(57)【要約】本発明は、アミノ酸の鏡像体分割のための新規な酵素的方法に関する。詳しくは、そのアミノ酸の鏡像体の分割方法は、アミノ酸のラセミ混合物をグルタル酸無水物で次いで酵素グルタリル-7-ACAアシラーゼで処理することよりなり、そのアミノ酸の一方の鏡像体が回収され、他方の鏡像体は対応するグルタリルアミド誘導体の形で残存する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸のラセミ混合物をグルタル酸無水物で、そして次に酵素グルタリル−７−ＡＣＡアシラーゼで処理して、そのアミノ酸の一方の鏡像体を回収し、他方の鏡像体は対応するグルタリルアミド誘導体の形で残存するものとして回収することよりなるアミノ酸の鏡像体の分離方法。
【請求項２】
アミノ酸が一般式（Ｉ）
【化１】
2005501561.tif 000012
（式中、ｎは０、１、２、３、４、５または６から選ばれた整数であり、
Ｒは水素原子またはアルキル、アルケン、アルキン、シクロアルキル、アリール基、縮合多環式炭化水素もしくは複素環を表し、これらの基の全ては場合により置換されており、そして、
Ｒ’はアルキル、アルケン、アルキン、シクロアルキル、アリール基、縮合多環式炭化水素、複素環、またはアルキル、アリール、シクロアルキル基もしくは複素環で置換されたオキシ、チオ、スルホキシドまたはスルホニル基であり、これらの基の全ては場合により置換されている）
を有することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
アミノ酸が一般式（Ｉ）
【化２】
2005501561.tif 000013
（式中、ｎは０、１、２または３から選択された整数であり、Ｒは水素原子またはアルキルもしくはアリール基を表し、Ｒ’は請求項２で定義したとおりである）
の化合物から選ばれることを特徴とする、請求項２記載の方法。
【請求項４】
アミノ酸が一般式（Ｉ）
【化３】
2005501561.tif 000014
(式中、ｎは０、１または２に等しい整数であり、Ｒは水素原子またはアルキル基であり、Ｒ’は場合により置換された複素環またはアリールから選ばれる)
の化合物から選択されることを特徴とする、請求項２または３記載の方法
【請求項５】
酵素グルタリル−７−ＡＣＡアシラーゼが可溶性または不溶性の形で使用されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
用いられる酵素の量が、出発のアミノ酸(基質)の総量に対して基質１mmole当たり１〜１００単位であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
反応を、緩衝化された水溶液中で行うことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
水溶性緩衝液が１０mMと２００mMの間の濃度であり、pH５〜６.５で使用し得る酢酸緩衝液、pH６.５〜８で使用し得るリン酸緩衝液およびpH８〜９で使用し得るピロリン酸緩衝液から選択されることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
pHがモニターされ、６〜９に調節されることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
アミノ酸とグルタル酸無水物との処理が２０℃と４０℃の間の温度で行われることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
酵素グルタリル−７−ＡＣＡアシラーゼによる処理が１０℃と５０℃の間の温度で行われることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
反応時間が１時間と１００時間の間で変化することを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
(Ｒ)と(Ｓ)の鏡像体が追加的に分離されることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
(Ｒ)と(Ｓ)の鏡像体の分離が、濾過、抽出、クロマトグラフィーまたは結晶化によって行われることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
