(57)【要約】  ヒトおよび動物に影響を与える神経変性疾患（例えば、ウシ、ヒツジ、およびネコにおける伝播性海綿状脳症）を担うプリオンタンパク質の病原形態に高い特異性を有する迅速な検出アッセイが提供される。病原性プリオンタンパク質の存在または濃度について動物食糧（例えば、動物飼料）を試験するためのアッセイもまた提供される。結果は、約０．５〜約２０分で、好ましくは、約５から約１０分以内に利用可能となる。このアッセイは、プロテイナーゼＫを用いて生物学的サンプルから正常なプリオンタンパク質を除去し、サンプルは、イムノクロマトグラフィーによって分析されて、病原性プリオンタンパク質の存在および濃度が決定される。プロテイナーゼＫは、干渉成分のインサイチュでの除去のために固体支持体上に固定化されているので、本発明は、その後の所望の検体の抽出を必要としない。
2005509852.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
食品または生物学的サンプルにおいて、病原性プリオンタンパク質の存在を決定するためのアッセイであって、該アッセイは以下の工程：
（ａ）食品または生物学的材料のサンプルを得る工程；
（ｂ）該サンプルとプロテイナーゼＫとを接触させることによって、該サンプルから分析に干渉する成分を除去する工程；
（ｃ）該サンプルを、試験デバイスに適用する工程であって、該試験デバイスは
（ｉ）メンブレン、
（ｉｉ）該メンブレンに固定された抗体、および
（ｉｉｉ）病原性プリオンタンパク質との複合体を形成させるための標識された抗体であって、形成された結果、該複合体は、該固定された抗体に向けて該メンブレンを移動する、抗体、
を備える、工程；
（ｄ）該サンプルにおける該病原性プリオンタンパク質の存在または濃度の指標となる結果を得る工程、
を包含する、アッセイ。
【請求項２】
前記除去する工程は、緩衝液を用いて前記サンプルを均質化することを包含する、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項３】
前記緩衝液は、少なくとも１つの乳化剤または表面活性剤、カゼイン、少なくとも１つのポリサッカリド、およびアルブミンを含む、請求項２に記載のアッセイ。
【請求項４】
前記緩衝液は、約２００ｍＭ〜約４００ｍＭのイオン強度を有する、請求項２に記載のアッセイ。
【請求項５】
前記除去する工程は、約２：１０００〜約２００：１０００の範囲の重量（ｍｇ）／体積（ｍｌ）比率で、緩衝液を用いて前記サンプルを均質化することを包含する、請求項２に記載のアッセイ。
【請求項６】
前記乳化剤または前記表面活性剤は、オクトキシノール、ノノキシノール、ポリグリコールエーテル、ポリオキシエチレン（１０）イソオクチルフェニルエーテル、ドデシル硫酸ナトリウム、およびデオキシコール酸ナトリウムから選択される、請求項３に記載のアッセイ。
【請求項７】
前記病原性プリオンタンパク質は、伝染性海綿状脳症、スクラピー、伝染性ミンク脳症、慢性消耗病、ネコ海綿状脳症、クールー、クロイツフェルト−ヤコブ病、ゲルストマン−シュトロイスラー−シャインカー症候群および致命的家族性不眠症のうちの少なくとも１つと関連する、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項８】
前記サンプルは、脳組織、全血、血清、血漿、唾液、尿および脳脊髄液からなる群より選択される、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項９】
前記サンプルは、ヒト消費のために指定される動物の飼料および動物の部分のうちの一つである、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項１０】
前記結果は、視覚的に読まれる、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項１１】
前記結果は、機器により読まれる、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項１２】
前記結果は、前記サンプルが前記試験デバイスに適用された後、約０．５分から約２０分後以内に生成される、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項１３】
前記結果は、前記サンプルが前記試験デバイスに適用された後、約５分から約１０分以内に生成される、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項１４】
前記得る工程は、前記結果と、既知の応答とを比較して前記病原性プリオンタンパク質の濃度を決定することを包含する、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項１５】
プリオンタンパク質を水性緩衝液中に抽出する工程をさらに包含する、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項１６】
前記除去する工程は、支持体に固定された前記プロテイナーゼＫによりなされる、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項１７】
前記除去する工程は、前記試験デバイスから離れた支持体上に固定されたプロテイナーゼＫによりなされる、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項１８】
前記除去する工程は、前記適用する工程の後になされる、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項１９】
前記除去する工程は、前記試験デバイスにおける前記サンプルに対して行われ、ここで、前記プロテイナーゼＫは、前記メンブレンと流体連絡している支持体に固定される、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項２０】
前記除去する工程は、前記サンプル中に存在する前記病原性プリオンタンパク質すべてを実質的に消化するに十分な量で存在する前記プロテイナーゼＫを用いて行われる、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項２１】
前記除去する工程は、前記サンプル中に存在する全タンパク質１ｍｇあたり、少なくとも３０単位の酵素の量で存在する前記プロテイナーゼＫを用いて行われる、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項２２】
