(57)【要約】本発明は、幹細胞培養、特に未分化幹細胞培養の分野、ならびにこのような細胞の導出および増殖方法に関する。より詳細には、本発明はヒトフィーダー層上および／またはフィーダー層の不在下での未分化ＨＥＳ細胞の導出および増殖に関する。ヒトフィーダー層は、ヒト胎児筋（ＨＦＭ）線維芽細胞、ヒト胎児皮膚（ＨＦＳ）線維芽細胞、ヒト成人卵管（ＨＡＦＴ）線維芽細胞およびヒト成人皮膚細胞を含む群から選択することができる。それらは、ヒト血清を補給した、または補給していないヒト胚性幹細胞（ＨＥＳ）、ノックアウト（ＫＯ）、またはヒトフィーダー（ＨＦ）培地を含む群から選択された適切な培地の存在下で培養できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に未分化の状態のＥＳ細胞の導出をサポートするヒトフィーダー細胞層であって、前記フィーダー細胞層が、ヒト成人細胞、ヒト胎児細胞もしくはヒト胚細胞またはそれらの組み合わせを含む群から選択された細胞を含むヒトフィーダー細胞層。
【請求項２】
実質的に未分化の状態のＥＳ細胞の培養をサポートするヒトフィーダー細胞層であって、前記フィーダー細胞層が、ヒト成人細胞、ヒト胎児細胞もしくはヒト胚細胞またはそれらの組み合わせを含む群から選択された細胞を含むヒトフィーダー細胞層。
【請求項３】
前記ヒト成人細胞が、ヒト線維芽細胞、ヒト成人皮膚線維芽細胞、ヒト成人筋線維芽細胞および成人上皮細胞またはそれらの組み合わせを含む群から選択される請求項１または２に記載のヒトフィーダー細胞層。
【請求項４】
前記ヒト成人細胞がヒト線維芽細胞である請求項３に記載のヒトフィーダー細胞層。
【請求項４】
前記ヒト線維芽細胞がヒト成人卵管（ＨＡＦＴ）線維芽細胞である請求項３または４に記載のヒトフィーダー細胞層。
【請求項５】
前記ヒト成人細胞がヒト皮膚細胞である請求項３に記載のヒトフィーダー細胞層。
【請求項６】
前記ヒト成人細胞がヒト筋細胞である請求項３に記載のヒトフィーダー細胞層。
【請求項７】
前記ヒト成人細胞がヒト成人上皮細胞である請求項３に記載のヒトフィーダー細胞層。
【請求項８】
前記ヒト成人上皮細胞がヒト卵管上皮細胞である請求項３または７に記載のヒトフィーダー細胞層。
【請求項９】
前記ヒト胎児細胞が、ヒト胎児筋（ＨＦＭ）細胞もしくはヒト胎児皮膚（ＨＦＳ）細胞またはそれらの組み合わせである請求項１または２に記載のヒトフィーダー細胞層。
【請求項１０】
前記ヒト胎児細胞がＨＦＭ細胞である請求項９に記載のヒトフィーダー細胞層。
【請求項１１】
前記ヒト胎児細胞がＨＦＳ細胞である請求項９に記載のヒトフィーダー細胞層。
【請求項１２】
前記ヒト胚細胞が、ヒト胚筋（ＨＥＭ）細胞もしくはヒト胚皮膚細胞またはそれらの組み合わせである請求項１または２に記載のヒトフィーダー細胞層。
【請求項１３】
前記ヒト胚細胞はＨＥＭ細胞である請求項１２に記載のヒトフィーダー細胞層。
【請求項１４】
前記ヒト胚細胞はヒト胚皮膚細胞である請求項１２に記載のヒトフィーダー細胞層。
【請求項１５】
ＨＦＥ培地の存在下の初代培養中で初めて樹立された請求項１〜１４のいずれかに記載のヒトフィーダー細胞層。
【請求項１６】
前記フィーダー層が、ＨＭ培地の存在下で増殖させられた請求項１または１５のいずれかに記載のヒトフィーダー細胞層。
【請求項１７】
線維芽細胞株Detroit 551（アクセッション番号ATCC-CCL-110）を含む請求項１〜１６のいずれかに記載のヒトフィーダー細胞層。
【請求項１８】
アクセッション番号ATCC-X-55またはATCC-CCL-171を有する細胞株ＭＲＣ−５を含む請求項１〜１６のいずれかに記載のヒトフィーダー細胞層。
【請求項１９】
アクセッション番号ATCC-CCL-75またはATCC-CCL-75.1を有する細胞株ＷＩ−３８を含む請求項１〜１６のいずれかに記載のヒトフィーダー層。
【請求項２０】
実質的に未分化の状態の胚性幹（ＥＳ）細胞株をＥＳ細胞集団から導出する方法であって、前記方法が、
未分化のＥＳ細胞を含むＥＳ細胞集団を入手するステップと；
ヒトフィーダー細胞から導出された可溶性因子またはその同等物の存在下において細胞サポートマトリックス上で前記未分化のＥＳ細胞を培養するステップと
を含む方法。
【請求項２１】
ＥＳ細胞株を導出するステップが、ＥＳ細胞源からＥＳ細胞株を作成するステップであって、前記ＥＳ細胞は事前に培養されていない細胞であるステップと；ＥＳ細胞株の増殖もしくは培養時間を伸長させるステップであって、前記ＥＳ細胞株が樹立細胞株であるステップと；樹立ＥＳ細胞株を増殖させるステップとを含む群から選択される請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＥＳ細胞株を導出するステップが、ＥＳ細胞株を増殖させるステップを含む請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＥＳ細胞集団が、胚細胞、胚盤胞細胞、内部細胞塊（ＩＣＭ）細胞、および未分化ＥＳ細胞の培養物を含む群から選択された起源から導出される請求項２０〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記起源が胚盤胞細胞である請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記可溶性因子が、ヒト成人細胞、胎児細胞もしくは胚細胞またはそれらの組み合わせを含む群から選択されるヒトフィーダー細胞から導出される請求項２０〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記ヒト成人細胞が、ヒト線維芽細胞、ヒト成人皮膚線維芽細胞、ヒト成人筋線維芽細胞および成人上皮細胞またはそれらの組み合わせを含む群から選択される請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ヒト成人細胞がヒト線維芽細胞である請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ヒト線維芽細胞がヒト成人卵管（ＨＡＦＴ）線維芽細胞である請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ヒト成人細胞がヒト皮膚細胞である請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記ヒト成人細胞がヒト筋細胞である請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記ヒト成人細胞がヒト成人上皮細胞である請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記ヒト成人細胞がヒト卵管上皮線維芽細胞である請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
前記ヒト胎児細胞が、ヒト胎児筋（ＨＦＭ）細胞もしくはヒト胎児皮膚（ＨＦＳ）細胞またはそれらの組み合わせである請求項２５に記載の方法。
【請求項３４】
前記ヒト胎児細胞がＨＦＭ細胞である請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ヒト胎児細胞がＨＦＳ細胞である請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記ヒト胚細胞が、ヒト胚筋（ＨＥＭ）細胞もしくはヒト胚皮膚細胞またはそれらの組み合わせである請求項２５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ヒト胚細胞がＨＥＭ細胞である請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ヒト胚細胞がヒト胚皮膚細胞である請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記ヒトフィーダー細胞が、上述のようなＨＥＳ、ＫＯ、ＨＦ、ＨＥＳ−ＨＳ、ＫＯ−ＨＳ、およびＨＦ−ＨＳを含む群から選択された培地の存在下で培養される請求項２０〜３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
前記培地が、ＨＥＳ−ＨＳまたはＫＯ−ＨＳである請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記培地がＫＯ−ＨＳである請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞サポートマトリックスが、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ヒト細胞外マトリックスもしくはMatrigel（商標）またはそれらの組み合わせを含む群から選択された非細胞性細胞サポートマトリックスである請求項２０〜４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
前記細胞サポートマトリックスが、コラーゲンＩまたはタイプＩコラーゲンを含む請求項２０〜４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞サポートマトリックスが、請求項１〜１９のいずれかに記載のヒトフィーダー細胞層を含む請求項２０〜４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
前記ＥＳ細胞が、上述のようなＨＥＳ、ＫＯ、ＨＥＳ−ＨＳ、ＫＯ−ＨＳ、およびＨＦ−ＨＳを含む群から選択された培地の存在下で培養される請求項２０〜４４のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
前記培地がＫＯ−ＨＳである請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記フィーダー細胞が、上述のようにＨＦＥ培地の存在下の初代培養中で初めて樹立される請求項２０〜４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
前記フィーダー細胞が、上述のようにＥＳ細胞と共に培養する前にＨＭ培地の存在下で増殖させられる請求項２０〜４７のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
前記ヒトフィーダー細胞が線維芽細胞株Detroit 551（アクセッション番号ATCC-CCL-110）である請求項２０〜４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
前記ヒトフィーダー細胞が、アクセッション番号ATCC-X-55またはATCC-CCL-171を有する細胞株ＭＲＣ−５である請求項２０〜４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
前記ヒトフィーダー細胞が、アクセッション番号ATCC-CCL-75またはATCC-CCL-75.1を有する細胞株ＷＩ−３８である請求項２０〜４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
ＥＳ細胞株が、ＬＩＦの不在下で培養される請求項２０〜５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５３】
増殖性の未分化ＥＳ細胞を含む細胞組成物であって、前記細胞組成物が、請求項２０〜５２のいずれかに記載の方法によって調製された増殖もしくは導出されたＥＳ細胞を含む細胞組成物。
【請求項５４】
請求項２０〜５２のいずれかに記載の方法によって調製された未分化ＥＳ細胞株。
【請求項５５】
