(57)【要約】本願において、癌（特に、乳癌）の治療および診断のための組成物および方法が開示される。例示的な組成物は、１つ以上の乳房腫瘍ポリペプチド、その免疫原性部分、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、このようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞、ならびにこのようなポリペプチドを発現する細胞に特異的なＴ細胞を含む。開示された組成物は、例えば、疾患（特に、乳癌）の診断、予防および／または処置において有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、
（ａ）配列番号３４２、３４１、および３４３〜３４４に提供される配列；
（ｂ）配列番号３４２、３４１、および３４３〜３４４に提供される配列の相補体；
（ｃ）配列番号３４２、３４１、および３４３〜３４４に提供される配列の少なくとも２０個連続する残基からなる配列；
（ｄ）配列番号３４２、３４１、および３４３〜３４４に提供される配列に高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列；
（ｅ）配列番号３４２、３４１、および３４３〜３４４の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列；
（ｆ）配列番号３４２、３４１、および３４３〜３４４の配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列；ならびに
（ｇ）配列番号３４２、３４１、および３４３〜３４４に提供される配列の縮重改変体、
からなる群より選択される配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、
（ａ）請求項１に記載のポリヌクレオチドによってコードされる配列；および
（ｂ）請求項１に記載のポリヌクレオチドによってコードされる配列と少なくとも７０％の同一性を有する配列；ならびに
（ｃ）請求項１に記載のポリヌクレオチドによってコードされる配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列；
（ｄ）配列番号３４５〜４２８に示される配列；
（ｅ）配列番号３４５〜４２８に示される配列と少なくとも７０％の同一性を有する配列；ならびに
（ｆ）配列番号３４５〜４２８に示される配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項３】
発現制御配列に作動可能に連結された請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた、宿主細胞。
【請求項５】
請求項２に記載のポリペプチドに特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
患者における癌の存在を検出するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）該患者から生物学的サンプルを得る工程；
（ｂ）該生物学的サンプルを、請求項２に記載のポリペプチドに結合する結合因子と接触させる工程；
（ｃ）該結合因子に結合するポリペプチドの量を該サンプル中で検出する工程；
（ｄ）該ポリペプチドの量を所定のカットオフ値と比較し、そして、それから、該患者における癌の存在を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項７】
請求項２に記載の少なくとも１つのポリペプチドを含む、融合タンパク質。
【請求項８】
配列番号３４２、３４１、および３４３〜３４４に示される配列に、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、オリゴヌクレオチド。
【請求項９】
腫瘍タンパク質に特異的なＴ細胞を刺激および／または増殖するための方法であって、該方法は、Ｔ細胞を、
（ａ）請求項２に記載のポリペプチド；
（ｂ）請求項１に記載のポリヌクレオチド；および
（ｃ）請求項２に記載のポリペプチドを発現する抗原提示細胞、
からなる群より選択される少なくとも１つの成分と、Ｔ細胞の刺激および／または増殖を可能にするのに十分な条件下および時間で接触させる工程、を包含する、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法に従って調製されたＴ細胞を含む、単離されたＴ細胞集団。
【請求項１１】
第１の成分および第２の成分を含む組成物であって、該第１の成分は、生理学的に受容可能なキャリアおよび免疫刺激剤からなる群より選択され、そして該第２の成分は、
（ａ）請求項２に記載のポリペプチド；
（ｂ）請求項１に記載のポリヌクレオチド；
（ｃ）請求項５に記載の抗体；
（ｄ）請求項７に記載の融合タンパク質；
（ｅ）請求項１０に記載のＴ細胞集団；および
（ｆ）請求項２に記載のポリペプチドを発現する抗原提示細胞、
からなる群より選択される、組成物。
【請求項１２】
患者における免疫応答を刺激するための方法であって、該方法は、請求項１１に記載の組成物を該患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１３】
患者における乳癌の処置のための方法であって、請求項１１に記載の組成物を該患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１４】
患者における癌の存在を決定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）該患者から生物学的サンプルを得る工程；
（ｂ）該生物学的サンプルを、請求項８に記載のオリゴヌクレオチドと接触させる工程；
（ｃ）該オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドの量を該サンプル中で検出する工程；
（ｄ）該オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドの量を所定のカットオフ値と比較し、そして、それから、該患者における癌の存在を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１５】
請求項８に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを備える、診断キット。
【請求項１６】
請求項５に記載の少なくとも１つの抗体と検出試薬とを備える診断キットであって、該検出試薬はレポーター基を含む、診断キット。
【請求項１７】
患者における乳癌の処置の方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）患者から単離されたＣＤ４＋  Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋  Ｔ細胞を、
（ｉ）請求項２に記載のポリペプチド；
（ｉｉ）請求項１に記載のポリヌクレオチド；および
（ｉｉｉ）請求項２に記載のポリペプチドを発現する抗原提示細胞、
からなる群より選択される少なくとも１つの成分と共に、Ｔ細胞が増殖するようにインキュベートする工程；
（ｂ）有効量の該増殖したＴ細胞を該患者に投与し、それにより、該患者における癌の発症を阻害する工程、
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（本発明の分野）
本発明は、一般に、癌（例えば、乳癌）の治療および診断に関する。本発明は、より詳細には、乳癌タンパク質の少なくとも一部を含むポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。このようなポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、乳癌の診断および処置のための、薬学的組成物（例えば、ワクチン）および他の組成物において有用である。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術の説明）
癌は、世界中で重大な健康問題である。癌の検出および治療において進歩がなされているが、予防および／または処置のためのワクチンも他の普遍的に成功する方法も、現在は利用可能ではない。現在の治療は、一般的には、化学療法または手術と、放射線との組み合わせに基づき、多くの患者において不十分であることが示され続けている。
【０００３】
乳癌は、米国および世界中で、女性についての重大な健康問題である。その疾患の検出および処置において、進歩が成されてきたが、乳癌は、女性の癌関係の第二番目の死因のままであり、毎年、米国で１８０，０００人を超える女性が罹患している。北米の女性に関して、生存中に乳癌に罹る可能性は、現在８人に１人である。
【０００４】
乳癌の予防または処置のためのワクチンも他の普遍的に成功する方法も、現在のところ利用可能ではない。この疾患の管理は、現在のところ、早期の診断（慣用的な乳房のスクリーニング手順を通じて）および積極的な処置の組み合わせに依存し、その処置は、１以上の種々の処置（例えば、手術、放射線治療、化学療法、およびホルモン療法）を含み得る。特定の乳癌の処置の過程は、しばしば、種々の予後のパラメータ（特定の腫瘍マーカーの分析を含む）に基づいて選択される。例えば、Ｐｏｒｔｅｒ−ＪｏｒｄａｎおよびＬｉｐｐｍａｎ、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  ８：７３−１００（１９９４）を参照のこと。しかし、確立されたマーカーの使用は、しばしば、解釈が難しい結果を導き、そして乳癌患者において観察される高い死亡率は、その疾患の処置、診断、および予防において、改善が必要とされることを示している。
【０００５】
これらの癌および他の癌についての治療に対するかなりの研究にも関わらず、乳癌は、有効に診断および処置するのが困難なままである。従って、当該分野において、このような癌を検出および処置するための改善された方法についての必要性が存在する。本発明は、これらの必要性を満たし、他の関係する利点をさらに提供する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
１つの局面において、本発明はポリヌクレオチド組成物を提供し、このポリヌクレオチド組成物は、
（ａ）配列番号１、３〜８６、１４２〜２９８、３０１〜３０３、３０７、３１３、３１４、３１６、３１７、３２３、３２５、３２７〜３３０、３３５、３３９、および３４１〜３４４に提供される配列；
（ｂ）配列番号１、３〜８６、１４２〜２９８、３０１〜３０３、３０７、３１３、３１４、３１６、３１７、３２３、３２５、３２７〜３３０、３３５、３３９、および３４１〜３４４に提供される配列の相補体；
（ｃ）配列番号１、３〜８６、１４２〜２９８、３０１〜３０３、３０７、３１３、３１４、３１６、３１７、３２３、３２５、３２７〜３３０、３３５、３３９、および３４１〜３４４に提供される配列の少なくとも２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、７５個、および１００個連続する残基からなる配列；
（ｄ）配列番号１、３〜８６、１４２〜２９８、３０１〜３０３、３０７、３１３、３１４、３１６、３１７、３２３、３２５、３２７〜３３０、３３５、３３９、および３４１〜３４４に提供される配列に、中程度にストリンジェントな条件または高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列；
（ｅ）配列番号１、３〜８６、１４２〜２９８、３０１〜３０３、３０７、３１３、３１４、３１６、３１７、３２３、３２５、３２７〜３３０、３３５、３３９、および３４１〜３４４の配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列；
（ｆ）配列番号１、３〜８６、１４２〜２９８、３０１〜３０３、３０７、３１３、３１４、３１６、３１７、３２３、３２５、３２７〜３３０、３３５、３３９、および３４１〜３４４の配列に提供される配列の縮重改変体、
からなる群より選択される配列を含む。
【０００７】
１つの好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチド組成物は、試験された乳癌サンプルの少なくとも約２０％において、より好ましくは少なくとも約３０％において、そして最も好ましくは少なくとも約５０％において、正常組織のレベルの少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約５倍、そして最も好ましくは少なくとも約１０倍のレベルで、発現される。
【０００８】
本発明は、別の局面において、上記のポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド組成物を提供する。
【０００９】
本発明はさらに、配列番号１３１〜１４０、２９９、３００、３０４〜３０６、３０８〜３１２、３１５、３１８、３２４、３２６、３３１〜３３４、３３６、３４０、および３４５〜４２８に示される配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド組成物を提供する。
【００１０】
特定の好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、本明細書中にさらに記載されるように、免疫原性である。すなわち、これらは、免疫応答（特に、体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答）を惹起し得る。
【００１１】
本発明はさらに、開示されたポリペプチド配列および／またはポリヌクレオチド配列のフラグメント、改変体および／または誘導体を提供し、ここで、このフラグメント、改変体および／または誘導体は、好ましくは、配列番号１３１〜１４０、２９９、３００、３０４〜３０６、３０８〜３１２、３１５、３１８、３２４、３２６、３３１〜３３４、３３６、３４０、および３４５〜４２８に示されるポリペプチド配列、または配列番号１、３〜８６、１４２〜２９８、３０１〜３０３、３０７、３１３、３１４、３１６、３１７、３２３、３２５、３２７〜３３０、３３５、３３９、および３４１〜３４４に示されるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列の免疫原性活性のうちの、少なくとも約５０％の免疫原性活性のレベル、好ましくは少なくとも約７０％そしてより好ましくは少なくとも約９０％の免疫原性活性のレベルを有する。
【００１２】
本発明はさらに、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドを含む発現ベクター、およびこのような発現ベクターで形質転換されたかまたはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
【００１３】
他の局面において、本発明は、上記のようなポリペプチドまたはポリヌクレオチドと生理学的に受容可能なキャリアとを含む、薬学的組成物を提供する。
【００１４】
本発明の関連した局面において、その薬学的組成物（例えば、ワクチン組成物）が、予防適用または治療適用のために提供される。このような組成物は、一般に、本発明の免疫原性ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと、免疫刺激剤（例えば、アジュバント）とを含む。
【００１５】
本発明はさらに、（ａ）本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合フラグメント、またはそれらのフラグメントと；（ｂ）生理学的に受容可能なキャリアとを含む、薬学的組成物を提供する。
【００１６】
さらなる局面において、本発明は、（ａ）上記のようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞と、（ｂ）薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤とを含む、薬学的組成物を提供する。例示的な抗原提示細胞としては、樹状細胞、マクロファージ、単球、線維芽細胞およびＢ細胞が挙げられる。
【００１７】
関連した局面において、（ａ）上記のようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞と、（ｂ）免疫刺激剤とを含む、薬学的組成物が提供される。
【００１８】
本発明はさらに、他の局面において、上記のような少なくとも１つのポリペプチドを含む融合タンパク質、ならびにこのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、代表的には、生理学的に受容可能なキャリアおよび／または免疫刺激剤を含む薬学的組成物（例えば、ワクチン組成物）の形態で提供する。この融合タンパク質は、本明細書中に記載されるような、複数の免疫原性ポリペプチドまたはその部分／改変体を含み得、そしてそのポリペプチドの発現、精製および／または免疫原性を容易にするための１つ以上のポリペプチドセグメントをさらに含み得る。
【００１９】
さらなる局面において、本発明は、患者における免疫応答（好ましくは、ヒト患者におけるＴ細胞応答）を刺激するための方法を提供し、この方法は、本明細書中に記載される薬学的組成物を投与する工程を包含する。その患者は、乳癌に罹患しており得る（この場合、この方法が、その疾患の処置を提供する）か、またはこのような疾患についてリスクがあると考えられる患者が、予防的に処置され得る。
【００２０】
さらなる局面において、本発明は、患者における癌の発症を阻害するための方法を提供し、この方法は、上記のような薬学的組成物を患者に投与する工程を包含する。その患者は、乳癌に罹患しており得る（この場合、この方法が、その疾患の処置を提供する）か、またはこのような疾患についてリスクがあると考えられる患者が、予防的に処置され得る。
【００２１】
本発明は、他の局面において、生物学的サンプルから腫瘍細胞を除去する方法をさらに提供する。この方法は、生物学的サンプルを、本発明のポリペプチドと特異的に反応するＴ細胞と接触させる工程を包含し、ここで、この接触させる工程は、このタンパク質を発現する細胞をこのサンプルから除去することを可能にするための条件下および十分な時間で実施される。
【００２２】
関連する局面において、患者における癌の発症を阻害するための方法が提供される。この方法は、上記のように処理された生物学的サンプルを患者に投与する工程を包含する。
【００２３】
他の局面において、本発明のポリペプチドに特異的なＴ細胞を刺激し、そして／または、これらを増殖する方法がさらに提供される。これらの方法は、Ｔ細胞の刺激および／または増殖を可能にするための条件下および十分な時間で、Ｔ細胞を、（ｉ）上記のようなポリペプチド；（ｉｉ）このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および／または（ｉｉｉ）このようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞のうちの１つ以上と接触させる工程を包含する。上記のように調製されたＴ細胞を含む単離されたＴ細胞集団もまた、提供される。
【００２４】
さらなる局面において、本発明は、患者における癌の発症を阻害する方法を提供する。この方法は、上記のような有効量のＴ細胞集団を患者に投与する工程を包含する。
【００２５】
本発明はさらに、患者における癌の発症を阻害する方法を提供する。この方法は、（ａ）患者から単離したＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を、（ｉ）本明細書中で開示されたポリペプチドの少なくとも１つの免疫原性部位を含むポリペプチド；（ｉｉ）このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および（ｉｉｉ）このようなポリペプチドを発現した抗原提示細胞のうちの１つ以上とともにインキュベートする工程；ならびに（ｂ）有効量の増殖したＴ細胞を患者に投与し、それによって、その患者における癌の発症を阻害する工程；を包含する。増殖した細胞は、患者への投与前にクローン化され得るが、必ずしもクローン化するに及ばない。
【００２６】
さらなる局面において、本発明は、患者において癌（好ましくは乳癌）の存在または非存在を決定するための方法を提供する。この方法は、（ａ）患者から得た生物学的サンプルを、上に列挙したポリペプチドに結合する結合因子と接触させる工程；（ｂ）そのサンプル中で、この結合因子に結合するポリペプチドの量を検出する工程；および（ｃ）このポリペプチドの量と所定のカットオフ値とを比較し、それによってこの患者における癌の存在または非存在を決定する工程；を包含する。好ましい実施形態において、この結合因子は、抗体であり、より好ましくはモノクローナル抗体である。
【００２７】
本発明はまた、他の局面において、患者における癌の進行をモニタリングする方法を提供する。このような方法は、（ａ）第１の時点で患者から得た生物学的サンプルを、上記のポリペプチドプチドに結合する結合因子と接触させる工程；（ｂ）そのサンプルにおいて、この結合因子に結合するポリペプチドの量を検出する工程；（ｃ）その後の時点において、その患者から得られた生物学的サンプルを使用し、工程（ａ）および工程（ｂ）を反復する工程；ならびに（ｄ）工程（ｃ）において検出されたポリペプチドの量を工程（ｂ）において検出された量と比較し、それらによって、患者におけるその癌の進行をモニタリングする工程；を包含する。
【００２８】
本発明は、他の局面において、患者における癌の存在または非存在を決定するための方法をさらに提供する。この方法は、（ａ）患者から得られた生物学的サンプル（例えば、腫瘍サンプル、血清サンプルなど）を、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと接触させる工程；（ｂ）そのサンプルにおいて、そのオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド（好ましくはｍＲＮＡ）のレベルを検出する工程；ならびに（ｃ）そのオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドのレベルを、所定のカットオフ値と比較して、それによってその患者における癌の存在または非存在を決定する工程；を包含する。特定の実施形態において、ｍＲＮＡの量は、例えば、上記のようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするかまたはそのようなポリヌクレオチドの相補体とハイブリダイズする、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応介して検出される。他の実施形態において、ｍＲＮＡの量は、上記のようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするかまたはそのようなポリヌクレオチドの相補体にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチドプローブを使用するハイブリダイゼーション技術を使用して検出される。
【００２９】
関連する局面において、患者における癌の進行をモニタリングする方法が、提供され、その方法は、（ａ）患者から得られた生物学的サンプルを、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと接触させる工程；（ｂ）そのサンプルにおいて、そのオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドの量を検出する工程；（ｃ）その後の時点において、その患者から得られた生物学的サンプルを使用し、工程（ａ）および工程（ｂ）を反復する工程；ならびに（ｄ）（ｃ）において検出されたポリヌクレオチドの量を工程（ｂ）において検出された量と比較し、それらによって、その患者におけるその癌の進行をモニタリングする工程；を包含する。
【００３０】
さらなる局面において、本発明は、上記のようなポリペプチドに結合する抗体（例えば、モノクロナール抗体）、ならびにこのような抗体を含む診断キットを提供する。上記のような１つ以上のオリゴヌレクオチドプローブまたはオリゴヌレクオチドプライマーを含む診断キットもまた、提供される。
【００３１】
本発明のこれらの局面および他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照することによって明らかになる。本明細書中で開示される全ての参考文献は、各々が個々に援用されるがごとく参考としてその全体が本明細書によって援用される。
【００３２】
（発明の詳細な説明）
本明細書中にて記載されそして／または出願データシートで列挙される米国特許、米国特許第特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物は、その全体が、本明細書中に参考として援用される。
【００３３】
本発明は、一般に、癌（特に乳癌）の治療および診断における組成物およびそれらの使用に関する。以下にさらに詳述するように、本発明の例示的な組成物としては、ポリペプチド（特に免疫原性ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、抗体および他の結合因子、抗原提示細胞（ＡＰＣ）ならびに免疫系細胞（例えば、Ｔ細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
本発明の実施には、特に反対のことが示されない限り、当業者の範囲のウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学、および組換えＤＮＡ技術の従来の方法を利用し、これらは多くは、例示の目的のための以下に記載される。そのような技術は、文献中で十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第１巻および第２巻（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）を参照のこと。
【００３５】
本明細書中で引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、前述されているものまたは下記のものにかかわらず、それらの全体が本明細書中に参考として援用される。
【００３６】
本明細書および添付の特許請求の範囲中で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、その内容が、明らかにそうではないと示さない限り、複数の言及を包含する。
【００３７】
（ポリペプチド組成物）
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、その従来の意味で（すなわち、アミノ酸の配列として）用いられる。これらのポリペプチドは、その生成物の特定の長さに限定されない；従って、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質は、ポリペプチドの定義内に含まれ、そのような用語が、本明細書中において、特にそうではないと示されない限り、互換可能に用いられ得る。この用語はまた、そのポリペプチドの発現後修飾（例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など、および当該分野で公知の他の修飾、天然に存在する修飾および天然に存在しない修飾の両方）を言及も排除もしない。ポリペプチドは、タンパク質全体であっても、その部分配列であってもよい。本発明の文脈における目的の特定のポリペプチドは、エピトープ（すなわちポリペプチド免疫原性特性に対して実質的に応答し、そして免疫応答を惹起し得る、抗原決定基）を含むアミノ酸部分配列である。
【００３８】
本発明の特に例示的なポリペプチドは、配列番号１、３〜８６、１４２〜２９８、３０１〜３０３、３０７、３１３、３１４、３１６、３１７、３２３、３２５、３２７〜３３０、３３５、３３９、および３４１〜３４４のうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、または、配列番号１、３〜８６、１４２〜２９８、３０１〜３０３、３０７、３１３、３１４、３１６、３１７、３２３、３２５、３２７〜３３０、３３５、３３９、および３４１〜３４４のうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列に、中程度にストリンジェントな条件下あるいは高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列によりコードされるポリペプチドを包含する。本発明の特定の他の例示的なポリペプチドは、配列番号１３１〜１４０、２９９、３００、３０４〜３０６、３０８〜３１２、３１５、３１８、３２４、３２６、３３１〜３３４、３３６、３４０、および３４５〜４２８のうちのいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列を包含する。
【００３９】
本発明のポリペプチドは、本明細書中で、しばしば、乳房腫瘍タンパク質または乳房腫瘍ポリペプチドを、それらの同定が、乳房腫瘍サンプルにおけるそれらの増加した発現レベルに少なくとも部分的に基づいた指標として、言及される。従って、「乳房腫瘍（乳癌）ポリペプチド」または「乳房腫瘍（乳癌）タンパク質」は、一般的に、本発明のポリペプチド配列、またはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列のポリペプチド配列であって、乳房腫瘍サンプルの実質的部分（例えば、好ましくは、試験される乳房腫瘍サンプルの２０％より多く、より好ましくは約３０％より多く、最も好ましくは約５０％より多く、またはそれ以上）において、本明細書中で提供される代表的なアッセイを用いて決定される場合に、正常な組織における発現のレベルより少なくとも２倍高く、好ましくは少なくとも５倍高いレベルで発現されるものを示す。本発明の乳房腫瘍ポリペプチド配列は、腫瘍細胞におけるその増加した発現レベルに基づき、以下にさらに記載されるように、診断マーカーおよび治療標的の両方として特定の有用性を有する。
【００４０】
特定の好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは免疫原性である。すなわちこれらは、乳癌に罹患している患者由来の抗血清および／またはＴ細胞を用いた免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡまたはＴ細胞刺激アッセイ）にて検出可能に反応する。免疫原性活性についてのスクリーニングは、当業者に周知の技術を使用して実施され得る。例えば、このようなスクリーニングは、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８に記載される方法を使用して実施され得る。１つの例示的な例において、ポリペプチドは固体支持体に固定され得、そして患者の血清と接触され得、その血清中の抗体が固定されたポリペプチドに結合するのが可能になる。次いで、非結合血清が除去され得、そして結合した抗体が、例えば、１２５Ｉ標識プロテインＡを用いて検出され得る。
【００４１】
当業者に認識されるように、本明細書中で開示されるポリペプチドの免疫原性部分もまた、本発明により包含される。本明細書中で用いられる場合、「免疫原性部分」とは、本発明の免疫原性ポリペプチドを認識するＢ細胞表面抗原レセプターおよび／またはＴ細胞表面抗原レセプターとそれ自体が免疫学的に反応性である（すなわち、特異的に結合する）、本発明の免疫原性ポリペプチドのフラグメントである。免疫原性部分は、一般に、周知の技術（例えば、Ｐａｕｌ、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第３版、２４３−２４７（Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３）およびこの文献で引用される参考文献に要約されている技術）を用いて同定され得る。このような技術は、抗原特異的抗体、抗血清、および／またはＴ細胞株もしくはクローンと反応する能力について、ポリペプチドをスクリーニングすることを包含する。本明細書中で用いられる場合、抗血清および抗体は、これらが、抗原に特異的に結合する（すなわち、これらが、ＥＬＩＳＡまたは他の免疫アッセイにおいてこのタンパク質と反応し、そして無関係のタンパク質とは検出可能に反応しない）場合に、「抗原特異的」である。このような抗血清および抗体は、本明細書中に記載されるように、そして周知技術を用いて、調製され得る。
【００４２】
１つの好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドの免疫原性部分は、（例えば、ＥＬＩＳＡおよび／またはＴ細胞反応性アッセイにおいて）全長ポリペプチドの反応性よりも実質的には低くないレベルで、抗血清および／またはＴ細胞と反応する部分である。好ましくは、その免疫原性部分の免疫原性活性のレベルは、全長ポリペプチドの免疫原性の少なくとも約５０％であり、好ましくは少なくとも約７０％であり、そしてもっとも好ましくは９０％より高い。いくつかの場合において、対応する全長ポリペプチドよりも高い免疫原性活性のレベルを有する（例えば、約１００％または１５０％もしくはそれより大きい免疫原性活性を有する）、好ましい免疫原性部分が同定される。
【００４３】
特定の他の実施形態において、例示的な免疫原性部分は、Ｎ末端リーダー配列および／または膜貫通ドメインが欠失されたペプチドを含み得る。他の例示的な免疫原性部分は、成熟タンパク質と比較して小さなＮ末端欠失および／またはＣ末端欠失（例えば、１〜３０アミノ酸、好ましくは５〜１５アミノ酸）を含む。
【００４４】
別の実施形態において、本発明のポリペプチド組成物はまた、本発明のポリペプチド（特に、本明細書中に開示されたアミノ酸配列を有するポリペプチド）に対して生成された抗体またはそれらの免疫原性フラグメントもしくは免疫原性改変体に対して生成されたＴ細胞および／または抗体と、免疫学的に反応性である１つ以上のポリペプチドを含み得る。
【００４５】
本発明の別の実施形態において、本明細書中に記載される１つ以上のポリペプチドと免疫学的に反応性であるＴ細胞および／もしくは抗体を惹起し得る１つ以上のポリペプチド、または本明細書中で開示されるポリヌクレオチド配列に含まれる連続的な核酸配列によりコードされる１つ以上のポリペプチドと免疫学的に反応性であるＴ細胞および／もしくは抗体を惹起し得る１つ以上のポリペプチド、またはそれらの免疫原性フラグメントもしくは免疫原性改変体、あるいは中程度のストリンジェンシーから高度のストリンジェンシーの条件下でこれらの配列のうちの１つ以上にハイブリダイズする１つ以上の核酸配列によりコードされる１つ以上のポリペプチドと免疫学的に反応性であるＴ細胞および／もしくは抗体を惹起し得る１つ以上のポリペプチドを含む、ポリペプチドが提供される。
【００４６】
別の局面において、本発明は、本明細書中に示されるポリペプチド組成物（例えば、配列番号１３１〜１４０、２９９、３００、３０４〜３０６、３０８〜３１２、３１５、３１８、３２４、３２６、３３１〜３３４、３３６、３４０、および３４５〜４２８の配列に示されるポリペプチド組成物、または配列番号１、３〜８６、１４２〜２９８、３０１〜３０３、３０７、３１３、３１４、３１６、３１７、３２３、３２５、３２７〜３３０、３３５、３３９および３４１〜３４４の配列に示されるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド組成物）の少なくとも約５個、１０個、１５個、２０個、２５個、５０個、または１００個連続するアミノ酸またはそれ以上（中間の長さを全て含む）を含む、ポリペプチドフラグメントを提供する。
【００４７】
別の局面において、本発明は、本明細書中に記載されるポリペプチド組成物の改変体を提供する。本発明により一般的に包含されるポリペプチド改変体は、代表的には、本明細書中に示されるポリペプチド配列に対して、その長さに沿って、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％またはそれ以上の同一性（以下に記載するように決定される）を示す。
【００４８】
１つの好ましい実施形態において、本発明により提供されるポリペプチドフラグメントおよびポリペプチド改変体は、本明細書中に詳細に示される全長ポリペプチドと反応する抗体および／またはＴ細胞と、免疫学的に反応性である。
【００４９】
別の好ましい実施形態において、本発明により提供されるポリペプチドフラグメントおよびポリペプチド改変体は、本明細書中に詳細に示される全長ポリペプチド配列により示される免疫原性活性レベルの少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７０％、そして最も好ましくは少なくとも約９０％以上の免疫原性活性レベルを示す。
【００５０】
ポリペプチド「改変体」は、本明細書中でこの用語が使用される場合、代表的には、本明細書中で詳細に開示されるポリペプチドと１つ以上の置換、欠失、付加、および／または挿入において異なる、ポリペプチドである。このような改変体は、天然に存在し得るか、または例えば、本発明の上記のポリペプチド配列のうちの１つ以上を改変し、そして本明細書中に記載されるようにそれらの免疫学的活性を評価することにより、ならびに／または当該分野で周知の多くの技術のうちのいずれかを用いて、合成的に作製され得る。
【００５１】
例えば、本発明のポリペプチドの特定の例示的な改変体として、１つ以上の部分（例えば、Ｎ末端リーダー配列または膜貫通ドメイン）が除去された改変体が挙げられる。他の例示的な改変体として、小さな部分（例えば、１〜３０アミノ酸、好ましくは５〜１５アミノ酸）が成熟タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端から除去された改変体が挙げられる。
【００５２】
多くの場合において、改変体は、保存的置換を含む。「保存的置換」とは、アミノ酸が類似の特性を有する別のアミノ酸で置換され、その結果、ペプチド化学の当業者がそのポリペプチドの二次構造および疎水的性質が実質的に変化されていないことを予期するような置換である。上記のように、改変は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造においてなされ得、そしてなお所望の特性（例えば、免疫原性特性）を有する改変体ポリペプチドまたは誘導体ポリペプチドをコードする機能的分子を獲得し得る。本発明のポリペプチドの等価物を（または本発明のポリペプチドの改善された免疫原性改変体もしくは改善された免疫原性部分さえも）作製するようポリペプチドのアミノ酸配列を変更することが所望される場合、当業者は、代表的に、表１に従ってコードＤＮＡ配列のコドンのうちの１つ以上を変更する。
【００５３】
例えば、特定のアミノ酸が、抗体の抗原結合領域または基質分子上の結合部位のような構造を有するタンパク質構造中の他のアミノ酸へと、相互作用的結合能を感知可能には損失することなく、置換され得る。タンパク質の生物学的機能的活性を規定するのは、タンパク質の相互作用的な能力および性質であるので、特定のアミノ酸配列置換が、タンパク質配列において、および当然ながら、その基礎となるＤＮＡコード配列においてなされ得、そしてそれにも関わらず、同様の特性を有するタンパク質が入手され得る。従って、開示された組成物の生物学的有用性または活性を感知可能には損失することなしに、開示された組成物のペプチド配列またはそのペプチドをコードする対応するＤＮＡ配列において種々の変化がなされ得ることが、企図される。
【００５４】
【表１−１】
2005508153.tif 000002
【００５５】
【表１−２】
2005508153.tif 000003
このような変化を作製する際に、アミノ酸の疎水性親水性指標が考慮され得る。タンパク質に相互作用的な生物学的機能を付与することにおける疎水性親水性アミノ酸指標の重要性は、当該分野において一般的に理解されている（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２（本明細書中に参考として援用される））。アミノ酸の相対的な疎水性親水性特性は、得られるタンパク質の二次構造に寄与し、これが次に、他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）とのそのタンパク質の相互作用を規定することが、受け入れられている。各アミノ酸は、その疎水性特性および電荷特性に基づいて疎水性親水性指標を割り当てられている（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２）。これらの値は以下である：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。
【００５６】
特定のアミノ酸が類似の疎水性親水性指標または疎水性親水性スコアを有する他のアミノ酸によって置換され得、そしてなお類似の生物学的活性を有するタンパク質を生じ得る（すなわち、機能的に等価な生物学的タンパク質をなお得る）ことが、当該分野において公知である。このような変化を作製する際に、その疎水性親水性指標が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、その疎水性親水性指標が±１以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、そしてその疎水性親水性指標が±０．５以内であるアミノ酸の置換がなおより特に好ましい。同様なアミノ酸の置換が、親水性に基づいて有効になされ得ることもまた、当該分野で理解されている。米国特許第４，５５４，１０１号（その全体が本明細書中に参考として特に援用される）は、その隣接するアミノ酸の親水性によって支配される、タンパク質の最大局所的平均親水性が、そのタンパク質の生物学的特性と相関することを言及している。
【００５７】
米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されるように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられた：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。アミノ酸は、類似の親水性値を有する別のアミノ酸に置換され得、そしてなお、生物学的に等価な（特に、免疫学的に等価な）タンパク質を獲得し得ることが理解される。このような変化において、その親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、その親水性値が±１以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、そしてその親水性値が±０．５以内であるアミノ酸の置換がなおより特に好ましい。
【００５８】
従って、上記で概説したように、アミノ酸置換は、一般的にアミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性（例えば、その疎水性、親水性、電荷、大きさ、など）に基づく。前述の種々の特徴を考慮する例示的な置換は当業者に周知であり、そしてこのような置換として以下が挙げられる：アルギニンとリジンとの置換；グルタミン酸とアスパラギン酸との置換；セリンとスレオニンとの置換；グルタミンとアスパラギンとの置換；ならびにバリンと、ロイシンと、イソロイシンとの置換。
【００５９】
さらに、任意のポリヌクレオチドが、インビボでの安定性を増加させるためにさらに改変され得る。可能性のある改変として以下が挙げられるがこれらに限定されない：５’末端および／または３’末端に隣接配列を付加すること；骨格においてホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエート結合または２’Ｏ−メチル結合を使用すること；ならびに／あるいは非伝統的塩基（例えば、イノシン、キューオシン、およびワイブトシン、ならびにアデニン、シチジン、グアニン、チミン、およびウリジンの、アセチル修飾形態、メチル修飾形態、チオ修飾形態、および他の修飾形態）の含有。
【００６０】
アミノ酸置換はさらに、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性特性の類似性に基づいてなされ得る。例えば、負に荷電したアミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ；正に荷電したアミノ酸としては、リジンおよびアルギニンが挙げられ；そして類似の親水性値を有する非荷電性極性ヘッドを有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシンおよびバリン；グリシンおよびアラニン；アスパラギンおよびグルタミン；ならびにセリン、スレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンが挙げられる。保存的変化を示し得るアミノ酸の他のグループとしては、（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓが挙げられる。改変体はまた、あるいは、非保存的変化を含み得る。好ましい実施形態において、改変体ポリペプチドは、５アミノ酸以下の置換、欠失または付加の分だけ、ネイティブの配列とは異なる。改変体はまた（あるいは）、例えば、ポリペプチドの免疫原性、二次構造および疎水性親水性特性に対して最小の影響しか有さないアミノ酸の欠失または付加によって、改変され得る。
【００６１】
上記のように、ポリペプチドは、そのタンパク質のＮ末端にシグナル（または、リーダー）配列を含み得、これは、翻訳と同時にか、または翻訳後に、そのタンパク質の移行を指向する。このポリペプチドはまた、このポリペプチドの合成、精製または同定を容易にするためのリンカー配列または他の配列（例えば、ポリＨｉｓ）、またはこのポリペプチドの固体支持体への結合を増強するための、リンカー配列または他の配列に結合体化され得る。例えば、ポリペプチドは、免疫グロブリンＦｃ領域に結合体化され得る。
【００６２】
ポリペプチド配列が比較される場合、以下に記載されるように最大の一致について整列した場合に２つの配列中のアミノ酸の配列が同じである場合、その２つの配列は、「同一」であるといわれる。２つの配列間の比較は、代表的には、比較ウインドウにわたって配列を比較して、配列類似性の局所的領域を同定および比較することによって行われる。本明細書中で使用される「比較ウインドウ」とは、少なくとも約２０個、通常は３０個〜約７５個、４０個〜約５０個連続する位置のセグメントをいい、この比較ウインドウにおいて、配列は、２つの配列が最適整列された後、同じ連続位置数の参照配列と比較され得る。
【００６３】
