(57)【要約】  電位依存性イオンチャンネルの活性化因子および阻害剤を同定する様々な方法が提供される。これらの方法では、細胞の電場刺激が、電位依存性イオンチャンネルの開／閉状態の移行を操作するために用いられる。これら方法は、これら開／閉状態の移行の、より簡便かつより精密な実験操作を可能にし、そして、チャンネルを通過するイオン流動の結果を検出する効率的な方法と組み合わせられたとき、高処理能スクリーニングのために特に好適である様々な方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）電位依存性イオンチャンネルを発現する細胞の膜の少なくとも一部分の膜横断電位を、電位依存性イオンチャンネル通過イオン流をモニターしながら、細胞外の電極を介して細胞に電圧を加えることによって変化させること；
（ｂ）工程（ａ）における細胞を物質にさらし、電位依存性イオンチャンネル通過イオン流をモニターすること；
（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）における電位依存性イオンチャンネル通過イオン流を比較すること
を含み、
工程（ａ）および工程（ｂ）における電位依存性イオンチャンネル通過イオン流の違いにより、該物質が電位依存性イオンチャンネルの調節因子であることが示される、電位依存性イオンチャンネルの活性の調節因子を同定するための方法。
【請求項２】
（ａ）電位依存性イオンチャンネルを発現する多数の細胞を対照部分と試験部分とに分けること；
（ｂ）電位依存性イオンチャンネル通過イオン流をモニターしながら、細胞外の電極を介して細胞に電圧を加えることによって、対照部分の細胞の膜横断電位を変化させること；
（ｃ）電位依存性イオンチャンネル通過イオン流をモニターしながら、物質の存在下、細胞外の電極を介して細胞に電圧を加えることによって、試験部分の細胞の膜横断電位を変化させること；
（ｄ）工程（ｂ）および工程（ｃ）における電位依存性イオンチャンネル通過イオン流を比較すること
を含み、
工程（ｂ）および工程（ｃ）における電位依存性イオンチャンネル通過イオン流の違いにより、該物質が電位依存性イオンチャンネルの調節因子であることが示される、電位依存性イオンチャンネルの活性の調節因子を同定するための方法。
【請求項３】
（ａ）多数の電位依存性イオンチャンネルをその形質膜に発現する生存している真核生物細胞が上に置かれた基体を提供すること；
（ｂ）事前に選択された電圧が正極および負極を介して加えられたとき、細胞の膜横断電気的電位が変化して、その結果、電位依存性イオンチャンネルの少なくとも一部が閉じるように基体上または基体近くのいずれかに配置された正極および負極を提供すること；
（ｃ）事前に選択された電圧を、正極および負極を介して加えること；
（ｄ）工程（ｃ）における細胞の電位依存性イオンチャンネル通過イオン流に対する対照値を測定すること；
（ｅ）物質が電位依存性イオンチャンネルの活性化因子である場合、閉じている電位依存性イオンチャンネルの一部の検出可能な数が開口し、検出可能な数の電位依存性イオンチャンネルを通過するイオン流を可能にするような十分な期間および条件下で工程（ｃ）の細胞を物質にさらすこと；
（ｆ）工程（ｅ）の細胞の電位依存性イオンチャンネル通過イオン流に対する試験値を測定すること；
（ｇ）対照値を試験値と比較すること
を含み、
対照値が試験値よりも小さい場合、該物質が電位依存性イオンチャンネルの活性化因子である、電位依存性イオンチャンネルの活性化因子を同定する方法。
【請求項４】
基体がガラスまたはマルチウエル組織培養プレートであり、ケイ素または電界効果トランジスタではない、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
基体が、細胞が存在するウエルを含有する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ウエルの数が、１２、２４、９６、３８４、１，５３６または３，４５６である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ウエルが実質上のウエルである、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも５０，０００個の物質が２４時間の期間で試験される、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
電位依存性イオンチャンネルが、電位依存性ナトリウムチャンネル、電位依存性カリウムチャンネルまたは電位依存性カルシウムチャンネルである、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
電位依存性イオンチャンネルが電位依存性ナトリウムチャンネルである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
電位依存性イオンチャンネルが電位依存性カリウムチャンネルである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
電位依存性イオンチャンネルが電位依存性カルシウムチャンネルである、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
細胞が、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＴＫ−）（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１．３）、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１．２）、ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５７３）、Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ８６）、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１７１）、ＣＰＡＥ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２０９）、Ｓａｏｓ−２（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−８５）、ＡＲＰＥ−１９ヒト網膜色素上皮（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２３０２）、ＧＨ３細胞および初代心筋細胞からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
細胞がＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５７３）またはＧＨ３細胞または初代心筋細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
細胞が蛍光指示薬化合物を含有する、請求項３に記載の方法。
【請求項１６】
蛍光指示薬化合物が、ｆｌｕｏ−３、ｆｕｒａ−２、ｆｌｕｏ−４、ｆｌｕｏ−５、カルシウムグリーン−１、オレゴングリーン、４８８ＢＡＰＴＡ、ＳＮＡＲＦ−１およびｉｎｄｏ−１からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
正極および負極が交互にかみ合っている、請求項３に記載の方法。
【請求項１８】
基体が、１つの正極および１つの負極を含有する多数のウエルを有するマルチウエル組織培養プレートである、請求項３に記載の方法。
【請求項１９】
基体が、正極または負極の一方がウエルの底部を形成し、かつ正極または負極のもう一方が上方からウエルに進入する多数のウエルを有するマルチウエル組織培養プレートである、請求項３に記載の方法。
【請求項２０】
基体が、多数の実質上のウエルを有するマルチウエル組織培養プレートである、請求項３に記載の方法。
【請求項２１】
各ウエルが１０３個から１０７個の細胞を含有し、細胞が蛍光指示薬化合物または蛍光性の電圧感知色素を含有する、請求項５に記載の方法。
【請求項２２】
細胞は、電位依存性イオンチャンネルを生来的には発現せず、しかし、電位依存性イオンチャンネルをコードする発現ベクターでトランスフェクションされている、請求項３に記載の方法。
【請求項２３】
（ａ）多数の電位依存性イオンチャンネルをその形質膜に発現する生存している真核生物細胞が存在する基体を提供すること；
（ｂ）事前に選択された電圧が正極および負極を介して加えられたとき、細胞の膜横断電気的電位が変化して、その結果、電位依存性イオンチャンネルの少なくとも一部が開口するように基体上または基体近くのいずれかに配置された正極および負極を提供すること；
（ｃ）事前に選択された電圧を、正極および負極を介して加えること；
（ｄ）工程（ｃ）における細胞の電位依存性イオンチャンネル通過イオン流に対する対照値を測定すること；
（ｅ）該物質が電位依存性イオンチャンネルの阻害剤である場合、開口している電位依存性イオンチャンネルの一部の検出可能な数が閉じ、検出可能な数の電位依存性イオンチャンネルを通過するイオン流を制限するような十分な期間および条件下で工程（ｃ）の細胞を物質にさらすこと；
（ｆ）工程（ｅ）の細胞の電位依存性イオンチャンネル通過イオン流に対する試験値を測定すること；
（ｇ）対照値を試験値と比較すること
を含み、
対照値が試験値よりも大きい場合、該物質が電位依存性イオンチャンネルの阻害剤である、電位依存性イオンチャンネルの阻害剤を同定する方法。
【請求項２４】
基体がガラスまたはマルチウエル組織培養プレートであり、ケイ素または電界効果トランジスタではない、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
基体が、細胞が存在するウエルを含有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ウエルの数が、１２、２４、９６、３８４、１，５３６または３，４５６である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ウエルが実質上のウエルである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも５０，０００個の物質が２４時間の期間で試験される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
電位依存性イオンチャンネルが、電位依存性ナトリウムチャンネル、電位依存性カリウムチャンネルまたは電位依存性カルシウムチャンネルである、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
電位依存性イオンチャンネルが電位依存性ナトリウムチャンネルである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
電位依存性イオンチャンネルが電位依存性カリウムチャンネルである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
電位依存性イオンチャンネルが電位依存性カルシウムチャンネルである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
細胞が、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＴＫ−）（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１．３）、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１．２）、ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５７３）、Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ８６）、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１７１）、ＣＰＡＥ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２０９）、Ｓａｏｓ−２（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−８５）、ＡＲＰＥ−１９ヒト網膜色素上皮（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２３０２）、ＧＨ３細胞および初代心筋細胞からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３４】
細胞がＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５７３）またはＧＨ３細胞または初代心筋細胞である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
細胞が蛍光指示薬化合物を含有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項３６】
蛍光指示薬化合物が、ｆｌｕｏ−３、ｆｕｒａ−２、ｆｌｕｏ−４、ｆｌｕｏ−５、カルシウムグリーン−１、オレゴングリーン、４８８ＢＡＰＴＡ、ＳＮＡＲＦ−１およびｉｎｄｏ−１からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
正極および負極が交互にかみ合っている、請求項２３に記載の方法。
【請求項３８】
基体が、１つの正極および１つの負極を含有する多数のウエルを有するマルチウエル組織培養プレートである、請求項２３に記載の方法。
【請求項３９】
基体が、正極または負極の一方がウエルの底部を形成し、かつ正極または負極のもう一方が上方からウエルに進入する多数のウエルを有するマルチウエル組織培養プレートである、請求項２３に記載の方法。
【請求項４０】
基体が、多数の実質上のウエルを有するマルチウエル組織培養プレートである、請求項２３に記載の方法。
【請求項４１】
各ウエルが１０３個から１０７個の細胞を含有し、細胞が蛍光指示薬化合物または蛍光性の電圧感知色素を含有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項４２】
細胞は、電位依存性イオンチャンネルを生来的には発現せず、しかし、電位依存性イオンチャンネルをコードする発現ベクターでトランスフェクションされている、請求項２３に記載の方法。
【請求項４３】
（ａ）多数の電位依存性イオンチャンネルをその形質膜に発現する生存している真核生物細胞が存在する基体を提供すること；
（ｂ）事前に選択された電圧が正極および負極を介して加えられたとき、細胞の膜横断電気的電位が変化して、その結果、電位依存性イオンチャンネルの少なくとも一部が閉じるように基体上または基体近くのいずれかに配置された正極および負極を提供すること；
（ｃ）事前に選択された電圧を、細胞の対照サンプルに正極および負極を介して加えること；
（ｄ）工程（ｃ）における細胞の対照サンプルの電位依存性イオンチャンネル通過イオン流に対する対照値を測定すること；
（ｅ）該物質が電位依存性イオンチャンネルの活性化因子である場合、試験サンプルにおいて閉じている電位依存性イオンチャンネルの一部の検出可能な数が開口し、検出可能な数の電位依存性イオンチャンネルを通過するイオン流を可能にするような十分な期間および条件下で細胞の試験サンプルを物質にさらしながら、事前に選択された電圧を、細胞の試験サンプルに正極および負極を介して加えること；
（ｆ）工程（ｅ）の細胞の試験サンプルの電位依存性イオンチャンネル通過イオン流に対する試験値を測定すること；
（ｇ）対照値を試験値と比較すること
を含み、
対照値が試験値よりも小さい場合、該物質が電位依存性イオンチャンネルの活性化因子である、電位依存性イオンチャンネルの活性化因子を同定する方法。
【請求項４４】
（ａ）多数の電位依存性イオンチャンネルをその形質膜に発現する生存している真核生物細胞が存在する基体を提供すること；
（ｂ）事前に選択された電圧が正極および負極を介して加えられたとき、細胞の膜横断電気的電位が変化して、その結果、電位依存性イオンチャンネルの少なくとも一部が開口するように基体上または基体近くのいずれかに配置された正極および負極を提供すること；
（ｃ）事前に選択された電圧を、細胞の対照サンプルに正極および負極を介して加えること；
（ｄ）工程（ｃ）における細胞の対照サンプルの電位依存性イオンチャンネル通過イオン流に対する対照値を測定すること；
（ｅ）該物質が電位依存性イオンチャンネルの阻害剤である場合、試験サンプルにおいて開口している電位依存性イオンチャンネルの一部の検出可能な数が閉じ、検出可能な数の電位依存性イオンチャンネルを通過するイオン流を制限するような十分な期間および条件下で細胞の試験サンプルを物質にさらしながら、事前に選択された電圧を、細胞の試験サンプルに正極および負極を介して加えること；
（ｆ）工程（ｅ）の細胞の試験サンプルの電位依存性イオンチャンネル通過イオン流に対する試験値を測定すること；
（ｇ）対照値を試験値と比較すること
を含み、
対照値が試験値よりも大きい場合、該物質が電位依存性イオンチャンネルの阻害剤である、電位依存性イオンチャンネルの阻害剤を同定する方法。
【請求項４５】
目的とする電位依存性イオンチャンネルをその形質膜に有する少なくとも１０３個の生存している真核生物細胞が存在する上部表面を有する基体；
事前に選択された電圧が正極および負極を介して加えられたとき、細胞の膜横断電位が制御されるように基体上または基体近くのいずれかに配置された多数の正極および多数の負極；
電位依存性イオンチャンネルの活性化因子または阻害剤であることが疑われる少なくとも１つの物質
を含み、
細胞が蛍光指示薬化合物を含有する、電位依存性イオンチャンネルの活性化因子または阻害剤を同定する際に使用される装置。
【請求項４６】
目的とする電位依存性イオンチャンネルをその形質膜に有する、ウエルあたり少なくとも１０３個の生存している真核生物細胞が存在する多数のウエル；
事前に選択された電圧が正極および負極を介して加えられたとき、細胞の膜横断電位が変化するように配置された多数の正極および多数の負極；
多数のウエルの少なくとも１つにおける、電位依存性イオンチャンネルの活性化因子または阻害剤であることが疑われる少なくとも１つの物質
を有し、
細胞が蛍光指示薬化合物または電圧感受性膜色素を含有する、マルチウエル組織培養プレート。
【請求項４７】
プレートの多数のウエルが、事前に選択された電圧が電極間に加えられたとき、ウエル内の細胞の膜横断電位が変化するように配置された１対の電極を含有する、マルチウエル組織培養プレート。
【請求項４８】
１対の電極の一方がウエルの底部に含有され、１対の電極のもう一方がウエルの側面に含有される、請求項４７に記載のマルチウエル組織培養プレート。
【請求項４９】
１対の電極の両方がウエルの底部に含有される、請求項４７に記載のマルチウエル組織培養プレート。
【請求項５０】
１対の電極の一方が、ウエルの底部を形成する導電性材料の層であり、１対の電極のもう一方が上方からウエルに進入する、請求項４７に記載のマルチウエル組織培養プレート。
【請求項５１】
１対の電極の両方が絶縁体に埋め込まれ、かつ上方からウエルに進入する、請求項４７に記載のマルチウエル組織培養プレート。
【請求項５２】
上方からウエルに進入する電極が、絶縁体によって囲まれている中心の導電性材料部分を有する、請求項５０に記載のマルチウエル組織培養プレート。
【請求項５３】
電極対により、正極および負極の交互パターンがウエルにおいて形成される、請求項４７に記載のマルチウエル組織培養プレート。
【請求項５４】
ウエルの底部を形成する導電性材料の層が、ガラス基体を覆うインジウムスズ酸化物の層である、請求項５０に記載のマルチウエル組織培養プレート。
【請求項５５】
導電性材料の層およびガラス基体が透明である、請求項５４に記載のマルチウエル組織培養プレート。
【請求項５６】
プレートの多数のウエルが、交互にかみ合う電極を含有する、請求項４７に記載のマルチウエル組織培養プレート。
【請求項５７】
事前に選択された電圧が電極間に加えられたとき、ウエル内の細胞の膜横断電位が変化するように、第１の電極および第２の電極が配置されているマルチウエル組織培養プレートであって、
ウエルの底部が、細胞を増殖させることができるフィルターメンブランであり、
ウエルが、流体を含有するために好適なトラフに配置され、
トラフには、第１の電極が含有され、
第２の電極が上方からウエルに進入する、
マルチウエル組織培養プレート。
【請求項５８】
蛍光画像化装置によりマルチウエル組織培養プレートのウエルからの蛍光読み取りを得ることができるように、マルチウエル組織培養プレートおよび蛍光画像化装置が互いに配置されている、請求項４６から５７に記載されるマルチウエル組織培養プレートと、蛍光画像化装置との組合せ。
【請求項５９】
上部基体および底部基体のそれぞれが、
多数の実質上のウエル、および
実質上のウエルの底部を形成する導電性材料の層
を含有し、
導電性材料の層が電極として機能し、その結果、事前に選択された電圧が電極間に加えられたとき、実質上のウエルにおける細胞の膜横断電位が変化するように、上部基体および底部基体における導電性材料の層がパルス発生器に接続されている、上部基体および底部基体の組合せ。
【請求項６０】
多数の全体に平行する正極および負極と、電極に対して全体に直角に配置された多数のスペーサーとによって形成された正方形または矩形のウエルを有し、
ウエルの１つの壁が正極により形成され、ウエルの反対側の壁が負極により形成され、
スペーサーは、電極により形成される壁に対して直角であるウエルの壁を形成し、
事前に選択された電圧が電極間に加えられたとき、ウエル内の細胞の膜横断電位が変化するように電極が配置されている、基体。
【請求項６１】
ウエルの底部が細胞を増殖させることができる光学的に透明なフィルターメンブランから構成されている、マルチウエル組織培養プレート；
流体を含有するために好適であり、かつ前記マルチウエル組織培養プレートをその中に入れることができるように設計されたトラフ；
前記トラフに配置された少なくとも１つの電極；および
前記マルチウエル組織培養プレートにおけるウエルの数に対応する量で多数の第２の電極を含む電極ヘッド（ただし、前記電極ヘッドおよび前記多数の前記第２の電極は、前記電極ヘッドを前記マルチウエル組織培養プレートに配置したとき、前記多数の第２の電極がマルチウエル組織培養プレートのウエルに配置されるように設計されている）
を含み、
事前に選択された電圧が電極間に加えられたとき、ウエル内の細胞の膜横断電位が変化するように、前記少なくとも１つの第１の電極および前記多数の前記第２の電極が配置されている、細胞に電場刺激を加えるためのシステム。
【請求項６２】
前記少なくとも１つの電極または前記多数の第２の電極またはそれらの両方と電気的に連絡している波形発生器をさらに含み、それにより、電気パルスシグナルが前記波形発生器によって発生させられる、請求項６１に記載のシステム。
【請求項６３】
前記波形発生器と電気的に接続されたコンピューターをさらに含み、前記コンピューターは、前記波形発生器によって作製された前記パルスシグナルを調整するためのソフトウエアを含む、請求項６２に記載のシステム。
【請求項６４】
前記波形発生器は、前記パルスシグナルによって刺激されるウエルのアドレスを表す二進値を作製する、請求項６２に記載のシステム。
【請求項６５】
前記多数の第２の電極の上流に電気的中継器をさらに含む、請求項６２に記載のシステム。
【請求項６６】
前記波形発生器および前記電気的中継器と電気的に連絡しているマイクロコントローラーをさらに含み、マイクロコントローラーは、前記波形発生器からのトリガーパルスおよび特定の二進値を受け取ったとき、適切な中継器のスイッチを入れ、それにより、前記特定の二進値に対応する特定の電極にパルスを導くように配置されている、請求項６５に記載のシステム。
【請求項６７】
前記トラフが１つの第１の電極を含む、請求項６１に記載のシステム。
【請求項６８】
ウエルの底部が、細胞を増殖させることができる光学的に透明なフィルターメンブランから構成されているマルチウエル組織培養プレート；
流体を含有するために好適な多数の個々のトラフを含み、前記多数のトラフの数は、前記マルチウエル組織培養プレートに含まれるウエルの量に対応し、前記多数のトラフは、前記マルチウエル組織培養プレートの各ウエルを個々に含有するように配置され、ならびに前記多数のトラフは、前記マルチウエル組織培養プレートに規定され、および各ウエルに対して側方に配置されたポートによってアクセスすることができる、トレー；
前記マルチウエル組織培養プレートの上方に載せられるように設計され、前記マルチウエル組織培養プレートのウエルが前記導電性電極プレートを通り抜けることを可能にするように設計された多数の開口部を含み、前記導電性電極プレートと一体化されているかまたは前記導電性電極プレートに取り付けられた多数の導電性ピンを含み、前記多数の導電性ピンの個々のピンは、前記マルチウエル組織培養プレートの上部に前記電極プレートを載せたとき、前記ポートを通り抜け、個々のトラフに配置される導電性電極プレート；および
前記マルチウエル組織培養プレートにおけるウエルの数に対応する量で多数の第２の電極を含む電極ヘッド（ただし、前記電極ヘッドおよび前記多数の前記第２の電極は、前記電極ヘッドを前記マルチウエル組織培養プレートに配置したとき、前記多数の電極がマルチウエル組織培養プレートのウエルに配置されるように設計されている）
を含み、
事前に選択された電圧が電極間に加えられたとき、ウエル内の細胞の膜横断電位が変化するように、前記少なくとも１つの第１の電極および前記多数の前記第２の電極が配置されている、細胞に電場刺激を加えるためのシステム。
【請求項６９】
誘電性材料から構成される誘電性ディスクと、前記誘電性ディスクの１つの面に配置された第１の導電性ディスクと、前記誘電性ディスクの反対側の面に配置された第２の導電性ディスクとを含む新規な電極。
【請求項７０】
少なくとも１つの内側リード線および少なくとも１つの外側リード線を含む同軸リード線をさらに含み、それにより、前記内側リード線が前記第１のディスクおよび前記誘電性ディスクを通り抜け、前記第２のディスクに電気的に接続される、請求項６９に記載の電極。
【請求項７１】
前記第１のディスクに電気的に接続された第１のリード線と、前記第２のディスクに電気的に接続された第２のリード線とをさらに含む、請求項６９に記載の電極。
【請求項７２】
事前に選択された電圧が、電場を確立するために、前記第１の導電性ディスクと前記第２の導電性ディスクとの間に加えられる、請求項６９に記載の電極。
【請求項７３】
前記電極が、処理される細胞の非常に近いところに前記電極を近づけることができるようなレベルに抵抗発熱を減らしながら、実質的に均一な電場な提供することができる、請求項７２に記載の電極。
【請求項７４】
