(57)【要約】本発明は、炎症応答から生じる病的容態を処置する化合物または治療剤を同定及び開発するための、組成物及び方法に関する。特に、本発明は、細胞において、糖化タンパク質産生によるシグナル伝達に関連した炎症応答の誘導を阻害または遮断する化合物または治療剤を検出するための方法に関する。本発明は、Ｉ型及びＩＩ型糖尿病誘発脈管障害の脈管合併症、他の脈管障害、微小血管障害、腎不全、アルツハイマー症候群、及び炎症により誘発される疾患（例えばアテローム性動脈硬化症）を含むがこれに限定されない、生物学的容態を処置するための組成物及びその方法を提供する。
2005501222.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）細胞に、炎症に対して効果があると推測される化合物を含む組成物を加え；
ｂ）刺激剤を加え；
ｃ）少なくとも１つの炎症決定因子の量を測定し；そして
ｄ）ｃ）に由来する少なくとも１つの決定因子の量を、刺激剤で処理した細胞に由来する少なくとも１つの決定因子の量と比較することを含む、炎症に対して効果のある化合物を検出する方法。
【請求項２】
ｂ）刺激剤の添加は、ａ）炎症に対して効果があると推測される組成物を細胞に添加する前に行なう、請求項１の方法。
【請求項３】
ａ）炎症に対して効果があると推測される化合物を含む組成物の細胞への添加、及びｂ）刺激剤の添加は、同時に行なわれる、請求項１の方法。
【請求項４】
化合物は、化学元素、分子、化合物、混合物、エマルション、化学療法剤、薬理作用物質、ホルモン、抗体、成長因子、細胞因子、核酸、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物質、ヌクレオチド、炭水化物、及びこのような実体の組合せ、断片、類似体または誘導体である、請求項１の方法。
【請求項５】
刺激剤は糖化タンパク質である、請求項１の方法。
【請求項６】
糖化タンパク質はＧ−ＨＳＡまたはＡＧＥである、請求項５の方法。
【請求項７】
炎症決定因子は、ＮＦκ−Ｂ、ＩＬ１−β、ＩＬ−１１、ｍ−ＣＳＦ、フィブリノーゲン、ＴＮＦ−α、粘着分子、セレクチン、ＶＣＡＭ−１、ＣＲＰ、ＭＣＰ−１またはＰＡＩ−１からなる群より選択した細胞因子を含む、請求項１の方法。
【請求項８】
請求項１の方法により決定したような、炎症の処置に効果的である化合物を含む、組成物。
【請求項９】
医薬適合性の担体中の請求項８の組成物。
【請求項１０】
ａ）細胞に、糖化タンパク質蓄積に対して効果があると推測される化合物を含む組成物を加え；
ｂ）刺激剤を加え；
ｃ）少なくとも１つの糖化タンパク質蓄積決定因子の量を測定し；そして
ｄ）ｃ）に由来する少なくとも１つの決定因子の量を、糖化タンパク質で処理しておいた細胞に由来する少なくとも１つの決定因子の量と比較することを含む、糖化タンパク質蓄積産生に対して効果のある化合物を検出する方法。
【請求項１１】
ｂ）刺激剤の添加は、ａ）糖化タンパク質産生に対して効果があると推測される組成物を細胞に添加する前に行なう、請求項１０の方法。
【請求項１２】
ａ）糖化タンパク質産生に対して効果があると推測される組成物の添加、及びｂ）刺激剤の添加は、同時に行なわれる、請求項１０の方法。
【請求項１３】
化合物は、化学元素、分子、化合物、混合物、エマルション、化学療法剤、薬理作用物質、ホルモン、抗体、成長因子、細胞因子、核酸、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、ヌクレオチド、炭水化物、及びこのような実体の組合せ、断片、類似体または誘導体である、請求項１０の方法。
【請求項１４】
刺激剤はＧ−ＨＳＡまたはＡＧＥである、請求項１０の方法。
【請求項１５】
糖化タンパク質蓄積決定因子は、ＮＦκ−Ｂ、ＩＬ１−β、ＩＬ−１１、ｍ−ＣＳＦ、フィブリノーゲン、ＴＮＦ−α、粘着分子、セレクチン、ＶＣＡＭ−１、ＣＲＰ、ＭＣＰ−１、またはＰＡＩ−１からなる群より選択された細胞因子を含む、請求項１０の方法。
【請求項１６】
請求項１０の方法により決定したような、糖化タンパク質蓄積に対して効果がある組成物。
【請求項１７】
医薬適合性の担体中の請求項１６の組成物。
【請求項１８】
ヒトまたは動物に、炎症に対して効果を有する少なくとも１つの化合物を含む組成物の有効量を投与することを含む炎症処置法であって、該化合物は請求項１の方法により決定される、前記炎症処置法。
【請求項１９】
炎症は糖化タンパク質による炎症である、請求項１８の方法。
【請求項２０】
炎症は、糖尿病血管合併症、心室肥大、アテローム性動脈硬化症、血管障害、心筋炎、腎炎、関節炎、糸球体腎炎、微小血管障害、腎不全、及びアルツハイマー病である、請求項１８の方法。
【請求項２１】
炎症を刺激する、請求項１８の方法。
【請求項２２】
炎症を抑制する、請求項１８の方法。
【請求項２３】
炎症を誘発する疾患を処置するために、ヒトまたは動物に、糖化タンパク質蓄積に対して効果を有する少なくとも１つの化合物を含む組成物の有効量を投与することを含む、炎症を処置する方法。
【請求項２４】
