(57)【要約】色素タンパクエンジイン及び非色素タンパクエンジインの両方のエンジイン化合物を特徴づける、ウォーヘッド構造を形成するために、５個のタンパク質ファミリーが協力する。かかるタンパク質ファミリーには、ポリケチドシンターゼ及びチオエステラーゼタンパク質が含まれ、これらはエンジインのウォーヘッド形成に関与するポリケチドシンターゼ触媒複合体を形成する。全てのエンジイン生合成遺伝子座において、該５個のタンパク質ファミリーのそれぞれのメンバーをコードする遺伝子が存在する。該遺伝子及びタンパク質は、新規のエンジイン化合物を設計するための遺伝子操作適用、及び、新規のエンジイン生合成遺伝子座を同定する方法に用いてもよい。
2005508140.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のａ．〜ｅ．からなる群より選択される配列を含む、単離、精製又は濃縮を行った核酸。
ａ．配列番号２、１４、２４、３４、４４、５４、６４、７４、８４、９４；配列番号２、１４、２４、３４、４４、５４、６４、７４、８４、９４に相補的な配列；配列番号２、１４、２４、３４、４４、５４、６４、７４、８４、９４の少なくとも２０００個のヌクレオチドを連続状態で含む断片；及び、配列番号２、１４、２４、３４、４４、５４、６４、７４、８４、９４に相補的な配列の少なくとも２０００個のヌクレオチドを連続状態で含む断片；
ｂ．配列番号４、６、１６、２６、３６、４６、５６、６６、７６、８６、９６；配列番号４、６、１６、２６、３６、４６、５６、６６、７６、８６、９６に相補的な配列；配列番号４、６、１６、２６、３６、４６、５６、６６、７６、８６、９６の少なくとも１５０個のヌクレオチドを連続状態で含む断片；及び、配列番号４、６、１６、２６、３６、４６、５６、６６、７６、８６、９６に相補的な配列の少なくとも１５０個のヌクレオチドを連続状態で含む断片；
ｃ．配列番号８、１８、２８、３８、４８、５８、６８、７８、８８、９８；配列番号８、１８、２８、３８、４８、５８、６８、７８、８８、９８に相補的な配列；配列番号８、１８、２８、３８、４８、５８、６８、７８、８８、９８の少なくとも２００個のヌクレオチドを連続状態で含む断片；及び、配列番号８、１８、２８、３８、４８、５８、６８、７８、８８、９８に相補的な配列の少なくとも２００個のヌクレオチドを連続状態で含む断片；
ｄ．配列番号１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００；配列番号１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００に相補的な配列；配列番号１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００の少なくとも４００個のヌクレオチドを連続状態で含む断片；及び、配列番号１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００に相補的な配列の少なくとも４００個のヌクレオチドを連続態で含む断片；
ｅ．配列番号１２、２２、３２、４２、５２、６２、７２、８２、９２、１０２；配列番号１２、２２、３２、４２、５２、６２、７２、８２、９２、１０２に相補的な配列；配列番号１２、２２、３２、４２、５２、６２、７２、８２、９２、１０２の少なくとも２００個のヌクレオチドを連続状態で含む断片；及び、配列番号１２、２２、３２、４２、５２、６２、７２、８２、９２、１０２に相補的な配列の少なくとも２００個のヌクレオチドを連続状態で含む断片
【請求項２】
請求項１記載の核酸と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズできる、単離、精製又は濃縮を行った核酸。
【請求項３】
請求項１記載の核酸と中程度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズできる、単離、精製又は濃縮を行った核酸。
【請求項４】
請求項１記載の核酸と低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズできる、単離、精製又は濃縮を行った核酸。
【請求項５】
デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＮバージョン２．０での分析により、請求項１記載の核酸に対して少なくとも７０％の相同性を有することが確認された、単離、精製又は濃縮を行った核酸。
【請求項６】
デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＮバージョン２．０での分析により、請求項１記載の核酸に対して少なくとも９９％の相同性を有することが確認された、単離、精製又は濃縮を行った核酸。
【請求項７】
下記の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択されるポリペプチドを含む、エンジインのポリケチドシンターゼタンパク質をコードする、単離、精製又は濃縮を行った核酸。
（ａ）配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３、９３；
（ｂ）デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３、９３のポリペプチドに対して少なくとも７５％の相同性を有することが確認され、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３又は９３のポリペプチドと置換することができるポリペプチド；及び、
（ｃ）エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３、９３のポリペプチドと置換することができる断片である（ａ）及び（ｂ）のポリペプチドの断片
【請求項８】
下記のａ．及びｂ．からなるエンジインのポリケチドシンターゼ触媒複合体をコードする、単離、精製又は濃縮を行った核酸。
ａ．配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３、９３からなる群より選択されるポリペプチド；デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３、９３のポリペプチドに対して少なくとも７５％の相同性を有することが確認され、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３又は９３のポリペプチドと置換することができるポリペプチド；及び、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３、９３のポリペプチドと置換することができるそれらの断片；及び、
ｂ．配列番号３、５、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５からなる群より選択されるポリペプチド；デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、配列番号３、５、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５のポリペプチドに対して少なくとも７５％の相同性を有することが確認され、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号３、５、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５のポリペプチドと置換することができるポリペプチド；及び、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号３、５、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５のポリペプチドと置換することができるそれらの断片；
【請求項９】
下記のａ．及びｂ．からなる遺伝子カセットをコードする、単離、精製又は濃縮を行った核酸。
ａ．請求項８に記載のエンジインのポリケチドシンターゼ触媒複合体をコードする核酸；及び、
ｂ．下記の１．〜３．からなる群より選択されるポリペプチドをコードする少なくとも１個の核酸：
１．配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７；デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７のポリペプチドに対して少なくとも７５％の相同性を有することが確認され、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７のポリペプチドと置換することができるポリペプチド；及び、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７のポリペプチドと置換することができる、それらの断片；
２．配列番号９、１９、２９、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９；デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、配列番号９、１９、２９、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９のポリペプチドに対して少なくとも７５％の相同性を有することが確認され、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号９、１９、２９、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９のポリペプチドと置換することができるポリペプチド；及び、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号９、１９、２９、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９のポリペプチドと置換することができる、それらの断片；及び、
３．配列番号１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１、１０１；デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、配列番号１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１、１０１のポリペプチドに対して少なくとも７５％の相同性を有することが確認され、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１、１０１のポリペプチドと置換することができるポリペプチド；及び、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１、１０１のポリペプチドと置換することができる、それらの断片
【請求項１０】
下記のａ．〜ｅ．からなる遺伝子カセットをコードする、単離、精製又は濃縮を行った核酸。
ａ．配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３、９３からなる群より選択されるポリペプチドをコードする核酸；デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３、９３のポリペプチドに対して少なくとも７５％の相同性を有することが確認され、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３若しくは９３のポリペプチドと置換することができるポリペプチド；又は、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３、９３のポリペプチドと置換することができる、それらの断片；
ｂ．配列番号３、５、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５からなる群より選択されるポリペプチドをコードする少なくとも１個の核酸；デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、配列番号３、５、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５のポリペプチドに対して少なくとも７５％の相同性を有することが確認され、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号３、５、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５のポリペプチドと置換することができるポリペプチド；又は、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号３、５、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５のポリペプチドと置換することができる、それらの断片；
ｃ．配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７からなる群より選択されるポリペプチドをコードする少なくとも１個の核酸；デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７のポリペプチドに対して少なくとも７５％の相同性を有することが確認され、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７のポリペプチドと置換することができるポリペプチド；及び、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７のポリペプチドと置換することができる、それらの断片；
ｄ．配列番号９、１９、２９、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９より選択されるポリペプチドをコードする少なくとも１個の核酸；デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、配列番号９、１９、２９、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９のポリペプチドに対して少なくとも７５％の相同性を有することが確認され、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号９、１９、２９、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９のポリペプチドと置換することができるポリペプチド；及び、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号９、１９、２９、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９のポリペプチドと置換することができる、それらの断片；及び、
ｅ．配列番号１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１、１０１より選択されるポリペプチドをコードする少なくとも１個の核酸；デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、配列番号１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１、１０１のポリペプチドに対して少なくとも７５％の相同性を有することが確認され、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１、１０１のポリペプチドと置換することができるポリペプチド；及び、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１、１０１のポリペプチドと置換することができる、それらの断片
【請求項１１】
下記のａ．〜（ｅ）からなる群より選択される配列からなる、単離又は精製を行ったポリペプチド。
ａ．配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３、９３；並びに、配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３及び９３のポリペプチドの１３００個のアミノ酸を連続状態で含む断片；
ｂ．配列番号３、５、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５；並びに、配列番号３、５、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５及び９５のポリペプチドの４０個のアミノ酸を連続状態で含む断片；
ｃ．配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７；配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７及び９７のポリペプチドの２２０個のアミノ酸を連続状態で含む断片；
ｄ．配列番号９、１９、２９、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９；並びに、配列番号９、１９、２９、３９、４９、５９、６９、７９、８９及び９９のポリペプチドの５２０個のアミノ酸を連続状態で含む断片；及び、
ｅ．配列番号１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１、１０１；並びに、配列番号１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１及び１０１のポリペプチドの２２０個のアミノ酸を連続状態で含む断片
【請求項１２】
デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムでの分析により、請求項１１に記載のポリペプチドに対して少なくとも７０％の相同性を有することが確認された、単離又は精製を行ったポリペプチド。
【請求項１３】
デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムにより、請求項１１に記載のポリペプチドに対して少なくとも９９％の相同性を有することが確認された、単離又は精製を行ったポリペプチド。
【請求項１４】
以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択されるポリペプチドからなる、単離又は精製を行ったエンジインのポリケチドシンターゼ。
（ａ）配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３、９３；
（ｂ）デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３、９３のポリペプチドに対して少なくとも７５％の相同性を有することが確認され、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３又は９３のポリペプチドと置換することができるポリペプチド；及び、
（ｃ）エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３、９３のポリペプチドと置換することができる、（ａ）及び（ｂ）のポリペプチドの断片
【請求項１５】
下記のａ．及びｂ．からなる、単離又は精製を行ったエンジインのポリケチドシンターゼ触媒複合体。
ａ．配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３、９３からなる群より選択されるポリペプチド；デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３、９３のポリペプチドに対して少なくとも７５％の相同性を有することが確認され、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３又は９３のポリペプチドと置換することができるポリペプチド；及び、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３、９３のポリペプチドと置換することができる、それらの断片；及び、
ｂ．配列番号３、５、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５からなる群より選択されるポリペプチド；デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、配列番号３、５、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５のポリペプチドに対して少なくとも７５％の相同性を有することが確認され、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号３、５、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５のポリペプチドと置換することができるポリペプチド；及び、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号３、５、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５のポリペプチドと置換することができる、それらの断片
【請求項１６】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１からなる群より選択される配列を有するポリペプチドと特異的に結合することが可能な、単離又は精製を行った抗体。
【請求項１７】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１からなる群より選択される配列を有するポリペプチドの製造方法であって、該ポリペプチドをコードし、かつ、操作可能な状態でプロモーターに連結されている核酸を、宿主細胞に導入することを特徴とする該ポリペプチドの製造方法。
【請求項１８】
ゲノムＤＮＡを含む試料を提供し、下記のａ．〜ｅ．からなる群の少なくとも１つからなるポリペプチドをコードする核酸配列の有無を検出することを特徴とする、エンジイン生合成遺伝子又は遺伝子断片の同定方法。
ａ．配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３、９３；及び、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３、９３のポリペプチドに対して少なくとも７５％の相同性を有することが確認されたポリペプチド；
ｂ．配列番号３、５、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５；及び、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、配列番号３、５、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５のポリペプチドに対して少なくとも７５％の相同性を有することが確認されたポリペプチド；
ｃ．配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７；及び、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７のポリペプチドに対して少なくとも７５％の相同性を有することが確認されたポリペプチド；
ｄ．配列番号９、１９、２９、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９；及び、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、配列番号９、１９、２９、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９のポリペプチドに対して少なくとも７５％の相同性を有することが確認されたポリペプチド；並びに、
ｅ．配列番号１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１、１０１；及び、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、配列番号１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１及び１０１のポリペプチドに対して少なくとも７５％の相同性を有することが確認されたポリペプチド
【請求項１９】
さらに、検出した核酸配列を使用して、ゲノムＤＮＡを含む試料からエンジイン遺伝子クラスターを単離するステップを含むことを特徴とする、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
さらに、試料中のゲノムＤＮＡから検出した核酸配列を含む生物を同定することを特徴とする、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
試料が、環境由来のバイオマスであることを特徴とする、請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
バイオマスが、微生物混合培養物であることを特徴とする、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
試料が、混合生物群であることを特徴とする、請求項１８記載の方法。
【請求項２４】
ゲノムＤＮＡを含む試料が、混合生物群より得られるゲノムライブラリーであることを特徴とする、請求項１８記載の方法。
【請求項２５】
ゲノムＤＮＡを含む試料が、純粋培養により得られることを特徴とする、請求項１８記載の方法。
【請求項２６】
ゲノムＤＮＡを含む試料が、複数個のクローンを含むゲノムライブラリーであって、かかるクローンを生成するためのＤＮＡが純粋培養により得られることを特徴とする、請求項１８記載の方法。
【請求項２７】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２の核酸コード、及び、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１のポリペプチドコードからなる群より選択される配列が保存されていることを特徴とする、コンピュータ読み取り可能な媒体。
【請求項２８】
プロセッサ及びデータ保存装置を含むコンピュータシステムであって、該データ保存装置には、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２の核酸コード、及び、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１のポリペプチドコードからなる群より選択される配列が保存されていることを特徴とするコンピュータシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物学分野に関する。より詳しくは、エンジイン（enediyne）産生に関与する遺伝子及びタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
エンジイン天然産物は、ウォーヘッド（warhead）とも呼ばれる、エンジイン環構造の存在により特徴づけられる。不安定なエンジイン環構造は、熱力学的に好ましいベルグマン環化を起こし、トランジェントなビラジカル種を形成する。かかるビラジカル種は、細胞中で、不可逆的なＤＮＡ損傷を誘導することができる。この反応により、細菌性細胞株及び腫瘍細胞株の両方に対する潜在的な生物活性が生じる。エンジインは、ＤＮＡを切断する能力があることから、抗癌剤として有望である。現在、カリケアマイシン（calicheamicin）は、急性骨髄性白血病の抗癌剤として臨床実験中である（Nabhan C. and Tallman MS, Clin Lymphoma (2002) Mar; 2 Suppl 1: S19-23；非特許文献１）。また、エンジインは、抗感染薬として有用である。したがって、既存のエンジインの産生を改善する方法や、新規の改良したエンジインを産生する方法は、製薬産業にとって大きな関心となっている。
【０００３】
エンジインは、構造的に多様な化合物の群である。色素タンパクエンジイン（chromoprotein enediynes）とは、生理的条件下で複合体に安定性を与えるタンパク質と会合するエンジインを意味する。非色素タンパクエンジイン（non-chromoprotein enediynes）とは、追加の安定化因子を必要としないエンジインを意味する。色素タンパクエンジインであるネオカルチノスタチン及びＣ−１０２７、並びに非色素タンパクエンジインであるカリケアマイシン及びダイネミシン（dynemicin）の構造を、以下に図示する。強調表示された各エンジインにおいて、ドデカポリエン（dodecapolyene）骨格が、ウォーヘッド構造を形成している。
【０００４】
【化１】
2005508140.tif 000003
カリケアマイシン
【０００５】
【化２】
2005508140.tif 000004
ネオカルチノスタチン
【０００６】
【化３】
2005508140.tif 000005
ダイネミシンＡ
【０００７】
【化４】
2005508140.tif 000006
Ｃ−１０２７
エンジインを特徴づけるウォーヘッド構造の合成に応答する遺伝子を見い出す試みは、これまでに成功していない。カリケアマイシンのアリールテトラサッカライド（aryltetrasaccharide）及びカリケアマイシン耐性の生合成酵素をコードする遺伝子については、国際公開公報第００／３７６０８号（特許文献１）に記載されている。色素タンパクエンジインであるＣ−１０２７の生合成に関与する追加の遺伝子は、単離されている（Liu, et al. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, vol. 44, pp 382-292 (2000）；非特許文献２，国際公開公報第００／４０５９６号；特許文献２)。同位体の取り込み実験を行なった結果、エスペラミシン（esperamicin）、ダイネミシン及びネオカルチノスタチンのエンジイン骨格が、アセテート由来のものであることが明らかになった（Hansens, O. D. et al. J. Am. Chem Soc. 11, vol 111 pp. 3295-3299 (1989)；非特許文献３， Lam, K. et al. J. Am. Chem. Soc. vol. 115, pp 12340-12345 (1993)；非特許文献４， Tokiwa, Y et al. J. Am. Chem Soc. vol. 113 pp. 4107-4110；非特許文献５）。しかしながら、Ｉ型ＰＫＳ及びII型ＰＫＳに相同的なＰＣＲプローブ及びＤＮＡプローブの両方は、微生物を産生する既知のエンジインにおいて、エンジインの生合成に関連するＰＫＳ遺伝子の存在を同定することができなかった（国際公開公報第００／４０５９６号；特許文献２， W. Liu & B. Shen, Antimicrobial Agents Chemotherapy, vol. 44 No. 2 pp. 382-392 (2000)；非特許文献６）。
【０００８】
エンジインの生合成に関与する遺伝子の解明、特に、ウォーヘッド構造の解明は、新規の薬剤情報（drug leads）を得るための合理的なエンジイン生合成工学へのアクセスを提供し、生合成の機構を調節解除することにより過剰産生系統を構築することが可能になるであろう。エンジインの生合成に関与するＰＫＳ遺伝子の解明は、コンビナトリアル生合成を介して新規エンジインを産生するために利用可能なＰＫＳ遺伝子のレパートリー（repertoire）を広げることにより、コンビナトリアル生合成の分野に貢献するであろう。
【０００９】
エンジイン産生微生物を同定するための既存のスクリーニング方法は、労力を要するとともに時間がかかるものであり、現在のところ識別も充分とはいえず、エンジイン天然産物を低いレベルで産生する生物の検出には至っていない。エンジイン産生生物を検出するツールの改良が必要とされている。また、従来の培養試験では検出されないレベルでエンジインを産生する生物を検出することが可能なツールも必要とされている。
【特許文献１】
国際公開公報第００／３７６０８号パンフレット
【特許文献２】
国際公開公報第００／４０５９６号パンフレット
【非特許文献１】
Nabhan C. and Tallman MS, Clin Lymphoma (2002) Mar; 2 Suppl 1: S19-23
【非特許文献２】
Liu, et al. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, vol. 44, pp 382-292 (2000）
【非特許文献３】
Hansens, O. D. et al. J. Am. Chem Soc. 11, vol 111 pp. 3295-3299 (1989)
【非特許文献４】
Lam, K. et al. J. Am. Chem. Soc. vol. 115, pp 12340-12345 (1993)
【非特許文献５】
Tokiwa, Y et al. J. Am. Chem Soc. vol. 113 pp. 4107-4110
【非特許文献６】
W. Liu & B. Shen, Antimicrobial Agents Chemotherapy, vol. 44 No. 2 pp. 382-392 (2000)
【発明の開示】
【００１０】
本発明の１つの実施形態においては、下記の（ａ）〜（ｅ）からなる群より選択される配列：（ａ）配列番号２、１４、２４、３４、４４、５４、６４、７４、８４、９４；配列番号２、１４、２４、３４、４４、５４、６４、７４、８４、９４に相補的な配列；配列番号２、１４、２４、３４、４４、５４、６４、７４、８４、９４の２０００個、好ましくは３０００個、より好ましくは４０００個、さらにより好ましくは５０００個、さらにより好ましくは５６００個、最も好ましくは５７５０個のヌクレオチドを連続状態で含む断片；及び、配列番号２、１４、２４、３４、４４、５４、６４、７４、８４、９４に相補的な配列の２０００個、好ましくは３０００個、より好ましくは４０００個、さらにより好ましくは５０００個、さらにより好ましくは５６００個、最も好ましくは５７５０個のヌクレオチドを連続状態で含む断片；（ｂ）配列番号４、６、１６、２６、３６、４６、５６、６６、７６、８６、９６；配列番号４、６、１６、２６、３６、４６、５６、６６、７６、８６、９６に相補的な配列；配列番号４、６、１６、２６、３６、４６、５６、６６、７６、８６、９６の１５０個、好ましくは２００個、より好ましくは２５０個、さらにより好ましくは３００個、さらにより好ましくは３５０個、最も好ましくは４００個のヌクレオチドを連続状態で含む断片；及び、配列番号４、６、１６、２６、３６、４６、５６、６６、７６、８６、９６に相補的な配列の１５０個、好ましくは２００個、より好ましくは２５０個、さらにより好ましくは３００個、さらにより好ましくは３５０個、最も好ましくは４００個のヌクレオチドを連続状態で含む断片；（ｃ）配列番号８、１８、２８、３８、４８、５８、６８、７８、８８、９８；配列番号８、１８、２８、３８、４８、５８、６８、７８、８８、９８に相補的な配列；配列番号８、１８、２８、３８、４８、５８、６８、７８、８８、９８の７００個、好ましくは７５０個、より好ましくは８００個、さらにより好ましくは８５０個、さらにより好ましくは９００個、最も好ましくは９５０個のヌクレオチドを連続状態で含む断片；及び、配列番号８、１８、２８、３８、４８、５８、６８、７８、８８、９８に相補的な配列の７００個、好ましくは７５０個、より好ましくは８００個、さらにより好ましくは８５０個、さらにより好ましくは９００個、最も好ましくは９５０個のヌクレオチドを連続状態で含む断片；（ｄ）配列番号１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００；配列番号１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００に相補的な配列；配列番号１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００の６００個、好ましくは７００個、より好ましくは７５０個、さらにより好ましくは８００個、さらにより好ましくは８５０個、最も好ましくは９００個のヌクレオチドを連続状態で含む断片；及び、配列番号１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００に相補的な配列の６００個、好ましくは７００個、より好ましくは７５０個、さらにより好ましくは８００個、さらにより好ましくは８５０個、最も好ましくは９００個のヌクレオチドを連続状態で含む断片；（ｅ）配列番号１２、２２、３２、４２、５２、６２、７２、８２、９２、１０２；配列番号１２、２２、３２、４２、５２、６２、７２、８２、９２、１０２に相補的な配列；配列番号１２、２２、３２、４２、５２、６２、７２、８２、９２、１０２に相補的な配列の７００個、好ましくは７５０個、より好ましくは８００個、さらにより好ましくは８５０個、さらにより好ましくは９００個、最も好ましくは９５０個のヌクレオチドを連続状態で含む断片；及び、配列番号１２、２２、３２、４２、５２、６２、７２、８２、９２、１０２の７００個、好ましくは７５０個、より好ましくは８００個、さらにより好ましくは８５０個、さらにより好ましくは９００個、最も好ましくは９５０個のヌクレオチドを連続状態で含む断片；を含む、単離、精製又は濃縮を行った核酸を提供するものである。本発明の１つの態様においては、この実施形態の核酸と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズできる、単離、精製又は濃縮を行った核酸を提供するものである。本発明の別の態様においては、この実施形態の核酸と中程度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズできる、単離、精製又は濃縮を行なった核酸を提供するものである。本発明の別の態様においては、この実施形態の核酸と低ストレンジェンシー条件下でハイブリダイズできる、単離、精製又は濃縮を行った核酸を提供するものである。本発明の別の態様においては、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＮバージョン２．０での分析により、この実施形態の核酸に対して少なくとも７０％の相同性を有することが確認された、単離、精製又は濃縮を行った核酸を提供するものである。本発明の別の態様においては、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＮバージョン２．０での分析により、この実施形態の核酸に対して少なくとも９９％の相同性を有することが確認された、単離、精製又は濃縮を行った核酸を提供するものである。