比較のための最適な配列のアライメントは、バイオインフォマティクスソフトウエアのＬａｓｅｒｇｅｎｅスイートにおけるＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、デフォルトパラメータを用いて行われ得る。このプログラムは、以下の参考文献に記載のいくつかのアライメントスキームを組織化する：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（編）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ  第５巻，補遺３，３４５〜３５８頁におけるＤａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（１９７８）Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．；Ｈｅｉｎ  Ｊ．（１９９０）Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ  ６２６〜６４５頁  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  第１８３巻，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３；Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒ  Ｗ．（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．（１９７１）Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ  １１：１０５；Ｓａｎｔｏｕ，Ｎ．Ｎｅｉ，Ｍ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６−４２５；Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．（１９７３）Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ−ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ，Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．，Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：７２６−７３０。
【００６４】
あるいは、比較のための最適な配列のアライメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ  ２：４８２の局所的同一性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の同一性アライメントアルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化した実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または目視によって行われ得る。
【００６５】
配列同一性および配列類似性のパーセントを決定するために適切なアルゴリズムの１つの好ましい例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらはそれぞれＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９７７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載される。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドについての配列同一性のパーセントを決定するために、例えば、本明細書中に記載のパラメータを使用して使用され得る。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウエアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎを通して公的に利用可能である。アミノ酸配列について、スコアマトリクスがその累積スコアを計算するために使用され得る。各方向におけるワードヒットの伸長は、以下の場合に停止する：累積アライメントスコアが、その最大到達値から量Ｘだけ低下した場合；累積スコアが、１以上の負のスコアの残基アライメントの累積に起因してゼロ以下になった場合；またはいずれかの配列の末端に到達した場合。このＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、アライメントの感度および速度を決定する。
【００６６】
１つの好ましいアプローチにおいて、「配列同一性のパーセンテージ」は、少なくとも２０の位置の比較ウインドウにわたって２つの最適にアライメントした配列を比較することによって決定され、ここで比較ウインドウ中のポリペプチド配列の部分は、参照配列（これは、付加も欠失も含まない）と比較して、２つの配列の最適なアライメントのために、２０パーセント以下、通常は５〜１５パーセント、または１０〜１２パーセントの付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。このパーセンテージは、両方の配列で同一のアミノ酸残基が生じる位置の数を決定して一致する位置の数を得、この一致する位置の数を参照配列中の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除算し、そしてこの結果に１００を乗算して配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出される。
【００６７】
他の例示的な実施形態において、ポリペプチドは、参照ポリペプチドとしての役割を果たすヒトポリペプチド（これはまた、自己抗原と称される）に対して上記のように実質的な配列同一性を有するポリペプチドを含む外因性のポリペプチドであり得るが、この外因性ポリペプチドは様々な非ヒト種に由来する。当業者は、しばしば、「自己」抗原は、ＣＤ８＋Ｔリンパ球応答およびＣＤ４＋リンパ球応答の微弱な刺激因子であり、したがって、腫瘍ポリペプチドに対して指向される効率的な免疫学的治療ストラテジーは、特定の自己腫瘍ポリペプチドに対する免疫寛容を克服するための方法の開発を必要とする。例えば、異種（非ヒト）起源からの前立腺タンパク質で免疫されたヒトは対応するヒトタンパク質（例えば、ヒト腫瘍細胞上に提示するヒトプロスターゼ腫瘍タンパク質）に対する免疫応答を起こすことができる。従って、本発明は、例えば、以下のような本明細書に記載の腫瘍タンパク質の異種形態を精製する方法を提供する：配列番号１３１〜１４０、２９９、３００、３０４〜３０６、３０８〜３１２、３１５、３１８、３２４、３２６、３３１〜３３４、３３６、３４０および３４５〜４２８に示されるポリペプチドまたは配列番号１、３〜８６、１４２〜２９８、３０１〜３０３、３０７、３１３、３１４、３１６、３１７、３２３、３２５、３２７〜３３０、３３５、３３９、および３４１〜３４４に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド。
【００６８】
従って、本発明の１つの局面は、本明細書中に記載のポリペプチド組成物の異種改変体を提供する。本発明に包含されるこのような異種改変体は、一般的には、本明細書中に記載のポリペプチド配列に対して、それらの長さに沿って、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％あるいはそれより高い同一性を提示する。
【００６９】
より具体的には、本発明は、本発明の腫瘍ポリペプチドに対して指向される免疫応答を誘導するための、本明細書に示されるヒトポリペプチドの異種形態として使用され得る、マウス、ラット、サル、ブタおよび他の非ヒトのポリペプチドに関する。
【００７０】
他の例示的な実施形態において、ポリペプチドは、本明細書中に記載の複数のポリペプチドを含むか、または本明細書に記載の少なくとも１つのポリペプチドおよび関連しない配列（例えば、公知の腫瘍タンパク質）を含む融合ポリペプチドであり得る。例えば、融合パートナーは、Ｔヘルパーエピトープ（免疫学的融合パートナー）、特にヒトによって認識され得るＴヘルパーエピトープを提供する際に補助し得るか、またはネイティブの組換えタンパク質より高い収量でタンパク質（発現エンハンサー）を発現する際に補助し得る。特定の好ましい融合パートナーは、免疫学的融合パートナーおよび発現増強融合パートナーの両方である。他の融合パートナーは、ポリペプチドの溶解性を増加するように、またはポリペプチドが所望の細胞内コンパートメントに標的化されることを可能にするように選択され得る。なおさらなる融合ポリペプチドパートナーには、親和性タグ（これは、ポリペプチドの精製を容易にする）が挙げられる。
【００７１】
融合ポリペプチドは、一般に、標準的な技術（例えば、化学的結合体化）を使用して調製され得る。好ましくは、融合ポリペプチドは、発現系において、組換えポリペプチドとして発現され、非融合ポリペプチドと比較して、増加したレベルの産生を可能にする。手短に言うと、このポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列を、別々にアセンブルし得、そして適切な発現ベクターに連結し得る。１つのポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の３’末端は、ペプチドリンカーを用いてかまたは用いずに、第２のポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の５’末端に、これらの配列のリーディングフレームが同じ相にあるように連結される。このことが、両方の成分ポリペプチドの生物学的活性を保持する単一の融合タンパク質への翻訳を可能にする。
【００７２】
ペプチドリンカー配列は、各ポリペプチドがその二次構造および三次構造へと折り畳まれるのを保証するために十分な距離で第一および第二のポリペプチド成分を隔てるために用いられ得る。このようなペプチドリンカー配列は、当該分野で周知の標準的な技術を用いて融合タンパク質中に組み込まれる。適切なペプチドリンカー配列は、以下の因子に基づいて選択され得る：（１）フレキシブルな伸長したコンホメーションを採用する能力；（２）第一および第二のポリペプチド上の機能的なエピトープと相互作用し得る二次構造を採ることができないこと；および（３）ポリペプチドの機能的なエピトープと反応し得る疎水性または荷電した残基のないこと。好ましいペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒ残基を含む。ＴｈｒおよびＡｌａのような中性に近い他のアミノ酸もまた、リンカー配列に用いられ得る。リンカーとして有用に用いられ得るアミノ酸配列は、Ｍａｒａｔｅａら、Ｇｅｎｅ  ４０：３９−４６、１９８５；Ｍｕｒｐｈｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：８２５８−８２６２、１９８６；米国特許第４，９３５，２３３号および米国特許第４，７５１，１８０号に開示されるアミノ酸配列を含む。リンカー配列は、一般的に１から約５０アミノ酸長であり得る。リンカー配列は、第一および第二のポリペプチドが、機能的ドメインを分離するため、および立体的な干渉を防ぐために用いられ得る非必須Ｎ末端アミノ酸領域を有する場合、必要とされない。
【００７３】
連結されたＤＮＡ配列は、適切な転写または翻訳の調節エレメントに作動可能に連結される。ＤＮＡの発現を担う調節エレメントは、第一のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の５’側にのみ位置する。同様に、翻訳および転写の終結シグナルを終了するために必要とされる停止コドンは、第二のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の３’側にのみ存在する。
【００７４】
本明細書中に記載のポリペプチドを関係のない免疫原性タンパク質とともに含む融合タンパク質もまた提供される。例えば、免疫原性タンパク質は、リコール（ｒｅｃａｌｌ）応答を惹起し得る。このようなタンパク質の例としては、破傷風タンパク質、結核タンパク質および肝炎タンパク質が挙げられる（例えば、Ｓｔｏｕｔｅら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３６：８６−９１（１９９７）を参照のこと）。
【００７５】
１つの好ましい実施形態において、免疫融合パートナーは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．由来である（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のＲａ１２フラグメント）。Ｒａ１２組成物および異種ポリヌクレオチド配列／ポリペプチド配列の発現および／または免疫原性を増強するためのそれらの使用方法が、米国特許出願６０／１５８，５８５（この開示は、本明細書で参考として全体が援用される）において記載される。手短には、Ｒａ１２は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＭＴＢ３２Ａ核酸の部分配列であるポリヌクレオチド領域をいう。ＭＴＢ３２Ａは、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの病原性株または非病原性株の中にある遺伝子によってコードされるセリンプロテアーゼ（分子量３２ＫＤ）である。ＭＴＢ３２Ａのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、すでに記述されている（例えば、米国特許出願６０／１５８，５８５；また、Ｓｋｅｉｋｙら  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎ．（１９９９）６７：３９９８〜４００７（これらは参考として援用される））。ＭＴＢ３２Ａコード配列のＣ末端フラグメントは、高レベルで発現し、その増殖過程に亘って可溶性のポリペプチドとして残存する。さらに、Ｒａ１２は、Ｒａ１２が融合している異種免疫原性ポリペプチドの免疫原性を増強する。１つの好ましいＲａ１２融合ポリペプチドは、ＭＴＢ３２Ａのアミノ酸残基の１９２位〜３２３位に対応する１４ＫＤ  Ｃ末端フラグメントを含む。他の好ましいＲａ１２ポリヌクレオチドは、一般に、Ｒａ１２ポリペプチドの一部分をコードする、少なくとも１５個連続するヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約２００ヌクレオチド、または少なくとも約３００ヌクレオチドを含み得る。Ｒａ１２ポリヌクレオチドは、ネイティブ配列（すなわち、Ｒａ１２ポリペプチドまたはその部分をコードする内因性配列）を含み得るかまたはこのような配列の改変体を含み得る。Ｒａ１２ポリヌクレオチド改変体は、天然のＲａ１２ポリペプチドを含む融合ポリペプチドと比較して、そのコードする融合ペプチドの生物学的活性が実質的に消滅しないように、１以上の置換、付加、欠失および／または挿入を含み得る。改変体は、天然のＲａ１２ポリペプチド配列またはその一部をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも７０％の同一性、より好ましくは８０％の同一性、最も好ましくは９０％の同一性を提示する。
【００７６】
好ましい実施形態において、免疫学的融合パートナーは、グラム陰性の細菌Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｂの表面タンパク質である、プロテインＤ（ＷＯ  ９１／１８９２６）に由来する。好ましくは、プロテインＤ誘導体は、ほぼ３分の１の最初のタンパク質（例えば、最初のＮ末端１００〜１１０アミノ酸）を含み、そしてプロテインＤ誘導体は、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｅｄ）され得る。特定の好ましい実施形態において、リポタンパク質Ｄ融合パートナーの最初の１０９残基は、さらなる外因性Ｔ細胞エピトープを有するポリペプチドを提供するように、そしてＥ．ｃｏｌｉ中の発現レベルを増加する（従って、発現エンハンサーとして機能する）ように、Ｎ末端において含まれる。脂質テールは、抗原提示細胞への抗原の最適な提示を保証する。他の融合パートナーは、インフルエンザウイルス由来の非構造タンパク質、ＮＳ１（血球凝集素）を含む。代表的に、Ｎ末端の８１アミノ酸が用いられるが、Ｔヘルパーエピトープを含む異なるフラグメントが用いられてもよい。
【００７７】
別の実施形態において、免疫学的融合パートナーは、ＬＹＴＡとして公知のタンパク質、またはその部分（好ましくはＣ末端部分）である。ＬＹＴＡは、アミダーゼＬＹＴＡ（ＬｙｔＡ遺伝子によりコードされる；Ｇｅｎｅ  ４３：２６５〜２９２，１９８６）として公知のＮ−アセチル−Ｌ−アラニンアミダーゼを合成するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来である。ＬＹＴＡは、ペプチドグリカン骨格中の特定の結合を特異的に分解する自己溶解素である。ＬＹＴＡタンパク質のＣ末端ドメインは、コリンまたはいくつかのコリンアナログ（例えば、ＤＥＡＥ）への親和性についての原因である。この性質は、融合タンパク質の発現のために有用なＥ．ｃｏｌｉ  Ｃ−ＬＹＴＡ発現プラスミドの開発のために開発された。アミノ末端でＣ−ＬＹＴＡフラグメントを含むハイブリッドタンパク質の精製が、記載されている（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７９５〜７９８，１９９２）。好ましい実施形態において、ＬＹＴＡの反復部分は、融合タンパク質に組み込まれ得る。反復部分は、残基１７８で開始するＣ末端領域中に見出される。特に好ましい反復部分は、残基１８８〜３０５を組み込む。
【００７８】
なお別の例示的な実施形態は、融合ポリペプチドおよびそれらをコードするポリヌクレオチドを含み得、ここで、この融合パートナーは、米国特許第５，６３３，２３４号に記載されるように、エンドソームコンパートメント／リソソームコンパートメントに対してポリペプチドを指向することができる標的化シグナルを含み得る。本発明の免疫原性ポリペプチドは、この標的化シグナルと融合しているとき、ＭＨＣ  ＩＩ型分子とより効率的に会合し、そして、それによって、このポリペプチドに特異的なＣＤ４＋  Ｔ細胞のインビボ刺激の増大を提供する。
【００７９】
本発明のポリペプチドは、種々の周知の合成技術および／または組換え技術のうちの任意のものを使用して調製され得る（後者については以下にさらに記載する）。一般的に約１５０アミノ酸よりも短い、ポリペプチド、部分および他の改変体は、当業者にとって周知の技術を使用する合成手段によって生成され得る。１つの例示的な例では、このようなポリペプチドは、市販されている固相技術のうち任意のもの（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成法であって、ここで、アミノ酸は伸長するアミノ酸鎖に連続的に付加される）を使用して合成される。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９〜２１４６（１９６３）を参照のこと。ポリペプチドの自動合成ための装置は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）のような供給業者から市販されており、そして製造者の指示書に従って操作され得る。
【００８０】
一般に、本発明のペプチド組成物（融合ペプチドを含む）は、単離されている。「単離」ポリペプチドとは、そのポリペプチドの本来の環境から取り出されたものである。例えば、天然系において共存する物質のいくつかまたはその全てのものから分離されているときに、天然に存在するタンパク質またはポリペプチドは、単離されているのである。好ましくは、このようなポリペプチドはまた、例えば、少なくとも約９０％の純度、好ましくは少なくとも約９５％の純度、そして、最も好ましくは少なくとも約９９％の純度で精製されている。
【００８１】
（ポリヌクレオチド組成物）
本発明は、他の局面において、ポリヌクレオチド組成物を提供する。用語「ＤＮＡ」および「ポリヌクレオチド」は、本質的に本明細書中で交換可能に使用されており、特定の種のゲノムＤＮＡ全体を含まずに単離さているＤＮＡ分子をいう。「単離（されている）」とは、本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチドが、他のコード配列から実質的に分離されていることを意味し、そして、このＤＮＡ分子は、関連しないコードＤＮＡの大部分（例えば、大きい染色体フラグメントままは他の機能遺伝子もしくは機能ポリペプチドコード領域）を含なまないことを意味する。当然、このことは、本来、単離されている場合のＤＮＡ分子をいい、人為的にそのセグメントに付加された遺伝子またはコード領域を排除する。
【００８２】
当業者によって理解されるように、本発明のポリヌクレオチド組成物は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドなどを発現するかまたはそれらを発現する、ゲノム配列、ゲノム外配列およびプラスミドコード配列ならびにより小規模に操作されたセグメントなどを含み得る。このようなセグメントは、天然に単離されているかまたは人為的に合成によって改変され得る。
【００８３】
当業者によって認識されるように、本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖（コード鎖またはアンチセンス鎖）あるいは二本鎖であり得、そして、ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡ）分子であるかまたはＲＮＡ分子であり得る。ＲＮＡ分子としては、ＨｎＲＮＡ分子（これは、イントロンを含み、１対１の様式でＤＮＡ分子と対応する）、およびｍＲＮＡ分子（これは、イントロンを含まない）が挙げられ得る。さらなるコード鎖または非コード鎖は、本発明のポリヌクレオチドの中に存在している必要はないが存在してもよく、他の分子および／または支持材料に連結される必要はないがそれらに連結してもよい。
【００８４】
ポリヌクレオチドは、ネイティブ配列（すなわち、本発明のポリペプチドまたはタンパク質をコードする内因性配列またはそれらの部分）を含み得るか、または、このような配列の改変体もしくは誘導体、そして、好ましくは、このような配列の免疫原性改変体もしくは誘導体改変体をコードする配列を含み得る。
【００８５】
したがって、本発明の別の局面において、配列番号１、３〜８６、１４２〜２９８、３０１〜３０３、３０７、３１３、３１４、３１６、３１７、３２３、３２５、３２７〜３３０、３３５、３３９、および３４１〜３４４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド配列および配列番号１、３〜８６、１４２〜２９８、３０１〜３０３、３０７、３１３、３１４、３１６、３１７、３２３、３２５、３２７〜３３０、３３５、３３９、および３４１〜３４４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド配列の相補配列、ならびに配列番号１、３〜８６、１４２〜２９８、３０１〜３０３、３０７、３１３、３１４、３１６、３１７、３２３、３２５、３２７〜３３０、３３５、３３９、および３４１〜３４４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド配列の縮重改変体のいくつかまたはその全部を含む、ポリヌクレオチド組成物が提供される。特定の好ましい実施形態において、本明細書中に記載のポリヌクレオチド配列は、上記のように、免疫原性ポリペプチドをコードする。
【００８６】
他の関連する実施形態において、本発明は、本明細書中の配列番号１、３〜８６、１４２〜２９８、３０１〜３０３、３０７、３１３、３１４、３１６、３１７、３２３、３２５、３２７〜３３０、３３５、３３９、および３４１〜３４４において開示される配列に対する実質的な同一性を有しているポリヌクレオチド改変体を提供し、例えば、これらの改変体は、本明細書に記載の方法（例えば、以下に記載の、標準的なパラメータを使用するＢＬＡＳＴ解析）を使用して本発明のポリヌクレオチド配列と比較したときに、少なくとも７０％の配列同一性を含むか、好ましくは、少なくとも、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を含む。これらの値が適切に調節され、コドン縮重、アミノ酸類似度、リーディングフレームポジショニングなどを考慮することによって、２つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の対応する同一性を決定することを、当業者は認識する。
【００８７】
代表的に、好ましくは、本明細書に具体的に記載されるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドと比較して、改変体ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの免疫原性が実質的に消失しないように、ポリヌクレオチド改変体は、１以上の置換、付加、欠失および／または挿入を含み得る。用語「改変体」はまた、体外に起源をもつ相同性遺伝子を包含するように理解されるべきである。
【００８８】
さらなる実施形態において、本発明は、本明細書にて開示される配列のうちの１つ以上に同一であるかまたはそれらに対して相補的である配列の種々の長さの連続したストレッチを含むかまたはこれらからなるポリヌクレオチドフラグメントを提供する。例えば、本明細書中に開示される配列の１つ以上のうちの１０個、１５個、２０個、３０個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、５００個もしくは１０００個またはそれより長く連続するヌクレオチドならびにこれらの間の全ての中間の長さのヌクレオチドを含むかあるいはこれらからなる、ポリヌクレオチドが本発明によって提供される。この文脈において「中間の長さ」とは、例えば、以下のような記載された値の間の任意の長さを意味する：１６、１７、１８、１９など；２１、２２、２３など；３０、３１、３２など；５０、５１、５２、５３など；１００、１０１、１０２、１０３など；１５０、１５１、１５２、１５３など；２００〜５００にわたる全ての整数を含む長さ；５００〜１０００など。本明細書に記載のポリヌクレオチド配列は、ネイティブ配列に見出されないさらなるヌクレオチドによって、一方の末端または両方の末端にて伸長され得る。さらなる配列は、開示される配列のいずれかの末端または開示された配列の両方の末端における、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチドまたは２０ヌクレオチドの配列からなり得る。
【００８９】
本発明の別の実施形態において、本明細書で提供されるポリヌクレオチド配列またはそれらのフラグメントもしくは相補的な配列に対して中程度〜高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る、ポリヌクレオチド組成物が提供される。例示目的のために、他のポリヌクレオチド配列と本発明のポリヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションを試験するのに適切な中程度のストリンジェント条件としては、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液でプレ洗浄し；一晩で、５×ＳＳＣ、５０℃〜６０℃にてハイブリダイゼーションダイズし；その後、２０分間にわたって、６５℃で、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ、０．５×ＳＳＣ、および０．２×ＳＳＣの各々を用いて洗浄を２回することが挙げられる。当業者は、ハイブリダイゼーションのストリージェンシーが、例えば、ハイブリダイゼーション溶液の塩の含有量および／またはハイブリダイゼーションを実施する温度を変更することによって容易に操作され得ることを理解する。例えば、別の実施形態において、適切な高度にストリージェントなハイブリダイゼーション条件としては、上に記載のハイブリダイゼーション条件が挙げられるが、但し、ハイブリダイゼーションの温度を、例えば、６０〜６５℃、または６５℃〜７０℃に上昇させる。
【００９０】
特定の好ましい実施形態において、上に記載のポリヌクレオチド（例えば、ヌクレオチド改変体、フラグメントおよびハイブリダイズする配列）は、本明細書に具体的に記載されるポリペプチド配列と免疫原的に交差反応性であるポリペプチドをコードする。他の好ましい実施形態において、このようなポリヌクレオチドは、本明細書中に具体的に記載されるポリペプチド配列の免疫原性活性の、少なくとも約５０％、好ましくは、少なくとも約７０％、そして、より好ましくは少なくとも約９０％の免疫原性活性のレベルを有するポリペプチドをコードする。
【００９１】
本発明のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは、そのコード配列自体の長さとは無関係に、他のＤＮＡ配列（例えば、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、さらなる制限酵素部位、マルチプルクローニングサイト、他のコードセグメントなど）と組み合わされ得、その結果、その全体の長さはかなり変動し得る。従って、ほぼあらゆる長さの核酸フラグメントが使用され得ることが意図され、その全体の長さは、好ましくは、意図される組換えＤＮＡプロトコルにおける調製および使用の容易さによって制限される。例えば、約１０，０００塩基対長、約５０００塩基対長、約３０００塩基対長、約２，０００塩基対長、約１，０００塩基対長、約５００塩基対長、約２００塩基対長、約１００塩基対長、約５０塩基対長など（中間にある全ての長さを含む）の全長を有する例示的なポリヌクレオチドセグメントは、本発明の多くの実施において有用であることが意図される。
【００９２】
ポリヌクレオチド配列を比較する場合、以下に記載されるような最大の一致でアライメントするときに２つの配列中のヌクレオチドの配列が同一である場合に、２つの配列は、「同一」であるといわれる。２つの配列間の比較は、代表的には、比較ウインドウにわたって配列を比較して、配列類似性の局所的領域を同定および比較することによって行われる。本明細書中で使用される場合「比較ウインドウ」とは、少なくとも約２０個、通常は３０個〜約７５個、４０個〜約５０個連続する位置のセグメントをいい、ここで、配列は、２つの配列が最適にアライメントされた後で、同数の連続する位置の参照配列と比較され得る。
【００９３】
比較のための最適な配列のアライメントは、バイオインフォマティクスソフトウエアのＬａｓｅｒｇｅｎｅスイートにおけるＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、デフォルトパラメータを用いて行われ得る。このプログラムは、以下の参考文献に記載のいくつかのアライメントスキームを組織化する：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（編）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ  第５巻，補遺３，３４５〜３５８頁におけるＤａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（１９７８）Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．；Ｈｅｉｎ  Ｊ．（１９９０）Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ  ６２６〜６４５頁  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  第１８３巻，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３；Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒ  Ｗ．（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．（１９７１）Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ  １１：１０５；Ｓａｎｔｏｕ，Ｎ．Ｎｅｓ，Ｍ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６−４２５；Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．（１９７３）Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ−ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ，Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．，Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：７２６−７３０。
【００９４】
あるいは、比較のための最適な配列のアライメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ  ２：４８２の局所的同一性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の同一性アライメントアルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化した実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または目視によって行われ得る。
【００９５】
配列同一性および配列類似性のパーセントを決定するために適切なアルゴリズムの１つの好ましい例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらはそれぞれＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９７７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載される。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０は、本発明のポリヌクレオチドについての配列同一性のパーセントを決定するために、例えば、本明細書中に記載のパラメータを使用して使用され得る。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎを通して公的に利用可能である。１つの例示的な例において、累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメータＭ（一致する残基の対についての報酬スコア（ｒｅｗａｒｄ  ｓｃｏｒｅ）；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティスコア；常に＜０）を使用して算出され得る。各方向におけるワードヒットの拡大は、以下の場合に停止する：累積アライメントスコアが、その最大到達値から量Ｘだけ低下した場合；累積スコアが、１以上の負のスコアの残基アライメントの累積に起因してゼロ以下になった場合；またはいずれかの配列の末端に到達した場合。このＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、アライメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、ワード長さ（Ｗ）１１、および期待値（Ｅ）１０をデフォルトとして、そしてＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５を参照のこと）アラインメントは、（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用する。
【００９６】
好ましくは、「配列同一性のパーセンテージ」は、少なくとも２０個の位置の比較ウインドウにわたって２つの最適にアライメントした配列を比較することによって決定され、ここで比較ウインドウ中のポリヌクレオチド配列の一部は、参照配列（これは、付加も欠失も含まない）と比較して、２つの配列の最適なアライメントのために、２０パーセント以下、通常は５〜１５パーセント、または１０〜１２パーセントの付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。このパーセンテージは、両方の配列で同一の核酸塩基が生じる位置の数を決定して一致する位置の数を得、この一致する位置の数を参照配列中の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除算し、そしてこの結果に１００を乗算して配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出される。
【００９７】
遺伝暗号の縮重の結果として、本明細書中に記載されるようなポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列が存在することが、当業者に理解される。これらのポリヌクレオチドのうちいくつかは、任意のネイティブな遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する。それにもかかわらず、コドン使用頻度における差異に起因して変動するポリヌクレオチドは、本発明によって特に意図される。さらに、本明細書中に提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は、本発明の範囲内である。対立遺伝子は、１以上の変異（例えば、ヌクレオチドの欠失、付加および／または置換）の結果として変化した内因性遺伝子である。得られたｍＲＮＡおよびタンパク質は、変化した構造または機能を有し得るが、有さなくてもよい。対立遺伝子は、標準的な技術（例えば、ハイブリダイゼーション、増幅および／またはデータベース配列比較）を用いて、同定され得る。
【００９８】
従って、本発明の別の実施形態において、変異誘発アプローチ（例えば、部位特異的変異誘発）が、本明細書中に記載のポリペプチドの免疫原性改変体および／または誘導体の調製のために使用される。このアプローチによって、ポリペプチド配列における特定の改変が、これらをコードする、基礎となるポリヌクレオチドの変異誘発を介してなされ得る。これらの技術は、例えば、ポリヌクレオチド中に１つ以上のヌクレオチド配列変化を導入することによって、前述の考慮事項の１つ以上を組み込んだ配列改変体を調製および試験するための直接的なアプローチを提供する。
【００９９】
部位特異的変異誘発は、所望の変異のＤＮＡ配列をコードする特定のオリゴヌクレオチド配列ならびに十分な数の隣接ヌクレオチドの使用を通して変異体を生成することを可能にし、相対する欠失連結部の両側に安定な二重鎖を形成するために、十分なサイズのプライマー配列および配列複雑性を提供する。変異は、ポリヌクレオチド自体の特性を改善するか、変更するか、減少させるか、改変するか、さもなければ変化させるため、そして／またはコードされたポリペプチドの特性、活性、組成、安定性または一次配列を変更するために、選択されたポリヌクレオチド配列において使用され得る。
【０１００】
本発明の特定の実施形態において、本発明者らは、コードされたポリペプチドの１つ以上の特性（例えば、ポリペプチドワクチンの免疫原性）を変更するために、開示されたポリヌクレオチド配列の変異誘発を意図する。部位特異的変異誘発の技術は、当該分野に周知であり、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの両方の改変体を作製するために広範に使用される。例えば、部位特異的変異誘発は、しばしば、ＤＮＡ分子の特定部分を変更するために使用される。このような実施形態では、代表的に、約１４ヌクレオチド長〜約２５ヌクレオチド長程度の長さを含むプライマーが使用され、配列の連結部の両側にある、約５残基〜約１０残基が変更される。
【０１０１】
当業者によって理解されるように、部位特異的変異誘発技術は、しばしば、一本鎖形態および二本鎖形態の両方で存在するファージベクターを使用してきた。部位特異的変異誘発において有用である代表的なベクターとしては、例えば、Ｍ１３ファージのようなベクターが挙げられる。これらのファージは、容易に商業的に入手可能であり、そしてそれらの使用は、一般的に当業者に周知である。二本鎖プラスミドもまた、目的の遺伝子をプラスミドからファージに転移する工程を排除する部位特異的変異誘発において慣用的に使用されている。
【０１０２】
一般的に、本明細書に従う部位特異的変異誘発は、所望のペプチドをコードするＤＮＡ配列をその配列中に含む一本鎖ベクターをまず入手する工程、またはこの配列を含む二本鎖ベクターの２本の鎖を融解して分離する工程によって実行される。所望の変異配列を保有するオリゴヌクレオチドプライマーは、一般的に、合成により調製される。次いで、このプライマーは、一本鎖ベクターとともにアニーリングされ、そして変異を保有する鎖の合成を完了するために、ＤＮＡ重合化酵素（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼＩ  Ｋｌｅｎｏｗフラグメント）に供される。このようにして、ヘテロ二重鎖が形成され、ここで一方の鎖が変異を有さない本来の配列をコードし、そして２つめの鎖は所望の変異を保有する。次いで、このヘテロ二重鎖ベクターは、適切な細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞）を形質転換するために使用され、そして、変異した配列配置を保有する組換えベクターを含むクローンが選択される。
【０１０３】
部位特異的変異誘発を使用する、選択されたペプチドコードＤＮＡセグメントの配列改変体の調製は、潜在的に有用な種を生成する手段を提供し、そしてこれは、限定を意味するものではない。なぜなら、ペプチドの配列改変体およびそれらをコードするＤＮＡ配列を入手し得る他の方法が存在するからである。例えば、所望のペプチド配列をコードする組換えベクターは、配列改変体を得るために、変異誘発剤（例えば、ヒドロキシルアミン）で処理され得る。これらの方法およびプロトコルに関する具体的な詳細は、Ｍａｌｏｙら、１９９４；Ｓｅｇａｌ、１９７６；ＰｒｏｋｏｐおよびＢａｊｐａｉ、１９９１；Ｋｕｂｙ、１９９４；およびＭａｎｉａｔｉｓら、１９８２（各々がこの目的のために本明細書中に参考として援用される）の教示において見出され得る。
【０１０４】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド特異的変異誘発手順」とは、鋳型依存的プロセスおよびベクター媒介性増殖をいい、これは、その初期の濃度と比較して、特定の核酸分子の濃度の増加を生じるか、または検出可能なシグナルの濃度の増加（例えば、増幅）を生じる。本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド特異的変異誘発手順」は、プライマー分子の鋳型依存的な伸長を含むプロセスをいうことが意図される。用語、鋳型依存的プロセスとは、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子の核酸合成をいい、ここで新規に合成された核酸の鎖の配列は、相補的塩基対形成の周知の規則によって指定される（例えば、Ｗａｔｓｏｎ、１９８７を参照のこと）。代表的には、ベクター媒介性の方法論は、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターへの核酸フラグメントの導入、ベクターのクローン性増幅、および増幅した核酸フラグメントの回収を包含する。これらの方法論の例は、その全体が具体的に参考として本明細書中に援用される、米国特許第４，２３７，２２４号によって提供される。
【０１０５】
本発明のポリペプチド改変体の生成のための別のアプローチにおいて、米国特許第５，８３７，４５８号に記載のような、再帰的な配列組換えが使用され得る。このアプローチにおいて、組換えおよびスクリーニングまたは選択の再帰性のサイクルが実施されて、例えば、増強された免疫原性活性を有する本発明の個々のポリヌクレオチド改変体を「進化」させる。
【０１０６】
本発明の他の実施形態において、本明細書中に提供されるポリヌクレオチド配列は、核酸ハイブリダイゼーションのためのプローブまたはプライマーとして、有利に使用され得る。このようにして、本明細書中に開示される１５ヌクレオチド長の連続配列と同じ配列か、またはこれに相補的な配列を有する、少なくとも約１５ヌクレオチド長の連続配列の配列領域を含むかまたはその配列領域からなる核酸セグメントが特定の用途を見出すことが、意図される。例えば、約２０、３０、４０、５０、１００、２００、５００、１０００（中間にある全ての長さを含む）およびまさに全長配列までの、より長い連続した同一配列または相補的な配列もまた、特定の実施形態において有用である。
【０１０７】
このような核酸プローブが目的の配列に特異的にハイブリダイズする能力は、所定のサンプル中における相補的配列の存在を検出する際にこれらが使用されることを可能にする。しかし、他の用途（例えば、変異種プライマーまたは他の遺伝子構築物の調製の際に使用するためのプライマーを調製するための配列情報の使用）もまた意図される。
【０１０８】
１０ヌクレオチド〜１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド〜２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、または１００ヌクレオチド〜２００ヌクレオチド程度（同様に、中間にある全ての長さを含む）までもの連続するヌクレオチドストレッチからなる配列領域を有し、本明細書中に開示されるポリヌクレオチド配列に同一または相補的なポリヌクレオチド分子は、例えばサザンブロッティングまたはノーザンブロッティングにおける使用のためのハイブリダイゼーションプローブとして特に意図される。これは、遺伝子産物またはそのフラグメントが、多様な細胞型およびまた種々の細菌細胞の両方において分析されることを可能とする。フラグメントの全体のサイズ、ならびに相補的ストレッチのサイズは、究極的には、特定の核酸セグメントの意図される用途または適用に依存する。より小さなフラグメントは、一般に、ハイブリダイゼーション実施形態における用途を見出し、ここで連続した相補領域の長さは変化され得る（例えば、約１５ヌクレオチドと約１００ヌクレオチドとの間）が、検出を望む相補配列の長さに従って、より長い連続した相補的ストレッチが使用され得る。