分離されたグルタリルアミドから得られた鏡像体をさらに加水分解し対応するアミノ酸を鏡像体の形で回収することを特徴とする、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
次の工程：
ａ）アミノ酸のラセミ混合物をグルタル酸無水物で、そして次に酵素グルタリル−７−ＡＣＡアシラーゼで処理して、そのアミノ酸の一方の鏡像体を回収し、他方の鏡像体は対応するグルタリルアミド誘導体の形で残存するものとして回収し、
ｂ）ついでこのようにして得られた２つの鏡像体を分離する、
よりなるアミノ酸の鏡像体を分離する方法。
【請求項１７】
次の工程：
ａ）アミノ酸のラセミ混合物をグルタル酸無水物で、そして次に酵素グルタリル−７−ＡＣＡアシラーゼで処理し、そのアミノ酸の一方の鏡像体を回収し、他方の鏡像体は対応するグルタリルアミド誘導体の形で残存するものとして回収し、
ｂ）ついでこのようにして得られた２つの鏡像体を分離し、そして
ｃ）グルタリルアミドから得られる鏡像体を加水分解して対応するアミノ酸を鏡像体の形で回収する、
よりなるアミノ酸の鏡像体を分離する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラセミ混合物の形態のアミノ酸の鏡像体分割をする新規な酵素的方法に関係する。
【背景技術】
【０００２】
アミノ酸は、あらゆる種類の産業、例えば生理学的に活性な化合物としてまたは合成中間体として、特に医薬品、化学品あるいは農業用目的において頻繁に使用される。従って、これらのアミノ酸の一方もしくは他方の光学的に活性な鏡像体を入手できることが多くの場合必要であることが急速に明らかになった。プロ−キラルアミノ酸の鏡像体を分離するための多数のルートが開発された。特に、それらの鏡像体分割する酵素的方法は、不斉合成手段に代わる有利な一方法であることが分かった。
【０００３】
そこで、Soloshonok等（Tetrahedron: Assymetry、Vol. 6(7)巻、1995, pp.1601-1610）は、次の反応スキームに従ってβ−アミノ酸の鏡像体分割のために酵素的方法を使用した。
【化１】
2005501561.tif 000002
【０００４】
同様に、Topgi等（Bioorg. & Med. Chem. 1999, vol. 7、pp.2221-2229）は、エチル３−アミノ−４−ペンチノエートの(Ｒ)および(Ｓ)鏡像体を次の反応スキームのうちの１つに従って鏡像体的に純粋な形に分割する工程を開発した。
【化２】
2005501561.tif 000003
【０００５】
出発のフェニル酢酸アミドは、対応するアミンをフェニル酢酸との反応によってアシル化すること等によって得られる。
【化３】
2005501561.tif 000004
【０００６】
特許出願WO 98／50575は、キラル型β−アミノ酸を製造する方法をもっと一般的に記述しており、それはそのβ−アミノ酸のラセミ混合物の鏡像体の一方を立体選択的にアシル化し対応するＮ−アシル化された誘導体とするに適切な条件において、そのアミノ酸のラセミ混合物をアシル供与体および酵素ペニシリンＧアシラーゼ（またはアミドヒドロラーゼ）と接触させ、β−アミノ酸の他方の鏡像体を鏡像体的に濃縮された形態で得ることからなり、次の反応スキームで表わされる。
【化４】
2005501561.tif 000005
【０００７】
その“アシル供与体”は次の一般式を有する。
【化５】
2005501561.tif 000006
式中、Ｒ3は、フェニル、フェノキシ、アミノ、フェニルの種々の誘導体、およびピリジルから選ばれ、Ｒ4は置換基ヒドロキシル、アルコキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、糖またはステロイドから選ばれる。
【０００８】
特許出願WO 98／50575は、さらに、キラル型β−アミノ酸を製造するもう一つの別法を記述しており、それは、ラセミ型のアミドの鏡像体の一方を選択的に脱アシル化し対応するβ−アミノ酸にするのに適切な条件の下でラセミ型のアミドを酵素ペニシリンGアシラーゼと接触させアミドの他方の鏡像体を鏡像体的に濃縮された形態で得ることからなり、次のスキームで表わされる。
