシル特異的Ｃドメイン由来の配列（アミノ酸のアミノ末端基にアシル基を縮合する）と高い配列類似性を示すことを示す。
【００９６】
【表４】
2005514067.tif 000012
【００９７】
同様に、配列番号３、２４、２６及び３６＊を有するＡＤＬＥドメイン並びに配列番号４、３８、４０及び３６＊＊を有するＡＣＰＨドメインをＤＥＣＩＰＨＥＲ（登録商標）ドメインデータベースと比較した。比較解析によれば、各々配列番号２８及び配列番号４２として記載され、また、００９Ｈ遺伝子座で確認された、ＡＤＬＥ及びＡＣＰＨの配列に高い配列相同性を有するタンパク質の存在が明らかになった。さらに、アシル特異的Ｃドメイン、ＡＤＬＥ及びＡＣＰＨタンパク質に対する配列番号１２、２８及び４２の関連性は、特定のタンパク質ドメインの保存を示すクラスタ配列アライメントによって、かつ系統発生解析によって確認した（図３〜図６）。
【００９８】
遺伝子座００９Ｈのより詳しい検査により、１３個のモジュールからなる４つのＮＲＰＳ  ＯＲＦの存在が明らかになった（図１ｂ）。第１のＮＲＰＳ  ＯＲＦは、典型的なアデニル化ドメインの代わりに、アシル特異的Ｃドメイン（配列番号１２）から始まる。ＡＤＬＥ及びＡＣＰＨタンパク質（各々、配列番号２８及び４２）は、３つの酵素がすべて同一の生合成遺伝子座の一部であることを示すアシル特異的Ｃドメインを保有するＮＲＰＳのすぐ近傍で確認されている。アシル特異的ＣドメインのＮ末端位置に伴ったこれらの３つの酵素の同時の存在と、多重酵素のＮＲＰＳ複合体の存在は、遺伝子座００９Ｈにより指定された、Ｎ−アシル化リポペプチドの生合成と一致している。
【実施例４】
【００９９】
推定上のリポペプチド生合成遺伝子座０２３Ｃの同定
コンセンサスタンパク質配列と、配列番号１、２、６、８及び１０として各々記載されている、アシル特異的Ｃドメインに対応するＲＡＭＯ、ＤＡＰＴ及びＡ５４１の座由来の配列を用いたＤＥＣＩＰＨＥＲ（登録商標）データベースのコンピュータ内スクリーニングは、さらに、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｉｚｕｎｅｎｓｉｓ  ＮＲＲＬ  Ｂ−１１２７７に存在する遺伝子座０２３Ｃにアシル特異的Ｃドメインが存在することを明らかにした。表５に示すように、配列比較解析は、０２３Ｃアシル特異的Ｃドメイン（配列番号１６として本明細書に記載されている）は、ＰＣＴ／ＣＡ０１／０１４６２に詳細に記載されているラモプラニンＯＲＦ１３で確認された第１モジュールのＣドメインによって表わされる典型的なＮＲＰＳ縮合ドメインに比べて、ＲＡＭＯ、ＤＡＰＴ及びＡ５４１由来のＮ−アシルキャッピングＣドメインにより密接に関係があることを明らかにしている。
【０１００】
【表５】
2005514067.tif 000013
【０１０１】
タンパク質のＡＤＬＥ及びＡＣＰＨファミリー（配列番号３２及び４６として本明細書に記載されている）と関係するタンパク質も、遺伝子座０２３Ｃで見出された（表５）。さらに、アシル特異的Ｃドメイン、ＡＤＬＥ及びＡＣＰＨタンパク質に対する配列番号１６、３２及び４６の関連性は、触媒活性にとって重要な特定のタンパク質ドメイン及びアミノ酸残基の保存を示すクラスタアライメントによって（図３〜５）、及び系統発生解析（図６）によって確認された。
【０１０２】
遺伝子座０２３Ｃの解析は、２８個のモジュールからなる６つのＮＲＰＳ  ＯＲＦの存在を示している（図１ｃ）。第１のＮＲＰＳ  ＯＲＦは、Ｎ−アシルキャッピング機構を示すアシル特異的Ｃドメイン（配列番号１６）から始まる（図７）。さらに、脂肪酸活性化及び結合に関与するＡＤＬＥ及びＡＣＰＨタンパク質（各々、配列番号３２及び４６）もまたＮＲＰＳ  ＯＲＦの近傍の０２３遺伝子座で発見されたが、このことは、遺伝子座０２３ＣがＮ−アシル化リポペプチド代謝産物をコードしている可能性が高いということを示唆している。
【実施例５】
【０１０３】
推定上のリポペプチド生合成遺伝子座０２４Ａの同定：