【００１１】
別の実施形態においては、本発明は、下記の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択されるポリペプチド：（ａ）配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３、９３；（ｂ）デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３、９３のポリペプチドに対して少なくとも７５％の相同性を有することが確認され、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３又は９３のポリペプチドと置換することができるポリペプチド；及び、（ｃ）エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３、９３のポリペプチドと置換することができる断片である（ａ）及び（ｂ）のポリペプチドの断片；を含む、エンジインのポリケチドシンターゼタンパク質をコードする、単離、精製又は濃縮を行った核酸を提供するものである。この実施形態の１つの態様においては、エンジインのポリケチドシンターゼタンパク質をコードする核酸は、エンジイン化合物のウォーヘッド構造を合成するために、遺伝子工学的な適用に用いてもよい。
【００１２】
別の実施形態においては、本発明は、下記の（ａ）及び（ｂ）からなるエンジインのポリケチドシンターゼ触媒複合体：（ａ）配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３、９３からなる群より選択されるポリペプチド；デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３、９３のポリペプチドに対して少なくとも７５％の相同性を有することが確認され、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３又は９３のポリペプチドと置換することができるポリペプチド；及び、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３、９３のポリペプチドと置換することができる、それらの断片；及び、（ｂ）配列番号３、５、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５からなる群より選択されるポリペプチド；デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、配列番号３、５、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５のポリペプチドに対して少なくとも７５％の相同性を有することが確認され、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号３、５、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５のポリペプチドと置換することができるポリペプチド；及び、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号３、５、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５のポリペプチドと置換することができる、それらの断片；をコードする、単離、精製又は濃縮を行った核酸を提供するものである。この実施形態の１つの態様においては、エンジインのポリケチドシンターゼ触媒複合体をコードする核酸は、エンジイン化合物のウォーヘッド構造を合成するために、遺伝子工学的な適用に用いてもよい。
【００１３】
別の実施形態においては、本発明は、下記の（ａ）及び（ｂ）からなる遺伝子カセット：（ａ）上記に記載のエンジインのポリケチドシンターゼ触媒複合体をコードする核酸；及び、（ｂ）下記の（ｉ）〜（iii）からなる群より選択されるポリペプチド：（ｉ）配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７；デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７のポリペプチドに対して少なくとも７５％の相同性を有することが確認され、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７のポリペプチドと置換することができるポリペプチド；及び、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７のポリペプチドと置換することができる、それらの断片；（ii）配列番号９、１９、２９、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９；デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、配列番号９、１９、２９、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９のポリペプチドに対して少なくとも７５％の相同性を有することが確認され、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号９、１９、２９、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９のポリペプチドと置換することができるポリペプチド；及び、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号９、１９、２９、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９のポリペプチドと置換することができる、それらの断片；及び、（iii）配列番号１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１、１０１；デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、配列番号１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１、１０１のポリペプチドに対して少なくとも７５％の相同性を有することが確認され、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１、１０１のポリペプチドと置換することができるポリペプチド；及び、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１、１０１のポリペプチドと置換することができる、それらの断片；をコードする少なくとも１個の核酸、をコードする、単離、精製又は濃縮を行った核酸を提供するものである。この実施形態の１つの態様においては、遺伝子カセットをコードする核酸は、エンジイン化合物のウォーヘッド構造を合成するための、遺伝子工学的な適用に使用してもよい。
【００１４】
別の実施形態においては、本発明は、下記の（ａ）〜（ｅ）からなる遺伝子カセット：（ａ）配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３、９３からなる群より選択されるポリペプチドをコードする核酸；デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３、９３のポリペプチドに対して少なくとも７５％の相同性を有することが確認され、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３若しくは９３のポリペプチドと置換することができるポリペプチド；又は、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３、９３のポリペプチドと置換することができる、それらの断片；（ｂ）配列番号３、５、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５からなる群より選択されるポリペプチドをコードする少なくとも１個の核酸；デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、配列番号３、５、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５のポリペプチドに対して少なくとも７５％の相同性を有することが確認され、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号３、５、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５のポリペプチドと置換することができるポリペプチド；又は、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号３、５、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５のポリペプチドと置換することができる、それらの断片；（ｃ）配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７からなる群より選択されるポリペプチドをコードする少なくとも１個の核酸；デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７のポリペプチドに対して少なくとも７５％の相同性を有することが確認され、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７のポリペプチドと置換することができるポリペプチド；及び、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７のポリペプチドと置換することができる、それらの断片；（ｄ）配列番号９、１９、２９、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９より選択されるポリペプチドをコードする少なくとも１個の核酸；デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、配列番号９、１９、２９、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９のポリペプチドに対して少なくとも７５％の相同性を有することが確認され、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号９、１９、２９、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９のポリペプチドと置換することができるポリペプチド；及び、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号９、１９、２９、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９のポリペプチドと置換することができる、それらの断片；及び、（ｅ）配列番号１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１、１０１より選択されるポリペプチドをコードする少なくとも１個の核酸；デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、配列番号１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１、１０１のポリペプチドに対して少なくとも７５％の相同性を有することが確認され、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１、１０１のポリペプチドと置換することができるポリペプチド；及び、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１、１０１のポリペプチドと置換することができる、それらの断片；
をコードする、単離、精製又は濃縮を行った核酸を提供するものである。この実施形態の１つの態様においては、遺伝子カセットをコードする核酸は、エンジイン化合物のウォーヘッド構造を合成するための、遺伝子工学的な適用に使用してもよい。
【００１５】
本発明の別の実施形態においては、下記の（ａ）〜（ｅ）からなる群より選択される配列：（ａ）配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３、９３；並びに、配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３、９３の１３００個、好ましくは１４５０個、より好ましくは１５５０個、さらにより好ましくは１６５０個、さらにより好ましくは１７５０個、最も好ましくは１８５０個のアミノ酸を連続状態で含む断片；（ｂ）配列番号３、５、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５；及び、配列番号３、５、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５の４０個、好ましくは６０個、より好ましくは８０個、さらにより好ましくは１００個、さらにより好ましくは１２０個、最も好ましくは１３０個のアミノ酸を連続状態で含む断片；（ｃ）配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７；配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７の２２０個、好ましくは２４０個、より好ましくは２６０個、さらにより好ましくは２８０個、さらにより好ましくは３００個、最も好ましくは３１０個のアミノ酸を連続状態で含む断片；（ｄ）配列番号９、１９、２９、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９；及び、配列番号９、１９、２９、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９の５２０個、好ましくは５４０個、より好ましくは５６０個、さらにより好ましくは５８０個、さらにより好ましくは６００個、最も好ましくは６２０個のアミノ酸を連続状態で含む断片；及び、（ｅ）配列番号１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１、１０１；並びに、配列番号１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１及び１０１の２２０個、好ましくは２４０個、より好ましくは２６０個、さらにより好ましくは２８０個、さらにより好ましくは３００個、最も好ましくは３２０個のアミノ酸を連続状態で含む断片；からなる、単離又は精製を行ったポリペプチドを提供するものである。本発明の１つの態様においては、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムでの分析により、この実施形態のポリペプチドに対して少なくとも７０％の相同性を有することが確認された、単離又は精製を行ったポリペプチドを提供するものである。本発明の別の態様においては、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムでの分析により、この実施形態のポリペプチドに対して少なくとも９９％の相同性を有することが確認された、単離又は精製を行ったポリペプチドを提供するものである。
【００１６】
別の実施形態においては、本発明は、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択されるポリペプチド：（ａ）配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３、９３；（ｂ）デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３、９３のポリペプチドに対して少なくとも７５％の相同性を有することが確認され、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３又は９３のポリペプチドと置換することができるポリペプチド；及び、（ｃ）エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３、９３のポリペプチドと置換することができる、（ａ）及び（ｂ）のポリペプチドの断片；からなる、単離又は精製を行ったエンジインのポリケチドシンターゼを提供するものである。この実施形態の１つの態様において、エンジインのポリケチドシンターゼタンパク質は、エンジイン化合物のウォーヘッド構造を合成するために、遺伝子工学的な適用に用いてもよい。
【００１７】
別の実施形態においては、本発明は、下記の、（ａ）配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３、９３からなる群より選択されるポリペプチド；デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３、９３のポリペプチドに対して少なくとも７５％の相同性を有することが確認され、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３又は９３のポリペプチドと置換することができるポリペプチド；及び、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３、９３のポリペプチドと置換することができる、それらの断片；及び、（ｂ）配列番号３、５、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５からなる群より選択されるポリペプチド；デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、配列番号３、５、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５のポリペプチドに対して少なくとも７５％の相同性を有することが確認され、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号３、５、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５のポリペプチドと置換することができるポリペプチド；及び、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号３、５、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５のポリペプチドと置換することができる、それらの断片；からなる、単離又は精製を行ったエンジインのポリケチドシンターゼ触媒複合体を提供するものである。この実施形知の１つの態様においては、エンジインのポリケチドシンターゼ触媒複合体は、エンジイン化合物のウォーヘッド構造を合成するために、遺伝子工学的な適用に用いてもよい。
【００１８】
別の実施形態においては、本発明は、下記の、（ａ）配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７；（ｂ）デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７のポリペプチドに対して少なくとも７５％の相同性を有することが確認され、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７のポリペプチドと置換することができるポリペプチド；及び、（ｃ）エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７のポリペプチドと置換することができる、（ａ）又は（ｂ）の断片；からなる群より選択されるポリペプチドを提供するものである。１つの態様においては、この実施形態のポリペプチドを、本発明のエンジインのポリケチドシンターゼ触媒複合体と共に、エンジイン化合物のウォーヘッド構造を合成するために、遺伝子工学的な適用に用いてもよい。
【００１９】
別の実施形態においては、本発明は、下記の、（ａ）配列番号９、１９、２９、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９；（ｂ）デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、配列番号９、１９、２９、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９のポリペプチドに対して少なくとも７５％の相同性を有することが確認され、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号９、１９、２９、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９のポリペプチドと置換することができるポリペプチド；及び、（ｃ）エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号９、１９、２９、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９のポリペプチドと置換することができる、（ａ）又は（ｂ）の断片；からなる群より選択されるポリペプチドを提供するものである。１つの態様においては、この実施形態のポリペプチドを、本発明のエンジインのポリケチドシンターゼ触媒複合体と共に、エンジイン化合物のウォーヘッド構造を合成するために、遺伝子工学的な適用に用いてもよい。
【００２０】
別の実施形態においては、本発明は、下記の、（ａ）配列番号１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１、１０１；（ｂ）デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、配列番号１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１、１０１のポリペプチドに対して少なくとも７５％の相同性を有することが確認され、エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１、１０１のポリペプチドと置換することができるポリペプチド；及び、（ｃ）エンジイン化合物におけるウォーヘッド構造の合成中に、配列番号１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１、１０１のポリペプチドと置換することができる、（ａ）又は（ｂ）の断片；からなる群より選択されるポリペプチドを提供するものである。この実施形態の１つの態様においては、この実施形態のポリペプチドを、本発明のエンジインのポリケチドシンターゼ触媒複合体と共に、エンジイン化合物のウォーヘッド構造を合成するために、遺伝子工学的な適用に用いてもよい。
【００２１】
ハイブリダイゼーションプローブやＰＣＲプライマー等の本発明の組成物を用いることにより、エンジイン遺伝子クラスターを同定することができる。本発明のハイブリダイゼーションプローブ又はＰＣＲプライマーは、エンジインのウォーヘッド構造の特徴に関与するタンパク質ファミリーに由来する。エンジイン遺伝子クラスターを同定する場合は、該ハイブリダイゼーションプローブ又はＰＣＲプライマーは、本発明においてＰＫＳＥ、ＴＥＢＣ、ＵＮＢＬ、ＵＮＢＶ及びＵＮＢＵと示す５個のタンパク質ファミリーに対応する１個又はそれ以上の核酸配列に由来している。本発明の組成物は、エンジイン生合成遺伝子、エンジイン遺伝子断片、エンジイン遺伝子クラスター、又は潜在的なエンジイン産生微生物を含有する試料から得られるエンジイン産生生体を同定するプローブとして使用されている。該試料は、環境由来バイオマス、純粋又は混合微生物培養物、純粋又は混合微生物培養物より単離したゲノムＤＮＡ、純粋又は混合培養微生物由来のゲノムＤＮＡライブラリーの形態であってもよい。該組成物は、当業者には周知の核酸ハイブリダイゼーション法及びポリメラーゼ連鎖反応で使用されている。
【００２２】
エンジインを産生する可能性のある微生物を含有する環境由来試料をＰＣＲ法で同定している。標的のオルトソマイシン生合成遺伝子配列を増幅するために、該環境由来試料に含まれる核酸を本発明のプライマーと接触させる。ＰＣＲにより陽性と考えられる環境由来試料については、標的の遺伝子配列を内包する微生物及びエンジイン遺伝子クラスターの同定及び単離を行う。該環境由来試料に含まれる各種微生物群から代表的なゲノムＤＮＡを集めたゲノムＤＮＡライブラリー（例えば、コスミド、ＢＡＣ等）を構築し、（例えば、ハイブリダイゼーション法又はＰＣＲによって）標的の配列を内包するゲノムＤＮＡクローン、及び重複する可能性のあるクローンの局在を確認し、目的のゲノムＤＮＡクローンの配列を決定し、エンジイン生合成遺伝子座のＯＲＦを推定することにより、エンジイン遺伝子クラスターの同定を行ってもよい。エンジイン生合成遺伝子座を含む微生物の同定及び単離は、例えば、本発明の核酸プローブ又は新しく同定したエンジイン生合成遺伝子座に由来する核酸プローブのいずれかを用いたコロニーハイブリダイゼーションによって行ってもよい。単離したエンジイン生合成遺伝子座を適切な代理宿主に導入して、エンジイン化合物のヘテロローガスな生産（heterologous production）を行ってもよい。あるいは、エンジイン生合成遺伝子座を含む微生物を同定し単離した場合には、発酵させることによりエンジイン化合物を産生してもよい。
【００２３】
エンジイン遺伝子クラスターを含有する微生物は、まず同定し、例えば、本発明の核酸プローブを用いたコロニーハイブリダイゼーションによって、純粋培養物として単離する。純粋培養物を出発点として、この単一の種から代表的なゲノムＤＮＡを集めたゲノムＤＮＡライブラリー（例えば、コスミド、ＢＡＣ等）を調製し、標的の配列を内包するゲノムＤＮＡクローン、及び重複する可能性のあるクローンの局在を、本発明のプローブを用いて（例えば、ハイブリダイゼーション法又はＰＣＲによって）確認し、目的のゲノムＤＮＡクローンの配列を決定し、エンジイン生合成遺伝子座のＯＲＦを推定する。エンジイン生合成遺伝子座を含む微生物を発酵させてエンジイン化合物を産生してもよく、又は、エンジイン生合成遺伝子座を適切な代理宿主に導入して、エンジイン化合物のヘテロローガスな生産を行ってもよい。
【００２４】
エンジイン特異的核酸コード及びエンジイン特異的ポリペプチドコードから選択した１つ以上の配列を本発明の教示の通りに用いて、エンジイン遺伝子クラスターをコンピュータシミュレーションで同定してもよい。コンピュータ読み取り可能な媒体に保存されているクエリー配列のセットから１つのクエリーを読み出して、本発明の参照配列から選択したサブジェクトと比較する。該サブジェクトとクエリーとの間の類似の程度を測定し、エンジイン遺伝子を表すクエリー配列を同定する。
【００２５】
したがって、本発明の別の実施形態においては、ゲノムＤＮＡを含む試料を提供し、下記の（ａ）〜（ｅ）からなる群のいずれか１つからなるポリペプチド：（ａ）配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３、９３；及び、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３、９３のポリペプチドに対して少なくとも７５％の相同性を有することが確認されたポリペプチド；（ｂ）配列番号３、５、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５；及び、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、配列番号３、５、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５のポリペプチドに対して少なくとも７５％の相同性を有することが確認されたポリペプチド；（ｃ）配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７；及び、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７のポリペプチドに対して少なくとも７５％の相同性を有することが確認されたポリペプチド；（ｄ）配列番号９、１９、２９、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９；及び、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、配列番号９、１９、２９、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９のポリペプチドに対して少なくとも７５％の相同性を有することが確認されたポリペプチド；並びに、（ｅ）配列番号１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１、１０１；及び、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、配列番号１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１及び１０１のポリペプチドに対して少なくとも７５％の相同性を有することが確認された、ポリペプチド；をコードする核酸配列の有無を検出することを特徴とする、エンジイン生合成遺伝子又は遺伝子断片の同定方法を提供するものである。この実施形態の１つの態様においては、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）の群の少なくとも２つから、ポリペプチドをコードする核酸配列を検出することを提供するものである。この実施形態の別の態様においては、かかる（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）の群の少なくとも３つから、ポリペプチドをコードする核酸配列を検出することを提供するものである。この実施形態の別の態様においては、かかる（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）の群の少なくとも４つから、ポリペプチドをコードする核酸配列を検出することを提供するものである。この実施形態の別の態様においては、かかる（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）の群のそれぞれからポリペプチドをコードする核酸配列を検出することを提供するものである。本発明のこの実施形態の別の態様においては、検出した核酸を用いて、ゲノムDNAを含む試料からエンジイン遺伝子クラスターを単離するさらなるステップを提供するものである。本発明のこの実施形態の別の態様においては、試料中のゲノムＤＮＡから検出した核酸配列を含む生物を同定することからなる。
【００２６】
当然のことながら、エンジイン生合成遺伝子クラスターを同定する組成物及び方法を提供する本発明は、同定された生合成遺伝子クラスターが産生するエンジインをも提供するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明は、エンジインに関連する組成物を提供するものである。かかる組成物を用いて、エンジインに関連する化合物を産生することができる。また、かかる組成物を用いて、エンジイン天然産物、エンジイン遺伝子、エンジイン遺伝子クラスター及びエンジイン産生生物を同定することができる。本発明は、色素タンパクエンジイン及び非色素タンパクエンジインを含む全てのエンジインが、ウォーヘッド構造を形成する際に保存された遺伝子のセットを用いるという驚くべき発見に基づくものである。
【００２８】
本発明の組成物及び方法を提供するため、微生物Streptomyces macromyceticusの試料を入手し、色素タンパクエンジインであるマクロモマイシン（macromomycin）の生合成遺伝子座を同定した。まず、Samy TS et al., J. Biol. Chem (1983) Jan 10; 258 (1) pp. 183-91にその配列が開示されている、色素タンパクと関連するアポタンパク質をコードする配列を確認し、次に、同時係属出願である米国特許出願第０９／９１０，８１３号に開示されているゲノムスキャン手順を用いることにより、遺伝子クラスターを、Streptomyces macromyceticus NRRL B-5335由来のマクロモマイシンの生合成遺伝子座として同定した（以下、ＭＡＣＲと称する場合がある）。
【００２９】
その後、微生物Micromonospora echinospora subsp. calichensisの試料を入手し、非色素タンパクエンジインであるカリケアマイシンの完全長生合成遺伝子座を同定した。配列と、国際公開公報ＷＯ００／４０５９６に開示されているＣＡＬＩの部分的な遺伝子座とを比較することにより、遺伝子クラスターを、Micromonospora echinospora subsp. Calichensis NRRL 15839由来のカリケアマイシンの生合成遺伝子座として同定した（以下、ＣＡＬＩと称する場合がある）。本発明者らは、同時係属出願である米国特許出願第０９／９１０，８１３号に開示した、ショットガンベースのアプローチ（shotgun-based approach）を用いることにより、これまでに生合成遺伝子座全体の単離及びクローンを試みたときに遭遇した問題を克服することができた。
【００３０】
さらに、本発明者らは、これまでにエンジイン化合物を産生するとは報告されていない生物から２つのエンジイン天然産物生合成遺伝子座、すなわち、Streptomyces ghanaensis NRRL B-12104由来の色素タンパクエンジイン（以下、００９Ｃと称する場合がある）及びAmycolatopsis orientalis ATCC43491由来の色素タンパクエンジイン（以下、００７Ａと称する場合がある）を同定した。００９Ｃ及び００７Ａにおいて、アポタンパク質をコードする遺伝子が存在することから、００９Ｃ及び００７Ａが色素タンパクエンジイン化合物を産生することを確認した。
【００３１】
ＭＡＣＲ、ＣＡＬＩ、００９Ｃ及び００７Ａの遺伝子座を比較した結果、全ての遺伝子座が５個のタンパク質ファミリーのうち少なくとも１つのメンバーを含むことが分かった。表１に示したように、かかる５個のタンパク質ファミリーを４文字で表記し、本明細書及び本図面では一貫してその表記を使用した。
【００３２】
【表１】
2005508140.tif 000007
研究した色素タンパクエンジイン及び非色素タンパクエンジインの１０個以上の生合成遺伝子座のそれぞれから、５個のタンパク質ファミリーの各メンバーが見つかった。５個のタンパク質ファミリーのうちの２つ、すなわち、ＰＫＳＥ及びＴＥＢＣは、エンジイン化合物を識別するウォーヘッド構造の形成に関与するポリケチドシンターゼ触媒複合体を形成する。色素タンパクエンジイン及び非色素タンパクエンジインの生合成遺伝子座の全域で保存されるその他３個のタンパク質ファミリーも、エンジイン化合物を特徴づけるウォーヘッド構造に関与している。これら５個のタンパク質ファミリーに関連する核酸配列及びポリペプチド配列は、本発明の組成物及び方法の基礎となっている。
【００３３】
ＭＡＣＲ、ＣＡＬＩ、００９Ｃ、００７Ａ、Kitasatosporia sp.由来のエンジイン生合成遺伝子座（以下、０２８Ｄと称する場合がある）、Micromonospora megalomicea由来のエンジイン生合成遺伝子座（以下、０５４Ａと称する場合がある）、Saccharothrix aerocolonigenes由来のエンジイン生合成遺伝子座（以下、１３２Ｈと称する場合がある）、Streptomyces kaniharaensis由来のエンジイン生合成遺伝子座（以下、１３５Ｅと称する場合がある）、Streptomyces citricolor由来のエンジイン生合成遺伝子座（以下、１４５Ｂと称する場合がある）及びStreptomyces carzinostaticus由来の色素タンパクエンジインネオカルチノスタチンの生合成遺伝子座（以下、ＮＥＯＣと称する場合がある）を含む、研究した１０個のエンジイン生合成遺伝子座の全てにおいて、本発明者らは、ＰＫＳＥ、ＴＥＢＣ、ＵＮＢＬ、ＵＮＢＶ及びＵＮＢＵタンパク質ファミリーのうち少なくとも１つのメンバーを確認した。
【００３４】
本発明のＰＫＳＥ、ＴＥＢＣ、ＵＮＢＬ、ＵＮＢＶ及びＵＮＢＵタンパク質ファミリーは、エンジイン化合物のウォーヘッド形成に関与し、色素タンパクエンジイン及び非色素タンパクエンジイン生合成遺伝子座の両方に存在する。エンジイン生合成遺伝子座中にあるＰＫＳＥ、ＴＥＢＣ、ＵＮＢＬ、ＵＮＢＶ及びＵＮＢＵタンパク質ファミリーのメンバーは、必ず単一のオペロンに存在し、したがって、必ずしも互いに転写的に結合しているとは限らない。しかしながら、単一のエンジイン生合成遺伝子座中にあるＰＫＳＥ、ＴＥＢＣ、ＵＮＢＬ、ＵＮＢＶ及びＵＮＢＵタンパク質ファミリーのメンバーは、互いに機能的に結合し、エンジイン産物の産生において協同型式（concerted fashion）で作用する。ＰＫＳＥ、ＴＥＢＣ、ＵＮＢＬ、ＵＮＢＶ及びＵＮＢＵタンパク質ファミリーのメンバーをコードする機能的に結合したエンジイン特異的遺伝子の発現は、識別可能な転写プロモーターに制御されてもよいが、それでもなお、それらは協同型式で発現してもよい。
