(57)【要約】本発明は、生きている生物の病理学的変性プリオンタンパク質（ＰｒＰSc）を濃縮および追跡する方法に関する。
2005531775.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
病理学的に変化したプリオンタンパク質（ＰｒＰSc）を検出する方法であって、
ａ）固体担体と一緒に標本をインキュベートするステップであって、前記固体担体がβ−プリーツシート結合性分子と結合されるステップと、
ｂ）前記β−プリーツシート結合性分子に結合されていない、前記標本の成分を除去するステップと
ｃ）β−プリーツシート結合性分子に結合された、前記標本の成分を検出するステップと、
を含む、方法。
【請求項２】
ステップａ）の前に、前記標本がプロテイナーゼ処理に付される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記固体担体が、球形ポリマー、プラスチック表面、シリカゲル被覆スライドガラス、毛細管または膜である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記β−プリーツシート結合性分子が、３〜３０アミノ酸残基の長さを有するオリゴペプチドか、または置換された複素環式芳香族である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記オリゴペプチドが、配列番号１〜１０に記載のアミノ酸配列を提供する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記検出が、免疫学的検出方法を用いて実施される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
病理学的に変化したプリオンタンパク質（ＰｒＰSc）を検出するためのキットであって、β−プリーツシート結合性分子と結合した少なくとも一の固体担体、洗浄液、溶離液および検出システムを含む、キット。
【請求項８】
前記検出システムが、免疫学的検出システムであって、抗ＰｒＰ抗体で被覆された第２の固体担体と、酵素でマークした二次抗体と、基質溶液と、停止溶液とを含む、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
前記一の固体担体が、使い捨てカラムに詰められており、前記第２の固体担体がマイクロタイタープレートである、請求項７または８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生きている生物の病理学的に変化したプリオンタンパク質を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）は、感染性の、常に致命的な、中枢神経系の変性疾患である。これらの疾患で生じる脳の組織病理学的変化は、天然の細胞プリオンタンパク質（ＰｒＰC）の配座異性体である、病理学的に変化したプリオンタンパク質（ＰｒＰSc）の蓄積と関連付けられている。疾患の経過中に生じるプリオン複製は、ＰｒＰScとＰｒＰCとの間の直接相互作用の結果として起こり、正常なＰｒＰCに、病的なＰｒＰScの立体配座を強制する。ＰｒＰCと比較すると、ＰｒＰScは、β−プリーツシート構造の含有量増加およびプロテアーゼ（たとえばプロテイナーゼＫ）に対する高い抵抗性を特徴とする。
【０００３】
このＰｒＰScの抵抗性が、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）を検出するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断で、現在使用されている。現行のテストシステムの原理は、脳幹（閂部）由来の組織部分をホモジナイズし、それらをプロテイナーゼＫで処理することにある。プロテアーゼ処理は、正常なＰｒＰCを完全に分解するが、ＢＳＥ感染動物由来のＰｒＰScは、アミノ酸数個分だけ短縮されるに過ぎず、その結果、相対分子量が、３３〜３５ｋＤａから２７〜３０ｋＤａに減少する。この後、ウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡ技術を使用し、モノクローナル抗体を用いて、残存するＰｒＰを可視化する。
【０００４】
このテストシステムの重大な不都合は、その感度が低いことである。ＢＳＥ感染牛におけるＰｒＰSc濃度は、中枢神経系（ＣＮＳ）における既存のテストシステムに十分な高く、したがって、診断は、これまでは、死後テストに限定され、また少なくとも１８ヶ月から数年という感染生物の潜伏期を頼りにする。
【０００５】
