(57)【要約】本発明は、in vivo中和活性を有することを特徴とするＨＣＶ  Ｅ２タンパク質に対するヒト抗体またはその機能的な断片；少なくとも一つの前記抗体を治療上の有効量で含む、抗ＨＣＶ治療用組成物；ゲル、クリーム、軟膏、及び小卵製剤における局所的使用のための前記組成物；抗ＨＣＶワクチンの評価のための前記抗体の使用に関する。
2005531286.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
in vivo中和活性を有することを特徴とするＨＣＶ  Ｅ２タンパク質に対するヒト抗体またはその機能的な断片。
【請求項２】
重鎖及び軽鎖の可変部分の以下の配列：
ｅ１３７重鎖（ＨＣ）
[配列１]
2005531286.tif 000037
ｅ１３７軽鎖（ＬＣ）
[配列２]
2005531286.tif 000038
を有することを特徴とする抗体ｅ１３７である、請求項１記載の抗体。
【請求項３】
重鎖及び軽鎖の可変部分の以下の配列：
ｅ３０１重鎖（ＨＣ）
[配列３]
2005531286.tif 000039
ｅ３０１軽鎖（ＬＣ）
[配列４]
2005531286.tif 000040
を有することを特徴とする抗体ｅ３０１である、請求項１記載の抗体。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項に記載の少なくとも一つの抗体を治療上の有効量で含む、抗ＨＣＶ治療用組成物。
【請求項５】
ゲル、クリーム、軟膏、及び小卵製剤における局所的使用のための、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
抗ＨＣＶワクチンの評価のための、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項７】
請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体をコードする核酸。
【請求項８】
原核生物細胞または真核生物細胞において、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体を有効に発現できる、請求項７に記載の核酸を含む組換え発現ベクター。
【請求項９】
細胞環境の外に請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体を輸送できる、この抗体をコードする配列と実質的に連結したシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項８に記載の組換えベクター。
【請求項１０】
遺伝子治療における請求項９に記載の組換えベクターの使用。
【請求項１１】
ａ）タンパク質Ｅ２の各種のエピトープに対して向けられた特異的ヒトＦａｂの結合を阻害できる、生物学的流体中の抗体の存在を測定する工程；
ｂ）予後、治療に対する応答性、感染のような患者の臨床上の特徴と、かくして滴定された抗体の存在を相関させる工程；
を含む、生物学的流体中のＨＣＶ  Ｅ２タンパク質の各種のエピトープに対して向けられた抗体の存在の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＣＶ  Ｅ２グリコプロテインに対して向けられ、in vitro中和活性を有するヒトモノクローナル抗体Ｆａｂ断片に関する。Ｃ型肝炎ウイルス（ＶＣＶ）は、世界人口の約4％に感染している(World Health Organization, 1999)。この病原体と接触した患者の８０％以上が、宿主免疫応答により感染を撲滅することができずに慢性的な感染を引き起こし、慢性肝炎、肝硬変、及び肝細胞カルシノーマのような重篤な肝臓疾患の危険を有する[1,2]。
【背景技術】
【０００２】