実質的に未分化の状態のＥＳ細胞を導出および培養するための細胞培養系であって、前記培養系は、
細胞サポートマトリックスと；
ヒト成人細胞、ヒト胎児細胞またはヒト胚細胞を含む群から選択されるヒトフィーダー細胞から導出された可溶性因子を提供するための細胞培養培地と
を含む細胞培養系。
【請求項５６】
前記ヒト成人細胞が、ヒト成人卵管（ＨＡＦＴ）線維芽細胞、ヒト成人皮膚線維芽細胞、ヒト成人筋線維芽細胞および成人上皮細胞またはそれらの組み合わせからなる群から選択される請求項５５に記載の細胞培養系。
【請求項５７】
前記ヒト成人細胞がヒト線維芽細胞である請求項５６に記載の細胞培養系。
【請求項５８】
前記ヒト成人細胞がヒト成人卵管（ＨＡＦＴ）線維芽細胞である請求項５６または５７に記載の細胞培養系。
【請求項５９】
前記ヒト成人細胞がヒト皮膚細胞である請求項５６に記載の細胞培養系。
【請求項６０】
前記ヒト成人細胞がヒト筋細胞である請求項５６に記載の細胞培養系。
【請求項６１】
前記ヒト成人細胞がヒト成人上皮細胞である請求項５６に記載の細胞培養系。
【請求項６２】
前記ヒト上皮成人細胞がヒト卵管上皮細胞である請求項５６に記載の細胞培養系。
【請求項６３】
前記ヒト胎児細胞が、ヒト胎児筋（ＨＦＭ）細胞もしくはヒト胎児皮膚（ＨＦＳ）細胞またはそれらの組み合わせである請求項５５に記載の細胞培養系。
【請求項６４】
前記ヒト胎児細胞がＨＦＭ細胞である請求項６３に記載の細胞培養系。
【請求項６５】
前記ヒト胎児細胞がＨＦＳ細胞である請求項６３に記載の細胞培養系。
【請求項６６】
前記ヒト胚細胞が、ヒト胚筋（ＨＥＭ）細胞もしくはヒト胚皮膚細胞またはそれらの組み合わせである請求項５５に記載の細胞培養系。
【請求項６７】
前記ヒト胚細胞がＨＥＭ細胞である請求項６６に記載の細胞培養系。
【請求項６８】
前記ヒト胚細胞がヒト胚皮膚細胞である請求項６６に記載の細胞培養系。
【請求項６９】
前記細胞サポートマトリックスが、コラーゲンＩもしくはマトリゲルまたはそれらの組み合わせを含む請求項５５に記載の細胞培養系。
【請求項７０】
前記細胞サポートマトリックスがコラーゲンＩを含む請求項６９に記載の細胞培養系。
【請求項７１】
前記細胞培養培地が、ヒトフィーダー細胞層から導出された可溶性因子を含む調整培地である請求項５５〜７０のいずれかに記載の細胞培養系。
【請求項７２】
前記細胞サポートマトリックスが、請求項１〜１４のいずれかに記載のヒトフィーダー細胞層を含む請求項５５〜６８のいずれかに記載の細胞培養系。
【請求項７３】
前記培養培地が、ＨＥＳ、ＫＯ、ＨＥＳ−ＨＳ、およびＫＯ−ＨＳを含む群から選択される請求項５５〜７２のいずれかに記載の細胞培養系。
【請求項７４】
前記培地はＫＯ−ＨＳである請求項７３に記載の細胞培養系。
【請求項７５】
実質的に未分化の状態のＥＳ細胞を導出および培養するための調整培地であって、前記培地は、
請求項１〜１９のいずれかに記載のフィーダー細胞層を入手するステップと；
ＨＥＳ、ＫＯ、ＨＥＳ−ＨＳ、ＫＯ−ＨＳ、ＨＦＥ、ＨＭ、ＨＦもしくはＨＦ−ＨＳを含む群から選択された培地の存在下で前記フィーダー細胞を培養するステップと；
前記細胞から前記培地を分離して、調整培地を入手するステップと
を含む方法によって調製される調整培地。
【請求項７６】
前記ヒトフィーダー細胞層が成人皮膚細胞を含む請求項７５に記載の調整培地。
【請求項７７】
前記ヒトフィーダー細胞層がＨＦＭ細胞を含む請求項７６に記載の調整培地。
【請求項７８】
前記培地がＫＯ−ＨＳを含む請求項７５〜７７のいずれかに記載の調整培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞培養、特に未分化幹細胞培養、ならびにこのような細胞の導出(derivation)および増殖方法の分野に関する。より詳細には、本発明は、ヒトフィーダー層上および／またはフィーダー層の不在下での未分化ＨＥＳ細胞の導出および増殖に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト多能性幹細胞は、胚盤胞の内部細胞塊（胚性幹細胞）および発達中の生殖隆起の始原生殖細胞（胚生殖細胞）から導出されてきた。ヒト胚性幹細胞（ＨＥＳ細胞:human embryonic stem cell）は、マウスのものとは相違して、γ線照射またはマイトマイシンＣ処理のいずれかをされたマウス胚性線維芽細胞フィーダー細胞（ＭＥＦ細胞:mouse embryonic fibroblast feeder cell）上で増殖させる際に、培養中では未分化状態でしか維持できない。
【０００３】
現在、動物線維芽細胞フィーダーが絶対的に必要であるため、ＨＥＳのスケールアップならびに下流での操作および実験に重大な欠点が生じる。これらの欠点として、（１）細胞と細胞との直接的な接触、そして現在の増殖系（ヒト／動物共培養）は異種移植と見なされてきたという事実のために、動物フィーダー細胞からヒトＨＥＳ細胞への病原菌が感染する潜在的なリスク、（２）ＨＥＳ細胞はマウス線維芽細胞依存性であるために、多数のＨＥＳ細胞へのスケールアップに制限があることおよび特異的系統への方向付け、（３）プラスチック上で増殖する他の細胞とは異なり、ＨＥＳ細胞を増殖させるには毎回、照射またはマイトマイシンＣ処理ＭＥＦを調製する必要がある集中的な労力、（４）トランスフェクトされたＨＥＳ細胞の抗生物質による選択には、線維芽細胞フィーダーが類似の抗生物質耐性を有することを必要とし、これは抗生物質耐性を備える特別なトランスジェニックマウス系統を作成する必要があることを意味すること、および最も顕著なことに、（５）培養中のＭＥＦ細胞とＨＥＳ細胞とが物理的に近接するために、これらの２種の細胞タイプを分離することが困難となり、このため実験方法および結果の両方が複雑になることが挙げられる。
【０００４】
このためこれらの欠点を克服して大規模／バルク規模のＨＥＳ細胞産生の見通しをつけるのに役立たせるため、ならびに他の種からの細胞およびタンパク質の汚染を生じることなくＨＥＳ細胞の純粋培養を提供するためには、ヒトフィーダー層上における、またはいずれかのフィーダー細胞の不在下における未分化ＨＥＳ細胞の導出および増殖方法の評価が急務である。
【０００５】
したがって、本発明の１つの目的は先行技術の問題の一部を克服することである。
【発明の開示】
【０００６】
本発明の第１態様では、実質的に未分化の状態の胚性幹（ＥＳ:embryonic stem）細胞株をＥＳ細胞集団から導出する方法であって、前記方法が、
未分化のＥＳ細胞を含むＥＳ細胞集団を入手するステップと；
ヒトフィーダー細胞から導出された可溶性因子またはその同等物の存在下において細胞サポートマトリックス上で未分化ＥＳ細胞を培養するステップと
を含む方法が提供される。
【０００７】
好ましくは、前記細胞株はヒト胚盤胞の内部細胞塊から導出される。
【０００８】
ＥＳ細胞は、以前は動物／マウス線維芽細胞フィーダー層上で培養されており、フィーダー層はたいてい線維芽細胞フィーダー層へ限定されている。本出願人らは、他のヒトフィーダー層が従来型ＨＥＳ培地（非調整培地）を用いると長期にわたり未分化状態でのＨＥＳ細胞の増殖をサポートできることを見いだした。さらに、これらのフィーダー層から導出された可溶性産物（調整培地:conditioned media）もまた、好ましくは線維芽細胞フィーダー層によって提供されない細胞サポートマトリックスの存在下で増殖させると、未分化状態でのＨＥＳ細胞の増殖をサポートできる。
【０００９】
本発明のまた別の態様では、実質的に未分化の状態の胚性幹（ＥＳ）細胞を増殖させる方法であって、前記方法が、
未分化のＥＳ細胞源を入手するステップと；
ヒトフィーダー細胞から導出された可溶性因子またはその同等物の存在下において細胞サポートマトリックス上で未分化ＥＳ細胞を培養するステップと
を含む方法が提供される。
【００１０】
本発明は、好ましくはヒト胚盤胞の内部細胞塊(inner cell mass)から導出された新規細胞株を樹立(establish)および作成(create)する方法を提供し、同時に、次の(ensuing)未分化状態のＥＳ細胞の持続的増殖を生じさせる方法を提供する。ＥＳ細胞は、これらの起源から導出された新規細胞株を樹立するために、胚、胚盤胞、またはＩＣＭから入手できる。あるいはまた、ＥＳ細胞は樹立ＥＳ細胞培養物から入手し、集団倍増時間、培養期間および継代を伸長させるための条件下で増殖させることができる。
【００１１】
細胞サポートマトリックスは、動物フィーダー細胞に取って代わることのできる細胞性または非細胞性細胞サポートマトリックスとすることができる。非細胞性細胞サポートマトリックスにあっては、支持体は、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ヒト細胞外マトリックスもしくはMatrigel（商標）またはそれらの組み合わせを含む群から選択することができる。
【００１２】
細胞性細胞サポートマトリックスにあっては、特に限定されるものではないが、サポートマトリックスは、細胞、ヒト胎児筋線維芽細胞、ヒト胎児皮膚線維芽細胞、ヒト成人卵管フィーダー線維芽細胞、ヒト胚筋線維芽細胞、ヒト胚皮膚線維芽細胞、ヒト成人皮膚線維芽細胞およびヒト成人筋線維芽細胞を含む群から選択できるフィーダー細胞を含む。
【００１３】
本発明の好ましい態様では、実質的に未分化の状態のＥＳ細胞を培養する方法であって、前記方法が、
未分化のＥＳ細胞源を入手するステップと；
フィーダー細胞から導出された調整ＨＥＳ培地の存在下において非細胞性サポートマトリックス上で未分化細胞を培養するステップと
を含む方法が提供される。
【００１４】
本発明のまた別の好ましい態様では、実質的に未分化の状態のＥＳ細胞を増殖させる方法であって、前記方法が、
未分化のＥＳ細胞源を入手するステップと；
ヒトフィーダー細胞から導出された調整ＨＥＳ培地の存在下において非細胞性細胞サポートマトリックス上で未分化細胞を培養するステップと
を含む方法が提供される。
【００１５】
好ましくは、非細胞性細胞サポートマトリックスはコラーゲンＩサポートマトリックスである。
【００１６】
本発明のまた別の好ましい態様では、実質的に未分化の状態のＥＳ細胞株をＥＳ細胞集団から導出する方法であって、前記方法が、
未分化ＥＳ細胞源を入手するステップと；
ＬＩＦの不在下で、非調整ＨＥＳ培地の存在下において、ヒトフィーダー細胞を含む細胞性細胞サポートマトリックス上で前記未分化細胞を培養するステップと
を含む方法が提供される。
【００１７】
本発明のまた別の好ましい態様では、実質的に未分化の状態のＥＳ細胞を増殖させる方法であって、前記方法が、
未分化のＥＳ細胞源を入手するステップと；
ＬＩＦの不在下で、非調整ＨＥＳ培地の存在下において、ヒトフィーダー細胞を含む細胞性細胞サポートマトリックス上で前記未分化細胞を培養するステップと
を含む方法が提供される。
【００１８】
本発明のさらにまた別の態様では、フィーダー細胞を含んでいない増殖性の未分化ＥＳ細胞を含む細胞組成物であって、前記細胞組成物はフィーダー細胞の不在下で本明細書に記載した方法によって調製される細胞組成物が提供される。
【００１９】
本発明のさらにまた別の態様では、フィーダー細胞層上に増殖性の未分化ＥＳ細胞を含む細胞組成物であって、前記細胞組成物は本明細書に記載した方法によって調製される細胞組成物が提供される。
【００２０】
本発明のまた別の態様では、実質的に未分化の状態のＥＳ細胞の導出および培養をサポートするヒトフィーダー細胞層が提供される。
【００２１】
