(57)【要約】本発明は、a)該核酸分子の一本鎖型を提供する；b)該核酸分子の該一本鎖型にプライマーをハイブリダイズして鋳型/プライマー複合体を形成する；c)ポリメラーゼ及び少なくとも一つのヌクレオチド及び少なくとも一つのヌクレオチドの少なくとも一つの標識誘導体の混合物を加えることによりプライマーを酵素的に伸長する、その少なくとも一つのヌクレオチドの少なくとも一つの標識誘導体は切断しうる連結を介してヌクレオチドに連結した標識を含んでおりそして少なくとも一つのヌクレオチド及び少なくとも一つのヌクレオチドの標識誘導体の該混合物中の少なくとも一つのヌクレオチドの標識誘導体の量は1‐50モル％、1−40モル％、1−30モル％、又は1−20モル％の範囲内である；d)プライマーに付加されたヌクレオチドの型を決定する：そしてe)段階c)からd)を少なくとも1回繰り返す；からなる核酸分子の塩基配列決定方法に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)核酸分子の一本鎖型を用意し；
b)該核酸分子の該一本鎖型に、プライマーをハイブリダイズして、鋳型/プライマー複合体を形成し；
c)ポリメラーゼと、
少なくとも一つのヌクレオチド及び該少なくとも一つのヌクレオチドの少なくとも一つの標識誘導体の混合物であって、該少なくとも一つのヌクレオチドの該少なくとも一つの標識誘導体が、切断しうる連結を介してヌクレオチドに連結した標識を含んでおり、該少なくとも一つのヌクレオチド及び該少なくとも一つのヌクレオチドの標識誘導体の該混合物において、該少なくとも一つのヌクレオチドの標識誘導体の量が、1‐50モル％、1−40モル％、1−30モル％、又は1−20モル％の範囲内である混合物と
を加えることにより、プライマーを酵素的に伸長し；
d)該プライマーに付加されたヌクレオチドの型を決定し：
e)段階c)からd)を少なくとも1回繰り返す
段階を含む、核酸分子の塩基配列の決定方法。
【請求項２】
該混合物中の少なくとも一つのヌクレオチドの標識誘導体の量が、5‐50モル％、5−40モル％、5−30モル％、又は5−20モル％の範囲内である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
該混合物中の少なくとも一つのヌクレオチドの標識誘導体の量が、10‐50モル％、10−40モル％、10−30モル％、又は10−20モル％の範囲内である、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
該核酸分子の一本鎖型が、担体に結合されている、請求項1−3のいずれか一つに記載の方法。
【請求項５】
結合の手段が、a)疎水性化合物、オリゴヌクレオチド、抗体又はそのフラグメント、蛋白質、ペプチド、挿入試薬、ビオチン、ストレプトアビジン又はアビジン；或いはb)アミノ‐リンカー及びエポキシ処理担体を使用する共有結合、の群から選択される、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
該担体が、ゲル、固形若しくは多孔性ビーズ、表面又は繊維の群から選択される請求項4に記載の方法。
【請求項７】
該標識が、段階ｄ)の後に標識と相互作用する試薬又は漂白により無効化される、請求項1−3のいずれか一つに記載の方法。
【請求項８】
該漂白が光漂白によって行われる、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
該取り込まれたヌクレオチドと該標識の間の連結が、段階d）の後に切断される、請求項1−3に記載の方法。
【請求項１０】
該蛍光団とヌクレオチドの間の連結がジスルフィド結合である、請求項1−3に記載の方法。
【請求項１１】
該切断が、還元剤を加えることにより行われ、それによりチオール基を露出する、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
該露出したチオール基が、ヨードアセトアミド又はN-エチルマレインイミドのような適当な試薬によりキャッピングされる、請求項10又は11に記載の方法。
【請求項１３】
該ジスルフィド架橋と塩基の間のリンカーが8原子より短い、上記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
段階c)がpH 7未満で、望ましくはpH 6.5未満で、より望ましくはpH 6未満で行われる、上記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
該ヌクレオチドの誘導体が、ジデオキシヌクレオチド又は非環状ヌクレオチド類似体である、上記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
アルカリホスファターゼ、PPi-アーゼ、アピラーゼ、ジメチルスルホキシド、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、スペルミジン；NP-40、Tween 20及び Triton  X-100のような界面活性剤、一本鎖DNA結合タンパク質（SSB）又は遺伝子32のタンパク質を含むDNAの二次構造に影響する種々のタンパク質からなる群から選択される試薬が添加される、上記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも一つのヌクレオチドの少なくとも一つの標識誘導体及び少なくとも一つのヌクレオチドの混合物であって、
該少なくとも一つのヌクレオチドの該少なくとも一つの標識誘導体は、切断し得る連結を介して該ヌクレオチドに連結した標識を含んでおり、
該少なくとも一つのヌクレオチド及び該少なくとも一つのヌクレオチドの標識誘導体の該混合物中において、該少なくとも一つのヌクレオチドの標識誘導体の量が、1‐50モル％、1−40モル％、1−30モル％、又は1−20モル％の範囲内であり、望ましくは5‐20モル％、5−30モル％、5−40モル％、又は5−50モル％の範囲内であり、さらに望ましくは10‐20モル％、10−30モル％、10−40モル％、又は10−50モル％の範囲内である、上記混合物。
【請求項１８】
請求項17に記載の混合物と、
請求項1−14のいずれかに記載の方法を実施するためのDNAポリメラーゼ、還元剤、担体、キャッピング試薬、アピラーゼ、アルカリホスファターゼ、PPi-アーゼ、一本鎖結合タンパク質又は遺伝子32のタンパク質の少なくとも一つの成分とを分離した容器中に含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリヌクレオチドの塩基配列決定の分野に関し、特に、蛍光的に活性化されたヌクレオチドを、プライマー‐鋳型複合体に取り込ませた後検出し、検出後に不活化する合成的塩基配列決定法であって、検出基をジスルフィドを含む連結によりdNTPに連結させる同決定法に関する。また、本発明は、上記方法を実施するためのキットも提供する。
【背景技術】
【０００２】
DNA塩基配列決定法は、この数十年の間、大部分のゲノム分析にとって極めて重要であった。これ等の方法は、生命科学において非常に価値があり、バイオテクノロジーの分野において著しい進歩を可能にした。これ等の技術は、短いポリヌクレオチドのみならず、遺伝子全体及びその他の遺伝物質の塩基配列決定を可能にした。二つの異なる方法が伝統的に使用されている。第一は化学的分解法であり、これはMaxam及びGilbert （Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 560, (1977)）により開発された。第二の方法は、Sanger et al, (Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5463, (1977)）により開発され、鋳型に結合したプライマーの酵素的伸長に基づいている。
【０００３】
酵素法は、配列決定用フラグメントを発生させるためにジデオキシヌクレオチドを使用するので、ジデオキシ塩基配列決定法としても知られている。
【０００４】
上記の方法には多数の欠点がある。これらは発生したフラグメントを大きさにしたがって分離する手段を必要とする。この分離はポリアクリルアミドゲル上で行われるが、時間を要し、高価な化学薬品を大量に使用し、そして一実験において分離できる塩基の数には厳しい制限がある。またゲルを読み取るにも時間を要する。さらに、あるフラグメントはゲルの中で異なる構造をとることが出来るので、このようなフラグメントの移動度の変化を生じる。
【０００５】
この数年、効率とスピードを上げるために、このような方法に対する多くの改良が施されてきた。塩基配列決定反応を行うための試薬が改良され、ゲルを読み取るための自動化塩基配列決定装置が開発され、ヌクレオチドの中に組み込むための種々の標識が開発された、等々。ヌクレオチドを標識するために異なる色素を使用することにより、4つの異なる塩基配列決定反応産物をゲル上の異なるレーンを泳動させる必要はなくなった。
【０００６】