前記プロテイナーゼＫは、ラテックスビーズ、ラテックスでコーティングされたロッド体、マイクロ粒子、ナノ粒子、および多孔性メンブレンから選択される支持体に固定される、請求項１に記載のアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、動物およびヒトにおける疾患について試験するための迅速診断アッセイに関し、より詳細には、プリオンにより引き起こされる疾患を有すると予測される動物およびヒトから得られた生物学的流体および組織、ならびにそのような生物学的流体および組織から製造された食品におけるプリオンの病原性形態を検出するためのアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ヒトおよび動物は、プリオン（細菌、ウイルス、およびウイロイドが感染病原体として参加する異常なタンパク質）による感染の結果として、種々の伝染性神経変性障害を生じる。動物に罹患するプリオン病の例としては、ヒツジおよびヤギにおけるスクラピー、ならびにウシにおけるウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）が挙げられる。動物は、感染した動物から臓器および他の成分（例えば、ウシ乳房および骨粉の形態での骨）から製造された食品を消費することによってプリオン病に接触し得る。ヒトは、４つのプリオン病に感染する。このプリオン病には、クールー、クロイツフェルト−ヤコブ病、ゲルストマン−シュトロイスラー−シャインカー症候群（Ｇｅｒｍａｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）および致命的家族性不眠症が含まれる。ヒトは、クロイツフェルト−ヤコブ病には、例えば、プリオンに感染した牛肉を消費することによって接触し得る。
【０００３】
正常な宿主プリオンタンパク質において生じるコンフォメーション変化は、プリオンとして知られる異常凝集形成性病原性構造へと、その正常なプリオンタンパク質を変換することによって、プリオン病を生じる。プリオンタンパク質の病原性形態は、「ＰｒＰＳＣ」と称され；正常な形態は、「ＰｒＰＣ」と称される。
【０００４】
プリオンの検出は、プリオンが多くの生物学的緩衝液中ではほとんど溶けないこと、およびそのプリオンが溶解に抵抗して強力に凝集することから、困難である。結果として、プリオンを分析するために使用される方法論は、しばしば、時間がかかりそして複雑である。例えば、親水性相互作用クロマトグラフィーは、異常プリオンタンパク質を精製するために使用されてきており、それに続き、キャピラリー電気泳動イムノアッセイが検出のために使用されてきている。Ｓｃｈｍｅｒｒ  ａｎｄ  Ｊｅｎｎｙ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １９：４０９（１９９８）（米国特許第６，１５０，１７２において引用）。
【０００５】
しかし、これらの課題にかからず、当該分野において異常プリオンタンパク質を選択的に検出するための種々のアッセイが知られている。プリオンタンパク質を決定するためのイムノアッセイとしては、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素連結イムノルベントアッセイ）、免疫放射アッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、インサイチュイムノアッセイ（コロイド金、酵素または放射性同位体標識を用いる）、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイおよび血球凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、プロテインＧアッセイ、および免疫電気泳動アッセイがある。
【０００６】
イムノクロマトグラフィーアッセイは、タンパク質を分析する能力に関して知られている。例えば、米国特許第６，１８０，４１７号（Ｈａｊｉｚａｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ．に対して発行）は、イムノクロマトグラフィーアッセイを開示しており、ここで、「サンドウイッチ」および競合形態の両方を特徴としている。米国特許第４，７０３，０１７号（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．に対して発行）および同第５，５９１，６４５号（Ｒｏｓｅｎｔａｉｎに対して発行）は、イムノクロマトグラフィー試験ストリップにおける可視性の粒子を使用する。しかし、これらの特許のこの試験ストリップおよびアッセイは、病原性プリオンタンパク質の抽出および迅速な分析を提供しない。
【０００７】
米国特許第６，２１４，５６５号において、Ｐｒｕｓｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．は、ヒトウシ、ヒツジ、ヤギおよび他の動物からの材料において感染性プリオンタンパク質を単離および検出するための、時間および労働力がかかるアッセイを開示している。このアッセイは、実質的にすべての非感染性プリオンタンパク質を除去するために、均質化されたサンプルをプロテアーゼで処理することを包含する。ついで、処理されたサンプルにおけるプリオンは、プラスチックの支持体に架橋される。次に、抗体含有溶液中にフィルターを浸し、そしてインキュベートし、続いて、結合していない抗体を除去する。この浸漬／インキュベーション／抗体除去工程は、抗Ｉｇ抗体（代表的には放射標識されている）を含む第二の溶液を用いて反復される。結果は、Ｘ線フィルムを用いたイムノブロット検出によって決定される。従来は、このアッセイは、イムノブロット検出のためのフィルターを調製するために少なくとも４時間かかる。
【０００８】
米国特許第６，１５０，１７２号（Ｓｃｈｍｅｒｒ  ｅｔ  ａｌ．らに対して発行）は、均質化された生物学的材料から異常プリオンタンパク質を抽出する工程およびクロマトグラフィーイムノアッセイを用いてその抽出されたタンパク質を分析するための３工程の方法を開示する。この抽出方法は、正常なプリオンタンパク質を予め測定した量のプロテイナーゼＫと生物学的サンプルの水性調製物とをインキュベートして消化する工程、病原性プリオンタンパク質を、予め処理したサンプルと、抽出溶媒とを混合することにより単離する工程、ならびに単離した病原性プリオンタンパク質を、その抽出溶媒において回収する工程を包含する。第４欄、第２１−２６行。この方法は、１〜２時間抽出時間を短縮する。第９欄、第２７−２８行。
【０００９】