慢性的な感染の治療は、インターフェロン及びリバビリンでの組み合わせ治療に基づくが、これはより重篤な副作用を非常に高い確率で引き起こし、且つ有効性も高くない(４人中わずかに一人のみが長期的な効果を得る)[3,4]。ウイルス感染は、免疫保護をもたらすものではない。この事実は、免疫系によって認識される抗原構造において、ウイルスが非常に可変的であるということと併せて、ＨＣＶ感染に対して患者を保護する有効な血清治療及びワクチンの開発を妨げている。それ故、新たな抗ウイルス戦略が強く必要とされていることは明らかである。
著者は、免疫保護応答の最重要の標的と考えた、ＨＣＶタンパク質の一つ、表面Ｅ２グリコプロテインに対して向けられた数多くのヒトＦａｂ抗体断片をコードする遺伝子をクローン化した[5]。しかしながら、これらの抗体の生物学的活性の進化は単純ではなく、信頼できるin vitroのシステムは、ＨＣＶに対する中和活性を測定するのに利用できない。それゆえ著者は、標的細胞に対するＥ２タンパク質の結合を阻害する各種のＦａｂの可変的な能力を評価して記載したに過ぎず、この活性と、血清の中和活性の間の相関関係は示されていない[5]。
【０００３】
以前の研究では、Burioni等(2001)[6]が、ＨＣＶ感染患者によって生産されたいくつかの抗Ｅ２抗体が、おそらくＥ２抗原に対する結合と、その立体構造の改変により、宿主免疫応答にウイルスをより非感受性にするネガティブ効果を有することを示した[6]。これは、高い抗Ｅ２抗体力価が、ＨＣＶ感染に対する保護を直接には相関しない理由を説明できた。
【０００４】
Bugli等, 2001[7]は、免疫応答が向けられている４の別個の領域を示す、抗Ｅ２ヒトＦａｂのパネルをin vitroで結合できるＥ２タンパク質エピトープのマップを作成した(図２)[7]。慢性的に感染した患者の血清におけるこれらの領域の一つ以上に対して向けられた抗体の存在は、治療の有効性と各種の予後を減少する合併症と関連できた。それ故、ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質の各種のエピトープに対して向けられた生物学的流体中の抗体を測定する方法の必要性が存在することは明らかである。本発明の一つの実施態様は、この方法を提供する。
本発明の著者はさらに、ウイルスシュードタイプ、即ちＨＣＶに外的に同一であるが、蛍光を生産するタンパク質を生産できる標的細胞に侵入した後のウイルスのシステムにおける各種の抗Ｅ２抗体の中和活性を評価した[8]。細胞中における蛍光の存在または不在を明らかにすることによって、この方法は、各種のエピトープに対して向けられた抗Ｅ２抗体のin vivo中和活性の直接的な測定を提供する。
【０００５】
予期せぬことに、著者は、ｅ１３７及びｅ３０１という二つのアッセイされた抗体が、抗体調製物の単一の全身的な投与で得られる濃度で、ウイルスを中和できることを見出した；二つの他の抗体は中和活性を有さず、一方はウイルス感染を促進さえできた。
【０００６】
患者における各種の抗体生産の滴定の方法の開発は、重篤な合併症を形成する危険のある感染患者と、より好ましい予後を有する患者の間を識別する可能性を有する高価値の診断及び予後装置を表す。この後者の群では、この方法は、重篤な副作用と関連する非常に有効性の低い治療を投与することを除去する一方で、かなりのコストの減少を提供するであろう。
【０００７】
かくして同定されたＥ２エピトープは、合成ペプチドを合成することによって再生産可能ではないので[5]、この方法は、相関する臨床上のデータと疫学的データを有する、タンパク質Ｅ２の各種の部分に対する抗体の量を測定する方法のみを表す。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
良好な中和能力を有するヒトＦａｂフォーマットにおける抗Ｅ２抗体の同定は、そのラージスケールの生産と、抗ＨＣＶ治療における医薬として、またはリスクのある患者（不調和なＨＣＶ状態を有するカップル、職業上の曝露の疑いのある患者等）に対してウイルスの伝播を阻害するための局所形態の予防薬としての使用を許容する。