【０１０９】
約１５ヌクレオチド長〜２５ヌクレオチド長のハイブリダイゼーションプローブの使用は、安定で選択的な二重鎖分子の形成を可能にする。しかし、１５塩基長より長いストレッチにわたる連続した相補配列を有する分子が、ハイブリッドの安定性および選択性を増加するために一般に好ましく、それによって、得られる特異的ハイブリッド分子の質および程度が改善される。１５個〜２５個連続するヌクレオチド、または望まれる場合にはより長い遺伝子相補的ストレッチを有する核酸分子を設計することが一般に好ましい。
【０１１０】
ハイブリダイゼーションプローブは、本明細書中に開示される配列のいずれかの任意の部分から選択され得る。必要とされるのは、本明細書中に記載の配列、あるいはプローブまたはプライマーとしての利用を望む場合は、約１５ヌクレオチド長〜２５ヌクレオチド長から全長以下の配列までの配列の任意の連続した部分までを再検討することのみである。プローブおよびプライマー配列の選択は、種々の要因によって支配され得る。例えば、全配列の末端に向かってプライマーを使用することが望まれ得る。
【０１１１】
小さなポリヌクレオチドセグメントまたはフラグメントは、自動オリゴヌクレオチド合成装置を使用して通常行われるように、例えば化学的手段によってフラグメントを直接合成することによって、容易に調製され得る。また、フラグメントは、核酸複製技術（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号（本明細書中に参考として援用される）のＰＣＲＴＭ技術）の適用によって、組換え生成のために選択された配列を組換えベクターに導入することによって、および一般に分子生物学の分野の当業者に公知の他の組換えＤＮＡ技術によって、得られ得る。
【０１１２】
本発明のヌクレオチド配列は、目的の完全遺伝子または遺伝子フラグメントの相補的ストレッチと、二重鎖分子を選択的に形成するその能力のために使用され得る。想定される適用に依存して、代表的には、標的配列に対するプローブの選択性の種々の程度に達するために、ハイブリダイゼーションの種々の条件を使用することが望ましい。高い選択性を必要とする適用のためには、代表的には、ハイブリッドを形成するために比較的ストリンジェントな条件（例えば、比較的低濃度の塩および／または高温の条件（例えば、約５０℃〜約７０℃の温度で、約０．０２Ｍ〜約０．１５Ｍの塩の塩濃度によって提供される）を使用することが望ましい。このような選択条件は、プローブとテンプレートまたは標的鎖との間にミスマッチがある場合にわずかに許容性であり、そして関連する配列の単離のために特に適切である。
【０１１３】
当然のことながら、いくつかの適用（例えば、潜在的なテンプレートにハイブリダイズする変異体プライマー鎖を使用する、変異体の調製が望ましい場合）について、低ストリンジェント（減少したストリンジェンシー）のハイブリダイゼーション条件が、ヘテロ二重鎖を形成させるために代表的に必要とされる。これらの状況では、約２０℃〜約５５℃の温度範囲で約０．１５Ｍ〜約０．９Ｍの塩の条件のような塩条件を使用することが所望され得る。これによって、交差ハイブリダイズする種は、コントロールハイブリダイゼーションに関して、陽性ハイブリダイズシグナルとして容易に同定され得る。いかなる場合でも、ホルムアミド（これは、温度上昇と同じ様式で、ハイブリッド二重鎖を不安定化するように作用する）の増加した量の添加によって、条件がよりストリンジェントになり得ることが一般に理解される。従って、ハイブリダイゼーション条件は、容易に操作され得、従って、一般に、選択される方法は所望の結果に依存する。
【０１１４】
本発明の別の実施形態に従って、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むポリヌクレオチド組成物が、提供される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、タンパク質合成の効果的かつ標識化されるインヒビターであることが実証されており、結果として、疾患に起因するタンパク質の合成を阻害することによって疾患が処置され得るという治療的なアプローチを提供する。タンパク質合成を阻害するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの効力は、十分に確立されている。例えば、ポリガラクタウロナーゼ（ｐｏｌｙｇａｌａｃｔａｕｒｏｎａｓｅ）の合成およびムスカリン２型アセチルコリンレセプターは、そのそれぞれのｍＲＮＡ配列に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドによって阻害される（米国特許第５，７３９，１１９号および米国特許第５，７５９，８２９号）。さらに、アンチセンス阻害の例が、核タンパク質サイクリン、多剤耐性遺伝子（ＭＤＧ１）、ＩＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチン、ＳＴＫ−１、線条体ＧＡＢＡＡレセプターおよびヒトＥＧＦを用いて示されている（Ｊａｓｋｕｌｓｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８８  Ｊｕｎ  １０；２４０（４８５８）：１５４４−６；ＶａｓａｎｔｈａｋｕｍａｒおよびＡｈｍｅｄ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９８９；１（４）：２２５−３２；Ｐｅｒｉｓら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１９９８  Ｊｕｎ  １５；５７（２）３１０−２０；米国特許第５，８０１，１５４号；同第５，７８９，５７３号；同第５，７１８，７０９号および同第５，６１０，２８８号）。種々の異常な細胞増殖（例えば、癌）を阻害しそして処置するために使用され得る、アンチセンス構築物もまた、記載されている（米国特許第５，７４７，４７０号；同第５，５９１，３１７号および同第５，７８３，６８３号）。
【０１１５】
従って、特定の実施形態において、本発明は、本明細書中に記載されるポリヌクレオチド配列に特異的に結合し得る任意の配列もしくはその相補体のすべてまたは一部を含む、オリゴヌクレオチド配列を提供する。１つの実施形態において、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはその誘導体を含む。別の実施形態において、そのオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡまたはその誘導体を含む。第３の実施形態において、そのオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート改変骨格を含む、改変ＤＮＡである。第４の実施形態において、そのオリゴヌクレオチド配列は、ペプチド核酸またはその誘導体を含む。各場合において、好ましい組成物は、本明細書中に開示されるポリヌクレオチドの１つ以上の部分に相補的な、より好ましくは実質的に相補的な、そしてさらにより好ましくは完全に相補的な、配列領域を含む。所定の遺伝子配列に特異的なアンチセンス組成物の選択は、選択された標的配列の分析に基づき、そして二次構造、Ｔｍ、結合エネルギー、および相対的安定性の決定に基づく。アンチセンス組成物は、二量体、ヘアピン、または宿主細胞において標的ｍＲＮＡへの特異的結合を減少または妨げる他の二次構造をそれらが形成できない相対的能力に基づいて選択され得る。ｍＲＮＡの非常に好ましい標的領域は、ＡＵＧ翻訳開始コドンの領域またはその付近の領域、およびｍＲＮＡの５’領域と実質的に相補的な配列である。これらの二次構造分析および標的部位選択の考慮は、例えば、ＯＬＩＧＯプライマー分析ソフトウェアのｖ．４および／またはＢＬＡＳＴＮ  ２．０．５アルゴリズムソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９７，２５（１７）：３３８９−４０２）を使用して実施され得る。
【０１１６】
短いペプチドベクター（ＭＰＧ（２７残基）と称する）を使用するアンチセンス送達法の使用もまた意図される。このＭＰＧペプチドは、ＨＩＶ  ｇｐ４１の融合配列由来の疎水性ドメインと、ＳＶ４０  Ｔ抗原の核局在化配列由来の親水性ドメインとを含む（Ｍｏｒｒｉｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９７  Ｊｕｌ  １５；２５（１４）：２７３０−６）。このＭＰＧペプチドのいくつかの分子がアンチセンスオリゴヌクレオチドをコートし、そして比較的高い効率（９０％）にて１時間未満で培養哺乳動物細胞へと送達され得ることが示された。さらに、ＭＰＧとの相互作用は、ヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの安定性および形質膜を横切る能力の両方を強力に増加させる。
【０１１７】
本発明の別の実施形態に従って、本明細書中に記載されるポリヌクレオチド組成物は、腫瘍ポリペプチドおよび腫瘍細胞に存在するタンパク質の発現を阻害するためのリボンザイム分子の設計および調製に使用される。リボザイムは、部位特異的様式で核酸を切断するＲＮＡ−タンパク質複合体である。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を保有する特異的触媒ドメインを有する（ＫｉｍおよびＣｅｃｈ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９８７  Ｄｅｃ；８４（２４）：８７８８−９２；ＦｏｒｓｔｅｒおよびＳｙｍｏｎｓ、Ｃｅｌｌ．１９８７  Ａｐｒ  ２４；４９（２）２１１−２０）。例えば、多数のリボザイムが、高い程度の特異性でホスホエステル転移反応を加速し、しばしば、オリゴヌクレオチド基質にある数個のホスホエステルのうちの１つのみを切断する（Ｃｅｃｈら、Ｃｅｌｌ．１９８１  Ｄｅｃ；２７（３  Ｐｔ  ２）：４８７−９６；ＭｉｃｈｅｌおよびＷｅｓｔｈｏｆ、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９０  Ｄｅｃ  ５；２１６（３）：５８５−６１０；Ｒｅｉｎｈｏｌｄ−ＨｕｒｅｋおよびＳｈｕｂ、Ｎａｔｕｒｅ．１９９２  Ｍａｙ  １４；３５７（６３７４）：１７３−６）。この特異性は、この基質が、化学反応の前にリボザイムの内部ガイド配列（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｇｕｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（「ＩＧＳ」）との特異的塩基対形成相互作用を介して結合するという要件に帰する。
【０１１８】
天然に存在する酵素的ＲＮＡの６つの基本的変種が、現在公知である。各々が、生理学的条件下で、トランスで、ＲＮＡホスホジエステル結合の加水分解を触媒し得る（従って、他のＲＮＡ分子を切断し得る）。一般に、酵素的核酸は、まず、標的ＲＮＡへの結合によって作用する。このような結合は、標的ＲＮＡを切断するように作用する分子の酵素的部分に近接して保持される、酵素的核酸の標的結合部分を介して生じる。従って、その酵素的核酸はまず、標的ＲＮＡを認識し、次いで相補的塩基対形成を介してその標的ＲＮＡに結合し、そして一旦正確な部位に結合すると、その標的ＲＮＡを酵素的に切断するように作用する。このような標的ＲＮＡの戦略的切断は、コードされるタンパク質を直接合成する標的ＲＮＡの能力を破壊する。酵素的核酸がそのＲＮＡ標的に結合しそして切断した後、その酵素的核酸は、別の標的を探索するためにそのＲＮＡから離れ、そして繰り返し、新しい標的に結合しそして切断し得る。
【０１１９】
リボザイムの酵素特性は、多くの技術（例えば、アンチセンス技術（ここで、核酸分子は、翻訳を阻害するために核酸標的に簡単に結合する））に対して有利である。なぜなら、治療的処置に影響を与えるのに必要であるリボザイムの濃度は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度よりも低いからである。この利点は、酵素的に作用するリボザイムの能力に影響を与える。従って、単一のリボザイム分子は、標的ＲＮＡの多くの分子を切断し得る。さらに、このリボザイムは、高度に選択的なインヒビターであり、この阻害の特異性は、標的ＲＮＡに結合する塩基対形成の機構に依存するだけでなく、標的ＲＮＡの切断の機構にも依存する。切断部位付近の１個のミスマッチまたは塩基置換により、リボザイムの触媒活性が完全になくなり得る。アンチセンス分子内の同様のミスマッチでは、それらの作用は妨げられない（Ｗｏｏｌｆら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９９２  ８月  １５；８９（１６）：７３０５−９）。従って、リボザイムの作用の特異性は、同じＲＮＡ部位に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドの作用の特異性よりも高い。
【０１２０】
この酵素的核酸分子は、ハンマーヘッド（ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ）モチーフ、ヘアピンモチーフ、δ型肝炎ウイルスモチーフ、Ｉ群イントロンモチーフまたはＲＮａｓｅＰ  ＲＮＡモチーフ（ＲＮＡ誘導配列に関連する）あるいはＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ＶＳ  ＲＮＡモチーフに形成され得る。ハンマーヘッドモチーフの例は、Ｒｏｓｓｉら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９２  ９月  １１；２０（１７）：４５５９−６５に記載される。ヘアピンモチーフの例は、Ｈａｍｐｅｌら（欧州特許出願公開番号ＥＰ  ０３６０２５７）、ＨａｍｐｅｌおよびＴｒｉｔｚ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９８９  Ｊｕｎ  １３；２８（１２）：４９２９−３３）、Ｈａｍｐｅｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９０  １月  ２５；１８（２）：２９９−３０４および米国特許第５，６３１，３５９号に記載される。δ型肝炎ウイルスモチーフの例は、ＰｅｒｒｏｔｔａおよびＢｅｅｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９２  １２月  １；３１（４７）：１１８４３−５２に記載される；ＲＮａｓｅＰモチーフの例は、Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａら，Ｃｅｌｌ．１９８３  １２月；３５（３  Ｐｔ  ２）：８４９−５７に記載される；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ＶＳ  ＲＮＡリボザイムモチーフは、Ｃｏｌｌｉｎｓ（ＳａｖｉｌｌｅおよびＣｏｌｌｉｎｓ，Ｃｅｌｌ．１９９０  Ｍａｙ  １８；６１（４）：６８５−９６；ＳａｖｉｌｌｅおよびＣｏｌｌｉｎｓ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９９１  １０月  １；８８（１９）：８８２６−３０；ＣｏｌｌｉｎｓおよびＯｌｉｖｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９３  Ｍａｒ  ２３；３２（１１）：２７９５−９）に記載される；そしてＩ群イントロンの例は、米国特許第４，９８７，０７１号に記載される。本発明の酵素的核酸分子において重要であることは、１以上の標的遺伝子ＲＮＡ領域に相補的である特定の基質結合部位を有すること、およびこの分子にＲＮＡ切断活性を付与する、基質結合部位内のヌクレオチド配列またはこの基質結合部位の周囲のヌクレオチド配列を有することだけである。従って、リボザイム構築物は、本明細書中に記載される特定のモチーフに限定する必要はない。
【０１２１】
リボザイムは、国際特許出願公開番号ＷＯ  ９３／２３５６９および国際特許出願公開番号ＷＯ  ９４／０２５９５（各々は、本明細書中で参考として詳細に援用される）に記載されるように設計され得、そして記載されるようにインビトロおよびインビボにおいて試験するために合成され得る。このようなリボザイムはまた、送達するために最適化され得る。特定の例が提供されるが、当業者は、他の種において等価なＲＮＡ標的が、必要な場合に利用され得ることを理解する。
【０１２２】
リボザイムの活性は、リボザイムの結合アームの長さを変更することにより、または血清リボヌクレアーゼによるこれらの分解を防ぐ改変（例えば、国際特許出願番号ＷＯ  ９２／０７０６５；国際特許公開番号ＷＯ  ９３／１５１８７；国際特許出願公開番号ＷＯ  ９１／０３１６２；欧州特許出願公開番号９２１１０２９８．４；米国特許第５，３３４，７１１号、および国際特許出願公開番号ＷＯ  ９４／１３６８８（これには、酵素的ＲＮＡ分子の糖部分に対して成され得る、種々の化学的改変が記載される）を参照のこと）、細胞中でのリボザイムの有効性を増強する改変、ならびにＲＮＡの合成時間を短縮および化学的必要性を低下させるためのステム（ｓｔｅｍ）ＩＩ塩基を除去して、リボザイムを化学的に合成することにより最適化され得る。
【０１２３】
Ｓｕｌｌｉｖａｎら（国際特許出願公開番号ＷＯ  ９４／０２５９５）は、酵素的ＲＮＡ分子の送達のための一般的な方法を記載する。リボザイムは、当業者に公知の種々の方法によって細胞に投与され得、これらには、リポソームへのカプセル化、イオン泳動法、あるいは、例えば、ヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセルおよび生体接着性ミクロスフィアのような他のビヒクルへの取り込みによるもの、が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの指針のために、リボザイムは、エキソビボで細胞または組織に、上記のビヒクルを使用してか、または使用せずに直接送達され得る。あるいは、ＲＮＡ／ビヒクルの組合せは、直接的な吸入、直接的な注射、またはカテーテル、注入ポンプまたはステントの使用により、局所的に送達され得る。他の送達経路としては、血管内注射、筋内注射、皮下注射または関節注射、エアロゾル吸入、経口送達（錠剤形態または丸薬形態）、局所送達、全身送達、眼送達、腹腔内送達および／またはくも膜下腔内送達が挙げられるが、これらに限定されない。リボザイム送達および投与のより詳細な記載は、国際特許出願公開番号ＷＯ  ９４／０２５９５および国際特許出願公開番号ＷＯ  ９３／２３５６９（各々は、本明細書中で参考として詳細に援用される）に提供される。
【０１２４】
高濃度のリボザイムを細胞内に蓄積する別の手段は、リボザイムコード配列をＤＮＡ発現ベクターに組み込むことである。リボザイム配列の転写は、真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ  Ｉ）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩ）、またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩＩ）のためのプロモーターにより駆動される。ｐｏｌ  ＩＩプロモーターまたはｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターからの転写物は、全ての細胞において高レベルで発現される；所定の細胞型における所定のｐｏｌ  ＩＩプロモーターのレベルは、近くに存在する遺伝子調節配列（エンハンサー、サイレンサーなど）の性質に依存する。原核生物のＲＮＡポリメラーゼプロモーターもまた使用され得るが、但し、原核生物ＲＮＡポリメラーゼ酵素は、適切な細胞において発現される。このようなプロモーターから発現するリボザイムは、哺乳動物細胞において機能することが示されている。このような転写ユニットは、哺乳動物細胞内への導入のための種々のベクター（プラスミドＤＮＡベクター、ウイルスＤＮＡベクター（例えば、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ベクター）、またはウイルスＲＮＡベクター（例えば、レトロウイルスベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター）が挙げられるがこれらに限定されない）に組み込まれ得る。
【０１２５】
本発明の別の実施形態において、ペプチド核酸（ＰＮＡ）組成物が提供される。ＰＮＡは、ＤＮＡ模倣物であり、ここで、核酸塩基は、偽ペプチド骨格に結合される（ＧｏｏｄおよびＮｉｅｌｓｅｎ、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．１９９７  ７（４）４３１〜３７）。ＰＮＡは、ＲＮＡまたはＤＮＡを伝統的に使用した多くの方法において利用され得る。しばしば、ＰＮＡ配列は、対応するＲＮＡ配列またはＤＮＡ配列よりも技術的により良く実施され、そしてＲＮＡにもＤＮＡにも固有でない有用性を有する。産生方法、特徴、および使用方法を含むＰＮＡの総説は、Ｃｏｒｅｙ（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９９７  ６月；１５（６）：２２４〜９）によって提供される。このように、特定の実施形態において、ＡＣＥ  ｍＲＮＡ配列の１以上の部分に相補的であるＰＮＡ配列を調製し得、そしてこのようなＰＮＡ組成物は、ＡＣＥ−特異的ｍＲＮＡの翻訳を調節、変更、減少、または低下させるために使用され得、これにより、このようなＰＮＡ組成物が投与された宿主細胞におけるＡＣＥ活性のレベルを変更する。
【０１２６】
ＰＮＡは、ＤＮＡの正常なホスホジエステル骨格を置換する２−アミノエチル−グリシン連結を有する（Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９１  １２月  ６；２５４（５０３７）：１４９７〜５００；Ｈａｎｖｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９２  １１月  ２７；２５８（５０８７）：１４８１〜５；ＨｙｒｕｐおよびＮｉｅｌｓｅｎ，Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．１９９６  １月；４（１）：５〜２３）。この化学は、３つの重要な結果を有する。第１に、ＤＮＡまたはホスホロチオエートオリゴヌクレオチドと比較して、ＰＮＡは、中性の分子であり；第２に、ＰＮＡは、アキラル（立体選択的な合成を開発する必要を避ける）であり；そして第３に、ＰＮＡ合成は、標準的なＢｏｃプロトコルまたはＦｍｏｃプロトコルを、固相ペプチド合成に使用する。一方、改良型Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ法を含む他の方法が使用されている。
【０１２７】
ＰＮＡモノマーまたは既製のオリゴマーは、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）から市販されている。ＢｏｃプロトコルまたはＦｍｏｃプロトコルのいずれかによるＰＮＡの合成は、手動プロトコルまたは自動プロトコルを直接使用される（Ｎｏｒｔｏｎら、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．１９９５  ４月；３（４）：４３７〜４５）。このマニュアルプロトコルは、それ自体で、化学的に改変されたＰＮＡの産生または密接に関係するＰＮＡのファミリーの同時合成を導く。
【０１２８】
ペプチドの合成に関して、特定のＰＮＡ合成の成功は、選択した配列の特性に依存する。例えば、理論上、ＰＮＡは、ヌクレオチド塩基の任意の組合せを取り込み得るが、隣接するプリンの存在は、産物中に１以上の残基の欠失を導き得る。この困難性の見込みにおいて、隣接するプリンを有するＰＮＡを産生する際に、非効率的に加えられているようである残基の連結を繰り返すべきであることを提案する。この後、ペプチド合成の間に観測されるのと類似する産物の収率および純度を提供する逆相高圧液体クロマトグラフィーによってＰＮＡを精製するべきである。
【０１２９】
所定の適用のためのＰＮＡの改変が、固相合成の間にアミノ酸を連結することによって、または露出されたＮ末端アミンにカルボン酸基を含む化合物を付加することによって達成され得る。あるいは、ＰＮＡは、導入されたリジンまたはシステインに連結することによって、合成した後に改変され得る。ＰＮＡが改変され得る簡便さにより、より良い溶解度または特定の機能的必要条件の最適化を容易にする。一旦合成されると、ＰＮＡおよびそれらの誘導体の同定は、質量分析法によって確認され得る。いくつかの研究が、ＰＮＡの改変物を作製および利用した（例えば、Ｎｏｒｔｏｎら、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．１９９５  ４月；３（４）：４３７〜４５；Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｓｃｉ．１９９５  ５〜６月；１（３）：１７５〜８３；Ｏｒｕｍら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．１９９５  ９月；１９（３）：４７２〜８０；Ｆｏｏｔｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９６  ８月  ２０；３５（３３）：１０６７３〜９；Ｇｒｉｆｆｉｔｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９９５  ８月  １１；２３（１５）：３００３〜８；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９５  ６月  ６；９２（１２）：５５９２〜６；Ｂｏｆｆａら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９５  ３月  １４；９２（６）：１９０１〜５；Ｇａｍｂａｃｏｒｔｉ−Ｐａｓｓｅｒｉｎｉら、Ｂｌｏｏｄ、１９９６  ８月  １５；８８（４）：１４１１〜７；Ａｒｍｉｔａｇｅら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１９９７  １１月  １１；９４（２３）：１２３２０〜５；Ｓｅｅｇｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９９７  ９月；２３（３）：５１２〜７）。米国特許第５，７００，９２２号は、ＰＮＡ−ＤＮＡ−ＰＮＡキメラ分子および診断におけるその分子の使用、生体におけるタンパク質の調節、ならびに治療に対して影響を受け易い状態の処置について議論する。
【０１３０】
ＰＮＡのアンチセンス結合特性を特徴づけする方法は、Ｒｏｓｅ（Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ、１９９３  １２月  １５；６５（２４）：３５４５〜９）およびＪｅｎｓｅｎら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９７  ４月  ２２；３６（１６）：５０７２〜７）において議論される。Ｒｏｓｅは、キャピラリーゲル電気泳動を使用して、相対的な結合速度論および化学量論を測定することで、ＰＮＡのそれらの相補的オリゴヌクレオチドに対する結合を決定する。同様のタイプの測定が、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ  技術を使用してＪｅｎｓｅｎらによってなされた。
【０１３１】
記載され、そして当業者に明らかであるＰＮＡの他の適用には、ＤＮＡ鎖の侵入、アンチセンス阻害、変異分析、転写のエンハンサー、核酸の精製、転写活性遺伝子の単離、転写因子結合の阻害、ゲノムの切断、バイオセンサー、インサイチュハイブリダイゼーションなどにおける使用が挙げられる。
【０１３２】
（ポリヌクレオチドの同定、特徴づけおよび発現）
本発明のポリヌクレオチド組成物は、種々の十分に確立された技術のいずれかを使用して、同定、調製および／または操作され得る（一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９、および他の類似の参考文献を参照のこと）。例えば、ポリヌクレオチドは、以下により詳細に記載されるように、ｃＤＮＡのマイクロアレイを腫瘍に関連する発現（すなわち、本明細書中で提供される代表的なアッセイを使用して決定する場合、正常な組織における発現よりも、腫瘍での少なくとも２倍高い発現）についてスクリーニングすることによって、同定され得る。このようなスクリーニングは、例えば、製造業者の指示書に従って、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）のマイクロアレイ技術を使用して、（そして本質的にＳｃｈｅｎａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１０６１４〜１０６１９，１９９６およびＨｅｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：２１５０〜２１５５，１９９７に記載されるように）、行われ得る。あるいは、ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載されるタンパク質を発現する細胞（例えば、腫瘍細胞）から調製されるｃＤＮＡから増幅され得る。
【０１３３】
多数の鋳型依存性プロセスが、サンプル中に存在する目的の標的配列を増幅するために利用可能である。最もよく知られた増幅方法の１つは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲＴＭ）であり、これは、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、および同第４，８００，１５９号に詳細に記載され、これらの各々はその全体が本明細書中に参考として援用される。手短に言えば、ＰＣＲＴＭにおいては、標的配列の向かい合った相補鎖上の領域に対して相補的な２つのプライマー配列が調製される。過剰のデオキシヌクレオシド三リン酸を、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）とともに反応混合液に添加する。標的配列がサンプル中に存在する場合、プライマーはその標的に結合し、そしてポリメラーゼは、ヌクレオチドに付加することによって標的配列に沿ってプライマーを伸長させる。反応混合液の温度を上昇および下降させることによって、伸長したプライマーは、標的から解離して反応生成物を形成し、過剰のプライマーは標的および反応生成物に結合し、そしてこのプロセスが反復される。好ましくは、逆転写およびＰＣＲＴＭ増幅手順が、増幅されたｍＲＮＡの量を定量するために実行され得る。ポリメラーゼ連鎖反応方法論は、当該分野で周知である。
【０１３４】
多くの他の鋳型依存性プロセスのいずれか（この多くは、ＰＣＲＴＭ増幅技術のバリエーションである）は、当該分野で容易に知られており、利用可能である。例示として、いくつかのこのような方法としては、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲといわれる）（例えば、欧州特許出願公開番号３２０，３０８号、および米国特許第４，８８３，７５０号において記載される）；Ｑβレプリカーゼ（ＰＣＴ国際特許出願公開番号ＰＣＴ／ＵＳ８７／００８８０に記載される）；鎖置換増幅（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ）および修復鎖反応（Ｒｅｐａｉｒ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＲＣＲ）が挙げられる。なお他の増幅法は、英国特許出願番号２  ２０２  ３２８号およびＰＣＴ国際特許出願公開番号ＰＣＴ／ＵＳ８９／０１０２５において記載される。他の核酸増幅手順には、転写に基づく増幅系（ＴＡＳ）（ＰＣＴ国際特許出願公開番号ＷＯ  ８８／１０３１５）が挙げられ、これには、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）および３ＳＲが含まれる。欧州特許出願公開番号３２９，８２２は、一本鎖ＲＮＡ（「ｓｓＲＮＡ」）、ｓｓＤＮＡ、および二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）をサイクル的に合成する工程を包含する核酸増殖プロセスを記載する。ＰＣＴ国際特許出願公開番号ＷＯ  ８９／０６７００は、プロモーター／プライマー配列の標的一本鎖ＤＮＡ（「ｓｓＤＮＡ」）へのハイブリダイゼーションに基づく核酸配列増幅スキーム、引き続くこの配列の多くのＲＮＡコピーの転写を記載する。「ＲＡＣＥ」（Ｆｒｏｈｍａｎ、１９９０）および「片側（ｏｎｅ−ｓｉｄｅｄ）ＰＣＲ」（Ｏｈａｒａ、１９８９）のような他の増幅方法はまた、当業者に周知である。
【０１３５】
本発明のポリヌクレオチドの増幅した部分を使用して、適切なライブラリー（例えば、腫瘍ｃＤＮＡライブラリー）から周知の技術を使用して全長遺伝子を単離し得る。このような技術において、増幅に適した１以上のポリヌクレオチドプローブまたはプライマーを使用して、ライブラリー（ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリー）をスクリーニングする。好ましくは、ライブラリーはより大きな分子を含むようにサイズが選択される。無作為に準備されたライブラリー（ｒａｎｄｏｍ  ｐｒｉｍｅｄ  ｌｉｂｒａｒｙ）もまた、遺伝子の５’領域および上流領域の同定のために好ましくあり得る。ゲノムライブラリーは、イントロンを入手することおよび５’配列を伸長させることについて好ましい。
【０１３６】
ハイブリダイゼーション技術に関して、部分配列は、周知の技術を使用して標識（例えば、ニックトランスレーションまたは３２Ｐでの末端標識）され得る。次いで、細菌ライブラリーまたはバクテリオファージライブラリーは、一般に、標識プローブと、変性した細菌コロニー（またはファージプラークを含む菌叢）を含むフィルターとをハイブリダイズすることによってスクリーニングされる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９を参照のこと）。ハイブリダイズするコロニーまたはプラークを選択し、そして増殖させる。そしてそのＤＮＡをさらなる分析のために単離する。ｃＤＮＡクローンを、付加配列の量を決定するために、例えば、部分配列由来のプライマーおよびそのベクター由来のプライマーを使用するＰＣＲによって分析し得る。制限地図および部分配列を作成して、１以上の重複クローンを同定し得る。次いで、標準的な技術（これは、一連の欠失クローンを作製することを包含し得る）を使用して完全配列を決定し得る。次いで、得られた重複配列を１つの連続配列中に構築し得る。周知の技術を使用して、適切なフラグメントに連結することにより全長ｃＤＮＡ分子を生成し得る。
【０１３７】
あるいは、上記のような増幅技術は、部分的なｃＤＮＡ配列から全長コード配列を得るために有用であり得る。このような増幅技術の１つは、インバースＰＣＲである（Ｔｒｉｇｌｉａら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：８１８６，１９８８を参照のこと）。この技術は、制限酵素を使用して、その遺伝子の既知の領域内のフラグメントを生成する。次いで、このフラグメントを分子内連結により環状化し、そして既知の領域に由来する多岐したプライマーを用いたＰＣＲのための鋳型として使用する。代替のアプローチにおいて、部分配列に隣接した配列を、リンカー配列に対するプライマーおよび既知の領域に特異的なプライマーを使用する増幅により取り出し得る。この増幅した配列を、代表的に、同じリンカープライマーおよび既知の領域に特異的な第２のプライマーを使用する２回目の増幅に供する。既知の配列から反対方向に伸長を開始する２つのプライマーを使用する、この手順についての改変は、ＷＯ  ９６／３８５９１に記載される。そのような別の技術は、「迅速なｃＤＮＡ末端の増幅」またはＲＡＣＥとして公知である。この技術は、公知配列の５’および３’である配列を同定するために、内側プライマーおよび外側プライマー（これらは、ポリＡ領域またはベクター配列にハイブリダイズする）の使用を含む。さらなる技術としては、キャプチャーＰＣＲ（Ｌａｎｇｅｒｓｔｒｏｍら，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌｉｃ．１：１１１−１９，１９９１）およびウォーキングＰＣＲ（Ｐａｒｋｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９：３０５５−６０，１９９１）が挙げられる。増幅を利用する他の方法もまた使用して、全長ｃＤＮＡ配列を入手し得る。
【０１３８】
特定の場合において、発現配列タグ（ＥＳＴ）データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋより入手可能のもの）に提供される配列の分析により、全長ｃＤＮＡ配列を入手することが可能である。重複ＥＳＴの検索は、一般に、周知のプログラム（例えば、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ検索）を使用して行われ得、そしてこのようなＥＳＴを使用して連続した全長配列を生成し得る。全長ＤＮＡ配列はまた、ゲノムフラグメントの分析により入手され得る。
【０１３９】
本発明の他の実施形態において、本発明のポリペプチドまたはその融合タンパク質もしくは機能的等価物をコードするポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントは、適切な宿主細胞におけるポリペプチドの発現に方向付けるように組換えＤＮＡ分子において使用され得る。遺伝コードの固有の縮重に起因して、実質的に同じか、または機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列が産生され得、そしてこれらの配列を使用して所定のポリペプチドをクローン化し、そして発現させ得る。
【０１４０】
当業者によって理解されるように、いくつかの場合において、天然に存在しないコドンを所有するポリペプチドコードヌクレオチド配列を作製することが有利であり得る。例えば、特定の原核生物宿主または真核生物宿主に好まれるコドンは、タンパク質発現の速度を増加させるためか、または所望の特性（例えば、天然に存在する配列から生成される転写物の半減期よりも長い半減期）を有する組換えＲＮＡ転写物を産生するように選択され得る。
【０１４１】
さらに、本発明のポリヌクレオチド配列は、種々の理由（遺伝子産物のクローニング、プロセシング、および／または発現を変更する改変が挙げられるが、それらに限定されない）のためにポリペプチドコード配列を変更するために、当該分野において一般的に公知の方法を使用して操作され得る。例えば、無作為フラグメント化によるＤＮＡシャッフリングならびに遺伝子フラグメントおよび合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再アセンブリを使用して、ヌクレオチド配列を操作するために使用し得る。さらに、部位指向性変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を使用して、新たな制限部位を挿入し得るか、グリコシル化パターンを改変し得るか、コドン優先（ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）を変化させ得るか、スプライス改変体を作製し得るか、または変異を導入したりなどし得る。
【０１４２】
本発明の別の実施形態において、天然の核酸配列、改変された核酸配列、または組換え核酸配列は、融合タンパク質をコードする異種配列に連結され得る。例えば、ポリペプチド活性のインヒビターについてペプチドライブラリーをスクリーニングするために、市販の抗体により認識され得るキメラタンパク質をコードすることが有用であり得る。融合タンパク質はまた、ポリペプチドコード配列と異種タンパク質配列との間に位置する切断部位を含むように操作され得、その結果そのポリペプチドは、切断されて、そして異種部分から精製されて取り出される。
【０１４３】
所望のポリペプチドをコードする配列が、当該分野において周知の化学的方法を使用して、全体または部分的に合成され得る（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．ら、（１９８０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２１５〜２２３、Ｈｏｒｎ，Ｔ．ら、（１９８０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２２５〜２３２を参照のこと）。あるいは、タンパク質自体は、ポリペプチドまたはその一部のアミノ酸配列を合成するための化学的方法を使用して産生され得る。例えば、ペプチド合成は、種々の固相技術を使用して実施され得（Ｒｏｂｅｒｇｅ，Ｊ．Ｙ．ら、（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：２０２〜２０４）、そして自動化合成は、例えば、ＡＢＩ  ４３１Ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して達成され得る。
【０１４４】
新たに合成されたペプチドは、調製用高性能液体クロマトグラフィー（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｔ．（１９８３）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ、ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．）または当該分野で利用可能な他の匹敵する技法によって実質的に精製され得る。これら合成ペプチドの組成物は、アミノ酸分析または配列決定（例えば、エドマン分解手順）により確認され得る。さらに、ポリペプチド、またはその任意の部分のアミノ酸配列は、直接合成の間に改変され得るか、および／または化学的方法を用いて、他のタンパク質、またはその任意の部分からの配列と結合され、改変体ポリペプチドを生成し得る。
【０１４５】
所望のポリペプチドを発現するために、上記ポリペプチド、またはその機能的等価物をコードするヌクレオチド配列は、適切な発現ベクター、すなわち、挿入されたコード配列の転写および翻訳のために必要なエレメントを含むベクター中に挿入され得る。当業者に周知である方法を用いて、目的のポリペプチド、および適切な転写制御エレメントおよび翻訳制御エレメントをコードする配列を含む発現ベクターを構築し得る。これらの方法としては、インビトロ組換えＤＮＡ技法、合成技法、およびインビボ遺伝子組換えが挙げられる。このような技法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．ら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．，およびＡｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．ら（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．Ｎ．Ｙ．に記載されている。
【０１４６】
種々の発現ベクター／宿主系を利用して、ポリヌクレオチド配列を含め、そして発現させ得る。これらとしては、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌のような微生物；酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染された昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換された植物細胞系；または動物細胞系が挙げられるが、これらに制限されない。
【０１４７】
発現ベクター中に存在する「制御エレメント」または「調節配列」は、ベクターエンハンサー、プロモーターの翻訳されない領域、５’および３’非翻訳領域（転写および翻訳を実施するために宿主細胞タンパク質と相互作用する）のような配列である。このようなエレメントは、それらの強さおよび特異性で異なり得る。利用されるベクター系および宿主に依存して、構成性プロモーターおよび誘導性プロモーターを含む、任意の数の適切エレメントな転写および翻訳エレメントが用いられ得る。例えば、細菌系でクローニングされるとき、ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）またはｐＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）のハイブリッドｌａｃＺプロモーターなどのような誘導性プロモーターが用いられ得る。哺乳動物細胞系では、哺乳動物遺伝子から、または哺乳動物ウイルスからのプロモーターが、一般に、好適である。多コピーのポリペプチドをコードする配列を含む細胞株を生成する必要があれば、ＳＶ４０またはＥＢＶに基づくベクターが、適切な選択マーカーとともに有利に用いられ得る。
【０１４８】
細菌系では、任意の数の発現ベクターが、発現されたポリペプチドについて意図される使用に依存して選択され得る。例えば、大量に必要なとき、例えば、抗体の誘導のためには、容易に精製される融合タンパク質の高レベル発現を指向するベクターが用いられ得る。このようなベクターとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：多機能Ｅ．ｃｏｌｉクローニングおよび発現ベクター（例えばｐＢＬＵＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））、ここでは、目的のポリペプチドをコードする配列は、ベクター中に、βガラクトシダーゼのアミノ末端Ｍｅｔおよび引き続く７残基のための配列とインフレームで連結され得、その結果、ハイブリッドタンパク質が生成される；ｐＩＮベクター（Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ、Ｇ．およびＳ．Ｍ．Ｓｃｈｕｓｔｅｒ（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５５０３〜５５０９）。ｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）もまた、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現するために用いられ得る。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、そしてグルタチオン−アガロースビーズへの吸着、次いで遊離のグルタチオンの存在下の溶出により溶解した細胞から容易に精製され得る。このような系で作製されるタンパク質は、ヘパリン、トロンビン、またはＸＡ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され、その結果、クローン化された目的のポリペプチドが、随意にＧＳＴ部分から放出され得る。