このような発展があったにもかかわらず、より安価でしかも迅速な塩基配列決定法に対するニーズが存在する。このような方法としては、ハイブリダイゼーションによる塩基配列決定法（R. Drmanac et al, Genomics, 4, (1989) 114; Drmanac et al, DNA Cell Biology, 9, (1990), 527; Bains et al, J. Theor. Biol., 135, (1988), 303-307, そのほか多数）、単一分子の蛍光検出（Jett et al, J. Biomol. Struct. Dyn., 7, (1989), 301; Nguyen et al, Anal. Chem., 56, (1987), 348）又は走査トンネル顕微鏡による塩基配列決定がある。上記方法には種々の欠点があり、一般的に費用効率が悪くそして/又は実施できそうもない。
【０００７】
WO 01/94546は、一塩基対の伸長を行うことにより点突然変異及びSNPを検出、分析する方法に関するものである。伸長段階におけるヌクレオチドの30から95％を標識することが出来る。
【０００８】
WO 01/11083は、配列欠失を検出する方法を記述しており、その方法は一つの標識ヌクレオチドを追加することにより核酸分子が伸長する段階を含んでいる。標識及び非標識のヌクレオチドの混合物が、この段階において使用される。
【０００９】
WO 98/44152は、異なる場所に存在する異なる核酸分子の塩基配列決定を平行して行う方法を開示している。この方法は、標識ヌクレオチドを使用するプライマー伸長を含んでいる。全体の<50％、<20％又は<10％の標識ヌクレオチドを含む標識/天然ヌクレオチド混合物が記述されている。このような混合物を使用する理由は、コストを減少させると共に、その標識のシグナルが相互に干渉する特定の標識を使用した場合に、できるだけクエンチング効果を減少させるためである。取り込んだシグナルを除去する試みはされていない。むしろ、取り込みごとに信号は蓄積する。この方法における蛍光変種は、全体の信号が増加するに従い感受性が次第に減少するであろうから、長い配列に対して機能することは期待できない。
【００１０】
別の方法、いわゆる合成的塩基配列決定法が、Melamede, US 4863849，により最初に記述された。簡潔に記すと、この方法は次のように記述することが出来る；1）活性化ヌクレオシド三リン酸をプライマー‐鋳型複合体に加える；2）活性化ヌクレオチドを検出する；3）段階１）を繰り返し、この際にヌクレオチドの陽性取り込みから配列が推定される。この一般的な記述において、活性基はdNTP分子のどの位置にでも存在することが出来る；US 5,302,509では、活性基は糖部分の3'‐位置に結合している、他方WO 93/21340では、活性基は塩基に結合している。Nyrenは第3の方法をWO 98/13523及びWO 98/28440に開示しており、その中で活性化はプライマー伸長段階において放出されるピロリン酸の検出に関連付けられている。
【００１１】
WO 00/53812及びWO 00/50642は、ヌクレオチドに色素を連結するためにジスルフィドを含むリンカーを使用したヌクレオチドの使用を記述している。このことは酸化還元のサイクルにより色素を容易に除去することを可能にする。WO 00/53812では、色素は塩基（dCTPのみ記述）に連結しており、そしてWO 00/50642では色素は糖部分の3'‐位置に結合している。
【００１２】
色素標識ヌクレオチドを使用する合成的配列決定法の一つの利点は、局在化した信号が得られることである。このことは、全てのポリヌクレオチドが異なっていても又は異なっていなくても、アレイ上のポリヌクレオチドの塩基配列決定のような応用が可能であることを意味している。さらに、一種の酵素のみを必要とするので塩基配列決定を安価にする。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、現行技術に比較して安価であり、そして精度と感度の増加を示す改良された合成的塩基配列決定法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明の要約
一態様において、本発明は、核酸分子の配列を決定するための方法において；
a)該核酸分子の一本鎖型を提供し；
b)該核酸分子の該一本鎖型にプライマーをハイブリダイズして鋳型/プライマー複合体を形成し；
c)ポリメラーゼと、少なくとも一つのヌクレオチド及びその少なくとも一つのヌクレオチドの少なくとも一つの標識誘導体の混合物とを加えることにより、酵素的にプライマーを伸長するものであって、
その少なくとも一つのヌクレオチドの少なくとも一つの標識誘導体は切断可能な連結を介してヌクレオチドに連結した標識を含んでおり、
少なくとも一つのヌクレオチド及び少なくとも一つのヌクレオチドの標識誘導体の混合物中において少なくとも一つのヌクレオチドの標識誘導体の量が1‐50モル％、1‐40モル％、1‐30モル％、又は1‐20モル％の範囲内であり、望ましくは5‐50モル％、5‐40モル％、5‐30モル％、又は5‐20モル％の範囲であり、より望ましくは10‐50モル％、10‐40モル％、10‐30モル％、又は10‐20モル％の範囲である、混合物を加えることにより、酵素的にプライマーを伸長し；
d)プライマーに付加されたヌクレオチドのタイプを決定する；
段階を含み、
上記段階c)からd)を少なくとも1回繰り返す、同方法に関する。
【００１５】
その他の態様において、標識を段階d)の後標識に相互作用する試薬（ａ  ｌａｂｅｌ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を加えることにより又は漂白、望ましくは光漂白（ｐｈｏｔｏ  ｂｌｅａｃｈｉｎｇ）により無効化する。標識は、漂白（光漂白）によるか又は別の標識のような放射蛍光を中和する化合物を加えることにより無効化することができ、次いで放射光はクエンチングにより減少する。
【００１６】
ある態様において、ヌクレオチドから標識を切り離すことが望ましい。これは例えば還元試薬により切断可能なヌクレオチドと標識の間のリンカーを使用することにより可能となる。このように、段階d)の後組み込まれたヌクレオチドと標識の間の連結が切断される上記の方法が提供される。これによれば、蛍光団とヌクレオチドの間の連結がS-S架橋である上記の方法が提供される。
【００１７】
一態様において、切断は還元試薬の添加により行われ、それによりチオールが出現する。
【００１８】
一態様において、出現したチオールは適当な試薬、例えばヨードアセトアミド又はN-エチルマレインイミドによりキャッピングする。
【００１９】
本発明の目的は、隣接する標識間の相互作用を防止するのに十分な短いリンカーを使用することにより達成することができる。このために、ジスルフィド架橋とヌクレオチド塩基の間のリンカーの長さは8原子より短いことが望ましい。かくして、別の態様において、ジスルフィド架橋と塩基の間のリンカーは8原子より短い。
【００２０】
一態様において、段階c)はpH 7未満、望ましくはpH 6.5未満、より望ましくはpH 6未満において実施する。
【００２１】
その他の態様において、該ヌクレオチドの誘導体はジデオキシヌクレオチド又は非環状ヌクレオチド類似体である。
【００２２】
さらにその他の態様において、アルカリホスファターゼ、PPi-アーゼ、アピラーゼ、ジメチルスルホオキシド、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、スペルミジン；NP-40、Tween 20 及びTriton X-100 のような界面活性剤；一本鎖DNA結合タンパク質（SSB）又は遺伝子32のタンパク質を含むDNAの二次構造に影響する種々のタンパク質からなる群から選択される試薬を加える。
【００２３】
本発明の一態様において、少なくとも一つのヌクレオチド及び少なくとも一つのヌクレオチドの標識誘導体の混合物であって、その少なくとも一つのヌクレオチドの少なくとも一つの標識誘導体は切断可能な連結を介してヌクレオチドに連結した標識を含み、少なくとも一つのヌクレオチド及び少なくとも一つのヌクレオチドの標識誘導体の混合物中において少なくとも一つのヌクレオチドの標識誘導体の量は1‐50モル％、1‐40モル％、1‐30モル％、又は1‐20モル％の範囲内であり、望ましくは5‐50モル％、5‐40モル％、5‐30モル％、又は5‐20モル％の範囲であり、さらに望ましくは10‐50モル％、10‐40モル％、10‐30モル％、又は10‐20モル％の範囲である混合物が提供される。
【００２４】
本発明の別の態様は、上記方法におけるいずれかの段階の方法を実施するためのキットであって、既に記述した態様に基づく混合物と、DNAポリメラーゼ、還元剤、担体、キャッピング試薬、アピラーゼ、アルカリホスファターゼ、PPi-アーゼ、一本鎖結合タンパク質又は遺伝子32のタンパク質の少なくとも一つの成分とを分離した容器に収めたキットである。
【００２５】