炎症を誘発する疾患は、糖尿病血管合併症、心室肥大、アテローム性動脈硬化症、血管障害、心筋炎、腎炎、関節炎、糸球体腎炎、微小血管障害、腎不全、及びアルツハイマー病である、請求項２３の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炎症応答から生じる病態生理学上の状態を処置する化合物を同定するための、組成物及び方法に関する。特に、本発明は、炎症及び炎症関連疾患を処置するための方法及び組成物に関し、好ましくは、内皮細胞において、糖化タンパク質産生による、シグナル伝達に関連した炎症反応の誘発を抑制または遮断する化合物を含む。
【背景技術】
【０００２】
糖化タンパク質及び糖化反応後期生成物（ＡＧＥ）は、年をとるにつれて、脈管組織及び腎組織にゆっくりと蓄積し、炎症疾患状態では蓄積はより急速である。ＡＧＥは、次の主な少なくとも２つの機序によって、細胞傷害、特に糖尿病組織損傷を引き起こす：特定の細胞表面受容体との相互作用による細胞機能の調節、及び、タンパク質架橋を形成を導く細胞外マトリックスの改変。研究により、糖化タンパク質及びＡＧＥと細胞の相互作用により、炎症プロセス及び酸化による細胞損傷が促進され得ることが示唆された。糖化タンパク質及びＡＧＥ蓄積が、推測される病因である疾患は、糖尿病血管合併症、心室肥大、アテローム性動脈硬化症、血管障害、心筋炎、腎炎、関節炎、糸球体腎炎、微小血管障害、腎不全、及びアルツハイマー病を含む。
【０００３】
糖尿病に認められるような、高血漿グルコースによって、微小血管傷害が引き起こされる正確な機序は、完全に解明されていない。高血糖を微小血管障害と関連づけることのできる、１つの可能性ある機序は、重要なタンパク質の非酵素的糖化プロセスである（１〜３）。非酵素的糖化、すなわち、グルコースとタンパク質の連結により、糖化タンパク質が形成される。この糖化経路の第一段階は、タンパク質中の遊離アミノ基、主にリジン残基のε−アミノ基と、グルコースの非酵素的縮合を含み、その結果、アマドリ（Ａｍａｄｏｒｉ）付加物が形成される。これらの初期の糖化反応生成物はさらに、転移、脱水及び縮合などの反応をさらに受けて、不可逆的な糖化反応後期生成物（ＡＧＥ）を形成することができる。ＡＧＥは、特定の細胞表面受容体と相互作用して、病的結果をもたらすと考えられている、反応性の高い分子群である。糖化タンパク質の蓄積は、糖尿病患者の基底膜に認められ、糖尿病性腎症及び網膜症の発症に関与すると考えられている（４、５）。アミノグアニジンなどのＡＧＥ形成阻害剤は、糖尿病性網膜症を含む糖尿病合併症の発症を予防する（６〜８）。
【０００４】
最もよく特徴付けられているＡＧＥ受容体はＲＡＧＥであり、これはＡＧＥ受容体である（３）。いくつかのインビトロ及びインビボでの研究により、抗体により、または、可溶性形態の受容体の添加によりＲＡＧＥを阻害すると、糖尿病性アテローム性動脈硬化症を含む糖尿病性血管障害が阻止されることが示された（９〜１１）。ＲＡＧＥは、ＡＧＥを除いて、正常な生理ならびに病理に関与する、いくつかのその他のリガンドの結合も媒介しているようである（１２、１３）。従って、単にＲＡＧＥを遮断するだけでは、その他の意図しなかった結果が生じることがある。さらに、ＲＡＧＥを遮断することで、循環中のＡＧＥが蓄積されるので、ＲＡＧＥを遮断することによる長期の効果は不明であり、予防しようとしている病状以上に有害になることもある。
【０００５】
現在、ＡＧＥまたは糖化タンパク質の蓄積を阻害するに効果的な化合物を決定する効率的な方法はない。糖化タンパク質またはＡＧＥの産生を妨害するのに使用できる化合物を検出するための方法及び組成物が必要である。このような検出法及び組成物は、ハイスループットで、効果的な化合物を容易に決定できる必要がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ＡＧＥ及び糖化タンパク質による炎症の阻害に効果的である化合物を検出するための方法及び組成物に関する。本発明の方法は、ＡＧＥまたは糖化タンパク質蓄積により引き起こされる炎症を測定するアッセイに化合物を添加すること、ならびに、該化合物による炎症の阻止などの、該化合物の効果を決定することを含む。このようなアッセイは、糖化タンパク質により誘発される炎症ならびに治療能力を示す可能性がある化合物による該炎症の阻止に関する、迅速で正確な検査である。
【０００７】
本発明の好適な実施形態は、糖化タンパク質により誘発される炎症により誘発される、内皮サイトカインを測定するための方法及び組成物を含む。より好適なアッセイは、ＮＦ−κＢ、ＩＬ−１β（インターロイキン１β）、ＩＬ−１１（インターロイキン１１）、ｍ−ＣＳＦ（マクロファージコロニー刺激因子）、フィブリノーゲン、ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子α）、粘着分子、セレクチン、ＶＣＡＭ−１（血管細胞粘着分子−１）、ＣＲＰ（Ｃ−反応性タンパク質）、及びＰＡＩ−１（プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤−１）などの決定因子を測定するが、これに限定されない。最も好適なサイトカインは、ＩＬ−６及び単球化学誘引タンパク質１（ＭＣＰ−１）を含む。これらのアッセイは、糖化タンパク質により誘発される炎症を、遮断または阻止する分子についての、迅速かつ正確なハイスループットスクリーニングを提供する。これらのエフェクター分子及び化合物の同定により、ＡＧＥ及び糖化タンパク質の蓄積及び相互作用という生物学的作用から生じる病状を処置するための、効果的な治療法が得られる。
