(57)【要約】核酸をポリカチオン性ポリマーと接触させることによる核酸の安定化法が記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸をポリカチオン性ポリマーと接触させることを特徴とする、核酸の安定化法。
【請求項２】
該核酸が、ヌクレオシド残基間にジホスフェート基を含むデオキシリボ核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
核酸の安定化のためのポリカチオン性ポリマーの使用。
【請求項４】
ヌクレオシド残基間にホスホジエステル基を含むデオキシリボ核酸を安定化させるためのものである、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
該核酸が、水性の溶液または懸濁液中で安定化される、請求項３または４に記載の使用。
【請求項６】
該ポリカチオン性ポリマーが、８アミノ酸残基を超える範囲に２０％を超える、とりわけ５０％を超える塩基性アミノ酸を含むポリカチオン性ペプチド、好ましくはポリペプチドである、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
個体に投与した核酸のインビボでの半減期が長くなる、請求項３ないし６のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の安定化法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸は、特定の医学分野で有望な医薬であることが示されている。核酸を製剤として使用するとりわけ興味深い分野は、とりわけ特定の（組換え）抗原を用いたワクチン接種、アンチセンス治療および遺伝子療法治療における、特定のポリヌクレオチドの一般的な免疫刺激作用を用いた裸のＤＮＡまたはＲＮＡによるワクチン接種である。
【０００３】
裸の核酸によるワクチン接種は、新たな世代のワクチンの開発における最も有望な進捗の一つとなりつつある。多くの進捗および特定の戦略がそのようなワクチン接種のために提唱されワクチン接種技術の有用な手段となりつつある。
【０００４】
一般的な免疫刺激剤としての核酸の使用もまた、学術的な探求から医学的な実践へと発展している。免疫系は、おそらく病原体と宿主細胞とのＤＮＡの構造上および配列使用の相違により細菌を含む下等生物を認識する。とりわけ、非脊椎動物に由来するＤＮＡの短いストレッチ、あるいはある種の塩基の前後関係での非メチル化シトシン−グアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）を含む短いオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の形態のものが標的にされる。ＣｐＧモチーフは細菌ＤＮＡでは予想された頻度で見出されるが、脊椎動物ＤＮＡでは遥かに低い頻度でしか見出されない。さらに、非脊椎動物のＣｐＧモチーフはメチル化されていないのに対して脊椎動物のＣｐＧ配列はメチル化されている。この細菌ＤＮＡと脊椎動物ＤＮＡとの相違は、脊椎動物が非脊椎動物ＤＮＡを危険なシグナルとして認識するのを可能にする。さらに、先天免疫系の細胞はウイルスの二本鎖ＲＮＡを危険なシグナルとして認識する。
【０００５】
アンチセンスおよび／または遺伝子療法治療もまた、核酸の医学的応用が中心的役割を演じるトピックである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、これら全ての応用分野で充分な医薬有効性を達成するには、予防または治療のために適用すべき核酸がとりわけインビボにおいてある種の安定性を有していなければならない。
【０００７】
核酸の有効性を高めてとりわけ個体に適用したときのインビボでの半減期を長くするため、幾つかの試みが従来技術においてなされている。たとえば、核酸のワクチン接種では、精巧かつ複雑なパッケージング系、たとえばミクロスフェア、リポソーム、ビロソーム（virosome）、エマルジョン、ミセルなどが核酸のために提唱されている。そのようなパッケージング系は、核酸、とりわけＤＮＡを有効かつ直接的に安定化させるためではなく、核酸を細胞に送達する点に主として真価を発揮する。一方、核酸の修飾、とりわけリン酸骨格における修飾が、そのような分子の半減期を長くするのに有効であることが報告されている（たとえば、米国特許第５,６６３,１５３号および同第５,７２３,３３５号を参照）。しかしながら、少なくとも一つのホスホロチオエート結合を有するそのような分子は天然には存在しない物質であり、とりわけヒトに投与したときに、長期にわたって投与した場合には潜在的な分解産物およびそのような物質の蓄積の両面に関して危険である。さらに、そのような修飾した核酸のヒトにおける効力および安全性は未だ確立されていない。