本発明はさらに、上記方法を実施するための試薬の混合物に関する。即ち、その他の態様において、（非標識）ヌクレオシド三リン酸及び該ヌクレオシド三リン酸の誘導体の混合物であって、該ヌクレオシド三リン酸の該誘導体は標識とヌクレオシド三リン酸の間の連結の一部としてジスルフィドを含む混合物を提供する。したがって、少なくとも一つのヌクレオシド三リン酸及び少なくとも一つのヌクレオシド三リン酸の少なくとも一つの標識誘導体の混合物であって、その少なくとも一つのヌクレオシド三リン酸の少なくとも一つの標識誘導体は標識とヌクレオシド三リン酸の間にジスルフィド架橋を含み、少なくとも一つのヌクレオシド三リン酸及び少なくとも一つのヌクレオシド三リン酸の標識誘導体の該混合物中において少なくとも一つのヌクレオシド三リン酸の標識誘導体の量が1‐50モル％、1‐40モル％、1‐30モル％、又は1‐20モル％の範囲内である混合物を提供する。望ましい量は、5‐50モル％、5‐40モル％、5‐30モル％、又は5‐20モル％の範囲内であり、さらに望ましい量は10‐50モル％、10‐40モル％、10‐30モル％、又は10‐20モル％の範囲内である。
【００２６】
本発明は、本発明の方法を実施するための適当な試薬を含むキットに関するものでもある。
【００２７】
定義
本明細書で使用されている用語「オリゴヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシドなどを含む天然若しくは修飾されたモノマー又は連鎖からなる線状オリゴマーを含み、ワトソン‐クリック型塩基対、塩基スタッキング、フーグスティーン型又は逆フーグスティーン型塩基対、などのようなモノマー対モノマー間相互作用の一定のパターンによりポリヌクレオチドに特異的に結合することが出来る。通常モノマーは、ホスホジエステル結合又はその類似物により連結して、モノマーの数単位、例えば3−4、からモノマーの数十単位、例えば40−60の大きさの範囲のオリゴヌクレオチドを形成する。オリゴヌクレオチドが"ATGCCTGG"のような文字列により示される場合は、必ず、ヌクレオチドは左から右へ5’→3'の順であり、そして"A"はデオキシアデノシン、"C"はデオキシシトシン、"G"はデオキシグアノシン、"T"はデオキシチミジンを示すと理解されている。
【００２８】
本明細書で使用されている用語「プライマー」は、伸長反応に使用され、DNAポリメラーゼにより受容される、すなわちプライマーが3'‐OH基を有しているオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは鋳型にアニール又はハイブリダイズして、伸長反応ができるプライマー/鋳型複合体を形成する。
【００２９】
本明細書で定義される用語「ヌクレオチド」は、デオキシヌクレオチド又はリボヌクレオチドのようなDNA又はRNAを構築する部品を表すために使用される。ヌクレオチドはまたデオキシ‐又はリボヌクレオシド三リン酸及び構築部品の修飾代替物も表すであろう。
【００３０】
本明細書で使用される用語「ヌクレオシド」は、Kornberg and Baker, DNA replication, 2nd Ed.(Freeman, San Francisco. 1992)に記述されているような、2'−デオキシ及び2'−ヒドロキシ型を含む天然ヌクレオシドを含む。ヌクレオシドに関する「類似体」は、修飾した塩基部分及び/又は修飾した糖部分を有する合成ヌクレオシドであって（例えば、Scheit, Nucleotide Analogs (John Wiley, New York, 1980); Uhlman and Peyman, Chemical Reviews, 90: 543-584 (1990) などに記述されている）、特異的ハイブリダイゼーションが出来るという唯一の条件を満たすものを含む。当該類似体は、LNA及びPNAのように、結合性を増強し、複雑さを減少させ、特異性を増強し、ポリヌクレオチドにおける二次構造を減少するなどの目的で設計された合成ヌクレオチドを含む。
【００３１】
本明細書で使用される用語ポリヌクレオチドに関する用語「塩基配列決定」又は「ヌクレオチド配列の決定」は、ポリヌクレオチドの部分的並びに完全な配列情報を決定することを含む。すなわち、この用語は、配列比較、フィンガープリント、標的ポリヌクレオチドの類型情報、並びにヌクレオシド、通常ポリヌクレオチド中の各ヌクレオシド、の同定及び配列を含む。この用語はまたポリヌクレオチドの中の4種のヌクレオチドの1、2又は3種を決定又は同定することも含む。
【００３２】
本明細書で定義される用語「鋳型」はヌクレオチドの配列の指令書となるDNA鎖として定義され、それぞれ付加されるヌクレオチドは塩基対マッチングにより選択される。
【００３３】
本明細書で定義される用語「標識」は、適当な方法で検出することが出来る分子を意味する。特に、用語「色素」、「標識」又は「色素‐標識」は、フルオレッセイン、U.S. 5,268,486 (Waggoner et al.)に開示されているCy-3、Cy-5 、Cy-7、Cy-9又はCy3.5及びCy5.5のようなシアニン色素又はそれらの変種といった蛍光分子を含むが、またローダミン、BODIPY、ROX、TAMRA、R110、R6G、Joe、HEX、TET、Alexa又はTexas Redのような分子も含む。
【００３４】
本明細書で定義される用語「標識ヌクレオチド」又は「色素標識ヌクレオチド」は、上記に定義した標識又は色素標識と連結したヌクレオチドを意味する。
【００３５】
本明細書で使用される用語「アレイ」は、支持マトリックス上に分布させた核酸分子の混成集合体のことである。配列の異なるこれらの分子は、アレイにおける個々の特性を同定するのに十分な距離を置いて配置されている。整列した固定オリゴヌクレオチドであるDNA又はRNA分子を含む縮小化された表面を意味することもある。
【００３６】
本明細書で定義される用語「担体」は、バイオテクノロジー又は医薬の分野で使用されるポリヌクレオチドを吸着し、保持し又は結合するための支持体を表すために使用される。担体は、ゲル、ビーズ（ミクロ粒子）、表面又は繊維のような担体であり得る。ゲルの種々の例としては、アクリルアミド又はアガロースがあり；ビーズの例としては標識又は磁性化合物を含むことが出来る固体ビーズがり；ビーズはまた、セファロースビーズのように多孔性であり得；表面は、硝子、プラスチックポリマー、シリカ又はセラミック物質であり得、これらの表面はいわゆる「アレイ」を作製するために使用することが出来る。繊維は、澱粉繊維又は光ファイバー及び繊維の末端でもあり得る。
【００３７】
本明細書で定義される用語「キャッピング」とは、標識とヌクレオチドとの間の連結の露出部分に保護基を加えることであり、例えば、露出したチオール基にヨードアセトアミドまたはN-エチルマレインイミドを結合することである。
【００３８】
実施例に使用される緩衝液は、それが最初に記述される文章中で定義される。
【００３９】
本明細書で定義される用語「ホモポリマー」又は「ホモポリマー的伸長」は、前後同じ塩基のヌクレオチド残基が少なくとも2個続くこと、すなわちAAn、TTn、CCn又はGGn（n>=1）と定義される。
【００４０】
本明細書及び請求項を通して、語「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｅ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）は、非除外的意味で使用されている。
【００４１】
本明細書で使用した用語は、本発明の特殊な態様を記述する目的にのみ使用したものであり、本発明の範囲を限定するためでないことは、理解されるべきである。
【００４２】
本明細書及び添付した特許請求の範囲で使用されている単数形 "a"、"an" 及び "the" は文章で明らかに記述しない限り複数への言及も含むことに注意が必要である。
【００４３】
そのほか特に定義しない場合は、本明細書で使用されている技術的及び科学的用語は、全て本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。
【００４４】
発明の詳細な説明
本発明は、既述の合成的塩基配列決定法の持つ問題を解決し、他の方法において遭遇する欠点を除いた塩基配列決定を実施することを可能にする。67％標識dCTPを使用するWO 00/53812による合成的塩基配列決定法の再現を試みる間に、取り込まれた色素標識dCTPの数とシグナルとの間の関係が、1−3塩基の範囲において直線でないことを見出した。これは、取り込まれた標識ヌクレオチドの数が増えるに従い蛍光が強くなるはずであるという予想に反するものである。さらに、色素標識され且つ切断されたdNTPに近接した標識dNTPの取り込みは、予想よりもかなり低い第二回目取り込みの信号を生じた。本発明者らは、非標識に対する標識ヌクレオチドの比率を下げることにより、標識ヌクレオチドの数の増加にしたがって増加するシグナルを得ることが可能であることを示すことができた。上記欠陥を説明するには二つの異なる方法があるように思われる、すなわち、クエンチングの問題とジスルフィド化学の問題である。
【００４５】
クエンチングの問題は、次のように記述することができる。
二個の色素標識分子（蛍光団のような）が極めて近接して存在する場合には、これ等の分子は相互作用して、放射光を減弱する。この現象はクエンチングと呼ばれる。全ての天然に存在する核酸では「ホモポリマー的伸長」の頻度は高い。このようなホモポリマー的伸長は、互いに短い距離の中に二つの蛍光団を配置するために、信号の減弱を生じるであろう。このように、WO 00/53812に開示された方法の大きな問題は、ホモポリマー的伸長を含むポリヌクレオチドの配列を決定する場合には、再現が困難であるという点である。