前記電極と前記細胞との間が１０ｍｍの距離から、前記電極を前記細胞と接触させることなく前記細胞に対してより近い距離まで、前記電極を前記細胞に近づけることができる、請求項７３に記載の電極。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電場を加えることによって真核生物細胞を刺激するための方法および関連する装置に関する。電場は、細胞の環境において電気的電位差を生じさせ、それにより、細胞の膜電位の変化をもたらすある種の電極配置によってもたらされる。膜電位の変化は、電位依存性イオンチャンネルの開閉を含む、細胞内の様々な生理学的プロセスに影響を及ぼす。本明細書中に記載されるような電場の適用により電位依存性イオンチャンネルの開／閉移行を変化させることができることは、電位依存性イオンチャンネルの活性を調節する能力について化合物をスクリーニングする新規な方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
真核生物細胞におけるいくつかの分子事象は、細胞の形質膜（すなわち、外膜）にかかる電気的電位勾配の存在または大きさに依存している。そのような事象のより重要なものの１つが、電位依存性イオンチャンネルを通って形質膜を横断するイオンの動きである。電位依存性イオンチャンネルは、細胞膜電位の変化に応答して開口し、イオンが膜を通過することを可能にする膜貫通孔を形成する。電位依存性イオンチャンネルは多くの生理学的役割を有している。電位依存性イオンチャンネルは、多くのタイプの細胞において、細胞膜電位を維持し、かつ活動電位の再分極を制御することに関与することが示されている（Ｂｅｎｎｅｔｔら、１９９３、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｒｕｇｓ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｙ、７：１９５〜２０２；Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９２、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１１３：５６５〜５８０；Ｂｅｎｎｅｔｔ＆Ｓｈｉｎ、「電位依存性ナトリウムチャンネルの生物物理学」、Ｃａｒｄｉａｃ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ：Ｆｒｏｍ  Ｃｅｌｌ  ｔｏ  Ｂｅｄｓｉｄｅ（第３版、Ｄ．Ｚｉｐｅｓ＆Ｊ．Ｊａｌｉｆｅ編、２０００年、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．）、６７頁〜８６頁；Ｂｅｎｎｅｔｔ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ、「心臓イオンチャンネルの分子生理学」、第２章、Ｂａｓｉｃ  Ｃａｒｄｉａｃ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（第１版、Ａ．Ｚａｓａ＆Ｍ．Ｒｏｓｅｎ編、２０００年、Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、２９頁〜５７頁）。さらに、不完全なチャンネルタンパク質をもたらす、ナトリウムまたはカルシウムまたはカリウムの電位依存性イオンチャンネル遺伝子における変異が、少数の例を挙げれば、先天性の長ＱＴ症候群、運動失調症、片頭痛、筋肉麻痺、難聴、発作および心臓伝導疾患を含む様々な障害に関係している（Ｂｅｎｎｅｔｔら、１９９５、Ｎａｔｕｒｅ、３７６：６８３〜６８５；Ｒｏｄｅｎら、１９９５、Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．、６：１０２３〜１０３１；Ｋｏｒｓら、１９９９、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．、１２：２４９〜２５４；Ｌｅｈｍａｎｎら、１９９９、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．、７９：１３１７〜１３７２；Ｈｏｌｂａｕｅｒ＆Ｈｅｕｆｅｌｄｅｒ、１９９７、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、１３６：５８８〜５８９；Ｎａｃｃａｒｅｌｌｉ＆Ａｎｔｚｅｌｅｖｉｔｃｈ、２０００、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．、１１０：５７３〜５８１）。
【０００３】
数タイプの電位依存性イオンチャンネルが存在する。電位依存性カリウムチャンネルは、ニューロン、筋肉細胞および分泌細胞において、静止膜電位を規定し、活動電位の振動数および持続時間を調節する。膜電位が脱分極した後、電位依存性カリウムチャンネルは開口し、これによりカリウムの流出を可能にし、従って、膜の再分極を可能にする。この挙動により、電位依存性カリウムチャンネルは、様々な疾患に関連して薬物発見に対する重要な標的になっている。正常に機能しない電位依存性カリウムチャンネルが多数の疾患および障害に関係している。Ｗａｎｇら（１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８２：１８９０〜１８９３）は、電位依存性カリウムチャンネルのＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３が、「Ｍチャンネル」として知られているヘテロマーのカリウムイオンチャンネルを形成することを示している。ＭチャンネルにおけるＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３での変異は、てんかんを生じさせる原因である（Ｂｉｅｒｖｅｒｔら、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７９：４０３〜４０６；Ｓｉｎｇｈら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．、１８：２５〜２９；Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９８、３９６：６８７〜６９０）。
【０００４】
電位依存性ナトリウムチャンネルは、興奮性細胞における活動電位の生成に不可欠な膜貫通タンパク質である（Ｃａｔｔｅｒａｌｌ、１９９３、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１６：５００〜５０６）。哺乳動物では、電位依存性ナトリウムチャンネルは、αサブユニットおよびβサブユニットの巨大分子アセンブリからなり、αサブユニットが孔形成成分である。様々なαサブユニットが、関連する遺伝子の大きなファミリーによってコードされ、いくつかのαサブユニットが中枢神経系に存在し（Ｎｏｄａら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ、３２２：８２６〜８２８；Ａｕｌｄら、１９８８、Ｎｅｕｒｏｎ、１：４４９〜４６１；Ｋａｙａｎｏら、１９８８、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、２２８：１８７〜１９４）、いくつかが筋肉に存在する（Ｒｏｇａｒｔら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：８１７０〜８１７４；Ｔｒｉｍｍｅｒら、１９８９、Ｎｅｕｒｏｎ、３：３３〜４９）。
【０００５】
電位依存性カルシウムチャンネルは、開口した形態では形質膜を横断するＣａ２＋イオンの能動的な流動を可能にし、電気化学的勾配を下げる膜貫通タンパク質である。電位依存性カルシウムチャンネルにより、興奮−収縮の共役、シグナル伝達、および神経伝達物質の放出を含む様々な細胞機能が媒介される。
【０００６】
現在の薬物発見方法では、多くの場合、所望する活性を有する少数のそのような化合物を同定するために、数万または数十万の化合物の生物学的活性を評価（すなわち、スクリーニング）することを伴う。多くの高処理能スクリーニングプログラムでは、１日あたり５０，０００〜１００，０００もの多くの化合物を試験することが望ましい。残念なことではあるが、電位依存性イオンチャンネルの活性を評価する現在の方法は、高処理能スクリーニングプログラムの要求には十分に適していない。現在の方法は、多くの場合、電気生理学的技術に頼っている。標準的な電気生理学的技術では、ガラスピペットを用いて細胞膜に対する「パッチ処理」または締め付け処理を行い、その後、ガラスピペットで吸引し、膜パッチの破裂を生じさせることを伴う（Ｈａｍｉｌｌら、１９８１、Ｐｆｌｕｇｅｒｓ  Ａｒｃｈ．、３９１：８５〜１００）。これには、様々な制約および欠点がある。細胞内部への操作は細胞の応答特性を変化させることがある。細胞およびピペットを顕微操作するために必要な高精度の光学装置では、一度に多くの細胞からの同時の読み取りが不可能である。これらの難点を考えた場合、電気生理学的技術を用いて達成され得る処理能は、高処理能スクリーニングのために必要な処理能にははるかに及ばない。
【０００７】
様々な技術が、電気生理学の標準的な方法に対する代替法として開発されている。例えば、細胞に放射性トレーサー（例えば、８６Ｒｂ＋、２２Ｎａ＋、［１４Ｃ］−グアニジニウム）が負荷され、色素の流出がモニターされる放射性流束アッセイが使用されている。トレーサーが負荷された細胞は様々な化合物にさらされ、そして、トレーサーの流出の増強または減少のいずれかをもたらすそのような化合物が、細胞の膜におけるイオンチャンネルの考えられる活性化因子または阻害剤として同定される。
【０００８】
イオンチャンネルの活性の変化による細胞の膜電位の変化を測定するアッセイが開発されている。そのようなアッセイでは、多くの場合、膜電位の変化に基づいて細胞外の環境と細胞の内部との間で再分布し、および、細胞の内側または外側に存在するかに依存して異なる蛍光スペクトルを有する電圧感受性色素が用いられる。関連するアッセイ方法では、膜電位の変化を検知するために蛍光共鳴エネルギー転移が可能な１対の蛍光性色素が使用される。この技術の説明については、Ｇｏｎｚａｌｅｚ＆Ｔｓｉｅｎ、１９９７、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ、４：２６９〜２７７を参照のこと。Ｇｏｎｚａｌｅｚ＆Ｔｓｉｅｎ、１９９５、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．、６９：１２７２〜１２８０；米国特許第５，６６１，０３５もまた参照のこと。他の方法では、カルシウムチャンネルの開口時および閉鎖時におけるＣａ２＋流入の変化をモニターするために、カルシウム依存性の蛍光色素などのイオン選択的な指示薬が用いられる。
【０００９】
理想的には、電位依存性イオンチャンネルに対するスクリーニング方法では、アッセイ中の細胞の膜横断電位を制御すること、および／または研究されているイオンチャンネルを開口した状態と閉じた状態との間で循環させることが要求される。これは様々な方法で行われている。標準的な電気生理学的技術では、実験設定により、膜電位の直接的な操作が、電圧固定法（Ｈｏｄｇｋｉｎ＆Ｈｕｘｌｅｙ、１９５２、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｏｎｄ．）、１５３：４４９〜５４４）によって、例えば、印加電圧を変化させるか、または様々なイオンを細胞に注入することによって可能になる。他の方法では、細胞外のＫ＋濃度を低い値（例えば、５ｍＭ）からより高い値（例えば、７０ｍＭから８０ｍＭ）に変化させることにより、細胞内カリウムおよび細胞外カリウムの相対的な割合が変化するために、Ｋ＋に対する電気化学的電位の変化が生じる。これは、より脱分極した状態に向かう膜横断電気的電位の変化をもたらす。この脱分極は多くの電位依存性イオンチャンネル（例えば、電位依存性のカルシウムチャンネルまたはナトリウムチャンネルまたはカリウムチャンネル）を活性化することができる。選択的に、Ｎａ＋チャンネルを、ベラトリジンまたはサソリ毒などのトキシンの使用によって開口した立体配座に誘導することができる（Ｓｔｒｉｃｈａｒｔｚら、１９８７、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１０：２３７〜２６７；Ｎａｒａｈａｓｈｉ＆Ｈａｒｍａｎ、１９９２、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２０７：６２０〜６４３）。ときには効果的であるが、そのような実験操作は、チャンネルの薬理学を変化させることがあり、実施するためには熟練を要し得るし、そして研究中のシステムにおいて人為的な乱れを生じさせ得る。
【００１０】
細胞の電場刺激が、ガラス微小電極を細胞膜にシールすることによって１個の細胞に対して行われる。細胞膜のシールされたパッチの破裂は、ガラス微小電極の内部液と細胞内の流体との電気的接続をもたらし、これは、電子パルス発生器によって細胞を刺激するために使用された。細胞の電気生理学的応答が高感度の電子増幅器によって測定された。この技術の欠点は、一度に１個の細胞のみが試験されるだけであり、そして個々の細胞に微小電極をシールすることは冗長かつ時間のかかる操作であるということである。
【００１１】
ＨＥＫ２９３細胞が、電界効果トランジスタのアレイから構成されるケイ素チップの表面で増殖させられている。細胞の一部がトランジスタのゲート領域を覆って存在し、従って、その形質膜の一部がソースおよびドレインに重なっていた。そのような細胞におけるパッチピペットにより、細胞内電圧が操作されたとき、細胞の形質膜におけるＭａｘｉ−Ｋカリウムチャンネルが開口した。これは、細胞の膜とトランジスタとの間の領域における電流の流れをもたらした。この電流の流れにより、適切なデバイスによって検出することができるソース−ドレイン電流が調節された。このチップ＋細胞は、センサとしての可能性、および神経補綴デバイスに対する原型体としての可能性を有すると言われた。Ｓｔｒａｕｂら、２００１、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９：１２１〜１２４；Ｎｅｈｅｒ、２００１、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９：１１４を参照のこと。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、電位依存性イオンチャンネルの活性化因子および阻害剤を同定するための方法に関する。この場合、本発明の方法では、電位依存性イオンチャンネルの開／閉状態の移行を操作するために、細胞外の電極による細胞の電場刺激が用いられる。これは、これらの移行のより簡便かつより精密な実験操作を可能にし、そして、イオン流動または膜電位を検出する効率的な方法と組み合わせられたとき、電位依存性イオンチャンネルの活性化因子および阻害剤である物質を同定するための高処理能スクリーニングのために特に好適である様々な方法をもたらす。
【００１３】
本発明はまた、上記に記載される方法において使用される装置を提供する。特に、標準的なマルチウエル組織培養プレートの様々な改変が提供され、この場合、改変されたマルチウエル組織培養プレートは、プレートのウエルにおける細胞の膜横断電気的電位を変化させることができ、従って、細胞における電位依存性イオンチャンネルの開／閉状態の比率を変化させることができる電極を有する。
【００１４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、細胞の生物学的応答をモニターしながら細胞の電場刺激（ＥＦＳ）を行うための装置および技術を提供する。好ましくは、生物学的応答は蛍光検出によってモニターされる。細胞は、例えば、好ましくは透明な電気伝導性の電極を含有するガラス製スライドガラス、または事前に選択された電圧が電極間に加えられたとき、マルチウエル組織培養プレートのウエルにおける細胞の膜横断電位が変化するように配置された電極を含有するマルチウエル組織培養プレートなどの特別に設計された基体において増殖し、かつ／またはそのような基体に付着する。
【００１５】
全般に、本発明は、電位依存性イオンチャンネルをその形質膜に発現する生存している真核生物細胞（好ましくは、哺乳動物細胞）が存在する基体を提供することに関する。正極および負極が基体上または基体近くのいずれかに配置され、その結果、電圧が電極間に加えられたとき、電位依存性イオンチャンネルは、開口または閉鎖され、それにより、細胞の形質膜を通過する少なくとも１つのタイプのイオンの流れを調節する。イオン流のこの調節、またはイオン流の調節からもたらされる膜電位の変化は、直接的または間接的のいずれかで、好ましくは、細胞内における蛍光指示薬化合物の使用によって検出される。物質の収集物、例えば、有機小分子のコンビナトリアルライブラリー、天然産物、ファージディスプレーペプチドライブラリーなどが、細胞の形質膜内の電位依存性イオンチャンネルと接触させられ、そしてイオン流の調節に影響を及ぼすことができるそのような化合物が同定される。このようにして、本発明は、電位依存性イオンチャンネルの活性化因子および阻害剤に対するスクリーニングの方法を提供する。そのような活性化因子および阻害剤は、医薬品として、または、医薬品が薬物開発の通常的なプロセス（例えば、医薬化学）によって開発され得るリード化合物として有用であることが期待される。
【００１６】
細胞外の電場が加えられている間、細胞膜の電気キャパシタンスは、極性および電場に対する細胞の配向に依存して充電または放電する。この結果、膜の所与パッチにおける膜横断電位の一時的な変化が生じる。膜横断電位のこれらの一時的な変化は、加えられた電場に対する膜の各パッチの配向、および存在する膜横断電位に依存してそれぞれの細胞の周りで連続的に変化する。それぞれの膜パッチにおいて、膜電位は、加えられた外部電場によって静止値から乱れる。膜電位のこの変化は、次に、膜のそれぞれの局所的パッチにおける開口している電位依存性イオンチャンネルおよび閉じている電位依存性イオンチャンネルの割合に影響を及ぼし、これにより、電位依存性イオンチャンネルのコンダクタンスが影響を受け、従って、膜電位がさらに変化する。このプロセスは、任意の所与細胞において、膜の異なるパッチおよび埋め込まれた電位依存性イオンチャンネルが異なる膜電位を受けるように、それぞれの細胞の周りで異なることが予想される。一般に、膜の所与パッチにおける膜電位は、ｄＶ／ｄｔ＝Ｉ／Ｃｍ（式中、Ｉは膜のパッチの両端における総電流の流れ（Ｉ＝Ｖ／Ｒ）である）であるようにその抵抗（１／コンダクタンス）およびそのキャパシタンス（Ｃｍ）に比例する割合で変化する。
【００１７】
図１４は、これらの概念を例示する。簡略化のために、図１４に示される細胞の形質膜は、左、上部、右および底部の４つのパッチに分けられている。電位差が加えられると、電流が電極の間に流れる。これにより、細胞の膜電位が変化する。電極１が正であり、電極２が負である場合、細胞の底部における膜パッチが過分極するが、上部パッチは脱分極する。左パッチおよび右パッチは膜電位の変化を「認識」しない。極性が逆になった場合、逆のことが生じる。
【００１８】
実際には、当然のことではあるが、細胞の形質膜は、図１４に示される４つのパッチの単純化された系ではなく、個々のパッチの連続体である。加えられた電圧は様々なパッチの膜電位を多くの異なる値に変化させ、その結果、埋もれた電位依存性イオンチャンネルが多くの異なる電位を「サンプルリング」し、それらの様々な立体配置状態によって駆動させられるようになる。これらには、開口した状態、閉じた状態、高親和性薬物が結合した状態、および低親和性薬物が結合した状態が含まれる。
【００１９】
従って、本発明は、電位依存性イオンチャンネルの活性の調節因子を同定するための方法であって、
（ａ）電位依存性イオンチャンネルを発現する細胞の膜の少なくとも一部分の膜横断電位を、電位依存性イオンチャンネル通過イオン流をモニターしながら、細胞外の電極を介して細胞に電圧を加えることによって変化させること；
（ｂ）工程（ａ）における細胞を物質にさらし、電位依存性イオンチャンネル通過イオン流をモニターすること；
（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）における電位依存性イオンチャンネル通過イオン流を比較すること
を含み、
工程（ａ）および工程（ｂ）における電位依存性イオンチャンネル通過イオン流の違いにより、該物質が電位依存性イオンチャンネルの調節因子であることが示される、方法を提供する。
【００２０】
この方法の変形は、
（ａ）電位依存性イオンチャンネルを発現する多数の細胞を対照部分と試験部分とに分けること；
（ｂ）電位依存性イオンチャンネル通過イオン流をモニターしながら、細胞外の電極を介して細胞に電圧を加えることによって、対照部分の細胞の膜横断電位を変化させること；
（ｃ）電位依存性イオンチャンネル通過イオン流をモニターしながら、物質の存在下、細胞外の電極を介して細胞に電圧を加えることによって、試験部分の細胞の膜横断電位を変化させること；
（ｄ）工程（ｂ）および工程（ｃ）における電位依存性イオンチャンネル通過イオン流を比較すること
を含み、
工程（ｂ）および工程（ｃ）における電位依存性イオンチャンネル通過イオン流の違いにより、該物質が電位依存性イオンチャンネルの調節因子であることが示される、方法である。
【００２１】
簡略化のために、上記の方法は、「１つ」の電位依存性イオンチャンネルに関して記載されている。だが、当業者は、実際の実施では、細胞が、その調節因子が探し求められる電位依存性イオンチャンネルの多数を発現することを理解する。一般に、それぞれの細胞は、少なくとも１０２分子、１０３分子、１０４分子、１０５分子、１０６分子またはそれ以上の電位依存性イオンチャンネルを発現する。また、イオン流は、１個の電位依存性イオンチャンネルではなく、多数の電位依存性イオンチャンネルによってモニターされる。同様に、これらの方法は、方法が「１個」の細胞に関して記載されているとしても、一般には、多数の細胞を用いることによって実施される。
【００２２】
一般に、本発明の方法は、標準的なマルチウエル組織培養プレートまたはマイクロタイタープレートの改変体である基体において実施される。そのような基体は、細胞が試験される場所（一般にはマルチウエル組織培養プレートまたはマイクロタイタープレートのウエル）を有し、そして、細胞内の電位依存性イオンチャンネルの開／閉状態における変化を生じさせる電気的電位が電極により送達され得るような、細胞に関する方位で、（プレート内または近くのいずれかに組み込まれた）正極および負極を有する。電極は細胞外である。すなわち、電極は、いくつかの実施形態では形質膜の外側に接触し得るが、細胞の形質膜の内部に、または細胞の形質膜を越えて突き抜けない。細胞外の電極には、細胞の内部との連続した接続を形成する電極（例えば、パッチ／クランプ電極）は含まれない。
【００２３】
従って、本発明は、電位依存性イオンチャンネルの活性化因子を同定する方法であって、
（ａ）多数の電位依存性イオンチャンネルをその形質膜に発現する生存している真核生物細胞が存在する基体を提供すること；
（ｂ）事前に選択された電位が正極および負極を介して加えられたとき、細胞の膜横断電気的電位が変化して、その結果、電位依存性イオンチャンネルの少なくとも一部が閉じるように基体上または基体近くのいずれかに配置された正極および負極を提供すること；
（ｃ）事前に選択された電圧を、正極および負極を介して加えること；
（ｄ）工程（ｃ）における細胞の電位依存性イオンチャンネル通過イオン流に対する対照値を測定すること；
（ｅ）該物質が電位依存性イオンチャンネルの活性化因子である場合、閉じている電位依存性イオンチャンネルの一部の検出可能な数が開口し、検出可能な数の電位依存性イオンチャンネルを通過するイオン流を可能にするような十分な期間および条件下で工程（ｃ）の細胞を物質にさらすこと；
（ｆ）工程（ｅ）の細胞の電位依存性イオンチャンネル通過イオン流に対する試験値を測定すること；
（ｇ）対照値を試験値と比較すること
を含み、
対照値が試験値よりも小さい場合、該物質が電位依存性イオンチャンネルの活性化因子である、方法を提供する。
【００２４】
上記に記載された方法は、電位依存性イオンチャンネルの阻害剤を同定するための方法を提供するために容易に改変することができる。電極を介して加えられる電圧は、細胞の周りの電場を変化させ、その結果として、膜横断の電気的電位を変化させるように事前に選択される。これは、その後、電位依存性イオンチャンネルが閉じる代わりに、電位依存性イオンチャンネルが開口し得るように、埋め込まれた電位依存性イオンチャンネルの状態を変化させる。次いで、様々な物質が、チャンネルを閉じさせるか、または阻害する能力についてスクリーニングされる。
【００２５】
従って、本発明は、電位依存性イオンチャンネルの阻害剤を同定する方法であって、
（ａ）多数の電位依存性イオンチャンネルをその形質膜に発現する生存している真核生物細胞が存在する基体を提供すること；
（ｂ）事前に選択された電位が正極および負極を介して加えられたとき、細胞の膜横断電気的電位が変化して、その結果、電位依存性イオンチャンネルの少なくとも一部が開口するように基体上または基体近くのいずれかに配置された正極および負極を提供すること；
（ｃ）事前に選択された電圧を、正極および負極を介して加えること；
（ｄ）工程（ｃ）における細胞の電位依存性イオンチャンネル通過イオン流に対する対照値を測定すること；
（ｅ）該物質が電位依存性イオンチャンネルの阻害剤である場合、開口している電位依存性イオンチャンネルの一部の検出可能な数が閉じ、検出可能な数の電位依存性イオンチャンネルを通過するイオン流を制限するような十分な期間および条件下で工程（ｃ）の細胞を物質にさらすこと；
（ｆ）工程（ｅ）の細胞の電位依存性イオンチャンネル通過イオン流に対する試験値を測定すること；
（ｇ）対照値を試験値と比較すること
を含み、
対照値が試験値よりも大きい場合、該物質が電位依存性イオンチャンネルの阻害剤である、方法を提供する。
【００２６】
活性化因子を同定するための上記に記載された方法において、用語「電位依存性イオンチャンネルの一部が閉じている」および用語「検出可能な数」は関連しており、絶対値ではなく、相対値を有する。同様に、阻害剤を同定するための上記に記載された方法において、用語「電位依存性イオンチャンネルの一部が開口している」および用語「検出可能な数」もまた関連しており、絶対値ではなく、相対値を有する。意図されることは、物質がチャンネルに対して作用したとき、十分な数のチャンネル（すなわち、「検出可能な数」）の開／閉状態における変化が生じ、その結果、用いられた検出システムによって測定されるためには十分に大きいイオン流の差が生じるように、電位依存性イオンチャンネルの一部が開口したり、または閉じたりするということである。イオン流の差が測定され得る限り、閉じているか、または開口している電位依存性イオンチャンネルの「一部」を構成するイオンチャンネルの実際の数または「検出可能な数」を測定する必要はない。方法が実施されるための、開口しているチャンネルまたは閉じているチャンネルの実際の部分、ならびに「検出可能な数」の実際の値は、研究中のチャンネル、試験される物質の濃度、イオン流に対する検出システムの性質などのような変数に依存する。そのような変数を考慮に入れて、その結果、対照値および試験値を得ることができるように、電極を介して加えられる電圧を調節することは、例えば、研究中の電位依存性イオンチャンネルの開／閉移行の知られている電圧依存性、イオン流をモニターするために用いられた検出システムの性質および感度、細胞におけるイオンチャンネルの発現レベルなどのこの分野における知識によって当業者が導かれる日常的な実験の範囲内である。
