(57)【要約】本発明はＧ蛋白質共役型受容体であるカルシトニン受容体様受容体（ＣＲＬＲ）と受容体活性調節蛋白質１（ＲＡＭＰ１）を含むヒト化型カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）受容体をコードする単離核酸分子に関する。本発明のヒト化ＣＧＲＰ受容体は特にアミノ酸７４位の各哺乳動物ＲＡＭＰ１ヌクレオチド配列の変異により野生型ヒト受容体に類似する薬理特性を実現する。前記ヒト化ＣＧＲＰ受容体を作製するための関連組換えベクター、組換え宿主及び関連方法も記載する。ヒト化ＲＡＭＰ１を発現する非ヒトトランスジェニック動物も記載する。前記動物はヒトＣＧＲＰに類似するＣＧＲＰ薬理特性を提供するように操作した。ＣＧＲＰ機能のアンタゴニストは偏頭痛、疼痛徴候、更年期のぼせ、偏頭痛予防、慢性緊張型頭痛、群発性頭痛、神経性又は慢性炎症、胃腸疾患、２型糖尿病及び心臓血管疾患等の種々の疾患の治療に有用であり得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質をコードする精製核酸分子であって、前記蛋白質がヒトＲＡＭＰ１蛋白質のアミノ酸残基７４に対応するアミノ酸残基においてトリプトファン残基を含む、前記精製核酸分子。
【請求項２】
組換え宿主細胞でヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質を発現させるための発現ベクターであって、前記発現ベクターが請求項１に記載のＤＮＡ分子を含む前記ベクター。
【請求項３】
組換えヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質を発現する宿主細胞であって、前記宿主細胞が請求項２に記載のベクターを含む前記宿主細胞。
【請求項４】
組換え宿主細胞におけるヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質の発現方法であって、
（ａ）請求項３に記載の発現ベクターを適切な宿主細胞にトランスフェクトする段階、および
（ｂ）前記ヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質を前記発現ベクターから発現させる条件下で段階（ａ）の宿主細胞を培養する段階
を含む前記方法。
【請求項５】
配列番号１、３、５及び７から構成される群から選択されるヌクレオチド配列を含むヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質をコードする精製ＤＮＡ分子。
【請求項６】
他の蛋白質を実質的に含まないヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質であって、前記蛋白質がヒトＲＡＭＰ１蛋白質のアミノ酸残基７４に対応するアミノ酸残基においてトリプトファン残基を含む前記ヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質。
【請求項７】
組換え宿主細胞内に含まれるＤＮＡ発現ベクターの産物である請求項６に記載のヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質。
【請求項８】
請求項７に記載の組換え宿主産物から精製されたヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質を含む実質的に純粋な膜調製物。
【請求項９】
機能的ＣＲＬＲ蛋白質を更に含む請求項８に記載の実質的に純粋な膜調製物。
【請求項１０】
前記蛋白質が配列番号２、４、６及び８から構成される群から選択される請求項６に記載のヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質。
【請求項１１】
組換え宿主細胞内に含まれるＤＮＡ発現ベクターの産物である請求項１０に記載のヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質。
【請求項１２】
請求項１１に記載の組換え宿主産物から精製されたヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質を含む実質的に純粋な膜調製物。
【請求項１３】
機能的ＣＲＬＲ蛋白質を更に含む請求項１２に記載の実質的に純粋な膜調製物。
【請求項１４】
ＣＲＬＲ蛋白質が配列番号１０、１２及び１４から構成される群から選択される請求項１３に記載の膜調製物。
【請求項１５】
ＣＧＲＰ受容体蛋白質のモジュレーターの同定方法であって、
（ａ）ヒトＲＡＭＰ１蛋白質のアミノ酸残基７４に対応するアミノ酸残基においてトリプトファン残基を含むヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質とＣＲＬＲ蛋白質を含むＣＧＲＰ受容体に試験化合物を接触させる段階と、
（ｂ）前記試験化合物がＣＧＲＰ受容体蛋白質に及ぼす効果を測定する段階を含む前記方法。
【請求項１６】
段階（ａ）のヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質が組換え宿主細胞内に含まれるＤＮＡ発現ベクターの産物である請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
体細胞と胚細胞がヒト化ＲＡＭＰ１についてホモ接合であるトランスジェニック非ヒト動物であって、発現されるヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質がヒトＲＡＭＰ１蛋白質のアミノ酸残基７４に対応するアミノ酸残基においてトリプトファン残基を含む前記トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１８】
トランスジェニックマウスである請求項１７に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１９】
請求項１８に記載のトランスジェニックマウスに由来する細胞系。
【請求項２０】
マウスが稔性であり、ヒト化ＲＡＭＰ１遺伝子をその子孫に伝達することができる請求項１８に記載のマウス。
【請求項２１】
体細胞と胚細胞が内在ＲＡＭＰ１遺伝子とヒト化ＲＡＭＰ１についてヘテロ接合であるトランスジェニック非ヒト動物であって、発現されるヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質がヒトＲＡＭＰ１蛋白質のアミノ酸残基７４に対応するアミノ酸残基においてトリプトファン残基を含む前記トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２２】
トランスジェニックマウスである請求項２１に記載のトランスジェニック動物。
【請求項２３】
請求項２２に記載のトランスジェニックマウスに由来する細胞系。
【請求項２４】
マウスが稔性であり、ヒト化ＲＡＭＰ１遺伝子をその子孫に伝達することができる請求項２２に記載のマウス。
【請求項２５】
体細胞がヒト化ＲＡＭＰ１についてヘミ接合であるトランスジェニック非ヒト動物であって、発現されるヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質がヒトＲＡＭＰ１蛋白質のアミノ酸残基７４に対応するアミノ酸残基においてトリプトファン残基を含む前記トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２６】
トランスジェニックマウスである請求項２５に記載のトランスジェニック動物。
【請求項２７】
請求項２５に記載のトランスジェニックマウスに由来する細胞系。
【請求項２８】
マウスが稔性であり、ヒト化ＲＡＭＰ１遺伝子をその子孫に伝達することができる請求項２６に記載のマウス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の１側面はＧ蛋白質共役型受容体であるカルシトニン受容体様受容体（ＣＲＬＲ）と受容体活性調節蛋白質１（ＲＡＭＰ１）を含むヒト化型カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）受容体をコードする単離核酸分子（ポリヌクレオチド）に関する。本発明のヒト化ＣＧＲＰ受容体は各哺乳動物ＲＡＭＰ１ヌクレオチド配列の変異により野生型ヒト受容体に類似する薬理特性を実現する。本発明はヒト化型ＣＧＲＰ受容体をコードするＤＮＡフラグメントを含む組換えベクターと組換え宿主、ＣＧＲＰ受容体の関連ヒト化型の実質精製形態、これらの蛋白質を含む組換え膜フラクション、関連突然変異体蛋白質、及び種々のアッセイでヒト化型ＲＡＭＰ１を利用してヒトＣＧＲＰ受容体活性を特異的に調節した化合物の同定に関連する方法にも関する。本発明はヒトＣＧＲＰに類似するＣＧＲＰ受容体薬理特性を提供するようにＲＡＭＰ１をコードする内在遺伝子を操作した細胞と非ヒトトランスジェニック動物にも関する。従って、本発明のトランスジェニック動物はＣＧＲＰ受容体のモジュレーターに関するその薬理特性がトランスジェニック動物に内在する型のＣＧＲＰ受容体ではなくヒト型受容体に類似する表現型を提供する。本発明はヒト化型ＣＧＲＰ受容体を利用してヒトＣＧＲＰのモジュレーターを選択的に同定することを含むＣＧＲＰモジュレーターのスクリーニング方法にも関する。このようなＣＧＲＰ受容体モジュレーターは限定されないが、偏頭痛、疼痛徴候、更年期のぼせ、偏頭痛予防、慢性緊張型頭痛、群発性頭痛、神経性又は慢性炎症、胃腸疾患、２型糖尿病及び心臓血管疾患等の種々の疾患の治療に潜在的に有用である。
【背景技術】
【０００２】
カルシトニン遺伝子関連蛋白質（ＣＧＲＰ）は中枢神経系と抹消神経系の両者で種々の細胞型で発現される３７アミノ酸神経ペプチドである。多くの組織でＣＧＲＰ含有繊維は血管に密接な関係がある。ＣＧＲＰについて報告されている種々の生理機能のうちで最も顕著なものは血管拡張である。ＣＧＲＰは最も強力な血管拡張伝達物質であり、その血管作用効果は脳、冠動脈及び腸間膜血管等の種々の血管で立証されている。
【０００３】
ＣＧＲＰが偏頭痛の病態生理に関与していること示唆する証拠はますます増えている。偏頭痛は脳血管拡張と三叉神経血管系の活性化に関係があると考えられている。偏頭痛の頭痛期には脳静脈循環のＣＧＲＰ濃度が増加する。頭痛が改善されるとＣＧＲＰ濃度が正常化するので、ＣＧＲＰはこの疾患の病態生理に関係があると考えられる。更に、ＣＧＲＰを偏頭痛患者に静脈内投与すると、患者によっては偏頭痛が遅延する。これらの所見から、ＣＧＲＰに媒介される血管拡張の抑制は偏頭痛や非限定的な例として本明細書に記載する他の疾患の治療に有用であると思われる。
【０００４】
Ａｉｙａｒら（１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１１３２５−１１３２９）はヒトカルシトニン受容体様受容体（ｈＣＲＬＲ）をコードする遺伝子を開示している。
【０００５】
ＭｃＬａｔｃｈｉｅら（１９９８，Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：３３３−３３９）はヒト受容体活性調節蛋白質（ｈＲＡＭＰ１）をコードする遺伝子を開示している。
【０００６】
Ｌｕｅｂｋｅら（１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ９３：３４５５−３４６０）はヒト受容体成分蛋白質（ｈＲＣＰ）をコードする遺伝子を開示している。
【０００７】
ヘテロダイマーＣＧＲＰ受容体はカルシトニン受容体様受容体（ＣＲＬＲ）と受容体活性調節蛋白質−１ないしＲＡＭＰ１と呼ぶ補助蛋白質の同時発現を必要とする。いくつかの種の小分子ＣＧＲＰ受容体アンタゴニストは、他の種に由来する受容体に比較して、ヒトＣＧＲＰ受容体に＞１００倍という顕著な種選択性を示すことが分かっている。ＣＧＲＰ活性はカルシトニン受容体と５５％相同のＧｓ共役型のＧ共役型蛋白質受容体（ＧＰＣＲ）であるＣＲＬＲにより媒介される。ＭｃＬａｔｃｈｉｅら（前出）は機能的ＣＧＲＰ及びアドレノメジュリン受容体がいずれもＣＲＬＲから誘導され、その表現型が特定ＲＡＭＰとの同時発現により決定されることを開示している。ＣＲＬＲをＲＡＭＰ１と同時発現させるとＣＧＲＰ受容体薬理特性が得られるが、ＲＡＭＰ２又はＲＡＭＰ３と同時発現させるとアドレノメジュリン受容体が生産される。ＲＡＭＰは単一の予想膜貫通ドメインと大きい細胞外ドメインと短い細胞質ドメインを含む比較的小さい（１４８〜１７５アミノ酸）蛋白質である。ＲＡＭＰの分子機能としては細胞表面ターゲティングがあり、直接リガンド結合もしくはＣＧＲＰコンホメーションの間接調節又はその両者に関与しているらしい。
【０００８】
Ｄｏｏｄｓら（２０００，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１２９：４２０−４２３）はＣＧＲＰ受容体の既知小分子アンタゴニストがヒトＣＧＲＰ受容体にＫｉ＝１４ｐＭの高い親和性を示すことを開示している。特に注目すべき所見として、この化合物はラット、ウサギ、イヌ及びモルモットに由来するＣＧＲＰ受容体に対する親和性は２００分の１であったが、マーモセット受容体に対する親和性はヒトと同等であると報告された。そこで、前記著者らは潜在的抗偏頭痛剤としてのＢＩＢＮ４０９６ＢＳの効力を評価するためにｉｎ  ｖｉｖｏ試験でマーモセットを使用した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