【００３５】
ＰＫＳＥ、ＴＥＢＣ、ＵＮＢＬ、ＵＮＢＶ及びＵＮＢＵタンパク質ファミリーのメンバー間の配列が全体的によく保存されているため、ＰＫＳＥ、ＴＥＢＣ、ＵＮＢＬ、ＵＮＢＶ及びＵＮＢＵタンパク質ファミリーのメンバーは、エンジイン化合物のウォーヘッド構造を合成するための新たなエンジイン生合成システムの能力を維持しながら、同じタンパク質ファミリーの別のメンバーと置き換えられることが期待される。したがって、２つ以上の異なるエンジイン生合成システムよりＰＫＳＥ、ＴＥＢＣ、ＵＮＢＬ、ＵＮＢＶ及びＵＮＢＵタンパク質ファミリー由来のポリペプチドをコードする遺伝子を、エンジインカセットの１つ以上の遺伝子カセットが固有の又は操作した最適な特性を有する、本発明の５個の遺伝子のエンジインカセットの完全な補体を得るために組み合わせてもよい。
【００３６】
ここに記載した１０個のエンジイン遺伝子座のそれぞれから得られる代表的な核酸配列及びポリペプチド配列を、本発明の組成物の例として、添付の配列表に記載した。該配列表を参照すると、Streptomyces macromyceticus由来のマクロモマイシン生合成遺伝子座（ＭＡＣＲ）由来の本発明のＰＫＳＥタンパク質ファミリーのメンバーをコードする核酸配列を配列番号２に示し、対応する推定ポリペプチド配列を配列番号１に示す。ＭＡＣＲ由来のＴＥＢＣタンパク質ファミリーの２個のメンバーをコードする核酸配列を配列番号４及び６に示し、それぞれに対応する推定ポリペプチド配列を配列番号３及び５に示す。ＭＡＣＲ由来のＵＮＢＬタンパク質ファミリーのメンバーをコードする核酸配列を配列番号８に示し、対応する推定ポリペプチド配列を配列番号７に示す。ＭＡＣＲ由来のＵＮＢＶタンパク質ファミリーのメンバーをコードする核酸配列を配列番号１０に示し、対応する推定ポリペプチド配列を配列番号９に示す。ＭＡＣＲ由来のＵＮＢＵタンパク質ファミリーのメンバーをコードする核酸配列を配列番号１２に示し、対応する推定ポリペプチド配列を配列番号１１に示す。
【００３７】
Micromonospora echinospora subsp. calichensis由来のカリケアマイシン生合成遺伝子座（ＣＡＬＩ）由来の本発明のＰＫＳＥタンパク質ファミリーのメンバーをコードする核酸配列を配列番号１４に示し、対応する推定ポリペプチド配列を配列番号１３に示す。ＣＡＬＩ由来のＴＥＢＣタンパク質ファミリーのメンバーをコードする核酸配列を配列番号１６に示し、対応する推定ポリペプチド配列を配列番号１５に示す。ＣＡＬＩ由来のＵＮＢＬタンパク質ファミリーのメンバーをコードする核酸配列を配列番号１８に示し、対応する推定ポリペプチド配列を配列番号１７に示す。ＣＡＬＩ由来のＵＮＢＶタンパク質ファミリーのメンバーをコードする核酸配列を配列番号２０に示し、対応する推定ポリペプチド配列を配列番号１９に示す。ＣＡＬＩ由来のＵＮＢＵタンパク質ファミリーのメンバーをコードする核酸配列を配列番号２２に示し、対応する推定ポリペプチド配列を配列番号２１に示す。
【００３８】
Streptomyces ghanaensis由来のエンジイン生合成遺伝子座（００９Ｃ）由来の本発明のＰＫＳＥタンパク質ファミリーのメンバーをコードする核酸配列を配列番号２４に示し、対応する推定ポリペプチド配列を配列番号２３に示す。００９Ｃ由来のＴＥＢＣタンパク質ファミリーのメンバーをコードする核酸配列を配列番号２６に示し、対応する推定ポリペプチド配列を配列番号２５に示す。００９Ｃ由来のＵＮＢＬタンパク質ファミリーのメンバーをコードする核酸配列を配列番号２８に示し、対応する推定ポリペプチド配列を配列番号２７に示す。００９Ｃ由来のＵＮＢＶタンパク質ファミリーのメンバーをコードする核酸配列を配列番号３０に示し、対応する推定ポリペプチド配列を配列番号２９に示す。００９Ｃ由来のＵＮＢＵタンパク質ファミリーのメンバーをコードする核酸配列を配列番号３２に示し、対応する推定ポリペプチド配列を配列番号３１に示す。
【００３９】
Streptomyces carzinostaticus subsp. neocarzinostaticus由来のネオカルチノスタチン生合成遺伝子座（ＮＥＯＣ）由来の本発明のＰＫＳＥタンパク質ファミリーのメンバーをコードする核酸配列を配列番号３４に示し、対応する推定ポリペプチド配列を配列番号３３に示す。ＮＥＯＣ由来のＴＥＢＣタンパク質ファミリーのメンバーをコードする核酸配列を配列番号３６に示し、対応する推定ポリペプチド配列を配列番号３５に示す。ＮＥＯＣ由来のＵＮＢＬタンパク質ファミリーのメンバーをコードする核酸配列を配列番号３８に示し、対応する推定ポリペプチド配列を配列番号３７に示す。ＮＥＯＣ由来のＵＮＢＶタンパク質ファミリーのメンバーをコードする核酸配列を配列番号４０に示し、対応する推定ポリペプチド配列を配列番号３９に示す。ＮＥＯＣ由来のＵＮＢＵタンパク質ファミリーのメンバーをコードする核酸配列を配列番号４２に示し、対応する推定ポリペプチド配列を配列番号４１に示す。
【００４０】
Amycolatopsis orientalis由来のエンジイン生合成遺伝子座（００７Ａ）由来の本発明のＰＫＳＥタンパク質ファミリーのメンバーをコードする核酸配列を配列番号４４に示し、対応する推定ポリペプチド配列を配列番号４３に示す。００７Ａ由来のＴＥＢＣタンパク質ファミリーのメンバーをコードする核酸配列を配列番号４６に示し、対応する推定ポリペプチド配列を配列番号４５に示す。００７Ａ由来のＵＮＢＬタンパク質ファミリーのメンバーをコードする核酸配列を配列番号４８に示し、対応する推定ポリペプチド配列を配列番号４７に示す。００７Ａ由来のＵＮＢＶタンパク質ファミリーのメンバーをコードする核酸配列を配列番号５０に示し、対応する推定ポリペプチド配列を配列番号４９に示す。００７Ａ由来のＵＮＢＵタンパク質ファミリーのメンバーをコードする核酸配列を配列番号５２に示し、対応する推定ポリペプチド配列を配列番号５１に示す。
【００４１】
Kitasatosporia sp.由来のエンジイン生合成遺伝子座（０２８Ｄ）由来の本発明のＰＫＳＥタンパク質ファミリーのメンバーをコードする核酸配列を配列番号５４に示し、対応する推定ポリペプチド配列を配列番号５３に示す。０２８Ｄ由来のＴＥＢＣタンパク質ファミリーのメンバーをコードする核酸配列を配列番号５６に示し、対応する推定ポリペプチド配列を配列番号５５に示す。０２８Ｄ由来のＵＮＢＬタンパク質ファミリーのメンバーをコードする核酸配列を配列番号５８に示し、対応する推定ポリペプチド配列を配列番号５７に示す。０２８Ｄ由来のＵＮＢＶタンパク質ファミリーのメンバーをコードする核酸配列を配列番号６０に示し、対応する推定ポリペプチド配列を配列番号５９に示す。０２８Ｄ由来のＵＮＢＵタンパク質ファミリーのメンバーをコードする核酸配列を配列番号６２に示し、対応する推定ポリペプチド配列を配列番号６１に示す。
【００４２】
Micromonospora megalomicea由来のエンジイン生合成遺伝子座（０５４Ａ）由来の本発明のＰＫＳＥタンパク質ファミリーのメンバーをコードする核酸配列を配列番号６４に示し、対応する推定ポリペプチド配列を配列番号６３に示す。０５４Ａ由来のＴＥＢＣタンパク質ファミリーのメンバーをコードする核酸配列を配列番号６６に示し、対応する推定ポリペプチド配列を配列番号６５に示す。０５４Ａ由来のＵＮＢＬタンパク質ファミリーのメンバーをコードする核酸配列を配列番号６８に示し、対応する推定ポリペプチド配列を配列番号６７に示す。０５４Ａ由来のＵＮＢＶタンパク質ファミリーのメンバーをコードする核酸配列を配列番号７０に示し、対応する推定ポリペプチド配列を配列番号６９に示す。０５４Ａ由来のＵＮＢＵタンパク質ファミリーのメンバーをコードする核酸配列を配列番号７２に示し、対応する推定ポリペプチド配列を配列番号７１に示す。
【００４３】
Saccharothrix aerocolonigenes由来のエンジイン生合成遺伝子座（１３２Ｈ）由来の本発明のＰＫＳＥタンパク質ファミリーのメンバーをコードする核酸配列を配列番号７４に示し、対応する推定ポリペプチド配列を配列番号７３に示す。１３２Ｈ由来のＴＥＢＣタンパク質ファミリーのメンバーをコードする核酸配列を配列番号７６に示し、対応する推定ポリペプチド配列を配列番号７５に示す。１３２Ｈ由来のＵＮＢＬタンパク質ファミリーのメンバーをコードする核酸配列を配列番号７８に示し、対応する推定ポリペプチド配列を配列番号７７に示す。１３２Ｈ由来のＵＮＢＶタンパク質ファミリーのメンバーをコードする核酸配列を配列番号８０に示し、対応する推定ポリペプチド配列を配列番号７９に示す。１３２Ｈ由来のＵＮＢＵタンパク質ファミリーのメンバーをコードする核酸配列を配列番号８２に示し、対応する推定ポリペプチド配列を配列番号８１に示す。
【００４４】
Streptomyces kaniharaensis由来のエンジイン生合成遺伝子座（１３５Ｅ）由来の本発明のＰＫＳＥタンパク質ファミリーのメンバーをコードする核酸配列を配列番号８４に示し、対応する推定ポリペプチド配列を配列番号８３に示す。１３５Ｅ由来のＴＥＢＣタンパク質ファミリーのメンバーをコードする核酸配列を配列番号８６に示し、対応する推定ポリペプチド配列を配列番号８５に示す。１３５Ｅ由来のＵＮＢＬタンパク質ファミリーのメンバーをコードする核酸配列を配列番号８８に示し、対応する推定ポリペプチド配列を配列番号８７に示す。１３５Ｅ由来のＵＮＢＶタンパク質ファミリーのメンバーをコードする核酸配列を配列番号９０に示し、対応する推定ポリペプチド配列を配列番号８９に示す。１３５Ｅ由来のＵＮＢＵタンパク質ファミリーのメンバーをコードする核酸配列を配列番号９２に示し、対応する推定ポリペプチド配列を配列番号９１に示す。
【００４５】
Streptomyces citricolor由来のエンジイン生合成遺伝子座（１４５Ｂ）由来の本発明のＰＫＳＥタンパク質ファミリーのメンバーをコードする核酸配列を配列番号９４に示し、対応する推定ポリペプチド配列を配列番号９３に示す。１４５Ｂ由来のＴＥＢＣタンパク質ファミリーのメンバーをコードする核酸配列を配列番号９６に示し、対応する推定ポリペプチド配列を配列番号９５に示す。１４５Ｂ由来のＵＮＢＬタンパク質ファミリーのメンバーをコードする核酸配列を配列番号９８に示し、対応する推定ポリペプチド配列を配列番号９７に示す。１４５Ｂ由来のＵＮＢＶタンパク質ファミリーのメンバーをコードする核酸配列を配列番号１００に示し、対応する推定ポリペプチド配列を配列番号９９に示す。１４５Ｂ由来のＵＮＢＵタンパク質ファミリーのメンバーをコードする核酸配列を配列番号１０２に示し、対応する推定ポリペプチド配列を配列番号１０１に示す。
【００４６】
ここで使用するように、ＰＫＳＥとは、エンジイン生合成遺伝子座と特に関連し、エンジイン化合物を特徴づけるウォーヘッド構造の合成に関与する、ポリケチドシンターゼタンパク質のファミリーを示す。ＰＫＳＥタンパク質ファミリーの代表的なメンバーとしては、配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３及び９３のポリペプチドが含まれる。ＰＫＳＥタンパク質ファミリーのその他のメンバーとしては、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３、９３の配列を有するポリペプチドに対して少なくとも７５％、好ましくは８０％、より好ましくは８５％、さらにより好ましくは９０％、最も好ましくは９５％以上の相同性を有することが確認され、エンジイン化合物のウォーヘッド構造の合成中に、別のＰＫＳＥタンパク質と置換することができ、ＴＥＢＣタンパク質と協同型式で作用する能力を維持することができるポリペプチドが挙げられる。ＰＫＳＥタンパク質ファミリーのその他のメンバーとしては、上記ポリペプチドの断片、類似体及び誘導体が含まれ、かかる断片、類似体及び誘導体は、エンジイン化合物のウォーヘッド構造の合成中に、別のＰＫＳＥタンパク質と置換することができ、ＴＥＢＣと協同型式で作用する能力を維持することができる。
【００４７】
ＴＥＢＣとは、ＰＫＳＥタンパク質ファミリー由来のタンパク質と共にエンジインのポリケチド触媒複合体を形成し、エンジイン化合物を特徴づけるウォーヘッド構造の合成に関与する、エンジイン生合成に特有のチオエステラーゼタンパク質のファミリーを示す。ＴＥＢＣタンパク質ファミリーＴＥＢＣの代表的なメンバーとしては、配列番号３、５、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５及び９５のポリペプチドが含まれる。ＴＥＢＣタンパク質ファミリーのその他のメンバーとしては、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、配列番号３、５、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５及び９５の配列を有するポリペプチドに対して少なくとも７５％、好ましくは８０％、より好ましくは８５％、さらにより好ましくは９０％、最も好ましくは９５％以上の相同性を有することが確認され、エンジイン化合物のウォーヘッド構造の合成中に、ＰＫＳＥタンパク質のタンパク質と協同型式で作用する能力を維持することができるポリペプチドが挙げられる。ＴＥＢＣタンパク質ファミリーのその他のメンバーとしては、上記ポリペプチドの断片、類似体及び誘導体が含まれ、かかる断片、類似体及び誘導体は、エンジイン化合物のウォーヘッド構造の形成中に、別のＴＥＢＣタンパク質と置換することができ、ＰＫＳＥタンパク質と協同型式で作用する能力を維持することができる。
【００４８】
ＵＮＢＬとは、塩基性アミノ酸が豊富であって、いくつかの保存された又は不変のヒスチジン残基を含む、エンジイン生合成遺伝子座を示すタンパク質のファミリーである。ＵＮＢＬタンパク質ファミリーの代表的なメンバーとしては、配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７及び９７のポリペプチドが含まれる。ＵＮＢＬタンパク質ファミリーのその他のメンバーとしては、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７及び９７の配列を有するポリペプチドに対して少なくとも７５％、好ましくは８０％、より好ましくは８５％、さらにより好ましくは９０％、最も好ましくは９５％以上の相同性を有することが確認され、エンジイン化合物の生合成に会合する遺伝子クラスターに存在するポリペプチドが挙げられる。ＵＮＢＬタンパク質ファミリーのその他のメンバーとしては、上記ポリペプチドの断片、類似体及び誘導体が含まれ、かかる断片、類似体及び誘導体は、エンジイン化合物のウォーヘッド構造を形成する際に、別のＵＮＢＬタンパク質と置換することができ、エンジイン生合成遺伝子座における遺伝子に対して協同型式で作用する能力を維持することができる。
【００４９】
ＵＮＢＶとは、エンジイン生合成遺伝子座を示すタンパク質のファミリーであり、切断可能なＮ末端シグナル配列を含んでもよいものを示す。ＵＮＢＶタンパク質ファミリーの代表的なメンバーとしては、配列番号９、１９、２９、３９、４９、５９、６９、７９、８９及び９９のポリペプチドが含まれる。ＵＮＢＶタンパク質ファミリーのその他のメンバーとしては、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、配列番号９、１９、２９、３９、４９、５９、６９、７９、８９及び９９の配列を有するポリペプチドに対して少なくとも７５％、好ましくは８０％、より好ましくは８５％、さらにより好ましくは９０％、最も好ましくは９５％以上の相同性を有することが確認され、エンジイン化合物の生合成に会合する遺伝子クラスターに存在するポリペプチドが挙げられる。ＵＮＢＶタンパク質ファミリーのその他のメンバーとしては、上記ポリペプチドの断片、類似体及び誘導体が含まれ、かかる断片、類似体及び誘導体は、エンジイン化合物のウォーヘッド構造を形成する際に、別のＵＮＢＶタンパク質と置換することができ、エンジイン生合成遺伝子座における遺伝子に対して協同型式で作用する能力を維持することができる。
【００５０】
ＵＮＢＵとは、エンジイン生合成遺伝子座を示す膜タンパク質のファミリーを示す。ＵＮＢＵタンパク質ファミリーの代表的なメンバーとしては、配列番号１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１及び１０１のポリペプチドが含まれる。ＵＮＢＵタンパク質ファミリーのその他のメンバーとしては、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、配列番号１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１及び１０１の配列を有するポリペプチドに対して少なくとも７５％、好ましくは８０％、より好ましくは８５％、さらにより好ましくは９０％、最も好ましくは９５％以上の相同性を有することが確認され、エンジイン化合物の生合成に会合する遺伝子クラスターに存在するポリペプチドが挙げられる。ＵＮＢＵタンパク質ファミリーのその他のメンバーとしては、上記ポリペプチドの断片、類似体及び誘導体が含まれ、かかる断片、類似体及び誘導体は、エンジイン化合物のウォーヘッド構造を形成する際に、別のＵＮＢＵタンパク質と置換することができ、エンジイン生合成遺伝子座における遺伝子に対して協同型式で作用する能力を維持することができる。
【００５１】
「エンジイン産生株」又は「エンジイン産生生物」とは、エンジイン化合物を産生するのに必要な遺伝情報を有する微生物を示し、該生物がエンジイン産物を産生することが周知であるかどうかは、問題としない。自然環境下で存在している生物においてエンジイン化合物を産生する遺伝情報が認められた場合も、組換え技術によって遺伝情報を生物に導入した場合も、この語は全ての生物に同じように適用される。本発明において検討する具体的な生物としては、Micromonosporaceae科、そのなかでも好ましくはMicromonospora、Actinoplanes及びDactylosporangium属の生物、Streptomycetaceae科、そのなかでも好ましくはStreptomyces及びKitasatospora属の生物、Pseudonocardiaceae科、そのなかでも好ましくはAmycolatopsis及びSaccharopolyspora属の生物、並びに、Actinosynnemataceae科、そのなかでも好ましくはSaccharothrix及びActinosynnema属の生物が挙げられる。しかしながら、これらの語は、エンジイン化合物を産生するのに必要な遺伝情報を含む全ての生物を包含することを意図するものである。
【００５２】
「エンジイン生合成遺伝子産物」とは、エンジインの生合成に関与するあらゆる酵素を示し、該酵素が色素タンパクエンジイン又は非色素タンパクエンジインであるかどうかは、問題としない。これらの遺伝子産物は、Micromonosporaceae科、そのなかでも好ましくはMicromonospora、Actinoplanes及びDactylosporangium属の生物、Streptomycetaceae科、そのなかでも好ましくはStreptomyces及びKitasatospora属の生物、Pseudonocardiaceae科、そのなかでも好ましくはAmycolatopsis及びSaccharopolyspora属の生物におけるあらゆるエンジイン生合成遺伝子座に局在する。具体的には、本発明に記載するエンジイン生合成遺伝子座は、Streptomyces macromyceticus、Micromonospora echinospora subsp. calichensis、Streptomyces ghanaensis、Streptomyces carzinostaticus subsp. neocarzinostaticus、Amycolatopsis orientalis、Kitasatosporia sp.、Micromonospora megalomicea、Saccharothrix aerocolonigenes、Streptomyces kaniharaensis及びStreptomyces citricoolorと関連するものである。しかしながら、この語は、Streptomyces、Micromonospora、Amycolatopsis、Kitasatosporia又はSaccharithrix属のいかなる微生物から単離されたエンジイン生合成酵素（及びかかる酵素をコードする遺伝子）も包含するものである。さらに、これら遺伝子は、ここに記載する請求の範囲に含まれる、いかなる微生物、放線菌又は非放線菌対しても新規のホモログを有してもよい。具体的な実施態様としては、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１のポリペプチドが含まれる。
【００５３】
「単離された」という語は、物質がその本来の環境、例えばそれが天然物として生じるのであればその自然環境から取り除かれたことを意味する。例えば、生体内に存在する自然に生じたポリヌクレオチド又はポリペプチドは、単離されてはいないが、その同じポリヌクレオチド又はポリペプチドが、自然界のシステムで共存している物質の全て又は一部から分離された場合は、単離されたことになる。そうしたポリヌクレオチドをベクターの一部とすることができ、及び／又は、そうしたポリヌクレオチド又はポリペプチドを組成物の一部とすることができる。その場合もやはり単離されたことになる。なぜなら、そうしたポリヌクレオチド又はポリペプチドにとって、該ベクターや組成物は自然環境の一部ではないからである。
【００５４】
「精製された」という語は、１００％の純度を必要とするわけではなく、どちらかといえば、相対的な定義を意図するものである。従来、ライブラリーから得た個々の核酸は、電気泳動上で同質となるまで精製されている。本発明の精製された核酸は、生物のゲノムＤＮＡの残存物から少なくとも１０4〜１０6倍に精製されたものである。しかし、「精製された」という語は、ゲノムＤＮＡの残存物又はライブラリー若しくは他の環境に存在する他の配列から、少なくとも１０1倍、好ましくは１０2倍又は１０3倍、さらに好ましくは１０4倍又は１０5倍に精製された核酸も含むものである。
【００５５】
「組換え体」という語は、核酸が、自然環境では隣接しない「骨格」核酸に隣接していることを意味する。「濃縮」核酸とは、核酸骨格分子群中に数にして５％以上の核酸インサートが存在することを示す。「骨格」分子には、発現ベクター、自己複製核酸、ウィルス、組込み（integrating）核酸等の核酸、及び目的の核酸の維持又は操作に使用する他のベクター又は核酸がある。該濃縮核酸は、組換え骨格分子群中に存在する核酸インサート数の１５％以上であることが好ましく、５０％以上であることがさらに好ましく、９０％以上であることが最も好ましい。
【００５６】
「組換えポリペプチド」又は「組換えタンパク質」とは、組換えＤＮＡ技術により作製された、すなわち、目的のポリペプチド又はタンパク質をコードする外部ＤＮＡコンストラクトにより形質転換された細胞から作製されたポリペプチド又はタンパク質を示す。「合成」ポリペプチド又はタンパク質とは、化学合成により調製されたポリペプチド又はタンパク質を示す。
【００５７】
「遺伝子」という語は、ポリペプチド鎖の作製に関与するＤＮＡのセグメントであり、コード領域前後の領域（リーダー及びトレーラー）、及び該当する場合には、個々のコードセグメント（エキソン）の間にある介在領域（イントロン）も含むものである。
【００５８】
「オペロン」という語は、単一の転写プロモーターの管理下にある転写遺伝子カセットであって、かかる遺伝子カセットは、協同型式で作動することによって生化学的経路及び／又は細胞プロセスを行なうことができるポリペプチドをコードする。
【００５９】
ＤＮＡ若しくはヌクレオチドの「コード配列」又はある特定のポリペプチド若しくはタンパク質を「コードする配列」とは、適切な制御配列の管理下に置かれた際にポリペプチド又はタンパク質に転写及び翻訳されるＤＮＡ配列のことである。
【００６０】
「オリゴヌクレオチド」とは、遺伝子、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はその他目的の核酸をコードするゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、又はｍＲＮＡ分子とハイブリダイズする核酸であって、一般的には少なくとも１０個、好ましくは１５個、より好ましくは少なくとも２０個以上で、好ましくは１００個以下のヌクレオチドを有する核酸のことである。
【００６１】
プロモーター配列は、プロモーターで転写を開始し、コード配列をｍＲＮＡに転写する、ＲＮＡポリメラーゼにより認識されたコード配列と「操作的に結合」している。
【００６２】
「プラスミド」は、小文字のｐの次に大文字及び／又は数字を続けた表記で示す。本発明のスタート時のプラスミドは、市販のもの、無制限で入手可能なもの、又は公開された方法により利用可能なプラスミドから構築可能なものである。また、ここに記載したプラスミドと同等のプラスミドは周知のものであり、当業者にとっては明確であろう。
【００６３】
ＤＮＡの「消化」とは、ＤＮＡ中の特定の配列にのみ作用する制限酵素を有するＤＮＡの酵素切断を示す。本発明で使用する各種制限酵素は市販のものであり、それらの反応条件、補助因子、及びその他の要件は、当業者に周知である方法で用いた。分析目的のため、大体１μｇのプラスミド又はDNA断片を、２０μｌの緩衝液中の約２単位の酵素と共に使用した。プラスミド構築のためのＤＮＡ断片を単離するため、大体５〜５０μｇのＤＮＡを、より量の多い２０〜２５０単位の酵素で消化した。適切な緩衝液及び特定の酵素に対する適切な基質の量については、製造者が特定している。通常は、３７℃で約１時間のインキュベーション時間を用いたが、供給者の指示に従って変更される場合もある。消化を行なった後、ゲル電気泳動を行なって目的の断片を単離してもよい。
【００６４】
２種の寄託株を、２００２年４月３日付で、カナダ国、Ｒ３Ｅ ３Ｒ２、マニトバ州、ウィニペグ、アーリントンストリート １０１５のカナダ国際寄託局、微生物研究所、ヘルスカナダに寄託した。１つ目の寄託株は、Streptomyces macromyceticus由来マクロモマイシンの部分的な生合成遺伝子座のコスミドクローン（０２０ＣＮ）を含有する大腸菌ＤＨ１０Ｂ株であり、配列番号１、３、５、７、９及び１１のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含み、該寄託株は、アクセッション番号ＩＤＡＣ０３０４０２−１が付与された。２つ目の寄託株は、Micromonospora echinospora subsp. calichensis由来カリケアマイシンの部分的な生合成遺伝子座のコスミドクローン（０６１ＣＲ）を含有する大腸菌ＤＨ１０Ｂ株であり、配列番号１３、１５、１７、１９及び２１のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含み、該寄託株は、アクセッション番号ＩＤＡＣ０３０４０２−２が付与された。ここでは、該寄託した大腸菌株を「寄託株」と称することとする。
【００６５】
上記寄託株は、色素タンパクエンジイン生合成遺伝子座（マクロモマイシン）から得た、ＰＫＳＥ、ＴＥＢＣ、ＵＮＢＬ、ＵＮＢＶ及びＵＮＢＵタンパク質ファミリーのそれぞれのメンバー、及び非色素タンパクエンジイン生合成遺伝子座（カリケアマイシン）から得た、ＰＫＳＥ、ＴＥＢＣ、ＵＮＢＬ、ＵＮＢＶ及びＵＮＢＵタンパク質ファミリーのそれぞれのメンバーからなる。本明細書中の配列に関する記載との間で齟齬が生じた場合は、寄託株に含まれるポリヌクレオチド配列及びそれらにコードされるあらゆるポリペプチドのアミノ酸配列が優先される。
【００６６】
上記寄託株の寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づいて行われた。特許証が発行されると、寄託株は最終的なものとして、無制限又は無条件で公開される。寄託株は当業者の便宜のためだけに提供されるものであり、米国特許法第１１２条で要求されている実施可能要件を満たすために寄託が必要というわけではない。寄託株又はそこに含まれる核酸、及びそれに由来する化合物の作製、使用又は販売には許諾が必要となる場合があり、かかる許諾が寄託により与えられることはない。
【００６７】
５個のタンパク質ファミリーのメンバーをコードする代表的な核酸配列については、添付した配列表に、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２として示す。５個のタンパク質ファミリーのメンバーを表す代表的なポリペプチドについては、添付した配列表に、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１として示す。
【００６８】
本発明の１つの態様においては、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２の配列のいずれかやそれらに相補的な配列の、単離、精製又は濃縮を行った核酸、又は配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２の配列のいずれか、若しくはそれらに相補的な配列の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００若しくは５００個の塩基を連続状態で含む断片を提供するものである。かかる単離、精製又は濃縮を行った核酸は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ等のＤＮＡを含んでもよい。かかるＤＮＡは、二本鎖又は単鎖であってもよく、単鎖である場合は、コード鎖又は非コード（アンチセンス）鎖であってもよい。また、かかる単離、精製又は濃縮を行った核酸は、ＲＮＡを含んでもよい。
【００６９】
下記に詳細を述べているように、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２のいずれかの単離、精製又は濃縮を行った核酸を、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１のポリペプチドのいずれか、又は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１のポリペプチドのいずれかの少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０個のアミノ酸を連続状態で含む断片の調製に用いてもよい。
【００７０】
したがって、本発明の別の態様においては、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１のポリペプチドのいずれか、又は配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１のポリペプチドのいずれかの少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０個のアミノ酸を連続状態で含む断片をコードする、単離、精製又は濃縮を行った核酸を提供するものである。これらの核酸のコード配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２の核酸のいずれか、又はその断片のコード配列の１つと同一であってもよい。または、遺伝コードの重複性又は縮重の結果として、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１のポリペプチドのいずれか、又は配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１のポリペプチドのいずれかの少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００又は１５０個のアミノ酸を連続状態で含む断片をコードする、異なるコード配列であってもよい。遺伝コードは、当業者に周知のものであり、例えば、Stryer, Biochemistry, 3rd edition, W. H. Freeman & Co., New Yorkより入手可能である。
【００７１】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１のポリペプチドのいずれかをコードする、単離、精製又は濃縮を行った核酸は、（１）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２のいずれかのコード配列のみ；（２）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２のコード配列、及びリーダー配列やプロタンパク質配列等の追加のコード配列；又は（３）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２のコード配列、及びコード配列の非コード配列の５'及び／又は３'やイントロン等の非コード配列；を含んでもよいが、これらに限定されるものではない。したがって、本明細書において使用するように、「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」の語には、ポリペプチドのコード配列のみを含むポリヌクレオチドと、追加のコード配列及び／又は非コード配列を含むポリヌクレオチドとが含まれる。
【００７２】
本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２に基づくポリヌクレオチドであって、「サイレント」なポリヌクレオチド変化、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２のポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列を変更しない変化を有するポリヌクレオチドに関する。また、本発明は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１のポリペプチドのアミノ酸の置換、付加、欠失、融解及び切断を生じさせるヌクレオチド変化を有するポリヌクレオチドに関する。かかるヌクレオチド変化は、特定部位の突然変異誘発、ランダムな化学的突然変異誘発、エキソヌクレアーゼIIIによる欠失など、その他の組換えＤＮＡ技術等を用いて導入してもよい。
【００７３】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２やそれらに相補的な配列の、単離、精製又は濃縮を行った核酸、又は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２の配列のいずれかを、又は、それらに相補的な配列の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００若しくは５００個の塩基を連続状態で含む断片をプローブとして用いて、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１のポリペプチドをそれぞれコードするＤＮＡの同定及び単離を行ってもよい。
【００７４】
例えば、微生物試料又はエンジイン産生株を含む試料からゲノムＤＮＡライブラリーを構築してもよい。次いで、コード配列又はコード配列の断片を含み、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１のポリペプチド又はその断片のいずれかをコードするプローブと該ゲノムＤＮＡライブラリーとを、該プローブがその相補配列と特異的にハイブリダイズできるような条件下で接触させる。１つの実施形態においては、該プローブは、長さにして約１０〜約３０個のヌクレオチドを有し、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２の核酸に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドである。次いで、該プローブとハイブリダイズするゲノムクＤＮＡローンを検出し、単離する。目的のＤＮＡクローンを調製し同定する手順は、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley 503 Sons, Inc. 1997、及びSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989に開示されている。別の実施形態において、該プローブは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２由来のＰＣＲで増幅した核酸又は制限断片である。
【００７５】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２やそれらに相補的な配列の、単離、精製又は濃縮を行った核酸、又は配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２の配列のいずれか、若しくはそれらに相補的な配列の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００若しくは５００個の塩基を連続状態で含む断片をプローブとして用いて、関連する核酸の同定及び単離を行ってもよい。いくつかの実施形態において、該関連する核酸は、潜在的エンジイン産生株由来のゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）であってもよい。１つの実施形態においては、配列番号２、１４、２４、３４、４４、５４、６４、７４、８４、９４やそれらに相補的な配列の、単離、精製又は濃縮を行った核酸、又は配列番号２、１４、２４、３４、４４、５４、６４、７４、８４、９４の配列のいずれか、若しくはそれらに相補的な配列の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００若しくは５００個の塩基を連続状態で含む断片をプローブとして用いて、関連する核酸の同定及び単離を行ってもよい。そうした手順においては、潜在的エンジイン産生株由来の核酸を含む核酸試料とプローブとを、該プローブが関連配列と特異的にハイブリダイズできるような条件下で接触させる。該核酸試料は、潜在的エンジイン産生株由来のゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）ライブラリーであってもよい。次いで、本明細書中に記載した方法を含め、当該技術において周知の方法のいずれかを用いて、該プローブと核酸とのハイブリダイゼーションを検出する。
