(57)【要約】  本発明は、以下の工程を含む胚性幹細胞の機能性細胞への四段階の分化誘導方法を提供する：１）ＥＳ細胞の増殖；２）白血病抑制因子および塩基性ＦＧＦの存在下での胚様体誘導；３）ＥＢの選択・増殖；および４）分化。本発明によると、ＥＳ細胞はインスリン分泌性膵島様細胞群または神経様細胞へと分化しうる。このようにして得られる機能性細胞は多くの患者のための細胞移植治療におけるドナー細胞の有力な供給源となりうる。
2005514944.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程；
１）哺乳類の胚性幹細胞をフィーダー細胞とともに、白血病抑制因子を含有する培地を用いて培養する；
２）得られた細胞をフィーダー細胞の非存在下、白血病抑制因子および塩基性ＦＧＦを含有する培地を用いて浮遊条件で培養し、胚様体を得る；
３）得られた胚様体を選択・増殖培地で培養する；および、
４）得られた細胞集団を分化培地を用いて培養して機能性細胞を得る、
を含む哺乳類の胚性幹細胞の機能性細胞への分化誘導方法。
【請求項２】
第２段階において用いられる培地が、白血病抑制因子を約１００−１００００Ｕ／ｍｌ含有する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
第２段階において用いられる培地が、ｂＦＧＦを約２−１００ｎｇ／ｍｌ含有する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
第３段階において用いられる培地が、無血清細胞培養用培地中に、ニコチンアミド、インスリンおよびフィブロネクチンを含有するものである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
機能性細胞がインスリン分泌性膵島様細胞塊である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
第４段階において用いられる培地が、無血清細胞培養用培地中に、ニコチンアミド、インスリンおよびラミニンを含有するものである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
機能性細胞が神経様細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
第４段階において用いられる培地が、無血清細胞培養用培地中に、Ｌ−リジン、インスリンおよびラミニンを含有するものである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
請求項１記載の方法によって哺乳類のＥＳ細胞から誘導される、機能性細胞。
【請求項１０】
請求項５記載の方法によって哺乳類のＥＳ細胞から誘導される、インスリン分泌性細胞集団。
【請求項１１】
請求項７記載の方法によって哺乳類のＥＳ細胞から誘導される、神経様細胞。
【請求項１２】
請求項５記載の方法によって同種ＥＳ細胞から誘導された膵島様細胞塊を患者に移植することを含む、膵島機能に障害のある哺乳類患者の治療方法。
【請求項１３】
患者がＩ型糖尿病患者である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
請求項７記載の方法によって同種ＥＳ細胞から誘導された神経様細胞を患者に移植することを含む、神経機能に障害のある哺乳類患者の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳類の胚性幹細胞の機能性細胞への分化誘導方法に関する。本発明はまた、本発明によって得られる機能性細胞および機能性細胞を患者に移植することによる患者の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多能性幹細胞は２種類の胚由来の系譜から導き出される。胚性幹（ＥＳ）細胞は着床前の胚盤胞の内部細胞塊に由来し、胚性生殖（ＥＧ）細胞は始原生殖細胞（ＰＧＣ）に由来する。ＥＳ細胞とＥＧ細胞はどちらも多能性があり、生殖系列にも分化できるため実験的にキメラをつくることができる。マウスのＥＳ細胞とＥＧ細胞はいくつかの形態学的性質を共有しており、いずれの細胞も細胞内のアルカリホスファターゼ（ＡＰ）が高値で、かつ細胞表面に特定の糖脂質や糖蛋白を発現している。これらの性質は多能性幹細胞に固有の性質ではないが、共通してみられる性質である。他の重要な性質としては、多細胞クローンとして増殖すること、正常で安定な核型をもつこと、長期間の継代が可能であること、三胚葉に由来するすべての細胞に分化しうることなどがある。これらの性質の多くを共有している多能性幹細胞系は、鶏、ミンク、ハムスター、豚、アカゲザル、マーモセットでも報告されている。幹細胞はまた、しばしばその個体の生涯を通じて無制限に分裂（自己増殖）する能力を有している細胞である。適切な条件のもと、あるいは適切なシグナルが与えられることで幹細胞は多くの異なる細胞を生み出し(分化)、臓器を形成し得る。
【０００３】
近年、S.H. Leeらが行った研究において(Nature Biotechnology 18、675 - 679 (2000)、この文献の開示内容を引用により本出願に含める)、ＥＳ細胞から中枢神経系の前駆細胞集団を作り出し、これらの細胞を増殖させ、ＥＳ細胞からマイトージェンと特定のシグナル分子の存在下でドーパミン産生やセロトニン産生神経への分化誘導を行ったことが記載されている。神経細胞の分化・成熟は培地からマイトージェンを取り除くことで完成した。この実験系はインビトロ、および生体内におけるこれらの神経細胞の機能をコントロールする分子機構の解析の強力な道具となり、神経変性疾患や精神科的疾患の研究や治療にも応用できる可能性がある。
【０００４】
またH. Kawasakiらの研究において (Neuron 28、31-40(2000)、この文献の開示内容を引用により本出願に含める)、彼らはマウスのＥＳ細胞を神経へと分化誘導する間質細胞由来誘導活性因子（stromal cell-derived inducing activity（ＳＤＩＡ）)を同定した。ＳＤＩＡはＰＡ６間質細胞の表面に蓄積し、無血清条件下でＥＳ細胞とともに培養されるとレチノイン酸や胚様体がなくても効率よく神経の分化を誘導する。ＢＭＰ４はアフリカツメガエル（Xenopus）において神経分化を抑制するモルフォーゲンとして働くが、これはＳＤＩＡによる神経誘導を抑制し、表皮への分化を促進する。ドーパミンを産生するチロシンハイドロキシラーゼ陽性神経細胞は、このＳＤＩＡによって操作されたＥＳ細胞から多く得られる。ＳＤＩＡによって誘導されたドーパミン産生神経細胞は移植されるとマウスの線条体に集まり、チロシンハイドロキシラーゼの発現は維持される。ＳＤＩＡによる神経誘導は基礎神経科学の研究や臨床応用への有力な方法となる。
【０００５】
B.Soriaらの研究ではマウスの胚性幹細胞はＩ型糖尿病患者における細胞治療に利用可能な新規な細胞供給源として紹介された(Diabetes 49: 157-162 (2000)、この文献の開示内容を引用により本出願に含める)。細胞トラップシステム（cell-trapping system）を用いて彼らは未分化なＥＳ細胞からインスリン分泌細胞のクローンを取り出した。遺伝子導入によって、ヒト・インスリン遺伝子の調節領域の制御でネオマイシン選択システムが発現できるようにした。キメラ遺伝子には感染させた細胞を選択するためハイグロマイシン耐性遺伝子（ｐＧＫ−ｈｙｇｒｏ）も組み込まれていた。完成したクローン（ＩＢ／３ｘ−９９）は１６．５ｎｇ／μｇタンパク質のインスリンを発現し、インビトロでは種々の分泌促進物質によってホルモンの分泌はコントロールされた。このクローンから得られた細胞集団は、ストレプトゾトシンによる糖尿病モデル動物の脾臓に移植された。移植された動物は、１週間以内に高血糖が是正され４週間で体重が回復した。腹腔内糖負荷による耐糖能検査では、移植された群は正常群に比べて回復の遅延を示したが、食事負荷後の血糖値は同じように正常化した。これらの試みはＩ型、II型糖尿病治療における組織移植の新たな可能性を広げるとともに、遺伝子治療という選択肢も提示している。
