(57)【要約】ある物質に対する過敏症を判定するための、アレルゲンによる刺激後の好塩基球の活性化の測定のための方法であって、サンプルならびに０．５〜１００単位／ｍｌの量の適切に希釈したアレルゲンの体積に基づいてインターロイキン−３を０．０５〜５０ｎｇ／ｍｌの量で添加した血液サンプルを、生理学的環境に一致する温度にて１５〜４５分間インキュベートし、その後、３〜３０μｌ／血液１００μｌの量の抗ＣＤ６３抗体による、および３〜３０μｌ／血液１００μｌの量の好塩基球の表面受容体に対する抗体による染色剤を０〜＋１０℃の温度にて添加し、次にサンプルをボルテックスした後に、氷浴で１５〜３０分間インキュベートし、さらに溶解させて、サイトフローメトリーにかける方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ある物質に対する過敏症を判定するために、アレルゲンによる刺激後の好塩基球の活性化を測定するための方法であって、サンプルならびに０．５〜１００単位／ｍｌの量の適切に希釈したアレルゲンの体積に基づいてインターロイキン−３を０．０５〜５０ｎｇ／ｍｌの量で添加した血液サンプルを、生理学的環境に一致する温度にて１５〜４５分間インキュベートし、その後、３〜３０μｌ／血液１００μｌの量の標識された抗ＣＤ６３抗体、および３〜３０μｌ／血液１００μｌの量の好塩基球の表面マーカーに対する標識抗体を０〜＋１０℃の温度にて添加し、次にサンプルをボルテックスした後に、氷浴で１５〜３０分間インキュベートし、さらに溶解させて、サイトフローメトリーにかけることを特徴とする方法。
【請求項２】
好塩基球の表面マーカーに対する抗体が抗ＣＤ１２３抗体であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
好塩基球の表面マーカーに対する抗体が抗ＣＤ２０３ｃ抗体であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
サンプルならびに０．５〜１００単位／ｍｌの量の適切に希釈したアレルゲンの体積に基づいてインターロイキン−３を０．０５〜５ｎｇ／ｍｌの量で添加した血液サンプルを、生理学的環境に一致する温度にて１５〜４５分間インキュベートし、その後、３〜３０μｌ／血液１００μｌの量の標識された抗ＣＤ６３抗体、および３〜３０μｌ／血液１００μｌの量の好塩基球の表面マーカーに対する標識抗体を０〜＋１０℃の温度にて添加し、次にサンプルをボルテックスした後に、氷浴で１５〜３０分間インキュベートし、さらに溶解させて、サイトフローメトリーにかけることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
好塩基球の表面マーカーに対する抗体が抗ＣＤ１２３抗体であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
好塩基球の表面マーカーに対する抗体が抗ＣＤ２０３ｃ抗体であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法で好塩基球の活性化を測定することに基づく、アレルゲンに対する過敏症を判定するためのキットであって、１００アッセイにつき、インターロイキン−３  １ｎｇ〜２μｇ、緩衝液２００ｍｌ、標識された抗ＣＤ６３抗体  ０．３〜３ｍｌ、および好塩基球の表面マーカーに対する標識抗体０．３〜３ｍｌ、Ｎ−ホルミル−Ｌ−メチオニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−フェニルアラニン  ４．３３μｇおよび場合により共通ビヒクルを含むことを特徴とするキット。
【請求項１０】
１００アッセイにつき、インターロイキン−３  １〜１００ｎｇ、緩衝液２００ｍｌ、標識された抗ＣＤ６３抗体  ０．３〜３ｍｌ、および好塩基球の表面マーカーに対する標識抗体０．３〜３ｍｌ、Ｎ−ホルミル−Ｌ−メチオニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−フェニルアラニン  ４．