(57)【要約】【解決手段】  本発明は、一般的には、ＣＮＳ障害の治療に有用な子孫を産生するために、中枢神経系細胞に作用する方法に関する。より具体的には、本発明は、前記障害をもつ患者に対し、ＰＡＣＡＰ、マキサディラン又はＶＩＰのシグナル伝達を通じて、中枢神経系細胞の増殖、移動、分化及び生存を調節する試薬を曝露することを含んでいる。これらの方法は、障害の少なくとも１つの症状を低減するのに有用である。
2005538942.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の神経系障害の症状を緩和する方法であって、
生体内でＮＳＣ活性を調節するために、神経系障害の疾病又は障害をもつ患者に対し、ＰＡＣＡＰ、マキサディラン、ＰＡＣＡＰレセプター作用剤、ＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１作用剤又はそれらの組合せを投与することを含んでいる、方法。
【請求項２】
ＮＳＣ活性は、増殖、分化、移動又は生存である請求項１の方法。
【請求項３】
ＰＡＣＡＰ、マキサディラン、ＰＡＣＡＰレセプター作用剤、ＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１作用剤又はそれらの組合せが投与される量は、0.001ng/kg/日乃至10mg/kg/日である請求項１の方法。
【請求項４】
ＰＡＣＡＰ、マキサディラン、ＰＡＣＡＰレセプター作用剤、ＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１作用剤は、標的組織の濃度が0.01ｎＭ−１μＭとなるように投与される請求項１の方法。
【請求項５】
標的組織は、脳室壁、脳室系の壁に隣接する部位、海馬、海馬白板、線条体、黒質、網膜、マイネルト基底核、脊髄、視床、視床下部及び大脳皮質からなる群から選択される請求項４の方法。
【請求項６】
ＰＡＣＡＰ、マキサディラン、ＰＡＣＡＰレセプター作用剤、ＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１作用剤は注射によって投与される請求項１の方法。
【請求項７】
注射は、皮下、腹腔内、筋肉内、脳室内、柔組織内、髄膜内又は頭蓋内へ行われる請求項６の方法。
【請求項８】
ＰＡＣＡＰ、マキサディラン、ＰＡＣＡＰレセプター作用剤、ＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１作用剤は経口投与される請求項１の方法。
【請求項９】
神経系の疾病又は障害は、神経変性障害、ＮＳＣ障害、神経前駆体障害、虚血性障害、神経外傷性障害、情動障害、精神神経疾患、網膜変性疾患、網膜損傷／外傷、認識能力障害並びに学習及び記憶障害からなる群から選択される請求項１の方法。
【請求項１０】
ＰＡＣＡＰレセプター若しくはマキサディランレセプター、又はＰＡＣＡＰ及びマキサディランのレセプターのＮＳＣに対する作用を調節する方法であって、前記レセプターを発現する細胞を、調節剤に曝露するステップを含んでおり、前記曝露の結果、ＮＳＣにより、増殖、分化、移動又は生存が誘起される、方法。
【請求項１１】
調節剤は、外因性試薬、抗体、アフィボディ又はこれらの組合せである請求項１０の方法。
【請求項１２】
ＰＡＣＡＰレセプターは、ＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１、ＶＩＰＲ１又はＶＩＰＲ２である請求項１０の方法。
【請求項１３】
マキサディランレセプターは、ＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１である請求項１０の方法。
【請求項１４】
調節剤は、ＰＡＣＡＰ、マキサディラン、ＰＡＣＡＰレセプター作用剤及びＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１作用剤からなる群から選択される請求項１１の方法。
【請求項１５】
調節剤は、ペグ化される請求項１１の方法。
【請求項１６】
抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である請求項１１の方法。
【請求項１７】
ＮＳＣは、胎児の脳、成体の脳、神経細胞培養又はニューロスフェアに由来する請求項１０の方法。
【請求項１８】
ＮＳＣは、硬膜、末梢神経又は神経節に包まれた組織に由来する請求項１０の方法。
【請求項１９】
ＮＳＣは、膵臓、皮膚、筋肉、成体骨髄、肝臓、臍帯組織又は臍帯血からなる群から選択される組織の幹細胞に由来する請求項１０の方法。
【請求項２０】
哺乳類の成体ＮＳＣの増殖又は神経発生を刺激する方法であって、哺乳類の成体ＮＳＣを含む細胞集団を、ＰＡＣＡＰ、マキサディラン、ＰＡＣＡＰレセプター作用剤及びＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１作用剤からなる群から選択される製剤に接触させて、接触処理されたＮＳＣを生成するステップを含んでおり、処理されたＮＳＣ細胞は、処理されていない細胞と比べて、増殖又は神経発生がすぐれている、方法。
【請求項２１】
ＮＳＣは、哺乳類の脳の側脳室壁に由来する請求項２０の方法。
【請求項２２】
ＮＳＣは、膵臓、皮膚、筋肉、成体骨髄、肝臓、臍帯組織又は臍帯血からなる群から選択される組織の幹細胞に由来する請求項２０の方法。
【請求項２３】
処理されたＮＳＣは、処理されていない細胞と比べて、分化、生存又は移動がすぐれている請求項２０の方法。
【請求項２４】
哺乳類の成体ＮＳＣの増殖又は神経発生を相乗的に刺激する方法であって、哺乳類の成体ＮＳＣを含む細胞集団を、成長因子と製剤とに接触させるステップを含んでおり、前記製剤は、ＰＡＣＡＰ、マキサディラン、ＰＡＣＡＰレセプター作用剤及びＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１作用剤からなる群から選択される、方法。
【請求項２５】
哺乳類の成体ＮＳＣの増殖の刺激は、成長因子による刺激又は前記製剤単独での刺激よりも大きい請求項２４の方法。
【請求項２６】
哺乳類の成体ＮＳＣの増殖の刺激は、成長因子による刺激と前記製剤単独での刺激の和よりも大きい請求項２４の方法。
【請求項２７】
成長因子はＥＧＦである請求項２４の方法。
【請求項２８】
哺乳類の成体ＮＳＣの増殖を刺激する方法であって、哺乳類の成体ＮＳＣを含む細胞集団を、ＶＥＧＦと製剤とに接触させるステップを含んでおり、前記製剤は、ＰＡＣＡＰ、マキサディラン、ＰＡＣＡＰレセプター作用剤及びＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１作用剤からなる群から選択される、方法。
【請求項２９】
ＮＳＣの増殖を促進する方法であって、細胞内ＣＲＥＢのリン酸化反応を促進するステップを含んでいる、方法。
【請求項３０】
細胞内ＣＲＥＢのリン酸化反応を促進するステップは、ＮＳＣを、ＰＡＣＡＰ、マキサディラン、ＰＡＣＡＰレセプター作用剤及びＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１作用剤からなる群から選択される製剤と接触させることを含んでいる請求項２９の方法。
【請求項３１】
ＮＳＣの増殖を促進する方法であって、細胞内ＡＰ−１の転写を促進するステップを含んでいる、方法。
【請求項３２】
細胞内ＡＰ−１の転写を促進するステップは、ＮＳＣを、ＰＡＣＡＰ、マキサディラン、ＰＡＣＡＰレセプター作用剤及びＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１作用剤からなる群から選択される製剤と接触させることを含んでいる請求項３１の方法。
【請求項３３】
ＮＳＣの増殖を促進する方法であって、細胞内蛋白質キナーゼＣの活性を向上させるステップを含んでいる、方法。
【請求項３４】
細胞内蛋白質キナーゼＣの活性を向上させるステップは、ＮＳＣを、ＰＡＣＡＰ、マキサディラン、ＰＡＣＡＰレセプター作用剤及びＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１作用剤からなる群から選択される製剤と接触させることを含んでいる請求項３３の方法。
【請求項３５】
哺乳類の成体ＮＳＣの子孫の生存を刺激する方法であって、哺乳類の成体ＮＳＣの子孫における細胞内ＣＲＥＢのリン酸化反応を促進するステップを含んでいる、方法。
【請求項３６】
細胞内ＣＲＥＢのリン酸化反応を促進するステップは、ＮＳＣを、ＰＡＣＡＰ、マキサディラン、ＰＡＣＡＰレセプター作用剤及びＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１作用剤からなる群から選択される製剤と接触させることを含んでいる請求項３５の方法。
【請求項３７】
ニューロスフェアを形成するために、一次成体成体哺乳類ＮＳＣの増殖を刺激する方法であって、増殖ＮＳＣを生成するために、細胞を、ＰＡＣＡＰ、マキサディラン、ＰＡＣＡＰレセプター作用剤及びＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１作用剤からなる群から選択される製剤と接触させることを含んでいる、方法。
【請求項３８】
哺乳類の神経組織にあるＮＳＣの増殖、分化、移動又は生存を、その位置にて促進する方法であって、細胞の増殖、分化、分化又は生存を促進するために、治療上有効な量のＰＡＣＡＰ、マキサディラン、ＰＡＣＡＰレセプター作用剤、又はＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１作用剤を神経組織に投与することを含んでいる、方法。
【請求項３９】
患者の所望される標的組織の中のＮＳＣの成長を促進する方法であって、
(ａ)  標的組織を、ＰＡＣＡＰ、マキサディラン、ＶＩＰＲ１、ＶＩＰＲ２又はＡＤＣＹＣＡＰ１Ｒ１遺伝子をエンコードする推定遺伝子領域を治療上有効な量が含まれる発現ベクターでトランスフェクトし、
(ｂ)  推定遺伝子領域を発現して、標的組織に蛋白質を生成する、
ステップを含んでいる、方法。
【請求項４０】
トランスフェクトするステップは、発現ベクターを注射によって投与することを含んでいる請求項３９の方法。
【請求項４１】
発現ベクターは、リポソ−ムに被包された非ウイルス性発現ベクターである請求項３９の方法。
【請求項４２】
中枢神経系の障害をもつ患者の神経発生を高める方法であって、ＰＡＣＡＰ、マキサディラン、ＰＡＣＡＰレセプター作用剤又はそのＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１作用剤を、患者に注入するステップを含んでいる、方法。
【請求項４３】
注入は、脳室内、静脈内、舌下、皮下及び動脈内への注入からなる群から選択される請求項４２の方法。
【請求項４４】
患者の中枢神経系障害の症状を緩和する方法であって、ＰＡＣＡＰ、マキサディラン、ＰＡＣＡＰレセプター作用剤及びＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１作用剤を、患者に注入するステップを含んでいる、方法。
【請求項４５】
ヒトのＮＳＣに対してリッチ化される細胞集団を作る方法であって、
(ａ)  ＮＳＣを含む細胞集団を、ＰＡＣＡＰレセプター、マキサディランレセプター又はＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１のデターミナントを識別する試薬と接触させ、
(ｂ)  前記ステップ(ａ)の細胞の表面上で、試薬とデターミナントが接触している細胞を選択して、中枢神経系幹細胞に対して高度にリッチ化される集団を作る、
ことを含んでいる方法。
【請求項４６】
試薬は、小分子、ペプチド、抗体及びアフィボディから成る群から選択される請求項４５の方法。
【請求項４７】
ＮＳＣを含む集団は、神経組織から得られる請求項４５の方法。
【請求項４８】
細胞集団は、全哺乳類の胎児脳又は全哺乳類の成体脳に由来する請求項４５の方法。
【請求項４９】
ヒトのＮＳＣｓは、膵臓、皮膚、筋肉、成体骨髄、肝臓、臍帯組織又は臍帯血からなる群から選択される組織の幹細胞に由来する請求項４５の方法。
【請求項５０】
生体外の細胞培養であって、請求項４５の方法によって生成された細胞集団を含んでおり、前記細胞集団は、ＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１、ＶＩＰＲ１及びＶＩＰＲ２からなる群から選択されるレセプターを発現する細胞にリッチ化される請求項、生体外の細胞培養。
【請求項５１】
中枢神経系障害の症状を緩和する方法であって、請求項５０の細胞集団を、その投与を必要とする哺乳類に対して投与することを含んでいる、方法。
【請求項５２】
患者の中枢神経系障害の症状を低減する方法であって、
(ａ)  胎児又は成体の組織から単離したＮＳＣｓの集団と、
(ｂ)  ＰＡＣＡＰ、マキサディラン、ＰＡＣＡＰレセプター作用剤、ＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１作用剤又はそれらの組合せと、
を含む組成物を、患者の脊髄へ投入するステップを有しており、これによって症状が低減される、方法。
【請求項５３】
患者の中枢神経系障害の症状を低減する方法であって、
(ａ)  ＰＡＣＡＰ、マキサディラン、ＰＡＣＡＰレセプター作用剤又はＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１作用剤をエンコードする核酸であって、その遺伝子が宿主で発現能力を有するプロモータに操作可能に結合された核酸を含む挿入部位を少なくとも１つ有するウイルスベクターを、標的細胞に導入し、
(ｂ)  標的細胞内で蛋白質が産生されるように核酸を発現させる、
ステップを有しており、これによって症状が低減される、方法。
【請求項５４】
患者の神経系の疾病又は障害の症状を緩和する方法であって、
(ａ)  ＮＳＣの集団を準備し、
(ｂ)  ＰＡＣＡＰ、マキサディラン、ＰＡＣＡＰレセプター作用剤、ＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１作用剤又はそれらの組合せを含む溶液の中にＮＳＣを懸濁させて、細胞懸濁液を生成し、
(ｃ)  前記細胞懸濁液を、患者の中枢神経系の注入部位に送達する、
ステップを有しており、これによって症状が緩和される、方法。
【請求項５５】
細胞懸濁液を送達するステップの前に、成長因子を、前記注入部位に所定時間投与するステップをさらに有している請求項５４の方法。
【請求項５６】
送達ステップの後、成長因子を、前記注入部位に投与するステップをさらに有している請求項５４の方法。
【請求項５７】
ヒトのＮＳＣにリッチ化される細胞集団を移植する方法であって、
(ａ)  ＮＳＣを含む集団を、ＰＡＣＡＰレセプター、マキサディランレセプター又はＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１のデターミナントを識別する試薬と接触させ、
(ｂ)  前記ステップ(ａ)の細胞の表面上で、試薬と決定要素が接触している細胞を選択して、中枢神経系幹細胞に対して高度にリッチ化される集団を作り、
(ｃ)  前記ステップ(ｂ)の選択された細胞を、ヒト以外の哺乳類に移植する、
ステップを含んでいる、方法。
【請求項５８】
ＮＳＣの表面で、マキサディランレセプター作用剤、ＰＡＣＡＰレセプター作用剤又はＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１作用剤を調節する方法であって、レセプターを発現する細胞を、外因性試薬、抗体又はアフィボディと接触させることを含んでおり、前記接触により、ＮＳＣの増殖、分化又は生存が引き起こされる、方法。
【請求項５９】
ＮＳＣは、胎児の脳、成体の脳、神経細胞培養又はニューロスフェアに由来している請求項５８の方法
【請求項６０】
単離されたＰＡＣＡＰ又はマキサディランのレセプター調節剤コンパウンド候補について、ＮＳＣ活性を調節する能力を有するかどうかを判定する方法であって、
(ａ)  単離された候補コンパウンドを、ヒト以外の哺乳類に投与し、
(ｂ)  候補コンパウンドが、ヒト以外の哺乳類の中でＮＳＣ活性を調節する作用を有するかどうかを判定する、
ステップを含んでいる、方法。
【請求項６１】
決定するステップは、ヒト以外の哺乳類の神経への影響を、ヒト以外の哺乳類で候補コンパウンドが投与されていない対照と比較することを含んでいる請求項６０の方法。
【請求項６２】
ＮＳＣの活性は、増殖、分化、移動又は生存である請求項６０の方法。
【請求項６３】
ＰＡＣＡＰ又はマキサディランレセプター調節剤は注射によって投与される請求項６０の方法。
【請求項６４】
注射は、皮下、腹腔内、筋肉内、脳室内、柔組織内、髄膜内又は頭蓋内へ行われる請求項６３の方法。
【請求項６５】
ＰＡＣＡＰ又はマキサディランレセプター調節剤は、ペプチド融合又はミセル送達によって投与される請求項６０の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜関連出願＞
この出願は、２００２年５月３日に出願された米国出願番号第６０／３７７,７３４号、２００２年７月２日に出願された米国出願番号第６０／３９３,２６４号及び２００２年１１月１５日に出願された米国出願番号第６０／４２６,８２７号の優先権を主張する。これら出願の内容は、引用を以て本願への記載加入とする。
＜発明の分野＞
本発明は、一般的には、損傷又は欠失したニューロン若しくは他の中枢神経系(ＣＮＳ)細胞タイプの代替となる子孫を作るために、成人の神経幹細胞及び神経前駆体細胞に影響を及ぼす方法に関するものである。より具体的には、本発明は、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性ポリペプチド(ＰＡＣＡＰ)、マキサディラン(Maxadilan)又はＶＩＰのシグナル伝達を調節(modulation)することにより、中枢神経系細胞の分化、増殖、生存及び移動を調節する試薬を、疾病に罹患した患者に投与する方法を含んでいる。これらの方法は、神経障害の少なくとも一つの症状を低減するのに有用である。
【背景技術】
【０００２】
この明細書では、技術の内容や状況を説明するのに、様々な特許、公開特許出願及び科学文献を引用している。これらの開示は、引用を以て本明細書への記載加入とする。
【０００３】
ここ数年の間に、神経幹細胞は、成体の哺乳類の脳に存在することが知られるようになった。この概念は特に重要であるが、それは、成人の脳の再生能力はごく限られたものであると考えられていたからである。さらにまた、組織修復のために成人の幹細胞を使用できると、胚細胞研究に関連する倫理的問題を解消するのに役立つことができる。ニューロンやグリアの発生は、成人の脳の中で観察することはできるが、生体外及び生体内でのヒトの神経幹細胞の刺激についての知識は非常に限られている。
【０００４】
新しいニューロンが成体の哺乳類の脳で生まれていたという最初の提案は、１９６０年代に行われた研究からもたらされたものである[Altman and Das 1965；Altman and Das 1967]。しかしながら、さらなる３０年が経過すると、技術的手法が改良され、哺乳類のＣＮＳ内での神経発生(neurogenesis)は胚形成時期及び周産期に制限されるという定説が覆された[Momma，Johansson et al．2000； Kuhn and Svendsen 1999参照]。神経の疾病及び損傷に対するこれまでの治療は、存在するニューロンの生存を維持することに焦点があてられていたが、今では、神経障害及び疾病の治療に神経発生の利用可能性が検討されている。
【０００５】
新しいニューロンのソース(source)は、神経幹細胞(ＮＳＣ)である。この神経幹細胞は、側脳室をライニングする上衣及び／又は副脳室領域(subventricular zone：ＳＶＺ)の中にあり[Doetsch，Caille et al．1999；Johansson Momma et al．1999]、また、海馬の歯状回の中にある[Gage，Kempermann et al．1998]。最近の研究によると、成人のＣＮＳ内部の幾つかの追加位置に、ＮＳＣの存在可能性が明らかにされている[Palmer，Markakis et al．1999]。ＮＳＣの非対称性分裂により、その数は維持されるが、急速分裂する前駆体又は前駆体細胞の集団が発生する[Johansson， Momma et al．1999]。前駆体は、分化する細胞タイプと、最終的に脳の中で占める位置に関して、それらの増殖及び致死(fate)の程度を表すキュー(cues)の範囲に反応する。
【０００６】
成体の脳室系のＮＳＣは、神経管をライニングする胚の脳室領域の幹細胞の対応物(counterparts)である可能性があり、その子孫の移動により、ＣＮＳを分化ニューロン及びグリアとして形成する[Jacobson 1991]。ＮＳＣは、成体の側脳室壁(ＬＶＷ)の中で生存して、神経前駆体を発生させる。この神経前駆体は、吻側移動路(rostral migratory stream)を下って嗅球へ移動し、該嗅球にて、顆粒細胞及び糸球体周辺のニューロンに分化する[Lois and Alvarez-Buylla 1993]。嗅球では、相当数のニューロンの死が起こるため、失われたニューロンを継続的に代替する必要があり、ＬＶＷに由来する移動性前駆体によって満たされる必要がある[Biebl，Cooper et al．2000]。嗅球ニューロンの集団の再構成を継続させることの他に、脳の他の場所で失われたニューロンが、ＬＶＷの前駆体で置き換えられることが強く示唆されており、前記前駆体は、適当な神経突起を有する喪失ニューロンの表現型及び正しい標的細胞タイプを有するシナプスの中に分化する[Snyder，Yoon et al．1997；Magavi，Leavitt et al．2000]。
【０００７】
ＮＳＣの増殖と分化の調節に関する外部シグナルを識別するために、生体外の培養技術が確立されてきた[Johansson， Momma et al．1999; Johansson，Svensson et al．1999]。マイトジェンＥＧＦ及び塩基性ＦＧＦは、脳室壁及び海馬から単離された神経前駆体の培養を大いに増大させることができる[McKay 1997; Johansson，Svensson et al．1999]。分裂する前駆体は、未分化状態のままで、ニューロスフェア(neurospheres)として知られる大きな球体の細胞に成長する。血清を加え、マイトジェンを中止すると、前駆体は、ニューロン、星状細胞、乏突起膠細胞の３種類の細胞系への分化が誘発される[Doetsch，Caille et al．1999；Johansson， Momma et al．1999]。特異的成長因子を適用すると、各細胞タイプの比率は、何らかの形で歪められる。例えば、ＣＮＴＦは、星状細胞が死に至るように神経前駆体に作用し[Johe，Hazel et al．1996；Rajan and McKay 1998]、甲状腺ホルモン及びトリヨードチロニン(Ｔ３)は乏突起膠細胞分化を促進することを示した[Johe，Hazel et al．1996]。ＰＤＧＦによる神経前駆体の神経分化が増すことも知られている[Johe，Hazel et al．1996；Williams，Park et al．1997]。
【０００８】
神経前駆体細胞を増大させる能力やそれらの細胞の運命を操作する能力もまた、特異的細胞タイプが失われた神経疾病の移植治療に密接な関係を有する。その最も顕著な例は、パーキンソン病(ＰＤ)であり、これは、黒質のドーパミン作動性ニューロンの変性(degeneration)によって特徴づけられる。ＰＤ患者に対する従来の移植治療では、黒質のドーパミン作動性ニューロンが最終分化を行なっているときに腹側中脳から採取した胎生組織を使用していた[Herman and Abrous 1994]。細胞は、線条体に移植され、宿主の線条体ニューロンの正常なシナプス標的とシナプス接合を形成し、ドーパミンターン代謝を回復して、正常レベルまで放出し、患者に対して機能的利益がもたらされる[Hermann and Abrous 1994][Bjorklund and Lindvall 2000参照]。胎生細胞の移植は、ドナー細胞の不足によって妨げられる。しかし、生体外でＮＳＣの増殖及び操作を行なうことにより、例えばＰＤのドーパミン作動性細胞のように、神経変性疾患に対する移植対処用に特徴づけられた一連の細胞を提供できる可能性がある。この目的の場合、神経細胞タイプの増殖や分化を支配する因子や経路を特定することは必須事項であろう。
【０００９】
結局のところ、これら増殖因子及び分化因子を特定することは、神経疾病及び障害の治療に対して内因性の神経発生に刺激を与えることを考察することになるようである。ＥＧＦと塩基性ＦＧＦの両方を脳室内に注入すると、脳室壁の細胞集団を増殖することが知られており、また、ＥＧＦの場合は、近傍の線条体柔組織に前駆体の移動が促進される[Craig，Tropepe et al．1996; Kuhn，Winkler et al．1997]。前駆体は、大部分はグリア系に分化し、ニューロンの発生を減少させる[Kuhn，Winkler et al．1997]。最近の研究によると、ＢＤＮＦを成体ラットの脳室内に注入すると、嗅求、吻側移動路及び柔組織構造(例えば、線条体、隔膜、視床、視床下部)の中で新たに発生したニューロンの数の増加を刺激することが判ってきた[Pencea，Bingaman et al．2001]。これらの研究によれば、ＬＶＷのＳＶＺ内の前駆体の増殖が刺激され、それらの系統(lineage)のニューロン及びグリアの運命が操作可能でることを示している。現在、生体内の神経発生に影響を及ぼすことがわかっている因子の数は、少なく、しかもそれらの効果は、所望通りのものでないか、又は限定されたものである。
【００１０】
それゆえ、神経前駆体の増殖と所望神経細胞タイプへの分化を通じて、神経幹細胞の活性を選択的に刺激することのできる他の因子を特定する(identify)ことが、長い間要請されている。この活性は、生体内における神経発生の刺激及び移植療法のための細胞の培養の両方にとって有益であろう。本発明は、ＰＡＣＡＰ、マキサディラン、ＶＩＰの役割を明らかにすると共に、生体内外での神経幹細胞の増殖、分化、生存及び移動において、それらのシグナル伝達経路を明らかにするものである。
【発明の開示】
【００１１】
＜発明の要旨＞
本発明は、一般的には、損傷又は欠失したニューロン若しくは他の中枢神経系細胞タイプの代替となる子孫(progeny)を作るために、中枢神経系細胞に影響を及ぼす方法に関するものである。
【００１２】
本発明の目的は、神経系障害の症状を緩和する方法を提供することであり、神経系の疾病又は障害をもつ患者に対して、生体内の神経幹細胞又は神経前駆体細胞の活性を調節するために、ＰＡＣＡＰ、マキサディラン、ＶＩＰ又はそれらの組合せを投与することを含んでいる。本明細書において、障害(disorder)と疾病(disease)は同じ意味である。
【００１３】
本発明の他の目的は、神経幹細胞又は神経前駆体細胞におけるＰＡＣＡＰレセプター、マキサディランレセプター、ＶＩＰレセプター又はそれらの組合せを調節する方法を提供することであり、レセプターを発現する細胞を、外因性試薬、抗体又はアフィボディに曝露する(exposing)ことを含んでおり、それによって、神経幹細胞又は神経前駆体細胞の増殖、分化、生存を誘起又は抑制するものである。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、哺乳類の中枢神経系の疾病又は障害の治療において、それら疾病又は障害の症状を緩和する方法を提供することであり、ＰＡＣＡＰ、マキサディラン、ＶＩＰ、ＰＡＣＡＰレセプター作用剤、マキサディランレセプター作用剤又はＶＩＰレセプター作用剤を哺乳類に投与することを含んでいる。
【００１５】
本発明のさらに他の目的は、哺乳類の神経組織にある神経幹細胞又は神経前駆体細胞の増殖、移動、分化、生存を、その位置にて誘起する方法を提供することであり、細胞の増殖、移動、分化、生存を調節するために、治療上有効な量のＰＡＣＡＰ、マキサディラン、ＶＩＰを神経組織に投与することを含んでいる。
【００１６】
本発明の他の目的は、患者の所望される標的組織の中の神経幹細胞又は神経前駆体細胞の成長を促進する方法を提供することであり、患者に対して、治療上有効的な量の発現ベクターを投与することを含んでおり、発現ベクターとして、ＰＡＣＡＰ、マキサディラン又はＶＩＰ遺伝子を含んでいる。
【００１７】
本発明の他の目的は、中枢神経系の病気や障害をもつ患者の神経発生を促進する方法を提供することであり、ＰＡＣＡＰ、マキサディラン、ＶＩＰ、ＰＡＣＡＰレセプター作用剤、マキサディランレセプター作用剤又はＶＩＰレセプター作用剤を注入することを含んでいる。
【００１８】
本発明のさらなる目的は、中枢神経系の病気や障害をもつ患者の症状を緩和する方法を提供することであり、ＰＡＣＡＰ、マキサディラン、ＶＩＰ、ＰＡＣＡＰレセプター作用剤、マキサディランレセプター作用剤又はＶＩＰレセプター作用剤の注入によって神経発生を促進することを含んでいる。
【００１９】
本発明の他の目的は、ヒトの神経幹細胞又はヒトの神経前駆体細胞に対してリッチ化される(enriched)細胞集団を作る方法を提供することであり、(ａ)神経幹細胞又は神経前駆体細胞を含む集団を、ＰＡＣＡＰレセプター、マキサディランレセプター又はＶＩＰレセプターのデターミナント(determinant)を識別する試薬と接触させ；(ｂ)前記ステップ(ａ)の細胞の表面上で、試薬とデターミナントが接触している細胞を選択して、中枢神経系幹細胞に対して高度にリッチ化される集団を作ることを含んでいる。本発明の一実施例において、試薬は、可溶性レセプター、小分子、ペプチド、抗体及びアフィボディから成る群から選択される。本発明の他の実施例において、可溶性レセプターは、ＰＡＣＡＰ、マキサディラン又はＶＩＰレセプターである。
【００２０】
本発明のさらなる目的は、前述の方法によって作成された細胞集団を含む細胞を生体外で培養することであり、前記細胞集団は、レセプターを発現する細胞の中でリッチ化され、前記レセプターは、ＰＡＣＡＰレセプター、マキサディランレセプター又はＶＩＰレセプターから成る群から選択される。
【００２１】
