(57)【要約】本発明は合成を行うテンプレートと結合したテンプレートされた分子の合成方法に関する。該方法はテンプレート、スカフォード機能的エンティティーおよびビルディングブロックに結合し、順次、テンプレートに結合する機能性エンティティーを用いる。スカフォード機能性エンティティーおよびビルディングブロックの機能性エンティティーは共に相補二量化ドメインを備えており、その相補二量化ドメインが相互に作用すると、その機能性エンティティーが密接に接近することが可能となる。該方法は生物学的活性について選択することのできるテンプレートされた分子のライブラリを生成するのに用いることができる。
2005521365.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）１以上のコドンを含む少なくとも一つのテンプレートを提供する工程、
ｂ）分子対の第二の部分と可逆的に相互作用できる分子対の第一の部分を含むジッピングドメインに結合した第一の機能的エンティティーを提供する工程、
ｃ）それぞれ、アンチコドン、さらなる機能的エンティティーおよびアンチコドンと機能的エンティティーを結合させるリンカーを含む１以上のビルディングブロックを提供する工程（ここにおいて、アンチコドンはテンプレートのコドンを補足し、機能的エンティティーは前記分子対の第二の部分を含むジッピングドメインと結合し、第一の機能的エンティティーと化学的に結合できる）、
ｄ）工程ａ）、ｂ）、およびｃ）の成分を、アンチコドンのテンプレートのコドンとの特異的ハイブリダイゼーションおよび分子対の２つの部分の二量化を許容する条件下で互いに接触させる工程、
ｅ）ビルディングブロックが第一の機能的エンティティーとの化学結合を形成するのを許容する工程、
ｆ）任意に、１以上のリンカーを開裂させる工程（ただし、少なくとも１つのリンカーは機能的エンティティーをテンプレートと結合させたままであるとする）、
ｇ）合成を行うテンプレートに結合したテンプレートされた分子を得る工程
を含むテンプレートされた分子を合成する方法。
【請求項２】
工程ｄ）からｆ）が１回以上繰り返される請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程ｄ）による接触工程においてジッピングドメインと結合した第一の機能的エンティティーとして工程ｇ）による合成を行ったテンプレートに結合したテンプレートされた分子を用いて繰り返しが行われる請求項２記載の方法。
【請求項４】
第一の機能的エンティティーがテンプレートに共有結合している請求項１ないし３記載の方法。
【請求項５】
第一の機能的エンティティーがハイブリダイゼーションによりテンプレートに結合している請求項１ないし３記載の方法。
【請求項６】
第一の機能的エンティティーがビルディングブロックの一部である請求項１、２、３、または５記載の方法。
【請求項７】
第一の機能的エンティティーを有するビルディングブロックのジッパードメイン極性が、さらなる機能的エンティティーを有するビルディングブロックのジッパードメイン極性と比べて反対である請求項６記載の方法。
【請求項８】
第一の機能的エンティティーのジッピングドメインがテンプレート中に存在する前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
分子対が核酸または核酸類似体の２つの相補配列を含む前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
第一の機能的エンティティーが、テンプレートにより保有される核酸の配列を補足する核酸の配列に結合している請求項１ないし９記載の方法。
【請求項１１】
ジッピングドメインがビルディングブロックのリンカーの一部である前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
ジッピングドメインが機能的エンティティーの近位にある請求項８または１１記載の方法。
【請求項１３】
ジッピングドメインが機能的エンティティーから２以下の核酸モノマーだけ離れている請求項１１または１２記載の方法。
【請求項１４】
ジッピングドメインおよび第一の機能的エンティティーが２以下の核酸モノマーだけ離れている請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
ビルディングブロックのさらに別の機能的エンティティーのジッピングドメインと第一の機能的エンティティーが同じ数の核酸モノマーだけそれぞれの機能的エンティティーから離れている前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
ジッピングドメイン配列が３ないし２０の核酸モノマーを含む前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
ジッピングドメイン配列が４ないし１６の核酸モノマーを含む請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
ジッピングドメイン配列が５ないし１０の核酸モノマーを含む請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
アンチコドンとジッピングドメイン間のリンカーが単結合である前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
コドン：アンチコドンハイブリッドのアニーリング温度がジッピングドメインハイブリッドのアニーリング温度より高い前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
アニーリング温度間の差が１０℃またはそれ以上である請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
アニーリング温度間の差が２５℃またはそれ以上である請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
アンチコドンのテンプレートのコドンに対する特異的ハイブリダイゼーションを許容する条件が、分子対の２対の最適な二量化を許容する条件と異なる前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
アンチコドンのコドンに対する特異的ハイブリダイゼーション中の条件が、分子対の２対の二量化中に用いられるコドンおよび／またはアンチコドンの濃度よりも高い、コドンおよび／またはアンチコドンの濃度を包含する請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
コドンとアンチコドンのハイブリダイゼーション中の濃度が、ジッピングドメインの２対の二量化に用いられる濃度と比較して少なくとも１０倍高い請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
工程ｄ）に従った接触を、ジッピングドメインのアニーリング温度以下および以上の温度を交互にすることにより行う前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
交互変化を複数回行う請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
最高温度がコドン：アンチコドンハイブリッドのアニーリング温度より低い請求項２６または２７記載の方法。
【請求項２９】
請求項１ないし２８のいずれかにしたがって得ることができるテンプレートされた分子。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、テンプレートされた分子を合成するための方法に関する。該方法は、結合の形成に関与することを意図される反応性基の高い局所濃度を含み、かくして結合形成の可能性を増大させる。本発明はさらに、複数のテンプレートされた分子であるライブラリーにも関し、ここにおいて、テンプレートされた分子のそれぞれはその合成を行うテンプレートに結合している。
【０００２】
（背景技術）
新規特性を有する分子の生成は困難な課題である。最近、さらに効率の良い生成およびさらに多数の分子のスクリーニングを可能にする多くの方法が提案されている。行われる方法は、ペプチド、ＲＮＡおよびＤＮＡなどの天然のバイオポリマー以外の分子のエンコーディングおよび／またはテンプレーティングを含む。これらの方法は、研究者らが短時間に膨大な数の分子を生成し、スクリーンすることを可能にする。この結果、所望の特性を有するさらに良好な分子が得られる。
【０００３】
生物学の主な定説は、ＤＮＡからＲＮＡ、タンパク質への情報の一方的な流れを説明している。最近、ファージ提示、ペプチド−オン−プラスミド、リボソーム提示およびｍＲＮＡ−タンパク質融合などの方法が開発され、タンパク質／ペプチドのレベルからＲＮＡまたはＤＮＡへの情報の伝達が可能になっている。これは、濃縮プロセスにさらされる膨大なペプチドに適用される分子進化の使用を可能にし、その後、ペプチドからＤＮＡへの情報の流れを活用し、ＤＮＡを増幅することにより、分子の濃縮されたプール（特定の特性、例えばレセプタータンパク質との結合について濃縮）が増幅される。
【０００４】
ごく最近、ペプチドおよび他の生化学的ポリマーのエンコーディングを可能にする方法が開発された。この方法の一例は、米国特許第５７２３５９８号に開示され、これは、結合反応複合体を形成するために標的とのあらかじめ選択された結合相互作用に関与する生化学的ポリマーを識別することに関する。従来法は、二機能性分子のライブラリーの生成を包含する。二機能性分子の一部分は生化学的ポリマーであり、他の部分は生化学的ポリマーをエンコードし、識別するヌクレオチドの配列を含む識別オリゴヌクレオチドである。二機能性分子のライブラリーの生成後、標的に対する親和力に関する分割を行い、二機能性分子の識別オリゴヌクレオチド部分をＰＣＲにより増幅する。最後に、ＰＣＲアンプリコンを配列させ、生化学的分子の識別に関してデコードする。しかしながら、この方法はライブラリーメンバーのワンポット増幅を許容しない。さらに、ヌクレオチドの配列は、面倒な配列化プロセス後にのみ生化学分子を識別する働きをする。かくして、識別配列から生化学的ポリマーへの情報の流れが制限される。
【０００５】
ＨａｌｐｉｎおよびＨａｒｂｕｒｙはＷＯ００／２３４５８において前記方法の改良法を提案し、ここにおいて、形成される分子は識別されるだけでなく、核酸標識により支配される。該方法は、２以上の合成工程を含むコンビナトリアルライブラリを合成するための伝統的なスプリット・アンド・コンバイン法に基づく。複数の核酸テンプレートが使用され、それぞれは一端に化学反応性部位を有し、該ストランド全体にわたって複数のコドン領域が分散し、前記コドン領域のそれぞれは異なるコドンを特定する。別に、第一コドン領域により識別されるストランドのそれぞれは、化学反応部位で特異的に選択された試薬と反応する。続いて、ストランドを全てプールし、第二のコドン領域に基づいた第二の分割に付す。スプリット・アンド・コンバイン法は、典型的には１０３から１０６の間の異なる化合物のライブラリーを製造するために適当な回数行われる。スプリット・アンド・コンバイン法は煩雑で、比較的小さなライブラリーしか生成しない。
【０００６】
Ｇａｒｔｎｅｒ  ＺＪおよびＬｉｕ  ＤＲ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００１，１２３，６９６１−６９６３）は、化学反応を配列特異的に行うためにＤＮＡが用いられる方法を開示している。ＤＮＡテンプレート合成により提供される近接効果は、化学反応を促進させるために使用できることが示されている。１以上の化学物質がエンコードされた分子の形成に関与する場合、１以上のコドンによりテンプレートの反応性部位からビルディングブロックが間隔をあけられていることが必要である。典型的には、ビルディングブロックとテンプレートの反応性部位間の距離は、数ヌクレオチド、例えば３０ヌクレオチドに達し、これはテンプレート反応性部位からの最大距離での反応は、該反応性部位の隣のコドンにアニールされたビルディングブロックにより保有される化学物質ほど促進されないことを意味する。
本発明は、反応の可能性を促進するために反応物質の局所濃度を増大させるための溶液を提案することを目的とする。
【０００７】
（発明の開示）
本発明はテンプレートされた分子を合成する方法を提供し、前記方法は：
ａ）１以上のコドンを含む少なくとも一つのテンプレートを提供する工程、
ｂ）分子対の第二の部分と可逆的に相互作用できる分子対の第一の部分を含むジッピングドメインに結合した第一の機能的エンティティーを提供する工程、
ｃ）それぞれ、アンチコドン、さらなる機能的エンティティーおよびアンチコドンと機能的エンティティーを結合させるリンカーを含む１以上のビルディングブロックを提供する工程（ここにおいて、アンチコドンはテンプレートのコドンを補足し、機能的エンティティーは前記分子対の第二の部分を含むジッピングドメインと結合し、第一の機能的エンティティーと化学的に結合できる）、
ｄ）工程ａ）、ｂ）、およびｃ）の成分を、アンチコドンのテンプレートのコドンとの特異的ハイブリダイゼーションおよび分子対の２つの部分の二量化を許容する条件下で互いに接触させる工程、
ｅ）ビルディングブロックが第一の機能的エンティティーとの化学的結合を形成するのを許容する工程、
ｆ）任意に、１以上のリンカーを開裂させる工程（ただし、少なくとも１つのリンカーはテンプレートと機能的エンティティーを結合させたままであるとする）、
ｇ）合成を行うテンプレートに結合したテンプレートされた分子を得る工程
を含む。
【０００８】
テンプレートは、好ましい具体例においては２以上のコドン、例えば３ないし１４のコドンを含む。本発明の一態様においてスカフォード（ｓｃａｆｆｏｌｄ）であり得る第一の機能的エンティティーは、次いで２以上の機能的エンティティーと結合させることができる。該方法は、スカフォード機能的エンティティーを所望の量の機能的エンティティーと結合させるために一回だけ行うことができるか、またはｄ）からｇ）の工程を１回以上繰り返して、機能的エンティティーまたは初期テンプレート分子と結合させられる機能的エンティティーを有するビルディングブロックを添加することができる。
多段合成を行う場合、工程ｄ）からｇ）の繰り返しは、工程ｄ）に従った接触工程においてジッピングドメインと結合した第一の機能的エンティティーとして工程ｇ）に従った合成を行うテンプレートに結合したテンプレートされた分子を用いて行われる。
【０００９】
ジッパードメインは、順序づけられた方法において可逆的に二量化できる２つの相互作用する部分として特徴づけることができ、これによりこれに結合した反応性基を架橋して近接させる。同じ二量化ドメインを有する異なる機能的エンティティーが反応性部位に結合した相補ジッパードメインと異なる回数相互作用することを許容するために、好ましい態様においては可逆性が必要とされる。多くの種類の分子部分をジッパードメインとして用いることができ、ジッパードメインの適当な対の非網羅的リストは次の通りである：ｉ）ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ、ＬＮＡ／ＤＮＡ、ＰＮＡ／ＲＮＡ、ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体の様々な組み合わせ；ｉｉ）ペプチド／ペプチド、例えば塩基および酸ロイシンジッパー（２つのアルファへリックスの渦巻き状にになったコイル構造）、抗体／抗原；ｉｉｉ）核酸−ペプチド、例えばＺｉｎｋ−フィンガーＤＮＡ結合ドメイン／ｄｓＤＮＡ；ｉｖ）ペプチド／小有機分子、例えばストレプトアビジン／ビオチン；ｖ）小有機分子／小有機分子、例えばニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）／ニトロトリ酢酸（ＮＴＡ）−Ｚｎ＋＋；ｖｉ）正に荷電した部分／負に荷電した部分、例えばポリグルタミン酸／ポリリシン。ジッパーボックスは、向上されると考えられる反応の条件に従って選択することができる。例えば、反応が中程度の温度および適度に高い塩濃度で行われるならば、ＤＮＡ／ＤＮＡジッパーボックスを用いることができる。ジッパーボックス（相補ＤＮＡストランド）の長さを変えることにより、所望の安定性および力学のジッパーボックスを設計することができる。他の種類のジッパーボックスは、ｐＨに非常に依存するであろう。例えば、グルタメート／リシン対の相互作用強度および力学はｐＨに依存し、例えばポリグルタメートは高ｐＨで高度に負に荷電し、低ｐＨでは全く荷電しない。
【００１０】
機能的エンティティーは本発明の一態様において１以上の共有結合によりテンプレートに結合する。しかしながら、第一の機能的エンティティーが、ハイブリダイゼーションによりスカフォードのテンプレートへの結合を可能にするためにテンプレートにより保有される核酸を補足する核酸の配列に結合するのが適当である。このようにして、テンプレートによりいくつかの異なるスカフォードをエンコードすることが可能である。本発明の好ましい具体例において、第一の機能的エンティティーはスカフォード、すなわち、通常１以上のビルディングブロックから発せられる官能基の添加により修正される化学的部分である。スカフォードは一つの反応性基または２以上の反応性基を含む化学構造である。通常、スカフォードはテンプレートされた分子の合成中ずっとテンプレートに結合したままである。
【００１１】
通常、ジッピングドメインが核酸を含む場合、第一の機能的エンティティーを有するビルディングブロックの極性は、さらに別の機能的エンティティーを有するビルディングブロックの極性と比較すると逆である。すなわち、第一の機能的エンティティーがオリゴヌクレオチドの５’末端と結合しているならば、さらに別の機能的エンティティーは、好ましくはビルディングブロックオリゴヌクレオチドの３’末端と結合しているか、または逆も同様である。ある態様において、１以上のビルディングブロックがテンプレートされた分子の形成において含まれるならば、スカフォードビルディングブロックがテンプレートのフランキング位置にアニールされること、すなわちビルディングブロックのコドン間に位置しないのが好ましい。
【００１２】
ジッピングドメインを機能的エンティティーの接近を促進する任意の方法で第一の機能的エンティティーに対して配置することができる。一態様において、ジッピングドメインはテンプレート中に存在する。一配置において、ジッピングドメインは、スカフォードオリゴをコードするコドンとビルディングブロックをコードするコドンの間に位置する。本発明のもう一つ別の態様において、ジッピングドメインはビルディングブロックのリンカーの一部である。好ましくは、ジッピングドメインは機能的エンティティーに近接する。さらに好ましくは、ジッピングドメインは該機能的エンティティーから核酸モノマー２個以下離れている。最も好ましい具体例において、ビルディングブロックの機能的エンティティーのジッピングドメインと第一の機能的エンティティーは、それぞれの物質から同じ数の核酸モノマー離れていて、機能的エンティティーの高い局所濃度を提供する。ビルディングブロックの機能的エンティティーのジッピングドメインおよび第一の機能的エンティティーのそれぞれの機能的エンティティーへの距離は、好ましくは０ヌクレオチドモノマーである。言い換えれば、結合を形成することを意図される２つの機能的エンティティーは、ジッピングドメインの末端ヌクレオチドに結合している。
【００１３】
ジッピングドメインの核酸モノマーの所望の数は、合成中に一般に用いられる温度およびストリンジェンシー条件に主に依存する。低ストリンジェンシーおよび／または比較的低い温度が好ましいならば、核酸モノマーの数は３まで低くてもよい。しかしながら、ジッパードメインの配列中の少数の核酸モノマーは、例えばテンプレートまたはビルディングブロックに対するハイブリダイゼーションの危険性を増大させ得る。従って、一般に少なくとも４の核酸モノマーを使用するのが好ましい。本発明の好ましい具体例によると、ジッピングドメイン配列は３ないし２０の核酸モノマーを含む。さらに好ましい具体例において、ジッピングドメイン配列は４ないし１６の核酸モノマーを含む。最も好ましいのは、５ないし１０の核酸モノマーを含むジッピングドメイン配列である。
【００１４】
アンチコドンとジッピングドメイン間の結合は、単結合であってもよいし、数百Åまで、例えば１から３００Åの間の化学結合であってもよい。結合は、任意の適当な化学的性質を有するものであってもよいが、結合はオリゴヌクレオチドであるのが一般に好ましい。好ましい具体例において、結合は単結合である、すなわち、アンチコドンはジッピングドメインに隣接する。
【００１５】
本発明の好ましい態様において、コドン：アンチコドンハイブリッドのアニーリング温度は、ジッピングドメインの相互作用がなくなっても、ビルディングブロックがテンプレートと結合したままであることを確実にするために、ジッピングドメインハイブリッドのアニーリング温度よりも高い。前記態様は、温度をジッピングドメインのアニーリング温度以下および以上に交互にすることにより工程ｄ）による接触が行われる場合が特に好ましい。交互変化の効果は、交替が複数回行われる場合に増大する。ビルディングブロックがテンプレートから放出されるのを避けるために、最高温度はコドン：アンチコドンハイブリッドのアニーリング温度より低いのが好ましい。
【００１６】