３３μｇおよび場合により共通ビヒクルを含むことを特徴とする、請求項９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二重標識によってある物質に対する過敏症を判定するための、アレルゲンによる刺激後の被験者の血液中好塩基球の反応を判定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ある物質に対する生物の過敏症を検知するために、インビボ試験（皮膚試験、二重盲検）またはインビトロ試験のどちらかが使用されている。近年、インビトロ試験が普及する傾向があるため、被験者に対するアレルギー負荷は回避される。インビトロ試験が好まれる他の理由は、被験者の年齢、過敏症反応の恐怖、被験者の快適さである（１本のスティックが１個のアレルゲンを判定することに相当する皮膚穿刺と異なり、インビトロ試験は、複数のアレルゲンを１回の血液採取で判定することが可能である）。
【０００３】
現在、最も広範に使用されるインビトロ試験は、被験者の血液中の特異性ＩｇＥ抗体（ｓＩｇＥ）の、すなわち細胞の特異性反応の最終生成物の、レベルの測定である。試験の最も広く知られている原理は、さまざまな変種の酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）である。判定は、被験者の血液採取後に時間遅延を取って行うことができる。１回の採取から、さらなるアレルゲンに対する抗体が判定できる。しかし結果は皮膚試験とは異なる場合がある。たとえば被験者がアレルゲンにある時間にわたって接触状態にならなかった場合、過敏症が関係する場合でも、抗体が消えることがある。また交差反応抗体はしばしば見出され、一般に方法はあまり標準化することができない
【０００４】
このことは、刺激に対する細胞の即時反応を監視する方法が最近開発され始めた理由である。近年、好塩基球に多くの注目が払われてきた。それらは免疫系の特殊エフェクタ細胞であり、アレルギー反応において重要な役割を果たす。感作細胞は、特異性アレルゲンによって活性化される。活性化は、一方では一部の受容体のその表面での発現（ＣＤ６３）によって、他方では（ＩｇＥの生成を支援する）サイトカインおよび介在物質（ヒスタミン、ロイコトリエンなど）の生成によって、明らかになる。それらはアレルギーの一部の臨床的発現の原因である。これらの方法は、未だ十分には普及していない。近年、ヒスタミンおよびスルフィドロイコトリエンは、ＥＬＩＳＡ試験によるアレルゲンを用いた細胞の刺激後に、上澄み中で判定できる。欠点は、細胞の分離の必要性である。その間に、非特異性活性化が起こることがある。加えて、被験者は少なくとも４８時間の間、どの抗ヒスタミン薬も使用してはならない。
【０００５】
好塩基球に対する活性化抗体ＣＤ６３の発現の判定は、以下の利点を有する。１）全血を用いた作業、２）皮膚試験用と同じアレルゲンである、可溶性アレルゲンの使用、３）周囲にｎＩｇＥｓが存在しない場合でも、アレルゲンに対するタイプ１過敏症を判定する可能性。さらに細胞は、その低い親和性のために、アレルゲンに対する交差反応抗体によって活性化されない。しかし、抗ＩｇＥを用いた染色による好塩基球の検知は、多少の制限を有する。
【０００６】
非常に低レベルの全ＩｇＥ（＜８０ＩＵ／ｍｌ）において、好塩基球は、非常な困難を伴ってのみ染色可能であり（低蛍光）、高レベルのＩｇＥにおいては、添加した抗体（抗ＩｇＥ）は血清ＩｇＥによって結合される。
【０００７】
フローサイトメトリー、すなわち表面受容体により細胞を標識することができるようにする方法の導入は、細胞反応の監視に基づく方法を開発することを可能にするであろう。それゆえ、本方法、アレルゲンに対する好塩基球の即時反応をインビトロで判定することを可能にする。末梢血中では、好塩基球のパーセンテージは非常に低い（約１％）。それらは、顆粒球の群に属し、顆粒球とともに大半の表面抗原を共有する。近年、他の細胞とは違って、それらがその表面にＦｃεＲＩ受容体を持ち、ＩｇＥを結合するという事実。それは抗体の抗ＩｇＥによって染色するために使用される。それゆえ好塩基球は、ＩｇＥに対して蛍光抗体によって標識される（Ｏｒｐｅｇｅｎ  Ｐｈａｒｍａが作成したＢａｓｏｔｅｓｔと比較せよ）。
【発明の概要】
【０００８】