【０００６】
S. Assadyらの研究では(Diabetes 50: 1691-1697 (2001)、この文献の開示内容を引用により本出願に含める)、多能性未分化ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）を系特異的分化のモデルとして用いた。ｈＥＳ細胞を付着条件と浮遊条件で培養しインスリンを分泌する膵β細胞の性質を持つ細胞の新生を含めた、インビトロにおける自然な分化を観察した。インスリン免疫組織染色では細胞の多くが陽性であった。インスリンの培養液中への分泌は、分化が進むに従って増加し、他の膵β細胞のマーカーの発現と関連があった。これらの発見はｈＥＳ細胞のモデルが糖尿病における移植治療の有力な供給源として、ヒト膵β細胞やその前駆細胞を豊富に与え得ることを証明している。
【０００７】
Su-Chun Zhangらの研究では(Nature Biotech. 19、1129-1133 (2001)、この文献の開示内容を引用により本出願に含める）ヒトＥＳ細胞から神経前駆細胞のインビトロ分化、濃縮、および移植について開示している。胚様体への凝集の際、分化中のＥＳ細胞は、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ−２）の存在下で多数の神経管様構造を形成した。かかる構造にある神経前駆細胞を選択的酵素消化によって単離し、さらに接着性の相違に基づいて精製した。ＦＧＦ−２を除いた後、神経細胞、星状細胞および乏突起膠細胞へと分化した。新生児期マウス脳へ移植した後、ヒトＥＳ細胞由来の神経前駆細胞は様々な脳領域へと取り込まれ、神経細胞および星状細胞に分化した。移植されたマウスにおいて奇形腫の形成は観察されなかった。これらの結果は、ヒトＥＳ細胞は神経系修復能を有する移植可能な神経前駆細胞の供給源であることを示す。
【０００８】
Nadya Lumelskyらは、マウス胚細胞から膵島に類似する組織像を示すインスリン分泌細胞群を分化させる一連の研究を発表した(Science 292、1389-1394 (2001)、その開示内容を引用により本出願に含める)。彼らはマウスのＥＳ細胞からインスリンや他の膵内分泌ホルモンを発現する細胞群を作成した。その細胞群は集まって３次元構造を構築し、神経細胞と密接な関係を持つ正常な膵島と類似する形態となる。生体での反応と同じ機序でこれらの細胞群はグルコースに反応し、インスリンを分泌する。糖尿病マウスに注入されると、このインスリン分泌細胞は血管誘導を受け、組織構造を維持し膵島様の器官となる。
【０００９】
しかしながら、Lumelskyにより得られたインスリン分泌細胞は膵臓細胞のマーカーであるアミラーゼおよびカルボキシペプチダーゼを発現するものではなかった。また、得られたインスリン分泌細胞を糖尿病モデル動物に移植しても、高血糖症状の改善は認められなかった。
【００１０】
Ｉ型糖尿病患者は日本、アメリカ合衆国においてそれぞれ７００万あるいは１６００万人いる。現在のところ糖尿病の治療法として、日常的なインスリンの投与や同種膵臓移植などが行われている。膵臓移植は近年、成功率が顕著に上昇しているが、臓器移植には非常に侵襲性の手術と一生涯にわたる免疫抑制療法が必要であり、これによる患者の拘束は甚だしい。また、ドナー数が圧倒的に不足しており一般的な治療法として採用することは難しい。それゆえ、膵臓移植に代わる、簡便かつ普遍的な糖尿病治療法の開発が強く望まれている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の１つの目的は、多能性胚性幹細胞から機能性細胞、特に膵島様細胞群および神経様細胞への新規な分化誘導方法を提供することである。
【００１２】
本発明の別の目的は、膵島機能に障害を有する患者の治療方法を提供することである。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、神経細胞変性または脊髄障害を患う患者の治療方法を提供することである。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、哺乳類のＥＳ細胞由来であって膵島様または神経様の機能を示す機能性細胞を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
したがって、本発明は以下の段階を含む哺乳類の胚性幹細胞から機能性細胞への分化誘導方法を提供する：
１）哺乳類の胚性幹細胞をフィーダー細胞とともに、白血病抑制因子を含有する培地を用いて培養する；
２）得られた細胞をフィーダー細胞の非存在下、白血病抑制因子および塩基性線維芽細胞成長因子（以下ｂＦＧＦと称する）を含有する培地を用いて浮遊条件で培養し、胚様体を得る；
３）得られた胚様体を選択・増殖培地で培養する；そして、
４）得られた細胞集団を分化培地を用いて培養して機能性細胞を得る。
【００１６】
本発明によると、膵島様細胞群や神経様細胞などの機能性細胞を哺乳類のＥＳ細胞から分化させることができる。
【００１７】
本発明により誘導される膵島様細胞塊は、インスリン産生能を有し、グルコースによる刺激に応答してインスリンを分泌し、かかる細胞群を構成する細胞は膵細胞に関連のある内分泌および外分泌マーカー（例えば、インスリン、グルカゴン、Glut-2、島アミロイドポリペプチド、アミラーゼおよびカルボキシペプチダーゼ）を発現する。
【００１８】
本発明により誘導される神経様細胞は、神経繊維状の形態を示し、かかる細胞群を構成する細胞は神経細胞に関連付けられるマーカー（例えば、ネスチン、β−チューブリンIII、セロトニン、チロシンハイドロキシラーゼNurt 1）を発現する。
【００１９】
本発明の方法によりマウスＥＳ細胞から誘導したインスリン分泌性島様細胞群をストレプトゾトシン誘導性糖尿病マウスに移植したところ、正常に近いレベルまで血糖値を下げることができた。このことから、本発明より得られるインスリン分泌性膵島様細胞群が糖尿病の治療に有用であることが示される。
【００２０】
本発明はさらに、本発明による同種ＥＳ細胞から誘導された島様細胞群を患者に移植することを含む膵島機能に障害のある哺乳類患者の治療方法を提供する。
【００２１】
本発明はまた、本発明による同種ＥＳ細胞から誘導された神経様細胞を患者に移植することを含む神経変性疾患または脊髄傷害を患う患者の治療方法を提供する。
【００２２】
さらに本発明は、本発明の方法によって哺乳類のＥＳ細胞から誘導される膵島様細胞群や神経様細胞などの機能性細胞を提供する。機能性細胞は細胞移植による治療に有用であるだけでなく、膵島細胞や神経機能に影響を与えるかあるいは機能を修復する様々な新規薬剤のインビトロでのスクリーニングや新規薬剤の安全性試験に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本出願の明細書、特許請求の範囲および図面において、「胚性幹細胞」または「ＥＳ細胞」の語は、授精未分化胚芽細胞のインビトロ内部細胞塊由来の多能性細胞を意味する。
【００２４】
「胚様体」または「ＥＢ」は、ＥＳ細胞のインビトロでの凝集により形成される三胚葉から構成される細胞集団を意味する。