本発明の１つの目的は、中枢神経系の病気又は障害の症状を緩和する方法を提供することであり、前記病気又は障害の治療を必要とする哺乳類に対し、前記細胞集団を投与することを含んでいる。本発明のさらなる目的には、前述のヒトの神経幹細胞又は神経前駆体細胞で移植されたヒト以外の哺乳類が含まれる。本発明の好ましい実施例において、ヒト以外の哺乳類は、ラット、マウス、ウサギ、馬、羊、豚及びテンジクネズミを含む群から選択される。
【００２２】
本発明の他の目的は、患者の中枢神経系の病気又は障害の症状を緩和する方法を提供することであり、患者の脊髄の中に、胎生又は成体組織から単離された神経幹細胞又は神経前駆体細胞の集団群、並びにＰＡＣＡＰ、マキサディラン、ＶＩＰ、ＰＡＣＡＰレセプター作用剤、マキサディランレセプター作用剤又はＶＩＰレセプター作用剤又はそれらの組合せを含む組成物を投与するステップを含んでいる。
【００２３】
本発明の他の目的は、本発明は、哺乳類の標的細胞において、遺伝子の送達及び発現の方法を提供することであり、ウイルスベクターを標的細胞に導入するステップを含んでおり、前記ウイルスベクターは、ＰＡＣＡＰ、マキサディラン、ＶＩＰ、ＰＡＣＡＰレセプター、マキサディランレセプター又はＶＩＰレセプターをエンコードする核酸を含む少なくとも１つの挿入部位を有しており、前記核酸の遺伝子は、宿主の中で発現能力を有するプロモータに対して操作可能に結合されている。本発明の一実施例において、ウイルスベクターは、非細胞溶解性(non-lytic)ウイルスベクターである。
【００２４】
本発明の他の目的は、哺乳類の標的細胞に遺伝子を送達(delivery)及び発現する方法を提供することであり、(ａ)ＰＡＣＡＰ、マキサディラン又はＶＩＰに対して、ＰＡＣＡＰレセプター、マキサディランレセプター又はＶＩＰレセプターをエンコードする核酸配列の単離された核酸断片を準備し、(ｂ)標的細胞の中で発現能力を有するプロモータに対して操作可能に結合された前記の単離された核酸断片を挿入するための挿入部位を少なくとも１つ有するウイルスベクターを選択し、(ｃ)単離された核酸断片を前記挿入位置に挿入し、(ｄ)標的細胞にベクターを導入し、遺伝子が検出可能なレベルで発現されることを含んでいる。本発明の一実施例において、ウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、イリドウイルス、コロナウイルス、トガウイルス、カリシウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス及びピコルナウイルスから成る群から選択される。本発明の他の実施例において、ポックスウイルスは痘疹である。本発明の他の実施例において、ウイルスは、遺伝子操作されるか、又は宿主の中で無毒化されるよう選択された菌株(strain)である。
【００２５】
本発明のさらなる目的は、患者の中枢神経系の病気や障害の症状を緩和する方法を提供することであり、(ａ)神経幹細胞又は神経前駆体細胞の集団を準備し、(ｂ)ＰＡＣＡＰ、マキサディラン又はＶＩＰからなる混合物を含む溶液の中で、神経幹細胞又は神経前駆体細胞を懸濁して、細胞懸濁液を調製し、(ｃ)前記症状を緩和させるために、前記細胞懸濁液を、患者の中枢神経系の注入部位に送達するステップを含んでいる。本発明の方法の一実施例において、細胞懸濁液を送達するステップの前に、注入部位に成長因子を所定時間注入するステップをさらに有している。本発明の他の実施例において、前記方法は、送達ステップの後、注入部位に成長因子を注入するステップをさらに有している。
【００２６】
本発明のさらなる目的は、ヒトの神経幹細胞又はヒトの神経前駆体細胞にリッチ化される細胞集団を移植する方法を提供することであり、(ａ)神経幹細胞又は神経前駆体細胞を含む集団を、デターミナントを識別する試薬と接触させ；(ｂ)前記ステップ(ａ)の細胞の表面上で、試薬とデターミナントが接触している細胞を選択して、中枢神経系幹細胞に対して高度にリッチ化される集団を調製し、(ｃ)前記ステップ(ｂ)で選択された細胞を、ヒト以外の哺乳類に移植するステップを含んでいる。
【００２７】
本発明のさらなる目的は、神経幹細胞又は神経前駆体細胞の表面で、ＰＡＣＡＰ、マキサディラン若しくはＶＩＰのレセプター、又はＰＡＣＡＰ、マキサディラン若しくはＶＩＰのリガンドを調節する方法を提供することであり、前記レセプター又はリガンドを発現する細胞を、外因性の試薬、抗体又はアフィボディに曝露するステップを含んでおりさらし、それによって、神経幹細胞又は神経前駆体細胞の増殖、分化又は生存を誘起するものである。本発明の一実施例において、神経幹細胞又は神経前駆体細胞は、胎児の脳、成人の脳、神経細胞培養又はニューロスフェアに由来している。
【００２８】
本発明のさらなる目的は、単離されたＰＡＣＡＰ、マキサディラン又はＶＩＰのレセプター調整剤化合物の候補について、神経幹細胞又は神経前駆体細胞の活性を調節する能力を有するかどうかを判定する方法を提供することであり、(ａ)単離された候補化合物を、ヒト以外の哺乳類に投与し、(ｂ)候補化合物が、ヒト以外の哺乳類の神経幹細胞又は神経前駆体細胞の活性を調節する作用を有するかどうかを判定するステップを含んでいる。本発明の一実施例において、判定するステップは、ヒト以外の哺乳類の神経への影響を、ヒト以外の哺乳類で候補化合物を投与していない対照(control)と比較することを含んでいる。本発明のさらなる実施例において、化合物は、ペプチド、小分子及びレセプター作用剤から選択される。神経幹細胞又は神経前駆体細胞の活性は、増殖、分化、移動又は生存に関するものである。
〈発明の詳細な説明〉
【００２９】
ある試薬が、生体外(in vitro)及び生体内(in vivo)において、神経幹細胞及び／又は神経前駆体細胞の分化、泳動、増殖及び生存を調節する能力を有することを発見した。本明細書に記載される「調節(modulate)」という語は、神経幹細胞(neural stem cell)(ＮＳＣ)又は神経前駆体細胞(neural progenitor cell)(ＮＰＣ)の活性の分化、泳動、増殖及び生存を変化させることができるような影響を及ぼすことを意味する。脱分化多能性細胞は、培養物の中で１年以上増殖することができるので、この明細書の中に記載される本発明は、神経前駆体をほぼ無制限に供給し得るものである。
【００３０】
本明細書を通じて、「神経幹細胞」(ＮＳＣ)という語は、「neural progenitor cell」「neuronal progenitor cell」「neural precursor cell」及び「neuronal precursor cell」(ここでは、全てＮＰＣと称する)を含んでいる。ＮＳＣとＮＰＣは、単一の細胞又は複数の細胞(例えば、細胞集団)の両方を含む。これらの細胞は、細胞の能力によって特定することができる。その能力として、細胞増殖を連続的に行なうこと、自らの正確なコピーを再生すること(自己再生)、大量の局部的(regional)細胞子孫を生成すること、損傷又は病気に反応して新細胞を作り出すことが挙げられる。ＮＰＣｓという語は、神経細胞(例えば、神経前駆体又は成熟ニューロン)、又はグリア細胞(例えば、グリア前駆体、成熟アストロサイト、成熟オリゴデンドロサイト)の子孫を生成することができる細胞を意味する。典型的には、その細胞は、神経系統を特徴づける表現型マーカーの一部を発現する。また、それら細胞は、インビトロで自己培養される場合に、何らかの方法で脱分化又は再プログラミングされなければ、通常、他の胚性生殖層の子孫を生成しない。ここで用いられる「ニューロスフェア(neurosphere)」という語は、ＮＳＣからなる細胞の球体を意味する。
【００３１】
ここで用いられる「試薬(reagent)」という語は、化学的及び生物学的にレセプターを活性化する能力を有する任意の物質を意味しており、レセプターには、ペプチド、小分子、抗体(又はその断片)、アフィボディ(affibodies)、及びレセプターを二量化若しくは多量体化するか、又は細胞外ドメインの活性化の必要性の代わりとなる任意の分子が含まれる。一実施例では、試薬は小分子である。
【００３２】
ここで用いられる「抗体」又は「免疫グロブリン」という語は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体と、それらの機能性誘導体(functional derivatives)(即ち、人工抗体(engineered antibody))の両方を意味する。抗体は、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥなどあらゆるクラスの全免疫グロブリン(whole immunoglobulin)、複抗原若しくは多抗原又はエピトープ特異性をもつハイブリッド抗原、例えば、Ｆ(ａｂ')２、Ｆ(ａｂ)２、Ｆａｂ'、Ｆａｂ１等、ハイブリッド断片を含む断片であってよい。なお、前記の範囲は、無傷の免疫グロブリン分子だけではなく、当該技術分野で知られた技術によって作製され、所望の抗体結合特異性を維持する免疫グロブリン分子(例えば、単鎖Ｆｖ構造、ダイアボディ(diabody)及び融合構造)の断片及び誘導体を意図的に含んでいる。「アフィボディ(affibody)」(米国特許第５,８３１,０１２号)という語は、所望される如何なる標的分子にも結合するように設計されることができる非常に特異的な親和性蛋白質を意味する。これらの抗体ミミックは、所望の特性(特異性及び親和性)を有するように製造することはできるし、その一方で、非常に強固であり、ｐＨ及び高温条件を含む広範囲の分析条件に耐えることができる。特異性結合特性を、各捕捉蛋白質に組み込むことにより、対応する標的蛋白質に対して非常に高い特異性と所望の親和性が与えられる。それゆえ、特異的標的蛋白質は、それに対応する捕捉蛋白質のみと結合する。小サイズ(５８個のアミノ酸のみ)、高溶解性、多機能構造へのさらなる工学的処理の容易性、すぐれた折り畳み性(folding)、システインの不存在、安定な足場(scaffold)を有するものが、低コストの細菌発現システム(bacterial expression systems)を用いて大量に作成されるので、様々な生命科学分野において、アフィボディは、Ｆａｂ又は単鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)断片のような抗体又は抗体断片よりもすぐれた捕獲分子となり得る。なお、抗体という語は、人工抗体を含む。
【００３３】
ここで、「人工抗体(engineered antibody)」という語は、生化学的に又は組み換えられて生成される抗体の機能性誘導体の全てを含む。蛋白質は、少なくとも１つの抗原結合部位(ＡＢＳ)又は相補性決定領域(ＣＤＲ)を具えているならば、抗体の機能性誘導体である。なお、相補性決定領域(ＣＤＲ)とは、他のＣＤＲ(同じポリペプチド鎖上又は異なるポリペプチド鎖上にある)と結合すると、ＡＢＳを形成するＣＤＲである。人工抗体という語は、少なくとも、組換え抗体、標識抗体(tagged antibodies, labeled antibodies)、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、組換えられた(天然物に対するという意味)多量体抗体、単鎖抗体、ダイアボディ(diabodies)、トリアボディ(triabodies)と、４価の多量体(２つのダイアボディの二量体)、５価の多量体(ダイアボディとトリアボディの二量体)と、６価の多量体(２つのトリアボディの二量体)、その他、抗体の７価以上の多量体形態を含んでいる。
【００３４】
「組換え核酸(recombinant nucleic acid)」又は「組換え技術で作られた核酸」という語は、天然又は内因性ソースから分離されるか、又は天然発生的なフランキングヌクレオチド若しくはインターナルヌクレオチドの追加、削除又は変更による化学的若しくは酵素的に修飾されたＤＮＡ又はＲＮＡの如き核酸を意味する。フランキング(flanking)ヌクレオチドは、記述されたヌクレオチドの配列又はサブ配列の上流又は下流に位置するヌクレオチドであり、インターナルヌクレオチドは、記述された配列又はサブ配列の内部で発生するヌクレオチドである。
【００３５】
「組換え手段」という語は、蛋白質を単離する技術を意味し、同定され、発現ベクターに挿入された蛋白質をコード化するｃＤＮＡ配列である。ベクターは、次に、細胞の中に導入されて、その細胞は蛋白質を発現する。また、組換え手段は、ＰＰＣの発現、蛋白質の構成的な(constitutive)発現、又は蛋白質の誘導的な(inducible)発現のために、異なるソースから１つのベクターへの暗号化ＤＮＡ又はプロモータＤＮＡのライゲーションを含む。
【００３６】
「プロモータ」という語は、ｍＲＮＡを生成するために構造遺伝子の転写を指令するＤＮＡ配列を意味する。一般的には、プロモータは、遺伝子の５'領域の中で、構造遺伝子の開始コドンに近接した位置に配置される。プロモータが誘導性プロモータである場合、転写速度は、誘発剤に反応して増加する。一方、プロモータが構成的プロモータである場合、転写速度は、誘発剤では調節されない。
【００３７】
「エンハンサー」という語は、プロモータ要素を意味する。エンハンサーは、転写の開始部位に対するエンハンサーの距離又は向きには関係なく、特定遺伝子がｍＲＮＡに転写される効果を向上させることができる。
【００３８】
「相補的ＤＮＡ(ｃＤＮＡ)」は、逆転写酵素(enzyme reverse transcriptase)によってｍＲＮＡテンプレートから形成される一本鎖(single-stranded)ＤＮＡ分子を意味する。一般的には、ｍＲＮＡの一部に相補的なプライマーが、逆転写の開始のために用いられる。また、当該技術分野の専門家であれば、「ｃＤＮＡ」という語は、このような一本鎖ＤＮＡ分子とその相補体とから構成される二本鎖ＤＮＡ分子を意味する語としても用いるであろう。
【００３９】
「発現(expression)」は、ポリペプチドが構造遺伝子から生成されるプロセスを意味する。該プロセスは、ｍＲＮＡへの遺伝子の転写と、前記ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を含んでいる。
【００４０】
「クローニングベクター」は、プラスミド、コスミド、ファージミド、又はバクテリオファージのように、宿主細胞内で自ら複製する能力を有し、遺伝子操作のために細胞の変換に用いられるＤＮＡ分子を意味する。クローニングベクターは、一般的には、１又は少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含んでおり、該部位では、外来ＤＮＡ配列は、ベクターの本質的生物学的機能を損なうことなく決定できるように挿入されることができる。これは、クローニングベクターで変換された細胞の同定及び選択に用いるのに適したマーカー遺伝子(marker gene)と同様である。マーカー遺伝子は、一般的には、テトラサイクリン耐性及びアンピシリン耐性をもたらす遺伝子を含んでいる。
【００４１】
「発現ベクター」は、外来蛋白質をエンコードして、組換え宿主内でその外来蛋白質の発現をもたらす外来蛋白質をエンコードするクローンされた構造遺伝子を具えるＤＮＡ分子を意味する。一般的に、クローン化遺伝子の発現は、プロモータ及びエンハンサー配列のような調節性配列に制御されて配置される(即ち、それら動作的にリンクされている)。プロモータ配列は、構成的又は誘導的の何れかである。
【００４２】
「組換え宿主」は、クローニングベクター又は発現ベクターのどちらかを含む原核細胞又は真核細胞を意味する。この語はまた、宿主細胞の染色体又はゲノム内にクローン化遺伝子を含むように遺伝子操作された原核細胞又は真核細胞を含むことを意味する。宿主細胞は、単細胞生物に限定されない。哺乳動物、昆虫及び植物のような多細胞有機体もまた、本発明において宿主細胞と考えられる。適当な宿主の例として、"MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUUAL, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)"を参照することができる。
【００４３】
本発明に関連する様々な文法形態の中での「治療(treating)」という語は、病気状態、病気の進行、病原体(例えば、バクテリア又はウイルス)又はその他異常状態の有害効果を、防止したり、治癒させたり、取り除いたり、弱めたり、緩和したり、少なくしたり、抑制したり、又は阻止することを意味する。
【００４４】
「組換え蛋白質」「組換えによって生成された蛋白質」という語は、蛋白質を発現できる内因的複製を有しない非天然細胞を用いて生成されたペプチド又は蛋白質を意味する。細胞が蛋白質を産生するのは、適当な核酸配列の導入によって遺伝子組換えが行なわれているためである。組換え蛋白質は、蛋白質及び該蛋白質を生成する細胞に通常関係する他の亜細胞要素と一緒には存在しないであろう。
【００４５】
特異的なケースとして、薬剤の「治療上有効な量」は、治療の必要上患者の症状を改善するのに十分な量、又は、病気及び合併症を少なくとも部分的に阻むのに十分な量として決定される。このような使用に対する有効量は、病気の重症度及び患者の健康の全身状態に依存する。投与については、投薬量に応じて、１回又は複数回の投与が行われ、頻度は、患者が耐え得る程度によって決められる。
【００４６】
本発明の蛋白質、抗体又は抗体結合部位(ＡＢＳ)に関して用いられる「結合特異性」「〜に特異的に結合する」又は「〜と特異的に免疫反応する」という語は、蛋白質及びその他生物製剤の異種集団(heterogeneous population)が存在する状況下で、蛋白質又は炭水化物の存在を決定する結合反応を意味する。結合を判定するのに、様々な免疫学的検定が用いられる。例えば、蛋白質又は炭水化物と特異的に免疫反応する抗体を選択するために、固相ＥＬＩＳＡ免疫学的検定が一般的に用いられる。特異的免疫反応性を求めるために用いられる免疫学的検定のフォーマット及び条件について記載された文献がある[Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publication, New York (1988)参照]。
【００４７】
「核酸の暗号化(encoding)」又は「核酸配列の暗号化」という語は、特異的蛋白質又はペプチドの発現を指令する核酸を意味する。核酸配列は、ＲＮＡに転写されるＤＮＡ鎖と、蛋白質に転写されるそのＲＮＡ配列の両方を含んでいる。核酸配列は、核酸の全長配列と、その全長配列に由来する短い配列を含んでいる。特定の核酸配列が、特異的宿主の中でコドンの優先選択(codon preference)をもたらすために導入される１又は複数の天然配列の縮重コドンを含むことは理解される。核酸は、単一鎖又は二本鎖のどちらかの形態のセンス鎖とアンチセンス鎖の両方を含んでいる。
【００４８】
「薬学的組成物(pharmaceutical composition)」は、様々に製剤の調合物を意味する。非経口調合物は知られており、本発明で好適に用いられる。治療的に有効な量の抗毒素(immunotoxins)を含む調合物は、滅菌溶液若しくは懸濁液のような液体か、又は凍結乾燥(lyophilized)の形態であり、選択的に、安定剤又は賦形剤(excipients)を含んでいる。凍結乾燥された組成物は、例えば、注射用水、生理食塩水、０.３％グリシン等の適当な希釈剤によって、宿主体重１ｋｇ当たり、約０.０１ｍｇ乃至１０ｍｇ以上の濃度に再構成される。
【００４９】
本発明の好ましい試薬は、例えばＰＡＣＡＰペプチドであるＰＡＣＡＰ３８及びＰＡＣＡＰ２７のようなペプチドのＶＩＰ/セクレチン/グルカゴンファミリーのメンバーを含んでおり、これらは、同一の２７−ａａＮ末端を共有しており、プリプロＰＡＣＡＰ[Arimura 1998; Vaudry, Gonzalez et al. 2000]と称される１７６−ａａ前駆体(precursor)から作製されることもできる。血管作動性腸管ペプチド(vasoactive intestinal peptide; ＶＩＰ)は、２８−アミノ酸ペプチドであり、中枢神経系(central nervous system; ＣＮＳ)及び幾つかの末梢器官で様々な作用を有する(Gressens 1999)。ＶＩＰは、特異的に結合することが可能であり、ＶＩＰＲ１及び２に対する結合性(affinity)は高いが、ＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１への結合性は１０〜１０００倍低い[Jaworski and Proctor 2000]。
【００５０】
本発明は、ＰＡＣＡＰの作用をインビボで調節し、ドラッグスクリーニングを行なうためのＰＡＣＡＰ及びマキサディランペプチドを治療のために投与する方法を提供する。一実施例では、上記コンパウンドが神経組織に投与される。好ましい実施例において、前記神経組織は、胎児又は成人の脳である。さらに他の実施例では、神経細胞又は神経由来細胞を含む集団は、神経細胞培養又はニューロスフェアから得られる。
【００５１】
本発明に含まれるレセプターの一つは、ＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１で、ＶＩＰ/セクレチン/グルカゴンファミリーのメンバーであり、全てのアイソフォーム(isoforms)と共に含まれる[Jaworski and Proctor 2000](実施例７を参照)。
【００５２】
＜ＰＡＣＡＰレセプター及びそれらのリガンド＞
神経発生及び神経分化における神経ペプチドの役割は明らかになっている。特に、明確な機能データは未だに不十分であるが、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド(ＰＡＣＡＰ)及び血管作動性腸管ペプチド(ＶＩＰ)がこれらのプロセスにて潜在的な役割を有していることが最近明らかにされた[Tyrrell and Landis 1994; Jaworski and Proctor 2000; Hansel, Eipper et al. 2001;  Hansel, May et al. 2001]。ＰＡＣＡＰは、ペプチドのＶＩＰ/セクレチン/グルカゴンファミリーのメンバーであり、ＰＡＣＡＰ３８とＰＡＣＡＰ２７の２種類のアミド化形態として存在し、同一の２７−ａａ Ｎ末端を共有している。或いはまた、プリプロＰＡＣＡＰと称される１７６−ａａ前駆体の処理によって得られる[Arimura 1998; Vaudry, Gonzalez et al. 2000]。ＰＡＣＡＰ３８の主要構造は、原索動物から哺乳類への進化の過程で有意的に保存されており、そのペプチドは脊椎動物門全体に重要な作用を有することを示唆している[Arimura 1998; Vaudry, Gonzalez et al. 2000]。 ショウジョウバエについて、エタノール感受性の嗅覚に関する学習及び修正の障害を含む記憶突然変異体(memory-mutant)の健忘症(amnesiac)における最近の分子クローニング及びトランスジェニックレスキュー(transgenic rescue)実験では、健忘症遺伝子が、脊椎動物のＰＡＣＡＰに相同性の神経ペプチドをエンコードすることが示されている[Feany and Quinn 1995; Moore, DeZazzo et al. 1998]。さらにまた、哺乳類のＰＡＣＡＰは、ショウジョウバエの神経のｃＡＭＰとＲａｓ/Ｒａｆ信号伝達経路の両方に作用して、特異的神経集団における健忘症の神経調節的役割(ショウジョウバエのＰＡＣＡＰ)を示す[Zhong 1995]。哺乳類では、ＰＡＣＡＰは神経要素に存在し、１つのＰＡＣＡＰ-特異性(ＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１)レセプターと、ＶＩＰ(ＶＩＰＲ１及びＶＩＰＲ２)と共有する２つのレセプターの３種類のヘプタヘリカル(heptahelical)Ｇ蛋白連結型レセプターを介して、多面性神経ペプチドとして作用する。結合性は低いが、ＶＩＰはまた、ＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１を結合できることを強調することは重要である[Jaworski and Proctor]。
【００５３】
ＰＡＣＡＰは、神経における幾つかの異なるシグナル伝達系を刺激して、アデニル酸シクラーゼ、ホスホリパーゼＣ及びマイトジェン活性蛋白質キナーゼを活性化させ、カルシウムを移動させる[Hashimoto, Ishihara et al. 1993; Arimura 1998; Vaudry, Gonzalez et al. 2000]。組織化学的研究により、ＰＡＣＡＰの免疫活性が、ドーパミン(ＤＡ)系及びセロトニン(５-ＨＴ)系を含む中枢神経系(ＣＮＳ)の幾つかの領域で観察されており、側座核、視床下部、扁桃体、黒質及び背側縫線核に非常に集中していることが明らかにされた[Ghatei, Takahashi et al. 1993; Masuo, Suzuki et al. 1993; Piggins, Stamp ete al. 1996]。ＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１はまた、中間皮質辺縁(mesocorticolimbic)系及び黒質線状体ＤＡ系の両系とさらに５-ＨＴ系の標的領域の全体に発現される[Hashimoto, Nogi et al. 1996]。ＶＩＰＲ１とＶＩＰＲ２もまた、これらの系の中で発現される[Usdin, Bonnner et al. 1994]。これらの組織化学的研究は、ＰＡＣＡＰ神経と、ＤＡ及び５-ＨＴ神経との機能的関係を示唆する。薬理学的研究では、ＰＡＣＡＰが、中脳ＤＡ神経[Takei, Skoglosa et al. 1998]、皮質神経[Morio, Tatsuno et al, 1996]、小脳顆粒細胞[Villalba, Bockaert et al. 1997]及びその他の神経[Arimura 1998; Vaudry, Gonzalez et al. 2000]に対し、神経分化誘導作用と神経防護作用を有することが明らかにされている。ＰＡＣＡＰは、側坐核のチロシン水酸化酵素活性を増加させ[Moser, Scholz et al. 1999]、星状細胞におけるインターロイキン-６の生成を促進する[Gottschall, Tasuno et al. 1994]。ＰＡＣＡＰはまた、海馬のシナプス可塑性に関与している[Gottschall, Tasuno et al. 1994]。
【００５４】
特に興味深いのは、ＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１は、全ての中枢神経軸を通じて、脳室帯(ventricular zone)が非常に高いレベルにある時に発現されることであ。増殖帯(proliferative zone)における胚エンリッチメント(enrichment)に加えて、ＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１の発現は、成人の中枢神経系、具体的には、脳室下帯の神経発生の領域及び海馬の歯状回(dentate gyrus)で維持され[Jaworski and Proctor 2000]、成人の神経発生におけるＰＡＣＡＰの極めて重要な役割を示唆している。さらに、ＶＩＰは、神経発生の際に増殖を刺激することが明らかにされており[Gressens, Paindaveine et al. 1997]、ＣＮＳの異なる発達段階で増殖と分化を調節するために、神経ペプチドは両方とも、それらのレセプターを介して、重要な役割を有することを示唆している。
【００５５】
ＰＡＣＡＰとＶＩＰの経路が、原理的には、細胞内のｃＡＭＰレベルの上昇によって調節されることを、生化学的及び分子的観点から観察することは興味深いことである。これは、ｃＡＭＰと該ｃＡＭＰ応答因子を結合する蛋白質(cAMP response element-binding protein; ＣＲＥＢ)が、海馬の歯状回における生体内神経発生に貢献する重要な役割を果たすことを示す最近のデータ[Nakagawa, Km et al. 2002]と一致する。しかしながら、近年、ＰＫＣはＣＲＥＢを活性化することも明らかにされている。ＰＡＣＡＰが、ＲＡＰ１のようなｃＡＭＰの下流エフェクターを介してＰＫＣ信号経路に漏話(crosstalk)することができ、ＣＲＥＢ転写因子のさらなる活性化をもたらす[Vaudry, Stork et al. 2002]ことは興味深いことである。
【００５６】
＜マキサディランは特異性ＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１の作用物質である＞
マキサディランは、ニューワールドサシチョウバエ(New Workd sand fly)、ルッツォミアロングパルピス(Lutzomyia longipalpis)の唾液腺抽出物から単離され、血管拡張能力特性を有する６３アミノ酸ペプチドである[Lermer, Ribeiro et al. 1991)]。ＰＡＣＡＰは、ＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１とＶＩＰＲ１＆２の両方に結合できるのに対し、マキサディランはＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１だけに特異的に結合することは、研究によって明らかにされている[Moro and Lerner 1997]。
【００５７】
＜試薬の調製＞
患者を治療する試薬は、広く知られた組換え技術により、作成され、精製されて、調合される。
本発明の試薬及び個々の骨格部又はそれらの類似体(analog)及び誘導体は、化学的に合成されることができる。当該技術分野では、ペプチド合成装置を用いた合成を含み、様々な蛋白質の合成方法がある。それらの文献として、例えば、「Peptide Chemistry, A Practical Textbook, Bodasnsky, Ed. Springer-Verlag, 1988; Merrifield, Science 232: 241-247 (1986)」「Barany, et al, Intl. J. Peptide Protein Res. 30: 705-739 (1987); Kent, Ann. Rev. Biochem. 57:957-989 (1998)」及び「Kaiser, et al, Sience 243: 187-198 (1989)」を参照することができる。ぺプチドは、標準のペプチド精製技術を用いて、化学前駆体又はその他の化学物質が実質的に含まないように精製される。「化学的前駆体又はその他の化学物質を実質的に含まない」という語は、ペプチドの合成に関係する化学的前駆体又はその他の化学物質から分離されたペプチドの調製物を含んでいる。一実施例では、「化学的前駆体又はその他の化学物質が実質的に含まない」という語は、化学的前駆体又は非ペプチド化学物質が約３０％(乾燥重量)より少ないペプチドの調製物を含んでいる。化学的前駆体又は非ペプチド化学物質は好適には約２０％より少なく、化学的前駆体又は非ペプチド化学物質は、さらに好適には、が約１０％より少なく、化学的前駆体又は非ペプチド化学物質は、最も好ましくは約５％よりも少ない。