Ｓｃｈｍｅｒｒらは、次いで、抽出溶媒が支持体に直接適用され、イムノクロマトグラフィーによってアッセイされ得ることを開示している。以下の米国特許は、この抽出溶媒をアッセイするのに使用され得る、当該分野で公知のイムノクロマトグラフィーアッセイの例を示している：米国特許第５，２４８，６１９号；同第５，４５１，５０４号；同第５，５００，３７５号；同第５，６２４，８０９号；および同第５，６５８，８０１号。参照する方法は、異常なプリオンタンパク質を単離および検出するが、複数の工程を伴い、そして検体を抽出するだけで２時間も必要とする。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、生物学的サンプルおよび動物飼料中の病原性プリオンタンパク質の存在および／または濃度を迅速に決定するためのデバイスおよび簡単なアッセイに対する必要性が存在する。例えば、特に、医療適用におけるプリオン疾患ならびに食肉処理産業における動物飼料中のウシ海綿状脳症および死体動物を検出するために、ナノグラム量の病原性プリオンタンパク質を検出可能な試験デバイスおよびアッセイに対する必要性もまた存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、ヒトまたは動物から得られた生物学的サンプル中の病原性プリオンタンパク質の存在および濃度を決定するためのアッセイである。本発明の各々の局面において、病原形態のプリオンタンパク質は、本質的に、正常な非病原形態のプリオンタンパク質を含まないように容易に抽出され、そしてイムノクロマトグラフィーによって分析される。干渉成分の除去は、サンプル中の実質的に全ての非病原性プリオンタンパク質を消化するプロテイナーゼＫでサンプルを処理することにより達成される。
【００１２】
本発明に従う第１の局面は、生物学的サンプル中の病原性プリオンを検出するアッセイである。このアッセイは、動物またはヒト由来の生物学的サンプルを緩衝液で均質化する工程、および試験デバイスを提供する工程を包含する。試験デバイスは、支持体に固定化されたプロテイナーゼＫ、プロテイナーゼＫ支持体と流体連通したメンブレン、および病原性プリオンタンパク質に特異的な抗体の対を有する。これらの抗体のうち、一方の抗体は、メンブレンに固定化されており、そしてもう一方の抗体は、病原性プリオンタンパク質と複合体（この複合体はメンブレンを通して固定化抗体の方に移動する）を形成するために標識されている。均質化されたサンプルが試験デバイスに適用されると、プロテイナーゼＫは、実質的に全ての干渉成分（例えば、非感染性プリオンタンパク質）を除去する。非病原性プリオンタンパク質を実質的に含まない均質化されたサンプルは、毛細管作用によりメンブレンを通じて移動する。サンプル中に存在する病原性プリオンタンパク質は、両方の抗体と結合し、試験ストリップにおいて応答を生じる。この応答は、サンプル中の病原性プリオンタンパク質の存在または濃度を示すと解釈される。
【００１３】
本発明の第２の局面において、生物学的サンプル中の病原性プリオンタンパク質の存在を検出するためのアッセイが提供される。このアッセイは、例えば、サンプルを適切な緩衝液で均質化することによって分析用サンプルを調製する工程を包含する。分析用試験デバイスも提供される。この試験デバイスは、（ｉ）生物学的サンプルから非病原性プリオンタンパク質を除去するためにプロテイナーゼＫが固定化されている消化パッド；（ｉｉ）病原性プリオンタンパク質に対する抗体対のうちの標識された第１の抗体を有する結合パッド；（ｉｉｉ）病原性プリオンタンパク質の存在または濃度の指標となる応答を生じるために、抗体対のうちの第２の抗体が固定化された試験ストリップを有する。結合パッドは、消化パッドと試験ストリップとの間に配置され、その結果、結合パッドの少なくとも一部が両方のパッドの少なくとも一部に流体連通している。調製サンプルが試験デバイスに適用される場合、サンプルは試験デバイスを通して側方に流れる。サンプルは最初に、実質的に全ての非病原性プリオンタンパク質を消化するプロテイナーゼＫで処理され、次いで、イムノクロマトグラフィーにより分析される。イムノクロマトグラフィーの間に、サンプル中の病原性プリオンタンパク質は、両方の抗体と結合し、応答を生じる。この応答は、サンプル中のプリオンの存在または濃度の指標となると解釈される。
【００１４】
本発明の第３の局面において、食品中の病原性プリオンタンパク質を検出するためのアッセイが提供される。このアッセイは、分析のために食品のサンプルを調製する工程および試験デバイスを提供する工程を包含する。この試験デバイスは、（ｉ）プロテイナーゼＫ、（ｉｉ）メンブレン（メンブレンを通じて、サンプルは毛細管作用により移動し、メンブレンは、プロテイナーゼ支持体と流体連通している）；および（ｉｉｉ）病原性プリオンタンパク質に特異的な抗体の対（メンブレンに固定化された抗体および標識抗体を含む）を含む。調製サンプルは、病原性プリオンタンパク質の酵素処理およびイムノクロマトグラフィー結合のために試験デバイスに適用される。結合により生じる応答は、抗体中の病原性プリオンタンパク質の存在または濃度の指標となると解釈される。
【００１５】
本発明のさらに別の局面において、動物飼料中の病原性プリオンタンパク質を検出するためのアッセイが提供される。このアッセイは、飼料サンプルと、支持体に固定化されたプロテイナーゼＫとを接触させることによって、飼料サンプルから干渉成分を除去する工程を包含する。サンプルは、（ｉ）メンブレン；（ｉｉ）メンブレンに固定化された抗体；および（ｉｉｉ）サンプル中の病原性プリオンタンパク質と複合体を形成し、そしてメンブレンを通して固定化抗体の方に移動する標識抗体を有する試験デバイスに適用される。検体に対する抗体のイムノクロマトグラフィー結合により得られる結果は、飼料中の病原性プリオンタンパク質の存在または濃度を示す。
【００１６】
本発明の最終局面は、生物学的材料における病原性プリオンタンパク質を分析するためのアッセイである。本発明の他の局面に対して、このアッセイは、プロテイナーゼＫ前処理を排除し、そして病原性プリオンタンパク質に対して、特に、高い親和性を有する抗体を利用する。このアッセイは、生物学的サンプルから水性緩衝液へプリオンタンパク質を抽出する工程を包含する。次いで、このプリオンタンパク質含有緩衝液は、試験デバイスに適用される。このデバイスは、（ｉ）均質化されたサンプルが、キャピラリー作用によって移動するメンブレンであって、プロテイナーゼ支持体と流体連通しているメンブレン、および（ｉｉ）病原性タンパク質に対して高い親和性を有する１対の抗体（標識された第１抗体およびメンブレンに固定化された第２抗体を含む）を備える。各抗体は、病原性プリオンタンパク質の異なるエピトープに対して特異的である。サンプル中の病原性プリオンタンパク質は、両方の抗体に結合し、試験結果を生成し得る。応答は、サンプル中の病原性プリオンタンパク質の存在または濃度を示すと解釈される。
【００１７】
本発明の全ての局面において、試験結果は、約０．５〜２０分内、好ましくは、約５〜１０分内に生成される。このアッセイは、動物およびヒトの両方における多数のプリオンが原因の疾患（例えば、ウシ、ヒツジ、およびヤギにおける伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）、ならびにヒトにおけるクロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ））を担うプリオンタンパク質の分析における適用を有する。サンプル調製および分析の簡易性のために、このアッセイは、当該分野（例えば、産業食肉加工および医療適用の両方）における使用に特に適している。