【０１４９】
酵母、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでは、αファクター、アルコールオキシダーゼ、およびＰＧＨのような構成性または誘導性プロモーターを含む多くのベクターが用いられ得る。総説には、Ａｕｓｕｂｅｌら（前述）およびＧｒａｎｔら、（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６〜５４４を参照のこと。
【０１５０】
植物発現ベクターが用いられる事例では、ポリペプチドをコードする配列の発現は、任意の多くのプロモーターにより駆動され得る。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓおよび１９Ｓプロモーターのようなウイルスプロモーターが、単独またはＴＭＶからのオメガリーダー配列と組み合わせて用いられ得る（Ｔａｋａｍａｔｓｕ、Ｎ．（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：３０７〜３１１）。あるいは、ＲＵＢＩＳＣＯの小サプユニットまたは熱ショックプロモーターのような植物プロモーターが用いられ得る（Ｃｏｒｕｚｚｉ、Ｇ．ら、（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：１６７１〜１６８０；Ｂｒｏｇｌｉｅ、Ｒ．ら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４：８３８〜８４３；およびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．ら（１９９１）Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ  Ｄｉｉｆｅｒ．１７：８５〜１０５）。これらの構築物は、直接的ＤＮＡ形質転換または病原体媒介トランスフェクションにより植物細胞中に導入され得る。このような手順は、多くの一般的に入手可能な総説に記載されている（例えば、Ｈｏｂｂｓ、Ｓ．またはＭｕｒｒｙ、Ｌ．Ｅ．  ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ  Ｙｅａｒｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｇｙ（１９９２）ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．；１９１〜１９６頁を参照のこと）。
【０１５１】
昆虫系がまた、目的のポリペプチドを発現するために用いられ得る。例えば、１つのこのような系では、オートグラファカリフォルニア核多角体病ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）（ＡｃＮＰＶ）が、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞中またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｌａｖａｅ中で外来遺伝子を発現するためのベクターとして用いられる。ポリペプチドをコードする配列は、ポリヘドリン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）遺伝子のような、ウイルスの必須でない領域中にクローン化され得、そしてポリヘドリンプロモーターの制御下に配置される。ポリペプチドをコードする配列の成功した挿入は、ポリヘドリン遺伝子を不活性にし、そしてコートタンパク質を欠く組換えウイルスを生成する。この組換えウイルスは、次いで、例えば、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｌａｒｖａｅを感染させるために用いられ得、そこで、目的のポリペプチドが発現され得る（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ、Ｅ．Ｋ．ら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：３２２４〜３２２７）。
【０１５２】
哺乳動物宿主細胞では、多くのウイルスを基礎にする発現ベクターが一般に利用可能である。例えば、アデノウイルスが発現ベクターとして用いられるとき、目的のポリペプチドをコードする配列は、後期プロモーターと３部からなるリーダー配列とからなるアデノウイルス転写／翻訳複合体中に連結され得る。このウイルスのゲノムの必須でないＥ１またはＥ３領域における挿入は、感染された宿主細胞においてこのポリペプチドを発現し得る生存ウイルスを得るために用いられ得る（Ｌｏｇａｎ、Ｊ．およびＳｈｅｎｋ、Ｔ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：３６５５〜３６５９）。さらに、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーのような、転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞中の発現を増大し得る。
【０１５３】
特定の開始シグナルもまた、目的のポリペプチドをコードする配列のより効率的な翻訳を達成するために用いられ得る。このようなシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含む。ポリペフチドをコードする配列、その開始コドン、および上流配列が、適切な発現ベクター中に挿入されている場合、さらなる転写制御シグナルまたは翻訳制御シグナルは必要とされなくてもよい。しかし、コード配列、またはその一部分のみが挿入されている場合には、ＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルを提供すべきである。さらに、開始コドンは、完全な挿入物の翻訳を確実にするために正確な読み取りフレームであるべきである。外因性翻訳エレメントおよび開始コドンは、天然および合成の両方である種々の起源からであり得る。発現の効率は、文献（Ｓｃｈａｒｆ、Ｄ．ら、（１９９４）Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１２５〜１６２）に記載されているような、使用される特定の細胞系に適切であるエンハンサーの封入により増大され得る。
【０１５４】
さらに、宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調整するその能力、または所望の様式で発現されたタンパク質をプロセッシングするその能力について選択され得る。ポリペプチドのこのような改変としては、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、リピド化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）、およびアシル化が挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質の「プレプロ」形態を切断する翻訳後プロセッシングもまた、正確な挿入、折り畳みおよび／または機能を促進するために用いられ得る。このような翻訳後活性のための特定の細胞機構（ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）および特徴的機構（ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）をもつ、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、およびＷＩ３８のような異なる宿主細胞が、外来タンパク質の正確な改変およびプロセッシングを確実にするために選択され得る。
【０１５５】
一般に、組換えタンパク質の長期間の高収率生産には、安定な発現が好ましい。例えば、目的のポリヌクレオチドを安定に発現する細胞株は、ウイルスの複製起点および／または内因性発現エレメントおよび選択マーカー遺伝子を、同一または別個のベクター上に含み得る発現ベクターを用いて形質転換され得る。ベクターの導入の後、細胞を、富化培地中で１〜２日間増殖させ得、その後、それらを選択培地に切り替える。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を付与することであり、そしてその存在は、導入された配列を首尾よく発現する細胞の増殖と回収を可能にする。安定に形質転換された細胞の耐性クローンは、細胞型に適切な組織培養技法を用いて増殖され得る。
【０１５６】
任意の数の選択系を用いて、形質転換された細胞株を回収し得る。これらとしては、ｔｋ．ｓｕｐ．細胞またはａｐｒｔ．ｓｕｐ．細胞中でそれぞれ使用され得る、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ、Ｍ．ら、（１９７７）Ｃｅｌｌ  １１：２２３〜３２）遺伝子およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ、Ｉ．ら（１９９０）Ｃｅｌｌ  ２２：８１７〜２３）遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。また、代謝拮抗物質、抗生物質または除草剤耐性が、選択の基礎として用いられ得る；例えば、メトトレキセートに対する耐性を与えるｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ、Ｍ．ら（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７：３５６７〜７０）；アミノグリコシド、ネオマイシンおよびＧ−４１８に対する耐性を与えるｎｐｔ（Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ、Ｆ．ら（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１〜１４）；およびクロロスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼにそれぞれ耐性を与えるａｌｓまたはｐａｔ（Ｍｕｒｒｙ、前述）。さらなる選択遺伝子が記載されており、例えば、細胞が、トリプトファンの代わりに、インドールを利用することを可能にするｔｒｐＢ、または、細胞が、ヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にするｈｉｓＤ（Ｈａｒｔｍａｎ、Ｓ．Ｃ．およびＲ．Ｃ．Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：８０４７〜５１）がある。このようなマーカーには、アントシアニン、β−グルクロニダーゼとその基質ＧＵＳ、およびルシフェラーゼとその基質ルシフェリンを用いる、目視できるマーカーの使用が人気を得ており、形質転換体を同定するためのみならず、特定のベクター系に帰し得る一時的または安定なタンパク質発現の量を定量するために広範に用いられている（Ｒｈｏｄｅｓ、Ｃ．Ａ．ら、（１９９５）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５：１２１〜１３１）。
【０１５７】
マーカー遺伝子発現の存在／不在は、目的の遺伝子がまた存在していることを示唆するが、その存在および発現は確認される必要があり得る。例えば、ポリペプチドをコードする配列がマーカー遺伝子配列内に挿入されている場合、配列を含む組換え細胞は、マーカー遺伝子機能の不在により同定され得る。あるいは、マーカー遺伝子は、単一プロモーターの制御下で、ポリペプチドコード配列とタンデムに配置され得る。誘導または選択に応答するマーカー遺伝子の発現は、通常、同様に、タンデム遺伝子の発現を示す。
【０１５８】
あるいは、所望のポリヌクレオチド配列を含みかつ発現する宿主細胞は、当業者に公知である種々の手順により同定され得る。このような手順としては、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡのハイブリダイゼーションおよびタンパク質バイオアッセイまたはイムノアッセイ技術（これらは、例えば、核酸またはタンパク質の検出および／または定量のための、膜、溶液、またはチップを基礎にした技法を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５９】
ポリヌクレオチドでコードされた産物に特異的であるポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを用いる、ポリヌクレオチドでコードされた産物の発現を検出および測定するための種々のプロトコルは、当該分野で公知である。例としては、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）が挙げられる。所定のポリペプチド上の２つの非干渉エピトープに反応性のモノクローナル抗体を利用する、２部位のモノクローナルを基礎にしたイムノアッセイがいくつかの適用には好適であり得るが、競争的結合アッセイもまた使用され得る。これらおよびその他のアッセイは、とりわけ、Ｈａｍｐｔｏｎ、Ｒ．ら、（１９９０；Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ＡＰＳ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓｔ  Ｐａｕｌ．Ｍｉｎｎ．）およびＭａｄｄｏｘ、Ｄ．Ｅ．ら、（１９８３；Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８：１２１１〜１２１６）に記載されている。
【０１６０】
広範な種類の標識および結合技法が当業者に公知であり、そして種々の核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイで用いられ得る。ポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための標識されたハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲプローブを生成する手段としては、標識されたヌクレオチドを用いる、オリゴラベリング（ｏｌｉｇｏｌａｂｅｌｉｎｇ）、ニックトランスレーション、末端標識またはＰＣＲ増幅が挙げられる。あるいは、これら配列、またはその任意の部分は、ｍＲＮＡプローブの産生のためにベクター中にクローニングされ得る。このようなベクターは、当該分野で公知であり、市販されており、そしてＴ７、Ｔ３、またはＳＰ６のような適切なＲＮＡポリメラーゼおよび標識されたヌクレオチドの添加によって、インビトロでＲＮＡプローブを合成するために用いられ得る。これらの手順は、種々の市販のキットを用いて実施され得る。用いられ得る適切なレポーター分子または標識としては、放射線核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、または発色試薬および基質、コファクター、インヒビター、磁気粒子などが挙げられる。
【０１６１】
目的のポリヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培養からタンパク質の発現および回収に適切な条件下で培養され得る。組換え細胞によって産生されたタンパク質は、用いた配列および／またはベクターに依存して細胞内に分泌され得るか、または含まれ得る。当業者によって理解されるように、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核生物または真核生物細胞の膜を通ってコードされたポリペプチドの分泌を指向するシグナル配列を含むように設計され得る。その他の組換え構築物を用い、可溶性タンパク質の精製を容易にするポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に、目的のポリペプチドをコードする配列を接続させ得る。このような精製を容易にするドメインとしては、固定化金属上での精製を可能にする金属キレート化ペプチド（例えば、ヒスチジン−トリプトファンモジュール）、固定化免疫グロブリン上の精製を可能にするプロテインＡドメイン、およびＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティー精製システム（Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｅａｔｔｌｅ、Ｗａｓｈ．）で利用されるドメインが挙げられるが、これらに限定されない。精製ドメインとコードされたポリペプチドとの間に、ＸＡ因子またはエンテロキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）に特異的な配列のような切断可能なリンカー配列を含めて、精製を促進し得る。１つのこのような発現ベクターは、目的のポリペプチドと、チオレドキシンに先行する６つのヒスチジン残基またはエンテロキナーゼ切断部位をコードする核酸を含む融合タンパク質の発現を提供する。このヒスチジン残基は、Ｐｏｒａｔｈ、Ｊ．ら、（１９９２、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ．３：２６３〜２８１）に記載のように、ＩＭＩＡＣ（固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー）上の精製を促進し、その一方、エンテロキナーゼ切断部位は、融合タンパク質から所望のポリペプチドを精製するための手段を提供する。融合タンパク質を含むベクターの論議は、Ｋｒｏｌｌ、Ｄ．Ｊ．ら、（１９９３；ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２：４４１〜４５３）に提供されている。
【０１６２】
組換え産生方法に加え、本発明のポリペプチド、およびそのフラグメントは、固相技法（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  Ｊ．（１９６３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９〜２１５４）を用いて直接的ペプチド合成により生成され得る。タンパク質合成は、手動技法を用いるか、または自動化により実施され得る。自動化合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３１Ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて達成され得る。あるいは、種々のフラグメントを別個に化学的に合成し得、そして化学的方法を用いて結合し得、完全長分子を生成する。
【０１６３】
（抗体組成物、そのフラグメントおよびその他の結合因子）
別の局面によれば、本発明は、本明細書に開示された腫瘍ポリペプチドに、またはその部分、改変体もしくは誘導体に対して免疫学的結合を示す、抗体およびその抗原結合性フラグメントのような結合因子をさらに提供する。抗体、またはその抗原結合性フラグメントは、それが、本発明のポリペプチドと（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ内で）検出可能なレベルで反応し、そして類似の条件下で非関連ポリペプチドと検出可能に反応しない場合、本発明のポリペプチドと「特異的に結合」、「免疫学的に結合」するといわれるか、および／またはそれに「免疫学的に反応性」であるといわれる。
【０１６４】
免疫学的結合は、この文脈で用いられるとき、一般に、免疫グロブリン分子と、この免疫グロブリン分子が特異的である抗原との間に生じるタイプの非共有結合的相互作用をいう。この免疫学的結合相互作用の強さ、または親和性は、この相互作用の解離定数（Ｋｄ）に関連して表現され得、ここで、より小さなＫｄはより大きな親和性を表す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合性質は、当該分野で周知の方法を用いて定量され得る。１つのこのような方法は、抗原結合部位／抗原複合体形成および解離の速度を測定することをともない、ここで、これらの速度は、複合体パートナーの濃度、この相互作用の親和性に、および両方向でこの速度に等しく影響する幾何学的パラメータに依存する。従って、「会合速度定数（ｏｎ  ｒａｔｅ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）（Ｋｏｎ）」および「解離速度定数（ｏｆｆ  ｒａｔｅ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）（Ｋｏｆｆ）」の両方が、濃度ならびに会合および解離の実際の速度の算出によって決定され得る。Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎの比は、親和性に関連しないすべてのパラメータの削除を可能にし、そしてそれ故、解離定数Ｋｄに等しい。一般に、Ｄａｖｉｅｓら、（１９９０）Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：４３９〜４７３を参照のこと。
【０１６５】
抗体の「抗原結合部位」または「結合部分」は、抗原結合に関係する免疫グロブリン分子の部分をいう。この抗原結合部位は、重鎖（「Ｈ」）および軽鎖（「Ｌ」）のＮ−末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。重鎖および軽鎖のＶ領域内の３つの高度に分岐したストレッチは、「超可変領域」と呼ばれ、これは、「フレームワーク領域」または「ＲＦ」として知られる、より保存的な隣接ストレッチの間に配置されている。従って、用語「ＦＲ」は、免疫グロブリン中の超可変領域の間で、そしてそれに隣接して天然に見出されるアミノ酸配列をいう。抗体分子中に、軽鎖の３つの超可変領域、および重鎖の３つの超可変領域が、三次元空間に互いに関連して配置され、抗原結合性表面を形成する。この抗原結合性表面は、結合した抗原の三次元表面に相補的であり、そして重鎖および軽鎖の各々の３つの超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」といわれる。
【０１６６】
結合因子は、本明細書中に提供される代表的なアッセイを用いて、乳癌のような癌をもつか、または癌をもたない患者間をさらに区別し得る。例えば、腫瘍タンパク質に結合する抗体またはその他の結合因子は、好ましくは、疾患をもつ患者の少なくとも約２０％、より好ましくは患者の少なくとも約３０％における癌の存在を示すシグナルを生成する。あるいは、またはさらに、この抗体は、癌をもたない個体の少なくとも約９０％におけるこの疾患の不在を示すネガティブシグナルを生成する。結合因子がこの条件を満たすか否かを決定するために、癌（標準的な臨床試験を使用して決定されるような）をもつ患者、および癌をもたない患者からの生物学的サンプル（例えば、血液、血清、唾液、尿および／または腫瘍生検試料）が、この結合因子に結合するポリペプチドの存在について、本明細書に記載のようにアッセイされ得る。好ましくは、この疾患をもつサンプル、およびこの疾患をもたないサンプルの統計学的に有意な数がアッセイされる。各結合因子は、上記の基準を満たすべきである；しかし、当業者は、感度を改善するために、結合因子が組み合せて用いられ得ることを認識する。
【０１６７】
上記の要求を満足するどの試薬も、結合因子であり得る。例えば、結合因子は、ペプチド成分を含むか含まないリボソーム、ＲＮＡ分子またはポリペプチドであり得る。好適な実施形態では、結合因子は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。抗体は、当業者に公知の種々の技法のいずれかによって調製され得る。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８を参照のこと。一般に、抗体は、細胞培養技術（本明細書に記載されるようなモノクローナル抗体の生成を含む）によってか、または組換え抗体の産生を許容するために、適切な細菌または哺乳動物の細胞宿主中への抗体遺伝子のトランスフェクションを経由して産生され得る。１つの技法では、ポリペプチドを含む免疫原が、最初に、広範な種類の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジまたはヤギ）のいずれかに注射される。このステップでは、本発明のポリペプチドは、改変なくして免疫原として機能し得る。あるいは、特に比較的短いポリペプチドについて、優れた免疫応答が、このポリペプチドが、ウシ血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニンのようなキャリアタンパク質に結合される場合に惹起され得る。免疫原は、動物宿主中に、好ましくは、１つ以上の追加免疫化を取り込む所定のスケジュールに従って注射され、そしてこれら動物は、定期的に採血される。ポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体が、次いで、例えば、適切な固体支持体にカップリングされたポリペプチドを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより、このような抗血清から精製され得る。
【０１６８】
目的の抗原性ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体は、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１〜５１９、１９７６の技法、ならびにそれに対する改良法を用いて調製され得る。簡単に述べれば、これらの方法は、所望の特異性（すなわち、目的のポリペプチドとの反応性）を有する抗体を生成し得る不死化細胞株の調製を含む。このような細胞株は、例えば、上記のように免疫化した動物から得られた脾臓細胞から生成され得る。次いで、この脾臓細胞を、例えば、好ましくは、免疫化された動物と同系であるミエローマ融合パートナーとの融合により不死化する。種々の融合技法が使用され得る。例えば、脾臓細胞および骨髄腫細胞を、数分間、非イオン性界面活性剤と組み合わせ得、そして次に、ハイブリッド細胞の増殖を支持するが、骨髄腫細胞の増殖は支持しない選択培地上に低密度でプレート塗沫する。好適な選択技法は、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択を用いる。十分な時間の後（通常、１〜２週間）、ハイブリッドのコロニーが観察される。単一コロニーを選択し、そしてそれらの培養上清液をポリペプチドに対する結合活性について試験する。高い反応性および特異性を有するハイブリドーマが好適である。
【０１６９】
モノクローナル抗体は、増殖しているハイブリドーマコロニーの上清から単離され得る。さらに、種々の技術が、収量を増加させるために使用され得、この技術は、例えば、適切な脊椎動物宿主（例えば、マウス）の腹腔へのハイブリドーマ細胞株の注入である。次いで、モノクローナル抗体が、腹水または血液から回収され得る。混入物が、従来の技術（例えば、クロマトグラフィー、ゲル濾過、沈澱、および抽出）によって抗体から除去され得る。本発明のポリペプチドは、例えば、アフィニティートクロマトグラフィー工程における精製プロセスにおいて使用され得る。
【０１７０】
抗体分子の免疫学的結合特性を示し得る抗原結合部位を含む多くの治療的に有効な分子が、当該分野で公知である。このタンパク質分解性酵素パパインは、優先的に、ＩｇＧ分子を切断して、いくつかのフラグメントを生じさせ、これら（「Ｆ（ａｂ）フラグメント」）のうちの２つの各々は、インタクトな抗原結合部位を含む共有結合ヘテロダイマーを含む。酵素ペプシンは、ＩｇＧ分子を切断して、いくつかのフラグメント（両方の抗原結合部位を含む「Ｆ（ａｂ’）２」フラグメントを含む）を提供し得る。「Ｆｖ」フラグメントは、ＩｇＭ、および稀有な場合にはＩｇＧまたはＩｇＡ免疫グロブリン分子の優先的なタンパク質分解的切断によって生成され得る。しかし、Ｆｖフラグメントは、当該分野で公知の組換え技術を使用して、より一般的に誘導される。Ｆｖフラグメントは、非共有結合的なＶＨ：：ＶＬヘテロダイマーを含み、このヘテロダイマーは、ネイティブな抗体分子の抗原認識および結合能力のほとんどを保持する抗原結合部位を含む。Ｉｎｂａｒら（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９：２６５９−２６６２；Ｈｏｃｈｍａｎら（１９７６）Ｂｉｏｃｈｅｍ  １５：２７０６−２７１０；およびＥｈｒｌｉｃｈら（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９：４０９１−４０９６。
【０１７１】
単鎖Ｆｖ（「ｓＦｖ」）ポリペプチドは、共有結合されたＶＨ：：ＶＬヘテロダイマーであり、このヘテロダイマーは、ペプチドをコードするリンカーによって連結されたＶＨをコードする遺伝子およびＶＬをコードする遺伝子を含む遺伝子融合物から発現される。Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５（１６）：５８７９−５８８３。抗体Ｖ領域からの天然に凝集する（化学的には分離された）ポリペプチド軽鎖および重鎖を、ｓＦｖ分子に転換するための化学構造を識別するための多くの方法が記述され、このｓＦｖは、抗原結合部位の構造に実質的に類似する３次元構造に折り畳まれる。例えば、米国特許第５，０９１，５１３号および同第５，１３２，４０５号（Ｈｕｓｔｏｎら）；ならびに米国特許第４，９４６，７７８号（Ｌａｄｎｅｒら）を参照のこと。
【０１７２】
上記分子の各々は、重鎖および軽鎖ＣＤＲセットを含み、各々は、ＣＤＲＳへの支持を提供し、そして互い対してＣＤＲの空間的関係を規定する重鎖および軽鎖ＦＲセットの間に挿入される。本明細書中で使用される場合、用語「ＣＤＲセット」は、重鎖または軽鎖Ｖ領域の３つの超可変領域をいう。重鎖または軽鎖のＮ末端から進んで、これらの領域は、各々、「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」および「ＣＤＲ３」と表記される。従って、抗原結合部位は、６つのＣＤＲを含み、この６つのＣＤＲは、重鎖および軽鎖Ｖ領域の各々からのＣＤＲセットを含む。単一ＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３）を含むポリペプチドは、本明細書中で「分子認識ユニット」といわれる。多くの抗原−抗体複合体の結晶学的分析により、ＣＤＲのアミノ酸残基は、結合した抗原との広範な接触を形成することが立証され、ここで、最も広範な接触は、重鎖ＣＤＲ３とである。従って、分子認識ユニットは、主に、抗原結合部位の特異性の原因である。
【０１７３】
本明細書中で使用される場合、用語「ＦＲセット」は、重鎖または軽鎖のＶ領域のＣＤＲセットのＣＤＲを構成する、４つの隣接アミノ酸配列をいう。いくつかのＦＲ残基は、結合抗原と接触し得る；しかし、ＦＲは、主に、Ｖ領域を抗原結合部位、特にＣＤＲＳに直接隣接するＦＲ残基に折り畳む原因である。ＦＲにおいて、特定のアミノ酸残基および特定の構造特徴が、非常に高度に保存される。この点において、全てのＶ領域配列は、約９０アミノ酸残基の内部ジスルフィドループを含む。Ｖ領域が、結合部位に折り畳まれる場合、このＣＤＲは、抗原結合表面を形成する突出したループモチーフとして表示される。正確なＣＤＲアミノ酸配列に関わらず、特定の「正準」構造に折り畳まれたＣＤＲループの形状に影響するＦＲの保存された構造領域が存在することが一般的に認識される。さらに、特定のＦＲ残基は、抗体重鎖および軽鎖の相互作用を安定化する非共有結合的なドメイン間接触に関係することが知られている。
【０１７４】
非ヒト免疫ブログリン由来の抗原結合部位を含む、多くの「ヒト化」抗体分子が記載され、この抗体分子には、げっ歯類Ｖ領域およびヒト定常領域に融合されたそれらの会合ＣＤＲ（Ｗｉｎｔｅｒら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３−２９９；Ｌｏｂｕｇｌｉｏら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：４２２０−４２２４；Ｓｈａｗら（１９８７）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：４５３４−４５３８；およびＢｒｏｗｎら（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：３５７７−３５８３）、適切なヒト抗体定常ドメインとの融合の前に、ヒト支持ＦＲにグラフトされたげっ歯類ＣＤＲ（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６；およびＪｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５）、ならびに組換えベニアリングされた（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌｙ  ｖｅｎｅｅｒｅｄ）げっ歯類ＦＲによって支持されるげっ歯類ＣＤＲ（欧州特許公開番号５１９，５９６（１９９２年１２月２３日公開）を含むキメラ抗体が挙げられる。これらの「ヒト化」分子は、ヒトレシピエントにおけるこれらの部分の治療的適用の持続期間および有効性を制限するげっ歯類抗ヒト抗体分子に対する所望されない免疫学的応答を最小化するように設計される。
【０１７５】
本明細書中で使用される場合、用語「ベニアリングされたＦＲ」および「組換えベニアリングされたＦＲ」は、ネイティブのＦＲポリペプチド折り畳み構造の実質的に全てを保持する抗原結合部位を含む異種分子を提供するために、例えば、げっ歯類重鎖または軽鎖のＶ領域からのＦＲ残基のヒトＦＲ残基での選択的置換をいう。ベニアリング技術は、抗原結合部位のリガンド結合特徴が、主に抗原結合表面内の重鎖および軽鎖のＣＤＲセットの構造および相対的な配置によって決定されるという理解に基づく。Ｄａｖｉｅｓら（１９９０）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：４３９−４７３。従って、抗原結合特異性は、ＣＤＲ構造、互いとのそれらの相互作用、およびＶ領域ドメインの残りとのそれらの相互作用が注意深く維持されるヒト化抗体のみにおいて保存され得る。ベニアリング技術を使用することによって、外部（例えば、溶媒がアクセス可能な）ＦＲ残基（これは、免疫系に容易に遭遇する）は、ヒト残基と選択的に置換されて、弱い免疫原性ベニアリング表面または実質的に非免疫原性のベニアリング表面のいずれかを含むハイブリッド分子を提供する。
【０１７６】
ベニアリングのプロセスは、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  第４版（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｏｆｆｉｃｅ，１９８７）において、Ｋａｂａｔらによって編集されたヒト抗体可変ドメインについての利用可能な配列データを使用し、Ｋａｂａｔデータベースに更新され、そして他の米国および海外のアクセス可能なデータベース（核酸およびタンパク質の両方）を使用する。Ｖ領域アミノ酸の溶媒アクセス可能性は、ヒトおよびマウス抗体フラグメントについての既知の３次元構造から推定され得る。マウス抗原結合部位をベニアリングする際に２つの一般的な工程が存在する。最初に、目的の抗体分子の可変ドメインのＦＲが、上記の供給源から得られたヒト可変ドメインの対応するＦＲ配列と比較される。次いで、最も相同的なヒトＶ領域が、対応するマウスアミノ酸と、残基ごとに比較される。ヒト対応物とは異なるマウスＦＲにおける残基は、当該分野において周知の組換え技術を使用して、ヒト部分に存在する残基によって置換される。残基スイッチングは、少なくとも部分的に露出した（溶媒アクセス可能である）部分を用いて実施されるのみであり、そしてＶ領域ドメインの三次構造に対する有意な効果を有し得るアミノ酸残基（例えば、プロリン、グリシンおよび荷電したアミノ酸）の置換において、注意がなされる。
【０１７７】
この様式において、得られた「ベニアリングされた」マウス抗原結合部位は、従って、マウスＣＤＲ残基、ＣＤＲに実質的に隣接する残基、埋没したかほとんど埋没した（溶媒のアクセスが不可能）として同定された残基、重鎖ドメインおよび軽鎖ドメインとの間の非共有結合的な（例えば、静電的および疎水的）接触に関係すると考えられる残基、およびＣＤＲループの「正準」三次構造に影響を与えると考えられるＦＲの保存された構造領域からの残基を保持するように設計される。次いで、これらの設計基準は、ヒト様ＦＲへのマウス抗原結合部位の軽鎖および重鎖の両方のＣＤＲを組合せる組換えヌクレオチド配列を調製するために使用され、このヒト様ＦＲは、マウス抗体分子の抗原特異性を示す組換えヒト抗体の発現のために哺乳動物細胞をトランスフェクトするために使用され得る。
【０１７８】
本発明の別の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、１つ以上の治療剤に結合され得る。この点に関して、適切な薬剤としては、放射性核種、分化インデューサー、薬物、毒素、およびそれの誘導体が挙げられる。好ましい放射性核種としては、９０Ｙ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔおよび２１２Ｂｉが挙げられる。好ましい薬物としては、メトトレキサート、ならびにピリミジンおよびプリンアナログが挙げられる。好ましい分化インデューサーとしては、ホルボールエステルおよび酪酸が挙げられる。好ましい毒素としては、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素、Ｓｈｉｇｅｌｌａ毒素、およびアメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質が挙げられる。
【０１７９】
治療剤は、適切なモノクローナル抗体に直接的または間接的に（例えば、リンカー基を介して）に結合（例えば、共有結合）され得る。薬剤と抗体との間の直接的な反応は、各々が他のものと反応し得る置換基を有する場合に可能である。例えば、一方の上の求核基（例えば、アミノ基またはスルフヒドリル基）は、他方のカルボニル含有基（例えば、酸無水物または酸ハロゲン化物）または良好な脱離基（例えば、ハロゲン化物）を含むアルキル基と反応し得る。
【０１８０】
あるいは、リンカー基を介して治療剤と抗体とを結合させることが所望され得る。リンカー基は、結合の可能性を妨げることを回避するために、抗体を薬剤から隔てるためのスペーサーとして機能し得る。リンカー基はまた、薬剤または抗体上の置換基の化学的反応性を増加させるためにはたらき得、従って結合効率を増大させる。化学的反応性の増大はまた、薬剤または薬剤上の官能基の使用を促進し得る（さもなければ、可能ではない）。
【０１８１】
種々の二官能性試薬または多官能性試薬（ホモ官能性とヘテロ官能性との両方（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬのカタログ中に記載されるもの））が、リンカー基として使用され得ることが当業者には明らかである。結合は、例えば、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、または酸化された炭水化物残基を介してもたらされ得る。このような方法論を記載する多数の参考文献（例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌらに対する米国特許第４，６７１，９５８号）が存在する。
【０１８２】
本発明の免疫結合体の抗体部分がないときに治療剤がより強力である場合、細胞中へのインターナリゼーションの間に、またはその際に切断可能なリンカー基を使用することが望ましくあり得る。多数の異なる切断可能なリンカー基が記載されている。これらのリンカー基からの薬剤の細胞内放出についての機構は、ジスルフィド結合の還元（例えば、Ｓｐｉｔｌｅｒへの米国特許第４，４８９，７１０号）、感光性結合の照射（例えば、Ｓｅｎｔｅｒらへの米国特許第４，６２５，０１４号）、誘導体化されたアミノ酸側鎖の加水分解（例えば、Ｋｏｈｎらへの米国特許第４，６３８，０４５号）、血清補体媒介性加水分解（例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌらへの米国特許第４，６７１，９５８号）、および酸触媒加水分解（例えば、Ｂｌａｔｔｌｅｒらへの米国特許第４，５６９，７８９号）による切断を含む。
【０１８３】
１つより多い薬剤を抗体に結合させることが望ましくあり得る。１つの実施形態において、薬剤の複数の分子が１つの抗体分子に結合される。別の実施形態において、１つより多い型の薬剤が１つの抗体に結合され得る。特定の実施形態に関わらず、１つより多い薬剤を有する免疫結合体は、種々の方法で調製され得る。例えば、１つより多い薬剤が、抗体分子に直接的に結合され得るか、または付着のための複数の部位を提供するリンカーが使用され得る。あるいは、キャリアが使用され得る。
【０１８４】
キャリアは、種々の方法（直接的にかまたはリンカー基を介するかのいずれかの共有結合を含む）で薬剤を保有し得る。適切なキャリアとしては、アルブミンのようなタンパク質（例えば、Ｋａｔｏらへの米国特許第４，５０７，２３４号）、ペプチド、およびアミノデキストランのような多糖類（例えば、Ｓｈｉｈらへの米国特許第４，６９９，７８４号）が挙げられる。キャリアはまた、例えばリポソーム小胞内に、非共有結合によってかまたはカプセル化によって、薬剤を保有し得る（例えば、米国特許第４，４２９，００８号および同第４，８７３、０８８号）。放射性核種薬剤に特異的なキャリアは、放射性ハロゲン化低分子およびキレート化合物を含む。例えば、米国特許第４，７３５，７９２号は、代表的な放射性ハロゲン化低分子およびそれらの合成を開示する。放射性核種キレートは、金属、または金属酸化物、放射性核種を結合するためのドナー原子として窒素原子および硫黄原子を含むキレート化合物から形成され得る。例えば、Ｄａｖｉｓｏｎらへの米国特許第４，６７３，５６２号は、代表的なキレート化合物およびそれらの合成を開示する。
【０１８５】
（Ｔ細胞組成物）
別の局面において、本発明は、本明細書中に開示される腫瘍ポリペプチドに特異的なＴ細胞、または本明細書中に開示される腫瘍ポリペプチドの改変体もしくは誘導体に特異的なＴ細胞を含み得る。このような細胞は、一般的に標準的手順を使用して、インビトロまたはエキソビボで調製され得る。例えば、Ｔ細胞は、市販の細胞分離システム（例えば、ＩｓｏｌｅｘＴＭシステム（Ｎｅｘｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ；米国特許第５，２４０，８５６号；米国特許第５，２１５，９２６号；ＷＯ８９／０６２８０；ＷＯ９１／１６１１６およびＷＯ９２／０７２４３もまた参照のこと）から入手可能）を使用して、患者の骨髄、末梢血あるいは骨髄または末梢血の画分中から単離され得る。あるいは、Ｔ細胞は、関連または無関連のヒト、非ヒト動物、細胞株または培養物から誘導され得る。
【０１８６】
Ｔ細胞は、ポリペプチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび／またはそのようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を用いて刺激され得る。このような刺激は、目的のポリペプチドに特異的であるＴ細胞の生成を可能にする条件下および十分な時間、行われる。好ましくは、本発明の腫瘍ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、送達ビヒクル（例えば、ミクロスフェア）中に存在して、特定のＴ細胞の生成を容易にする。
【０１８７】
Ｔ細胞は、このＴ細胞が、特異的に増殖するか、サイトカインを分泌するか、または本発明のポリペプチドで被覆されるか、もしくはこのポリペプチドをコードする遺伝子を発現する標的細胞を殺傷する場合に、本発明のポリペプチドに特異的であるとみなされる。Ｔ細胞特異性は、種々の標準的技術のいずれかを使用して評価され得る。例えば、クロム放出アッセイまたは増殖アッセイにおいて、ネガティブコントロールと比較して、溶解および／または増殖における２倍を超える増加の刺激指標は、Ｔ細胞特異性を示す。このようなアッセイは、例えば、Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：１０６５−１０７０，１９９４に記載されるように、実行され得る。あるいは、Ｔ細胞の増殖の検出は、種々の公知の技術によって達成され得る。例えば、Ｔ細胞増殖は、ＤＮＡ合成の速度の増加を測定することによって検出され得る（例えば、トリチウム化チミジンでＴ細胞の培養物をパルス標識し、そしてＤＮＡに取り込まれたトリチウム化チミジンの量を測定することによって）。３〜７日間の腫瘍ポリペプチド（１００ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは、２００ｎｇ／ｍｌ〜２５μｇ／ｍｌ）との接触は、代表的に、Ｔ細胞の増殖において少なくとも２倍の増加を生じる。２〜３時間の上記のような接触は、標準的なサイトカインアッセイを使用して測定されるように（ここで、サイトカイン（例えば、ＴＮＦまたはＩＦＮ−γ）放出のレベルの２倍の増加が、Ｔ細胞の活性化を示す）、Ｔ細胞の活性化を生じるべきである（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（Ｇｒｅｅｎｅ  １９９８）を参照のこと）。腫瘍ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド発現ＡＰＣに応答して活性化されたＴ細胞は、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋であり得る。腫瘍ポリペプチド特異的Ｔ細胞は、標準的な技術を使用して増殖され得る。好ましい実施形態において、Ｔ細胞は、患者、関連するドナーまたは無関連のドナーに由来し、そして刺激および増殖後にその患者に投与される。
【０１８８】
