(57)【要約】  本発明は、遺伝子銃を介するトランスジェニック・チャ（カメリア・シネンシス(camelliasinensis(L.)O.Kuntze)）の産生に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｒ）葉外殖片を３６０の組み合わせにかける前に、異なる濃度（０．２５〜０．７５Ｍ）の異なる浸透物質、例えばスクロース、ミオイノシトール、ソルビトール、マンニトールのみ、マンニトールとソルビトールの組み合わせ、並びに基礎ＭＳ培地(Murashige T. and Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473-497; 1962)にチアミン塩酸塩（０．１ｍｇ／ｌ）、ピリドキシン塩酸塩（０．５ｍｇ／ｌ）及びニコチン酸（０．５ｍｇ／ｌ）のようなビタミンとグリシン（２．０ｍｇ／ｌ）を添加したものによって、２〜８時間に及ぶ、異なる期間葉外殖片を処理し；
（ｓ）最も外側の円の直径が９．０ｃｍのペトリ皿のものと同一である、透明なポリエチレンシート上に、２．０〜９．０ｃｍに及ぶ可変の直径の同心円を描き；
（ｔ）ボンバードメント(bombardment)のために再生培地上に向軸面を上向きにして葉外殖片を配置し；
（ｕ）BioRadによって製造されたｐＲＴ９９ＧＵＳプラスミドＤＮＡでコーティングしたマイクロプロジェクタイルの最大の貫通のために、９．０ｃｍのペトリ皿の異なる同心円（２．０〜５．０ｃｍ）内に再生培地上の葉外殖片を配置し；
（ｖ）７０％アルコール、続いて滅菌水で各３回洗浄することによって金粒子を滅菌し；
（ｗ）０．５〜１．５ｍｌの滅菌蒸留水中で６０μｇの金粒子を懸濁し；
（ｘ）各ボンバードメントごとに、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに２５〜６０μｌのこの懸濁液を分注し；
（ｙ）５０μｌの金懸濁液と、１０μｌの異なる濃度のｐＲＴＧＵＳプラスミドＤＮＡ（０．５〜５μｇ／μｌ）、４０〜５０μｌの１．５〜３．５ＭのＣａＣｌ2及び１０〜５０μｌのリン酸塩を含まないスペルミジンとを、時々同時にボルテックスをかけて混合し、５００〜１１００ｒｐｍで５〜２０秒間スピンし、続いて上清を除去し、そして７０％エタノール及び５０〜１００μｌの１００％エタノールの最後の懸濁液によって洗浄し；
（ｚ）速やかにボルテックスをかけて、滅菌したマクロキャリアー(BioRad)上に金粒子とＤＮＡの１０μｌの懸濁液をコーティングし；
（ａａ）最大の粒子貫通のための表面積の増大、最少の細胞損傷／傷害及び最大の再生効率のために、ギャップ距離又はラプチャーディスクとマクロキャリアーとの間の距離（単独で且つ併せて１／４〜３／８インチ（６．３５〜９．５２５ｍｍ））、マクロキャリアーの飛行距離又はマクロキャリアーとストッピングスクリーンとの間の距離（６〜１６ｍｍ）、及び標的距離又はマイクロプロジェクタイルストッピングスクリーンと標的組織との間の距離（６〜１２ｃｍ）を含んで成る、３６０の組み合わせを構築し；
（ｂｂ）遺伝子銃(biolistic gun)、例えばDupontのGene booster、しかし、具体的にはヘリウムの圧力による粒子送達系、PDS-1000/He (BioRad)を用いて、２２〜２８インチ（５５．８８〜７１．１２ｃｍ）の水銀のチャンバー圧のもと、金粒子（０．６〜１．６μｍ）と１，２及び４μｇ／μｌの濃度のＤＮＡとを、上記３６０の組み合わせ（ここで、ガスの衝撃及び粒子の高分散に起因する組織の損傷は、最適な粒子の分散のために標的距離を増大させることによって回避され、そして同時に、マイクロプロジェクタイルの飛行距離の中心を外れた飛行に起因する組織の損傷は、ギャップ距離を減少させることによって克服した）で葉外殖片をボンバードメントし；
（ｃｃ）ペトリ皿の方向を１８０度回すことによって変化させた後に各プレートを２回ボンバードメントし；
（ｄｄ）葉、体細胞胚、受精胚(zygotic embryos)及び胚形成カルスに及ぶボンバードメントした外殖片を、ボンバードメントした面が再生培地に触れるように、背軸面を上向きにして再生培地上で裏返し；
（ｅｅ）培養室の２５＋２℃の温度で２日間、暗がりで培養し；
（ｆｆ）Jeffersonの方法（ここで、ＧＵＳ（５−ブロモ、４−クロロ、３−インドリル、β−Ｄ−グルクロニド）化学物質と形質転換した葉外殖片との反応が青色の「反応産物」を生み、それによってBioRadのｐＲＴ９９ＧＵＳプラスミドＤＮＡでコーティングしたマイクロプロジェクタイルが、外殖片組織の細胞内に侵入したことが示される(Jefferson RA 1987, Assaying chimeric genes in plants: The GUS gene fusion system, Plant Mol Biol Rep 5: 389-405)に従い、ＧＵＳ発現についてボンバードメントした葉をアッセイし；
（ｇｇ）２００１年に出願されたSandal I, Bhattacharya A, Sharma M, Ahuja P.S.'An efficient method for micropropagation of tea (Camellia sinensis) plants using leaf explants'特許の再生培地に、培養室の５２μｍｏｌｍ-2ｓ-1の白色(cool)蛍光下で、１６時間の正常な明期のもと、２日後のボンバードメントした葉外殖片を移し；
（ｈｈ）カナマイシン（２５０〜１１００μｇ／ｍｌ）を含む選択培地上で、１５日おきに推定上の形質転換体を最終的に選択し；
（ｒ）２００１年に出願されたSandal I, Bhattacharya A, Sharma M, Ahuja P.S.'An efficient method for micropropagation of tea (Camellia sinensis) plants using leaf explants'特許のプロトコールに従い、３〜５ヶ月齢のin vitroで生育された培養物の、完全に折れた、半分開いた、又は十分に広がった葉外殖片からシュートの芽(shoot bud)を再生し；
（ｓ）Sandal I, Bhattacharya A, Ahuja P. S. An efficient liquid culture system for tea shoot proliferation Plant Cell Tissue Organ Culture 65(1) : 75-80 (2001)の液体培地中で、トランスジェニックシュートを成長させ、そして増殖させ；
（ｔ）標準的な方法に従いＰＣＲ及びサザンハイブリダイゼーションを用い、２５０〜１１００μｇ／ｍｌのカナマイシンで選択したトランスジェニック植物のＧＵＳポジティブな組織を分子的に特徴づけること、
を含んで成る、遺伝子銃を介するトランスジェニック・チャ（カメリア・シネンシス(camellia sinensis (L.) O. Kuntze)）の産生のための３６０の因子の新規組み合わせ。
【請求項２】
異なる品種（中国種(Chinary)、カンボジア種(Cambod)及びアッサム種(Assamica)）の異なる外殖片、例えば葉、体細胞胚、受精胚及び胚形成カルスは、上述のように遺伝子銃を介して遺伝的に形質転換された、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ex vitroで生育した植物の葉外殖片が、ホルモンを含まない液体基礎ＭＳ培地及び異なる浸透物質で処理され、ここで、最も扱いやすく且つ安価なＭＳ培地が、遺伝子銃によるボンバードメントの前に最も有効であった、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
葉外殖片が、ホルモンを含まない液体基礎ＭＳ培地及び異なる範囲の浸透物質、例えばスクロース、ミオイノシトール、ソルビトール、マンニトールのみ、及びマンニトールとソルビトールの組み合わせで処理され、ここで、そのまの濃度の(full strength)のホルモンを含まない基礎ＭＳ培地が最も有効であった、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
葉外殖片が、ホルモンを含まない液体基礎ＭＳ培地及び異なる浸透物質で、２〜８時間に及ぶ異なる期間処理され、ここで、ホルモンを含まない液体基礎ＭＳ培地の４時間の処理が最も有効であった、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