上述のＰｒＰScの検出に加えて、ＴＳＥを診断するための２つの他の方法：ＣＮＳにおける典型的な海綿状変化を検出するための組織病理学的方法、およびマウスモデルで標本の感染性を実証するバイオアッセイがある。これらの方法は両者とも、重大な不都合を有する。脳の構造変化は、臨床期直前の、潜伏後期のみに生じるため、該組織病理学的方法は、発症前診断に適さない。さらに、必要な脳成分を生きている生物から得ることはできないため、この方法を用いた場合は、死後に診断が行われる。理論上は、バイオアッセイは、１つの感染単位を検出することができるが、この方法は、少なくとも数ヶ月を要し、数年を必要とすることさえある。
【０００６】
潜在的感染後できる限り速く、かつ／または未だ生きている生物で、診断を実施するためには、以前の検出方法の感度を実質的に上昇させなければならず、またＣＮＳ以外の組織／体液での検出を可能にしなければならない。
【０００７】
病的なＰｒＰScの、ヒト血清タンパク質、たとえばプラスミノゲンへの結合は、フィッシャー（Ｆｉｓｃｈｅｒ）らによって記載されている［Ｆｉｓｃｈｅｒ，ＭＢ；Ｒｏｅｃｋｌ，Ｃ；Ｐａｒｉｚｅｋ，Ｐ；Ｓｃｈｗａｒｚ，ＨＰ；Ａｇｕｚｚｉ，Ａ（２０００）；「Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｄｉｓｅａｓｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｏ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ」。Ｎａｔｕｒｅ，４０８：４７９−４８３］。ＰｒＰCを結合させることはできないため、プリオンタンパク質のプラスミノゲンへの結合は、該タンパク質の立体配座によって左右される。フィブリノゲンもＰｒＰScを結合することができるが、Ｃａ2+イオンがない場合は、結合することができない。
【０００８】
ＷＯ  ０２／００７１３号によれば、ＣＮＳ物質からＰｒＰScを単離するためには、ＰｒＰScの、ヒトプラスミノゲンへの特異的結合が使用される。この目的のために、ヒトプラスミノゲンを磁気粒子上に固定する。しかし、この方法は、プラスミノゲンを含有しない、体液中および組織中のＰｒＰScの検出に適するにすぎず、たとえば、血清中のＰｒＰScの検出には適さない。この方法の他の不都合は、高価なことおよびプラスミノゲンを担持した磁気粒子のタンパク質結合能力が限られていることである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、本発明は、高い感度を達成し、また生きている生物でのＴＳＥの診断を可能にする方法を提供するという目的に基づく。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
この目的は、特許請求の範囲に明確に規定される主題事項によって達成される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明を、添付の図面を参照しながら説明する。
【００１２】
本明細書で使用されるとき、用語「β−プリーツシート結合性分子」は、その三次元構造および／またはその物理的性質のために、タンパク質、たとえば病理学的に変化したモノマー／オリゴマーのプリオンタンパク質におけるβ−プリーツシート構造と相互に作用できる、また、この相互作用に基づいてそれらを結合することができる、有機分子を表す。代表的なβ−プリーツシート結合性分子を、配列番号１〜１０に記載する。
【００１３】
本明細書で使用されるとき、用語「β−シートブレーカー（ＢＳＢ）」は、β−アミロイドのβ−プリーツシート構造（アルツハイマー病ではタンパク質が凝集する）およびアミロイド様構造に結合するのみならず、それらの異常な折り畳みを阻止したり逆戻りさせたりすることもできる、短いペプチドを表す。
【００１４】
本明細書で使用されるとき、用語「病理学的に変化したプリオンタンパク質」は、ＰｒＰScを指す。ＰｒＰScは、モノマー形および／またはオリゴマー形、および繊維状の形、アミロイド凝集体でも存在することができる。
【００１５】
本明細書では、死後に、脳幹組織でプロテイナーゼＫ耐性ＰｒＰScが検出されるウシを、「ＢＳＥ陽性牛」と定義する。
【００１６】
本発明は、
ａ）固体担体と一緒に標本をインキュベートするステップであって、該固体担体をβ−プリーツシート結合性分子に結合させるステップと、
ｂ）β−プリーツシート結合性分子に結合されていない、該標本の成分を除去するステップと、
ｃ）β−プリーツシート結合性分子に結合された、病理学的に変化したプリオンタンパク質（ＰｒＰSc）を検出するステップと
を含む、病理学的に変化したプリオンタンパク質（ＰｒＰSc）を検出する方法に関する。
【００１７】