【０００８】
本発明はまた、アッセイによって所望の活性を有するとして同定した化合物を含む組成物も含む。該組成物は、細胞、組織または生物体全身の処置に有用である。このような組成物は、Ｉ型及びＩＩ型糖尿病誘発脈管障害の脈管合併症、他の脈管障害、微小血管障害、腎不全、アルツハイマー症候群、及び炎症により誘発される疾患（アテローム性動脈硬化症を含むがこれに限定されない）を含むがこれに限定されない、生物学的容態などの容態を処置するために、投与用として有効量で処方されている。該組成物は、所望の活性を示す化合物または化合物群の投与に必要な薬学的補助剤を含んでいてもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、特殊な生物作用を示し、治療剤として有用であり得る、化合物または分子を検出するための方法及び組成物に関する。特に、本発明は、炎症に対して効果がある化合物または分子を検出するための方法及び組成物に関する。より特定すると、本発明は、糖化タンパク質またはＡＧＥの蓄積または存在により引き起こされる炎症を阻止するのに効果的である、化合物または分子を検出するための方法及び組成物に関する。本発明はまた、Ｉ型及びＩＩ型糖尿病性脈管障害、他の脈管障害、血管障害、心筋炎、腎炎、関節炎、冠動脈疾患、微小血管障害、腎不全、アルツハイマー症候群、及び炎症により誘発される疾患（アテローム性動脈硬化症を含むがこれに限定されない）を含むがこれに限定されない生物学的容態を処置するための組成物及びその処置法を提供する。
【００１０】
本発明は、糖化タンパク質またはＡＧＥによる炎症または細胞活性化を阻止するのに、どの化合物または分子が有効であるかを決定するのに有用である。ＡＧＥにより、リポタンパク質酸化能は高まり、アテローム産生は増加する。任意の特定の理論で固めたくはないが、ＡＧＥは、マトリックスタンパク質に結合し、ＩＬ−１、ＴＮＦα、ＶＣＡＭ−１、ヘムオキシゲナーゼ、インスリン様成長因子及びＩＬ−６の合成を誘導し、ＮＦ−κＢを活性化すると考えられている。ＡＧＥが誘発する細胞活性化を薬理学的に阻害することは、多くの疾患における、最も顕著には糖尿病性合併症及びアルツハイマー病における、治療的介入の基礎であり得る。ＡＧＥが誘発する炎症を阻止するための治療的アプローチは、タンパク質の糖化の遮断、ＡＧＥと受容体の相互作用の遮断、ならびに、ＡＧＥが誘発するシグナル伝達またはシグナル伝達に関連した炎症応答の遮断を含むがこれに限定されない。
【００１１】
ＡＧＥの作用を遮断する有用な方法は、ＡＧＥの誘発するシグナル伝達を遮断する阻害剤を決定することである。シグナル伝達事象から炎症までの筋道は不明である。この問題を克服する１つの方法は、ＡＧＥが誘発する炎症分子のアップレギュレーションを遮断する化合物をスクリーニングすることである。本発明は、このような化合物または分子のスクリーニングが可能となるような、方法及び組成物を含む。
【００１２】
本発明の好適な実施形態は、糖化タンパク質が誘発する炎症を遮断する化合物をスクリーングする方法を含む。より好適な実施形態は、阻害化合物または分子のスクリーニング法（炎症サイトカインなどの炎症決定因子を測定するために、該化合物をアッセイに添加し、該化合物の阻害作用を決定することを含む）を含む。最も好適な実施形態は、糖化アルブミンが、内皮による決定因子の産生、特にＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＩＬ１−β、ＴＮＦ−α、ＣＲＰ、ＰＡＩ−１、ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、セレクチン及び粘着分子などの炎症決定因子の産生を刺激している、アッセイを含む方法を含む。内皮細胞は、炎症反応において重要であり、本明細書に記載した方法及び組成物は、糖化タンパク質により誘発される炎症を遮断する分子についてのハイスループットスクリーニングを提供する。
【００１３】
本明細書に使用したような「化合物」なる語は、単数形及び複数形の両方を含み、本発明のアッセイで測定できる活性を示す、任意の単一実体または複合実体を含む。このような実体は、化学元素、分子、化合物、混合物、エマルション、化学療法剤、薬理作用物質、ホルモン、抗体、成長因子、細胞因子、核酸、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、ヌクレオチド、炭水化物、及びこのような実体の組合せ、断片、類似体または誘導体を含むがこれに限定されない。
【００１４】
本発明のアッセイにおいて、最初、化合物の活性、効果または複数の効果が不明である。本発明のアッセイにおける該化合物の効果が依然決定されていないという点で、該化合物の活性は不明である。該化合物は、多くのその他の既知の活性も有することがあり、他の治療用途を有する場合もある。
【００１５】
本明細書に使用したような刺激剤は、アッセイ中の細胞を刺激して、予め決まった様式ですなわち既知の様式で応答する、アッセイの中の成分である。刺激剤は、化学的な化合物または分子でも、生物学的因子でもよい。最も好適な実施形態において、刺激剤は、糖化タンパク質であり、最も好適には、糖化ヒト血清アルブミン（Ｇ−ＨＳＡ）である。本明細書に使用したような、糖化タンパク質は、主にタンパク質中の遊離ε−アミノ基とグルコースの縮合により、酵素的または非酵素的にグルコースに連結して、アマドリ付加物を与えるような、タンパク質を含む。さらに、本明細書に使用したような、糖化タンパク質は、これらの糖化反応初期生成物を含むタンパク質だけでなく、不可逆な糖化反応後期生成物を形成する転位、脱水、及び縮合などの、さらなる反応から生じる糖化生成物も含む。この実施形態は限定的なものではなく、本発明では、アッセイの細胞または成分を測定可能な様式で応答させる任意の薬剤が考えられる。
