(57)【要約】本発明は、Ｎ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンを有効成分として含有する抗がん剤組成物及びがん治療用キットに関する。 本発明に係る抗がん剤組成物は、スフィンゴシンキナーゼの活性を抑制できることから、スフィンゴシンキナーゼが誘発する多くのメカニズムを遮断することができる。例えば、スフィンゴキナーゼによりスフィンゴシンがリン酸化することを防ぐことにより、セラミドとスフィンゴシンの濃度を高く保持でき、これらのセラミドとスフィンゴシンによりがん細胞からアポトーシスが誘発されることから、がん細胞を死滅させるという効果がある。
2005531542.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンを有効成分として含有する抗がん剤組成物。 
【請求項２】
フィトスフィンゴシン、アセチル化フィトスフィンゴシン及びエチル化フィトスフィンゴシンからなる群より選ばれる何れか１種以上のフィトスフィンゴシン誘導体をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の抗がん剤組成物。
【請求項３】
前記Ｎ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシン対前記フィトスフィンゴシン誘導体の重量比は、１：１であることを特徴とする請求項２に記載の抗がん剤組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の抗がん剤組成物を含むことを特徴とするがん治療用キット。
【請求項５】
前記抗がん剤組成物を他の抗がん剤の補助剤(Sensitizer)として含むことを特徴とする請求項４に記載のがん治療用キット。
【請求項６】
Ｎ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンを有効成分として含有するスフィンゴシンキナーゼ抑制剤組成物。
【請求項７】
Ｎ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンを有効成分として含有するアポトーシス誘導組成物。
【請求項８】
Ｎ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンを有効成分として含有するプロテインキナーゼＣ抑制剤組成物。
【請求項９】
Ｎ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンを有効成分として含有する抗炎性剤組成物。
【請求項１０】
Ｎ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンを有効成分として含有する細胞過形成性の疾患の治療用組成物。 
【請求項１１】
前記過形成性の疾患は、乾癬であることを特徴とする請求項１０に記載の過形成性の疾患の治療用組成物。
【請求項１２】
Ｎ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンを有効成分として含有する抗菌用組成物。
【請求項１３】
Ｎ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシン化合物の製造方法であって、
前記Ｎ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシン化合物は、下記式３で表される化合物を中間物質として、下記式２で表わされるフィトスフィンゴシンを溶媒中で、かつ還元剤の存在下でホルムアルデヒドと反応させることにより得られることを特徴とする方法。
【化１】
2005531542.tif 000015
【化２】
2005531542.tif 000016
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はジメチルフィトスフィンゴシンを含有する組成物に係り、より詳細には、スフィンゴシンキナーゼ抑制活性、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）抑制活性、アポトーシス誘導活性、過形成性の疾患の治療活性、抗がん活性、抗炎活性、抗菌活性を有する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在のところがんは、死亡率１位の難治病であり、近年、その発病率は益々増えつつある。がんの治療法としては、手術、放射線治療、化学療法などが挙げられ、その完治率は約５０％に留まっているのが現状である。がんは、発病初期に発見された場合には手術や放射線療法によっても完治が可能ではあるものの、がんが進んでいる場合には主として化学療法剤を使用する。しかしながら、化学療法剤は、その不作用により投薬期間及び投薬量に制限があり、しかも薬剤耐性が生じ易いため、その治療効果は他の疾患に比べて低いとされている。
【０００３】
近年、抗がん剤の開発を目指した研究が盛んに行われて作用点が多様化するに伴い、副作用が小さく、しかも効果の良好な薬が開発されつつある。また、プロテインキナーゼなどを抗がん剤と併用して抗がん剤の効果を高めるという増進剤に関する研究も盛んに行われてきている。
【０００４】
このような抗がん剤の開発が究極的に目指しているのは、正常細胞には効かないつつもがん細胞には選択的に作用する薬剤、及び薬剤耐性が生じているがん細胞にも効くか、さらには薬剤耐性を生じさせない薬剤の開発であると言える。現在開発されているほとんどの抗がん剤の作用メカニズムは、がん細胞内でのセラミドのプールを高めてがん細胞の死滅効果をもたらすことである。抗がん剤の処理によるがん細胞の死滅メカニズムは、次のように捉えられる。抗がん剤や放射線の照射など外部より刺激が加えられれば、スフィンゴミエリンの分解が起こりつつ細胞内のセラミドとスフィンゴシンの濃度が高まり、これにより、細胞はアポトーシスに移行する。ところが、スフィンゴシンがスフィンゴシンキナーゼの作用によりリン酸化スフィンゴシンに変われば、細胞がアポトーシスに移行するのではなく、細胞の成長を誘導する結果、がん細胞が反って増殖してしまう現象が現れる。一方、最近には、グリコシルセラミド合成酵素（Ｇｌｙｃｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅａｓｅ）によりグリコシルセラミドが多量合成されれば、薬剤耐性を帯びるという報告もある。
【０００５】
抗がん剤の作用メカニズムは、結果的に、がん細胞内でのセラミドの濃度変化を引き起こすことである。特に、がん細胞の場合には、セラミドの含量が正常細胞に比べて低いと報告されており、この理由から、セラミドの濃度向上や分解抑止に寄与する物質が、抗がん剤としての開発可能性が高いと期待されている。これにより、セラミドの代謝経路から様々な目標を定めることが可能である。まず、抗がん剤の開発目標の一つは、セラミド合成酵素(ceramide synthease)に影響してセラミドの新規な合成を増やすことである。今まで知られている物質としては、パクリタキセル(paclitaxel)、エトポシド(etoposide)、アントラサイクリン(anthracyclines)、ビンカ・アルカロイド(vinca alkaloids)、Ｃ６−セラミド、ＴＮＦ−α、ＳＤＺ ＰＳＣ ８３３などがある。また、抗がん剤の別の開発目標は、スフィンゴミエリナーゼ(sphingomyelinase)に影響してスフィンゴミエリンの分解を促進することにより、セラミドの含量を高めることである。かかる効果が得られる物質としては、放射線の照射を含めてＣＤ−９５、アントラサイクリン、ＴＮＦ−α、Ｆａｓリガンド、Ａｒａ−Ｃなどが知られている。細胞内でのセラミドの含量を高める方法も重要であるが、生成されたセラミドの分解を抑えることも立派な開発目標になりうる。