(57)【要約】  本発明は、約０．５ｍｍ〜１０．０ｍｍの粒度を有する鳥類胚粒子を含むバイオマス、ウイルス抗原の生産法でのその使用を提供する。また、ウイルス疾患の緩和および予防に有用なワクチンの製造法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
約０．５ｍｍ〜１０．０ｍｍの粒度を有する鳥類胚粒子を含み、該粒子がウイルスに感染しているところの、ウイルス抗原を生産するためのバイオマス。
【請求項２】
粒度が約１．０ｍｍ〜３．０ｍｍである請求項１記載のバイオマス。
【請求項３】
該鳥類胚がニワトリの胚である請求項１記載のバイオマス。
【請求項４】
該ウイルスが、レオウイルス；伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス；マレック病ウイルス；ニューカッスル病ウイルス；伝染性気管支炎ウイルス；ポックスウイルス；ニワトリ貧血ウイルス；軟卵症候群；七面鳥の鼻気管炎ウイルス；肺炎ウイルス；伝染性喉頭気管炎ウイルス；脳脊髄炎ウイルス；インフルエンザウイルス；狂犬病ウイルス；ジステンパーウイルス；出血性腸炎ウイルス；肝炎ウイルス；ヘモフィルス・パラガリナルム；およびクラミジア・シッタシからなる群から選択される請求項１記載のバイオマス。
【請求項５】
該ウイルスが鳥ウイルスである請求項１記載のバイオマス。
【請求項６】
該ウイルスが伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスである請求項５記載のバイオマス。
【請求項７】
ウイルス抗原の生産方法であって：
ａ）約０．５ｍｍ〜１０．０ｍｍの粒度を有する鳥類胚粒子を、培養培地中でウイルスに感染させてバイオマスを形成すること；
ｂ）該バイオマスを高温で酸素処理して酸素化混合物を形成すること；および
ｃ）該混合物を濾過して所望のウイルス抗原生成物を含有する濾液を得ること；
を含む方法。
【請求項８】
該胚の粒度が約１．０ｍｍ〜３．０ｍｍである請求項７記載の方法。
【請求項９】
該培養培地がトリプトースリン酸ブロスである請求項７記載の方法。
【請求項１０】
該酸素化混合物が、約４０％〜６０％の溶解酸素を含有する請求項７記載の方法。
【請求項１１】
高温が約９５°Ｆ〜１０５°Ｆである請求項７記載の方法。
【請求項１２】
ウイルスが、レオウイルス；伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス；マレック病ウイルス；ニューカッスル病ウイルス；伝染性気管支炎ウイルス；ポックスウイルス；ニワトリ貧血ウイルス；軟卵症候群；七面鳥の鼻気管炎ウイルス；伝染性喉頭気管炎ウイルス；脳脊髄炎ウイルス；インフルエンザウイルス；狂犬病ウイルス；ジステンパーウイルス；出血性腸炎ウイルス；肝炎ウイルス；およびクラミジア・シッタシからなる群から選択される請求項７記載の方法。
【請求項１３】
ウイルスが鳥ウイルスである請求項７記載の方法。
【請求項１４】
ウイルスが伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスである請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
ウイルスワクチンの製造方法であって；
ａ）約０．５ｍｍ〜１０．０ｍｍの粒度を有する鳥類胚粒子を、培養培地中でウイルスに感染させてバイオマスを形成すること；
ｂ）該バイオマスを高温で酸素処理して酸素化混合物を形成すること；
ｃ）該混合物を濾過して所望のウイルス抗原生成物を含有する濾液を得ること；
ｄ）該濾液を生理学的に許容される液体担体と混合すること；および
ｅ）任意に免疫原性刺激剤を添加すること；
を含む方法。
【請求項１６】
該ウイルスが、レオウイルス；伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス；マレック病ウイルス；ニューカッスル病ウイルス；伝染性気管支炎ウイルス；ポックスウイルス；ニワトリ貧血ウイルス；軟卵症候群；七面鳥の鼻気管炎ウイルス；伝染性喉頭気管炎ウイルス；脳脊髄炎ウイルス；インフルエンザウイルス；狂犬病ウイルス；ジステンパーウイルス；出血性腸炎ウイルス；肝炎ウイルス；およびクラミジア・シッタシからなる群から選択される請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
該ウイルスが鳥ウイルスである請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
該ウイルスが伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスである請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
