(57)【要約】  本発明は、イヌの重鎖および軽鎖（λとκの双方）可変ドメインの核酸およびポリペプチドを提供する。本発明はまた、本明細書で開示されるイヌ可変ドメインのフレームワーク配列と、イヌ以外（好ましくは、マウス）に由来する抗体から得た抗原特異的なＣＤＲと、からなるイヌ化抗体を提供する。本発明はまた、イヌ化抗体を作製する方法およびそれを使用する方法を提供する。本開示内容は、イヌのアレルギーの治療に有用なイヌ化抗体について詳細に記載する。イヌ化の一般的な手法により、限定されるものではないが、アレルギー、骨肉種およびリンパ腫などの有用な治療薬の開発が可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の配列：
Ｆｒ１−ＣＤＲ１−Ｆｒ２−ＣＤＲ２−Ｆｒ３−ＣＤＲ３−Ｆｒ４
（配列中、
【化１】
2005514063.tif 000122
であり、
【表１】
2005514063.tif 000123
であり、ならびに
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は相補性決定領域（ＣＤＲ）であって、「−」はその各位置にアミノ酸残基が存在しないことを意味し、Ｘ７９が−であるときにはＸ８０が−であることを条件とする）
からなるイヌ重鎖可変ドメインポリペプチド。
【請求項２】
以下の配列：
Ｆｒ１−ＣＤＲ１−Ｆｒ２−ＣＤＲ２−Ｆｒ３−ＣＤＲ３−Ｆｒ４
（配列中、
Ｆｒ１は
【表２】
2005514063.tif 000124
であり、Ｆｒ２は
【表３】
2005514063.tif 000125
であり、Ｆｒ３は
【表４】
2005514063.tif 000126
であり、Ｆｒ４は
【表５】
2005514063.tif 000127
である）
からなる請求項１に記載のイヌ重鎖可変ドメインポリペプチド。
【請求項３】
以下の配列：
Ｆｒ１−ＣＤＲ１−Ｆｒ２−ＣＤＲ２−Ｆｒ３−ＣＤＲ３−Ｆｒ４
（配列中、
【表６】
2005514063.tif 000128
である）
からなる請求項１に記載のイヌ重鎖可変ドメインポリペプチド。
【請求項４】
以下の配列：
Ｆｒ１−ＣＤＲ１−Ｆｒ２−ＣＤＲ２−Ｆｒ３−ＣＤＲ３−Ｆｒ４
（配列中、
【化２】
2005514063.tif 000129
【表７】
2005514063.tif 000130
である）
からなるイヌ重鎖可変ドメインポリペプチド。
【請求項５】
以下の配列：
Ｆｒ１−ＣＤＲ１−Ｆｒ２−ＣＤＲ２−Ｆｒ３−ＣＤＲ３−Ｆｒ４
（配列中、
【化３】
2005514063.tif 000131
である）
からなる請求項４に記載のイヌ重鎖可変ドメインポリペプチド。
【請求項６】
以下の配列：
Ｆｒ１−ＣＤＲ１−Ｆｒ２−ＣＤＲ２−Ｆｒ３−ＣＤＲ３−Ｆｒ４
（配列中、
【表８】
2005514063.tif 000132
である）
からなる請求項４に記載のイヌ重鎖可変ドメインポリペプチド。
【請求項７】
以下の配列：
Ｆｒ１−ＣＤＲ１−Ｆｒ２−ＣＤＲ２−Ｆｒ３−ＣＤＲ３−Ｆｒ４
（配列中、
【化４】
2005514063.tif 000133
【表９】
2005514063.tif 000134
である）
からなるイヌ重鎖可変ドメインポリペプチド。
【請求項８】
以下の配列：
Ｆｒ１−ＣＤＲｌ−Ｆｒ２−ＣＤＲ２−Ｆｒ３−ＣＤＲ３−Ｆｒ４
（配列中、
【化５】
2005514063.tif 000135
である）
からなる請求項７に記載のイヌ重鎖可変ドメインポリペプチド。
【請求項９】
以下の配列：
Ｆｒ１−ＣＤＲ１−Ｆｒ２−ＣＤＲ２−Ｆｒ３−ＣＤＲ３−Ｆｒ４
（配列中、
【表１０】
2005514063.tif 000136
である）
からなる請求項７に記載のイヌ重鎖可変ドメインポリペプチド。
【請求項１０】
以下の配列：
Ｆｒｌ−ＣＤＲ１−Ｆｒ２−ＣＤＲ２−Ｆｒ３−ＣＤＲ３−Ｆｒ４
（配列中、Ｆｒ１、Ｆｒ２、Ｆｒ３およびＦｒ４は、表Ｎその他のＨに示される重鎖可変配列のフレームワーク領域から選択されるフレームワーク領域である）
からなる請求項７に記載のイヌ重鎖可変ドメインポリペプチド。
【請求項１１】
ＣＤＲがすべてイヌ抗体由来である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のイヌ重鎖可変ドメインポリペプチド。
【請求項１２】
ＣＤＲがすべて同一の非イヌ抗体由来である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のイヌ重鎖可変ドメインポリペプチド。
【請求項１３】
２つのＣＤＲが同一の非イヌ抗体由来であり、第３のＣＤＲがイヌＣＤＲである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のイヌ重鎖可変ドメインポリペプチド。
【請求項１４】
前記イヌＣＤＲがＣＤＲ１である、請求項１３に記載のイヌ重鎖可変ドメインポリペプチド。
【請求項１５】
ＣＤＲ１が
ａ）Ｃ’２Ｃ’３Ｃ’４Ｃ’５Ｃ’６Ｃ’７Ｃ’８Ｃ’９Ｃ’１０Ｃ’１１であって、
【表１１】
2005514063.tif 000137
である、
ｂ）次の
【表１２】
2005514063.tif 000138
からなる群から選択される、
ｃ）Ｃ’１Ｃ’２Ｃ’３Ｃ’４Ｃ’５Ｃ’６Ｃ’７Ｃ’８Ｃ’９Ｃ’１０であって、
【表１３】
2005514063.tif 000139
である、
ｄ）ＧＹＴＦＴＤＹＹＭＨおよびＧＹＩＦＩＤＱＹＭＨからなる群から選択される、
ｅ）Ｃ’１Ｃ’２Ｃ’３Ｃ’４Ｃ’５Ｃ’６Ｃ’７Ｃ’８Ｃ’９Ｃ’１０であって、
【表１４】
2005514063.tif 000140
である、
ｆ）ＧＳＶＴＤＩＨＹＷＳおよびＧＳＶＮＳＧＹＹＷＳからなる群から選択される、または
ｇ）マウス１５Ａ２抗体ＣＤＲ１、ＳＧＹＳＦＴＤＹＦＭＮである、
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のイヌ重鎖可変ドメインポリペプチド。
【請求項１６】
ＣＤＲ２が
ａ）Ｃ’’１Ｃ’’２Ｃ’’３Ｃ’’４Ｃ’’５Ｃ’’６Ｃ’’７Ｃ’’８Ｃ’’９Ｃ’’１０Ｃ’’１１Ｃ’’１２Ｃ’’１３Ｃ’’１４Ｃ’’１５Ｃ’’１６Ｃ’’１７であって、
【表１５】
2005514063.tif 000141
である、
ｂ）次の
【表１６】
2005514063.tif 000142
からなる群から選択される、
ｃ）Ｃ’’１Ｃ’’２Ｃ’’３Ｃ’’４Ｃ’’５Ｃ’’６Ｃ’’７Ｃ’’８Ｃ’’９Ｃ’’１０Ｃ’’１１Ｃ’’１２Ｃ’’１３Ｃ’’１４Ｃ’’１５Ｃ’’１６であって、
【表１７】
2005514063.tif 000143
である、
ｄ）ＩＤＰＥＤＧＴＴＳＹＡＱＫＦＱＧおよびＩＤＰＥＤＤＴＴＧＹＡＱＫＦＱＧからなる群から選択される、
ｅ）Ｃ’’１Ｃ’’２Ｃ’’３Ｃ’’４Ｃ’’５Ｃ’’６Ｃ’’７Ｃ’’８Ｃ’’９Ｃ’’１０Ｃ’’１１Ｃ’’１２Ｃ’’１３Ｃ’’１４Ｃ’’１５Ｃ’’１６であって、
【表１８】
2005514063.tif 000144
である、
ｆ）ＹＷＲＧＧＴＮＨＮＰＡＦＱＥＲＩおよびＹＷＳＧＴＴＨＹＮＰＴＦＱＧＲＩからなる群から選択される、または
ｇ）マウス１５Ａ２抗体ＣＤＲ２、ＲＩＮＰＦＮＧＤＰＦＹＮＱＫＦＫＧである、
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のイヌ重鎖可変ドメインポリペプチド。
【請求項１７】
ＣＤＲ３が
ａ）Ｃ’’’１Ｃ’’’２Ｃ’’’３Ｃ’’’４Ｃ’’’５Ｃ’’’６Ｃ’’’７Ｃ’’’８Ｃ’’’９Ｃ’’’１０Ｃ’’’１１Ｃ’’’１２Ｃ’’’１３Ｃ’’’１４Ｃ’’’１５Ｃ’’’１６Ｃ’’’１７Ｃ’’’１８Ｃ’’’１９Ｃ’’’２０であって、
【表１９】
2005514063.tif 000145
である、
ｂ）次の
【表２０】
2005514063.tif 000146
からなる群から選択される、
ｃ）ＧＧＳＲＰＦＮＡＦＧ、ＫＷＲＹＹＧＳＱＤ、ＤＩＷＤＦＤおよびＹＩＹＧＹＡＡＹＬＤからなる群から選択される、
ｄ）ＮＳＤおよびＬＹＲＳＮＹＬＬＤからなる群から選択される、または
ｅ）マウス１５Ａ２抗体ＣＤＲ３、ＦＹＹＧＲＹＹＡＭＤＹである、
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のイヌ重鎖可変ドメインポリペプチド。
【請求項１８】
ＣＤＲ１がマウス１５Ａ２抗体ＣＤＲ１、ＳＧＹＳＦＴＤＹＦＭＮであり、かつ／または
ＣＤＲ２がマウス１５Ａ２抗体ＣＤＲ２、ＲＩＮＰＦＮＧＤＰＦＹＮＱＫＦＫＧであり、かつ／または
ＣＤＲ３がマウス１５Ａ２抗体ＣＤＲ３、ＦＹＹＧＲＹＹＡＭＤＹである、
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のイヌ重鎖可変ドメインポリペプチド。
【請求項１９】
次の
【化６】
2005514063.tif 000147
からなる群から選択されるイヌ重鎖可変ドメインポリペプチド。
【請求項２０】
請求項１〜１０および１９のいずれか一項に記載のイヌ重鎖可変ドメインポリペプチドをコードする核酸であって、各コドンが、該ポリペプチドの対応するアミノ酸をコードする遺伝暗号のいずれかのコドンであることを特徴とする核酸。
【請求項２１】
請求項１１に記載のイヌ重鎖可変ドメインポリペプチドをコードする核酸であって、各コドンが、該ポリペプチドの対応するアミノ酸をコードする遺伝暗号のいずれかのコドンであることを特徴とする核酸。
【請求項２２】
請求項１２に記載のイヌ重鎖可変ドメインポリペプチドをコードする核酸であって、各コドンが、該ポリペプチドの対応するアミノ酸をコードする遺伝暗号のいずれかのコドンであることを特徴とする核酸。
【請求項２３】
請求項１３に記載のイヌ重鎖可変ドメインポリペプチドをコードする核酸であって、各コドンが、該ポリペプチドの対応するアミノ酸をコードする遺伝暗号のいずれかのコドン
であることを特徴とする核酸。
【請求項２４】
請求項１４に記載のイヌ重鎖可変ドメインポリペプチドをコードする核酸であって、各コドンが、該ポリペプチドの対応するアミノ酸をコードする遺伝暗号のいずれかのコドンであることを特徴とする核酸。
【請求項２５】
請求項１５に記載のイヌ重鎖可変ドメインポリペプチドをコードする核酸であって、各コドンが、該ポリペプチドの対応するアミノ酸をコードする遺伝暗号のいずれかのコドンであることを特徴とする核酸。
【請求項２６】
請求項１６に記載のイヌ重鎖可変ドメインポリペプチドをコードする核酸であって、各コドンが、該ポリペプチドの対応するアミノ酸をコードする遺伝暗号のいずれかのコドンであることを特徴とする核酸。
【請求項２７】
請求項１７に記載のイヌ重鎖可変ドメインポリペプチドをコードする核酸であって、各コドンが、該ポリペプチドの対応するアミノ酸をコードする遺伝暗号のいずれかのコドンであることを特徴とする核酸。
【請求項２８】
請求項１８に記載のイヌ重鎖可変ドメインポリペプチドをコードする核酸であって、各コドンが、該ポリペプチドの対応するアミノ酸をコードする遺伝暗号のいずれかのコドンであることを特徴とする核酸。
【請求項２９】
イヌ重鎖可変ドメインをコードする核酸であって、（ａ）表ＮＨ５８中の核酸のうちの１つの、フレームワークをコードする核酸配列、および（ｂ）１つまたは複数の保存的ヌクレオチド置換を含む、表ＮＨ５８中の核酸のうちの１つの、フレームワークをコードする核酸配列、から選択されるフレームワークをコードする配列からなる核酸。
【請求項３０】
イヌ重鎖可変ドメインをコードする核酸であって、（ａ）表ＮＨ７４中の核酸のうちの１つの、フレームワークをコードする核酸配列、および（ｂ）１つまたは複数の保存的ヌクレオチド置換を含む、表ＮＨ７４中の核酸のうちの１つの、フレームワークをコードする核酸配列、から選択されるフレームワークをコードする配列からなる核酸。
【請求項３１】
イヌ重鎖可変ドメインをコードする核酸であって、（ａ）表Ｎその他のＨ中の核酸のうちの１つの、フレームワークをコードする核酸配列、および（ｂ）１つまたは複数の保存的ヌクレオチド置換を含む、表Ｎその他のＨ中の核酸のうちの１つの、フレームワークをコードする核酸配列、から選択されるフレームワークをコードする配列からなる核酸。
【請求項３２】
以下の配列：
Ｆｒ１−ＣＤＲ１−Ｆｒ２−ＣＤＲ２−Ｆｒ３−ＣＤＲ３−Ｆｒ４
（配列中、
【化７】
2005514063.tif 000148
【表２１】
2005514063.tif 000149
であり、ｋ≦４０のＹｋが−である場合には、１＜ｋのＹ１は−であり、ｎ≧６９のＹｎが−である場合には、ｍ＞ｎのＹｍは−であることを条件とする）
からなるイヌ軽鎖可変ドメインポリペプチド。
【請求項３３】
以下の配列：
Ｆｒ１−ＣＤＲ１−Ｆｒ２−ＣＤＲ２−Ｆｒ３−ＣＤＲ３−Ｆｒ４
（配列中、
Ｆｒ１は
【表２２】
2005514063.tif 000150
であり、Ｆｒ２は
【表２３】
2005514063.tif 000151
であり、Ｆｒ３は
【表２４】
2005514063.tif 000152
であり、Ｆｒ４は
【表２５】
2005514063.tif 000153
である）
からなる請求項３２に記載のイヌ軽鎖可変ドメインポリペプチド。
【請求項３４】
以下の配列：
Ｆｒ１−ＣＤＲ１−Ｆｒ２−ＣＤＲ２−Ｆｒ３−ＣＤＲ３−Ｆｒ４
（配列中、Ｆｒ１、Ｆｒ２、Ｆｒ３およびＦｒ４は以下の組合せ：
【表２６】
2005514063.tif 000154
【表２７】
2005514063.tif 000155
から選択される）
からなる請求項３２に記載のイヌ軽鎖可変ドメインポリペプチド。
【請求項３５】
以下の配列：
Ｆｒ１−ＣＤＲ１−Ｆｒ２−ＣＤＲ２−Ｆｒ３−ＣＤＲ３−Ｆｒ４
【化８】
2005514063.tif 000156
（ここで、
【表２８】
2005514063.tif 000157
であり、ａ≦２５のＹａが−である場合には、ｂ＜ａのＹｂは−であり、ｃ≧９４のＹｃが−である場合には、ｄ＞ｃのＹｄは−であることを条件とする）
からなるイヌ軽鎖可変ドメインポリペプチド。
【請求項３６】
以下の配列：
Ｆｒ１−ＣＤＲ１−Ｆｒ２−ＣＤＲ２−Ｆｒ３−ＣＤＲ３−Ｆｒ４
（配列中、
Ｆｒ１は
【表２９】
2005514063.tif 000158
であり、Ｆｒ２は
【表３０】
2005514063.tif 000159
であり、Ｆｒ３は
【表３１】
2005514063.tif 000160
であり、Ｆｒ４は
【表３２】
2005514063.tif 000161
である）
からなる請求項３５に記載のイヌ軽鎖可変ドメインポリペプチド。
【請求項３７】
以下の配列：
Ｆｒ１−ＣＤＲ１−Ｆｒ２−ＣＤＲ２−Ｆｒ３−ＣＤＲ３−Ｆｒ４
（配列中、
【表３３】
2005514063.tif 000162
である）
からなる請求項３５に記載のイヌ軽鎖可変ドメインポリペプチド。
【請求項３８】
以下の配列：
Ｆｒ１−ＣＤＲ１−Ｆｒ２−ＣＤＲ２−Ｆｒ３−ＣＤＲ３−Ｆｒ４
（配列中、
【化９】
2005514063.tif 000163
【表３４】
2005514063.tif 000164
であり、ｋ≦２２のＹ’ｋが−である場合には、１＜ｋのＹ’１は−であり、ｎ≧８０のＹ’ｎが−である場合には、ｍ＞ｎのＹ’ｍは−であることを条件とする）
からなるイヌ軽鎖可変ドメインポリペプチド。
【請求項３９】
Ｆｒ１が
【表３５】
2005514063.tif 000165
であり、Ｆｒ２が
【表３６】
2005514063.tif 000166
であり、Ｆｒ３が
【表３７】
2005514063.tif 000167
であり、Ｆｒ４が
【表３８】
2005514063.tif 000168
である、請求項３８に記載の軽鎖可変ドメインポリペプチド。
【請求項４０】
Ｆｒ１、Ｆｒ２、Ｆｒ３およびＦｒ４が以下の組合せ：
【表３９】
2005514063.tif 000169
から選択される、請求項３８に記載の軽鎖可変ドメインポリペプチド。
【請求項４１】
次式：
Ｆｒ１−ＣＤＲ１−Ｆｒ２−ＣＤＲ２−Ｆｒ３−ＣＤＲ３−Ｆｒ４
（式中、
【化１０】
2005514063.tif 000170
【表４０】
2005514063.tif 000171
であり、ｋ≦３７のＺ’ｋが−である場合には、１＜ｋのＺ’１は−であることを条件とする）
のイヌ軽鎖可変ドメインポリペプチド。
【請求項４２】
Ｆｒ１が
【表４１】
2005514063.tif 000172
であり、Ｆｒ２が
【表４２】
2005514063.tif 000173
であり、Ｆｒ３が
【表４３】
2005514063.tif 000174
であり、Ｆｒ４が
【表４４】
2005514063.tif 000175
である、請求項４１に記載の軽鎖可変ドメイン。
【請求項４３】
Ｆｒ１、Ｆｒ２、Ｆｒ３およびＦｒ４が以下の組合せ：
【表４５】
2005514063.tif 000176
【表４６】
2005514063.tif 000177
【表４７】
2005514063.tif 000178
から選択される、請求項４１に記載の軽鎖可変ドメイン
【請求項４４】
以下の配列：
Ｆｒ１−ＣＤＲ１−Ｆｒ２−ＣＤＲ２−Ｆｒ３−ＣＤＲ３−Ｆｒ４
（配列中、Ｆｒ１、Ｆｒ２、Ｆｒ３およびＦｒ４は、表Ｎλに示された重鎖可変配列のフレームワーク領域から選択されるフレームワーク領域である）
からなるイヌ軽鎖可変ドメイン。
【請求項４５】
ＣＤＲがすべてイヌ抗体由来である、請求項３２〜４４のいずれか一項に記載のイヌ軽鎖可変ドメインポリペプチド。
【請求項４６】
ＣＤＲがすべて同一の非イヌ抗体由来である、請求項３２〜４４のいずれか一項に記載のイヌ軽鎖可変ドメインポリペプチド。
【請求項４７】
２つのＣＤＲが同一の非イヌ抗体由来であり、第３のＣＤＲがイヌＣＤＲである、請求項３２〜４４のいずれか一項に記載のイヌ軽鎖可変ドメインポリペプチド。
【請求項４８】
イヌＣＤＲがＣＤＲ１である、請求項４７に記載のイヌ軽鎖可変ドメインポリペプチド。
【請求項４９】
ＣＤＲ１が
ａ）Ｃ’１Ｃ’２Ｃ’３Ｃ’４Ｃ’５Ｃ’６Ｃ’７Ｃ’８Ｃ’９Ｃ’１０Ｃ’１１Ｃ’１２Ｃ’１３であって、
【表４８】
2005514063.tif 000179
である（ただし、ｍ＞２のＣ’ｍが−である場合には、ｎ＜ｍのＣ’ｎは−である）、
ｂ）次の
【表４９】
2005514063.tif 000180
からなる群から選択される、
ｃ）Ｃ’１Ｃ’２Ｃ’３Ｃ’４Ｃ’５Ｃ’６Ｃ’７Ｃ’８Ｃ’９Ｃ’１０Ｃ’１１Ｃ’１２Ｃ’１３であって、
【表５０】
2005514063.tif 000181
である、
ｄ）次の
【表５１】
2005514063.tif 000182
からなる群から選択される、
ｅ）Ｃ’１Ｃ’２Ｃ’３Ｃ’４Ｃ’５Ｃ’６Ｃ’７Ｃ’８Ｃ’９Ｃ’１０Ｃ’１１Ｃ’１２Ｃ’１３Ｃ’１４であって、
【表５２】
2005514063.tif 000183
である、または
ｆ）次の
【表５３】
2005514063.tif 000184
からなる群から選択される、
請求項３２〜４４のいずれか一項に記載のイヌ軽鎖可変ドメインポリペプチド。
【請求項５０】
ＣＤＲ２が、
【表５４】
2005514063.tif 000185
である、かつ／または
ＣＤＲ２が
【表５５】
2005514063.tif 000186
からなる群から選択される、かつ／または