【００７６】
ハイブリダイゼーションは、低ストリンジェンシー条件下、中程度のストリンジェンシー条件下、又は高ストリンジェンシー条件下で行ってもよい。核酸ハイブリダイゼーションの一例を挙げる。０．９ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．０、５．０ｍＭのＮａ2ＥＤＴＡ、０．５％のＳＤＳ、１０×Denhardt's、及び０．５ｍｇ／ｍｌのポリリボアデニル酸からなる溶液中で、不動化変性核酸を含むポリマー膜を、まず４５℃で３０分間プレハイブリダイズする。その後、約２×１０7ｃｐｍ（比放射能４〜９×１０8ｃｐｍ／ｕｇ）の32Ｐ末端標識オリゴヌクレオチドプローブを溶液に添加する。１２〜１６時間のインキュベーションを行った後、０．５％のＳＤＳを含む１×ＳＥＴ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ塩酸、ｐＨ７．８、１ｍＭのＮａ2ＥＤＴＡ）中で、かかる膜を室温で３０分間洗浄し、新しい１×ＳＥＴ中で、オリゴヌクレオチドプローブ用にＴｍ−１０℃で３０分間洗浄する。ここでＴｍとは融解温度のことである。その後、ハイブリダイゼーションシグナルを検出するため、かかる膜をオートラジオグラフ用フィルムに曝露させる。
【００７７】
検出可能なプローブとハイブリダイズする、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡなどの核酸の同定に使用するハイブリダイゼーションストリンジェンシーの条件を変えると、該プローブに対して異なる相同性を有する核酸の同定及び単離が可能になる。該プローブの融解温度よりも低い温度で、いろいろと温度を変えてハイブリダイゼーションを行うことによって、ストリンジェンシーを変えてもよい。該プローブの融解温度は、下記の式を利用して計算してもよい。
【００７８】
長さにして１４〜７０個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドのプローブの場合、摂氏での融解温度（Ｔｍ）は、下記の式を利用して計算してもよい。
Ｔｍ＝８１．５+１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ+］）+０．４１（フラクションＧ+Ｃ）−（６００／Ｎ）、式中、Ｎはオリゴヌクレオチドの長さ
ホルムアミドを含む溶液中でハイブリダイゼーションを行う場合、以下の方程式を用いて融解温度を計算してもよい。
Ｔｍ＝８１．５+１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ+］）+０．４１（フラクションＧ+Ｃ）−（０．６３％のホルムアミド）−（６００／Ｎ）、式中、Ｎはプローブの長さ
６×ＳＳＣ、５×Denhardt's試薬、０．５％のＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌの変性分画サケ精子ＤＮＡ、又は６×ＳＳＣ、５×Denhardt's試薬、０．５％のＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌの変性分画サケ精子ＤＮＡ、５０％のホルムアミド中で、プレハイブリダイゼーションを行ってもよい。ＳＳＣ及びDenhardt's溶液の組成については、上記Sambrook et al.中に列挙されている。
【００７９】
上に列挙したハイブリダイゼーション溶液に検出可能なプローブを添加することにより、ハイブリダイゼーションを行う。該プローブが二本鎖ＤＮＡを含む場合には、温度を上げながらインキュベーションを行い、次いで急激に冷却することによりかかるＤＮＡを変性させ、その後でハイブリダイゼーション溶液に添加する。また、二次構造の形成若しくはオリゴマー化を皆無にするため又は減らすために、一本鎖プローブを同様に変性させることが望ましい場合もある。フィルターを充分な時間ハイブリダイゼーション溶液と接触させて、相補配列又は相同配列を内包するｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡと該プローブがハイブリダイズできるようにする。長さにして２００以上のヌクレオチドからなるプローブについては、Ｔｍよりも１５〜２５℃低い温度でハイブリダイゼーションを行ってもよい。オリゴヌクレオチドプローブなど、それよりも短いプローブについては、Ｔｍよりも５〜１０℃低い温度でハイブリダイゼーションを行ってもよい。短いプローブのハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣ中で行うのが好ましい。長いプローブのハイブリダイゼーションは、５０％のホルムアミドを含む溶液中で行うのが好ましい。
【００８０】
これまで述べたハイブリダイゼーションは全て、高ストリンジェンシー条件下で行われるハイブリダイゼーションの例と考えられている。
【００８１】
ハイブリダイゼーションに続いて、２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中で少なくとも１５分間、目的のストリンジェンシーに応じて室温又はそれよりも高い温度で、フィルターを洗浄する。その後フィルターを０．１×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳで、３０分〜１時間、（再び）室温で洗浄する。
【００８２】
プローブとハイブリダイズした核酸を、オートラジオグラフィー又は他の従来の方法で同定する。
【００８３】
プローブ配列との相同性が低下している核酸を同定する際には、上記手順を修正してもよい。例えば、検出可能なプローブとの相同性が低下している核酸を得るためには、低ストリンジェンシー条件を用いてもよい。例えば、Ｎａ+の濃度が約１Ｍのハイブリダイゼーション緩衝液において、ハイブリダイゼーション温度を、６８℃から４２℃まで、５℃ずつ下げていってもよい。ハイブリダイゼーション後、フィルターを２×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳで、ハイブリダイゼーション温度で洗浄してもよい。これらの条件は、５０℃を越える温度では「中程度のストリンジェンシー」条件で、５０℃以下の温度では「低ストリンジェンシー」条件であると考えられている。「中程度のストリンジェンシー」ハイブリダイゼーション条件の具体例として、上記ハイブリダイゼーションを５５℃で行った場合が挙げられる。「低ストリンジェンシー」ハイブリダイゼーション条件の具体例として、上記ハイブリダイゼーションを４５℃で行った場合が挙げられる。
【００８４】
あるいは、ホルムアミドを含む、例えば６×ＳＳＣ等の緩衝液中で、４２℃でハイブリダイゼーションを行ってもよい。この場合、プローブとの相同性が低下しているクローンを同定するために、ハイブリダイゼーション緩衝液中のホルムアミドの濃度は、５０％から０％へ、５％ずつ下げてもよい。ハイブリダイゼーション後、フィルターを６×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳで、５０℃で洗浄してもよい。これらの条件は、ホルムアミドが２５％を越える場合には「中程度のストリンジェンシー」条件で、２５％以下の場合には「低ストリンジェンシー」条件であると考えられている。「中程度のストリンジェンシー」ハイブリダイゼーション条件の具体例として、上記ハイブリダイゼーションを３０％のホルムアミドで行った場合が挙げられる。「低ストリンジェンシー」ハイブリダイゼーション条件の具体例として、上記ハイブリダイゼーションを１０％のホルムアミドで行った場合が挙げられる。
【００８５】
プローブとハイブリダイズした核酸を、オートラジオグラフィー又は他の従来の方法で同定する。
【００８６】
例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２の配列、上記配列の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００若しくは５００個の塩基を連続状態で含む断片、及びそれらの相補配列からなる群から選択した核酸配列に対して、少なくとも９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、若しくは少なくとも７０％の相同性を示す配列を有する核酸を単離するのに、上記方法を用いてもよい。デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＮバージョン２．０で相同性を測定してもよい。例えば、相同的なポリヌクレオチドは、ここに記載したコード配列のいずれかに対して自然に発生したアレル変異体であるコード配列を有していてもよい。そうしたアレル変異体には、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、又はその相補配列の核酸と比較して、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、付加が生じていてもよい。
【００８７】
また、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１のいずれかの配列を有するポリペプチド、又は、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰバージョン２．２．２アルゴリズムで測定した際に、上記配列の、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、若しくは１５０個のアミノ酸を連続状態で含む断片を有するポリペプチドに対して、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、若しくは少なくとも７０％の相同性を示すポリペプチドをコードする核酸を単離するのに、上記方法を用いてもよい。
【００８８】
全てのエンジイン化合物の生合成に共通する構造上の特徴として、５個の特定のタンパク質ファミリー群、すなわち、ＰＫＳＥ、ＴＥＢＣ、ＵＮＢＬ、ＵＮＢＶ及びＵＮＢＵより選択される１つ以上のタンパク質が必要とされる。したがって、これら５個のタンパク質ファミリーのいずれかのメンバーを代表するポリペプチド、若しくはこれら５個のタンパク質ファミリーのいずれかのメンバーを代表するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、エンジイン遺伝子クラスター、エンジイン天然産物、若しくはエンジイン産生生物を示すと考えられる。エンジイン生合成遺伝子座及びエンジイン産生生物を同定するために、エンジイン化合物を示すと考えられる５個のタンパク質ファミリーの各メンバーを検出する必要はない。むしろ、少なくとも１個、好ましくは２個、より好ましくは３個、さらにより好ましくは４個、最も好ましくは５個の、ＰＫＳＥ、ＴＥＢＣ、ＵＮＢＬ、ＵＮＢＶ及びＵＮＢＵタンパク質ファミリーの存在が、エンジイン天然産物、エンジイン生合成遺伝子座又はエンジイン産生生物の存在を示す。
【００８９】
エンジイン天然産物、エンジイン遺伝子クラスター又はエンジイン産生生物を同定するため、培養した微生物、又は、例えば土壌など、エンジイン化合物を産生する遺伝的能力をもつ生物を含有する可能性のある環境試料に由来する核酸を、５個のタンパク質ファミリー、ＰＫＳＥ、ＴＥＢＣ、ＵＮＢＬ、ＵＮＢＶ及びＵＮＢＵのメンバーをコードするヌクレオチド配列に基づくプローブと接触させてもよい。
【００９０】
そうした手順においては、培養した微生物、又は、エンジイン化合物を産生する遺伝的能力をもつ生物を含有する可能性のある環境試料から核酸を得る。該核酸と本発明の教示及び組成物に基づいて設計したプローブとを、本発明のＰＫＳＥ、ＴＥＢＣ、ＵＮＢＬ、ＵＮＢＶ及びＵＮＢＵタンパク質ファミリーのメンバーの存在を示すどのような相補配列とも該プローブが特異的にハイブリダイズできるような条件下で接触させる。ＰＫＳＥ、ＴＥＢＣ、ＵＮＢＬ、ＵＮＢＶ及びＵＮＢＵタンパク質ファミリーのうち、少なくとも１個、好ましくは２個、より好ましくは３個、さらにより好ましくは４個又は５個が存在しているということは、エンジイン遺伝子クラスター又はエンジイン産生生物が存在するということである。
【００９１】
エンジイン遺伝子、生合成遺伝子座、及びそうした遺伝子又は遺伝子クラスターを含有する微生物を同定するための、ＰＫＳＥ、ＴＥＢＣ、ＵＮＢＬ、ＵＮＢＶ及びＵＮＢＵタンパク質ファミリーのメンバーをコードする特徴的な核酸配列を、環境試料（例えば、土壌）由来の微生物の複雑な混合物に用いてもよい。微生物混合物とは、２つ以上の種又は株からなる異種微生物群を指す。微生物をその生息環境内でしか増幅させない場合には、そうした微生物混合物は培養されたものとはみなされない。必須栄養素を提供する各種成長培地を用いたインビトロ培養によってその生息環境以外で増幅や増殖を行うことにより、培養微生物混合物を得てもよい。しかしながら、使用する成長培地によっては、そのような増幅は、結果として混合物のサブ群の増幅になる場合が多いため、常に望ましいとは限らない。必要であれば、連続稀釈後に固形培地で増殖させるなど、個々のコロニー形成単位を単離するための確立した微生物学的技術により、培養又は非培養微生物混合物から、単一の種又は株である純粋培養物を得てもよい。
【００９２】
ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、ショットガン配列決定法等の実験法を行い、その後で配列データを生物情報学的に分析することにより、本発明に開示されている特徴的な核酸配列を用いた純粋培養物又は培養若しくは非培養微生物混合物のいずれかから、エンジイン生合成遺伝子及び／又はエンジイン生合成遺伝子クラスターを同定してもよい。単一の生物からなる純粋培養物中のＰＫＳＥ、ＴＥＢＣ、ＵＮＢＬ、ＵＮＢＶ及びＵＮＢＵタンパク質ファミリーの１つ以上のメンバー、又はＰＫＳＥ、ＴＥＢＣ、ＵＮＢＬ、ＵＮＢＶ及びＵＮＢＵタンパク質ファミリーの１つ以上のメンバーを含むエンジイン遺伝子クラスターを同定することは、そのようなエンジイン産生株を直接識別するということである。培養又は非培養微生物混合物中の、ＰＫＳＥ、ＴＥＢＣ、ＵＮＢＬ、ＵＮＢＶ及びＵＮＢＵタンパク質ファミリーの１つ以上のメンバー、又はＰＫＳＥ、ＴＥＢＣ、ＵＮＢＬ、ＵＮＢＶ及びＵＮＢＵタンパク質ファミリーの１つ以上のメンバーを含むエンジイン遺伝子クラスターを同定するには、それらを含有する微生物の同定及び単離を行って、その微生物の純粋培養物を得るという別の段階を経る必要がある。
【００９３】
培養微生物混合物から、エンジイン遺伝子及び／又はエンジイン生合成遺伝子座を含有する微生物を同定する際に適用してもよい一般的な方法の１つに、コロニーリフト法（Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley 503 Sons, Inc. 1997、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）がある。そうした手順においては、かかる微生物の混合物を、適切な固形培地で増殖させる。結果として生じたコロニー形成単位をナイロン膜等の固形マトリックス上で複製する。該膜を検出可能な特徴的核酸配列と接触させ、陽性のコロニー形成単位を同定し、元の培地上の対応するコロニー形成単位を同定し、精製し、増幅させる。
【００９４】
ＰＫＳＥ、ＴＥＢＣ、ＵＮＢＬ、ＵＮＢＶ及びＵＮＢＵタンパク質ファミリーのメンバーをコードする核酸を用いて、多数の環境試料について、エンジイン化合物を産生する可能性をもつ生物、すなわち、エンジイン遺伝子及び／又はエンジイン生合成遺伝子座を含有する生物の有無を調査してもよい。非培養微生物混合物から単離したＤＮＡがコードするポリペプチドを同定するために調査を利用するプロトコルの１つが、Seow et al. (1997) J. Bacteriol. Vol. 179 pp. 7360-7368に概述されている。
【００９５】
必要な場合には、エンジイン産生株から得た相補配列とエンジイン産生株に由来しないコントロール配列の両方にＰＫＳＥ、ＴＥＢＣ、ＵＮＢＬ、ＵＮＢＶ及びＵＮＢＵタンパク質ファミリーのメンバーに基づくプローブを接触させることにより、該プローブがエンジイン産生株由来の相補配列と特異的にハイブリダイズできるような条件を決定してもよい。いくつかの分析においては、コントロール配列がエンジイン産生株に関連する生物に由来している場合がある。あるいは、コントロール配列がエンジイン産生株に無関係の場合もある。該プローブがエンジイン産生株由来の核酸と特異的にハイブリダイズできるような条件を確認するために、ハイブリダイゼーション緩衝液の塩濃度、ハイブリダイゼーション緩衝液のホルムアミド濃度、ハイブリダイゼーション温度などのハイブリダイゼーション条件を変えてもよい。
【００９６】
試料中にエンジイン産生株由来の核酸が含まれる場合は、プローブとエンジイン産生株由来の核酸との特異的ハイブリダイゼーションがやがて検出される。放射性同位体、蛍光染料、又は検出可能な産物の形成に触媒作用を及ぼせる酵素などの検出可能な試薬を用いてプローブを標識することにより、ハイブリダイゼーションを検出してもよい。
【００９７】
当業者であれば、標識プローブを用いて試料中の核酸の有無を検出する多くの方法に精通している。そうした方法としては、サザンブロット法、ノーザンブロット法、コロニーハイブリダイゼーション法、及びドットブロット法が挙げられる。
【００９８】
本発明の別の態様は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１のいずれかの配列を含む単離又は精製を行ったポリペプチド、又は上記配列の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００又は１５０個のアミノ酸を連続状態で含む断片である。上述のとおり、ポリペプチドをコードする核酸をベクターに挿入し、その際に、該コードされたポリペプチドを適切な宿主細胞内で発現させることができる配列に、コード配列が操作可能な状態で連結されるようにすることにより、該ポリペプチドを得てもよい。例えば、かかる発現ベクターは、プロモーター、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、及び転写ターミネーターを含んでいてもよい。かかるベクターは、発現レベルを調節する適切な配列、複製起点、及び選択マーカーも含んでいてもよい。
【００９９】
細菌内でポリペプチド又はその断片を発現させる適切なプロモーターには、大腸菌ｌａｃ又はｔｒｐプロモーター、ｌａｃＩプロモーター、ｌａｃＺプロモーター、Ｔ３プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、ラムダＰRプロモーター、ラムダＰLプロモーター、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）などの解糖酵素をコードするオペロン由来のプロモーター、及び酸ホスファターゼプロモーターなどがある。真菌プロモーターとしては、α因子プロモーターが挙げられる。真核生物のプロモーターとしては、ＣＭＶ前初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、熱ショックプロモーター、初期及び後期ＳＶ４０プロモーター、レトロウィルス由来のＬＴＲ、及びマウスメタロチオネイン−Ｉプロモーターが挙げられる。原核細胞又は真核細胞内で遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーター及びそれらのウィルスを用いてもよい。
【０１００】
哺乳類の発現ベクターは、複製起点、必要とする全てのリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与体部位及び受容体部位、転写終結配列、及び５’フランキング非転写配列を含んでいてもよい。いくつかの実施形態においては、ＳＶ４０スプライス部位及びポリアデニル化部位由来のＤＮＡ配列を用いて、必要な非転写遺伝要素を提供している場合がある。
【０１０１】
真核細胞内でポリペプチド又はその断片を発現させるベクターは、発現レベルを高めるエンハンサーも含んでいてもよい。エンハンサーはＤＮＡのシス作用性因子で、通常は約１０〜約３００ｂｐの長さをもち、プロモーターに作用してその転写を増大させる。例として、複製起点の後部側、ｂｐ１００〜２７０にあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後部側にあるポリオーマエンハンサー、及びアデノウィルスエンハンサーが挙げられる。
【０１０２】
また、かかる発現ベクターは、ベクターを含む宿主細胞を選択できるように、選択マーカー遺伝子を１つ以上含んでいることが好ましい。使用してもよい選択マーカーの例としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする遺伝子、又は真核細胞培養物にネオマイシン耐性を与える遺伝子、大腸菌においてテトラサイクリン又はアンピシリン耐性を与える遺伝子、及びS. cerevisiaeＴＲＰ１遺伝子が挙げられる。
【０１０３】
いくつかの実施形態においては、翻訳したポリペプチド又はその断片の分泌を誘発できるリーダー配列を用いて、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１のポリペプチドのいずれかを、コードする核酸、又は、上記配列の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００又は１５０個のアミノ酸を連続状態で含む断片をコードする核酸が、適切な相に集められる。状況に応じて、該核酸は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１のポリペプチドのいずれか、又は、上記配列の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０個のアミノ酸を連続状態で含む断片のいずれかと、安定性の増大、精製や検出の簡単さといった望ましい性質を授けるＮ末端同定ペプチドなどの非相同ペプチド又はポリペプチドとを融合させた融合ポリペプチドをコードすることができる。
【０１０４】
各種の手順により、適切なＤＮＡ配列をベクターに挿入してもよい。一般に、ＤＮＡ配列がベクター中の目的の場所に連結されるのは、挿入物及びベクターが適切な制限エンドヌクレアーゼで分解された後である。あるいは、ＰＣＲによって、適切な制限酵素部位のＤＮＡ配列中への工学的処理を行うこともできる。Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley 503 Sons, Inc. 1997及びSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2d Ed., Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989には、各種クローニング技術が開示されている。かかる手順及びその他の手順は、当業者であればその知識の範囲に入っていると思われる。
【０１０５】
ベクターの形態は、例えばプラスミド、ウィルス粒子、又はファージでもよい。その他のベクターとしては、染色体ＤＮＡ配列、非染色体ＤＮＡ配列及び合成ＤＮＡ配列の誘導体、ウィルス、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウィルス、酵母プラスミド、プラスミド及びファージＤＮＡの組み合わせに由来するベクター、ワクシニア、アデノウィルス、鶏痘ウィルス、仮性狂犬病ウィルス等のウィルスＤＮＡが挙げられる。宿主である原核生物及び真核生物に用いる各種クローニングベクター及び発現ベクターは、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989) に記載されている。
【０１０６】
使用してもよい特定の細菌ベクターとしては、周知のクローニングベクターであるpBR322（ＡＴＣＣ３７０１７）、pKK223-3（スウェーデン国、ウプサラ、Pharmacia Fine Chemicals社製）、ＧＥＭ１（米国、ウィスコンシン州、マジソン、Promega Biotec社製）、pQE70、pQE60、pQE-9（Qiagen社製）、pD10、psiX174 pBluescript II KS、pNH8A、pNH16A、pNH18A、pNH46A（Stratagene社製）、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5（Pharmacia社製）、pKK232-8及びpCM7の遺伝因子を含む市販品のプラスミドが挙げられる。特定の真核ベクターとしては、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG（Stratagene社製）、pSVK3、pBPV、pMSG及びpSVL（Pharmacia社製）が挙げられる。しかしながら、宿主細胞内で複製可能であり、かつ安定しているものであれば、その他のどのようなベクターを用いてもよい。
【０１０７】
宿主細胞については、原核細胞又は真核細胞など当業者が精通しているものであれば、どのような宿主細胞を用いてもよい。適切な宿主の代表的な例として記載してよいものとしては、大腸菌、Streptomyces lividans、Bacillus subtilis、Salmonella typhimurium、及びPseudomonas属、Streptomyces属、Staphylococcus属に含まれる多様な種などの細菌細胞、酵母などの真菌細胞、ドロソフィラＳ２又はスポドプテラＳｆ９などの昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ又はＢｏｗｅｓメラノーマなどの動物細胞、及びアデノウィルスが挙げられる。当業者であれば、適切な宿主を選択できる。
【０１０８】
かかるベクターの宿主細胞への導入に際しては、エレクトロポレーション、形質転換、トランスフェクション、トランスダクション、ウィルス感染、遺伝子銃、又はＴｉを介した遺伝子導入をはじめとするさまざまな技法のどれを用いてもよい。それが適切な場合であれば、工学的処理を行った宿主細胞を、プロモーターの活性化、形質転換体の選択、又は本発明の遺伝子の増幅に適するように、従来の栄養培地を改変した培地で培養することができる。次に述べる適切な宿主株の形質転換及び宿主株の適切な細胞密度への増殖には、適切な手段（例えば、温度変化又は化学的誘導）で選択プロモーターを誘導してもよく、目的のポリペプチド又はその断片が生成されるように、細胞の培養期間を延長してもよい。
【０１０９】
細胞を遠心分離によって回収し、物理的又は化学的方法によって破壊し、結果として生じた粗抽出物をさらなる精製のために保有しておくのが一般的である。タンパク質の発現に使用する微生物細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的な破壊、又は細胞溶解剤など従来のどの方法で破壊してもよい。これらの方法は、当業者に周知である。発現したポリペプチド又はその断片を、組換え細胞培養物から回収し精製することができる。その際に用いる方法には、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー等がある。必要に応じて、ポリペプチドの形状を完成させる際にタンパク質の再折りたたみ工程（refolding steps）を使用することができる。望ましい場合は、最終的な精製工程で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用することができる。
【０１１０】
組換えタンパク質を発現させるため、様々な哺乳類細胞培養システムも使用可能である。哺乳類の発現系としては、サル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７株（Cell, 23: 175 (1981)にGluzmanによる記載あり）、及びＣ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＢＨＫ細胞株等の、適合性ベクター由来のタンパク質を発現させられるその他の細胞株が例示できる。
【０１１１】
宿主細胞内の構造物を従来の手法で用いて、組換え型配列にコードされる遺伝子産物を生成することができる。組換え体の生成手順で使用した宿主に応じて、ベクターを含む宿主細胞が生成したポリペプチドは、グリコシル化されていてもよく、グリコシル化されていなくてもよい。本発明のポリペプチドは最初のメチオニンアミノ酸残基を含んでいても含んでいなくてもよい。
【０１１２】
あるいは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１のポリペプチド、又は、上記配列の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０個のアミノ酸を連続状態で含む断片を、従来のペプチド合成機での合成により生成することができる。他の実施形態においては、ポリヌクレオチドの断片又は部分を使用して、対応する完全長ポリペプチドをペプチド合成によって生成してもよい。したがって、完全長ポリペプチドを生成するための中間物質として、かかる断片を使用してもよい。
【０１１３】
ポリペプチド又はその断片をコードする核酸に操作可能な状態で連結されたプロモーターを含むＤＮＡコンストラクトから転写されたｍＲＮＡを用いて、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１のポリペプチドのいずれか、又は、上記配列の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０個のアミノ酸を連続状態で含む断片を生成する際には、無細胞翻訳系も使用することができる。いくつかの実施形態においては、インビトロでの転写反応を行う前に、かかるＤＮＡコンストラクトを線状化してもよい。次いで、転写されたｍＲＮＡを、ウサギの網状赤血球抽出物などの適切な無細胞翻訳抽出物でインキュベーションして、目的のポリペプチド又はその断片を生成する。
【０１１４】
また、本発明は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１のポリペプチド、又は、上記配列の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０個のアミノ酸を連続状態で含む断片の変異体に関する。「変異体」という語には、これらのポリペプチドの誘導体又は類似体が含まれる。特に、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１のポリペプチド由来のアミノ酸配列に生じる１つ以上の置換、付加、欠失、融合及び切断が変異体間の相違点となる場合がある。これらはあらゆる組み合わせで生じている場合がある。
【０１１５】
かかる変異体は、自然に生じる場合もあれば、インビトロで作製される場合もある。特に、特定部位の突然変異誘発、ランダムな化学的突然変異誘発、エキソヌクレアーゼIIIの欠失などの遺伝子組換え技術、及び標準的なクローニング技術を用いてかかる変異体を作製してもよい。あるいは、化学合成又は化学修飾により、かかる変異体、断片、類似体、又は誘導体を作製してもよい。
【０１１６】
他の変異体作製方法も、当業者にはよく知られている。これらの方法のなかには、天然の隔離集団から得た核酸配列を修飾して、自らの産業上又は実験上の応用価値を高めるような性質をもつポリペプチドをコードする核酸を作製する方法が含まれる。そうした手順においては、天然の隔離集団から得た配列との間でヌクレオチドの相違点を１つ以上有している大量の変異体配列を作製し、特徴づける。これらのヌクレオチドの相違点により、天然の隔離集団由来の核酸がコードするポリペプチドでアミノ酸の変化が生じることが好ましい。
【０１１７】
例えば、変異性ＰＣＲを用いて変異体を作製してもよい。変異性ＰＣＲでは、ＰＣＲ産物の全長に沿って高い割合で点変異が得られるように、ＤＮＡポリメラーゼの信頼度が低い条件でＤＮＡ増幅を行う。変異性ＰＣＲについては、Leung, D. W., et al., Technique, 1: 11-15 (1989)及びCaldwell, R. C. & Joyce G. F., PCR Methods Applic., 2: 28-33 (1992)に記載されている。また、特定部位の突然変異誘発を使って、目的とするクローン化ＤＮＡセグメント内に部位特異的な突然変異を発生させ、変異体を作製してもよい。オリゴヌクレオチドの突然変異誘発については、Reidhaar-Olson, J. F. and Sauer, R. T., Science, 241: 53-57 (1988) に記載されている。また、米国特許第６，３６１，９７４号及び第６，３７２，４９７号に記載された方法等の定向進化法（directed evolution strategies）を用いて変異体を作製してもよい。
【０１１８】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１のポリペプチドの変異体は、（ｉ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１のポリペプチドの、１つ以上のアミノ酸残基が、保存又は非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換され、かかる置換されたアミノ酸残基が遺伝子コードにコードされている場合もあれば、コードされていない場合であってもよい。
【０１１９】
同類置換とは、ポリペプチド中の所定のアミノ酸を、同様の特徴をもつ別のアミノ酸で置換することである。同類置換として一般的に見うけられるのは、次のような置換である：Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅなどの脂肪族アミノ酸を別の脂肪族アミノ酸で置換する；ＳｅｒをＴｈｒで置換する、またはその逆；Ａｓｐ又はＧｌｕなどの酸性残基を別の酸性残基で置換する；Ａｓｎ又はＧｌｎなどのアミド基を有する残基を、アミド基を有する別の残基で置換する；Ｌｙｓ又はＡｒｇなどの塩基性残基を、別の塩基性残基で置換する；及びＰｈｅ又はＴｙｒなどの芳香族残基を、別の芳香族残基で置換する。
【０１２０】
他の変異体としては、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１のポリペプチドの、１つ以上のアミノ酸残基に置換基が含まれるものがある。
【０１２１】
その他の変異体としては、かかるポリペプチドが、ポリペプチドの半減期を延長する化合物（例えば、ポリエチレングリコール）等の他の化合物と会合しているものがある。
【０１２２】
さらに他の変異体としては、追加されたアミノ酸がポリペプチドと融合しているもの、例えば、リーダー配列、分泌配列、プロタンパク質配列又はポリペプチドの精製、濃縮若しくは安定化を促進する配列がある。
【０１２３】
いくつかの実施形態においては、かかる断片、誘導体又は類似体は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１のポリペプチドと同様の生物学的機能又は活性を保有している。他の実施形態においては、かかる断片、誘導体又は類似体には、かかる断片、誘導体又は類似体から酵素によって全体的又は部分的に切断することができるポリペプチドの精製、濃縮、検出、安定化又は分泌を促進する融合異種配列が含まれる。
【０１２４】
本発明の別の態様は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１のポリペプチドのいずれか、又は、上記配列の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０個のアミノ酸を連続状態で含む断片に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は９５％以上の相同性を有するポリペプチド又はその断片である。相同性の測定には、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰバージョン２．２．２などのプログラムを用いてもよい。このプログラムは、比較対象のポリペプチド又は断片を整列（align）させ、比較対象物間のアミノ酸の相同性又は類似性の程度を測定する。当然のことながら、アミノ酸「相同性」には上述した同類置換も含まれる。
【０１２５】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１のポリペプチドのいずれか、又は、上記配列の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０個のアミノ酸を連続状態で含む断片に対して相同性を有するポリペプチド又は断片を、それらをコードする核酸を上記の技法で単離することによって得てもよい。
【０１２６】
あるいは、生化学的濃縮手順又は精製手順により、相同的なポリペプチド又は断片を得てもよい。相同的と思われるポリペプチド又は断片の配列を、タンパク質分解、ゲル電気泳動、及び／又はマイクロシーケンシングによって測定してもよい。デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰバージョン２．２．２などのプログラムを用いて、相同的と思われるポリペプチド又は断片の配列を、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１のポリペプチドのいずれか、又は、上記配列の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０個のアミノ酸を連続状態で含む断片と比較することができる。
【０１２７】