限定されないが、偏頭痛、疼痛、更年期のぼせ、偏頭痛予防、慢性緊張型頭痛、群発性頭痛、神経性又は慢性炎症、胃腸疾患、２型糖尿病等の種々の疾患の治療のためにＣＧＲＰ受容体を阻害する新規薬剤と、種々の心臓管疾患の治療に有用であると思われるＣＧＲＰアゴニストを発見することが望ましい。このためには、ヒトＣＧＲＰ薬理特性に類似するＣＧＲＰ受容体を発現する簡便な動物モデルを開発し、ＣＧＲＰ受容体活性、特にヒトＣＧＲＰ活性の潜在的モジュレーターを試験するためにｉｎ  ｖｉｖｏ効力及び受容体占有率試験を可能にすることが不可欠である。本発明は哺乳動物ＲＡＭＰ１の「ヒト化」型を開示することによりこれらの必要に対処し、満足するものである。このようなＲＡＭＰ１突然変異体と哺乳動物型ＣＲＬＲの同時発現の結果、小分子ＣＧＲＰ受容体アンタゴニストがヒトＣＧＲＰ受容体に対すると同等の効力を示すＣＧＲＰ受容体か得られる。このような突然変異体は当分野で公知の種々のスクリーニングアッセイ（例えば細胞アッセイ、受容体結合アッセイ及び／又は放射性リガンド結合アッセイ）のみならず、このヒト化ＣＧＲＰ受容体活性を提供するトランスジェニック動物の作製にも有用であろう。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明はヒト化型受容体活性調節蛋白質１（ＲＡＭＰ１）をコードする単離又は精製核酸分子（ポリヌクレオチド）に関する。
【００１１】
本発明は更にヒトＣＧＲＰに類似するＣＧＲＰ受容体薬理特性を提供するようにＲＡＭＰ１をコードする内在遺伝子を操作した（即ち「ヒト化」した）非ヒト動物細胞、非ヒトトランスジェニック動物（例えばファウンダー及び同腹仔）、特にトランスジェニック「ノックイン」動物に関する。このような標的「ノックイン」の作製に好適なトランスジェニック動物はマウスである。
【００１２】
本発明は哺乳動物ＲＡＭＰ１蛋白質のキメラ、ハイブリッド及び／又は突然変異体型をコードする単離又は精製哺乳動物核酸分子に関し、このような誘導ＲＡＭＰ１蛋白質は少なくとも約アミノ酸１〜アミノ酸６５と約アミノ酸１１３〜約アミノ酸１４８の各哺乳動物アミノ酸配列を含み、約アミノ酸６６〜アミノ酸１１２に対応する領域は少なくとも一部がヒトＲＡＭＰ１をコードする領域に由来する。
【００１３】
本発明は更に哺乳動物ＲＡＭＰ１蛋白質のキメラ、ハイブリッド及び／又は突然変異体型をコードする単離又は精製哺乳動物核酸分子に関し、このような誘導ＲＡＭＰ１蛋白質は限定されないが、本明細書に配列番号１、３、５及び７として開示する核酸分子により例示されるＲＡＭＰ１のヒト化哺乳動物型が得られるようにアミノ酸残基７４をトリプトファン残基に変異させるヌクレオチド変異を少なくとも含む。
【００１４】
本発明は、「ヒト化」アミノ酸残基、即ちヒトＲＡＭＰ１蛋白質のアミノ酸７４に対応し、各哺乳動物ＲＡＭＰ１ヌクレオチド配列内でトリプトファン残基をコードするように変更したアミノ酸残基をコードする領域を含むヒト化ＲＡＭＰ１ヌクレオチド配列のフラグメント又は部分にも関し、これらには、限定されないが、発現される哺乳動物ＲＡＭＰ１蛋白質の「ヒト化」に関与するとして本明細書に示されるアミノ酸残基７４をコードする領域を含む配列番号１、３、５及び７から作製したこのようなフラグメントが挙げられる。
【００１５】
本発明は本明細書に開示する核酸分子を含むように形質転換又はトランスフェクトされており、ヒト化型ＣＧＲＰ受容体とその関連フラグメントをコードする組換えベクターと原核及び真核組換え宿主細胞、ヒト化型ＣＧＲＰ受容体の実質精製形態、これらの蛋白質を含む組換え膜フラクション（例えばＣＲＬＲ及びヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質を含むＣＧＲＰ受容体）、関連突然変異体蛋白質、及び種々のアッセイでヒト化型ＣＧＲＰ受容体を利用してヒトＣＧＲＰを特異的に調節した化合物の同定に関連する方法にも関する。
【００１６】
本発明はヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質の実質精製形態にも関し、限定されないが、実質的に精製され、完全にプロセシング（例えば蛋白分解プロセシング、グリコシル化及び／又はリン酸化）され、組換え宿主細胞から得られる成熟ヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質が挙げられる。
【００１７】
本発明は更にヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質を含み、適切に発現するＤＮＡ発現ベクターで形質転換又はトランスフェクトされた組換え宿主細胞から得られた実質精製膜調製物、部分精製膜調製物、又は細胞溶解液にも関する。上述のように、前記膜調製物は活性なヒト化ＣＧＲＰ受容体を形成するように各哺乳動物ＣＲＬＲ及びＲＡＭＰ１蛋白質の両者を含むことが好ましい。
【００１８】
本発明は配列番号２、４、６及び／又は８に示すようなアミノ酸配列を含むか及び／又は前記配列から構成されるヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質の生体活性フラグメント及び／又は突然変異体にも関する。
【００１９】
本発明は各種形態のヒト化ＲＡＭＰ１に対するポリクローナル及びモノクローナル抗体、ヒト化ＲＡＭＰ１の生体活性フラグメント、及び／又はヒト化ＲＡＭＰ１を含むＣＧＲＰ受容体複合体にも関する。
【００２０】
本発明はヒト化ＲＡＭＰ１融合構築物をコードする単離核酸分子にも関する。
【００２１】
本発明の目的は配列番号２、４、６及び８に夫々示すようなヒト化型ＲＡＭＰ１、又はＲＡＭＰ１のフラグメント、突然変異体もしくは誘導体をコードする単離核酸分子（限定されないが、配列番号１、３、５及び／又は７）を提供することである。任意前記ポリヌクレオチドは必ずしも限定されないが、ヌクレオチド置換、欠失、付加、アミノ末端切断及びカルボキシ末端切断を含み、これらの突然変異体は哺乳動物ＣＲＬＲ蛋白質と同時発現させた場合にヒトＣＧＲＰ受容体に類似する薬理特性を示すことができる蛋白質又は蛋白質フラグメントを発現するｍＲＮＡをコードする。
【００２２】
本発明の特に好ましい目的はＲＡＭＰ１の「ヒト化」型を内在ＣＲＬＲと同時発現させるか又はより好ましくは、相補的内在配列を置換するようにヒト化トランスジーン（又はアミノ酸残基７４を含む部分）の「ノックイン」を行う非ヒトトランスジェニック動物を提供することである。
【００２３】
本発明の別の目的は上記核酸分子によりコードされるヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質又は蛋白質フラグメントを提供することである。
【００２４】
本発明の別の目的はヒト化型ＲＡＭＰ１又はその生物学的等価物をコードする核酸配列を含む組換えベクター及び組換え宿主細胞を提供することである。
【００２５】
本発明の目的は限定されないが、配列番号２、４、６及び８に示すようなヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質の実質精製形態を提供することである。
【００２６】
本発明の別の目的は哺乳動物ＲＡＭＰ１遺伝子の完全オープンリーディングフレームを含み、適切に発現するＤＮＡ発現ベクター（限定されないが、各ヒト化ＲＡＭＰ１の機能的プロセシング後形態が得られるように夫々配列番号１、３、５及び７に示すような核酸分子を含むＤＮＡ発現ベクター）で形質転換又はトランスフェクトされた組換え宿主細胞から得られたヒト化型ＲＡＭＰ１蛋白質の実質精製組換え形態を提供することである。本明細書に記載するように、本発明のＲＡＭＰ１蛋白質はＣＲＬＲの哺乳動物形と同時発現させることが好ましい。この点で、本発明の別の目的はＣＲＬＲと本発明のヒト化ＲＡＭＰ１を含む薬理的に活性なヒト化ＣＧＲＰ受容体を含む組換え細胞に由来する実質精製サブ細胞膜調製物、部分精製サブ細胞膜調製物、又は粗溶解液を提供することである。組換え宿主細胞が真核宿主細胞系（例えば哺乳動物細胞系）に由来することも好ましい。
【００２７】
本発明の別の目的は薬理的に活性なヒト化ＣＧＲＰ受容体もしくは薬理的に活性なヒト化ＣＧＲＰ受容体を含む膜調製物又は生物学的等価物を発現する細胞を使用してＣＧＲＰ活性のモジュレーター、好ましくは選択的アンタゴニストをスクリーニングすることである。任意前記蛋白質、蛋白質複合体又は膜関連蛋白質受容体は本明細書に記載するような種々の症状の治療に使用するＣＧＲＰアンタゴニストをスクリーニング及び選択するのに有用であり得る。
【００２８】
本明細書で使用する「単離又は精製核酸分子」とは他の核酸を少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９９％、更に好ましくは９９．９％除去していることを意味する。「単離核酸」又は「精製核酸」は「実質的に他の核酸を含まない」又は「実質的に精製」と同義に使用し、同様に他の細胞成分を除去したヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質のコーディング領域を含むＤＮＡ分子を意味する。従って、他の核酸を実質的に含まないヒト化ＲＡＭＰ１ＤＮＡ調製物はその合計核酸の百分率として表した場合に非ヒト化ＲＡＭＰ１核酸分子の含有率が１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは１％以下、更に好ましくは０．１％以下である。所与ヒト化ＲＡＭＰ１調製物が実質的に他の核酸を含まないか否かは例えばアガロースゲル電気泳動と適当な染色法（例えばエチジウムプロミド染色）の組合せ等の慣用核酸純度試験法又は配列決定により決定することができる。
【００２９】
本明細書で使用する「実質的に他の蛋白質を含まない」又は「実質的に精製」とは他の蛋白質を少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９９％、更に好ましくは９９．９％除去していることを意味する。従って、他の蛋白質を実質的に含まないヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質調製物は、その合計蛋白質の百分率として表した場合に、ヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質の１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは１％以下、更に好ましくは０．１％以下を含む。所与ヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質調製物が実質的に他の蛋白質を含まないか否かは例えばドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）と適当な検出法（例えば銀染色又はイムノブロッティング）の組合せ等の慣用蛋白質純度試験法により決定することができる。「単離ヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質」又は「精製ヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質」なる用語は「実質的に他の蛋白質を含まない」又は「実質的に精製」と同義に使用し、同様に天然源から分離されたヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質を意味する。「単離」又は「精製」なる用語を使用する場合には、ヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質がその通常の細胞環境から取出されていることを意味する。従って、単離ヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質は無細胞溶液でもよいし、天然環境とは異なる細胞環境にあってもよい。単離なる用語は単離ヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質が存在する唯一の蛋白質であるという意味ではなく、単離ヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質がｉｎ  ｖｉｖｏで天然にヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質に付随する他の蛋白質及び非アミノ酸物質（例えば核酸、脂質、炭水化物）を実質的に含まないことを意味する。従って、原核又は真核細胞で組換え発現され、天然（即ち無操作）ではこのＲＡＭＰ１蛋白質を発現しないこの宿主から実質的に精製されたヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質は本明細書に記載する任意状況で当然のことながら「単離ヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質」である。上述のように、単離又は精製ヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質であるヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質調製物は実質的に他の蛋白質を含まず、その合計蛋白質の百分率として表した場合に非ヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質の含有率が１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは１％以下、更に好ましくは０．１％以下である。