【００４６】
ジスルフィドの問題は、次のように記述することができる。
この方法は、蛍光団の除去の間におけるS-S結合の形成と切断に依拠している。C（又はA、G、U、T）は、非修飾デオキシヌクレオシド三リン酸を示し（及びNはこれ等の塩基のいずれかを示す）、C-SS-label（又はA-SS-label、G-SS-label、U-SS-label)は、修飾デオキシヌクレオシド三リン酸（標識-SS-dCTP）を示し、C-SH（又はA-SH、G-SH、U-SH）は、還元剤により切断された修飾デオキシヌクレオシドであり、HS-dCp（又はHS-dAp、HS-dGp、HS-dUp）を生成する。
【００４７】
最初の取り込み：
2005521422.tif 000002
【００４８】
最初の切断：
2005521422.tif 000003
【００４９】
第二の取り込み：
2005521422.tif 000004
この時点において伸長したプライマー上で次の反応が生じうる：
2005521422.tif 000005
【００５０】
これは、取り込まれた塩基上のチオール基が新規に取り込まれた塩基のジスルフィド架橋と反応して、標識-SH基を置換することを意味する。そのような反応により新規に取り込まれた塩基は検出できないので、鋳型の配列決定を不可能にすることは明白である。塩基に結合したリンカーの腕が十分に長く、そして二つの反応基が相互作用できる場合には、チオール基を持つ塩基と蛍光団を持つ塩基の間に1又はそれ以上の非修飾塩基が存在する場合であっても、この反応が起こる可能性がある。
【００５１】
既述された方法が機能しない根本的理由、すなわち、分子内チオール架橋の形成、を理解したとき、本発明者らは上記問題を回避するための多数の方法を認識した。基本的に、本発明は、当該チオール架橋の形成の確率を減少させる手段に関係する。これは以下の方法の一つ又はそれ以上により達成される：
【００５２】
1.  二つの隣接して取り込まれた塩基が修飾されている確率を減らすために、少なくとも一つのデオキシヌクレオシド三リン酸と少なくとも一つのデオキシヌクレオシド三リン酸の少なくとも一つの標識誘導体を混合する。これは明らかに、検出を確実にするために蛍光デオキシヌクレオシド三リン酸誘導体を十分に取り込むことと、上記のような交差反応のリスクを減少させることの間のバランスである。これは、望ましいアプローチであり、この方法を機能させることができた。少なくとも一つのデオキシヌクレオシド三リン酸と少なくとも一つのデオキシヌクレオシド三リン酸の標識誘導体との混合物中において、少なくとも一つのデオキシヌクレオシド三リン酸の標識誘導体の量は、1‐50モル％、1‐40モル％、1‐30モル％、又は1‐20モル％の範囲内であり、望ましくは5‐50モル％、5‐40モル％、5‐30モル％、又は5‐20モル％の範囲内であり、さらに望ましくは10‐50モル％、10‐40モル％、10‐30モル％、又は10‐20モル％の範囲内でなければならない。この量は、取り込みのレベルがクエンチング及び分子内チオール基形成による問題を避けるために十分低く、有効な検出を可能にするために十分高いことを保証する。標識分子の取り込みのレベルは、0.1−30％、望ましくは0.1−20％、さらに望ましくは1‐20％でなければならない。反応混合物中の標識デオキシヌクレオシド三リン酸のレベルは、二つの形態に対するDNAポリメラーゼの相対的選択性によって必要とされる非修飾デオキシヌクレオシド三リン酸取り込みのレベルよりも高いか又は低いことがありうることに注意が必要である。この方法は、またホモポリマー的伸長の検出に関する別の利点もある（下記参照）。
【００５３】
2.  唯一の修飾デオキシヌクレオシド三リン酸を使用し、残りの3種は非修飾でありそして別々に加えることにより、個別の鋳型分子又は分子のグループを単純に配列決定する。しかし、この方法はいわゆるホモポリマー的伸長の説明を複雑にする（下記参照）。
【００５４】
3.  露出したチオール基をチオール基に対して高い反応性を有する試薬でキャッピングすることにより保護する。該試薬の例はヨードアセトアミド及びN-エチルメレインイミドを含む。
【００５５】
4.  リンカーの腕の長さを減らす、すなわち、ジスルフィド架橋とヌクレオチドの間の原子数を減らすことによって、反応基が相互に反応を生じるほどに接近する確率を減らす。
【００５６】
5.  分子間反応の確率を減少させるために、（分子数を減らすことにより、又は担体からの距離をリンカーを介して増加することにより）担体上のプライマー/鋳型複合体の密度を減らす。
【００５７】
6.  チオール基の反応種は、チオレートイオン、−S-である。平衡反応：−SH⇔−S-は約8のpKaを有しており、環境のpHを下げると上記の交差反応のリスクを減少させるはずであることを意味する。このことから取り込み反応、続く洗浄段階及び検出をpH7未満、望ましくは6.5未満、より望ましくは6.0未満で行う必要があるであろう。
【００５８】
7.  プライマーのそれ以上の伸長を中止させることによって、分子内反応のリスクを除去するような方法で、標識ヌクレオシド三リン酸を修飾することも可能であり、それは、ジデオキシヌクレオチドを使用して行うことができる。明らかに、これは、伸長配列決定の間、信号の連続的減少を生じさせるであろうが、それは修飾ヌクレオシドの取り込みのレベルに依存して、優位であることも優位でないこともある。
【００５９】
8.  これ等の問題は、シグナル対ノイズ比が低くなりしだい、標識基を周期的に切り離すことによっても解決することができるであろう。これにより分子内チオール相互作用を生じるリスク無しに、取り込みが進行するにしたがって段階的にシグナルが増加することになる。切断の直後にヨードアセトアミド又はN-エチルマレインイミドのような適当な試薬によりキャッピングを行うことができる。
【００６０】
本発明者らは、標識及び非標識ヌクレオチドの比を最適化することにより、取り込まれた標識ヌクレオチドの数の増加と共に直線的な増加が得られることを、確信を持って示すことができる。
【００６１】
隣接する標識分子間のクエンチング及びその他の相互作用は、一つの伸長されるDNA鎖上の隣接分子が、実際に修飾され、相互作用することがある確率を減少させるのに、十分に低い標識デオキシヌクレオシド三リン酸の取り込み率を確保することにより調節することができる。この取り込みを左右する過程は、デオキシヌクレオシド三リン酸の種々の形態に対するDNAポリメラーゼの「選択性」である。言い換えると、この過程は、非標識デオキシヌクレオシド三リン酸に対する標識体の取り込み反応速度の相違に関連する。多分、天然のデオキシヌクレオシドに優先的に結合する酵素活性の能力のために、非標識（天然の）デオキシヌクレオシド三リン酸の取り込み速度の方が修飾デオキシヌクレオシド三リン酸のそれよりも早いことが、極く一般的に観察される。突然変異を導入して酵素の活性部位を修飾することにより、修飾デオキシヌクレオシド三リン酸の取り込み速度を改善することができる。反応混合物中の標識及び非標識デオキシヌクレオシド三リン酸の最適比率は以下のような多数の因子に依存している：
【００６２】
1.  ポリメラーゼ及びその活性部位（活性部位の修飾を含む）の性質。
2.  デオキシヌクレオシド三リン酸の型‐異なる塩基は異なる選択性を示す。
3.  蛍光団の性質。
4.  標識及び非標識デオキシヌクレオシド三リン酸の合計濃度‐使用するポリメラーゼによっては、低い合計濃度ではDNAポリメラーゼの選択性が減少するように思われる。
5.  反応混合物中のその他の変動又はポリメラーゼが作動する近傍の環境、例えば、鋳型/プライマーが固定されている担体の性質。
【００６３】
かくして、本発明は、下記段階を含む配列決定法に基づいている；
1）配列決定すべきポリヌクレオチドからなる一本鎖鋳型を準備する；
2）鋳型にプライマーをハイブリダイズすることによりプライマー/鋳型複合体を形成する；
3）DNA又はRNAポリメラーゼのようなポリメラーゼの助けにより、一つの標識ヌクレオチドを付加してプライマーを伸長する；
4）標識ヌクレオチドの型を決定する、或いは、標識ヌクレオチドの取り込みを検出する；
5）標識を除去又は無効化（neutraliized）する；
6）段階3‐5を反復し、それによってヌクレオチドの順序を決定する。
【００６４】
以下の反応試薬は、市販品を入手するか又は当業者の実験室において調製することができる。
【００６５】
DNAポリメラーゼは、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性がなく、蛍光分子で修飾されたデオキシヌクレオチドを受容するものでなければならない。例としては、クレノーエキソ‐(Stratagene)、Sequenase，Thermo Sequenase, Thermo Sequenase II (Amersham Biosciences)、rTth DNAポリメラーゼ（Applied Biosystems)、Tli DNAポリメラーゼエキソ‐（Vent(exo-)DNAポリメラーゼ、New England Biolabs)、Deep Vent(exo-)DNAポリメラーゼ（New England Biolabs)、AmpliTaq DNAポリメラーゼ（Amersham Biosciences)、Bst DNAポリメラーゼ（New England Biolabs)、DyNAzyme I及びII  DNAポリメラーゼ（Finnzymes Oy）が含まれる。