【０００８】
それゆえ本発明の目的は、医薬として適用する場合の核酸、とりわけＤＮＡの安定化、とりわけインビボでの安定化の方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この目的は、核酸をポリカチオン性ポリマーと接触させることを特徴とする核酸の安定化法によって解決される。本発明による好ましいポリカチオン性ポリマーは、ポリカチオン性ペプチド、とりわけポリアルギニン、ポリリジンおよび同様の化合物である。
【００１０】
驚くべきことに、本発明により、ポリカチオン性ポリマー、好ましくはポリカチオン性ペプチド、とりわけポリアルギニンなどのポリアミノ酸が、核酸、とりわけ天然のホスホジエステル結合を有する核酸に対して防御および安定化作用を有することが示された。それゆえ、本発明は、とりわけリン酸骨格に人為的な修飾を欠く核酸に適している。それゆえ、本発明の好ましい態様は、ヌクレオシド残基間にジホスフェート基を含む（すなわち、ホスホロチオエート結合を欠く）デオキシリボ核酸を安定化する方法に向けられている。
【００１１】
修飾した核酸も本発明に従って用いることができるが、本発明の有効性は骨格を修飾していない核酸、とりわけ修飾していないＤＮＡおよびＲＮＡで核酸を医学に適用したときにとりわけ顕著である。
【００１２】
他の側面によれば、本発明はまた核酸を安定化するためのポリカチオン性ポリマー、好ましくはポリカチオン性ペプチド、とりわけポリアルギニンなどの使用に関する。上記のように、本発明による使用は、ヌクレオシド残基、とりわけデオキシリボ核酸間にホスホジエステル基を含む核酸を安定化するのに特に適している。
【００１３】
驚くべきことに、核酸（たとえば、ＯＤＮ）の化学の方が配列（たとえば、ＣｐＧモチーフ）よりも有意に一層重要であることが見出された。それゆえ、従来法ではホスホロチオエート修飾した分子の方がより有効であるのに対し、本発明ではホスホロチオエート修飾した分子よりも天然の形態の核酸で比活性が良好な結果となる。
【００１４】
本発明は、安定化が水性の溶液または懸濁液で、好ましくはとりわけ、たとえば、遺伝子療法やアンチセンス薬におけるようなワクチンにおいて個体に適用すべき（「使用の用意のできた」）溶液または懸濁液で起こるならば、特に適している。
【００１５】
水性の溶液または懸濁液は、緩衝物質、医薬賦形剤および担体、さらなる安定化剤、さらなる医薬など、とりわけ核酸とポリカチオン性ポリマーとの混合物とともに使用するのに当該技術分野で知られた補助物質をさらに含んでいてよい。
【００１６】
本発明によるポリカチオン性ポリマー、好ましくはポリカチオン性ペプチドの使用は、個体に投与した核酸のインビボ半減期を、特定の投与とは無関係に、すなわち核酸をたとえば「裸の」ＤＮＡワクチンとして、一般的な免疫刺激剤として、アンチセンス薬としてまたは遺伝子療法薬として投与するかに関わりなく、長くすることができることが本発明により示された。このことは、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡなど）に基づくそのような医薬の長期にわたる有効性を可能にするものである。
【００１７】
本発明に従って用いるポリカチオン性化合物は、たとえば、ＷＯ９７／３０７２１による特徴的な作用を示すあらゆるポリカチオン性化合物であってよい。好ましいポリカチオン性化合物は、塩基性ポリペプチド、有機ポリカチオン、塩基性ポリアミノ酸、またはその混合物から選ばれる。これらポリアミノ酸は、少なくとも４アミノ酸残基の鎖長を有していなければならない。特に好ましいのは、ポリリジン、ポリアルギニン、および８を超える、とりわけ２０を超えるアミノ酸残基の範囲に２０％を超える、とりわけ５０％を超える塩基性アミノ酸を含むポリペプチドまたはその混合物のようなペプチド結合を含む物質である。他の好ましいポリカチオンおよびその医薬組成物は、ＷＯ９７／３０７２１（たとえば、ポリエチレンイミン）およびＷＯ９９／３８５２８に記載されている。好ましくは、これらポリペプチドは２０〜５００アミノ酸残基、とりわけ３０〜２００残基を含む。