５０〜７０μｇの金粒子が、マクロキャリアー上へのＤＮＡの負荷の間、残留グリセロールの阻害作用を克服するために、直接的な使用及び保存両方のために、滅菌水中で調製された、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
２．０〜９．０ｃｍに及ぶ可変の直径の同心円が、透明なポリエチレンシート上に描かれ、ここで、最も外側の円の直径は、９．０ｃｍのペトリ皿のものと同一であった、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
外殖片が、ボンバードメントのために、再生培地上に向軸面を上にして配置された、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
外殖片が、ｐＲＴ９９ＧＵＳプラスミドＤＮＡでコーティングしたマイクロプロジェクタイル(BioRad)の異なる拡散パターンの最適化のために、そしてJeffersonのＧＵＳアッセイ法(Jefferson RA 1987, Assaying chimeric genes in plants: The GUS gene fusion system, Plant Mol Biol Rep 5: 389-405)を用いるために.、９．０ｃｍのペトリ皿の２．０〜５．０ｃｍに及ぶ異なる同心円内の再生培地上に配置された、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
０．５〜１．５ｍｌに及ぶ金粒子が、７０％アルコール及び滅菌水を用いて、各３回洗浄することによって滅菌された、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
２５〜６０μｌに及ぶ懸濁液が、各ボンバードメントにつき１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中に分注された、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
４０〜６０μｌの金の懸濁液が、５〜１５μｌの異なる濃度のｐＲＴ９９ＧＵＳプラスミドＤＮＡ（０．５〜５μｇ／μｌ）、４０〜６０μｌの１．５〜３．５ＭのＣａＣｌ2及び１０〜５０μｌの０．５〜２．０Ｍの、リン酸塩を含まないスペルミジンと混合された、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
懸濁液が、５００〜１１００ｒｐｍで５〜２０秒間スピンし、続いて上清を除去し、そして７０％エタノール及び５０〜１００μｌの１００％エタノールの最後の懸濁液によって洗浄しながら、時々ボルテックスにかけられた、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
５〜１５μｌの金粒子とＤＮＡの懸濁液が、速やかにボルテックスをかけながら、滅菌したマクロキャリア(BioRad)上にコーティングした、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
外殖片は、遺伝子銃、例えばDuPontのGene Booster及びヘリウムの圧力による粒子送達系PDS-1000/He (BioRad)、しかし、好ましくは２２〜２８インチ（５５．８８〜７１．１２ｃｍ）の水銀のチャンバー圧のもとでのヘリウムの圧力による粒子送達系PDS-1000/He (BioRad)を用いてボンバードメントされた、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
３６０の組み合わせは、最大の粒子貫通のための表面積の増大、最少の細胞損傷／傷害及び最大の再生効率のために、ギャップ距離又はラプチャーディスクとマクロキャリアーとの間の距離（単独で且つ併せて１／４〜３／８インチ（６．３５〜９．５２５ｍｍ）、マクロキャリアーの飛行距離又はマクロキャリアーとストッピングスクリーンとの間の距離（６〜１６ｍｍ）、及び標的距離又はマイクロプロジェクタイルストッピングスクリーンと標的組織との間の距離（６〜１２ｃｍ）を含んで成るものが構築された、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記３６０の組み合わせが、０．６〜１．６μｍに及ぶ金粒子、及び１，２及び４μｇ／μｌに及ぶＤＮＡの濃度と一緒に使用され、ここで、好ましくは、１．０μｍの金粒子、１１００ｐｓｉ（７５８４．２ｋＰａ）の破裂圧力、標的距離（９ｃｍ）、ギャップ距離（３／８インチ＋１／４インチ及び１／４インチ（９．５２５ｍｍ＋６．３５ｍｍ及び６．３５ｍｍ）、マクロキャリアーの飛行距離（１６ｍｍ）及び１μｇ／μｌのＤＮＡの組み合わせが、最大の形質転換頻度をもたらした、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
各外殖片が、ペトリ皿の方向を１８０度変えることによって２回ボンバードメントされた、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ボンバードメントした外殖片が、背軸面を上にして再生培地上で裏返しにされた、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
ボンバードメントした外殖片、好ましくは葉外殖片が、２５＋２℃の培養室条件下で２日間暗がりで培養され、続いて２００１年に出願されたSandal I, Bhattacharya A, Sharma M, Ahuja P. S.'An efficient method for micropropagation of tea (Camellia sinensis) plants using leaf explants'特許の再生培地上で培養された、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
ボンバードメントした外殖片が、ボンバードメントから６日後に、Jefferson RA (1987) Assaying chimeric genes in plants: The GUS gene fusion system, Plant Mol Biol Rep 5: 389-405のＧＵＳアッセイ法を用いて、一過性発現について試験された、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
葉由来のカルスが、カナマイシン含有選択培地上で、１５日おきに選択された、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
２５０〜１１００μｇ／ｍｌに及ぶカナマイシンレベルが、ほぼ「エスケープ(escape)」不可能な形質転換体の選択に使用された、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
１．０ｃｍ長の健康的なトランスジェニック植物が、SandalI, Bhattacharya A, Ahuja P. S. An efficient liquid culture system for tea shoot proliferation Plant Cell Tissue Organ Culture 65(1) : 75-80 (2001)のカナマイシンを含まない液体増殖培地上で生育され、そして増殖された、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
２５０〜１１００μｇ／ｍｌのカナマイシンで選択したトランスジェニック植物のＧＵＳポジティブな組織が、標準的な方法に従うＰＣＲ及びサザンハイブリダイゼーションを用いて（分子的に）特徴付けられた、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子銃(biolistic)を介するトランスジェニック・チャ(tea)（カメリア・シネンシス(camellia sinensis (L.) O. Kuntze)）の産生に関する。
【背景技術】
【０００２】