本発明による方法を用いると、体液、細胞溶解物または体組織の中に含まれるモノマーおよび／またはオリゴマー形の、病理学的に変化したプリオンタンパク質は、最小の、これまでは検出不可能であった濃度のＰｒＰScを実証できるような方法で濃縮される。結果として、ＴＳＥ誘発性プリオンによる感染直後でさえも、生きている動物またはヒトを、感染していると分類することができる。以前は、この種の高感度テストを使用することができず、その上、検出は、死後に、ＰｒＰSc濃度が十分に高い脳組織を用いて実施することしかできなかったため、これが不可能であった。さらに、該方法は、感度が高いため、体組織で、たとえば、既存の検出方法を用いた場合には、感染がかなりの程度まで既に進行したときに限って結果を示す脳ホモジネートで、感染後、かなり早期に、結果を提供する。
【００１８】
調査すべき標本は、体液、たとえば血液、血清、血漿、脳脊髄液、水性体液、涙液、尿、唾液、リンパ液、乳汁、あるいは、たとえば白血球またはリンパ系組織由来の細胞の細胞溶解物、あるいは、たとえば中枢神経系由来の組織、リンパ組織（たとえば脾臓、扁桃、リンパ節）または他の器官の組織ホモジネートであってもよい。
【００１９】
インキュベーション前に、標本を、場合により、標本調製段階に付してもよい。これは、特に、組織標本の場合に必要かもしれない。組織標本は、適切な緩衝液、たとえば５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．５を加えた後、たとえば、超音波処理またはリボライザー（ｒｉｂｏｌｙｓｅｒ）処理を使用して機械的に粉砕し、次いで、それらの成分を、溶液または懸濁液に変えるためにホモジナイズする。機械的処理により得られた組織懸濁液または細胞懸濁液中の固体成分、または体液中に存在する固体成分を分離するために、標本を、遠心分離段階および／または濾過段階にも付してもよい。
【００２０】
上述の標本調製の有無にかかわらず、標本を、任意選択的に、付加的にまたは排他的に、プロテイナーゼ処理に付して、インキュベーション前に、ＰｒＰCのタンパク質分解的分解を達成することができる。これは、検出されるＰｒＰSc、たとえばＰｒＰScのモノマーおよび／またはオリゴマー形が、プロテイナーゼ処理後に限ってＰｒＰScとＰｒＰCとを区別することができる抗体を使用して検出される場合に、主として指示される。この目的のために、該標本材料を、プロテアーゼ、たとえばプロテイナーゼＫで処理する。プロテアーゼ消化は、それぞれのプロテアーゼの標準条件で実施してもよく、製造業者の説明書に従って実施してもよく、好ましくは、３７℃で１時間で実施される。使用される酵素濃度は、標本材料によって、およそ１０μｇ／ｍｌ〜およそ１ｍｇ／ｍｌの範囲内であってもよく、好ましくは、およそ５０μｇ／ｍｌの酵素で、標本材料のタンパク質含有量はおよそ０.５〜およそ１０ｍｇ／ｍｌである。
【００２１】
該固体担体は、球形ポリマー（たとえばセファロース、アガロースまたはラテックス）、プラスチック表面（たとえばマイクロタイタープレート）、シリカゲル被覆ガラスプレート（たとえば薄層クロマトグラフィ用）、毛細管または膜であってもよい。球形ポリマーは、カラムクロマトグラフィまたはバッチ操作（たとえば磁気ビーズ）における担体として使用することができる。該ポリマーを、カラムクロマトグラフィに使用する場合、ポリマーは、予め充填された、使い捨てカラムで使用することが好ましい。本明細書に列挙した固体担体とともに、β−プリーツシート結合性分子のカップリングに使用することができる、任意の固体担体が適する。
【００２２】
標本は、閉鎖した容器内で、固体担体、たとえばガラスプレート、マイクロタイタープレートと一緒に、約４℃〜約５０℃の範囲内の温度で、約５分〜約１２０分間、インキュベートしてもよい。インキュベーションは、好ましくは、低回転数（たとえば８０ｒｐｍ）のインキュベーターシェーカーで、３７℃で１時間、実行される。標本を固体担体と一緒にインキュベートすることにより、標本中に含まれるＰｒＰScは、固体担体上に固定されたβ−プリーツシート結合性分子に結合される。固体担体、たとえば、球形ポリマーをポリマークロマトグラフィに使用する場合、インキュベーションは、カラムで実施される。カラムの装置への連結および標本の流通速度に基づいて、カラムに応じてインキュベーション期間を変えることができる。
【００２３】
固体担体に結合したβ−プリーツシート結合性分子は、ＰｒＰCよりかなり大きい親和力でＰｒＰScを結合し、また、本発明によれば、体液中に存在する可溶性ならびにモノマーおよび／またはオリゴマー形のＰｒＰScを捕獲することができる。本発明によれば、該β−プリーツシート結合性分子は、３〜約３０アミノ酸、好ましくは、４、５または６アミノからなるオリゴペプチド酸である。これらのペプチドは、たとえば、溶解性を良くするために、Ｃ末端および／またはＮ末端修飾することができる。ＰｒＰScを結合する特性に加えて、β−プリーツシート結合性分子は、β−シートブレーカー［ＢＳＢ］の特性も提供することができる。しかし、ＢＳＢ特性のほかに、本発明によるβ−？プリーツシート結合性分子は、ＰｒＰScへの結合特性（親和性、結合の可逆性）を提供し、その結果、溶液からのＰｒＰScの捕獲および濃縮を可能にする。β−プリーツシート構造を非常にしっかりと、すなわち不可逆的な様式で結合し、その結果、溶離を防止する、ＢＳＢペプチドは、β−プリーツシート結合性分子として不適当である。ＰｒＰScを余りにも低い親和力で、すなわち非永久的様式で結合する（たとえば、β−プリーツシート構造の破壊後、ＢＳＢからＰｒＰScを放出する）ＢＳＢも、やはり不適当である。特に好ましいβ−プリーツシート結合性分子を表１に示し、配列番号１〜１０に列挙する。β−プリーツシート結合性分子は、置換された複素環式芳香族であってもよく、フラボノイド、たとえば、チオフラビンＴ、バイカリンまたはクエルシトリンが有利である。