ＣＤＲ３が
【表５６】
2005514063.tif 000187
からなる群から選択される、
請求項３２〜４４のいずれか一項に記載のイヌ軽鎖可変ドメインポリペプチド。
【請求項５１】
ＣＤＲ３が
ａ）Ｃ’’’１Ｃ’’’２Ｃ’’’３Ｃ’’’４Ｃ’’’５Ｃ’’’６Ｃ’’’７Ｃ’’’８Ｃ’’’９Ｃ’’’１０Ｃ’’’１１Ｃ’’’１２
【表５７】
2005514063.tif 000188
である、
ｂ）次の
【表５８】
2005514063.tif 000189
からなる群から選択される、
ｃ）Ｃ’’’１Ｃ’’’２Ｃ’’’３Ｃ’’’４Ｃ’’’５Ｃ’’’６Ｃ’’’７Ｃ’’’８Ｃ’’’９Ｃ’’’１０Ｃ’’’１１Ｃ’’’１２であって、
【表５９】
2005514063.tif 000190
である、
ｄ）次の
【表６０】
2005514063.tif 000191
からなる群から選択される、
ｅ）Ｃ’’’１Ｃ’’’２Ｃ’’’３Ｃ’’’４Ｃ’’’５Ｃ’’’６Ｃ’’’７Ｃ’’’８Ｃ’’’９Ｃ’’’１０Ｃ’’’１１Ｃ’’’１２であって、
【表６１】
2005514063.tif 000192
である、または
ｆ）次の
【表６２】
2005514063.tif 000193
からなる群から選択される、
請求項３２〜４４のいずれか一項に記載のイヌ軽鎖可変ドメインポリペプチド。
【請求項５２】
【化１１】
2005514063.tif 000194
であるイヌ軽鎖可変ドメインポリペプチド。
【請求項５３】
請求項３２〜４４のいずれか一項に記載のイヌ軽鎖可変ドメインポリペプチドをコードする核酸であって、各コドンが、該ポリペプチドの対応するアミノ酸をコードする遺伝暗号のいずれかのコドンであり得る核酸。
【請求項５４】
請求項４５に記載のイヌ軽鎖可変ドメインポリペプチドをコードする核酸であって、各コドンが、該ポリペプチドの対応するアミノ酸をコードする遺伝暗号のいずれかのコドンであり得る核酸。
【請求項５５】
請求項４６に記載のイヌ軽鎖可変ドメインポリペプチドをコードする核酸であって、各コドンが、該ポリペプチドの対応するアミノ酸をコードする遺伝暗号のいずれかのコドンであり得る核酸。
【請求項５６】
請求項４７に記載のイヌ軽鎖可変ドメインポリペプチドをコードする核酸であって、各コドンが、該ポリペプチドの対応するアミノ酸をコードする遺伝暗号のいずれかのコドンであり得る核酸。
【請求項５７】
請求項４８に記載のイヌ軽鎖可変ドメインポリペプチドをコードする核酸であって、各コドンが、該ポリペプチドの対応するアミノ酸をコードする遺伝暗号のいずれかのコドンであり得る核酸。
【請求項５８】
請求項４９に記載のイヌ軽鎖可変ドメインポリペプチドをコードする核酸であって、各コドンが、該ポリペプチドの対応するアミノ酸をコードする遺伝暗号のいずれかのコドンであり得る核酸。
【請求項５９】
請求項５０に記載のイヌ軽鎖可変ドメインポリペプチドをコードする核酸であって、各コドンが、該ポリペプチドの対応するアミノ酸をコードする遺伝暗号のいずれかのコドンであり得る核酸。
【請求項６０】
請求項５１に記載のイヌ軽鎖可変ドメインポリペプチドをコードする核酸であって、各
コドンが、該ポリペプチドの対応するアミノ酸をコードする遺伝暗号のいずれかのコドンであり得る核酸。
【請求項６１】
請求項５２に記載のイヌ軽鎖可変ドメインポリペプチドをコードする核酸であって、各コドンが、該ポリペプチドの対応するアミノ酸をコードする遺伝暗号のいずれかのコドンであり得る核酸。
【請求項６２】
イヌ軽鎖可変ドメインをコードする核酸であって、（ａ）表ＮＧ１中の核酸のうちの１つの、フレームワークをコードする核酸配列、および（ｂ）１つまたは複数の保存的ヌクレオチド置換を含む、表ＮＧ１中の核酸のうちの１つの、フレームワークをコードする核酸配列、から選択されるフレームワークをコードする配列からなる核酸。
【請求項６３】
イヌ軽鎖可変ドメインをコードする核酸であって、（ａ）表ＮＧ２中の核酸のうちの１つの、フレームワークをコードする核酸配列、および（ｂ）１つまたは複数の保存的ヌクレオチド置換を含む、表ＮＧ２中の核酸のうちの１つの、フレームワークをコードする核酸配列、から選択されるフレームワークをコードする配列からなる核酸。
【請求項６４】
イヌ軽鎖可変ドメインをコードする核酸であって、（ａ）表ＮＧ３中の核酸のうちの１つの、フレームワークをコードする核酸配列、および（ｂ）１つまたは複数の保存的ヌクレオチド置換を含む、表ＮＧ３中の核酸のうちの１つの、フレームワークをコードする核酸配列、から選択されるフレームワークをコードする配列からなる核酸。
【請求項６５】
イヌ軽鎖可変ドメインをコードする核酸であって、（ａ）表Ｎκ中の核酸のうちの１つの、フレームワークをコードする核酸配列、および（ｂ）１つまたは複数の保存的ヌクレオチド置換を含む、表Ｎκ中の核酸のうちの１つの、フレームワークをコードする核酸配列、から選択されるフレームワークをコードする配列からなる核酸。
【請求項６６】
イヌ軽鎖可変ドメインをコードする核酸であって、（ａ）表Ｎλ中の核酸のうちの１つの、フレームワークをコードする核酸配列、および（ｂ）１つまたは複数の保存的ヌクレオチド置換を含む、表Ｎλ中の核酸のうちの１つの、フレームワークをコードする核酸配列、から選択されるフレームワークをコードする配列からなる核酸。
【請求項６７】
請求項１〜１０および請求項１９のいずれか一項に記載のイヌ重鎖可変ドメインポリペプチドからなる重鎖可変ドメインと、軽鎖可変ドメインと、からなる抗体。
【請求項６８】
請求項１１に記載のイヌ重鎖可変ドメインポリペプチドからなる重鎖可変ドメインと、軽鎖可変ドメインと、からなる抗体。
【請求項６９】
請求項１２に記載のイヌ重鎖可変ドメインポリペプチドからなる重鎖可変ドメインと、軽鎖可変ドメインと、からなる抗体。
【請求項７０】
請求項１３に記載のイヌ重鎖可変ドメインポリペプチドからなる重鎖可変ドメインと、軽鎖可変ドメインと、からなる抗体。
【請求項７１】
請求項１４に記載のイヌ重鎖可変ドメインポリペプチドからなる重鎖可変ドメインと、軽鎖可変ドメインと、からなる抗体。
【請求項７２】
請求項１５に記載のイヌ重鎖可変ドメインポリペプチドからなる重鎖可変ドメインと、軽鎖可変ドメインと、からなる抗体。
【請求項７３】
請求項１６に記載のイヌ重鎖可変ドメインポリペプチドからなる重鎖可変ドメインと、軽鎖可変ドメインと、からなる抗体。
【請求項７４】
請求項１７に記載のイヌ重鎖可変ドメインポリペプチドからなる重鎖可変ドメインと、軽鎖可変ドメインと、からなる抗体。
【請求項７５】
請求項１８に記載のイヌ重鎖可変ドメインポリペプチドからなる重鎖可変ドメインと、軽鎖可変ドメインと、からなる抗体。
【請求項７６】
請求項３２〜４４および請求項５２のいずれか一項に記載のイヌ重鎖可変ドメインポリペプチドからなる重鎖可変ドメインと、軽鎖可変ドメインと、からなる抗体。
【請求項７７】
請求項４５に記載のイヌ重鎖可変ドメインポリペプチドからなる重鎖可変ドメインと、軽鎖可変ドメインと、からなる抗体。
【請求項７８】
請求項４６に記載のイヌ重鎖可変ドメインポリペプチドからなる重鎖可変ドメインと、軽鎖可変ドメインと、からなる抗体。
【請求項７９】
請求項４７に記載のイヌ重鎖可変ドメインポリペプチドからなる重鎖可変ドメインと、軽鎖可変ドメインと、からなる抗体。
【請求項８０】
請求項４８に記載のイヌ重鎖可変ドメインポリペプチドからなる重鎖可変ドメインと、軽鎖可変ドメインと、からなる抗体。
【請求項８１】
請求項４９に記載のイヌ重鎖可変ドメインポリペプチドからなる重鎖可変ドメインと、軽鎖可変ドメインと、からなる抗体。
【請求項８２】
請求項５０に記載のイヌ重鎖可変ドメインポリペプチドからなる重鎖可変ドメインと、軽鎖可変ドメインと、からなる抗体。
【請求項８３】
請求項５１に記載のイヌ重鎖可変ドメインポリペプチドからなる重鎖可変ドメインと、軽鎖可変ドメインと、からなる抗体。
【請求項８４】
請求項３２〜５２のいずれか一項に記載の軽鎖可変ドメインからさらになる、請求項６７〜７５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項８５】
請求項６７〜８３のいずれか一項に記載の抗体の断片であって、前記抗体が特異的に結合する抗原に特異的に結合する断片。
【請求項８６】
イヌ可変ドメイン核酸配列を作製する方法であって、
ａ）イヌ生体サンプルを、イヌ定常領域配列に相補的な第１の遺伝子特異的アンチセンスプライマーと、第１の遺伝子特異的アンチセンスプライマーが相補的である配列の５’側のイヌ定常領域内の配列に相補的な第２の遺伝子特異的配列とを用いる５’ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ）に供する工程、および
ｂ）５’ＲＡＣＥ増幅したイヌ可変ドメインを特徴とする配列を含む、工程ａ）の５’ＲＡＣＥによって生産された核酸を単離する工程
からなり、
該イヌ生体サンプルが少なくとも１つのイヌ免疫グロブリンをコードするポリ（Ａ）＋ＲＮＡを含むことを特徴とする方法。
【請求項８７】
イヌ可変ドメイン核酸を作製する方法であって、
ａ）ドナー免疫グロブリンフレームワークまたは可変領域アミノ酸配列を、イヌ免疫グロブリンの収集物中の対応する配列と比較する工程と、
ｂ）ドナー免疫グロブリン配列と少なくとも６０％相同なイヌ免疫グロブリン（アクセプター免疫グロブリン）を、収集物から選択する工程と、
ｃ）アクセプター免疫グロブリンの１つ、２つまたは３つのＣＤＲを、ドナー免疫グロブリンの対応するＣＤＲと置換する工程と
からなる方法。
【請求項８８】
イヌ可変ドメイン核酸を作製する方法であって、アクセプターイヌ免疫グロブリンの少なくとも１つのフレームワークアミノ酸（第１のアミノ酸）を、ドナー免疫グロブリンの対応するアミノ酸（第２のアミノ酸）に置換することからなり、
ａ）第１のアミノ酸がその位置では稀であり、かつ、第２のアミノ酸がイヌ免疫グロブリン配列のその位置では一般的であるか稀である、
ｂ）第１のアミノ酸がＣＤＲと直接隣接している、
ｃ）該アクセプター免疫グロブリンのアミノ酸または該ドナー免疫グロブリンの対応するアミノ酸が、三次元免疫グロブリンモデルにおいてＣＤＲの約６Å以内にあると推定され、該免疫グロブリンが結合する抗原と相互作用するか、または対応するドナーもしくはアクセプター免疫グロブリンのＣＤＲと相互作用する、あるいは
ｄ）該アクセプター免疫グロブリンのイヌフレームワーク領域中のアミノ酸がドナー免疫グロブリンの対応するアミノ酸と異なっている、
ことを特徴とし、かつ
ドナーおよびアクセプター免疫グロブリンが互いに６０％より高い相同性を有し、少なくとも１つの共通の抗原と結合することを特徴とする方法。
【請求項８９】
前記アクセプターイヌ免疫グロブリンが、請求項６７〜８３のいずれか一項に記載の免疫グロブリンから選択される、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記アクセプターイヌ免疫グロブリンが、請求項１〜１０および請求項１９のいずれか一項に記載の重鎖可変ドメインからなる、請求項８８に記載の方法。
【請求項９１】
前記アクセプターイヌ免疫グロブリンが、請求項１〜１０および請求項１９のいずれか一項に記載の重鎖可変ドメインからなる、請求項８８に記載の方法。
【請求項９２】
前記アクセプターイヌ免疫グロブリンが、請求項１１に記載の重鎖可変ドメインからなる、請求項８８に記載の方法。
【請求項９３】
前記アクセプターイヌ免疫グロブリンが、請求項１２に記載の重鎖可変ドメインからなる、請求項８８に記載の方法。
【請求項９４】
前記アクセプターイヌ免疫グロブリンが、請求項１３に記載の重鎖可変ドメインからなる、請求項８８に記載の方法。
【請求項９５】
前記アクセプターイヌ免疫グロブリンが、請求項１４に記載の重鎖可変ドメインからなる、請求項８８に記載の方法。
【請求項９６】
前記アクセプターイヌ免疫グロブリンが、請求項１５に記載の重鎖可変ドメインからなる、請求項８８に記載の方法。
【請求項９７】
前記アクセプターイヌ免疫グロブリンが、請求項１６に記載の重鎖可変ドメインからなる、請求項８８に記載の方法。
【請求項９８】
前記アクセプターイヌ免疫グロブリンが、請求項１７に記載の重鎖可変ドメインからなる、請求項８８に記載の方法。
【請求項９９】
前記アクセプターイヌ免疫グロブリンが、請求項１８に記載の重鎖可変ドメインからなる、請求項８８に記載の方法。
【請求項１００】
前記アクセプターイヌ免疫グロブリンが、請求項３２〜５２のいずれか一項に記載の軽鎖可変ドメインからなる、請求項８８〜９９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
請求項８９〜１００のいずれか一項に記載の方法にしたがって生産されるイヌ免疫グロブリン。
【請求項１０２】
ＩｇＥ媒介性の疾患に罹患しているイヌを治療する方法であって、前記イヌに、前記疾患と関係している１つまたは複数の症状を軽減または排除するのに十分な量の請求項６７〜８５のいずれか一項に記載のイヌ化抗体またはその結合断片を投与することからなる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［０００１］  本発明は、免疫学の分野に関する。より詳しくは、本発明は、イヌ免疫グロブリン軽鎖および重鎖可変ドメイン、イヌ化抗体、ならびにそれらを作製および使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
［０００２］  ある動物由来のモノクローナル抗体を、ヒトへの治療的投与のために免疫原性を低下させるよう改変する方法（ヒト化）は積極的に追及されており、多数の出版物に記載されている（例えば、非特許文献１）。しかし、この方法はイヌの治療薬または診断薬の開発には適用されていない。実際、イヌ可変ドメインに関して公開されているものはほとんどない。
【０００３】
［０００３］  ワッサーマン（Ｗａｓｓｅｒｍａｎ）およびカプラ（Ｃａｐｒａ）（非特許文献２）が、イヌＩｇＭおよびイヌＩｇＡ重鎖の可変領域のアミノ酸配列を決定している。
【０００４】
［０００４］  ワッサーマン（Ｗａｓｓｅｒｍａｎ）およびカプラ（Ｃａｐｒａ）（非特許文献３）は、イヌＩｇＡのκ軽鎖のアミノ酸配列を決定している。
［０００５］  イヌμ鎖の配列。
【０００５】
［０００６］  非特許文献４は、単一のイヌＩｇＧ−Ａγ鎖ｃＤＮＡおよび４つのイヌＩｇＧ−Ａγ鎖タンパク質配列を開示している。同文献にはヒト、マウス、ブタおよびウシＩｇＧの保存領域から設計した縮重オリゴヌクレオチドプライマーを用いるイヌ脾臓ｃＤＮＡライブラリーのＰＣＲ増幅が記載されている。
【０００６】
［０００７］  イヌ抗体に関して入手可能な情報が不足していることによって、イヌの疾患を治療するための治療薬としてのその開発が妨げられている。
［０００８］  本明細書に記載したすべての出版物（例えば、特許文書および科学的学術論文）はその全文を本願明細書に援用する。
【非特許文献１】カール  エー  ケー  ボーレバエック（Ｃａｒｌ  Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ）編、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  ｐｒａｃｔｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ．」ダブリュー  エイチ  フリーマン  アンド  カンパニー（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、１９９２年
【非特許文献２】ワッサーマン（Ｗａｓｓｅｒｍａｎ）およびカプラ（Ｃａｐｒａ）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第１６巻、３１６０ページ（１９７７年）
【非特許文献３】ワッサーマン（Ｗａｓｓｅｒｍａｎ）およびカプラ（Ｃａｐｒａ）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．、第１５巻、３０３ページ（１９７８年）
【非特許文献４】タンら（Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  第８０巻、２５９ページ（２００１年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、イヌ免疫グロブリン軽鎖および重鎖可変ドメイン、イヌ化抗体、ならびにそれらを作製および使用する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
［０００９］  本発明は、イヌ重鎖および軽鎖（λとκの双方）ドメイン核酸およびポリペプチドを提供する。
［００１０］  本発明はまた、本明細書に開示されるイヌ可変領域と、イヌ科の動物以外（好ましくは、マウスまたはイヌ）由来の抗体から得た抗原に特異的なＣＤＲと、からなるイヌ化抗体を提供する。
【０００９】
［００１１］  本発明はまた、イヌ化抗体を作製する方法およびそれを使用する方法を提供する。本開示内容は、イヌのアレルギーの治療に有用なイヌ化抗体を詳細に記載する。イヌ化の一般的な方法によって、それだけには限らないが、アレルギー、骨肉種およびリンパ腫を含め、有用な治療薬の開発が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
［００２１］  ＩＤＥＸＸは、イヌのアレルギーを治療するための治療用モノクローナル抗体の開発に従事している。イヌの臨床試験に用いた治療用抗体は、マウスモノクローナル抗体１５Ａ２のマウス由来抗体可変ドメインと結合させた、重鎖および軽鎖のイヌ抗体定常ドメインから構成されるキメラ組換え分子であった。ブタクサで感作したイヌへのこの抗体の治療的投与は、アレルギーの症状を軽減し、成功したと考えられた。しかし、イヌにおける該キメラ分子の反復および長期投与は、治療薬に対する中和的な体液性免疫応答を誘導し、これによって治療薬は無効となった。この抗キメラ応答の解析によって、この応答が該治療用分子のうちのマウス成分に対するものであることが明確に証明された。したがって本発明者らは、抗体の「イヌ化」によりこの欠点を克服するために、別の生物、通常はマウス由来のモノクローナル抗体を用いること、ならびにイヌに投与する場合には、該分子の免疫原性を低下させるために可変ドメイン内にイヌの免疫グロブリン配列を使用することを示す。特に、この方法は、免疫グロブリン可変ドメインのフレームワーク領域に焦点を当てているが、可変ドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）も含み得る。本方法の実施を可能にする工程および変形を本開示内容に記載する。
【００１１】
（ポリペプチド組成物）
第１の態様では、本発明は、非イヌ抗体由来の１つまたは複数のＣＤＲを含むキメラのイヌ可変ドメインポリペプチドからなる。
【００１２】
１．Ｈ５８ファミリー属
［００２２］  一実施形態では、本発明は、非イヌ抗体由来の１つまたは複数のＣＤＲを含むキメラのイヌ重鎖可変ドメインポリペプチドを提供する。本発明によるキメラのイヌ重鎖可変ドメインポリペプチドは、以下の配列：