チャは、抗ガン特性を有する、大衆的なカフェイン含有飲料である(Jankun, J. , Selman, S. H. , Swiercz, R. Why drinking green tea could prevent cancer. Nature 5: 561; 1997)。チャは重要な雇用創出源でもあり、そして世界の全てのチャ生育領域において主要な外貨の稼ぎ手である(Wilson, K. C. Botany and Plant Improvement In: Wilson R. C. , ed. Coffea, Cocoa and Tea. CABI Publishing, Wallingford, UK : 167-173; 1999)。一方、チャの全生産量は、国内市場及び世界市場の需要を満たすほど十分でない(Kabra, G. D. Tea statistics for 1999 In : Tea time, Vol. VIII, No. 3 Sep-Nov 99,30-31 ; 1999)。チャの収量及び品質は、異なる生物学的（真菌、害虫及びウイルス）及び非生物学的（霜、霰、冷気、日照り、栄養欠乏等）ストレスによって更に低下する(Wilson, K. C. Botany and Plant Improvement In : Wilson R. C. , ed. Coffea, Cocoa and Tea. CABI Publishing, Wallingford, UK : 167-173; 1999)。多くの作物にとって、単位面積当たりの収量が多いことは最も重要なことであるが、チャにとって大きな目標は、より良い順応性及びカップ特性(cup character)と一体となった、収量の改善である。更に、世界市場は、製品が高い商業的価値に到達するために一致しなければならない、世界の異なる場所に由来するチャのための重大な基準を持っている。収量及びカップ品質(cup quality)を兼ね備えている、優れたストレス耐性チャ植物は、それ故に最大に重要なものである(Barua, D. N. The tea plant of commerce In : Barua, D. N. , ed. Science and practice in tea culture, Tea Research Association Calcutta; 53-68; 1989)。作物改良プログラムはまた、合理的な程度の、子孫の形態学的な均質性を目指している。高度な自家不和合性及び近交弱勢と一体となった、ほぼ１０年の長い生活環(Barua, D. N. The tea plant of commercehi : Barua, D. N.,ed. Science and practice in tea culture, Tea Research Association Calcutta; 53-68; 1989)は、従来のチャ育種プログラムにとっての主要な制限である。これらの制限を克服するのに重要な且つ効率的な代替案は、所望の遺伝子を植物ゲノムに直接導入することができる、アグロバクテリウム・ツメファシエンス又は遺伝子銃を介する遺伝的形質転換である。
【０００３】
遺伝子銃は、特に植物が長い生活環を有する場合や、植物の遺伝についての基本的な情報が欠けている場合に、木の多年生植物の遺伝的な改良において利用され、成功を収めてきた。このように、遺伝子銃を介する遺伝的な形質転換は、特に葉が最初の外殖片として使用される場合に、チャの非常に大きな可能性を有している。何故なら、更に、葉外殖片が作物改良について非常に大きな可能性を有しているにも関わらず、恐らくはあるフェノール化合物の存在に起因して、アグロバクテリウム・ツメファシエンス媒介型の形質転換に対して非常になじまないためである(Biao Xi, Toru K, Jian Xu, Yongyan B Effect of polyphenol compounds in tea transformations. Abstr. no. 314. In : American Society of Plant Physiologists, Plant Biology 1998)。
【０００４】
高収量で且つ高品質の幾つかのチャのクローンが同定されているが、まだこれらはもち病に罹りやすい。葉外殖片のような同種組織を介するバイオテクノロジーによる改良がこれらのクローンにおいて必要とされるのは、子葉外殖片のような異種組織が、遺伝的な可変性及び高収量且つ良質な所望の特性の欠損をもたらすためである。従って、葉外殖片の使用は重要であった。しかしながら、アグロバクテリウム・ツメファシエンスを介する葉の形質転換は、多量のあるポリフェノールに起因して有効であることが知られている。
【０００５】
主に３つの要因、すなわち、（ｉ）最大の粒子貫通のための表面積の増大、（ｉｉ）最少の細胞損傷／傷害及び（ｉｉｉ）最大の再生効率が、トランスジェニックのプロトコールを成功させるために必要であることが認識された。したがって、葉外殖片を用いるチャ（カメリア・シネンシス(camellia sinensis (L.) O. Kuntze)）の遺伝子銃を介するトランスジェニックの産生が、選択された優良種の更なる遺伝的な改良を可能にするために、上記３つの要因を考慮して開発された。
【０００６】
アグロバクテリウム・ツメファシエンスを介する遺伝的形質転換は、最初にチャの葉で開始され(Matsumoto S and Fukai M 1998 Agrobacterium tumefaciens mediated gene transfer in tea plant (Camellia sinensis) cells. Japan Agricultural Research Quarterly, 32: 287-291; Matsumoto S and Fulcai M 1999 Effect of acetosyringone application on Agrobacterium mediated gene transfer in tea plant (Camelliasinensis), Bulletin of the National Research Institute of vegetables, ornamental plants and tea, Shizuoka, Japan, 14: 9-15)、この中で、形質転換した葉のカルスは、５００μＭのアセトシリンゴンを用いて産生され、２００μｇ／ｍｌのカナマイシンで選択された。これらの形質転換したカルスは、nptII遺伝子プライマーでのＰＣＲ増幅を示した。主な欠点は、トランスジェニック植物が、これらの形質転換した葉カルスから再生され得ないことである。葉の上でのカルスの誘導でさえ、非常に大量の高価な化学品であるアセトシリンゴンを必要とした。
【０００７】
アグロバクテリウム・ツメファシエンスを介する遺伝的形質転換は、Biaoによって試みられ(Biao Xi, TomIZ, Jian Xu, Yongyan B Effect of polyphenol compounds in tea transformations. Abstr. no. 314. In: American Society of Plant Physiologists, Plant Biology 1998)、この中で、葉及び子葉が試験された。この報告の欠点は、葉外殖片をアグロバクテリウム・ツメファシエンスに有意に感染させることができず、そして大量のポリフェノール、主にカテキンのために形質転換することができなかったことである。
【０００８】
本発明の目的：
本発明の主な目的は、葉外殖片を用いる、遺伝子銃を介したトランスジェニック・チャ（カメリア・シネンシス(camellia sinensis (L.) O. Kuntze)）の産生方法であって、上述の欠点を未然に防ぐ方法を提供することである。本方法の新規制は、それが、遺伝子銃の使用により高頻度でチャの葉外殖片を形質転換してトランスジェニック植物を産生することに初めて成功した方法ということにある。
【０００９】
本発明の別の目的は、最大の粒子貫通のための表面積の増大、最少の細胞損傷／傷害及び最大の再生効率の組み合わせの達成である。
【００１０】
本発明の別の目的は、（ｉ）最大の粒子貫通のための表面積の増大、（ｉｉ）最少の細胞損傷／傷害及び（ｉｉｉ）最大の再生効率を達成するために、遺伝子銃に影響を及ぼす要因の異なる組み合わせ（３５４）を構築することにある。
【００１１】
本発明の別の目的は、遺伝子銃の間のある段階において直面する問題の幾つかを克服することにある。
【００１２】
本発明の別の目的は、生物学的及び非生物学的ストレスに耐性のあるトランスジェニック・チャの産生である。
【００１３】
本発明の更に別の目的は、より高収量で、且つ良好なカップ品質を有するチャ植物を提供することである。
【００１４】
本発明の更に別の目的は、優良種のチャ植物を遺伝的に形質転換して品質及び収量を共に改善することである。
【００１５】
本発明の更に別の目的は、脱カフェイン・チャ植物を産生することである。
