(57)【要約】本発明はイヌ、フェレット及びアカゲザルＭＣＨ−１Ｒに関連するポリペプチド及び核酸配列に関する。好適ポリペプチド及び核酸はイヌ、フェレット及びアカゲザルＭＣＨ−１Ｒに共通し、ヒト、ラット又はマウスＭＣＨ−１Ｒには存在しない領域を含む。
2005508161.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１３のアミノ酸配列を含む精製ポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドが配列番号１、配列番号２及び配列番号３から構成される群から選択される配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドが配列番号１から構成される請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドが配列番号２から構成される請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記ポリペプチドが配列番号３から構成される請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む精製核酸。
【請求項７】
配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１４の相補体、配列番号１５の相補体、配列番号１６の相補体、配列番号１７の相補体及び配列番号１８の相補体から構成される群から選択されるヌクレオチド配列を含む精製核酸。
【請求項８】
前記ヌクレオチド配列が配列番号１４又はその相補体を含む請求項７に記載の精製核酸。
【請求項９】
前記ヌクレオチド配列が配列番号１５又はその相補体を含む請求項７に記載の精製核酸。
【請求項１０】
前記ヌクレオチド配列が配列番号１６又はその相補体を含む請求項７に記載の精製核酸。
【請求項１１】
前記ヌクレオチド配列が配列番号１７又はその相補体を含む請求項７に記載の精製核酸。
【請求項１２】
前記ヌクレオチド配列が配列番号１８又はその相補体を含む請求項７に記載の精製核酸。
【請求項１３】
（ａ）請求項１から６のいずれか一項に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列又は（ｂ）請求項７から１２のいずれか一項に記載の配列を含む組換え核酸。
【請求項１４】
前記組換え核酸が発現ベクターである請求項１３に記載の組換え核酸。
【請求項１５】
組換え細胞により認識されるプロモーターに機能的に結合している請求項１から６のいずれか一項に記載のアミノ酸配列をコードする発現ベクターを含む組換え細胞。
【請求項１６】
請求項１４に記載の発現ベクターを細胞に導入する段階を含む方法により作製された組換え細胞。
【請求項１７】
化合物がＭＣＨ−１Ｒ活性に影響を及ぼす能力を測定する方法であって、
ａ）請求項１から６のいずれか一項に記載のアミノ酸配列を含む機能的ＭＣＨ−１Ｒを発現する組換え核酸を含む組換え細胞を前記化合物と接触させる段階と、および
ｂ）ＭＣＨ−１Ｒ活性を測定する段階を含む、前記方法。
【請求項１８】
前記方法が更にＭＣＨ−１Ｒアゴニストの使用を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリペプチドを前記発現ベクターから発現させる条件下で請求項１５に記載の組換え細胞を増殖させる段階を含む、ＭＣＨ−１Ｒポリペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
【背景技術】
【０００２】
本願は２００１年９月２４日付け仮米国特許出願第６０／３２４，４１９号の優先権主張出願であり、その開示内容を参考資料として本明細書に組込む。
【０００３】
本明細書に引用する文献は本発明の先行技術であるとは認めていない。
【０００４】
視床下部に存在する神経ペプチドは体重調節に重要な役割を果たす（Ｆｌｉｅｒら，１９９８，Ｃｅｌｌ，９２，４３７−４４０）。メラニン凝集ホルモン（ＭＣＨ）は、神経ペプチドＮＥＩ及びＮＧＥをもコードするより大きいプレ−プロホルモン前駆物質の一部として視床下部で合成される環状１９アミノ酸神経ペプチドである（Ｎａｈｏｎら，１９９０，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．４，６３２−６３７）。ＭＣＨはサケ下垂体で最初に同定され、魚類ではＭＣＨは、メラニン凝集に関与し、従って、皮膚色素沈着に関与する。マスとウナギでもＭＣＨはストレス性又はＣＲＦにより刺激されるＡＣＴＨ放出に関与していることが示された（Ｋａｗａｕｃｈｉら，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５，３２１−３２３）。
【０００５】
ヒトでは、脳において発現される、ＭＣＨをコードする２種の遺伝子が同定されている（Ｂｒｅｔｏｎら，１９９３，Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１８，２９７−３１０）。哺乳動物では、ＭＣＨは、摂食量の調節に関与する視床下部の神経細胞体（外側視床下部の核周部とゾナ・イナーチア（ｚｏｎａ  ｉｎｅｒｔｉａ）を含む）に主に存在している（Ｋｎｉｇｇｅら，１９９６．Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  １７，１０６３−１０７３）。
【０００６】
薬理学的及び遺伝学的事実によると、主要なＭＣＨ作用モードは摂食促進（食欲促進）である。ＭＣＨ  ｍＲＮＡは絶食マウス及びラットやｏｂ／ｏｂマウスでアップレギュレートされる（Ｑｕら，１９９６．Ｎａｔｕｒｅ  ３８０，２４３−２４７）。ＭＣＨを中枢に注射（ＩＣＶ）すると摂食が刺激され、ＭＣＨはαメラノサイト刺激ホルモン（αＭＳＨ）に見られる摂食低下効果を抑制する（Ｑｕら，１９９６．Ｎａｔｕｒｅ  ３８０，２４３−２４７）。ＭＣＨ欠損マウスは痩せて摂食低下しており、代謝率が高い（Ｓｈｉｍａｄａら，１９９８．Ｎａｔｕｒｅ  ３９６，６７０−６７３）。ＭＣＨを過剰発現するトランスジェニックマウスは摂食亢進し、インスリン抵抗性と軽度の肥満を発症する（Ｌｕｄｗｉｇら，２００１．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０７，３７９−３８６）。
【０００７】
ＭＣＨ作用は摂食量の調節に限らず、視床下部−下垂体軸に影響を及ぼすことも報告されている（Ｎａｈｏｎ，１９９４．Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖ．ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．８，２２１−２６２）。ＭＣＨはストレス性ＡＣＴＨ放出も調節することができる（Ｎａｈｏｎ，１９９４．Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖ．ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．８，２２１−２６２）。
【０００８】
数件の文献がＭＣＨに結合する受容体（「ＭＣＨ−１Ｒ」）を記載している（Ｃｈａｍｂｅｒｓら，１９９９．Ｎａｔｕｒｅ  ４００，２６１−２６５，Ｓａｉｔｏら，１９９９．Ｎａｔｕｒｅ  ４００，２６５−２６９，Ｂａｃｈｎｅｒら，１９９９．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４５７：５２２−５２４，Ｓｈｉｍｏｍｕｒａら，１９９９．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ２６１，６２２−６２６，Ｌｅｍｂｏら，１９９９．Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １，２６７−２７１）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、イヌ、フェレット及びアカゲザルＭＣＨ−１Ｒに関連するポリペプチド及び核酸配列を特徴とする。好ましいポリペプチド及び核酸は、イヌ、フェレット及びアカゲザルＭＣＨ−１Ｒに共通の、ヒト、ラット又はマウスＭＣＨ−１Ｒには存在しない領域を含む。
【００１０】
イヌ、フェレット、アカゲザル、ヒト、ラット及びマウスの全長ＭＣＨ−１Ｒアミノ酸及び核酸配列を比較すると、これらの各種に固有の配列と２種またはそれ以上に共通の配列とがあることがわかる。イヌ、フェレット、アカゲザル、ヒト、ラット及びマウスの全長アミノ酸配列を配列番号１〜６に示す。イヌ、フェレット、アカゲザル、ヒト、ラット及びマウスの全長ｃＤＮＡ配列を配列番号７〜１２に示す。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
従って、本発明の第１の側面は、配列番号１３のアミノ酸配列領域を含む精製ポリペプチドに関する。配列番号１３はイヌ、フェレット及びアカゲザルＭＣＨ−１Ｒに存在するが、ヒト、マウス又はラットＭＣＨ−１Ｒには存在しない。
【００１２】
共通領域又は共通配列が存在するという場合には、付加領域の存在を除外せず、付加領域はイヌ、フェレット又はアカゲザルＭＣＨ−１Ｒに存在するものでも存在しないものでもよい。例えば、配列番号１３を含むポリペプチドはイヌ、フェレットもしくはアカゲザルＭＣＨ−１Ｒ配列が有する付加アミノ酸領域又はイヌ、フェレットもしくはアカゲザルＭＣＨ−１Ｒに存在しない配列を有する付加アミノ酸領域を有することができる。