【００３０】
「機能的等価物」又は「生物学的に活性な等価物」は本明細書で同義に使用し、選択的スプライシング、欠失、突然変異、置換又は付加により、天然又はヒト化ＲＡＭＰ１と厳密に同一のアミノ酸配列をもたないが、夫々の天然又はヒト化ＲＡＭＰ１と実質的に同一の生物活性を維持する蛋白質を意味する。このような機能的等価物は特にアミノ酸残基７４における「ヒト化」トリプトファンコドンの存在により天然又はヒト化ＲＡＭＰ１に対して有意なアミノ酸配列一致度をもつ。
【００３１】
本明細書で使用する「機能的」なる用語は細胞中又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ系に存在している場合に天然ないし非改変条件又は環境にあるかのように正常に機能する遺伝子又は蛋白質を表すために使用する。従って、機能的でない遺伝子（即ち「非機能的」、「破壊」、「変異」等）は野生型天然ないし非改変蛋白質として機能しない蛋白質をコードするか、又は蛋白質を全くコードしない。このような非機能的遺伝子は本明細書に記載するような相同組換えイベントの産物とすることができ、非機能的遺伝子の機能的形態を含むターゲット染色体の領域に非機能的遺伝子を特異的にターゲティングし、野生型ないし天然遺伝子の「ノックアウト」を形成する。
【００３２】
本明細書で使用する「モジュレーター」とは哺乳動物ＣＧＲＰ受容体（例えばヒト又はヒト化ＣＧＲＰ受容体）の発現もしくは活性を変化させるか、又は各受容体とそのリガンドもしくは他の蛋白質との相互作用の効果を変化させる化合物（例えばアンタゴニスト又はアゴニスト）である。
【００３３】
本明細書で使用する「齧歯類」とはかじるために上下１対の門歯をもち、歯が伸び続け、門歯と臼歯の違いが明白な齧歯目に属する種を意味する。トランスジェニック動物の作製に好適な例としてはドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、クマネズミ（Ｒａｔｔｕｓ  ｒａｔｔｕｓ）及びハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
本明細書で使用する「ラット」とは全身動物学的観点からクマネズミ属（Ｒａｔｔｕｓ）に属する動物を言う。本発明のトランスジェニック動物は限定されないが、ドブネズミやクマネズミ等のクマネズミ属の任意種から作製することができる。
【００３５】
本明細書で使用する「マウス」とは全身動物学的観点からハツカネズミ属（Ｍｕｓ）に属する動物を言う。本発明のトランスジェニック動物は限定されないが、イエネズミやハツカネズミ等のハツカネズミ属の任意種から作製することができる。
【００３６】
本明細書で使用する「カニクイザル」（ｃｙｎｏｍｏｌｇｏｕｓ）とはマカカ（Ｍａｃａｃａ）属の非ヒト霊長類（ｍａｃａｑｕｅ）をいい、限定されないが、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ）が挙げられる。
【００３７】
本明細書で使用する「マーモセット」は親指以外の全指に柔毛と（平爪でなく）鉤爪をもつキヌザル（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｃｉｄａｅ）科に属する非ヒト霊長類を意味することが知られている。
【００３８】
本明細書で使用する「ブタ」（ｐｉｇ）は英名「ｐｏｒｃｉｎｅ」と同義である。
【００３９】
本明細書で使用する「哺乳動物」なる用語は、「ヒト化」ＲＡＭＰ１蛋白質を作製するために「哺乳動物」ＲＡＭＰ１配列を利用する関連での記載を除いて、ヒトを含む任意哺乳動物を言う。前記関連では当然のことながらヒト配列を除外する。
【００４０】
本発明はＧ蛋白質共役型受容体であるカルシトニン受容体様受容体（ＣＲＬＲ）と受容体活性調節蛋白質１（ＲＡＭＰ１）を含むヒト化型カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）受容体をコードする単離又は精製核酸分子（ポリヌクレオチド）に関する。より詳細には、本発明は誘導ヒト化型ＣＧＲＰ受容体をコードする単離又は精製脊椎動物、より好ましくは哺乳動物核酸分子、即ち脊椎動物（同じく好ましくは哺乳動物）ＣＲＬＲ受容体蛋白質と組合せた場合にＣＧＲＰ受容体の「ヒト化」に関与するものとして本明細書に示す哺乳動物ＲＡＭＰ１配列のキメラ、ハイブリッド又は突然変異体誘導体をコードするＤＮＡ分子に関する。本明細書に開示するＣＲＬＲ及びＲＡＭＰ１ＤＮＡ分子は選択宿主細胞に同時トランスフェクトすることができ、組換え宿主細胞は発現される機能的ヒト化型ＣＧＲＰ受容体の実質的レベルの供給源を提供する。従って、これらの組換え発現されたヒト化ＣＧＲＰ受容体蛋白質は小分子ＣＧＲＰ受容体アンタゴニストが「野生型」ヒトＣＧＲＰ受容体に対して示すと同等の効力を示す受容体複合体を形成する。このような突然変異体受容体は細胞アッセイ、受容体結合アッセイ及び／又は放射性リガンド結合アッセイや、後述するようにこのヒト化ＣＧＲＰ受容体活性を提供するトランスジェニック動物の作製で有用である。
【００４１】
この点で、本明細書を考慮した場合のみに提供される本発明の特に好適な側面は非ヒト動物細胞、非ヒトトランスジェニック動物（例えばファウンダー及び同腹仔）、特にトランスジェニック「ノックイン」動物の作製であり、ヒトＣＧＲＰに類似するＣＧＲＰ受容体薬理特性を提供するようにＲＡＭＰ１をコードする内在遺伝子が操作（即ち「ヒト化」）されている。このような非ヒトトランスジェニック動物はＣＧＲＰのモジュレーターに関する非ヒトトランスジェニック動物の薬理特性がヒト型ＣＧＲＰ受容体に類似する改変表現型（内在ＣＲＬＲと「ヒト化」ＲＡＭＰ１）を提供することが好ましい。非ヒトＲＡＭＰ１配列（例えば本明細書に示すラット、マウス及びブタに加え、カニクイザルやイヌ等の付加種）の単一アミノ酸残基を変異させてＣＲＬＲの哺乳動物型と組合せるとＲＡＭＰ１の「ヒト化」型が得られるという本発明の知見によｔｕよよると、種々のるとてるとしゅじゅ非ヒトトランスジェニック動物を予想することができる。換言するならば、公知アンタゴニストの種特異的薬理特性はヒトＲＡＭＰ１のアミノ酸残基７４（トリプトファン残基）又はその周囲の領域に局在することが本発明により明らかになったため、非ヒトＲＡＭＰ１型を作製及び使用し、内在ＲＡＭＰ１蛋白質に加えて又はその代わりにヒト化型を発現するトランスジェニック動物を作製することができる。
【００４２】
従って、本発明はＲＡＭＰ１蛋白質のキメラ、ハイブリッド及び／又は突然変異体型をコードする単離又は精製核酸分子に関し、前記蛋白質は機能的であり（即ちＣＲＬＲと同時発現させた場合に予想薬理特性を示す）、更に前記蛋白質はヒトアミノ酸残基７４に対応するアミノ酸をトリプトファン残基に変更することによりヒト化されている。このような核酸分子はアミノ酸７４がその天然残基からヒト残基即ちトリプトファンに変更している限り、キメラ、ハイブリッド又は各種突然変異体蛋白質のいずれをコードするかに拘わらず本発明に属する。
【００４３】
本発明は更にＲＡＭＰ１蛋白質のキメラ、ハイブリッド及び／又は突然変異体型をコードする単離又は精製核酸分子に関し、このような誘導ＲＡＭＰ１蛋白質は少なくとも約アミノ酸１〜アミノ酸６５と約アミノ酸１１３〜約アミノ酸１４８の各アミノ酸配列を含み、約アミノ酸６６〜アミノ酸１１２に対応する領域は少なくとも一部がヒトＲＡＭＰ１をコードする領域に由来する。このようなＤＮＡ分子はＣＲＬＲ遺伝子又はその機能的誘導体と同時発現させた場合にヒトＣＧＲＰ受容体薬理特性に類似するＣＧＲＰ受容体となる「ヒト化」ＲＡＭＰ１蛋白質をコードする。
【００４４】
本発明は更にＲＡＭＰ１蛋白質のキメラ、ハイブリッド及び／又は突然変異体型をコードする単離又は精製核酸分子に関し、このような誘導ＲＡＭＰ１蛋白質はヒト化型ＲＡＭＰ１が得られるようにアミノ酸残基７４をトリプトファン残基に変更するヌクレオチド変異を少なくとも含む。この点で、本発明の特定態様はアミノ酸残基７４のコドンをリジン残基からトリプトファン残基に変更したラット由来単離又は精製核酸分子に関する。本発明の別の特定態様はアミノ酸残基７４のコドンをリジン残基からトリプトファン残基に変更したマウス由来単離又は精製核酸分子に関する。本発明の更に別の特定態様はヒト残基７４に対応するアミノ酸残基のコドンをシステイン残基からトリプトファン残基に変更したカニクイザル由来単離又は精製核酸分子に関する（即ち「Ｃ７４Ｗ」突然変異体）。本発明の更に別の特定態様はヒト残基７４に対応するアミノ酸残基のコドンをアルギニン残基からトリプトファン残基に変更したブタ由来単離又は精製核酸分子に関する（即ち「Ｒ７４Ｗ」突然変異体）。従って、本発明は更にヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質を発現するｍＲＮＡをコードする単離核酸分子（ポリヌクレオチド）にも関し、このＤＮＡ分子は下表１に配列番号１（ラット）、配列番号３（マウス）、配列番号５（カニクイザル部分配列）及び配列番号７（ブタ部分配列）として開示するヌクレオチド配列を含む。表１は全長ＲＡＭＰ１蛋白質として発現させた場合にＲＡＭＰ１の「ヒト化」型に対応するこれらの各種哺乳動物ＲＡＭＰ１配列のヌクレオチド及び予想アミノ酸配列を開示する。
【００４５】
【表１】
2005503809.tif 000002
2005503809.tif 000003
【００４６】
本発明はヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質を発現するｍＲＮＡをコードする配列番号１、３、５及び７の生体活性フラグメント又は突然変異体にも関する。任意前記生体活性フラグメント及び／又は突然変異体は限定されないが、配列番号２、配列番号４、配列番号６及び配列番号８（このうち、配列番号６及び８は各ＲＡＭＰ１蛋白質のヒト化のために操作した領域に相当する部分配列を示す）に示すようなヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質等のヒトＲＡＭＰ１の薬理特性に少なくとも実質的に類似する蛋白質又は蛋白質フラグメントをコードする。任意前記ポリヌクレオチドは必ずしも限定されないが、キメラ構築物（限定されないが、例えば本明細書に記載する例示キメラ構築物）、ハイブリッド構築物、ヌクレオチド置換、欠失、付加、アミノ末端切断及びカルボキシ末端切断を含み、これらの変異体は真核細胞で機能的ヒト化ＲＡＭＰ１を哺乳動物ＣＲＬＲ蛋白質と同時発現させることができるｍＲＮＡをコードし、従ってＣＧＲＰ活性のアゴニスト及び／又はアンタゴニストのスクリーニングに有用である。この点で、本発明のこの部分の好適側面はいずれもヒト化型ＲＡＭＰ１をコードする配列番号１、３及び５として表１に開示する。
【００４７】
本発明の単離核酸分子としてはデオキシリボ核酸分子（ＤＮＡ）が挙げられ、例えば１本鎖（コーディング又は非コーディング鎖）でも２本鎖でもよいゲノムＤＮＡ及び相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）と、合成ＤＮＡ（例えば合成１本鎖ポリヌクレオチド）が挙げられる。本発明の単離核酸分子はリボ核酸分子（ＲＮＡ）でもよい。
【００４８】
本発明は更に本明細書に開示する核酸分子を含み、ヒト化型ＣＧＲＰ受容体とその関連フラグメントをコードする組換えベクターと原核及び真核組換え宿主細胞、関連ヒト化型ＣＧＲＰ受容体の実質精製形態、これらの蛋白質を含む組換え膜フラクション（例えばＣＲＬＲ及びヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質を含む活性ＣＧＲＰ受容体）、関連突然変異体蛋白質、及び種々のアッセイでヒト化型ＲＡＭＰ１を利用してヒトＣＧＲＰ受容体を特異的に調節する化合物の同定に関連する方法にも関する。
【００４９】
本発明は更に表１に開示するアミノ酸配列（例えば配列番号２、４、６及び８）を含むヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質の実質精製形態にも関する。本発明は更に表１に開示するアミノ酸配列（例えば配列番号２、４、６及び８）から構成されるヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質にも関する。本明細書に記載するように、脊椎動物配列が本発明の範囲であるが、哺乳動物配列（限定されないが、例えば本明細書に例示するもの）が好ましい。
【００５０】
本発明の別の好適側面は実質的に精製され、完全にプロセシング（例えば蛋白分解プロセシング、グリコシル化及び／又はリン酸化）され、各ヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質を発現する配列番号１、３、５及び７に示すようなヌクレオチド配列を含むＤＮＡ発現ベクターを含む組換え宿主細胞から得られる成熟ヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質に関する。組換え宿主細胞は哺乳動物細胞系等の真核宿主細胞が特に好ましい。
【００５１】