中でも、薬剤耐性を引き起こすグリコシルセラミドの合成を抑えることは、抗がん剤の効果を倍加させる上で有効である。今まで知られている物質としては、タモキシフェン(tamoxifen)、トレミフェン(toremifen)、ミフェプリストン(mifepristone)、サイクロスポリン・エー（Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ Ａ）、ケトコナゾール(keroconazole)、ベラパミル(verapamil)、ＰＰＭＰなどがある。これらの物質は、単独で使用するよりは、セラミドの生成を促進する物質と併用した方が、抗がん剤の効果を一層高められる上で有効である。セラミドの分解を抑えられる別の方法は、スフィンゴシンキナーゼの活性を抑えるか、あるいはリン酸化スフィンゴシンからリン酸基を取り除くことによりスフィンゴシンに戻すスフィンゴシンホスファターゼを活性化させることである。スフィンゴシンキナーゼの活性を抑える物質に代表されるのは、ジメチルスフィンゴシン(Dimethylsphingosine)である。このほかに、プロテインキナーゼ抑制剤なども、抗がん剤と併用すればがん細胞の死滅効果を高めると知られている。このため、最近は、これら各種多様な作用メカニズムを有した薬剤を併用することにより、抗がん効果を極大化させようとする研究が活発に行われ始めている。
【０００６】
セラミドの分解を抑える物質は、細胞に影響しないほどの量だけを使用すれば抗がん剤との併用による相乗効果(Synergic effect)が得られることから、副作用へのリスクも低減可能である。
【０００７】
セラミド及びタクソール(taxol)を併用する場合、頭頸部(Head and Neck)がん細胞のアポトーシスを増やすということが報告されている。また、直腸がん細胞の場合、セラミドの含量が正常細胞の約５０％に過ぎないと知られており、強力なセラミダーゼ阻害剤を使用すればアポトーシスが誘発されるということが明らかになっている。特に、セラミダーゼ阻害剤は、がん細胞に対する選択性がないため、抗がん剤の立派なターゲットになりうる。さらに、サフィンゴル（Ｓａｆｉｎｇｏｌ： Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｄｉｈｙｄｒｏｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ）をプロテインキナーゼ抑制剤として抗がん剤であるドキソルビシン(doxorubicin)と併用する場合、抗がん効果が高まるという臨床実験の結果も出ている。一方、ＮＩＨ ３Ｔ３線維芽細胞においてスフィンゴシンキナーゼを発現させたときに細胞の分裂速度が上がり、しかも形質転換された様子を示すことから、スフィンゴシンキナーゼが癌遺伝子(oncogene)の特性を有するということが推測可能である。併せて、スフィンゴシンキナーゼの発現増加はアポトーシスを防止すると報告されており、これは、スフィンゴシンキナーゼ阻害剤が抗がん剤として使用可能であることを示唆している。
【０００８】
この研究に先行する研究として、各種多様なものが報告されている。プロテインキナーゼの競争的な抑制剤であるサフィンゴル（Ｓａｆｉｎｇｏｌ： Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｄｉｈｙｄｒｏｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ）をドキソルビシンやマイトマイシン・シー（Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ）と併用すれば、がん細胞の死滅効果が高まり、抗がん剤の耐性を帯びた細胞株においても細胞毒性を有するということが明らかになっている（例えば、ＵＳＰ６，４４４，６３８、ＵＳＰ５，８２１，０７２を参照）。また、ＵＳＰ６，３６８，８３１等は、セラミド分解抑制剤を細胞過形成性の疾患を治療するのに使用すれば、優れた効果が得られるということを報告している。この上文で言及した特許によれば、セラミド分解抑制剤として、ジメチルスフィンゴシンを各種の抗がん剤と併用していることが記載されている。
【０００９】
また、最近、エーム・ディー・アンダーソン（Ｍ．Ｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ）がん治療センターからは、ジメチルスフィンゴシンが薬剤耐性を有する急性白血病に効果があると報告されている。
【００１０】
スフィンゴシンあるいはフィトスフィンゴシン及びその誘導体は、前記の如き機能を含めて各種の機能を有するとの報告がある。リン酸化したスフィンゴシンは、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ：ｐｌａｔｅｌｅｔ ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）が関与する細胞増殖に対するシグナル伝達体（ｓｅｃｏｎｄ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ）である。これは、血小板に多量含有されて血小板を活性化させたり、活性化した血小板から遊離されて止血、血栓症、創傷治癒に関与したりするなど、病態生理学的な機能をすると知られており、さらに、細胞の運動性を調節するシグナルl伝達体（としても機能する。スフィンゴシンは、セラミダーゼ(Ceramidase)により生成され, 、がん細胞のアポトーシスを誘発する役割を果たす。メチル化したスフィンゴシンの中でも、Ｎ，Ｎ−ジメチルスフィンゴシンは、細胞内において代謝的に安定したスフィンゴシンであるとも言えるほど、その機能がスフィンゴシンに類似している。さらに、スフィンゴシンよりも一層強力なＰＫＣ抑制剤であって、表皮がん細胞、白血病細胞に加えて、様々ながん細胞の成長を抑えるアポトーシス誘発物質である。そして、血小板の活性化およびリン酸化したスフィンゴシンの遊離（生成）を抑える機能もする。Ｎ，Ｎ、Ｎ−トリメチルスフィンゴシンは、ジメチルスフィンゴシンの細胞毒性と水への溶解度を改善した物質であって、ジメチルスフィンゴシンとほとんど類似なＰＫＣ抑制効果を有している。しかし、アポトーシスの機能は有しておらず、しかもジメチルスフィンゴシンに比べてスフィンゴシンリン酸化酵素を抑える機能も極めて微々である。これに対し、抗炎効果は極めて優れていると知られている（例えば、Ｉｇａｒａｓｈｉ，Ｙ．１９９７  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２２，１０８０−１０８７を参照）。ほとんどの場合、フィトスフィンゴシンの代謝に関する研究はイーストを通じて行われてきたが、このフィトスフィンゴシンはイーストだけではなく、人体の表皮内にも実質的に存在するということが明らかになった。また、このフィトスフィンゴシンについては、ＰＫＣ及びＰＬＤ（ホスホリペーゼＤ）の抑制効果があり、生体内において紫外線により引き起こされる炎症に対する抑制効果があるということが確認された。さらに、抗生剤エリスロマイシンと比較してプロピオン酸菌属(Propionibaterium acnes)とブドウ状球菌(Staphylococcus aureu)に対する成長抑制効果に優れているということが明らかになった（例えば、下記の特許文献４から６を参照）。
【００１１】