Ｆｒ１−ＣＤＲ１−Ｆｒ２−ＣＤＲ２−Ｆｒ３−ＣＤＲ３−Ｆｒ４
（配列中、
【００１３】
【化１】
2005514063.tif 000002
【００１４】
【表１】
2005514063.tif 000003
であり、Ｘ７９が−である場合にはＸ８０は−である（「−」はその各位置に残基が存在しないことを意味する）ことを条件とする）からなる化合物である。
【００１５】
２．Ｈ５８ファミリー亜属
［００２３］  本発明のイヌ重鎖可変ドメインは、以下の配列からなる化合物であることが好ましい：
Ｆｒ１−ＣＤＲ１−Ｆｒ２−ＣＤＲ２−Ｆｒ３−ＣＤＲ３−Ｆｒ４
（配列中、Ｆｒ１は
【００１６】
【表２】
2005514063.tif 000004
であり、Ｆｒ２は
【００１７】
【表３】
2005514063.tif 000005
であり、Ｆｒ３は
【００１８】
【表４】
2005514063.tif 000006
であり、かつＦｒ４は
【００１９】
【表５】
2005514063.tif 000007
である）。
３．Ｈ５８ファミリー種
［００２４］  より好ましい実施形態では、本発明のキメラ重鎖可変領域は以下の配列からなる化合物である：
Ｆｒ１−ＣＤＲ１−Ｆｒ２−ＣＤＲ２−Ｆｒ３−ＣＤＲ３−Ｆｒ４
（配列中、Ｆｒ１、Ｆｒ２、Ｆｒ３およびＦｒ４は以下の組合せ：
【００２０】
【表６】
2005514063.tif 000008
から選択される）。
４．Ｈ７４重鎖可変ドメイン属
［００２５］  本発明のイヌの群のＨ７４重鎖可変ドメインポリペプチドは以下の配列からなる化合物である：
Ｆｒ１−ＣＤＲ１−Ｆｒ２−ＣＤＲ２−Ｆｒ３−ＣＤＲ３−Ｆｒ４
（配列中、
【００２１】
【化２】
2005514063.tif 000009
であり、ここで、
【００２２】
【表７】
2005514063.tif 000010
である）。
５．Ｈ７４重鎖可変ドメイン亜属
［００２６］  本発明のイヌ重鎖可変ドメインは、以下の配列からなる化合物であることが好ましい：
Ｆｒ１−ＣＤＲ１−Ｆｒ２−ＣＤＲ２−Ｆｒ３−ＣＤＲ３−Ｆｒ４
（配列中、
【００２３】
【化３】
2005514063.tif 000011
である）。
６．Ｈ７４重鎖可変ドメイン種
［００２７］  より好ましい実施形態では、本発明のキメラ重鎖可変領域は以下の配列からなる化合物である：
Ｆｒ１−ＣＤＲ１−Ｆｒ２−ＣＤＲ２−Ｆｒ３−ＣＤＲ３−Ｆｒ４
（配列中、Ｆｒ１、Ｆｒ２、Ｆｒ３およびＦｒ４は以下の組合せ：
【００２４】
【表８】
2005514063.tif 000012
から選択される）。
７．Ｈ１０３重鎖可変ドメイン属
［００２８］  以下の配列からなるイヌ重鎖可変ドメインポリペプチド：
Ｆｒ１−ＣＤＲ１−Ｆｒ２−ＣＤＲ２−Ｆｒ３−ＣＤＲ３−Ｆｒ４
（配列中、
【００２５】
【化４】
2005514063.tif 000013
【００２６】
【表９】
2005514063.tif 000014
である）。
８．Ｈ１０３重鎖可変ドメイン亜属
［００２９］  別の実施形態では、本発明は、以下の配列からなる段落［００２８］に
記載のイヌ重鎖可変ドメインポリペプチドからなる：
Ｆｒ１−ＣＤＲ１−Ｆｒ２−ＣＤＲ２−Ｆｒ３−ＣＤＲ３−Ｆｒ４
（配列中、
【００２７】
【化５】
2005514063.tif 000015
である）。
９．Ｈ１０３重鎖可変ドメイン種
［００３０］  別の実施形態では、本発明は、以下の配列からなる段落［００２８］に記載のイヌ重鎖可変ドメインポリペプチドからなる：
Ｆｒ１−ＣＤＲ１−Ｆｒ２−ＣＤＲ２−Ｆｒ３−ＣＤＲ３−Ｆｒ４
（配列中、
【００２８】
【表１０】
2005514063.tif 000016
である）。
１０．その他の重鎖可変ドメイン
［００３１］  別の実施形態では、本発明は以下の配列からなる：
Ｆｒ１−ＣＤＲ１−Ｆｒ２−ＣＤＲ２−Ｆｒ３−ＣＤＲ３−Ｆｒ４
（配列中、Ｆｒ１、Ｆｒ２、Ｆｒ３およびＦｒ４は表Ｎその他のＨに示される重鎖可変配列のフレームワーク領域から選択されるフレームワーク領域である）。表Ｎその他のＨ中のポリペプチドのフレームワーク配列は、一般に認められた広く入手可能な多数の配列アラインメント・プログラムのいずれかを用いて、既知のヒト可変ドメイン配列のいずれかの対応するフレームワーク配列とアラインする配列として、当業者によって容易に、かつ、慣例的に決定可能である。
【００２９】
１１．第２群のλ軽鎖可変ドメイン属
［００３２］  本発明のキメラのイヌ軽鎖可変ドメインポリペプチドは以下の配列からなる化合物である：
Ｆｒ１−ＣＤＲ１−Ｆｒ２−ＣＤＲ２−Ｆｒ３−ＣＤＲ３−Ｆｒ４
（配列中、
【００３０】
【化６】
2005514063.tif 000017
【００３１】
【表１１】
2005514063.tif 000018
であり、ｋ≦４０のＹｋが−である場合には、ｌ＜ｋのＹｌは−であり、ｎ≧６９のＹｎが−である場合には、ｍ＞ｎのＹｍは−であることを条件とする）。
【００３２】
１２．第２群のλ軽鎖可変ドメイン亜属
［００３３］  本発明のイヌλ軽鎖可変ドメインは、以下の配列からなる化合物であることが好ましい：
Ｆｒ１−ＣＤＲ１−Ｆｒ２−ＣＤＲ２−Ｆｒ３−ＣＤＲ３−Ｆｒ４
（配列中、
Ｆｒ１は
【００３３】
【表１２】
2005514063.tif 000019
であり、Ｆｒ２は
【００３４】
【表１３】
2005514063.tif 000020
であり、Ｆｒ３は
【００３５】
【表１４】
2005514063.tif 000021
であり、Ｆｒ４は
【００３６】
【表１５】
2005514063.tif 000022
である）。
１３．第２群の軽鎖可変ドメイン種
［００３４］  本発明のイヌλ軽鎖可変ドメインは以下の配列からなる化合物であることが好ましい：
Ｆｒ１−ＣＤＲ１−Ｆｒ２−ＣＤＲ２−Ｆｒ３−ＣＤＲ３−Ｆｒ４
（配列中、Ｆｒ１、Ｆｒ２、Ｆｒ３およびＦｒ４は以下の組合せ：
【００３７】
【表１６】
2005514063.tif 000023
【００３８】
【表１７】
2005514063.tif 000024
から選択される）。
１４．第１群の軽鎖可変ドメイン属
［００３５］  本発明のキメラのイヌ群第１群軽鎖可変ドメインポリペプチドは以下の配列からなる化合物である：
Ｆｒ１−ＣＤＲ１−Ｆｒ２−ＣＤＲ２−Ｆｒ３−ＣＤＲ３−Ｆｒ４
（配列中、
【００３９】
【化７】
2005514063.tif 000025
であり、ここで
【００４０】
【表１８】
2005514063.tif 000026
であり、ａ≦２５のＹａが−である場合には、ｂ＜ａのＹｂは−であり、ｃ≧９４のＹｃ
が−である場合にはｄ＞ｃのＹｄは−であることを条件とする）。
【００４１】
１５．第１群の軽鎖可変ドメイン亜属
［００３６］  本発明のキメラのイヌ群第１群軽鎖可変ドメインポリペプチドは以下の配列からなる化合物である：
Ｆｒ１−ＣＤＲ１−Ｆｒ２−ＣＤＲ２−Ｆｒ３−ＣＤＲ３−Ｆｒ４
（配列中、
Ｆｒ１は
【００４２】
【表１９】
2005514063.tif 000027
であり、Ｆｒ２は
【００４３】
【表２０】
2005514063.tif 000028
であり、Ｆｒ３は
【００４４】
【表２１】
2005514063.tif 000029
であり、Ｆｒ４は
【００４５】
【表２２】
2005514063.tif 000030
である）。
１６．第１群の軽鎖可変ドメイン種
［００３７］  本発明のイヌ第１群軽鎖可変ドメインは以下の配列からなる化合物であることが好ましい：
Ｆｒ１−ＣＤＲ１−Ｆｒ２−ＣＤＲ２−Ｆｒ３−ＣＤＲ３−Ｆｒ４
（配列中、Ｆｒ１、Ｆｒ２、Ｆｒ３およびＦｒ４は以下の組合せ：
【００４６】
【表２３】
2005514063.tif 000031
から選択される）。
１７．第３群の軽鎖可変ドメイン属
［００３８］  本発明のキメラのイヌ軽鎖可変ドメインポリペプチドは、以下の配列からなる化合物である：
Ｆｒ１−ＣＤＲ１−Ｆｒ２−ＣＤＲ２−Ｆｒ３−ＣＤＲ３−Ｆｒ４
（配列中、
【００４７】
【化８】
2005514063.tif 000032
【００４８】
【表２４】
2005514063.tif 000033
であり、ｋ≦２２のＹ’ｋが−である場合には、ｌ＜ｋのＹ’ｌは−であり、ｎ≧８０のＹ’ｎが−である場合にはｍ＞ｎのＹ’ｍは−であることを条件とする）。
【００４９】
１８．第３群の軽鎖可変ドメイン亜属
［００３９］  本発明のイヌλ軽鎖可変ドメインは、以下の配列からなる化合物であることが好ましい：
Ｆｒ１−ＣＤＲ１−Ｆｒ２−ＣＤＲ２−Ｆｒ３−ＣＤＲ３−Ｆｒ４
（配列中、
Ｆｒ１は
【００５０】
【表２５】
2005514063.tif 000034
であり、Ｆｒ２は
【００５１】
【表２６】
2005514063.tif 000035
であり、Ｆｒ３は
【００５２】
【表２７】
2005514063.tif 000036
であり、Ｆｒ４は
【００５３】
【表２８】
2005514063.tif 000037
である）。
１９．第３群の軽鎖可変ドメイン種
［００４０］  本発明のイヌ群３軽鎖可変ドメインは、以下の配列からなる化合物であることが好ましい：
Ｆｒ１−ＣＤＲ１−Ｆｒ２−ＣＤＲ２−Ｆｒ３−ＣＤＲ３−Ｆｒ４
（配列中、Ｆｒ１、Ｆｒ２、Ｆｒ３およびＦｒ４は以下の組合せ：
【００５４】
【表２９】
2005514063.tif 000038
から選択される）。
２０．κ軽鎖可変ドメイン属
［００４１］  本発明はまた、次式のκ軽鎖可変ドメインポリペプチドからなる：
Ｆｒ１−ＣＤＲ１−Ｆｒ２−ＣＤＲ２−Ｆｒ３−ＣＤＲ３−Ｆｒ４
（式中、
【００５５】
【化９】
2005514063.tif 000039
であり、ここで、
【００５６】
【表３０】
2005514063.tif 000040
であり、ｋ≦３７のＺ’ｋが−である場合には、ｌ＜ｋのＺ’ｌは−であることを条件とする）。
【００５７】
２１．κ軽鎖可変ドメイン亜属
［００４２］  本発明のイヌκ軽鎖可変ドメインは、以下の配列からなる化合物であることが好ましい：
Ｆｒ１−ＣＤＲ１−Ｆｒ２−ＣＤＲ２−Ｆｒ３−ＣＤＲ３−Ｆｒ４
（配列中、
Ｆｒ１は
【００５８】
【表３１】
2005514063.tif 000041
であり、Ｆｒ２は
【００５９】
【表３２】
2005514063.tif 000042
であり、Ｆｒ３は
【００６０】
【表３３】
2005514063.tif 000043
であり、Ｆｒ４は
【００６１】
【表３４】
2005514063.tif 000044
である）。
２２．κ軽鎖可変ドメイン種
［００４３］  本発明のイヌκ軽鎖可変ドメインは、以下の配列からなる化合物であることが好ましい：
Ｆｒ１−ＣＤＲ１−Ｆｒ２−ＣＤＲ２−Ｆｒ３−ＣＤＲ３−Ｆｒ４
（配列中、Ｆｒ１、Ｆｒ２、Ｆｒ３およびＦｒ４は以下の組合せ：
【００６２】
【表３５】
2005514063.tif 000045
【００６３】
【表３６】
2005514063.tif 000046
【００６４】
【表３７】
2005514063.tif 000047
から選択される）。
２３．その他のλ軽鎖可変ドメイン
［００４４］  別の実施形態では、本発明は以下の配列からなる：
Ｆｒ１−ＣＤＲ１−Ｆｒ２−ＣＤＲ２−Ｆｒ３−ＣＤＲ３−Ｆｒ４
（配列中、Ｆｒ１、Ｆｒ２、Ｆｒ３およびＦｒ４は、表Ｎλに示された重鎖可変配列のフレームワーク領域から選択されるフレームワーク領域である）。表Ｎλ中のポリペプチドのフレームワーク配列は、一般に認められ広く入手可能である多数の配列アラインメント・プログラムのいずれかを用いて、既知のヒト可変ドメイン配列のいずれかの対応するフレームワーク配列とアラインする配列として、当業者によって容易に、かつ、慣例的に決定可能である。
【００６５】
（相補性決定領域）
［００４５］  本明細書では、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、ある実施形態ではイヌＣＤＲであり、別の実施形態では同一の非イヌ抗体に由来する非イヌＣＤＲであるようなＣＤＲである。２つのＣＤＲが同一の非イヌ抗体由来であり、かつ、第３のＣＤＲ（好ましくはＣＤＲ１）がイヌＣＤＲであることが好ましい。各位置で好ましいアミノ酸は、太字および下線で示されるものである。本発明のキメラのイヌ重鎖可変ドメインポリペプチドは、イヌ抗血清と免疫学的に反応性でない。
【００６６】
［００４６］  好ましい実施形態では、重鎖のＣＤＲ１は以下の通りである：
ａ）Ｃ’２Ｃ’３Ｃ’４Ｃ’５Ｃ’６Ｃ’７Ｃ’８Ｃ’９Ｃ’１０Ｃ’１１であって、
【００６７】
【表３８】
2005514063.tif 000048
である、
ｂ）以下の
【００６８】
【表３９】
2005514063.tif 000049
からなる群から選択される、
ｃ）Ｃ’１Ｃ’２Ｃ’３Ｃ’４Ｃ’５Ｃ’６Ｃ’７Ｃ’８Ｃ’９Ｃ’１０であって、
【００６９】
【表４０】
2005514063.tif 000050
である、
ｄ）ＧＹＴＦＴＤＹＹＭＨおよびＧＹＩＦＩＤＱＹＭＨからなる群から選択される、
ｅ）Ｃ’１Ｃ’２Ｃ’３Ｃ’４Ｃ’５Ｃ’６Ｃ’７Ｃ’８Ｃ’９Ｃ’１０であって、
【００７０】
【表４１】
2005514063.tif 000051
である、
ｆ）ＧＳＶＴＤＩＨＹＷＳおよびＧＳＶＮＳＧＹＹＷＳからなる群から選択される、または
ｇ）マウス１５Ａ２抗体ＣＤＲ１、ＳＧＹＳＦＴＤＹＦＭＮである。
【００７１】
［００４７］  好ましい実施形態では、重鎖のＣＤＲ２は以下の通りである：
ａ）Ｃ’’１Ｃ’’２Ｃ’’３Ｃ’’４Ｃ’’５Ｃ’’６Ｃ’’７Ｃ’’８Ｃ’’９Ｃ’’１０Ｃ’’１１Ｃ’’１２Ｃ’’１３Ｃ’’１４Ｃ’’１５Ｃ’’１６Ｃ’’１７であって、
【００７２】
【表４２】
2005514063.tif 000052
である、
ｂ）次の
【００７３】
【表４３】
2005514063.tif 000053
からなる群から選択される、
ｃ）Ｃ’’１Ｃ’’２Ｃ’’３Ｃ’’４Ｃ’’５Ｃ’’６Ｃ’’７Ｃ’’８Ｃ’’９Ｃ’’１０Ｃ’’１１Ｃ’’１２Ｃ’’１３Ｃ’’１４Ｃ’’１５Ｃ’’１６であって、
【００７４】
【表４４】
2005514063.tif 000054
である、
ｄ）ＩＤＰＥＤＧＴＴＳＹＡＱＫＦＱＧおよびＩＤＰＥＤＤＴＴＧＹＡＱＫＦＱＧからなる群から選択される、
ｅ）Ｃ’’１Ｃ’’２Ｃ’’３Ｃ’’４Ｃ’’５Ｃ’’６Ｃ’’７Ｃ’’８Ｃ’’９Ｃ’’１０Ｃ’’１１Ｃ’’１２Ｃ’’１３Ｃ’’１４Ｃ’’１５Ｃ’’１６であって、
【００７５】
【表４５】
2005514063.tif 000055
である、
ｆ）ＹＷＲＧＧＴＮＨＮＰＡＦＱＥＲＩおよびＹＷＳＧＴＴＨＹＮＰＴＦＱＧＲＩからなる群から選択される、または
ｇ）マウス１５Ａ２抗体ＣＤＲ２、ＲＩＮＰＦＮＧＤＰＦＹＮＱＫＦＫＧである。
【００７６】
［００４８］  好ましい実施形態では、重鎖のＣＤＲ３は以下の通りである：
ａ）Ｃ’’’１Ｃ’’’２Ｃ’’’３Ｃ’’’４Ｃ’’’５Ｃ’’’６Ｃ’’’７Ｃ’’’８Ｃ’’’９Ｃ’’’１０Ｃ’’’１１Ｃ’’’１２Ｃ’’’１３Ｃ’’’１４Ｃ’’’１５Ｃ’’’１６Ｃ’’’１７Ｃ’’’１８Ｃ’’’１９Ｃ’’’２０であって、
【００７７】
【表４６】
2005514063.tif 000056
である、
ｂ）次の
【００７８】
【表４７】
2005514063.tif 000057
からなる群から選択される、
ｃ）ＧＧＳＲＰＦＮＡＦＧ、ＫＷＲＹＹＧＳＱＤ、ＤＩＷＤＦＤおよびＹＩＹＧＹＡＡＹＬＤからなる群から選択される、
ｄ）ＮＳＤおよびＬＹＲＳＮＹＬＬＤからなる群から選択される、または
ｅ）マウス１５Ａ２抗体ＣＤＲ３、ＦＹＹＧＲＹＹＡＭＤＹである。
【００７９】
［００４９］  好ましい実施形態では、軽鎖のＣＤＲ１は以下の通りである：
ａ）Ｃ’１Ｃ’２Ｃ’３Ｃ’４Ｃ’５Ｃ’６Ｃ’７Ｃ’８Ｃ’９Ｃ’１０Ｃ’１１Ｃ’１２Ｃ’１３であって、
【００８０】
【表４８】
2005514063.tif 000058
である（ただし、ｍ＞２のＣ’ｍが−である場合には、ｎ＜ｍのＣ’ｎは−である）、
ｂ）次の
【００８１】
【表４９】
2005514063.tif 000059
からなる群から選択される、
ｃ）Ｃ’１Ｃ’２Ｃ’３Ｃ’４Ｃ’５Ｃ’６Ｃ’７Ｃ’８Ｃ’９Ｃ’１０Ｃ’１１Ｃ’１２Ｃ’１３であって、
【００８２】
【表５０】
2005514063.tif 000060
である、
ｄ）次の
【００８３】
【表５１】
2005514063.tif 000061
からなる群から選択される、
ｅ）Ｃ’１Ｃ’２Ｃ’３Ｃ’４Ｃ’５Ｃ’６Ｃ’７Ｃ’８Ｃ’９Ｃ’１０Ｃ’１１Ｃ’１２Ｃ’１３Ｃ’１４であって、
【００８４】
【表５２】
2005514063.tif 000062
である、または
ｆ）次の
【００８５】
【表５３】
2005514063.tif 000063
からなる群から選択される。
［００５０］  好ましい実施形態では、軽鎖のＣＤＲ２は以下の通りである：
ａ）Ｃ’’１Ｃ’’２Ｃ’’３Ｃ’’４Ｃ’’５Ｃ’’６Ｃ’’７であって、
【００８６】
【表５４】
2005514063.tif 000064
である、
ｂ）次の
【００８７】
【表５５】
2005514063.tif 000065
からなる群から選択される、
ｃ）Ｃ’’１Ｃ’’２Ｃ’’３Ｃ’’４Ｃ’’５Ｃ’’６Ｃ’’７であって、
【００８８】
【表５６】
2005514063.tif 000066
である、
ｄ）次の
【００８９】
【表５７】
2005514063.tif 000067
からなる群から選択される、
ｅ）Ｃ’’１Ｃ’’２Ｃ’’３Ｃ’’４Ｃ’’５Ｃ’’６Ｃ’’７であって、
【００９０】
【表５８】
2005514063.tif 000068
である、または
ｆ）次の
【００９１】
【表５９】
2005514063.tif 000069
からなる群から選択される。
［００５１］  好ましい実施形態では、軽鎖のＣＤＲ３は、以下の通りである：
ａ）Ｃ’’’１Ｃ’’’２Ｃ’’’３Ｃ’’’４Ｃ’’’５Ｃ’’’６Ｃ’’’７Ｃ’
’’８Ｃ’’’９Ｃ’’’１０Ｃ’’’１１Ｃ’’’１２
【００９２】
【表６０】
2005514063.tif 000070
である、
ｂ）次の
【００９３】
【表６１】
2005514063.tif 000071
からなる群から選択される、
ｃ）Ｃ’’’１Ｃ’’’２Ｃ’’’３Ｃ’’’４Ｃ’’’５Ｃ’’’６Ｃ’’’７Ｃ’’’８Ｃ’’’９Ｃ’’’１０Ｃ’’’１１Ｃ’’’１２であって、
【００９４】
【表６２】
2005514063.tif 000072
である、
ｄ）次の
【００９５】
【表６３】
2005514063.tif 000073
からなる群から選択される、
ｅ）Ｃ’’’１Ｃ’’’２Ｃ’’’３Ｃ’’’４Ｃ’’’５Ｃ’’’６Ｃ’’’７Ｃ’’’８Ｃ’’’９Ｃ’’’１０Ｃ’’’１１Ｃ’’’１２
【００９６】
【表６４】
2005514063.tif 000074
である、または
ｆ）次の
【００９７】
【表６５】
2005514063.tif 000075
からなる群から選択される。