【００１６】
本発明の更に別の目的は、タウマチン及びレクチン等のような遺伝子を用いて、甘いチャの葉を持つトランスジェニック・チャ植物を産生することである。
【００１７】
本発明の詳細な説明：
本発明は、遺伝子銃を介したトランスジェニック・チャ（カメリア・シネンシス(camellia sinensis (L.) O. Kuntze)）の産生のための３６０個のパラメーターの新規組み合わせを介したトランスジェニック・チャ（カメリア・シネンシス(camellia sinensis (L.) O. Kuntze)）の産生に関する。本発明の方法は、
（ａ）葉外殖片を３６０の組み合わせにかける前に、異なる濃度（０．２５〜０．７５Ｍ）の異なる浸透物質、例えばスクロース、ミオイノシトール、ソルビトール、マンニトールのみ、マンニトールとソルビトールの組み合わせ、並びに基礎ＭＳ培地(Murashige T. and Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473-497; 1962)にチアミン塩酸塩（０．１ｍｇ／ｌ）、ピリドキシン塩酸塩（０．５ｍｇ／ｌ）及びニコチン酸（０．５ｍｇ／ｌ）のようなビタミンとグリシン（２．０ｍｇ／ｌ）を添加したものによって、２〜８時間に及ぶ、異なる期間葉外殖片を処理し；
（ｂ）最も外側の円の直径が９．０ｃｍのペトリ皿のものと同一である、透明なポリエチレンシート上に、２．０〜９．０ｃｍに及ぶ可変の直径の同心円を描き；
（ｃ）ボンバードメント(bombardment)のために再生培地上に向軸面を上向きにして葉外殖片を配置し；
（ｄ）BioRadによって製造されたｐＲＴ９９ＧＵＳプラスミドＤＮＡでコーティングしたマイクロプロジェクタイルの最大の貫通のために、９．０ｃｍのペトリ皿の異なる同心円（２．０〜５．０ｃｍ）内に再生培地上の葉外殖片を配置し；
（ｅ）７０％アルコール、続いて滅菌水で各３回洗浄することによって金粒子を滅菌し；
（ｆ）０．５〜１．５ｍｌの滅菌蒸留水中で６０μｇの金粒子を懸濁し；
（ｇ）各ボンバードメントごとに、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに２５〜６０μｌのこの懸濁液を分注し；
（ｈ）５０μｌの金懸濁液と、１０μｌの異なる濃度のｐＲＴＧＵＳプラスミドＤＮＡ（０．５〜５μｇ／μｌ）、４０〜５０μｌの１．５〜３．５ＭのＣａＣｌ2及び１０〜５０μｌのリン酸塩を含まないスペルミジンとを、時々同時にボルテックスをかけて混合し、５００〜１１００ｒｐｍで５〜２０秒間スピンし、続いて上清を除去し、そして７０％エタノール及び５０〜１００μｌの１００％エタノールの最後の懸濁液によって洗浄し；
（ｉ）速やかにボルテックスをかけて、滅菌したマクロキャリアー(BioRad)上に金粒子とＤＮＡの１０μｌの懸濁液をコーティングし；
（ｊ）最大の粒子貫通のための表面積の増大、最少の細胞損傷／傷害及び最大の再生効率のために、ギャップ距離又はラプチャーディスクとマクロキャリアーとの間の距離（単独で且つ併せて１／４〜３／８インチ（６．３５〜９．５２５ｍｍ））、マクロキャリアーの飛行距離又はマクロキャリアーとストッピングスクリーンとの間の距離（６〜１６ｍｍ）、及び標的距離又はマイクロプロジェクタイルストッピングスクリーンと標的組織との間の距離（６〜１２ｃｍ）を含んで成る、３６０の組み合わせを構築し；
（ｋ）遺伝子銃(biolistic gun)、例えばDupontのGene booster、しかし、具体的にはヘリウムの圧力による粒子送達系、PDS-1000/He (BioRad)を用いて、２２〜２８インチ（５５．８８〜７１．１２ｃｍ）の水銀のチャンバー圧のもと、金粒子（０．６〜１．６μｍ）と１，２及び４μｇ／μｌの濃度のＤＮＡとを、上記３６０の組み合わせ（ここで、ガスの衝撃及び粒子の高分散に起因する組織の損傷は、最適な粒子の分散のために標的距離を増大させることによって回避され、そして同時に、マイクロプロジェクタイルの飛行距離の中心を外れた飛行に起因する組織の損傷は、ギャップ距離を減少させることによって克服した）で葉外殖片をボンバードメントし；
（ｌ）ペトリ皿の方向を１８０度回すことによって変化させた後に各プレートを２回ボンバードメントし；
（ｍ）葉、体細胞胚、受精胚(zygotic embryos)及び胚形成カルスに及ぶボンバードメントした外殖片を、ボンバードメントした面が再生培地に触れるように、背軸面を上向きにして再生培地上で裏返し；
（ｎ）培養室の２５＋２℃の温度で２日間、暗くして培養し；
（ｏ）Jeffersonの方法（ここで、ＧＵＳ（５−ブロモ、４−クロロ、３−インドリル、β−Ｄ−グルクロニド）化学物質と形質転換した葉外殖片との反応が青色の「反応産物」を生み、それによってBioRadのｐＲＴ９９ＧＵＳプラスミドＤＮＡでコーティングしたマイクロプロジェクタイルが、外殖片組織の細胞内に侵入したことが示される(Jefferson RA 1987, Assaying chimeric genes in plants: The GUS gene fusion system, Plant Mol Biol Rep 5: 389-405)に従い、ＧＵＳ発現についてボンバードメントした葉をアッセイし；
（ｐ）２００１年に出願されたSandal I, Bhattacharya A, Sharma M, Ahuja P.S.'An efficient method for micropropagation of tea (Camellia sinensis) plants using leaf explants'特許の再生培地に、培養室の５２μｍｏｌｍ-2ｓ-1の白色(cool)蛍光下で、１６時間の正常な明期のもと、２日後のボンバードメントした葉外殖片を移し；
（ｑ）カナマイシン（２５０〜１１００μｇ／ｍｌ）を含む選択培地上で、１５日おきに推定上の形質転換体を最終的に選択し；
（ｒ）２００１年に出願されたSandal I, Bhattacharya A, Sharma M, Ahuja P.S.'An efficient method for micropropagation of tea (Camellia sinensis) plants using leaf explants'特許のプロトコールに従い、３〜５ヶ月齢のin vitroで生育された培養物の、完全に折れた、半分開いた、又は十分に広がった葉外殖片からシュートの芽(shoot bud)を再生し；
（ｓ）Sandal I, Bhattacharya A, Ahuja P. S. An efficient liquid culture system for tea shoot proliferation Plant Cell Tissue Organ Culture 65(1) : 75-80 (2001)の液体培地中で、トランスジェニックシュートを成長させ、そして増殖させ；
（ｔ）標準的な方法に従いＰＣＲ及びサザンハイブリダイゼーションを用い、２５０〜１１００μｇ／ｍｌのカナマイシンで選択したトランスジェニック植物のＧＵＳポジティブな組織を分子的に特徴づけること、
を含んで成る。
【００１８】
ある態様において、異なる品種（中国種(Chinary)、カンボジア種(Cambod)及びアッサム種(Assamica)）の異なる外殖片、例えば葉、体細胞胚、受精胚及び胚形成カルスは、上述のように遺伝子銃を介して遺伝的に形質転換した。
【００１９】
別の態様において、ex vitroで生育した植物の葉外殖片は、ホルモンを含まない液体基礎ＭＳ培地及び異なる浸透物質で処理し、ここで、最も扱いやすく且つ安価なＭＳ培地が、遺伝子銃によるボンバードメントの前に最も有効であった。
【００２０】
更に別の態様において、葉外殖片は、ホルモンを含まない液体基礎ＭＳ培地及び異なる範囲の浸透物質、例えばスクロース、ミオイノシトール、ソルビトール、マンニトールのみ、及びマンニトールとソルビトールの組み合わせで処理され、ここで、そのまの濃度の(full strength)のホルモンを含まない基礎ＭＳ培地が最も有効であった。
【００２１】
更に別の態様において、葉外殖片は、ホルモンを含まない液体基礎ＭＳ培地及び異なる浸透物質で、２〜８時間に及ぶ異なる期間処理され、ここで、ホルモンを含まない液体基礎ＭＳ培地の４時間の処理が最も有効であった。
【００２２】
ある態様において、５０〜７０μｇの金粒子が、マクロキャリアー上へのＤＮＡの負荷の間、残留グリセロールの阻害作用を克服するために、直接的な使用及び保存両方のために、滅菌水中で調製された。
【００２３】