治療目的で、腫瘍ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはＡＰＣに応答して増殖するＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞は、インビトロまたはインビボのいずれかで大量に増殖され得る。このようなＴ細胞のインビトロでの増殖は、種々の方法で達成され得る。例えば、Ｔ細胞は、Ｔ細胞増殖因子（例えば、インターロイキン−２）の添加を伴うか、または伴わずに、腫瘍ポリペプチド、またはこのようなポリペプチドの免疫原性部分に対応する短いペプチドに対して再曝露され得、そして／または腫瘍ポリペプチドを合成する刺激細胞に対して再曝露され得る。あるいは、腫瘍ポリペプチドの存在下で増殖する１つ以上のＴ細胞は、クローニングによって数の上で拡大され得る。細胞をクローニングするための方法は、当該分野で周知であり、そしてこれらとしては、限界希釈が挙げられる。
【０１８９】
（Ｔ細胞レセプター組成物）
Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）は、２つの異なる重鎖可変ポリペプチド鎖（Ｔ細胞レセプターα鎖およびβ鎖と称される）からなり、これらは、ジスルフィド結合によって連結されている（Ｊａｎｅｗａｙ，Ｔｒａｖｅｒｓ，Ｗａｌｐｏｒｔ．Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ．第４版、１４８−１５９、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ／Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ．１９９９）。α／βヘテロダイマーは、細胞膜において、不変ＣＤ３鎖と複合体化する。この複合体は、ＭＨＣ分子に結合した特異的抗原性ペプチドを認識する。ＴＣＲ特異性の大きな多様性は、体細胞遺伝子再編成によって、免疫グロブリン同様に生成される。β鎖遺伝子は、５０を超える可変（Ｖ）セグメント、２つの多様性（Ｄ）セグメント、１０を超える結合（Ｊ）セグメント、および２つの定常領域セグメントを含む。α鎖遺伝子は、７０を超えるＶセグメントおよび６０を超えるＪセグメントを含むがＤセグメントを含まず、そして１つのＣセグメントを含む。胸腺におけるＴ細胞発達の間、β鎖のＤ遺伝子のＪ遺伝子への再編成が生じ、その後Ｖ遺伝子セグメントがＤＪへと再編成する。この機能的ＶＤＪβエキソンは、転写され、そしてスプライシングされてＣβに結合する。α鎖について、Ｖα遺伝子セグメントは、Ｊα遺伝子セグメントに再編成して、機能的エキソンを生成し、このエキソンは、その後、転写され、そしてスプライシングされてＣαになる。多様性は、β鎖のＶセグメントとＤセグメントとＪセグメントとの間、および□鎖のＶセグメントとＪセグメントとの間の、Ｐ−ヌクレオチドおよびＮ−ヌクレオチドのランダムな付加によって、組換えプロセスの間にさらに増大される（Ｊａｎｅｗａｙ，Ｔｒａｖｅｒｓ，Ｗａｌｐｏｒｔ．Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ．第４版、９８および１５０、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ／Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ．１９９９）。
【０１９０】
別の局面において、本発明は、本明細書中に開示されるポリペプチドまたはその改変体もしくは誘導体に特異的なＴＣＲを提供する。本発明に従って、ポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、本明細書中に記載される腫瘍ポリペプチドを認識するＴ細胞レセプターのα鎖およびβ鎖について、Ｖ−Ｊ結合領域もしくはＶ−Ｄ−Ｊ結合領域またはその部分について提供される。一般に、本発明のこの局面は、ＭＨＣに関して提示される腫瘍ポリペプチドを認識または結合する、Ｔ細胞レセプターに関する。好ましい実施形態において、Ｔ細胞によって認識される腫瘍抗原は、本発明のポリペプチドを含む。例えば、乳房腫瘍ペプチドに特異的なＴＣＲをコードするｃＤＮＡは、標準的な分子生物学的技術および組換えＤＮＡ技術を使用して、腫瘍ポリペプチドに特異的なＴ細胞から単離され得る。
【０１９１】
本発明は、さらに、Ｔ細胞レセプター、または腫瘍ポリペプチドを認識もしくは結合する本発明のＴ細胞レセプターと同じ機能もしくは活性を実質的に有する、そのアナログを含む。このようなレセプターとしては、レセプターのフラグメント、または本明細書中に提供されるＴ細胞レセプターの置換変異体、付加変異体もしくは欠失変異体が挙げられるが、これらに限定されない。本発明はまた、本明細書中に提供されるＴ細胞レセプターと実質的に相同であるか、または同じ活性を実質的に保持する、ポリペプチドまたはペプチドを包含する。用語「アナログ」は、本明細書中に提供されるＴ細胞レセプターと実質的に同一なアミノ酸残基配列を有し、１つ以上の残基、好ましくは５以下の残基、より好ましくは２５以下の残基が、機能的に類似する残基によって保存的に置換されており、そして本明細書中に記載されるようなＴ細胞レセプターの機能的局面を示す、任意のタンパク質またはポリペプチドを含む。
【０１９２】
本発明はさらに、本明細書中に記載されるポリペプチドに特異的なＴＣＲをコードするポリヌクレオチドで形質転換された、適切な哺乳動物宿主細胞（例えば、非特異的Ｔ細胞）が提供され、それによって宿主細胞をこのポリペプチドに対して特異的にする。ＴＣＲのα鎖およびβ鎖は、別個の発現ベクター上に含まれ得るか、あるいはＩＲＥＳの下流の遺伝子のキャップ非依存的翻訳のための内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）もまた含み得る、単一の発現ベクター上に含まれ得る。このポリペプチドに特異的なＴＣＲを発現する上記宿主細胞は、例えば、以下にさらに考察されるような乳癌の養子免疫治療のために使用され得る。
【０１９３】
本発明のさらなる局面において、クローニングされた、本明細書中に列挙されるポリペプチドに特異的なＴＣＲは、乳癌診断のためのキットにおいて使用され得る。例えば、腫瘍特異的ＴＣＲの核酸配列またはその部分は、生物学的サンプル中の、特異的ＴＣＲをコードする再編成された遺伝子の発現の検出のための、プローブまたはプライマーとして使用され得る。従って、本発明は、さらに、ポリペプチドに特異的なＴＣＲをコードするメッセンジャーＲＮＡまたはＤＮＡを検出するためのアッセイを提供する。
【０１９４】
（薬学的組成物）
さらなる実施形態において、本発明は、細胞または動物への投与のための、単独でかまたは治療の１つ以上の他の様相と組み合わせてかのいずれかでの、薬学的に受容可能なキャリア中の本明細書中に開示される１つ以上のポリヌクレオチド、ポリペプチド、Ｔ細胞、ＴＣＲおよび／または抗体組成物の処方物に関する。
【０１９５】
所望される場合、本明細書中に開示される組成物が、他の薬剤（例えば、他のタンパク質もしくはポリペプチドまたは種々の薬学的に活性な薬剤など）と組み合わせても同様に投与され得ることが、理解される。事実、さらなる薬剤が標的細胞または宿主組織と接触した際に有意な有害な影響をもたらさないとすれば、さらに含まれ得る他の成分に実質的に制限はない。従って、この組成物は、特定の例において必要とされる場合、種々の他の薬剤と共に送達され得る。このような組成物は、宿主細胞または他の生物学的供給源から精製され得るか、あるいは、本明細書中に記載されるように化学的に合成され得る。同様に、このような組成物はさらに、置換または誘導体化されたＲＮＡ組成物またはＤＮＡ組成物を含み得る。
【０１９６】
従って、本発明の別の局面において、生理学的に受容可能なキャリアと組み合わせた、本明細書中に記載される１つ以上のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、ＴＣＲおよび／またはＴ細胞組成物を含む薬学的組成物が、提供される。特定の好ましい実施形態において、本発明の薬学的組成物は、予防ワクチン適用および治療ワクチン適用における使用のための、本発明の免疫原性ポリヌクレオチド組成物および／または免疫原性ポリペプチド組成物を含む。ワクチン調製物は、一般的に、例えば、Ｍ．Ｆ．ＰｏｗｅｌｌおよびＭ．Ｊ．Ｎｅｗｍａｎ編、「Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ（ｔｈｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ）」、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ（ＮＹ，１９９５）に記載される。一般的にこのような組成物は、１つ以上の免疫刺激剤と組み合わせた、本発明のポリヌクレオチド組成物および／またはポリペプチド組成物の１つ以上を含む。
【０１９７】
本明細書中に記載される任意の薬学的組成物が、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの薬学的に受容可能な塩を含み得ることは、明らかである。このような塩は、例えば、薬学的に受容可能な非毒性の塩基（有機塩基（例えば、一級アミン、二級アミンおよび三級アミンならびに塩基性アミノ酸の塩）および無機塩基（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩）を含む）から調製され得る。
【０１９８】
別の実施形態において、本発明の例示的な免疫原性組成物（例えば、ワクチン組成物）は、上記のような１つ以上のポリペプチドをコードするＤＮＡを含み、その結果このポリペプチドは、インサイチュで生成される。上記のように、ポリヌクレオチドは、当業者に公知の種々の送達系の内のいずれかで投与され得る。実際、多数の遺伝子送達技術（例えば、Ｒｏｌｌａｎｄ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  １５：１４３−１９８，１９９８およびこの中に引用される参考文献に記載される遺伝子送達技術）が、当該分野で周知である。当然、適切なポリヌクレオチド発現系は、患者における発現のための必要な調節性のＤＮＡ調節配列（例えば、適切なプロモーターおよび終結シグナル）を含む。あるいは、細菌送達系は、その細胞表面上にポリペプチドの免疫原性部分を発現するか、またはエピトープなどを分泌する細菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ−Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｒｉｎ）の投与を含み得る。
【０１９９】
従って、特定の実施形態において、本明細書中に記載される免疫原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、多数の公知のウイルスベースの系のうちのいずれかを用いて、発現のための適切な哺乳動物宿主細胞に導入される。１つの例示的な実施形態において、レトロウイルスが、遺伝子送達系のための簡便かつ有効な基盤を提供する。本発明のポリペプチドをコードする選択されたヌクレオチド配列は、当該分野で公知の技術を用いて、ベクターに挿入され得、そしてレトロウイルス粒子にパッケージングされ得る。次いで、組換えウイルスが、単離され、そして被験体に送達され得る。多数の例示的なレトロウイルス系が、記載されている（例えば、米国特許第５，２１９，７４０号；ＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎ（１９８９）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ７：９８０−９９０；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：５−１４；Ｓｃａｒｐａら（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８０：８４９−８５２；Ｂｕｒｎｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：８０３３−８０３７；ならびにＢｏｒｉｓ−ＬａｗｒｉｅおよびＴｅｍｉｎ（１９９３）Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．３：１０２−１０９）。
【０２００】
さらに、多数の例示的なアデノウイルスベースの系もまた、記載されている。宿主ゲノムに組込むレトロウイルスとは異なり、アデノウイルスは、染色体外に残り、このようにして、挿入変異誘発に関連する危険性を最小化する（Ｈａｊ−ＡｈｍａｄおよびＧｒａｈａｍ（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７−２７４；Ｂｅｔｔら（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：５９１１−５９２１；Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒら（１９９４）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７１７−７２９；Ｓｅｔｈら（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：９３３−９４０；Ｂａｒｒら（１９９４）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：５１−５８；Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６−６２９；ならびにＲｉｃｈら（１９９３）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：４６１−４７６）。
【０２０１】
種々のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター系もまた、ポリヌクレオチド送達のために開発されている。ＡＡＶベクターは、当該分野で周知の技術を用いて容易に構築され得る。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号および同第５，１３９，９４１号；国際公開番号ＷＯ  ９２／０１０７０およびＷＯ  ９３／０３７６９；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら（１９８８）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３９８８−３９９６；Ｖｉｎｃｅｎｔら（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９０（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：５３３−５３９；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９；Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７９３−８０１；ＳｈｅｌｌｉｎｇおよびＳｍｉｔｈ（１９９４）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：１６５−１６９；ならびにＺｈｏｕら（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１８６７−１８７５を参照のこと。
【０２０２】
遺伝子移入による、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを送達するのに有用なさらなるウイルスベクターとしては、ポックスウイルスのファミリー（例えば、ワクシニアウイルスおよび鳥類ポックスウイルス）から誘導されるものが挙げられる。例として、新規分子を発現するワクシニアウイルスの組換え体は、以下のように構築され得る。ポリペプチドをコードするＤＮＡを最初に、ワクシニアプロモーターおよび隣接ワクシニアＤＮＡ配列（例えば、チミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードする配列）に隣接するように適切なベクターに挿入する。次いで、このベクターを使用して、ワクシニアで同時に感染させる細胞にトランスフェクトする。相同組換えによって、ワクシニアプロモーターおよび目的のポリペプチドをコードする遺伝子を、ウイルスゲノムに挿入する。生じるＴＫ．ｓｕｐ．（−）組換え体を、５−ブロモデオキシウリジンの存在下でこの細胞を培養し、そして５−ブロモデオキシウリジンに耐性のウイルスプラークをピックアップすることによって、選択し得る。
【０２０３】
ワクシニアベースの感染／トランスフェクション系は、生物の宿主細胞における、本明細書中に記載される１つ以上のポリペプチドの誘導可能な一過性発現または同時発現を提供するために、好都合に使用され得る。この特定の系において、細胞を最初に、インビトロで、バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードするワクシニアウイルスの組換え体で感染させる。このポリメラーゼは、それがＴ７プロモーターを保有する鋳型のみを転写する点で、鋭敏な特異性を示す。感染後、細胞を、Ｔ７プロモーターによって駆動される目的のポリヌクレオチドでトランスフェクトする。ワクシニアウイルスの組換え体から細胞質中で発現されるポリメラーゼは、トランスフェクトされたＤＮＡをＲＮＡに転写し、このＲＮＡは次いで、宿主翻訳機構によってポリペプチドに翻訳される。この方法は、大量のＲＮＡおよびその翻訳産物の、高レベルで一過性の細胞質産生を提供する。例えば、Ｅｌｒｏｙ−ＳｔｅｉｎおよびＭｏｓｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９０）８７：６７４３−６７４７；Ｆｕｅｒｓｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８６）８３：８１２２−８１２６を参照のこと。
【０２０４】
あるいは、アビポックスウイルス（ａｖｉｐｏｘｖｉｒｕｓ）（例えば、鶏痘ウイルスおよびカナリア痘ウイルス）もまた使用されて、目的のコード配列を送達し得る。哺乳動物病原体由来の免疫原を発現する組換えアビポックスウイルスは、非鳥類種に投与された場合に、防御免疫を与えることが公知である。アビポックスベクターの使用は、ヒトおよび他の哺乳動物種において特に望ましい。なぜなら、アビポックス属のメンバーは、感受性の鳥類種においてのみ生産的に複製し得、故に、哺乳動物細胞において感染性ではないからである。組換えアビポックスウイルスを産生するための方法は、当該分野で公知であり、そしてワクシニアウイルスの産生に関して上記に記載されるように、遺伝子組換えを使用する。例えば、ＷＯ  ９１／１２８８２；ＷＯ  ８９／０３４２９；およびＷＯ  ９２／０３５４５を参照のこと。
【０２０５】
任意の多数のアルファウイルスベクターもまた、本発明のポリヌクレオチド組成物の送達のために使用され得る（例えば、米国特許第５，８４３，７２３号；同第６，０１５，６８６号；同第６，００８，０３５号および同第６，０１５，６９４号に記載されるベクター）。ベネズエラウマ脳脊髄炎（ＶＥＥ）に基づく特定のベクターもまた、使用され得、この例示的な例は、米国特許第５，５０５，９４７号および同第５，６４３，５７６号に見出され得る。
【０２０６】
さらに、分子結合体化ベクター（例えば、Ｍｉｃｈａｅｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９３）２６８：６８６６〜６８６９およびＷａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：６０９９〜６１０３に記載のアデノウイルスキメラベクター）はまた、本発明における遺伝子送達に用いられ得る。
【０２０７】
これらおよび他の公知のウイルスベースの送達系に対するさらなる例示的情報は、例えば、以下に見出され得る：Ｆｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：３１７〜３２１、１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５６９：８６〜１０３、１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ  ８：１７〜２１、１９９０；米国特許第４，６０３，１１２号、同第４，７６９，３３０号および同第５，０１７，４８７号；ＷＯ８９／０１９７３；米国特許第４，７７７，１２７号；ＧＢ  ２，２００，６５１：ＥＰ  ０，３４５，２４２号；ＷＯ  ９１／０２８０５；Ｂｅｒｋｎｅｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６〜６２７、１９８８；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１〜４３４、１９９１；Ｋｏｌｌｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：２１５〜２１９、１９９４；Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１１４９８〜１１５０２、１９９３；Ｇｕｚｍａｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８８：２８３８〜２８４８、１９９３；ならびにＧｕｚｍａｎら、Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．７３：１２０２〜１２０７、１９９３。
【０２０８】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドを標的細胞のゲノムに組み込み得る。この組み込みは、相同組み換え（遺伝子置換）を介して特定の位置および方向であり得るか、または無作為な非特異的位置に組み込まれ得る（遺伝子増大）。なおさらなる実施形態において、ポリヌクレオチドはＤＮＡの別のエピソームセグメントとして細胞において安定に維持され得る。このようなポリヌクレオチドセグメントすなわち「エピソーム」は、宿主細胞の周期と独立してまたは同調した維持および複製を可能にするのに十分な配列をコードする。発現構築物が細胞に送達され、そしてこの細胞中にこのポリヌクレオチドが残る様式は、使用される発現構築物のタイプに依存する。
【０２０９】
本発明の別の実施形態において、例えば、Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１７４５〜１７４９、１９９３に記載され、そしてＣｏｈｅｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１６９１〜１６９２、１９９３によって概説されるように、ポリヌクレオチドは、「裸の」ＤＮＡとして投与／送達される。裸のＤＮＡの取り込みは、生分解性ビーズ（これは、細胞中に効率的に輸送される）上にそのＤＮＡをコーティングすることによって増加され得る。
【０２１０】
なお別の実施形態において、本発明の組成物は、微粒子銃アプローチ（その多くが記載されている）を介して送達され得る。１つの代表的な例において、ガス駆動粒子加速（ｇａｓ−ｄｒｉｖｅｎ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ）は、Ｐｏｗｄｅｒｊｅｃｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ＰＬＣ（Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）およびＰｏｄｅｒｊｅｃｔ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって製造されたデバイスのようなデバイスで達成され得る。そのいくつかの例は、米国特許第５，８４６，７９６号；同第６，０１０，４７８号；同第５，８６５，７９６号；同第５，５８４，８０７号；およびＥＰ特許番号第０５００７９９号に記載されている。このアプローチは、注射針のない（無注射針）（ニードルフリー）送達アプローチを提供する。ここでは、微視的な粒子（例えば、ポリヌクレオチド粒子、またはポリペプチド粒子）の乾燥粉末処方物を、手持ちデバイスによって生成されるヘリウムガスジェット内で高速まで加速し、目的の標的組織内へ粒子を噴射する。
【０２１１】
関連の実施形態において、本発明の組成物のガス駆動注射針なし注入に有用であり得る他のデバイスおよび方法には、Ｂｉｏｊｅｃｔ，Ｉｎｃ．（Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）によって提供されるものが挙げられ、そのいくつかの例は、米国特許第４，７９０，８２４号；同第５，０６４，４１３号；同第５，３１２，３３５号；同第５，３８３，８５１号；同第５，３９９，１６３号；同第５，５２０，６３９号；および同第５，９９３，４１２号に記載されている。
【０２１２】
別の実施形態に従って、本明細書に記載される薬学的組成物は、本発明の免疫原性ポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、Ｔ細胞ＴＣＲおよび／またはＡＰＣ組成物に加えて、１つ以上の免疫賦活剤（免疫刺激因子）を含む。免疫賦活剤とは、本質的に、外因性抗原に対する免疫応答（抗原および／または細胞媒介）を増大または増強する任意の物質をいう。免疫賦活薬の１つの好ましい型は、アジュバントを含む。多くのアジュバントは、迅速な異化作用から抗原を保護するように設計された物質（例えば、水酸化アルミニウムまたは鉱油）および免疫応答の刺激物質（例えば、脂質Ａ、Ｂｏｒｔａｄｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓまたはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来タンパク質）を含む。特定のアジュバントが、例えば、フロイント不完全アジュバントおよびフロイント完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）；Ｍｅｒｃｋ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  ６５（Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．，Ｒａｈｗａｙ，ＮＪ）；ＡＳ−２（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）；アルミニウム塩（例えば、水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）またはリン酸アルミニウム）；カルシウム、鉄または亜鉛の塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁液；アセチル化糖；カチオンの誘導化多糖またはアニオンの誘導化多糖；ポリフォスファーゼン（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅ）；生分解性ミクロスフェア：モノホスホリル脂質Ａおよびモノホスホリルクイル（ｑｕｉｌ）Ａとして、市販されている。サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン−２、インターロイキン−７、インターロイキン−１２および増殖因子のような他のもの）もまた、アジュバントとして使用され得る。
【０２１３】
本発明の特定の実施形態において、アジュバント組成物は、Ｔｈ１型の免疫応答を優勢に誘導するものが好ましい。高レベルのＴｈ１型サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２およびＩＬ−１２）は、投与された抗原に対する細胞媒介性免疫応答の誘導を支持する傾向がある。対照的に、高レベルのＴｈ２型サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０）は、体液性免疫応答の誘導を支持する傾向がある。本明細書中に提供されるようなワクチンの適用の後、患者は、Ｔｈ１型応答およびＴｈ２型応答を含む免疫応答を支持する。応答が優勢にＴｈ１型である好ましい実施形態において、Ｔｈ１型サイトカインのレベルは、Ｔｈ２型サイトカインのレベルより高い程度まで増加する。これらのサイトカインのレベルは、標準的アッセイを使用して容易に評価され得る。サイトカインのファミリーの概説については、ＭｏｓｍａｎｎおよびＣｏｆｆｍａｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：１４５〜１７３、１９８９を参照のこと。
【０２１４】
Ｔｈ１型優勢の応答を誘発するための特定の好ましいアジュバントは、例えば、モノホスホリルリピドＡ、好ましくは３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡとアルミニウム塩との組み合わせを含む。ＭＰＬ（登録商標）アジュバントは、Ｃｏｒｉｘａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ；例えば、米国特許第４，４３６，７２７号；同第４，８７７，６１１号；同第４，８６６，０３４号および同第４，９１２，０９４号を参照のこと）から入手可能である。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ここで、ＣｐＧジヌクレオチドはメチル化されていない）はまた、Ｔｈ１優勢の応答を誘導する。このようなオリゴヌクレオチドは周知であり、そして例えばＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ９９／３３４８８ならびに米国特許第６，００８，２００号および同第５，８５６，４６２号に記載される。免疫賦活ＤＮＡ配列がまた、例えば、Ｓａｔｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３：３５２，１９９６によって記載される。別の好ましいアジュバントは、サポニン（例えば、Ｑｕｉｌ  Ａ）、またはその誘導体（ＱＳ２１およびＱＳ７（Ａｑｕｉｌａ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）を含む）；Ｅｓｃｉｎ；Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ；またはＧｙｐｓｏｐｈｉｌａまたはＣｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ  ｑｕｉｎｏａサポニンを含む。他の好ましい処方物は、本発明のアジュバントの組み合わせ、例えば、ＱＳ２１、ＱＳ７、Ｑｕｉｌ  Ａ、β−エスシン、またはジギトニンを含む以下の群のうち少なくとも２つの組み合わせ中に１種より多いサポニンを含む。
【０２１５】
あるいは、このサポニン処方物は、キトサン、または他のポリカチオン性ポリマーからなるワクチンビヒクル、ポリラクチドおよびポリラクチド−コ−グリコチド粒子、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンベースのポリマーマトリックス、ポリサッカライドまたは化学的に改変されたポリサッカライドからなる粒子、リポソームおよび脂質ベースの粒子、グリセロールモノエステルからなる粒子などと組み合わせられ得る。サポニンはまた、コレステロールの存在下で処方されて、リポソームまたはＩＳＣＯＭのような粒子構造を形成し得る。さらに、サポニンは、非粒子的溶液もしくは懸濁液で、または小数層リポソームもしくはＩＳＣＯＭのような粒子状構造のいずれかで、ポリオキシエチレンエーテルまたはエステルと一緒に処方され得る。サポニンはまた、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）のような賦形剤と一緒に処方されて、粘度を増大され得るか、またはラクトースのような粉末賦形剤とともに乾燥粉末形態に処方され得る。
【０２１６】
１つの好ましい実施形態において、アジュバント系は、モノホスホリルリピドＡとサポニン誘導体との組み合わせ（例えば、ＷＯ９４／００１５３に記載されるような、ＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬ（登録商標）アジュバントとの組み合わせ、またはＷＯ９６／３３７３９に記載されるような、ＱＳ２１がコレステロールでクエンチ（ｑｕｅｎｃｈ）される、あまり反応発生的（ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃ）でない組成物）を含む。他の好ましい処方物は、水中油型エマルジョンおよびトコフェロールを含む。水中油型エマルジョン中のＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬ（登録商標）アジュバントおよびトコフェロールを使用する、別の特に好ましいアジュバント処方物は、ＷＯ９５／１７２１０に記載されている。
【０２１７】
別の強化されたアジュバント系は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドとサポニン誘導体との組み合わせを含み、特にＣｐＧとＱＳ２１との組み合わせがＷＯ００／０９１５９に開示されている。好ましくは、この処方物は、さらに、水中油型エマルジョンおよびトコフェールを含む。
【０２１８】
本発明の薬学的組成物における使用のためのさらなる代表的アジュバントとしては、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ７２０（Ｓｅｐｐｉｃ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＳＡＦ（Ｃｈｉｒｏｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）、ＩＳＣＯＭＳ（ＣＳＬ）、ＭＦ−５９（Ｃｈｉｒｏｎ）、ＳＢＡＳシリーズのアジュバント（例えば、ＳＢＡＳ−２またはＳＢＡＳ−４（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ、Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍから入手可能）、Ｄｅｔｏｘ（Ｅｎｈａｎｚｙｎ（登録商標））（Ｃｏｒｉｘａ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）、ＲＣ−５２９（Ｃｏｒｉｘａ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）および他のアミノアルキルグルコサミニド４−ホスフェート（ＡＧＰ）（例えば、係続中の米国出願登録番号０８／８５３，８２６および０９／０７４，７２０（これらの開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される）に記載されるアジュバント）、ならびにＷＯ  ９９／５２５４９Ａ１に記載のポリオキシエチレンエーテルアジュバントのようなアジュバントが挙げられる。
【０２１９】
他の好ましいアジュバントは、一般式
（Ｉ）：ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ−Ｒ
のアジュバント分子を含み、
ここで、ｎは、１〜５０であり、Ａは、結合または−Ｃ（Ｏ）−であり、Ｒは、Ｃ１〜５０アルキルまたはフェニルＣ１〜５０アルキルである。
【０２２０】
本発明の１つの実施形態は、一般式（Ｉ）のポリオキシエチレンエーテルを含むワクチン処方物からなり、ここで、ｎは、１と５０との間、好ましくは４〜２４、最も好もしくは９であり、このＲ成分は、Ｃ１〜５０アルキル、好ましくはＣ４〜Ｃ２０アルキル、そして最も好ましくはＣ１２アルキルであり、そしてＡは、結合である。ポリオキシエチレンエーテルの濃度は、０．１〜２０％の範囲、好ましくは０．１〜１０％、そして最も好ましくは０．１〜１％の範囲にあるべきである。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−９−ステアリル（ｓｔｅｏｒｙｌ）エーテル、ポリオキシエチレン−８−ステアリル（ｓｔｅｏｒｙｌ）エーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。ポリオキシエチレンラウリルエーテルのようなポリオキシエチレンエーテルは、Ｍｅｒｃｋインデックス（第１２版、項目７７１７）に記載される。これらのアジュバント分子は、ＷＯ９９／５２５４９に記載される。
【０２２１】
上記の一般式（Ｉ）に従うポリオキシエチレンエーテルは、所望の場合、別のアジュバントと組み合わせられ得る。例えば、好ましいアジュバントの組み合わせは、好ましくは、係属中の英国特許出願第ＧＢ９８２０９５６．２号に記載されるようなＣｐＧとの組み合わせである。
【０２２２】
本発明の別の実施形態に従って、本明細書に記載される免疫原性組成物は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、単球、および有効なＡＰＣであるように操作され得る他の細胞）を介して宿主に送達される。このような細胞は、抗原を提示する能力を増大するように、Ｔ細胞応答の活性化および／または維持を改良するように、それ自体で抗腫瘍効果を有するように、そして／あるいは受け手と免疫学的に適合性（すなわち、一致するＨＬＡハプロタイプ）であるように遺伝学的に改変されてもよいが、改変される必要はない。ＡＰＣは、一般に、種々の生物学的な流体および器官（腫瘍および腫瘍周辺組織を含む）のいずれかから単離されてもよいし、そして自己細胞、同種異系細胞、同系細胞、または異種細胞であってもよい。
【０２２３】
本発明の特定の好ましい実施形態は、抗原提示細胞として、樹状細胞またはその前駆細胞を使用する。樹状細胞は、高度に強力なＡＰＣであり（ＢａｎｃｈｅｒｅａｕおよびＳｔｅｉｎｍａｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：２４５−２５１、１９９８）、そして予防的または治療的な抗腫瘍免疫を誘発するための生理学的アジュバントとして有効であることが示されてきた（ＴｉｍｍｅｒｍａｎおよびＬｅｖｙ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５０：５０７−５２９、１９９９を参照のこと）。一般に、樹状細胞は、それらの代表的な形状（インサイチュでは星状、インビトロでは目に見える顕著な細胞質突起（樹状突起）を有する）、高い効率で抗原を取り込み、プロセシングし、そして提示するそれらの能力、およびナイーブな（ｎａｉｖｅ）Ｔ細胞応答を活性化するそれらの能力に基づいて同定され得る。もちろん樹状細胞は、インビボまたはエキソビボで樹状細胞上に通常見出されない特定の細胞表面レセプターまたはリガンドを発現するように操作され得、このような改変樹状細胞は本発明によって意図される。樹状細胞の代替として、分泌小胞抗原装荷樹状細胞（ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｌｏａｄｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）（エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）と呼ばれる）がワクチン内で使用され得る（Ｚｉｔｖｏｇｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．４：５９４−６００，１９９８を参照のこと）。
【０２２４】
樹状細胞および前駆細胞は、末梢血、骨髄、腫瘍浸潤細胞、腫瘍周辺組織浸潤細胞、リンパ節、脾臓、皮膚、臍帯血、または任意の他の適切な組織もしくは流体から得られ得る。例えば、樹状細胞は、末梢血から収集された単球の培養物に、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３および／またはＴＮＦαのようなサイトカインの組み合わせを添加することによってエキソビボで分化され得る。あるいは、末梢血、臍帯血または骨髄から収集されたＣＤ３４陽性細胞は、培養培地にＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＴＮＦα、ＣＤ４０リガンド、ＬＰＳ、ｆｌｔ３リガンドならびに／または樹状細胞の分化、成熟、および増殖を誘導する他の化合物の組み合わせを添加することによって、樹状細胞に分化され得る。
【０２２５】
樹状細胞は、「未熟」細胞および「成熟」細胞として便宜上分類され、このことは、２つの十分に特徴付けられた表現型の間を区別する単純な方法を与える。しかしこの学名は、あらゆる可能な分化の中間段階を排除するように解釈されるべきではない。未熟な樹状細胞は、抗原の取り込みおよびプロセシングの高い能力を有するＡＰＣとして特徴付けられ、この能力は、Ｆｃγレセプターおよびマンノースレセプターの高度な発現と相関する。成熟表現型は、代表的に、クラスＩ  ＭＨＣおよびクラスＩＩ  ＭＨＣ、接着分子（例えば、ＣＤ５４およびＣＤ１１）ならびに同時刺激性分子（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６および４−１ＢＢ）のようなＴ細胞活性化を担う細胞表面分子の高度な発現ではなく、これらのマーカーのより低い発現によって特徴付けられる。
【０２２６】
ＡＰＣは、一般に、本発明のポリヌクレオチド（またはその部分もしくは他の改変体）を用いてトランスフェクトされ得、その結果、コードされたポリペプチドまたはその免疫原性部分が、細胞表面上に発現される。このようなトランスフェクションはエキソビボで起こり得、次いでこのようなトランスフェクト細胞を含む薬学的組成物は、本明細書中に記載されるように、治療目的で使用され得る。あるいは、樹状細胞または他の抗原提示細胞を標的とする遺伝子送達ビヒクルが、患者に投与され得、結果としてインビボでトランスフェクションが起こる。樹状細胞のインビボおよびエキソビボでのトランスフェクションは、一般に、例えば、ＷＯ９７／２４４４７に記載される方法、またはＭａｈｖｉら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７５：４５６−４６０、１９９７によって記載される遺伝子銃アプローチのような当該分野で公知の任意の方法を使用して実施され得る。樹状細胞の抗原負荷は、樹状細胞または前駆細胞を、腫瘍ポリペプチド、ＤＮＡ（裸のもしくはプラスミドベクター中の）またはＲＮＡ；あるいは抗原発現性組換え細菌またはウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘、アデノウイルスまたはレンチウイルスのベクター）と共にインキュベートすることによって達成され得る。負荷の前に、ポリペプチドは、Ｔ細胞補助（例えば、キャリア分子）を提供する免疫学的パートナーに共有結合され得る。あるいは、樹状細胞は、別個にかまたはポリペプチドの存在下で、結合していない免疫学的パートナーによりパルスされ得る。
【０２２７】
当業者に公知の任意の適切なキャリアが本発明の薬学的組成物において用いられ得るが、キャリアのタイプは、代表的に、投与の様式に基づいて変わる。本発明の組成物は、任意の適切な投与様式（例えば、局所投与、経口投与、鼻腔投与、経粘膜投与、静脈内投与、頭蓋内投与、腹腔内投与、皮下投与および筋肉内投与を含む）のために処方され得る。
【０２２８】
このような薬学的処方物において使用するためのキャリアは、生体適合性であり、そしてまた生分解性であり得る。特定の実施形態において、好ましくは、この処方物は比較的一定レベルの活性成分の放出を提供する。しかし、他の実施形態において、投与直後のより迅速な放出速度が所望され得る。このような組成物の処方は十分に、公知の技術を使用する当業者のレベル内である。この点に関して有用な例示的なキャリアとしては、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グルコリド）、ポリアクリレート、ラテックス、デンプン、セルロース、デキストランなどの微粒子が挙げられる。他の例示的な遅延放出キャリアとしては、非液性（ｎｏｎ−ｌｉｑｕｉｄ）親水性コア（例えば、架橋ポリサッカリドまたはオリゴサッカリド）、ならびに必要に応じて、両親媒性化合物（例えば、リン脂質）を含む外部層を含む超分子バイオベクター（例えば、米国特許第５，１５１，２５４号およびＰＣＴ出願ＷＯ９４／２００７８、ＷＯ／９４／２３７０１およびＷＯ９６／０６６３８を参照のこと）が挙げられる。徐放性処方物内に含まれる活性化合物の量は、移植の部位、放出の速度および予期される持続期間、ならびに処置または予防されるべき状態の性質に依存する。
【０２２９】
別の例示的な実施形態において、生分解性ミクロスフェア（例えば、ポリ乳酸ポリグリコレート）は、本発明の組成物のためのキャリアとして使用される。適切な生分解性ミクロスフェアは、例えば、米国特許第４，８９７，２６８号；同第５，０７５，１０９号；同第５，９２８，６４７号；同第５，８１１，１２８号；同第５，８２０，８８３号；同第５，８５３，７６３号；同第５，８１４，３４４号；同第５，４０７，６０９号および同第５，９４２，２５２号に開示される。改変Ｂ型肝炎コアタンパク質キャリア系（例えば、ＷＯ／９９  ４０９３４およびそこで引用される参考文献に記載されるような系）もまた、多くの用途に有用である。別の例示的なキャリア／送達システムは、キャリア含有粒子−タンパク質複合体（例えば、米国特許第５，９２８，６４７号に記載される複合体）を使用し、これは、宿主においてクラスＩ拘束細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘導し得る。
【０２３０】
別の例示的な実施形態において、リン酸カルシウムコア粒子は、キャリア、ワクチンアジュバント、または本発明の組成物のための制御放出マトリクスとして使用される。代表的なリン酸カルシウム粒子は、例えば、公開特許出願ＷＯ／００４６１４７に開示される。
【０２３１】
本発明の薬学的組成物はしばしば、１つ以上の、緩衝剤（例えば、中性の緩衝化生理食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水）；糖質（例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン）；マンニトール；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸（例えば、グリシン）；抗酸化剤；静菌剤；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン）；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；処方物をレシピエントの血液に対して等張性、低張性または弱く高張性にする溶質；懸濁剤；濃化剤および／または保存剤をさらに含む。あるいは、本発明の組成物は、凍結乾燥物として処方され得る。