【００１６】
糖化タンパク質及びＡＧＥの形成及び蓄積の強化は、糖尿病合併症及びアテローム動脈硬化症（腎症、網膜症及び神経障害を含む一連の糖尿病性合併症の発症へと至る）の病状発生において主な役割を果たしていると考えられている（１〜３）。例えば、糖尿病関連合併症は、１）タンパク質の糖化を防ぐことにより（６〜８）、２）糖化タンパク質中の架橋を破壊することにより（２２）、または３）糖化タンパク質と受容体の相互作用を遮断することにより（１０、１１）減少させることができることを示唆するインビボでの十分な証拠が存在する。糖尿病性微小血管障害及び脈管障害の病状発生にＡＧＥが重要であるにも関わらず、ＡＧＥ形成を遮断することが知られる施行可能な薬物療法は現在ない。
【００１７】
ＡＧＥ形成を防ぐ、アミノグアニジンは、糖尿病性脈管障害の治療法として、活発に探求されている（８〜１０）。しかし、この薬物が、正常なグルコース代謝またはタンパク質のグリコシル化に影響を及ぼすかどうかは明らかでない。さらに、アミノグアニジンはＡＧＥ形成を減少させるが、糖尿病ラットの糸球体基底の厚さを阻害することもなく、内皮機能を改善することもなかったことが、いくつかの研究により示された（１８、１９）。
【００１８】
ＡＧＥ形成阻害剤に加えて、ＡＧＥ架橋破壊剤も、脈管障害の治療法として活発に探求されている。Ｎ−フェナシルチアゾリウムブロミド（ＰＴＢ）は、ＡＧＥ由来の共有結合のタンパク質架橋と反応して切断する、原型ＡＧＥ架橋破壊剤である。ＰＴＢはＡＧＥ蓄積を減少させたが、脈管透過性は予防しなかった。
【００１９】
ＡＧＥ受容体との反応を阻害することは、関連病状を処置する上での代替的なアプローチである。ＡＧＥの既知受容体であるＲＡＧＥは、可能性のある治療標的である。ＲＡＧＥを遮断することによっても、ＡＧＥにより誘発される炎症は阻止された。しかし、ＲＡＧＥの機能が複数あること、そして血漿中の蓄積ＡＧＥの副作用が長期におよぶ可能性から、この方法は現在、ヒトにおいては探求されていない。本発明の方法及び組成物を使用して、より特定の阻害化合物を決定できる。
【００２０】
任意の特定の理論で固めたくはないが、本発明は、ＡＧＥにより誘発される炎症において終点測定法に役立たせると理論づけられている。内皮は、糖尿病における標的傷害器官である（２０、２１）。ＩＬ−６及び単球化学誘引タンパク質−１（ＭＣＰ−１）などの内皮炎症に関与する分子のアップレギュレーションにより、内皮機能障害及び脈管傷害が起こる（２１）。糖尿病及びその合併症の解明及び処置への全体的なアプローチは、遺伝子（例えば、これら２つの遺伝子）の調節を妨害することである。
【００２１】
本発明は、化合物の活性を測定するための方法及び組成物を含む。このような方法は、既知の細胞応答に関与する生物学的成分の特定な活性についてのアッセイを含む。アッセイにより測定可能な応答が与えられ、よって化合物の活性を決定する。この応答は、当業者に既知の方法により、好ましくはＥＬＩＳＡで測定できる。本発明の好適な実施形態は、刺激剤の存在に対する細胞による炎症応答に対する、化合物の効果の測定を含む。
【００２２】
本発明の別の実施形態において、炎症に対して効果があると推測される組成物を細胞に加え、これをその後、刺激剤で処理する。刺激剤は、炎症に対して効果があると推測される組成物を添加する前に添加しても、同時に添加してもよい。細胞は、特定な炎症決定因子を産生することにより応答する。これらの決定因子の量は、当業者に既知の方法により測定でき、刺激剤で処理したが、炎症に対して効果があると推測される組成物では処理していない、細胞により産生される決定因子の量と比較できる。該化合物は、刺激作用、阻害作用、安定化作用を有している場合もあり、全く作用がない場合もある。
【００２３】
本発明のさらなる実施形態は、刺激剤である糖化タンパク質の添加により刺激される、内皮細胞を含む、アッセイを含む。内皮細胞は、特異的サイトカインを産生することにより応答する。産生されるサイトカインの量は、当業者に既知の測定プロトコルにより決定する。未知の作用を有する化合物を、同じアッセイ条件に加え、サイトカイン産生を測定する。該化合物を含まないアッセイを、該化合物を含むアッセイと比較することから、該化合物の生物学的作用を決定できる。該化合物は、阻害作用、刺激作用、安定化作用を有する場合もあり、全く作用がない場合もある。
【００２４】
本発明の別の好適な実施形態は、細胞の応答を測定することによる、ＡＧＥまたは糖化タンパク質の蓄積に対する、該化合物の作用を測定することを含む。
【００２５】