更に別の態様において、２．０〜９．０ｃｍに及ぶ可変の直径の同心円が、透明なポリエチレンシート上に描かれ、ここで、最も外側の円の直径は、９．０ｃｍのペトリ皿のものと同一であった。
【００２４】
ある態様において、外殖片は、ボンバードメントのために、再生培地上に向軸面を上にして配置された。
【００２５】
別の態様において、外殖片は、ｐＲＴ９９ＧＵＳプラスミドＤＮＡでコーティングしたマイクロプロジェクタイル(BioRad)の異なる拡散パターンの最適化のために、そしてJeffersonのＧＵＳアッセイ法(Jefferson RA 1987, Assaying chimeric genes in plants: The GUS gene fusion system, Plant Mol Biol Rep 5: 389-405)を用いるために.、９．０ｃｍのペトリ皿の２．０〜５．０ｃｍに及ぶ異なる同心円内の再生培地上に配置された。
【００２６】
ある態様において、０．５〜１．５ｍｌに及ぶ金粒子が、７０％アルコール及び滅菌水を用いて、各３回洗浄することによって滅菌された。
【００２７】
別の態様において、２５〜６０μｌに及ぶ懸濁液は、各ボンバードメントにつき１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中に分注された。
【００２８】
別の態様において、４０〜６０μｌの金の懸濁液は、５〜１５μｌの異なる濃度のｐＲＴ９９ＧＵＳプラスミドＤＮＡ（０．５〜５μｇ／μｌ）、４０〜６０μｌの１．５〜３．５ＭのＣａＣｌ2及び１０〜５０μｌの０．５〜２．０Ｍの、リン酸塩を含まないスペルミジンと混合された。
【００２９】
別の態様において、懸濁液は、５００〜１１００ｒｐｍで５〜２０秒間スピンし、続いて上清を除去し、そして７０％エタノール及び５０〜１００μｌの１００％エタノールの最後の懸濁液によって洗浄しながら、時々ボルテックスにかけた。
【００３０】
別の態様において、５〜１５μｌの金粒子とＤＮＡの懸濁液は、速やかにボルテックスをかけながら、滅菌したマクロキャリア(BioRad)上にコーティングした。
【００３１】
別の態様において、外殖片は、遺伝子銃、例えばDuPontのGene Booster及びヘリウムの圧力による粒子送達系PDS-1000/He (BioRad)、しかし、好ましくは２２〜２８インチ（５５．８８〜７１．１２ｃｍ）の水銀のチャンバー圧のもとでのヘリウムの圧力による粒子送達系PDS-1000/He (BioRad)を用いてボンバードメントされた。
【００３２】
別の態様において、３６０の組み合わせは、最大の粒子貫通のための表面積の増大、最少の細胞損傷／傷害及び最大の再生効率のために、ギャップ距離又はラプチャーディスクとマクロキャリアーとの間の距離（単独で且つ併せて１／４〜３／８インチ（６．３５〜９．５２５ｍｍ）、マクロキャリアーの飛行距離又はマクロキャリアーとストッピングスクリーンとの間の距離（６〜１６ｍｍ）、及び標的距離又はマイクロプロジェクタイルストッピングスクリーンと標的組織との間の距離（６〜１２ｃｍ）を含んで成るものが構築された。
【００３３】
別の態様において、上述の３６０の組み合わせは、０．６〜１．６μｍに及ぶ金粒子、及び１，２及び４μｇ／μｌに及ぶＤＮＡの濃度と一緒に使用され、ここで、好ましくは、１．０μｍの金粒子、１１００ｐｓｉ（７５８４．２ｋＰａ）の破裂圧力、標的距離（９ｃｍ）、ギャップ距離（３／８インチ＋１／４インチ及び１／４インチ（９．５２５ｍｍ＋６．３５ｍｍ及び６．３５ｍｍ）、マクロキャリアーの飛行距離（１６ｍｍ）及び１μｇ／μｌのＤＮＡの組み合わせが、最大の形質転換頻度をもたらした。
【００３４】
別の態様において、各外殖片は、ペトリ皿の方向を１８０度変えることによって２回ボンバードメントした。
【００３５】
別の態様において、ボンバードメントした外殖片は、背軸面を上にして再生培地上で裏返しにされた。
【００３６】
別の態様において、ボンバードメントした外殖片、好ましくは葉外殖片は、２５＋２℃の培養室条件下で２日間暗がりで培養され、続いて２００１年に出願されたSandal I, Bhattacharya A, Sharma M, Ahuja P. S.'An efficient method for micropropagation of tea (Camellia sinensis) plants using leaf explants'特許の再生培地上で培養された。
【００３７】
別の態様において、ボンバードメントした外殖片は、ボンバードメントから６日後に、Jefferson RA (1987) Assaying chimeric genes in plants: The GUS gene fusion system, Plant Mol Biol Rep 5: 389-405のＧＵＳアッセイ法を用いて、一過性発現について試験された。
【００３８】
別の態様において、葉由来のカルスは、カナマイシン含有選択培地上で、１５日おきに選択された。
【００３９】
別の態様において、２５０〜１１００μｇ／ｍｌに及ぶカナマイシンレベルは、ほぼ「エスケープ(escape)」不可能な形質転換体の選択に使用された。
【００４０】
別の態様において、１．０ｃｍ長の健康なトランスジェニック植物が生育され、そして、SandalI, Bhattacharya A, Ahuja P. S. An efficient liquid culture system for tea shoot proliferation Plant Cell Tissue Organ Culture 65(1) : 75-80 (2001)のカナマイシンを含まない液体増殖培地上で増殖された。
【００４１】
別の態様において、２５０〜１１００μｇ／ｍｌのカナマイシンで選択したトランスジェニック植物のＧＵＳポジティブな組織が、標準的な方法に従うＰＣＲ及びサザンハイブリダイゼーションを用いて（分子的に）特徴付けられた。
【００４２】
本発明の別の態様において、異なる外殖片、例えば体細胞及び胚形成カルスは、ボンバードメントのために上述の因子を用いて使用された。
【００４３】
本発明の更に別の態様において、異なる品種の葉外殖片は、in vitro及びex vitroの両方の植物から、ボンバードメントのために使用された。
【００４４】
（ｉ）葉外殖片は、ホルモンを含まない液体基礎ＭＳ培地(Murashige T. and Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473-497; 1962)及び異なる濃度の浸透物質、例えばスクロース、ミオイノシトール、ソルビトール、マンニトールのみ、及びマンニトールとソルビトールの組み合わせにより、異なる期間（２〜８時間）処理された。
【００４５】
（ｉｉ）同心円は、透明なポリエチレンシート上に描かれ、ここで、最も外側の円の直径は、９．０ｃｍのペトリ皿のものと同一であった。
【００４６】
（ｉｉｉ）ＤＮＡコーティングしたマイクロプロジェクタイルの最大の拡散のための、９．０ｃｍのペトリ皿の異なる同心円（２．０〜５．０ｃｍ）内の再生培地上での、向軸面を上にした葉外殖片の配置。
【００４７】
（ｉｖ）０．５〜１．５ｍｌの金粒子は、７０％アルコール及び滅菌水で各３回洗浄した後に、滅菌水中で懸濁された。
【００４８】
（ｖ）懸濁液（２５〜６０μｌ）は、各ボンバードメントにつき１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ内に分注された。
【００４９】
（ｖｉ）５０μｌの金の懸濁液は、１０μｌの異なる濃度のプラスミドＤＮＡ（０．５〜５μｇ／μｌ）、４０〜５０μｌの１．５〜３．５ＭのＣａＣｌ2及び１０〜５０μｌの０．５〜２．０Ｍの、リン酸塩を含まないスペルミジン、と混合した。
【００５０】
（ｖｉｉ）懸濁液は、時々ボルテックスにかけ、５００〜１１００ｒｐｍで５〜２０秒間スピンし、続いて上清を除去し、そして７０％エタノール及び５０〜１００μｌの１００％エタノールの最後の懸濁液によって洗浄した。
【００５１】
（ｖｉｉｉ）１０μｌの金粒子とＤＮＡの懸濁液は、速やかにボルテックスをかけながら、滅菌したマクロキャリア(BioRad)上にコーティングした。
【００５２】