【０２３２】
本明細書中に記載される薬学的組成物は、単回用量容器または多用量容器（例えば、密閉アンプルまたはバイアル）中に存在し得る。このような容器は、代表的に、使用まで処方物の無菌性および安定性を維持するために、密封される。一般に、処方物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクル中の、懸濁液、溶液またはエマルジョンとして保存され得る。あるいは、薬学的組成物は、使用の直前に無菌水性キャリアの添加のみを必要とする、凍結乾燥状態で保存され得る。
【０２３３】
様々な処置レジメンにおいて本明細書中で記載される特定の組成物を使用するための適切な投薬レジメンおよび処置レジメン（例えば、経口、非経口、静脈内、鼻腔内、および筋肉内の投与および処方物を含む）の開発は、当該分野で周知であり、これらのいくつかは、一般的な例示目的のために以下で簡単に考察される。
【０２３４】
特定の用途において、本明細書中で開示される薬学的組成物は、経口投与によって動物に送達され得る。このように、これらの組成物は、不活性希釈剤と共にかまたは同化可能食用キャリアと共に処方され得るか、あるいはこれらの組成物は、硬質または軟質殻ゼラチンカプセルに入れられ得るか、あるいはこれらの組成物は錠剤に圧縮され得るか、あるいはこれらの組成物は食餌の食品に直接組み込まれ得る。
【０２３５】
活性化合物は、賦形剤にも組み込まれ得、そして経口摂取錠剤、経頬粘膜錠剤、トローチ、カプセル剤、エリキシル、懸濁液、シロップ、カシェ剤などの形態で使用される（例えば、Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９７  Ｍａｒ  ２７；３８６（６６２３）：４１０−４；Ｈｗａｎｇら、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ  １９９８；１５（３）：２４３−８４；米国特許第５，６４１，５１５号；米国特許第５，５８０，５７９号および米国特許第５，７９２，４５１号を参照のこと）。錠剤、トローチ、丸剤、カプセル剤などはまた、任意の種々のさらなる成分を含み得、例えば、結合剤（例えば、トラガカントゴム、アラビアゴム、コーンスターチまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、リン酸二カルシウム）；崩壊剤（例えば、コーンスターチ、ポテトデンプン、アルギン酸など）；潤沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）；および甘味料（例えば、スクロース、ラクトースまたはサッカリン）または香料（例えば、ペパーミント、ウインターグリーン油、またはチェリー香料）が添加され得る。投薬量単位形態がカプセル剤である場合、これは上記のタイプの材料に加えて液体キャリアを含み得る。様々な他の材料が、コーティングとして存在し得るか、またはそうでなければ物理的形態の投薬単位を改変し得る。例えば、錠剤、丸剤またはカプセル剤は、セラック、糖またはその両方でコーティングされ得る。もちろん、任意の投薬単位形態を調製する際に使用される任意の材料は、薬学的に純粋でありかつ用いられる量で実質的に非毒性でなければならない。さらに、活性化合物は、徐法性調製物および処方物に組み込まれ得る。
【０２３６】
代表的に、これらの処方物は、少なくとも約０．１％またはそれよりも多い活性化合物を含むが、活性成分の割合は、もちろん、変化し得、そして好都合に、全処方物の重量または体積の約１％または約２％と、約６０％または約７０％以上のとの間であり得る。当然、薬学的に有用な組成物の各々の中の活性化合物の量は、適切な投薬量が、化合物の任意の所定の単位用量において得られるような様式で、調製され得る。溶解度、バイオアベイラビリティー、生物学的半減期、投与の経路、製品の有効期限のような因子、および他の薬理学的考慮が、このような薬学的処方物を調製する分野の当業者によって考慮され、そして、種々の投薬量および処置レジメンはそれ自体が、所望され得る。
【０２３７】
あるいは、経口投与について、本発明の組成物は、うがい薬、歯みがき剤、バッカル錠、経口スプレー、または舌下経口投与処方物の形態で、１つ以上の賦形剤と混合され得る。あるいは、活性成分は、経口溶液（例えば、ホウ酸ナトリウム、グリセリンおよび炭酸水素カリウムを含む溶液）に組み込まれ得るか、または歯みがき剤に分散され得るか、または治療的有効量で、水、結合剤、研磨剤、香料、発泡剤、および湿潤剤を含み得る組成物に添加され得る。あるいは、これらの組成物は、舌下に置かれ得るか、そうでなければ口の中で溶解され得る錠剤形態または溶液形態に成形され得る。
【０２３８】
特定の状況において、本明細書中で開示される薬学的組成物を、非経口送達、静脈内送達、筋肉内送達またはさらに腹腔内送達することが所望される。このようなアプローチは、当業者に周知であり、これらのいくつかは例えば、例えば、米国特許第５，５４３，１５８号；米国特許第５，６４１，５１５号および米国特許第５，３９９，３６３号にさらに記載される。特定の実施形態において、遊離塩基または薬学的に受容可能な塩としての活性化合物の溶液は、界面活性剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース）と適切に混合された水中で調製され得る。分散物もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中で、ならびにオイル中で調製され得る。保存および使用の通常の条件下で、これらの調製物は一般に、微生物の増殖を防止するために、防腐剤を含む。
【０２３９】
注入用途に適切な例示的な薬学的形態として、滅菌水性液剤または滅菌水性分散物および滅菌注射用液剤または滅菌注射用分散物の即時調製のための滅菌散剤が挙げられる（例えば、米国特許第５，４６６，４６８号を参照のこと）。全ての場合において、その形態は、滅菌でなければならず、そして容易に注射することができる程度に、流動性でなければならない。それは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、そして微生物（例えば、細菌および真菌）の汚染作用に対して保存されなければならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および／もしくは植物油を含む溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング（例えば、レシチン）の使用によって、分散物の場合には必要とされる粒子サイズの維持によって、そして／または界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン（ｐａｒａｂｅｎ）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）によって促進され得る。多くの場合において、等張剤（例えば、糖または塩化ナトリウム）を含むことが、望ましい。注射可能な組成物の長期にわたる吸収は、組成物中での吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）の使用によって、もたらされ得る。
【０２４０】
１つの実施形態において、水溶液の非経口投与のために、必要ならばその溶液は、適切に緩衝化されるべきであり、そして液体希釈剤が、最初に、十分な生理食塩水またはグルコースで等張にされる。これらの特定の水溶液は、特に、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、および腹腔内投与に適切である。これに関連して、使用され得る滅菌水性媒体は、本開示の観点から当業者に公知である。例えば、一投与量は、１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液に溶解され得、そして１０００ｍｌの皮下注入流体に添加され得るか、または注入予定部位で注入され得るかのいずれかである（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１５版、１０３５〜１０３８頁および１５７０〜１５８０頁を参照のこと）。投薬量におけるある程度の変動が、処置される被験体の状態に依存して、必然的に生じる。さらに、ヒト投与について、調製物は、もちろん、好ましくは、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ｓｔａｎｄａｒｄｓによって要求されるような、無菌性、発熱性、ならびに一般的な安全性標準および純度標準を満たす。
【０２４１】
本発明の別の実施形態において、本明細書中で開示される組成物は、中性形態または塩形態で処方され得る。例示的な薬学的に受容可能な塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基とともに形成される）が挙げられ、そしてこれらの塩は、無機酸（例えば、塩酸またはリン酸）、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸とともに形成される。遊離カルボキシル基とともに形成される塩もまた、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化鉄）、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基から誘導され得る。処方の際に、溶液は、投薬処方物と適合する様式でかつ治療的に有効な量で投与される。
【０２４２】
キャリアは、任意および全ての溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝液、キャリア溶液、懸濁液、コロイドなどをさらに含み得る。薬学的活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が、活性成分と不適合である場合を除いては、治療組成物におけるその使用が、企図される。補助的活性成分もまた、これらの組成物に組み込まれ得る。句「薬学的に受容可能な」とは、ヒトに投与される場合に、アレルギー反応または類似の厄介な反応を生成しない分子実体および組成物をいう。
【０２４３】
特定の実施形態において、薬学的組成物は、鼻腔内スプレー、吸入、および／または他のエアロゾル送達ビヒクルによって送達され得る。遺伝子、核酸およびペプチド組成物は、経鼻エアロゾルスプレーを介して肺に直接送達するための方法は、例えば、米国特許第５，７５６，３５３号および米国特許第５，８０４，２１２号に記載されている。同様に、鼻腔内微粒子樹脂（Ｔａｋｅｎａｇａら、Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １９９８  Ｍａｒ  ２；５２（１−２）：８１−７）およびリゾホスファチジル−グリセロール化合物（米国特許第５，７２５，８７１号）を使用する薬物の送達はまた、薬学分野で周知である。同様に、ポリテトラフルオロエチレン支持マトリックスの形態での経粘膜薬物送達は、米国特許第５，７８０，０４５号に記載される。
【０２４４】
特定の実施形態において、リポソーム、ナノカプセル、微粒子、脂質粒子、小胞などを、適切な宿主細胞／生物への本発明の組成物の導入のために使用する。特に、本発明の組成物は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフィア、またはナノ粒子などのいずれかにカプセル化して送達するために処方され得る。あるいは、本発明の組成物は、このようなキャリアビヒクルの表面に、共有結合的または非共有結合的のいずれかで結合され得る。
【０２４５】
潜在的な薬物キャリアとしてのリポソーム調製物およびリポソーム様調製物の形成および使用は一般に、当業者に公知である（例えば、Ｌａｓｉｃ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９９８  Ｊｕｌ；１６（７）：３０７−２１；Ｔａｋａｋｕｒａ，Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ  １９９８  Ｍａｒ；５６（３）：６９１−５；Ｃｈａｎｄｒａｎら、Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ．１９９７  Ａｕｇ；３５（８）：８０１−９；Ｍａｒｇａｌｉｔ，Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．１９９５；１２（２−３）：２３３−６１；米国特許第５，５６７，４３４号；米国特許第５，５５２，１５７号；米国特許第５，５６５，２１３号；米国特許第５，７３８，８６８号および米国特許第５，７９５，５８７号（これらの各々は、その全体が本明細書中で参考として詳細に援用される）を参照のこと）。
【０２４６】
リポソームは、Ｔ細胞懸濁液、初代肝細胞培養物およびＰＣ１２細胞を含む他の手順によるトランスフェクションが通常困難である多くの細胞型とともに、首尾よく使用されている（Ｒｅｎｎｅｉｓｅｎら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９０  Ｓｅｐ  ２５；２６５（２７）：１６３３７−４２；Ｍｕｌｌｅｒら、ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９０  Ａｐｒ；９（３）：２２１−９）。さらに、リポソームは、ウイルスベースの送達系に典型的なＤＮＡ長の制限がない。リポソームは、遺伝子、種々の薬物、放射線治療剤、酵素、ウイルス、転写因子およびアロステリックエフェクターなどを、種々の培養細胞株および動物に導入するために効果的に使用されている。さらに、リポソームの使用は、全身送達後の、自己免疫応答にも受容不可能な毒性にも関連しないようである。
【０２４７】
特定の実施形態において、リポソームは、水性媒体中に分散したリン脂質から形成され、そして多層同心性二重層小胞（多層小胞（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を自発的に形成する。
【０２４８】
あるいは、他の実施形態において、本発明は、本発明の組成物の薬学的に受容可能なナノカプセル処方物を提供する。ナノカプセルは一般に、化合物を安定かつ再現可能な様式で捕捉し得る（例えば、Ｑｕｉｎｔａｎａｒ−Ｇｕｅｒｒｅｒｏら、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  Ｉｎｄ  Ｐｈａｒｍ．１９９８  Ｄｅｃ；２４（１２）：１１１３−２８を参照のこと）。細胞内ポリマー過負荷に起因する副作用を回避するために、このような超微粒子（約０．１μｍのサイズ）は、インビボで分解され得るポリマーを使用して設計され得る。このような粒子は、例えば、Ｃｏｕｖｒｅｕｒら、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．１９８８；５（１）：１−２０；ｚｕｒ  Ｍｕｈｌｅｎら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｐｈａｒｍ．１９９８  Ｍａｒ；４５（２）：１４９−５５；Ｚａｍｂａｕｘら、Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ．１９９８  Ｊａｎ  ２；５０（１−３）：３１−４０；および米国特許第５，１４５，６８４号に記載されるようにして作製され得る。
【０２４９】
（癌治療法）
癌治療への免疫学的アプローチは、癌細胞が、異常な細胞および分子または外来の細胞および分子に対する人体の防御をしばしば回避し得、そしてこれらの防御が、失った基盤（ｇｒｏｕｎｄ）を取り戻すために治療的に刺激され得るという認識に基づく（例えば、Ｋｌｅｉｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８２）、６２３〜６４８頁）。多数の免疫エフェクターが腫瘍の増殖を直接的または間接的に阻害し得るという種々の最近の知見は、癌治療に対するアプローチにおける新たな関心を導いた（例えば、Ｊａｇｅｒら、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２００１；６０（１）：１−７；Ｒｅｎｎｅｒら、Ａｎｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２０００  Ｄｅｃ；７９（１２）：６５１−９）。
【０２５０】
抗腫瘍細胞の免疫および人体からの腫瘍細胞の除去に関連する機能を有する４つの基本的な細胞型は、以下の通りである：ｉ）非自己侵入細胞を認識および標識するために免疫グロブリンを血漿に分泌するＢ−リンパ球；ｉｉ）免疫グロブリンでコーティングされた標的侵入細胞の溶解およびプロセシングを担う補体タンパク質を分泌する単球；ｉｉｉ）腫瘍細胞の破壊、抗体依存性細胞傷害およびナチュラルキリング（ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｉｎｇ）のための２種類の機構を有するナチュラルキラーリンパ球；ならびにｉｖ）抗原特異的レセプターを保持し、そして相補的マーカー分子を保有する腫瘍細胞を認識する能力を有するＴ−リンパ球（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｈ．，１９８９、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（編）、Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ、９２３〜９５５頁）。
【０２５１】
癌の免疫治療は、一般に、体液性免疫応答、細胞性免疫応答、またはそれらの両方を誘導することに集中している。さらに、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞の誘導は、抗体または細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかを二次的に誘導するために必要であることが十分に確立されている。癌細胞、特に、乳癌細胞に対して選択的であるか、または理想的には特異的であるポリペプチド抗原は、卵巣癌に対する免疫応答を誘導するための強力なアプローチをしばしば提供し、そしてこれは、本発明の重要な局面である。
【０２５２】
従って、本発明のさらなる局面において、本明細書に記載される薬学的組成物は、癌に対する免疫応答を刺激するため、特に、乳癌の免疫治療のために使用され得る。このような方法において、本明細書中に記載される薬学的組成物は、患者、代表的には、温血動物、好ましくはヒトに投与される。患者は、癌に罹患していてもしていなくてもよい。薬学的組成物およびワクチンは、原発性腫瘍の外科的除去および／または放射線治療剤もしくは従来の化学療法剤の投与のような処置の前、あるいはその後のいずれかに投与され得る。上記のように、薬学的組成物の投与は、任意の適切な方法（静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、皮内、肛門、膣、局所的および経口経路による投与を含む）によってであり得る。
【０２５３】
特定の実施形態において、免疫療法は、能動的免疫療法であり得、この療法において処置は、免疫応答改変剤（例えば、本明細書中で提供されたポリペプチドおよびポリヌクレオチド）の投与で腫瘍に対して反応する内因性宿主免疫系のインビボ刺激に依存する。
【０２５４】
他の実施形態において、免疫療法は、受動的免疫療法であり得、この療法において処置は、確立された腫瘍免疫反応性を有する因子（例えば、エフェクター細胞または抗体）（抗腫瘍効果を直接的または間接的に媒介し得、そしてインタクトな宿主免疫系に依存する必要はない）の送達を含む。エフェクター細胞の例としては、上記のようなＴ細胞、本明細書中に提供されるポリペプチドを発現するＴリンパ球（例えば、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球およびＣＤ４＋Ｔヘルパー腫瘍浸潤性リンパ球）、キラー細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞およびリンホカイン活性化キラー細胞）、Ｂ細胞および抗原提示細胞（例えば、樹状細胞およびマクロファージ）が挙げられる。本明細書中に列挙されるポリペプチドに特異的なＴ細胞レセプターおよび抗体レセプターは、養子免疫療法のために他のベクターまたはエフェクター細胞中にクローニングされ、発現され、そして移入され得る。本明細書に提供されるポリペプチドはまた、受動免疫療法のための抗体または抗イディオタイプ抗体（上記および米国特許第４，９１８，１６４号に記載される）を生成するために用いられ得る。
【０２５５】
モノクローナル抗体は、検出、診断アッセイまたは治療適用における所望の選択的使用法のための種々の標識（本明細書にそれらの全体が、あたかも各々が個々に援用されるように、参考として援用される米国特許第６，０９０，３６５号；同第６，０１５，５４２号；同第５，８４３，３９８号；同第５，５９５，７２１号；および同第４，７０８，９３０号に記載のように）のいずれかで標識され得る。各々の場合において、標識されたモノクローナル抗体の抗原決定部位への結合は、特定の治療剤の非正常細胞上の抗原性決定基に対する検出または送達の合図である。本発明のさらなる目的は、このような所望のその選択的使用法を達成するために適切に標識された特異的モノクローナル抗体を提供することである。
【０２５６】
エフェクター細胞は、一般に、本明細書中に記載されるように、インビトロでの増殖により養子免疫治療のために十分な量で得られ得る。単一の抗原特異的エフェクター細胞を、インビボでの抗原認識を保持しながら数十億まで増殖させるための培養条件は当該分野で周知である。このようなインビトロの培養条件は代表的に、しばしばサイトカイン（例えば、ＩＬ−２）および分裂しない支持細胞の存在下で、抗原での間欠刺激を用いる。上で述べたように、本明細書中で提供される免疫反応性ポリペプチドは、抗原特異的Ｔ細胞培養物を急速に増殖するために用いられ、免疫治療に十分な数の細胞を生成し得る。詳細には、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ、単球、線維芽細胞、および／またはＢ細胞）は、当該分野で周知の標準的技術を用いて、免疫反応性ポリペプチドでパルスされ得るか、または１つ以上のポリヌクレオチドでトランスフェクトされ得る。例えば、抗原提示細胞は、組換えウイルスまたは他の発現系における発現を増大するのに適切なプロモーターを有するポリヌクレオチドでトランスフェクトされ得る。治療において使用するための培養されたエフェクター細胞は、インビボで増殖されかつ広範に分散され得、そして長期間生存され得なければならない。培養されたエフェクター細胞が、インビボで増殖し、そしてＩＬ−２を補充された抗原での反復刺激によって、長期間、多数生存しするように誘導され得ることが研究で示されている（例えば、Ｃｈｅｅｖｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １５７：１７７、１９９７を参照のこと）。
【０２５７】
あるいは、本明細書において列挙されるポリペプチドを発現するベクターは、患者から得られた抗原提示細胞に導入され得、そして同じ患者に戻す移植のためにエキソビボでクローン的に増殖され得る。トランスフェクトされた細胞は、当該分野で公知の任意の手段（好ましくは、静脈投与、腔内投与、腹腔内投与、または腫瘍内投与による滅菌形態）を用いて患者に再導入され得る。
【０２５８】
本明細書中に記載される治療的組成物の投与の経路および頻度、ならびに投薬量は、個々人で異なり、そして標準的技術を用いて容易に確立され得る。概して、薬学的組成物およびワクチンは、注射（例えば、皮内、筋肉内、静脈内、または皮下）により、経鼻的に（例えば、吸引により）または経口的に、投与され得る。好ましくは、５２週間にわたって１〜１０用量の間が投与され得る。好ましくは、１ヶ月の間隔で６用量が投与され、そしてブースター（追加）ワクチン接種がその後定期的に与えられ得る。交互のプロトコルが個々の患者に適切であり得る。適切な用量は、上記のように投与された場合、抗腫瘍免疫応答を促進し得、そして基底（すなわち、未処置）レベルより少なくとも１０〜５０％上である、化合物の量である。このような応答は、患者内の抗腫瘍抗体を測定することによってか、または患者の腫瘍細胞をインビトロで殺傷し得る細胞溶解性エフェクター細胞のワクチン依存性の生成によってモニターされ得る。このようなワクチンはまた、ワクチン接種されていない患者と比較すると、ワクチン接種された患者において、改善された臨床的結果（例えば、より頻繁な寛解、完全もしくは部分的に疾患を有さないか、またはより長く疾患を有さない生存）を導く免疫応答を生じ得るはずである。一般に、１つ以上のポリペプチドを含む薬学的組成物およびワクチンについて、用量中に存在する各ポリペプチドの量は、宿主の体重（ｋｇ）あたり、約２５μｇ〜５ｍｇの範囲である。適切な用量サイズは、患者の大きさで変化するが、代表的には約０．１ｍＬ〜約５ｍＬの範囲である。
【０２５９】
一般に、適切な投薬量および処置レジメンは、治療的および／または予防的利点を提供するのに十分な量の活性化合物を提供する。このような応答は、処置されていない患者に比較して、処置された患者において、改善された臨床的結果（例えば、より頻繁な寛解、完全なまたは部分的な、あるいはより長い疾患なしでの生存）を確立することによってモニターされ得る。腫瘍タンパク質に対する既存の免疫応答における増加は、一般的に、改善された臨床的結果と関連する。このような免疫応答は、一般的に、標準的な増殖アッセイ、細胞障害性アッセイまたはサイトカインアッセイを使用して評価され得、これは、処置の前または後に患者から得られるサンプルを使用して行われ得る。
【０２６０】
（癌の検出および診断用の組成物、方法およびキット）
一般的に、癌は、患者から得られた生物学的サンプル（例えば、血液、血清、痰、尿、および／または腫瘍生検）における１つ以上の乳房腫瘍タンパク質および／またはこのようなタンパク質をコードするポリヌクレオチドの存在に基づいて患者において検出され得る。言い換えると、このようなタンパク質は、乳癌のような癌の存在または非存在を示すためのマーカーとして使用され得る。さらに、このようなタンパク質は、他の癌の検出に有用であり得る。本明細書に提供される結合剤が、一般的に、生物学的サンプル中の薬剤に結合する抗原のレベルの検出を可能にする。
【０２６１】
ポリヌクレオチドプライマーおよびポリヌクレオチドプローブは、腫瘍タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを検出するために使用され得、これもまた、癌の存在または非存在を示す。一般に、腫瘍の配列は、腫瘍が生じた同じタイプの正常な組織におけるよりも、腫瘍組織において少なくとも２倍高い、好ましくは３倍高い、そしてより好ましくは５倍またはそれより高いレベルで存在するはずである。腫瘍が生じたのとは異なる組織タイプにおける特定の腫瘍配列の発現レベルは、特定の実施形態では無関係である。なぜなら、腫瘍細胞の存在は、同じタイプの正常組織の発現レベルに対する腫瘍組織中の所定の異なる発現レベル、例えば、２倍、５倍などの観察により確認され得るからである。
【０２６２】
その他の異なる発現パターンが、診断目的に有利に利用され得る。例えば、本発明の１つの局面では、腫瘍組織および同じタイプの正常組織中の腫瘍配列（しかし、その他の正常組織タイプ、例えば、ＰＢＭＣ中ではない）の過剰発現は、診断に利用され得る。この場合、腫瘍が生じたのとは異なる循環または特定の他の組織部位から採取されたサンプル中の転移性腫瘍細胞の存在は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲを用いてこのサンプル中の腫瘍配列の発現を検出することにより、同定および／または確認され得る。多くの事例では、細胞捕捉または他の同様の技法を用いて、目的のサンプル、例えばＰＢＭＣ中の腫瘍細胞を濃縮することが所望される。
【０２６３】
サンプル中のポリペプチドマーカーを検出するために結合剤を使用するための、当業者に公知の種々のアッセイ型式が存在する。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照のこと。一般的に、患者における癌の存在または非存在は、（ａ）患者から得られた生物学的サンプルを結合剤と接触させる工程；（ｂ）結合剤に結合するポリペプチドのレベルをサンプルにおいて検出する工程；および（ｃ）ポリペプチドのレベルと所定のカットオフ値とを比較する工程によって決定され得る。
【０２６４】
好ましい実施形態において、このアッセイは、ポリペプチドに結合するためおよびサンプルの残りからポリペプチドを除くために固体支持体上に固定化された結合剤の使用を含む。次いで、結合されたポリペプチドは、レポーター基を含み、結合剤／ポリペプチド複合体に特異的に結合する検出試薬を使用して検出され得る。このような検出試薬は、例えば、ポリペプチドまたは抗体に特異的に結合する結合剤あるいは結合剤に特異的に結合する他の薬剤（例えば、抗免疫グロブリン、プロテインＧ、プロテインＡまたはレクチン）を含み得る。あるいは、競合アッセイが、使用され得、ここで、ポリペプチドは、レポーター基で標識され、そしてサンプルと結合剤のインキュベーション後にその固定化結合剤に結合される。サンプルの成分が、標識ポリペプチドの結合剤への結合を阻害する程度は、サンプルの固定化結合剤との反応性を示す。このようなアッセイにおける使用に適切なポリペプチドは、上記のような、全長乳房腫瘍タンパク質および結合剤が結合するそのポリペプチド部分を含む。
【０２６５】
固体支持体は、腫瘍タンパク質が付着され得る、当業者に公知の任意の材料であり得る。例えば、固体支持体は、マイクロタイタープレートにおける試験ウェルあるいはニトロセルロースまたは他の適切な膜であり得る。あるいは、その支持体は、ビーズまたはディスク（例えば、ガラス）、ファイバーグラス、ラテックス、またはプラスチック物質（例えば、ポリスチレン、またはポリ塩化ビニル）であり得る。その支持体はまた、磁気粒子または光ファイバーセンサー（例えば、米国特許第５，３５９，６８１号に記載のような）であり得る。この結合剤は、当業者に公知の種々の技術を使用して固体支持体上に固定化され得、これらは特許および科学文献に十分に記載されている。本発明の状況において、用語「固定化」とは、非共有結合的な会合（例えば、吸着）および共有結合的な付着（これは、薬剤と支持体上の官能基との間で直接結合され得るかまたは架橋剤を用いる結合であり得る）の両方をいう。マイクロタイタープレートのウェル、または膜への吸着による固定化が好ましい。このような場合、吸着は、適切な緩衝液中で、適切な時間量で結合剤を固体支持体と接触させることによって達成され得る。接触時間は、温度によって変化するが、代表的には、約１時間から約１日の間である。一般的には、約１０ｎｇ〜約１０μｇ、そして好ましくは約１００ｎｇ〜約１μｇの範囲の量の結合剤とプラスチックマイクロタイタープレート（例えば、ポリスチレンまたはポリ塩化ビニル）のウェルを接触させることは、適切な量の結合剤を固定化するのに十分である。
【０２６６】
固体支持体への結合剤の共有結合的付着は、一般に、支持体および結合剤上の官能基（例えば、水酸基またはアミノ基）の両方と反応する二官能性試薬と支持体を最初に反応させることによって達成され得る。例えば、この結合剤は、ベンゾキノンを用いるかまたは結合パートナー上のアミンおよび活性水素での支持体上のアルデヒド基の縮合によって、適切なポリマーコーティングを有する支持体に、共有結合的に付着され得る（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、１９９１、Ａ１２−Ａ１３を参照のこと）。
【０２６７】
特定の実施形態において、このアッセイは、２抗体サンドイッチアッセイである。本アッセイは、最初に、固体支持体（一般に、マイクロタイタープレートのウェル）上で固定化されている抗体をサンプルに接触させて、その結果、サンプル中のポリペプチドを固定化抗体に結合させることによって実施され得る。次いで、非結合サンプルは固定化ポリペプチド−抗体複合体から除去され、そして検出試薬（好ましくは、そのポリペプチド上の異なる部位に結合し得る第２の抗体（レポーター基を含む））が添加される。次いで、固体支持体に結合したままである検出試薬の量が、特定のレポーター基に関して適切な方法を用いて決定される。
【０２６８】
より詳細には、一旦抗体が上記のように支持体上に固定化されると、支持体上の残りのタンパク質結合部位は、典型的にはブロックされる。任意の適切なブロック剤（例えば、ウシ血清アルブミンまたはＴｗｅｅｎ２０ＴＭ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））は、当業者に公知である。固定化抗体は次いで、サンプルとインキュベートされ、そしてポリペプチドをこの抗体に結合させる。インキュベーションの前に、このサンプルは適切な希釈液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ））で希釈され得る。概して、適切な接触時間（すなわち、インキュベーション時間）は、乳癌を有する個体から得られたサンプル内のポリペプチドの存在を、少なくとも約９５％において検出（結合ポリペプチドと非結合ポリペプチドとの間の平衡において達成される）するのに十分な時間である。当業者は、ある時間にわたって起こる結合レベルをアッセイすることによって、平衡に達するまでに必要な時間が容易に決定され得ることを認識する。室温では、一般に、約３０分間のインキュベーション時間で十分である。
【０２６９】
次いで、非結合サンプルが、適切な緩衝液（例えば、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭを含むＰＢＳ）を用いて固体支持体を洗浄することによって除去される。レポーター基を含む第２抗体が次いで、固体支持体に添加され得る。好ましいレポーター基は、上記の基を含む。
【０２７０】
次いで、検出試薬が、結合されたポリペプチドを検出するのに十分な量の時間、固定化抗体−ポリペプチド複合体とインキュベートされる。適切な時間は、一般に、ある時間にわたって起こる結合のレベルをアッセイすることによって決定され得る。次いで、非結合の検出試薬は除去され、そして結合した検出試薬は、レポーター基を用いて検出される。レポーター基を検出するために使用される方法は、レポーター基の性質に依存する。放射性基について、一般的には、シンチレーション計数法またはオートラジオグラフィー法が適切である。分光法は、色素、発光基および蛍光基を検出するために使用され得る。ビチオンは、異なるレポーター基（一般に、放射性基もしくは蛍光基または酵素）に結合されたアビジンを使用して検出され得る。酵素レポーター基は、一般に、基質の添加（一般には、特定の時間の間）、続いて反応産物の分光分析または他の分析により検出され得る。
【０２７１】
癌（例えば、乳癌）の存在または非存在を決定するために、固体支持体に結合したままのレポーター基から検出されるシグナルが、一般に、所定のカットオフ値と対応するシグナルと比較される。１つの好ましい実施形態において、癌の検出のためのカットオフ値は、固定化抗体を、癌を有さない患者由来のサンプルとインキュベートした際に得られる平均シグナル値である。概して、所定のカットオフ値を３標準偏差上回るシグナルを生じるサンプルが、癌に対して陽性とみなされる。代替の好ましい実施形態において、このカットオフ値は、Ｓａｃｋｅｔｔら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，１９８５，１０６〜７頁の方法に従って、レシーバーオペレーターカーブ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｏｒ  Ｃｕｒｖｅ）を使用して決定される。簡単に言うと、本実施形態において、このカットオフ値は、診断試験結果についての各可能なカットオフ値に対応する真の陽性割合（すなわち、感度）および偽陽性割合（１００％−特異性）の対のプロットから決定され得る。プロット上の上方左手角に最も近いカットオフ値（すなわち、最大領域を囲む値）が、最も正確なカットオフ値であり、そして本方法によって決定されたカットオフ値より高いシグナルを生ずるサンプルが陽性と見なされ得る。あるいは、カットオフ値は、偽陽性割合を最小にするためにプロットに沿って左へシフトされ得るか、または偽陰性割合を最小にするために右へシフトされ得る。概して、本方法によって決定されたカットオフ値より高いシグナルを生ずるサンプルが、癌に対して陽性と見なされる。
【０２７２】
関連の実施形態において、このアッセイは、フロースルー試験形式またはストリップ試験形式で実行される（ここで、結合剤は、ニトロセルロースのような膜上で固定化される）。フロースルー試験では、サンプル内のポリペプチドは、サンプルが膜を通過するにつれて固定化結合剤に結合する。次いで、第２の標識化された結合剤が、この第２の結合剤を含む溶液がその膜を通って流れるにつれて、結合剤−ポリペプチド複合体と結合する。次いで、結合した第２の結合剤の検出は、上記のように実行され得る。ストリップ試験形式では、結合剤が結合される膜の一端を、サンプルを含む溶液中に浸す。このサンプルは、膜に沿って、第２の結合剤を含む領域を通って、そして固定化結合剤の領域まで移動する。固定化抗体の領域での第２の結合剤の濃度が、癌の存在を示す。代表的には、その部位での第２の結合剤の濃度は、視覚的に読みとられ得るパターン（例えば、線）を生成する。このようなパターンを示さないことは陰性の結果を示す。概して、この膜上に固定化される結合剤の量は、生物学的サンプルが、上記の形式において、２抗体サンドイッチアッセイにおいて陽性シグナルを生じるのに十分であるレベルのポリペプチドを含む場合、視覚的に識別可能なパターンを生じるように選択される。このようなアッセイにおける使用に好ましい結合剤は、抗体およびその抗原結合フラグメントである。好ましくは、膜上に固定化される抗体の量は、約２５ｎｇ〜約１μｇの範囲であり、そしてより好ましくは、約５０ｎｇ〜約５００ｎｇの範囲である。このような試験は、代表的には、非常に少ない量の生物学的サンプルを用いて実施され得る。
【０２７３】
当然、本発明の腫瘍タンパク質または結合剤との使用に適する多数の他のアッセイ手順が存在する。上記の記載は、例示のみを意図する。例えば、上記手順が、腫瘍ポリペプチドを使用するために容易に改変され得、生物学的サンプル内でこのようなポリペプチドに結合する抗体を検出し得ることが当業者に明かである。このような腫瘍タンパク質特異的抗体の検出は、癌の存在と相関し得る。
【０２７４】
癌はまた、あるいは代替的に、生物学的サンプル中の腫瘍タンパク質と特異的に反応するＴ細胞の存在に基づいて検出され得る。特定の方法では、患者から単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を含む生物学的サンプルは、腫瘍ポリペプチド、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび／またはこのようなポリペプチドの少なくとも免疫原性部分を発現するＡＰＣとともにインキュベートされ、そしてＴ細胞の特異的活性化の存在または非存在が検出される。適切な生物学的サンプルとしては、単離されたＴ細胞が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、Ｔ細胞は、慣用的な技術によって（例えば、末梢血リンパ球のＦｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離法によって）患者から単離され得る。Ｔ細胞は、２〜９日間（代表的に４日間）、３７℃にてポリペプチド（例えば、５〜２５μｇ／ｍｌ）とともにインビトロでインキュベートされ得る。Ｔ細胞サンプルの別のアリコートを、コントロールとして役立てるために、腫瘍ポリペプチドの非存在下でインキュベートすることが所望され得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞に関して、活性化は好ましくは、Ｔ細胞の増殖を評価することによって検出される。ＣＤ８＋Ｔ細胞に関しては、活性化は好ましくは、細胞溶解活性を評価することによって検出される。疾患を有さない患者におけるよりも少なくとも２倍高い増殖レベルおよび／または少なくとも２０％高い細胞溶解活性レベルは、患者における癌の存在を示す。
【０２７５】
上記のように、癌はまた、あるいは代替的に、生物学的サンプル中の腫瘍タンパク質をコードするｍＲＮＡレベルに基づいて検出され得る。例えば、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づくアッセイにおいて用いて、生物学的サンプルに由来する腫瘍ｃＤＮＡの一部を増幅し得る。ここで、オリゴヌクレオチドプライマーのうちの少なくとも１つは、腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドに特異的である（すなわち、ハイブリダイズする）。次いで、増幅されたｃＤＮＡが、当該分野で周知の技術（例えば、ゲル電気泳動）を用いて分離され、そして検出される。
【０２７６】
同様に、腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いて、生物学的サンプル中でこの腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドの存在を検出し得る。
【０２７７】
アッセイ条件下でのハイブリダイゼーションを可能にするために、オリゴヌクレオチドのプライマーおよびプローブは、少なくとも１０ヌクレオチド、そして好ましくは少なくとも２０ヌクレオチドの長さの、本発明の腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドの一部に対して少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７５％、そしてより好ましくは少なくとも約９０％の同一性を有するオリゴヌクレオチド配列を含むべきである。好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブは、上記に規定されるような、中程度にストリンジェントな条件下で、本明細書中に記載されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする。本明細書中に記載される診断方法において有用に用いられ得るオリゴヌクレオチドのプライマーおよび／またはプローブは、好ましくは、少なくとも１０〜４０ヌクレオチドの長さである。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーは、本明細書中に開示される配列を有するＤＮＡ分子の少なくとも１０連続するヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１５連続するヌクレオチドを含む。ＰＣＲに基づくアッセイおよびハイブリダイゼーションアッセイの両方についての技術は、当該分野で周知である（例えば、Ｍｕｌｌｉｓら，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，５１：２６３，１９８７；Ｅｒｌｉｃｈ編，ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９を参照のこと）。
【０２７８】
１つの好ましいアッセイは、ＲＴ−ＰＣＲを用い、ここで、ＰＣＲは、逆転写と組み合わせて適用される。代表的に、ＲＮＡは生物学的サンプル（例えば、生検組織）から抽出され、そして逆転写されてｃＤＮＡ分子を生成する。少なくとも１つの特異的プライマーを用いるＰＣＲ増幅は、ｃＤＮＡ分子を生成し、このｃＤＮＡ分子は、例えば、ゲル電気泳動を用いて分離および可視化され得る。増幅は、試験患者および癌に罹患していない個体から採取された生物学的サンプルについて行われ得る。増幅反応は、２桁の大きさに及ぶいくつかのｃＤＮＡ希釈物について行われ得る。試験患者サンプルのいくつかの希釈物における発現の増加が、癌のないサンプルの同一希釈の物と比較して２倍以上である場合、これは、代表的に、陽性とみなされる。
【０２７９】
本発明の別の局面において、細胞捕捉技術は、例えば、リアルタイムＰＣＲとともに使用されて、乳房腫瘍抗原を発現する転移性細胞の検出のためのより高感度のツールを提供し得る。生物学的サンプル（例えば、骨髄サンプル、末梢血サンプル、および小さな針による吸引サンプル）中の乳癌細胞の検出は、乳癌患者における診断および予後のために望ましい。
【０２８０】
細胞表面マーカーに特異的なモノクローナル抗体またはテトラマー抗体複合体を被覆した免疫磁性ビーズは、サンプル中のガン細胞を最初に富化またはポジティブ選択するために使用され得る。種々の市販のキットが使用され得、これらのキットとしては、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈ（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）、ＳｔｅｍＳｅｐＴＭ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）、およびＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が挙げられる。当業者は、他の方法論を認識し、キットはまた、所望の細胞集団を富化またはポジティブ選択するために使用され得る。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈは、正常上皮組織および新生物上皮組織上で発現される２つの糖タンパク質膜抗原に特異的なｍＡｂを被覆した磁性ビーズを含む。この被覆されたビーズがサンプルに添加され得、次いで、そのサンプルは、磁石に適用され、それにより、ビーズに結合した細胞が捕捉され得る。所望されない細胞は、洗い流され、磁石により単離された細胞は、ビーズから溶出され、さらなる分析において使用される。
【０２８１】
ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐは、血液サンプルから直接細胞を富化するために使用され得、種々の所望されない細胞を標的とし、サンプル中に存在する赤血球（ＲＢＣ）上のグリコホリンＡにこの細胞を架橋して、ロゼットを形成するテトラマー抗体のカクテルからなる。Ｆｉｃｏｌｌに対して遠心分離した場合、標的化された細胞は、遊離ＲＢＣとともにペレット化する。除去カクテル中の抗体の組み合わせにより、どの細胞が除去され、同時にどの細胞が回収されるかが決定される。利用可能な抗体としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５６、ＣＤ６６Ｂ、ＣＤ６６ｅ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩｇＥおよびＴＣＲαβ。
【０２８２】
