(57)【要約】本発明はタンパク質の精製およびウイルス性病原体のような汚染物質を除去するための小さい、ナノメーターの大きさの有効排除フィルターを通す大きなタンパク質性材料の回収の分野に関する。
2005529948.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質性材料を精製する方法であって、
（ａ）タンパク質性材料を
（ｉ）ｐＨを５．０〜６．０に低下させ、イオン強度を３０ｍＳ／ｃｍ未満に処方した低ｐＨ、低導電率のバッファ溶液、
（ｉｉ）非イオン性界面活性剤、および
（ｉｉｉ）クラスレート修飾剤
と混合する工程と、
（ｂ）前記タンパク質性材料にナノフィルトレーションを行ってウイルス粒子を実質的に含まない精製材料を得る工程と
を含む方法。
【請求項２】
前記タンパク質性材料は免疫グロブリンであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記クラスレート修飾剤は水酸基を４個〜８個有するポリオール糖または糖アルコールであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリオールは単糖類または二糖類であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリオールはスクロースであることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
クラスレート修飾剤として使用される前記ポリオールの濃度は約５％ｗ／ｖであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
タンパク質性材料を精製する方法であって、
ａ）タンパク質性材料をバッファ溶液と混合し、
該バッファ溶液のｐＨとイオン強度をｐＨが５．０〜６．０に、イオン強度が３０ｍＳ／ｃｍ未満になるように調節する工程、
ｂ）該バッファに界面活性剤を添加してタンパク質−タンパク質およびタンパク質−膜相互作用を最低限にする工程、
ｃ）該バッファ溶液にクラスレート修飾剤を添加する工程、ここで、該クラスレート修飾剤は
ｉ）タンパク質の水力学的半径を減少し、かつ
ｉｉ）タンパク質の自己会合を最低限にするものであり、
ｄ）システムにインライン予備フィルターを設置する工程、
ｅ）システムにインライン濃度監視モニターを設置する工程、
ｆ）該インライン濃度監視モニターから得られる情報を用いてバッファのｐＨおよびタンパク質濃度のパラメータをｐＨ５．０〜６．０の範囲内、およびイオン強度を３０ｍＳ／ｃｍ未満に維持する工程
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００２年６月１４日に出願された米国仮出願第６０／３９４，７３３号の利益を主張する。
【０００２】
本発明はタンパク質の精製およびタンパク質性材料をウイルス性病原体のような汚染物質を除去するための微細なナノメーターの寸法の孔を有する排除フィルターを通して回収することに関する。本発明は病原体、特にウイルス性病原体を除去するために濾過される溶液中のタンパク質の溶解性を高める添加物の使用に関し、特に免疫グロブリンのような大きなタンパク質性の生体分子の生成に適用し得るものに関する。
【背景技術】
【０００３】
液体および気体の分離方法は当技術において周知である。もっとも一般的な方法は相変化を含むので、方法のコストが増大し、かつ製品を変質させることがある過大な温度変化を必要とすることが多い。しかし、膜分離は物質の相変化を伴うことなく所望の分離を達成することができる。本質的に、膜分離は選択的に１種以上の物質をフィルターの孔を通して、１種以上のより大きい物質を後に残す。この方法は、しばしば、満足のゆくレベルの分離が達成されるまでフィルターの孔径を小さくして繰り返えされる。
【０００４】