本発明の抗体は、抗ＨＣＶワクチン、即ち中和抗体を刺激できるが、有効ではないまたはネガティブな抗体に対するin vitroの候補分子を評価するために有利に使用できる。
広いスペクトルのウイルスを認識できるヒト抗体を中和する利用可能性は、人工ワクチンの生産において重要であろう。この文献に記載された中和抗体は、中和交差反応応答を刺激できるワクチン(ペプチドまたは抗イディオタイプ抗体から調製された)の開発のための鋳型として使用できる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の目的は、ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質に対する、in vivo中和活性を与えるヒト抗体、またはその機能的な断片である。
特定の実施態様では、本発明の抗体は、重鎖及び軽鎖の可変部分の以下のアミノ酸配列によって特徴づけされる、ｅ１３７抗体である：
ｅ１３７重鎖（ＨＣ）
[配列１]
2005531286.tif 000003
ｅ１３７軽鎖（ＬＣ）
[配列２]
2005531286.tif 000004
【００１０】
別の実施態様では、本発明の抗体は、重鎖及び軽鎖の可変部分の以下のアミノ酸配列によって特徴づけされる、ｅ３０１抗体である：
ｅ３０１重鎖（ＨＣ）
[配列３]
2005531286.tif 000005
ｅ３０１軽鎖（ＬＣ）
[配列４]
2005531286.tif 000006
【００１１】
本発明の更なる目的は、治療上の有効量で、本発明の抗体の少なくとも一つを含む、抗ＨＣＶ治療用組成物である。好ましくは前記組成物は、全身性の使用のための精製形態、または当業者に既知の賦形剤との、ゲル、クリーム、軟膏、小卵としての局所的使用のための別の製剤で供給される。本発明の更なる目的は、本発明の抗体のそれぞれをコードする核酸である。有利には前記核酸は、原核生物細胞または真核生物細胞において本発明の抗体を有効に発現できる発現ベクターに含まれ得る。好ましい形態では、組換えベクターはまた、本発明の抗体のコード配列と実質的に連結し、細胞環境の外に抗体を輸送できるシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００１２】
本発明の更なる目的は、遺伝子治療に記載されるような組換えベクターの使用である。本発明は、以下の図面を参考にして、本発明自体を制限するものではない以下の実験例において記載される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
実施例１
物質と方法
抗ＨＣＶ  Ｆａｂ及び全長ＩｇＧ１の生産
抗ＨＣＶ/Ｅ２  Ｆａｂの生産、精製、及び特徴づけは、別の文献に記載されている[5]。ＦＬＡＧ−Ｆａｂ（ペンタペプチド架橋で重鎖断片のカルボキシ末端で融合したＦＬＡＧエピトープで標識されたＦａｂ）を、別の文献に記載されたように構築して精製した[6]。アッセイの正当性と標準化をＦａｂコード遺伝子を使用して実施し、全長ヒトモノクローナル抗体（ＨｕＭａｂ）を構築し、それをトランスフェクト化細胞における後の生産のための適切な真核生物ベクターに挿入した[9]。培養上清中に存在するＨｕＭａｂを記載されたようにイムノアフィにティーにより精製し[10]、ＰＡＧＥによって純度チェックした。ヒト抗体の量を、サンドイッチイムノアッセイによってアッセイした。全ての抗体及びＦａｂを使用まで−７０℃で貯蔵した。
【００１４】
血清及び標本
健康なドナー及びＨＣＶ陽性患者から得た血清を、標準法に引き続き、市販の診断キット(Ortho, Raritan, NJ)を使用して分析した。所定のエピトープに対して向けられた既知の量の抗体を有する見かけの標本を調製するために、ＨＣＶネガティブ血清をＰＢＳ中の濃縮した精製ＨｕＭａｂでスパイクし、ポジティブ及びネガティブ血清と正確に同様に処理した。