【００５８】
ペプチドの化学合成により、Ｄ-アミノ酸及び他の小さな有機分子を含む被修飾アミノ酸又は人工アミノ酸の含有が促進される。ぺプチド内の１又は２以上のＬ-アミノ酸を、対応するＤ-アミノ酸アイソフォームと置き換えることを利用して、酵素加水分解に対するペプチドの抵抗性を増加させ、生物学的に活性なペプチドの特性、例えば、レセプター結合、機能的能力(functional potency)又は作用の持続性等のうちの少なくとも１つを向上させる[Doherty, et al., 1993. J. Med Chem. 36: 2585-2594; Kirby, et al., 1993, J. Med Chem. 36: 3802-3808; Morita, et al., 1994, FEBS Lett. 353: 84-88; Wang, et al., 1993, Int. J. Pept. Protein Res. 42:392-399; Fauchere and Thinuieau, 1992, Adv. Drug Res. 23: 127-159をを参照]。
【００５９】
共有結合架橋(covalernt cross-links)のプチド配列への導入により、立体配座的及び領域特異的(topographically)にペプチドのバックボーンを制御することができる。この方策は、試薬のペプチド類似体の能力、選択性及び安定性を高めるのに用いることができる。その他に幾つかの方法を用いて、ペプチド配列に立体配座的制御を導入に成功し、それらの能力、レセプター選択性及び生物学的半減期を向上させたものがある。それら方法の中には、(i)Ｃα-メチルアミノ酸を用いるもの(例えば、Rose, et al., Adv. Protein Chem. 37: 1-109 (1985); Prasad and Balaram, CRC Crit. Rev. Biochem. 16: 307-1348 (1984)を参照)、(ii)Ｎα-メチルアミノ酸を用いるもの(例えば、Aubry, et al., Int. Pept. Protein Res., 18: 195-202 (1981); Manavalan and Momany, Biopolymers 19: 1943-1973 (1980)を参照)、(iii)α,β-不飽和アミノ酸を用いるもの(例えば,Bach and Gierasch, Biopolymers 25: 5175-S192 (1986); Singh, et al., Biopolymers 26: 819-829 (1987)を参照)がある。これらアミノ酸及びその他多くのアミノ酸類似体は、商業的に入手可能であり、又は容易に作製できる。さらに、Ｃ-末端の酸をアミドで置き換えることにより、ペプチドの溶解性及びクリアランスが向上する。
【００６０】
或いはまた、組換えペプチドの発現及び精製に関して当該技術分野で広く知られた方法を用いて、試薬を得ることもできる。蛋白質試薬をエンコードするＤＮＡ分子を作製することができる。ＤＮＡ配列は知られており、又は公知のコドンを利用して蛋白質配列から推定することもできる[例えば、Old and Primrose, Prionciples of Genen Manipulation 3rd ed., Brackwell Scientific Publications, 1985; Wada et al., Nucleic Acids Res. 20: 2111-2118 (1992)を参照」。ＤＮＡ分子は、好適には、例えばプラスミドのような適当なクローニングベクターへのクローニングを促進する制限酵素の認識部位の如き追加配列を含んでいる。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はそれらの組合せであってよい。試薬をエンコードする核酸を、当該技術分野で知られている任意の方法により(例えば、配列の３'末端及び５'末端にハイブリダイゼーション可能な(hybridizable)合成プライマーを用いたＰＣＲ増幅により、及び/又は、所定の遺伝子配列に特異性のオリゴヌクレオチド配列等を用いて、ｃＤＮＡ若しくはゲノムライブラリーからクローニングすることにより)得られる。核酸はまた、化学合成によって作ることもできる。
【００６１】
適当な転写/翻訳制御信号及び試薬コーディング(reagent-coding)配列を具えるキメラ遺伝子を含む発現ベクターを構成するために、核酸断片のベクターへの挿入に関連する技術分野で知られた任意の方法を用いることができる。本発明では、発現ベクター内のプロモーター/エンハンサーに、植物、動物、昆虫、又は菌の調節配列を用いることができる。
【００６２】
宿主細胞は、どんな原核細胞又は真核細胞であってもよい。例えば、ぺプチドは、大腸菌のようなバクテリア細胞、昆虫細胞、菌細胞、又は哺乳類細胞(例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞(ＣＨＯ)又はＣＯＳ細胞)の中で発現されることができる。適当な宿主細胞として、その他にも、当該技術分野の通常の知識を有する者に知られたものがある。一実施例では、試薬をエンコードする核酸は、哺乳類の発現ベクターを用いて、哺乳類細胞の中で発現される。哺乳類の発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８[Seed (1987) Nature 329:840]及びｐＭＴ２ＰＣ[Kaufman et al. (1987) EMBO J6: 187-195]がある。
【００６３】
宿主細胞は、培養でペプチドを生成するのに使用することができる。それ故、本発明はまた、本発明の宿主細胞を用いてペプチドを生成する方法を提供するものである。本発明の方法の一実施例では、ペプチドを生成するために、適当な培地(medium)の中で、本発明の宿主細胞を培養する工程を含んでいる(ペプチドをエンコードする組換え発現ベクターが導入される)。この方法は、培地又は宿主細胞からペプチドを単離する工程を含んでいる[Ausubel et al., (Eds). In: Current Protocols in Molecular Biology. J. Wiley and Sons, New York, NY. 1998を参照]。
【００６４】
「単離された(isolated)」若しくは「精製された(purified)」組換えペプチド、又はその生物学的活性部分は、そのペプチドが由来する細胞源又は組織源からの細胞物質又はその他の汚染をもたらす蛋白質を実質的に含んでいない。「細胞物質を実質的に含まない」という語に含まれる調製物において、ペプチドは、単離されるか又は組換え技術で生成される細胞の細胞成分から分離されている。一実施例において、「細胞物質を実質的に含まない」という語は、所望のペプチド以外のペプチド(ここでは「汚染をもたらす蛋白質(contaminating protein)」と称す)が３０％未満(乾燥重量)の調製物を含んでおり、該調製物について、汚染をもたらす蛋白質は、より好適には２０％未満であり、さらに好適には１０％未満であり、最も好適には５％未満である。ペプチド又はその生物学的活性部分が組換え技術で生成される場合、培地(culture medium)を実質的に含まないことが好ましく、培地は、例えば、ペプチド調製物の体積の約２０％未満であり、より好ましくは１０％未満であり、最も好ましくは５％未満である。
【００６５】
本発明はまた、作用物質(ミメティクス)又は拮抗物質(antagonists)として機能する試薬の様々な変異体に関する。試薬の変異体は、突然変異生成、例えば不連続な点突然変異によって生成されることができる。試薬の作用物質は、試薬の天然発生的形態の生物学的活性と略同じ活性又はそれら活性のサブセットを維持することができる。試薬の拮抗物質は、例えばレセプターに競争的に結合することによって、試薬の天然発生的形態の１又は２以上の生物学的活性を阻害することができる。従って、特異的な生物活性効果は、制限された機能を持つ変異体で処理することによって引き出されることができる。一実施例では、試薬の天然発生的形態の生物学的活性のサブセットを有する変異体で対象者を治療すると、試薬の天然発生的形態を用いて治療した対象者よりも副作用が少なくなる。
【００６６】
類似体、変異体又は誘導試薬は機能的に活性であるのが好ましい。本明細書で用いられる「機能的活性(functionally active)」は、完全長さの試薬について１又は２以上の公知の機能的特質を示す種(species)を意味する。「変異体(variant)」は、天然発生的試薬とは異なり、その本質的特性を保持する試薬を意味する。一般的に、変異体は、天然発生的試薬とは全体として極めて類似し、多くの領域で同一である。
【００６７】
作用物質(ミメティクス)又は拮抗物質として機能する試薬の変異体は、ぺプチド作用物質又は拮抗物質の活性に対する試薬の突然変異体のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって同定されることができる。一実施例では、変異体の多様な(variegated)ライブラリーが、核酸レベルでのコンビナトリアルな突然変異によって生成され、多様な遺伝子ライブラリーによってエンコードされる。変異体の多様なライブラリーは、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列の中に酵素的にライゲーションすることによって作成されることができる。その結果、潜在的配列(potential sequences)の縮重セット(degenerate set)は、個々のペプチドとして、或いは又、配列のセットを含むより大きな融合蛋白質(例えば、ファージディスプレイ用)のセットとして発現可能である。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的変異体のライブラリーを作製するために様々な方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動ＤＮＡ合成装置の中で実行されることができ、合成遺伝子はその次に適当な発現ベクターにライゲーションされる。遺伝子の縮重セットを用いることにより、潜在的配列の所望の組合せをエンコードする配列の全てを、単一の混合物として提供することができる。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は、当該技術分野で知られている[例えば、Narang (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu Rev Biochem 53:323; Itakura et al. (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucl. Acids Res 11:477を参照]。
【００６８】
試薬又は個々の部分(moieties)の誘導体及び類似体は、当該技術分野で知られた様々な方法で作られる。例えば、ポリペプチド配列は、当該技術分野で知られた任意の方法によって修飾されることができる[例えば、Sambrook, et al., 1990. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., (Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, NYを参照]。修飾(modifications)には、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミノ化、公知の保護／封鎖基(ptotecting/blocking groups)による誘導体化、抗体分子又はその他の細胞試薬への連鎖(linkage)等が含まれる。当該技術分野で知られた数多くの化学的修飾法のどれを用いることもでき、限定するものでない例として、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ4による特異的化学切断(chemical cleavage)、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元、ツニカマイシンの存在下での代謝合成等を挙げられる。
【００６９】
誘導体又は類似体は、完全な長さであるが、以下に記載されるように、誘導体又は類似体が修飾核酸又はアミノ酸を含む場合には、完全な長さでなくてもよい。試薬の誘導体又は類似体として、限定するものではないが、様々な実施例の中で、アミノ酸が３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、好適には９５％以上が同一の領域を含む分子を挙げることができる。なお、比較される同一性とは、(i)同一サイズのアミノ酸配列、(ii)当該技術分野で公知のコンピュータホモロジープログラム(例えば、ウィスコンシンＧＣＧソフトウェア)によって整列された配列、(iii)ストリンジェント(この条件が好ましい)、中程度のストリンジェント、又はストリンジェントでない条件下で、前記ペプチドをエンコードする配列にハイブリダイゼーションが可能な核酸、に関してである[例えば、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, New York, NY, 1993を参照]。
【００７０】
試薬の誘導体は、機能的に等価な分子になるように、置換、付加又は削除によってそれらの配列を変更することによって作られることができる。試薬内の１又は２以上のアミノ酸残基は、極性及び正味電荷が同じである別のアミノ酸で置換されることができ、暗黙的変更(silent alteration)の結果となる。その配列内でのアミノ酸の保存的置換(conservative substitutes)は、そのアミノ酸が属する類の中の他のメンバーから選択されることができる。例えば、非極性(疎水性)アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンがある。極性のアミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンがある。正帯電の(塩基性)アミノ酸には、アルギニン、リジン及びヒスチジンがある。負帯電の(酸性)アミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸がある。
【００７１】
試薬は、ＣＮＳ障害の病状に関与する任意の座位、例えば、病気の原因である神経細胞不足の任意の座位に対して局部的に投与されることができる。例えば、試薬は、脳の脳室、黒質、線条体、青斑核(locus ceruleous)、マイネルトの基底核、中脳脚橋核、大脳皮質、脊髄及び網膜に局所的に投与されることができる。
【００７２】
神経幹細胞及びそれら子孫の増殖、分化、生存又は移動が生体内で引き起こされるようにするには、宿主に対し、試薬を単独で又は他の試薬と共に投与することにより、又は、細胞の増殖と分化を引き起こす試薬を含む薬学的組成物を投与することによって行なうことができる。薬学的組成物は、阻害作用を妨げる任意の物質、及び/又は、神経幹細胞及び幹細胞の子孫の増殖、分化、移動及び/又は生存を促進する任意の物質を含んでいる。このように生体内でこれら細胞の操作と修飾を行なうことにより、負傷又は疾病による細胞の損失を内生的に補うことができるので、外来細胞(foreign cells)を患者に移植する必要性が無くなる。
【００７３】
＜抗体＞
本発明は、試薬として用いられる抗体を含んでいる。本明細書で用いられる「抗体」という語は、免疫グロブリン分子、及び該免疫グロブリン(Ｉｇ)分子の免疫活性部を意味し、免疫グロブリン分子とは、例えば、抗原と特異的に結合する(免疫反応する)抗原結合部位を含む分子である。このような抗体として、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単一鎖、Ｆab、Ｆab'及びＦ(ab')2 断片、及び、Ｆab発現ライブラリーがあるが、これらに限定されるものではない。一般的に、ヒトから得られる抗体分子は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ及びＩｇＤのどれかのクラスに属しており、これら類は、分子にある重鎖の性質によって互いに区別される。クラスの中には、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2などのサブクラスを有するものもある。また、ヒトでは、軽鎖がカッパ鎖又はラムダ鎖の場合がある。ここでの抗体の意味は、このようなクラス、サブクラス及びヒトの抗体種の種類に関する全てが含まれる。
【００７４】
本発明の単離された蛋白質は、抗原、又は抗原の一部又は断片として作用することを目的とするもので、ポリクローナル及びモノクローナル抗体調製物を生成するための一般的な技術を用いて、免疫特異的に抗原に結合する抗体を生成するためのイムノゲンとして用いられることができる。完全長さの蛋白質が用いられるが、もう１つの方法として、本発明では、抗原の抗原性ペプチド断片をイムノゲンとして使用に供することもできる。抗原性ペプチド断片は、完全長さの蛋白質のアミノ酸配列のアミノ酸残基を６以上有し、そのエピトープを含んでいるので、ペプチドに対して産生された抗体が、完全長さの蛋白質又は前記エピトープを含む任意の断片と複合した特異的免疫を生成する。抗原性ペプチドは、１０以上のアミノ酸残基、又は１５以上のアミノ酸残基、又は２０以上のアミノ酸残基、又は３０以上のアミノ酸残基を有することが好ましい。抗原性ペプチドに含まれる好ましいエピトープは、その表面上にある蛋白質領域であり、通常、これらは親水性の領域である。
【００７５】
本発明の幾つかの実施例において、抗原性ペプチドに含まれるエピトープの少なくとも１つは、ＰＡＣＡＰ、マキサディラン、ＶＩＰの領域、又は、蛋白質の表面の上、例えば疎水性領域に配置されるＰＡＣＡＰ、マキサディラン、ＶＩＰのレセプターである。ヒトの疎水性分析を行なうと、それらの蛋白質配列は、ペプチドのどの領域が具体的に親水性であるかを示すので、抗体作製を標的にするのに有用な表面の残基をエンコードできる可能性がある。抗体作製を標的にする手段として、親水性及び疎水性の領域を示すハイドロパシープロット(hydropathy plot)を、当該技術分野で広く知られた任意の方法によって作成することができる。そのような方法として、例えば、カイトドリトル法又はホップウッズ法があり、フーリエ変換が行なわれる場合と行われない場合がある[Hopp and Woods, 1981, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78: 3824-3828; Kyte and Doolittle 1982, J. Mol. Biol. 157: 105-142を参照]。これら文献は全て、引用を以て本願への記載加入とする。抗原性蛋白質、又はその誘導体、断片、類似体若しくは同族体(homologs)の中の１又は２以上のドメインに対して特異的な抗体についても、ここで提供される。
【００７６】
「エピトープ(epitope)」という語は、免疫グロブリン又はＴ細胞レセプターに特異的結合を行なうことができる全ての蛋白質決定基を含んでいる。エピトープ決定基は、通常は、アミノ酸又は糖側鎖のような化学的に活性界面を有するグループの分子から構成され、特異的な荷電特性だけでなく、特異的な三次元構造特性を有している。ＰＡＣＡＰ、マキサディラン、ＶＩＰ、又はリガンド若しくはレセプターポリペプチド又はこれらの断片は、少なくとも１つの抗原性エピトープを含んでいる。本発明の抗ＰＡＣＡＰ、抗マキサディラン、抗ＶＩＰ又は抗蛋白質Ａ抗体は、平衡結合定数(ＫD)が、(ＫD)≦１μＭ、望ましくは(ＫD)≦１００ｎＭ、より望ましくは、(ＫD)≦１０ｎＭ、最も望ましくは、(ＫD)≦１００ｐＭから約１ｐＭであるときに、抗原体に特異的結合をすると言われている。この平衡結合定数は、当業者に知られた放射性リガンド結合アッセイ又は同様なアッセイによって測定されることができる。
【００７７】
本発明の蛋白質又はその誘導体、断片、類似体、同族体若しくは相同分子種(orthologs)に対するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を産生するのに、当該分野で知られた様々な手法を用いることができる[例えば、Antibodies:A Laboratory Manual,Harlow E,and Lane D,1988,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NYを参照。この文献は引用をもって本願への記載加入とする]。これらの抗体の幾つかについて、以下で説明する。
【００７８】
＜ポリクローナル抗体＞
ポリクローナル抗体は、種々の適当な宿主動物(例えば、ウサギ、ヤギ、マウス又はその他の哺乳動物)に、天然蛋白質、その人工変異体、又は、前述の誘導体を１又は複数注射することによって免疫化させることにより産生することができる。適当な免疫原生剤(immunogenic preparation)として、例えば、天然由来免疫原生蛋白質、免疫原生蛋白質が化学的に合成されたポリペプチド、又は、組換え発現免疫原生蛋白質(recombinantly expressed immunogenic protein)がある。さらに、蛋白質は、免疫化される哺乳動物中で免疫原生であることを知られている第２の蛋白質に共役結合され(conjugated)てもよい。そのような免疫原生蛋白質として、限定されるものではないが、スカシ貝ヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシン阻害剤を例示できる。製剤には、さらに、アジュバント(adjuvant)を含むことができる。免疫反応を増大させるために用いられる種々のアジュバントとして、限定されるものではないが、フロイント(完全及び不完全)、ミネラルジェル(例えば水酸化アルミニウム)、界面活性物質(例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、ジニトロフェノール等)、ＢＣＧ(Bacille Calmette-Guerin)、コリネ菌パルヴムのように人に利用できるアジュバント、又は、同様な免疫刺激因子が挙げられる。使用可能なアジュバントの更なる例として、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント(モノフォスフォリル脂質Ａ(monophosphoryl Lipid A)、合成トリハロースジコリノミコレート(synthetic trehalose dicorynomycolate))が挙げられる。
【００７９】
免疫原生蛋白質に対するポリクローナル抗体分子は、哺乳動物から(例えば、血液から)単離されることができ、さらに、主として免疫血清のＩｇＧフラクションを提供する蛋白質Ａ又は蛋白質Ｇを用いたアフィニティプロマトグラフィのような公知の技術で精製することができる。その後で、又は前記技術に代えて、求められる免疫グロブリンの標的である特異的抗原又はそのエピトープは、カラム上で固定化され、イムノアフィニティクロマトグラフィによって免疫特異性抗体が精製される。免疫グロブリンの精製については、例えば、D.Wilkinson[The Scientist,published by The Scientist,Inc.,Philadelphia PA,Vol.14,No.8(April 17,2000),pp.25-28]によって説明されている。
【００８０】
＜モノクローナル抗体＞
ここで用いられる「モノクローナル抗体」(ＭＡｂ)又は「モノクローナル抗体組成物」という語は、固有の軽鎖遺伝子産生物及び固有の重鎖遺伝子産生物からなる抗体分子の１分子種だけを含む抗体分子の集団を意味する。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域(ＣＤＲｓ)は、集団の分子全てにおいて同じである。ＭＡｂｓは、抗原結合部位に対して固有の結合親和性によって特徴づけられる抗原の特異的エピトープと免疫反応することができる抗原結合部位を含んでいる。
【００８１】
モノクローナル抗体は、例えば、Kohler and Milstein,Nature,256:495(1975)に記載されたハイブリドーマ法を用いて調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター、又はその他適当な宿主動物は、一般的には、リンパ球を引き出す免疫剤で免疫化され、免疫剤に特異的に結合する抗体を産生又は産生することができる。リンパ球はまた、生体外で免疫化されることもできる。
【００８２】
免疫剤は、一般的には、蛋白質抗原、その断片又はその融合蛋白質を含んでいる。なお、一般的には、ヒト起源の細胞が所望される場合は、末梢血リンパ球が用いられ、ヒト以外の哺乳動物起源の細胞が所望される場合、脾臓細胞又はリンパ節細胞が用いられる。リンパ球は、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて不死化細胞株で融合され、ハイブリドーマ細胞を形成する[Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press,(1986)pp.59-103]。不死化細胞株は、通常は、トランスフォームされた哺乳動物の細胞であり、特に、齧歯動物、牛及びヒトの骨髄腫細胞である。通常は、ラットやマウスの骨髄腫細胞株が用いられる。ハイブリドーマ細胞は、望ましくは融合されていない不死化細胞の成長又は生存を阻害する１又は複数の物質を含む適当な培地の中で培養されることができる。例えば、親細胞が酵母ヒポキサンチングアニンフォスフォシボシルトランスファーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠く場合、ハイブリドーマの培地には、一般的には、ＨＧＰＲＴ欠損細胞(HGPRT-deficient cells)の成長を防止するヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン("ＨＡＴ培地")が含むことになるであろう。
【００８３】
好適な不死化細胞株は、効果的に融合し、選択された抗体産生細胞によって抗体の安定した高レベル発現をサポートし、ＨＡＴ培地のような培地に感受性(sensitive)を有する細胞株である。より好適な不死化細胞株は、ハツカネズミの骨髄腫株であり、これは、Salk institute Cell Distribution Center,San Diego,California及びAmerican Type Culture Collection,Nanassas,Virginiaから入手することができる。ヒト骨髄腫細胞株及びマウス・ヒトのヘテロミエローマ細胞株については、ヒトモノクローナル抗体の産生に記載されている[Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984); Brodeur et al.,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,Marcel Dekker,Inc.,New York,(1987)pp.51-63]。
【００８４】
ハイブリドーマ細胞が培養される培地の評価は、抗原に対するモノクローナル抗体の存在を調べることによって行なわれる。ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降法、又は、放射性免疫測定法(ＲＩＡ)や酵素標識免疫定量法(ＥＬＩＳＡ)のようなインビトロ結合試験によって求められることが望ましい。そのような技術及び試験は、当該技術分野で知られている。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、the Scatchard analysis of Munson and Pollard,Anal.Biochem.,107:220(1980)によって決定することができる。モノクローナル抗体の治療への適用においては、標的抗原に対して高い特異度及び高い結合親和性を有する抗体を特定することが目的であり、特に重要である。
【００８５】
所望のハイブリドーマ細胞が特定された後、クローンは、限界希釈法によってサブクローン化され、標準的な手法[Goding,1986]によって成長させることができる。この目的のための適当な培地として、例えば、Dulbecco's Modified Eagle's MediumやRPMI-1640 mediumが挙げられる。一方、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物の腹水のような生体内で成長させることができる。
【００８６】
サブクローンが分泌したモノクローナル抗体は、蛋白質Ａセファローズ(protein A-Sepharose)、ハイドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析、又は、親和性クロマトグラフィのように、これまで行われている免疫グロブリン精製法により、培地又は腹水液から単離され又は精製されることができる。
【００８７】