本発明の別の側面は各ヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質の機能的形態となる例えば配列番号１、３、５及び７に示すような完全オープンリーディングフレームを含み、これを適切に発現するＤＮＡ発現ベクターで形質転換又はトランスフェクトされた組換え宿主細胞から得られた実質精製膜調製物、部分精製膜調製物、又は細胞溶解液に関する。これらの組換え膜は表１に開示するもの（即ち配列番号２、４、６及び８）等の完全ヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質、又はヒト化型ＲＡＭＰ１となる付加等価物、即ちトリプトファン残基をコードするようにヒトアミノ酸残基７４に対応するアミノ酸残基を変更した哺乳動物ＲＡＭＰ１蛋白質を含む。
【００５２】
本発明のこの部分の１好適側面は哺乳動物ＣＲＬＲ  ＧＰＣＲ蛋白質を含み、これを適切に発現するＤＮＡ発現ベクターと共に本明細書に記載するようなヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質を含み、これを適切に発現するＤＮＡ発現ベクターで形質転換又はトランスフェクトされた組換え宿主細胞から得られた実質精製膜調製物、部分精製膜調製物、又は細胞溶解液に関する。この目的に利用可能な哺乳動物ヌクレオチド配列の例としては限定されないが、表２に配列番号７、９及び１１として開示し、ヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質と同時発現させた場合にヒトＣＧＲＰ受容体を調節するモジュレーターをスクリーニングするのに有用になる哺乳動物ＣＲＬＲ  ＧＰＣＲの機能的形態となるヒト、ラット及びマウス核酸分子が挙げられる。組換え宿主細胞（原核細胞でも真核細胞でもよく、安定的及び一過的に形質転換させた細胞）からのサブ細胞膜フラクション及び／又は膜含有細胞溶解液は本明細書に開示する核酸分子によりコードされる機能的なプロセシング後蛋白質を含む。この組換え膜調製物は哺乳動物ＣＲＬＲ蛋白質と、汚染性蛋白質をほとんど含まないヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質を含む。これらのサブ細胞フラクションは内在濃度と少なくとも同等であるか又は場合により実質的にこれを上回る濃度のヒトＣＧＲＰ受容体のモジュレーター（例えばアゴニスト及び特にアンタゴニスト）のスクリーニングに有効に機能する「ヒト化」ＣＧＲＰ受容体を含む。任意前記「ヒト化」ＣＧＲＰ受容体含有膜調製物は各ＣＧＲＰ受容体のモジュレーターを選択するための種々のアッセイで有用である。本発明のＣＧＲＰ受容体を発現させるために好適な選択真核宿主細胞は哺乳動物細胞系である。
【００５３】
【表２】
2005503809.tif 000004
2005503809.tif 000005
2005503809.tif 000006
【００５４】
本発明は配列番号２、４、６又は８に示すようなアミノ酸配列を含むヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質の生体活性フラグメント及び／又は突然変異体にも関し、必ずしも限定されないが、アミノ酸置換、欠失、付加、アミノ末端切断及びカルボキシ末端切断か挙げられ、これらの突然変異体は診断、治療又は予防用蛋白質又は蛋白質フラグメントを提供し、限定されないが、ヒトＣＧＲＰ受容体薬理特性のアゴニスト及び／又はアンタゴニスト等の選択的モジュレーターのスクリーニングに有用である。
【００５５】
本発明の１好適側面は配列番号２、４、６及び８として表１に開示するものであり、アミノ酸残基をトリプトファン（「Ｔｒｐ」ないし「Ｗ」）残基に変更することのみにより「ヒト化」された哺乳動物ＲＡＭＰ１蛋白質又はその部分の各アミノ酸配列である。上述のように、本発明のヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質を哺乳動物ＣＲＬＲ蛋白質と同時発現させるとＣＧＲＰ受容体のアンタゴニストのスクリーニングに有用である。
【００５６】
本発明は各種形態のヒト化ＲＡＭＰ１に対するポリクローナル及びモノクローナル抗体、ヒト化ＲＡＭＰ１の生体活性フラグメント、又はヒト化ＲＡＭＰ１を含むＣＧＲＰ受容体複合体にも関する。
【００５７】
本発明はヒト化ＲＡＭＰ１融合構築物をコードする単離核酸分子（及び殆どの場合にはＤＮＡ発現ベクターの形態で融合構築物を含む各宿主細胞内で発現され、この宿主細胞から回収される実質精製蛋白質）にも関し、限定されないが、これらには、ヒト化ＲＡＭＰ１の一部を発現し、限定されないが、ＧＦＰ（グリーン蛍光蛋白質）、ＭＹＣエピトープ、ＧＳＴ、Ｆｃ、Ｆｌａｇ、ＨＡ及びＨｉｓタグ等の種々のマーカーに結合した融合構築物が挙げられる。任意前記融合構築物はアミノ酸７４のトリプトファン残基への変異をコードするＲＡＭＰ１オープンリーディングフレームの少なくとも一部を含み、各融合蛋白質は哺乳動物ＣＲＬＲ蛋白質と組合せた場合にヒト様薬理特性を示す。
【００５８】
上述のように、ヘテロダイマーＣＧＲＰ受容体はカルシトニン受容体様受容体（ＣＲＬＲ）と受容体活性調節蛋白質−１ないしＲＡＭＰ１と呼ぶ補助蛋白質の同時発現を必要とする。数種の小分子ＣＧＲＰ受容体アンタゴニストは他の種に由来する受容体に比較してヒトＣＧＲＰ受容体に＞１００倍という顕著な種選択性を示すことが分かっている。本発明によると、ＣＧＲＰモジュレーターの種選択性はＲＡＭＰ１のみにより決定されることが判明した。ハイブリッドヒト／ラットＣＲＬＲ／ＲＡＭＰ１受容体を構築することにより、ｈＣＲＬＲとｒＲＡＭＰ１の同時発現によりラット受容体薬理特性が生じ、逆も同様であることが判明した（ｈ＝ヒト、ｒ＝ラット、ｍ＝マウス）。更に、ラット／ヒトＲＡＭＰ１キメラ及び部位特異的突然変異体では、ＲＡＭＰ１蛋白質の７４位の単一アミノ酸がＣＲＬＲ／ＲＡＭＰ１に対する小分子アンタゴニストの親和性を調節することも分かった。ｒＣＲＬＲとｒＫ７４Ｗ  ＲＡＭＰ１及びｍＣＲＬＲとｍＫ７４Ｗ  ＲＡＭＰ１の同時発現の結果、これらのアンタゴニストの親和性は＞１００倍増加し、その結果、ＩＣ５０値はヒト受容体と同等になった。従って、ＣＧＲＰ受容体に対する小分子アンタゴニストの親和性はＲＡＭＰ１のアミノ酸７４の種類に大きく左右され、ＲＡＭＰ１はアンタゴニスト結合部位に関与していることが立証された。
【００５９】
本発明によると、ＲＡＭＰ１のアミノ酸７４位はＣＧＲＰ受容体の数種の公知アンタゴニストに認められる種選択性に関与していることが判明し、単一アミノ酸変異により小分子アンタゴニストの親和性を変えることができ、これらのアンタゴニストはＲＡＭＰ１と直接相互作用しているようである。ヒト様薬理特性を示すようにマウスＣＧＲＰ受容体を変換することが可能な単一アミノ酸突然変異が同定されたことから、当分野で周知の種々の技術によりリジン７４をトリプトファンで置換する「かノックイン」ストラテジーによりヒト化ＣＧＲＰ受容体マウスを作製できることが明らかになった。このようなヒト化非ヒトトランスジェニック動物（例えばトランスジェニックマウス）はＣＧＲＰ受容体アンタゴニストのｉｎ  ｖｉｖｏ薬理試験のための薬剤発見及び開発プログラムや、前記試験に適した動物モデルとしてのマーモセットの補完に有用である。
【００６０】
この点で、本発明は内在ＲＡＭＰ１遺伝子の両方の対立遺伝子をヒト化したトランスジェニック非ヒト動物（例えばファウンダー又はその後代同腹仔）と、単一内在ＲＡＭＰ１対立遺伝子をヒト化したヘテロ接合トランスジェニック非ヒト動物に関し、更に各ターゲットゲノム内に安定的に組込まれた少なくとも１個のヒト化ＲＡＭＰ１対立遺伝子に加えて野生型内在ＲＡＭＰ１対立遺伝子を含む非ヒトトランスジェニック動物にも関する。この点で、本発明はヒト化ＲＡＭＰ１についてホモ接合であり、各ターゲットゲノム内の直接遺伝子ターゲティングにより内在ＲＡＭＰ１コーディング領域又はその部分を置換して内在ＲＡＭＰ１を破壊した動物細胞、非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物及び非ヒトトランスジェニック同腹仔に関する。本発明は該当動物に天然の機能的ＲＡＭＰ１遺伝子についてヘテロ接合性の動物細胞、非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物（例えばファウンダー動物及びトランスジェニック同腹仔）にも関する。即ち、ヘテロ接合とは１個の機能的内在ＲＡＭＰ１遺伝子と１個の機能的ヒト化ＲＡＭＰ１遺伝子を意味する。更に、本発明は少なくとも１個、場合により複数のヒト化ＲＡＭＰ１遺伝子をターゲットゲノム内にランダムに挿入し、機能的内在ＲＡＭＰ１蛋白質とヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質の両者を発現できるようにした動物細胞、非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物及び非ヒトトランスジェニック同腹仔に関する。本発明のトランスジェニック動物はＣＧＲＰ受容体のモジュレーター、特にアンタゴニストの効果の試験に使用することができる。このようなトランスジェニック非ヒト動物は限定されないが、偏頭痛、疼痛、更年期のぼせ、偏頭痛予防、慢性緊張型頭痛、群発性頭痛、神経性又は慢性炎症、胃腸疾患、２型糖尿病及び心臓血管疾患等の（ＣＧＲＰ受容体の活性化による）種々の疾患の治療に使用されるＣＧＲＰ受容体モジュレーター、特にアンタゴニストを試験するためのｉｎ  ｖｉｖｏ効力及び受容体占有率試験に特に有用である。ヒト様突然変異体ＲＡＭＰ１を発現する遺伝子組換えマウスを作製すると、小分子ＣＧＲＰ受容体アンタゴニストがヒトＣＧＲＰ受容体に対して示すと同等の効力を示す種が得られる。本発明の非ヒトトランスジェニック動物はｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験用培養細胞も提供する。従って、本発明の特定態様では、本明細書に記載する段階で作製された任意動物から細胞系を作製し、細胞を単離する。
【００６１】
本発明のこの部分の１側面はヒト化型ＲＡＭＰ１で内在ＲＡＭＰ１対立遺伝子を置換するように動物に天然の内在ＲＡＭＰ１遺伝子を「ノックイン」技術により置換した動物を獲得するための方法である。動物に天然に存在するＲＡＭＰ１遺伝子を天然遺伝子、内在遺伝子及び／又は「野生型」遺伝子と言う。非天然ＲＡＭＰ１遺伝子（例えば「ヒト化」ＲＡＭＰ１遺伝子）の発現は天然ＲＡＭＰ１遺伝子の不在下にトランスジェニック動物で行われることが好ましい。このようなトランスジェニック「ノックイン」非ヒト動物（例えばトランスジェニックマウス）は内在ＣＲＬＲ遺伝子と「ヒト化」ＲＡＭＰ１遺伝子を利用しながらヒトＣＧＲＰ受容体の薬理特性に類似させる動物試験で特に有用である。本方法はトランスジーン形態のヒト化型ＲＡＭＰ１の遺伝子を提供する段階と、天然ＲＡＭＰ１遺伝子の位置又は別の染色体位置で動物の染色体にトランスジーンをターゲティングする段階を含む。トランスジーンはエレクトロポレーション、マイクロインジェクション及びリポフェクション等の当分野で公知の種々の方法により胚幹細胞に導入することができる。その後、トランスジーンを導入した細胞を胚盤胞に注入した後、胚盤胞を疑妊娠動物に移植する。代替態様では、トランスジーンをターゲティングした胚幹細胞を受精卵又は桑実胚と共に同時インキュベートした後に雌に移植することができる。妊娠後に、得られる動物はキメラファウンダートランスジェニック動物である。ファウンダー動物を別の態様で使用して野生型動物と交配し、改変ＲＡＭＰ１遺伝子にヘテロ接合のＦ１動物を作製することもできる。別態様では、これらのヘテロ接合動物を同系交配し、体細胞と胚細胞が改変ヒト化ＲＡＭＰ１についてホモ接合である生存可能なトランスジェニック胚を得ることができる。他の態様では、ヘテロ接合動物を使用して細胞系を作製することができる。好適態様では、動物はマウス又はラットである。従って、本発明のこの部分の好適側面は天然ＲＡＭＰ１ヌルバックグラウンドに非天然ヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質を発現するトランスジェニック非ヒト動物である。上述のように、動物はヘテロ接合（即ち天然ＲＡＭＰ１／ヒト化ＲＡＭＰ１のように二倍体ゲノムの１対の染色体の各々に遺伝子の異なる対立遺伝子発現をもつ）でもよいし、改変ＲＡＭＰ１遺伝子についてホモ接合（即ちヒト化ＲＡＭＰ１／ヒト化ＲＡＭＰ１のように二倍体ゲノムの１対の染色体の各々に遺伝子の同一発現をもつ）でもよいし、ヘミ接合（即ち二倍体ゲノムの１対の染色体の一方のみに発現される遺伝子、好ましくはヒト化型ＲＡＭＰ１をもつ）でもよいし、ヒト化ＲＡＭＰ１遺伝子についてホモ接合でもよい。好適態様では、動物はマウス又はラットであり、マウスが特に好ましい。別態様では、ターゲティング又はランダム挿入したヒト化ＲＡＭＰ１遺伝子をプロモーターに機能的に連結することができる。本明細書で使用する場合、機能的に連結とは相対方向が変動し得る２エレメント間の機能的結合を表すために使用する。この特定例では、当業者の自明の通り、遺伝子構築物中でコーディング配列から種々の距離に配置しながらコーディング配列の発現を誘導するように、遺伝子のコーディング配列にプロモーターを機能的に連結することができる。別態様は本発明のこの側面の動物に由来する細胞系と細胞である。
【００６２】
本発明の非ヒトトランスジェニック動物としては限定されないが、トランスジェニックマウスやトランスジェニックラット等のヒト化の候補である非ヒト哺乳動物と、ＲＡＭＰ１ヒト化の候補である非ヒト霊長類が挙げられる。トランスジェニックマウスが好ましい。
