(57)【要約】  ヒスチジンプロリンリッチ糖タンパク質（ＨＰＲＧ）ポリペプチド、またはそのフラグメント（ペンタペプチドフラグメントおよびその多量体を含む）、およびＨＰＲＧの他の生物学的に活性な誘導体は、抗脈管形成である。これらの化合物を使用し得、脈管形成を阻害し得るか、または脈管形成が病原である疾患もしくは状態を処置し得る。従って、これらの化合物は、抗腫瘍活性を有し、そして、原発腫瘍の増殖または転移を阻害する方法において使用される。ＨＰＲＧのＨｉｓ−Ｐｒｏドメインのエピトープに特異的な抗体は、脈管形成の刺激因子であり、そして、関連する疾患状態における新生血管管形成を促進するのに有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された抗脈管形成ポリペプチドまたはペプチドであって、以下の配列：
（ａ）ヒトヒスチジン−プロリンリッチ糖タンパク質（ＨＰＲＧ）のヒスチジン−プロリン−リッチ（Ｈ／Ｐ）ドメイン（配列番号５）
（ｂ）ヒトウサギＨＰＲＧのＨ／Ｐドメイン（配列番号６）
（ｃ）インビトロまたはインビボのバイオアッセイにおいて、脈管形成、内皮細胞増殖、または内皮管形成を阻害するための実質的に同一の生物学的活性を有する、配列番号５または配列番号６の配列改変体；
（ｄ）配列（Ｈｉｓ，Ｐｒｏ）−（Ｈｉｓ，Ｐｒｏ）−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ（配列番号７）を有する該Ｈ／Ｐドメイン由来のペンタペプチド、または、該ペンタペプチドのＮ末端またはＣ末端に付加されたＨｉｓ、ＰｒｏまたはＧｌｙからなる群から選択されるさらなる１〜４個のアミノ酸を有する、その付加改変体、
を有する、脈管形成ポリペプチドまたはペプチド。
【請求項２】
Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ（配列番号８）、Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ（配列番号９）もしくはＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ（配列番号１０）、またはその付加改変体からなる群から選択される配列を有する、請求項１に記載の単離されたペプチド。
【請求項３】
請求項２に記載のペプチドまたは付加改変体を含む、化学合成されたペプチド多量体であって、該ペプチド多量体は、以下：
（ａ）式Ｐ１ｎを有する多量体であって、ここで、
（ｉ）Ｐ１は、請求項２に記載のペプチドまたは付加改変体であり、そして
（ｉｉ）ｎ＝２〜８、
である多量体、
（ｂ）式（Ｐ１−Ｘｍ）ｎ−Ｐ２を有する多量体であって、ここで、
（ｉ）Ｐ１およびＰ２は請求項２に記載のペンタペプチドまたは付加改変体であり、
（ｉｉ）Ｐ１およびＰ２は、同一のペプチドであるかまたは異なるペプチドであり；
（ｉｉｉ）Ｘは、４個までの酸素原子を含む、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ１〜Ｃ５アルケニル、Ｃ１〜Ｃ５アルキニル、Ｃ１〜Ｃ５ポリエーテルであり；
（ｉｖ）ｍ＝０または１；そして
（ｖ）ｎ＝１〜７
である多量体、
からなる群から選択され、そして、ここで、該ペプチド多量体が、インビトロまたはインビボのバイオアッセイにおいて、脈管形成、内皮細胞増殖または内皮管形成を阻害するための生物学的活性を有する、ペプチド多量体。
【請求項４】
請求項２に記載のペプチドまたは付加改変体を含む、組換え的に産生されたペプチド多量体であって、該多量体は、式（Ｐ１−Ｇｌｙｚ）ｎ−Ｐ２を有し、ここで：
（ｉ）Ｐ１およびＰ２は、請求項２に記載のペンタペプチドまたは付加改変体であり、
（ｉｉ）Ｐ１およびＰ２は、同一であるか、または異なり；
（ｉｉｉ）ｚ＝０〜６；そして
（ｉｖ）ｎ＝１〜１００
である、ペプチド多量体。
【請求項５】
診断的または治療的に標識された抗脈管形成ポリペプチド、ペプチド、またはペプチド多量体であって、以下：
（ａ）診断的または治療的に標識された、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載のポリペプチド、ペプチドまたはペプチド多量体；
（ｂ）診断的もしくは治療的ヒトＨＰＲＧタンパク質（配列番号１）；
（ｃ）診断的もしくは治療的ウサギＨＰＲＧタンパク質（配列番号３）；または
（ｄ）（ｂ）もしくは（ｃ）のホモログである、診断的もしくは治療的に標識されたポリペプチド、
を含む、抗脈管形成ポリペプチド、ペプチド、またはペプチド多量体。
【請求項６】
請求項５に記載の診断的または治療的に標識されたポリペプチドまたはペプチドであって、該ポリペプチドは、以下：
（ａ）ヒトＨＰＲＧのＨ／Ｐドメイン（配列番号５）；
（ｂ）ウサギＨＰＲＧのＨ／Ｐドメイン（配列番号６）；および
（ｃ）配列番号７の配列を有する前記ペプチド、またはその前記付加改変体、
からなる群から選択される、ポリペプチド。
【請求項７】
治療的に有用なＨＰＲＧ関連組成物であって、該組成物が、以下：
（ａ）請求項５または請求項６に記載の治療的に標識されたポリペプチド、ペプチドまたはペプチド多量体、
（ｂ）治療的に受容可能なキャリア
を含む、組成物。
【請求項８】
請求項７に記載の組成物であって、ここで、検出可能な標識が、放射性核種、ＰＥＴ造影剤、ＭＲＩ造影剤、蛍光剤、蛍光発色剤、発色団、色原体、燐光剤、化学発光剤または生物発光剤である、組成物。
【請求項９】
請求項８に記載の組成物であって、ここで、前記検出可能な標識が、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、８９Ｚｒ、９７Ｒｕ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１６９Ｙｂおよび２０１Ｔｌからなる群から選択される、放射性核種である、組成物。
【請求項１０】
請求項８に記載の組成物であって、ここで、前記検出可能な標識が、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、フルオレサミン、フルオレセイン誘導体、オレゴングリーン、ローダミングリーン、ロドールグリーンおよびテキサスレッドからなる群から選択される、蛍光剤または蛍光発色剤である、組成物。
【請求項１１】
抗脈管形成薬学的組成物であって、該組成物は、以下：
（ａ）有効量の請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載のポリペプチド、ペプチドまたはペプチド多量体；および
（ｂ）薬学的に受容可能なキャリア、
を含む、組成物。
【請求項１２】
治療的な抗脈管形成薬学的組成物であって、該組成物が、以下：
（ａ）治療的活性部分に直接的または間接的に結合される、有効量の請求項５または請求項６に記載のポリペプチド、ペプチドまたはペプチド多量体；および
（ｂ）薬学的に受容可能なキャリア、
を含む、組成物。
【請求項１３】
注入に適切な形態の、請求項１１または請求項１２に記載の治療的な薬学的組成物。
【請求項１４】
前記治療的活性部分が放射性核種である、請求項１２に記載の治療的な薬学的組成物。
【請求項１５】
請求項１４に記載の治療的な薬学的組成物であって、ここで、前記放射性核種が、４７Ｓｃ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、１０９Ｐｄ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１９９Ａｕ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂおよび２１７Ｂｉからなる群から選択される、組成物。
【請求項１６】
ヒトＨＰＲＧのＨ／Ｐドメイン（配列番号５）またはウサギＨＰＲＧのＨ／Ｐドメイン（配列番号６）中に存在する、ＨＰＲＧのエピトープに特異的であり、そして、ＨＰＲＧまたは該ドメインの抗脈管形成活性を阻害する方法で、ＨＰＲＧまたは該ドメインのいずれかに結合する抗体、または、該抗体の抗原結合フラグメント。
【請求項１７】
請求項１６に記載の抗体または該抗体の抗原結合フラグメントであって、ここで、前記エピトープが、配列Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ（配列番号８）、Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ（配列番号９）、またはＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ（配列番号１０）を有する前記Ｈ／Ｐドメイン由来のペンタペプチドを含み、該ペンタペプチドの抗脈管形成活性を阻害する、抗体またはフラグメント。
【請求項１８】
モノクローナル抗体である、請求項１６または請求項１７に記載の抗体。
【請求項１９】
ヒトモノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体である、請求項１８に記載の抗体。
【請求項２０】
該抗体が検出可能に標識されている、請求項１６〜請求項１９のいずれか１項に記載の抗体またはフラグメントを含む、ＨＰＲＧを検出するのに有用な抗体。
【請求項２１】
ＨＰＲＧまたはそのエピトープを標的化する治療的に有用な抗体であって、請求項１６〜請求項１９のいずれか１項に記載の抗体またはフラグメントを含み、治療的に活性な部分に直接的または間接的に結合される、抗体。
【請求項２２】
インビボまたはインビトロで脈管形成を刺激する薬学的組成物であって、該組成物が以下：
（ａ）請求項１６〜請求項１９のいずれか１項に記載の抗体またはフラグメント；および
（ｂ）薬学的に受容可能なキャリア
を含む、組成物。
【請求項２３】
細胞移動、細胞侵襲、細胞増殖または脈管形成を阻害するため、またはアポトーシスを誘導するための方法であって、該方法は、所望されない細胞移動、侵襲、増殖または脈管形成に関連する細胞と、有効量の請求項１１〜請求項１５のいずれか１項に記載の治療的な薬学的組成物とを接触させる工程を包含する、方法。
【請求項２４】
所望されない細胞移動、侵襲、増殖または脈管形成に関連する疾患または状態を有する被験体を処置する方法であって、該方法は、有効量の請求項１１〜請求項１５のいずれか１項に記載の薬学的組成物を被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２５】
脈管形成を刺激する方法であって、該方法は、脈管形成に関与する細胞に、有効量の請求項１６〜請求項１９のいずれか１項に記載の抗体またはフラグメントを提供する工程を包含する、方法。
【請求項２６】
脈管形成を増大させる必要のある被験体において、脈管形成を刺激する方法であって、該方法が、有効量の請求項２２に記載の薬学的組成物を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２７】
生物学的サンプル中のＨＰＲＧ、またはその分解産物もしくはペプチドの存在を検出する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）該サンプルと、請求項２０に記載の抗体またはフラグメントとを接触させる工程；および
（ｂ）該サンプルに結合された標識の存在を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項２８】
前記サンプルが、血漿、血清、細胞、組織、器官、または該細胞、組織、もしくは器官の抽出物である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記接触させる工程および前記検出する工程が、インビトロである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記接触させる工程がインビボで、そして、前記検出する工程がインビトロである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記接触させる工程がインビボで、前記検出する工程がインビトロである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記接触させる工程および前記検出する工程が、インビボである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３３】
請求項１または請求項２に記載のポリペプチドまたはペプチドをコードするか、または請求項４に記載のペプチド多量体をコードする、単離された核酸。
【請求項３４】
請求項３３に記載の核酸配列を含む発現ベクターであって、該核酸配列が、以下：
（ａ）プロモーター、および
（ｂ）必要に応じて、真核生物細胞中で該核酸の発現を調節する、さらなる調節配列、
に作動可能に連結される、発現ベクター。
【請求項３５】
請求項３４に記載の発現ベクターが、プラスミドである、発現ベクター。
【請求項３６】
請求項３４に記載の発現ベクターが、ウイルスベクターである、発現ベクター。
【請求項３７】
請求項３３に記載の核酸分子で形質転換、またはトランスフェクトされた、細胞。
【請求項３８】
請求項１３〜請求項１６のいずれか１項の発現ベクターで形質転換されたか、またはトランスフェクトされた、細胞。
【請求項３９】
請求項３７または請求項３８のいずれか１項に記載の細胞が、哺乳動物細胞である、細胞。
【請求項４０】
請求項３９に記載の細胞がヒト細胞である、細胞。
【請求項４１】
脈管形成阻害量のＨＰＲＧ、ＨＰＲＧのＨ／Ｐドメイン、もしくは配列（Ｈｉｓ，Ｐｒｏ）−（Ｈｉｓ，Ｐｒｏ）−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ（配列番号７）を有する該Ｈ／Ｐドメインのペンタペプチド、または該ペンタペプチドを含むペプチド多量体を、細胞、組織、または器官に提供する方法であって、該方法は、
請求項３４〜請求項３６のいずれか１項に記載の発現ベクターを、該細胞、組織または器官に投与し、その結果、該細胞、組織または器官中に核酸が取り込まれ、そして、発現される工程、
を包含する、方法。
【請求項４２】
前記投与する工程がインビボである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
脈管形成阻害量のＨＰＲＧ、ＨＰＲＧのＨ／Ｐドメイン、配列（Ｈｉｓ，Ｐｒｏ）−（Ｈｉｓ，Ｐｒｏ）−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ（配列番号７）を有する該Ｈ／Ｐドメインのペンタペプチド、または該ペンタペプチドを含むペプチド多量体を、細胞、組織、または器官に提供する方法であって、該方法は、
該細胞、組織または器官と、請求項３７〜請求項４０のいずれか１項に記載の形質転換された細胞またはトランスフェクトされた細胞とを接触させる工程を包含し、ここで、前記投与された細胞が、該ポリペプチド、ペプチドまたはペプチド多量体を発現する方法。
【請求項４４】
前記接触させる工程がインビボである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
脈管形成阻害が必要な被験体中で、脈管形成を阻害する方法であって、該方法が、以下：
該被験体に、有効量の請求項３４〜請求項３６のいずれか１項に記載の発現ベクターを投与し、その結果、核酸が発現され、脈管形成阻害量の前記ポリペプチド、ペプチドまたはペプチド多量体の存在を生じる、工程を包含し、
これによって、該脈管形成を阻害する方法。
【請求項４６】
脈管形成阻害が必要な被験体中で、脈管形成を阻害する方法であって、該方法は、以下：
有効量の請求項３７〜請求項４０のいずれか１項に記載の形質転換された細胞またはトランスフェクトされた細胞を、該被験体に投与し、該細胞が、被験体中で脈管形成阻害量のポリペプチド、ペプチドまたはペプチド多量体を産生および提供する、工程を包含し、
これによって、該脈管形成を阻害する、方法。
【請求項４７】
請求項４５または請求項４６に記載の方法であって、前記被験体が腫瘍を有し、そして、前記脈管形成阻害が、該腫瘍の大きさもしくは増殖速度の減少、または該腫瘍の破壊を生じる、方法。
【請求項４８】
前記被験体がヒトである、請求項４５〜請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
ＨＰＲＧ結合分子、または該結合分子を発現する細胞に結合するか、またはこれらを単離するのに有用な親和性リガンドであって、該リガンドが、固体支持体またはキャリアに固定された、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載のポリペプチド、ペプチドまたはペプチド多量体を含む、リガンド。
【請求項５０】
複合混合物から、ＨＰＲＧ結合分子を単離する方法であって、該方法が、以下：
（ａ）該混合物と、請求項４９に記載の親和性リガンドを接触させる工程；
（ｂ）該混合物中の任意の物質を、該リガンドに結合させる工程；
（ｃ）該リガンドから、非結合物質を除去する工程；および
（ｄ）結合したＨＰＲＧ結合分子を溶出する工程、
を包含する、方法。
【請求項５１】
細胞混合物から、ＨＰＲＧ結合部位またはレセプターを発現する細胞を単離するか、または濃縮する方法であって、該方法が、以下：
（ａ）該細胞混合物と、請求項４９に記載の親和性リガンドとを接触させる工程；
（ｂ）該結合部位またはレセプターを発現する任意の細胞を、該リガンドに結合させる工程；
（ｃ）非結合細胞から、化合物に結合した細胞を分離する工程；および
（ｄ）結合細胞を除去する工程を包含し、
これによって、該ＨＰＲＧ結合部位を発現する細胞を単離または濃縮する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
生化学および医薬の分野における本発明は、「ヒスチジンプロリンリッチ糖タンパク質」と呼ばれる糖タンパク質、またはその生物学的に活性なフラグメントおよび他の誘導体を用いて、脈管形成を阻害し、ならびに腫瘍および癌を処置するための新規方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景技術の記載）
予め存在する毛細血管からの新たな毛細血管の形成である脈管形成（Ｆｏｌｋｍａｎ、Ｊ．、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、１９７１、２８５：１１８２−１１８６；Ｈａｎａｈａｎ  Ｄ．ら、Ｃｅｌｌ、１９９６、８６：３５３−３６４）は、胎児発生、創傷治癒および女性の生殖機能の正常部分である。しかし、脈管形成はまた、特定の疾患の確立および進行において病因的役割を演じている。癌、慢性関節リウマチおよび糖尿病性網膜症は、このような疾患の例である（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ  Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、２０００、４０７：２４９−２５７）。抗脈管形成治療は、これらの疾患の進行を阻害することで有望である。
【０００３】
脈管形成は、いくつかの血管新生促進サイトカインにより引き起こされ得る。癌の設定条件では、低酸素条件下の腫瘍細胞は、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）および／または線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を分泌する。これらのタンパク質は拡散し、そして局所血管系中の内皮細胞（ＥＣ）上の特異的レセプターに結合し、脈管形成に有利になるように血管新生促進力および抗脈管形成力のバランスを混乱させる。これらタンパク質の結合の結果、ＥＣは活性化されて（ａ）会合した組織マトリックスのリモデリングを誘導する酵素を分泌し、そして（ｂ）インテグリンのような接着分子の発現のパターンおよびレベルを変化させる。マトリックス分解の後、ＥＣは増殖し、そして低酸素腫瘍に向けて移動し、新たな血管の生成および成熟をもたらす。
【０００４】
興味深いことに、多くの抗血管形成因子は、マトリックスタンパク質の分解から生じる−すなわち、血管新生促進酵素の作用の結果である。例として、エンドスタチン、コラーゲンＸＩＩＩのフラグメント（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ、Ｍ．Ｓ．ら、Ｃｅｌｌ  １９９７、８８：２７７−２８５）；プラスミノゲンのクリングル５（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ、Ｍ．Ｓ．ら、Ｃｅｌｌ  ９９４、７９：３１５−３２８）およびＰＥＸ、ＭＭＰ−２のＣ末端非触媒的サブユニット（Ｂｒｏｏｋｓ  Ｐ．Ｃ．ら、Ｃｅｌｌ、１９９８、９２：３９１−４００）が挙げられる。
【０００５】
血管新生促進因子の豊富さに起因して、これらの抗脈管形成分子は、原発性腫瘍中の血管新生促進バランスを克服することができないという考えが出現した。しかし、それらは循環中に分泌されるので、これら抗脈管形成分子は、腫瘍細胞が侵入し始め得る他の位置で脈管形成を阻害し得る。その結果、これらの新たな位置におけるこれら腫瘍細胞を含む微小転移は、休眠したままである。この仮説は、何年も前に外科医によってなされた訳のわからない観察：明らかな転移疾患をもたない患者中の原発性腫瘍の外科的除去の後の種々の時点で、患者が進行した転移疾患に戻る、を説明する。
【０００６】
従って、１つ以上の抗脈管形成因子を用いる治療による臨床的介入は、脈管形成プロセスを阻害し得、そして腫瘍成長および転移を止める。この概念を支持する顕著な証拠が（上記引用された）文献中にある。
【０００７】
（ヒスチジンプロリンリッチ糖タンパク質（ＨＰＲＧ＝Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  Ｒｉｃｈ  Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＨＲＧ））
ＨＰＲＧは肝臓中で合成される（Ｍｏｒｇａｎ  Ｗ．Ｔ．、「Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−Ｒｉｃｈ  Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ」：Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００１）。この糖タンパク質は、通常ないような高い割合のＰｒｏおよびＨｉｓ残基をもち（ヒトＨＰＲＧは５２５残基をもち、６６がＨｉｓそして６５がＰｒｏである）、それが名前に反映されている。ＨＰＲＧは、Ｎ末端に２つのシスタチン様ドメインを、そしてＣ末端の２つのＰｒｏリッチドメイン間に、本明細書では「Ｈ／Ｐドメイン」とも呼ばれるＨｉｓ−Ｐｒｏリッチドメイン−（ヒトＨＰＲＧにおける１４８残基のうち、４２がＨｉｓそして３１がＰｒｏ）を含む。このＣ末端ドメインは、（キニノーゲンにおけるように）Ｎ末端ドメインにつながれ、そして３つのすべてのＮ連結オリゴ糖を含む；その配列は、シスタチンのプロテアーゼインヒビター活性のすべてを失うに十分シスタチンから分岐している。ＨＰＲＧは、血漿中に極めて豊富である（１．５μＭ、１２５μｇ／ｍｌ）。これにもかかわらず、ＨＰＲＧの生理学的役割についてはほとんど知られていない。
【０００８】
ＨＰＲＧは、以下の３つの主要な群に分割され得るリガンドの大アレイを結合する：
（１）ヘパリン、プラスミノゲン、フィブリノゲン、ビトロネクチンおよびトロンボスポンディンのような凝固／フィブリン溶解系に属するリガンド；
（２）ヘムおよび遷移金属イオン（亜鉛、銅およびニッケル）のような小リガンド、および
（３）Ｔ細胞（Ｌａｍｂ−Ｗｈａｒｔｏｎ  Ｒ．Ｊ．ら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９３、１５２：５４４−５５５；Ｏｌｓｅｎ、ＨＭら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９９６、８８：１９８−２０６）、マクロファージおよび血小板のような細胞。
【０００９】
先行する記載に基づき、凝固およびフィブリン分解の調整、金属輸送および免疫系の調節における、ＨＰＲＧの可能な役割について、いくつかの仮説が提案されている。しかし、このマルチドメインタンパク質の結合の見かけの「乱交」を説明かつ統合し得る仮説はまだない。
【００１０】
ＨＰＲＧのいくつかの生物学的性質は、ｐＨまたは金属の結合に依存する。例えば、ヘパリンへの、またはＥＣの表面上のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）へのＨＰＲＧ結合は、低ｐＨまたは多量のＺｎ＋２またはＣｕ＋２に依存する（Ｂｏｒｚａ  Ｄ−Ｂ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９８、２７３：５４９３−５４９９）。Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−リッチドメインへのＺｎ＋２またはＣｕ＋２の結合は、ＧＡＧへの次の結合を可能にする。低酸素症または虚血の間に生じ得るような、（正常血漿のｐＨ７．４から）０．２５〜０．５０単位のｐＨにおける穏やかな変化は、Ｈ／ＰドメインのＨｉｓ残基のプロトン化を誘導する。従って、ｐＨおよび金属結合は、ＨＰＲＧ活性の精緻なレギュレーターである。
【００１１】
ＨＰＲＧは、溶液中のとき、またはＥＣ表面上のＧＡＧに結合するとき、プラスミノゲンを結合する。この細胞表面結合は、組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔＰＡ）によるプラスミノゲンのプラスミンへの活性化を促進し（Ｂｏｒｚａ  Ｄ−Ｂ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９７、２７２：５７１８−５７２６）、これは血管新生促進性である。保存されたＣ末端Ｌｙｓは、Ｎ末端ドメインでそうであるように、プラスミノゲンとの相互作用に必須である。ＨＰＲＧはまた、フィブリノゲンのγ鎖に結合する。ｐＨ７．４ではそうではないが、ｐＨ６．８で、ＨＰＲＧは、トロンビンによるフィブリンの重合を増大する。
【００１２】
ニワトリＨＰＲＧ（ｃＨＰＲＧ）のヘパリンサルフェートプロテオグリカン類への結合は、これら部位からｂＦＧＦおよびαＦＧＦを置換することが示されている（Ｂｒｏｗｎ  Ｋ．Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９４、３３：１３９１８）。
【００１３】
脈管形成に対するＨＰＲＧの影響は調査されていないけれども、上記の影響は、ｂＦＧＦ活性を促進または阻害し得ると推測される。この性質に関連して、８０μｇ／ｍｌ（約１μＭ）以上の濃度のｃＨＰＲＧは、線維芽細胞におけるＦＧＦ刺激内因性ＤＮＡ合成およびベースライン内因性ＤＮＡ合成を有意に阻害した（Ｂｒｏｗｎら、前述）。ベースライン増殖もまた阻害されたので、この影響は、ＦＧＦ刺激ＤＮＡ合成に特異的でないかも知れない。むしろ、ＨＰＲＧは、刺激剤の性質にかかわらず、ＤＮＡ合成を調節し得る。しかし、Ｂｒｏｗｎらは、ＥＣおよび脈管形成プロセスに対するＨＰＲＧの可能な影響を調査しなかった。
【００１４】
ウサギおよびヒトのＨＰＲＧは、組成および機能が非常に類似している。この２つのタンパク質の最適アラインメントは、６３．５％配列同一性および６８．６％相同性を示した（Ｂｏｒｚａ  Ｄ−Ｂ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９６、３５：１９２５−１９３４）。最も高い相同性は、Ｎ末端およびＣ末端にある。しかし、Ｈｉｓ−Ｐｒｏリッチドメインにおける見かけのより低い相同性は、ウサギ分子中のＨｉｓのＰｒｏによる置換に起因する。ヒトタンパク質は、配列ＨＨＰＨＧの１５の繰り返しを含み、その一方、ウサギタンパク質は、この配列の２つの繰り返し、ＨＰＰＨＧの６つの繰り返しおよびＰＰＰＨＧの７つの繰り返しを含む。従って、これら繰り返し単位のコンセンサス配列は、［Ｈ／Ｐ］［Ｈ／Ｐ］ＰＨＧと称される。
【００１５】
Ｓｉｍａｎｔｏｖ、Ｒ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０７：４５−５２（２００１）は、ＨＰＲＧがトロンボスポンディン（ＴＳＰ−１）の抗脈管形成活性を阻害したことを開示し、そしてＨＰＲＧの領域は、ＴＳＰ−１レセプターであるＣＤ３６に相同であると結論した。これらの領域は、ＨＰＲＧのＮ末端にあり、これは、本発明者らの、抗脈管形成活性のＨ／Ｐドメインへの局在化とは対照的である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
（発明の要旨）
本発明者らは、ＨＰＲＧポリペプチド、またはドメインおよびペンタペプチドを含むそのフラグメント、改変されたコンホメーションのＨＰＲＧ、他の生物学的に活性なＨＰＲＧ誘導体が、抗脈管形成活性および抗腫瘍活性を示し、その一方、ＨＰＲＧに特異的な抗体が、インビボでＨＰＲＧの作用をブロックすることにより脈管形成を刺激するこを発見した。この抗脈管形成作用は、一部、酸化ストレスの阻害を通じて生じ得、これは、最近、脈管形成の病態生理学に寄与することがインビトロで示された（Ｂｒｏｗｎら、（２０００）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：６２９８）。脈管形成に至る酸化ストレスは、亜鉛または銅のような遷移金属を必要とし得−−低分子銅キレーターが、インビボの腫瘍増殖を阻害することが示された（Ｂｒｅｗｅｒ、ＧＪ、国際特許公開ＷＯ／０１３７１２（２０００））。
【００１７】