【００１５】
Ｆａｂ阻害力価（ＦＩＴ）アッセイのデザイン
このアッセイの目的は、エピトープに対する標識Ｆａｂの結合を阻害する血清の能力を評価し、かくして血清中のエピトープ結合抗体の量の間接的な測定を得ることである(図１)。
ＦＬＡＧ-Ｆａｂを精製し[10]、ＦＡＬＧ-Ｆａｂ特異的ＥＬＩＳＡでアッセイし、阻害実験で使用される正確な濃度を測定した。略記すると、既知の濃度のＦＬＡＧ-Ｆａｂ調製物をＥＬＩＳＡによって滴定し[11]、そこでは抗原被覆プレートをＰＢＳ/１％ＢＳＡで37℃で1時間ブロックした。ブロッキング溶液の除去の後、ＰＢＳ/ＢＳＡ１％で調製されたＦＬＡＧ-Ｆａｂの50μ1の段階的な希釈物をウェルに加え、37℃で2時間インキュベートした。自動化プレート洗浄器(DiaSorin, Saluggia, Italy)においてＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０でプレートを１０回洗浄し、その後ＰＢＳ/ＢＳＡ１％中の抗ＦＬＡＧマウスモノクローナル抗体Ｍ２(Sigma, St. Louis, MO;ＰＢＳ中に10μg/ml)の１０μg/ml溶液を５０μl加えた。３７℃で１時間のインキュベーションの後、前述のようにＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ−２０でウェルを１０回洗浄し、マウスモノクローナル抗体結合を、セイヨウワサビペルオキシダーゼ接合ヤギ抗マウスＩｇＧ(Pierce; ＰＢＳ中で1:8000)で視覚化した。基質を加え、暗所で室温で３０分インキュベートした後、自動化プレートリーダーにおいてＯＤ４５０についてプレートを読み取った。全てのアッセイを少なくとも二重で実施した。ネガティブコントロール抗原（ＢＳＡ）を常に含み、ＯＤの読み取りのバックグランドとして差し引いた。
【００１６】
血清のＦａｂ阻害力価（ＦＩＴ）の測定のため、標準条件で、最大の読み取りの50％に等しいＯＤ４５０の読み取りを与える精製ＦＬＡＧ-Ｆａｂの濃度を、Ｆａｂ阻害ＥＬＩＳＡの更なる実験のため使用した。これらの実験のため、プレートを前述のように被覆してブロックした。ＰＢＳ/ＢＳＡ１％中の段階的な1：4の血清希釈物を、ＥＬＩＳＡウェル当たり５０μｌの量で加えた。３７℃で２時間のインキュベーションの後、精製したＦＬＡＧ-Ｆａｂを血清希釈物に直接加え、所望の最終濃度に到達させた。プレートをさらに３０分インキュベートし、ＦＬＡＧ-Ｆａｂ  ＥＬＩＳＡのため前述のように加工した。100％阻害に対応する、20：1の過剰な精製非標識Ｆａｂを含むポジテロイブコントロールサンプルを含む。過剰量のコントロール非相関Ｆａｂ[12]を含み、０％疎外に対応するネガティブコントロールサンプルもまた含まれる。最終結果は、式：阻害率＝１００×（プローブＦＬＡＧ-Ｆａｂ単独のＯＤ４５０−競合血清とプローブＦＬＡＧ-ＦａｂのＯＤ４５０）／プローブＦＬＡＧ-Ｆａｂ単独のＯＤ４５０での阻害の％として測定される。
ＦＬＡＧ-Ｆａｂ結合の70％より大きい阻害を与える最高の血清希釈は、当該エピトープと当該血清についてのＦａｂ阻害力価（ＦＩＴ）として考慮される。
【００１７】
結果
アッセイで使用される適切なＦＬＡＧ-Ｆａｂ濃度が各ＦＬＡＧ-Ｆａｂについて測定され、１０μｇ／ｍｌ（ｅ８、ｅ２０、ｅ１３７、ｅ３０１、ｅ５０９）から０．１μｇ／ｍｌ（ｅ１０−Ｂ）までの範囲である。各種の抗体の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列は以下の通りである：
【００１８】
ｅ８ＨＣ
[配列５]
2005531286.tif 000007
ｅ８ＬＣ
[配列６]
2005531286.tif 000008
ｅ１０ＨＣ
[配列７]
2005531286.tif 000009
ｅ１０ＬＣ
[配列８]
2005531286.tif 000010
ｅ２０ＨＣ
[配列９]