モノクローナル抗体は、米国特許第4,516,567号に記載されているような組換えＤＮＡ法によって作製することもできる。本発明のモノクローナル抗体をエンコードするＤＮＡは、従来の手法(例えば、ハツカネズミ抗体の重鎖及び軽鎖をエンコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)を用いて簡単に単離及び配列することができる。本発明のハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましいソースとして供される。一旦単離されると、ＤＮＡは、発現ベクターに置き換えられ、通常は免疫グロブリン蛋白質を産生しないサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞の中でモノクローナル抗体の合成が行われる。ＤＮＡはまた、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖の定常ドメインに対するコード配列を、同種ハツカネズミの配列に置き換えたり[米国特許第4,816,567号; Morrison,Nature 368,812-13(1994)]、非免疫グロブリンポリペプチドに対するコード配列の全部又は一部を免疫グロブリンのコード配列に共有結合(covalently joining)することによって、修飾されることができる。そのようは非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインと置き換えたり、本発明の抗体の抗原結合部位の可変ドメインと置き換えて、キメラ二価抗体を作製することもできる。
【００８８】
＜ヒト化(humanized)抗体＞
本発明の蛋白質抗原に対する抗体は、ヒト化抗体又はヒト抗体をさらに含むことができる。これら抗体は、投与された免疫グロブリンに対してヒトによる免疫反応を引き起こすことがないので、ヒトに投与するのに適している。ヒト化された形態の抗体は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、又はそれらの断片(Fv,Fab,Fab',F(ab')2や抗体の他の抗原結合配列)であり、主としてヒト免疫グロブリンの配列から構成され、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含んでいる。ヒト化は、ウインターらの方法[Jones et al.,Nature,321:522-525(1986); Riechmann et al.,Nature,332:323-327(1988); Verhoeyen et al.,Science,239:1534-1536(1988)]により、齧歯類ＣＤＲｓ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列と置き換えることによって行なうことができる[米国特許第5,225,539号も参照]。なお、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基(residues)は、対応する非ヒト残基と置き換えられる。ヒト化された抗体は、受容体抗体の中にも、また、インポートされたＣＤＲ又はフレームワーク配列のどちらにも見られない残基を含むこともできる。一般的に、ヒト化された抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの略全部を含んでおり、ここでは、ＣＤＲ領域の全部又は略全部が非ヒト免疫グロブリンの可変ドメインに対応しており、フレームワーク領域の全部又は略全部は、ヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列の可変ドメインである。ヒト化された抗体は、免疫グロブリンの定常領域(Ｆｃ)の少なくとも一部を選択的に含んでおり、典型的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域である[Jones et al.,1986; Riechmann et al.,1988; and Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596(1992)]。
【００８９】
＜ヒト抗体＞
完全な(fully)ヒト抗体は、本質的には、ＣＤＲｓを含む軽鎖及び重鎖の両鎖の完全配列(entire sequence)がヒト遺伝子に由来する抗体分子に関する。この明細書では、そのような抗体を「ヒト抗体」又は「完全ヒト抗体」と称している。ヒトのモノクローナル抗体は、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法[Kozbor,et al.,1983 Immunol Today 4:72参照]、及び、ヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ法[Cole,et al.,1985 In:MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY,Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96参照]によって作製することができる。ヒトのモノクローナル抗体は、本発明の実施に利用されることができ、ヒトのハイブリドーマを用いることにより[Cote,et al.,1983.Proc Natl Acad Sci USA 80:2026-2030参照]、また、ヒトＢ細胞を、生体外でエプステインバーウィルスでトランスフォームすることにより[Cole,et al.,1985 In:MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY,Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96参照]、産生することができる。
【００９０】
さらにまた、ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリー[Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991); Marks et al.,J.Mol.Biol.,222:581(1991)]を含む追加の手法を用いて産生することもできる。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン座位を、例えばマウス等のトランスジェニック動物(内因性免疫グロブリン遺伝子は部分的に又は完全に不活性になっている)に導入することによって作製されることができる。挑戦のために、ヒトの抗体産生を観察してみると、遺伝子再構成、組立て、及び抗体レパートリーを含むあらゆる点でヒトに見られるものと非常に似ている。この方法は、例えば米国特許第5,545,807号、第5,545,806号、第5,569,825号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,661,016号の他、Marks et al.[Bio/Technology 10,779-783(1992)]、Lonberg et al.[Nature 368 856-859(1994))、Morrison(Nature 368,812-13(1994)]、Fishwild et al.[Nature Biotechnology 14,845-51(1996)]、Neuberger[Nature Biotechnology 14,826(1996)]及びLonberg and Huszar[Intern.Rev.Immunol.13 65-93(1995)]に記載されている。
【００９１】
ヒト抗体は、さらにまた、抗原による挑戦に応答して、動物の内因性抗体よりもむしろ完全なヒト抗体を産生することができるように修飾されたヒト以外のトランスジェニック動物を用いて産生されることができる[ＰＣＴ公報WO94/02602号参照]。非ヒト宿主中で重鎖及び軽鎖の免疫グロブリンをエンコードする内因性遺伝子が無能力化され(incapacitated)、ヒトの重鎖及び軽鎖免疫グロブリンをエンコードする活性座位は、宿主のゲノムの中に挿入される。ヒト遺伝子は、例えば、必須ヒトＤＮＡ断片を含む酵母人工染色体を用いて組み入れられることができる。所望される修飾を全て行なうことのできる動物は、修飾の全補体(full complement)よりも少ない中間トランスジェニック動物を異種交配することにより、子孫として得られる。そのような非ヒト動物の望ましい具体例はマウスであり、Xenomouse(商標名)と称され、これについては、ＰＣＴ公報第WO96/33735号及びWO96/34096号に記載されている。この動物は、完全ヒト免疫グロブリンを分泌するＢ細胞を産生する。抗体は、例えば、ポリクローナル抗体の調製物として、対象のイムノゲンで免疫化した後、動物から直接得られることができるし、或いはまた、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのような動物由来の不死化Ｂ細胞をから得られることができる。さらにまた、ヒト可変領域を有する免疫グロブリンをエンコードする遺伝子は、抗体を直接得るために回復又は発現されるか、又は、例えば、単鎖Ｆｖ分子のような抗体の類似体を得るためにさらに修飾される。
【００９２】
非ヒト宿主がマウスである宿主の産生方法において、内因性免疫グロブリン重鎖の発現が不足する例が、米国特許第5,939,598号に記載されている。この方法は、座位の再構成を防止し、再構成された免疫グロブリンの重鎖座位の転写の形成を防止するために、胚幹細胞内の少なくとも１つの内因性重鎖座位からＪセグメント遺伝子を削除することを含んでおり、削除は、選択可能なマーカーをエンコードする遺伝子を含む標的ベクターによって行われ、前記胚幹細胞より、その体細胞及び生殖細胞が、選択可能なマーカーをエンコードする遺伝子を含むトランスジェニックマウスが産生される。
【００９３】
ヒト抗体のように所望の抗体を産生する方法は、米国特許第5,916,771号に開示されている。該特許は、培養中の第１の哺乳動物の宿主細胞に重鎖をエンコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを導入すること、及び、別の哺乳動物の宿主細胞に軽鎖をエンコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを導入すること、及び２種類の細胞を融合してハイブリッド細胞を形成することを含んでいる。ハイブリッド細胞は、重鎖と軽鎖を含む抗体を発現する。
【００９４】
この手法をさらに改良し、臨床的に重要なエピトープをイムノゲンの上で同定する方法、及び、これに関連して、高い親和性にて重要なエピトープへ免疫特異的に(immunospecifically)結合する抗体を選択する方法が、ＰＣＴ公報WO99/53049号に開示されている。
【００９５】
＜ＦＡＢ断片及び単鎖抗体＞
本発明の技術は、本発明の抗原性蛋白質の産生に特異的な単鎖抗体の産生に適用することができる[米国特許第4,946,778号参照]。さらにまた、本発明の方法は、Ｆab発現ライブラリーの構築に適用することができ[Huse,et al.,1989 Science 246:1275-1281参照]、蛋白質、又はその誘導体、断片、類似体若しくは同族体に対して特異性を有するモノクローナルＦab断片を迅速且つ効果的に確認することができる。蛋白質抗原に対するイディオタイプを含む抗体断片は、当該技術分野で知られる手法によって産生することができる。それら断片として、限定するものではないが、(i)抗体分子のペプシン消化によって産生されるＦ(ab')2、(ii)Ｆ(ab')2断片のジスルフィド結合を減じることによって生じるＦab断片、(iii)パパイン及び還元剤(reducing agent)で抗体分子を処理することにより生じるＦab断片、及び、(iv)ＦV断片、を挙げることができる。
【００９６】
＜二重特異性抗体＞
二重特異性抗体は、モノクローナルであり、望ましくは、２以上の異なる抗原に対して結合特異性を有するヒト又はヒト化された抗体である。この場合、結合特異性の１つは、本発明の抗原性蛋白質に対するものである。第２の結合標的は、他のどんな抗原でもよいが、細胞表面蛋白質又はレセプター又はレセプターのサブユニットであることが有利である。
【００９７】
二重特異性抗体を作る方法は、当該技術分野で知られている。これまで、二重特異性抗体の組換え作成は、２組の免疫グロブリン重鎖と軽鎖を共同発現させることによって行われており、２つの重鎖は、異なる特異性を有している[Milstein and Cuello,Nature,305:537-5398(1983)]。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖をランダムに組み合わせることによって行われ、これらのハイブリドーマ(クアドローマ(quadromas))は、異なる抗体分子からなる１０種類の潜在的混合物(potential mixture)を作り、そのただ１つだけが正しい二重特異性抗体を有している。正しい分子の精製は、通常、親和性クロマトグラフィによって行なうことができる。同様の手法は、1993年5月13日に公開されたWO93/08829号、及び、Traunecker et al.,EMBO J.,10:3655-3659(1991)に開示されている。
【００９８】
所望の結合特異性(抗体−抗原結合サイト)を有する抗体可変ドメインは、免疫グロブリンの定常ドメイン配列に融合される。融合は、好適には、ヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの間で行われる。第１の重鎖定常領域(ＣＨ１)は、少なくとも１つの融合の中に存在する軽鎖結合に必要なサイトを含むことが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をエンコードするＤＮＡｓは、所望により免疫グロブリン軽鎖と共に、分離発現ベクターに挿入され、適当な宿主有機体へ同時にトランスフェクトされる(co-transfected)。二重特異性抗体の発生について、さらに詳しくは、例えば、Suresh et al.,Methods in Enzymology,121:210(1986)を参照することができる。
【００９９】
WO96/27011号に記載された他の方法によると、一対の抗体分子間の界面は、再組換え細胞用培地から再生されたヘテロダイマーの割合が最大となるように作製されることができる。望ましい境界面は、抗体の定常領域のＣＨ３領域の少なくとも一部を含んでいる。この方法では、第１の抗体分子の境界面から、１又は複数の小さいアミノ酸側鎖が、より大きな側鎖(例えば、チロシンやトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同一又は同様の大きさの代償性「キャビティ」は、大きなアミノ酸側鎖を小さなアミノ酸(例えば、アラニンやスレオニン)で置き換えることにより、第２の抗体分子の境界面に作られる。これにより、ホモダイマーのような他の不要な最終産生物と比べて、ヘテロダイマーの収率を向上させる機構が提供される。
【０１００】
二重特異性抗体は、完全長さの抗体又は抗体断片(例えば、F(ab')2二重特異性抗体)として調製されることができる。抗体断片から二重特異性抗体を生成する技術は、文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は、化学結合により調製することができる。Brennan et al.[Science 229:81(1985)]は、無傷抗体が蛋白質分解によってり分割され、F(ab')2断片が生成される方法を開示している。これらの断片は、ジチオール錯化剤亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元され、近隣のジチオールを安定化させ、分子間のジスルフィド形成を阻止する。生成されたFab'断片は、次に、チオニトロベンゾネート(TNB)誘導体に変換される。Fab'-TNB誘導体の１つは、メルカプトエチラミンで還元することにより、Fab'チオールに再変換され、等モル量の他のFab'-TNB誘導体と混合されて、二重特異性抗体が形成される。産生された二重特異性抗体は、酵素の選択的不動化剤として使用されることができる。
【０１０１】
さらに、Fab'断片は、大腸菌(E.coli)から直接回収したり、化学的な結合によって、二重特異性抗体が形成される。Shaleby et al.[J.Exp.Med.175:217-225(1992)]は、完全なヒト化二重特異性抗体F(ab')2分子の産生について開示している。各Fab'断片は、大腸菌から別々に分泌され、生体外で化学的に結合されて、二重特異性抗体が形成される。このように形成された二重特異性抗体は、胸部腫瘍ターゲットに対して、ヒト細胞傷害性リンパ球の酵素活性をトリガする他に、ErbB2受容体及び正常Ｔ細胞を過剰発現する細胞に結合することができた。
【０１０２】
二重特異性抗体断片を、直接、組換え細胞培養から作り、単離する様々な方法が開示されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを用いて産生される[Kostelny et al.,j.Immunol.148(5):1547-1553(1992)]。Fos蛋白質及びJun蛋白質からのロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合により、異なる２種類の抗体のFab'部分に結合された。抗体ホモダイマーは、ヒンジ領域で還元されてモノマーを形成し、再酸化されて抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法は、抗体ホモダイマーの産生にも利用することもできる。「二重特異性抗体(diabody)」の技術については、Hollinger et al.[Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)]が記載しており、二重特異性抗体断片を作るための代替機構を明らかにしている。断片は、リンカーによって軽鎖可変ドメイン(VL)に接続された重鎖可変ドメイン(VH)を含んでいる。なお、前記リンカーは、短すぎて、同一鎖上の２つのドメイン間で対形成(pairing)ができない。従って、１つの断片中のVLドメインとVHドメインは、他の断片の相補的なVLドメインとVHドメインとの間で対形成することを強いられ、これによって、２つの抗原結合部位が形成される。単鎖Fv(sFv)ダイマーを用いて、二重特異性抗体断片を作る他の方法も報告されている[Gruber et al.,J.Immunol.152:5368(1994)参照]。二価より多い抗体についても検討されている。例えば、三価の特異性抗体(trispecific antibodies)が調製されることができる[Tutt et al.,J.Immunol.147-60(1991)]。
【０１０３】
例示した二重特異性抗体は、２つの異なるエピトープに結合することができ、少なくとも１つは、本発明の蛋白質抗原を起源としている。或いはまた、細胞防御機構が特定の抗原を発現する細胞へ集中されるように、免疫グロブリン分子の抗−抗原性アームは、Ｔ細胞受容体分子(例えば、CD2、CD3、CD28、又はB7)又はFcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、及びFcγRIII(CD16)のようなIgG(FcγR)に対するFc受容体のような白血球上のトリガ分子に結合するアームと結合されることができる。二重特異性抗体は、細胞傷害性剤を、特定の因子を発現する細胞に向かわせるために用いられることができる。これらの抗体は、抗原結合アームと、ＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ又はＴＥＴＡのような放射性核種キレート剤を所有する。他の二重特異性抗体は、ここに記載された蛋白質抗原に結合し、組織因子(ＴＦ)にさらに結合する。
＜免疫リポソーム＞
【０１０４】
ここに開示される抗体はまた、免疫リポソームとして調製されることができる。リポソームは、抗体を含んでおり、当該技術分野で公知の方法により作成されることができる[例えば、Epstein et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:3688(1985); Hwang et al., Proc Natl Acad.Sci.USA,77:4030(1980); 米国特許第4,485,045号及び第4,544,545号参照]。循環時間が向上したリポソームは、米国特許第5,013,556号に開示されている。
【０１０５】
特に有用なリポソームは、フォスファチジルコリン、コレステロール及びPEG-由来フォスファチヂルエタノールアミン(PEG-PE)を含む脂質組成物を用いて、逆相蒸発法(reverse-phase evaporation method)によって産生することができる。リポソームは、所定孔サイズのフィルターを通して押し出され、所望の直径を有するリポソームが生産される。本発明の抗体のFab'断片は、Martin et al.らに記載された文献[J.Biol.Chem.,257:286-288(1992)]のリポソームに対し、ジスルフィド相互交換反応を介して、共役結合されることができる。
【０１０６】
＜抗体治療法＞
本発明の抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、及び、完全なヒト抗体があり、本発明の１つである治療剤として用いられることができる。そのような治療剤は、一般的には、被検体の疾病又は病状、特に神経疾患を治療又は防止のために用いられる。抗体の産生は、好適には、その標的抗原に対して高特異性で高親和性を有するものが被検体に投与され、一般的には、標的との結合による効果がもたらされる。この効果は２種類あり、与えられた抗体分子と、標的抗原との相互作用の特異的性質に応じて１つの効果がもたらされる。第１の場合では、抗体の投与によって、標的と、該標的が自然結合する内因性のＰＡＣＡＰ、マキサディラン、ＶＩＰリガンドとの結合が排除又は阻止される。この場合、抗体は、標的と結合し、自然発生リガンドの結合部位をマスクするので、ここでのリガンドは、エフェクター分子として作用する。このように、レセプターは、リガンドが関与するシグナル伝達経路を媒介する。
【０１０７】
或いはまた、前記効果は、標的分子のエフェクター結合部位への結合により、抗体が生理学的結果を引き出すものであるかもしれない。この場合、標的であるＰＡＣＡＰ、マキサディラン又はＶＩＰレセプターは調節の必要がある内因性リガンドを有しており、抗体を、代替エフェクターリガンドとして結合し、レセプター主体のシグナル伝達行動を開始する。
【０１０８】
本発明の抗体の治療上有効量は、一般的には、治療目的を達成するのに必要な量に関係する。前述したように、これは、抗体とその標的抗原との間の結合相互作用であり、標的の機能に干渉する場合と、生理学的応答を促進する場合とがある。投与に必要な量は、特異的抗原の抗体の結合親和性と、投与された抗体が、投与された被検体の自由体積から減少する速度に依存する。
【０１０９】
＜疾病及び障害＞
疾病又は障害でない者のレベル又は生物学的活性と比較して異なるという点によって特徴づけられる疾病及び障害に対しては、反作用(例えば、低減又は抑制)をもたらす治療剤又はＰＡＣＡＰ、マキサディラン又はＶＩＰを活性化させる治療剤で治療される。活性に反作用をもたらす治療剤(therapeutics)は、治療的又は予防的目的で投与されるだろう。治療剤の例として、限定されるものではないが、(i)前記ペプチド、類似体、誘導体、断片又はそれらの同族体；(ii)前記ペプチドに対する抗体；(iii)前述のペプチドをエンコード化する核酸；(iv)相同的組換えによる前記ペプチドの内因性機能を「不能にする(knockout)」のに用いられ、機能しないアンチセンス核酸及び核酸(例えば、前記ペプチドに対するコード配列内への異種挿入による)［例えば、Capecchi，1989．Science 244：1288-1292参照］；又は、(v)前記ペプチドとその結合相手との相互作用を変える調節剤(例えば、阻害剤、作用剤、拮抗剤であり、本発明の追加のペプチドミメティ又は本発明のペプチドに特異的な抗体を含む)、を挙げることができる。
【０１１０】
疾病又は障害でない者のレベル又は生物学的活性と比較して異なるという点によって特徴づけられる疾病及び障害に対しては、活性を向上させる治療剤(例えば、作用剤)で治療される。望ましい実施例において、治療される疾病は、アルツハイマー病、脳梗塞、パーキンソン病が挙げられる。活性を亢進する治療剤は、治療的又は予防的目的で投与されるであろう。使用される治療剤は、限定されるものではないが、前記ペプチド、類似体、誘導体、断片若しくはそれらの同族体、又は生物学的利用能を向上させる作用剤を挙げることができる。
【０１１１】
増加又は減少したレベルの検出は、ペプチド及び／又はＲＮＡを定量化し、患者の細胞組織サンプル(例えば、生検組織から)を入手し、発現したペプチド(又は前記ペプチドのｍＲＮＡｓ)について、ＲＮＡレベル若しくはペプチドレベル、構造及び／又は活性を生体外で分析することによって行われる。当該技術分野で広く知られた方法として、免疫学的検定法(例えば、ウェスタンブロット分析、ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動による免疫沈降法、免疫細胞化学など)、及び／又はｍＲＮＡｓの発現を検知するハイブリダイゼーションアッセイ(例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット法、インサイチュ・ハイブリッダイゼーションなど)に限定されるのでなく、包含するものである。
【０１１２】
＜治療方法＞
本発明の他の目的は、ＰＡＣＡＰ、マキサディラン又はＶＩＰの発現又は活性を治療の目的のために調節する方法に関するものである。一実施例において、本発明の調節方法は、細胞を、ＰＡＣＡＰ、マキサディラン又はＶＩＰについて１又は２以上の活性を調節する製剤と接触させることを含んでいる。この蛋白質活性を調節する製剤は、例えば、核酸又はタンパク質；ＰＡＣＡＰ、マキサディラン又はＶＩＰ受容体の自然発生コグネイトリガンド(cognate ligand)；ペプチド；ＰＡＣＡＰ、マキサディラン又はＶＩＰのペプチドミミテクス、又は他の小分子など、明細書に記載されたものでよい。一実施例において、製剤は、ＰＡＣＡＰ、マキサディラン又はＶＩＰのシグナル伝達経路の活性を刺激する。そのような刺激剤の例として、活性ＰＡＣＡＰ、マキサディラン又はＶＩＰタンパク質の他、細胞内に導入されたＰＡＣＡＰ、マキサディラン又はＶＩＰをエンコードする核酸分子を挙げることができる。これらの調節方法は、生体外で(例えば、製剤を用いて細胞を培養することにより)、又は生体内で(例えば、製剤を患者に投与することにより)、行なうことができる。それゆえ、本発明は、特に、神経に関する疾病又は障害をもつ患者を治療する方法を提供するものである。一実施例において、本発明の方法は、試薬(例えば、この明細書に記載されたスクリーニングアッセイによって特定された試薬)、又はＰＡＣＡＰ、マキサディラン又はＶＩＰの発現及び／又は活性を調節(例えば、機能向上又は機能低下)する複数の製剤を投与することを含んでいる。他の実施例において、本発明の方法は、ＮＳＣの増殖、分化、移動及び／又は生存を調節する治療法として、ＰＡＣＡＰ、マキサディラン、ＶＩＰ又は前記蛋白質をエンコードする核酸分子を投与することを含んでいる。
【０１１３】
ＰＡＣＡＰ、マキサディラン又はＶＩＰ活性を刺激することは、ＰＡＣＡＰ、マキサディラン又はＶＩＰが異常に機能低下する状況、及び／又は、ＰＡＣＡＰ、マキサディラン又はＶＩＰ活性の向上が有利な効果をもたらす状況において望ましい。そのような状況の例として、患者の障害が、異常な細胞の増殖及び／又は分化の特徴を有する場合(例えば、パーキンソン病及びアルツハイマー病)を挙げることができる。
【０１１４】
＜治療剤の生物学的効果の判定＞
本発明の様々な実施例において、具体的な治療剤の効果、及びその投与が罹患組織の治療に有効かどうかを判断するために、生体外又は生体内で、適当な検査が行なわれる。
【０１１５】
様々な実施例において、その治療剤が、細胞タイプに所望の効果を及ぼすかどうか判断するために、患者の障害に関する代表的な幹細胞又は新たに分化した細胞について、生体外での分析が行われる。治療に用いられる化合物は、人間の患者で試験する前に、適当な動物モデル系で試験される。この動物として、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギ等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。同様に、生体内での試験の場合にも、人間の患者に投与する前に、この技術分野で知られた任意の動物モデル系を使用することができる。
【０１１６】
＜薬学的組成物＞
本発明は、中枢神経系又はその他の中枢神経系細胞タイプにおいて損傷又は欠失したニューロンの代替となる子孫を作るために、中枢神経系細胞に影響を及ぼす方法を提供するものであり、神経系疾患又は障害をもつ患者に対し、生体内でＮＳＣ又はＮＰＣ活性を調節する試薬(例えば、ＰＡＣＡＰ、マキサディラン又はＶＩＰ)を、適当な投与ルートを通じて、適当な形態で投与するものである。本発明の全ての実施例において、神経系の疾病又は障害とは、全ての疾患を含むもので、少なくとも、神経変性障害、神経幹細胞障害、神経前駆体障害、虚血性障害、神経外傷性障害、情動障害、精神神経疾患、網膜の変性疾患、網膜損傷／外傷、学習障害及び記憶障害が含まれる。本発明の一実施例において、神経系の疾病又は障害は、パーキンソン病、パーキンソン病様障害、ハンチントン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄虚血、虚血性脳卒中、脊髄損傷、及び癌関連の脳／脊髄損傷から成る群から選択される。本発明の更なる実施例において、神経系の疾病又は障害は、統合失調症及び他の精神病、滑脳症症候群、うつ病、双極性うつ病／障害、不安症候群／障害、恐怖症、ストレス及び関連症候群、認知機能障害、攻撃性、薬物及びアルコール中毒、脅迫神経行動症、季節気分障害、境界性人格障害、脳性麻痺、生活改善薬、多発脳梗塞性痴呆、レヴィー小体痴呆、加齢関連／老人痴呆、てんかん及び損傷関連てんかん、側頭葉てんかん、脊髄損傷、脳損傷、脳外科手術、外傷関連の脳／脊髄損傷、抗癌治療関連の脳／脊髄組織損傷、感染及び炎症関連の脳／精髄損傷、環境有害物質関連の脳／脊髄損傷、多発性硬化症、自閉症、注意力欠如障害、発作性睡眠、睡眠障害、及び認識行動又は記憶の障害から成る群から選択される。
