(57)【要約】本発明は進行中の自己免疫疾患の防止および処置に有用なＤＮＡ予防接種に関する。本発明の組成物および方法は、好ましくは２つの５’プリンおよび２つの３’ピリミジンにより挟まれたモチーフ中のＣｐＧオリゴヌクレオチドを特徴とする。ワクチンはさらに、特異的抗原をコードするＤＮＡまたはペプチド抗原自体を含んで成ることができる。本発明はＩＤＤＭについて例示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣｐＧモチーフを含んで成る配列を持つＤＮＡ分子を含んで成る効果的な量のＤＮＡワクチンで自己免疫疾患を有する患者に予防接種することを含んで成る、進行中の自己免疫疾患の処置法。
【請求項２】
上記自己免疫疾患がインスリン−依存性糖尿病である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記ＤＮＡ分子が、５’側で２つのプリンにより、そして３’側で２つのピリミジンにより挟まれたジヌクレオチドＣＧを含んで成る配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記配列がＡＡＣＧＴＴを含んで成る、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
上記ＤＮＡワクチンが、Ｈｓｐ６０、ｐ２７７、ｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）およびｐ１２から成る群から選択されるペプチドまたはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列をさらに含んで成る、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
さらにＨｓｐ６０、ｐ２７７、ｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）およびｐ１２から成る群から選択されるペプチドまたはポリペプチド分子を投与する工程を含んで成る、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
ペプチドまたはポリペプチドがＤＮＡワクチンと同時に投与される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ペプチドまたはポリペプチドがＤＮＡワクチンと別に投与される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
ＣｐＧモチーフを含んで成る配列を持つＤＮＡ分子を含んで成る効果的な量のＤＮＡワクチンを用いて、自己免疫疾患の防止が必要な個体に予防接種することを含んで成る、自己免疫疾患の防止法。
【請求項１０】
上記自己免疫疾患がインスリン−依存性糖尿病である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
上記ＤＮＡワクチンが、５’側で２つのプリンにより、そして３’側で２つのピリミジンにより挟まれたジヌクレオチドＣＧを含んで成る配列を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
上記配列がＡＡＣＧＴＴを含んで成る、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
上記ＤＮＡワクチンが、Ｈｓｐ６０、ｐ２７７、ｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）およびｐ１２から成る群から選択されるペプチドまたはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列をさらに含んで成る、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
さらにＨｓｐ６０、ｐ２７７、ｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）およびｐ１２から成る群から選択されるペプチドまたはポリペプチド分子を投与する工程を含んで成る、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
ペプチドまたはポリペプチドがＤＮＡワクチンと同時に投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ペプチドまたはポリペプチドがＤＮＡワクチンと別に投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
進行中の自己免疫疾患の処置または防止のためのワクチンを調製するためのＣｐＧモチーフを含んで成るＤＮＡ分子の使用。
【請求項１８】
自己免疫疾患がインスリン−依存性糖尿病である、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
上記ＤＮＡ分子が、５’側で２つのプリンにより、そして３’側で２つのピリミジンにより挟まれたジヌクレオチドＣＧを含んで成る配列を有する、請求項１７に記載の使用。
【請求項２０】
上記配列がＡＡＣＧＴＴを含んで成る、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
上記ＤＮＡワクチンが、Ｈｓｐ６０、ｐ２７７、ｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）およびｐ１２から成る群から選択されるペプチドまたはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列をさらに含んで成る、請求項１７に記載の使用。
【請求項２２】
上記ワクチンがＨｓｐ６０、ｐ２７７、ｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）およびｐ１２から成る群から選択されるペプチドまたはポリペプチド分子をさらに含んで成る、請求項１７に記載の使用。
【請求項２３】
ＩＤＤＭに関連するペプチドまたはポリペプチド抗原をコードするＤＮＡ配列を含んで成るＤＮＡワクチン。
【請求項２４】
上記ＣｐＧモチーフが、Ｈｓｐ６０、ｐ２７７、ｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）およびｐ１２から成る群から選択されるペプチドまたはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列をさらに含んで成る、請求項２４に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項２５】
ＣｐＧモチーフをさらに含んで成る、請求項２３に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項２６】
上記ＣｐＧモチーフが、５’側で２つのプリンにより、そして３’側で２つのピリミジンにより挟まれたジヌクレオチドＣＧを含んで成る配列を有する、請求項２４に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項２７】
上記ＣｐＧモチーフがＡＡＣＧＴＴを含んで成る、請求項２４に記載のＤＮＡワクチン。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
発明の分野
本発明は、自己免疫疾患、そして特にインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）の防止または処置に関する方法、そしてより詳細にはワクチンがＣｐＧモチーフを含むＤＮＡ分子を含むそのような方法に関する。
【０００２】
発明の背景
ＤＮＡの予防接種は感染性病原体（Ｔａｓｃｏｎ ｅｔ ａｌ，１９９６）およびガン（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ，１９９９）に対する防御を誘導し、そして自己免疫プロセスをモジュレートする（Ｗａｉｓｍａｎ ｅｔ ａｌ，１９９６）ための効率的な取り組みである。裸（ｎａｋｅｄ）の発現ベクターを筋肉内に注射した後、プラスミドＤＮＡは筋肉細胞により取り込まれ、そしてエピソームで維持され、コードされた抗原の発現を可能とする（Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ，１９９２）。すなわちＤＮＡの単回または反復注射後、コードされたタンパク質に対する細胞性および／または体液性免疫応答が生成し、そして長寿（ｌｏｎｇ−ｌｉｖｅｄ）記憶リンパ球が誘導される（Ｈａｓｓｅｔｔ ｅｔ ａｌ，２０００）。これらの記憶細胞は調節機能を有し、したがって自己免疫状態のモジュレーションの道具として役立つかもしれない。
【０００３】
ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ−ＯＤＮ）は、主に細菌に存在する免疫刺激配列である（Ｌｉｐｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ １９９８；Ｋｒｉｅｇ ｅｔ ａｌ １９９８；およびＫｒｉｅｇ ｅｔ ａｌ １９９９）。細菌ＤＮＡは、２個の５’プリンおよび２個の３’ピリミジンにより挟まれた中央にある非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドから成る免疫刺激モチーフを含む（Ｋｌｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ，１９９７）。ＣｐＧモチーフは哺乳動物ゲノムではＣｐＧサプレッションおよびＣｐＧメチル化の組み合わせにより十分に表示されない（Ｋｌｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ，１９９６）。このモチーフがＴｈ１応答をインビボで刺激することが報告された（Ｋｌｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ，１９９６）。この理由から、このモチーフを含む１本鎖ＤＮＡが体液性および細胞性免疫応答の両方の強力なアジュバントとして役立つことが示唆された（Ｌｉｐｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ １９９７、Ｋｒｉｅｇ ｅｔ ａｌ １９９８）。ＣｐＧモチーフを含むホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドの腫瘍内注射が、樹立された腫瘍の拒絶を誘導し、すなわちヒトのグリオーマにおける新規な免疫療法的取り組みを表し、これにより腫瘍抗原の選択および精製の必要性が克服される（Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ ２０００）。