【００２５】
本明細書において用いるフィーダー細胞層は周知方法によって作成されるものであり、マウス胎生線維芽細胞から得られる。フィーダー細胞は市販のものを使用できる。
【００２６】
本発明において用いる哺乳類のＥＳ細胞は特に限定されず、例えば、げっ歯類のものでもよく（マウスＥＳ細胞およびラットＥＳ細胞）、霊長類のものでもよい（カニクイザルＥＳ細胞およびヒトＥＳ細胞）。今日、様々なＥＳ細胞を入手することができ、例えば、マウスやヒトのＥＣ細胞から得られる。あるいは本発明において用いるＥＳ細胞は公知文献で報告されている方法により哺乳類受精卵から得てもよい。例えば、ヒト胚性幹細胞の安定な培養物を得る技術は、Thomsonら(米国特許第５８４３７８０号および６２００８０６号； Science vol. 282 1145-1147 (1998)、かかる文献の開示内容は引用により本出願に含まれる)によって記載されている。
【００２７】
本発明の方法の第１段階は、従来から知られているＥＳ細胞の増殖段階である。これは例えば、N. Lumelsky et al.、Science 292、1389-1394 (2001)（この文献の開示内容を引用により本出願に含める）に記載されている。
【００２８】
典型的にはマウス胎性フィーダー細胞をゼラチンでコーティングした培養容器の底に層状に培養した上へ、白血病抑制因子（以下「ＬＩＦ」と称する）を含有するＥＳ細胞増殖培地を用いてＥＳ細胞を培養する。かかる条件で培養することによって、ＥＳ細胞は未分化のまま無限に増殖させることができる。
【００２９】
本発明の方法において、フィーダー細胞は、市販のものを適宜用いればよく、また常套の方法でマウス胎性線維芽細胞から誘導したものを用いてもよい。
【００３０】
第１段階に用いられるＥＳ細胞増殖培地は、ＬＩＦを１００−１００００Ｕ／ｍｌ含んでいるものが用いられる。この段階で用いる培地としては、ＬＩＦを含有し、ＥＳ細胞の増殖に有用であるいかなる培地を用いてもよい。特に好適な培地は例えば、高グルコースダルベッコ改変イーグル培地 (Life Technology (以下、Life Tech,と略称する)、Grand、NY)に２０％ウシ胎児血清リプレースメント（replacement） (Life Tech.)、２％非必須アミノ酸 (Life Tech.)、０．１ｍｍｏｌ／ｌの２−メルカプトエタノール (Life Tech.)、１０００Ｕ／ｍｌの白血病抑制因子(LIF; Life Tech.)および２ｍｍｏｌ／ｌのＬ−グルタミン (Life Tech.)を添加したものが例示される。
【００３１】
第１段階では、所望の量のＥＳ細胞が得られるまで培養する。典型的には３〜７日培養すればよい。得られたＥＳ細胞を次の段階に供する。
【００３２】
本発明の誘導方法の全段階を通して、細胞または細胞集団の培養は通常の細胞培養条件、例えば３７℃、９５％空気中５％ＣＯ２加湿雰囲気下で行えばよい。
【００３３】
第２段階では、ＬＩＦおよびｂＦＧＦを添加した培地にてＥＳ細胞を浮遊培養により増殖させる。従来はＬＩＦの存在によってＥＳ細胞の未分化性が保たれており、ＬＩＦを除去しなくてはＥＳ細胞からの分化誘導は不可能であると考えられていた。したがって、本発明者らの知る限りでは、ＥＢの誘導条件としては従来から提唱されているものがいくつかあるが、これらはすべて増殖させたＥＳ細胞をＬＩＦを含有しない培地で浮遊培養してそれを凝集させるものである（例えば、Su-Chen Zhang et al.、Nature biotechnology、19、1129-1133 (2001)、この文献の開示内容を引用により本出願に含める)。
【００３４】
これに対して本発明者らはＬＩＦおよびｂＦＧＦを添加した培地を用いることによって、ＥＳ細胞から、非常に効率良くＥＢを形成させることに成功した。
【００３５】
本発明の第２段階において用いる培地には、ＬＩＦとｂＦＧＦを含有させる。培地中のＬＩＦは好ましくは約１００―１００００Ｕ／ｍｌとする。培地中のｂＦＧＦは好ましくは約２〜１００ｎｇ／ｍｌとする。第２段階において用いられる培地にはさらに、１または複数の成長因子、例えばアクチビン、神経増殖因子など、サイトカイン類、例えばインターロイキン１、インターロイキン２など、ビタミン類、例えばレチノールやニコチンアミド類、追加的アミノ酸、例えばチロシン、リジン、および細胞外マトリックス成分、例えばフィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、ヘパリンなどを常套の細胞培養用培地へ適宜添加したものを用いればよい。第２段階において用いられる特に好ましい培地としては、高グルコースダルベッコ改変イーグル培地(Life Tech.)に２０％ウシ胎児血清リプレースメント(Life Tech.)、２％非必須アミノ酸(Life Tech.)、０．１ｍｍｏｌ／ｌの２−メルカプトエタノール(Life Tech.)、１０００Ｕ／ｍｌの白血病抑制因子 (LIF; Life Tech.)、２ｍｍｏｌ／ｌのＬ−グルタミン(Life Tech.)および４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ (R&D systems、Minneapolis)を添加したものが例示される。
【００３６】
第２段階では、ＥＳ細胞をフィーダー細胞層を用いずに浮遊培養して、細胞を凝集させて胚様体を得る。ＥＢの形成は顕微鏡下で判断すればよい。本発明によると、ＥＢ形成は浮遊培養から２日程度で観察される。浮遊培養を５〜１０日続けて十分な量のＥＢを得る。本発明によると、ＬＩＦもｂＦＧＦ培地も含有しない培地による従来の浮遊培養による場合と比較して、格段に多いＥＢが誘導される。
【００３７】
第２段階で得られたＥＢを次いで、選択・増殖段階（第３段階）に供する。第３段階において、得られたＥＢをタンパク質（例えばコラーゲンタイプＩＶ）でコーティングした培養容器へ移し、適当な選択・増殖培地を用いて培養する。ＥＢはタンパク質でコーティングした培養容器で第２段階に用いた培地により約２日間培養し、その後培地を選択・増殖培地と交換するのが好ましい。
【００３８】
第３段階に用いる選択・増殖培地は好ましくは無血清細胞培養用培地にニコチンアミド、インスリンおよびフィブロネクチンを添加したものである。この段階で用いる培地はさらに１または複数の成長因子、例えばアクチビン、神経増殖因子など、サイトカイン、例えばインターロイキン−１やインターロイキン−２、ビタミン類、例えば、レチノール、追加的アミノ酸、例えばチロシンやリジン、そして細胞外マトリックス成分、例えば、ラミニン、コラーゲンおよびヘパリンなどを常套の細胞培養用培地へ適宜添加したものを用いればよい。好ましい培地の例は無血清ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地にニコチンアミド、フィブロネクチン、およびＮ−２サプリメント(GIBCO、17502-014:水中、インスリン５００μｇ／ｍｌ、ヒトトランスフェリン１００００μｇ／ｍｌ、プロゲステロン０．６３μｇ／ｍｌ、プトレシン１６１１μｇ／ｍｌおよび亜セレン酸０．５２μｇ／ｍｌからなる)を添加したものが挙げられる。
【００３９】
第３段階において、ＥＢを選択・増殖培地で３〜１４日間、好ましくは４〜７日間培養する。
【００４０】
第３段階で得られた細胞集団を容器から剥離し、その底面がタンパク質またはアミノ酸でコーティングされた培養容器に移す。移した細胞集団をさらに分化培地で培養する。
【００４１】
第４段階において、細胞集団を膵島様細胞群または神経様細胞へと分化させることができる。
【００４２】