【００１３】
「精製ポリペプチド」は試料又は調製物中に存在する全蛋白質の少なくとも１０％を表わす。好適態様では、精製ポリペプチドは試料又は調製物中に存在する全蛋白質の少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、又は少なくとも約９５％を表わす。「精製ポリペプチド」という場合には、ポリペプチドが精製されている必要はなく、例えば化学的に合成された未精製ポリペプチドでもよい。
【００１４】
本発明の別の側面は、配列番号１３をコードするヌクレオチド配列領域を含む精製核酸に関する。「精製核酸」は試料又は調製物中に存在する全核酸の少なくとも１０％を表わす。好適態様では、精製核酸は試料又は調製物中に存在する全核酸の少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、又は少なくとも約９５％を表わす。「精製核酸」という場合には、核酸が精製されている必要はなく、例えば化学的に合成された未精製核酸でもよい。
【００１５】
本発明の別の側面は、イヌ、フェレット及びアカゲザルＭＣＨ−１Ｒに共通の、ヒト、マウス又はラットＭＣＨ−１Ｒには存在しない少なくとも１１ヌクレオチド長のヌクレオチド配列領域を有する精製核酸に関する。このような配列の例は配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８及びその相補体である。
【００１６】
本発明の別の側面は、（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え核酸に関し、あるいは（ｂ）イヌ、フェレット及びアカゲザルＭＣＨ−１Ｒに共通の、ヒト、ラット又はマウスＭＣＨ−１Ｒには存在しない配列領域を提供するヌクレオチド配列を含む組換え核酸に関する。
【００１７】
「組換え核酸」とは天然には相互に関係のない１個またはそれ以上の領域を含む核酸である。組換え核酸はゲノム内に存在することも、ゲノムの外側に存在することもできる。
【００１８】
本発明の別の側面は、配列番号１３のアミノ酸領域をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む組換え細胞に関する。この配列は細胞により認識されるプロモーターに結合している。
【００１９】
本発明の別の側面は、配列番号１３のアミノ酸領域をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターの使用を含む方法により作製された組換え細胞に関する。
【００２０】
本発明の別の側面は、化合物がＭＣＨ−１Ｒ活性に影響を及ぼす能力を測定する方法に関する。この方法は、ａ）機能的ＭＣＨ−１Ｒを発現する組換え核酸を含む組換え細胞を前記化合物と接触させる段階と、ｂ）ＭＣＨ−１Ｒ活性を測定する段階を含む。細胞により発現される機能的ＭＣＨ−１Ｒは配列番号１３のアミノ酸配列領域を有する。
【００２１】
本発明の別の側面は、ＭＣＨ−１Ｒポリペプチドの製造方法に関する。この方法は前記ポリペプチドを組換え核酸から発現させる条件下で組換え細胞を増殖させる段階を含む。この組換え核酸は配列番号１３のアミノ酸配列領域を含む機能的ＭＣＨ−１Ｒをコードする。
【００２２】
本発明の他の特徴と利点は各種実施例を含む以下の付加説明に明示される。後記実施例は本発明の実施に有用な各種要素と手法を例示する。この実施例は特許請求の範囲に記載した発明を限定するものではない。本開示に基づき、当業者は本発明の実施に有用な他の要素と手法を認識し、利用することができる。
【００２３】
イヌ、フェレット及びアカゲザルでＭＣＨ−１Ｒが同定されると、ＭＣＨ−１Ｒアミノ酸及び核酸配列情報が得られ、ＭＣＨ−１Ｒ活性を調節する化合物の効果を評価するためのモデルが得られる。イヌ、フェレット及びアカゲザルＭＣＨ−１Ｒ配列情報はＭＣＨ−１Ｒポリペプチド及び核酸を生産するための使用等の種々の用途がある。
【００２４】
ＭＣＨ−１Ｒアミノ酸配列及び核酸配列の１好適用途は、ＭＣＨ−１Ｒと結合してＭＣＨ−１Ｒ活性を調節する化合物の初期同定に使用可能なＭＣＨ−１Ｒ機能的ポリペプチドの生産である。その後、例えばイヌ、フェレット又はアカゲザルを使用してこのような化合物のｉｎ  ｖｉｖｏ活性を評価することができる。
【００２５】
ＭＣＨ−１Ｒ活性を調節する化合物は、ＭＣＨ−１Ｒ活性を更に試験するためのツールとして利用したり、患者に有益な効果を達成するための物質として利用するなどの多種多様の用途がある。ＭＣＨ−１Ｒ活性の調節としては受容体に対する応答の誘起や、ＭＣＨ−１Ｒアゴニスト又はアンタゴニストにより誘起される応答の改変が挙げられる。
【００２６】
ＭＣＨ−１Ｒ活性を調節する有益な効果としては、体重減少、体重増加、癌治療（例えば大腸癌又は乳癌）、疼痛緩和、糖尿病治療、ストレス緩和又は性機能障害治療の１種以上を患者で達成することが挙げられる。患者は哺乳動物、好ましくはヒトである。患者という場合には必ずしも疾病又は疾患の存在を意味しない。患者なる用語は予防処置する対象と疾病又は疾患をもつ対象を含む。
【００２７】
糖尿病治療、体重減少又は体重増加を得るようにＭＣＨ−１Ｒ活性を調節することが好ましい。糖尿病は例えばグルコース耐性増加又はインスリン抵抗性減少の一方又は両方により治療することができる。
【００２８】
過体重は、高血圧、糖尿病、脂血不全、心血管疾患、胆石、変形性関節炎及び所定の癌等の種々の疾患の要因である。例えばこのような疾患の確率を減らすために、およびこのような疾患の治療の一部として、体重減少誘導を使用することができる。体重減少は例えば食欲低下、代謝率増加、脂肪摂取低下又は炭水化物欲求低下の１種以上により達成できる。
【００２９】
体重減少を伴う疾病もしくは疾患を有するか又は体重減少を伴う治療を受けている患者には、体重増加が特に有用である。体重減少を伴う疾病又は疾患の例としては拒食症、過食症、癌性悪液質、エイズ、衰弱、悪液質及び虚弱高齢者が挙げられる。体重減少を伴う治療の例としては化学療法と放射線療法が挙げられる。
【００３０】
ＭＣＨ−１Ｒポリペプチド
本発明のＭＣＨ−１Ｒポリペプチドは、少なくとも９連続アミノ酸長の、配列番号１、２又は３の領域を含む。ＭＣＨ−１Ｒポリペプチドは配列番号１〜３に由来するＭＣＨ−１Ｒ配列のみから構成されるものでもよいし、キメラポリペプチドでもよい。ＭＣＨ−１Ｒポリペプチドは機能的受容体の成分の提供、ＭＣＨ−１Ｒに結合する抗体を生産するための免疫原としての使用、ＭＣＨ−１Ｒと結合する化合物を同定するためのターゲットとしての使用、及び化合物がＭＣＨ−１Ｒ活性に影響を及ぼす能力を測定するためのアッセイにおける使用等の種々の用途がある。
【００３１】
キメラポリペプチドは、１個またはそれ以上のＭＣＨ−１Ｒ由来領域と１個またはそれ以上のＭＣＨ−１Ｒ非由来領域を含む。ＭＣＨ−１Ｒ非由来領域は、例えば、特定目的を達成するため、又はＭＣＨ−１Ｒもしくはそのフラグメントに置換可能なポリペプチドを生産するために使用することができる。キメラであるＭＣＨ−１Ｒポリペプチドを使用して達成可能な特定の目的としては、単離用マーカーの提供、各種受容体領域の機能的分析、免疫応答の強化、及びＧ蛋白質結合の改変が挙げられる。
【００３２】
ＭＣＨ−１Ｒポリペプチドはイヌ、フェレットもしくはアカゲザルに固有であるか又はこれらの各種動物の２種以上に存在する配列領域を含むことができる。図１Ａ及び１Ｂはイヌ、フェレット、アカゲザル、ヒト、ラット及びマウスＭＣＨ−１Ｒのアミノ酸配列比較を示す。図１に示す配列比較により、固有アミノ酸配列と共通アミノ酸配列を識別できる。
【００３３】
「固有」アミノ酸配列は少なくともヒト、ラット及びマウス配列と異なり、好ましくは更にイヌとフェレット、イヌとアカゲザル、フェレットとアカゲザル、又はイヌとアカゲザルとも異なる。本発明の１態様では、ＭＣＨ−１Ｒポリペプチドは配列番号１から３の少なくとも１つに固有の少なくとも９塩基長のアミノ酸配列を含むか又はこのような配列から構成される。付加態様では、固有配列は少なくとも１８アミノ酸長、少なくとも２７アミノ酸長、又は少なくとも５４アミノ酸長である。
【００３４】
「共通」アミノ酸配列はイヌ、フェレット及びアカゲザル配列の少なくとも２種に共通である。本発明の１態様では、ＭＣＨ−１Ｒポリペプチドはイヌ、フェレット及びアカゲザルＭＣＨ−１Ｒに共通であるが、ヒトＭＣＨ−１Ｒには存在しない少なくとも１８アミノ酸長のアミノ酸配列領域を有する。このようなポリペプチドの１例は配列番号１３：ＩＮＩＩＭＰＳＶＦＧＴＩＣＬＬＧＩＩである。
【００３５】
本明細書に記載する追加のＭＣＨ−１Ｒポリペプチドとしては、ＭＣＨに応答し且つ（１）配列番号１、２もしくは３と少なくとも約９８％の配列類似度を有するか、又は（２）配列番号１、２もしくは３に対して約１０カ所までの変異を有する配列を提供する機能的Ｇ蛋白質受容体が挙げられる。ポリペプチドの配列類似度はＢＬＡＳＴにより決定することができる（参考資料として本明細書に組込むＡｌｔｓｃｈｕｌら，１９９７．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５，３３８９−３４０２参照）。１態様では、配列類似度はｔＢＬＡＳＴｎ検索プログラムで以下のパラメーター：ＭＡＴＲＩＸ：ＢＬＯＳＵＭ６２、ＰＥＲ  ＲＥＳＩＤＵＥ  ＧＡＰ  ＣＯＳＴ：１１、及びλ比：１を使用して決定する。