ナノフィルトレーションを使用してウイルス粒子のような汚染物質を体腔タンパク質生成物から除去することは、所定の孔径のフィルターが可溶性タンパク質は通過させるがより多きいウイルス粒子は通さない能力を有することに基づいている（ジレオ、エイジェイ等、バイオテクノロジー、１９９２年、第１０巻第１８２頁、１８８頁（ＤｉＬｅｏ，ＡＪ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９２，１０：１８２，１８８．）。大きさによる排除により免疫グロブリン（モノクローナルまたはポリクローナル抗体）のような巨大生体分子からナノメーターの大きさ、典型的には１２ｎｍ〜１５ｎｍのウイルスを除去することは、巨大生体分子を通過させることが困難であることによりうまくゆかない。溶液中のタンパク質は、免疫グロブリンのような大きなものでさえも、ウイルス粒子よりも分子半径がずっと小さいことが期待されているが、いくつかの要因により孔径と分級効率が低下することがある。これらの要因のいくつかはタンパク質とフィルター表面の相互作用によるものであり、膜の表面にゲル化または分極層として知られる構造を生じる。他の要因、例えばタンパク質の自己会合または凝集により、タンパク質がフィルターの孔を通過できない大きさを有していたり、膜表面または孔の表面に親和性を示す表面特性を有していたりする塊を形成して膜に付着し通過できなくするため、フィルターに捕捉されてしまう。
【０００５】
国際特許出願第ＷＯ９６００２３７号明細書は１５ｎｍの小さい孔径を使用して分子量１５０ｋＤａ未満の精製タンパク質のナノフィルトレーション方法の成功例を記載している。国際特許出願第ＷＯ９６００２３７号明細書は約０．２Ｍから飽和溶液までの塩濃度をタンパク質、糖類およびポリペプチドのウイルス濾過に使用して分級効率を向上させることを開示している。同国際出願の出願人の述べている上記塩の利点は「タンパク質が収縮する」のでフィルターを通過するのが容易になるためである。この方法による高塩濃度を使用すると、５ｎｍ〜３０ｎｍの孔径の膜を用いて「行き止まり（ｄｅａｄ  ｅｎｄ）」濾過を使用することが可能になることが示唆されている。行き止まり濾過は単一のポンプを用いて液体を膜の表面から通過させて行うことをいう。行き止まる濾過は、第１のポンプにより膜の表面に一定の流速を維持し、第２のポンプにより膜の裏面に負圧（吸引）を発生させることによりフィルターを通してタンパク質を引く接線（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ）濾過方法よりも、簡単で低コストである。
【０００６】
米国特許第６，０９６，８７２号公報明細書は界面活性剤の添加と高イオン強度緩衝をナノフィルトレーションの際に用いて免疫グロブリン含有溶液からウイルスを除去すると、タンパク質の二量化、三量化および凝集を低減するのに有効であることを認識している。この教示は本明細書において参照されることにより、本発明の一部を構成する。
【０００７】
物質と膜表面との相互作用を低減するためには、膜表面の「ゼータ−」または「ｚ−」電位がその物質を吸引してはならず、膜の電荷の性質を変更すると表面の沈殿を最低限にすることができることも一般に知られている。例えば、米国特許第６，１７７，０１１号公報明細書はゼータ電位で測定した表面電荷を中和すると、物質が帯電された基を有する場合の逆浸透濾過方法の際に膜汚染物質が表面に吸着するのを低減できることを教示している。しかしながら、ある場合には、塩を添加してｚ−電位を操作すると、望ましくない結果を生じることがあり、可溶性凝集物が増加したり、膜の疎水性が増加して疎水性のタンパク質領域との相互作用を促進したりする。ポール等（コロイドおよび表面  第１巻（１９８０年）第２３５頁〜２５６頁（Ｐａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  １（１９８０），２３５−２５６）はフィルターの孔よりも小さい粒子が除去される現象は粒子と孔壁とが反対に帯電した状態で、または粒子と膜の孔壁のゼータ電位がともに低い状態で粒子が孔壁に付着するためである。ジールト（アプライド・アンド・エンバイロンメンタル・マイクロバイオロジー、１９７９年第３８巻第１１６６頁〜１１７２頁）（Ｚｉｅｒｄｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，（１９７９）３８：１１６６−１１７２）は上記現象を静電力に帰している。さらに、これらの変更は溶液中の分子の形状またはタンパク質の凝集の膜濾過に対する効果を問題としていない。