アシル特異的Ｃドメイン（配列番号１、２、６、８及び１０）に対応する配列を用いたタンパク質相同性解析によるＤＥＣＩＰＨＥＲ（登録商標）データベースのスクリーニングにより、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｅｆｕｉｎｅｕｓ  ＮＲＲＬ  ３１４３で確認された遺伝子座０２４Ａのアシル特異的Ｃドメインの存在が明らかになった。表６に示すように、ＢＬＡＳＴＰ解析によると、ＰＣＴ／ＣＡ０１／０１４６２に詳細に記載されているラモプラニンＯＲＦ１３で確認された第１モジュールのＣドメインにより示されているように、０２４ＣにコードされているＣドメイン（配列番号１４）は、２個のアミノ酸を縮合するドメインよりも、アミノ酸にアシル基を縮合するドメインとより密接に関係があることが明らかである。
【０１０４】
【表６】
2005514067.tif 000014
【０１０５】
また、ＡＤＬＥ及びＡＣＰＨ関連タンパク質（配列番号３０及び４４として本明細書に記載されている）は、遺伝子座０２４Ａで確認された（表６）。３つのすべてのタンパク質の配列アライメント（配列番号１４、３０及び４４）は、対応する酵素の触媒活性にとって重要なドメイン及びアミノ酸残基の保存を示している（図３〜５）。さらに、これらのタンパク質は、系統発生の解析によって示されているように、タンパク質のアシル特異的Ｃドメイン、ＡＤＬＥ及びＡＣＰＨファミリーのメンバーと進化的に関係がある（図６）。
【０１０６】
０２４Ａの完全遺伝子座（図１ｃ、並びに米国特許出願第６０／３４２，１３３号、米国特許出願第３０／３７２，７８９号、及び同時係属中の米国特許出願第１０／ＸＸＸ，ＸＸＸ号）の解析によると、１３個のモジュールからなる４つのＮＲＰＳ  ＯＲＦの存在が明らかである。Ｎ−アシルペプチドキャッピング機構と一致しているので、アシル特異的Ｃドメイン（配列番号１４）は、第１のＮＲＰＳ  ＯＲＦのＮ末端位置に位置する。さらに、ＡＤＬＥ及びＡＣＰＨのＯＲＦ（各々、配列番号３０及び４４）は、３つのタンパク質間の機能的相互作用を示す、アシル特異的Ｃドメインに近接している。これらの所見に基づくと、遺伝子座０２４Ａは、Ｎ−アシル化リポペプチドの生合成を誘導することが予測され、かつ次いで証明された（実施例８を参照）。
【実施例６】
【０１０７】
リポペプチド４１，０１２生合成遺伝子座Ａ４１０の同定：
ＤＥＣＩＰＨＥＲ（登録商標）データベースで確認された配列とアシル特異的Ｃドメイン（配列番号１、２、６、８及び１０）を指定する配列のタンパク質相同性比較により、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｎｉｐｐｏｎｅｎｓｉｓ  Ｒｏｕｔｉｅｎ  ＡＴＣＣ  ３１１４５で確認された遺伝子座Ａ４１０にある関連するＣドメイン（配列番号１８として本明細書に記載されている）の存在が明らかになった。この微生物は、Ｎ−アシル化リポペプチドのアンホマイシン群に属する、化学的構造が未決定の酸性ポリペプチド抗生物質（化合物４１，０１２）を合成することがわかっている（米国特許第４，００１，３９７号）。表７に示したように、ＢＬＡＳＴＰは、ＰＣＴ／ＣＡ０１／０１４６２に詳細に記載されているラモプラニンＯＲＦ１３で確認された第１モジュールのＣドメインにより示されているように、Ａ４１０にコードされているＣドメイン（配列番号１８）が、２個のアミノ酸が縮合しているドメインよりも、アミノ酸にアシル基を縮合するドメインとより密接に関係があることが明らかである。
【０１０８】
【表７】
2005514067.tif 000015
【０１０９】
ＡＤＬＥ及びＡＣＰＨ関連タンパク質（配列番号３４及び４８として本明細書に記載されている）もまた遺伝子座Ａ４１０で確認された（表７）。３つのすべてのタンパク質の配列アライメント（配列番号１８、３４及び４８）は、これらの酵素の触媒活性にとって重要なドメイン及びアミノ酸残基の保存を示している（図３〜５）。さらに、これらのタンパク質は、系統発生解析によって示されるように、タンパク質のアシル特異的Ｃドメイン、ＡＤＬＥ及びＡＣＰＨファミリーのメンバーと進化的に関係している（図６）。
【０１１０】