【０００４】
国際公開第９９／５２５４７号明細書は、ＣＤ−１抗原または脂質抗原およびＴ−細胞刺激化合物を含んで成るワクチン組成物を開示する。特許請求された免疫アジュバントの１つはＣｐＧモチーフを含有するアジュバントであるが、このモチーフが特異的抗原無しに効率的であることは示唆していない。ワクチン組成物は自己免疫疾患を含む障害に有用である。
【０００５】
国際公開第００／０１４２１７号明細書は、免疫系に効果を有し、そして遺伝子療法で使用するＧ−モチーフオリゴヌクレオチドを開示する。この発明はまた、自己免疫疾患およびＴｈ１−媒介疾患を含む障害を防止し、または処置するための医薬組成物を調製するためのクレームされたオリゴヌクレオチドの使用にも関する。
【０００６】
国際公開第９９／５８１１８号明細書は、ＣｐＧ−オリゴヌクレオチドを使用した造血を調節する方法を開示する。この発明は免疫系の障害を処置するためにＣｐＧを含有するオリゴヌクレオチドを使用した造血を調節する方法に関する。特にこの発明は造血を調節することによる血小板産生および貧血を処置する方法に関する。この発明はまた、造血を制御するためにＣｐＧオリゴヌクレオチドを投与することにより、免疫系リモデリングの調節法に関する。
【０００７】
米国特許第５，８５６，４６２号明細書は、遺伝子発現およびアンチセンス療法の研究に有用な修飾化ＣｐＧジヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを開示する。この発明は遺伝子発現を阻害し、そして通例のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドよりも少ない副作用を生じる修飾されたオリゴヌクレオチドを提供する。この発明はさらに、異型の（ａｂｅｒｒａｎｔ）遺伝子発現により引き起こされる疾患の治療的処置にそのような使用を含む、遺伝子発現をインビボでモジュレートするためのそのようなオリゴヌクレオチドの使用法を提供する。
【０００８】
ＤＮＡ予防接種に加えて、自己免疫疾患の他の抗原特異的な処置も提案された。ペプチド療法は、ＩＤＤＭを含め細胞性免疫応答により媒介される幾つかの自己免疫疾患に示唆された。ペプチド療法は進行中の免疫プロセスをモジュレートするための方法になり得ると考えられる。
【０００９】
ＮＯＤマウスは、膵臓のインスリン−生産β細胞の破壊を導く自己免疫プロセスの結果として自然にインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）を発症する（Ｔｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ，１９９６）。幾つかの抗原が糖尿病誘発性Ｔ−細胞の標的として同定され、それらにはインスリンのようなβ−細胞特異的タンパク質、ＧＡＤのような非β−細胞制限（ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ）抗原、およびさらに熱ショックタンパク質６０のような偏在する抗原を含む（Ｈｓｐ６０、Ｔｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ，１９９６）。糖尿病の発症は、Ｈｓｐ６０およびｐ２７７と名付けられた完全な分子のアミノ酸４３７および４６０を含んで成るＨｓｐ６０ペプチドに対するＴ細胞の反応性が上昇することにより進行することが示された（Ｅｌｉａｓ ｅｔ ａｌ，１９９１）。初期のＴ細胞反応性とは対照的に、Ｈｓｐ６０およびｐ２７７に対する抗体は、破壊的なプロセスが終了した時、臨床的な糖尿病の発症から数カ月後に、疾患の自然な経過において後期に検出できるだけである（Ｋｒａｕｓｅ ｅｔ ａｌ，１９９９）。ＮＯＤマウスに投与した不完全フロインドアジュバント中のペプチドｐ２７７は、糖尿病の進行を阻止することができる（Ｅｌｉａｓ ｅｔ ａｌ，１９９５）。さらにｐ２７７処置は高血糖症の臨床的な発病の後でも、進行したインスリン炎の寛解を誘導することができる（Ｅｌｉａｓ ｅｔ ａｌ，１９９４）。成功裏の処置にはｐ２７７に対する自然発生Ｔ−細胞反応性のダウンレギュレーション、およびｐ２７７に対する抗体の誘導が関係し；これらの抗体はＴｈ２関連アイソタイプを有するか（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｂ）、そうでなければ若いＮＯＤマウスには見いだされない（Ｅｌｉａｓ ｅｔ ａｌ，１９９７；Ａｂｌａｍｕｎｉｔｓ ｅｔ ａｌ，１９９８）。
【００１０】
細菌のＤＮＡが自己免疫炎症に及ぼす効果は知られている。細菌のＤＮＡは、２個の５’プリンおよび２個の３’ピリミジンにより挟まれた中央にある非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドから成る免疫刺激モチーフを含む（Ｋｌｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ，１９９７）。ＣｐＧモチーフは哺乳動物ゲノムではＣｐＧサプレッションおよびＣｐＧメチル化の組み合わせにより十分に表わされない（Ｋｌｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ，１９９６）。しかし細菌ＤＮＡによる自己免疫状態のモジュレーションがすでに報告された。Ｇｉｌｋｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ（１９９６）は、細菌ＤＮＡを用いた免疫感作が自己免疫ＮＺＢ／ＮＺＷマウスにおける腎臓疾患をモジュレートすることができ、一方ウシ胸腺ＤＮＡは効果的でなかったことを示した（Ｇｉｌｋｅｓｏｎ，１９９６）。さらに腎臓疾患における改善は、免疫感作直後の糸球抗原に対する抗体の誘導と関連した（Ｇｉｌｋｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ，１９９６）。Ｂｏｃｃａｃｉｏおよび彼の共同研究者は、非−コードプラスミドＤＮＡがインビボでＩＦＮγを活性化するその能力によりＥＡＥを阻害できると報告した（Ｂｏｃｃａｃｉｏ ｅｔ ａｌ，１９９９）。
【００１１】
従来技術において、ＣｐＧモチーフを含むＤＮＡ分子が一般に、または特にＩＤＤＭにおいて自然に進行する、または自然発生的な自己免疫疾患の防止または処置にワクチンとして使用できることはどこにも教示または示唆されていない。
【００１２】
発明の要約
本出願の目的は、ＣｐＧモチーフを含むＤＮＡ分子を含んで成るワクチンを提供することである。本発明の別の目的は、自己免疫疾患、特にインスリン−依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）の防止または処置のための方法を提供することである。
【００１３】
糖尿病のＤＮＡに基づく治療の可能性を調査するために、本発明者は熱ショックタンパク質−６０（Ｈｓｐ６０）をコードするＤＮＡ構築物を用いた免疫感作が自己免疫をモジュレートし、そして疾患の発症を防止できるかどうかを調査することを計画した。驚くべきことには、Ｈｓｐ６０含有構築物だけでなく、空ベクター（ｐｃＤＮＡ３）も糖尿病の発症を下げることができた。実際、構築物中に存在するＣｐＧオリゴヌクレオチドモチーフはそれ自体で、ＮＯＤ糖尿病の発症を抑制するために使用することができた。Ｈｓｐ６０の不存在にもかかわらず、効果的処置はＨｓｐ６０自己反応性に及ぼす特異的免疫効果：Ｈｓｐ６０およびそのペプチド同族体ｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）に対する自然発生Ｔ−細胞増殖のダウンレギュレーション、およびこれらの分子に対する特異的抗体の誘導に関連した。
【００１４】
したがって本発明は、ＣｐＧモチーフを含む分子であるＤＮＡワクチンを投与することによる自己免疫疾患の処置または防止法に関する。ＣｐＧモチーフは好ましくは、５’側で２つのプリンにより、そして３’側で２つのピリミジンにより挟まれたジヌクレオチドＣＧであり、そしてもっとも好ましくはＡＡＣＧＧＴである。
【００１５】
本発明はさらに、自己免疫疾患、特にＩＤＤＭに関連するペプチドまたはポリペプチド抗原をコードするＤＮＡ配列を含んで成るＤＮＡワクチンに関する。
【００１６】
これらのワクチンはさらに、Ｈｓｐ６０、ｐ２７７、ｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）およびｐ１２、ならびに例えば米国特許第５，７８０，０３４号、同第６，０９６，３１４号、同第６，１８０，１０３号および同第６，１１０，７４６号明細書および国際公開第９６／１９２３６号および同第９７／０１９５９明細書（これらの全内容は引用により本明細書に編入する）に開示された他の抗原を含む糖尿病の処置に使用されて来た抗原をコードするＤＮＡを含むこともできるが、そのような抗原をコードするＤＮＡよりはワクチンはペプチドまたはポリペプチド抗原自体を含んでもよい。これらのペプチドまたはポリペプチド抗原は、ＤＮＡワクチンと同時に、または独立して投与することができる。そのようなＤＮＡワクチン単独またはそのようなＤＮＡまたはペプチド分子を一緒に投与することを含んで成る自己免疫疾患の防止および処置法は、本発明の範囲内である。
【００１７】
ＣｐＧモチーフを含んで成るＤＮＡ分子を、進行中の自己免疫疾患、特にＩＤＤＭの処置または防止のためのワクチンの調製に使用することは、本発明の別の観点を表す。
【００１８】
発明の詳細な説明
本出願の目的は、ＣｐＧモチーフを含むＤＮＡ分子を含んで成るワクチンを提供することである。本発明の別の目的は、自己免疫疾患、特にインスリン−依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）の防止または処置のための方法を提供することである。
【００１９】
本発明は、ＮＯＤ糖尿病に特異的な免疫療法としてＨｓｐ６０を含むＤＮＡ予防接種の効力を試験するための調査過程で見いだされた。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＨｓｐ６０プラスミドの特異的免疫原性（図１Ａおよび１Ｂ）が最初に確認された。しかしＤＮＡ処置をＮＯＤマウスで使用した時に３つの予期せぬ考察がなされた。
