(57)【要約】固体支持体結合ポリヌクレオチド、好ましくは３’−Ｏ−又は５’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドが開示される。これらのポリヌクレオチドは、以下の式：【化１】2005503773.tif 000010のものであり、式中、Ｑは、実質的に純粋なポリヌクレオチドであり、それぞれのＸは、Ｏ又はＳであり；Ｙは、不活性スペーサー基であり；Ｒは、固体支持体を表す。また、開示されるものは、標的生体分子、好ましくはタンパク質又はポリヌクレオチドを、混合物から単離する方法である。
2005503773.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式：
【化１】
2005503773.tif 000007
［式中：
Ｑは、実質的に純粋なポリヌクレオチドであり；
それぞれのＸは、独立にＯ又はＳであり；
Ｙは、不活性スペーサー基であり；そして
Ｒは、固体支持体である］
の固体支持体結合ポリヌクレオチド。
【請求項２】
固体支持体結合３’−Ｏ−又は５’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドであって、ここにおいて前記３’−Ｏ−及び５’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドが、以下の構造式：
【化２】
2005503773.tif 000008
［式中：
それぞれのＸは、独立にＯ又はＳであり；
Ｙは、不活性スペーサー基であり；そして
Ｒは、固体支持体である］
によって表され；そして、前記３’−Ｏ−及び５’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドが実質的に純粋である、前記固体支持体結合ポリヌクレオチド。
【請求項３】
Ｙが、直鎖ヒドロカルビル基であるか又はポリアルキレングリコール基であり、そしてそれぞれのＸがＯである、請求項１又は２のいずれか１項に記載の固体支持体結合ポリヌクレオチド。
【請求項４】
Ｙが、Ｃ３−Ｃ１０アルキレン基である、請求項３に記載の固体支持体結合ポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドが、ポリデオキシヌクレオチドである、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の固体支持体結合ポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドが、ポリリボヌクレオチドである、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の固体支持体結合ポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記固体支持体が、アミノセファロース、アミノポリスチレン、アミノシリカビーズ、シリカコントロール多孔性ガラスビーズ、アクリレートベースアミノ支持体又はメタクリレートベースアミノ支持体である、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の固体支持体結合ポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記固体支持体が、アミノセファロースである、請求項７に記載の固体支持体結合ポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチドが、標的タンパク質を選択的に結合する、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の固体支持体結合ポリヌクレオチド。
【請求項１０】
固体支持体結合ポリヌクレオチドを調製する方法であって、２’−Ｏ−、３’−Ｏ−又は５’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドの末端ホスフェートを、固体支持体からのペンダントであるアミン又はヒドロキシル基でエステル化又はアミド化する工程を含んでなり、ここにおいて２’−Ｏ−、３’−Ｏ−又は５’−Ｏ−置換基が、以下の構造式：
【化３】
2005503773.tif 000009
によって表され、そしてそれぞれのＸが、独立にＯ又はＳであり；そしてＹが、直鎖ヒドロカルビル基又はポリアルキレングリコール基である、前記方法。
【請求項１１】
前記末端ホスフェートが、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチル−カルボジイミドの存在下でエステル化又はアミド化される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記固体支持体が、アミノセファロース、アミノポリスチレン、アミノシリカビーズ、シリカコントロール多孔性ガラスビーズ、アクリレートベースアミノ支持体又はメタクリレートベースアミノ支持体である、請求項１０又は１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記固体支持体がアミノセファロースである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
混合物から標的生体分子を単離する方法であって：
ａ）請求項１ないし１３のいずれか１項に記載の固体支持体結合ポリヌクレオチドを用意し、ここにおいて前記ポリヌクレオチドは、標的生体分子を選択的に結合するものであり；そして
ｂ）前記混合物を、固体支持体結合ポリヌクレオチドと、標的生体分子をポリヌクレオチドに結合させるために適した条件下で接触させること；
の工程を含んでなる、前記方法。
【請求項１５】
前記標的分子が、標的タンパク質である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