本発明は、タンパク質性金属キレーター（ＨＰＲＧ）が、恐らくはその結合性遷移金属に起因して、脈管形成を阻害することの最初の実証を含む。本発明は、ＨＰＲＧ、ドメインおよびペプチドフラグメント、改変されたコンホメーションならびにその他の生物学的に活性な誘導体を用いて、脈管形成、腫瘍増殖、ＥＣ増殖、ＥＣ移動またはＥＣチューブ形成を阻害または低減する新規な方法を提供する。
【００１８】
遷移金属および酸化ストレスの誘導は、非癌疾患、特に、アルツハイマー病、パーキンソン病および筋萎縮側索硬化（ＡＬＳ）のような神経変性疾患の病因学に関係している。従って、本発明はまた、その病理生物学が、遷移金属の存在が酸化ストレスを誘導し得る状態を含む、遷移金属の異常な存在または所望されない作用に関与する、任意の疾患の処置のための組成物および方法を提供する。
【００１９】
本発明は、以下の配列を有する、単離された抗血管形成ポリペプチドまたはペプチドを提供する。（ａ）ヒトヒスチジン−プロリンリッチ糖タンパク質（ＨＰＲＧ）のヒスチジン−プロリン−リッチ（Ｈ／Ｐ）ドメイン（配列番号５）（ｂ）ヒトウサギＨＰＲＧのＨ／Ｐドメイン（配列番号６）（ｃ）インビトロまたはインビボバイオアッセイにおける、脈管形成、内皮細胞増殖または内皮チューブ形成を阻害する、実質的に同じ生物学的活性を有する、配列番号５または配列番号６の配列改変体；（ｄ）配列（Ｈｉｓ、Ｐｒｏ）−（Ｈｉｓ、Ｐｒｏ）−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ（配列番号７）を有するＨ／Ｐドメイン由来のペンタペプチド、または、このペンタペプチドのＮ末端またはＣ末端で付加された、Ｈｉｓ、ＰｒｏまたはＧｌｙからなる群から選択されるさらなる１〜４のアミノ酸を有するその付加改変体。
【００２０】
好ましくは、この上記の単離されたペプチドは、Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ（配列番号８）、Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ（配列番号９）、またはＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ（配列番号１０）からなる群から選択される配列を有する。
【００２１】
また、上記のペプチドまたは付加改変体を含む、化学的に合成されたペプチド多量体が提供され、この多量体は、以下からなる群から選択され：
（ａ）式Ｐ１ｎを有する多量体であって、ここで、（ｉ）Ｐ１は、請求項２のペプチドまたは付加改変体であり、そして（ｉｉ）ｎ＝２〜８であり、（ｂ）式（Ｐ１−Ｘｍ）ｎＰ２を有する多量体であって、ここで、（ｉ）Ｐ１およびＰ２は、請求項によるペンタペプチドまたは付加改変体であり、（ｉｉ）Ｐ１およびＰ２は、同一または異なるペプチドであり、（ｉｉｉ）Ｘは、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ１〜Ｃ５アルケニル、Ｃ１〜Ｃ５アルキニル、４つまでの酸素原子を含むＣ１〜Ｃ５ポリエーテルであり、（ｉｖ）ｍ＝０または１であり、そして（ｖ）ｎ＝１〜７であり、そして、ここで、このペプチドマチルマーは、インビトロまたはインビボバイオアッセイにおいて、脈管形成、内皮細胞増殖または内皮チューブ形成を阻害する生物学的活性を有する。
【００２２】
別の実施形態は、上記のペプチドまたは付加改変体を含む組換えにより産生されたペプチド多量体であり、この多量体は、式（Ｐ１−Ｇｌｙｚ）ｎＰ２を有し、ここで：（ｉ）Ｐ１およひＰ２は、請求項２に記載のペンタペプチドまたは付加改変体であり、（ｉｉ）Ｐ１およびＰ２は、同一または異なり；（ｉｉｉ）ｚ＝０〜６であり；そして（ｉｖ）ｎ＝１〜１００である。
【００２３】
本発明はまた、診断的または治療的に標識された抗脈管形成ポリペプチド、ペプチドまたはペプチドマチルマーに関し、これらは：（ａ）診断的または治療的に標識されている、上記のポリペプチド、ペプチドまたはペプチド多量体；（ｂ）診断的または治療的に標識されたヒトＨＰＲＧタンパク質（配列番号１）；（ｃ）診断的または治療的に標識されたウサギＨＰＲＧタンパク質（配列番号３）；または（ｄ）上記（ｂ）もしくは（ｃ）のホモログである、診断的または治療的に標識されたポリペプチドを含む。
【００２４】
好ましくは、この診断的または治療的に標識されたポリペプチドまたはペプチドは：（ａ）ヒトＨＰＲＧのＨ／Ｐドメイン（配列番号５）；（ｂ）ウサギＨＰＲＧのＨ／Ｐドメイン（配列番号６）；および（ｃ）配列番号７の配列を有するペプチドまたはその付加改変体からなる群から選択される。
【００２５】
診断的に有用なＨＰＲＧ関連組成物は、上記の診断的に標識されたタンパク質、ペプチドまたはペプチド多量体、および診断的に受容可能なキャリアを含む。
【００２６】
上記の診断組成物において、好ましくは、検出可能な標識は、放射性核種、ＰＥＴ造影剤、ＭＲＩ造影剤、蛍光剤、蛍光発色剤、発色団、色原体、燐光剤、化学発光剤または生物発光剤である。
【００２７】
好適な放射性核種は、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、８９Ｚｒ、９７Ｒｕ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１６９Ｙｂおよび２０１Ｔｌを含む。
【００２８】
好適な、蛍光剤または蛍光発色剤は、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、フルオレスカミン、フルオレセイン誘導体、オレゴングリーン、ローダミングリーン、ロドールグリーンおよびテキサスレッドを含む。
【００２９】
抗脈管形成薬学的組成物は、請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質ペプチドまたはペプチド多量体の有効量；および薬学的に受容可能なキャリアを含む。
【００３０】
１つの実施形態では、治療的抗脈管形成薬学的組成物は、治療的に活性な部分が直接または間接的に結合した上記に記載のポリペプチド、ペプチドまたはペプチド多量体の有効量；および薬学的に受容可能なキャリアを含む。好ましくは、この薬学的組成物は、注射に適切な形態である。
【００３１】
治療的に活性な部分は、放射性核種であり得、好ましくは、４７Ｓｃ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、１０９Ｐｄ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１０９Ａｕ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂまたは２１７Ｂｉである。
【００３２】
本発明はまた、ヒトＨＰＲＧのＨ／Ｐドメイン（配列番号５）またはウサギＨＰＲＧのＨ／Ｐドメイン（配列番号６）中に存在しているＨＰＲＧのエピトープに特異的であって、かつ、ＨＰＲＧまたは任意のそのドメインに、それがＨＰＲＧまたはこのドメインの抗脈管形成活性を阻害する様式で結合する抗体、（またはこの抗体の抗原結合性フラグメント）に関する。このエピトープは、抗体またはフラグメントにより認識され、好ましくは、配列Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ（配列番号８）、Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ（配列番号９）、またはＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ（配列番号１０）を有するＨ／Ｐドメイン由来のペンタペプチドを含む。この抗体は、モノクローナル抗体であり得、ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体を含む。
【００３３】
ＨＰＲＧを検出するために有用な抗体の実施形態は、検出可能に標識されている上記の抗体またはフラグメントを含む。
【００３４】
ＨＰＲＧまたはそのエピトープを標的にする治療的に有用な抗体は、治療的に活性な部分が直接または間接的に結合している上記の抗体またはフラグメントを含む。
【００３５】
本発明は、インビトロまたはインビボで脈管形成を刺激する薬学的組成物を提供し、この組成物は：（ａ）上記の抗体またはフラグメント；および（ｂ）薬学的に受容可能なキャリアを含む。
【００３６】
本発明は、細胞移動、細胞侵入、細胞増殖または脈管形成を阻害するため、またはアポトーシスを誘導するための方法を提供し、この方法は、所望されない細胞移動、侵入、増殖または脈管形成に関連する細胞を、有効量の上記に記載の治療薬学的組成物と接触させる工程を包含する。
【００３７】
また含まれるのは、所望されない細胞移動、侵入、増殖または脈管形成に関連する疾患または状態を有する被験体を処置する方法であり、この方法は、この被験体に、上記ポリペプチド、ペプチドまたは多量体を含む有効量の薬学的組成物を投与する工程を包含する。この処置に好適な疾患または状態は、腫瘍または癌である。
【００３８】
脈管形成を刺激する別の方法は、脈管形成に関与する細胞に、上記の抗体またはフラグメントの有効量を提供する工程を包含する。増大した脈管形成が必要な被験体中の脈管形成を刺激する方法は、この被験体に、有効量の上記抗体ベースの薬学的組成物を投与する工程を包含する。
【００３９】
生物学的サンプルにおいてＨＰＲＧ、またはその切断生成物もしくはペプチドの存在を検出するための方法もまた提供され、この方法は、以下の工程：
（ａ）請求項２０に記載の抗体またはフラグメントをサンプルと接触する工程；および
（ｂ）このサンプルと会合する標識の存在を検出する工程。
【００４０】
サンプルは、好ましくは、血漿、血清、細胞、組織、器官、または細胞、組織、もしくは器官の抽出物である。接触および検出は、インビトロであり得るか；あるいは、接触はインビボで、そして検出はインビトロ（またはこの反対）である。別の実施形態では、接触および検出は、インビボである。
【００４１】
本発明はまた、上記のポリペプチドまたはペプチドまたはペプチド多量体をコードする単離された核酸に関する。本発明の発現ベクターは、プロモーター、および、必要に応じて、真核生物細胞において核酸の発現を調節するさらなる調節配列に作動可能に連結した請求項に記載の上記核酸を含む。好ましい発現ベクターは、プラスミドまたはウイルスベクターである。
【００４２】
また、上記の核酸分子または発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた細胞も含まれる。細胞は、好ましくは、哺乳動物細胞、最も好ましくは、ヒト細胞である。
【００４３】
本発明は、細胞、組織または器官に、脈管形成を阻害する量のＨＰＲＧ、ＨＰＲＧのＨ／Ｐドメイン、または配列（Ｈｉｓ，Ｐｒｏ）−（Ｈｉｓ，Ｐｒｏ）−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ（配列番号７）を有するＨ／Ｐドメインのペンタペプチド、またはこのペンタペプチドを含むペプチド多量体を提供するための方法を含み、この方法は、以下の工程を包含する：細胞、組織または器官に、上記の発現ベクターを投与する工程であって、その結果、核酸が取り込まれ、そしてこれらの細胞、組織または器官で発現される、工程。投与は、好ましくは、インビボである。
【００４４】
以下の工程を包含する、細胞、組織または器官に、脈管形成を阻害する量のＨＰＲＧ、ＨＰＲＧのＨ／Ｐドメイン、または配列（Ｈｉｓ，Ｐｒｏ）−（Ｈｉｓ，Ｐｒｏ）−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ（配列番号７）を有するＨ／Ｐドメインのペンタペプチド、またはこのペンタペプチドを含むペプチド多量体を提供するための方法もまた含まれる：細胞、組織または器官を、上記の形質転換した細胞またはトランスフェクトした細胞と接触させる工程であって、ここで、投与される細胞は、ポリペプチド、ペプチド、またはペプチド多量体を発現する、工程。好ましくは、接触は、インビボである。
【００４５】
本発明はまた、脈管形成を阻害する必要のある患者において、脈管形成を阻害する方法に関し、この方法は、上記のように、被験体に有効量の発現ベクターを投与する工程であって、その結果、核酸が発現され、脈管形成を阻害する量のポリペプチド、ペプチド、またはペプチドマルチーの存在を生じ、それにより、脈管形成を阻害する、工程。
【００４６】
脈管形成を阻害する必要のある被験体において脈管形成を阻害するための方法は、上記のように、被験体に有効量の形質転換したまたはトランスフェクトした細胞を投与する工程を包含し、ここで、細胞は、被験体において、脈管形成を阻害する量のポリペプチド、ペプチドまたはペプチド多量体を産生または提供し、それにより、脈管形成を阻害する。
【００４７】
上記の方法において、被験体は腫瘍を有し、そして脈管形成阻害は、腫瘍のサイズもしくは増殖速度の低下、または腫瘍の破壊を生じる。好ましくは、被験体はヒトである。
【００４８】
上記方法が有効である疾患または状態のより広い例としては、固形腫瘍、白血病、またはリンパ腫の第１次増殖；腫瘍転移物の腫瘍侵襲、転移または増殖；良性の過形成；動脈硬化症；心筋の脈管形成；バルーン血管形成後の血管再狭窄；血管損傷後の新脈管内膜形成（ｎｅｏｉｎｔｉｍａ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）；脈管移植片再狭窄（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｇｒａｆｔ  ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ）；環状側副血管形成（ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）；深静脈血栓症；虚血肢脈管形成；毛細血管拡張症；化膿性肉芽腫；角膜疾患；ルベオーシス；脈管形成緑内障；糖尿病性網膜症および他の網膜症；水晶体後線維増殖症；糖尿病性新生血管形成；黄斑変性；子宮内膜症；関節炎；慢性炎症状態に関係する繊維症、虚血、瘢痕または線維症を含む外傷性脊髄損傷；肺繊維症、化学療法誘発性繊維症；瘢痕および繊維症を伴う創傷治癒；消化性潰瘍；骨折；ケロイド；あるいは、病原性細胞侵襲もしくは脈管形成と関連する、脈管形成、造血、排卵、月経、妊娠、または胎盤形成が挙げられる。
【００４９】
上記の方法により処置される好ましい疾患または状態は、腫瘍増殖、腫瘍侵襲、または腫瘍転移である。これには、脳腫瘍も含まれる。このような脳腫瘍の例は、神経膠星状細胞腫、未分化星状細胞腫、神経膠芽細胞腫、多形神経膠芽細胞腫、毛様星状細胞腫（ｐｉｌｏｃｙｔｉｃ  ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ）、汎形態性黄色星状膠細胞腫、上衣下巨細胞星状細胞腫、線維性星状細胞腫、大円形細胞性星状細胞腫、原形質性星状細胞腫、乏突起膠腫、退形成型乏突起膠腫、脳室上衣腫、未分化脳室上衣腫、粘液乳頭型脳室上衣腫、上衣下腫、混合型乏星状細胞腫、および悪性乏星状細胞腫である。
【００５０】
本方法はまた、子宮内膜症のような子宮疾患、ならびに増殖性糖尿病性網膜症、脈管形成加齢性黄斑変性、未熟児網膜症、鎌状赤血球網膜症、または網膜静脈閉塞に関連するか、または起因するような、病原性眼新生血管形成を処置するために用いられる。
【００５１】
ＨＰＲＧ−リガンド、結合部位、またはこのリガンドもしくは結合部位を発現する細胞に結合するか、またはこれらを単離するために有用な「ＨＰＲＧ親和性（アフィニティー）リガンド」もまた、本明細書中で提供される。これは、固体支持体もしくはキャリアに固定された、上記のポリペプチド、ペプチドまたはペプチド多量体を含む。
【００５２】
このアフィニティーリガンドは、複合０．混合物からＨＰＲＧタンパク質またはペプチドを単離するための方法に用いられ、この方法は、以下を包含する：
（ａ）  混合物を上記の親和性リガンドと接触させる工程；
（ｂ）  混合物中の任意の物質を、リガンドに結合させる工程；
（ｃ）  リガンドから結合していない物質を取り除く工程；および
（ｄ）  結合したＨＰＲＧタンパク質またはペプチドを溶離する工程。
【００５３】
細胞混合物からＨＰＲＧ結合部位／レセプターを発現する細胞を単離または濃縮するための方法もまた提供され、この方法は、以下：
（ａ）  細胞混合物を上記のＨＰＲＧ親和性リガンドと接触させる工程；
（ｂ）  結合部位を発現する任意の細胞を化合物に結合させる工程；
（ｃ）  化合物に結合した細胞を、結合していない細胞から分離する工程；および
（ｄ）  結合した細胞を取り出す工程、
を包含し、それにより、ＨＰＲＧ結合部位を発現する細胞を単離または濃縮する。
【００５４】
（好ましい実施形態の説明）
脈管形成のインヒビターとしてのＨＰＲＧの役割は、本発明がなされる前には示唆されていなかった。本発明者らは、ネイティブのＨＰＲＧおよび生物学的に活性なＨＰＲＧポリペプチド、ホモログ、改変体、およびＨＰＲＧのペプチドフラグメントおよび立体配座異性体を含む他の機能的誘導体、ならびにＨＰＲＧに特異的な抗体は、抗脈管形成活性、従って、抗腫瘍活性を示すと考えた。これらの化合物を含む薬学的組成物は、癌、および異常なまたは望ましくない脈管形成と関連する他の疾患の処置に有用である。
【００５５】
ヒトＨＰＲＧは、配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：）１のアミノ酸を有する。
【００５６】
【化１】
2005528879.tif 000002
イタリック体：シグナル配列
２重下線：Ｐｒｏリッチドメイン
下線：Ｈｉｓ−Ｐｒｏ（Ｈ／Ｐ）リッチドメイン
従って、ヒトＨＰＲＧは、５２５アミノ酸残基からなり、分子量：５９，５７８Ｄａ、および７．０９の理論ｐＩを有する。
【００５７】
ヒトＨＰＲＧは、以下の配列（配列番号２）のＤＮＡによりコードされる。
【００５８】
【化２】
2005528879.tif 000003
ウサギＨＰＲＧは、以下の配列番号３のアミノ酸配列を有する：
【００５９】
【化３】
2005528879.tif 000004
【００６０】
【化４】
2005528879.tif 000005
イタリック体：シグナル配列
２重下線：Ｐｒｏリッチドメイン
下線：Ｈｉｓ−Ｐｒｏ（Ｈ／Ｐ）リッチドメイン
ウサギタンパク質は、配列番号４の配列を有するＤＮＡ分子によりコードされる。
【００６１】
【化５】
2005528879.tif 000006
好ましいポリペプチドは、ヒトＨＰＲＧのＨ／Ｐドメイン、
【００６２】
【化６】
2005528879.tif 000007
およびウサギＨＰＲＧのＨ／Ｐドメイン、
【００６３】
【化７】
2005528879.tif 000008
である。
【００６４】
さらに、ＨＰＲＧタンパク質のホモログ、またはＨＰＲＧと配列類似性を共有する、そのドメイン（例えば、Ｂｏｒｚａら、１９９６、前出）もしくはそのペプチドのホモログはまた、抗脈管形成および抗腫瘍活性を示す。
【００６５】
このようなホモログの例は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ赤血球膜タンパク質−１、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍヒスチジンリッチタンパク質２（ＰｆＨＲＰ２）およびヒスタチンファミリーのタンパク質である。
【００６６】
機能的ホモログは、本明細書中に記載されるインビトロ方法またはインビボ方法を用いて試験され得る、生化学的活性および生物学的活性、好ましくは、抗脈管形成活性および抗腫瘍活性を保有していなければならない。この機能的特徴を考慮して、他の種由来の相同ＨＰＲＧタンパク質（まだ発見されていないタンパク質を含む）の使用は、これらのタンパク質が配列類似性、および列挙した生化学的活性および生物学的活性を有する場合、本発明の範囲内にある。
【００６７】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の％同一性を決定するために、配列を最適な比較を目的として整列する（例えば、ギャップが、最適な整列のために第１および第２のアミノ酸配列または核酸配列の一方または両方に導入され得、そして非相同配列が、比較目的のために無視され得る）。整列の好ましい方法では、Ｃｙｓ残基を整列させる。
【００６８】
好ましい実施形態において、比較される配列の長さは、参照配列の長さの、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、なおより好ましくは少なくとも６０％、そしてなおより好ましくは少なくとも７０％、８０％、または９０％である。例えば、好ましいアラインメントは、ヒトＨＰＲＧタンパク質Ｈ／Ｐドメイン（配列番号５）またはウサギＨＰＲＧタンパク質Ｈ／Ｐドメイン（配列番号６）とのアラインメントであり、アミノ酸残基の、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、なおより好ましくは少なくとも６０％そしてなおより好ましくは少なくとも７０％、８０％または９０％が整列される。次いで、対応するアミノ酸（またはヌクレオチド）位置のアミノ酸残基（またはコード配列由来のヌクレオチド）が比較される。第１の配列内の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基（またはヌクレオチド）で占められる場合、その分子は、その位置において同一である（本明細書中で使用される場合、アミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸の「相同性」と等価である）。これら２つの配列間の同一性パーセントは、ギャップの数、および各ギャップの長さ（これらは、２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要がある）を考慮して、これらの配列により共有される同一の位置の数の関数である。
【００６９】
配列の比較および２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。好ましい実施形態において、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３（１９７０）アルゴリズムを使用して決定される。このアルゴリズムは、ＧＣＧソフトウエアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍにおいて入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれており、Ｂｌｏｓｓｏｍ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重みおよび１、２、３、４、５または６の長さ重みを使用する。さらに別の好ましい実施形態において、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍにおいて入手可能）におけるＧＡＰプログラムを使用して決定される。このプログラムは、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス、ならびに４０、５０、６０、７０または８０のギャップ重み、および１、２、３、４、５または６の長さ重みを使用する。別の実施形態において、２つのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、Ｅ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７（１９８９））のアルゴリズムを使用して決定され、このアルゴリズムは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれており、ＰＡＭ１２０重み残余（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ）表、ギャップ長さペナルティ１２、およびギャップペナルティ４を使用する。
【００７０】
本発明の核酸配列およびタンパク質配列は、例えば、他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定するために、公共のデータベースに対する検索を実施するための「問い合わせ配列」としてさらに使用され得る。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＮＢＬＡＳＴプログラムおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実行され得る。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ヒトまたはマウスのＨＰＲＧ核酸分子に相同性のヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝１００、ワード長さ＝１２）を用いて実行され得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝５０、ワード長さ＝３）用いて、本発明のＨＰＲＧタンパク質分子に対して相同性のアミノ酸配列を得るために実行され得る。比較の目的でギャップのある（ｇａｐｐｅｄ）アラインメントを得るために、ＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２に記載されるとおりに利用し得る。ＢＬＡＳＴプログラムおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトのパラメーターが使用され得る。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．ｋを参照のこと。
【００７１】
従って、上記のＨＰＲＧのホモログは、（ａ）ネイティブＨＰＲＧの機能的活性、および（ｂ）上で決定された場合のネイティブＨＰＲＧに対する配列類似性（少なくとも約３０％（アミノ酸レベルで）、好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７０％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％）を有するとして特徴付けられる。
【００７２】
ＨＰＲＧの開示された配列に基づいてＤＮＡプローブを使用してこのようなタンパク質を得て発現させることは、当該分野の技術範囲内である。次いで、そのタンパク質の生化学的活性および生物学的活性は、当該分野で認識された方法（例えば、本明細書中に記載される方法）を使用して容易に試験され得る。内皮細胞増殖の生物学的アッセイは、そのホモログが「機能的」ホモログとみなすために必須の活性を有するか否かを示す。
【００７３】
（ペプチド組成物）
好ましい組成物は、ＨＰＲＧの結合活性および／または生物学的活性を有することを特徴とする、ＨＰＲＧの生物学的に活性なペプチドであるか、またはこのペプチドを含む。このような結合は、好ましくは以下のリガンドのクラスのメンバーであるリガンドに対する結合である：
（１）凝固／フィブリン溶解系に属するリガンド（例えば、ヘパリン、プラスミノーゲン、フィブリノーゲン、ビトロネクチンおよびトロンボスポンジン）。ＨＰＲＧは、これらのリガンドと相互作用する他の分子に対して同様に結合し得る。従って、本発明は、好ましくは、上述のリガンドに結合する新規な任意の分子を含む。
（２）小リガンド（例えば、ヘムまたは遷移金属イオン（亜鉛、銅およびニッケル））、または
（３）細胞（例えば、Ｔ細胞、マクロファージおよび血小板）。
【００７４】
さらに、生物学的に活性なペプチドは、本明細書中で特徴付けされるような、結合活性または生物学的活性の、インビトロまたはインビボでのアッセイにおいて、ＨＰＲＧ活性を有する。好ましくはこのペプチドは、全長ＨＰＲＧの活性の少なくとも約２０％のレベルで、内皮細胞増殖もしくは遊走、ＥＣ管形成、脈管形成または腫瘍成長を阻害する。
【００７５】
好ましいペプチドは、最小のコンセンサス配列［Ｈ／Ｐ］［Ｈ／Ｐ］ＰＨＧ（配列番号７）を含み、これは、異なる種間でＨＰＲＧの１つ以上のドメインのアミノ酸配列を比較することにより誘導される。このようなコンセンサス配列ペプチドの付加改変体は、Ｈ、ＰおよびＧから任意の組合せで選択される１〜４個のさらなるアミノ酸を有する。本発明のより長いペプチド多量体は、以下に記載される。
【００７６】
このペプチドは、そのＮ末端およびＣ末端において、アシル（「Ａｃ」と略す）基およびアミド（「Ａｍ」と略す）基でそれぞれキャップされ得る（例えば、Ｎ末端におけるアセチル（ＣＨ３ＣＯ−）およびＣ末端におけるアミド（−ＮＨ２））。
【００７７】
好ましくは末端アミノ基に対して連結した、広範なＮ−末端キャップ官能基としては、例えば以下が企図される：
ホルミル；
１〜１０個の炭素原子を有するアルカノイル（例えば、アセチル、プロピオニル、ブチリル）；
１〜１０個の炭素原子を有するアルケノイル（例えば、ヘキサ−３−エノイル）；
１〜１０個の炭素原子を有するアルキノイル（例えば、ヘキサ−５−イノイル）；
アロイル（例えば、ベンゾイルまたは１−ナフトイル）；
ヘテロアロイル（例えば、３−ピロイルまたは４−キノロイル）；
アルキルスルホニル（例えば、メタンスルホニル）；
アリールスルホニル（例えば、ベンゼンスルホニルまたはスルファニリル）；
ヘテロアリールスルホニル（例えば、ピリジン−４−スルホニル）；
１〜１０個の炭素原子を有する置換アルカノイル（例えば、４−アミノブチリル）；
１〜１０個の炭素原子を有する置換アルケノイル（例えば、６−ヒドロキシ−ヘキサ−３−エノイル）；
１〜１０個の炭素原子を有する置換アルキノイル（例えば、３−ヒドロキシ−ヘキサ−５−イノイル）；
置換アロイル（例えば、４−クロロベンゾイルまたは８−ヒドロキシ−ナフト−２−オイル）；