しかしながら、かかる生理活性物質としてのフィトスフィンゴシンは、優れた機能を有していることから大きく注目されてはいるが、純粋な合成方法により製造するにはあまりにも高価であり、経済的な理由から使用に難点があった。また、合成により得られたものは、人体内に存在するスフィンゴ脂質とは立体化学的な構造が異なる場合が多く、抽出による方法もまたその起点についての議論が絶えず提起され、その結果、使用に制限があった。かかる状況下で、本発明者らは、既に母菌株（ＮＲＲＬ Ｙ−１０３１（Ｆ−６０−１０））から胞子分離方法により選別した菌株を用い（大韓民国特許登録第１８８８５７号公報；米国特許登録第６，１９４，１９６号公報を参照）、酵母発酵を通じてフィトスフィンゴシンを大量に得る方法を開発するに至った（大韓民国特許登録第２２１３５７号公報；米国特許登録第５，９５８，７４２号公報；フランス特許登録第２８７１５０２号公報を参照）。このようにして得られたフィトスフィンゴシンは、人体内に存在するスフィンゴ脂質と立体化学的に同じ構造を有することが明らかになり、産業的な活用度が益々高まりつつある。これにより、量産が可能なフィトスフィンゴシンを基にする、生理活性効果に優れた各種の誘導体を開発することになった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、スフィンゴシンキナーゼの活性を抑えてアポトーシスを誘発するセラミドとスフィンゴシンの濃度を高く保持することにより、がんを治療または予防するところにある。また、本発明の他の目的は、プロテインキナーゼの活性を抑え、かつ、細胞増殖を促進するスフィンゴシンキナーゼの活性を抑えることにより、細胞過形成性の疾患、例えば、がんと乾癬などを治療または予防するところにある。さらに、本発明のさらに他の目的は、それ自体としても優れたアポトーシス誘導活性を有する組成物を提供するところにある。さらにまた、本発明のさらに他の目的は、抗菌活性、抗炎症活性などの効能を有する組成物を提供するところにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記の諸目的を達成するために、本発明による抗がん剤組成物は、Ｎ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシン(N,N-Dimethylphytosphingosine)を有効成分として含有することを特徴とする。
【００１４】
ここで、前記抗がん剤組成物は、フィトスフィンゴシン、アセチル化フィトスフィンゴシン及びエチル化フィトスフィンゴシンからなる群より選ばれる何れか１種以上のフィトスフィンゴシン誘導体をさらに含むことを特徴とする。
【００１５】
好ましくは、前記Ｎ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシン対フィトスフィンゴシン誘導体の重量比は、１：１である。
【００１６】
また、本発明によるがん治療用キットは、前記抗がん剤組成物を含むことを特徴とする。
【００１７】
ここで、前記がん治療用キットは、前記抗がん剤組成物を他の抗がん剤の補助剤として含むことを特徴とする。
【００１８】
さらに、本発明による組成物は、Ｎ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンを有効成分として含有するスフィンゴシンキナーゼ抑制剤組成物、アポトーシス誘導組成物、プロテインキナーゼＣ抑制剤組成物、または抗炎症剤組成物、細胞過形成性の疾患の治療用組成物または抗菌剤組成物であることを特徴とする。
【００１９】
前記細胞過形成性の疾患の治療用組成物において、前記細胞過形成性の疾患は、乾癬であることを特徴とする。
【００２０】
本発明による組成物に含まれるジメチルフィトスフィンゴシンは、下記式１で表される。
【化１】
2005531542.tif 000003
【００２１】
前式１で表されるＮ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシン化合物は、下記式３で表される化合物を中間物質として用い、下記式２で表されるフィトスフィンゴシンを溶媒中で、かつ還元剤の存在下でホルムアルデヒドと反応させることにより得られる。
【化２】
2005531542.tif 000004
【化３】
2005531542.tif 000005
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、前記製造方法についてより詳細に説明する。
【００２３】
この製造方法は、タンパク質のアミンメチル化反応に基づく還元的なメチル化反応に用いられる。アミンの反応性を高めるためには、水素化物、好ましくは、水素化ホウ素ナトリウムが使われる。この時、その量としては、化学式２で表わされる化合物を基準として８．０ないし１０倍量（モルベース）使用することが好ましい。溶媒としては、ホウ酸緩衝液とメタノールを同じ割合にて混合したものを使用する。反応は、３７％のホルムアルデヒド水溶液を一定量ずつ時間間隔をおいて数回に亘って加え、７２時間の間常温状態で放置することにより行われる。
【００２４】
しかし、本発明による方法に使用できる酸化剤は、以上に挙げられたものに限定されることなく、反応に影響しない範囲内であれば、当業界において既に公知のものが制限なく使用可能である。また、前述した方法により製造された、化学式１で表される化合物をクロロホルムやクロロホルム及びメタノールの混合溶媒などの有機溶媒により抽出し、シリカゲルによる吸着クロマトグラフィにより精製を行う。
【００２５】
本発明による組成物に含まれるジメチルフィトスフィンゴシンは、ジメチルスフィンゴシンに比べてスフィンゴシンキナーゼ抑制効果に優れている。特に、本発明者らは、ジメチルフィトスフィンゴシンがアポトーシス誘発効果、プロテインキナーゼＣの抑制効果などに優れていることから、単独で使用する場合でも各種のがん細胞株からアポトーシスを強力に誘発するということを知見した。
【００２６】
ジメチルフィトスフィンゴシンはそのまま使用しても良く、薬学的に認められる塩状にて医薬に使用しても良い。前記塩としては、薬学的に認められるものであれば、特に限定されることなく、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、フッ化水素酸、臭素化水素酸、ギ酸、酢酸、酒石酸、乳酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸などが使用可能である。
【００２７】
本発明による組成物を製造するために、ジメチルフィトスフィンゴシンを抗がん剤または抗がん治療向けの増進剤の薬剤学的な組成物として製剤化する場合、有効成分に悪影響を及ぼさない限り、必要に応じて医薬に使われる各種の補助剤、例えば、担体やその他の添加剤、例えば、安定剤、弛緩剤、乳化剤などを添加することができる。
【００２８】
また、本発明に係るジメチルフィトスフィンゴシンを含有する組成物は非経口または経口などにより投与することができ、注射剤、散剤、顆粒剤、錠剤などを始めて製剤学的に見て適したものであれば、いかなる剤型にも製造することができる。
【００２９】
ジメチルフィトスフィンゴシンは単独で使用しても良く、あるいは他のフィトスフィンゴシン誘導体と併用しても良い。この時、併用して投与する場合の両成分間の混合比としては、最も好ましくは、ジメチルフィトスフィンゴシン５０重量％と、その他のフィトスフィンゴシン誘導体５０％の割合である。しかし、本発明は必ずしもこれに限定されることはなく、前記の混合比は、剤型に応じて様々に変化でき、通常の方法に準拠する。本発明によるジメチルフィトスフィンゴシンの一日投与量は、好ましくは、０．００１から１，０００ｍｇ／Ｋｇである。
【００３０】
本発明による組成物は単独で投与されても良く、他の抗がん剤と等価に、または他の抗がん剤を補助するために投与されても良い。
【００３１】
一方、本発明による組成物は、化粧料の組成物であっても良く、この時、その剤型は特に制限されることなく、皮膚軟化剤、収れん化粧水、スキンローション、エッセンス、ローション、栄養クリーム、ジェル、パック、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォータなどの剤型でありうる。
