(57)【要約】１，０００ヌクレオチド超を有するポリヌクレオチドが固相合成技術を用いて作製されることができる。上記技術の特徴は、共有結合したオリゴヌクレオチドを含む、再使用可能な固相支持体の使用である。この共有結合したオリゴヌクレオチドは、架橋オリゴヌクレオチドにアニーリングされ、ここで架橋オリゴもまた、標的ポリヌクレオチドの部分を形成する第１オリゴヌクレオチドにアニーリングされる。標的ポリヌクレオチドの合成後、それは、変性条件下で固相支持体から除去されることができ、そして固相支持体は、さらなる標的ポリヌクレオチドを作製するために再使用される。標的ポリヌクレオチドの収率は、成長するオリゴヌクレオチドに連結された固相支持体にシアー力が適用される場合、増加する。このシアー力は、固相支持体に結合した他のオリゴヌクレオチドとの接触から離れて、オリゴヌクレオチドの成長する末端を伸長させ、その末端を成長する溶液オリゴヌクレオチドとよりアニーリングしやすくすると考えられる。上記合成は多孔質フリット上で便利に達成され、ここで、試薬及び洗浄緩衝液はポンプ作用によってフリットを通過させられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子構築方法であって、以下のステップ：
（ａ）固相支持体に結合した普遍的オリゴを提供すること；
（ｂ）粘着末端を含む開始二本鎖を形成するために、上記普遍的オリゴに架橋オリゴをアニーリングすること；
（ｃ）第１中間二本鎖を形成するために、第１オリゴ又は第１二本鎖を、上記架橋オリゴにアニーリングすること；
（ｄ）第２中間二本鎖を形成するために、第２オリゴ又は第２二本鎖を、上記第１中間二本鎖にアニーリングすること；
（ｅ）最終的な二本鎖を形成するために、必要に応じてステップ（ｄ）を繰り返すこと；及び
（ｆ）上記普遍的オリゴがライゲーション反応を行わず、且つ上記架橋オリゴが上記第１オリゴ又は第１二本鎖のいずれともライゲーションされない条件下で、最終的な二本鎖のオリゴと二本鎖を一緒にしてライゲーションすること；
を含む、前記方法。
【請求項２】
ステップ（ａ）による上記固相支持体に結合した上記普遍的オリゴを提供し、そしてステップ（ｂ）〜（ｆ）を繰り返すために、上記普遍的オリゴが上記架橋オリゴから分離される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記普遍的オリゴが連結基を介して上記固相支持体に結合される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記連結基が、ポリ（オキシアルキレン）部分を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
上記連結基がリン酸基を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
上記普遍的オリゴが５〜５０ヌクレオチドを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
上記普遍的オリゴが３‘末端  及び５’末端を有し、上記普遍的オリゴの上記５‘末端が連結基に結合され、ここで、上記連結基が上記固相支持体に結合されている、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
上記架橋オリゴが、リンカー配列と呼ばれる、近接するヌクレオチドの配列を含み、ここで、上記リンカー配列が上記開始二本鎖中の上記普遍的オリゴのいくつか又は全部にアニーリングする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
上記リンカー配列が５〜５０ヌクレオチドを有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
上記架橋オリゴが、標的配列と呼ばれる、近接するヌクレオチドの配列を含み、ここで、上記標的配列が上記第１オリゴ又は上記第１二本鎖の粘着末端にアニーリングする、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
上記架橋オリゴが５‘末端及び３’末端を有し、且つ上記５‘末端がリン酸基を欠いている、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
上記第１中間二本鎖が、上記普遍的オリゴと上記第１オリゴ又は第１二本鎖の間に位置するヌクレオチドギャップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
上記ヌクレオチドギャップが、1〜５ヌクレオチドの長さである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
以下の：
（ａ）固相支持体に結合した普遍的オリゴ；及び
（ｂ）粘着末端を含む開始二本鎖を形成するために、上記普遍的オリゴにアニーリングされた、架橋オリゴ
を含む、組成物。
【請求項１５】
さらに、以下の：
（ｃ）第１中間二本鎖を形成するために、上記架橋オリゴにアニーリングされた、第１オリゴ又は第１二本鎖；
を含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
さらに、以下の：
（ｄ）第２中間二本鎖を形成するために、上記第１中間二本鎖にアニーリングされた、第２オリゴ又は第２二本鎖；
を含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
さらに、以下の：
（ｅ）第３中間二本鎖を形成するために、上記第２中間二本鎖にアニーリングされた、第３オリゴ又は第３二本鎖；
を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
さらに、リガーゼを含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
中間二本鎖のライゲーション条件への露出が、上記普遍的オリゴ又は上記架橋オリゴにライゲーション反応を行なわせることを引き起こさない、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
上記普遍的オリゴが、連結基を介して上記固相支持体に結合される、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
上記連結基がポリ（オキシアルキレン）部分をふくむ  、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
上記普遍的オリゴが５〜５０ヌクレオチドを有する、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
上記普遍的オリゴが３‘末端及び５’末端を有し、且つ上記普遍的オリゴの上記５‘末端が連結基に結合されており、ここで、上記連結基が上記固相支持体に結合される、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
上記架橋オリゴが、リンカー配列と呼ばれる、近接するヌクレオチドの配列を含み、ここで、上記リンカー配列が上記開始二本鎖中の普遍的オリゴにアニーリングされる、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
上記リンカー配列が５〜５０ヌクレオチドを有する、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
上記架橋オリゴが、標的配列と呼ばれる、近接するヌクレオチドの配列を含み、ここで、上記標的配列が上記第１オリゴ又は第１二本鎖にアニーリングする、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７】
上記第１中間二本鎖中の、上記普遍的オリゴと上記第１オリゴ又は第１二本鎖の間に、ヌクレオチドギャップが存在する、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２８】
上記ヌクレオチドギャップが１〜５ヌクレオチドの長さである、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
普遍的オリゴに結合された固相支持体を含む物品であって、１以上のリン酸基及びポリオキシアルキレン基が、上記固相支持体と上記普遍的オリゴの末端ヌクレオチドの間に位置する、上記物品。
【請求項３０】
上記固相支持体が多孔質のモノリスである、請求項２９に記載の物品。
【請求項３１】
上記固相支持体がビーズ及び繊維から選ばれる、請求項２９に記載の物品。
【請求項３２】
上記固相支持体が、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアクリレート及びポリメタクリレートから選ばれる有機ポリマーを含む、請求項２９に記載の物品。
【請求項３３】
上記固相支持体が金属酸化物を含む、請求項２９に記載の物品。
【請求項３４】
上記ポリオキシアルキレン基がポリオキシエチレン基である、請求項２９に記載の物品。
【請求項３５】
リン酸基によって分離された２のポリオキシアルキレン基を含む、請求項２９に記載の物品。
【請求項３６】
上記普遍的オリゴが、５〜５０ヌクレオチドから成る、請求項２９に記載の物品。
【請求項３７】
さらに、架橋オリゴを含み、ここで、上記架橋オリゴが、上記普遍的オリゴの５以上のヌクレオチドにアニーリングされているリンカーポリヌクレオチド領域を含む、請求項２９に記載の物品。
【請求項３８】
遺伝子構築方法であって、以下のステップ；
（ａ）請求項２９〜３６のいずれか１項に記載の物品を提供すること；
（ｂ）上記普遍的オリゴに架橋オリゴをアニーリングすること；及び
（ｃ）２以上のオリゴヌクレオチドを一緒にして結合し、そして標的ポリヌクレオチド又はその断片を形成するために、リガーゼを使用すること；
を含む、前記方法。
【請求項３９】
さらに、以下のステップ：
（ｄ）上記架橋オリゴから上記普遍的オリゴを分離すること；
を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
他の標的ポリヌクレオチド又はその断片を作製するために、上記物品を再使用することをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
水性の環境における固相支持体上でのポリヌクレオチド構築方法における進歩であって、以下の：
（ａ）直接的に又は連結基を介して、普遍的オリゴを固相支持体に共有結合させること；
（ｂ）開始二本鎖を形成するために、架橋オリゴを上記普遍的オリゴにアニーリングすること、ここで上記開始二本鎖は粘着末端を提供するために、一本鎖形態の上記架橋オリゴの部分を有する；及び
（ｃ）第１オリゴ又は第１二本鎖を、上記開始二本鎖の上記粘着末端にハイブリダイズすること、ここで、上記第１オリゴ又は第１二本鎖が次にライゲーション条件におかれ、そして標的ポリヌクレオチド又はその断片中に取り込まれる；
を含む、前記進歩。
【請求項４２】
固相支持体上での遺伝子の部分の構築方法であって、以下のステップ：
（ａ）固相支持体上で第１遺伝子断片を構築すること、ここで、上記第１断片が少なくとも５０塩基対を有する；
（ｂ）第１断片を溶液中に提供するために、上記第１断片を上記固相支持体から分離すること；
（ｃ）固相支持体上で第２遺伝子断片を構築すること、ここで、上記第２断片が少なくとも５０塩基対を有し、且つ上記第１断片と同一でない；
（ｄ）第２断片を溶液中に提供するために、上記第２断片を上記固相支持体から分離すること；
（ｅ）固相支持体上で第３断片を構築すること；
（ｆ）より長い遺伝子断片を提供するために、上記第３断片を上記第１断片に結合させること；
（ｇ）最終的な遺伝子を提供するために、上記第２断片を普遍的オリゴをステップ（ｅ）のより長い遺伝子断片に結合させること；及び
（ｈ）上記最終的な遺伝子を上記固相支持体から分離すること；
を含む、前記方法。
【請求項４３】
溶液中で遺伝子の部分を構築する方法であって、以下のステップ：
（ａ）第１遺伝子断片を固相支持体上で構築すること、ここで上記第１断片が少なくとも５０塩基対を有する；
（ｂ）第１断片を溶液中に提供するために、上記第１断片を上記固相支持体から分離すること；
（ｃ）第２遺伝子断片を固相支持体上で構築すること、ここで、上記第２断片が少なくとも５０塩基対を有し、且つ上記第１断片と同一でない；
（ｄ）第２断片を溶液中に提供するために、上記第２断片を上記固相支持体から分離すること；
（ｅ）上記第１断片と上記第２断片を単一の溶液中で併合すること；そして
（ｆ）最終的な遺伝子を溶液中に提供するために、ステップ（ｅ）の上記第１及び第２断片を共有結合させること；
を含む、前記方法。
【請求項４４】
上記第１及び第２断片が、細菌又は酵母中で同種性組換えによって一緒にして結合される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
遺伝子構築方法であって、以下のステップ：
（ａ）固相支持体に結合した部分的に二本鎖の核酸（ds-NA）を提供すること；
（ｂ）上記ds-NAの一本鎖部分に対して少なくとも部分的に相補的な一本鎖核酸（ss-NA）の溶液を提供すること；及び
（ｃ）以下のような方向：（ｉ）上記ss-NAがステップ（ａ）の上記ds-NAの一本鎖部分にアニーリングし、且つ（ｉｉ）少なくともステップ（ｂ）の上記溶液のいくらかが上記ds-AAを少なくとも２回通過するように、その方向が少なくとも１回逆行する、のような上記方向に働く力の影響によって、上記溶液の少なくともいくらかが上記ds-AAを通過するという条件下で、ステップ（ａ）の上記ds-NAとステップ（ｂ）の上記溶液を接触させること；
を含む、前記方法。
【請求項４６】
遺伝子構築方法であって、以下のステップ：
（ａ）固相支持体に結合した部分的に二本鎖の核酸（ds-NA）を提供すること；
（ｂ）上記ds-NAの一本鎖部分に対して少なくとも部分的に相補的な一本鎖核酸（ss-NA）を提供すること；及び
（ｃ）以下の：（ｉ）上記ss-NAがステップ（ａ）の上記ds-NAの一本鎖部分にアニーリングし、且つ（ｉｉ）力の減少が上記ds-NAの一本鎖部分へアニーリングするss-NAの量を減少させる力の影響によって、上記溶液の少なくともいくらかが上記ds-NAを通過するという以外は一定である条件下で、ステップ（ａ）の上記ds-NAとステップ（ｂ）の上記溶液を接触させること；
を含む、前記方法。
【請求項４７】
上記固相支持体が多孔質である、請求項４５又は４６に記載の方法。
【請求項４８】
ステップ（ｂ）の上記溶液が、上記孔を多数回通り抜けることを必要とする、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
自動遺伝子構築のための装置であって、以下の：
（ａ）複数の反応容器、ここで、各反応容器が第１オリフィス、第２オリフィス、及び内幅を有し、そして各容器が上記内幅にわたる多孔質固相支持体を含む；そして
（ｂ）上記複数の反応容器と流体連絡している１以上のポンプ；
を含む、前記装置。
【請求項５０】
さらに、流体モニタリング手段を含む、請求項４９に記載の装置であって、ここで、上記流体モニタリング手段が反応容器中の流体レベルをモニターする、前記装置。
【請求項５１】
さらに、温度制御手段を含み、ここで、上記温度制御手段が反応容器内部の温度を制御する、請求項４９に記載の装置。
【請求項５２】
さらに、上記第１オリフィスと上記ポンプの間に位置する弁を含み、ここで、上記弁が液体貯蔵容器と流体連絡しており、液体が上記容器から反応容器中へポンプの作用によって押し出されることのできる、請求項４９に記載の装置。
【請求項５３】
さらに、コンピュータ制御された上記装置の操作を提供する、コンピュータを含む、請求項４９に記載の装置。
【請求項５４】
さらに、マイクロプレート貯蔵ステージを含む、請求項４９に記載の装置。
【請求項５５】
上記マイクロプレート貯蔵ステージが、上記マイクロプレート貯蔵ステージ上に位置される、マイクロプレートと接触している溶液の温度をモニターし且つ制御するために、温度モニタリング及び制御手段を含む、請求項５４に記載の装置。
【請求項５６】
さらに、マルチプレート貯蔵システムを含む、請求項４９に記載の装置。
【請求項５７】
上記マルチプレート貯蔵システムが温度制御されている、請求項５６に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固相合成技術を用いる、ポリヌクレオチド合成に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連技術の説明
ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの直鎖であって、ここでヌクレオチドは糖、塩基及びリン酸塩から成る。鎖を形成するために、１のヌクレオチドの糖は隣接するヌクレオチドのリン酸塩に結合する。ヒト遺伝子はポリヌクレオチドから形成され、ここで糖はデオキシリボース、そして鎖の各位置の塩基はアデニン（A）、シトシン（C）、グアニン（G）及びチミン（T）から選ばれる。したがって、ポリヌクレオチド鎖中の連結間の化学的相違は、連結中に存在する塩基のみである。大部分において、遺伝子はそれらの異なる鎖の長さによって、そして鎖に沿った４の塩基の異なる配列によってお互いに異なる。
【０００３】
薬品会社における発見研究のおおくが、薬品開発の標的又はタンパク治療のいずれかとしての遺伝子に注目している。ゲノムDNA分子の配列決定に向けた最近の継続的な努力によって、これらの会社はヒト遺伝子の大半の塩基配列に近づいた。実際、これらの会社は、それらの競争相手が同じ可能性の組み合わせに着目していることを緊急に認識し、最近はすでに同定された遺伝子断片についてよりも多くの研究をすることができずに、潜在的な機会に圧倒されている。
【０００４】
遺伝子分野における研究を行うにあたっての主要な障害の一つは、例えば研究又は診断ツール又は可能性のある治療剤として使用され得る、所望の塩基配列の遺伝子を作製するのに必要とされる時間及び努力である。典型的には、遺伝子は数百〜数千ヌクレオチド長であり、それらのヌクレオチド配列によって定義される。うまく遺伝子を作製するためには、遺伝子のヌクレオチドは正確に特定された順番でなければならない、すなわち４つの塩基の特定の一つが鎖に沿った特別な位置にあることが特定され、そして他の塩基のいずれでもないその塩基がその特別な位置に存在しなければならず、いかなるヌクレオチドのいかなる余分も欠失もあってはならない。
【０００５】
鎖の長さが約１００ヌクレオチドよりも短い場合にしばしばオリゴヌクレオチドと呼ばれる、短いヌクレオチド鎖の製造は、よく開発された商業的に採用されている方法である。典型的には、不溶性の支持体が最初のヌクレオチドに結合され、該支持体は第２のヌクレオチドの反応性前駆体を含む溶液中に置かれる。第２のヌクレオチドが最初のヌクレオチドに結合した後、反応混合物をフリット（frit）を通して洗浄し、そうして固相支持体がいかなる非反応性前駆体からも分離される。初期のオリゴヌクレオチドを含む固相はその後、第3のヌクレオチドの反応性前駆体に露出され、そして所望のオリゴヌクレオチドが製造されるまで、この手順が繰り返される。
【０００６】
初期のオリゴヌクレオチドのすべてが望む通りに反応性前駆体と反応するわけではなく、したがって、典型的に化学的収率が９０％より大きいにもかかわらず、固相支持体に結合した最初のヌクレオチドの量に基づいた所望の産物の収率は、サイクルの反復回数が増加するにしたがって低下する。また、この手順によって作製されたいくつかのオリゴヌクレオチドが、所望の数のヌクレオチドを含んでいるにもかかわらず、所望の塩基配列を正確に有していないということも経験的に観察される。おそらく、特別なヌクレオチド前駆体が偶然、成長する鎖と２回反応するか、又は特別なヌクレオチド前駆体が、１ラウンドの反応後に完全に洗い流されずに残って、次に添加されたヌクレオチド前駆体と競合するのであろう。いずれにしても、ポリヌクレオチド作製へのこのアプローチは、約１００ヌクレオチドを超える長さを有する定義された配列の鎖を作製するのに有効であると証明されてはいない。オリゴヌクレオチド作製の検討のために以下の参考文献を参照すること：Schmitz, C. and Reetz, M.T., Org. Lett. 1(11):1729-1731(1999)。
【０００７】
遺伝子が一部分、そのような望ましい研究道具であり、且つ潜在的な治療剤でさえあるため、いくつかの研究グループがポリヌクレオチド、特別には所定の配列中に幾百もの塩基を有する遺伝子、の製造方法に注目し、彼らの研究の結果を発表した。例えば、Pachuk, C. J. et al., Gene 243:19-25(2000); Evans, G. A., PCT国際出願公開第WO99/14318号（１９９９）：Hunkapiller，１９９９年８月に発行されたM. W. et al., 米国特許第5,942,609号；Dietrich, R. et al., Biotech. Tech. 12(1):49-54(1998); Rosenblum, M.G. et al., J. Interferon and Cytokine Res. 15:547-555(1995); Kato, T. et al., Anal. Biochem. 220:428-429(1994); Stahl, S. et al. BioTechniques 14(3):424-434(1993); Dombrowski, K. E. and Wright, S. E. Nucl. Acids Res. 20(24):6743-6744(1922); Makarova, K. S. et al. Mol. Bio. (Mosk) 26(1):93-103(1992) Beattie, K. L. and Fowler, R. F., Nature 352:548-549, 742(1991); Filippov, S. A. et al., Bioorg. Khim. 16(8):1045-1051(1990); Beattie, K. L. et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 10:510-521(1988); 及びJerala R. and Turk V, Nuc. Acids Res. 16(5):1759-1766(1988); Hostomsky, Z. et al., Nuc. Acids Res. 15(12):4849-4856(1987)を参照のこと。
【０００８】
これらの文献に記載された各アプローチは、長所と短所を有する。しかしながら、これらのアプローチのいずれも数百ヌクレオチドを有する所定の配列のポリヌクレオチドの有効な生産において完全に成功したと証明されていない。例えば、１のアプローチにおいては遺伝子又は他の大きなDNAフラグメントは、短い、化学的に合成されたDNA断片を連結してより長い断片にするための酵素DNAリガーゼを用いて合成される。正確な２本鎖断片の形成に好ましい条件下では、一度に少数のオリゴヌクレオチド断片がアニーリングすることが可能である。これらの断片は、標的配列中の隣接する断片と混合され、酵素的DNA連結反応を受ける。断片が構築する順番は、各短いフラグメント末端の一本鎖オーバーハングによって決定される。このアプローチによる遺伝子合成の信頼性の主要な制限因子の一つは、DNAリガーゼ反応の低いフィデリティーであり：酵素はミスマッチの末端を有する断片を結合することができ、したがって、断片を間違った順番で構築させる。この基本的ストラテジーについてのいくつかの変法が記載された（例えば、Khorana, H., Science 203:614-625(1979); Stabinsky, Y., 米国特許第4,652,639号；及びHostomsky, Z. and J. Smrt, Nucleic Acids Symposium Series (18):241-244(1987)を参照のこと。）これらのストラテジーのいくつかは、クローン産物のいくらか又はすべてを生産するためのポリメラーゼの使用を含む（例えば、Withers Martinez C. et al., Protein Engineering 12:1113-20(1999)）及びHunkapiller及びHiattに対する米国特許第5,492,609号を参照のこと）。他のアプローチは他の欠点を有する。