【０１１７】
本発明は、神経系疾患又は障害を治療する方法を提供するもので、生体内で神経幹細胞又は神経前駆体細胞の活性を調節する試薬を哺乳動物へ投与することを含んでいる。「哺乳動物」という語は、哺乳動物として分類される全ての哺乳動物を意味し、人間、牛、馬、犬、羊及び猫を含む。一実施例において、哺乳動物は人間である。
【０１１８】
本発明は、神経変性疾患の再生治療(regenerative cure)を提供するもので、細胞が損傷又は欠失した所望神経表現型標的座の中へ、上衣細胞及び副脳室領域細胞の増殖、移動、分化及び生存を刺激することによって治療を施すものである。上衣幹細胞の生体内刺激は、適当な調合形態の試薬を、局部的に細胞へ投与することによって行われる。ニューロン新生の増加により、損傷又は欠失したニューロンが置換され、病的状態の脳機能が高められる。
【０１１９】
中枢神経系障害の治療の治療薬として有効な薬学的組成物を提供するものである。該組成物は、例えば、本発明の試薬を含んでおり、該試薬は、単独で投与されるか、又は１種又は２種以上の追加薬剤と共に全身又は局部的に投与される。この薬剤として、保存剤、脳室壁透過性向上剤、幹細胞マイトジェン、生存因子(survival factors)、グリア系統防止剤(glial lineage preventing agents)、抗アポトーシス剤、抗ストレス剤、神経保護剤(neuroprotectants)、解熱剤がある。この薬学的組成物は、細胞(例えば、上皮細胞及び副脳室領域細胞)を刺激することによってＣＮＳ疾患を優先的に治療し、細胞が損傷又は欠失した部位を標的とする所望の神経表現型の中で増殖、移動、分化する。
【０１２０】
ＣＮＳの疾病又は障害をもつ患者を治療する方法を、提供するものである。この方法は、試薬を含む有効量の薬学的組成物を、患者に対して投与することを含んでおり、投与は、(1)単独で、(2)脳室壁透過性向上剤と共に、(3)局部的又は全身に同時投与される薬剤と共に行われ、投与量は、0.001ng/kg/日乃至10mg/kg/日であり、好適には0.01ng/kg/日乃至5mg/kg/日であり、より好適には0.1ng/kg/日乃至1mg/kg/日であり、最も好適には0.1ng/kg/日乃至10μg/kg/日の範囲である。
【０１２１】
本発明の薬学的組成物は、所望の投与ルートに適合するように調製される。投与ルートの例として、非経口(例えば、静脈内)、皮内、皮下、経口(例えば、吸入)、経皮(局所的)、経粘膜、及び直腸投与が挙げられる。非経口、皮内又は皮下に適用される溶液又は懸濁液は、例えば、注射用水、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶剤の如き無菌希釈剤；例えば、ベンジルアルコール又はメチルパラベンの如き抗菌剤；例えば、アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムの如き酸化防止剤；例えば、エチレンジアミン四酢酸の如きキレート剤；例えば、酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩の如き緩衝剤、及び、例えば、塩化ナトリウム又はデキストロースの如き張力調節剤のような成分を含有することができる。ｐＨは、塩酸又は水酸化ナトリウムのような酸又は塩基で調節されることができる。非経口製剤は、アンプル、使い捨て注射器又は複数回投与できるガラス又はプラスチック製の薬瓶に入れられることができる。
【０１２２】
注射用に適した薬学的組成物は、注射可能な無菌溶液又は分散を即時調製するための無菌水溶液(水溶性の場合)又は分散及び無菌粉末を含んでいる。静脈内投与に適した担体(carrier)として、生理食塩水、静菌水、Cremophor ELTM (ＢＡＳＦ，Parsippany，Ｎ.Ｊ.)又はリン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)がある。どの場合も、組成物は、無菌であらねばならず、注射器で取り扱える程度に流動性を有するべきである。また、製造及び保存状態では安定であらねばならず、バクテリアや菌類のような微生物の汚染から保護されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール(例えばグリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール等)、及びそれらの適当な混合物を含む溶媒又は分散媒である。適当な流動性を維持するには、例えば、レシチンのようなコーティングを使用し、分散の場合は所定の粒子サイズを維持し、また界面活性剤を使用することによって行なうことができる。微生物の作用を防止するには、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等の様々な抗菌剤及び抗真菌剤によって行なうことができる。多くの場合、組成物の中に、等張剤(例えば砂糖)、多価アルコール(例えば、マニトール、ソルビトール)、塩化ナトリウムを含有することが望ましい。注入可能な組成物を長時間に亘って吸収させるには、組成物の中に、吸収を遅らせる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含有することが好ましい。
【０１２３】
注射可能な無菌溶液は、所定量の活性化合物(例えば、キメラペプチド)を、前掲の１種又は２種以上の成分を含む適当な溶媒の中に加えることによって調製され、所望により、ろ過滅菌される。一般的に、分散剤は、活性化合物を、塩基性分散媒の他に、所望により前掲の成分を含む殺菌用賦形剤の中に加えることによって調製される。注射可能な殺菌溶液の調製に殺菌粉末を用いる場合、その調製は、真空乾燥及び凍結乾燥で行われ、活性成分に、前述の殺菌濾過溶液からの所望成分が加えられた粉末が生成される。
【０１２４】
経口組成物は、一般的には、不活性希釈剤又は食用に適する担体を含んでいる。それらは、ゼラチンカプセルに入れられるか、又はタブレットに圧縮される。治療のために経口投与する場合、活性化合物は、賦形剤と共に含められ、タブレット、トローチ又はカプセルの形状で使用される。経口組成物はまた、うがい薬用として流体担体を用いて調合されることができ、流体担体の中の成分は、経口投与され、口の中でゆすいで、吐き出されるか、又は飲み込まれる。薬学的な適合性を有する結合剤及び／又は補助物質を、組成物の一部分として含められることができる。タブレット、錠剤、カプセル、トローチ等は、例えば、微結晶性セルロース、トラガカントゴム又はゼラチンのような結合剤；例えば、でんぷん又は乳糖のような賦形剤；例えば、アルギン酸、プリモゲル(Primogel)又はコーンスターチのような崩壊剤；例えば、ステアリン酸マグネシウム又はステロテス(Sterotes)のような潤滑剤；例えば、コロイド状二酸化ケイ素のような流動促進剤；例えば、ショ糖又はサッカリンのような甘味剤；例えば、ペパーミント、サルチル酸メチル又はオレンジ香料のような香料剤、の中の任意の成分、又はこれらと同様な性質を有する任意の化合物を含むことができる。
【０１２５】
吸入による投与の場合、その化合物は、例えば二酸化炭素のような気体の発射剤を含む加圧容器若しくはディスペンサーからのエアゾールスプレー又は噴霧器(nebulizer)の形態で供給される。
【０１２６】
全身投与は、また経粘膜又は経皮的方法によって行なうことができる。経粘膜又は経皮投与の場合、バリアを適当に通過できるように、浸透剤が調合剤の形態で用いられる。そのような浸透剤は、当技術分野では一般的に知られており、例えば経粘膜投与の場合、洗剤、胆汁塩、フシジン酸誘導体がある。経粘膜投与は、鼻腔用スプレー又は坐薬を使用して行われることもできる。経皮投与の場合、活性化合物は、当該分野で一般的に知られているように、軟膏(ointments)、軟膏(salves)、ジェル又はクリームの中へ調製される。
【０１２７】
化合物はまた、坐薬(例えば、カカオバターや他のグリセリドのような従来の坐薬の基剤を有する)、又は直腸送達のための滞留浣腸の形態でも調合されることができる。
【０１２８】
一実施例において、活性化合物は担体と共に調製される。該担体は、例えば、制御された徐放製剤(released formation)のように、体部からの急速な放出を防止する化合物を保護するもので、インプラントやマイクロカプセルに入れられた送達システムがある。また、例えばエチレン酢酸ビニール、ポリアンヒドリド(polyanhydrides)、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸等の生分解性ポリマー、生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤の調製方法は、当業者であれば明らかであろう。材料は、Alza Corporation及びNova Pharmaceuticals，Inc．から商業的に入手することができる。リポソームの懸濁液(ウィルス抗原のモノクローナル抗体で感染細胞にターゲティングされたリポソームを含む)はまた、薬学的に許容される担体として使用されることができる。これらは、当業者に知られた方法によって調製されることができる[例えば、米国特許第4,522,811号参照]。
【０１２９】
投与を容易にし、投与量の均一性のために、経口組成物又は非経口組成物を用量単位で調製することが特に有利でなる。この明細書で使用される用量単位の形態は、治療される患者に対する単位投与量として適当な量で、物理的に分離した単位を意味し、各単位は、必要な薬学的担体と共に、所望の治療効果がもたらさられるようにに計算された所定量の活性化合物を含有するものである。本発明の用量単位に対する仕様は、活性化合物の特性、達成されるべき具体的な治療効果、また、個々の患者の治療のための活性化合物を調合する技術に固有の制約によって決められ、また、直接左右される。
【０１３０】
タンパク剤をエンコードする核酸分子は、ベクターに挿入され、遺伝子治療ベクターとして使用されることができる。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈注射、局部投与[米国特許第5,328,470号参照]、又は定位注入［Chen et al．(1994)PNAS 91：3054-3057参照］によって患者へ送達することが可能である。遺伝子治療ベクターの薬学的調製物は、遺伝子治療ベクターを、使用が許容される希釈剤の中に含めることができるし、遺伝子送達ビークルが埋め込まれた徐放出性(slow release)マトリックを含むこともできる。或いはまた、完全な遺伝子運搬ベクターは、組み換え細胞、例えばレトロウィルスベクターから無傷状態で生成される場合、薬学的調製物は、遺伝子送達システムをもたらす１又は複数の細胞を含むことができる。
【０１３１】
薬学的組成物は、投与の使用説明書と共に、容器、パック又はディスペンサーの中に収容される。
他の実施例において、試薬は、純度９０％以上の試薬を含む組成物の中に投与される。試薬は、例えば、ＰＡＣＡＰ、マキサディラン又はＶＩＰである。
【０１３２】
試薬は、好適には、最大の安定性をもたらし、副作用が最少となる媒体の中で調製される。試薬に加えて、本発明の組成物は、一般的には、蛋白質担体、緩衝剤、等張塩及び安定剤を少なくとも１種以上含むことができる。
【０１３３】
また、試薬は、ポンプ装置に連結されたカテーテルを挿入する外科手術によって投与することも可能である。ポンプ装置は、埋め込むこともできるし、体外に設置することも可能である。試薬の投与は、間欠脈動(intermittent pulses)でも、又、連続注入としても可能である。脳の分離した部位への注入装置は、当該分野では知られている[米国特許6,042,579; 5,832,932; 4,692,147参照]。
【０１３４】
試薬を含有する組成物は、蛋白質の投与形態として知られている任意の形態で投与されることができる。試薬は、当該分野では知られた任意の方法で投与されることができ、血液脳関門を通過してもよいし、バイパスを通るものでもよい。作用因子が血液脳関門を通過可能な方法として、因子のサイズをできるだけ小さくし、より容易に通過させるための疎水性因子を供給し、蛋白質試薬又は他の薬剤を、血液脳関門を通るのに十分な浸透性を有する担体分子に共役接合することを含んでいる[米国特許第5,670,477号参照]。
【０１３５】
試薬、誘導体及び同時投与される製剤は、投与に適した薬学的組成物の中へ含められることができる。そのような組成物は、一般的に、製剤及びを薬学的に許容される担体を含んでいる。この明細書で用いられる「薬学的に許容される担体」という語は、薬剤投与に適合可能であればよく、溶媒、分散剤、コーティング、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤などを含むものである。前記媒体及び作用剤を、薬学的に活性物質に対して用いることは、当該分野で広く知られている。媒体又は製剤が活性化合物と不適合である場合を除いて、従来の媒体又は製剤を組成物の中に用いることはできるであろう。活性補助化合物は、組成物へ含められることが可能である。ペプチドの可溶性又はクリアランスに影響を与えるために、製剤への修飾が行われる。ペプチド分子はまた、Ｄ-アミノ酸と合成され、酵素的分解に対する抵抗性を向上させる。組成物は、可溶化剤、防腐剤、浸透促進剤の１又は２種以上と同時投与が可能である。薬学的に許容される担体の例として、乳糖、グルコース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、コーンスターチ、結晶性セルロース、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム、ゼラチン、シロップ、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルヒドロキシ安息香酸エステル、プロピルヒドロキシ安息香酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、不活性ポリマー、水及び鉱油を挙げることができる。
【０１３６】
例えば、組成物は、防腐剤、又は蛋白質、炭水化物及び薬学的組成物の密度を増加させる化合物等の担体を含むことができる。組成物はまた、等張塩及び酸化還元制御剤を含むことができる。
【０１３７】
いくつかの実施例において、投与される組成物は、試薬と、脳室壁の浸透性を増加させる作用剤、例えば「脳室壁浸透性エンハンサー」の１種又は２種以上を含んでいる。そのような組成物は、注入された組成物を、脳室壁よりも深く浸透するのを助けることができる。適当な脳室壁浸透性エンハンサーの例として、例えば、リポソーム、血管内皮成長因子(vascular endothelial growth factor; ＶＥＧＦ)、ＩＬ−ｓ、ＴＮＦα、ポリオキシエチレン、脂肪酸のポリオキシエチレン  エーテル、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、フシジン酸及びその誘導体、ＥＤＴＡ、ジソジウムＥＤＴＡ、コール酸及び誘導体、デオキシコール酸、グリココール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸 、タウロデオキシコール酸、コール酸ナトリウム、グリココール酸、デオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、グリコデオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、ケノデオキシコール酸、ウロスデオキシコール酸、サポニン、グリシルリジン化アンモニウム、デカメトニウム、臭化デカメトニウム、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム、及びジメチルβ-シクロデキストリン又は他のシクロデキストリンを挙げることができる。
【０１３８】
＜薬剤スクリーニング＞
本発明はまた、幹細胞集団又は前駆体細胞集団を分析又は精製するために、レセプター、又はレセプター/試薬の複合体を使用する方法であって、レセプター、又はレセプター/試薬複合体に対する抗体を使用する方法を提供する。
【０１３９】
本発明の他の目的は、幹細胞及び前駆体細胞に作用する試薬をスクリーニングする方法を提供することである。用途の中には、神経細胞への成熟を促進し、又は長時間培養中に前記細胞の増殖及び維持を促進する因子をスクリーニングするために、神経細胞(未分化のもの又は分化したもの)が用いられるものもある。例えば、投与量を変えて、培養中の細胞に加えることによって候補試薬のテストを行ない、どんな変更をすべきかについては、細胞をさらなる培養及び使用に供するために要求される基準に基づいて判定される。細胞の物理的特性は、細胞と神経突起の成長を顕微鏡で観察することによって分析される。増殖、分化及び移動について、増加レベルの発現が誘起されたかどうかは、当該分野で広く知られた技術で分析されることができ、増殖及び分化を確認することができる。そのような技術として、ＰＴ−ＰＣＲ、インサイチュ・ ハイブリダイゼーション(in situ hybridization)及びＥＬＩＳＡがある。
【０１４０】
一実施例において、未分化のニューロスフェアにおける新規なレセプター/試薬について、ＲＴ−ＰＣＲ技術を用いて検査を行なった。具体的には、この未分化ニューロスフェアの中で亢進された(up-regulated)遺伝子が同定された。この明細書で用いられる「亢進(up-regulation)」という語は、利用可能なレセプター数の増加により、試薬/レセプターの相互作用を増大させるプロセスを意味する。この遺伝子の存在は、ＮＳＣ機能の調節のシグナル伝達経路の媒介において潜在的役割を有することを示唆している。更に、レセプター又は該レセプターの様々な試薬の発現レベルを知ることにより、疾病の診断、又は疾病における幹細胞及び前駆体細胞の役割を判断することが可能である。遺伝子又は遺伝子産生物の遺伝子配列又はアミノ酸配列の変化を分析することにより、疾病の進行を診断又は予測することが可能である。この分析結果は、幹細胞又は前駆体細胞に基づく治療を疾病に用いることが有用かどうかを判断するのに必要な情報を提供する。
【０１４１】
他の実施例において、インサイチュ・ ハイブリダイゼーションは、成体マウスの脳部で行なわれ、成体脳のどの細胞がこれら信号経路を発現するかが判断される。このデータは、様々な神経系疾患の治療法の選択を判断するのに役立つ。
【０１４２】
神経細胞に対して試薬が潜在的に有する効果を調べるために、多能性幹細胞に由来するＮＳＣの培養は、正常な神経組織から得られるが、或いはまた、ＣＮＳ疾患又は障害をもつ宿主からも得られる。培養の選択は、試験される具体的な薬剤及び所望される効果によって決められる。細胞が所定ドナーの組織から入手されると、増殖誘起剤の存在下で、生体外で増殖される。
【０１４３】
増殖要因の存在下で増殖された幹細胞の子孫の数及び性質を、何らかの状態で、増加、減少又は変化させる能力を有する様々な生物剤について、既に説明した方法によって増殖された細胞をスクリーニングされる。例えば、ＮＳＣの増殖能力を増加又は減少させる試薬をスクリーニングすることは、移植目的のために大量の細胞を発生させるのに有用であろう。これらの研究では、前駆体細胞は対象試薬の存在下でプレーティングされ、増殖と生存の程度が検査され、前駆体細胞及びその子孫について判定される。スクリーニング前に既に分化を誘起された神経系細胞をスクリーニングすることは可能である。分化の前に、試薬を前駆体細胞に適用することにより、分化プロセスにおける試薬の効果を調べることもできる。一般的には、試薬は可溶性にされて、様々な濃度で培地に加えられ、各投与量での薬剤の効果が判定される。培地は、試薬の濃度が略一定に保たれるように、数日毎に試薬が補充される。
【０１４４】
増殖の変化の観察は、形成されるニューロスフェアの数の増加又は減少、及び／又は、ニューロスフェアのサイズの増加又は減少について行われる。増殖の変化は、増殖率を反映するものでであり、ニューロスフェア当たりの前駆体細胞の数によって判定される。
【０１４５】
これらのスクリーニング方法を用いて、幹細胞及び前駆体細胞の増殖並びに前駆体細胞の分化に及ぼす生物剤の効果、又は分化されたＣＮＳ細胞の生存及び機能を試験することにより、ＣＮＳ細胞の発生前後に及ぼす薬剤の副作用をスクリーニングすることができる。
【０１４６】
本発明のスクリーニン方法の他の適用例は、薬学的化合物の神経組織に対する効果を試験することである。スクリーニングを行なうのは、化合物が神経細胞に薬学的効果を有するように設計されているためであり、また、どこかで作用するように設計された化合物が、神経系に対して、予期せぬ副作用をもたらすことがあるかもしれないためである。スクリーニングは、本発明の神経前駆体細胞又は最終分化細胞を用いて行なうことができる。
【０１４７】
細胞機能の効果は、標準的な検査法を用いて評価されることができ、神経細胞の表現型又は活性の観察、例えば、細胞培養又は適当なモデルにおけるレセプターの結合、増殖、分化、生存が観察される。
【０１４８】
＜治療的使用＞
神経幹細胞は成熟脳室をライニングする組織中にあるという事実は、生体内でのこれら細胞の修飾及び操作に対して、また、ＣＮＳの異なる部位に作用する様々な神経系疾患、障害及び損傷の最終治療に対して、いくつかの利点が提供される。それゆえ、これら疾患に対する治療は、患部近傍の脳室周辺の幹細胞が、この明細書に記載の方法を用いて、生体内で操作又は修飾されるように行われる。脳室系は、殆ど全ての脳部位に存在するので、患部へのアクセスを容易に行なうことができる。試薬を含む組成物へ幹細胞を曝露することにより、幹細胞を生体内で修飾するために、脳室ひいては神経幹細胞へ組成物を投与する装置を埋め込むことは比較的容易に行なうことができる。例えば、組成物を送達するために、浸透圧ポンプに取り付けられたカニューレを用いることができる。或いはまた、組成物は直接脳室へ注入されることもできる。神経幹細胞の子孫は、負傷又は疾患によって損傷した部位に移動することができる。また、脳室は多くの脳部位に非常に近接しているため、幹細胞又はそれらの子孫により、分泌された神経剤の拡散が可能となる。
【０１４９】
さらなる実施例において、本発明の試薬は、上述の通り、局部的又は全身に投与される薬剤と共に、局部的に投与される。そのような薬剤として、例えば、幹細胞マイトジェン、生存因子、グリア系統防止剤、抗アポトーシス剤、抗ストレス剤、神経保護剤、解熱剤又はそれらの任意の組合せの少なくとも１種を挙げることができる。
【０１５０】
薬剤は、本発明の試薬を投与する前、投与する間、投与した後に、全身投与される。局部的投与用薬剤は、本発明の試薬を投与する前、投与する間、投与した後に投与される。
【０１５１】
ハンチントン舞踏病、アルツハイマー病、パーキンソン病、その他、主として前脳に関する神経障害の治療については、生体内で幹細胞の修飾又は操作を行なうために、試薬は、単独で、又は少なくとも１種の追加薬剤と共に前脳の脳室へ送達される。例えば、パーキンソン病は、脳、特に線条体におけるドーパミン量の不足によるものである。従って、患者自身の静止期幹細胞が生体内で分裂を開始するようにし、それらの細胞の子孫が線条体の患部でドーパミン作動性細胞へ分化するようにさせて、ドーパミン量を局部的に上昇するように作用させることが有利である。
【０１５２】
通常、ドーパミン作動性ニューロンの細胞体は、中脳の黒質及び隣接部位に位置しており、軸索が線条体へ突出している。本発明の方法及び組成物は、パーキンソン病の治療のために、薬剤の使用及び論議されている多量の胚組織の使用の代替となるものである。ドーパミン細胞は、本発明の試薬を含む組成物を側脳室へ投与することにより、線条体で生成されることができる。
【０１５３】
ＭＳ及び他の脱ミエリン化又はミエリン形成不全障害の治療、及び筋萎縮性側索硬化症又は他の運動ニューロン疾患の治療については、本発明の試薬は、単独で又は追加の薬剤と共に中心管(central canal)へ送達される。
【０１５４】
脳室の直ぐ周辺のＣＮＳ組織の治療に加えて、本発明の試薬は、単独で又は追加の少なくとも１種の薬剤と共に、ＣＮＳ全体を循環するように、腰椎槽へ投与されることができる。
【０１５５】
他の実施例において、本発明の試薬を投入する前、投入する間、及び／又は投入した後に、神経保護剤を、全身又は局所的に同時投与されることができる。神経保護剤として、酸化防止剤(例えば、セレニウム、ビタミンＥ、ビタミンＣ、グルタチオン、システイン、フラボノイド、キノリン、活性減少酵素などの活性を低下させる物質)、Ｃａチャネル調節剤、Ｎａチャネル調節剤、グルタミン酸受容体調節剤、セロトニン受容体作動剤、リン脂質、不飽和脂肪酸、多価不飽和脂肪酸、エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体調節剤(ＳＥＲＭＳ)、プロゲスチン、甲状腺ホルモン及び甲状腺ホルモン様化合物、サイクロスポリンＡ及び誘導体、サリドマイド及び誘導体、メチルキサンチン、ＭＡＯ阻害剤、セロトニン・ノルアドレナリン・ドーパミン摂取ブロッカー、ドーパミン作動剤、Ｌ−ＤＯＰＡ、ニコチン及び誘導体、及びＮＯシンターゼ調節剤を挙げることができる。
【０１５６】
本発明の試薬は、ＩＶ注射の後で発熱する可能性がある[in rats; Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 2000 278:R1275-81]。それゆえ、本発明は、ｃｏｘ２阻害剤のような解熱剤、インドメタシン、サリチル酸誘導体、その他の一般的な抗炎症性/抗発熱性化合物を、本発明の試薬を投与する前、投与する間、投与した後に、全身又は局所的に投与することができる。
【０１５７】
本発明の他の実施例において、カスパーゼ阻害剤並びにアポトーシス酵素及び因子のアンチセンス調節に有用な薬剤を含む抗アポトーシス薬剤を、本発明の試薬を投与する前、投与する間、投与した後に投与することができる。
ストレス症候群はニューロンの新生を低下させるので、患者の治療に際し、例えばグルココルチコイド(例えばRU486)及びベータブロッカーなどの抗ストレス剤を、本発明の試薬を注入する前、注入する間、及び／又は注入した後に、全身又は局所的に投与することが望ましい場合もある。
【０１５８】
試薬を投薬する形態の準備方法については、当該分野の技術者にとって既知であるか、又は自明であろう。
投与される試薬の量は、患者のサイズ(体重)及び状態に依存するが、0.5ng/kg/日乃至500ng/kg/日、体積では0.001〜10mlであろう。
【０１５９】
治療期間及び試薬の投与期間についても  患者のサイズ及び状態、疾病の重症度の他、用いられる具体的組成物及び方法によって異なる。
ＣＮＳ疾病又は障害をもつ患者の治療に対する前記方法の各々の有効性については、疾病評価の標準的な検査方法として知られた任意の方法によって判断されることができる。
【０１６０】
＜具体的な実施例＞
本発明の一実施例は、神経系障害の患者に「ＮＳＣ治療剤」を投与することにより、患者の神経系障害の症状を緩和させる方法に関するものである。ＮＳＣ治療剤は、ＰＡＣＡＰ、マキサディラン、ＰＡＣＡＰレセプター作用剤、ＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１作用剤又はこれらの組合せである。ＮＳＣ治療剤の投与により、生体内でのＮＳＣ活性(増殖、分化、移動、又は生存)が調節され、障害の症状が緩和される。
【０１６１】
ＮＳＣ治療剤の投与は、0.001ng/kg/日乃至10mg/kg/日であってよい。この投与量は、好適には、0.01ng/kg/日乃至５mg/kg/日であり、0.1ng/kg/日乃至１mg/kg/日であり、0.1ng/kg/日乃至10μg/kg/日である。
【０１６２】
適切な投与量を判断する別の方法として、標的組織の濃度が0.01nM〜１μMに達するように、十分なＮＳＣ治療剤を投与することもできる。監視される標的組織は、どの神経組織又はＣＮＳ組織であってもよいが、これら組織として、少なくとも、脳室壁、脳室系の壁に隣接する部位、海馬、海馬白板(alveus)、線条体、黒質(substantia nigra)、網膜、マイネルト基底核、脊髄、視床、視床下部、及び大脳皮質がある。他の適当な標的組織として、脳梗塞又は虚血性損傷によって損なわれた組織部位が挙げられる。
【０１６３】
ＮＳＣ治療剤の投与は注入によって行なうことができる。注入方法として、皮下、腹腔内、筋肉内、脳室内、柔組織内、髄膜内、頭蓋内への注入がある。他の実施例では、ＮＳＣ治療剤の投与は経口によって行なうことができる。他の適当な投与手段として、口腔、鼻腔、又は直腸粘膜への投与がある。更に、ＮＳＣ治療剤の投与は、ペプチド融合又はミセル送達によって行なうこともできる。
【０１６４】
本発明の方法によって治療できる障害は、この明細書に記載した全ての障害を含むものである。これらの障害として、少なくとも、神経変性障害、ＮＳＣ障害、神経前駆体細胞障害、虚血性障害、神経外傷性障害、情動障害、精神神経疾患、網膜変性疾患、網膜損傷／外傷、認識能力及び学習並びに記憶障害を挙げることができる。
【０１６５】
本発明の他の実施例は、ＮＳＣにおけるＰＡＣＡＰ又はマキサディランのレセプターの活性を調節する方法である。この方法は、レセプターを発現する細胞を調節剤へ曝露することを含んでおり、その結果、ＮＳＣは増殖、分化、移動、又は生存を誘起される。この実施例において、調節剤は、外因性試薬、抗体(モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、又は人工抗体)、アフィボディ、又はそれらの組合せである。ＰＡＣＡＰレセプターは、調節剤による接触を標的としており、例えば、ＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１、ＶＩＰＲ１、又はＶＩＰＲ２である。同様に、マキサディランレセプターは、例えばＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１である。
【０１６６】