（ｉｘ）最大の粒子貫通のための表面積の増大、最少の細胞損傷／傷害及び最大の再生効率のために、（ａ）ギャップ距離又はラプチャーディスクとマクロキャリアーとの間の距離（単独で且つ併せて１／４〜３／８インチ（６．３５〜９．５２５ｍｍ））、（ｂ）マクロキャリアーの飛行距離又はマクロキャリアーとストッピングスクリーンとの間の距離（６〜１６ｍｍ）、（ｃ）標的距離又はマイクロプロジェクタイルストッピングスクリーンと標的組織との間の距離（６〜１２ｃｍ）、及びラプチャーディスク(BioRad)の破裂圧力（６５０〜１３５０ｐｓｉ（４４８１．５〜９３０７．９ｋＰａ））を含んで成る３５４の組み合わせが構築された。
【００５３】
（ｘ）葉外殖片は、ヘリウムの圧力による粒子送達系、PDS-1000/He (BioRad)を用いて、２５インチ（６３．５ｃｍ）の水銀のチャンバー圧のもと、０．６〜１．６μｍの金粒子、１，２及び４μｇ／μｌの濃度のＤＮＡ、及び上文で導いた３５４の組み合わせによりボンバードメントした。
【００５４】
（ｘｉ）各プレートは、ペトリ皿の方向を１８０度変えることによって２回ボンバードメントした。
【００５５】
（ｘｉｉ）ボンバードメントした外殖片は、ボンバードメントした面が迅速な治癒のために再生培地上に触れるように、背軸面を上向きにして、裏返しにされた。
【００５６】
（ｘｉｉｉ）ボンバードメントした葉の外殖片は、培養室の条件下で２日間暗がりで培養した。
【００５７】
（ｘｉｖ）ボンバードメントした葉外殖片は、粒子の貫通の最大の拡散を試験するために、Jefferson RA (1987) Assaying chimeric genes in plants: The GUS gene fusion system, Plant Mol Biol Rep 5: 389-405のＧＵＳアッセイ法を用いて、一過性発現について試験された。
【００５８】
（ｘｖ）２日後、ボンバードメントした葉外殖片は、２００１年に出願されたSandal I, Bhattacharya A, Sharma M, Ahuja P. S.'An efficient method for micropropagation of tea (Camellia sinensis) plants using leaf explants'特許の再生培地に、正常な光周期の培養室条件のもとで移された。
【００５９】
（ｘｖｉ）シュートの芽は、２００１年に出願されたSandal I, Bhattacharya A, Sharma M, Ahuja P. S.'An efficient method for micropropagation of tea (Camellia sinensis) plants using leaf explants'特許のプロトコールに従い、ボンバードメントした葉外殖片から再生された。
【００６０】
（ｘｖｉｉ）推定上の形質転換体は、カナマイシン（２５０〜１１００μｇ／ｍｌ）を含む選択培地上で、１５日おきに選択された。
【００６１】
（ｘｖｉｉｉ）推定上のトランスジェニックシュートは、Sandal I, Bhattacharya A, Ahuja P. S. An efficient liquid culture system for tea shoot proliferation Plant Cell Tissue Organ Culture 65(1) : 75-80 (2001) SandalI, Bhattacharya A, Ahuja P. S. 2001の液体培地中で生育され、そして増殖された。
【００６２】
（ｘｉｘ）２５０〜１１００μｇ／ｍｌのカナマイシン上で選択されたトランスジェニック植物のＧＵＳポジティブ組織は、標準的な方法に従うＰＣＲ及びサザンハイブリダイゼーションを用いて特徴付けられた。
【００６３】
チャの葉外殖片における最大の一過性発現のための要因の最適化を表１に示す。
【００６４】
遺伝子銃を介するトランスジェニックスの産生の成功にとって、（ａ）最大の粒子貫通のために表面積を増大させ、（ｂ）細胞損傷／傷害を最小化し、そして（ｉｉｉ）再生効率を最大化するために、遺伝子銃に影響を及ぼす異なるパラメーターを全て最適に組み合わせることが必要であると感じられた。
【００６５】
トランスジェニックスの産生のための、組織の質感（硬い又は柔らかい）及び出発材料（属又は種）に依存する１又は２つの要因の使用は、複数の作物において報告されてきた。しかしながら、本発明の新規性は、世界的に利用され得る遺伝子銃の成功に影響を及ぼす全てのパラメーターのチェッカーボードの構築にある。当該チェッカーボードの３５４の組み合わせ（ラプチャーディスクの破裂圧力、マクロキャリアーの飛行距離、標的距離及びギャップ距離を含んで成る）の助けを借りて、あらゆる形質転換実験が、属、作物又は組織に関係なく成功し得る。
【００６６】
ホルモンを含まない液体基礎ＭＳ(Murashige T. and Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473-497; 1962)培地又は０．２５Ｍのソルビトールによる４時間の前処理は、チャの葉外殖片のザラザラの質感をもたらしてそれらを再生培地上で平らにすることを可能にし、そして最少の損傷でボンバードメントのためのより大きな表面積を提供しただけでなく、粒子の貫通に起因して生じた損傷を治癒した。通常、ボンバードメント前の浸透物質による処理は、それが標的細胞の原形質分離をもたらすので、一過性発現をかなり増強する。原形質分離は、細胞からの原形質の押出しを防ぎ、そして更に、ボンバードメントの間の粒子の貫通に伴う細胞の損傷を低下させる。Vain P, McMullen M. D. , Finer J. J, 1993. 浸透処理は、粒子のボンバードメント媒介型の一過性で且つ安定なトウモロコシの形質転換を増強させる。Plant Cell Rep 12, 84-88. 組織の前処理は、ＤＮＡの複製を誘導し、高レベルのＤＮＡのゲノム内への挿入をもたらす。
【００６７】
ストッピングスクリーンから標的組織へと金粒子が横断した経路は、通常円錐形である。従って、ボンバードメントされる外殖片が、金粒子の分散の最大化のために配置される再生培地上の既定の同心円でこの円錐の底面の表面積を覆うことが必要である。従って、透明なポリエチレンシート上に可変性の直径（２．０〜９．０ｃｍ）の同心円を描く方法が考案され、ここで、最も外側の円の直径は、９．０ｃｍのペトリ皿のものと同一であった。標的組織を含むペトリ皿をこれらの円の上に置き、そしてそれらをボンバードメントの後にＧＵＳを介して一過性発現についてそれらをアッセイすることによって、２．０ｃｍの直径を有する同心円が最適であったことが明らかとなった。これは、最大の粒子の貫通が、チャの葉外殖片をこの領域内に配置した場合に達成されたためである。
【００６８】
ラプチャーディスクの破裂圧力、マイクロプロジェクタイル速度の増大は、ガスの衝撃及び粒子の高分散に起因する組織の損傷を増大させ、低い一過性遺伝子発現をもたらす。このことは、標的距離を増大させるか、又は粒子の分散のためにストッピングスクリーンからより遠い距離で組織を保持することによって回避された。
【実施例】
【００６９】
以下の実施例は例示目的で記されており、そして本明細書の発明の概念に対しての限定として解釈されるべきではない。
【００７０】
実施例１
in vitroで生育した植物の葉外殖片を、基礎ＭＳ(Murashige T. andSkoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473-497; 1962)培地及び異なる濃度の浸透物質、例えばスクロース、ミオイノシトール、ソルビトール、マンニトールのみ、及びマンニトールとソルビトールの異なる組み合わせにより、異なる期間（２〜８時間）処理した。処理した葉外殖片は、ＤＮＡコーティングしたマイクロプロジェクタイルの拡散パターンの最適化のために、９．０ｃｍのペトリ皿の異なる同心円（２．０〜５．０ｃｍ）内の再生培地上に、向軸面を上にして配置した。ボンバードメントのために、０．５〜１．５ｍｌの金粒子を、７０％アルコール及び滅菌水で各３回洗浄した後に滅菌蒸留水中で懸濁し、そして当該懸濁液（２５〜６０μｌ）を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに分注した。ＤＮＡの調製のために、５０μｌの金懸濁液、１０μｌの異なる濃度のプラスミドＤＮＡ（０．５〜５μｇ／μｌ）、４０〜５０μｌの１．５〜３．５ＭのＣａＣｌ2及び１０〜５０μｌの０．５〜２．０Ｍのスペルミジン遊離塩基を混合する。懸濁液は、５００〜１１００ｒｐｍで５〜２０秒間スピンし、続いて上清を除去し、そして７０％エタノール及び５０〜１００μｌの１００％エタノールの最後の懸濁液によって洗浄しながら、時々ボルテックスにかけた。