置換ヘテロアロイル（例えば、２，４−ジオキソ−１，２，３，４−テトラヒドロ−３−メチル−キナゾリン−６−オイル）；
置換アルキルスルホニル（例えば、２−アミノエタンスルホニル）；
置換アリールスルホニル（例えば、５−ジメチルアミノ−１−ナフタレンスルホニル）；
置換ヘテロアリールスルホニル（例えば、１−メトキシ−６−イソキノリンスルホニル）；
カルバモイルまたはチオカルバモイル；
置換カルバモイル（Ｒ’−ＮＨ−ＣＯ）または置換チオカルバモイル（Ｒ’−ＮＨ−ＣＳ）（ここでＲ’は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、置換アリールまたは置換ヘテロアリールである）；
置換カルバモイル（Ｒ’−ＮＨ−ＣＯ）および置換チオカルバモイル（Ｒ’−ＮＨ−ＣＳ）（ここでＲ’は、アルカノイル、アルケノイル、アルキノイル、アロイル、ヘテロアロイル、置換アルカノイル、置換アルケノイル、置換アルキノイル、置換アロイル、または置換ヘテロアロイル）（全て上記で定義したとおり）。
【００７８】
Ｃ末端キャップ官能基は、末端カルボキシルとのアミド結合またはエステル結合のいずれかであり得る。アミド結合を提供するキャップ官能基は、ＮＲ１Ｒ２として示され、ここでＲ１およびＲ２は、以下の群から独立して選び出され得る：
水素；
好ましくは１〜１０個の炭素原子を有するアルキル（例えば、メチル、エチル、イソプロピル）；
好ましくは１〜１０個の炭素原子を有するアルケニル（例えば、プロパ−２−エニル）；
好ましくは１〜１０個の炭素原子を有するアルキニル（例えば、プロパ−２−イニル）；
１〜１０個の炭素原子を有する置換アルキル（例えば、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、メルカプトアルキル、アルキルチオアルキル、ハロゲノアルキル、シアノアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、アルカノイルアルキル、カルボキシアルキル、カルバモイルアルキル）；
１〜１０個の炭素原子を有する置換アルケニル（例えば、ヒドロキシアルケニル、アルコキシアルケニル、メルカプトアルケニル、アルキルチオアルケニル、ハロゲノアルケニル、シアノアルケニル、アミノアルケニル、アルキルアミノアルケニル、ジアルキルアミノアルケニル、アルカノイルアルケニル、カルボキシアルケニル、カルバモイルアルケニル）；
１〜１０個の炭素原子を有する置換アルキニル（例えば、ヒドロキシアルキニル、アルコキシアルキニル、メルカプトアルキニル、アルキルチオアルキニル、ハロゲノアルキニル、シアノアルキニル、アミノアルキニル、アルキルアミノアルキニル、ジアルキルアミノアルキニル、アルカノイルアルキニル、カルボキシアルキニル、カルバモイルアルキニル）；
１０個までの炭素原子を有するアロイルアルキル（例えば、フェナシルまたは２−ベンゾイルエチル）；
アリール（例えば、フェニルまたは１−ナフチル）；
ヘテロアリール（例えば、４−キノリル）；
１〜１０個の炭素原子を有するアルカノイル（例えば、アセチルまたはブチリル）；
アロイル（例えば、ベンゾイル）；
ヘテロアロイル（例えば、３−キノロイル）；
ＯＲ’またはＮＲ’Ｒ’’（ここでＲ’およびＲ’’は、独立して水素、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アシル、アロイル、スルホニル、スルフィニル、またはＳＯ２−Ｒ’’’もしくはＳＯ−Ｒ’’’であり、ここでＲ’’’は、置換アルキルもしくは無置換のアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルケニル、もしくはアルキニルである）。
【００７９】
エステル結合を提供するキャッピング官能基を、ＯＲと称し、ここでＲは：アルコキシ；アリールオキシ；ヘテロアリールオキシ；アラルキルオキシ；ヘテロアラルキルオキシ；置換アルコキシ；置換アリールオキシ；置換ヘテロアリールオキシ；置換アラルキルオキシ；または置換ヘテロアラルキルオキシであり得る。
【００８０】
Ｎ末端キャッピング官能基またはＣ末端キャッピング官能基のいずれか、あるいはその両方は、キャッピングされた分子が、活性な薬物を放出するために体内で自発的な変換または酵素的な変換を受け、そして親薬物分子よりも改善された送達特性を有するプロドラッグ（親薬物分子の薬理学的に不活性な誘導体）として機能する構造であり得る（Ｂｕｎｄｇａａｒｄ  Ｈ，Ｅｄ：Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８５）。
【００８１】
キャッピング基の思慮深い選択は、ペプチドに対する他の活性の追加を可能にする。例えば、Ｎ末端キャップまたはＣ末端キャップに連結したスルフヒドリル基の存在は、誘導体化されたペプチドの他の分子との結合を可能にする。
【００８２】
（ペプチドおよび誘導体の産生）
（一般的な化学合成手順）
本発明のペプチドは、組換えＤＮＡ技術を用いて調製し得る。しかし、その長さによって、ペプチドは、好ましくは、固相合成（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−５４（１９６３）に一般的に記載されるように）を用いて調製されるが、当該分野において公知の他の同等な化学合成もまた有用である。固相ペプチド合成は、ペプチドのＣ末端から、保護されたαアミノ酸を適切な樹脂にカップリングさせることによって、開始され得る。そのような開始物質は、αアミノ保護されたアミノ酸を、エステル結合によって、クロロメチル化樹脂またはヒドロキシメチル樹脂に付着させることによってか、またはＢＨＡ樹脂またはＭＢＨＡ樹脂へのアミド結合によって、調製され得る。
【００８３】
当該分野において周知のそような方法は、例えば、米国特許第５，９９４，３０９号（１９９９年１１月３０日発行）（これはその全体が参考として援用される）に開示される。
【００８４】
（アミノ酸置換改変体およびアミノ酸付加改変体）
本発明はまた、少なくとも１つのアミノ酸残基、好ましくは１つのみのアミノ酸残基が除去され、天然の配列と比較して異なる残基がその場所に挿入されたペプチドを含む。タンパク質化学およびタンパク質構造の詳細な記載については、Ｓｃｈｕｌｚ，  Ｇ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７９、およびＣｒｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｔ．Ｅ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９８４（これらは、本明細書において参考として援用される）を参照のこと。本発明のペプチド分子中になされ得る置換のタイプは、保存的置換であり、保存的置換とは、本明細書において以下の群の１つ内の交換であるとして定義される。
１．小さな、脂肪族、非極性またはわずかに極性の残基：例えば、Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｇｌｙ；
２．極性、負に荷電した残基およびそのアミド：例えば、Ａｓｐ，Ａｓｎ，Ｇｌｕ，ＧＩｎ；
３．極性の正に荷電した残基：例えば、Ｈｉｓ，Ａｒｇ，Ｌｙｓ；
Ｐｒｏ，その独特の幾何学のために、鎖を密接に束縛する。機能的特性における実質的な変更は、さほど保存的でない置換、例えば、上記の群内よりもむしろ、上記の群の間（または上記に示されていない２つの他のアミノ酸群）の置換を選択することによってなされ、この置換は、（ａ）置換の領域におけるペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の荷電または疎水性、あるいは（ｃ）側鎖の体積の維持に対する効果において、より顕著に異なる。本発明に従うほとんどの置換は、ペプチド分子の特徴において、極端な変化を生じない置換である。置換を行う前に、その正確な効果を予測することが困難な場合であっても、当業者は、その効果を、慣用的なスクリーニングアッセイ（好ましくは、以下に記載する生物学的アッセイ）によって評価し得ることを理解する。酸化還元または熱安定性、疎水性、タンパク質分解性分解に対する感受性、あるいはキャリアと凝集する傾向または、多量体に凝集する傾向を含むペプチド特性の改変は、当業者にとって周知の方法によってアッセイされる。
【００８５】
本発明は、脈管形成、腫瘍成長、ＥＣ増殖、ＥＣ移動、またはＥＣ管形成を阻害または減少する方法を提供する。
【００８６】
本発明はまた、ＨＰＲＧのフラグメント、ペプチド、コンフォーマー（ｃｏｎｆｏｒｍｅｒ）、抗体、生物学的等価物または誘導体を含む薬学的組成物を提供する。
【００８７】
本発明において使用されるＨＰＲＧは、天然においてＨＰＲＧを産生する任意の生物（例えば、ウサギ、または好ましくはヒト）由来であり得る。ヒトＨＰＲＧのヌクレオチド配列（配列番号２）およびアミノ酸配列（配列番号１）は、ＧｅｎＢａｎｋから入手可能である（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ１３４９，およびＳｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ番号：ＰＯ４１９６）。
【００８８】
ＨＰＲＧは、血液および尿のような体液から単離されるが、他の供給源（例えば、組織抽出物、あるいは「ネイティブ」のＨＰＲＧを産生する培養物中で増殖している細胞株の産物、またはネイティブＨＰＲＧまたはその機能的な誘導体をコードするＤＮＡによって遺伝子改変され、ＨＰＲＧタンパク質またはその機能的な誘導体（例えば、ドメインまたはより短いフラグメント）を発現する培養物中で増殖している細胞株の産物）からもまた、得ることができる。
【００８９】
ＨＰＲＧ、フラグメントまたは誘導体は、化学的に合成されるか、または組換え方法によって産生される。当該分野において公知である組換え技術は、限定されることはないが、ｃＤＮＡライブラリーのＰＣＲ（例えば、細胞抽出物中のｍＲＮＡの逆転写およびその後のＰＣＲによる）を用いるＤＮＡ増幅が挙げられる。
【００９０】
分子生物学の一般的方法を開示する基本的なテキストとしては以下が挙げられる（これらの全てが本明細書において参考として援用される）：Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（現在の版）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （１９９０）；Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．Ｍ．，ｅｄ，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ  ＆  ＩＩ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８５；Ａｌｂｅｒｓ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  （１９８９）；Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２；およびＯｌｄ，ＲＷ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ：Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ  （１９８１）。
【００９１】
ＨＰＲＧのフラグメントは、制御されたプロテアーゼ反応によって得られる（Ｂｏｒｚａ  Ｄ−Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９６，３５；１９２５−１９３４）。その例は、脈管形成、ＥＣ増殖、移動もしくは管形成および／または腫瘍成長を阻害するＨＰＲＧフラグメントを生成する、ＨＰＲＧの限定されたプラスミン消化、およびそれに続くジチオスレイトールを用いる部分的な還元である。
【００９２】
（ＨＰＲＧの化学的誘導体）
ＨＰＲＧの「化学的誘導体」は、通常はタンパク質の一部ではない追加的な化学的部分を含む。ポリペプチドの共有結合による改変は、本発明の範囲に含まれる。そのような誘導体部分は、溶解度、吸収、生物学的半減期などを改善し得る。そのような効果を媒介し得る部分は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９８０）に開示される。
【００９３】
そのような改変は、ポリペプチドの標的アミノ酸残基を、選択された側鎖または末端の残基と反応し得る有機誘導化薬剤と反応させることによって、分子中に導入され得る。別の改変は、タンパク質の環化である。
【００９４】
システイニル残基は、αハロアセテート（および対応するアミン）と最も一般的に反応し、カルボキシメチル誘導体またはカルボキシアミドメチル誘導体を生じる。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロルメルクリ安息香酸、２−クロルメルクリ−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によって誘導体化される。
【００９５】
ヒスチジル残基は、比較的ヒスチジル側鎖に特異的であるジエチルプロカーボネート（ｄｉｅｔｈｙｌｐｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）（ｐＨ５．５〜７．０）と反応させることによって、誘導体化する。ｐ−ブロモフェナシルブロミドもまた、有用である；反応は、好ましくは、０．１Ｍのカコジル酸ナトリウム中で、ｐＨ６．０で行われる。
【００９６】
リジニル残基およびアミノ末端残基は、無水コハク酸または他の無水カルボン酸を用いて誘導体化される。環状無水カルボン酸を用いる誘導体化は、リジニル残基の電荷を逆転させる効果を有する。アミノを含む残基の誘導体化のための他の適切な試薬としては、イミドエステル（例えば、メチルピコリンイミデート）；ピリドキサルリン酸；ピリドキサール；クロロボロヒドリド；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソウレア；２，４ペンタンジオン；およびトランスアミナーゼによって触媒されるグリオキシル酸との反応が挙げられる。
【００９７】
アルギニル残基は、１つまたは数個の従来の試薬（フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンを含む）との反応によって改変される。そのような誘導体化は、グアニジン官能基の高いｐＫａのために、反応がアルカリ条件で行われることが必要である。さらに、これらの試薬は、リジンの基、およびアルギニンのεアミノ基とも反応し得る。
【００９８】
チロシル残基の改変は、スペクトル標識をペプチドに導入することを可能とする。この導入は、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によって達成される。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミジゾルおよびテトラニトロメタンを用いて、それぞれＯ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体を生成する。
【００９９】
カルボキシ側鎖基（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）（例えば、１−シクロヘキシル−３−（２−モルフォリニル−（４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミド（１−ｅｔｈｙｌ−３−（４−ａｚｏｎｉａ−４，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ））と反応することによって、選択的に修飾され得る。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基は、アンモニアとの反応によって、アスパラギニル残基およびグルタミニル残基に変換され得る。
【０１００】
アスパルチル残基およびグルタミル残基は、アンモニウムイオンでの反応によってアスパラギニル残基およびグルタミニル残基に変換される。逆に、グルタミニル残基およびアスパラギニル残基は、対応するグルタミル残基およびアスパルチル残基に脱アミドされ得る。脱アミドは、穏やかな酸性条件下で行われ得る。これらの残基のいずれかの形態は、本発明の範囲内に入る。
【０１０１】
二官能性薬剤での誘導体化は、水不溶性支持体マトリクスまたは他の高分子キャリアにペプチドを架橋させるために有用である。一般に使用される架橋剤としては、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、４−アジドサリチル酸とのエステル、ホモ二官能性イミドエステル（ジスクシンイミドエステル（例えば、３，３’−ジチオビス（スクシニミジルプロピオネート））および二官能性マレイミド（例えば、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン）を含む）が挙げられる。
【０１０２】
誘導体化剤（例えば、メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデート）は、光の存在下で架橋を形成し得る光活性化可能な中間体を産生する。あるいは、反応性水不溶性マトリクス（例えば、臭化シアン活性化炭水化物）および米国特許第３，９６９，２８７号；同３，６９１，０１６号；同４，１９５，１２８号；同４，２４７，６４２号；同４，２２９，５３７号；および同４，３３０，４４０号に記載される反応性基質が、タンパク質固定化に使用される。
【０１０３】
他の改変としては、プロリンおよびリジンの水酸化、セリン残基またはトレオニン残基の水酸基のリン酸化、リジン側鎖、アルギニン側鎖およびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６（１９８３））、Ｎ末端アミンのアセチル化、ならびにいくつかの場合において、Ｃ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
【０１０４】
また、１つ以上のＤ−アミノ酸が１つ以上のＬ−アミノ酸に対して置換されるペプチドが含まれる。
【０１０５】
（多量体ペプチド）
本発明はまた、抗脈管形成活性を有する、ＨＰＲＧタンパク質のＨ／Ｐドメイン由来の１つ以上の配列単位の反復から形成されるより長いペプチドを含む。このような多量体の好ましいペプチド単位は、ペンタペプチドであり、好ましくはＨｉｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ（配列番号８）、Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ（配列番号９）またはＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ（配列番号１０）である。
【０１０６】
これらのペプチド単位のさらなる改変体は、好ましくはＨｉｓ、ＰｒｏおよびＧｌｙより選択される１〜４アミノ酸を含む。
【０１０７】
このような多量体は、本明細書中に記載されるペプチドまたはこれらの改変体のいずれかより形成され得る。さらに、ペプチド多量体は、ペプチドモノマー（ヒトＨＰＲＧまたはウサギＨＰＲＧのネイティブな配列またはそのさらなる改変体のいずれか）の異なる組み合わせを含み得る。このようなオリゴマーペプチドまたは多量体ペプチドは、化学合成、または本明細書中に考察されるような組換えＤＮＡ技術によって作製され得る。化学合成によって産生される場合、オリゴマーは、好ましくはコアペプチド配列の２〜１２回の反復を有し、より好ましくは、２〜８回の反復を有し、そして多量体中のアミノ酸（または、リンカーまたはスペーサーを含む場合、これらの等価物）の総数は、約１１０残基を超えるべきではない。
【０１０８】
好ましい合成化学ペプチド多量体は、式
Ｐ１ｎ
を有し、ここで、Ｐ１は、哺乳動物ＨＰＲＧタンパク質のＨ／Ｐドメイン由来の５つ連続するアミノ酸に対応するペンタペプチド、またはこれらのペンタペプチドの置換改変体もしくは付加改変体であり、ここで、ｎ＝２〜８であり、ここで、このペンタペプチドは、単独または多量体形態で、細胞浸潤、内皮管形成または脈管形成を阻害する生物学的活性を、このような活性のインビトロまたはインビボでのバイオアッセイにおいて有する。
【０１０９】
別の実施形態において、好ましい合成化学ペプチド多量体は、式
（Ｐ１−Ｘｍ）ｎ−Ｐ２
を有し、Ｐ１およびＰ２は、哺乳動物ＨＰＲＧタンパク質のＨ／Ｐドメイン由来の５つ連続するアミノ酸に対応するペンタペプチド、またはこれらのペンタペプチドの付加改変体であり、ここで、（ａ）Ｐ１およびＰ２は、同一であっても異なってもよく；さらに、多量体中のＰ１の各発生は、異なるペンタペプチド（または改変体）であり得；（ｂ）Ｘは、Ｃ１−Ｃ５アルキル、Ｃ１−Ｃ５アルケニル、Ｃ１−Ｃ５アルキニル、４つまでの酸素原子を含むＣ１−Ｃ５ポリエーテルであり、ここで、ｍ＝０または１であり、ｎ＝１〜７であり；Ｘはまた、ＧｌｙＺであり得、ここで、ｚ＝１〜６であり、そして、ここで、このペンタペプチドは、単独または多量体形態で、細胞浸潤、内皮管形成または脈管形成を阻害する生物学的活性を、このような活性のインビトロまたはインビボでのバイオアッセイにおいて有する。
【０１１０】
組換え的に産生される場合、スペーサーは、上記のようにＧｌｙＺであり、ここで、ｚ＝１〜６であり、そしてこの多量体は、この発現系が可能とする程度のコアペプチド配列の反復数（例えば、２〜約１００回の反復）を有し得る。好ましい組換え産生されたペプチド多量体は、式
（Ｐ１−Ｇｌｙｚ）ｎ−Ｐ２
を有し、ここで、
（ａ）Ｐ１およびＰ２は、哺乳動物ＨＰＲＧタンパク質のＨ／Ｐドメイン由来の５つ連続するアミノ酸に対応するペンタペプチド、またはこれらのペンタペプチドの付加改変体であり、ここで、Ｐ１およびＰ２は、同一であっても異なってもよく；さらに、多量体中のＰ１の各発生は、異なるペンタペプチド（または改変体）であり得；
ここで、ｎ＝１〜１００であり、ｚ＝０〜６であり；
ここで、このペンタペプチドは、単独または多量体形態で、細胞浸潤、内皮管形成または脈管形成を阻害する生物学的活性を、このような活性のインビトロまたはインビボでのバイオアッセイにおいて有する。
【０１１１】
前述のペプチド多量体において、Ｐ１およびＰ２は、好ましくは配列番号８，９または１０である。
【０１１２】
多量体は、必要に応じてＮ末端およびＣ末端でキャップされる。
【０１１３】
このような多量体が本明細書中に記載されるペプチドまたは改変体のいずれかより形成され得ることは、理解される。多量体の付加改変体モノマー単位が上記の生物学的活性を有することは、好ましいが、このことは、そのモノマー単位が寄与する多量体が活性を有する限り必要ではない。
【０１１４】
（診断組成物および予後組成物）
本発明のペプチドは、検出可能に標識され得、そして、例えば、ペプチド結合タンパク質リガンド、または細胞の表面上または細胞内部に関わらない細胞結合部位／レセプター（例えば、上記のようなＴ細胞、マクロファージまたは血小板上の結合部位）を検出するために使用され得る。結合中および結合後のペプチドの運命は、標識を検出するための適切な方法を使用することによってインビトロまたはインビボで追跡され得る。標識されたペプチドは、インビボで診断および予後のため（例えば、潜伏した転移病巣を画像化するため、または他の型のインサイチュでの評価のため）に利用され得る。
【０１１５】
用語「診断的に標識された」は、ポリペプチドまたはペプチドが診断的に検出可能な標識を付着されていることを意味する。以下に記載される当業者に公知の多くの種々の標識および標識方法が存在する。本発明において使用され得る一般的な標識のクラスとしては、放射性同位元素、パラ磁気同位元素、および陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）により画像化され得る化合物、蛍光化合物または着色化合物などが挙げられる。適切な検出可能な標識としては、放射性標識、蛍光（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ）標識、蛍光（ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ）標識、色素発生性標識または他の化学標識が挙げられる。γカウンター、シンチレーションカウンターまたはオートラジオグラフィーによって単純に検出される有用な放射標識（放射性核種）としては、３Ｈ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓおよび１４Ｃが挙げられる。１３１Ｉはまた、有用な治療用同位元素である（以下を参照のこと）。
【０１１６】
多数の米国特許（本明細書中で参考として援用される）は、金属を、より大きな分子と複合化するための方法および組成物（有用なキレート剤の記載を含む）を開示する。それらの金属は、好ましくは、検出可能な金属原子（放射性核種を含む）であり、そしてタンパク質および他の分子と複合体化される。これらの書類としては、米国特許第５，６２７，２８６号（Ｈｅｔｅｒｏａｔｏｍ−ｂｅａｒｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄｓ  ａｎｄ  ｍｅｔａｌ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｔｈｅｒｅｏｆ）；米国特許第５，６１８，５１３号（Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）；米国特許第５，５６７，４０８号；米国特許第５，４４３，８１６号（Ｐｅｐｔｉｄｅ−ｍｅｔａｌ  ｉｏｎ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄ）；米国特許第５，５６１，２２０号（Ｔｃ−９９ｍ  ｌａｂｅｌｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）が挙げられる。
【０１１７】
一般的蛍光標識としては、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒドおよびフルオレサミンが挙げられる。発蛍光団（例えば、ダンシル基）は、特定の波長の光によって、蛍光を発すように励起されなければならない。例えば、Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，第６版，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，１９９６を参照のこと。フルオレセイン、フルオレセイン誘導体およびフルオレセイン様分子（例えば、Ｏｒｅｇｏｎ  ＧｒｅｅｎＴＭおよびその誘導体、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ＧｒｅｅｎＴＭならびにＲｈｏｄｏｌ  ＧｒｅｅｎＴＭ）は、イソチオシアネート、スクシンイミジルエステルまたはジクロロトリアジニル反応性基を使用して、アミン基と結合される。同様に、発蛍光団はまた、マレイミド、ヨードアセトアミド、およびアジリジン反応性基を使用して、チオール基と結合され得る。長波長ローダミン（これらは、窒素上に置換基を有する基本的にはＲｈｏｄａｍｉｎｅ  ＧｒｅｅｎＴＭ誘導体である）は、公知の最も光安定性の蛍光標識試薬のうちにある。それらのスペクトルは、ｐＨ４とｐＨ１０との間での変化により影響されない。このことは、多くの生物学的適用のためにフルオレセインを上回る重要な利点である。このグループは、テトラメチルローダミン、Ｘ−ローダミン、およびＴｅｘａｓ  ＲｅｄＴＭ誘導体を包含する。本発明に従うペプチドを誘導体化するための他の好ましい発蛍光団は、紫外光により励起される発蛍光団である。例としては、カスケードブルー、クマリン誘導体、ナフタレン類（塩化ダンシルがメンバーである）、ピレン類、およびピリジルオキサゾール誘導体が挙げられる。また、標識として含まれるのは、最近記載された２つの関連無機物質（半導体ナノクリスタル（例えば、硫酸カドミウムを含む）（Ｂｒｕｃｈｅｚ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：２０１３−２０１６（１９９８））およびクォンタムドット（例えば、硫酸亜鉛キャップＣｄセレン化合物）（Ｃｈａｎ，Ｗ．Ｃ．Ｗ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：２０１６−２０１８（１９９８））である。
【０１１８】
なお別のアプローチにおいて、そのペプチドのアミノ基は、蛍光産物（例えば、フルオレサミン、ジアルデヒド（例えば、ｏ−フタルジアルデヒド、ナフタレン−２，３−ジカルボキシレート、およびアントラセン−２，３−ジカルボキシレート））を生じる試薬と反応可能にされる。７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ）誘導体（塩化物およびフッ化物の両方）が、蛍光産物を生じるようにアミンを改変するために有用である。
【０１１９】
本発明のペプチドはまた、蛍光発光金属（例えば、１５２Ｅｕ、またはランタニド系列の他の金属）を使用して、検出用に標識され得る。これらの金属は、金属キレート基（例えば、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ（下記実施例Ｘを参照のこと））またはエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ））を使用して、そのペプチドに結合され得る。例えば、ＤＴＰＡは、無水物として入手可能であり、これは、本発明のＮＨ２含有ペプチドを容易に改変し得る。