［００５２］  度数分布表およびＣＤＲ同定に用いる選択方法は、ウェブ上のカバット（Ｋａｂａｔ）データベースを用いるものである。度数分布表を得るためには、http://immuno.bme.nwu.edu/に行き、「検索および解析ツール（ｓｅａｒｃｈｉｎｇ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｏｏｌｓ）」下の「変動（ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ）」ツールを用いて、作表したデータをカバット（ｋａｂａｔ）データベースで得ることが可能である。（デフォルトの変動プロット（ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ  ｐｌｏｔ）の代わりに）「分布（ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）」表、すなわち与えられたドメイン中の各位置について所与
の位置における各アミノ酸の度数分布の表を選択する。カバット  イー  エー（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．）、ウー  ティー  ティー（Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．）、ペリー  エイチ  エム（Ｐｅｒｒｙ，Ｈ．Ｍ．）、ゴッテスマン  ケー  エス（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｋ．Ｓ．）、フォエラー  シー（Ｆｏｅｌｌｅｒ，Ｃ．）、１９９１年、「免疫学的に興味深い蛋白質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔｓ）、第５版」、米国厚生省国立衛生研究所［米国メリーランド州ベテスダ所在］（ＮＩＨ出版物第９１−３２４２号）参照。
【００９８】
（フレームワーク領域の変動およびその他の相同配列）
［００５３］  本発明のポリペプチドはまた、１つまたは複数のフレームワーク領域中の１個または複数のアミノ酸をヒト配列の対応する（すなわち、同一位置の）アミノ酸に置換することによって改変された、前記に開示した配列のうちの１つを備えたポリペプチドを含む。ヒト配列由来のアミノ酸は種々の公的に入手可能なデータベースに見られる。段落［００５２］参照。
【００９９】
［００５４］  イヌ化した可変ドメインおよび抗体については、Ｆｒ１、Ｆ２、Ｆｒ３およびＦｒ４フレームワーク配列は、２または３の非イヌＣＤＲを得る非イヌ抗体の対応するフレームワーク配列と少なくとも６０％相同であるべきである。より好ましくは、かかる配列は、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％相同である。配列間の相同性（％）は、当技術分野で認められた任意のアラインメント・アルゴリズムを用いて求めることができる。以下に開示するイヌ可変ドメインポリペプチド配列は本発明の範囲から特に排除する：
ａ）ワッサーマン（Ｗａｓｓｅｒｍａｎ）およびカプラ（Ｃａｐｒａ）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．第１６巻、３１６０ページ（１９７７）
【０１００】
【化１０】
2005514063.tif 000076
ｂ）ワッサーマン（Ｗａｓｓｅｒｍａｎ）およびカプラ（Ｃａｐｒａ）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．第１５巻、３０３ページ（１９７８）：
【０１０１】
【化１１】
2005514063.tif 000077
および
ｃ）タングら（Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  第８０巻、２５９ページ（２００１）。
【０１０２】
［００５５］  非イヌＣＤＲが得られる配列（例えば、１５Ａ２マウス配列）へ復帰突然変異させるイヌフレームワーク領域内のアミノ酸について同定するために、ホモロジー・モデリングを用いることができる。復帰突然変異とは、イヌフレームワーク領域内のアミノ酸を非イヌフレームワーク領域内に見られるアミノ酸へ「戻す」こととして定義する。
【０１０３】
［００５６］  当業者であれば、適当な復帰突然変異を調べるために、イヌ化抗体に用
いるための１つまたは複数のＣＤＲを備えた非イヌ抗体の三次元分子モデルを作製する既知の方法を使用し得る。各モデルについて、ＣＤＲの周囲３オングストローム・シェルおよび６オングストローム・シェル内のアミノ酸を決定する。３および６オングストローム・シェル内に見られるアミノ酸は、標的抗原に対する親和性を向上させる可能性が強い。次いで、６、好ましくは３オングストローム・シェル内のアミノ酸に相当するイヌ抗体フレームワーク領域の１個または複数のアミノ酸を、対応する非イヌ抗体のアミノ酸に、任意選択で「復帰突然変異」させる。
【０１０４】
［００５７］  ブルックヘブン（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ）タンパク質データ・バンク（ＰＤＢ）ファイルの操作、モデル構築、モデル改良および部位特異的突然変異誘発のための特定アミノ酸の予測には、分子モデリング／画像プログラムＤＥＥＰ  ＶＩＥＷが使用可能である（http://www.expasy.ch/spdbv/mainpage.htm で入手可能）。ゲクス  エヌ（Ｇｕｅｘ，Ｎ．）およびピーチ  エム  シー（Ｐｅｉｔｓｃｈ，Ｍ．Ｃ．）（１９９７）「スイスモデルとスイスビューア：タンパク質モデル比較のための一環境（SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer:An environment for comparative protein modeling ）」、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  第１８巻、２７１４〜２７２３ページ。この方法によって適当な復帰突然変異を決定する１モデルでは、非イヌ抗体重鎖および軽鎖の直線配列を、結晶構造が（例えば、ブルックヘブン（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ）タンパク質データ・バンク中に）存在する既存の配列と比較する。選択される配列は、種々の非イヌ抗体可変ドメインと高い相同性を有する、結晶構造既知の配列である。次いで、この既知の結晶構造に基づいてＤＥＥＰ  ＶＩＥＷを用いて非イヌ抗体重鎖および軽鎖をモデリング可能である。各モデルについて、ＣＤＲの周囲３オングストローム・シェルおよび６オングストローム・シェル内のアミノ酸を決定する。既知の構造およびＣＤＲ周囲のこれら２つの同心シェル内のアミノ酸を比較することによって、ＣＤＲに直接および／または間接に影響を及ぼし得る重要なアミノ酸の同定が可能となる。
【０１０５】
［００５８］  本発明のこの態様のイヌ可変ドメインポリペプチドは、当業者に公知の標準的な技法によって作製可能である。例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）およびラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）、「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning:A Laboratory Manual ）」（第３版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press ）［米国ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー所在］、２００１）。簡単に述べれば、イヌ可変ドメインポリペプチドは、イヌ可変ドメインポリペプチドをコードする、対応する核酸を発現させることによって作製可能である。この核酸については以下に、より詳しく記載する。本発明の核酸は適当なベクターに挿入可能であり、好適な発現系でこれらのベクターからイヌ可変ドメインポリペプチドを発現させることができる。
【０１０６】
［００５９］  本発明はまた、段落［００４６］〜［００５１］のいずれか１つに記載の１、２または３つのＣＤＲを含む、段落［００２２］〜［００４３］のいずれか１つに記載のイヌ化可変領域配列からなる。本発明はさらに、段落［００４６］〜［００５１］のいずれか１つに記載の０〜３つのＣＤＲを含む、段落［００２２］〜［００４３］のいずれか１つに記載のイヌ化可変領域配列からなる抗体からなる。
【０１０７】
［００６０］  また、本明細書に明確に開示された配列の１つに１または複数のアミノ酸が付加されているか、または該配列から欠失している配列も包含される。置換、欠失および／または付加によって本明細書に明確に開示された配列のうちの１つと異なっており、かつ本明細書に明確に開示された配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有する配列も、同様に本発明内に包含されるとみなされる。特に、本発明は、（ａ）本明細書に明確に開示されたポリペプチド配列の対応するフレームワーク配列（Ｆｒ１〜Ｆｒ４）と９５、９６、９７、９８または９９％相同なフレームワーク
配列、または（ｂ）本明細書に明確に開示されたポリペプチド配列の対応する配列と９５、９６、９７、９８または９９％相同な、フレームワーク配列およびＣＤＲ１およびＣＤＲ２である配列であるか、前記（ａ）または（ｂ）の配列をその中に含む配列からもなる。
【０１０８】
［００６１］  例えば、参照配列と９５％相同である配列は、候補配列を参照配列とアラインメントさせた後に、配列中のアミノ酸の９５％が参照配列中の対応するアミノ酸と同一であることが必要である。かかる相同配列には、保存的アミノ酸置換によって本明細書に明確に開示された配列と異なる配列が含まれるであろう。保存的アミノ酸置換とは、あるアミノ酸が、ペプチド化学の当業者であればそのポリペプチドの二次構造とハイドロパシー（疎水性親水性）の性質とが実質的に変化しないと予想するであろう、類似の特性を有する別のアミノ酸と置き換わるような置換である。一般に、以下のアミノ酸群は保存的変化を示す：（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓおよび（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓ。
【０１０９】
［００６２］  より詳しくは、「保存的アミノ酸置換」は、その位置のアミノ酸残基の極性または電荷に影響をほとんどまたは全く及ぼさない非天然のアミノ酸残基で天然の残基を置換することを含み得る。さらに、「アラニンスキャニング突然変異誘発」について先に記載されているように、ポリペプチド中の天然の残基はいずれもアラニンで置換してもよい。
【０１１０】
［００６３］  保存的アミノ酸置換はまた、生体システムにおける合成ではなく、通常化学的ペプチド合成によって組み込まれる、非天然アミノ酸残基も包含する。これらとしては、ペプチドミメティックスおよびその他の逆または反転した形態のアミノ酸部分が挙げられる。
【０１１１】
［００６４］  天然に存在する残基は、共通した側鎖の特性に基づいてクラス分けが可能である：
１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）鎖の方向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
例えば、非保存的置換としては、これらのクラスのうちの１つのあるメンバーを、別のクラスのメンバーと交換することが挙げられる。
【０１１２】
［００６５］  かかる交換を行う際には、アミノ酸のハイドロパシー指数を考慮してもよい。各アミノ酸には、その疎水性と電荷の特性に基づいてハイドロパシー指数が割り当てられている。ハイドロパシー指数は以下の通りである：イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／シスチン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、スレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタミン酸（−３．５）、グルタミン（−３．５）、アスパラギン酸（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リシン（−３．９）およびアルギニン（−４．５）。
【０１１３】
［００６６］  タンパク質への相互作用的生物学的機能の付与におけるアミノ酸ハイド
ロパシー指数の重要性は、当技術分野では広く理解されている（カイトら（Ｋｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．）、１９８２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第１５７巻：１０５〜３１ページ）。特定のアミノ酸を、類似のハイドロパシー指数またはスコアを有する別のアミノ酸と置換してもよく、依然として同様の生物活性を保持するということが知られている。ハイドロパシー指数に基づいて交換を行う際には、ハイドロパシー指数が±２内にあるアミノ酸の置換が好ましく、±１内のものが特に好ましく、±０．５内のものがさらに特に好ましい。
【０１１４】
［００６７］  当技術分野では、特に、この場合のように、置換により作られる生物学的機能的に同等なタンパク質またはペプチドが免疫学的実施形態で使用するためのものである場合には、親水性に基づく類似アミノ酸の置換も効果的になされ得るということも理解されている。タンパク質の隣接するアミノ酸の親水性によって支配される、該タンパク質の最大局所平均親水性は、その免疫原性および抗原性、すなわち該タンパク質の生物学的特性と相関がある。
【０１１５】
［００６８］  以下の親水性値が、これらのアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）、リシン（＋３．０）、アスパラギン酸（＋３．０±１）、グルタミン酸（＋３．０±１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、スレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５±１）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）およびトリプトファン（−３．４）。類似の親水性値に基づいて交換する際には、親水性値が±２内のアミノ酸の置換が好ましく、±１内のものが特に好ましく、±０．５内のものがさらに特に好ましい。また、親水性に基づいて一次アミノ酸配列からエピトープを同定することもできる。これらの領域は「エピトープ性コア領域」とも呼ばれる。
【０１１６】
［００６９］  当業者ならば、所望のアミノ酸置換（保存的であろうと非保存的であろうと）をかかる置換が望まれるときに決定し得る。アミノ酸置換の例を表Ｉに示す。
【０１１７】
【表６６】
2005514063.tif 000078
［００７０］  本発明の第１の可変ドメインアミノ酸配列が１個または複数のアミノ酸置換により本発明の第２のアミノ酸配列とは異なる場合、第２の配列中のアミノ酸置換は保存的置換であることが好ましい。第２の配列に到達するよう第１の可変ドメイン配列中の特定の位置にどのアミノ酸を置換するかを特定する際には、おそらくは、第１の配列と少なくとも８０％（好ましくは、少なくとも８５％、９０％または９５％）の相同性を有するイヌ可変ドメインまたはヒト可変ドメイン中のその位置に現れるアミノ酸を選択する。本発明の第１の配列と第２の配列は少なくとも９５％相同となる。
【０１１８】
［００７１］  表現型上サイレントなアミノ酸置換を為す方法に関するガイダンスは、ボウイら（Ｂｏｗｉｅ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４７巻：１３０６〜１３１０ページ（１９９０）に提供されており、同文献はアミノ酸配列の変更に対する許容度を研究するための２つの主要な戦略を教示している。
【０１１９】
［００７２］  第１の戦略では、進化の過程の間の自然選択によるアミノ酸置換の許容度を利用する。様々な種においてアミノ酸配列を比較することによって、種間で保存されていたアミノ酸位置を同定することが可能である。これらの保存されたアミノ酸は、タンパク質機能にとって重要である可能性が高い。対照的に、自然選択による置換が許容されていたアミノ酸位置は、タンパク質機能にとって重要ではない位置を示す。したがって、アミノ酸置換を許容する位置は、ポリペプチドの特異的結合活性を維持しながら改変可能である。
【０１２０】
［００７３］  第２の戦略は、タンパク質機能にとって重要な領域を同定するために、クローニングされた遺伝子の特定の位置にアミノ酸変更を導入するために遺伝子工学を用いる。例えば、部位特異的突然変異誘発またはアラニンスキャニング突然変異誘発（分子内の各残基に単一のアラニン突然変異を導入すること）が使用可能である（カニンガムら（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４４巻：１０８１〜１０８５（１９８９））。次いで、得られた変異体分子を、本発明の抗体との特異的結合について試験すればよい。
【０１２１】
［００７４］  ボウイら（Ｂｏｗｉｅ  ｅｔ  ａｌ．）によれば、これら２つの戦略により、タンパク質はアミノ酸置換を驚くほど許容するということが示された。著者らはさらに、タンパク質のあるアミノ酸位において、どのアミノ酸変更が許容的である可能性が高いかを示す。例えば、（タンパク質の三次構造内の）最も埋もれたまたは内側にあるアミノ酸残基は非極性の側鎖を必要とする一方、表面または外側の側鎖の特徴は一般にほとんど保存されていない。
【０１２２】
［００７５］  タンパク質のアミノ酸に突然変異を導入する方法は、当業者に十分に公知である。例えば、オーズベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）（編）、「分子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．）（１９９４）；ティー  マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）、イー  エフ  フリッチ（Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ）およびジェイ  サムブルック（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning:A Laboratory Manual ）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、米国ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー所在（１９８９）参照。突然変異はまた、「ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）部位特異的突然変異誘発キット」（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））などの市販のキットを用いても導入可能である。ポリペプチドの機能に影響を及ぼさないアミノ酸の置換による、機能的に活性なポリペプチド変異体の作製は、当業者であれば達成可能である。