【化６】
2005501561.tif 000007
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、上記において議論された方法は、その酵素的段階に先立ってあるいは同時に、その式が以下のように要約される中間体アミドを経由して、進行するという大きな欠点がある。
【化７】
2005501561.tif 000008
【００１０】
そのようなアミドは、芳香核の存在により、水性媒体に不溶性であるという欠点を持っている。例えば、ある酵素は水性媒体において可溶であるが、多くの場合有機溶媒の存在に敏感であることが知られている。しかしながら、酵素反応の収率を最適化することができるためには、酵素に対して基質が充分な溶解度を持つことが、それらを充分に接触させるために重要である。本発明が解決しようとするのは主としてこの欠点である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は第一にアミノ酸の鏡像体を分離する新規な方法に関し、そのアミノ酸のラセミ混合物をグルタル酸無水物で、そして次に酵素グルタリル−７−ＡＣＡアシラーゼで処理して、そのアミノ酸の一方の鏡像体を回収し、他方の鏡像体は対応するグルタリルアミド誘導体の形で残存するものとして回収することからなる。
【００１２】
グルタル酸無水物の使用によって、出発のアミノ酸に対応するグルタリルアミド誘導体を経由して中間的に進行することを可能にし、そしてグルタリル基がその分子に水性媒体中での溶解度を付与するのでこの方法は特に有利である。従って、本発明の方法は、温和な反応条件下でまた水性媒体中で、つまり特には有機性の共溶媒を用いないで行うことができる。
【００１３】
本発明の方法は、さらに、全ての型のアミノ酸（α、β、γなど）に広範囲に応用できるという利点を有する。本発明において、一般的用語「アミノ酸」はアミノ酸（すなわちアミノ基および酸基−ＣＯＯＨを有する化合物）のみならず対応するエステル誘導体（すなわち酸基がエステル基ＣＯＯＲで置換された化合物）をも包含する。好ましくは、本発明の方法はさらに特定的には一般式（Ｉ）のアミノ酸に適用される：
【００１４】
【化８】
2005501561.tif 000009
式中、ｎは０、１、２、３、４、５または６から選ばれた整数であり、
Ｒは水素原子またはアルキル、アルケン、アルキン、シクロアルキル、アリール基、縮合多環式炭化水素もしくは複素環を表し、これらの基の全ては場合により置換されており、そして、
Ｒ’はアルキル、アルケン、アルキン、シクロアルキル、アリール基、縮合多環式炭化水素、複素環、またはアルキル、アリール、シクロアルキル基もしくは複素環で置換されたオキシ、チオ、スルホキシドまたはスルホニル基であり、これらの基の全ては場合によりさらに置換されている。
【００１５】
したがって、アミノ酸が一般式（Ｉ）である場合には、本発明の方法は図１の反応スキームによって表わすことができる。 このスキームは、グルタル酸無水物によって処理する第１の工程および酵素グルタリル−７−ＡＣＡアシラーゼによって処理する第２の工程を示す。得られた生成物のそれぞれ、つまり一方ではアミノ酸他方ではグルタリルアミド誘導体の立体配置は、基Ｒ’の性質に依存する。
【００１６】
本発明における、アルキル、アルケンおよびアルキン基は、一般に直鎖状または分枝鎖状の1〜30の炭素原子を含むが、これは如何なる意味でも制限的なものではない。このことは、これらの基が他の基の置換基である場合にも当てはまる。好ましくは、これらの基は直鎖状あるいは分枝鎖状の１〜２０の炭素原子を含んでおり、より好ましくは、直鎖状または分枝鎖状の１〜１０の炭素原子を含む。アルキル基は、例えば メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デシル、ｎ−ウンデシル、ｎ−ドデシル、ｎ−トリデシル、ｎ−ペンタデシル、ｎ−ヘキサデシル、ｎ−ヘプタデシル、ｎ−オクタデシル、イソプロピル、イソブチル、イソペンチル、イソヘキシル、３−メチルペンチル、ネオペンチル、ネオヘキシル、２、３、５−トリメチルヘキシル、sec−ブチル、tert−ブチル、tert−ペンチルから選択することができる。好ましいアルキル基は、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｎ−ヘキシルおよびイソヘキシルである。アルケン基は、例えばビニル、１−プロペニル、アリル、ブテニル、２−メチル−ｌ−プロペニル、２−メチル−２−プロペニルまたは３−メチル−２−ブテニルから選ぶことができる。 アルキン基は、例えばエチニル、１−プロピニルまたはプロパルギルから選ぶことができる。