本発明の好ましい態様によると、テンプレートが２以上のコドンを含む場合、これらのコドンに結合したビルディングブロックは本質的に同一のジッピングドメインの配列を有する。温度の交互変化は、ビルディングブロックによりアニールされる異なる機能的エンティティーをスカフォードに引き寄せるであろう。したがって、様々な機能的エンティティーをスカフォードと近接させることが可能である。
コドン：アンチコドンハイブリッドのアニーリング温度と二量化ジッピングドメイン間の差は、適当には１０℃以上である。さらに好ましくは、アニーリング温度間の差は２５℃またはそれ以上である。
【００１７】
本発明の一態様において、コドンのアンチコドンとのハイブリダイゼーションおよびジッパードメイン二量化は別の工程において起こる。すなわち、アンチコドンのテンプレートのコドンに対する特異的ハイブリダイゼーションを許容する条件は、分子対の２対の最適二量化を許容する条件と異なる。工程の分離により、各工程の最適条件が提供される。第二の工程、二量化工程において、コドンおよびアンチコドンが結合したままであることを確実にする条件および機能的エンティティー間の反応に有利な条件を使用するのが好ましい。
アンチコドンのコドンに対する特異的ハイブリダイゼーション中の条件は、適当には、コドンおよび／またはアンチコドンの濃度を包含し、これは分子対の２対の二量化中に使用されるコドンおよび／またはアンチコドンの濃度よりも高い。濃度における差は、コドン：アンチコドンハイブリッドが機能的エンティティーの反応前に形成される可能性を高め、これにより遺伝子情報の伝達を確実にする。好適には、コドンおよびアンチコドンのハイブリダイゼーション中の濃度は、ジッピングドメインの２対の二量化に用いられる濃度と比較して少なくとも１０倍高い。媒体中で一般に反応性基の濃度に対してエンコードされた反応性基の局所濃度が増大するので、ジッピングドメイン二量化中の希釈条件も、媒体中に現れるランダムな反応性基間で架橋反応よりもテンプレート指向性反応に有利である。
【００１８】
本発明の一態様において、該方法は、分子の合成を行うテンプレートに結合したテンプレートされた分子（あるいは相補テンプレート）のライブラリーを生成するために使用される。一例として、１以上の可能なコドン：アンチコドン相互作用を有することにより、ライブラリーを生成させることができる。これは、異なる機能的エンティティーであるが、類似したアンチコドンを有するいくつかのビルディングブロックを有することにより行うことができるが、しかしながら、スカフォードに結合した機能的エンティティーとテンプレートのコドンの同一性間の１対１の関係を得るために、各ビルディングブロックは機能的エンティティーを識別する特異的アンチコドンを有するのが通常好ましい。
ライブラリーは好ましくは異なる独自のコドンおよび／または独自のコドンの種類を有する複数のテンプレートを含む。テンプレートの独自のコドンに対応するアンチコドンを有する複数のビルディングブロックが通常提供される。本発明の一態様において、独自のコドンのそれぞれについて特定のビルディングブロックが提供される。もう一つの態様において、コドンのいくつかはビルディングブロックにより合致しないか、あるいは機能的エンティティーなしのオリゴヌクレオチド配列によりブロックされる。
【００１９】
以下に、特定の非制限的例についての原則を説明する。この例におけるアンチコドンはおよそ２０ヌクレオチドの長さであり（約６０℃のその相補配列に近い融点を有する）、一方、ジッパードメインはおよそ５ヌクレオチドの長さである（例えば１７℃付近のかなり低い融点を有する）。ビルディングブロックおよび複数のテンプレートを一緒に中程度の温度（例えば５５℃）でインキュベートすると、アンチコドンが対応するコドンを見いだし、これと結合することが可能になる。この温度で、アンチコドンは有効かつ特異的にコドンと相互作用し、一方、ジッパーボックスは有効に相互作用しない。過剰の未結合ビルディングブロックを洗い流す。次いで、例えば１０℃に温度を低下させ、温度以外の条件を潜在的に変更することにより、隣接する機能的エンティティーの反応性基間の反応を開始させる。１０℃で、標準的なビルディングブロックのジッパードメインはスカフォード機能的エンティティーのジッパードメインの相補配列と相互作用し、これにより反応性基が非常に近接するようになる（図１４参照）。これにより、反応性基の局所濃度が非常に上昇し、その結果、反応性基が反応する。次いで再び温度を中程度の温度（５５℃）まで上昇させ、ジッピングボックスは融解し、その結果、機能的エンティティーが分離する。温度を次いで約１０℃に低下させると、もう一つ別のビルディングブロックがそのジッパードメインをスカフォードのジッパードメインとハイブリッド形成させ、その後、その機能的エンティティーがスカフォードと反応することができる。
【００２０】
ジッパードメイン
ジッパーボックスは、ある環境条件下で互いに対する親和力を有する２つの部分からなる分子親和性対である。分子親和性対の本質的性質は、分子親和対を組み立てるために２つの部分が相互作用できることである。バイオテクノロジー分野において、分子親和性対として使用できる様々な相互作用分子対が公知である。例としては、これらに限定されるわけではないが、タンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−ポリサッカライド相互作用、ＲＮＡ−タンパク質相互作用、ＤＮＡ−ＤＮＡ相互作用、ＤＮＡ−ＲＮＡ相互作用、ＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用、酵素−リガンド相互作用、抗体−リガンド相互作用、タンパク質−リガンド相互作用などが挙げられる。
【００２１】
分子親和性対間の相互作用の結果、強力または弱い結合が得られる。親和性対群間に共有結合が形成されるならば、該部分間の結合は強力であると見なすことができ、一方、水素結合、疎水性ドメイン間の相互作用、および金属キレート化の確立の結果は一般に弱い結合が得られる。一般に、比較的弱い結合が好ましい。本発明の好ましい態様において、親和性対の第一部分は親和性対の第二部分と可逆的に相互作用することができ、したがって媒体の条件の変化に従って該部分の結合または脱離が起こる。
【００２２】
本発明の好ましい態様において、分子親和性対はヌクレオチド間の相互作用に基づく。すなわち、親和性対の第一部分はヌクレオチドの配列であり、親和性対の第二部分は親和性対の第一部分とハイブリッド形成できるヌクレオチドの配列である。親和性対の第一部分はテンプレートまたはビルディングブロックの一部であってもよく、天然に存在する核酸塩基、すなわち、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、およびウラシルから選択される核酸塩基（（デオキシ）リボース−ホスフェート単位の繰り返し配列などの主鎖に結合している）を有するオリゴヌクレオチドを含んでもよい。親和性対の第二部分は、第一部分を補足し、これにより特異的に認識される核酸塩基を有するオリゴヌクレオチドであり得る。すなわち、第一部分がシトシンを含有する場合、第二部分はグアニンを含有し、逆も同様であり、第一部分がチミンまたはウラシルを含有する場合、第二部分はアデニンを含有する。しかしながら、本発明の一態様において、親和性対の第二部分の核酸塩基の少なくともいくつかは非特異的塩基対合核酸塩基であるのが好ましい。非特異的塩基対合核酸塩基は、主鎖と結合した場合に、前記の５の天然に存在する核酸塩基のうちの少なくとも２つの対をなすことができる塩基である。好ましくは、２以上の天然に存在する核酸塩基間で対を形成する塩基および非特異的塩基対合核酸塩基は本質的に等エネルギー的に起こる。すなわち、形成される結合は同じ程度の強度を有する。「非特異的塩基対合核酸塩基」なる用語は、本発明において「一般的塩基」と同義的に用いられる。
【００２３】
天然のｔＲＮＡにおいて、核酸塩基イノシンが見いだされる。イノシンは３つの核酸塩基、すなわち、シトシン、チミン、およびアデニンと非特異的にハイブリッド形成する能力を有する。天然の核酸塩基と非特異的に塩基対合する同じ能力を有する他の合成化合物が形成され、とりわけ以下に図示する化合物が挙げられる：
【００２４】
【化１】
2005521365.tif 000003
【００２５】
テンプレート
テンプレートのコドンはもう一つ別のエンティティーにより特異的に認識され得る能力を有する任意の生化学的エンティティーであり得る。しかしながら、コドンはヌクレオチドの配列であるのが好ましい。ヌクレオチドの配列は主鎖上に一連の核酸塩基を有する。コドンの核酸塩基は相補エンティティーにより特異的に認識される能力を有する任意の化学的エンティティーであり得る。核酸塩基は通常天然の核酸塩基（アデニン、グアニン、ウラシル、チミン、およびシトシン）から選択されるが、ワトソン−クリック水素結合則に従う他の核酸塩基、例えば米国特許第６０３７１２０号に開示されている合成核酸塩基などを用いることできる。
【００２６】
コドンは単一のヌクレオチドであってもよい。ライブラリーの生成において、これは４つの異なる機能的エンティティーがテンプレート指向性分子中に組み入れられるのを許容する。しかしながら、さらに高度の多様性を得るためには、コドンは好ましくは少なくとも２、さらに好ましくは少なくとも３のヌクレオチドを含む。理論的には、これは、それぞれ４２および４３の異なる機能的エンティティーを提供する。コドンは通常１００以上のヌクレオチドを含まない。３ないし３０のヌクレオチドの配列を有するコドンを有するのが好ましい。
【００２７】
テンプレートの少なくとも２つのコドンは一列に、すなわち互いに隣り合って配列され、スペーサー基で隔てられていてもよい。形成されることを意図されるテンプレート依存性分子によって、テンプレートはさらにコドンを含んでも良い。さらに別のコドンのそれぞれは適当なスペーサー基で隔てられていてもよい。好ましくは、テンプレートのコドンの全てまたは少なくとも大部分は、一列に配列され、コドンのそれぞれはスペーサー基により隣接するコドンから隔てられている。一般に、さらに複雑なテンプレート指向性分子の合成を可能にするためには、テンプレート上には２以上のコドンがあるのが好ましい。本発明の好ましい態様において、テンプレートのコドンの数は２ないし１００である。３ないし１５のコドンを含むテンプレートがさらに好ましい。
【００２８】
スペーサー配列は様々な目的にかなう。本発明の一例において、スペーサー基はコドンの位置を識別する。通常、コドンの上流または下流のいずれかのスペーサー基は、コドンの位置の決定を可能にする情報を含む。スペーサー基はまた、高親和性の領域を提供することができる。高親和性領域は、アンチコドンとテンプレートのハイブリダイゼーションがフレーム内で起こることを確実にするであろう。さらに、スペーサー配列はアニーリング温度を所望のレベルに調節する。
【００２９】
高親和性を有するスペーサー基は、同種核酸塩基に対する３つの水素結合を形成する１以上の核酸塩基を組み入れることにより提供することができる。この性質を有する核酸塩基の例はグアニンである。別法として、あるいはさらには、スペーサー配列を主鎖修飾に付すことができる。リボース部分、ペプチド核酸（ＰＮＡ）の２‘−Ｏ−メチル置換、およびリボース部分（ＬＮＡ（ロックされた核酸）とも称する）の２’−４’−Ｏ−メチレン環化などのいくつかの主鎖修飾は、さらに高い親和力を提供する。テンプレートはフランキング領域を含むことができる。フランキング領域の一つは本発明の一態様においてはミクロアレイなどの固体支持体の表面にテンプレートを固定化する働きをすることができる。本発明のもう一つ別の態様において、テンプレートの存在の直接検出を可能にするために、フランキング領域はシグナル基、例えばフルオロフォアまたは放射性基を含むことができる。フランキング領域はＰＣＲなどの増幅反応のプライミング部位としての働きをすることもできる。
【００３０】
一態様において、第一の機能的エンティティーはテンプレートに共有結合している。反応性基の共有結合は通常、テンプレート指向性分子が前記反応性基で、または反応性基付近で形成されることを必要とする。最終テンプレート指向性分子はしたがってその合成を行い、エンコードするテンプレートと共有結合する。この場合、本発明に従って調製される複数の複合体を含むライブラリーが形成され、テンプレートからテンプレート指向性分子が分離する危険性なしに選択手順の高ストリンジェンシー条件を用いることができる。
【００３１】
本発明のもう一つ別の態様において、第一の機能的エンティティーはテンプレートに非共有結合している。通常、非共有結合は、水素結合および疎水性相互作用を含む。特に、非共有結合はオリゴヌクレオチドまたはその一部の間のハイブリダイゼーション反応を含む。好ましい具体例において、機能的エンティティーは、テンプレートのヌクレオチドの配列を補足するヌクレオチドの配列に結合する。反応性基に結合した相補配列は、アンカーとして、すなわち、初期テンプレート指向性分子をテンプレートと結合させる働きをすることができる。通常、アンカーの相補配列は、ビルディングブロックが分離する条件下でさえも、アンカーの結合を確実にするために、ビルディングブロックのそれぞれよりも高いアニーリング温度を有する。
【００３２】
第一の機能的エンティティー、例えばスカフォードは、選択的に開裂可能なリンカーを介してテンプレートと結合することができ、これにより、実験者により決定された時間でテンプレートからテンプレート指向性分子を分離することが可能になる。第一の機能的エンティティーは一般に反応性基を含む。反応性基は、おそらくは改良された形態において最終のテンプレートされた分子において現れる初期テンプレート指向性分子の一部であり得る。反応性基は、１以上の反応性基を含む分子エンティティーなどのスカフォードの一部でもあり得る。さらに、反応性基は、本発明の方法が開始する前に活性化されるべき代用形であっても良い。
【００３３】
ライブラリーの生成に関する本発明の一態様において、第一の機能的エンティティーをテンプレート上の（さらに別の）コドンを補足するアンチコドンとカップリングさせるのが望ましく、かくして、１種以上の機能的エンティティーが媒体中に存在することが可能になる。別法として、反応性基を含む機能的エンティティーまたはスカフォードは変化し得る。
【００３４】
テンプレートが直線状である場合、分子親和性対の第一の部分は、通常、活性コドンと機能的エンティティーまたはハイブリダイゼーションによりテンプレートに共有結合または結合した初期テンプレート分子間に配置され、反応性基が非常に近接するようになる。さらに好ましくは、分子親和性対の第一の部分はテンプレート反応性基に対して近接して配置される。
【００３５】
分子親和性対の第二の部分は、ビルディングブロック中に位置する。分子親和性対の第二の部分は、ビルディングブロックが結合するコドンがテンプレート反応性基に近接する事象において分配されるか、または別の方法で発現することができ、ビルディングブロックのアンチコドンは分子親和性対の第二の部分と少なくとも部分的に同一である。スカフォードなどのテンプレート反応性基と遠位のコドンと相互作用することを意図されるアンチコドンを有するビルディングブロックは、分子親和性対の第二の部分をリンカーの一部として含む。「遠位」なる用語は、活性コドン、すなわち、ビルディングブロックのアンチコドンとハイブリッド形成するコドンが１以上の不活性コドンを有するテンプレート反応性基に対して空間をおく場合として理解されるべきである。
【００３６】
ビルディングブロックのリンカーにおける分子親和性対の第二の部分は、ビルディングブロック反応性基とテンプレート反応性基間の近接性を増大させるために機能的エンティティーに近接して配置されるのが好ましい。さらに好ましくは、分子親和性対の第二の部分は、機能的エンティティーを有するヌクレオチドから０ないし２ヌクレオチド間隔を置いている。
【００３７】
ハイブリダイゼーション条件
当業者らは所望のデザインのヌクレオチドを構築することができる。特定のアニーリング温度が望ましい場合、適当な組成の核酸モノマーおよびその長さを示すのが標準的方法である。適当なデザインの構築は、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ｓｕｉｔｅまたはインターネットアドレスｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｗｆｓｃ．ｎｏａａ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／ｏｌｉｇｏＴＭｃａｌｃ．ｈｔｍｌ．の公共データベースなどのソフトウェアを利用することができる。
【００３８】
コドンおよびアンチコドンの特異的ハイブリダイゼーションを許容する条件は、温度、塩濃度、緩衝液の種類、および酸性度を包含する多くの因子により影響を受ける。テンプレートとビルディングブロック間の接触がハイブリダイゼーション条件で行われることを確実にするために、適当な条件を当業者らは選択することができる。２つの一本鎖オリゴヌクレオチドが二本鎖を形成する温度を、アニーリング温度または融解温度と称する。融解極性は通常鋭くなく、このことはアニーリングは温度範囲全体にわたって起こることを示す。融解曲線の二次導関数は、本発明において融解温度を示すために用いられる。
【００３９】
機能的エンティティー
ビルディングブロックの機能的エンティティーは、テンプレート分子中に最終的に組み入れられる構造的エンティティーの前駆体の働きをする。従って、本出願と請求の範囲において、機能的エンティティーが初期テンプレート指向性分子に移されるという場合は、本来の機能的エンティティーの全ての原子が最終的に形成されるテンプレート指向性分子において見いだされる必要はないと理解される。また、結合に関与する反応の結果として、機能的エンティティーの構造は、初期テンプレート分子上に出現する場合に変化し得る。特に、結果として機能的エンティティーを放出することになる開裂は、その後の工程において初期テンプレート分子と機能的エンティティー間の結合の形成に関与し得る反応性基を生成することができる。
【００４０】
ビルディングブロックの機能的エンティティーは、ビルディングブロックの機能的エンティティーと、テンプレート反応性基を有するテンプレートとハイブリッド形成したテンプレートまたは相補テンプレートの一部の間に結果として結合をもたらす反応に関与できる少なくとも一つの反応性基を含む。結合は機能的エンティティーの１以上の反応性基により補助される。機能的エンティティー上に現れる反応性基の数は好適には１ないし１０である。１つだけの反応性基を特徴づけるビルディングブロックはポリマーの末端位置において用いられ、一方、２つの反応性基を有するビルディングブロックはさらに反応できるポリマーまたはスカフォードの本体部分の形成に好適である。結合の形成に意図される２以上の反応性基は、典型的にはスカフォード上に存在する。スカフォードはコア構造であってもよく、これは複数の変異体の形成の基礎をなす。スカフォードの変異形は典型的には、エンティティー間の結合形成下で、フィルイン基または触媒により媒介されてもよい、スカフォードの反応性基と他のビルディングブロックの反応性基の間の反応により形成される。スカフォードと結合される機能的エンティティーは、結合を形成できる１、２またはいくつかの反応性基を含有することができる。
【００４１】
ビルディングブロックの反応性基は、もう一つ別のビルディングブロックの反応性基、初期テンプレート分子またはテンプレート反応性部位の直接結合を形成できる。本発明のある具体例において、間接結合は、橋かけフィルイン基を用いて形成される。機能的エンティティーの全ての原子が形成される（初期）テンプレート分子において維持される必要はないと理解される。むしろ、機能的エンティティーは最終テンプレート分子の構造の前駆体と見なされるべきである。
【００４２】
工程ｆ）による任意の開裂は、適当な方法で行うことができる。本発明の一態様において、開裂は試薬または酵素の使用を含む。開裂の結果、さらに別の機能的エンティティーが初期テンプレート指向性分子に移されるか、または初期テンプレート指向性分子がビルディングブロックの機能的エンティティーに移される。場合によっては、リンカー開裂の結果として新しい化学基を導入するのが有利である。新しい化学基は、直接または活性化した後に、次のサイクルにおけるさらに別の反応に用いることができる。他の場合においては、リンカーが開裂後に全く残存していないのが望ましい。
【００４３】
もう一つ別の態様において、結合および開裂は同時反応として行われる。すなわち、ビルディングブロックの機能的エンティティーまたは初期テンプレート指向性分子のいずれかがが反応の脱離基である。一般に、結合および開裂が同時に起こるようにシステムをデザインするのが工程数および複雑さを軽減するので好ましい。前記のように、リンカーが全く残存しないか、あるいはさらなる反応の新規化学基が導入されるように、同時結合および開裂を設計することもできる。
【００４４】
本発明の方法に関して、少なくとも１つのリンカーが開裂工程後に変化していない状態であるのが重要である。少なくとも１つのリンカーは、初期テンプレート指向性分子をその合成を行うテンプレートと結合させる。該方法が本質的に機能的エンティティーをスカフォードまたは進化ポリマーに移すことを含む場合、最終的なスカフォード分子またはポリマーは選択的に開裂可能なリンカーと結合することができる。選択的に開裂可能なリンカーは、機能的エンティティーが結果として初期テンプレート指向性分子に移されるような条件下で開裂しないように設計される。
【００４５】
ビルディングブロック