膵島様細胞群へ分化誘導する場合には、細胞集団を無血清細胞培養用培地にニコチンアミド、インスリンおよびラミニンを追加した培地で培養するとよい。さらに１または複数の成長因子、例えばアクチビンおよび神経増殖因子、サイトカイン、例えばインターロイキン−１やインターロイキン−２、ビタミン類、例えばレチノール、追加的アミノ酸、例えばチロシンやリジン、および細胞外マトリックス成分、例えばフィブロネクチン、コラーゲンおよびヘパリンなどを常套の細胞培養用培地へ適宜添加したものを用いてもよい。特に好ましくは、無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地にニコチンアミド、ラミニンおよびＮ−２サプリメントを追加した培地を用いる。
【００４３】
本発明の方法において、神経様細胞へと分化させるには、細胞集団をリジン及びラミニンを添加した無血清細胞培養用培地で培養するとよい。培地には上記のほかに、１または複数の成長因子、例えばアクチビンおよび神経増殖因子、サイトカイン、例えばインターロイキン−１およびインターロイキン−２、ビタミン類、例えばレチノールおよびニコチンアミド、追加的アミノ酸、例えばチロシンやリジン、および細胞外マトリックス成分、例えばフィブロネクチン、コラーゲンおよびヘパリンなどを常套の細胞培養用培地へ適宜添加したものを用いればよい。特に好ましい例は、リジン、ラミニンおよびＮ−２サプリメントを追加した無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地である。
【００４４】
第４段階において、細胞集団は３〜９０日間、あるいはそれ以上培養する。４〜１２日間の培養で十分に、所望の機能性細胞へと分化するが、さらなる培養により分化した集団を増殖させるとよい。
【００４５】
本発明の方法によって得られる膵島様細胞群は、インスリン産生能を示し、グルコースによる刺激に応答してインスリンを分泌するのみならず、集団を構成する細胞は、膵内分泌細胞（インスリン、グルカゴン、Ｇｌｕｔ−２および島アミロイドポリペプチド）および膵外分泌細胞（アミラーゼおよびカルボキシペプチダーゼ）に特異的な遺伝子を発現する。
【００４６】
本発明により得られる神経様細胞は、神経繊維状の形状を示し、ネスチン、β−チューブリンＩＩＩ、セロトニン、チロシンハイドロキシラーゼなどの神経細胞に関連するマーカーを発現する。それゆえ、該神経様細胞は成熟神経細胞になる能力を有する。
【００４７】
マウスＥＳ細胞とヒトＥＳ細胞はインビトロで増殖し、一年以上も未分化状態にて多能性を維持することができることから、本発明の方法は細胞移植治療に使用される十分な量のドナー細胞の供給源として利用可能である。
【００４８】
本発明はさらに、本発明による同種ＥＳ細胞から誘導された島様細胞集団を患者に移植することを含む、膵島機能に障害のある哺乳類患者の治療方法を提供する。本発明において、「膵島機能に障害のある哺乳類患者」には、これらに限定されないが、Ｉ型糖尿病患者、膵臓摘出患者およびインスリン要求性糖尿病患者、例えばＩＩ型糖尿病患者または嚢胞性線維症患者が含まれる。哺乳類患者はヒト患者であってもよい。
【００４９】
この態様において、上記のように得られた膵島様細胞群の移植は臨床的に実践または提案されている島移植プロトコール(例えば、Kazutomo Inoue and Masaaki Miyamoto、J. Hepatobiliary Pancreat. Surg. 7: 163-177 (2000)、および Wenjing Wang et al.、Transplantation 73: 122-129 (2002); かかる文献の開示内容は引用により本出願に含める)に従って行えばよい。例えば、膵島様細胞群は肝臓に門脈内移植してもよい。あるいは膵島様細胞群は、未血管形成（prevascularized）皮下部位に移植してもよい。該細胞群は移植前に生体適合性材料によってマクロカプセル封入してもよい。移植すべき細胞群の量は得られた細胞群のタイターおよび治療すべき患者の全身症状、年齢、性別、体重などに基づき当業者に決定されよう。
【００５０】
さらに、本発明は同種ＥＳ細胞由来の神経様細胞を患者に移植することを含む神経機能に障害のある哺乳類患者の治療方法も提供する。本発明において、「神経機能に障害のある哺乳類患者」には、これらに限定されないが、神経変性疾患、例えばアルツハイマー病、クロイツフェルトヤコブ病あるいは脊髄傷害を患う患者が含まれる。哺乳類患者はヒト患者であってもよい。
【００５１】
本発明を以下の実施例によりさらに説明する。かかる実施例は例示の目的であり本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００５２】
マウスＥＳ細胞からの膵島様細胞群の分化
第１段階
未分化ＥＳ細胞の増殖
本実施例において、マウスＥＳ細胞系１２９ｓｖ（１１継代（大日本製薬（株）日本国大阪市）を用いた。なお、同様の実験をＣ５７／ＢＬ６マウスＥＳ細胞クローン系（１１継代；日本国京都大学再生医化学研究所、ナカツジノリオ教授から譲り受けた）でも実施したが、同様の結果が得られた（データは示さず）。
【００５３】
哺乳類のＥＳ細胞は白血病抑制因子の存在下でフィーダー層とともに培養すると未分化状態で増殖できる。２０μｇ／ｍｌのマイトマイシンで増殖を不活性化させたマウス胎生フィーダー細胞（大日本製薬（株）日本国大阪市）)を用いた。ＥＳ細胞培養用培地としては、高グルコースダルベッコ改変イーグル培地 (D-MEM Cat# 12100: Life Technology、Grand、NY) に２０％ウシ胎児血清リプレースメント(Life Tech.)、２％非必須アミノ酸(Life Tech.)、０．１ｍｍｏｌ／ｌの２−メルカプトエタノール(Life Tech.)、１０００Ｕ／ｍｌの白血病抑制因子（LIF：Life Tech.）および２ｍｍｏｌ／ｌのＬ−グルタミン（LIF：Life Tech.）を添加したものを用いた。
【００５４】
マイトマイシン処理したマウス胎性線維芽細胞のフィーダー層をゼラチンコーティングした培養ディッシュ（６ｃｍ）上に調製し、５ｍｌの培地を添加し、１０６のＥＳ細胞を層上に接種した。細胞は３７℃で９５％空気中５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気下で培養した。３日ごとに細胞を０．０４％ＥＤＴＡ中の０．０５％トリプシン溶液（Life Tech.）によってディッシュから剥離し、新たに調製したフィーダー層上の新たに調製した培地に継代した。ＥＳ細胞の培養は３〜７日間行った。
【００５５】
第２段階
胚様体（ＥＢ）の形成
トリプシン−ＥＤＴＡ溶液によって剥離されたＥＳ細胞を非粘着性培養ディッシュに細胞密度が６ｘ１０５細胞／ｃｍ２となるように接種した。細胞を第１段階と同じ培地にｂＦＧＦ（４ｎｇ／ｍｌ; R&D Systems、Minneapolis、U.S.A. and Kaken Pharmaceuticals、Co. Ltd.、Tokyo Japan)を添加あるいは添加しない条件で浮遊培養した。細胞は３７℃で９５％空気中５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気下で培養した。２日毎に新たに調製した培地と交換した。
【００５６】
培養物は、顕微鏡下で毎日確認した。２日目にｂＦＧＦ存在下で培養した細胞は凝集し始めてＥＢを形成した。浮遊培養を５日間続けた。５日目に、従来のＬＩＦとｂＦＧＦを含まない培地を用いてのＥＢの誘導と比して、顕著に増大したＥＢの形成が認められた（データ示さず）。ｂＦＧＦを添加していない培地を用いた場合には、凝集はほとんど観察されなかった。