調節剤は、ＰＡＣＡＰ、マキサディラン、ＰＡＣＡＰレセプター作用剤、又はＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１作用剤である。更にまた、調節剤は、患者における安定性及び有効性を向上させるためにペグ化される。ペグ化蛋白質及試薬の方法は、当該分野の専門家には広く知られており、例えば、米国特許第5,166,322号、第5,766,897号、第6,420,339号及び第6,552,170号に記載されている。
【０１６７】
望ましい実施例において、ＮＳＣは胎児脳、成体脳、神経細胞培養又はニューロスフェアに由来する。他の望ましい実施例において、ＮＳＣは、硬膜、末梢神経又は神経節に包まれた組織に由来する。適当なＮＳＣの他の例として、膵臓、皮膚、筋肉、成体骨髄、肝臓、臍帯組織又は臍帯血の幹細胞に由来するＮＳＣが挙げられる。
【０１６８】
本発明の他の実施例は、哺乳類の成体ＮＳＣの増殖、ニューロン新生、分化又は移動を刺激する方法に関する。この方法では、成体ＮＳＣ細胞は、ＰＡＣＡＰ、マキサディラン、ＰＡＣＡＰレセプター作用剤、及びＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１作用剤に接触させて、ＮＳＣ細胞の増殖、ニューロン新生、移動又は分化特性を向上させるものである。ＮＳＣ細胞は、哺乳類の脳の側脳室壁に由来する。望ましい実施例では、ＮＳＣは膵臓、皮膚、筋肉、成体骨髄、肝臓、臍帯組織又は臍帯血の幹細胞に由来する。
【０１６９】
本発明の他の実施例は、哺乳類の成体ＮＳＣの増殖及びニューロン新生を相乗的に活性化させる方法に関する。この方法では、哺乳類成体ＮＳＣは、成長因子(growth factor)及びＮＳＣ治療剤に接触させられる。２種類の試薬は哺乳類のＮＳＣ細胞の増殖を、成長因子又はＮＳＣ治療剤のどちらの場合よりも速い速度で誘導する。成長因子とＮＳＣ治療剤を組み合わせると、相乗効果を有し、成長因子効果とＮＳＣ治療剤効果の合計よりも大きくなることは、驚くべき発見である。望ましい実施例において、この方法で使用される成長因子はＥＧＦである。
【０１７０】
本発明の他の実施例は、哺乳類の成体ＮＳＣの増殖及びニューロン新生を同時に刺激する方法に関する。この方法では、哺乳類成体ＮＳＣは、成長因子及びＮＳＣ治療剤に接触される。２種類の試薬は哺乳類のＮＳＣ細胞の増殖を、成長因子又はＮＳＣ治療剤のどちらの場合よりも速い速度で誘導する。望ましい実施例において、この方法で使用される成長因子はＶＥＧＦである。
【０１７１】
本発明の他の実施例は、哺乳類の成体ＮＳＣの増殖を刺激する方法に関する。この方法は、ＮＳＣ治療剤を哺乳類の成体ＮＳＣに接触させることを含んでいる。ＮＳＣ治療剤は、細胞内ＣＲＥＢのリン酸化反応の促進を誘導する。哺乳類成体ＮＳＣの増殖は、細胞内ＣＲＥＢリン酸化反応によって誘起される。
【０１７２】
本発明の他の実施例は、哺乳類の成体ＮＳＣの増殖を刺激する方法に関する。この方法は、ＮＳＣ治療剤を哺乳類の成体ＮＳＣに接させることを含んでいる。ＮＳＣ治療剤は細胞内ＡＰ−１の転写の促進を誘導する。哺乳類成体ＮＳＣの増殖は、細胞内ＡＰ−１の転写によって誘起される。
【０１７３】
本発明の他の実施例は、哺乳類の成体ＮＳＣの増殖を刺激する方法に関する。この方法は、ＮＳＣ治療剤を哺乳類の成体ＮＳＣに接触させることを含んでいる。ＮＳＣ治療剤は、細胞内蛋白質キナーゼＣ活性の向上を誘導する。哺乳類成体ＮＳＣの増殖は、細胞内蛋白質キナーゼＣ活性によって誘起される。
【０１７４】
本発明の他の実施例は、哺乳類の成体ＮＳＣ子孫の生存を、ＮＳＣ細胞とＮＳＣ治療剤との接触によって刺激する方法に関する。ＮＳＣ子孫の生存の増加は、(１)細胞内ＣＲＥＢリン酸化反応の増加、(２)細胞内ＡＰ−１転写の増加、(３)細胞内蛋白質キナーゼＣ活性の増加、(４)細胞内蛋白質キナーゼＡ活性の増加、によって特徴付けられ、予測される。哺乳類成体ＮＳＣの子孫の生存は、ＮＳＣ治療剤を使用することにより、上記４つの特徴の中のどれかの特徴を刺激することによって達成される。
【０１７５】
本発明の他の実施例は、初代(primary)成体哺乳類のＮＳＣの増殖を刺激して、ニューロスフェアを形成する方法に関する。この方法では、成体哺乳類ＮＳＣは、ＮＳＣ治療剤と接触させられ、細胞を増殖させて、ニューロスフェアが形成される。
【０１７６】
本発明の他の実施例は、ＮＳＣ治療剤を哺乳動物へ投与することにより、哺乳動物の中枢神経系障害の症状を低減する方法に関する。作用剤は、例えば、抗体、アフィボディ、小分子、ペプチド及びレセプターである。レセプターは、ＰＡＣＡＰ、マキサディラン又はＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１に対するレセプターであってよい。望ましい実施例において、投与は局部的又は全身に行われる。投与に際しては、脳室壁透過性向上剤を含めることができる。脳室壁透過性向上剤は、ＮＳＣ治療剤の投与前又は投与後に投与される。望ましい実施例において、ＮＳＣ治療剤は、透過性向上剤及び薬学的に許容される担体と混合された後、投与される。望ましい実施例において、本発明の方法は、幹細胞マイトジェン、生存因子、グリア系統防止剤、抗アポトーシス剤、抗ストレス剤、神経保護剤、解熱剤、分化因子(differentiation factors)及びそれらの組合せを更に投与することによって高められる。
【０１７７】
本発明の他の実施例は、哺乳動物の神経組織に位置するＮＳＣのインサイチュ増殖、分化、移動又は生存を誘起する方法に関する。この方法は、治療的に有効な量のＮＳＣ治療剤を神経組織へ投与し、ＮＳＣの増殖、分化、移動、又は生存を誘起することを含んでいる。
【０１７８】
本発明の他の実施例は、患者の所定標的組織におけるＮＳＣの成長を促進させる方法に関する。この方法では、標的組織は、ＰＡＣＡＰ、マキサディラン、ＶＩＰＲ１、ＶＩＰＲ２又はＡＤＣＹＣＡＰ１Ｒ１遺伝子をエンコードする推定遺伝子領域(open reading frame)を治療上有効な量が含まれる発現ベクターでトランスフェクトされる。発現ベクターは、推定遺伝子領域の発現を指令し、発現された蛋白質は、標的組織内のＮＳＣの成長を促進する。この方法の利点は、標的組織の全ての細胞又は大部分の細胞がトランスフェクトされる一方、ＮＳＣ細胞だけが成長を促進するようには仕向けられることである。
【０１７９】
トランスフェクション段階は、発現ベクターを注入投与することによって行なわれる。この明細書に記載した任意の注入方法が用いられる。これらの注入方法は、少なくとも、皮下、腹腔内、筋肉内、脳室内、柔組織内、髄膜内又は頭蓋内への注入を含む。発現ベクターは、例えば、リポソ−ムの中に被包された非ウイルス性発現ベクターである。
【０１８０】
本発明の他の実施例は、中枢神経系障害をもつ患者に、ＮＳＣ治療剤を注入することによって、患者の神経発生を促進する方法に関する。
【０１８１】
本発明の他の実施例は、ＰＡＣＡＰ、マキサディラン、ＰＡＣＡＰレセプター作用剤、及びＡＤＣＹＣＡＰ１Ｒ１作用剤を患者へ注入することにより、患者の中枢神経系障害の症状を緩和する方法に関する。
【０１８２】
本発明の他の実施例は、ヒトＮＳＣにリッチ化される細胞集団を生成する方法に関する。この方法は、ＮＳＣを有する細胞集団を、ＰＡＣＡＰ又はマキサディランのレセプター上で決定基と特異的に結合する試薬と接触させること含んでいる。次に、試薬と、前の段階の細胞表面上の決定基との間で接触があった細胞が選択され、中枢神経系幹細胞用に高濃縮される集団が形成される。試薬は、小分子、ペプチド、抗体又はアフィボディである。一実施例において、ＮＳＣを含む集団は、神経組織前駆体細胞から入手される。神経組織前駆体細胞は、神経組織を増加させる全ての細胞集団である。例えば、細胞集団は、哺乳類の胎児脳全体、又は哺乳類の成体脳の全体に由来する細胞集団である。更にまた、ヒトＮＳＣは、膵臓、皮膚、筋肉、成体骨髄、肝臓、臍帯組織又は臍帯血などの組織の幹細胞に由来する。記載した方法は、ＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１、ＶＩＰＲ１又はＶＩＰＲ２などのレセプターを発現する細胞をリッチ化するのに有用である。
【０１８３】
本発明の他の実施例は、前記の方法によって生成された細胞集団を含む細胞培養を生体外で行なうものである。本発明の他の実施例は、中枢神経系障害の症状を緩和させる方法に関するもので、前記症状を有する哺乳動物に対して、前記細胞を投与することを含んでいる。この方法により作られたヒトＮＳＣを移植されたヒト以外の哺乳動物についても想定されている。ヒト以外の哺乳動物は、例えば、ラット、マウス、ウサギ、馬、羊、豚、又はテンジクネズミである。
【０１８４】
本発明の他の実施例は、患者のＣＮＳ障害の症状を低減する方法に関するもので、胎児又は成体の組織から単離されたＮＳＣの集団とＮＳＣ治療剤を、患者の脊髄へ投与するステップを有している。
【０１８５】
本発明の他の実施例は、患者の中枢神経系障害の症状を低減する方法に関する。この方法では、ＮＳＣ治療剤を発現するウイルスベクターが標的細胞へ注入される。発現のために、ウイルスベクターは、宿主細胞(即ち標的細胞)の中で発現可能なプロモーターに結合されたＮＳＣ治療剤をエンコードした核酸を含む少なくとも１つの挿入部位を有することもできる。ＮＳＣ治療剤は、標的細胞の中で蛋白質を生成するように発現され、前記症状が低減される。望ましい実施例において、ウイスルベクターは、非細胞溶解性ウイルスベクターである。
【０１８６】
本発明の他の実施例は、哺乳動物の標的細胞に遺伝子の送達と発現を行なう方法に関する。この方法は、ＮＳＣ治療剤をエンコードする核酸分子を準備し、該分子が標的細胞で発現可能なプロモータに動作可能に連結されるように、単離された核酸分子挿入のためのウイルスベクターを選択し、単離された核酸断片を前記挿入部位へ挿入し、ベクターを標的細胞に導入し、遺伝子が検出可能なレベルで発現されるようにするものである。
【０１８７】
ウイルスは、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス(痘疹)、イリドウイルス、コロナウイルス、トガウイルス、カリシウイルス、レンチウイルス、アデノ関連ウイルス又はピコルナウイルスがある。望ましい実施例において、ウイルス株は、宿主の中で、非悪性となるように遺伝子操作される。
【０１８８】
本発明の他の実施例は、神経系疾患の症状を緩和する方法に関するもので、ＮＳＣの集団を準備し、ＰＡＣＡＰ又はマキサディラン又はそれらの組合せを含む溶液の中にＮＳＣを懸濁して細胞懸濁液を作り、該細胞懸濁液を患者の神経系の注射部位へ送達して、症状を緩和するステップを有している。また、細胞懸濁液を送達する前又は送達した後に、成長因子を前記注射部位へ所定時間投与するステップをさらに含めることができる。
【０１８９】
本発明の他の実施例は、ヒトＮＳＣにリッチ化される細胞集団を移植する方法に関するもので、ＮＳＣを含む集団を、ＰＡＣＡＰ受容体、マキサディラン受容体又はＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１のデターミナントを識別する試薬と接触させ、前記ステップの細胞の表面上で、試薬とデターミナントが接触している細胞を選択して、中枢神経系幹細胞に対して高度にリッチ化される集団を生成し、選択された細胞をヒト以外の哺乳動物に移植することを含んでいる。
【０１９０】
本発明の他の実施例は、ＮＳＣの表面におけるＰＡＣＡＰレセプター又はマキサディランレセプターを調節する方法に関するもので、レセプターを発現する細胞を、外因性試薬、抗体又はアフィボディに曝露することを含んでおり、それによって、ＮＳＣの増殖、分化、生存を誘起するものである。この実施例において、ＮＳＣは、胎児脳、成体脳、神経細胞培養又はニューロスフェアに由来するものが挙げられる。
【０１９１】
本発明の他の実施例は、単離されたＰＡＣＡＰ、マキサディラン又はＶＩＰのレセプター調節剤化合物の候補の中から、ＮＳＣの活性を調節する能力を有するものを決定する方法に関するものである。前記方法において、単離された候補化合物を、ヒト以外の哺乳類に投与し、候補化合物が、ヒト以外の哺乳類のＮＳＣの活性を調節する作用を有するかどうかを決定するステップを含んでいる。決定するステップは、ヒト以外の哺乳類の神経への影響を、ヒト以外の哺乳類で候補化合物を投与していない対照と比較することを含んでいる。ＮＳＣの活性は、増殖、分化、移動又は生存に関するものである。投与は、例えば、この明細書に記載したペプチド融合又はミセル送達を含む任意の方法を用いた注射によって行なうことができる。
【０１９２】
本発明の他の実施例は、ＮＳＣ細胞における細胞内ｃＡＭＰ又は細胞内アデニル酸シクラーゼ活性の量を増加させる方法に関するもので、細胞とＮＳＣ治療剤を接触させることを含んでいる。
【０１９３】
本発明の他の実施例は、細胞内ｃＡＭＰ又は細胞内アデニル酸シクラーゼ活性の量を増加させる方法に関するもので、十分な量のＰＡＣＡＰ又はマキサディランを患者へ投与することを含んでいる。
【０１９４】
本発明はまた、細胞内アデニル酸シクラーゼ活性を促進する薬学的組成物を提供するものである。組成剤は、ＮＳＣ治療剤を活性成分として含んでいる。一実施例において、ＮＳＣ治療剤はペグ化される。他の実施例において、薬学的組成物は成長因子を含んでいる。成長因子として、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、又はその組合せがある。薬学的組成物の形態は任意であり、少なくとも、パッチ、タブレット、カプセル、トローチ、薬包、エリクサー、軟膏、無菌態様、注入可能形態、ハップ剤、パッチ、テープ、坐薬又は無菌粉末が含まれる。薬学的組成物は、ＮＳＣ治療剤の１回の投与量が例えば0.1〜2000mgである。例えば、薬学的組成物は、ＮＳＣ治療剤の１回の投与量が10〜1000mgであってよい。薬学的組成物は、細胞内ｃＡＭＰの向上又は神経系疾患の治療用に使われる。
【０１９５】
本発明の他の特徴は、次の代表的な実施例に関する説明によって明らかになるであろう。なお、実施例は、本発明の例示であって、発明を制限するものではない。全ての文献、特許及び特許出願は、それらの引用を以てその全体が本願へ記載加入されるものとする。
【実施例１】
【０１９６】
成体マウス及びヒトＮＳＣ並びに成体マウス及びヒト脳の神経部位におけるadcyap1r1遺伝子の発現
方法
Ａ．マウス及びヒトの培養並びにマウスのニューロスフェアの培養
生後５−６週間のマウスの側脳室の前側壁は、4.5mg/mlグルコース及び80units/mlDNaseを含有するＤＭＥＭ培地にて、0.8mg/mlヒアルロニダーゼ及び0.5mg/mlトリプシンにより、３７℃で２０分間、酵素的に解離した。細胞は、ゆっくりと粉砕され、３種類の体積のニューロスフェア培地と混合した。培地は、20ng/mlＥＧＦ(特に明記しない限り)、100units/mlペニシリン及び100μg/mlストレプトマイシンを含有するニューロスフェア培地(ＤＭＥＭ／Ｆ12、Ｂ27サプルメント、12.5 ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ7.4)である。70μmのストレーナーを通過した後、細胞は、160×ｇで５分間処理し、ペレット化された。次に、上澄みを取り除いた後、細胞は、上記のとおり添加されたニューロスフェア培地で再懸濁し、培養皿にプレーティングし、３７℃で培養した。ニューロスフェアは、プレーティング後およそ７日間で分裂できる状態になった。
【０１９７】
ニューロスフェア培養を分裂させるために、ニューロスフェアを、160×ｇの遠心分離を５分間行なって収集した。ニューロスフェアは、ＨＢＳＳ(1x)にて0.5mlトリプシン／ＥＤＴＡに再懸濁され、３７℃で２分間培養し、解離を促進するために、ゆっくりと粉砕した。３７℃でさらに３分間培養し、粉砕した後、３種類の氷入りＮＳＰＨ−培地−ＥＧＦを加えて、トリプシンのさらなる活性を停止させる。細胞は、220×ｇで４分間処理し、ペレット化し、20ng/mlＥＧＦ及び１ｎＭ ｂＦＧＦが加えられた新たなニューロスフェアの培地に再懸濁し、プレーティングし、３７℃で培養した。
【０１９８】
成人ヒトの神経幹細胞(ａＨＮＳＣ)の培養
側脳室の前外側壁からの生検を行なうために、成人のヒト患者から採取し、4.5mg/mlグルコースを含むＤＭＥＭにて、ＰＤＤ(パパイン 2.5U/ml; ディスパーゼ 1U/ml; DnaseI 250 U/ml)により、３７℃で２０分間、酵素的に解離した。細胞は、ゆっくりと粉砕され、３種類の体積の培地と混合した。培地は、ヒト神経幹細胞プレーティング用培地(Human Neural Stem Cell Plating Medium;ＨＮＳＣＰＭ)(ＤＭＥＭ/Ｆ12;10％ ウシ胎仔血清(ＦＢＳ)である。細胞は、250×ｇで５分間処理し、ペレット化された。次に、上澄みを取り除いた後、細胞は、ＨＮＳＣＰＭで再懸濁し、フィブロネクチンがコートされた培養皿にプレーティングし、５％ＣＯ2中、３７℃で培養した。その次の日、培地がａＨＮＳＣ培地(ＤＭＥＭ/Ｆ12；ＢＩＴ9500；ＥＧＦ20ng/ml；ＦＧＦ20ng/ml)に変化することにより、培養の増幅展が開始した。ａＨＮＳＣは、標準条件下で、トリプシン及びＥＤＴＡを使用して分割された。次に、反応を抑制するためにＦＢＳを添加し、細胞を２５０×ｇで５分間遠心分離を行って収集した。ａＨＮＳＣは、ａＨＮＳＣ培地に再び再プレーティングされた。
【０１９９】
Ｂ．ＲＴ−ＰＣＲ
マウスのニューロスフェア及び側脳室壁：
マウスのニューロスフェア及び側脳室壁組織におけるadcyap1r1遺伝子の発現及びそのアイソフォームの存在を、特異的に同定するために、次のプライマー対を作製した。増幅するイソフォームに応じて推定した各プライマー対のバンドサイズを次の表に示す。
【０２００】
【表１】
2005538942.tif 000003
【０２０１】
ニューロスフェアは、前述のＬＶＷから調製された。第１分割の３日後、ニューロスフェアを採取し、製造者のインストラクションに基づいて、Qiagen[Hilden, Germany]のRNeasy Mini Kitを使用し、トータルＲＮＡを単離した。adcyap1r1 ｍＲＮＡの存在を検出するのに、ライフ  テクノロジー[Gaithersburg, MD]のOne-Step RT-PCR Kitを用いた。簡単に説明すると、各反応に使用したトータルＲＮＡは、12.5ng、アニーリング温度は５５℃である。トータルＲＮＡのゲノム汚染によって結果が偽陽性とならないように、同じ反応液中でRT-taqポリメラーゼ混合物とtaqポリメラーゼ単独とを置き換えたものを準備し、ＲＴ−ＰＣＲと平行して実験を行なった。反応物は、臭化エチジウムを含む1.5％アガロースゲルを用いて電気泳動を行ない、バンドを紫外線の下で視覚化させた。所望遺伝子のＰＣＲ産生物の推定全長に対応するバンドが、クローニングベクターｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙの中にクローン化され、その同一性を確認するための配列が決定された。
【０２０２】
成体ヒトの神経幹細胞
ＨＮＳＣ培養におけるadcyap1r1遺伝子の発現及びそのアイソフォームの存在を、特異的に同定するために、次のプライマー対を作製した。増幅するイソフォームに応じて推定した各プライマー対のバンドサイズを次の表に示す。
【０２０３】
【表２】
2005538942.tif 000004
【０２０４】
ａＨＮＳＣは上記に記載の通り調製され培養された。トータルＲＮＡは、製造者のインストラクションに基づき、QiagenのRNeasy Mini Kitを使用して単離し、ＤＮaseは、Ambion DNase I を使用し、プロトコルに基づいて処理した。adcyap1r1 ｍＲＮＡの存在を検出するのに、ライフ  テクノロジーのOne-Step RT-PCR Kitを用いた。簡単に説明すると、各反応に使用したトータルＲＮＡは、50ng、アニーリング温度は５５℃である。トータルＲＮＡのゲノム汚染によって結果が偽陽性とならないように、同じ反応液中でRT-taqポリメラーゼ混合物とtaqポリメラーゼ単独とを置き換えたものを準備し、ＲＴ−ＰＣＲと平行して実験を行なった。反応物は、臭化エチジウムを含む1.5％アガロースゲルを用いて電気泳動を行ない、バンドを紫外線の下で視覚化させた。所望遺伝子のＰＣＲ産生物の推定全長に対応するバンドが、クローニングベクターｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙの中にクローン化され、その同一性を確認するための配列が決定された。
【０２０５】
Ｃ．放射性インサイチュ・ハイブリダイゼーションのプローブ
【表３】
2005538942.tif 000005
【０２０６】
組織の調製及びハイブリダイゼーション
マウスの脳、ヒトの死後の側脳室壁及び海馬組織の一部(14μm)を、−１７℃のクリオスタットで切断し、顕微鏡用スライド[Superfrost Plus, BDH, UK]の上で解凍し、４％ホルムアルデヒドの中で５分間保持し、0.2MＨＣｌ中で１５分間、脱蛋白質化し、0.25％無水酢酸を加え、ｐＨ８.０の0.1Mトリエタノールアミンバッファーにて２０分間処理し、ハイブリダイゼーションの前にクロロホルム処理を５分間行ない、エタノール濃度を上昇系列で変化させて脱水した。adcyal1rl mRNAを検出するために、アンチセンスｃＲＮＡプローブ(公知の全てのアイソフォームに特異性)を、ｃＤＮＡ(上記adcyal1rl遺伝子のコード配列の塩基に対応)を含み、現在[α-35Ｓ]ＵＴＰ-ラベルが付されたプラスミド(ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ)から転写した。プローブ(マウスの場合はＰＡＣＲ１、ＰＡＣＲ１S、Ｈｏｐ１、ヒトの場合はＰＡＣＲ１)を用い、切除部を、５５℃のハイブリダイゼーションバッファの中で１６時間培養した。なお、前記バッファは、１mlにつき、５２％ホルムアミド、１０％硫酸デキストラン、２０８mMＮａＣｌ、２％の５０倍デンハート溶液(１％フィコール、１％ポリビニルピロリデン、１％ＢＳＡ)１０mM Tris ｐＨ8.0、１mM ＥＤＴＡ、５００ng/mlイーストｔＲＮＡ、10mMジチオスレイトール(ＤＴＴ)及び２０x１０6cpmプローブを含んでいる。ハイブリダイゼーション後、0.5M NaCl中、RNase A、10μg/ml、３７℃で３０分間処理され、４×クエン酸緩衝液(SSC;1xSSCは0.15Mクエン酸ナトリウム、0.015Mクエン酸三ナトリウム、pH7.0)で２０分間、２×SSCで１０分間、１×SSCで１０分間、及び0.5×SSCで１０分間、室温で洗浄した。0.1×SSCでは、高ストリンジェンシー洗浄を７０℃で３０分間行なった。洗浄ステップは全て、１mMＤＴＴを追加した。切除部は、エタノール濃度が上昇系列の液中で脱水し、１晩乾燥させ、頂部に自動Ｘ線撮影フィルム[Beta-max、Amersham]が積層されたカセットに３週間組み込んだ。フィルムは、コダックＤ−１９現像液で現像され、１：３に希釈されたコダックＲＡ−３０００で定着処理され、洗浄し、乾燥した。切除部は、１：１に希釈されたコダックＮＴＢ−２核トラック乳剤に浸漬し、６週間露出し、コダックＤ−１９の中で３分間現像し、コダックＲＡ−３０００定着剤で定着処理し、クレシルバイオレットで対比染色した。 ハイブリダイゼーションの特異性の検査は、同じプラスミドから転写したセンスプローブを用いて行なった。この条件下ではハイブリダイゼーションの兆候はなかった。乳剤に浸漬された切除部は、ニコンＥ６００顕微鏡を用いて、手操作で分析した。
【０２０７】
結果
図１Ａは、全てが既知のマウスadcyaplrlアイソフォームに特異的なプローブを用いて、成体マウスの脳の冠状及び矢状断面におけるadcyaplrl ｍＲＮＡ陽性細胞を明視野観察及び暗視野観察した顕微鏡写真である。図１Ａは、海馬の歯状回及び側脳室壁におけるadcyap1r1の発現を表す低倍率顕微鏡写真である。図１Ｂ及び図１Ｄは、側脳室壁の高倍率顕微鏡写真である。側脳室壁の副脳室領域に陽性ラベルの細胞があることに留意されるべきである。図１Ｃ及び図１Ｅは、海馬の歯状回の発現を示している。顆粒細胞層に高レベルのラベルがあることに留意されるべきである。略語ＤＧは歯状回、ＧＣＬは顆粒細胞層、ＬＶは側脳室、ＬＶＷは側脳室壁、Ｓｔｒは線条体、ＳＶＺは副脳室領域を表している。
【０２０８】
図２は、全てが既知の遺伝子(Ａ,Ｂ)アイソフォームに特異性のプローブ、及び成体マウスの脳の冠状(Ａ,Ｃ,Ｅ)及び矢状(Ｂ,Ｄ,Ｆ)断面のhop1/2アイソフォーム(Ｃ,Ｄ)及びショートアイソフォーム(Ｅ,Ｆ)に特異的なプローブを用いて、adcyaplrl ｍＲＮＡの発現を観察した低倍率顕微鏡写真である。海馬の歯状回及び側脳室の壁の両アイソフォームの発現に留意されるべきである。略語ＤＧは歯状回、ＬＶは側脳室を表している。
【０２０９】
ヒトの側脳室壁(Ａ)の副脳室領域及びヒトの海馬歯状回(Ｂ)におけるadcyaplrl mＲＮＡ陽性細胞の高倍率顕微鏡写真である。略語ＤＧは歯状回、ＬＶは側脳室を表している。
【０２１０】
培養された非接着性マウスニューロスフェア(ＮＳ)、マウス側脳室壁(ＬＶＷ)、脳組織の残部(ＲＯＢ)(図４及び図５)、及び成体ＨＮＳＣ(図６)から調製されたトータルＲＮＡについて、ＲＴ−ＰＣＲを、マウス及びヒトのadcyap1r1遺伝子に特異的なプライマー対を用いて行なった。矢印で示されたバンドは、それらが表すadcyap1r1遺伝子のアイソフォームの所望ＰＣＲ生成品サイズに対応する。図４は、マウスadcyap1r1(801bp)([lane1 NS; lane2LVW; lane3ROB])である。図５は、マウスadcyap1r1ショートフォーム(330bp)及びhop1/2(413/410bp)([lane1 NS; lane2 LVW; lane3 ROB])である。図６は、ヒトadcyap1r1ショートフォーム(330bp)([lane1 NS])及びhop1/2アイソフォーム(413/410bp)([lane2])である。これらバンドの配列により、正しい生成物であることが確認された。マウスhop１及びhop２に対応するバンドの場合、両アイソフォームが同定された。逆転写酵素を使用せずに並列して行なった制御実験は、taqポリメラーゼのみであり、ゲノム汚染による偽陽性バンドを除外した。
【実施例２】
【０２１１】
ＰＡＣＡＰによるAdcyaplrl刺激及びAdcyaplrl特異性作用剤、マキサディランが、生体外で成体マウスのＮＳＣの増殖を媒介する
方法
Ａ．マウスのニューロスフェアの培養
生後５−６週間のマウスの側脳室の前側壁は、4.5mg/mlグルコース及び80units/mlDNaseを含有するＤＭＥＭ培地にて、0.8mg/mlヒアルロニダーゼ及び0.5mg/mlトリプシンにより、３７℃で２０分間、酵素的に解離した。細胞は、ゆっくりと粉砕され、３種類の体積のニューロスフェア培地と混合した。培地は、20ng/mlＥＧＦ(特に明記しない限り)、100units/mlペニシリン及び100μg/mlストレプトマイシンを含有するニューロスフェア培地(ＤＭＥＭ／Ｆ12、Ｂ27サプルメント、12.5 ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ7.4)である。70μmのストレーナーを通過した後、細胞は、160×ｇで５分間処理し、ペレット化された。次に、上澄みを取り除いた後、細胞は、上記のとおり添加されたニューロスフェア培地で再懸濁し、培養皿にプレーティングし、３７℃で培養した。ニューロスフェアは、プレーティング後およそ７日間で分裂できる状態になった。
【０２１２】
ニューロスフェア培養を分裂させるために、ニューロスフェアを、160×ｇの遠心分離を５分間行なって収集した。ニューロスフェアは、ＨＢＳＳ(1x)にて0.5mlトリプシン／ＥＤＴＡに再懸濁され、３７℃で２分間培養し、解離を促進するために、ゆっくりと粉砕した。３７℃でさらに３分間培養し、粉砕した後、３種類の氷入りＮＳＰＨ−培地−ＥＧＦを加えて、トリプシンのさらなる活性を停止させる。細胞は、220×ｇで４分間処理し、ペレット化し、20ng/mlＥＧＦ及び１ｎＭ ｂＦＧＦが加えられた新たなニューロスフェアの培地に再懸濁し、プレーティングし、３７℃で培養した。
【０２１３】
組織を解離する化学物質について、トリプシン、ヒアルロニダーゼ及びDNaseは、SIGMAから入手し、培地(ＤＭＥＭ 4.5mg/mlグルコース、及びＤＭＥＭ／Ｆ12)、Ｂ27サプルメント及びトリプシン／ＥＤＴＡは、GIBCOから入手した。プラスチックは全て、コーニングコスター(CorningCostar)から購入した。細胞培養のＥＧＦは、ＢＤバイオサイエンス(BD Biosciences)から入手した。
【０２１４】
Ｂ．細胞内のＡＴＰ分析
細胞内のＡＴＰレベルは、細胞数と相関関係を有することが明らかにされている[Crouch，Kozlowski et al．1993]。前述のとおり培養した継代２のマウスのニューロスフェアを、９６ウエルのプレートにＢ２７を加えたＤＭＥＭ／Ｆ１２に接種した。前記プレートには、単細胞(10000細胞/ウエル)が所定濃度で単細胞被測定物質に加えられている。培養３日後、スウェーデンのBioThemaのＡＴＰ−ＳＬキットを使用し、製造者のインストラクションに基づいて、細胞内のＡＴＰを測定した。ＰＡＣＡＰとＶＩＰは、Bachemから購入した。マキサディランの入手先は、Richard G Titus，Dept. Microbiology，Immunology and Pathology，College of Veterinary Medicine and Biological Sciences，Colorado State Univeristyである。
【０２１５】
シグナル経路を調べる実験において、細胞は、上述のように単細胞として接種された(seeded)。ＰＡＣＡＰ、100nMを、10ｕＭ ＰＫＡ阻害剤Ｈ８９[Alexis-Biochemicals]又は１uM ＰＬＣ阻害剤Ｕ73122[Alexis-Biochemicals]又は１uM ＰＫＣ阻害剤Ｇo6976[Sigma-Aldrich]と同時に培養した。細胞は、ＡＴＰの測定前に４日間培養した。
ＰＡＣＡＰとＥＧＦの組合せ効果を分析する実験において、100nMのＰＡＣＡＰは、３nM ＥＧＦと共に、３日間培養した。
【０２１６】
Ｃ．チミジンの取込み