本発明のさらにまた別の態様では、ここに記載した方法によって調製された未分化ＥＳ細胞もしくはＥＳ細胞株が提供され、最も好ましくはＥＳ細胞もしくはＥＳ細胞株は、哺乳動物ＥＳ細胞もしくはＥＳ細胞株である。より好ましくは、ＥＳ細胞もしくはＥＳ細胞株は、サルまたはヒトから選択された霊長類細胞である。いっそうより好ましくは、ＥＳ細胞もしくはＥＳ細胞株は、ヒトＥＳ細胞もしくはＥＳ細胞株である。
【００２２】
本発明のまた別の態様では、実質的に未分化の状態のＥＳ培養を導出および増殖させるための細胞培養系であって、前記系が、
細胞サポートマトリックスと；
ヒトフィーダー細胞から導出された可溶性因子またはそれらの同等物を提供するための細胞培養培地と
を含む細胞培養系が提供される。
【００２３】
本発明のまた別の好ましい態様では、実質的に未分化の状態のＥＳ細胞培養を導出および増殖させるための細胞培養系であって、前記系が、
ヒトフィーダー細胞を含む細胞性細胞サポートマトリックスと；
ＥＳ細胞の培養をサポートするためのＬＩＦが不在である非調整細胞培養培地と
を含む細胞培養系が提供される。
【００２４】
そこで、本発明は、実質的に未分化の状態のＥＳ細胞を導出および増殖させるための新規物質および方法を提供する。本発明によって提供される方法および物質を使用すると、例えばヒトおよびサルから単離されたＥＳ細胞をより効率的に増殖させることができる。このような細胞を分化させずに増殖させる能力は、組織移植術および／または遺伝子療法技術を使用してヒトの疾患を治療するためのＥＳ細胞の治療使用において重要な用途がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明の第１態様では、実質的に未分化の状態の胚性幹（ＥＳ）細胞株をＥＳ細胞集団から導出する方法であって、前記方法が、
未分化ＥＳ細胞を含むＥＳ細胞集団を入手するステップと；
ヒトフィーダー細胞から導出された可溶性因子またはその同等物の存在下において細胞サポートマトリックス上で未分化ＥＳ細胞を培養するステップと
を含む方法が提供される。
【００２６】
細胞株を導出する方法は、好ましくはＩＣＭ期から先の新規ＥＳ細胞源から、様々な方法によって新規細胞株を作成するステップを含み、ならびにこの新規方法を使用して既に樹立されたＥＳ細胞株の増殖もしくは培養時間および継代数を伸長させることができる。新規ＥＳ細胞源から新規細胞株を作成する場合には、これには、特に限定されるものではないが、胚、胚盤胞または内部細胞塊（ＩＣＭ）細胞等の自然源から新規細胞株を樹立するステップが含まれる。これらの予め培養されていない細胞は、さらに培養し、ＥＳ細胞株を樹立することのできる未分化ＥＳ細胞を含むＥＳ細胞集団を形成する。樹立すると、細胞株は増殖させることができる。
【００２７】
本発明のまた別の態様では、実質的に未分化の状態の胚性幹（ＥＳ）細胞株を増殖させる方法であって、前記方法が、
未分化のＥＳ細胞を含むＥＳ細胞集団を入手するステップと；
ヒトフィーダー細胞から導出された可溶性因子またはその同等物の存在下において細胞サポートマトリックス上で未分化ＥＳ細胞を培養するステップと
を含む方法が提供される。
【００２８】
導出および増殖させる方法は、ＥＳ細胞を未分化状態に維持する同一の方法を利用することと関連し得る。細胞株が導出されると、大規模／バルク規模のＥＳ細胞集団への効果的なスケールアップを可能にするために、増殖させて、その細胞培養寿命を伸長させることが必要である。
【００２９】
ＥＳ細胞は組織培養用プラスチック容器に付着はするがその上で良好には増殖せず、しばしば培養中に短時間で実質的な分化が生じる。ＥＳ細胞は、以前はマウス線維芽細胞フィーダー層上で培養されてきたが、フィーダー層はしばしば線維芽細胞フィーダー層へ限定される。分化は、特にマウス線維芽細胞フィーダー層を使用した場合に発生することがある。マウスフィーダー層は、しばしばマウス胎児の様々な組織由来の線維芽細胞の浸軟混合物(macerated mixture)から導出した不均質な細胞集団を含む。この細胞産物、細胞タイプおよび様々な種の混合物は、純粋なＥＳ細胞集団、特にヒトＥＳ細胞を培養するためには極めて不都合である。本出願人らは、他のヒトフィーダー層またはこれらのフィーダー層から導出された可溶性産物は、好ましくは線維芽細胞フィーダー層によっては提供されない細胞サポートマトリックスの存在下で増殖させると、未分化状態の細胞をサポートできることを見いだした。
【００３０】
未分化胚性幹（ＥＳ）細胞は、胚、胚盤胞、内部細胞塊（ＩＣＭ）等であるがそれらに限定されない自然源または分化していないＥＳ細胞の以前の培養から導出することができる。好ましくは、未分化ＥＳ細胞は明確に特徴付けられたＥＳ細胞培養であって、前記細胞がＥＳ細胞を表示する細胞マーカーを用いて明確に特徴付けられているものから導出される。適切な細胞マーカーは、国際特許出願PCT/AU99/00990号に提供されている。より好ましくは、ＥＳ細胞は多数の継代数にわたって維持された培養から導出される。そこで胚、胚盤胞、もしくはＩＣＭ等であるがそれらに限定されない自然源からのＥＳ細胞株は、新規に導出された細胞株であろう。しかし既に樹立されたＥＳ細胞培養物からの未分化ＥＳ細胞は、前記細胞株が増殖を継続して継代数を増加させるように維持された場合には、ここで使用するように新規に導出されたと見なすことができる。
【００３１】
増殖方法には、持続的継代培養を可能にする増殖性状態の細胞を維持するために前記細胞株を培養するステップが含まれる。
【００３２】
好ましい実施形態では、本発明は、実質的に未分化の状態の胚性幹（ＥＳ）細胞株を、ヒト胚盤胞由来のＩＣＭ細胞のＥＳ細胞集団から導出する方法であって、前記方法が、
胚盤胞から内部細胞塊（ＩＣＭ）細胞を取り出すステップであって、前記ＩＣＭ細胞が未分化ＥＳ細胞を含むステップと；
ヒトフィーダー細胞から導出された可溶性因子またはその同等物の存在下において細胞サポートマトリックス上で未分化ＥＳ細胞を含むＩＣＭ細胞を培養するステップと；場合によって、
未分化ＥＳ細胞について選択するために培養するステップと、
を含む方法を提供する。
【００３３】
ＥＳ細胞株は受精卵母細胞から生じた胚盤胞から導出することができる。前記細胞は、未分化状態のＥＳ細胞の培養について開示するが、線維芽細胞フィーダー層に基づいている国際特許出願第PCT/AU99/00990号に記載の方法により導出できる。より好ましくは、未分化ＥＳ細胞源は着床前期の胚の胚盤胞期から入手できる。
【００３４】
胚盤胞期は卵母細胞の受精によって得られる。好ましくは、胚には受精後および受胎後６〜７日間までが含まれる。
【００３５】
本発明で必要とされる胚はインビトロ受精胚であってよい、またはヒトもしくは非ヒト起源の除核卵母細胞内への体細胞核の導入によって導出された胚であってよく、胚はその後活性化されて胚盤胞期へ発達させられる。
【００３６】
胚は、利用できるいずれかのインビトロ法による受精によって生成できる。例えば、胚は従来型人工授精または細胞質内精子注入を使用することによる受精によって生成できる。いずれかの胚培養法を使用するのが好ましいが、高品質（良好な形態学的等級）の胚盤胞を作製する方法を使用するのが最も好ましい。胚の高品質は、形態学的基準によって評価できる。最も好ましくは、内部細胞塊が良好に発達している。これらの基準は当業者であれば評価できる。
【００３７】
人工授精後、胚は胚盤胞期へ培養することができる。この胚盤胞期での胚の品質を評価すると、ＩＣＭ細胞を導出するために適切な胚を決定することができる。胚は、それらの生存を維持して胚盤胞の発達を強化するあらゆる培地で培養することができる。
【００３８】
好ましい実施形態では、胚盤胞は透明帯またはその一部分を取り除くために酵素消化に供される。好ましくは、胚盤胞はおよそ第６日であってよい拡大された胚盤胞期での消化に供される。一般に、これは人工授精の約６日後である。酵素消化は、好ましくはほぼ１０ＩＵのプロナーゼを使用して達成でき、その中で胚盤胞が培養される培地へ添加される。
【００３９】
透明帯の除去後、ＨＥＳ細胞を導出するために、胚盤胞を洗浄して抗ヒト全血清へ曝露させ、この後にモルモット補体等の補体処理を実施することができる。
【００４０】
透明帯を除去すると栄養外肺葉が露出する。さらに栄養外肺葉を除去するとＩＣＭ細胞を露出させることができる。次に、ＩＣＭ細胞を除去して培養することができる。当業者が利用できるＩＣＭ細胞を除去するあらゆる方法は、未分化ＥＳ細胞を回収する手段として使用できる。好ましくは、ＩＣＭをパスツール型ピペットに通過させるとＩＣＭ細胞を遊離かつ分離させることができる。
【００４１】
場合によっては、この培養はＩＣＭから導出された不均質な細胞集団を含んでいることがある。細胞集団は、未分化ＥＳ細胞を含有し得る。ＥＳ細胞源が不均質な細胞集団を提供する場合、またはＥＳ細胞源が胚盤胞もしくはＩＣＭである場合、培養の前に未分化ＥＳ細胞を選択して取り出す、または未分化ＥＳ細胞を選択的に培養するいずれかのためにまた別の選択ステップを含むことができる。
【００４２】
ＥＳ細胞はＩＣＭの一部として直接に培養できる、またはＥＳ細胞は未分化ＥＳ細胞の実質的に純粋な集団を入手するためにさらにＩＣＭから単離することができる。胚盤胞からの未分化ＥＳ細胞は、国際特許出願第PCT/AU99/00990号に記載された方法によって回収かつ培養することができる。
【００４３】
ＩＣＭ細胞が胚盤胞から放出されると、ＩＣＭ細胞はフィーダー層上にプレーティングすることができ、ＥＳ細胞コロニーが明白になると引き続き継代培養することができる。最初の継代培養を行う前にはほぼ７日間を要することがある。
【００４４】
ＥＳ細胞の継代培養は、自然源または先在(pre-existing)ＥＳ細胞培養のどちらかから新規に導出されたものであっても、ＥＳ細胞凝集塊の外周の周辺を切断することによって実施できる。この凝集塊は、増殖のために手作業で切断し、好ましくはジスパーゼのようなプロテアーゼにより処理することができる。ＥＳ細胞凝集塊はさらに新規フィーダー層上で増殖させることができる。この方法でＥＳ細胞を増殖させるためには連続的継代培養を使用できる。
【００４５】
新規に導出されたＥＳ細胞は、好ましくは哺乳動物ＥＳ細胞であるが、最も好ましくは霊長類ＥＳ細胞である。より好ましくは、それらはヒトＥＳ細胞である。それらは、ここに記載した非分化条件下で培養したときに未分化状態を維持できるが、分化条件に供されると分化する能力を有している。好ましくは、それらは広範囲の体細胞系統へ分化する能力を有する。
【００４６】
胚盤胞等の自然源から入手されるＥＳ細胞源の代わりに、ＥＳ細胞はフィーダー細胞層上で増殖した先在未分化培養から入手することができる。それらはプロテアーゼ、好ましくはジスパーゼもしくはプロナーゼによってフィーダー細胞から取り出し、その後ここに記載した条件下で、またはここに記載した細胞サポートマトリックス上で培養するために移すことができる。実質的に未分化の状態でＥＳ細胞を培養もしくは増殖させるステップは、実質的に未分化の状態に維持された細胞の数継代を生じさせる長期培養を提供することを目的としている。
【００４７】
用語「実質的未分化」とは、少なくとも５０％が未分化の全能状態にあるＥＳ細胞に関する。全能状態は、制限なく骨髄幹細胞、心筋細胞、星状膠細胞または結合組織細胞等のような、多能性細胞および十分に分化した細胞を含むあらゆる細胞タイプへ分化することのできる状態である。
【００４８】
ヒト胎児（ＨＦＭ、ＨＦＳ）細胞、成人（ＨＡＦＴ）フィーダー細胞および成人皮膚細胞は、未分化ヒトＥＳ細胞の導出および増殖において非細胞性マトリックスに比べて優れている。ＥＳ細胞は、適切な培地の存在下で細胞サポートマトリックス上で増殖させることができる。ＨＥＳ培地もしくはＫＯ（ノックアウト）培地は、ヒト胎児筋（ＨＦＭ:human fetal muscle）細胞、ヒト胎児皮膚（ＨＦＳ: human fetal skin）細胞、ヒト成人卵管（ＨＡＦＴ:human adult fallopian tubal）細胞、ヒト成人皮膚細胞のフィーダー層上または非細胞性サポートマトリックス上で使用できる。