【０１２０】
インビボ診断またはインビボ治療のために、放射性核種が、キレート剤（例えば、ＤＴＰＡおよびＥＤＴＡ）を使用して、直接的または間接的のいずれかで、そのペプチドに結合され得る。このような放射性核種の例としては、９９Ｔｃ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、９７Ｒｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、８９Ｚｒ、９０Ｙおよび２０１Ｔｌが、挙げられる。一般的に、診断用途における検出可能性に必要な標識ペプチドの量は、考慮要件（例えば、年齢、性別、および患者における疾患の程度、禁忌（存在する場合）および他の変数）に依存して変化し、そして個々の医師または診断者により調整されるべきである。投与量は、０．０１ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇまで変化し得る。
【０１２１】
このペプチドはまた、リン光化合物または化学発光化合物に結合することによって、検出可能にされ得る。その後、この化学発光タグ化ペプチドの存在は、化学反応の経過の間に生じる発光の存在を検出することによって、決定され得る。特に有用な化学発光物質の例は、ルミノール、イソルミノール、サーモマティック（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸塩である。同様に、生物発光化合物が、このペプチドを標識するために使用され得る。生物発光は、化学発光の型であり、触媒タンパク質がその化学発光反応の効率を増加する生物学的系において見出される。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することによって、決定される。標識のために重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、およびエクオリンである。
【０１２２】
なお別の実施形態において、高い励起係数を有する発色団を有するかまたは生じる、色素原性化合物に基づく、比色検出が使用される。
【０１２３】
標識されたペプチドのインサイチュ検出は、被検体から組織学的検体を取り出すこと、およびその検体を、その標識を検出するに適切な条件下で顕微鏡により検査することによって、達成され得る。広範な種類の組織学的方法（例えば、染色手順）のいずれかが、このようなインサイチュ検出を達成するために改変され得ることを、当業者は容易に認識する。
【０１２４】
診断的インビボ放射線画像化のために、利用可能な検出装置の型は、放射性核種を選択する際の主要な要因である。選択される放射性核種は、特定の装置により検出可能な型の減衰を有さなければならない。一般的に、診断的画像化を可視化するための従来の任意の方法が、本発明に従って使用され得る。インビボ診断のために放射性核種を選択する際の別の要因は、その放射性核種の半減期が、その標識が標的組織による最大取込み時になお検出可能であるに十分に長いが、宿主の有害な照射を最小にするに十分に短い。１つの好ましい実施形態において、インビボ画像化のために使用される放射性核種は、粒子を発しないが、１４０〜２００ｋｅＶの範囲にある多数の光子を生じ、この光子が、従来のガンマ線カメラにより容易に検出され得る。
【０１２５】
インビボ画像化は、他の方法によっては観察可能ではない原発巣転移を検出するために使用され得る。画像化は、腫瘍を非侵襲的に病期決定するため、またはＨＰＲＧ結合部位またはリガンドの増加したレベルの存在と関連する他の疾患を検出するために、使用され得る。
【０１２６】
（ペプチド模倣物）
本明細書中に記載されるペプチドの化学的誘導体の好ましい型は、ＨＰＲＧの生物学的効果またはＨＰＲＧの生物学的に活性なペプチドの生物学的効果を模倣する、ペプチド模倣化合物である。ペプチド模倣因子は、ＨＰＲＧの結合エレメントの空間間隔特性を再現して、ＨＰＲＧの結合活性または生物学的活性を有するようにする、非天然ペプチドまたは非ペプチド因子であり得る。生物学的に活性なＨＰＲＧペプチドと同様に、ペプチド模倣物は、結合面（これは、ＨＰＲＧが結合する任意のリガンドと相互作用する）および非結合面を有する。また、ＨＰＲＧまたはそのペプチドと同様に、ペプチド模倣物の非結合面は、そのペプチド模倣物の結合面を改変することなく種々の治療部分および診断部分によって改変され得る、官能基を含む。ペプチド模倣物の好ましい実施形態は、この分子の非結合面上にアニリンを含む。アニリンのＮＨ２基は、ｐＫａ約４．５を有し、従って、そのペプチド模倣物の結合面上のいかなるＮＨ２官能基も改変することなく、任意のＮＨ２選択試薬により改変され得る。他のペプチド模倣物は、その結合面上にいかなるＮＨ２官能基も有さないかもしれず、従って、任意のＮＨ２が、ｐＫａに関わらず、結合のための部位として非結合面上に提示され得る。さらに、他の改変可能な官能基（例えば、−ＳＨおよび−ＣＯＯＨ）が、結合の部位としてペプチド模倣物の非結合面に組み込まれ得る。治療部分または診断部分はまた、ペプチド模倣物の合成の間に直接組込まれ得、この部分は、その分子の非結合面上に優先的に提示される。
【０１２７】
本発明はまた、部分的ペプチド特性を保持する化合物を包含する。例えば、本発明のペプチド内のタンパク質分解的に不安定な任意の結合が、その分子の残りがそのペプチドの特性を保持しつつ、非ペプチドエレメント（例えば、アイソスター（Ｎ−メチル化；Ｄ−アミノ酸）または減少したペプチド結合により、選択的に置換され得る。
【０１２８】
ペプチド模倣化合物（アゴニスト、基質、またはインヒビターのいずれか）は、多数の生物活性ペプチド（例えば、オピオイドペプチド、ＶＩＰ，トロンビン、ＨＩＶプロテアーゼなど）について記載されている。ペプチド模倣化合物を設計および調製するための方法は、当該分野で公知である（Ｈｒｕｂｙ，Ｖ．Ｊ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ３３：１０７３−１０８２（１９９３）；Ｗｉｌｅｙ，Ｒ．Ａ．ら、Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．１３：３２７−３８４（１９９３）；Ｍｏｏｒｅら、Ａｄｖ．ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ３３：９１−１４１（１９９５）；Ｇｉａｎｎｉｓら、Ａｄｖ．ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．２９：１−７８（１９９７）（これらの参考文献は、その全体が参考として援用される））。これらの方法は、ＨＰＲＧペプチドの少なくとも結合能力およびと結合特異性を保有し、かつ好ましくはその生物学的活性も保有する、ペプチド模倣物を作製するために使用される。当業者が利用可能なペプチド化学の知識および一般的有機化学は、本開示を考慮して、そのような化合物を設計および合成するために十分である。
【０１２９】
例えば、そのようなペプチド模倣物は、遊離しているかまたはリガンド（例えば、（ａ）ヘパリン、プラスミノゲン、フィブリノゲン、ビトロネクチン、およびトロンボスポンジン、または（ｂ）小さいリガンド（例えば、ヘムおよび遷移金属イオン（亜鉛、銅、およびニッケル））と複合体化されているかのいずれかである、本発明のペプチドの結晶学的に誘導した３次元構造の検査によって、同定され得る。あるいは、そのリガンドに結合している本発明のペプチドの構造は、核磁気共鳴分光法技術によって、得られ得る。このペプチドとそのリガンドまたはレセプターとの相互作用の立体化学に関するより良好な知識は、そのようなペプチド模倣因子の合理的設計を可能にする。リガンドの非存在下での本発明のペプチドまたはタンパク質の構造もまた、模倣分子の設計のために足場を提供し得る。
【０１３０】
（ＨＰＲＧのエピトープに特異的な抗体）
本発明は、ＨＰＲＧのエピトープ（好ましくは、Ｈ／Ｐドメインのエピトープ）と反応性である抗体（ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方）を提供する。本明細書中で「抗Ｈ／Ｐ抗体」と呼ばれる抗体は、異種であっても、同種異系であっても、同系であっても、またはそれらの改変形態（例えば、ヒト化抗体またはキメラ抗体）であってもよい。抗ＨＰＲＧ抗体のイディオタイプに特異的な抗イディオタイプ抗体もまた、包含される。
【０１３１】
以下の説明において、免疫学の当業者に公知の種々の方法論に対して、言及がなされる。言及がなされるそのような公知の方法論を示す刊行物および他の物質は、その全体が本明細書中に参考として、あたかも完全に示されたかのように援用される。免疫学の一般的原理を示す標準的参考業績としては、Ａ．Ｋ．Ａｂｂａｓら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第４版）、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，２０００；Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙら、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ．Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ，第４版、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９；Ｒｏｉｔｔ，Ｉ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（現行版）Ｃ．Ｖ．Ｍｏｓｂｙ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ（１９９９）；Ｋｌｅｉｎ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ（１９９０）が、挙げられる。
【０１３２】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ならびにその産生および使用のための方法が、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５）；米国特許第４，３７６，１１０号；Ｈａｒｔｌｏｗ，Ｅ．ら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８８）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８０）；Ｈ．Ｚｏｌａら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９８２）に記載されている。
【０１３３】
抗イディオタイプ抗体は、例えば、Ｉｄｉｏｔｙｐｙ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８４；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，第７９巻，１９８４；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，第９０巻、１９８６；Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１１９巻、１９８５；Ｂｏｎａ，Ｃ．ら、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．ｐｐ．３３−８１（１９８１）；Ｊｅｒｎｅ，ＮＫ，Ａｎｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２５Ｃ：３７３−３８９（１９７４）；Ｊｅｒｎｅ，ＮＫ，Ｉｄｉｏｔｙｐｅｓ−Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｉｎｓｉｄｅ，Ｗｅｓｔｅｎ−Ｓｃｈｎｕｒｒ，Ｉ．編、Ｅｄｉｔｉｏｎｅｓ  Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，１９８２，Ｕｒｂａｉｎ，Ｊら、Ａｎｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３Ｄ：１７９−（１９８２）；Ｒａｊｅｗｓｋｙ，Ｋ．ら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：５６９−６０７（１９８３）に記載されている。
【０１３４】
用語「抗体」はまた、抗原結合部位を含みかつＨＰＲＧエピトープに結合可能である、インタクトな分子とそのフラグメントとの両方を包含することが意味される。これらは、ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントを包含し、これらのフラグメントは、インタクトな抗体のＦｃフラグメントを欠く、循環からより迅速に除去され、そしてインタクトな抗体よりも非特異的でない組織結合を有し得る（Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６−３２５（１９８３））。また、Ｆｖフラグメント（Ｈｏｃｈｍａｎ，Ｊ．ら（１９７３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １２：１１３０−１１３５；Ｓｈａｒｏｎ，Ｊ．ら（１９７６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １５：１５９１−１５９４）もまた、包含される。これらの種々のフラグメントは、従来の技術（例えば、プロテアーゼ切断または化学的切断（例えば、Ｒｏｕｓｓｅａｕｘら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２１：６６３−６９（１９８６）を参照のこと）を使用して生成される。
【０１３５】
ポリクローナル抗体は、免疫した動物（例えば、ウサギ、ヤギ、齧歯類など）由来の血清として得られ、そしてさらなる処理なしで直接使用され得るか、または従来の濃縮方法もしくは精製方法（例えば、硫酸アンモニウム沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィー（Ｚｏｌａ（前出）を参照のこと）に供され得る。
【０１３６】
本発明の抗Ｈ／Ｐ抗体を生成するために使用される免疫原は、完全ＨＰＲＧタンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体を含み得る。好ましい免疫原は、ＨＰＲＧのＨ／Ｐ中心ドメインのすべてまたは一部を含む。このドメインを含む免疫原は、当該分野で公知の種々の方法（例えば、従来の組換え方法を使用するクローン化遺伝子の発現、起源細胞からの単離、高レベルのＨＰＲＧを発現する細胞集団など）において生成される。
【０１３７】
そのｍＡｂは、従来のハイブリドーマ技術（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（前出）により紹介された手順およびその改変形（上記参考文献を参照のこと））を使用して、生成され得る。動物（好ましくは、マウス）が、上記のような免疫原で免疫することによって初回刺激され、その初回刺激された動物において所望の抗体応答が惹起される。
【０１３８】
初回刺激された動物のリンパ節、脾臓、または末梢血に由来するＢリンパ球が、一般的には融合促進剤（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））の存在下で、骨髄腫細胞と融合される。以下の多数のマウス骨髄腫細胞株のいずれかが、そのような用途のために利用可能である：Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４、またはＨＬ１−６５３骨髄腫株（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌ，ＭＤから入手可能）。その後の工程は、未融合親骨髄腫細胞およびドナーリンパ球細胞が最終的には死滅すると同時にそのハイブリドーマ細胞のみが生存するように、選択培地中で増殖させることを包含する。これらは、クローン化され増殖され、そしてその上清が、所望の特異性の抗体の存在について、例えば、ＨＰＲＧタンパク質を使用する免疫アッセイ技術によって、スクリーニングされる。ポジティブクローンが、例えば、限界希釈により、サブクローン化され、そのｍＡｂが単離される。
【０１３９】
これらの方法に従って生成されるハイブリドーマは、当該分野で公知の技術（一般的には、Ｆｉｎｋら、Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．９：１２１−３３（１９８４）９を使用して、インビトロまたはインビボで（腹水中で）増殖され得る。一般的には、個々の細胞株が、培養中で増殖され、そして高濃度の単一ｍＡｂを含む培養培地が、デキャンテーション、ろ過、または遠心分離によって採集され得る。
【０１４０】
その抗体は、通常の多価構造の代わりに単鎖抗体すなわちｓｃＦｖとして、生成され得る。単鎖抗体は、目的のＩｇ由来の超可変領域を含み、そしてネイティブＩｇの抗原結合部位を再現すると同時にインタクトなＩｇの大きさの一部である（Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．ら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８−１０４１；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．ら（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８：４９７−５１５；Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３−２９９）；Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３；Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９；Ｊｏｓｔ  ＣＲら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９４  ２６９：２６２６７−２６２７３；米国特許第４，７０４，６９２号、同第４，８５３，８７１号、同第４，９４６，７７８号；同第５，２６０，２０３号；同第５，４５５，０３０号）。そのＨ鎖のＶ領域およびＬ鎖のＶ領域をコードするＤＮＡ配列は、少なくとも約４アミノ酸（代表的には、小型の中性アミノ酸）をコードするリンカーに連結される。この融合物によりコードされるタンパク質は、もとの抗体の特異性および親和性を保持する、機能性可変領域の集合を可能にする。
【０１４１】
インビボ用途のため（特に、ヒトへの注入）のために、当該分野で公知の方法を使用して抗体をヒト化することによって、そのｍＡｂの免疫原性を減少させることが望ましい。そのヒト化抗体は、トランスジェニックヒトＩｇ定常領域遺伝子（例えば、ＷＯ  ９０／１００７７およびＷＯ  ９０／０４０３６）を有する動物の産物であり得る。あるいは、目的の抗体は、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ヒンジドメイン、および／またはフレームワークドメインを、対応するヒト配列で置換するように遺伝子操作され得る（ＷＯ  ９２／０２１９０を参照のこと）。
【０１４２】
抗体は、特定の望ましい特性について選択され得る。治療のために使用される抗体の場合、抗体スクリーニング手順は、脈管形成、細胞浸潤などを測定する、インビトロまたはインビボでのバイオアッセイのいずれかを包含し得る。さらに、それらの抗体は、それらが脈管形成（または生じる腫瘍の増殖もしくは転移）を促進または阻害するか否かを観察するために、本明細書中に記載される種々の腫瘍モデルにおいてスクリーニングされ得る。このようにして、ＨＰＲＧ模倣物またはＨＰＲＧアンタゴニストである抗体が、選択され得る。従って、本発明は、ＨＰＲＧまたはそのＨ／Ｐドメインに結合しその作用を阻害することによって脈管形成を促進する、治療抗体（以下により詳細に考察される）を包含する。
【０１４３】
（ＨＰＲＧの遊離Ｈ／Ｐドメインを検出するための抗体の使用）
Ｈ／Ｐドメインのエピトープに特異的な抗体は、体液またはサンプル（好ましくは、血清または血漿）中で、これらのエピトープを含む分子を検出するイムノアッセイにおいて有用である。このような抗体は、ＨＰＲＧ、ＨＰＲＧの切断されたＨ／Ｐドメインまたはこのドメインのエピトープ含有フラグメントを検出する。従って、腫瘍環境におけるタンパク質分解が生じる場合、血漿（腫瘍環境におけるタンパク質分解が遊離Ｈ／Ｐを放出する場合のみ）または組織におけるＨ／Ｐドメインの放出を生じる。
【０１４４】
ＨＰＲＧから放出されたＨ／Ｐドメインのレベルを測定することにより、本発明の抗体およびイムノアッセイは、疾患の進行をモニターするために診断的に使用される。ここで、Ｈ／Ｐドメインレベルは、存在する腫瘍組織の量を反映し得る。
【０１４５】
当該分野で公知の任意の従来の方法が、この目的のために使用され得るが、ＥＬＩＳＡのような酵素イムノアッセイが好ましい。イムノアッセイ法はまた、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．ら、編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９１（すなわち最新版）；Ｂｕｔｔ，Ｗ．Ｒ．（編）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：Ｔｈｅ  Ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｒｔ，Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８４；Ｂｉｚｏｌｌｏｎ，Ｃｈ．Ａ．，編，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８４；Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．，ＥＬＩＳＡ（第２９章），ｖａｎ  Ｏｓｓ，Ｃ．Ｊ．ら，（編），ＩＭＭＵＮＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４，ｐｐ．７５９−８０３；Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．（編），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９１；Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｎ  Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｍａｒｃｈ，１９８６；Ｗｏｒｋ，Ｔ．Ｓ．ら，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｏｒｔｈ  Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＹ，（１９７８）（Ｃｈａｐｔｅｒ  ｂｙ  Ｃｈａｒｄ，Ｔ．，「Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｅ  Ａｓｓａｙ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」）に記載される。
【０１４６】
（組成物のインビトロ試験）
（Ａ．内皮細胞移動についてのアッセイ）
ＥＣ移動については、１トランスウェルあたり、２００μＬのＩ型コラーゲン（５０μｇ／ｍＬ）溶液を添加し、３７℃にて一晩インキュベートすることにより、トランスウェルを、Ｉ型コラーゲン（５０μｇ／ｍＬ）を用いてコーティングする。トランスウェルを、２４ウェルプレート中でアセンブリし、走化性因子（例えば、ＦＧＦ−２）を、総容量０．８ｍＬの培地中にて底部チャンバに添加する。例えば、ヒト臍静脈上皮細胞（ＨＵＶＥＣ）のようなＥＣ（これは、トリプシンを使用して単層培養物から剥離される）を、無血清培地を使用して、約１０６細胞／ｍＬの最終濃度に希釈し、この細胞懸濁物うちの０．２ｍＬを各トランスウェルの上部チャンバーに添加する。試験されるインヒビターを、上部チャンバおよび底部チャンバの両方に添加し、移動を、３７℃の加湿雰囲気下で５時間続行する。トランスウェルをプレートからはずし、ＤｉｆｆＱｕｉｋ（登録商標）を使用して染色する。移動しなかった細胞を、綿棒で掻き取ることにより上部チャンバから取り出し、膜を外し、スライドに固定し、高出力視野（４００×）下で計数して、移動した細胞の数を決定する。
【０１４７】
（Ｂ．抗侵襲性活性の生物学的アッセイ）
本発明の組成物は、それらの抗侵襲性能力について試験される。Ｍａｔｒｉｇｅｌ侵襲アッセイ系（Ｋｌｅｉｎｍａｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５：３１２−３１８，１９８６およびＰａｒｉｓｈら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５２：３７８−３８３，１９９２により詳細に記載される）として公知のアッセイにおけるＥＣまたは腫瘍細胞（例えば、ＰＣ−３ヒト前立腺癌腫細胞）のような細胞が再構築された基底膜（例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標））を通過して侵襲する能力。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）は、ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（例えば、ペルルカン（ｐｅｒｌｅｃａｎ）（これは、ｂＦＧＦに結合し、ｂＦＧＦを局在化させる））、ビトロネクチン、ならびにトランスホーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）、ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子（ｕＰＡ）、組織プラスミノゲン活性化因子（ｔＰＡ）、およびプラスミノゲン活性化因子インヒビター１型（ＰＡＩ−１）として公知のセルピンを含む、再構成された基底膜である（Ｃｈａｍｂｅｒｓら，Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．５５：１５７８−１５８５，１９９５）。細胞外レセプターまたは細胞外酵素を標的とする化合物についてのこのアッセイで得られた結果により、インビボでのこれらの化合物の効力が予測されることは、当該分野で受け入れられている（Ｒａｂｂａｎｉら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６３：８４０−８４５，１９９５）。
【０１４８】
このようなアッセイは、トランスウェル組織培養挿入物を使用する。侵襲性細胞は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）およびポリカーボネート膜の上側を通過して横断し、この膜の底部に接着し得る細胞と規定される。ポリカーボネート膜（８．０μｍ孔サイズ）を含むトランスウェル（Ｃｏｓｔａｒ）は、滅菌ＰＢＳにて終濃度７５μｇ／ｍｌに希釈したＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（挿入物あたり６０μＬの希釈したＭａｔｒｉｇｅｌ）を使用してコーティングされ、２４ウェルプレートのウェルに配置される。この膜を生物学的安全キャビネット中で一晩乾燥させ、次いで、抗生物質を含む１００μＬのＤＭＥＭを添加して、振盪機テーブルで１時間振盪することにより再水和する。このＤＭＥＭを、吸引によって各挿入物から取り除き、０．８ｍＬのＤＭＥＭ／１０％  ＦＢＳ／抗生物質を、２４ウェルプレートの各ウェルに添加し、これがトランスウェルの外側（「底部チャンバ」）を囲むようにする。新たなＤＭＥＭ／抗生物質（ｌ００μＬ）、ヒトＧｌｕ−プラスミノゲン（５μｇ／ｍＬ）、および試験される任意のインヒビターをトランスウェルの内側にある上部（「上部チャンバ」）に添加する。試験される細胞を、トリプシン処理し、ＤＭＥＭ／抗生物質中に再懸濁し、次いで、この細胞を、終濃度８００，０００細胞／ｍＬにてトランスウェルの上部チャンバに添加する。上部チャンバの最終容積を、２００μＬに調節する。次いで、アセンブリしたプレートを、加湿５％ＣＯ２雰囲気にて７２時間インキュベートする。インキュベーションの後、細胞を固定し、ＤｉｆｆＱｕｉｋ（登録商標）（ギムザ染色）を使用して染色し、次いで、上部チャンバを、綿棒を使用して掻き取って、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）および膜を通過して侵襲しなかった全ての細胞を除去する。この膜を、Ｘ−ａｃｔｏ（登録商標）ブレードを使用してトランスウェルから剥がし、Ｐｅｒｍｏｕｎｔ（登録商標）およびカバーガラスを使用してスライドガラスに固定し、高出力（４００×）視野で計数する。侵襲された細胞の平均を、計数される５〜１０視野から決定し、インヒビター濃度の関数としてプロットする。
【０１４９】
（Ｃ．抗脈管形成活性の管形成アッセイ）
本発明の化合物を、それらの抗脈管形成活性について、インビトロでの２つの異なるアッセイ系のうちの１つで試験する。
【０１５０】