本発明の別の実施形態では、ＡＧＥまたは糖化タンパク質の蓄積に対して効果があると推測される組成物を細胞に加え、これはまた糖化タンパク質でも処理する。糖化タンパク質は、ＡＧＥまたは糖化タンパク質の蓄積に対して効果があると推測される組成物の添加前、添加後、または同時に添加できる。細胞は、ＡＧＥまたは糖化タンパク質蓄積の特定な決定因子を産生することにより応答する。これらの決定因子の量は、当業者に既知の方法により測定でき、刺激剤で処理したが、ＡＧＥまたは糖化タンパク質蓄積に対して効果があると推測される組成物で処理していない細胞により産生される決定因子の量と比較できる。該化合物は、刺激作用、阻害作用、安定化作用を有する場合もあり、全く作用がない場合もある。
【００２６】
本発明の最も好適な実施形態は、アッセイを使用して該化合物の活性を決定する方法を含む。好適なアッセイは、糖化タンパク質、すなわち糖化ヒト血清アルブミンの存在により、炎症応答において刺激される内皮細胞を含む。好適な実施形態の内皮細胞はサイトカインを産生する。好適な方法は、サイトカインＩＬ−６量の測定を含み、別の好適な実施形態は、サイトカインＭＣＰ−１量の測定を含む。好適には、産生されるサイトカインの量は、免疫学的方法を使用して、より好適にはＥＬＩＳＡアッセイを使用して決定する。本発明の方法は、産生されるサイトカインの量の測定に使用した種類のアッセイのタイプに限定されず、当業者に既知でありその後に開発された任意の方法を使用して、刺激剤及び未知の活性を有する化合物に応答して産生されたサイトカインの量を測定できる。
【００２７】
ＩＬ−６は、糖尿病及びアテローム性動脈硬化症の病状発生に重要な役割を果たすことが知られている炎症前サイトカインである（２３）。ＩＬ−６はまた、腎糸球体間質細胞の成長を促進し、よって腎症の一因である（２４）。糖尿病被検者における血清中ＩＬ−６レベルは、正常な健常人対照よりも有意に高かった（３．４８＋/−３．２９ｐｇ/ｍｌ対０．７８４＋/−０．９０ｐｇ/ｍｌ、平均＋/−ＳＤ）。さらに、尿中ＩＬ−６レベルは糖尿病性腎症の良好な指標である。血清中ＩＬ−６は、アテローム動脈硬化症及び腎症の評価に有用である。
【００２８】
別の炎症前サイトカインである、ＭＣＰ−１は、ヒトアテローム性動脈硬化症病変に高度に発現していることが認められ、動脈壁への単球の補充及び病変の発症に重要な役割を果たしていると推論されている。近年の結果により、ＭＣＰ−１はまた、糖尿病性腎症においても重要な病態発生因子であることが示された（２５）。進行段階の患者の尿中ＭＣＰ−１レベルは、軽度の疾患段階の患者のレベルより、または健常対照のレベルより有意に高かった。尿中ＭＣＰ−１の測定は、腎症患者の腎損傷度及び／または予後を評価するのに有用である。
【００２９】
糖化アルブミンは、ＩＬ−６及びＭＣＰ−１の内皮の産生を刺激する。ＩＬ−６に対する作用は、既知のＩＬ−６誘導物質である、ＴＮＦαの作用と同等である。脈管疾患におけるこれらのサイトカインの役割は十分に確立されていることから、ＡＧＥによるこれらサイトカインの誘導を遮断する化合物をスクリーニングすることにより、インビボでＡＧＥにより誘発される炎症を遮断する治療剤を同定するための新しいアプローチが提供される。
【００３０】
好適な実施形態において、内皮細胞によるサイトカイン産生に関する、刺激剤に対する基線応答が一旦確立されれば、スクリーニングアッセイの対照レベルが含まれているので、方法は、未知の活性を有する化合物の添加を含む。基線応答に対する化合物の作用は、刺激剤の存在下で産生されるサイトカインの量と、刺激剤及び未知の活性を有する化合物の存在下で産生されるサイトカインの量を比較することにより決定する。好適な方法において、Ｇ−ＨＳＡの存在下で細胞の炎症に対する阻害作用を示す化合物を、その後、治療剤として使用するための、さらなる試験にかけるために選択する。１つまたは1つ以上の化合物をスクローニングアッセイに添加し得る。化合物の組合せまたは混合物を添加してもよい。さまざまな量及び処方の化合物を加えて、スクリーニングアッセイに対する作用を決定する。またスクリーニングアッセイを使用して、刺激化合物またはアッセイで全く作用のない化合物群を決定することもできる。
【００３１】
本発明はまた、前記方法により所望の活性を有するとして同定された化合物を含む組成物を含む。該組成物は、細胞、組織または生物体全身の処置に有用である。このような組成物は、Ｉ型及びＩＩ型糖尿病誘発脈管障害の脈管合併症、他の脈管障害、微小血管障害、腎不全、アルツハイマー症候群、及び炎症により誘発される疾患（アテローム性動脈硬化症を含むがこれに限定されない）を含むがこれに限定されない、生物学的容態などの容態を処置するために投与用として有効量で処方されている。該組成物は、所望の活性を示す化合物または化合物群の投与に必要な薬学的補助剤を含んでいてもよい。
【００３２】
本発明の組成物は、経口、バッカル、鼻腔、エアゾール、局所、経皮、注射、遅延放出、放出制御、イオン導入法、超音波導入法、及び他の送達装置及び方法を含むがこれに限定されない投与経路により投与し得る。注射法は、静脈内、筋肉内、腹腔内、脊髄内、くも膜下腔内、脳室内、動脈内、皮下及び鼻腔内経路を含むがこれに限定されない。
【００３３】
本発明により病状を処置するための組成物はさらに、医薬適合性の担体を含む。該組成物はまた、他の医学的薬剤、薬学的薬剤、担体、アジュバント、希釈剤、及び、当業者に既知の他の薬学的調製物を含むことができる。これらの薬剤は当業者に既知であり、一般的に生物学的に不活性であると記載され、有効成分と共に有害な相互作用を引き起こすことなく、患者に投与できる。経口投与用の担体または賦形剤の例は、コーンスターチ、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、微結晶セルロース及びステアリン酸、ポビドン、リン酸二カルシウム及びグリコール酸ナトリウムスターチを含む。本発明では所望の投与経路に適した任意の担体が考えられる。
