(57)【要約】本発明は、新しい菌種、放線菌ストレプトミセスflavidovirensを用いて最適な発酵パラメーターのもとで発酵によるプラバスタチンナトリウム塩製造の改良方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
新種の菌、放線菌ストレプトミセスflavidovirens BICC 6826。
【請求項２】
微生物による一般式２の基質化合物（Ｒは、アルカリ金属かアンモニウムイオン）から式１の化合物の製造方法は、
１）式２の化合物を６β−ヒドロキシル化できる放線菌ストレプトミセスflavidovirensの１菌種の種となる接種材料を準備する
【化１】
2005503174.tif 000004
【化２】
2005503174.tif 000005
２）前記種接種材料を生産培養液に植菌する
３）前記生産培養液を発酵させる
４）形質転換させる基質を異なる間隔で前記生産培養液に供給する
５）発酵の間、炭素供給源を供給する事によってＰＨ調製を行う
６）生物変換が終わるまで基質を発酵する
７）すべてのセルブイヨンを抽出し、式１の化合物を分離する
８）式１の化合物を単離する
工程を含む。
【請求項３】
請求項２記載の工程において、放線菌ストレプトミセスflavidovirens菌種は、放線菌ストレプトミセスflavidovirens BICC 6826であること。
【請求項４】
請求項２記載の工程において、放線菌ストレプトミセスflavidovirens菌種は、ＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zellkulturen GmbH(微生物と細胞培養のドイツの保管有限会社)）に受け入れ番号ＤＳＭ  １４４５５で寄託された放線菌ストレプトミセスflavidovirensであること。
【請求項５】
請求項１記載の種として使用の前記接種材料は胞子の懸濁液か栄養菌糸体であること。
【請求項６】
請求項１記載の工程において供給する基質はコンパクチン、コンパクチン塩又はコンパクチン誘導体であること。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新種の微生物  放線菌ストレプトミセスflavidovirens BICC 6826を用いたプラバスタチンナトリウム塩の製造及び精製方法 に関する。
【背景技術】
【０００２】
ロバスタチン、プラバスタチン、コンパクチン及びその誘導体、同族体はHMG-CoA還元酵素の薬効の高い阻害剤として知られており、抗高コレステロール血症試薬として、使用されている。ロバスタチン、プラバスタチン、コンパクチンは、それぞれ麹かびアスペルギルス、青カビペニシリウム、放線菌ストレプトミセス属に属する異なる種の微生物を使った発酵によって生産される。
【０００３】
特に高血漿コレステロールの予防や治療において長期間の条件でとり続けなければならない薬の生産物において、安全で有効な薬を製造するためには、活性成分の純度は、重要な要素である。低純度の薬剤の不純物の蓄積は、薬物治療中のたくさんの副作用をもたらすかもしれない。
【０００４】
微生物によって生産されたすべてのスタチンの中で、プラバスタチンは、より強い、かつコレステロール合成の高い組織選択的阻害を行う最適の薬である（Tsujita 等 Biochim Biophy Acta,1986,877,50-60）。プラバスタチンは、その前駆物質コンパクチン（ＭＬ−２３６Ｂとも呼ぶ）の微生物によるヒドロキシル化によって生産される。この生物変換は多数の微生物例えば、放線菌ストレプトミセス（US5,179,013,US4,448,979)、Nocardia、Amycolata,Saccharopolyspora,Amycolatopsis,Saccharothrix,Gibertella(EP0649907,WO 99/60151),Actinomadura(WO 96/40863),Mortierella(WO 00/46175)Norcardia(US5,830,695),Bacillus sp.(US6,245,535,WO99/07827)によっておこる。放線菌ストレプトミセスのたくさんの種例えばS.carbophilus,S.hastedii(JP4,349,034) S.flavovirens(WO99/10419), S.rosenchromogenous(US4,346,227), S.californicus(EP649907), S.exfoliatus(WO 98/45410)は、この生物変換を起こすことが知られている。
【０００５】