更に前記混合物から前記固体支持体結合ポリヌクレオチドを分離し、そして前記標的タンパク質を前記ポリヌクレオチドから溶出する工程を含んでなる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記標的分子が、固体支持体結合ポリヌクレオチドとハイブリッド形成する標的ポリヌクレオチドである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
更に前記混合物から前記固体支持体結合ポリヌクレオチドを分離し、そして前記固体支持体結合ポリヌクレオチドから標的ポリヌクレオチドを変性し、そして標的ポリヌクレオチドを単離する工程を含んでなる、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
固体支持体上に固定化された生体分子は、親和性試薬として大きな用途を有し、これらはしばしば混合物から標的分子を結合し、そして分離するために使用される。オリゴヌクレオチドは、この目的のために使用することができる生体分子の一つの例である。例えば、オリゴヌクレオチドは、相補的配列とハイブリッド形成することができる。更に、調節領域において見出される配列を有するオリゴヌクレオチドは、これらの領域に特異性を有する調節タンパク質と結合することができる。従って、固定化されたオリゴヌクレオチドを伴う固体支持体を含んでなる親和性試薬は、特に相補的オリゴヌクレオチド及び調節タンパク質の精製、同定及び単離に使用することができる。
【０００２】
オリゴヌクレオチドを固相支持体に接続するための現時点の方法は、多くの欠点を有する。例えば、いくつかの方法ではオリゴヌクレオチドの非特異的接続となるか、又は副反応を起こしうる。特異的である方法は、典型的には反応性基を直接オリゴヌクレオチドの５’又は３’末端に接続することを含む。いずれかの末端における直接の接続は、オリゴヌクレオチドを固体支持体ときわめて接近させ、これは、オリゴヌクレオチドを標的分子と結合するための適切な配置に適合することを防止することができる。他の方法は、基質（ｍａｔｒｉｘ）及びオリゴヌクレオチドの有意な操作を必要とし、そして使用するためには不都合である。
【０００３】
従って、オリゴヌクレオチドを、使用するために好都合であり、部位特異的であり、副反応が最小であるか又はそれがなく、そしてオリゴヌクレオチドが標的分子と結合するために適切な配向に適合させることを可能にする固体基質に接続するための新しい方法に対する必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００４】
ポリヌクレオチドに、特にポリヌクレオチドの３’末端に接続したアルキルリン酸連結基が、ポリヌクレオチドを固体支持体に共有結合するために使用することができることが見出された。例えば、誘導されたオリゴヌクレオチドＧＧＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧ−ＯＰＯ−（Ｏ−ヘキシル）−リン酸（配列番号：１）（トロンビン結合アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ））及びＴＡＡＴＡＴＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＴＡＡＣＴ  Ｔ−ＯＰＯ−（Ｏ−ヘキシル）−リン酸（配列番号：２）を調製し、そして末端ホスフェートによって、カルボジイミド媒介カップリングによって、アミノセファロースに接続した（実施例２）。この発見に基づいて、結合されたオリゴヌクレオチドを伴う新規な基質、前記の基質により生体分子を精製及び／又は単離する方法並びに前記の基質を調製する方法が、本明細書中で開示される。
【０００５】
本発明によれば、以下の式（Ａ）：
【０００６】
【化１】
2005503773.tif 000003
【０００７】
［式中：
Ｑは、実質的に純粋なポリヌクレオチドであり；
それぞれのＸは、独立にＯ又はＳであり；
Ｙは、不活性スペーサー基であり；そして
Ｒは、固体支持体である］
の固体支持体結合ポリヌクレオチドが提供される。
【０００８】
本発明の一つの態様は、固体支持体結合３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドである。３’−Ｏ−置換基は、以下の構造式（Ｉ）：
【０００９】
【化２】
2005503773.tif 000004
【００１０】
によって表される。
それぞれのＸは、独立にＳ又はＯであり；Ｙは、不活性スペーサー基であり；Ｒは、固体支持体であり；そして３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドは、実質的に純粋である。好ましくはそれぞれのＸはＯである。
【００１１】
本発明のもう一つの態様は、標的生体分子を、混合物から単離する方法である。この方法は、固体支持体結合３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドを用意する工程を含んでなり、ここにおいて３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドは、標的生体分子を選択的に結合することができ、そして３’−Ｏ−置換基は、上記の構造式（Ｉ）によって表される。混合物を、固体支持体結合３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドと、標的生体分子を３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドに結合するために適した条件下で接触させる。
【００１２】
本発明のもう一つの態様は、固体支持体結合ポリヌクレオチドを調製する方法である。この方法は、３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドの末端ホスフェートを、固体支持体からのペンダントであるアミン基又はヒドロキシル基で、エステル化又はアミド化する工程を含んでなる。３’−Ｏ−置換基は、以下の構造式（ＩＩ）：
【００１３】
【化３】
2005503773.tif 000005
【００１４】
によって表される。
Ｙ及びＸは、構造式（Ｉ）について記載した通りである。