調製され得るかまたは市販され得る内皮細胞（例えば、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）またはヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ））を、２×１０５細胞／ｍＬの濃度にて、フィブリノーゲン（リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中、５ｍｇ／ｍＬ）と、１：１（ｖ／ｖ）の比で混合する。トロンビンを添加し（終濃度５単位／ｍＬ）、この混合物を、直ぐに２４ウェルプレートに移す（０．５ｍＬ／ウェル）。フィブリンゲルを形成させ、次いで、試験化合物とともに、ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦをウェルに添加する（各々、終濃度５ｎｇ／ｍＬ）。細胞を、３７℃にて、５％ＣＯ２中、４日間インキュベートし、その時点で、各ウェル中の細胞を、計数し、丸形、枝なし細長形、１つの枝あり細長形、または２以上の枝あり細長形に分類する。結果を、各濃度の化合物について、５つのウェルの平均として表す。代表的には、脈管形成インヒビターの存在下で、細胞は、丸形のままであるか、または未分化の管を形成するかのいずれか（例えば、０個または１つの枝）である。
【０１５１】
このアッセイは、インビボでの脈管形成効力（または抗脈管形成効力）が推定されることが当該分野で認識されている（Ｍｉｎ，ＨＹら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：２４２８−２４３３，１９９６）。
【０１５２】
別のアッセイにおいて、内皮細胞管形成は、内皮細胞がＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上で培養された場合に観察されている（Ｓｃｈｎａｐｅｒら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１６５：１０７−１１８  １９９５）。内皮細胞（１×１０４細胞／ウェル）をＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）コーティング２４ウェルプレートに移し、管形成を、４８時間後に定量する。インヒビターを内皮細胞と同時または内皮細胞を添加した後の種々の時点のいずれかで添加することにより、インヒビターを試験する。管形成をまた、（ａ）脈管形成増殖因子（例えば、ｂＦＧＦまたはＶＥＧＦ）、（ｂ）分化刺激薬剤（例えば、ＰＭＡ）または（ｃ）これらの組み合わせを添加することにより、刺激し得る。
【０１５３】
このアッセイは、内皮細胞に特定の型の基底膜（すなわち、移動し分化している内皮細胞が、最初に遭遇すると予測され得るマトリクスの層）に提示することにより、脈管形成を模倣する。結合された増殖因子に加えて、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）中に見いだされるマトリクス成分（およびインサイチュで基底膜において見出されるマトリクス成分）またはそのタンパク質分解性産物はまた、内皮細胞管形成について刺激性であり得、このことにより、このモデルは、以前に記載された（ＢｌｏｏｄおよびＺｅｔｔｅｒ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０３２：８９−１１８，１９９０；ＯｄｅｄｒａおよびＷｅｉｓｓ，Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．４９：１１１−１２４，１９９１）フィブリンゲル脈管形成モデルを補足する。本発明の化合物は、両方のアッセイにおいて内皮細胞管形成を阻害する。このことは、この化合物がまた、抗脈管形成活性を有することを示唆する。
【０１５４】
（Ｄ．増殖の阻害についてのアッセイ）
本発明の化合物がＥＣの増殖を阻害する能力は、９６ウェル形式にて決定され得る。Ｉ型コラーゲン（ゼラチン）を使用して、プレートのウェルをコーティングする（ＰＢＳ中、０．１〜１ｍｇ／ｍＬ、室温にて３０分間０．１ｍＬ／ウェル）。プレートを洗浄（３×ｗ／ＰＢＳ）した後、１ウェルあたり３〜６，０００個の細胞をプレートし、０．１〜２％ＦＢＳを含有する、内皮細胞増殖培地（ＥＧＭ；Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）またはＭ１９９培地中で４時間接着させる（３７℃／５％ＣＯ２）。この培地および接着していない全ての細胞を４時間目に除去し、新たな培地（ｂＦＧＦ（１〜１０ｎｇ／ｍＬ）またはＶＥＧＦ（１〜１０ｎｇ／ｍＬ）を含む）を各ウェルに添加する。試験される化合物を最後に添加し、このプレートを、２４〜４８時間インキュベートする（３７℃／５％ＣＯ２）。ＭＴＳ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、各ウェルに添加し、１〜４時間インキュベートする。次いで、４９０ｎｍの吸光度（細胞数に比例する）を測定して、コントロールウェルと、試験化合物を含むウェルとの間の増殖差を決定する。
【０１５５】
類似のアッセイ系を、培養した接着腫瘍細胞を使用して設定し得る。しかし、コラーゲンは、この形式においては省略され得る。腫瘍細胞（例えば、３，０００〜１０，０００／ウェル）を、プレートし、一晩接着させる。次いで、無血清培地を、ウェルに添加し、細胞を、２４時間にわたり同期化させる。次いで、１０％ＦＢＳを含有する培地を、各ウェルに添加して、増殖を刺激する。試験される化合物を、ウェルのいくつかに含める。２４時間後、ＭＴＳをプレートに添加し、上記のようにアッセイを行い、読み取る。
【０１５６】
（Ｅ．細胞傷害性のアッセイ）
組成物の抗増殖効果および細胞傷害性効果を、種々の細胞型（腫瘍細胞、ＥＣ、線維芽細胞およびマクロファージが挙げられる）について決定し得る。これは、治療部分（例えば、放射療法薬または毒素）に結合体化された本発明の化合物を試験する際に特に有用である。例えば、組成物の１つとＢｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬との結合体（１３１Ｉでヨウ素化されている）は、ＨＰＲＧ結合部位／レセプターを発現する細胞の増殖を阻害すると予測される（最もありそうなのは、アポトーシスの誘導によるものである）。抗増殖効果は、腫瘍細胞および刺激された内皮細胞に対して予測されるが、いくつかの環境下では、休止内皮細胞または正常ヒト皮膚線維芽細胞に対して予測されない。正常細胞において認められた任意の抗増殖効果または細胞傷害性効果は、結合体の非特異的活性を示す。
【０１５７】
代表的アッセイは、９６ウェルプレート中、５〜１０，０００細胞／ウェルの密度にて細胞をプレートすることを含む。試験される化合物を、結合アッセイにて測定されたＩＣ５０（これは、結合体に依存して変化する）の１０倍の濃度で添加し、細胞とともに３０分間インキュベートする。細胞を培地で３回洗浄し、次いで、［３Ｈ］チミジン（１μＣｉ／ｍＬ）を含有する新たな培地を、細胞に添加し、これら細胞を、５％ＣＯ２中、３７℃にて２４時間および４８時間インキュベートする。細胞を、１Ｍ  ＮａＯＨを使用して、種々の時点で溶解し、１ウェルあたりの数を、β−カウンターを使用して決定する。増殖を、ＭＴＳ試薬またはＣｙＱｕａｎｔ（登録商標）を使用して放射活性によらずに測定して、総細胞数を測定し得る。細胞傷害性アッセイ（細胞溶解を測定する）については、Ｐｒｏｍｅｇａ  ９６ウェル細胞傷害性キットを使用する。抗増殖活性が明らかな場合、アポトーシスの誘導を、ＴｕｍｏｒＴＡＣＳ（Ｇｅｎｚｙｍｅ）を使用して測定し得る。
【０１５８】
（カスパーゼ３アッセイ）
本発明の化合物がＥＣのアポトーシスを促進する能力を、カスパーゼ３の活性化を測定することにより決定し得る。Ｉ型コラーゲン（ゼラチン）を使用して、Ｐ１００プレートをコーティングし、５×１０５個のＥＣを、１０％  ＦＢＳを含有するＥＧＭ中に播種する。（５％ＣＯ２中、３７℃で）２４時間後、この培地を、２％  ＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦおよび所望の試験化合物を含有するＥＧＭと交換する。この細胞を６時間後に採取し、１％  Ｔｒｉｔｏｎにて細胞溶解物を調製し、ＥｎｚＣｈｅｋ（登録商標）カスパーゼ３アッセイキット＃１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を、製造業者の指示に従って使用してアッセイする。
【０１５９】
（ＨＰＲＧペプチドのインビボ研究）
（Ａ．角膜脈管形成モデル）
使用するプロトコルは、Ｖｏｌｐｅｒｔら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：６７１−６７９（１９９６））により記載されるプロトコルと本質的に同一である。簡潔には、雌性Ｆｉｓｃｈｅｒラット（１２０〜１４０ｇ）を麻酔し、Ｈｙｄｒｏｎ（登録商標）、ｂＦＧＦ（１５０ｎＭ）、および試験される化合物から構成されるペレット（５μｌ）を、角膜縁から１．０〜１．５ｍｍの角膜中に作製した小さな切開部分に移植する。新生血管形成を、移植の５日後および７日後に評価する。７日目に、動物を麻酔し、炭素コロイドのような色素を注入して、脈管を染色する。次いで、動物を安楽死させ、角膜をホルマリンで固定し、この角膜を平らにし、写真を撮って、新生脈管形成の程度を評価する。新脈管を総脈管面積または長さを画像化するか、または単に脈管を計数することにより、定量し得る。
【０１６０】
（Ｂ．Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）プラグアッセイ）
このアッセイを、本質的に、Ｐａｓｓａｎｉｔｉら（Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．６７：５１９−５２８（１９９２）により記載されるように行う。氷冷Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（例えば、５００μＬ）（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を、ヘパリン（例えば、５０μｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ−２（例えば、４００ｎｇ／ｍｌ）および試験される化合物と混合する。いくつかのアッセイにおいては、ｂＦＧＦを、脈管形成刺激因子としての腫瘍細胞で置き換え得る。このＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）混合物を、４〜８週齡の無胸腺ヌードマウスの腹部正中線付近の部位に皮下注射する（好ましくは、１匹のマウスあたり、３回の注射）。注射したＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）は、触診可能な固体ゲルを形成する。各動物が、陽性コントロールプラグ（例えば、ＦＧＦ−２＋ヘパリン）、陰性コントロールプラグ（例えば、緩衝液＋ヘパリン）および脈管形成に対する効果について試験される化合物を含むプラグ（例えば、ＦＧＦ−２＋ヘパリン＋化合物）を受け入れるように、注射部位を選択する。好ましくは、全ての処置を三連で行う。注射して約７日後または脈管形成を観察するに最適でありうる別のときに、動物を頚椎脱臼により屠殺する。マウスの皮膚を腹部正中線に沿って剥離し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）プラグを回収し、直ぐに高解像度でスキャンする。次いで、プラグを水中に分散させ、３７℃にて一晩インキュベートする。ヘモグロビン（Ｈｂ）レベルを、Ｄｒａｂｋｉｎ溶液（例えば、Ｓｉｇｍａから入手される）を製造業者の指示に従って使用して、決定する。プラグ中のＨｂ量は、サンプル中の血液量を反映するので、脈管形成の間接的指標である。さらに、または代替的に、屠殺する前に、動物に、発蛍光団を結合体化した高分子量デキストランを含有する緩衝液（好ましくは、ＰＢＳ）０．１ｍｌを注射し得る。分散したプラグ中の蛍光の量（蛍光測定により決定される）もまた、プラグ中の脈管形成の基準として役立ち得る。ｍＡｂ抗ＣＤ３１（ＣＤ３１は、「血小板−内皮細胞接着分子すなわちＰＥＣＡＭ」である）を使用した染色もまた使用して、プラグ中の脈管形成および微小管密度を確認し得る。
【０１６１】
（Ｃ．ニワトリ漿尿膜（ＣＡＭ）脈管形成アッセイ）
このアッセイを、本質的には、Ｎｇｕｙｅｎら（Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓ．４７：３１−４０（１９９４））により記載されるように行う。脈管形成因子（ｂＦＧＦ）または腫瘍細胞＋インヒビターのいずれかを含むメッシュを、８日齢のニワトリ胚のＣＡＭに配置し、サンプルの移植後、３〜９日間、ＣＡＭを観察する。血管を含むメッシュの区画の割合を決定することにより、脈管形成を定量する。
【０１６２】
（Ｄ．腫瘍細胞とＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）プラグアッセイを使用する脈管形成阻害および抗腫瘍効果のインビボ評価）
このアッセイにおいて、腫瘍細胞（例えば、１〜５×１０６細胞の３ＬＬ  Ｌｅｗｉｓ肺癌腫またはラット前立腺細胞株ＭａｔＬｙＬｕ）を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）と混合し、次いで、上記Ｂ節に記載されるプロトコルに従って、マウスの側腹部に注射する。腫瘍細胞塊および強い脈管形成応答を、約５日後〜約７日後に観察し得る。実際の腫瘍環境における化合物の抗腫瘍作用および抗脈管形成作用を、プラグ中にこの化合物を含めることによって評価し得る。次いで、腫瘍重量、Ｈｂレベル、または（屠殺する前に注射したデキストラン−発蛍光団の結合体の）蛍光レベルの測定を行う。Ｈｂまたは蛍光を測定するために、このプラグを、まず組織ホモジナイザーによりホモジナイズする。
【０１６３】
（Ｅ．皮下（ｓ．ｃ．）腫瘍増殖の異種移植片モデル）
ヌードマウスの右側腹部に、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ヒト乳癌）およびＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（０．２ｍＬ中に１×１０６細胞）をｓ．ｃ．接種する。腫瘍を、２００ｍｍ３の段階にし（ｓｔａｇｅ）し、次いで、試験組成物での処置を開始する（毎日、１００μｇ／動物／日をＩＰで与える）。腫瘍容積を、一日おきに得て、動物を処置の２週間後に屠殺する。腫瘍を切り出し、秤量し、パラフィンに包埋する。腫瘍の組織学的切片を、ヘマトキシリンおよびエオシン、抗ＣＤ３１、Ｋｉ−６７、ＴＵＮＥＬ、およびＣＤ６８染色により分析する。
【０１６４】
（Ｆ．転移の異種移植片モデル）
本発明の化合物はまた、実験的転移モデルを用いて後期転移の阻害について試験される（Ｃｒｏｗｌｅｙ，Ｃ．Ｗ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０  ５０２１−５０２５（１９９３））。後期転移は、腫瘍細胞の付着および管外遊出、局所浸潤、播種、増殖および脈管形成の工程を包含する。レポーター遺伝子（好ましくは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子であるが、代替として酵素クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、またはＬａｃＺをコードする遺伝子）でトランスフェクトされたヒト前立腺癌腫細胞（ＰＣ−３）がヌードマウスに接種される。このアプローチは、これらの細胞の最終結果を追跡するためにこれらのマーカーのいずれかの利用を可能にする（ＧＦＰの蛍光検出または酵素活性の組織化学比色検出）。細胞は、注入（好ましくは静脈内）され、そして転移は、約１４日後に、特に肺においてであるるが、また局所リンパ節、大腿、および脳においても検出される。このことは、ヒト前立腺癌において天然に存在する転移の器官に対する親和性（ｔｒｏｐｉｓｍ）を模倣する。例えば、ＧＦＰ発現ＰＣ−３細胞（マウス１匹につき１×１０６細胞）が、ヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウスの尾静脈に静脈内注射される。動物は、毎日腹腔内（ｑ．ｄ．ＩＰ．）に与えた１日当たり動物１匹につき１００μｇの試験組成物で処理される。単一の転移細胞および病巣は、蛍光顕微鏡組織化学もしくは光学顕微鏡組織化学により、または組織の粉砕および検出標識の定量比色アッセイにより可視化され、そして定量される。
【０１６５】
（Ｇ．ＨＰＲＧおよび機能的誘導体によるインビボでの自発性転移の阻害）
ラット同系乳癌システム（Ｘｉｎｇ  ら、Ｉｎｔ．Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ６７：４２３−４２９（１９９６）は、Ｍａｔ  ＢＩＩＩ  ラット乳癌細胞を用いる。腫瘍細胞（例えば、０．１ｍＬ  ＰＢＳ中に懸濁された約１０６）が、雌Ｆｉｓｈｅｒラットの乳脂肪パッドに接種される。接種時に、１４日Ａｌｚａ浸透圧ミニポンプ（１４−ｄａｙ  Ａｌｚａ  ｏｓｍｏｔｉｃ  ｍｉｎｉ−ｐｕｍｐ）が、試験化合物を分配するために腹腔内に移植される。この化合物はＰＢＳ中に溶解され（例えば、２００ｍＭストック）、滅菌濾過され、そしてミニポンプ中に配置されて、約４ｍｇ／ｋｇ／日の放出速度を達成する。コントロール動物は、ミニポンプ中にビヒクル（ＰＢＳ）単独またはビヒクルコントロールペプチドを受容する。動物は約１４日目に屠殺される。
【０１６６】
（治療結果）
本発明の活性化合物で処理したラットにおいて、原発性腫瘍のサイズならびに脾臓、肺、肝臓、腎臓、およびリンパ節における転移の数（個別の病巣として数えられる）における有意な減少が観察される。組織化学および免疫組織化学分析は、処置動物において、腫瘍における壊死およびアポトーシス兆候の増大を明らかにする。大きな壊死領域は、新生血管形成を欠く腫瘍領域において見られる。１３１Ｉ  が結合体化されたヒトまたはウサギＨＰＲＧおよびそれらの誘導体（ペプチド１分子につき１または２のＩ原子）は、有効な放射線治療薬であり、非結合体化ポリペプチドよりも少なくとも２倍強力であることが見出される。対照的に、コントロールペプチドでの処置は、腫瘍の大きさまたは転移において有意な変化を引き起こすことができない。
【０１６７】
（Ｈ．３ＬＬルイス（Ｌｅｗｉｓ）肺癌腫：原発性腫瘍成長）
この腫瘍株は、１９５１年において、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの肺の癌腫として自発的に生じた（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １５：３９，１９５５．Ｍａｌａｖｅ，Ｉ．ら、Ｊ：Ｎａｔ’ｌ．Ｃａｎｃ．Ｉｎｓｔ．６２：８３−８８（１９７９）もまた参照のこと）。それは、皮下（ｓｃ）接種によるＣ５７ＢＬ／６マウスにおける継代により繁殖され、そして半同種異系（ｓｅｍｉａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）Ｃ５７ＢＬ／６×ＤＢＡ／２Ｆ１マウスにおいて、または同種異系Ｃ３Ｈマウスにおいて試験される。代表的には、皮下（ｓｃ）移植のために１群当たり６匹の動物、または筋内（ｉｍ）移植のために１０匹が使用される。腫瘍は、２〜４ｍｍ断片として皮下移植され得るか、または約０．５〜２×１０６細胞の懸濁細胞の接種物として筋内または皮下移植され得る。処置は、移植２４時間後に始めるか、または特定の大きさ（通常、約４００ｍｇ）の腫瘍が触診され得るまで遅らされる。試験化合物は、１１日間、毎日腹腔内投与される。
【０１６８】
動物には、計量、触診、および腫瘍の大きさの測定，が行われる。筋内接種１２日後の未処理コントロールレシピエントにおける代表的な腫瘍の重量は、５００〜２５００ｍｇである。代表的なメジアン（ｍｅｄｉａｎ）生存時間は、１８〜２８日である。１〜１１日目において１日当たり２０ｍｇ／ｋｇ／注射のポジティブコントロール化合物（例えば、シクロホスファミド）が使用される。コンピューター結果は、平均動物重量、腫瘍大きさ、腫瘍重量、生存時間を含む。確認された治療活性については、試験化合物は、２つの多用量アッセイにおいて試験されるべきである。
【０１６９】
（Ｉ．３ＬＬルイス肺癌腫：原発性成長および転移モデル）
このモデルは、多数の研究者によって利用されてきている。例えば、Ｇｏｒｅｌｉｋ，Ｅ．ら、Ｊ．Ｎａｔ’ｌ．Ｃａｎｃ．Ｉｎｓｔ．６５：１２５７−１２６４（１９８０）；Ｇｏｒｅｌｉｋ，Ｅ．ら、Ｒｅｃ．Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．７５：２０−２８（１９８０）；Ｉｓａｋｏｖ，Ｎ．ら、Ｉｎｖａｓｉｏｎ  Ｍｅｔａｓ．２：１２−３２（１９８２）；Ｔａｌｍａｄｇｅ  Ｊ．Ｅ．ら、Ｊ：Ｎａｔ’ｌ．Ｃａｎｃ．Ｉｎｓｔ．６９：９７５−９８０（１９８２）；Ｈｉｌｇａｒｄ，Ｐ．ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ３５：７８−８６（１９７７）を参照のこと）。試験マウスは、雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（２〜３ヶ月齢）である。皮下、筋内、または足蹠内部への移植後に、この腫瘍は、転移（肺において優先的に）を生じる。腫瘍のいくつかの株を用いると、原発性腫瘍は、抗転移効果を奏するので、転移相の研究の前に第一に取り除かねばならない（米国特許第５，６３９，７２５号もまた参照のこと）。
【０１７０】
０．３％トリプシン溶液を用いて細片した腫瘍組織を処理することにより、単一細胞懸濁液が固形腫瘍から調製される。細胞は、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄され、そしてＰＢＳ中で懸濁される。このようにして調製された３ＬＬ細胞の生存度は、一般に約９５〜９９％である（トリパンブルー染料排除による）。０．０５ｍｌ  ＰＢＳ中に懸濁された生存腫瘍細胞（３×１０４〜５×１０６）が、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの背部領域で、または一方の後足蹠でのいずれかで皮下注射される。腫瘍が目に見えるのは、１０６細胞の背部皮下注射後３〜４日である。腫瘍出現の日および樹立された腫瘍の直径は、２日ごとにカリパスにより測定される。
【０１７１】
処置は、１週当たりペプチドまたは誘導体の１または２用量として与えられる。別の実施形態では、ペプチドは、浸透圧ミニポンプにより送達される。
【０１７２】
背部腫瘍の腫瘍切除を包含する実験において、腫瘍が約１５００ｍｍ３の大きさに達する場合、マウスは、２つの群に無作為化される：（１）原発性腫瘍が完全に切除される；または（２）偽手術が実施され、腫瘍がそのまま残っている。５００〜３０００ｍｍ３の腫瘍が転移の成長を阻害するが、１５００ｍｍ３が高い生存で、かつ局所的な再成長がなく安全に切除され得る原発性腫瘍の最も大きなサイズである。２１日後、全てのマウスが屠殺され、解剖される。
【０１７３】
肺が摘出され、計量される。肺は、Ｂｏｕｉｎ溶液中に固定され、そして可視転移の数が記録される。転移の直径もまた、８×倍率下でマイクロメーター含有接眼レンズを備えた双眼ステレオスコープを用いて測定される。記録された直径に基づいて、各転移の体積を計算することができる。肺当たりの転移の総体積を決定するために、可視転移の平均数を、転移の平均体積で積算する。転移成長をさらに決定するために、肺細胞への１２５ＩｄＵｒｄの取り込みを測定することができる（Ｔｈａｋｕｒ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．８９：２１７−２２８（１９７７）。腫瘍切断の１０日後、２５μｇのフルオロデオキシウリジンが腫瘍保有マウス（および、用いられる場合、腫瘍切除マウス）の腹膜に接種される。３０分後、マウスに、１μＣｉの１２５ＩｄＵｒｄ（ヨードデオキシウリジン）を与える。１日後、肺および脾臓が摘出され、そして計量されて、１２５ＩｄＵｒｄ取り込みの程度がガンマカウンタを用いて測定される。
【０１７４】
足蹠腫瘍を有するマウスにおいて、腫瘍が約８〜１０ｍｍの直径に達したとき、マウスは、２つの群に無作為化される：（１）腫瘍を有する脚が、膝関節の上方の連結後に切断される；または（２）マウスは、切断していない腫瘍保有コントロールとしてそのまま残される。（腫瘍保有マウスにおける無腫瘍脚の切断は、続く転移に対して既知の影響を有さず、麻酔、ストレス、または手術の考えられる影響を除外する）。マウスは、切断の１０〜１４日後に殺される。転移は、上記のように評価される。
【０１７５】
統計学：腫瘍保有マウスの肺における転移の発生数およびそれらの成長を表す値は、正規分布されない。従って、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定のような非パラメーター統計学が分析のために使用され得る。
【０１７６】
Ｇｏｒｅｌｉｋら（１９８０，前出）によるこのモデルの研究は、腫瘍細胞接種物の大きさが転移成長の程度を決定することを示した。手術されたマウスの肺における転移の割合は、原発性腫瘍保有マウスとは異なる。従って、より多い用量の３ＬＬ細胞（１〜５×１０６）の接種（その後外科的に除去される）により原発性腫瘍が誘導されたマウスの肺において、転移の数は、手術していない腫瘍保有マウスにおけるよりも少なかったが、転移の体積は、手術していないコントロールにおけるよりも高かった。肺転移の尺度として１２５ＩｄＵｒｄ取り込みを用いて、腫瘍切除マウスの肺と腫瘍保有マウスの肺（もともと１０６の３ＬＬ細胞を接種された）との間で有意な差異は見出されなかった。１０５の腫瘍細胞の摂取後生成された腫瘍の切断は、転移成長を劇的に促進した。これらの結果は、局所腫瘍の切除後のマウスの生存と一致した。局所腫瘍の切除後の転移成長の促進の現象は、繰り返し観察されている（例えば、米国特許第５，６３９，７２５号を参照のこと）。これらの所見は、癌手術を受けた患者の予後についての関連を有する。
【０１７７】
本発明に従って有用である化合物については、それは、上記の（インビトロまたはインビボ）アッセイ系の少なくとも１つにおいて活性を示すべきである。
【０１７８】
（薬学的および治療用組成物およびそれらの投与）
本発明の薬学的組成物において使用され得る化合物としては、上記のポリペプチド化合物およびペプチド化合物の全て、ならびにこれらの化合物の薬学的に受容可能な塩が挙げられる。塩基性基を含有する本発明の化合物の薬学的に受容可能な酸付加塩は、適切には、当該分野に公知の方法により、強いまたは適度に強い、無毒の有機または無機の酸を用いて形成される。本発明に含まれる酸付加塩の例は、マレイン酸塩、フマル酸塩、乳酸塩、シュウ酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、塩酸塩、  臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩および硝酸塩である。
【０１７９】
酸性基を含有する本発明の化合物の薬学的に受容可能な塩基付加塩は、有機塩基および無機塩基から公知の方法により調製され、そして例えば、無毒のアルカリ金属およびアルカリ土類金属（例えば、水酸化カルシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、および水酸化アンモニウム）；および無毒の有機塩基（例えば、トリエチルアミン、ブチルアミン、ピペラジン、およびトリ（ヒドロキシメチル）メチルアミン）が挙げられる。
【０１８０】
上述したように、本発明の化合物は、内皮細胞の増殖、移動度、または浸潤性および脈管形成を阻害する能力、癌（特に転移癌）の処置において利用される特性を有する。本発明の組成物は、それ自体活性であり得るか、または活性形態にインビボで変換される「プロドラッグ」として作用し得る。
【０１８１】
（治療的に標識された組成物）
好ましい実施形態では、本明細書中に記載のポリペプチドおよびペプチドは、「治療的に結合体化」または「治療的に標識」（これらの用語は交換可能であることが意図される）され、そして化合物がホーミングし、結合する部位に治療剤を送達するために使用される。このような部位としては、腫瘍転移の部位、または感染／炎症、再狭窄、または線維症の病巣が挙げられる。用語「治療的に結合体化された」は、改変されたペプチドは、腫瘍浸潤、脈管形成、炎症、もしくは他の病理の根底にある原因に、または「成分」にのいずれかに指向される別の治療剤に結合体化されることを意味する。治療的に標識されたタンパク質またはペプチドは、本明細書中で「治療的部分」とも呼ばれる適切な治療上の「標識」を有する。治療的部分は、標的疾患または状態（主に、望ましくない脈管形成と関連した）を処置するにあたりペプチドを活性にする、そのペプチドに付加される原子、分子、化合物または任意の化学成分である。上記のように、本発明のペプチドは、従来の手段（化学合成、ＨＰＲＧのタンパク質分解、または組換えの手段）によって調製される。治療的部分は、直接または間接的に、ペプチドに結合され得る。治療的に標識されたタンパク質またはペプチドは、薬学的組成物として投与され、これは、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含み、そして、好ましくは、注入に適切な形態である。
【０１８２】
有用な治療的放射性同位体の例（原子番号の順で）としては、４７Ｓｃ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、１０９Ｐｄ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１９９Ａｕ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂおよび２１７Ｂｉが挙げられる。これらの原子は、直接、キレートの一部として間接的に、またはヨウ素の場合、ヨード化Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ基の一部として間接的に、ペプチドに結合体化され得る。放射性ヨウ素は、この基がペプチド化合物にカップリングされる前または後のいずれかに導入され得る。