【００４９】
ＨＥＳ培地は、その調製物中に２０％ＦＣＳ、ウシインスリンおよびブタトランスフェリンを有する。この培地は、典型的には８０％ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、２０％Hyclone既知組成ウシ胎仔血清(ＦＣＳ:fetal calf serum)（Hyclone社、ローガン、ユタ州）、１×Ｌグルタミン、１×ペニシリン／ストレプトマイシン、１×非必須アミノ酸（Invitrogen社、カールズバード、カリフォルニア州）、１×インスリン−トランスフェリン−セレニウムＧサプリメント（Invitrogen社、カールズバード、カリフォルニア州）および１ｍＭ  β−メルカプトエタノール（Sigma社、セントルイス、ミズーリ州）を含有している可能性がある。
【００５０】
ＫＯ培地は、その調製物中にウシインスリンおよびブタトランスフェリンを有する。この培地は、典型的には８０％KNOCＫＯUT-ＤＭＥＭ（Invitrogen社、カールズバード、カリフォルニア州）、２０％KNOCＫＯUT代用血清（Invitrogen社、カールズバード、カリフォルニア州）、１×Ｌグルタミン、１×ペニシリン／ストレプトマイシン、１×非必須アミノ酸、１×インスリン−トランスフェリン−セレニウムＧサプリメントおよび１ｍＭ  β−メルカプトエタノールを含んでいる可能性がある。４ｎｇ／ｍＬのrhbFGF（Sigma社、セントルイス、ミズーリ州）を添加することができる。
【００５１】
ＨＥＳ培地もしくはＫＯ培地におけるＦＣＳ、ウシインスリンおよび／またはブタトランスフェリンからの動物性病原体のヒト線維芽細胞フィーダーへの交差移入の可能性を減少させるためには、ＦＣＳが２０％ヒト血清（ＨＳ:human serum）と置換されている既知組成ＨＥＳ（ＨＥＳ−ＨＳ）もしくはＫＯ（ＫＯ−ＨＳ）培地を使用することができ、そして動物性のトランスフェリンおよびインスリンはヒトインスリンおよびヒトトランスフェリン（Sigma社、セントルイス、ミズーリ州）と置換することができる。これらの培地を使用すると、ヒト胚性幹細胞の未分化増殖を良好にサポートすることができる。ＨＥＳ−ＨＳおよびＫＯ−ＨＳは、動物性成分を有していないので好ましい。
【００５２】
ヒト血清（ＨＳ）が補給されたＨＥＳ培地（ＨＥＳ−ＨＳ）は、典型的には８０％ＤＭＥＭ、２０％プールヒト血清、１×Ｌグルタミンと１×ペニシリン／ストレプトマイシン、１×非必須アミノ酸、１×ヒトインスリン−ヒトトランスフェリン−セレニウムＧサプリメントおよび１ｍＭ  β−メルカプトエタノールを含んでいる可能性がある。
【００５３】
ヒト血清（ＨＳ）が補給されたＫＯ培地（ＫＯ−ＨＳ）は、典型的には８０％ＫＯ  ＤＭＥＭ、２０％プールヒト血清、１×Ｌグルタミン、１×ペニシリン／ストレプトマイシン、１×非必須アミノ酸、１×ヒトインスリン−ヒトトランスフェリン−セレニウムＧサプリメントおよび１ｍＭ  β−メルカプトエタノールを含んでいる可能性がある。４ｎｇ／ｍＬのｒｈｂＦＧＦを添加することができる。
【００５４】
新規ヒト胚性幹細胞株を導出するためのヒトＩＣＭ増殖は、ＨＦＭもしくはＨＦＳもしくはＨＡＦＴフィーダーおよび次の１）ＨＥＳ（２）ＫＯ（３）ＨＥＳ−ＨＳまたは（４）ＫＯ−ＨＳのいずれかの培地を用いてサポートすることができる。ＨＥＳ−ＨＳおよびＫＯ−ＨＳは、動物性成分を有していないので好ましい。
【００５５】
細胞サポートマトリックスは、一般的にフィーダー細胞の表面によって提供されるような細胞増殖をサポートするための条件と実質的に同一の条件を提供するあらゆる物質であってよいが、しかし本発明はこの実施例にのみ限定されない。重要なことに、細胞サポートマトリックスは細胞増殖をサポートしなければならない。細胞サポートマトリックスはさらに、細胞を実質的に未分化の状態でサポートする。
【００５６】
細胞サポートマトリックスは、動物フィーダー細胞と置換することのできる細胞性（フィーダー細胞）または非細胞性細胞サポートマトリックスであってよい。後者では、調整培地は、ＥＳ細胞を導出および増殖させるために必要な可溶性因子を提供してもよい。調整培地は、フィーダー細胞の培養から導出できる。非細胞性細胞サポートマトリックスについては、前記支持体はコラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ヒト細胞外マトリックスもしくはMatrigel（商標）またはそれらの組み合わせを含む群から選択することができる。
【００５７】
様々な細胞サポートマトリックスは、ＥＳ細胞未分化のパーセンテージによって区別することができる。未分化度は、細胞サポートマトリックス間で相違する可能性がある。各マトリックスは、「実質的未分化」である細胞を少なくとも５０％未分化としてサポートする。細胞サポートマトリックスは５０％を超える未分化をサポートできる。好ましくは、コラーゲンＩは少なくとも９０％を超える未分化をサポートする。Matrigel（商標）は少なくとも８０％を超える未分化をサポートすることができる。
【００５８】
ＥＳ細胞コロニーの厚みは、マトリックス間で相違することがある。コラーゲンＩコロニーは、Matrigel（商標）より厚くてよい。コラーゲンＩはより多くの細胞を提供することが見いだされており、したがって支持系としてより優れている。
【００５９】
好ましくは、非細胞性細胞サポートマトリックスはコラーゲンＩまたはマトリゲルまたはその組み合わせである。最も好ましくは、非細胞性サポートマトリックスはコラーゲンＩもしくはＩ型コラーゲンである。Ｉ型コラーゲンは、２本のα1鎖および１本のα2鎖から構成される長さ３００ｎｍのヘテロ三量体である。コラーゲン結合インテグリン受容体は、α1β1、α2β1およびα3β1である。コラーゲンＩセルウェアは、細胞付着および拡散の促進、細胞接着アッセイおよび培養中での一次細胞増殖の改善のために効果的に使用されてきた。本出願人らは、ＥＳ細胞、特にヒトＥＳ細胞がコラーゲンＩをコートしたプラスチック製容器上に未分化コロニーとして良好に付着して増殖することを見いだした。
【００６０】
コラーゲンマトリックスは、Becton Dickinson社から入手されるBIOCOATコラーゲンＩ（５μｇ／ｃｍ2）セルウェアシャーレのような市販で入手できるセルウェアとして供給される、または好ましくは約５〜１０μｇ／ｃｍ2の濃度にある液状形で供給されることがある。液状形もまたBecton Dickinson社から入手できる。
【００６１】
Matrigel（商標）は、ラミニン、コラーゲンＩＶ、eulactinおよびヘパリン硫酸およびプロテオグリカンから構成される。マトリゲルは、プレコートされた３５ｍｍシャーレとして入手される（製品番号：40460、Becton Dickinson社）。
【００６２】
細胞性細胞サポートマトリックスについては、細胞はフィーダー細胞であり、ヒト成人細胞、胎児細胞または胚細胞を含むがそれらに限定されない群から選択できる。好ましくは、成人細胞については、それらはヒト成人線維芽細胞、皮膚細胞、筋細胞もしくは上皮細胞またはそれらの組み合わせを含む群から選択される。好ましくは、成人線維芽細胞はヒト成人卵管（ＨＡＦＴ）線維芽細胞である。細胞が胎児細胞である場合は、ヒト胎児筋（ＨＦＭ）細胞、またはヒト胎児皮膚（ＨＦＳ）細胞であるのが好ましい；細胞が胚細胞である場合は、ヒト胚筋線維芽細胞、またはヒト胚皮膚線維芽細胞であるのが好ましい。成人上皮細胞は、好ましくは成人卵管上皮線維芽細胞である。
【００６３】
胎児皮膚線維芽細胞および胎児筋線維芽細胞は、流産児、好ましくは１４週流産児の特定部位から最も好都合に入手される。成人卵管上皮線維芽細胞は、閉経前子宮摘出女性から入手できる。これらの部位は、それらがフィーダー細胞の実質的に純粋な集団を提供するので特に有用である。純粋集団は、未分化ＥＳ細胞を導出および増殖させるための長所である。フィーダー細胞は、一般に未分化胚性幹細胞にとってのサポートマトリックスとして使用する前にγ線照射されるか、またはマイトマイシンＣ処理される。
【００６４】
フィーダー細胞層は、当業者が利用できるいずれかの方法によって調製できる。ヒト成人卵管フィーダー細胞は、Bongsoら(1994,1月)、「ヒト胚盤胞からの内部細胞塊の増殖(The growth of inner cell mass cells from human blastocysts),Theriogenology(米国）,41:167(要約);Bongsoら(1994,10月),「ヒト胚盤胞からの内部細胞塊の単離および培養(Isolation and culture of inner cell mass cells from human blastocysts)」,Hum Reprod(英国),9:2110-2117、およびBongsoら(1989),「ヒト卵管膨大部細胞培養の樹立(Establishment of human ampullary cell cultures)」,Hum Reprod,4:486-494に記載された方法によって調製できる。
【００６５】
提供された卵管からヒト成人卵管細胞を最初に増殖させる場合は、内上皮表層細胞を使用する。細胞層の最初の増殖（初代培養）の形態は上皮性（非線維芽性）であり、間質性（線維芽性）細胞ではない。引き続いての継代培養では、上皮細胞が線維芽細胞に転換する。これは、従来方法で使用される最初から初代培養が線維芽細胞であるマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）とは全く相違する。さらに、ヒト成人卵管フィーダー細胞は、おそらくＭＥＦ細胞によっては放出されない卵管特異的糖タンパク質を放出する。
【００６６】
ヒト胚筋細胞およびヒト胚皮膚細胞に関しては、これらは１４週齢正常非病理的ヒト流産児のこれらの領域から特別に採取して培養として増殖させることができる。初代培養では、胚筋細胞は線維芽細胞として出発するが、胚皮膚細胞は上皮細胞として出発する。引き続き継代培養すると、胚皮膚細胞は線維芽細胞へ転換する。これとは対照的に、ＭＥＦ細胞は極めて小さく、したがって詳細には皮膚および筋ではない多数の細胞タイプの混合物である浸軟マウス胚から増殖した線維芽細胞である。
【００６７】
ヒト成人皮膚フィーダー細胞は、生検を介して腹部皮膚の表皮層から導出することができる。しかし、皮膚は他の部位から入手してもよい、または自由に入手できる営利的起源から入手してもよい。
【００６８】
本発明で使用するフィーダー層は、好ましくはＬＩＦの存在を必要としない。より重要なことには、以下で説明するように、未分化状態のＥＳ細胞を導出および増殖させるために必要とされる非調整培地は培地中でＬＩＦを利用しない。本発明の１つの長所は、ＥＳ細胞、特にヒトＥＳ細胞がヒトフィーダー細胞の存在下またはフィーダー細胞層の不在下で増殖すること、したがって異種移植片ではないことにある。
【００６９】
フィーダー層をサポートするために適切な培地のタイプは、プラスチック製組織培養シャーレのようなサポートマトリックスへの付着を保証する。ヒトフィーダー（ＨＦ:human feeder）培養培地は、組織培養プレートまたはプラスチックへのＨＦＭ線維芽細胞、ＨＦＳ線維芽細胞およびＨＡＦＴ線維芽細胞フィーダー付着を促進することができる。一般に、ＨＦ培地は９０％ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ:Dulbecco's Modified Eagles Medium）（Invitrogen社、カールスバード、カリフォルニア州）、１０％ウシ胎児血清（Invitrogen社、カールスバード、カリフォルニア州）、１×Ｌグルタミン（Invitrogen社、カールスバード、カリフォルニア州）および１×ペニシリン／ストレプトマイシン（Invitrogen社、カールスバード、カリフォルニア州）を含んでいる。