【００６３】
本発明は特にＣＧＲＰ受容体の複雑な機能の分析に関する。天然野生型遺伝子は標的遺伝子送達により選択的に置換されるか、又は全能性ＥＳ細胞へのヒト化ＲＡＭＰ１遺伝子のランダム組込みにより同一ゲノム内に配置され、本発明のトランスジェニックマウスを作製するために使用される。内在ホモログに置換するため又はこのようなホモログを内在ゲノムバックグラウンドにランダムに挿入するためには、夫々公知標的相同組換え又はランダム組込みを使用して作製した遺伝子型変異を染色体対立遺伝子に挿入する技術を利用できる。従って、上述のように、本発明は破壊したＲＡＭＰ１遺伝子及び／又はヒト化ＲＡＭＰ１遺伝子の挿入についてヘテロ接合又はホモ接合の二倍体動物細胞、非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物及び非ヒトトランスジェニックファウンダー及び／又はトランスジェニック同腹仔に関する。細胞、胚及び非ヒトトランスジェニック動物はヒト化ＲＡＭＰ１の２個の染色体対立遺伝子を含み、ＲＡＭＰ１活性が野生型レベルよりも低くなるように野生型ＲＡＭＰ１対立遺伝子の少なくとも一方が突然変異されている。野生型対立遺伝子に置換するようにヒト化ＲＡＭＰ１遺伝子をターゲティングしたヒト化ＲＡＭＰ１遺伝子についてホモ接合の二倍体細胞、胚又は非ヒトトランスジェニック動物は（内在ＣＧＲＰ受容体の「野生型」薬理特性の低下により測定した場合に）少なくとも約５０％以上、好ましくは約１００％の野生型ＲＡＭＰ１活性の低下と、それに伴って野生型二倍体細胞に比較してヒトＣＧＲＰ受容体薬理特性に類似するＣＧＲＰ受容体活性を示すことができる。破壊ＲＡＭＰ１遺伝子についてヘテロ接合（即ちｗｔＲＡＭＰ１／ヒト化ＲＡＭＰ１）である本発明で作製される二倍体マウス細胞、胚又は非ヒトトランスジェニックマウスは野生型二倍体細胞に比較して少なくとも約１０％〜約１００％の内在ＲＡＭＰ１活性の低下を示すことができる。ヒト化ＲＡＭＰ１遺伝子にホモ、ヘテロ又はヘミ接合のマウス細胞における転写、発現及び／又は機能的ＣＲＬＲ／ＲＡＭＰ１活性レベルを測定するために公知分子生物学技術を使用することが当業者は実施可能である。従って、本発明は特にホモ、ヘテロ又はヘミ接合トランスジェニックマウスを作製し、種々の潜在的モジュレーターがこれらの変異動物内でどのように相互作用するかを調べることによりＣＧＲＰ受容体の複雑な機能を分析する方法に関する。１好適態様では、本発明の動物（特に内在ＲＡＭＰ１遺伝子の２つの対立遺伝子をヒト化ＲＡＭＰ１遺伝子で置換したトランスジェニック動物）を提供し、動物を化合物（好ましくはＣＧＲＰ受容体活性の潜在的アンタゴニスト）に暴露し、前記化合物がＣＧＲＰ活性に関連する生化学及び生理的応答又はその欠失に及ぼす効果を測定することによりアッセイを実施する。遺伝的に類似又は一致する動物を化合物に暴露せずに測定し、前記アッセイの測定値と比較することができる。
【００６４】
上述のように、特にトランスジェニックマウスを作製する場合でＥＳ細胞の培養に特に成功している場合にはトランスジーン導入のターゲット細胞型は胚幹細胞（ＥＳ）が好ましい。ＥＳ細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養した移植前の胚から得られ、胚と融合することができる（Ｅｖａｎｓら，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１５４−１５６；Ｂｒａｄｌｅｙら，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ  ３０９：２５５−２５８；Ｇｏｓｓｌｅｒら，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：９０６５−９０６９；及びＲｏｂｅｒｔｓｏｎら，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：４４５−４４８）。トランスジーンはＤＮＡトランスフェクション、マイクロインジェクション又はレトロウイルス媒介形質導入等の種々の標準技術によりＥＳ細胞に効率的に導入することができる。その後、得られた形質転換ＥＳ細胞を非ヒト動物からの胚盤胞と一体にすることができる。その後、導入したＥＳ細胞は胚に定着し、得られるキメラ動物の生殖細胞系に加わる（Ｊａｅｎｉｓｃｈ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１４６８−１４７４）。遺伝子標的トランスジェニックマウスの作製における遺伝子標的ＥＳ細胞の使用は１９８７年に記載され（Ｔｈｏｍａｓら，Ｃｅｌｌ  ５１：５０３−５１２（１９８７））、他の文献にも記載されている（Ｆｒｏｈｍａｎら，Ｃｅｌｌ  ５６：１４５−１４７（１９８９）；Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔ．５：７０−７６（１９８９）；Ｂａｒｉｂａｕｌｔら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．６：４８１−４９２（１９８９）；Ｗａｇｎｅｒ，ＥＭＢＯ  Ｊ．９：３０２５−３０３２（１９９０）；Ｂｒａｄｌｅｙら，Ｂｉｏｌ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：５３４−５３９（１９９２））。いずれも参考資料として本明細書に組込むＣａｐｐｅｃｃｈｉとＴｈｏｍａｓの１９９５年１１月７日発行米国特許第５，４６４，７６４号とＢｅｒｎｓらの１９９８年８月４日発行米国特許第５，７８９，２１５号も参照。従って、本発明のトランスジェニック動物細胞、非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物及び非ヒトトランスジェニック同腹仔を作製するための技術は当分野で入手可能である。標的組換えイベントと得られるノックアウトマウスの評価方法も当分野で容易に入手可能であり、公知である。このような方法としては限定されないが、ＤＮＡ（サザン）ハイブリダイゼーションによる標的対立遺伝子の検出、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション並びにウェスタンブロットによるＤＮＡ、ＲＮＡ及び蛋白質の検出が挙げられる。
【００６５】
トランスジェニック「ノックイン」動物等のトランスジェニック動物を作製するために種々のストラテジーが当業者に容易に利用可能であることは当分野で現在周知である。例えば、ＢＡＣ組換え技術としては限定されないが、特に参考資料としてその開示内容全体を本明細書に組込む以下の文献に記載されている技術即ちＳｈｉｚｕｙａら，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：８７９４−８７９７（ＢＡＣベクターの導入）；Ｚｈａｎｇら，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２０：１２３−１２８及びＭｕｙｒｅｒｓら，２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２７（６）：１５５５−１５５７（夫々Ｒａｃファージに由来するｒｅｃＡ／ｒｅｃＴ蛋白質又はλファージに由来するｒａｄαもしくはｒａｄβのプラスミド発現によるＢＡＣクローンの改変、Ｍｕｙｒｅｒｓら，２００１，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２６（５）：３２５−３３１も参照）；Ｙｕら，２０００，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７（１１）：５９７８−５９８３及びＬｅｅら，２００１，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ７３：５４−６５（欠損λプロファージを使用してｒａｄα又はｒａｄβ蛋白質を提供し、ＢＡＣ組換えを促進）の教示が挙げられる。これらの技術はＥＳ細胞又は回収した前核への適切なターゲティングベクター送達と前記細胞内での組換えを行うためにＢＡＣクローンの効率的な組換えと操作を可能にする。部位特異的組換えを助長して精密な染色体及びトランスジーン組換えを可能にする技術が容易に入手できることも公知である。２種の周知系として酵母由来ＦＬＰリコンビナーゼとバクテリオファージＰ１由来Ｃｒｅリゴンビナーゼ系については、Ｋｉｌｂｙら，１９９３，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ９：４１３−４２１、米国特許第５，６５４，１８２号、５，６７７，１７７号及び５，８８５，８３６号（ＦＬＰ／ｆｒｔ）と、米国特許第４，９５９，３１７号（Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ）に記載されており、各米国特許は参考資料としてその開示内容全体を本明細書に組込む。従って、この技術を利用してＲＡＭＰ１ゲノムクローン（例えばマウスゲノムクローン）を同定し、コーディング配列をヒト化するように前記ゲノムクローンを改変し（即ちアミノ酸残基７４のＬｙｓ→Ｔｒｐ；例えばトランスジェニックマウスを作製する場合には必要な唯一の改変は２ヌクレオチドの突然変異誘発であり、リジン（ＡＡＧ）をトリプトファン（ＴＧＧ）に置換し、スクリーニング目的に有用なＢｓｔＮＩ制限部位を導入する［ＣＣＡＡＧ→ＣＣＴＧＧ］）、その後、相同又は非相同組換えによりＥＳ細胞又は前核に送達して安定的に組込む。ヒト化マウス「ノックイン」ストラテジーを開発する手引きとして、マウス配列コンソーシアム（ＭＳＣ）データベースにＲＡＭＰ１ヌクレオチド配列を照会する。最初の検索の結果、２種のゲノム配列がマウスＲＡＭＰ１に一致するとして「ヒット」した。これらの２種のヒットはマウスＲＡＭＰ１の推定エキソン２及び３をコードした。推定エキソン２及び３は夫々７１２ｂｐフラグメントと２フラグメントの１３３９ｂｐコンティグに検出された。推定エキソン３は��ミノ酸残基７４を含む。この情報を利用してマウスＢＡＣライブラリースクリーニング用プローブを設計し、ターゲティングベクター構築のために推定エキソンと周囲のイントロン配列を得ることができる。ゲノム構成はイントロン／エキソン境界が類似残基に位置するヒトとマウスの間で保存されていると思われる（Ｄｅｒｓｔら，２０００，Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ  ９０：１１５−１１８）。
【００６６】
好ましくは該当化合物を本明細書に記載するトランスジェニック又は野生型動物に投与してこのヒト化ＣＧＲＰ受容体に及ぼす化合物のｉｎ  ｖｉｖｏ効果を測定し、更に非ヒト動物に及ぼす化合物投与の生物学的及び生理的効果を測定することにより、ヒト化ＣＧＲＰ受容体にｉｎ  ｖｉｔｒｏ調節効果を示すスクリーニング後の化合物をｉｎ  ｖｉｖｏ分析することも本発明の範囲に含まれる。これらのｉｎ  ｖｉｖｏ試験は単独で実施してもよいし、既知ＲＡＭＰ１と併用して実施してもよい。
【００６７】
本明細書に記載するようなトランスジェニック非ヒト動物モデルは必ずしも限定されないが、ペプチド、蛋白質又は非蛋白性有機もしくは無機分子等のＣＧＲＰ受容体活性の任意潜在的モジュレーター（例えばアンタゴニスト又はアゴニスト）をスクリーニングするのに有用である。この点で、本発明は本発明のトランスジェニック動物とその子孫の作製方法及び薬理試験のためのその使用に関する。本発明は更に試験化合物をトランスジェニック動物に投与し、ヒト化ＣＧＲＰ受容体の活性に及ぼす化合物の効果を測定することにより、本発明のトランスジェニック動物内で発現されるヒト化ＣＧＲＰ受容体の潜在的モジュレーター（特にアンタゴニスト）の選択性と活性を測定する方法にも関する。この点で、本発明は本発明のトランスジェニック非ヒト動物に関連して実施可能な種々の占有率アッセイにも関する。
【００６８】
本明細書で使用及び例示するトランスジーンは遺伝子を含む遺伝子構築物である。該当トランスジーンはターゲット細胞のターゲットゲノムに取込まれてその胚細胞及び／又は体細胞に導入され、安定的に取込まれて所望機能を実施できる。ターゲット動物にトランスジーンを安定的に取込むために好適なターゲットは染色体であるが、「ゲノム」なる用語は生物の完全ＤＮＡ相補体を意味し、例えば核ＤＮＡ（染色体又は染色体外ＤＮＡ）や、細胞質内に局在するミトコンドリアＤＮＡが挙げられる。従って、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は１個以上のトランスジーンをマウス胚細胞又は体細胞のいずれか一方又は両者（好ましくは両者）に安定的に取込み、トランスジーン（例えばヒト化型哺乳動物ＲＡＭＰ１）の発現により、ヒトＲＡＭＰ１のモジュレーターの特異的受容体占有率モデルを提供したり、試験化合物がヒトＲＡＭＰ１受容体を調節する選択性を試験するための薬物動態動物モデルシステムを提供するという所望効果を達成する。子孫に情報を伝達する能力を付与するようにトランスジーンを生殖系細胞に導入することが好ましい。子孫が実際に遺伝情報の一部又は全部をもつ場合には、これらの子孫もトランスジェニック動物である。
【００６９】