【００１８】
これらポリカチオン性化合物は化学的にまたは組換えにより製造してよく、あるいは天然の採取源に由来してもよい。
【００１９】
カチオン性（ポリ）ペプチドはまた、ポリカチオン性で抗菌性の微生物ペプチドであってもよい。これら（ポリ）ペプチドは、原核生物または動物または植物起源のものであってよく、化学的にまたは組換えにより製造されてよい。ペプチドはまた、デフェンシンのクラスに属していてよい。
【００２０】
そのような宿主防御ペプチドまたはデフェンシンもまた、本発明によるポリカチオン性ポリマーの好ましい形態である。一般に、好ましくはＡＰＣ（樹状細胞を含む）によって媒介される獲得免疫系を活性化（またはダウンレギュレーション）することを最終産物として可能にする化合物はポリカチオン性ポリマーとして用いる。
【００２１】
本発明においてポリカチオン性物質として使用するのに特に好ましいのは、カテリシジン（cathelicidin）由来の抗菌ペプチドまたはその誘導体（Ａ１４１６／２０００、参照のため本明細書中に引用する）、とりわけ哺乳動物カテリシジン、好ましくはヒト、ウシまたはマウスのカテリシジンに由来する抗菌ペプチド、または（ヒト）成長ホルモンなどの神経活性（neuroactive）化合物（たとえば、ＷＯ０１／２４８２２号に記載）である。
【００２２】
天然の採取源に由来するポリカチオン性化合物としては、ＨＩＶ−ＲＥＶまたはＨＩＶ−ＴＡＴ由来のカチオン性ペプチド、アンテナペディア（antennapedia）ペプチド、キトサンまたはキトサンの他の誘導体または生化学的な製造または組換え製造によりこれらペプチドまたはタンパク質に由来する他のペプチドが挙げられる。他の好ましいポリカチオン性化合物は、カテリン（cathelin）またはとりわけマウス、ウシまたは特にヒトカテリンおよび／またはカテリシジンからのカテリン関連物質またはカテリン由来物質である。カテリン関連物質またはカテリン由来物質はカテリン配列の全部または一部を含み、少なくとも１５〜２０アミノ酸残基を有する。誘導体化は、２０の標準アミノ酸以外のアミノ酸による天然アミノ酸の置換または修飾を含む。さらに、さらなるカチオン性残基がそのようなカテリン分子中に導入されてよい。これらカテリン分子は、本発明による抗原／ワクチン組成物と組み合わせるのが好ましい。しかしながら、これらカテリン分子は驚くべきことに、さらなるアジュバントを加えなくとも抗原に対するアジュバントとして有効なことがわかった。それゆえ、そのようなカテリン分子は、さらなる免疫刺激物質を用いたまたは用いないワクチン製剤において有効なアジュバントとして用いることが可能である。
【００２３】
本発明に従って用いることのできる他の好ましいポリカチオン性物質は、３〜７の疎水性アミノ酸、好ましくはロイシンのリンカーによって隔てられた少なくとも２のＫＬＫ−モチーフを含む合成ペプチドである（Ａ１７８９／２０００、参照のため本明細書中に引用する）。
【００２４】
いずれにしても、本発明によるポリカチオン性化合物、とりわけポリカチオン性ペプチドはそれ自身によって免疫原性であってはならず（すなわち、免疫応答を惹起してはならず）、免疫応答を助けるのみでなければならない。
【００２５】
本発明を以下の実施例および図面によりさらに詳細に記載するが、本発明はこれら特定の態様に限られるわけではない。
【００２６】
実施例１
ｐＲおよびＣｐＧ含有オリゴデオキシヌクレオチドＣｐＧ１６６８（チオホスフェートで置換されていない）を用いた卵アルブミン由来ペプチド（ＯＶＡ２５７−２６４）に対する特異的免疫応答の生成
マウス：Ｃ５７Ｂ１／６（Harlan/Olac）
ペプチド：ニワトリ卵アルブミンのＭＨＣクラスＩ（Ｈ−２Ｋｂ）拘束エピトープであるＯＶＡ257-264−ペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）(Rotzschkeら、1991）を標準固相Ｆ−ｍｏｃ合成法を用いて合成し、ＨＰＬＣ精製し、ついで純度をマススペクトロメトリーにより分析した。投与量：３００μｇ／マウス。
【００２７】
ポリ−Ｌ−アルギニン（ｐＲ）：平均重合度が４３アルギニン残基のポリ−Ｌ−アルギニン；SIGMA chemicals。投与量：１００μｇ／マウス。
【００２８】