本発明の方法において用いられるビルディングブロックは、ビルディングブロックに含まれる特定のエンティティーにしたがって設計することができる。一例として、アンチコドンをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーで分子親和性対の第二の部分に結合させることができ、機能的エンティティーを分子親和性対の第二の部分に直接結合させることができる。もう一つ別の好ましい例において、アンチコドン、リンカーおよび分子親和性対の第二の部分は連続した直線状オリゴヌクレオチドである。
【００４６】
機能的エンティティーのリンカーへの結合は、好ましくは、末端ヌクレオチドあるいは、オリゴヌクレオチドの１または２ヌクレオチド下方である。機能的エンティティーの結合は、結合に利用可能な任意のエンティティーであり得る。すなわち、機能的エンティティーは核酸塩基、または主鎖でオリゴヌクレオチドのヌクレオチドと結合させることができる。一般に、ヌクレオチド間結合のリンまたは核酸塩基で機能的エンティティーを結合させるのが好ましい。
【００４７】
本発明の一態様において、機能的エンティティーの反応性基は、リンカーオリゴヌクレオチドに結合される。反応性基は、好ましくは、それぞれの反応性基間の直接反応または適当なフィルイン基を使用することにより、初期テンプレート指向性分子との結合を形成できる種類のものである。機能的エンティティーをリンカーでカップリングさせる反応性基は、好ましくは結合の確立と同時に開裂される。機能的エンティティーは場合によってはその後のサイクルにおいて結合の形成に関与することができる第二の反応性基を含有し得る。第二の反応性基は、結合の形成に関与することができる前に、活性化をする必要がある種類のものである場合もある。
【００４８】
オリゴヌクレオチドリンカーは、スペーサー基により機能的エンティティーから間隔を置いている。スペーサーは、反応性基により間隔を置かれた構造が初期テンプレート指向性分子の反応性基との反応に最適化することができる。
アンチコドンを含むビルディングブロックの設計は、機能的エンティティーが化学反応により互いに結合する前に、アンチコドンがテンプレートにアニールされていることを確実にするために、全てまたは一部のビルディングブロック：テンプレートハイブリッドについての特定の範囲のアニーリング温度を得ることを目的とする。ビルディングブロックが本質的に同じ親和性を有するテンプレートとアニールされる場合、各サイクルにおいてビルディングブロックを付加することが必要である。すなわち、ビルディングブロックをテンプレートと接触させることは、個々のビルディングブロックを別々に付加することを含む。
【００４９】
本発明の一態様において、ビルディングブロックは、第一サイクルにおいてテンプレートに付加されるビルディングブロックが、その後のビルディングブロックよりも低いアニーリング温度を有するように設計される。前の工程よりも高い第二またはその後の工程における結合工程の温度を使用することにより、意図されるビルディングブロックのみをテンプレートにアニールさせることが可能であり、一方、以前の使用済または未反応ビルディングブロックの大部分は一本鎖である。任意に、各サイクル間で回収工程を使用して、その後のビルディングブロックにアニールするために利用可能な一本鎖テンプレートの数を増大させることができる。回収工程は、前記のように、ビルディングブロックオリゴヌクレオチド中にビオチンを組み入れること、およびアニーリング温度より高い温度で、ストレプトアビジンコートされたビーズを用いてテンプレートからビルディングブロックを分離することを含む。
【００５０】
開裂工程後、分子親和性対の一部を分離して、次のビルディングブロックをジッピングドメインの第一の部分と相互作用させる。任意に、分子親和性対の分離後に、開裂工程を行うことができる。分子親和性対が二本鎖オリゴヌクレオチドである場合、ストリンジェンシーを増大させることにより、例えば温度を上昇させることにより、親和性対の一部を分離させることができる。別法において、ビルディングブロックに保有される親和性対の第二の部分を以下に記載するように、酵素によるかまたは化学的に分解することができる。
【００５１】
例えば機能的エンティティーをスカフォードに移すことによるビルディングブロックの反応後、アンチコドンはその後のサイクル中テンプレートにアニールされたままである。しかしながら、一般に、工程ｄ）からｇ）を繰り返す前に、テンプレートから初期テンプレート指向性分子を有さない反応したビルディングブロックのアンチコドンを除去することが好ましい。アニールされたアンチコドンが存在しないことにより、リンカー中に一般的塩基を組み入れて、リンカーと不活性な以前に使用されたコドンとの間の親和性を得ることが可能になる。
【００５２】
アンチコドンは、ストリンジェンシーを増大させることによる、典型的には温度を上昇させることによるテンプレートからの分離；部分的または完全酵素消化；または化学分解などの様々な技術を用いて除去することができる。ストリンジェンシーを増大させることを使用した方法が適用するのに最も簡単である。しかしながら、再アニーリングが起こり得るか、またはアンチコドンの選択的除去が望ましい場合においては、酵素法または化学法またはその混合法を用いることができる。
【００５３】
使用済ビルディングブロック、未反応ビルディングブロックおよび過剰のビルディングブロックを除去する方法は、ビオチンまたは類似した小分子の取り込み、およびビオチンとアビジンまたはコートされたビーズ上のストレプトアビジン間の接着性を用いた前記ビルディングブロックの離脱を含む。さらに詳細には、ビオチンをその合成中にビルディングブロック中に組み入れる。本発明の移動または開裂工程後、ストレプトアビジンのビオチンとのカップリングを可能にする条件下、ストレプトアビジンでコートされたビーズで混合物を処理する。その後、温度をビルディングブロック：テンプレートハイブリッドのアニーリング温度以上に上昇させ、例えば遠心分離器においてスピンさせることにより、混合物に増大した重力をかける。上清はビルディングブロックから放出されたテンプレートを含む。ビオチン−ストレプトアビジンカップリングの代替法は、Ｓ−Ｓブリッジの形成である。一例として、アンチコドンを含むオリゴヌクレオチドに、例えばＣ６Ｓ−Ｓチオール修飾剤（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ＃１０−１９３６−９０）の還元生成物など、−ＳＨ基を付与されている。ビルディングブロックの−ＳＨ基は、酸化条件下で固体支持体上のもう一つ別の−ＳＨ基とカップリングさせることができ、固体物質がビーズであるならばスピンさせることにより、あるいは固体支持体がカラムの固相マトリックスであるならば溶出により、ビルディングブロックを固体支持体とともに除去することができる。
【００５４】
いくつかの用途については、アンチコドン含有オリゴヌクレオチドを選択的に分解することが有利である。ＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖のＲＮＡ部分を分解するためのいくつかの方法が利用可能である。従って、テンプレートは一本鎖オリゴヌクレオチドとして提供することができ、アンチコドンは一本同種ＲＮＡ鎖であり得る。ＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖を次いで、ＲＮＡｓｅＨ、ＲＮＡｓｅＡ、ＲＮＡｓｅ１から選択される酵素で分解することができる。別法において、ＲＮＡ：ＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖のＲＮＡ部分を、弱アルカリ性条件下（ｐＨ９〜１０）または水性Ｐｂ（Ａｃ）２での処理により化学的に分解することができる。
【００５５】
ヌクレオシド間リンカーがチオホスフェートを含むならば、リンカーはヨウ素で開裂することができる。従って、この方法にしたがって、オリゴヌクレオチドテンプレート、例えば、ヌクレオシド間リンカー中にチオホスフェートを含む、これとハイブリッド形成したＤＮＡまたはＲＮＡアンチコドンを有するＤＮＡまたはＲＮＡテンプレートは、水性ヨウ素またはヨードエタノールで処理して、アンチコドンを開裂させることができる。
【００５６】
もう一つ別の方法に従って、ＤＭＡモノマーがウラシル核酸塩基を含有するならば、ウラシル部分を除去するためにウラシル−グリコシラーゼで二本鎖をまず処理し、続いて弱酸で処理することにより、二本鎖を開裂させることができる。さらにもう一つ別の方法は、ヌクレオチド間リンカー中にメチルホスフェートを含めることおよび、例えば３７℃で１時間１００ｍＭのピペリジン濃度で処理することにより、ピペリジンを用いてリンカーを開裂させることを含む。
【００５７】
テンプレートからアンチコドンを除去する様々な方法をアンチコドンの選択的分解において用いることができる。選択的分解の利点は、初期テンプレート指向性分子ならびにビルディングブロックがテンプレートによりエンコードされる場合に特に明らかである。一態様において、スカフォードはテンプレートによりコードされ、ビルディングブロックが連続して組み入れられる。前記方法のいずれかを用いることにより、アンチコドンおよびリンカーを含むビルディングブロックを選択的に除去することが可能であり、一方、スカフォードをコードするコドンの認識に用いられるアンチコドンはテンプレートに結合したままである。
【００５８】
テンプレート分子
生じたテンプレート分子が相補エレメント（アンチコドンを含むかどうかに関わらない）によりテンプレートに結合する方法を行う場合、水素結合および疎水性相互作用のみが部分を結合させるので、親和力は比較的弱い。従って、本発明の一態様において、最終的にテンプレート分子を有する相補エレメントを、テンプレートの他のコドン：アンチコドンハイブリッドよりも高いアニーリング温度を有する相補エレメント：テンプレートハイブリッドを介してテンプレートと結合させることができる。別法として、好ましくはいくつかの適用例において、テンプレート分子は、共有結合によりその合成を行うテンプレートと結合される。共有結合は水素結合以外であってもよいし、あるいは共有結合は代替であってもよい。共有結合の存在により、複合体のさらに過酷な化学処理が可能になる。本発明の一態様において、共有結合は選択的に開裂可能であり、相補テンプレートからテンプレート分子が分離される。
【００５９】
本発明の方法は、さらに別の工程として、テンプレートとテンプレートされた分子間に有効な化学結合を確立するために、テンプレート上の固定点にテンプレートされた分子を移すこと、またはテンプレートを補足する配列を含むことができる。テンプレートされた分子のテンプレートまたはテンプレートに対して相補性の配列間の有効なカップリングは、濃縮条件の変性または製造された分子のテンプレート後修飾の変性を可能にするために望ましい。固定は、テンプレートされた分子上の反応性基の存在およびテンプレート上の反応パートナーの存在を含み、これによりこれらの反応性基間の反応が共有結合を確立する。別法として、テンプレートとハイブリッド形成した相補配列上に固定点が存在してもよい。好ましい具体例において、濃縮および所望により使用されたビルディングブロックの除去中のさらに高いストリンジェンシーの使用を可能にするために、相補配列は１以上のビルディングブロック、特に末端ビルディングブロックよりも高いアニーリング温度を有する。
【００６０】
ライブラリー
本発明はさらに、二機能性複合体のライブラリーにも関する。ライブラリーは複数の異なる複合体、たとえば、１０３、１０６、１０９、１０１２、または１０１５の異なる複合体からなる。複数の異なる複合体は、まず複数の異なるテンプレートならびに複数のビルディングブロックを提供することにより製造される。ビルディングブロックのアンチコドンのそれぞれは、少なくとも１つのテンプレートの少なくとも１つのコドンと相互作用できるようにされる。複数の異なるテンプレートは、本明細書に記載された方法に同時に付される。該方法の増殖部分を、テンプレートされた分子を発生させるために望ましい回数繰り返すことができる。増殖の繰り返しのそれぞれは、さらに別のビルディングブロックの新規サブセットとテンプレートを接触させることにより開始される。
【００６１】
本発明の様々な異なるテンプレートは一般的スキームに従うように構築するのが好都合である。スキームにしたがって、多くのコーディングセクションがテンプレート上に提供される。同様に、コーティングセクションのそれぞれは１以上の独自のコドンを特定する。従って、特定のテンプレートは所定の数の独自のコドンを含む。複数のテンプレートは、全体としてみると、可能な独自のコドンの異なる組み合わせの全量、または任意のそのサブセットを含むライブラリーとして特徴づけることができる。コーディングセクションは、個々のコーディングセクションが互いのすぐ隣に、所望によりスペーサー配列により間隔をおいて位置するように、直線状配列中に適当に配置される。いくつかの具体例において、反応性基の近接性、触媒を反応性基に近接して導入することまたは第三の反応物質として導入することを確実にするために、分岐テンプレートを使用することが有利である。
【００６２】
テンプレートの独自のコドンは好ましくはヌクレオチドなどの核酸モノマーの配列からなる。それぞれのコドンは好ましくは、同じコーディングセクション内で他のコドンが同じ配列および長さの核酸モノマーを有さないという意味で独自である。好ましくは、独自のコドンは、複数のテンプレート中のどこにも対応する配列を有さない。個々のテンプレート間のハイブリダイゼーションを避けるために、任意の他のテンプレート上に相補配列が存在しないように独自のコドンのそれぞれをデザインするのも望ましい。
【００６３】
コーディングセクションの数は、なかでも望ましい最終のテンプレートされた化合物の数、利用可能なビルディングブロックおよびテンプレートされた化合物の予想される構造に従って選択することができる。本発明によると、コーディング領域の数は、望ましい多様性を達成するためには、好ましくは少なくとも３である。コーディング領域の数の上限は、まだ明確にされていないが；１００を越える数は実施上の問題をもたらすと考えられている。一般に、好ましくは２から５の間のコーディング領域を有するエンプレートを使用することが好ましく、さらに好ましくは、３から３０の間、さらに一層好ましくは４から１５の間のコーディング領域を有するテンプレートを使用する。
【００６４】
各コーディング領域内で、独自のコドンの数は、多様性の必要性に従って選択することができる。コーディング領域のそれぞれにおける独自のコドンの数は、類似していても、異なっていても良い。独自のコドンの数は、１まで低いこともあり得る。特定の化合物が進化するテンプレートされた分子において望まれる場合に候補となり得る。独自のコドンの数の上限は、アンチコドンのオリゴヌクレオチドのテンプレート上のその相補体との特異的ハイブリダイゼーションが起こる限りかなり高く選択することができる。上限の一例は１００００であるが、必要に応じてこの範囲よりも低く、または高く選択することもできる。
【００６５】
比較的小さなライブラリーの一例として、それぞれのコーディング領域が３０の独自のコドンを特定する、４のコーディング領域を有するテンプレートについて１０６付近の異なる複合体を得ることができる。独自のコドンのそれぞれが一度にテンプレート上に存在できるだけであるならば、少なくとも１２０の異なるビルディングブロックを提供しなければならない。アルファまたはベータペプチドなどの４−ｍｅｒ化合物の生成に、複数のテンプレートおよびビルディングブロックを用いることができる。１０１０複合体のさらに大きなライブラリーは、５のコーディング領域および１００の独自のコドンをそれぞれのコーディング領域内に有するテンプレートから出発して調製することができる。
治療または診断法において使用される化合物および植物保護化合物、例えば殺虫剤、殺菌剤などの探索を包含する様々な用途にライブラリーを用いることができる。ライブラリーは、任意の数の本発明の複合体を含むことができる。
【００６６】
例えば治療用途において用いることができる最も活性な化合物を識別するための一方法は、ライブラリーを濃縮処理に付すことである。本発明の一態様によると、テンプレートされた分子を含む複合体のライブラリーのあらかじめ決められた活性に関する濃縮は、次の工程を含む：
ｉ）テンプレートされた分子を含む複合体の第一のライブラリーを確立する工程（前記ライブラリーは本発明の方法のいずれかに従って得ることができる）、
ｉｉ）ライブラリーをあらかじめ決められた活性を有する複合体に関して濃縮する条件に該ライブラリーを付す工程、
ｉｉｉ）濃縮されたライブラリーの複合体を増幅する工程、
ｉｖ）所望により、工程ｉｉ）からｉｉｉ）を繰り返す工程、および
ｖ）さらに高い割合の、あらかじめ決められた活性を有するテンプレートされた分子を含む複合体を有する濃縮されたライブラリーを得る工程。
【００６７】
増幅工程が通常好ましいが、必ず必要であるとは限らない。特に、濃縮の数サイクルが行われる場合、十分な複合体を得るために増幅を行うのが有利である。本発明の好ましい態様において、濃縮されたライブラリーの複合体の増幅は、増幅手段と複合体のライブラリーを接触させる工程、テンプレートまたは相補テンプレートを増幅する工程、およびテンプレートとして増幅産物を用いて本発明の方法を行う工程を含む。増幅手段は、ＰＣＲなどのテンプレートの増幅に好適な任意の核酸増幅手段であり得る。好ましくは、複合体の増殖は、１０１ないし１０１５倍の増幅を含む。
【００６８】
複数の濃縮サイクルを可能にするために、工程ｉｉ）およびｉｉｉ）を少なくとも２、３、５回、例えば少なくとも１０回、例えば少なくとも１５回繰り返す。各サイクルが完了した後、複合体を識別することができるか、または最後のサイクル後にのみ識別できる。テンプレートまたはその相補体に適当なプライマー領域が付与されるならば、増幅は、テンプレートの配列またはテンプレートを補足する配列を知らずに行うことができるので、中間識別の明確な必要性はない。濃縮プロセス後の識別は、テンプレートの配列の決定および／またはテンプレートされた分子および／またはあらかじめ決められた活性を有する全複合体の構造決定を含む。
【００６９】
好ましくは、ライブラリーを濃縮する条件は、関心のあるテンプレートされた分子に結合パートナーを接触させることを含む。結合パートナーは溶液中にあるか、または支持体上に直接的または間接的に固定することができる。濃縮は一般に親和性または活性分析を用いて行われる。本発明の一態様において、濃縮は、標的分子または標的エンティティーに対する親和性を有するかまたはこれに対して影響を及ぼす複合体についてスクリーニングすることにより行われる。もう一つ別の態様において、濃縮は触媒活性についての選択により行われる。別法として、ライブラリーを濃縮する条件は、電気泳動分離、ゲル濾過、免疫沈降、等電点電気泳動、遠心分離、および固定化のうちの任意の１以上を含む。
【００７０】
濃縮プロセスは、細胞を含むことができる。従って、一具体例において、ライブラリーを濃縮する条件は、テンプレートされた分子を取り込むことができる細胞を提供すること、または所望のあらかじめ決められた活性を有するテンプレートされた分子との相互作用を行うことを含む。
複合体のライブラリーが濃縮されて、あらかじめ決められた活性を示す複合体を含む小さなプールになる場合、複合体のそれぞれを別々に得ることが望ましい。１以上のビルディングブロックのリンカーを開裂させて、テンプレートからテンプレートされた分子を放出させることにより、テンプレートされた分子を複合体から得ることができる。
【００７１】
ヌクレオチド
本発明において用いられるヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド中で一緒に結合させることができる。各ヌクレオチドモノマーは通常２つの部分、すなわち、核酸塩基部分、および主鎖からなる。主鎖は、いくつかの場合においては、糖部分とヌクレオシド間リンカーに再分割することができる。
核酸塩基部分は、天然に存在する核酸塩基ならびに天然に存在しない核酸塩基間で選択することができる。以前は「天然に存在しない」と考えられていた様々な核酸塩基が自然界でその後見いだされていることは当業者には明らかである。従って、「核酸塩基」は、公知プリンおよびピリミジン複素環だけでなく、複素環類似体およびその互変異性体を包含する。核酸塩基の例は、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウラシル、プリン、キサンチン、ジアミンプリン、８−オキソ−Ｎ６−メチルアデニン、７−デアザキサンチン、７−デアザグアニン、Ｎ４，Ｎ４−エタノシトシン、Ｎ６，Ｎ６−エタノ−２，６−ジアミノ−プリン、５−メチルシトシン、５−（Ｃ３−Ｃ６）−アルキニルシトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、シュードイソシトシン、２−ヒドロキシ−５−メチル−４−トリアゾロピリジン、イソシトシン、イソグアニン、イノシンおよびＢａｎｎｅｒら、米国特許第５４３２２７２号に記載されている「天然に存在しない」核酸塩基である。「核酸塩基」なる用語は、これらの例のそれぞれおよびすべてならびにその類似体および互変異性体を網羅することを意図される。特に、興味深い核酸塩基は、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、およびウラシルであり、これらはヒトにおける治療および診断用途に関して天然に存在する核酸塩基と見なされる。
【００７２】
核酸塩基の適当な特定の対の例を以下に示す：
【化２】
2005521365.tif 000004
【化３】
2005521365.tif 000005
【化４】
2005521365.tif 000006