本明細書で使用する「動物」なる用語は全動物を含むことができるが、トランスジェニック動物と言う場合には、この用語の使用はヒトを除外する。この用語は胚及び胎児段階を含む全発生段階の個体動物も含む。「トランスジェニック動物」とは例えばマイクロインジェクション、標的遺伝子送達（例えば相同組換え）、又は組換えウイルスの感染等によりサブ細胞レベルで意図的に遺伝子操作することにより直接又は間接的に遺伝情報を付与した１個以上の細胞を含む動物である。上述のように、この導入ＤＮＡ分子（即ちトランスジーン）は染色体内に組込んでもよいし、染色体外で複製するＤＮＡでもよい。
【００７０】
本明細書では本発明のトランスジェニック動物に関して「トランスジーン」及び「遺伝子」と言う。遺伝子は蛋白質をコードするヌクレオチド配列又は構造ＲＮＡである。遺伝子及び／又はトランスジーンは当分野で公知の遺伝調節因子及び／又は構造因子も含むことができる。本明細書で使用及び例示する場合、トランスジーンは遺伝子を含む遺伝子構築物である。トランスジーンは当分野で公知の方法により動物の細胞の１個以上の染色体に組込まれる。一旦組込まれると、トランスジーンはトランスジェニック動物のゲノム内の少なくとも１箇所、好ましくは染色体に担持される。
【００７１】
本明細書で使用する「ファウンダー」とはマイクロインジェクションした卵細胞から発生するトランスジェニック動物を意味する。ファウンダーは遺伝子産物の適当な任意アッセイにより機能的遺伝子が発現しているか否かを試験される。
【００７２】
本明細書で使用する「系」なる用語は１つのファウンダーの直系子孫であり、生殖細胞系に安定的に組込まれた１個のトランスジーン遺伝子座をもつ動物を意味する。
【００７３】
本明細書で使用する「同系」なる用語は全内在遺伝子座が遺伝的に同一である動物を意味する。当分野では、同系はある動物から次の動物への繁殖能、動物間の細胞又は組織伝達能、及び内在遺伝子の役割を識別する確定遺伝試験の実施能を含むように、使用することができる。このような同系は樹立同系のマウスをマイクロインジェクションに使用するような系から発生させることができる。
【００７４】
本明細書で使用する「遺伝子型」なる用語は生物の遺伝構成を意味する。
【００７５】
本明細書で使用する「表現型」なる用語は遺伝子型と環境の相互作用の結果として細胞又は生物がもつ形態、生理及び／又は生化学的形質の総称である。非天然トランスジーンを動物に導入してその遺伝子型プロフィルを改変し、このトランスジーンを動物で発現させ、このトランスジーンの機能的発現により１種以上の化合物に対する新規薬理的選択性を付与する場合、このような生化学的形質もこの表現型の定義に含む。この点で、「表現型発現」なる用語は物質（例えばポリペプチド又は蛋白質）の生産をもたらすか又は接合体もしくは生物の天然表現型の発現を改変するトランスジーンの発現を意味する。
【００７６】
該当トランスジーンはターゲット細胞のターゲットゲノムに取込まれてその胚細胞及び／又は体細胞に導入され、安定的に取込まれて所望機能を実施できる。ターゲット動物にトランスジーンを安定的に取込むための好適なターゲットは染色体であるが、「ゲノム」なる用語は生物の完全ＤＮＡ相補体を意味し、例えば核ＤＮＡ（染色体又は染色体外ＤＮＡ）や、細胞質内に局在するミトコンドリアＤＮＡが挙げられる。従って、上述のように、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は１個以上のトランスジーンをマウス胚細胞又は体細胞のいずれか一方又は両者（好ましくは両者）に安定的に取込み、トランスジーン（例えば機能的ヒト化型ＲＡＭＰ１）の発現により、ヒト化ＣＧＲＰ受容体のモジュレーターの特異的受容体占有率モデルを提供したり、試験化合物が内在ＣＲＬＲ蛋白質とヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質を含むヒト化ＣＧＲＰ受容体を調節する選択性を試験するための薬物動態動物モデルシステムを提供するという所望効果を達成する。子孫に情報を伝達する能力を付与するようにトランスジーンを生殖系細胞に導入することが好ましい。子孫が実際に遺伝情報の一部又は全部をもつ場合には、これらの子孫もトランスジェニック動物である。
【００７７】
本明細書で使用する「動物」なる用語は全動物を含むことができるが、トランスジェニック動物と言う場合には、この用語の使用はヒトを除外する。この用語は胚及び胎児段階を含む全発生段階の個体動物も含む。「トランスジェニック動物」とは例えばマイクロインジェクション、標的遺伝子送達（例えば相同組換え）、又は組換えウイルスの感染等によりサブ細胞レベルで意図的に遺伝子操作することにより直接又は間接的に遺伝情報を付与した１個以上の細胞を含む動物である。上述のように、この導入ＤＮＡ分子（即ちトランスジーン）は染色体内に組込んでもよいし、染色体外で複製するＤＮＡでもよい。本発明の１好適側面では、標的「ノックイン」を実施することにより、ヒト化型ＲＡＭＰ１を挿入して内在ＲＡＭＰ１コーディング領域に置換する。
【００７８】
遺伝コードの縮重により、２種を除く全アミノ酸で２種以上のコドンが特定アミノ酸をコードする。これにより、非限定的な例として本明細書に開示するヌクレオチド配列と合成ＤＮＡのヌクレオチド配列が有意に異なっている、ヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質をコードする合成ＤＮＡを構築することができるようになる。このような合成ＤＮＡも本発明の範囲に含むものとする。このような合成ＤＮＡを特定宿主細胞又は生物で発現させることが所望される場合には、前記特定宿主のコドン使用を反映するように合成ＤＮＡのコドン使用を調節し、ヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質の宿主発現レベルを上げることができる。換言するならば、特定アミノ酸をコードする種々のコドンのこの重複性も本発明の範囲に含まれる。従って、本発明は同一アミノ酸の最終的翻訳をコードする下記代替アミノ酸を含むＲＮＡをコードするＤＮＡ配列にも関する。
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン：コドンＧＣＡ，ＧＣＣ，ＧＣＧ，ＧＣＵ
Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン：コドンＵＧＣ，ＵＧＵ
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸：コドンＧＡＣ，ＧＡＵ
Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸：ＧＡＡ，ＧＡＧ
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン：コドンＵＵＣ，ＵＵＵ
Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン：コドンＧＧＡ，ＧＧＣ，ＧＧＧ，ＧＧＵ
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン：コドンＣＡＣ，ＣＡＵ
Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン：コドンＡＵＡ，ＡＵＣ，ＡＵＵ
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リジン：コドンＡＡＡ，ＡＡＧ
Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン：コドンＵＵＡ，ＵＵＧ，ＣＵＡ，ＣＵＣ，ＣＵＧ，ＣＵＵ
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン：コドンＡＵＧ
Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン：コドンＡＡＣ，ＡＡＵ
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン：コドンＣＣＡ，ＣＣＣ，ＣＣＧ，ＣＣＵ
Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン：コドンＣＡＡ，ＣＡＧ
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン：コドンＡＧＡ，ＡＧＧ，ＣＧＡ，ＣＧＣ，ＣＧＧ，ＣＧＵ
Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン：コドンＡＧＣ，ＡＧＵ，ＵＣＡ，ＵＣＣ，ＵＣＧ，ＵＣＵ
Ｔ＝Ｔｈｒ＝スレオニン：コドンＡＣＡ，ＡＣＣ，ＡＣＧ，ＡＣＵ
Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン：コドンＧＵＡ，ＧＵＣ，ＧＵＧ，ＧＵＵ
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン：コドンＵＧＧ
Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン：コドンＵＡＣ，ＵＡＵ。
【００７９】
従って、本発明は同一蛋白質を発現する異なるＤＮＡ分子を生じることができるコドン重複を開示する。本明細書の趣旨では、１個以上の置換コドンをもつ配列を縮重変異として定義する。以下に記載するようなＲＮＡ編集により別の原因で配列変異が生じる場合もある。このようなＲＮＡ編集はオープンリーディングフレームの変異が発現される蛋白質のアミノ酸残基を変異させない別形態のコドン冗長を生じることができる。発現される蛋白質の最終的物性を実質的に変えないＤＮＡ配列又は翻訳蛋白質も本発明の範囲に含む。例えば、ロイシンをバリン、リジンをアルギニン、又はグルタミンをアスパラギンに置換してもポリペプチドの機能は変化しないと思われる。
【００８０】
ペプチドをコードするＤＮＡ配列を改変し、天然ペプチドと異なる性質をもつペプチドをコードするようにできることは知られている。ＤＮＡ配列の改変方法としては限定されないが、部位特異的突然変異誘発が挙げられる。改変される性質の例としては限定されないが、酵素の基質親和性や受容体のリガンド親和性の変化が挙げられる。
【００８１】
「一致度」はヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の一致度の尺度である。一般に、最高一致が得られるように配列を整列させる。「一致度」自体は当業者に周知の意味であり、公開技術を使用して計算することができる（例えばＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．とＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；及びＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．とＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編，Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１参照）。２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列間の一致度を測定する方法は多数存在するが、「一致度」なる用語は当業者に周知である（ＣａｒｉｌｌｏとＬｉｐｔｏｎ，ＳＩＡＭ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ  ４８：１０７３）。２つの配列間の一致度又は類似度を決定するために一般に使用されている方法としては限定されないが、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｈｕｇｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９４やＣａｒｉｌｌｏとＬｉｐｔｏｎ，１９８８，ＳＩＡＭ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ  ４８：１０７３に記載されている方法が挙げられる。一致度及び類似度を決定する方法はコンピュータープログラムで体系化されている。２つの配列間の一致度及び類似度を決定するための好適コンピュータープログラム法としては限定されないが、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２（１）：３８７）、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３）が挙げられる。
【００８２】