本発明者は、好塩基球の活性化の測定は、インビボ条件に最も近い方法であると考えており、本発明者は、抗ＩｇＥ抗体によって好塩基球の染色の欠点を克服することを試みた。本発明者は、それらに特異性である表面受容体に対する抗体によって好塩基球を標識することがはるかに有利であることを見出した。それゆえ、主として低レベルのＩｇＥに関連する欠点は、この標識が該レベルとは無関係であるため、克服可能である。現在、インターロイキン−３（ＩＬ−３）の受容体が好塩基球上で発現され、名称ＣＤ１２３を持つことが既知である。そのため、好塩基球を染色するために、本受容体に対して調製された蛍光標識抗体を選択することが可能である。ＣＤ２０３ｃは、抗ＣＤ２０３ｃ抗体が使用できるような、好塩基球を染色するための別の表面マーカーである。
【０００９】
判定は全血中で実施する。アレルゲンを添加した後、およびそれに続くインキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）の間、添加したアレルゲンに感受性である細胞の場合、アレルゲンはそれ自体、所与のアレルゲンに対して特異性であるＩｇＥ抗体に結合する。抗原−抗体結合は、細胞に活性化を開始するよう指示し、それゆえ、インビボでのアレルギー反応の原因である、好塩基球の脱顆粒および介在物の放出で終わるプロセスを開始するようにも指示する。好塩基球の反応は、ＣＤ６３抗原の発現の測定により監視する。好塩基球は、好ましくはＣＤ１２３（ＩＬ−３の受容体）に対する、またはＣＤ２０３ｃ受容体に対する抗体とともに、その表面上に持つ受容体に対する抗体によって染色する。被験者の好塩基球に結合された添加アレルゲンに対する抗体がない場合、抗原−抗体反応が上昇し、それゆえ細胞の活性化が起こらず、したがってＣＤ６３の発現が起こらない。
【００１０】
添付図は、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｅｐｉｃｓ  ＸＬフローサイトメーターによって得た試験を行った各被験者のヒストグラムのセットを示す。
【００１１】
添付ずにおける個々のヒストグラムの意味は以下の通りである。
ヒストグラム１−前方方向（ＦＳ）および側方方向（ＳＳ）における光散乱による細胞の分布。ゲートＮは、好塩基球が存在する区域を表す。
ヒストグラム２−側方散乱（ＳＳ）の光散乱に、および抗ＩｇＥ／ＦＩＴＣ抗体の結合に基づく、好塩基球領域の図（ゲートＦ）。
ヒストグラム３−側方散乱（ＳＳ）の光散乱に、および抗ＣＤ１２３抗体（または抗ＣＤ２０３ｃ／ＰＥ）の結合に基づく、好塩基球領域の図（ゲートＡ）。
ヒストグラム４−蛍光強度、すなわち抗ＩｇＥ／ＦＩＴＣ結合による細胞の分布
ヒストグラム５−蛍光強度、すなわち抗ＣＤ１２３／ＰＥ  （または抗ＣＤ２０３ｃ／ＰＥ）結合による細胞の分布。
ヒストグラム６−抗ＩｇＥ／ＦＩＴＣによって染色した好塩基球の分布パーセンテージ（ゲートＦ、ヒストグラム２）。
象限１（Ｂ１）−抗ＩｇＥ／ＦＩＴＣ抗体によって染色した細胞−ゲートＦに存在する好塩基球以外の細胞。
象限２（Ｂ２）−抗ＣＤ１２３／ＰＥ（または抗ＣＤ２０３ｃ／ＰＥ）抗体と抗ＩｇＥ／ＦＩＴＣ抗体の両方によって標識した細胞。
象限３（Ｂ３）−未染色細胞。
象限４（Ｂ４）−抗ＣＤ１２３／ＰＥ（または抗ＣＤ２０３ｃ／ＰＥ）抗体によって染色した細胞。
ヒストグラム７−抗ＣＤ１２３／ＰＥで染色した好塩基球の分布パーセンテージ（ゲートＡ、ヒストグラム３）。
象限１（Ｇ１）−抗ＩｇＥ／ＦＩＴＣ抗体によって染色した細胞−ゲートＦに存在する好塩基球以外の細胞。
象限２（Ｇ２）−抗ＣＤ１２３／ＰＥ（または抗ＣＤ２０３ｃ／ＰＥ）抗体と抗ＩｇＥ／ＦＩＴＣ抗体の両方によって標識した細胞。
象限３（Ｇ３）−未染色細胞。
象限４（Ｇ４）−抗ＣＤ１２３／ＰＥ（または抗ＣＤ２０３ｃ／ＰＥ）抗体によって標識した細胞。
ヒストグラム８−側方方向（ＳＳ）の光散乱に、および抗ＩｇＥ/ＦＩＴＣ抗体の結合に基づく、抗ＣＤ１２３／ＰＥ（または抗ＣＤ２０３ｃ／ＰＥ）標識である好塩基球の分布。
【実施例】
【００１２】
（実施例１）
アッセイ（ａｓｓａｙ：分析）は、ヘパリン中に採取された全血から実施する。各試験について、全血１００μｌおよびＩＬ−３  １０μｌのＰＢＳ（緩衝生理的溶液）中の濃度０．０５μｇ／ｍｌの溶液をピペットによって試験管に移す。負の対照の場合はＰＢＳ  １００μｌを試験管に添加し、正の対照の場合は、ＦＭＬＰ（化学走化性ペプチドＮ−ホルミル−Ｌ−メチオニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−フェニルアラニン）１００μｌを濃度０．４３３μｇ／ｍｌで試験管に添加し、適切に希釈したアレルゲン１００μｌを、試験するサンプルとともに試験管に添加する。