2005531286.tif 000011
ｅ２０ＬＣ
[配列１０]
2005531286.tif 000012
ｅ１３７ＨＣ
[配列１１]
2005531286.tif 000013
ｅ１３７ＬＣ
[配列１２]
2005531286.tif 000014
ｅ３０１ＨＣ
[配列１３]
2005531286.tif 000015
ｅ３０１ＬＣ
[配列１４]
2005531286.tif 000016
ｅ５０９ＨＣ
[配列１５]
2005531286.tif 000017
ｅ５０９ＬＣ
[配列１６]
2005531286.tif 000018
前述のＦａｂ断片をコードするヌクレオチド配列は、以下の通りである：
ｅ８ＨＣ
[配列１７]
2005531286.tif 000019
ｅ８ＬＣ
[配列１８]
2005531286.tif 000020
ｅ１０ＨＣ
[配列１９]
2005531286.tif 000021
ｅ１０ＬＣ
[配列２０]
2005531286.tif 000022
ｅ２０ＨＣ
[配列２１]
2005531286.tif 000023
ｅ２０ＬＣ
[配列２２]
2005531286.tif 000024
ｅ１３７ＨＣ
[配列２３]
2005531286.tif 000025
ｅ１３７ＬＣ
[配列２４]
2005531286.tif 000026
ｅ３０１ＨＣ
[配列２５]
2005531286.tif 000027
ｅ３０１ＬＣ
[配列２６]
2005531286.tif 000028
ｅ５０９ＨＣ
[配列２７]
2005531286.tif 000029
ｅ５０９ＬＣ
[配列２８]
2005531286.tif 000030
【００１９】
精製した標識化Ｆａｂ分子上のＦＬＡＧ-Ｆａｂ  ＥＬＩＳＡは、非常に特異的で再生産性の結果を生ずる。ＦＩＴの測定は、10のＨＣＶ-ネガティブ血清で実施される；その力価は、我々の試験の上限の検出として一貫して＞1：20であり、特異的な抗ＨＣＶ抗体の不在で阻害が生じないことを示す。
【００２０】
我々のＦＬＡＧ-Ｆａｂによって認識されるエピトープに対して向けられた抗体を、ＦＩＴが有効に測定することを示すために、我々のＦａｂによって定義されたＨＣＶ  Ｅ２エピトープに対して向けられた既知の量のＩｇＧを含む偽のサンプルを得る、所定の特異性のヒトモノクローナル抗体とネガティブ血清を混合することによって模倣の標本で同じ分析を実施する。その結果(図２Ａ及びＢ)は、ＦＩＴと抗体量の間の良好な相関を示し、ＦＩＴが患者の血清中のエピトープ特異的抗体の量に関する信頼できる情報を提供できることが示される。
【００２１】
最後に、広範囲の希釈物を包含する値で、ＦＩＴはＨＣＶ陽性血清において常にポジティブである。患者間でのかなりの異種性で、ＦＩＴは同じ血清サンプルにおける各種のＦａｂについて非常に多様化している。
【００２２】
実施例２
物質と方法
ヒト抗体断片
この実施例におけるヒト組換え抗体断片は、Bugli等(2001)[7]に十分に記載されており、実施例１で使用されたものに相当する。略記すると、Ｆａｂをコードする遺伝子を、１ｂ遺伝子型のＨＣＶ  ＲＮＡの血液中の持続的な存在の慢性肝炎を有する58歳の女性のＩｇＧ1/カッパレパートリーを含むファージディスプレーの組み合わせライブラリーから得た。選択された遺伝子を適切な細菌発現ベクター[13]に挿入し、トランスフォーム化細胞を組換えＦａｂのソースとして使用し、組換えＦａｂを記載されたように生産して精製した[14]。細胞に対するＥ２結合の中和（ＮＯＢ）活性[5,15]、及びこれらの分子の相互作用[7]は記載されている。ＨＣＶ感染患者の血清中の同様な抗体の存在は、阻害ＥＬＩＳＡによって測定される[7]。
【００２３】
シュードタイプ及び中和アッセイ