【００２４】
β−プリーツシート結合性分子は、好ましくは、共有結合によって、固体担体状に固定されている。β−プリーツシート結合性分子上のアミノ基、カルボキシル基またはヒドロキシル基等の官能基を使用して、担体とのカップリングが達成される。β−プリーツシート結合性分子がペプチドであれば、カップリングは、Ｎ末端のアミノ基またはＣ末端のカルボキシル基により好ましく達成される。オリゴペプチドが配列ＫＬＶＦＦ（配列番号２）を有するペンタペプチドである場合、アミノ基によるカップリングを用いると、該ペプチドはリシン残基の側鎖にも固定され、これがＰｒＰSc結合の立体障害を招く可能性があるため、カップリングは、Ｃ末端のカルボキシルにより形成されることが好ましい。
【００２５】
固体担体と一緒に標本をインキュベートした後、β−プリーツシート結合性分子に結合されていない、該標本の成分を、好ましくは洗浄段階で除去する。適切なストリンジェンシー上昇添加物を含む緩衝化溶液を洗浄液として使用する。該洗浄液のｐＨ値は、中性の範囲内、好ましくはおよそｐＨ７．５である。できれば、該溶液を緩衝化するために、５０ｍＭリン酸緩衝液を使用する。さもなければ、中性の範囲でｐＨ値を調節することができる緩衝液が適当である。ストリンジェンシーを高める添加物は、無機塩類、たとえばＮａＣｌであってもよく、ＳＤＳ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ  １００またはＴｗｅｅｎ  ２０等の界面活性剤、あるいは、カオトロピック試薬、たとえば尿素、塩酸グアニジンまたはグアニジンイソチオシアナートであってもよい。１〜４ＭのＮａＣｌを含む緩衝液が洗浄液として有利に使用される。
【００２６】
担体材料の表面特性によって、β−プリーツシート結合性分子に結合したＰｒＰScは、場合により固体担体から溶離される（たとえば、球形ポリマーをカラムクロマトグラフィで使用するとき）。他の担体、たとえば膜またはプラスチック表面を使用する場合、該ＰｒＰScは、固体担体で直接検出することができる。しかし、この場合、必要に応じて、溶離も可能である。
【００２７】
β−プリーツシート結合性分子から、したがって固体担体から、該ＰｒＰScを溶離するために、該担体を極めて少量の溶離液ですすぐ。使用する検出システムの感度に十分な濃度を達成するためには、溶離体積は、標本の体積よりかなり少なくなければならない。
【００２８】
ＰｒＰScとキャッチャー分子との間の結合を解く添加物を含有する緩衝化溶液を、溶離液として使用する。該溶離液のｐＨ値は、約ｐＨ６〜約ｐＨ８．５の範囲内、好ましくはおよそｐＨ７．５である。できれば、該溶液を緩衝化するために、５０ｍＭリン酸緩衝液を使用する。さもなければ、上述の範囲で、好ましくは中性の範囲で、ｐＨ値を調節することができる緩衝液が適当である。該添加物は、たとえば、界面活性剤、たとえばＳＤＳ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ  １００またはＴｗｅｅｎ  ２０、カオトロピック試薬、たとえば尿素、塩酸グアニジンまたはグアニジンイソチオシアナート、無機塩類、たとえばＮａＣｌであってもよい。該溶離液は、好ましくはデタージェント、たとえば、５％ＳＤＳを含有する。
【００２９】
この後、前段階で濃縮されたＰｒＰScを検出することができる。この目的のために、免疫化学的検出方法（たとえばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、免疫沈殿）；生物物理学的検出方法（たとえば質量分析法、蛍光相関分光法）；生化学的検出方法（たとえば生化学的パラメーター、相対モル質量、Ｎ末端またはＣ末端アミノ酸配列、結合パートナーの会合定数および解離定数の測定）；または生物学的検出方法（たとえば細胞毒性アッセイ）を使用することができる。
【００３０】
できれば、該検出は、ＰｒＰScの速やかな検出を可能にする方法で実行する。これは、たとえば、免疫学的検出方法、好ましくはサンドイッチＥＬＩＳＡであってもよい。サンドイッチＥＬＩＳＡは、既知の方法を使用して実施される。この状況で、検出抗体たとえば酵素（たとえばセイヨウワサビペルオキシダーゼ）を、着色した化合物、蛍光染色（たとえばフルオレセイン）、金粒子または核酸（たとえばＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチド）で、マークすることができる。