【０００８】
緩衝成分とそれらの濃度の考察に加えて、タンパク質を良好な流動とフィルターの両端にかかる膜横断圧力が最低限に維持されるのに適当な濃度で濾過されるように維持するよう注意する必要がある。国際特許出願第ＷＯ９８３７０８６号明細書は、保持物にバッファを添加して予備処理工程において接線流の際の膜横断圧力を維持して製品タンパク質よりも分子量の大きいタンパク質を除去することを教示している。国際特許出願第ＷＯ９８３７０８６号明細書は、さらに、ナノフィルトレーションは分子量１５０ｋＤＡ以下の治療用タンパク質に限定されることを認めている。免疫グロブリンＧ分子は２本の重鎖ポリペプチドと２本の軽鎖ポリペプチドとからなり、すべて共有結合しており、平均分子量が約１８０ｋＤａである。米国特許第６，０９６，８７２号公報明細書は非イオン性賦形剤を比較的高い（生理的であり約３００ｍＯｓｍの）イオン強度のバッファと共に含めることにより、ＩｇＧ製品からウイルス類を濾過する方法の問題に取り組んでいる。しかしながら、高イオン強度バッファを使用すると、タンパク質が凝集したり製品処方から塩を除去する問題を生じたりする。米国特許第６，０９６，８７２号公報明細書は免疫グロブリンを濃縮し、低イオン強度のバッファ中で捕集することを教示し権利請求している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
これらの方法には種々の欠点があり、特に効率に欠点がある。従って、本発明の目的は従来技術の欠点、特に病原性ウイルスを免疫グロブリン製品から効率的に濾過することにより、ウイルスを含まない純粋な注射用免疫グロブリンを提供するするシステムを開発する際の欠点を克服することである。
【００１０】
タンパク質種の分子の形状または大きさは分比体積の変化とタンパク質の自己会合により予測されている。そのように修飾されたタンパク質の分比体積の変化は分析用遠心分離を用いて沈降係数を独立に測定することによって得られる。ここに記載した方法はクラスレート修飾物質の添加を用いて、タンパク質の分子形状を変更して比体積を最低限にし、それによりナノフィルトレーションにおけるタンパク質の膜通過を向上させている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の方法は、膜表面の疎水性を増加させ、かつタンパク質の水力学的半径を減少させるとともに、濾過しようとするタンパク質の自己会合の傾向を減少させることを目的としたバッファ添加物を使用することにより、膜濾過の際にタンパク質の通過を最大にする。本発明の方法は、第１に、膜表面の疎水性を増加し、タンパク質の水力学的半径を減少させるバッファのｐＨと塩を減少させることにより、タンパク質の通過を最大にする。第２に、クラスレート修飾剤をバッファ中に含め、この修飾剤がタンパク質の水力学的半径を減少させ、一方でタンパク質が自己自身または膜フィルターと会合する傾向を最低限にする。第３に、本発明の方法は、任意的に、濾過を連続的にインラインで監視して、上記のｐＨとクラスレート修飾剤定数を維持し、一方で可溶性タンパク質の局所濃度を低く維持している。本発明の方法を使用することにより、ウイルス粒子の濾過の際の分級係数と膜横断圧力を低く維持する能力とが向上する。本発明の方法は任意の大きなタンパク質性の生体分子、特に免疫グロブリンの精製に適用可能である。免疫グロブリンはモノクローナル免疫グロブリンでもポリクローナル免疫グロブリンでもよい。
【００１２】
クラスレート修飾剤は水酸基を４個〜８個有するポリオール糖または糖アルコールであるのが好ましい。好適なポリオール類は糖類であり、単糖類および二糖類、好ましくはスクロースである。クラスレート修飾剤として使用するポリオールの濃度は一般に５％ｗ／ｖ以上である。スクロースを使用すると分子の大きさが減少し、ウイルス粒子の除去が望まれるタンパク質の自己会合の傾向を減少させる。