【０１２３】
［００７６］  本明細書において、２つのアミノ酸配列の（または２つの核酸配列の）同一性または相同性（％）は、カーリン（Ｋａｒｌｉｎ）およびアルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）のアルゴリズム（ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  第８７巻：２２６４〜２２６８ページ、１９９０年）を、カーリン（Ｋａｒｌｉｎ）およびアルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  第９０巻：５８７３〜５８７７ページ、１９９３年のように改変したものを用いて求められる。かかるアルゴリズムは、アルトシュルら（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第２１５巻：４０３〜４１０、１９９０年）のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア（ｓｃｏｒｅ）＝１００、語長（ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ）＝１２を用いて実施される。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア（ｓｃｏｒｅ）＝５０、語長（ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ）＝３を用いて実施される。比較目的でギャップのあるアラインメントを得るには、アルトシュルら（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．第２５巻：３３８９〜３４０２ページ、１９９７年）に記載されたようなＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴが利用される。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合には、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトのパラメータを用いて、本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得る。
【０１２４】
（好ましいイヌ化可変領域）
［００７７］  イヌＩｇＥに対して結合親和性を有する十分にイヌ化された重鎖可変ドメインの、以下の配列：
【０１２５】
【化１２】
2005514063.tif 000079
が好ましい。
［００７８］  イヌＩｇＥに対して結合親和性を有する十分にイヌ化された軽鎖可変領域Ｔ１ｃの、以下の配列：
（ａ）Ｔ１ｃ：
【０１２６】
【化１３】
2005514063.tif 000080
が好ましい。
（物質の核酸組成）
［００７９］  第２の態様では、本発明はイヌ可変ドメインをコードする核酸からなる。核酸配列を示す表（ＮＨ５８、ＮＨ７４、Ｎその他のＨ、ＮＧ２、ＮＧ１、ＮＧ３、Ｎ
κおよびＮλ）では、下線を引いた核酸配列は分泌リーダー配列をコードする。表ＮＨ５８、ＮＨ７４、Ｎその他のＨ、ＮＧ２、ＮＧ１、ＮＧ３、ＮκおよびＮλ中の核酸配列は、段落［００２２］〜［００４４］のＨ５８、Ｈ７４、Ｇ２、Ｇ１、Ｇ３およびκファミリーのポリペプチドにそれぞれ対応する。分泌リーダー配列を含む、あるいは含まない、表ＮＨ５８、ＮＨ７４、Ｎその他のＨ、ＮＧ２、ＮＧ１、ＮＧ３、ＮκおよびＮλの核酸によってコードされるポリペプチドもまた、本発明の実施形態である。本発明の核酸は、分泌リーダーをコードする配列を含む、あるいは含まない、表ＮＨ５８、ＮＨ７４、Ｎその他のＨ、ＮＧ２、ＮＧ１、ＮＧ３、ＮκおよびＮλ中の配列を含む。表Ｎその他のＨおよびＮλは、開示された核酸配列によってコードされるポリペプチドを含む。分泌リーダー配列を含む、または含まないこれらのポリペプチドもまた、本発明の実施形態である。
【０１２７】
［００８０］  詳しくは、本発明の核酸は、イヌ化された軽鎖または重鎖可変ドメインポリペプチドをコードし、表ＮＨ５８、ＮＨ７４、Ｎその他のＨ、ＮＧ２、ＮＧ１、ＮＧ３、ＮκおよびＮλ中の核酸のうち１つに由来するフレームワークをコードする配列と、ＣＤＲをコードする配列とからなる。表ＮＨ５８、ＮＨ７４、Ｎその他のＨ、ＮＧ２、ＮＧ１、ＮＧ３、ＮκおよびＮλ中の核酸のフレームワークをコードする配列は、それらの核酸配列を、フレームワーク配列が本明細書に開示されているか、あるいは決定可能である対応するポリペプチドと比較することによって容易に決定可能である。代替例として、当業者であれば、表ＮＨ５８、ＮＨ７４、Ｎその他のＨ、ＮＧ２、ＮＧ１、ＮＧ３、ＮκおよびＮλの核酸配列のフレームワークをコードする領域を、一般に認められ広く入手可能な配列アラインメント・プログラムのいずれか（前記で論じた）を用いる配列アラインメントによって既知の特性決定されたヒト可変ドメイン配列と比較することによって日常的に決定し得る。ＣＤＲをコードする配列は、段落［００４６］〜［００５１］中のものなどの適当なＣＤＲをコードする。
【０１２８】
［００８１］  また、本発明の一部は、１つまたは複数の保存的ヌクレオチド置換を含む本明細書に開示された核酸でもある。コドン内の「保存的ヌクレオチド置換」は、そのコドンによってコードされるアミノ酸を変更しない。
【０１２９】
１．Ｈ５８重鎖可変ドメイン
［００８２］  本発明のこの態様の１実施形態では、核酸は、表ＮＨ５８（下記）中の核酸からなる。これらの配列は、段落［００２４］に開示されたＶＨポリペプチドをコードする。
【０１３０】
［００８３］  最も広い実施形態では、本発明のこの態様は、段落［００２２］または段落［００２３］に開示された可変ドメインポリペプチドをコードする任意の核酸からなる。この核酸の配列は、遺伝暗号を用いてポリペプチドから日常的に決定可能である。
【０１３１】
２．Ｈ７４重鎖可変ドメイン
［００８４］  本発明のこの態様の別の実施形態では、核酸は表ＮＨ７４（下記）中の核酸からなる。これらの配列は、段落［００２７］に開示されたＶＨポリペプチドをコードする。
【０１３２】
［００８５］  この態様の別の実施形態では、本発明は、段落［００２５］に、より好ましくは、段落［００２６］に開示された、可変ドメインポリペプチドをコードする核酸からなる。最も広い実施形態では、本発明のこの態様は、段落［００２５］または段落［００２６］に開示された可変ドメインポリペプチドをコードする任意の核酸からなる。この核酸の配列は、遺伝暗号を用いて日常的に決定可能である。
【０１３３】
３．その他の重鎖可変ドメイン
［００８６］  本発明のこの態様の別の実施形態では、核酸は表Ｎその他のＨ（下記）中の核酸からなる。
【０１３４】
４．第２群の軽鎖可変ドメイン
［００８７］  本発明のこの態様の別の実施形態では、核酸は表ＮＧ２（下記）中の核酸からなる。これらの配列は、段落［００３４］に開示された第２群のλ軽鎖可変ドメインポリペプチドをコードする。
【０１３５】
［００８８］  この態様の別の実施形態では、本発明は段落［００３２］に、より好ましくは、段落［００３３］に開示された可変ドメインポリペプチドをコードする核酸からなる。最も広い実施形態では、本発明のこの実施形態は、段落［００３２］または段落［００３３］に開示された可変ドメインポリペプチドをコードする任意の核酸からなる。この核酸の配列は、遺伝暗号を用いて日常的に決定可能である。
【０１３６】
５．第１群の軽鎖可変ドメイン
［００８９］  本発明のこの態様の別の実施形態では、核酸は表ＮＧ１（下記）中の核酸からなる。これらの配列は、段落［００３７］に開示された第１群の軽鎖可変ドメインポリペプチドをコードする。
【０１３７】
［００９０］  この態様の別の実施形態では、本発明は、段落［００３５］に、より好ましくは、段落［００３６］に開示された可変ドメインポリペプチドをコードする核酸からなる。最も広い実施形態では、本発明のこの実施形態は、段落［００３５］または段落［００３６］に開示された可変ドメインポリペプチドをコードする任意の核酸からなる。この核酸の配列は、遺伝暗号を用いて日常的に決定可能である。
【０１３８】
６．第３群の軽鎖可変ドメイン
［００９１］  本発明のこの態様の別の実施形態では、核酸は表ＮＧ２（下記）中の核酸からなる。これらの配列は、段落［００４０］に開示された第２群の軽鎖可変ドメインポリペプチドをコードする。
【０１３９】
［００９２］  この態様の別の実施形態では、本発明は、段落［００３８］に、より好ましくは、段落［００３９］に開示された可変ドメインポリペプチドをコードする核酸からなる。最も広い実施形態では、本発明のこの実施形態は、段落［００３８］または段落［００３９］に開示された可変ドメインポリペプチドをコードする任意の核酸からなる。この核酸の配列は、遺伝暗号を用いて日常的に決定可能である。
【０１４０】
７．κ軽鎖可変ドメイン
［００９３］  本発明のこの態様の別の実施形態では、核酸は表Ｎκ（下記）中の核酸からなる。これらの配列は、段落［００４３］に開示されたκ軽鎖可変ドメインポリペプチドをコードする。この核酸の配列は、遺伝暗号を用いて日常的に決定可能である。
【０１４１】
［００９４］  好ましい実施形態では、核酸は、段落［００２４］、［００２７］、［００３４］、［００３７］、［００４０］、［００４３］、［００４１］の適当なポリペプチドをコードするよう必要に応じてそれぞれ改変された、表ＮＨ５８、ＮＨ７４、Ｎその他のＨ、ＮＧ２、ＮＧ１、ＮＧ３、ＮκまたはＮλのうち１つ由来の配列からなる。改変は、適当なコドンをこれらの各表の配列中に置換により組み込んで対象ポリペプチドをコードする配列を得ることからなる。表の配列中に置換により組み込まれるコドンは、いずれかの表に用いたコドンから選択され、一般に、コドンを置換により組み込む位置と同一表内、同一位置の配列に見られる。したがって、例えば、Ｈ３の１５位でのＡ→Ｇアミノ酸変更を除いてＨ３（表ＮＨ５８中）と同一であるポリペプチドをコードする本発明の
この態様の核酸は、ＧＣＧコドン（Ｈ３ポリペプチドの１５位でＡをコードするＨ３ヌクレオチド配列のアミノ酸１０６〜１０８）が、Ｈ４の１５位にアミノ酸Ｇをコードするコドンである（かつＨ４ヌクレオチド配列のアミノ酸１０６〜１０８からなる）ＧＧＧと置き換わっている表ＮＨ５８のＨ３核酸配列からなるであろう。
【０１４２】
［００９５］  別の好ましい実施形態では、本発明の核酸は、この核酸を発現するための宿主にとって好ましいコドンからなる。ナカムラら（Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．第２８巻、２９２ページ（２０００）。原核生物から哺乳類にわたる多数の種にとって好ましいコドンは公知であり文書に示されている。例えば、上記の文献。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの適用については、細菌の、または他の好ましいコドンが使用可能である。
【０１４３】
［００９６］  本発明の核酸は任意の技法で作製可能であり、その多くが当業者に十分に公知である。例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）およびラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）の上記文献。本発明の核酸は、自動シンセサイザーを用いて合成可能であり、ＰＣＲ増幅可能である。
【０１４４】
（イヌ可変ドメインの作製方法）
［００９７］  別の態様では、本発明は、イヌ生体サンプルから単離することによるイヌ可変ドメイン核酸の作製方法からなる。哺乳類免疫グロブリン間の相同性が大きいことを考慮して、イヌ可変ドメイン核酸配列を単離するための本発明者らの最初の試みでは、ヒトおよびマウス可変ドメイン配列に基づいた縮重プライマーを用いた。イヌ可変ドメイン核酸配列はそれまで知られていなかったので、このアプローチを採用した。本発明者らは驚くべきことに、５’プライマーを使用しイヌ定常ドメイン配列における反応を３’末端でアンカーすると、軽鎖ではすべての反応が失敗し、重鎖の増幅も極めて低率（２１の可能性ある陽性反応のうちの１陽性反応のみ）でしか成功しないということを発見した。哺乳類免疫グロブリン間の著しい相同性のため、この問題は予測不可能であった。したがって、別のアプローチが必要であり、該アプローチは本発明のこの態様の方法からなる。
【０１４５】
［００９８］  この態様では、本発明は、イヌ可変ドメイン核酸配列の作製方法からなり、この方法は、少なくとも１種のイヌ免疫グロブリンをコードするポリ（Ａ）＋ＲＮＡを含むイヌ生体サンプルを、イヌ定常領域配列に相補的な第１の遺伝子特異的アンチセンスプライマーと、第１の遺伝子特異的アンチセンスプライマーが相補的である配列の５’のイヌ定常領域内の配列に相補的な第２の遺伝子特異的配列とを用いる５’ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ）に供することからなる。イヌ生体サンプルが、イヌ末梢血リンパ球を含むことが好ましい。５’ＲＡＣＥ技法は当業者には十分に公知であり、いくつかの総説の主題となっている。例えば、フローマン  エム  エー（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．）（１９９０）「ＰＣＲプロトコール：手法と応用のガイド（PCR Protocols:A Guide to Methods and Apllications ）」（イニス
エム  エー（Ｉｎｉｓ  Ｍ．Ａ．）、ゲルファンド  ディー  エイチ（Ｇｅｌｆａｎｄ
Ｄ．Ｈ．）、スニンスキー  ジェイ  ジェイ（Ｓｎｉｎｓｋｙ  Ｊ．Ｊ．）およびホワイト  ティー  ジェイ（Ｗｈｉｔｅ，Ｔ．Ｊ．）編）２８ページ、サンディエゴ所在のアカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ））；ロー  イー（Ｌｏｈ，Ｅ．）（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２、１１；およびフローマン  エム  エー（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．）（１９９３）「Rapid Amplification of Complementary DNA Ends for Generation of Full-Length Complementary DNAs:Thermal RACE 」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  第２１８巻：３４０〜３５６ページ。
【０１４６】
［００９９］  当技術分野では多数のイヌ定常ドメイン配列が知られており、第１および第２の遺伝子特異的プライマーを作製するために使用可能である：パテルら（Ｐａｔｅ
ｌ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９９５年、第４１巻（５）、２８２〜６ページ；タングら（Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）Ｖｅｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ  ２００１年８月１０日、第８０巻（３〜４）、２５９〜７０ページ；ワッサーマンら（Ｗａｓｓｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  第２００巻（４３４６）、１１５９〜１１６１ページ（１９７８）；米国特許第５，５９３，８６１号、同第５，８５２，１８３号、特開平０９−１６９７９５号公報（１９９７年６月３０日公開）（日立化成工業株式会社）；特開平０４−０４０８９４号公報（１９９２年２月１２日公開）（財団法人化学及血清療法研究所（Ｃｈｅｍｏ  Ｓｅｒｏ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔ  Ｒｅｓ  Ｉｎｓｔ））；特開平０３−１２３４８９号公報（１９９１年５月２７日公開）（財団法人化学及血清療法研究所（Ｃｈｅｍｏ  Ｓｅｒｏ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔ  Ｒｅｓ  Ｉｎｓｔ））；特開平０３−０８３５７９号公報（１９９１年４月９日公開）（財団法人化学及血清療法研究所（Ｃｈｅｍｏ  Ｓｅｒｏ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔ  Ｒｅｓ  Ｉｎｓｔ））；ワッサーマンら（Ｗａｓｓｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  第１６巻（１４）、３１６０〜３１６８ページ（１９７７）；マックンバーら（ＭｃＣｕｍｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１６巻（８）、５６５〜５７０ページ（１９７９）。
【０１４７】
（イヌ化抗体およびその作製方法）
［００１００］  本発明は、ドナー免疫グロブリン由来の１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、イヌ免疫グロブリン由来のフレームワーク領域とを通常備えたイヌ化免疫グロブリン鎖の新規調製方法を提供する。イヌ化は、イヌ免疫グロブリンの１つまたは複数のＣＤＲを非イヌ供給源由来のＣＤＲに置き換えることによって達成される。本発明のこの態様によれば、非イヌＣＤＲは、完全イヌ免疫グロブリン中の対応するＣＤＲ（またはその結合断片）と直接置換可能であり、またはＣＤＲ遺伝子座を含有する免疫グロブリン断片（例えば、可変ドメイン）中に置換により組み込み、その後置換した断片を完全な免疫グロブリンまたはその結合断片（結合性を有する断片）にしてもよい。
【０１４８】
［００１０１］  好ましい方法は、まず、ドナー免疫グロブリンのフレームワークまたは可変領域アミノ酸配列を、イヌ免疫グロブリン鎖の収集物中の対応する配列と比較すること、および該収集物からさらに相同性の高い配列の１つをイヌ免疫グロブリンとして選択することからなる。イヌ免疫グロブリン、すなわち、アクセプター免疫グロブリンの配列は、一般に、少なくとも１０〜２０種の免疫グロブリン可変領域配列の収集物から選択され、通常、収集物中のあらゆる配列の中でドナー免疫グロブリン配列と最も高い相同性を有する。イヌ免疫グロブリンフレームワーク配列は、一般に、ドナー免疫グロブリンフレームワーク配列に対し約６０〜７０％、またはそれよりの高い相同性を有する。ドナー免疫グロブリンは重鎖であっても軽鎖であってもよく、イヌの収集物には同種の鎖が含まれるであろう。イヌ化軽鎖および重鎖は、部分的または完全長のイヌ定常領域を含む、または含まない、２つの軽鎖／重鎖対を備えた、完全なイヌ化免疫グロブリンまたは抗体を形成するために使用可能である。
