(57)【要約】本発明は爆発物（２）の検出において、核酸（１）が爆発物（２）の分子構造の一部（３）又は全分子構造と特異的に結合し、部分分子構造（３）又は全分子構造と核酸（１）間の結合事象を検出するのに核酸（１）を使用し、そのような使用とその実施用装置のための核酸（１）関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
爆発物（２）検出において、核酸（１）が爆発物（２）の分子構造の一部（３）又は全分子構造と特異的に結合し、この部分分子構造（３）或いは全分子構造と核酸（１）間の結合事象を検出するための核酸（１）の使用。
【請求項２】
部分分子構造（３）が一個の窒素原子又は数個の窒素原子と直接に結合した利用可能な酸素を有してなる請求項１記載の使用。
【請求項３】
部分分子構造（３）が“亜硝酸エステル、硝酸エステル、ニトロ化合物及びニトロソ化合物”からなる一群から選ばれてなる請求項２記載の使用。
【請求項４】
爆発物が”ニトロベンゼン誘導体、ＴＮＴ、２，４−ＤＮＴ、２，６−ＤＮＴ，２−ＮＴ、ピクリン酸、ヘキソーゲン、オクトーゲン、ヘクシール、テトリル、エチレングリコール二硝酸エステル、ジチレングリコール二硝酸エステル、ニトログリセリン、ニトロペンタ及びこのような化合物の誘導体かなる一群から選ばれてなる請求項１〜３のいずれか記載の使用。
【請求項５】
核酸（１）が、“図８及び図９の配列或いは長さが少なくとも６個、特に少なくとも１０個のヌクレオチッドを有するこれら配列のいかなる断片”からなる一群から選ばれてなる請求項１〜４のいずれか記載の使用。
【請求項６】
結合事象が、標識化、特に蛍光標識化（４）され、且つ核酸（１）との結合が爆発性分子（２）により競合的に置換された検出分子（５）の信号を測定して検出されてなる請求項１〜５のいずれか記載の使用。
【請求項７】
核酸（１）が、選択肢としてスペーサー化合物（６）により固体担体表面（７）特に光ファイバー（８）表面に固定されてなる請求項１〜６のいずれか記載の使用。
【請求項８】
信号が、結合した検出分子（５）の信号強度の減少又は増加により発生する請求項６又は７記載の使用。
【請求項９】
信号が、放出した検出分子（５）の信号強度の増加により発生する請求項６〜８のいずれか記載の使用。
【請求項１０】
図８及び図９の配列の一つ或いは長さが少なくとも６個、特に少なくとも１０個のヌクレオチッドを有するこれら配列の断片を用いる請求項１〜９のいずれか記載の使用のための核酸（１）。
【請求項１１】
好ましくは固体担体表面（７）に固定した爆発物の部分分子構造（３）に特異的な核酸（１）を用いて爆発物（２）を検出し、部分分子構造（３）と核酸（１）間の結合事象（９）を検出する手段を含み且つ試料（１０）を核酸（１）に供給する手段からなる装置。
【請求項１２】
核酸（１）を光ファイバー（８）にスペーサー化合物（６）を用いて固定し、核酸（１）を蛍光標識化（４）検出分子（５）と共に取り込み、核酸（１）／検出分子（５）間の結合力が核酸（１）／部分分子構造（３）間の結合力より弱く、検出分子（５）の蛍光励起用光源（１１）を備え、光ファイバー（８）を蛍光検出器（９）と接続し、少なくとも光ファイバー（８）の一部が気体又は液体空間（１２）内に配置し、その中へ気体又は液体試料（１３）を供給できる請求項１１記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は爆発物検出用への分析物質の使用に関連し、この分析物質は少なくとも爆発物の一個の一部分子構造と特異的に結合し且つ一部分子構造と分析物質間の結合事象を検出し且つその使用又は方法における分析物質に関する。
【０００２】
このような分析物質は例えば環境、特に大気、飲料水及び/又は土壌の分析研究、更には生化学分析及び医療診断研究の他分野での爆発物或いはその主化学成分の検出に使用できる。更にセキュリティー対策、例えば航空手荷物や類似物のような運搬物中の爆発物の存在対策に応用できる。
【０００３】
ドイツ連邦規格ＤＩＮ２０１６３（１９８５年９月）で定義した爆発物は技術的に爆薬物、推進物或いは黒色火薬、発火剤、開始剤或いは爆薬として使用する爆発性物質である。爆発物の例はＴＮＴ（トリニトロトルエン）、ニトラミン（ヘキソーゲン＝ＲＤＸ＝ヘキサヒドロ−１，３，５−トリニトロ−１，３，５−トリアジン）、ニトロサミン及びピクリン酸のような有機ニトロ化合物がある。しかし鉛アジドのような無機化合物の名前を挙げることも又出来る。