遺伝子座Ａ４１０は、１１個のモジュールからなる３つのＮＲＰＳ  ＯＲＦを指定する（図１ｄ）。Ｎ−アシル化ペプチドキャッピング機構と一致しているので、アシル特異的Ｃドメイン（配列番号１８）は、第１のＮＲＰＳ  ＯＲＦのＮ末端位置に位置する。さらに、ＡＤＬＥ及びＡＣＰＨのＯＲＦ（各々、配列番号３４及び４８）は、遺伝子座Ａ４１０が、複合抗生物質４１，０１２の記載されている特性と一致するＮ−アシル化リポペプチドを指定することを示す、アシル特異的Ｃドメインに隣接していることが確認された。
【実施例７】
【０１１１】
推定上のリポペプチド生合成遺伝子座０７０Ｂの同定：
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．（Ｅｃｏｐｉａ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ、０７０株）で発見された遺伝子座０７０Ｂ中のアシル特異的Ｃドメインの存在が、アシル特異的Ｃドメイン（配列番号１、２、６、８及び１０）に対応する配列を用いたＤＥＣＩＰＨＥＲ（登録商標）データベースのコンピュータによるスクリーニングで明らかになった。表８から明らかなように、ＢＬＡＳＴＰ解析によれば、０７０ＢにコードされているＣドメイン（配列番号２０）は、ＰＣＴ／ＣＡ０１／０１４６２に詳細に記載されているラモプラニンＯＲＦ１３で発見された第１のモジュールのＣドメインにより示されているように、２個のアミノ酸を縮合しているドメインよりもアミノ酸にアシル基を縮合しているドメインにより密接に関係している。
【０１１２】
【表８】
2005514067.tif 000016
【０１１３】
種々のリポペプチド生合成ＯＲＦ由来の関連ドメインとの０７０Ｂアシル特異的Ｃドメイン（配列番号２０）の配列アライメントは、これらの酵素の触媒活性にとって重要なドメイン及びアミノ酸残基の保存を明らかにしている（図３）。さらに、このタンパク質は、系統発生の解析によって明らかなように、アシル特異的Ｃドメインのメンバーと進化上の関係がある（図６）。
【０１１４】
本明細書に示している他の座とは対照的に、ＡＤＬＥ及びＡＣＰＨに関連するタンパク質は０７０Ｂでは検出されなかった。
【０１１５】
ＤＥＣＩＰＨＥＲ（登録商標）データベースで発見された０７０Ｂ遺伝子座の解析によれば、３つのモジュールからなる不完全ＮＲＰＳ  ＯＲＦの存在が明らかである（図１ｄ）。Ｎ−アシル化リポペプチドの生合成と一致しているので、アシル特異的Ｃドメインは、ＮＲＰＳ  ＯＲＦのＮ末端に位置する。ＡＤＬＥ及びＡＣＰＨの配列の欠失は、遺伝子座の配列が未だ完全ではないという事実による可能性がある。あるいは、０７０Ｂは、Ｎ−アシル化リポペプチドを特定化する、あるいはＡＤＬＥ及びＡＣＰＨに関連する酵素を欠失しているＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）中のＣＡＤＡ遺伝子座に類似している可能性がある。アシル特異的Ｃドメインの存在と位置は、０７０Ｂ中のＡＤＬＥ及びＡＣＰＨの潜在的不在にかかわらず、０７０ＢがＮ−アシル化リポペプチドを特定化することを明らかに示している。
【実施例８】
【０１１６】
遺伝子座０２４ＡによるＮ−アシル化リポペプチドの生合成：
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｅｆｕｉｎｅｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ  ＮＲＲＬ  ３１４３中の遺伝子座０２４Ａは、Ｎ−アシル化リポペプチドをコードする遺伝子座のいくつかの特性、すなわち、ポリペプチドのアセンブリー（ＡＤＬＥ及びＡＣＰＨファミリータンパク質（各々、配列番号３０及び４４））に関与する第１のＮＲＰＳ  ＯＲＦのＮ末端に位置しているアシル特異的Ｃドメイン（配列番号１４）の存在、並びに、１３個のモジュールからなるＮＲＰＳ多重酵素システムを有することが明らかになった（実施例５及び図１ｃ参照）。
【０１１７】