【００３２】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、これらの実施例は単なる例示的なものに過ぎない。
【実施例】
【００３３】
＜実施例１：Ｎ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンの製造＞
本発明者らは、先ず、前式１で表わされるＮ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンを次のようにして製造した。２ｇのフィトスフィンゴシン（０．００６３モル）を２００mlのメタノールに加え、４０℃の温度条件下で攪拌して溶解させた後、メタノールと同量の０.２Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ ９.０）を徐々に加え、超音波処理により分散させた。次に、４℃のアイスバスにおいて、この分散液に１ｇの水素化ホウ素ナトリウムを注意深く加えた。この時、急激に沸騰する場合があるので、注意する必要がある。１０分後に３７％のホルムアルデヒド水溶液を１０mlずつ５分おきに加え、合計で６回に亘って加えた。２４時間が経過した後、同じ方法により水素化ホウ素ナトリウムをさらに加えた。反応は、実温において７２時間行った。７２時間後に１００mlのクロロホルムを加え、蒸留水にて抽出を行うことにより、反応を終えた。次に、シリカゲルによる吸着クロマトグラフィにより精製を行い、前式１で表わされる化合物を得た。シリカゲル薄膜クロマトグラフィ（ＴＬＣ）により精製（クロロホルム：メタノール：アンモニア水＝８０：２０：２、Ｒｆ＝０．６）を行い、化学式１で表わされる白い化合物を１．５ｇ（収率：６８.９％）得た。図１に示すように、１Ｈ ＮＭＲにてメチル基が２つ導入されたこと（＝２．４ｐｐｍ，ｓ，６Ｈ）を確認し、図２に示すように、ＭＡＬＤＩ−ＭＡＳＳにて分子量（計算値：３４６.３２、測定値：３４６．４６）を測定することにより確認を行った。
【００３４】
＜実施例２：Ｎ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンのスフィンゴシンキナーゼ活性抑制＞
本発明者らは、本発明による組成物がスフィンゴシンキナーゼ活性の抑制効果を有するということを見せるために、次のように実験を行った。
【００３５】
本発明によるジメチルフィトスフィンゴシンの効果をジメチルスフィンゴシンと比較するために、ジメチルスフィンゴシンに対しても同じ実験を行った。スフィンゴシンキナーゼの活性を測定するために、スフィンゴシンキナーゼ 測定 用の緩衝溶液(sphingosine kinase assay buffer)を次の如き組成を持つべく製造した：２０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ ７．２、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、２０％グリセロール、１ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ Ｎａ3ＶＯ4、１５ｍＭ ＮａＦ、１０ｇ／mlロイペプチン(leupeptin)及びアプロチニン、１ｍＭ ＰＭＳＦ及び０．５ｍＭ ４−デオキシピリドキシン。
【００３６】
反応量は２００μlとし、０．２５％のトリトンＸ−１００に溶かした５０μＭのジメチルスフィンゴシン及びジメチルフィトスフィンゴシンと、マウス由来のスフィンゴシンキナーゼ１０ｎｇと、１ｍＭ [32Ｐ] ＡＴＰと、をそれぞれ入れ、３７℃で２０分間反応を行った。反応が終わった後、２０から５０μlの１Ｎ ＨＣｌを加えてから反応を止めた。その後、１mlのクロロホルムを入れて脂質の分離精製を行い、窒素ガスの雰囲気下で乾燥を行った。シンチレーション計数器を用いて放射線同位元素を測定することにより、生成されたスフィンゴシン−１−フォスフェイトを測定し、スフィンゴシンキナーゼに対する抑制効果を確認した。その結果を示す図３のグラフにおいて、Ｘ軸はＣＰＭ(count per minute)を、Ｙ軸は濃度（μＭ）を示す。図３に示すように、ジメチルフィトスフィンゴシンは、ジメチルスフィンゴシンに比べて強力なスフィンゴシンキナーゼの抑制効果を有することが分かり、これは、スフィンゴシンキナーゼを直接的に阻害するということを示唆している。
【００３７】
＜実施例３：ＨＬ６０細胞におけるＮ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンのアポトーシスの誘発効果＞
Ｎ−Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンのアポトーシス誘発効能を調べてみた。抗がん効果は、その作用メカニズムと化学構造に応じて細胞内の様々なシグナル伝達経路を経るが、結果的には、細胞を死滅させるアポトーシスを誘発する。がん細胞に対するＮ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンの抗がん効果を調べるために、先ず、細胞毒性の度合いを測定し、その測定結果に基づきアポトーシスを確かめた。
【００３８】
実験は、ＭＴＴ分析方法により行った。ＭＴＴ（３−[４，５−ジメチルチアゾール−２イル]−２，５−ジフェニルテトラゾリウム）は、培地への溶解時には黄色を帯びる染色試薬であるが、生きている細胞のミトコンドリア内における活性を帯びたデヒドロゲナーゼという酵素により紫色のホルマザンに変わる。このため、細胞の成長が止まったり細胞が死ねば紫色への変色が減り、その度合いを級光度を通じて測定することになる。ＨＬ６０細胞株を適正な濃度にて９６−ウェルプレートに播種し、５％のＣＯ2培養器において３７℃の温度条件下で２４時間培養を行った。培養後、アポトーシス効果をテストする各試料（フィトスフィンゴシン、Ｃ２フィトセラミド、テトラアセチルフィトスフィンゴシン、Ｃ６フィトセラミド、Ｃ８フィトセラミド、Ｃ３セラミド、スフィンガニン、ジメチルスフィンゴシン及びジメチルフィトスフィンゴシン）を血清無しでＲＰＭＩに希釈し、０．５Ｍ〜５０Ｍの濃度にて細胞に処理した後、２４時間培養を行った。最終的な濃度が０．５ｍｇ／mlであるＭＴＴを個々のウェルに入れて３時間さらに培養した後、ピペットにより染色試薬を溶かし、５７０ｎｍにて級光度を測定した。その結果を図４に示す。
【００３９】
図４に示すように、本発明によるＮ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンは、ＨＬ６０細胞において細胞死滅を誘導するということが分かり、このため、アポトーシス誘発による抗がん効果があると判断される。
【００４０】
図４において、各略字は、それぞれ以下の意味を有する。
ＰＳ：フィトスフィンゴシンスフィンゴ
Ｃ２−ＰＣＥＲ：Ｃ２フィトセラミド（Ｎ−アセチルフィトスフィンゴシン）
ＴＡＰＳ：テトラアセチルフィトスフィンゴシン
Ｃ６−ＰＣＥＲ：Ｃ６フィトセラミド
Ｃ８−ＰＣｅｒ：Ｃ８フィトセラミド
Ｃ２−Ｃｅｒ ：Ｃ２セラミド
Ｓｐｈｉｎｇａｎｉｎｅ：スフィンガニン
ＤＭＳ：ジメチルスフィンゴシン
ＤＭＰＳ：ジメチルフィトスフィンゴシン
【００４１】
＜実施例４：ＨａＣａＴ細胞におけるＮ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンのアポトーシスの誘発効果＞
アポトーシスを誘発する細胞株としてＨａＣａＴ細胞を用いたことを除いては、前記実施例３の方法と同様にして実験を行った。その結果を図５に示す。
【００４２】