【００６６】
配列決定反応の性能を改善するために開示の方法において多数の試薬又は添加物を使用することができる。そのような添加物の例としては、ジメチルスルホキシド、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、スペルミジン；NP-40、Tween 20及びTriton X-100のような界面活性剤、一本鎖DNA結合蛋白質（Amersham Biosciences）及び遺伝子32 蛋白質（Amersham Biosciences）を含むDNAの二次構造に影響する種々のタンパク質がある。
【００６７】
種々のヌクレオチド分解酵素を、取り込まれなかったヌクレオチドを分解するために使用することができ、これにより合成的塩基配列決定におけるフレームシフトのリスクを減少させる。そのようなヌクレオチド分解酵素としては、えびアルカリホスファターゼ、PPi-アーゼ又はアピラーゼが挙げられ、それらはAmersham Biosciences 及び/又はSigmaから入手できる。
【００６８】
複雑な二次構造の領域における配列決定プライマーの伸長を改善するためにPCR産物の修飾をすることができ、例えば、dITP、deaza-dGTP又はdeaza-dATPのようなヌクレオチド類似体の取り込みがある。
【００６９】
取り込まれたヌクレオチドを検出するための標識として使用することができる蛍光団の例としては、Molecular Probes Inc., USAから入手できる、Alexa Fluor、フルオレッセイン、BODIPY、ローダミングリーン、テトラメチルローダミン、テキサスレッド、カスケードブルー又はオレゴンブルーを含むが、シアニン色素、ROX、TAMRA、R110、R6G、Joe、HEX又はTETのような分子も含まれる。
【００７０】
さらに、鋳型の量の変動が懸念される場合には、取り込まれた標識塩基からのシグナルを正規化するためにプライマー上にフルオレッセイン又はその他の蛍光団を取り入れることができる。
【００７１】
核酸配列決定用の鋳型は、適当な方法、例えば、ゲノムDNAからPCRによる増幅により調製することができる。鋳型は、例えば、ストレプトアビジン表面上に固定できるようなビオチン化PCRプライマーの使用により、担体上に一つの（又は両方の）鎖を固定し易いように、修飾されていることが望ましい。担体に鋳型を接着する多数の方法を使用することができ、それには疎水性化合物、オリゴヌクレオチド、抗体若しくはそのフラグメント、タンパク質、挿入剤、ビオチン、又はストレプトアビジン若しくはアビジンとの特異的結合を介して鋳型を結合することが含まれる。さらに、アミノ‐リンカー及びエポキシ処理担体を使用することにより共有結合することができる。
【００７２】
鋳型にプライマーを結合する条件は、プライマーの長さと配列によって変わる。その条件を確立することは当業者の知識の範囲内である。詳細な説明は、例えば、Maniatis, Molecular Cloning‐A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press の中に見ることができる。
【００７３】
担体は、バイオテクノロジー又は医薬の分野の中で使用されているどのような担体でもよい。種々のゲルの例は、アクリルアミド又はアガロースである。ビーズの例は固体ビーズであり、それは標識又は磁性化合物を含むことができる。ビーズはセファロースビーズのように多孔性であってもよい。表面としては、硝子、プラスチックポリマー、シリカ又はセラミック物質の表面があり、これ等の表面は、いわゆるアレイを調製するために使用することができる。プラスチック表面の実用的一例は、マイクロタイタープレートの底又は低い部分である。プライマー‐鋳型複合体であっても当該底面上にアレイを形成することができる。繊維としては、澱粉繊維又は光ファイバーがあり、繊維の末端であってもよい。
【００７４】
さらに、そのような担体は種々の方式で扱うことができる。ゲルは表面を覆うことができる。ビーズは、WO 0185341に記述されているように微小流体装置のチャネル内に捕捉させることができる。ビーズは、いわゆるビーズアレイの表面上に捕捉させることができる。ビーズは色素標識することができ、合成的塩基配列決定反応を行うと同時に分類することができる。
【００７５】
鋳型を担体上に固定することができ、変性させて固定一本鎖鋳型を生じさせ、これに配列決定プライマーがアニーリングすることができる。
【００７６】
そのほかには、非修飾末端を持つ一本鎖鋳型を作製し、これを（鋳型にハイブリダイズする前又は後に）5'−末端を介して担体の表面上に固定したオリゴヌクレオチド（配列決定プライマー）にハイブリダイズすることができる。
【００７７】
プライマーは、1又はそれ以上の標識ヌクレオチド、A、C、G、T又はU (又はI、イノシン)の存在下に、DNAポリメラーゼにより伸長される。一標識ヌクレオチドの使用が望ましい。多数の適当なポリメラーゼを使用することができ、ポリメラーゼは、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性がなく、蛍光分子で修飾されたデオキシヌクレオチドを受容するものでなければならない。望ましいポリメラーゼはクレノーエキソ-DNAポリメラーゼである。ポリメラーゼのその他の例は、既に記述した。伸長を実施する条件は、当業者によって容易に確立されるものであり、詳細な説明は、例えば、Maniatis et al.又は使用する特異的ポリメラーゼの供給業者の説明書を参照されたい。基本的に、DNAポリメラーゼ、必要な緩衝液、及び4種の修飾デオキシヌクレオシド三リン酸の一つの混合物を、用意した鋳型に加え、そして伸長が行われるのに適当な長さの時間インキュベートする。修飾デオキシヌクレオシド三リン酸は、蛍光団又はその他の標識が切断可能なリンカーによって結合しているデオキシヌクレオシド三リン酸を含むことができる。このデオキシヌクレオシド三リン酸は、例えば、蛍光団‐SS−dATP、蛍光団‐SS−dCTP、蛍光団‐SS−dGTP、蛍光団‐SS−dUTP又は蛍光団‐SS−dITPの一つを含むことができる。蛍光団は、各デオキシヌクレオシド三リン酸において同じでも異なってもよい。蛍光団は、US 5268486のCy-5が望ましいが、Cy-3又はフルオレッセインのようなほかの蛍光団の使用も想定することができる。
【００７８】
プライマーにヌクレオチドを付加するために標識ヌクレオチドを単独でそして連続的に使用することができる。ヌクレオチドが鋳型の次のヌクレオチドに対して相補的である場合には、そのヌクレオチドはプライマーの末端、又は新規に合成されたDNA鎖に付加されるであろう。このことは、鋳型中の単一ヌクレオチドごとについて、1−4ヌクレオチドが、配列情報によるDNA鎖への取り込みについて試験される必要があることを意味する。
【００７９】
一つ又はそれ以上の修飾デオキシヌクレオシド三リン酸を反応に加えることができる。過剰の試薬を洗浄により除去し、鋳型/プライマー複合体からの蛍光のレベルを測定する。
【００８０】
さらに、非特異的な取り込みを阻止するために、ブロック基を標識ヌクレオチドのデオキシリボース基の3'部位に結合したチェーンターミネーターヌクレオチドを使用することができる。ヌクレオチド上の標識の結合は、デオキシリボースの3'部位であることが有利である。この標識は、次には除去されて3'−OHを生じ、その後の鎖の伸長が可能になる。望ましくは、ヌクレオチドへの標識の結合は化学的又は酵素的に切断しうるリンカーによるものである。ジスルフィド架橋が糖の3'−末端と標識の間にある場合には、前記したような問題が想定されるが、この問題も本発明は解決するであろう。
【００８１】
取り込まれたヌクレオチドの検出は、使用された標識のタイプによる。蛍光標識については、検出は、CCDカメラ、光増幅器または光子カウンターを併用するレーザー励起法、を含む種々の検出法により行うことができる。標識の検出はヌクレオチドに結合している標識で行うことができるし、あるいはヌクレオチドと標識の間の連結を切断した後に行うこともできる。プライマー/鋳型複合体に結合したままの標識の利点は、信号が局在化し、アレイを使用する方法を支持することである。
【００８２】
取り込まれたヌクレオチドに結合した標識は、除去又は無効化することができるし、あるいはしなくてもよい。標識とヌクレオチドの間の連結の性質によって、標識を除去するために種々の方法が考えられる。ジスルフィドからなる連結の場合には、チオール基を還元することにより連結を切断することができる。これは、DTT（ジチオトレイトール）又はTCEP（塩酸トリス‐(2‐カルボキシエチル)ホスフィン）のような還元剤を使用することにより行うことができる。その他の還元剤も使用することができる。標識から放射される光を無効化するための方法は、例えば、漂白、望ましくは光漂白、又は標識を検出できなくするように標識と相互作用する化合物を加えることによる。そのような化合物としては、クエンチングにより放射光を減少させる他の標識があり得る。