ＤＥＣＩＰＨＥＲ（登録商標）データベース中の他のタンパク質によるアシル特異的Ｃドメイン、ＡＤＬＥ及びＡＣＰＨタンパク質のタンパク質相同性解析によれば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｄｉａｅ  ＮＲＲＬ  １８１５８中の抗生物質Ａ５４１４５の産生を指定するＡ５４１遺伝子座（配列番号１０、３６＊及び３６＊＊）で発見された、対応するタンパク質とこれらのタンパク質に高い相同性があることが明らかとなった（実施例５の表６）。この２つの座をより詳しく調べた結果、Ａ５４１４５のもと同一の０２４Ａポリペプチド足場の合成に関与し得る同一のＮＲＰＳ系の存在が明らかになった（図１ｂ及び図ｃ、並びに米国特許出願第６０／３４２，１３３号、米国特許出願第３０／３７２，７８９号及び同時係属中の米国特許出願第１０／ＸＸＸ，ＸＸＸ号）。
【０１１８】
これらの所見、及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｄｉａｅ中のリポペプチドＡ５４１４５を発現する増殖条件についての周知の事実によれば（米国特許第４，９７７，０８３号）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｅｆｕｉｎｅｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓは、同一の培養条件下で増殖し、遺伝子座０２４Ａの可能な誘導を判断し、特定の産物の性質を検出した。
【０１１９】
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｄｉａｅ及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｅｆｕｉｎｅｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓを、水道水中、グルコース（１０ｇ／ｌ）、ジャガイモデンプン（３０ｇ／ｌ）、大豆粉（２０ｇ／ｌ）、Ｐｈａｒｍａｍｅｄｉａ（２０ｇ／ｌ）及びＣａＣＯ３（２ｇ／ｌ）を含有するシード培地２５ｍＬ中に接種し、回転式振盪機中、３０℃にて４８時間増殖させた。４Ｌ容バッフルフラスコ（ｂａｆｆｌｅｄ  ｆｌａｓｋ）中の産生培地５００ｍＬへ接種するために、この種培養物５ｍＬを用いた。産生培地は、水道水に溶解したグルコース（２５ｇ／ｌ）、大豆粉（１８．７５ｇ／ｌ）、廃糖蜜（３．７５ｇ／ｌ）、カゼイン（１．２５ｇ／ｌ）、酢酸ナトリウム（８ｇ／ｌ）、及びＣａＣＯ３（３．１３ｇ／ｌ）からなり、回転式振盪機上で７日間、３０℃にて培養した。産生培養物を遠心分離にかけて濾過し、菌糸体と固形物を除去した。ｐＨを６．４に調節し、Ｄｉａｉｏｎ  ＨＰ２０を４６ｍＬ添加し、３０分間撹拌した。ＨＰ２０樹脂をブーフナー濾過により回収し、１４０ｍＬの水と９０ｍＬの１５％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏで連続して洗浄し、その洗浄物は廃棄した。次いで、１４０ｍＬの５０％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２ＯによりＨＰ２０樹脂を溶出した（画分ＨＰ２０  Ｅ２）。このプール５ｍＬをアンバーライトＩＲＡ６８カラム（アセテートサイクル）にかけ、そのカラムからの流出液（画分ＩＲＡ  ＦＴ）をバイオアッセイ用として確保した。２５ｍＬの５０％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏでこのカラムを洗浄し、０．１ＮのＨＯＡｃを含有する２５ｍＬの５０％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２０で溶出し（画分ＩＲＡ  Ｅ１）、次いで、１．０ＮのＨＯＡｃを含有する２５ｍＬの５０％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２０で溶出した（画分ＩＲＡ  Ｅ２）。精製に続いて、生物活性は、５ｍＭのＣａＣｌ２を含有する栄養寒天中のＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓを用いたバイオアッセイに従った。
【０１２０】
図９ａは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｄｉａｅ由来の陰イオンリポペプチドの抽出時に得られたプレートの写真である。図９ａは、酸性リポペプチドの発現と一致するＩＲＡ６７陰イオン交換クロマトグラフィーによる活性の増強を示す。溶菌の環の直径が大きくなることから明らかなように、この活性は抽出方法の間に濃縮される。Ａ５４１４５  Ｃ、Ｄの構造と一致する質量イオンＥＳ２＋＝８３０．５により明らかなように（米国特許第４，９９４，２７０号）、Ａ５４１４５が画分ＩＲＡ  Ｅ２においてＨＰＬＣ／ＭＳにより検出された。