本明細書中に記載される３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドは、部位特異的様式（ｓｉｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍａｎｎｅｒ）で、最小の副反応を伴って、固体支持体に容易にそして好都合に共有結合することができる。従って、固体支持体結合３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドは、高い純度及び収率で調製することができる。更に、スペーサー基は、好都合には標的分子が、３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドに固体支持体の妨害が最小限であるか又はそれがないように充分な長さのものである。従って、固体支持体結合３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドは、標的生体分子を混合物から単離するための好都合な手段（ｔｏｏｌ）を提供する。
【００１５】
本発明は、ポリヌクレオチドの３’末端ヒドロキシ基を置き換えるリンカー基によって固体支持体に結合又は固定化された、実質的に純粋なポリヌクレオチドを指向する。リンカーは、以下の構造式（ＩＩＩ）：
【００１６】
【化４】
2005503773.tif 000006
【００１７】
によって表され、Ｘ及びＹは、構造式（Ｉ）について記載した通りである。
本発明が３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドについて記載されていることが理解されるべきである。然しながら、本発明は、更に対応する固体支持体結合５’−Ｏ−置換ポリヌクレオチド、即ちポリヌクレオチドの５’末端ヒドロキシ基を置き換えるリンカー基によって固体支持体に結合又は固定化された、実質的に純粋なポリヌクレオチドを含む。リンカーは、構造式（ＩＩＩ）によって表される。固体支持体結合５’−Ｏ−ポリヌクレオチドは、類似の有用性（ｕｔｉｌｉｔｉｅｓ）を有し、そして対応する３’−Ｏ−置換組成物を調製するために使用される方法の好適な適合（ｓｕｉｔａｂｌｅ  ａｄａｐｔａｔｉｏｎｓ）によって調製することができる。更に、本発明が支持体結合２’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドを含むことが理解されるべきである。リンカーは構造式（ＩＩＩ）によって表される。固体支持体結合２’−Ｏ−ポリヌクレオチドは、類似の用途を有し、そして対応する３’−Ｏ−置換組成物を調製するために使用される方法の好適な適合によって調製することができる。更に、本発明は、核塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）上の接続点を経由して固体支持体に結合又は固定化されたポリヌクレオチドをも更に含む。このような接続は、核塩基を構造式（ＩＩＩ）のリンカーに対して適した接続手段で、例えばアミノヘキサノールのようなアミノアルカノール部分の形成によって誘導することによって達成することができる。
【００１８】
多くの態様において、支持されたポリヌクレオチドは、スピーゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）ではなく、特に配列ＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＴＧＧＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＧＧＣＣＧＧＧＧＧＧＣＧＴＧＣＧＴＡＡＧＣＡＣＧＴＡＧＣＣＴＣＧＣＣＧＣ（配列番号：３）を有するスピーゲルマーではない。
【００１９】
構造式（Ａ）及び（Ｉ）−（ＩＩＩ）中のＹは、不活性なスペーサー基である。本明細書中で使用される“不活性なスペーサー基”は、ポリヌクレオチドの３’末端に結合した場合、ポリヌクレオチドの固相合成を妨害せず、そしてポリヌクレオチドの、ポリヌクレオチドに結合する標的分子に対する親和性又は選択性を有意に減少しない部分である。多くの場合、開示された固体支持体結合３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドは、３’末端で固体支持体と直接結合する場合、対応する非置換ポリヌクレオチドより大きい親和性で標的分子と結合する。適した不活性スペーサー基の例は、ポリアルキレングリコール基（即ちＹは−（ＣＨ2）n−［Ｏ（ＣＨ2）n］m−であり、ここにおいてｎは、２又は３であり、そしてｍは、０ないし約４の整数である）、直鎖ヒドロカルビル基及び鎖の２又は３個の炭素原子が１，４−フェニレン基で置き換えられた直鎖ヒドロカルビル基を含む。好ましくは、ポリアルキレングリコール及び直鎖ヒドロカルビル基は、約１５までの原子の長さ、更に好ましくは２ないし１０個の原子の長さである。ヒドロカルビル及びポリアルキレングリコールスペーサー基は、先に記載したように、ポリヌクレオチドの合成又は標的分子に対するその親和性を有意に妨害しない基で置換することができる。適した置換基の例は、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＣＨ3又はエチルを含む。然しながら、ヒドロカルビル及びポリアルキレンスペーサー基は、好ましくは置換されていない。更に好ましくは、不活性スペーサー基は、Ｃ３−Ｃ１０直鎖の置換されていないアルキレン基であり、そしてなお一層好ましくはＣ５−Ｃ７直鎖アルキル基である。
【００２０】