【００３１】
酵素マーキングの場合、染色の強度を、基質の変換後に測光法的に記録し、また標本中に含まれるＰｒＰScの量に比例する。該抗体マーキングが、着色された化合物または蛍光染色であれば、染色またはそれぞれの蛍光の強度が直接測定される。該抗体マーキングが核酸である場合、結合した抗体の量は、ＰＣＲ（たとえばリアルタイムＰＣＲ）を使用してシグナルが増幅されることを特徴とする、ＤＮＡ標識またはＲＮＡ標識の吸収によって測定される。
【００３２】
本発明はまた、体液、細胞溶解物、組織ホモジネートまたは他の流体中のＰｒＰScを検出するためのキットにも関する。本発明によれば、該テストキットは、ＰｒＰSc濃縮用固体担体、免疫学的検出システム、可溶化、洗浄および溶離緩衝液濃縮物、様々なコントロール、酵素マーク抗ＰｒＰ抗体および対応する基質、ならびに停止液を含有する。
【００３３】
使用される固体担体は、好ましくは、アフィニティークロマトグラフ用材料、たとえば使い捨てカラムで、またはプラスチック表面上、たとえばマイクロタイタープレートで、使用される、本発明に従ってβ−プリーツシート結合性分子と結合されているセファロースである。該固体担体が、本発明による結合を有するアフィニティークロマトグラフ用材料である場合、これらは、懸濁液中に含まれてもよく、乾燥形であってもよく、またはテストキット中の使い捨てカラム内に既に詰められていてもよい。
【００３４】
該免疫学的検出システムは、好ましくは、第２の固体担体、たとえばマイクロタイタープレートが、ＰｒＰに特異的な抗体で、好ましくはモノクローナル抗ＰｒＰ抗体で、特に、マウス抗ＰｒＰ抗体で、被覆されている、サンドイッチＥＬＩＳＡである。テストキット中の固体担体は、特に、真空包装様式で提供される。
【００３５】
組換え方法で製造されるＰｒＰおよび／またはＰｒＰペプチドが、コントロールとして使用されることが好ましい。好ましくは、セイヨウワサビペルオキシダーゼが、抗体マーキングとして使用される。
【００３６】
本発明による方法およびテストキットは、医学および農学の分野で必要とされる、多数の標本を考慮して、広くデザインされた研究を可能にする。適切に設備が整った研究所では、検出方法の自動化が可能である。前述の全ての方法と比較してみると、本発明による方法は生きている動物およびヒトでのＴＳＥ診断にも適する。
【００３７】
以下の実施例を参考にしながら、本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００３８】
実施例１：ＭＴＰフォーマットで異なるペプチドを使用した、脳ホモジネートからのＰｒＰScの単離。
マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）（ヌンク・イムノ（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ）（商標）プレート・マキシソープ（Ｐｌａｔｅ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ）（商標）サーフィス（Ｓｕｒｆａｃｅ）Ｆ９６（デンマークのロスキレにあるヌンク（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ））を、表１に記載のペプチドで被覆した（図２参照）。被覆は、穴１個につき１００μｌのペプチド溶液（０．１Ｍの炭酸緩衝液ｐＨ９．６中１０μｇ／ｍｌ）と、４℃で１６時間インキュベートすることにより実施した。流体を真空除去し、ＭＴＰを、穴１個につき３００μｌの洗浄緩衝液（ＰＢＳ（１０ｍＭリン酸緩衝液、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２）；０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０））で３回洗浄した。洗浄用緩衝液中０．５％のカゼインと、室温で１時間インキュベートすることにより、遊離型の結合部位をブロックした。
【００３９】
洗浄段階（穴１個当たり３００μｌの洗浄用緩衝液）の後、被覆ＭＴＰをホイルで覆い、穴１個当たり１００μｌのＰｒＰSc含有標本（プラテリア（Ｐｌａｔｅｌｉａ）登録商標でＯＤ＞４．０の、ＢＳＥ陽性動物からの脳ホモジネート；陽性所見は、脳組織の免疫組織学的調査で確認した）と、３７℃で１時間インキュベートした。未結合の標本材料を、真空除去し、ＭＴＰを、穴１個当たり３００μｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄した。検出抗体（プラテリア（Ｐｌａｔｅｌｉａ）（登録商標）ＢＳＥ検出キット、米国ハーキュリーズにあるバイオ・ラド研究所（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＵＳＡ）とのインキュベーションを、製造業者の説明書に従って、室温で１時間実施した。洗浄穴１個当たり３００μｌの洗浄用緩衝液で５回洗浄することにより、余分の検出抗体を除去した。基質溶液（テトラメチルベンジジン［ＴＭＢ］、プラテリア（Ｐｌａｔｅｌｉａ）（登録商標）ＢＳＥ検出キット、米国ハーキュリーズにあるバイオ・ラド研究所（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＵＳＡ））を加えた後、１ＭのＨ2ＳＯ4を加えることにより、３０分後に染色現像を停止した。４５０ｎｍ（リファレンス６２０ｎｍ）における吸光測定により、染色の強度を記録した。