【０００４】
分析物質は物質の種類と量を決定する分析法に利用され、結合した分析物質量を直接或いは間接的に半定量或いは定量的に決定し、これをもとに爆発物の量或いは濃度を決定表示する物質である。半定量的測定と云う用語は結合した分析物質の規定限界量を上回るか下回るかに関する情報も含みその結果関連爆発物の限界量或いは限界濃度（検出感度で決まる限界量の存在/不在）に関する情報も含む。
【０００５】
結合事象はいかなる種類の（物理）化学的結合/相互作用、即ちイオン結合、共有結合、ファンデルワールス力或いは水素結合型の結合が可能である。
【０００６】
部分分子構造は一個の官能基、数個の官能基、特に隣接基の組み合わせ或いは官能基保有又は非保有の炭素構造が可能である。その特徴は分子或いは化合物の一部であり分子全体では無いことである。同様の考えは無機爆発性分子にも適用される。
【０００７】
結合事象は光学的、化学的、生物的或いはその他の物理的又は物理工学的方法で検出
出来る。
【背景技術】
【０００８】
爆発物は一面ではその爆発性のため非常に危険であり得る。例えば空港などのようなセキュリティー分野では、例えば爆発物を活用する人間による好ましくない行動を防止するために爆発物は検出されねばならない。他方では爆発物は更に多くの場合人毒性で且つ/又は環境毒性であり、それ故更に好ましくは発見した特定爆発物の検出を含めて最低量でも土壌、水試料、エアロゾル中で検出出来ることが望ましい。後者は例えば放棄軍施設の転用対策に特に重要である。最後に犯罪科学目的で爆発物痕跡の検出及び爆発物タイプの同定がしばしば必要となる。
【０００９】
実際には異なる古典的（湿式）化学分析法が既存技術として知られている。その利用は相当の努力が必要で実験室を必要とし（現場測定は通常不可能）更には迅速な結果が得られない。更に達成可能な検出限界は不満足である。試料はこれら試験システムでの高検出限界以下に入るためにその濃度を高価な方法で前もって濃縮せねばならない。このような試料の濃度濃縮は更に時間がかかり且つ高コストである。更に試験システムは試料に含まれる物質で交差感応性を示す事が既に知られている。
【００１０】
蛍光性検出化合物、即ち抗体使用の免疫学的検定法に基づきＴＮＴを検出する光ファイバーバイオセンサーはエッチ・クレッグ（Craig, H.）等の文献、“地下水中ＴＮＴ及びＲＤＸの現場分析法の現地実証”（認ield Demonstration of On-site Analytical Methods for TNT and RDX in Ground Water煤j、環境に関するＨＳＲＣ／ＷＥＲＣ共同会議議事録（Proceedings of the HSRC/WERC Joint Conference on the Environment）、１９９６年、５月で知られている。そこで爆発物の定量的検出に用いた方法は最大限でも不十分であり抗体と他物質との交差反応性は更に問題となる。
【００１１】
更に爆発物検出にガス又は液体クロマートグラフ法が実際には使用することが知られている。このような測定機器は現場では使用できない。
【００１２】
異なる技術分野ではトロンビン検出に固定化蛍光標識化アプタマーを用いるバイオセンサーが記載されている。（アールエイ．ポチライロ等（Potyrailo, RA. et al）、“精選核酸リガンド（アプタマー）のバイオセンサーへの応用”(Adapting Selected Nucleic Acid Ligands (Aptamers) to Biosensors)、分析化学（Analytical Chemistry）、７０巻、３４１９−３４２５頁、１９９８年）。他のトロンビン検出用バイオセンサーはエム．リー等（Lee, M. et al.）による“受容体としてのアプタマー使用の光ファイバーミクロアレイバイオセンサー”（A Fiber-Optic Microarray Biosensor Using Aptamers as Receptors煤A分析生化学（Analytical Biochemistry）、２８２巻、１４２−１４６頁、２０００年に記述されている。この文献ではトロンビン検出にガラスマイクロボールに固定したアプタマーの使用が記載されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の技術目的は爆発物検出方法を提供し、この方法により爆発物が改良した感度及び特異性で検出でき、現場での爆発物測定を可能にし、そのための分析物質を特定する事である。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本技術目的達成のため本発明は合成爆発物検出に核酸の使用を教示し、この核酸は爆発物の分子構造の一部又は全分子構造と特異的に結合し、且つ分子構造の一部又は全分子構造と核酸間の結合事象を検出する。