【０１２１】
図９ｂは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｅｆｕｉｎｅｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ由来の抽出物で行われた同様の抽出スキーム中に得られたプレートの写真である。図９ｂは、酸性リポペプチドの発現と一致するＩＲＡ６７陰イオン交換クロマトグラフィーによる活性が同様に高いことを示している。溶菌の環の直径が大きくなることから明らかなように、この活性は抽出の間、濃化される。Ａ５４１４５のものと同一のＥＳ２＋＝８３０．５の質量イオンは、Ａ５４１４５Ｃ、Ｄと同一である、Ｎ−アシル化酸性リポペプチドがＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｅｆｕｉｎｅｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ中の０２４Ａにより産生されることが確認されている画分ＩＲＡ  Ｅ２の中に存在していた。
【実施例９】
【０１２２】
新規リポペプチドを産生可能なペプチド合成酵素を操作するためのＮ−アシルキャッピングカセットの使用
リポペプチドＮ−アシルキャッピング成分の有効性と解明により、操作したペプチド合成酵素によって天然産物又は非天然産物の設計を再編することができる可能性が高まる。既知の分子生物学技術を使用すると、合理的に設計されたペプチド産物を産生可能な機能的なハイブリッドペプチド合成酵素を操作することができることが報告されている（Ｍｏｏｔｚ  ｅｔ  ａｔ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．Ｖｏｌ．９７  ｐｐ．５８４８−５８５３）。さらに、ドメイン交換、突然変異生成による基質特異性の変更、及び一定の短縮型産物の放出を達成するための誘導末端を通じて、アンチパイン（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｕｓにより産生される効き目のあるカテプシン阻害剤であり、その生合成的機構は未知である）を産生する組換えＮＲＰＳ系を得ることが可能であり得ることが想定されている（Ｄｏｅｋｅｌ  Ｓ、Ｍａｒａｈｉｅｌ  ＭＡ．（２００１）Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．Ｖｏｌ．３  ｐｐ．６４−７７）。Ｍｏｏｔｚら（上掲）は、天然産物ではないペプチド産物を産生するためのＮＲＰＳ系を用いた遺伝子操作について記載しており、Ｄｏｅｋｅｌ及びＭａｒａｈｉｅｌ（上掲）は、既知の天然産物であるアンチパインを得るためのＮＲＰＳ系を遺伝子操作する机上の実験例を記載している。
【０１２３】
非リポペプチド天然産物（コンプレスタチン）のＮＲＰＳの生合成上の機構が、コンプレスタチンのＮ−アシル化類似体を産生するために変性され得る方法について下記に概説する（図１０）。
【０１２４】
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌａｖｅｎｄｕｌａｅはコンプレスタチンを産生する。コンプレスタチンは、相補体カスケードのＣ４ｂ、２ｂ複合体の形成、及びＨＩＶライフルサイクル中で結合するｇｐ１２０−ＣＤ４を含む、薬理学的に関連のあるタンパク質間の相互作用を拮抗する環状ペプチド天然産物である。コンプレスタチン（天然産物のバンコマイシン群のメンバー）は、酸化的フェノール結合とハロゲン化によって修飾されているα−ケトアシルヘキサペプチドバックボーンからなる。約５０ｋｂに及ぶ完全コンプレスタチンの生合成上の調節遺伝子クラスタは、クローニングされ、かつ配列決定されている（Ｃｈｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  Ｖｏｌ．