【００１３】
従って、本発明は、免疫グロブリンのようなタンパク質性材料を精製する方法であって、下記：
（ａ）タンパク質性材料を
（ｉ）ｐＨを５．０〜６．０に低下させ、イオン強度を３０ｍＳ／ｃｍ未満に処方した低ｐＨ、低導電率のバッファ溶液、
（ｉｉ）非イオン性界面活性剤、および
（ｉｉｉ）クラスレート修飾剤
と混合する工程と、
（ｂ）前記タンパク質性材料にナノフィルトレーションを行ってウイルス粒子を実質的に含まない精製材料を得る工程と
を含む方法を企図している。
【００１４】
上記クラスレート修飾剤は水酸基を４個〜８個有するポリオール糖または糖アルコールであるのが好ましい。
【００１５】
本発明の方法は、また、インラインの予備濾過工程を行い、インラインの濃度調節モニターを設置することにより上記材料の濃度を監視して、ｐＨおよびタンパク質濃度のパラメータを精製する材料に最適の予備設定された範囲内に維持することを含んでいてもよい。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、ウイルス粒子の濾過の際の分級係数と膜横断圧力を低く維持する能力とが向上する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明はバッファ、非イオン性界面活性剤およびクラスレート修飾剤の使用を組み合わせて、大きなタンパク質性生体分子の精製のためのサイズ排除ナノフィルトレーションを用いてウイルスの低減またはウイルスの除去の際に処理助剤として使用する。本発明は小孔径排除ナノフィルターを免疫グロブリンのような球状タンパク質分子とともに、効率的に流通し、収率損失を最低限にし、かつ免疫グロブリンの特徴的凝集レベルまたは安定性を実質的に変化させないで使用することを可能にする。
【００１８】
本発明のナノフィルトレーション方法によりタンパク質性材料から除去されたウイルスは考えうるあらゆるカテゴリーの、有エンベロープ（例えば、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎）および無エンベロープ（例えば、Ａ型肝炎、パルボウイルスＢ１９）ウイルスの双方を含む。
【００１９】
本発明の処理助剤および方法を使用する利点としては、下記のものが挙げられる。
（１）使用した条件が膜表面の疎水性を増加し、悲哀石をおよびタンパク質性材料の凝集を減少させるので、処理時間が短縮し、収率が増加すること、
（２）より小さい孔径のナノフィルターを使用する能力を有することにより、より小さいウイルス粒子の除去が確実になること、
（３）工程を自動化して連続的に監視して単位フィルター面積当たりの最大効率および最高の製品収率を得ることができること。
（４）タンパク質性材料の本質的特性が、最終製品の統合性と品質を維持する工程により影響を受けないこと。
【００２０】
広義には、クラスレートは結果物が粒子を形成する分子会合である。クラスレートは１つの成分（ホスト）が空隙または、結晶の場合は、長いトンネルまたはチャンネルの形の空間を含む結晶格子を形成し、その中に第二の化学種（ゲスト）の分子状存在が配置される。ゲストとホストの間に共有結合は存在せず、牽引は一般にファン・デア・ワールス力による。ホストの格子内の空間が全ての側に含まれており、ゲスト種がかご内に「トラップ」されているならば、そのような化合物は「クラスレート」または「かご」化合物として知られる。ファン・デア・ワールス力および疎水性相互作用がクラスレートおよび包接化合物中でゲストをホスト分子に結合している。クラスレートを形成する水素結合した分子の例はハイドロキノンと水であり、包接化合物のホスト分子は尿素またはチオ尿素である。
【００２１】
本発明の場合、「クラスレート修飾剤」という用語は水性環境内でタンパク質のクラスレート構造を修飾し、その全体的な比体積を減少させることが可能である物質を意味する。本発明のポリオールクラスレート修飾剤は、水性環境内で水素結合を形成する能力を持つので、クラスレート修飾剤の良い候補である。本発明のポリオールクラスレート修飾剤はタンパク質性材料のクラスレート複合体を修飾することによりその比体積を減少させ、かつ処理時間を短縮し、ナノフィルトレーション工程において流過量を増大させることができる。