さらに、乳房腫瘍抗原に特異的なｍＡｂが生成され得、同様の様式にて使用され得ることが、本発明において企図される。例えば、腫瘍特異的細胞表面抗原に結合するｍＡｂは、磁性ビーズに結合体化され得るか、またはテトラマー抗体複合体に処方され得、そしてサンプルから転移性乳房腫瘍細胞を富化またはポジティブ選択するために使用され得る。一旦サンプルが富化またはポジティブ選択されると、細胞は溶解され得、ＲＮＡが単離され得る。次いで、ＲＮＡは、乳房腫瘍特異的プライマーを使用して、本明細書中に記載されるようにリアルタイムＰＣＲアッセイにおいて、ＲＴ−ＰＣＲ分析に供され得る。当業者は、富化または選択された集団の細胞が、他の方法（例えば、インサイチュハイブリダイゼーションまたはフローサイトメトリー）によって分析され得ることを認識する。
【０２８３】
別の実施形態において、本明細書中に記載の組成物は、癌の進行についてのマーカーとして使用され得る。この実施形態において、癌の診断のための上記のアッセイは、経時的に行われ得、反応性ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルの変化が評価され得る。例えば、このアッセイは、６ヶ月から１年の期間にわたり、２４〜７２時間毎に行われ得、その後、必要に応じて行われ得る。一般に、癌は、検出されるポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルが経時的に増大する患者において進行している。対照的に、その癌は、反応性ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルが、一定のままであるかまたは時間とともに減少するかのいずれかの場合は、進行しない。
【０２８４】
特定のインビボ診断アッセイは、腫瘍に対して直接行われ得る。１つのこのようなアッセイは、腫瘍細胞と結合剤とを接触させる工程を包含する。次いで、結合した結合剤は、直接的に、またはレポーター基を介して間接的に検出され得る。このような結合剤はまた、組織学的適用において使用され得る。あるいは、ポリヌクレオチドプローブが、このような適用内で使用され得る。
【０２８５】
上記のように、感度を改善するために、複数の腫瘍タンパク質マーカーが、所定のサンプル内でアッセイされ得る。本明細書中に提供される異なるタンパク質に特異的な結合剤が、単一のアッセイ内で合わされ得ることが明らかである。さらに。複数のプライマーまたはプローブが、同時に使用され得る。腫瘍タンパク質マーカーの選択は、慣用的な実験に基づき、最適な感度を生じる組み合わせが決定され得る。さらに、または代わりに、本明細書中に提供される腫瘍タンパク質についてのアッセイは、他の既知の腫瘍抗原についてのアッセイと組み合わされ得る。
【０２８６】
本発明はさらに、上記の診断方法のいずれかにおける使用のためのキットを提供する。このようなキットは、代表的には、診断アッセイを行うために必要な２以上の成分を含む。成分は、化合物、試薬、容器、および／または装置であり得る。例えば、キット内の１つの容器が、腫瘍タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含み得る。このような抗体またはフラグメントは、上記のように、支持体材料に結合して提供され得る。１以上のさらなる容器は、このアッセイにおいて使用されるべき、試薬または緩衝液のような要素を封入し得る。このようなキットはまた、または代わりに、抗体結合の直接的検出または間接的検出に適切なレポーター基を含む、上記のような検出試薬を含み得る。
【０２８７】
あるいは、キットは、生物学的サンプル中の腫瘍タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを検出するように設計され得る。このようなキットは、一般に、上記のような、腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを含む。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲまたはハイブリダイゼーションアッセイ内で使用され得る。このようなキット内に存在し得るさらなる成分は、腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドの検出を容易にするために、第２のオリゴヌクレオチドおよび／または診断試薬あるいは容器を含む。
【実施例】
【０２８８】
以下の実施例は、例示のために提供されるのであって、限定のために提供されるのではない。
【０２８９】
（実施例）
（実施例１）
（ディファレンシャルディスプレイＲＴ−ＰＣＲを使用する、乳房腫瘍特異的ｃＤＮＡの調製）
この実施例は、ディファレンシャルディスプレイスクリーニングを使用する、乳房腫瘍特異的ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ分子の調製を説明する。
【０２９０】
（Ａ．Ｂ１８Ａｇ１  ｃＤＮＡの調製およびｍＲＮＡ発現の特徴付け）
組織サンプルを、乳癌を患う患者の乳房腫瘍組織および正常組織から調製し、これを、患者からサンプルを取り出した後、病理学によって確認した。正常ＲＮＡおよび腫瘍ＲＮＡをこのサンプルから抽出し、そしてｍＲＮＡを単離し、そして（ｄＴ）１２ＡＧ（配列番号１３０）アンカー３’プライマーを使用して、ｃＤＮＡへ変換した。次いで、ディファレンシャルディスプレイＰＣＲを、無作為に選択したプライマー（ＣＴＴＣＡＡＣＣＴＣ）（配列番号１０３）を使用して実行した。増幅条件は、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｐｍｏｌのプライマー、５００ｐｍｏｌ  ｄＮＴＰおよび１単位のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ、ＮＪ）を含む標準的な緩衝液であった。４０サイクルの増幅を、９４℃で３０秒間の変性、４２℃で１分間のアニーリング、そして７２℃で３０秒間の伸長、を使用して実行した。７６の増幅産物を含むＲＮＡフィンガープリントを得た。乳房腫瘍組織のＲＮＡフィンガープリントは、正常乳房組織のＲＮＡフィンガープリントと９８％を超えて同一であったが、バンドは、腫瘍のＲＮＡフィンガープリントパターンに特異的であることが繰り返し観察された。このバンドを銀染色されたゲルから切り出し、Ｔベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）中にサブクローニングし、そして配列決定した。
【０２９１】
このｃＤＮＡの配列（Ｂ１８Ａｇ１という）は、配列番号１に提供される。ＧＥＮＢＡＮＫおよびＥＭＢＬのデータベース検索により、最初にクローニングされたＢ１８Ａｇ１フラグメントが、内因性ヒトレトロウイルスエレメントＳ７１（これは、シミアン肉腫ウイルス（ＳＳＶ）に相同な短縮型レトロウイルスエレメントである）に７７％同一であることが明らかになった。Ｓ７１は、不完全なｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子の一部および３’末端にＬＴＲ様構造を含む（Ｗｅｒｎｅｒら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７４：２２５−２３８（１９９０）を参照のこと）。Ｂ１８Ａｇ１はまた、Ｐ３０（ｇａｇ）遺伝子座に対応する領域中のＳＳＶに対して６４％同一である。Ｂ１８Ａｇ１は、哺乳動物に感染するレトロウイルスの広範な種々のｇａｇタンパク質にかなりの相同性を共有する領域を含む、３つの別個かつ不完全なリーディングフレームを含む。さらに、Ｓ７１に対する相同性は、単にｇａｇ遺伝子内にあるのではなく、ＬＴＲを含む配列の数ｋｂにまたがる。
【０２９２】
Ｂ１８Ａｇ１特異的ＰＣＲプライマーを、コンピュータ分析ガイドラインを使用して合成した。ＲＴ−ＰＣＲ増幅（９４℃、３０秒；６０℃→４２℃、３０秒；７２℃、３０秒を４０サイクル）により、Ｂ１８Ａｇ１が、患者の乳房腫瘍組織中に比較的高レベルで存在する実際のｍＲＮＡ配列を示すことを確認した。増幅において使用されるプライマーは、３．５ｍＭ  マグネシウム濃度およびｐＨ８．５にてＢ１８Ａｇ１−１（ＣＴＧ  ＣＣＴ  ＧＡＧ  ＣＣＡ  ＣＡＡ  ＡＴＧ）（配列番号１２８）およびＢ１８Ａｇ１−４（ＣＣＧ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＧＡＡ  ＧＣＴ  ＡＧＡ  ＧＧＡ  ＡＴＡ）（配列番号１２９）、ならびに２ｍＭ  マグネシウム（ｐＨ９．５）にてＢ１８Ａｇ１−２（ＡＴＧ  ＧＣＴ  ＡＴＴ  ＴＴＣ  ＧＧＧ  ＧＣＣ  ＴＧＡ  ＣＡ）（配列番号１２６）およびＢ１８Ａｇ１−３（ＣＣＧ  ＧＴＡ  ＴＣＴ  ＣＣＴ  ＣＧＴ  ＧＧＧ  ＴＡＴ  Ｔ）（配列番号１２７）であった。同じ実験により、この患者の正常乳房組織では、発現のレベルが存在しない程度まで非常に低いことが示された（図１を参照のこと）。次いで、ＲＴ−ＰＣＲ実験を使用して、Ｂ１８Ａｇ１  ｍＲＮＡが、９つの他の乳房腫瘍サンプル（ブラジル人患者およびアメリカ人患者由来）において存在するが、各癌患者に対応する正常乳房組織において存在しないかまたは非常に低いレベルであることを示した。ＲＴ−ＰＣＲ分析はまた、Ｂ１８Ａｇ１転写産物が、種々の正常な組織（リンパ節、心筋および肝臓を含む）において存在せず、比較的低レベルでＰＢＭＣおよび肺組織中に存在することを示した。乳房腫瘍サンプル中にはＢ１８Ａｇ１  ｍＲＮＡが存在し、正常乳房組織にはそれが存在しないことが、図２において示されるように、ノーザンブロット分析により確認された。
【０２９３】
乳房腫瘍組織中のＢ１８Ａｇ１の差示的発現はまた、ＲＮａｓｅ保護アッセイにより確認された。図３は、種々の組織型におけるＢ１８Ａｇ１  ｍＲＮＡのレベルが、４つの異なるＲＮａｓｅ保護アッセイにおいて決定されたことを示す。レーン１〜１２は、種々の正常乳房組織サンプルを示し、レーン１３〜２５は、種々の乳房腫瘍サンプルを示し；レーン２６〜２７は、正常前立腺サンプルを示し；レーン２８〜２９は、前立腺腫瘍サンプルを示し；レーン３０〜３２は、結腸腫瘍サンプルを示し；レーン３３は、正常大動脈を示し；レーン３４は、正常小腸を示し；レーン３５は、正常皮膚を示し、レーン３６は、正常リンパ節を示し；レーン３７は、正常卵巣を示し；レーン３８は、正常肝臓を示し；レーン３９は、正常骨格筋を示し；レーン４０は、第１の正常胃サンプルを示し、レーン４１は、第２の正常胃サンプルを示し；レーン４２は、正常肺を示し；レーン４３は、正常腎臓を示し；ならびにレーン４４は、正常膵臓を示す。実験間比較を、ポジティブコントロールＲＮＡである既知のβ−アクチンのメッセージ量を各アッセイに含め、異なるアッセイの結果を、このポジティブコントロールに対して正規化することによって、容易にした。
【０２９４】
ＲＴ−ＰＣＲおよびサザンブロット分析は、Ｂ１８Ａｇ１遺伝子座が、単一コピーの内因性レトロウイルスエレメントとして、ヒトゲノムＤＮＡに存在することを示した。約１２〜１８ｋｂのゲノムクローンを、最初のＢ１８Ａｇ１配列をプローブとして使用して単離した。４つのさらなるサブクローンもまた、ＸｂａＩ消化により単離した。これらのクローンのＸｂａｌ消化の末端から得られたさらなるレトロウイルス配列（図４に示されるように位置する）は、配列番号３〜配列番号１０として示され、ここで配列番号３は、図４において１０と表示された配列の位置を示し、配列番号４は、１１〜２９と表示された配列の位置を示し、配列番号５は、３と表示された配列の位置を示し、配列番号６は、６と表示された配列の位置を示し、配列番号７は、１２と表示された配列の位置を示し、配列番号８は、１３と表示された配列の位置を示し、配列番号９は、１４と表示された配列の位置を示し、そして配列番号１０は、１１〜２２と表示された配列の位置を示す。
【０２９５】
その後の研究により、図５Ａおよび５Ｂに示されるように、１２〜１８ｋｂのゲノムクローンが、約７．７５ｋｂのレトロウイルスエレメントを含むことが示された。このレトロウイルスエレメントの配列を、配列番号１４１に示す。図５Ａの先頭の番号付けされた線は、レトロウイルスゲノムクローンのセンス鎖配列を示す。この線の下のボックスは、選択される制限部位の位置を示す。矢印は、レトロウイルスエレメントを配列決定するために使用される異なる重複クローンを示す。矢印の方向は、シングルパス（ｓｉｎｇｌｅ−ｐａｓｓ）サブクローン配列が、センス鎖またはアンチセンス鎖に対応するか否かを示す。図５Ｂは、エレメント内のウイルス遺伝子の組織化を示す、Ｂ１８Ａｇ１を含むレトロウイルスエレメントの模式図である。白抜きボックスは、エレメント全体を通して見いだされるメチオニンで開始する、推定リーディングフレームに対応する。ボックスの左側に示されるように、センス鎖に見いだされるフレームに対応するフレーム１〜３とともに、６つのあり得るリーディングフレームの各々が示される。
【０２９６】
配列番号１のｃＤＮＡをプローブとして用いて、より長いｃＤＮＡを得た（配列番号２２７）。これは、配列番号１４１に示されるゲノム配列と比較して、わずかなヌクレオチドの差異（１％未満）を含む。
【０２９７】
（Ｂ．他の乳房腫瘍特異的ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ分子の調製）
正常ＲＮＡおよび腫瘍ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡを単離して、（ｄＴ）１２ＡＧアンカー３’プライマーを用いて、上記のようにｃＤＮＡに変換した。次いで、配列番号８７〜１２５のランダムに選択されたプライマーを使用して、ディファレンシャルディスプレイＰＣＲを行った。増幅条件は、上記のとおりであり、腫瘍のＲＮＡフィンガープリントパターンに特異的であると認められたバンドを、銀染色ゲルから切り出し、Ｔ−ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）またはｐＣＲＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のいずれかにサブクローニングし、配列決定した。その配列を、配列番号１１〜配列番号８６に提供する。単離された７９個の配列のうち、６７個が、新規であることが分かった（配列番号１１〜２６および２８〜７７）（図６〜２０もまた参照のこと）。
【０２９８】
抗原Ｂ１５Ａｇ１（元来は、配列番号２７において提供される同定された部分配列）についての伸長したＤＮＡ配列（配列番号２９０）を、さらなる研究において得た。配列番号２９０の配列と、上記のようにジーンバンクにおける配列とを比較すると、既知のヒトβ−Ａアクチビン遺伝子に対する相同性が明らかになった。さらなる研究により、抗原Ｂ２１ＧＴ２（Ｂ３１１Ｄともいわれる；元来は、配列番号５６において提供される、同定された部分ｃＤＮＡ配列）についての全長ｃＤＮＡ配列の単離がもたらされた。全長配列を、配列番号３０７に提供し、対応するアミノ酸配列を配列番号３０８に提供する。さらなる研究により、Ｂ３１１Ｄのスプライス改変体の単離がもたらされた。配列番号３１６のＢ３１１Ｄクローンを配列決定し、このクローンからのＸｈｏＩ／ＮｏｔＩフラグメントをゲル精製し、さらなるスクリーニングのためのプローブとして使用するために、ランダムプライミングにより３２Ｐ−ｃＤＴＰ標識して、さらなるＢ３１１Ｄ遺伝子配列を得た。ヒト乳房腫瘍ｃＤＮＡ細菌ライブラリーの２つの画分を、標準的技術を使用してスクリーニングした。このようにして単離されたクローンのうちの１つから、ポリＡ＋テールを含むさらなる配列が得られた。このクローン（Ｂ３１１＿ＤＴ１＿１Ａといわれる）の決定されたｃＤＮＡ配列を、配列番号３１７に提供する。配列番号３１６および３１７の配列は、配列番号３１７のポリＡ＋配列の近辺で分岐した配列を有する４６４ｂｐ領域にわたって同一性を共有することが見出された。
【０２９９】
その後の研究により、さらに１４６個の配列（配列番号１４２〜２８９）を同定し、そのうち、１１５個が新規であるようである（配列番号１４２、１４３、１４６〜１５２、１５４〜１６６、１６８〜１７６、１７８〜１９２、１９４〜１９８、２００〜２０４、２０６、２０７、２０９〜２１４、２１６、２１８、２１９、２２１〜２４０、２４３〜２４５、２４７、２５０、２５１、２５３、２５５、２５７〜２６６、２６８、２６９、２７１〜２７３、２７５、２７６、２７８、２８０、２８１、２８４、２８８および２９１）。本発明者らの知る限りでは、以前に同定された配列のいずれも、これまでに、正常乳房組織よりヒト乳房腫瘍組織において大きなレベルで発現されることが示されていない。
【０３００】
さらなる研究において、いくつかの異なるスプライス形態の抗原Ｂ１１Ａｇ１（Ｂ３０５Ｄともいわれる）が単離され、種々のスプライス形態の各々は、Ｂ１１Ａｇ１コードフレームのわずかに異なるバリエーションを含んでいた。スプライス接合配列は、種々のパターンおよび構成において、種々のスプライス形態を構成する個々のエキソンを規定する。プライマーを設計して、以下に記載のようにＲＴ−ＰＣＲを使用して、エキソンの各々の発現パターンを試験した。各々のエキソンは、元来のＢ１１Ａｇ１クローンと同じ発現パターンを示すことが見いだされ、発現は、乳房腫瘍特異的、正常前立腺特異的および正常精巣特異的であった。単離されたタンパク質のコードエキソンについて決定されたｃＤＮＡ配列を、それぞれ、配列番号２９２〜２９８に提供する。配列番号２９２および２９８の配列に対応する推定アミノ酸配列を、配列番号２９９および３００に提供する。ｃＤＮＡ末端の迅速な増幅（ＲＡＣＥ）、上記のＢ１１Ａｇ１のスプライス形態のうちの１つに対する５’特異的プライマーおよび乳房腺癌を用いたさらなる研究により、３つのさらなる関連したスプライス形態（アイソフォームＢ１１Ｃ−１５、Ｂ１１Ｃ−８およびＢ１１Ｃ−９，１６といわれる）の単離がもたらされた。これらのアイソフォームについての決定されたｃＤＮＡ配列を、配列番号３０１〜３０３に提供し、その対応する推定アミノ酸配列を、配列番号３０４〜３０６に提供する。
【０３０１】
Ｂ１１Ｃ−１５（配列番号３０１；Ｂ３０５ＤアイソフォームＣともいわれる）のタンパク質コード領域を、Ｇｅｎｂａｎｋ  ＤＮＡデータベースのＢＬＡＳＴＮ検索において、クエリー配列として使用した。マッチを、第２１染色体からのゲノムクローン（登録番号ＡＰ００１４６５）に対して見出した。ＢＬＡＳＴＮ出力において提供される対形成様式の整列を使用して、推定エキソンまたはＢ３０５Ｄ配列に対応する第２１染色体配列のコード配列を同定した。ＢｌａｓｔＮ対形成様式整列に基づいて、ＧｅｎＢａｎｋ記録ＡＰ００１４６５の以下の一部を、まとめた：塩基対６７９７８〜６８４９９、７２８７０〜７２９８７、７３１４４〜７３３３５、７６０８５〜７６２０６、７７９０５〜７８０８５、８０５２０〜８０６２４、８７６０２〜８７６３３。次いで、この配列を、ＤＮＡ  Ｓｔａｒ  Ｓｅｑｍａｎプログラムを用いてＢ３０５ＤアイソフォームＣ配列と整列させ、余分の配列を、Ｂ３０５Ｄに最も類似する配列を維持するような方法にて削除した。第２１染色体配列の最終的な編集形態は、Ｂ３０５Ｄと９６．５％同一であった。次いで、この第２１染色体から得られた編集配列を翻訳すると、Ｂ３０５Ｄの位置と同じ位置で最終終止コドン以外の終止コドンを含まないことが分かった。Ｂ３０５Ｄと同様に、第２１染色体配列（配列番号３２５に提供される）は、３８４アミノ酸を有するタンパク質（配列番号３２６）をコードした。このタンパク質と、Ｂ３０５ＤアイソフォームＣタンパク質（配列番号３０４）との整列は、９０％のアミノ酸同一性を示した。
【０３０２】
Ｂ３０５ＤアイソフォームＣ（配列番号３０１）のｃＤＮＡ配列を使用して、Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＨＴＧＳ）データベース（ＮＣＢＩ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｆｏｒ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）を検索することによって、ホモログを同定した。ホモログを、第２染色体（クローンＩＤ  ９８３８１８１）、第１０染色体（クローンＩＤ  １０９３３０２２）、第１５染色体（クローンＩＤ  １１５６０２８４）に対して同定した。これらのホモログは、核酸レベルにてＢ３０５ＤアイソフォームＣと９０％を超える同一性を共有した。これらのホモログの３つ全てが、３８４アミノ酸のＯＲＦをコードし、配列番号３０４のアミノ酸配列と９０％を超える同一性を共有する。配列番号３０１の配列を用いたＧｅｎＢａｎｋデータベースのさらなる検索により、第２２染色体（クローンＩＤ  ５９３１５０７）に対して部分配列ホモログが得られた。第２染色体ホモログ、第１０染色体ホモログ、第１５染色体ホモログ、および第２２染色体ホモログについてのｃＤＮＡ配列を、Ｂ３０５ＤアイソフォームＣとの相同性およびイントロン−エキソン接合部のその保存配列に基づいて構築した。第２２染色体ホモログ、第２染色体ホモログ、第１５染色体ホモログおよび第１０染色体ホモログについてのｃＤＮＡ配列を、それぞれ、配列番号３２７〜３３０に提供し、その対応するアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号３３１、３３４、３３３および３３２に提供する。
【０３０３】
続くＢ３０５ＤアイソフォームＡ（配列番号２９２で示されるｃＤＮＡ配列）についての研究において、ｃＤＮＡ配列（配列番号３１３で示される）は、８８４位にさらなるグアニン残基（これはオープンリーディングフレームにおけるフレームシフトを生じる）を含むことが見出された。このＯＲＦの決定されたＤＮＡ配列を、配列番号３１４で示す。このフレームシフトは、Ｂ３０５Ｄの他のアイソフォームと共通しているＣ末端ドメインを含むが、Ｎ末端領域において異なる２９３アミノ酸のタンパク質配列（配列番号３１５で示される）を生成する。
【０３０４】
（実施例２）
（ヒトゲノムＤＮＡからのＢ１８Ａｇ１  ＤＮＡの調製）
この実施例は、ヒトゲノムＤＮＡからの増幅によるＢ１８Ａｇ１  ＤＮＡの調製を例示する。
【０３０５】
Ｂ１８Ａｇ１  ＤＮＡを、以下の増幅パラメータを使用し、２０ｐｍｏｌのＢ１８Ａｇ１特異的プライマー、５００ｐｍｏｌのｄＮＴＰＳおよび１ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，ＮＪ）を使用して、２５０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡから調製し得る：９４℃で３０秒間の変性、６０℃〜４２℃で３０秒間のタッチダウンアニーリング（２サイクルごとに２℃上昇）、および７２℃で３０秒間の伸長。最後の上昇（４２℃のアニーリング温度）は、２５回繰り返されるべきである。プライマーを、コンピュータ分析を使用して選択した。合成したプライマーは、Ｂ１８Ａｇ１−１、Ｂ１８Ａｇ１−２、Ｂ１８Ａｇ１−３、およびＢ１８Ａｇ１−４であった。使用され得るプライマー対は、１＋３、１＋４、２＋３および２＋４である。
【０３０６】
ゲル電気泳動の後、Ｂ１８Ａｇ１ＤＮＡに対応するバンドを切り取り、そして適切なベクターにクローニングし得る。
【０３０７】
（実施例３）
（乳房腫瘍ｃＤＮＡからのＢ１８Ａｇ１  ＤＮＡの調製）
本実施例は、ヒト乳房腫瘍ｃＤＮＡからの増幅による、Ｂ１８Ａｇ１  ＤＮＡの調製を例示する。
【０３０８】
第１鎖（ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ）ｃＤＮＡを、５００ｎｇのポリＡ＋ＲＮＡ、２００ｐｍｏｌのプライマー（Ｔ）１２ＡＧ（すなわち、ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＡＧ）（配列番号１３０）、１×第１鎖逆転写酵素緩衝液、６．７ｍＭのＤＴＴ、５００ｍｍｏｌのｄＮＴＰ、および１ユニットのＡＭＶまたはＭＭＬＶ逆転写酵素（任意の供給業者（例えば、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ））から）を３０μｌの最終容量で含む反応混合液において、ヒト乳房腫瘍組織から調製したＲＮＡから合成した。第１鎖合成の後に、このｃＤＮＡを、およそ２５倍に希釈して、そして１μｌを、実施例２に記載されるような増幅に使用した。いくつかのプライマー対が、転写物の不均一な集団を生じ得るが、プライマーＢ１８Ａｇ１−２（５’ＡＴＧ  ＧＣＴ  ＡＴＴ  ＴＴＣ  ＧＧＧ  ＧＧＣ  ＴＧＡ  ＣＡ）（配列番号１２６）およびＢ１８Ａｇ１−３（５’ＣＣＧ  ＧＴＡ  ＴＣＴ  ＣＣＴ  ＣＧＴ  ＧＧＧ  ＴＡＴ  Ｔ）（配列番号１２７）は、単一の１５１ｂｐの増幅産物を生じる。
【０３０９】
（実施例４）
（Ｂ１８Ａｇ１のＢ細胞およびＴ細胞のエピトープの同定）
本実施例は、Ｂ１８Ａｇ１エピトープの同定を例示する。
【０３１０】
Ｂ１８Ａｇ１配列を、種々のコンピュータアルゴリズムを使用してスクリーニングし得る。Ｂ細胞エピトープを決定するために、この配列を、Ｈｏｐｐ，Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．１７２Ｂ：３６７〜７７（１９８５）またはＣｅａｓｅら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６４：１７７９〜８４（１９８６）もしくはＳｐｏｕｇｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：２０４〜１２（１９８７）の方法を使用して、疎水性および親水性の値についてスクリーニングし得る。さらなるクラスＩＩ  ＭＨＣ（抗体またはＢ細胞）エピトープを、ＡＭＰＨＩのようなプログラム（例えば、Ｍａｒｇａｌｉｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：２２１３（１９８７））またはＲｏｔｈｂａｒｄおよびＴａｙｌｏｒの方法（例えば、ＥＭＢＯ  Ｊ．７：９３（１９８８））を使用して、推定し得る。
【０３１１】
一旦、これらの技術を使用してペプチド（１５〜２０アミノ酸長）を同定すると、個々のペプチドを、自動化ペプチド合成装置（製造業者（例えば、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から入手可能）およびメリーフィールド合成のような技術を使用して合成し得る。合成の後に、このペプチドを使用して、乳癌を患う患者がこのペプチドと反応する抗体を保有するか否かを決定するために、健常者または乳癌患者のいずれかから収集した血清をスクリーニングし得る。乳癌患者におけるこのような抗体の存在により、問題となる特異的Ｂ細胞エピトープの免疫原性が確認される。このペプチドをまた、インビボでの免疫後に動物（マウス、ラット、ウサギ、チンパンジー（ｃｈｉｍｐｓ）など）において血清学的免疫または液性免疫を生じるそれらの能力について試験し得る。このような免疫の後のペプチド特異的抗血清の生成により、問題となる特異的Ｂ細胞エピトープの免疫原性がされに確認される。
【０３１２】
Ｔ細胞エピトープを同定するために、Ｂ１８Ａｇ１配列を、ＨＬＡクラスＩ  ＭＨＣ分子に結合し得るＢ１８Ａｇ１配列内の８〜１０個のアミノ酸モチーフを同定するのに有用である、異なるコンピュータアルゴリズムを使用してスクリーニングし得る（例えば、Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４１：１７８〜２２８（１９９５）を参照のこと）。合成後に、このようなペプチドを、標準的な結合アッセイ（例えば、Ｓｅｔｔｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：５５８６〜９２（１９９４））を使用して、クラスＩ  ＭＨＣに結合するそれらの能力について試験し得、そしてより重要なことに、患者または正常な末梢単核細胞のインビトロ刺激の後に、抗原反応性細胞傷害性Ｔ細胞を生成するそれらの能力について、例えば、Ｂａｋｋｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５：５３３０−３４（１９９５）；Ｖｉｓｓｅｒｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：３９９１−９８（１９９５）；Ｋａｗａｋａｍｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：３９６１−６８（１９９５）；およびＫａｓｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３９０４−１２（１９９４）の方法を使用して、試験し得る。インビトロでのペプチド刺激の後の、自系（同じクラスＩ  ＭＨＣ分子を保有する）腫瘍細胞を殺傷し得るＴ細胞のインビトロでの首尾よい生成により、Ｂ１８Ａｇ１抗原の免疫原性がさらに確認される。さらに、このようなペプチドを使用して、特定のヒトＭＨＣクラスＩハプロタイプを発現するようにトランスジェニックされたマウスにおけるインビボでの免疫の後に、マウスペプチドおよびＢ１８Ａｇ１反応性細胞傷害性Ｔ細胞を生成し得る（Ｖｉｔｉｅｌｌｏら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１００７〜１５（１９９１））。
【０３１３】
推定ＨＬＡクラスＩ  ＭＨＣ結合抗原に従って破壊された、推定Ｂ１８Ａｇ１  Ｂ細胞およびＴ細胞のエピトープの代表的な表を、以下に示す：
推定Ｔｈモチーフ（Ｂ細胞エピトープ）（配列番号１３１〜１３３）
ＳＳＧＧＲＴＦＤＤＦＨＲＹＬＬＶＧＩ
ＱＧＡＡＱＫＰＩＮＬＳＫＸＩＥＶＶＱＧＨＤＥ
ＳＰＧＶＦＬＥＨＬＱＥＡＹＲＩＹＴＰＦＤＬＳＡ
推定ＨＬＡ  Ａ２．１モチーフ（Ｔ細胞エピトープ）（配列番号１３４〜１４０）
ＹＬＬＶＧＩＱＧＡ
ＧＡＡＱＫＰＩＮＬ
ＮＬＳＫＸＩＥＶＶ
ＥＶＶＱＧＨＤＥＳ
ＨＬＱＥＡＹＲＩＹ
ＮＬＡＦＶＡＱＡＡ
ＦＶＡＱＡＡＰＤＳ
。
【０３１４】
（実施例５）
（Ｂ１１Ａｇ１のＴ細胞エピトープの同定）
本実施例は、Ｂ１１Ａｇ１（Ｂ３０５Ｄともいわれる）エピトープの同定を例示する。Ｂ１１−８、Ｂ１１−１、Ｂ１１−５およびＢ１１−１２といわれる４つのペプチド（それぞれ、配列番号３０９〜３１２）を、Ｂ１１Ａｇ１遺伝子から得た。
【０３１５】
ヒトＣＤ８  Ｔ細胞を、Ｖａｎ  Ｔｓａｉら（Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １８：６５−７５，１９９８）のプロトコルに従って、樹状細胞を使用してペプチドＢ１１−８に対してインビトロでプライムした。得られたＣＤ８  Ｔ細胞培養物を、Ｂ−ＬＣＬ株ＪＹによって提示された、Ｂ１１−８ペプチドまたは陰性コントロールペプチドを認識するそれらの能力について試験した。簡潔には、Ｔ細胞を、１０μｇ／ｍｌのペプチド、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７および１０μｇ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で自系単球とともにインキュベートし、そして標準的な５１−Ｃｒ放出アッセイにおいて標的細胞を特異的に溶解するそれらの能力についてアッセイした。図２２に示されるように、バルク培養株は、Ｂ１１−８ペプチドの強力な認識、およびペプチドＢ１１−１の弱い認識を実証した。
【０３１６】
このＣＴＬ株由来のクローンを、モノクローナル抗体ＯＫＴ３およびヒトＩＬ−２を使用する迅速な増殖後に単離した。図２３に示されるように、このクローン（Ａ１といわれる）は、特定のペプチドを認識し得ることに加えて、Ｂ１１Ａｇ１遺伝子で形質導入されたＪＹ  ＬＣＬを認識した。このデータは、Ｂ１１−８がＢ１１Ａｇ１遺伝子の天然にプロセスされるエピトープであることを実証する。さらに、これらのＴ細胞は、ＨＬＡ−Ａ２制限様式において、Ｂ１１Ａｇ１を天然に発現している樹立腫瘍細胞株を認識しそして溶解することがさらに見出された（図２４）。このＴ細胞は、ＨＬＡ−Ａ２で形質導入されたＢ１１Ａｇ１を天然に発現している肺腺癌（ＬＴ−１４０−２２）、およびＢ１１Ａｇ１で形質導入されたＡ２＋乳癌（ＣＡＭＡ−１）を強力に認識するが、非形質導入株または別の陰性腫瘍株（ＳＷ６２０）を強力に認識しない。
【０３１７】
これらのデータは、これらのヒトＴ細胞がＢ１１特異的ペプチドのみでなく、形質導入された細胞および天然に発現する腫瘍株もまた認識することを明確に実証する。
【０３１８】
上記の手順を使用して、抗原Ｂ１１−５およびＢ１１−１２に対して惹起されたＣＴＬ株は、対応するペプチドでコーティングされた標的を認識することが見出された。
【０３１９】
（実施例６）
（ディファレンシャルディスプレイＰＣＲによって発見された乳房腫瘍遺伝子の特徴付け）
ディファレンシャルディスプレイＰＣＲによって発見された乳房腫瘍遺伝子の特異性および感受性を、ＲＴ−ＰＣＲを使用して決定した。この手順によって、多量のＲＮＡを使用することなく、乳房腫瘍遺伝子ｍＲＮＡ発現の半定量的な迅速な評価が可能となった。遺伝子特異的プライマーを使用して、種々の組織（８つの乳房腫瘍、５つの正常乳房、２つの前立腺腫瘍、２つの結腸腫瘍、１つの肺腫瘍、および１４の他の正常な成人組織（正常な前立腺、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、骨格筋、皮膚、胃および精巣を含む）を含む）におけるｍＲＮＡ発現レベルを試験した。
【０３２０】
ＲＴ−ＰＣＲの半定量的性質を確実にするために、β−アクチンを、試験した組織の各々に対する内部コントロールとして使用した。第１鎖ｃＤＮＡの系列希釈物を調製し、そしてＲＴ−ＰＣＲアッセイを、β−アクチン特異的プライマーを使用して実施した。次いで、β−アクチンテンプレートの線形範囲増幅を可能にし、そして最初のコピー数の差異を反映するに十分に感受性であった希釈物を選択した。この条件を使用して、β−アクチンレベルを、各組織からの各逆転写反応に対して決定した。ＤＮＡ汚染を、ＤＮａｓｅ処理によって、そして逆転写酵素を添加することなく調製された第１鎖ｃＤＮＡを使用する場合のネガティブな結果を保証することによって、最小化した。
【０３２１】
遺伝子特異的プライマーを使用して、ｍＲＮＡ発現レベルを種々の組織において決定した。現在まで、３８の遺伝子が、ＲＴ−ＰＣＲによって首尾よく試験され、これらのうちの５つが、乳房腫瘍に対して良好な特異性および感受性を示す（Ｂ１５ＡＧ−１、Ｂ３１ＧＡ１ｂ、Ｂ３８ＧＡ２ａ、Ｂ１１Ａ１ａおよびＢ１８ＡＧ１ａ）。図２１Ａおよび２１Ｂは、これらの遺伝子のうちの３つ（Ｂ１５ＡＧ−１（配列番号２７）、Ｂ３１ＧＡ１ｂ（配列番号１４８）およびＢ３８ＧＡ２ａ（配列番号１５７））に対する結果を示す。表２は、正常乳房組織および乳房腫瘍、ならびに他の組織においてもまた試験した、全ての遺伝子の発現レベルを要約する。
【０３２２】
（表２）
（種々の組織において発現される乳癌抗原の割合）
【０３２３】
【表２】
2005508153.tif 000004
（実施例７）
（乳房腫瘍ポリペプチドに対する抗体の調製および特徴付け）
乳房腫瘍抗原Ｂ３０５Ｄに対するポリクローナル抗体を、以下のように調製した。
【０３２４】
Ｅ．ｃｏｌｉ組換え発現系で発現される乳房腫瘍抗原を、振とうインキュベーター中において３７℃で、適切な抗生物質と共にＬＢブロス中で一晩増殖させた。次の朝、一晩培養物の１０ｍｌを、２Ｌのバッフル付Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ中の５００ｍｌの２×ＹＴおよび適切な抗生物質に添加した。培養物の光学濃度（５６０ｎｍで）が０．４〜０．６に達した時点で、細胞をＩＰＴＧ（１ｍＭ）によって誘導した。ＩＰＴＧによる誘導の４時間後、細胞を遠心分離によって回収した。次いで、この細胞をリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄し、そして再び遠心分離した。上清を捨て、そして細胞をさらなる使用のために凍結させるかまたは直ぐに処理した。溶解緩衝液２０ｍｌを、細胞ペレットに添加し、そしてボルテックスした。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を破壊して開くために、次いで、この混合物を、１６，０００ｐｓｉの圧力でＦｒｅｎｃｈ  Ｐｒｅｓｓに通した。次いで、細胞を、再び遠心分離し、そして上清およびペレットを、組換えタンパク質を分離するためのＳＤＳ−ＰＡＧＥによってチェックした。細胞ペレット中に位置するタンパク質について、このペレットを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１％  ＣＨＡＰＳ中に再懸濁し、そして封入体ペレットを洗浄し、そして再び遠心分離した。この手順をもう２回繰り返した。洗浄された封入体ペレットを、８Ｍ  尿素または６ＭグアニジンＨＣｌ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０および１０ｍＭ  イミダゾールを含む）で可溶化した。可溶化されたタンパク質を、５ｍｌのニッケルキレート樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）に添加し、そして連続して攪拌しながら室温で４５分〜１時間インキュベートした。インキュベーション後、この樹脂およびタンパク質混合物を、使い捨てのカラムを通して注ぎ、フロースルーを回収した。次いで、カラムの１０〜２０容量の可溶化緩衝液でこのカラムを洗浄した。次いで、抗原を、８Ｍ  尿素、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０および３００ｍＭ  イミダゾールを使用してカラムから溶出し、そして３ｍｌの画分に集めた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、どの画分をさらなる精製のためにプールするかを決定するために、電気泳動した。
【０３２５】
最終精製工程として、強アニオン交換樹脂（例えば、ＨｉＰｒｅｐＱ（Ｂｉｏｒａｄ）を、適切な緩衝液で平衡化して、そして上記からプールされた画分をカラム上にロードした。抗原を、漸増する塩勾配でカラムから溶出した。このカラムに流れるにつれて画分が収集され、そしてカラムからのどの画分をプールするかを決定するために、別のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを電気泳動した。プールされた画分を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０に対して透析した。次いで、タンパク質を、０．２２ミクロンフィルターを介した濾過後にバイアルにし（ｖｉａｌｅｄ）、
そして抗原を免疫のために必要になるまで凍結した。
【０３２６】
４００μｇのＢ３０５Ｄ抗原を、１００μｇのムラミルジペプチド（ＭＤＰ）と合わせた。等量の不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）と混合した１００μｇで、４週間ごとにウサギをブーストした。各々のブーストの７日後、動物を採血した。血液を４℃で１２〜２４時間インキュベートし、次いで遠心分離することによって血清を作製した。
【０３２７】
９６ウェルのプレートを、５０μｌ（代表的には１μｇ）の組換えタンパク質と共に４℃で２０時間インキュベートすることによってＢ３０５Ｄ抗原で被覆した。２５０μｌのＢＳＡブロッキング緩衝液をウェルに添加し、そして室温で２時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ／０．０１％  Ｔｗｅｅｎで６回洗浄した。ウサギ血清を、ＰＢＳ中に希釈した。５０μｌの希釈した血清を各ウェルに添加し、そして室温で３０分インキュベートした。プレートを上記のように洗浄し、その後、１：１００００の希釈で５０μｌのヤギ抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を添加し、そして室温で３０分インキュベートした。プレートを再び上記のように洗浄し、そして１００μｌのＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ基質を各ウェルに添加した。室温での暗所での１５分間のインキュベーション後、比色反応を１００μｌの１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で停止させ、４５０ｎｍで直ぐに読み取った。このポリクローナル抗体は、Ｂ３０５Ｄに対して免疫活性を示した。
【０３２８】
乳癌標本および正常乳房標本におけるＢ３０５Ｄ発現の免疫組織化学的（ＩＨＣ）分析を、以下のように実施した。パラフィンに埋包したホルマール固定した組織を、８ミクロンの切片にスライスした。０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）における蒸気熱誘導エピトープ想起（Ｓｔｅａｍ  ｈｅａｔ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）（ＳＨＩＥＲ）を、最適な染色条件として使用した。切片を１０％血清／ＰＢＳと共に５分間インキュベートした。一次抗体を、示される濃度において２５分間、各切片に添加し、続いて抗ウサギビオチン化抗体または抗マウスビオチン化抗体のいずれかと共に、２５分間インキュベートした。内因性ペルオキシダーゼ活性を、過酸化水素と共に１．５分間３回インキュベートすることによって、ブロックした。アビジンビオチン複合体／西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＡＢＣ／ＨＲＰ）系を、ＤＡＢ色素原（ｃｈｒｏｍａｇｅｎ）と共に使用して、抗原発現を可視化した。スライドをヘマトキシリンで対比染色した。Ｂ３０５Ｄ発現は、乳房腫瘍と正常乳房組織との両方において検出された。しかし、染色の強度は、腫瘍サンプルにおいてより正常サンプルにおいてずっと低く、そしてＢ３０５Ｄの表面発現は、乳房腫瘍組織においてのみ観察された。
【０３２９】
正常組織の広範なパネルにおけるＢ３０５Ｄ発現のリアルタイムＰＣＲおよび免疫組織化学的分析の要約を、以下の表３に示す。これらの結果は、精巣においてＢ３０５Ｄの最小の発現を示し、胆嚢において不十分な結果を示し、そして試験した他の全ての組織においては検出されない。
【０３３０】
（表３）
【０３３１】
【表３−１】
2005508153.tif 000005
【０３３２】
【表３−２】
2005508153.tif 000006
（実施例８）
（乳房腫瘍抗原のタンパク質発現）
本実施例は、Ｅ．ｃｏｌｉおよび哺乳動物細胞における乳房腫瘍抗原Ｂ３０５Ｄの発現および精製を記載する。
【０３３３】
Ｂ３０５ＤアイソフォームＣ−１５（配列番号３０１；３８４のアミノ酸に翻訳された）の、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現を、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原Ｒａ１２（配列番号３１８）の最初の３０アミノ酸の下流の、Ｂ３０５ＤアイソフォームＣ−１５のオープンリーディングフレームをｐＥＴ１７ｂにクローニングすることによって、達成した。第一に、Ｂ３０５Ｄ  ＯＲＦにおける内部ＥｃｏＲＩ部位を、タンパク質配列を変化させることなく変異させ、その結果、この遺伝子は、ＥｃｏＲＩ部位においてＲａ１２でクローニングされ得た。部位特異的変異誘発のために使用されるＰＣＲプライマーを、配列番号３１９（ＡＷ０１２と称する）および配列番号３２０（ＡＷ０１３と称する）に示す。次いで、ＥｃｏＲＩ部位改変Ｂ３０５ＤのＯＲＦを、プライマーＡＷ０１４（配列番号３２１）およびＡＷ０１５（配列番号３２２）を使用するＰＣＲによって増幅した。このＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで消化し、そしてＥｃｏＲＩ部位においてＲａ１２／ｐＥＴ１７ｂベクターに連結した。得られた融合構築物（Ｒａ１２ｍＢ１１Ｃと称する）の配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。この融合構築物に対して決定したｃＤＮＡ配列を、配列番号３２３に提供し、そしてアミノ酸配列を配列番号３２４に提供する。
【０３３４】
この融合構築物をＢＬ２１（ＤＥ３）ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ−ＲＩＬ  Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換し、そしてカナマイシンと共にＬＢブロス中で一晩増殖させた。得られた培養物に、ＩＰＴＧを導入した。タンパク質をＰＶＤＦ膜に移し、そして５％の脱脂乳（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ緩衝液中）でブロックし、３回洗浄し、そしてマウス抗Ｈｉｓタグ抗体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）と共に１時間インキュベートした。この膜を３回洗浄し、そしてＨＲＰ−プロテインＡ（Ｚｙｍｅｄ）で３０分間プローブした。最後に、この膜を３回洗浄し、そしてＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で現像した。発現を、ウェスタンブロットによって検出した。
【０３３５】
哺乳動物細胞における組換え発現のために、Ｂ３０５ＤアイソフォームＣ−１５（配列番号３０１；３８４のアミノ酸に翻訳された）を、哺乳動物発現ベクターｐＣＥＰ４およびｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。これらの構築物を、Ｆｕｇｅｎｅ６試薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用してＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ）にトランスフェクトした。簡単に言えば、ＨＥＫ細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中１００，０００細胞／ｍｌの密度でプレートし、そして一晩増殖させた。翌日、２μｌのＦｕｇｅｎｅ６を、ＦＢＳを含まない１００μｌのＤＭＥＭに添加し、そして室温で１５分間インキュベートした。このＦｕｇｅｎｅ６／ＤＭＥＭ混合物を、１μｇのＢ３０５Ｄ／ｐＣＥＰ４またはＢ３０５Ｄ／ｐｃＤＮＡプラスミドＤＮＡに添加し、そして室温で１５分間インキュベートした。次いで、Ｆｕｇｅｎｅ／ＤＮＡ混合物をＨＥＫ２９３細胞に添加し、そして７％ＣＯ２で３７℃にて４８〜７２時間インキュベートした。細胞をＰＢＳでリンスし、収集し、そして遠心分離によってペレット化した。
【０３３６】
