(57)【要約】タンパク質相互作用の方法および組成物が記載される。その方法および組成物は、以下を含む多数の目的のために有用である：マルチサブユニットタンパク質複合体の再構築、既知の結合サブユニットの同定、マルチサブユニットタンパク質複合体の自己アセンブリの速度論および次数の決定、ならびに薬剤スクリーニング。その方法は、固定化された第一コイル形成ペプチドを有する固体表面と結合物とを接触する工程を含む、この第一コイル形成ペプチドは、選択された電荷と、逆に荷電した第二コイル形成ペプチドと相互作用して安定なα−らせんコイルドコイルへテロ二量体を形成する能力とによって特徴付けられる。この結合物は、（ａ）逆に荷電した第二コイル形成ペプチドと、（ｂ）第一サブユニットポリペプチドとを含む。上記接触により、上記結合物は、上記固体表面に結合される。
2005524057.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質相互作用方法であって、該方法は、以下：
固定化された第一コイル形成ペプチドを有する固体表面と結合物を接触する工程であって、該第一コイル形成ペプチドは、選択された電荷と、逆に荷電した第二コイル形成ペプチドと相互作用して、安定なα−らせんコイルドコイルへテロ二量体を形成する能力とによって特徴付けられており、
ここで該結合物は、
（ａ）該反対に荷電した第二コイル形成ペプチド、および
（ｂ）マルチサブユニット複合体中で、複数のサブユニットポリペプチドのうちの一つである第一サブユニットポリペプチド
を含む、結合物である、工程、
該接触によって、該固体表面に該結合物を結合する工程、ならびに
該固体表面上のサブユニット複合体の自己アセンブリの促進のために効果的である条件下で、該固体表面および結合した第一サブユニットポリペプチドを、該複合体の一つ以上の他のサブユニットに結合する工程、
を包含する、タンパク質相互作用の方法。
【請求項２】
前記第一サブユニットポリペプチドが、核ホルモンレセプターである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核ホルモンレセプターが、アンドロゲンレセプター、甲状腺レセプター、エストロゲンレセプター、ビタミンＤレセプター、レチノイン酸レセプター、グルココルチコイドレセプターおよび鉱質コルチコイドレセプターからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
既知の処方のマルチタンパク質複合体の再構築に使用するための請求項１に記載の方法であって、ここで、前記他のサブユニットが、個々に添加される、方法。
【請求項５】
未知の結合サブユニットの同定に使用するための請求項１に記載の方法であって、ここで、前記他のサブユニットが、混合物として添加される、方法。
【請求項６】
宿主細胞からマルチサブユニットタンパク質複合体を単離する際に使用するための請求項１に記載の方法であって、ここで、前記マルチサブユニット複合体中の前記他のタンパク質が、予めアセンブルしており、さらに、該宿主細胞中に含まれ、
前記固体支持体に該他のタンパク質を添加する前に、該宿主細胞を溶解する工程、および、
残りのサブユニットを添加した後に、該マルチサブユニット複合体を分析して、該マルチタンパク質複合体を構成するサブユニットを決定する、工程
を包含する、方法。
【請求項７】
前記宿主細胞が、疾患細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記宿主細胞が、正常細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記宿主細胞が、ホルモン、リガンドおよび薬剤からなる群から選択される因子で処理されている、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
マルチサブユニットタンパク質複合体の自己アセンブリの速度論および／または次数を決定するために使用される請求項１に記載の方法であって、該方法は、
前記他のサブユニットの添加後の種々の時間に前記固体支持体に結合したサブユニットを分析する工程；ならびに、
前記タンパク質複合体のサブユニットアセンブリの速度または次数を決定する工程
を包含する、方法。
【請求項１１】
薬剤スクリーニングに使用するための請求項１に記載の方法であって、さらに、
前記自己アセンブリしたマルチサブユニットタンパク質複合体への前記化合物の結合を可能にするために効果的な条件下で、前記固体表面を、一個以上の化合物と接触する工程；
非結合成分を除去するために、該固体表面を洗浄する工程；および
前記結合化合物を同定するために、該複合体を分析する工程
を包含する、方法。
【請求項１２】
前記固体表面が、ＭＡＬＤＩ質量分析法に適した、改変された標的プレートである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
複数のマルチサブユニットタンパク質複合体の相互作用を行うための方法であって、以下、
基板中の複数のウェルの各々に、複数の異なった配列のサブユニット分子のうちの選択された分子を添加する工程であって、各ウェルは、該ウェル中に、第一コイル形成ペプチドをその中に有し、該分子の各々は、共通の第二コイル形成ペプチド捕捉部分と、マルチサブユニットタンパク質複合体中の複数のサブユニットから選択された異なる配列の標的タンパク質とを有する、工程、
該複合体の各々の自己アセンブリを促進するために効果的な条件下で、該マルチサブユニットタンパク質複合体の各々由来の残りのサブユニットと、該ウェルとを接触させる工程；および
非結合成分を除去するために、該ウェルを洗浄する工程
を包含する方法。
【請求項１４】
組成物であって、以下：
固体表面に固定された、選択された電荷と、逆に荷電した第二コイル形成ペプチドと相互作用して、安定なα−らせんコイルドコイルへテロ二量体を形成する能力とを有する第一コイル形成ぺプチド；
該第一コイル形成ペプチドに結合したタンパク質結合物であって、
（ａ）該逆に荷電した第二コイル形成ペプチド、および
（ｂ）マルチサブユニットタンパク質複合体中の複数のサブユニットから選択された第一標的サブユニット；
を含む、組成物；ならびに、
該タンパク質結合物とのタンパク質相互作用を介して、該固体表面上にアセンブルした複合体の他のサブユニット、
を含有する、組成物。
【請求項１５】
第一生体分子または第二生体分子の活性を測定するための生体機能チップであって、以下：
複数の空間的に離れた領域を含む表面であって、ここで、各領域が、選択された電荷を有する第一コイル形成ペプチドにより機能化されており、そして、逆に荷電した第二コイル形成ペプチドと相互作用して、安定なα−らせんコイルドコイルへテロ二量体を形成する、表面；および
該第二コイル形成ペプチドの遠位端に付着した該第一生体分子を含み、該第一生体分子と該第二生体分子との相互作用が、該第一生体分子もしくは該第二生体分子または両方を改変するために効果的である、生体機能チップ。
【請求項１６】
前記チップ上の各領域が、複数の第１コイル形成ペプチドを含む、請求項１５に記載の生体機能チップ。
【請求項１７】
前記第一生体分子が、タンパク質、糖タンパク質、天然ペプチドおよび合成ペプチド、アルカロイド、多糖、核酸分子ならびに低分子からなる群から選択される、請求項１５に記載の生体機能チップ。
【請求項１８】
前記第二生体分子が、タンパク質、糖タンパク質、天然ペプチドおよび合成ペプチド、アルカロイド、多糖、核酸分子ならびに低分子からなる群から選択される、請求項１５に記載の生体機能チップ。
【請求項１９】
前記第一生体分子が、キナーゼ基質、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ基質およびプロテアーゼ基質からなる群から選択される、請求項１５に記載の生体機能チップ。
【請求項２０】
前記第一生体分子が、核酸分子である、請求項１７に記載の生体機能チップ。
【請求項２１】
前記核酸分子が、メチル化により修飾される、請求項２０に記載の生体機能チップ。
【請求項２２】
各離れた領域が、独特の第一生体分子を含む、請求項１５に記載の生体機能チップ。
【請求項２３】
前記第一生体分子の少なくとも一部が、同じタンパク質に由来する、請求項１５に記載の生体機能チップ。
【請求項２４】
前記改変された標的プローブまたは改変された標的化合物の質量が、レーザー脱離パルスを介したイオン化によって、飛行時間質量分析計にて測定される、請求項１５に記載の生体機能チップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００２年４月２５日に出願された米国仮出願番号第６０／３７５，６２７号の恩恵を主張し、この仮出願は、その全体が本明細書に参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、マルチサブユニットタンパク質複合体の同定および分析のための方法、ならびにその方法の実施において使用するための生体機能チップおよび組成物に関する。
【０００３】
【化１】
2005524057.tif 000003
【０００４】
【化２】
2005524057.tif 000004
【背景技術】
【０００５】
（発明の背景）
多数のタンパク質発現系が、生物化学的研究における手段として、使用されてきた。これらの発現系としては、目的のタンパク質（例えば、レセプター、抗体または酵素）を過剰発現する遺伝子操作細胞株、改変細菌、および複数のタンパク質のファージディスプレイライブラリーが挙げられる。これらのアプローチを介して調製されたタンパク質は、単離され得、そして、溶液中でスクリーニングされ得るかまたは、目的の標的（例えば、他のタンパク質、レセプター、リガンド、低分子など）に対してスクリーニングをするための固体支持体に付着され得る。最近、多数の研究者が、現在市販されているヌクレオチドバイオチップに概念が類似した、タンパク質のアレイの形成にその努力を集中してきた。例えば、ＷＯ  ００／０４３８９およびＷＯ  ００／０４３８２は、有機薄層と、複数のタンパク質パッチまたはタンパク質捕捉因子とを有する基板上に形成された、タンパク質のマイクロアレイならびにタンパク質捕捉因子のマイクロアレイを記載する。また、ＷＯ９９／４０４３４号は、抗体アレイを使用して抗原／抗体相互作用を同定し、抗原が結合する抗体を同定する方法を、記載する。
【０００６】
タンパク質のアレイおよびタンパク質捕捉因子のアレイは、ヌクレオチドバイオチップとは異なる分析の方法を提供するのが、このようなアレイの調製は、そのアレイを産生するために使用されるタンパク質の精製を必要とする。さらに、特定の位置における結合事象または触媒的事象の検出には、適用されたタンパク質の正体を知ることか、またはそのアレイのその位置に適用されたタンパク質を単離し、そしてその正体を決定することが、必要とされる。また、アレイへのタンパク質の付着は、これらのタンパク質に、固定化後に他のタンパク質またはリガンドと相互作用する能力を失わせる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
必要とされるものは、そのタンパク質が、他のタンパク質と相互作用する能力を保持した状態で、結合因子または基板にタンパク質が提示される、タンパク質結合事象を同定するための手段である。さらに、結合事象または触媒事象が検出されるタンパク質の効率的な単離および／または同定を可能にする様式で、タンパク質を提示させることが、好ましい。最後に、その系は、化学的サンプルまたは生物学的サンプルの迅速な高処理能力分析を可能にする検出系に、このアレイを組み合わせることによって、タンパク質の迅速な分析を可能にすべきである。このような技術は、マルチサブユニット複合体におけるサブユニットの同定において極めて価値がある。本発明は、これらの必要性を満たすために設計されている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