【０１８３】
放射性核種結合体の好ましい用量は、腫瘍型、腫瘍位置および脈管形成、ペプチドキャリアの動態および生体分布、核種による放射線放出のエネルギーなどで変化する標的部位に送達される比放射能の関数である。放射線療法の分野の当業者は、過度の実験を行うことなく、所望の治療利点を発揮するために特定の核種の用量と共にペプチドの用量を容易に調整し得る。
【０１８４】
本明細書中に含まれる別の治療アプローチは、ホウ素中性子捕捉療法（ｂｏｒｏｎ  ｎｅｕｔｒｏｎ  ｃａｐｔｕｒｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）の使用であり、ここでは、ホウ素化された（ｂｏｒｏｎａｔｅｄ）ペプチドが、所望の標的部位（例えば、腫瘍）に送達される。最も好ましくは、頭蓋内腫瘍（Ｂａｒｔｈ，ＲＦ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔ．１４：５３４−５５０（１９９６）；Ｍｉｓｈｉｍａ，Ｙ．（編），Ｃａｎｃｅｒ  Ｎｅｕｔｒｏｎ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．，１９９６；Ｓｏｌｏｗａｙ，Ａ．Ｈ．，ら、（編），Ｊ  Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌ  ３３：１−１８８（１９９７））である。安定な同位体１０Ｂは、低エネルギー（＜０．０２５ｅＶ）熱中性子で照射され、そして得られる核捕捉はα−粒子および７Ｌｉ核（これは、高い線形エネルギー転移およびそれぞれ約９μｍおよび約５μｍの路程（ｐａｔｈ  ｌｅｎｇｔｈ）を有する）を生じる。この方法は、腫瘍中の１０Ｂ蓄積、ならびに血液、内皮細胞および正常組織（例えば、脳）中でのより低いレベルに基づかされる。このような送達は、上皮増殖因子を用いて達成されている（Ｙａｎｇ．Ｗ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５７：４３３３−４３３９（１９９７）。
【０１８５】
本発明の方法に従ってペプチド化合物にカップリングされ得る他の治療剤は、薬物、プロドラッグ、プロドラッグを活性化するための酵素、光増感剤、核酸治療薬、アンチセンスベクター、ウイルスベクター、レクチン、および他の毒素である。
【０１８６】
レクチンは、糖質に結合するタンパク質（通常、植物に由来する）である。他の活性物質の間で、いくつかのレクチンは毒性である。公知のほとんどの細胞傷害性物質のいくつかは、細菌起源および植物起源のタンパク質毒素である（Ｆｒａｎｋｅｌ，Ａ．Ｅ．ら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．３７：１２５−１４２（１９８６））。これらの分子は、細胞表面に結合し、そして細胞タンパク質合成を阻害する。最も通常に用いられる植物毒素は、リシンおよびアブリンである；最も通常に用いられる細菌毒素は、ジフテリア毒素およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａである。リシンおよびアブリンにおいては、結合機能および毒性機能は、２つの別個のタンパク質サブユニットＡ鎖およびＢ鎖中に含まれる。リシンＢ鎖は、細胞表面糖質に結合し、そして細胞へのＡ鎖の取り込みを促進する。いったん細胞内に入ると、リシンＡ鎖は、真核生物リボソームの６０Ｓサブユニットを不活性化することによりタンパク質合成を阻害する（Ｅｎｄｏ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：５９０８−５９１２（１９８７））。他の植物由来毒素（これは、単鎖リボソーム阻害タンパク質である）としては、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、コムギ胚芽タンパク質、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎｓ）、モモルチャリン（ｍｏｍｏｒｃｈａｒｉｎｓ）、トリコサンチン（ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ）、および多くの他のものが挙げられる（Ｓｔｒｉｐ，Ｆ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９５：１−８（１９８６））。ジフテリア毒素およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａはまた、単鎖タンパク質であり、そしてそれらの結合機能および毒性機能は、同じタンパク質の別個のドメインに存在する。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａは、ジフテリア毒素と同じ触媒活性を有する。リシンは、その毒性α鎖を、標的化分子（例えば、抗体）に結合し、毒性効果の部位特異的送達を可能にすることにより、治療的に用いられている。細菌性毒素はまた、抗腫瘍結合体として使用されている。本明細書中で意図されるように、毒性ペプチド鎖またはドメインは、本発明の化合物に結合体化され、そして毒性活性が所望される標的部位（例えば、転移病巣）に部位特異的様式で送達される。タンパク質（例えば、抗体または他のリガンド）への毒素の結合体化は当該分野で公知である（Ｏｌｓｎｅｓ，Ｓ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １０：２９１−２９５（１９８９）；Ｖｉｔｅｔｔａ，Ｅ．Ｓ．ら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：１９７−２１２（１９８５））。
【０１８７】
重要な細胞プロセス（ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質合成を包含する）を妨害する細胞傷害性薬物は、抗体に結合体化されて、続いてインビボ治療において用いられている。このような薬物（ダウノルビシン、ドキソルビシン、メトトレキセート、およびマイトマイシンＣが挙げられるがこれらに限定されない）もまた、本発明の化合物にカップリングされ、そしてこの形態で治療的に使用される。
【０１８８】
本発明の化合物、ならびにそれらの薬学的に受容可能な塩は、便利な投薬形態（例えば、カプセル、含浸オブラート、錠剤または注射可能調製物）に取り込まれ得る。固体または液体の薬学的に受容可能なキャリアが用いられ得る。
【０１８９】
固体キャリアとしては、デンプン、ラクトース、硫酸カルシウム二水和物、白土、スクロース、滑石、ゼラチン、アガー、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、およびステアリン酸が挙げられる。液体キャリアとしては、シラップ、ラッカセイ油、オリーブ油、生理食塩水、水、デキストロース、グリセロールなどが挙げられる。同様に、キャリアまたは希釈剤は、持続放出物質（例えば、グリセリルモノステアレートまたはグリセリルジステアレート）を、単独または蝋と共に含み得る。液体キャリアが使用される場合、調製物は、シラップ、エリキシル、エマルジョン、軟性ゼラチンカプセル、滅菌注射液（例えば、溶液）（例えば、アンプル）、または水性もしくは非水性液体懸濁液の形態であり得る。このような薬学的組成物の概要は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（Ｇｅｎｎａｒｏ  １８ｔｈ  編．１９９０）に見られ得る。
【０１９０】
この薬学的製剤は、以下のような工程を含む薬化学の従来技術に従って作製される：錠剤形態に必要な場合、混合し、顆粒化し、そして圧縮する工程、あるいは経口投与、非経口投与、局所投与、経皮投与、膣内投与、陰茎内投与、鼻腔内投与、気管支内投与、頭蓋内投与、眼内投与、耳内投与および直腸投与のための所望の製品を与えるために、適切に成分を混合し、充填し、そして溶解する工程のような工程。この薬学的組成物はまた、少量の、湿潤剤または乳化剤のような非毒性補助物質、ｐＨ緩衝剤などを含んでもよい。
【０１９１】
本発明は、多くの動物属および動物種のいずれかの診断または処置において使用され得、そしてヒト医学または獣医学の実施において等しく適用可能である。従って、この薬学的組成物は、家畜動物および市販の動物（鳥を含む）、より好ましくは哺乳動物、ならびにヒトを処置するために使用され得る。
【０１９２】
用語「全身投与」とは、被験体の循環系への組成物の導入を生じるか、さもなくば静脈内（ｉ．ｖ．）注射または注入のような身体を通したその拡散を可能にする様式での、本明細書中に記載されるポリペプチド、ペプチドまたは核酸のような組成物または因子の投与をいう。「局所」投与とは、腹腔内、髄腔内、硬膜下のような特異的で幾分かより制限された解剖学的空間内への投与、または特定の器官への投与をいう。例として、膣内、陰茎内、鼻内、気管支内（または肺点滴注入）、頭蓋内、耳内または眼内が挙げられる。用語「局所投与」とは、腫瘍塊への腫瘍内注射、皮下（ｓ．ｃ．）注射、筋肉内（ｉ．ｍ．）注射のような、制限されたまたは囲まれた解剖学的空間への組成物または薬物の投与をいう。当業者は、局所投与（ｌｏｃａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｒ  ｒｅｇｉｏｎａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）はまた、しばしば、循環系への組成物の流入を生じ、すなわち、その結果、ｓ．ｃ．またはｉ．ｍ．はまた、全身投与のための経路でもあることを当業者は理解する。注射または注入可能な製剤は、溶液または懸濁液として、注射または注入前の液体中の溶液または懸濁液に適した固体形態として、あるいはエマルジョンとして、従来の形態で調製され得る。投与の好ましい経路は全身性（例えば、ｉ．ｖ．）であるが、薬学的組成物は、例えば、軟膏、クリームまたはゲルとして、局所的にまたは経皮的に；経口的に；例えば、坐剤として直腸に；投与され得る。
【０１９３】
局所適用の場合、本化合物は、軟膏（ｓａｌｖｅ  ｏｒ  ｏｉｎｔｍｅｎｔ）のような局所的に適用されたビヒクルに組み込まれ得る。活性成分のためのキャリアは、噴霧可能な形態であってもよいし、噴霧不可能な形態であってもよい。噴霧不可能な形態は、局所適用に固有のキャリアを含み、好ましくは、水の粘度より大きな動的粘度を有する半固体形態または固体形態であり得る。適切な処方物として、溶液、懸濁液、エマルジョン、クリーム、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、散剤、擦剤、軟膏（ｓａｌｖｅ）などが挙げられるが、これらに限定されない。所望される場合、これらは、滅菌されてもよいし、補助剤（例えば、保存剤、安定化剤、湿潤剤、緩衝剤、または浸透圧に影響を及ぼすための塩など）と混合されてもよい。噴霧不可能な局所製剤のための好ましいビヒクルとして、軟膏基剤（例えば、ポリエチレングリコール−１０００（ＰＥＧ−１０００））；ＨＥＢクリームのような従来のクリーム；ゲル；およびワセリン（ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ  ｊｅｌｌｙ）などが挙げられる。
【０１９４】
局所適用および肺点滴注入にはまた、噴霧可能なエアロゾル製剤が適しており、ここで、好ましくは、固体または液体の不活性キャリア材料と組み合わせた化合物は、スクイズボトル内に、または加圧された揮発性で通常はガス状の噴霧剤との混合物内に、封入される。このエアロゾル製剤は、本発明の化合物に加えて、溶媒、緩衝剤、界面活性剤、香油、および／または酸化防止剤を含み得る。
【０１９５】
特にヒトのための、好ましい局所投与の場合、有効量の化合物を、患部（例えば、皮膚表面、粘膜、眼など）に投与することが好ましい。この量は、一般に、処置される領域、症状の重篤度、および使用される局所ビヒクルの性質に依存して、一回の適用あたり約０．００１ｍｇ〜約１ｇの範囲である。
【０１９６】
本発明のポリペプチドまたは核酸組成物のための他の薬学的に受容可能なキャリアは、リポソームであり、活性タンパク質が含まれる薬学的組成物は、脂質層に付着した水性同心層からなるカプセル内に分散されるか、多様に存在する。この活性ポリペプチドもしくはペプチド、または核酸は、好ましくは、水性層および脂質層に、内側または外側に存在するか、あるいは、いずれの場合においても、一般にリポソーム様懸濁液として公知の不均一系に存在する。この疎水性層、または脂質層は、一般に、排他的ではないが、レシチンおよびスフィンゴミエリンのようなリン脂質、コレステロールのようなステロイド、ジセチルホスフェート、ステアリルアミンまたはホスファチジン酸のような多かれ少なかれイオン性表面活性物質、および／または疎水性の性質の他の材料を含む。当業者は、本リポソーム処方物の他の適切な実施形態を理解する。
【０１９７】
腫瘍および癌を処置するための治療学的組成物は、ペプチドに加えて、１つ以上の追加の、有糸分裂インヒビター（例えば、ビンブラスチン）のような抗腫瘍剤；アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド）；葉酸インヒビター（例えば、メトトレキサート、ピリトレキシム（ｐｉｒｉｔｒｅｘｉｍ）またはトリメトレキサート）；代謝拮抗物質（例えば、５−フルオロウラシルおよびシトシンアラビノシド）；インターカレート抗生物質（例えば、アドリアマイシンおよびブレオマイシン）；酵素または酵素インヒビター（例えば、アスパラギナーゼ、エトポキシドのようなトポイソメラーゼインヒビター）；あるいは生物学的応答改変剤（例えば、インターフェロンまたはインターロイキン）を含んでもよい。実際に、本明細書中に開示されるペプチドと組み合わせて任意の公知の癌治療剤を含む薬学的組成物は、本発明の範囲内にある。この薬学的組成物はまた、標的患者を危険な状態にさせる追加の症状を処置するために、１つ以上の他の医薬（例えば、抗感染剤（抗細菌剤、抗真菌剤、抗寄生虫剤、抗ウイルス剤、および抗コクシジウム剤が挙げられる））を含んでもよい。
【０１９８】
投与される治療学的投薬量は、当業者に公知であるか、または容易に確認され得るような、治療学的に有効な量である。この用量はまた、レシピエントの年齢、健康、および体重、同時処置の種類（存在する場合）、処置の頻度、ならびに所望される効果の性質（例えば、抗炎症性効果または抗細菌効果）に依存する。
【０１９９】
上で議論されるように、Ｈ／Ｐドメインのエピトープに対して特異的な抗体は、Ｈ／Ｐドメインを介してＨＰＲＧの抗血管形成効果を阻害することによって、新生血管形成の導入に有用であり、脈管形成の増加が所望される疾患または状態を処置するために使用され得る。このような状態として、冠状動脈疾患および末梢性動脈疾患が挙げられ、ここで、治療学的脈管形成は、有用であることが公知である（Ｆｒｅｅｄｍａｎ  ＳＢおよびＩｓｎｅｒ  Ｊ  Ｍ，Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ，２００２，１３６：５４−７１  ａｎｄ  ＪＭｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ，２００１  ３３：３７９−３９３；Ｄｕｒａｉｒａｊ，Ａ．ら，Ｃａｒｄｉｏｌ  Ｒｅｖ，２０００，８：２７９−２８７；Ｅｍａｎｕｅｌｉ  Ｃら，Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２００１，１３３：９５１−９５８；Ｉｓｎｅｒ，ＪＭら，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，１９９６，７：９５９−８８）。一般に、血管閉塞、血管疾患または血管手術から生じる組織虚血の任意の形態は、この様式で処置され得る（Ｉｓｎｅｒら，前出；Ｗｅｂｓｔｅｒ  ＫＡ．，Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｅｕｋａｒｙｏｔ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒ，２０００，１０：１１３−１２５）。組織虚血には、例えば、末梢肢虚血または肝臓移植における肝動脈閉塞（Ｙｅｄｌｉｃｋａ，ＪＷら，Ｊ  Ｖａｓｃ  Ｉｎｔｅｒｖ  Ｒａｄｉｏｌ，１９９１，２：２３５−２４０）があり、存在する抗体は、虚血性組織の血管再生を促進する。
【０２００】
これらの抗体は、創傷治癒（外科創傷からの回復を含む）の促進において有用であり、この促進は、抗脈管形成過程に依存することが公知であり（Ｌｉｅｋｅｎｓ  Ｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２００１，６１：２５３−２７０；Ｌｉｎｇｅｎ，ＭＷ，Ａｒｃｈ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ，２００１，１２５：６７−７１；Ｒａｚａ  ＳＬら，Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｓｙｍｐ  Ｐｒｏｃ，２０００，５：４７−５４；Ｔｏｎｎｅｓｅｎ  ＭＧら，Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｓｙｍｐ  Ｐｒｏｃ，２０００，５：４０−４６；Ｈｕｎｔ  ＴＫ，Ａｄｖ  Ｓｋｉｎ  Ｗｏｕｎｄ  Ｃａｒｅ，２０００，１３（２  補足）：６−１１；Ｇｒａｎｔ  ＤＳら，Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ，２０００，４７６：１３９−１５４；Ｄｒｉｘｌｅｒ  ＴＡら，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｓｕｒｇ，２０００，１６６：４３５−４４６；Ｓｉｎｇｅｒ  ＡＪら，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，１９９９，３４１：７３８−７４６；Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９７，２７６：７５−８１）、そしてこれらの抗体は、骨折修復の加速または向上に有用である（Ｇｌｏｗａｃｋｉ，Ｊ，Ｃｌｉｎ  Ｏｒｔｈｏｐ，１９９８，３５５  補足：Ｓ８２−８９）。
【０２０１】
血管内皮が膵臓器官形成および膵臓β細胞によるインシュリン産生を刺激または誘導するために作用するため、抗−ＨＩＰ抗体は、糖尿病の処置において細胞治療およびランゲルハンス島の移植と組み合わせて使用され得る（Ｌａｍｍｅｒｔ  Ｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，２９４：５６４−５６７；５３０−５３１頁もまた参照のこと）。肝臓器官形成はまた、血管性内皮細胞および新生血管によって促進される（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，２９４：５５９−５６３）。ＤｅＦｒａｎｃｅｓｃｏ，Ｌ．，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ  １５：１７（２００１）も参照のこと。
【０２０２】
所望の血管新生促進活性をもつ抗−Ｈ／Ｐ抗体を検出するための抗体またはハイブリドーマ培養物の上清のスクリーニングは、上記のインビトロおよびインビボ生物学的アッセイ（例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）プラグアッセイ）を使用して実施される。
【０２０３】
（治療方法）
本発明の方法は、内皮細胞増殖および移動を阻害することによって、被験体における腫瘍増殖および侵入を阻害するか、または腫瘍により誘導される脈管形成を抑制するために使用され得る。腫瘍または脈管形成の増殖または侵入を阻害することによって、この方法は、腫瘍転移の阻害を生じる。脊椎被験体、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトは、腫瘍増殖、侵入または脈管形成を阻害するのに有効な量の化合物を投与される。本化合物またはその薬学的に受容可能な塩は、好ましくは、上記のように、薬学的組成物の形態で投与される。
【０２０４】
タンパク質（抗体を含む）、ペプチド、ペプチド多量体などの用量として、好ましくは、有効量のペプチドを含む薬学的投薬量単位が挙げられる。投薬量単位形態は、哺乳動物被験体に対して単回投薬量として適した物理的に別個の単位をいい；各単位は、必要とされる薬学的キャリアと組み合わせて、所望の治療効果を得るように計算された所定量の活性物質（例えば、ＨＰＲＧ−由来ドメインもしくはペプチド、またはこのポリペプチドをコードする核酸）を含む。本発明の投薬量単位形態についての詳細は、（ａ）活性材料の固有の性質および達成されるべき特定の治療効果、ならびに（ｂ）個々の被験体の処置および感受性に対する、このような活性化合物を配合する当該分野における固有の制限、によって、およびそれらに直接依存して、指示される。
【０２０５】
有効量とは、疾患の任意の関連するパラメータ（初期腫瘍または転移性腫瘍の増殖、炎症応答性の任意の受容された指数、または疾患の無い期間もしくは生存の測定可能な延長を含み得る）の測定可能な減少を生じる、インビボでの定常状態濃度を達成するのに十分な量を意味する。例えば、２０％の患者における腫瘍増殖の減少は、効果的であると考えられる（ＦｒｅｉＩＩＩ，Ｅ．，Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ３：１２７−１３６（１９９７））。しかし、この大きさの効果は、本発明に従って有効である用量についての最小限の要件であるとは考えられない。
【０２０６】
１実施形態において、有効用量は、本明細書に記載されるように、インビボアッセイにおける化合物の５０％有効用量（ＥＤ５０）に比べて、好ましくは１０倍高く、より好ましくは１００倍高い。
【０２０７】
投与される活性化合物の量は、選択されるまさにペプチドまたは誘導体、疾患または状態、投与の経路、レシピエントの健康および体重、他の同時処置の存在（もし存在する場合）、処置の頻度、所望される効果の性質（例えば、腫瘍転移の阻害）、および熟練した医師の判断に依存する。
【０２０８】
腫瘍を有する、被験体、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを処置するために好ましい用量は、体重１ｋｇあたり約１００ｍｇまでの量の活性タンパク質またはペプチドベース化合物である。ペプチドまたはペプチド模倣物の代表的な単一投薬量は、体重１ｋｇあたり約１ｎｇと約１００ｍｇとの間である。局所投与の場合、約０．０１〜２０重量％、好ましくは１〜５重量％の濃度の範囲内の投薬量が示唆される。約０．１ｍｇ〜約７ｇの範囲内の１日の総投薬量は、静脈内投与の場合、好ましい。しかし、上記範囲は、個々の処置レジメンにおける変数の数が大きいため、示唆的であり、そしてこれらの好ましい値からの考えられ得る偏位が予想される。
【０２０９】
インビトロにおける内皮細胞増殖または移動を阻害するための有効量または用量のペプチドは、１細胞あたり約１ピコグラム〜約５ナノグラムの範囲内である。有効な用量および最適な用量の範囲は、本明細書中に記載の方法を使用して、インビトロで決定され得る。
【０２１０】
本発明の化合物は、腫瘍細胞もしくは内皮細胞の増殖、移動、侵入、または脈管形成、腫瘍転移、または炎症性応答に及ぼす阻害効果を生じるとして、特徴付けられ得る。本化合物は、腫瘍を宿す哺乳動物宿主、好ましくはヒトにおける抗腫瘍効果を生じることで、特に有効である。
【０２１１】
脈管形成インヒビターは、外傷性脊髄傷害後の炎症性脈管形成および神経膠症を阻害する役割を担い、それによって神経連結性の回復を促進し得る（Ｗａｍｉｌ，Ａ．Ｗ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１３１８８−１３１９３（１９９８））。それ故に、本発明の組成物は、神経連結性の回復を立体的に防止する脈管形成および神経膠症を阻害するために、外傷性脊髄傷害後できるだけ早く、そして７日〜約２週間、投与される。この処置は、脊髄傷害の部位における損傷の領域を減少させ、そして神経機能の再生を容易にし、それによって麻痺を予防する。本発明の化合物はまた、ウォーラー変性、逆アミノブチレート媒介脱分極（外傷を受けた神経を生じる）から軸索を保護し、そして単離された中枢神経系細胞および培養物中の組織の神経伝導度の回復を改善することが予想される。
【０２１２】
（一般的な組換えＤＮＡ法）
分子生物学の一般的方法を開示する基本テキストの全てが、参考として援用され、以下が挙げられる：Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版（またはそれ以降の版），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ，ＦＭら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（最新版）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９０）；Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＭ，編，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８５；Ａｌｂｅｒｓ，Ｂ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，第２版（またはそれ以降の版），Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８９）；Ｗａｔｓｏｎ，ＪＤら，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，第２版（またはそれ以降の版）Ｅｄ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２；およびＯｌｄ，ＲＷら，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ：Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，第２版（またはそれ以降の版），Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ（１９８１）。
【０２１３】
他に指示されない限り、特定の核酸配列は、その保存置換改変体（例えば、縮重コドン置換）および相補的配列を包含することが意図される。用語「核酸」は、「ポリヌクレオチド」と同義語であり、遺伝子、ｃＤＮＡ分子、ｍＲＮＡ分子、ならびにオリゴヌクレオチドのようなこれらのいずれかのフラグメント、そしてさらにそれらの等価物を含むことが意図される（以下により詳細に説明される）。核酸のサイズは、キロベース（ｋｂ）または塩基対（ｂｐ）のいづれかで記載される。これらは、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）から誘導された見積りであるか、使用者によって決定されるか、または公表された核酸配列に由来する。タンパク質のサイズは、キロダルトン（ｋＤａ）の分子量としてか、または長さ（アミノ酸残基の数）として記載される。タンパク質のサイズは、ＰＡＧＥから、配列決定から、コード核酸配列に基づく推定アミノ酸配列から、または、公表されたアミノ酸配列から、見積もられる。
【０２１４】
詳細には、本発明のＨＰＲＧポリペプチド、ドメインもしくはペプチドフラグメント、またはそれらの活性改変体に対応するアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ分子は、本明細書中に開示されるタンパク質の配列に由来するプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって合成され得る（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号を参照のこと）。次いで、これらのｃＤＮＡ配列は、真核生物発現ベクターまたは原核生物発現ベクターに組み立てられ得、この得られるベクターは、適切な宿主細胞（例えば、ＣＯＳ細胞またはＣＨＯ細胞）によって融合ポリペプチドまたはそのフラグメントまたは誘導体の合成を指向するために使用され得る。
【０２１５】
本発明は、新規なＨＰＲＧポリペプチド、ドメイン、ペプチドフラグメント、ペプチド多量体、またはそれらの等価物をコードするヌクレオチド配列を有する単離された核酸、ならびにそれらのポリペプチド産物を発現するためにインビトロまたはインビボで細胞をトランスフェクトする際のそれらの使用を含む。本明細書で用いるとき、用語「核酸」は、このようなフラグメントまたは等価物を含むことが意図される。本発明の核酸配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。
【０２１６】
ｃＤＮＡヌクレオチド配列ＨＰＲＧポリペプチドは、適切な細胞株から全ｍＲＮＡを単離することによって得られ得る。二本鎖ｃＤＮＡは、全ｍＲＮＡから調製される。ｃＤＮＡは、多くの公知の技術のうちのいずれか１つを使用して、適切なプラスミド、バクテリオファージまたはウイルスベクターに挿入され得る。
【０２１７】