９８  ｐｐ．８５４８−８５５３）。それには、４つのＮＲＰＳ遺伝子、すなわちｃｏｍＡ、ｃｏｍＢ、ｃｏｍＣ及びｃｏｍＤが含まれている（図１０、パネルａ）。ｃｏｍＡ遺伝子は、ヒドロキシフェニルグリシン（ＨＰＧ；又はその誘導体）を組み込んでいるローディングモジュールと、その後のトリプトファン（Ｔｒｐ）を組み込んでいるモジュールから構成されているＮＲＰＳをコードし、コンプレスタチンの第１の２個の残基を有する。そのローディングモジュールと、トリプトファンが組み込まれているＣドメインは、ドメイン交換を通じて、本明細書に記載されているアシル特異的Ｃドメインのうちの１つと置換され得る。好ましくは、Ａ５４１、ＤＡＰＴ又は０２４Ａ遺伝子座のアシル特異的Ｃドメインを用いる。その理由は、これらのドメインが、トリプトファン残基へのアシル成分の縮合に本来特異的であるからである。このドメイン交換に加えて、ＡＤＬＥ遺伝子及びＡＣＰＨ遺伝子をその系へ導入して、アシル特異的Ｃドメインにより利用可能な、活性化アシル基質を生成する手段を提供する。したがって、図１０ｂには、Ｎ−アシル化コンプレスタチン類似体を生じさせるはずである、合理的に遺伝子操作された組換え体ＮＲＰＳ系を記載している。図１０ｂ中に記載されている組換え体ＮＲＰＳ系は、適当な組換え宿主を利用してｉｎ  ｖｉｖｏで用いることができるか、あるいは適当な基質が補充された精製酵素を利用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで用いることができる。
【０１２５】
Ｎ−アシル化コンプレスタチン類似体をｉｎ  ｖｉｖｏで産生することができる１つの手法には、宿主株として、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ（コンプレスタチン産生体）を使用することが含まれる。簡単に説明すると、Ｎ−アシルキャッピングカセットは、ｃｏｍＡ遺伝子を置換する。これは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ染色体上のｃｏｍＡ遺伝子の不活性化、次いで、ＡＤＬＥ、ＡＣＰＨ及び組換えのＣｏｍＡ誘導体を発現するプラスミドの導入によって、あるいは、二重組換（Ｋｅｉｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、上掲）により、ＡＤＬＥ、ＡＣＰＨ及び組換えＣｏｍＡ誘導体をコードする遺伝子を含有するカセットでＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ染色体上のｃｏｍＡ遺伝子を物理的に置換することにより実施することができる。得られた組換え型菌株は、アシル成分の生合成に関与する遺伝子を含むようにさらに改変することができ、かつ／又は、発酵培地中にアシル成分又はそれらの前駆体を供給することができる。
【０１２６】
１種又は複数のＮ−アシル化コンプレスタチン類似体をｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生することができる１つの手法には、Ｍｏｏｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）で概説されているように、適当な宿主（例えば大腸菌）におけるＡＤＬＥ、ＡＣＰＨ、組換え型ＣｏｍＡ、ＣｏｍＢ、ＣｏｍＣ及びＣｏｍＤポリペプチドの過剰発現、次いで、これらの抽出物又は精製画分の調製、並びに適当な基質と併用する前記調製物の使用が含まれる。アクセサリータンパク質の不在下では、このｉｎ  ｖｉｔｒｏ系によって産生される産物は、特定のコンプレスタチンシトクロムＰ４５０酵素により触媒される、残基の架橋などのある種の修飾は含まれないであろう。
【０１２７】
本明細書に引用されているすべての特許、特許出願及び公開されている文献は、参照によりそれらの全体を本明細書に組み入れるものとする。本発明は、これらの好ましい実施形態に関して特に開示し記載したが、形態や詳細における各種修正は、添付の特許請求の範囲によって包含されている本発明の範囲から逸脱することなく実施することができることは、当業者であれば理解されよう。