【００４０】
測定された吸光は、該ペプチドに結合したＰｒＰScの量に比例し、したがって、キャッチャー分子の効率の尺度を提供する。最高のβ−プリーツシート結合性分子（ペプチド２）からのシグナルを１００％として、被験ペプチドの相対結合効率を表１にまとめる。
【００４１】
【表１】
2005531775.tif 000003
【００４２】
＜実施例２：ＭＴＰフォーマットでＫＬＶＦＦに結合したＰｒＰScの溶離＞
ＰｒＰScとキャッチャー分子との間の結合は、非常に強く、またＰｒＰScを固体担体から溶離するためには、比較的強烈な条件が必要である。溶離条件も、ＭＴＰフォーマットを使用してテストした。
【００４３】
実施例１の場合と同様に、ＭＴＰをペプチド２（ＫＬＶＦＦ）で被覆し、ＰｒＰScを含有する脳ホモジネート（プラテリア（Ｐｌａｔｅｌｉａ）（登録商標）で、ＯＤ＞３．０）を加えた。穴１個につき３００μｌの洗浄用緩衝液（ＰＢＳ；０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した後、潜在的緩衝液（表２参照）１００μｌを加え、室温で５分間インキュベートした。この後、流体を除去し、溶離緩衝液中に溶離したＰｒＰSc量およびＭＴＰ上に残っているＰｒＰSc量を、プラテリア（Ｐｌａｔｅｌｉａ）（登録商標）ＢＳＥ検出キット（米国ハーキュリーズにあるバイオ・ラド研究所（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＵＳＡ））を使用して測定した。界面活性剤含有緩衝液（５％ＳＤＳを含む）のみが、キャッチャー分子からＰｒＰScを完全に溶離するために適していたことが、溶離効率の比較（表２）から分かる。カオトロピック試薬（たとえば６Ｍ尿素）の存在下では、ＰｒＰScが部分的に溶離しただけであった。ｐＨ値が低い（たとえばｐＨ３）、すなわち、それぞれ高いイオン強度（たとえば２ＭのＮａＣｌ）を有する溶離緩衝液中では、ＰｒＰScは、キャッチャー分子にほぼ完全に結合したままであった。
【００４４】
【表２】
2005531775.tif 000004
【００４５】
＜実施例３：ペプチドＫＬＶＦＦのＥＡＨセファロースへの共有カップリング＞
アミノ基によるカップリングの場合には、ペプチドがＮ末端および側鎖（Ｌｙｓ）の両方に固定され、これが、三次元構造を妨げる可能性がある。こういう理由で、ペプチドのＣ末端のカルボキシル基により、β−プリーツシート結合性分子ＫＬＶＦＦの該固体担体への特異的結合を達成した。ＥＡＨ−セファロース４Ｂ（スウェーデンのアップサラにあるアマーシャム・ファルマシア・バイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ））を担体材料として使用した。
【００４６】
カップリング反応の準備をするために、ＥＡＨ−セファロースを０．５ＭのＮａＣｌで洗浄し、余分の流体を完全に除去した。リガンド（配列ＫＬＶＦＦを有するペンタペプチド）を、最終濃度である５ｍｇ／ｍｌまでＨ2Ｏに溶解し、ｐＨをＨＣｌで４．５に調節した。ゲルを、リガンド溶液に再懸濁し（ゲル１部＋リガンド溶液２部）、およびＥＤＣ（Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カーボジイミド）を、最終濃度０．１Ｍで加えた。穏やかに回転させながら、室温で２４時間にわたって、カップリング反応を実施した。この後、上澄みをゲル沈殿物から完全に除去した。製造業者の薦めに従って、存在するあらゆる遊離形の結合位置を、０．１Ｍ  ＥＤＣの存在下、１Ｍ酢酸でブロックした。ＫＬＶＦＦを加えたゲルを、クロマトグラフ用カラム（床体積１ｍｌ）に入れ、いずれの場合にも、３×２ｍｌの緩衝液Ａ（０．１Ｍの酢酸ナトリウム、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ４）および３×２ｍｌの緩衝液Ｂ（０．１Ｍのトリス／ＨＣｌ、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８）で交互に少なくとも３回、さらに最後に１０×２ｍｌのＨ2Ｏで洗浄した。
【００４７】
＜実施例４：ＫＬＶＦＦ−セファロースを用いた、脳ホモジネートからのＰｒＰScの単離＞