【００５７】
第３段階
ＥＢの選択・増殖
第２段階でｂＦＧＦ含有培地で得られたＥＢを、第２段階で用いた培地を入れたコラーゲンタイプＩＶ(Sigma、St. Louis、MO)でコーティングされている６ｃｍディッシュに移した。４８時間の培養後、培地を選択・増殖培地である無血清ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（１：１）培地(cat# 11320、Life Tech.)に５００μｇ／ｍｌのウシインスリン、１μｇ／ｍｌのプロゲステロン、１６００μｇ／ｍｌのプトレシンおよび５μｇ／ｍｌのフィブロネクチンそして１０ｍＭのニコチンアミドを添加した培地と交換した。細胞集団をさらに７日間培養した。培養中、培地は３日毎に新たに調製されたものと交換した。
【００５８】
第４段階
細胞の分化
選択・増殖培地で７日間培養した後、さらに細胞集団を無血清ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（１：１）培地（cat# 11320、Life Tech.）に５００μｇ／ｍｌのウシインスリン、１μｇ／ｍｌのプロゲステロン、１６００μｇ／ｍｌのプトレシン、１μｇ／ｍｌのラミニンおよび１０ｍＭのニコチンアミドを添加した培地で培養することによって分化させた。細胞を９５％空気中５％ＣＯ２の加湿雰囲気下で３７℃で１２日間インキュベートして直径約１００−４００μｍの島様細胞群を得た。
【００５９】
ＲＮＡ抽出およびＲＴ−ＰＣＲ分析
各段階の後に、細胞の膵臓に関連する遺伝子発現をＲＴ−ＰＣＲ分析によって調べた。
【００６０】
各段階で得られた細胞より、細胞ＲＮＡをISOGEN(Nippon Gene; Osaka、Japan)を用い、説明書にしたがって単離した。細胞を０．８ｍｌのISOGEN中、Potterホモジナイザーをを用いて４℃でホモジナイズした。ホモジネートを１ｍｌのクロロホルムと混合し、水相中のＲＮＡを等量のイソプロパノールによって沈殿させた。ｃＤＮＡの合成は、オリゴｄＴプライマー（Takara Shuzo Co. Ltd.、Kyoto、Japan）およびモロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）スーパースクリプトII（Superscript II）逆転写酵素 (Gibco/BRL)を用いて、説明書に従って行った。
【００６１】
このようにして得られたｃＤＮＡに基づいて、転写因子のｍＲＮＡの発現レベルをＰＣＲ法によって測定した。ＰＣＲはＴａｑポリメラーゼ（Boehringer-Mannheim、Indianapolis、IN）を用いて標準的プロトコールに従って行った。サイクルパラメーターは以下の通りである：変性９４℃、１分、アニーリング５２〜６１℃、３０〜１２０秒（アニーリング条件はプライマーごとに設定）、伸展反応７２℃、１分、サイクル数はｍＲＮＡ量に応じて２５〜４０回とした。サイクル数およびｃＤＮＡの量はＰＣＲ条件が反応曲線の直線部となるように設定し、ＰＣＲの「飽和効果」を避けた。得られたＰＣＲ産物はシークエンシングにより確認した。
【００６２】
プライマー配列(フォワードおよびリバース)および増幅産物の長さは以下の通りであった:
β-アクチン: 
ATGGATGACGATATCGCTG
ATGAGGTAGTCTGTCAGGT  
569 bp
【００６３】
ネスチン: 
GGAGTGTCGCTTAGAGGTGC
TCCAGAAAGCCAAGAGAAGC
327 bp
【００６４】
インスリン-I:
TAGTGACCAGCTATAATCAGAG
ACGCCAAGGTCTGAAGGTCC
288 bp
【００６５】
インスリン-II:
CCCTGCTGGCCCTGCTCTT
AGGTCTGAAGGTCACCTGCT
212 bp
【００６６】
グルカゴン:
TCATGACGTTTGGCAAGTT
CAGAGGAGAACCCCAGATCA
202 bp
【００６７】
島アミロイドポリペプチド (IAPP):
GATTCCCTATTTGGATCCCC
CTCTCTGTGGCACTGAACCA
221 bp
【００６８】
グルコーストランスポーター2 (Glut2):
CCACCCAGTTTACAAGCTC
TGTAGGCAGTACGGGTCCTC
325 bp
【００６９】
PDX-1:
TGTAGGCAGTACGGGTCCTC
CCACCCCAGTTTACAAGCTC
325 bp
【００７０】
アミラーゼ-2A
CATTGTTGCACCTTGTCACC
TTCTGCTGCTTTCCCTCATT
300 bp
【００７１】
カルボキシペプチダーゼA: 
GCAAATGTGTGTTTGATGCC
ATGACCAAACTCTTGGACCG
521 bp
【００７２】
GATA-4:
CGCCGCCTGTCCGCTTCC
TTGGGCTTCCGTTTTCTGGTTTGA
193 bp
【００７３】
HNF3:
ACCTGAGTCCGAGTCTGACC
GGCACCTTGAGAAAGCAGTC
345 bp
【００７４】
OCT-4:
GGCGTTCTCTTTGGAAAGGTGTTC 
CTCGAACCACATCCTTCTCT 
293bp
【００７５】
結果を以下の表１に示す;
表１：第２段階でｂＦＧＦの存在下で培養した細胞の遺伝子発現
【表１】
2005514944.tif 000003
【００７６】
膵細胞に関連する転写因子ＰＤＸ−１遺伝子（膵臓の発生に必要とされる転写因子）は第１段階および第４段階で発現していた。Ｏｃｔ−４（ＥＳ細胞の分化に関連する転写因子）は第１段階の細胞で発現しているが、ＥＳ細胞の分化過程で発現が低下する。最終（definitive）（胚性）および内臓（visceral）（胚外性）内胚葉のマーカーであるＧＡＴＡ−４や最終内胚葉のマーカーで膵β細胞の運命をたどる細胞に関連のあるＨＮＦ−３βは全ての段階でのＥＳ細胞で発現された。未分化なホルモン陰性の膵細胞集団に関連する転写因子であるネスチンは第２段階で強く発現しその後、ＥＳ細胞の分化に伴い減少した。この結果より、ネスチン陽性の膵内分泌前駆細胞が、ｂＦＧＦの存在下で得られたＥＢに多く存在することが分かる。興味深いことに、ｂＦＧＦ処理により誘導されたＥＢは内分泌細胞関連転写因子（インスリンＩ、インスリンＩＩ、グルカゴン、グルコーストランスポーター−２（Ｇｌｕｔ−２）、および島アミロイドポリペプチド）特異的遺伝子を発現していたが、第２段階においてｂＦＧＦを含有しない培地を用いて得られた細胞集団では膵島細胞に関連する遺伝子は発現していなかった。第３、４段階では、細胞は外分泌特異的遺伝子（アミラーゼおよびカルボキシペプチダーゼ）を発現していた。これらの結果は、本発明の膵島様細胞群は内分泌細胞（グルカゴン産生性α細胞、インスリン産生性β細胞、膵ポリペプチド産生性γ細胞およびソマトスチン産生性ο細胞）および外分泌細胞から構成される膵組織構造に成熟し得ることが示された。
【００７７】
インスリン分泌試験
第４段階で得た細胞集団（２０〜２５集団）をＰＢＳ（−）で３回洗浄し、１２０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、２．５ｍＭのＣａＣｌ２、１．１ｍＭのＭｇＣｌ２、２５ｍＭのＮａＨＣＯ３および０．１％ウシ血清アルブミン含有Krebs-Ringer重炭酸緩衝液を満たした６ｃｍの細胞培養ディッシュに接種し、３７℃でインキュベートした。３．３ｍｍｏｌ／ｌ（Ｌ）または２５ｍｍｏｌ／ｌ（Ｈ）のグルコースを添加し、インキュベートした。グルコースによる刺激の５日および３０日後に、緩衝液中のインスリン含量をインスリン酵素結合免疫吸着検定(ELISA)キット(ALPCO、Windham、NH)を用いて測定した。結果を図２に示す。図２において、低グルコースまたは高グルコースによる刺激の５分および３０分後に応答した１細胞集団あたりに分泌されたインスリン量を示す。細胞集団は用量依存的にグルコースによる刺激に応答してインスリン分泌を示した。