【００２０】
最初に、Ｈｓｐ６０をコードするいかなる配列も含まないｐｃＤＮＡ３プラスミドが、ｐＨｓｐ６０プラスミドのように糖尿病発症の抑制に効果的であった（図２および３）。第２に、ｐｃＤＮＡ３プラスミドはＨｓｐ６０の不存在にもかかわらず、ＮＯＤの糖尿病誘発性プロセスに本質的なＨｓｐ６０に対する自己免疫に特異的な効果（Ｔ−細胞増殖のダウンレギュレーションおよび全Ｈｓｐ６０およびそのペプチド同族体ｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）に対するＩｇＧ２ｂ抗体の誘導）を及ぼすことができた。ＮＯＤ糖尿病に深く関係する他の抗原、ＧＡＤおよびインスリンに対する応答は、検出されなかった（図４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、７Ａおよび７Ｂ）。第３に、ＣｐＧオリゴヌクレオチドはそれ自体が、Ｈｓｐ６０自己免疫および糖尿病に及ぼすｐｃＤＮＡ３プラスミドの効果を本質的に再生することができた（５Ａ、５Ｂ、６、７Ａおよび７Ｂ）。
【００２１】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドは主に細菌に存在する免疫刺激配列であり（Ｌｉｐｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ，１９９８；Ｋｒｉｅｇ ｅｔ ａｌ，１９９８；およびＫｒｉｅｇ，１９９９）、そしてＣｐＧを使用したこの結果は、細菌の感染がＮＯＤマウスにおける糖尿病の発症を抑制することができるメカニズムを説明しているのかもしれない（Ａｔｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ，１９９９）；細菌の感染はＣｐＧ刺激を供給することができる。
【００２２】
Ｈｓｐ６０およびペプチドｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）に対する抗体がＩｇＧ２ｂアイソタイプであったことは注目に値する（図７Ａおよび７Ｂ）。ＩｇＧ２ｂ抗体の生産に必要なサイトカインはＴＧＦαであり、その抑制効果が知られている（ＭｃＩｎｔｙｒｅ ｅｔ ａｌ，１９９３およびＳｎａｐｐｅｒ ｅｔ ａｌ，１９９３）。ＴＧＦαはＴｈ２−関連サイトカインであり、これはＮＯＤマウスを糖尿病から保護することが示された（Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ，１９９８）。ＤＮＡ予防接種はＨｓｐ６０およびペプチドｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）に特異的な、ＩＦＮγに依存的であると考えられているＩｇＧ２ａサブクラスの抗体も誘導したが、これらの抗体の量はＩｇＧ２ｂ抗体の量よりは有意に少なかった。すなわちサイトカインのバランスはＴｈ２応答に重きがおかれ、ＤＮＡの治療的効果がＴｈ２−様Ｔ細胞の活性化に関連するかもしれないことを示唆していた。Ｔｈ２−様Ｔ細胞の活性化はまた、Ｈｓｐ６０に由来するペプチドｐ１２またはｐ２７７の投与により、ＮＯＤの自然発生糖尿病が防止された時にも説明された（Ｅｌｉａｓ ｅｔ ａｌ，１９９７ およびＢｏｃｋｏｖａ ｅｔ ａｌ，１９９７）。そのようなＴ細胞は、β−細胞への傷害に関与すると考えられるＴｈ１細胞を抑制するかもしれない（Ｂｏｃｋｏｖａ ｅｔ ａｌ，１９９７）。
【００２３】
ｐｃＤＮＡ３により、またはＣｐＧオリゴヌクレオチドを用いた処置により、あるいはＣｐＧオリゴヌクレオチドにより誘導された、糖尿病から保護されたマウスにおけるＨｓｐ６０およびｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）に対する抗体の源は（図５Ａ）、種に特異的である。ＢＡＬＢ／ｃマウスはｐｃＤＮＡ３を注射した時にこれらの抗体を生産しなかった（図１Ａ）。ＮＯＤマウスはＨｓｐ６０およびｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）に対して自然発生自己免疫応答を現すようであり、これは図４Ａおよび４Ｂに表す。Ｈｓｐ６０およびｐ２７７に対する免疫は、疾患の発症前にＴ細胞の反応性のピークとして現れる（Ｅｌｉａｓ ｅｔ ａｌ，１９９９およびＢｉｒｋ ｅｔ ａｌ，１９９６）。明白な糖尿病の発病から数カ月後、Ｈｓｐ６０およびｐ２７７に対する抗体を検出することができる（Ｋｒａｕｓｅ ｅｔ ａｌ，１９９９）。ＤＮＡ処置後、Ｔ細胞増殖応答は縮小し、そして抗体、ほとんどＩｇＧ２ｂの生産に置き換わる。これは事前に存在する自己免疫応答（ＮＯＤマウスに自然に生じる）が、細菌のＤＮＡまたはＣｐＧモチーフにより活性化された後にその表現型を変え、Ｔｈ−２様のＩｇＧ２ｂ抗体の誘導を導くことを示唆している。同様に、モノクローナル抗体を用いた狼瘡のイディオタイプ的誘導によるＮＯＤ糖尿病の防止も、Ｈｓｐ６０およびｐ２７７に対する特異的抗体の誘導が関連した（Ｋｒａｕｓｅ ｅｔ ａｌ，１９９９）。このようにたとえＨｓｐ６０およびｐ２７７に対する抗体の誘導が特異的な免疫感作から生じない時でも、そのような抗体の出現は糖尿病誘発プロセス阻止の指標として役立つと思われる。
【００２４】
ＣｐＧモチーフはインビボでＴｈ１応答を刺激する（Ｋｌｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ，１９９６）。従来はＴｈ１表現型に関連していたこのモチーフが今、Ｔｈ２が媒介すると知られている糖尿病の抑制に予期せずに効果的であると開示する。このパラドックスは自然発生糖尿病の動物モデルで観察された。Ｐｏｌｙ−Ｉ：Ｃ、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＴＮＦαおよびＩＬ−１８（これらは全てＴｈ１応答の周知のインデューサーまたはメディエータである）はインスリン炎を減少させ、そして糖尿病を防止することが示された（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ，１９９１；Ｎｉｃｏｌｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ，１９９８；Ｒｏｔｈｅ ｅｔ ａｌ，１９９９；Ｓｅｒｒｅｚｅ ｅｔ ａｌ，１９８９；Ｓｏｂｅｌ ｅｔ ａｌ，１９９８；およびＹａｎｇ ｅｔ ａｌ、１９９４）。さらにＩＬ−１８の場合は、防御は小島に浸潤する細胞のＴｈ２表現型へのシフトと一緒に、Ｔｈ１型免疫の全身的活性化が関連した（Ｒｏｔｈｅ ｅｔ ａｌ，１９９９）。したがってＮＯＤ免疫系の非特異的刺激は、たとえＴｈ１インデューサーによっても、小島の抗原に対する進行中の免疫応答を戻すことができ、そして糖尿病誘発プロセスを阻止することができる。
【００２５】
ＮＯＤ脾臓細胞に対するＣｐＧオリゴヌクレオチドの効果をインビトロで分析する時、これは用量依存的様式でＩＦＮγおよびＩＬ−１０を明らかに誘導した（図８Ａおよび８Ｂ）。しかしＣｐＧにより生産されるサイトカインの量をＣｏｎＡ刺激により誘起される量と比較する時、ＣｐＧモチーフの効果はＩＬ−１０の放出を優先したことが明らかであった。おそらく糖尿病誘発プロセスのモジュレーティングにおいては、ＩＬ−１０の突出（ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ）が重要なのだろう。
【００２６】
さらに自然発生ＮＯＤ−糖尿病の自然な経過に及ぼすＣｐＧの効果には、２つのメカニズムが関与することが分かった：ａ．ＡＰＣ機能に及ぼす非特異的効果。ｂ．糖尿病に関係する抗原に対するＴ−細胞応答に及ぼす特異的効果。本明細書に記載するように、脾臓細胞のＣｐＧ刺激はＨｓｐ６０のアップレギュレーションおよび分泌、およびＨｓｐ６０−特異的Ｔ−細胞の活性化を導く。さらに外因性ペプチドの添加を通したＨｓｐ６０−特異的Ｔ−細胞の活性化と比較して、ＣｐＧ刺激は活性化Ｔ−細胞の表現型をＴｈ２へとシフトさせる。ｐ１２およびｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）エピトープに向けられたＨｓｐ６０ Ｔ−細胞は、自然発生ＮＯＤ−糖尿病の進行を調節することが示され、ＣｐＧの活性化抗−ｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）および抗−ｐ１２ Ｔｈ２免疫に及ぼす効果は、糖尿病に及ぼすその調節効果（ｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ）を説明するかもしれない。
【００２７】
さらに、ＣｐＧは恐らくＩＬ−１０が媒介するメカニズムを通してＮＯＤマウスのＡＰＣ機能に影響する。このＡＰＣ機能における変化は、糖尿病に関係する抗原に向けられた自己−反応性の、病原性Ｔｈ１表現型から防御的Ｔｈ２応答ヘのダウンレギュレーションおよびシフトを導く。
【００２８】
特定のメカニズムに拘束されずに、ＮＯＤ−自然発生糖尿病のＣｐＧによる防止には、Ｈｓｐ６０ Ｔ−細胞媒介自己反応性の特異的調節、ならびに他の糖尿病関連抗原へのＴｈ２シフトの広がりを導くＡＰＣ機能における変化が関与すると推論される。
【００２９】
したがって本発明は、すべての自己免疫疾患の防止および特にインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）の防止のための方法を対象とする。この方法には、ＣｐＧモチーフを含む効果的な量のＤＮＡワクチンで個体を予防接種することを含む。この同じ予防接種法を自己免疫疾患の処置、および特にＩＤＤＭの処置に使用することができる。
【００３０】
ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドは、好ましくは５’側で２つのプリンにより、そして３’側で２つのピリミジンにより挟まれたジヌクレオチドＣＧを含んで成るものである。ヌクレオチドＡおよびＧはプリンであり、そしてヌクレオチドＣおよびＴはピリミジンである。正確なプリンおよびピリミジンは変動できるが、モチーフは好ましくはＡＡＣＧＴＴである。この６個のヌクレオチドモチーフがワクチンに使用できる最小のサイズであるが、ワクチンに使用する構築物の全長は、このモチーフを含むｐｃＤＮＡ３空ベクターの効率により明示されるので、限定されない。当業者は種々の実験について技術文献中で使用されたＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドを知っており、そしてこれらの任意のオリゴヌクレオチドを本発明の目的に使用できる。配列番号２のオリゴヌクレオチドは、そのようなオリゴヌクレオチドの非限定的例の１つである。配列番号２は、ＣｐＧモチーフを持つ２単位を含むことに注目されたい。より多くのＣｐＧモチーフを持つ構築物も作成でき、そして本発明の一部と考える。