ＣｐＧ−ＯＤＮ１６６８：ＣｐＧモチーフを含むチオホスフェート置換ＯＤＮ：tcc atg acg ttc ctg atg ctをPurimex GmbH、ゲッチンゲンにより合成。投与量：５ナノモル／マウス。
【００２９】
ＣｐＧ−ＯＤＮ１６６８ｂ：ＣｐＧモチーフを含むＯＤＮ（チオホスフェートで置換されていない）：tcc atg acg ttc ctg atg ctをPurimex GmbH、ゲッチンゲンにより合成。投与量：５ナノモル／マウス。
【００３０】
実験群（１群４匹のマウス）
１．ＯＶＡ257-264 ＋ ｐＲ
２．ＯＶＡ257-264 ＋ ＣｐＧ−ＯＤＮ１６６８
３．ＯＶＡ257-264 ＋ ＣｐＧ−ＯＤＮ１６６８ｂ
４．ＯＶＡ257-264 ＋ ＣｐＧ−ＯＤＮ１６６８ ＋ ｐＲ
５．ＯＶＡ257-264 ＋ ＣｐＧ−ＯＤＮ１６６８ｂ ＋ ｐＲ
【００３１】
第０日目にマウスの後肢に上記化合物を含む全量１００μｌ（各足当たり５０μｌ）を注射した。注射４日後に動物を屠殺し、膝窩リンパ節を回収した。リンパ節を７０μｍ細胞濾過器に通し、５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、SIGMA Chemicals）を含むＤＭＥＭ培地（GIBCO BRL）で２回洗浄した。細胞をＤＭＥＭ／５％／ＦＣＳ中に適当な細胞数に調節した。ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを記載に従って（Miyahiraら、1995）３回行った。この方法は、抗原特異的なＴ細胞の定量を可能にする方法として広く用いられているものである。リンパ球を培地（バックグラウンド−対照）、ＯＶＡ257-264−ペプチド、無関係のペプチドＴＲＰ−２181-188およびコンカナバリンＡ（ConA）とともに３つずつイクスビボにて刺激した。単一のＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞を表しているスポットをカウントし、全ての試料からバックグラウンドスポットの数を差し引いた。ConAで刺激した後に検出されるスポットの数が多いことは（データは示していない）、使用したリンパ球が良好な条件にあることを示している。マウスの各実験群に対してＩＦＮ−γ産生細胞／１×１０6リンパ節細胞の数を図１に示してあり、イクスビボ刺激した３つの実験の標準偏差を示してある。
【００３２】
この実験は、チオホスフェート置換ＣｐＧ−ＯＤＮ１６６８とともにＯＶＡ257-264を注射すると、ポリ−Ｌ−アルギニンと組み合わせてＯＶＡ257-264を注射した場合に比べてＯＶＡ257-264特異的な免疫応答が促進されることを示している。ポリ−Ｌ−アルギニンの同時注射はＣｐＧ−ＯＤＮ１６６８誘発免疫応答を強く促進する。対照的に、チオホスフェートで置換されていないＣｐＧ−ＯＤＮ１６６８ｂを用いた場合は、ポリ−Ｌ−アルギニンを同時に注射した場合にのみ高い免疫応答が誘発された。
【００３３】
実施例２
ｐＲおよびデオキシイノシン修飾したオリゴヌクレオチドＩ−ＯＤＮ２ｂ（チオホスフェートで置換されていないホスホジエステル結合）またはデオキシウリジン一リン酸修飾したオリゴヌクレオチドＵ−ＯＤＮ１３ｂ（チオホスフェートで置換されていないホスホジエステル結合）を用いたメラノーマ由来ペプチド（ＴＲＰ−２181-188）に対する特異的免疫応答の生成
マウス：Ｃ５７Ｂ１／６（Harlan/Olac）
ペプチド：マウスチロシナーゼ関連タンパク質−２のＭＨＣクラスＩ（Ｈ−２Ｋｂ）拘束エピトープであるＴＲＰ−２−ペプチド181-188（ＶＹＤＦＦＶＷＬ）(Ｂ１６メラノーマ、Bloom, M. B.ら、J. Exp. Med. 1997 185, 453-459）を標準固相Ｆ−ｍｏｃ合成法を用いて合成し、ＨＰＬＣ精製し、ついで純度をマススペクトロメトリーにより分析した。投与量：１００μｇ／マウス。
【００３４】
ポリ−Ｌ−アルギニン（ｐＲ）：平均重合度が４３アルギニン残基のポリ−Ｌ−アルギニン；SIGMA chemicals。投与量：１００μｇ／マウス。
【００３５】
Ｉ−ＯＤＮ２：デオキシイノシンを含むチオホスフェート置換ＯＤＮ：tcc atg aci ttc ctg atg ctをPurimex GmbH、ゲッチンゲンにより合成。投与量：５ナノモル／マウス。
【００３６】
Ｉ−ＯＤＮ２ｂ：デオキシイノシンを含むＯＤＮ（チオホスフェートで置換されていない）：tcc atg aci ttc ctg atg ctをPurimex GmbH、ゲッチンゲンにより合成。投与量：５ナノモル／マウス。