生物変換は、チトクロームｐ４５０依存系で酵素は培地中のコンパクチンの存在によって誘導される（Matsuoka等, European Journal of Biochemistry, 1989:184:707-713, Serizawa等「抗生物質のバイオ工学」WR Strohl著 1997)。コンパクチンは、効果的な生物変換のために、よく種培地にも添加される(WO 98/45410)。プラバスタチンの生産をはじめから１ステップで行わせるために真菌類の宿主（例えば Penicillium citrinum）に組み換えDNA操作によってこのシステムを発現させ、クローン化する試みが行われた(WO 99/10499)。しかしながら生産は、経済的に実行できなかった。放線菌ストレプトミセス種を用いた生物変換は、現在の所、まだ最も効果的なプラバスタチンの生産方法である。
【発明の開示】
【０００６】
現在の目的は、新しい放線菌の新株を用いて、コンパクチンの効果的変換、及び精製により、プラバスタチンナトリウム塩を提供することである。
【０００７】
それゆえに本発明は、プラバスタチンナトリウム塩の製造及び精製方法を提供し、
１）式２の化合物を６βーヒドロキシル化できる放線菌ストレプトミセスflavidovirensの１菌種の種となる接種材料を準備する
２）前記種接種材料を生産培養液に植菌する
３）前記生産培養液を発酵させる
４）形質転換させる基質を異なる間隔で前記生産培養液に供給する
５）発酵の間、炭素供給源を供給する事によってＰＨ調製を行う
６）生物変換が終わるまで基質を発酵する
７）すべてのセルブイヨンを抽出し、式１の化合物を分離する
８）式１の化合物を単離する
ことを特徴とする。
【０００８】
その工程において、放線菌ストレプトミセスflavidovirens菌種は、放線菌ストレプトミセスflavidovirens BICC 6826であること。
【０００９】
その工程において、放線菌ストレプトミセスflavidovirens菌種は、ＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zellkulturen GmbH(微生物と細胞培養のドイツの保管有限会社)）に受け入れ番号ＤＳＭ  １４４５５で寄託された放線菌ストレプトミセスflavidovirensであること。
【００１０】
その種として使用の前記接種材料は胞子の懸濁液か栄養菌糸体であること。
【００１１】
その工程において前記種培地の成分は、麦芽エキスかペプトンから選択されること。
【００１２】
その工程において前記種培地のＰＨは、滅菌前はＰＨ６．０から７．５であること。
【００１３】
その工程において前記種培地は、２５℃から３５℃において４０から５５時間培養されること。
【００１４】
その工程において前記生産培地の成分は、ぶどう糖一水和物、ペプトン又は酵母エキスから選択されること。
【００１５】
その工程において前記生産培地のＰＨは、滅菌前はＰＨ６．０から７．５であること。
【００１６】
その工程において前記生産培地は、２４℃から３５℃において４８から１４８時間培養されること。
【００１７】
その工程において供給する基質はコンパクチン、コンパクチン塩又はコンパクチン誘導体であること。
【００１８】
その工程において、ＰＨ調製のために供給される炭素源はサッカライドかグリセロールから選択されること。
【００１９】
本発明は、他の報告された方法に比べ、
１）放線菌ストレプトミセスflavidovirens  BICC 6826の新しい菌種であること
２）工程を経済的に、魅力的にする高い生物変換率
３）純粋な生産物を得るために単離と精製の工程が少ないこと
上記のような利点を持つ。
【００２０】
放線菌ストレプトミセスは、そのチトクローム系がよく研究されているため（EP 281245,US5,830,695)、最も一般的に微生物として使用されている。ストレプトミセスの中でも、S.flavidovirensは、S.exfoilatus（WO 98/45410）と違って栄養期に誘導を必要としないという生物変換において特異な利点を提供する。ここで生物変換は、コンパクチン濃度が栄養ブイヨン中0.05g/Lから10g/Lの間、多くの場合3g/Lから6g/Lの間の場合、４０％から９０％、多くの場合６０％から８０％おこる。
【００２１】
先行技術（例えば、Mortielella maculata WO 00/46175)で報告された、生物変換がゆっくりで発酵が１２日以上実行される多くの培養株と違って、S.flavidovirensは変換を２４時間以内から７日間好ましくは２日から５日の間に実行する。
【００２２】
以下に例を述べる。
【実施例１】
【００２３】
［種接種材料の調製］
培養斜面へ滅菌水３ｍｌを加えて作製した放線菌ストレプトミセスflavidovirens BICC 6826の胞子懸濁液約１００μＬを麦芽エキス３０g/L、ペプトン５g/Lを含む培地３５ｍｌを入れた２５０ｍｌ三角フラスコに加え、滅菌前のＰＨを６．８に調製する。種フラスコをロータリーシェーカー（回転数２００ｒｐｍ）で４８時間２８℃で培養する。
【実施例２】
【００２４】
［種接種材料の調製］