１つの局面では、本発明は、タンパク質相互作用方法を含む。その方法の実施において、結合物が、固定化された第一コイル形成ペプチドを有する固体表面と接触される。この第一コイル形成ペプチドは、選択された電荷と、逆に荷電した第二コイル形成ペプチドと相互作用して安定なα−らせんコイルドコイルへテロ二量体を形成する能力とによって、特徴付けられる。その結合物は、この逆に荷電した第二コイル形成ペプチド、およびマルチサブユニット複合体における複数のサブユニットポリペプチドの内の１つである第一サブユニットポリペプチドを含む。このことが、この結合物が上記固体表面に結合することを可能にする。次いで、その複合体の他のサブユニットが、この固体表面に添加され、この固体表面上でのこのサブユニット複合体の自己アセンブリを促進するために有効な条件下で、第一サブユニットポリペプチドに結合される。
【０００９】
１つの実施形態において、上記第一サブユニットポリペプチドは、核ホルモンレセプターである。好ましくは、この核ホルモンレセプターは、アンドロゲンレセプター、甲状腺レセプター、エストロゲンレセプター、ビタミンＤレセプター、レチノイン酸レセプター、グルココルチコイドレセプターおよび鉱質コルチコイドレセプターからなる群から選択される。
【００１０】
その方法は、既知の処方のマルチタンパク質複合体の再構築において使用するために、容易に適合され、ここで、上記他のサブユニットは、個々に添加される。あるいは、その方法は、未知の結合サブユニットの同定のために使用され得、ここで、上記他のサブユニットは、混合物として添加される。
【００１１】
別の実施形態において、その方法は、宿主細胞からマルチサブユニットタンパク質を単離するために使用され、ここで、上記マルチサブユニット複合体中の上記他のタンパク質は、予めアセンブリしており、その宿主細胞中に含まれる。この方法は、上記固体支持体に上記他のタンパク質を添加する前に、上記宿主細胞を溶解する工程、および、残りのサブユニットを添加した後にそのマルチサブユニット複合体を分析して、上記マルチタンパク質複合体を構成するサブユニットを決定する工程を含む。１つの実施形態では、上記宿主細胞は、疾患細胞である。あるいは、上記宿主細胞は、正常細胞である。その宿主細胞は、ホルモン、リガンドおよび薬剤からなる群から選択される因子で処理され得る。
【００１２】
１つの実施形態において、その方法は、マルチサブユニットタンパク質複合体の自己アセンブリの速度論および／または次数を決定するために、有用である。この実施形態は、上記他のサブユニットの添加後の種々の時間にて、上記固体支持体に結合したサブユニットを分析する段階およびタンパク質複合体のサブユニットの組織化の速度または次数を決定する段階を含む。
【００１３】
別の実施形態では、その方法は、薬剤スクリーニングのために有用である。この実施形態は、上記の自己アセンブルしたマルチサブユニットタンパク質複合体に上記化合物が結合するのを可能にするために有効な条件下で、上記固体表面を一個以上の化合物と接触する工程、その固体表面を洗浄して非結合成分を除去する工程、および上記複合体を分析して結合化合物を同定する工程を含む。
【００１４】
本発明の１つの実施形態では、その表面は、ＭＡＬＤＩ質量分析法に適した、改変された標的プレートである。
【００１５】
なお別の実施形態では、本発明は、複数のマルチサブユニットタンパク質複合体の相互作用を実行するための方法を含む。その方法の実施において、基板中の複数のウェルの各々（各ウェルは、第一コイル形成ペプチドをその中に有する）に、複数の異なった配列のサブユニット分子のうちの選択された分子を添加する工程（各分子は、共通の第二コイル形成ペプチド捕捉部分と、マルチサブユニットタンパク質複合体中の複数のサブユニットから選択される異なる配列の標的タンパク質部分とを有する）。これらのウェルは、その複合体の各々の自己アセンブリを促進するために有効な条件下で、上記マルチサブユニットタンパク質複合体の各々由来の残りのサブユニットと接触される。次いで、それらのウェルは、非結合成分を除去するために、洗浄される。
【００１６】
別の局面では、本発明は、第一コイル形成ペプチドを含む組成物を含み、この第一コイル形成ペプチドは、選択された電荷と、逆に荷電した第二コイル形成ペプチドと相互作用して、固体表面上に固定された安定なα−らせんコイルドコイルへテロ二量体を形成する能力とを有する。タンパク質結合物は、この第一コイル形成ペプチドに結合している。このタンパク質結合物は、上記逆に荷電した第二コイル形成ペプチドと、マルチサブユニットタンパク質複合体中の複数のサブユニットから選択された第一標的サブユニットとを含む。その複合体の他のサブユニットは、そのタンパク質結合物とのタンパク質相互作用を介して、上記固体表面上でアセンブルされる。
【００１７】
本発明のなお別の局面は、第一生体分子または第二生体分子の活性を測定するための生体機能チップを含む。そのチップは、表面を含み、その表面は、複数の空間的に離れた領域を含み、ここで、各領域は、第一コイル形成ペプチドを用いて機能化されており（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ）、この第一コイル形成ペプチドは、選択された電荷と、逆に荷電した第二コイル形成ペプチドと相互作用して安定なα−らせんコイルドコイルへテロ二量体を形成する。この第一生体分子は、この第二コイル形成ペプチドの遠位端に付着している。この第一生体分子と第二生体分子との相互作用は、この第一生体分子または第二生体分子あるいは両方を改変するために、有効である。
【００１８】
一つの実施形態において、上記チップ上の各領域は、複数の第１コイル形成ペプチドを含む。
【００１９】
別の実施形態において、その第一生体分子は、タンパク質、糖タンパク質、天然ペプチドおよび合成ペプチド、アルカロイド、多糖、核酸分子ならびに低分子からなる群から選択される。関連した実施形態では、その第二生体分子は、タンパク質、糖タンパク質、天然ペプチドおよび合成ペプチド、アルカロイド、多糖、核酸分子ならびに低分子からなる群から選択される。
【００２０】
別の実施形態において、その第一生体分子は、キナーゼ基質、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ基質およびプロテアーゼ基質からなる群から選択される。好ましい実施形態において、その第一生体分子は、核酸分子である。関連した実施形態において、その核酸分子は、メチル化により修飾される。
【００２１】
なお別の実施形態では、各離れた領域が、独特の第一生体分子を含む。さらに、なお別の実施形態では、その第一生体分子の少なくとも一部が、同じタンパク質に由来する。
【００２２】
好ましくは、改変された標的プローブまたは化合物の質量が、レーザー脱離パルスを介したイオン化によって、飛行時間質量分析計にて測定される。
【００２３】
本発明のこれらの目的および他の目的ならびにこれらの特徴および他の特徴は、以下の本発明の詳細な説明が、添付した図面と併せて読まれた場合に、より十分に理解される。
【００２４】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
他に示されない場合、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明の当業者に対して有するのと同じ意味を有する。実施者は、当該分野における定義および用語に関しては、特に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、第３版、およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９３）に方向付けられる。本発明は、記載された特定の方法論、プロトコルおよび薬剤に限定されないことが、理解されるべきである。なぜなら、これらは変化し得るからである。本明細書に引用された全ての出版物および特許は、本発明と組み合わせて使用され得る組成物および方法論を記載および開示する目的で、本明細書に参考として明示的に援用される。
【００２５】
本明細書で使用される場合、用語「タンパク質」「ポリペプチド」または「ペプチド」とは、ペプチドサブユニット間結合または他のサブユニット間結合により結合した、アミノ酸またはアミノ酸アナログサブユニット（代表的には、生物学的タンパク質中において見出される２０個の一般的なＬアミノ酸のいくつかまたは全て）から構成される、生体高分子をいう。このタンパク質は、そのサブユニット配列により示される一次構造を有し、そして二次らせん構造または二次ひだ構造を有し得、ならびに全体で３次元構造を有し得る。「タンパク質」は、比較的大きなポリペプチド（例えば、１００アミノ酸またはそれより多いアミノ酸を含む）を一般にいい、そして、「ペプチド」は、より小さなポリペプチドをいうが、これらの用語は、本明細書では、互換可能に使用される。つまり、用語、タンパク質とは、より大きなポリペプチドならびにより小さなポリペプチドを指し得、そしてその逆もまた真である。
【００２６】
用語「低分子」としては、合成、天然由来、または部分合成のいずれかである、化合物または分子複合体を含み、好ましくは、５０００ダルトンより小さい分子量を有する。より好ましくは、低分子は、１００ダルトンと１，５００ダルトンとの間の分子量を有する。
【００２７】
用語「生体分子」とは、人工的に合成されたかまたは生物学的生物により合成された分子をいい、それは、可溶性であり、代表的には、約６〜約９のｐＨの範囲に荷電している。好ましくは、用語、生体分子は、タンパク質、糖タンパク質、天然ペプチドおよび合成ペプチド、アルカロイド、多糖、核酸分子、低分子などを包含する。より好ましくは、用語、生体分子は、タンパク質をいう。
【００２８】
用語「保存的な置換」とは、その分子の活性（特異性または結合親和性）を実質的には変えないアミノ酸置換を反映するために、タンパク質またはペプチドに関連して使用される。代表的には、保存的なアミノ酸置換は、類似した化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する別のアミノ酸による、一つのアミノ酸の置換を含む。以下の六群は、それぞれ、互いに対して典型的な保存的置換であるアミノ酸を含む：
ｉ．アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；
ｉｉ．アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
ｉｉｉ．アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
ｉｖ．アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
ｖ．イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および
ｖｉ．フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【００２９】
用語「核酸分子」とは、ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子およびｃＤＮＡ分子を含む。遺伝コードの縮重の結果として、所定のペプチド（例えば、Ｅ−ｃｏｌｉペプチドおよびＫ−ｃｏｌｉペプチド）をコードする複数のヌクレオチド配列が生成され得ることが、理解される。
【００３０】