該胚粒子が約１．０ｍｍ〜３．０ｍｍの粒度を有する請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
該粒子がニワトリ胚粒子である請求項１９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
ウイルス抗原を生産する慣用的な方法は、インオボ生産、すなわち、感染した発育卵中での生産；または細胞培養生産、すなわち、感染した一次細胞または細胞株での生産を含む。抗原を生産する典型的なインオボ法は、自動化が困難であり、労働集約的で、時間がかかり、汚染され易い多くの工程を含む。一般的には、細胞培養生産は、別個の細胞、および組織を機械的または 酵素的に最大限に分解または分離する必要がある、可能な限り小さい細胞集合体の使用を必要とする。この処理は、所望の生成物から分離することが難しい高度な細胞蛋白質の汚染をもたらす可能性がある、多くの細胞の腐敗を誘発しうる。ダニ媒介脳炎ウイルス抗原およびインフルエンザウイルスワクチンの生産方法は、米国特許第５，３９１，４９１号および米国特許第５，６９８，４３３号にそれぞれ記載されている。これらの方法は、１００μｍより大きく、１０００μｍより小さい径を有する鳥類胚細胞集合体を使用し、酵素的工程を必要とする。
【０００２】
したがって、本発明の目的は、インオボ抗原生産および別個の細胞、細胞株またはミクロン規模の細胞集合体を用いる抗原生産の不利点を解消する、ウイルス抗原の生産に有用なバイオマスを提供することである。
【０００３】
本発明の別の目的は、ウイルス抗原の高生産高を導く、商業規模で用いることができる、ウイルス抗原の生産方法を提供する。
本発明の利点は、バイオマスの取り扱いが容易であること、該抗原生産法が工程の経済性を提供することおよび有意に汚染の機会を減少させることである。
本発明の特徴は、ウイルス感染症および疾患に対して効果的なワクチンを、より容易に、経済的に生成することができることである。
本発明のさらなる目的および特徴は、以下の詳細な記載から明らかになるだろう。
【０００４】
（発明の概要）
本発明は、約０．５ｍｍ〜１０．０ｍｍの粒度を有する鳥類胚粒子を含み、該粒子がウイルスに感染しているウイルス抗原を生産するためのバイオマスを提供する。
【０００５】
また、本発明は、ウイルス抗原の生産方法であって：
ａ）約０．５ｍｍ〜１０．０ｍｍの粒度を有する鳥類胚粒子を、培養培地中でウイルスに感染させてバイオマスを形成すること；
ｂ）該バイオマスを高温で酸素処理して酸素化混合物を形成すること；および
ｃ）該混合物を濾過して所望のウイルス抗原生成物を含有する濾液を得ること；
を含む方法を提供する。
【０００６】
さらに、本発明は、ワクチンの製造方法であって；
ａ）約０．５ｍｍ〜１０．０ｍｍの粒度を有する鳥類胚粒子を、培養培地中でウイルスに感染させてバイオマスを形成すること；
ｂ）該バイオマスを高温で酸素処理して酸素化混合物を形成すること；
ｃ）該混合物を濾過して所望のウイルス抗原生成物を含有する濾液を得ること；
ｄ）該濾液を生理学的に許容される液体担体と混合すること；および
ｅ）任意に免疫原性刺激剤を添加すること；
を含む方法を提供する。
【０００７】
（発明の詳細な説明）
ウイルス抗原を生産する慣用的な方法は、感染発育卵、例えば鶏卵中での生産、感染している一次細胞培養物または感染している細胞株中での生産、あるいはミクロン規模の鳥類胚細胞集合体を用いる生産を含む。これらのすべての方法は、多工程および／または酵素的開裂および分離技術、例えば遠心分離、沈降等を含む。
【０００８】
意外にも、この度、ウイルスに感染した、約０．５ｍｍ〜１０．０ｍｍ、好ましくは約１．０ｍｍ〜３．０ｍｍの粒度を有する、鳥類、好ましくはニワトリ胚粒子を含むバイオマスを用いて、効果的かつ効率的にウイルス抗原を生産することを見出した。本発明のバイオマスの鳥類胚粒子は、慣用的な機械的サイズ減少法、例えば高剪断混合、高速多バッフル撹拌、均質化等、好ましくは均質化により得ることができる。例えば、９〜１２、好ましくは１１日齢のインキュベート鶏卵から収穫したニワトリ胚を、滅菌緩衝溶液で洗浄し、約５０〜２５０、好ましくは約８０〜１２０、より好ましくは約１００個の胚／リットルの濃度に、培養培地、例えばトリプトースリン酸ブロスで希釈して、機械的に大きさを減少させて、約０．５ｍｍ〜１０．０ｍｍ、好ましくは１．０ｍｍ〜３．０ｍｍの粒度を有する鳥類胚粒子の懸濁液を得る。ついで、この懸濁液をウイルスに感染させるか、あるいは、ウイルスマスターを播種して、本発明のバイオマスを得る。