本発明の固体支持体結合３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドは、固相ポリヌクレオチド合成のための標準的方法によって調製される。例えば、１−Ｏ−（ジメトキシトリチル）−ω−［Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−β−シアノエトキシ−ホスフィノ］−１，ω−アルカンジオールは、標準的なアミドリン酸化化学反応（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を使用して、固相ポリヌクレオチド合成のために適した固相支持体にカップリングされる。固相ポリヌクレオチド合成のために適した固体支持体の一つの例は、スクシニル化シリルアミンである。スクシニル化シリルアミンは、シリカをシリルアミンを含有するために誘導する、例えば、シリカを３’−アミノプロピルトリエトキシシランと反応させ、そして次いで遊離アミンをスクシニル化することによって調製される。他の適した固体支持体の例は、スクシニル化調整細孔ガラス（ｓｕｃｃｉｎｙｌａｔｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ；本明細書中で以下“ＣＰＧ”と略す）、及びＣＰＧ−ＣＯ−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＳＯ2−ＣＨ2ＣＨ2ＯＨを含む。１−Ｏ−（ジメトキシトリチル）−ω−［Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−β−シアノエトキシ−ホスフィノ］−１，ω−アルカンジオールの調製及びその固相支持体へのカップリングは、Ｓｅｅｌａ  ａｎｄ  Ｋａｉｓｅｒ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５：３１１３（１９８７），Ｗｉｌｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：２０６５（１９９０）ａｎｄ  Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １６：１９５１（１９９７）に記載されている。これらの参考文献の全ての教示内容は、本明細書中に参考文献として援用される。
【００２１】
１−Ｏ−（ジメトキシトリチル）−ω−［Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−β−シアノエトキシ−ホスフィノ］−１，ω−アルカンジオールの固体支持体への接続に続いて、ポリヌクレオチドの合成が、標準的なプロトコルによって行われる。プロトコルは、典型的には次の四つの工程のサイクル：１）例えば塩化メチレン中のジクロロ酢酸（２：１００容積／容積）又は２０％酢酸によるトリチル保護基の除去；２）ヌクレオシドアミドリン酸、例えば、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシヌクレオシド３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）アミドリン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）との亜リン酸トリエステルを形成する縮合；３）例えば、無水酢酸及びジメチルアミノピリジン／テトラヒドロフラン／ルチジン（６：９０：１０容積／容積／容積）による、未反応の５’−ヒドロキシ基のアシル化又はキャッピング（ｃａｐｐｉｎｇ）；並びに４）例えば、ヨウ素溶液による亜リン酸トリエステルのリン酸トリエステルへの酸化；である。合成が完了した時点で、ポリヌクレオチドは、保護基を離され、そして典型的には濃水酸化アンモニウムにより、固体支持体から切断される。
【００２２】
本発明の固体支持体結合３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドは、３’−Ｏ−置換ポリデオキシヌクレオチド、３’−Ｏ−置換ポリリボヌクレオチド並びに混合された３’−Ｏ−ポリデオキシ及びポリリボヌクレオチドを含む。３’−Ｏ−置換ポリリボヌクレオチドを調製する場合、２’−ヒドロキシル基は、固相合成及びその後の３’−Ｏ−ポリリボヌクレオチドの固体支持体への接続中、保護されなければならない。
【００２３】
更に含まれるものは、一つ又はそれより多いプリン又はピリミジン基における修飾、例えば、５−ハロゲン化チミジン、シトシン又はウラシル；プロピン（ｐｒｏｐｙｎｅ）により５位で修飾されたチミジン、シトシン又はウラシル；或いは７位の窒素が−ＣＨ−で置き換えられたアデノシン又はグアニンを伴う、固体支持体結合３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドである。更に含まれるものは、一つ又はそれより多いデオキシリボース基の２’位において、例えば−Ｏ−（保護基）、−Ｏ−ＣＨ3、−Ｆ  ＣＨ2ＯＣＨ3、−ＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3  等で置換された、固体支持体結合３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドである。
【００２４】
固相ポリヌクレオチド合成のそれぞれのサイクル中に、小さいパーセント（典型的には１％−２％）のポリヌクレオチドが、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシヌクレオシドアミドリン酸とのカップリングに失敗する。従って、不純物の水準は、合成のそれぞれのサイクルに伴って増加する。未反応のオリゴマーは、好ましくは合成のそれぞれのサイクル中に“キャッピング”されて、これらの未反応のオリゴマーがその後の合成サイクル中に更に延長することを防止し、これによってこれらの不純物の最終生成物からの除去を促進する。生成物のポリヌクレオチドは、“失敗した”キャッピングされたポリヌクレオチドから任意の適した方法によって分離することができる。典型的には、分離は、ゲル電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー又は逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって達成することができる。
【００２５】