１０μｌの金粒子とＤＮＡの懸濁液は、速やかにボルテックスをかけながら、滅菌したマクロキャリア上にコーティングした。葉外殖片は、ヘリウムの圧力による粒子送達系、PDS-1000/He (BioRad)を用いて、２５インチ（６３．５ｃｍ）の水銀のチャンバー圧のもと、０．６〜１．６μｍの金粒子、１，２及び４μｇ／μｌの濃度のＤＮＡ、及び上文で導いた３５４の組み合わせによりボンバードメントし、そして各プレートは、ペトリ皿の方向を１８０度変えることによって２回ボンバードメントした。ボンバードメントした外殖片は。背軸面を上向きにして裏返しにされた。ボンバードメントした葉の外殖片は、Jefferson RA (1987) Assaying chimeric genes in plants: The GUS gene fusion system, Plant Mol Biol Rep 5: 389-405の方法に従いＧＵＳ発現についてアッセイした後、２００１年に出願されたSandal I, Bhattacharya A, Sharma M, Ahuja P. S.'An efficient method for micropropagation of tea (Camellia sinensis) plants using leaf explants'特許の再生培地上での培養に従う培養室条件のもと、２日間暗がりで培養した。最後に、葉由来のカルスは、２５０〜１１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む選択培地上で、１５日おきに選択された。ＧＵＳポジティブ組織は、標準的な方法に従うＰＣＲ及びサザンハイブリダイゼーションを用いて（分子的に）特徴付けられた。
【００７１】
実施例２
ex vitroで生育された植物の葉外殖片は、異なる濃度の浸透物質で処理され、続いて上述のように遺伝子銃を介して遺伝的に形質転換された。
【００７２】
実施例３
異なる品種（中国種、カンボジア種及びアッサム種）の植物の葉外殖片は、異なる濃度の浸透物質で処理され、続いて上述のように遺伝子銃を介して遺伝的に形質転換された。
【００７３】
実施例４
異なる外殖片、例えば体細胞胚、受精細胞胚及び胚形成カルスは、上述のように遺伝子銃を介して遺伝的に形質転換された。
【００７４】
前記方法の新規性は、組織の型、外殖片又は属に関係なく、遺伝子銃を介したトランスジェニックの産生の成功を保証する、３５４の組み合わせを含んで成るチェッカーボードが構築されたことである。
【００７５】
導入された新規な特徴の幾つかは、以下の通りである：
【００７６】
１．基礎ＭＳ(Murashige T. andSkoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473-497; 1962)培地が浸透圧調整物質の代わりに初めて使用され、そしてこのことが、既知の浸透物質による厄介で且つ費用のかかる前処理段階を回避する。
【００７７】
２．可変性の直径（２．０〜９．０ｃｍ）の同心円が、透明なポリエチレンシート上に描かれ、ここで、最も外側の円は、９．０ｃｍのペトリ皿と同一であり、その結果、標的組織が配置されなければならない正確な領域がボンバードメントの前に知られるようになる。更に、このことは、粒子の環津のための領域の最大化も可能にする。
【００７８】
３．金粒子は、マクロキャリアー上へのＤＮＡの負荷の間の、残留グリセロールの阻害作用の問題を克服するために、初めてグリセロールの代わりに水の中で懸濁された。
【００７９】
４．粒子の貫通に起因する損傷のより素早い治癒のための段階が、ボンバードメントの後に葉を裏返しすることによって考案された。このことは、損傷部位を培地と接触させることを可能とし、そしてより早い再生反応をもたらした。
【００８０】
５．当該反応性の葉外殖片、すなわち葉カルスの形成後のものは、あらゆるエスケープを防ぎ、且つ高いパーセンテージの安定な形質転換体（９５〜１００％）を保証するために、非常に大量のカナマイシン、すなわち、５００又は１０００μｇ／ｍｌのカナマイシンで選択された。これは、形質転換体の選択のために１０００μｇ／ｍｌほどの大量のカナマイシンを用いることの初めての報告である。
【００８１】
６．この方法はまた、健康な、形質転換したチャのシュートの産生を保証するものである。
【００８２】
本発明の主な利点
１）５０％の作物の損失を克服するための遺伝子銃を介するトランスジェニックスの産生によりもち病のような真菌病に対して耐性の優良種。
【００８３】
２）遺伝子銃を介するトランスジェニックスの産生により細菌性の枝枯病(shoot blight)のような細菌病に対して耐性の優良種。
【００８４】
３）遺伝子銃を介するトランスジェニックの産生によりウイルス病に耐性の優良種。
【００８５】
４）遺伝子銃を介するトランスジェニックスの産生により昆虫、アザミウマ及びダニのような害虫に対して耐性の優良種。
【００８６】
５）遺伝子銃を介するトランスジェニックの産生により、グリホスフェート、２，４−Ｄ、パラコート及びジウロンのような除草剤及びアトラジン及びオキシフルルフォン(oxyflurfon)のような発芽前散布除草剤に耐性の優良種。
【００８７】
６）遺伝子銃を介するトランスジェニックスの産生により、（ｉ）増大した酸素ラジカルを捕捉するための酵素をコードする遺伝子の過剰発現、（ｉｉ）マンニトール、プロリン、フルクタン、グリシン−ベタイン等のようなオスモライトの含量の増大(Bonhert et al. , 1996; Hayashi et al. , 1997)、（ｉｉｉ）細胞膜の柔軟性の改善及び（ｉｖ）ストレス誘導タンパク質、例えばＬＥＡタンパク質、デヒドリン、不凍タンパク質（ＡＦＰ）、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）並びに低酸素及び無酸素緩和(reducing)タンパク質の発現操作、による異なるストレスに耐性の優良種。
【００８８】
７）雑草、例えば芝生、広葉雑草等に耐性のトランスジェニック・チャの産生。
【００８９】
８）ほとんど又は全く冬季休眠しないトランスジェニック・チャの産生。
【００９０】
９）植物のシュートの数の増大に特異的なプロモーターの支配下にあるＡＰＥＴＡＬＡ又はＬＥＡＦＹのような遺伝子を発現するトランスジェニック植物の産生。
【００９１】
１０）増大した光合成率の適したプロモーターのもとにあるRUBPcaseをコードするトランスジェニック・チャ遺伝子の産生。
【００９２】
１１）密殖のためのフィトクロム遺伝子を過剰発現しているトランスジェニック・チャの産生及びより早い摘み取りに良いティーテーブル
【００９３】
１１）より多い収量及び良好なカップ品質を有するチャ植物の産生。
【００９４】
１２）遺伝子銃を介したトランスジェニックスの産生による向上した品質及び収量についての優良種の改良。
【００９５】
１３）脱カフェイントランスジェニック・チャ植物の産生。
【００９６】
１４）タウマチン及びレクチン等のような遺伝子を用いて甘い茶葉を有するトランスジェニック・チャ植物の産生。
【００９７】
１５）属、作物、組織、外殖片等に関係なく、高率のトランスジェニックの産生のための遺伝子銃を介する遺伝的形質転換法を提供すること。
【００９８】
１６）遺伝子銃を介する遺伝的形質転換の幾つかの段階の間に直面する幾つかの問題を克服すること。
【００９９】
【表１】
2005514952.tif 000002
【表２】
2005514952.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１ａ．ｂ．ｃ】チャ植物の葉外殖片を表す。
【図１ｄ−ｒ】ｇｕｓの発現を示している、異なる形質転換葉外殖片を表す。
【図１】
2005514952.tif 000004
【手続補正書】
【提出日】平成16年6月8日(2004.6.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
葉外殖片を用いた遺伝子銃によるトランスジェニック・チャ（カメリア・シネンシス(camellia sinensis (L.) O. Kuntze)）の産生のための使用であって、
ａ．異なる濃度の、スクロース、ミオイノシトール、ソルビトール、及びマンニトールのみ、マンニトールとソルビトールの組み合わせ、から成る群から選択される浸透物質、並びに液体基礎ＭＳ培地(Murashige T. and Skoog F)に約０．１ｍｇ／ｌのチアミン塩酸塩、約０．５ｍｇ／ｌのピリドキシン塩酸塩及び、約０．５ｍｇ／ｌのニコチン酸から成る群から選択されるビタミンと約２．０ｍｇ／ｌのグリシンを添加したものによって、２〜８時間に及ぶ異なる期間葉外殖片を処理し；