サンプルを完全に混合し、３７℃にて３０分間インキュベートする。次にサンプルを氷浴に移す。ＰＥ（フィコエリスリン；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎより)で標識したモノクローナル抗ＣＤ１２３抗体  ２０μｌ、およびＣａｌｔａｇからのＦＩＴＣで標識したモノクローナル抗体、抗ＣＤ６３  ５μｌをピペットで各試験管に入れる。サンプルを完全に混合し、氷浴中で１５〜２０分間インキュベートする。さらなる処理を室温にて行う。サンプル中の赤血球は、溶解剤、たとえばＮＨ４Ｃｌ  ２ｍｌの添加により溶解させる。溶解させた後、サンプルを１０００ｒｐｍで遠心分離する。サンプルをデカンテーションし、ＰＢＳ  ０．５ｍｌを沈殿物に加える。この方法で調製したサンプルを用いて、サイトメーターでの測定を行う。
【００１３】
（実施例２）
試験は、ヘパリン中に採取された全血から実施する。各試験について、全血１００μｌおよびＩＬ−３  １０μｌのＰＢＳ中の濃度０．０５μｇ／ｍｌの溶液をピペットによって試験管に移す。負の対照の場合はＰＢＳ  １００μｌを試験管に添加し、正の対照の場合は、ＦＭＬＰ  １００μｌを濃度０．４３３μｇ／ｍｌで試験管に添加し、適切に希釈したアレルゲン１００μｌを、試験するサンプルとともに試験管に添加する。サンプルを完全に混合し、３７℃にて３０分間インキュベートする。次にサンプルを氷浴に移す。ＩｍｍｕｎｏｔｅｃｈからのＰＥで標識したモノクローナル抗体、抗ＣＤ２０３ｃ抗体  ２０μｌ、およびＣａｌｔａｇからのＦＩＴＣで標識したモノクローナル抗体、抗ＣＤ６３  ５μｌをピペットで各試験管に入れる。サンプルを完全に混合し、氷浴中で１５〜２０分間インキュベートする。さらなる処理を室温にて行う。サンプル中の赤血球は、溶解剤、たとえばＮＨ４Ｃｌ  ２ｍｌの添加により溶解させる。溶解させた後、サンプルを１０００ｒｐｍで遠心分離する。サンプルをデカンテーションし、ＰＢＳ  ０．５ｍｌを沈殿物に加える。この方法で調製したサンプルを用いて、サイトメーターでの測定を行う。
【００１４】
（実施例３）
試験は、ヘパリン中に採取された全血から実施する。各試験について、全血１００μｌおよびＩＬ−３  １０μｌのＰＢＳ中の濃度０．５μｇ／ｍｌの溶液をピペットによって試験管に移す。負の対照の場合はＰＢＳ  １００μｌを試験管に添加し、正の対照の場合は、ＦＭＬＰ  １００μｌを濃度０．４３３μｇ／ｍｌで試験管に添加し、適切に希釈したアレルゲン１００μｌを、試験するサンプルとともに試験管に添加する。サンプルを完全に混合し、３７℃にて３０分間インキュベートする。次にサンプルを氷浴に移す。ＩｍｍｕｎｏｔｅｃｈからのＰＥで標識したモノクローナル抗体、抗ＣＤ２０３ｃ抗体  ２０μｌ、およびＣａｌｔａｇからのＦＩＴＣで標識したモノクローナル抗体、抗ＣＤ６３  ５μｌをピペットで各試験管に入れる。サンプルを完全に混合し、氷浴中で１５〜２０分間インキュベートする。さらなる処理を室温にて行う。サンプル中の赤血球は、溶解剤、たとえばＮＨ４Ｃｌ  ２ｍｌの添加により溶解させる。溶解させた後、サンプルを１０００ｒｐｍで遠心分離する。サンプルをデカンテーションし、ＰＢＳ  ０．５ｍｌを沈殿物に加える。この方法で調製したサンプルを用いて、サイトメーターでの測定を行う。
【００１５】
（実施例４）
濃度０．０５μｇ／ｍｌのＩＬ−３（Ｓｉｇｍａ）  １ｍｌ、ＰＢＳ  ２００ｍｌ、ＦＩＴＣ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）で標識した抗ＣＤ６３抗体  ２ｍｌ、ＰＥ  （Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）で標識した抗ＣＤ２０３ｃ抗体  ２ｍｌ、濃度４．３３μｇ／ｍｌのＦＭＬＰ溶液  １０ｍｌおよび溶解溶液ＮＨ４Ｃｌ  ２００ｍｌを含有するキットにより、アッセイを行う。アッセイは、ヘパリン中に採取された全血から実施する。各試験について、全血１００μｌおよびＩＬ−３  １０μｌの、ＰＢＳ（緩衝生理的溶液）中の濃度０．０５μｇ／ｍｌの溶液をピペットによって試験管に移す。負の対照の場合はＰＢＳ  １００μｌを試験管に添加し、正の対照の場合は、ＦＭＬＰ  １００μｌを濃度０．