ここで使用されるシュードタイプは、Mathuura等, 2001[8]において十分に特徴づけされ記載されている。略記すると、ＶＳＶΔＧ＊/ＨＣＶＥ1-Ｅ２シュードタイプ（ＶＳＶ/ＨＣＶ）は、Ｎ末端シグナル配列に融合した１ｂタイプＨＣＶ  ｃＤＮＡクローン（ＮＩＨ-Ｊ1）のＥ１及びＥ２タンパク質のエクトドメインと、ＶＳＶ  Ｇプロテインの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインからなるキメラＥ１及びＥ２  ＨＣＶエンベロープグリコプロテインで、Ｇエンベローププロテインが置換されている小水疱性口内炎ウイルスからなる[8]。プラスミドの構築[16]及び真核生物発現ベクターは、記載されている[8,17]。Ｇプロテインコード領域が緑色蛍光タンパク質遺伝子（ＧＦＰ）で置換されている組換えＶＳＶを有するキメラＥ１及びＥ２  ｃＤＮＡを構成的に発現するＣＨＯ細胞を感染することによって、ＶＳＶ/ＨＣＶを調製する[18]。コントロールとして(及びＶＳＶ/ＨＣＶシュードタイプを生産するために)使用されるＶＳＶΔＧ＊/ＨＣＶＥ1-Ｅ２（ＶＳＶ/Ｇ）シュードタイプを、Ｇプロテインを一過的に発現しているＶＳＶΔＧ＊細胞系を感染することによって生産する。中和アッセイを記載されたように実施する[8]。精製ヒト組換えＦａｂの希釈物を、37℃で30分シュードタイプＶＳＶ/ＨＣＶまたはＶＳＶ/Ｇの2.4×103感染単位（ＩＵ）でインキュベートし、96穴ウェルプレートで調製されたＨｅｐＧ２細胞（4×104細胞）内にイノキュレートする。37℃で60分の吸着の後、10％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで細胞を3回洗浄し、37℃で16時間インキュベートする。ウイルスのＩＵを、蛍光顕微鏡によりＧＦＰ発現細胞の数を計測することによって測定する。データは、抗体が添加されていないコントロールウェルと比較した阻害のパーセンテージとして提供される。データは二重で実施された3の実験の平均である。
【００２４】
結果
抗ＨＣＶ/Ｅ２ヒトモノクローナル抗体のパネル生産と配列特徴づけ
ヒトモノクローナル抗体Ｆａｂ断片のパネルは、１ｂ遺伝子型のＨＣＶでの持続的な感染を有する患者の抗ＨＣＶ/Ｅ２免疫レパートリーを表す[5,19]。ＣＨＯ細胞において発言された１ａ遺伝子型（Ｈ株）[20]の精製組換えＨＣＶ/Ｅ２で選択された抗体断片は十分に特徴づけされ、ＨＣＶ/Ｅ２に対する共有された等しいアフィニティーを有する慢性感染患者の血清[7]に存在するクローンに対応する。５の抗体のそれぞれは、この患者の全抗Ｅ２抗体レパートリーの属する５のファミリーの一つを表す。同じファミリーに属するＦａｂは、同様の生物学的活性を共有し、ＤＮＡ配列の強力なホモロジーを有する[5]。５のＦａｂのそれぞれは、２の表面上の異なるエピトープを認識する[7]。相対的な生殖系列配列からの多様性は、抗原由来のアフィニティーの成熟の典型であり(表１ａ及び１ｂ)、抗原に対する著機的な曝露を示唆する。
【００２５】
表１Ａ、Ｂ：生殖系列と抗ＨＣＶＥ２ヒトモノクローナル抗体の可変領域におけるＶ遺伝子のミューテーション
Burioni等, 1998[5]に記載されたように配列を決定し、ＩＭＧＴデータベースにおいて生殖系列配列と並べる[21]。ヌクレオチドとアミノ酸ミューテーションのパーセンテージを、重鎖及び軽鎖についてのフレームワーク領域（ＦＲ）１、ＦＲ２、及びＦＲ３、重鎖についての相補性決定領域（ＣＤＲ）１及びＣＤＲ２、軽鎖についてのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を考慮して、Kabat及びWuのアライメント法[22]に従って計算する。
【００２６】
表１ａ−重鎖
【表１ａ】
2005531286.tif 000031
【００２７】
表１ｂ−軽鎖
【表１ｂ】
2005531286.tif 000032
【００２８】
細胞に対するＨＣＶ/Ｅ２結合を阻害できないことが見出されたいくつかのクローン（ｅ１３７及びｅ８）、並びに非常に低濃度でさえＨＣＶ/Ｅ２結合を阻害する他のもので、各Ｆａｂの結合の中和（ＮＯＢ）活性を測定した[5](以下参照)。