【００３６】
アミノ酸配列変異は付加、欠失及び置換である。種々の態様でＭＣＨ−１Ｒポリペプチドは配列番号１、２又は３に対して１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０カ所の変異を有する。
【００３７】
ポリペプチドは化学合成と生化学合成を含む標準技術を使用して生産することができる。ポリペプチドの化学合成技術は当分野で周知である（例えばＶｉｎｃｅｎｔ，Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｄｅｋｋｅｒ，１９９０参照）。
【００３８】
ポリペプチドの生化学合成技術も当分野で周知である。このような技術はポリペプチド合成用核酸鋳型を利用する。特定アミノ酸をコードする核酸トリプレットの配列を提供する遺伝コードは当分野で周知である（例えばＬｅｗｉｎ  ＧＥＮＥＳ  ＩＶ，ｐ．１１９，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９０参照）。核酸を細胞に導入して核酸を発現させ、蛋白質を生産する技術の例はＡｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，１９８７−１９９８及びＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９等の文献に記載されている。
【００３９】
機能的ＭＣＨ−１Ｒ
機能的ＭＣＨ−１Ｒはリガンドと結合するとＧ蛋白質共役型細胞内シグナルを伝達する。アミノ酸及び核酸ＭＣＨ−１Ｒ配列が同定されると、イヌ、フェレット及びアカゲザルＭＣＨ−１Ｒを生産するため、他の起源からＭＣＨ−１Ｒを得るため、ＭＣＨ−１ＲキメラＧ蛋白質共役型受容体を生産するため、並びにイヌ、フェレット及びアカゲザルＭＣＨ−１Ｒの機能的誘導体を生産するためのツールが得られる。
【００４０】
イヌ、フェレット又はアカゲザルのＭＣＨ−１Ｒとの配列類似性に基づいて各種起源に由来するＭＣＨ−１Ｒポリペプチドを同定し、獲得することができる。イヌ、フェレット及びアカゲザルＭＣＨ−１Ｒのアミノ酸及び核酸配列は、追加のＭＣＨ−１Ｒポリペプチドを同定及び獲得するのに利用できる。例えば、配列番号１、２又は３を使用し、ＭＣＨ−１Ｒポリペプチドをコードする核酸を同定及びクローニングするための縮重核酸プローブ又はプライマーを設計することができ、配列番号７、８又は９、配列番号７、８又は９の相補体及びそのフラグメントを中度ストリンジェンシー条件下で使用し、ＭＣＨ−１Ｒポリペプチドをコードする核酸を同定及びクローニングすることができる。
【００４１】
クローニングにおける縮重プローブと中度ストリンジェンシー条件の使用は当分野で周知である。このような技術の例はＡｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，１９８７−１９９８及びＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９に記載されている。
【００４２】
特定起源から獲得したＭＣＨ−１Ｒから出発して受容体活性をもつ誘導体を生産することができる。このような誘導体としてはアミノ酸置換、付加及び欠失を含むポリペプチドが挙げられる。ほぼ同一性質をもつ誘導体を生産するには、三次構造を変えないようにＭＣＨ−１Ｒ結合ドメインの外側でＭＣＨ−１Ｒを変異させる必要がある。ポリペプチドがＭＣＨ−１Ｒ活性をもつか否かはＧ蛋白質活性測定等の技術を使用して確認することができる。
【００４３】
天然アミノ酸の差異はＲ基の差異に起因する。物理的サイズ、電荷及び疎水性等のアミノ酸の種々の性質はＲ基に左右される。アミノ酸は中性疎水性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン及びメチオニン）、中性、極性（グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン及びグルタミン）、塩基性（リジン、アルギニン及びヒスチジン）、及び酸性（アスパラギン酸及びグルタミン酸）等の種々の群に分類できる。
【００４４】
一般に、異なるアミノ酸に置換する際には、類似性質をもつアミノ酸を交換することが好ましい。ロイシンをバリンに、リジンをアルギニンに及びグルタミンをアスパラギンに等の特定群内の異なるアミノ酸への置換が、ポリペプチドの機能に変化を生じない良好な候補である。
【００４５】
アミノ酸群と異なる他への置換も可能である。このような置換は置換するアミノ酸のポリペプチド内の位置を考慮して行う。例えば、アルギニンは脂肪族側鎖が長いため、ポリペプチドの内部の非極性アミノ酸にグルタミン酸よりも自由に置換することができる（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，１９８７−１９９８，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３３  Ａｐｐｅｎｄｉｘ  １Ｃ参照）。
【００４６】
ＭＣＨ−１Ｒ抗体
配列番号１、２もしくは３を含むポリペプチド又はそのフラグメントを免役原として使用し、ＭＣＨ−１Ｒを認識する抗体を生産することができる。本発明の１態様では、免役原として使用するポリペプチドは配列番号１、２もしくは３のポリペプチド又は少なくとも９アミノ酸長のフラグメントから構成される。
【００４７】
ＭＣＨ−１Ｒに対する抗体は、ＭＣＨ−１Ｒの存在の同定や、ＭＣＨ−１Ｒポリペプチドの単離等の種々の用途がある。ＭＣＨ−１Ｒの存在の同定を利用し、例えばＭＣＨ−１Ｒを産生する細胞を同定することができる。このような同定によりＭＣＨ−１Ｒの追加の供給源が得られ、またＭＣＨ−１Ｒを産生することが分かっている細胞をＭＣＨ−１Ｒを産生しない細胞から区別することができる。
【００４８】
抗体を生産及び使用する技術は当分野で周知である。このような技術の例はＡｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，１９８７−１９９８、Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｔｏｒａｂｏｔｏｒｙ，１９９８及びＫｏｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７，１９７５に記載されている。
【００４９】
結合アッセイ
ＭＣＨ−１Ｒ又はそのフラグメントはこの受容体と結合する化合物を同定するための結合試験で使用することができる。このような試験は競合及び非競合形式等の種々の形式を使用して実施することができる。
【００５０】
リガンド結合に関与する特定ＭＣＨ−１Ｒ配列は受容体と各種受容体フラグメントに結合する標識化合物を使用して同定することができる。種々のストラテジーを利用して結合領域を狭めるように被験フラグメントを選択することができる。このようなストラテジーの例としてはＮ末端から約１５アミノ酸長の連続フラグメントの試験や、もっと長いフラグメントの試験が挙げられる。長いフラグメントを試験する場合には、化合物に結合するフラグメントを細分又は突然変異させて結合領域を更に局限することができる。結合試験に使用するフラグメントは組換え核酸技術により作製することができる。
【００５１】
組換え核酸から発現されるＭＣＨ−１Ｒを使用して結合アッセイを実施することが好ましい。本発明の１態様では、組換え発現されるＭＣＨ−１Ｒは配列番号１、配列番号２又は配列番号３のアミノ酸配列から構成される。
【００５２】
結合アッセイは個々の化合物又は各種個数の化合物を含む調製物を使用して実施することができる。ＭＣＨ−１Ｒに結合することが可能な各種個数の化合物を含む調製物をもっと小さい化合物群に分けて試験すると、ＭＣＨ−１Ｒに結合する化合物を同定することができる。
【００５３】
結合アッセイは種々の環境に存在するＭＣＨ−１Ｒを使用して実施することができる。このような環境としては例えばＭＣＨ−１Ｒを含む細胞抽出液及び精製細胞抽出液が挙げられ、更に例えば別環境に導入された精製ＭＣＨ−１Ｒポリペプチドの使用が挙げられる。
【００５４】
ＭＣＨ−１ＲのアゴニストとしてＭＣＨが同定されると、受容体活性を生成させる手段が得られ、受容体と結合して受容体活性を刺激するためのターゲットが得られる。ＭＣＨアゴニストはＭＣＨの構造に基づいて設計することができる。ＭＣＨアゴニストの例としてはヒトＭＣＨ、サケＭＣＨ及びその誘導体が挙げられる。利用可能な誘導体は例えばヒトＭＣＨの１個以上のアミノ酸を欠失又は置換し、得られたポリペプチドを試験することにより実験により同定することができる。特定配列のポリペプチドを生産するための技術は当分野で周知である。ＭＣＨ−１Ｒに結合するＭＣＨ誘導体の１例は（Ｐｈｅ１３Ｔｙｒ１９）−ＭＣＨである。
【００５５】
ＭＣＨアゴニストへの各種ラベルを利用することができる。このようなラベルの例としては放射性ラベル、発光分子、ハプテン及び酵素基質が挙げられる。特定ラベルが結合を妨げる能力は、この特定ラベルを含むＭＣＨが未標識ＭＣＨと競合する能力を比較することにより決定することができる。
【００５６】
機能アッセイ
１個またはそれ以上のＭＣＨ−１Ｒ領域を含む機能的Ｇ蛋白質受容体に関するアッセイは、ＭＣＨ−１Ｒに活性な化合物の選択、化合物が受容体活性に影響を及ぼす能力の評価、及び種々のＭＣＨ−１Ｒ領域の活性のマッピング等の種々の目的に利用することができる。ＭＣＨ−１Ｒ活性は、ＭＣＨ−１Ｒの細胞内コンホメーション変化の検出、Ｇ蛋白質活性の測定、細胞内メッセンジャーレベルの測定等の種々の技術を使用して測定することができる。