例えば、配列番号１の参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも例えば９５％の「一致度」をもつヌクレオチド配列をもつポリヌクレオチドと言う場合には、ポリヌクレオチド配列は配列番号１の参照ヌクレオチド配列の１００ヌクレオチド当たり５カ所までの点突然変異又は代替ヌクレオチドを含んでいてもよいが、それ以外はポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と一致していることを意味する。換言するならば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％一致するヌクレオチド配列をもつポリヌクレオチドを得るためには、参照配列中のヌクレオチドの５％までを欠失又は別のヌクレオチドで置換してもよいし、参照配列中の合計ヌクレオチドの５％までの数のヌクレオチドを参照配列に挿入してもよい。参照配列のこれらの突然変異又は代替ヌクレオチド置換は参照ヌクレオチド配列の５’もしくは３’末端位置又はこれらの末端位置間の任意場所に配置してもよいし、参照配列中のヌクレオチド間に個々に点在させてもよいし、参照配列内の１個以上の連続基に配置してもよい。一致度を１００％未満にするこのような「変異」又は置換の原因の１例としてＲＮＡ編集が挙げられる。ＲＮＡ編集プロセスの結果としてｍＲＮＡ分子が変異し、この変異ｍＲＮＡを鋳型として使用してクローン化ｃＤＮＡを作製すると、コドン変異を生じる場合と生じない場合を含めて１箇所以上のヌクレオチド変異を生じる。このＲＮＡ編集はＲＮＡ編集酵素により触媒されることが知られている。このようなＲＮＡ編集酵素はＲＮＡアデノシンデアミナーゼであり、アデノシン残基をシトシン残基に類似する傾向のあるイノシン残基に変換する。この点で、ｍＲＮＡ残基がＡからＩに変換されると、クローン化ｃＤＮＡのコーディング領域と非コーディング領域でＡ→Ｇ転移が生じる（例えばＨａｎｒａｈａｎら，１９９９，Ａｎｎａｌｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６８：５１−６６参照；参考のためにＢａｓｓ，１９９７，ＴＩＢＳ  ２２：１５７−１６２参照）。同様に、配列番号２の参照アミノ酸配列に対して少なくとも例えば９５％の「一致度」をもつアミノ酸配列をもつポリペプチドと言う場合には、ポリペプチド配列が配列番号２の参照アミノ酸の１００アミノ酸当たり５カ所までのアミノ酸変異を含んでいてもよいが、それ以外はポリペプチドのアミノ酸配列が参照配列と一致していることを意味する。換言するならば、参照アミノ酸配列と少なくとも９５％一致するアミノ酸配列をもつポリペプチドを得るためには、参照配列中のアミノ酸残基の５％までを欠失又は別のアミノ酸で置換してもよいし、参照配列中の合計アミノ酸残基の５％までの数のアミノ酸を参照配列に挿入してもよい。参照配列のこれらの変異は参照アミノ酸配列のアミノもしくはカルボキシ末端位置又はこれらの末端位置間の任意場所に配置してもよいし、参照配列中の残基間に個々に点在させてもよいし、参照配列内の１個以上の連続基に配置してもよい。この場合も上述のように、ＲＮＡ編集によりコドン変異が生じ、発現される蛋白質の「一致度」がゲノム配列のオープンリーディングフレームに直接対応する「非ＲＮＡ編集」転写産物から発現される他の蛋白質と相違することがある。従って、哺乳動物ＣＲＬＲ���白質と組合せた場合に発現される各ＲＡＭＰ１蛋白質とヒトＲＡＭＰ１の類似性が有意に変わらない限りアミノ酸残基７４の「ヒト化」以外の変異は本発明の範囲に含まれるという意味で核酸配列一致度の概念を本発明に適用することができる。
【００８３】
上述したように、本発明は本明細書に開示する実質精製核酸分子を含む組換えベクターと原核及び真核組換え宿主にも関する。ＲＡＭＰ１蛋白質を完全又は部分的にコードする本発明の核酸分子を他のＤＮＡ分子、即ちＲＡＭＰ１コーディング配列が天然には連結していないＤＮＡ分子と連結し、各ＲＡＭＰ１蛋白質をコードする「組換えＤＮＡ分子」を形成することができる。本発明のＤＮＡ分子はＲＡＭＰ１又は機能的等価物をコードする核酸を含むベクターに挿入することができる。これらのベクターはＤＮＡ又はＲＮＡから構成することができ、殆どのクローニング目的ではＤＮＡベクターが好ましい。典型的なベクターとしてはプラスミド、改変ウイルス、バクテリオファージ、コスミド、酵母人工染色体、及びＲＡＭＰ１蛋白質をコードすることが可能な他の形態のエピソーム又は組込みＤＮＡが挙げられる。特定遺伝子導入又は他の用途に適したベクターを決定することは当業者が十分に実施可能である。従って、多数の蛋白質でそうであるように、ＲＡＭＰ１蛋白質のアミノ酸の多くを改変しながら野生型蛋白質と実質的に同一の生物活性を維持することが可能である。従って、本発明はアミノ酸欠失、付加又は置換をもちながら対応する各ヒト化ＲＡＭＰ１と実質的に同一の生物活性を維持する改変ＲＡＭＰ１ポリペプチドを含む（即ちアミノ酸７４がトリプトファン残基であり、他の変異は改変後のＲＡＭＰ１とヒトＣＧＲＰ受容体としてのヒト薬理特性の類似性に有意に影響しない）。本発明の核心は脊椎動物ＲＡＭＰ１アミノ酸配列の残基７４をトリプトファン残基に変異させることにより脊椎動物ＲＡＭＰ１蛋白質をヒト化できる点である。従って、単一アミノ酸を変異させただけでこのような突然変異蛋白質には完全に異なる現在予想可能な薬理特性が得られた。単一アミノ酸置換は蛋白質の生物活性を一般に変えないと歴史的に一般に認められているので、これは予想外の結果である（例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，Ｗａｔｓｏｎら，１９８７，第４版，Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，ｐａｇｅ  ２２６；及びＣｕｍｍｉｎｇｈａｍ  ＆  Ｗｅｌｌｓ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５参照）。この点で、本発明は小さい付加変異（例えば１、２又は数箇所の非サイレントコドン変異）がＴｒｐ７４変異をもつＲＡＭＰ１蛋白質のヒト化特性に影響しないことも開示し、従って、このような突然変異体蛋白質は本発明の範囲に含まれる。従って、本発明は配列番号２、４、６及び／又は８に１箇所以上の付加アミノ酸置換を加えながら対応するＲＡＭＰ１蛋白質と実質的に同一の生物活性を維持するポリペプチドを含む。例えば、ラットＫ７４ＷはＬｙｓ１０３→Ｓｅｒ残基の突然変異を含む。このヒト化二重突然変異体はラットＫ７４Ｗと同一の「ヒト化」薬理特性を示し、付加アミノ酸置換はＫ７４ＷがＲＡＭＰ１蛋白質を「ヒト化」する能力に有害な影響を与えない。本発明は配列番号２、４、６又は８に２箇所以上のアミノ酸置換を加えながら対応するＲＡＭＰ１蛋白質と実質的に同一の生物活性を維持するポリペプチドを含む。特に、本発明は上記置換が保存置換であ��態様を含む。この点で、小さいアミノ酸欠失又は挿入であるＲＡＭＰ１アミノ酸配列変異をもつＲＡＭＰ１の機能的等価物であるポリペプチドも同一方法（即ちＲＡＭＰ１と関連蛋白質のアミノ酸配列差を最小にする）に従って生産できることも当業者に自明である。小さい欠失又は挿入は一般に約１〜５アミノ酸の範囲である。このような小さい欠失又は挿入が改変ＲＡＭＰ１ポリペプチドの生物活性に与える効果はポリペプチドを合成により製造するか又はＲＡＭＰ１をコードするＤＮＡに必要な変異を形成した後にＤＮＡを組換えにより発現させ、このような組換え発現により生産された蛋白質を定量することにより容易にアッセイすることができる。例えば、アミノ酸残基７４が「ヒト化」形（即ちＴｒｐ）に維持される限り、ＲＡＭＰ１配列の残余の小さい変異を形成すると、発現後のＣＲＬＲ受容体と共に試験し、発現後のヒト薬理特性が維持されているか否かを容易に調べることができる。更に、本発明はＲＡＭＰ１の切断形も含む。このような切断蛋白質は結晶化試験や構造−活性関係試験のために本明細書に記載する種々のアッセイで有用である。
【００８４】
本発明は野生型ＲＡＭＰ１活性を調節する化合物を同定するためのアッセイで有用な融合蛋白質を発現する融合構築物である単離核酸分子と、ＲＡＭＰ１に対する抗体の作製にも関する。本発明のこの部分の１側面としては限定されないが、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−ＲＡＭＰ１融合構築物が挙げられる。組換えＧＳＴ−ＲＡＭＰ１融合蛋白質はバキュロウイルス発現ベクター（ｐＡｃＧ２５，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用してＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ２１）昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）等の種々の発現系で発現させることができる。別の側面は限定されないが、ＧＦＰ（グリーン蛍光蛋白質）、ＭＹＣエピトープ、Ｈｉｓタグ及びＧＳＴ等の種々のマーカーに結合したＲＡＭＰ１融合構築物を含む。この場合も、任意前記融合構築物を該当細胞系で発現させ、本明細書に開示され、発現及び精製されるＲＡＭＰ１蛋白質の１種以上のモジュレーターをスクリーニングするために使用することができる。
【００８５】
種々の任意方法を使用して脊椎動物又は哺乳動物ＲＡＭＰ１（例えばラット、マウス、ヒト等のＲＡＭＰ１）をクローニングし、作製することができる。これらの方法としては限定されないが、以下の方法が挙げられる。（１）ＲＡＣＥ  ＰＣＲクローニング法（Ｆｒｏｈｍａｎら，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：８９９８−９００２）。５’及び／又は３’ＲＡＣＥを実施して全長ｃＤＮＡ配列を作製することができる。このストラテジーはＲＡＭＰ１ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅に遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用する。これらの遺伝子特異的プライマーは任意数の公開核酸及び蛋白質データベースを検索して同定した発現配列タグ（ＥＳＴ）ヌクレオチド配列の同定により設計する。（２）適当な発現ベクターシステムでＲＡＭＰ１を含むｃＤＮＡライブラリーの構築後にＲＡＭＰ１ｃＤＮＡを直接機能的に発現させる。（３）ＲＡＭＰ１蛋白質のアミノ酸配列から設計した標識縮重オリゴヌクレオチドプローブを用いてバクテリオファージ又はプラスミドシャトルベクターで構築したＲＡＭＰ１を含むｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする。（４）ＲＡＭＰ１蛋白質をコードする部分ｃＤＮＡを用いてバクテリオファージ又はプラスミドシャトルベクターで構築したＲＡＭＰ１を含むｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする。この部分ｃＤＮＡはＲＡＭＰ１蛋白質に関連する他の蛋白質について分かっているアミノ酸配列から縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計することによりＲＡＭＰ１ＤＮＡフラグメントの特異的ＰＣＲ増幅により得られる。（５）ＲＡＭＰ１蛋白質に相同の部分ｃＤＮＡ又はオリゴヌクレオチドを用いてバクテリオファージ又はプラスミドシャトルベクターで構築したＲＡＭＰ１を含むｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする。このストラテジーも上記のようにＥＳＴとして同定したＲＡＭＰ１ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅に遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用する場合もある。（６）開示する任意哺乳動物ＲＡＭＰ１配列を鋳型として使用して５’及び３’遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを設計し、公知ＲＡＣＥ技術により全長ｃＤＮＡを作製できるようにするか、又はこれらの同一公知ＲＡＣＥ技術によりコーディング領域の一部を作製し、ＲＡＭＰ１をコードするヌクレオチド分子の全長形を単離するために多種のｃＤＮＡ及び／又はゲノムライブラリーの１つをスクリーニングするためのプローブとして使用するようにコーディング領域の一部を作製及び単離できるようにする。当業者に自明の通り、他の型のライブラリーや、他の細胞型もしくは種型から構築したライブラリーもＲＡＭＰ１をコードするＤＮＡ又はＲＡＭＰ１ホモログを単離するために有用であり得る。他の型のライブラリーとしては限定されないが、他の褐色イヌダニ細胞型に由来するｃＤＮＡライブラリーが挙げられる。
【００８６】
当業者に自明の通り、ＲＡＭＰ１活性をもつ細胞又は細胞系から適当なｃＤＮＡライブラリーを作製することができる。ＲＡＭＰ１をコードするｃＤＮＡを単離するためにｃＤＮＡライブラリーの作製に使用する細胞又は細胞系の選択はこのような目的に利用可能な任意公知アッセイを使用してまず細胞関連ＲＡＭＰ１活性を測定することにより実施することができる。
【００８７】
ｃＤＮＡライブラリーの作製は当分野で周知の標準技術により実施することができる。周知ｃＤＮＡライブラリー構築技術は例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。ｃＤＮＡライブラリーは多数の製造業者から入手することもでき、限定されないが、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．やＳｔｒａｔａｇｅｎｅが挙げられる。
【００８８】
本発明は、更にヒト化ＲＡＭＰ１遺伝子を含むベクター、前記ベクターを含む宿主細胞、及びヒト化ＲＡＭＰ１遺伝子を宿主細胞に導入する段階と、ヒト化ＲＡＭＰ１が生産されるような適当な条件下に宿主細胞を培養する段階を含む実質的に純粋なヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質の製造方法も含む。こうして生産されたヒト化ＲＡＭＰ１は従来通りに宿主細胞から回収することができる。従って、本発明は、本明細書に開示するヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質及び生物学的等価物の発現方法、これらの遺伝子産物を利用するアッセイ、これらの蛋白質を発現するＤＮＡ構築物を含む組換え宿主産物、及びヒト化ＲＡＭＰ１活性のアゴニスト又はアンタゴニストとして作用するこれらのアッセイにより同定された化合物にも関する。