【００３７】
Ｕ−ＯＤＮ１３：デオキシウリジン一リン酸を含むチオホスフェート置換ＯＤＮ：tcc atg acu ttc ctg atg ctをPurimex GmbH、ゲッチンゲンにより合成。投与量：５ナノモル／マウス。
【００３８】
Ｕ−ＯＤＮ１３ｂ：デオキシウリジン一リン酸を含むＯＤＮ（チオホスフェートで置換されていない）：tcc atg acu ttc ctg atg ctをPurimex GmbH、ゲッチンゲンにより合成。投与量：５ナノモル／マウス。
【００３９】
実験群（１群４匹のマウス）
１．ＴＲＰ−２181-188
２．ＴＲＰ−２181-188 ＋ ｐＲ
３．ＴＲＰ−２181-188 ＋ Ｉ−ＯＤＮ２
４．ＴＲＰ−２181-188 ＋ Ｉ−ＯＤＮ２ｂ
５．ＴＲＰ−２181-188 ＋ Ｕ−ＯＤＮ１３
６．ＴＲＰ−２181-188 ＋ Ｕ−ＯＤＮ１３ｂ
７．ＴＲＰ−２181-188 ＋ Ｉ−ＯＤＮ２ ＋ ｐＲ
８．ＴＲＰ−２181-188 ＋ Ｉ−ＯＤＮ２ｂ ＋ ｐＲ
９．ＴＲＰ−２181-188 ＋ Ｕ−ＯＤＮ１３ ＋ ｐＲ
１０．ＴＲＰ−２181-188 ＋ Ｕ−ＯＤＮ１３ｂ ＋ ｐＲ
【００４０】
マウスの注射および免疫応答の分析を実施例１と同様にして行った。結果を図２に示す。リンパ節細胞のイクスビボでの再刺激のため、ＴＲＰ−２181-188を特異的ペプチドとして、ＯＶＡ257-264を無関係のペプチドとして用いた。
【００４１】
この実験は、チオホスフェート置換Ｉ−ＯＤＮまたはＵ−ＯＤＮとともにＴＲＰ−２181-188を注射すると、ＴＲＰ−２181-188単独で注射した場合に比べてＴＲＰ−２181-188特異的な免疫応答が強く促進されることを示している。ポリ−Ｌ−アルギニンを各ＯＤＮとともに同時注射すると、これら応答はさらに促進される。対照的に、チオホスフェートで置換されていないＩ−ＯＤＮ２ｂまたはＵ−ＯＤＮ１３ｂを用いた場合は、ポリ−Ｌ−アルギニンを同時に注射した場合にのみ高い免疫応答が誘発された。
【００４２】
実施例３
ｐＲおよびデオキシウリジン一リン酸修飾したオリゴヌクレオチド（Ｕ−ＯＤＮ１５ｂ、チオホスフェートで置換されていない）のカクテルを用いたメラノーマ由来ペプチド（ＴＲＰ−２181-188）に対する特異的免疫応答の生成
マウス：Ｃ５７Ｂ１／６（Harlan/Olac）
ペプチド：マウスチロシナーゼ関連タンパク質−２のＭＨＣクラスＩ（Ｈ−２Ｋｂ）拘束エピトープであるＴＲＰ−２−ペプチド181-188（ＶＹＤＦＦＶＷＬ）(Ｂ１６メラノーマ、Bloom，M. B.ら、J. Exp. Med. 1997，185，453-459）を標準固相Ｆ−ｍｏｃ合成法を用いて合成し、ＨＰＬＣ精製し、ついで純度をマススペクトロメトリーにより分析した。投与量：１００μｇ／マウス。
【００４３】
ポリ−Ｌ−アルギニン（ｐＲ）：平均重合度が４３アルギニン残基のポリ−Ｌ−アルギニン；SIGMA chemicals。投与量：１００μｇ／マウス。
【００４４】
Ｕ−ＯＤＮ１５ｂ：デオキシウリジンを含むＯＤＮ（チオホスフェートで置換されていない）のカクテル：nhh hhh wdu dhh hhh hhh wnをPurimex GmbH、ゲッチンゲンにより合成（ｎ＝ＧＣＡＴ、ｈ＝ＣＡＴ、ｗ＝ＡＴ、ｄ＝ＧＡＴ）。投与量：５ナノモル／マウス。
【００４５】
実験群（１群４匹のマウス）
１．ＴＲＰ−２181-188
２．ＴＲＰ−２181-188 ＋ ｐＲ
３．ＴＲＰ−２181-188 ＋ Ｕ−ＯＤＮ１５ｂ
４．ＴＲＰ−２181-188 ＋ Ｕ−ＯＤＮ１５ｂ ＋ ｐＲ
【００４６】
マウスの注射および免疫応答の分析を実施例１と同様にして行った。結果を図３に示す。リンパ節細胞のイクスビボでの再刺激のため、ＴＲＰ−２181-188を特異的ペプチドとして、ＯＶＡ257-264を無関係のペプチドとして用いた。
【００４７】
ＴＲＰ−２181-188、ｐＲおよびチオホスフェートで置換されていないＵ−ＯＤＮ（Ｕ−ＯＤＮ１５ｂ）のカクテルを同時に注射すると、ＴＲＰ−２181-188単独またはＴＲＰ−２181-188とｐＲまたはＵ−ＯＤＮ１５ｂとの各組み合わせに比べてＴＲＰ−２181-188特異的な免疫応答が強く促進される。
【００４８】
実施例４
ｐＲおよび種々のオリゴデオキシヌクレオチド（チオホスフェートで置換されていないホスホジエステル結合）によるメラノーマ由来ペプチド（ＴＲＰ−２181-188）特異的な免疫応答は長期間持続する