【００２９】
ヒト組換えＦａｂによるシュードタイプウイルスの中和
ＨＣＶ/Ｅ２の表面上の異なるエピトープを認識するＦａｂの二つ、ｅ８及びｅ２０[7]は、高濃度(80μg/ml)でさえ、ＶＳＶ／ＨＣＶシュードタイプ感染を中和しない。これらの二つのＦａｂの一方、ｅ２０は強力なＮＯＢ活性を有し[5]。Ｅ２結合を阻害する抗体でさえ、ウイルス感染を防止しないかもしれないことを確認する。
【００３０】
二つの他のＦａｂ、ｅ１３７及びｅ３０１は10μg/mlの濃度でＶＳＶ／ＨＣＶを有効に中和する一方、ＶＳＶ  Ｇエンベローププロテイン（ＶＳＶ/Ｇシュードタイプ）を有するＶＳＶシュードタイプは影響されない(図３ａ及び３ｂ)。ＨＣＶ/Ｅ２上のヒトエピトープの二次元表面マップで示されているような、中和活性を与えられたヒト抗体によっておそらく認識される、同じＥ２領域に対して、これらの二つのクローンが競合することを示す以前の発見と、これらのデータは一致する(図４)。Ｆａｂ５０９は、ＮＯＢ活性の観点で現在最も強い入手可能な抗体であり、非常に低濃度で、Ｅ２と細胞標的の間の結合を阻害可能である(表２)。このＦａｂとＶＳＶ/ＨＣＶシュードタイプのインキュベーションは、1μg/mlの濃度にヘパトーム細胞内へのウイルス侵入を増大する。ＶＳＶ/Ｇシュードタイプが使用される場合、感染の増大は示されず、かくして細胞膜とのこのＦａｂの非特異的な相互作用が、細胞内へのウイルスエントリーを促進する可能性を除外する。(図３Ｃ)。
【００３１】
表２−抗ＨＣＶ/Ｅ２抗体特徴づけ
ＮＯＢ活性は、細胞標的に対する精製ＨＣＶ/Ｅ２調製物の結合の中和の50％を達成する濃度(μg/ml単位)として計算される：
【表２】
2005531286.tif 000033
【００３２】
コントロール抗体[23]は、ＶＳＶ/ＨＣＶ及びＶＳＶ/Ｇシュードタイプの両者を中和できないため、シュードタイプシステムに対して効果を発揮しない。ＶＳＶ/ＨＣＶに対して効果を有しないこれらの実験における中和コントロールとして使用されたポリクローナル抗ＶＳＶ抗血清の1：1000までの希釈物によって、ＶＳＶ/Ｇシュードタイプは十分に中和される。いくつかの宿主において生産されたポリクローナル及びモノクローナル抗Ｅ１及び抗Ｅ２抗体は、ＶＳＶ/ＨＣＶシュードタイプに対して中和効果を示さない。
【００３３】
一価Ｆａｂの中和活性は、ビリオンの凝集または交差結合のために必要なく、ＨＣＶの侵入を阻害できることを示す；さらに、ウイルスとその細胞標的の間の相互作用のブロックは、ＨＣＶ中和における鍵となる因子である可能性は低いようである。これらのデータは、血清中のＮＯＢ活性と疾患からの保護の間の相関関係の欠如を分子レベルで説明できる。
１ａ遺伝子型のＥ２で選択された抗Ｅ２抗体が、１ｂ遺伝子型のＥ２を有するシュードタイプを中和できるため、ある程度の交差保護が、抗ＨＣＶ抗体によって提供される。
【００３４】
この結果は、Ｆａｂ５０９が、ＶＳＶ/ＨＣＶシュードタイプウイルスの感染を増大できることを示すが、ＶＳＶ/Ｇ構築物に対して効果を表さなかった。ウイルス侵入を促進するｅ５０９の能力についての考え得る説明は、細胞に対するウイルス付着に関与する細胞構築物であるＣＤ８１に結合するＥ２の領域に対して、この抗体が特異的に且つ非常に有効に結合するという観察に見出すことができる[24]。Ｅ２に対するｅ５０９の結合は、その細胞標的の一つに対するＥ２の結合を模倣でき、ＣＤ８１によって誘導されるものと同様なＥ２の三次元構造の改変を促進できた。Ｅ２は少なくとも二つの三次元構造状態で存在し、このタンパク質に結合する抗体は、結合の競合なく、ヒトＦａｂのＮＯＢ活性を調節することによってタンパク質の立体状態を改変できる[6]。それ故、Ｆａｂ５０９は、ＨＣＶと細胞表面の間の相互作用の研究のための鍵となるツールであるようであり、ワクチンのための分子の評価のためのin vitroモデルにおいて使用できるであろう。