【００７０】
ＨＦ培地中のＦＢＳからヒト線維芽細胞フィーダーへの動物性病原体の交差移入の可能性を減少させるためには、ＦＢＳは１０％プールヒト血清（ＨＳ）と置換することができるが、ＦＢＳを使用するとヒトフィーダー線維芽細胞フィーダーをプラスチックへ良好に付着させることができる。このヒトフィーダーサポート培地（ＨＦ−ＨＳ培地）は、９０％ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、１０％プールヒト血清、１×Ｌグルタミンおよび１×ペニシリン／ストレプトマイシンを含んでいてよい。ヒト血清は患者からの血液試料を３００ｇで１５分間遠心分離することによって入手した。各遠心分離血液試料から上清を取り出し、プールした。ヒト血清は新鮮な状態で、または４℃で保管した後に使用できる。ヒトフィーダー線維芽細胞はプラスチックへ付着させることができ、それらの増殖はＨＦ培地もしくはＨＦ−ＨＳ培地のどちらかを使用してサポートできる。ＨＦ−ＨＳ培地は、動物性成分を有していないので好ましい。
【００７１】
ヒト胎児筋細胞、ヒト胎児皮膚細胞およびヒト成人卵管細胞の初代培養を樹立するために有用であるまた別の代替培地は、ヒトフィーダー樹立（ＨＦＥ:human feeder establishment）培地である。この培地は、典型的には５０％ＤＭＥＭ（Invitrogen社）、５０％ヒト血清（好ましくはＨＩＶ１および２、Ｂ型肝炎についてスクリーニング済み）（好ましくは、社内またはIrvine SC社、カリフォルニア州から市販されている）、１×Ｌグルタミン、１×ペニシリン−ストレプトマイシン、１×非必須アミノ酸（Invitrogen社）、１ｍＭメルカプトエタノールおよびヒトインスリン−トランスフェリン−セレニウムサプリメント（Sigma社、ミズーリ州）を含んでいる。
【００７２】
さらに連続継代培養のために細胞を維持するために、ヒト維持（ＨＭ:human maintenance）培地を使用できる。この培地は、典型的には８０％ＤＭＥＭ、２０％ヒト血清、１×Ｌ−グルタミンおよび１×ペニシリン−ストレプトマイシンを含有していてよい。フィーダー層を継代培養するために、継代培養前に細胞を剥離させるために一般的にトリプシンを使用する。しかし、トリプシンは一般に非ヒト起源から入手される。このため、細胞を剥離させるために他の方法を採用するのが好ましい。機械的に攪拌しながらＥＤＴＡを用いて細胞を処理するか、または細胞を除去するためにゴム冠ポリスマンを使用するのが好ましい。細胞はその後、ＨＭ培地中で維持できる。
【００７３】
細胞サポートマトリックスが上述したようなフィーダー層である場合、フィーダー層は平板なプラスチックまたはゼラチンをコートしたプラスチック上で直接的にプレーティングできる。
【００７４】
理論によって制限されることなく、サポートマトリックスがフィーダー細胞層である場合、これらのフィーダー細胞はＥＳ細胞の未分化増殖をサポートするために特有の可溶性因子を産生すると想定される。好ましくは、この状況では、細胞は非調整培地で増殖させられる。好ましくは、非調整培地はＨＦ、ＨＦ−ＨＳまたはＨＭ培地である。
【００７５】
ここで使用する用語「可溶性因子」はフィーダー細胞によって産生または発現した、細胞−細胞相互作用を導出でき、細胞膜によって吸収もしくは取り込まれる、または取り込まれないが、それでもまだ前記細胞膜を通してシグナルを送信することのできる全因子を含むことが意図されている。一般に、細胞によって産生した可溶性因子は、細胞が応答するのを誘発する培地および細胞膜内に吸収または可溶化することができる。
【００７６】
本発明はさらにまたその範囲内に、非細胞性マトリックス上でプレーティングできるフィーダー細胞と一緒に、上述のような非細胞性マトリックスの使用を含んでいる。フィーダー細胞は、未分化細胞の増殖および培養を維持するための可溶性因子のインサイチュー産生を提供する。
【００７７】
最も好ましくは、フィーダー細胞は、ヒト成人細胞、胎児細胞もしくは胚細胞またはそれらの組み合わせを含むがそれらに限定されない群から選択される。
【００７８】
好ましくは、ヒト成人細胞については、細胞はヒト線維芽細胞、皮膚細胞、筋細胞または上皮細胞を含む群から選択される。最も好ましくは、ヒト線維芽細胞はヒト成人卵管（ＨＡＦＴ）線維芽細胞である。最も好ましくは、ヒト上皮細胞は、ヒト卵管上皮線維芽細胞である。
【００７９】
好ましくは、ヒト胎児細胞については、細胞はＨＦＭ細胞およびＨＦＳ細胞を含む群から選択される。ヒト胚細胞については、細胞は好ましくはヒト胚筋（ＨＥＭ:human embryonic muscle）細胞またはヒト胚皮膚細胞である。
【００８０】
また別の好ましい実施形態では、ヒト胎児皮膚フィーダー細胞は正常ヒト胎児皮膚線維芽細胞株であるDetroit 551（ATCCカタログ番号CCL-110）である。
【００８１】
フィーダー細胞はさらにまた、ATCC-X-55もしくはATCC-CCL-171のアクセッション番号を有する正常胎児肺組織細胞株ＭＲＣ−５またはATCC-CCL-75もしくはATCC-CCL-75.1のアクセッション番号を有する胚肺組織細胞株ＷＩ−３８を含む群から選択することができる。
【００８２】
本発明のまた別の好ましい態様では、実質的に未分化の状態のＥＳ細胞株をＥＳ細胞集団から導出する方法であって、前記方法が、
未分化ＥＳ細胞を含むＥＳ細胞集団を入手するステップと；
ヒトフィーダー細胞から導出された調整培地が補給された培地の存在下において非細胞性細胞サポートマトリックス上で未分化細胞を培養するステップと
を含む方法が提供される。
【００８３】
本発明のまた別の好ましい態様では、実質的に未分化の状態のＥＳ細胞をＥＳ細胞集団から増殖させる方法であって、前記方法が、
未分化ＥＳ細胞を含むＥＳ細胞集団を入手するステップと；
ヒトフィーダー細胞から導出された調整培地が補給された培地の存在下において非細胞性細胞サポートマトリックス上で未分化細胞を培養するステップと
を含む方法が提供される。
【００８４】
好ましくは、非細胞性細胞サポートマトリックスはコラーゲンＩサポートマトリックスである。
【００８５】
可溶性因子またはその同等物はヒトフィーダー細胞から導出される。それらは一般にその中でフィーダー細胞が増殖する、さもなければ調整培地として知られている培地から導出される。これは、実質的にコンフルエントな単層を提供する期間中に上述のフィーダー細胞タイプのいずれかを細胞タイプに適切な標準培地中で培養し、γ線照射またはマイトマイシンＣ処理のために細胞を取り出すことによって入手できる。不活化された細胞は、その後置換して、ＥＳ細胞増殖をサポートする培地の存在下で培養できる。培地は、ＨＥＳ、ＫＯ、ＨＥＳ−ＨＳまたはＫＯ−ＨＳを含む群から選択することができる。ある期間後、培地は調整培地として収集できる。好ましくは、培地はプレーティングのおよそ１０〜２０時間の期間後に収集され、より好ましくは培地はプレーティングのおよそ１６時間後に収集される。培地は、無菌性を維持するように処理できる。処理方法は、当業者に知られている処理方法である。好ましくは濾過法を使用する。培地は直接的に使用できる。調整培地は、マイトマイシンＣもしくは照射により不活化されていないコンフルエントなヒト単層と類似する方法で調製でき、そのような調整培地はさらにまたコラーゲンＩもしくはマトリゲルマトリックス上で増殖させたときに未分化状態のＨＥＳ細胞増殖をサポートする。
【００８６】
可溶性因子に適用するような用語「それらの同等物」は、フィーダー細胞から導出された培地中で見いだされる可溶性因子に等しい因子のあらゆる合成組み合わせを意味する。
【００８７】
調整培地は、さらにまたＨＦ、ＨＦ−ＨＳまたはＨＦＥ培地中で培養されている培養線維芽細胞から導出することもできる。これらの培養から入手して無菌条件下で処理した上述のような上清培地もまた使用できる。しかし、これらの培地はその後にＨＥＳ、ＫＯ、ＨＥＳ−ＨＳおよびＫＯ−ＨＳであるがそれらに限定されないＥＳ細胞増殖をサポートするために最も適した培地であるフィーダー層を培養するために最もよく使用される。したがって、「ヒトフィーダー細胞から導出された調整培地が補給された培地」は、その中でフィーダー細胞が増殖させられるＨＥＳ、ＫＯ、ＨＥＳ−ＨＳもしくはＫＯ−ＨＳ培地を含むＥＳ細胞増殖培地であってよい、またはそれはその中でフィーダー細胞が増殖させられているＨＦもしくはＨＦ−ＨＳが補給されたＥＳ細胞増殖培地であってよい。
【００８８】
いずれかの理論に限定することは望まないが、このようなフィーダー細胞の使用、またはこのようなフィーダー細胞から導出された調整培地の使用は、ＥＳ細胞の増殖を促進および／または防止するため、またはこのような細胞の分化速度を低下させるために必要な１つ以上の物質を提供する。このような物質には、細胞によって周囲培地内へ分泌される膜結合および／または可溶性細胞産物が含まれると考えられる。さらに、当業者は、フィーダー細胞によって産生する、または調整培地中に含まれる１つ以上の物質は、このようなフィーダー細胞および／またはこのような調整培地の必要を防ぐために同定して本発明の細胞培養培地へ添加することができると認識し得る。
【００８９】
マウスフィーダー層とは相違して、ヒトフィーダー層、詳細には純粋フィーダー層は培地内へ補給されたＬＩＦの存在を必要としない。理論によって限定されることなく、ＬＩＦを含まない培地およびヒト胎児フィーダーおよび成人フィーダーの使用の単純性はＥＳ細胞、特別には未分化状態にあるＨＥＳ細胞の導出および持続的増殖のために重要である。
【００９０】
調整培地を産生するために使用するフィーダー細胞は、Detroit 551、ＭＲＣ−５もしくはＷＩ−３８を含む群から選択することができる。
【００９１】
本明細書の説明および特許請求の範囲を通して、用語「含む(comprise)」、ならびに「含んでいる(comprising)」および「含む(comprises)」等の用語の変形は、他の添加物、成分、整数もしくはステップを排除することを意図していない。
【００９２】
培養条件は、当業者であれば精通している標準培養条件である。一般には３７℃の温度および５％ＣＯ2を含む大気が採用される。しかし、特異的細胞増殖に適応させるためにはこれらの条件から逸脱することができる。
【００９３】
ＥＳ細胞は、無期限に増殖させることができる。しかし、コロニー形成はおよそ５〜７日間後に出現し始める。好ましくは、コロニー形成は５日後に開始する。
【００９４】
本発明のまた別の好ましい態様では、実質的に未分化の状態のＥＳ細胞株をＥＳ細胞集団から導出する方法であって、前記方法が、
未分化ＥＳ細胞を含むＥＳ細胞集団を入手するステップと；
ＬＩＦの不在下でＥＳ細胞増殖をサポートする非調整培地の存在下においてヒトフィーダー細胞を含む細胞性細胞サポートマトリックス上で未分化細胞を培養するステップと
を含む方法が提供される。
【００９５】
本発明のさらにまた別の好ましい態様では、実質的に未分化の状態のＥＳ細胞をＥＳ細胞集団から増殖させる方法であって、前記方法が、
未分化ＥＳ細胞を含むＥＳ細胞集団を入手するステップと；
ＬＩＦの不在下でＥＳ細胞増殖をサポートする非調整培地の存在下においてヒトフィーダー細胞を含む細胞性細胞サポートマトリックス上で未分化細胞を培養するステップと  を含む方法が提供される。
【００９６】
未分化ＥＳ細胞の起源は上述の通りである。
【００９７】