【０１４９】
［００１０２］  イヌ化可変領域を形成するには、当業者に十分に公知の方法（例えば、実施例５に例示したような、一部ドナーＣＤＲコーディング配列からなるプライマーを用いる可変ドメイン核酸配列のＰＣＲ増幅）を用いて、イヌアクセプター配列中のアミノ酸をドナー配列のＣＤＲ由来の対応するアミノ酸と置き換える。
【０１５０】
［００１０３］  本発明の別の実施形態では、前記の比較工程と併せて、または、別個に、アクセプター免疫グロブリン鎖（好ましくは、軽鎖）中のさらなるアミノ酸をＣＤＲドナー免疫グロブリン鎖由来のアミノ酸に置き換えることが可能である。より詳しくは、アクセプター免疫グロブリンのイヌフレームワークのアミノ酸を、ドナー免疫グロブリン由来の対応するアミノ酸に、以下の位置においてさらに任意選択で置換する：
ａ．アクセプター免疫グロブリンのイヌフレームワーク領域中のアミノ酸が、その位置では稀であり、かつ、ドナー免疫グロブリン中の対応するアミノ酸がイヌ免疫グロブリン配列中のその位置では一般的であるような位置、
ｂ．アミノ酸がＣＤＲのうちの１つと直接隣接している位置、
ｃ．アミノ酸が、三次元免疫グロブリンモデルにおいてＣＤＲから約６オングストローム内にあり、かつ抗原またはドナーもしくはイヌ化免疫グロブリンのＣＤＲと相互作用し得ると予想される位置、または
ｄ．アクセプター免疫グロブリンのイヌフレームワーク領域中のアミノ酸が、ドナー免疫グロブリンの対応するアミノ酸とは異なっている位置。
【０１５１】
［００１０４］  アクセプター免疫グロブリン中のアミノ酸がその位置では稀であり、ドナー免疫グロブリン中の対応するアミノ酸も他のイヌ配列と比べて稀である場合には、任意選択で、アクセプター配列中のアミノ酸を、その位置のイヌ配列に典型的なアミノ酸に置き換えることが可能である。
【０１５２】
［００１０５］  組み合わせて完全な抗体とする場合、本発明のイヌ化軽鎖および重鎖はイヌでは実質的に非免疫原性であり、かつ、抗原（エピトープを含むタンパク質または他の化合物など）に対しドナー免疫グロブリンと実質的に同じ親和性を保持することになる。これらの親和性レベルは約１０８Ｍ−１またはそれ以上に異なる可能性があり、ドナー免疫グロブリンの約４倍以内、好ましくは、約２倍以内であり得る。理想的には、イヌ化抗体は、ドナー免疫グロブリンの抗原に対する本来の親和性の少なくとも約６０〜９０％の親和性レベルを示す。
【０１５３】
［００１０６］  設計してしまえば、本発明の免疫グロブリン（結合断片を含む）は、種々の組換えＤＮＡ技術または他の技術によって容易に生産可能である。所望のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを合成によって生産し、必要に応じてＰＣＲを用いて核酸配列に連結されることが好ましい。ポリヌクレオチドは、ＰＣＲを用いて、また好ましくは適当なクローニング媒体に挿入して増幅可能であり、コードされるポリペプチドプチドを好適な発現系で発現させることが可能である。
【０１５４】
［００１０７］  特に、本発明の方法によって、最適の結合特性を有するイヌ化免疫グロブリンが得られる見込みが最大となる。イヌ化免疫グロブリンは、モノクローナル抗体療法に感受性の高いイヌ疾患の治療において特に有用である。したがって、別の態様では、本発明は、ＩｇＥ媒介性の疾患に罹患しているイヌに、本発明のイヌ化抗体（またはその結合断片）を、該疾患と関連している１つまたは複数の症状を軽減するか排除するのに十分な量投与することによって、そのイヌを治療する方法からなる。
【０１５５】
［００１０８］  本発明はまた、完全イヌ化免疫グロブリンの他に、その結合断片からなる。抗体の断片の使用および作製は十分に公知である、例えば、Ｆａｂ断片［チジュセン（Ｔｉｊｓｓｅｎ）、「酵素免疫測定法の実践と理論（Practice and Theory of Enzyme Immunoassays）」、１９８５年、アムステルダム所在のエルゼビア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）］、Ｆｖ断片［ホックマンら（Ｈｏｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  第１２巻、１１３０ページ（１９７３年）］、ｓｃＦｖ断片（「ファージディスプレイ：実験マニュアル（Phage Display:A Laboratory Manual ）」、カール  エフ  バルバス  ザ  サード（Ｃａｒｌ  Ｆ．Ｂａｒｂａｓ  ＩＩＩ）、デニス  アール  バートン（Ｄｅｎｎｉｓ  Ｒ．Ｂｕｒｔｏｎ）、ジャミー  ケー  スコット（Ｊａｍｉｅ  Ｋ．Ｓｃｏｔｔ）およびグレッグ  ジェイ  シルバーマン（Ｇｒｅｇｇ  Ｊ．Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ）、米国ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー所在のコールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ．））などである。
【０１５６】
［００１０９］  別の態様では、本発明は少なくとも１種の本発明のイヌ化抗体と製薬上許容可能な担体と、からなる組成物を提供する。
［００１１０］  イヌ化抗体およびその結合断片は、生体サンプル中の抗原の存在を検出するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにも有用である。
【実施例】
【０１５７】
（実施例１）イヌ可変ドメインの単離
［００１１１］  イヌλおよびイヌκ軽鎖可変ドメインｃＤＮＡならびにＩｇＧＨ可変ドメインｃＤＮＡを、イヌ末梢血リンパ球（ＰＢＬ）から単離したｍＲＮＡから合成した。Ｖ−Ｄ−Ｊ組換え済みであり機能的分子をコードする、Ｂ細胞由来の可変ドメインｃＤＮＡを標的とした。
【０１５８】
［００１１２］  ５〜１０ｍｌのイヌ血液を、Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  ＣＰＴ（商標）クエン酸ナトリウム採血管に採取し、１，５００×ｇで２０分間遠心した。血漿層を吸引した後、単核細胞層を回収し、ＰＢＳで洗浄した。細胞ペレットを２ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、Ｍｉｃｒｏ−ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ（商品名）ｍＲＮＡ単離キット（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いて、製造業者によって指示された通りにポリアデニル化ｍＲＮＡを単離した。単離後、ｍＲＮＡは、エタノール中の沈殿物として−８０℃で保存した。
【０１５９】
［００１１３］  可変ドメインを５’ＲＡＣＥキット（ギブコライフテクノロジーズ（ＧＩＢＣＯ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、バージョン２．０）を用いてｍＲＮＡから合成した。簡単に述べると、λ、κまたはＩｇＧＨ定常領域のイヌ定常領域に相補的な遺伝子特異的アンチセンスプライマー（ＧＳＰ１）を用いて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴ  ＩＩ酵素（ギブコライフテクノロジーズ（ＧＩＢＣＯ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））によって、第１鎖ｃＤＮＡをポリ（Ａ）＋ＲＮＡから作製した。重鎖可変ドメインの単離用には、サブドメイン１をコードする４種の異なるイヌＩｇＧ定常鎖（２種は、米国特許第５，５９３，８６１号に開示されており（ＤＥ９４およびＤＢ３１）、他の２種（１ｅ５ｂおよび３ｋ９ｃ）は本出願人がクローニングした）中で一致しているＤＮＡ配列からＧＳＰ１プライマーを誘導した。軽鎖可変ドメインの単離用には、米国特許第５，５９３，８６１号に開示されているλおよびκ定常ドメインの定常領域の配列からＧＳＰ１プライマーを誘導した。用いたＧＳＰ１プライマーを以下の表に列挙する。
【０１６０】
【表６７】
2005514063.tif 000081
［００１１４］  第１鎖合成後、ＲＮＡをＲＮアーゼ混合物（ＲＮＡｓｅ  Ｍｉｘ）で分解し、ｃＤＮＡをＧｌａｓｓｍａｘ  Ｓｐｉｎ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｙ（商品名）システムで精製した。次いで、末端デオキシヌクレオチド・トランスフェラーゼを用いてｃＤＮＡにｄＣテールを付加した。ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）のＡｂｒｉｄｇｅｄ  Ａｎｃｈｏｒ  プライマーおよび適当なネステッドＧＳＰ２プライマーを用いてＰＣＲ増幅を実施した。ＧＳＰ２プライマーはＧＳＰ１プライマーに用いたものと同一の配列から重鎖および軽鎖用に誘導したが、５’ＲＡＣＥプロトコールに記載のように改変した。用いたＧＳＰ２プライマーを以下の表に列挙する。
【０１６１】
【表６８】
2005514063.tif 000082
［００１１５］  次いで、増幅したｃＤＮＡをｐＣＲ２．１  ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）キット（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））およびＴＯＰ
１０コンピテント細胞（インビトロゲン）を用い、製造業者のプロトコールにしたがってクローニングした。プラスミドＤＮＡは、５ｍｌのＬＢ（Ｌｕｒｉａ’ｓ  Ｂｒｏｔｈ）培地中３７℃で一晩培養して増殖させたシングルコロニーから単離し、次いで、Ｑｉａｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉ  単離キット（キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ））を用い、製造業者のプロトコールに従って単離した。バージニア大学の配列決定施設で、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭシーケンサー・モデル３７７バージョン３．３を用いてプラスミド挿入部分の自動配列決定を行った。
【０１６２】
［００１１６］  ＤＮＡ配列は日立ＤＮＡｓｉｓ（登録商標）プログラムを用いて解析した。可変ドメインを特徴とするオープンリーディングフレームを保持するクローンを、イヌ免疫グロブリンＤＮＡデータベースを作成するために選抜した。重鎖可変ドメイン・クローン候補を評価するために用いた最初の基準は、５’ＲＡＣＥに用いたプライマーが推定リーディングフレームの３’末端に存在すること、５’ＲＡＣＥに用いたプライマーの配列の５’に、４つのＩｇＧ重鎖定常ドメイン配列に対応する配列が存在すること、およびＤＮＡ配列のアミノ酸配列への翻訳後に、２２位および９６位に高度に保存されたシステインが存在することとした。λ鎖可変ドメイン・クローン候補を評価するために用いた基準は、５’ＲＡＣＥに用いたプライマーが、推定リーディングフレームの３’末端に存在すること、５’ＲＡＣＥに用いたプライマーの配列の５’に、κ鎖定常ドメインに対応する配列が存在すること、およびＤＮＡ配列のアミノ酸配列への翻訳後に、λ鎖の２２位および９０位に高度に保存されたシステインが存在することとした。κ鎖可変ドメイン・クローン候補を評価するために用いた基準は、５’ＲＡＣＥに用いたプライマーが、推定リーディングフレームの３’末端に存在すること、５’ＲＡＣＥに用いたプライマーの配列の５’に、κ鎖定常ドメインに対応する配列が存在すること、ＤＮＡ配列のアミノ酸配列への翻訳後に、κ鎖の２３位および９３位に高度に保存されたシステインが存在することとした。
【０１６３】
［００１１７］  １５Ａ２に対し最も相同性の高い配列を、イヌ化の鋳型として選択した。まず、可変ドメインを、結合している定常ドメインの種類に基づいて選別した：ＩｇＧ重鎖、λ鎖またはκ鎖。次いで、日立ＤＮＡｓｉｓタンパク質アラインメント・プログラムを用いて、可変ドメイン配列を、相同性に基づいて、および必要に応じて１５Ａ２重鎖可変ドメインまたは１５Ａ２軽鎖可変ドメインの配列と比較して、別個の属に分類した。マウス１５Ａ２とクローニングしたイヌ可変ドメイン配列との間の相同領域の順位付けは以下の通りである：第１に適当な可変ドメインファミリー（λとλ、重鎖可変ドメインと重鎖可変ドメイン）、次いでフレームワーク領域１、２および３の相同性、次いで、必要に応じて、クローニングしたイヌ可変ドメインのＣＤＲ３の、１５Ａ２の重鎖または軽鎖のＣＤＲ３中のアミノ酸配列との相同性。
【０１６４】
（実施例２）可変ドメインの適当な定常ドメインへの移植
［００１１８］  テール付加ＰＣＲ反応を用いて、ＣＤＲ移植に適していると考えられる可変ドメインを、適当な定常ドメイン（λまたはＩｇＧＨ）に融合し、一過性ＣＯＳ細胞発現系における発現について調べた。
【０１６５】
［００１１９］  イヌ可変ドメインの完全長クローンは、タンパク質の合成、分泌および折り畳みの際にタンパク質分解によって免疫グロブリンから切断される分泌リーダー配列を含む。重鎖可変ドメイン用には、５’末端にコンセンサスＫｏｚａｋ配列（Ｈ５８にはＲＫ２７８：５’−ＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＣＴＴＧＴＧＧＣＴＡＡＡＣＴおよびＨ７４にはＲＫ２７１：５’−ＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＧＧＧＴＣ）が付加された、ＭＤＷＴＷＲＶＦＦＬＡＬＬＡＬＡＴＧＶＨＳという分泌リーダー配列に相当するオリゴヌクレオチドを合成した。このオリゴをＲＫ２７６（配列ＡＣＣＧＡＧＧＧＣＧＣＣＧＴＧＧＴＧＧＡ）と対にし、ＤＮＡ鋳型としてｐ
ＣＲ２．１  ＴＯＰＯクローンを用いて重鎖可変ドメインをＰＣＲ増幅した。別のＰＣＲ反応では、ＩｇＧＨＤＥ９４定常ドメイン（米国特許第５，５９３，８６１号）を、ＲＫ２７５：５’−ＴＣＣＡＣＣＡＣＧＧＣＧＣＣＣＴＣＧＧＴおよびＲＫ１８６  ５’−ＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＣＣＣＴＴＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＡＴＧを用いて増幅した。これらの反応の産物は、アガロースゲル電気泳動を用いた大きさの確認と、続いてゲル精製することによって検証した。
【０１６６】
［００１２０］  ゲル精製後、約２ｎｇの各ＰＣＲ産物を、２μｍの５’プライマーＲＫ２７１および２μｍの３’プライマーＲＫ１８６と合わせ、混合し、ＰＣＲ増幅に供して、可変ドメインをコードするＤＮＡを、定常ドメインをコードするＤＮＡと融合した。ＲＫ２７５およびＲＫ２７６プライマーからは、可変ドメイン／ＣＨ１ドメイン接合部に相当するＤＮＡコーディング配列の重複部分が生じる。この重複部分によって、ＰＣＲ反応の際に可変ドメインをコードするＤＮＡの、定常ドメインをコードするＤＮＡとの融合が可能となる。増幅後、ＰＣＲ産物をゲル精製し、フェノールクロロホルム抽出し、ＥｔＯＨ沈殿させた。ＴＥに再懸濁した後、増幅した可変ドメインを、製造業者のプロトコールにしたがって、ｐｃＤＮＡ３．１  ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）キット（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いてクローニングし、ＴＯＰ  １０コンピテント細胞（インビトロゲン）に形質転換した。プラスミドＤＮＡは、５ｍｌのＬＢ培地中３７℃で一晩培養して増殖させたシングルコロニーから単離し、次いで、Ｑｉａｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉ  単離キット（キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ））を用い、製造業者のプロトコールにしたがって単離した。機能的な重鎖のクローンを以下に記載のようにスクリーニングした。
【０１６７】
［００１２１］  イヌ免疫グロブリンの完全長クローンは、タンパク質分解によって成熟タンパク質鎖から切断される分泌リーダー配列と、可変ドメインと、定常ドメインとを含む。λ可変ドメイン用に、５’末端にコンセンサスＫｏｚａｋ配列（第２群にはＬＧ０３６：５’−ＣＴＡＣＧＡＴＣＴＣＴＧＡＧＡＧＴＣＣ）が付加された、分泌リーダー配列に相当するオリゴヌクレオチドを合成した。このオリゴをＬＧ０１２：５’−ＧＡＧＣＴＣＣＴＣＡＧＡＧＧＡＧと対にして、ＰＣＲを用いて軽鎖可変ドメインを増幅した。別のＰＣＲ反応では、λ定常ドメインを、ＬＧ０３５：ＣＣＧＣＣＣＴＣＣＴＣＴＧＡＧＧＡＧおよびＬＧ０２７：５’−ＣＴＡＡＧＡＧＣＡＣＴＣＴＧＣＧＧＧを用いて増幅した。これらの反応の産物は、アガロースゲル電気泳動を用いた大きさの確認と、それに続くゲル精製によって検証した。
【０１６８】
［００１２２］  約２ｎｇの各ＰＣＲ産物を、２μｍのＬＧ０３６および２μｍのＬＧ０２７と合わせ、混合し、記載の通りＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物をゲル精製し、フェノール−クロロホルム抽出し、ＥｔＯＨ沈殿させた。ＴＥに再懸濁した後、増幅した完全長免疫グロブリン鎖を、ｐｃＤＮＡ３．１  ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）キット（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））およびＴＯＰ  １０コンピテント細胞（インビトロゲン）を用い、製造業者のプロトコールにしたがってクローニングした。次いで、プラスミドＤＮＡを、５ｍｌのＬＢ培地中３７℃で一晩培養して増殖させたシングルコロニーから、Ｑｉａｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉ  単離キット（キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ））を用い、製造業者のプロトコールにしたがって単離した。機能的軽鎖のクローンを以下に記載のようにスクリーニングした。
【０１６９】
（実施例３）機能的可変ドメインのスクリーニング
［００１２３］  機能的可変ドメインのＤＮＡクローンは、一過性ＣＯＳ細胞発現系においてＩｇＧＨ鎖の効率的な分泌に依存するスクリーニングを用いて同定した。ＣＯＳ細胞をＤＮＡなし（偽トランスフェクション）、Ｈｘのみ（１μｇのＨｘ発現ベクター）、ＨｘＬｘ（各１μｇのＨｘおよびＬｘ発現ベクター）またはＨｘ１Ｃ９Ｌ（１μｇのＨｘ