【００５７】
組換え発現受容体を使用すると、化合物が当該受容体又は別の受容体に活性か否かを決定し易くすることができる。例えば、通常にはこの受容体を発現しないＨＥＫ２９３、ＣＯＳ７又はＣＨＯ等の細胞系で発現ベクターによりＭＣＨ−１Ｒを発現させることができ、発現ベクターをもたないか又はＭＣＨ−１Ｒをコードしない発現ベクターをもつ同一細胞系を対照としてここで利用できる。
【００５８】
Ｇｉ、Ｇｓ及びＧｑ等の種々のＧ蛋白質活性を測定する方法は当分野で周知である。Ｇｉ及びＧｓ活性はメロナフォア（ｍｅｌｏｎａｐｈｏｒｅ）アッセイ、ｃＡＭＰ生産を測定するアッセイ、ｃＡＭＰ蓄積の阻害を測定するアッセイ、及び３５Ｓ−ＧＴＰの結合を測定するアッセイ等の方法により測定することができる。ｃＡＭＰはラジオイムノアッセイやｃＡＭＰ応答性遺伝子レポーター蛋白質による間接測定等の種々の方法を使用して測定することができる。
【００５９】
Ｇｑ活性は細胞内Ｃａ２＋の測定等の方法を使用して測定することができる。Ｃａ２＋
を測定するために利用可能な当分野で周知の方法の例としてはＦｕｒａ−２等の色素の使
用や、エクオリン等のＣａ２＋感受性生物発光レポーター蛋白質の使用が挙げられる。Ｇ蛋白質活性を測定するためにエクオリンを利用する細胞系の１例はＨＥＫ２９３／ａｅｑ１７である（いずれも参照により本明細書に組込むＢｕｔｔｏｎら，１９９３，Ｃｅｌｌ  Ｃａｌｃｉｕｍ，１４，６６３−６７１、及びＦｅｉｇｈｎｅｒら，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４，２１８４−２１８８参照）。
【００６０】
キメラＭＣＨ−１Ｒを使用してこの受容体に活性な化合物をアッセイし、この受容体の種々の領域に関する情報を得ることもできる。キメラＭＣＨ−１Ｒ受容体は、Ｎ末端細胞外ドメインと、膜貫通領域（好ましくは７個の膜貫通領域）からなる膜貫通ドメインと細胞外ループ領域と細胞内ループ領域と、細胞内カルボキシ末端ドメインとを含み、１個以上のドメインは少なくとも１８連続アミノ酸の配列番号１〜３の固有又は共通領域を含む。種々の態様でキメラＭＣＨ−１Ｒは配列番号１、２又は３のいずれかに存在するＭＣＨ−１Ｒの細胞外ドメインを含み、固有又は共通ドメインは配列番号１、２又は３に存在する少なくとも３６連続アミノ酸を含むか、又は配列番号１３の配列をもつ共通領域が存在する。
【００６１】
Ｇ蛋白質共役の特異性は細胞内ドメインにより決定される。所望Ｇ蛋白質に機能的に共役するようにキメラＭＣＨ−１Ｒを生産することができる。キメラ受容体を生産し、Ｇ蛋白質共役応答を測定する技術は例えば国際公開第ＷＯ９７／０５２５２号、米国特許第５，９８１，１９５号及び米国特許第５，２６４，５６５号に記載されている。
【００６２】
機能アッセイは個々の化合物又は種々の化合物を含む調製物を使用して実施することができる。１種以上の化合物がＭＣＨ−１Ｒ活性に影響を及ぼしている種々の化合物を含む調製物をもっと小さい化合物群に分けると、ＭＣＨ−１Ｒ活性に影響を及ぼす化合物を同定することができる。
【００６３】
機能アッセイは種々の環境に存在する組換え生産ＭＣＨ−１を使用して実施することができる。このような環境としては例えば機能的ＭＣＨ−１Ｒをコードする組換え核酸を発現する細胞や、組換え核酸から発現されるＭＣＨ−１Ｒを含む細胞抽出液及び精製細胞抽出液や、組換え手段により生産され、Ｇ蛋白質活性を測定するのに適した別環境に導入される精製ＭＣＨ−１Ｒの使用が挙げられる。
【００６４】
ＭＣＨ−１Ｒ受容体活性化合物のスクリーニングは、そのアッセイにおいてＭＣＨアゴニストを使用することにより容易になる。スクリーニングアッセイでＭＣＨアゴニストを使用するとＭＣＨ−１Ｒ活性が得られる。試験化合物がこのような活性に及ぼす効果を測定すると、例えばアロステリックモジュレーター及びアンタゴニストを同定することができる。
【００６５】
ＭＣＨ−１Ｒ核酸
本発明のＭＣＨ−１Ｒ核酸は、配列番号１、２又は３に存在する少なくとも１８アミノ酸長の固有領域又は共通領域を有するＭＣＨ−１Ｒポリペプチドをコードする領域を含む核酸と、配列番号７、８もしくは９の少なくとも１種又はその相補体に存在する少なくとも１１連続塩基の固有領域又は共通領域を含む核酸を含む。ＭＣＨ−１Ｒ核酸はＭＣＨ−１Ｒ核酸の存在を同定するためのハイブリダイゼーションプローブ又はＰＣＲプライマーとしての使用や、ＭＣＨ−１Ｒに関連する受容体をコードする核酸を同定するためのハイブリダイゼーションプローブ又はＰＣＲプライマーとしての使用や、ＭＣＨ−１Ｒポリペプチドの組換え発現における使用等の種々の用途がある。
【００６６】
ＭＣＨ−１Ｒ核酸はＭＣＨ−１Ｒ非由来核酸を伴っていてもよい。ＭＣＨ−１Ｒセグメントをコードしないか又は配列番号７、８、９もしくはその相補体に存在しない領域は、ＭＣＨ−１Ｒ核酸に存在する場合、特定の用途のためにこのような領域を選択することが好ましい。特定目的を達成するために使用可能な付加領域の例としてはサンドイッチアッセイの一部として使用可能な捕捉領域、核酸の存在を示すためにプローブとして使用可能なレポーター領域、発現ベクター領域、及び他のポリペプチドをコードする領域が挙げられる。
【００６７】
ＭＣＨ−１Ｒ核酸はイヌ、フェレットもしくはアカゲザルに固有であるか又はこれらの動物の２種以上に存在する配列領域を含むことができる。図２Ａ〜２Ｃはイヌ、フェレット、ヒト及びアカゲザルＭＣＨ−１Ｒをコードする核酸のヌクレオチド配列比較を示す。図２Ａ〜２Ｃに示す配列比較により、固有ヌクレオチド配列と共通ヌクレオチド配列を識別できる。
【００６８】
「固有」ヌクレオチド配列は少なくともヒト配列と異なり、好ましくは更にイヌとフェレット、イヌとアカゲザル、フェレットとアカゲザル、又はイヌとアカゲザルとも異なる。本発明の態様では、ＭＣＨ−１Ｒ核酸は配列番号７、８もしくは９の少なくとも１種又はその相補体に固有の少なくとも１８塩基長のヌクレオチド配列を含むか又はこのような配列から構成される。付加態様では、固有配列は少なくとも３６又は５４塩基長である。
【００６９】
「共通」ヌクレオチド配列はイヌ、フェレット及びアカゲザル配列の少なくとも２種に共通である。本発明の１態様では、ＭＣＨ−１Ｒ核酸は、イヌ、フェレット及びアカゲザルＭＣＨ−１Ｒに共通であるが、ヒト、ラット又はマウスＭＣＨ−１Ｒには存在しない少なくとも１１塩基長のヌクレオチド配列を有する。このような核酸の例は、
配列番号１４：ＡＡＣＣＴＣＡＣＣＴＣ；
配列番号１５：ＴＴＣＡＴＣＡＧＣＡＴＣＡＣＣＣＣＣＧＴＧ；
配列番号１６：ＣＡＡＣＣＣＡＧＡＣＡＣＴＧＡＣＣＴＴＴ；
配列番号１７：ＣＴＧＣＣＣＴＴＣＧＴＧＧＴＣＡＴＣ；及び
配列番号１８：ＣＴＣＡＣＣＴＴＴＧＴＣＴＡＣＣＴ
から構成される群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００７０】
追加のＭＣＨ−１Ｒ核酸としては、ＭＣＨに応答し、（１）コードされたＧ蛋白質が配列番号１、２もしくは３と少なくとも約９８％の配列類似度をもつか、（２）コードされたＧ蛋白質が配列番号１、２もしくは３に対して約１０カ所まで変異した配列をもつか、又は（３）核酸が配列番号７、８もしくは９と少なくとも約９８％の配列類似度をもつ、機能的Ｇ蛋白質が挙げられる。核酸の配列類似度はＢＬＡＳＴにより決定することができる（参照により本明細書に組込むＰｅａｒｓｏｎ  １９００．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８３，６３−９８参照）。１態様では、配列類似度はＦＡＳＴＡ検索プログラムで以下のパラメーター：ＭＡＴＲＩＸ：ＢＬＯＳＵＭ５０、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＩＥＳ：オープン＝−１２；残基＝−２を使用して決定する。
【００７１】
本明細書に記載する手引きに基づき、各種起源に由来するＭＣＨ−１Ｒ関連受容体をコードする核酸配列を取得し、ＭＣＨ−１Ｒ活性を有する受容体を構築することができる。各種起源に由来するＭＣＨ−１Ｒ関連受容体をコードする核酸を取得するには、縮重プローブ及びプライマーの組合せを使用し、ハイブリダイゼーション条件を適正に選択すると有利である。縮重プローブ及びプライマーの組合せは遺伝コードの縮重を考慮して作製する。ハイブリダイゼーション条件の調節は類似配列をもつ核酸とハイブリダイズできるようにプローブ又はプライマー特異性を制御するために有用である。
【００７２】
ハイブリダイゼーション検出及びＰＣＲクローニングに利用する技術は当分野で周知である。核酸検出技術は例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９に記載されている。ＰＣＲクローニング技術は例えばＷｈｉｔｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，第６７巻，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７に記載されている。
【００７３】
ＭＣＨ−１Ｒプローブ及びプライマーは例えばゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡを含む核酸ライブラリーをスクリーニングするために使用することができる。このようなライブラリーは市販されており、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，１９８７−１９９８に記載されているような技術を使用して作製することができる。