マウス：Ｃ５７Ｂ１／６（Harlan/Olac）
ペプチド：マウスチロシナーゼ関連タンパク質−２のＭＨＣクラスＩ（Ｈ−２Ｋｂ）拘束エピトープであるＴＲＰ−２−ペプチド181-188（ＶＹＤＦＦＶＷＬ）(Ｂ１６メラノーマ、Bloom，M. B.ら、J. Exp. Med. 1997，185，453-459）を標準固相Ｆ−ｍｏｃ合成法を用いて合成し、ＨＰＬＣ精製し、ついで純度をマススペクトロメトリーにより分析した。投与量：１００μｇ／マウス。
【００４９】
ポリ−Ｌ−アルギニン（ｐＲ）：平均重合度が４３アルギニン残基のポリ−Ｌ−アルギニン；SIGMA chemicals。投与量：１００μｇ／マウス。
【００５０】
ＣｐＧ−ＯＤＮ１６６８：ＣｐＧモチーフを含むチオホスフェート置換ＯＤＮ：tcc atg acg ttc ctg atg ctをPurimex GmbH、ゲッチンゲンにより合成。投与量：５ナノモル／マウス。
【００５１】
Ｕ−ＯＤＮ１３：デオキシウリジン一リン酸を含むチオホスフェート置換ＯＤＮ：tcc atg acu ttc ctg atg ctをPurimex GmbH、ゲッチンゲンにより合成。投与量：５ナノモル／マウス。
【００５２】
Ｕ−ＯＤＮ１３ｂ：デオキシウリジン一リン酸を含むＯＤＮ（チオホスフェートで置換されていない）：tcc atg acu ttc ctg atg ctをPurimex GmbH、ゲッチンゲンにより合成。投与量：５ナノモル／マウス。
【００５３】
Ｕ−ＯＤＮ１５：デオキシウリジンを含むチオホスフェート置換ＯＤＮのカクテル：nhh hhh wdu dhh hhh hhh wnをPurimex GmbH、ゲッチンゲンにより合成（ｎ＝ＧＣＡＴ、ｈ＝ＣＡＴ、ｗ＝ＡＴ、ｄ＝ＧＡＴ）。投与量：５ナノモル／マウス。
【００５４】
Ｕ−ＯＤＮ１５ｂ：デオキシウリジンを含むＯＤＮ（チオホスフェートで置換されていない）のカクテル：nhh hhh wdu dhh hhh hhh wnをPurimex GmbH、ゲッチンゲンにより合成（ｎ＝ＧＣＡＴ、ｈ＝ＣＡＴ、ｗ＝ＡＴ、ｄ＝ＧＡＴ）。投与量：５ナノモル／マウス。
【００５５】
実験群（１群５匹のマウス）
１．ＴＲＰ−２181-188
２．ＴＲＰ−２181-188 ＋ ｐＲ
３．ＴＲＰ−２181-188 ＋ ＣｐＧ１６６８
４．ＴＲＰ−２181-188 ＋ Ｕ−ＯＤＮ１３
５．ＴＲＰ−２181-188 ＋ Ｕ−ＯＤＮ１３ｂ
６．ＴＲＰ−２181-188 ＋ Ｕ−ＯＤＮ１５
７．ＴＲＰ−２181-188 ＋ Ｕ−ＯＤＮ１５ｂ
８．ＴＲＰ−２181-188 ＋ ｐＲ ＋ ＣｐＧ１６６８
９．ＴＲＰ−２181-188 ＋ ｐＲ ＋ Ｕ−ＯＤＮ１３
１０．ＴＲＰ−２181-188 ＋ ｐＲ ＋ Ｕ−ＯＤＮ１３ｂ
１１．ＴＲＰ−２181-188 ＋ ｐＲ ＋ Ｕ−ＯＤＮ１５
１２．ＴＲＰ−２181-188 ＋ ｐＲ ＋ Ｕ−ＯＤＮ１５ｂ
【００５６】
マウスの注射および免疫応答の分析を実施例１と同様にして行った。結果を図４に示す。注射後４０日目の免疫応答を分析するため、脾臓細胞の単一細胞懸濁液を調製した。脾臓細胞を、特異的ペプチドとしてＴＲＰ−２181-188、無関係のペプチドとしてＯＶＡ257-264およびConAでイクスビボにて再刺激した。
【００５７】
ＴＲＰ−２181-188をｐＲ、ＣｐＧ１６６８、Ｕ−ＯＤＮ１３またはチオホスフェート置換されたＵ−ＯＤＮ（Ｕ−ＯＤＮ１５）のカクテルとともに注射すると、ＴＲＰ−２181-188単独の注射に比べてＴＲＰ−２181-188特異的な免疫応答が促進される。ポリ−Ｌ−アルギニンをＣｐＧ１６６８またはＵ−ＯＤＮ１３とともに同時注射すると、この応答は有意に（Ｕ−ＯＤＮ１５の場合はわずかだけ）増大する。対照的に、Ｕ−ＯＤＮ１３やチオホスフェートで置換されていないＵ−ＯＤＮ１５ｂを用いた場合は、ポリ−Ｌ−アルギニンを同時に注射した場合にのみ高い免疫応答が誘発された。注目すべきことに、ｐＲ／Ｕ−ＯＤＮ１５ｂ（チオホスフェートで置換されていない）の注射後の応答は、ｐＲ／Ｕ−ＯＤＮ１５（チオホスフェートで置換されている）により誘発された応答を有意に上回っていた。
【００５８】
実施例５
メラノーマ由来ペプチド（ＴＲＰ−２181-188）をｐＲおよびＣｐＧ含有オリゴデオキシヌクレオチドＣｐＧ−ＯＤＮ１６６８ｂ（チオホスフェートで置換されていないホスホジエステル結合）とともに同時に注射したときのＴＲＰ−２181-188に対する長期に持続する特異的免疫応答の誘発