【００３１】
Ｐｕｒ−Ｐｕｒ−Ｃ−Ｇ−Ｐｙｒ−ＰｙｒモチーフはＣｐＧモチーフの最も一般的なモチーフであるが、当業者はＣｐＧモチーフが他の形態もとることが知られていたと考えるするだろう。１つのそのようなこれまでに開示されたモチーフは、Ｐｕｒ−Ｐｕｒ−Ｃ−Ｇ−Ｐｙｒ−Ｐｕｒ−Ｃ−Ｇ−Ｐｙｒ−Ｐｙｒである。技術文献で使用され、そして本発明でも使用することができるＣｐＲ−ＯＤＮの幾つかの非限定的例には：ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ（Ｂｒａｚｏｌｏｔ Ｍｉｌｌａｎ ｅｔ ａｌ，１９９８）、ＴＣＴＣＣＣＡＧＣＧＴＧＣＧＣＣＡＴ（Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ，１９９７）、ＧＡＧＡＡＣＧＣＴＣＧＡＣＣＴＴＣＧＡＴ（Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ，１９９７）、ＴＣＴＣＣＣＡＧＣＧＴＧＣＧＣＣＡＴ（Ｗｏｏｌｄｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，８９、２９９４−２９９８（１９９７）、ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ（Ｈａｒｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ ９６：９３０５−９３１０（１９９９）、ＴＣＧＴＣＧＴＴＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ（Ｈａｒｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，（１９９９）を含む。
【００３２】
好ましくはオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート修飾骨格を用いて合成して、それらのヌクレアーゼ耐性を向上させる。
【００３３】
ＤＮＡ予防接種の分野は十分に確立され、そして当業者はそのような予防接種に関して通常使用される量および技術について知っている。ＤＮＡワクチンは純粋なプラスミド（すなわち裸）ＤＮＡの筋肉内注射により投与することができるが、ＤＮＡは皮内注射により、または表皮の細胞に遺伝子銃でバイオリスティカリー（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃａｌｌｙ）に導入する金粒子上に顕微鏡下でコートして与えることもでき、これらはすべて当該技術分野では周知である。ＣｐＧモチーフはメチル化されるとワクチンとしての活性を失うので、ＣｐＧモチーフは好ましくはメチル化されない。遺伝子銃投与の取り組みは、抗原に対して比較的強いＴｈ２応答を伴うと報告されたので好ましく、一方ＤＮＡワクチンのｉ．ｍ．注射はＴｈ１応答を伴う（Ｒａｚ ｅｔ ａｌ １９９６）。ＤＮＡ予防接種の技術は知られているように、初期投与後の適当な時期、例えば初期注射から１８日後、またはそれ以上の１２週のような実質的期間の後に、追加免疫（ｐｏｓｔｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）を必要とするかもしれない。
【００３４】
ワクチンに使用するＤＮＡの量も当業者には周知であり、そして経験的観察により容易に至適化することができる。その量は好ましくは約１μｇ〜約５００μｇであるが、この範囲外の量も適切な状況下で使用してよい。
【００３５】
本発明を以下の非限定的な実施例により例示する。
【００３６】
【実施例】
実施例
方法
マウス
メスのマウスＮＯＤ／ＬｔＪ種は、ジャクソン研究所のＥ．Ｌｅｉｔｅｒ博士の好意により供給されたブリーダーから、ワイズマン研究所の動物育種センターで病原体無しの条件下で生育し、そして管理した。これらのマウスは約１カ月齢で始まるインスリン炎を現し、これは約３カ月齢で始まる明らかな高血糖症へと進行する。ＩＤＤＭの累積的発病率は６カ月齢までに８５％以上にのぼる。メスのＢＡＬＢ／ｃマウハもワイズマン研究所で成長させた。
ＤＮＡワクチンの構築
ＤＮＡワクチンは、ｐｃＤＮＡ３ベクター（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＮＶ、リーク、オランダ）を使用して構築した。これは周知の一般的な目的のクローニングおよび発現ベクターであり、ＣＭＶ−前初期プロモーター、ポリリンカーおよびウシ成長ホルモンポリアデニレーション部位を含む。このベクターはまた真核細胞中でネオマイシン耐性も発現する。その制限地図およびヌクレオチド配列は公開された。この配列は本明細書で配列番号１として説明する。
【００３７】
ヒトｈｓｐ６０遺伝子の完全長ｃＤＮＡを、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下にｐｃＤＮＡ３ベクターにクローン化した。簡単に説明すると、ｐＧＥＭ中のｈｓｐ６０ｃＤＮＡは、酵素ＢａｍＨＩまたはＨｉｎｄＩＩＩの制限部位を含む特異的オリゴヌクレオチドを使用することにより増幅した。アンプリコンおよびｐｃＤＮＡ３ベクターを精製し、そしてＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化した。Ｈｓｐ６０をコードする消化したＰＣＲ産物および直線化ｐｃＤＮＡ３ベクターを、製造元により与えられた標準的なプロトコールに従いＴ４ ＤＮＡリガーゼを使用して連結した。連結したプラスミドを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）中で形質転換させ、後に配列を決定してｃＤＮＡの正しい挿入を確認した（データは示さず）。
プラスミド調製および注射
大規模なプラスミドＤＮＡ調製は、Ｑｉａｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｅｇａ Ｐｒｅｐ（キアジェン、サンタ クラリア、カリフォルニア州、米国）を使用してアルカリ溶解法により調製した。ＤＮＡはエタノール沈殿し、そして滅菌ＰＢＳ中に再懸濁した。分光光度的分析では、２６０／２８０ｎｍ比＞１．８０であった。ＤＮＡ調製物の純度は、１％アガロースゲルで確認した。エンドトキシンレベルはＬｉｍｕｌｕｓ Ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅにより検査し、そして常にインビボ使用について許容されるレベル未満であることが分かった（０．０２ＥＵ／μｇ ＤＮＡ未満）。
【００３８】
８週齢のＮＯＤまたはＢＡＬＢ／ｃのメスは、針の貫通を２ｍｍに制限するためのプラスチック製カラーをつけた２７Ｇの滅菌シリンジを使用して前脛骨筋中に１００μｌの１０ｍＭ カルジオトキシン（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、レホボット、イスラエル）を注射した。５、１２および１９日後、マウスに１００μｌの１μｇ／μｌの所望するＤＮＡワクチンまたは対照としてＰＢＳを注射した。
【００３９】
ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、ワイズマン科学研究所のオリゴヌクレオチド合成ユニットで合成した。１００マイクロリットル（１μｇ／μｌ）の各調製物を同じタイムスケジュールで上記のように注射した。このオリゴヌクレオチドＣｐＧは２つの９ｍｅｒのセグメントを含み、これらはｐｃＤＮＡ３アンピシリン耐性遺伝子中に存在する。対照オリゴヌクレオチドＧｐＣは逆モチーフの同じヌクレオチドを表す。
オリゴヌクレオチドＣｐＧ：５’−ＴＣＣＡＴＡＡＣＧＴＴＧＣＡ−ＡＡＣＧＴＴＣＴＧ−３’（配列番号２）
オリゴヌクレオチドＧｐＣ：５’−ＴＣＣＡＴＡＡＧＣＴＴＧＣＡＡＡＧＣＴＴＣＴＧ−３’（配列番号３）
血中グルコース
高血糖症は、ベックマンのグルコース分析機ＩＩ（ベックマン インスツルメンツ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、ブレア、カリフォルニア州、米国）を使用して試験して、１３ｍＭを越えるレベルの血中グルコースと定義した。
ペプチドおよび抗原
ペプチドは、記載されているように（Ｅｌｉａｓ，ｅｔ ａｌ，１９９４）、標準的なＦｍｏｃ法により合成した。ペプチドは逆相ＨＰＬＣにより精製し、そしてそれらの組成をアミノ酸分析により確認した。ｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）と命名したこの実験で使用するＨｓｐ６０ペプチド同族体は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＶＬＧＧＧＶＡＬＬＲＶＩＰＡＬＤＳＬＴＰＡＮＥＤ（配列番号４）。このＨｓｐ６０の同族体は、米国特許第６，１８０，１０３号明細書に開示された。本明細書でｐ１２と命名した別のＨｓｐ６０同族体は配列：ＥＥＩＡＱＶＡＴＩＳＡＮＧＤＫＥＩＧＮＩ（配列番号５）を有する。この同族体は米国特許第６，１１０，７４６号明細書に開示された。インスリンおよびグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）は、シグマ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、レホーボット、イスラエル）から購入した。組換えＨｓｐ６０は（Ｅｌｉａｓ，ｅｔ ａｌ，１９９１）に記載されているように調製した。コンカナバリンＡはシグマから購入した。
Ｔ細胞増殖