「異種の」核酸構築物または核酸配列は、それが発現される細胞に対してネイティブ（生来のもの）ではない配列部分を有する。コントロール配列に対して異種とは、現在調節している同じ遺伝子を調節するために天然では機能しない、コントロール配列（すなわち、プロモーターまたはエンハンサー）をいう。一般に、異種核酸配列は、それが存在する細胞にもゲノムの一部に対しても内因性ではなく、感染、トランスフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどによって、その細胞に添加されている。「異種」核酸構築物は、ネイティブ細胞で見出されるコントロール配列／ＤＮＡコード配列の組み合わせと同じであるかまたは異なる、コントロール配列／ＤＮＡコード配列の組み合わせを含み得る。
【００３１】
本明細書で使用される場合、用語「ベクター」とは、異なる宿主細胞間での移動のために設計された核酸構築物をいう。「発現ベクター」とは、外来細胞中で異種ＤＮＡフラグメントを組込みそして発現する能力を有する、ベクターをいう。多くの原核生物発現ベクターおよび真核生物発現ベクターが、市販されている。適切な発現ベクターの選択は、当業者の知識の範囲内である。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「発現カセット」または「発現ベクター」は、標的細胞中かまたはインビトロでの特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントを有する、組換え的に産生されたかまたは合成的に生成された核酸構築物である。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ウイルスまたは核酸フラグメント中に組込まれ得る。代表的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分は、数ある配列の中でも、転写されるべき核酸配列と、プロモーターとを含む。
【００３３】
本明細書で使用される場合、用語「プラスミド」とは、クローニングベクターとして使用され、そして多くの細菌およびいくつかの真核生物中で染色体外自己複製遺伝子エレメントを形成する、環状の二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ構築物をいう。
【００３４】
本明細書で使用される場合、用語「選択マーカーをコードするヌクレオチド配列」とは、宿主細胞で発現し得、その選択マーカーの発現は、発現した遺伝子を含む細胞に、対応する選択薬剤の存在下で増殖する能力を与える、ヌクレオチド配列を指す。
【００３５】
本明細書で使用される場合、用語「プロモーター」および「転写イニシエーター」とは、下流遺伝子の転写を指向するように機能する核酸配列をいう。プロモーターは、一般には、標的遺伝子が発現する宿主細胞に対して適切である。他の転写調節核酸配列および翻訳調節核酸配列（これらは、「制御配列」とも呼ばれる）と合わせたプロモーターは、所定の遺伝子を発現するために、必要である。一般に、転写調節配列および翻訳調節配列としては、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始配列および終結配列、翻訳開始配列および翻訳終止配列、ならびにエンハンサー配列またはアクチベーター配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
本明細書で定義される場合、「キメラ遺伝子」または「異種核酸構築物」とは、調節エレメントを含む異なった遺伝子の部分から構成され得る非ネイティブ遺伝子（すなわち、宿主中に導入された遺伝子）をいう。宿主細胞の形質転換のためのキメラ遺伝子構築物は、代表的には、異種タンパク質コード配列に作動可能に連結されているか、または形質転換した宿主細胞に抗生物質耐性を与えるタンパク質をコードする選択マーカー遺伝子に、選択マーカーキメラ遺伝子中で作動可能に連結されている、転写調節領域（プロモーター）から構成される。宿主細胞中に形質転換するための本発明の代表的なキメラ遺伝子としては、構成的であるかまたは誘導性である転写調節領域、タンパク質コード配列およびターミネーター配列が挙げられる。標的タンパク質の分泌が所望される場合、キメラ遺伝子構築物はまた、シグナルペプチドをコードする第二ＤＮＡ配列を含み得る。
【００３７】
別の核酸配列との機能的な関係に配置される場合、核酸は、「作動可能に連結」されている。例えば、分泌リーダーをコードするＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現する場合、それは、そのポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結されている；プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列の転写に影響する場合、それらは、そのコード配列に作動可能に連結されている；または、リボソーム結合部位は、翻訳を容易にするために位置する場合、それは、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、「作動可能に連結された」とは、連結されているＤＮＡ配列が、連続しており、そして分泌リーダーの場合には、連続しておりかつ読み取り相中にあることを意味する。しかし、エンハンサーは、連続している必要はない。連結は、好都合な制限部位におけるライゲーションにより、達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来的な実施に従って、使用される。
【００３８】
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子」とは、ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡのセグメントであって、コード領域の前および後ろの領域（例えば、５’非翻訳（５’ＵＴＲ）配列または「リーダー」配列、および３’ＵＴＲ配列または「トレーラー（ｔｒａｉｌｅｒ）」配列、ならびに個々のコードセグメント（エクソン）の間の介在配列（イントロン））を含んでも含まなくてもよい、セグメントを、意味する。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「組換え」とは、異種核酸配列の導入によって改変されているか、または細胞が、そのように改変された細胞に由来する、細胞またはベクターに似対する言及を含む。従って、例えば、組換え細胞は、その細胞のネイティブ（非組換え）形態では同一の形態では見いだされない遺伝子を発現するか、または、意図的なヒトの介入の結果として、異常に発現するか、発現量が低いかまたは全く発現しない、ネイティブ遺伝子を発現する。
【００４０】
細胞へ核酸配列を挿入する文脈中での用語「導入された」は、「トランスフェクション」または「形質転換」または「形質導入」を意味し、そして、真核細胞または原核細胞中への核酸配列の組み込みに対する言及を含み、ここで、その核酸配列は、その細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、プラスチドまたはミトコンドリアＤＮＡ）へ組み込まれ得るか、自律性レプリコンに転換され得るか、または一時的に発現され得る（例えば、トランスフェクトｍＲＮＡ）。
【００４１】
本明細書で使用される場合、用語「発現」とは、遺伝子の核酸配列に基づいて、ポリペプチドが産生されるプロセスをいう。そのプロセスは、転写および翻訳の両方を含む。
【００４２】
用語「シグナル配列」とは、細胞の外側への成熟形態のタンパク質の分泌を促進する、そのタンパク質のＮ末端部分にあるアミノ酸配列をいう。細胞外タンパク質の成熟形態は、分泌の過程の間に切断される、シグナル配列を欠如する。
【００４３】
用語「宿主細胞」によって、ベクターを含み、そして、発現構築物の複製または転写および翻訳（発現）を支持する、細胞が意味される。本発明に使用するための宿主細胞は、原核細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）かまたは真核細胞（酵母、植物、昆虫、両生類または哺乳動物の細胞）であり得る。
【００４４】
本明細書で使用される場合、用語「活性な」および「生物学的に活性な」とは、特定の標的タンパク質に関連した生物学活性（例えば、酵素活性）をいう。所定のタンパク質の生物学的活性は、代表的には当業者によりそのタンパク質に帰せられる、任意の生物学的活性を指す。
【００４５】
（ＩＩ．発明の方法）
本発明は、一つの局面では、固体支持体上でのタンパク質相互作用の方法を含む。コイル形成ペプチドとの相互作用を介して固体支持体に結合したタンパク質結合体が、それが結合する他のポリペプチドを同定するため、自己アセンブリの速度論を決定するため、および薬剤をスクリーニングするために使用され得ることが、発見された。
【００４６】
以下に記載するような種々の分析方法と組み合わせて使用される場合、多くの利点を提供する本発明の特徴が、いくつかある。これらの特徴としては、以下が挙げられる：（ｉ）目的のタンパク質の一部として産生される結合部分を有すること；（ｉｉ）目的のタンパク質のインビトロでの転写および翻訳、ならびに翻訳されたタンパク質の固定化を、一つのウェルで可能にすること；（ｉｉｉ）結合因子の化学量論、および目的のタンパク質上での（Ｃ末端またはＮ末端のいずれかでの）その結合因子の配置が、正確に制御され得ること；（ｉｖ）結合事象が、固定化されかつ提示されたタンパク質の提示および／または活性に対して、ほとんど効果を有さないこと；（ｖ）ＭＡＬＤＩ質量分析法と組み合わせて実施される場合、結合が、酸マトリックスにより、破壊され得ること。本発明の実施における工程が、以下に検討される。
【００４７】
図１は、基板１４の平面図であり、そして、必要に応じて、透明であり得かつ基板に取り付けられる、被覆１６の平面図である。その基板は、複数の離れたウェル２０を含む。図３に示されるように、基板１４中の各ウェル２０は、第一コイル形成ペプチド  ３０を用いて機能化されており、この第一コイル形成ペプチドは、選択された電荷を有し、かつ、逆に荷電した第二コイル形成ペプチドと相互作用して安定なα−らせんコイルドコイルへテロ二量体を形成し得る。これらの二つの逆に荷電したペプチドは、自然に、ヘテロ二量体複合体に自己アセンブリする。コイルドコイルへテロ二量体の相互作用は、以下のＩＩ．Ｃ．節で、さらに記載される。
【００４８】
（Ａ．結合体の形成）
本方法は、コイル形成ペプチドおよび第一サブユニットポリペプチドを含む、キメラポリペプチド結合体を使用する。好ましくは、その第一サブユニットポリペプチドは、マルチサブユニット複合体中の複数のサブユニットポリペプチドの一つである。そのコイル形成ペプチドは、逆に荷電した第二コイル形成ペプチドと相互作用して安定なα−らせんコイルドコイルへテロ二量体を形成する能力を有する。このキメラポリペプチド結合体は、以下に記載される、組換え方法およびタンパク質合成方法およびライゲーション方法を含む、多くの方法により形成され得る。
【００４９】
（Ａ１．組換え方法）
本発明のキメラポリペプチド結合体は、組換えタンパク質発現方法により産生され得る。例えば、第一サブユニットポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結した、コイル形成ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターが使用され得る。発現ベクターを構築するための従来的な分子生物学的方法は、当業者に公知である。
【００５０】
図２Ａおよび図２Ｂは、コード配列の上流および下流の相手の配列２２および２４と一緒に、インビボ発現系またはインビトロ発現系での操作のために設計されたコード配列２１を含む、本発明に使用するための発現ベクターを図示する。このコード配列は、図２Ａに示されるように、目的の配列２６のＣ末端に、コイルドコイル領域２５を有し得る。あるいは、コード配列２１のコイルドコイル領域２５は、図２Ｂに示されるように、目的の配列２６のＮ末端に位置し得る。