【００１８】
（発明の詳細な説明）
本発明は、多くの異なる形態の実施形態が可能であるが、本発明の好ましい実施形態は、本発明の開示は、本発明の原理の例示としてみなされるべきであり、そして示された実施形態に対する本発明の広い局面を限定することは意図されないという理解とともに、図面に示され、そして本明細書に詳細に記載される。
【００１９】
本発明は、生物学的サンプル中の病原性プリオンタンパク質の存在および濃度を決定するためのイムノクロマトグラフィーを利用する試験デバイス、システムおよび方法に関する。本発明は、干渉成分のインサイチュ除去のための固定化されたプロテイナーゼＫ（ＰＫ）酵素を利用する。このデバイス、システム、および方法は、生物学的サンプル中の検出可能な最小限の量の病原性プリオンタンパク質を定量するのに適している。さらに、高い特異性を有する病原性プリオンタンパク質の迅速検出は、サンプル調製の簡易性と組み合わされて、本発明を当該分野における使用に適するものとする。
【００２０】
試験デバイス、システム、および方法は、プリオン疾患（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、および他の動物におけるスクラピーおよび海綿状脳症）の迅速検出のために使用され得る。さらに、このデバイス、システム、および方法は、クールー、クロイツフェルト−ヤコブ病、ゲルストマン−シュトロイスラー−シャインカー疾患および致命的家族性不眠症についてのヒト組織の分析のために、医学界で使用され得る。
【００２１】
本願全体を通じて、以下の用語は、以下に示される意味を有する。
【００２２】
「生物学的材料」または「生物学的サンプル」とは、脊椎動物から抽出された流体または組織（例えば、脳組織、全血、血清、血漿、唾液、尿、および脳脊髄液）をいう。
【００２３】
「標識」とは、選択されたタンパク質に共有結合される成分または「タグ」をいう。この標識は、多数の検出可能な群（例えば、酵素、可視粒子、ナノ粒子、および蛍光成分など）由来であり得る。
【００２４】
「ＰｒＰＣ」とは、プリオンタンパク質の非病原性形態をいい、これは、生物学的サンプルから酵素的に除去される。
【００２５】
「ＰｒＰＳＣ」は、病原性プリオンタンパク質をいい、これは、本発明の方法における検体である。
【００２６】
（サンプル調製）
本発明の方法、試験デバイスおよびシステムは、動物またはヒトから抽出された生物学的材料と共に使用される。脳組織のサンプル（器官を含む）は、死後抽出されるが、他のサンプル（例えば、尿、全血、血清および血漿）は、生きた動物またはヒトから得られ得る。試験されるサンプルとしては、例えば、動物飼料が挙げられ得る。なぜなら、このような物品は、慣用的に、動物部分（例えば、ウシ乳房、骨粉および他の器官）を用いて作製されるからである。
【００２７】
生物学的サンプルは、緩衝液媒体へのプリオンタンパク質の抽出を最適化するように処方された適量の緩衝液を用いて均質化される。均質化は、当該分野で公知の任意の技術によって達成され得、この技術としては、例えば、生物学的物質の荷重下での振盪、この物質の撹拌、超音波消化、またはホモジナイザーでのサンプルの粉砕が挙げられる。しかし、好ましくは、ホモジナイゼーションは、荷重下での物質の撹拌または振盪によって行われる。
【００２８】
緩衝液は、有機溶媒を有さない。代表的には、緩衝液は、サンプルからのプリオンの抽出を容易にするために、約２００〜約４００ｍＭのイオン強度を有するように処方された水溶液である。この緩衝液は、少なくとも１種の乳化剤または界面活性剤、カゼイン、少なくとも１種のポリサッカリド（例えば、糖）、アルブミン（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））、および混合物を形成するのに十分な量の水を含む。代表的に、乳化剤とは、少なくとも１種の乳化剤または界面活性剤（例えば、オクトキシノール（例えば、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標））、ノノキシノール、ポリグリコールエーテル（例えば、例として、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）  ＮＰ）、ポリオキシチレン（ｐｏｌｙｏｘｙｔｈｙｌｅｎｅ）（１０）イソオクチルフェニルエーテル、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、またはデオキシコール酸ナトリウム）を含む。保存剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）およびアジ化ナトリウム）が使用され得る。ポリサッカリドとしては、例として、少なくとも１種のスクロース、マンニトール、トレハロース、マルトース、および他の適切なポリサッカリドを、約６０〜約８０ｍＭの範囲のモル濃度を生じるのに十分な量で含む。さらに、緩衝液は、変性化合物（例えば、グアニジンヒドロクロリド、尿素およびグアニジンイソチオシアネート）を含み得る。緩衝液はまた、双性イオン性緩衝塩（例えば、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタン−スルホン酸（ＨＥＰＥＳ）を含み得、これは、分析のダウンストリームで使用される酵素のための固体支持体の完全性を維持するために、約１．５〜約５重量％の範囲の濃度で使用される。
【００２９】
乳化剤および界面活性剤の総濃度は、緩衝液の約０．０５〜約５重量％の範囲であり、そしてカゼインは、一般に、緩衝液の約１０〜約４０重量％の範囲である。ポリサッカリドの総濃度は、緩衝液の約０．１〜約３０重量％の範囲である。アルブミンは、代表的には、緩衝液の約０．５〜約４重量％の範囲の濃度で使用される。双性イオン性緩衝剤は、約２〜約５重量％の範囲の濃度で使用され得る。変性剤は、約０．１〜約１Ｍの範囲の濃度で存在し得る。
【００３０】
適切な緩衝液の例を、表１に示す。
【００３１】
（表１．プリオンタンパク質を抽出するための緩衝処方物の例）
緩衝液成分                      濃度（重量％）
オクトキシノール                  ０．１
カゼイン                        ４０．０
ＨＥＰＥＳ                        ３．０
ＥＤＴＡ                          ０．２
トレハロース                      ０．１
スクロース                      １８．５