【００７８】
総細胞インスリン含量の測定のため、第４段階で得た細胞集団を酸エタノール(無水エタノール中１０％氷酢酸）で一晩４℃で抽出し、 次いで細胞を超音波処理にかけ、上清中のインスリン含量をELISAキットによって測定した。総細胞タンパク量をＤＣタンパク質アッセイシステム(Bio-Rad laboratories、Hercules、CA)を用いて測定した。細胞集団の総細胞インスリン含量は、７１．３ｎｇ／ｍｇタンパク質であった。
【００７９】
織学的・免疫組織化学学的分析
第４段階において得た細胞集団のパラフィン切片を以下のように作成した。細胞集団（第４段階において１２日間インキュベートしたもの）を氷冷ＰＢＳで３回洗浄し、メタノール／アセトン（１：１）にて一晩固定した。細胞集団をアルコール（７０−１００％）で脱水し、パラフィンブロックに包埋し、ブロックをスライスして４μｍおよび８μｍの厚さの切片を得た。
【００８０】
このようにして得た４μｍの厚さの切片をヘマトキシリン／エオシン染色によって組織学的に評価した。
【００８１】
免疫組織化学的評価のために、８μｍの厚さの切片を標準的プロトコールで抗体によって染色した。本発明において用いる一次抗体は以下の通りである:
ネスチンウサギポリクローナル１：５００(Dako、Carpinteria、CA)、
チューブリンタイプＩＩＩ（ＴｕＪ１）マウスモノクローナル１：５００（Babco、Richmond、CA）、
チューブリンタイプＩＩＩ（ＴｕＪ１）ウサギポリクローナル１：２０００（Babco、Richmond、CA）、
インスリンマウスモノクローナル１：１０００（Sigma、St. Louis、MO）、
インスリンモルモットポリクローナル１：１００（DAKO、Carpinteria、CA）、
グルカゴンウサギポリクローナル（DAKO、Carpinteria、CA）。
【００８２】
一次抗体を検出するため、蛍光色素でラベルされた二次抗体(Jackson Immunoresearch Laboratories、West Grove、PA) を推奨される方法に基づいて使用した。
【００８３】
得られたインスリン分泌細胞集団はインスリンおよびグルカゴンに対して強い陽性を示し、ネスチンおよびＴｕＪ１に陽性であった。
【実施例２】
【００８４】
ＳＴＺ由来糖尿病マウスへのインスリン分泌細胞集団の移植
インスリン分泌性膵島様細胞群を移植し、細胞集団が生体内で機能する膵島へと分化し得るか否かを調べた。
【００８５】
全ての動物実験は京都大学の動物実験ガイドラインに沿って行われた。糖尿病モデル動物はH. Iwata et al.、Pancreas vol. 23(4) 375-381(2001)（この文献の開示内容を引用により本出願に含める）に開示の方法によって作成した。凍結保存しているストレプトゾトシン（ＳＴＺ）粉末 (Sigma、St. Louis、MO)を使用前に０．１Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ４．５に溶解した。ＳＴＺ溶液を腹腔内に８週から１０週齢の雄性ヌードマウス(Shimizu、Kyoto、Japan)に注入した（２２７ｍｇ／ｋｇ体重）。安定な高血糖、即ち血糖値約３５０−６００ｍｇ／ｄｌの上昇がＳＴＺ単回注入の後７から１０日の間に発生した。
【００８６】
マウスの血糖値はGlucometer Elite XL 血中グルコースメーター（Fujii Corp.、Tokyo、Japan）を用いて測定した。ＳＴＺ注入後７日目から１０日目に非絶食下の血中グルコースが３５０ｍｇ／ｄｌ以上を示すようになったマウスを糖尿病マウスとして、ＳＴＺ注入の４日目より以下の実験に用いた。
【００８７】
ＳＴＺ注入の１４日後、糖尿病マウスに実施例１で得られた３０００個のインスリン分泌性膵島様細胞群を移植するかあるいは偽手術を行った。ネンブタール麻酔状態下で、ＰＢＳ（−）に懸濁した細胞集団を糖尿病マウスの腎臓被膜下領域（一方の腎臓）に２３−ゲージ翼付針で注入した。偽手術群には、等量のＰＢＳ（−）を上記と同様にして注入した。細胞集団を与えられた被験群、非処理対照群および偽手術群はそれぞれ６匹、３匹および３匹のマウスからなった。移植後、非絶食下の血中グルコースおよび体重を毎日モニターした。結果を図３及び図４に示す。
【００８８】
移植の１日後、被験群の血中グルコースは有意に低下しており、実験期間にわたって血糖値は偽手術群より有意に低かった。移植群の体重はわずかに増加し、安定していた。
【００８９】
細胞集団を移植した動物を移植後１４および２１日目にそれぞれ２および４匹サクリファイスした。すべての被験マウスはサクリファイスまで健康であり、偽手術群よりも有意に低い血中グルコース値を維持していた。一方、非処理対照および偽手術群の血糖値は徐々に上昇して消耗状態を来たした。対照群と偽手術群のすべてのマウスは糖尿病の合併症により手術の１４から３０日の間に早期に死亡した。
【００９０】
サクリファイスした動物より移植片を取り出し、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンブロックに包埋した。得られた組織切片（厚さ４−８μｍ）を実施例１と同様にして免疫組織化学的に調べた。
【００９１】
移植領域においてンスリンとグルカゴンに対して免疫組織化学的に陽性な単一の塊の内分泌細胞が観察された。移植部位に奇形腫は認められなかった。
【実施例３】
【００９２】
神経様細胞の誘導
実施例１の第１〜３段階と同様にして実施例１に用いたものと同じマウスＥＳ細胞を処理した。得られた細胞集団をポリ−Ｌ−リジンでコーティングした、無血清ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（１：１）培地（cat# 11320、Life Tech.）に５００μｇ／ｍｌのウシインスリン、１μｇ／ｍｌのプロゲステロン、１６００μｇ／ｍｌのプトレシン、１０ｍＭのリジンおよび１μｇ／ｍｌのラミニンを追加した培地を満たしたディッシュで培養した。細胞を１２日間培養し、得られた細胞を実施例１と同様に遺伝学的および免疫組織化学的に分析した。本実施例において、チロシンハイドロキシラーゼ（ＴＨ）ポリクローナル１：２００（Pel-Freeze、Rogers、AR）、チロシンハイドロキシラーゼ（ＴＨ）モノクローナル１：１０００（Sigma、St. Louis、MO）、セロトニンポリクローナル１：４０００（Sigma、St.Louis, MO)、ＭＡＰ２ポリクローナル（Chemicon International, Temecula, CA) およびＧＦＡＰモノクローナル（Clon Tech、Palo Alto、CA）を実施例１に用いた抗体に加えて用いた。
【００９３】
得られた細胞は神経繊維様の外観を示し、免疫組織化学的には、ネスチン、ＴｕＪ１（β−チューブリンＩＩＩ）、セロトニン、ＧＦＡＰ、ＭＡＰ２およびチロシン−ハイドロキシラーゼに対して陽性であった。
【００９４】
実施例１に記載のＲＴ−ＰＣＲによって、この神経様細胞がＮｕｒｔ−１転写因子を発現していることが確認された。Ｎｕｒｔ−１の検出用のプライマー配列は以下の通りである：
TGAAGAGAGC GGAGAAGGAG ATC
TCTGGAGTTA AGAAATCGGA GCTG
255 bp.