【００５１】
発現ベクターは、キメラポリペプチド結合体の発現のために、トランスフェクトした宿主細胞を産生するための従来的な分子生物学的方法により、宿主細胞に移され得る。結合体を産生するために、このトランスフェクトされた細胞は、従来的な細胞培養技術により、培養される。あるいは、その発現ベクターは、結合体を産生するために、インビトロで転写され得、そして翻訳され得る。そのポリペプチドのコード配列は、ｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡまたはその両方を含み得る。
【００５２】
本発明の組換えポリペプチドの発現のために使用される宿主細胞は、細菌細胞（例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）または好ましくは真核生物細胞のいずれかであり得る。一つの実施形態では、哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞）が使用される。発現ベクターの選択は、宿主細胞の選択に依存し、そして選択された宿主細胞中で所望の発現特性および調節特性を有するように選択され得る。
【００５３】
本発明のベクターの構築のための一般的な方法、本発明の宿主細胞を産生するための細胞のトランスフェクション、インビトロでの転写および翻訳、ならびに本発明の結合体を産生するための細胞の培養は、全て従来的な分子生物学的方法である。同様に、一旦生成されると、本発明の結合体は、直交流濾過、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティカラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む、当該技術の標準的な手順により精製され得る。
【００５４】
キメラポリペプチド結合体を形成するための他の例示的な方法としては、共有に係る、２００１年８月２２日に出願された米国特許出願番号６０／３１４，３３３および２００２年８月２２日に出願された米国特許出願番号１０／２２５，７８８（これらは、それぞれ本明細書にその全体が、明示的に参考として援用される）に記載されるような、ＰＣＲ増幅またはｍＲＮＡ単離およびプライマーライゲーションが挙げられる。
【００５５】
（Ａ２．タンパク質合成およびライゲーション方法）
キメラポリペプチド結合体は、タンパク質合成およびライゲーション方法により構築され得る。マルチサブユニット複合体中の複数のサブユニットポリペプチドの一つであり得る第一サブユニットペプチドは、コイル形成ペプチドを連結するために必要な付着機能を提供するために、合成され得るか、または合成後に誘導体化され得る。一般に、大部分の結合方法は、コイル形成ペプチドのコイル形成活性または第一サブユニットポリペプチドの活性および／もしくは構造を破壊しない。
【００５６】
例えば、クローン化ペプチドセグメントまたは合成ペプチドセグメントの酵素的連結は、比較的短いペプチドフラグメントが結合されて、より大きなペプチドフラグメント、ポリペプチドまたは完全タンパク質ドメインを産生することを可能にし得る（Ａｂｒａｈｍｓｅｎら、１９９１）。あるいは、大きなペプチドまたはポリペプチドをより短いペプチドフラグメントから合成的に構築するために、合成ペプチドの天然の化学的連結もまた、使用され得る。この方法は、二段階の化学反応からなる（Ｄａｗｓｏｎら、１９９４）。第一段階は、最初の共有結合産物としてチオエステル結合中間体を与えるための、非保護合成ペプチド−［比例］−チオエステルと、アミノ末端Ｃｙｓ残基を有する別の非保護ペプチドセグメントとの化学選択反応である。反応条件を変化することなく、この中間体は、連結部位にネイティブペプチド結合を形成するように、自然に生じる急速な分子内反応を受ける。タンパク質分子の全合成のための、この天然の化学的連結方法の適用は、ヒトインターロイキン８の調製により示される（Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓら、１９８７；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓら、１９９４；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓら、１９９１；およびＲａｊａｒａｔｈｎａｍら、１９９４）。
【００５７】
あるいは、非保護ペプチドセグメントは、化学的に連結され得、ここで、この化学的連結の結果としてペプチドセグメントの間に形成される結合は、非天然結合または非ペプチド結合である（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒら、１９９２）。この技術は、タンパク質ドメインのアナログならびに十分な生物学的活性を有する大量の比較的純粋なタンパク質を合成するために、使用されてきた（ｄｅＬｉｓｌｅ  Ｍｉｌｔｏｎら、１９９２）。
【００５８】
（Ｂ．第一コイル形成ペプチドの固定化）
上述のように、一つのコイル形成ペプチドは、基板に固定される。固体基板上にペプチドを固定化するための適切な方法としては、イオン性相互作用、疎水性相互作用および共有結合相互作用などが挙げられる。ペプチドを固体支持体上に固定化するための例示的な方法は、米国特許出願番号第５，０７１，９０９号中に記載され、これは、本明細書中にその全体が参考として援用される。
【００５９】
固体支持体は、空間的に離れ、そして指定可能かまたは識別可能である、領域を含む。各領域は、それに結合したコイルドコイルペプチド３０を含む。一つの実施形態では、その領域は、脂質の通過に対して抵抗性である任意の物理的な障壁により、互いに隔てられている。別の実施形態では、基板（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＭＳプレート）は、分離した浅いウェルを有するようにエッチングされる。あるいは、基板は、分離もウェルも有さない領域（例えば、平らな基板）含み得、その分離した領域の輪郭を描く構造（すなわち、プラスチック片またはガラス片）を重層することにより、さらに規定され得る。分離した領域のアレイを産生するために、当該分野で公知の種々の技術が使用され得る。例えば、有機薄膜のパッチが、マイクロスタンプリング（米国特許第５，５１２，１３１号および同５，７３１，１５２号）、マイクロフルイディクス印刷、インクジェットプリンターによって、またはマルチチャンネルピペットまたは単一チャンネルピペットによって手で、作製され得る。その領域の相対的な方向は、任意の種々の形態を取り得、その形態としては、正方形または長方形または他の表面内にある平行アレイもしくは垂直アレイ、円形の基板内で半径方向に延びるアレイ、または線状アレイが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６０】
アレイそれ自体は、標準的なマイクロタイタープレート形式（例えば、２４ウェル、４８ウェル、９６ウェル、３８４ウェルまたは１５３６ウェル）から１〜数ｃｍ２以内に数百このスポットを含む小さなマイクロアレイにまで及び得る。従って、一つの実施形態では、本発明は、アレイ上に少なくとも２つの分離した領域を有する基板を含む。好ましくは、その基板は、アレイ上に少なくとも１０個の分離した領域を有する。より好ましくは、その基板は、一つのアレイ上に少なくとも１０２個の分離した領域を含む。さらにより好ましくは、その基板は、一つのアレイ上に少なくとも１０３個の分離した領域を含む。さらにより好ましくは、その基板は、一つのアレイ上に少なくとも１０４個の分離した領域を含む。二つの例示的なアレイが、図８に図示される。
【００６１】
領域における結合したコイル形成ペプチドの数は、少なくとも二つであり得、好ましくは、約５個と約１００００個との間であり得、より好ましくは、約１０個と約１０００個の間であり得、最も好ましくは、約５０個と約５００個の間であり得る。一つの実施形態では、そのコイル形成ペプチドは、約１×１０２個／ｍｍ２〜１×１０１５個／ｍｍ２の間のコイル形成ペプチドの密度で結合している。別の実施形態において、そのコイル形成ペプチドは、約１×１０５個／ｍｍ２〜１×１０１２個／ｍｍ２のコイル形成ペプチドの密度で結合している。なお別の実施形態において、そのコイル形成ペプチドは、約１×１０１０個／ｍｍ２〜１×１０１１個／ｍｍ２のコイル形成ペプチドの密度で結合している。なおさらに別の実施形態において、そのコイル形成ペプチドは、約８．５×１０１０個／ｍｍ２より少ないコイル形成ペプチドの密度で結合している。
【００６２】
領域間の距離は、アレイの配置に依存して異なる。例えば、一つの実施形態において、約１ｃｍ２またはそれより小さい全体領域を含むアレイの一区分に、２個以上の領域が、配置される。好ましい実施形態において、５個またはそれより多い領域が、約１ｃｍ２またはそれより小さい全体領域を含むアレイの一区分に、配置される。アレイの領域の寸法および領域間の寸法を示すアレイの例示的な実施形態が、図８に示される。
【００６３】
「固体表面」「固体支持体」「固体基板」または「チップ」は、本明細書で使用される場合、不溶性であるかまたは後の反応により不溶性にされ得る、任意の材料をいう。固体表面は、第一コイル形成ペプチドを引き付け、そして固定化するその固有の能力について、選択され得る。あるいは、固体相は、第一コイル形成ペプチドを引き付け、そして固定化す能力を有する、付着分子を保持し得る。その付着分子は、第一コイル形成ペプチドそれ自体に対して逆に荷電しているか、またはか第一コイル形成ペプチドに結合した荷電した基板に対して逆に荷電している、基板を含み得る。まだ別の代替法としては、その付着分子は、固体相上に固定化されるかまたは付着し、かつ特定の結合反応を介して第一コイル形成ペプチドを固定化する能力を有する、任意の特定の結合部分であり得る。従って、固体表面は、試験管、マイクロタイターウェル、シート、ビーズ、微粒子および当業者に公知の他の構成の、プラスチック表面、プラスチック誘導体表面、磁性金属表面または非磁性金属表面、ガラス表面またはシリコン表面であり得る。例示的な固体支持体は、米国特許第５，５９１，４４０号中に記載され、これは、本明細書にその全体が、明示的に参考として援用される。
【００６４】
本発明の一つの実施形態において、固体表面は、半導体材料組成物から構成され、その組成物は、多孔性にされた場合に、光ルミネセンス特性を有する。このような半導体材料組成物としては、カドミウム、酸化銅、ゲルマニウム、ガリウム、ヒ化ガリウム、セレニウム、ケイ素、炭化ケイ素、二酸化シリコン、リン酸ケイ素ガリウムおよびこれらの組み合わせが挙げられ得るが、これらに限定されない。選択された半導体材料組成物はまた、添加物（例えば、エルビウム、ホウ素、リン、銅、ランタニド系列（イッテルビウム、ホルミウムおよびツリウムならびにそれらの組み合わせ）のリン光体が挙げられるが、これらに限定されない）も組み入れ得る。また、選択された半導体材料組成物は、放射波長を改変するために、別の化合物（例えば、ハロゲン（例えば、臭素）を含むが、これらに限定されない）を用いて処理され得る（Ｂｒｅｓｓｅｒｓら、１９９６）。好ましい実施形態において、固体支持体または固体表面は、以下に示すように、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）における使用に適したプレートである。
【００６５】