ｂ．ＤＮＡでコーティングしたマイクロプロジェクタイルの最大の拡散及びＧＵＳアッセイ法を用いての一過性発現についての試験のために、９．０ｃｍのペトリ皿の２．０〜５．０ｃｍに及ぶ異なる同心円内にある再生培地上に向軸面を上にして葉外殖片を配置し、
ｃ．約５０μｌの金懸濁液と、約１０μｌの、０．５〜５μｇ／μｌにわたり変化する濃度のプラスミドＤＮＡ、約４０〜５０μｌの１．５〜３．５ＭのＣａＣｌ2及び約１０〜５０μｌの０．５〜２．９Ｍのスペルミジン遊離塩基とを、時々同時にボルテックスをかけて混合し、約５００〜１１００ｒｐｍで約５〜２０秒間スピンし、続いて上清を除去し、そして約７０％エタノール及び約５０〜１００μｌの１００％エタノールの最後の懸濁液によって洗浄し、
ｄ．速やかにボルテックスをかけて滅菌したマクロキャリアー上に金粒子とＤＮＡの約１０μｌの懸濁液をコーティングし、
ｅ．ヘリウムの圧力による粒子送達系を用いて、約２５インチ（約６３．５ｃｍ）の水銀のチャンバー圧のもと、約０．６〜１．６μｍの金粒子、１，２及び４μｇ／μｌの濃度のＤＮＡと一緒に、且つ最大の粒子貫通のための表面積の増大、最少の細胞損傷／傷害及び最大の再生効率のために、ギャップ距離又はラプチャーディスクとマクロキャリアーとの間の距離（単独で且つ併せて１／４〜３／８インチ（６．３５〜９．５２５ｍｍ））、マクロキャリアーの飛行距離又はマクロキャリアーとストッピングスクリーンとの間の距離（６〜１６ｍｍ）、及び標的距離又はマイクロプロジェクタイルストッピングスクリーンと標的組織との間の距離（６〜１２ｃｍ）を含んで成る、３５４の組み合わせに注意しながら葉外殖片をボンバードメントし、
ｆ．ペトリ皿の方向を変え、そしてまたボンバードメントした外殖片を、ボンバードメントした面が再生培地上に触れるように背軸面を上向きにして裏返しにした後、プレートを二回ボンバードメントし、
ｇ．ＧＵＳ発現についてボンバードメントした葉をアッセイするために、培養室条件下で約２日間暗がりで培養し、
ｈ．約２日後にボンバードメントした葉外殖片を、培養室条件の正常な明期のもとで再生培地に移し、
ｉ．約２５０〜１１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む選択培地上で、１５日おき形質転換体を選択し、そして
ｊ．形質転換した葉外殖片からシュートの芽(shoot bud)を再生する、
段階を含んで成る使用。
【請求項２】
中国種(Chinary)、カンボジア種(Cambod)及びアッサム種(Assamica)を含んで成る群から選択される品種の葉外殖片が遺伝的に形質転換される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
ex vitroで生育した植物の葉外殖片が、ホルモンを含まない液体基礎ＭＳ培地及び異なる浸透物質で処理され、ここで、最も扱いやすく且つ安価なＭＳ培地が、遺伝子銃によるボンバードメントの前に最も有効であった、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
葉外殖片が、ホルモンを含まない液体基礎ＭＳ培地及び異なる濃度の浸透物質、例えばスクロース、ミオイノシトール、ソルビトール、マンニトールのみ、及びマンニトールとソルビトールの組み合わせで処理され、ここで、そのまの濃度の(full strength)のホルモンを含まない基礎ＭＳ培地が最も有効であった、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
葉外殖片が、ホルモンを含まない液体基礎ＭＳ培地及び異なる浸透物質で、異なる期間（２〜８時間）処理され、ここで、ホルモンを含まない液体基礎ＭＳ培地の４時間の処理が最も有効であった、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
金粒子が、マクロキャリアー上へのＤＮＡの負荷の間の残留グリセロールの阻害作用を克服するために、直接的な使用及び保存両方のために、滅菌水中で調製された、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
可変の直径の同心円が、透明なポリエチレンシート上に描かれ、ここで、最も外側の円の直径は、９．０ｃｍのペトリ皿のものと同一であった、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
葉外殖片が、ボンバードメントのために、再生培地上に向軸面を上にして配置される、請求項１に記載の使用。
【請求項９】
葉外殖片が、ＤＮＡでコーティングしたマイクロプロジェクタイルの拡散パターンの最適化及びＧＵＳアッセイ法を用いての一過性発現についての試験のために、約９．０ｃｍのペトリ皿の異なる同心円内の再生培地上に配置された、請求項１に記載の使用。
【請求項１０】
約０．５〜１．５ｍｌの金粒子が、７０％アルコール及び滅菌水を用いて、約各３回洗浄される、請求項１に記載の使用。
【請求項１１】
懸濁液が、各ボンバードメントにつき約１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中に分注される、請求項１に記載の使用。
【請求項１２】
約５０μｌの金の懸濁液が、約１０μｌの０．５〜５μｇ／μｌの異なる濃度のプラスミドＤＮＡ、４０〜５０μｌの約１．５〜３．５ＭのＣａＣｌ2及び約１０〜５０μｌの約０．５〜２．０Ｍの、リン酸塩を含まないスペルミジンと混合された、請求項１に記載の使用。
【請求項１３】
懸濁液が、時々ボルテックスにかけられ、約５００〜１１００ｒｐｍで約５〜２０秒間スピンし、続いて上清を除去し、そして約７０％エタノール及び５０〜１００μｌの１００％エタノールの最後の懸濁液によって洗浄された、請求項１に記載の使用。
【請求項１４】
１０μｌの金粒子とＤＮＡの懸濁液が、速やかにボルテックスをかけて滅菌したマクロキャリア上でコーティングされた、請求項１に記載の使用。
【請求項１５】
葉外殖片が、約２５インチ（６３．５ｃｍ）水銀のチャンバー圧のもとでのヘリウムの圧力による粒子送達系を用いてボンバードメントされた、請求項１に記載の使用。
【請求項１６】
最大の粒子貫通のための表面積の増大、最少の細胞損傷／傷害及び最大の再生効率のために、ギャップ距離又はラプチャーディスクとマクロキャリアーとの間の距離（単独で且つ併せて１／４〜３／８インチ（６．３５〜９．５２５ｍｍ）、マクロキャリアーの飛行距離又はマクロキャリアーとストッピングスクリーンとの間の距離（６〜１６ｍｍ）、及び標的距離又はマイクロプロジェクタイルストッピングスクリーンと標的組織との間の距離（６〜１２ｃｍ）を含んで成る約３５４の組み合わせが構築された、請求項１に記載の使用。
【請求項１７】
前記約３５４の組み合わせが、約０．６〜１．６μｍの金粒子、及び１，２及び４μｇ／μｌに及ぶＤＮＡの濃度と一緒に使用される、請求項１に記載の使用。
【請求項１８】
各外殖片が、ペトリ皿の方向を変えることによって２回ボンバードメントされる、請求項１に記載の使用。
【請求項１９】
ボンバードメントした葉外殖片が、背軸面を上にして再生培地上で裏返しにされる、請求項１に記載の使用。
【請求項２０】
ボンバードメントした葉外殖片が、培養室条件下で２日間暗がりで培養され、続いて再生培地上で培養される、請求項１に記載の使用。
【請求項２１】
ボンバードメントした外殖片が、ＧＵＳアッセイ法を用いて一過性発現について試験された、請求項１に記載の使用。
【請求項２２】
葉由来のカルスが、カナマイシン含有選択培地上で、約１５日おきに選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項２３】
２５０〜１１００μｇ／ｍｌに及ぶカナマイシンレベルが、ほぼ「エスケープ(escape)」不可能な形質転換体の選択に使用された、請求項１に記載の使用。
【請求項２４】
約１．０ｃｍ長の健康なトランスジェニックが、カナマイシンを含まない液体増殖培地上で生育され、そして増殖される、請求項１に記載の使用。
【請求項２５】
約２５０〜１１００μｇ／ｍｌのカナマイシンで選択したトランスジェニック植物のＧＵＳポジティブな組織が、標準的な方法に従うＰＣＲ及びサザンハイブリダイゼーションを用いて分子的に特徴付けられる、請求項１に記載の使用。
【国際調査報告】
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