“実質的に純粋なポリヌクレオチド”は、合成によって調製され、そして次いで“失敗した”キャッピングされたポリヌクレオチドを実質的に含まないように精製された、例えば少なくとも約９０．０重量％遊離の、好ましくは少なくとも約９５．０重量％遊離の、そして更に好ましくは少なくとも約９８重量％遊離のポリヌクレオチドを指す。典型的には、本明細書中に記載される３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドは、キャッピングされた中間体を除去するために精製されてから、これらは、混合物から生体分子を分離することにおいて使用するために固体支持体に共有結合される。
【００２６】
一般的に、本発明は、長さに関して制約のない固体支持体結合３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドを含む。然しながら、好ましくはポリヌクレオチドは、約１００個の核塩基の長さ、更に好ましくは約７５個、そしてなお更に好ましくは約５０個の長さより短い。典型的には、固体支持体結合３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドは、少なくとも約８個の核塩基の長さ、そして好ましくは約１０ないし３５個の間の長さである。
【００２７】
固体支持体結合３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドのために適した固体支持体は、第一ホスフェート基（ｐｒｉｍａｒｙ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｇｒｏｕｐｓ）と安定した共有結合を形成することができるものである。このような固体支持体は、典型的にはポリマー骨格のペンダントであるか又はポリマー骨格のペンダントであるリンカーに結合するアミン基、ヒドロキシル基又はチオール基を有する。適した固体支持体の例は、制約されるものではないが、アミノセファロース、アミノポリスチレン、アミノシリカビーズ（アミノで誘導されたシリカ）、シリカで調整された多孔性ガラスビーズ及びアクリレート又はメタクリレートベースのアミノ支持体（ａｃｒｙｌａｔｅ  ｏｒ  ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ  ｂａｓｅ  ａｍｉｎｏ  ｓｕｐｐｏｒｔ）を含む。
【００２８】
３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドは、第一アミン及びホスフェートからアミドリン酸を調製するために適した任意の方法によって、ペンダントな第一アミン基を含有する固体支持体にカップリングすることができる。３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドは、アルコール及びホスフェート（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）からリン酸エステルを調製するために適した任意の方法によって、ペンダントなヒドロキシル基を含有する固体支持体にカップリングすることができる。典型的には、活性化されたリン酸エステルは、“カップリング剤”によりインサイチュー（ｉｎ  ｓｉｔｕ）で形成される。カップリング剤は、ホスフェートのヒドロキシル基と反応し、ヒドロキシルを、例えば第一級アミン又は第一級アルコールによる求核的置換に敏感である脱離基に転換する。カップリング剤の例は、１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、クロロギ酸イソブチル並びに１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチル−カルボジイミド（ＥＤＣ）及びジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）のようなカルボジイミドカップリング剤を含む。ＥＤＣが好ましいカップリング剤である。
【００２９】
本発明の固体支持体結合３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドは、生体分子を混合物から分離するために使用することができる。標的生体分子に選択的に結合する３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドが選択される。“選択的に結合する”は、３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドが、混合物の他の成分より標的に対して大きい親和性を、好ましくは少なくとも２倍の親和性、更に好ましくは少なくとも５倍の親和性、そしてなお更に好ましくは少なくとも１０倍の親和性を有することを意味する。例えば、標的分子がＲＮＡ又はＤＮＡである場合、３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドが標的にハイブリッド形成し、そしてポリヌクレオチド二本鎖を形成するように、標的に対して充分に相補的である３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドが選択される。３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドは、タンパク質が特定のポリヌクレオチド配列に対して親和性を有することを条件として、更にタンパク質を混合物から分離することもできる。ＤＮＡ発現、転写酵素、翻訳酵素を制御するタンパク質は、これらのタンパク質の例である。このようなタンパク質を混合物から分離するために、関心のあるタンパク質に対して親和性を有する３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドが選択される。
【００３０】