基板は、コーティングを含み得る。そのコーティングは、結合表面上に形成され得るかまたは適用され得る。例えば、本発明の一つの実施形態では、そのコーティングは、図６に図示されるように、金属フィルム（例えば、金）である。コーティングのために使用され得るさらに適切な材料としては、白金、銀、銅、亜鉛、ニッケルおよびコバルトが挙げられ得るが、これらに限定されない。さらに、市販の金属様物質（例えば、ＴＡＬＯＮ金属親和性樹脂など）が、使用され得る。コーティングは、電子ビームエバポレーションまたは物理的／化学的蒸着により適用され得る。固体基板上でのコイル形成ペプチドの安定かつ効率的な固定化を促進するために、基板の表面は、最初に、非制御酸化に対して安定化され得る。このような安定化手順の一つは、例えば、熱酸化プロセス（Ｐｅｔｒｏｖａ−Ｋｏｃｈら、１９９２）、化学酸化プロセス（Ｌｅｅら、１９９５）およびオゾン酸化プロセス（Ｊａｎｓｈｏｆｆら、１９９８）を使用した酸化である。これらのプロセスは、反応性ヒドロキシル基を生成する。コーティングは、基板全体を覆い得るか、または、関連する結合表面を含む領域に限定され得る。
【００６６】
（Ｃ．表面への結合体の結合）
第一コイル形成ペプチドおよび第二コイル形成が、α−らせんコイルドコイルへテロ二量体の形成に好都合な条件下で、一緒に混合される場合、それらは、相互作用して、二つのサブユニットのα−らせんコイルドコイルへテロ二量体複合体を形成する。α−らせんコイルドコイル立体構造のペプチドは、各ペプチドの一次配列により決定される特徴的な様式で、互いに相互作用する。α−らせんの三次構造は、その一次配列中の七個のアミノ酸残基が、そのα−らせんの約二ターン分に対応するようになっている。従って、α−らせん立体構造を生じる一次アミノ酸配列は、七つ組（ｈｅｐｔａｄ）と呼ばれる七つの残基各々の単位に分解され得る。ヘテロ二量体サブユニットペプチドは、直列の一連の七つ組から構成される。七つ組の配列が、特定のヘテロ二量体サブユニットペプチド中で繰り返される場合、その七つ組は、「七つ組反復」または単に「反復」といわれ得る。
【００６７】
第一コイル形成ペプチドおよび第二コイル形成ペプチドは、平行の配置または逆平行の配置のいずれかで、ヘテロ二量体コイルドコイルらせん（コイルドコイルヘテロ二量体）へとアセンブルされ得る。平行な配置では、その二つのヘテロ二量体サブユニットペプチドらせんは、それらが同じ向きを有する（アミノ末端からカルボキシ末端へ）ように並ぶ。逆平行な配置では、らせんは、一方のらせんのアミノ末端が、他方のらせんのカルボキシ末端と整列するように（逆もまた同様）配置される。このようなヘテロ二量体サブユニットは、１９９５年１１月２３日に公開されたＰＣＴ特許出願  ＷＯ９５／３１４８０号「Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ」中に記載され、これは、本明細書にその全体が、参考として援用される。さらなる配列およびサブユニットは、米国特許第６，４７８，９３９号；同６，４６１，４９０号；同６，１６５，３３５号；同６，１３０，０３７号および同５，９５５，３７９号中に記載され、これらのそれぞれは、本明細書にその全体が、参考として援用される。
【００６８】
例示的なサブユニットは、本明細書では、電荷がリジン残基により主に提供される、正に荷電したサブユニットをＫ−コイルと呼び、電荷がグルタミン酸残基により主に提供される負に荷電したサブユニットをＥコイルと呼ぶ。上記出願からの好ましい例は、配列番号１〜２を含む。
【００６９】
上記出願において示される指針に従って設計されたヘテロ二量体サブユニットペプチドは、平行向き対逆平行向きでのアセンブルに対して平行向き向きでのアセンブルに、優先度を代表的には示す。例えば、配列番号３および配列番号４により同定される例示的なペプチドは、他のペプチド配列が形成するように、平行配置のヘテロ二量体を形成する（ＷＯ  ９５／３１４８０号出願中で議論される）。目的のタンパク質を、第一コイル形成ペプチドに付着する場合、一般に、その目的のタンパク質を、ヘテロ二量体の遠位端に付着させることが望ましい。特に、そのヘテロ二量体が、平行配置を形成する場合、第二コイル形成ペプチドは、基板表面に、そのＣ末端で、固定されることが好ましく、目的のタンパク質が、第一コイル形成ペプチドに、そのＮ末端で結合することが好ましい。
【００７０】
上記のように、ヘテロ二量体中の二つのサブユニットの内の一つが、その基板に固定され、そして他のペプチドが、マルチサブユニット複合体中の複数のサブユニットポリペプチドの一つである目的のタンパク質を含む。両方の場合とも、そのペプチドは、必要な付着機能を提供するために、合成され得るかまたは合成後に誘導体化され得る。一般に、大部分の結合方法は、そのコイル形成ペプチドのいずれかのコイル形成活性を破壊せず、また、このような結合は、目的の結合したタンパク質の活性も破壊しない。
【００７１】
第一コイル形成ペプチドの改変を考慮すると、そのペプチドは、基板表面と、そのペプチドのらせん形成部分との間のスペーサーとして機能し得る、さらなる末端ペプチドを有するように、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかで合成され得る。あるいは、第一コイル形成ペプチドは、高親和性結合反応（例えば、ペプチド上に保有されるビオチン部分と、表面に共有結合的に付着したアビジン分子との間での反応）を介して、基板表面に付着され得る。
【００７２】
目的のタンパク質は、アセンブルしたヘテロ二量体中で遠位方向を向いて、第二コイル形成ペプチドの末端に目的のタンパク質を含むように、インビボまたはインビトロで、上に述べたように、固体状態法、ＰＣＲ法または組換え方法により合成され得る。固体状態法を介しての結合体の形成において、目的のタンパク質は、好ましくは、Ｎ末端アミノ酸残基に共有結合しているか、またはヘテロ二量体の露出した表面に面する残基の一つに共有結合している。好ましい結合基は、システイン残基のチオール基であり、これは、標準的な方法によって、容易に改変される。他の有用な結合基としては、メチオニンのチオエステル、ヒスチジンのイミダゾリル基、アルギニンのグアニジニル基、チロシンのフェノール基およびトリプトファンのインドリル基が挙げられる。これらの結合基は、当業者に公知の反応条件を使用して、誘導体化され得る。
【００７３】
標的タンパク質−第二コイル形成ペプチド結合体５９（図５Ａ）を、表面固定化第一コイル形成ペプチド５２に結合するために、その二つのペプチドは、ヘテロ二量体形成を支持する条件下で接触される。コイルドコイルへテロ二量体形成を支持する例示的な媒体は、生理学的に適合性の（代表的には、約６と約８の間のｐＨを有し、そして、約５０ｍＭと約５００ｍＭとの間の塩濃度を有する）水性溶液である。好ましくは、その塩濃度は、約１００ｍＭと約２００ｍＭとの間である。例示的な良性の媒体は、以下の組成を有する：５０ｍＭ  リン酸カリウム、１００ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７。等しく有効な媒体は、例えば、リン酸カリウムをリン酸ナトリウムで置換し、および／またはＫＣｌをＮａＣｌで置換することにより、作られ得る。ヘテロ二量体は、上記ｐＨおよび塩範囲、媒体の外側の条件下で形成され得、そして、ヘテロ二量体対ホモ二量体の分子相互作用および相対的安定性は、上記の特徴とは異なり得る。例えば、ヘテロ二量体を安定化する傾向があるイオン性基間の相互作用は、低ｐＨ値または高ｐＨ値では、例えば、酸性ｐＨでのＧｌｕ側鎖のプロトン化または例えば、塩基性ｐＨでのＬｙｓ側鎖の脱プロトン化のために、崩壊し得る。しかし、コイルドコイルへテロ二量体形成に対する、低ｐＨ値および高ｐＨ値のこのような影響は、塩濃度の増加により克服され得る。
【００７４】
塩濃度の増加は、安定化イオン親和力を中和し得るか、または不安定化イオン性反発力を抑制し得る。特定の塩は、イオン性相互作用の中和において、より大きな効果を有する。例えば、Ｋ−コイルペプチドの場合において、最大のα−らせん構造を誘導するために、１Ｍまたはそれより高いＣｌＯ４−アニオン濃度が必要であり、それに対して、同じ効果のために、３Ｍまたはそれより高いＣｌ−イオン濃度が必要である。低ｐＨおよび高ｐＨでのコイルドコイル形成に対する高塩濃度の効果はまた、らせん内のイオン性親和力が、らせん形成に対して不可欠ではなく、むしろコイルドコイルが、ホモ二量体に対してヘテロ二量体として生成する傾向があるかどうかを支配していることを示す。Ｅ−コイルペプチドおよびＫ−コイルペプチドはまた、共有に係る米国出願番号０９／６５４，１９１（代理人参照番号：５４８００−８０１５．ＵＳ０１）（これは、本明細書にその全体が、明示的に参考として援用される）の実施例２中にあるように、目的のタンパク質または他の生体分子に結合され得る。
【００７５】
上に述べたように、ＫコイルおよびＥコイルは、合成的にかまたは組換えＤＮＡ技術により、作られ得る。当業者は、軽微な配列の変化が、コイルが二量体化する能力を弱めて互いに対する結合能に特異的にもまたは有意にも影響することなく、なされ得ることを認識する。短いアミノ酸リンカー（例えば、マルチグリシン）は、いずれかのコイルのいずれかの末端に添加され得、そして、コイルドコイル構造の形成に、通常は影響しないことも認識される。さらに、提示するためのタンパク質、ペプチドまたは他の生体分子に対するコイルの結合を促進するために、これらのコイルの末端に、化学的に活性な基（例えば、二官能価の架橋剤）が添加され得る。
【００７６】
（Ｄ．さらなる多複合体サブユニット）
本発明の一局面に従って、その結合体の第一サブユニットポリペプチドは、マルチサブユニット複合体中の複数のサブユニットポリペプチドの一つである。固定化されたペプチドとのα−らせんコイルドコイルヘテロ二量体形成を介したその固体表面へのその結合体の結合に続いて、支持体上でのサブユニット複合体の自己アセンブリを促進するために有効な条件下で、複合体のさらなるサブユニットが添加される。
【００７７】
一つの実施形態では、個々にサブユニットポリペプチドを添加することにより、マルチサブユニット複合体が、アセンブルされる。図４Ａ〜４Ｄを参照すると、基板４１中の各ウェル４０は、その中に第一コイル形成ペプチドを有する。第二コイル形成ペプチド４３および第一サブユニットポリペプチド４４を含む結合体は、コイルドコイルへテロ二量体形成を介して、固体表面に結合する。マルチサブユニット複合体中の複数のサブユニットポリペプチドの一つである、第二サブユニットポリペプチド４５は、図４Ａに示されるように、第一サブユニットポリペプチド４４および第二サブユニットポリペプチド４５の自己アセンブリを促進するために有効な条件下で、ウェルに添加される。同様に、マルチサブユニット複合体中の複数のサブユニットポリペプチドの一つである第三サブユニットポリペプチド４６は、図４Ｂに示されるように、第一サブユニットポリペプチド４４、第二サブユニットポリペプチド４５および第三サブユニットポリペプチド４６の自己アセンブリを促進するために有効な条件下で、ウェル４０に添加される。これは、図４Ｃ〜４Ｄに図示されるように、マルチサブユニット複合体の所望のサブユニットポリペプチド４７および４８が固体表面上でアセンブルされるまで、継続され得る。
【００７８】
別の実施形態では、図５Ａ〜５Ｂに図示されるように、マルチタンパク質複合体は、サブユニットポリペプチドを混合物として添加することにより、アセンブルされる。基板中のウェルは、これらのサブユニットポリペプチドを含む溶液で満たされ得る。図５Ａ中に示されるように、基板５１中の各ウェル５０は、その中に第一コイル形成ペプチド５２を有する。第二コイル形成ペプチド５３および第一サブユニットポリペプチド５４を含む、結合体５９は、コイルドコイルヘテロ二量体形成を介して固体表面に結合する。マルチタンパク質複合体のサブユニットポリペプチド５５、５６、５７、５８は、図５Ｂに図示されるように、第一サブユニットポリペプチド５４を有するポリペプチドの混合物の自己アセンブリを促進するために有効な条件下で、ウェル５０に添加される。混合物中のポリペプチドの自己アセンブリに続いて、ウェルは、非結合成分を除去するために洗浄され得る。
【００７９】