【００１７】
本発明においては、シクロアルキル基は一般に３〜１２の炭素原子を含んでいる。それらは、好ましくはシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シコロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシル、シクロウンデシルおよびシクリドデシルから選ぶことができる。 本発明の別の態様では、シクロアルキル基は多環であってもよい。 好ましくは、これらの基はビシクロアルキルまたはトリシクロアルキルから選ばれる。
【００１８】
本発明によれば、用語“アリール”基は一価の芳香族炭化水素基のことである。アリール基の中でも場合により置換されたフェニル基が好ましい。
【００１９】
本発明においては、縮合多環式炭化水素なる用語は好ましくはペンタレン、インデン、ナフタリン、アズレン、ヘプタレン、ビフェニレン、as-インダセン、s-インダセン、アセナフチレン、フルオレン、フェナレン、フェナントレン、アントラセン、フルオラセン、アセフェナンスリレン、アセアンスリレン、トリフェニレン、ピレン、クリセン、ナフタセン、プレイアデン、ピセン、ペリレン、ペンタフェン、ペンタセン、テトラフェニレン、ヘキサフェン、ヘキサセン、ルビセン、コロネン、トリナフタレン、ヘプタフェン、ヘプタセン、ピラントレンまたはオバレンから選ばれる基を意味する。
【００２０】
本発明においては、用語“複素環”は、１つ以上のヘテロ原子を含んでいる単環式または縮合多環式化合物を意味し、それぞれの環は３〜１０員で構成されている。本発明の複素環は、好ましくは３〜１０員で構成された環の中に酸素、硫黄および窒素から選ばれた１〜３つのヘテロ原子を含んでいる。 本発明の複素環式は、好ましくはチオフェン、ベンゾ[b]チオフェン、ナフト[2,3-b]チオフェン、チアントレン、フラン、２Ｈ−ピラン、イソベンゾフラン、２Ｈ−クロメン、キサンテン、フェノキサチイイン、２Ｈ−ピロール、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インダゾリン、イソインドール、３Ｈ−インドール、インドール、１Ｈ−インドール、プリン、４Ｈ−キナゾリン、 イソキノリン、キノリン、フタラジン、１,８−ナフチルピリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、４ａＨ−カルバゾール、カルバゾール、β−カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、ペリミジン、１,７−フェナントロリン、フェナジン、フェナルサジン、イソチアゾール、フェノチアジン、イソオキサゾール、フラゾン、フェノキサジン、イソクロマン、ピロリジン、△２−ピロリン、イミダゾリジン、△２−イミダゾリン、ピラゾリジン、△３−ピラゾリン、ピペリジン、ピペラジン、インドリン、イソインドリン、キヌクリジンおよびモルホリンから選択される。
【００２１】
本発明においては、上に定義されるような様々な基が置換される場合、その基の性質に応じて、その置換基は一般にハロゲン原子、アリール、複素環、ヒドロキシル、アルコキシル、アリールオキシ、チオール、アルキチオ、アリールチオ、アルキルスルホキシド、アリールスルホキシド、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、シアノ、ニトロ、スルホンアミド、アルキルスルホンアミドおよびアリールスルホンアミド基から選択される。好ましくは、上に定義される各種の基は、１、２または３置換される。好ましい態様によれば、ハロゲン原子は、塩素、フッ素、臭素およびヨウ素から選ばれる。アルキル基がハロゲン原子によって置換される場合、その原子は好ましくはフッ素原子である。フッ素置換基の数は好ましくは１、２、３、４、５、６または７である。例えば、その基はトリフルオロメチルであることができる。