チミジンのＤＮＡへの取込みを調べるために、ニューロスフェアを分割し、１ウエル10,000細胞入りの96ウエルプレートの中で、ニューロスフェア培地に単細胞として接種した。測定される物質は、１組に４つずつ加え、細胞を３７℃で３日間培養した。３Ｈ−チミジン、10 uCi/mlが、最後の２４時間に現れた。細胞は、ろ紙で集められ、放射能(radioactivity)を測した。３Ｈ−チミジン(6,7 Ci/mmol)はPerkinElmerから入手した。
【０２１７】
Ｄ．細胞計数のためのＮＳＣの培養
前側脳室壁を切除し、細胞を上述のように処理した。但し、ＥＧＦの代わりに、培地には、ＰＡＣＡＰ(100nM)又はＶＥＧＦ(１nM)の一方又は両方が加えられている。細胞懸濁液を、２４ウエルプレートのウエルの中にプレーティングした。培地には、ＰＡＣＡＰ及び／又はＶＥＧＦが２日毎にさらに加えた。培養７日後、ＮＳＣをリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡで解離させた。１ウエル当たりの細胞数は、バーカーチャンバを用いて計数した。ＶＥＧＦは、Ｒ＆Ｄシステムズから購入した。
【０２１８】
Ｅ．ウェスタンブロット
成体マウスのＮＳＣとａＨＮＳＣを、実施例２(方法Ａ)及び実施例１(方法Ａ)に記載した要領で、調製し、培養した。培養物は、10nMＰＡＣＡＰ、又はＥＧＦ(１nM)及びＦＧＦ(１nM)に、所定時間、曝露した。処理後、細胞は、Patrone et al.[Patrone，Andersson et al．1999]に示されるように、溶出バッファーの中で溶解させた。ＤＮＡ成分は、細胞抽出物のｄｓ ＤＮＡ計量用ピコグリーンキットを用いて決定した。蛋白質測定は全て、ナノオレンジキットを用いて行なった。等量の蛋白質を、勾配ゲル４−１２％、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル(NuPage/Mopsバッファー)で処理し、ニトロセルロース膜に転写した。ウェスタンブロットを行ない、リン酸化ＣＲＥＢについては、ウサギの抗ホスホＣＲＥＢ(１：1000，Upstate biotechnology)、二次抗ウサギＨＲＰ抗体(１：10.000)を用いてラベル付けした。リン酸化ＣＲＥＢ蛋白質バンド(43kD)は、ＥＣＬキット[Amersham]を用いて検出された。
【０２１９】
Ｆ．ＡＰ−１  転写調節因子レポーターアッセイ
ベクター：ＡＰ−１のレポーター要素及び空のクローニングベクター(ｐＴＡＬ)をルシフェラーゼレポーターと共に含有するベクターＤＮＡを、Promegaから購入した。ベクターを、大腸菌ＪＭ−１０９(Promega)の中で増殖させ、Qiagensのmaxi-prepキット[Qiagen]で精製した。濃度は、およそ１mg/mlベクターに希釈した。
【０２２０】
トランスフェクション：過渡トランスフェクション(transient transfection)は、30,000細胞／ウエルを使用し、浮遊ニューロスフェア細胞培養及び接着ニューロスフェア細胞培養(１〜３日間の培養)に、前述のとおり接種することによって行われた。各ウエルには、0.1mgのプラスミド、0.6μgのNupheriニューロン[Biomol]及び0.6μlのFugene−６[Roche]を一時的にトランスフェクトした。プラスミドとNupherinを混合し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２の中で50μl/ウエルとなるまで希釈し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２の中で50μl/ウエルまで希釈されたFugene−６と混合する前に、１５分間培養した。プラスミド、Nupherin及びFugene−６の混合物は、２０分間培養した。トランスフェクション試薬100μl/ウエルを加える前に、混合物の体積を100μlに調整した。
【０２２１】
アッセイ：次の日、一時的にトランスフェクトされた細胞は、ＭＥＫ阻害剤、ＰＤ89059(Sigma-Aldrich)の存在下又は不存在下で、最終濃度が100ｎＭ/ウエルとなるように、ＰＡＣＡＰ[Bachem]が添加された。ルシフェラーゼ活性は、製造者のインストラクションに基づき、定常発光物質(steady glow)[Promega]で分析した。細胞分析はＰＡＣＡＰを添加した後２０時間後に行なった。
【０２２２】
結果
ＰＡＣＡＰは、非接着(non-adherent)培養条件で成体マウスのＮＳＣ増殖を刺激する
培養中の神経幹細胞に対するＰＡＣＡＰの効果を調べるために、成体マウスの神経幹細胞を脳の側脳室壁から取り出し、ＥＧＦの中でニューロスフェアとして発達させた後、トリプシンを用いて酵素によって解離した。前記細胞は、非接着条件下で３日間、異なる濃度のＰＡＣＡＰが加えられたニューロスフェア培地で培養した。ＰＡＣＡＰ処理された細胞の数が対照細胞よりも増加しているかどうかを調べるのに、これまで細胞数との相関関係を調べるのに用いられていた細胞内ＡＴＰレベル測定方法[Crouch，Kozlowski et al．1993]が用いられた。図７Ａは、細胞内のＡＴＰレベルが統計学的に有意量増加し、ＰＡＣＡＰの投与量に応じて、細胞数が増加することを示している。ＰＡＣＡＰの効果が増殖によるものかどうかを調べるために、トリチウム化チミジンを用いて、ＮＳＣのＤＮＡ合成を評価した。ＰＡＣＡＰ処理した全ては、対照と比べて、トリチウム化チミジンの含有量が多いほど、ＰＡＣＡＰは、非接着条件下でＮＳＣの増殖を促進することが観察された(図７Ｂ)。図７に示されたデータは、６通りに行われた実験から得たものである。棒は±ＳＥＭを表す。対照よりも有意的に増加したレベルは、対データに対するｔ検定(paired Student t test)；*Ｐ＜0.05，**Ｐ＜0.01，***Ｐ＜0.005によって決定した。
【０２２３】
マキサディランは、非接着培養条件で成体マウスのＮＳＣ増殖を刺激する。
マキサディランは、ＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１のみに特異的に結合する[Moro and Lerner 1997]。培養中の神経幹細胞におけるマキサディラン及びsMaxの効果を調べるために、成体マウスの神経幹細胞を脳の側脳室壁から取り出し、ＥＧＦの中でニューロスフェアとして発達させた後、トリプシンを用いて酵素によって解離した。前記細胞は、非接着条件下で３日間、異なる濃度のマキサディランが加えられたニューロスフェア培地で培養した。マキサディラン処理された細胞の数が対照細胞よりも増加しているかどうかを調べるのに、細胞内ＡＴＰレベル測定法を用いた。図８は、細胞内のＡＴＰレベルが統計学的に有意量増加し、マキサディランの投与量に応じて、細胞数が増加することを示している。このデータは、ＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１を媒介とするマキサディランの効果により、ＮＳＣの増殖を促進することを示している。図８に示されたデータは、６通りに行われた実験から得たものである。棒は±ＳＥＭを表す。対照よりも有意的に増加したレベルは、対データに対するｔ検定(paired Student t test)；*Ｐ＜0.01，**Ｐ＜0.005によって決定した。
【０２２４】
ＰＡＣＡＰとＥＧＦは生体外で成体マウスのＮＳＣを相乗的に増殖する
ＮＳＣは、ＰＡＣＡＰ又はＥＧＦ又はその両方で処理した。２つの因子のどちらも単独で、細胞内のＡＴＰレベル、それゆえ、ＮＳＣの数を増加させた。一方、両方を用いると、２つの因子間で相乗効果を示す数値のさらなる上昇があった(図９)。示されたデータは、８通りに行われた実験から得たものである。棒は±ＳＥＭを表す。対照よりも有意的に増加したレベルは、対データに対するｔ検定(paired Student t test)；*Ｐ＜0.005によって決定した。
【０２２５】
ＰＡＣＡＰ及びＶＥＧＦは生体外で成体マウスのＮＳＣ数に追加効果を有する
ＬＶＷから、ＮＳＣを、前述の実施例２(方法Ａ)に記載したとおり調製した。但し、ＥＧＦは、省略されるか、又は、ＰＡＣＡＰ(100ｎＭ)、ＶＥＧＦ(１ｎＭ)若しくはＰＡＣＡＰ(100ｎＭ)＋ＶＥＧＦ(１ｎＭ)と置き換えられている。ＮＳＣを７日間培養した後、細胞をトリプシンで解離し、計数した。ＰＡＣＡＰで処理されたＮＳＣと比べて、ＶＥＧＦで処理したＮＳＣは、細胞数の大幅な増加が観察された。しかし、ＰＡＣＡＰをＶＥＧＦと共に用いると、細胞数にさらなる効果が観察され(図１０)、その数値は、これら２つの因子間の相加効果を示している。示されたデータは、４通りに行われた実験から得たものである。棒は±ＳＥＭを表す。ＰＡＣＡＰ＋ＶＥＧＦの有意差レベルは、対データに対するｔ検定(paired Student t test)；*Ｐ＜0.05により決定した。
【０２２６】
ＰＡＣＡＰで刺激された成体マウスのＮＳＣ増殖は、ＰＫＡによっては阻害されないが、ＰＬＣ及びＰＫＣ阻害剤によって阻害される
ＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１を通じてＰＡＣＡＰの効果によってトリガされる細胞内経路については、十分研究されている。ＰＡＣＡＰ刺激により、ＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１は、ＰＬＣ／ＰＫＣとＰＫＡカスケードの両方を引き出す(elicit)ことができる。ＰＡＣＡＰのＮＳＣ培養に対する増殖効果において、これらカスケードの相対的重要性を調べるために、ＰＬＣ(U73122)、ＰＫＣ(Go6976)及びＰＫＡ(H89)の阻害剤を、ＮＳＣ処理したＰＡＣＡＰに加えて、細胞内のＡＴＰを検定した。図１１に示されるように、ＰＡＣＡＰは、対照と比べて、細胞内のＡＴＰレベルを有意的に増加させ、その効果は、ＰＫＡ阻害剤の存在によっても変わらない。これに対し、ＰＬＣとＰＫＣの両阻害剤は、ＰＡＣＡＰの効果を完全に打ち消してしまう。このデータは、ＰＬＣ／ＰＫＣカスケードが、ＰＡＣＡＰの効果を媒介する上で重要な役割を果たしていることを示している。棒は±ＳＥＭを表す。対照との有意差レベルは、対データに対するｔ検定(paired Student t test)；**Ｐ＜0.01により決定した。ＰＡＣＡＰ処理との違いについての有意差レベルは、対データに対するｔ検定(paired Student t test)；**Ｐ＜0.01により決定した。
【０２２７】
ＰＡＣＡＰは成体マウス及び成人ヒトＮＳＣのＣＲＥＢリン酸化反応を刺激する
ＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１刺激を通じてＰＡＣＡＰの効果として、転写因子ＣＲＥＢのリン酸化をトリガすることはこれまでから知られている。非接着培養条件下で成長した成体マウス及び未分化のａＨＮＳＣが、ＰＡＣＡＰ処理の際、ＣＲＥＢのリン酸化を引き起こすかどうかを調べるために、ＰＡＣＡＰを、上記細胞に１５分間と２４０分間加えて、リン酸化形態のＣＲＥＢに特異的な抗体によるウェスタンブロッティング技術を用いて分析した。図１２Ａに示されるように、ＰＡＣＡＰへの曝露時間が１５分間で、成体マウスのＮＳＣにＣＲＥＢのリン酸化の亢進(up-regulated)が観察されたが、２４０分後に、ＣＲＥＢのリン酸化は、基本レベルに戻った。ＰＡＣＡＰに対するこの反応は、未分化のａＨＮＳＣ場合と本質的に同じであり、１５分後に、ＣＲＥＢのリン酸化の強力な初期亢進作用が認められたが、２４０分後には、リン酸化反応レベルが低下し、基本レベルより僅か超える程度になる(図１２Ｃ)。
【０２２８】
ＰＡＣＡＰは、ＭＥＫシグナル伝達系を通じてＡＰ−１転写を刺激する
ＰＡＣＡＰが、非接着培養条件下で生育した成体マウスＮＳＣにおける転写因子ＡＰ−１(ｃ−Ｆｏｓ及びｃ−Ｊｕｎから成る)の発現を促進するかどうか調べるために、ＡＰ−１ルシフェラーゼレポーターベクターで成体マウスＮＳＣをトランスフェクトし、ＰＡＣＡＰ(100nm)を加えた。図１３を参照すると、ＡＰ−１の発現は、ＰＡＣＡＰによって有意的に促進され、反応は、ＭＥＫ阻害剤、ＰＤ８９０５９(10μm)によって阻害されることを示している。ルシフェラーゼ活性は、反応促進のない細胞(対照)と比較した。示されたデータは、８通りに行われた実験から得たものである。棒は±ＳＥＭを表す。対照よりも有意的に増加したレベルは、対データに対するｔ検定(paired Student t test)；*Ｐ＜0.05によって決定した。
【実施例３】
【０２２９】
ＶＩＰは、成体マウスＮＳＣの増殖を生体内で刺激する
方法
実施例２を参照(方法Ａ及び方法Ｂ)
結果
培養中の神経幹細胞に対するＶＩＰの効果を調べるために、成体マウスの神経幹細胞を脳の側脳室壁から取り出し、ＥＧＦの中でニューロスフェアとして発達させた後、トリプシンを用いて酵素によって解離した。前記細胞は、非接着条件下で３日間、異なる濃度のＶＩＰが加えられたニューロスフェア培地で培養した。ＶＩＰ処理された細胞の数が対照細胞よりも増加しているかどうかを調べるのに、これまで細胞数との相関関係を調べるのに用いられていた細胞内ＡＴＰレベル測定方法[Crouch，Kozlowski et al．1993]が用いられた。図１４は、細胞内のＡＴＰレベルが統計学的に有意量増加し、ＶＩＰが１μＭ濃度のときの細胞数増加を示している。図示のデータは、６通りに行われた実験から得たものである。棒は±ＳＥＭを表す。対照よりも有意的に増加したレベルは、対データに対するｔ検定(paired Student t test)；*Ｐ＜0.005によって決定した。
【実施例４】
【０２３０】
ＰＡＣＡＰは、神経幹細胞の自己再生能及び多能性特性を保持しつつ、初代成体マウスのＮＳＣの増殖を刺激する。
方法
Ａ．ニューロスフェアの培養の計数及び写真撮影
側脳室の前側壁を、実施例２(方法Ａ)と同じ要領で解離し、細胞は、ＥＧＦを含有しないニューロスフェアで再懸濁された。細胞の懸濁液は２４ウエルプレートに分割され、対照(添加なし)、ＰＡＣＡＰ処理された細胞及びＥＧＦ(１nM)処理された細胞が３通りずつ含まれる。ＰＡＣＡＰの最終濃度は100nMであった。７日後、Nikon Eclipse TE300顕微鏡及びNikon Spot Insightカメラを使用して、ニューロスフェアを計数し、写真撮影した。
【０２３１】
Ｂ．自己再生能及び多能性アッセイ
側脳室の前側壁を、実施例２(方法Ａ)と同じ要領で解離し、細胞は、ＥＧＦを含有しないニューロスフェア培地で再懸濁された。細胞の懸濁液は２４ウエルプレートに３通りづつ分割され、ＰＡＣＡＰを最終濃度100nMになるまで加えた。７日後、マウス神経幹細胞は、実施例１(方法Ａ)と同じ要領で、単細胞に分割された。但し、ＥＧＦは含まれていない。細胞を単細胞として再びプレートに載せ、ＰＡＣＡＰを100nMになるまで加え、さらに７日間培養した。さらにもう一度、細胞を通過させ、ニューロスフェア培地に単細胞としてプレーティングした。ニューロスフェア培地は、ポリ−Ｄ−リジンプレートに１％ウシ胎仔血清[Gibco]及び100nMのＰＡＣＡＰ[Bachem]が加えられている。細胞は一晩培養され、その間、細胞は、ポリ−Ｄ−リジンプレートに接着され、培地は、100nMのＰＡＣＡＰ３８を含むがウシ胎仔血清は含まないニューロスフェア培地に変更した。細胞はさらに３日間培養され、その後、ＰＢＳ(Gibco)で２回洗浄し、室温で１５分間４％ホルムアルデヒド(Sigma)で固定され(fixed)、ＰＢＳの０.１％トリトンＸ−１００[Sigma]に室温で２０分間浸出させた(permeabilised)。固定及び浸出後、細胞は、マウスのモノクローナル抗β−IIIチューブリン(1:1000 Promega)、ウサギの抗ＧＦＡＰ(a:500 Sigma)及びマウスの抗ＣＮＰａｓａ(1:500 Sigma)でラベル付けされた。一次抗体は、抗マウスTexas-Red及び抗ウサギＦＩＴＣ(a:500 CVector Laborartories)で視覚化された。全ての抗体は、０.１％トリトンＸ−１００を含むＰＢＳで希釈された。
【０２３２】
結果
ＰＡＣＡＰは、一次(primary)成体マウスのＮＳＣの増殖、マニューロスフェア形成及び自己再生を促進する
マイトジェンが不存在のときに、ＰＡＣＡＰが単独で初代成体ＮＳＣの増殖を刺激するように作用するかどうかを調べるために、側脳室の前側壁を解離し、ＥＧＦを含まないか又はＰＡＣＡＰ(100nM)と置き換えられたニューロスフェア培地に再懸濁した。ＮＳＣを７日間培養し、その後、ＮＳＣの増殖と形態を検査した。図１５は、ＰＡＣＡＰで処理されたＮＳＣが増殖してニューロスフェアを形成し、そのサイズ(Ａ及びＢ)と数(Ｃ)は、対照のものより大きいことが観察される。ＰＡＣＡＰ処理されたニューロスフェアは、ＰＡＣＡＰが存在し、他のマイトジェンが無い場合、それらの自己再生能力を保持し、二次及び三次のニューロスフェアを産生したことを示している。複数回通過した(multiply-passaged)ＰＡＣＡＰで処理されたニューロスフェアは、ＥＧＰ処理されたニューロスフェアと比べて、関連のある差異を示さなかった。
【０２３３】
ＰＡＣＡＰ処理によって増殖した成体マウスのＮＳＣは、それらの多能性を保持する
ＰＡＣＡＰ処理されたＮＳＣが、脳の神経細胞、星状細胞及び乏突起膠細胞の３種類の細胞系統に分化する能力を保持するかどうかを調べるために、ニューロスフェアを分割し、予めポリ−Ｄ−リジンで被覆されたペトリ皿上で細胞を自然発生的に分化させた。図１６を参照すると、細胞は、神経細胞マーカーチューブリン(Ａ)、星状細胞マーカーＧＦＡＰ(Ｂ)及び乏突起膠細胞マーカーＣＮＰａｓｅ(Ｃ)に対して免疫反応性であり、ＣＮＳの全細胞を産生する能力を保持していることを示している。
【実施例５】
【０２３４】
ＰＡＣＡＰは、成体マウスＮＳＣに由来する細胞の生体内生存を促進する
方法
【０２３５】
Ａ．細胞培養
実施例２(方法Ａ)に記載の要領にて、生後５〜６週間のマウスの側脳室の前側壁から、成体マウスＮＳＣを培養した。
【０２３６】
Ｂ．細胞内ＡＴＰのアッセイ
細胞内のＡＴＰ量が細胞数と関連を有することは、これまで明らかにされている[Crouch, Kozlowski et al. 1993]。前述のとおり培養した継代２のマウスのニューロスフェアを、９６ウエルのプレートにＢ２７及び１％ウシ胎仔血清を加えたＤＭＥＭ／Ｆ１２に接種し、１晩培養した。前記プレートには、単細胞(30000細胞/ウエル)としてポリ−Ｄ−リジンがコートされている。その次の日、培地をニューロスフェア培地と取り替え、ＰＡＣＡＰを所定濃度まで加えた。培養３日後、スウェーデンのBioThemaのＡＴＰ−ＳＬキットを使用し、製造者のインストラクションに基づいて、細胞内のＡＴＰを測定した。
写真撮影のために、プレートが２４ウエルである点以外は上記と同じ密度であるプロトコルを使用した。７日後、Nikon Eclipse TE300顕微鏡及びNikon Spot Insightカメラを使用して、写真撮影した。
【０２３７】
Ｃ．チミジンの取込み
チミジンのＤＮＡへの取込みを調べるために、前述のとおり培養した継代２のマウスのニューロスフェアを、９６ウエルのプレートにＢ２７及び１％ウシ胎仔血清を加えたＤＭＥＭ／Ｆ１２に接種し、１晩培養した。前記プレートには、単細胞(30000細胞/ウエル)としてポリ−Ｄ−リジンがコートされている。その次の日、培地をニューロスフェア培地と取り替え、ＰＡＣＡＰを所定濃度まで加えて、さらに３日間培養した。３Ｈ−チミジン、10 uCi/mlが、最後の２４時間に現れた。細胞は、フィルター紙に集められ、放射能を測した。３Ｈ−チミジン(6,7 Ci/mmol)はPerkinElmerから入手した。
【０２３８】
Ｅ．ウェスタンブロット
成体マウスのＮＳＣとａＨＮＳＣを、実施例５(方法Ａ及びＢ)及び実施例２(方法Ａ)に夫々記載した要領で、調製し、培養した。培養物は、10nMＰＡＣＡＰに、所定時間、曝露した。処理後、細胞は、Patrone et al.[Patrone，Andersson et al．1999]に示されるように、溶出バッファーの中で溶解させた。ＤＮＡ成分は、細胞抽出物の２本鎖ＤＮＡ計量用ピコグリーンキットを用いて決定した。蛋白質測定は全て、ナノオレンジキットを用いて行なった。等量の蛋白質を、勾配ゲル４−１２％、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル(NuPage/Mopsバッファー)で処理し、ニトロセルロース膜に転写した。ウェスタンブロットを行ない、リン酸化ＣＲＥＢについては、ウサギの抗ホスホＣＲＥＢ(１：1000，Upstate biotechnology)、二次抗ウサギＨＲＰ抗体(１：10.000)を用いてラベル付けした。リン酸化ＣＲＥＢ蛋白質バンド(43kD)は、ＥＣＬキット[Amersham]を用いて検出された。
【０２３９】
結果
ＰＡＣＡＰは、成体マウスＮＳＣに由来する細胞の生存をin vitroで促進する
培養中の神経幹細胞の分化に対するＰＡＣＡＰの効果を調べるために、成体マウスの神経幹細胞を脳の側脳室壁から取り出し、ＥＧＦの中でニューロスフェアとして発達させた後、トリプシンを用いて酵素によって解離した。前記細胞は、接着条件下で３日間、異なる濃度のＰＡＣＡＰが加えられたニューロスフェア培地で培養した。ＰＡＣＡＰ処理された細胞の数が対照細胞よりも増加しているかどうかを調べるのに、これまで細胞数との相関関係を調べるのに用いられていた細胞内ＡＴＰレベル測定方法[Crouch，Kozlowski et al．1993]が用いられた。図１７Ａは、細胞内のＡＴＰレベルが統計学的に有意量増加し、ＰＡＣＡＰの投与量に応じて、細胞数が増加することを示している。ＰＡＣＡＰの効果が増殖によるものかどうかを調べるために、トリチウム化チミジンを用いて、ＮＳＣのＤＮＡ合成を評価した。ＰＡＣＡＰ処理したものと対照を比較すると、トリチウム化チミジンの取込みについて実質的な違いは観察されず、ＰＡＣＡＰは、分化するＮＳＣに生存反応(survival reaction)を引き出すことを示している(図１７Ｂ)。接着条件で成長したＮＳＣについて、ＰＡＣＡＰ処理しなかったＮＳＣと、100nMＰＡＣＡＰを用いて96時間処理したＮＳＣの位相コントラスト像を、夫々、図Ｃ及び図Ｄに示している。図１７Ａ及び１７Ｂに示されたデータは、６通りに行われた実験から得たものである。棒は±ＳＥＭを表す。対照よりも有意的に増加したレベルは、対データに対するｔ検定(paired Student t test)；*Ｐ＜0.05，**Ｐ＜0.005によって決定した。
【０２４０】
ＰＡＣＡＰは成体マウスＮＳＣの分化においてＣＲＥＢリン酸化反応を刺激する
ＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１刺激を通じてＰＡＣＡＰの効果として、転写因子ＣＲＥＢのリン酸化をトリガすることはこれまでから知られている。接着培養条件下で成長した成体マウス及び未分化のａＨＮＳＣが、ＰＡＣＡＰ処理の際、ＣＲＥＢのリン酸化を引き起こすかどうかを調べるために、ＰＡＣＡＰを、上記細胞に１５分間と２４０分間加えて、リン酸化形態のＣＲＥＢに特異的な抗体によるウェスタンブロッティング技術を用いて分析した。図１２Ａに示されるように、ＰＡＣＡＰへの曝露時間が１５分間で、成体マウスのＮＳＣに分化する際、ＣＲＥＢのリン酸化の亢進が観察されたが、２４０分後に、ＣＲＥＢのリン酸化は、基本レベルより僅か超える程度になった。
【実施例６】
【０２４１】
ＰＡＣＡＰは、成体マウスＮＳＣの生体外での増殖及びニューロン新生を促進する
方法
Ａ．浸透圧ポンプの埋込み及びＰＡＣＡＰ／ＢｒｄＵの注入
生後１０週間のオスのマウス(C57B1/2)に食料と水を自由に与え、１２時間毎に明暗サイクルを行ない、右側脳室に、Alzetポンプ(1007D)を使用してＰＡＣＡＰ３８[Backem]を注入した。投与量は31ng/日(600nMのＰＡＣＡポンプ濃度で0.5μl/hr.の割合で注入)で、３.５日間又は７日間投与した。ＤＮＡのＢｒｄＵ含有量の定量化によって増殖測定できるように、ブロモデオキシウリジン(ＢｒｄＵ)(50mg/ml)を、注入ビークル(infusion vehicle)(1mg/mlマウス血清アルブミン[Sigma]を含有する0.9％生理食塩水)の中へ含有させた。ＰＡＣＡＰ/ＢｒｄＵ、又はビークル/ＢｒｄＵのどちらかを３日間及び５日間注入したグループのマウスは、この時点で死亡した。ＰＡＣＡＰ/ＢｒｄＵ、又はビークル/ＢｒｄＵのどちらかを７日間注入したグループは、さらに１０日間生存することができた。割り当てられた時間の経過後死亡したマウスについて、ＰＢＳで潅流し、脳を取り除き、免疫組織化学分析を行なうための切除前に、−７０℃で冷凍した。
【０２４２】
Ｂ．免疫組織化学
クリオスタットマイクロトームを使用し、脳を１４μｍの冠状断面に切断した。切断部は、予め処理したスライド上で解凍し、４％(wt/vol)パラホルムアルデヒド/ＰＢＳの中で１０分間固定させた。細胞核への抗ＢｒｄＵ抗体の接近可能性(accessibility)を向上させるために、ＰＢＳで洗浄後、切断部を３７℃で３０分間２Ｍ ＨＣｌで処理した。切断部をＰＢＳで洗浄し、ブロッキング溶液(blocking solution)(ＰＢＳ；0.1％Tween；10％ヤギ血清)に移し、４℃で一晩保持した。一次抗体(ラット抗ＢｒｄＵ、Harlan Sera Labs)を、1：100でブロッキング溶液の中で、室温で９０分間保持した。ＰＢＳ／0.1％Tweenの中で３回×３０分間洗浄した後、ビオチニル化二次抗体(ヤギ抗ラット、VectorLabs)を1：200に希釈してブロッキング溶液に加え、室温で６０分間保持した。Vectastain Kit[VectorLabs]の製造者のインストラクションにより、前記Kitで処理する前に、切断部を２時間洗浄した。１時間洗浄した後、ＢｒｄＵ抗体複合体は、0.01％Ｈ2Ｏ2含有0.05％ジアミノベンジジンを使用して検出され、ヘマトキシリンで対比染色を行なった。切断部を、一連の段階的なエタノール濃度で洗浄し、その後、キシレン及び99％エタノールで洗浄し、Pertexに搭載した。切断部を、Nikon Eclipse E600顕微鏡を使用して視覚化し、Nikon Insight CCDカメラを使用して写真撮影した。
【０２４３】
ＮｅｕＮでＢｒｄＵを二重標識するための処理を連続して行なった。簡単に説明すると、４％(wt/vol)パラホルムアルデヒド/ＰＢＳに１０分間固定した後、切断部を４℃のブロッキング溶液(ＰＢＳ；０.１％Tween；１０％ウマ血清)の中で一晩培養した。抗ＮｅｕＮ(マウス、Chemicon)を１：100でブロッキング溶液の中で培養した。ＰＢＳ/0.1％Tweenで３回×３０分間洗浄した後、ＦＩＴＣ共役結合された二次抗体(ウマ抗マウス、Vector Laboratories, CA)を１：200で希釈して、室温の適当なブロッキング溶液の中で６０分間保持した。切断部は、２時間洗浄した後、４％(wt/vol)パラホルムアルデヒド／ＰＢＳで１０分間洗浄し、細胞核への抗ＢｒｄＵ抗体の接近可能性を高めるために、３７℃で３０分間２Ｍ ＨＣｌで処理した。切断部をＰＢＳで洗浄し、ブロッキング溶液(blocking solution)(ＰＢＳ；0.1％Tween；10％ヤギ血清)に移し、４℃で一晩保持した。一次抗体(ラット抗ＢｒｄＵ、Harlan Sera Labs)を、1：100でブロッキング溶液の中で、室温で９０分間保持した。ＰＢＳ／0.1％Tweenの中で３回×３０分間洗浄した後、Texas Red共役抗体(ヤギ抗ラット、VectorLabs)を1：200に希釈してブロッキング溶液に加え、室温で６０分間保持した。切断部を２時間洗浄した後、ガラススライドの上に載せた。切断部を、Nikon Eclipse E600顕微鏡を使用して視覚化し、Nikon Insight CCDカメラを使用して写真撮影した。
【０２４４】
Ｃ．定量化と統計分析
全てのＢｒｄＵを標識化する実験では、動物毎に３〜６切断部を分析した。海馬に関しては、切断部を、背側海馬の前部、中部及び後部に分割された断面を、顆粒細胞層(上歯側(superior blade)及び下歯側(inferior blade))全体を包含する領域で分析した。なお、前記顆粒層は、最大２細胞分の幅から門部領域(hilus region)に拡大するものとして規定された内顆粒領域(sub-granular zone)を含んでいる。解剖学的ランドマークに基づいて、対照と実験動物から同等部分が選択され、著者の１人によってコード化され、研究の間中、検査員に秘密にされていた。歯状顆粒細胞層の領域毎のＢｒｄＵラベル細胞の数は、手操作で計数された。側脳室壁に関しては、切断部は、脳梁属の後方と、前交連の終結部の前方に集められた。それらは、マウスの脳のアトラスの冠状プレート２２〜２９番に相当する[Paxinos, G & Franklin, KBJ. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, second Edition]。上記の如く、対照と実験動物の同等部分が選択され、著者の１人によってコード化され、研究の間中、検査員には秘密にされていた。ＢｒｄＵ陽性細胞は、側脳室壁の２×２５０ミクロン片に沿って計数された(図１８参照)。歯状顆粒細胞層と、側脳室層の「計数された」領域(上衣細胞層及び副脳室領域を含む)の両方に関する領域測定は、細胞の計数に使用された各スライドから行われた。実験グループの平均値を対照グループの平均値と比較した。歯状脳回のＢｒｄＵ計数の結果は、それぞれ個々の動物についての面積(ｍｍ2)毎のＢｒｄＵ陽性細胞の平均数として表し、平均±ＳＥＭとして報告された。側脳室壁断面の分析によって作製されたデータは、２つの独立した実験から得たものである。面積(ｍｍ2)毎のＢｒｄＵ陽性細胞の数は、対照グループの平均±ＳＥＭとして表した。平均値間の差異は、Student's t testによって決定した。
【０２４５】
ＢｒｄＵ／ＮｅｕＮの同時標識化(co-labelling)実験の全てに関して、動物毎に１〜２断面を分析した。海馬に関しては、切断部を、最大２細胞分の幅から門部領域に拡大するものとして規定された内顆粒領域を含む顆粒細胞層(上歯側及び下歯側)全体を包含する領域で分析した。解剖学的ランドマークに基づいて、対照と実験動物から同等部分が選択され、著者の１人によってコード化され、研究の間中、検査員に秘密にされていた。歯状顆粒細胞層の領域毎のＢｒｄＵ/ＮｅｕＮラベル細胞の数は、手操作で計数された。歯状顆粒細胞層の領域測定は、細胞の計数に使用された各スライドから行われた。実験グループの平均値を対照グループの平均値と比較した。歯状脳回のＢｒｄＵ/ＮｅｕＮの計数の結果は、それぞれ個々の動物について歯状回毎のＢｒｄＵ/ＮｅｕＮ陽性細胞の平均数として表し、平均±ＳＥＭとして報告された。