マルチサブユニット複合体中のサブユニットポリペプチドの自己アセンブリを促進するために有効な条件は、従来的であり、文献全体に記載され、そして、サブユニットポリペプチドおよび／またはマルチサブユニット複合体の性質に従って変わる。米国特許第６，２９４，３６３号および同６，０８３，７０８号（これらは、本明細書に参考として援用される）を参照のこと。その文献中に記載され、当業者に公知の種々の緩衝液系および条件が、使用され得る。本発明の一つの実施形態において、当業者に公知の適切な界面活性剤または複数の界面活性剤が添加される場合、提示されるタンパク質、ペプチドまたは他の生体分子、および形成される複合体は、膜結合性であり得る。
【００８０】
（Ｅ．例示的なマルチサブユニット複合体）
核ホルモンレセプターは、大きなスーパーファミリーに分類され、進化的に、共通の祖先に由来すると考えられる。哺乳動物核レセプターの七つのサブファミリーが、存在する。クラスＩは、以下：甲状腺ホルモンレセプター、レチノイン酸レセプター、ビタミンＤレセプター、ペルオキシソーム増殖因子活性化レセプター、プレグナンＸレセプター、構成的アンドロスタンレセプター、肝臓Ｘレセプター、ファムソイド（ｆａｍｅｓｏｉｄ）Ｘレセプター、逆ＥｒｂＡ、レチノイドＺレセプター／レチノイン酸関連オーファンレセプターおよび遍在性レセプターからなる。クラスＩＩは、以下：レチノイドＸレセプター、ニワトリオボアルブミン上流プロモーター転写因子、肝細胞核因子４、テイルレス（ｔａｉｌｌｅｓ）関連レセプター、光受容体特異的核レセプターおよび精巣レセプターからなる。クラスＩＩＩとしては、以下：グルココルチコイドレセプター、アンドロゲンレセプター、プロゲステロンレセプター、エストロゲンレセプターおよびエストロゲン関連レセプターが挙げられる。ＮＧＦ誘導性クローンＢは、クラスＩＶ核レセプターであり；ステロイド生成性（ｓｔｅｒｏｉｄｇｅｎｉｃ）因子１およびＦｕｓｈｉ  Ｔａｒａｚｕ因子１は、クラスＶレセプターであり；生殖細胞核因子は、クラスＶＩレセプターであり；小へテロ二量体パートナーおよび投薬量感受性性逆転は、クラス０レセプターである。ＡｒａｎｄａおよびＰａｓｃｕａｌ、２００１に総説される。
【００８１】
これらのレセプターの内のいくつかに対するリガンドが、同定されており、これは、脂質代謝産物（例えば、脂肪酸、プロスタグランジンまたはコレステロール誘導体）が、核レセプターに結合することによって、遺伝子発現を調節し得ることを示されている。これらの核レセプターは、一量体、ホモ二量体またはＤＮＡに対するＲＸＲヘテロ二量体として、ホルモン応答エレメントに結合する。リガンドは、二量体化およびＤＮＡに対する結合において役割を担い得る（Ｒｉｂｅｉｒｏ、１９９２）。多くのタンパク質は、一般的転写因子を含むこれらのレセプターと相互作用する。他の転写調節タンパク質と同様に、核レセプターがＲＮＡポリメラーゼＩＩ指向性転写の速度に影響する機構の一局面は、レセプターと、転写開始前複合体成分との相互作用を含むようである。この相互作用は、直接的であり得、または、架橋因子の作用を介して、間接的に生じ得る（Ｓｃｈｕｌｍａｎ、１９９５）。配列特異的転写因子（Ｃａｓｔｉｌｌｏ、１９９９）、コアクチベーターおよびコリプレッサー（Ｃａｖａｉｌｌｅｓ、１９９５）もまた、これらの核レセプターと相互作用することが見出されている。
【００８２】
電圧依存性カルシウムチャネルは、カルシウムのニューロンおよび他の興奮性細胞への流入を媒介し、そして、膜興奮性、神経伝達物質放出および遺伝子発現を含む、種々の神経機能において重要な役割を担う。カルシウムチャネルは、主に細孔形成サブユニットに媒介されるチャネル活性を有する、マルチサブユニット複合体であるが、さらなるサブユニットが、チャネル活性を調節する補助タンパク質として作用する（Ｃａｔｔｅｒａｌｌ、１９９５）。
【００８３】
ユビキチン媒介性タンパク質分解は、多用途の酵素セットの協調作用を介して達成される、極めて選択的なプロセスである（ＨｅｒｓｈｋｏおよびＣｉｅｃｈａｎｏｖｅｒ、１９９８；Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ、１９９７）。単一のＥ１酵素（ユビキチン活性化酵素）は、小タンパク質ユビキチンの活性化を担い、次いで、この小タンパク質ユビキチンは、トランスアセチル化によって、数個のＥ２酵素（ユビキチン結合酵素）に運ばれる。各Ｅ２は、タンパク質−ユビキチン結合体の生成において、いくつかの異なったＥ３タンパク質と共同して作用し得る。ユビキチン−タンパク質リガーゼと呼ばれるＥ３は、この系に対して特異性を与え、一般的特性（基質認識および結合）を共有する。Ｅ２タンパク質が、互いに対して顕著な相同性を有するのに対して、多くが大きなマルチサブユニット複合体と結合するＥ３は、非常に不均質な基を形成する。これらの複合体中では、個々のサブユニットの特定の仕事は、常に明らかというわけではない（Ｙａｍａｎｏら、１９９８；ＺａｃｈａｒｉａｅおよびＮａｓｍｙｔｈ、１９９９）。さらに、その複合体の組成は、必ずしも固定的ではなく、そして、細胞の機能状態と関連した調節プロセスに支配され得る（Ｆａｎｇら、１９９８；Ｚａｃｈａｒｉａｅら、１９９８）。ほんの少しのＥ３のみが、詳細に特徴付けられており、哺乳動物のＥ３に関しては、わずかな情報しかない。後者の内で、よりよく規定されたＥ３の一つは、ＳＣＦ（β−ＴｒＣＰ／Ｅ３ＲＳ）であり、これは、分解のためにｐｌκＢαおよびβ−カテニンを標的とする、最近同定されたｋａｐｐａて、細胞の機能状態と関連した調節プロセスに制約Ｅ３複合体である（（ＫａｒｉｎおよびＢｅｎ−Ｎｅｒｉａｈ、２０００；Ｍａｎｉａｔｉｓ、１９９９；Ｐｏｌａｋｉｓ、１９９９）中に総説される）。
【００８４】
さらなるマルチサブユニット複合体が、当該分野で公知であり、文献中に記載され、それらとしては：核孔複合体、リボソーム複合体、２６Ｓプロテオソーム複合体、Ｆ０Ｆ１  ＡＴＰアーゼ複合体、ＤＮＡポリメラーゼおよび転写開始複合体の成分（（少なくとも１２個のサブユニットから構成される）ＲＮＡポリメラーゼＩＩおよびＴＦＩＩＤ、ＴＦＩＩＢ、ＴＦＩＩＡ、ＴＦＩＩＦ、ＴＦＩＩＥおよびＴＦＩＩＨを含む）が挙げられるが、これらに限定されない（Ｗｉｌｓｏｎら、１９９６に総説される）。一つ以上の核酸分子を含む複合体もまた、企図される。
【００８５】
（Ｆ．結合したポリペプチドの同定）
本発明のタンパク質相互作用方法および生物機能チップは、短時間で多量のサンプルの迅速な分析を可能にし、それによって、分析のコストを減少する。従って、本発明は、高処理能力検出系と結びついて、マルチサブユニット複合体および生物機能チップの生成物を同定することを企図する。
【００８６】
マルチサブユニット複合体および本発明の他の産物をアッセイするために適切な、多くの異なる型の検出系がある。このような系としては、蛍光、吸光度／透過度、放射性計数、化合物または分析物を曝露した際の電子効果の測定、発光、紫外光、可視光、衝突に誘導される解離（ＣＩＤ）、ＣＣＤカメラ、電子および三次元顕微鏡観察が挙げられるが、これらに限定されない。他の技術は、当業者に公知である。例えば、コンビナトリアルアレイおよび生物チップ型の分析のためのレーザー誘導性蛍光（ＬＩＦ）検出方法が、Ｉｄｅｕｅ、Ｓら（２０００）に記載される。
【００８７】
好ましい実施形態において、質量分析検出系が使用される。有用な質量分析検出系は、イオン化（Ｉ）技術（例えば、米国特許第６，２２５，０６１号（これは、本明細書に、明白に参考として援用される）に記載されるマトリックス支援レーザー脱離法（ＭＡＬＤＩ）、連続的エレクトスプレーまたはパルスエレクトロスプレー法（ＥＳＩ）、イオンスプレー法、熱スプレー法またはマッシブクラスター衝撃法（ＭＣＩ））を含む、任意の種々の型であり得る。このようなイオン源は、線形またはリフレクトロン飛行時間法（ＴＯＦ）、単一または複合的な四重の磁場の単一または複合的な磁気セクター、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴法（ＦＴＩＣＲ）、イオントラップ、およびハイブリッド検出器を得るためのこれらの組み合わせ（例えば、イオン−トラップ／飛行時間）を含む検出型に、好都合に適合し得る。例えば、多数のマトリックス／波長の組合せ（ＭＡＬＤＩ）または溶媒の組合せ（ＥＳＩ）が、使用され得る。遅延抽出ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法を含むＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法は、検出系として特に有用である。例えば、国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ９８／２００１９およびＷｈｉｔｔａｌら（１９９８）を参照のこと。並行抽出技術を使用して、ＴＯＦ質量分析法は、アレイ中にそれぞれ離れて位置するサンプル混合物中の数百の分子の詳細な特徴づけのために、使用され得る。この系は、極めて迅速な分析および高レベルの選択性を可能にする。
【００８８】
本発明の方法の好ましい実施形態には、以下の段階：（ｉ）Ｅコイル末端セグメントまたはＫコイル末端セグメントを有する目的のタンパク質の調製；（ｉｉ）相補的なＫコイルまたはＥコイルを含むウェルへのそのタンパク質の添加；（ｉｉｉ）コイル−コイル結合によるそのウェル中のタンパク質の固定化；（ｉｖ）そのウェルから非結合成分を洗浄して結合タンパク質を残すこと；および（ｖ）提示されたタンパク質の分析が、含まれる。
【００８９】
本発明の方法が、上記のように、ＭＡＬＤＩ質量分析法と組み合わせて実施される場合、ＭＡＬＤＩプレート上の個々のウェル中で、方法全体が、行われ得る。好ましい実施形態では、以下の段階：（ａ）質量分析の前に光吸収マトリックスの溶液を基板に添加すること、およびその溶液を基板上で乾燥させること（マトリックス溶液の添加は、タンパク質の基板からの解離に有効であり、その結果、基板上の乾燥した物質が、結晶性マトリックスおよび遊離しているかまたは固定化されていないタンパク質の混合物を含む）；ならびに（ｂ）タンパク質／マトリックス混合物にレーザービームを照射し、そのマトリックスに迅速なエネルギー放出を受けさせ、解離したタンパク質に爆発エネルギーを与えることが、含まれる。
【００９０】
この実施形態において、タンパク質−タンパク質解離は、好ましくは、ウェルへの酸性マトリックス（ｐＨ２〜５）の添加の後に生じる。タンパク質放出が、質量分析の前に生じ得るという証拠として、本発明者らは、マトリックス溶液が解離を引き起こすことを示す一連の実験を行った。最初の実験では、上に論じたようなコイル−コイル相互作用を介してウェルに結合した目的のタンパク質を有するウェルに、マトリックスが添加された。ＭＡＬＤＩ分析は、分析した目的のタンパク質の定量的プロフィールを生じた。二番目の実験では、一番目の実験と同様に、ウェルに結合した目的のタンパク質を有するウェルに、マトリックスを添加した。しかし、分析の前に、マトリックス溶液およびあらゆる解離したタンパク質が、ウェルから除去され、第二のウェルにスポットされた。除去されたマトリックス溶液および解離されたタンパク質を含む第二ウェルのＭＡＬＤＩ分析は、一番目の実験で得たプロフィールと実質的に等しい、目的のタンパク質の定量的プロフィールを示した。従って、このマトリックス溶液は、レーザーによるエネルギーの脱離およびイオン化の前に、コイル−コイル相互作用を解離する。
【００９１】
（ＩＩＩ．有用性）
上に示したように、この方法は、マルチタンパク質複合体の再構築に、容易に適合される。その方法は、図４Ａ〜４Ｄに図示され、それらは、第二コイル形成ペプチド４３および第一サブユニットポリペプチド４４を含む結合体と相互作用してマルチタンパク質複合体を形成する、コイル形成ペプチド４２を示す。その方法はまた、そのサブユニットを上記領域に添加した後、種々の時間において結合されたサブユニットを分析することにより、サブユニットアセンブリの速度論および／またはの次数の決定に適合される。