図５に示すように、本発明によるＮ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンは、ＨａＣａＴ細胞において細胞死滅を誘導するということが分かり、このため、アポトーシス誘発による抗がん効果があると判断できる。特に、ジメチルスフィンゴシンに比べてその効果が一層優れていることが明らかになった。図５における各略字は、前記実施例３における説明と同じである。
【００４３】
＜実施例５：ＬＬＣ−ＰＫ１細胞におけるＮ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンのアポトーシス誘発効果＞
アポトーシスを誘発する細胞株としてＬＬＣ−ＰＫ１細胞を用いたことを除いては、前記実施例３の方法と同様にして実験を行った。その結果を図６に示す。
【００４４】
図６に示すように、本発明によるＮ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンは、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞において細胞死滅を誘導するということが分かり、このため、アポトーシス誘発による抗がん効果があると判断できる。特に、ジメチルスフィンゴシンに比べてその効果が一層優れていることが明らかになった。図５における略字は、前記実施例３における説明と同じである。
【００４５】
＜実施例６：Ｂ１０４細胞におけるＮ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンのアポトーシス誘発効果＞
アポトーシスを誘発する細胞株としてＢ１０４細胞を用いたことを除いては、前記実施例３の方法と同様にして実験を行った。その結果を図７に示す。
【００４６】
図７に示すように、本発明によるＮ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンは、Ｂ１０４細胞において細胞死滅を誘導するということが分かり、このため、アポトーシス誘発による抗がん効果があると判断できる。特に、ジメチルスフィンゴシンに比べてその効果が一層優れていることが明らかになった。図７における略字は、前記実施例３における説明と同じである。
【００４７】
＜実施例７：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるＮ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンのアポトーシス誘発効果＞
アポトーシスを誘発する細胞株としてＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を用いたことを除いては、前記実施例３の方法と同様にして実験を行った。その結果を図８に示す。
【００４８】
図８に示すように、本発明によるＮ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において細胞死滅を誘導することが分かり、このため、アポトーシス誘発による抗がん効果があると判断できる。特に、ジメチルスフィンゴシンに比べてその効果が一層優れていることが明らかになった。図８における略字は、前記実施例３における説明と同じである。
【００４９】
＜実施例８：Ｎ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンのＤＮＡ断片化実験＞
細胞毒性を示す濃度レベルにおいて、アポトーシスの代表的な特徴であるＤＮＡ断片化検査を行った。アポトーシスは、プログラム細胞死により形態学的な変化だけではなく、クロマチン凝縮、アポトーシス体(apoptotic body)形成など、複雑な生物学的な特徴が現れるが、この実験では、中でもＤＮＡの断片化を調べてみた。ＨＬ−６０細胞を１×１０7細胞／１０mlの数だけ播種し、５％のＣＯ2の培養器において２４時間３７℃の温度条件下で培養を行った後、Ｎ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンの対照群として使用した物質を図９に示す濃度下で処理し、２４時間培養を行った。全ての物質はエタノールに溶かした。細胞を遠心分離を通じて回収し、溶菌緩衝液（５ｍＭトリス−ＨＣＬ（ｐＨ ７．４）、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％のトリトンＸ−１００）を加えて細胞膜を破砕した。１２，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離を行った後、切り取られたＤＮＡ断片が溶解されている上澄み液を回収した。上澄み液と同量のフェノールを加えてポルラックスにかけた後、１２，０００ｒｐｍにて１０分間さらに遠心分離を行い、上澄み液を注意深く回収した。フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）あるいはクロロホルムを通じたＤＮＡ抽出も上記のフェノール方法と同様にして行われた。各種の溶媒処理を通じて得られた上澄み液に０．３Ｍ酢酸ナトリウム及びｐＨ ５．２のエタノールを加え、一日間 -２０℃の冷凍庫において沈澱を行った。１２，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離を行った後、得られたＤＮＡペレットだけを残して上記の上澄み液は捨て、７０％のエタノールを入れて洗浄を行った。さらに遠心分離を行った後、上澄み液は捨て、残されたＤＮＡ切片をＴＥ緩衝液に溶かした。ＤＮＡ切片の他に存在可能なＲＮＡを取り除くために、０．５ｍｇ／mlのＲＮＡｓｅを１ulだけ入れ、３７℃において３０分間反応を行った。１．２％のアガロースゲル電気泳動を通じてＤＮＡ断片化を確かめ、その結果を図９に示す。図９に示すように、短鎖セラミドの一つであるＮ−アシールスフィンゴシン（Ｃ２−セラミド）が２５．０μＭの濃度においてＤＮＡの断片化現象を示した。Ｎ−アシールスフィンゴシンはアポトーシス誘発物質として知られており、ＤＮＡの断片化現象は、かかる効能についての一例である。同様に、本発明によるＮ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンが同じ濃度においてＤＮＡの断片化現象を引き起こすということが確かめられた。特徴的な点としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンは、対照群として使用したＣ２−セラミドよりも低濃度において梯形のＤＮＡ断片化現象を明示的に示し、しかもその度合いが一層強かったということである。よって、本発明によるＮ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンは、Ｎ−アシールスフィンゴシンに比べてアポトーシス誘発効果に一層優れていると判断される。スフィンゴシンセラミドの一種であるＣＬＡセラミドは、同じ濃度にてＤＮＡ断片化現象を示さなかった。
【００５０】
図９における記号の意味は、それぞれ次の通りである。
ＳＭ： ＤＮＡサイズマーカー
ＥｔＯＨ ：エタノール
１： ＤＭＰＳ １２．５μＭ
２： ＤＭＰＳ ２５．０μＭ
３： ＤＭＰＳ ５０．０μＭ
４： Ｃ２セラミド２５．０μＭ
５： Ｃ２セラミド５０．０μＭ
６： ＣＬＡセラミド２５．０μＭ
７： ＣＬＡセラミド５０．０μＭ
【００５１】
＜実施例９：Ｎ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンのアンチヒストン抗体結合への効果＞