【００２２】
本発明のアミノ酸は、好ましくは一般式（Ｉ）においてｎが０、１、２または３から選ばれた整数であり、Ｒが水素原子またはアルキルまたはアリールであり、Ｒ’が上記に定義したものである化合物から選ばれる。
【００２３】
さらに好適には、本発明のアミノ酸は、ｎが０、１または２に等しい整数であり、Ｒは水素原子またはアルキル基であり、Ｒ’は場合により置換された複素環またはアリールから選ばる一般式（Ｉ）の化合物から選ばれる。後者において、アリールおよび／または複素環基は好ましくは１、２または３置換される。
【００２４】
酵素グルタリル−７−ＡＣＡアシラーゼは、既に多数の工業的方法の中で触媒として、特にＮ−グルタリル−７−アミノアセトキシセファロスポリン酸のようなβ−ラクタム類の加水分解に使用されてきた。それは、例えばアシネトバクター（Acinetobacter）、アースロバクター（Arthrobacter）、バチルス(Bacillus)、シュードモナス（Pseudomonas)、ステノトロホモナス(Stenotrophomonas)またはキサントモナス（Xanthomonas）属の多数の微生物から、当業者である酵素専門家によく知られた方法によって得られる。酵素グルタリル-7-ACAアシラーゼは、例えばロッシュ  ダイアグノスチック社(Roche Diagnostic GmbH: Roche Molecular Biochemicals, Standhofer Strasse 116、D-68305 Mannheim)またはレコルダチ エス ピー エー（Recordati S.p.A, Stabilimento di opera, Via Lambro 38, I-20090 (MI)）から市販されている。
【００２５】
酵素グルタリル−７−ＡＣＡアシラーゼは、その立体特異性とその立体選択性を変更しないで、様々な形で使用することができる。例えば、グルタリル-7-ACAアシラーゼは可溶性の状態または固定化された状態で使用すすることが出来る。この第２の場合には、酵素は当業者によく知られた方法によって一般的に固定化される。例えば、酵素は高分子状ゲルに含有されまたは固体支持体に共有結合、架橋、吸着またはカプセル化によって結合される。一般に使用される適切な支持体は、例えば一般に用いられているもの、例えば多孔性ガラス、多孔質セラミックス、合成高分子(例えばポリスチレン、ポリビニルアルコール、ポリエチレン、ポリアミドまたはポリアクリルアミド)または天然起源の高分子（例えばセルロース）である。
【００２６】
酵素グルタリル−７−ＡＣＡアシラーゼの使用によって、各鏡像体を高いエナンチオマー余剰(“ee”）、特には９０％相当かそれ以上、または９５％相当かそれ以上、好ましくは９９％相当かそれ以上で得ることができる。本発明において、「エナンチオマー過剰」はラセミ型混合物に関する鏡像体の一方の余剰％を意味する。詳しくは、エナンチオマー余剰は次のようにして計算される。
【００２７】
【数１】
2005501561.tif 000010
ここで[Ｒ]と[Ｓ]は、それぞれ(Ｒ)および(Ｓ)鏡像体の濃度を意味する。
【００２８】
一般に、出発のアミノ酸(基質)の合計量に対して、使用される酵素の量は、基質１mmole当たり１〜１００単位(Ｕ)、好ましくは基質１mmole当たり１０〜４０単位である。酵素の１単位は、当業者に知られている標準的なpHおよび温度条件の下で毎分１μmolのＮ−グルタリル−７−アミノアセトキシセファロスポリン酸を加水分解するに要する酵素量に相当する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明によれば、反応は場合により緩衝された水性溶媒中で行われる。この場合、水性緩衝液は、１０mM〜２００mMの濃度で、pH５〜６.５で用いられる酢酸緩衝液、またはpH６.５〜８で用いられるリン酸緩衝液、またはpH８〜９で用いられるピロリン酸緩衝液から選ぶことができる。
【００３０】
したがって、発明の方法はpHをモニターして６〜９に調節した媒体中で実施される。好ましくは、反応媒体のpHをモニターして特に７.５〜８.５、さらに好ましくは８〜８.５に調節する。pHは、例えば塩酸、硫酸あるいはリン酸のような酸、および例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウムあるいはアンモニア水のような塩基の添加によってpH−スタット（pH-stat）を用いてモニターすることができる。