ＴＫＬＶＦＦ−セファロースが、β−プリーツシート結合性分子とし適当であることを証明するために、ＢＳＥ陽性牛の脳ホモジネートからのＰｒＰScを、該カラム材料に結合させ、次いで、再度溶離した。ＢＳＥ精製キット（米国ハーキュリーズにあるバイオ・ラド研究所（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＵＳＡ））を使用し、製造業者の説明書に従って、脳材料を準備した。該標本材料も、製造業者の説明書に従って、標本希釈緩衝液Ｒ６（プラテリア（Ｐｌａｔｅｌｉａ）（登録商標）ＢＳＥ検出キット、米国ハーキュリーズにあるバイオ・ラド研究所（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＵＳＡ））に溶解した（プラテリア（Ｐｌａｔｅｌｉａ）（登録商標）で、ＯＤ  ６．０）。
【００４８】
実施例３に示した通りに、ＫＬＶＦＦ−セファロース１ｍｌを用いてドリップ・カラムを調製し、室温で、ＰＢＳを満たし、平衡化した。該標本（２５０μｌ）を加えた後、カラムをＰＢＳ  ２ｍｌで洗浄し、流出液を分画で回収した。次いで、結合しているＰｒＰScを、ＰＢＳ中５％のＳＤＳ  １．５ｍｌを用いて、分画で溶離した。プラテリア（Ｐｌａｔｅｌｉａ）（登録商標）ＢＳＥ検出キットを使用して、個々の分画で得られたＰｒＰScの量を免疫学的に測定した。
【００４９】
図３は、この実験の溶離プロフィールを示し、ＫＬＶＦＦ−セファロースがＰｒＰScを可逆的に結合する能力、したがって、この材料が、大量の標本からＰｒＰScを選択的に濃縮するのに適することを記録する。ここで使用される脳標本は、ＰｒＰSc含有量が非常に高い（ＯＤｉｎプラテリア（Ｐｌａｔｅｌｉａ）（登録商標）でＯＤ  ６．０）ため、この状況で、流出液中に含まれるＰｒＰScは、カラム容量の過負荷に起因する。溶離液中に得られるシグナルは、ＥＬＩＳＡにおける溶離緩衝液中のＳＤＳの妨害作用によって低減される。
【００５０】
＜実施例５：ＭＴＰフォーマットでＫＬＶＦＦを用いた、体液からのＰｒＰScの単離（プリオン型ｉｎ  ｖｉｖｏＢＳＥテスト）＞
ＭＴＰ（ヌンク・イムノ（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ）（商標）プレート・マキシソープ（Ｐｌａｔｅ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ）（商標）サーフィス（Ｓｕｒｆａｃｅ）、Ｆ９６（デンマークのロスキレにあるヌンク（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）））を、ペプチドＫＬＶＦＦ（図２）で被覆した。被覆は、１００μｌのペプチド溶液（０．１Ｍの炭酸緩衝液ｐＨ９．６中１０μｇ／ｍｌ）と、４℃で１６時間インキュベートすることにより行った。この後、流体を真空除去し、穴１個につき３００μｌの洗浄用緩衝液（ＰＢＳ；０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０；ｐＨ７．２）で、ＭＴＰを３回洗浄した。洗浄用緩衝液中０．５％のカゼインと、室温で１時間インキュベートすることにより、遊離形の結合位置をブロックした。洗浄段階（穴１個につき３００μｌの洗浄用緩衝液で３回）の後、被覆ＭＴＰをホイルで覆い、穴１個につき１００μｌのＰｒＰSc含有標本と、室温で１時間インキュベートした。
【００５１】
この実験では、ＢＳＥ陽性の牛９頭およびＢＳＥ陰性の牛５頭からの水性体液標本ならびにＢＳＥ陽性の牛６頭およびＢＳＥ陰性の牛１３頭からの脳脊髄液標本を調査した。全ての標本は、ＢＳＥ精製キット（米国ハーキュリーズにあるバイオ・ラド研究所（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＵＳＡ））を用いて、予め準備しておいた。未結合標本材料を真空除去し、穴１個につき３００μｌの洗浄用緩衝液でＭＴＰを３回洗浄した。検出抗体（洗浄用緩衝液中５μｇ／ｍｌのＶ５Ｂ２、ダルムシュタットにあるｒ−バイオファーム（ｒ−Ｂｉｏｐｈａｒｍ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）））とのインキュベーションを、室温で１時間実施した。この後、再度、プレートを３００μｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼコンジュゲート（洗浄用緩衝液中１：２００００、米国ジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ，ＵＳＡ））と、室温で１時間、インンキュベートした。穴１個につき３００μｌの洗浄用緩衝液で５回洗浄することにより、余分のコンジュゲートを除去した。基質溶液（ＴＭＢ）を加えた後、１ＭのＨ2ＳＯ4を加えることにより、１５分後に染色現像を停止し、４５０ｎｍ（リファレンス６２０ｎｍ）における吸光測定により、染色強度を記録した。