【００１５】
本発明で意味する核酸はヌクレオチッド配列としてリボ核酸、ＤＮＡ又はペプチド核酸を含み、誘導化非天然ヌクレオチッドを含んでも良い。このヌクレオチッド配列に加えて、この核酸は例えばヌクレオチッドを含有しないヌクレオチッド配列末端で結合した分子も又含む。核酸は特にアプタマーであっても良い。アプタマーは抗体／抗原親和性（“鍵／錠”）と類似し、或いは誘導適合性結合モデルから分子レベルでの一定標的構造への結合親和性を含む核酸の一つである。オリゴヌクレオチッドは又スピゲルマーでも良い。スピゲルマーはＬ−リボース又はＬ−２‘−デゾキシリボース単位からなる高親和性鏡像核酸である。
【００１６】
古典的分析法に比べ本発明により爆発物検出に関し非常に低い検出限界が得られ、爆発物検出用試験システムの感度は増加する。この高検出感度のため測定前の爆発物濃度増加のための濃縮は不必要でありその必要性はない。抗体技術による利点は（より高感度で且つ現場利便性に加えて）アプタマーが完全に生体外で同定でき（例えば理論的三次元構造計算により）且つ生産可能であり、その結果免疫目的での実験動物を必要としない。それにもかかわらず少なくとも抗体技術の特異性と同等の特異性が得られ、古典的分析法より遙かに優れている。
【００１７】
本発明は更に本発明の方法を用いて実行する実施例に記載の手順を教示する。
【００１８】
本発明は核酸が標的分子に対し選択性或いは親和性を示す事を見いだした事に基づく。発見したヌクレオチッド配列は特に小さな標的分子の場合いわば一部分子構造の周りに、更には全分子構造の周りに折り畳まれるのに対し、他のヌクレオチッド配列はこの性質を有さないかあってもわずかでスクリーニングにより排除される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
爆発物の部分分子構造は窒素原子と直接結合した利用可能な酸素を有し、“亜硝酸エステル、硝酸エステル、ニトロ化合物及びニトロソ化合物”からなる一群から選ばれる。この爆発物は“ニトロベンゼン誘導体、ＴＮＴ、２，４−ＤＮＴ、２，６−ＤＮＴ，２−ＮＴ、ピクリン酸、ヘキソーゲン、オクトーゲン、ヘクシール、テトリル、エチレングリコール二硝酸エステル、ジチレングリコール二硝酸エステル、ニトログリセリン、ニトロペンタ及びこれら化合物の誘導体“からなる一群から選ばれる。
【００２０】
核酸は“図８又は図９の配列或いはこれら断片が少なくともこの配列の６個、１０個或いは１５個の連続ヌクレオチッドからなる限りいかなるこれら配列の断片”からなる一群から選ばれる。好ましいものは共通配列含有のしるし付き（図８で下線を引いた）核酸である。核酸は固体担体表面に直接固定するか代わりにスペーサー化合物を通して間接的に固体担体表面に固定出来る。スペーサー化合物は例えば固体担体表面と核酸或いはアプタマーとを連結する分子である。スペーサー化合物はリンカー核酸、例えば短鎖合成二重鎖ＤＮＡでも良い。しかしその他のいかなる細長い有機分子、典型的にはオリゴマー又はポリマーも又適する。更にビオチン／ストレプトアビジンのような通常の親和対による結合も又可能で、親和対分子は核酸と結合し補完分子を固定する。固体担体表面は光ファイバーとして備えることも出来る。幾つかの異なる核酸種をこの表面やファイバー上に固定できると考えられる。この場合には各核酸種と特異的に結合した異なるタイプの各爆発物が同時に検出できる。
【００２１】