【００２７】
電極は、適正な刺激を規定するために様々な方法で配置することができる。多数の配置が本明細書中に記載され、添付された図面に例示される。これらには、細胞が基体におけるウエルに存在し、そして
（ａ）正極および負極の両方が各ウエルに存在する配置；
（ｂ）一方の電極がウエルに存在し、もう一方の電極が、ウエルの側面または底部と接触することなく、上方からウエル内の流体培地に進入する配置；
（ｃ）電極がウエルの側面または底部の一部を形成する配置；
（ｄ）互いにかみ合う電極のパターンが基体の表面に形成されており、細胞の少なくとも一部が正極および負極の互いにかみ合う支線の間に配置される配置
が含まれる。
【００２８】
当業者は、本明細書中に記載される様々な方法と一緒に対照を操作することが一般には有益であることを認識する。例えば、当該細胞が目的とする電位依存性イオンチャンネルを発現しないことを除いて、好ましくはこれらの方法において、使用される細胞と本質的には同一である細胞に対して物質がこれらの方法において試験される対照を有することは、通常有用である。このようにして、これらの方法によって同定される物質が、何らかの予想されない非特異的な機構によるのではなく、目的とする電位依存性イオンチャンネルによりその作用を実際に発揮していることを決定することができる。そのような対照細胞に対する１つの可能性は、実際の実験の細胞が、目的とする電位依存性イオンチャンネルを、目的とするそのような電位依存性イオンチャンネルの組換え発現のために発現する非組換えの親細胞を使用することである。
【００２９】
他のタイプの対照には、目的とする電位依存性イオンチャンネルの活性化因子または阻害剤として本発明の方法によって同定される物質を採用し、そして、これら物質を、先行技術の方法で試験されたとき、活性化因子および阻害剤であることを確認するための、先行技術の方法で試験することが含まれる。
【００３０】
当業者は、本発明が、イオン流に対する対照値をイオン流に対する試験値と比較して、対照値が試験値よりも大きいか、または小さいかどうかを決定することを含むとき、小さくない差が探し求められていることを認識する。例えば、阻害剤を同定する方法において、対照値が試験値よりも１％大きいことが見出された場合、このことは、その物質が阻害剤であることを示していない。むしろ、当業者は、そのような小さい差を正常な実験的変動のためであると考える。探し求められているものは、対照値と試験値との間における有意な差である。本発明のためには、有意な差は、生物学的シグナルの統計学的に有効な測定値に対する通常の条件に従う。例えば、実験構成の細部に依存して、有意な差は、少なくとも１０％の差であり、好ましくは少なくとも２０％の差であり、より好ましくは少なくとも５０％の差であり、最も好ましくは少なくとも１００％の差であり得る。
【００３１】
当業者は、対照値をもたらす細胞が、試験値をもたらす細胞と物理的に同じである必要がないこと、だが、そうすることは可能であることを理解する。必要なことは、対照値をもたらす細胞が、試験値をもたらす細胞と実質的に同じタイプの細胞であるということである。特定の電位依存性イオンチャンネルでトランスフェクションされ、それを発現する細胞株を、対照細胞および試験細胞の両方のために使用することができる。多数のそのような細胞を増殖させることができ、そしてそのような細胞の一部を物質にさらすことができ、従って、イオン流に対する試験値をもたらす細胞として使用することができ、その一方で、一部は物質にさらされず、従って、イオン流に対する対照値をもたらす細胞として役立つ。個々の細胞それ自体が、対照細胞および試験細胞の両方ではなくとも、細胞株におけるすべての細胞が事実上同一であるということにより、この方法はそれにもかかわらず信頼できることが保証される。
【００３２】
従って、本発明は、電位依存性イオンチャンネルの活性化因子を同定する方法であって、
（ａ）多数の電位依存性イオンチャンネルをその形質膜に発現する生存している真核生物細胞が存在する基体を提供すること；
（ｂ）事前に選択された電圧が正極および負極を介して加えられたとき、細胞の膜横断電気的電位が変化して、その結果、電位依存性イオンチャンネルの少なくとも一部が閉じるように基体上または基体近くのいずれかに配置された正極および負極を提供すること；
（ｃ）細胞の対照サンプルに事前に選択された電位を正極および負極を介して加えること；
（ｄ）工程（ｃ）における細胞の対照サンプルの電位依存性イオンチャンネル通過イオン流に対する対照値を測定すること；
（ｅ）該物質が電位依存性イオンチャンネルの活性化因子である場合、試験サンプルにおいて閉じている電位依存性イオンチャンネルの一部の検出可能な数が開口し、検出可能な数の電位依存性イオンチャンネルを通過するイオン流が可能であるような十分な期間および条件下で細胞の試験サンプルを物質にさらしながら、事前に選択された電圧を、細胞の試験サンプルに正極および負極を介して加えること；
（ｆ）工程（ｅ）の細胞の試験サンプルの電位依存性イオンチャンネル通過イオン流に対する試験値を測定すること；
（ｇ）対照値を試験値と比較すること
を含み、
対照値が試験値よりも小さい場合、該物質が電位依存性イオンチャンネルの活性化因子である、方法を提供する。
【００３３】
同様に、本発明は、電位依存性イオンチャンネルの阻害剤を同定する方法であって、
（ａ）多数の電位依存性イオンチャンネルをその形質膜に発現する生存している真核生物細胞が存在する基体を提供すること；
（ｂ）事前に選択された電圧が正極および負極を介して加えられたとき、細胞の膜横断電気的電位が変化して、その結果、電位依存性イオンチャンネルの少なくとも一部が開口するように基体上または基体近くのいずれかに配置された正極および負極を提供すること；
（ｃ）事前に選択された電圧を、細胞の対照サンプルに正極および負極を介して加えること；
（ｄ）工程（ｃ）における細胞の対照サンプルの電位依存性イオンチャンネル通過イオン流に対する対照値を測定すること；
（ｅ）該物質が電位依存性イオンチャンネルの阻害剤である場合、試験サンプルにおいて開口している電位依存性イオンチャンネルの一部の検出可能な数が閉じ、検出可能な数の電位依存性イオンチャンネルを通過するイオン流を制限するような十分な期間および条件下で細胞の試験サンプルを物質にさらしながら、事前に選択された電圧を、細胞の試験サンプルに正極および負極を介して加えること；
（ｆ）工程（ｅ）の細胞の試験サンプルの電位依存性イオンチャンネル通過イオン流に対する試験値を測定すること；
（ｇ）対照値を試験値と比較すること
を含み、
対照値が試験値よりも大きい場合、該物質が電位依存性イオンチャンネルの阻害剤である、方法を提供する。
【００３４】
「物質」は、薬物開発プロセス時に製薬企業において一般にスクリーニングされる任意の物質であり得る。例えば、物質は、低分子量の有機化合物（例えば、分子量が約１，０００ダルトン未満である有機化合物）；ＲＮＡ、ＤＮＡ、抗体、ペプチドまたはタンパク質であり得る。
【００３５】
細胞が、本明細書中に記載される方法において物質にさらされる条件は、タンパク質−リガンド相互作用の研究のためにこの分野で典型的に使用されている条件である：例えば、生理学的ｐＨ；ＰＢＳのような一般的に使用されている緩衝液によって、または組織培養培地において表される塩条件；約４℃から約５５℃の温度；数秒から数時間のインキュベーション時間。一般に、細胞は基体におけるウエルに存在し、物質は、場合によりウエル内の培地を先ず洗い流した後、ウエルに直接加えられる。
【００３６】
本発明の方法でイオン流の値を測定することは、蛍光指示薬化合物の使用によって達成され得る。蛍光指示薬化合物の１つのタイプは、本発明において使用される細胞における細胞内カルシウムイオンのレベルに対して感受性があるものである。このタイプの蛍光指示薬化合物は、方法がその活性が細胞内カルシウムレベルの変化を生じさせるような電位依存性イオンチャンネルに対するものであるときに、使用することができる。そのような電位依存性イオンチャンネルには、電位依存性カルシウムチャンネルだけでなく、それらのチャンネルの活性が、細胞内カルシウムレベルの変化に生来的に共役するか、または細胞内カルシウムレベルの変化に共役し得る他のタイプの電位依存性イオンチャンネルも含まれる。多くのタイプの電位依存性カリウムチャンネルが上のように共役させることができる。電位依存性カルシウムチャンネルでない目的とする電位依存性イオンチャンネルを研究するためにこの方法を使用するとき、目的とする電位依存性イオンチャンネルに共役する電位依存性カルシウムチャンネルを組換え発現させるように、用いられる細胞を操作することが望ましいであろう。
【００３７】
細胞内カルシウムレベルを測定するために好適な蛍光指示薬化合物には、様々なカルシウム指示薬色素（例えば、ｆｕｒａ−２、ｆｌｕｏ−３、ｉｎｄｏ−１、カルシウムグリーン；Ｖｅｌｉｃｅｌｅｂｉら、１９９９、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２９４：２０〜４７を参照のこと）が含まれる。
【００３８】
カルシウム指示薬色素は、カルシウムと結合したとき、蛍光特性の変化、例えば、非常に増大した蛍光強度および／または蛍光スペクトルの変化（すなわち、放射極大または励起極大の変化）を示す物質である。ｆｌｕｏ−３、ｆｕｒａ−２およびｉｎｄｏ−１が、非常に選択的なカルシウムキレーターであるエチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）および１，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）の構造的アナログとして設計された一般に使用されているカルシウム指示薬色素である。ｆｌｕｏ−３から得られる蛍光強度は、カルシウムが結合したとき、１００倍以上増大する。非結合の色素はほとんど蛍光を示さないが、カルシウムと結合したｆｌｕｏ−３は５２６ｎｍにおける強い蛍光放射を示す。ｆｕｒａ−２は、カルシウムが結合したとき、その蛍光スペクトルの変化を示す色素の例である。非結合の状態では、ｆｕｒａ−２は３６２ｎｍの励起極大を有する。この励起極大は、カルシウムが結合したとき、３３５ｎｍに変化する。だが、放射極大は全く変化しない。カルシウムのｆｕｒａ−２に対する結合を、この２つの励起極大における励起、そして３３５ｎｍにおける励起後の蛍光放射量と比較して、３６２ｎｍにおける励起後の蛍光放射量の比率を求めることによってモニターすることができる。低下した比率（すなわち、３６２ｎｍにおける励起後の放射が小さくなること）により、より多くのｆｕｒａ−２がカルシウムに結合していることが示され、従って、細胞におけるより大きい内部カルシウム濃度が示される。
【００３９】
カルシウム指示薬色素の使用には、細胞に色素を負荷すること、すなわち、細胞を色素の膜透過性アセトキシメチルエステルにさらすことによって達成することができるプロセスを伴い得る。細胞の形質膜の内部に入ると、細胞内エステラーゼにより、上のエステルが切断され、遊離色素中の負荷電が露出する。これにより、遊離色素が形質膜を横断することが妨げられ、従って、遊離色素が細胞内に留められる。次いで、色素からの蛍光の測定が行われる。すなわち、（例えば、電位依存性イオンチャンネルの活性化因子または阻害剤に細胞をさらすことによって）内部カルシウム濃度が変化するような方法で細胞が処理され、蛍光測定が再び行われる。
【００４０】
指示薬色素からの蛍光は、ルミノメーターまたは蛍光画像化装置を用いて測定することができる。１つの好ましい検出装置が蛍光測定画像化プレート読み取り装置（ＦＬＩＰＲ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）である。ＦＬＩＰＲは、マイクロタイタープレートの９６ウエルまたは３８４ウエルにおいて同時にピペット操作することが可能な一体化された液体取扱いと、電荷結合デバイスによる画像化カメラに結合されたアルゴンレーザーを使用する迅速な速度論的検出とを含むので、本発明の方法を使用する高処理能スクリーニングには十分に適する。
【００４１】
カルシウム指示薬色素を使用するための典型的なプロトコルでは、目的とする電位依存性イオンチャンネルを発現する細胞を適切な基体（例えば、正極および負極の好適な配置を有する透明なかつ平底の黒色壁９６ウエルプレート）に入れて、細胞を標準的な組織培養条件（例えば、５％ＣＯ２、３７℃）で一晩増殖させることを伴う。細胞は、一般には、適切な増殖培地において約１０，０００細胞／ウエルから１００，０００細胞／ウエルの密度で置床される。アッセイ当日に、増殖培地が除かれ、色素負荷培地がウエルに加えられる。
【００４２】
例えば、カルシウム指示薬色素がｆｌｕｏ−３である場合、色素負荷培地は、５０μｇのｆｌｕｏ−３−ＡＭエステル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｆ−１２４２）を２２μｌのＤＭＳＯに可溶化して、２ｍＭの色素ストック液を得ることによって調製することができる。細胞への負荷の直前に、２２μｌの２０％プルロニック酸（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｐ−３０００）が色素に加えられる。色素を含有するチューブがボルテックスミキサーで混合され、４２ｍｌの色素／プルロニック酸溶液が、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬカタログ番号１５６０−０８０）、２．５ｍＭのプロベネシド（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｐ−８７６１）および１％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬカタログ番号２６１４０−０８７；ＢＳＡではない）を含む１０．５ｍｌのハンクス平衡塩溶液（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬカタログ番号１４０２５−０７６）に加えられる。色素および負荷培地は、繰り返し反転することによって混合される（最終的な色素濃度は約４μＭである）。
【００４３】
増殖培地は、洗浄（洗浄培地は、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬカタログ番号１５６０−０８０）、２．５ｍＭのプロベネシド（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｐ−８７６１）および０．１％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ａ−９６４７；ＦＢＳではない）を含むハンクス平衡塩溶液（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬカタログ番号１４０２５−０７６）である）を３回行い、４回目の洗浄の後、ウエルに１００μｌの残留培地を残すことによって細胞から除くことができる。その後、負荷培地における１００μｌの色素が各ウエルに加えられる。その後、細胞は、色素の負荷を行わせるために６０分間インキュベーションされる。
【００４４】
色素を負荷した後、細胞の蛍光測定が、試験される物質に細胞がさらされる前に測定される。その後、細胞は物質にさらされ、色素の蛍光特性の変化を生じさせるような物質が同定される。測定装置は、ＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）などの蛍光プレート読み取り装置であり得る。対照細胞ではなく、試験細胞において蛍光特性の変化を生じさせる物質が、電位依存性イオンチャンネルの考えられる活性化因子または阻害剤である。
【００４５】
上記に概略された手順の正確な詳細は例示であることが意図される。当業者は、特定の関連する実験変数（例えば、使用される細胞タイプ、使用された色素の本質）に依存して日常的な実験によって様々な実験パラメーター（細胞数、色素濃度、色素負荷時間、インキュベーション温度、細胞洗浄条件、浴溶液のイオン組成、および装置設定など）を最適化することができる。使用され得る実験プロトコルのいくつかの例が、Ｖｅｌｉｃｅｌｅｂｉら、１９９９、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２９４：２０〜４７に記載される。光学的方法により膜横断電位の変化を測定するための他の好適な装置計測および方法には、顕微鏡、マルチウエルプレート読み取り装置、および迅速かつ高感度な蛍光検出が可能である他の装置計測が含まれる。例えば、ＶＩＰＲ（Ａｕｒｏｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）は、９６ウエルおよびより大規模なマルチウエルプレートに対する一体化された液体操作装置および速度論的蛍光読み取り装置である。ＶＩＰＲ読み取り装置には、８チャンネルの液体操作装置、マルチウエル配置ステージ、ならびに光ファイバー照明および検出システムが一体化されている。このシステムは、別のマイクロタイタープレートまたはトラフから得られる液体サンプルの導入前、導入時および導入後、８ウエルの縦列からの蛍光を同時に測定するように設計されている。ＶＩＰＲ読み取り装置は励起させ、そして、８個の三叉光学束（各ウエルに対して１つの束）を用いることによってマルチウエルの底部から放射シグナルを検出する。三叉ファイバーの１つの脚部が励起源として使用され、三叉ファイバーのそれ以外の２つの脚部が、蛍光放射を検出するために使用される。ファイバーの端部に位置する球レンズは、光の励起効率および収集効率を増大させる。二叉放射ファイバーは、読み取り装置が２つの放射シグナルを同時に検出することを可能にし、ＦＲＥＴ型電圧色素によって生じる迅速なシグナルとの適合性がある。
【００４６】
その場合、光電子増倍管により、放射蛍光が検出され、サブ秒の放射比検出が可能になる。
【００４７】
いくつかの実施形態において、カルシウム指示薬色素は、ｆｌｕｏ−３、ｆｕｒａ−２、ｆｌｕｏ−４、ｆｌｕｏ−５、カルシウムグリーン−１、オレゴングリーン、４８８ＢＡＰＴＡ、ＳＮＡＲＦ−１およびｉｎｄｏ−１からなる群から選択される。
【００４８】
いくつかの実施形態において、蛍光特性の変化は蛍光放出極大の強度の増大である。他の実施形態において、蛍光特性の変化は吸収極大の波長の変化である。
【００４９】
いくつかの実施形態において、細胞は、目的とする電位依存性イオンチャンネルおよび／またはカルシウムチャンネルを生来的に発現する。他の実施形態において、細胞は、目的とする電位依存性イオンチャンネルおよび／またはカルシウムチャンネルを生来的に発現しないが、代わりに、目的とする電位依存性イオンチャンネルおよび／またはカルシウムチャンネルをコードする発現ベクターでトランスフェクションされており、その結果、細胞は、目的とする電位依存性イオンチャンネルおよび／またはカルシウムチャンネルを組換え発現する。トランスフェクションは、発現ベクターを細胞に導入するためにこの分野で知られている任意の方法を含むことが意図される。例えば、トランスフェクションには、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウムにより媒介されるトランスフェクション、リポフェクション、レトロウイルス構築物を用いた感染、およびエレクトロポレーションが含まれる。
【００５０】
カルシウム指示薬色素の使用に対する代替法には、エクオリンシステムの使用がある。エクオリンシステムでは、タンパク質アポエクオリンが使用され、この場合、アポエクオリンが、アポエクオリンと、エクオリンとして知られているセレンテラジンとの組合せ体を形成する親油性の発色団セレンテラジンに結合する。エクオリンは３つのカルシウム結合部位を有しており、カルシウムが結合したとき、エクオリンのアポエクオリン部分はその立体配置を変化させる。立体配置のこの変化により、セレンテラジンは、セレンテラミド、ＣＯ２および青色光（４６６ｎｍ）の光子に酸化される。この光子を、好適な装置計測を用いて検出することができる。
【００５１】
アポエクオリンをコードする遺伝子はクローン化されている（米国特許第５，５４１，３０９号；米国特許第５，４２２，２６６号；米国特許第５，７４４，５７９号；Ｉｎｏｕｙｅら、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：３１５４〜３１５８；Ｐｒａｓｈｅｒら、１９８５、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、１２６：１２５９〜１２６８）ので、アポエクオリンを、細胞内カルシウム濃度を測定することが所望される細胞において組換え発現することができる。あるいは、組換えアポエクオリンを安定に発現する既存の細胞を使用することができる。ＨＥＫ２９３細胞およびＣＨＯ−Ｋ１細胞に由来するそのような細胞が、Ｂｕｔｔｏｎ＆Ｂｒｏｗｎｓｔｅｉｎ、１９９３、Ｃｅｌｌ  Ｃａｌｃｉｕｍ、１４：６６３〜６７１に記載されている。例えば、ＨＥＫ２９３／ａｅｑ１７細胞株を下記のように使用することができる。
【００５２】
ＨＥＫ２９３／ａｅｑ１７細胞が、１０％ウシ胎児血清（熱不活性化）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５００μｇ／ｍｌのジェネティシン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１００ユニット／ｍｌのペニシリンを含むダルベッコ改変培地（ＤＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、米国）において増殖させられる。目的とする電位依存性イオンチャンネル、ならびに必要な場合には、所望する電位依存性カルシウムチャンネルサブユニット（α１Ａ、α１Ｂ、α１Ｃ、α１Ｄ、α１Ｅ、α１Ｇ、α１Ｈ、α１Ｉ、α２δ、β１、β２、β３、β４など）をコードする発現ベクターを、所望する電位依存性イオンチャンネルサブユニットおよび電位依存性カルシウムチャンネルサブユニットをＨＥＫ２９３／ａｅｑ１７細胞において発現させるために、標準的な方法によってＨＥＫ２９３／ａｅｑ１７細胞にトランスフェクションすることができる。細胞はＤＭＥＭ＋０．１％ウシ胎児血清で１回洗浄され、その後、８μＭのセレンテラジンｃｐ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、米国）および３０μＭのグルタチオンを含有するＤＭＥＭに３７℃／５％ＣＯ２において１時間入れられる。その後、細胞はＶｅｒｓｅｎｅ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、米国）で１回洗浄され、ＥＣＢ（０．３ｍＭのＣａＣｌ２、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）、０．１％のウシ胎児血清を含むハムＦ１２栄養混合物（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ））に希釈された酵素非含有細胞解離緩衝液（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、米国）を使用して剥離される。細胞懸濁物は５００ｘｇで５分間遠心分離される。上清が除かれ、ペレットが１０ｍｌのＥＣＢで再懸濁される。細胞密度が、血球計を用いて計数することによって測定され、ＥＣＢにおいて５００，０００細胞／ｍｌに調節される。試験される物質は、所望する濃度にＥＣＢで希釈され、好ましくは三連で、０．１ｍｌ／ウエルでアッセイプレートに分注される。細胞懸濁物が０．１ｍｌ／ウエルで注入され、読み取りが行われ、積算が、ルミノメーター（Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ、Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｏｙ、Ｈｅｌｓｉｎｋｉ、フィンランド）を使用して合計で４００個の読み取り値について行われる。選択的に、細胞を最初にアッセイプレートに入れることができ、その後、物質を加えることができる。データが、ソフトウエアＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン３．０（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、米国）を使用して分析される。
【００５３】
上記に概略された手順は、行なわれることが望まれる特定のアッセイの具体的な細部を考慮に入れて様々な工程および変数を少し改変することができる一般的な指針であることが、当業者によって理解される。例えば、半合成されたセレンテラジンを使用することができる（Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ、１９８９、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２６１：９１３〜９２０；Ｓｈｉｍｏｍｕｒａら、１９９３、Ｃｅｌｌ  Ｃａｌｃｉｕｍ、１４：３７３〜３７８）；セレンテラジンとの細胞のインキュベーション時間を少し変化させることができる；ウエルあたり少し大きい細胞数または少し少ない細胞数を使用することができる；その他。
【００５４】
エクオリンの使用に関する総説については、Ｃｒｅｔｏｎら、１９９９、Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、４６：３９０〜３９７；Ｂｒｉｎｉら、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７０：９８９６〜９９０３；Ｋｎｉｇｈｔ＆Ｋｎｉｇｈｔ、１９９５、Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、４９：２０１〜２１６を参照のこと。米国特許第５，７１４，６６６号もまた注目することができ、これには、アポエクオリンを発現する哺乳動物細胞にセレンテラジン補因子を加えることによって哺乳動物細胞における細胞内カルシウムを測定する方法が記載されている。
【００５５】
イオン流を測定するための別の方法は、電位依存性イオンチャンネルの活性から生じる転写の変化を転写型アッセイによってモニターすることである。転写型アッセイでは、電位依存性イオンチャンネルの活性によって引き起こされる特定の細胞内事象（例えば、細胞内カルシウムレベルの変化）によってその活性が調節される誘導性プロモーターによりその転写が駆動されるレポーター遺伝子の使用を含む。様々な転写型アッセイが、Ｒｕｔｔｅｒら、１９９８、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ、５：Ｒ２８５〜Ｒ２９０に総説されている。本発明の転写型アッセイは、活性化因子または阻害剤が電位依存性イオンチャンネルと相互作用することによって引き起こされる細胞内事象の結果としてその転写が活性化または抑制されるレポーター遺伝子の発現に依存する。
【００５６】