４３３μｇ／ｍｌで試験管に添加し、適切に希釈したアレルゲン１００μｌを、試験するサンプルとともに試験管に添加する。サンプルを完全に混合し、３７℃にて３０分間インキュベートする。次にサンプルを氷浴に移す。モノクローナル抗体、抗ＣＤ２０３ｃ抗体  ２０μｌ、およびモノクローナル抗体、抗ＣＤ６３  ２０μｌをピペットで各試験管に入れる。サンプルを完全に混合し、氷浴中で１５〜２０分間インキュベートする。さらなる処理を室温にて行う。サンプル中の赤血球は、溶解剤、たとえばＮＨ４Ｃｌ  ２ｍｌの添加により溶解させる。溶解させた後、サンプルを１０００ｒｐｍで遠心分離する。サンプルをデカンテーションし、ＰＢＳ  ０．５ｍｌを沈殿物に加える。この方法で調製したサンプルを用いて、サイトメーターでの測定を行う。
【００１６】
（実施例５）
濃度１μｇ／ｍｌのＩＬ−３（Ｓｉｇｍａ）  １ｍｌ、ＰＢＳ  ２００ｍｌ、ＦＩＴＣ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）で標識した抗ＣＤ６３抗体  ２ｍｌ、ＰＥ  （Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）で標識した抗ＣＤ２０３ｃ抗体  ２ｍｌ、濃度４．３３μｇ／ｍｌのＦＭＬＰ溶液  １０ｍｌおよび溶解溶液ＮＨ４Ｃｌ  ２００ｍｌを含有するキットにより、アッセイを行う。アッセイは、ヘパリン中に採取された全血から実施する。各試験について、全血１００μｌおよびＩＬ−３  １０μｌの、ＰＢＳ（緩衝生理的溶液）中の濃度０．０５μｇ／ｍｌの溶液をピペットによって試験管に移す。負の対照の場合はＰＢＳ  １００μｌを試験管に添加し、正の対照の場合は、ＦＭＬＰ  １００μｌを濃度０．４３３μｇ／ｍｌで試験管に添加し、適切に希釈したアレルゲン１００μｌを、試験するサンプルとともに試験管に添加する。サンプルを完全に混合し、３７℃にて３０分間インキュベートする。次にサンプルを氷浴に移す。モノクローナル抗体、抗ＣＤ２０３ｃ抗体  ２０μｌ、およびモノクローナル抗体、抗ＣＤ６３  ２０μｌをピペットで各試験管に入れる。サンプルを完全に混合し、氷浴中で１５〜２０分間インキュベートする。さらなる処理を室温にて行う。サンプル中の赤血球は、溶解剤、たとえばＮＨ４Ｃｌ  ２ｍｌの添加により溶解させる。溶解させた後、サンプルを１０００ｒｐｍで遠心分離する。サンプルをデカンテーションし、ＰＢＳ  ０．５ｍｌを沈殿物に加える。この方法で調製したサンプルを用いて、サイトメーターでの測定を行う。
【００１７】
フローサイトメーターＣｏｕｌｔｅｒ  ＥｐｉｃｓＸＬ  （Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）での測定結果を、以下の表にまとめ、添付図に示す。
【００１８】
略語および用語の表：
ＩＬ−３−インターロイキン−３
ＰＢＳ−緩衝生理的溶液
ＦＭＬＰ−Ｎ−ホルミル−Ｌ−メチオニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−フェニルアラニン
ＦＩＴＣ−フルオレセインイソチオシアネート
ＰＥ−フィコエリスリン
ＤＦ−Ｄｅｒｍａｔｈｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｆａｒｉｎａｅ（コナヒョウダニ）（コナダニ）
ＤＰ−Ｄｅｒｍａｔｈｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ（ヤケヒョウダニ）（コナダニ）
ゲート、ゲーティング−サイトメトリーの分野において。たとえば、モノクローナル抗体によって染色した細胞が試験される領域の定義
【００１９】
【表１】
2005509845.tif 000002
【００２０】
表および添付図１−１〜１−８は、好塩基球の２色染色のいくつかの例を与える。抗ＩｇＥ抗体で染色した好塩基球の何パーセントがＣＤ１２３受容体も持つか、およびその逆の、抗ＣＤ１２３で染色した好塩基球の何パーセントが抗ＩｇＥ陽性でもあるかを判定した。
【００２１】
１００〜４００Ｕ／ｍｌのＩｇＥ血清レベルでは、抗ＩｇＥ抗体による好塩基球の染色が適していることが表より生じる。低レベルのＩｇＥ（被験者ＭＨ、１８５３５、１８４５５、１８５０７、１２５６０）では、抗ＩｇＥで染色した好塩基球は、抗体がそれらに結合しないため、ゲートできない。これに対して、高レベルのＩｇＥ（被験者番号１５９３１）においては、抗体の単球への非特異性結合が生じるか、添加された抗体が血清ＩｇＥと置換される。