ヒトフィーダー細胞層と組み合わせて使用する非調整培地は、未分化細胞増殖をサポートするため、特に未分化状態の新規細胞株を導出するために重要である。好ましくは、ヒトフィーダー細胞はヒト成人卵管細胞もしくはヒト胚筋細胞およびヒト胚皮膚フィーダー細胞、ヒト胎児筋細胞もしくはヒト胎児皮膚細胞またはヒト成人卵管上皮線維芽細胞もしくはヒト成人皮膚細胞から入手する。より好ましくは、ヒトフィーダー細胞は胎児筋細胞または成人皮膚細胞である。
【００９８】
非調整培地は、ＬＩＦの不在によって、ほとんどの場合は一般にマウスフィーダー細胞が使用される場合は培養に補給されるｈＬＩＦの不在によって単純に維持される。
【００９９】
ＥＳ細胞増殖をサポートする培地は、ＨＥＳ、ＫＯ、ＨＥＳ−ＨＳまたはＫＯ−ＨＳを含む群から選択することができる。
【０１００】
細胞株を産生するために次の未分化ヒト胚性幹（ＨＥＳ）細胞を長期にわたり増殖および導出するためには、ＨＦＭフィーダー層、ＨＦＳフィーダー層もしくはＨＡＦＴフィーダー層はＩＣＭを増殖させるために使用する上述の４つの培地のいずれか１つと一緒に使用できる。ＨＥＳ−ＨＳおよびＫＯ−ＨＳは、動物性成分を含有していないので好ましい。
【０１０１】
本発明のさらにまた別の態様では、フィーダー細胞を含んでいない増殖性の未分化ＥＳ細胞を含む細胞組成物であって、前記細胞組成物はフィーダー細胞の不在下で本明細書に記載した方法によって調製される増殖または導出されたＥＳ細胞を含む細胞組成物が提供される。
【０１０２】
好ましくは、本発明の細胞組成物は細胞培養物として提供されるが、細胞はコラーゲンＩ、コラーゲンＩＶまたはマトリゲルを含むがそれらに限定されない群から選択される１つの成分または複数の成分の組み合わせを含む細胞サポートマトリックス上で培養される。最も好ましくは、１つ以上の成分にはコラーゲンＩＶまたはマトリゲルが含まれる。フィーダー細胞の不在下では、培養された未分化ＥＳ細胞は上述の通りに、調整培地中で維持される。
【０１０３】
本発明のさらにまた別の態様では、フィーダー細胞層上の増殖性の未分化ＥＳ細胞を含む細胞組成物であって、前記細胞組成物はここに記載した方法によって調製される増殖または導出されたＥＳ細胞を含む細胞組成物が提供される。
【０１０４】
フィーダー細胞層はヒト細胞を含み、そして好ましくは、ヒト成人卵管フィーダー細胞もしくはヒト胚筋細胞およびヒト胚皮膚細胞、ヒト胎児筋細胞もしくはヒト胎児皮膚細胞またはヒト成人卵管上皮線維芽細胞もしくはヒト成人皮膚細胞を含むがそれらに限定されない群から選択される。
【０１０５】
最も好ましくは、フィーダー層の優先順位は成人皮膚細胞、胚筋細胞、胚皮膚細胞および成人卵管細胞である。より好ましくは、それらは成人皮膚細胞もしくは胎児筋細胞であり、最も好ましくはヒト胎児筋細胞である。それらは、好ましくはコラーゲンを含まないプラスチック容器上で増殖させられる。
【０１０６】
本発明のまた別の態様では、培養中のＥＳ細胞を実質的に未分化の状態でサポートするヒトフィーダー細胞層が提供される。
【０１０７】
本出願人らは、培養時に実質的に未分化の状態で、ＥＳ細胞、好ましくはヒトＥＳ細胞をサポートできるフィーダー細胞の少数の起源を見いだした。これらのフィーダー細胞は、現在はＥＳ細胞を実質的に未分化の状態でサポートおよび維持するために使用されている既知の線維芽細胞フィーダー細胞層に類似する方法で使用できる。好ましくは、フィーダー細胞層は、ヒト細胞または胚または胎児由来のヒト細胞もしくはヒト筋フィーダー細胞もしくはヒト皮膚フィーダー細胞を含む。成人フィーダー細胞もまた使用できる。最も好ましくは、それらはヒト胎児筋フィーダー細胞であってよい、またはそれらはヒト成人卵管線維芽細胞もしくは成人卵管上皮線維芽細胞または成人皮膚細胞であってよい。
【０１０８】
胚皮膚細胞および胚筋細胞は、正常非病原性１４週齢流産児から導出できる。組織は、特別にはこれらの領域から切除することができる。成人卵管細胞は、避妊手術を受けている女性から提供された非病原性閉経前卵管から導出することができる。細胞は、卵管の内上皮表層細胞から収集できる。好ましくは、細胞はＨＩＶ、Ｂ型肝炎およびその他の病原体についてすべてスクリーニングされる。筋細胞、皮膚細胞および卵管細胞は、すべてBongsoら(1989)Hum Reprod,4;486-494に記載された方法と同一方法によって処理される。これらの細胞はそれらの自然起源から直接導出されるが、さらにまた細胞はこれらのフィーダー細胞の持続性培養から導出できることも可能である。
【０１０９】
好ましくは、ＥＳ細胞はヒトＥＳ細胞であり、フィーダー細胞層はヒト細胞を含む。
【０１１０】
フィーダー層は、好ましくは１０％ＦＣＳを含有していてよいＨＦ培地の存在下で培養されるが、最も好ましくはＦＣＳは１０％ＨＳ（ＨＦ−ＨＳ）によって置換される。あるいはまた、フィーダー細胞はＨＦＥ培地の存在下で初代培養として樹立される。連続継代培養によって細胞を維持するためには、ヒト維持（ＨＭ）培地を使用できる。しかし、継代培養前に、細胞は培地表面から剥離しなければならない。機械的攪拌によるＥＤＴＡまたはゴム冠ポリスマンの使用は、トリプシンのような非ヒト性プロテアーゼに対する必要を取り除いて減らすことを容易にする可能性がある。
【０１１１】
フィーダー細胞は、さらにまたDetroit 551、ＭＲＣ−５もしくはＷＩ−３８を含む群から選択することができる。
【０１１２】
本発明のさらにまた別の態様では、ここに記載した方法によって調製された未分化ＥＳ細胞が提供されるが、最も好ましくはＥＳ細胞は哺乳動物ＥＳ細胞である。より好ましくは、ＥＳ細胞もしくはＥＳ細胞株はサルまたはヒトから選択された霊長類細胞である。いっそうより好ましくは、ＥＳ細胞はヒトＥＳ細胞である。
【０１１３】
本発明のさらにまた別の態様では、ここに記載した方法によって導出されるＥＳ細胞株が提供される。
【０１１４】
ここに記載したＥＳ細胞およびＥＳ細胞株は、ＥＳ細胞を特徴付けるために使用されるいずれかのマーカーによって規定できる。これらには、Ｏｃｔ−４、ＴＲＡ−１−６０、プロテオグリカン、ＳＳＥＡおよびＳＣＩＤマウス奇形腫産生の発現が含まれるがそれらに限定されない。
【０１１５】
本発明のまた別の態様では、実質的に未分化の状態のＥＳ培養を提供するための細胞培養系であって、前記細胞培養系が、
細胞サポートマトリックスと；
ヒトフィーダー細胞から導出された可溶性因子またはそれらの同等物を提供するための細胞培養培地と
を含む細胞培養系が提供される。
【０１１６】
前記細胞培養系は、ＥＳ細胞を実質的に未分化の状態で培養するために使用するように設計されている。ＥＳ細胞は、上述のいずれかの起源から入手できる。
【０１１７】
細胞サポートマトリックスは、細胞増殖をサポートする適切な培養系の表面上でサポートできる。理想的には、細胞サポートマトリックスはいずれかの適切な組成物、好ましくはプラスチックまたはガラスであってよい組織培養プレート上で作製される。その他の適切な表面には、スライド、ガラスビーズ、ゼラチンをコートしたプラスチック容器、アルブミンをコートしたプラスチック容器、ポリリシンをコートしたプラスチック容器、バイオ工学研究者が足場として使用する生物分解性ポリマーおよび海洋接着性物質が含まれる。
【０１１８】
細胞サポートマトリックスは、上述の細胞性もしくは非細胞性サポートマトリックスのいずれかであってよい。最も好ましくは、それらはヒト細胞性もしくは非細胞性サポートマトリックスである。
【０１１９】
培地は、ＥＳ細胞増殖をサポートするいずれかの培地であってよい。好ましくは、培地は上述の調整培地である。しかし、細胞サポートマトリックスがここに記載したフィーダー細胞層である場合は、細胞サポートマトリックスのフィーダー細胞から産生した可溶性因子を受け入れるために非調整培地を使用することができる。好ましくは、非調整培地は上述の通りにＬＩＦまたはｈＬＩＦも不在である。
【０１２０】
細胞培養系は、ここに記載した方法を用いて使用するためのキットとして提供されてよい。
【０１２１】
本発明の好ましい態様では、
コラーゲンＩまたはマトリゲルを含む細胞サポートマトリックスと；
ヒトフィーダー細胞層から導出された可溶性因子を含む調整培地と
を含む細胞培養系が提供される。
【０１２２】
本発明のいっそう好ましい態様では、
コラーゲンＩを含む細胞サポートマトリックスと；
胚筋細胞、胚皮膚細胞もしくは成人卵管フィーダー層、胎児筋細胞および胎児胎児皮膚細胞、成人卵管上皮線維芽細胞または成人皮膚細胞を含む群から選択されたヒトフィーダー細胞層から導出された可溶性因子を含む調整培地と
を含む細胞培養系が提供される。
【０１２３】
より好ましくは、調整培地は胚筋細胞、または胚皮膚細胞を含むフィーダー層から導出される。より好ましくは、フィーダー層はヒトフィーダー層である。
【０１２４】
本発明のまた別の好ましい態様では、実質的に未分化の状態のＥＳ培養を導出および増殖させるための細胞培養系であって、前記組織培養系が、
ヒトフィーダー細胞を含む細胞性細胞サポートマトリックスと；
ＥＳ細胞の培養をサポートするためのＬＩＦが不在である非調整細胞培養培地と
を含む細胞培養系が提供される。
【０１２５】
ヒトフィーダー細胞層は上述の通りである。細胞培養系は、ＥＳ細胞の新規細胞株を導出するため、およびすでに培養されているＥＳ培養を保持もしくは維持するために上述の起源からの未分化ＥＳ細胞を受け入れるために使用されるのが好ましい。
【０１２６】
細胞培養系に使用する培地は、好ましくはＥＳ細胞増殖をサポートする培地である。上述のように、そのような培地には、ＨＥＳ、ＫＯ、ＨＥＳ−ＨＳまたはＫＯ−ＨＳが含まれる。ＨＥＳ−ＨＳおよびＫＯ−ＨＳは、動物性成分を含有していないので最も好ましい。
【０１２７】
ＥＳ細胞を実質的に未分化の状態で培養するためのここに記載した方法は、ＥＳ細胞が有用であるすべての工学技術に適用できることは明白であろう。特に重要であるのは、増殖させるための新規細胞株の作成である。ヒト胚盤胞由来の内部細胞塊（ＩＣＭ）は、免疫手術により単離して、ここに記載した調整培地を使用して、または使用せずにヒトフィーダー層および非細胞性マトリックス上で未分化状態で増殖させられることが考えられる。さらに、それは単一または複数の遺伝的修飾を有する細胞株を提供する。
【０１２８】
遺伝的修飾は、遺伝子療法のための修飾遺伝子を提供する、またはグラフト術もしくは移植術用の組織置換のためのような多数の理由から望ましい。
【０１２９】
細胞への遺伝的修飾を実行するために使用する方法は、そのような遺伝的形質転換を行うための分子生物学の分野において知られている方法のいずれかであってよい。
【０１３０】
ここで使用する用語「遺伝的修飾」には、遺伝子産物をコードする配列の変化、ならびにフランキング領域、特にコード配列の５’上流領域（プロモーターを含む）への変化が含まれる。同様に、用語「遺伝子」にはコード配列および前記コード配列を挟んで存在することがある調節配列、ならびにコード配列を挟んでいるその他の配列が含まれる。さらに、当分野において知られているように、遺伝的修飾は、例えば組み換えによってゲノム内へ挿入できる核酸を導入することにより、必ずしも全遺伝子配列を含んでいない核酸を細胞内へ導入することによって達成できる。
【０１３１】
近年は生物学および医学において幹細胞の潜在的用途に極めて多くの注意が向けられてきた。多能性および不死性という特性はＥＳ細胞に特有であり、これにより研究者らはヒトの生物学および医学における多数の問題に初めて取り組むことが可能になる。ＥＳ細胞は、特に代替培養系では必要な免疫委任幹細胞の増殖をサポートできない場合に、移植術手技に使用するためのドナー組織の不足に対処できる可能性がある。ＥＳ細胞は、胎生学的研究、機能的ゲノム学、新規増殖因子の同定、および新薬発見、ならびに毒物学等の領域でのヒト医学における多数の他の広範囲に及ぶ用途がある。
【０１３２】