極めて高感度な転写型アッセイが、Ｚｌｏｋａｒｎｉｋら、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７９：８４〜８８（Ｚｌｏｋａｒｎｉｋ）に、そしてまた米国特許第５，７４１，６５７号に開示されている。Ｚｌｏｋａｒｎｉｋおよび米国特許第５，７４１，６５７号に開示されているアッセイでは、誘導性プロモーターの制御下にβ−ラクタマーゼをコードするプラスミドが用いられる。このプラスミドは、そのアゴニストを同定することが望まれる受容体をコードするプラスミドと一緒に細胞内にトランスフェクションされる。β−ラクタマーゼにおける誘導性プロモーターは、アゴニストが受容体に結合したときに生じる少なくとも１つの細胞内シグナルにプロモーターが応答するように選ばれる。従って、受容体に対するアゴニストの結合の後、トランスフェクションされた細胞におけるβ−ラクタマーゼのレベルが増大する。β−ラクタマーゼのこの増大が、β−ラクタマーゼによる切断に対する基質である細胞透過性色素で細胞を処理することによって測定される。この色素は２つの蛍光性成分を含有している。無傷の色素では、２つの蛍光性成分が物理的に連結されており、従って、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）がそれらの間で生じ得るように互いに十分に接近している。β−ラクタマーゼによって色素が２つの部分に切断された後、２つの蛍光性成分は異なる部分に存在し、従って、離れるように拡散し得る。これは、これらの蛍光性成分の間の距離を増大させ、従って、それらの間で生じ得るＦＲＥＴの量を減少させる。アッセイで測定されるのは、ＦＲＥＴにおけるこの減少である。
【００５７】
Ｚｌｏｋａｒｎｉｋおよび米国特許第５，７４１，６５７号に記載されているアッセイは、β−ラクタマーゼを駆動させる、電位依存性イオンチャンネルの開閉により生じる細胞内シグナルによってプロモーターが活性化される誘導性プロモーターを使用することによって、本発明の方法における使用のために改変することができる。電位依存性イオンチャンネルと、誘導性プロモーターにより駆動されるβ−ラクタマーゼとを発現する細胞が、電位依存性イオンチャンネルの開口した状態または閉じた状態を制御することができる本発明の装置に入れられる。細胞は細胞透過性色素にさらされ、その後、電位依存性イオンチャンネルの活性化因子または阻害剤であることが疑われる物質にさらされる。電位依存性イオンチャンネルの開口した状態または閉じた状態の変化を生じさせるこれら物質は、誘導性プロモーターにより駆動されるβ−ラクタマーゼに対する影響によって、従ってＦＲＥＴに対する影響によって同定される。誘導性プロモーターにより駆動されるβ−ラクタマーゼは、アッセイの性質に依存して物質が活性化因子または阻害剤のいずれかであるときにβ−ラクタマーゼが誘導されるように、好適なプロモーターを用いて作成される。
【００５８】
電位依存性イオンチャンネル通過イオン流はまた、蛍光性の電圧感受性色素を使用して膜電位の変化を測定することによって測定することができる。膜電位の変化は、細胞膜におけるイオンチャンネルに依存する。生じる膜電位は、チャンネルすべての正味の性質、および目的とする電位依存性イオンチャンネルを（阻害剤もしくはアンタゴニストである物質により）阻害することによって、または目的とする電位依存性イオンチャンネルを（活性化因子もしくはアゴニストである物質により）活性化することによって生じる変化に依存する。細胞および膜の生物物理学および電気生理学における１つの知見により、膜電位の変化の方向が理解される。そのような変化は、存在するイオンチャンネルに、および試験物質によるこれらチャンネルの阻害または活性化に依存するからである。蛍光性の電圧感受性色素が使用される多くの場合において、実験システムは、目的するイオンチャンネルの知られている活性化因子または阻害剤を使用することによって較正することができる。
【００５９】
従って、本発明には、第１の蛍光色素と第２の蛍光色素との間におけるＦＲＥＴに基づく、電位依存性イオンチャンネルの活性化因子または阻害剤により引き起こされるイオン流の変化をモニターするアッセイが含まれる。この場合、第１の色素が、目的とする電位依存性イオンチャンネルを発現する細胞の形質膜の一方の側に結合し、第２の色素が、膜電位の変化に応答して、膜の一方の面から反対側の面に自由に移動する。いくつかの実施形態において、第１の色素は細胞の形質膜を突き抜けることができず、形質膜の細胞外表面に主に結合している。第２の色素は形質膜内に捕捉されるが、膜内を自由に拡散する。膜の正常（すなわち、負）の静止電位のとき、第２の色素は形質膜の細胞外面の内側表面に主に結合しており、従って、第２の色素は第１の色素の非常に近いところに位置する。このように非常に近いことは、２つの色素の間における大きいＦＲＥＴ量の生成を可能にする。膜が脱分極した後、第２の色素は膜の細胞外面から細胞内面に移動し、従って、色素間の距離が増大する。この増大した距離はＦＲＥＴの減少をもたらし、このため、第１の色素に由来する蛍光放射がそれに従って増大し、第２の色素に由来する蛍光放射がそれに従って減少する。Ｇｏｎｚａｌｅｚ＆Ｔｓｉｅｎ、１９９７、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ、４：２６９〜２７７の図１を参照のこと。また、Ｇｏｎｚａｌｅｚ＆Ｔｓｉｅｎ、１９９５、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．、６９：１２７２〜１２８０；および米国特許第５，６６１，０３５号も参照のこと。
【００６０】
いくつかの実施形態において、第１の色素は、蛍光ドナーとして作用する蛍光性のレクチンまたは蛍光性のリン脂質である。そのような第１の色素の例には、クマリンで標識されたホスファチジルエタノールアミン（例えば、Ｎ−（６−クロロ−７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボキサミドアセチル）−ジミリストイルホスファチジルエタノールアミンまたはＮ−（７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾル−４−イル）−ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン）；蛍光標識されたレクチン（例えば、フルオレセインで標識されたコムギ胚芽アグルチニン）がある。いくつかの実施形態において、第２の色素は、蛍光アクセプターとして作用するオキソノールである。そのような第２の色素の例には、ビス（１，３−ジアルキル−２−チオバルビツラート）トリメチンオキソノール（例えば、ビス（１，３−ジヘキシル−２−チオバルビツラート）トリメチンオキソノール）またはペンタメチンオキソノールアナログ（例えば、ビス（１，３−ジヘキシル−２−チオバルビツラート）ペンタメチンオキソノール；もしくはビス（１，３−ジブチル−２−チオバルビツラート）ペンタメチンオキソノール）がある。本発明における使用のために好適な様々な色素を合成する方法については、Ｇｏｎｚａｌｅｚ＆Ｔｓｉｅｎ、１９９７、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ、４：２６９〜２７７を参照のこと。いくつかの実施形態において、アッセイは、一重状態酸素による光力学的損傷を減少させるために、天然カロテノイド（例えば、アスタキサンチン）を含むことができる。
【００６１】
形質膜の一方の面から反対側の面に移動することができるそのような蛍光色素の使用は、本発明の方法が、内向き整流カリウムチャンネルに対するものであるときには特に適している。内向き整流カリウムチャンネルの活性化は、形質膜を横断する増大したカリウム電流の流れをもたらす。この増大した電流の流れは細胞膜の過分極をもたらすが、そのような過分極は、より大きいＦＲＥＴをもたらすので、上記に記載される技術の使用によって検出することができる。
【００６２】
様々なタイプの基体および電極の、非常に多くの可能な組合せ；電極の物理的配置；細胞を保持するためのウエルの数および形状および配置が、本発明における使用のために好適である。
【００６３】
図１には、電極が、金などの導電性材料の一般に平行したワイヤまたは細片である本発明の実施形態が例示される。電極はガラス基体の表面に存在し、スペーサーと一緒になって、ウエルの壁を形成する。分かりやすくするために、ウエルの一列のみが図１には示される。一般に、ガラス基体の実質的に表面全体が、示された様式で形成されたウエルによって覆われる。細胞がウエルに入れられ、そして適切な数の細胞がウエルに存在するまで、好適な培地において増殖させられる。あるいは、適切な数の細胞をウエルに入れて、さらに増殖させることなく使用することができる。
【００６４】
図２Ｂには、ウエルが、典型的なマルチウエル組織培養プレートの場合のような基体の表面におけるへこみまたはくぼみである本発明の実施形態が例示される。各ウエルは、ウエルの底部における１つの電極と、ウエルの側面に沿って配置されたもう１つの電極とを有する。細胞が、図２Ｂではウエルの底部に付着しているとして示されているが、いくつかの実施形態では、細胞は、ウエル内の流体に分散された懸濁細胞であってもよい。
【００６５】
図２Ｃには、図２Ｃでは、両方の電極がウエルの底部に存在することを除いて、図２Ｂに示される実施形態と類似する本発明の実施形態が例示される。
【００６６】
図３には、交互にかみ合う透明な電極のアレイがガラス基体の表面に化学的にエッチングされている本発明の実施形態が例示される。正極および負極の櫛状体を構成する電極アレイが、インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）被覆のガラスプレートに化学的にエッチングされている。ＩＴＯの薄い層（約２００Åから２，０００Åまたは５００Åから１，５００Å、好ましくは１，２００Åの厚さ）により、グラスプレートの表面における透明な導電性被覆が形成される。必須ではないが、ＩＴＯ層は、透明であるために十分に薄いことが好ましい。化学的エッチングプロセスにより、選択された領域からＩＴＯが除かれ、ガラスプレートに結合した透明なＩＴＯ電極のアレイが得られる。多数の反応ウエルを、異なる電極アレイ部位に流体保持ウエルを形成することによって１枚のガラスプレートに含有させることができる。ウエルは、ウエルフレームをガラスプレートに取り付けること（例えば、接着すること）によって、または疎水性インクによりプレート上を覆うことなどの方法によりガラスプレートに実質上のウエルを形成することによって形成させることができる。
【００６７】
図４Ａおよび図４Ｂには、ウエルが、ウエルフレームを基体に取り付けることによって形成される実施形態が例示される。
【００６８】
図６には、電位依存性イオンチャンネルを発現する細胞を含有する液体液滴が２つのプレートの間に挟まれる実施形態が例示される。ガラスプレートであり得るプレートはそれぞれが、インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）などの導電性材料の薄い層でコーティングされる。導電性材料の層は、一方の層が正極として機能し、もう一方の層が負極して機能するようにパルス発生器に接続される。
【００６９】
図７および図８には、電極の一方が上方からウエルに進入する実施形態が例示される。図９および図１０では、両方の電極が上方から進入する。
【００７０】
本発明において使用される基体は実質上のウエルを含有することができる。実質上のウエルは、表面が、比較的疎水性の場の内部に比較的親水性のドメインを有するようにパターン化されたときに形成され、その結果、水性サンプルが、より疎水性の場の端により、より親水性のドメインに対する表面張力によって物理的に拘束される。親水性のドメインは、従来のマイクロタイタープレートのウエルに類似するパターンを形成する小さい円形であり得る。実質上のウエルは、従来のマイクロタイタープレートに見出される深いくぼみを伴うことなくサンプルを閉じ込めることができる位置を提供する。図５には、実質上のウエルが形成され、かつ交互にかみ合う電極のパターンもまた形成されている修飾されたガラス表面である、本発明において使用される表面が例示される。図３には、この表面からの個々のウエルが示されている。国際特許出願公開ＷＯ９９／３９８２９には、実質上のウエルおよびそれらの作製方法が記載されている。
【００７１】
「交互にかみ合う」は、正極および負極が、１つの直線が正極の１つの支線からその正極の隣の支線にまで引かれた場合、この直線が負極の支線と交差するように配置されている支線を含有するような、正極および負極の配置を示す。同様に、１つの直線が負極の１つの支線からその負極の隣の支線にまで引かれた場合、直線は正極の支線と交差する。一般に、交互にかみ合うそれぞれの正極または負極は、少なくとも２つ、または少なくとも４つ、または少なくとも１０、または少なくとも２０の交互にかみ合う支線を有する。交互にかみ合う電極の一例が図３に示される。
【００７２】
ガラス基体上の導電性材料から形成される電極の様々なさらなる配置が可能である。１つの配置は、２つの平行したガラス基体の表面に形成された正極および負極を有する。例えば、１枚のガラス基体に正極および負極を有する代わりに、２つのＩＴＯ被覆ガラス基体を、ガラス基体を互いに平行して置き、細胞を含有する生物学的流体をガラス基体間の隙間に置くことによって利用することができる。この配置では、一方の導電性ガラス基体が正極として役立ち、その一方で、第２のガラス基体が負極として役立つ。電極場が、プレートの表面に対して直角に形成される。この配置により、細胞を含有する流体をプレート間に分配させるか、または毛管作用によって隙間に引き込むことのいずれかが可能になる。検出器の光ビームがガラス基体に対して直角に進入し、ガラス基体間の隙間に入り、流体および細胞を照らす。細胞からの蛍光送出が、類似する様式で検出器よって集められる。図６には、この配置の１つの形式が例示される。別の形式が、多数の実質上のウエルをそれぞれが含有する２つのＩＴＯ被覆プレートを含む実施形態が示されている図１３に示される。ＩＴＯは、電極だけでなく、ウエルの底部を形成する。
【００７３】
別の配置は、１枚のガラス基体によって形成される正極および負極と、参照電極とを有する。この配置では、一方の電極としてＩＴＯなどの導電性材料でコーティングされた１枚のガラス基体が利用される。生物学的流体および細胞を保持するウエルが、ガラス基体をコーティングする導電性材料の表面に形成される。ウエル内に設置されたワイヤまたは類似する導電性部材が第２の電極として役立つ。図７には、この配置の形式の１個のウエルが例示される。図１２には、マルチウエル形式で通常実施されるようなこのタイプの配置が示される。図１５には、一方の電極が、ＩＴＯ層と接触している高導電性の金属グリッドであるこの配置の改変が示される。
【００７４】
別の配置は、隣接ウエルに設置された正極と負極との対によってもたらされた電流に対する導電体として作用する１枚の導電性ガラス基体を有する。図１６Ａから図１６Ｄを参照のこと。この配置では、接地グリッドが使用されない。電流は、第１のウエルにおける第１の電極から、第１のウエルのＩＴＯ底部を通って、隣接する第２のウエルのＩＴＯ底部に、および第２のウエルにおける第２の電極を通って、流れる。隣接する電極は交互に正極および負極である。図１６Ａおよび図１６Ｃを参照のこと。
【００７５】
交互にかみ合う電極を使用するいくつかの実施形態において、電極の支線の間隔および幅は、個々の細胞のサイズと同じ程度の大きさである。細胞は、細胞が１対の正極支線と負極支線との間に付着する場合、より低い加えられた刺激パルスが利用できるような様式で、増殖させ、基体に付着させることができる。この近い電極間隔の利点は、流体培地を通る刺激電流パルスのより少ない分流および流体のより少ない発熱が、細胞を刺激している間において生じるということである。透明な交互にかみ合う電極の使用は、蛍光放射光源からの光を、好ましくはガラス基体および透明な電極を通って、細胞に伝えるという利点、そして光検出器に戻る蛍光シグナルの光通過を提供する。電極をインジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）などの透明な材料から作製することは、いくつかの実施形態では様々な利点を有しているが、電極はまた、白金、銀または金などの、透明でない導電性材料から作製することができる。電極材料が透明でない場合、光が電極間のガラスを通過することができるので、蛍光測定は依然として可能である。
【００７６】
電極の配置とは関係なく、刺激パルスがパルス発生器によって作製され、単ウエル電極アレイまたは多ウエル電極アレイのいずれかに加えられる。波形発生および振幅調節を可能にする様々な市販のパルス発生器を利用することができる。定電圧または定電流の波形を電極に加えることができる。本発明において使用され得る市販の電源装置には、ＳＴＧ１００４もしくはＳＴＧ１００８の刺激発生器、またはＮａｔｉｏｎａｌ  ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓのＰＣＩ６７１３の８チャンネルｐｃｂが含まれる。
【００７７】
細胞を刺激するためにパルス発生器を使用する際には、使用される振幅およびパルス幅および極性には特に注意を払わなければならない。いくつかの極端な電場強度の場合、生物学的膜のエレクトロポレーションが生じることがあり、これは避けなければならない。外部電場を変化させるとき、所望する目標は、膜横断電場（Ｖｍ）の変化をおよそ±１００ｍＶ未満にすることである。そのため、細胞膜のキャパシタンスに加えられるか、または細胞膜のキャパシタンスから除かれる電荷の量が重要である。パルスの振幅および持続時間を調節することが、細胞のエレクトロポレーションを伴わないＶｍの変化を保証にするために必要である。典型的には、電極間の電圧変化は±１０ボルト程度であり得るが、好ましくは±５ボルト未満であり、可能な場合には±１ボルト未満である。これらの値は、細胞膜のエレクトロポレーションを伴わない細胞の膜電位変化を最適化するために、日常的な実験によって経験的に調節することができる。一般に、細胞膜における電荷変化の量は、電気的電流に依存する局所的な電場変化に依存する。外部電場の変化によって決定されるような印加電流の面積（電流−時間の積分）を調節することは、経験的に容易に最適化することができる。一般に、目標が、細胞の活動電位を刺激することである場合、パルスの持続時間は短時間に保たれ、振幅が、活動電位生成のための閾値を超える点にまで増大される。これは、細胞で発現するイオンチャンネルの相対的なレベルによって影響を受け、それに従って変化し、そのため、経験的な調節を必要とする。典型的な値は１ミリ秒のパルス持続時間および５ボルトのパルス振幅であり得る。しかしながら、これは、例えば、持続時間を２ミリ秒に増大させ、振幅を２．５ボルトに低下させるために、または持続時間を減少させ、振幅を増大させるために変化させることができる。一般に、加えられたパルスの持続時間と振幅との間には、印加電流−時間積分の面積が一定のままである逆放物線的関係が存在する。イオンチャンネルの速度論および活動電位は迅速かつ短時間であり得るので、パルスの持続時間を最小限にすることが有用である。これらのパラメーターはまた、製造された電極、そのキャパシタンスおよび抵抗、細胞に対する幾何学的関係、使用される溶液のイオン強度および組成、ならびに細胞に対する電気的結合に依存する。これらの多くの変数のために、上記の指針に基づく経験的な取扱いが最良である。
【００７８】
電極配置は、１２ウエル、２４ウエル、９６ウエル、３８４ウエル、１，５３６ウエル、３，４５６ウエルおよび他のプレート形式に適合化させることができ、これにより、本発明を高処理能スクリーニング適用において使用することが可能になる。
【００７９】
多数のウエルが基体に存在し、各ウエルが、それと結合した電極を有する図１２に例示される実施形態などの本発明の実施形態において、電極を介してそれぞれのウエルに送達される刺激は、パルス発生器を調節する好適なソフトウエアを適用することによって個々に制御することができる。そのようなソフトウエアは、この分野では広く知られているか、または当業者によって容易に設計することができる。
【００８０】
本発明のいくつかの実施形態では、基体が、高処理能スクリーニングのために使用される典型的なマルチウエル組織培養プレート（例えば、９６ウエルプレート）と同じ形態因子を有するように、基体における電極およびウエルの配置が用いられる。基体におけるウエルの間隔は、基体におけるウエルの中心間距離が、高処理能スクリーニングのために使用される典型的な９６ウエルプレートにおけるウエル間の典型的な中心間距離と同じであるようにすることができる。これにより、プレート取扱い装置、検出器、自動分注器などの、高処理能スクリーニングにおいて使用される現在の装置と一緒に本発明の使用が容易になる。基体は、本明細書中に開示される電極の様々な形状の少なくとも１つに従ってプレートに電極を加えることにより、マルチウエル組織培養プレートを作製するために一般に使用されている広く知られている製造プロセスを改変することによって製造することができる。
【００８１】
本発明のいくつかの実施形態において、基体はケイ素または電界効果トランジスタではない。
【００８２】
本発明のいくつかの実施形態において、電位依存性イオンチャンネルをコードするＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフェクションされている細胞が利用される。好ましくは、細胞は、対応する電位依存性イオンチャンネルを生来的に発現しない。例えば、発現ベクターにより、電位依存性カルシウムチャンネルの発現が行われる場合、細胞は電位依存性カルシウムチャンネルを生来的に発現しない。あるいは、細胞が、対応する電位依存性イオンチャンネルを生体的に発現する場合、それらの対応する電位依存性イオンチャンネルは、トランスフェクションされている電位依存性イオンチャンネルから、何らかの様式で、例えば、適切な阻害剤の使用によって、膜電位の操作によって区別することができる。本発明において使用される好ましい細胞株には、ＨＥＫ２９３細胞株（ＡＴＣＣ１５７３）がある。これは、この細胞が、膜電位の脱分極を生じさせるチャンネル（例えば、ナトリウムチャンネルまたはカルシウムチャンネル）を用いた電場刺激実験のために有益であり得る内因性のカリウムチャンネルを生来的に発現するからである。
【００８３】
細胞は、一般には真核生物細胞であり、好ましくは哺乳動物細胞である。細胞は、基体上で適切な数に増殖させることができ、または基体に置き、さらに増殖させることなく使用することができる。細胞を基体に付着させることができ、または、細胞がウエルに入れられるか、もしくはウエル内で増殖されるそのような実施形態では、細胞は、ウエル内の流体に懸濁されている懸濁細胞であり得る。一次細胞または樹立された細胞株を使用することができる。
【００８４】
電位依存性イオンチャンネルの発現を行わせる発現ベクターを用いたトランスフェクションのための好適な細胞には、ヒト起源、ウシ起源、ブタ起源、サル起源および齧歯類起源の細胞株が含まれるが、これらに限定されない。細胞は接着性または非接着性であり得る。好適であり、かつ広範囲に入手可能である細胞および細胞株には、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＴＫ−）（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１．３）、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１．２）、ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５７３）、Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ８６）、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１７１）、ＣＰＡＥ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２０９）、Ｓａｏｓ−２（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−８５）、ＡＲＰＥ−１９ヒト網膜色素上皮（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２３０２）、ＧＨ３細胞および初代心筋細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【００８５】
様々な電位依存性イオンチャンネルを本発明において使用することができる。例えば、電位依存性ナトリウムチャンネル、電位依存性カリウムチャンネルおよび電位依存性カルシウムチャンネルが好適である。
【００８６】
本発明のいくつかの実施形態において、使用される細胞は、目的とする電位依存性イオンチャンネルを生来的に発現しない。代わりに、電位依存性イオンチャンネルをコードするＤＮＡが、電位依存性イオンチャンネルを細胞の形質膜に発現させるために、細胞にトランスフェクションされる。電位依存性イオンチャンネルをコードするＤＮＡは、この分野で広く知られている方法によって得ることができる。例えば、電位依存性イオンチャンネルをコードするｃＤＮＡフラグメントを、好適なプライマー対を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することによって好適なｃＤＮＡライブラリーから単離することができる。電位依存性イオンチャンネルをコードするｃＤＮＡフラグメントは、その後、好適な発現ベクターにクローン化することができる。プライマー対は、得ることが所望される電位依存性イオンチャンネルの知られているＤＮＡ配列に基づいて選択することができる。好適なｃＤＮＡライブラリーを、電位依存性イオンチャンネルをコードするｍＲＮＡを含有することが知られている細胞源または組織源から作製することができる。
【００８７】
当業者は、いくつかの電位依存性イオンチャンネルについて、機能的な電位依存性イオンチャンネルを得るために、２つ以上のサブユニットをトランスフェクションし、それにより、２つ以上のサブユニットを発現させることが望ましいことを知っている。例えば、Ｎ型カルシウムチャンネルは、α１Ｂサブユニット、α２δサブユニットおよびβ１サブユニットを少なくとも含有する多サブユニット複合体から構成される。他方で、Ｔ型カルシウムチャンネルは、１個のサブユニット（例えば、α１Ｇ、α１Ｈまたはα１Ｉ）だけで機能的である。目的とする電位依存性イオンチャンネルのサブユニット組成のこの分野での共通する知識により、当業者は、トランスフェクションされた細胞において正しいサブユニットを発現させることができる。
【００８８】
当業者は、電位依存性イオンチャンネルをコードするＤＮＡを得るために、発表された電位依存性イオンチャンネルの配列を使用して、ＰＣＲプライマーを設計することができ、そして電位依存性イオンチャンネルの発現の発表された研究を使用して、ｃＤＮＡライブラリーを作製するための適切な供給源を選択することができる。下記の刊行物は、これに関して有用であり得る：
米国特許第５，３８０，８３６号には、ラット心臓の電位依存性ナトリウムチャンネルをコードする核酸配列が記載されている。
【００８９】
米国特許第６，０３０，８１０号には、多数の電位依存性かつテトロドトキシン感受性のナトリウムチャンネルが記載されている。