本発明の、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１のポリペプチド、又は、上記配列の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０個のアミノ酸を連続状態で含む断片、誘導体若しくは類似体を、様々な応用に用いてもよい。例えば、ポリペプチド、又はその断片、誘導体若しくは類似体を、生化学反応の生体触媒として用いてもよい。特に、エンジインウォーヘッド又はその構造の合成若しくは修飾を誘発するために、ＰＫＳＥファミリー、すなわち、配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３、９３のポリペプチド、又はその断片、誘導体若しくは類似体；ＴＥＢＣファミリー、すなわち、配列番号３、５、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５のポリペプチド、又はその断片、誘導体若しくは類似体を、どのようにでも組み合わせて、インビトロ又はインビボで用いてもよい。エンジインウォーヘッド又はその構造の合成若しくは修飾を、誘発又は補助（aid）するために、ＵＮＢＬファミリー、すなわち、配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７のポリペプチド、又はその断片、誘導体若しくは類似体を、インビトロ又はインビボで用いてもよい。エンジインウォーヘッド又はその構造の合成若しくは修飾を、誘発又は補助するために、ＵＮＢＶファミリー、すなわち、配列番号９、１９、２９、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９のポリペプチド、又はその断片、誘導体若しくは類似体を、インビトロ又はインビボで用いてもよい。エンジインウォーヘッド又はその構造の合成若しくは修飾を、誘発又は補助するために、ＵＮＢＵファミリー、すなわち、配列番号１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１、１０１のポリペプチド、又はその断片、誘導体若しくは類似体を、インビトロ又はインビボで用いてもよい。
【０１２８】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１のポリペプチド、又は、上記配列の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０個のアミノ酸を連続状態で含む断片、誘導体又は類似体を用いて、ポリペプチド、断片、誘導体又は類似体に特異的に結合する抗体を作製してもよい。配列番号１、３、５、７、９、１１から作製される抗体を用いて、生体試料中にStreptomyces macromyceticus又は関連微生物が含まれているかどうかを測定してもよい。配列番号１３、１５、１７、１９、２１から作製される抗体を用いて、生体試料中にMicromonospora echinospora subsp. calichensis又は関連微生物が含まれているかどうかを測定してもよい。配列番号２３、２５、２７、２９、３１から作製される抗体を用いて、生体試料中にStreptomyces ghanaensis又は関連微生物が含まれているかどうかを測定してもよい。配列番号３３、３５、３７、３９、４１から作製される抗体を用いて、生体試料中にStreptomyces carzinostaticus subsp. neocarzinostaticus又は関連微生物が含まれているかどうかを測定してもよい。配列番号４３、４５、４７、４９、５１から作製される抗体を用いて、生体試料中にAmycolatopsis orientalis又は関連微生物が含まれているかどうかを測定してもよい。配列番号５３、５５、５７、５９、６１から作製される抗体を用いて、生体試料中にKitasatosporia sp.又は関連微生物が含まれているかどうかを測定してもよい。配列番号６３、６５、６７、６９、７１から作製される抗体を用いて、生体試料中にMicromonospora megalomicea又は関連微生物が含まれているかどうかを測定してもよい。配列番号７３、７５、７７、７９、８１から作製される抗体を用いて、生体試料中にSaccharothrix aerocolonigenes又は関連微生物が含まれているかどうかを測定してもよい。配列番号８３、８５、８７、８９、９１から作製される抗体を用いて、生体試料中にStreptomyces kaniharaensis又は関連微生物が含まれているかどうかを測定してもよい。配列番号９３、９５、９７、９９、１０１から作製される抗体を用いて、生体試料中にStreptomyces citricolor又は関連微生物が含まれているかどうかを測定してもよい。
【０１２９】
そうした手順においては、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１のポリペプチドのいずれか、又は、上記配列の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０個のアミノ酸を連続状態で含む断片に特異的に結合できる抗体と、生体試料とを接触させる。その後、かかる生体試料の抗体結合能力を測定する。例えば、蛍光剤、酵素標識又は放射性同位元素などの検出可能な標識を用いて抗体に標識を施すことによって、結合を測定してもよい。あるいは、検出可能な標識を施された二次抗体を用いて、抗体の試料への結合を測定してもよい。試料中の、Micromonospora echinospora subsp. calichensis、Streptomyces ghanaensis、Streptomyces carzinostaticus subsp. neocarzinostaticus、Amycolatopsis orientalis、Kitasatosporia sp.、Micromonospora megalomicea、Saccharothrix aerocolonigenes、Streptomyces kaniharaensis、Streptomyces citricolor又は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１に関連するポリペプチドの有無を検出するために、様々な測定方法のプロトコルを用いてもよい。特定の測定方法としては、ＥＬＩＳＡ法、サンドイッチ法、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロット等がある。あるいは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１から作製した抗体を用いて、生体試料中に、エンジイン天然産物又はエンジイン様化合物の生合成に関与する場合もある、関連ポリケチドが含まれているかを測定してもよい。
【０１３０】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１のポリペプチド、又は上記配列の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０個のアミノ酸を連続状態で含む断片に対して作製されたポリクローナル抗体は、かかるポリペプチドを動物に直接注入すること、又はかかるポリペプチドを動物に投与することにより、得ることが可能である。そのようにして得た抗体は、その後、ポリペプチド自体に結合する。このように、ポリペプチドの断片のみをコードする配列でさえ、未加工のポリペプチド全体に結合すると思われる抗体の作製に使用できる。その後、かかる抗体を使用して、該ポリペプチドを発現する細胞から該ポリペプチドを単離することができる。
【０１３１】
モノクローナル抗体の調製に使用する技術としては、連続細胞系培養物から作製される抗体を提供できるものであれば、どのようなものでも使用できる。例としては、ハイブリドーマ法（Kholer and Milstein, 1975, Nature, 256: 495-497）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4: 72）、及びＥＢＶハイブリドーマ法（Cole, et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96）が挙げられる。
【０１３２】
一本鎖抗体の製造法（米国特許第４，９４６，７７８号）に記載の方法を適用して、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１のポリペプチド、又は、上記配列の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０個のアミノ酸を連続状態で含む断片に対する一本鎖抗体を作製することができる。あるいは、トランスジェニックマウスを使用して、これらのポリペプチド又はその断片に対するヒト化抗体を発現させてもよい。
【０１３３】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１のポリペプチド、又は、上記配列の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０個のアミノ酸を連続状態で含む断片に対して作製された抗体を、生物又はその無細胞抽出物を含む試料から類似したポリペプチドをスクリーニングする際に使用してもよい。そうした方法においては、試料のポリペプチドを抗体と接触させ、かかる抗体に特異的に結合するポリペプチドを検出する。抗体結合の検出には、上記のいずれの方法を用いてもよい。そうしたスクリーニング法の１つが、“Methods for measuring Cellulase Activities”、Methods in Enzymology, Vol 160, pp. 87-116に記載されている。
【０１３４】
ここで使用する「エンジイン特異的核酸コード」という語には、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２のヌクレオチド配列、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２の断片、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２に相同的なヌクレオチド配列、又は配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２の断片に相同的なヌクレオチド配列、及び前記全配列の相補配列が含まれる。該断片としては、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２の、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００若しくは５００個のヌクレオチドを連続状態で含む、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２の部分が挙げられる。該断片は新規断片であることが好ましい。配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２の相同配列及び断片とは、これらの配列に対して、少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８０％、７５％、又は７０％の相同性を有する配列のことである。相同性の測定は、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＮ及びＴＢＬＡＳＴＸをはじめとする、ここに記載したコンピュータプログラム及びパラメータのいずれを用いて行ってもよい。相同配列には、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２の核酸コード中のチミンがウリジンに置換されているＲＮＡ配列も含まれる。相同配列は、ここに記載したどの手順を用いて得てもよく、また、シーケンシングエラー訂正の結果として生じる場合もある。当然のことながら、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２の核酸コードは、Ｇ、Ａ、Ｔ及びＣがデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列のグアニン、アデニン、チミン及びシトシン塩基をそれぞれ表し、Ｇ、Ａ、Ｕ及びＣがリボ核酸（ＲＮＡ）配列のグアニン、アデニン、ウラシル及びシトシン塩基をそれぞれ表す、従来の１文字表記形式（Stryer, Biochemistry, 3rd edition, W. H. Freeman & Co., New Yorkの裏表紙の見返し部分を参照のこと）、又は、配列中のヌクレオチドの同一性を記録する他のどの形式でも表すことができる。
【０１３５】
「エンジイン特異的ポリペプチドコード」という語には、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１のｃＤＮＡによりコードされる配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１のポリペプチド配列、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１のポリペプチドに相同的なポリペプチド配列、又は前記配列のいずれかの断片が含まれる。相同的なポリペプチド配列とは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１のポリペプチド配列のいずれかに対して、少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％又は７０％の相同性を有する配列のことである。ポリペプチド配列の相同性の測定は、デフォルトパラメータ又はユーザー指定パラメータを用いたＢＬＡＳＴＰバージョン２．２．２をはじめとする、ここに記載したコンピュータプログラム及びパラメータのいずれを用いて行ってもよい。相同配列は、ここに記載したどの手順を用いて得てもよく、また、シーケンシングエラー訂正の結果として生じる場合もある。ポリペプチド断片は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１のポリペプチドの、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００若しくは１５０個のポリペプチドを連続状態で含む。該断片は新規断片であることが好ましい。当然のことながら、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１のポリペプチドコードは、従来の１文字表記形式又は３文字表記形式（Stryer, Biochemistry, 3rd edition, W. H. Freeman & Co., New Yorkの裏表紙の見返し部分を参照のこと）、又は、配列中のポリペプチドの同一性に関する他のどの形式でも表すことができる。
【０１３６】
エンジイン特異的核酸コード及びエンジイン特異的ポリペプチドコードより選択される単一の配列を、ここでサブジェクト配列と称する場合がある。
【０１３７】
当業者であれば容易にわかることだが、エンジイン特異的核酸コード、該核酸コードのサブセット、エンジイン特異的ポリペプチドコード、該ポリペプチドコードのサブセット、及びサブジェクト配列は、コンピュータによる読み取り及びアクセスが可能ないかなる媒体においても、保存、記録、及び操作が可能である。ここで使用する「記録した」及び「保存した」という語は、コンピュータ媒体に情報を保存する処理のことである。熟練者であれば、現時点で周知の、コンピュータ読み取り可能な媒体への情報の記録方法を容易に適用して、１つ以上のエンジイン特異的核酸コード、該核酸コードのサブセット、エンジイン特異的ポリペプチドコード、該ポリペプチドコードのサブセット、及びサブジェクト配列を含む製品を作製することができる。
【０１３８】
コンピュータ読み取り可能な媒体としては、磁気的に読み取りが可能な媒体、光学的に読み取りが可能な媒体、電子的に読み取りが可能な媒体、及び磁気／光学的媒体が挙げられる。例えば、該コンピュータ読み取り可能な媒体が、ハードディスク、フレキシブルディスク、磁気テープ、ＣＤ−ＲＯＭ、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、又はリードオンリーメモリ（ＲＯＭ）、及び当業者に周知の他の種類の媒体であってもよい。
【０１３９】
様々なフォーマットの様々なデータプロセッサプログラムにおいて、エンジイン特異的核酸コード、該核酸コードのサブセット及びサブジェクト配列の保存及び操作を行ってもよい。例えば、エンジイン特異的核酸コード、該核酸コードのサブセット、エンジイン特異的ポリペプチドコード、該ポリペプチドコードのサブセット、及びサブジェクト配列を、ＤＢ２又はORACLEなど当業者が精通している各種データベースプログラム中の、MicrosoftWORD又はWORDPERFECTなどのワードプロセッシングファイルにテキストやＡＳＣＩＩとして保存してもよい。また、配列の比較や同定を行う手段として、又は、エンジイン特異的核酸コード、該核酸コードのサブセット、エンジイン特異的ポリペプチドコード、該ポリペプチドコードのサブセット及びサブジェクト配列と比較するためのクエリーヌクレオチド配列又はクエリーポリペプチド配列の供給源として、多くのコンピュータプログラム及びデータベースを用いてもよい。
【０１４０】
下記のリストは、本発明を制限することではなく、本発明のエンジイン特異的核酸コード、該核酸コードのサブセット、エンジイン特異的ポリペプチドコード、該ポリペプチドコードのサブセット及びサブジェクト配列に有用なプログラム及びデータベースへの指針を提供することを目的とするものである。使用してもよいプログラム及びデータベースとしては、MacPattern（EMBL社製）、DiscoveryBase（Molecular Applications Group社製）、GeneMine（Molecular Applications Group社製）、Look（Molecular Applications Group社製）、MacLook（Molecular Applications Group社製）、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２（NCBI社製）、ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＸ（Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403 (1990)）、ＦＡＳＴＡ（Person and Lipman, Proc. Nalt. Acad. Sci. USA, 85: 2444(1998)）、ＦＡＳＴＤＢ（Brutlag et al. Comp. App. Biosci. 6-237-245, 1990）、Catalyst（Molecular Simulations Inc.社製）、Catalyst/SHAPE（Molecular Simulations Inc.社製）、Cerius2. DBAccess（Molecular Simulations Inc.社製）、HypoGen（Molecular Simulations Inc.社製）、Insight II（Molecular Simulations Inc.社製）、Discover（Molecular Simulations Inc.社製）、CHARMm（Molecular Simulations Inc.社製）、Felix（Molecular Simulations Inc.社製）、DelPhi（Molecular Simulations Inc.社製）、QuanteMM（Molecular Simulations Inc.社製）、Homology（Molecular Simulations Inc.社製）、Modeler（Molecular Simulations Inc.社製）、ISIS（Molecular Simulations Inc.社製）、Quanta/Protein Design（Molecular Simulations Inc.社製）、WetLab（Molecular Simulations Inc.社製）、WetLab Diversity Explorer（Molecular Simulations Inc.社製）、Gene Explorer（Molecular Simulations Inc.社製）、SeqFold（Molecular Simulations Inc.社製）、ＭＤＬ利用可能化学品ディレクトリーデータベース、ＭＤＬ薬剤データレポートデータベース、総合的医薬品化学データベース、Derwents'世界薬剤インデックスデータベース、BioByteMasterFileデータベース、Genbankデータベース、Gensyqnデータベース等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本開示内容を入手した当業者であれば、この他にも多くのプログラム及びデータベースがあることがわかるであろう。
【０１４１】
本発明の実施形態は、システム、特に、ここに記載した配列情報を保存し操作するコンピュータシステムを含むものである。ここで使用する「コンピュータシステム」という語は、エンジイン特異的核酸コード、該核酸コードのサブセット、エンジイン特異的ポリペプチドコード、該ポリペプチドコードのサブセット又はサブセット配列の分析に使用する、ハードウェアコンポーネント、ソフトウェアコンポーネント及びデータ保存コンポーネントを指す。
【０１４２】
かかるコンピュータシステムが、処理装置、データを保存するための１つ以上の内部データ保存コンポーネント、及び該データ保存コンポーネントに保存されたデータを取り出すための１つ以上のデータ取り出し装置を含む多目的システムであることが好ましい。現在利用可能なコンピュータシステムであれば全て好適であることは、熟練者であれば容易にわかることである。
【０１４３】
コンピュータシステムの一例を図１に示す。図４のコンピュータシステムには、中央システムバス１１６に接続された多数のコンポーネントが含まれている。そうしたコンポーネントとしては、内蔵キャッシュメモリ１１８及び／又は外部キャッシュメモリ１２０を備えた中央処理装置１１８、システムメモリ１２２、モニター１００に接続したディスプレイアダプタ１０２、ネットワークインターフェイスとも称するネットワークアダプタ１２６、内蔵モデム１２４、サウンドアダプタ１２８、キーボード１４０及びマウス１３８、又はトラックボール若しくはタブレットなど他の適切な入力装置を接続してもよいＩＯコントローラ１３２、及び外部プリンター１３４、及び／又は、かなり多数の外部装置が挙げられる。かかる外部装置には、外部モデム、テープ保存ドライブ、又はディスクドライブなどがある。図１に示された全てのコンポーネントが本発明を実施する際に必要であるわけではないこと、同様に、図１に示されていない他のコンポーネントが、本発明に用いるために考えられたコンピュータシステム中に存在している場合があることは、当業者であれば容易にわかることである。
【０１４４】
１つ以上のホストバスアダプタ１１４を、システムバス１１６に接続してもよい。ディスクドライブ１１２（着脱可能式又は固定式）、フレキシブルディスクドライブ１１０、テープドライブ１０８、デジタル多用途ディスクＤＶＤドライブ１０６、及びコンパクトディスクＣＤ−ＲＯＭドライブ１０４など１つ以上の保存ドライブを、ホストバスアダプタ１１４に任意に接続してもよい。読み取り専用モード、及び／又は読み取り書き込みモードで、かかる保存装置を操作してもよい。かかるコンピュータシステムは、多数の中央処理装置１１８又は多数のメモリバンク１２２を任意に含んでいてもよい。
【０１４５】
図１の矢印１４２は、コンピュータシステムの内蔵コンポーネントの相互接続を示すものである。かかる矢印は説明のみを目的としており、実際の接続アーキテクチャを特定するものではない。
【０１４６】
参照配列へのアクセス及び処理を行うためのソフトウェア（配列比較ソフトウェア、分析ソフトウェア、及び、検索ツール、アノテーションツール、モデリングツール等）は、実行中は、メインメモリ１２２に存在している。
【０１４７】
１つの実施形態においては、かかるコンピュータシステムは、コンピュータ読み取り可能な媒体に保存されたクエリー配列の核酸コードと、同じくコンピュータ読み取り可能な媒体に保存されたサブジェクト配列とを比較する配列比較ソフトウェア、又はコンピュータ読み取り可能な媒体に保存されたクエリー配列のポリペプチドコードと、同じくコンピュータ読み取り可能な媒体に保存されたサブジェクト配列とを比較する配列比較ソフトウェアをさらに含んでいる。「配列比較ソフトウェア」とは、コンピュータシステムに搭載され、ヌクレオチド配列を、データ保存手段内に保存された他のヌクレオチド配列と比較する、１つ以上のプログラムを指す。配列比較ソフトウェアの設計の一例を図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ及び２Ｄに示す。
【０１４８】
配列比較ソフトウェアは１つ以上の特定のコンパレータアルゴリズムを利用しているのが一般的である。当該分野で周知の各種配列コンパレータアルゴリズム及びプログラムを用いて、タンパク質及び／又は核酸配列類似性を評価してもよい。そうしたアルゴリズム及びプログラムとしては、ＴＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ、ＣＬＵＳＴＡＬ、ＨＭＭＥＲ、ＭＡＳＴ、又は当業者には周知のその他の適切なアルゴリズムが挙げられるが、これらに限定されるものではない（Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (8): 2444-2448、Altschul et al, 1990, J. Mol. Biol. 215 (3): 403-410、Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Res. 22 (2): 4673-4680、Higgins et al., 1996, Methods Enzymol. 266: 383-402、Altschul et al, 1990, J. Mol. Biol. 215 (3): 403-410、Altschul et al., 1993, Nature Genetics 3: 266-272、Eddy S. R., Bioinformatics 14: 755-763, 1998、Bailey TL et al., J Steroid Biochem Mol Biol 1997 May; 62 (1): 29-44）。コンパレータアルゴリズムの一例を図３に示す。本明細書で確認した配列コンパレータアルゴリズムは、本発明のこの態様で使用するために特別に考えられたものである。
【０１４９】
配列比較ソフトウェアは１つ以上の特定のアナライザアルゴリズムを利用しているのが一般的である。アナライザアルゴリズムの一例を図４に示す。適切なアナライザアルゴリズムを用いて、コンパレータアルゴリズムにより測定されたクエリー配列とサブジェクト配列（ここでは、クエリー／サブジェクト対と称する）の間の類似性を評価することができる。また、コンテキスト依存規則に基づいて、サブジェクト配列のアノテーションをクエリー配列に割り当ててもよい。熟練者であれば、適切なアナライザアルゴリズム及び適切なコンテキスト依存規則の選択を容易に判断することができる。本明細書中の他の部分で確認したアナライザアルゴリズムは、本発明のこの態様での使用を目的として特別に考えたものである。
【０１５０】
図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ及び２Ｄは、クエリー配列とサブジェクト配列とを比較する配列比較ソフトウェアの一例のフローチャートである。ヌクレオチド配列、ポリペプチド配列又は他の形で表される１つの遺伝子又は１セットの遺伝子（クエリー配列）と、本発明のエンジイン特異的核酸コード、該核酸コードのサブセット、エンジイン特異的ポリペプチドコード、該ポリペプチドコードのサブセット（サブジェクト配列）との間に有意な類似性があるかどうかを、該ソフトウェアが判断する。Ｃ又はＣ++プログラミング言語、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｐｅｒｌ又は当業者に周知の他の適切なプログラミング言語で該ソフトウェアを実行してもよい。
【０１５１】
図２Ａに関しては、データベース２０８にアクセスしている又はテキストファイル２０６を開いているユーザーからの入力２１０により、該プログラムによるクエリー配列へのアクセスを行ってもよい。「クエリー開始プロセス」により、クエリー配列へのアクセス及びクエリー配列のコンピュータメモリ１２２への取りこみ、又はディスクドライブ１１２若しくはクエリー配列アレイ２１６の形式の他の保存装置に保存されたプログラムによる管理が可能になる。クエリーアレイ２１６は、１つ以上のクエリーヌクレオチド又はポリペプチド配列であり、適切な識別子を伴うものである。
【０１５２】
データベース２２６にアクセスしている又はテキストファイル２２４を開いているユーザーからの入力２２８により、プログラムがデータセットにアクセスする。図２Ｂの「サブジェクトデータソース初期化プロセス」とは、それによって、エンジイン特異的核酸コード、該核酸コードのサブセット、エンジイン特異的ポリペプチドコード、該ポリペプチドコードのサブセット又はサブジェクト配列から選択した１つ以上の配列を含む参照データセットがコンピュータメモリ１２２に取りこまれる方法、又はディスクドライブ１１２若しくはサブジェクトアレイ２３４の形式の他の保存装置に保存されたプログラムの管理下に置かれる方法を示す。サブジェクトアレイ２３４は、１つ以上のサブジェクトヌクレオチド又はポリペプチド配列であり、適切な識別子を伴うものである。
【０１５３】
図２Ｃの「比較サブプロセス」とは、クエリー配列アレイ２１６のクエリー要素とサブジェクトアレイ２３４のサブジェクト要素とを２つ一組で比較するソフトウェアによりコンパレータアルゴリズム２３８が呼び出されるプロセスである。図２Ｃの「コンパレータアルゴリズム」とは、それぞれのアレイ２１６、２３４からのクエリー配列及びサブジェクト配列を２つ一組で、すなわち、クエリー／サブジェクト対で比較することである。コンパレータアルゴリズム２３８は、クエリー／サブジェクト対に作用するものであればどのようなアルゴリズムでもよく、ＢＬＡＳＴ、Smith Waterman、Fastaなどの相同アルゴリズム、ＨＭＭＥＲなどのMarkovモデルのような統計的表示／確率的アルゴリズム、又は当業者に周知の他の適切なアルゴリズムが例示できるが、これらに限定されるものではない。適切なアルゴリズムは一般に、クエリー／サブジェクト対の入力を要求し、スコア（クエリーとサブジェクトとの間の類似性表示）を返してくる。通常このプロセスには、ＢＬＡＳＴで使用されるKarlin Altschul統計、Markovモデルで使用されるForward又はViterbiアルゴリズムなどの適切な統計方法、又は当業者に周知の他の適切な統計が用いられる。
【０１５４】
図２Ｃの配列比較ソフトウェアには、コンパレータアルゴリズム２３８により２つ一組で比較した結果を分析する手段も含まれている。図２Ｃの「分析サブプロセス」とは、該ソフトウェアによりアナライザアルゴリズム２４４が呼び出されるプロセスである。「アナライザアルゴリズム」とは、コード化されてプログラムとなったコンテキスト依存規則、又は実行時間中に動的にロードされたコンテキスト依存規則にしたがってコンパレータアルゴリズム２３８が測定したクエリー／サブジェクト類似性に基づき、サブジェクトのアノテーションがクエリーに割り当てられるプロセスである。
【０１５５】
コンテキスト依存規則とは、比較というコンテキストを与えられたクエリーにサブジェクトのアノテーションを割り当てることが可能かどうかをプログラムが判断するために用いるものである。こうした規則によって該ソフトウェアは、コンパレータアルゴリズム２３８が出した結果の全体的意味を適切なものにすることができる。
【０１５６】
１つの実施形態においては、コンパレータアルゴリズム２３８は、エンジイン遺伝子座を代表するものと考えられる一連のクエリー配列について、該一連のクエリー配列が、下記の（１）〜（５）からなる群のうち、２つの群に由来するポリペプチドの核酸配列コードに対応する参照配列に対して統計的類似性を示すクエリー配列を少なくとも１つ含んでいるかどうかを判断しなくてはならない、とコンテキスト依存規則により指示される場合がある。（１）配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３、９３、及び、配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３、９３のポリペプチド配列に対して少なくとも７５％の相同性を有するポリペプチド；（２）配列番号３、５、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５、及び、配列番号３、５、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５のポリペプチド配列に対して少なくとも７５％の相同性を有するポリペプチド；（３）配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７、及び、配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７、７７、８７、９７のポリペプチド配列に対して少なくとも７５％の相同性を有するポリペプチド；（４）配列番号９、１９、２９、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９、及び、配列番号９、１９、２９、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９のポリペプチド配列に対して少なくとも７５％の相同性を有するポリペプチド；（５）配列番号１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１、１０１、及び、配列番号１１、２１、３１、４１、５１、６１、７１、８１、９１、１０１のポリペプチド配列に対して少なくとも７５％の相同性を有するポリペプチド。もちろん、好ましいコンテキスト依存規則が、エンジイン生合成遺伝子又はエンジイン産生生物を同定するための種々さまざまな基準点を、本発明の範囲から逸脱することなく特定する場合もある。好ましい基準点として考えられているものに、一連のクエリー配列のうち少なくとも１つのクエリー配列が、上記エンジイン生合成遺伝子に特徴的な５群のポリペプチドのうち２、３、４又は５のポリペプチドに対応する核酸コードに対して統計的類似性を示す点が挙げられる。他コンテキスト依存規則は、各群に必要とされる相同性の程度を、１つ以上のサブジェクト配列について、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９８％に設定してもよい。
【０１５７】
別の実施形態においては、コンパレータアルゴリズム２３８は、エンジインポリケチドシンターゼと考えられるクエリー配列について、配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３、９３のポリペプチド、配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３、９３のポリペプチドに対して少なくとも７５％の相同性を有するポリペプチド、及び、配列番号１、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３、９３のポリペプチドの少なくとも５００個のアミノ酸を連続状態で含む断片の核酸配列コードに対応するサブジェクト配列に対して統計的類似性を示すクエリー配列であるかどうかを判断しなくてはならない、とコンテキスト依存規則により指示される場合がある。もちろん、好ましいコンテキスト依存規則が、エンジインポリケチドシンターゼタンパク質を同定するための種々さまざまな基準点を、本発明の範囲から逸脱することなく特定する場合もある。
いくつかのコンテキスト依存規則は、クエリー配列に必要とされる相同性の程度を、参照配列について、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９８％に設定する。
【０１５８】
このように、分析サブプロセスを、他のどのようなコンテキスト依存規則と併用してもよく、また、別の実施形態に適合させるために採用してもよい。アナライザアルゴリズム２４４の主な機能は、コンテキスト依存規則に基づき、意味又は診断を１つのクエリー又は一連のクエリーに割り当てることである。かかるコンテキスト依存規則はアプリケーション特異的であり、アナライザアルゴリズム２４４の全体的役割を変えずに、コンテキスト依存規則が変更される場合がある。
【０１５９】
最後に、図２の配列比較ソフトウェアには、コンパレータアルゴリズム２３８による比較の結果、及びアナライザアルゴリズム２４４による分析結果を、その比較を要求したユーザー又はプロセスに返す手段が含まれている。図２Ｄの「ディスプレイ／レポートサブプロセス」とは、コンパレータアルゴリズム２３８による比較の結果、及びアナライザアルゴリズム２４４による分析結果を、その比較を要求したユーザー又はプロセスに返すプロセスのことである。結果２４０、２４６をファイル２５２に書き込み、コンソール、カスタム・グラフィカル・インターフェース、ウェブ・インターフェース、若しくは他の適切な実装時固有インターフェースなどのユーザー・インターフェースに表示してもよく、又は、リレーショナルデータベース若しくは他の適切な実装時固有データベースなどのデータベースにアップロードしてもよい。
【０１６０】
その比較を要求したユーザー又はプロセスに結果を一旦返してしまうと、かかるプログラムは終了する。
【０１６１】
図２の配列比較ソフトウェアの原理は、クエリーの受領又はロードを行い、参照データセットの受領又はロードを行った後、コンパレータアルゴリズム２３８によって２つ一組での比較を行い、その後アナライザアルゴリズム２４４を用いて結果を評価して、クエリーが参照配列に対して有意な類似性を有しているかどうかの判断に達し、最終的にユーザー又は呼び出しているプログラム若しくはプロセスに結果を返すということである。