主鎖の適当な例を以下に示す（Ｂは核酸塩基を示す）：
【化５】
2005521365.tif 000007
【００７３】
主鎖の糖部分は適当にはペントースであるが、ＰＮＡの適当な部分または６員環であっても良い。可能なペントースの適当な例は、リボース、２’−デオキシリボース、２’−Ｏ−メチル−リボース、２’−フルオロ−リボース、および２’−４’−Ｏ−メチレン−リボース（ＬＮＡ）を包含する。適当には、核酸塩基はペントースエンティティーの１’位に結合している。
ヌクレオシド間リンカーは、主鎖の糖部分が２’−デオキシリボースのリボースなどのペントースである場合、後続のモノマーの５’末端に先行するモノマーの３’末端を結合させる。ヌクレオシド間結合は天然に存在するホスホジエステル結合またはその誘導体であっても良い。かかる誘導体の例としては、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホルアミデート、ホスホトリエステル、およびホスホジチオエートが挙げられる。さらに、ヌクレオシド間リンカーは、当該分野において公知の多くの非リン含有リンカーのいずれかであり得る。
【００７４】
好ましい核酸モノマーは、ＤＮＡの一部を形成する天然に存在するヌクレオシドならびにホスホジエステル結合により結合されたＲＮＡファミリーを包含する。ＤＮＡファミリーのメンバーは、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、およびデオキシシチジンを包含する。ＲＮＡファミリーのメンバーは、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジン、およびイノシンを包含する。イノシンは非特異性対合ヌクレオシドであり、イノシンはほぼ等エネルギー的にＡ、Ｔ、およびＣと対合できるので、前記のような一般的な塩基として使用できる。
各コドンはアンチコドンにより補足される。アンチコドンはこれが補足するコドンと特異的に協働する能力を有する。コドンと相補アンチコドン間の親和性は、周知のワトソン−クリック塩基対システムにしたがって水素結合により影響を受ける。従って、アンチコドンはコドンそれ自体と同じ種類の核酸モノマーからなる。
【００７５】
官能基
機能的エンティティーは１以上の官能基、すなわちテンプレートされた分子を最終的に形成する基を含むことができる。テンプレートされた分子は１以上の以下の官能基を単独または組み合わせにおいて含むことができる：
１．  ヒドロキシル
２．  第一、第二、第三アミン
３．カルボン酸
４．ホスフェート、ホスホネート
５．スルホネート、スルホンアミド
６．アミド
７．カーバメート
８．カーボネート
９．尿素
１０．アルカン、アルケン、アルキン
１１．アンヒドリド
１２．ケトン
１３．アルデヒド
１４．ナイトレート、ナイトライト
１５．イミン
１６．フェニルおよび他の芳香族基
１７．ピリジン、ピリミジン、プリン、インドール、イミダゾール、および複素環式塩基
１８．複素環
１９．多環
２０．フラビン
２１．ハライド
２２．金属
２３．キレート
２４．メカニズムベースの阻害剤
２５．小分子触媒
２６．デキストリン、サッカライド
２７．フルオロセイン、ローダミンおよび他のフルオロフォア
２８．ポリケチド、ペプチド、様々なポリマー
２９．酵素およびリボザイムおよび他の生物学的触媒
３０．官能基の重合後／活性化後カップリングのための官能基
３１．薬剤、例えばタキソール部分、アシクロビル部分、「天然の生成物」
３２．超分子構造、例えばナノクラスター
３３．脂質
３４．オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド類似体（例えば、ＰＮＡ、ＬＮＡ、モルホリノ）
３５．水素
【００７６】
反応性基
反応性基は特に、機能的エンティティーの一部を形成し、直接または適当な橋かけ分子エンティティーを介して結合を形成する反応に関与することができる基に関する。反応性基の例を以下に列挙する：
１．Ｎ−カルボキシアンヒドリド（ＮＣＡ）
２．Ｎ−チオカルボキシアンヒドリド（ＮＴＡ）
３．アミン
４．カルボン酸
５．ケトン
６．アルデヒド
７．ヒドロキシル
８．チオール
９．エステル
１０．チオエステル
１１．二重結合の共役系
１２．アルキルハライド
１３．ヒドラジン
１４．Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
１５．エポキシド
１６．ハロアセチル
１７．ＵＤＰ−活性化サッカライド
１８．スルフィド
１９．シアネート
２０．カルボニルイミダゾール
２１．チアジアノン
２２．ホスフィン
２３．ヒドロキシルアミン
２４．スルホネート
２５．活性化ヌクレオチド
２６．塩化ビニル
２７．アルケン、キニン
【００７７】
テンプレートされた分子
本発明に従って、本明細書に開示された一般法を用いて実質的に任意の分子をテンプレートすることができる。合成できる化合物の例としては、これらに限定されないが、以下に列挙する化合物が挙げられる：
アルファ−、ベータ−、ガンマ−、およびオメガ−ペプチド；モノ−、ジ−、およびトリ−置換ペプチド；Ｌ−およびＤ−形ペプチド；シクロヘキサン−およびシクロペンタン主鎖修飾ベータ−ペプチド；ビニル系ポリペプチド；グリコポリペプチド；ポリアミド；ビニル系スルホンアミドペプチド；ポリスルホンアミド；共役ペプチド（すなわち、補欠分子団を有する）；ポリエステル；ポリサッカライド；ポリカーバメート；ポリカーボネート；ポリウレア；ポリ−ペプチジルホスホネート；アザチド；ペプトイド（オリゴＮ−置換グリシン）；ポリエーテル；エトキシホルムアセタールオリゴマー；ポリ−チオエーテル；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；ポリエチレン；ポリジスルフィド；ポリアリーレンスルフィド；ポリヌクレオチド；ＰＮＡ；ＬＮＡ；モルホリノ；オリゴピロリノン；ポリオキシム；ポリイミン；ポリエチレンイミン；ポリアセテート；ポリスチレン；ポリアセチレン；ポリビニル；脂質；リン脂質；糖脂質；多環（脂肪族）；多環（芳香族）；ポリ複素環；プロテオグリカン；ポリシロキサン；ポイリソシアニド；ポリイソシアネート；ポリメタクリレート；一機能的、二機能的、三機能的およびオリゴ機能的開鎖炭化水素；一機能的、二機能的、三機能的およびオリゴ機能的非芳香族炭素環；単環、二環、三環、および多環複素環、橋かけ多環複素環；一機能的、二機能的、三機能的、およびオリゴ機能的芳香族炭素環；単環、二環、三環、および多環芳香族炭素環；一機能的、二機能的、三機能的およびオリゴ機能的芳香族複素環；単環、二環、三環および多環複素環；キレート、フラーレン；ステロイド；シクロスポリン類似体；ならびに前記分子部分の任意の組み合わせ。
【００７８】
濃縮
所望の活性（例えば、特定の標的に対する結合、触媒活性、または活性分析における特定の効果）に関してのテンプレートされた分子を含む複合体のライブラリーの選択またはスクリーニング（通常、濃縮と称する）は、任意の標準的プロトコルに従って行うことができる。例えば、親和性選択は、ファージ提示、ポリソーム提示またはｍＲＮＡ−タンパク質融合提示ペプチドについて用いられる原理に従って行うことができる。触媒活性についての選択は、遷移状態類似アフィニティーカラム上での親和性選択（Ｂａｃａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１９９７；９４（１９）：１００６３−８）、または機能に基づいた選択スキーム（Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１９９８，９５（１８）：１０５２３−８）により行うことができる。所望の特徴についてのスクリーニングは、標準的マクロタイタープレートベースのアッセイ、またはＦＡＣＳ−ソーティングアッセイにしたがって行うことができる。
【００７９】
一般に、親和性選択は、標的または結合パートナーを固体支持体、例えばカラム上に固定化することを含む。続いて、本発明に従って製造された複合体を、複合体の一部が標的と結合するのを許容する条件下でカラムに添加する。標的に結合していない複合体をカラムから溶出し、排出する。標的に結合した複合体の部分を、テンプレートされた分子を伴うテンプレートを用いて増幅することができる。
【００８０】
増幅の選択は、コドンおよびアンチコドンの選択によって変わる。天然のオリゴヌクレオチドは任意の技法により増幅することができる。これらの方法は、これらに限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；ならびに例えば核酸配列に基づく増幅（例えば、Ｃｏｍｐｔｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ３５０、９１−９２（１９９１））、増幅されたアンチセンスＲＮＡ（例えば、ｖａｎ  Ｇｅｌｄｅｒら、ＰＮＡＳ  ８５：７７６５２−７７６５６（１９８８））；自立性配列複製システム（例えば、Ｇｎａｔｅｌｌｉら、ＰＮＡＳ８７：１８７４−１８７８（１９９０））；Ｓｃｈｍｉｄｔら、ＮＡＲ２５：４７９７−４８０２（１９９７）に記載されているようなポリメラーゼ独立増幅、ならびにクローンされたＤＮＡフラグメントを有するプラスミドのインビボ増幅を包含する。リガーゼによる増幅法、例えばＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）も用いることができる。
【００８１】
非天然ヌクレオチドに関して、有効な増幅法の選択の対象はさらに少ない。非天然のヌクレオチドを、ポリメラーゼを含むある種の酵素により取り込むことができる。各伸張サイクル中にポリメラーゼを添加することにより、手作業のポリメラーゼ連鎖反応を行うことが可能である。
ヌクレオチド類似体を含有するオリゴヌクレオチドに関して、存在する増幅法はさらに少ない。非酵素増幅スキーム（Ｓｃｈｍｉｄｔら、ＮＡＲ２５：４７９７−４８０２（１９９７））を用いることができる。主鎖修飾オリゴヌクレオチド類似体、例えばＰＮＡおよびＬＮＡに関して、この増幅法を用いることができる。次回の選択またはスクリーニングのためにさらに多様性を高めるために、増幅前または増幅中に、テンプレートまたは相補テンプレートを突然変異誘発または組み換えることができる。
【００８２】
複合体のテンプレート部分の増幅後、テンプレートとして増幅産物を用いて本発明の方法を行う。結果は、テンプレート分子に結合したテンプレートの複合体の減少または濃縮されたライブラリーが得られる。
ライブラリーをさらに濃縮することが必要と考えられるならば、選択および増幅工程を繰り返すことができる。選択および増幅工程が繰り返される場合、標的および複合体を必要とする結合工程は、好ましくはさらに厳しい条件下で行われ、複合体の一部のみが標的に結合することを確実にする。
濃縮サイクルは、２ないし１５回、またはそれ以上行うことができ、各サイクルにおいて濃縮は１０ないし１０００倍である。一方法において、出発ライブラリーは１０１４の複合体になる。７サイクルの濃縮後（各サイクルにおいて１００倍濃縮）、標的に対して最高の親和性を有する複合体が理論的に得られる。しかしながら、最終サイクルは興味のある複合体の小さなプールを供給する可能性が高く、これは他の手段により調査しなければならない。
【００８３】
選択の最終回後、個々のテンプレートされた分子の組成を決定するために、個々のテンプレートを配列化させるのが望ましいことが多い。テンプレートが天然のヌクレオチドを含有するならば、単離されたテンプレートを任意にＰＣＲ増幅（テンプレートがＲＮＡ分子であるならば、ＰＣＲ増幅前にｃＤＮＡを産生するために逆転写酵素を使用する必要がある）をし、次いでＤＮＡフラグメントを例えばプラスミド中にクローンし、これらを形質転換し、次いで１または複数のタンデムＤＮＡ配列を含有する個々のプラスミド−クローンを配列化させることが標準的手順である。この場合において、フランキング配列の両方において制限部位をテンプレートの中心コーディング配列（すなわち、プライマー結合部位）に設計することが実際的である。これにより、単離されたヌクレオチドの容易なクローニングが可能になる。配列化は、標準的ジデオキシ鎖終止法、またはさらに古典的な手段、例えばマキサム−ギルバート配列決定により行うことができる。
【００８４】
テンプレートが非天然ヌクレオチドを含有するならば、微生物宿主による移行により個々の配列をクローンできない場合もある。しかしながら、各ビーズが１つのオリゴヌクレオチド配列を担持するビーズ集団を用いることにより、インビトロでクローンすることが可能であり、その後、特定のビーズに結合した全てのヌクレオチドを所望により増幅し、次いで配列化することができる（Ｂｒｅｎｎｅｒら、２０００、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７，１６６５−１６７０）。別法として、単離物の集団を適当に希釈し、次いでウェルが平均で例えば０．１テンプレートを含有するようにマイクロタイタープレート中に等分することができる。単一のテンプレートを例えばＰＣＲにより増幅することにより、標準的方法を用いて配列化することが可能になる。もちろん、これは非天然ヌクレオチドがＰＣＲにおいて用いられる熱安定性ポリメラーゼの基質であることを必要とする。
【００８５】
さらに短いオリゴヌクレオチドを必要とする代替法が用いられるならば、出発テンプレートがテンプレートのエンコーディング／テンプレーティング領域のいずれかの側に制限部位を含有するように設計することが望ましい。これにより、最終回の選択後、テンプレートを制限して、テンプレートされた分子をエンコードする短いオリゴヌクレオチドを得ることができ、次いでこれらの短いオリゴヌクレオチドを様々な分析法に適用することができる。
ランダムであるが、あらかじめ決められた配列を有するオリゴヌクレオチドのＤＮＡアレイの使用により、単離物を配列化することも可能である。
【００８６】
例えば、初期ライブラリーは既知の（比較的高い）望ましい活性を有するポリマー配列に基づいた縮重配列からなるので、配列が見当に合っていると期待されるならば、単離物の集団をプールとして配列化させることが望ましい。したがって、全ての単離物が選択前のテンプレートの初期配列と類似した配列を有すると予想される。従って、単離物の集団を全体として配列化させて、全体として集団のコンセンサス配列を得ることができる。
本発明はさらに、異なる標的と結合することができる小分子の選択を可能にする方法にも関する。テンプレート提示分子技術は、直接選択および増幅のためのビルトイン機能を含む。選択された分子の結合は、これらが特定の標的に対して配位結合し、これにより特定の生物学的効果を防止または誘発するだけである点で選択的である。最終的に、これらの結合分子は、例えば治療薬として、または診断薬として用いることが可能である。
【００８７】
テンプレート提示分子ライブラリーは、標的の機能に対する分子リガンドの結合の影響を評価するためのスクリーニング、選択、または分析と容易に組み合わせることができる。さらに特別な例において、テンプレート提示法は、超分子、巨大超分子、高分子および低分子構造（例えば、核酸およびタンパク質（酵素、レセプター、抗体、および糖タンパク質を包含する））；シグナル分子（例えば、ｃＡＭＰ、イノシトールトリホスフェート、ペプチド、プロスタグランジン）；および表面（例えば、金属、プラスチック、複合材料、ガラス、セラミック、ゴム、皮膚、組織）と結合する分子リガンドを単離し、識別するための迅速な手段を提供する。
【００８８】
特に、この意味における選択または分割は、標的分子と結合するテンプレート提示分子複合体、すなわち、複合体−標的対を標的分子と結合していないテンプレート提示分子から分離できる任意のプロセスを意味する。
選択法は、ほとんどの標的に対する選択を可能にするように行うことができる。重要なことには、この選択法における工程はどれもライブラリー中の標的または分子の詳細な構造情報を必要としない。全プロセスは、所定の標的に対するライブラリー中の分子の特異的認識／配位結合に関与する結合親和性により支配される。しかしながら、いくつかの用途においては、必要ならば、ファージ提示を用いて触媒活性についての選択に類似した機能を含めることもできる（Ｓｏｕｍｉｌｌｉｏｎら、（１９９４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３７：４１５−２２；Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、（１９９８）ＰＮＡＳ、１８：１０５２３−１０５２８）。様々な選択法の例を以下に記載する。
【００８９】
ビルトインテンプレート提示分子選択法は、最適化に非常に適し、ここにおいて、選択工程は、連続して結合分子の選択で始まり、最適化結合分子で終わるようにされる。各工程における単一の手順は、様々なロボットシステムを用いて自動化することが可能である。これは、事象の連続した流れがあり、各事象は別々に行うことができるからである。最も好ましい設定において、適当なテンプレート提示分子ライブラリーおよび標的分子は、完全自動化システムに供給することができ、これにより最終的に最適化結合分子が生成する。さらに一層好ましくは、このプロセスは全工程中、ロボットシステムの外側での外部作業を必要とせずに行われる。
【００９０】
テンプレート提示分子のライブラリーは、既知または未知の標的に潜在的に配位結合できる分子を含有する。標的上の結合の領域は、酵素の触媒部位中、レセプター（例えば、ＧＰＣＲ）上の結合ポケット、タンパク質−タンパク質相互作用に関与するタンパク質表領域（特にホットスポット領域）、およびＤＮＡ上の特定の部位（例えば、主溝）中にあり得る。テンプレート提示分子技術は、標的分子と配位結合する分子をまず識別する。標的の天然の機能は、テンプレート提示分子の結合により、刺激される（アゴナイズ）または低減される（拮抗）または影響を受けないかのいずれかである。これは、正確な結合様式およびテンプレート提示分子が標的上に占有する特定の結合部位によって変わる。
【００９１】
しかしながら、機能的部位（例えば、タンパク質−タンパク質相互作用または触媒部位）または異なるタンパク質は、タンパク質上の他のさらに中性の表面部分である分子とさらに結合しやすいことが知られている。加えて、これらの機能的部位は通常、結合エネルギーに一次的責任があると思われるさらに小さな領域、いわゆるホットスポット領域を含有する（Ｗｅｌｌｓら、（１９９３）Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐｒｏｇ．Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒｅｓ．４８；２５３−２６２）。この現象は、ある種の標的の生物学的機能に影響を及ぼす小分子の直接選択の可能性を増大させる。
【００９２】
本発明のテンプレート提示分子技術は、ファージ提示（Ｓｍｉｔｈ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１３１５−１３１７）などの他の提示法と類似した選択法を可能にする。ファージ提示選択は、ペプチド（Ｗｅｌｌｓ＆Ｌｏｗｍａｎ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２，５９７−６０４）、タンパク質（Ｍａｒｋｓら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１６００７−１６０１０）および抗体（Ｗｉｎｔｅｒら（１９９４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３−４５５）についてうまく用いられてきた。類似の選択法もリボソーム提示（Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：９０２２−９０２６）およびｍＲＮＡ提示（Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：１２２９７−３０２）などの他の種類の提示システムに活用される。
【００９３】
テンプレートされた分子（提示された分子）とＤＮＡ複製単位（コーディングテンプレート）間の結合により、様々な選択法を用いた結合分子の識別が可能になる。本発明は、本質的に任意の公知標的に対する結合分子の識別における広範囲の方法を可能にする。加えて、この技術は、未知の抗原（エピトープ）に対する結合分子の単離により新規の未知標的の発見と、識別および確認のためのこれらの結合分子の使用を可能にする。
【００９４】
理解されるように、テンプレート提示分子ライブラリーからの結合分子の選択は、最適の結合分子を識別するための任意の様式で行うことができる。精製された標的に対する典型的な選択法は、次の主な工程を包含する：テンプレート提示分子ライブラリーの生成；適当な固定化法を用いた標的分子の固定化；テンプレート提示分子の結合を可能にするためのライブラリーの添加；非結合テンプレート提示分子の除去；固定化標的に結合したテンプレート提示分子の溶出；配列決定による識別または次回の選択のためにインプットするための濃縮されたテンプレート提示分子の増幅。一般的工程を図１２に概略的に示す。
【００９５】
好ましい具体例において、テンプレート提示分子ライブラリーを使用した標準的選択プロトコルは、バイオパンニング（ｂｉｏ−ｐａｎｎｉｎｇ）法を使用することである。この技術において、標的（例えば、タンパク質またはペプチド接合体）を固体支持体上に固定化し、潜在的に標的と配位結合するテンプレート提示分子は、選択され、濃縮されるものである。しかしながら、選択手順は、結合したテンプレート提示分子が未結合のもの、すなわち溶液中にあるものから分離できることを必要とする。これが当業者に公知のようにして行うことができる多くの方法がある。