【０００９】
DNAは現代の生物学の中心にあるため、信頼性があり、費用効果の高い遺伝子合成は、純粋に発見に基づいたアプローチよりも製品開発への工学的アプローチに向かう生物学の動きにおいて役割を果たす可能性を有する。より特別には、費用効果の高い遺伝子合成は、薬物探索研究者が複雑な分子生物学の研究を外部に求めることを可能とすることによって、彼らに何百万ドルもの節約をさせる可能性を有する。以下に詳細に記載するように、本発明は、遺伝子のようなポリヌクレオチドの製造における顕著な前進を提供する。
【発明の開示】
【００１０】
発明の要約
本発明は、固相ポリヌクレオチド合成において使用されることのできる方法、装置及び組成物を提供する。本発明の技術は以下の：１）支持体上に成長する鎖を固定することは、反応を単純化し（１の末端のみが露出されるので、より少ない副反応が可能となる）；２）モル過剰の溶液相成分が反応を推進することができ；そして３）溶液中の副反応が各サイクルにおいて洗い流される；を含む、いくつかの理由によって有利である。固相技術は、遺伝子合成をより信頼性があり、且つより費用効果の高いものとし、したがって、それがより広い範囲の慣用のクローニング研究に取って代わることを可能とする。
【００１１】
固相合成は、以下のいくつかの方法：例えば、１）それは４００塩基対までの断片の製造をスピードアップすることができ；２）それはより少ない試薬の使用の可能性を有し、したがって、規模を小さくしたオリゴ合成の使用を可能とし；そして３）それは構築プロセスの信頼性を高め、デリバリー時間の変動を縮め,そして間違った断片の再作製に関する費用を減少させる；などによってポリヌクレオチド製造プロセスに影響を与えることができる。
【００１２】
１の側面において、本発明は、以下の：（ａ）支持体に結合した普遍的オリゴを提供すること；（ｂ）粘着末端を含む開始二本鎖を形成するために、架橋オリゴを普遍的オリゴにアニーリングすること；（ｃ）第１中間二本鎖を形成するために、第１オリゴ又は第１二本鎖を架橋オリゴにアニーリングすること；（ｄ）第２中間二本鎖を形成するために、第２オリゴ又は第２二本鎖を第１中間二本鎖にアニーリングすること；（ｅ）最終的な二本鎖を形成するのに必要なだけステップ（ｄ）を繰り返すこと；（ｆ）普遍的オリゴがライゲーション反応を起こさず、且つ架橋オリゴが第１オリゴ又は第１二本鎖のいずれかにライゲーションされない条件下で、最終的な二本鎖のオリゴ及び二本鎖を一緒にしてライゲーションすること；を含む、遺伝子構築のための方法を提供する。
【００１３】
他の側面において、本発明は、以下の：（ａ）固相支持体に結合された普遍的オリゴ；及び（ｂ）粘着末端を有する開始二本鎖を形成するために、普遍的オリゴにアニーリングされた架橋オリゴ；を含む組成物を提供する。この組成物は、場合により、以下の：（ｃ）第１中間二本鎖を形成するために、普遍的オリゴにアニーリングされた第１オリゴ又は第１二本鎖；及び場合により（ｄ）第２中間二本鎖を形成するために、第１中間二本鎖にアニーリングされた第２オリゴ又は第２二本鎖；及び場合により（ｅ）第３中間二本鎖を形成するために、第２中間二本鎖にアニーリングされた、第３オリゴ又は第３二本鎖；及び場合によりリガーゼを含むことができる。
【００１４】
他の側面においては、本発明は、普遍的なオリゴに結合した固相支持体を含み、ここで１以上のリン酸基及びポリオキシアルキレン基が固相支持体及び普遍的オリゴの末端ヌクレオチドの間に位置する、物品を提供する。好ましい実施態様において、この物品はさらに、架橋オリゴを含み、ここで架橋オリゴは、普遍的オリゴの５以上のヌクレオチドにアニーリングされたリンカーポリヌクレオチド領域を含む。関連する側面において、本発明は、（ａ）普遍的オリゴを含むが、架橋を含まないこの物品を提供すること；（ｂ）架橋オリゴを普遍的オリゴにアニーリングすること；及び（ｃ）２以上のオリゴヌクレオチドを一緒にして結合させるためのリガーゼを使用して標的ポリヌクレオチド又はその断片を形成すること；を含む、遺伝子構築法を提供する。この物品及び方法の利点は、普遍的オリゴ／固相支持体構成物が再使用可能なことである。したがって、該方法はさらに、以下の任意のステップ：（ｄ）普遍的オリゴを架橋オリゴから分離すること；及び（ｅ）他の標的ポリヌクレオチド又はその断片を作製するために、該物品を再使用すること、を含む。
【００１５】
他の側面において、本発明は、水性の環境における固相支持体上でのポリヌクレオチド構築方法を提供し、普遍的オリゴを固相支持体に直接に又は連結基を介して、共有結合で結合させること、粘着末端を提供するために、一本鎖の形態の架橋オリゴの部分を有する開始二本鎖を形成するために、架橋オリゴを普遍的オリゴにアニーリングすること、開始二本鎖の粘着末端に第１オリゴ又は第１二本鎖をハイブリダイズさせること、ここで、第１オリゴ又は第１二本鎖が引き続いてライゲーション条件に置かれ、標的ヌクレオチド又はその断片中に取り込まれる、を含む改善を有する。
【００１６】
本発明は、最終的な遺伝子又は遺伝子の断片を固相支持体上に作製する。最終的な所望の遺伝子が非常に長い、例えば、約１０００塩基対超、である場合、固相支持体上で２以上の遺伝子断片を作製し、そしてこれらの遺伝子断片を結合して最終的な所望の遺伝子にすることはより有効である。したがって、１の側面において、本発明は固相支持体上で遺伝子の部分を構築する方法を提供し、該方法は、以下のステップ：（ａ）少なくとも５０塩基対を有する第１断片を固相支持体上で構築すること；（ｂ）溶液中に第１断片を提供するために、上記第１断片を固相支持体から分離すること；（ｃ）少なくとも５０塩基対を有し、第１断片とは同一でない第２遺伝子断片を固相支持体上で構築すること；（ｄ）溶液中に第２断片を提供するために、上記第２断片を固相支持体から分離すること；（ｅ）固相支持体上で第３遺伝子断片を構築すること；（ｆ）より長い遺伝子断片を提供するために、上記第３断片を第１断片に結合させること；（ｇ）最終的な遺伝子を提供するために、ステップ（ｅ）のより長い遺伝子断片を第２断片に結合させること；及び（ｈ）最終的な遺伝子を固相支持体から分離すること、を含む。
【００１７】
基本的に、上記方法によれば、本発明の固相合成法を使用していかなる数の遺伝子断片も製造されることができ、それらの遺伝子断片の一つが固相支持体上に結合して残る一方、先に作製された遺伝子断片は、支持体に結合した遺伝子断片に順次付加される。或いは、遺伝子断片のすべてが固相支持体から離れ、そして溶液中で構築される。この側面によれば、本発明は、遺伝子又はその部分を溶液中で構築するための方法を提供し、該方法は、以下のステップ：（ａ）少なくとも５０塩基対を有する第１遺伝子断片を固相支持体上で構築すること；（ｂ）溶液中に第１断片を提供するために、第１断片を固相支持体から分離すること；（ｃ）少なくとも５０塩基対を有し、典型的には第１断片と同一でない第２遺伝子断片を固相支持体上で構築すること；（ｄ）溶液中に第２断片を提供するために、第２断片を固相支持体から分離すること；（ｅ）第１断片及び第２断片を単一の溶液中で結合させること；及び（ｆ）溶液中に最終的な遺伝子を提供するために、ステップ（ｅ）の第１断片と第２断片を、典型的にはライゲーション条件下、共有結合で結合させること；を含む。
【００１８】
他の側面においては、本発明は、支持体結合オリゴと溶液相オリゴの間の高収率のハイブリダイゼーションを達成するための、上記２のオリゴを混合する方法を提供する。したがって、１の側面において、本発明は以下のステップ：（ａ）固相支持体に結合した、部分的に二本鎖の核酸（ds-NA）を提供すること；（ｂ）上記ds-NAの一本鎖部分に対して少なくとも部分的に相補的な一本鎖核酸（ss-NA）の溶液を提供すること；（ｃ）以下のような方向：（ｉ）上記ss-NAがステップ（ａ）の上記ds-NAの一本鎖部分にアニーリングし、且つ（ｉｉ）少なくともステップ（ｂ）の上記溶液のいくらかが上記ds-AAを少なくとも２回通過するように、その方向が少なくとも１回逆行する、のような上記方向に働く力の影響によって、上記溶液の少なくともいくらかが上記ds-AAを通過するという条件下で、ステップ（ａ）の上記ds-NAとステップ（ｂ）の上記溶液を接触させること；を含む、遺伝子構築方法を提供する。関連する側面において、本発明は、以下のステップ：（ａ）固相支持体に結合した部分的に二本鎖の核酸（ds-NA）を提供すること；（ｂ）上記ds-NAの一本鎖部分に少なくとも部分的に相補的な一本鎖核酸（ss-NA）の溶液を提供すること；及び（ｃ）以下の：（ｉ）上記ss-NAがステップ（ａ）の上記ds-NAの一本鎖部分にアニーリングし、且つ（ｉｉ）力の減少が上記ds-NAの一本鎖部分へアニーリングするss-NAの量を減少させる力の影響によって、上記溶液の少なくともいくらかが上記ds-NAを通過するという以外は一定である条件下で、ステップ（ａ）の上記ds-NAとステップ（ｂ）の上記溶液を接触させること；を含む、遺伝子構築方法を提供する。
【００１９】
本発明はまた、遺伝子構築において特に有用な反応器及び装置を提供する。１の側面において、本発明は、自動化された遺伝子構築に特によく適合した装置を提供する。該装置は、以下の：（ａ）複数の反応容器であって、各反応容器が第１オリフィス、第２オリフィス及び内幅を有し、ここで各容器が、内幅にわたる多孔質の固相支持体を有する；及び（ｂ）上記複数の反応容器と流体連絡している１以上のポンプ；を含む。この装置は、追加の部品をつけることができ、例えば、該装置は、反応容器中の流体レベルをモニターするモニター手段をさらに含むことができ；該装置は、反応容器内部の温度を制御する温度制御手段をさらに含むことができ、；該装置は、液体貯蔵容器と流体連絡している、第１オリフィスとポンプの間に位置する弁をさらに含むことができ、ここで、液体が上記容器から反応容器中へポンプの作用によって押し出されることができ；該装置は、その上に位置するマイクロプレートに接触する溶液の温度をモニター及び制御するためのモニター及び制御手段を任意に含むことのできる、マイクロプレート貯蔵ステージをさらに含むことができ；該装置は、任意的に温度制御されたマルチプレート貯蔵システムをさらに含むことができ；そして該装置は、コンピュータ制御された該装置の操作を提供するためのコンピュータをさらに含むことができる。
【００２０】
本発明のこれらの及び他の側面は以下にさらに詳細に記載される。
【００２１】
発明の詳細な説明
本発明は、ポリヌクレオチド合成、より特別には、固相プロセスによるポリヌクレオチド合成を目的とする。本発明を詳細に記載する前に、本発明の概説及び本発明を記載するために使用されるいくつかの用語の説明が提供される。
【００２２】
Ａ．定義及び約束
本明細書において使用されるとおり、「ポリヌクレオチド」及び「遺伝子」、並びにそれらに対応する複数形は、相互に交換可能に使用される。したがって、「遺伝子」という用語は、天然にも見出されるヌクレオチド配列を必ずしも意味せず、この意味を有することができるにもかかわらず、より一般的にはいずれかの塩基配列のポリヌクレオチドを指す。以下においてもっと詳細に検討されるように、本発明は、オリゴを一緒にして結合させるために固相化学を使用し、それによって遺伝子を構築する。最終的な所望の遺伝子が、例えば、２０００塩基対を有する場合、本発明の１の側面において、この２０００塩基対の遺伝子の二本鎖断片は、オリゴを固相支持体上で構築することによって作製され、そしてこれらの遺伝子断片は最終的な（２０００塩基対の）遺伝子を形成するために構築される。後に検討される理由によって、３００〜５００のオーダーの塩基対を有する遺伝子断片にオリゴを構築し、複数のそれらの遺伝子断片を最終的な遺伝子に構築することが好ましい。明確性のために、直接的なオリゴの固相構築による産物は、本明細書において「遺伝子断片」又は「第１ポリヌクレオチド」と呼ばれるであろう。２以上の「遺伝子断片」又は第１及び第２ポリヌクレオチド等の構築によって作製される産物は、「遺伝子」と呼ばれるであろう。
【００２３】
本発明は、二本鎖形態の遺伝子断片を作製し、ここで、（時にはポリヌクレオチド鎖と呼ばれる）第１ポリヌクレオチド分子中のヌクレオチド（ｎｔ）塩基は、第２（隣接）ポリヌクレオチド分子中の対応するヌクレオチド塩基に水素結合されている。例えば高温のような適切な条件下において、遺伝子断片の二本鎖（ｄｓ）形態は、２の一本鎖（ｓｓ）分子に変換されることができる。したがって、「遺伝子」、「遺伝子断片」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、それぞれ二本鎖及び一本鎖形態の両方を指すために使用されることができる。「ポリヌクレオチド分子」という用語は、１の特別なヌクレオチド鎖であって、一本鎖又は二本鎖形態のいずれかであることができるものを指すであろう。
【００２４】
遺伝子断片が二本鎖形態にある場合、それは多数の塩基対（bps）を有するだろう。本発明は、いかなる数の塩基対も有する遺伝子断片を提供する。本発明が短い遺伝子断片、すなわち、１００未満の塩基対を有する遺伝子断片、を作製することができる一方、短い遺伝子断片を作製するための別の技術が本分野において知られている。本発明の利点は、それが長い遺伝子及び長い遺伝子断片、すなわち、１００を超える塩基対を有する遺伝子及び遺伝子断片、の作製が可能であるということである。本発明の多様な実施態様において、約１００を超える塩基対、又は約２００を超える塩基対、又は約３００を超える塩基対、又は約４００を超える塩基対、又は約５００を超える塩基対、又は６００を超える塩基対、又は約７００を超える塩基対、又は約８００を超える塩基対、又は約９００を超える塩基対、又は約１０００を超える塩基対を有する遺伝子及び遺伝子断片が作製されることができる。ほとんどの遺伝子は、約５０００未満の塩基対を有し、したがって本発明は典型的には、約１００〜１０００塩基対を有する遺伝子断片から約１００〜５０００塩基対を有する遺伝子を作製することにおいて有用であろう。
【００２５】
本発明によって作製された遺伝子断片が塩基対の形態でいくつかのヌクレオチドを有するであろう一方、上記遺伝子断片（又は遺伝子）中に存在するヌクレオチドのすべてが必ずしも塩基対の形態ではない。実際、多くの（しかし全部ではない）場合において、特定のポリヌクレオチド分子の１又は両方の末端にあるヌクレオチドのいくつかは、他の塩基のいずれとも対にならず、そうであってもその分子の内部に位置するヌクレオチドは塩基対の形態である。ポリヌクレオチド分子末端にある１以上の非塩基対ヌクレオチドの配列は、本明細書において「粘着末端」を形成する、と呼ばれることができる。これらの１以上の非塩基対ヌクレオチドは「粘着性」であると考えられ、それは、すでに二本鎖形態にあり、もはや「粘着性」でないヌクレオチドとは対照的に、それらが他の一本鎖ポリヌクレオチド分子とハイブリダイズすることができるからである。
【００２６】
二本鎖ポリヌクレオチドは、本明細書において「二本鎖」とよばれ、ここで、二本鎖は必然的に２の（第１及び第２）ポリヌクレオチド分子を有し、第１ポリヌクレオチド分子中の近接するヌクレオチド配列が第２ポリヌクレオチド分子中の近接するヌクレオチド配列にハイブリダイズされる。「ハイブリダイズ」及び「アニ−ル」という用語は、２の一本鎖ポリヌクレオチド分子が一緒になって二本鎖を形成するプロセスを意味するために、本明細書中で交換可能に使用されるだろう。したがって、「二本鎖」という用語は、遺伝子及び遺伝子断片の両方を包含する。
【００２７】
２のss−ポリヌクレオチドから二本鎖を形成するために、第１ポリヌクレオチド分子中のヌクレオチド配列は、第２ポリヌクレオチド分子中のヌクレオチド配列に対して相補的でなければならない。アデニン（A）及びグアニン（G）に由来するヌクレオチドは、チミン（T）及びシトシン（C）に由来するヌクレオチドに対して相補的であり、したがってこれらとの塩基対は本分野で周知である。以下において詳述されるように、本発明は、適切な条件下で混合されると、２のポリヌクレオチドは自然にハイブリダイズして二本鎖を形成するという現象に依存する。この自然のハイブリダイゼーションが起こるためには、第１ポリヌクレオチド分子中の充分な数のヌクレオチドが、それらが第２の鎖中の相補的ヌクレオチドと塩基対を形成することを可能とするように配列されなければならない。言い換えれば、該２のポリヌクレオチド分子は相補的配列を有していなくてはならない。
【００２８】
多くの目的のために、本発明によって作製された遺伝子又は遺伝子断片中のすべての塩基対がＡ／Ｔ又はＧ／Ｃのいずれかであることが望ましく、ミスマッチ（例えば、Ａ／Ａ、Ｔ／Ｔ、Ｇ／Ｇ、Ｃ／Ｃ、Ａ／Ｃ、Ａ／Ｇ、Ｔ／Ｃ、及びＴ／Ｇ塩基対）は望ましくない。しかしながら、本発明は、それが作製された遺伝子又は遺伝子断片中にいくつかのミスマッチ塩基を意図的に作り出すことができるという柔軟性を有する。したがって、本明細書中で使用される「二本鎖」という用語は、ミスマッチ塩基が全くないことを必要とせず、実際に、いくつかのミスマッチが二本鎖中に存在することができる。しかしながら、これらのミスマッチの数が増加するにしたがって、二本鎖は安定性を失い、そしてついに該二本鎖は室温で安定でなくなる。したがって、本発明によって作製された二本鎖が１以上のミスマッチ塩基を有することができる一方、ミスマッチ塩基の数は二本鎖が室温で不安定であるほどに多くてはならない。
【００２９】
本発明は、遺伝子又は遺伝子断片を形成するために、オリゴヌクレオチド（オリゴ、又はＯＤＮ）を結合する。本明細書で使用されるように、「オリゴヌクレオチド」（オリゴ、ＯＤＮ）という用語は、ヌクレオチドの短い鎖を指す。現在の技術は、約１００未満のヌクレオチドを有するポリヌクレオチド分子を作製することが可能であり、この技術は鎖を「成長させること」によってこれらの分子を作り出す。本質的には、この「成長」プロセスは第１ヌクレオチドを固相支持体に結合させること、該第１ヌクレオチドを活性化すること、反応性の第２ヌクレオチドを活性化された第１ヌクレオチドに加えること、ジヌクレオチド形成するために、第２ヌクレオチドを第１ヌクレオチドと反応させること；未反応物質及び反応副産物を洗浄除去すること、該第２ヌクレオチドに由来する部分が反応性となるように、上記ジヌクレオチドを活性化すること；そして上記プロセスを繰り返すこと（すなわち、活性化されたジヌクレオチドに、反応性の第３のヌクレオチドを加え、該第３のヌクレオチドを該ジヌクレオチドと反応させる、等）を伴なう。そして、上記プロセスによって形成されたオリゴヌクレオチドは固相支持体から放出される。
【００３０】
「成長」プロセスは、短いポリヌクレオチドの作製にかなりよくはたらく。しかしながら、毎回、ヌクレオチドが鎖に添加され、例えば、１のかわりに２のヌクレオチドが鎖に添加され、又はヌクレオチドが鎖に付加されない等のいくつかの間違いが取り込まれる。したがって、ポリヌクレオチドの長さが増加するにつれて、所望の産物の収率は急速に低下する。部分的にこのエラーの率によって、また、このプロセスの遅さ及び他の理由によって、「成長」方法は長い遺伝子の作製、すなわち、１００よりもかなり多いヌクレオチドの遺伝子の製造には不適であり、使用されない。
【００３１】
本発明のオリゴは、少なくとも１０ヌクレオチドを有する。好ましくは、オリゴは少なくとも２０、又は少なくとも３０、又は少なくとも４０、又は少なくとも５０、又は少なくとも６０、又は少なくとも７０、又は少なくとも８０、又は少なくとも９０、又は少なくとも１００ヌクレオチドを有する。実際、一般的により長いオリゴが好ましい。より長いオリゴを使用することの問題は、標準的な商業的技術を用いてそれらが作られるとき、それらがしばしば純粋でなく、例えば、５０塩基オリゴ（「５０-mer」）は（重量で）９０％の５０-mer及びいくらかの非５０-mer、例えば、いくらかの４８-mer、４９-mer、５１-mer、５２-mer等、を有することができる。さらに、５０-merの約９０％のみが所望のヌクレオチド配列を有する。一般的に、クロマトグラフィーが所望のオリゴよりも短いか又は長いオリゴを除去するために使用されることができる一方、望ましくないヌクレオチド配列を有する５０-merを除去するための５０-merの精製は非常に難しい。したがって、遺伝子作製のためのこの段階的成長プロセスは商業的に成功していない。
【００３２】
本発明のオリゴは、ヌクレオチド（nts）鎖を含む合成分子である。オリゴは少なくとも１０のヌクレオチドを有するであろう。オリゴ中のヌクレオチド数の上限は決定的なものではない。しかしながら、オリゴ自身が長く（例えば、３００ヌクレオチド以上）、そして、所望の遺伝子又は遺伝子断片が短い（例えば、約３００ヌクレオチド）場合、該オリゴ（及びその相補物）の作製方法は、該遺伝子を作製するために使用されることができ、本発明は遺伝子を作製するために必要とされない。本発明は、オリゴ合成に使用される技術がなんらかの理由で不適切であるか、又は所望のヌクレオチド数を有する長いポリヌクレオチドを形成するのにうまく適合していない場合に、より長いポリヌクレオチドを形成することを目的とする。商業的規模でオリゴを製造する最近の技術は、約１００以下のヌクレオチドを有するオリゴを作製するのに適している。したがって、１の側面において、本発明のオリゴは１０〜約１００のヌクレオチドを有する。
【００３３】
本明細書において使用されるとおり、「ａ」は「１以上」を指す。例えば、「a pump」は、以上のポンプを指す。いくつかの場合において、明確性のために、「１以上の」という用語が使用されるであろうが、「a」及び「１以上の」は、一般的に交換可能である。
【００３４】
B.遺伝子又は遺伝子断片の合成方法
１．方法の概説
本発明は、以下の３の主要なステップによって、オリゴを構築して遺伝子を形成する。ステップ１は、遺伝子断片を形成するためのオリゴの構築である。繰り返すと、もし、遺伝子断片が所望の長さを有していれば,遺伝子及び遺伝子断片は全く同じである。しかしながら、所望の遺伝子が遺伝子断片よりも多くの塩基対を有していれば、該遺伝子断片を高度に純粋な形態で得るために、第2のステップにおいて該遺伝子断片はクローン化され、配列決定される。第3のステップにおいて、精製された遺伝子断片が最終的な大きなポリヌクレオチドに構築される。
【００３５】
ステップ１、中間の遺伝子断片の構築、を図１に例解する。すなわち、以下の３の成分：１）普遍的オリゴを担持する固相支持体；２）支持体を成長する断片に連結するために使用される断片特異的架橋オリゴ；及び３）遺伝子断片を構築するために使用されるオリゴの組；がこのプロセスにおいて使用される。架橋オリゴは、２の部分から成り、１つは支持体に結合した普遍的オリゴに相補的であり、２つめは、「第1オリゴ」に相補的である。第1オリゴは一本鎖又は二本鎖形態であることができる。二本鎖形態である場合、第1オリゴは、それによって第1オリゴが架橋オリゴにアニーリングすることのできる「粘着末端」を提供する。図１は、二本鎖の形態、すなわち、第2オリゴに先にアニーリングされた形態、の第1オリゴの使用を示す。架橋は、支持体と成長する断片との間の可逆的な連結を提供し、固相支持体からの断片の放出後に除去される。架橋オリゴは断片クローン又は最終的な遺伝子中には含まれない。