【００９０】
米国特許第６，１８４，３４９号Ｂ１には、ＰＮ３として知られている、ヒトのテトロドトキシン抵抗性の末梢神経電位依存性ナトリウムチャンネルが開示されている。ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＦ１１７９０７もまた参照のこと。
【００９１】
Ｉｓｏｍら、１９９４、Ｎｅｕｒｏｎ、１２：１１８３〜１１９４には、ラットの電位依存性ナトリウムチャンネルβサブユニットが開示されている。
【００９２】
ＭａＣｌａｔｃｈｅｙら、１９９３、Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．、２：７４５〜７４９には、ヒトの電位依存性ナトリウムチャンネルβ１サブユニット（ｈＳＣＮβ１）が開示されている。
【００９３】
Ｉｓｏｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９２、２５６：８３９〜８４２には、ラット脳の電位依存性ナトリウムチャンネルβ１サブユニット（ｒＳＣＮβ１）が開示されている。
【００９４】
Ｍｉｓｇｅｌｄら、１９９５、Ｐｒｏｇ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、４６：４２３〜４６２；Ｎｏｒｔｈ、１９８９、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、９８：１３〜２３；Ｇａｈｗｉｌｅｒら、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：１５５８〜１５６２；Ａｎｄｒａｄｅら、１９８６、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３４：１２６１〜１２６５には、本発明の方法における使用のために好適である内向き整流性の電位依存性カリウムチャンネルが開示されている。
【００９５】
米国特許第５，８７４，２３６号および米国特許第５，４２９，９２１号には、ヒト電位依存性カルシウムチャンネルの様々なα１サブユニットおよびβサブユニットが記載されている。
【００９６】
米国特許第５，４０７，８２０号および米国特許第５，７１０，２５０号には、ヒト電位依存性カルシウムチャンネルのα２サブユニットが開示されている。
【００９７】
国際特許出願公開ＷＯ９８／１３４９０には、家族性片麻痺性片頭痛に関与する脳特異的なＰ／Ｑ型ヒト電位依存性カルシウムチャンネルが記載されている。
【００９８】
表１には、本発明における使用のために好適であるイオンチャンネル遺伝子の一覧が示される。
【００９９】
【表１】
2005514909.tif 000002
2005514909.tif 000003
2005514909.tif 000004
2005514909.tif 000005
2005514909.tif 000006
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2005514909.tif 000010
2005514909.tif 000011
【０１００】
ＰＣＲ反応は、ＡｍｐｌｉＴａｑ、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＧｏｌｄまたはＶｅｎｔポリメラーゼ（これらに限定されない）を含む様々な熱安定性酵素を用いて行うことができる。ＡｍｐｌｉＴａｑの場合、反応を、１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．３）、２．０ｍＭのＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、５０ｍＭのＫＣｌ、０．２μＭの各プライマー、１０ｎｇのＤＮＡテンプレート、０．０５ユニット／μｌのＡｍｐｌｉＴａｑにおいて行うことができる。反応液は９５℃で３分間加熱され、その後、９５℃で２０秒間、６２℃で２０秒間、７２℃で３分間（これらに限定されない）を含む好適なサイクル処理パラメーターを使用して３５回サイクル処理される。これらの条件に加えて、様々な好適なＰＣＲプロトコルを、ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（編集：Ｃ．Ｗ．ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＧ．Ｓ．Ｄｖｅｋｓｌｅｒ、１９９５年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）またはＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｍｉｃｈａｅｌら編、１９９０年、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）に見出すことができる。
【０１０１】
所望する電位依存性イオンチャンネルが実際に得られていることを確認し、予想外の変化がＰＣＲ反応によって配列に導入されていないことを確認するために、本明細書中に記載される方法によって得られる、電位依存性イオンチャンネルをコードするＤＮＡを配列決定することが望ましい。ＤＮＡは、好適なクローニングベクターまたは発現ベクターにクローン化することができ、例えば、哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、またはこの分野で知られているか、もしくは本明細書中に記載される他の発現ベクターにクローン化することができる。
【０１０２】
様々な発現ベクターを、本発明において使用される電位依存性イオンチャンネルをコードするＤＮＡを組換え発現させるために使用することができる。好適である市販の発現ベクターには、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐｃＤＮＡＩおよびｐｃＤＮＡＩａｍｐ、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＲ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７１９８）、ｐＣＩ．ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＴＲＥ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）、ｐＶ１Ｊｎｅｏ、ｐＩＲＥＳｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ｐＳＣ１１、ならびにｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）が含まれるが、これらに限定されない。ベクターの選択は、電位依存性イオンチャンネルを発現させることが所望される細胞タイプ、ならびに所望される発現レベルなどに依存する。
【０１０３】
発現ベクターは、電位依存性イオンチャンネルの一過性発現または安定発現を行わせるために使用することができる。トランスフェクションされているＤＮＡの一過性発現または安定発現はこの分野では広く知られている。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９５年、「哺乳動物細胞へのＤＮＡの導入」、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、９．５．１節から９．５．６節（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）を参照のこと。
【０１０４】
上記に記載されたＰＣＲ法に対する代替法として、イオンチャンネルをコードするｃＤＮＡクローンを、所望する電位依存性イオンチャンネルに対して特異的なオリゴヌクレオチドをプローブとして使用し、そしてオリゴヌクレオチドプローブを用いてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることに関してこの分野で広く知られている方法を使用してｃＤＮＡライブラリーから単離することができる。そのような方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．Ｍ．（編）、１９８５年、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＭＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕ．Ｋ．、第Ｉ巻、第ＩＩ巻）に記載されている。特定の電位依存性イオンチャンネルに対して特異的であり、かつｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用することができるオリゴヌクレオチドは、電位依存性イオンチャンネルの知られているＤＮＡ配列に基づいて容易に設計することができ、そしてこの分野で広く知られている方法によって合成することができる。
【０１０５】
本発明はまた、本明細書中に開示される方法とともに使用される装置を提供する。例えば、本発明は、事前に選択された電圧が電極間に加えられたとき、ウエル内の細胞の膜横断電位が変化するように配置された１対の電極がプレートの多数のウエルに含有されるマルチウエル組織培養プレートを提供する。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、マルチウエル組織培養プレートは、１対の電極の一方をウエルの底部に、そして１対の電極のもう一方をウエルの側面に含有する。この実施形態が図２Ｂに示される。
【０１０７】
他の実施形態において、マルチウエル組織培養プレートは１対の電極の両方をウエルの底部に含有する。この実施形態が図２Ｃに示される。
【０１０８】
マルチウエル組織培養プレートの他の実施形態において、１対の電極の一方が、ウエルの底部を形成する導電性材料の層であり、１対の電極のもう一方が上方からウエルに進入する。この実施形態が、図７、図１２および図１６に示される。
【０１０９】
マルチウエル組織培養プレートの他の実施形態において、１対の電極の両方が絶縁体に埋め込まれ、上方からウエルに進入する。この実施形態が図９および図１０に示される。
【０１１０】
マルチウエル組織培養プレートの他の実施形態において、上方からウエルに進入する電極は、絶縁体により囲まれた中心の導電性材料部分を有する。この実施形態が図８に示される。
【０１１１】
マルチウエル組織培養プレートの他の実施形態において、１対の電極の一方がウエルの底部を形成し、１対の電極のもう一方が上方からウエルに進入する。この実施形態が図７および図１０に示される。
【０１１２】
マルチウエル組織培養プレートの他の実施形態において、電極の対により、正極および負極の交互パターンがウエルにおいて形成される。この実施形態が図１６に示される。
【０１１３】
マルチウエル組織培養プレートの他の実施形態において、ウエルの底部を形成する導電性材料の層が、ガラス基体を覆うインジウムスズ酸化物の層である。好ましくは、導電性材料の層およびガラス基体は透明である。
【０１１４】
マルチウエル組織培養プレートの他の実施形態において、プレートの多数のウエルが、交互にかみ合う電極を含有する。この実施形態が図３および図５に示される。
【０１１５】
本発明は、事前に選択された電圧が電極間に加えられたとき、ウエル内の細胞の膜横断電位が変化するように、第１の電極および第２の電極が配置されているマルチウエル組織培養プレートであって、
ウエルの底部が、細胞を増殖させることができるフィルターメンブランであり、
ウエルが、流体を含有することができるトラフに位置し、
トラフには、第１の電極が含有され、
第２の電極が上方からウエルに進入する、
マルチウエル組織培養プレートを提供する。この実施形態が図８に示される。
【０１１６】
本発明はまた、本明細書中に開示されたマルチウエル組織培養プレートと、蛍光画像化装置との組合せで、蛍光画像化装置により、マルチウエル組織培養プレートのウエルからの蛍光読み取りを得ることができるように、マルチウエル組織培養プレートおよび蛍光画像化装置が互いに配置されている組合せを提供する。
【０１１７】
本発明はまた、上部基体および底部基体のそれぞれが、
多数の実質上のウエル、および
実質上のウエルの底部を形成する導電性材料の層
を含有する上部基体および底部基体の組合せで、
導電性材料の層が電極として機能し、その結果、事前に選択された電圧が電極間に加えられたとき、実質上のウエルにおける細胞の膜横断電位が変化するように、上部基体および底部基体における導電性材料の層がパルス発生器に接続されている、上部基体および底部基体の組合せを提供する。そのような組合せが図６および図１３に示される。
【０１１８】
本発明はまた、多数の一般には平行する正極および負極と、電極に対して一般には直角に配置された多数のスペーサーとによって形成される正方形または矩形のウエルを有する基体であって、
ウエルの１つの壁が正極により形成され、ウエルの反対側の壁が負極により形成され、
スペーサーが、電極により形成される壁に対して直角であるウエルの壁を形成し、
事前に選択された電圧が電極間に加えられたとき、ウエル内の細胞の膜横断電位が変化するように電極が配置されている、基体を提供する。そのような基体が図１に示される。
【０１１９】
本発明の別の実施形態の一例は、
目的とする電位依存性イオンチャンネルをその形質膜に有する少なくとも１０３個の生存している真核生物細胞が存在する上部表面を有する基体：
電圧が正極および負極を介して加えられたとき、細胞の膜横断電位が変化するように基体上または基体近くのいずれかに配置された多数の正極および多数の負極；
電位依存性イオンチャンネルの活性化因子または阻害剤であることが疑われる少なくとも１つの物質
を含み、
この場合、細胞が蛍光指示薬化合物を含有する。
【０１２０】
本発明の別の実施形態の一例は、
目的とする電位依存性イオンチャンネルをその形質膜に有する、ウエルあたり少なくとも１０３個の生存している真核生物細胞が存在する多数のウエルを有するマルチウエル組織培養プレート；
事前に選択された電圧が正極および負極を介して加えられたとき、細胞の膜横断電位が変化するように基体上または基体近くのいずれかに配置された多数の正極および多数の負極；
多数のウエルの少なくとも１つにおける、電圧依存性イオンチャンネルの活性化因子または阻害剤であることが疑われる少なくとも１つの物質
を含み、
細胞が蛍光指示薬化合物または電位感受性膜色素を含有する。
【０１２１】
下記の非限定的な実施例は、本発明をより良く例示するために示される。
【実施例１】
【０１２２】
図２４に、ＥＦＳ刺激を使用して高処理能スクリーニングを行うための好ましいシステムを示す。このシステムは、コンピューター２４０２と電気的に結合する任意波形発生器カード２４０４を含むコンピューター２４０２から構成される。この目的のために作られたソフトウエアが、任意波形発生器カード２４０４に適切な電気的刺激のパルス電圧波形（２４０６）を発生させるコンピューター２４０２に書き込まれていた。電圧波形（２４０６）が８個の定電流増幅器２４０８への入力に使用される。それぞれの定電流増幅器２４０８は９６ウエルサンプルフィルタープレート２４１０上の横列に出力する。増幅器２４１２からの出力は、電流パルスを電極２４１６に加えることがことができる電気的中継器２４１４の接点を通過する。
【０１２３】
波形発生器カード２４０４はまた、刺激によって刺激されることになるウエルのアドレスを表す７ビットの二進トランジスタ−トランジスタ論理ＴＴＬ値（２４１８）を生じさせる。さらに、トリガーパルス２４２０が発生させられる。マイクロプロセッサーコントローラー２４２２はトリガーパルス２４２０を待ち、この二進値（２４１８）を解釈して、サンプルウエルにおける電極接続ワイヤ２４１７を介して定電流パルス（２４２４）を特定の電極２４１６（１つまたは複数）に向かわせる適切な中継器２４１４に切り換える。電流は、増幅器の出力（２４２４）から、中継器接点２４１４を通って、ウエル２４２８内の電極２４１６および液体を通り、そしてウエルのメンブラン２４３０を通って、メンブラン２４３０下側の流体２４３２および帰還ワイヤ２４３４を介して戻る。１つの大きい共通する電流帰還トラフ２４３６が９６個の電極すべてにつながる。各サンプルウエルがそれ自身の隔離された電流帰還トラフおよび電流帰還ワイヤを有する他の配置が可能である。下記の実施例２を参照のこと。
【０１２４】
メンブラン２４３０下側の電流帰還トラフ２４３６は、光源２４４２からの励起光（２４４０）が透明なメンブラン２４３０を通ってガラス底部２４３８を通過し、メンブラン２４３０に接着した細胞２４４４を照らすことを可能にする透明なガラス底部２４３８を有する。細胞２４４４からの蛍光光（２４４６）がメンブラン２４３０およびガラス底部２４３８を通って戻り、検出器２４４８に進入する。好適な検出器には、上記で記載された検出器が含まれる。好ましい検出器には、ＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）蛍光画像化装置またはＶＩＰＲ（Ａｕｒｏｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）がある。
【０１２５】
パルス列が完了したとき、マイクロプロセッサーコントローラー２４２２は中継器２４１４を切り、定電流増幅器のパルス（２４２４）を電極２４１６から切離す。
【０１２６】
図２５および図２６を参照すると、図２５には、上部電極２５１６および第１の電極接続ワイヤ２５１７を含む電極ヘッド２５００の実施形態の写真が示されている。電極ヘッドは接地接点ロッド２５１０を含む。図２６には、図２５に示される電極ヘッド２５００の実施形態と一緒に使用されるトラフ実施形態２６００の写真が示されている。トラフ２６００は、電極ヘッド２５００における開口部２５２０を通る、電極ヘッドの整列および取り付けを助けるための支持ポスト２６１０を含む（図２８を参照のこと）。底部電極ワイヤ（隠されている）が、ＥＦＳシステムが組み立てられたとき（図２８を参照のこと）、塩／緩衝液の溶液に浸されると、ウエルのそれぞれに対する底部電極として作用するトラフに配置されている。底部電極ワイヤは位置２６３０において帰還接続ワイヤ２６２０と電気的に連絡している。帰還接続ワイヤは、ＥＦＳシステムが組み立てられたとき、接地接点パッド２５１０に固定される。トラフ２６００はまた、好ましくはガラスから作製された透明な底部部分２６４０を含む。
【０１２７】
図２７は、９６ウエル２７１０を有するＭｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ（商標）−ＢｌａｃｋＣＭ９６ウエルプレート２７００がトラフ２６００に配置されるトラフ実施形態２６００の写真を表す。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅのマルチスクリーンプレートおよびバイオポアメンブランに関する情報が、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ．ｃｏｍ／ｃａｔａｌｏｇｕｅ．ｎｓｆ／ｄｏｃｓ／Ｃ７７８１およびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ．ｃｏｍ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ．ｎｓｆ／ｄｏｃｓ／ｔｎ０６２において見出される。
【０１２８】
図２８は、ウエルプレート２７００を所定位置に有するトラフ２６００を含む組み立てられたＥＦＳシステム２８００の写真である。電極ヘッド２５００が、電極２４１６がウエルあたり１つの電極でウエル２７１０の中に挿入されるようにトラフ２６００の上部に固定される。電極ヘッド２５００は、留め具２８１０によって支持ポスト２６１０（隠されている）に固定される。留め具は、好ましくはねじ込みナットである。好ましくは、組立てに先立って、各ウエル２７１０（隠されている）には、ウエル２７１０（隠されている）の底部を覆うまでに培養された細胞が負荷されている。細胞が標準的かつ知られている条件のもとで培養された後、そしてＥＦＳユニット２８００が組み立てられる前に、それぞれの細胞は、好ましくは、細胞培地を除くために洗浄され、その後、細胞には、上記で議論されたように所定の緩衝液溶液が負荷される。
【０１２９】
図２９には、図２８に示される実施形態に類似する本発明の実施形態から得られたデータのグラフ表示が示されている。データは、ヒトＰＮ１電位依存性ナトリウムチャンネルを発現させるためにトランスフェクションされているＨＥＫ２９３細胞における膜電位の変化を表している。各プロットは９６ウエルプレートの横列（１２ウエル）ＡからＨを表している。９６ウエルプレートの各縦列データはＶＩＰＲ（商標）で１５秒間取得された。刺激パルスプロトコルが下記のようにデータ取得時に加えられた：２ｓのベースラインの後、２ｍｓの方形パルス、振幅＝２０ｍＡ、振動数＝１０Ｈｚ、持続時間＝５ｓ。当業者は、当該システムが１μｓから１ｓの間のパルスを発生させ得ることを、本明細書中の教示を考慮して、容易に理解する。好ましくは、発生させられるパルスは約０．１ｍｓから約１００ｍｓの間である。
【０１３０】
図３０は、図２９に示されているデータの最大比率変化の棒グラフ表示である。１μＭのＴＴＸ（テトロドトキシン（ＴＴＸ）感受性の電位依存性ナトリウムチャンネルの特異的かつ強力な阻害剤）が、Ｅ１、Ｆ１、Ｇ１、Ｈ１、Ａ１２、Ｂ１２、Ｃ１２およびＤ１２のウエルに存在する。さらに、ウエルＡ１１には、ＴＴＸ感受性の電位依存性ナトリウムチャンネルを阻止するための内部標準物が含有される。Ｚスコアは、非阻害シグナルおよび阻害シグナルの標準偏差の和により除された非阻害シグナルおよび阻害シグナルの差の尺度である。
【０１３１】
図３１には、ＨＥＫ２９３／ＰＮ１細胞におけるＥＦＳ刺激による脱分極シグナルに対するＴＴＸ（上パネル）および化合物Ａ（下パネル）の濃度を増大したときの影響が示されている。これらの実験で得られたＩＣ５０は、他の技術により得られたＩＣ５０と匹敵する。大きいヒル係数（ｎＨ）が、刺激プロトコルの閾値性質およびイオンチャンネル活性と膜電位との間における非線形的関係から得られる。
【実施例２】
【０１３２】
図３２は、別のＥＦＳシステム配置に関するＥＦＳ実施形態３２００の写真を表す。電極ヘッド２５００は、図２５において上記に記載された電極ヘッドと類似する。しかし、電極、ウエルおよびトラフの配置は、電場をさらに離すために異なって設計されている。これにより、ウエル間の混線および干渉が減少する。この実施形態のために、本発明者らは、ＥＦＳシステムとしての使用のためにＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＭｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ（商標）Ｃａｃｏ−２アッセイシステムを改造した。Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ（商標）Ｃａｃｏ−２アッセイシステムに関する情報をｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ．ｃｏｍ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ．ｎｓｆ／ｄｏｃｓ／ＰＦ１７８０ＥＮ００において見出すことができる。標準的な市販のＣａｃｏ−２プレートシステムは、２つのプレート、すなわち、メンブラン底部の細胞増殖プレートと、９６ウエルの受容トレーとを含む。Ｃｏｃａ−２システムの他にない特徴の１つは、各ウエルが、各ウエルに底部側面からつながる個々の対応するトラフを有するということである。従って、そのことは、ウエルのすべてが置かれる共通トラフが必要であることに取って代わる。この実施形態により、上部電極２５１６が、メンブラン底部の細胞増殖プレート（隠されている）におけるウエルのそれぞれに配置される。各ウエルに対する底部電極を確立するために、導電性電極プレート３２２０が提供される。導電性電極プレート３２２０は一連のウエル開口部３２３０を含み、これにより、個々のウエルの中への上部電極２４１０のアクセスが組立て時にもたらされる。導電性電極プレート３２２０はまた、それに固定され、かつ位置３２４０において下方向に延びる一連の導電性のピン（隠されている）を含む。これらの導電性ピンは、メンブラン底部の細胞増殖プレート（示されず）の底部側面のアクセスポートを介して挿入される。
【０１３３】
図３３は、導電性電極プレート３２２０の底部を示すものであり、頁から読者の方に向かって延びている導電性ピン３３１０を示している。図３４は、メンブラン底部の細胞増殖プレート３４１０および９６ウエル受器トレー３４２０の上に正しく配置された導電性電極プレート３２２０の側面図を示す。導電性電極プレート３２２０がメンブラン底部の細胞増殖プレート３４１０の上に正しく配置されたとき、導電性ピン３３１０が、底部側面のアクセスポート（示されず）を介して９６ウエル受容トレーの個々のトラフ領域（示されず）に挿入される。個々のトラフ領域が適切な溶液で満たされたとき、個々のトラフ領域は各ウエルの底部および個々のピンと接触する。従って、ウエルおよびトラフ領域が溶液で満たされたとき、電流が、操作時に上部電極から下部電極に流れることができる。図３５は、組み立てられたＥＦＳシステムの側面図である。組み立てられたシステムは、９６ウエルトレー３４２０に配置されたメンブラン底部の細胞増殖プレート３４１０を含む。電極プレート３２２０がメンブラン底部のウエルプレート３４１０の上に載せられる。電極ヘッド２５００が、電極プレート３２２０の上に載せられて示される。
【０１３４】
上記の実施例１および実施例２ならびに本明細書のどこかに記載されるＥＦＳシステムに対する１つの明らかな利点は、細胞に対して接線方向とは対照的に、細胞を横断する均一な電場を生じさせることができることである。細胞を横断する電場を発生させることは、マルチウエル形式での電極の新規な「上部から底部への」設置によって可能になる。
【実施例３】
【０１３５】
図３６には、新規な電極実施形態３６００が示されている。図３６Ａは電極３６００の拡大図を示す。電極３６００は、プレート間に低誘電性のプレートまたはディスク３６２０を有する２つの平行するプレート３６１０およびプレート３６３０を含む。任意に、電極は絶縁性材料でコーティングされ得る。この設計の潜在的な利点は、特別なマルチウエルプレートを必要としないということである。すなわち、細胞が付着し、かつ刺激光および放射光が通過する任意のプレートを使用することができる。長いインキュベーションのとき、化合物を吸収し得るか、または化合物を通過させ得るフィルターがウエルには存在しない。コーティングされた電極の場合、ｄｃ電流の場合でさえ、そして長期間の刺激の場合でさえ、ほとんど電流が使用されず、そして抵抗発熱が減少する。キャパシタンス電流は十分に低いので、この利点はａｃ電流にも適用される。シールされた電極は、より均一な刺激のために、細胞層の非常に近いところへの設置を可能にする。
【０１３６】