【００７４】
特定アミノ酸配列と遺伝コードの既知縮重から出発し、多数の異なるコーディング核酸配列を得ることができる。遺伝コードの縮重が生じるのは、ほぼ全アミノ酸がヌクレオチドトリプレット即ち「コドン」の種々の組合せによりコードされるためである。アミノ酸は以下のようにコドンによりコードされる。
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン：コドンＧＣＡ，ＧＣＣ，ＧＣＧ，ＧＣＵ
Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン：コドンＵＧＣ，ＵＧＵ
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸：コドンＧＡＣ，ＧＡＵ
Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸：ＧＡＡ，ＧＡＧ
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン：コドンＵＵＣ，ＵＵＵ
Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン：コドンＧＧＡ，ＧＧＣ，ＧＧＧ，ＧＧＵ
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン：コドンＣＡＣ，ＣＡＵ
Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン：コドンＡＵＡ，ＡＵＣ，ＡＵＵ
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リジン：コドンＡＡＡ，ＡＡＧ
Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン：コドンＵＵＡ，ＵＵＧ，ＣＵＡ，ＣＵＣ，ＣＵＧ，ＣＵＵ
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン：コドンＡＵＧ
Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン：コドンＡＡＣ，ＡＡＵ
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン：コドンＣＣＡ，ＣＣＣ，ＣＣＧ，ＣＣＵ
Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン：コドンＣＡＡ，ＣＡＧ
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン：コドンＡＧＡ，ＡＧＧ，ＣＧＡ，ＣＧＣ，ＣＧＧ，ＣＧＵ
Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン：コドンＡＧＣ，ＡＧＵ，ＵＣＡ，ＵＣＣ，ＵＣＧ，ＵＣＵ
Ｔ＝Ｔｈｒ＝スレオニン：コドンＡＣＡ，ＡＣＣ，ＡＣＧ，ＡＣＵ
Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン：コドンＧＵＡ，ＧＵＣ，ＧＵＧ，ＧＵＵ
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン：コドンＵＧＧ
Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン：コドンＵＡＣ，ＵＡＵ。
【００７５】
所望配列をもつ核酸は化学及び生化学技術を使用して合成することができる。化学技術の例はＡｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，１９８７−１９９８及びＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９に記載されている。
【００７６】
生化学合成技術は核酸鋳型とＤＮＡ及び／又はＲＮＡポリメラーゼ等の適切な酵素を使用する。このような技術の例としてはＰＣＲや転写による増幅等のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅技術とｉｎ  ｖｉｖｏ核酸複製が挙げられる。適切な技術の例はＡｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，１９８７−１９９８、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９及びＫａｃｉａｎら，米国特許第５，４８０，７８４号に記載されている。
【００７７】
ＭＣＨ−１Ｒプローブ
ＭＣＨ−１Ｒのプローブは適切なハイブリダイゼーション条件下でＭＣＨ−１Ｒターゲット核酸と特異的にハイブリダイズすることができ、ターゲット核酸を１種以上の非ターゲット核酸から区別できる領域を含む。ＭＣＨ−１ＲのプローブはＭＣＨ−１Ｒ核酸に非相補的な核酸も含むことができる。
【００７８】
存在する非相補的核酸はレポーター配列や捕獲配列等の特定目的をもつことが好ましい。しかし、追加の核酸はＭＣＨ−１Ｒプローブがターゲットと非ターゲットを区別するのを妨げない限り、特定目的をもつ必要がない。
【００７９】
ハイブリダイゼーションは相補的ヌクレオチド塩基を介して生じる。ハイブリダイゼーション条件は２種の分子又は領域が安定なハイブリッドを形成するために十分に強い相互作用をもつか否かを決定する。
【００８０】
相互にハイブリダイズする２種の分子間の相互作用の程度は形成されるハイブリッドのＴｍに依存する。Ｔｍが高いほど相互作用は強く、ハイブリッドは安定している。Ｔｍは相補度、存在する相補的塩基の種類（例えばＡ−ＴハイブリダイゼーションかＧ−Ｃハイブリダイゼーションか）、変異核酸の存在及び溶液成分等の当分野で周知の種々の因子に依存する。（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９参照。）
ハイブリッドのＴｍが特定系列のハイブリダイゼーションアッセイ条件下で使用する温度よりも高い場合には安定なハイブリッドが形成される。プローブの特異度はハイブリダイゼーションストリンジェンシー条件を調節することにより変えることができる。検出可能なラベルを使用することによりプローブハイブリダイゼーションの検出が容易になる。検出可能なラベルの例としては発光、酵素及び放射性ラベルが挙げられる。
【００８１】
ストリンジェンシー条件の例はＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９に記載されている。高ストリンジェンシー条件の１例を以下に挙げる。ＤＮＡを含むフィルターを６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液及び変性サケ精子ＤＮＡ１００μｇ／ｍｌから構成される緩衝液中で２時間〜一晩６５℃でプレハイブリダイズさせる。変性サケ精子ＤＮＡ１００μｇ／ｍｌと３２Ｐ標識プローブ５〜２０×１０６ｃｐｍを含むプレハイブリダイゼーション混合物中でフィルターを１２〜４８時間６５℃でハイブリダイズさせる。２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む溶液で３７℃で１時間フィルターを洗浄する。次いで０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで５０℃で４５分間洗浄した後、オートラジオグラフィーにかける。高ストリンジェンシー条件を使用する他の手順としては、例えば５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、５０％ホルムアミド中で４２℃で１２〜４８時間実施するハイブリダイゼーション段階や、０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳで６５℃で３０〜６０分間実施する洗浄段階が挙げられる。
【００８２】
プローブは核酸又は修飾核酸やペプチド核酸等のその誘導体から構成される。修飾核酸としては１個以上の改変糖基、改変ヌクレオチド間結合及び／又は改変ヌクレオチドプリン又はピリミジン塩基をもつ核酸が挙げられる。修飾核酸に関する文献としては、各々参照により本明細書に組込むＷＯ９８／０２５８２、米国特許第５，８５９，２２１号及び米国特許第５，８５２，１８８号が挙げられる。
【００８３】
組換え発現
ＭＣＨ−１Ｒポリペプチドは翻訳系を使用して適切な宿主又は試験管で組換え核酸から発現させることができる。組換え発現されたＭＣＨ−１ＲポリペプチドはＭＣＨ−１Ｒに結合してこの受容体の活性を調節する化合物をスクリーニングするためのアッセイで使用することが好ましい。
【００８４】
発現は発現ベクターを使用して宿主細胞で行うことが好ましい。発現ベクターは適正な転写とプロセシングのための調節因子と共にポリペプチドをコードする組換え核酸を含む。利用可能な調節因子としては天然に組換え核酸に関連するものと天然には組換え核酸に関連しない外来調節因子が挙げられる。特定宿主で組換え核酸を発現させるためには外来プロモーター等の外来調節因子が有用であり得る。
【００８５】