ヌクレオチド配列に参照して、用語「等価物」とは、これらのタンパク質の、天然に存在するイソ形態または関連した免疫学的に交差反応性のファミリーメンバーのような、構造的に相同および／または機能的に等価なタンパク質をコードする配列を含むことが意図される。このようなイソ形態またはファミリーメンバーは、例えば、配列番号１、３、５または６と同様の機能およびアミノ酸配列を共有するタンパク質として定義される。
【０２１８】
（核酸のフラグメント）
核酸配列のフラグメントは、全長ＨＰＲＧタンパク質またはＨ／Ｐドメインをコードするヌクレオチド配列より短いヌクレオチドを有するヌクレオチド配列として規定される。本発明は、（１）脈管形成、内皮管（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｔｕｂｅ）形成、細胞浸潤、または腫瘍の増殖もしくは転移を阻害する、ＨＰＲＧポリペプチドの能力、を保持するポリペプチドをコードするような核酸フラグメントを含む。
【０２１９】
一般に、ＨＰＲＧのフラグメントをコードする核酸配列は、成熟タンパク質（またはその活性なＨ／Ｐドメイン）をコードする配列由来のヌクレオチドを含む。
【０２２０】
核酸配列、特に本発明のペプチド多量体をコードする核酸配列はまた、（好ましくは、Ｇｌｙ１〜６をコードする）リンカー配列またはスペーサー配列を含み得る。核酸はさらに、天然または改変された制限エンドヌクレアーゼ部位、およびコードされたポリペプチドまたはペプチドのクローニング、発現または精製に関する操作に有用である他の配列を含み得る。核酸配列のこれらおよび他の改変は、本明細書中に記載されるかまたは当該分野において周知である。
【０２２１】
ＤＮＡコード配列をアセンブリおよび発現するための技術としては、オリゴヌクレオチドの合成、ＰＣＲ、細胞の形質転換、ベクターの構築、発現系などが挙げられる。これらは、当該分野において十分確立されており、その結果、当業者は、標準的な資源材料、特定の条件および手順に精通している。
【０２２２】
（発現ベクターおよび宿主細胞）
本発明は、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されたＨＰＲＧのポリペプチド、ドメイン、ペプチドまたはペプチド多量体をコードする核酸配列を含む発現ベクターを含む。
【０２２３】
本明細書中で使用される場合、用語「発現ベクター」または「発現カセット」は、宿主中でタンパク質コード配列の発現をもたらし得るヌクレオチドをいい、この宿主は、このような配列に適合性である。発現カセットは、ポリペプチドコード配列、および必要に応じて他の配列（例えば、転写終止シグナル）と作動可能に連結されたプロモーターを含む。発現をもたらすに必要であるかまたは有用であるさらなる因子（例えば、エンハンサー）がまた、少なくとも含まれ得る。
【０２２４】
「作動可能に連結された」は、コード配列がそのコード配列の発現を可能にする様式で調節配列に連結されていることを意味する。公知の調節配列は、適切な宿主細胞中で所望のタンパク質の発現を指向するように選択される。従って、用語「調節配列」としては、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメントが挙げられる。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０））に記載される。
【０２２５】
従って、発現カセットとしては、プラスミド、組み換えウイルス、任意の型の組換え「裸のＤＮＡ」ベクターなどが挙げられる。「ベクター」は、細胞を感染、トランスフェクト、一過性または永続的に形質導入し得る核酸を含む。ベクターが、裸の核酸、またはタンパク質もしくは脂質と複合体化された核酸であり得ることが認識される。ベクターは、必要に応じてウイルス性核酸もしくは細菌性核酸、および／またはタンパク質、および／あるいは膜（例えば、細胞膜、ウイルス脂質エンべロープなど）を含む。ベクターとしては、ＤＮＡフラグメントが結合し得、複製し得るようになるレプリコン（例えば、ＲＮＡレプリコン、バクテリオファージ）が挙げられるが、これらに限定されない。よって、ベクターとしては、自立性自己複製性環状ＤＮＡもしくはＲＮＡ、または線状ＤＮＡもしくはＲＮＡ（例えば、プラスミド、ウイルスなど（米国特許第５，２１７，８７９号））が挙げられるがこれらに限定されず、そして発現プラスミドおよび非発現プラスミドの両方を含む。組換え微生物または細胞培養物が「発現ベクター」についての宿主である場合、ベクターは、宿主染色体中に組み込まれている染色体外環状ＤＮＡおよびＲＮＡならびに線状ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含む。ベクターが宿主細胞によって維持されている場合、ベクターは、細胞分裂中に、自立性構造として細胞によって安定に複製され得るか、または宿主のゲノム内に組み込まれるかのいずれかである。
【０２２６】
当業者は、本発明の発現ベクターの特定の設計がトランスフェクトされるべき宿主細胞および発現されるべきポリペプチドの特徴（例えば、サイズ）のような考慮に依存することを認識する。
【０２２７】
本発明の発現ベクターは、ＨＰＲＧのポリペプチド、ドメインまたはペプチドフラグメントおよびそのペプチド多量体、改変体などを含む種々の実施形態をコードする核酸分子の全範囲を含む。
【０２２８】
このような発現ベクターを使用して、ＤＮＡの発現およびコードされたタンパク質（融合タンパク質または融合ペプチドを含む）の産生のために、宿主細胞を（インビトロ、エキソビボまたはインビボで）トランスフェクトする。ＨＰＲＧのポリペプチド、ドメイン、ペプチドフラグメントまたは多量体を発現する遺伝子改変された細胞が、その示された目的に有用である細胞に十分な時間にわたって外因性ＤＮＡを一過性に発現し得ることは、理解される。
【０２２９】
宿主細胞はまた、ＨＰＲＧポリペプチドまたはＨ／Ｐドメインの少なくとも一部をコードするＤＮＡ、および第２のＨＰＲＧ由来配列（または改変体）の少なくとも一部をコードするＤＮＡを単独でかまたは組合わせて含む、１つ以上の発現ベクターでトランスフェクトされ得、その結果、その宿主細胞は、なおさらなるＨＰＲＧのポリペプチド、ドメインまたはペプチドフラグメント（両方の部分を含む）を産生する。
【０２３０】
ＨＰＲＧのポリペプチド、ドメインまたはペプチドフラグメントを産生する方法は、当該分野において全て慣用的である。培養物は、典型的には、宿主細胞、適切な増殖媒体および他の副産物を含む。適切な培養媒体は、当該分野において周知である。ＨＰＲＧのポリペプチド、ドメインまたはペプチドフラグメントは、タンパク質およびペプチドを精製するために慣用的な技術（硫酸アンモニウム沈殿、分画カラムクロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーなど）および／または電気泳動（一般に、Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，２２：２３３−５７７（１９７１）を参照のこと）を含む）を使用して、媒体または細胞溶解物から単離され得る。一旦、部分的または均一に精製されると、本発明の組換えポリペプチドは、本明細書中により詳細に記載されるような薬学的組成物に利用され得る。
【０２３１】
本明細書中で使用される場合、用語「単離された」は、分子または組成物に対していわれる場合、その分子または組成物が、少なくとも１つの他の化合物（タンパク質、他の核酸など）または本来結合しているかもしくは処理の間に結合した他の夾雑物から分離されていることを意味する。単離された組成物はまた、実質的に純粋であり得る。単離された組成物は、均一な状態であり得、そして乾燥されているかまたは水溶液中であり得る。純度および均一性が、例えば、分析化学的技術（例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ））を使用して決定され得る。タンパク質がゲルパターン中に均一なバンドまたは優性なバンドとして現れるように単離されている場合でさえ、通常、そのタンパク質と同時精製される微量夾雑物が存在することは、理解される。
【０２３２】
ＨＰＲＧのポリペプチド、ドメインまたはペプチドフラグメントを発現するように形質転換またはトランスフェクトされている原核生物宿主細胞または真核生物細胞は、本発明の範囲内である。例えば、ＨＰＲＧのポリペプチド、ドメインまたはペプチドフラグメントは、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（バキュロウイルス）、酵母または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはヒト細胞（これらは、このトランスフェクトされた細胞のヒト治療用途に好ましい））中で発現され得る。他の適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ（１９９０）（上述）に見出され得るか、またはさもなくば当業者に公知であり得る。
【０２３３】
真核生物細胞中での発現は、部分的もしくは完全なグリコシル化、および／または組換えポリペプチドの関連の鎖内ジスルフィド結合もしくは鎖間ジスルフィド結合の形成を導く。
【０２３４】
酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ  ６：２２９−２３４），ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｃｅｌｌ  ３０：９３３−９４３），ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｇｅｎｅ  ５４：１１３−１２３），およびｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。培養された昆虫細胞（ＳＦ９細胞）におけるタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ，Ｖ．Ａ．，およびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．，（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１−３９）が挙げられる。一般に、ＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．，（１９８１）Ｃｅｌｌ  ２３：１７５−１８２）は、哺乳動物細胞における一過性の増幅／発現のために、ｐＣＤＭ  ８（Ａｒｕｆｆｏ  Ａ．およびＳｅｅｄ，Ｂ．，（上述）のようなベクターと組合わせて使用されるが、ＣＨＯ細胞（ｄｈｆｒ−ネガティブなＣＨＯ細胞）は、哺乳動物細胞における安定な増幅／発現のために、ｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７），ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８７−１９５）のようなベクターとともに使用される。ＮＳ０骨髄腫細胞株（グルタミン合成酵素発現系）は、Ｃｅｌｌｔｅｃｈ  Ｌｔｄより入手可能である。
【０２３５】
しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解性切断部位が、レポーター基と標的タンパク質との連結部に導入されて、融合タンパク質の精製の後のレポーター基からの標的タンパク質の分離を可能にする。このような切断のためのタンパク質分解酵素およびその認識配列としては、第Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが挙げられる。
【０２３６】
典型的な融合発現ベクターとしては、ｐＧＥＸ（Ａｍｒａｄ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ），ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が挙げられる。これらは、それぞれグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトースＥ結合タンパク質またはプロテインＡをその標的組換えポリペプチドに融合する。
【０２３７】
誘導可能な非融合発現ベクターとしては、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ１１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ（１９９０）６０−８９）が挙げられる。標的遺伝子発現は、ｐＴｒｃ中のハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーター由来の宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依存するが、ｐＥＴ１１ｄへ挿入された標的遺伝子の発現は、ウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ｇｎ１）を同時発現することによって媒介されるＴ７ｇｎ１０−ｌａｃＯ融合プロモーターからの転写に依存する。このウイルスポリメラーゼは、Ｔ７ｇｎ１を保有するレジデントλプロファージ由来の宿主系統ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）によって、ｌａｃＵＶ５プロモーターの転写制御下で供給される。
【０２３８】
（ベクター構築）
所望のコード配列および制御配列を含む適切なベクターの構築は、当該分野において十分理解されている標準的なライゲーション技術および制限技術を使用する。単離されたプラスミド、ＤＮＡ配列または合成オリゴヌクレオチドは、所望される形態で切断され、調整され、そして再連結される。ベクターを形成するＤＮＡ配列は、多くの供給源より入手可能である。バックボーンベクターおよびコントロール系は、構築における大部分の配列のために使用される利用可能な「宿主」ベクターに一般に見出される。適切なコード配列について、最初の構築は、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリーからの適切な配列の回復の問題であり得、通常はそうである。しかし、一旦配列が開示されると、個々のヌクレオチド誘導体から始めて、インビトロで遺伝子配列全体を合成することが可能である。相当な長さ（例えば、５００〜１０００ｂｐ）の遺伝子についての遺伝子配列全体は、個々に重複する相補的なオリゴヌクレオチドを合成して、デオキシリボヌクレオチド三リン酸の存在下でＤＮＡポリメラーゼを使用して一本鎖非重複部分を埋めることによって調製され得る。このアプローチは、公知の配列のいくつかの遺伝子の構築において首尾よく使用されている。例えば、Ｅｄｇｅ，Ｍ．Ｄ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９２：７５６；Ｎａｍｂａｉｒ，Ｋ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８４）２２３：１２９９；およびＪａｙ，Ｅ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９８４）２５９：６３１１を参照のこと。
【０２３９】
合成オリゴヌクレオチドは、上記で引用される参考文献によって記載されるようなホスホトリエステル法、またはＢｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．，およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄ  Ｌｅｔｔ（１９８１）２２：１８５９；ならびにＭａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．Ｄ．，およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ（１９８１）１０３：３１８５によって記載されるようなホスホラミダイト法のいずれかによって調製され、そして、市販の自動化オリゴヌクレオチド合成機を使用して調製され得る。アニーリング前の、または標識のための一本鎖のキナーゼ処理は、周知の方法を使用して達成される。
【０２４０】
従って、一旦、所望のベクターの成分が利用可能となれば、これらは、標準的な制限手順およびライゲーション手順を使用して切り出され得、そして連結され得る。部位特異的ＤＮＡ切断は、当該分野において一般に理解されている条件下で、適切な制限酵素での処理によって行われ、特定の条件は、これらの市販の制限酵素の製造者によって特定されている。例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｃａｔａｌｏｇを参照のこと。所望ならば、切断されたフラグメントのサイズ分離は、標準的技術を使用するポリアクリルアミドゲル電気泳動またはアガロースゲル電気泳動によって行われ得る。サイズ分離の一般的な記載は、Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９８０）６５：４９９−５６０に見出される。
【０２４１】
多くの方法のいずれかを使用して、コード配列へ変異を導入し、本発明の改変体（これらが組換え的に産生される場合）を生成する。これらの変異としては、単純な欠失または挿入、塩基クラスターの合成的な欠失、挿入または置換、あるいは単一塩基の置換が挙げられる。ＤＮＡ配列の改変は、そのプロトコルおよび試薬が市販されている周知技術である部位特異的変異誘発によって作製される（Ｚｏｌｌｅｒ，ＭＪ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９８２）１０：６４８７−６５００およびＡｄｅｌｍａｎ，ＪＰ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ（１９８３）２：１８３−１９３））。単離されたＤＮＡは、制限によって分析されるか、および／あるいはＭｅｓｓｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９８１）９：３０９によってさらに記載されるＳａｎｇｅｒのジデオキシヌクレオチド法（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９７７）７４：５４６３）、またはＭａｘａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，（上述）の方法により配列決定される。
【０２４２】
ベクターＤＮＡは、慣用的技術（例えば、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウムの同時沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーション）を介して哺乳動物細胞に導入され得る。宿主細胞を形質転換するための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（上述）および他の標準的な教科書に見出され得る。融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解性切断部位が、レポーター基と標的タンパク質との連結部に導入されて、融合タンパク質の精製の後のレポーター基からの標的タンパク質の分離を可能にする。このような切断のためのタンパク質分解酵素およびその認識配列としては、第Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが挙げられる。
【０２４３】
（プロモーターおよびエンハンサー）
ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子のプロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼを結合し、そして「作動可能に連結された」核酸配列の転写を促進する。本明細書中で使用される場合、「プロモーター配列」は、ＲＮＡポリメラーゼによって転写されるＤＮＡまたはＲＮＡの鎖上に見出されるプロモーターのヌクレオチド配列である。本発明の好ましいプロモーター配列は、哺乳動物細胞において作動可能でなければならず、そして真核生物プロモーターまたはウイルスプロモーターのいずれかであり得る。好ましいプロモーターは、実施例に記載されるが、他の有用なプロモーターおよび調節エレメントは、以下に考察される。適切なプロモーターは、誘導性、抑制性または構成的であり得る。「構成的」プロモーターは、細胞の環境および発達を通じて遭遇するほとんどの条件下で活性なプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、環境調節または発達調節下でのプロモーターである。「組織特異的」プロモーターは、生物の特定の組織型において活性である。構成的プロモーターの例は、ウイルスプロモーターＭＳＶ−ＬＴＲである。これは、種々の細胞型において効率的かつ活性であり、そして、他のプロモーターのほとんどとが対照的に、停止された細胞および増殖する細胞において同様に増強された活性を有する。他の好ましいウイルスプロモーターとしては、ＣＭＶ−ＬＴＲ（サイトメガロウイルス由来）（Ｂａｓｈａｒｔ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ４１：５２１（１９８５））またはＲＳＶ−ＬＴＲ（ラウス肉腫ウイルス由来）（Ｇｏｒｍａｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：６７７７（１９８２）中に存在するプロモーターが挙げられる。また、以下のプロモーターが有用である：マウスメタロチオネインＩ遺伝子のプロモーター（Ｈａｍｅｒ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：２７３−２８８（１９８２））；ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｓ．，Ｃｅｌｌ  ３１：３５５−３６５（１９８２））；ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−３１０（１９８１））；および酵母ｇａｌ４遺伝子プロモーター（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｓ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７９：６９７１−６９７５（１９８２））；Ｓｉｌｖｅｒ，Ｐ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８１：５９５１−５９５５（１９８４））。プロモーター領域ならびに別々の活性化および転写因子のＤＮＡ結合に関連する転写因子の他の例示的記述としては、Ｋｅｅｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）２３１：６９９；Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４０：２４５；Ｊｏｎｅｓ，Ｃｅｌｌ（１９９０）６１：９；Ｌｅｗｉｎ，Ｃｅｌｌ（１９９０）６１：１１６１；Ｐｔａｓｈｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４６：３２９；Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９９３）７２：３０６が挙げられる。これらの上記で列挙された参考文献の全ての関連する開示は、本明細書中に参考として援用される。
【０２４４】
プロモーター領域はさらに、特定の組織中に見出される特定のタンパク質と相互作用することによって組織特異的エンハンサーとしてもまた機能し得るオクタマー領域を含み得る。本発明のＤＮＡ構築物のエンハンサードメインは、トランスフェクトされる標的細胞に特異的であるものであるか、またはこのような標的細胞の細胞性因子によって高度に活性化されている。ベクター（プラスミドまたはレトロウイルス）の例は、Ｒｏｙ−Ｂｕｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，１１２，７６７号中に開示されている。エンハンサーおよびその転写における作用の一般的考察について、Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．Ｍ．，Ｇｅｎｅｓ  ＩＶ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，（１９９０），ｐｐ．５５２−５７６を参照のこと。レトロウイルスエンハンサー（例えば、ウイルスＬＴＲ）が、特に有用である。エンハンサーは、好ましくは、遺伝子発現を刺激するために相互作用するプロモーターの上流に置かれる。レトロウイルスベクターを用いる使用について、内因性ウイルスＬＴＲは、エンハンサーなしになされ得、そして組織特異性または他の所望される特性（例えば、転写効率）を与える他の所望のエンハンサー配列と置換され得る。
【０２４５】
本発明の核酸配列はまた、標準的な技術を使用して化学的に合成され得る。ポリデオキシヌクレオチド化学的に合成する種々の方法が、公知であり、ペプチド合成に類似して市販のＤＮＡ合成機を用いて完全に自動化されている固相合成法が挙げられる（例えば、参考として本明細書中に援用されるＩｔａｋｕｒａ，米国特許第４，５９８，０４９号；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、米国特許第４，４５８，０６６号；およびＩｔａｋｕｒａら、米国特許第４，４０１，７９６号および同第４，３７３，０７１号を参照のこと。）。
【０２４６】
（細胞および動物への核酸の送達）
ＤＮＡ送達は、「外来」ＤＮＡの移入を包含し、この移入は（１）エキソビボ、最終的には、生きている動物の中にこの細胞を投与することにより移入するか、または（２）直接的に動物に移入するかのいずれかである。「遺伝子治療」を含む目的のための「遺伝子送達」のためのいくつかの一般的なストラテジー（すなわち、任意の核酸ベクターの送達）は、研究され、そして広範に概説されている（Ｙａｎｇ，Ｎ−Ｓ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：３３５−３５６（１９９２）；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｗ．Ｆ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：８０８−８１３（１９９２）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｓ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５７：４５５−４６０（１９９２）；Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｒ．Ｇ．，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．９２（補遺６Ａ）：４４Ｓ−５２Ｓ（１９９２）；Ｚｗｉｅｂｅｌ，Ｊ．Ａ．ら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６１８：３９４−４０４（１９９１）；ＭｃＬａｃｈｌｉｎ，Ｊ．Ｒ．ら、Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．３８：９１−１３５（１９９０）；Ｋｏｈｎ，Ｄ．Ｂ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔ．７：１７９−１９２（１９８９）（これらの参考文献は、その全体が本明細書中に参考として援用される））。
【０２４７】
１つのアプローチは、培養物中の初代細胞への核酸移入、それに続くエキソビボで形質転換された細胞の、宿主中（全身的または特定の器官もしくは組織のいずれか）への自家移植を包含する。
【０２４８】
送達のために好ましいＤＮＡ分子は、以下に記載されるように、ＨＰＲＧ（例えば、配列番号１または３）、そのＨ／Ｐドメイン（配列番号５または６）あるいは配列番号７、８、９または１０に基づくペプチドまたはペプチド多量体をコードする。
【０２４９】
本発明の目的を達成するために、核酸治療は、機能的に活性なＤＮＡをインビボで哺乳動物の体細胞組織または体細胞器官に直接移入することによって達成される。ＤＮＡ移入は、以下に記載される多数のアプローチを使用して達成され得る。これらの系は、選択マーカー（例えば、Ｇ４１８抵抗性）の使用により、インビトロでの首尾よい発現について試験され得、ＤＮＡを発現する形質転換されたクローンを選択し、その後、（誘導性の系の場合、誘導物質を用いる処理の後で）適切な免疫学的アッセイにおいて抗原含有発現産物に対する抗体を使用して、その産物の存在を検出する。ＤＮＡの取り込み、プラスミドの組み込みおよび組み込まれたプラスミドの安定性を含む、この手順の有効性は、公知の方法を使用する、プラスミドＤＮＡの直線化、および高分子量の哺乳動物ＤＮＡを「キャリア」として使用する同時トランスフェクションによって改善され得る。
【０２５０】