何らかの理論によってとらわれるものではないが、細胞に与えられる電場が均一であるほど、細胞に対する電位調節のより正確な指示が達成されることが考えられる。すなわち、電場が均一であるほど、本明細書中に示される方法のいずれかによって、例えば、蛍光によって観測されるような電位調節は、細胞膜におけるイオンチャンネルの実際の調節とより直接的に相関し、そして、交差干渉、交差照明、色素効果、色素溶出、またはシステムにおける任意の他の妨害によって引き起こされるシステムにおけるバックグラウンドノイズとの相関がより小さくなる。細胞に加えられる電場の均一性を増大させるための１つの方法は、電極の１つ以上を、細胞の非常に近いところに置くか、または細胞と接触させて置くことである。しかし、これは、システムにおける機能停止をもたらす有害な方法で細胞に影響を及ぼし得る。電極を細胞に非常に接近させること、または電極を細胞と接触させることに関連する問題のいくつかは、例えば、電極における抵抗発熱および酸化および気泡形成が原因である。図８、図１１、図２４から図２８および図３２から図３５に教示されるような本発明の実施形態は、電極を細胞と接触させることなく、または電極を細胞の非常に近いところに置くことなく、細胞を横断する均一な電場を達成するので、特に好ましい。さらに、図３６に示される新規な電極設計は、細胞の抵抗発熱、酸化または気泡形成の問題を生じさせることなく、電極を細胞の非常に近いところに置くことを可能にすることによって、均一な電場を達成する。
【０１３７】
本発明のＥＦＳシステム実施形態は、１つ以上の電場が、観測領域について、任意の時間における平均電場から約３０％以下変化する実質的に均一な電場をもたらすと考えられる。割合は二次元での測定によって求められ、または好ましくは、変動が三次元で計算される。より好ましい実施形態において、１つ以上の電場は、観測領域について、任意の時間における平均電場から約１５％以下変化する。さらにより好ましい実施形態において、１つ以上の電場は、観測領域について、任意の時間における平均電場から約１０％以下変化する。最適な実施形態において、変動は平均から５％以下である。
【０１３８】
コンデンサとの類似性が明らかであるが、プレート３６１０とプレート３６３０との間における低誘電体３６２０は、これらのプレートの間に電荷を維持するために必要とされるだけの小さい電流でこれらのプレートを先ず充電させるために必要とされる電流の量を減少させる。細胞を脱分極させるために使用することができる外部電場が作製される。外部電場密度は、本物のコンデンサに関して使用されるようなプレート間の高誘電体によって低下し、そしてテフロンもしくはマイラーなどの低誘電体で、または誘電体の非存在下で最大になる。外部電場密度は、これらのプレートを非常に接近させて緊密に設置することによってさらに高まるが、最適な分離は経験的に決定することができる。
【０１３９】
図３６Ｂには、並行リード線のデザインを含む実施形態が示される。並行リード線は内側ワイヤ３６５５および外側ワイヤ３６５０を含む。内側ワイヤは上部プレート３６１０および誘電性プレート３６２０を通り抜け、底部プレート３６３０に取り付けられるか、または底部プレート３６３０と一体化される。外側ワイヤは上部プレート３６１０に取り付けられるか、または上部プレート３６１０と一体化される。当業者は、リード線の前記配置が逆にできることを理解する。図３６Ｃには、端部リード線３６６０および３６６５を含む実施形態が示される。端部リード線３６６０は上部プレート３６１０に取り付けられるか、または上部プレート３６１０と一体化され、端部リード線３６６５は底部プレート３６３０に取り付けられるか、または底部プレート３６３０と一体化される。
【０１４０】
本発明の実施形態のいくつかには、下記が含まれる：
候補化合物の生物学的活性を特徴づける方法であって、
１個以上の細胞を前記化合物にさらすこと；前記１個以上の細胞を１つ以上の電場に繰り返しさらして、前記１個以上の細胞の膜横断電位の制御された変化を生じさせるようにすること；およびパッチクランプを使用することなく、前記１個以上の細胞の膜横断電位の変化をモニターすること、を含む方法。
【０１４１】
モニターすることが、前記１個以上の細胞を含有する観測領域からの蛍光放射を検出することを含む、上記方法。
【０１４２】
電場が二相性である、上記方法。
【０１４３】
不可逆的な細胞のエレクトロポレーションを最小限に抑えるように電場強度の空間的変動を制限することをさらに含む、上記方法。
【０１４４】
１つ以上の電場が、目的とするイオンチャンネルを異なる電位依存性状態の間で循環させることができる、上記方法。
【０１４５】
１つ以上の電場が目的とするイオンチャンネルを開口させる、上記方法。
【０１４６】
１つ以上の電場が目的とするイオンチャンネルを不活性化から解放させる、上記方法。
【０１４７】
１つ以上の細胞が、ＦＲＥＴに基づく電圧センサ、エレクトロクロミック性膜横断電位色素、膜横断電位再分配色素、イオン感受性の蛍光分子または発光分子、および放射性イオンからなる群から選択される電圧センサを含む、上記方法。
【０１４８】
１つ以上の細胞が電位調節型イオンチャンネルを含む、上記方法。
【０１４９】
電位調節型イオンチャンネルが、カリウムチャンネル、カルシウムチャンネル、塩素イオンチャンネルおよびナトリウムチャンネルからなる群から選択される、上記方法。
【０１５０】
電場が、観測領域において、その領域における平均強度から約２５％未満の、強度の制限された空間変動を示す、上記方法。
【０１５１】
１つ以上の電場が、観測領域について、任意の時間における平均電場から大きくても約１５％変化する、上記方法。
【０１５２】
１つ以上の電場が、観測領域について、任意の時間における平均電場から大きくても約５％変化する、上記方法。
【０１５３】
１つ以上の電場が、方形波形、正弦波形または鋸波形のいずれかによる刺激を含む、上記方法。
【０１５４】
１つ以上の電場が約１０Ｖ／ｃｍから約１００Ｖ／ｃｍの範囲内の振幅を有する、上記方法。
【０１５５】
１つ以上の電場が約２０Ｖ／ｃｍから約８０Ｖ／ｃｍの範囲内の振幅を有する、上記方法。
【０１５６】
１つ以上の電場が、前記１個以上の細胞の膜横断時定数の逆数よりも大きいか、またはそのような逆数と等しい刺激振動数で繰り返される、上記方法。
【０１５７】
１つ以上の電場が０ｋＨｚから１ｋＨｚの範囲内の刺激振動数で繰り返される、上記方法。
【０１５８】
１つ以上の電場が約１００マイクロ秒から約２０ミリ秒の範囲内のパルス持続時間を有する、上記方法。
【０１５９】
膜横断電位が前記１個以上の細胞の形質膜全体に現れる、上記方法。
【０１６０】
標的イオンチャンネルに対する化合物の生化学的活性をアッセイする方法であって、
前記標的イオンチャンネルの選択された電位依存性状態に対応する正常な静止膜横断電位を有する細胞株を選択すること；前記選択された細胞株の細胞集団において前記標的イオンチャンネルを発現させること；前記細胞集団を前記化合物にさらすこと；前記細胞集団を１つ以上の電場にさらして、前記１個以上の細胞の膜横断電位の制御された変化を生じさせるようにすること；および、前記１個以上の細胞の膜横断電位の変化をモニターすること、を含む方法。
【０１６１】
標的イオンチャンネルが前記細胞株において外因的に発現させられる、上記方法。
【０１６２】
細胞株が、前記標的イオンチャンネルをコードする核酸でトランスフェクションされる、上記方法。
【０１６３】
細胞株が意味のないレベルの他のイオンチャンネルを発現する、上記方法。
【０１６４】
細胞株が、ＣＵＬ、ＬＴＫ（−）およびＣＨＯ−Ｍからなる群から選択される、上記方法。
【０１６５】
標的イオンチャンネルがナトリウムチャンネルであり、前記細胞集団が、ＣＨＬ細胞、ＬＴＫ（−）細胞およびＣＨＯ−Ｋ１細胞からなる群から選択される、上記方法。
【０１６６】
標的イオンチャンネルがナトリウムチャンネルであり、前記細胞集団が、ＨＥＫ−２９３細胞、ＲＢＬ細胞、Ｆ１１細胞およびＨＬ５細胞からなる群から選択される、上記方法。
【０１６７】
標的イオンチャンネルがカリウムチャンネルであり、前記細胞集団が、ＣＨＬ細胞、ＬＴＫ（−）細胞およびＣＨＯ−Ｋ１細胞からなる群から選択される、上記方法。
【０１６８】
標的イオンチャンネルがカルシウムチャンネルであり、前記細胞集団が、ＣＨＬ細胞、ＬＴＫ（−）細胞およびＣＨＯ−Ｋ１細胞からなる群から選択される、上記方法。
【０１６９】
イオンチャンネルの活性をアッセイする方法であって、
少なくとも１個の細胞を多数の電場パルスにさらして、膜横断電位の制御された変化を生じさせるようにし、かつ目的とするイオンチャンネルを活性化させるようにすること；およびパッチクランプを使用することなく、膜横断電位における１つ以上の変化を検出することによってイオンチャンネルの活性を検出すること、を含む方法。
【０１７０】
少なくとも１個の細胞が、ＦＲＥＴに基づく電圧センサ、エレクトロクロミック性膜横断電位色素、膜横断電位再分配色素、イオン感受性の蛍光分子または発光分子、および放射性イオンからなる群から選択される電圧センサを含む、上記方法。
【０１７１】
電圧センサが、ＦＲＥＴに基づく電圧センサを含む、上記方法。
【０１７２】
目的とするイオンチャンネルが電位調節型イオンチャンネルである、上記方法。
【０１７３】
多数の電場パルスにより、目的とする前記イオンチャンネルが異なる電位依存性状態の間で循環させられる、上記方法。
【０１７４】
少なくとも１個の細胞が真核生物細胞である、上記方法。
【０１７５】
少なくとも１個の細胞が非興奮性細胞である、上記方法。
【０１７６】
少なくとも１個の細胞が原核性物細胞である、上記方法。
【０１７７】
少なくとも１個の細胞が組織培養細胞である、上記方法。
【０１７８】
少なくとも１個の細胞が初代細胞株である、上記方法。
【０１７９】
少なくとも１個の細胞が無傷の生存生物の一部である、上記方法。
【０１８０】
イオンチャンネルの活性をアッセイする方法であって、
選択された標的イオンチャンネルを少なくとも１個の細胞において発現させること；選択された対向イオンチャンネルを前記少なくとも１個の細胞において発現させること；前記少なくとも１個の細胞を多数の電場パルスにさらして、膜横断電位の制御された変化を生じさせるようにし、かつ前記対向イオンチャンネルを活性化させるようにすること；および前記少なくとも１個の細胞の膜横断電位をモニターすること、を含む方法。
【０１８１】
膜横断電位の変化が、目的とする前記イオンチャンネルが阻止されたときに検出される、上記方法。
【０１８２】
目的とするイオンチャンネルがリガンド依存性イオンチャンネルを含む、上記方法。
【０１８３】
対向チャンネルがナトリウムチャンネルを含む、上記方法。
【０１８４】
細胞の膜横断電位を変化させる方法であって、
二相性の電場パルスを前記細胞に繰り返し加えることを含み、前記パルスが約９０Ｖ／ｃｍ未満の最大振幅を有し、前記パルスが少なくとも約１個／秒の割合で加えられ、各パルスの総持続時間が少なくとも約１ミリ秒である、方法。
【０１８５】
最大振幅が約２０Ｖ／ｃｍから４０Ｖ／ｃｍである、上記方法。
【０１８６】
パルス持続時間が相あたり約２ミリ秒から１０ミリ秒である、上記方法。
【０１８７】
パルスが約２０パルス／秒から１００パルス／秒の割合で加えられる、上記方法。
【０１８８】
候補化合物の生物学的活性を特徴づける方法であって、
１個以上の細胞をサンプルウエル内の観測領域に入れること；前記１個以上の細胞を前記化合物にさらすこと；前記１個以上の細胞を一連の二相性電場に約２０パルス／秒から１００パルス／秒の割合で繰り返しさらすこと、ここにおいて、前記電場は、観測領域において、その領域における平均強度から約２５％未満の、強度の制限された空間的変動を示し、および前記電場により、前記１個以上の細胞の膜横断電位の制御された変化がもたらされる；および、前記１個以上の細胞を含有する観測領域からの、ＦＲＥＴに基づく電圧センサの蛍光放射を検出することによって、前記１個以上の細胞の膜横断電位の変化をモニターすること、を含む方法。
【０１８９】
１つ以上の電場パルスが目的とするイオンチャンネルを開口させる、上記方法。
【０１９０】
１つ以上の電場パルスが目的とするイオンチャンネルを不活性化から解放させる、上記方法。
【０１９１】
１個以上の細胞が電位調節型イオンチャンネルを含む、上記方法。
【０１９２】
電位調節型イオンチャンネルが、カリウムチャンネル、カルシウムチャンネル、塩素イオンチャンネルおよびナトリウムチャンネルからなる群から選択される、上記方法。
【０１９３】
１つ以上の電場が、観測領域について、任意の時間における平均電場から多くても約１５％変化し得る、上記方法。
【０１９４】
１つ以上の電場が、観測領域について、任意の時間における平均電場から多くても約５％変化する、上記方法。
【０１９５】
１つ以上の電場が、方形波形、正弦波形または鋸波形から選択される、上記方法。
【０１９６】
ウエルに存在する細胞が観測領域において光学的に測定可能である高透過率部分を有する多数のウエル；前記多数のウエルのそれぞれにおける２つの電極；前記高透過率部分を介して前記ウエルから発する光を検出するように設計された光学検出器；前記電極に接続された電源装置、ただし、前記電源装置および前記電極は、一連の電場を前記観測領域内の細胞に加えるために設計され、この場合、前記電場は、前記観測領域内の平均電場強度の約２５％未満の空間的変動を有し、前記電場は、前記細胞の一部の膜横断電位を制御可能に変化させるために効果的であり；前記高透過率部分を介して前記ウエルから発する前記光を、前記膜横断電位変化から生じるイオンチャンネル活性として解釈するために設計されたデータ処理ユニット、を含む、高処理能スクリーニングシステム。
【０１９７】
多数のウエルがマルチウエルプレートに設置される、上記高処理能スクリーニングシステム。
【０１９８】
前記高透過率部分が、ガラス、石英、シクロオレフィン、アクラー（Ａｃｌａｒ）、ポリプロピレン、ポリエチレンおよびポリスチレンからなる群から選択される材料から作製される、上記高処理能スクリーニングシステム。
【０１９９】
前記高透過率部分が、２５０ｎｍから４００ｎｍの範囲のＵＶ光で励起されたとき、ポリスチレンよりも少ない蛍光を示す、上記高処理能スクリーニングシステム。
【０２００】
電極が前記多数のウエルのウエルに設置される、上記高処理能スクリーニングシステム。
【０２０１】
電極が前記多数のウエルの底部層に設置される、上記高処理能スクリーニングシステム。
【０２０２】
マルチウエルプレートが９６個までのウエルを含む、上記高処理能スクリーニングシステム。
【０２０３】
マルチウエルプレートが９６個よりも多くのウエルを含む、上記高処理能スクリーニングシステム。
【０２０４】
マルチウエルプレートが３８４個よりも多くのウエルを含む、上記高処理能スクリーニングシステム。
【０２０５】
電極が、金、白金、パラジウム、クロム、モリブデン、イリジウム、タングステン、タンタルおよびチタンからなる群から選択される材料から作製される、上記高処理能スクリーニングシステム。
【０２０６】
マルチウエルプレートが、光の透過を低下させるための光学的に不透明な材料または色素を含む、上記高処理能スクリーニングシステム。
【０２０７】
電極が約１ｍｍから４ｍｍの範囲内の隙間によって隔てられる、上記高処理能スクリーニングシステム。
【０２０８】
電極が約０．１ｍｍから１ｍｍの範囲内の隙間によって隔てられている、上記高処理能スクリーニングシステム。
【０２０９】
電極が約０．０１ｍｍから０．１ｍｍの範囲内の隙間によって隔てられている、上記高処理能スクリーニングシステム。
【０２１０】
電極が、５Ｖ／ｃｍから１００Ｖ／ｃｍの間の電場強度を前記隙間を横切って生じさせるために充電され、ウエルの内部と流体的に接続されている電気導電性材料の表面領域を横断して移された総電荷が１００μＣ／ｍｍ２以下である、上記高処理能スクリーニングシステム。
【０２１１】
多数のウエルが、前記ウエル内に観測領域を生じさせるように配置および設計された絶縁体をさらに含み、ただし、電気導電性材料の前記少なくとも２つの細片が、５Ｖ／ｃｍから１００Ｖ／ｃｍの間の電場強度を前記隙間を横切って生じさせるために充電されたとき、電場強度が平均電場強度から多くても１０％未満変化し、そしてウエルの内部と流体的に接続されている電気導電性材料の表面領域を横断して移された総電荷が１００μＣ／ｍｍ２以下である、上記高処理能スクリーニングシステム。
【０２１２】
多数のウエルが少なくとも２つのサテライト電気導電体をさらに含む、上記高処理能スクリーニングシステム。
【０２１３】
高処理能スクリーニングシステムであって、
サンプルウエル；試薬および／または細胞を前記サンプルウエルに加えるための液体取扱い装置；およびイオンチャンネルの活性を選択的に生じさせるように前記サンプルウエル内の細胞の膜横断電位を制御するための手段；前記膜横断電位の変化を光学的にモニターするための手段、を含むシステム。
【０２１４】
前記手段が、観測領域内の平均電場強度の約２５％未満の空間的変動を有する電場を生じさせるように設計された電極を含む、上記高処理能スクリーニングシステム。
【０２１５】
膜横断電位を制御するための手段が電極アレイアセンブリを含む、上記高処理能スクリーニングシステム。
【０２１６】
電極アセンブリアレイが８個の電極アセンブリを含む、上記高処理能スクリーニングシステム。
【０２１７】
電極アセンブリアレイが９６個の電極アセンブリを含む、上記高処理能スクリーニングシステム。
【０２１８】
電極アセンブリアレイが９６個よりも多くの電極アセンブリを含む、上記高処理能スクリーニングシステム。
【０２１９】
前記電極アセンブリをマルチウエルプレートのウエルの中に入れたり、またはマルチウエルプレートのウエルから出したりするための手段をさらに含む、上記高処理能スクリーニングシステム。
【０２２０】
膜横断電位を制御するための手段が、２つの実質的に平行する平面状表面を有する電気導電体を含む、上記高処理能スクリーニングシステム。
【０２２１】
電気導電体が１ｍｍから４ｍｍの範囲内の隙間によって隔てられている、上記高処理能スクリーニングシステム。
【０２２２】
電気導電体が０．１ｍｍから１ｍｍの範囲内の隙間によって隔てられている、上記高処理能スクリーニングシステム。
【０２２３】
電気導電体が第１の絶縁体をさらに含む、上記高処理能スクリーニングシステム。
【０２２４】
第１の絶縁体が、前記電気導電体の前記実質的に平行する平面状表面に対して直角に配置され、かつ互いに関して実質的に平行する２つの平面状表面を含む、上記高処理能スクリーニングシステム。
【０２２５】
電気導電体が、前記少なくとも２つの電気伝導体に取り付けられた第２の絶縁体をさらに含み、前記第２の絶縁体が前記少なくとも２つの電気伝導体の間における前記隙間に置かれて、前記少なくとも２つの電気伝導体の間における前記水溶液の深さを規定する、上記高処理能スクリーニングシステム。
【０２２６】
第１の絶縁体が低蛍光性材料から構成され、前記低蛍光性材料が、２５０ｎｍから４００ｎｍの範囲のＵＶ光で励起されたとき、匹敵するサイズのポリスチレンよりも少ない蛍光を示す、上記高処理能スクリーニングシステム。
【０２２７】
第２の絶縁体が低蛍光性材料から構成され、前記低蛍光性材料が、２５０ｎｍから４００ｎｍの範囲のＵＶ光で励起されたとき、匹敵するサイズのポリスチレンよりも少ない蛍光を示す、上記高処理能スクリーニングシステム。
【０２２８】
第１の絶縁体が、プラスチック、ガラスおよびセラミックからなる群から選択される絶縁体を含む、上記高処理能スクリーニングシステム。
【０２２９】
プラスチックが、ナイロン、ポリスチレン、テフロン（テトラフルオロエチレン）、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニルおよびシクロオレフィンからなる群から選択される、上記高処理能スクリーニングシステム。
【０２３０】
電気導電体が、金、白金、チタン、タングステン、モリブデン、イリジウム、バナジウム、Ｎｂ、Ｔａ、ステンレススチール、およびグラファイトからなる群から選択される導電体を含む、上記高処理能スクリーニングシステム。
【０２３１】
電気導電体が、電気分解を減少させるための表面処理物を含む、上記高処理能スクリーニングシステム。
【０２３２】
電気分解を減少させるための表面処理物が、白金ブラック、金ブラック、イリジウム／酸化イリジウム、チタン／窒化チタンまたはポリピロール薄膜を含む、上記高処理能スクリーニングシステム。
【０２３３】
前記少なくとも２つの電気導電体が、５Ｖ／ｃｍから１００Ｖ／ｃｍの間の電場強度を前記隙間を横切って生じさせるために充電されたとき、電場強度が平均電場強度から多くても１０％変化し、そして前記水溶液と接触している電気導電体の表面領域を横断して移された総電荷が１００μＣ／ｍｍ２以下である、上記高処理能スクリーニングシステム。
【０２３４】
前記少なくとも２つの電気導電体が、５Ｖ／ｃｍから１００Ｖ／ｃｍの間の電場強度を前記隙間を横切って生じさせるために充電されたとき、電場強度が平均電場強度から多くても５％変化し、そして前記水溶液と接触している電気導電体の表面領域を横断して移された総電荷が１００μＣ／ｍｍ２以下である、上記高処理能スクリーニングシステム。
【０２３５】
標的イオンチャンネルに対して多数の薬物候補化合物をスクリーニングする方法であって、
前記標的イオンチャンネルを宿主細胞集団において発現させること；多数の前記宿主細胞を多数のサンプルウエルのそれぞれに入れること；候補薬物化合物を前記多数のサンプルウエルの少なくとも１つに加えること；および前記標的イオンチャンネルの事前に選択された電位依存性状態に対応するレベルに前記膜横断電位を設定するように電場を繰り返し加えることによって前記多数のサンプルウエルにおける宿主細胞の膜横断電位を調節するすること、を含む方法。
【０２３６】
前記標的イオンチャンネルの第２の事前に選択された電位依存性状態に対応する正常な静止膜横断電位を有する宿主細胞株を選択することをさらに含む、上記方法。
【０２３７】
電場が二相性である、上記方法。
【０２３８】
電場が、目的とするイオンチャンネルを異なる電位依存性状態の間で循環させる、上記方法。
【０２３９】
電場が、目的とするイオンチャンネルを開口させる、上記方法。
【０２４０】
電場が、目的とするイオンチャンネルを不活性化から解放させる、上記方法。
【０２４１】
１個以上の細胞が、ＦＲＥＴに基づく電圧センサ、エレクトロクロミック性膜横断電位色素、膜横断電位再分配色素、イオン感受性の蛍光分子または発光分子、および放射性イオンからなる群から選択される電圧センサを含む、上記方法。
【０２４２】
標的イオンチャンネルが、カリウムチャンネル、カルシウムチャンネル、塩素イオンチャンネルおよびナトリウムチャンネルからなる群から選択される、上記方法。
【０２４３】
１つ以上の電場が、方形波形、正弦波形または鋸波形のいずれかによる刺激を含む、上記方法。
【０２４４】
１つ以上の電場が約１０Ｖ／ｃｍから約１００Ｖ／ｃｍの範囲内の振幅を有する、上記方法。
【０２４５】
１つ以上の電場が約２０Ｖ／ｃｍから約８０Ｖ／ｃｍの範囲内の振幅を有する、上記方法。
【０２４６】
電極がその中に置かれている少なくとも１つのウエルを含むアッセイプレートと電極とのアセンブリであって、前記電極がウエルの底部表面に対して配置されて、前記底部表面の表面積の少なくとも約２０％にわたって、平均電場強度から約１０％未満変化する電場が前記底部表面に隣接して提供される、アセンブリ。
【０２４７】
電極が、前記電極の底部端が前記底部表面に隣接するが、前記底部表面と接触しないように、前記ウエル中に下方に延びるプレート電極を含む、上記アセンブリ。
【０２４８】
サンプルウエルあたり２つの電極を含む上記アセンブリ。サンプルウエルあたり３つ以上の電極を含む上記アセンブリ。
【０２４９】
電極が前記ウエルの前記底部表面に置かれる上記アセンブリ。底部表面が大きい光学的透過率部分を含む上記アセンブリ。
【０２５０】
高透過率部分が、ガラス、石英、シクロオレフィン、アクラー（Ａｃｌａｒ）、ポリプロピレン、ポリエチレンおよびポリスチレンからなる群から選択される材料から作製される、上記アセンブリ。
【０２５１】
高透過率部分が、２５０ｎｍから４００ｎｍの範囲のＵＶ光で励起されたとき、ポリスチレンよりも少ない蛍光を示す、上記アセンブリ。
【０２５２】
電極が前記多数のウエルの壁に配置される、上記アセンブリ。
【０２５３】
プレートが９６個までのウエルを含む、上記アセンブリ。
【０２５４】
プレートが９６個よりも多くのウエルを含む、上記アセンブリ。
【０２５５】
プレートが３８４個よりも多くのウエルを含む、上記アセンブリ。
【０２５６】
電極が、金、白金、パラジウム、クロム、モリブデン、イリジウム、タングステン、タンタルおよびチタンからなる群から選択される材料から作製される、上記アセンブリ。
【０２５７】
電極が約１ｍｍから４ｍｍの範囲内の隙間によって隔てられる、上記アセンブリ。
【０２５８】
電極が約０．１ｍｍから１ｍｍの範囲内の隙間によって隔てられている、上記アセンブリ。
【０２５９】
電極が約０．０１ｍｍから０．１ｍｍの範囲内の隙間によって隔てられている、上記アセンブリ。
【０２６０】
マルチウエルプレート用の底部パネルであって、
ウエル存在位置に対応する位置にある少なくとも１つの横列の高透過率領域；前記横列に沿って広がり、前記ウエル存在位置の第１の部分と重なる導電性材料の第１の細片；および前記横列に沿って広がり、前記ウエル存在位置の第２の部分と重なる導電性材料の第２の細片、を含む底部パネル。
【０２６１】
前記第１の細片の一方の端部に近い第１の電気的接点と、前記第２の細片の一方の端部に近い第２の電気的接点とをさらに含む、上記底部パネル。
【０２６２】
サンプルウエル；前記サンプルウエル内に配置された第１の１対の電極；前記サンプルウエル内に配置された少なくとも１つのさらなるサテライト電極、を含むアッセイ装置。
【０２６３】
少なくとも１つのさらなるサテライト電極が第２および第３の１対の電極を含む、上記アッセイ装置。
【０２６４】
サテライト電極が、第１の１対の電極の電位よりも低い電位に充電される、上記アッセイ装置。
【０２６５】
電極がウエルの底部表面に対して配置されて、前記底部表面の表面積の少なくとも約２０％について、平均電場強度から約１０％未満変化する電場が前記底部表面に隣接して提供される、上記アッセイ装置。
【０２６６】
本発明は、本明細書中に記載される具体的な実施形態によって範囲が限定されるものではない。実際、本明細書中に記載される改変に加えて、本発明の様々な改変が、前記の記載から当業者には明らかになる。そのような改変は、添付された請求項の範囲に含まれるものとする。
【０２６７】
様々な刊行物が本明細書中に引用されているが、それらの開示はその全体が参照して組み込まれる。さらに、一般的な情報のために、ＰＣＴ公開番号ＰＣＴ／ＵＳ０１／２１６５２は、正確であり、かつ本明細書中の教示と矛盾しない限りにおいてその全体が本明細書中に組み込まれる。本明細書中で議論されているか、または本明細書中に引用されている特許、特許出願、刊行物、書籍および参考文献はすべて、個々の刊行物または特許出願のそれぞれが具体的かつ個々にその全体が示されているかのようにそれと同じ程度に参照して組み込まれることが理解される。さらに、発明の開示宣言、引用参考文献の審査官による要約において引用されているか、またはそれ以外の場合には、本出願のファイル履歴に入れられる参考文献、特許、特許出願および他の文書はすべて、本出願に対する優先権を主張する後願の利益のために、本出願に参照して組み込まれるために採用される。最後に、具体的に定義されていない用語はすべて、この開示における使用により示される意味を有することが最初に理解され、そしてそのような意味が推測できない場合には、それらの通常の意味を有することが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０２６８】