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【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】図１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ及び１ｅは、（１ａ）Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｓｐ．ＡＴＣＣ  ３３０７６（ＲＡＭＯ）由来のラモプラニン、及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ  ＮＲＲＬ  １１３７９（ＤＡＰＴ）由来のＡ２１９７８Ｃ；（１ｂ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｄｉａｅ  ＡＴＣＣ  １８１５８（Ａ５４１）由来のＡ５４１４５、及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ  ＮＲＲＬ  Ｂ−１２１０４（００９Ｈ）由来のリポペプチド；（１ｃ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｅｆｕｉｎｅｕｓ  ＮＲＲＬ  ３１４３（０２４Ａ）由来のリポペプチド、及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｉｚｕｎｅｎｓｉｓ  ＮＲＲＬ  Ｂ−１１２７７（０２３Ｃ）由来のリポペプチド；（１ｄ）Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｎｉｐｐｏｎｅｎｓｉｓ  ＦＤ  ２４８３４  ＡＴＣＣ  ３１１４５（Ａ４１０）由来のリポペプチド、及びＥｃｏｐｉａ’ｓ  ｐｒｉｖａｔｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎの有機体０７０由来の推定上のリポペプチド天然物（０７０Ｂ）；並びに（１ｅ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（ＣＡＤＡ）由来のカルシウム依存性抗生物質、についての生合成座の概略図を示し、塩基対中のスケールと、本発明の代表的なアシル特異的Ｃドメインをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の相対的位置と定位、並びに本発明の代表をアデニル化酵素及びアシルキャリアタンパク質を示している。また、本発明の遺伝子が含まれている寄託コスミドは、ＲＡＭＯ、Ａ５４１及び０２４Ａについて示している。
【図２】図２は、灰色で強調したＮ−アシル化に関与する本発明の代表的なＣドメインの明らかな分岐クラスタを有する種々のリポペプチドＮＲＰＳ由来のＣドメインに関する進化の関連性を示す樹状図を表わす。
【図３】図３ａ及び３ｂは、ＲＡＭＯ、ＤＡＰＴ、Ａ５４１、ＣＡＤＡ、００９Ｈ、０２４Ａ、０２３Ｃ、Ａ４１０及び０７０Ｂの各リポペプチド生合成遺伝子座で発見された本発明の代表的なアシル特異的Ｃドメインのアミノ酸アライメントを表わす。保存モチーフは強調している。各クラスタアライメントでは、アライメント上のラインは、高度に保存されている位置をマークするために用いている。さらに、３つの記号、すなわち「＊」（星印）、「：」（コロン）及び「．」（ピリオド）用いている。「＊」は、１つの完全に保存されている残基を有する位置を示し、「：」は、以下の強い基、すなわち、ＳＴＡ、ＮＥＱＫ、ＮＨＱＫ、ＮＤＥＱ、ＱＨＲＫ、ＭＩＬＶ、ＭＩＬＦ、ＨＹ及びＦＹＷのうちの１つが完全に保存されていることを示し、「．」は、以下のより弱い基、すなわち、ＣＳＡ、ＡＴＶ、ＳＡＧ、ＳＴＮＫ、ＳＴＰＡ、ＳＧＮＤ、ＳＮＤＥＱＫ、ＮＤＥＱＨＫ、ＮＥＱＨＲＫ、ＦＶＬＩＭ及びＨＦＹのうちの１つが完全に保存されていることを示す。
【図４】図４ａ、４ｂ及び４ｃは、Ａ５４１遺伝子座由来のＡＤＬＦ融合タンパク質のＡＤＬＥ部分とともに、ＲＡＭＯ、ＤＡＰＴ、００９Ｈ、０２４Ａ、０２３Ｃ及びＡ４１０座の各々で発見された本発明の代表的なＡＤＬＥタンパク質のアミノ酸アライメントを表わす。アシルＣｏＡリガーゼの保存されたモチーフは強調されている。