適当なウイルスは、鳥類胚細胞において再生産されうるいずれのウイルスまたは他の抗原、例えばレオウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）、マレック病ウイルス（ＭＤＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ポックスウイルス、ニワトリ貧血ウイルス（ＣＡＶ）、軟卵症候群（ＥＤＳ）、七面鳥の鼻気管炎ウイルス（ＴＲＴ）、肺炎ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴ）、脳脊髄炎ウイルス、インフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、ジステンパーウイルス、出血性腸炎ウイルス、肝炎ウイルス、クラミジア・シッタシ、ヘモフィルス・パラガリナルム等、好ましくは鳥ウイルス、より好ましくは、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスを含む。
【０００９】
したがって、本発明は、ウイルス抗原の生産方法であって、約０．５ｍｍ〜１０．０ｍｍ、好ましくは約１．０ｍｍ〜３．０ｍｍの粒度を有する鳥類胚粒子を、培養培地中でウイルス、好ましくは鳥ウイルス、より好ましくは伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスに感染させてバイオマスを形成すること；該バイオマスを高温で酸素処理して酸素化混合物を形成すること；および該混合物を濾過して所望のウイルス抗原生成物を含有する濾液を得ることを含む方法を提供する。
【００１０】
本発明の方法に用いるのに適当な培養培地は、トリプトースリン酸ブロス、ＥＭＥＭ、ＤＭＥＭ（Anhui Chemicalsにより製造されている）または生物学的培養に適したいずれの慣用的な培地、好ましくはトリプトースリン酸ブロスを含む。
【００１１】
本発明の方法に用いるのに適当な高温は、約９０°Ｆ〜１１０°Ｆ、好ましくは約９５°Ｆ〜１０５°Ｆ、より好ましくは約９８°Ｆ〜１０２°Ｆである。
本発明の方法で得られる酸素化混合物は、約４０％〜６０％、好ましくは約４５％〜５５％、より好ましくは約５０％の溶解酸素を含有しうる。
【００１２】
実際には、約５０〜２５０、好ましくは約８０〜１２０、より好ましくは１００個の胚／リットルの培養培地の濃度を有する、培養培地、例えばトリプトースリン酸ブロス中の約０．５ｍｍ〜１０．０ｍｍ、好ましくは約１．０ｍｍ〜３．０ｍｍの粒度を有する鳥類胚粒子の懸濁液を、ウイルス、好ましくは鳥ウイルス、より好ましくは伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスに感染させてバイオマスを得；該バイオマスを、約９０°Ｆ〜１１０°Ｆ、好ましくは約９５°Ｆ〜１０５°Ｆ、より好ましくは約９８°Ｆ〜１０２°Ｆの高温で酸素処理して、約４０％〜６０％、好ましくは約４５％〜５５％、より好ましくは約５０％の溶解酸素を有する酸素化混合物を得；この酸素化混合物を、約５０ミクロン〜１００ミクロン、好ましくは約７０ミクロン〜８０ミクロン、より好ましくは約７５ミクロンのスクリーンにより濾過して、所望の抗原生成物を含有する濾液を得る。このように得られた抗原貯蔵物は、将来ワクチン調製に用いるために慣用的な賦形剤、例えば安定化剤、酸化防止剤等で処理して、冷凍するか、または凍結乾燥することにより貯蔵することができるか、あるいはそのままワクチン調製に用いることができる。
【００１３】
したがって、また、本発明は、ワクチンの製造方法であって、上記した方法により製造した抗原貯蔵物を生理学的に許容される担体と混合すること、および任意に免疫原性刺激アジュバントを添加することを含む方法を提供する。
本発明のワクチン製造法で用いるのに適当な生理学的に許容される担体は、獣医学的医薬製剤に適したいずれの慣用的な液体担体、好ましくは組織培養培地に用いるのに適した平衡塩溶液を含む。
【００１４】
本発明のワクチン製造法で用いるのに適した免疫原性刺激アジュバントは、抗原、例えば界面活性剤、すなわち、ヘキサデシルアミン、オクダデシルアミン、リソレシチン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド、Ｎ，Ｎ−時オクダデシル−Ｎ’−Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル−プロパンジアミン）、メトキシヘキサデシルグリセロール、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ポリオール、サポニン、Ｑｕｉｌ（登録商標）Ａ等；ポリアニオン、例えばピラン、硫酸デキストラン、ポリイノシン酸ポリシジチル酸のポリヌクレオチド複合体、ポリアクリル酸、カルボポール、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム等；ペプチド、例えばムラミールジペプチド、ジメチルグリシン、タフトシン等；油性エマルジョン；免疫調整剤、例えばインターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−１２、ＧＭ−ＣＳＦ等；またはそれらの組み合わせと組み合わせて投与した場合、動物の免疫応答を増強するか刺激することのできるいずれの化合物である。