【００９６】
親和性濃縮サイクルにおける第一工程は、固定化された標的に対して低親和性を示すテンプレート提示分子が洗い流され、標的と結合した、強力に結合するテンプレート提示分子が残る場合である。濃縮された集団は、ストリンジェントな洗浄後、標的に結合したままであり、次いで例えば酸、カオトロピックな塩、熱、既知のリガンドでの競合的溶出または標的／テンプレート分子のタンパク分解的放出で溶出される。溶出されたテンプレート提示分子は、ＰＣＲに好適であり、高次の増幅に至る。すなわち、第一回の選択において濃縮される各テンプレート提示分子は非常に増大したコピー数で選択のさらなる回に関与する。典型的には３ないし１０回の濃縮後、標的に最も強力に結合するテンプレート提示分子について非常に濃縮された分子の集団が得られる。これは、固定化標的に結合したままであるテンプレート提示分子の集団を分析することにより定量的に追跡される。変異テンプレート配列を次いで個々に配列化する。
【００９７】
ビーズ上での標的（ペプチド、タンパク質、ＤＮＡまたは他の抗原）の固定化は、標的が試験管に吸着する疑いがある場合（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから溶出された未フォールド標的）に有用である。単にビーズをベンチ遠心分離器中で沈降させることにより、誘導化されたビーズを次いでテンプレート提示分子から選択するために用いることができる。別法として、アフィニティーカラムおよびカラムを通って再循環されるテンプレート提示ライブラリー懸濁液を調製するためにビーズを使用することができる。たとえば−ＮＨ２基および−ＳＨ基に対する結合を包含する標的分子を固定化するために利用可能な反応性マトリックスが多くある。電磁ビーズは本質的に前記についての変異体であり；標的を電磁ビーズに結合させ、これは次いで選択において用いられる。活性化されたビーズは−ＮＨ２基または−ＣＯＯＨ基の結合部位（カップリングに使用できる）があれば利用できる。標的は、ニトロセルロースまたはＰＶＤＦ上にブロットすることもできる。ブロッティング法を用いる場合、標的の（例えば、ＢＳＡまたは類似のタンパク質での）固定化後、使用されるブロットのストリップを確実にすることが重要である。
【００９８】
もう一つ別の好ましい具体例において、選択または分割は：標的分子がテンプレート提示結合分子で補足される免疫沈降または間接的免疫沈降；標的がカラム上に固定化され、標的結合分子を補足するためにテンプレート提示ライブラリーが流されるアフィニティーカラムクロマトグラフィー；選択されたテンプレート提示分子がゲル中で標的と一緒に移動するゲル−シフト（アガロースまたはポリアクリルアミド）；テンプレート提示分子と配位結合する細胞を局在化するためのＦＡＣＳ分類；標的分子をテンプレート提示結合分子と共に分離するためのＣｓＣｌ勾配遠心分離；テンプレート提示分子で標識される標的分子を識別するための質量分析等を制限なく用いて行うこともできる。一般に、テンプレート提示分子／標的複合体を標的に結合していないテンプレート提示分子から分離できる任意の方法が有用である。
【００９９】
【表１】
2005521365.tif 000008
【０１００】
テンプレート提示分子の溶出は、異なる方法において行うことができる。結合分子は、変性、酸、またはカオトロピックな塩により標的分子から放出され、次いで増幅のために別のバイアルに移すことができる。別法として、溶出はバックグラウンドを減少させるためにさらに特異的であり得る。溶出は、標的と固定化表面間、または提示分子とテンプレート間のリンカーを開裂させるためのタンパク質分解を用いて行うことができる。さらに、溶出は既知のリガンドとの競合により行うことができる。別法として、選択反応の最後に洗浄されたウェル中でＰＣＲ反応を直接行うことができる。
【０１０１】
本発明の考えられる特徴は、結合分子それ自体でなく、エンコーディングテンプレートＤＮＡのみがさらなる増幅またはクローニングに必要であるので、結合分子が選択可能である標的から溶出可能である必要はないという事実である。ある選択法は、最も強力なリガンドと非常に堅固に結合できるので、溶出するのが非常に困難である。しかしながら、本発明の方法はうまく実施して、強力なリガンド、共有結合リガンドさえも得ることができる。
【０１０２】
別の選択プロトコルは、公知リガンドをライブラリー中の各提示分子のフラグメントとして包含する。公知リガンドは、標的分子上の所定の部分と配位結合させ、選択を同じ領域と結合する分子に集中させることにより選択を左右するであろう。これは、所望の生物学的機能を有するが、効力が低すぎるリガンドについての親和性を増大させるのに特に有用である。
【０１０３】
本発明のさらに別の態様は、選択された結合分子単独または混合物の多様性または複雑さを増大させる方法に関する。初期選択後、濃縮された分子を変更して、提示された分子の化学的多様性または複雑さをさらに増大させることができる。これは、当該分野において公知の様々な方法を用いて行うことができる。例えば、合成されたランダム化オリゴヌクレオチド、スパイク付オリゴヌクレオチドまたはランダム突然変異誘発を用いる。ランダム化は、好ましいコドンを許容するために集中させることができるか、またはテンプレートヌクレオチドのあらかじめ決められた部分またはサブ配列に局在化させることができる。他の好ましい方法は、タンパク質の相同遺伝子に関して使用されるＤＮＡシャッフリングと類似した方法で結合分子をコードするテンプレートを組み換えることである（Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ３７０：３８９−９１）。この方法は、初期ライブラリーを組み換えるために、さらに好ましくは濃縮されたエンコーディングテンプレートを組み換えるために用いることができる。
【０１０４】
本発明のもう一つの具体例において、例えばイオンチャンネルまたは貫膜レセプターなどの細胞表面上で唯一発現が可能な特定の抗原に対する結合分子が必要とされる場合、細胞粒子それ自体を選択剤として用いることができる。この種の方法において、特異的標的を欠いた細胞はを１回以上の負の選択を行うために用いるべきであるか、または選択プロセスにおいて大過剰で存在しなければならない。ここで、不適切なテンプレート提示分子は除去される。例えば、全細胞上で発現されたレセプターに対する正の選択に関して、負の選択は形質転換されていない細胞に対するものである。この方法は、サブトラクション選択とも呼ばれ、抗体ライブラリーに関するファージ提示についてうまく用いられる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ．４：１−２０）。
【０１０５】
選択法の具体例は、レセプターが選択された結合分子と共に細胞質または細胞核中に侵入できるように、膜から取り込まれるようになる細胞表面レセプターに対する選択を含む。特定の選択された結合分子について一定である分離速度に応じて、これらの分子は吸収後、細胞質または核のいずれかに主に存在する。
当業者らは、テンプレート提示分子が配位結合できるバイト（ｂａｉｔ）として標的が使用される任意の状況において選択プロセス行うことができることを認識するであろう。
【０１０６】
本発明の選択法は、結合により標的分子機能を修飾できる分子リガンドを識別するための二次選択またはスクリーニングと組み合わせることができる。従って、本明細書において記載される方法は、任意のタンパク質または核酸の機能と結合し、修飾する結合分子を分離または産生するために用いることができる。本発明の方法は、標的酵素の触媒活性に影響を及ぼす、すなわち、触媒作用を阻害するか、または基質結合を修飾し、タンパク質レセプターの機能に影響を及ぼし、すなわち、レセプターに対する結合を阻害するかまたはレセプターに対する結合の特異性を修飾し；タンパク質マルチマーの形成に影響を及ぼす、すなわち、タンパク質サブユニットの四次構造を破壊し；タンパク質の輸送特性を修飾する、すなわち、小分子またはイオンのタンパク質による輸送を中断する結合分子を識別するか、分離するか、または産生するために用いることができる。
【０１０７】
本発明のさらに別の態様は、選択プロセスにおける機能を可能にする方法に関する。例えば、多くの異なるヒットを生成するためにある種の標的に対する濃縮が行われる場合、これらのヒットを次いで直接機能（例えば、細胞シグナル伝達）について試験することができる。これは、例えば、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）を用いて行うことができる。
変更された表現型は広範囲に及ぶさまざまな方法で検出することができる。一般に、変更された表現型を、例えば：細胞形態の顕微鏡分析；標準的細胞生存性分析（増大した細胞死および増大した細胞生存性の両方を包含する）；標準的標識分析、例えば特定の細胞または分子のレベルの存在についての蛍光計インジケーター分析（ＦＡＣＳまたは他の色素染色技術を包含する）；細胞を殺した後の標的化合物の発現の生化学的検出などを用いて検出される。いくつかの場合において、特定のシグナリング経路は、様々なレポーター遺伝子構築物を用いてプローブすることができる。
【０１０８】
テンプレート提示分子技術と組み合わせることができる二次選択法は、特に酵素阻害、変更または基質結合、官能基の損失、構造の破壊などについての選択またはスクリーンを包含する。当業者らは、本明細書に記載される方法と適合性の選択またはスクリーニング法の様々な代替法から選択することができる。
本発明の結合分子は、結合以外の他の性質について選択することができる。例えば、選択中に；最終生成物の所望の作業環境のある種の条件に対する安定性を選択基準として含めることができる。ある種のプロテアーゼの存在下で安定な結合分子が望ましい場合、該プロテアーゼは選択中に用いられる緩衝媒体の一部であり得る。同様に、選択は血清または細胞抽出物または任意の種類の媒体中で行うこともできる。理解されるように、このテンプレート提示法を用いる場合、テンプレートを破壊または分解する条件は、増幅を許容するために回避しなければならない。当業者らには理解されるように、他の望ましい性質を提示分子中に直接取り入れることができる。例えば、高い疎水性を有するビルディングブロックを用いることにより、特性として膜親和性を含めることができる。
【０１０９】
テンプレート提示分子技術により選択される分子は、様々な合成法により産生することができる。選択された結合分子の構造がコーディングテンプレートの核酸配列から容易に得られるので化学合成を行うことができる。結合分子を構成するビルディングブロックはこれらを組み立てる化学反応以外にも公知であるので選択された分子の化学合成も可能である。
好ましい具体例において、選択された結合分子が合成され、生物学的効果および効力について選択された候補を検証するための種々の適当なインビトロおよびインビボ試験において試験される。当業者らには理解されるように、これは様々な方法で行うことができ、生物活性な分子の組成によって変わる。
【０１１０】
標的識別および検証
もう一つ別の態様において、本発明は病理プロセスまたは他の生物学的事象に含まれる標的を識別または単離するための方法を提供する。この態様において、標的分子はここでも好ましくはタンパク質または核酸であるが、特に、炭水化物および特異的分子リガンド結合が達成できる様々な分子も含むことができる。原則として、テンプレート提示分子技術は、細胞上、組織またはインビボで見いだされる抗原上の特異性エピトープに関して選択するために用いることができる。これらのエピトープは、重要な生物学的事象に関与する標的に属する。加えて、これらのエピトープは標的の生物学的機能にも関与する。
【０１１１】
抗体およびペプチドライブラリーでのファージ提示は、新規細胞抗原の識別において多数回成功裏に用いられてきた（例えば、Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ３８０：３６４−３６６；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら（２０００）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：７２２−７２７；Ｓｃｈｅｆｆｅｒら、（２００２）Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ８６：９５４−９６２；Ｋｕｐｓｃｈら（１９９９）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５：９２５−９３１；Ｔｓｅｎｇ−Ｌａｗら、（１９９９）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２７：９３６−９４５；Ｇｅｖｏｒｋｉａｎら（１９９８）Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．８６：３０５−３０９）。特に有効なのは、細胞特異性抗原を発現すると予想される細胞上での直接選択である。重要なことには、細胞表面抗原の選択の場合、テンプレート分子を細胞の外側に維持することができる。これにより、テンプレート分子が細胞表面について放出後にもとのままである可能性が増大するであろう。
【０１１２】
テンプレート提示分子のインビボ選択は、非常に有効である。インビボでテンプレート提示分子のライブラリーから選択することにより、正常組織に対して特異的に向かうことができる分子および他の病的組織（例えば、腫瘍）を単離できる。この原則は、ペプチドライブラリーのファージ提示を用いて説明されている（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ＆Ｒｕｏｓｌａｔｈｉ（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ２８０：３６４−３６６）。このシステムはまた、異なる器官に局在化したペプチドモチーフを識別するためにヒトにおいて用いられてきた（Ａｒａｐら（２００２）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：１２１−１２７）。類似の選択法をテンプレート提示ライブラリーについて用いることができる。ファージ粒子により有効に保護されたファージ提示におけるコーディングＤＮＡによりインビボでの選択が可能になる。従って、インビボでのテンプレートの安定性は、増幅および識別に重要である。テンプレートは、インビボ用途についてアプタマーを安定化するために用いられてきたのと類似の方法で様々なヌクレオチド誘導体を用いて安定化することができる（Ｎｏｌｔｅ（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１１１６−１１２１；Ｐａｇｒａｔｉｓら、（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：６８−７２）。しかしながら、テンプレート構造が提示された分子をエンコードするために用いられる修飾された塩基による分解に対して安定化されると考えるのは妥当である。テンプレート分子がさまざまな方法を用いて溶液についてシールドされている場合に、他の種類の保護も可能である。これは例えば、リポソーム、ペギレーション、結合タンパク質または他の種類の保護を包含する。テンプレート分子は、テンプレートを外部操作から保護する別の設計された構造中に組み入れることもできる。例えば、リンカーは、ベシクルの内部にテンプレートを、外側に提示分子を配置するためにベシクル中に組み入れられるように設計することができる。該配置は、テンプレート分子を外部操作から保護し、同時に選択を可能にするために提示分子の暴露を許容するであろう。
【０１１３】
ほとんどの抗体は、抗原上にある程度エピトープを産生することを必要とする大きな凹形の結合領域を有する。さらに、抗体分子は、（例えば表面上の）多くの異なる抗原への接近を立体的に軽減する大きな巨大分子（１５０ｋＤａ）である。テンプレート提示技術は、抗体に接近できないエピトープに接近し、認識することができなければならない。小結合分子は、抗原上の活性部位、溝および他の領域中に結合できる。コーディングテンプレートエレメントはテンプレート結合分子の物理的接近を増大させる抗体よりも小さい。加えて、テンプレート提示分子ライブラリーの多様性および複雑さは、ペプチドライブラリーに比べてかなり大きい。これは、不適当な化学的性質のためにペプチドに接近できないエピトープと配位結合できる分子を見いだす可能性を増大させるであろう。全体から見て、テンプレート提示分子技術は抗体またはペプチドと同一であるとすることができない新規抗原を識別する可能性を有する。当業者は、様々な種類の細胞を選択手順において用いることができることを認識するであろう。新規抗原についての選択は、前記のようなサブストラクション法を用いても行うことができると理解される。
【０１１４】
本発明のもう一つ別の態様は、識別された標的を確認する方法に関する。識別された結合分子が標的の生物学的反応を変えるならば、これらを直接用いることができる。これは、インビトロで任意の直接または細胞ベースのアッセイを用いるか、あるいは直接インビボで任意の表現型反応を研究するかのいずれかで行うことができる。この方法の長所は、様々な標的の識別および確認の両方に同じ分子が用いられることである。最も都合の良いことには、結合分子は治療薬としても直接用いることができる。
【０１１５】
もう一つの好ましい具体例において、テンプレート提示分子は、標的分子を引き抜くために用いられる。これは、例えば、バクテリオファージ上に発現されたｃＤＮＡライブラリーに対する選択により達成することができる（ライブラリー対ライブラリー）。テンプレート提示分子ライブラリーをｃＤＮＡライブラリーと混合することにより、テンプレート提示分子ライブラリー中の小分子とｃＤＮＡライブラリーからのタンパク質間に結合対を見いだすことができる。ファージ提示ライブラリーをテンプレート提示ライブラリーと混合し、ファージまたはテンプレートライブラリーのいずれかについて選択を行うことが可能である。選択されたライブラリーを次いで局在化されたファージクローンにプレートし、次いでＰＣＲを用いて該ファージをコードするＤＮＡおよびテンプレート提示された分子を識別することができる。ｃＤＮＡ以外の種類のライブラリー、例えば核酸、炭水化物、合成ポリマーなども用いることができる。
【０１１６】
本発明のもうひとつ別の具体例において、インビボおよびインビトロ薬剤代謝を明らかにするためにテンプレート提示分子技術を用いることができる。これは、Ｉ期（活性化）およびＩＩ期（無害化）反応の両方を包含する。主な反応は、酸化、還元、および加水分解である。他の酵素は、共役を触媒する。これらの酵素は、これらの酵素に配位結合しやすい提示された分子を除去するための選択プロセスにおいて標的として用いることができる。これらの提示された分子に対応するテンプレートを次いで、テンプレート提示分子ライブラリーを調製する場合に、これらの分子を競合または除去するために用いることができる。
【０１１７】
これらの得られたライブラリーは、Ｉ〜ＩＩ期に関与する酵素と結合する傾向を有し、より早く除去される可能性がある分子がない。これらの代謝酵素に配位結合しやすいこれらの結合分子を識別するために、例えば、それぞれの独立した酵素またはチトクロームＰ４５０酵素、フラビンモノオキシゲナーゼ、モノアミンオキシダーゼ、エステラーゼ、アミダーゼ、ヒドロラーゼ、リダクターゼ、デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼＵＤＰ−グルクロシルトランスフェラーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼならびに他の関連する酵素の任意の組み合わせに関する選択を行うことができる。阻害剤はその結合親和性のために容易に選択されるが、基質は識別されるためには少なくともマイクロモルの親和性が必要である。
【０１１８】
本発明のもう一つ別の興味深い具体例は、受動的または積極的に上皮原形質膜、または他の膜を通過して輸送されるようになる分子を直接選択する可能性である。可能な選択分析法は、ＣａＣＯ−２細胞、ヒト結腸上皮細胞系（一般に、胃腸管における上皮バリアについての良好なモデルとして承認されている）を使用する。ＣａＣＯ−２分析は、ヒト結腸上皮細胞系を組織培養ウェルインサート上で成長させ、結果として得られる単層が先端および基底コンパートメント間に生物学的バリアを形成するようにすることを含む。テンプレート提示分子ライブラリーを細胞単層のいずれかの側に置き、細胞単層を透過できる分子を集め、増幅させる。活性分子が識別されるまでこのプロセスを繰り返すことができる。他の細胞系またはこの分析法の設定が可能であり、当業者には明らかである。
【０１１９】
本発明のさらに別の態様は、選択された分子の安定性について選択する方法に関する。これは、結合分子の濃縮されたプールを、結合分子の構造を分解または変化させるおそれのある環境に付すことにより行うことができる。様々な条件は、ある種のプロテアーゼまたはプロテアーゼ、細胞抽出物、および例えば胃腸管からのさまざまな液体の混合物であり得る。他の条件は、様々な塩または酸環境または高温であり得る。もう一つ別の可能性は、既知のリガンドのライブラリーを生成させ、該ライブラリーを安定性試験および選択に付して、前記のようなある条件下で安定な分子を識別することである。