【００２２】
本明細書において、「ポリオール糖類および糖アルコール類」という用語は４個〜８個の水酸基を有する一群のポリオールを意味する。好適なポリオールの例は単糖類および二糖類を含む糖類、および糖アルコール類並びにそれらの誘導体であって４個〜８個の水酸基を有するものである。
【００２３】
水酸基を４個有する単糖類の例はアラビノース、リボース、およびキシロースである。水酸基を４個有する糖アルコールの一例はエリスロースから誘導される糖アルコール、すなわちエリスリトールである。
【００２４】
水酸基を５個有する単糖類の例はガラクトース、フルクトース、グルコースおよびソルボースである。水酸基を５個有する糖アルコールはキシロースから誘導された糖アルコール、すなわちキシリトールである。
【００２５】
水酸基を６個有する糖アルコールの例はグルコースとソルボースから誘導されたもの並びにスクロースの加水分解物から誘導されたもの、例えばソルビトールおよびマンニトールである。
【００２６】
二糖類の例はマルトース、ラクトースおよびスクロースであり、後者が好ましいが、すべて８個の水酸基を含んでいる。
【００２７】
本発明に従って処理することができる大きいタンパク質性材料としては免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）のような球状タンパク質およびそれらの断片、血液凝固因子、成長ホルモン、アポリポタンパク質、酵素および同様の生体分子が挙げられ、天然のものであると遺伝子工学的に得られたものであるとを問わない。
【００２８】
本明細書において使用されている「z−電位」という用語は表面電荷を意味する。粒子の表面荷電はある場合にはそのｚ−電位として言及され、距離と共に低下する電荷の測定値である。ｚ−電位は化合物の極性および正味荷電と直接相関する。
【００２９】
本明細書において使用される「ナノフィルトレーション」という用語は孔径がナノメーターのサイズであるサイズ排除手段を用いる濾過をいう。実質的に純粋な、ウイルスを含まない本発明の免疫グロブリン製品の製造に使用される、ＵＦフィルターともいわれるナノフィルトレーションユニットの孔径は、一般に約３０ｎｍ未満、最も好ましくは約１５ｎｍ未満である。しかしながら、無エンベロープ・ウイルスをタンパク質性溶液から減少または排除するのに十分なカットオフ等級を有する任意の膜を本発明の処理方法に用いることができる。例えば、バイアソルブ（ＶＩＲＥＳＯＬＶＥ（登録商標））１８０システム  ウルトラフィルトレーション  システム（Ｕｌｔｒａ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）（ミリポア社、米国マサチューセッツ州ベッドフォード市）ユニットを使用してもよい。このユニットは約１８０ｋＤ未満の分子量または約１２ｎｍ未満の孔径等級を有する。
【００３０】
本発明において使用できる非イオン性の界面活性剤または洗剤としては、非イオン性のポリオキシエチレン洗剤、例えばポリソルベート、ツイーン（ＴＷＥＥＮＳ）；ビニルポリマー類、プルロニック（ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ）；ポリオキシエチレン−ポリプロピレン重合体類または共重合体類；Ｂｒｊ、ステロックス−エイジェイ（Ｓｔｅｒｏｘ−ＡＪ）およびトリトン（Ｔｒｉｔｏｎｓ）があげられる。最も好適なものはポリオキシエチレン・ソルビタン・モノオレエート、ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ  ８０）である。
【００３１】
本発明において使用されるバッファは任意の好適な低ｐＨ、低導電率のバッファ、例えばｐＨ約５．０の燐酸バッファ、クエン酸バッファ、ホウ酸バッファ、酢酸バッファおよびグリシンバッファである。このバッファはｐＨ６未満に維持し、タンパク質の凝集を低減し、それによりナノフィルターを通過する効率的な流れを可能にする。５０ｍＭ±２０％の低イオン強度のバッファが好ましく、ｐＨ５．０の酢酸ナトリウムバッファが好ましい。