【００２２】
【表２】
2005509845.tif 000003
【００２３】
表および添付図２−１〜２−５は、好塩基球の２色染色のいくつかの例を与える。抗ＩｇＥ抗体で染色した好塩基球の何パーセントがＣＤ２０３ｃ受容体も持つか、およびその逆の、抗ＣＤ２０３ｃで染色した好塩基球の何パーセントが抗ＩｇＥ陽性でもあるかを判定した。
【００２４】
ＩＬ−３濃度の関数としての、好塩基球の活性化
【表３】
2005509845.tif 000004
【表４】
2005509845.tif 000005
【表５】
2005509845.tif 000006
【表６】
2005509845.tif 000007
【表７】
2005509845.tif 000008
【００２５】
アレルゲンによるインキュベーション時間の関数としての、好塩基球の活性化
【表８】
2005509845.tif 000009
【表９】
2005509845.tif 000010
【表１０】
2005509845.tif 000011
【表１１】
2005509845.tif 000012
【００２６】
ＩＬ−３による血液予備インキュベーションの関数としての、好塩基球の活性化
【表１２】
2005509845.tif 000013
【表１３】
2005509845.tif 000014
【表１４】
2005509845.tif 000015
【００２７】
アレルゲン希釈の関数としての、好塩基球の活性化
【表１５】
2005509845.tif 000016
【表１６】
2005509845.tif 000017
【表１７】
2005509845.tif 000018
【表１８】
2005509845.tif 000019
【表１９】
2005509845.tif 000020
【表２０】
2005509845.tif 000021
【表２１】
2005509845.tif 000022
【表２２】
2005509845.tif 000023
【表２３】
2005509845.tif 000024
【００２８】
ＩＬ−３濃度およびアレルゲン希釈の関数としての活性化
【表２４】
2005509845.tif 000025
【００２９】
ここで、基準アレルゲン濃度は１００Ｕ／ｍｌである。
正常値：Ｋ０＜８％
アレルゲン＜１５％
【００３０】
上述の手順より得た被験者の結果（抗ＩｇＥ、抗ＣＤ１２３または抗２０３によって染色した好塩基球）と、ＯＲＰＥＧＥＮより入手可能なＢＡＳＯＴＥＳＴという名称の試験との比較
【００３１】
比較：抗ＩｇＥ／ＣＤ６３対Ｂａｓｏｔｅｓｔ
【表２５】
2005509845.tif 000026
【表２６】
2005509845.tif 000027
【００３２】
比較：抗ＣＤ１２３対Ｂａｓｏｔｅｓｔ
【表２７】
2005509845.tif 000028
【表２８】
2005509845.tif 000029
【００３３】
比較：Ｂａｓｏｔｅｓｔ対抗ＣＤ１２３／ＣＤ６３、抗ＣＤ２０３ｃ／ＣＤ６３
【表２９】
2005509845.tif 000030
【００３４】
比較：抗ＩｇＥ／ＣＤ６３対Ｂａｓｏｔｅｓｔ、抗ＣＤ１２３／ＣＤ６３、抗ＣＤ２０３ｃ／ＣＤ６３
【表３０】
2005509845.tif 000031
【００３５】
比較：抗ＩｇＥ／ＦＩＴＣ−ＣＤ６３／ＰＥ、抗ＣＤ１２３／ＰＥ−ＣＤ６３／ＦＩＴＣ、およびＣＤ２０３ｃ／ＰＥ−ＣＤ６３／ＦＩＴＣ
【００３６】
ミツバチおよびスズメバチアレルゲンに対する過敏症を試験した。結果を図３−１〜３−４に示し、陽性好塩基球、すなわちアレルゲンに感受性である塩基球のパーセンテージとして表現する（図では、ヒストグラム３または６、象限２−好塩基球のマーカーとＣＤ６３活性化抗原との両方を持つ細胞）。Ｋ０−刺激なしのサンプル（負の対照）。
【表３１】
2005509845.tif 000032
【００３７】
ここで、正常値：Ｋ０＜８％
アレルゲン＜１５％
【００３８】
比較のため、次のアレルゲンへの特異性ＩｇＥ抗体を被験者について決定した。
スズメバチ  ０．３５Ｕ／ｍｌ
ミツバチ    １．４Ｕ／ｍｌ    正の値＞０．３５Ｕ／ｍｌ
【００３９】
全ＩｇＥのレベル（約９０ＩＵ／ｍｌ）により、好塩基球の染色の３方式すべてが適切であり、比較できる結果を有する。