所望する標的生体分子に関して好適な固体支持体結合３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドが選択された時点で、当該標的生体分子を含有する混合物をこの固体支持体結合３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドと接触させる。例えば、固体支持体結合３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドを、可溶化された混合物を含有する水溶液のような溶液に加えることができる。固体支持体結合３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチド及び混合物を、３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチド及び標的生体分子間の結合のために適した条件下で接触させる。結合のために適した条件は、標的によって変化するものであり、そしてそれぞれの標的生体分子に対して当業者によって容易に決定することができる。
【００３１】
標的生体分子が固体支持体結合３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドに接続した、即ち“捕獲された”時点で、固体支持体を濾過のように任意の適した手段によって混合物から分離する。濾過された場合、固体支持体を、好ましくは適した溶媒で洗浄して、標的生体分子を放出することなく結合していない不純物を除去する。洗浄後、捕獲された標的は、固体支持体結合３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドから、任意の適切な手段によって分離することができる。捕獲された生体分子がポリヌクレオチドである場合、適した温度、典型的には約９０℃に暴露することによって二本鎖を変性し、これによって捕獲された一本鎖のポリヌクレオチドを固体支持体結合３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドから放出することができる。次いで固体支持体を、放出された標的ポリペプチドから、例えば濾過によって分離することができる。捕獲された生体分子がタンパク質である場合、固体支持体は適した溶出溶液で洗浄されて、捕獲されたタンパク質は、３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドから放出される。適した溶出溶液は、タンパク質及びポリヌクレオチド配列に依存するものである。
【００３２】
本発明の固体支持体結合３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドは、更に混合物、例えば組織試料から得られた混合物中の、標的生体分子の存在又は非存在を検出するためにも使用することができる。従って、開示された固体支持体結合３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドは、特定の組織型が、特定の配列を有するメッセンジャーＲＮＡ、又はポリヌクレオチド配列と結合することが知られている特定のタンパク質を発現しているか否かを決定するために使用することができる。関心のある標的生体分子（例えば、タンパク質、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ又は一本鎖ＤＮＡ）に選択的に結合する３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドが選択される。適した３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドが所望する標的生体分子に対して選択された時点で、混合物を、それに結合した選択された３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドを有する固体支持体と、３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチド及び標的生体分子間の結合に適した条件下で接触させる。次いで固体支持体結合３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドを混合物から分離し、そして固体支持体結合３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドに接続した標的分子の存在又は非存在を検出するために適した任意の手段によって評価する。別の方法として、固体支持体結合３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドを結合した標的を固体支持体から分離するために適した条件に暴露してから、先に記載したようにその存在又は非存在を評価することができる。
【００３３】
別の方法として、開示された固体支持体結合３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドは、特定のポリヌクレオチド配列に結合する新しいタンパク質の同定のために使用することができる。関心のある配列を有する３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドを調製し、そして先に記載したように固体支持体に接続する。次いで評価されるべき生物学的試料を、固体支持体結合３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドと、３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチド及び標的タンパク質間の結合のために適していると信じられる条件下で接触させる。次いで捕獲されたタンパク質の存在又は非存在を先に記載したように評価する。次いで任意の捕獲されたタンパク質を単離し、そして特徴付けすることができる。未知のものを結合するために必要な正確な条件は、知ることができず、そして同じ試料を多数の結合条件下で評価することができることが理解されるべきである。
【００３４】
例示
実施例１−  ３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドの調製
Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．から入手したアミノで官能化したプライマー固体支持体（Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｏｌｉｄ  Ｓｕｐｐｏｒｔ）を、ＤＭＴ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2ＳＯ2ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯＯ−ニトロフェニルで誘導した。支持体の担持量（ｌｏａｄｉｎｇ）は、約５０μｍｏｌ／ｇ固体支持体であった。
【００３５】
ＤＭＴ−Ｏ−ヘキシルホスホルアミダイト（ｈｅｘｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）の合成は、Ｓｅｅｌａ  ａｎｄ  Ｋａｉｓｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５：３１１３（１９８７），Ｗｉｌｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：２０６５（１９９０）および  Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １６：１９５１（１９９７）中に記載されている手順によって行うことができる。
【００３６】
ＤＭＴ−Ｏ−ヘキシルホスホルアミダイトを、先に記載したアミノ官能化された固体支持体に固相ポリヌクレド合成のために標準的なホスホルアミダイト法を使用してカップリングした。この生成物から、固相ポリデオキシヌクレオチド合成のための標準的プロトコルによって、５’Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシヌクレオシド３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホルアミダイトを使用して、次の３’−Ｏ−置換ポリデオキシヌクレオチド：ＧＧＴ  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＧＧＴ  ＴＧＧ  −ＯＰＯ−（Ｏ−ヘキシル）−ホスフェート（配列番号：１）（トロンビン結合アプタマー）及びＴＡＡ  ＴＡＴ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＣＴＡ  ＴＡＧ  ＧＴＡ  ＡＣＴ  Ｔ−ＯＰＯ−（Ｏ−ヘキシル）−ホスフェート（“ＳＰ２”）（配列番号：２）を調製した。この粗生成物をイオン交換ＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩＴＯＦ質量分析器によって分析し、そして次いでイオン交換クロマトグラフィーによって精製した。所望するプールされた画分を脱塩して、過剰の塩化ナトリウムを除去し、そして得られた生成物をイオン交換ＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩＴＯＦによって再度分析した。これらの物質の純度は、９０％より大きく、予想した分子量を持つことが見出された。リンカーを伴うトロンビン結合アプタマー：分子量は４９７３であり、そしてイオン交換ＨＰＬＣによる純度は９４．４％であり；そしてリンカーを伴うＳＰ２オリゴヌクレオチド：分子量は７９０６であり、そしてイオン交換ＨＰＬＣによる純度は９６．７％であった。
【００３７】
実施例２−  アミノセファロース樹脂上の３’−Ｏ−置換ポリヌクレオチドの固定化
アミノセファロース樹脂をＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈから得た。使用に先立って、この支持体を、水（樹脂の３倍量（３×  ｏｆ  ｒｅｓｉｎ）、０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液（３倍量（３×））、そして再び水（５倍量（５×））で洗浄した。
非特異的結合の研究
約３．０ｍｌの洗浄した樹脂を、約１３０．０光学単位（ｏｐｔｉｃａｌ  ｕｎｉｔ：ＯＤ）のオリゴヌクレオチドＤ（ＴＡＡ  ＴＡＴ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＣＴＡ  ＴＡＧ  ＧＴＡ  ＡＣＴ  Ｔ）−Ｏ−ＰＯ−（Ｏ−ヘキシル）−ホスフェート溶液と共にプラスチックビンに入れた。この懸濁液を時々撹拌しながら室温で２０時間静置した。この懸濁液中に、カップリング試薬ＥＤＣは加えなかった。
【００３８】
この樹脂を焼結ガラス漏斗に移し；液体をドレイン（ｄｒａｉｎ）し、そして目盛り付き試験管に収集した。その後、樹脂を、水、１０ｍＭの水酸化ナトリウムを含有する２．０Ｍの塩化ナトリウム溶液（３×１２ｍｌ）、水（２×１２ｍｌ）、そして最後に塩化ナトリウム溶液（３×１１ｍｌ）で洗浄した。
【００３９】
吸収を、ＡＰＢ分光光度計を使用して２６０ｎｍで測定した。以下の測定値を得た：
１．ドレインされた液体及び水洗液の全吸収は０．０２２であった。
２．ＮａＣｌ／ＮａＯＨ洗液の全吸収は１２６．４６であった。
３．水洗液の全吸収は１．６２であった。
４．ＮａＣｌ及びＮａＯＨ洗液の全吸収は１．５６であった。
洗液から得られた全吸収：１２９．６６ＯＤ。
【００４０】
この結果は、オリゴヌクレオチドのアミノセファロースへの非特異的結合の存在を示し、これは、塩化ナトリウム溶液による洗浄によって完全に除去することができる。
オリゴヌクレオチドの共有的又は特異的連結
１０ＯＤ単位のトロンビン結合アプタマーオリゴヌクレオチド誘導体（０．５４５ｍｌ）を、続いて２００ｍｌのｐＨ６の０．１ＭのＥＤＣ／０．１ＭのＮ−メチル−イミダゾール溶液を、２２０ｍｌの洗浄されたアミノセファロース樹脂に加えた。この懸濁液を室温で３日間インキュベートし、そして次いで５℃で２日間保った。
【００４１】
樹脂の少量の試料を取り出し、そして１０ｍＭの水酸化ナトリウム溶液中の２．０Ｍの塩化ナトリウムで、洗浄溶液の吸収が２６０ｎｍで０．００３の読みを与えるまで洗浄した。次いで樹脂をＭｉｌｌｉ−Ｑ水で洗浄した。次いで約２．５ｍｌの樹脂を１．５ｍｌの１．０Ｎの塩酸溶液で４５ＥＣで６０分間処理した。室温まで冷却し、そして遠心した後、５００：ｌの透明な液を取り出し、１．０ｍｌに希釈し、そして吸収を２６０ｎｍで測定し、そして０．１３０ＯＤであることを見出した。従って、２．５ｍｌの樹脂から溶液中に放出された全ＯＤは０．３９ＯＤ（１．５ｍｌ）であった。樹脂の担持量は０．１５６ＯＤオリゴヌクレオチド／ｍｌ樹脂であった。この結果から、樹脂に担持されたオリゴヌクレオチドの濃度は、１．０４μＭであることが計算された。