【００３２】
本発明の方法は問題とするタンパク質を低ｐＨ（ｐＨ５．０〜６．０）、低導電率（１０ｍＳ／ｃｍ〜２０ｍＳ／ｃｍ）のバッファであって、非イオン性洗剤、例えばＴＷＥＥＮ８０を０．０１％の濃度およびスクロースを５％ｗ／ｖ〜１０％ｗ／ｖの濃度で含有するバッファ中に移すことを含む。接線流装置は他のいくつかの容器、すなわち製品タンク、バッファタンクおよび攪拌機を備えた供給／再循環タンクと液体連絡している。これらの容器の関係およびそれらの間の流れを図１に示す。
【００３３】
本発明の処理において使用するタンパク質濃度は約０．１重量％〜約１重量％の範囲内である。タンパク質がモノマー性またはモノクローナルである場合は、約１％までは使用可能である。キメラ性モノクローナルＩｇＧ１のような免疫グロブリンについては、処理に用いる当初タンパク質濃度は約１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌである。
【００３４】
処理および濾過の間、タンパク質濃度を監視して最適のレベルを維持するのが好ましい。図１に示すように、これはインライン濃度モニターを設置することにより達成することができる。行き止まり予備フィルターをライン中の供給／再循環タンクとＵＦフィルターとの間に配置してもよい。保持ライン上で、ＵＶモニターをＵＦフィルターと再循環タンクとの間にインラインで配置して供給タンクおよびバッファ添加タンクにフィードバックして目的のタンパク質濃度を維持できるようにしている。予備濾過された製品を含有する溶液の調整はバッファを供給／再循環タンクに添加して所望のｐＨ、導電率、洗剤濃度およびスクロース濃度を達成することにより達成される。図１は供給／再循環タンクからの液体の流れを示す。濾過の間、保持物の濃度はバッファの添加により一定に保たれ、タンパク質とタンパク質の相互作用を最低限に抑えている。図示の例では、これは製品を再循環タンクに供給するポンプを制御することにより達成される。ポンプの速度を増加／減少することにより、濃度を狭い特定の範囲内に保つことができる。再循環タンクの下の負荷セルはバッファポンプの追加フィードバックとして使用されタンクが溢れないようにしている。
【００３５】
濾過の間、膜横断圧力は０．２バール〜約２．０バールの範囲内であるのが好ましく、最も好ましくは約１．０バール未満に維持される。分級効率は７５％〜９５％の範囲内であり、排除率は６０％以上である。
【実施例１】
【００３６】
本発明の実施例をキメラ性ヒト／マウスＩｇＧ１の製造について示す。タンパク質を、ｐＨ５．０のカチオン交換カラムから溶出した後、製品タンク内に置く。バッファタンクを５０ｍＭ酢酸ナトリウム、６％スクロース、０．０１％ポリソルベート（ＴＷＥＥＮ）８０で充填する。タンパク質とバッファを混合して供給タンク内の最終タンパク質濃度を２．０±０．２ｍｇ／ｍｌとする。濾過をｘｘ  ｍＬ／分／ｃｍ 2の横流速度（ｃｒｏｓｓ  ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ）およびｙｙ  ｍＬ／分／ｃｍ 2以下の透過速度で開始する。膜横断圧力および保持物濃度を監視して工程が確実に所定の制限内に納まるようにする。製品タンクが空になると、フィルターをシステムのホールドアップ体積の３倍で洗浄し、収率を最大にする。
【産業上の利用分野】
【００３７】
本発明は、タンパク質の精製およびウイルス性病原体のような汚染物質を除去するための小さい、ナノメーターの大きさの有効排除フィルターを通す大きなタンパク質性材料の回収の分野に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】ナノフィルトレーションに用いる容器および監視装置並びに液体の流動方向の概略図である。
【図１】
2005529948.tif 000003
【国際調査報告】
2005529948.tif 000004