この実験は、ＥＬＩＳＡの原理に基づくものである。すなわち、一本鎖あるいは二本鎖のＤＮＡとヒストン（Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３及びＨ４）に対する特異的な単一クロン抗体を用い、細胞質内に分解された核酸のモノソームあるいはオリゴソームを検出することができる。アポトーシスの起こった細胞は、Ｃａ2+とＭｇ2+に依存的なエンドヌクレアーゼを活性化させ、この酵素は隣り合う二本鎖のＤＮＡを分解してモノあるいはオリゴソームを形成する。これにより、核内においてＤＮＡと堅固に結合されていたヒストンは外に表出される。
【００５２】
まず、抗ヒストン抗体を９６ウェルに固定させ、コート液中及び常温下で１時間反応を行った。次に、各試料を処理して得られた細胞分解物の細胞質内に発生したヌクレオソームに存在するヒストン成分を、抗ヒストン抗体が固定されている９６ウェルに取り付けた。これは、１５から２５℃において９０分間行った。そして、抗−ＤＮＡ−ペルオキシダーゼ（Anti-DNA-peroxidase）を細胞質内のヌクレオソームのＤＮＡ部分と結合させた。これは、常温において９０分間行った。結合できなかったペルオキシダーゼ共役を洗浄し、基質であるＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ジ−[３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸]）を加えた後、１０から２０分間反応を行い、４０５ｎｍの波長における吸光度を測定した。その結果を図１０に示す。
【００５３】
図１０に示すように、ジメチルフィトスフィンゴシンの場合に、他の対照群に比べて吸光度（Ａ４０５ｎｍからＡ４９０ｎｍ）が高いことが分かる。これは、モノソームあるいはオリゴソームが最大に増えていることから、他の試料に比べて核酸の断片化が多いに引き起こされたと解釈することができる。核酸の断片化が大いに発生したということは、アポトーシスが多量発生したことを裏付けるものである。
【００５４】
前記実施例３から９の結果によれば、本発明によるＮ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンは、免疫細胞株(HL-60)、皮膚がん細胞株(HaCAT)、メラノサイト(B104)、肺がん細胞株(LLC-PK1)、及び乳房がん細胞株(MDA-MB231)のいずれにおいても細胞死を誘導し、他のスフィンゴ脂質誘導体に比べて、本発明によるジメチルスフィンゴシンはがん細胞株に対する毒性に最も優れているということが明らかになった。
【００５５】
＜実施例１０：Ｎ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンのＰＫＣ抑制効果＞
本発明者らは、ラットの皮膚表皮細胞を用い、Ｎ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンのプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）抑制効果について調べてみた。表皮細胞を２×１０7細胞／mlになるべく培養したあと、Ｎ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシン及びその他のスフィンゴ脂質誘導体の各含量が１００μＭ、４００μＭになるように加え、反応を行った。前記細胞をＰＢＳにて洗浄した後、ホモジュナイザーにより細胞を破砕した。細胞の破砕液を遠心分離し、上澄み液をＤＥ５２カラムを通しつつプロテインキナーゼＣを含む部分を得た。活性化したＰＫＣ反応のために、ＰＫＣコアクチベーション５Ｘ緩衝液、ＰＫＣアクチベーション５Ｘ緩衝液、ＰＫＣビオチン化したペプチド基質、（32Ｐ）ＡＴＰミックスをそれぞれ５μだけ加えたチューブと、対照反応を調べるためにＰＫＣコアクチベーション５Ｘ緩衝液、コントロール５Ｘ緩衝液、ＰＫＣビオチン化したペプチド基質、（32Ｐ）ＡＴＰミックスをそれぞれ５μlだけ加えたチューブと、を用意し、それぞれに５μの酵素を添加した後、３０℃において５分間反応を行った。反応後、１２．５μlの反応止め溶液を添加して反応を止めた後、１０μlをＳＡＭ２ＴＭ膜に滴下した後、２Ｍ ＮａＣｌにて３０秒間１回、２Ｍ ＮａＣｌにて２分間３回、１％のＨ3ＰＯ4と２Ｍ ＮａＣｌ溶液に２分間４回、蒸留水にて３０秒間２回洗浄を行った。次いで、これを乾燥した後、シンチレーション計数器を用いて放射性同位元素を測定することにより、ＰＫＣ阻害効果を測定し、その結果を図１１に示す。図１１に示すように、本発明によるＮ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンの場合、ＰＫＣ阻害効果が高いということが分かる。これから、本発明による組成物は、抗炎症効果があると判断される。
【００５６】
＜実施例１１：Ｎ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンの抗菌活性＞
本発明者らは、Ｎ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンの抗菌活性を調べるために、グラム陽性菌であるバチルスリケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、グラム陰性菌である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を用いて実験を行った。この時、培地としてＬＢ（バクトペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母抽出物５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ）あるいはＴＳ（トリプトン１５ｇ／Ｌ、ソイトン５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）を加圧殺菌して用い、３０℃または３７℃において２−３日間培養を行った。培養が終わった後、菌数を測定して抗菌力を調べてみた。本発明においては、抗菌効果を調べるために、Ｎ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンをエタノールに溶かし、１μg／ml、５μg／ml、１００μg／ml、１，０００μg／mlの濃度にて使用した。それぞれの微生物を培養して１０倍ずつ順次に希釈し、それぞれの培養培地に塗抹して培養した後、平らな培地当たり約３０から３００個の集落を形成する希釈倍数を決定した。それぞれの微生物を培養した後、前記の実験において決定された希釈倍数に希釈した。この時、希釈溶液としては、０．８５％のＮａＣｌを使用する。前記の方法により用意した試料を、試料の用意に使われた溶媒に順次に希釈して所望の濃度にした後、希釈した試料を９mlの微生物希釈溶液に１mlだけ添加し、十分に混合した。３０℃あるいは３７℃において１時間放置した後（時々混合）、培地に１００μlずつ塗抹してそれぞれの培養条件下で培養を行った。培養後に集落の数を調べ、その結果を図１２に示す。
【００５７】
図１２に示すように、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）とバチラス・リケニフォルミス(B. licheniformis)の両方においてそのコロニの数が減り、１μg／Ｌという少量をもってコロニーの量が４０％まで減ったことが分かる。
【００５８】
以下、本発明による組成物の好ましい製剤例を挙げて本発明を一層詳細に説明する。
【００５９】
＜製剤例１：Ｎ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシン２％クリーム＞
【表１】
2005531542.tif 000006
【００６０】