【０１２０】
治療用途
本発明のテンプレート提示分子技術は、様々な標的をブロックするか、または刺激するために用いることができる。治療的に関連する標的は、多機能性であり、従って疾患状態に至る調節プロセスに関与することが知られているか、または予想される物質である。かかるプロセスの例は、レセプター−リガンド相互作用、転写−ＤＮＡ相互作用、およびに接着分子を含む細胞−細胞相互作用、コファクター−酵素相互作用、および細胞内シグナル伝達におけるタンパク質−タンパク質相互作用である。標的分子とは、分子リガンドが望ましい興味のある任意の化合物を意味する。従って、標的は、例えば、化合物、化合物の混合物、空間的に局在化した化合物のアレイ、生物学的高分子、例えば、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ、バクテリオファージペプチド提示ライブラリー、リボソームペプチド提示ライブラリー、細菌、植物、真菌、または動物（例えば、哺乳動物）細胞または組織などの生物学的物質から調製される抽出物、タンパク質、融合タンパク質、ペプチド、酵素、レセプター、レセプターリガンド、ホルモン、抗原、抗体、薬剤、色素、成長因子、脂質、基質、毒素、ウイルスなどを制限なく包含する。標的の他の例は、例えば、全細胞、全組織、関連するタンパク質または関連しないタンパク質の混合物、ウイルスまたは細菌株の混合物などを制限なく包含する。
【０１２１】
治療薬標的は、機能に従って異なる種類：レセプター、酵素、ホルモン、転写因子、イオンチャンネル、核レセプター、ＤＮＡに分類することができる（Ｄｒｅｗｓ，Ｊ．（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：１９６０−１９６４）。これらのうち、レセプター、核レセプター、および代謝酵素が既存の薬剤について公知の標的のほとんどを圧倒的に構成する。特に、Ｇ−タンパク質結合レセプター（ＧＰＣＲ）は、薬理学的介入についてプロテアーゼと共に薬剤標的の最も重要な種類の一つを構成する。前記例は最も関連する標的に集中しているが、当業者には、他の治療標的も重要であることは自明であろう。
【０１２２】
テンプレート提示分子技術を用いる本発明は、各標的の持つ特性に応じて、これらの種類の薬剤標的の全てについて作用物質または拮抗物質を識別するために用いることができる。標的のほとんどは、直接選択法について精製された形態で得ることができる。他の標的は、埋め込まれた細胞表面レセプターなどのその本来の環境にある場合に用いなければならない。これらの状況において、テンプレート提示分子ライブラリーを用いた選択は、前記のサブトラクション選択を用いて行うことができる。
【０１２３】
本発明のテンプレート提示分子技術のある用途は、拮抗物質として機能できる分子を生成させることであり、ここにおいて分子はレセプターと１以上のリガンド間の相互作用をブロックする。もう一つ別の用途は、細胞ターゲティングを包含する。例えば、特定の表面タンパク質またはレセプターを認識する生成した分子はある種のセルタイプと結合することができる。かかる分子は、有効性を増大し、副作用を軽減するためにさらにもう一つ別の治療薬を有することができる（例えば癌治療）。抗ウイルス薬を含む用途も包含される。例えば、ウイルス粒子上のエピトープと強力に結合する生成した分子は、抗ウイルス薬として有用である。本発明のテンプレート提示分子技術のもう一つ別の用途は、作用物質として機能できる分子を生成させることであり、ここにおいて分子はレセプターを刺激または活性化して、細胞シグナル伝達経路を開始させる。
【０１２４】
（図面の簡単な記載）
図１は、共通のテンプレートにアニールされた２つのオリゴヌクレオチドのアミノ官能基の架橋を示すＰＡＧＥゲルの複写を示す。
図２は、共通のテンプレートにアニールされ、０、１、２、および３０塩基対間隔をおいて架橋された、２つのオリゴヌクレオチドを示すＰＡＧＥゲルの複写を示す。
図３は、それぞれアミンおよびカルボン酸が末端にある２つのオリゴヌクレオチドの架橋を示すＰＡＧＥゲルの複写を示す。
図４は、架橋効率に対する異なるｐＨ特性の影響を示すＰＡＧＥゲルの複写を示す。
図５は、架橋効率に対する異なるｐＨ特性の影響を示すＰＡＧＥゲルの複写を示す。
図６は、ｐＨ９での架橋効率を示すＰＡＧＥゲルの複写を示す。
図７は、ｐＨ１０での架橋効率を示すＰＡＧＥゲルの複写を示す。
図８は、１０ｍｅｒジッパーボックスが用いられる場合、テンプレートが存在しない影響を分析するＰＡＧＥゲルの複写である。
図９は、高いインキュベーション温度の架橋効率に対する影響を分析するＰＡＧＥゲルの複写を示す。
図１０は、架橋効率に対する５ｍｅｒジッパーボックスの影響を示すＰＡＧＥゲルの画像を示す。
図１１は、１０ｍｅｒジッパーボックスが用いられる場合、架橋効率に対する異なる温度の影響を示すＰＡＧＥゲルの画像を示す。
図１２は、実験において用いられる一般的原則の概略図を示す。
図１３は、（Ａ）スカフォード分子および（Ｂ）ポリマー分子の合成における二量化ドメインの使用の概略図を示す。
図１４は、一般的原則の好ましい具体例を示す。
図１５は、２つの異なる機能的エンティティーのスカフォード分子への移動のＬＣ−クロマトグラムを示す。
図１６は、実施例において用いられる２つのオリゴセットアップを開示する。
図１７は、実施例１５における実験ＡおよびＢの結果を示す。
図１８は、実施例１６において報告されている実験Ｄ、Ｅ、およびＦの結果を示す。
図１９は、実施例１７において報告されている実験ＡおよびＢの結果を示す。
図２０は、実施例１７の結果を示す。
図２１は、実施例１８において行われた実験の結果を示す。
図２２は、実施例１９において開示された実験の結果を示す。
図２３は、実施例２０において報告される実験ＡからＢの結果を示す。
図２４は、実施例２１において報告される実験ＥからＨの結果を開示する。
図２５は、実施例２１の結果を示す。
【０１２５】
図１３において、（Ａ）スカフォード分子および（Ｂ）ポリマー分子の合成における二量化ドメインの使用の概略図を示す。スカフォード分子（この実施例において、同じ種類の４つの反応性基Ｙを含有する）をテンプレートする場合、同一のジッパーボックス（ｂ）を有する４つのビルディングブロック、および（ｂ）に対して相補性のジッパーボックス（ａ）を有する１つのビルディングブロック（４つの反応性基Ｙを有する）を使用するのが好都合である。ポリマー分子をテンプレートする場合、ジッパー同一性間で交替することができる。すなわち、第一のビルディングブロックはジッパーボックス（ａ）を有し、該配列内の第二のビルディングブロックは（ａ）と二量化する（ｂ）を有し、第三のビルディングブロックは（ａ）を有するなど。
【０１２６】
図１４に示す好ましい具体例は、２つのジッパーボックスの二量化によりＸおよびＹを非常に接近させることにより、反応性基ＸおよびＹの局所濃度を増大させる。この例において、３つのビルディングブロックが示され、それぞれはジッパーボックスを有し、その内の２つは同じ配列（ａ）を有し、１つは相補配列（ｂ）である。まず、ビルディングブロックを中程度の温度でテンプレートにアニールする（ここにおいて、ジッパーボックス間の相互作用は微々たるものである）。次いで、温度を、２つの相補ジッパードメイン（（第一のビルディングブロックの）ａおよび（第二のビルディングブロックの）ｂ）が互いにアニールされるさらに低い温度まで低下させる。これにより、ＸおよびＹは非常に接近し、ＸおよびＹは反応して、ＹＸを形成することができる。この例において、ＸとＹの間の反応は、Ｘを、第一のビルディングブロックから、Ｙを有する第二のビルディングブロックへ移動させることを含む。温度が中程度の温度まで上昇する場合、ジッパーボックスが分離する。温度がさらに下げられる場合、第二のビルディングブロックのジッパードメインを第三のビルディングブロックのジッパーボックス（反応性基Ｘを有する）にアニールすることができる。その結果、このＸを第二のビルディングブロックに移すことができ、その結果、近接性が増大し、従ってＸとＹの間の反応性が増大する。
【０１２７】
（実施例）
実施例１ないし１１の一般法および材料
２つのオリゴが同じテンプレート上で隣接する部位にアニールされる場合に、それぞれがオリゴヌクレオチドにカップリングした２つの反応性基間の反応効率を調べるために、
下記に示す一般的セットアップを使用した。２つのオリゴは、下記の図に示されるように、カルボン酸またはアミンで誘導化される末端ヌクレオチド（Ｘ、ＹおよびＺ）を含有する。２つのオリゴの末端上の反応性基の反応（架橋）後、２つのオリゴがこの架橋の結果としてカップリングするようになり、従ってカラムを通してさらにゆっくりと移動するので、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により架橋効率を分析した。
2005521365.tif 000009
ビルディングブロック
・Ａｈ１：５’−ＧＣＴＡＣＴＣＧＴＡＣＧＡＧＸ
・Ａｈ３：５’−ＧＣＴＡＣＴＣＧＴＡＣＧＡＧＹ
・Ａｈ５：５’−ＧＣＴＡＣＴＣＧＴＡＣＧＡＧＺ
・Ａｈ２：５’−ＸＣＡＣＴＴＧＣＡＧＡＣＡＧＣ
・Ａｈ４：５’−ＹＣＡＣＴＴＧＣＡＧＡＣＡＧＣ
・Ａｈ６：５’−ＺＣＡＣＴＴＧＣＡＧＡＣＡＧＣ
・Ａｈ１４：５’−ＧＣＴＡＣＴＣＧＴＡＣＧＡＧ
・Ａｈ２３：５’−ＧＣＴＡＣＴＧＧＣＡＴＣＧＧＸ
・Ａｈ２４：５’−ＧＣＴＡＣＴＧＧＣＡＴＣＧＧＹ
・Ａｈ２７：５’−ＹＣＡＣＴＴＧＣＡＧＡＣＡＧＣ
【０１２８】
ジッパーボックスに関連する実施例において、次の配列を使用した
・ＡＨ３６：５’−ＣＧＡＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＧＣＡＴＣＧＧＴＣＡＴＧＧＣＴＧＡＣＴＧＴＣＣＧＴＣＧＡＡ−ＴＧＴＧＴＣＣＡＧＴＴＡＣＸ
・ＡＨ３７：５’−ＺＧＴＡＡＣＴＧＧＡＣＴＧＴＡＡＧＣＴＧＣＣＴＧＴＣＡＧＴＣＧＧＴＡＣＴＧＡＣＣＴ−ＧＴＣＧＡＧＣＡＴＣＣＡＧＣＴ
・ＡＨ５１：５’−ＺＧＴＡＡＣＡＣＣＴＧＴＧＴＡＡＧＣＴＧＣＣＴＧＴＣＡＧＴＣＧＧＴＡＣＴＧＡＣＣＴ−ＧＴＣＧＡＧＣＡＴＣＣＡＧＣＴ
・ＡＨ６７：５’−ＺＣＡＴＴＧＡＣＣＴＧＴＧＴＡＡＧＣＴＧＣＣＴＧＴＣＡＧＴＣＧＧＴＡＣＴＧ−ＡＣＣＴＧＴＣＧＡＧＣＡＴＣＣＡＧＣＴ
・ＡＨ６９：５’−ＡＧＺＡＡＣＡＣＣＴＧＴＧＴＡＡＧＣＴＧＣＣＴＧＴＣＡＧＴＣＧＧＴＡＣＴＧ−ＡＣＣＴＧＴＣＧＡＧＣＡＴＣＣＡＧＣＴ
・ＡＨ６６：５’−ＺＴＴＧＴＡＡＣＴＧＧＡＣＴＧＴＡＡＧＣＴＧＣＣＴＧＴＣＡＧＴＣＧＧＴＡＣＴＧＡＣＣ−ＴＧＴＣＧＡＧＣＡＴＣＣＡＧＣＴ
・ＡＨ６５：５’−ＣＧＡＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＧＣＡＴＣＧＧＴＣＡＴＧＧＣＴＧＡＣＴＧＴＣＣＧＴＣＧ−ＡＡＴＧＴＧＴＣＣＡＧＴＴＡＣＴＴＸ
ジッパーボックスドメインに下線を施す。
・Ｘ＝Ｘ＝カルボキシ−ｄＴ
・Ｙ＝アミノフェノール−修飾因子Ｃ２  ｄＴ
・Ｚ＝アミノフェノール−修飾因子Ｃ６  ｄＴ
【０１２９】
【化６】
2005521365.tif 000010
【０１３０】
従来のホスホアミダイト法にしたがってオリゴヌクレオチドを調製した。商業的に入手可能なカルボキシ−ｄＴホスホルアミダイト（Ｇｌｅｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈからの１０−１０３５−９０）を用いてＸを組み入れた。末端がＹおよびＺであるオリゴヌクレオチドは、一般法を用いて対応するＸ末端オリゴヌクレオチドから調製することができる。
【０１３１】
テンプレート
Ａｈ２８：５’−ＧＣＴＧＴＣＴＧＣＡＡＧＴＧＡＡＣＣＧＡＴＧＣＣＡＧＴＡＧＣ
Ａｈ３８：５’−ＡＧＣＴＧＧＡＴＧＣＴＣＧＡＣＡＧＧＴＣＣＣＧＡＴＧＣＡＡＴＣＣＡＧＡＧＧ  ＴＣＧ
Ａｈ７：５’−ＧＣＴＧＴＣＴＧＣＡＡＧＴＧＡＡＣＴＣＧＴＡＣＧＡＧＴＡＧＣＧＡＣＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧＧＴＣＡＣＧ−ビオチン−３’
Ａｈ８：５’−ＧＣＴＧＴＣＴＧＣＡＡＧＴＧＡＣＡＣＴＣＧＴＡＣＧＡＧＴＡＧＣＧＡＣＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧＧＴＣＡＣＧ−ビオチン−３’
Ａｈ９：５’−ＧＣＴＧＴＣＴＧＣＡＡＧＴＧＡＣＧＡＣＴＣＧＴＡＣＧＡＧＴＡＧＣＧＡＣＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧＧＴＣＡＣＧ−ビオチン−３’
Ａｈ１１：５’−ＧＣＴＧＴＣＴＧＣＡＡＧＴＧＡＣＧＡＣＴＧＡＴＣＣＡＧＴＧＡＣＡＴＧＣＧＴＡＣＣＡＴＣＧＡＡＣＴＣＧＴＡＣＧＡＧＴＡＧＣＧＡＣＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧＧＴＣＡＣＧ−ビオチン−３’
テンプレートを通常のホスホルアミダイト合成法により調製した。
【０１３２】
緩衝液
緩衝液Ａ（１００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ＝７．５、１Ｍ  ＮａＣｌ）
緩衝液Ｂ：（１００ｍＭ  ＮａＰＯ４  ｐＨ＝６、１Ｍ  ＮａＣｌ）
緩衝液Ｃ：（１００ｍＭ  ホウ酸ナトリウム  ｐＨ＝９、１Ｍ  ＮａＣｌ）
緩衝液Ｄ：（１００ｍＭ  ホウ酸ナトリウム  ｐＨ＝１０、１Ｍ  ＮａＣｌ）
緩衝液Ｅ：（５００ｍＭ  ＮａＰＯ４  ｐＨ＝７、１Ｍ  ＮａＣｌ）
緩衝液Ｆ：（５００ｍＭ  ＮａＰＯ４  ｐＨ＝８、１Ｍ  ＮａＣｌ）
【０１３３】
ＤＮＡオリゴヌクレオチドのアニーリング
関連する緩衝液中でオリゴを混合し、８０℃に加熱し、次いで２８℃に冷却する（−２℃／３０秒）。
３２Ｐでの５’−標識
２００ピコモルのオリゴヌクレオチド、２μｌの１０×ホスホリル化緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号４１０３）、１μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号４１０３）、１μｌのγ−３２Ｐ  ＡＴＰ、Ｈ２Ｏ（２０μｌになるように）を混合する。３７℃で１０〜３０分間インキュベートする。
【０１３４】
ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）
サンプルをホルムアミド色素１：１（９８％ホルムアルデヒド、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８、０．０２５％キシレンシアノール、０．０２５％ブロモフェノールブルー）と混合し、８０℃で２分間インキュベートし、変性１０％ポリアクリルアミドゲルにかける。オートラジオグラフィー（Ｋｏｄａｋ、ＢｉｏＭａｘ  ｆｉｌｍ）を用いてゲルを展開する。
【実施例１】
【０１３５】
２μｌの緩衝液Ａ、２μｌの関連するオリゴ１（２ピコモル／ｕｌ）、２μｌの関連するオリゴ２（２ピコモル／ｕｌ）、４μｌの関連するオリゴ３（２ピコモル／ｕｌ）を混合する（下記の表Ｉ参照）。
【表２】
2005521365.tif 000011
前記のようにアニールする。１μｌの１００ｍＭ、１μｌの１０ｍＭ、または０．１μｌの１０ｍＭ  ＴＳＡＴ（トリス−スクシニミジルアミノトリアセテート、Ｐｉｅｒｃｅカタログ番号３３０６３、ＤＭＳＯ中に溶解）を添加する。２５℃で約１時間インキュベートし、次いで前記のように１０％尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析する。
結果を図１に示す。
【実施例２】
【０１３６】
２μｌの緩衝液Ａ、２μｌの関連するオリゴ１（０．２ピコモル／ｕｌ）、１μｌの関連するオリゴ２（１０ピコモル／ｕｌ）、１μｌの関連するオリゴ３（１０ピコモル／ｕｌ）、４μｌのＨ２Ｏを混合する（下記の表ＩＩ参照）。
【表３】
2005521365.tif 000012
前記のようにアニールする。１μｌの１００ｍＭ、１０ｍＭまたは１ｍＭ  ＴＳＡＴ（トリス−スクシニミジルアミノトリアセテート、Ｐｉｅｒｃｅカタログ番号３３０６３、ＤＭＳＯ中に溶解）を添加する。２５℃で約５時間インキュベートし、次いで前記のように１０％尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動を実行する。
結果を図２に示す。
【実施例３】
【０１３７】
２μｌの緩衝液Ａ、２μｌの関連するオリゴ１（０．２ピコモル／ｕｌ）、１μｌの関連するオリゴ２（１０ピコモル／ｕｌ）、１μｌの関連するオリゴ３（１０ピコモル／ｕｌ）、４μｌのＨ２Ｏを混合する（下記の表ＩＩＩ参照）。
【表４】
2005521365.tif 000013
前記のようにアニールする。１μｌの１Ｍ、１００ｍＭ、１０ｍＭまたは１ｍＭ  ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、Ｆｌｕｋａ＃０３４５０）および１μｌの１００ｍＭ  ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）（Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号１３０６７−２）を添加する。２５℃で約５時間インキュベートし、前記のように１０％尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析する。
結果を図３に示す。
【実施例４】
【０１３８】
２μｌの緩衝液Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥまたはＦ、２μｌの関連するオリゴ１（０．２ピコモル／ｕｌ）、１μｌの関連するオリゴ２（１０ピコモル／ｕｌ）、１μｌの関連するオリゴ３（１０ピコモル／ｕｌ）、４μｌのＨ２Ｏを混合する（下記の表ＩＶ参照）。
【表５】
2005521365.tif 000014
前記のようにアニールする。実験Ｑを１μｌの１００Ｍ  ＥＤＣおよび１μｌの１００ｍＭ  ＮＨＳに添加する。実験Ｒを１μｌの１００ｍＭ  ＴＳＡＴに添加する。２５℃で約１．５時間インキュベートし、前記のように１０％尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析する。
結果を図４に示す。
【実施例５】
【０１３９】
２μｌの緩衝液ＡまたはＤ、２μｌの関連するオリゴ１（０．２ピコモル／ｕｌ）、２μｌの関連するオリゴ２（１０ピコモル／ｕｌ）、２μｌの関連するオリゴ３（１０ピコモル／ｕｌ）、２μｌのＨ２Ｏを混合する（下記の表Ｖ参照）。
【表６】
2005521365.tif 000015
前記のようにアニールする。１μｌの１００Ｍ  ＴＳＡＴを添加する。２５℃で約１．５時間インキュベートし、次いで１０％尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析する。
結果を図５に示す。
【実施例６】
【０１４０】
２μｌの緩衝液Ａ、ＢまたはＤ、１μｌの関連するオリゴ１（２ピコモル／ｕｌ）、１μｌの関連するオリゴ２（１０ピコモル／ｕｌ）、１μｌの関連するオリゴ３（１０ピコモル／ｕｌ）、５μｌのＨ２Ｏを混合する（下記の表ＶＩ参照）。
【表７】
2005521365.tif 000016
前記のようにアニールする。実験ＵおよびＶを１μｌの１００Ｍ  ＥＤＣおよび１μｌの１００ｍＭ  ＮＨＳに添加し、２４℃で約１時間インキュベートし、次いで２μｌの緩衝液Ｃを添加し、次いで２４℃で３０分間インキュベートする。実験ＸおよびＹを２μｌの５０ｍＭ  ＴＳＡＴに添加する。前記のように、２４℃で約１．５時間インキュベートし、次いで１０％尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析する。
結果を図６に示す。
【実施例７】
【０１４１】
２μｌの第一緩衝液（下記参照）、１μｌのＡｈ２３（２ピコモル／ｕｌ）、１μｌのＡｈ２７（１０ピコモル／ｕｌ）、１μｌのＡｈ２８（１０ピコモル／ｕｌ）、５μｌのＨ２Ｏを混合する。前記のようにしてアニールし、次いで１μｌの１００ｍＭ  ＮＨＳおよび１μｌの１Ｍ  ＥＤＣを添加し、２４℃で３０分間インキュベートし、次いで３μｌの第二の緩衝液（下記参照）を添加する。２４℃で４０分間インキュベートし、次いで１０％尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析する。
【表８】
2005521365.tif 000017
結果を図７に示す。
【実施例８】
【０１４２】
ミックス８−１：２μｌの緩衝液Ｂ、５μｌのＡｈ３６（０．４ピコモル／ｕｌ）、１μｌのＡｈ３７（２ピコモル／ｕｌ）、１μｌのＡｈ３８（２ピコモル／ｕｌ）、１μｌのＨ２Ｏを混合する。
ミックス８−２：２μｌの緩衝液Ｂ、５μｌのＡｈ３６（０．４ピコモル／ｕｌ）、１μｌのＡｈ３７（２ピコモル／ｕｌ）、２μｌのＨ２Ｏを混合する。８０℃に加熱することによりアニールし、次いで４４℃に冷却する（−２℃／３０秒）。１μｌの１００ｍＭ  ＮＨＳおよび１μｌの１Ｍ  ＥＤＣを添加する。表示された温度（下記参照）で４５分間インキュベートし、次いで２μｌの緩衝液Ｄを添加する。約２時間インキュベートし、次いで１０％尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析する。
インキュベーション温度：
４５℃、４８．２℃、５３．０℃、５８．５℃、６３．１℃、６５．６℃
結果を図８に示す。
【実施例９】
【０１４３】