【００８３】
本明細書で記述した方法は、プラスチック、シリコン又は硝子上にプライマー又は鋳型を固定した小型装置又はアレイにおいてSNPを計測することにより遺伝子型分類するような広範囲の分野に応用可能であることを、想定している。その他の応用としては、類似の装置による鋳型の塩基配列決定の再実験又は類似の装置により配列が既知となっている鋳型の塩基配列決定であろう。その他の応用はWO99/35293A2に記述されており、それにはディファレンシャル発現遺伝子の固相ビーズ選別が記述されている。本発明のその他の応用は、微小粒子に固定した分析物の同時分析の装置及びシステムにおいて使用することである。そのようなシステムはWO98/53300に記述されている。
【実施例】
【００８４】
（実施例1）
隣接して取り込まれたCy5−SS−dCTPを未熟切断から保護するためのチオール基のキャッピング
5'末端にビオチンを結合したオリゴヌクレオチド鋳型E3PN10b及びE3PN22bをプライマー（下記のNUSPT−フルオレッセイン）にアニールした。取り込むべき塩基を太字で示し、これには、下線付き太字で示したC取り込みの2箇所の位置が含まれる。
2005521422.tif 000006
【００８５】
アニーリング反応は、以下の段階を含む：
50 pモルの鋳型を全量250 μLのアニーリング緩衝液（20 mM Tris-酢酸、5 mM MgAc2、pH 7.6）(ABと命名)中で30 pモルのプライマーと混合し、80℃で5分間インキュベートし、冷却した。アニールしたオリゴヌクレオチドを250 μLのビーズスラリー及び500 μLの結合緩衝液（10 mM Tris-HCl、2 M NaCl、1 mM EDTA、0.1 % Tween 20）(BBと命名)と共に振とうしつつ20分間インキュベーションすることによりストレプトアビジンセファロースハイパホーマンスビーズ（Amersham Biosciences）上に固定した。フィルターチューブ（Nanosep MF GHP 0.45 μm、Pall）中でビーズを洗うことにより過剰のオリゴヌクレオチドを除去し、ビーズを500μLの2ｘAB（40 mM Tris-酢酸、10 mM MgAc2、pH 7.6）に再懸濁し、フィルタープレート（Multiscreen、Millipore）のウエルに50μLずつ分配した。
【００８６】
反応混合物（1 μM Cy5‐SS‐dCTP、5U クレノーエキソ-DNAポリメラーゼ/2ｘAB緩衝液）を加え、2分間37℃でインキュベートすることにより、最初のCy5‐SS‐dCTPを取り込んだ。ビーズを4回200μLのTENT緩衝液（40 mM Tris-HCl、50 mM NaCl、1 mM EDTA、0.1 % Tween 20、pH 8.8）で減圧下フィルターを通して緩衝液を吸引することにより洗い、50μLのTENT緩衝液に再懸濁し、蛍光計（Victor2、Perkin-Elmer）を使用してCy5‐標識ヌクレオチドの蛍光（励起590 nm、放射670 nm）及びフルオレッセイン‐標識プライマーの蛍光（励起485 nm、放射535 nm）を測定するために蛍光計プレートに移した。フルオレッセインシグナルはビーズの移動の変動を正規化するために使用した。
【００８７】
ウエルの内容物を3つの群に集め、フルターチューブに移した。切断緩衝液（50 mM ジチオトレイトール、50 mM NaCl、40 mM Tris-HCl、20 mM MgCl2、pH 8.4）(CBと命名)と共に5分間室温でインキュベートすることにより標識ヌクレオチド上のCy5標識を除去し、ビーズを400 μLのTENT緩衝液で3回次いで400 μLの2ｘABで2回洗った。チューブの内容物を100 μLの（1）対照として2ｘABで、（2）1 mMヨードアセトアミド（Sigma I-1149）又は（3）10 mM ヨードアセトアミド/2ｘABと共に5分間室温において光を遮断してインキュベートした。次いで、100 μLの切断緩衝液を加えることにより、過剰のヨードアセトアミドを不活化し、次いで4回400 μLの2ｘABで洗った。
【００８８】
ビーズを2ｘABに再懸濁し、フィルタープレートのウエルに再度分配した。Cの次の取り込み位置にプライマーを伸長するために天然ヌクレオチドを取り込んだ（E3PN10b：dATP、dGTP及びdTTPのそれぞれの1 μM、5 Uのクレノーエキソ-DNAポリメラーゼ/2ｘAB緩衝液；E3PN22b：dTTPのみを使用する以外はE3PN10bと同じ）。反応は上記と同様に行い、そしてビーズをAB中で洗った。
【００８９】
次いで、二番目のCy5‐SS‐dCTPは最初と同様に取り込んだ。二番目の標識の取り込みを決定するために蛍光を再度測定した。結果を図1に示す。その結果は、E3PN10b/NUSPTの場合にはCy5‐SS‐dCTPの最初と二番目の取り込みは、ヨードアセトアミドで処理してもしなくても、同じであったことを示しているが、他方E3PN22b/NUSPTへの二番目のCy5‐SS‐dCTPの取り込みのシグナルは、以前の実験において観察されていたように、対照における最初の取り込みのシグナルよりも低いことを示している。Cy5‐SS‐dCTPの取り込みに続く切断の後に、プライマー/鋳型複合体を10 mMのヨードアセトアミドで処理すると、このシグナルは回復した。このことは、露出したチオール基をキャッピングすることにより二番目の隣接Cy5‐SS‐dCTPが未熟切断から保護されることを示している。
【００９０】
（実施例２）
Cy5‐SS‐dCTP/dCTP混合物を使用するホモポリマー的伸長における蛍光シグナルと取り込んだ塩基の数の間の直線関係の達成
2005521422.tif 000007
5'末端にビオチンを結合したオリゴヌクレオチド鋳型をプライマー（上記NUSPT-フルオレッセイン）にアニールした。取り込むべき塩基を太字で示し、これには、下線付き太字で示したC取り込み位置が含まれる。
【００９１】
アニーリング反応は以下の段階を含む：
50 pモルの鋳型を全量250 μLのアニーリング緩衝液（20 mM Tris-酢酸、5 mM MgAc2、pH 7.6）中で30 pモルのプライマーと混合し、80℃で5分間インキュベートし、冷却した。アニールしたオリゴヌクレオチドを50 μLのビーズスラリー及び500 μLの結合緩衝液（10 mM Tris-HCl、2 M NaCl、1 mM EDTA、0.1 % Tween 20）と共に振とうしつつ20分間インキュベーションすることによりストレプトアビジンセファロースハイパホーマンスビーズ（Amersham Biosciences）上に固定した。フィルターチューブ（Nanosep MF GHP 0.45 μm、Pall）中でビーズを洗うことにより過剰のオリゴヌクレオチドを除去し、ビーズを500μLの2ｘAB（40 mM Tris-酢酸、10 mM MgAc2、pH 7.6）に再懸濁し、フィルタープレート（Multiscreen、Millipore）のウエルに50μLずつ分配した。
【００９２】
反応混合物（1 μM dATP、1 μM C-mix*、5 Uクレノーエキソ-ポリメラーゼ/2ｘAB緩衝液）を加えて2分間37℃でインキュベートすることにより最初のdATP及びCy5‐SS‐dCTPを取り込んだ。*C-mixは等容積の100％ Cy5‐dCTP、100％ Cy5‐SS‐dCTP、又は20％ Cy5‐SS‐dCTP＋80％ dCTPを使用して調製した。ビーズを4回400μLのTENT緩衝液（40 mM Tris-HCl、50 mM NaCl、1 mM EDTA、0.1 % Tween 20、pH 8.8）で減圧下フィルターを通して緩衝液を吸引することにより洗い、50μLのTENT緩衝液に再懸濁し、蛍光計（Victor2、Perkin-Elmer）を使用してCy5‐標識ヌクレオチドの蛍光（励起590 nm、放射670 nm）及びフルオレッセイン‐標識プライマーの蛍光（励起485 nm、放射535 nm）を測定するために蛍光計プレートに移した。フルオレッセインシグナルはビーズの移動の変動を正規化するために使用した。
【００９３】
ヌクレオチドの取り込みのレベルは、Cを分配する点においてピークのないことが前の実験における完全な取り込みを示すというメーカー説明書（Pyrosequencing AB、スエーデン）に従ってPSQ 96及び関連キットを使用するピロシークエンシングにより固定化鋳型を分析することによりチェックした。
【００９４】
図2の結果は、100％標識dCTPを使用した場合に（Cy5‐dCTP又はCy5‐SS‐dCTPのいずれであっても）蛍光シグナルの著しい減少を示す。これは伸長したプライマー上のCy5基の接近による信号の強いクエンチングを示している。
【００９５】
図3の結果は、20％ Cy5‐SS‐dCTP及び80％d CTPの混合物を使用して取り込みを行った場合のシグナルの直線性を示す。
【００９６】