【００４０】
（抗ＩｇＥ／ＦＩＴＣ）に対する、および活性化抗原ＣＤ６３  (ＣＤ６３／ＰＥ)に対する抗体を持つ細胞の染色。
【００４１】
結果の比較：抗ＩｇＥ／ＦＩＴＣ−ＣＤ６３／ＰＥ対抗ＣＤ１２３／ＰＥ−ＣＤ６３／ＦＩＴＣ
【００４２】
卵白、牛乳、および小麦粉のアレルゲンに対する過敏症を試験した。
【００４３】
結果を図４−１〜４−８に示し、すなわちアレルゲンに感受性である塩基球のパーセンテージとして表現する（図では、ヒストグラム３または６、象限２−好塩基球のマーカーとＣＤ６３活性化抗原との両方を持つ細胞）。Ｋ０−刺激なしのサンプル（負の対照）。
【００４４】
【表３２】
2005509845.tif 000033
【００４５】
ここで、正常値：Ｋ０＜８％
アレルゲン＜１５％
【００４６】
比較のため、次のアレルゲンへの特異性ＩｇＥ抗体を被験者について決定した。
卵白＞２５Ｕ／ｍｌ
牛乳＞２５Ｕ／ｍｌ
小麦粉１．７１Ｕ／ｍｌ；正の値＞３５Ｕ／ｍｌ
【００４７】
高レベルの全ＩｇＥ（＞１７，８００ＩＵ／ｍｌ）により、抗ＩｇＥ抗体よりも、抗ＣＤ１２３によって好塩基球に染色することがさらに適切である（血清ＩｇＥへのその結合が明らかに生じる）。
【００４８】
小麦粉に対する特異性ＩｇＥの結果の不一致（１．７−陽性）および本発明者が見出した非過敏症は、ｓＩｇＥｓの判定中に非特異性結合が発生しないという本発明者の発見を確認する。抗体が低い親和性を持ち、臨床反応を示さないことが多い交差反応抗体を同時に判定する（偽陽性結果）。
【００４９】
好塩基球の活性化、ｓＩｇＥおよび臨床徴候の結果の比較
【表３３】
2005509845.tif 000034
【００５０】
ここで、陽性結果：＞０．３５Ｕ／ｍｌ  ｓＩｇＥ
＞１５％活性化好塩基球
【００５１】
【表３４】
2005509845.tif 000035
【００５２】
ここで、陽性結果：＞０．３５Ｕ／ｍｌ  ｓＩｇＥ
＞１５％活性化好塩基球
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１−１〜１−８は、表１にまとめた血清中のＩｇＥ全体の濃度の関数としての、好塩基球でのＣＤ１２３＋／ＩｇＥ＋の共通発現を示す。
【図２】図２−１〜２−５は、表１にまとめた血清中のＩｇＥ全体の濃度の関数としての、好塩基球でのＣＤ２０３ｃ＋／ＩｇＥ＋の共通発現を示す。
【図３】図３−１〜３−４は：図３−１−刺激なしのサンプル（Ｋ０の負の対照）図３−２−ＦＭＬＰによって刺激されたサンプル、非特異性対照）図３−３−スズメバチアレルゲンによって刺激されたサンプル図３−４−ミツバチアレルゲンによって刺激されたサンプルを示す。図３−１〜図３−４のヒストグラムの意味：ヒストグラム１−前方方向（ＦＳ）および側方方向（ＳＳ）における光散乱による細胞の分布。ゲートＮは、好塩基球が存在する区域を表す。ヒストグラム２−側方散乱（ＳＳ）の光散乱に、および抗ＩｇＥ／ＦＩＴＣ抗体の結合に基づく、好塩基球領域の図（ゲートＢ）。ヒストグラム３−抗体の結合による好塩基球の分布パーセンテージ。象限１（Ｃ１）−ＣＤ６３／ＰＥ抗体によって染色した細胞−ゲートＢに存在する好塩基球以外の細胞（ヒストグラム２）。象限２（Ｃ２）−抗ＣＤ６３／ＰＥ抗体と抗ＩｇＥ／ＦＩＴＣ抗体の両方によって染色した細胞、すなわち活性化細胞。象限３（Ｃ３）−未染色細胞。象限４（Ｃ４）−抗ＩｇＥ／ＦＩＴＣ抗体によって染色した細胞−非活性化好塩基球。ヒストグラム４−蛍光強度、すなわち抗ＩｇＥ／ＦＩＴＣ結合による細胞の分布。ヒストグラム５−蛍光強度、すなわちＣＤ６３／ＰＥ結合による細胞の分布。
【図４】図４−１〜４−８は、抗ＩｇＥ  ／ＦＩＴＣ−ＣＤ６３／ＰＥおよび抗ＣＤ１２３／ＰＥ−ＣＤ６３／ＦＩＴＣの結果の比較を示す。
【図１−１】
2005509845.tif 000036
【図１−２】
2005509845.tif 000037
【図１−３】
2005509845.tif 000038
【図１−４】
2005509845.tif 000039
【図１−５】
2005509845.tif 000040
【図１−６】
2005509845.tif 000041
【図１−７】
2005509845.tif 000042
【図１−８】
2005509845.tif 000043
【図２−１】
2005509845.tif 000044