種接種材料は、胞子懸濁液をグリセロールに貯蔵された栄養菌糸体１ｍｌと置き換えて実施例１と同様の方法で調製された。
【実施例３】
【００２５】
［プラバスタチンの生物変換］
実施例２記載の種接種材料約０．５ｍｌを２５０ｍｌ三角フラスコ中のぶどう糖一水和物20g/L、ペプトン10g/L、酵母エキス1g/Lを含む生産培地３５ｍｌに移植した。接種前に培地は、ＰＨ７，０に調製し、フラスコは１２１℃で３０分滅菌した。
【００２６】
フラスコを、ロータリーシェーカー（回転数２００ｒｐｍ）で２８℃で培養した。培養２日後滅菌したコンパクチン水溶液のナトリウム塩を滅菌したぶどう糖飼料（５０％w/v)と共に加えた。生物変換は、２４時間後同条件で行った多数のフラスコの内の一つを採集することによって概算した。この操作は、累積的にコンパクチンが3mg/mlになるまで毎２４時間ごとに繰り返された。この実験の終わりに、採集したプラバスタチンの最高量は、約1.5g/mlであった。
【実施例４】
【００２７】
［プラバスタチンの生物変換］
２４時間ごとにコンパクチン水溶液と一緒に7mg/mlのぶどう糖飼料を加えること以外は実施例３記載と同様な方法で生物変換を２５０ｍｌ三角フラスコ中で行った。約2.0g/mlのプラバスタチンが培養１２０時間後フラスコ中から得られた。
【実施例５】
【００２８】
［プラバスタチンの生物変換］
生物変換を１．７Ｌの培地を入れた２Ｌの攪拌タンクバイオリアクターにて行った。実施例３に記載の培地成分に加えて、培地を高圧滅菌する前に0.1%(v/v)のシリコン泡止め剤を加えた。
【００２９】
種接種材料（３．５％）は、無菌的にバイオリアクターに移植され、２８℃で成長させられる。溶解酸素濃度を２５％飽和以上に保った。培養４８時間後約1mg/mlコンパクチン飼料を毎日加えた。コンパクチン飼料と一緒に毎回ぶどう糖飼料も加えた。反応混合物のＰＨは、要求があれば、ぶどう糖飼料を加えることによって７．６から８．０の間に保った。４日後1.6g/Lのプラバスタチンが生産された。
【実施例６】
【００３０】
［プラバスタチンの生物変換］
生物変換をコンパクチン飼料と一緒に糖は加えないこと以外は実施例５記載と同様の方法で行った。
【００３１】
約0.5mg/mlのコンパクチン飼料を、すべてのショット添加毎に加えた。反応混合物のＰＨは、要求があれば、ぶどう糖飼料を加えることによって８．４から８．６の間に保った。2.9g/Lのコンパクチン飼料の約４６％が発酵されプラバスタチンとして得られた。
【実施例７】
【００３２】
［プラバスタチンの生物変換］
生物変換をコンパクチンをアンモニウム塩として加えること以外は実施例３記載方法で行った。総コンパクチン飼料（2.9g/L）の内、０．９ｇがプラバスタチンとして測定された。
【実施例８】
【００３３】
［ブイヨンの抽出］
すべての発酵後のセルブイヨンを手に入れ、ＰＨを１２に調節し、一時間保持した。現在の総生産物の９０％は、上清に抽出された。
【実施例９】
【００３４】
［疎水性相互反応樹脂上でのスケールアップ研究］
疎水性相互反応性樹脂ＳＰ８２５はＸＫ２６／７０カラム（ファルマシア）に詰められた。実施例８でＰＨ１２で抽出され、濾過されたブイヨンを前平衡カラムを通し、プラバスタチンを捕捉した。ＰＨ１２の水を用いて洗浄し、メタノール溶出を行った。ブイヨン抽出物からの総回収率は９２％だった。
【実施例１０】
【００３５】
［２級アミンを用いたプラバスタチンの分離］
１０ｇのプラバスタチンナトリウム塩を含むHIC樹脂のメタノール抽出物８０ｍｌを希塩酸を用いてＰＨ４まで酸性にし、プラバスタチンの酸性型を同量の酢酸エチル中に抽出した。この中に１２０mole%のジベンジルアミンを加え、半時間攪拌し、４℃で１，２時間冷却した。プラバスタチンのジベンジルアミン塩は、濾過によって分離された。結晶は酢酸エチルで洗浄され、濾過し、乾燥された。９ｇ当量のプラバスタチン酸を含むプラバスタチンのジベンジルアミン塩が得られた。
【実施例１１】
【００３６】
［カプリル酸ナトリウム塩を用いたプラバスタチンナトリウム塩の沈降］
プラバスタチンアミン塩の約５ｇを乾燥し、１０％水酸化ナトリウム水溶液２０ｍｌに溶かした、酢酸エチルで洗浄し、希塩酸を用いてＰＨ４に調節した。その後同量の酢酸エチルで抽出した。
【００３７】
酢酸エチル層を食塩水で洗浄し、活性炭を加え、室温で３０分攪拌した。その後濾過し、酢酸エチルで洗浄した。酢酸エチル溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。
【００３８】
酢酸エチル溶液にカプリル酸ナトリウム塩1.2gmsを加え、室温で２時間攪拌した。その後１２．５ｍｌのアセトニトリルを加え、１時間攪拌した。反応混合物は、５℃に冷却し、１時間攪拌した。
【００３９】
プラバスタチンナトリウム塩の沈殿は、濾過され冷却したアセトニトリルで洗浄した。化合物は真空乾燥され、９０％の収率で９９％以上の分析純度のプラバスタチンナトリウム塩を得た。