一般に、発現ベクターで使用する調節因子としては転写プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、及び場合により存在するオペレーターが挙げられる。別の好ましい因子は真核細胞でのプロセシングを可能にするポリアデニル化シグナルである。発現ベクターは更に宿主細胞での自律複製のための複製起点、選択マーカー、制限数の有用制限酵素部位及び高コピー数の可能性を含むことが好ましい。発現ベクターの例はクローニングベクター、改変クローニングベクター、特定設計プラスミド及びウイルスである。
【００８６】
種々の宿主で適切なレベルのポリペプチド発現を可能にする発現ベクターは当分野で周知である。当分野で周知の哺乳動物発現ベクターとしてはｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ３７４６０）、ｐＣＩ−ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）及びλＺＤ３５（ＡＴＣＣ３７５６５）が挙げられる。当分野で周知の細菌発現ベクターとしてはｐＥＴ１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、λｇｔ１１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が挙げられる。当分野で周知の真菌細胞発現ベクターとしてはｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｐｉｃｈｉａ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられる。当分野で周知の昆虫細胞発現ベクターとしてはＢｌｕｅ  Ｂａｃ  ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられる。
【００８７】
組換え宿主細胞は原核細胞でも真核細胞でもよい。組換え宿主細胞の例としては、細菌類（例えば大腸菌）、真菌細胞（例えば酵母）、哺乳動物細胞（例えばヒト、ウシ、ブタ、サル及び齧歯類）、及び昆虫細胞（例えばショウジョウバエ及びカイコに由来する細胞系）が挙げられる。市販哺乳動物細胞系としてはＬ細胞Ｌ−Ｍ（ＴＫ．ｓｕｐ．−）（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１．３）、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１．２）、２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５７３）、Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ８６）、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２６）及びＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１７１）が挙げられる。
【００８８】
特定宿主における発現を強化するためには、宿主のコドン使用を考慮するように配列番号７、８又は９に記載の配列を改変することが有用な場合もある。種々の生物のコドン使用は当分野で周知である。（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，１９８７−１９９８，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３３  Ａｐｐｅｎｄｉｘ  １Ｃ参照）。
【００８９】
発現ベクターは標準技術を使用して宿主細胞に導入することができる。このような技術の例としては形質転換、トランスフェクション、リポフェクション、プロトプラスト融合及びエレクトロポレーションが挙げられる。
【００９０】
ＭＣＨ−１Ｒポリペプチドをコードする核酸は発現ベクターを使用せずに例えばＭＣＨ−１Ｒポリペプチドをコードする組換え核酸を作製するか又は細胞ゲノムに導入することにより細胞で発現させることもできる。更に、ｍＲＮＡをコムギ胚芽抽出液や網状赤血球抽出液等の種々の無細胞系及びカエル卵母細胞等の細胞系で翻訳することもできる。ｍＲＮＡを細胞系に導入するには例えばマイクロインジェクションを利用できる。
【００９１】
ＭＣＨ−１Ｒ活性の調節
本明細書を手引きとして使用し、ＭＣＨ−１Ｒを調節することが可能な化合物を取得し、これを使用して患者に有益な効果を達成することができる。有益な効果は例えばＭＣＨ−１Ｒに対して活性な化合物を使用して体重を変化させるか又はストレスを軽減することにより得ることができる。
【００９２】
体重変化は体重不足患者の体重を増加するか又は過体重患者の体重を減らすのに特に有用である。更に、例えば家畜の体重を増加するように処置することもできる。体重不足患者としては「正常」体重範囲ないし体重指数（ＢＭＩ）の下限に対する体重不足が約１０％以下、２０％以下、又は３０％以下の患者が挙げられる。過体重患者としては「正常」体重範囲ないしＢＭＩの上限に対する体重超過が約１０％以上、２０％以上、３０％以上又は５０％以上の患者が挙げられる。「正常」体重範囲は当分野で周知であり、患者の年齢、身長及び体型等の因子を考慮する。
【００９３】
ＢＭＩは身長／体重比を表す。これは体重（ｋｇ）を身長（ｍ）の二乗で割ることにより計算される。ＢＭＩ「正常」範囲は１９〜２２である。
【００９４】
ＭＣＨ−１Ｒ調節化合物はキットとして提供することができる。このようなキットは一般に投与用製剤中に活性化合物を含む。製剤は１日以上の期間に一定間隔で（例えば１日１〜６回）患者に投与した場合に有益な効果が得られるように十分な量の活性化合物を含む。キットは（例えば肥満症又は過体重を治療するための）減量又はストレス緩和を適応症とする製剤の使用や、特定期間に摂取すべき製剤の量を指示した説明書を添付することが好ましい。
【００９５】
治療用投与
薬剤投与一般の指針は例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９９０及びＭｏｄｅｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，第２版，ＢａｎｋｅｒとＲｈｏｄｅｓ編，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９９０に記載されており、いずれも参考資料として本明細書に組込む。
【００９６】
適当な官能基をもつＭＣＨ−１Ｒ活性化合物は酸性又は塩基性塩として製造することができる。（水溶性、油溶性、水分散性又は油分散性生成物形態の）医薬的に許容可能な塩としては例えば無機又は有機酸又は塩基から形成される慣用非毒性塩又は第４級アンモニウム塩が挙げられる。このような塩の例としては酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、蓚酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩及びウンデカン酸塩等の酸付加塩と、アンモニウム塩、アルカリ金属塩（例えばナトリウム及びカリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えばカルシウム及びマグネシウム塩）、有機塩基との塩（例えばジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン）及びアミノ酸（例えばアルギニンやリジン）との塩等の塩基性塩が挙げられる。
【００９７】
ＭＣＨ−１Ｒ活性化合物は経口、鼻腔、吸入及び経粘膜等の種々の経路を使用して投与することができる。懸濁液として経口投与する活性成分は製薬分野で周知の技術により製造することができ、増量剤として微結晶セルロース、懸濁剤としてアルギン酸又はアルギン酸ナトリウム、増粘剤としてメチルセルロース、及び甘味／香味剤を加えることができる。即時放出錠として、これらの組成物は微結晶セルロース、リン酸２カルシウム、澱粉、ステアリン酸マグネシウム及び乳糖及び／又は他の賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、希釈剤及び滑剤を加えることができる。
【００９８】
鼻腔エアゾール又は吸入により投与する場合には、製薬分野で周知の技術により組成物を製造することができる。このような技術としては、ベンジルアルコール又は他の適当な防腐剤、バイオアベイラビリティを増進するための吸収促進剤、フルオロカーボン、又は他の溶解もしくは分散助剤を使用して塩類溶液を調製する方法が挙げられる。
【００９９】
投与経路としては静脈内（一時投与と点滴の両者）、腹膜組織内、皮下、閉塞の有無を問わずに局所、又は筋肉内が挙げられる。当分野で公知の注射溶液又は懸濁液としてはマンニトール、１，３−ブタンジオール、水、リンゲル液及び等張塩化ナトリウム液等の適当な非経口的に許容可能な非毒性希釈剤又は溶媒が挙げられる。分散又は湿潤剤及び懸濁剤としては合成モノ又はジグリセリド等の無菌無刺激性不揮発性油や、オレイン酸等の脂肪酸が挙げられる。
【０１００】
座剤形態の直腸投与としてはカカオバター、合成グリセリドエステル又はポリエチレングリコール等の適当な非刺激性賦形剤の使用が挙げられる。これらの賦形剤は常温で固体であるが、肛門内で液化及び／又は溶解して薬剤を放出する。
【０１０１】
本発明の治療用途に適した投薬計画は患者の年齢、体重、性別及び症状、治療する症状の重篤度、投与経路、患者の腎及び肝機能、並びに使用する特定化合物等の当分野で周知の因子を考慮して選択される。