ＢＳＡ                            １．０
ＮａＣｌ                          １．５
デオキシコール酸ナトリウム        ０．５
ＳＤＳ                            ０．４
水                              ３４．７
ホモジネートを、生物学的サンプルを緩衝液と共に、約２：１０００〜約２００：１０００の範囲、好ましくは約５：１０００〜約１００：１０００の範囲のサンプル（ｍｇ）  対  緩衝液（ｍｌ）の重量／容量比で、ホモジナイズすることによって調製する。最も好ましくは、サンプル（ｍｇ）  対  緩衝液（ｍｌ）の比は、約３０：１０００〜約７０：１０００である。
【００３２】
（Ａ．試験デバイス）
（単一の複合ユニット）
第１の実施形態の試験デバイス１０が、図１に示される。この試験デバイス１０は、ＰｒＰＳＣに特異的な一対の抗体を使用する。これらは、（１）ＰｒＰＳＣを「検出」する標識抗体、および（２）プリオンタンパク質−抗体−標識複合体を「捕獲」して、「サンドイッチ」を形成する、固定化抗体、を含む。簡単には、本発明において、生物学的材料のホモジナイズされたサンプルが、試験デバイスに導入される。好ましい実施形態において、このサンプルは、最初に、固定化プロテイナーゼＫを含む領域を通って移動し、この固定化プロテイナーゼＫは、非病原性プリオンタンパク質を消化し、分析のためのＰｒＰＳＣを残す。このプロテイナーゼＫは、固体支持体に固定される。正常なプリオンタンパク質の除去は、サンプルの干渉を最小限にし、そして検体に対するより高い特性を生じる。試験されたサンプルが試験デバイスを通って移動するにつれて、このサンプルは、標識に結合体化されかつ試験デバイスの一部に固定された、第１の特異的抗体に遭遇する。一実施形態において、この標識は、着色ラテックスビーズである。
【００３３】
均質化されたサンプル中の流体は、抗体−標識結合体を再懸濁させるので、この結合体は、デバイスを通って自由に移動できる。抗体−標識結合体がメンブレンを通って移動すると、標識された抗体は、ＰｒＰＳＣの特定のエピトープに結合して、プリオンタンパク質−抗体−標識複合体を形成する。毛細管力を介して、標識された複合体は、この複合体が第二の特異的抗体に到達するまで、このデバイスの多孔性メンブレンを通って移動する。この抗体は、代表的には、バンドまたはストライプの形態で、メンブレンに固定される。二次抗体は、この抗体が特異的なＰｒＰＳＣの第二のエピトープに結合し、その結果、検体が、これら２つの抗体の間に「サンドイッチ」される。得られる「サンドイッチ」ＰｒＰＳＣは、メンブレンにおいて検出可能な変化（例えば、有色試験線の形成）を生じ、これは、陽性の結果を示す。抗原の非存在下では、「サンドイッチ」複合体が形成せず、そして試験線が現れない。
【００３４】
代替の実施形態において、試験ストリップは、１つより多くの「捕捉」抗体を含み得、これらの各々は、別個の試験線に適用されており、ここで、各試験線は、異なるプリオン疾患に特異的であり、その結果、この試験デバイスは、スクリーニングの目的で使用され得る。
【００３５】
試験デバイス１０は、試験ストリップ１２を備え、この試験ストリップは、前端１４、遠位端１６、およびこれらの間の「試験線」１８を有する。試験ストリップ１２は、細孔（図示せず）を有する吸収剤材料を含み、これらの細孔は、約１０〜約１０００ミクロン、そして好ましくは、約１０〜約１００ミクロンの範囲である。これらの細孔は、一般に、均質化されたサンプル（再懸濁された標識された抗体、およびプリオンタンパク質と結合した標識された抗体によって形成された結合体を含む）を、試験ストリップ１２を横方向に、試験線１８へと移動させるために十分な大きさである。
【００３６】
試験ストリップ自体は、少なくとも１層の吸収剤材料を有する。適切な材料は、例えば、ニトロセルロース、セルロース、ガラス繊維、結合したガラス繊維、ポリエステル、ナイロン、ポリエチルスルホン、および吸収剤特性を有する他の材料（これらの全てが、試験ストリップの一方の端部に適用される水性サンプルを、毛細管作用によって、反対側の端部に移動させる）のうちの少なくとも１つを含む。
【００３７】
図１は、ニトロセルロースメンブレンまたは試験ストリップ１２を、形状が矩形であるとして示すが、試験ストリップは、もちろん、サンプルが導入される地点から検体が検出される地点へと、検体が移動することを可能にする、事実上任意の形状を有し得る。従って、試験ストリップは、正方形、三角形、円形、または八角形、あるいは任意の他の適切な形状であり得る。
【００３８】
図２は、円形の構成を有する試験デバイス１１０を示し、ここで、固定された抗体は、サンプル導入部位１１１から予め決定された距離で付着されている。図２に示される実施形態は、２つのプリオン疾患のための抗体を有し、従って、それぞれの病原性プリオンタンパク質が、同じ試験デバイスにおいて、これらの疾患について分析されることが可能である。試験線１１８ａ、ｂの各々は、異なるプリオン疾患の病原性プリオンタンパク質に対応する、固定された抗体を有し、このことは、このデバイスが、診断ツールとして使用されることを可能にする。任意の試験デバイスが、それらの形状にかかわらず、プリオン疾患以上のものを同時に分析するために使用され得る。
【００３９】
好ましい実施形態において、試験ストリップ１２は、十分に剛性の、不浸透性かつ非反応性の材料（例えば、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、およびポリエチレンテレフタレート）のストリップ支持体１３に付着される。代表的に、このストリップ支持体は、本質的に疎水性であり、最大量の試験サンプルが分析に向けられることを確実にする。好ましい実施形態において、このストリップ支持体は、少なくとも１層の不浸透性材料を含む。
【００４０】
なお別の実施形態において、試験ストリップ全体、および以下に記載される補助的な構成要素は、少なくとも部分的に、このデバイスを環境から保護するための、デバイスホルダ内に収容され得る。この形態の試験デバイスは、より要求が多い試験環境（例えば、屠畜場）における使用に、最も適している。
【００４１】
図１に示される、試験ストリップ１２の前端１４またはその近くに、消化パッド２０が存在し、このパッドは、均質化された生物学的サンプル中に存在する、非病原性プリオンタンパク質を消化するための、固定されたプロテイナーゼＫを含む。消化パッド２０は、一般に、ガーゼのような吸収剤材料であるが、他の適切な材料（例えば、ガラス繊維中のプラスチックフィルタ床、ポリエステル、およびプラスチックを結合したガラス線維など）を含み得る。
【００４２】