ステアリルアルコール、セチルアルコール、モノステアリン酸ソルビタン及びミリスチン酸イソプロピルを２重壁付き容器に入れ、混合物が完全に溶融するまで加熱した。この混合物を７０〜７５℃において、液体に対する均一器を使いつつ別々に製造した精製水、プロピレングリコール及びポリソルベート６０の混合物に加えた。生成されたエマルジョンを混合し続けつつ、２５℃未満に冷却した。Ｎ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシン、ポリソルベート８０及び精製水の溶液及び精製水中の無水亜硫酸ナトリウム溶液を混合し続けつつ、エマルジョンに加えた。クリームを均一化させ、適当なチューブに詰めた。
【００６１】
＜製剤例２：Ｎ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシン２％局所用ジェル＞
【表２】
2005531542.tif 000007
【００６２】
塩酸を溶液になるまで適当量加えた。水酸化ナトリウムをｐＨ ６．０になるまで適当量加えた。精製水を適当量加え、１００ｍｇにした。
【００６３】
精製水中のヒドロキシプロピルβ−シクロデクストリンの溶液にＮ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンを攪拌しつつ加えた。塩酸を溶液になるまで加え、次いで、水酸化ナトリウムをｐＨ ６．０になるまで加えた。この溶液を混合しつつプロピレングリコール中のカラギーナンＰＪの分散液に加えた。徐々に混合しつつ混合物を５０℃に加熱し、エチルアルコールを加えて約３５℃に冷却させた。精製水の残量を加え、混合物を均一になるまで混合した。
【００６４】
＜製剤例３：Ｎ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシン２％局所用クリーム＞
【表３】
2005531542.tif 000008
【００６５】
塩酸を溶液になるまで適当量加えた。水酸化ナトリウムをｐＨ ６．０になるまで適当量加えた。精製水を適当量加え、１００ｍｇにした。
【００６６】
精製水中のヒドロキシプロピルβ−シクロデクストリンの溶液にＮ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンを攪拌しつつ加えた。
【００６７】
塩酸を溶液になるまで加え、次いで、水酸化ナトリウムをｐＨ ６．０になるまで加えた。グリセロール及びポリソルベート６０を攪拌しつつ加え、混合物を７０℃に加熱した。この加熱された混合物を７０℃において鉱油、ステアリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルモノステアレート及びソルベイト６０の混合物に加えた。２５℃未満に冷却させた後、精製水の残量を加え、混合物を均一になるまで混合した。
【００６８】
＜製剤例４：Ｎ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシン２％リポソーム製剤＞
【表４】
2005531542.tif 000009
【００６９】
Ｎ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシン、フォスファチジルコリン、コレステロール及びエチルアルコールの混合物を攪拌し、溶液になるまで５５ないし６０℃において加熱し、均一化しつつ精製水中のメチルパラフィン、プロピルパラフィン、エデト酸２ナトリウム及び塩化ナトリウムの溶液に加えた。精製水中のヒドロキシプロピルメチルセルローズを加え、膨潤するまで混合し続けた。
【００７０】
＜製剤例５：Ｎ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシン２％リポソーム製剤＞
【表５】
2005531542.tif 000010
【００７１】
エチルアルコール中のフォスファチジルコリン及びコレステロールの混合物を攪拌し、溶液になるまで４０℃において加熱した。Ｎ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンを４０℃において加熱しつつ混合した後、精製水に溶解させた。アルコール性溶液を１０分間均一化しつつ徐々に水溶液に加えた。精製水中のヒドロキシプロピルメチルセルロースを加え、膨潤するまで混合した。得られた溶液を１Ｎ水酸化ナトリウムを加えてｐＨ ５．０に調節し、精製水の残量を希釈する。
【００７２】
＜製剤例６：Ｎ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンのナノ分散液＞
【表６】
2005531542.tif 000011
【００７３】
ミグリオール８１２、Ｎ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシン及びポリソルベート８０を混合した。フォスファチジルコリンをエタノールに溶解させ、前記混合物に加えて均一な透明液体を得た。
【００７４】
【表７】
2005531542.tif 000012
【００７５】
Ｎ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンを含有する水相（例えば、９４．５４ｇ）を攪拌しつつ５０℃の容器内に放置した。転相のナノ分散液（例えば、５．４６ｇ）を攪拌しつつ水相に加えた。
【００７６】
＜製剤例７：医学用軟膏ベース製剤＞
【表８】
2005531542.tif 000013
【００７７】
＜製剤例８：化粧品クリーム製剤＞
【表９】
2005531542.tif 000014
【００７８】
水相部と油相部をそれぞれ７５℃に加熱した。
【００７９】
水相部と油相部が完全に溶解されたことを確認した後、水相部をメイン釜に入れた。
【００８０】
メインオープンに油相部を徐々に入れつつ、ホモミキサーを用いて３，５００ｒｐｍ、ペダルミキサーを用いて３０ｒｐｍにて３分間攪拌した後、冷却させた。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
以上述べたように、本発明による組成物を用いれば、スフィンゴシンキナーゼの活性を抑制できることから、スフィンゴシンキナーゼが誘発する多くのメカニズムを遮断することができる。例えば、スフィンゴキナーゼによりスフィンゴシンがリン酸化することを防ぐことにより、セラミドとスフィンゴシンの濃度を高く保持でき、これらのセラミドとスフィンゴシンによりがん細胞からアポトーシスが誘発されることから、がんを治療あるいは予防することができる。また、スフィンゴシンキナーゼの細胞増殖促進の活性を抑えることにより、細胞過形成性の疾患、例えば、がんと乾癬などを治療あるいは予防することができる。さらに、本発明による組成物は、プロテインキナーゼＣの活性を抑えることにより、プロテインキナーゼＣが誘発する多くのメカニズムを遮断することができる。 中でも、特に炎症を抑える効果に優れていることから、他の抗がん剤と混合して投与する場合、優れた抗がん効果を期待することができる。なおかつ、本発明による組成物は、その自体としても優れたアポトーシス活性を有することから、アポトーシスが要される状況で単独で使用できる。そして、本発明による組成物は、抗菌活性に優れた効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】図１は、本発明によるＮ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシン（N,N-Dimethylphytosphingosine:ＤＭＰＳ）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。
【図２】図２は、本発明によるＮ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンのＭＡＬＤＩ−ＭＡＳＳスペクトルである。