【図２−２】
2005509845.tif 000045
【図２−３】
2005509845.tif 000046
【図２−４】
2005509845.tif 000047
【図２−５】
2005509845.tif 000048
【図３−１】
2005509845.tif 000049
【図３−２】
2005509845.tif 000050
【図３−３】
2005509845.tif 000051
【図３−４】
2005509845.tif 000052
【図４−１】
2005509845.tif 000053
【図４−２】
2005509845.tif 000054
【図４−３】
2005509845.tif 000055
【図４−４】
2005509845.tif 000056
【図４−５】
2005509845.tif 000057
【図４−６】
2005509845.tif 000058
【図４−７】
2005509845.tif 000059
【図４−８】
2005509845.tif 000060
【手続補正書】
【提出日】平成15年9月18日(2003.9.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ある物質に対する過敏症を判定するために、アレルゲンによる刺激後の好塩基球の活性化を測定するための方法であって、サンプルならびに０．５〜１００単位／ｍｌの量の適切に希釈したアレルゲンの体積に基づいてインターロイキン−３を０．０５〜５０ｎｇ／ｍｌの量で添加した血液サンプルを、生理学的環境に一致する温度にて１５〜４５分間インキュベートし、その後、３〜３０μｌ／血液１００μｌの量の標識された抗ＣＤ６３抗体、および３〜３０μｌ／血液１００μｌの量の、好塩基球の表面マーカーに対する標識抗体であって、抗ＣＤ１２３抗体および抗ＣＤ２０３ｃ抗体から選択される抗体を０〜＋１０℃の温度にて添加し、次にサンプルをボルテックスした後に、氷浴で１５〜３０分間インキュベートし、さらに溶解させて、サイトフローメトリーにかけることを特徴とする方法。
【請求項２】
抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
サンプルならびに０．５〜１００単位／ｍｌの量の適切に希釈したアレルゲンの体積に基づいてインターロイキン−３を０．０５〜５ｎｇ／ｍｌの量で添加した血液サンプルを、生理学的環境に一致する温度にて１５〜４５分間インキュベートし、その後、３〜３０μｌ／血液１００μｌの量の標識された抗ＣＤ６３抗体、および３〜３０μｌ／血液１００μｌの量の、抗ＣＤ１２３抗体および抗ＣＤ２０３ｃ抗体から選択される標識抗体を０〜＋１０℃の温度にて添加し、次にサンプルをボルテックスした後に、氷浴で１５〜３０分間インキュベートし、さらに溶解させて、サイトフローメトリーにかけることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法で好塩基球の活性化を測定することに基づく、アレルゲンに対する過敏症を判定するためのキットであって、１００アッセイにつき、インターロイキン−３  １ｎｇ〜２μｇ、緩衝液２００ｍｌ、標識された抗ＣＤ６３抗体  ０．３〜３ｍｌ、および好塩基球の表面マーカーに対する、抗ＣＤ１２３抗体および抗ＣＤ２０３ｃ抗体から選択される標識抗体０．３〜３ｍｌ、Ｎ−ホルミル−Ｌ−メチオニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−フェニルアラニン  ４．３３μｇおよび場合により共通ビヒクルを含むことを特徴とするキット。
【請求項６】
１００アッセイにつき、インターロイキン−３  １〜１００ｎｇ、緩衝液２００ｍｌ、標識された抗ＣＤ６３抗体  ０．３〜３ｍｌ、および抗ＣＤ１２３抗体および抗ＣＤ２０３ｃ抗体から選択される標識抗体０．３〜３ｍｌ、Ｎ−ホルミル−Ｌ−メチオニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−フェニルアラニン  ４．３３μｇおよび場合により共通ビヒクルを含むことを特徴とする、請求項５に記載のキット。
【国際調査報告】
2005509845.tif 000061
2005509845.tif 000062
2005509845.tif 000063
2005509845.tif 000064