【０１０２】
無毒性で効力を生じる範囲内の薬剤濃度を最適精度で達成するには、薬剤のターゲット部位送達動態に基づく投薬計画が必要である。このためには薬剤の分布、平衡及び排泄を考慮する必要がある。患者の１日用量は０．０１〜１，０００ｍｇ／成人患者／日であると予想される。
【０１０３】
以下、実施例により本発明の種々の特徴を更に例示する。以下の実施例は本発明の有用な実施方法も例示する。これらの実施例は特許請求の範囲に記載した発明を限定するものではない。
【実施例１】
【０１０４】
アカゲザルＭＣＨ−１Ｒのクローニング
アカゲザルＭＣＨ−１Ｒの全長コーディング配列を次のようにクローニングした。
【０１０５】
２種の混合塩基プライマーＭＣＨ３−１（ＧＧＩ  ＡＴＧ  ＣＣＩ  ＴＴＹ  ＨＴＩ  ＡＴＨ  ＣＡＹ  ＣＡ；配列番号１９）及びＭＣＨ３−２（ＡＲＹ  ＴＧＩ  ＡＤＩ  ＡＣＲ  ＴＲＲ  ＴＡＩ  ＧＧＩ  ＧＣ；配列番号２０）を合成した（Ｈ＝Ａ，Ｃ又はＴ、Ｒ＝Ｇ又はＡ、Ｙ＝Ｔ又はＣ、Ｉ＝イノシン）。アカゲザル脳ｃＤＮＡλｇｔ１０ライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を鋳型とし、上記プライマーを使用してＰＣＲを実施し、産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした。クローンをランダムに抽出し、Ｍ１３フォワード及びリバースプライマーを使用してＡＢＩ３７７シーケンサー（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）でダイターミネーター法により配列決定した。その結果、アカゲザルＭＣＨ−１Ｒ  ｃＤＮＡの部分配列が得られた。
【０１０６】
上記部分配列に基づいて４種のプライマーｍＭＣＨ１Ｒ−１（ＣＡＣＧＧＣＣＡＴＧＧＡＴＧＣＣＡＡＴＡＧＴＣＡＧ；配列番号２１）、ｍＭＣＨ１Ｒ−２（ＡＡＧＡＡＧＡＣＣＡＧＧＣＡＧＡＴＧＧＣＧＡＴＧＧ；配列番号２２）、ｍＭＣＨ１Ｒ−３（ＴＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＴＣＣＴＧＡＣＣＧＣ；配列番号２３）及びｍＭＣＨ１Ｒ−４（ＣＡＧＧＧＣＡＡＡＧＧＣＣＡＧＧＡＡＡＡＡＣＴＧＧ；配列番号２４）を設計し、合成した。ベクターと遺伝子に特異的なプライマーを使用してＰＣＲによるＲＡＣＥ反応を実施した。アカゲザル脳ｃＤＮＡライブラリーを使用し、まずｍＭＣＨ１Ｒ−１＋ｇｔ１０−１（ベクター特異的プライマー：ＡＧＴＣＡＡＣＡＣＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＡＧＣＴＧＡ；配列番号２５）又はｇｔ１０−３（ＣＧＣＣＴＣＣＡＴＣＡＡＣＡＡＡＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＴ；配列番号２６）とｍＭＣＨ１Ｒ−２＋ｇｔ１０−１又はｇｔ１０−３でＲＡＣＥ反応を実施した。これらの反応（一次反応）からのＰＣＲ産物を鋳型として使用し、一次反応産物の内側に入れ子にしたプライマーを使用して二次ＰＣＲ反応を実施した。即ちｍＭＣＨ１Ｒ−１を含む一次反応からの鋳型にはｍＭＣＨ１Ｒ−３（ｍＭＣＨ１Ｒ−１の内側）＋ｇｔ１０−２（ベクター特異的、ｇｔ１０−１の内側；ＴＴＡＧＴＴＴＴＡＣＣＧＴＴＴＴＣＧＡＧＣＴＧＣＴＣＴＡ；配列番号２７）又はｇｔ１０−４（ベクター特異的、ｇｔ１０−３の内側；ＧＡＴＴＧＧＧＧＧＴＡＡＡＴＡＡＣＡＧＡＧＧＴＧＧ；配列番号２８）を使用し、ｍＭＣＨ１Ｒ−２を含む一次反応からの鋳型にはｍＭＣＨ１Ｒ−４（ｍＭＣＨ１Ｒ−２の内側）＋ｇｔ１０−２又はｇｔ１０−４を使用した。増幅産物を上述のようにクローニングし、配列決定した。ソフトウェアＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）を使用して全ヌクレオチド配列データを集計し、３５３アミノ酸のポリペプチドをコードする１０６２ヌクレオチドのオープンリーディングフレームと終止コドンを同定した。アカゲザル脳ｃＤＮＡλｇｔ１０ライブラリーを使用してＰＣＲにより完全ＯＲＦ配列を含むｃＤＮＡをクローニングした。
【実施例２】
【０１０７】
アカゲザルＭＣＨ−１Ｒの一過性発現
アカゲザルＭＣＨ−１Ｒの完全コーディング配列をｐＥＦ１／Ｖ５−ＨｉｓＢプラスミドベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｓｂａｄ，ＣＡ）のＥｃｏＲＩ−ＮｔｏＩ部位にクローニングした。ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ  ＰＬＵＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を製造業者の指示に従って使用し、前記構築物をＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。加湿雰囲気下５％ＣＯ２、３７℃で１０％ウシ胎児血清、１００単位／ｍｌペニシリン−Ｇ及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを加えたダルベッコ変法イーグル培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でＳＶ４０ラージＴ抗原を構成的に発現するヒト胚性腎細胞（ＨＥＫ−２９３Ｔ）を培養した。
【０１０８】
Ｃａ２＋感受性蛍光色素ｆｕｒａ−２を使用して細胞内カルシウムイオン濃度（［Ｃａ２＋］）を蛍光測定した。アカゲザルＭＣＨ−１ＲｃＤＮＡを含むｐＥＦ１／Ｖ５−ＨｉｓＢプラスミドを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクションから４８時間後に２ｍＭ  ＥＤＴＡを加えたリン酸緩衝塩類で回収し、アッセイ緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳと０．１％ＢＳＡを加えたハンクス平衡塩類溶液，ｐＨ７．４）で１回洗浄した。２μＭ  ｆｕｒａ−２アセトキシメチルエステルを加えた緩衝液（同仁化学、熊本、日本）に細胞を細胞密度１．０×１０７個／ｍｌに懸濁し、静かに振盪しながら３７℃で６０分間培養した。ｆｕｒａ−２を取込ませた細胞を前記緩衝液で２回洗浄し、緩衝液に１．０×１０６個／ｍｌまで再懸濁した。得られた懸濁液０．５ｍｌをガラスキュベット内で３７℃で連続撹拌しながら測定した。ＭＣＨ（ペプチド研究所、大阪、日本）又は［Ｐｈｅ１３，Ｔｙｒ１９］−ＭＣＨ（Ｂａｃｈｅｍ，Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ，スイス）のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液２．５μｌを細胞懸濁液に加え、発光波長５００ｎｍと励起波長３４０及び３８０ｎｍの蛍光強度をＣＡＦ−１１０細胞内イオン測定装置（日本分光、東京、日本）でモニターした。ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．０（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，米国）を使用してデータを分析した。
【０１０９】
図３に示すように、ＭＣＨと［Ｐｈｅ１３，Ｔｙｒ１９］−ＭＣＨのどちらもアカゲザルＭＣＨ−１Ｒを一過性に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞で細胞内カルシウム濃度を用量依存的に強力に増加した（ＭＣＨと［Ｐｈｅ１３，Ｔｙｒ１９］−ＭＣＨのＥＣ５０を計算した処、夫々０．３０及び１．１ｎＭであった）が、トランスフェクトしなかった細胞では検出可能な［Ｃａ２＋］増加を誘導することができなかった（データは示さず）。これらの結果から、アカゲザルＭＣＨ−１Ｒ配列は活性ＭＣＨ受容体をコードすることが確認された。
【実施例３】
【０１１０】
ＭＣＨ結合実験
ポリ−Ｄ−Ｌｙｓを被覆した２４ウェル培養プレートにＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１×１０５細胞／ウェルで播種し、一晩培養した。接着細胞にｐＥＦ１／Ｖ５−ＨｉｓＢ／アカゲザルＭＣＨ−１Ｒプラスミド（実施例２参照）をトランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後に、トランスフェクトした単層細胞をアッセイ緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．２％ＢＳＡ及び１００μｇ／ｍｌバシトラシンを加えたハンクス平衡塩類溶液，ｐＨ７．４）でリンスした。次に、［１２５Ｉ］−ＭＣＨ（１００ｐＭ，ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）又は［１２５Ｉ］−［Ｐｈｅ１３，Ｔｙｒ１９］−ＭＣＨ（１００ｐＭ，ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を加えた同一緩衝液２５０μｌ／ウェルで細胞を３０分間３７℃で培養した。培養後に細胞を氷冷アッセイ緩衝液で３回洗浄し、２Ｍ  ＮａＯＨ５００μｌ／ウェルで溶解させた。溶解液を試験管に移し、細胞に結合した放射能をＣＯＢＬＡ  Ｑｕａｎｔｕｍ  γカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ）により測定した。１μＭ冷ＭＣＨ又は［Ｐｈｅ１３，Ｔｙｒ１９］−ＭＣＨの共存下で対応する放射性リガンドについて非特異的結合を決定した。