【００３４】
本発明は、このような製剤、プロセス段階及び材料は若干変更されることがあり、本明細書に開示した特定の製剤、プロセス段階、及び材料に限定されないと理解されたい。本明細書に使用した専門用語も、単に特定の実施形態を説明ためのものであり、限定するためのものではない。なぜなら、本明細書の範囲は、添付の特許請求の範囲及びその均等物によってのみ限定されるからである。
【００３５】
本明細書に開示した全ての特許及び特許出願の全体を、参照として本明細書に取り込む。本明細書に列挙または引用した全ての参考文献の全体を、参照として取り込む。
【００３６】
前記は、本発明を実施する上で最善と現在考えられる形態を含む。この記載は、本発明の一般的原則を説明するためになされ、限定するものとして捉えるべきではない。本発明は、さらに、以下の実施例により説明され、これらの実施例はいずれにしても、その範囲を限定するものではない。対照的に、さまざまな他の実施形態、変形例、及びその均等物も可能であり、これは、本明細書を読んだ後、本発明の精神から逸脱することなく、当業者には思いつくであろうことが明瞭に理解されるだろう。
【実施例】
【００３７】
実施例１
ＩＬ−６ＥＬＩＳＡにより決定したＡＧＥにより誘発される炎症応答
ヒト大動脈（ＨＡＥＣ）及び微小血管（ＨＭＶＥＣ）内皮細胞（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）を培養し、増殖培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）中で製造業者の指示に従って継代培養した：基礎培地は、ｈＥＧＦ、ヒドロコルチゾン、ＶＥＧＦ、ＨＦＧＦ−Ｂ（ヘパリン含有）、長Ｒ３−ＩＧＦ−１、アスコルビン酸、ゲンタマイシン／アムホテリシン及び５％ＦＢＳを含む。実験処理にかける前に、これらの細胞が９０％を超える集密度を達成するようにした。Ｇ−ＨＳＡはＵＳバイオロジカルズ由来であった。腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）はＲ＆Ｄシステムズ由来であった。
【００３８】
ＨＭＶＥＣを、対照培地または１００ｎｇ/ｍｌＴＮＦαまたは３００μｇ/ｍｌＧ−ＨＳＡを含む培地で２４時間処理した。全ての処理及び対照は、０．２％アルブミンを含む血清非含有培地中で実施した。処理後、細胞培地を集め、ＩＬ−６ＥＬＩＳＡに使用した。
【００３９】
ＩＬ−６ＥＬＩＳＡを、製造業者（Ｒ＆Ｄシステムズ）の説明したように、ヒトＩＬ−６ＤｕｏＳｅｔＥＬＩＳＡデベロップメントキットを使用して実施した。マウス抗ヒトＩＬ−６を、捕獲抗体（２μｇ/ｍｌ）として使用し、ビオチン化ヤギ抗ヒトＩＬ−６（２００ｎｇ/ｍｌ）を検出抗体として使用した。培養培地を、９６ウェルプレート中で捕獲抗体と共に２時間室温でインキュベートした。ウェルを３回、洗浄緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液ｐＨ７．４）で洗浄し、その後、室温で検出抗体と共に２時間インキュベートした。３回洗浄した後、ウェルを、ストレプトアビジン−ＨＲＰと共に２０分間インキュベートした。発色を、マイクロプレート解読器で４５０ｎｍで解読した。
【００４０】
基礎条件下における内皮細胞は、約２５〜１００ｐｇ/ｍｌのＩＬ−６を分泌した。内皮細胞を、既知のＩＬ−６誘導物質であるＴＮＦαと共にインキュベートすると、内皮細胞によるＩＬ−６分泌の２倍以上の増加が誘導された。同様に、Ｇ−ＨＳＡは、ＩＬ−６分泌を８７％まで増加した。これらのデータにより、Ｇ−ＨＳＡは、内皮細胞において、ＴＮＦαと同等にＩＬ−６分泌を誘導した。図１に示したように、ＴＮＦα及びＧ−ＨＳＡと共にインキュベートすると、ＩＬ−６分泌はそれぞれ１４７％及び８７％増加した。
【００４１】
実施例２
ＭＣＰ−１  ＥＬＩＳＡにより決定したＡＧＥにより誘発された炎症応答
ＨＡＥＣ及びＨＭＶＥＣ（クロネティクス）を培養し、増殖培地（クロネティクス）中で製造業者の指示に従って継代培養した：基礎培地は、ｈＥＧＦ、ヒドロコルチゾン、ＶＥＧＦ、ＨＦＧＦ−Ｂ（ヘパリン含有）、長Ｒ３−ＩＧＦ−１、アスコルビン酸、ゲンタマイシン／アムホテリシン及び５％ＦＢＳを含む。実験処理にかける前に、これらの細胞が９０％を超える集密度を達成するようにした。Ｇ−ＨＳＡはＵＳバイオロジカルズ由来であった。ＴＮＦαはＲ＆Ｄシステムズ由来であった。
【００４２】
細胞を、対照培地または１００ｎｇ/ｍｌＴＮＦαまたは３００μｇ/ｍｌＧ−ＨＳＡを含む培地で２４時間処理した。全ての処理及び対照を、０．２％アルブミンを含む血清非含有培地中で実施した。処理後、培地を集め、ＭＣＰ−１ＥＬＩＳＡに使用した。
【００４３】