【００９２】
本発明の方法はまた、未知の結合サブユニットの同定および／または単離において有用である。この実施形態において、コイルドコイルへテロ二量体は、リガンドまたは生体分子（例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子、糖質など）を提示するために使用され、そしてその生体分子は、その天然レセプター、変異レセプター、または合成レセプターに、さらに結合するために使用される。従って、この実施形態では、マルチサブユニット複合体は、レセプターおよびそのリガンドからなる。一つの実施形態では、生体分子を提示するコイルドコイルは、タンパク質、ペプチドまたは生体分子を捕まえる。次いで、この複合体は、科学的研究（例えば、アゴニスト／アンタゴニストのスクリーニング、例えば酵素活性検出のような機能性アッセイ、または当業者に公知の他のアッセイ）のために提示される。
【００９３】
好ましい実施形態において、その方法は、オーファン分泌生体分子に結合する標的レセプター、そのレセプターに対する生体分子の結合親和性、および生体分子−レセプター結合を調節し得る化合物の同定のために、有用である。従って、本発明の一つの実施形態において、第一サブユニットポリペプチドは、レセプター（例えば、核ホルモンレセプター）に特異的に結合する生体分子である。レセプターおよび生体分子（例えば、オーファンタンパク質）の自己アセンブリを促進するために有効な条件下で、上記領域にレセプターが添加される。自己アセンブリの後、その領域は、非結合成分を除去するために、洗浄され得る。洗浄後、そのレセプターは、上記の方法のうちの１つ以上を使用して同定され得る。あるいは、第一サブユニットポリペプチドは、レセプターおよび生体分子（それは、リガンドまたはそのレセプターの他の結合パートナーであり得、例えば、ＲＸＲ核ホルモンレセプターサブユニットであり得る）であり、そして、その第一サブユニットポリペプチドは、そのレセプターと生体分子との自己アセンブリを促進するために有効な条件下で、その領域に添加される。洗浄後、生体分子（リガンドまたはレセプター結合パートナーまたは複合体の全ての成分）が、以前記載したように同定される。従って、提示されたレセプターは、天然の、変異した、または公知のもしくは未知の、相互作用する生体分子に結合するために、使用される。このことはまた、「マイニング（ｍｉｎｉｎｇ）」と呼ばれる。
【００９４】
別の好ましい実施形態において、固定化された第一コイル形成ペプチドは、単一のコピーの核ホルモンレセプターに融合する。ホモ二量体サブユニットまたはヘテロ二量体サブユニットのいずれかであり得る適切に調製されたＥコイル−核ホルモンレセプターが、表面に添加される。Ｅ／Ｋ二量体形成は、好ましくは、二量体核ホルモンレセプター複合体を作製する。その複合体は、上記マイニングプロセスで使用される。核ホルモンレセプター上の、Ｋコイルが融合される部位は、天然で観察される核ホルモンレセプターと同様に、Ｅ／Ｋコイルドコイルが形成されるにつれて、二量体核ホルモンレセプターの形成を促進するような方法で同定され得る。
【００９５】
なお別の好ましい実施形態において、提示された表面は、最初に第一コイル形成ペプチドを用いて機能化される。核ホルモンレセプターの二量体形態を認識する第一サブユニット（例えば、別のタンパク質、核酸分子または抗体のような、生体分子）に融合したＥコイルが、添加される。次いで、核ホルモンレセプターが、固体表面上でのサブユニットと核ホルモンレセプター複合体との自己アセンブリを促進するために有効な条件下で、第一サブユニットの表面に添加され、その第一サブユニットに結合する。
【００９６】
その方法はまた、マルチサブユニット複合体（例えば、２６Ｓ  プロテオソーム複合体）中の一つ以上の他のサブユニットポリペプチドに、一つ以上のサブユニットポリペプチドが結合するのを調節する（例えば、増強するかまたは阻害する）能力について、複数の試験化合物のスクリーニングに容易に適合される。このようなアッセイの目的は、例えば、サブユニット−サブユニット結合に干渉し得る化合物を見出すための薬剤送達プログラムの一部として、サブユニット内結合の程度を変える能力について複数の化合物を試験することである。
【００９７】
図４Ａ〜４Ｄは、試験化合物の非存在下でのアッセイを図示し、ここで、サブユニット４４および４５（図４Ａ）およびそれに続くサブユニット４６、４７および４８（図４Ｂ〜４Ｄ）は、試験化合物によって、影響されない。この実施形態において、タンパク質、ペプチドまたは他の生体分子を提示するコイルドコイルは、タンパク質、ペプチドまたは他の生体分子を捕まえるかもしくは結合し、そして、その二次分子は、三次分子を補充し、そして、その三次部分は、次いで、既存の複合体に結合し得る他のものを補充する。このことは、「連続的複合体アセンブリ」と呼ばれる。次いで、形成された複合体は、当業者に公知の従来的な科学研究のために提示される。別の実施形態では、図５Ａ〜５Ｂに図示されるように、コイルドコイルにより提示されるタンパク質、ペプチドまたは生体分子５４は、複合体５５、５６、５７、５８にか、または中間の周囲もしくは環境もしくは領域に既に存在する複数の複合体に、結合する。このことは、「非連続的複合体アセンブリ」と呼ばれる。マルチ複合体の結合は、天然では、共同的もしくは連続的であっても、そうでなくてもよい。次いで、アセンブルした複合体またはマルチ複合体は、上記のように分析される。
【００９８】
本発明の示されていない一つの実施形態において、試験化合物は、サブユニット４４に結合し得る領域４０に、最初に添加される。サブユニット４５のサブユニット４４への結合は、サブユニット４５および試験化合物の相対濃度、ならびにサブユニット４４に対するその二つの相対親和性に依存して、一部または完全に、阻害され得る。
【００９９】
好ましい実施形態において、複数のマルチサブユニット複合体は、例えばマイクロタイタープレートフォーマット中では、それぞれ、異なる試験化合物と混合されるか、または種々の濃度の同一試験化合物と混合される。結合の後、この反応混合物は検出される。各サンプルが、異なった試験化合物を含む場合、サブユニット−サブユニット結合に対する複数のそのような化合物の各々の相対的な効果が決定され得る。各サンプルが、異なる濃度の同じ試験化合物を含む場合、相対的な結合親和性および有効化合物濃度の範囲が、決定され得る。
【０１００】
別の実施形態では、第一サブユニットペプチドが、（例えば、基質および／または形成された産物）が、質量分析法、蛍光、放射計数、光学的技術および他の生物学的技術により区別され得る場合、その方法は、酵素活性を評価するために適している。
【０１０１】
別の実施形態では、その方法は、バイオセンサーデバイスとしての使用に適合され、ここで、電気化学的検出スキームまたは光学的検出スキームが、その実験の進行または結果を評価するために使用される。バイオセンサーは、例えば、米国特許第６，３００，１４１号、同６，１６５，３３５号、同６，１３０，０３７号、同６，１０７，０８０号および同５，９５５，３７９号中に記載され、これらは、それぞれ本明細書に参考として、明示的に援用される。
【０１０２】
本発明の別の実施形態において、インビボでのマイニングプロセスが使用され得る。一つの実施形態では、第一コイル形成ペプチドをコードする第一核酸配列を含むコード配列（例えば、Ｅコイルおよび核ホルモンレセプター遺伝子）は、選択された正常宿主細胞および／または疾患宿主細胞中にトランスフェクトされる。その宿主細胞は、物質（例えば、ホルモンまたは薬物）で処理される。この細胞は、溶解され、そして、Ｅコイルでタグ化された核ホルモンレセプター複合体が、Ｋコイル機能化マトリックス（例えば、カラム、膜または生物チップ）を使用して採集される。
【０１０３】
（ＩＶ．タンパク質の提示）
本発明は、別の局面では、上に言及した共有に係る、２００１年８月２２日に出願された米国特許出願番号６０／３１４，３３３号（これは、本明細書に参考として明示的に援用される）に記載されるように、複数の標的タンパク質の提示を行う方法を含む。一般に、複数の異なる配列の核酸分子に由来する選択された異なる配列の核酸分子が、基板中の複数のウェルのそれぞれに添加される。基板中の各ウェルは、その中に第一コイル形成ペプチドを有する。異なる配列の核酸分子のそれぞれは、二つの部分（第二コイル形成ペプチドをコードする共通配列捕捉部分、および標的タンパク質をコードする異なる配列の標的部分）を含む。
【０１０４】
基板中のウェルは、選択されたタンパク質合成条件下で異なる配列の核酸分子を発現し得るタンパク質合成成分を含む溶液で満たされている。次いで、その異なる配列の核酸分子が発現される。各ウェル中で発現した標的タンパク質は、基板結合型コイル形成ペプチドとのコイル−コイルへテロ二量体形成を介して、ウェルに結合し、従って、捕捉された形態で、ウェル中に分析のために提示される。次いで、そのウェルは、非結合成分を除去するために洗浄され得る。これらの提示されたタンパク質は、次いで、上に議論したように、リガンド−レセプタースクリーニングのため、構造／機能研究（例えば、アラニン走査変異誘発、抗体パネルおよび２−ハイブリッド研究）に使用され得る。
【０１０５】
一つの実施形態において、それぞれの異なった配列の標的部分は、ｃＤＮＡ分子のライブラリーから選択された異なったｃＤＮＡ分子である。発現の後、各ウェル中で提示されたタンパク質は、異なる配列を有する。各ウェル中で発現した標的タンパク質は、基板結合型コイル形成ペプチドとのコイル−コイルへテロ二量体形成を介してウェルに結合し、従って、分析のために、捕捉された形態でウェル中に提示される。各タンパク質は、ｃＤＮＡライブラリーの代表である。次いで、提示されたタンパク質は、選択された薬剤と相互作用するタンパク質を同定するために、一つ以上の薬剤に対してスクリーニングされる。
【０１０６】
別の実施形態では、所定の基板上で各ウェルが同一タンパク質の異なる変異体を含むように、異なる領域に変異を受けたタンパク質が、各ウェルに配置される。例えば、９６ウェルプレートは、同一タンパク質の９６個の異なる変異を有する。タンパク質または薬剤が、高親和性結合についてのプレートのスクリーニングのために使用される。次いで、タンパク質または薬剤の結合親和性の増加を担う変異がどこに存在するかを同定するために、質量分析が使用され得る。
【０１０７】
なお別の実施形態では、それぞれの異なる配列の標的部分が、同一ＤＮＡ分子によってコードされる。発現およびタンパク質結合の後、各ウェルに提示されたタンパク質は、全て同一である。次いで、提示されたタンパク質は、提示されたタンパク質と相互作用する薬剤を同定するために、一群の異なる化合物に対してスクリーニングされ得る。一つの実施形態では、化学物質ライブラリーが、プールに細分割され、次いで、各ウェルに、各プールが添加される。提示されたタンパク質に特異的に結合する化合物または化合物プールを同定するために、質量分析が使用される。別の実施形態では、ＤＮＡライブラリーが、プールに細分割され、次いで、各ウェルに各プールが添加される。提示されたタンパク質に対する特異的なＤＮＡ結合配列を同定するために、質量分析が使用される。なお別の実施形態では、提示されたタンパク質は、各ウェルに提示された酵素または酵素改変体である。潜在的な酵素基質のライブラリーが、ウェルに添加され、ウェル中の生成物生成を同定するために、質量分析が使用される；または、インヒビターの場合は、固く結合した分子を同定するために、質量分析が使用される。
【０１０８】