プロテイナーゼＫは、消化パッドに共有結合し得るか、または消化パッドに含浸された固体支持体（図示せず）に結合体化し得る。この固体支持体は、例えば、ラテックスビーズ、ラテックスでコーティングされたロッド状本体、マイクロ粒子もしくはナノ粒子、色素または蛍光化合物もしくは化学発光化合物でコーティングされたビーズ、あるいは多孔性メンブレンパッドであり得る。さらに、プロテイナーゼＫは、消化パッドに含まれるゲル化物質中において、消化パッドに組み込まれ得る。消化パッド内のラテックスビーズは、約１〜約１０ミクロンの平均直径を有する。
【００４３】
支持媒体上の酵素の量は、通常、約３０μｇ〜約４００μｇの範囲にわたり、そして好ましくは約１００μｇ〜約３５０μｇの範囲にわたる。使用される酵素の量は、そのサンプル中に存在する実質的に全てのＰｒＰＣを消化するのに十分であるべきである；代表的には、この量は、そのサンプル中に存在する全タンパク質１ｍｇ当たり少なくとも３０単位の酵素である。酵素処理は、プロテインキナーゼＫが非病原性プリオンタンパク質を消化するのに十分な時間および温度で実施される。一般的には、消化は、存在するプリオンの量に依存して、約２５℃〜約６０°の範囲の温度で実施された場合、約２〜約１５分で完了する。
【００４４】
結合パッド２２を、消化パッド２０と試験ストリップ１２との間に、一般的にはこの試験片１２の前方端１４の付近に配置し、そしてＰｒＰＳＣに特異的な抗体のうちの１つの結合された標識（代表的には、粒子）を含浸させる。上述のように、この粒子は、抗体に対して標識として機能し、ニトロセルロースメンブレンの容易な下流検出を可能にする。抗体との結合体化に適切な粒子としては、例として、ラテックスビーズ、ラテックスでコーティングされたロッド体、色素を含む粒子、コロイド状粒子、金属粒子、マイクロ粒子、ナノ粒子、蛍光化合物、化学発光化合物、および磁気ビーズが挙げられる。一実施形態において、この粒子は、色素を充填されるかまたは色素で被覆されたラテックスビーズ（例えば、ブルーラテックスビーズ）である。ラテックスビーズは、代表的に、約５０〜約５００ナノメートルの平均直径、好ましくは約１００〜約３５０ナノメートルの平均直径を有する。磁気ビーズは、約５０〜約３５０ナノメートルの平均直径、好ましくは約１００〜約３００ナノメートルの平均直径を有する。
【００４５】
結合パッドは、任意の吸収性材料または標識された抗体に適切な支持体（例えば、ガラス繊維、ポリエステル、ガラス繊維に結合されたプラスチック、およびその他の不織材料中のプラスチックフィルターベッド）を含む。この結合体パッドは、試験ストリップと直接流体連絡して配列される。
【００４６】
代替の実施形態は、結合パッド２２の反対側で消化パッド２０と流体連絡したフィルターパッド２４を含む。均質化されたサンプルは、フィルターパッド２４（流体サンプルを受容する材料の吸収性パッド）に適用され得、そしてそのサンプルが結合パッド２２に流入することを可能にする。このフィルターパッド２４はまた、このアッセイに干渉し得るより大きな粒子を除去するように機能し得る。フィルターパッド２４は、任意の適切な材料（例えば、ガーゼ、セルロース、酢酸セルロース、その他のポリエステル、および他の多孔性メンブレン）を含み得る。あるいは、このサンプルは、消化パッドへの導入前の別々の工程において濾過され得る。
【００４７】
試験デバイス１０はまた、検出領域２６（図１に示され、そして図４において参照数字「３２６」で示される）を有し、この領域において、ユーザは、試験結果を見得る。この検出領域２６は、このデバイスに組み込まれた場合、試験ライン１８（図４において「３１８」と示される）およびコントロールライン３０（図４において「３３０」と示される）を含む。
【００４８】
図１に示されるように、これら３つのパッドは、後方端においてまたは後方端の付近でフィルターパッド２４が試験ストリップ１２から最も離れたパッドであり、結合パッド２２が試験ストリップ１２と隣接しかつ実質的に整列し、そして消化パッド２０がフィルターパッドと結合パッドの間にあるように、それぞれ上に積み重ねられる。
【００４９】
図３に示される、デバイス２１０の好ましい実施形態において、パッドは、あるパッドの一部のみが、隣接するパッドの一部と接触するように、互いに対して部分的にずらして実質的に同一平面に整列される。代表的に、この接触部分は、隣接パッド間のオーバーレイ（ｏｖｅｒｌａｙ）の形態であり、その結果、隣接パッド間および結合パッド２２２と試験ストリップ２１２との間のオーバーレイは、約０．５〜約５ミリメートルの範囲にわたり、そして好ましくは約１〜約２ミリメートルの範囲である。フィルターパッド２２４、消化パッド２２０、および結合パッド２２２が、図３に示される。好ましい実施形態において、各パッドおよび試験ストリップ２１２の少なくとも一部は、支持体２１３に付着される。これらパッドの選択、形状、サイズ、および互いに対しておよび試験ストリップ２１２に対する位置決めは、必要に応じて最適化され得る。一実施形態において、これらのパッドは１つのパッドの異なる区画であり得る。
【００５０】
パッドの順番は、実質的に上記のとおりであり得る；例えば、フィルターパッドは、検出領域から最も遠くにあり、続いて、消化パッド、次いで、結合パッドとなる。各パッドは、他のパッドのサイズおよび形状にほぼ対応する外縁を有し得るが、他の構成が、本発明の範囲内に包含される。
【００５１】
さらなるパッドは、結合パッドから消化パッドを分離するために必要であり得る。本発明の別の実施形態において、試験ストリップは、消化パッドおよびフィルターパッドの両方として作用する、ＰＫ酵素を含浸された単一のパッド有し得る。任意であるが、スペーサーパッド２２８が、消化パッド２２０と結合パッド２２２との間に配置されて、結合パッドに到達する前の、正常プリオンのより完全な消化を可能にする。
【００５２】
図１に示されるように、検出領域２６には、ＰｒＰＳＣに特異的な第２抗体があり、代表的には「試験ライン」またはストリップの形態でメンブレンに固定される。あるいは、抗体は、試験結果を見ることを可能にするか、そうでなければ視覚的もしくは機器により読み出されることを可能にする任意の適切な配置で付着され得る。別の実施形態において、応答は、既知の応答または標準曲線に対して比較されて、検体の濃度を決定し得る。
【００５３】
別の実施形態において、図１に示されるように、試験デバイス１０は、試験ストリップ１２の遠位端に、ウィッキングパッド２９を備える。このウィッキングパッド２９は、遠位端に液体サンプルを「引き寄せる」ことによって、均質化された液体サンプルの試験ストリップを通した毛細管流を促進する。
【００５４】
一般的に、試験デバイスに導入されたサンプルの量は、マイクロリットルの範囲であり、代表的には、約５〜約５００マイクロリットルであり、好ましくは、約７５〜約１５０マイクロリットルである。
【００５５】