【００３６】
したがって、遺伝子構築における第1ステップは、遺伝子を遺伝子断片に分解し、そして断片の配列を分解して一組の重複するオリゴにすることである。これらのオリゴはその後、本分野で知られた方法によって合成される。各オリゴが短くて１０ヌクレオチド、そして長くて１００ヌクレオチドより長くさえある一方、本発明の多様な側面において、各オリゴは２０〜１００ヌクレオチド、又は２０〜８０ヌクレオチド、又は２０〜６０ヌクレオチド、又は２０〜４０ヌクレオチド、又は３０〜１００ヌクレオチド、又は３０−８０ヌクレオチド、又は３０〜６０ヌクレオチド、又は３０〜４０ヌクレオチドである。好ましい側面において、各オリゴは約３０〜６０ヌクレオチドの長さであり、反対の鎖中の２のオリゴと重複する。２のオリゴ間の各重複領域は一緒にアニーリングされ、各連結点において安定な二本鎖を室温で形成する。オリゴが成長する鎖に順番に付加されることができる一方、１の側面において２以上のオリゴが先にアニーリングされて（粘着末端を有する）二本鎖を形成し、該二本鎖は成長する鎖の粘着末端にアニーリングされる。
【００３７】
構築プロセスは、架橋オリゴを、普遍的オリゴで誘導体化した固相支持体にアニーリングすることで開始する。アニーリングステップの後、結合しなかった過剰の架橋オリゴが固相支持体から洗浄除去される。次に、場合により二本鎖である第１オリゴが架橋オリゴにアニーリングされる。過剰の結合しなかった二本鎖が固相支持体から洗浄除去される。このアニーリング及び洗浄サイクルを各連続するオリゴ又は二本鎖において、すべてのオリゴが共にアニーリングされるまで繰り返す。一つの酵素的ライゲーション反応が、遺伝子末端の結合部位をすべて共有結合によって連結する。最後に、二本鎖の遺伝子断片が固相支持体から放出される。
【００３８】
したがって、本発明は、以下のステップ：
（ａ）固相支持体に結合した普遍的オリゴを提供すること；
（ｂ）粘着末端を有する開始二本鎖を形成するために、該普遍的オリゴに架橋オリゴをアニーリングすること；
（ｃ）第１中間二本鎖を形成するために、第１オリゴまたは第１二本鎖を粘着末端にアニーリングすること；
（ｄ）第２中間二本鎖を形成するために、第２オリゴ又は第２二本鎖を第１中間二本鎖にアニーリングすること；
（ｅ）最終的な二本鎖を形成するために、必要に応じてステップ（ｄ）を繰り返すこと；及び
（ｆ）普遍的オリゴと架橋オリゴがお互いに或いは他のオリゴ又は二本鎖にライゲーションしない条件下で、最終的な二本鎖のオリゴ及び二本鎖を一緒にライゲーションすること；
を含む、遺伝子構築方法を提供する。
【００３９】
２．固相支持体
本明細書中で使用されるとおり、「固相支持体」という用語は固相支持体について行われる有機合成の分野の当業者によって理解されるような普通の意味を有する。本発明において有用であるためには、固相支持体は固体、すなわち液体又は気体でない、であって、室温及びpH７において水に不溶である。本発明の固相支持体は水の存在下で安定であり、すなわち、本発明の固相支持体は長期間、例えば２４時間、水に露出している間に、その化学的組成及び形態を保持する。本発明において有用な固相支持体は、最初の水への露出によって、膨潤するなどの何らかの変化をおこすが、この最初の変化の後は、固相支持体は水中で安定、すなわち化学的構造に関して不変、である。固相支持体が水中へ置かれる場合、固相支持体の表面は水に溶解された溶質と接触できるようになる。
【００４０】
固相支持体は表面積対容積比率を有するであろう。表面積対容積比率を決定する方法は、本分野において周知であり、有機合成のための固相支持体の商業的供給者は、しばしば固相支持体の表面積対容積比率を報告している。典型的には、より高い表面積対容積比率が、本発明の固相支持体については好ましい。なぜなら、本発明によるポリヌクレオチドの作製は、最初に固相支持体の表面に連結していたポリヌクレオチドを伸長させることに依存するからである。固相支持体の表面積が固相支持体の固定した容積に対して増加した場合、典型的には、より多量の最初のポリヌクレオチドを表面に連結することが可能であり、それによって本発明の所望の産物である、伸長されたポリヌクレオチドをより多量に製造することが可能である。したがって、多孔質固相支持体が本発明において好ましい。
【００４１】
固相支持体は好ましくは、１以上の以下の性質：（ａ）該支持体は大きな分子を捕捉することを避けるために,溶液中で膨潤しないものであるべきであり；（ｂ）該支持体は、さらなるポリマー鎖の成長を妨げるのに充分に小さい孔又は凹部を含むべきでなく；（ｃ）該官能基が支持体表面にアクセス可能であるべきであり；（ｄ）該支持体は、該プロセスにおいて使用される試薬及び条件に対して不活性であるべきで、構築プロセスを妨害しないものであるべきであり；（ｅ）該官能基の表面密度は、遺伝子構築に適切であるべきであり；そして（ｆ）表面結合化学は、再現可能であり、有効且つ経済的なものであるべきである。；を有する。
【００４２】
固相遺伝子構築のための、好ましい固相支持体材料は、多孔質ポリエチレン又はポリプロピレンである。これらの表面はプラズマ処理によって誘導体化されることができ（R. Matson J. Rampal and P. Coassin, Analytical Biochemistry, (1994), vol. 217, 306-310）、続いてカルボジイミド化学によってプラズマ処理で導入された反応性の基の普遍的リンカーオリゴへの共有結合が行われる。樹脂ビーズの緩い集合体に対して一体型の、すなわち一体成形の多孔質フリットの利点は、該フリットが、アニーリング及びライゲーション反応中に、小容量の試薬が固相表面周辺を循環するための反復順逆方向流動方法を可能とすることである。この混合様式は、２００塩基対を超える遺伝子長の大分子固相反応について特に有益である。この理論によって結合されることは意味しないが、この流れが、長いコイル状のds−ポリヌクレオチド分子を伸長させることを助け、そしてそれらの広がる末端を溶液の標的に対してよりアクセス可能とすると考えられる（T. Perkins, D. Smith and S. Chu, Science (1999) vol. 276, 2016-2021; D. Smith, H. Babcock and S. Chu, Science, (1999) vol. 283, 1724-1727; C. Haber and D. Witz, Biophysical Journal, (2000) vol. 79, 1530-1536）。結合ステップの効率を高めるために、該支持体は好ましくは緩いビーズよりは固定した支持体である。
【００４３】
本発明の装置及び方法において使用されるのに好ましい固相支持体材料は、５〜３５μmの孔を有する多孔質ポリエチレンである。この材料は、Porex Technologies (Fairburn, GA)及びPorvair Advanced Materials (Hendersonville, NC)のようないくつかの製造者から商業的に入手可能である。どちらの会社もフリットを直接成形することができる。或いは、これらの会社及び他の売主は、バルク材料のシート又はロッドから注文のフリット形状を染色打ち抜き（dye stamping）することができる。
【００４４】
他の固相支持体材料は、上記の同じカラムにおいて使用可能なポリスチレン樹脂である。この材料を使用することの利点は、それが固相支持体の作製に使用されることができ、慣用のバッチ様式でそこへオリゴを結合することができることである。樹脂はきつく圧縮され、上記の同じ反応カラム中の２つのポリエチレンフリットの間に含まれる。カラムの充填がより時間がかかるにもかかわらず、固相支持体の製造は、個別のフリットを製造するよりもより単純で経済的である。
【００４５】
本発明において使用されることのできる他の有機固相支持体は、制限なく、ポリプロピレン、ポリアクリレート及びポリメタクリレートを含む。有機固相支持体の代わりに、無機材料が使用されることができ、代表的な無機材料は、制限なく、シリカ又はアルミナのような金属酸化物を含む。
【００４６】
固相支持体はいずれの便利な形態であることもでき、好適な形態は、制限なく、一体成形された多孔質材料及び膜を含む。固相支持体は、非多孔質材料、例えば、ビーズ、繊維又は他の粒子形態の集合体であることによって、多孔質であることができる。
【００４７】
３．普遍的オリゴ
本発明の構築プロセスは、固体表面に連結されたオリゴヌクレオチドで開始し、ここで、この特別なオリゴヌクレオチドは、本明細書中で普遍的オリゴヌクレオチド又は普遍的オリゴと呼ばれる。普遍的オリゴは、二本鎖ポリヌクレオチド（ds−ポリヌクレオチド）を提供するために、任意に二本鎖形態である追加の（第２、第３など）オリゴとの以下に記載の方法による接触によって伸長される。ds−ポリヌクレオチドの部分はその後、固相支持体から離れて、所望のds−ポリヌクレオチド及び固体表面にまだ結合している普遍的オリゴの両方を提供する。本発明の多くの利点の一つは、出発材料、すなわち固相表面に結合した普遍的オリゴヌクレオチド、がポリヌクレオチド合成の最後において再生成されること、及び追加のポリヌクレオチドを生成するために使用されることができることである。固相支持体に連結したオリゴヌクレオチドは、普遍的オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列が第１ポリヌクレオチドから独立している、すなわち、普遍的オリゴがいずれの配列の第１ポリヌクレオチドについても「普遍的に」使用されることができるので、本明細書において普遍的オリゴヌクレオチドと呼ばれる。
【００４８】
固相支持体に普遍的オリゴヌクレオチドが連結される方法は、普遍的オリゴが（ｉ）第２オリゴヌクレオチド（本明細書において架橋オリゴヌクレオチドと称される）に、ハイブリダイゼーション反応にアクセス可能な方法で連結されており、そして（ｉｉ）伸長反応の進行中に固相支持体に連結したままでいる限り、本発明において決定的なものではない。オリゴヌクレオチド及び固相支持体の両方が非常に本分野において周知である。さらに、本発明によって必要な方法で固相支持体に連結したオリゴヌクレオチドは、本分野の当業者に非常に周知である。
【００４９】
一つの一般的なアプローチは、カルボン酸の機能性を有する固相支持体を使用し、そしてそれらのカルボキシル基をアミンを末端に有するオリゴヌクレオチドと反応させることである。反対のアプローチ、すなわち、支持体表面にアミンの機能性を有する固相支持体を使用し、その支持体をカルボン酸を末端に有するオリゴヌクレオチドと反応させる、も本分野において一般的に使用される。どちらの場合にも、アミド基がオリゴヌクレオチドを固相支持体に連結させる。
【００５０】
慣例的に、オリゴヌクレオチドは３’末端と５’末端の両方を有すると認識される。普遍的オリゴの３’末端又は５’末端のいずれかが本発明の固相支持体に連結されることができる。しかしながら、支持体に結合した普遍的オリゴヌクレオチドに対する特別な要求は、オリゴヌクレオチドの固相支持体に連結されない末端、本明細書中で自由末端と呼ばれる、が非反応性であって、且つ空間的に自然のヌクレオチドと類似又は同一でなければならないことである。非反応性の自由末端を達成するための選択肢は本明細書において後に記載される。
【００５１】
普遍的オリゴ中に存在するヌクレオチド数及びそれらのヌクレオチドの塩基配列は決定的なものではない。好ましくは、普遍的オリゴは５〜５０ヌクレオチドを有する。もし普遍的オリゴが５ヌクレオチドより少ないと、それは架橋オリゴと非常に安定なハイブリッドを形成しないだろう。適度に安定なハイブリッドを達成するためには、普遍的オリゴは好ましくは、１０〜３０ヌクレオチド、例えば、約２０ヌクレオチドを有する。３０を超えるヌクレオチドを有する普遍的オリゴが本発明の実行において採用されることができる一方、これらの比較的長い普遍的オリゴは（特に連結基が普遍的オリゴと固相支持体の間に位置する場合）特別に有益ではなく、一般的に作製がより高価である。
【００５２】
普遍的オリゴの塩基配列は決定的なものではない。好ましくは、その配列は普遍的オリゴがヘアピン構造を形成しないように選択される。また、その配列は配列のハイブリッドが反応の作用温度より高いＴｍ（二本鎖の５０％についての融解温度）、すなわち、およそ室温より高い、を有するように選択される。また、普遍的オリゴの配列はＡのみ、又はＴのみ、又はＧのみ、又はＣのみを有するものでないことが好ましい。
【００５３】
４．連結基
普遍的オリゴが直接的に固相支持体に連結することができる一方、本発明の１の実施態様において、連結基が普遍的オリゴと固相支持体の間に位置する。部分的には、連結基は便宜性のために存在する。すなわち、いくつかの固相支持体は、普遍的オリゴ中に容易にそして経済的に存在する反応基と反応しない反応基を有する。この場合、連結基は二機能性であり、固相支持体と普遍的オリゴの両方と反応性である官能基を有する。しかしながら、連結基は、普遍的オリゴがさらに溶液中へ伸長し、そして架橋オリゴと反応することをより可能とさせるという目的も果たす。したがって、本発明の１の側面において、連結基が固相支持体と普遍的オリゴの間に配置される。
【００５４】
好ましい側面において、ポリオキシアルキレンの一部分が固相支持体と普遍的オリゴのヌクレオチド配列の間に配置される。このポリオキシアルキレンの部分は、好ましくはポリオキシエチレンである。他の多様な側面において２〜４０、４〜４０、６〜４０、２〜３０、４〜３０、６〜３０のオキシアルキレン単位がポリオキシアルキレン中にある一方、１の側面において、２〜５０のオキシアルキレン単位がポリオキシアルキレンの部分中にある。ポリオキシアルキレン単位が３０を超えるオキシアルキレン基を有する一方、それは普遍的オリゴ／固相支持体物品の価格を増加させる傾向にある。このポリオキシアルキレン部分はリン酸基を有することができる。リン酸基はポリオキシアルキレンの部分中に便利に位置することができる。なぜなら、それは例えば、ポリアルキシアルキレンの部分がリン酸基を含んでいる場合には、オリゴの製造への固相合成法アプローチが、ポリオキシアルキレンの部分をポリヌクレオチドの部分内に又はそれに近接して含ませるのに容易に使用されることができるからである。
【００５５】
５．架橋オリゴ及び開始二本鎖
図２に図解したように、架橋オリゴは、固相支持体上の普遍的リンカーオリゴと標的遺伝子の１の末端の両方にアニーリングされる。この架橋オリゴはライゲーションには参加せず、したがって弱い変性条件で除去され得る。この方法にはいくつかの利点がある。普遍的オリゴを有する単一の固相支持体は、製造、品質管理及び棚卸しを単純化する。連結の選択的逆行性は、正しい緩衝剤及び温度条件下で、産物である遺伝子又は遺伝子断片の固相支持体からの容易な放出を可能とし、したがって、標的への制限部位配列の付加を避ける。逆行可能な連結の主要な利点は、固相支持体が再使用可能である、つまり、新しい遺伝子の作製が新しい固相支持体を手動で加えるプロセスを含まない、ということである。
【００５６】
本発明による最初のステップにおいて、架橋オリゴヌクレオチドが普遍的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる。いずれかの所望のヌクレオチド配列の架橋オリゴヌクレオチドを得る方法は、本分野で非常に周知である。実際、そのようなオリゴヌクレオチドは、多くの供給源から商業的に入手可能である。この最初のステップの産物は、開始（又は最初の）二本鎖と呼ばれる。
【００５７】
開始二本鎖が必要なのは、架橋オリゴヌクレオチドのある部分は普遍的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしないということである。好ましくは、普遍的ＯＤＮにハイブリダイズしない架橋ＯＤＮの該部分が、少なくとも５、又は６、又は７、又は８、又は９、又は１０、又は１１、又は１２、又は１３、又は１４、又は１５、又は１６、又は１７、又は１８、又は１９、又は２０或いはそれを超える長さの近接するヌクレオチドの配列から成る。普遍的（支持体に結合した）オリゴヌクレオチドと架橋（溶液相の）オリゴヌクレオチドの間の好適なハイブリッドを形成する方法は、本分野において非常に周知である。
【００５８】
普遍的オリゴヌクレオチドと架橋オリゴヌクレオチドの間のハイブリッドは、比較的強固、少なくとも架橋ＯＤＮと第１ポリヌクレオチドの一部分を形成する第１ＯＤＮとの間のハイブリッドに比較して強固なものであるべきである。Ｇ／Ｃ結合はＡ／Ｔ結合よりも強固であるため、１の側面において、普遍的ＯＤＮは少なくとも５０％のＧＣ含量を有する。第１ハイブリッドを形成するためにハイブリダイズする典型的な数の塩基は、１７である。このハイブリッド中のハイブリダイズした塩基の数が減少するにしたがって、該ハイブリッドの強度を維持するために、典型的にはハイブリッドはより大きなパーセンテージのＧ／Ｃ塩基対を含む。典型的には、ハイブリッドに十分な強度を与えるためには、第１ハイブリッドは少なくとも約１０のハイブリダイズした形態の塩基を有するべきである。ハイブリッドが、１７を超えるハイブリダイズした形態の塩基を含むことができる一方、約２５を越える塩基がハイブリダイズした形態である場合には、所望の塩基対を有さないハイブリッドを形成する機会がより大きいということが観察される。それにもかかわらず、第１ハイブリッド中のハイブリダイズした塩基の数の上限は２５より大きく、なお３０よりも大きい。
【００５９】
６．第１中間二本鎖
第１のステップに先立って、同時に、又はそれに続いて行われる第２のステップにおいて、第１ODNが架橋ODNに接触することが可能となる。これまで検討してきたODNのうちで最初に第１のポリヌクレオチドの部分となるため、第１ODNは、「第１」ODNと呼ばれる。普遍的ODNに対して相補的でなく、したがってハイブリダイズしない架橋ODNの部分に対して、第１ODNは少なくとも部分的に相補的であるため、架橋ODNの一部分にハイブリダイズする。第１ODNが架橋ODNにハイブリダイズする場合、これによって第２ハイブリッドが形成され、ここで、第２ハイブリッドは架橋ODNの第１ヌクレオチド領域にハイブリダイズする普遍的オリゴ、及び架橋ODNの第２ヌクレオチド領域にハイブリダイズする第１ODNを含み、ここで、第１ODNはさらに、普遍的ODN又は架橋ODNのいずれにもハイブリダイズしないヌクレオチド領域を含む。
【００６０】
第２ステップが第１ステップと同時に行われる場合、架橋及び第１ODNは同時に普遍的オリゴと接触することが可能となる。この「同時」アプローチの１の実施態様において、架橋ODN及び普遍的ODNは、それらが普遍的ODNと接触させられる前に、お互いにアニーリングされる。第２ステップが第１ステップに続いて行われる場合、第１ODNは第１ハイブリッドにハイブリダイズされる。第２ステップが第１ステップに先立って行われる場合、普遍的ODN及び第１ODNはお互いに接触させられるが、ハイブリダイズせず、そして架橋オリゴヌクレオチドが添加されると、それは普遍的ODN及び架橋ODNの両方にハイブリダイズする。
【００６１】
第１中間ハイブリッドは、本発明において有用であるために、多くの要求に答えなければならない。先ず、普遍的ODNの自由末端、すなわち固相支持体に直接的に結合しない末端、は、オリゴヌクレオチドのライゲーション反応の進行中にいずれの他のオリゴヌクレオチドとも共有結合してはならない。この目的を達成するための１の方法は、普遍的ODNの自由末端が、ヒドロキシル基を含まないことを確認することである。普遍的ODNの３’末端の固相支持体への結合において、５’末端は、他のODNとのライゲーション反応に加わらないことを確実にするために、リン酸基を含まないことができる。さらに、本発明の好ましい実施態様によれば、普遍的ODNにハイブリダイズするヌクレオチド配列と第１ODNにハイブリダイズするヌクレオチド配列との間にある、本明細書中でギャップ配列と呼ばれるヌクレオチド配列が存在するように、架橋ODNは設計される。このギャップ配列は、これらの末端が第２ハイブリッド中に存在するために、ギャップ配列の長さに等しい距離によって、普遍的ODNの自由末端を、普遍的ODNの自由末端に最も近い第１ODNの末端から有効に分離する。
【００６２】
追加の基準として、普遍的ODNと架橋ODNとの間に形成されたハイブリッドのTm（融解温度）は、好ましくは架橋ODN及び第１ODNとの間に形成されたハイブリッドのTmよりも高い。この場合、架橋ODN及び第１ODNが融解（脱ハイブリダイズ）する条件下で、架橋ODNと普遍的ODNはハイブリダイズしたままである。
【００６３】
７．洗浄ステップ
プロセス中の各ステップの間、所望の産物は精製された形態、すなわち望ましくないODNを含まない形態、であるべきである。例えば、普遍的ODNが固相支持体に連結された後、いずれの非連結（溶液相）普遍的ODNも洗浄除去されることが望ましい。同様に、第１中間ハイブリッドを形成することが望ましい場合、架橋ODNは、好ましくはオリゴヌクレオチド伸長反応を続ける前に、第１ハイブリッドから洗浄除去される。同様に、第２中間ハイブリッドが形成された後は、第２ハイブリッドの部分でない普遍的ODN、架橋ODN又は第１ODNは、好ましくはそれがさらに第２ハイブリッドと接触できないように洗浄除去される。この場合、表面に結合した普遍的ODNに基づいた所望のポリヌクレオチドの収率は、増加の傾向にある。
【００６４】
８．第１オリゴ対第１二本鎖
第１ODNは、第１ODNが架橋ODNにハイブリダイズする時に第２ODNにハイブリダイズされることができるか又はできない。しかしながら、第１ODNに必要な特徴は、それが架橋ODNにハイブリダイズした後でさえ、第２の、部分的に相補的なODNにハイブリダイズすることが可能なヌクレオチド配列が存在することである。第１ポリヌクレオチド又はその所望の部分を作製するための必要に応じた、第３ODN、及び第４ODNなどについても同様である。すなわち、第１、第２、第３、第４、第５などのODNを含む各ODNは、本発明によって作製された二本鎖ポリヌクレオチドの相補鎖中に存在する２のODNにハイブリダイズする。言い換えれば、第１、第２などの各ODNは、２のODNに部分的にハイブリダイズする。ODN、例えば第２ODN、が２の相補的ODN、例えば第１及び第３ODN、にハイブリダイズされる場合、好ましくは２の相補的ODN、例えば第１及び第３ODN、が両方とも第２ODNにハイブリダイズされる時、これらの相補的ODNの間にヌクレオチドギャップは存在しない。この場合、リガーゼが第１及び第３ODNを一緒にして結合させることができるだろう。言い換えれば、結局、第１、第２、第３などのODNは、第１ポリヌクレオチドに存在する各ヌクレオチド又はその所望の部分を含む。
【００６５】
本発明の任意の実施態様において、第１ポリヌクレオチドを形成する最後のライゲーション反応の前に、２以上のODNが一緒にライゲーションされることができる。例えば、第１中間二本鎖を形成するために、第１、第２、及び第３ODNが一緒にアニーリングされた後、得られた構築物はライゲーション条件に露出される。このライゲーションされた産物は、その後、第１ポリヌクレオチドの作製に向けた構築のために、第４ODN及び／又は二本鎖などに露出されることができる。最後のライゲーション反応の前には、部分的にライゲーションされた又はライゲーションされない形態の表面結合ODNは、本明細書中でODN構築物と呼ばれる。
【００６６】
９．ライゲーション
各ODNが所望の順序でお互いにハイブリダイズされた後は、完全にハイブリダイズされた構築物は、第１、第３、第５などのODNとお互いに共有結合で順番に結合し、第２、第４、第６などのODNとお互いに共有結合で順番に結合するために、ライゲーション条件に露出される。このライゲーション反応後、他のODNとライゲーションされていない唯一のODNが普遍的及び架橋ODNである。