【００３５】
[参考文献]
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【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】FIT:THEORETICAL BASIS。パネルＡは、競合因子の存在しない、エピトープに対するＦａｂ-ＦＬＡＧの結合を示す。（Ａ）に存在するＦａｂの同濃度を使用して、患者の血清での抗原のプレインキュベーションは、血清中のＦａｂによって認識されるエピトープに対して向けられた抗体の定量分析を可能にする。パネルＢ及びＣでは、結合した抗体は、Ｆａｂと競合して、パネルＡと比較して結合量を比例的に減少する。パネルＤ及びＥでは、特異的なエピトープに対して向けられていない抗体の存在は、Ｆａｂ結合に最低限でも影響するものではない。
【図２Ａ】既知の濃度のｅ８−ＩｇＧ１及びｅ５０９−ＩｇＧ１を含む血清（Ｆａｂによって認識されたエピトープに対して向けられた全抗体）によるＨＣＶ/Ｅ２に対するｅ８−ＦＬＡＧ（Ａ）とｅ５０９−ＦＬＡＧ（Ｂ）の間の結合の阻害。ＦＡＢ結合の阻害が、同じ特異性を有する全抗体の存在下でのみ観察でき、これは抗体濃度に依存することは明らかである。
【図２Ｂ】既知の濃度のｅ８−ＩｇＧ１及びｅ５０９−ＩｇＧ１を含む血清（Ｆａｂによって認識されたエピトープに対して向けられた全抗体）によるＨＣＶ/Ｅ２に対するｅ８−ＦＬＡＧ（Ａ）とｅ５０９−ＦＬＡＧ（Ｂ）の間の結合の阻害。ＦＡＢ結合の阻害が、同じ特異性を有する全抗体の存在下でのみ観察でき、これは抗体濃度に依存することは明らかである。
【図３Ａ】各種の濃度の精製抗ＨＣＶ／Ｅ２ヒト組換えＦａｂによるＶＳＶ/ＨＣＶ及びＶＳＶ/Ｇシュードタイプの感染の阻害。Ｆａｂ処理シュードタイプで感染されたＨｅｐＧ２を１６時間インキュベートし、緑色蛍光タンパク質発現細胞の数を、蛍光顕微鏡によって測定した。データは、コントロールウェル（Ｆａｂが添加されていない）で検出された感染の％として提示されている。示された結果は、二重で実施した３の個々のアッセイの平均である。
【図３Ｂ】各種の濃度の精製抗ＨＣＶ／Ｅ２ヒト組換えＦａｂによるＶＳＶ/ＨＣＶ及びＶＳＶ/Ｇシュードタイプの感染の阻害。Ｆａｂ処理シュードタイプで感染されたＨｅｐＧ２を１６時間インキュベートし、緑色蛍光タンパク質発現細胞の数を、蛍光顕微鏡によって測定した。データは、コントロールウェル（Ｆａｂが添加されていない）で検出された感染の％として提示されている。示された結果は、二重で実施した３の個々のアッセイの平均である。
【図３Ｃ】各種の濃度の精製抗ＨＣＶ／Ｅ２ヒト組換えＦａｂによるＶＳＶ/ＨＣＶ及びＶＳＶ/Ｇシュードタイプの感染の阻害。Ｆａｂ処理シュードタイプで感染されたＨｅｐＧ２を１６時間インキュベートし、緑色蛍光タンパク質発現細胞の数を、蛍光顕微鏡によって測定した。データは、コントロールウェル（Ｆａｂが添加されていない）で検出された感染の％として提示されている。示された結果は、二重で実施した３の個々のアッセイの平均である。
【図４】この実験で使用されたモノクローナル抗体によって認識される、ＨＣＶ/Ｅ２の表面に存在するヒトＢ細胞エピトープの二次元表面様マップ。オーバーラップしている円は、相互的な阻害を示す。ＶＳＶ/ＨＣＶシュードタイプ中和活性を与えられたＦａｂは下線で示されている。細胞標的とのＨＣＶ/Ｅ２の相互作用を介在する推定の領域は、二重線で示されている。中和抗体によって認識される推定の領域は、塗りつぶした黒色の円によって示されている。抗原-抗体相互作用によって誘導できる改変のため、この模式図は、実際の物理的マップに対応していない。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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