なお別の実施形態において、試験デバイスは、試験が適切に進行していることを示すコントロールラインを備える。試験ラインに対する固定された関係で、コントロールラインは、標識抗体（例えば、免疫グロブリン抗体）に対する抗体を含み、この抗体は、標識抗体と結合して、視覚的に検出可能なラインを生じる。あるいは、コントロールラインは、粒子またはビーズ上の二次抗体（例えば、タンパク質またはビオチン−アビジン結合部位）と結合する抗体であり得る。
【００５６】
試験ラインは、持続性であるが、時間と共に視覚的によりはっきりしたラインになり得る。好ましくは、この試験結果は、均質化されたサンプルが試験ストリップに適用された時点から約２〜約１０分間の間の読み取りである。
【００５７】
本発明は、病原性プリオンタンパク質を、サンプルが試験デバイスに導入された後約０．５〜約２０分以内に、好ましくは約５〜約１０分以内に検出することを可能にする。本発明は、試験ストリップにおける結果の実質的にリアルタイムの読み取りを可能にし、それによって、試験結果がほとんど即座に利用可能となる。従って、本発明の好ましい実施形態は、試験デバイス内での酵素消化を用い、それによって、サンプルは、１つのみの労力投入工程（すなわち、均質化）に供される。しかし、酵素の前処理が試験ストリップと別に実施される場合、イムノクロマトグラフィーフェーズを通じた検出は、変性される正常なプリオンタンパク質の濃度に依存して、サンプル導入後約１〜約５分の間、好ましくは、約２〜約１０分の間に読み取り可能な結果を生じ得る。
【００５８】
（分離酵素前処理のためのデバイス）
ＰｒＰｓｃはまた、（ａ）試験ストリップに均質化サンプルを導入する前に実施される別のウェット分析（ｗｅｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）においてプリオンタンパク質の非病原形態を消化するために、試験ストリップの外側の支持体に固定化されたプロテイナーゼＫ；および（ｂ）ＰｒＰｓｃの存在および濃度について酵素処理したサンプルを分析する試験ストリップを含む試験系を使用することによって生物学的サンプルおよび動物飼料において検出され得る。本発明のこの局面において使用するために適切な、不浸透性片支持体３１３を有する試験デバイス３１０が、図４に示される。試験デバイス３１０は、結合パッド３２２、検出領域３２６、および試験ライン３１８を備える。必要に応じて、試験デバイスはまた、１つ以上のフィルターパッド３２４、スペーサーパッド３２８、コントロールライン３３０、およびウィッキングパッド３２９を備え得る。試験系は、上記のようにして調製されたサンプルと共に使用される。
【００５９】
試験ストリップ（抗体、粒子、結合パッド、および試験ラインを含む）およびその操作は、酵素処理およびアッセイの両方を実施するデバイスについて上述した通りである。さらに、試験ストリップまたはメンブレンは、上記のような、試験が正確に進行しているか否かを決定するためのコントロールラインを組み込み得る。本発明のこの局面において、試験ストリップから分離された固定化酵素を有する支持体は、消化パッドの代わりとなる。
【００６０】
試験系は、例えば、サンプルが消化のために加熱されなければならない場合およびＰＫ処理が加熱なしでリアルタイムで実施できない場合の適用を有する。
【００６１】
試験系は、いくつかの実施形態を含む。１つの実施形態において、支持体は磁気ビーズを含む。代替の実施形態において、支持体は、例えば、ラテックス支持体、フィルターチップ、コロイド状粒子、微結晶粒子、結合支持体、プラスチック表面、およびガラス表面を含む。ラテックス支持体は、例えば、任意の形状のラテックスビーズおよびラテックスコーティング粒子を含む。支持媒体における酵素量は、約３０マイクログラム〜約４００マイクログラムの範囲であり、そして好ましくは、約１００マイクログラム〜約３５０マイクログラムの範囲である。酵素は、サンプル中に存在する全てのＰｒＰｃを実質的に消化するのに十分な量（すなわち、サンプル中に存在する全タンパク質１ｍｇあたり少なくとも３０単位の酵素）で使用される。
【００６２】
サンプルが、例えば、試験管またはビーカー中で支持体と混合される場合、非病原性プリオンタンパク質の酵素消化は、約１５分以内に完了する。消化は、代表的に、約２５℃〜約６０℃の範囲の温度で実施される。
【００６３】
消化後、磁気ビーズは、磁気ラックまたは他の適切なデバイスを用いて混合物から分離され、上清が残る。他の形態の固体支持体は、インラインフィルトレーションまたは任意の他の適切な方法によって処理サンプルから除去される。次いで、上清は、さらなるプリオン検体の抽出を必要とせずに、ＰｒＰｓｃを検出および定量するために試験ストリップに適用される。上記のように、ＰｒＰｓｃの存在下で、試験ストリップは、検出可能な変化を起こし、これはポジティブな結果の指標である。
【００６４】
（Ｂ．アッセイ）
本発明に従って、生物学的サンプルおよび生物学的サンプルを含む他の材料（例えば、動物供給原料（動物飼料））中のＰｒＰｓｃを検出または定量するためのアッセイが提供される。このアッセイは、上記のような試験デバイスおよびシステムを用いて実施される。第１の実施形態において、このアッセイは、上記のような、プロテイナーゼＫのための支持体が試験ストリップとパッド連通しているラテラルフローデバイスまたは試験系を用いて実施される。この実施形態において、支持体は、例えば、ラテックスビーズ、ラテックスでコーティングされたロッド体、マイクロ粒子またはナノ粒子、色素または蛍光化合物もしくは化学発光化合物でコーティングされたビーズ、あるいは多孔性メンブレンパッドであり得る。さらに、プロテイナーゼＫは、消化パッドに含まれるゲル化材料中に組み込まれ得る。
【００６５】
第２の実施形態において、このアッセイは、プロテイナーゼＫに対する支持体が多孔性メンブレンの外側にある試験系または試験デバイスを用いて実施される。この支持体は、例えば、磁気ビーズ、ラテックス支持体、フィルターチップ、コロイド粒子、結合支持体、プラスチック表面、またはガラス表面であり得る。
【００６６】
このアッセイの第１の実施形態は、実質的に上記のように、サンプルを適切な緩衝液で均質化する工程、および均質化されたサンプルを試験デバイス（例えば、上述され図１に示される複合体（ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ））に適用する工程を包含する。サンプルは、消化パッドまたはフィルターパッドに直接適用され得るか、またはこのようなパッドのいずれかにおいて濾過され得る。しかし、好ましくは、濾過は、このデバイスによって、直接的に、インサイチュで達成される。
【００６７】
消化パッドにおいて、均質化されたサンプルは、固定化されたプロテイナーゼＫで処理される。均質化されたサンプルおよびＰｒＰｓｃは、このデバイスを通って流れるにつれて、標識（例えば、着色ビーズまたは他の粒子）に結合された抗体は、ＰｒＰｓｃに結合して標識複合体を形成する。毛細管力によって、標識抗体ＰｒＰｓｃ複合体は、検出帯メンブレンを通って固定化抗体の方に移動し、固定化抗体と複合体を形成してメンブレン上で視覚的かまたはそうでなければ読み取り可能な応答を生じる。この応答は、ＰｒＰｓｃの存在または濃度の指標である。