【図３】図３は、本発明によるＮ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンのスフィンゴシンキナーゼ抑制効果を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明によるＮ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンのＨＬ６０細胞株におけるアポトーシス誘導効果を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明によるＮ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンのＨａＣａＴ細胞株におけるアポトーシス誘導効果を示すグラフである。
【図６】図６は、本発明によるＮ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンのＬＬＣ−ＰＫ１(Lewis Lung Carcinoma 1)におけるアポトーシス誘導効果を示すグラフである。
【図７】図７は、本発明によるＮ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンのＢ１０４細胞株(melanoma cell)におけるアポトーシス誘導効果を示すグラフである。
【図８】図８は、本発明によるＮ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンのＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株(mammary tumor cell line)におけるアポトーシス誘導効果を示すグラフである。
【図９】図９は、本発明によるＮ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンのＤＮＡ断片化効果を示す電気泳動の結果である。
【図１０】図１０は、本発明によるＮ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンによる抗ヒストン抗体結合力の増加効果を示すグラフである。
【図１１】図１１は、本発明によるＮ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンによるＰＫＣ阻害効果を示すグラフである。
【図１２】図１２は、本発明によるＮ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンの抗菌活性を示すグラフである。
【図１】
2005531542.tif 000017
【図２】
2005531542.tif 000018
【図３】
2005531542.tif 000019
【図４】
2005531542.tif 000020
【図５】
2005531542.tif 000021
【図６】
2005531542.tif 000022
【図７】
2005531542.tif 000023
【図８】
2005531542.tif 000024
【図９】
2005531542.tif 000025
【図１０】
2005531542.tif 000026
【図１１】
2005531542.tif 000027
【図１２】
2005531542.tif 000028
【手続補正書】
【提出日】平成16年11月9日(2004.11.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンを有効成分として含有する抗がん剤組成物。
【請求項２】
フィトスフィンゴシン、アセチル化フィトスフィンゴシン及びエチル化フィトスフィンゴシンからなる群より選ばれる何れか１種以上のフィトスフィンゴシン誘導体をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の抗がん剤組成物。
【請求項３】
前記Ｎ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシン対前記フィトスフィンゴシン誘導体の重量比は、１：１であることを特徴とする請求項２に記載の抗がん剤組成物。
【請求項４】
請求項１から３のうち何れか１項に記載の抗がん剤組成物を含むことを特徴とするがん治療用キット。
【請求項５】
前記抗がん剤組成物を他の抗がん剤の補助剤(Sensitizer)として含むことを特徴とする請求項４に記載のがん治療用キット。
【請求項６】
Ｎ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンを有効成分として含有するスフィンゴシンキナーゼ抑制剤組成物。
【請求項７】
Ｎ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンを有効成分として含有するアポトーシス誘導組成物。
【請求項８】
Ｎ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンを有効成分として含有するプロテインキナーゼＣ抑制剤組成物。
【請求項９】
Ｎ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンを有効成分として含有する細胞過形成性の疾患の治療用組成物。
【請求項１０】
前記過形成性の疾患は、乾癬であることを特徴とする請求項９に記載の過形成性の疾患の治療用組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
本発明の目的は、スフィンゴシンキナーゼの活性を抑えてアポトーシスを誘発するセラミドとスフィンゴシンの濃度を高く保持することにより、がんを治療または予防するところにある。また、本発明の他の目的は、プロテインキナーゼの活性を抑え、かつ、細胞増殖を促進するスフィンゴシンキナーゼの活性を抑えることにより、細胞過形成性の疾患、例えば、がんと乾癬などを治療または予防するところにある。さらに、本発明のさらに他の目的は、それ自体としても優れたアポトーシス誘導活性を有する組成物を提供するところにある。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
さらに、本発明による組成物は、Ｎ，Ｎ−ジメチルフィトスフィンゴシンを有効成分として含有するスフィンゴシンキナーゼ抑制剤組成物、アポトーシス誘導組成物、プロテインキナーゼＣ抑制剤組成物、または細胞過形成性の疾患の治療用組成物であることを特徴とする。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
以上述べたように、本発明による組成物を用いれば、スフィンゴシンキナーゼの活性を抑制できることから、スフィンゴシンキナーゼが誘発する多くのメカニズムを遮断することができる。例えば、スフィンゴキナーゼによりスフィンゴシンがリン酸化することを防ぐことにより、セラミドとスフィンゴシンの濃度を高く保持でき、これらのセラミドとスフィンゴシンによりがん細胞からアポトーシスが誘発されることから、がんを治療あるいは予防することができる。また、スフィンゴシンキナーゼの細胞増殖促進の活性を抑えることにより、細胞過形成性の疾患、例えば、がんと乾癬などを治療あるいは予防することができる。さらに、本発明による組成物は、プロテインキナーゼＣの活性を抑えることにより、プロテインキナーゼＣが誘発する多くのメカニズムを遮断することができる。他の抗がん剤と混合して投与する場合、優れた抗がん効果を期待することができる。なおかつ、本発明による組成物は、その自体としても優れたアポトーシス活性を有することから、アポトーシスが要される状況で単独で使用できる。そして、本発明による組成物は、抗菌活性に優れた効果を奏する。
【国際調査報告】
2005531542.tif 000029
2005531542.tif 000030