【００６７】
１０．遺伝子断片の単離
ライゲーション反応が完了後、ライゲーションされた断片が架橋ODNから変性され、架橋ODNが普遍的ODNから変性されるような条件下で、産物が変性条件に露出される。この一連の反応による最終産物は、普遍的ODNに連結された固相支持体、架橋ODN及び第１、第２、第３、第４などのODNからの産物である第１ポリヌクレオチドである。今や、普遍的オリゴは、他の遺伝子又は遺伝子断片を作製するために使用されることができる。
【００６８】
C.遺伝子断片から遺伝子へ
１．遺伝子断片の構築
本発明の１の側面において、オリゴを一緒にしてライゲーションすることによって作製されたポリヌクレオチドは、最終的な所望のポリヌクレオチド（遺伝子）の断片である。一緒にしてライゲーションされるオリゴの数が増加するにしたがって、特別なポリヌクレオチドが所望の配列を有する可能性は低下する。これは、オリゴが１００％純粋でないということに大きく依存する。したがって、約８００を超える塩基対を有する所望のポリヌクレオチドを作製するための本発明の好ましい側面において、２以上の遺伝子断片が本明細書に記載の固相合成法を使用して作製され、そしてこれらの２の遺伝子断片は、最終的な所望のポリヌクレオチドを作り出すために、好ましくはライゲーション条件下で一緒に結合される。
【００６９】
したがって、第１ポリヌクレオチドは、最終的な所望の標的ポリヌクレオチドであってよく、又はそうでなくてもよい。本発明の１の側面において,第１ポリヌクレオチドは最終的な所望の標的であって、ベクター中への又はmRNA合成のためのテンプレートとして機能するなどの第１ポリヌクレオチドの利用を可能とする他の構築物中への、第１ポリヌクレオチドの挿入を可能とする末端基を有する。しかしながら、本発明の他の側面においては、第１ポリヌクレオチドは最終的な所望の標的ではない。最終的な所望の標的を作製するために、好ましくは第１ポリヌクレオチドが作製されたのと同じ方法で、第２ポリヌクレオチドが作製される。これらの第１及び第２ポリヌクレオチドは、それらのそれぞれがオーバーハングヌクレオチド配列を有し、ここで、第１ポリヌクレオチド中のオーバーハングヌクレオチド配列が第２ポリヌクレオチド中のオーバーハングヌクレオチド配列に相補的であるように設計される。最終的な標的ポリヌクレオチドを作製するために、第１及び第２ポリヌクレオチドは、第１及び第２ポリヌクレオチドを一緒にして結合させるリガーゼの存在下、溶液中で接触させられる。前述のように、標的ポリヌクレオチドは、ベクター中への又はmRNA合成のためのテンプレートとして機能するなどの標的ポリヌクレオチドの利用を可能とする他の構築物中への、標的ポリヌクレオチドの挿入を可能とするように設計されることができる。
【００７０】
本発明の他の側面において、複数のポリヌクレオチド、すなわち第１、第２などのポリヌクレオチド、は、これらの複数のポリヌクレオチドがライゲーション反応などを介して一緒になって標的ポリヌクレオチドを形成する、以上において記載された固相プロセスによって作製される。言い換えれば、本発明は、それらのポリヌクレオチドの少なくとも１が本発明の固相合成法によって合成された、２以上のポリヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドを形成するために一緒になってライゲーションされることができることを提供する。
【００７１】
したがって、本発明の１の側面は、以下のステップ：
（ａ）少なくとも５０塩基対を有する第１遺伝子断片を、固相支持体上で構築すること；
（ｂ）第１断片を溶液中に提供するために、上記第１断片を固相支持体から分離すること；
（ｃ）少なくとも５０塩基対を有し、上記第１断片と同一でない、第２遺伝子断片を固相支持体上で構築すること；
（ｄ）最終的な遺伝子を提供するために、上記第１断片を、表面結合第２遺伝子断片と結合させること；そして
（ｅ）上記（ｄ）の遺伝子を固相支持体から分離すること；
を含む、固相支持体上での遺伝子又はその部分の構築方法を提供する。
【００７２】
明確化のために、この記載された方法中の遺伝子断片は二本鎖又は部分的に二本鎖の形態の２の核酸分子であり、−それらは一緒にハイブリダイゼーションされる個別のオリゴの組ではない、ことは注記される。２の遺伝子断片のみを一緒にして結合させるかわりに、所望の遺伝子を作製するために、２を超える遺伝子断片が結合される。例えば、本発明は、３の遺伝子断片が結合される、以下のステップ：
（ａ）少なくとも５０塩基対を有する、第１遺伝子断片を、固相支持体上で構築すること；
（ｂ）第１断片を溶液中に提供するために、上記第１断片を固相支持体から分離すること；
（ｃ）少なくとも５０塩基対を有し、上記第１断片と同一でない、第２遺伝子断片を固相支持体上で構築すること；
（ｄ）第２遺伝子断片を溶液中に提供するために、上記第２断片を固相支持体から分離すること。
（ｅ）第３遺伝子断片を固相支持体上で構築すること；
（ｆ）より長い遺伝子断片を提供するために、上記固相結合第３遺伝子断片に上記第１断片を結合させ、そして最終的な遺伝子を提供するために、上記より長い遺伝子断片に上記第２遺伝子断片を結合させること；そして
（ｇ）上記最終的な遺伝子を上記固相支持体から分離すること；
を含む方法を提供する。
【００７３】
４、５、６、７又はそれを超える遺伝子断片の結合を可能とするために、この方法は拡張されることができる。これらの方法は、部分的に、固相支持体に結合した遺伝子断片のうちの１を残し、そして溶液相遺伝子断片を固相支持体結合遺伝子断片に結合させることに依存する。しかしながら、本発明の他の側面においては、すべての遺伝子断片は溶液中で一緒に結合される。例えば、本発明は、以下のステップ：
（ａ）少なくとも５０塩基対を有する、第１遺伝子断片を、固相支持体上で構築すること；
（ｂ）第１断片を溶液中に提供するために、上記第１断片を固相支持体から分離すること；
（ｃ）少なくとも５０塩基対を有し、上記第１断片と同一でない、第２遺伝子断片を固相支持体上で構築すること；
（ｄ）第２遺伝子断片を溶液中に提供するために、上記第２断片を固相支持体から分離すること。
（ｅ）上記第１断片及び上記第２断片を単一の溶液中で併合すること；そして
（ｆ）最終的な遺伝子を溶液中で提供するために、ステップ（ｅ）の上記第１及び第２断片を共有結合で結合させること；
を含む、最終的な遺伝子を溶液中で構築するための方法を提供する。
【００７４】
この方法は、３、４、５などの遺伝子断片を作製し、そして溶液中のそれらの断片を結合させて最終的な所望の遺伝子を提供するために、拡張されることができる。
【００７５】
Ｄ．普遍的オリゴに結合した固相支持体を含む物品
１．固相支持体＋連結基＋普遍的オリゴ
本発明の別の側面においては、固相支持体、ポリヌクレオチド（例えば、先に記載の普遍的オリゴ）、及び支持体とポリヌクレオチドの間に配置される連結基を含む物品が提供される。連結基は、固相支持体及びポリヌクレオチドの両方に共有結合で結合し、したがって、本発明のこの側面は、式ＳＳ）−Ｌ−ＰＮ、ここで、「ＳＳ）」は固相支持体、「Ｌ」は連結基、そして「ＰＮ」はポリヌクレオチドを表す、によって表されることのできる物品を提供する。ＰＮの５’末端は、直接的にＬに結合することができ、この場合、上記物品は式ＳＳ）−Ｌ−ＰＮ（５’）によって表されることができ、又はＰＮの３’末端は直接的にＬに結合されることができ、この場合には上記物品は式ＳＳ）−Ｌ−ＰＮ（３’）によって表されることができ、これらは本発明の２の別々の側面である。
【００７６】
連結基は、（１以上の）ポリオキシアルキレン基であるか、これを含むことができる。多様な実施態様において、１又は２以上のいずれかの以下の基準：ポリオキシアルキレン基は、ポリオキシエチレン基であり；２のポリオキシアルキレン基が連結基中に存在し、ここで、これらの２のポリオキシアルキレン基がリン酸基によって分離され、したがって、ＰＯＡ−ＰＨ−ＰＯＡによって表されることのできる構造を提供し、ここで「ＰＯＡ」はポリオキシアルキレン基を表し、そして「ＰＨ」はリン酸基を表す；３のポリオキシアルキレン基が連結基中に存在し、それらはお互いにリン酸基によって分離され、すなわち上記連結基は、ＰＯＡ−ＰＨ−ＰＯＡ−ＰＨ−ＰＯＡという構造を含み；上記連結基はさらに炭化水素基（ＨＣ）を有し、ここで、ＨＣ−ＰＯＡ−(任意にＰＨ−ＰＯＡ等）により表される構造を提供するように上記炭化水素基が上記固相支持体とポリオキシアルキレン基との間に配置され、ここで「ＨＣ」は炭化水素基を表す；上記炭化水素基は、式量５０〜５００ｇ／モルを有し；上記ポリヌクレオチド基は、５〜５０ヌクレオチドから成り；上記ポリヌクレオチドの５’末端は、連結基に結合され、上記ポリヌクレオチドの３’末端は、リン酸基又は他のオリゴ又は二本鎖の５’リン酸化末端とライゲーションされることのできない他の基を含み；ポリヌクレオチドの５’末端は連結基に結合され、ポリヌクレオチドの３’末端はヒドロキシル基で終端する；が、上記物品を記載するために使用されることができる。したがって、１の側面において、本発明は、式ＳＳ）−（ＰＯＡ−ＰＨ）n−ＰＯＡ−ＨＣ−ＰＮ（３’）によって表されることができ、ここでｎは、１〜１０から選ばれる整数である。
【００７７】
２．固相支持体＋連結基＋普遍的オリゴ＋架橋オリゴ
他の側面において、本発明は上記の物品（すなわち、式ＳＳ）−Ｌ−ＰＮの物品）を提供し、これは架橋オリゴにアニーリングされる。架橋オリゴは、「Ｐ」基中に存在するいくつかの又はすべてのヌクレオチドにアニーリングされる、リンカーポリヌクレオチド領域を含む。好ましくは、リンカーポリヌクレオチド領域は、５〜５０の近接するヌクレオチドから成る。架橋オリゴはさらに、５〜５０の近接するヌクレオチドから成る、架橋ポリヌクレオチド領域を含み、ここで、架橋ポリヌクレオチド領域は、ＰＮのポリヌクレオチド基にアニーリングしない。ＰＮとアニーリングされた形態の架橋オリゴは、本明細書中で最初の、又は開始二本鎖と呼ばれ、この開始二本鎖は本発明の１の側面である。１の側面において、上記物品は式ＳＳ）−Ｌ−ＰＮ（３’）によって表され、ＰＮにアニーリングする架橋オリゴは架橋オリゴの３’末端のリン酸基を欠く。
【００７８】
３．固相支持体＋連結基＋普遍的オリゴ＋架橋オリゴ＋第１オリゴ
他の側面において、架橋ＯＤＮの架橋ポリヌクレオチド領域は、第１オリゴ（Ａ）又は第１二本鎖（Ａ＋Ｂ）にアニーリングされ、便宜のためにこの論議は第１二本鎖に関する。この状況は図３に例解され、ここで、太線は固相支持体、そして、細線及び破線は、それぞれポリヌクレオチドを表す。
【００７９】
図３に示されるように、この構成においては、Ａの３’及び５’末端は、ライゲーション反応を行うことができ、そしてＢの３’及び５’末端はライゲーション反応を行うことができることが望ましい。しかしながら、図３に示される構築物がリガーゼと接触した場合、ＰＮの３’末端もＢＯの５’末端もライゲーション反応を行う必要がない。これらの目的を達成するためには、２のアプローチが採用されることができる。第１は、ギャップアプローチと呼ばれ、それによってPN及びAの両方がBOにアニーリングするが、それらは、ヌクレオチドギャップ又はスペーサー領域がPNの３’末端及びAの５’末端の間に形成されるような方法でアニーリングする。これは図３において、ギャップ１として示される。このギャップは、少なくとも１ヌクレオチドの長さであり、本発明の多様な側面において、上記ギャップは２、又は３、又は４、又は５、又は６ヌクレオチドの長さである。この同じアプローチ、すなわち、ギャップを作り出すこと、は、BOの５’末端がBの３’末端とライゲーションしないことを確実にするために採用されることができ、ここで、このアプローチは図３においてギャップ２として示される、これらの２の末端の間のギャップの形成を伴なう。
【００８０】
代わりのアプローチは、PNの３’末端を「ライゲーション不可能」、すなわち構造的にリガーゼの作用に調和しないものとすることである。Aの５’末端がリン酸基で終端するため、PNの３’末端をAの５’末端とライゲーション不可能とするためには、PNの３’末端はヒドロキシル基を欠いたものであるべきである。例えば、PNの３’末端とAの５’末端の両方がリン酸基を有し、２のリン酸基がリガーゼの作用下で一緒にライゲーションしないように、PNの３’末端はリン酸基を有することができる。この場合、ギャップ１は０ヌクレオチドの長さであることができる。場合により、ギャップ1は１以上のヌクレオチドの長さであり、PNの３’末端はAの５’リン酸基とライゲーション不可能であるだろう。このアプローチは、Aとのライゲーション反応に入るPNの３’末端に対する二重の防御を提供する。
【００８１】
本発明の以下の多様な側面において：ギャップ1は１〜約５のヌクレオチドの長さであり、PNは３’ヒドロキシル基を有し、ギャップ２は０ヌクレオチドであり、BOは５’リン酸基を欠き；ギャップ１は１〜約５ヌクレオチドの長さであり、PNは３’ヒドロキシル基を有し、ギャップ２は１〜５ヌクレオチドの長さであり、BOは５’リン酸を有し；ギャップ１は０ヌクレオチドの長さであり、PNは３’ヒドロキシルを欠き、ギャップ２は０ヌクレオチドであり、BOは５’リン酸基を欠き；ギャップ１は０ヌクレオチドの長さであり、PNは３’ヒドロキシルを欠き、ギャップ2は１〜約５ヌクレオチドであり、BOは５’リン酸基を有する。
【００８２】
４．物品の使用方法
他の側面において、本発明は、上記の物品を利用するポリヌクレオチド構築方法を提供する。すなわち、本発明は、以下のステップ：
（ａ）上記固相支持体、上記連結基、上記普遍的オリゴ及び上記架橋オリゴを含む,上記の物品を提供すること；
（ｂ）（ａ）の物品にオリゴ又は二本鎖をアニーリングすること；そして
（ｃ）２以上のオリゴを一緒にして結合させ、第１標的オリゴヌクレオチドを形成するために、リガーゼを使用すること；
を含む、ポリヌクレオチド合成法を提供する。
【００８３】
任意の実施態様において、本発明はさらに、以下のステップ：
（ｄ）上記普遍的オリゴから上記架橋オリゴを分離すること；
を含む。
【００８４】
他の任意の実施態様においては、第２標的ポリヌクレオチドの形成を可能とするために、架橋オリゴが普遍的オリゴから分離された後、普遍的オリゴが他の架橋オリゴにアニーリングされる。言い換えれば、固相結合普遍的オリゴは、他の遺伝子又は遺伝子断片を作製するために再使用される。
【００８５】
他の側面において、本発明は、水性の環境における固相支持体上でのポリヌクレオチド構築法を提供し、それは、普遍的オリゴを固相支持体に共有結合で結合させること、架橋オリゴを普遍的オリゴにアニーリングさせて開始二本鎖を形成すること、上記開始二本鎖は、粘着末端を提供するために、一本鎖形態の架橋ＯＤＮの部分を有し、第１オリゴ又は第１二本鎖を開始二本鎖の粘着末端にハイブリダイズし、ここで、第１オリゴ／二本鎖が引き続き標的ポリヌクレオチドを形成するために生成される、を含む、進歩性のある改良を有する、本分野で知られたポリヌクレオチド構築法を利用することができる。任意の実施態様において、１以上の以下の基準：普遍的オリゴがポリオキシアルキレン基及びポリヌクレオチド群をを含み、ここで、ポリオキシアルキレン基が固相支持体とポリヌクレオチド群との間に配置され；ポリオキシアルキレン基はポリオキシエチレン基であり；リン酸基によって分離された２のポリオキシアルキレン基が固相支持体と普遍的オリゴとの間に存在し；リン酸基によって分離された複数のポリオキシアルキレン基が固相支持体と普遍的オリゴの間に存在し；炭化水素基が普遍的オリゴとポリオキシアルキレン基の間に配置され、ここで上記炭化水素基が５０〜５００ｇ／モルの式量を有し；普遍的オリゴが５〜５０ヌクレオチドから成り；普遍的オリゴが末端リン酸基を欠き；普遍的オリゴが末端リン酸基を有し；架橋オリゴが普遍的オリゴを形成するいくつかの、又はすべてのヌクレオチドにアニーリングするリンカーポリヌクレオチド領域を含み；架橋オリゴのリンカーポリヌクレオチド領域が５〜５０の近接するヌクレオチドから成り；架橋オリゴが５〜５０の近接するヌクレオチドから成る架橋ポリヌクレオチド領域をさらに含み、ここで、架橋ポリヌクレオチド領域が普遍的オリゴのヌクレオチドにアニーリングせず；架橋ポリヌクレオチド領域が、スペーサー群によって普遍的ポリヌクレオチド領域から分離されており；ここで、上記スペーサー群が近接する一連の１〜約  ヌクレオチドであり；そして、上記方法がさらに、架橋オリゴの架橋ポリヌクレオチド領域を第１オリゴ又は第１二本鎖の粘着末端にアニーリングさせることを含み、ここで第１オリゴ／二本鎖が、架橋ＯＤＮにアニーリングするポリヌクレオチド領域を含み、そして第１オリゴ／二本鎖がさらに、一本鎖であるが、架橋オリゴにアニーリングしないポリヌクレオチド領域を含み；架橋オリゴにアニーリングしない第１オリゴ／二本鎖の一本鎖領域が５〜５０ヌクレオチドを有し；この方法によって作製された第１標的ポリヌクレオチドが、少なくとも１００、又は少なくとも２００、又は少なくとも３００、又は少なくとも４００、又は少なくとも５００の塩基対を含む；がさらにこの進歩性のある方法を定義するために使用されることができる。
【００８６】
Ｅ．混合条件
１の側面において、本発明は、溶液中のポリヌクレオチドを固相支持体に結合したポリヌクレオチドにアニーリングするために、（そのどちらかは部分的に二本鎖形態である）支持体に結合したポリヌクレオチドと溶液中のポリヌクレオチドとを接触させる方法を提供する。支持体に結合したポリヌクレオチドが、好ましくは先に記載した本発明の側面により普遍的オリゴと架橋オリゴを組み込んでいる一方、本発明のこの側面においては、支持体に結合したポリヌクレオチドはこの特別な構成を有する必要はない。言い換えれば、溶液中のポリヌクレオチドを固相支持体に結合したポリヌクレオチドにアニーリングするために、固相支持体に結合したポリヌクレオチドと溶液中のポリヌクレオチドを接触させるこの方法は、一般的には、いずれの支持体に結合したポリヌクレオチドにも適用可能である。
【００８７】
本発明によるポリヌクレオチドを作製するために、表面に結合した部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチド（開始二本鎖）は、新しく入ってくるオリゴ又は二本鎖にアニーリング可能である。表面に結合したオリゴヌクレオチドの長さを伸長し続けるために、新しく入ってくるオリゴ／二本鎖のそれぞれは、部分的に二本鎖の支持体に結合したODN構築物にアニーリングし、新しく入ってくるODNの残りはさらなる伸長のための部位を提供できるように一本鎖のままであるだろう。新しく入ってくるオリゴ又は二本鎖が部分的に二本鎖の表面に結合したODN構築物と接触させられる反応条件は、高収率のアニーリング産物を達成するために非常に重要である。アニーリング産物の収率は、新しく入ってくるODNにアニーリングする部分的に二本鎖の表面に結合したODNのパーセンテージである。
【００８８】
本発明の１の側面において、新しく入ってくるODNを含む溶液は、部分的に二本鎖のODN構築物が伸長された構成にあるとき、固相支持体の表面に接触する。この理論によって結合されることを意図しない一方、本出願人はODN構築物が一定の長さに達して、それ自身螺旋状又は折りたたまれた場合に、該ODN構築物は熱力学的に安定な形態にあることを示唆する。したがって、構築物の熱力学的に安定な形態は、該ODN構築物内に埋め込まれた、又は該ODN構築物の残りの部分若しくは隣接するODN構築物にさえ埋め込まれた若しくは遮蔽された、成長する末端を有することができ、そしてしばしば有する。そしてしたがって、溶液との接触から遠ざかる。この成長する末端を新しく入ってくるODNと接触させるためには、該成長する末端が、他の固相支持体に結合したODNと相互反応するよりも溶液中へ伸長することが助けになる。この伸長を達成するために、本発明は、新しく入ってくるODNの溶液がODN構築物及び／又はODN構築物を支持する表面を、好ましくは勢いよく通り過ぎるようにさせることを提供する。この力は、成長する末端が新しく入ってくるODNによりアクセス可能となるように、成長する末端を他のODN分子から離れるように溶液中へ伸長させる。
【００８９】
したがって、好ましい側面においては、この伸長された構成は、溶液が固相表面を通り過ぎさせられた時に達成される。例えば、該表面は管の内部であることができ、該溶液はODN構築物の構成を伸長させるのに充分な速度で管を流される。他の例としては、該表面は反応チャンバーを２の副チャンバーに分割するフリットであることができ、該溶液は１の副チャンバーから他の副チャンバーへ、ODN構築物の構成を伸長させるのに充分な速度で移される。他の代替例としては、ODN構築物はチャンバーの内部表面に結合することができ、新しく入ってくるODNを含む溶液が該チャンバーへ注ぎ込まれ、攪拌によって、溶液が表面に結合したODN構築物を通り過ぎ、成長する末端が該ODN構築物と密接に接触しないようにするために、機械的スターラーなどの攪拌装置が溶液内に置かれる。新しく入ってくるODNの溶液が、静止したODN構築物を通り過ぎさせられるこのアプローチは、静止表面アプローチと呼ばれる。
【００９０】
或いは、新しく入ってくるODNの溶液は静止していることができ、ODN構築物を連結した表面は溶液中へ押し出され又は引っ張られることができる。例えば、新しく入ってくるODNの溶液はチャンバー内に置かれることができ、ODN構築物を結合した表面が機械的スターラーなどの撹拌装置の羽であることができる。攪拌装置の作動中、羽の表面は溶液中を押し出され、部分的に二本鎖のODN構築物が強制的に伸長された構成とされる。洗濯機型の作用を達成するために、羽が回る方向は変えることができる。一般的に、ポリヌクレオチドに結合した表面が強制的に溶液中を動かされるこのアプローチは、本明細書中で静止溶液アプローチと呼ばれる。静止溶液アプローチは、反復フロースルー混合の一例である。
【００９１】
発明者の理論が正しいか否かにかかわらず、新しく入ってくるODNの溶液が表面に結合したODNを通り過ぎるようにさせること及び／又は表面に結合したODN構築物に新しく入ってくるODNの溶液中を通らせることは、どちらの一方も他方を通り過ぎさせない状態に比較して、第１ポリヌクレオチドの収率において所望の増加に導くということが経験的に観察された。
【００９２】
アニーリング産物の高い収率を達成するためには、表面に結合したODN構築物が、溶液中の新しく入ってくるオリゴヌクレオチドと接触する複数の機会を有することが好ましい。本発明の１の側面において、この目的は、固定された量のオリゴヌクレオチドを含む溶液が、部分的に二本鎖のODN構築物を結合した表面を繰り返し（例えば、２回、３回、４回）通ることによって達成される。例えば、部分的に二本鎖の表面に結合したODN構築物は、２の副チャンバーを分けるフリットに結合され、新しく入ってくるODNの溶液は１の副チャンバーから他の副チャンバーへ複数回移動させられることができる。部分的に二本鎖の表面に結合したODN構築物が管の内部に結合されている場合、該管はループを形成することができ、新しく入ってくるODNの溶液は、繰り返しループ中を押し通されることができる。固定容量のオリゴヌクレオチド含有溶液が、部分的に二本鎖のODN構築物がそこへ結合された表面上の位置を繰り返し通過させられる、このアプローチは、本明細書中で連続的フロースルー接触又はリサイクリングアプローチと呼ばれる。
【００９３】
或いは、充分なオリゴヌクレオチド含有溶液が利用可能であれば、部分的に二本鎖のODN構築物を結合した表面を、増加する量のオリゴヌクレオチド含有溶液を通過させることによってこの目的は達成されることができる。例えば、オリゴヌクレオチド含有溶液は、所望の量の表面に結合した部分的に二本鎖のODN構築物を新しく入ってきたODNにアニーリングするのに十分な時間の間、貯蔵器から部分的に二本鎖のODN構築物が結合した内部を有する管を通じてポンプでくみ出されることができる。非サイクリングアプローチと呼ばれる、このアプローチは典型的には、アニーリング産物の同じ収率を達成するために、リサイクリングアプローチよりもより多量の溶液オリゴヌクレオチドを必要とし、この理由によって、非リサイクリングアプローチは、より好ましくないアプローチである。