８週齢のメスのＮＯＤマウス群は記載したように、３週間の、ＰＢＳ、ｐｃＤＮＡ３またはｐＨｓｐ６９の注射を受容した。最後の投与から４週間後、脾臓を摘出し、そしてＴ細胞マイトジェンであるＣｏｎＡ、ｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）ペプチドまたはＨｓｐ６０タンパク質に応答するＴ−細胞増殖応答をインビトロでアッセイした（Ｅｌｉａｓ，ｅｔ ａｌ，１９９９）。用量応答曲線は、最適用量を確立するために行った（示さず）。結果を具体的に説明するためにＨｓｐ６０タンパク質について１０μｇ／ｍｌの濃度を選択し、ｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）について１μｇ／ｍｌを選択し、そしてＣｏｎＡについて１．２５μｇ／ｍｌを選択したのは、これらの濃度が最適応答を生成するからであった。Ｔ細胞応答は７２時間培養のうち最後の１８時間、４連のカルチャーのウェルに加えた［メチル−３Ｈ］チミジンの取り込みにより検出した。刺激指数（ＳＩ）は、いずれも含まずに培養した対照ウェルに対して、抗原−またはマイトジェン−を含有するウェルの平均ｃ．ｐ．ｍ．の比率として計算した。平均ｃ．ｐ．ｍ．からのＳＤは、常に＜１０％であった。抗原無しのバックグラウンドｃ．ｐ．ｍ．は、８００〜１５００ｃ．ｐ．ｍ．であった。
サイトカインアッセイ
脾臓細胞は、１０週齢のＮＯＤメスから調製した。脾臓細胞は３連で、培地単独、またはＣｐＧもしくはＧｐＣオリゴヌクレオチドの濃度を上げてインキューベーションした。上清を４８時間で集めた。上清中のサイトカインは、ファルミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の対合抗体（ファルミンゲン、サンディエゴ、カリフォルニア州）を使用して、ファルミンゲンのサイトカインＥＬＩＳＡプルトコールに従ってＥＬＩＳＡにより検出した。ファルミンゲンの組換えマウスのサイトカインは、カリブレーションカーブ用の標準として使用した。サイトカイン濃度は、標準として組換えサイトカインを使用したカリブレーションカーブから誘導した平均ｎｇ／ｍｌとして示す。
ＥＬＩＳＡアッセイ
マウス血清は、ｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）ペプチドに対する、またはＨｓｐ６０に対する抗体の結合について記載されているように試験した（Ｅｌｉａｓ，ｅｔ ａｌ，１９９７）。簡単に説明すると、１０μｇ／ｍｌの種々の抗原をアッセイのマイクロプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ：ヌンク（Ｎｕｎｃ）、ロスキルデ、デンマーク）に適用し、そしてプレートを試験血清とインキューベーションした。抗体の結合はアルカリホスファターゼ−結合抗マウスＩｇＧまたはアイソタイプ−特異的抗−マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｂ（ジャクソン イムノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用して検出した。有意な量の抗体は、０．２５より高いＯＤ４０５ｎｍの読み取りとして定め、これは１０匹の正常ＢＡＬＢ／ｃマウスの血清を使用して得た平均ＥＬＩＳＡの読み取りから３ＳＤ高い。
膵臓の組織学
各処置群からのマウスは、ほとんどすべての非−処置または対照−処置ＮＯＤマウスが病気であった６カ月齢で殺した。膵臓は１０％緩衝化ホルマリンに固定し、切片とし、そして標準的なヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、そしてインスリン炎の程度の平均を膵臓あたり２０個を越える小島の採点について評価した。浸潤が検出されなかった時、小島は透明；周囲−インスリン炎または小島内の浸潤が小島の２５％未満を占めることが検出された時は、軽度の浸潤；小島の２５〜５０％が小島内の炎症細胞により占められている時は、浸潤；そして小島の５０％より多く占められている時は重度の浸潤と分類した。
統計的有意性
ＩｎＳｔａｔ  ２．０１プログラムを統計分析に使用した。スチューデントｔ検定およびχ２−検定を行って実験と対照群との間の統計的有意性をアッセイした。
結果
Ｈｓｐ６０ ＤＮＡはＢＡＬＢ／ｃマウスを特異的に免疫感作する
ヒトＨｓｐ６０を含有するｐｃＤＮＡ３（ここではｐＨｓｐ６０と呼ぶ）が特異的な免疫原性であるかどうかを試験するために、メスのＢＡＬＢ／ｃマウスに２回（５および２３日）、１００μｇのｐｃＤＮＡ３またはｐＨｓｐ６０をｉ．ｍ．注射し、そして血清抗体を周期的にアッセイした。
【００４０】
図１Ａは、ｐＨｓｐ６０で免疫感作したＢＡＬＢ／ｃマウスが特異的な抗−Ｈｓｐ６０ ＩｇＧ抗体を生じ、一方Ｈｓｐ６０タンパク質に対する抗体はｐｃＤＮＡ３で免疫感作したこれら動物では検出できなかったことを示す。８週例のメスＢＡＬＢ／ｃの５群をカルジオトキシンで前処置し（０日）、そして５および２４日にｐＨｓｐ６０、ｐｃＤＮＡ３またはＰＢＳで免疫感作するか、あるいは未処置のままとした。矢印は注射時期を示す。血清サンプルはカルジオトキシンでの処置前および各注射から１０日後に採取し、そしてＨｓｐ６０（図１Ａ）、およびＧＳＴ（図１Ｂ）に対する抗体をＥＬＩＳＡにより測定した。ＧＳＴに対する抗体は、最後の注射から１０日後に表す。平均±ＳＤを示す（１つのアスタリスクはｐｃＤＮＡ３処置マウスと比べてＰ＜０．０２を示し、２つのアスタリスクはｐｃＤＮＡ３処置マウスと比べてＰ＜０．００５を示し、プラス記号は最初のＤＮＡ投与後にｐＨｓｐ６０で処置したマウスと比べてＰ＜０．０５を示す）。
【００４１】
抗−Ｈｓｐ６０特異的抗体は、１回のＤＮＡ注射から１４日後に早くも検出された（ｐｃＤＮＡ３予防接種対照に比べてｐ＜０．０２）。２回目のＤＮＡ注射から１０日後の追加免疫効果は明らかであった（最初の投与後の同じ群と比べてｐ＜０．０５、ｐｃＤＮＡ予防接種したマウスと比べてｐ＜０．００５）。ｐＨｓｐ６０を用いた予防接種により誘導される免疫応答は特異的であった：ｐＨｓｐ６０は図１Ｂで示すように、非−関連組換えタンパク質であるグルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）に対する抗体を誘導しなかった。これらの結果は、空のｐｃＤＮＡ３ベクターではなくｐＨｓｐ６０構築物が１回の予防接種で有意な量の特異的抗体をＢＡＬＢ／ｃマウスに誘導することができ、そして追加免疫後に力価を上昇させることを示している。
ＤＮＡ注射はＮＯＤ糖尿病の発症を抑制する
ｐＨｓｐ６０の免疫感作がＮＯＤマウスにおいて自然発生糖尿病の発症をモジュレートするのかどうかを試験するために、本発明者は８週齢のメスＮＯＤマウスを１週間の間隔で３回予防接種し、そしてそれらのグルコースレベルを追跡した。図２は糖尿病の累積的発病率を示す。メスのＮＯＤマウスは各群１７〜１８匹に配置し、そしてＰＢＳ、ｐｃＤＮＡ３またはｐＨｓｐ６０で免疫感作した。対照群は未処置のままであった。ｐｃＤＮＡ３およびＨｓｐ６０を予防接種した群は、糖尿病の有意に低い発病率をもたらした（１つのアスタリスクはＰＢＳ処置マウスに比べてｐ＜０．００１を表し、２つのアスタリスクはＰＢＳ処置マウスに比べてｐ＜０．００２を表す）。
【００４２】
未処置およびＰＢＳで処置した動物の両方が、ＮＯＤのメスに予想された糖尿病の発病率をもたらした：それらの約９０％が６カ月までに病気になった。ｐＨｓｐ６０を予防接種したマウス、および驚くべきことには空のｐｃＤＮＡ３構築物を予防接種したマウスは、糖尿病の発病率において有意な低下を示した。ｐＨｓｐ６０で処置したマウスの約４１％（ｐ＜０．００２）およびｐｃＤＮＡ３で処置したマウスの３８％（ｐ＜０．００１）のみが６カ月齢で糖尿病であった。このようにＤＮＡ予防接種は、投与するベクター中のｈｓｐ６０遺伝子の存在に関係しないメカニズムにより糖尿病の発症をモジュレートする。
【００４３】
マウスが６カ月齢である観察期間の終わりに、組織学検査のために膵臓を得た。図３は非処理またはＰＢＳ処理マウスから得た小島の４０〜５０％が重度に浸潤され、そして５〜１０％の小島にインスリン炎が無いだけであった。対照的にＤＮＡで処置したマウスから得た小島の５０〜７０％にインスリン炎がなかった：非処置マウスまたはＰＢＳ処置マウスに比べて、ｐｃＤＮＡ３注射マウスおよびｐＨｓｐ６０群の両方についてｐ＜０．００１。ｐＨｓｐ６０およびｐｃＤＮＡ３で処置した群間の差異は、有意でなかった。
【００４４】
８週齢のＮＯＤのメスに、ＰＢＳ、ｐｃＤＮＡ３またはｐＨｓｐ６０を図２の脚注に記載したように注射するか、または処理せず、そしてそれらの膵臓を６カ月齢で摘出した。インスリン炎の程度は、各膵臓中の少なくとも２０個の小島を採点することにより決定した。小島は透明（中抜き棒）、周囲−インスリン炎または小島の２５％未満を占める小島内浸潤（明るい灰色の棒）、小島の２５〜５０％を占める小島内浸潤（暗い灰色の棒）、および小島の５０％より多くを占める小島内浸潤（黒色の棒）として表す。１つのアスタリスクはＰＢＳ処置マウスに比べてｐ＜０．００１を表す。
【００４５】
したがって、ヒトＨｓｐ６０をコードするベクター（ｐＨｓｐ６０）、または空のベクター（ｐｃＤＮＡ３）のいずれを用いたＤＮＡ予防接種も、ＮＯＤのメスに自然発生糖尿病の発病を減少させた。この効果はインスリン炎の無い膵臓の小島の数の有意な上昇を伴った。
ＤＮＡ予防接種したマウスにおいて、Ｈｓｐ６０およびｐ２７７（Ｖａｌｌ６−Ｖａｌ１１）に対するＴ細胞増殖の阻害
ＮＯＤマウスの糖尿病発症を導くプロセスは、Ｈｓｐ６０タンパク質に由来するペプチドｐ２７７の投与により阻止することができる（Ｅｌｉａｓ ｅｔ ａｌ，１９９１）。ペプチドｐ２７７またはその同族体ｐ２７７（Ｖａｌｌ６−Ｖａｌ１１）でのＮＯＤマウスの成功裏の処置には、Ｈｓｐ６０およびｐ２７７に対するＴ細胞増殖の低下と一緒に、ｐ２７７に対する特異的抗体の誘導を関係する（Ｅｌｉａｓ ｅｔ ａｌ，１９９７）。したがって本発明者はＤＮＡを予防接種した、またはＰＢＳで処置したＮＯＤマウスから単離した膵臓細胞をアッセイして、それらのｐ２７７（Ｖａｌｌ６−Ｖａｌ１１）およびＨｓｐ６０に対する増殖的応答を検査した。５群の８週齢のメスのＮＯＤマウスは、ＰＢＳ、ｐｃＤＮＡ３またはｐＨｓｐ６０の注射を３回、一週間の間隔で受容した。４週間後、それらの膵臓細胞を摘出し、そしてＴ−細胞の増殖的応答を、１０μｇ／ｍｌのヒトＨｓｐ６０（図４Ａ）または１μｇ／ｍｌのｐ２７７（Ｖａｌｌ６−Ｖａｌ１１）（図４Ｂ）で刺激してから７２時間後にアッセイした。結果は、培地単独でインキューベーションしたサンプル対と比較して、刺激指数（ＳＩ）±ＳＤとして表す。（１つのアスタリスクはＰＢＳ処置マウスに比べてｐ＜０．０１を表し、プラス記号はＰＢＳ処置マウスに比べてｐ＜０．０５を表す）。
【００４６】