【図１】図１Ａは、本発明の１つの実施形態の上面図を示す。この実施形態は、約２５μｍから１００μｍの隙間４が電極間に存在するように間隔が置かれた金の正極２および金の負極３がその内部またはその表面に存在するガラス製スライドガラス１を含む。電極に対して一般に直角に配置されたスペーサー５（この場合にはプラスチック細片として示される）と一緒になって、電極は、細胞を入れ、かつ／または増殖させることができる、深さが約１００μｍである一連のウエル６を規定する。図１Ｂは、図１Ａの実施形態の断面側面図を示す。この実施形態では、正極および負極の実体は、所望する場合には互いに入れ替えることができる。電極は金から作製される必要はなく、他の導電性材料を使用することができる。また、スペーサーはプラスチックである必要はなく、他の非導電性材料を使用することができる。
【図２Ａ】図２Ａは、典型的な９６ウエルプレートが電極を各ウエル内に含有する本発明の実施形態の上面図を示す。ウエルは、ウエルの側面２における第１の電極１（この場合には正極として示される）と、ウエルの底部４における第２の電極３（この場合には負極として示される）と、ウエルの底部における必要に応じて使用される絶縁性材料５の細片と、ウエルの底部での細胞６とを有する。１個の細胞が単に例示の便宜のために示されており、ほとんどの場合には多数の細胞がウエルの底部に存在する。ウエルの側面２は、プラスチックなどの非導電性材料から作製され、ウエルの底部は、インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）などの導電性材料から作製される。ウエルは、ウエルの底部４における細胞６および第２の電極３を完全に覆うために、そしてウエルの側面２における第１の電極１に達するために十分な流体レベル７とともに示される。ウエルは、図２Ａに関して実際の大きさ比率で描かれていない。この実施形態では、正極１および負極２の両方がウエルの底部３に存在する。この実施形態では、ウエルの側面４および底部３が、プラスチックなどの非導電性材料から作製される。流体レベル５は、細胞６ならびに正極１および負極２を覆うようにされる。
【図２Ｂ】図２Ｂは、図２Ａにおけるウエルの１つの断面側面図を示す。ウエルは、ウエルの側面２における第１の電極１（この場合には正極として示される）と、ウエルの底部４における第２の電極３（この場合には負極として示される）と、ウエルの底部における必要に応じて使用される絶縁性材料５の細片と、ウエルの底部での細胞６とを有する。１個の細胞が単に例示の便宜のために示されており、ほとんどの場合には多数の細胞がウエルの底部に存在する。ウエルの側面２は、プラスチックなどの非導電性材料から作製され、ウエルの底部は、インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）などの導電性材料から作製される。ウエルは、ウエルの底部４における細胞６および第２の電極３を完全に覆うために、そしてウエルの側面２における第１の電極１に達するために十分な流体レベル７とともに示される。ウエルは、図２Ａに関して実際の大きさ比率で描かれていない。この実施形態では、正極１および負極２の両方がウエルの底部３に存在する。この実施形態では、ウエルの側面４および底部３が、プラスチックなどの非導電性材料から作製される。流体レベル５は、細胞６ならびに正極１および負極２を覆うようにされる。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ウエルにおける別の電極配置を示す。ウエルは、ウエルの側面２における第１の電極１（この場合には正極として示される）と、ウエルの底部４における第２の電極３（この場合には負極として示される）と、ウエルの底部における必要に応じて使用される絶縁性材料５の細片と、ウエルの底部での細胞６とを有する。１個の細胞が単に例示の便宜のために示されており、ほとんどの場合には多数の細胞がウエルの底部に存在する。ウエルの側面２は、プラスチックなどの非導電性材料から作製され、ウエルの底部は、インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）などの導電性材料から作製される。ウエルは、ウエルの底部４における細胞６および第２の電極３を完全に覆うために、そしてウエルの側面２における第１の電極１に達するために十分な流体レベル７とともに示される。ウエルは、図２Ａに関して実際の大きさ比率で描かれていない。この実施形態では、正極１および負極２の両方がウエルの底部３に存在する。この実施形態では、ウエルの側面４および底部３が、プラスチックなどの非導電性材料から作製される。流体レベル５は、細胞６ならびに正極１および負極２を覆うようにされる。
【図３】図３は、第１の電極２および第２の電極３が交互にかみ合い、ガラス基体４の表面における導電性材料の層に化学的にエッチングされている本発明の実施形態に由来する１個のウエル１を示す。ウエルは、一般には、直径が３ｍｍの円形である。電極は、幅が１０μｍであり、１６０μｍの間隔を有する。第１の電極２または第２の電極３のいずれかが正極として機能し得る。電極の幅および電極間の間隔は変化させることができる。幅は、好ましくは１μｍから１０μｍの間であり、電極間の間隔は、好ましくは５μｍから１６０μｍである。特に好ましい実施形態では、電極間の間隔は、少なくとも、真核生物細胞の典型的な直径と同じくらいの大きさである（すなわち、約４０μｍから５０μｍ）。
【図４Ａ】図４Ａおよび図４Ｂは、ウエルフレームを基体を取り付けることによってウエルが形成される実施形態を例示する。図４Ａは、開口部２が基体３におけるウエルを形成するウエルフレーム１（この場合、ウエルフレーム１が（例えば、所定位置に接着することによって）基体３に取り付けられる）と、バネ押し接点６を有する接触ガイドプレート５と、印刷回路ボード（ＰＣＢ）７とを含有する実施形態の分解図を示す。基体ホルダー４が、組み立てられたデバイスを顕微鏡または蛍光プレート読み取り装置などの測定装置（示されず）において所定位置に保持するために使用される。ＰＣＢ７は、電極（示されず）がパルス発生器（示されず）に連結され得る接続部を含有する。
【図４Ｂ】図４Ａおよび図４Ｂは、ウエルフレームを基体を取り付けることによってウエルが形成される実施形態を例示する。図４Ｂは組み立て後の図を示す。
【図５】図５は、実質上のウエルを含有する基体に形成された交互にかみ合う電極の配置を示す。実質上のウエルは本明細書中においてさらに説明される。
【図６】図６は、２つの実質的に平行するプレート１が、試験される細胞３を含有する流体液滴がその間に挟まれる導電性層２でコーティングされたそれらの向き合う表面を有する本発明の実施形態に由来する１個のウエルを示す。一方の導電性層が正極（この場合には上部導電層４）であり、一方、反対側の導電性層が負極（この場合には下部導電層５）である。当然のことではあるが、これらの電極特性は逆にすることができ、この場合、上部の導電性層が負極であり、下部の導電性層が正極である。この実施形態のいくつかの変形では、プレートはガラスであり、導電性層はインジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）である。導電性層は、好ましくは、厚さが約２００Åから２，０００Åであるか、または約５００Åから１，５００Åであるか、または約８００Åから１，２００Åである。
【図７】図７は、電極の一方が、平坦な基体１の表面における導電性材料の薄い被覆物２であり、ウエルの底部１０を形成する本発明の実施形態に由来する１個のウエル３を示す。もう一方の電極７が上方からウエル３に進入し、ウエル３内の流体５と接触する。電極７は切開図で示される。電極７は、絶縁体６によって囲まれている中心の導電性材料部分８を含有する。簡略化のために、１個の細胞４がウエル内に示される。一般には、少なくとも１０５個の細胞がウエルに存在する。導電性層は、好ましくは、厚さが約２００Åから２，０００Åであるか、または約５００Åから１，５００Åであるか、または約８００Åから１，２００Åである。
【図８】図８は、ウエル４の底部が、細胞を増殖させることができるフィルターメンブラン１２である本発明の実施形態に由来する１個のウエル４を示す。簡略化のために、１個の細胞８がフィルターメンブラン１２の上に示される。ウエル４は、ガラスの底部１を有し、かつ第１の流体３で満たされるトラフ２に設置される。一方の電極７が上方からウエル４に進入し、ウエル４内の第２の流体５と接触する。電極７は、絶縁体６によって囲まれ、パルス発生器（示されず）に第１のリード線９によって接続される中心の導電性材料部分を含有する。第２の電極１１が、第１の流体３内に配置され、パルス発生器に第２のリード線１０によって接続される。第２の電極１１は切開図で示される。第２の電極１１は、実際には、ウエル４の底部に円を形成する。第１の電極７が正極であり、一方、第２の電極１１が負極であるか、または第１の電極７が負極であり、一方、第２の電極１１が正極であるかのいずれかである。
【図９Ａ】図９Ａは、正極５および負極８の両方が上方からウエル２に進入する本発明の実施形態に由来する１個のウエル２を示す。ウエル２は、１個の細胞９が示される流体３を含有する。一般には多数の細胞がウエル２に存在する。正極５はパルス発生器（示されず）に正極リード線６によって接続される。負極８はパルス発生器に負極リード線７によって接続される。両方の電極は絶縁体４に埋め込まれる。正極５および負極８は、正極５および負極８が、ウエル２の底部を形成するガラスプレート１に対して一般には直角であるように、絶縁体４の内部を横切る。しかし、正極５および負極８が絶縁体４の底部１０から出るとき、正極５および負極８は、正極５および負極８が絶縁体４の底部１０に存在し、かつ平行するように９０ｏの角度にそれぞれが曲げられる。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ウエル２の底部を形成するガラスプレート１から上を見た図であり、絶縁体４の底部にある正極５および負極８の曲げられた部分の配置を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、正極５および負極８の両方が上方からウエル２に進入し、正極５および負極８が同軸ケーブルの様式と類似する様式で配置される本発明の実施形態を示す。正極５が絶縁体４に埋め込まれ、負極８が絶縁体４の外側を覆っている。正極５はパルス発生器（示されず）に正極リード線６によって接続される。負極８はパルス発生器に負極リード線７によって接続される。ウエル２は、１個の細胞９が示される流体３を含有する。だが、一般には多数の細胞がウエル２に存在する。ガラスプレート１はウエル２の底部を形成する。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、正極５および負極８の下から上を見た図を示す。
【図１１】図１１は、図８に示される実施形態に類似する本発明の実施形態を示すが、図１１では、上方からウエルに進入する電極７が絶縁体によって囲まれず、代わりに、ピペットチップ６内に存在し、ウエル４内の第１の流体５に関して同時に存在するピペットチップ６内の第１の流体５とも接触する。この配置は、電極７の端部での領域において第１の流体５における気泡の形成を最小限に抑えるという利点を有する。ウエル４の底部は、細胞を増殖させることができるフィルターメンブラン１２である。簡略化のために、１個の細胞８がフィルターメンブラン１２の上に示される。ウエル４が、ガラスの底部１を有し、かつ第２の流体３で満たされるトラフ２に位置する。電極７がパルス発生器（示されず）に第１のリード線９によって接続される。第２の電極１１が、第２の流体３の中に配置され、パルス発生器に第２のリード線１０によって接続される。第２の電極１１は切開図で示される。第２の電極１１は、実際には、ウエル４の底部に円を形成する。いずれかの電極が正極または負極であり得る。
【図１２Ａ】図１２ＡからＢは、一方の電極が上方から進入し、その一方で、もう一方の電極がウエルの底部を形成するという点で、図７の実施形態に類似する実施形態を示す。図１２Ａは、一方の電極１が、ウエル２の底部を形成する導電性材料（ＩＴＯなど）の層である、９６ウエルマイクロタイタープレートである基体を示す側面断面図である。もう一方の電極３が上方からウエルに進入し、ウエル内の流体と接触する（流体は示されず）。電極は電気的パルス発生器４にリード線５によって接続される。いずれかの電極が正極または負極であり得る。別の実施形態は、示されている実施形態に類似するが、標準的な９６ウエルプレート、３８４ウエルプレート、１５３６ウエルプレートまたは３４５６ウエルプレートの底部を、一方の電極を形成する導電性材料（ＩＴＯなど）で置き換えることである。第２の電極が上方から各ウエルの中に下げられる。ＩＴＯ電極に対する接触を、電気伝導性の銀エポキシドによって、またはＩＴＯの底部から白金ワイヤへの接触としての１つ置きのウエルに３ＭＫＣｌ（もしくは類似する塩溶液）を入れることによって行うことができる。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは基体の上面図を示す。
【図１３Ａ】図１３ＡからＢは、実質上のウエルを含有する２つのマルチウエル基体を含む実施形態を示す。図１３Ａは、底部基体２に近づく上部基体１を示す側面断面図である。上部電極３は、ＩＴＯなどの導電性材料から作製され、上部基体１の実質上のウエル４の底部を形成する。同様に、底部電極５は、ＩＴＯなどの導電性材料から作製され、底部基体２の実質上のウエル６の底部を形成する。テフロン（登録商標）または類似する疎水性材料の薄い層１１が基体上の導電性材料の表面を覆う。テフロン（登録商標）を有しない基体の表面の円形領域は比較的親水性であり、実質上のウエルを形成する。テフロン（登録商標）層は厚さが約０．５μｍから１００μｍである。上部電極３および底部電極５は電気的パルス発生器６にリード線７によって接続される。装置の最も左側のウエルが、液体の液滴を含有して示される。上部液滴８は、試験される薬物または化合物などの物質を含有することができ、一方、底部液滴９は、電位依存性イオンチャンネルを発現する細胞を含有することができる。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、上部基体１および底部基体２が十分に近くに移動して、その結果、上部液滴８および底部液滴９が混合された後の装置を示す。１０は、上部基体１および底部基体２を整列するために役立ち、かつ液滴を混合するために適切な距離を離して基体を保つスペーサー（図１３Ａでは示されず）である。
【図１４】細胞の電場刺激の原理を例示する。
【図１５】図１５は、一方の電極が上方１からウエルに進入し、一方、第２の電極が、高導電性の金属接地グリッド４と接触している透明な基体３の透明なＩＴＯ被覆底部２から形成される実施形態に由来する２つのウエルを示す。矢じりを伴う破線は、電流が、どのように、上方１から進入する電極から、緩衝化塩溶液５および細胞６を通って、そしてＩＴＯ層２および金属接地グリッド４を通って流れるかを例示する。基体３内の矢７は、検出システム（示されず）において使用される光源からの光が、どのように、上方向に、透明な基体３およびＩＴＯ層２を通って細胞６に入り、その後、蛍光として細胞６によって再放射され、下方向に通過して検出器（示されず）に至るかを例示する。ウエルをＩＴＯ被覆基体３に取り付けるために使用することができる、必要に応じて使用される接着シール８が示される。ＩＴＯ層の厚さは、好ましくは、約２００Åから２，０００Å、約５００Åから１，５００Å、または約８００Åから１，２００Åである。
【図１６Ａ】図１６Ａは、ウエルの底部を形成するＩＴＯなどの導電性層１を有するマルチウエル実施形態の２つのウエルを示す。正極２が上方から左ウエル３に進入し、一方、負極４が上方から右ウエル５に進入する。ＩＴＯなどの導電性材料の透明な層１が、ガラスなどの透明な基体７を覆う。矢じりを伴う点線は、電流が流れる経路を示す。当然のことではあるが、正極および負極の実体は逆にすることができる。細胞８がウエル内の流体９の中に示される。ウエルをＩＴＯ被覆基体７に取り付けるために使用することができる、必要に応じて使用される接着シール１０が示される。光路が基体内の矢によって示される。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、正極２および負極４がどのようにパルス発生器１１に接続されるかを例示する、この実施形態の側面切開図を示す。透明な基体７を覆う透明な導電性の層６もまた示される。
【図１６Ｃ】図１６Ｃは、正極および負極の交互パターンを例示する実施形態の上面図を示す。
【図１６Ｄ】図１６Ｄは、一部が解体されているこの実施形態の写真である。ウエルが、ＩＴＯでコーティングされているガラス基体１３に取り付けられるウエルフレーム１２によって形成される。通常の操作時には、基体により、すべてのウエルが覆われる。例示目的のために、この図では、基体の一部のみが示されている。
【図１７】図１７は、図１６に示される実施形態に類似する本発明の実施形態から得られたデータのグラフ表示を示す。データは、ヒトα１Ｈ  Ｔ型電位依存性カルシウムチャンネル（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＦ０７３９３１）を発現させるためにトランスフェクションされているＨＥＫ２９３細胞内へのＣａ２＋の流入を表す。Ｃａ２＋の流入が、Ｔ型チャンネルが開口したときに生じ、そして４８０ｎｍで励起されたカルシウム指示薬色素Ｆｌｕｏ４の５２０ｎｍから５６０ｎｍにおける蛍光放射を検出することによって測定された。示された時点で、事前に選択された電圧が電極を介して加えられた。これはＴ型チャンネルの一部を開口させ、Ｃａ２＋の流入を可能にした。これは、カルシウム指示薬色素Ｆｌｕｏ４による５２０ｎｍから５６０ｎｍにおける蛍光放射の急激な上昇を生じさせた。この急激な上昇は、示されるように徐々に減衰した。
【図１８Ａ】図１８ＡからＢは、ヒトＰＮ３ナトリウムチャンネルをコードするヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。
【図１８Ｂ】図１８ＡからＢは、ヒトＰＮ３ナトリウムチャンネルをコードするヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。
【図１８Ｃ】図１８Ｃはその対応するアミノ酸配列（配列番号２）を示す。ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＦ１１７９０７に由来する。
【図１９Ａ】図１９ＡからＢは、ヒトＴ型カルシウムチャンネルのα１Ｈサブユニットをコードするヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。
【図１９Ｂ】図１９ＡからＢは、ヒトＴ型カルシウムチャンネルのα１Ｈサブユニットをコードするヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。
【図１９Ｃ】図１９Ｃはその対応するアミノ酸配列（配列番号４）を示す。ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＦ０７３９３１に由来する。
【図２０Ａ】図２０ＡからＢは、ヒトＮ型カルシウムチャンネルのα１Ｂサブユニットのスプライス変化体をコードするヌクレオチド配列（配列番号５）を示す。
【図２０Ｂ】図２０ＡからＢは、ヒトＮ型カルシウムチャンネルのα１Ｂサブユニットのスプライス変化体をコードするヌクレオチド配列（配列番号５）を示す。
【図２０Ｃ】図２０Ｃはその対応するアミノ酸配列（配列番号６）を示す。ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｍ９４１７２に由来する。
【図２１Ａ】図２１ＡからＢは、ヒトＮ型カルシウムチャンネルのα１Ｂサブユニットのスプライス変化体をコードするヌクレオチド配列（配列番号７）を示す。
【図２１Ｂ】図２１ＡからＢは、ヒトＮ型カルシウムチャンネルのα１Ｂサブユニットのスプライス変化体をコードするヌクレオチド配列（配列番号７）を示す。
【図２１Ｃ】図２１Ｃはその対応するアミノ酸配列（配列番号８）を示す。ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｍ９４１７３に由来する。
【図２２Ａ】図２２ＡからＢは、ヒトカルシウムチャンネルα１Ａイソ型の１Ａ−１サブユニットをコードするヌクレオチド配列（配列番号９）を示す。
【図２２Ｂ】図２２ＡからＢは、ヒトカルシウムチャンネルα１Ａイソ型の１Ａ−１サブユニットをコードするヌクレオチド配列（配列番号９）を示す。
【図２２Ｃ】図２２Ｃはその対応するアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＦ００４８８４に由来する。
【図２３Ａ】図２３ＡからＢは、ヒトカルシウムチャンネルα１Ａイソ型の１Ａ−２サブユニットをコードするヌクレオチド配列（配列番号１１）を示す。
【図２３Ｂ】図２３ＡからＢは、ヒトカルシウムチャンネルα１Ａイソ型の１Ａ−２サブユニットをコードするヌクレオチド配列（配列番号１１）を示す。
【図２３Ｃ】図２３Ｃはその対応するアミノ酸配列（配列番号１２）を示す。ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＦ００４８８３に由来する。
【図２４】図２４は、とりわけ、コンピューター、電圧発生器、増幅器、メンブラン底部ウエル、共通トラフおよび蛍光検出器を用いるＥＦＳシステムの１つの実施形態の概略図を示す。
【図２５】図２５は、９６ウエルトレーとの使用のために特に適合化された電極ヘッド実施形態を示す写真である。
【図２６】図２６は、図２５に示される電極ヘッド実施形態と組み合わせて使用されるトラフ実施形態を示す写真である。
【図２７】図２７は、マルチスクリーンウエルトレーがその間に配置される図２６のトラフ実施形態を示す写真である。
【図２８】図２８は、組み立てられた電極ヘッド、トラフおよびマルチスクリーンを示す写真である。
【図２９】図２９は、図２８に示される実施形態に類似する本発明の実施形態から得られたデータのグラフ表示を示す。データは、ヒトＰＮ１電位依存性ナトリウムチャンネルを発現させるためにトランスフェクションされているＨＥＫ２９３細胞の膜電位変化を表す。各プロットは９６ウエルプレートの横一列（１２ウエル）ＡからＨを表す。９６ウエルプレートのデータの各縦列はＶＩＰＲ（商標）で１５秒間取得された。刺激パルスプロトコルがデータ取得時に下記のように加えられた：２秒のベースラインの後、２ｍｓの方形パルス、振幅＝２０ｍＡ、振動数＝１０Ｈｚ、持続時間＝５ｓ。
【図３０】図３０は、図２９に示されるデータの最大比率変化の棒グラフ表示である。１μＭのＴＴＸ（テトロドトキシン（ＴＴＸ）感受性の電位依存性ナトリウムチャンネルの特異的かつ強力な阻害剤）が、Ｅ１、Ｆ１、Ｇ１、Ｈ１、Ａ１２、Ｂ１２、Ｃ１２およびＤ１２のウエルに存在する。さらに、ウエルＡ１１には、ＴＴＸ感受性の電位依存性ナトリウムチャンネルを阻止するための内部標準物が含有される。Ｚスコアは、標準偏差の和により除された非阻害シグナルおよび阻害シグナルの差の尺度である。
【図３１】図３１は、ＨＥＫ２９３／ＰＮ１細胞におけるＥＦＳ刺激による脱分極シグナルに対するＴＴＸ（上パネル）および化合物Ａ（下パネル）の濃度を増大したときの影響を示す。これらの実験で得られたＩＣ５０は、他の技術により得られたＩＣ５０と匹敵する。大きいヒル係数（ｎＨ）が刺激プロトコルの閾値的性質から得られる。
【図３２】図３２は、別の実施形態を示す写真である。図３２には、図２５に示される電極ヘッドに類似する電極ヘッド、および銅電極プレートが示される。この実施形態は、Ｃａｃｏ−２マルチスクリーン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）との使用のために特に適合化されている。
【図３３】図３３は、銅電極プレートが、導電性ピンを示すために裏返しにされていることを除いて、図３２に示される写真に類似する写真である（注：ピンは頁から読者の方に向かって延びている）。
【図３４】図３４は、組み立てられたＣａｃｏ−２メンブラン底部ウエルおよび受器トレーに置かれた銅電極プレートを示す写真である。
【図３５】図３５は、図３４の組み立てられた実施形態（すなわち、電極ヘッド、ピンを伴う銅電極プレート、Ｃａｃｏ−２メンブラン底部ウエル、およびＣａｃｏ−２受器トレー）を示す写真である。
【図３６Ａ】図３６は、２つの導電性ディスクに挟まれた誘電性ディスクを含む新規な電極実施形態を示す。図３６Ａはこの新規な電極実施形態の拡大図を示す。
【図３６Ｂ】図３６は、２つの導電性ディスクに挟まれた誘電性ディスクを含む新規な電極実施形態を示す。図３６Ｂは、同心状のリード線に電気的に接続された新規な電極実施形態を示す。
【図３６Ｃ】図３６は、２つの導電性ディスクに挟まれた誘電性ディスクを含む新規な電極実施形態を示す。図３６Ｃは、端リード線に電気的に接続された新規な電極実施形態を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2005514909.tif 000060
【図５】
2005514909.tif 000061
【図６】
2005514909.tif 000062
【図７】
2005514909.tif 000063
【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
2005514909.tif 000073
【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７】
2005514909.tif 000080
【図１８Ａ】
2005514909.tif 000081
【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図２０Ａ】
2005514909.tif 000088
【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２１Ａ】
2005514909.tif 000092
【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
2005514909.tif 000097
【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
2005514909.tif 000099
【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
2005514909.tif 000102
【図２３Ｄ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
2005514909.tif 000109
【図３０】
2005514909.tif 000110
【図３１】
2005514909.tif 000111
【図３２】
2005514909.tif 000112
【図３３】
2005514909.tif 000113