ＭＣＰ−１ＥＬＩＳＡを、製造業者（Ｒ＆Ｄシステムズ）に説明したように、ヒトＭＣＰ−１のＤｕｏＳｅｔＥＬＩＳＡデベロップメントシステムを使用して実施した。２μｇ/ｍｌのマウス抗ヒトＭＣＰ−１を、捕獲抗体として使用し、１００ｎｇ/ｍｌビオチン化ヤギ抗ヒトＭＣＰ−１を検出抗体として使用した。培養培地を、９６ウェルプレート中、捕獲抗体と共に、２時間室温でインキュベートした。ウェルを、洗浄緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液ｐＨ７．４）で３回洗浄し、その後、検出抗体と共に２時間室温でインキュベートした。発色を、マイクロプレート解読器で４５０ｎｍで解読した。
【００４４】
内皮ＭＣＰ−１に対するＧ−ＨＳＡの作用を図２に示す。対照条件下での内皮細胞により、約４００ｐｇ/ｍｌのＭＣＰ−１が産生された。ＴＮＦα及びＧ−ＨＳＡと共にインキュベートすると、ＭＣＰ−１分泌はそれぞれ５４０％及び６５％増加した。
【００４５】
実施例３
ＩＬ−６ＥＬＩＳＡにより決定したＡＧＥ産生による炎症応答誘発を遮断する、化合物についてのハイスループットスクリーニング
内皮細胞を、対照培地または３００μｇ/ｍｌＧ−ＨＳＡを含む培地または３００μｇ/ｍｌＧ−ＨＳＡ及び１０μＭの試験化合物を含む培地中でインキュベートした。この集合の一連の試験化合物（Ａ１〜Ａ７）の代表的なデータを図３に示す。非処理細胞（７４ｐｇ/ｍｌ）と比べて、Ｇ−ＨＳＡと共にインキュベートした細胞では、ＩＬ−６分泌（１５０ｐｇ/ｍｌ）は２倍増加した。本明細書に示した化合物の中で、１つ（Ａ４）は、Ｇ−ＨＳＡにより誘発されるＩＬ−６の分泌を遮断できた。ＩＬ−６分泌は、化合物Ａ４によりほぼ基線レベルまで標準化した。図３で示した結果は、７つの化合物についてだけのものであるが、２５０より多くの化合物を、１週間未満で一人の人が全く同一にスクリーニングできるように、本発明の方法はハイスループットスクリーニング用に設計されている。
【００４６】
参考文献
１．Ｂｒｏｗｎｌｅｅ．Ｍら、非酵素的グリコシル化及び糖尿病合併症の病態発生、Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ  １９８４；１０１：５２７−５３７
２．Ｙａｎｇ  ＣＷら、糖化反応後期生成物は、糖尿病糸球体疾患にみられる遺伝子発現をアップレギュレートする、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９４  ９１：９４３６−４０
３．Ｓｃｈｍｉｄｔ  ＡＭら、糖化反応後期生成物の受容体の活性化：糖尿病脈管障害及びアテローム性動脈硬化症における慢性脈管機能不全機序、Ｃｉｒ  Ｒｅｓ．１９９９  ８４：４８９−９７
４．Ｙａｎｏ  Ｍら、糖尿病ラット腎における糖化タンパク質の免疫組織化学的局在、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃｔ．１９９０  ８：２１５−９
５．Ｃｏｈｅｎ  ＭＰら、糖尿病腎症の病態発生におけるアマドリで修飾した非酵素的に糖化した血清タンパク質の役割、Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．１９９６  ７：１８３−９０
６．Ｂｒｏｗｎｌｅｅ．Ｍら、アミノグアニジンは、糖尿病により誘発される動脈壁タンパク質架橋を予防する、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：１６２９−１６３２、１９８６
７．Ｌｉ  ＹＭら、糖化反応後期阻害剤のアミノグアニジンによる、加齢の心臓血管病態及び腎病態の予防、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１９９６  ９３：３９０２−７
８．Ｐｉｅｒｃｙ  Ｖら、ＩＩ型糖尿病の進行における糖化反応後期生成物阻害剤の可能性ある利点：Ｃ５７/ＢＬＫｓＪ糖尿病マウスにおけるアミノグアニジンを用いた研究、Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  １９９８  ４７：１４７７−８０
９．Ｗａｕｔｉｅｒ  ＪＬら、糖尿病脈管障害における受容体を介した内皮細胞機能障害、糖化反応後期生成物の可溶性受容体は、糖尿病ラットの透過性亢進を遮断する、Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１９９６  ９７：２３８−４３。
【００４７】
１０．Ｓｃｈｍｉｄｔ  ＡＭら、その内皮受容体と相互作用している糖化反応後期生成物は、培養ヒト内皮細胞及びマウスにおいて、血管細胞粘着分子−１（ＶＣＡＭ−１）の発現を誘導する。糖尿病の脈管障害亢進の可能性ある機序、Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  １９９５  ９６：１３９５−４０３
１１．Ｐａｒｋ  Ｌら、糖化反応後期生成物の可溶性受容体による糖尿病性アテローム性動脈硬化症亢進の抑制、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．１９９８  ４：１０２５−３１
１２．Ｈｏｆｍａｎｎ  ＭＡら、ＲＡＧＥは、新しい炎症前の軸である、Ｓ１００／カルグラヌリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ）ポリペプチドの中心的細胞表面受容体を媒介する。Ｃｅｌｌ．１９９９  ９７：８８９−９０１