ミックス９−１：２μｌの緩衝液Ｂ、１μｌのＡｈ３６（２ピコモル／ｕｌ）、１μｌのＡｈ５１（２ピコモル／ｕｌ）、１μｌのＡｈ３８（２ピコモル／ｕｌ）、５μｌのＨ２Ｏを混合する。
ミックス９−２：２μｌの緩衝液Ｂ、１μｌのＡｈ３６（２ピコモル／ｕｌ）、１μｌのＡｈ５１（２ピコモル／ｕｌ）、６μｌのＨ２Ｏを混合する。８０℃に加熱することによりアニールし、次いで３５℃に冷却するか（−２℃／３０秒）（温度１〜６）、または８０℃に加熱し、次いで１５℃に冷却する（−２℃／３０秒）（温度７〜１２）。１μｌの１００ｍＭ  ＮＨＳおよび１μｌの１Ｍ  ＥＤＣを添加する。表示された温度（下記参照）で１時間インキュベートし、次いで２μｌの緩衝液Ｄを添加する。前記のように、１時間インキュベートし、次いで１０％尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析する。
インキュベーション温度：
１）３４．９℃、２）３６．３℃、３）４０．３℃、４）４５．７℃、５）５１．０℃、６）５５．７７℃、７）１４．９℃、８）１７．８℃、９）２２．７℃、１０）２８．３℃、１１）３１．０℃、１２）３６℃
ミックス９−３：２μｌの緩衝液Ｂ、０．５μｌのＡｈ３６（２ピコモル／ｕｌ）、１μｌのＡｈ５１（２ピコモル／ｕｌ）、１μｌのＡｈ３８（２ピコモル／ｕｌ）、５．５
μｌのＨ２Ｏを混合する。
ミックス９−４：２μｌの緩衝液Ｂ、０．５μｌのＡｈ３６（２ピコモル／ｕｌ）、１μｌのＡｈ５１（２ピコモル／ｕｌ）、６．５μｌのＨ２Ｏを混合する。８０℃で加熱することによりアニールし、次いで５℃に冷却する（−２℃／３０秒）。
１μｌの１００ｍＭ  ＮＨＳおよび１μｌの１Ｍ  ＥＤＣを添加する。異なる温度（下記参照）で１時間インキュベートし、次いで２μｌの緩衝液Ｄを添加する。１時間インキュベートし、次いで１０％尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析する。
インキュベーション温度：
１）５．９℃、２）９．９℃、３）１２．６℃、４）１８．３℃、５）２３．３℃、６）２７．９℃、７）３５．６℃、８）４５．９℃
結果を図９に示す。
【実施例１０】
【０１４４】
２μｌの緩衝液Ａ、１μｌの関連するオリゴ１（２ピコモル／ｕｌ）、１μｌの関連するオリゴ２（１０ピコモル／ｕｌ）、１μｌの関連するオリゴ３（１０ピコモル／ｕｌ）、５μｌのＨ２Ｏを混合する（下記の表ＶＩ参照）。前記のようにアニールする。
１μｌの１００ｍＭ  ＮＨＳおよび１μｌの１Ｍ  ＥＤＣを添加する。異なる温度１）７．７℃、２）１５．４℃、３）２１．０℃、４）２６．２℃で約２時間、５）１０℃で約１秒間、次いで３５℃で１秒間インキュベートする。９９回繰り返す。１０％尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析する。
【表９】
2005521365.tif 000018
結果を図１０Ａおよび図１０Ｂに示す。
【実施例１１】
【０１４５】
２．５μｌの緩衝液Ａ、１μｌの関連するオリゴ１（２ピコモル／ｕｌ）、１μｌの関連するオリゴ２（１０ピコモル／ｕｌ）、１μｌの関連するオリゴ３（１０ピコモル／ｕｌ）、４．５μｌのＨ２Ｏを混合する（下記表参照）。８０℃に加熱し、次いで３０℃または５５℃に冷却することによりアニールする。１μｌの１００ｍＭ  ＮＨＳおよび１μｌの１Ｍ  ＥＤＣを添加する。３０℃または５５℃でインキュベートする。次いで、１０％尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析する。
【表１０】
2005521365.tif 000019
結果を図１１に示す。
【０１４６】
実施例１ないし１１の結果の考察
架橋効率に対するリンカーの長さおよび反応性基間の間隔の影響
本発明者らはまず、アミンとヌクレオチドを結合させるリンカーの長さを変えることの影響を調べた。オリゴＡｈ３およびＡｈ５は、それぞれ７および１１の結合（それぞれアミノ修飾因子Ｃ２  ｄＴおよびアミノ修飾因子Ｃ６  ｄＴと呼ばれる。前記式参照）によりヌクレオチドの塩基から離れたアミンを含有する。これらのオリゴを、オリゴＡｈ４またはＡｈ６（それぞれアミノ修飾剤Ｃ２  ｄＴおよびアミノ修飾因子Ｃ６  ｄＴを有する）のすぐ隣に、すなわち、２つのオリゴ間の間隔が０塩基対でアニールした。
図１、レーンＡおよびＢにおいて見られるように、架橋の効率はどちらのアミノ修飾因子についてもほぼ同じである。
次の実験全てにおいて、オリゴＡｈ５（アミノ酸修飾因子Ｃ６  ｄＴを含有）を反応性基アミンとして使用した。
【０１４７】
次に、２つのオリゴを、２つのオリゴ間の間隔が０、１、２、および３０塩基対でテンプレートにアニールし、架橋の効率を調べた。まず、ＴＳＡＴ（トリス−スクシニミジルアミノトリアセテート、Ｐｉｅｒｃｅカタログ番号３３０６３、ＤＭＳＯ中に溶解）を用いて架橋を調べた。オリゴＡｈ５およびＡｈ６を使用した場合、架橋反応の効率は０塩基対の間隔で最高であり（図１、レーンＢ；図２、パネルＨ）、１塩基対の間隔で効率が低く（図１、レーンＤ；図２、パネルＩ）、２および３０塩基対の間隔で非常に効率が低かった（図１、レーンＥおよびＦ；図２、パネルＪおよびＫ）。
第二に、アミンおよびカルボン酸の架橋を調べた。この実験において、２つの反応性基を架橋するために、ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩およびＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）を添加した。オリゴＡｈ１およびＡｈ６を使用した場合、架橋の効率はここでも０塩基対の間隔で最高であり（図３、パネルＭ）、１塩基対の間隔で比較的高く（図３、パネルＮ）、２および３０塩基対の間隔でそれぞれ少しおよびわずかであった（図３、パネルＯおよびＰ）。
【０１４８】
ＴＳＡＴおよびＥＤＣ濃度の最適化
オリゴＡｈ５およびＡＨ６を使用することによりＴＳＡＴ濃度の重要性を試験した。１または１０ｍＭ  ＴＳＡＴの濃度により、０．１ｍＭおよび１００ｍＭ  ＴＳＡＴ（図１および２）の両方よりも有効な架橋が得られる。最高のＴＳＡＴ濃度（１００ｍＭ）を用いた場合に得られるさらに低い架橋効率は、隣接するアミンのそれぞれと反応する２つのＴＳＡＴ分子により説明することができる。次に、ＥＤＣ濃度の重要性を、アミンを有するオリゴ（Ａｈ６）およびカルボン酸を有するオリゴ（Ａｈ１）について調べた。あらかじめ、約１０ｍＭのＮＨＳ濃度はＥＤＣと共に使用した場合に最高の架橋効率を提供することが判明している。図３に示すように、１００ｍＭ  ＥＤＣの結果、０．１ｍＭ、１ｍＭおよび１０ｍＭ  ＥＤＣと比較した場合に最高の架橋効率が得られる。
【０１４９】
ＴＳＡＴおよびＥＤＣ／ＮＨＳ架橋反応についてのｐＨの最適化
次に、本発明者らは、ＥＤＣ／ＮＨＳまたはＴＳＡＴ試薬のいずれかを使用して架橋効率についての異なるｐＨ特性の影響を試験した。
１０のｐＨで２つのアミンの最も有効なＴＳＡＴ架橋が得られる（図４、パネルＲ；図５、パネルＳ）。オリゴＡｈ５およびＡｈ６をこの研究において使用した。実験６（図６）において、ｐＨ１０、およびアミンを有するオリゴＡｈ２４とＡｈ２７の間の０塩基対の間隔を用いて８０％の架橋効率が得られる。相補エレメント（テンプレートにアニールするオリゴの領域）と反応性基（アミンまたはカルボン酸）を分離するリンカーがもっと大きい（例えば、図１１および１２）他の実験において、架橋効率はもっと低い。
【０１５０】
ＥＤＣ／ＮＨＳを用いて異なるｐＨ特性の架橋効率に対する影響を調べるために、オリゴＡｈ１およびＡｈ６を次に使用した。最も有効な架橋を仲介する一定のｐＨは、ｐＨ７．５である（図４、パネルＱ）。しかしながら、ｐＨがまずｐＨ６に保持され、次いでｐＨ９（図６）または１０（図７）に上昇する場合に、さらに良好な架橋効率が得られる。後者の２つの実験において、オリゴＡｈ２３およびＡｈ２７を使用した。これらの条件下で、架橋効率はほぼ１００％である。これらの実験において、反応性基と相補エレメントを結合するリンカーは比較的短いことに注意（例えば、Ａｈ２７については１１結合）。
【０１５１】
ジッパーボックス配列を使用した場合の架橋効率の調査
本発明者らは次に、反応性基（アミンまたはカルボン酸）を有するオリゴを用いて架橋効率を調査し、ここにおいて、反応性基とアニーリング領域を結合するリンカーはほぼ２５ヌクレオチドであった。
第一の実験において、オリゴＡｈ３６（カルボン酸を有する）およびＡｈ６７（アミンを有する）を使用した。使用したテンプレート（Ａｈ３８）はすぐ隣にある、すなわち間隔が０塩基対である２つのオリゴをアニールする。
実験の条件下で、５％未満の架橋効率が、試験した最高の温度でのみ観察される（図１０、ＡおよびＢ、レーン５）。架橋効率を向上させるために、本発明者らはいわゆるジッパーボックス配列をそれぞれオリゴＡｈ６７およびＡｈ３６の５’−および３’−末端、（反応性基を有する同じ末端）で導入した。ジッパーボックスは相補配列であり、従って２つのオリゴの反応性基を非常に近接させる。２つの異なる長さのジッパーボックス、すなわち、１０’ｍｅｒジッパーボックス（Ａｈ３７／Ａｈ６６、Ａｈ３７は１０塩基対のＤＮＡ二本鎖を形成する）および５’ｍｅｒジッパーボックス（５塩基対のＤＮＡ二本鎖を形成する）を試験した。図１２参照。さらに、異なるデザインのジッパーボックス、例えば反応性基がジッパーボックスのすぐ隣に結合しているオリゴ（Ａｈ３６、Ａｈ３７、Ａｈ５１）、またはジッパーボックスから２ヌクレオチド上流にあるオリゴ（Ａｈ６５、Ａｈ６６）、またはジッパーボックスの中央にあるオリゴ（Ａｈ６７）を試験した。
【０１５２】
本発明者らは、まず架橋効率に対する５’ｍｅｒジッパーボックスの影響を試験した。分かるように、５’ｍｅｒジッパーボックスは架橋効率を著しく向上させる（図１０、ＡおよびＢ、レーン３とレーン５を比較）。テンプレートは試験したあらゆる温度での架橋に絶対に必要であることに注意。温度が１０℃から３５℃の間で９９回上下することを繰り返す場合に最高の架橋効率が得られる（図１０Ｂ）。温度が２１℃または２６℃に一定に保たれる場合にも高い効率が得られる（図１０ＡおよびＢ、レーン３）。架橋効率は２６℃より高い温度ではさらに向上されない（図９、ＡおよびＢ）。
本発明者らは次に、１０’ｍｅｒジッパーボックス様式における架橋効率を試験した。オリゴＡｈ３６およびＡｈ３７をテンプレートＡｈ３８にアニールし、架橋効率を様々な温度で調べた。テンプレートの不在下で、驚くほど高い架橋効率が観察された（図８、４５℃および４８．２℃）。しかしながら、５８．５℃より高い温度では、テンプレートの不在下で架橋は観察されない。
【０１５３】
次に、ジッパーボックスに対して異なる位置の反応性基を試験した。図１０、ＡおよびＢ、レーン７において示すように、反応性基がジッパーボックスの中央に位置する（すなわち、反応性基がＤＮＡ二重螺旋形成に関与するヌクレオチドに結合している；Ａｇ６７）場合に、架橋効率は著しく減少する。
ジッパーボックスに対する反応性基の位置も１０’ｍｅｒジッパーボックスに関して試験した。これに関連して、両反応性基がジッパーボックスから２ヌクレオチド離れている場合（Ａｈ６５、Ａｈ６６）、架橋効率は若干減少する（図１１、レーン１と３を比較）。Ａｈ６５、Ａｈ６６、Ａｈ３６およびＡｈ３７の異なる組み合わせを試験する場合（すなわち、反応性基がジッパーボックスのすぐ隣、または２ヌクレオチド上流にある場合）、架橋効率は著しく変化しない。１０’ｍｅｒジッパーボックスに関連してあらゆる温度でテンプレートは絶対に必要というわけではないことに注意。このテンプレート非依存性は、低い温度で特に顕著である（例えば、図１１、３０℃）。
【実施例１２】
【０１５４】
トリスアミンスカフォードビルディングブロック
カルボン酸部分を有する修飾された核酸塩基を含有するオリゴを、慣例のホスホルアミダイト法を用いて合成した：
（配列番号）５’−ＧＡＣ  ＣＴＧ  ＴＣＧ  ＡＧＣ  ＡＴＣ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＣＡＴ  ＧＧＧ  ＡＡＴ  ＴＣＣ  ＴＣＧ  ＴＣＣ  ＡＣＡ  ＡＴＧ  Ｘ
商業的に入手可能なカルボキシ−ｄＴホスホルアミダイト（Ｇｌｅｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈから得られる１０−１０３５−９０）を用いてＸを組み入れた。下線を施した核酸塩基は、ジッパー領域を表す。
【０１５５】
反応の概略図
【化７】
2005521365.tif 000020
カルボン酸部分を有する修飾された核酸塩基を含有するオリゴ（１ナノモル）を水（１００ｕＬ）、ヘペス緩衝液（２００ｍＭを４０ｕＬ、ｐＨ＝７．５）、ＮＨＳ（１００ｍＭ溶液を２０ｕＬ）、ＥＤＣ（新たに調製した１Ｍ溶液を２０ｕＬ）およびテトラキス（アミノメチル）メタンテトラヒドロクロリド（１００ｍＭ溶液を２０ｕＬ）と混合した。反応混合物を室温で一夜放置した。真空中での蒸発化により体積を６０ｕＬに減少させた。濃ＮＨ３（２０ｕＬ）を添加し、続いてＨＰＬＣ精製により、純粋なオリゴが得られた。次の勾配を用いて約６分後にピークを単離することができた：０〜３分  １００％Ａ、次いで１５％Ａおよび８５％Ｂ３〜１０分、次いで１００％Ｂ１０〜１５分、次いで１００％Ａ１５〜２０分。Ａ＝１０ｍＭ  ＴＥＡＡ中２％アセトニトリル、Ｂ＝１０ｍＭ  ＴＥＡＡ中８０％アセトニトリル。
【実施例１３】
【０１５６】
機能的エンティティーをチオオリゴと結合させるための一般的手順
Ｓ−トリフェニルメチル保護チオ部分を有する修飾された核酸塩基を含有する次のオリゴを、慣例のホスホルアミダイト法を用いて合成した：
（配列番号）：５’−ＷＣＡ  ＴＴＧ  ＡＣＣ  ＴＧＴ  ＣＴＧ  ＣＣＢ  ＴＧＴ  ＣＡＧ  ＴＣＧ  ＧＴＡ  ＣＴＧ  ＴＧＧ  ＴＡＡ  ＣＧＣ  ＧＧＡ  ＴＣＧ  ＡＣＣ  Ｔ
（配列番号）：５’−ＷＣＡ  ＴＴＧ  ＡＣＣ  ＴＧＴ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＢＴＡ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  ＣＴＧ  ＴＣＡ  ＧＴＣ  ＧＧＴ  ＡＣＴ  ＡＣＧ  ＡＣＴ  ＡＣＧ  ＴＴＣ  ＡＧＧ  ＣＡＡ  ＧＡ
商業的に入手可能なチオ修飾因子ホスホルアミダイト（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈから得られる１０−１９２６−９０）を用いてＷを組み入れた。Ｂは、商業的に入手可能なホスホルアミダイト（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈから得られる１０−１９５３−９５）を用いて組み入れられた内部ビオチンである。下線の核酸塩基は、ジッパー領域を表す。
Ｓ−トリフェニルメチル保護チオオリゴ（１０ナノモル）を真空中で蒸発させて、ＴＥＡＡ緩衝液（０．１Ｍ溶液を２００ｕＬ、ｐＨ＝６．４）中に再懸濁させた。ＡｇＮＯ３（１Ｍ溶液を３０ｕＬ）を添加し、混合物を室温で１〜２時間放置した。ＤＴＴ（１Ｍ溶液を４６ｕＬ）を添加し、５〜１０分間放置した。反応混合物をスピンダウンし（２０．０００Ｇで２０分間）、上清を集めた。固体を追加のＴＥＡＡ緩衝液（０．１Ｍ溶液を１００ｕｌ、ｐＨ＝６．４）で抽出した。慣例のＥｔＯＨ沈殿により純粋なチオオリゴを得た。
【０１５７】
反応の概略図：
【化８】
2005521365.tif 000021
【０１５８】
各チオオリゴ（１ナノモル）を真空中で乾燥し、機能的エンティティー：
【化９】
2005521365.tif 000022
を含む化学物質で、ジメチルホルムアミド（０．１Ｍ溶液を５０ｕｌ）中処理し、一夜室温で放置した。ビルディングブロックをスピンダウンし（２０．０００Ｇで１０分間）、上清を除去した。ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）を添加し、ビルディングブロックをスピンダウンした（２０．０００Ｇで１０分間）。ジメチルホルムアミドを除去し、ロードされたチオオリゴをＴＥＡＡ緩衝液中に再懸濁し（０．１Ｍ溶液を２５ｕｌ、ｐＨ＝６．４）、ＨＰＬＣにより分析した。
【実施例１４】
【０１５９】
エンコードされたスカフォード分子の合成
【化１０】
2005521365.tif 000023
テンプレートオリゴ５’−ＢＴＣＴＴＧＣＣＴＧＡＡＣＧＴＡＧＴＣＧＴＡＧＧＴＣＧＡＴＣＣＧＣＧＴＴＡＣＣＡＧＡＧＣＴＧＧＡＴＧＣＴＣＧＡＣＡＧＧＴＣＣＣＧＡＴＧＣＡＡＴＣＣＡＧＡＧＧＴＣＧ（配列番号）（１ナノモル）を実施例１３において調製した２つのビルディングブロックおよび実施例１２において調製したスカフォードビルディングブロック（１ナノモル）とヘペス緩衝液（１００ｍＭヘペスおよび１Ｍ  ＮａＣｌ溶液２０ｕＬ、ｐＨ＝７．５）および水（最終体積が１００ｕＬになるように添加）中混合した。５０℃に加熱し、３０℃に冷却（−２℃／３０秒）することによりビルディングブロックをテンプレートにアニールした。混合物を次いで変動する温度（１０℃で１秒間、次いで３５℃で１秒間）で一夜放置した。ストレプトアビジンビーズ（１００ｕＬ、２×１ｍＬ  １００ｍＭヘペス緩衝液および１Ｍ  ＮａＣｌで予洗、ｐＨ＝７．５）の添加によりオリゴ複合体をストレプトアビジンに結合させた。ビーズをヘペス緩衝液（１ｍＬ）で洗浄した。水（２００ｕＬ）を添加し、続いて７０℃に加熱することにより、トリスアミンスカフォードビルディングブロックをストレプトアビジン結合複合体から分離した。水を移し、真空中で蒸発させ、ＴＥＡＡ緩衝液（０．１Ｍ溶液４５ｕＬ）中に再懸濁させ、生成物形成をＨＰＬＣにより分析した（図１５参照）。
【０１６０】
ＨＰＬＣクロマトグラムは、２つの機能的エンティティーのスカフォードビルディングブロックへの移動を示す。上のクロマトグラムは、対照ビルディングブロックを示す。下のクロマトグラムは、１（７．９４分でのピーク）および２（１０．７６分でのピーク）の同一の機能的エンティティーの部分的移動後のストレプトアビジン精製スカフォードビルディングブロックを示す。次の勾配を使用した：０〜３分１００％Ａ、次いで１５％Ａおよび８５％Ｂ３〜１０分、次いで１００％Ｂ１０〜１５分。Ａ＝１０ｍＭ  ＴＥＡＡ中２％アセトニトリル、Ｂ＝１０ｍＭ  ＴＥＡＡ中８０％アセトニトリル。
機能的エンティティーの親油性により、ＨＰＬＣクロマトグラムにおいて、１つの機能的エンティティーと比較して２つの機能的エンティティーを有するスカフォード分子のより長い保持時間が観察された。２つの同一の機能的エンティティーを有するスカフォード分子のテンプレート合成の効率は、約２５％であった（図１５において１０．７６分でのピーク）。
【０１６１】
実施例１５〜２１の一般法および材料
それぞれがオリゴヌクレオチドとカップリングした２つの反応性基間の反応効率を調べるために、２つのオリゴが同じテンプレートにアニールされている場合、図１６に示す２のセットアップを使用した（セットアップＡおよびセットアップＢ）。２つのオリゴはカルボン酸またはアミンで誘導化される末端ヌクレオチドを含有する。２つのオリゴの末端上の反応性基の反応（架橋）後、２つのオリゴがこの架橋の結果カップリングするようになり、従ってカラムを通ってよりゆっくりと移動するので、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により架橋効率を分析することができる。
【０１６２】
ＤＮＡオリゴ
Ｘ＝カルボキシ−ｄＴ
Ｚ＝アミノ修飾因子Ｃ６
６＝アミノ−修飾因子５  カタログ番号１０−１９０５
ジッパーボックス配列に下線を引いた。ビルディングブロックジッパーボックスがテンプレートにおいてジッパーボックスと相互作用する場合、ジッパーボックス二本鎖の長さは下線を引いたものより１ヌクレオチド長い。
ＡＨ３６：５’−
ＣＧＡＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＧＣＡＴＣＧＧＴＣＡＴＧＧＣＴＧＡＣＴＧＴＣＣＧＴＣＧＡＡＴＧＴＧＴＣＣＡＧＴＴＡＣＸ
ＡＨ５１：５’−
ＺＧＴＡＡＣＡＣＣＴＧＴＧＴＡＡＧＣＴＧＣＣＴＧＴＣＡＧＴＣＧＧＴＡＣＴＧＡＣＣＴＧＴＣＧＡＧＣＡＴＣＣＡＧＣＴ
ＡＨ８２：５’−ＺＧＴＡＡＣＡＣＣＴＧＧＡＣＣＴＧＴＣＧＡＧＣＡＴＣＣＡＧＣＴ
ＡＨ２０１：５’−ＴＣＴＧＧＡＴＴＧＣＡＴＣＧＧＧＡＧＴＴＡＣＸ
ＡＨ１３３：５’−ＺＧＴＡＡＣＴＣＣＴＧＴＧＴＡＡＧＣＴＧＣＣＴＧＴＣＡＧＴＣＧＧＴＡＣＴＧＡＣＣＴＧＴＣＧＡＧＣＡＴＣＣＡＧＣＴ
ＡＨ１３４：５’−ＺＧＴＡＡＣＴＧＣＴＧＴＧＴＡＡＧＣＴＧＣＣＴＧＴＣＡＧＴＣＧＧＴＡＣＴＧＡＣＣＴＧＴＣＧＡＧＣＡＴＣＣＡＧＣＴ
ＡＨ１３５：５’−ＺＧＴＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＡＡＧＣＴＧＣＣＴＧＴＣＡＧＴＣＧＧＴＡＣＴＧＡＣＣＴＧＴＣＧＡＧＣＡＴＣＣＡＧＣＴ
ＡＨ１４２：５’−ＣＧＡＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＧＣＡＴＣＧＧＴＣＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＣＴＧＡＣＴＧＴＣＣＧＴＣＧＡＡＴＧＴＧＴＣＣＡＧＴＴＡＣＸ
ＡＨ１５６：５’−ＺＧＡＣＣＴＧＴＣＧＡＧＣＡＴＣＣＡＧＣＴ
ＡＨ２０２：５’−ＴＣＴＧＧＡＴＴＧＣＡＴＣＧＧＧＴＴＡＣＸ
ＡＨ２０３：５’−ＴＣＴＧＧＡＴＴＧＣＡＴＣＧＧＴＴＴＴＴＸ
ＡＨ２３６：５’−６ＧＴＡＡＣＡＣＣＴＧＧＡＣＣＴＧＴＣＧＡＧＣＡＴＣＣＡＧＣＴ