図４Ａおよび４Ｂに示すように、ＰＢＳで処置したＮＯＤマウスはＨｓｐ６０（図４Ａ）およびｐ２７７（Ｖａｌｌ６−Ｖａｌ１１）（図４Ｂ）に対する自然発生反応性を現した。対照的に、ｐｃＤＮＡ３またはｐＨｓｐ６０を予防接種したマウスからの脾臓細胞は、ｐ２７７（Ｖａｌｌ６−Ｖａｌ１１）（ｐ＜０．０５）に対する、およびＨｓｐ６０（ｐ＜０．０１）に対する反応性の減少を示した。しかし両処置および非処置マウスからのＴ細胞はＣｏｎＡに対して同様な反応性を示し（示さず）、これはＤＮＡ予防接種による誘導されるＴ細胞反応性の一般的な阻害がなかったことを示す。これらの結果はプラスミドＤＮＡでの処置が、ＮＯＤマウスでの糖尿病誘発性プロセスに特徴的なＨｓｐ６０およびｐ２７７（Ｖａｌｌ６−Ｖａｌ１１）に向けられた自然発的な増殖応答をダウンレギュレートしたことを示唆した。
ＤＮＡ予防接種によるｐ２７７（Ｖａｌｌ６−Ｖａｌ１１）に対する、およびＨｓｐ６０に対する抗体の誘導
ｐ２７７またはその同族体での処置により糖尿病から保護されたＮＯＤマウスで観察されたＨｓｐ６０およびそのペプチドｐ２７７または同族体ｐ２７７（Ｖａｌｌ６−Ｖａｌ１１）に対するＴ細胞増殖の減少は、ｐ２７７に対する抗体の誘導と関連する（Ｅｌｉａｓ ｅｔ ａｌ，１９９７）。ＤＮＡ予防接種の防御的効果が、Ｈｓｐ６０およびｐ２７７（Ｖａｌｌ６−Ｖａｌ１１）に対する抗体の出現と関係するのかどうかを見るために、本発明者は最後のＤＮＡ注射から１４日後に、１４週齢でＤＮＡ予防接種をした動物の抗体応答を分析した。１８ＮＯＤマウス群を、ＰＢＳ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＨｓｐ６０またはＣｐＧもしくはＧｐＣオリゴヌクレオチドで処置する一方、１群は未処置のままにした。処置から２週間後、個々の血清を１：１００の希釈で特異的抗体の存在について試験した。図５ＡはＨｓｐ６０およびｐ２７７（Ｖａｌｌ６−Ｖａｌ１１）に対する血清抗体を示し、そして図５ＢはＧＡＤ、インスリンおよびＧＳＴに対する血清抗体を示す。データは各群について平均±ＳＤで表す（アスタリスクはＰＢＳ処置マウスに比べてｐ＜０．００１を表す）。
【００４７】
図５Ａは、ｐ２７７（Ｖａｌｌ６−Ｖａｌ１１）に対する抗体が未処置またはＰＢＳ注射動物の血清では検出されなかったことを示す。ｐ２７７（Ｖａｌｌ６−Ｖａｌ１１）およびＨｓｐ６０に対する抗体の不存在は、この年齢のＮＯＤマウスでは予想される（Ｋｒａｕｓｅ ｅｔ ａｌ，１９９９）。ｐＨｓｐ６０で免疫感作したＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるｐ２７７（Ｖａｌｌ６−Ｖａｌ１１）に対する抗体は検出されず、一方抗−Ｈｓｐ６０抗体の出現が示された（図７およびデータは示さず）。しかしｐＨｓｐ６０またはｐｃＤＮＡ３を予防接種したＮＯＤマウスは、ｐ２７７（Ｖａｌｌ６−Ｖａｌ１１）に対する有意なレベルの抗体を現した（ｐ＜０．００１）。このようにｐｃＤＮＡ３またはｐＨｓｐ６０のいずれかを用いたＤＮＡ予防接種によるＮＯＤマウスにおける糖尿病の抑制は、たとえｐｃＤＮＡ３構築物がＨｓｐ６０をコードする遺伝材料を含まなくても、Ｈｓｐ６０およびペプチドｐ２７７（Ｖａｌｌ６−Ｖａｌ１１）に対する抗体の誘導に関連する。
ＣｐＧ注射はＨｓｐ６０およびペプチドｐ２７７（Ｖａｌｌ６−Ｖａｌ１１）に対する抗体を誘導する
細菌のＤＮＡは免疫系に危険なシグナルとして認識される免疫刺激配列を含み、先天性および適応免疫系の両方の細胞に一連の応答を誘起する（Ｌｉｐｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ，１９９８；Ｋｒｉｅｇ ｅｔ ａｌ，１９９８９；Ｋｒｉｅｇ，１９９９）。ｐｃＤＮＡ３ベクターはそのアンピシリン耐性遺伝子内に免疫刺激ＣｐＧ配列を含む（Ｂｏｃｃａｃｃｉｏ ｅｔ ａｌ，１９９９）。本発明者は２つのＣｐＧ配列を持つＤＮＡオリゴヌクレオチドがｐｃＤＮＡ３での予防接種に続いてＨｓｐ６０およびｐ２７７（Ｖａｌｌ６−Ｖａｌ１１）に対する特異的抗体の生産を誘導できるかどうかを試験した。対照として、ＣｐＧモチーフが逆のオリゴヌクレオチドＧｐＣを使用した。
【００４８】
８週齢のＮＯＤマウスをオリゴヌクレオチドＣｐＧまたはＧｐＣで処置し、そしてＨｓｐ６０、ｐ２７７（Ｖａｌｌ６−Ｖａｌ１１）  、ＧＡＤ、インスリンおよびＧＳＴに対する抗体をＥＬＩＳＡにより１４週齢でアッセイした。図５Ａに示すようにＣｐＧオリゴヌクレオチドでの処置は、Ｈｓｐ６０およびｐ２７７（Ｖａｌｌ６−Ｖａｌ１１）に対する有意なレベルの抗体を誘導した（ｐ＜０．００２）。さらにＣｐＧにより誘導される抗体の力価も、ＧｐＣ処置マウスで見られるレベルと比べた時に有意であった（ｐ＜０．０２）。ＧｐＣオリゴヌクレオチドはＨｓｐ６０およびｐ２７７（Ｖａｌｌ６−Ｖａｌ１１）に対する特異的抗体を誘導できなかったので、これら特異的抗体のｐｃＤＮＡ３ベクターによる誘導は、ＣｐＧモチーフの存在と関連するかもしれない。すなわち免疫刺激配列単独でのＮＯＤ免疫系の刺激は、Ｈｓｐ６０およびそのペプチド同族体であるｐ２７７（Ｖａｌｌ６−Ｖａｌ１１）に対する特異的な自己抗体の生産を誘起することができる。
【００４９】
ｐ２７７（Ｖａｌｌ６−Ｖａｌ１１）およびＨｓｐ６０抗原に対する抗体の出現は、ＩｇＧ−分泌クローンのポリクローナル活性化をもたらすと考えられた。それゆえに、異なるマウス群に由来する血清を、インスリン、ＧＡＤおよび細菌組換えタンパク質ＧＳＴについてアッセイした。図５Ｂはインスリン、ＧＡＤまたはＧＳＴに対する抗体のレベルが群間で本質的に同じであったことを示す。すなわちｐＨｓｐ６０、ｐｃＤＮＡ３ベクターまたはＣｐＧオリゴヌクレオチドの投与は、Ｈｓｐ６０およびｐ２７７（Ｖａｌｌ６−Ｖａｌ１１）に対する特異的抗体を誘導した。これはＨｓｐ６０およびｐ２７７（Ｖａｌｌ６−Ｖａｌ１１）に対する特異的抗体の誘導がポリクローナル活性化の結果ではないことを示す。
ＣｐＧ注射はＮＯＤ糖尿病を抑制する
ＣｐＧオリゴヌクレオチドの投与がｐｃＤＮＡ３ベクターと同様にＮＯＤマウスにおける自然発生糖尿病の発症をモジュレートするかどうかを試験するために、８週齢のメスのＮＯＤマウス群を１週間の間隔で３回、予防接種し、そしてそれらのグルコースレベルを追跡した。図６は糖尿病の累積的発病率を示す。メスのＮＯＤマウスは各群１５〜１８匹に配置し、そしてＰＢＳ、ＣｐＧまたはＧｐＣで免疫感作した。対照群は未処置のままであった。ＣｐＧ予防接種した群は、糖尿病の有意に低い発病率をもたらした（アスタリスクはＧｐＣ処置マウスに対してｐ＜０．０１５を表す）。
【００５０】
未処置およびＰＢＳで処置した動物の両方が、メスのＮＯＤに予想された糖尿病の発症率をもたらした：それらの約８５％が６カ月齢までに病気になった。さらに対照オリゴヌクレオチドＧｐＣを予防接種したマウス群では糖尿病の発病率が影響を受けなかった。しかしＣｐＧを予防接種したマウスは、糖尿病の発症率において有意な低下を示した。ＣｐＧで処置したマウスのわずか約４０％（ｐ＜０．０１５）が６カ月齢で糖尿病であった。
【００５１】
したがってｐｃＤＮＡ３を用いた免疫感作後に観察される防御効果は、ＣｐＧモチーフを含むＤＮＡオリゴヌクレオチドで再現できた。対照オリゴヌクレオチドＧｐＣは疾患の発病率に有意な効果がなかったので、関与するメカニズムは配列特異的である。
抗体アイソタイプ
特異的な血清抗体のアイソタイプは抗原に対する免疫応答の表現型を特徴つけるものであり；抗体のアイソタイプが免疫応答を調節するサイトカインの複雑なネットワークのインビボでの統合に反映する。ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｂアイソタイプの抗体は、それらがそれぞれＩＬ−４およびＴＧＦ−αに依存的であるので特異的なＴｈ２応答を明示する（ＭｃＩｎｔｙｒｅ ｅｔ ａｌ，１９９３；Ｓｎａｐｐｅｒ ｅｔ ａｌ，１９９３）。対照的に、ＩｇＧ２ａアイソタイプの抗体はＩＦＮ−γ依存的であり、そしてそれらはＴｈ１応答の存在を明らかにする（ＭｃＩｎｔｙｒｅ ｅｔ ａｌ，１９９３；Ｓｎａｐｐｅｒ ｅｔ ａｌ，１９９３）。したがって、最後の注射から１４日後にＤＮＡ予防接種したマウスで検出される、ｐ２７７（Ｖａｌｌ６−Ｖａｌ１１）およびＨｓｐ６０に対する抗体のアイソタイプを研究した。ｐｃＤＮＡ３、ｐＨｓｐ６０またはＣｐＧオリゴヌクレオチドで処置したＮＯＤ（黒い棒、ｎ＝１８）またはＢＡＬＢ／ｃ（白い棒、ｎ＝５）マウスに由来する、Ｈｓｐ６０（図７Ａ）またはｐ２７７（Ｖａｌｌ６−Ｖａｌ１１）（図７Ｂ）に対する血清抗体のアイソタイプを、最後の予防接種から２週間後に測定した。抗体のアイソタイプは、個々の血清を１：１０００に希釈して試験した。データは各群について平均±ＳＤとして示す（アスタリスクは同じ群中のＩｇＧ２ａレベルと比べてｐ＜０．０１を表す）。
【００５２】
図７Ａおよび７Ｂは、Ｈｓｐ６０およびｐ２７７（Ｖａｌｌ６−Ｖａｌ１１）に対して誘導された抗体が、主にＩｇＧ２ｂアイソタイプであったことを示す（ＩｇＧ２ａレベルと比べてｐ＜０．０１）。Ｈｓｐ６０およびｐ２７７（Ｖａｌｌ６−Ｖａｌ１１）に対するＩｇＧ１抗体のレベルにもわずかな上昇があったが、この誘導はＣｐＧオリゴヌクレオチドで処置した群のＩｇＧ２ａ特異的抗体の量と比べる時のみ有意であった。さらにｐＨｓｐ６０、ｐｃＤＮＡ３およびＣｐＧ処置ＮＯＤマウス間に抗体のアイソタイプに差異は無かった。すなわちＤＮＡプラスミドにより、またはＣｐＧオリゴヌクレオチドにより誘導される糖尿病の抑制は、両方の場合でＨｓｐ６０およびｐ２７７（Ｖａｌｌ６−Ｖａｌ１１）に対する、Ｔｈ−２型応答の特徴であるＩｇＧ２ｂアイソタイプの抗体の誘導を伴う。
【００５３】
興味深いことには、ＮＯＤマウスに比べてＢＡＬＢ／ｃで誘導された抗体に顕著な差異があったことである。ＢＡＬＢ／ｃマウスはｐＨｓｐ６０で予防接種した時にＨｓｐ６０に対する抗体を生成したが、ｐｃＤＮＡ３での免疫感作後には生成しなかった（図１Ａ）。さらに誘導された抗体は主にＩｇＧ１サブクラスであり、そしてＢＡＬＢ／ｃマウスはｐ２７７（Ｖａｌｌ６−Ｖａｌ１１）に対する抗体を作成しなかった。これらの結果は、自己抗原Ｈｓｐ６０に対する抗体分泌を調節するサイトカインネットワークにおける種−特異的差異を示す。
ＣｐＧオリゴヌクレオチドによるＩＬ−１０およびＩＦＮγ分泌の誘導