【００９５】
したがって得られた神経様細胞は生体内に移植された場合に成熟神経細胞をとなることができるものであった。
【実施例４】
【００９６】
ヒトＥＳ細胞
実施例１と同様にして、インスリン分泌性膵島様細胞群をヒトＥＳ細胞から得た。ＥＳ細胞は従来技術文献（例えば米国特許第第５８４３７８０号および第６２００８０６号; Science 282、1145-1147 (1998)、これら文献の開示内容を本出願に含める）に記載のものでもよい。こうして得た細胞集団はインスリンを産生し、グルコースに用量依存的に応答してインスリンを分泌する。この細胞集団をヒトＩ型糖尿病患者に移植した。約３−５１０５の細胞集団を約５０−１００ｍｌのクレブス・リンゲル（Krebs-Ringer）溶液に懸濁し、懸濁液を門脈を介して肝臓に注入するかあるい人工膵臓として皮下部位に移植した。移植患者の膵臓機能は回復し、患者はインスリン非依存性を獲得した。
【実施例５】
【００９７】
マウス胚性幹細胞からのドーパミン産生（ＤＡ）神経細胞の誘導
実施例１と実質的に同様にして、マウスＥＳ細胞系１２９ｓｖ(Dainippon-pharm. Co. LTD.、Osaka、Japan)の分化を誘導した。 
【００９８】
第１段階
細胞をマイトマイシン処理したマウス胎性線維芽細胞のフィーダー層上でＤＭＥＭ（Invitrogen、Grand Island、NY、USA）培地に２０％ウシ胎児血清（FBS、JRH Bioscience、Lenexa、KS、USA）、１０００Ｕ／ｍｌの白血病抑制因子 （ＬＩＦ）、５０ｍＭの２−メルカプトエタノール、２ｍＭのＬ−グルタミン酸および１０Ｘ非必須アミノ酸（Invitrogen、Grand Island、NY、USA）を含有させた培地で増殖させた。ＥＳ細胞コロニーを剥離し、所望の量の細胞が得られるまで継代培養した。
【００９９】
第２段階
ＥＢ形成の誘導のため、トリプシン−ＥＤＴＡによって剥離した単一細胞を、非接着細菌培養用ディッシュで６ｘ１０５細胞／ｃｍ２未満の密度となるように接種し、ＥＢを上記の培地でｂＦＧＦ（４ｎｇ／ｍｌ； R&D Systems、Minneapolis、USA）の存在下で３日間浮遊培養した。
【０１００】
第３段階
ＥＢが形成した後、それをポリ（Ｌ−リジン）−コーティングしたディッシュ（Falcon Labware、Bedford、MA）に上記段階に用いたＥＢ培養用培地に接種した。２４時間の培養後、ＥＢ培養用培地を、無血清ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Invitrogen、Grand Island、NY、USA）培地に５００μｇ／ｍｌのウシインスリン、１μｇ／ｍｌのプロゲステロン、１６００μｇ／ｍｌのプトレシン、０、５または１０ｍＭのニコチンアミドおよび５μｇ／ｍｌのフィブロネクチン（Nakalai tesque、Kyoto）を含有させた培地と交換し、４日間培養した。
【０１０１】
第４段階
４日間の培養後、培地を無血清ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に５００μｇ／ｍｌのウシインスリン、１μｇ／ｍｌのプロゲステロン、１６００μｇ／ｍｌのプトレシン、０、５または１０ｍＭのニコチンアミド、５μｇ／ｍｌのフィブロネクチン(Nakalai tesque、Kyoto、Japan)および１μｇ／ｍｌのラミニン(Nakalai tesque、Kyoto、Japan)を含有させた培地に交換することによって細胞の分化を誘導した。細胞を培養して得た細胞を以下のようにして調べた。
【０１０２】
ＴｕＪ−陽性コロニー
上記のようにして得られたコロニーを免疫組織化学的分析にかけ、神経細胞マーカーＴｕＪの発現について調べた。結果を図５に示す。
【０１０３】
第２段階におけるｂＦＧＦの効果を調べるために、上記と同様に処理し、ただし、第２段階においてｂＦＧＦの存在下（４ｎｇ／ｍｌ）または不在下で、第３および第４段階で１０ｍＭのニコチンアミド存在下で培養したＥＳ細胞から得られたコロニーのＴｕＪ−発現について調べた。結果を図６に示す。図６において、ｂＦＧＦの存在下または不在下で培養したものを「処理」または「非処理」としてそれぞれ示す。
【０１０４】
これらの結果はＮＡとｂＦＧＦの両方がＴｕＪを発現するコロニー数を増加させることを示す。
【０１０５】
細胞における神経関連遺伝子の発現
実施例１に記載のＲＴ−ＰＣＲによって、未分化ＥＳ細胞（第１段階）および第４段階で得た細胞を遺伝的に調べた。被験細胞は第２段階でｂＦＧＦで処理し、第３および第４段階で１０ｍＭのＮＡの存在下で培養したものである。この実験で用いたプライマーは以下の通りであった：
【０１０６】
Nurt-1: チロシンハイドロキシラーゼ
TGAAGAGAGC GGAGAAGGAG ATC
TCTGGAGTTA AGAAATCGGA GCTG
【０１０７】
Wnt-1: 中脳ドーパミン産生性神経細胞転写因子シグナル伝達分子
5'-ACCTGTTGACGGATTCCAAG-3'
5'-TCATGAGGAAGCGTAGGTCC-3';
【０１０８】
エングレイルド-1 (En 1): 中脳ドーパミン産生性神経細胞転写因子
5'-TCAAGACTGACTCACAGCAACCCC-3'
5'-CTTTGTCCTGAACCGTGGTGGTAG-3'
【０１０９】
Ptc: SHH シグナル受容体、（patched）
5'-CCTCCTTTACGGTGGACAAA-3'
5'-ATCAACTCCTCCTGCCAATG-3'
【０１１０】
糖蛋白ソニック・ヘッジホッグ(Shh)
5'-GGAAGATCACAAGAAACTCCGAAC-3'
5'-GGATGCGAGCTTTGGATTCATAG-3'
【０１１１】
Otx 1: 脳形態形成に必須の転写因子
5'-GCTGTTCGCAAAGACTCGCTAC-3'
5'-CCATGACCTATACTCAGGCTTCAGG-3'; 
【０１１２】
Otx 2: 脳形態形成に必須の転写因子
5'-CCATGACCTATACTCAGGCTTCAGG-3'
5'-GAAGCTCCATATCCCTGGGTGGAAAG-3'
【０１１３】
Pax 2:中脳ドーパミン産生性神経細胞転写因子
5'-CCAAAGTGGTGGACAAGATTGCC-3'
5'-GGGATAGGAAGGACGCTCAAAGAC-3'
【０１１４】
Pax 5:中脳ドーパミン産生性神経細胞転写因子
5'-CAGATGTAGTCCGCCAAAGGATAG-3'
5'-ATGCCACTGATGGAGTATGAGGAGCC-3'
【０１１５】
Smo: SHH シグナル受容体、（smoothened）
5'-CTGAGAGTGCCAGAAAAGGG-3'
5'-TCATCATGCTGGAGAACTCG-3'
【０１１６】
線維芽細胞成長因子受容体(FGFR 3R)
5'-ATCCTCGGGAGATGACGAAGAC-3'
5'-GGATGCTGCCAAACTTTGTTCTC-3'
【０１１７】
結果は表２に示す。
【表２】
2005514944.tif 000004
【０１１８】
表２に示すように、本発明により誘導されたコロニーは高レベルの転写因子およびシグナル伝達分子をコードする神経特異的遺伝子を発現した。
【０１１９】
神経回路網様の外観の発達
得られたコロニーを顕微鏡下で観察して神経回路網様の形成密度を判定した。結果を図７に示す。図７はＥＢの神経回路網様の形成密度に対するＮＡ（ニコチンアミド）およびｂＦＧＦの効果を要約したヒストグラムである。ＥＢを第２段階において４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦの不在下または存在下で培養し（「非処理」または「処理」としてそれぞれ示す）、第３および第４段階においてＮＡの存在下で培養した。各条件について培養中のすべてのＥＢを計数することによりアッセイし、実験を２回繰り返したところ類似の結果が得られた。
【０１２０】
ＢＭＰ−４またはＦＢＳ処理
第２段階においてｂＦＧＦで処理した細胞を後の段階（第３および第４段階）において１０ｍＭのＮＡに加えて０．５ｎＭ骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ−４）または５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）の存在下で培養した。この手順において、ＢＭＰ４は培地交換ごとに新鮮なものを添加した。ＢＭＰ−４とＦＢＳはともに細胞の神経細胞への分化を抑制した。
【０１２１】
結果を図８に示す。ＢＭＰ−４とＦＢＳはともにコロニーにおけるＴｕＪの発現を抑制した。
【０１２２】
分化細胞の移植の６−ＯＨＤＡ病変および回転性挙動に対する効果