マウス：Ｃ５７Ｂ１／６（Harlan/Olac）
ペプチド：マウスチロシナーゼ関連タンパク質−２のＭＨＣクラスＩ（Ｈ−２Ｋｂ）拘束エピトープであるＴＲＰ−２−ペプチド181-188（ＶＹＤＦＦＶＷＬ）(Ｂ１６メラノーマ、Bloom，M. B.ら、J. Exp. Med. 1997，185，453-459）を標準固相Ｆ−ｍｏｃ合成法を用いて合成し、ＨＰＬＣ精製し、ついで純度をマススペクトロメトリーにより分析した。投与量：１００μｇ／マウス。
【００５９】
ポリ−Ｌ−アルギニン（ｐＲ）：平均重合度が４３アルギニン残基のポリ−Ｌ−アルギニン；SIGMA chemicals。投与量：１００μｇ／マウス。
【００６０】
ＣｐＧ−ＯＤＮ１６６８ｂ：ＣｐＧモチーフを含むＯＤＮ（チオホスフェートで置換されていない）：tcc atg acg ttc ctg atg ctをPurimex GmbH、ゲッチンゲンにより合成。投与量：５ナノモル／マウス。
【００６１】
実験群（１群５匹のマウス）
１．ＴＲＰ−２181-188
２．ＴＲＰ−２181-188 ＋ ｐＲ
３．ＴＲＰ−２181-188 ＋ ＣｐＧ１６６８ｂ
４．ＴＲＰ−２181-188 ＋ ｐＲ ＋ ＣｐＧ１６６８ｂ
【００６２】
マウスの注射を実施例１と同様にして行った。結果を図５に示す。注射後６日目、４９日目および９８日目の免疫応答を分析するため、脾臓細胞の単一細胞懸濁液を調製した。脾臓細胞を、特異的ペプチドとしてＴＲＰ−２181-188、無関係のペプチドとしてＯＶＡ257-264（データは示していない）およびConAでイクスビボにて再刺激した。
【００６３】
ＴＲＰ−２181-188、ｐＲおよびＣｐＧ１６６８ｂを同時に注射すると、ＴＲＰ−２181-188をｐＲまたはＣｐＧ１６６８ｂのいずれかとともに注射した場合に比べてペプチド特異的なＩＦＮ−ｇ産生細胞の数が有意に高い結果となる。このことは単一注射後６日目のみならずさらに遅い時点（４９日目、９８日目）でも観察され、ｐＲ／ＣｐＧ１６６８ｂの組み合わせの強力かつ長期にわたって持続する免疫刺激作用を示している。
【００６４】
実施例６
ＫＬＫおよびデオキシイノシン修飾したオリゴヌクレオチドＩ−ＯＤＮ２ｂ（チオホスフェートで置換されていないホスホジエステル結合）を用いたＯＶＡ257-264−ペプチドに対する特異的免疫応答の生成
マウス：Ｃ５７Ｂ１／６（Harlan/Olac）
ペプチド：ニワトリ卵アルブミンのＭＨＣクラスＩ（Ｈ−２Ｋｂ）拘束エピトープであるＯＶＡ257-264−ペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）(Rotzschkeら、1991）を標準固相Ｆ−ｍｏｃ合成法を用いて合成し、ＨＰＬＣ精製し、ついで純度をマススペクトロメトリーにより分析した。投与量：３００μｇ／マウス。
【００６５】
ＫＬＫ：KLKLLLLLKLK-COOH。投与量：１６８μｇ／マウス。
Ｉ−ＯＤＮ２ｂ：デオキシイノシンを含むＯＤＮ（チオホスフェートで置換されていない）：tcc atg aci ttc ctg atg ctをPurimex GmbH、ゲッチンゲンにより合成。投与量：５ナノモル／マウス。
【００６６】
実験群（１群５匹のマウス）
１．ＯＶＡ257-264 ＋ ＫＬＫ
２．ＯＶＡ257-264 ＋Ｉ−ＯＤＮ２ｂ
３．ＯＶＡ257-264 ＋ ＫＬＫ ＋Ｉ−ＯＤＮ２ｂ
【００６７】
マウスの注射を実施例１と同様にして行った。結果を図６に示す。注射後７日目の免疫応答を分析するため、血液を採取し、末梢血単核細胞をフィコール勾配により単離した。ＰＢＭＣを、特異的ペプチドとしてＯＶＡ257-264、無関係のペプチドとしてＴＲＰ−２181-188およびConAを用いてイクスビボにて再刺激した。
【００６８】
ＯＶＡ257-264をＫＬＫまたはＩ−ＯＤＮ２ｂとともに注射してもペプチド特異的なＩＦＮ−γ産生は誘発されない。しかしながら、ＯＶＡ257-264、ＫＬＫおよびＩ−ＯＤＮ２ｂを同時に注射すると高い数のＯＶＡ257-264特異的なＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞を検出することができる。
【００６９】
実施例７
ＫＬＫおよびデオキシイノシン修飾したオリゴヌクレオチドＩ−ＯＤＮ２ｂ（チオホスフェートで置換されていないホスホジエステル結合）を用いたメラノーマ由来ペプチド（ＴＲＰ−２181-188）に対する特異的免疫応答の生成