ＡＨ２４０：５’−ＣＧＡＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＧＣＡＴＣＧＧＧＣＡＣＧＧＴＴＡＣＸ
ＡＨ２４９：５’−ＺＣＴＧＧＡＣＡＧＣＴＣＧＴＡＧＧＴＣＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ
ＡＨ２５１：５’−ＺＧＡＣＣＴＧＴＣＧＡＧＣＡＴＣＣＡＧＣＴ
ＡＨ２５２：５’−ＸＧＡＣＣＴＧＴＣＧＡＧＣＡＴＣＣＡＧＣＴ
ＡＨ２５５：５’−ＣＧＡＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＧＣＡＴＣＧＧＴＧＴＴＡＣＺ
ＡＨ２５８：５’−ＡＣＧＡＣＴＡＣＧＴＴＣＡＧＧＣＡＡＧＡＧＴＴＡＣＺ
ＡＨ２６０：５’−ＸＣＴＧＧＡＣＡＧＣＴＣＧＴＡＧＧＴＣＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ
ＡＨ２６１：５’−ＣＧＡＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＧＣＡＴＣＧＧＺ
ＡＨ２６２：５’−ＣＧＡＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＧＣＡＴＣＧＧＴＴＡＣＺ
ＡＨ２７０：５’−６ＧＴＡＡＣＧＡＣＣＴＧＴＣＧＡＧＣＡＴＣＣＡＧＣＴ
ＡＨ２７１：５’−６ＧＴＡＡＣＴＧＧＡＣＣＴＧＴＣＧＡＧＣＡＴＣＣＡＧＣＴ
ＡＨ２７２：５’−ＡＣＧＡＣＴＡＣＧＴＴＣＡＧＧＣＡＡＧＡＧＴＴＡＣＸ
ＡＨ２７３：５’−ＡＣＧＡＣＴＡＣＧＴＴＣＡＧＧＣＡＡＧＡＧＣＧＴＴＡＣＸ
ＡＨ２７４：５’−ＡＣＧＡＣＴＡＣＧＴＴＣＡＧＧＣＡＡＧＡＧＣＡＣＧＧＴＴＡＣＸ
ＡＨ２７５：５’−ＣＧＡＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＧＣＡＴＣＧＧＧＣＧＴＴＡＣＸ
ＡＨ２７６：５’−ＣＴＧＧＴＡＡＣＧＣＧＧＡＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＣＧＧＴＴＡＣＸ
ＡＨ２７７：５’−ＣＴＧＧＴＡＡＣＧＣＧＧＡＴＣＧＡＣＣＴＧＣＧＴＴＡＣＸ
慣例のホスホルアミダイト法を用いてオリゴヌクレオチドを調製した。Ｘは商業的に入手可能なカルボキシ−ｄＴホスホルアミダイト（Ｇｌｅｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈから得られる１０−１０３５−９０）を表す。Ｚはアミノ修飾因子Ｃ６  ｄＴ（Ｇｌｅｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈから得られる１０−１０３９）を表す。６はアミノ修飾因子５（Ｇｌｅｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈから得られる１０−１９０５）を表す。
【０１６３】
テンプレート
ジッパーボックス配列に下線を引く。
ＡＨ３８：５’−ＡＧＣＴＧＧＡＴＧＣＴＣＧＡＣＡＧＧＴＣＣＣＧＡＴＧＣＡＡＴＣＣＡＧＡＧＧＴＣＧ
ＡＨ１４０：５’−
ＡＧＣＴＧＧＡＴＧＣＴＣＧＡＣＡＧＧＴＣＡＧＧＴＣＧＡＴＣＣＧＣＧＴＴＡＣＣＡＧＴＣＴＴＧＣＣＴＧＡＡＣＧＴＡＧＴＣＧＴＣＣＧＡＴＧＣＡＡＴＣＣＡＧＡＧＧＴＣＧ
ＡＨ１５４：５’−
ＡＧＣＴＧＧＡＴＧＣＴＣＧＡＣＡＧＧＴＣＡＡＧＴＡＡＣＡＧＧＴＣＧＡＴＣＣＧＣＧＴＴＡＣＣＡＧＴＣＴＴＧＣＣＴＧＡＡＣＧＴＡＧＴＣＧＴＣＣＧＡＴＧＣＡＡＴＣＣＡＧＡＧＧＴＣＧ
ＡＨ２５０：５’−
ＣＧＡＣＣＴＡＣＧＡＧＣＴＧＴＣＣＡＧＡＡＧＴＡＡＣＡＧＧＴＣＧＡＴＣＣ
ＡＨ２５６：５’−
ＡＧＣＴＧＧＡＴＧＣＴＣＧＡＣＡＧＧＴＣＡＡＧＴＡＡＣＡＣＣＡＧＧＴＣＧＡＴＣＣＧＣＧＴＴＡＣＣＡＧＴＣＴＴＧＣＣＴＧＡＡＣＧＴＡＧＴＣＧＴＣＣＧＡＴＧＣＡＡＴＣＣＡＧＡＧＧＴＣＧ
ＡＨ２６３：５’−
ＣＧＡＣＣＴＡＣＧＡＧＣＴＧＴＣＣＡＧＡＡＧＴＡＡＣＡＧＧＴＣＧＡＴＣＣＧＣＧＴＴＡＣＣＡＧＴＣＴＴＧＣＣＴＧＡＡＣＧＴＡＧＴＣＧＴＣＴＧＧＴＣＡＣＧＴＧＧＡＴＣＣＴＴＧＡ
ＡＨ２７８：５’−
ＡＧＣＴＧＧＡＴＧＣＴＣＧＡＣＡＧＧＴＣＧＡＧＧＴＣＧＡＴＣＣＧＣＧＴＴＡＣＣＡＧＴＣＴＴＧＣＣＴＧＡＡＣＧＴＡＴＣＧＴＣＣＧＡＴＧＡＡＴＣＣＡＧＡＧＧＴＣＧ
ＡＨ２７９：５’−
ＣＧＡＣＣＴＡＣＧＡＧＣＴＧＴＣＣＡＧＡＡＧＴＡＡＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＧＧＴＣＡＣＧＴＧＧＡＴＣＣＴＴＧＡ
慣例のホスホルアミダイト合成法によりテンプレートを調製した。
【０１６４】
緩衝液
緩衝液Ａ（１００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ＝７．５；１Ｍ  ＮａＣｌ）
緩衝液Ｂ（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ＝７．５；２００Ｍ  ＮａＣｌ）
３２Ｐでの５’−標識
５ピコモルのオリゴヌクレオチド、２μｌの１０×ホスホリル化緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号４１０３）、１μｌ  Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号４１０３）、１μｌ  γ−３２Ｐ  ＡＴＰを混合し、Ｈ２Ｏを２０μｌになるように添加する。３７℃で１０〜３０分間インキュベートする。
ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）
サンプルをホルムアミド色素１：１（９８％ホルムアミド、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８、０．０２５％キシレンシシアノール、０．０２５％ブロモフェノールブルー）と混合し、８０℃で２分間インキュベートし、変性１０％ポリアクリルアミドゲル上にかける。オートラジオグラフィー（Ｋｏｄａｋ，ＢｉｏＭａｘ  ｆｉｌｍ）を用いてゲルを展開する。
【実施例１５】
【０１６５】
セットアップＢに関してアニーリング効率、反応効率およびテンプレート依存性に対する濃度の影響を調べるために、本発明者らは、ｉ）高ビルディングブロックおよびテンプレート濃度でのアニーリングおよび反応（実験ＡおよびＢ）、ｉｉ）高濃度でアニーリング、続いて１００倍希釈およびこの低濃度での反応（ＥおよびＦ）、ならびにｉｉｉ）低濃度でのアニーリングおよび反応（ＣおよびＤ）を含む実験を行った。テンプレート非依存性反応が起こる程度を調べるために、本発明者らはまた、競争テンプレートおよび反応性基（アミン）を有する競争オリゴからなる対照複合体を含めた。
実験
１０μｌ緩衝液Ａ、様々な濃度の関連するオリゴ（下記表Ｘ参照）を混合し、Ｈ２Ｏを５０μｌになるように添加する。
【表１１】
2005521365.tif 000024
Ａ〜Ｄについて８０℃から２０℃（−１℃／３０秒）、ＥおよびＦについて８０℃から２０℃（−１℃／１分）でアニールする。ＥおよびＦを緩衝液Ｂ中でアニール後１００倍に希釈する。次いで、Ｈ２Ｏ中に溶解させた５μｌの５００ｍＭ  ＤＭＴ−ＭＭ（Ｋｕｎｉｓｈｉｍａら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（２００１）、５７，１５５１にしたがって調製）を添加する。様々な温度で一夜インキュベートし、次いで１０％尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析する。
結果を図１７（実験ＡおよびＢ）および図１８（実験Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦ）に示す。
結論：
テンプレート非依存性反応が２０℃でしばしば観察される。この生成物は、競争テンプレート（ジッパーボックスを有する）がインキュベーション混合物中に含まれない場合でも観察されるので（例えば、図１７、実験Ｂ、レーン１参照）、おそらくはテンプレート中のジッパーボックスにより支配されない。高濃度でアニーリングし、続いて希釈し、結果として得られる低濃度で反応させることにより、テンプレート非依存性反応が排除されるが、反応工程前のテンプレートでビルディングブロックオリゴの有効なアニーリングは保持される（実験ＥおよびＦの有効な架橋およびテンプレート非依存性反応の不在をあまり興味深くない実験Ａ、Ｂ、ＣおよびＤと比較）。
【実施例１６】
【０１６６】
セットアップＢにおけるジッパーボックスの効果を調べるために、ビルディングブロックが３位にアニールされる場合、２つの異なるビルディングブロックオリゴ（そのうちの１つは６−ｍｅｒジッパーボックスを有し（ビルディングブロックオリゴの６ヌクレオチドはテンプレート上の相補ジッパーボックスとアニールする）、そのうちの１つはジッパーボックスを有さない）を用いて実験を行った。
実験
１０μｌ緩衝液Ａ、様々な濃度の関連するオリゴ（下記表ＸＩ参照）を混合し、Ｈ２Ｏを５０μｌになるように添加する。
【表１２】
2005521365.tif 000025
８０℃から２０℃（−１℃／３０秒）でアニールする。次いで、Ｈ２Ｏ中に溶解させた５μｌの５００ｍＭ  ＤＭＴ−ＭＭ（Ｋｕｎｉｓｈｉｍａら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（２００１）、５７，１５５１にしたがって調製）を添加する。様々な温度で一夜インキュベートし、次いで１０％尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析する。
結果を図１９に示す。
結論：
実験Ａは６ｍｅｒジッパーボックスを有するビルディングブロックを用い、約３０％の架橋効率が観察される（実験Ａ、レーン２〜４）。ジッパーボックスを有さないビルディングブロックを用いる場合（実験Ｂ）、架橋は観察されない（レーン３〜４におけるスポットがフィルム上の生成物であり、架橋を示さない）、架橋は観察されず、２０℃でも反応は観察されない（おそらくは、ビルディングブロックがジッパーボックスを有さないため）。
【実施例１７】
【０１６７】
本発明者らは、３位にアニールするビルディングブロックを用いてセットアップＢにおいて５、６または７ヌクレオチドの長さのジッパーボックスを用いて架橋効率を調べた。  実験
１０μｌ緩衝液Ａ、様々な濃度の関連するオリゴ（下記表ＸＩＩ参照）を混合し、Ｈ２Ｏを５０μｌになるように添加する。
【表１３】
2005521365.tif 000026
８０℃から２０℃（−１℃／３０秒）でアニールする。緩衝液Ｂ＋５０ｍＭ  ＤＭＴ−ＭＭ（Ｋｕｎｉｓｈｉｍａら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（２００１）、５７，１５５１にしたがって調製）中で１００倍に希釈する。様々な温度で一夜インキュベートし、次いで１０％尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析する。
結果を図２０に示す。
結論：
５、６または７ヌクレオチドの長さのジッパーボックスは２４〜２８℃の範囲の温度における有効な架橋を支配する（図２０、パネルＡ、Ｃ、Ｅ）。これらの条件下で（アニーリングが高濃度で、架橋が低濃度である場合）、競争複合体に対する架橋は観察されない（図２０、パネルＢ、ＤおよびＦ）。
【実施例１８】
【０１６８】
この実験において、本発明者らセットアップＡにおいてさまざまなリンカー長さの架橋効率を分析した（リンカーはアンチコドンおよびジッパーボックスを結合させる）。
実験
１０μｌ緩衝液Ａ、様々な濃度の関連するオリゴ（下記表ＸＩＩＩ参照）を混合し、Ｈ２Ｏを５０μｌになるように添加する。
【表１４−１】
2005521365.tif 000027
【表１４−２】
2005521365.tif 000028
８０℃から２０℃（−１℃／３０秒）でアニールする。５μｌの５００ｍＭ  ＤＭＴ−ＭＭ（Ｋｕｎｉｓｈｉｍａら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（２００１）、５７，１５５１にしたがって調製）を添加する。１０℃で５秒間、次いで３５℃で１秒間インキュベートする。一夜繰り返し、次いで１０％尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析する。
結果を図２１に示す。
結論：
２つの点を調べる：ｉ）リンカーの長さの架橋効率に対する影響（０、２、および５ヌクレオチドのリンカー長さを調べる）、ｉｉ）２つの反応するビルディングブロック間の間隔の重要性。図２１、レーン１〜６は、３位にアニールしたビルディングブロックオリゴを含み：レーン７は同じビルディングブロックを含むが、レーン７にはテンプレートは存在しない。レーン８〜１３は２位にアニールしたビルディングブロックオリゴを含み：レーン１４は同じビルディングブロックを含むが、レーン７にはテンプレートは存在しない。レーン１５〜２０は１位にアニールしたビルディングブロックオリゴを含み：レーン２１は同じオリゴを含み、テンプレートが存在しない。レーン１、３、５、８、１０、１２、１５、１７、１９は、ビルディングブロックオリゴ間の間隔が、レーン２、４、６、９、１１、１３、１６、１８、および２０の実験において使用したテンプレートよりも１ヌクレオチド大きいテンプレートを使用する。
架橋効率に関して言えば、最適のリンカー長さはあらゆる位置において０ヌクレオチドである（図２１、３位についてはレーン１、２；２位についてはレーン８、９；１位についてはレーン１５、１６）。１位および０位に結合したビルディングブロック間の０または１ヌクレオチドの間隔は、２つのビルディングブロック間の架橋の効率に影響を及ぼさない（図２１、例えばレーン１と２を比較）。非常に高い架橋効率が全ての３つの位置から観察される。５ヌクレオチドのジッパーボックスを用いると、ビルディングブロックオリゴがそれぞれ位置３、２および１にアニールされ、リンカー長さが０ヌクレオチドである場合に、反応効率は約５０％、９５％および９５％およびである（図２１、レーン１、２、および８、９および１５、１６）。
【実施例１９】
【０１６９】
この実施例、実験５、８、１４および１７において、本発明者らセットアップＢにおいてさまざまなリンカー長さの架橋効率を分析した。
実験
１０μｌ緩衝液Ａ、様々な濃度の関連するオリゴ（下記表ＸＩＶ参照）を混合し、Ｈ２Ｏを５０μｌになるように添加する。
【表１５−１】
2005521365.tif 000029
【表１５−２】
2005521365.tif 000030
８０℃から２０℃（−１℃／３０秒）でアニールする。５μｌの５００ｍＭ  ＤＭＴ−ＭＭ（Ｋｕｎｉｓｈｉｍａら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（２００１）、５７，１５５１にしたがって調製）を添加する。１０℃で５秒間、次いで３５℃で１秒間インキュベートする。一夜繰り返し、次いで１０％尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析する。
結果を図２２に示す。
結論：
この実験は、オリゴセットアップＢにおいて３位で結合したビルディングブロックオリゴ間の反応効率を測定する。０、５、３０および５０ヌクレオチドのリンカー長さは、それぞれ約９０％（レーン８）、５０％（レーン５）、２０〜４０％（レーン１４）および２０〜４０％（レーン１７）の反応効率を仲介する。言い換えれば、セットアップＡについても観察されたように、０ヌクレオチドのリンカー長さがセットアップＢについて最適である。セットアップＢにおいて、約７５％および９０％の２位および１位からの反応効率が達成された（データは省略）。
【実施例２０】
【０１７０】
本発明者らは、テンプレート非依存性反応が観察される条件下で、５、６、７、または８ヌクレオチドのジッパーボックス長さを用いて、様々な温度で、テンプレート非依存性反応の程度を試験した（すなわち、アニーリングと反応はどちらも高いテンプレートおよびビルディングブロック濃度で行う）。
実験
２μｌ緩衝液Ａ、様々な濃度の関連するオリゴ（下記表ＸＶ参照）を混合し、Ｈ２Ｏを１０μｌになるように添加する。
【表１６】
2005521365.tif 000031
８０℃から２０℃（−１℃／３０秒）でアニールする。１μｌの５００ｍＭ  ＤＭＴ−ＭＭ（Ｋｕｎｉｓｈｉｍａら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（２００１）、５７，１５５１にしたがって調製）を添加する。様々な温度で一夜インキュベートし、次いで１０％尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析する。
結果を図２３および２４に示す。
結論：
５−ｍｅｒジッパーボックス（実験ＡおよびＢ）を用いて、テンプレート非依存性反応は９．９℃から５０．８℃の間の温度で観察されない（図２３、レーン１〜１２）。６、７、または８ヌクレオチドの長さのジッパーボックスを用いて、テンプレート非依存性反応がそれぞれ５〜２８℃、５〜３２℃、および５〜３５℃の温度範囲において観察される。実験者により（例えば、試薬の添加により）開始できないテンプレートされた反応を行う場合、テンプレート非依存性反応に至らない温度（例えば、５−、６−、７−、および８−ヌクレオチドのジッパーボックス長さについて、それぞれ２５℃、３０℃、３４℃、および３７℃）でアニーリングおよび反応を行うことが推奨される。
実験者により（例えば、試薬の添加またはＵＶ−暴露による）開始できない反応を行う場合、高度のジッパーボックス−ジッパーボックス複合体形成を確実にするために、さらに低い温度で複合体を形成することができ、ここにおいて、過剰のビルディングブロック−オリゴを洗浄により除去した後、反応を開始することができる。洗浄後の低濃度のビルディングブロックのために、テンプレート非依存性反応はずっと顕著ではない。
【実施例２１】
【０１７１】
多段法（ビルディングブロック−オリゴがテンプレートスカフォード複合体に添加され、一度に反応する）において、オリゴ（前工程において使用、依然としてテンプレートに結合）が最後に添加されたビルディングブロック−オリゴの反応を妨害しないことが重要である。
ここでは、本発明者らは、セットアップＡおよびＢの両方において、２位と０位で結合したビルディングブロックオリゴ間の架橋の効率が、３位で結合したビルディングブロックオリゴにより影響を受けるかどうかを調べる。
実験
１０μｌ緩衝液Ａ、様々な濃度の関連するオリゴ（下記表ＸＶＩ参照）を混合し、Ｈ２Ｏを５０μｌになるように添加する。
【表１７】
2005521365.tif 000032
ＢＢ１なしで８０℃から３０℃（−１℃／３０秒）でアニールする。ＢＢ１を添加し、再び５５℃から３０℃（−１℃／３０秒）でアニールする。緩衝液Ｂ＋５０ｍＭ  ＤＭＴ−ＭＭ（Ｋｕｎｉｓｈｉｍａら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（２００１）、５７，１５５１にしたがって調製）中で１００倍に希釈する。Ａ〜Ｄについては３０℃で一夜インキュベートし、ＥおよびＦについては１０℃で５秒間、次いで３５℃で１秒間を一夜繰り返し、次いで１０％尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析する。
結果を図２５に示す。
結論：
占有された３位は、２位および０位で結合したビルディングブロックの架橋を妨害しない（図２５、レーンＡとレーンＢ、レーンＣとレーンＤ、レーンＥとレーンＦを比較）。
【図面の簡単な説明】
【０１７２】
（原文に記載なし）
【図１】
2005521365.tif 000033
【図２】
2005521365.tif 000034
【図３】
2005521365.tif 000035
【図４】
2005521365.tif 000036
【図５】
2005521365.tif 000037
【図６】
2005521365.tif 000038
【図７】
2005521365.tif 000039
【図８】
2005521365.tif 000040
【図９Ａ】
2005521365.tif 000041
【図９Ｂ】
2005521365.tif 000042
【図１０Ａ】
2005521365.tif 000043
【図１０Ｂ】
2005521365.tif 000044
【図１１】
2005521365.tif 000045
【図１２】
2005521365.tif 000046
【図１３】
2005521365.tif 000047
2005521365.tif 000048
【図１４】
2005521365.tif 000049
【図１５】
2005521365.tif 000050
【図１６】
2005521365.tif 000051
【図１７】
2005521365.tif 000052
【図１８】
2005521365.tif 000053
【図１９】
2005521365.tif 000054
【図２０】
2005521365.tif 000055
【図２１】
2005521365.tif 000056
【図２２】
2005521365.tif 000057
【図２３】
2005521365.tif 000058
【図２４】
2005521365.tif 000059
【図２５】
2005521365.tif 000060
【国際調査報告】
2005521365.tif 000061
2005521365.tif 000062
2005521365.tif 000063
2005521365.tif 000064