インキュベーションは全てピロシークエンシングにより評価して95％を超える取り込みであった（結果は示さず）。
【００９７】
（実施例３）
例：「指定分配」を使用する、オリゴヌクレオチドE3PN19bの塩基配列決定
2005521422.tif 000008
【００９８】
5 pモルの鋳型E3PN19b及び3 pモルのプライマーNUSPT-FLを25 μlのアニーリング緩衝液（20 mM Tris-酢酸、5 mM MgAc2、pH 7.6）中80℃で5分間アニールした。室温に冷却した後、鋳型に4 μlのビーズスラリー（ストレプトアビジンセファロースハイパホーマンスビーズ）を29 μlの結合緩衝液（10 mM Tris-HCl、2 M NaCl、1 mM EDTA、0.1 % Tween 20）と共に加え、次いで室温において1400 rpmで振とうしつつ20分間インキュベーションすることによりストレプトアビジンビーズ上に固定した。
【００９９】
ビーズをフィルタープレート（Multiscreen、Millipore）に移し、そして4回2ｘAB（40 mM Tris-酢酸、10 mM MgAc2、pH 7.6）で洗った。フィルタープレートを37℃に2分間予熱した。50 μL反応混合物（0.5 μM  Cy5‐SS‐dUTP、0.5 μM  dUTP、5 Uクレノーエキソ、2ｘAB）を加えそして37℃で2分間インキュベートすることにより最初の塩基を取り込んだ。
【０１００】
フィルタープレートのウエルを4回TENT（40 mM Tris-HCl pH 8.8、50 mM NaCl、1 mM EDTA、0.1% Tween 20）で減圧下フィルターを通して緩衝液を吸引することにより洗った。ビーズを50μlのTENTに再懸濁し、蛍光計（Victor2、Perkin-Elmer）を使用してCy5‐標識ヌクレオチドの蛍光（励起590 nm、放射670 nm）及びフルオレッセイン‐標識プライマー（励起485 nm、放射535 nm）を測定するために蛍光計プレートに移した。フルオレッセインシグナルはビーズの移動の変動を正規化するために使用した。測定後、ビースをフィルタープレートに戻し、切断緩衝液（250 mM ジチオトレイトール、50 mM NaCl、40 mM Tris-HCl、20 mM MgCl2、pH 8.4）と共に3分間37℃でインキュベートすることにより取り込まれたdUTPからCy5標識を切断した。次いでビーズを2回TENTで次いで2回2ｘABで洗った。
【０１０１】
続くCy5‐SS‐dNTPを最初と同様に取り込み、上記のように切断した。配列決定反応混合物は標識dNTPの比率以外は4種全てのデオキシヌクレオチドについて同じであった。混合物は、対応する天然デオキシヌクレオチドでバランスを取ることにより、20％ Cy5‐SS‐dCTP、30％ Cy5‐SS‐dATP又は30％ Cy5‐SS‐dGTPを含んでいた。
【０１０２】
図4に見ることができるように、得られたシグナルは再現性があり、そして異なるヌクレオチドに対しても配列を通して安定していた。異なる塩基間のシグナルの高さの内部変動は、クレノーエキソポリメラーゼの標識ヌクレオチドの受容の程度の相違によるものである。ヌクレオチドの取り込みのレベルはそれぞれのdNTPを分配する点においてピークのないことが前の実験における完全な取り込みを示すというメーカー説明書（Pyrosequencing AB、スエーデン）に従ってPSQ 96及び関連キットを使用するピロシークエンシングにより固定化鋳型を分析することによりチェックした。インキュベーションは全てピロシークエンシングにより評価して95％を超える取り込みであった（結果は示さず）。
【０１０３】
（実施例５）
標識/非標識ヌクレオチドに対するクレノーエキソDNAポリメラーゼの選択性の測定
2005521422.tif 000009
【０１０４】
5'末端にビオチンを結合したオリゴヌクレオチド鋳型をプライマー（上記NUSPT-フルオレッセイン）にアニールした。取り込むべき塩基を下線付き太字で示す。
【０１０５】
アニーリング反応は各反復について以下の段階を含む：
5 pモルの鋳型を全量25 μLのアニーリング緩衝液（20 mM Tris-酢酸、5 mM MgAc2、pH 7.6）中で3 pモルのプライマーと混合し、80℃で5分間インキュベートし、冷却した。アニールしたオリゴヌクレオチドを25 μLのビーズスラリー及び50 μLの結合緩衝液（10 mM Tris-HCl、2 M NaCl、1 mM EDTA、0.1% Tween 20）と共に振とうしつつ20分間インキュベーションすることによりストレプトアビジンセファロースハイパホーマンスビーズ（Amersham Biosciences）上に固定した。フィルターチューブ（Nanosep MF GHP 0.45 μm、Pall）中でビーズを2ｘAB（40 mM Tris-酢酸、10 mM MgAc2、pH 7.6）で洗うことにより過剰のオリゴヌクレオチドを除去し、ビーズを50μLの2ｘABに再懸濁し、フィルタープレート（Multiscreen、Millipore）のウエルに移した。
【０１０６】
反応混合物（1 μM  dNTP-mix*、5 U クレノーエキソポリメラーゼ/2ｘAB緩衝液）を加え、2分間37℃でインキュベーションすることにより、関係するCy5‐SS‐dNTPを取り込んだ。*dNTP-mixは、100、80、50、20又は10％ Cy5‐SS‐dNTPを使用して対応する非標識dNTPで100％にして調製した。ビーズを200 μLのTENT緩衝液（40 mM Tris-HCl、50 mM NaCl、1 mM EDTA、0.1% Tween 20、pH 8.8）で減圧下フィルターを通して緩衝液を吸引することにより4回洗い、50 μLのTENTに再懸濁し、蛍光計（Victor2、Perkin-Elmer）を使用してCy5‐標識ヌクレオチドの蛍光（励起590 nm、放射670 nm）及びフルオレッセイン‐標識プライマーの蛍光（励起485 nm、放射535 nm）を測定するために蛍光計プレートに移した。フルオレッセインシグナルはビーズの移動の変動を正規化するために使用した。
【０１０７】
ヌクレオチドの取り込みのレベルは関係ヌクレオチドを分配する点においてピークのないことが前の実験における完全な取り込みを示すというメーカー説明書（Pyrosequencing AB、スエーデン）に従ってPSQ 96及び関連キットを使用するピロシークエンシングにより固定化鋳型を分析することによりチェックした。インキュベーションは全てピロシークエンシングにより評価して95％を超える取り込みであった（結果は示さず）。
【０１０８】
図5−8の結果は、非標識ヌクレオチドに対する標識体のポリメラーゼの選択性を示す。ポリメラーゼの種々のCy5‐SS‐ヌクレオチド、特にU*及びG*の間、の受容の仕方に明らかな相違が存在する。
【０１０９】
（実施例６）
WO 00/53812によるCy5‐SS‐dGTP/dGTP混合物を使用してホモポリマー伸長に取り込まれた塩基の数と蛍光シグナルの間の関係の測定
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【０１１０】
25 μlのアニーリング緩衝液（20 mM Tris-酢酸、5 mM MgAc2、pH 7.6）中で5 pモルの鋳型及び3 pモルのプライマーNUSPT-FLを80℃で5分間アニールした。室温に冷却した後、29 μlの結合緩衝液（10 mM Tris-HCl、2 M NaCl、1 mM EDTA、0.1% Tween 20）と共に4 μlのビーズスラリー（ストレプトアビジンセファロースハイパーフォーマンスビーズ）を加えて、室温において20分間1400 rpmで振とうすることにより鋳型をストレプトアビジンビーズに結合した。
【０１１１】
ビーズをフィルタープレート（Multiscreen、Millipore）に移し、4回2ｘAB（40 mM Tris-酢酸、10 mM MgAc2、pH 7.6）で洗った。
【０１１２】
30 μLの反応混合物（0.2 μM  Cy5‐SS‐dGTP、0.1 μM dGTP、6.5 Uシクエナーゼバージョン2.0、40 mM Tris-HCl pH 7.5、20 mM MgCl2、50 mM NaCl）を加えて室温で4分間インキュベートすることにより1、2又は3個のCy5‐SS‐dGTPを取り込んだ。
【０１１３】
フィルタープレートのウエルを4回TENT（40 mM Tris-HCl pH 8.8、50 mM NaCl、1 mM EDTA、0.1 % Tween 20）で減圧下に洗った。ビーズを50 μl  TENTに再懸濁し、蛍光計プレートに移した。蛍光計（Victor2、PerkinElmer）を使用してプライマー上のフルオレッセイン及び取り込んだdNTP上のCy5の蛍光シグナルを測定した。フルオレッセインのシグナルを蛍光計プレートに移したビーズの量の変動を正規化するために使用した。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】二番目のCy5‐SS‐dCTP取り込みの蛍光に及ぼすヨードアセトアミド（IAN）とのインキュベーションの影響。二個のCy5‐SS‐dCTPは二つのオリゴヌクレオチド10b（C TGAA C）及び22b（C T C）において二つの異なる位置（C1及びC2）に取り込まれた。最初の取り込みに続いて、緩衝液（対照）、1 mM IAN 又は10 mM IANで処理した。