【０１６２】
図３は、２つの配列がホモログであるかどうかを判断するコンパレータアルゴリズム２３８のコンピュータ内プロセスの１つの実施形態を示すフローチャートである。かかるコンパレータアルゴリズムは、比較用のクエリー／サブジェクト対を受け取り、適切な比較を行い、類似性の程度を計算して、かかる対とともに返す。
【０１６３】
図３については、シーケンス３０４の冒頭で比較が開始されている。３０６で（ｘ）個の文字の照合を試みているが、この（ｘ）はユーザーが指定した数字である。一致物（match）が見つからない場合は、サブジェクトについてポリペプチド１個分だけクエリー配列を３１６に進ませ、クエリーの最後が３１８に到達しない場合は、３０６で（ｘ）個の文字について別の照合を試みる。一致物がまったく見つからない場合は、クエリー全体を、サブジェクトの開始位置を越えてさらに前進させ、クエリーの最後が３１８に到達すると、サブジェクトポインターがポリペプチド１個分だけ前進し、クエリーポインターが、クエリー３１８の冒頭に設定される。サブジェクトの最後が到達し、それでも一致物が見つからない場合は、ヌル相同性結果スコア（null homology result score）が３２４で割り当てられ、アルゴリズムが、一対の配列をヌルスコアとともに呼び出しプロセス又はプログラムへ返す。その後、アルゴリズムは３２６を終了する。３０８で一致物が見つかった場合、照合した領域の拡大が３１０で試みられ、一致物は３１２で統計的に分析される。かかる拡大は一方向性でも双方向性でもよい。アルゴリズムは閉回路内で照合した領域の拡大と相同性スコアの計算を継続し、ポリペプチド側鎖の化学的特性を考えれば全ての不一致物が同じであるとは限らないことを考慮して、不一致物にペナルティーを与える。例えば、ともに塩基性側鎖を有するリジンとアルギニンとの不一致には、酸性側鎖を有するリジンとグルタミン酸との間の不一致よりも少ないペナルティーが与えられる。蓄積したペナルティーが、ユーザーにより指定されたある値を一旦越えた場合、又はいずれかの配列の最後が３１２に一旦到達した場合、拡大閉回路はストップする。最大スコアを３１４で保存し、３１６でサブジェクトについてポリペプチド１個分だけクエリー配列を進ませ、クエリーの最後が３１８に到達しない場合は、３０６で（ｘ）個の文字について別の照合を試みる。クエリーの全長に対する一致物が存在するかどうかをサブジェクトの全長について評価するまで、かかるプロセスは続く。かかるアルゴリズムによって個々のスコア及びアラインメントを３１４で保存し、全体スコアを３２４で計算し、保存する。アルゴリズムは、一対の配列を局所的スコア及び全体的スコアとともに呼び出しプロセス又はプログラムへ返す。その後、アルゴリズムは３２６で終了する。
【０１６４】
コンパレータアルゴリズム２３８アルゴリズムは、下記のとおり擬似コードで表してもよい。
2005508140.tif 000008
ヌクレオチド配列に使用するために、コンパレータアルゴリズム２３８を書いてもよい。その場合は、スコアを計算し、ヌクレオチドの化学特性に基づいてペナルティーを適用するために、採点計画を実施する。コンパレータアルゴリズム２３８は、ヌクレオチド又はポリペプチド配列の採点方法における格差の存在も考慮している場合がある。
【０１６５】
ＢＬＡＳＴは、コンパレータアルゴリズム２３８の一実施手段である。ＨＭＭＥＲは、Markovモデル分析に基づくコンパレータアルゴリズム２３８の別の実施手段である。ＨＭＭＥＲという実施手段においては、クエリー配列は、配列相同性を利用するのではなく、サブジェクト配列を表す数学モデルと比較される。
【０１６６】
図４はエンジイン生合成遺伝子座の有無を検出するアナライザアルゴリズム２４４のプロセスを図示するフローチャートである。図４のアナライザアルゴリズムを、コンパレータアルゴリズム２３８で測定した類似性に基づいて、及び、コード化されてプログラムとなったコンテキスト依存規則、又は実行時間中に動的にロードされたコンテキスト依存規則にしたがって、サブジェクトのアノテーションをクエリーに割り当てるプロセスに用いてもよい。コンテキスト依存規則とは、比較というコンテキストを与えられたクエリーにサブジェクトのアノテーションを割り当てることが可能かどうかを判断するものである。コンテキスト依存規則は、一致した対を評価するプロセスで受け入れられる類似性の程度と質を判断する基準点を設定する。
【０１６７】
アナライザアルゴリズム２４４は、コンパレータアルゴリズム２３８により組み合わされたアレイ状の対をインプットとして受け取る。そうしたアレイは、少なくともクエリー識別子、サブジェクト識別子、及びそれらの類似性測定における関連値で構成されている。一群のクエリー配列がエンジイン生合成遺伝子クラスターに特徴的な配列を含んでいるかどうかを判断するため、データソースにアクセスし、エンジイン特異的核酸コード及びエンジイン特異的ポリペプチドコードに関するエンジイン特異的情報４０４を取り出すことにより、参照又は診断アレイ４０６を作製する。診断アレイ４０６は、少なくともサブジェクト識別子及びそれらの関連アノテーションで構成されている。エンジイン生合成遺伝子クラスターに特徴的な５個のタンパク質ファミリー、すなわち、ＰＫＳＥ、ＴＥＢＣ、ＵＮＢＬ、ＵＮＢＶ及びＵＮＢＵへの言及が、アノテーションに含まれていてもよい。遺伝子座における特異的構造分類の排他的存在に関する情報、又は、例えば以前コンピュータで算出した、モチーフのデータベースなど他のデータベースとの一致物が、アノテーションに含まれていてもよい。
【０１６８】
一旦、アルゴリズムによって、２つの必要なアレイ４０２と４０６の構築又は受理が首尾良く行われ、メモリにいずれかのコンテキスト依存規則が保有されると、コンパレータアルゴリズム２３８が判断したように、一致した対のそれぞれに対する評価が可能になる。該アルゴリズムは、一致した対のそれぞれに対して４０８での評価を行い、コンテキスト依存規則に基づいて、４１０で一致物が有効かどうかを確認する、又は確認しない。４１０で一致物の確認がうまくいった場合は、サブジェクトのアノテーションがクエリーに割り当てられる。それぞれの比較の結果は４１２で保存される。閉回路は、クエリー／サブジェクトアレイの最後が到達したときに終了する。エンジイン特異的核酸コード及びエンジイン特異的ポリペプチドコードについての、全てのクエリー／サブジェクト対の評価が終わると、ＯＲＦのクエリーのセットがエンジイン遺伝子座４１６であるかどうかを最終的に判断することができる。
【０１６９】
次いで該アルゴリズムは、呼び出し中のプログラム又はプロセスに、全体的な診断及び特徴づけを行ったクエリー／サブジェクト対のアレイを裏付けとなる証拠とともに返し、その後４１８で終了する。
【０１７０】
異なる診断アレイ及びコンテキスト依存規則を動的にロードするように、アナライザアルゴリズム２４４の設定を行ってもよい。例えば、クエリー／サブジェクト対と、色素タンパクエンジイン特異的核酸コード又は非色素タンパクエンジイン特異的ポリペプチドコードなどの他の生合成経路に特徴的なサブジェクト、又は一連のアノテーション済サブジェクトとの比較に用いてもよい。
【０１７１】
これより本発明を下記の実施例によりさらに詳しく説明するが、本発明がそれら実施例に制限されるものではないことは、承知されてしかるべきである。
【実施例１】
【０１７２】
マクロモマイシン(アウロモマイシン)生合成遺伝子座の同定及びシーケンシング
マクロモマイシンは、Streptomyces macromyceticus（ＮＲＲＬ Ｂ−５３３５株）により産生される色素タンパクエンジインである。マクロモマイシンは、アウロモマイシン（auromomycin）と称されるより大きな色素タンパクエンジイン化合物の誘導体であると考えられている（Vandre and Montgomery (1982) Biochemistry Vol 21 pp. 3343-3352; Yamashita et al. (1979) J. Antibiot. Vol. 32 pp. 330-339）。したがって、本明細書中では、マクロモマイシンへの言及は、命名者によってはアウロモマイシンと称される分子が含まれることを意図している。同様に、マクロモマイシンの生合成遺伝子座への言及は、命名者によってはマクロモマイシン及びアウロモマイシンと称される分子の合成を誘導する生合成遺伝子座が含まれることを意図している。
【０１７３】
農業研究サービスカルチャーコレクション（６１６０４、イリノイ州、ピオリア、ユニヴァーシティーストリート、１８１５Ｎに所在の米国農務省農業研究センター）より、微生物Streptomyces macromyceticus（NRRL B-5335）を入手し、標準的な微生物学的技法を用いて培養した（上記Kieser et al.）。この生物をオートミール寒天培地上にて数日間２８℃で増殖させた。高分子量のゲノムＤＮＡを単離するため、増殖させたばかりの、ほぼ密集状態になっている３つの１００ｍｍペトリ皿の細胞集団を使用した。かかる細胞集団をプラスチック製のスパチュラでそっとすくい取った。ＳＴＥ緩衝液（７５ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２５ｍＭのＥＤＴＡ）で繰返し洗浄し、残った寒天培地を除去した。確立したプロトコル（上記Kieser et al.）により、高分子量のＤＮＡを単離し、FIGE MAPPERTM power supply（BIORAD社製）の事前設定プログラムＮｏ．６を用いたフィールドインバージョンゲル電気泳動（ＦＩＧＥ）により、その完全性を実証した。この高分子量のゲノムＤＮＡは、大型の断片クラスター同定ライブラリー（ＣＩＬ）、すなわち大型挿入物ライブラリーだけではなく、小型の断片ゲノムサンプリングライブラリー（ＧＳＬ）、すなわち小型挿入物ライブラリーの調製にも役に立つ。これらのライブラリーはともに、ランダムに作製されたS. macromyceticusのゲノムＤＮＡ断片を含んでおり、そのため、この生物の全ゲノムを代表するものとなっている。
【０１７４】
S. macromyceticusのＧＳＬライブラリー構築のため、ゲノムＤＮＡを超音波でランダムに切断した。標準的な分子生物学的技法（上記Sambrook et al.）を用いて、１．５〜３ｋｂの大きさを有するＤＮＡ断片をアガロースゲル上で分画し、単離した。供給者の記載のとおりにＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（Roche社製）を用いて、得られたＤＮＡ断片の末端を修復した。この酵素は、その後のクローニングにより適切なベクターへの導入が可能な、平滑末端を有するＤＮＡ断片を作製する。修復したＤＮＡ断片を、クローン化したＤＮＡ断片の転写を不可能にするpBlurscriptＳＫ＋ベクター（Stratagene社製）の誘導体にサブクローンする。Ｔ３、Ｔ７、ＳＫ及びＫＳ（Stratagene社製）などの一般的なシーケンシングプライマーに相当する配列に囲まれた便利なポリリンカー領域を含んでいるため、このベクターが選択された。平滑末端ＤＮＡ断片の挿入が可能になることから、かかるポリリンカー領域中で見られる独特のＥｃｏＲＶ制限部位を使用した。かかる挿入物の結合、宿主である大腸菌ＤＨ１０Ｂ（Invitrogen社製）の形質転換を目的とした結合産物の使用及び組換えクローンの選択は、文献（上記Sambrook et al.）記載の方法で行われた。アルカリ溶解法（上記Sambrook et al.）にしたがって、S. macromyceticusのゲノムＤＮＡ断片を有するプラスミドＤＮＡを抽出し、アガロースゲル上での電気泳動により、挿入物の大きさが１．５〜３ｋｂであることを確認した。この手順を用いて、小型ランダムゲノムＤＮＡ断片のライブラリーを構築した。かかるライブラリーは、研究した微生物の全ゲノムを表すものである。作製可能な個々のクローンの数は無限であるが、かかる微生物のゲノムのサンプルを抽出するためにさらに分析するクローンの数は、ほんの少数である。
【０１７５】
SuperCos-1コスミドベクター（StratageneTM社製）を用いて、S. macromyceticus高分子量ゲノムＤＮＡよりＣＩＬライブラリーを構築した。製造者の指示にしたがい、コスミドアームを調製した。製造者から供給された緩衝液中で、ＤＮＡ１００μｇあたり約１単位のＳａｕ３ＡＩ制限酵素（New England Biolabs社製）を使用して、高分子量ＤＮＡを３７℃で部分的に分解した。この酵素は、初期の未分解時の大きさのＤＮＡから、その長さがゲノム中の酵素ＤＮＡ認識部位の頻度及びＤＮＡ分解範囲の広さによって決まる短い断片にいたるまで、ＤＮＡのランダムな断片を作製する。さまざまな時点で、分解物の部分標本を新しい微量遠心チューブに移し、最終濃度で１０ｍＭのＥＤＴＡ及び０．１％のＳＤＳを添加してかかる酵素を失活させた。目的とするサイズ範囲（３０〜５０ｋｂ）の重要なＤＮＡ断片を含むことがＦＩＧＥ分析によって判明した部分標本をプールし、フェノール／クロロホルム（１：１  ｖｏｌ：ｖｏｌ）で抽出し、エタノール沈殿によりペレット化した。
【０１７６】
製造者の説明書にしたがってアルカリホスファターゼ（Roche社製）を用いて、Ｓａｕ３ＡＩ  ＤＮＡ断片の５’末端を３７℃で３０分間脱リン酸化した。かかるホスファターゼを７０℃で１０分間熱失活させ、フェノール／クロロホルム（１：１  ｖｏｌ：ｖｏｌ）でＤＮＡを抽出し、エタノール沈殿によりペレット化し、滅菌水に再懸濁した。脱リン酸化したＳａｕ３ＡＩ  ＤＮＡ断片を、モルにして約４倍を越えるSuperCos-1コスミドアームを含む反応において、室温で一晩SuperCos-1コスミドアームに結合させた。
【０１７７】
GigapackR III XL パッケージング抽出物（StratageneTM社製）を製造者の説明書にしたがって使用し、結合産物のパッケージングを行った。ＣＩＬライブラリーは、大腸菌ＤＨ１０Ｂ（Invitrogen社製）において、８６４個の単離したコスミドクローンからなるものであった。これらのクローンを選択し、ＬＢ培養液（水１リットルあたり：１０．０ｇのＮａＣｌ、１０．０ｇのトリプトン、５．０ｇの酵母エキス）を入れた９枚の９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、一晩増殖させた後、最終濃度で２５％のグリセロールを含むように調節した。これらのマイクロタイタープレートを−８０℃で保管し、ＣＩＬライブラリーのグリセロールの備蓄品とした。二つ組のマイクロタイタープレートをナイロン膜上に下記のように並べた。マイクロタイタープレート上で増殖した培養物を、ペレット化及び少量のＬＢ培養液での再懸濁によって濃縮した。１グリッドあたり９６ピンの３×３グリッドをナイロン膜に置いた。
【０１７８】
完全なＣＩＬライブラリーであるこれらの膜を、その後ＬＢ寒天上で層状とし、３７℃で一晩インキュベーションし、コロニーが育つようにした。ＤＮＡを変性させるため、事前に０．５ＮのＮａＯＨ／１．５ＭのＮａＣｌに１０分間浸しておいた濾紙上で、かかる膜を層状とし、その後、事前に０．５ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）／１．５ＭのＮａＣｌに１０分間浸しておいた濾紙上に移して中和した。細胞の残骸をプラスチック製のスパチュラでそっとすくい取り、GS GENE LINKERTM UV Chamber（BIORAD社製）を使用したＵＶ照射により、ＤＮＡを膜上に交差結合させた。actinomycetesのゲノムの大きさが平均で８Ｍｂであり、ＣＩＬライブラリーにおけるゲノム挿入物の大きさが平均で３５ｋｂであることを考えると、このライブラリーは、かかる微生物の全ゲノムの４倍の範囲をカバーしていることになる。
【０１７９】
クローン処理したゲノムＤＮＡ挿入物の配列決定により、ＧＳＬライブラリーを分析した。フォワード（Ｆ）プライマーと称されるユニバーサルプライマーのＫＳ又はＴ７を使用して標識ＤＮＡの重合を開始した。ＴＦ、ＢＤＴｖ２．０シーケンシングキットを供給業者（Applied Biosystems社）の指定どおりに用いて、プライミング部位から少なくとも７００ｂｐの伸長が可能である。3700 ABI capillary electrophoresis DNA sequencer（Applied Biosystems社製）を用いて、小型のゲノムＤＮＡ断片（ゲノム配列タグ、ＧＳＴ）の配列分析を行った。かかるＤＮＡ配列の平均長は〜７００ｂｐであった。各種タンパク質配列データベースとの配列相同性を比較することにより、得られたＧＳＴをさらに分析した。得られたＧＳＴのＤＮＡ配列をアミノ酸配列に翻訳し、文献（上記Altschul et al.）記載のアルゴリズムを用いて、National Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）の非冗長タンパク質データベース及び占有的なエコピア天然産物生合成遺伝子データベースであるDecipherTMと比較した。データベースに存在する機能が明らかな既知のタンパク質との配列類似性により、翻訳されたＧＳＴにコードされる部分タンパク質の機能を予測することが可能となる。
【０１８０】
フォワードシーケンシングプライマーとともに得られた合計で４７９個のS. macromyceticusのＧＳＴを、Ｂｌａｓｔアルゴリズムを用いた配列比較によって分析した（上記Altschul et al.）。配列のアラインメントが少なくともｅ−５というＥ値を示すと、その配列は有意な相同性を有していると見なされ、さらに評価を加えるために保存された。目的の遺伝子との類似性を示すＧＳＴをこの時点で選択して、目的の遺伝子を含むＣＩＬライブラリーからより大型のゲノムＤＮＡセグメントを同定する際に用いることができる。目的の遺伝子を含む数個のS. macromyceticusＧＳＴを追跡した。これらのＧＳＴのうちの１つは、フォワード読みのＢｌａｓｔ分析に基づくオキシドレダクターゼの一部、及びリバース読みのＢｌａｓｔ分析に基づくマクロモマイシンアポタンパク質の一部をコードした。そのようなＧＳＴ由来のオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ＣＩＬライブラリーのスクリーニングを行ない、結果として生じた陽性のコスミドクローンの配列決定を行なった。オーバーラップするコスミドクローンは、マクロモマイシンアポタンパク質遺伝子を囲んで１２５ｋｂ以上の配列情報を示した。
【０１８１】
製造者により供給されたキナーゼ反応緩衝液中に５ピコモルのオリゴヌクレオチドと６．６ピコモルの［γ−Ｐ32］ＡＴＰを含む１５μｌの反応液において、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（New England Biolabs社製）を使用し、ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドプローブをＰ32で放射能標識した。最終濃度が５ｍＭになるようにＥＤＴＡを添加することにより、１時間後に３７℃でキナーゼ反応を終了させた。積分器の機能を内蔵したモデル３ガイガーカウンター（テキサス州、スイートウォーター、Ludlum Measurements Inc.社製）を用いて、放射能標識したオリゴヌクレオチドプローブの特異的作用を評価した。８５℃で１０分間のインキュベーションに続いて氷中での急速冷却を行うことにより、放射能標識したオリゴヌクレオチドプローブを使用の直前に熱変性させた。
【０１８２】
ハイブリダイゼーションオーブンを低速振盪で使用し、プレハイブリダイゼーション溶液（６×ＳＳＣ、２０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、５×Denhardt's、０．４％のＳＤＳ、超音波処理及び変性処理済の０．１ｍｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ）において、４２℃で少なくとも２時間のインキュベーションを行うことにより、S. macromomyceticusＣＩＬライブラリー膜を前処理した。その後、１×１０6ｃｐｍ／ｍｌの放射能標識オリゴヌクレオチドプローブを含むハイブリダイゼーション溶液（６×ＳＳＣ、２０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、０．４％のＳＤＳ、超音波処理及び変性処理済の０．１ｍｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ）にかかる膜を入れ、ハイブリダイゼーションオーブンを低速振盪で使用し、４２℃で一晩のインキュベーションを行った。翌日、ハイブリダイゼーションオーブンを低速振盪で使用して、洗浄緩衝液（６×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ）でかかる膜を４６℃、４８℃及び５０℃で、４５分間ずつ洗浄した。その後、S. macromomyceticusＣＩＬ膜をＸ線フィルムに曝露し、陽性のコスミドクローンの視覚化及び同定を行った。陽性のクローンを同定し、アルカリ溶解法（上記Sambrook et al.）を用いて３０ｍｌの培養物からコスミドＤＮＡを抽出し、ショットガンシーケンシング法（Fleischmann et al., (1995) Science, 269: 496-512）により、かかる挿入物の完全な配列決定を行った。
【０１８３】
Phred-PhrapTMアルゴリズム（米国、シアトル、ワシントン大学）を用いて、配列決定時に読み込んだ情報を組み立てて、コスミド挿入物の全ＤＮＡ配列を再作製した。元のコスミドの末端に由来するプローブを用いてＣＩＬライブラリーのハイブリダイゼーションを繰り返すと、元のコスミド配列の両端にある配列情報を無限に拡張することができ、最終的には、目的の遺伝子クラスターを完全な形で得ることができる。マクロモマイシン（アウロモマイシン）の構造は、依然として解明されていないが、アポタンパク質のコンポーネントについては、特徴づけられている（Van Roey and Beerman (1989) Proc Natl Acad Sci USA Vol. 86 pp. 6587-6591）。マクロモマイシンアポタンパク質遺伝子から約４０ｋｂ上流で、独特の（unusual）ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳＥ）が見つかった（図５）。かかるマクロモマイシンアポタンパク質遺伝子の周辺には、その他のポリケチドシンターゼ又は脂肪酸シンターゼ遺伝子クラスターは確認されなかった。これは、ＰＫＳＥだけが、マクロモマイシン（アウロモマイシン）の生合成に関与するポリケチドシンターゼである可能性を示している。
【０１８４】
マクロモマイシン生合成遺伝子座中で、ＰＫＳＥ遺伝子とクラスターする又は近接する、その他４個のエンジイン特異的遺伝子が見つかった。これらの遺伝子と、該遺伝子がコードするポリペプチドは、ＴＥＢＣ、ＵＮＢＬ、ＵＮＢＶ及びＵＮＢＵのファミリー名が割り当てられている。マクロモマイシン遺伝子座は、ＴＥＢＣ遺伝子のコピーを２つ含んでいる（図６、表２）。表２は、マクロモマイシン遺伝子座由来の各エンジイン特異的ポリペプチドの、Ｂｌａｓｔアルゴリズム（上記Altschul et al.）を用いた配列比較の結果を示す。デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、相同性を測定した。
【０１８５】
【表２】
2005508140.tif 000009
表２に示したマクロモマイシン遺伝子は、図６に示したように並べてある。ＵＮＢＬ、ＵＮＢＶ、ＵＮＢＵ、ＰＫＳＥ及びＴＥＢＣ1遺伝子のスパンは、約１０.５ｋｂであり、列挙された順番で直列に並べてある。したがって、これらの５個の遺伝子は、オペロンを構成してもよい。５−遺伝子エンジイン特異的カセットから約６.６ｋｂ下流に第２のＴＥＢＣ遺伝子（ＴＥＢＣ２）が見つかった。マクロモマイシンのエンジイン特異的カセットは、６つの機能的に結合した遺伝子及びポリペプチドから構成され、そのうちの５つは単一のオペロンとして表してもよい。
【実施例２】
【０１８６】
カリケアマイシン生合成遺伝子座の同定及びシーケンシング
カリケアマイシンは、Micromonospora echinospora subsp. Calichensis NRRL15839により産生される非色素タンパクエンジインである。実施例１の手順に従って、M. echinosporaゲノムＤＮＡのＧＳＬ及びＣＩＬゲノムＤＮＡライブラリーの両方を調製した。フォワードプライマーを使用して、全部で２８８個のＧＳＬクローンの配列を決定し、Ｂｌａｓｔアルゴリズム（上記Altschul et al.）を用いた配列比較により分析を行い、マクロモマイシン（アウロモマイシン）生合成遺伝子、特にＰＫＳＥに関連する挿入物を含むクローンを同定した。かかるＧＳＴクローンをいくつか同定し、それを使用して、M. echinosporaＣＩＬライブラリーからコスミドクローンを単離した。オーバーラップするコスミドクローンの配列を決定し、実施例１に記載の通り並べた。得られたＤＮＡ配列情報は、長さにして１２５ｋｂ以上であり、国際公開公報第００／３７６０８号に記載のカリケアマイシン遺伝子が含まれていた。国際公開公報第００／３７６０８号に開示されたカリケアマイシン生合成遺伝子は、図５においてスパンが３７１４０〜５９７７４ｂｐだけであり、マクロモマイシン生合成遺伝子座に対して相同性を有する、独特のＰＫＳ遺伝子（ＰＫＳＥ）及びその他４個のフランキング遺伝子（ＵＮＢＬ、ＵＮＢＶ、ＵＮＢＵ及びＴＥＢＣ）を含まない。表３は、カリケアマイシン遺伝子座由来の各エンジイン特異的ポリペプチドに対する、Ｂｌａｓｔアルゴリズム（上記Altschul et al.）を用いた配列比較の結果を示す。デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、相同性を測定した。
【０１８７】
【表３】
2005508140.tif 000010
表３に列挙したカリケアマイシン遺伝子は、図６に示したように並べてある。ＵＮＢＬ、ＵＮＢＶ、ＵＮＢＵ、ＰＫＳＥ及びＴＥＢＣ遺伝子のスパンは、約１０．５ｋｂであり、列挙された順番で直列に並べてある。したがって、これらの５個の遺伝子は、オペロンを構成してもよい。したがって、カリケアマイシンのエンジイン特異的カセットは、単一のオペロンとして表してもよい、５個の機能的に結合した遺伝子及びポリペプチドから構成されている。
【実施例３】
【０１８８】
Streptomyces ghanaensisにおける未知の色素タンパクエンジインの生合成遺伝子座の同定及びシーケンシング
Streptomyces ghanaensisＮＲＲＬ−Ｂ−１２１０４由来のゲノムＤＮＡに、実施例１に記載のゲノムサンプリング法を適用した。これまでに、S. ghanaensisが、エンジイン化合物を産生するという報告はない。実施例１に記載の方法に従って、S. ghanaensisゲノムＤＮＡのＧＳＬ及びＣＩＬゲノムＤＮＡライブラリーの両方を調製した。フォワードプライマーを使用して、全部で４３５個のＧＳＬクローンの配列を決定し、Ｂｌａｓｔアルゴリズム（上記Altschul et al.）を用いた配列比較により分析を行った。
【０１８９】
驚いたことに、マクロモマイシン及びカリケアマイシンエンジイン生合成遺伝子座の両方に共通する５−遺伝子カセットにおける遺伝子のコード部分として、S. ghanaensis由来の２つのＧＳＴを同定した。これらのＧＳＴのうちの１つは、ＴＥＢＣ相同体の一部をコードし、もう１つはＵＮＢＶ相同体の一部をコードした。その後、これらのS. ghanaensisＧＳＴは、ここで００９Ｃと称される遺伝子座中で確認された（図５）。マクロモマイシン及びカリケアマイシンのエンジイン生合成遺伝子座と同様に、００９ＣのＵＮＢＶ及びＴＥＢＣ遺伝子は、ＰＫＳＥ遺伝子に隣接し、ＵＮＢＬ及びＵＮＢＵ遺伝子に隣接することが分かった。００９Ｃ遺伝子座は、ＵＮＢＶ−ＵＮＢＵ−ＵＮＢＬ−ＰＫＳＥ−ＴＥＢＣカセットから約５０ｋｂ下流のマクロモマイシンアポタンパク質の相同体をコードする遺伝子を含んでいた。アポタンパク質に隣接して５−遺伝子カセットが存在することは、００９Ｃが、これまでにS. ghanaensis NRRL B-12104が産生するとは報告されていない、未知の色素タンパクエンジインの生合成遺伝子座を表すことを示唆している。
【０１９０】
表４は、００９Ｃ遺伝子座由来の各エンジイン特異的ポリペプチドの、Ｂｌａｓｔアルゴリズム（上記Altschul et al.）を用いた配列比較の結果を示す。デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、相同性を測定した。
【０１９１】
【表４】
2005508140.tif 000011
表４に列挙した００９Ｃ遺伝子は、図６に示したように並べてある。ＵＮＢＬ、ＵＮＢＶ、ＵＮＢＵ、ＰＫＳＥ及びＴＥＢＣ遺伝子のスパンは、約１０．５ｋｂであり、列挙された順番で直列に並べられている。これらの５個の遺伝子は、オペロンを構成してもよい。したがって、００９Ｃのエンジイン特異的カセットは、単一のオペロンとして表してもよい、５個の機能的に結合した遺伝子及びポリペプチドから構成されている。
【実施例４】
【０１９２】
ネオカルチノスタチン生合成遺伝子座中に５−遺伝子エンジインカセットは存在する
ネオカルチノスタチンは、Streptomyces carzinostaticus subsp. Neocarzinostaticus ATCC15944により産生される色素タンパクエンジインである。ネオカルチノスタチン生合成遺伝子座の配列決定を行ったところ、ネオカルチノスタチンアポタンパク質遺伝子に加えて、マクロモマイシン及びカリケアマイシンのエンジイン生合成遺伝子座中に存在する５−遺伝子カセットが含まれることが分かった。ネオカルチノスタチンの生合成に関与する遺伝子及びタンパク質については、同時係属出願の米国特許出願第６０／３５４，４７４号に開示されている。ネオカルチノスタチン生合成遺伝子座中に５−遺伝子カセットが存在することは、該カセットが全てのエンジイン生合成遺伝子座に存在することを再確認する。
【０１９３】
表５は、ネオカルチノスタチン遺伝子座由来の各エンジイン特異的ポリペプチドの、Ｂｌａｓｔアルゴリズム（上記Altschul et al.）を用いた配列比較の結果を示す。デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、相同性を測定した。
【０１９４】
【表５】
2005508140.tif 000012
表５に列挙したネオカルチノスタチン遺伝子は、図６に示したように並べてある。ＵＮＢＬ、ＵＮＢＶ、ＵＮＢＵ、ＰＫＳＥ及びＴＥＢＣ遺伝子のスパンは、約１０．５ｋｂであり、列挙された順番で直列に並べてある。したがって、これらの５個の遺伝子は、オペロンを構成してもよい。したがって、ネオカルチノスタチンのエンジイン特異的カセットは、単一のオペロンとして表してもよい、５個の機能的に結合した遺伝子及びポリペプチドから構成されている。
【実施例５】
【０１９５】
Amycolatopsis orientalisの未知の色素タンパクエンジインの生合成遺伝子座中に５−遺伝子エンジインカセットは存在する
Amycolatopsis orientalis ATCC43491由来のゲノムＤＮＡに、実施例１に記載のゲノムサンプリング法を適用した。これまでに、A. orientalisが、エンジイン化合物を産生するという報告はない。実施例１に記載の方法に従って、A. orientalisゲノムＤＮＡのＧＳＬ及びＣＩＬゲノムＤＮＡライブラリーの両方を調製した。
【０１９６】
フォワードプライマーを使用して、全部で１０２５個のＧＳＬクローンの配列を決定し、Ｂｌａｓｔアルゴリズム（上記Altschul et al.）を用いた配列比較により分析を行った。数個の二次代謝遺伝子座を同定し、実施例１の記載に従って配列を決定した。これらの遺伝子座（ここでは００７Ａと称する）の１つとして、全てのエンジイン生合成遺伝子座に共通する５−遺伝子カセットが含まれる。００７Ａにおけるカセットの５個の遺伝子の配列を、図６に示す。興味深いことに、A. orientalisゲノムも、マクロモマイシン及び００９Ｃ遺伝子座や、その他の色素タンパクエンジイン（データに図示せず）のエンジインアポタンパク質遺伝子と類似したエンジインアポタンパク質遺伝子を含む。したがって、周知のグリコペプチド系抗生物質バンコマイシンの産生株であるA. orientalisは、色素タンパクエンジインを産生する遺伝的潜在能力を有する。
【０１９７】
表６は、００７Ａ遺伝子座由来の各エンジイン特異的ポリペプチドの、Ｂｌａｓｔアルゴリズム（上記Altschul et al.）を用いた配列比較の結果を示す。デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、相同性を測定した。
【０１９８】
【表６】
2005508140.tif 000013
表６に列挙した００７Ａ遺伝子は、図６に示したように並べてある。ＵＮＢＬ、ＵＮＢＶ及びＵＮＢＵ遺伝子のスパンは、約４ｋｂであり、列挙された順番で直列に並べてある。ＰＫＳＥ及びＴＥＢＣ遺伝子のスパンは、約６．５ｋｂであり、列挙された順番で直列に並べてある。したがって、これらの５個の遺伝子は、２つのオペロンを構成してもよい。かかる２つの推定上のオペロンは、約５ｋｂ分離されている。これらの遺伝子の２つのクラスターは互いに転写的に結合していない場合もあるが、それでも機能的に結合している。したがって、００７Ａエンジイン特異的カセットは、５個の機能的に結合した遺伝子及びポリペプチドから構成されており、そのうちの３つは単一のオペロンとして表してもよく、２つは第２オペロンとして表してもよい。
【実施例６】
【０１９９】
Kitasatosporia sp.ＣＥＣＴ４９９１の未知のエンジインの生合成遺伝子座中に５−遺伝子エンジインカセットは存在する
Kitasatosporia sp. CECT4991由来のゲノムＤＮＡに、実施例１に記載のゲノムサンプリング法を適用した。これまでに、この生物がエンジイン化合物を産生するという報告はない。実施例１に記載の方法に従って、Kitasatosporia sp.ゲノムＤＮＡのＧＳＬ及びＣＩＬゲノムＤＮＡライブラリーの両方を調製した。
【０２００】
フォワードプライマーを使用して、全部で１３９０個のＧＳＬクローンの配列を決定し、Ｂｌａｓｔアルゴリズム（上記Altschul et al.）を用いた配列比較により分析を行った。驚いたことに、Kitasatosporia sp.由来の２つのＧＳＴが、エンジイン生合成遺伝子座に共通する５−遺伝子カセットにおける遺伝子のコード部分として同定された。これらのＧＳＴの１つは、ＰＫＳＥ相同体の一部をコードし、もう１つはＵＮＢＶ相同体の一部をコードした。その後、これらのKitasatosporia sp.ＧＳＴは、全てのエンジイン生合成遺伝子座に共通する５−遺伝子カセットを含む、ここで０２８Ｄと称する遺伝子座中で見つかった。０２８Ｄにおけるカセットの５個の遺伝子の配列を、図６に示す。したがって、Kitasatosporia sp. CECT4991は、エンジイン化合物を産生する遺伝的潜在能力を有する。
【０２０１】
表７は、０２８Ｄ遺伝子座由来の各エンジイン特異的ポリペプチドの、Ｂｌａｓｔアルゴリズム（上記Altschul et al.）を用いた配列比較の結果を示す。デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、相同性を測定した。
【０２０２】
【表７】
2005508140.tif 000014
表７に列挙した０２８Ｄ遺伝子は、図６に示したように並べてある。ＵＮＢＶ、ＵＮＢＵ、ＰＫＳＥ及びＴＥＢＣ遺伝子のスパンは、約９．５ｋｂであり、列挙された順番で直列に並べてある。したがって、これらの４個の遺伝子は、オペロンを構成してもよい。この推定上のオペロンは、約１０．５ｋｂで推定上のオペロンに関連する逆の方向に配向された、ＵＮＢＬ遺伝子から分離される。ＵＮＢＬ遺伝子は、その他の遺伝子に転写的に結合することはできないが、それらと機能的に結合している。したがって、０２８Ｄエンジイン特異的カセットは、５個の機能的に結合した遺伝子及びポリペプチドから構成され、そのうちの４個は単一のオペロンとして表してもよい。機能的に結合したエンジイン特異的遺伝子の発現は、異なる転写的プロモーターにより制御されていてもよく、それにも関わらず、協同型式で発現してもよい。図６に示すように、０２８Ｄ生合成遺伝子座は、そのエンジイン特異的遺伝子が全て同じ方向に配向していない唯一の例であるため、独特のものである。
【実施例７】
【０２０３】
Micromonospora megalomiceaの未知のエンジインの生合成遺伝子座中に５−遺伝子エンジインカセットは存在する
Micromonospora megalomicea NRRL3275由来のゲノムＤＮＡに、実施例１に記載のゲノムサンプリング法を適用した。これまでに、この生物がエンジイン化合物を産生するという報告はない。実施例１に記載の方法を用いて、M. megalomiceaゲノムＤＮＡのＧＳＬ及びＣＩＬゲノムＤＮＡライブラリーの両方を調製した。
【０２０４】
フォワードプライマーを使用して、全部で１３９０個のＧＳＬクローンの配列を決定し、Ｂｌａｓｔアルゴリズム（上記Altschul et al.）を用いた配列比較により分析を行った。驚いたことに、M. megalomicea.由来の１つのＧＳＴが、生合成遺伝子座に共通する５−遺伝子カセットに存在するＰＫＳＥ遺伝子の一部をコードすることが分かった。このＧＳＴのフォワード読みは、ＰＫＳＥ遺伝子において、ＫＳドメインのＣ末端部分と、ＡＴドメインのN末端部分をコードした。このＧＳＴのリバース読みの補体は、ＰＫＳＥ遺伝子のＡＴドメインのＣ末端部分をコードした。次いで、このM. megalomiceaＧＳＴは、全てのエンジイン生合成遺伝子座に共通する５−遺伝子カセットを含む、ここで０５４Ａと称する遺伝子の遺伝子座中で見つかった。０５４Ａにおけるカセットの５個の遺伝子の配列を、図６に示す。したがって、M. megalomiceaは、エンジイン化合物を産生する遺伝的潜在能力を有する。
【０２０５】