【図３４】
2005514909.tif 000114
【図３５】
2005514909.tif 000115
【手続補正書】
【提出日】平成15年2月12日(2003.2.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３６Ａ
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図３６Ａ】
2005514909.tif 000116
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３６Ｂ
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図３６Ｂ】
2005514909.tif 000117
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３６Ｃ
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図３６Ｃ】
2005514909.tif 000118
【手続補正書】
【提出日】平成16年3月10日(2004.3.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６８】
【図１】図１Ａは、本発明の１つの実施形態の上面図を示す。この実施形態は、約２５μｍから１００μｍの隙間４が電極間に存在するように間隔が置かれた金の正極２および金の負極３がその内部またはその表面に存在するガラス製スライドガラス１を含む。電極に対して一般に直角に配置されたスペーサー５（この場合にはプラスチック細片として示される）と一緒になって、電極は、細胞を入れ、かつ／または増殖させることができる、深さが約１００μｍである一連のウエル６を規定する。図１Ｂは、図１Ａの実施形態の断面側面図を示す。この実施形態では、正極および負極の実体は、所望する場合には互いに入れ替えることができる。電極は金から作製される必要はなく、他の導電性材料を使用することができる。また、スペーサーはプラスチックである必要はなく、他の非導電性材料を使用することができる。
【図２Ａ】図２Ａは、典型的な９６ウエルプレートが電極を各ウエル内に含有する本発明の実施形態の上面図を示す。ウエルは、ウエルの側面２における第１の電極１（この場合には正極として示される）と、ウエルの底部４における第２の電極３（この場合には負極として示される）と、ウエルの底部における必要に応じて使用される絶縁性材料５の細片と、ウエルの底部での細胞６とを有する。１個の細胞が単に例示の便宜のために示されており、ほとんどの場合には多数の細胞がウエルの底部に存在する。ウエルの側面２は、プラスチックなどの非導電性材料から作製され、ウエルの底部は、インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）などの導電性材料から作製される。ウエルは、ウエルの底部４における細胞６および第２の電極３を完全に覆うために、そしてウエルの側面２における第１の電極１に達するために十分な流体レベル７とともに示される。ウエルは、図２Ａに関して実際の大きさ比率で描かれていない。この実施形態では、正極１および負極２の両方がウエルの底部３に存在する。この実施形態では、ウエルの側面４および底部３が、プラスチックなどの非導電性材料から作製される。流体レベル５は、細胞６ならびに正極１および負極２を覆うようにされる。
【図２Ｂ】図２Ｂは、図２Ａにおけるウエルの１つの断面側面図を示す。ウエルは、ウエルの側面２における第１の電極１（この場合には正極として示される）と、ウエルの底部４における第２の電極３（この場合には負極として示される）と、ウエルの底部における必要に応じて使用される絶縁性材料５の細片と、ウエルの底部での細胞６とを有する。１個の細胞が単に例示の便宜のために示されており、ほとんどの場合には多数の細胞がウエルの底部に存在する。ウエルの側面２は、プラスチックなどの非導電性材料から作製され、ウエルの底部は、インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）などの導電性材料から作製される。ウエルは、ウエルの底部４における細胞６および第２の電極３を完全に覆うために、そしてウエルの側面２における第１の電極１に達するために十分な流体レベル７とともに示される。ウエルは、図２Ａに関して実際の大きさ比率で描かれていない。この実施形態では、正極１および負極２の両方がウエルの底部３に存在する。この実施形態では、ウエルの側面４および底部３が、プラスチックなどの非導電性材料から作製される。流体レベル５は、細胞６ならびに正極１および負極２を覆うようにされる。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ウエルにおける別の電極配置を示す。ウエルは、ウエルの側面２における第１の電極１（この場合には正極として示される）と、ウエルの底部４における第２の電極３（この場合には負極として示される）と、ウエルの底部における必要に応じて使用される絶縁性材料５の細片と、ウエルの底部での細胞６とを有する。１個の細胞が単に例示の便宜のために示されており、ほとんどの場合には多数の細胞がウエルの底部に存在する。ウエルの側面２は、プラスチックなどの非導電性材料から作製され、ウエルの底部は、インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）などの導電性材料から作製される。ウエルは、ウエルの底部４における細胞６および第２の電極３を完全に覆うために、そしてウエルの側面２における第１の電極１に達するために十分な流体レベル７とともに示される。ウエルは、図２Ａに関して実際の大きさ比率で描かれていない。この実施形態では、正極１および負極２の両方がウエルの底部３に存在する。この実施形態では、ウエルの側面４および底部３が、プラスチックなどの非導電性材料から作製される。流体レベル５は、細胞６ならびに正極１および負極２を覆うようにされる。
【図３】図３は、第１の電極２および第２の電極３が交互にかみ合い、ガラス基体４の表面における導電性材料の層に化学的にエッチングされている本発明の実施形態に由来する１個のウエル１を示す。ウエルは、一般には、直径が３ｍｍの円形である。電極は、幅が１０μｍであり、１６０μｍの間隔を有する。第１の電極２または第２の電極３のいずれかが正極として機能し得る。電極の幅および電極間の間隔は変化させることができる。幅は、好ましくは１μｍから１０μｍの間であり、電極間の間隔は、好ましくは５μｍから１６０μｍである。特に好ましい実施形態では、電極間の間隔は、少なくとも、真核生物細胞の典型的な直径と同じくらいの大きさである（すなわち、約４０μｍから５０μｍ）。
【図４Ａ】図４Ａおよび図４Ｂは、ウエルフレームを基体を取り付けることによってウエルが形成される実施形態を例示する。図４Ａは、開口部２が基体３におけるウエルを形成するウエルフレーム１（この場合、ウエルフレーム１が（例えば、所定位置に接着することによって）基体３に取り付けられる）と、バネ押し接点６を有する接触ガイドプレート５と、印刷回路ボード（ＰＣＢ）７とを含有する実施形態の分解図を示す。基体ホルダー４が、組み立てられたデバイスを顕微鏡または蛍光プレート読み取り装置などの測定装置（示されず）において所定位置に保持するために使用される。ＰＣＢ７は、電極（示されず）がパルス発生器（示されず）に連結され得る接続部を含有する。
【図４Ｂ】図４Ａおよび図４Ｂは、ウエルフレームを基体を取り付けることによってウエルが形成される実施形態を例示する。図４Ｂは組み立て後の図を示す。
【図５】図５は、実質上のウエルを含有する基体に形成された交互にかみ合う電極の配置を示す。実質上のウエルは本明細書中においてさらに説明される。
【図６】図６は、２つの実質的に平行するプレート１が、試験される細胞３を含有する流体液滴がその間に挟まれる導電性層２でコーティングされたそれらの向き合う表面を有する本発明の実施形態に由来する１個のウエルを示す。一方の導電性層が正極（この場合には上部導電層４）であり、一方、反対側の導電性層が負極（この場合には下部導電層５）である。当然のことではあるが、これらの電極特性は逆にすることができ、この場合、上部の導電性層が負極であり、下部の導電性層が正極である。この実施形態のいくつかの変形では、プレートはガラスであり、導電性層はインジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）である。導電性層は、好ましくは、厚さが約２００Åから２，０００Åであるか、または約５００Åから１，５００Åであるか、または約８００Åから１，２００Åである。
【図７】図７は、電極の一方が、平坦な基体１の表面における導電性材料の薄い被覆物２であり、ウエルの底部１０を形成する本発明の実施形態に由来する１個のウエル３を示す。もう一方の電極７が上方からウエル３に進入し、ウエル３内の流体５と接触する。電極７は切開図で示される。電極７は、絶縁体６によって囲まれている中心の導電性材料部分８を含有する。簡略化のために、１個の細胞４がウエル内に示される。一般には、少なくとも１０５個の細胞がウエルに存在する。導電性層は、好ましくは、厚さが約２００Åから２，０００Åであるか、または約５００Åから１，５００Åであるか、または約８００Åから１，２００Åである。
【図８】図８は、ウエル４の底部が、細胞を増殖させることができるフィルターメンブラン１２である本発明の実施形態に由来する１個のウエル４を示す。簡略化のために、１個の細胞８がフィルターメンブラン１２の上に示される。ウエル４は、ガラスの底部１を有し、かつ第１の流体３で満たされるトラフ２に設置される。一方の電極７が上方からウエル４に進入し、ウエル４内の第２の流体５と接触する。電極７は、絶縁体６によって囲まれ、パルス発生器（示されず）に第１のリード線９によって接続される中心の導電性材料部分を含有する。第２の電極１１が、第１の流体３内に配置され、パルス発生器に第２のリード線１０によって接続される。第２の電極１１は切開図で示される。第２の電極１１は、実際には、ウエル４の底部に円を形成する。第１の電極７が正極であり、一方、第２の電極１１が負極であるか、または第１の電極７が負極であり、一方、第２の電極１１が正極であるかのいずれかである。
【図９Ａ】図９Ａは、正極５および負極８の両方が上方からウエル２に進入する本発明の実施形態に由来する１個のウエル２を示す。ウエル２は、１個の細胞９が示される流体３を含有する。一般には多数の細胞がウエル２に存在する。正極５はパルス発生器（示されず）に正極リード線６によって接続される。負極８はパルス発生器に負極リード線７によって接続される。両方の電極は絶縁体４に埋め込まれる。正極５および負極８は、正極５および負極８が、ウエル２の底部を形成するガラスプレート１に対して一般には直角であるように、絶縁体４の内部を横切る。しかし、正極５および負極８が絶縁体４の底部１０から出るとき、正極５および負極８は、正極５および負極８が絶縁体４の底部１０に存在し、かつ平行するように９０ｏの角度にそれぞれが曲げられる。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ウエル２の底部を形成するガラスプレート１から上を見た図であり、絶縁体４の底部にある正極５および負極８の曲げられた部分の配置を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、正極５および負極８の両方が上方からウエル２に進入し、正極５および負極８が同軸ケーブルの様式と類似する様式で配置される本発明の実施形態を示す。正極５が絶縁体４に埋め込まれ、負極８が絶縁体４の外側を覆っている。正極５はパルス発生器（示されず）に正極リード線６によって接続される。負極８はパルス発生器に負極リード線７によって接続される。ウエル２は、１個の細胞９が示される流体３を含有する。だが、一般には多数の細胞がウエル２に存在する。ガラスプレート１はウエル２の底部を形成する。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、正極５および負極８の下から上を見た図を示す。
【図１１】図１１は、図８に示される実施形態に類似する本発明の実施形態を示すが、図１１では、上方からウエルに進入する電極７が絶縁体によって囲まれず、代わりに、ピペットチップ６内に存在し、ウエル４内の第１の流体５に関して同時に存在するピペットチップ６内の第１の流体５とも接触する。この配置は、電極７の端部での領域において第１の流体５における気泡の形成を最小限に抑えるという利点を有する。ウエル４の底部は、細胞を増殖させることができるフィルターメンブラン１２である。簡略化のために、１個の細胞８がフィルターメンブラン１２の上に示される。ウエル４が、ガラスの底部１を有し、かつ第２の流体３で満たされるトラフ２に位置する。電極７がパルス発生器（示されず）に第１のリード線９によって接続される。第２の電極１１が、第２の流体３の中に配置され、パルス発生器に第２のリード線１０によって接続される。第２の電極１１は切開図で示される。第２の電極１１は、実際には、ウエル４の底部に円を形成する。いずれかの電極が正極または負極であり得る。
【図１２Ａ】図１２ＡからＢは、一方の電極が上方から進入し、その一方で、もう一方の電極がウエルの底部を形成するという点で、図７の実施形態に類似する実施形態を示す。図１２Ａは、一方の電極１が、ウエル２の底部を形成する導電性材料（ＩＴＯなど）の層である、９６ウエルマイクロタイタープレートである基体を示す側面断面図である。もう一方の電極３が上方からウエルに進入し、ウエル内の流体と接触する（流体は示されず）。電極は電気的パルス発生器４にリード線５によって接続される。いずれかの電極が正極または負極であり得る。別の実施形態は、示されている実施形態に類似するが、標準的な９６ウエルプレート、３８４ウエルプレート、１５３６ウエルプレートまたは３４５６ウエルプレートの底部を、一方の電極を形成する導電性材料（ＩＴＯなど）で置き換えることである。第２の電極が上方から各ウエルの中に下げられる。ＩＴＯ電極に対する接触を、電気伝導性の銀エポキシドによって、またはＩＴＯの底部から白金ワイヤへの接触としての１つ置きのウエルに３ＭＫＣｌ（もしくは類似する塩溶液）を入れることによって行うことができる。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは基体の上面図を示す。
【図１３Ａ】図１３ＡからＢは、実質上のウエルを含有する２つのマルチウエル基体を含む実施形態を示す。図１３Ａは、底部基体２に近づく上部基体１を示す側面断面図である。上部電極３は、ＩＴＯなどの導電性材料から作製され、上部基体１の実質上のウエル４の底部を形成する。同様に、底部電極５は、ＩＴＯなどの導電性材料から作製され、底部基体２の実質上のウエル６の底部を形成する。テフロン（登録商標）または類似する疎水性材料の薄い層１１が基体上の導電性材料の表面を覆う。テフロン（登録商標）を有しない基体の表面の円形領域は比較的親水性であり、実質上のウエルを形成する。テフロン（登録商標）層は厚さが約０．５μｍから１００μｍである。上部電極３および底部電極５は電気的パルス発生器６にリード線７によって接続される。装置の最も左側のウエルが、液体の液滴を含有して示される。上部液滴８は、試験される薬物または化合物などの物質を含有することができ、一方、底部液滴９は、電位依存性イオンチャンネルを発現する細胞を含有することができる。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、上部基体１および底部基体２が十分に近くに移動して、その結果、上部液滴８および底部液滴９が混合された後の装置を示す。１０は、上部基体１および底部基体２を整列するために役立ち、かつ液滴を混合するために適切な距離を離して基体を保つスペーサー（図１３Ａでは示されず）である。
【図１４】細胞の電場刺激の原理を例示する。
【図１５】図１５は、一方の電極が上方１からウエルに進入し、一方、第２の電極が、高導電性の金属接地グリッド４と接触している透明な基体３の透明なＩＴＯ被覆底部２から形成される実施形態に由来する２つのウエルを示す。矢じりを伴う破線は、電流が、どのように、上方１から進入する電極から、緩衝化塩溶液５および細胞６を通って、そしてＩＴＯ層２および金属接地グリッド４を通って流れるかを例示する。基体３内の矢７は、検出システム（示されず）において使用される光源からの光が、どのように、上方向に、透明な基体３およびＩＴＯ層２を通って細胞６に入り、その後、蛍光として細胞６によって再放射され、下方向に通過して検出器（示されず）に至るかを例示する。ウエルをＩＴＯ被覆基体３に取り付けるために使用することができる、必要に応じて使用される接着シール８が示される。ＩＴＯ層の厚さは、好ましくは、約２００Åから２，０００Å、約５００Åから１，５００Å、または約８００Åから１，２００Åである。
【図１６Ａ】図１６Ａは、ウエルの底部を形成するＩＴＯなどの導電性層１を有するマルチウエル実施形態の２つのウエルを示す。正極２が上方から左ウエル３に進入し、一方、負極４が上方から右ウエル５に進入する。ＩＴＯなどの導電性材料の透明な層１が、ガラスなどの透明な基体７を覆う。矢じりを伴う点線は、電流が流れる経路を示す。当然のことではあるが、正極および負極の実体は逆にすることができる。細胞８がウエル内の流体９の中に示される。ウエルをＩＴＯ被覆基体７に取り付けるために使用することができる、必要に応じて使用される接着シール１０が示される。光路が基体内の矢によって示される。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、正極２および負極４がどのようにパルス発生器１１に接続されるかを例示する、この実施形態の側面切開図を示す。透明な基体７を覆う透明な導電性の層６もまた示される。
【図１６Ｃ】図１６Ｃは、正極および負極の交互パターンを例示する実施形態の上面図を示す。
【図１６Ｄ】図１６Ｄは、一部が解体されているこの実施形態の写真である。ウエルが、ＩＴＯでコーティングされているガラス基体１３に取り付けられるウエルフレーム１２によって形成される。通常の操作時には、基体により、すべてのウエルが覆われる。例示目的のために、この図では、基体の一部のみが示されている。
【図１７】図１７は、図１６に示される実施形態に類似する本発明の実施形態から得られたデータのグラフ表示を示す。データは、ヒトα１Ｈ  Ｔ型電位依存性カルシウムチャンネル（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＦ０７３９３１）を発現させるためにトランスフェクションされているＨＥＫ２９３細胞内へのＣａ２＋の流入を表す。Ｃａ２＋の流入が、Ｔ型チャンネルが開口したときに生じ、そして４８０ｎｍで励起されたカルシウム指示薬色素Ｆｌｕｏ４の５２０ｎｍから５６０ｎｍにおける蛍光放射を検出することによって測定された。示された時点で、事前に選択された電圧が電極を介して加えられた。これはＴ型チャンネルの一部を開口させ、Ｃａ２＋の流入を可能にした。これは、カルシウム指示薬色素Ｆｌｕｏ４による５２０ｎｍから５６０ｎｍにおける蛍光放射の急激な上昇を生じさせた。この急激な上昇は、示されるように徐々に減衰した。
【図１８Ａ】図１８ＡからＢは、ヒトＰＮ３ナトリウムチャンネルをコードするヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。
【図１８Ｂ】図１８ＡからＢは、ヒトＰＮ３ナトリウムチャンネルをコードするヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。
【図１８Ｃ】図１８Ｃはその対応するアミノ酸配列（配列番号２）を示す。ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＦ１１７９０７に由来する。
【図１９Ａ】図１９ＡからＣは、ヒトＴ型カルシウムチャンネルのα１Ｈサブユニットをコードするヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。
【図１９Ｂ】図１９ＡからＣは、ヒトＴ型カルシウムチャンネルのα１Ｈサブユニットをコードするヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。
【図１９Ｃ】図１９ＡからＣは、ヒトＴ型カルシウムチャンネルのα１Ｈサブユニットをコードするヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。
【図１９Ｄ】図１９Ｄはその対応するアミノ酸配列（配列番号４）を示す。ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＦ０７３９３１に由来する。
【図２０Ａ】図２０ＡからＣは、ヒトＮ型カルシウムチャンネルのα１Ｂサブユニットのスプライス変化体をコードするヌクレオチド配列（配列番号５）を示す。
【図２０Ｂ】図２０ＡからＣは、ヒトＮ型カルシウムチャンネルのα１Ｂサブユニットのスプライス変化体をコードするヌクレオチド配列（配列番号５）を示す。
【図２０Ｃ】図２０ＡからＣは、ヒトＮ型カルシウムチャンネルのα１Ｂサブユニットのスプライス変化体をコードするヌクレオチド配列（配列番号５）を示す。
【図２０Ｄ】図２０Ｄはその対応するアミノ酸配列（配列番号６）を示す。ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｍ９４１７２に由来する。
【図２１Ａ】図２１ＡからＣは、ヒトＮ型カルシウムチャンネルのα１Ｂサブユニットのスプライス変化体をコードするヌクレオチド配列（配列番号７）を示す。
【図２１Ｂ】図２１ＡからＣは、ヒトＮ型カルシウムチャンネルのα１Ｂサブユニットのスプライス変化体をコードするヌクレオチド配列（配列番号７）を示す。
【図２１Ｃ】図２１ＡからＣは、ヒトＮ型カルシウムチャンネルのα１Ｂサブユニットのスプライス変化体をコードするヌクレオチド配列（配列番号７）を示す。
【図２１Ｄ】図２１Ｄはその対応するアミノ酸配列（配列番号８）を示す。ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｍ９４１７３に由来する。
【図２２Ａ】図２２ＡからＣは、ヒトカルシウムチャンネルα１Ａイソ型の１Ａ−１サブユニットをコードするヌクレオチド配列（配列番号９）を示す。
【図２２Ｂ】図２２ＡからＣは、ヒトカルシウムチャンネルα１Ａイソ型の１Ａ−１サブユニットをコードするヌクレオチド配列（配列番号９）を示す。
【図２２Ｃ】図２２ＡからＣは、ヒトカルシウムチャンネルα１Ａイソ型の１Ａ−１サブユニットをコードするヌクレオチド配列（配列番号９）を示す。
【図２２Ｄ】図２２Ｄはその対応するアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＦ００４８８４に由来する。
【図２３Ａ】図２３ＡからＣは、ヒトカルシウムチャンネルα１Ａイソ型の１Ａ−２サブユニットをコードするヌクレオチド配列（配列番号１１）を示す。
【図２３Ｂ】図２３ＡからＣは、ヒトカルシウムチャンネルα１Ａイソ型の１Ａ−２サブユニットをコードするヌクレオチド配列（配列番号１１）を示す。
【図２３Ｃ】図２３ＡからＣは、ヒトカルシウムチャンネルα１Ａイソ型の１Ａ−２サブユニットをコードするヌクレオチド配列（配列番号１１）を示す。
【図２３Ｄ】図２３Ｄはその対応するアミノ酸配列（配列番号１２）を示す。ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＦ００４８８３に由来する。
【図２４】図２４は、とりわけ、コンピューター、電圧発生器、増幅器、メンブラン底部ウエル、共通トラフおよび蛍光検出器を用いるＥＦＳシステムの１つの実施形態の概略図を示す。
【図２５】図２５は、９６ウエルトレーとの使用のために特に適合化された電極ヘッド実施形態を示す写真である。
【図２６】図２６は、図２５に示される電極ヘッド実施形態と組み合わせて使用されるトラフ実施形態を示す写真である。
【図２７】図２７は、マルチスクリーンウエルトレーがその間に配置される図２６のトラフ実施形態を示す写真である。
【図２８】図２８は、組み立てられた電極ヘッド、トラフおよびマルチスクリーンを示す写真である。
【図２９】図２９は、図２８に示される実施形態に類似する本発明の実施形態から得られたデータのグラフ表示を示す。データは、ヒトＰＮ１電位依存性ナトリウムチャンネルを発現させるためにトランスフェクションされているＨＥＫ２９３細胞の膜電位変化を表す。各プロットは９６ウエルプレートの横一列（１２ウエル）ＡからＨを表す。９６ウエルプレートのデータの各縦列はＶＩＰＲ（商標）で１５秒間取得された。刺激パルスプロトコルがデータ取得時に下記のように加えられた：２秒のベースラインの後、２ｍｓの方形パルス、振幅＝２０ｍＡ、振動数＝１０Ｈｚ、持続時間＝５ｓ。
【図３０】図３０は、図２９に示されるデータの最大比率変化の棒グラフ表示である。１μＭのＴＴＸ（テトロドトキシン（ＴＴＸ）感受性の電位依存性ナトリウムチャンネルの特異的かつ強力な阻害剤）が、Ｅ１、Ｆ１、Ｇ１、Ｈ１、Ａ１２、Ｂ１２、Ｃ１２およびＤ１２のウエルに存在する。さらに、ウエルＡ１１には、ＴＴＸ感受性の電位依存性ナトリウムチャンネルを阻止するための内部標準物が含有される。Ｚスコアは、標準偏差の和により除された非阻害シグナルおよび阻害シグナルの差の尺度である。
【図３１】図３１は、ＨＥＫ２９３／ＰＮ１細胞におけるＥＦＳ刺激による脱分極シグナルに対するＴＴＸ（上パネル）および化合物Ａ（下パネル）の濃度を増大したときの影響を示す。これらの実験で得られたＩＣ５０は、他の技術により得られたＩＣ５０と匹敵する。大きいヒル係数（ｎＨ）が刺激プロトコルの閾値的性質から得られる。
【図３２】図３２は、別の実施形態を示す写真である。図３２には、図２５に示される電極ヘッドに類似する電極ヘッド、および銅電極プレートが示される。この実施形態は、Ｃａｃｏ−２マルチスクリーン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）との使用のために特に適合化されている。
【図３３】図３３は、銅電極プレートが、導電性ピンを示すために裏返しにされていることを除いて、図３２に示される写真に類似する写真である（注：ピンは頁から読者の方に向かって延びている）。
【図３４】図３４は、組み立てられたＣａｃｏ−２メンブラン底部ウエルおよび受器トレーに置かれた銅電極プレートを示す写真である。
【図３５】図３５は、図３４の組み立てられた実施形態（すなわち、電極ヘッド、ピンを伴う銅電極プレート、Ｃａｃｏ−２メンブラン底部ウエル、およびＣａｃｏ−２受器トレー）を示す写真である。
【図３６Ａ】図３６は、２つの導電性ディスクに挟まれた誘電性ディスクを含む新規な電極実施形態を示す。図３６Ａはこの新規な電極実施形態の拡大図を示す。
【図３６Ｂ】図３６は、２つの導電性ディスクに挟まれた誘電性ディスクを含む新規な電極実施形態を示す。図３６Ｂは、同心状のリード線に電気的に接続された新規な電極実施形態を示す。
【図３６Ｃ】図３６は、２つの導電性ディスクに挟まれた誘電性ディスクを含む新規な電極実施形態を示す。図３６Ｃは、端リード線に電気的に接続された新規な電極実施形態を示す。
【国際調査報告】
2005514909.tif 000119