そこで、本発明はＥＳ細胞を実質的に未分化の状態で増殖させるための新規物質および方法を提供する。本発明によって提供される方法および物質を使用すると、ヒトおよびサルから単離されるようなＥＳ細胞をより効率的に増殖させることができる。このような細胞を分化させずに効率的に増殖させる能力には、このような細胞を直接的に、またはここに記載した１つ以上の遺伝的修飾の後に使用した場合は、組織移植術および／または遺伝子療法技術を使用してヒトの疾患を治療するためのＥＳ細胞の治療使用にとって重要な用途がある。さらに、ここに記載した方法および物質を使用して増殖させたＥＳ細胞を使用すると、新規生物活性物質について、または培養中のそのような細胞の分化を促進もしくは遅延させる他の因子についてスクリーニングできる。
【０１３３】
今度は、本発明を以下の実施例を参照しながらより詳細に説明しよう。しかし、以下の説明は例示することだけを目的としており、決して前述の本発明の普遍性を限定するものと見なすべきではない。
【実施例】
【０１３４】
［実施例１：コラーゲンＩおよびMatrigel（商標）上でのＨＥＳ細胞の増殖］
ａ）調整培地の調製
Ｔ−７５（Falcon社、米国）組織培養フラスコ中で増殖させた第４継代ＭＥＦ、第３継代ヒト胚筋細胞、ヒト胚皮膚細胞（８週齢流産児）および第６継代成人閉経前ヒト卵管線維芽細胞の９０％コンフルエント単層を３７℃、５％ＣＯ2を含む大気中で２．５時間にわたりマイトマイシンＣ（Sigma社、M-0503）により処理した。この単層を０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡを用いて分散させ、フィーダー細胞の単細胞懸濁液を作製した。遠心分離および上清の分離によりトリプシン−ＥＤＴＡを除去し、フィーダー細胞のペレットを、ゼラチンをコートした１ｍＬのプラスチック製１−ウェル組織培養シャーレ（Falcon社、米国）上でプレーティングした。180,000マイトマイシンＣ処理フィーダー細胞は各１ｍＬの培養シャーレ上でプレーティングした。次に、各培養シャーレは新鮮ＨＥＳ培地を用いて２回洗浄し、洗浄した不活化フィーダー細胞は３７℃、５％ＣＯ2を含む大気中で１６時間にわたりＨＥＳ培地の存在下で一晩培養した。１６時間調整ＨＥＳ培地を収集し、０．０２μｍフィルター（Sterivex、Millipore社）を使用して濾過し、新鮮なまま使用するか、４℃で保存した後に３７℃へ加温して使用した。
【０１３５】
ｂ）非調整培地の調製
非調整培地は、８０％ダルベッコ変法イーグル培地（Life Technologies社、製品番号11960-044）、２０％Hyclone既知組成ウシ胎児血清（Hyclone社、製品番号SH30070.03）、１×Ｌグルタミン（Life Technologies社、製品番号25030-081）、１×ペニシリン／ストレプトマイシン（Life Technologies社、製品番号15070-063）、１×非必須アミノ酸（Life Technologies社、製品番号11140-050）、１×インスリン−トランスフェリン−セレニウムＧサプリメント（Life Technologies社、製品番号41400-0450）、１ｍＭ  β−メルカプトエタノール（Life Technologies社、21985-023）から構成した。
【０１３６】
ｃ）組織培養プレート上のコーティングの調製
（ｉ）Becton Dickinson社のBIOCOAT（登録商標）コラーゲンＩセルウェア３５ｍｍシャーレ（製品番号40456）を全実験で使用した。製造業者のコラーゲンＩの起源は、ラット尾腱（Becton Dickinson社製品カタログ）であった。
【０１３７】
（ii）コラーゲンＩ液はBecton Dickinson社（製品番号40231）から入手した。この起源はウシ真皮であり、プラスチック容器へのプレーティングは１０μｇ／ｃｍ2の組織培養面で実施した。
【０１３８】
（iii）Matrigel（商標）がコートされたプラスチック容器はBecton Dickinson社（製品番号４０４６０）から入手した。マトリゲルの起源はengelbreth-holm-swarmマウス腫瘍であった。
【０１３９】
ｄ）調整培地を用いたコラーゲンＩおよびMatrigel（商標）上でのＨＥＳ細胞の増殖
（ｉ）実験群：成熟未分化ＨＥＳ−３およびＨＥＳ−４細胞コロニーは国際特許出願第PCT/AU99/00990号によって増殖させ、ＭＥＦ細胞上で増殖させ、無菌針を用いて各約３００細胞の断片へ切断し、ジスパーゼ（Sigma社、製品番号P3417）を用いてフィーダー層から浮かび上がらせ、コラーゲンＩおよびマトリゲルをコートした３５ｍｍシャーレ（Becton Dickinson社）へ移した。ＨＥＳ細胞は、２ｍＬの０．２２μｍ径Sterivex（登録商標）（Millipore社）で濾過したフィーダー（ＭＥＦ／胚筋細胞、胚皮膚細胞／成人卵管細胞）を１６時間調整ＨＥＳ培地の存在下で、これらのシャーレのこのマトリックス上で増殖させた。調整培地は毎日取り換え、細胞は３７℃の５％ＣＯ2を含む大気中で増殖させた。
【０１４０】
（ii）対照群：同一細胞株（ＨＥＳ−３およびＨＥＳ−４）由来の未分化ＨＥＳ細胞の類似サイズの断片はジスパーゼ（Sigma社）を用いてフィーダー層から浮かび上がらせ、（１）フィーダー調整培地を含む平らなプラスチック製シャーレ、（２）ＨＥＳ培地を含むコラーゲンＩをコートしたシャーレ上で再増殖させた。
【０１４１】
実験群および対照群の両方のシャーレを同一培養器に収容し、７日間にわたりコロニー形成および増殖（分化または未分化）について毎日監視した。これを数回繰り返した。相違する人種的背景由来の２つの相違するＨＥＳ細胞株（ＨＥＳ−３およびＨＥＳ−４）について評価した。
【０１４２】
ｅ）非調整ＨＥＳ培地を用いたヒト胚筋細胞、ヒト胚皮膚細胞およびヒト成人卵管細胞上でのＨＥＳ細胞の増殖
（ｉ）実験群：ＭＥＦ細胞上で増殖させた成熟未分化ＨＥＳ−３およびＨＥＳ−４細胞コロニーは、無菌針を用いて各約３００細胞の断片に切断し、ジスパーゼ（Sigma社、製品番号P3417）を用いてＭＥＦ層から浮かび上がらせ、正常非調整ＨＥＳ培地の存在下で、プレーティングした（〜180,000マイトマイシンＣ処理）ヒト胚筋線維芽細胞、ヒト胚皮膚線維芽細胞およびヒト成人卵管線維芽細胞フィーダー細胞を含有する１ｍＬ１−ウェル組織培養シャーレ（Falcon社、米国）へ移した。
【０１４３】
（ii）対照群：同一細胞株（ＨＥＳ−３およびＨＥＳ−４）由来の未分化ＨＥＳ細胞の類似サイズの断片は、ジスパーゼを用いてフィーダー層から浮かび上がらせ、マイトマイシンＣ処理ＭＥＦフィーダー層上で再増殖させた。
【０１４４】
実験群および対照群のシャーレ両方を同一培養器内に収容し、７日間にわたりコロニー形成および増殖（分化または未分化）について毎日監視した。数回の繰り返しを試みた。相違する人種的背景由来の２つの相違するＨＥＳ細胞株（ＨＥＳ−３およびＨＥＳ−４）について評価した。
【０１４５】
ｆ）ヒト胎児皮膚線維芽細胞Detroit 551上でのＨＥＳ細胞の増殖
Detroit 551（CCL-110）細胞株は白人女性胎児の皮膚由来である。この細胞株は、正常な核型を有し、起源組織から連続２５継代培養の有限寿命を有する。この細胞株は、ＡＴＣＣから第１０継代で発送される。この培養をインビトロでＨＦ培地を用いて第１４継代へ拡張し、低温保存した。ＨＦ培地中で増殖させた第１４もしくは第１５継代Detroit 551線維芽細胞のコンフルエント単層は、２．５時間にわたりマイトマイシンＣ（Sigma社、セントルイス、ミズーリ州）を用いて処理した。この単層を分散させてフィーダー細胞の単細胞懸濁液を作製し、ゼラチンをコートしたプラスチック製１ｍＬ１−ウェル組織培養シャーレ（Falcon、Becton Dickinson社、米国）上でプレーティングした。180,000マイトマイシンＣ処理Ｄ５５１細胞は各１ｍＬシャーレ上でプレーティングした。
【０１４６】
Detroit 551細胞は、インビトロで長期未分化ＨＥＳ細胞の増殖をサポートすることができる。Detroit 551フィーダー上で増殖したＨＥＳ−３および新規細胞株コロニーは、ＨＦＭ線維芽細胞、ＨＦＳ線維芽細胞およびＨＡＦＴ線維芽細胞フィーダー上で増殖した未分化ＨＥＳコロニーと形態学的に類似であるように見えた。Ｄ５５１上のＨＥＳコロニーは、他のヒト線維芽細胞フィーダー上で形成するコロニーのような直線状の辺縁を有しており、高倍率下の個々のＨＥＳ細胞は高い核対細胞質比を有する顕著な核小体を示す。
【０１４７】
ｇ）未分化の確認
数種の特徴付けの方法を使用した。
【０１４８】
（１）形態学的特徴
明視野および位相差倒立顕微鏡下でＨＥＳ細胞形態の観察を毎日実施した。未分化状態での増殖の速度、細胞のサイズ、厚みおよびコロニーが密集した性質の均質性についての各コロニーの内側、外側および辺縁の形態、コロニー辺縁の鮮明度および反射の性質、コロニーの拡大の性質および核−細胞質細胞比について特別な注意を払った。
【０１４９】
（２）ＲＴ−ＰＣＲ
実験群および対照群のシャーレ両方からのコロニーの断片はジスパーゼを用いて分離し、洗浄し、その後ＲＴ−ＰＣＲにより特徴付けるために冷凍した。
【０１５０】
（３）ＳＣＩＤマウス
断片（１５〜２０）を同様に実験群および対照群のシャーレ各々から取り出し、ＳＣＩＤマウス内に注入して６〜８週間で奇形腫を作製した。この奇形腫は、全３種の一次生殖系統からのヒト組織の存在を確認するために従来型組織学検査のために分離して処理した。
【０１５１】
ｈ）要約
予備試験データは、ＨＥＳ細胞が、コラーゲンＩ（プレコートされた、ならびに液体がコートされた）およびマトリゲルをプレコートしたプラスチック製シャーレ上で、ＭＥＦ細胞、ヒト成人卵管フィーダー線維芽細胞およびヒト胚筋フィーダー線維芽細胞およびヒト胚皮膚フィーダー線維芽細胞の存在下で未分化状態を良好に維持しながら付着、拡大および増殖できることを示唆している。さらに、マイトマイシンＣ処理ヒト成人卵管フィーダー細胞、ヒト胚筋フィーダー細胞およびヒト胚皮膚フィーダー細胞もまた非調整ＨＥＳ培地の存在下で未分化ＨＥＳ細胞の増殖をサポートすることができる。
【０１５２】
フィーダー層調整培地を含むコラーゲンＩシャーレ上で増殖させたＨＥＳ細胞コロニーは、培養中の７日後でさえＭＥＦフィーダー上で増殖させた多能性ＨＥＳ細胞の形態に類似する密集した形態を維持する。コラーゲンＩをコートしたプラスチック上で増殖したＨＥＳ細胞は、不活化マウスフィーダー上で増殖した多能性ＨＥＳ細胞に典型的な高い核−細胞質塊比を示す。マトリゲルをコートしたシャーレ上でのコロニー増殖は、コラーゲンＩ上と同等に良好ではあるが、マトリゲル上のＥＳ細胞はより迅速に拡大し、より薄く、それ自体では継代するのが困難である（図７を参照）。
【０１５３】
ＭＥＦ細胞への物理的付着は、ＨＥＳ細胞の生存にとって決定的に重要であるとは思われない。しかし、フィーダー層調整ＨＥＳ培地は、ＨＥＳ細胞をコラーゲンＩまたはマトリゲルをコートしたシャーレ上で増殖させる場合には増殖および未分化状態の維持にとって不可欠であると思われる。分化は、ＨＥＳ細胞がコラーゲンＩおよびマトリゲルマトリックス上の非調整ＨＥＳ培地の存在下で増殖させられた場合、およびＨＥＳ細胞がフィーダー層調整培地を含むプラスチック上で増殖させられた場合にも発生した。コラーゲンＩ上で増殖したＨＥＳ細胞はより小さな断片に切断し、金属プロテアーゼであるジスパーゼを用いて浮かび上がらせ、インビトロでの持続的増殖のために新鮮シャーレへ移すことができる。
【０１５４】