ウェスタンブロット分析のために、全細胞溶解物を、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００含有溶解緩衝液中で細胞を３０分間氷上でインキュベートすることによって、生成した。次いで、溶解物を１０，０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心分離することによって、清澄化した。サンプルを、β−メルカプトエタノールを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥ負荷緩衝液で希釈し、そして１０分間煮沸し、その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを負荷した。タンパク質をニトロセルロースに移し、そしてプロテインＡで精製した抗Ｂ３０５Ｄウサギポリクローナル抗血清（上記のように調製した）を使用して、１μｇ／ｍｌの濃度でプローブした。ブロットを、ＨＲＰに結合体化したヤギ抗ウサギＩｇで明らかにし、次いで、ＥＣＬ基質中でインキュベートした。Ｂ３０５Ｄの発現は、Ｂ３０５ＤでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３溶解物中で検出されたが、ベクター単独でトランスフェクトしたコントロールＨＥＫ２９３細胞においては検出されなかった。
【０３３７】
ＦＡＣＳ分析のために、細胞をさらに氷冷染色緩衝液で洗浄し、次いでヤギ抗ウサギＩｇ（Ｈ＋Ｌ）−ＦＩＴＣ試薬（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の１：１００の希釈物と共に３０分間氷上でインキュベートした。３回の洗浄に続いて、これらの細胞を、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）および透過性細胞の同定を可能にするウイルス染料を含む染色緩衝液中に再懸濁させ、次いでＦＡＣＳによって分析した。このＦＡＣＳ分析は、Ｂ３０５Ｄタンパク質の表面発現を示した。
【０３３８】
（実施例９）
（バキュロウイルス発現系を使用する、昆虫細胞における全長Ｂ３０５Ｄの発現）
Ｃ末端Ｈｉｓ  Ｔａｇを有する、全長乳房腫瘍抗原に対するｃＤＮＡ（Ｂ３０５アイソフォームＣ（配列番号３０１））を、テンプレートとしてのＢ１１Ｃ１５／ｐＢｉｂおよび以下のプライマーを使用して、ＰＣＲによって作製した：
【０３３９】
【化１】
2005508153.tif 000007
予期されたサイズのＰＣＲ産物を、アガロースゲルから回収し、Ｂａｍ  ＨＩおよびＸｂａ  Ｉ制限酵素を用いて消化し、そして移入プラスミドｐＦａｓｔＢａｃ１に連結し、これを、同じ制限酵素で消化した。挿入物の配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認し、そして配列番号３３５と記載する。Ｃ末端Ｈｉｓタグを有するＢ３０５Ｄの推定アミノ酸配列を、配列番号３３６と記載する。組換え移入プラスミドｐＦＢＢ３０５Ｄを使用して、Ｂａｃ−Ｔｏ−Ｂａｃバキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によって、組換えバクミド（ｂａｃｍｉｄ）ＤＮＡおよびウイルスを作製した。組換えＢＶＢ３０５Ｄウイルスを、Ｓｆ９昆虫細胞において増幅し、そしてハイファイブ（Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ）昆虫細胞を感染させるために使用した。感染細胞を、感染の２４〜３０時間後に収集した。組換えタンパク質の同定を、Ｂ３０５Ｄに対するウサギポリクローナル抗体を用いてウェスタンブロットによって確認した。組換えタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続くクーマシーブルー染色によってさらに分析した。
【０３４０】
（実施例１０）
（バイオインフォマティクス研究によって発見されたさらなるＢ３０５Ｄホモログの同定）
Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＨＴＧＳ）データベースを、Ｂ３０５Ｄ  Ｃ形態配列（配列番号３０１）を用いて検索し、そしてＢ３０５Ｄの別の高度に関連したコピー（仮説として、第１４染色体に局在する）を明らかにした。同定された配列を、Ｂ３０５Ｄ  Ｃ形態配列およびエキソン−イントロンスプライス部位に基づいて、一緒にスプライシングした。この推定ｃＤＮＡ配列（配列番号３３９）を翻訳して、推定アミノ酸配列（配列番号３４０）を作製した。Ｂ３０５Ｄ遺伝子ファミリーメンバーは、乳癌、前立腺癌、および卵巣癌において過剰発現することが示された。
【０３４１】
（実施例１１）
（Ｂ３０５Ｄ発現の免疫組織化学（ＩＨＣ）分析）
Ｂ３０５Ｄが、１つの推定膜貫通橋架け（ｓｐａｎｎｉｎｇ）ドメインを有する、約４３ｋＤａのＩＩ型形質膜タンパク質であることを、分析は示唆する。グリコシル化部位が存在せず、そしてその機能は、未知のままである。種々の腫瘍および正常な組織において、免疫組織化学（ＩＨＣ）分析によってＢ３０５Ｄ発現のさらなる試験が、本明細書中で開示される。
【０３４２】
（方法および材料）：
組織が乳癌抗原Ｂ３０５Ｄを発現するか否かを決定するために、ＩＨＣ分析を、多様な範囲の組織切片において実行した。組織サンプルを、１２〜２４時間、ホルマリン中に固定し、そしてパラフィンに包埋し、その後、８ミクロンの切片にスライスした。０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中の蒸気熱誘導エピトープ回収（ＳＨＩＥＲ）を、最適な染色条件のために使用した。切片を５分間、１０％血清／ＰＢＳとともにインキュベートした。一次抗体を、２５分間、各切片に添加し、続いて、抗ウサギビオチン化抗体とともに２５分間インキュベートした。内因性ペルオキシダーゼ活性を、ハイドロジェンペルオキシダーゼとともに３回の１．５分間のインキュベーションによってブロックした。アビジンビオチン複合体／西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＡＢＣ／ＨＲＰ）系を、ＤＡＢ色素原（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ）と共に使用して、抗原発現を可視化した。スライドをヘマトキシリンで対比染色して、細胞核を可視化した。
【０３４３】
Ｂ３０５Ｄに対するウサギポリクローナル抗体は、実施例７において、ホルマリン固定パラフィン包埋組織において反応することが示された。抗体は、サブセットの乳癌の形質膜を標識することが示された。Ｂ３０５Ｄは、ｃｅｒｂ−２（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕとも呼ばれる）に対して陽性である組織を標識することが示された。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（ｐ１８５）は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質発ガン遺伝子のタンパク質産物である。ＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子は増幅され、そしてＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質は、種々の癌（乳癌、卵巣癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌および血液学的癌を含む）において過剰発現する。ＨＥＲ−２／ｎｅｕは、悪性形質転換に関連し、腺管上皮内癌（ｄｕｃｔａｌ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）の５０％〜６０％、および全ての乳癌の２０％〜４０％、ならびに卵巣、前立腺、結腸および肺において生じる腺癌の実質的な画分において見出される。ＨＥＲ−２／ｎｅｕは、悪性表現型だけでなく、悪性疾患の攻撃性（全ての侵襲性乳癌の１／４において見出される）とも親密に関連する。ＨＥＲ−２／ｎｅｕ過剰発現は、乳癌および卵巣癌の両方において、乏しい予後と関連する。この研究において、乳癌を２つの年齢群（腫瘍除去のときに５０歳以下の女性および腫瘍除去のときに５０歳以上の女性）から試験した。Ｂ３０５Ｄ染色を、それぞれについて評価した。乳癌に加えて、卵巣癌、正常膵臓、正常腎臓および正常胃を、Ｂ３０５Ｄ反応性ついて試験した。
【０３４４】
２３人の異なる患者由来のホルマリン固定パラフィン包埋乳癌を、Ｂ３０５Ｄ反応性について試験した。腫瘍除去のときの患者の年齢は、患者の年齢がＢ３０５Ｄ染色に関連するか否かを決定するために、全ての場合において利用可能であった。多くの場合において、エストロゲンレセプター／プロゲステロンレセプター（ＥＲ／ＰＲ）データおよびｃｅｒｂ２データは、病理学レポートから入手可能であった。乳房患者を、単純に年齢に基づいて選択した。「より若い」群におけるこれらの患者は、４０歳に近い。本発明者らはまた、７０歳により近い患者から腫瘍を得た。この群は、「より老いた」群と呼ばれる。
【０３４５】
乳癌に加えて、１７個の異なる卵巣癌を、Ｂ３０５Ｄ染色について免疫組織化学的に分析した。正常な胃、腎臓および膵臓のそれぞれ５個のサンプルもまた試験した。大部分の組織について、Ｂ３０５Ｄ抗体を、２つの異なる検出系（一方は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）酵素連結試薬として、ＡＢＣを用い、そして他方は、ＨＲＰ試薬として、ストレプト−アビジンを用いる）を用いて試験した。全ての場合において、ウサギＩｇＧを、Ｂ３０５Ｄ抗体と並行して、ネガティブコントロールとして実行した。Ｂ３０５Ｄを、ＳＨＩＥＲ  ＩＩ熱前処理を使用して、２．５μｇ／ｍｌで試験した。乳癌マルチ組織ブロック（ＱＭＴＢ２１）を、抗体に対するポジティブコントロールとして使用した。ブロックにおける腫瘍＃５は、Ｂ３０５Ｄ抗体を有する膜パターンを用いて標識することが以前に示された。
【０３４６】
（結果：乳癌（表４において示される結果））
膜染色がポジティブコントロールにおいて検出されたが、アビジン−ビオチン複合体（ＡＢＣ）染色スライドは、予想よりも薄かった。ポジティブ染色を見逃さないことを確実にするために、スライドを、ストレプト−アビジン（ＳＡ）検出を用いて試験した。ＡＢＣスライドの分析において、１つの腫瘍のみが、膜パターンで標識された。この腫瘍は、４２歳の患者由来であり、これはまた、ｃｅｒｂ２について膜染色を実証した。ＳＡを用いて再試験した場合、ｃｅｒｂ２膜ポジティブであった、より老いた患者を含めた。この腫瘍は、８０歳の患者由来であった。乳癌染色結果は、以下の表４に概説される。表４〜６に提示される染色データは、ＳＡ−ＨＲＰ染色由来である。Ｂ３０５Ｄ抗体は、細胞質および形質膜において乳癌を標識する。膜染色は、腫瘍細胞に限定されるが、一方、細胞質染色はまた、しばしば、正常管上皮において提示される。ＳＡ標識組織において、ｃｅｒｂ２陽性であったポジティブコントロールならびに４２歳および８０歳のみが、Ｂ３０５Ｄに対して陽性な膜を標識した。２つの他の場合は、少数の腫瘍細胞における薄い膜染色で標識された。１つの場合は、２８歳の患者由来であり、他方は、７３歳由来であった；ｃｅｒｂ２状態は、これらの場合のいずれかのついても、利用可能でなかった。より薄い染色を用いるこれらの２つの場合における制限染色は、ポジティブな細胞が、組織の末梢部において見出されたので、組織固定に起因し得る。
【０３４７】
従って、２３のうち４つの場合（２０％未満）がＢ３０５Ｄについての膜パターンで標識された。１０％未満の腫瘍（２３のうち２）が、決定的な膜染色で標識された。以前のランダムな研究において、１５のうちの３つの場合が、Ｂ３０５Ｄについて膜染色を実証した。ｃｅｒｂ２データは、試験された組織全てついて入手可能であるわけではなかったが、Ｂ３０５Ｄについて決定的にポジティブな２つの場合について、入手可能であり、両方が、ｃｅｒｂ２について強力にポジティブであった。Ｂ３０５Ｄ膜ポジティブな場合を、「より若い」群および「より老いた」群にわたって均一に分けた。より若い群は、５０歳より下の１１人の患者を含み、そしてより老いた群は、５０歳以上の１２人の患者を含んだ。この老いた群について、９人の患者が、６６歳以上であり、そして７人が、７０代および８０代であった（５０歳由来の１つの腫瘍は、ブロックにおいて、少量の腫瘍のみを有し、従って、２２人のうち４人ポジティブと割り引かれ得る）。ＥＲ／ＰＲデータは、大部分の場合について入手可能であるが、Ｂ３０５Ｄとの関連は、決定され得なかった。従って、このデータおよび先のＩＨＣデータに基づいて、Ｂ３０５Ｄ発現は、ｃｅｒｂ２発現に密接に関連する。ｃｅｒｂ２ポジティブな乳房腫瘍のさらなるＢ３０５Ｄ試験は、この関係を強化する。この研究の結果から、腫瘍除去のときの患者の年齢は、Ｂ３０５Ｄ染色と関連しないようである。
【０３４８】
【表４−１】
2005508153.tif 000008
【０３４９】
【表４−２】
2005508153.tif 000009
（卵巣癌（表５において概説される結果））
Ｂ３０５Ｄ抗体を用いて試験された１７個の卵巣癌は、膜パターンで標識されなかった。約半分の組織は、細胞質染色パターンで標識された。
【０３５０】
【表５】
2005508153.tif 000010
（正常組織（表６において概説される結果））
試験された５個の胃の場合について、全てが、胃の上皮より下の腺においてバックグラウンドより上に染色された。染色は、細胞質で、粒状であり、そして両方の検出系で存在した。ネガティブコントロールにおいていくらかの染色があったが、この染色は、拡散し、粒状ではなかった。バックグラウンド染色は、これらの細胞においてよくある。Ｂ３０５Ｄ染色は、抗体結合に起因するようであり、検出系に起因しないようである。
【０３５１】
５つの異なる腎臓の場合を試験した。骨髄領域は、各場合において表された。腎臓の至る所の細管において染色したが、これは、類似するがより薄い染色がネガティブコントロールに存在するので、内因性ビオチンに起因しているようである。ストレプト−アビジンスライドと比較して、ＡＢＣ染色スライドにおいてかなり少ない染色が存在し、これはまた、内因性ビオチンと一致する。抗体を用いた染色を得るために必要とされるＳＨＩＥＲ  ＩＩ前処理は、特に、内因性ビオチンに起因して、より多くのバックグラウンド染色を与える傾向がある。
【０３５２】
５個の異なる膵臓組織のうち、特異的染色は、検出されなかった。サブセットの腺房細胞は、Ｂ３０５ＤおよびウサギＩｇＧコントロールの両方において染色を与えた。またもや、この染色は、非特異的であった。膵臓は、しばしば、おそらく、組織の酵素活性に起因して、非特異的染色を与えた。
【０３５３】
種々の他の正常組織（表６に示さない）（皮膚、精巣、結腸、心臓、胸腺、動脈、骨格筋、小腸、下垂体、脊髄、脾臓、尿管、胆嚢、胎盤、甲状腺、肝臓、脳−小脳、骨髄、胸腺、肺食道、子宮、副腎、リンパ節、脳−皮質、ファロピウス管、膀胱、および前立腺を含む）を試験した。弱いＩＨＣ染色が、小腸、子宮、および膀胱において観測された。しかし、ｍＲＮＡ発現は、これらの組織において観察されなかった。従って、この弱い染色は、これらの組織におけるタンパク質発現を表さないようである。胆嚢は、ポジティブに染色し、さらに分析される。前立腺サンプルの半分が、ポジティブに染色し、そして１つの精巣サンプルを試験した。
【０３５４】
Ｂ３０５Ｄ発現もまた、前立腺腫瘍サンプルにおいて分析した。５グレード３＋３サンプルの１つがポジティブに染色したが、グレード３＋４サンプルは、ポジティブに染色しなかった。３つの未知のグレードのサンプルの１つの追加のサンプルが、ポジティブに染色した。しかし、５５個の原発性前立腺腫瘍サンプルおよび原発転移性前立腺腫瘍サンプルの追加のアレイを試験して、染色は観察されなかった。
【０３５５】
【表６−１】
2005508153.tif 000011
【０３５６】
【表６−２】
2005508153.tif 000012
要約すると、Ｂ３０５Ｄは、乳癌の２０％未満においてのみ観察された。染色は、正常前立腺サンプルの半分において観察されたが、膜染色は、正常乳房においても、卵巣癌においても、正常膵臓、腎臓、胃においても、他の正常組織のパネルにおいても検出されなかった。
【０３５７】
（実施例１２）
（乳房腫瘍特異的Ｂ３０５Ｄ配列の分析）
多数の形態の乳房腫瘍抗原Ｂ３０５Ｄが単離された。現在までに、アイソフォームＡ（ＤＮＡ配列番号２９１、２９２、２９６、３１３、３１４）、Ａ改変体（ＤＮＡ配列番号２９９）、Ｂ（ＤＮＡ配列番号２９４、２９７）およびＣ（ＤＮＡ配列番号２９５、３０１、３０２、３０３）が、同定されている。Ｂ３０５Ｄの全ての公知の形態を代表するＢ３０５Ｄ遺伝子特異的な５’プライマーおよび３’プライマーを使用して、乳房腫瘍において発現されるこの遺伝子の特定の形態を増幅した。配列番号３４１〜３４８において本明細書中で開示されるものは、以下に記載されるように乳房腫瘍において特異的に同定された、４つのＤ３０５Ｄヌクレオチド配列およびそれらの対応するアミノ酸配列である。
【０３５８】
２回のＰＣＲ反応を、Ｂ３０５Ｄに特異的なプライマーを使用して実施した。次いで、その産物を分析し、そして全長配列を編集した。第一の反応について、プライマーを、全てのＢ３０５Ｄ形態に共通の、この遺伝子の５’末端および３’末端の近くの領域について設計した。第二のセットのＰＣＲ反応は、これらの形態の各々に特異的な開始部位の各々に特異的なプライマーを使用した。３つの５’プライマーを、Ｂ３０５ＤのＡ形態、Ａ形態フレームシフトおよびＣ形態の開始部位から増幅するように設計した。３’逆方向プライマーを、全てのＢ３０５Ｄ形態の、第一のＰＣＲ反応において使用した３’プライマーのわずかに上流の共通の領域について設計した。これらのプライマーならびに乳房腫瘍ＲＮＡ番号４４３、２３Ｂ、およびＳ７６由来のｃＤＮＡを使用してＰＣＲを実施した。全ての産物を配列決定し、分析し、そして編集した。
【０３５９】
Ｂ３０５Ｄ  Ａアイソフォームの２つの改変体を、乳房腫瘍サンプル中で同定した。これら２つの改変体のヌクレオチド配列を、配列番号３４１および３４２に示し、そして対応するアミノ酸配列を、配列番号３４５および３４６に示す。これらの改変体のうちの１つ（配列番号３４１）は、実施例１に記載され、そして配列番号３１４に示されるＢ３０５Ｄ  Ａアイソフォームの、以前に同定された改変体と同一である。他の改変体（配列番号３４２）は、２つの塩基対が配列番号３１４と異なり、そして配列番号３１５に示される、以前に同定されたＡアイソフォームと１アミノ酸が異なるアミノ酸配列（配列番号３４６）をコードする。
【０３６０】
Ｂ３０５Ｄ  Ｃアイソフォームの２つの新たな改変体もまた、乳房腫瘍サンプルから同定された。これら２つの改変体のヌクレオチド配列は、配列番号３４３および３４４において提供され、そして対応するアミノ酸配列が、配列番号３４７および３４８に示される。２つのＣアイソフォーム改変体の５’末端は、Ｃアイソフォームにおいて通常見られる２つの４塩基対反復の１つを欠いている、短縮化Ｃアイソフォームであるようである。これらの改変体の３’末端は、Ａアイソフォームと良好に整列する。より具体的には、塩基２９７の周囲にスプライス接合部が存在する。この接合部において、配列番号３４３および３４４が標準的なＣ形態から分割し、そして残りの３’末端は、Ａ形態である。この接合部の上流（５’側）の、配列番号３４３および３４４に示されるＢ３０５Ｄアイソフォームの配列は、標準的なＢ３０５Ｄ  Ｃ形態反復配列の１１１塩基対を欠く。配列番号３４３に示される改変体は、最も短く、大きな失われた反復においてさらに６塩基対の欠失を有する。従って、要約すると、配列番号３４３および３４４は、標準的なＢ３０５Ｄ  ＣアイソフォームのＡＴＧで開始する。この配列は、配列番号３４４については約１８５塩基対について、そして配列番号３４３については１７９塩基対についてのＣアイソフォームとして続く。従って、両方の配列は、スプライス接合部の直前の反復配列の、約１１２塩基対の欠失を有する。スプライス接合部に続いて、両方の改変体は、Ａ形態に従う。
【０３６１】
（実施例１３）
（Ｂ３０５ＤについてのＣＤ４  Ｔ細胞エピトープの同定）
この実施例は、Ｂ３０５ＤのＣ形態のＣＤ４＋  Ｔ細胞エピトープの同定を実証する（Ｂ３０５Ｄの全長ｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３０１および３０４に示されている）。
【０３６２】
ＣＤ４＋  Ｔ細胞応答を、Ｂ３０５Ｄ  Ｃアイソフォームタンパク質全体にまたがる、オーバーラップする２０マーペプチドでパルス化した樹状細胞（ＤＣ）を使用して、正常なドナーのＰＢＭＣを使用して発生させた。簡単にいえば、ＣＤ４＋  Ｔ細胞を、オーバーラップするペプチドの混合物でパルス化されたＤＣで、第一の刺激においてはＩＬ−６およびＩＬ−１２を含むＩＭＤＭ培地中で、そして他の全ての刺激においてはＩＬ−２およびＩＬ−７を含むＩＭＤＭ培地中で、３〜４回刺激した。引き続いて、これらの株を、標準的な増殖アッセイ（三重水素化チミジン取り込みを測定する）を使用して、プライミングペプチドまたは組換えＥ．ｃｏｌｉ由来のＢ３０５Ｄとの反応性についてアッセイした。
【０３６３】
多数の異なるペプチドが、Ｂ３０５Ｄ特異的Ｔ細胞を惹起した。これらのＣＤ４＋  Ｔ細胞エピトープは、以下の配列に含まれた：
ＶＮＫＫＤＫＱＫＲＴＡＬＨＬＡＳＡＮＧＮＳＥＶＶＫＬＬＬＤＲ（配列番号３４９）：（配列番号３０４のアミノ酸１６６〜１９５に対応するペプチド３４〜４６）。
ＡＬＨＬＡＳＡＮＧＮＳＥＶＶＫＬＬＬＤＲＲＣＱＬＮＶＬＤＮＫ（配列番号３５０）（配列番号３０４のアミノ酸１７６〜２０５に対応するペプチド３６〜３８）。
ＧＳＡＳＩＶＳＬＬＬＥＱＮＩＤＶＳＳＱＤＬＳＧＱＴ（配列番号３５１）（配列番号３０４のアミノ酸３１６〜３４０に対応するペプチド６４〜６５）。
【０３６４】
これらのペプチドを認識するＣＤ４＋  Ｔ細胞はまた、組換えＢ３０５Ｄタンパク質も認識し、このことは、これらの細胞が、天然にプロセシングされたエピトープであることを示唆する。これらの株のうちの２つ（配列番号３４９および３５０に示される、株３１．９および３１．１０を認識するペプチド）はまた、バキュロウイルスタンパク質、Ｂ３０５Ｄで一時的にトランスフェクトされたＨＥＫ細胞由来の溶解物、およびアデノウイルス発現Ｂ３０５Ｄで感染させた細胞由来の溶解物を含む、Ｂ３０５Ｄの哺乳動物供給源を認識する。
【０３６５】
従って、これらの研究は、Ｂ３０５Ｄに対するＣＤ４＋  Ｔ細胞の免疫性が惹起され得、そして配列番号３４９〜３５１に示されるペプチドを、免疫原性の、天然にプロセシングされたＣＤ４＋  Ｔ細胞エピトープであると同定し得ることを実証する。
【０３６６】
（実施例１４）
（乳癌血清におけるＢ３０５Ｄに対する自己抗体および抗原性部位のエピトープマッピング）
特異的Ｂ３０５Ｄエピトープに対する自己抗体を、乳癌患者の血清において同定した。Ｂ３０５Ｄ配列全体にまたがるオーバーラップするペプチド（Ｂ３０５ＤのＣ形態のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３０１および３０４に示されている）を合成し、そして乳癌を罹患する患者由来の血清を用いるＥＬＩＳＡによって試験し、Ｂ３０５Ｄ特異的抗体の存在を決定した。いくつかの免疫反応性領域が同定され、これらは、分子のアンキリン反復部分を含む免疫ドミナント領域を含む。
【０３６７】
Ｂ３０５Ｄのオープンリーディングフレーム全体にまたがる、１５アミノ酸によってオーバーラップした７４個の２０マーペプチドを合成した（アミノ酸配列は、配列番号３５２〜４２５に示されている）。これらの７４個のペプチドを、ＥＬＩＳＡにおいて試験して、どのエピトープが、乳癌血清およびコントロール血清と反応したかを評価した。最初に、ペプチドをプールし、そして試験して、活性の領域を位置決定した。最も高い活性は、ペプチド１〜２４（配列番号３５２〜３７５）において得られ、そしてこれらを個々に再試験して、特異的エピトープを決定した。次いで、ペプチド３、５、６、１１、１３、１９および２０（それぞれ配列番号３５４、３５６、３５７、３６２、３６４、３７０、３７１）を、７４個の乳癌血清、５０の卵巣癌血清および５５の前立腺癌血清ならびにコントロールの完全なパネルを使用して、さらに試験した。７４の乳癌血清のうちの１８が、１つ以上のエピトープと反応性であった。乳癌血清と卵巣癌血清との両方が、反応性を示し、そして活性エピトープは、Ｂ３０５Ｄのアンキリン反復領域に位置するようであった。Ｂ３０５Ｄに見出された３つのアンキリン反復配列のアミノ酸配列が配列番号４２６〜４２８に示され、そしてそれぞれ、配列番号３５６〜３５９、３６３〜３６６、および３６８〜３７６に示されるオーバーラッピングペプチド内に存在する。
【０３６８】
乳癌血清におけるＢ３０５Ｄに対する自己抗体の検出は、このような患者が、特定のエピトープに対して免疫応答を誘発し得ることを示し、そしてＢ３０５Ｄが、単独でかまたは他の乳房腫瘍抗原と組み合わせて、ワクチン開発の標的として使用され得ることを示す。Ｂ３０５Ｄに対する抗体が乳癌患者の血清中に存在することがわかったので、この抗原のワクチン標的としての潜在的な使用が強まる。さらに、Ｂ３０５Ｄに対する抗体の検出が、単独でかまたは他の抗原（例えば、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕまたは他の腫瘍抗原）に対する抗体を検出することと組み合わせて、乳癌の診断として使用され得る。Ｂ３０５Ｄに対する抗体の存在はまた、Ｂ３０５Ｄ抗原が血清中に存在し、そして特定の抗原検出アッセイの開発のための標的として使用され得ることを示す。
【０３６９】
（実施例１５）
（マイクロアレイ技術を使用するｃＤＮＡ発現の分析）
さらなる研究において、本明細書中に開示される配列を、マイクロアレイ分析によって、特定の腫瘍組織における過剰発現について評価する。このアプローチを使用して、ｃＤＮＡ配列をＰＣＲ増幅し、そしてそれらのｍＲＮＡ発現プロフィールを、腫瘍組織および正常組織において、ｃＤＮＡマイクロアレイ技術を、本質的に、記載されるように（Ｓｈｅｎａ，Ｍ．ら、１９９５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４６７−７０）使用して試験する。簡単にいえば、これらのクローンを複数の複製物としてスライドガラス上でアレイにする（各位置が、独特のｃＤＮＡクローンに対応する）（５５００ものクローンが、単一のスライドまたはチップ上にアレイにされ得る）。各チップを、それぞれＣｙ３およびＣｙ５で蛍光標識された一対のｃＤＮＡプローブでハイブリダイズする。代表的に、１μｇのポリＡ＋  ＲＮＡを使用して、各ｃＤＮＡプローブを作製する。ハイブリダイゼーション後、これらのチップを走査し、そしてＣｙ３チャネルとＣｙ５チャネルとの両方について、蛍光強度を記録する。複数の組み込まれた品質制御工程が存在する。第一に、プローブの品質を、遍在的に発現される遺伝子のパネルを使用して、モニタリングする。第二に、コントロールプレートはまた、酵母ＤＮＡフラグメント（これの相補的ＲＮＡが、プローブの品質および分析の感度を測定するために、プローブ合成にスパイクされ得る）を含み得る。現在、この技術は、１００，０００コピーのうち１のｍＲＮＡの感度を与える。最後に、この技術の再現性は、異なる位置で二連にしたコントロールｃＤＮＡエレメントを含めることによって、確実にされ得る。
【０３７０】
（実施例１６）
（リアルタイムＰＣＲを使用するｃＤＮＡ発現の分析）
リアルタイムＰＣＲ（Ｇｉｂｓｏｎら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：９９５−１００１、１９９６；Ｈｅｉｄら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：９８６−９９４，１９９６を参照のこと）は、増幅の間のＰＣＲ産物の蓄積のレベルを評価する技術である。この技術は、複数のサンプル中のｍＲＮＡレベルの定量的評価を可能にする。簡単にいえば、ｍＲＮＡは、腫瘍組織および正常組織から抽出され、そして標準的な技術を使用して、ｃＤＮＡが調製される。リアルタイムＰＣＲは、例えば、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）７７００  Ｐｒｉｓｍ機器を使用して、実施される。一致するプライマーおよび蛍光プローブが、目的の遺伝子について、例えば、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）によって提供されるプライマー発現プログラムを使用して、設計される。プライマーおよびプローブの最適な濃度は、最初、当業者によって決定され、そしてコントロール（例えば、β−アクチン）プライマーおよびプローブが、例えば、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から商業的に入手される。サンプル中の特定のＲＮＡの量を定量するために、目的の遺伝子を含むプラスミドを使用して、標準曲線が作成される。標準曲線は、リアルタイムＰＣＲにおいて決定されたＣｔ値（これは、アッセイにおいて使用されるｃＤＮＡの初期濃度に関連する）を使用して作成される。１０〜１０６の範囲のコピーの目的の遺伝子の標準希釈が、一般に十分である。さらに、標準曲線は、コントロール配列について作成される。このことにより、比較の目的で、コントロールの量に対して、組織サンプルの初期ＲＮＡ含有量の標準化が可能となる。
【０３７１】
代替のリアルタイムＰＣＲ手順は、以下のように実施され得る：定量リアルタイムＰＣＲで使用するための第一鎖ｃＤＮＡを、２０μｇの総ＲＮＡから合成し、これをＤＮａｓｅ  Ｉ（例えば、Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｇｒａｄｅ，Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ，ＭＤ）で、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＲＴ）（例えば、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して、最初に処理する。リアルタイムＰＣＲを、例えば、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭ  ５７００配列検出システム（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて実施する。この５７００システムは、ＳＹＢＲＴＭグリーン（二重鎖ＤＮＡにのみインターカレートする蛍光色素）、ならびに遺伝子特異的な順方向プライマーおよび逆方向プライマーのセットを使用する。全増幅プロセスの間、蛍光の増加をモニタリングする。プライマーの最適な濃度は、チェッカーボードアプローチを使用して決定され、そして乳房腫瘍由来のｃＤＮＡのプールが、このプロセスにおいて使用される。ＰＣＲ反応を、２５μｌの容量で実施し、これは、２．５μｌのＳＹＢＲグリーン緩衝液、２μｌのｃＤＮＡテンプレート、ならびに各２．５μｌの、目的の遺伝子のための順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含有する。ＲＴ反応のために使用されるｃＤＮＡは、各目的の遺伝子については約１：１０に希釈され、そしてβ−アクチンコントロールについては１：１００に希釈される。サンプル中の特定のｃＤＮＡ（および従って初期ｍＲＮＡ）の量を定量するために、各実施に対して、目的の遺伝子を含むプラスミドＤＮＡを使用して、標準曲線が作成される。標準曲線は、リアルタイムＰＣＲにおいて決定されたＣｔ値（これは、アッセイにおいて使用されるｃＤＮＡの初期濃度に関連する）を使用して作成される。２０〜２×１０６の範囲のコピーの目的の遺伝子の標準希釈が、この目的で使用される。さらに、標準曲線は、２００ｆｇ〜２０００ｆｇの範囲のβ−アクチンについて作成される。このことにより、比較の目的で、β−アクチンの量に対して、組織サンプルの初期ＲＮＡ含有量の標準化が可能となる。試験される組織の各群についての平均コピー数は、β−アクチンの一定量に対して標準化され、この遺伝子の各々を用いて見られる過剰発現レベルの評価を可能にする。
【０３７２】
（実施例１７）
（Ｔ−ヘルパー株のペプチドプライミング）
ＣＤ４＋  Ｔヘルパー株の作製、およびＨＬＡクラスＩＩ分子の観点でＣＤ４＋  Ｔ細胞によって認識され得る腫瘍特異的抗原由来のペプチドエピトープの同定を、以下のように実施する。
【０３７３】
１０アミノ酸がオーバーラップした、腫瘍特異的抗原由来の１５マーペプチドを、標準的な手順を使用して作製する。樹状細胞（ＤＣ）を、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を使用して、標準的なプロトコルによって、正常なドナーのＰＢＭＣから誘導する。ＣＤ４＋  Ｔ細胞を、ＭＡＣＳビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）およびネガティブ選択を使用して、ＤＣとして、同じドナーから作製した。ＤＣを１５マーペプチド（各ペプチドは、０．２５μｇ／ｍｌの最終濃度にある）のプールで一晩パルス化する。パルス化されたＤＣを洗浄し、そして９６ウェルのＶ底プレートで１×１０４細胞／ウェルでプレートし、そして精製したＣＤ４＋  Ｔ細胞を、１×１０５／ウェルで添加する。培養物に、６０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６および１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２を補充し、そして３７℃でインキュベートする。培養物を、１週間ごとに、作製されたＤＣで上記のように再刺激し、そして抗原提示細胞として上記のようにパルス化し、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７および１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を補充する。４回のインビトロ刺激サイクルの後、得られるＣＤ４＋  Ｔ細胞株（各株は、１つのウェルに対応する）を、ペプチドのプールの刺激に応答する、特異的増殖およびサイトカイン産生について、コントロールとして使用したペプチドの無関係なプールと試験する。
【０３７４】
（実施例１８）
（インビトロ全遺伝子プライミングを使用する、腫瘍特異的ＣＴＬ株の作製）
腫瘍抗原−ワクシニア感染ＤＣ（例えば、Ｙｅｅら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５７（９）：４０７９−８６、１９９６を参照のこと）を使用するインビトロ全遺伝子プライミングを使用して、インターフェロン−γ  ＥＬＩＳＰＯＴ分析によって決定される場合に、特異的腫瘍抗原で形質導入された自己線維芽細胞を特異的に認識するヒトＣＴＬ株を誘導する。具体的には、樹状細胞（ＤＣ）を、１０％ヒト血清、５０ｎｇ／ｍｌヒトＧＭ−ＣＳＦおよび３０ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ−４を含有するＲＰＭＩ媒体中で５日間増殖させることによって、正常ヒトドナーのＰＢＭＣ由来の単球培養物から分化させる。培養後、ＤＣを腫瘍抗原組換えワクシニアウイルスで、５の感染多重度（Ｍ．Ｏ．Ｉ．）で一晩感染させ、そして３μｇ／ｍｌのＣＤ４０リガンドの添加によって、一晩成熟させる。次いで、ウイルスをＵＶ照射によって不活化する。ＣＤ８＋  Ｔ細胞を、磁気ビーズシステムを使用して単離し、そしてプライミング培養を、標準的な培養技術を使用して開始する。培養物を、予め同定された腫瘍抗原を用いてレトロウイルスにより形質導入した自己一次線維芽細胞を使用して７〜１０日ごとに再刺激する。４回の刺激サイクルの後に、腫瘍抗原形質導入自己線維芽細胞で刺激される場合にインターフェロン−γを特異的に産生するＣＤ８＋  Ｔ細胞株を同定する。腫瘍抗原を発現するベクターで形質導入されたＨＬＡミスマッチＢ−ＬＣＬ株のパネルを使用し、そしてＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいてＣＴＬ株によるインターフェロン−γ産生を測定することによって、ＣＴＬ株のＨＬＡ拘束が決定される。
【０３７５】
（実施例１９）
（抗腫瘍抗原モノクローナル抗体の作製および特徴付け）
マウスモノクローナル抗体を、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の腫瘍抗原タンパク質に対して、以下のように惹起させる：マウスを、５０μｇ組換え腫瘍タンパク質を含有する完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）で免疫し、引き続いて、１０μｇ組換えタンパク質を含有する不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）で腹腔内ブーストする。脾臓の除去の３日前に、これらのマウスを、約５０μｇの可溶性組換えタンパク質で静脈内免疫する。腫瘍抗原に対して陽性の力価を有するマウスの脾臓を除去し、そして単一細胞懸濁を作製し、そしてＳＰ２／Ｏ骨髄腫細胞との融合のために使用して、Ｂ細胞ハイブリドーマを作製する。ハイブリッドクローン由来の上清を、ＥＬＩＳＡによって、組換え腫瘍タンパク質に対する特異性について試験し、そして腫瘍タンパク質配列全体にまたがるペプチドを使用して、エピトープマッピングする。ｍＡｂもまた、フローサイトメトリーによって、腫瘍タンパク質をコードするｃＤＮＡを安定にトランスフェクトされた細胞の表面における腫瘍タンパク質を検出する能力について、試験する。
【０３７６】
（実施例２０）
（ポリペプチドの合成）
ポリペプチドを、ＨＰＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）活性化を伴うＦＭＯＣ化学反応を使用して、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ４３０Ａペプチドシンセサイザーで合成する。Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ配列は、ペプチドの結合体化、固定された表面への結合、または標識化の方法を提供するためにそのペプチドのアミノ末端に付着する。固体支持体からのそのペプチドの切断を、以下の切断混合物を使用して実施する：トリフルオロ酢酸：エタンジチオール：チオアニソール：水：フェノール（４０：１：２：２：３）。２時間の切断の後、そのペプチドを、冷したメチル−ｔ−ブチル−エーテル中において沈殿させる。次いで、そのペプチドペレットを、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含有する水中に溶解し、そしてＣ１８逆相ＨＰＬＣによる精製の前に凍結乾燥する。水中（０．１％ＴＦＡを含有する）０％〜６０％のアセトニトリル（０．１％ＴＦＡを含有する）の勾配を使用して、ペプチドを溶出させる。純粋な画分の凍結乾燥後、そのペプチドを、エレクトロスプレーもしくは他の型の質量分析法を使用し、そしてアミノ酸分析によって特徴付ける。
【０３７７】
（実施例２１）
（インビトロ全遺伝子プライミングを使用する、Ｂ３０５Ｄ特異的ＣＴＬ株およびクローンの作製）
この実施例は、正常なドナー由来のＢ３０５Ｄ特異的ＣＤ８＋  Ｔリンパ球の作製、および２つのＣＤ８＋  Ｔ細胞クローンのＨＬＡ拘束の同定を記載する。Ｂ３０５Ｄ  Ｃアイソフォームは、正常な乳房組織と比較して、乳房腫瘍において優先的に発現される乳房腫瘍抗原である。これらの実験は、Ｂ３０５Ｄタンパク質の免疫原性をさらに確認し、そしてワクチンのための標的および／または他の免疫療法アプローチとしてのその使用を支持する。
【０３７８】
標準的なインビトロプライミングを、９６ウェルプレートにおいて、ほぼ実施例１８に記載されるように樹立した。より具体的には、合計で９６０の培養物を、最初の刺激のために、ＡＰＣ  ＤＣとしてアデノウイルス発現Ｂ３０５Ｄ  Ｃアイソフォームに感染したＤＣを使用し、そして３回のさらなる刺激のために、Ｂ３０５Ｄ  Ｃアイソフォーム（配列番号３０１）の５’側の１／２または３’側の１／２を発現するように形質導入された自己線維芽細胞を使用して、樹立した。Ｔ細胞株を、Ｂ３０５Ｄ  Ｃアイソフォームの５’側の半分（配列番号３０４のアミノ酸１〜２００）または３’側の半分（配列番号３０４のアミノ酸１６０〜３８４）を発現する線維芽細胞について、γ−ＩＦＮ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによってスクリーニングした。Ｂ３０５Ｄ  Ｃアイソフォームの５’フラグメント（３Ｂ９、７Ｅ５、および８Ｈ８）または３’フラグメント（４Ｇ２、５Ｅ６、７Ｅ１０）のいずれかを認識する６つのＴ細胞株を同定した。次いで、クローンを、株３Ｂ９、５Ｅ６および８Ｈ８から作製し、そしてγ−ＩＦＮ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって、Ｂ３０５Ｄを認識することを示した。抗体ブロッキングγ−ＩＦＮ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施して、クローンの各々の関連する拘束対立遺伝子を同定した。８Ｈ８クローンおよび３Ｂ９クローン（３’フラグメント特異的）の活性は、パンクラスＩおよびＨＬＡ−Ｂ／Ｃブロッキング抗体によって特異的にブロックされ、そして５Ｅ６クローンの活性は、パンクラスＩおよびＨＬＡ−Ａ２ブロッキング抗体によってブロックされた。これらの結果は、８Ｈ８応答および５Ｅ６応答についての拘束対立遺伝子が、ドナーＤ３８５のＢ対立遺伝子またはＣ対立遺伝子（Ｂ７、Ｂ３５、Ｃｗ４、Ｃｗ７）の１つであり、そして３Ｂ９クローンについての拘束対立遺伝子は、Ｄ３８５によって発現されるＨＬＡ−Ａ０２０５対立遺伝子である。これらの結果は、これらのＴ細胞クローンによって認識される、Ｂ３０５Ｄ由来の少なくとも２つのエピトープが存在することを、さらに示唆する。
【０３７９】
要約すると、これらのデータは、ワクチン接種ストラテジーによって活性化され得る、Ｂ３０５Ｄ  Ｃアイソフォームに特異的な前駆Ｔ細胞が存在することを実証し、そしてさらに、ワクチン接種と免疫モニタリングストラテジーとの両方に使用され得る、Ｂ３０５Ｄ由来の天然にプロセシングされたエピトープが存在することを示す。
【０３８０】
上記より、本発明の特定の実施形態が本明細書において例示の目的で記載されているが、種々の改変が本発明の趣旨および範囲から逸脱することなくなされ得ることが理解される。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲によるものを除いて限定されない。
【図面の簡単な説明】
【０３８１】
【図１】図１は、ディファレンシャルディスプレイＰＣＲ産物を示す。このＰＣＲ産物は、ゲル電気泳動によって分離され、正常な乳房組織から調製されたｃＤＮＡ（レーン１およびレーン２）から、および同じ患者の乳房腫瘍組織から調製されたｃＤＮＡ（レーン３およびレーン４）から得た。矢印は、Ｂ１８Ａｇ１に対応するバンドを示す。
【図２】図２は、乳房腫瘍組織におけるＢ１８Ａｇ１  ｍＲＮＡのレベル（レーン１）を、正常な乳房組織におけるＢ１８Ａｇ１  ｍＲＮＡのレベルと比較する、ノーザンブロットである。
【図３】図３は、ＲＮアーゼプロテクションアッセイによって決定された、様々の正常組織および非乳房腫瘍組織におけるＢ１８Ａｇ１  ｍＲＮＡのレベルと比較した場合の、乳房腫瘍組織におけるＢ１８Ａｇ１  ｍＲＮＡのレベルを示す。
【図４】図４は、Ｂ１８Ａｇ１に対するＸｂａＩ制限酵素消化物の末端から得られたさらなるレトロウイルス配列（配列番号３〜配列番号１０に提供される）の位置を示すゲノムクローンマップである。
【図５】図５Ａおよび図５Ｂは、Ｂ１８Ａｇ１を含むレトロウイルスエレメントについての、配列決定ストラテジー、ゲノム構成、および推定オープンリーディングフレームを示す。
【図６】図６は、代表的な乳房腫瘍特異的ｃＤＮＡ  Ｂ１８Ａｇ１のヌクレオチド配列を示す。
【図７】図７は、代表的な乳房腫瘍特異的ｃＤＮＡ  Ｂ１７Ａｇ１のヌクレオチド配列を示す。
【図８】図８は、代表的な乳房腫瘍特異的ｃＤＮＡ  Ｂ１７Ａｇ２のヌクレオチド配列を示す。
【図９】図９は、代表的な乳房腫瘍特異的ｃＤＮＡ  Ｂ１３Ａｇ２ａのヌクレオチド配列を示す。
【図１０】図１０は、代表的な乳房腫瘍特異的ｃＤＮＡ  Ｂ１３Ａｇ１ｂのヌクレオチド配列を示す。
【図１１】図１１は、代表的な乳房腫瘍特異的ｃＤＮＡ  Ｂ１３Ａｇ１ａのヌクレオチド配列を示す。
【図１２】図１２は、代表的な乳房腫瘍特異的ｃＤＮＡ  Ｂ１１Ａｇ１のヌクレオチド配列を示す。
【図１３】図１３は、代表的な乳房腫瘍特異的ｃＤＮＡ  Ｂ３ＣＡ３ｃのヌクレオチド配列を示す。
【図１４】図１４は、代表的な乳房腫瘍特異的ｃＤＮＡ  Ｂ９ＣＧ１のヌクレオチド配列を示す。
【図１５】図１５は、代表的な乳房腫瘍特異的ｃＤＮＡ  Ｂ９ＣＧ３のヌクレオチド配列を示す。
【図１６】図１６は、代表的な乳房腫瘍特異的ｃＤＮＡ  Ｂ２ＣＡ２のヌクレオチド配列を示す。
【図１７】図１７は、代表的な乳房腫瘍特異的ｃＤＮＡ  Ｂ３ＣＡ１のヌクレオチド配列を示す。
【図１８】図１８は、代表的な乳房腫瘍特異的ｃＤＮＡ  Ｂ３ＣＡ２のヌクレオチド配列を示す。
【図１９】図１９は、代表的な乳房腫瘍特異的ｃＤＮＡ  Ｂ３ＣＡ３のヌクレオチド配列を示す。
【図２０】図２０は、代表的な乳房腫瘍特異的ｃＤＮＡ  Ｂ４ＣＡ１のヌクレオチド配列を示す。
【図２１Ａ】図２１Ａは、乳房腫瘍組織における乳房腫瘍遺伝子（レーン１〜８）および正常な乳房組織における乳房腫瘍遺伝子（レーン９〜１３）ならびにＨ２Ｏ（レーン１４）のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、以下における乳房腫瘍遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す：前立腺腫瘍（レーン１、２）、結腸腫瘍（レーン３）、肺腫瘍（レーン４）、正常な前立腺（レーン５）、正常な結腸（レーン６）、正常な腎臓（レーン７）、正常な肝臓（レーン８）、正常な肺（レーン９）、正常な卵巣（レーン１０、１８）、正常な膵臓（レーン１１、１２）、正常な骨格筋（レーン１３）、正常な皮膚（レーン１４）、正常な胃（レーン１５）、正常な精巣（レーン１６）、正常な小腸（レーン１７）、ＨＢＬ−１００（レーン１９）、ＭＣＦ−１２Ａ（レーン２０）、乳房腫瘍（レーン２１〜２３）、Ｈ２Ｏ（レーン２４）および結腸腫瘍（レーン２５）。
【図２２】図２２は、抗Ｂ１１−８  ＣＴＬ株による、（Ｂ１１−８と称される）Ｂ１１Ａｇ１ペプチドの認識を示す。
【図２３】図２３は、Ｂ１１−８特異的クローンＡ１による、抗原Ｂ１１Ａｇ１で形質導入された細胞株の認識を示す。
【図２４】図２４は、Ｂ１１−８特異的クローンＡ１による、肺腺癌株（ＬＴ−１４０−２２）および乳房腺癌株（ＣＡＭＡ−１）の認識を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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