測定される吸光は、該ペプチドに結合したＰｒＰSc量に比例する。図４から分かる通り、ＢＳＥ陽性動物で得られる値は、ＢＳＥ陰性動物と比較して、有意に（ｔ−検定法）上昇している。水性体液標本では、陽性標本と陰性標本との間の差は、脳脊髄液の場合より、かなり明白である。これは、対応する体液中に存在するＰｒＰSc濃度によって説明される。これらの結果を考慮すると、水性体液は、生きている動物の体液で、ＰｒＰScを検出するための標本材料として、脳脊髄液より好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】固相結合したβ−プリーツシート結合性分子を使用して、ＰｒＰScを濃縮および検出するための、本発明による方法の原理を図式的に示す図である。
【図２】マイクロタイタープレート形式（ＭＴＰ）における、ＰｒＰSc結合アッセイの構造を図式的に示す図である（実施例１）。様々なβ−シートブレーカー（ＢＳＢ）ペプチドを、潜在的β−プリーツシート−結合分子およびＰｒＰScキャッチャーとして、担体上に固定した；標本材料とのインキュベーション後、モノクローナル抗ＰｒＰ抗体を使用して、結合したＰｒＰScを可視化した。
【図３】ＢＳＥ陽性牛の脳ホモジネートからのＰｒＰScをＫＬＶＦＦ−セファロースに結合後、個々の分画中のＰｒＰSc含量の溶離プロフィールを示す図である。分画中に含まれるＰｒＰScの量は、プラテリア（Ｐｌａｔｅｌｉａ）（登録商標）ＢＳＥ検出キットを使用して、半定量的方式で測定し、光学密度（Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｄｅｎｓｉｔｙ）［ＯＤ］値で示す。
【図４】牛からの水性体液標本および脳脊髄液標本における、ＰｒＰSc検出の評価を示す図である。この実施例では、ＥＬＩＳＡ形式で、ＰｒＰScのキャッチャー分子として、ペプチドＫＬＶＦＦを使用した。検出は、ＰｒＰScに対するモノクローナル抗体Ｖ５Ｂ２（ダルムシュタットにあるｒ−バイオファーム（ｒ−Ｂｉｏｐｈａｒｍ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ））およびポリクローナルペルオキシダーゼがコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を用いて実施した。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年3月7日(2005.3.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
病理学的に変化したプリオンタンパク質（ＰｒＰSc）を検出する方法であって、
ａ）固体担体と一緒に標本をインキュベートするステップであって、前記固体担体が、β−プリーツシート結合性分子と結合されており、前記β−プリーツシート結合性分子が、配列番号１〜１０に記載のアミノ酸配列のオリゴペプチドからなる群から選択されるオリゴペプチドか、またはチオフラビンＴ、バイカリンおよびクエルシトリンからなる群から選択される置換された複素環式芳香族である、ステップと、
ｂ）前記β−プリーツシート結合性分子に結合していない、前記標本の成分を除去するステップと、
ｃ）前記β−プリーツシート結合性分子に結合した、前記標本の成分の病理学的に変化したプリオンタンパク質（ＰｒＰSc）を検出するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
ステップａ）の前に、前記標本がプロテイナーゼ処理に付される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記固体担体が、球形ポリマー、プラスチック表面、シリカゲル被覆スライドガラス、毛細管または膜である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記検出が、免疫学的検出方法を用いて実施される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
病理学的に変化したプリオンタンパク質（ＰｒＰSc）を検出するためのキットであって、β−プリーツシート結合性分子と結合した少なくとも一の固体担体と、洗浄液と、溶離液と、検出システムとを含む、キット。
【請求項６】
前記検出システムが、免疫学的検出システムであり、抗ＰｒＰ抗体で被覆された第２の固体担体と、酵素でマークされた二次抗体と、基質溶液と、停止溶液とを含む、請求項５に記載のキット。
【請求項７】
前記１種の固体担体が使い捨てカラム内に詰められており、前記第２の固体担体がマイクロタイタープレートである、請求項５または６に記載のキット。
【国際調査報告】
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