結合事象は（直接或いは間接的に）核酸との結合を爆発物分子で標識化し且つ置換した検出分子の信号を測定する事より検出できる。特に検出分子の蛍光標識化が使用できる。蛍光標識化は蛍光色素による標識化である。蛍光色素は例えばフルオレセイン、アクリジンオレンジ或いはＣｙ５、Ｃｙ３等のようなその他の通常の蛍光色素である。信号は結合検出分子の信号強度低下又は放出（置換）検出分子の信号強度増加により発生する。スタッキングのような協調効果の場合、例えば蛍光共鳴エネルギー移動法のように結合検出分子の信号強度増加が起こる。異なる核酸種の同時使用においては異なる核酸種の信号を区別できるように各核酸種は異なる標識化検出分子を備える事が推奨される。
【００２２】
本発明は更に爆発物検出用装置を教示し、その装置は爆発物の部分分子構造に特異な核酸を備えている。核酸は直接或いは代わりに好ましくは光ファイバーの固体担体表面にスペーサー化合物により固定できる。好ましくはこの装置は部分分子構造と核酸間の結合事象の検出手段、例えば蛍光検出器からなる。この装置は検出分子の蛍光励起用光源を備え、光ファイバーを蛍光検出器に接続する。更に試料の核酸への供給手段を組み込んでも良い。セキュリティー分野での爆発物検出において、例えば大気試料を監視すべき目的環境から採取し分析できる。検出前に大気試料をまず液相に取り込み、上記のように検出される。しかし気相での検出も又可能で、例えば本発明により使用する核酸或いは／又は検出分子をエアロゾルとして気体試料と接触しても良い。核酸は蛍光標識化検出分子と共に取り込んでも良く、核酸と検出分子間結合力は核酸と部分分子構造間結合力より小さく無ければならない。光ファイバーの一部は気体又は液体試料が供給できるように試料気体又は液体空間内に配置する。照射光の波長はマーカーの透過光波長より短波長領域であることが好ましい。これら波長は蛍光領域の波長でも良い。光は光ファイバーを通して、外膜表面を通して、又一正面或いは両面を通して導入する。同じ事が透過光（蛍光信号）の出射にも当てはまる。光ファイバーは回転出来るように支えても良い。一般に透過光は直接検出せず、間接的に分子の発光に続いて透過光で励起して検出すると考えられる。このようにして光増幅が又達成出来る。
【００２３】
マーカーの置換による検出は他の方法、例えば電気化学的センサー法で可能であると考えられる。更に非結合マーカー濃度は被分析体量の直接に比例し例えば電気酵素的増幅システムで定量出来る。これにより試験システム感度の増大が達成できる。
【００２４】
光ファイバーに基づく携帯測定機器は可搬性電源、即ち電池で運転できる。測定信号の記録及び評価のために測定機器は電子部品、例えばコンピューターを備えることができ、気体又は液体試料運搬用の搬送装置、例えばホースポンプを含む事ができる。
【００２５】
以下に実行実施例だけに示した図を参照してより詳細に説明する。
【００２６】
図１に核酸１が爆発物２の分子構造の一部３に特異的に結合した合成爆発物２検出用核酸１を示す。爆発物２はＴＮＴである。適当な核酸１は図８と図９に示す。
【００２７】
図２から図５に爆発物の検出機構を示す。核酸１はスペーサー化合物６により固体担体表面７、例えば光ファイバー表面８に固定する。図２は核酸１の蛍光標識化４検出分子５の取り込みを示し、図３は蛍光標識化４検出分子５の信号測定による結合事象の検出を示す。図４に核酸と結合した検出分子５の爆発物分子２による置換を示す。図５に結合した検出分子５の信号強度低下による信号発生を示す。
【００２８】
図６に図１と図５を組み合わして爆発物２の部分分子構造３に特異的な核酸１による爆発物２の検出装置を示す事が出来る。核酸は固体担体表面７に固定する。核酸１はスペーサー化合物６により光ファイバー８に固定し蛍光標識化４検出分子５を取り込む。検出分子５の蛍光励起用光源１１を備え、光ファイバー８を蛍光検出器９と接続し光ファイバー８の一部を気体又は液体試料１３が供給出来るように試料気体又は液体空間１２に配置する。光ファイバーに基づいた携帯型測定機器は移動型電源１４、即ち車用電池で運転できる。測定値の記録及び評価には測定機器に電子部品、例えばコンピューター１５を備えることができ、気体又は液体試料運搬用に搬送装置１６、例えばホースポンプを含む事が出来る。試料収集には収集容器１７を備えることが出来る。
【００２９】
図７に結合強度の比較試験を示す。ＴＮＴ／抗体と比較した本発明によるＴＮＴ／核酸結合検査を示す。アプタマー反応の解離定数は約ｋＤ＝１０−８であるのに対し抗体反応の解離定数はｋＤ＝１０−５にしかすぎない。
【００３０】