発現ベクターおよび１μｇの１Ｃ９κ軽鎖をコードする発現ベクター）でトランスフェクションした。４８時間および７２時間でＤＮＡおよび細胞培養上清を回収した。次いで、組織培養上清を、実施例４に記載したようにＥＬＩＳＡでＩｇＧについてアッセイした。
【０１７０】
［００１２４］  機能的軽鎖がない場合には、ＩｇＧＨ鎖は、トランスフェクション後Ｔ＝４８時間までにはＣＯＳ細胞から効率的に分泌されない（図１参照）。軽鎖クローン候補のスクリーニングは、１５Ａ２キメラ重鎖用の発現クローンとのコトランスフェクションによって達成した。逆に、重鎖クローン候補のスクリーニングは、１５Ａ２キメラ軽鎖用の発現クローンとのコトランスフェクションによって達成した。
【０１７１】
［００１２５］  完全長λ鎖のスクリーニングには、１０μｌのミニプレップ（ｍｉｎｉｐｒｅｐ）ＤＮＡと１μｇのｐｃＤＮＡ３．１：：ｃ１５Ａ２ＩｇＧＨとのコトランスフェクションを含めた。６ウェルＣＯＳＴＡＲ（コーニング社（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．））組織培養プレートで７５〜９５％コンフルエントにしたＣＯＳ細胞をトランスフェクションに用いた。ＤＮＡは２３０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ（ギブコ  ビーアールエル（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ））を用いて、最終体積２５０μｌに希釈した。１０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔ  ＡＭＩＮＥ（商標）２０００（ギブコ  ビーアールエル（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ））を２４０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉで希釈し、希釈したＤＮＡと混合し、室温で２０分間インキュベートしてＤＮＡをＬｉｐｏｆｅｃｔ  ＡＭＩＮＥ（商標）２０００と複合体化させた。インキュベーションの間、増殖培地を除去してから５００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉを加えることによって細胞を調製した。０．５ｍｌのＤＮＡ／ＬＰ２０００複合体を各ウェルに加え、５時間インキュベートした。さらに、各ウェルに１ｍｌの増殖培地を加え（ＤＭＥＭ＋２０％ウシ胎児血清、＋Ｌ‐ｇｌｕ）、その後、細胞培養上清をＴ＝４８時間で回収した。
【０１７２】
［００１２６］  細胞培養上清を１，０００×ｇで５分間遠心分離することによって細胞細片について清澄化し、アジ化ナトリウム最終濃度０．０２％に調節して細菌増殖を防いだ。細胞培養上清は、直ちにＩｇＧＨレベルおよびＩｇＥ結合活性についてアッセイするか、後でアッセイするために−２０℃で凍結した。対照組織培養ウェルは、ＤＮＡを入れず、ｐｃＤＮＡ３．１：：ｃ１５Ａ２ＩｇＧＨのみ、またはｐｃＤＮＡ３．１：：ｃ１５Ａ２ＩｇＨ／ｐｃＤＮＡ３．１ｃ１５Ａ２：：λを入れることによって調製した。ＩｇＧＨの産生を、以下に記載のようにアッセイした。
【０１７３】
［００１２７］  このアッセイで陽性のクローンを、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）のエンドトキシンフリー・キット（キアゲン・コーポレイション（Ｑｉａｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）、米国カリフォルニア州バレンシア所在）を用いる大規模なＤＮＡ単離のために大腸菌に再度形質転換し、ＤＮＡ配列決定のために発送した。
【０１７４】
［００１２８］  完全長の重鎖を発現するクローンのスクリーニングを、重鎖発現クローン候補の１０μｌのミニプレップＤＮＡを１μｇのｐｃＤＮＡ３．１：ｃ１５Ａ２λＤＮＡと同時トランスフェクションした以外は同一の方法で実施した。
【０１７５】
［００１２９］  正しいＤＮＡ配列のものである機能的可変ドメインをコードする単離物を、前記のように、１μｇの重鎖に対して１μｇの軽鎖という比を用いてＣＯＳ細胞にトランスフェクションした。細胞上清を回収し、ＩｇＧＨ分泌、ＩｇＥ結合、および可溶性ＩｇＥについて組換え高親和性ＩｇＥ受容体と競合する能力について評価した。
【０１７６】
（実施例４）ＥＬＩＳＡアッセイ
［００１３０］  ＩｇＧＨ発現についてアッセイするために、９６ウェルＩｍｍｕｌｏｎ（登録商標）４プレート（サーモ・ラボ・システムス（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂ  Ｓｙｓ
ｔｅｍｓ）、フィンランド国ヘルシンキ所在）でＥＬＩＳＡアッセイを実施した。本研究では一貫して４種の異なる種類のＥＬＩＳＡアッセイを実施した。ＩｇＧＨ濃度、ＩｇＥ結合、ＩｇＥミモトープ結合の測定、および可溶性ＩｇＥの中和アッセイである。
【０１７７】
［００１３１］  細胞培養上清中のＩｇＧＨ濃度を測定するために、９６ウェルプレートを、炭酸ナトリウム・バッファー（１００ｍＭ、ｐＨ１０）で２μｇ／ｍｌに希釈したウサギ抗イヌＦｃ（ジャクソン・イミノロジカルズ（Ｊａｃｋｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、米国ペンシルバニア州ウェストグローブ（Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ）所在）をプレートの各ウェルに１００μｌ用いて、コーティングした。プレートへの非特異的結合は、プレートを３％ウシ血清アルブミンでブロッキングすることによって防いだ。キメラ１５Ａ２標準物質は、バキュロウイルスによって発現されたタンパク質を、ＯｐｔｉＭＥＭ（商標）で１００、５０、２５、１２．５、６．２５および３．１３ｎｇ／ｍｌに希釈することによって調製した。細胞培養上清の段階希釈物をＯｐｔｉＭＥＭで調製し、各希釈物の１００μｌをプレートに加え、室温で１時間インキュベートした。インキュベート後、プレートをＴＢＳ  ０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で５回洗浄した。結合している抗体を検出するために、コンジュゲート希釈液（イデックス・ラボズ社（ＩＤＥＸＸ  Ｌａｂｓ
Ｉｎｃ．）、米国メイン州ウェストブルック所在）で１：５０００希釈した抗イヌＦｃセイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート（ジャクソン・イミノロジカルズ（Ｊａｃｋｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｓ））１００μｌを各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。ＴＢＳ  ０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で５回洗浄した後、結合しているウサギ抗イヌＨＲＰコンジュゲートの存在を、ＴＭＢ基質（イデックス・ラボズ社（ＩＤＥＸＸ  Ｌａｂｓ  Ｉｎｃ．））を添加して１０分間発色させてから停止溶液（１００μｌ／ウェル、イデックス・ラボズ社（ＩＤＥＸＸ  Ｌａｂｓ  Ｉｎｃ．））を添加することによって検出した。ＳＯＦＴｍａｘ（登録商標）Ｐｒｏソフトウェアを用いて６５０ｎｍで吸光度を読み取り、標準曲線をプロットし、データを解析した。ＩｇＧ発現活性の活性は、組換えｃ１５Ａ２の希釈標準物質、ならびにトランスフェクション対照物の活性と比較することによって評価した。
【０１７８】
［００１３２］  ＩｇＥ結合活性を測定するために、９６Ｉｍｍｕｎｏｌｏｎ（登録商標）４プレートを、炭酸ナトリウム・バッファー（１００ｍＭ、ｐＨ９．５）で２．５μｇ／ｍｌに希釈した組換えイヌＩｇＥをプレートの各ウェルに１００μｌ加えて、コーティングした。プレートへの非特異的結合は、プレートを３％ウシ血清アルブミンでブロッキングすることによって防いだ。標準物質の調製およびＩｇＧＨの検出は前記の通りである。
【０１７９】
［００１３３］  ＩｇＥミモトープ結合活性を測定するために、プレートを、炭酸ナトリウム・バッファー（１００ｍＭ、ｐＨ９．５）で希釈した２μｇ／ｍｌのペプチド／ＫＬＨコンジュゲートでコーティングした。このペプチドは、ＩｇＥに見られる１５Ａ２エピトープを模倣するペプチドである。プレートへの非特異的結合は、プレートを３％ウシ血清アルブミンでブロッキングすることによって防いだ。標準物質の調製およびＩｇＧＨの検出は前記のとおりである。
【０１８０】
［００１３４］  可溶性ＩｇＥの中和アッセイは、抗ＩｇＥ免疫グロブリン分子の、可溶性ＩｇＥへの結合能力、および可溶性ＩｇＥが高親和性ＩｇＥ受容体と相互作用するのを抑制する能力を調べるものである。１５Ａ２免疫グロブリンはＩｇＥのサブドメイン３と結合し、ＩｇＥが高親和性ＩｇＥ受容体と相互作用するのを抑制する。９６ウェルＩｍｍｕｌｏｎ（登録商標）４プレートを、炭酸ナトリウム・バッファーで１０μｇ／ｍｌに希釈した高親和性ＩｇＥ受容体をプレートの各ウェルに１００μｌ加えてコーティングする。プレートへの非特異的結合は、プレートを３％ウシ血清アルブミンでブロッキングすることによって防いだ。ＩｇＥはＯｐｔｉＭＥＭ培地で１００ｎｇ／ｍｌに希釈した。清
澄化した細胞培養上清の段階希釈液を調製し、希釈したＩｇＥ（最終濃度５０ｎｇ）と１：１混合した（最終体積２００μｌ）。室温で１時間インキュベートした後、この混合物を高親和性ＩｇＥ受容体プレートに加えた。１時間インキュベートした後、プレートをＴＢＳ  ０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０で５回洗浄した。結合している抗体を検出するために、コンジュゲート希釈液（イデックス・ラボズ社（ＩＤＥＸＸ  Ｌａｂｓ  Ｉｎｃ．））で２μｇ／ｍｌに希釈した、ＨＲＰとコンジュゲートしている抗ＩｇＥモノクローナル抗体１００μｌを、各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。ＴＢＳ  ０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で５回洗浄した後、結合している抗ＩｇＥ  ＨＲＰコンジュゲートの存在を、ＴＭＢ基質（イデックス・ラボズ社（ＩＤＥＸＸ  Ｌａｂｓ  Ｉｎｃ．））を添加して１０分間発色させてから停止溶液（１００μｌ／ウェル、イデックス・ラボズ社（ＩＤＥＸＸ  Ｌａｂｓ  Ｉｎｃ．））を添加することによって検出した。
【０１８１】
（実施例５）ＣＤＲ移植
［００１３５］  マウス１５Ａ２の相補性決定領域（ＣＤＲ）を、可変ドメインについてカバット（Ｋａｂａｔ）のナンバリング・システムを用いて、ならびにＣＤＲが同定されている他のマウス可変ドメインに対する相同性アラインメントを用いて同定した。
【０１８２】
［００１３６］  ＣＤＲ移植は、ＰＣＲ反応を用いて達成した。ＰＣＲ増幅のプロトコールを、イヌ可変ドメインのコード配列を改変するために、注目する突然変異を含む「テール付加した」オリゴを用いた以外は記載された通りに実施した。ＣＤＲ移植に適した重鎖を同定した後、図５に示される合成オリゴヌクレオチドを合成して使用した。単離されたイヌ可変ドメインはＰＣＲ反応の鋳型として用いる。マウス１５Ａ２と移植のレシピエントとして選択したイヌ可変ドメインとの比較が図２および３である。１５Ａ２  ＣＤＲをＨ７４重鎖および第２群の軽鎖に移植するのに用いたオリゴヌクレオチドを以下の表に示す：
【０１８３】
【表６９】
2005514063.tif 000083
［００１３７］  これらのＰＣＲ反応の最終産物を、記載したようにｐｃＤＮＡ３．１
ＴＯＰＯ（登録商標）にクローニングした。個々のクローンを、前記のようにＩｇＧＨ鎖の機能的分泌についてスクリーニングし、陽性の単離物を、記載したようにそのＤＮＡを配列決定した。
【０１８４】
［００１３８］  機能的可変ドメインをコードし、正しいＤＮＡ配列のものである単離物を、前記のようにＣＯＳ細胞にトランスフェクションした。細胞上清を回収し、ＩｇＧＨ濃度、ＩｇＥ結合および可溶性ＩｇＥを中和する能力および高親和性ＩｇＥ受容体と相互作用するのを抑制する能力について評価した。完全にイヌ化された分子が明らかにＩｇＥに結合するという結果を以下に示す。表４は、前記のように実施したＥＬＩＳＡアッセイの６５０ｎｍのＯＤを示す。ＣＯＳ細胞上清は、示された構築物でトランスフェクションされた細胞由来のものである。表５は、１５Ａ２キメラ抗体に対して発現レベルを比較した場合の相対濃度レベルを示す。表６は、相対発現レベルに対するＩｇＥ結合のＯＤを示す。表７は、ＩｇＥ結合／発現の比を示す。
【０１８５】
【表７０】
2005514063.tif 000084
［００１３９］  ｉｎ  ｖｉｖｏでの適用における組換え分子による結合親和性およびＩｇＥ中和は、前に示したものよりも高いことが好ましい。したがって、本発明者らは、ＩｇＥに対する結合親和性を向上させるためにイヌ化免疫グロブリンのさらなる改変に取り組んだ。
【０１８６】
（実施例６）ホモロジー・モデリングおよび部位特異的突然変異誘発
［００１４０］  ホモロジー・モデリングを用いて、イヌフレームワーク領域から、１５Ａ２マウス配列へ復帰突然変異させ得るアミノ酸を同定した。ブルックヘブン（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ）タンパク質データ・バンク（ＰＤＢ）ファイルの操作、モデル構築、モデル改良および部位特異的突然変異誘発のための特定のアミノ酸の予測には、分子モデリング／画像プログラムＤＥＥＰ  ＶＩＥＷを用いた（http://www.expasy.ch/spdbv/mainpage.htm で入手可能）。ゲクス  エヌ（Ｇｕｅｘ，Ｎ．）およびピーチ  エム  シー（Ｐｅｉｔｓｃｈ，Ｍ．Ｃ．）（１９９７）「スイスモデルとスイスビューア：タンパク質モデル比較のための一環境（SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer:An environment for comparative protein modeling ）」、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  第１８巻、２７１４〜２７２３ページ。ＤＥＥＰ  ＶＩＥＷは以前はＳｗｉｓｓ−ＰｄｂＶｉｅｗｅｒと
して知られていた。
【０１８７】
［００１４１］  マウス１５Ａ２の重鎖および軽鎖の直線配列は、１ＮＧＱ、１ＦＢＩおよび２ＶＩＲと呼ばれる、ブルックヘブン（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ）タンパク質データ・バンクに結晶構造が存在する３つの異なる可変ドメインと高い相同性を有することが判明した。マウス１５Ａ２の重鎖および軽鎖は、ＤＥＥＰ  ＶＩＥＷを用いて、これら３つの個別の結晶構造に基づいてモデリングした。各モデルについて、ＣＤＲの周囲３オングストローム・シェルおよび６オングストローム・シェル内のアミノ酸を決定した。３つの構造を比較し、ＣＤＲの周囲のこれら２つの同心シェル内のアミノ酸を比較することによって、直接および間接的に接触してＣＤＲを支持する可能性がある重要なアミノ酸を同定した。３構造すべてにおいて３および６オングストローム・シェル内に見られたアミノ酸を、ＣＤＲコンホメーションに及ぼす影響が高いものとして評価した。
【０１８８】
［００１４２］  図５は、第２群−１の可変ドメインとマウス１５Ａ２の軽鎖可変ドメインとのアラインメント、およびＨ７４−１とマウス１５Ａ２の重鎖可変ドメインとのアラインメントを示す。ＣＤＲは大きな、太字の、下線を引いた活字で示されており、３オングストローム・シェルを構成するアミノ酸は太字で示されており、６オングストローム・シェルを構成するアミノ酸には下線が引いてある。これらドメインの間のアミノ酸の相違は、縦の短線で示されている。ＣＤＲの３オングストロームおよび６オングストローム・シェル内で異なっているアミノ酸を復帰突然変異のために指定した。復帰突然変異とは、イヌフレームワーク領域内のアミノ酸をマウスフレームワーク領域内に見られるアミノ酸へ「戻す」こととして定義する。これらのアミノ酸は、抗体のＣＤＲを支持すると考えられ、ＣＤＲを支持するアミノ酸のシェルをマウスの配列に変更することは、標的抗原に対する親和性を著しく改善する可能性がある。
【０１８９】
［００１４３］  軽鎖については、Ｔ５Ａ、Ｙ４１Ｖ、ＰＲＴＩ４９ＦＴＧＣ、Ｙ５４Ｇ、Ｓ６５Ａ、Ｓ７２Ｉ、Ｎ７４ＤおよびＨ９２Ｆを指定した。各復帰突然変異を有する第２群−１の個々の誘導体を前記のように構築し、前記のように一過性ＣＯＳ細胞発現系でキメラ重鎖と同時発現させた。例えば、Ｙ５１Ｇは、前記のようにＣＯＳ細胞に１５Ａ２キメラ重鎖（Ｈｘ）と同時トランスフェクションされている、さらなるＹ５１Ｇ突然変異を保持する第２群−１の軽鎖である。ＣＯＳ細胞を、示したＤＮＡによって一過性トランスフェクションする。Ｔ＝４８時間で、ＣＯＳ細胞上清を回収し、イヌ免疫グロブリン濃度およびＩｇＥ結合活性についてアッセイする。図６は、イヌＩｇＧ濃度（抗イヌ）またはＩｇＥ結合活性を測定したＥＬＩＳＡアッセイの６５０ｎｍのＯＤを示す。このアッセイでは、第２群−１の３つの復帰突然変異が、第２群−１のＩｇＥ結合活性を増強するとわかる。これらは、Ｙ４１Ｇ，Ｙ５４ＧおよびＨ９２Ｆである。
【０１９０】
［００１４４］  ３つの復帰突然変異が、イヌ化抗体のＩｇＥとの結合をそれぞれ増強することが判明した。これらはＹ４１Ｖ、Ｙ５４ＧおよびＨ９２Ｆであった（図６参照）。これら３つの復帰突然変異を合わせて１つの軽鎖、第２群−１とし、Ｔ１と名付けた。（例えば、Ｙ５４は、前記のようにＣＯＳ細胞に１５Ａ２キメラ重鎖（Ｈｘ）と同時トランスフェクションされた、さらなるＹ５４突然変異を保持する第２群−１の軽鎖である）。ＣＯＳ細胞を、図７に示したＤＮＡで一過性トランスクフェクションした。Ｔ＝４８時間で、ＣＯＳ細胞上清を回収し、イヌ免疫グロブリン濃度およびＩｇＥ結合活性についてアッセイした。図７は、イヌＩｇＧ濃度（抗イヌ）またはＩｇＥ結合活性を測定するＥｌｉｓａアッセイの６５０ｎｍのＯＤ値を示す。第２群−１の３つの復帰突然変異は、合わせて１つの軽鎖にすると、相乗作用的にＩｇＥ結合を増強することが見出された。増強されたＩｇＥ結合はキメラ１５Ａ２、ＨｘＬｘと同等である。１つの単離物が、ＩｇＥに対して特に増強された結合性を有するとわかった。この軽鎖単離物は、３つの復帰突然変異の他にＶ７Ａ突然変異を有すると判明し、Ｔ１ｃと名付けられた。Ｔ１ｃをキメラ重鎖と
同時発現させると、ＩｇＥ結合およびＩｇＥ受容体競合において第２群−１と比べて著しい増強が観察された（図７参照）。
【０１９１】