【００３１】
本発明によるグルタル酸無水物によるアミノ酸の処理は、２０℃〜４０℃、好ましくは２５℃〜３５℃の温度で行う。さらに、酵素グルタリル−７−ＡＣＡアシラーゼを使用する第２の工程は１０℃〜５０℃、好ましくは２５℃〜３５℃の温度で行う。
【００３２】
最後に、反応時間は１時間と１００時間の間で広範に変化し、主として用いられるアミノ酸および酵素濃度に依存する。一般に、満足なエナンチオマー余剰の鏡像体を得るために必要なだけ長く反応を進行させる。得られたキラル型のアミノ酸量およびエナンチオマー余剰は、当業者に知られている従来の技術を用いてモニターされる。好ましくは、モニタリングはＨＰＬＣ(高速液体クロマトグラフィー)によって実施する。
【００３３】
本発明によれば、上に記述された方法によって得られた(Ｒ)と(Ｓ)の鏡像体は、その一方が水性媒体に可溶性のアミンの形で存在し、他方は固体のアミドの形で存在するという事実に基づき容易に分離される。従って、本発明の更なる主題は、引き続く工程として(Ｒ)と(Ｓ)の鏡像体を分離する上述の工程に関する。
【００３４】
前述の(Ｒ)および(Ｓ)鏡像体の分離は、当業者に知られている従来の技術によって容易に実行し得る。これは、例えば濾過、抽出、クロマトグラフィーまたは結晶化によって行われる。
【００３５】
他方の鏡像体をグルタリルアミド誘導体の形ではなくアミノ酸の形で分離することが望まれる場合には、上述の方法で分離されたグルタリルアミド誘導体の当該鏡像体を加水分解し、対応するアミノ酸を鏡像体の形で回収する。加水分解は用いた化合物の立体化学を保持し、キラル型のグルタリルアミド誘導体のラセミ化を起こさない点でこの方法は優れており注目される。アミノ酸が一般式（Ｉ）のものである場合、この追加工程は、図２による反応スキームによって表わされる。
【００３６】
加水分解は、当業者に知られている従来の技術に従って実行される。その加水分解は特に酸性あるいは塩基性での加水分解であり得る。後者の場合では、例えば水酸化ナトリウムのような塩基の存在において５０℃と９０℃の間の温度で、および大気圧下で実施される。しかしながら、当業者に知られている適当な他のいかなる操業条件を使ってもよい。
【００３７】
本発明は、ラセミ型のアミノ酸を分割し、そのことによってそのアミノ酸の一方または他方の鏡像体を入手することを可能にし、それらの鏡像体はとくに合成中間体となる。
【００３８】
例示すれば、本発明によって(Ｓ)−３−アミノ−３−フェニルプロパン酸が製造され、それは特に喘息に関与するＶＬＡ４受容器アンタゴニストである一般式
【化９】
2005501561.tif 000011
の合成中間体となる。
【００３９】
先の記述と同様に、本発明は、その範囲を制限することなく例示として考慮されるべき次に記載する実施例から明らかとなる特徴および利点をも包含する。
【００４０】
〔図面〕
図１は、本発明の一般式(Ｉ)のアミノ酸をグルタル酸無水物で処理する第１工程、および酵素グルタリル−７−ＡＣＡアシラーゼで処理する第２工程の概要を表す。得られた生成物の各々、すなわち一方のアミノ酸および他方のグルタリルアミド誘導体の配置は、基Ｒ’の性質に依存する。
【００４１】
図２は、キラル型グルタリルアミド誘導体を対応するアミノ酸へ加水分解によって変換する概要を表す。
【００４２】
［実施例１］
ラセミ型3-アミノ-3-(4'-ニトロフェニル)-プロパン酸の分割
ａ）ラセミ型3-アミノ-3-(4'-ニトロフェニル)-プロパン酸のアシル化
ラセミ型の3-アミノ-3-(4'-ニトロフェニル)-プロパン酸40.6ｇを蒸留水200mlおよびトリエチルアミン55mlに溶解した。グルタル酸無水物29.4gを少量ずつ添加し、反応混合物を１時間攪拌した。その後、反応混合物を95%(重量/容量)の硫酸8.2mlで酸性化した。このようにして得られた沈殿を濾取し、蒸留水15mlで３回洗浄し、55℃で真空下において恒量となるまで乾燥した。こうしてラセミ型の3-(グルタリルアミド)-3-(4'-ニトロフェニル)プロパン酸52.84ｇを得た。得られた生成物の性質はHPLC(高速液体クロマトグラフィー)によって決定した。