【０１１１】
［１２５Ｉ］−ＭＣＨ及び［１２５Ｉ］−［Ｐｈｅ１３，Ｔｙｒ１９］−ＭＣＨはアカゲザルＭＣＨ−１Ｒを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞に良好な精度で結合した。モックをトランスフェクトした細胞に特異的結合は観察されなかった（表１）。
【０１１２】
【表１】
2005508161.tif 000003
【０１１３】
ｐＥＦ１／Ｖ５−ＨｉｓＢ／ＭＣＨ−１ＲプラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクションから４８時間後に２ｍＭ  ＥＤＴＡを加えたリン酸緩衝塩類で回収し、アッセイ緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．２％ＢＳＡ及び１００μｇ／ｍｌバシトラシンを加えたハンクス平衡塩類溶液，ｐＨ７．４）で１回洗浄した。次に、１００ｐＭ［１２５Ｉ］−ＭＣＨを加えた同一緩衝液２５０μｌ／試験管で細胞（４×１０５個／試験管）を３０分間３７℃で培養した。培養後に、０．３％ポリエチレンイミンに予め浸しておいたＵｎｉｆｉｌｔｅｒ  ＧＦ／Ｂガラスフィルター（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）で濾過することにより結合［１２５Ｉ］−ＭＣＨと遊離［１２５Ｉ］−ＭＣＨを分離した。ＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＨＴＳ（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）でＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔ  ０  シンチレーションカクテル（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を使用してフィルターの残留放射能を定量した。１μＭ冷ＭＣＨの共存下の総結合量と非特異的結合量の差として特異的結合量を決定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．０を使用してデータを分析した。
【０１１４】
図４に示すように、コールドＭＣＨ及び［Ｐｈｅ１３，Ｔｙｒ１９］−ＭＣＨはＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現させたアカゲザルＭＣＨ−１Ｒと［１２５Ｉ］−ＭＣＨの結合を用量依存的に阻害した。本実験のＭＣＨと［Ｐｈｅ１３，Ｔｙｒ１９］−ＭＣＨのＩＣ５０値を計算した処、夫々０．０７４及び０．１４ｎＭであった。
【実施例４】
【０１１５】
イヌＭＣＨ−１Ｒクローニング
まず受容体の一部をコードするイヌＭＣＨ−１Ｒの７００ｂｐフラグメントを得た後にこのフラグメントを使用してもっと長い配列を得ることによりイヌＭＣＨ−１Ｒをクローニングした。イヌＭＣＨ−１Ｒフラグメントはラット、マウス及びヒトＭＣＨ−１Ｒ間で完全に保存されているプライマーを使用してイヌ視床下部ライブラリーグリセロールストックからＰＣＲにより作製した。フォワードプライマーはＲＭＨ−ＭＣＨ−１Ｆ５’−ＴＴＣＡＴＧＡＴＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＡＴＧＧＧ−３’（配列番号２９）とした。リバースプライマーはＲＭＨ−ＭＣＨ−ｔｇａＲ５’−ＴＣＡＧＧＴＧＣＣＴＴＴＧＣＴＴＴＣＴＧＴＣＣ−３’（配列番号３０）とした。イヌＭＣＨ−１Ｒフラグメントはゲル電気泳動を使用して単離した。得られたバンドＴＡをクローニングし、配列を確認した。
【０１１６】
イヌＭＣＨ−１Ｒフラグメントをイヌ視床下部ｃＤＮＡライブラリーのコロニーハイブリダイゼーションスクリーニングでプローブとして使用した。スプライス接合部でイントロンとなるイヌＭＣＨ−１Ｒのエキソン２のみから構成される多数の非スプライスｃＤＮＡクローンが同定された。イヌＭＣＨ−１Ｒのエキソン１をもつ１個のクローンが同定されたので、残りの８０ｂｐ配列が決定された。
【実施例５】
【０１１７】
フェレットＭＣＨ−１Ｒクローニング
フェレットＭＣＨ−１Ｒをフェレット脳ｃＤＮＡライブラリーからクローニングした。２６週齢去勢雄フェレットをと殺解剖し、脳組織をすぐに液体窒素で冷凍した。セラミック乳棒と乳鉢を使用して脳組織を液体窒素下にホモジナイズした。Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−１５９，１９８７に記載されているように全脳ＲＮＡを抽出した。
【０１１８】
次いでポリアデニル化メッセンジャーＲＮＡを抽出するために、ＰｏｌｙＡ  Ｔｒａｃｔ  ｍＲＮＡ抽出システム（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を製造業者のプロトコールに従って使用した。オリゴｄＴミックスとランダムヘキサマープライマーとＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を製造業者の指示に従って使用して第１鎖ｃＤＮＡ合成を開始した。第２鎖合成とアダプターライゲーション（ＢｓｔＸＩ／ＥｃｏＲＩ）後にｃＤＮＡをプラスミドベクターｐｃＤＮＡ３．１  Ｈｙｇｒｏ（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした。
【０１１９】
部分フェレットＭＣＨ−１Ｒプローブを使用して高ストリンジェンシー（０．１×ＳＳＣ，６５℃）下に１．５×１０６コロニーをスクリーニングすることによりフェレットＭＣＨ−１Ｒの全長ｃＤＮＡを単離した。ＭＣＨ−１ＲプローブはＲＴ−ＰＣＲにより予め単離した。合計１８個のクローンが同定され、２．６ｋｂのｃＤＮＡインサートをもつクローンの配列が決定された。
【０１２０】
次に、フェレットＭＣＨ−１Ｒの結合と機能性を分析するために、プライマーとしてＦ１Ｒ／Ｅｃｏ／Ｋｏｚａｋ／ＡＴＧとＦ１Ｒ／ＴＧＡ／Ｘｂａ／ｒｅｖを使用してＰＣＲによりコーディング領域を増幅した。ＰＣＲ条件は９５℃１分、（９５℃３０秒、６５℃１分、６８℃２分）３０サイクル、６８℃３分とした。コーディング領域をプラスミドベクターｐｃＤＮＡ３．１ｈｙｇｒｏ＋とｐＣＩｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に移した。プライマー配列はＦ１Ｒ／Ｅｃｏ／Ｋｏｚａｋ／ＡＴＧ：ＣＧＧＡＡＴＴＣＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＡＣＣＴＧＧＧＡＧＣＣＴＣＧＣＴＧＣ（配列番号３１）及びＦ１Ｒ／ＴＧＡ／Ｘｂａ／ｒｅｖ：ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＧＧＴＧＣＣＴＴＴＧＣＴＴＴＣＴＧＴＣＣＴＣ（配列番号３２）とした。
【０１２１】
他の態様も特許請求の範囲に含まれる。以上、数種の態様を示し、説明したが、本発明の精神と範囲から逸脱することなく種々の変更が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１Ａ】図１Ａ及び１Ｂはイヌ（配列番号１）、フェレット（配列番号２）、アカゲザル（配列番号３）、ヒト（配列番号４）、ラット（配列番号５）及びマウス（配列番号６）ＭＣＨ−１Ｒのアミノ酸配列の比較を示す。
【図１Ｂ】図１Ａ及び１Ｂはイヌ（配列番号１）、フェレット（配列番号２）、アカゲザル（配列番号３）、ヒト（配列番号４）、ラット（配列番号５）及びマウス（配列番号６）ＭＣＨ−１Ｒのアミノ酸配列の比較を示す。
【図２Ａ】図２Ａ、２Ｂ及び２Ｃはイヌ（配列番号７）、フェレット（配列番号８）、アカゲザル（配列番号９）、ヒト（配列番号１０）、ラット（配列番号１１）及びマウス（配列番号１２）ＭＣＨ−１ＲのｃＤＮＡ配列の比較を示す。
【図２Ｂ】図２Ａ、２Ｂ及び２Ｃはイヌ（配列番号７）、フェレット（配列番号８）、アカゲザル（配列番号９）、ヒト（配列番号１０）、ラット（配列番号１１）及びマウス（配列番号１２）ＭＣＨ−１ＲのｃＤＮＡ配列の比較を示す。
【図２Ｃ】図２Ａ、２Ｂ及び２Ｃはイヌ（配列番号７）、フェレット（配列番号８）、アカゲザル（配列番号９）、ヒト（配列番号１０）、ラット（配列番号１１）及びマウス（配列番号１２）ＭＣＨ−１ＲのｃＤＮＡ配列の比較を示す。
【図３】ＭＣＨと［Ｐｈｅ１３，Ｔｙｒ１９］−ＭＣＨがアカゲザルＭＣＨ−１Ｒを一過性発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞で細胞内カルシウム濃度の用量依存的増加を生じる能力を示す。
【図４】ＭＣＨと［Ｐｈｅ１３，Ｔｙｒ１９］−ＭＣＨがＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現させたアカゲザルＭＣＨ−１Ｒと［１２５Ｉ］−ＭＣＨの結合を用量依存的に阻害する能力を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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