【００９４】
上記の方法において、部分的に二本鎖のODN構築物の伸長と部分的に二本鎖のODN構築物と溶液中の新しく入ってきたODNとの複数の接触を達成するためには、同じ機械的な力が用いられる。これは本発明の好ましい側面である。しかしながら、このアプローチは、部分的に二本鎖のODN構築物と溶液中の新しく入ってきたODNとの複数の接触を達成するために用いられる力が、部分的に二本鎖のODN構築物の伸長を達成するためにも充分であることを必要とする。例えば、ポリヌクレオチドが機械的スターラーの羽に結合される場合、スターラーは、結合したODN構築物が伸長するのに充分な回転速度で運転されなければならない。同様に、ODN構築物がフリットの表面に結合している場合、新しく入ってくるODNの溶液は、ODN構築物の成長する末端を溶液中へ伸長させるのに充分な速度で１のチャンバーから他のチャンバーへフリットを通過させられなければならない。本明細書中で使用されるように、「機械的な力」は、溶液及び／又は表面の動きを達成するためにシステムに加えられるエネルギーの量を指す。
【００９５】
機械的な力が、部分的に二本鎖の表面に結合したODN構築物の伸長を起こすのに充分であるか否かは、溶液の粘稠性及び反応容器の正確な構成に依存する。例えば、カラムの長さ及び内径、又はフリットの孔サイズ及び厚さである。いずれの特別な構成についても、ODN構築物の伸長を達成するのに必要な条件は、いくつかの試験的反応を行うことによって容易に決定されることができる。例えば、構成が確立された後、一組の反応条件が無作為に選ばれ、それらの条件下でのアニーリングの収率が測定される。そして、５０％などの選ばれた値で機械的な力が増加されることができ、これらの新しい条件下でのアニーリングの収率が測定される。例えば、部分的に二本鎖のODN構築物が結合した表面上の特定の固定点を通過する流速は、約５０％増加されることができる。これらの新しい反応条件がより大きなアニーリングの収率を達成する場合、機械的な力はさらに、例えば、５０％増加されることができ、アニーリングの収率が再測定される。これらの新しい反応条件がより大きなアニーリングの収率を達成しない場合、過剰の機械的な力が最初の反応において使用されたこととなり、第２反応は、例えば５０％少ない、より少ない機械的な力を用いて行われるべきである。この方法によって、機械的な力対アニーリングの収率のプロットを容易に達成することができる。典型的には、機械的な力の閾値未満では、機械的な力を変化させることは、アニーリングの収率を増加させない。また、典型的には、一定の機械的な力を超えると、機械的な力の増加は、アニーリングの収率をさらに増加させないが、その代わりに、DNA鎖／ODN構築物の破壊を引き起こすことができる。当業者は、特異的な制約及び目的に基づいて、好適な機械的な力及び構成を選択することができる。
【００９６】
本明細書中で使用されるように、より高いアニーリングの収率は部分的に二本鎖の表面に結合したポリヌクレオチドの伸長によって引き起こされると主張され、且つ伸長は機械的な力によって引き起こされると主張される。これは、観察された結果を説明するための、発明者の理論である。実際に観察された結果は、適切な機械的な力がアニーリング反応の間に使用されない限り、アニーリングの収率は非常に高いものではない、というものである。すなわち、それによって溶液及び表面がお互いに通過させられる何らかの機械的な力が用いられない限り、部分的に二本鎖の表面に結合したODN構築物の比較的長いものに関しては、アニーリングの収率はかなり低いということが経験的に観察された。
【００９７】
本発明の好ましい側面においては、ある容量の溶液が繰り返し固相支持体の表面領域を通過させられ、そこで表面領域は部分的に二本鎖のODN構築物に結合させられ、溶液の該容量は表面に結合したODN構築物の一本鎖部分に相補的なオリゴヌクレオチドを含む。好ましくは、時間、オリゴヌクレオチド濃度、及び温度などのすべての因子が一定に保たれた状態で、圧力の低下が、部分的に二本鎖の表面に結合したODN構築物にアニーリングされたODNの低収率を引き起こすような圧力のもとに、溶液の該容量は、固相支持体の表面領域を繰り返し通過させられる。
【００９８】
関連する側面において、表面に結合した部分的に二本鎖のODN構築物は強制的に、新しく入ってくるODNを含む溶液中を移動させられ、ここで、新しく入ってくるODNは、表面に結合した部分的に二本鎖のODN構築物の一本鎖部分に対して少なくとも部分的に相補的である。好ましくは、時間、オリゴヌクレオチド濃度、及び温度などのすべての因子が一定に保たれた状態で、力の減少が、部分的に二本鎖の表面に結合したODN構築物にアニーリングされたODNの低収率を引き起こすような力のもとに、表面に結合した部分的に二本鎖のODN構築物は、溶液中を強制的に移動させられる。
【００９９】
１の実施態様において、本発明は、すべてではなくても、ほとんどの表面に結合した部分的に二本鎖のODN構築物が新しく入ってくるオリゴヌクレオチドにアニーリングすることを提供し、そしてしたがって多様な側面において本発明は、少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の表面に結合した部分的に二本鎖のODN構築物が新しく入ってくるオリゴヌクレオチドにアニーリングし、ここでパーセント値は固相支持体に結合した部分的に二本鎖のODN構築物のモルに基づいたモル％である、を提供する。
【０１００】
流れの混合によるODNの成長する末端の伸長の、アニーリングの収率に対する効果は、約２００ヌクレオチド未満など、ODN構築物が比較的短い場合には非常に目立ったものではない。しかしながら、ODN構築物がより長くなると、成長する末端の溶液への露出が、高いアニーリングの収率を達成するためにより重要な因子となる。したがって、本発明の多様な側面において、成長する末端の伸長条件に露出された、表面に結合した部分的に二本鎖のＯＤＮ構築物は、２００ヌクレオチドよりも大きいか、又は３００ヌクレオチドより大きいか、又は４００ヌクレオチドよりも大きいか、又は５００ヌクレオチドよりも大きいか、又は６００ヌクレオチドよりも大きいか、又は７００ヌクレオチドよりも大きいか、又は８００ヌクレオチドよりも大きいか、又は９００ヌクレオチドよりも大きいか、又は１０００ヌクレオチドよりも大きいか、又は１，２００ヌクレオチドよりも大きいか、又は１，４００ヌクレオチドよりも大きいか、又は１，６００ヌクレオチドよりも大きいか、又は１，８００ヌクレオチドよりも大きいか、又は２，０００ヌクレオチドよりも大きいか、又は２，５００ヌクレオチドよりも大きいか、又は３，０００ヌクレオチドよりも大きいか、又は３，５００ヌクレオチドよりも大きいか、又は４，０００ヌクレオチドよりも大きいか、又は５，０００ヌクレオチドよりも大きく、これらの各値は場合により約、６，０００ヌクレオチド、又は７，０００ヌクレオチド、又は８，０００ヌクレオチド、又は９，０００ヌクレオチド、又は１０，０００ヌクレオチドを上限とする。
【０１０１】
支持体に結合した部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドの溶液を混合することを達成するための、本発明による「力」の使用は、これらの２の成分を有するいずれのシステムにも一般的に適用できる。したがって、支持体に結合した部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、しかし必然的にではなく、上記の定義による普遍的オリゴと架橋オリゴから形成された「出発二本鎖」である。
【０１０２】
したがって、１の側面においては、本発明は以下のステップ：
（ａ）固相支持体に結合した部分的に二本鎖の核酸（ds‐ＮＡ）を提供すること；
（ｂ）上記ds-NAの一本鎖部分に対して少なくとも部分的に相補的な一本鎖核酸（ss-NA）の溶液を提供すること；
（ｃ）（ｉ）ss-NAがds-NAの一本鎖部分にアニーリングし、そして（ｉｉ）ステップ（ｂ）の溶液の少なくともいくらかがds-NAを少なくとも２回通過するように、その方向が少なくとも１回逆にされる、ような方向に現される力の影響下において、該溶液の少なくともいくらかがds-NAを通過するという条件下で、ステップ（ａ）のds-NAとステップ（ｂ）の溶液を接触させること；
を含む、遺伝子構築法を提供する。
【０１０３】
本発明の他の側面においては、以下のステップ：
（ａ）固相支持体に結合した部分的に二本鎖の核酸（ds‐ＮＡ）を提供すること；
（ｂ）上記ds-NAの一本鎖部分に対して少なくとも部分的に相補的な一本鎖核酸（ss-NA）の溶液を提供すること；
（ｃ）（ｉ）ss-NAがds-NAの一本鎖部分にアニーリングし、そして（ｉｉ）その他は一定の条件下で、力の減少が、ds-NAの一本鎖部分にアニーリングするss-NAの量を減少させる、ような力の影響下において、ステップ（ｂ）の溶液の少なくともいくらかがds-NAを通過するという条件下で、ステップ（ａ）のds-NAとステップ（ｂ）の溶液を接触させること；
を含む、遺伝子構築法を提供する。
【０１０４】
これらの２の側面の好ましい実施態様において、固相支持体は多孔質であり、ステップ（ｂ）の溶液は該孔を複数回通過することを必要とされる。
【０１０５】
Ｆ．合成プロセスを評価するための定量アッセイ
固相遺伝子合成プロセスにおける以下の２の重要なステップ：
（１）       固相支持体結合能；および
（２）       固相のライゲーション効率の推定；
を定量化するために、２のアッセイ法が使用されることができる。これらのアッセイは以下に記載される。
【０１０６】
１．固相支持体結合能のアッセイ
この遺伝子構築において使用される固相支持体は、好ましくは約１７のヌクレオチドを有する普遍的リンカーオリゴヌクレオチドに共有結合で結合されている。固相支持体表面の結合能は、以下の蛍光に基づくアッセイによって決定される。リンカーオリゴを伴う固相支持体は、最初に蛍光標識された相補的オリゴとハイブリダイズされる。ハイブリダイズしない標識オリゴは、過剰の洗浄によって除去され、洗浄液は蛍光によってモニターされる。ハイブリダイズした標識オリゴは、その後、高温での変性によって放出され、その量を蛍光光度計によって測定される。固相支持体は、典型的には、表面上で約１〜３ピコモル/cm2の結合能を有する。
【０１０７】
２．段階的固相ライゲーション効率の推定のためのアッセイ
他の固相を基礎とする反応のように、固相上での酵素的ライゲーションは、液体を基礎とする反応よりも効率が低く、且つ遅い（V. Chan, D. Graves, P. Fortina and S. Mckenzie, Langmuir, (1997) vol. 13, 320-329; M. Shchepinov, S. Case-Green and E. Southern, Nucleic Acid Research, (1997) vol. 25, 1155-1161; H. Hakala, E. Maki and H. Lonnberg, Bioconjugation Chem. Research, (1999) vol. 27, 1719-1727）。試薬の１つの拡散による損失及び増加した立体障害は、反応位置近傍における試薬濃度を大いに減少させる。さらに、固相ライゲーション効率はまた、DNA鎖全体の長さにも依存する。したがって、DNAが短い場合、構築の初期段階におけるライゲーション効率は、DNAが長くなった時の構築のより後の段階におけるライゲーション効率に相当しないかも知れない。
【０１０８】
本明細書中で記載されたアッセイを用いて、ライゲーション効率に対するいくつかのパラメーターの効果が評価された。以下のパラメーターが固相ライゲーション効率に直接的に影響を与えることが発見された。それらの相対的な重要性は、単純な順番に一般化されることができない。なぜなら、各因子は、反応の異なる段階において効果を示すからである。
・   リガーゼ濃度
・   ライゲーション時間及び温度
・   溶液中の標的濃度
・   オリゴ二本鎖のオーバーハング長
・   固相支持体材料
・   伸長する末端と固相表面の間の距離
・   緩衝液中のイオン強度
・   インキュベーション中の混合
【０１０９】
固相ライゲーションの効率を評価するために、図４に示された、蛍光標識及びゲル画像解析を組み合わせたモデルシステムを使用する。
【０１１０】
最初に、蛍光標識オリゴが、「粘着末端」を作り出す固相支持体上のリンカーオリゴにハイブリダイズされる（図４A）。いずれのハイブリダイズされない標識オリゴもアニーリング緩衝液で固相支持体を洗浄することによって除去される。そして、相補的な「粘着末端」を有する第１二本鎖がアニーリングされ、リガーゼ及びライゲーション緩衝液の存在下で、固相支持体につなぎとめられたオリゴにライゲーションされる（図４B）。いずれのライゲーションされない二本鎖１も、洗浄によって除去される。そのサイクルは第２のライゲーションサイクルについても繰り返される（図４C）。そして、二本鎖のライゲーション産物は変性され、一番下の鎖が固相支持体から溶出される（図４D）。一番下の鎖を含む溶液はその後、アクリルアミド変性ゲル上で分析され、蛍光標識された各分画がKodak Digital Science（登録商標）1D 画像解析ソフトウエアによって定量化される。この方法は、固相遺伝子構築における多様なサイクルでのライゲーション効率の推定を可能とする。
【０１１１】
固相支持体としてフロースルー多孔質材料を使用する本発明は、３５塩基オリゴを用いて、全体で１０〜３０％の累積収率をもって、１２サイクルで４００塩基対遺伝子断片の合成を提供した。これは計算によって、１サイクルあたり８５〜９０％の収率の理論値となる。
【０１１２】
G. 遺伝子合成のための装置
１．概説
多様な側面において本発明は、自動化された遺伝子合成を提供する装置を含む、遺伝子合成のための装置並びにこれらの装置の遺伝子合成における使用方法を提供する。１の側面において、本発明は以下の：
ｉ）複数の反応チャンバーであって、上記複数のそれぞれが以下の：
（ａ）多孔質の領域を含む、チャンバー内に位置し且つチャンバー内に広がる固相支
持体；
（ｂ）第１及び第２オリフィスであって、第１オリフィスから第２オリフィスへの直
線が固相支持体の横を通るか又は貫通するように位置する、第１及び第２オリフィス；
（ｃ）上記第１オリフィスと上記第２オリフィスとの間に位置するチャンバーの第１
容積；及び
（ｄ）上記第２オリフィスと固相支持体との間に位置するチャンバーの第２容積；
を含む、固相遺伝子構築のための装置を提供する。
【０１１３】
上記装置は、好ましくはさらに、第１オリフィスと、第１オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列に対して少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列を有する第２オリゴヌクレオチドの溶液を保持する貯蔵器との間に流体連絡を提供する管システム及び弁を含む。運転中、第２オリゴヌクレオチドの溶液は好ましくは、繰り返し又は連続的に、固相支持体の横を通り過ぎるか又は貫通する。したがって、本発明は、固相遺伝子構築法であって、以下のステップ：
ｉ）以下の：
（ａ）第１オリゴヌクレオチドに結合され、チャンバー内に位置する固相支持体；及
び
（ｂ）第１オリフィスから第２オリフィスへの直線が固相支持体の横を通るか又は貫通するように位置する、第１オリフィス及び第２オリフィス；
を含む、反応チャンバーを提供すること；
ｉｉ）第１オリフィスを通って第２オリゴヌクレオチドの溶液を送達し、第２オリフィスの方向にある固相支持体の横を通って又はこれを貫通して第２オリゴヌクレオチドの溶液を輸送すること；
ｉｉｉ）第２オリゴヌクレオチドの溶液を繰り返し又は連続的に、固相支持体の横を通らせるか又はこれを貫通させること；
を含む、上記固相遺伝子構築法を提供する。
【０１１４】
２．反応器の設計
１の側面において、本発明の遺伝子合成は、複数の反応チャンバー内で実施される。この複数のそれぞれは、そこへオリゴヌクレオチドが結合する内部固相表面を有する。図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ，５Ｄ及び５Ｅは、５つの固相表面の構成を例示する。図５Ａにおいては、固相表面は、チャンバーの内壁から伸びる繊維である。図５Ｂにおいては、固相表面は、チャンバーの内壁に隣接する縁である。図５Ｃにおいては、固相表面は、チャンバーを効果的に第１及び第２副チャンバーに分割する、チャンバーの幅にわたる多孔質の栓である。図５Ｄにおいては、チャンバーの幅にわたる２の堅い多孔質の障壁が、障壁間に位置する、ビーズで満たされた空間を定義する。ビーズは、オリゴヌクレオチドが結合する固相支持体である。図５Ｅにおいては、固相支持体は、反応器中に吊り下げられたブラシであり、該ブラシはモーターの操作によって、溶液中を回転することができる。他の表面構成は代替的に利用されることができる。
【０１１５】
固相支持体に結合したオリゴヌクレオチドを含むことに加えて、各反応チャンバーは２のオリフィスを有する。各オリフィスは、反応チャンバーから溶液及び試薬を出し入れするのに使用されることができる。１の孔から他の孔への直接的な通過が固相支持体の横を通るか又は貫通しておこなわれるように、孔が位置されるべきである。図５Ｃの反応器を例として用いて、図６Ａ、６Ｂ及び６Ｃは、２つの孔（オリフィス）の３の可能な配置を示す。図６Ａにおいては、孔は栓を真ん中に有し、チャンバーの一番上及び一番下に位置する。図６Ｂにおいては、孔はチャンバーの同じ側に、上下になるように位置する。図６Ｃにおいては、孔はチャンバーの反対側どうしに位置する。各場合において、２の孔の間の直線が栓を貫通するように、ひとつの孔は栓の上におかれ、もうひとつは栓の下におかれる。「フロースルー反応器」という用語は、１の孔から他の孔への直接的な通路が固相支持体の横を通るか又は貫通するように、２の孔が配置される反応器を意味する。
【０１１６】
他の側面において、固相は、反応器の末端、すなわちオリフィスに又はその近く、に位置する。これは図７Ａ、７Ｂ，及び７Ｃに、固相支持体として多孔質の栓を使用して例示される。図７Ａにおいて、多孔質の支持体は、反応器の末端であるが、その内部に位置する。図７Ｂにおいて、多孔質の支持体は、反応器の末端であるが、その外部に位置する。図７Ｃにおいて、反応器はチップを有し、多孔質の支持体はこのチップ内に位置する。
【０１１７】
類似するシステムが米国特許第５，４３７，９７９号中に記載され、それは、本発明の方法を実施するために利用されることができる。‘９７９号特許は、貯蔵器から引き出された液体を入れるためのピペットチップを利用し、ここで、チップは固相支持体上に固定された化学種を保持する。本発明に適用されるように、第１オリゴヌクレオチドはピペットチップ中に固定されることができ、第２オリゴヌクレオチドの溶液は貯蔵器中に置かれることができる。第２オリゴヌクレオチドの溶液はピペットチップ中へ引き込まれ、そして排出され、そしてこのプロセスは少なくとも１回、好ましくは複数回繰り返される。’９７９号特許は、固相支持体を正しい位置に保有するために１又は２の多孔質のフリットを使用することを開示する。本発明における使用に適合させるために、ビーズを固定するために、２の多孔質のフリットが必要である。
【０１１８】
ピペットチップの使用は、本発明の方法の好ましい実施態様ではない。なぜなら、ピペットチップは摩擦による適合によって正しい位置に固定され、‘９７９号特許に開示されるように、チップが残りの装置と結合する連結部においてしばしば漏れるからである。わずかな漏れでさえ、本発明の方法にとっては問題となり得る。それは、（１）第２オリゴヌクレオチドの溶液が固相支持体を多数回通り、そして（２）オリゴヌクレオチドの新しい溶液及び洗浄溶液が反応容器に多数回導入される、からである。ピペットチップは１又は２回の使用のために設計されており、さらなる使用のためではない。薄い壁のピペットチップはしばしば、さらなる使用によってゆがみ、それらがピペットとの間に有するはずの摩擦による適合が失われる。
【０１１９】
先に示したように、本発明の装置及び方法における使用に好ましい固相支持体材料は、５〜３５μmの孔を有する多孔質ポリエチレンである。この材料は、Porex Technologies (Fairburn, GA)及びPorvair Advanced Materials (Hendersonville, NC)などのいくつかの製造者から商業的に入手可能である。どちらの会社も直接的にフリットを成形することが可能である。原料の多孔質ポリエチレンフリットは、アミン基を表面に導入するためにプラズマ処理されることができる。Belmont, CAの４th State, Inc. は、プラズマ処理サービスを宣伝するいくつかの売主のひとつである。プラズマ処理の後、支持体は反応容器を収納するカラム中へプレスによって適合させられる。
【０１２０】
好ましくは、固相支持体は連結基を介して普遍的オリゴに結合される。例えば、５‘−カルボキシル末端を有するPEG化リンカーオリゴが上記のように固相支持体に結合されることができる。オリゴの結合及びアッセイ反応は、すべてのカラムについて同じ試薬を用いて、すべて室温で行われる。以下に記載される遺伝子構築ステーションは、固相支持体に普遍的オリゴ（所望により、リンカーも）を結合させるために使用されることができる。
【０１２１】
本発明の反応容器及び装置とともに普遍的オリゴ及び架橋オリゴを使用することは、非常に有用である。なぜなら、それは、新しい遺伝子又は遺伝子断片を製造するためにカラムが再使用されることを可能とし、そしてこの再使用可能な性質は自動化によって達成されることができるからである。すなわち、ひとつの遺伝子断片が完成し、そして他の遺伝子断片の構築が開始すべきときに、本発明の装置中で固相支持体を新しい固相支持体に交換することが不必要である。遺伝子断片は、支持体に結合した普遍的オリゴを残して固相支持体を単に洗浄することによって洗い出され、遺伝子構築のプロセスは、適切な架橋オリゴを固相支持体／普遍的オリゴに添加することによって開始されることができる。したがって、１の側面において、本発明は、同じ反応器から多数の遺伝子断片を連続的に作製することを提供し、ここで、遺伝子断片が固相支持体から洗い流され、そして遺伝子断片構築を再び開始するために、新しい架橋オリゴが固相支持体に導入される。
【０１２２】
好ましい実施態様において、反応器の設計は、反応器中の流体のレベルをモニターする能力を組み込む。反応器中の流体のレベルをモニターする方法及び装置は、本分野で周知であり、本発明の反応器中に組み込まれることができる。
【０１２３】
３．ポンプ＋反応器
各反応チャンバーは、ポンプと流体連絡している。同じポンプが、複数の反応チャンバーのすべて又は一部分と流体連絡している。１の側面において、単一のポンプが複数の反応チャンバーのすべてと流体連絡している。この側面は、複数のポンプを購入し、保持するのにかかる出費を減少させるという利点を有する。他の側面においては、各反応チャンバーが、別々の特有のポンプと流体連絡している。この側面は、操作の最大のフレキシビリティー、すなわち各反応チャンバーが個別に制御されることができ、そしてすべての反応チャンバーが同じ操作条件におかれる必要がない、という理由によって有利である。各反応チャンバーを特有のポンプと流体連絡の関係におくことも、１の反応チャンバーにおける機能不全が他の反応チャンバーの操作にわずか影響しか与えないか、又は影響しないという理由で、有利である。各反応チャンバーに存在する２の孔のひとつはポンプと流体連絡している。