マウス：Ｃ５７Ｂ１／６（Harlan/Olac）
ペプチド：マウスチロシナーゼ関連タンパク質−２のＭＨＣクラスＩ（Ｈ−２Ｋｂ）拘束エピトープであるＴＲＰ−２−ペプチド181-188（ＶＹＤＦＦＶＷＬ）(Ｂ１６メラノーマ、Bloom，M. B.ら、J. Exp. Med. 1997，185，453-459）を標準固相Ｆ−ｍｏｃ合成法を用いて合成し、ＨＰＬＣ精製し、ついで純度をマススペクトロメトリーにより分析した。投与量：１００μｇ／マウス。
【００７０】
ＫＬＫ：KLKLLLLLKLK-COOH。投与量：１６８μｇ／マウス。
Ｉ−ＯＤＮ２ｂ：デオキシイノシンを含むＯＤＮ（チオホスフェートで置換されていない）：tcc atg aci ttc ctg atg ctをPurimex GmbH、ゲッチンゲンにより合成。投与量：５ナノモル／マウス。
【００７１】
実験群（１群５匹のマウス）
１．ＴＲＰ−181-188
２．ＴＲＰ−181-188 ＋ ＫＬＫ
３．ＴＲＰ−181-188 ＋Ｉ−ＯＤＮ２ｂ
４．ＴＲＰ−181-188 ＋ ＫＬＫ ＋Ｉ−ＯＤＮ２ｂ
【００７２】
マウスの注射を実施例１と同様にして行った。結果を図７に示す。注射後７日目の免疫応答を分析するため、血液を採取し、末梢血単核細胞をフィコール勾配により単離した。ＰＢＭＣを、特異的ペプチドとしてＴＲＰ−２181-188、無関係のペプチドとしてＯＶＡ257-264およびConAを用いてイクスビボにて再刺激した。
【００７３】
ＴＲＰ−181-188単独またはＫＬＫまたはＩ−ＯＤＮ２ｂと組み合わせて注射してもペプチド特異的なＩＦＮ−γ産生は誘発されない。対照的に、ＴＲＰ−181-188、ＫＬＫおよびＩ−ＯＤＮ２ｂを同時に注射すると非常に高い数のペプチド特異的なＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞を検出することができる。
【００７４】
実施例８
ポリ−Ｌ−アルギニンは血清ＤＮアーゼによるＤＮＡの分解を防ぐ
ＤＮアーゼによるＤＮＡの分解を防ぐうえでのｐＲの防御作用を調べるため、以下のインビトロ実験を行った。インビボとの関連の可能性を示すため、血清をＤＮアーゼ源として用いた。
【００７５】
ＤＮＡプラスミドｐＳＰ６５（１.５８μｇ／２μｌ）をポリ−Ｌ−アルギニン（２.４μｇ／２.４μｌ）の存在下または不在下でナイーブなマウスからの血清（８μｌ）とともに３７℃で１時間インキュベーションした。ＤＮＡ／ｐＲ複合体の解離のためにヘパリン（１.６Ｕ／１.６μｌ）を室温で２０分間加えてＤＮＡをゲルへ移動させた。図８は１％アガロースゲル（３０分／１００ボルト）を示す。対照として１００ｂｐ ＤＮＡマーカー（GIBCO BRL）を用いた。
【００７６】
未処理のｐＳＰ６５ ＤＮＡでは典型的な環状プラスミドの超らせん／らせん／弛緩のバンドパターンを観察することができる。ＤＮＡを血清とともにインキュベーションすると分解されて、種々のランダムなＤＮアーゼ開裂産物の染みとして検出される。この血清ＤＮアーゼによる分解は、ポリ−Ｌ−アルギニンを添加すると防ぐことができる。
それゆえ、ポリ−Ｌ−アルギニンは酵素的な分解に対してＤＮＡを安定化させ、ＤＮＡの半減期およびバイオアベイラビリティーを長くする。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】ｐＲおよびＣｐＧ含有ＯＤＮを用いた特異的免疫応答の生成を示す。
【００７８】
【図２】ｐＲおよびデオキシＩまたはデオキシＵ含有ＯＤＮを用いた特異的免疫応答の生成を示す。
【００７９】
【図３】ｐＲおよびデオキシＵ含有ＯＤＮのカクテルを用いた特異的免疫応答の生成を示す。
【００８０】
【図４】ｐＲおよびＯＤＮを用いた特異的免疫応答の生成を示す。
【００８１】
【図５】ｐＲを用いた長期持続免疫応答の誘発を示す。
【００８２】
【図６】ＫＬＫおよびデオキシＩ含有ＯＤＮを用いた特異的免疫応答の生成を示す。
【００８３】
【図７】ＫＬＫおよびデオキシＩ含有ＯＤＮを用いた特異的免疫応答の生成を示す。
【００８４】
【図８】ｐＲの存在下または不在下でＤＮアーゼにより処理したＤＮＡの１％アガロースゲルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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