ＣｐＧのサイトカイン効果について洞察を深めるために、ＣｐＧオリゴヌクレオチドでインビトロ刺激した後のＮＯＤ脾臓細胞により分泌されるＩＬ−１０（Ｔｈ２サイトカイン）、およびＩＦＮγ（Ｔｈ１サイトカイン）の量をアッセイした。様々なサイトカインが異なる生理学的量で分泌されるので、ＣｏｎＡ（プロトタイプ型のＴ−細胞マイトジェン）とインキューベーションした脾臓細胞の対照群を含めた。ＮＯＤ脾臓細胞はＣｐＧまたはＧｐＣオリゴヌクレオチドの濃度を上げながら３連で４８時間インキューベーションし、そしてそれらの上清を、放出されたＩＦＮγおよびＩＬ−１０サイトカインの量について試験した。対照脾臓細胞はＣｏｎＡ（１，２５μｇ／ｍｌ）とインキューベーションして、相対的な応答の規模を得た。図８ＡはＩＬ−１０生産を示し、そして図８ＢはＩＦＮγ生産を示す。データは３連の平均±ＳＤとして示す。３回の独立した実験では同様な結果を生じた。
【００５４】
図８Ａおよび８Ｂに示すように、ＣｐＧオリゴヌクレオチドはＮＯＤ脾臓細胞で用量−依存的様式でＩＬ−１０およびＩＦＮγの両方の生産を誘導した。しかしＣｏｎＡ刺激に対して放出されたサイトカインの量と比べた時、ＣｐＧ処置の効果はＩＦＮγの刺激よりもＩＬ−１０の刺激に相対的により効果的となるようであった。ＣｐＧは、ＣｏｎＡにより放出されるＩＦＮγの約１／４の７ｎｇ／ｍｌのＩＦＮγの最大放出を誘起した。対照的に、ＣｐＧは、ＣｏｎＡ刺激により誘導される量よりもほぼ１０倍高い１．５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１０の放出を誘導した。
ＣｐＧはインビトロで脾臓細胞を活性化する
ＣｐＧ処置による自然発生ＮＯＤ糖尿病の制御に関与する調節メカニズムを研究するために、我々は１または２つのＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドを使用した。オリゴはそれぞれＤＰ（ダブルポジティブ）またはＳＰ（シングルポジティブ）と呼んだ。対照として、我々はＣｐＧモチーフが逆のオリゴ、したがって不活性になったものを使用した。これらの対照オリゴはＤＮ（ダブルネガティブ）またはＳＮ（シングルネガティブ）と呼んだ。脾臓細胞に対するＣｐＧモチーフのインビトロ効果を調査するために、脾臓細胞を正常血糖値の３カ月齢のＮＯＤメスから調製し、そして９６ウェルプレート中で７２時間、種々の濃度の対照、またはＣｐＧを含有するオリゴヌクレオチドとインキューベーションした。最後の１６時間中に、標識したチミジンを培養基に加え、そしてインキューベーション期間の終わりに細胞を回収し、そして種々の刺激物に応答する増殖を定量した。ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド（ＤＰおよびＳＰ）は、用量依存的増殖を誘導することが分かった。さらに２つのＣｐＧモチーフを含むオリゴ（ＤＰ）は、１つのＣｐＧモチーフを含むオリゴ（ＳＮ）よりも強い増殖を誘導した。対照オリゴヌクレオチドは逆転により除去されたＣｐＧモチーフであり（ＤＮおよびＳＮ）、有意な効果が無かった。ＣｐＧが誘導した応答はＬＰＳが誘導する応答と同じくらい強い。脾臓細胞を３０００Ｒａｄｓで照射すると（培養中のＴ−細胞系の刺激に、ＡＰＣとしてそれらを使用するための標準的な手法）、ＣｐＧが誘導する増殖は排除された。
【００５５】
同じ実験を、異なる年齢のＮＯＤのメスに由来する脾臓を用いて行った。ＣｐＧ刺激に対する応答で誘導される増殖的応答についてはＳＰまたはＤＰでも差異が検出されなかった。さらにＮＯＤ脾臓を、年齢と性別が合った動物から取ったＣ５７ＢＬ／６またはＢＡＬＢ／ｃ脾臓と比較した時、有意な差異がなかった。したがって、ＣｐＧは脾臓細胞の増殖を誘導し、そしてこの増殖はガンマ照射により抑制されることが確認された。
ＣｐＧはＨｓｐ６０発現をアップレギュレートする
ウエスタンブロット実験を行って、脾臓細胞についてＣｐＧ刺激がＨｓｐ６０の発現をアップレギュレートするかどうかを調査した。ＮＯＤ脾臓細胞は、正常血糖値のメスから単離し、そしてインビトロで４８時間、異なる濃度のＤＰオリゴで刺激した。刺激した脾臓細胞は氷上で５分間溶解させ、そして１４０００ｒｐｍで１０分間遠心した後、上清（細胞質画分を表す）はＨｓｐ６０特異的ポリクローナル抗体を使用してウエスタンブロットにより分析した。ＣｐＧとのインキューベーションにより、用量依存的様式でＨｓｐ６０の発現が誘導された。これゆえに糖尿病の抑制におけるＣｐＧの効果にはＣｐＧによるＨｓｐ６０のアップレギュレーションが関与し得た。
ＣｐＧはＨｓｐ６０の分泌を誘導する
ＣｐＧによる脾臓細胞の刺激後に、Ｈｓｐ６０の組織培養基への放出を研究した。ＮＯＤ脾臓細胞をインビトロでＣｐＧ−ポジティブ（ＤＰおよびＳＰ）または対照（ＤＮおよびＳＮ）オリゴで４８時間刺激した。捕捉Ｅｌｉｓａ法を使用して、刺激期間の終わりに組織培養上清に存在するＨｓｐ６０を定量した。Ｈｓｐ６０は図９に与えるように実際に用量−依存的様式で、ＣＰＧで活性化した脾臓細胞の上清中に検出することができる。ＣｏｎＡまたはＬＰＳで活性化した脾臓細胞はＨｓｐ６０を放出せず、たとえそれらがパターン認識受容体（ＬＰＳ／ＴＬＲ−４）を介してシグナルを発信しても、Ｈｓｐ６０の放出はＴまたはＢ細胞の活性化を導く他の経路とは共有しないＣｐＧ／ＴＬＲ−９経路の特異的な性質であることを示唆する。
ＣｐＧはＨｓｐ６０−特異的Ｔ−細胞系を活性化する
ＣｐＧを含むオリゴヌクレオチドはＨｓｐ６０発現および細胞外培地への放出をアップレキュレートした；ＣｐＧがＨｓｐ６０−特異的Ｔ−細胞系に及ぼす効果を、照射したＡＰＣの存在下で試験した。ＮＯＤ Ｔ−細胞系は哺乳動物Ｈｓｐ６０の２つの免疫優性エピトープ、ｐ１２およびｐ２７７に対して生じ、そして対照としてＯＶＡに特異的なＮＯＤ Ｔ−細胞系を使用した。表１はＣｐＧを含むオリゴがＴ−細胞増殖を誘導したことを示す。さらにＤＰオリゴがＳＰオリゴよりもより強い増殖を誘導したので、オリゴ中に存在するＣｐＧ配列数も増殖の強さに影響した。対照オリゴＤＮおよびＳＮに応答した有意な増殖は観察されなかった。ＯＶＡ−特異的Ｔ−細胞系はＣｐＧポジティブオリゴに応答して増殖しなかったが、すべての系がそれらの適切な抗原に応答して増殖した。ＬＰＳはＡＰＣの存在下で有意な増殖を誘導せず、Ｔ−細胞系が非−Ｔ細胞を混入していないことを示す。これらのＣｐＧが誘導する応答は、抗−ＭＨＣ−クラスＩＩ抗体により抑制され、ＣｐＧが誘導する増殖がＭＨＣ−クラスＩＩ分子中のＨｓｐ６０エピトープの提示に関与することを示した。したがってＣｐＧはＨｓｐ６０をアップレキュレートし、そしてＨｓｐ６０エピトープであるｐ２７７およびｐ１２の提示を誘導し、これが特異的なＴ−細胞に提示でき、そしてそれらが増殖することを刺激できると結論することができる。
【００５６】
【表１】
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【００５７】
ｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）、ｐ１２またはＯＶＡに特異的なＮＯＤ Ｔ細胞系をインビトロで、ＣｐＧポジティブまたは対照オリゴ（１０μｇ／ｍｌ）を用いて、またはそれらの対応する抗原（１０μｇ／ｍｌ）を用いて刺激した。増殖は７２時間後に測定し、そして刺激指数（ＳＩ）として表す。
ＣｐＧは活性化Ｔ−細胞のサイトカインを非−炎症プロフィールへシフトする
ＣｐＧを含むオリゴヌクレオチドを用いた刺激に応答したサイトカインの生産を研究した。表２に示すように、１または２個のＣｐＧモチーフを含むオリゴでのインビトロ刺激は、ＩＬ−１０およびＩＦＮγの放出を誘導した。ＣｐＧで刺激したＴ−細胞系の上清中にＩＬ−２またはＩＬ−４は検出されなかった。ペプチドに特異的な刺激に応答して放出されるサイトカインの量と比較した時、ＣｐＧはより高いＩＬ−１０量およびより低いＩＦＮγ量の分泌を誘導した。ＩＬ−１０は免疫応答に対して抑制効果を有することが知られているので、ＩＬ−１０分泌における相対的な上昇は、ＮＯＤ糖尿病に及ぼすＣｐＧのポジティブ効果を説明しているかもしれない（Ａｋｉｄｉｓ ａｎｄ Ｂｌａｓｅｒ，２００１）。
【００５８】
【表２】
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【００５９】
Ｐ１２に特異的なＴ−細胞を、ＡＰＣの存在下で７２時間、ＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）、ＣｏｎＡ（１．２５μｇ／ｍｌ）、ＣｐＧポジティブおよび対照オリゴヌクレオチド（１０μｇ／ｍｌ）またはｐ１２（１０μｇ／ｍｌ）で活性化した。上清を集め、そして分泌したサイトカインを捕捉ＥＬＩＳＡで測定した。結果は分泌したサイトカインのｐｇ／ｍｌとして表す。ＮＤは検出されず。
ＣｐＧはＡＰＣ機能をインビボでダウンレギュレートする
ＣｐＧ処置がインビボのＡＰＣ機能に影響するかどうかを試験するために実験を行った。最近、ＬＰＳがＮＯＤマウスにおいてＡＰＣ機能をダウンレギュレートすることが報告された（Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ，２００１）。３カ月齢のメスに１００μｇ／マウスで１回、２つのＣｐＧを含むオリゴヌクレオチド、または２つの不活性ＧｐＣモチーフを含む対照オリゴヌクレオチドを注射した。脾臓細胞はオリゴヌクレオチド−またはＰＢＳ−処理動物から調製し、そして次いでそれらをＡＰＣとして使用するために３０００Ｒａｄで照射した。ＡＰＣはＨｓｐ６０のｐ１２ペプチドに特異的なＮＯＤ Ｔ−細胞系とコーインキューベーションし、次いで系（異なるＡＰＣの存在下で）をｐ１２ペプチドまたはＣｐＧまたは対照オリゴヌクレオチドのいずれかで刺激した。１０μｇ／ｍｌのｐ１２およびＣｐＧで処置したマウスから調製したＡＰＣの存在下で活性化されたＴ−細胞は、ＰＢＳまたはＧｐＣ処置マウスから単離したＡＰＣの存在下で活性化されたＴ−細胞（それぞれ２９８±２４および２７５±１８）よりも有意に低いＳＩ（１５０±３）を示した。したがってＣｐＧ処置したマウスから調製したＡＰＣはＧｐＣまたはＰＢＳ処置マウスから取ったものよりも効率が低い。ＣｐＧを含むオリゴヌクレオチドにより誘導される増殖的応答において、有意差はなかった。
【００６０】
この明らかなＡＰＣ機能のダウンレギュレーションの元にあるメカニズムをよりよく理解するために、我々は異なるＡＰＣ調製物の存在下、ｐ１２またはＣｐＧを含むオリゴヌクレオチドを用いた刺激に応答して放出されるサイトカインを研究した。
【００６１】
【表３】
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【００６２】
ＡＰＣはＣｐＧモチーフを含むか、または含まないオリゴで処置した動物から単離し、そしてｐ１２特異的Ｔ−細胞系を刺激するために使用した。刺激から７２時間後、組織培養上清を集め、そして放出されたサイトカインを捕捉ＥＬＩＳＡを使用して定量した。