【０１２４】
本発明の遺伝子構築を達成するために、第２オリゴヌクレオチドの溶液が必要である。第２オリゴヌクレオチドのこの溶液は、反応チャンバーに添加され、固相支持体に結合した第１オリゴヌクレオチドとの接触が可能となる。第２オリゴヌクレオチドの溶液は、チャンバーの２のオリフィスの１を介して反応チャンバーに入る。ポンプは、第２オリゴヌクレオチドの溶液が反応チャンバーへ移動するための力を提供する。
【０１２５】
ポンプの作用下において、反応チャンバー内の第２オリゴヌクレオチドの溶液は反応チャンバーの第２の孔に向かって送られる。この輸送過程で、第２オリゴヌクレオチドの溶液は、そこへ第１オリゴヌクレオチドが結合した固相表面に接触し、第１及び第２オリゴヌクレオチドがそれによってお互いに接触することとなる。
【０１２６】
１の側面において、本発明の遺伝子構築法の重要な特徴は、第２オリゴヌクレオチドの溶液が、第１の孔から固相表面を横切って又はその横を通って第２の孔に向かって移動し、そして第１の及び第２のオリゴヌクレオチドがお互いに接触することを可能とした後、該溶液が向きを反対にする、という点である。すなわち、第１の孔から第２の孔の方向へ移動した後、該溶液は反対方向に、すなわち第２の孔から第１の孔へ、移動させられる。その後、該溶液は方向をさらに再び逆にし、第１の孔から第２の孔に向かう方向にその移動を繰り返す。第１ヌクレオチドがそこへ結合した固相表面を、溶液が行ったり来たりして横切って通り過ぎるように、この方向の変化は多数回繰り返される。固相表面を行ったり来たりして溶液が固相表面を横切るこのプロセスは、本明細書において反復フロースルー接触と呼ばれる。
【０１２７】
驚くべきことに、本発明の発明者らは、反復フロースルー接触が遺伝子構築の収率を増加させることを発見した。すなわち、反復フロースルー接触は、第２オリゴヌクレオチドに結合する第1オリゴヌクレオチドの数を増加させる。この驚くべき発見の背景にある作用のメカニズムは未だ確かではなく、本明細書中で先に検討したものである。基本的に、本発明の遺伝子構築のメカニズムは、標準的なヌクレオチドの塩基対形成規則によって第１オリゴヌクレオチドが第２オリゴヌクレオチドへアニーリングすることを必要とする。このアニーリングプロセスが起こるには、第１オリゴヌクレオチドは、そのヌクレオチド塩基が露出され、そして第２オリゴヌクレオチドの塩基と接触可能となるように充分に伸長される必要がある。本発明の反復フロースルー接触の側面は、それによって第１及び第２オリゴヌクレオチドの塩基の間のアニーリングが可能となり、そして促進される、第１オリゴヌクレオチドの伸長を促進すると考えられる。
【０１２８】
反復フロースルー接触は、第１オリゴヌクレオチドが多孔質固体の孔の内側に結合する場合に、特に重要であると考えられる。多孔質固体は、大きな表面／容積比を提供し、それによって比較的多数の第１オリゴヌクレオチドが比較的小さな容量の固相支持体に結合することを可能とするため、本発明による好ましい固相支持体である。この状況において、固相支持体の孔の内側に、連続的な又は少なくとも頻繁な流れを提供することは重要であると考えられる。この頻繁な流れは、第１オリゴヌクレオチドが比較的伸びた形態に留まり、それによって第２オリゴヌクレオチドと比較的より反応性であることを促進すると考えられる。
【０１２９】
反復フロースルー接触は、例示の目的で再び図５Cの反応チャンバーを使用して、図８A〜８Eに例解される。図８Aにおいて、反応チャンバーは伸長され、そして固相表面はチャンバーにわたる多孔質マトリックスであって、チャンバーの長さのほぼ半分の位置に配置される。この多孔質フリットは、反応チャンバーを２の副チャンバー、すなわち第１及び第２チャンバーに分割する。ポンプの作用下で、図８Bに例示されたように、第２オリゴヌクレオチドの溶液が第１の孔を通って貯蔵器から反応容器中へ引き出される。該溶液は、図８Cに例示された状態である、完全に固相表面がそれにつかるまで、そしてさらなる第２の孔への動きが固相表面を空気に露出するまで、チャンバー中へ引き入れられる。この特別な実施態様において、第２オリゴヌクレオチドの溶液は、ポンプと第２オリゴヌクレオチドの間の１以上の減圧によって、そして溶液が第１の孔から逆流することを阻害する毛細管作用によって、正しい位置に保持される。好ましくは、第２オリゴヌクレオチドの溶液は、固相表面全体を湿った状態に保ち続ける。これは図８Dに例解される。図８C及び８Dは、反復フロースルー接触を例解する。反復フロースルー接触は、図８Eにおいて例解されるように持続されることができ、ここでは、ポンプが反対方向に作用し、第２オリゴヌクレオチドの溶液を第２の孔に向かって引き戻す。
【０１３０】
他の側面においては、本発明の方法は、本明細書中で連続的フロースルー接触と呼ばれる、反復フロースルー接触の変形を提供する。この様式においては、第２オリゴヌクレオチドの溶液は、連続的に第１の孔から固相表面を横切って第２の孔へ通り抜ける。連続的フロースルー接触を達成するために必要な第２オリゴヌクレオチドの溶液を最小限にするためには、該溶液は、図９に示されるように再生させられることができ、ここでは、例示の目的で図５Cの反応容器を利用する。図９において示されるように、反応チャンバーは、反応チャンバーの両側にわたる多孔質フリットを有することを条件とする。第２オリゴヌクレオチドは、貯蔵器から反応チャンバーへ導入され、そして貯蔵器への弁が閉じられる。その後、ポンプが第２オリゴヌクレオチドの溶液を、連続的に時計回り又は反時計回りのいずれかの方向に反応器中を循環させる。それによって反復フロースルー接触を提供するために、流れの方向は所望により、任意に又は周期的に逆向きにされることができる。
【０１３１】
好ましい装置において、反応容器はフリットに適合したカラムである（図１０A）。この設計において、カラムはプログラム可能なシリンジポンプに結合され、フリット及び一番上のルアーフィッティングと適合し、3方切り替え弁を通じて緩衝液貯蔵器に連結する。この反応器及びシリンジポンプの構成によって、試薬（オリゴ及びリガーゼ）はマイクロプレートから、反応器の底を通って引き出される。同じシリンジポンプによる上下運動及び溶液をフリットを通して流すことによって混合が達成される。洗浄緩衝液は反応器の一番上から切り替え弁を通って送達される。廃液は、溶液をカラムを通ってカラムの一番下に位置する廃液収集容器中へポンプによって押し出すことによってカラムから洗い流される。そのような構成によって、プログラム可能なシリンジポンプは、遺伝子断片構築プロセスのすべてのステップを操作することができる。この設計は、図１０Bに例解されたマルチカラム装置に拡張されることができる。
【０１３２】
試薬の送達及び混合のためのユニットは、自動化された固相遺伝子構築ステーションにおける重要な要素である。好ましい部品は、試薬の送達及び混合操作の両方を制御するプログラム可能な平行シリンジポンプユニットである。このユニットは、小容量のオリゴ溶液を固相支持体表面全体にわたって均一に送達するために、一貫した圧力差を作り出すことができる。このユニットはまた、DNA構築反応の間、固相支持体の孔を通る連続的な逆行可能な試薬の流れを提供することもできる。
【０１３３】
本発明の１の側面において、各反応カラムは、カラムの一番上から離れたシリンジに結合される。或いは、さらに２のカラムが一つのシリンジに結合されることができる。各反応サイクルの開始時点で、マルチウエルプレート中のオリゴが反応ブロックの下に置かれ、各オリゴ溶液は底を通って反応カラムに引き入れられる。そして、溶液が一定して支持体を行ったり来たりして通過するように、シリンジポンプが一定の速度及び容量置換で連続的に上下のポンプ運動をするようにプログラムされる。サイクルの最後に、溶液はカラムから廃液収集器へ洗い流される。各アニーリング反応の後、シリンジポンプと反応器カラムの間の切り替え弁を通ってカラムの一番上から加えられる新鮮な洗浄緩衝液による洗浄サイクルが繰り返しおこなわれる（図１０）。
【０１３４】
各カラムについて個別のシリンジを使用することは、各カラム及びカラムの組全体にわたる流速並びに容量の信頼性のある一貫した制御を提供する。単一のシリンジポンプ又は真空チャンバーに基づく設計では、各カラムの均一性を確実にすることは難しいが、このアプローチもまた、使用されることができる。
【０１３５】
４．マルチカラムブロック
１の側面において、遺伝子構築システムは、以下の：１）各カラムに対する個別の温度制御を伴なう、マルチ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、など）カラムシステムを含む。他の側面においては、遺伝子構築システムは、ブロック全体にわたる均一の温度制御を伴なう、マルチカラムシステムを含む。固相構築ステーションの中心要素は、カラムに基づく固相反応器カートリッジ（図１０B）である。この型の構築ステーションは、この目的のために商業的製作者によって製造されることができる。カラムは、不活性で、滅菌可能であり、且つ適切な熱伝導特性を有し、DNA吸着性の低い、成形可能なプラスチックから作られることができる。成形された部分は好ましくは、カラムが反応ブロック中へ摩擦による適合で正しい位置に保持され、今度は固相フリットがカラム中へ摩擦による適合で正しい位置に保持されるように、寸法的に安定である。各カラムの一番上には好ましくは、容易に試薬の送達及び混合ユニットの管に連結しそして外れる結合連結部を有する。各反応器は好ましくは、小容量の試薬を採取するために、標準的な９６ウエルプレートの底に届くことのできる先細りのチップを有する。反応カラムの容量は好ましくは、固相支持体のバルク容量の約３倍である。複数の反応容器を保持する反応ブロックは、上流及び下流の自動化を容易にするために、好ましくは９６ウエルプレートのフォーマットに適合するやり方で反応容器を配置する。反応ブロックは好ましくは、温度制御（例えば、＋/−１℃又は＋/−２℃、毎分１０℃の昇降温速度）を含む。反応の模式的ダイアグラム、及び反応のブロックが図１０Bに示される。
【０１３６】
５．温度制御
反応ブロックは、＋/−１℃の精度の室温〜１００℃の加熱能を有する。温度制御ユニットは、好ましくはコンピュータプロセス制御へのインターフェースによってプログラム可能である。反応ブロック及び温度制御ユニットは、J-KEM Scientific (St. Louis, MO)のような、多数の製作者のうちのいずれによっても製造されることができる。
【０１３７】
６．マルチプレート貯蔵システム及び自動的プレート輸送システム
本発明の１の側面において、マルチプレート貯蔵システム及び自動的プレート輸送システムが設計全体の中へ取り入れられる。装置のこの部品は、オリゴ供給物を貯蔵し、そして固相アニーリング反応の各サイクルへ送達する役割を果たす。４８の４００塩基対遺伝子断片の構築は、約１０のアニーリングサイクルを含む。これらのサイクルのためのオリゴは、１０のマイクロタイタープレート中において供給されることができる。バッチサイクル全体が一回で約２日間で終了するため、オリゴは顕著な蒸発及び変性をすることなく、待機モードに保たれなくてはならない。一つの解決法は、プレート輸送のための自動化アームに連結された、温度及び湿度の制御された貯蔵ユニットである。そのような装置は、最近、多様な販売者を通じて入手可能である。
【０１３８】
図１０Bに示されたとおりに反応器を反応ブロック中へ配置することは、特別に望ましい。なぜなら、その配置は、マルチウエル・マイクロタイタープレート中のウエルの配置に相補的なものだからである。本発明の１の側面において、遺伝子又は遺伝子断片の作製に必要なすべての試薬は単一の９６ウエルプレート中に置かれ、反応ブロックは８の反応器を有する。これは、反応物（例えば、第１オリゴ／第１二本鎖、第２オリゴ／第２二本鎖、リガーゼなど）がそこから反応容器に送達される、１２以下の独立したウエルを提供する。洗浄緩衝液は、離れた貯蔵器中に入れられ、管及びポンプ作用によってアクセスされる。
【０１３９】
７．プロセスの質管理プロトコールの開発
プロセスの質管理プロトコールは、望ましくは各重要ステップに含まれる。固相結合能及びライゲーション効率のアッセイは、本明細書中ですでに記載された。最終的な溶出された遺伝子断片は、ゲル電気泳動によって立証されることができる。
【０１４０】
８．自動的合成
１の側面において、本発明は、固相遺伝子プロセスを用いた自動的遺伝子構築を目的とする。この構築は図１１に例解されたようないくつかの重要なモジュールを含む。固相遺伝子構築ステーションは、反応ブロック、温度制御システム、液体操作及び混合ユニット並びにマイクロタイタープレートの貯蔵及び管理システムを含む。反応ブロックモジュールは、個別の反応カラムを保持し、各反応サイクルの温度を維持する。マルチプレート管理システムは、４００塩基対の遺伝子断片の構築に含まれるすべてのサイクルのためのオリゴ供給物を保管し、管理する。試薬送達及び混合ユニットは、オリゴ及び緩衝液の、添加及び除去並びに反応周期の間の混合を制御する。
【０１４１】
以下の実施例は、例示の目的で提供されるものであって、限定を目的とするものではない。核酸配列のクローニング及びそれらの核酸の配列決定のための方法論は、本発明の分野の当業者にとって周知である。例えば、以下の実験研究マニュアル：(本明細書に参考文献として,そっくりそのまま援用されている)Sambrook et al., "Molecular Cloning" (Cold Spring Harbor Press, 3rd Edition, 2001)及びAusubel et al., "Short Protocols in Molecular Biology" (1999)中に例示的な技術が記載されている。
【実施例】
【０１４２】
実施例１
微粒子固相支持体上での３１０塩基対遺伝子の構築
樹脂の酸処理
アミノメチル化ポリスチレン樹脂（３グラム、直径１００ミクロン以下、Aldrich）を、ガラスシンチレーションバイアル中で４mlの濃塩酸（HCl）及び１２mlの水と混合した。樹脂を室温で酸性の溶液に１．５時間攪拌した。酸処理した樹脂を、濾液のpHが５〜６に達するまで水で洗浄した。この手順を、酸処理条件として、濃HClの代わりに酢酸、水の代わりにジメチルホルムアミド（DMF）を用いて、アミノメチル化ポリスチレン樹脂の第２のバッチについて繰り返した。酸処理したアミノメチル化ポリスチレン樹脂のバッチを湿った固体として、４℃で貯蔵した。
【０１４３】
上記の２の洗浄された酸処理した樹脂を、トリ−ニトロベンゼンスルホン酸（TNBSA）を用いて表面アミン成分について定性試験した。対照実験のために、未処理樹脂を同じ方法で試験した。結果を表１に示す。樹脂が濃いオレンジ色に変わったとき、これは表面上の高いアミン含量を示す。樹脂が薄い黄色に変わったとき、これは表面上の低いアミン含量を示す。これらの試験条件下で、未処理樹脂は僅かに黄色に変わった。しかしながら、未処理樹脂を４０℃で維持するほど、より黄色の着色が明らかとなった。
【０１４４】
【表１】
2005521419.tif 000002
【０１４５】
樹脂−オリゴの結合
（上記のパートAで調製したように）濃HClで処理し、水で洗浄したアミノポリスチレン樹脂を以下の記載のように、リンカーオリゴに共有結合させた。以下の構造式：
【化１】
2005521419.tif 000003
｛式中、
mは１〜５０の範囲内の整数から選ばれ；
nは１〜２０の範囲内の整数から選ばれ；そして、
ｐは０及び１〜１０の範囲内の整数から選ばれる。｝
により例示されるように、リンカーオリゴは、１７ヌクレオチド塩基、スペーサー群、及びその５’末端に一級アミン基を含むオリゴヌクレオチド部分を含有する。
【０１４６】
本実験において使用したスペーサーは、ｐ＝１である先の構造式によって示されるように、２のリン酸基に隣接する単一のポリエチレングリコール単位、又はｐ＝２である先の構造式によって示されるように、リン酸基によって分割され、２のリン酸基に隣接する２のポリエチレングリコール単位のいずれかであった。これらのリンカーオリゴは、Trilink Biotechnologies, Inc. (San Diego, CA, USA; @trilinkbiotech.com)によって製造された。リンカーオリゴを、以下の記載の通りに塩化シアヌル化学を用いて樹脂の別のバッチに結合した。２を超えるポリエチレングリコール単位を有するリンカーオリゴについて、同じプロセスが採用されることができる。
【０１４７】
選択されたリンカーオリゴを脱イオン水に溶解して１mM溶液を形成した。塩化シアヌルによって活性化されたリンカーオリゴを製造するために、リンカーオリゴ溶液２０マイクロリッター（２０ナノモル）を５０マイクロリッターの１Mホウ酸塩とpH８．４において混合した。この混合物に、３０．８mgの塩化シアヌル（Aldrich Chemicals, トルエンから再結晶化）を５８０マイクロリッターのアセトニトリル（Allied Signal）に溶解することによって新たに調製した、塩化シアヌル溶液の１４マイクロリッターを添加した。反応は室温で４０分間行った。過剰の塩化シアヌルを除去するために、０．１Mホウ酸塩で、pH８．４において、Sephadex G-50（Sigma）ゲルカラムから溶出した。塩化シアヌルによって活性化されたリンカーオリゴを凍結乾燥し、そして８０マイクロリッターの脱イオン水中に溶解した。オリゴの回収量は１４ナノモルであった。
【０１４８】
塩化シアヌルによって活性化されたリンカーオリゴを、処理され洗浄されたアミノポリスチレン樹脂（固相支持体）に結合させる前に、固相支持体（充填容量で0.5ml）を１mlの０．５Mホウ酸塩pH８．４で５分間処理し、その後濾過によってホウ酸塩溶液を除去した。そして、塩化シアヌルによって活性化されたリンカーオリゴを固相支持体に添加し、混合物を室温で１時間維持した。この反応時間の後、固体から濾過によって液体を除去し、以下に記載のキャッピング反応を行う前に、固体樹脂を２mlの０．１Mホウ酸塩、pH８．４で３回洗浄した。各洗浄ステップは、洗浄溶液を固相支持体に接触させること及び混合物の攪拌後、液体を固体から濾過によって除去することから成るものであった。
【０１４９】
キャッピング反応
固相支持体を１００マイクロリッターの０．５Mホウ酸塩、５００マイクロリッターの１−メチル−２−ピロリジノン（NMP、Aldrich Chemicals）及び５００マイクロリッターの無水酢酸（Fisher Scientific）と、室温で１．５時間混合することによって、アミノメチル化ポリスチレン樹脂上の未処理−NH2基を無水酢酸でキャッピングした。液体を固体から濾過によって除去し、その後、固相支持体を２mlの１−メチル−２−ピロリジノン／水（５０／５０  ｖ／ｖ）で３回、２mlの１mMEDTAで３回、２mlの１０mMトリス／１mMEDTA／０．１％ドデシル硫酸ナトリウム溶液で３回、そして最後に２mlの１０mMトリス／２mMEDTAで３回洗浄した。各洗浄ステップは、洗浄溶液を固相支持体と接触させること、そして混合物の攪拌後、液体を固体から濾過によって除去することから成るものであった。樹脂を４℃で貯蔵した。
【０１５０】
分子ビーコンによる固相支持体上のリンカーオリゴの量のアッセイ
分子ビーコン技術は、溶液相オリゴヌクレオチド（すなわち、溶液中に溶解されたオリゴヌクレオチド）中の特異的なヌクレオチド配列を検出する感度の高い方法として周知である。本発明によれば、我々は固相支持体上に固定されたリンカーオリゴヌクレオチド量の直接的アッセイに、分子ビーコン技術をうまく適用した。この方法は、他の溶液に基づいた決定法に一般的に使用されるアッセイ技術を採用した場合に起こる、固相支持体のリンカーオリゴ含量の過大評価を防ぐ。
【０１５１】
本アッセイにしたがって使用された（Trilinkによって製造された）分子ビーコンは、リンカーオリゴ中に存在するヌクレオチドの塩基配列に相補的な塩基配列と有する１７ヌクレオチドから成る中心部分を有する。いずれかの末端にあるこの中心部分に隣接するのは、お互いに相補的な６のヌクレオチド塩基、すなわち、ビーコンの１の末端にある６の塩基は、ビーコンの他の末端にある６の塩基に相補的である、である。その３’末端において、ビーコンは蛍光団（特別には、FAM）に連結する一方、その５’末端においてビーコンはクエンチャーDABCYLである。分子ビーコン自身は、すなわちビーコンの中心部分に相補的なオリゴヌクレオチドの存在しない場合、顕著な蛍光シグナルを発生させない。
【０１５２】
アッセイを実施する前に、１５マイクロリッター（充填容量）の、リンカーオリゴに結合した固相支持体を１mlの２X SSPE緩衝液（０．３M NaCl、０．０２M リン酸一ナトリウム、２mM EDTA、pH７．６）で洗浄した。そして、５マイクロリッターの分子ビーコン溶液（１０ピコモル／マイクロリッター）を固相支持体に添加した。混合物を一夜、室温で穏やかに振盪した。その後、固相支持体をSDS洗浄溶液（０．０５％ドデシル硫酸ナトリウム、０．５M NaCl、５mMトリス、１mM EDTA）で６回、１mlの洗浄溶液を各回において使用して洗浄した。
【０１５３】
洗浄した固相支持体を１７０マイクロリッターの３２重量％ショ糖を添加して溶液中に懸濁した。糖溶液は、固体ポリスチレン球を沈殿させることなく、１０分又はそれより長く溶液中に懸濁させた状態で保つ。安定な固体球の懸濁液を直接的に蛍光光度計中に置いた。その蛍光シグナル強度を、同量の固相支持体樹脂を含有するが分子ビーコンを含まない対照サンプル懸濁液と比較した。蛍光シグナルの純増加を、溶液中の同じリンカーオリゴにアニーリングした既知の量の分子量ビーコンの標準的な較正ライン、すなわちリンカーオリゴをいくつかの溶液中に溶解し、多様な既知の量の分子量ビーコンをこれらの溶液に添加した、を使用して、ピコモル（pmoles）に換算した。本アッセイによれば、上記のポリスチレン樹脂は、樹脂の充填容量１マイクロリッターあたり１〜２ピコモルのリンカーオリゴを含んでいた。
【０１５４】
オリゴヌクレオチドの設計
図１２Aに例解するように、両方の３’末端にCTTTC配列を有する３１０塩基対の標的ポリヌクレオチド（遺伝子）のヌクレオチド配列を得た。この遺伝子は、概念的には、AからUの文字が特別なオリゴの名前を提供し、（例えば、３０、３３、３５などの）数字が特別なオリゴ中に存在するヌクレオチド数を表す、図１２Bにおいて定義された、短いオリゴヌクレオチド配列（オリゴ）のファミリーに分類される。図１２Bに示すように、遺伝子内部のオリゴはそれぞれ３３〜３５の塩基から成る一方、遺伝子末端付近のオリゴ（オリゴK及びU）は、いくらか短かった。オリゴ間の中断は、各内部オリゴが、相補鎖中の１５〜１７ヌクレオチドの長さにわたる、２の部分的に相補的なオリゴと重複するように設計された。遺伝子末端を形成するオリゴは、それらの相補的オリゴと、１５〜１６ヌクレオチドの長さにわたって重複するように設計された。これらのオリゴの設計後、それらを標準的な固相技術によって合成した。
【０１５５】
遺伝子合成を達成するために、２の「架橋」オリゴを設計し、そして合成した。これらの架橋オリゴを「架橋オリゴL」（図１２C中）及び「架橋オリゴR」（図１２D中）と名づけた。各架橋オリゴは、これらの領域がポリヌクレオチド構築プロセスにおいて果たす機能によって定義された、３つのヌクレオチド領域から成る。各架橋オリゴは、近接したヌクレオチドの組であって、普遍的オリゴの第１領域にアニーリングする第１の近接するヌクレオチド配列と、標的ポリヌクレオチド中に取り込まれる第１オリゴの第１領域にアニーリングする第２の近接するヌクレオチド配列との間に存在するヌクレオチドの「ギャップ配列」と呼ばれるヌクレオチドの組を含んだ。ヌクレオチドのこのギャップ配列は、普遍的オリゴの第１領域又は第１オリゴの第１領域のいずれにもアニーリングしない。実際に、ギャップ配列の主要な目的は、普遍的オリゴの第１領域が第１オリゴの第１領域近傍のライゲーション可能な近傍に入らないということを確実にすることである。それぞれ部分的に他のオリゴにアニーリングする２のオリゴは、それらがお互いに「ライゲーション可能な近傍に」ある場合にのみ、相互にライゲーションする。本質的に、これは、その両方があるオリゴにアニーリングする２のオリゴが相互に「ライゲーション可能な近傍に」あるためには、２のオリゴの間にはギャップがあってはならないことを意味する。