当該分野で報告される首尾よい「遺伝子移入」の例としては、以下が挙げられる：（ａ）不定の期間にわたるマーカー遺伝子の発現を導く、マウス筋組織へのプラスミドＤＮＡの直接的な注入（Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１４６５（１９９０）；Ａｃｓａｄｉ，Ｇ．ら、Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ  ３：７１（１９９１））；（ｂ）レトロウイルスベクターは、血管組織のインビボ感染およびインサイチュ感染に効果的である；（ｃ）レトロウイルス調製物の肝臓への門脈注入および直接的な注入は、インビボでの遺伝子送達および遺伝子発現をもたらした（Ｈｏｒｚａｇｌｏｕ，Ｍ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１７２８５（１９９０）；Ｋｏｌｅｋｏ，Ｍ．ら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：２７（１９９１）；Ｆｅｒｒｙ，Ｎ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８３８７（１９９１））；（ｄ）組換えアデノウイルスの肺組織への気管内注入は、肺気道上皮における外来遺伝子のインビボでの移入および長期の発現に効果的であった（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１（１９９１））；（ｅ）単純ヘルペスウイルスベクターは、インビボでの脳組織への遺伝子移入を達成した（Ａｈｍａｄ，Ｆ．ら、編、Ｍｉａｍｉ  Ｓｈｏｒｔ  Ｒｅｐｏｒｔｓ−Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅ，  Ｖｏｌ  １，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｅｈｅｉｍ  １  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ＵＳＡ，１９９１）。多数の方法の中のいずれかを使用するプラスミドによるトランスフェクションおよびレトロウイルスベクターによるトランスフェクションを使用する嚢胞性線維症の遺伝子治療は、Ｃｏｌｌｉｎｓら、米国特許第５，２４０，８４６号によって記載されている。
【０２５１】
レトロウイルス媒介型ヒト治療は、両栄養性（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｈｉｃ）の、複製欠損性レトロウイルス系を利用する（Ｔｅｍｉｎ，Ｈ．Ｍ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：１１１（１９９０）；Ｔｅｍｉｎら、米国特許第４，９８０，２８９号；Ｔｅｍｉｎら、米国特許第４，６５０，７６４号；Ｔｅｍｉｎら、米国特許第５，１２４，２６３号；Ｗｉｌｌｓ，Ｊ．Ｗ．米国特許第５，１７５，０９９号；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．，米国特許第４，８６１，７１９号）。このようなベクターは、機能的ＤＮＡをヒト細胞または組織に移入するために使用され、この機能的ＤＮＡとしては、例えば、リンパ球へのアデノシンデアミナーゼ遺伝子、ＮＰＴ−ＩＩ遺伝子、および腫瘍浸潤性リンパ球への腫瘍壊死因子についての遺伝子が挙げられる。レトロウイルス媒介型遺伝子送達は、概して、遺伝子移入のために標的細胞の増殖を必要とする（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｄ．Ｇ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：４２３９（１９９０））。この条件は、このＤＮＡ分子がその中に移入される、特定の好ましい標的細胞（すなわち、活性に増殖する腫瘍細胞）によってもたらされ得る。本発明のＨＰＲＧのポリペプチド、ドメインまたはペプチドフラグメントをコードするＤＮＡ分子は、当該分野で周知であるような、複製欠損レトロウイルスを生成するパッケージング細胞株を使用して、レトロウイスルベクターの中にパッケージングされ得る（例えば、Ｃｏｎｅ，Ｒ．Ｄ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６３４９−６３５３（１９８４）；Ｍａｎｎ，Ｒ．Ｆ．ら、Ｃｅｌｌ  ３３：１５３−１５９（１９８３）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．ら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４３１−４３７（１９８５）；Ｓｏｒｇｅ，Ｊ．，ら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１７３０−１７３７（１９８４）；Ｈｏｃｋ，Ｒ．Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２０：２５７（１９８６）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．ら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８９５−２９０２（１９８６）を参照のこと）。遺伝子移入のための効率的かつ安全な、より新しいパッケージング細胞株がまた、記載される（Ｂａｎｋら、米国特許第５，２７８，０５６号）。
【０２５２】
このアプローチは、レトロウイルスベクターを選択された組織または器官に送達するための部位特異的な様式で利用され得る。従って、例えば、カテーテル送達系が、使用され得る（Ｎａｂｅｌ，ＥＧら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１３４２（１９８９））。レトロウイルスベクターまたはリポソームベクターのいずれかを使用するこのような方法は、腫瘍の血管壁または血液循環中において発現されるべき核酸を送達するために特に有用である。
【０２５３】
他のウイルスベクターもまた、使用され得、これは、組換えアデノウイルス（Ｈｏｒｏｗｉｔｚ，Ｍ．Ｓ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｆｉｅｌｄｓ，ＢＮら編、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９０，１６７９頁；Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６  ９１９  １９８８），Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｓ．Ｅ．，Ｔｈｅ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，ＨＳ編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８４，１１章）、ニューロン特異的送達および持続のための単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）が挙げられる。ヒト遺伝子送達のためのアデノウイルスベクターの利点としては、組換えがめったに起こらず、このようなウイルスに関連するヒト悪性腫瘍が知られてなく、アデノウイルスゲノムは、２本鎖ＤＮＡであり、７．５ｋｂまでの大きさの外来遺伝子を許容するように操作され得、そして生きたアデノウイルスは、安全なヒトワクチン生物であることが挙げられる。アデノ随伴ウイルスはまた、本発明において、ヒトの治療（Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３９４１（１９９１））のために有用である。
【０２５４】
別の有用なベクター（特にヒトにおいて）は、ワクシニアウイルスであり、このウイルスは、非複製型となされ得る（米国特許第５，２２５，３３６号；同第５，２０４，２４３号；同第５，１５５，０２０号；同第４，７６９，３３０号；Ｓｕｔｔｅｒ，Ｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１０８４７−１０８５１；Ｆｕｅｒｓｔ，Ｔ．Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８９）８６：２５４９−２５５３；Ｆａｌｋｎｅｒ  Ｆ．Ｇ．ら；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９８７）１５：７１９２；Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ，Ｓら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８５）５：３４０３−３４０９）。異種ＤＮＡを含有する組換えワクシニアウイルスおよび他のウイルス、ならびに免疫およびＤＮＡ治療におけるそれの使用についての記載は、以下に概説される：Ｍｏｓｓ，Ｂ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．（１９９３）３：８６−９０；Ｍｏｓｓ，Ｂ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）２０：３４５−３６２；Ｍｏｓｓ，Ｂ．，Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９２）１５８：２５−３８；Ｍｏｓｓ，Ｂ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５２：１６６２−１６６７；Ｐｉｃｃｉｎｉ，Ａら、Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．（１９８８）３４：４３−６４；Ｍｏｓｓ，Ｂ．ら、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐｌｉｆ  Ａｎａｌ（１９８３）３：２０１−２１３。
【０２５５】
裸のＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいはウイルスベクターに加えて、設計された細菌は、ベクターとして使用され得る。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、ＢＣＧおよびＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（ＬＭ）を含む多数の細胞株が、挙げられる（Ｈｏｉｓｅｔｈ＆Ｓｔｏｃｋｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ２９１，２３８−２３９（１９８１）；Ｐｏｉｒｉｅｒ，ＴＰら、Ｊ  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８，２５−３２（１９８８）；（Ｓａｄｏｆｆ，Ｊ．Ｃ．，ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０，３３６−３３８（１９８８）；Ｓｔｏｖｅｒ，Ｃ．Ｋ．，ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５１，４５６−４６０（１９９１）；Ａｌｄｏｖｉｎｉ，Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５１，４７９−４８２（１９９１）；Ｓｃｈａｆｅｒ，Ｒ．，ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９，５３−５９（１９９２）；Ｉｋｏｎｏｍｉｄｉｓ，Ｇ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０，２２０９−２２１８（１９９４））。これらの生物は、腸管経路の感染を可能とし、経口による核酸送達の可能性を提供する。
【０２５６】
インビボでのウイルス媒介型遺伝子移入に加えて、当該分野で周知の物理的手段が、ＤＮＡの直接的な移入のために使用され得、プラスミドＤＮＡの投与（Ｗｏｌｆｆらら、１９９０，上述）および微粒子ボンバードメント媒介型遺伝子移入（Ｙａｎｇ，Ｎ．−Ｓ．，ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：９５６８（１９９０）；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｒ．Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：２７２６（１９９１）；Ｚｅｌｅｎｉｎ，Ａ．Ｖ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２８０：９４（１９９１）；Ｚｅｌｅｎｉｎ，Ａ．Ｖ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２４４：６５（１９８９）；Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｓ．Ａ．ら、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２７：１１（１９９１））。
【０２５７】
さらに、インビトロで細胞内に遺伝子を移入するための周知の手段であるエレクトロポレーションは、本発明のＤＮＡ分子をインビボにおいて組織に移入するために使用され得る（Ｔｉｔｏｍｉｒｏｖ，Ａ．Ｖ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０８８：１３１（１９９１））。
【０２５８】
「キャリア媒介型遺伝ボンバードメント移入」がまた、記載されている（Ｗｕ，Ｃ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１６９８５（１９８９）；Ｗｕ，Ｇ．Ｙ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１（１９８８）；Ｓｏｒｉａｎｏ，Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：７１２８（１９８３）；Ｗａｎｇ，Ｃ−Ｙ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７８５１（１９８２）；Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３（１９９２））。好ましいキャリアは、標的化されたリポソーム（Ｎｉｃｏｌａｕ，Ｃ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：１０６８（１９８３）；Ｓｏｒｉａｎｏら、上述）、例えば免疫リポソーム（ｉｍｍｕｎｏｌｉｐｏｓｏｍｅ）であり、これは、脂質２重膜の中にアシル化されたｍＡｂをとり込み得る（Ｗａｎｇら、上述）。アシアロ糖タンパク質／ポリリジンのようなポリカチオン（Ｗｕら、１９８９，上述）が、使用され得、ここで、この結合体は、標的組織を認識する分子（例えば、アシアロオロソムコイド）、および形質転換されたＤＮＡに結合するためのＤＮＡ結合化合物を含有する。ポリリジンは、ＤＮＡ結合分子の例であり、ＤＮＡに損傷を与えることなくＤＮＡに結合する。次いで、この結合体は、移入のために本発明のプラスミドＤＮＡと複合化される。
【０２５９】
トランスフェクションまたはマイクロインジェクションのために使用されるプラスミドＤＮＡは、当該分野で周知の方法を使用して（例えば、Ｑｕｉａｇｅｎ  手順（Ｑｕｉａｇｅｎ）を使用して）調製され得、その後に、本明細書中で例示される方法のような、公知の方法を使用してＤＮＡが精製される。
【０２６０】
ここまでに本発明は概ね記載され、同一の事項は、以下の実施例に対する参照を通して、より容易に理解される。これらの実施例は、例示の目的で提供され、特定されない限り、本発明が限定されることは意図されない。
【０２６１】
（実施例１）
ウサギＨＰＲＧを、プラスミンによって切断し、Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−リッチドメイン（Ｈ／Ｐ）およびその残りのＮ／Ｃドメインを放出する。このドメイン構造を、図１に図示する。図１中のはさみは、プラスミン切断部位を示す。
【０２６２】
次いで、これらのドメインを精製し、抗脈管形成活性についてインビトロおよびインビボで試験し得、抗脈管形成効果を媒介するＨＰＲＧの領域を同定し得る。
【０２６３】
（実施例ＩＩ）
（ＨＰＲＧによる内皮細胞増殖の阻害）
ｂＦＧＦを使用して、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）増殖を刺激する。細胞を、ｂＦＧＦ単独の存在下か、または増殖インヒビターの添加と共に、９６ウェルプレート中で４８時間インキュベートする。次いで、増殖を、比色定量試薬であるＭＴＳを用いて測定する。図２Ａおよび図２Ｂの結果は、ｂＦＧＦ単独と共にインキュベートしたウェル中で観察された増殖（１００％  増殖）のパーセンテージとして示す。
【０２６４】
ウサギＨＰＲＧ（ｒＨＰＲＧ）は、用量依存様式でＨＵＶＥＣのｂＦＧＦ刺激増殖を阻害し、この阻害は、図２Ａに示されるように、１００ｎＭにおいてほぼ完全であった。
【０２６５】
図２Ｂは、プラスミンによるＨＰＲＧの制限タンパク質分解によって調製したＨ／Ｐドメインが、インタクトなＨＰＲＧの抗増殖活性を保持し、一方、タンパク質分解産物（Ｎ／Ｃドメイン、これは、ＨＰＲＧのＨ／Ｐドメイン以外の全てのドメインを含んだ）は、活性を有さなかったことを示す。ＨＫａを、ポジティブコントロールとして含む。
【０２６６】
１μＭ  ＨＰＲＧで処理したＨＵＶＥＣの生存性は、コントロールの生存性にまさるとも劣らず、このことは、このポリペプチドがＨＵＶＥＣに対して細胞傷害性ではないことを示す。
【０２６７】
（実施例ＩＩＩ）
（ＨＰＲＧおよびＨ／Ｐドメインは、カスパーゼ−３活性の誘導を介して内皮細胞アポトーシスを誘導する）
ＨＰＲＧの観察された抗増殖活性がアポトーシスの誘導に起因したか否かを評価するために、カスパーゼ−３（いくつかの（プロ）アポトーシス経路に対して中心である酵素）の活性を測定した。ＨＵＶＥＣをｂＦＧＦまたはｂＦＧＦ＋ＨＰＲＧの存在下で１００ｍｍ２のペトリ皿中で増殖させた。細胞を抽出して、カスパーゼ−３活性を、蛍光基質を用いて測定した。
【０２６８】
ＨＫａ（これは、ＨＵＶＥＣ中でカスパーゼ−３活性を誘導することが以前に示された（Ｚｈａｎｇら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ（２０００）１４：２５８９−２６００））を、ポジティブコントロールとして使用した。
【０２６９】
この結果を図３に示す。１０ｎＭおよび１００ｎＭのｒＨＰＲＧは、ＨＫａと同程度でカスパーゼ−３活性を誘導した。結果は、ＨＫａ活性（これを、本アッセイにおいて１００％であるとする）のパーセントとして表す。ＨＰＲＧのＨ／Ｐドメインもまた、本アッセイ中で類似した濃度のＨ／Ｐにおいて同程度までアポトーシスを誘導した。このことは、増殖アッセイにおいて観察された細胞数の明らかな低下が、ＨＰＲＧおよびそのＨ／Ｐドメインによる内皮細胞中での細胞死の直接的な誘導に関連し得ることを示す。
【０２７０】
（実施例ＩＶ）
（ウサギＨＰＲＧは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上でＨＵＶＥＣの内皮細胞管形成を阻害する）
ＨＵＶＥＣをＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）でコーティングした９６ウェルプレートに播種した。結果を示す顕微鏡写真は、図４Ａおよび図４Ｂである。
【０２７１】
Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上での内皮細胞管形成を、ＦＧＦ−２（２０ｎｇ／ｍｌ）を用いて２４時間、ＶＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）およびＰＭＡ（４０ｎｇ／ｍｌ）を用いて２４時間（図４Ａ）インキュベートすることによって刺激した。ＨＰＲＧ（５００ｎＭ）の添加は、これらの条件下で管形成をほぼ完全に破壊した（図４Ｂ）。
【０２７２】
（実施例Ｖ）
（ＨＰＲＧ（ＡＴＮ−２３４）およびＨ／Ｐ（ＡＴＮ−２３６）ドメインは、ＣＡＭモデル中で脈管形成を阻害する）
本アッセイは、本質的に、Ｎｇｕｙｅｎら（Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓ．４７：３１−４０（１９９４））によって記載されるように実行した。脈管形成因子（ｂＦＧＦ、３０μｇ／ｍｌ）またはｂＦＧＦ（同じ濃度）およびインヒビター（２０μｇ／ｍｌ）のいずれかを含むフィルターを、８日齢のヒヨコ胚のＣＡＭ上に配置し、そしてそのＣＡＭを３〜９日間観察した。そのフィルターと接触した微細血管の数を計数することによって、脈管形成を定量した。本実験において、微細血管を、フィルターの移植の４日後に計数した。
【０２７３】
図５に示されるように、ＨＰＲＧ（ＡＴＮ−２３４）、ＨＫａ（ＡＴＮ−２３５）およびＡＴＮ−２３６（Ｈ／Ｐドメイン）は全て、本モデルにおいて脈管形成を阻害し得た。
【０２７４】
（実施例ＶＩ）
（ＨＰＲＧおよびＨ／Ｐドメインは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）プラグモデルにおいてＦＧＦ−２によって刺激された脈管形成をインビボにて阻害する）
本研究において、氷冷Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（５００μＬ）を、ヘパリン（５０μｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ−２（４００ｎｇ／ｍｌ）および試験される化合物と混合した。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）混合物を、４〜８週齢の雌性Ｎｃｒ無胸腺ヌードマウスへと腹部中線付近の部位に３プラグ／マウスで皮下注射した。注射したＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）は、触診可能な固形ゲルを形成する。動物を、注射後７日目に、頸部脱臼によって屠殺した。マウスの皮膚を腹部中線に沿って剥がし、そしてＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）プラグを収集し、そして高解像度で直ちにスキャンした。次いで、プラグを水中に分散させ、そして３７℃で一晩インキュベートした。ヘモグロビンレベルを、ドラブキン溶液（Ｓｉｇｍａ製）を用いて製造業者の指示書に従って決定した。
【０２７５】
結果を図６に示す。ＨＰＲＧ（０．２５μＭ、Ａ）およびＨ／Ｐドメイン（０．６μＭ、Ｃ）は、脈管形成を完全に阻害した。対照的に、ＨＰＲＧのＮ／Ｃフラグメント（０．２５μＭ、Ｂ）は、脈管形成に対して実質的に何の効果も有さなかった。ポジティブコントロールに対して比較したＨｂレベルは、１２４±４２％（３つのプラグの平均±ＳＤ）であった。
【０２７６】
（実施例ＶＩＩ）
（ＨＰＲＧおよびＨ／Ｐドメインは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）プラグモデルにおいて腫瘍細胞（３ＬＬ）媒介脈管形成をインビボにて阻害する）
本研究において使用した方法は、３ＬＬ腫瘍細胞をｂＦＧＦの代わりに脈管形成を刺激するために使用した以外は、実施例ＶＩに記載される方法と本質的に同じであった。Ｌｅｗｉｓ肺腺癌３ＬＬ細胞（１０６細胞／プラグ）を、注射前に冷Ｍａｔｒｉｇｅｌと混合した。７日後、動物を、頸部脱臼によって屠殺し、そしてＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）プラグを回収し、そして上記のように処理した。
【０２７７】
結果を図７に示す（ここでは、Ｈｂの量が示される）。３ＬＬ細胞単独のコントロール群（Ａ）は、最大レベルの脈管形成を示し、一方、腫瘍細胞の非存在下において（Ｂ）、ベースラインでのＨｂの存在が観察され、このことは、コントロールレベルの脈管形成を反映する。「ポジティブ」コントロールの抗脈管形成分子であるＨＫａ（０．７５μＭ）（Ｃ）は、約５０％脈管形成を阻害する。ＨＰＲＧのＨ／Ｐドメイン（１．８μＭ）（Ｄ）は、同程度の阻害を示す。
【０２７８】
（実施例ＶＩＩＩ）
（ＨＰＲＧおよびＨ／Ｐドメインは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）プラグモデルにおいて腫瘍細胞（ＭａｔＬｙＬｕ）媒介脈管形成をインビボにて阻害する）
ラット前立腺腫瘍細胞株（ＭａｔＬｙＬｕ）を使用して、実施例ＶＩＩおよびＶＩＩＩに記載されるようなＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）プラグモデルにおいて脈管形成を刺激した。本研究において、腫瘍増殖を評価した。
【０２７９】
結果を、図８Ａおよび８Ｂに示す。コントロール群において、プラグをＭａｔＬｙＬｕ腫瘍細胞単独に接種する。腫瘍細胞と一緒でのＨ／Ｐドメイン（１．８μＭ）の導入は、腫瘍重量（図８Ａ）および脈管形成（図８Ｂ）の有意な減少を生じた。類似の効果が、同じ濃度のエンドスタチンを用いて観察された。
【０２８０】
（実施例ＩＸ）
（Ｈ／Ｐコンセンサス配列の同定）
Ｈ／Ｐドメインを、反復配列の存在について分析した。これらを以下に記載し、そして以下の表１にて定量する。各コンセンサス配列を、ウサギ配列およびヒト配列の両方について比較した。
【０２８１】
【化８】
2005528879.tif 000009
３つの異なるコンセンサス反復を示すために、上記の配列に注釈をつける。
【０２８２】
【化９】
2005528879.tif 000010
これを、以下に配列番号６の異なるバージョンとして示す。
【０２８３】
【表１】
2005528879.tif 000011
（実施例ＸＩ）
（ＨＰＲＧ  Ｈ／Ｐドメイン由来のコンセンサス配列は、脈管形成を阻害する）
インビトロでのＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）管形成アッセイを上記のように実行した。
【０２８４】
結果を以下の表２に要約する。ＨＰＲＧのＨ／Ｐドメイン由来の２つのコンセンサス配列（ＨＨＰＨＧ（配列番号８）およびＨＰＰＨＧ（配列番号９））は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）プラグアッセイにおいて活性であった。後者のＮ末端をＡｌａで置換した改変体であるＡＰＰＨＧ（配列番号１１）は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）アッセイにおける管形成によって測定した場合、新生血管形成に対して何の効果も有さなかった。
【０２８５】
【表２】
2005528879.tif 000012
上記で引用される参考文献は全て、特別に援用されるか否かにかかわらず、本明細書中に参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【０２８６】
【図１】図１は、種々のドメインを示す、ＨＰＲＧの構造の概略図である。はさみは、プラスミン切断部位の位置を示す。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）のｂＦＧＦ−刺激増殖の阻害を示す。ウサギＨＰＲＧ（図２Ａ）およびそのＨｉｓ−Ｐｒｏリッチ（「Ｈ／Ｐ」）ドメインは、ＨＵＶＥＣの増殖を阻害する。
【図３】図３は、ＨＰＲＧおよびＨＫａ（二鎖ヒトキニノーゲンタンパク質）による、ｂＦＧＦ−刺激ＨＵＶＥＣにおけるカスパーゼ−３の誘導を示す。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、コントロール（図４Ａ）と比較した、ＨＰＲＧ（図４Ｂ）による、ＥＣ管形成の阻害を示す、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）−コーティングした９６ウェルプレートにプレートしたＨＵＶＥＣの顕微鏡写真である。
【図５】図５は、ニワトリ胚を用いる絨毛尿膜（ＣＡＭ）における脈管形成の阻害を示す。ＨＰＲＧ（ＡＮＴ−２３４）およびＨ／Ｐドメイン（ＡＴＮ−２３６）は、脈管形成を阻害する（血管数として表される）ことを示す。
【図６】図６は、ＨＰＲＧおよびＨ／Ｐドメインが、インビボでのＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）プラグモデルにおいて、ＦＧＦ−２により刺激された脈管形成を阻害することを示す。
【図７】図７は、ＨＰＲＧおよびＨ／Ｐドメインが、インビボでのＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）プラグモデルにおいて、３ＬＬ腫瘍媒介性脈管形成を阻害することを示す。
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、ＨＰＲＧのＨ／Ｐドメインが、インビボでのＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）プラグモデルにおいて、ＭａｔＬｙＬｕ腫瘍細胞の増殖（図８Ａ）、およびＭａｔＬｙＬｕ腫瘍細胞による脈管形成（図８Ｂ）を阻害することを示す。Ｈ／Ｐドメインは、（陽性コントロールのエンドスタチンタンパク質のように）１．８μＭで試験された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年6月16日(2005.6.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2005528879000001.app
【国際調査報告】
2005528879.tif 000022
2005528879.tif 000023
2005528879.tif 000024