【００６８】
第２の実施形態は、実質的に上記のように、サンプルを適切な緩衝液で均質化する工程、および固定化されたプロテイナーゼＫを有する支持体を均質化されたサンプルと接触させる工程を包含する。この酵素が、実質的にそして好ましくは完全に、非病原形態のプリオンタンパク質を消化した後、酵素処理サンプルは、イムノクロマトグラフィーによってプリオンタンパク質を分析するラテラルフローデバイスに適用される。視覚的にかまたは機器により読み取り可能な結果は、サンプル中の病原性プリオンタンパク質の存在または濃度に相関する。
【００６９】
このアッセイはまた、動物用食料（例えば、動物飼料）中の病原性プリオンタンパク質の存在を検出するのに適している。本発明のこの局面において、このアッセイは、（ａ）適切な緩衝液中で動物飼料のサンプルを均質化する工程；（ｂ）サンプル中の非病原性プリオンタンパク質を、支持体に固定化されたプロテイナーゼＫで酵素処理する工程；および（ｃ）均質化されたサンプルを試験デバイスに適用する工程、を包含する。試験デバイスは、実質的に上記の通りであり（すなわち、多孔性メンブレンを有し、このメンブレンを通して、非病原性プリオンタンパク質を実質的に含まないサンプルは、毛細管作用により移動し、メンブレンは、プロテイナーゼ支持体と流体連通している）；そして病原性プリオンタンパク質に特異的な抗体の対（それらの抗体のうちの一方は、病原性プリオンタンパク質を検出するためにメンブレンに固定化されており；そしてそれらの抗体のうちの他方は、病原性プリオンタンパク質と複合体（複合体は固定化抗体の方に移動する）を形成するために標識されている。分析はクロマトグラフィーを通して進行し、動物食糧中の病原性プリオンタンパク質の存在または濃度の指標となる結果をもたらす。
【００７０】
酵素支持体は、上記のような、ラテックスビーズ、ラテックスでコーティングされたロッド体、マイクロ粒子もしくはナノ粒子、または多孔性メンブレンであり得る。支持体に固定化されたプロテイナーゼＫの量は、サンプル中の全てのタンパク質（約３０マイクログラム〜約４００マイクログラム、好ましくは、約１００マイクログラム〜約３５０マイクログラムの範囲）を実質的に消化するのに十分である。抗体および標識は上記の通りである。
【００７１】
均質化工程において使用される緩衝液は、プリオンタンパク質の抽出を容易にする。この緩衝液は、少なくとも１つの乳化剤もしくは界面活性剤、カゼイン、少なくとも１つのポリサッカライド、塩、アルブミン、および混合物を形成するのに十分な量の水を含む。代表的には、緩衝液は、約２００〜約４００ｍＭのイオン強度を有する水溶液である。均質化工程において、サンプルは、約２：１０００〜約２００：１０００の範囲の重量（ｍｇ）／容積（ｍｌ）比の緩衝液で均質化される。
【００７２】
検体の存在下で生じる試験ラインの強度の比較は、サンプル中の検体の量を定量するために使用され得る。このような比較は、視覚的に、機器によって、または機器による読み取りを用いた標準曲線によってなされ得る。
【００７３】
本発明の別の実施形態は、動物飼料またはヒトもしくは動物から得られた生物学的材料のサンプル中の病原性プリオンタンパク質の存在または濃度を決定するためのアッセイである。この実施形態において、アッセイは、プロテイナーゼＫ前処理工程を必要とせず、そして病原性プリオンタンパク質に対して特に高い親和性を有する抗体を用いて実施され得る。このアッセイは、適切な水性緩衝液中で、上記の重量：容積比でサンプルを均質化しプリオンタンパク質を抽出する工程を包含する。溶媒は、約２００〜約４００ｍＭの範囲のイオン強度を有する。ホモジネートは、固定化酵素なしで、上記のように試験デバイスに適用される。この試験デバイスは、多孔性メンブレン（メンブレンを通して、均質化されたサンプルが毛細管作用により移動し、メンブレンは、プロテイナーゼ支持体と流体連通している）；および病原性プリオンタンパク質に特異的な抗体の対を含む。一方の抗体は、病原性プリオンタンパク質を捕捉するためにメンブレン上に固定化されており、他方の抗体は標識されており、そして病原性プリオンを検出するために病原性プリオンタンパク質と複合体を形成する。この複合体は、固定化抗体の方に移動し、抗体に結合すると、検出可能か、そうでなければ読み取り可能な応答を生じる。この応答は、サンプル中の病原性プリオンタンパク質の存在または濃度を示す。
【００７４】
この実施形態において使用される抗体は、病原性プリオンのタンパク質に対して高い親和性を有し、それらは、外来の材料（例えば、非感染形態のプリオンタンパク質）から干渉を受けることなく、プリオンタンパク質のエピトープに結合し得る。この抗体は、Ｃａｓｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｏｈｉｏから入手され得る。
【００７５】
本発明に従うアッセイは、試験デバイスにおいて実質的にリアルタイムの結果の読み取りを可能とし、それらはほぼ即座に利用可能である。干渉成分のインサイチュでの酵素消化は、サンプルが、デバイスへの導入前に均質化工程のみに供されることを必要とする。しかし、酵素の前処理が、試験ストリップとは別々に実施される場合、イムノクロマトグラフィーフェーズを介した検出は、変性される正常なプリオンタンパク質の濃度に依存して、サンプル導入の約１〜約５分後、好ましくは約２〜約１０分後に読み取り可能な結果をもたらし得る。他の場合、結果は、ホモジネートがラテラルフローデバイスに導入された約０．５〜約２０分後に利用可能となる。
【００７６】
特定の実施形態が例示され説明されているが、本発明の意図および保護範囲から大きく逸脱することなく想起される多くの変更は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【００７７】
本発明を理解するために、本発明は、添付の図面を参照して例として記載される。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】図１は、本発明の教示に従った試験デバイスの１実施形態の側面斜視図である。
【図２】図２は、本発明に従った試験デバイスの別の実施形態の側面斜視図である。
【図３】図３は、本発明に従って作製された試験デバイスの別の実施形態の上面概略図である。
【図４】図４は、本発明に従って作製された試験デバイスのなお別の実施形態の側面斜視図である。
【図１】
2005509852.tif 000003
【図２】
2005509852.tif 000004
【図３】
2005509852.tif 000005
【図４】
2005509852.tif 000006
【国際調査報告】
2005509852.tif 000007