【０１５６】
ギャップ配列は、少なくとも１ヌクレオチドの長さである。普遍的オリゴが標的ポリヌクレオチドの第１オリゴにライゲーションする可能性をさらに低下させるためには、好ましくはギャップ配列は、１ヌクレオチドを超える長さ、例えば、２、又は３、又は４、又は５、又は６、又は７、又は８、又はそれを超える長さのヌクレオチドである。それらのヌクレオチドが普遍的オリゴ又は標的ポリヌクレオチドの第１オリゴのいずれかにアニーリングしない限り、ギャップ配列中に存在する特異的ヌクレオチドは決定的なものではない。G及びCヌクレオチドはA及びTヌクレオチドよりも強い水素結合団であるため、１の側面において、ギャップ配列は、少なくとも優勢にA及び／又はTヌクレオチドから形成される。図１２C及び図１２Ｄにおいて、ギャップ配列は、５の「A」ヌクレオチドによってあらわされる。
【０１５７】
この「ギャップ配列」に加えて、固相支持体に固定化された普遍的オリゴ中に存在するヌクレオチド塩基（本実施例中ではそのうちの１７）に相補的なヌクレオチド配列を含むように、各架橋オリゴを設計し、そして合成した。さらに、架橋オリゴは、標的オリゴヌクレオチドの第１オリゴ中のヌクレオチドの近接する配列に相補的なヌクレオチド塩基配列（本実施例中ではそのうちの１６）を含む。図１２C及び１２Dからわかるように、５ヌクレオチドの「ギャップ配列」は、普遍的オリゴからの３‘OH及び第１オリゴの５’リン酸の間に発生するライゲーションを防ぐ。
【０１５８】
この遺伝子構築プロセスにおいて使用した架橋オリゴ以外のすべてのオリゴを、リン酸化した。それらを合成し、そしてMetabion Company (Germany)によるHPLCによって精製した。凍結乾燥したオリゴをすべて約１００ピコモル／マイクロリッターの濃度で精製水（Millipore, Bedford, MA, USA; @Millipore.com）中に懸濁した。
【０１５９】
固相支持体上での遺伝子構築
組に対する要素が２又は３のいずれかである、相補的オリゴの組を併合し、アニーリングさせて、二本鎖のハイブリッドを形成した。図１２E及び１２Fにおいて、特別な組を示し、「０A」、「１A」などの用語によって同定した。オリゴを相互にアニーリングさせるアニーリングプロセスは、相当するオリゴを１×SSPE緩衝液中、６５℃、１５分間併合することを必要とした。２の架橋オリゴ「L」及び「R」は、一本鎖オリゴとして固相支持体にアニーリングすることができるか、又はそれらの隣接するオリゴ二本鎖「３A」及び「４A」にそれぞれアニーリングして、固相支持体に結合する前に三量体を形成することができる。遺伝子末端のそれらの短いオリゴのために、二本鎖の三量体を作製した。同定の容易のために、図１２E及び１２Fに示すように、組のそれぞれに連続する名前を与えた。
【０１６０】
図１２E及び１２Fにおいて同定されたハイブリッドの溶液を、以下の構築プロセスにおいて使用した。全部で約１００ピコモルのリンカーオリゴがそこに結合した、約７５マイクロリッターの充填用量の固相支持体を図１２Gに例示したカートリッジ（Orochem Technologies, Westmont, IL, USA）中に添加した。
【０１６１】
貯蔵緩衝液を除去し、支持体を０．４mlの２×SSPE緩衝液で３回洗浄した。緩衝液及び試薬の送達を、ピペットチップを介して行い、緩衝液及び試薬の除去を使い捨てシリンジで行った。フリットの位置を変えること及び固相支持体樹脂をばらばらにすることを防ぐために、カートリッジにシリンジが接触する前にプランジャーを引くことが重要である。
【０１６２】
図１２Eにおいて同定された断片を、カートリッジ中に含まれる固相支持体への連続的アニーリング３A、２A、１A、及び０Aによって、構築した。同様に、図１２Fにおいて同定された断片を、別のカートリッジ中の固相支持体への連続的アニーリング４A、５A、６A、７A及び８Aによって、構築した。アニーリングプロセスは、５０マイクロリッターの２×SSPE緩衝液と４００ピコモルの二量体又は三量体の溶液を混合すること、そして室温においてカートリッジを穏やかに２時間振とうすることから成る。各アニーリングサイクルの間で、支持体を０．４mlの冷蔵した２×SSPEで５回処理することから成る洗浄プロセスを、過剰の二量体を除去するために使用した。
【０１６３】
すべての断片を一緒にしてアニーリングした後、固相支持体を、０．４mlの冷蔵した２×SSPE緩衝液で５回洗浄し、０．４mlの冷蔵したライゲーション洗浄緩衝液（５０mM 
トリス‐HCl、１０ｍM MgCl2、１０mMジチオスレイトール、２５μg／mlBSA,ｐH７．５）で二回洗浄し１００マイクロリッターの１×ライゲーション緩衝液（５０mM トリス‐HCl、１０mM MgCl2、１０mM MgCl2、１０mMジチオスレイトール、1mMATP、２５μg／mlBSA、pH７．５）で１回洗浄した。５０マイクロリッターの１×ライゲーション緩衝液及び８００粘着末端ユニットT4DNAリガーゼ（New England Biolabs, Beverly, MA, USA; @neb.com）をカートリッジに添加し、カートリッジを室温で３時間、穏やかに振とうすることによって、ライゲーション反応を実施した。そして、固相支持体を０．４mlの冷蔵した２×SSPEで３回洗浄した。
【０１６４】
繰り返し固相支持体を０．４mlの５０℃の脱イオン水で洗浄することによって、ライゲーションした遺伝子断片を固相支持体から放出させた。典型的には、３回の洗浄サイクルは、すべてのDNAを固相支持体から放出させるのに充分だった。溶出溶液を併合し、YM-30 MicroCon Ultrafiltration 装置（Millipore）中で遠心分離することによって、２５マイクロリッターまで濃縮した。
【０１６５】
DNA断片の大きさを立証するために、ゲル分析を行った。６％のネイティブアクリルアミドゲルを１×TBE泳動緩衝液（８９mM トリス、８９mMホウ酸及び２mMEDTA、pH７．６）とともに使用した。各断片を含む、２．５マイクロリッターの溶液を、２マイクロリッターの泳動用色素（Gesura Type II 6X）及び４０％ショ糖の混合物（１／１  ｖ/ｖ）と混合した。ゲルを一定の１５０ボルトで泳動し、SYBR Gold (Molecular Probes, Eugene, OR, USA; @probes.com)で後染色した。結果を図１２Hに示す。図１２Hにおいて、レーン１及び４は、２０塩基対のマーカー配列である。レーン２は、左断片（１７４塩基対）及びレーン３は、右断片（１９６塩基対）である。ゲルは、左及び右の断片の両方が正確な大きさを有し、主要な産物であったことを確認した。画像の強度によって、両断片産物の収量が８０〜９０ピコモルであったことを推定した。
【０１６６】
最終的な左及び右断片の集合を溶液中で行った。濃縮した左及び右断片溶液を、１０×ライゲーション緩衝液の５マイクロリッター及び８００粘着ユニットT4 DNAリガーゼと混合した。ライゲーション反応を、３７℃で１時間実施し、続いて６５℃まで１５分間加熱した。このプロセスをさらに２回、それぞれ新鮮な４００ユニットの用量のリガーゼを用いて繰り返した。産物混合物を４００マイクロリッターの１０mMトリス／１mM EDTA緩衝液で希釈してYM-30 MicroCon Ultrafiltration 装置（Millipore）中においた。溶液を、５０マイクロリッター未満まで濃縮した。その後、４００マイクロリッターの脱イオン水を添加し、溶液を５０マイクロリッター未満まで脱水した。後者のプロセスを繰り返し、最終的な産物を５０マイクロリッターの溶液中に回収した。産物のアリコートを５％アクリルアミドゲル上で分析し、結果を図１２Iに示す。図１２I中の画像は４つのバンドを示す：レーン１及び２は、異なる負荷濃度での最終的なライゲーション産物である。レーン３は、２０塩基対マーカー、及びレーン４は、１００塩基対マーカーである。レーン１及び２は、最終的な遺伝子産物（３１０塩基対の）、未反応の左及び右断片、その架橋オリゴ（１９６及び１７６塩基対）及びアニーリングした架橋オリゴ（６０塩基対）を示す。最終的な産物が所望の配列を有したことを実証するために、それをクローン化し、配列決定した。
【０１６７】
実施例２
多孔質ポリエチレン支持体上での２４０塩基対遺伝子の構築
カルボジイミドによる、ポリエチレンフリットへのリンカーオリゴの結合
直径９mm及び厚さ１．５mmで、７及び２０ミクロンの孔サイズを有する、ポリエチレンフリットをOrchem Technologies (Westmont, IL, USA; @orochem.com)から購入した。一級アミン基を、４thState Inc(Belmont, CA, USA; @4thstate com)によって実施したプラズマプロセスによってPEフリットの表面上に導入した。フリットを含む、続くすべての反応及びプロセスを、図１２Gに示したように、ポリプロピレンカートリッジ（これもOrchem Technologiesから購入した）中で実施した。容器の壁との摩擦によって、フリットを正しい位置に保持した。
【０１６８】
試薬及び緩衝液を、カートリッジの一番上からフリットに送達し、液体をポンプの作用でフリットを通じて上げ下げすることによって、フリットの孔を通じて混合し、空のシリンジによってフリットから除去した。カートリッジの底の開口に反応中は栓をする。リンカーオリゴをフリットに結合させる前に、フリットを０．１M酢酸ナトリウム溶液（pH４．５）中１０％の無水コハク酸中に室温え１７時間置くことによって、サクシニル化した。サクシニル化したフリットを室温において水で洗浄し、続いて０．１M酢酸ナトリウム(pH６〜７）で４５℃において１回、室温において２回洗浄し、最後に室温において水で３回洗浄した。
【０１６９】
その後、サクシニル化したポリエチレンフリットを、ポリ（エチレングリコール）（ｎ＝１２）スペーサーを（Trilink Biotechnologiesにより製造された）1級アミンで終端するその５’末端に含む、１７ヌクレオチドのリンカーオリゴヌクレオチドに結合させた。各フリットを、５０μlのリンカーオリゴヌクレオチド濃度が６μM、エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）濃度が０．４MのpH４．５の０．１Mモルホリノエタンスルホン酸（MES）中に室温において３時間置いた。反応後、フリットを洗浄緩衝液（０．３M塩化ナトリウム、１０mMトリス、１mM EDTA及び０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、pH８）で６回、２×SSPE（０．３M塩化ナトリウム、２０mMリン酸ナトリウム、２mM EDTA、pH７．６）で２回洗浄した。フリットは、４℃において２×SSPE中で貯蔵する。
【０１７０】
蛍光によるハイブリダイゼーション能アッセイ
オリゴヌクレオチドにアニーリングするフリットの能力を決定するために、以下のアッセイを行った。リンカーオリゴヌクレオチドに結合したポリエチレンフリットを、リンカーオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する蛍光標識オリゴヌクレオチドの溶液と併合する。その後、過剰の（ハイブリダイズしない）相補的オリゴを除去するために、フリットを洗浄した。そして、ハイブリダイズした相補的オリゴを溶出した条件にフリットを露出し、溶出された溶液からの蛍光シグナルを測定した。
【０１７１】
（相補的オリゴヌクレオチドとの）アニーリング反応を２×SSPE中で室温において２時間行った。洗浄を２×SSPEで行い、洗浄が完了したことを蛍光によってモニターした。1mlの５０℃Millipore水で、ハイブリダイズした蛍光標識オリゴヌクレオチドをフリットから３回溶出した。９５％を超える蛍光シグナルを最初の溶出から得た。既知量の標識相補的オリゴ溶液の検量線との比較は、７μm孔のフリットのハイブリダイゼーション能が１７０ピコモル／フリット、そして２０μm孔のフリットのハイブリダイゼーション能が１７５ピコモル／フリットであるという決定を可能とした。
【０１７２】
ポリエチレンフリット上での遺伝子構築
図１３Aに例解されるように、標的遺伝子は、１の末端上の５塩基オーバーハング及び他の末端上の１７塩基オーバーハングを含む２４０塩基対を有する。
【０１７３】
実施例１に記載された実験のように、そして図１３Bに例解されるように、この標的遺伝子を、３３〜３５塩基を内部オリゴとして、そしてより短い配列を末端に有するオリゴのファミリーに「切断」した。各内部オリゴは、１５〜１７ヌクレオチドにわたって２の相補的オリゴと重複し、そして末端のオリゴは１５〜１６ヌクレオチドにわたって１の相補的オリゴと重複する。アスタリスクでマークした架橋オリゴは、遺伝子の左端に付加されるように設計した。架橋オリゴは、５’末端にリン酸を有さないので、遺伝子のライゲーションには加わらない。架橋オリゴのオーバーハング領域は、ポリエチレンフリット上のリンカーオリゴに相補的な１７塩基からなる配列を有する。
【０１７４】
この遺伝子構築において使用したすべてのオリゴを、商業的な自動合成装置（ABI）上で周知のホスホアミダイト化学によって合成し、キナーゼによってリン酸化した。オリゴの合成後、１×SSPE緩衝液中、６５℃、１５分間、それらをアニーリングさせて、１５〜２５ピコモル／μlで二量体又は三量体断片を形成した。この遺伝子についての、二量体および三量体の正確な配置を以下に例解する。同定の容易のために、それらに連続する名前を与えた。二量体又は三量体断片を含む溶液をそのまま室温において冷却させた。図１３Cにおいて、断片を１A〜６Aの範囲のコードで同定する。これらの断片を含む溶液を以下の構築プロセスにおいて使用した。
【０１７５】
リンカーオリゴに結合した１片のポリエチレンフリットをカートリッジ内に置いた。貯蔵緩衝液を除去し、フリットを０．４mlの２×SSPE緩衝液で３回洗浄した。全体で３００ピコモルの第１オリゴ三量体１Aを５０μlの６×SSPE緩衝液とともにフリットに加えた。シリンジによるポンプ作用でフリットを通って溶液を上下させた。アニーリングを、１時間３０分行った。ハイブリダイズしないオリゴ三重体を除去するために、２×SSPEによる洗浄（０．５ml、５回）がアニーリングステップに続いた。オリゴ二量体２A、３A、４A、５A及び最後に三量体６Aについて、このプロセスを連続して繰り返した。
【０１７６】
遺伝子についてのすべてのオリゴを一緒にしてアニーリングした後、フリットを０．４mlの冷蔵したライゲーション洗浄緩衝液（５０mMトリス-HCl、１０ｍM MgCl2、１０mMジチオスレイトール、２５μg/ml BSA、pH７．５）で１回、１００マイクロリッターの１×ライゲーション緩衝液（５０mMトリス-HCl、１０mM MgCl2、１０mMジチオスレイトール、１mM ATP、２５μg/ml BSA、pH７．５）で１回洗浄した。５０マイクロリッターの１×ライゲーション緩衝液及び８００粘着末端ユニットT4 DNAリガーゼ（New England Biolabs）をカートリッジに添加し、室温で３時間、シリンジを用いたポンプ作用によって溶液を上下させて反応成分を混合することによって、ライゲーション反応を実施した。その後、フリットを０．５mlの６×SSPEで３回、及び０．５mlの２×SSPEで３回洗浄した。
【０１７７】
フリットを０．４mlの５０℃ミリポア水で３回洗浄して、ライゲーションした遺伝子をフリットから放出させた。溶出溶液を併合し、YM-30 MicroCon Ultrafiltration装置（Millipore）中で遠心分離することによって、約２０マイクロリッターに濃縮した。
【０１７８】
DNA断片の大きさを立証するために、ゲル分析を行った。５％プレキャストネイティブアクリルアミドゲル（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA; @bio-rad.com）を１×TBE泳動緩衝液（８９mMトリス、８９mMホウ酸及び２mM EDTA、pH７．６）とともに使用した。ゲルを一定に１６０ボルトで泳動し、SYBR Gold（Molecular Probes）で後染色した。結果（図１３D）は、正確な大きさの予想された遺伝子断片が主要な産物であったことを確認した。図１３D中の左レーン中のサンプルは２００塩基対ラダーである。右レーン中のサンプルは、構築産物の混合物である。
【０１７９】
実施例３
PEGスペーサーを伴なうか又は伴なわない固相支持体上での固相遺伝子構築の比較
アミノメチル化ポリスチレン樹脂の別のバッチを２の異なるリンカーオリゴに結合させた。１のリンカーオリゴはPEGスペーサー（ｎ＝２４）を末端アミン基とオリゴヌクレオチドの間に含む。（１７塩基のオリゴヌクレオチド−PEG（ｎ＝２４）−ＮＨ2）他のリンカーオリゴは、いずれのスペーサーも含まず、カルボン酸末端を有する（１７塩基のオリゴヌクレオチド−ＣＯＯＨ）。両方のオリゴをTrilinkから得た。実施例１に記載の方法を使用して、PEGスペーサーを有するオリゴをポリスチレン支持体に結合させた。スペーサーを有さないリンカーオリゴを同じポリスチレン支持体の別のバッチに結合させ、次に記載するカルボジイミド法を用いてポリエチレンフリットにも結合させた。
【０１８０】
結合の前に、１５０μlの充填容量のポリスチレン樹脂を１mlの０．１M、pH４．５のモルホリンプロパンスルホン酸（MOPS）で２回洗浄した。結合反応を、１００μlの０．１M、ｐH４．５のMOPS中３μlのカルボキシ機能を有するオリゴ（１ナノモル／μl）及び２０μlのEDC溶液（５００μlミリポア水中２６．６mg EDC）によって室温で１．５時間行った。反応後、樹脂を４５０μｌの０．５Ｍホウ酸／０．２５Ｍ塩化ナトリウムで５回洗浄した。残りのアミンを、３００μlの無水酢酸／N−メチルピロリジノン／０．５Mホウ酸（８／２／２  ｖ／ｖ／ｖ）と室温で１．３時間混合することによって、無水酢酸でキャップした。その後、樹脂を５０／５０（ｖ／ｖ）N-メチルピロリジノン／１mM EDTAを含む混合物で３回、１mM EDTA（pH８）で３回、洗浄緩衝液（０．３M塩化ナトリウム、１０mMトリス、１mM EDTA及び０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、pH８）で２回、そして１０mMトリス、1mM EDTA（pH８）で５回洗浄した。
【０１８１】
両ポリスチレン樹脂のハイブリダイゼーション能を、実施例１に記載の分子ビーコン法によってアッセイした。それらは、両方とも約０．７ピコモル／μlの充填樹脂であった。ポリエチレンフリットのハイブリダイゼーション能を、実施例２に記載の方法によってアッセイした。それは、フリットあたり８４ピコモルであると決定した。
【０１８２】
１３４塩基対の遺伝子の構築
実施例１に記載のアプローチに類似して、標的遺伝子を、それぞれ３０〜３３ヌクレオチド塩基を有する一連のオリゴに「切断」した。より短い２２塩基の配列を、一番下の鎖の末端においた。各内部オリゴは、２の相補的オリゴと１５〜１８ヌクレオチド塩基にわたって重複した。図１４Aに示すように、一番上の鎖の中の第1オリゴは、その５’末端において蛍光団FAM（三重丸）で標識されている。アスタリスクでマークした架橋オリゴを遺伝子の左端に付加した。架橋オリゴは、５’末端にリン酸を有さないので、遺伝子のライゲーションには加わらない。また、架橋オリゴも３’末端において蛍光標識する。
【０１８３】
蛍光標識したオリゴはTrilink Inc.が製造した。他のすべてのオリゴは、商業的な自動合成装置上で周知のホスホアミダイト化学によって合成した。すべての一本鎖オリゴヌクレオチドを1×SSPE緩衝液中、６５℃で１５分間アニーリングして、２５〜３０ピコモル／μlの二量体又は三量体のいずれかのハイブリッドを形成した。この遺伝子の二量体及び三量体の正確な配置を図１４Bに例解する。それらに、同定を容易にするために、それぞれ連続した名前を与える。ハイブリッドを含有する溶液をそのまま室温まで冷却させる。これらのハイブリッド溶液を以下の構築プロセスに使用した。
【０１８４】
フリットを備えた各ポリプロピレンカートリッジ中へ、リンカーオリゴと結合した充填された１００〜１５０μlの固相支持体を置く。ポリエチレンフリットの場合には、未処理の（バージン）フリットを使用する代わりに、フリットに結合したオリゴを直接的にカートリッジ中に置いた。貯蔵緩衝液を除去し、支持体を０．４mlの２×SSPE緩衝液で３回洗浄した。全体で２００ピコモルの第１オリゴ三量体０Aを、５０μlの６×SSPE緩衝液とともに各支持体に加えた。アニーリング混合物を室温で１時間４５分、ボルテックスにかけた。６×SSPEによる洗浄（０．４ml、５回）が、ハイブリダイズしないオリゴ三量体を除去するために、アニーリングに続いた。該プロセスをオリゴ二量体１A、２A、及び３Aについて、それぞれ室温でアニーリング時間１時間で、順次繰り返した。
【０１８５】
遺伝子についてのすべてのオリゴを一緒にしてアニーリングした後、カートリッジに含まれる固相支持体を、０．４mlの冷蔵したライゲーション洗浄緩衝液（５０mMトリス-HCl、１０m MgCl2、１０mMジチオスレイトール、２５μg/ml BSA、pH７．５）で２回、５０μlの１×ライゲーション緩衝液（５０mMトリス-HCl、１０m MgCl2、１０mMジチオスレイトール、1mM ATP、２５μg/ml BSA、pH７．５）で１回洗浄した。５０μlの１×ライゲーション緩衝液及び８００粘着性末端ユニットT4 DNAリガーゼ（New England Biolabs）をカートリッジに加え、室温において３時間ポンプ作用によって溶液を上下させて反応成分を混合することによって、ライゲーション反応を実施した。その後、支持体を０．５mlの２×SSPEで５回洗浄した。
【０１８６】
支持体を０．４mlの５０℃、ミリポア水で３回洗浄することによって、ライゲーションした遺伝子を支持体から放出させた。溶出溶液を併合し、YM-30 MicroCon Ultrafiltration装置（Millipore）中で遠心分離することによって、約２０マイクロリッターに濃縮した。DNA断片の大きさを立証するために、ゲル分析を行った。８％ネイティブアクリルアミドゲルを１×TBE泳動緩衝液（８９mMトリス、８９mMホウ酸及び２mM EDTA、pH７．６）とともに使用した。ゲルを一定の１７５ボルトで泳動し、SYBR Gold（Molecular Probes）で後染色する前後に画像撮影した。ゲルの画像を以下の図１４C及び図１４Dに示す。ここで、レーンの割り当ては、以下の：（１）リンカーオリゴに結合したポリスチレン支持体上で構築した、PEGスペーサーを含む遺伝子；（２）リンカーオリゴに結合したポリエチレンフリット上で構築した、スペーサーを含まない遺伝子；（３）リンカーオリゴに結合したポリスチレン支持体上で構築した、スペーサーを含まない遺伝子；（４）２０塩基対のラダー；である。図１４Cは、染色前のゲル、図１４Dは染色後のゲルを示す。
【０１８７】