表８は、０５４Ａ遺伝子座由来の各エンジイン特異的ポリペプチドの、Ｂｌａｓｔアルゴリズム（上記Altschul et al.）を用いた配列比較の結果を示す。デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、相同性を測定した。
【０２０６】
【表８】
2005508140.tif 000015
表８に列挙した０５４Ａ遺伝子は、図６に示したように並べてある。ＵＮＢＬ、ＰＫＳＥ及びＴＥＢＣ遺伝子のスパンは、約７．５ｋｂであり、列挙された順番で直列に並べてある。ＵＮＢＶ及びＵＮＢＵ遺伝子のスパンは、約３ｋｂであり、列挙された順番で直列に並べてある。したがって、これらの５個の遺伝子は、２つのオペロンを構成してもよい。かかる２つの推定上のオペロンは、約２ｋｂで分離される。したがって、０５４Ａのエンジイン特異的カセットは、５個の機能的に結合した遺伝子及びポリペプチドから構成され、そのうちの３個は単一のオペロンとして表してもよく、２個は別のオペロンとして表してもよい。
【実施例８】
【０２０７】
Saccharothrix aerocolonigenesの未知のエンジインの生合成遺伝子座に５−遺伝子エンジインカセットは存在する
Saccharothrix aerocolonigenes ATCC39243由来のゲノムＤＮＡに、実施例１に記載のゲノムサンプリング法を適用した。これまでに、この生物がエンジイン化合物を産生するという報告はない。実施例１に記載の方法を用いて、Saccharothrix aerocolonigenesゲノムＤＮＡのＧＳＬ及びＣＩＬゲノムＤＮＡライブラリーの両方を調製した。
【０２０８】
フォワードプライマーを使用して、全部で５１３個のＧＳＬクローンの配列を決定し、Ｂｌａｓｔアルゴリズム（上記Altschul et al.）を用いた配列比較により分析を行った。数個の二次代謝遺伝子座を同定し、実施例１の記載に従って配列を決定した。これらの遺伝子座（ここでは１３２Ｈと称する）の１つとして、全てのエンジイン生合成遺伝子座に共通する５−遺伝子カセットが含まれる。１３２Ｈにおけるカセットの５個の遺伝子の配列を、図６に示す。したがって、Saccharothrix aerocolonigenesは、エンジイン化合物を産生する遺伝的潜在能力を有する。
【０２０９】
表９は、１３２Ｈ遺伝子座由来の各エンジイン特異的ポリペプチドの、Ｂｌａｓｔアルゴリズム（上記Altschul et al.）を用いた配列比較の結果を示す。デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、相同性を測定した。
【０２１０】
【表９】
2005508140.tif 000016
表９に列挙した１３２Ｈ遺伝子は、図６に示したように並べてある。ＵＮＢＬ、ＵＮＢＶ、ＵＮＢＵ、ＰＫＳＥ及びＴＥＢＣ遺伝子のスパンは、約１０．５ｋｂであり、列挙された順番で直列に並べてある。したがって、これらの５個の遺伝子は、オペロンを構成してもよい。したがって、１３２Ｈのエンジイン特異的カセットは、単一のオペロンとして表してもよい、５個の機能的に結合した遺伝子及びポリペプチドから構成される。
【実施例９】
【０２１１】
Streptomyces kaniharaensisの未知のエンジインの生合成遺伝子座中に５−遺伝子エンジインカセットは存在する
Streptomyces kaniharaensis ATCC21070由来のゲノムＤＮＡに、実施例１に記載のゲノムサンプリング法を適用した。これまでに、この生物がエンジイン化合物を産生するという報告はない。実施例１に記載の方法を用いて、S. kaniharaensisゲノムＤＮＡのＧＳＬ及びＣＩＬゲノムＤＮＡライブラリーの両方を調製した。
【０２１２】
フォワードプライマーを使用して、全部で１０２０個のＧＳＬクローンの配列を決定し、Ｂｌａｓｔアルゴリズム（上記Altschul et al.）を用いた配列比較により分析を行った。驚いたことに、S. kaniharaensis由来の１つのＧＳＴが、生合成遺伝子座に共通する５−遺伝子カセットに存在するＰＫＳＥ遺伝子の一部をコードすることが分かった。このＧＳＴのフォワード読みは、ＰＫＳＥ遺伝子のＫＳドメインのＮ末端部分をコードした。このＧＳＴのリバース読みの補体は、ＰＫＳＥ遺伝子のＡＴドメインのＣ末端部分をコードした。次いで、このS. kaniharaensisＧＳＴは、全てのエンジイン生合成遺伝子座に共通する５−遺伝子カセットを含む、ここで１３５Ｅと称する遺伝子の遺伝子座中で見つかった。１３５Ｅにおけるカセットの５個の遺伝子の配列を、図６に示す。したがって、S. kaniharaensisは、エンジイン化合物を産生する遺伝的潜在能力を有する。
【０２１３】
表１０は、１３５Ｅ遺伝子座由来の各エンジイン特異的ポリペプチドの、Ｂｌａｓｔアルゴリズム（上記Altschul et al.）を用いた配列比較の結果を示す。デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、相同性を測定した。
【０２１４】
【表１０】
2005508140.tif 000017
表１０に列挙した１３５Ｅ遺伝子は、図６に示したように並べてある。ＵＮＢＬ、ＵＮＢＶ及びＵＮＢＵ遺伝子のスパンは、約４ｋｂであり、列挙された順番で直列に並べてある。ＰＫＳＥ及びＴＥＢＣ遺伝子のスパンは、約６．５ｋｂであり、列挙された順番で直列に並べてある。したがって、これらの５個の遺伝子は、２つのオペロンを構成してもよい。かかる２つのオペロンは約６ｋｂで分離される。これら遺伝子の２つのクラスターは、互いに転写的に結合していない場合があるが、それでも機能的に結合している。したがって、１３５Ｅのエンジイン特異的カセットは、５個の機能的に結合した遺伝子及びポリペプチドから構成され、そのうちの３個は単一のオペロンとして表してもよく、２個は別のオペロンとして表してもよい。
【実施例１０】
【０２１５】
Streptomyces citricolorの未知のエンジインの生合成遺伝子座に５−遺伝子エンジインカセットは存在する
Streptomyces citricolor IFO13005由来のゲノムＤＮＡに、実施例１に記載のゲノムサンプリング法を適用した。これまでに、この生物がエンジイン化合物を産生するという報告はない。実施例１に記載の方法を用いて、S. citricolorゲノムＤＮＡのＧＳＬ及びＣＩＬゲノムＤＮＡライブラリーの両方を調製した。
【０２１６】
フォワードプライマーを使用して、全部で１２４５個のＧＳＬクローンの配列を決定し、Ｂｌａｓｔアルゴリズム（上記Altschul et al.）を用いた配列比較により分析を行った。数個の二次代謝遺伝子座を同定し、実施例１に従って配列を決定した。これらの遺伝子座（ここでは１４５Ｂと称する）の１つとして、全てのエンジイン生合成遺伝子座に共通する５−遺伝子カセットが含まれる。１４５Ｂにおけるカセットの５個の遺伝子の配列を、図６に示す。したがって、S. citricolorは、エンジイン化合物を産生する遺伝的潜在能力を有する。
【０２１７】
表１１は、１４５Ｂ遺伝子座由来の各エンジイン特異的ポリペプチドの、Ｂｌａｓｔアルゴリズム（上記Altschul et al.）を用いた配列比較の結果を示す。デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムの使用により、相同性を測定した。
【０２１８】
【表１１】
2005508140.tif 000018
表１１に列挙した１４５Ｂ遺伝子を、図６に示したように並べてある。ＵＮＢＶ及びＵＮＢＵ遺伝子のスパンは、約３ｋｂであり、列挙された順番で直列に並べてある。ＰＫＳＥ及びＴＥＢＣ遺伝子のスパンは、約６．５ｋｂであり、列挙された順番で直列に並べてある。したがって、これらの４個の遺伝子は、２つのオペロンを構成してもよい。かかる２つの推定上のオペロンは、ＵＮＢＬ遺伝子を含む約９．５ｋｂで分離される。これらの遺伝子は、互いに転写的に結合していない場合もあるが、それでも機能的に結合している。したがって、１４５Ｂのエンジイン特異的カセットは、５個の機能的に結合した遺伝子及びポリペプチドから構成され、そのうちの４個は、それぞれ２個の遺伝子を含む２つのオペロンとして表してもよい。
【実施例１１】
【０２１９】
５−遺伝子特異的カセットがコードするポリペプチドの分析
上記１０個のエンジイン生合成遺伝子座由来のＰＫＳＥ、ＴＥＢＣ、ＵＮＢＬ、ＵＮＢＶ及びＵＮＢＵタンパク質ファミリーのアミノ酸配列を、Clustalアルゴリズム（Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Res. 22 (2): 4673-4680; Higgins et al., 1996, Methods Enzymol. 266: 383-402、Higgins and Sharp (1988) Gene Vol. 73 pp.237-244）を用いて多重配列アラインメント（multiple sequence alignment）により互いを比較した。アラインメントを、図８、１１、１２、１３及び１５のそれぞれに示す。適用可能なところでは、機能にとって重要な保存された残基又はモチーフを黒色で強調し、追加の特徴を示した。
【０２２０】
ＰＫＳＥファミリーは、エンジインのウォーヘッド構造の形成に関与する、ポリケチドシンターゼのファミリーである。図７は、一般的なＰＫＳＥのドメイン機構を図解的に示し、ＰＫＳドメインのMarkovモデリングに基づく推定上のドメインの位置及び相対的な大きさを示している。すなわち、ケトシンターゼ（ketosynthase）（ＫＳ）、アシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）、アシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）、ケトレダクターゼ（ketoreductase）（ＫＲ）、デヒドラターゼ（ＤＨ）及び４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（ＰＰＴＥ）活性である。カリケアマイシンＰＫＳＥを例として用いると、完全長ＰＫＳＥタンパク質は、長さにして１９１９個のアミノ酸である。カリケアマイシンＰＫＳＥについて図８に示すように、ＫＳドメインのスパンは、ＰＫＳＥの位置３〜４６７；ＡＴドメインのスパンは、ＰＫＳＥの位置４８２〜９０５；ＡＣＰドメインのスパンは、ＰＫＳＥの位置９３９〜１００９；ＡＣＰ及びＫＲドメインの間には、未知の機能を有する約１３０個のアミノ酸の小型ドメイン（ＰＫＳＥのスパニング位置１０２５〜１１４４）が存在する；ＫＲドメインのスパンは、ＰＫＳＥの位置１１５３〜１４１４；ＤＨドメインのスパンは、ＰＫＳＥの位置１４２１〜１５６３；Ｃ末端４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（ＰＰＴＥ）ドメインのスパンは、ＰＫＳＥの位置１７０８〜１９１４；ＤＨ及びＰＰＴＥドメインの間には、約１１０個のアミノ酸の小型ドメイン（ＰＫＳＥのスパニング位置１５９１〜１７０１）が存在する。
【０２２１】
ＰＫＳＥは、保存された独特のＡＣＰドメインを含む（図９Ａ）。このＡＣＰドメインは、アクチノロジンII型ＰＫＳのよく特徴づけられたＡＣＰ（図９ＢのＰＤＢｉｄ：１ＡＦ８）にも存在する、いくつかの保存された残基を含む。最も重要な保存された残基はセリン残基であり、そこに４’−ホスホパンテテイニル補欠分子族が共有結合的につながっている（１ＡＦ８のＳｅｒ−４２に対応する）。また、Ｓｅｒ−４２に加えて、いくつかの表面が曝露した荷電残基、すなわち、Ｇｌｕ−２０、Ａｓｐ−３７及びＧｌｕ−８４（図９Ａのアラインメントで強調、及び図９Ｂに示す三次元構造で強調及び標識）が保存されている。ＡＣＰドメインの全体的な折り重ね（overall fold）を安定させるのに重要である可能性がある埋もれた(buried)非荷電残基又は非極性残基、すなわち、Ｌｅｕ−１４、Ｖａｌ−１５、Ｇｌｙ−５７、Ｐｒｏ−７１、Ａｌａ−８３及びＡｌａ−８５（図９に示すアラインメント及び三次元構造において強調）も保存されている。興味深いことに、保存されたセリン（Ｓｅｒ−４２）は、ＰＫＳＥのＡＣＰドメインにおいてほとんどの場合、別のセリンの直前で先行されている。図８に示すように、１０個のＰＫＳＥメンバーのうちの９個は、この二重セリン配列を含んでおり、例外的なのは、１３２Ｈ遺伝子座において最初のセリンがトレオニンに置換されることである。したがって、ＰＫＳＥは、互いに近接した２つの潜在的なヒドロキシ含有残基を有するＡＣＰドメインを含んでいる。これらのＡＣＰは、２つの４’−ホスホパンテテイニル補欠分子族を保有していてもよい。ＡＣＰの後のＫＲ及びＤＨドメインの位置決めは、ＰＫＳの中では独特のものであるが、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）及びドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）生合成機構の３つのＰＫＳ様成分のうちの１つに示されている（Metz et al (2001) Science Vol. 293 pp. 290-293）。本発明のＰＫＳＥ遺伝子により共有される独特のドメイン機構と多価不飽和の脂肪酸の合成に関与するＰＫＳ様シンターゼは、エンジインのウォーヘッド形成に、多価不飽和脂肪酸が集合する際に生成されるものと類似した中間体が関与することを示唆している。
【０２２２】
ＰＫＥにおける独特のＡＣＰドメインが存在し、エンジイン生合成遺伝子座に共通する明白な４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ又はホロ−ＡＣＰシンターゼ（ＡＣＰの保存されたセリンへのホスホパンテテイニルの転移）が不在であったことから、本発明者らは、４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの有無を調べた。本発明者らは、機能が不明である、ＰＫＳＥの保存されたドメインを調べ、ＵＮＢＬ、ＵＮＢＶ及びＵＮＢＵのポリペプチドについては詳細を調べた。ＰＰＴＥドメインが４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼであることを決定し。
【０２２３】
二次構造予測及び溶媒可能性情報（solvation potential information）（Kelley et al. (2000) J. Mol. Biol. Vol. 299 pp. 499-520）を用いて、３個の周知のエンジイン、すなわち、ネオカルチノスタチン（ＮＥＯＣ、ａａ１６２０−１９７７）、カリケアマイシン（ＣＡＬＩ、ａａ１５６２−１９１９）及びマクロモマイシン（ＭＡＣＲ、ａａ１５８２−１９３６）の生合成遺伝子座由来のＰＫＳＥのＣ末端ドメインについて、それらの折りたたみ（folding）構造について分析した。周知のタンパク質の３−Ｄ構造のデータベースを用いて比較検索を行なった結果、Bacillus subtilis surfactin生合成遺伝子座由来の４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ （Reuter et al. (1999) EMBO Vol. 18 pp. 6823-6831）であるＳｆｐ及びＰＫＳＥのＣ末端ドメインの間に類似性があることが分かった。図１０Ａに示すアラインメントは、Ｘ線結晶学で測定したＳｆｐの二次構造（ＰＤＢｉｄ：１ＱＲ０）とともに、３つのＣ末端ＰＫＳＥドメイン（ＰＰＴＥドメイン）の全ての予測された二次構造を示す。α−ヘリックスを長方形で示し、β−シートを矢印で示す。
【０２２４】
タンパク質の全体の長さにわたって、二次構造の全体が保存されることは、明らかである。Ｓｆｐの全ての主要な構成物、すなわち、α−ヘリックスであるα１〜α５並びにβ−シートであるβ２〜β４及びβ８も、ＰＰＴＥドメイン中に存在する。Ｓｆｐと同様に、ＰＰＴＥドメインは、分子内に２つに折りたたんだ偽対称（2-fold pseudosymmetry）を有すると予測されている。
【０２２５】
Ｓｆｐにおけるα５及びβ７の間に形成されるループは、ＰＰＴＥドメイン中には存在しない。Ｓｆｐのこの領域は、ＡＣＰの認識に部分的に応答し、この酵素に観察される広い基質の特異性に貢献すると考えられている。このループの大きさは、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの間で異なるようである。なぜなら、Ｓｆｐよりも大きなＡＣＰ基質の特異性を示すＥｎｔＤ酵素は、α５構造とβ７構造との間に領域を有し、それはＳｐｆよりは短いがＰＰＴＥドメインの領域よりは長いからである。ＰＰＴＥドメインにある短いα５／β７ループ領域は、ＰＫＳＥ酵素にあるむしろ独特なＡＣＰドメインとの特定の相互作用の必要性を反映するかも知れない。全てのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼに保存され、ＣｏＡ基質及びＭｇ++補助因子と接触するようにＳｆｐに示される残基は、ＰＰＴＥドメインにも保存されている（図１０Ａで強調されている）。
【０２２６】
図１０Ｂに関して、Ｓｆｐの残基であるＬｙｓ−２８及びＬｙｓ−３１は、ＣｏＡの３’−リン酸と塩橋を形成し、ＰＰＴＥドメイン中には見られない。しかしながら、対応する保存された残基であるＡｒｇ−２６により、同様の相互作用が得られる。ＣｏＡの３’−リン酸により、Ｓｐｆ  Ｔｈｒ−４４は水素結合し、Ｈｉｓ−９０は塩橋を形成する。ＰＰＴＥドメインの対応する位置４４にある保存されたセリンにより、同様の水素結合の可能性がある。また、ヒスチジン９０残基は、３つのＰＰＴＥドメインの全てにおいて完全に保存されている。
【０２２７】
Ｓｆｐのアミノ酸残基７３〜７６は、所定の位置でＣｏＡのアデニン塩基を有する。Ｔｙｒ−７３の主鎖カルボニル基は、アデニンのアミノ基と水素結合し、Ｇｌｙ−７４、Ｌｙｓ−７５及びＰｒｏ−７６の残基は、アデニン環を所定の位置で維持する。ＰＰＴＥドメインでは、アデニンのアミノ基と塩橋を形成してもよい保存されたアスパラギン酸をＴｙｒ−７３で置換し、保存されたアルギニン残基をＬｙｓ−７５で置換する。残りの２つの残基であるＧｌｙ−７４及びＰｒｏ−７６も、ＰＰＴＥドメイン中に存在する。
【０２２８】
Ｓｆｐ残基であるＳｅｒ−８９及びＨｉｓ−９０は、Ｃｏａ基質のα−リン酸との水素結合及び塩橋を介して相互作用する。同様に、ヘリックスα５のＬｓｙ−１５５は、ＣｏＡのα−リン酸と相互作用する。Ｈｉｓ−９０及びＬｙｓ−１５５残基は、ＰＰＴＥドメイン中で高度に保存されるが、それに対し、Ｓｅｒ−８９は、ネオカルチノスタチンＰＰＴＥドメインにのみ認められる。
【０２２９】
β４シートのＳｐｆ残基であるＡｓｐ−１０７、Ｇｌｕ−１０９、及び、α５ヘリックスのＧｌｕ−１５１は、ＣｏＡピロリン酸のα及びβリン酸と水の分子とともに、金属イオン（おそらくＭｇ++）の複合体形成に関与する。また、３つの残基は全て、ＰＰＴＥドメインでも保存される。重要なことには、Ａｓｐ−１０７をＳｆｐの突然変異誘発法により変性させたところ、触媒活性には重要であるが、タンパク質のＣｏＡ結合には重要でないことを示し、Ｍｇ++イオンが触媒に重要であることを示唆した（Quadri et al., 1998, Biochemistry, Vol. 37, 1585-1595）。
【０２３０】
Ｓｆｐタンパク質において、Ｇｌｕ−１２７残基は、Ｌｙｓ−１５０のアミノ基を塩橋する。ＰＰＴＥドメインにおいて、対応する位置１２７でＧｌｕ／Ａｓｐ残基が認められるが、Ｌｙｓ−１５０は保存されない。Ｇｌｕ−１２７はＰＰＴＥドメインにおいて高度に保存されるため、Ｌｙｓ−１５０の役割が近接するその他の塩基残基、すなわち、対応する位置１４５の保存されたアルギニンにより果たされると考えることができる。全てのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼに保存され、触媒活性に重要であることを示すＴｒｐ−１４７残基は、３つのＰＰＴＥドメインの全てに存在する（Quadri et al., 1998, Biochemistry, Vol. 37, 1585-1595）。
【０２３１】
ＰＫＳＥのエンジインウォーヘッドＰＫＳのＣ末端中にホスホパンテテイニルドメイン（ＰＰＴＥ）が存在することは、酵母脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）複合体に見られる４’−ホスホパンテテイニルドメインを連想させるものである。どそれは、ＦＡＳαサブユニットのＣ末端領域に属する。ＦＡＳは、自己パンテテイニル化（auto-pantetheinylation）が可能であり、その結果、この酵素の転写後の自己活性化が生じる（Fichtlscherer et al., 2000, Eur. J. Biochem., Vol. 267, 2666-2671）。同じように、ＰＫＳＥウォーヘッドＰＫＳは、エンジインの核を形成する多価不飽和ポリケチド中間体の反復性の合成を行なう前に、ＡＣＰドメインの自己パンテテイニル及び活性化が可能であるだろう。
【０２３２】
ＰＫＳＥのＡＣＰ及びＫＲドメインは、約１３０個のアミノ酸により分離される。このアミノ酸の伸展内に多数の不変残基が存在することは、これら１３０個のアミノ酸により形成される推定上のドメインに機能的な役割があることを示唆する。かかる推定上のドメインは、構造上の役割、例えばタンパク質−タンパク質相互作用ドメインの役割を果たしたり、又は成長するポリケチド鎖の「鎖の長さ要素」として作用するＡＣＰに近接して間隙（cleft）を形成してもよい。Reverse Position SpecificＢＬＡＳＴを用いたＮＣＢＩのConserved Domain Databaseで検索を行なった結果、葉酸塩や二本鎖ＲＮＡ（アデノシンデアミナーゼ）と同様に、ＡＴＰ、ＡＭＰ、ＮＡＤ（Ｐ）等の基質を結合するタンパク質に対する相同性を示した。したがって、かかる推定上のドメインは、アデノシン又はアデノシン様構造に適応する構造を採用して補助因子結合部位の役割を果たしてもよい。あるいは、かかるドメインは、補酵素Ａ（ＣｏＡ）のアデノシン部分と相互作用するかも知れない。したがって、ＣｏＡからＡＣＰドメインへの物理的な接近は、ＡＣＰのホスホパンテテイニル化を促進するかも知れない。しかし、別の可能性として挙げられるのは、ＣｏＡの分子が、そのアデノシン部分を介してＡＣＰの下流の推定上のドメインに非共有結合的に結合し、ホロ−ＡＣＰのホスホパンテテイニル（phosphopantetheinyl）のテイルがそうであるように、そのホスホパンテテイニルのカルボキシ末端は酵素から外へ突出することである。あるいは、ＰＰＴＥドメインは、非共有結合的に結合したＣｏＡの分子を保有することができる。したがって、ＫＳは、アセチル−ＡＣＰ−チオエステルのアセチル基から、酵素に非共有結合的に結合した成長するアシル−ＣｏＡ鎖への移行に関与するいくつかの縮合反応の反復を行なうと予想される。この提案したシナリオは、「従来の」ＰＫＳ型チオエステラーゼよりむしろ、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼであるＴＥＢＣの存在を説明する。ＰＫＳＥが生成する完全長ポリケチド鎖はホロ−ＡＣＰに繋ぎ止められてはいないが、むしろ非共有結合的に結合したＣｏＡに繋ぎ止め、ＴＥＢＣは、ポリケチド−ＣｏＡのチオエステル結合を加水分解し、完全長ポリケチド及びＣｏＡを放出する。ＣｏＡで活性化したチオエステルは、ポリケチドを、ＴＥＢＣによる加水分解放出と同時又は以前に、環化及びアセチレン化（acetylenation）に関与する補助的な酵素によりアクセス可能なポリケチドにすることができる。
【０２３３】
図１１は、ＴＥＢＣタンパク質ファミリーと、結晶構造が既に決定されている（Benning et al. (1998) J. Biol. Chem. Vol. 273 pp. 33572-33579）Pseudomonas sp. 細胞株ＣＢＳ−３の酵素４−ヒドロキシベンゾイル−ＣｏＡチオエステラーゼ（１ＢＶＱ）との間の関係を示す、クラスタルな（Clustal）アミン酸アラインメントである。黒色のバーは、４−ヒドロキシベンゾイル−ＣｏＡチオエステラーゼの触媒において重要な役割を果たすと考えられている３つの保存領域を示す。ＴＥＢＣタンパク質ファミリーと１ＢＶＱとの間の相同性は、これらの３つの強調した領域に集中している。
【０２３４】
図１２は、ＵＮＢＬタンパク質ファミリーのクラスタルなアミノ酸アラインメントである。ＵＮＢＬタンパク質ファミリーは、エンジイン生合成遺伝子座に独特の保存された新規のタンパク質群を示す。ＵＮＢＬタンパク質は、塩基残基が豊富であり、いくつかの保存された又は不変のヒスチジン残基を含む。ＰＫＳＥ及びＴＥＢＣタンパク質以外で、ＰＳＯＲＴプログラム（Nakai et al. (1999) Trends Biochem. Sci. Vol. 24 pp. 34-36）が細胞基質であると予測したその他のタンパク質は、ＵＮＢＬタンパク質だけである。該ＵＮＢＬタンパク質は、エンジインウォーヘッド遺伝子カセットによりコードされ、したがって、ウォーヘッド構造に三重結合を導入することが要求されているアセチレナーゼ（acetylenase）活性の最もよい候補である。
【０２３５】
図１３は、ＵＮＢＶタンパク質ファミリーのクラスタルなアミノ酸アラインメントである。ＵＮＢＶタンパク質ファミリーのＰＳＯＲＴ分析は、それらが分泌タンパク質であると予測する。推定上の切断可能なＮ末端シグナル配列のおおよその位置は、アラインメントの上に示す。ＵＮＢＶタンパク質は、多数のアミノ酸保存を示すが、周知の相同体を持たない。したがって、ＵＮＢＶタンパク質ファミリーは、エンジイン生合成遺伝子座に独特の、機能が不明な保存された新規のタンパク質群を表す。
【０２３６】
図１４は、ＵＮＢＵタンパク質ファミリーのクラスタルなアミノ酸アラインメントである。ＵＮＢＵタンパク質ファミリーのＰＳＯＲＴ決定は、それらが７個又は８個の推定上の膜をスパニングするαヘリックスを有する複合的な膜タンパク質であると予測する（図１４において、ダッシュ記号で示す）。ＵＮＢＵタンパク質は、多数のアミノ酸保存を示すが、周知の相同体を持たない。ＵＮＢＵタンパク質ファミリーは、エンジイン生合成遺伝子座に独特の、保存された新規のタンパク質群を表す。
【０２３７】
ＵＮＢＵは、細胞膜の向こう側へのエンジインの輸送に関与するようである。また、ＵＮＢＵは、ウォーヘッドの完成に関与する生物化学に、ある意味では貢献しているかも知れない。色素タンパクエンジインの場合は、アポタンパク質は、自己の切断可能なＮ末端シグナル配列を保有し、一般的なタンパク質分泌機構による色素タンパクとは個別に輸出される。生理活性ウォーヘッドの形成、輸出、並びに発色団及びタンパク質コンポーネントの結合は、産生株の損傷を最小限にとどめ、天然産物の安定性を最大限にするため、細胞膜の中又は周囲で生じなければならない。ＵＮＢＶは、細胞外タンパク質であると予測されている。ＵＮＢＶは、ウォーヘッド構造を完成又は安定させてもよい。また、ＵＮＢＶは、ＵＮＢＶの細胞外で曝露した部位と深く関連させて、作用させてもよい。
【０２３８】
現在まで、本発明者らは、ＰＫＳＥ、ＴＥＢＣ、ＵＮＢＬ、ＵＮＢＶ及びＵＮＢＵ遺伝子からなる５−遺伝子カセットを含む１０個以上のエンジイン生合成遺伝子座の配列を決定した。全ての場合において、ＰＫＳＥ及びＴＥＢＣ遺伝子は、互いに隣接しており、ＴＥＢＣ遺伝子は必ずＰＫＳＥ遺伝子の下流にある。また、これら２つの遺伝子は、必ずでないとしても、通常は、翻訳共役している。これらの観察から、ＰＫＳＥ及びＴＥＢＣ遺伝子の発現は、強く協調（tightly coordinated）し、それらの遺伝子産物、すなわち、ポリペプチドが、共に作用することを示唆する。同様に、ＵＮＢＶ及びＵＮＢＵ遺伝子は、常に互いに隣接しており、ＵＮＢＵ遺伝子は必ずＵＮＢＶ遺伝子の下流にある。また、これらの２つの遺伝子は、必ずでないとしても、通常は、転写共役している。これらの観察から、ＵＮＢＶ及びＵＮＢＵ遺伝子の発現は、強く協調し、それらの遺伝子産物、すなわちポリペプチドが、共に作用することを示唆する。
【実施例１２】
【０２３９】
エンジインウォーヘッドの生合成における通常の機構
特定の生合成スキーム又は作用の機構に限定されることは意図せずに、本発明の遺伝子及びタンパク質は、色素タンパクエンジイン及び非色素タンパクエンジインの両方におけるエンジインウォーヘッドエンジインの形成を説明することができる。
【０２４０】
ＰＫＳＥは、多価不飽和脂肪酸シンターゼ（ＰＵＦＡ）の作用と類似した方法で、高度に共役する多価不飽和ヘプタ／オクタケチド中間体を生成すると示唆されている。その後、かかる多価不飽和脂肪アシル中間体は、１つ以上のＵＮＢＬ、ＵＮＢＵ及びＵＮＢＶに関与する酵素を目的に合わせて修飾することにより、アセチレン結合を導入して環構造を形成する。保存された補助的なタンパク質である、ＵＮＢＬ、ＵＮＢＵ及びＵＮＢＶは、ＰＫＳＥにより行なわれる調節反復、又は、少なくとも１つの補助的なタンパク質の補助により、反復における異なる酸化的／還元的化学を行なうことが可能な細菌の反復性のＩ型ポリケチドシンターゼである、lovastatin monaketide synthaseの作用と同様の、その後のエンジインの核を産生するための形質転換に関与すると考えられている（Kennedy et al., 1999, Science Vol. 284 pp. 1368-1372）。
【０２４１】
エスペラミシン及びダイネミシンのエンジイン部分のアセテート濃縮パターンは、両者がインタクトなヘプタケチド／オクタケチド由来のものであることを示唆する。エスペラミシン及びダイネミシンは、共通の前駆体を有すると示唆されている（Lam et al., J. Am. Chem. Soc. 1993, Vol. 115 pp. 12340）。しかしながら、他の色素タンパクエンジインの代表であるネオカルチノスタチンの場合は、炭素−炭素結合を調べる取り込み研究により、最終エンジイン核が非結合アセテート原子を含むことが分かり（Hensens et al., 1989 JACS, Vol. 111, pp. 3295-3299）、また、ポリアセチレン生合成に関するその他の研究（上記Hensens et al.）により、色素タンパクエンジイン先駆体が非色素タンパクエンジインとは異なることが示唆された。したがって、エンジイン核の形成に関する先行技術の研究は、色素タンパクエンジイン及び非色素タンパクエンジインの両方に共通する遺伝子及びタンパク質が、エンジインの両方のクラスの形成に応答するという本発明から再に責任があるとする教示は、本発明とは異なるものである。
【０２４２】
本発明者らは、骨格の再構成により、区別可能な色素タンパク／非色素タンパクエンジイン標識パターンが明らかになる可能性を提案する。例えば、中間体シクロブテンの１，３ジエンへの熱電気環状の再構成により、報告したものと一致する同位体的な標識パターンが生じるかも知れない。
【化５】
2005508140.tif 000019
【０２４３】
したがって、ネオカルチノスタチンの形成におけるウォーヘッド前駆体は、その他のエンジインのクラスに対して提案されたのと同様に、ヘプタケチドであるかも知れない。カリケアマイシン及びエスペラミシンは非結合アセテートを含まないため、一般的な不飽和ポリケチド前駆体は、色素タンパククラスとは異なって再構成しなければならない。しかしながら、提案された生合成スキームは、本発明の１つの態様、すなわち、全てのエンジインにおけるウォーヘッド形成は一般的な遺伝子、タンパク質及び共通する前駆体と関与することと、一致している。
【実施例１３】
【０２４４】
カリケアマイシンエンジインカセットの遺伝子及びタンパク質の異種発現
ルーチン的なサブクローニングを行なうため、大腸菌を一般的な宿主として使用した。Streptomyces lividansＴＫ２４を、異種発現宿主として用いた。マルチクローニング部位（ＭＣＳ）中のＫｐｎｌ部位を除去し、プラスミドpANT1202（Desanti, C. L. 2000.  The molecular biology of the Strptomyces snp Locus, 262 pp., Ph.D dissertation, Ohio State Univ., Colombus, OH）からプラスミドpECO1202を得た。pECO1202RBSは、pECO1202のＭＣＳに局在するＣｌａｌ部位のすぐ上流に導入された、推定上のリボソーム結合部位（ＡＧＧＡＧ）をコードするＤＮＡ配列を含む。
【０２４５】
Luria-Bertani（ＬＢ）培地でプラスミドを保有する大腸菌株を増殖させ、適切な抗生物質を用いて選択した。S. lividansＴＫ２４細胞株をＲ２ＹＥ培地で育てた（Kieser, T. et al., Practical Streptomyces Genetics, The John Innes Foundation, Norwich, United Kingdom, 2000）。
【０２４６】
標準的な方法（上記Kieser et al.）を用いて、S. lividansＴＫ２４原形質体を調製した。１回の形質転換につき１μｇのＤＮＡを用いて、ポリエチレングリコールを導入した原形質体の形質転換を行った。Ｒ５寒天培地で３０℃で１６時間原形質体の再生を行なった後、各Ｒ５プレートを５０μｇのアプラマイシン溶液で覆うことにより、形質転換体を選択した。Ｒ２ＹＥ培地とアプラマイシンを含む５０ｍｌのフラスコの中で、形質転換体を７日間育てた。
【０２４７】
標準的な手順（Sambrook, J. et al. 1989.  Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed.  Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.）により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット法を行った。Qiagen社よりＰｅｎｔａ−Ｈｉｓ抗体を入手した。製造業者のプロトコルに従い、Amersham Pharmacia biotech社製のＥＣＬ検出キットを用いて、ウエスタンブロット法を行なった。７日間培養した１ｍＬのS. lividans培養物を遠心分離にかけ、菌糸体を冷えた検出緩衝液（０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１０ｍＭのＭｇＣｌ2及び１ｍＭのＰＭＳＦ）で再び懸濁した。かかる菌糸体を氷上で４×２０秒間超音波処理し、可溶性のタンパク質を放出させるために１分間の間隔を空けた。２０，０００ｇで１０分間の遠心分離を行った後、上清及びペレットの断片をサンプル緩衝液で希釈し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット法による分析を行なった。
【０２４８】
標準的な方法（上記Sambrook, J. et al.）により、発現プラスミドの構築に用いるＤＮＡの操作を行なった。プラスミドpECO1202を、親プラスミドとして用いた。カリケアマイシン生合成遺伝子座を保有するコスミド０６１ＣＲをＭｆｅｌで消化させ、制限断片をＤＮＡポリメラーゼＩのKlenow断片で処理することにより、平滑末端化した。フェノール抽出及びエタノール沈殿後にＢｇ／ｌｌを用いてさらに消化を行ない、結果として得られた１１．５ｋｂの平滑末端化したＢｇ／ｌｌ断片をゲル精製し、pECO1202にクローニングし（前にＥｃｏＲＩで消化し、ポリメラーゼＩのKlenow断片の処理により平滑末端化し、ＢａｍＨＩで消化し）、図１５に示すように、pECO1202-CALI-1を得た。
【０２４９】
Ｐｆｕポリメラーゼ及びStratagene社より入手した緩衝液を用いて、ＰＴＣ−１００のプログラム可能な熱調節機（ＭＪリサーチ）を用いてＰＣＲを行なった。一般的なＰＣＲ混合物として、１０ｎｇのテンプレートＤＮＡ、２０μｇのｄＮＴＰ、５％のジメチルスルホキシド、２ＵのＰｆｕポリメラーゼ、１μＭのプライマー、及び１×緩衝液を最終量で５０μｌにした。ＰＣＲ温度プログラムは、以下の通りである。最初の変性を９４℃で２分間行ない、９４℃で４５秒間、５５℃で１分間、７２℃で２分間を３０サイクル、次いで、さらに７２℃で７分間行なった。プライマー１４０２、５’−ＧＡＧＴＴＧＴＡＴＣＧＡＴＧＡＧＣＡＧＧＡＴＣＧＣＣＧＴＣＧＴＣＧＧＣ−３’［ＣｌａＩ部位（斜体）及びＰＫＳＥ遺伝子の開始コドン（強調）を含む］、及び、プライマー１４２０、５’−ＧＴＡＧＣＣＧＧＣＣＧＣＣＴＣＣＧＧＣＣ（ＰＫＳＥのヌクレオチド配列９４０〜９５９ｂｐに対応）で増幅したＰＣＲ産物を、ＣｌａＩ及びＮｈｅＩで消化し、ゲル精製を行った。その後、この断片を、ＣｌａＩ及びＮｈｅＩで消化したpECO1202-CALI-1にクローニングし、pECO1202-CALI-5を得た（図１６）。
【０２５０】
プライマー１４２１、５’−ＧＡＣＣＴＧＣＣＧＴＡＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣ−３’（ＰＫＳＥのヌクレオチド配列５３６７〜５３８７ｂｐに対応）及び、プライマー１４０３、５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＣＣＣＴＧＣＣＣＣＡＣＣＧＴＧＧＣＣＧＡＣ−３’［ＨｉｓＴａｇ（下線）、ＨｉｎｄIII部位（斜体）及びＴＥＢＣのストップコドン（強調）を含む］、又はプライマー１５００、５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＡＣＣＣＣＴＧＣＣＣＣＡＣＣＧＴＧＧＣＣＧＡＣ−３’（ＴＥＢＣのＨｉｎｄIII部位（斜体）及びストップコドン（強調）を含む）を用いて、ＰＣＲ産物を増幅した。これらのＰＣＲ産物を、ＨｉｎｄIII及びＰｓｔＩで消化してゲル精製を行い、その後ＨｉｎｄIIIにクローニングし、pECO1205をＰｓｔＩで消化して、pECO1202-CALI-2（ＨｉｓＴａｇ有り）及びpECO1202-CALI-3（ＨｉｓＴａｇ無し）を得た（図１６）。
【０２５１】
図１６に示すように、pECO1202-CALI-2及びpECO1202-CALI-3より得たＣｌａＩ及びＨｉｎｄIII断片をpECO1202RBSにクローニングし、pECO1202-CALI-6（ＨｉｓＴａｇ有り）及びpECO1202-CALI-7（ＨｉｓＴａｇ無し）のそれぞれを得た。
【０２５２】