【０２４６】
結果
ＰＡＣＡＰは、生体外で、成体マウスの副脳室領域のＮＳＣ増殖を刺激する
ＰＡＣＡ(ポンプ濃度600nM)又はビークル(vehicle)と、ＢｒｄＵ(ポンプ濃度50mg/ml)とを、０.５μl/hr.の割合で３.５日間、オスの成体マウスの側脳室へ注入した。分裂細胞の核へＢｒｄＵを導入することは、細胞の増殖集団を標識する標準的方法であり、分裂幹細胞及びそれらの子孫用として広く用いられるマーカーとなる[Zhang, Zhang et al. 2001]。増殖細胞の核へ導入されたＢｒｄＵは、ＤＡＢ−免疫組織化学によって検出され、全ての核はヘマトキシリンで対比染色される。側脳室の冠状断面でＢｒｄＵ標識される細胞の数は、ＰＡＣＡＰ処理したマウス(図１８Ｂ)の方が、ビークルで処理されたマウス(図１８Ａ)よりも、実質的に多いことが示される。データは、２つの独立した実験の代表的な領域である。定量化のために(図１８Ｃ)、各動物について３〜６の切断面を採取し、囲まれた領域内を目視で計数した。ＢｒｄＵの免疫反応細胞を計数し、ＢｒｄＵ免疫陽性ビークルで処理された動物(ｎ＝１１)(ビークルに関して*ｐ＜０.０５)の平均百分率±ＳＥＭとして(ｎ＝１０)と表した。ＣＣは脳梁、ＬＶは側脳室、Ｓｔｒは線条体である。定量的データを参照すると、ＰＡＣＡＰ処理したものは、ビークルと比べて、側脳室壁の副脳室領域の増殖が有意的に増大することを示している。
【０２４７】
ＰＡＣＡＰは、生体内で、成体マウスの海馬ＮＳＣ／神経前駆体細胞の増殖を刺激する
ＰＡＣＡ(ポンプ濃度600nM)又はビークルと、ＢｒｄＵ(ポンプ濃度50mg/ml)とを、０.５μl/hr.の割合で３.５日間、オスの成体マウスの側脳室へ注入した。分裂細胞の核へＢｒｄＵを導入することは、細胞の増殖集団を標識する標準的方法であり、分裂幹細胞及びそれらの子孫用として広く用いられるマーカーとなる[Zhang, Zhang et al. 2001]。増殖細胞の核へ導入されたＢｒｄＵは、ＤＡＢ−免疫組織化学によって検出され、全ての核はヘマトキシリンで対比染色される。同側の歯状回の冠状断面でＢｒｄＵ標識される細胞の数は、ＰＡＣＡＰ処理したマウス(図１９Ｂ)の方が、ビークルで処理されたマウス(図１９Ａ)よりも、実質的に多いことが示される。データは、２つの独立した実験の代表的な領域である。定量化のために(図１９Ｃ)、各動物について３個の切断面を採取し、顆粒細胞層(上歯側及び下歯側)の全体を包含する領域の同側(ipsilateral)と対側(contralateral)を目視にて計数した。なお、前記細胞層は、最大２細胞分の幅から門部領域に拡大するものとして規定された内顆粒領域を含んでいる。結果は、１ｍｍ2当たりのＢｒｄＵ免疫陽性細胞数(ＰＡＣＡＰ ｎ＝７)(ビークルｎ＝８)(ビークルに関して*ｐ＜０.００５)の平均百分率±ＳＥＭとして(ｎ＝１０)と表されている。定量的データを参照すると、ＰＡＣＡＰ処理したものは、ビークルと比べて、同側の歯状回の増殖が有意的に増大することを示している。
【０２４８】
ＰＡＣＡＰは、生体内で、生体マウスの海馬神経発生を刺激する
ＰＡＣＡ(ポンプ濃度600nM)又はビークルと、ＢｒｄＵ(ポンプ濃度50mg/ml)とを、０.５μl/hr.の割合で７日間、オスの成体マウスの側脳室へ注入した。これにより、マウスは、さらに１０日間生存することができた。分裂細胞の核へ導入されたＢｒｄＵとＮｅｕＮ染色剤は、蛍光免疫組織化学によって検出され、BioRad Radiance Confocal顕微鏡を用いて視覚化された。ニューロンの１２焦点面において、二重標識された細胞が確認された。定量化のために(図２０)、各動物について切断面を採取し、顆粒細胞層(上歯側及び下歯側)の全体を包含する領域の同側を目視にて計数した。なお、前記細胞層は、最大２細胞分の幅から門部領域に拡大するものとして規定された内顆粒領域を含んでいる。結果は、歯状回(ＰＡＣＡＰ ｎ＝６)(ビークルｎ＝８)に対して、ＢｒｄＵ／ＮｅｕＮ陽性細胞の平均±ＳＥＭとして(ｎ＝１０)と表されている。定量的データを参照すると、ＰＡＣＡＰ処理したものは、ビークルと比べて、同側の歯状回において神経発生の有意的な増加が示されている。
【実施例７】
【０２４９】
バイオポリマーの配列
本明細書の中で引用したＤＮＡと蛋白質の配列は、次の通りである。
【表４】
2005538942.tif 000006
【０２５０】
【表５】
2005538942.tif 000007
【０２５１】
【表６】
2005538942.tif 000008
【０２５２】
ＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１(ヒト)のスプライシング変異
Pantaloni, C., Brabet, P., Bilanges, B., Dumuis, A., Houssami, S., Spengler, D., Bockaert, J. and Journot, L.
下垂体アデニル酸シクラーゼ活性ポリペプチド(ＰＡＣＡＰ)レセプターのＮ末端細胞外領域の可変スプライシングは、ホスホリパーゼＣ活性におけるＰＡＣＡＰ−２７及びＰＡＣＡＰ−３８のレセプター選択性及び相対親和性強度(relative potencies)を調節する。
J. Biol. Chem. 271 (36), 22146-22151 (1996)
MEDLINE 96355616
PUBMED 8703026
【０２５３】
Pisegna, J. R. and Wank, S. A.
ヒトの下垂体アデニル酸シクラーゼ活性ポリペプチドレセプターの４つのスプライス変異について、クローニング化とシグナル伝達の特徴付け。アデニル酸シクラーゼ及びホスホリパーゼＣに対する二重結合の証拠。
J. Biol. Chem. 271 (29), 17267-17274 (1996)
MEDLINE 96291878
PUBMED 8663363
【０２５４】
【表７】
2005538942.tif 000009
【０２５５】
【表８】
2005538942.tif 000010
【０２５６】
【表９】
2005538942.tif 000011
【０２５７】
【表１０】
2005538942.tif 000012
【０２５８】
【表１１】
2005538942.tif 000013
【０２５９】
【表１２】
2005538942.tif 000014
【０２６０】
【表１３】
2005538942.tif 000015
【０２６１】
＜参考文献＞
・Altman, J. and G. Das (1965). "Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats." J Comp Neurol 124: 319-335.
・Altman, J. and G. Das (1967). "Postnatal neurogenesis in the guinea-pig." Nature 214: 1098-1101.
・Arimura, A. (1998). "Perspectives on pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) in the neuroendocrine, endocrine, and nervous systems." Jpn J Physiol 48(5): 301-31.
【０２６２】
・Biebl, M., C. M. Cooper, et al. (2000). "Analysis of neurogenesis and programmed cell death reveals a self-renewing capacity in the adult rat brain." Neurosci Lett 291(1): 17-20.
・Bjorklund, A. and O. Lindvall (2000). "Cell replacement therapies for central nervous system disorders." Nat Neurosci 3(6): 537-44.
【０２６３】
・Craig, C. G., V. Tropepe, et al. (1996). "In vivo growth factor expansion of endogenous subependyimal neural precursor cell populations in the adult mouse brain." J Neurosci 16(8): 2649-58.
・Crouch, S. P., R. Kozlowski, et al. (1993). "The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity." J Immunol Methods 160(1): 81-8.
【０２６４】
・Doetsch, F., I. Caille, et al. (1999). "Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain." Cell 97(6): 703-16.
【０２６５】
・Feany, M. B. and W. G. Quinn (1995). "A neuropeptide gene defined by the Drosophila memory mutant amnesiac." Science 268(5212): 869-73.
【０２６６】
・Gage, F. H., G. Kempermann, et al. (1998). "Multipotent progenitor cells in the adult dentate gyrus." J Neurobiol 36(2): 249-66.
・Ghatei, M. A., K. Takahashi, et al. (1993). "Distribution, molecular characterization of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide and its precursor encoding messenger RNA in human and rat tissues." J Endocrinol 136(1): 159-66.  ・Gottschall, P. E., I. Tatsuno, et al. (1994). "Regulation of interleukin-6 (IL-6) secretion in primary cultured rat astrocytes: synergism of interleukin-1 (IL-1) and pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP)." Brain Res 637(1-2): 197-203.
・Gressens, P. (1999). "VIP neuroprotection against excitotoxic lesions of the developing mouse brain." Ann NY Acad Sci 897: 109-24.
・Gressens, P., B. Paindaveine, et al. (1997). "Growth factor properties of VIP during early brain development. Whole embryo culture and in vivo studies." Ann NY Acad Sci 814: 152-60.
【０２６７】
・Hansel, D. E., B. A. Eipper, et al. (2001). "Regulation of olfactory neurogenesis by amidated neuropeptides." J Neurosci Res 66(1): 1-7.
・Hansel, D. E., V. May, et al. (2001). "Pituitary adenylyl cyclase-activating peptides and alpha-amidation in olfactory neurogenesis and neuronal survival in vitro." J Neurosci 21(13): 4625-36.
・Hashimoto, H., T. Ishihara, et al. (1993). "Molecular cloning and tissue distribution of a receptor for pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide." Neuron 11(2): 333-42.
・Hashimoto, H., H. Nogi, et al. (1996). "Distribution of the mRNA for a pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide receptor in the rat brain: an in situ hybridization study." J Comp Neurol 371(4): 567-77.
・Herman, J. P. and N. D. Abrous (1994). "Dopaminergic neural grafts after fifteen years: results and perspectives." Prog Neurobiol 44(1): 1-35.
【０２６８】
・Jacobson, M. (1991). Histosenesis and morphogenesis of cortical structures. Developmental Neurobiology, Plenum Press, New York: 401-451.
・Jaworski, D. M. and M. D. Proctor (2000). "Developmental regulation of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide and PAC(1) receptor mRNA expression in the rat central nervous system." Brain Res Dev Brain Res 120(1): 27-39.
・Johansson, C. B., S. Momma, et al. (1 999). "Identification of a neural stem cell in the adult mammalian central nervous system." Cell 96(1): 25-34.
・Johansson, C. B., M. Svensson, et al. (1999). "Neural stem cells in the adult human brain." Exp Cell Res 253(2): 733-6.
・Johe, K. K., T. G. Hazel, et al. (1996). "Single factors direct the differentiation of stem cells from the fetal and adult central nervous system." Genes Dev 10(24): 3129-40.
【０２６９】
・Kuhn, H. G. and C. N. Svendsen (1999). "Origins, functions, and potential of adult neural stem cells." Bioessays 21(8): 625-30.
・Kuhn, H. G., J. Winkler, et al. (1997). "Epidermal growth factor and fibroblast growth factor-2 have different effects on neural progenitors in the adult rat brain." J Neurosci 17(15): 5820-9.
【０２７０】
・Lerner, E. A., J. M. Ribeiro, et al. (1991). "Isolation of maxadilan, a potent vasodilatory peptide from the salivary glands of the sand fly Lutzomyia longipalpis." J Biol Chem 266(17): 11234-6.
・Lois, C. and A. Alvarez-Buylla (1993). "Proliferating subventricular zone cells in the adult mammalian forebrain can differentiate into neurons and glia." Proc Natl Acad Sci USA 90(5): 2074-7.
【０２７１】
・Magavi, S. S., B. R. Leavitt, et al. (2000). "Induction of neurogenesis in the neocortex of adult mice [see comments]." Nature 405(6789): 951-5.
・Masuo, Y., N. Suzuki, et al. (1993). "Regional distribution of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) in the rat central nervous system as determined by sandwich-enzyme immunoassay." Brain Res 602(1): 57-63.
・McKay, R. (1997). "Stem cells in the central nervous system." Science 276(5309): 66-71.
・Momma, S., C. B. Johansson, et al. (2000). "Get to know your stem cells." Curr Opin Neurobiol 10(1): 45-9.
・Moore, M. S., J. DeZazzo, et al. (1998). "Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway." Cell 93(6): 997-1007.
・Morio, H., I. Tatsuno, et al. (1996). "Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide protects rat-cultured cortical neurons from glutamate-induced cytotoxicity." Brain Res 741(1-2): 82-8.
・Moro, O. and E. A. Lerner (1997). "Maxadilan, the vasodilator from sand flies, is a specific pituitary adenylate cyclase activating peptide type I receptor agonist." J Biol Chem 272(2): 966-70.
・Moser, A., J. Scholz, et al. (1999). "Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP-27) enhances tyrosine hydroxylase activity in the nucleus accumbens of the rat." Neuropeptides 33(6): 492-7.
【０２７２】
・Nakagawa, S., J.-E. Kim, et al. (2002). "Regulation of neurogenesis in adult mouse hippocampus by cAMP and the cAMP response element-binding protein." J Neurosci 22(9): 3673-3682.
【０２７３】
・Palmer, T. D., E. A. Markakis, et al. (1999). "Fibroblast growth factor-2 activates a latent neurogenic program in neural stem cells from diverse regions of the adult CNS." J Neurosci 19(19): 8487-97.
・Patrone, C., S. Andersson, et al. (1999). "Estrogen receptor-dependent regulation of sensory neuron survival in developing dorsal root ganglion." Proc Natl Acad Sci USA 96(19): 10905-10.
・Pencea, V., K. D. Bingaman, et al. (2001). "Infusion of Brain-Derived Neurotrophic Factor into the Lateral Ventricle of the Adult Rat Leads to New Neurons in the Parenchyma of the Striatum, Septum, Thalamus, and Hypothalamus." J Neurosci 21(17): 6706-17.
・Piggins, H. D., J. A. Stamp, et al. (1996). "Distribution of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) immunoreactivity in the hypothalamus and extended amygdala of the rat." J Comp Neurol 376(2): 278-94.
【０２７４】
・Rajan, P. and R. D. McKay (1998). "Multiple routes to astrocytic differentiation in the CNS." J Neurosci 18(10): 3620-9.
【０２７５】
・Snyder, E. Y., C. Yoon, et al. (1997). "Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex." Proc Natl Acad Sci USA 94(21): 11663-8.
【０２７６】
・Takel, N., Y. Skoglosa, et al. (1998). "Neurotrophic and neuroprotective effects of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) on mesencephalic dopaminergic neurons." J Neurosci Res 54(5): 698-706.
・Tyrrell, S. and S. C. Landis (1994). "The appearance of NPY and VIP in sympathetic neuroblasts and subsequent alterations in their expression." J Neurosci 14(7): 4529-47.
【０２７７】
・Usdin, T. B., T. I. Bonner, et al. (1994). "Two receptors for vasoactive intestinal polypeptide with similar specificity and complementary distributions." Endocrinology 135(6): 2662-80.
【０２７８】
・Vaudry, D., B. J. Gonzalez, et al. (2000). "Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide and its receptors: from structure to functions." Pharmacol Rev 52(2): 269-324.
・Vaudry, D., P. J. Stork, et al. (2002). "Signaling pathways for PC12 cell differentiation: making the right connections." Science 296(5573): 1648-9.
・Villalba, M., J. Bockaert, et al. (1997). "Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP-38) protects cerebellar granule neurons from apoptosis by activating the mitogen-activated protein kinase (MAP kinase) pathway." J Neurosci 17(1): 83-90.
【０２７９】
・Williams, B. P., J. K. Park, et al. (1997). "A PDGF-regulated immediate early gene response initiates neuronal differentiation in ventricular zone progenitor cells." Neuron 18(4): 553-62.
【０２８０】
・Zhang, R. L., Z. G. Zhang, et al. (2001). "Proliferation and differentiation of progenitor cells in the cortex and the subventricular zone in the adult rat after focal cerebral ischemia." Neuroscience 105(1): 33-41.
・Zhong, Y. (1995). "Mediation of PACAP-like neuropeptide transmission by coactivation of Ras/Raf and cAMP signal transduction pathways in Drosophila." Nature 375(6532): 588-92.
【図面の簡単な説明】
【０２８１】
【図１】全てが既知のマウスadcyaplrlアイソフォームに特異的なプローブを用いて、成体マウスの脳の冠状及び矢状断面におけるadcyaplrl mＲＮＡ陽性細胞を明視野観察及び暗視野観察した顕微鏡写真である。
【図２】全てが既知の遺伝子アイソフォームに特異性のプローブ、及び成体マウスの脳の冠状及び矢状断面のhop1/2アイソフォーム及びショートアイソフォームに特異的なプローブを用いて、adcyaplrl mＲＮＡの発現を観察した低倍率顕微鏡写真である。
【図３】ヒトの側脳室壁の副脳室領域及びヒトの海馬歯状回におけるadcyaplrl mＲＮＡ陽性細胞の高倍率顕微鏡写真である。
【図４】adcyaplrl遺伝子が、成体マウスの培養された神経幹細胞の中に発現されることを示している。
【図５】adcyaplrl遺伝子のショートアイソフォーム及びhop1/2アイソフォームが、成体マウスの培養された神経幹細胞の中に発現されることを示している。
【図６】adcyaplrl遺伝子が、成体マウスの培養された神経幹細胞の中に発現されることを示している。
【図７】ＰＡＣＡＰは、非接着培養条件下で成体マウスのＮＳＣ増殖を活性化することを示している。
【図８】マキサディランは、非接着培養条件下で成体マウスのＮＳＣ増殖を活性化することを示している。
【図９】ＰＡＣＡＰとＥＧＦは、生体外で、成体マウスのＮＳＣを相乗的に増殖させることを示している。
【図１０】ＰＡＣＡＰとＶＥＧＦは、生体外で、成体マウスのＮＳＣの数に相加的効果を有することを示している。
【図１１】成体マウスのＮＳＣ増殖におけるＰＡＣＡＰの刺激作用は、ＰＫＡ阻害物質ではなく、ＰＬＣ及びＰＫＣ阻害物質によって阻害されることを示している。
【図１２】ＰＡＣＡＰは、成体マウス及び成人ヒトのＮＳＣにおいてＣＲＥＢリン酸化反応を刺激することを示している。
【図１３】ＰＡＣＡＰは、ＭＥＫシグナル伝達経路を通じて、ＡＰ−１転写を刺激することを示している。
【図１４】ＶＩＰは、生体外で成体マウスのＮＳＣ増殖を刺激することを示している。
【図１５】ＰＡＣＡＰは、生体外で初代(primary)成体マウスのＮＳＣ増殖及びニューロスフェア形成を刺激することを示している。
【図１６】ＰＡＣＡＰ治療後に増殖する成体マウスのＮＳＣは、多能性を維持して、ニューロン(β−III チュブリン(Ａ))、星状細胞(ＧＦＡＰ(Ｂ))、乏突起膠細胞(ＣＮＰase(Ｃ))を形成する。
【図１７】ＰＡＣＡＰは、生体外で、成体マウスのＮＳＣに由来する細胞の生存を促進することを示している。
【図１８】ＰＡＣＡＰは、生体内で、成体マウスの副脳室領域のＮＳＣの増殖を刺激することを示している。
【図１９】ＰＡＣＡＰは、生体内で、成体マウスの海馬ＮＳＣ／神経前駆細胞の増殖を刺激することを示している。
【図２０】ＰＡＣＡＰは、生体内で、成体マウスの海馬神経発生を刺激することを示している。
【図１】
2005538942.tif 000016
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2005538942.tif 000022
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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