【００１５】
実際には、上記した本発明の抗原生成法により得られたウイルス抗原、鳥ウイルス抗原、より好ましくは伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス抗原貯蔵物を、生理学的に許容される担体、例えばリン酸緩衝化セイライン溶液および任意に免疫原性刺激アジュバントと混合して、最小限の保護投与量の約１．２対数倍の抗原濃度を有するワクチン生成物を得る。
【００１６】
かくして調製されたワクチンは、さらに、獣医学的ワクチンにおいて一般に用いられる慣用的な賦形剤、安定化剤、酸化防止剤、消泡剤等で処理することができる。
【００１７】
本発明の一の具体例において、ウイルス抗原貯蔵物は、ワクチン調製前に不活性化することができる。本発明の抗原生成法により調製されたウイルス抗原貯蔵物は、慣用的な不活性化法、例えば化学的不活性化剤、例えばバイナリーエチレンイミン、ベータ−プロピオラクトン、ホルマリン、メルチオレイト、グルタルアルデヒド、ドデシル硫酸ナトリウム等またはその混合物、好ましくはホルマリンを用いる化学的不活性化法により不活性化することができる。また、該抗原は、加熱または紫外線の存在下のソラレンにより不活性化することもできる。
【００１８】
本発明をより明確に理解するために、下記実施例を以下に示す。これらの実施例は、単に本発明を説明するものであって、何ら本発明の範囲または基本原理を限定するものではないと理解される。実際、本発明の種々の改変、加えて、本明細書に示され、記載されたものは、以下の実施例および上記記載から当業者には明らかだろう。また、かかる改変は請求の範囲に含まれる。
特記しない限り、すべての割合は、重量による割合である。
【００１９】
実施例１
伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）抗原の調製
９９°Ｆで１１日間インキュベーションした鶏卵から得た胚を収穫し、リン酸緩衝液中のゲンタマイシンの溶液（３０ｍｇ／ｍＬ）で、室温で３回洗浄する。洗浄した胚を、トリプトースリン酸ブロス中に、約１００個の胚／リットルに希釈する。希釈した胚を、Chemineer（Greerco）製の、プリセットギャップセッティングが３．０ｍｍである、Ｗ２５０Ｖ（Gifford-Wood）モデルホモゲナイザーを用いて、１．０〜３．０μｍの粒度に均質化する。得られた懸濁液を、機械的に、０．２ｍＬ／胚のＸ＋４Ｌｕｋｅｒｔ株処理シード（ＵＳＤＡ−ＡＰＨＩＳ承認ＩＢＤＶ）（５．５ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）と、２０〜３０分間混合する。得られた混合物を、ｐＨ７．１、３．０ｐｓｉ、１００．４°Ｆおよび２０個の胚／リットルの濃度で酸素処理して、最終溶解酸素（ＤＯ）含有量を５０％ＤＯにした。４８時間後、酸素処理した混合物を、７５ミクロンのスクリーンで濾過し、スタビライザーＨ１と１：１で、室温で１時間混合し、４０°Ｆ未満で貯蔵する。
上記した方法を用いて、９．２ＴＣＩＤ５０／ｍＬの効力を有するＩＢＤＶ抗原貯蔵物を得る。ＴＣＩＤは、組織培養感染投与量を指定する。
【００２０】
１スタビライザーＨ形成：下記に示す成分を、示した順に混合する。各々の成分を、次の添加の前に完全に溶解させる。必要に応じて最大６０℃に加熱する。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
実施例２
ウイルス抗原の調製
実施例２に記載と本質的に同様の方法および適当なウイルスを用いて、表１に示す抗原貯蔵物を得た。
【００２３】
【表２】
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【００２４】
実施例３
伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスワクチンの調製
実施例１に記載の方法に従って調製され、冷凍された伝染性ファブリキウス嚢病抗原貯蔵物を、室温で回答し、スタビライザーＨおよびＤ−ｍｅｍ１の１：１の混合物で希釈し、最小限の防御投与量の１．２対数倍の最終抗原濃度にした。この希釈貯蔵物を、機械的に、少なくとも１５分間撹拌し、単回または複数回投与バイアルに入れた。

１Ｄ−ｍｅｍは、JRH Bioscience製の最小必須培地である。
【国際調査報告】
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