染色の前後において、画像は一致する。固相支持体上で構築した、スペーサーを有する産物は、産物混合物の中で最も強いバンドを示した（レーン１）。同じ型の支持体上で構築した、スペーサーを含まない産物は、構築プロセスで失敗し、２０及び４０塩基対の間の位置にFAM標識された架橋オリゴの非常に強いバンドを有した（レーン３）。ポリエチレンフリット上で構築した遺伝子（レーン２）は、全体の強度がやや低い以外は、レーン１のバンドに類似する。
【０１８８】
実施例４
オーバーハングの異なる大きさの比較
PEG(ｎ＝６)スペーサーを含むリンカーオリゴと結合したポリスチレン球固相支持体をこの実施例に使用した。結合方法は、実施例１に記載されたものと同じであった。固相支持体は、１ピコモル／μl充填樹脂のハイブリダイゼーション能を有した。
【０１８９】
オリゴヌクレオチドの設計
２の異なる組のオリゴヌクレオチドから構築するために、１３４塩基対の標的遺伝子を設計した。１の組は、１５〜１８塩基の範囲の長いオーバーハングを有した（図１５Aを参照のこと）。他の組は、４塩基のみの短いオーバーハングを有した（図１５Bを参照のこと）。各組において、第1の一番上の鎖は、５’末端に蛍光団（FAM、三重丸）を有し、架橋オリゴは３’末端にFAM団を有した。
【０１９０】
すべてのFAM標識オリゴをTrilink Inc.が製造した。長いオーバーハングの組において使用したすべてのオリゴを、商業的なオリゴヌクレオチド合成装置（Beckman）上で合成し、そしてリン酸化した。短いオーバーハングの組において使用したすべてのオリゴを、Life Technologies Inc.が製造した。
【０１９１】
固相支持体上での１７塩基オーバーハングオリゴヌクレオチドの遺伝子構築
一番上の鎖のオリゴヌクレオチドすべてを、離れた相補的な一番下の鎖のオリゴヌクレオチドに、１×SSPE緩衝液中で６５℃、１５分間アニーリングして二量体を形成した。架橋オリゴを第1二量体にアニーリングして三量体を形成した。得られた断片を、図１５Cにおいて同定した。
【０１９２】
断片を一緒にして結合させるために、全体で約１００ピコモルのリンカーオリゴがそこへ結合した、約１２０マイクロリッターの充填容量の固相支持体を、１mlの２×SSPE緩衝液で３回洗浄した。第1オリゴ三量体（０A、全体で４００ピコモル）を、１００μlの２×SSPE緩衝液とともに支持体に加えた。アニーリング混合物を室温で２時間ボルテックスにかけた。アニーリングプロセスに続いて、ハイブリダイズしないオリゴ三量体を除去するために、２×SSPEによる洗浄（０．４ml、５回）を行った。該プロセスをオリゴ二量体１A、２A、及び３Aについて、それぞれ室温でアニーリング時間２時間及び２×SSPEによる洗浄（０．４ml、５回）で、順次繰り返した。
【０１９３】
遺伝子についてのすべてのオリゴを一緒にしてアニーリングした後、カートリッジに含まれる固相支持体を、１mlの冷蔵したライゲーション洗浄緩衝液（５０mMトリス-HCl、１０m MgCl2、１０mMジチオスレイトール、２５μg/ml BSA、pH７．５）で３回、９０μlの１×ライゲーション緩衝液（５０mMトリス-HCl、１０m MgCl2、１０mMジチオスレイトール、1mM ATP、２５μg/ml BSA、pH７．５）で３回洗浄した。７０μlの１×ライゲーション緩衝液及び８００粘着性末端ユニットT4 DNAリガーゼ（New England Biolabs）をカートリッジに加え、室温において２時間、ボルテックスで反応成分を混合することによって、ライゲーション反応を実施した。その後、支持体を１mlの洗浄溶液（０．３M塩化ナトリウム、１０mMトリス、１mM EDTA及び０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、pH８）で５回洗浄した。支持体を０．４mlの５０℃、ミリポア水で３回洗浄することによって、ライゲーションした遺伝子を支持体から放出させた。溶出溶液を併合し、YM-30 MicroCon Ultrafiltration装置（Millipore）中で遠心分離することによって、約２０マイクロリッターに濃縮した。
【０１９４】
固相支持体上での４塩基オーバーハングオリゴヌクレオチドの遺伝子構築
一番上の鎖のオリゴヌクレオチドすべてを、１の相補的な一番下の鎖のオリゴヌクレオチドに、１×SSPE緩衝液中で６５℃、１５分間アニーリングして二量体を形成した。架橋オリゴを第1三量体にアニーリングして四量体を形成した。得られた断片を、図１５Dにおいて同定した。
【０１９５】
全体で約１００ピコモルのリンカーオリゴがそこへ結合した、約１１０マイクロリッターの充填容量の固相支持体を、１mlの２×SSPE緩衝液で３回洗浄した。１００μlの２×SSPE緩衝液中の架橋オリゴ（３５０ピコモル）を室温で１時間、固相支持体へアニーリングした。その後、四量体０A／１A（全体で４００ピコモル、３１ピコモル／μl）を添加した。アニーリング混合物を室温で１時間４０分、ボルテックスにかけた。アニーリングステップに続いて、ハイブリダイズしないオリゴを除去するために、２×SSPEによる洗浄（０．４ml、４回）を行った。アニーリングしたオリゴを、１００μlの１×ライゲーション緩衝液の存在下、室温で２時間、１００粘着性末端ユニットT4 DNAリガーゼでライゲーションした。固相支持体上のライゲーション産物を、２×SSPE（０．４ml、５回）で洗浄した。
【０１９６】
アニーリング及びライゲーションプロセスを、オリゴ二量体２A、３A及び４Aについて順次繰り返した。新しい二量体のアニーリング及びライゲーションプロセの開始の前に、各ライゲーション産物のサンプルとして、少量の固相支持体を除去した。最後の二量体をアニーリング、そしてライゲーションした後、各サイクルの後に採取した少量のサンプルを含む産物を、４００μlの５５℃の水で３回溶出した。溶出溶液を併合し、YM-30 MicroCon Ultrafiltration装置（Millipore）中で遠心分離することによって、約５０〜６０マイクロリッターに濃縮した。
【０１９７】
ゲル分析
DNA断片の大きさを立証するために、ゲル分析を行った。８％のネイティブアクリルアミドゲルを１×TBE泳動緩衝液（８９mM トリス、８９mMホウ酸及び２mMEDTA、pH７．６）とともに使用した。６〜７マイクロリッターの各断片を、３マイクロリッターの泳動用色素（Gesura Type II 6X）及び４０％ショ糖の混合物（１／１  ｖ/ｖ）と混合した。ゲルを一定の１５０ボルトで泳動し、SYBR Gold (Molecular Probes, Eugene, OR, USA; @probes.com)で後染色した。結果を図１５Eに示す。図１５Eにおいて、レーン１及び２は、１７塩基オーバーハングの構築産物を示す。レーン３及び７は、２０塩基対マーカーである。レーン４〜６は、２Aのライゲーション後（レーン４を参照）、３Aのライゲーション後（レーン５を参照）、及び４Aのライゲーション後（レーン６を参照）の４塩基対オーバーハングの構築産物を示す。
【０１９８】
結果は、両方のオリゴの組からの正しい大きさの１４５塩基対の遺伝子が作製されたことを確認した。しかしながら、４塩基オーバーハングオリゴの組が３のライゲーションサイクルのすべての産物を産生した一方、１７塩基対オーバーハングの組は１の主要な産物を産生したのみであった。
【０１９９】
実施例５
一般的なリンカーオリゴと結合した固相支持体の再使用
本発明中に記載された一般的なリンカーオリゴヌクレオチドは、一般的に再使用可能である。１の遺伝子を構築し、固相支持体から溶出した後、支持体はミリポア水及びそして２×SSPEで洗浄することができ、精製水中、４℃で貯蔵することができる。支持体は、他の遺伝子を構築するために、再度使用することができる。そのようなプロセスは複数回繰り返すことができる。
【０２００】
３５５塩基対の遺伝子を、実施例１に記載したのと同じ手順を用いて構築した。「左」及び「右」断片を別々に、２の異なるポリスチレン樹脂支持体上で構築し、そして最終的な遺伝子を作製するために併合した。新たに製造した固相支持体及び先に使用し／きれいにした支持体を用いて構築の比較を行った。両方の場合において使用した試薬の量は同じであった。図１６に示すように、溶出した断片を６％アクリルアミドゲル上で分析した。図１６において、レーン１及び６は、２０塩基対のラダーであり、レーン３は、先に使用した支持体上で構築した右断片（長いオーバーハング配列を含む、１６９塩基対）、レーン５は、新たな支持体上で構築した右断片、レーン２は、先に使用した支持体上で構築され、４回のアニーリングサイクルの後に中止した左断片（１６６塩基対）、及びレーン４は、新たな支持体上で構築した、６回のアニーリングサイクル後の左断片（２３０塩基対）である。ゲルは、先に使用された支持体が新たな支持体と同じ質及び収率のポリヌクレオチドを作製することができたことを実証している。
【０２０１】
実施例６
多孔質ポリエチレン支持体上での４２５塩基対遺伝子の構築
カルボジイミドによる、ポリエチレンフリットへのリンカーオリゴの結合
直径９mm及び厚さ１．５mmで、７及び２０ミクロンの孔サイズを有する、ポリエチレンフリットをOrchem Technologies (Westmont, IL)から購入した。一級アミン基を、４thState IncによるプラズマプロセスによってPEフリットの表面上に導入した。フリットを含む、続くすべての反応及びプロセスを、図１２Gに示したように、ポリプロピレンカートリッジ（これもOrchem Technologiesから購入した）中で実施した。試薬及び緩衝液をカートリッジの一番上からフリットに送達し、液体をシリンジによるポンプ作用で上下させることによってフリットの孔を通して混合し、空のシリンジによってフリットから除去した。反応の間、カートリッジの底の開口に栓をする。
【０２０２】
オリゴヌクレオチドに結合させる前に、フリットを０．１M酢酸ナトリウム（pH４．５）中１０％の無水コハク酸中に室温で１７時間置くことによって、サクシニル化した。サクシニル化したフリットを室温において水で洗浄し、続いて０．１M酢酸ナトリウム(pH６〜７）で４５℃において１回、室温において２回洗浄し、最後に室温において水で３回洗浄した。その後、サクシニル化したポリエチレンフリットを、５’ポリ（エチレングリコール）（式（１）中でm＝１２）スペーサー及び末端一級アミン（式（１）中でR1＝アミノ）を含む、Trilink Biotechnologiesにより製造された１７ヌクレオチドのリンカーオリゴヌクレオチドに結合させた。フリットあたり、リンカーオリゴヌクレオチド濃度が６μM、エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド濃度が０．４μMのpH４．５の０．１Mモルホリノエタンスルホン酸（MES）の５０μl容量中に室温で３時間置いた。反応後、フリットを洗浄緩衝液（０．３M塩化ナトリウム、１０mMトリス、１mM EDTA及び０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、pH８）で６回、２×SSPE（０．３M塩化ナトリウム、２０mMリン酸ナトリウム、２mM EDTA、pH７．６）で２回洗浄した。フリットを、４℃において２×SSPE中で貯蔵した。
【０２０３】
蛍光によるハイブリダイゼーション能アッセイ
実施例１に記載のプロセスに類似して、リンカーオリゴヌクレオチドと結合したポリエチレンフリットを、蛍光標識した相補的なヌクレオチドとアニーリングし、過剰の相補的オリゴを除去するために、フリットを洗浄し、ハイブリダイズした相補的オリゴを溶出し、そして溶出された溶液からの蛍光を測定した。アニーリング反応を２×SSPE中で室温において２時間行った。洗浄を２×SSPEで行い、洗浄が完了したことを蛍光によってモニターした。1mlの５０℃Millipore水で、ハイブリダイズした蛍光標識オリゴヌクレオチドをフリットから３回溶出した。９５％を超える蛍光シグナルを最初の溶出から得た。既知量の標識相補的オリゴ溶液の検量線との比較は、７μm孔のフリットのハイブリダイゼーション能が１７０ピコモル／フリットであり、２０μm孔のフリットのハイブリダイゼーション能が１７５ピコモル／フリットであると決定した。
【０２０４】
ポリエチレンフリット上での遺伝子構築
一般的に図１７Aに例解されるように、標的遺伝子は、両方の５’末端上の１７塩基オーバーハングを含む４２５塩基対を有する。
【０２０５】
実施例１に記載されたプロセスに類似して、そして図１７Bに例解されるように、この４２５塩基対のポリヌクレオチドを、それぞれが３３〜３５ヌクレオチド塩基の配列長を有する、２４のオリゴの一組に切断した。先の実施例に記載したように、オリゴは、１６〜１７塩基にわたって相補鎖中のオリゴと重複した。遺伝子の左５’オーバーハング及び固相支持体上のリンカーオリゴの両方に相補的なヌクレオチド配列を有する（アスタリスクでマークした）架橋オリゴを、遺伝子構築において使用するために設計した。架橋オリゴは、５’末端にリン酸を有さないので、いかなる遺伝子のライゲーションにも加わることができなかった。架橋オリゴは、遺伝子と固相支持体との間の除去可能な副木（splint）としてのみ作用した。この遺伝子構築において使用したすべてのオリゴを、商業的な自動合成装置（ABI）上で周知のホスホアミダイト化学によって合成し、キナーゼによってリン酸化した。
【０２０６】
合成プロセスを開始するために、すべての一本鎖オリゴヌクレオチドを１９ピコモル／μlで二量体に１×SSPE緩衝液中、６５℃、１５分間、アニーリングした。この遺伝子についての、二量体および三量体の正確な配置を図１７Cに例解する。同定を容易にするために、それらのそれぞれに連続的な名前を与えた。ハイブリッドを含む溶液をそのまま室温において冷却させた。これらのハイブリッドを含む溶液を以下の構築プロセスにおいて使用した。
【０２０７】
リンカーオリゴと結合した１片のポリエチレンフリットをカートリッジ内に置いた。貯蔵緩衝液を除去し、フリットを０．４mlの２×SSPE緩衝液で３回洗浄した。第１オリゴ（三量体１A、全体で３００ピコモル）を５０μlの６×SSPE緩衝液とともにフリットに加えた。シリンジによるポンプ作用でフリットを通って溶液を上下させた。アニーリングを、１時間３０分行った。ハイブリダイズしないオリゴ三量体を除去するために、２×SSPEによる洗浄（０．５ml、５回）がアニーリングステップに続いた。アニーリング時間を１時間に短縮した以外は、オリゴハイブリッド２A〜１２Aについて、このプロセスを連続して繰り返した。
【０２０８】
遺伝子についてのすべてのオリゴを一緒にしてアニーリングした後、フリットを０．４mlの冷蔵したライゲーション洗浄緩衝液（５０mMトリス-HCl、１０ｍM MgCl2、１０mMジチオスレイトール、２５μg/ml BSA、pH７．５）で１回、１００マイクロリッターの１×ライゲーション緩衝液（５０mMトリス-HCl、１０mM MgCl2、１０mMジチオスレイトール、１mM ATP、２５μg/ml BSA、pH７．５）で１回洗浄した。５０マイクロリッターの１×ライゲーション緩衝液及び１２００粘着末端ユニットT4 DNAリガーゼ（New England Biolabs）をカートリッジに添加し、室温で３時間、シリンジを用いたポンプ作用によって溶液を上下させて反応成分を混合することによって、ライゲーション反応を実施した。その後、フリットを０．５mlの６×SSPEで５回、及び０．５mlの２×SSPEで１回洗浄した。
【０２０９】
フリットを０．４mlの５０℃ミリポア水で３回洗浄して、ライゲーションした遺伝子をフリットから放出させた。溶出溶液を併合し、YM-30 MicroCon Ultrafiltration装置（Millipore）中で遠心分離することによって、約２０マイクロリッターに濃縮した。DNA断片の大きさを立証するために、ゲル分析を行った。５％プレキャストネイティブアクリルアミドゲル（Bio-Rad）を１×TBE泳動緩衝液（８９mMトリス、８９mMホウ酸及び２mM EDTA、pH７．６）とともに使用した。ゲルを一定の１３０ボルトで泳動し、SYBR Gold（Molecular Probes）で後染色した。１００塩基対のラダーを含む図１７Dに示す結果（図１３D）は、正確な大きさの予想された遺伝子断片が主要な産物の一つであったことを確認した。
【０２１０】
一番上の鎖の第1オリゴ及び一番したの鎖の最後のオリゴをプライマーとして使用して、最終的な遺伝子産物についてポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）を実施した。PCR産物もまた、５％アクリルアミドゲルによって分析し、結果を図１７E中に示す。左のレーンは構築した遺伝子断片のPCR産物であった。真中のレーンは、約５２０塩基対のPCR対照サンプルであった。右のレーンは、１００塩基対のマーカーである。４２５mer断片がゲル上に明瞭に表される。
【０２１１】
実施例７
新しいプロトコールを使用した、１KB遺伝子断片の合成
我々が構築したモデル遺伝子は、１１９９塩基対の大腸菌（E. coli）Lacリプレッサー遺伝子（Lacl）である。このモデル遺伝子の構築を図１８のフローチャートに示す。それぞれが約４００塩基対である、３の中間遺伝子断片を固相支持体上で作製した。最終的な１．２kbの遺伝子を、溶液に基づく技術を使用して構築した。オリゴは、商業的なオリゴ合成装置上で独自に合成した。
【０２１２】
固相は、７〜２０ミクロンの孔サイズのポリエチレンフリットであり、反応ハウジングは、ポリプロピレンSPEカートリッジであった。フリット及びカートリッジの両方をOrochem Inc.(Westmont, IL)から購入した。４thState Inc(Belmont, California)におけるプラズマ処理によってフリット表面を誘導体化した。１７ヌクレオチドの普遍的オリゴを、その５’末端においてPEGスペーサーに結合し、一級アミン基で終端した。このリンカーオリゴを、水相カルボジイミド化学によって固相支持体に共有結合で連結した。固相支持体の結合能を、本明細書の他の部分に記載された蛍光アッセイによって決定した。
【０２１３】
各中間断片構築物は、１２対のオリゴから成るものであった。それらは、１２回反復したアニーリング−洗浄サイクルによって固相支持体上で別々に構築した。アニーリングした断片をT4 DNAリガーゼでライゲーションした。遺伝子断片を、温水による溶出で固相支持体から放出させた。それらの大きさを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって確認した。４００塩基対の断片を手動で構築するための、全体のサイクル時間は、１８時間であった。
【０２１４】
よりきれいな産物を作り出すため、及び後のプロセスのための材料を増量するために、中間断片をPCRによって増幅した。最終的な遺伝子構築を酵母同種性組換え技術（yeast homologous recombination technique）(K. Oldenburg, K. Vo, S. Michaelis and C.Paddon, Nuclei Acid Research, (1997), vol.25, 451-452; and P.Gunyuzlu, G. Hollis and J. Toyn, Biotechniques,(2001), vol. 31, 1246-125）によって溶液相中で行った。最終的な構築遺伝子をクローン化し、配列決定した。試験した６の完全な大きさのクローンの中で、それぞれは４〜５のランダムな、修復可能な１ヌクレオチドエラーを含んでいた。このエラーの発生率及び型は、溶液相で構築した類似する大きさの遺伝子中に見出されるものに匹敵する（データは含まない）。４００塩基対の中間断片の一つを配列決定してみると、４の正しい配列を１０のクローンから発見した。エラーはここでもランダムであり、ほとんどが１塩基の置換、欠失又は挿入であった。
【０２１５】
２００２年６月２０日に出願された米国特許出願第６０／３９０，５２２号及び２００２年４月１日に出願された米国特許出願第６０／３６９，４７８号を含むがこれらに限定されない、本明細書中で引用され、及び／又は出願データシートに列挙された上記のすべての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願及び非特許文献は、そっくりそのまま本明細書中に参考文献として援用されている。
【０２１６】
以上のことから、本発明の特別な実施態様が例示の目的で本明細書中に記載され、多様な改変が、本発明の精神及び発明の範囲を離れることなくなされることができるということは理解されるであろう。例えば、本発明の方法、化合物及び組成物は、固相DNA合成及び／又は自動化学DNA合成において使用されることができ、ここで遺伝子は好ましくはDNA分子である。
【図面の簡単な説明】
【０２１７】
【図１】図１は、本発明の遺伝子断片構築方法の模式的説明を提供する。
【図２．３】図２及び図３は、固相支持体、普遍的オリゴ、架橋オリゴ、及び標的遺伝子又はその断片の間に形成される構築物の模式的説明を提供する。
【図４】図４は、ライゲーション効率を決定するためのアッセイ法の模式的説明を提供する。
【図５Ａ−５Ｅ】図５A〜図５Eは、本発明において使用されることのできる固相支持体を有する反応容器を示す。
【図６Ａ−６Ｃ】図６A〜図６Cは、本発明において使用されることのできる、反応容器中のオリフィスの相対的配置を例解する。
【図７Ａ−７Ｃ】図７A〜図７Cは、本発明において使用されることのできる、３の反応容器を示す。
【図８Ａ−８Ｅ】図８A〜図８Eは、本発明の反復フロースルー混合プロセスを例解する。
【図９】図９は、本発明の連続的フロースルー混合を提供するために使用されることのできる、装置を例解する。
【図１０Ａ】図１０Aは、ポンプ、弁及び緩衝液貯蔵器と組み合わせた本発明の反応容器を例解する。
【図１０Ｂ】図１０Bは、本発明の遺伝子構築において使用されることのできる、複数の反応容器を含む、反応ブロックを例解する。
【図１１】図１１は、自動遺伝子構築を達成するための、固相遺伝子構築システムダイアグラムを提供する。
【図１２Ａ−１２Ｆ】図１２A〜１２Fは、遺伝子断片を作製するためのオリゴ構築を例解する。
【図１２Ｇ】図１２Gは、本発明において使用されることのできる反応器の模式的説明である。
【図１２Ｈ．１２Ｉ】図１２H及び図１２Iは、ゲル電気泳動の結果を示す。
【図１３Ａ−１３Ｃ】図１３A〜図１３Cは、遺伝子断片を作製するための、オリゴ構築を例解する。
【図１３Ｄ】図１３Dは、ゲル電気泳動の結果を示す。
【図１４Ａ．１４Ｂ】図１４A及び図１４Bは、遺伝子断片を作製するためのオリゴ構築を例解する。
【図１４Ｃ．１４Ｄ】図１４C及び図１４Dは、ゲル電気泳動の結果を示す。
【図１５Ａ−１５Ｄ】図１５A〜図１５Dは、遺伝子断片を作製するためのオリゴ構築を例解する。
【図１５Ｅ】図１５Eは、ゲル電気泳動による分析結果を示す。
【図１６】図１６は、ゲル電気泳動による分析結果を示す。
【図１７Ａ−１７Ｃ】図１７A〜図１７Cは、遺伝子断片を作製するためのオリゴ構築を例解する。
【図１７Ｄ．１７Ｅ】図１７D及び図１７Eは、ゲル電気泳動による分析結果を示す。
【図１８】図１８は、１．２kbの遺伝子の作製方法のフローチャートを提供する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ−４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１２Ｇ】
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【図１２Ｈ】
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【図１２Ｉ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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