【実施例１２】
【００４０】
［プラバスタチンの精製］
ブイヨン（10000L）を５０％オルトリン酸を加えてＰＨ４の酸性にし、同量の酢酸エチルを加えた。層分離し、有機層を水で洗浄し減圧下でトータル量が３００Ｌになるまで濃縮し、２４時間還流して攪拌した。室温まで冷やし、５％の重炭酸ナトリウム塩水溶液で洗浄し、減圧下で１２５Ｌになるまで濃縮した。残分を０℃まで冷やし、２時間攪拌した。得られた固体を濾過して、ラクトンを得た。
【００４１】
前記ステップで得られたラクトン１ｋｇにメタノール（１Ｌ）と１０％水酸化ナトリウム（２Ｌ）を加え、室温で０．５時間攪拌した。水（１Ｌ）と酢酸エチル（２Ｌ）を加え、内容物を室温で１０分攪拌した。酢酸エチル層は分離し、廃棄された。水溶性層のＰＨは、６Ｎの塩酸によって注意深くＰＨ４に調節され、酢酸エチル（４Ｌ））で抽出された。層は分離され、酢酸エチル層は食塩水で洗浄され、活性炭を加え、濾過し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記濾過物にカプリル酸ナトリウム塩（３４７ｇ）を加え、内容物を１時間攪拌した。アセトニトリル（２．５Ｌ）を加え、さらに２時間攪拌を続け、０℃まで冷却し、プラバスタチンのナトリウム塩の固体沈殿物を濾過し４０℃で真空乾燥した。
【００４２】
粗ナトリウム塩は、２Ｌの水に溶かし、アセトニトリル（３０Ｌ）を２時間以上かけて加えた。内容物を０℃に冷却し、０℃で４時間攪拌し、濾過し、固体をアセトニトリルで洗浄した。固体を４０℃で真空乾燥し、製薬級のプラバスタチンナトリウム塩を得た。
【実施例１３】
【００４３】
［プラバスタチンの精製］
実施例１２で得られた酢酸エチル層に、カプリル酸ナトリウム塩の代わりに酢酸ナトリウムを加え、製薬級のプラバスタチンナトリウム塩を得た。
【実施例１４】
【００４４】
［プラバスタチンの精製］
実施例１２と同様の方法で得られた１００ｇｍの粗プラバスタチンラクトンを３００ｍｌのアルカリメタノリック溶液に加えた。溶液のＰＨをＰＨ４に調節し、プラバスタチン酸は４００ｍｌの酢酸エチルに抽出された。この酢酸エチル溶液に１２０mole%のジベンジルアミンを加え、一時間攪拌し、４℃に冷却し、濾過した。結晶は、メタノールに溶かされ、ＰＨは希塩酸によってＰＨ４に調節され、プラバスタチンは、酢酸エチルへ抽出された。ここに９０mole%のカプリル酸ナトリウム塩を加え、よく攪拌した。溶液にアセトニトリルを加えるとナトリウム塩の結晶が沈殿した。これを一時間冷却した。９９％以上の分析純度で回収された生産物は７０％であった。
【００４５】
【化１】
2005503174.tif 000002
【００４６】
【化２】
2005503174.tif 000003
【国際公開パンフレット】
2005503174.tif 000006
2005503174.tif 000007
2005503174.tif 000008
2005503174.tif 000009
2005503174.tif 000010
2005503174.tif 000011
2005503174.tif 000012
2005503174.tif 000013
2005503174.tif 000014
2005503174.tif 000015
2005503174.tif 000016
2005503174.tif 000017
2005503174.tif 000018
2005503174.tif 000019
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005503174.tif 000020
2005503174.tif 000021
2005503174.tif 000022
2005503174.tif 000023
2005503174.tif 000024
2005503174.tif 000025
2005503174.tif 000026
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2005503174.tif 000028
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2005503174.tif 000030
2005503174.tif 000031
2005503174.tif 000032
2005503174.tif 000033
2005503174.tif 000034
2005503174.tif 000035
2005503174.tif 000036
【国際調査報告】
2005503174.tif 000037
2005503174.tif 000038
2005503174.tif 000039
2005503174.tif 000040