【図５】図５は、ＲＡＭＯ、ＤＡＰＴ、００９Ｈ、０２４Ａ、０２３Ｃ及びＡ４１０座由来の本発明の代表的なＡＣＰＨタンパク質のアミノ酸アライメントと、Ａ５４１遺伝子座由来のＡＤＬＦ融合タンパク質の対応する部分である。ホスホパンテテイン基が翻訳後に共有結合で結合されているチオール化ドメインの保存されたセリン残基は強調されている。
【図６】図６ａは、本発明の代表的なＮＲＰＳ  Ｃドメインの進化の関連性を示す樹状図である。図６ｂは、本発明の代表的なＡＤＬＥタンパク質の進化の関連性を示す樹状図である。図６ｃは、本発明の代表的なＡＣＰＨタンパク質の進化の関連性を示す樹状図である。
【図７】図７ａ及び７ｂは、本発明のアシル特異的Ｃドメイン、ＡＤＬＥタンパク質及びＡＣＰＨタンパク質を用いて、リポペプチドにおけるＮ−アシル化ペプチド結合の形成に関する一般的な生合成のスキームを説明する。
【図８】図８は、ラモプラニンとＡ５４１４５におけるＮ−アシル化ペプチド結合の形成に適用される図７ａ及び７ｂの生合成のスキームを説明する。
【図９】図９ａ及び９ｂは、陰イオンリポペプチド単離試験のバイオアッセイで得られたプレートの写真であり、ＩＲＡ６７陰イオン交換クロマトグラフィーに基づいた、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｅｆｕｉｎｅｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｄｉａｅ由来のリポペプチドの活性の強さを示している。
【図１０】図１０ａ及び１０ｂは、コンプレスタチンのＮ−アシル化類似体を産生するために、非リポペプチド天然産物（コンプレスタチン）のＮＲＰＳの生合成上の機構を使用することについて説明している。図１０ａは、コンプレスタチンの生合成を説明している。図１０ｂは、Ｎ−アシル化コンプレスタチン類似体を生じさせる合理的に設計された組換え型ＮＲＰＳ系を説明している。
【図１１】図１１は、本発明の一実施形態によるコンピュータシステムのブロックダイヤグラムである。
【図１２】図１２は、候補配列を、本発明の一実施形態による１つ又は複数の基準配列と比較するためコンピュータシステムによって実施される方法を表わすフローチャートである。
【図１３】図１３は、候補配列を１つ又は複数の基準配列と比較するコンピュータシステムによって実施される方法と、本発明の一実施形態による比較結果の表示を表わすフローチャートである。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
2005514067.tif 000021
【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図１ｅ】
2005514067.tif 000024
【図２】
2005514067.tif 000025
【図３ａ】
2005514067.tif 000026
【図３ｂ】
2005514067.tif 000027
【図４ａ】
2005514067.tif 000028
【図４ｂ】
2005514067.tif 000029
【図４ｃ】
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【図５】
2005514067.tif 000031
【図６ａ】
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【図６ｂ】
2005514067.tif 000033
【図６ｃ】
2005514067.tif 000034
【図７ａ】
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【図７ｂ】
2005514067.tif 000036
【図８】
2005514067.tif 000037
【図９ａ】
2005514067.tif 000038
【図９ｂ】
2005514067.tif 000039
【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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