上記方法のいわば逆も可能で、爆発性分子を固体相に固定し（即ち例えば発光ダイオードにより励起した蛍光色素の透過光検出器に接続したフローセル中に配置した光誘導ファイバーで）且つ標識化した核酸を用いて信号を発生する。この逆転により実際の測定だけでなく（もし爆発性分子が固相又は液相に存在する場合、固相に結合した核酸量はその平衡により減少し）検量線も確立でき又核酸の本発明での妥当性を試験することも出来る。
【００３１】
図８aから図８ｈ及び図９に本発明に適する核酸或いはアプタマー配列を示す。しるし付き部分（下線付きの部分配列）或いは共通部分（それぞれ個別の或いは任意数のヌクレオチッドで連結）はそれぞれ独自の重要性がある。図９にアプタマー−共通配列の変形を示す。ヌクレオチッドに関して置換の可能性を列に記載する。上記配列は又配列プロトコールで表示する。
【００３２】
原理的には本発明による配列或いは部分配列は個別の分子として或いは大きな分子内の一個別として利用出来る。しかしこれらは個別分子内で互いに任意に組み合わす事も出来る。（核酸）分子において本発明の異なる配列を用いて、異なる爆発物或いは特定の爆発物がより高い特異性を持って検出出来る。最初の場合統合配列は異なる爆発性分子の分子構造の一部又は全構造に特異的である。後者の場合統合配列は単一爆発性分子の異なる部分分子構造に特異的（“二重特異的”或いは“多重特異的”）である。しかし本発明の同一配列又は部分配列を統合する事ができ、その結果単一核酸分子が幾つかの（同一）爆発性分子と結合できる。いずれの場合も適当なスペーサー配列を本発明による配列又は部分配列間に挿入する事が推奨される。このようなスペーサー配列は特に二重特異的又は多重特異的核酸の場合例えば細胞核モデリング法により計算でき、更にここで種々な配列に関して必要な三次元結合情報は例えば三次元相関ＮＭＲ（即ち１Ｈ／１Ｈ或いは１Ｈ／１４Ｃ）により得られる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】典型的爆発物のスペーサー化合物により固定したアプタマーへの吸着。
【図２】蛍光標識化検出分子を取り入れ、光ファイバーにスペーサー化合物により固定化したアプタマー。−光照射無しの暗所で爆発物含有試料との接触以前。
【図３】蛍光標識化検出分子を取り入れ、光ファイバーにスペーサー化合物により固定化したアプタマー。−光照射下で爆発物含有試料との接触以前。光ファイバーが蛍光色素による透過光を光ファイバー中に導く。
【図４】蛍光標識化検出分子を取り入れ、光ファイバーにスペーサー化合物により固定化したアプタマー。−光照射無しの暗所で爆発物含有試料との接触以後。爆発物は幾つかの検出分子を置換しアプタマーと結合する。
【図５】蛍光標識化検出分子を取り入れ、光ファイバーにスペーサー化合物により固定化したアプタマー。−光照射下で爆発物含有試料との接触以後後。爆発物は幾つかの検出分子を置換しアプタマーと結合する。光ファイバーが蛍光色素による透過光を光ファイバー中に導く。発光はより少量の蛍光色素が励起するので図２より弱い。
【図６】本発明による装置の図式表示。
【図７】アプタマーとの結合強度と免疫法での抗体との比較試験。
【図８ａ】本発明によるアプタマー配列。
【図８ｂ】本発明によるアプタマー配列。
【図８ｃ】本発明によるアプタマー配列。
【図８ｄ】本発明によるアプタマー配列。
【図８ｅ】本発明によるアプタマー配列。
【図８ｆ】本発明によるアプタマー配列。
【図８ｇ】本発明によるアプタマー配列。
【図８ｈ】本発明によるアプタマー配列。
【図９】本発明による共通配列。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｇ】
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【図８ｈ】
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【図９】
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【国際調査報告】
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2005538366.tif 000020
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