pECO1202-CALI-2を含有するS. lividansＴＫ２４の６つの形質転換体を用いて、ＨｉｓでタギングされたＴＥＢＣタンパク質の発現について分析した。図１７によると、レーンＭは分子量マーカーを提供する；レーン１〜６は、pECO1202-CALI-2を含有するS. lividansＴＫ２４の独立した形質転換体の粗製抽出物を表す；レーン７は、pECO1202-CALI-4を含有するS. lividansＴＫ２４の粗製抽出物を表す；レーン８は、pECO1202（対照）を含有するS. lividansＴＫ２４の粗製抽出物を表す。Ｈｉｓ−Ｔａｇを認識する抗体を用いたウエスタンブロットにより、４つのpECO1202-CALI-2形質転換体においてＴＥＢＣタンパク質の発現が検出された（レーン２、３、５、６）。ＴＥＢＣタンパク質の発現は、pECO1202-CALI-4を含有するS. lividansＴＫ２４の形質転換体においても確認された（レーン７）。
【０２５３】
図１２に示すように、ＴＥＢＣタンパク質は、S. lividans中では可溶性タンパク質として発現したが、ペレット断片もＴＥＢＣタンパク質を含んでおり、これは使用した超音波処理によるS. lividansの不溶性タンパク質又は不完全な溶解によるものかも知れない。図１２は、免疫ブロットによる組換えS. lividansＴＫ２４由来のＨｉｓでタギングしたＴＥＢＣタンパク質の分析である。S. lividans形質転換体の可溶性又は不溶性のタンパク質断片を、１２％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ＰＤＶＦ膜にブロットし、Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ抗体で検出を確認した。図１２によると、レーンＭは、分子量マーカーを提供する；レーン１〜６は、pECO1202-CALI-2を含有するS. lividansＴＫ２４の独立した形質転換体の粗製の抽出物を表す；レーン７は、pECO1202-CALI-4を含有するS. lividansＴＫ２４の可溶性（Ｓ）及びペレット（Ｐ）タンパク質断片を表す；レーンＣは、pECO1202（対照）を含有するS. lividansＴＫ２４のタンパク質断片を表す。
【実施例１４】
【０２５４】
ＰＫＳＥ遺伝子の破壊は、エンジインの産生を消滅させる
ＰＫＳＥがエンジインの生合成に重要であることを確認するため、カリケアマイシン産生株であるM. echinosporaのＰＫＳＥ遺伝子を、選択可能なアプラマイシンマーカーにより、以下のように破壊した。M. echinosporaを５０ｍＬのＭＳ培地（上記Kieser et al.）中の１：１００の新鮮な接種菌液で増殖させ、５％のＰＥＧ８０００及び５ｍＭのＭｇＣｌ2を２４〜３６時間及び回収の６時間前に添加し、０．５％のグリシンを添加した。細胞壁の消化は、公開されている方法により行ったが、例外として、５ｍｇ  ｍＬ-1のリゾチーム及び２０００Ｕのmutanolysinを使用した。これらの条件下で、混合液を脱脂綿で２回濾過した後、３０〜６０分以内に原形質体の形成が終了した。一般的な方法論（上記Kieser et al.）により、１回の形質転換に対し１０μｇのアルカリ変性ＤＮＡ含む、Ｔ緩衝液とＰＥＧ２０００が１：１の混合物を用いて、形質転換を行なった。次いで、かかる原形質体を、１０ｍｇ  Ｌ-1のＣｏＣｌ2を添加したＲ２ＹＥプレート上に置き、３〜４日後に抗菌圧縮（７０μｇ  ｍＬ-1のアプラマイシン）を行なった。今日まで、原形質体化学形質転換（例えば、ファージトランスダクション、共役及びエレクトロポレーション）以外の方法を用いてＤＮＡをM. echinosporaに導入しようとする試みは、全て失敗している。調べた全てのカリケアマイシン産生Micromonospora系統において、系統の成長により開発したものを含め、形質転換の効率は低かった。ほかのactinomycetesと比較して、M. echinospora原形質体の再生は、遅かった（〜４週間）。また、遺伝子座への組み込みは、大きさにして３ｋｂを越える相同断片が要求される。なぜなら、３ｋｂよりも小さいＰＫＳＥ断片（又は別のカリケアマイシン遺伝子断片）を含む構築物は全て、染色体に組み込むことができなかったからである（データは図示せず）。
【０２５５】
９個の独立したアプラマイシン耐性ＰＫＳＥ破壊クローンを得た。ＰＣＲ断片の増幅及びサザンハイブリダイゼーションにより、９個の単離物は全て、期待されたＰＫＳＥ遺伝子破壊と一致してマッピングされた（データには図示せず）。その後、９個のＰＫＳＥ破壊変異体の全てと、２つの親対照（parental control）のカリケアマイシン産生について、同時に調べた。これらの系統から得た抽出物を、以下のように調製した。Ｒ２ＹＥで増殖させた新鮮なM. echinosporaを１：１００で１０ｍＬの培地Ｅ（上記Kieser et al.）に、よりよい通気のために４ｃｍのステンレスコイルのバネを含む共栓付きの２５ｍｌグラスチューブ中で播種し、オービタル振盪機（orbital shaker）で２３０ｒｐｍで２８℃、１〜３週間インキュベーションを行なった。様々な時点で６００μｌの部分標本を取り除き、同量のＥｔＯＡｃで抽出し、１００００×ｇで５分間、ベンチトップ遠心機を用いて遠心分離した。上清を乾燥するまで濃縮し、ペレットを２００μｌのアセトニトリルに再び溶解し、再び遠心分離を行なって上清を除去し、乾燥するまで濃縮を行ない、残留物を最終的に１０μｌのアセトニトリルに溶解した。この溶解液のうち１μｌはバイオアッセイに使用し、残りの８μｌの部分標本をＨＰＬＣ（Ultrasphere-ODSクロマトグラフィー、５μｍ、４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、５５：４５のＣＨ3ＣＮ−０．２  ＮＨ4ＯＡｃ、ｐＨ６．０、１．０ｍＬ  ｍｉｎ-1、２８０ｎｍ検出）による分析に用いた。一般的なM. echinospora発酵には、ＨＰＬＣ−γ1I（保持時間−７分、〜６０％）、σ1I（保持時間−５．７分、〜３０％）及びα3I（保持時間−３．８分、〜１０％）により分解するカリケアマイシンの混合物が含まれる。これらカリケアマイシンコンポーネントの全ては、バイオアッセイ活性に貢献する。最もよい産生物は、後期対数期（late log）又は早期定常期（early stationary phase）の増殖の最中に生じることが分かった。親のM. echinosporaによるカリケアマイシン産生は、約０．７８〜０．８５ｍｇ  ｍＬ-1である。ｉ）最初にカリケアマイシンを見つけたときに使用された修正されたプロファージ導入アッセイである、生物学的導入アッセイ（Greenstein et al. (1986) Antimicrob. Agents Chemotherap. Vol. 29, 861）；ii）エンジインによるＤＮＡ切断に最適な分子内蛍光クエンチングに基づくＤＮＡ切断アッセイである、分子ブレイクライトアッセイ（molecular break light assay）（ｆＭカリケアマイシン濃縮を検出できる）（Biggins et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 97, 13537）；及びiii）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（上記の通り）により、抽出物の分析を行なった。予想された通り、これら３つの全ての方法により、親であるM. echinosporaの発酵が０．５〜０．８ｍｇ  Ｌ-1産生することが分かった。これに対して、ＰＫＳＥ遺伝子破壊変異体系統は、これら３つの全ての検出方法により、いかなるカリケアマイシン、周知のカリケアマイシン誘導体及び／又はエンジイン活性も欠いていた。ＰＫＳＥ遺伝子の破壊により生じるカリケアマイシン産生の消失は、それがカリケアマイシンの生合成の本質的な活性を与えることを示している。これまでにシークエンシングが行なわれた全てのエンジイン生合成遺伝子座及びその他の全体的な保存にＰＫＳＥが存在することから、ＰＫＳ��は、全てのエンジイン構造の生合成における同じ本質的な機能を満たすことが期待される。
【０２５６】
本発明は、ここに記載した具体的な実施形態により、その範囲を限定されるものではない。特に、ここに記載したもの、及びそれ以外の本発明の各種修正は、当業者がここまでの記載及び付随する図面を見れば、容易にわかるものである。そうした修正も、後述のクレームの範囲に含まれるものとする。
【０２５７】
さらに、全てのサイズ、及び全ての分子量又は質量の値は、おおよそのものであり、記載のために提供されたものであることも、承知されてしかるべきである。
【０２５８】
さらに、全てのサイズ、及び全ての分子量又は質量の値は、おおよそのものであり、記載のために提供されたものであることも、承知されてしかるべきである。
【０２５９】
ここに列挙したいくつかのオープンリーディングフレームは、標準開始コドンのＡＴＧ、すなわち、配列番号２、８、１６、２８、３０、３２、３８、４０、４２、４８、５４、５６、７０、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９２、９８、１００よりもむしろ、非標準開始コドン（例えば、ＧＴＧ−バリン又はＴＴＧ−ロイシン）で始まっている。ＯＲＦの最初のコドンの特異性を示すため、全てのＯＲＦを、アミノ末端部位のＭ、Ｖ又はＬアミノ酸とともに列挙している。しかしながら、全ての事例において、生合成されたタンパク質がメチオニン残基、より具体的にはホルムメチオニン残基をアミノ末端部位に含むであろうことが予測される。このことは、細菌中のタンパク質の生合成は、コードする遺伝子が非標準開始コドンを指定している場合でも、メチオニン（ホルムメチオニン）で始まる（例えば、Stryer, Biochemistry, 3rd edition, 1998, W. H. Freeman & Co., New York, pp. 752-754）という広く受け入れられている原則と一致している。
【０２６０】
本出願に引用した特許、特許公報、手順及び刊行物は、あらゆる目的に使用できるように完全な形でここに組み込んでいる。
【図面の簡単な説明】
【０２６１】
【図１】本発明の参照配列から選択したサブジェクトとクエリーとの比較を目的としたソフトウェアツールを実行するコンピュータシステムのブロック図である。
【図２Ａ】本発明の参照配列から選択したサブジェクトとクエリーとを比較する際に使用可能な配列比較ソフトウェアのフローチャートであり、配列比較ソフトウェアのクエリー初期化サブプロセスを示す図である。
【図２Ｂ】本発明の参照配列から選択したサブジェクトとクエリーとを比較する際に使用可能な配列比較ソフトウェアのフローチャートであり、配列比較ソフトウェアのサブジェクトデータソース初期化サブプロセスを示す図である。
【図２Ｃ】本発明の参照配列から選択したサブジェクトとクエリーとを比較する際に使用可能な配列比較ソフトウェアのフローチャートであり、配列比較ソフトウェアの比較サブプロセス及び分析サブプロセスを示す図である。
【図２Ｄ】本発明の参照配列から選択したサブジェクトとクエリーとを比較する際に使用可能な配列比較ソフトウェアのフローチャートであり、配列比較ソフトウェアのディスプレイ／レポートサブプロセスを示す図である。
【図３】クエリー／サブジェクト対の間の類似性を１対単位で測定する際に使用可能なコンパレータアルゴリズムの１つの実施形態である図２Ｃのコンパレータアルゴリズム（２３８）のフローチャートを示す図である。
【図４】本発明の参照配列であるサブジェクト配列との類似性に基づいてクエリー配列に同一性を割り当てる際に使用可能なアナライザアルゴリズムの１つの実施形態である図２Ｃのアナライザアルゴリズム（２４４）のフローチャートを示す図である。
【図５】Micromonospora echinospora subsp. calichensis由来のカリケアマイシンエンジイン生合成遺伝子座（ＣＡＬＩ）、Streptomyces macromycetius由来のマクロモマイシン（アウロモマイシン）エンジイン生合成遺伝子座（ＭＡＣＲ）、及びStreptomyces ghanaensis由来の色素タンパクエンジイン生合成遺伝子座（００９Ｃ）とを比較した概略図である。各遺伝子座のオープンリーディングフレームを、ボックスで示す。灰色のボックスは、かかる３つのエンジイン遺伝子座に共通しないORFを示す。黒色のボックスは、かかる３つのエンジイン遺伝子座に共通するORFを示し、タンパク質ファミリーの４文字表記を用いて標識されている。スケールの単位は、キロベースである。
【図６】色素タンパク及び非色素タンパクエンジイン遺伝子座の両方を含む、多種多様な属のうち１０種のエンジイン生合成遺伝子座の至るところに保存される５つの遺伝子を示す図である。
【図７】エンジインポリケチドシンターゼ（ＰＫＳＥ）に典型的なドメイン構築を示す図である。
【図８Ａ】１０種のエンジイン生合成遺伝子座由来の完全長エンジインポリケチドシンターゼ（ＰＫＳＥ）タンパク質のアミノ酸クラスターアラインメントを示す図である。近似のドメイン境界を、アラインメントの上部に示す。各ドメインの機能に重要な保存された残基又はモチーフを、黒色で強調表示した。
【図８Ｂ】１０種のエンジイン生合成遺伝子座由来の完全長エンジインポリケチドシンターゼ（ＰＫＳＥ）タンパク質のアミノ酸クラスターアラインメントを示す図である。
【図８Ｃ】１０種のエンジイン生合成遺伝子座由来の完全長エンジインポリケチドシンターゼ（ＰＫＳＥ）タンパク質のアミノ酸クラスターアラインメントを示す図である。
【図８Ｄ】１０種のエンジイン生合成遺伝子座由来の完全長エンジインポリケチドシンターゼ（ＰＫＳＥ）タンパク質のアミノ酸クラスターアラインメントを示す図である。
【図８Ｅ】１０種のエンジイン生合成遺伝子座由来の完全長エンジインポリケチドシンターゼ（ＰＫＳＥ）タンパク質のアミノ酸クラスターアラインメントを示す図である。
【図８Ｆ】１０種のエンジイン生合成遺伝子座由来の完全長エンジインポリケチドシンターゼ（ＰＫＳＥ）タンパク質のアミノ酸クラスターアラインメントを示す図である。
【図８Ｇ】１０種のエンジイン生合成遺伝子座由来の完全長エンジインポリケチドシンターゼ（ＰＫＳＥ）タンパク質のアミノ酸クラスターアラインメントを示す図である。
【図８Ｈ】１０種のエンジイン生合成遺伝子座由来の完全長エンジインポリケチドシンターゼ（ＰＫＳＥ）タンパク質のアミノ酸クラスターアラインメントを示す図である。
【図８Ｉ】１０種のエンジイン生合成遺伝子座由来の完全長エンジインポリケチドシンターゼ（ＰＫＳＥ）タンパク質のアミノ酸クラスターアラインメントを示す図である。
【図８Ｊ】１０種のエンジイン生合成遺伝子座由来の完全長エンジインポリケチドシンターゼ（ＰＫＳＥ）タンパク質のアミノ酸クラスターアラインメントを示す図である。
【図８Ｋ】１０種のエンジイン生合成遺伝子座由来の完全長エンジインポリケチドシンターゼ（ＰＫＳＥ）タンパク質のアミノ酸クラスターアラインメントを示す図である。
【図９Ａ】３つの公知のエンジイン、すなわち、マクロモマイシン（ＭＡＣＲ）、カリケアマイシン（ＣＡＬＩ）及びネオカルチノスタチン（ＮＥＯＣ）由来のＰＫＳＥのアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）ドメインと、アクチノロジン（actinorhodin）II型ＰＫＳシステム（１ＡＦ８）のＡＣＰドメインとを比較した、アミノ酸のクラスターアラインメントを示す図である。
【図９Ｂ】アクチノロジンII型ＰＫＳシステム（１ＡＦ８）のＡＣＰの三次元構造における保存された残基の空間実体側鎖を示す図である。
【図１０Ａ】３つの公知のエンジイン、すなわち、マクロモマイシン（ＭＡＣＲ）、カリケアマイシン（ＣＡＬＩ）及びネオカルチノスタチン（ＮＥＯＣ）由来のＰＫＳＥの４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（4'-phosphopantetheinyl transferase）（ＰＰＴＥ）ドメインと、Bacillus subtilis（sfp.）のSｆｐである、４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼとを比較した、アミノ酸のクラスターアラインメントを示す図である。保存された残基を、ボックスで示す。Ｓｆｐの公知の二次構造は、整列させた（aligned）配列の下に示し、ＰＫＳＥのＰＰＴＥドメインの予測された二次構造は、整列させた配列の上に示し、ボックスはα−ヘリックス、矢印はβ−シートを示す。
【図１０Ｂ】４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼのＳｆｐの保存された残基がどのようにしてマグネシウムイオン及び補酵素Ａを配位するのかを示す図である。ネオカルチノスタチンＰＰＴＥドメインの対応する残基は、強調表示されている。
【図１１】１１個のＴＥＢＣタンパク質と４−ヒドロキシベンゾイル−ＣｏＡチオエステラーゼ（１ＢＶＱ）を、１ＢＶＱの二次構造と重ねた（superimposed）アミノ酸のクラスターアラインメントを示す図である。アルファ−ヘリックス（α）及びベータ−シーツ（β）を矢印で示す。
【図１２Ａ】１０個のＵＮＢＬタンパク質のアミノ酸のクラスターアラインメントを示す図である。
【図１２Ｂ】１０個のＵＮＢＬタンパク質のアミノ酸のクラスターアラインメントを示す図である。
【図１３Ａ】１０個のＵＮＢＶタンパク質のアミノ酸のクラスターアラインメントを示す図であり、これらのタンパク質の分泌のために標的とするであろう推定Ｎ末端シグナル配列を強調して示す。
【図１３Ｂ】１０個のＵＮＢＶタンパク質のアミノ酸のクラスターアラインメントを示す図である。
【図１３Ｃ】１０個のＵＮＢＶタンパク質のアミノ酸のクラスターアラインメントを示す図である。
【図１３Ｄ】１０個のＵＮＢＶタンパク質のアミノ酸のクラスターアラインメントを示す図である。
【図１４Ａ】１０個のUNBUタンパク質のアミノ酸のクラスターアラインメントを示す図であり、細胞膜内でこのタンパク質のファミリーをアンカーするであろう推定膜貫通ドメインを強調して示す。
【図１４Ｂ】１０個のUNBUタンパク質のアミノ酸のクラスターアラインメントを示す図である。
【図１４Ｃ】１０個のUNBUタンパク質のアミノ酸のクラスターアラインメントを示す図である。
【図１５】本発明のプラスミドpECO1202-CALI-1及びpECO1202-CALI-4の制限部位及び機能的マッピングを示す図である。本発明による遺伝子カセットを形成する遺伝子のオープンリーディングフレームは、転写の方向を指す矢印で示す。
【図１６】プラスミドpECO1202-CALI-5、pECO1202-CALI-2、pECO1202-CALI-3、pECO1202-CALI-6及びpECO1202-CALI-7の制限部位及び機能的マッピングを示す図である。本発明による遺伝子カセットを形成する遺伝子のオープンリーディングフレームは、転写の方向を指す矢印で示す。
【図１７】pECO1202-CALI-2又はpECO1202-CALI-4発現ベクターを含有する、組換えS. lividansＴＫ２４クローンの全タンパク質抽出物におけるＨｉｓでタグしたＴＥＢＣタンパク質の免疫ブロット分析結果を示す図である。
【図１８】pECO1202-CALI-2発現ベクターを含有する、組換えS. lividansＴＫ２４クローンの分画した抽出物におけるＨｉｓでタグしたＴＥＢＣタンパク質の免疫ブロット分析結果を示す図である。
【図１】
2005508140.tif 000020
【図２Ａ】
2005508140.tif 000021
【図２Ｂ】
2005508140.tif 000022
【図２Ｃ】
2005508140.tif 000023
【図２Ｄ】
2005508140.tif 000024
【図３】
2005508140.tif 000025
【図４】
2005508140.tif 000026
【図５】
2005508140.tif 000027
【図６】
2005508140.tif 000028
【図７】
2005508140.tif 000029
【図８Ａ】
2005508140.tif 000030
【図８Ｂ】
2005508140.tif 000031
【図８Ｃ】
2005508140.tif 000032
【図８Ｄ】
2005508140.tif 000033
【図８Ｅ】
2005508140.tif 000034
【図８Ｆ】
2005508140.tif 000035
【図８Ｇ】
2005508140.tif 000036
【図８Ｈ】
2005508140.tif 000037
【図８Ｉ】
2005508140.tif 000038
【図８Ｊ】
2005508140.tif 000039
【図８Ｋ】
2005508140.tif 000040
【図９Ａ】
2005508140.tif 000041
【図９Ｂ】
2005508140.tif 000042
【図１０Ａ】
2005508140.tif 000043
【図１０Ｂ】
2005508140.tif 000044
【図１１】
2005508140.tif 000045
【図１２Ａ】
2005508140.tif 000046
【図１２Ｂ】
2005508140.tif 000047
【図１３Ａ】
2005508140.tif 000048
【図１３Ｂ】
2005508140.tif 000049
【図１３Ｃ】
2005508140.tif 000050
【図１３Ｄ】
2005508140.tif 000051
【図１４Ａ】
2005508140.tif 000052
【図１４Ｂ】
2005508140.tif 000053
【図１４Ｃ】
2005508140.tif 000054
【図１５】
2005508140.tif 000055
【図１６】
2005508140.tif 000056
【図１７】
2005508140.tif 000057
【図１８】
2005508140.tif 000058
【国際公開パンフレット】
2005508140.tif 000059
2005508140.tif 000060
2005508140.tif 000061
2005508140.tif 000062
2005508140.tif 000063
2005508140.tif 000064
2005508140.tif 000065
2005508140.tif 000066
2005508140.tif 000067
2005508140.tif 000068
2005508140.tif 000069
2005508140.tif 000070
2005508140.tif 000071
2005508140.tif 000072
2005508140.tif 000073
2005508140.tif 000074
2005508140.tif 000075
2005508140.tif 000076
2005508140.tif 000077
2005508140.tif 000078
2005508140.tif 000079
2005508140.tif 000080
2005508140.tif 000081
2005508140.tif 000082
2005508140.tif 000083
2005508140.tif 000084
2005508140.tif 000085
2005508140.tif 000086
2005508140.tif 000087
2005508140.tif 000088
2005508140.tif 000089
2005508140.tif 000090
2005508140.tif 000091
2005508140.tif 000092
2005508140.tif 000093
2005508140.tif 000094
2005508140.tif 000095
2005508140.tif 000096
2005508140.tif 000097
2005508140.tif 000098
2005508140.tif 000099
2005508140.tif 000100
2005508140.tif 000101
2005508140.tif 000102
2005508140.tif 000103
2005508140.tif 000104
2005508140.tif 000105
2005508140.tif 000106
2005508140.tif 000107
2005508140.tif 000108
2005508140.tif 000109
2005508140.tif 000110
2005508140.tif 000111
2005508140.tif 000112
2005508140.tif 000113
2005508140.tif 000114
2005508140.tif 000115
2005508140.tif 000116
2005508140.tif 000117
2005508140.tif 000118
2005508140.tif 000119
2005508140.tif 000120
2005508140.tif 000121
2005508140.tif 000122
2005508140.tif 000123
2005508140.tif 000124
2005508140.tif 000125
2005508140.tif 000126
2005508140.tif 000127
2005508140.tif 000128
2005508140.tif 000129
2005508140.tif 000130
2005508140.tif 000131
2005508140.tif 000132
2005508140.tif 000133
2005508140.tif 000134
2005508140.tif 000135
2005508140.tif 000136
2005508140.tif 000137
2005508140.tif 000138
2005508140.tif 000139
2005508140.tif 000140
2005508140.tif 000141
2005508140.tif 000142
2005508140.tif 000143
2005508140.tif 000144
2005508140.tif 000145
2005508140.tif 000146
2005508140.tif 000147
2005508140.tif 000148
2005508140.tif 000149
2005508140.tif 000150
2005508140.tif 000151
2005508140.tif 000152
2005508140.tif 000153
2005508140.tif 000154
2005508140.tif 000155
2005508140.tif 000156
2005508140.tif 000157
2005508140.tif 000158
2005508140.tif 000159
2005508140.tif 000160
2005508140.tif 000161
2005508140.tif 000162
2005508140.tif 000163
2005508140.tif 000164
2005508140.tif 000165
2005508140.tif 000166
2005508140.tif 000167
2005508140.tif 000168
2005508140.tif 000169
2005508140.tif 000170
2005508140.tif 000171
2005508140.tif 000172
2005508140.tif 000173
2005508140.tif 000174
2005508140.tif 000175
2005508140.tif 000176
2005508140.tif 000177
2005508140.tif 000178
2005508140.tif 000179
2005508140.tif 000180
2005508140.tif 000181
2005508140.tif 000182
2005508140.tif 000183
2005508140.tif 000184
2005508140.tif 000185
2005508140.tif 000186
2005508140.tif 000187
2005508140.tif 000188
2005508140.tif 000189
2005508140.tif 000190
2005508140.tif 000191
2005508140.tif 000192
2005508140.tif 000193
2005508140.tif 000194
2005508140.tif 000195
2005508140.tif 000196
2005508140.tif 000197
2005508140.tif 000198
2005508140.tif 000199
2005508140.tif 000200
2005508140.tif 000201
2005508140.tif 000202
2005508140.tif 000203
2005508140.tif 000204
2005508140.tif 000205
2005508140.tif 000206
2005508140.tif 000207
2005508140.tif 000208
2005508140.tif 000209
2005508140.tif 000210
2005508140.tif 000211
2005508140.tif 000212
2005508140.tif 000213
2005508140.tif 000214
2005508140.tif 000215
2005508140.tif 000216
2005508140.tif 000217
2005508140.tif 000218
2005508140.tif 000219
2005508140.tif 000220
2005508140.tif 000221
2005508140.tif 000222
2005508140.tif 000223
2005508140.tif 000224
2005508140.tif 000225
2005508140.tif 000226
2005508140.tif 000227
2005508140.tif 000228
2005508140.tif 000229
2005508140.tif 000230
2005508140.tif 000231
2005508140.tif 000232
2005508140.tif 000233
2005508140.tif 000234
2005508140.tif 000235
2005508140.tif 000236
2005508140.tif 000237
2005508140.tif 000238
2005508140.tif 000239
2005508140.tif 000240
2005508140.tif 000241
2005508140.tif 000242
2005508140.tif 000243
2005508140.tif 000244
2005508140.tif 000245
2005508140.tif 000246
2005508140.tif 000247
2005508140.tif 000248
2005508140.tif 000249
2005508140.tif 000250
2005508140.tif 000251
2005508140.tif 000252
2005508140.tif 000253
2005508140.tif 000254
2005508140.tif 000255
2005508140.tif 000256
2005508140.tif 000257
2005508140.tif 000258
2005508140.tif 000259
2005508140.tif 000260
2005508140.tif 000261
2005508140.tif 000262
2005508140.tif 000263
2005508140.tif 000264
2005508140.tif 000265
2005508140.tif 000266
2005508140.tif 000267
2005508140.tif 000268
2005508140.tif 000269
2005508140.tif 000270
2005508140.tif 000271
2005508140.tif 000272
2005508140.tif 000273
2005508140.tif 000274
2005508140.tif 000275
2005508140.tif 000276
2005508140.tif 000277
2005508140.tif 000278
2005508140.tif 000279
2005508140.tif 000280
2005508140.tif 000281
2005508140.tif 000282
2005508140.tif 000283
2005508140.tif 000284
2005508140.tif 000285
2005508140.tif 000286
2005508140.tif 000287
2005508140.tif 000288
2005508140.tif 000289
2005508140.tif 000290
2005508140.tif 000291
2005508140.tif 000292
2005508140.tif 000293
2005508140.tif 000294
2005508140.tif 000295
2005508140.tif 000296
2005508140.tif 000297
2005508140.tif 000298
2005508140.tif 000299
2005508140.tif 000300
2005508140.tif 000301
2005508140.tif 000302
2005508140.tif 000303
2005508140.tif 000304
2005508140.tif 000305
2005508140.tif 000306
2005508140.tif 000307
2005508140.tif 000308
2005508140.tif 000309
2005508140.tif 000310
2005508140.tif 000311
2005508140.tif 000312
2005508140.tif 000313
2005508140.tif 000314
2005508140.tif 000315
2005508140.tif 000316
2005508140.tif 000317
2005508140.tif 000318
2005508140.tif 000319
2005508140.tif 000320
2005508140.tif 000321
2005508140.tif 000322
2005508140.tif 000323
2005508140.tif 000324
2005508140.tif 000325
2005508140.tif 000326
2005508140.tif 000327
2005508140.tif 000328
2005508140.tif 000329
2005508140.tif 000330
2005508140.tif 000331
2005508140.tif 000332
2005508140.tif 000333
2005508140.tif 000334
2005508140.tif 000335
2005508140.tif 000336
2005508140.tif 000337
2005508140.tif 000338
2005508140.tif 000339
2005508140.tif 000340
2005508140.tif 000341
2005508140.tif 000342
2005508140.tif 000343
2005508140.tif 000344
2005508140.tif 000345
2005508140.tif 000346
2005508140.tif 000347
2005508140.tif 000348
2005508140.tif 000349
2005508140.tif 000350
2005508140.tif 000351
2005508140.tif 000352
2005508140.tif 000353
2005508140.tif 000354
2005508140.tif 000355
2005508140.tif 000356
2005508140.tif 000357
2005508140.tif 000358
2005508140.tif 000359
2005508140.tif 000360
2005508140.tif 000361
2005508140.tif 000362
2005508140.tif 000363
2005508140.tif 000364
2005508140.tif 000365
2005508140.tif 000366
2005508140.tif 000367
2005508140.tif 000368
2005508140.tif 000369
2005508140.tif 000370
2005508140.tif 000371
2005508140.tif 000372
2005508140.tif 000373
2005508140.tif 000374
2005508140.tif 000375
2005508140.tif 000376
2005508140.tif 000377
2005508140.tif 000378
2005508140.tif 000379
2005508140.tif 000380
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005508140.tif 000381
2005508140.tif 000382
【国際調査報告】
2005508140.tif 000383
2005508140.tif 000384
2005508140.tif 000385
2005508140.tif 000386
2005508140.tif 000387
2005508140.tif 000388