【図２】100％ Cy5‐SS‐dCTP又はCy5‐dCTPを使用したクエンチング効果。蛍光シグナルはホモポリマー伸長に取り込まれた塩基の数の関数としてプロットされている。
【図３】20％ Cy5‐SS‐dCTP及び80％の天然ヌクレオチドの反応混合物を使用してホモポリマー伸長に1から5個のCy5‐SS‐dCTPを取り込んだ後の蛍光シグナル。ヌクレオチド上のCy5とプライマー上のフルオレッセインの蛍光シグナルの比はホモポリマー伸長に取り込まれた塩基の数の関数としてプロットされている。
【図４】最終ヌクレオチド濃度1 μMにおいて50％ Cy5‐SS‐dUTP、20％ Cy5‐SS‐dCTP、30％ Cy5‐SS‐dGTP、および30％ Cy5‐SS‐dATPを使用したオリゴヌクレオチドE3PN19bの塩基配列決定。ヌクレオチド上のCy5とプライマー上のフルオレッセインの蛍光シグナルの比は各取り込みについてプロットされている。
【図５】Cy5‐SS‐dCTPに対する選択性曲線。ヌクレオチド上のCy5とプライマー上のフルオレッセインの蛍光シグナルの比は反応混合物中のCy5‐SS‐dCTPの種々のパーセンテージの関数としてプロットされている。
【図６】Cy5‐SS‐dGTPに対する選択性曲線。ヌクレオチド上のCy5とプライマー上のフルオレッセインの蛍光シグナルの比は反応混合物中のCy5‐SS‐dGTPの種々のパーセンテージの関数としてプロットされている。
【図７】Cy5‐SS‐dATPに対する選択性曲線。ヌクレオチド上のCy5とプライマー上のフルオレッセインの蛍光シグナルの比は反応混合物中のCy5‐SS‐dATPの種々のパーセンテージの関数としてプロットされている。
【図８】Cy5‐SS‐dUTPに対する選択性曲線。ヌクレオチド上のCy5とプライマー上のフルオレッセインの蛍光シグナルの比は反応混合物中のCy5‐SS‐dUTPの種々のパーセンテージの関数としてプロットされている。
【図９】6.5 U シークエナーゼバージョン2.0（USB）と共に0.2 μM Cy5‐SS‐dGTP及び0.1 μM dGTPを使用してWO 00/53812に従ってホモポリマー伸長に取り込んだ1から3個のCy5‐SS‐dGTPの蛍光シグナル。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年4月28日(2004.4.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)核酸分子の一本鎖型を用意し；
b)該核酸分子の該一本鎖型に、プライマーをハイブリダイズして、鋳型/プライマー複合体を形成し；
c)ポリメラーゼと、
少なくとも一つのヌクレオチド及び該少なくとも一つのヌクレオチドの少なくとも一つの標識誘導体の混合物であって、該少なくとも一つのヌクレオチドの該少なくとも一つの標識誘導体が、切断しうる連結を介してヌクレオチドに連結した標識を含んでおり、該少なくとも一つのヌクレオチド及び該少なくとも一つのヌクレオチドの標識誘導体の該混合物において、該少なくとも一つのヌクレオチドの標識誘導体の量が、1‐50モル％、1−40モル％、1−30モル％、又は1−20モル％の範囲内である該混合物と
を加えることにより、プライマーを酵素的に伸長し；
d)該プライマーに付加されたヌクレオチドの型を決定し：
e)段階c)からd)を少なくとも1回繰り返す
段階を含む、核酸分子の塩基配列の決定方法。
【請求項２】
該混合物中の少なくとも一つのヌクレオチドの標識誘導体の量が、5‐50モル％、5−40モル％、5−30モル％、又は5−20モル％の範囲内である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
該混合物中の少なくとも一つのヌクレオチドの標識誘導体の量が、10‐50モル％、10−40モル％、10−30モル％、又は10−20モル％の範囲内である、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
該核酸分子の一本鎖型が、担体に結合されている、請求項1−3のいずれか一つに記載の方法。
【請求項５】
該結合の手段が、a)疎水性化合物、オリゴヌクレオチド、抗体又はそのフラグメント、蛋白質、ペプチド、挿入試薬、ビオチン、ストレプトアビジン又はアビジン；或いはb)アミノ‐リンカー及びエポキシ処理担体を使用する共有結合、の群から選択される、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
該担体が、ゲル、固形若しくは多孔性ビーズ、表面又は繊維の群から選択される請求項4に記載の方法。
【請求項７】
該標識が、段階ｄ)の後に標識と相互作用する試薬又は漂白により無効化される、請求項1−3のいずれか一つに記載の方法。
【請求項８】
該漂白が光漂白によって行われる、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
該取り込まれたヌクレオチドと該標識の間の連結が、段階d）の後に切断される、請求項1、2又は3に記載の方法。
【請求項１０】
該蛍光団とヌクレオチドの間の連結がジスルフィド結合である、請求項1、2又は3に記載の方法。
【請求項１１】
該切断が、還元剤を加えることにより行われ、それによりチオール基を露出する、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
該露出したチオール基が、ヨードアセトアミド又はN-エチルマレインイミドのような適当な試薬によりキャッピングされる、請求項10又は11に記載の方法。
【請求項１３】
該ジスルフィド架橋と塩基の間のリンカーが8原子より短い、上記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
段階c)がpH 7未満で、望ましくはpH 6.5未満で、より望ましくはpH 6未満で行われる、上記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
該ヌクレオチドの誘導体が、ジデオキシヌクレオチド又は非環状ヌクレオチド類似体である、上記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
アルカリホスファターゼ、PPi-アーゼ、アピラーゼ、ジメチルスルホキシド、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、スペルミジン；NP-40、Tween 20及び Triton  X-100のような界面活性剤、一本鎖DNA結合タンパク質（SSB）又は遺伝子32のタンパク質を含むDNAの二次構造に影響する種々のタンパク質からなる群から選択される試薬が添加される、上記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも一つのヌクレオチドの少なくとも一つの標識誘導体及び少なくとも一つのヌクレオチドの混合物であって、
該少なくとも一つのヌクレオチドの該少なくとも一つの標識誘導体は、切断し得る連結を介して該ヌクレオチドに連結した標識を含んでおり、
該少なくとも一つのヌクレオチド及び該少なくとも一つのヌクレオチドの標識誘導体の該混合物中において、該少なくとも一つのヌクレオチドの標識誘導体の量が、1‐50モル％、1−40モル％、1−30モル％、又は1−20モル％の範囲内であり、望ましくは5‐20モル％、5−30モル％、5−40モル％、又は5−50モル％の範囲内であり、さらに望ましくは10‐20モル％、10−30モル％、10−40モル％、又は10−50モル％の範囲内である、上記混合物と、
還元剤とを、
分離した容器中に含む、キット。
【請求項１８】
さらに、請求項1−14のいずれかに記載の方法を実施するための、DNAポリメラーゼ、担体、キャッピング試薬、アピラーゼ、アルカリホスファターゼ、PPi-アーゼ、一本鎖結合タンパク質又は遺伝子32のタンパク質の少なくとも一つの成分を含む、請求項１７に記載のキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０３】
（実施例４）
標識/非標識ヌクレオチドに対するクレノーエキソDNAポリメラーゼの選択性の測定
2005521422.tif 000020
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０９】
（実施例５）
WO 00/53812によるCy5‐SS‐dGTP/dGTP混合物を使用してホモポリマー伸長に取り込まれた塩基の数と蛍光シグナルの間の関係の測定
2005521422.tif 000021
【国際調査報告】
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2005521422.tif 000023
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