ＨＥＳ細胞はさらにまた、ヒト胚筋フィーダー線維芽細胞、ヒト胚皮膚フィーダー線維芽細胞およびヒト成人卵管フィーダー線維芽細胞上で直接的に増殖させるとコロニーを形成して未分化のままとなる（図１、８、９、１０、１１、１２、１３または１４を参照）。ＭＥＦ、ヒト胚筋フィーダー、ヒト胚皮膚フィーダーおよびヒト成人卵管フィーダーを含むコラーゲンＩをコートしたシャーレ上で増殖させたＨＥＳ細胞もまた未分化状態で良好に増殖できる。
【０１５５】
ＥＳ細胞は、調整培地の存在下では、ラミニンをコートしたシャーレ上で未分化状態では増殖できない（図６）。
【０１５６】
コラーゲンＩ上で増殖したＨＥＳ細胞およびヒトフィーダー層が実際上において多能性であるかどうかを確証するためのＳＣＩＤマウスを使用したＲＴ−ＰＣＲ試験は現在進行中である。
【０１５７】
［実施例２：ヒトフィーダー層上でのヒトＩＣＭの増殖および次のヒト胚性幹細胞の導出］
ａ）ヒトフィーダー層の調製
ヒト胎児筋試料は新鮮正常１４週齢ヒト流産児の大腿筋から直接に入手した。胎児筋試料は、無菌プラスチック製シャーレ内の輸送用培地（ASP100、Vitrolife社、エーテボリ、スウェーデン）内で先の尖った無菌曲剪刀を用いて機械的に極めて微細な細片に切断した。外植片および細胞懸濁物は３００ｇで１０分間遠心分離し、上清をデカンテーションし、外植片および細胞を含有するペレットは２ｍＬのチャン培地（Irvine Sc社、カリフォルニア州、米国）またはヒトフィーダー樹立培地（ＨＦＥ）を含有する２５ｃｍ2の無菌プラスチック製組織培養フラスコ内へ播種し、３７℃の５％ＣＯ2を含有する大気中でインキュベートした。１週間後に、初代培養（線維芽細胞）が樹立した。
【０１５８】
筋線維芽細胞は、トリプシン−ＥＤＴＡ（GIBCO社、グランドアイランド、米国）を用いたトリプシン化によりプラスチックから剥離させた。あるいはまた、それらは機械的攪拌機を用いて、もしくはゴム冠ポリスマンを使用することによりＥＤＴＡ処理してもよい。これにより細胞解離のためのトリプシンの使用が避けられる。剥離したら、細胞は遠心分離し、上清をデカンテーションし、細胞ペレットは、１０％ＦＢＳ（GIBCO社）または１０％〜２０％ヒト血清１×Ｌ−グルタミン（GIBCO社）およびペニシリン／ストレプトマイシン（GIBCO社）が補給されたＤＭＥＭ培地（GIBCO社）を含有する新規の２５ｃｍ2組織培養フラスコ内へ播種した。このＤＭＥＭ補給培地は、今後はＨＥＳ培地（ヒト胚性幹細胞培養培地）と呼ぶ。連続的継代培養は、第６継代までの各継代培養において、コンフルエントな状態になるまで実施した。ＤＭＥＭ補給培地中の第４、第５および第６継代培養からの筋線維芽細胞は液体窒素（−１９６℃）中で冷凍した。
【０１５９】
ヒト内部細胞塊（ＩＣＭ）および次のヒトＥＳ細胞を増殖およびサポートするためには、第４、第５もしくは第６筋線維芽細胞を最初に解凍し、組織培養フラスコ内へ播種し、それらがコンフルエントになるまで増殖させた。
【０１６０】
筋線維芽細胞培養はマイトマイシンＣにより処理し、それらが９５％コンフルエントになると、マイトマイシンＣは洗い流し、細胞は１シャーレ当たり180,000細胞の密度で１−ウェル器官培養シャーレ上でプレーティングした。
【０１６１】
ｂ）冷凍−解凍ヒト胚からＩＣＭを分離するための免疫手術
２日齢冷凍胚を解凍し、インビトロで第６日胚盤胞期になるまでＧ２．２連続培地（Vitrolife社、エーテボリ、スウェーデン）を用いて増殖させた。大きな内部細胞塊（ＩＣＭ）を有する品質の良好な胚盤胞だけを使用した。
【０１６２】
胚盤胞は、透明帯を除去するために３７℃の５％ＣＯ2を含有する大気中で２分間、プロナーゼ（１０ＩＵ）（プロテアーゼ、Sigma社、ミズーリ州、米国）中でインキュベートした。
【０１６３】
透明帯の完全な除去後、胚盤胞はダルベッコリン酸緩衝食塩液（ＤＰＢＳ）中で完全に洗浄してＧ２．２培地を除去し、抗ヒト全血清（ＤＢＰＳを用いて１：１に希釈）を用いて３７℃の５％ＣＯ2を含有する大気中で３０分間インキュベートした。
【０１６４】
抗ヒト全血清を用いたインキュベーション後、胚盤胞は再びＤＰＢＳを用いて完全に洗浄し、モルモット補体（ＤＰＢＳを用いて１：１に希釈）と一緒に３７℃の５％ＣＯ2を含む大気中で３０分間インキュベートした。
【０１６５】
胚盤胞はその後、ＨＥＳ培地（ＤＭＥＭが補給された）へ移し、内部細胞塊（ＩＣＭ）凝集塊を遊離させて分離するために極めて細く伸ばした研磨ガラス製パスツール型ピペットに数回通過させた。
【０１６６】
細胞のＩＣＭ凝集塊はＨＥＳ培地中で完全に洗浄し、その後マイトマイシンＣ不活化ヒト筋フィーダー層上でプレーティングした。
【０１６７】
ｃ）ＩＣＭプレーティング
１−ウェルシャーレ中の培地は、ヒトフィーダー層へＩＣＭを移す前に新鮮ＨＥＳ培地と３回取り換えた。ＩＣＭは２もしくは３つの小さな凝集塊へ粉砕した。各凝集塊は、個別にフィーダー層上へ置いた。フィーダー層はＩＣＭのプレーティング２日前に調製した。フィーダー層上にＩＣＭを含有するシャーレは、ＩＣＭがフィーダー層上に付着して増殖するのを妨害しないように注意深くインキュベートした。位相差倒立顕微鏡下でＩＣＭ増殖について監視を毎日実施した。培地は、第１週中に新鮮ＨＥＳ培地と２もしくは３回取り換えた。
【０１６８】
ｄ）ＩＣＭ初代培養の継代培養
ＩＣＭの第１継代培養は、初回プレーティングの７日後に顕著な核を伴う小さな円形のＥＳ様細胞の領域が観察された場合に実施した。
【０１６９】
シャーレの中の培地はＤＰＢＳと２回取り換え、３０Ｇ無菌針の尖った縁を使用してＥＳ様細胞の凝集塊の外周の周辺を切断し、凝集塊自体は同等の２片に切断した。
【０１７０】
ＤＰＢＳを除去し、濃度０．１７ｇ／１０ｍＬの１ｍＬの濾過ジスパーゼ液（Sigma社、ミズーリ州、米国）をシャーレへ添加した。
【０１７１】
３０秒間のインキュベーション後、無菌ピペットチップを備えたGilson製Ｐ２０マイクロピペットを使用して各半分のＥＳ凝集塊を注意深く取り出し、ＨＥＳ培地を含有するマイトマイシンＣ不活化ヒト胎児筋フィーダー細胞を含む新規１−ウェルシャーレへ移した。
【０１７２】
新規シャーレ中の培地は、各凝集塊がフィーダー層へ付着した後に毎日取り換えた。
【０１７３】
ＥＳ細胞凝集塊の増殖についても毎日監視した。
【０１７４】
８〜１０日後、ＥＳ細胞の凝集塊は典型的なＥＳ細胞様コロニーへ成熟した。これらのコロニーの未分化領域を再び新規胎児筋フィーダー層上で継代培養した。この方法で連続継代培養を実施した。図１５は、第１７継代での未分化ＨＥＳ細胞のコロニーを示している。図１６は、このコロニーの辺縁を示している。
【０１７５】
ｅ）Ｏｃｔ−４  ＲＴ−ＰＣＲを用いた特徴付け
細胞は、実施例１に記載した方法により特徴付けた。Ｏｃｔ−４  ＲＴ−ＰＣＲの決定のためには、以下のプライマーを使用した。
フォワードプライマー:CGRGAAGCTGGAGAAGGAGAAGCTG
リバースプライマー:CAAGGGCCGCAGCTTACACATGTTC
予想産物：２４７ｂｐ
【０１７６】
ｆ）その他の特徴付けの方法
Ｏｃｔ−４を発現したヒトフィーダー層上で増殖したＩＣＭからの未分化ＨＥＳ細胞（第１０継代）は免疫染色によりＳＳＥＡおよびＴｒａ−１−６０陽性であり、正常なギムザバンディング核型を提示し、ＳＣＩＤマウスにおける奇形腫中の全３層の一次胚葉（多能性）を示した。
【０１７７】
導出されたＨＥＳ細胞株はヒト胎児筋フィーダーによってサポートされており、現在のところ第１９継代まで生存している。この細胞株は、コロニー増殖、未分化コロニーにおける鮮明かつ明確なコロニー境界および顕著な核を伴う小さな円形のＥＳ様細胞のようなマウス胚線維芽細胞フィーダーによってサポートされる他のＨＥＳ細胞株のすべての形態学的特徴を保持している。現在までに導出された他のＨＥＳ細胞株と同様に、この細胞株もまたＯｃｔ−４発現で陽性反応を示す。形態学的には、このＨＥＳ細胞株は、マウスフィーダーによってサポートされる他のＨＥＳ細胞株より薄いコロニーを形成する。
【０１７８】
最後に、ここに記載した本発明の精神から逸脱することなく様々な他の修飾および／または変更を加えることができると理解されなければならない。
【図面の簡単な説明】
【０１７９】
【図１】図１は、ＨＥＳ培地の存在下でマイトマイシンＣ処理ヒト成人閉経前卵管線維芽細胞フィーダー細胞上で増殖している未分化ＨＥＳ４細胞の図である。これらの細胞は初代培養である。
【図２】図２ａは、ヒト成人閉経前ヒト卵管線維芽細胞調整ＨＥＳ培地の存在下でコラーゲンＩをプレコートしたシャーレ上で増殖している未分化ＨＥＳ４細胞の図である。これらの細胞は初代培養である。
図２ｂは、ヒト成人閉経前ヒト卵管線維芽細胞調整ＨＥＳ培地の存在下でコラーゲンＩをプレコートしたシャーレ上で増殖している未分化ＨＥＳ４細胞の図である。これらの細胞は初代培養である。
【図３】図３は、ＭＥＦ／ＨＥＳ調整培地の存在下でコラーゲンＩをプレコートしたシャーレ上で増殖している未分化ＨＥＳ４細胞の図である。これらの細胞は初代培養である。
【図４】図４は、ヒト胚筋線維芽細胞調整ＨＥＳ培地の存在下でコラーゲンＩをプレコートしたシャーレ上で増殖している未分化ＨＥＳ４細胞の図である。これらの細胞は初代培養である。
【図５】図５は、ヒト胚皮膚線維芽細胞調整ＨＥＳ培地の存在下でコラーゲンＩをプレコートしたシャーレ上で増殖している未分化ＨＥＳ４細胞の図である。これらの細胞は初代培養である。
【図６】図６は、ＭＥＦ／ＨＥＳ調整培地の存在下でラミニンをプレコートしたシャーレ上で増殖している未分化ＨＥＳ４細胞の図である。不良な細胞増殖に注目されたい。これらの細胞は初代培養である。
【図７】図７は、ＭＥＦ／ＨＥＳ調整培地の存在下でマトリゲルをプレコートしたシャーレ上で増殖している未分化ＨＥＳ４細胞の図である。鮮明なコロニー境界に注目されたい。これらの細胞は初代培養である。
【図８】図８は、ＨＥＳ培地の存在下でマイトマイシンＣ処理ヒト胎児筋線維芽細胞フィーダー細胞上で増殖している未分化ＨＥＳ４細胞の図である。これらの細胞は初代培養である。
【図９】図９は、ＨＥＳ培地の存在下でマイトマイシンＣ処理ヒト胎児筋線維芽細胞フィーダー細胞上で増殖している未分化ＨＥＳ４細胞の図である。これらの細胞は第２継代である。
【図１０】図１０は、ＨＥＳ培地の存在下でマイトマイシンＣ処理ヒト胎児皮膚線維芽細胞フィーダー細胞上で増殖している未分化ＨＥＳ４細胞の図である。これらの細胞は第２継代である。
【図１１】図１１は、ＨＥＳ培地の存在下でマイトマイシンＣ処理ヒト成人閉経前卵管線維芽細胞フィーダー細胞上で増殖している未分化ＨＥＳ３細胞の図である。これらの細胞は第２継代である。
【図１２】図１２は、ＨＥＳ培地の存在下でマイトマイシンＣ処理ヒト胎児筋線維芽細胞フィーダー細胞上で増殖している未分化ＨＥＳ３細胞の図である。これらの細胞は初代培養である。
【図１３】図１３は、ＨＥＳ培地の存在下でマイトマイシンＣ処理ヒト胎児筋線維芽細胞フィーダー細胞上で増殖している未分化ＨＥＳ３細胞の図である。これらの細胞は第２継代である。
【図１４】図１４は、ＨＥＳ培地の存在下でマイトマイシンＣ処理ヒト胎児皮膚線維芽細胞フィーダー細胞上で増殖している未分化ＨＥＳ３細胞の図である。これらの細胞は第２継代である。
【図１５】図１５は、ヒト胎児筋線維芽細胞上のＩＣＭ期から先へ導出および増殖させた未分化ＨＥＳ細胞のコロニー（第１７継代）の図である。
【図１６】図１６は、ヒト胎児筋線維芽細胞上のＩＣＭ期から先へ導出および増殖させた未分化ＨＥＳ細胞の高倍率でのコロニー（第１７継代）の辺縁の図である。前記コロニーの辺縁が分化を有していないことに注目されたい。
【図１７】図１７は、ＫＯ−ＨＳ培地の存在下でのＨＦＭ線維芽細胞上で増殖した未分化ヒトＥＳ細胞コロニー（第５継代）の図である。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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