【００４３】
ｂ）懸濁液中における結晶性グルタリル-7-ACAアシラーゼによる酵素的脱アシル化(100mlの反応器)
先の工程で得られた酸20gを蒸留水75mlに溶解した。30％(重量／容量)の水酸化ナトリウムを11.2ml加えることにより、懸濁液のpHを8.2に調節した。結晶性グルタリル-7-ACAアシラーゼの懸濁液826mg(626単位)をこの溶液に添加した。反応混合物を35℃で51時間攪拌し、この間pHをモニターして7.9〜8.1に調節した。反応終了後、反応混合物を20℃に冷却し、5N塩酸を加えることによりpHを7.0に調節した。ついで、エタノール20mlを添加した。生成する(R)-3-アミノ-3-(4'-ニトロフェニル)プロパン酸の沈殿を濾取し、エタノール30mlで３回洗浄し、45℃で真空下において恒量となるまで乾燥した。これにより、エナンチオマー余剰が99％以上の(R)-3-アミノ-3-(4'-ニトロフェニル)プロパン酸5.65ｇを得た。
【００４４】
母液を5N塩酸の17.5mlで酸性化した。生成する沈殿を濾取し、蒸留水10mlで2度洗浄した。得られた濾過ケーキを45℃で真空下において恒量となるまで乾燥した。こうして、(S)-3-(グルタリルアミド)-3-(4'-ニトロフェニル)プロパン酸および(R)-3-(グルタリルアミド)-3-(4'-ニトロフェニル)プロパン酸の8.25gをその比率91:9として得た。得られた生成物の性質はHPLCによって決定した。
【００４５】
ｃ）ロッシュ イアグノスチック社(Roche Diagnostic GmbH)から入手した固定化グルタリル-7-ACAアシラーゼを使用する酵素的脱アシル化(100mlの反応器)
工程ａ）で得られた酸20.5ｇを蒸留水75mlに溶解した。30％(重量／容量)の水酸化ナトリウムを11.9ml加えることにより、懸濁液のpHを、8.2に調節した。湿った固定化グルタリル-7-ACAアシラーゼ(ロッシュ イアグノスチック社)6.2ｇ(632.4単位)をこの溶液に加えた。反応混合物を35℃で18時間攪拌し、この間pHをモニターし7.9〜8.1に調節した。反応終了後、30％(重量／容量)の水酸化ナトリウムの添加によって反応混合物のpHを9.5に
調節し、反応混合物の容量を200mlに調節し、生成した(R)-3-アミノ-3-(4'-ニトロフェニル)プロパン酸を溶解した。固定化酵素を濾過によって除去し、5N塩酸の添加によって母液のpHを7.0に調節した。ついで、エタノール50mlを反応混合物に添加した。沈殿した(R)-3-アミノ-3-(4'-ニトロフェニル)プロパン酸を濾取し、エタノール10mlで洗浄し、45℃で真空下において恒量となるまで乾燥した。こうして、98％に相当するエナンチオマー余剰の(R)-3-アミノ-3-(4'-ニトロフェニル)-プロパン酸5.375ｇを得た。
【００４６】
母液を5N塩酸の20mlで酸性化した。生成する沈殿を濾取し、蒸留水15mlで２度洗浄した。濾過ケーキは45℃で真空下において恒量となるまで乾燥した。こうして、比率94:6の(S)-3-(グルタリルアミド)-3-(4'-ニトロフェニル)プロパン酸６ｇを得た。得られた生成物の性質はHPLCによって決定した。
【００４７】
ｄ）懸濁液中における結晶性グルタリル-7-ACAアシラーゼを用いる酵素的脱アシル化(500mlの反応器)
工程ａ）で得られたラセミ型3-(グルタリルアミド)-3-(4'-ニトロフェニル)プロパン酸100ｇを蒸留水400mlに溶解した。30％(重量／容量)の水酸化ナトリウムを60ml加えることにより、懸濁液のpHを8.2に調節した。結晶性グルタリル-7-ACAアシラーゼの懸濁液6.4mg(4653単位)をこの溶液に添加した。反応混合物を35℃で30時間攪拌し、この間pHをモニターし7.9〜8.1に調節した。反応終了後、反応混合物を20℃に冷却し、30％(重量／容量)の水酸化ナトリウムの25mlの添加によってpHを13に調節し、生成した(R)-3-アミノ-3-(4'-ニトロフェニル)プロパン酸を溶解した。不溶性の粒子を濾過し、36％の塩酸の27mlの添加によって母液のpHを7.0に調節した。その後エタノール100mlを反応混合物に添加した。得られた(R)-3-アミノ-3-(4'-ニトロフェニル)プロパン酸の沈殿を濾取し、エタノール100mlで2度洗浄し、45℃で真空下において恒量となるまで乾燥した。こうして、97％に等しいエナンチオマー余剰の(R)-3-アミノ-3-(4'-ニトロフェニル)プロパン酸28.87ｇを得た。得られた生成物の性質はHPLCによって決定した。