【００６３】
表３は、ＩＦＮγまたはＩＬ−５のレベルには差は無かったが、ｐ１２系をＣｐＧ処置マウスから取ったＡＰＣとインキューベーションした時に、周知のサプッサーサイトカインであるＩＬ−１０およびＩＬ−４の用量依存的放出があったことを示す。したがってＣｐＧ処置はＡＰＣ機能に影響し、刺激特性が縮小したＡＰＣの生成を導いた。この効果は、サプレッサーサイトカインである主にＩＬ−１０の分泌、およびまたＩＬ−５およびＩＬ−４により主に媒介されると思われる。
ＣｐＧは自然発生ＮＯＤ自己免疫をダウンレギュレートする
インビトロでのＣｐＧの効果の観点から、糖尿病に関連するＮＯＤマウスの特異的な自己免疫にＣｐＧが及ぼすインビボ効果を明らかにする実験を計画した。ＣｐＧモチーフを含むオリゴを、２カ月齢のＮＯＤメスに１回注射した（１００μｇ／マウス）。脾臓細胞はＣｐＧまたは対照オリゴで処置してから１カ月後に調製し、そして糖尿病に関係する自己抗原（ＧＡＤ、Ｈｓｐ６０およびインスリン）およびＣｐＧ含有オリゴに対する自然発生増殖応答を研究した。表４は、ＣｐＧ含有オリゴで処置したマウスが、Ｈｓｐ６０、ＧＡＤおよびインスリンに対する増殖の減少を示したが、オリゴ自体（表４）、またはＣｏｎＡ、ｐ１２、ｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）、ｐ３４およびｐ３５（データは示さず）に対する増殖的応答には差がないように見えた。すなわちＣｐＧ処置は、ＮＯＤマウスにおいて特異的な糖尿病に関連する抗原に対する自然発生自己−反応性をダウンレギュレートする。
【００６４】
【表４】
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【００６５】
ＮＯＤ脾臓細胞は、ＣｐＧ、ＧｐＣ含有オリゴまたはＰＢＳで処理してから１カ月後に単離し、そしてそれらの自己抗原およびオリゴヌクレオチドに対する増殖的応答をインビトロで追跡した。結果は平均ｃｐｍ±ＳＤとして与える。
ＣｐＧは自然発生自己免疫のサイトカインプロフィールをシフトする
糖尿病に関連する自己抗原およびＣｐＧに対する免疫応答の表現型を研究した。脾臓細胞はオリゴヌクレオチドまたはＰＢＳ処置したマウスから単離し、そしてインビトロ刺激に応答するサイトカインの放出を捕捉ＥＬＩＳＡにより測定した。表５はＣｐＧ処置マウスがそれらの自己免疫応答をＴｈ２表現型にシフトし、糖尿病に関連する抗原での再刺激に応答してＩＬ−１０の分泌が上昇し、そしてＩＦＮγの分泌が低下したことを示す。対照ペプチドｐ３５とのインキューベーションに応答したサイトカインの有意な放出は検出されなかった。すなわちＣｐＧの処置は、ＮＯＤマウスの自然発生自己免疫応答をＴｈ１からＴｈ２ヘシフトする。
【００６６】
【表５】
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【００６７】
ＮＯＤ脾臓細胞は、ＣｐＧ、ＧｐＣ含有オリゴまたはＰＢＳで処理してから１カ月後に単離して、異なる自己−抗原でのインビトロ刺激に応答するサイトカイン放出を追跡した。結果は平均ｐｇ／ｍｌの分泌サイトカインとして与える。
ＩＤＤＭ患者のためのＣｐＧ予防接種
本発明によるＩＤＤＭ患者用のＣｐＧ予防接種は、幾つかの実験で試験した。これらの実験の対象群は、新たに診断され、そして慢性化した（ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ）ＩＤＤＭ患者である。これらの患者では、ＣｐＧ予防接種は残りの貯蔵ベータ細胞に破壊的な前−炎症性自己免疫攻撃をモジュレートし、それらの生存および機能の続行を可能とすることが期待される。ベータ細胞機能の維持は、改善された代謝制御、インスリン要求の低下および高血糖的攻撃の率の低下をもたらすはずである。改善された代謝制御は、疾患の後期に糖尿病が関係する健康上の合併症を下げるか、または遅らせることが示された。
【００６８】
フェイズＩ−慢性化したＩＤＤＭを対象とした安全性試験；二重盲検、無作為のプラセボ−対照；ＣｐＧワクチンの３用量、２回投与；投薬スケジュール：０、６カ月＋７週間の追跡。
【００６９】
フェイズＩＩ−安全性＆効力試験−慢性化したＩＤＤＭ；二重盲検、無作為のプラセボ−対照；ＣｐＧワクチンの３用量、４回投与；投薬スケジュール：０、１、６および１２カ月＋６カ月の追跡。基準Ｃ−ペプチドレベルが０．１ピコモル／ｍｌ以上の患者を実験に含める。試験の終点：刺激したＣ−ペプチド、インスリン用量、ＨｂＡ１Ｃ、ＣｐＧワクチンに対する免疫学的応答（Ｔｈ２シフト）。
【００７０】
フェイズＩＩ−安全性＆効力試験−新たに診断されたＩＤＤＭ成人；二重盲検、無作為のプラセボ−対照；ＣｐＧワクチンの１〜３用量、４回投与；投薬スケジュール：０、１、６および１２カ月＋６カ月の追跡。基準Ｃ−ペプチドレベルが０．１ピコモル／ｍｌ以上の患者を実験に含める。試験の終点：刺激したＣ−ペプチド、インスリン用量、ＨｂＡ１Ｃ、ＣｐＧワクチンに対する免疫学的応答（Ｔｈ２シフト）。
【００７１】
フェイズＩＩ−安全性＆効力試験−新たに診断されたＩＤＤＭ幼児；二重盲検、無作為のプラセボ−対照；ＣｐＧワクチンの１〜３用量、４回投与；投薬スケジュール：０、１、６および１２カ月＋６カ月の追跡。基準Ｃ−ペプチドレベルが０．１ピコモル／ｍｌ以上の患者を実験に含める。試験の終点：刺激したＣ−ペプチド、インスリン用量、ＨｂＡ１Ｃ、ＣｐＧワクチンに対する免疫学的応答（Ｔｈ２シフト）。
【００７２】
すべての臨床試験は、ワクチンに関する通例のスケジュールに従う時期に、限られた数の投与を必要とする、ＣｐＧワクチンがワクチンとして作用するという作業仮説に基づく。ＣｐＧワクチンは慢性的処置のために治療用ワクチンとしても投与することができ、そして疾患に特異的なＴｈ１からＴｈ２へのシフトを維持するために、より強い投薬スケジュールが必要である。
【００７３】
ＩＤＤＭ患者の処置のためのＤＮＡワクチンは、さらにＨｓｐ６０、ｐ２７７、ｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）およびｐ１２から成る群から選択されるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含んで成ることができる。さらなるワクチンおよび処置計画は、さらにＨｓｐ６０、ｐ２７７、ｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）およびｐ１２から成る群から選択されるペプチドまたはポリペプチド分子の投与を含んで成ることができる。ペプチドまたはポリペプチド分子は、ＤＮＡワクチンと一緒に、またはＤＮＡワクチンとは独立して、または別に投与してもよい。
【００７４】
前述の具体的態様の記載は、本発明の一般的性質を完全に明らかにしているので、他者が現在の知識を応用することにより、実験を行うことなく、そして一般的概念から逸脱することなくそのような具体的態様を種々の応用に容易に修飾かつ／または適合でき、したがってそのような適合および修飾は開示した態様の均等物の意味および範囲内に包含されるべきであり、かつ包含することを意図する。本明細書で使用する語法および用語は、説明を目的とするものであり限定するものではない。種々の開示した機能を行うための手段、材料および工程は、本発明から逸脱することなく様々な代替的形態を取ることができる。すなわち上記明細書および／または特許請求の範囲に見いだされる、「〜するのための手段」および「〜のための手段」という表現、または任意の方法の工程の用語、続いて機能的叙述は、いかなる構造的、物理的、化学的または電気的要素または構造でも、あるいは述べた機能を行う現在、または将来存在し得るいかなる方法工程でも、上記の明細書に開示した態様（１つまたは複数）に厳密に等しくても、等しくなくても、すなわち同じ機能を行うために他の手段または工程を使用することができることを意図し、そして網羅し：そしてそのような表現にはそれらの最も広い解釈が与えられることを意図する。
【００７５】
【表６】
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【００７６】
【表７】
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【００７７】
【表８】
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【００７８】
【表９】
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【００７９】
【表１０】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１Ａおよび１Ｂは、プラスミドｐＨｓｐ６０で免疫感作したＢＡＬＢ／ｃマウス中のＨｓｐ６０に対する抗体を表すグラフである。
【図２】
ＤＮＡ予防接種によるＮＯＤ糖尿病の防止を示すグラフである。
【図３】
ＤＮＡ予防接種によるインスリン炎の減少を示すグラフである。
【図４】
図４Ａおよび４Ｂは、ＤＮＡ予防接種したマウスにおけるＨｓｐ６０およびｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）に対する増殖的応答を示すグラフである。
【図５】
図５Ａおよび５Ｂは、プラスミドまたはＣｐＧオリゴヌクレオチドで予防接種することにより、Ｈｓｐ６０およびｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）に対する抗体の誘導を示すグラフである。
【図６】
ＣｐＧ注射によるＮＯＤ糖尿病の防止を示すグラフである。
【図７】
図７Ａおよび７Ｂは、プラスミドまたはＣｐＧオリゴヌクレオチドで予防接種することにより、Ｈｓｐ６０およびｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）に対する抗体のアイソタイプを示すグラフである。
【図８】
図８Ａおよび８Ｂは、ＮＯＤ脾臓細胞カルチャー中のＣｐＧオリゴヌクレオチドに応答するＩＬ−１０およびＩＦＮγの生産を示すグラフである。
【図９】
ＣｐＧを用いた脾臓細胞の活性化がＨｓｐ６０放出を導くことを示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2005503320.tif 000076
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