【００４２】
約２２０ｍｌの洗浄された樹脂を、プラスチック容器に入れた。３６００ＯＤ単位のトロンビン結合アプタマーオリゴヌクレオチドＧＧＴ  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＧＧＴ  ＴＧＧ−ＯＰＯ−Ｏ−ヘキシル−ホスフェートをこの容器に加え、そして混合した。次いでカップリング溶液（２００ｍｌの０．１ＭのＥＤＣ／０．１ＭのＮ−メチル−イミダゾール溶液、ｐＨ６）を加え、そして溶液を室温で３日間インキュベートした。アリコート（ａｌｉｑｕｏｔｅ）を取り出し、そして塩化ナトリウム溶液、水酸化ナトリウム溶液、水、そして再び塩化ナトリウム及び水酸化ナトリウム溶液で、洗液中に２６０ｎｍの吸収が観察されなくなるまで洗浄した。次いで樹脂を水で洗浄して、水酸化ナトリウムを除去した。
【００４３】
次いで５００μｌの樹脂を、２．０ｍｌの１．０ＮのＨＣｌ溶液と共に１．５時間インキュベートした。得られた透明な溶液の吸収を測定し、そして３．０ＯＤの担持量／ｍｌ樹脂が得られたことを見出した。全体の樹脂（ｂｕｌｋ  ｒｅｓｉｎ）を５ＥＣで更に２日間保ち、そして次いで全体の樹脂を、２．５Ｌの２．０Ｍの塩化ナトリウム、１０ｍＭの水酸化ナトリウム、１．０Ｌの塩化ナトリウム及び１０ｍＭの水酸化ナトリウムで洗浄し；洗液の吸収が０．００２ＯＤであることを見出した。最後に塩化ナトリウム及び塩基を５００ｍｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ水で洗浄することによって除去した。担持量は、再び約１．０ｍｌの洗浄された樹脂を２．０ｍｌの１．０ＮのＨＣｌ中で６０分間４５ＥＣでインキュベートすることによって決定された。透明な液体の吸収を測定し、そして４．８ＯＤの担持量／ｍｌ樹脂が得られたことを見出した。この結果から、樹脂に担持されたオリゴヌクレオチドの濃度が３２．０μＭであることが計算された。
【００４４】
約３０ｍｌの洗浄されたアミノセファロース樹脂を、１００ＯＤ単位のＳＰ２オリゴヌクレオチドを含有する、２５ｍｌの０．１ＭのＥＤＣ／０．１ＭのＮ−メチルイミダゾール溶液と共に室温でインキュベートした。４０時間のインキュベーション後、樹脂のアリコートを取り出し、そして２．０ＭのＮａＣｌ／１０ｍＭのＮａＯＨの溶液で、洗液中に２６０ｎＭの吸収がなくなるまで当該アリコート洗浄した。これの担持量は、先に記載したようにして決定し、そして１．７８μＭであることを見出した。全体の物質を上記の手順に従って洗浄した。再び担持量を決定し、そして約１．７５μＭの濃度であることを見出した。
【００４５】
約３０ｍｌの洗浄された樹脂を、１６０ＯＤ単位のＳＰ２オリゴヌクレオチドを含有する、２５ｍｌの０．１ＭのＥＤＣ／０．１ＭのＮ−メチルイミダゾール溶液と共に室温でインキュベートした。担持量を、２日後（約１２μＭ）、４日後（約２３μＭ）、５日後（約２５μＭ）及び６日後（約２６μＭ  Ｍ）に、先に記載したように推定した。キャッピング前の全体の物質の最終的担持量は、約２７μＭであることが見出された。
【００４６】
樹脂上に担持された約７−８ｍｌのトロンビン結合アプタマーを、安定性の実験に使用した。この樹脂の担持量は、キャッピング前約３２μＭであった。この樹脂を４０ｍｌの１．０ＭのＮａＯＨの溶液（１０×）及び水（４０ｍｌ×３）で洗浄した。この物質の担持量を決定し、そして約３１μＭであることを見出した。次いで樹脂を４０ｍｌの１．０ＭのＮａＯＨ溶液（２０×）、続いて水（４０ｍｌ×３）で洗浄し、そして担持量を約３０．８μＭであると決定した。１．０ＭのＮａＯＨによる洗浄を４０ｍｌで２０回繰り返した。水で洗浄した後、担持量を再度決定し、そして約３０．８μＭであることを見出した。これらの実験は、強塩基溶液による有意な物質の放出がないことを示す。
【００４７】
実施例３−  緩衝された酢酸溶液による担持されたアミノセファロース上の遊離アミノ基のキャッピング
５００ｍｌの酢酸の溶液（０．２Ｍ）を脱イオン水中で調製し、そしてこの溶液のｐＨをＮ−メチルイミダゾールを加えることによって６．０に調節した。約等容量のこの溶液をオリゴヌクレオチドを担持した樹脂に加えた。懸濁液を混合し、そして固体のＥＤＣ（カップリング試薬）を、０．１Ｍの最終濃度まで加えた。
【００４８】
２０時間のインキュベーション後、少量の試料を取出した。それぞれの試料を、水（２０ｍｌ×３）１．０ＭのＮａＯＨ（２０ｍｌ×３）、１．０ＭのＮａＣｌ／１０ｍＭのＮａＯＨ（２０ｍｌ×３）、そして最後に水（２０ｍｌ×２）で洗浄した。洗浄した試料をニンヒドリン溶液で５０℃で５分間処理した。遊離アミンの機能は検出されなかった。
【００４９】
本発明は、特にその好ましい態様に関してこれまでに示し、かつ記載してきたが、形態及び詳細についての各種の変更を、付属の請求項によって包含される本発明の範囲から逸脱することなく本発明内において行うことができることは当業者にとって了解されるであろう。
【国際公開パンフレット】
2005503773.tif 000011
2005503773.tif 000012
2005503773.tif 000013
2005503773.tif 000014
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2005503773.tif 000021
2005503773.tif 000022
2005503773.tif 000023
2005503773.tif 000024
2005503773.tif 000025
2005503773.tif 000026
【国際調査報告】
2005503773.tif 000027
2005503773.tif 000028
2005503773.tif 000029