【００４８】
［実施例２］
ラセミ混合物の形の3-アミノ-3-フェニルプロパン酸の分割
ａ）ラセミ型の3-アミノ-3-フェニルプロパン酸のアシル化
ラセミ型の3-アミノ-3-フェニルプロパン酸488ｇを、水酸化ナトリウム236ｇをペレットの形で含む蒸留水２リットルに溶解した。グルタル酸無水物437.5gを20℃で攪拌下に１時間かけて反応混合物に少量ずつ添加した。１時間後に反応混合物を95％(重量／容量)の硫酸の236mlで酸性化し、10℃に冷却する。成形された沈殿を濾過し蒸留水600mlで３回洗浄した。ラセミ型の3-グルタリルアミド-3-フェニルプロパン酸602ｇを含む、重さ1610ｇの湿った濾過ケーキを得た。得られた生成物の性質はHPLCによって決定した。
【００４９】
ｂ）懸濁液中における結晶性グルタリル-7-ACAアシラーゼを用いる酵素的脱アシル化(5リットルの反応器)
ラセミ型の3-グルタリルアミド-3-フェニルプロパン酸589ｇを含む、先に得られた湿った濾過ケーキ1575ｇを蒸留水1610mlに溶解した。30％(重量／容量)の水酸化ナトリウム440mlを加えることにより、懸濁液のpHを8.0に調節した。結晶性グルタリル-7-ACAアシラーゼの懸濁液52.6ｇ(32,000単位)をこの溶液に添加した。反応混合物を35℃で41時間攪拌し、この間pHをモニターしながら7.9〜8.1に調節した。反応終了後、反応混合物を20℃に冷却し、30％(重量／容量)の水酸化ナトリウムの25mlを添加してpHを13に調節すると、生産された(R)―3-アミノ-3-フェニルプロパン酸は溶解した。不溶性の粒状物を濾過し、36％の塩酸27mlを添加して母液のpHを7.0に調節した。
生じる(R)―3-アミノ-3-フェニルプロパン酸の沈殿を濾取し、蒸留水150mlで洗浄し、45℃で真空下で恒量となるまで乾燥した。これにより、98％に相当するエナンチオマー余剰の(R)―3-アミノ-3-フェニルプロパン酸96.9ｇが得られた。
【００５０】
95％(重量／容量)硫酸の180mlで母液を酸性化した。このようにして形成された沈殿を濾取し、冷却された蒸留水400mlで２度洗浄した。濾過ケーキを45℃で真空下で恒量となるまで乾燥した。こうして(S)-3-(グルタリルアミド)―3-フェニルプロパン酸および(R)-3-(グルタリルアミド)―3-フェニルプロパン酸314.6ｇをその比率90:10で得た。得られた生成物の性質はHPLCによって決定した。
【００５１】
ｃ）塩基性加水分解による(S)―3-グルタリルアミド-3-フェニルプロパン酸の脱アシル化
先の工程ｂ）で得られた(S)-3-グルタリルアミド―3-フェニルプロパン酸および(R)-3-グルタリルアミド―3-フェニルプロパン酸の比率が90:10である混合物557.2ｇを、蒸留水3.91リットルおよび30％(重量／容量)の水酸化ナトリウムの1.65リットル中に溶解した。反応混合物は４日間70℃で攪拌した。
【００５２】
その後、反応混合物は15℃に冷却した。得られた生成物は、37％(重量／容量)の塩酸3.21リットルを添加してpH6.9に調節することにより沈殿させ濾取し、45℃真空下において恒量となるまで乾燥された。こうして、98％以上のエナンチオマー余剰の(S)―3-アミノ-3-フェニルプロパン酸および(R)−3-アミノ-3-フェニルプロパン酸が得られた。得られた生成物の性質はHPLCによって決定された。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】グルタル酸無水物によってアミノ酸を処理する第１工程、および酵素グルタリル−７−ＡＣＡアシラーゼによる第２工程の概要を表す。
【図２】キラル型グルタリルアミド誘導体を対応するアミノ酸へ加水分解して変換する概要を表す。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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