１３．Ｄｕ  Ｙａｎ  Ｓら、糖化反応後期生成物相互作用におけるアミロイドβペプチド受容体は、アルツハイマー病の炎症前経路である、マクロファージ−コロニー刺激因子の神経での発現を誘発する。Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９７  ９４：５２９６−３０１
１４．Ｌａｎｄｅｒ  ＨＭら、糖化反応後期生成物の受容体の活性化は、酸化ストレスにより調節される、ｐ２１（ｒａｓ）依存的マイトジェン活性化プロテインキナーゼ経路を誘発する。Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９７  ２７２：１７８１０−４
１５．Ｔｈｏｒｎａｌｌｅｙ  ＰＪ、糖化タンパク質による細胞の活性化。ＡＧＥ受容体、受容体認識因子及びＡＧＥの機能的分類。Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．(Ｎｏｉｓｙ−ｌｅ−ｇｒａｎｄ）１９９８  ４４：１０１３−２３
１６．Ｍｏｒｏｈｏｓｈｉ  Ｍら、ヒト単球によるＩＬ−６産生に対する、グルコース及び糖化反応後期生成物の作用。Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．１９９５  ７４８：５６２−７０
１７．Ｔａｋａｇｉ  Ｍら、糖化反応後期生成物は、ヒト骨由来細胞によるインターロイキン−６生成を刺激する。Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ．１９９７  １２：４３９−４６
１８．Ｗａｄａ  Ｒら、ストレプトゾトシン誘導糖尿病ラットにおける、末梢神経機能、（Ｎａ＋、Ｋ＋）−ＡＴＰアーゼ活性及びトロンボモジュリン発現に対する、アミノグアニジン処理の効果は非常に限定されている。Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  １９９９  ４２：７４３−７
１９．Ｓｏｕｌｉｓ  Ｔら、実験的糖尿病腎症の予防におけるアミノグアニジンの効果は、処置期間に関連する。Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．  １９９６  ５０：６２７−３４
２０．Ｌａｉｇｈｔ  ＤＷら、内皮細胞機能障害及び糖尿病性大血管障害の病態発生。Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｔａｂ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ．１５：２７４−８２(１９９９)
２１．Ｓｔｅｈｏｕｗｅｒ  ＣＤら、内皮機能障害及び糖尿病性血管障害の病態発生。Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３４：５５−６８(１９９７)
２２．Ｈｏｒｉｉ  Ｙら、糸球体間質増殖糸球体腎炎の進行におけるインターロイキン−６の役割。Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  Ｓｕｐｐｌ．１９９３  ３９：Ｓ７１−５
２３．Ｈｕｂｅｒ  ＳＡら、インターロイキン−６は、マウスの初期アテローム性動脈硬化症を悪化させる。Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ．１９９９  １９：２３６４−７
２４．Ｋａｄｏ  Ｓら、２型糖尿病患者における、インターロイキン−６、その可溶性受容体及びインターロイキン−６／インターロイキン−６受容体複合体の循環中レベル。Ａｃｔａ  Ｄｉａｂｅｔｏｌ．  １９９９  ３６：６７−７２
２５．Ｅｉｔｎｅｒ  Ｆら、インビボでのメサンギウム細胞増殖及びマトリックス産生を媒介する上でのインターロイキン−６の役割。Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．１９９７  ５１：６９−７８
２６．Ｓａｉｔｏｈ  Ａ、Ｓｕｚｕｋｉ  Ｙ、Ｔａｋｅｄａ  Ｍ、Ｋｕｂｏｔａ  Ｋ、Ｉｔｏｈ  Ｋ、Ｔｏｍｉｎｏ  Ｙ、ＩｇＡ腎症患者における単球化学誘引タンパク質（ＭＣＰ−１）及び疾患活性の尿中レベル。Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｌａｂ  Ａｎａｌ．１９９８  １２：１−５
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１は、内皮細胞でのＩＬ−６産生誘発における、糖化ヒト血清アルブミン（Ｇ−ＨＳＡ）の作用を示したグラフである。
【図２】図２は、内皮細胞でのＭＣＰ−１産生誘発における、Ｇ−ＨＳＡの作用を示したグラフである。
【図３】図３は、内皮細胞でＧ−ＨＳＡ産生によるＩＬ−６産生の誘発を遮断する化合物を同定するために、化合物集合をスクリーニングすることによって得られた結果を示したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2005501222.tif 000035
【国際調査報告】
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2005501222.tif 000037
2005501222.tif 000038
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