提示されたタンパク質は、上に記載したように、生化学的反応（例えば、タンパク質、核酸、低分子などの相互作用）をモニタリングするために使用され得る。例えば、抗原と抗体との間、またはレセプター（例えば、精製されたレセプター、または細胞膜に結合したレセプター）とそれらのリガンド、アゴニストまたはアンタゴニストと間、および酵素（例えば、プロテアーゼまたはキナーゼ）とその基質と間の相互作用の特異性の効率性は、生成物に転換される基質の量ならびに他の多くのもので、増加するかまたは減少する。標的タンパク質の特性を特徴付けるためまたはスクリーニングアッセイの基礎として、このような生化学的アッセイが使用され得る。例えば、特定のプロテアーゼＸａおよびＶＩＩａの存在についてサンプルをスクリーニングするために、そのサンプルは、標的タンパク質が個々のプロテアーゼである組み合わせについて、アッセイされ得る。提示された特定のプロテアーゼに対して特異的である蛍光発生基質が、そのプロテアーゼに結合し、そして切断される場合、その基質は、通常は、例えば２つのエネルギー移動対の間の切断および分離の結果として、蛍光を発し、そのシグナルは、検出され得る。別の例では、特定のキナーゼ（例えば、Ｓｒｃ、チロシンキナーゼまたはＺＡＰ７０）の存在についてサンプルをスクリーニングするために、結合され提示されたポリペプチドが、目的のキナーゼの一つによって選択的にリン酸化され得る組み合わせについて、一つ以上の目的のキナーゼを含むサンプルが、アッセイされ得る。
【０１０９】
当該分野で認識される日常的に決定される条件を使用して、サンプルは、基板のアレイとともに、適切な緩衝液中で、および必要な補因子とともに、経験的に決定した時間の間、インキュベートされ得る。結合していない成分および望ましくない成分を除去するために、経験的に決定された条件下で各反応を処理（例えば、洗浄）した後、結合した成分が、質量分析により検出され得る。
【０１１０】
別の実施形態では、提示されたタンパク質は、提示されたタンパク質と所定のプローブとの相互作用を調節する因子についてスクリーニングするために、使用され得る。因子は、プローブ、タンパク質、またはプローブ＋タンパク質により形成された複合体のいずれかに直接的または間接的に相互作用することにより、タンパク質／プローブ相互作用を調節し得る。この調節は、種々の形態を取り得、その形態としては、タンパク質のプローブに対する結合親和性の増加あるいは減少、タンパク質およびプローブが結合する速度の増加あるいは減少、プローブのタンパク質への結合の競争的阻害あるいは非競争的阻害、あるいはプローブまたはある場合にはプローブ／タンパク質相互作用の増加または減少をもたらし得るタンパク質の活性の増加または減少が、挙げられるがこれらに限定されない。このような因子は、合成物質または天然に存在する物質であり得る。また、このような因子は、それらの未変化状態で、または他の種との凝集体として、使用され得、そして、それらは、結合メンバーに直接かまたは特定の結合物質を介してかのいずれかにより、共有結合的にかまたは非共有結合的に、結合する。
【０１１１】
上記から、本発明のどのような種々の目的および特徴が満たされるか、理解され得る。
【実施例】
【０１１２】
（ＩＶ．実施例）
以下の実施例は、本明細書に記載された本発明をさらに例証し、これらの実施例は、決して本発明の範囲を限定することを意図しない。
【０１１３】
（実施例１）
ヘテロ二量体タンパク質技術（ＨＰＴ）は、バイオチップ標的プレートに機能性を加える。よく規定されそして空間的に順序立った方向を向いたタンパク質層を、作製する。ＨＰＴは、表面上にタンパク質をタグ化し、捕捉しおよび提示する方法を提供するために、親和性ペプチドのセット（ＫコイルおよびＥコイル）を使用する。このＫコイルは、７アミノ酸（配列番号５）反復から作られるペプチドである。一つの実施形態では、このＫコイルは、３５アミノ酸長である。それは、正に荷電し、溶液中では、特定の構造を有さない。そのＥコイルは、７アミノ酸（配列番号６）反復から作られるペプチドである。一つの実施形態では、そのＥコイルは、３５アミノ酸長である。それは、負に荷電し、そして、溶液中では、特定の構造を有さない。
【０１１４】
へテロ二量体のＥコイルおよびＫコイルは、独特のらせんおよび二量体構造を形成する。その表面は、２〜２０μｍ  Ｋコイルを３０分間添加し、ＰＢＳ−Ｔを用いてリンスし、１ｍＭ  システイン中で３０分間インキュベートし、そして、ＰＢＳ−Ｔを用いてリンスすることにより、調製する。一つの実施形態では、Ｅ／Ｋコイル濃度は、８．５×１０１０分子／ｍｍ２より少ないかまたは等しい。これにより、ＭＡＬＤＩ  ＭＳ下で脱離せず、長期間（例えば、１日間、２日間、８日間、１４日間および２２日間）保たれ得るＫコイルの安定な表面を生じる。
【０１１５】
このＥコイルを、結合化学または組換えＤＮＡ技術のいずれかにより、目的のタンパク質に結合する。次いで、このＥコイル−タンパク質を、Ｋコイル表面に添加し、その後１５〜３０分間インキュベートする。次いで、その表面を、ＰＢＳ−Ｔ／水を用いてリンスし、その後、ＭＳ  ＭＡＬＤＩを使用して分析する。
【０１１６】
（実施例２）
チップ上での（ｏｎ−ｃｈｉｐ）タンパク質生成手順を、実施する。ここで、発現、検出、単離、特徴付けおよびインビボでの翻訳を、全てチップ上に統合する。簡単にいうと、Ｋコイルをウェルの表面に結合し、Ｓ３０細菌抽出物およびウサギ網状赤血球溶解物からなる翻訳混合物を添加し、Ｅ融合ベクターを添加し、そのベクターを３０〜６０分間翻訳し、次いで、洗浄し、検出する（１５分間）。図７は、コントロールとともに、Ｅ−ＧＦＰを添加したＫコイルプレートの例（上パネル）、ＧＦＰを添加したＫコイルプレート、そしてＥ−ＧＦＰのみを含む標準ＭＳプレート（それぞれ、中パネルおよび下パネル）を示す。
【０１１７】
図８は、酵素機能を含む生物機能チップを図示する。チップ上でのＡｂｌタンパク質チロシンキナーゼのリン酸化を、図９に示す。反応成分は、ｐＨ７．５の０．４Ｕ／ウェルのＡｂｌ、０．１ｍＭ  ＡＴＰおよび４００ｎＭ基質からなる。ウェル当たり４μｌを添加し、その反応を２３℃で９０分間インキュベートした。種々の基質濃度（０ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭおよび３００ｎＭ）を有するウサギ網状赤血球抽出物中のチップ上でのリン酸化を、図１０に示す。インビトロＡｂｌ  ＰＴＫ基質発現およびコントロールＭＡＬＤＩ  ＭＳスペクトルを、図１１に示す。リン酸化基質に対するリン酸化シグナルを、図１２に示す。リン酸化ピークに対して標準化した同じスケールおよび異なるスケールのスペクトルの再現性を、図１３に示す。ウェルあたり１ユニットの基質のリン酸化パーセント  対  ウェルあたり０．１２ユニット基質のリン酸化パーセントを、経時的に決定する。
【０１１８】
リン酸化を阻害し得るＡＴＰアナログまたは基質アナログについてのスクリーニングアッセイもまた、試験した。図１４は、漸増濃度のＡＴＴＰ（ＡＴＰアナログ）での、ＡＴＴＰによるリン酸化の阻害を示す。２５０ｎＭ  基質、５μＭ  ＡＴＰ、２０Ｕ／ウェル  Ａｂｌ  ＴＫおよび０μＭ  ＡＴＴＰ、４μＭ  ＡＴＴＰ、８μＭ  ＡＴＴＰ、１２μＭ  ＡＴＴＰ、１６μＭ  ＡＴＴＰおよび２０μＭ  ＡＴＴＰを、２３℃で６０分間インキュベートした。図１５は、ＡＴＰアナログであるゲニステインによるリン酸化の阻害を示す。２５０ｎＭ  基質、５μＭ  ＡＴＰ、２０Ｕ／ウェル  Ａｂｌ  ＴＫおよび０μＭのゲニステイン、５μＭのゲニステイン、１０μＭのゲニステイン、１５μＭのゲニステインおよび４０μＭのゲニステインを、２３℃で６０分間インキュベートした。図１６は、基質アナログであるエルブスタイン（Ｅｒｂｓｔａｉｎ）によるリン酸化の阻害を示す。２５０ｎＭ  基質、１００μＭ  ＡＴＰ、０．４ユニット／ウェル  Ａｂｌ  ＴＫおよび０μＭのエルブスタイン、１μＭのエルブスタイン、２μＭのエルブスタイン、４μＭのエルブスタイン、８μＭのエルブスタイン、および１２μＭのエルブスタインを２３℃で６０分間インキュベートした。
【０１１９】
生物機能チップの成分は、キナーゼ研究、ヒストンアセチル化研究、ＤＮＡメチル化研究およびプロテアーゼ研究のために有用である。スクリーニングアッセイは、例えば、過剰の酵素ＡＴＰ濃度（１００μＭ）が使用され、そしてその酵素が適切なリン酸化を達成するように制御されるように、ＡＴＰアナログ−コントロールＡＴＰ濃度（５μｍ）および適切なリン酸化の達成のためには過剰な酵素；および／または基質アナログを含み得る。
【０１２０】
上記の発明は、理解の明瞭化を目的として、図および実施例により、ある程度詳細に記載されるが、本発明の教示を考慮に入れて、添付の請求の範囲の精神または範囲から離れることなく、いくつかの変更および改変が、本発明に対してなされ得ることは、当業者には、容易に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】図１は、本発明の一つの実施形態に従って構築された基板の透視図である。
【図２Ａ】図２Ａは、目的の配列およびＣ末端コイルドコイルドメインを含む、プラスミドｐＥＴ−１７ｂの特徴および関連した制限部位を示す地図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、目的の配列およびＮ末端コイルドコイルドメインを含む、プラスミドｐＥＴ−１７ｂの特徴および関連した制限部位を示す地図である。
【図３】図３は、本発明の一つの実施形態に従って構築された、各ウェル中に複数のポリペプチドサブユニットの内の一つを含むマルチサブユニット複合体組成物の、図１の矢印３−３の向きにとった断面図である。
【図４】図４Ａ〜図４Ｄは、本発明の一つの実施形態における、マルチサブユニット複合体の個々のサブユニットポリペプチドのアセンブリにおける工程を図示する。
【図５】図５Ａ〜図５Ｂは、混合物としてサブユニットポリペプチドを添加することによる、マルチサブユニット複合体のアセンブリにおける工程を図示する。
【図６】図６は、本発明の一つの実施形態に従って構築された基板の図である。
【図７】図７は、コントロール（ＧＦＰを加えたＫコイルプレート）およびＥ−ＧＦＰのみを含む標準ＭＳプレート（それぞれ、中央パネルおよび下パネル）とともに、Ｅ−ＧＦＰを加えたＫコイルプレート（上パネル）の例を示す。
【図８】図８は、本発明の一つの実施形態に従った、酵素機能を有する生体機能チップを図示する。
【図９】図９は、本発明の一つの実施形態に従った、Ａｂｌプロテインチロシンキナーゼのチップ上でのリン酸化を図示する。
【図１０】図１０は、本発明の一つの実施形態に従って添加された種々の基質濃度（０ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭおよび３００ｎＭ）を有する、ウサギ網状赤血球抽出物中のチップ上でのリン酸化を図示する。
【図１１】図１１は、インビトロでのＡｂｌ  ＰＴＫ基質発現およびコントロールのＭＡＬＤＩ  ＭＳスペクトルを示す。
【図１２Ａ】図１２Ａは、リン酸化基質に対してリン酸化シグナルを表現するグラフである。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、リン酸化基質に対してリン酸化シグナルを表現するグラフである。
【図１３】図１３は、同じスケールおよび異なるスケールにおける、リン酸化ピークに対して標準化されたスペクトルの再現性を示す。
【図１４】図１４は、基質リン酸化を阻害する能力について、試験化合物（ＡＴＰのアナログであるＡＴＴＰ（漸増濃度のＡＴＴＰにて阻害する））をスクリーニングするための本発明の適用を示す。
【図１５】図１５は、ＡＴＰアナログであるゲニステインによるリン酸化の阻害を示す。
【図１６】図１６は、基質アナログであるエルブスタイン（Ｅｒｂｓｔａｉｎ）によるリン酸化の阻害を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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