［００１４５］  重鎖について復帰突然変異されたアミノ酸は、Ｖ５Ｑ、Ｑ３８Ｍ、Ｄ４６Ｅ、Ｍ４８Ｉ、Ｒ６７Ｋ、Ｖ６８ＡおよびＳ８４Ｒであった。各復帰突然変異を有する個々のＨ７４−１誘導体を前記のように構築し、前記のように一過性ＣＯＳ細胞発現系を用いてキメラ軽鎖と同時発現させた。これら復帰突然変異のうちの１つが、ＩｇＥ結合を特に増強し、ＩｇＥ受容体競合アッセイにおいてＩｇＥを中和する効率を特に高めることが見出されたが、Ｓ８４Ｒである（イヌＩｇＧ濃度またはＩｇＥ結合アッセイを測定するＥｌｉｓａアッセイの６５０ｎｍのＯＤ値を示す、図８Ａおよび８Ｂを参照）。
【０１９２】
［００１４６］  Ｈ７４−１可変ドメインと１５Ａ２可変ドメインの高い同一性を考えて、復帰突然変異を、ＣＤＲの周囲３オングストロームおよび６オングストローム・シェルの外側の領域に広げることを決めた。これによってアミノ酸Ｋ１２Ｖ、Ｖ２０Ｉ、Ｇ４４Ｓ、Ａ７２Ｖ、Ｔ７４Ｋ、Ｔ７６Ｓ、Ｙ８０Ｈ、Ｒ８７ＡおよびＡ８８Ｓを含めた。１５Ａ２重鎖可変ドメインと異なる、Ｈ７４−１可変ドメイン中の隣接するアミノ酸も、対で突然変異させた。これには、ＡＡ８ＧＰ、ＡＰ４０ＳＨ、ＡＧ４３ＫＳ、ＲＶ６７ＫＡおよびＲＡ８７ＡＳを含めた。ＣＯＳ細胞一過性発現系で１５Ａ２キメラ軽鎖と同時発現させると、これらの構築物のうち５つの細胞上清でＩｇＥ結合の増強が見られた。これらはＡ４３Ｋ、Ａ７２Ｖ、Ｔ７４Ｋ、Ａ８８ＳおよびＡ９１Ｓであった（図８Ａおよび８Ｂを参照）。
【０１９３】
［００１４７］  ６つの復帰突然変異、Ａ４３Ｋ、Ａ７２Ｖ、Ｔ７４Ｋ、Ｓ８４Ｒ、Ａ８８ＳおよびＡ９１Ｓを混合し、整合させて、Ｈ７４−１誘導体の多数のシリーズを作製した。最大で３つの突然変異を合わせて１つのＨ７４−１誘導体とした。６種のＨ７４−１誘導体が、キメラ抗体と同程度またはより良好にＩｇＥと結合することがわかった（図９および段落［００７７］参照）。
【０１９４】
［００１４８］  これらの抗体を、競合アッセイにおいてＩｇＥを中和する能力について調べた。図９に示した構築物を、記載したように、血清を含まない培地で増殖しているＣＯＳ７Ｌ細胞にトランスフェクションした。各構築物について、３０の別個のトランスフェクションを実施した。Ｔ＝４８時間で、細胞培養上清を回収し（２ｍｌ／トランスフェクション）、各構築物につき３０トランスフェクションをプールし、この物質を遠心分離して細胞細片を除去し、０．２２ミクロン（μｍ）のフィルターを通して濾過した。イヌ免疫グロブリンは、細胞培養上清からプロテインＡクロマトグラフィーを用いて精製した。０．２５ｍｌの重力流出カラムを用い、細胞培養液をこのカラムに３回通した。カラム体積の１０倍容のＰＢＳで洗浄した後、ＩｇＧを、Ｐｉｅｒｃｅ  ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ（登録商標）ＩｇＧ溶出バッファーを用いて酸溶出させた。ｐＨを、Ｎａ２ＰＯ４を用いて直ちにｐＨ７．０に調節した。各構築物について、前記のようにＩｇＧ濃度を測定し、他の構築物の結合活性との比較のために７．５μｇ／ｍｌの濃度に希釈した。各構築物を段階希釈し、２μｇ／ｍｌのＨＲＰとコンジュゲートしているイヌＩｇＥに加えた（１反応あたり１００μｌ）。１時間インキュベートした後、物質を、イヌ高親和性ＩｇＥ受容体でコーティングしたＥｌｉｓａプレートに加えた。前記のように受容体競合アッセイを完了した。ＯＤが低いほど、高親和性受容体と結合するＩｇＥが少ない、したがって、組換え免疫グロブリンがうまく競合したことを示す。
【０１９５】
［００１４９］  このアッセイでは、６種の異なるイヌ化１５Ａ２誘導体が、可溶性ＩｇＥの高親和性受容体への結合の抑制に成功した。これらのイヌ化誘導体は、１５Ａ２モノクローナル抗体由来の元の可変ドメインと同程度か、またはより良好にＩｇＥと結合する（図９参照）。
【０１９６】
（実施例７）抗ＩｇＥキメラモノクローナル抗体の治療的投与
［００１５０］  本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｖｏでイヌＩｇＥを標的とする作用を得るために、キメラ抗ＩｇＥモノクローナル抗体を作製した。キメラ抗体ｃ１５Ａ２は、マウス抗ＩｇＥモノクローナル抗体（１５Ａ２）由来の定常ドメインと、イヌ抗ＩｇＥ可変ドメインと、からなるものであった。ｃ１５Ａ２は、ＩｇＥのサブドメイン３と結合し、肥満細胞および好塩基球上の高親和性ＩｇＥ受容体と結合するのを阻害するが、高親和性ＩｇＥ受容体と結合しているイヌＩｇＥとは結合しない。ｃ１５Ａ２キメラ抗体を、ＩｇＥと高親和性受容体との結合を阻害する能力について、マウス抗ＩｇＥモノクローナル抗体１５Ａ２と比較したところ、同様に効果的であるとわかった。
【０１９７】
［００１５１］  次に、イヌのアレルギーモデル系で、アレルギーに対する、抗体に基づいた治療の実現可能性を証明しようとした。生きている動物でＩｇＥ媒介性の過敏性を低減または排除し得るかどうかを調べようとした。モデルとしてブタクサで感作したイヌを用い、キメラ抗体を用いた治療後にこれらの動物においてブタクサ過敏性が排除されることを目標とした。
【０１９８】
［００１５２］  以下のプロトコールを用いた。約５日間隔で８回の連続投与とした。最初の注入の３日前に実験前の遊離ＩｇＥレベルを調べた。キメラ抗体の最初２回の注入はこのレベルの１０倍を与えた。その後の用量はすべて、実験前のＩｇＥ濃度の５倍を与えた。週１回の頻度でイヌから血清を採取し、アッセイを実施して遊離ＩｇＥおよび全ＩｇＥを調べた。また、週１回の頻度で、これらの動物における遊離キメラ抗体の量および免疫複合体としてキメラ抗体と結合しているＩｇＥのレベルも調べた。フローサイトメトリー解析を用いて、血中好塩基球上の高親和性ＩｇＥ受容体の発現レベルを調べた。
【０１９９】
［００１５３］  対照のイヌで６カ月かけて遊離および全血清ＩｇＥレベルを測定し、そのレベルは互いにかなり厳密に同等であって、一般に、１５〜２０μｇ／ｍｌの範囲にあるが、約１０μｇ／ｍｌほどの低さ〜約３５μ／ｍｌまで変動することがわかった。処置したイヌでは、遊離ＩｇＥレベルは、キメラ抗ＩｇＥ抗体の初回注入の約１．５日後には検出不能レベルにまで低下し、全血清ＩｇＥ（キメラ抗体と結合しているＩｇＥに相当する）は、３回のキメラ抗体注入後の、１５日目に検出不能レベルまで単調な低下を示した。本発明者らのアッセイにおける感度レベルは５ｎｇ／ｍｌのＩｇＥであると推定している。処置したイヌでは、キメラ抗ＩｇＥ抗体の最後の注入（３３日目）のかなり後であり、かつキメラ抗体が循環血中から除去されたと判断したかなり後である、１５０日まで、検出可能なレベルの遊離ＩｇＥまたは全ＩｇＥ抗体が観察されなかった。１５０〜１８０日の期間でさえ、ＩｇＥレベルは、未処置のイヌにおけるレベルよりもかなり低い１００〜２００ｎｇ／ｍｌの範囲にすぎなかった。
【０２００】
［００１５４］  皮内ブタクサ感受性皮膚試験を実施した。予備処置試験の後、３６、４０および１７４日目にさらなる試験を実施した。各試験では、１０００ＰＮＵ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｕｎｉｔ）から０．１ＰＮＵまで漸減させてブタクサアレルゲンを投与し、その作用を観察した。対照のイヌでは実験の過程にわたってブタクサに対する感受性の増大を示したのに対し、処置した３個体のイヌのうち２個体は、３６および４０日目には検出可能な感受性を示さず、感受性が低下した（処置前レベルと比べて）。処置したイヌの３個体目は、３回の処置後の各感受性試験でいくらかの感受性を示したが、処置前レベルよりは低いままであった。これらおよび他の試験によって、血清ＩｇＥと結合したキメラ抗体ｃ１５Ａ２は、
ｂ）ＩｇＥ受容体結合を抑制すること、
ｃ）肥満細胞の脱顆粒を抑制すること、
ｄ）好塩基球および肥満細胞でのＩｇＥ受容体の発現を減少させること、
ｅ）ＩｇＥ合成をダウンレギュレーションすること、および
ｆ）ブタクサで感作されたイヌにおいて皮膚試験反応性をなくすこと
が示された。
【０２０１】
［００１５６］  さらに、本発明者らは
ａ）ｃ１５ａ２抗ＩｇＥ抗体で処置されたイヌでは、約６カ月間、遊離ＩｇＥおよび全血清ＩｇＥレベルがなくなること、
ｂ）ブタクサに対する皮膚試験感受性がｃ１５Ａ２処置後になくなること、
ｃ）処置したイヌでは、最大６カ月間、新規ＩｇＥを合成する能力がなくなること、および
ｄ）循環血中の好塩基球でＩｇＥ受容体の発現がダウンレギュレーションされること
を観察した。
【０２０２】
（実施例８）イヌ化抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの使用
［００１５７］  イヌ化モノクローナル抗体１５Ａ２は、種々の方式でイヌに投与可能でありＩｇＥレベルの低下を引き起こすことが可能である。
【０２０３】
（血清中の血中ＩｇＥおよびＩｇＥ複合体を検出するためのＥｌｉｓａアッセイ）
［００１５８］  「遊離」ＩｇＥ  −遊離ＩｇＥとは、高親和性ＩｇＥ受容体と結合可能な血清中のＩｇＥと定義する。このアッセイは、マウスｍＡｂ１５Ａ２を固相上で用いる。イヌ血清の段階希釈物を、コンジュゲート・ディリージェント（ｄｉｌｉｇｅｎｔ）ＩＤＥＸＸ６６８０で調製し、１５Ａ２プレートで１時間インキュベートする。プレートを洗浄した後、αイヌＨＲＰコンジュゲートを用いてＩｇＥを検出する。
【０２０４】
［００１５９］  ＩｇＥ複合体／全ＩｇＥ  −ＩｇＥ複合体とは、高親和性受容体と結合不可能な血清中のＩｇＥと定義する。これらのＩｇＥ分子は試験物質または何らかの他の分子と結合している可能性がある。このアッセイでは、１４Ｋ２を固相上で用いる。イヌ血清の段階希釈物を、コンジュゲート・ディリージェント（ｄｉｌｉｇｅｎｔ）ＩＤＥＸＸ６６８０で調製し、１４ｋ２プレートで１時間インキュベートする。プレートを洗浄した後、αイヌＨＲＰコンジュゲートを用いてＩｇＥを検出する。
【０２０５】
（用量計算）
［００１６０］  試験物質の用量計算には、ＩｇＥ濃度と、体重に基づくイヌの推定血液体積とを取り入れる。次式：
μｇ／ｍｌ  ＩｇＥ（遊離）×Ｋｇ×０．０６＝血清中の遊離ＩｇＥ（ｍｇｓ）
（式中、
μｇ／ｍｌ  ＩｇＥ（遊離）は前記のＥｌｉｓａによって求め、
Ｋｇ＝イヌの体重（キログラム）であり、
０．０６＝イヌの血液体積を推定するための定数である）
を用いる。
【０２０６】
［００１６１］  以下に開示した研究には、１０倍の遊離ＩｇＥ濃度のイヌ化１５Ａ２モノクローナル抗体を、体積３０ｍｌとして３０分かけて静脈注入した。投与の前に、該イヌ化抗体を５％グリセロールを含むＰＢＳ（ビヒクル）で希釈した。プラセボ群のイヌにはビヒクルのみを、体積３０ｍｌとして３０分かけて静脈注入した。イヌ化モノクローナル抗体（変異体Ｈ７４−５８／Ｔｉｃ）は、ＮＳＯ発現系を用いて哺乳類細胞培養物で産生させた。抗体は、プロテインＡアフィニティーカラムを用いて組織培養上清からアフィニティー精製し、次いで、ｍｏｎｏ−Ｑカラムを通して夾雑物を吸着させた。イヌには全部で９回用量の試験物質を毎週与えたが、投与番号２については４日ごとに投与した。
【０２０７】
（用量の計算）
【０２０８】
【表７１】
2005514063.tif 000085
［００１６２］  プラセボ群のイヌでは、研究の過程の間に全ＩｇＥ濃度がいくらか変化している。試験物質を与えたイヌでは、血清ＩｇＥレベルが初期に増加し、４８時間後に急降下しはじめる。２５日目には、ＩｇＥは本発明者らのアッセイでは血清中で検出不能である。このアッセイの感度は血清中で約５ｎｇ／ｍｌである。
【０２０９】
【表７２】
2005514063.tif 000086
【０２１０】
【表７３】
2005514063.tif 000087
【０２１１】
【表７４】
2005514063.tif 000088
【０２１２】
【表７５】
2005514063.tif 000089
【０２１３】
【表７６】
2005514063.tif 000090
【０２１４】
【表７７】
2005514063.tif 000091
【０２１５】
【表７８】
2005514063.tif 000092
【０２１６】
【表７９】
2005514063.tif 000093
【０２１７】
【表８０】
2005514063.tif 000094
【０２１８】
【表８１】
2005514063.tif 000095
【０２１９】
【表８２】
2005514063.tif 000096
【０２２０】
【表８３】
2005514063.tif 000097
【０２２１】
【表８４】
2005514063.tif 000098
【０２２２】
【表８５】
2005514063.tif 000099
【０２２３】
【表８６】
2005514063.tif 000100
【０２２４】
【表８７】
2005514063.tif 000101
【０２２５】
【表８８】
2005514063.tif 000102
【０２２６】
【表８９】
2005514063.tif 000103
【０２２７】
【表９０】
2005514063.tif 000104
【０２２８】
【表９１】
2005514063.tif 000105
【０２２９】
【表９２】
2005514063.tif 000106
【０２３０】
【表９３】
2005514063.tif 000107
【０２３１】
【表９４】
2005514063.tif 000108
【０２３２】
【表９５】
2005514063.tif 000109
【０２３３】
【表９６】
2005514063.tif 000110
【０２３４】
【表９７】
2005514063.tif 000111
【０２３５】
【表９８】
2005514063.tif 000112
【０２３６】
【表９９】
2005514063.tif 000113
【０２３７】
【表１００】
2005514063.tif 000114
【０２３８】
【表１０１】
2005514063.tif 000115
【０２３９】
【表１０２】
2005514063.tif 000116
【０２４０】
【表１０３】
2005514063.tif 000117
【０２４１】
【表１０４】
2005514063.tif 000118
【０２４２】
【表１０５】
2005514063.tif 000119
【０２４３】
【表１０６】
2005514063.tif 000120
【０２４４】
【表１０７】
2005514063.tif 000121
本願明細書および特許請求の範囲の表において、「ａｎｄ」は「および」、「ｏｒ」は「または」を意味する。また、表中の「ｉｓ」は「（主語に続いて）は〜である」を意味する。従って、例えば「Ｘ１  ｉｓ  Ｄ  ｏｒ  Ｅ」は「Ｘ１はＤまたはＥである」を意味する。
【図面の簡単な説明】
【０２４５】
【図１】ＣＯＳ細胞からのＩｇＧＨの分泌を測定することによる機能的重鎖および軽鎖可変ドメインのスクリーニング結果を示す図。
【図２】イヌ化用に選択された軽鎖可変ドメインおよび同ドメインの１５Ａ２に対するアラインメントを示す図。アミノ酸の相違が縦線で示されている。
【図３】イヌ化用に選択されたＨ７４重鎖可変ドメインおよび同ドメインの１５Ａ２に対するアラインメントを示す図。相違が縦線で示されている。
【図４】１５Ａ２  ＣＤＲのイヌ可変ドメインへのＣＤＲ移植と、完全長の重鎖および軽鎖の構築とを示す図。
【図５】１５Ａ２：軽鎖および重鎖の分子モデリングの解説を示す図。
【図６】復帰突然変異を有するイヌ化軽鎖可変ドメインによるＩｇＥへの結合の増強を示す図。
【図７】個々の軽鎖復帰突然変異を合わせて単一の分子とした結果ＩｇＥへの結合が増強されたことを示す図。
【図８Ａ】復帰突然変異を有するイヌ化重鎖可変ドメインによるＩｇＥへの結合の増強を示す図。
【図８Ｂ】復帰突然変異を有するイヌ化重鎖可変ドメインによるＩｇＥへの結合の増強を示す図。
【図９】完全にイヌ化された免疫グロブリンによるＩｇＥの中和を示す図。
【図１】
2005514063.tif 000195
【図２】
2005514063.tif 000196
【図３】
2005514063.tif 000197
【図４】
2005514063.tif 000198
【図５】
2005514063.tif 000199
【図６】
2005514063.tif 000200
【図７】
2005514063.tif 000201
【図８Ａ】
2005514063.tif 000202
【図８Ｂ】
2005514063.tif 000203
【図９】
2005514063.tif 000204
【手続補正書】
【提出日】平成16年10月15日(2004.10.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項４】
以下の配列：
Ｆｒ１−ＣＤＲ１−Ｆｒ２−ＣＤＲ２−Ｆｒ３−ＣＤＲ３−Ｆｒ４
（配列中、
【化２】
2005514063.tif 000205
【表７】
2005514063.tif 000206
である）
からなるイヌ重鎖可変ドメインポリペプチド。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項７】
以下の配列：
Ｆｒ１−ＣＤＲ１−Ｆｒ２−ＣＤＲ２−Ｆｒ３−ＣＤＲ３−Ｆｒ４
（配列中、
【化４】
2005514063.tif 000207
【表９】
2005514063.tif 000208
である）
からなるイヌ重鎖可変ドメインポリペプチド。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項５２】
【化１１】
2005514063.tif 000209
であるイヌ軽鎖可変ドメインポリペプチド。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
【化１】
2005514063.tif 000210
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
【表１】
2005514063.tif 000211
であり、Ｘ７９が−である場合にはＸ８０は−である（「−」はその各位置に残基が存在しないことを意味する）ことを条件とする）からなる化合物である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
【表４】
2005514063.tif 000212
であり、かつＦｒ４は
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
【表７】
2005514063.tif 000213
である）。
５．Ｈ７４重鎖可変ドメイン亜属
［００２６］  本発明のイヌ重鎖可変ドメインは、以下の配列からなる化合物であることが好ましい：
Ｆｒ１−ＣＤＲ１−Ｆｒ２−ＣＤＲ２−Ｆｒ３−ＣＤＲ３−Ｆｒ４
（配列中、
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
【化４】
2005514063.tif 000214
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005514063000001.app
【国際調査報告】
2005514063.tif 000215
2005514063.tif 000216