６−ＯＨＤＡによって誘導される一方向ドーパミン産生神経変性動物はパーキンソン病（ＰＤ）の有用なモデルであると考えられている。というのは黒質ドーパミン産生神経細胞の欠乏がＰＤ症状の特徴だからである。線条体における顕著なドーパミン欠乏（９５％を超える）がドーパミン受容体の過感受性を誘導することが知られている。それゆえ６−ＯＨＤＡ−病変ラットにおいて、混合Ｄ１／Ｄ２受容体アゴニストであるアポモルフィンは反対側方向における回転非対称を誘導し、ＤＡ誘発因子であるアンフェタミンは同側回転を誘導する。したがって、本発明者らは生体内での分化細胞および未分化ＥＳ細胞の移植の６−ＯＨＤＡ病変モデルに対する効果を調べた。
【０１２３】
全ての動物実験は京都大学の動物実験ガイドラインおよび「National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals」に沿って行われた。用いた実験動物は、体重約２８０ｇの８週齡の雄性Ｗｉｓｔｅｒラット（SLC Inc.、Hamamatsu、Japan）であった。ラットを自由に水を与えて一晩絶食させた。６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）溶液を１２ｇの６−ＯＨＤＡ（Ｓigma、St Louis、MO、USA）を最終容量４ｌの０．０２％アスコルビン酸を含有する滅菌生理的食塩水に溶解することによって調製した。定位微量注入を行うために、ラットを麻酔し（ペントバルビタールナトリウム、５０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）、Kopf定位フレームに固定した。次いでラットの左黒質に６−ＯＨＤＡ溶液を注入し、十字縫合は−４．８ｍｍ尾側、１．８ｍｍ左側、−７．８ｍｍ腹側とし、モーター駆動１０μｌ−ハミルトンシリンジによって２６ゲージ針を用いて行った。座標はラット脳アトラス（Paxinos G. and Watson C. (1986）「The rat brain in stereotaxic coordinates」 (Second Edition). Academic Press、North Ryde、Australia)に従って決めた。２週間後、アポモルフィンに(Sigma)応答する回転性挙動の評価によって移植に用いる病変ラットを選択した。回転試験はrotometer bowl (Ungerstedt、U. (1971) 「Postsynaotic supersensitivity after 6-hydroxydopamine induced degeneration of the nigro-striatal dopamine system」Acta Physiol. Scand.、82 Suppl. 367、69-93)にて行い、反対側方向に完全に３６０°回転した総数を計数した。アポモルフィン（０．６ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）の投与により誘導される強い反対側回転性挙動を示した動物を選んで次ぎの移植手術に用いた。
【０１２４】
移植手術
６−ＯＨＤＡ−病変ラットに媒体（滅菌リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）ｎ＝１０、ａ：媒体）または少数の未分化ＥＳ細胞（約４０００細胞の第１段階のＥＳ細胞、ｎ＝１０、ｂ：ＥＳ−Ｌ）および分化細胞（約２０，０００細胞の第４段階の４日目の細胞、ｎ＝１０、ｉ：４Ｆ）を含む細胞懸濁液を注入した。
【０１２５】
選択したラットを麻酔し（ペントバルビタールナトリウム、５０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）Kopf 定位フレームに固定した。各動物に１．０μｌの移植細胞懸濁液または媒体を左線条体の２カ所に微量注入し、十字縫合はラット脳アトラス（前掲）にしたがって＋１．０ｍｍ尾側、３．０ｍｍ左側、−５．５および５．０ｍｍ腹側とし、２２ゲージ針付き１０μｌ−ハミルトンシリンジを用いた。５分間で移植細胞は定着し、その後針を除いた。ついで、アポモルフィン誘導性回転非対称を２週間ごとに評価した。
【０１２６】
アポモルフィン（０．６ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）投与の６０分後に反対側方向に完全に３６０°回転した数を数えた。
【０１２７】
統計分析
結果を図９−１１に示す。データは平均±ＳＥＭとして示し、独立スチューデント検定または一元配置分散分析で比較した。危険率０．０５未満を有意差とした。さらに後知恵比較のための統計分析をBonferroni/Dunn検定を用いて行って(Statview、Abacus Concepts、Berkely、USA)アポモルフィン誘導性回転非対称の数を評価した。
【０１２８】
アポモルフィン誘導性回転非対称は２週間後の第４段階の分化ＤＡ−神経細胞の移植によって有意に改善した。しかし、その他の移植細胞は有効な反対側回転を示さなかった。有意差(ANOVAの後のBonferroni/Dunn 後じえ比較: 媒体注入（ａ）における各時点に対して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１；各群の移植前に対して！ｐ＜０．０５、！！！ｐ＜０．００１)。
【０１２９】
この実験において、未分化ｍＥＳ細胞および媒体はアポモルフィン誘導性回転非対称を改善させなかった。それに対して、本発明に従って処理された第４段階のＥＳ細胞の移植によりアポモルフィン誘導性回転非対称を２週間後に有意に減少させた。さらにこの修復は１２週間目に挙動評価が完了するまで持続した。
【０１３０】
実施例５の結果によると、マウスＥＳ細胞は本発明の方法によってドーパミン産生神経細胞へと分化したと結論される。
【０１３１】
上記実施例と同様にして、神経様細胞をヒトＥＳ細胞から得ることができる。ヒトＥＳ細胞は実施例４に記載のものとすればよい。培養条件を最適化するためにいくらかの改変を行うことが必要であろうが、これは当業者にとってルーチン的な作業である。本発明によると、ドーパミン産生神経細胞は遺伝子操作、フローサイトメトリーによる分取、磁気ビーズによる分離などを行わずに効率的に分化ＥＳ総細胞集団から濃縮できる。本発明の簡単な四段階方法によりＥＳ細胞から誘導される神経様細胞は、パーキンソン病患者に良好な治療効果をもたらし、治療を受けた患者は長期間生存できる。
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１】図１は、本発明のＥＳ細胞から機能性細胞への分化段階を示す模式図である。
【図２】図２は、実施例１にて得られた細胞集団からの、グルコースによる刺激に応答したインスリン分泌の結果を示す。グラフにおいて、コラムＬは低用量（３．３ｍｇ／Ｌ）のグルコースによる刺激に応答して分泌された細胞集団あたりのインスリン量（刺激の５分後および３０分後）である。コラムＨは高用量（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）のグルコースによる刺激に応答して分泌された細胞集団あたりのインスリン量である。
【図３】図３は、マウスＥＳ細胞から誘導された膵島様細胞群を移植された糖尿病マウスの非絶食時の血糖値を偽手術群と比較したタイムコースである。
【図４】図４は、ＥＳ細胞から誘導された膵島様細胞群を移植された糖尿病マウスの体重を偽手術群と比較したタイムコースである。
【図５】図５は、第３段階および４において、０（対照）、５および１０ｍＭのニコチンアミドの存在下で培養したマウスＥＳ細胞から誘導されたＴｕＪ−陽性細胞コロニーのパーセンテージを示す。
【図６】図６は、４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦの存在下または不在下（それぞれ処理または非処理）で培養した後、１０ｍＭのニコチンアミドの存在下で培養した（第３段階および第４段階）マウスＥＳ細胞から誘導されたＴｕＪ−陽性細胞コロニーのパーセンテージを示す。
【図７】図７は、様々な程度の神経回路網の密度を示すＥＢ(第４段階）の比率に対するｂＦＧＦの効果を要約したヒストグラムである。
【図８】図８は、マウスＥＳ細胞から誘導されたコロニーにおけるＴｕＪの発現に対するＢＭＰ−４およびＦＢＳの効果を示す。
【図９】図９は、分化および未分化ＥＳ細胞の６−ＯＨＤＡ病変ラットに対する移植の効果を示す。
【図１０】図１０は、分化および未分化ＥＳ細胞の６−ＯＨＤＡ病変ラットに対する移植の効果を示す。
【図１１】図１１は、分化および未分化ＥＳ細胞の６−ＯＨＤＡ病変ラットに対する移植の効果を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年9月22日(2004.9.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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