【００８９】
上記方法により得られたクローン化ヒト化ＲＡＭＰ１ｃＤＮＡは適当なプロモーターと他の適当な転写調節因子を含む発現ベクター（例えばｐｃＤＮＡ３ｎｅｏ，ｐｃＤＮＡ３．１，ｐＣＲ２．１，ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２，ｐＬＩＴＭＵＳ２８，ＣｌｏｎｔｅｃｈのｐＩＲＥＳシリーズ，及び以下に挙げる他の例）に分子クローニングにより組換え発現させ、原核又は真核宿主細胞にトランスフェクトして組換えヒト化ＲＡＭＰ１を生産することができる。本明細書では、クローニングしたＤＮＡを転写してそのｍＲＮＡを適切な宿主で翻訳するために必要なＤＮＡ配列として発現ベクターを定義する。このようなベクターを使用すると細菌、藍藻類、植物細胞、昆虫細胞及び動物細胞等の各種宿主で真核ＤＮＡを発現させることができる。特別に設計したベクターは細菌−酵母又は細菌−動物細胞等の宿主間でＤＮＡを交換することができる。適切に構築した発現ベクターは宿主細胞で自律複製するための複製起点と、選択マーカーと、制限数の有用制限酵素部位と、高コピー数の可能性と、活性プロモーターを含む。プロモーターはＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡに結合させてＲＮＡ合成を開始させるＤＮＡ配列として定義される。強力プロモーターは高頻度でｍＲＮＡに開始させるプロモーターである。最適レベルのヒト化ＲＡＭＰ１が得られるヒト化ＲＡＭＰ１ｃＤＮＡ配列を決定するためには、限定されないが、ヒト化ＲＡＭＰ１の全長オープンリーディングフレームを含むｃＤＮＡフラグメントや、蛋白質の特定ドメインのみ又は蛋白質の再配置ドメインをコードするｃＤＮＡの部分を含む各種構築物等のｃＤＮＡ分子を構築することができる。全構築物はヒト化ＲＡＭＰ１ｃＤＮＡの５’及び／又は３’非翻訳領域を全く含まないように設計してもよいし、その全部又は一部を含むように設計してもよい。ＲＡＭＰ１の発現レベルと活性はこれらの構築物を適当な宿主細胞に単独及び併用導入後に決定することができる。トランジェントアッセイで最適発現を生じるヒト化ＲＡＭＰ１ｃＤＮＡカセットを決定した後に、このヒト化ＲＡＭＰ１ｃＤＮＡ構築物を限定されないが、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、卵母細胞、細菌及び酵母細胞等の種々の発現ベクター（組換えウイルスを含む）に導入する。このような操作を行うための技術はＳａｍｂｒｏｏｋら，前出に記載されており、当業者に周知であり、入手可能である。従って、本発明の別の側面はヒト化ＲＡＭＰ１をコードするＤＮＡ配列を含むか及び／又は発現させるように改変した宿主細胞を含む。ヒト化ＲＡＭＰ１様蛋白質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターは組換え宿主細胞でヒト化ＲＡＭＰ１を発現させるために使用することができる。このような組換え宿主細胞はヒト化ＲＡＭＰ１又は生物学的等価形を生産するのに適した条件下で培養することができる。発現ベクターとしては限定されないが、クローニングベクター、改変クローニングベクター、特別に設計したプラスミド又はウイルスが挙げられる。組換えヒト化ＲＡＭＰ１発現に利用可能な市販哺乳動物発現ベクターとしては限定されないが、ｐｃＤＮＡ３ｎｅｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＩ−ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＬＩＴＭＵＳ２８、ｐＬＩＴＭＵＳ２９、ｐＬＩＴＭＵＳ３８及びｐＬＩＴＭＵＳ３９（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＮＡＩａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ３７４６０）、ＩＺＤ３５（ＡＴＣＣ３７５６５）及びｐＩＲＥＳシリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。また、種々の細菌発現ベクターを使用して細菌細胞で組換えヒト化ＲＡＭＰ１を発現させることもできる。組換えヒト化ＲＡＭＰ１発現に利用可能な市販細菌発現ベクターとしては限定されないが、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＥＴ１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、λｇｔ１１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が挙げられる。更に、種々の真菌細胞発現ベクターを使用して真菌細胞で組換えＲＡＭＰ１を発現させることもできる。組換えヒト化ＲＡＭＰ１発現に利用可能な市販真菌細胞発現ベクターとしては限定されないが、ｐＹＥＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とＰｉｃｈｉａ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられる。更に、種々の昆虫細胞発現ベクターを使用して昆虫細胞で組換え蛋白質を発現させることもできる。ヒト化ＲＡＭＰ１の組換え発現に利用可能な市販昆虫細胞発現ベクターとしては限定されないが、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ及びｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とｐＡｃＧ２Ｔ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）が挙げられる。
【００９０】
組換え宿主細胞は原核細胞でも真核細胞でもよく、限定されないが、例えば細菌（例えば大腸菌）、真菌細胞（例えば酵母）、哺乳動物細胞（限定されないが、例えばウシ、ブタ、サル及び齧歯類由来細胞系や昆虫細胞）が挙げられる。例えば、ある昆虫発現系はバキュロウイルス発現ベクター（ｐＡｃＧ２５，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と共にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ２１）昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用する。更に、利用可能な市販哺乳動物細胞としては、限定されないが、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＴＫ−）（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１．３）、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１．２）、Ｓａｏｓ−２（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−８５）、ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５７３）、Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ８６）、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１７１）、ＣＰＡＥ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２０９）及び２９３ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられる。
【００９１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生産した合成ｍＲＮＡを使用してヒト化ＲＡＭＰ１  ＤＮＡの発現を実施してもよい。合成ｍＲＮＡは限定されないが、例えばコムギ胚芽抽出液や網状赤血球抽出液等の種々の無細胞系で有効に翻訳させることができ、限定されないが、例えばカエル卵母細胞へのマイクロインジェクション等の細胞系で有効に翻訳させることもでき、カエル卵母細胞へのマイクロインジェクションが好ましい。
【００９２】
ヒト化ＲＡＭＰ１を宿主細胞で発現させた後にヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質を回収し、活性形のヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質を提供することができる。数種のヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質精製法が利用可能であり、使用に適している。塩析、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、及び金属キレートクロマトグラフィー（例えばＨｉｓタグ付き蛋白質）を種々に組合せるか又は個々に適用することにより細胞溶解液及び抽出液から組換えヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質を精製することができる。更に、全長ヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質又はヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質のポリペプチドフラグメントに特異的なモノクローナル又はポリクローナル抗体を用いて作製したイムノアフィニティーカラムを使用することにより他の細胞蛋白質から組換えヒト化ＲＡＭＰ１を分離することもできる。
【００９３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生産した合成ｍＲＮＡを使用してヒト化ＲＡＭＰ１  ＤＮＡの発現を実施してもよい。合成ｍＲＮＡは限定されないが、例えばコムギ胚芽抽出液や網状赤血球抽出液等の種々の無細胞系で有効に翻訳させることができ、限定されないが、例えばカエル卵母細胞へのマイクロインジェクション等の細胞系で有効に翻訳させることもでき、カエル卵母細胞へのマイクロインジェクションが好ましい。
【００９４】
ヒト化ＲＡＭＰ１を宿主細胞で発現させた後にヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質を回収し、活性形のヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質を提供することができる。数種のヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質精製法が利用可能であり、使用に適している。塩析、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、及び金属キレートクロマトグラフィーを種々に組合せるか又は個々に適用することにより細胞溶解液及び抽出液から組換えヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質を精製することができる。更に、全長ヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質又はヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質のポリペプチドフラグメントに特異的なモノクローナル又はポリクローナル抗体を用いて作製したイムノアフィニティーカラムを使用することにより他の細胞蛋白質から組換えヒト化ＲＡＭＰ１を分離することもできる。
【００９５】
本発明のヒト化ＲＡＭＰ１蛋白質は、実施例１及び２に示すようにＣＧＲＰ受容体モジュレーター（例えばＣＧＲＰ受容体活性のアンタゴニスト）を同定するためのＣＲＬＲ  ＧＰＣＲを用いるアッセイ法で使用するために、当分野で公知の方法により作製することができる。一般に、このような受容体モジュレーターを同定するためのアッセイ法は本発明のヒト化ＣＧＲＰ受容体と、推定ＣＧＲＰ受容体モジュレーターを含む試験化合物又は試料を含む。試験化合物又は試料は例えば天然又は組換え精製受容体蛋白質、天然又は組換え受容体産生細胞のサブ細胞フラクション、及び／又は天然又は組換え受容体を発現する全細胞で直接試験することができる。試験化合物又は試料を既知標識又は未標識受容体リガンドの存在下又は不在下に受容体に加えることができる。例えば、ヒト化ＣＧＲＰ受容体を含む組換え膜フラクションを使用し、放射性リガンド結合アッセイで１２５Ｉ−ＣＧＲＰと受容体の結合を阻害する化合物をスクリーニングすることができる。試験化合物又は試料の調節活性は例えば試験化合物又は試料が受容体に結合する能力、受容体を活性化する能力、受容体活性を阻害する能力、他の化合物と受容体の結合を阻害もしくは促進する能力、受容体調節を改変する能力、又は細胞内活性を改変する能力を分析することにより決定することができる。
【００９６】
本発明は更にヒト化ＣＧＲＰ受容体をコードするＤＮＡ又はＲＮＡの発現とヒト化ＣＧＲＰ受容体のｉｎ  ｖｉｖｏ機能を調節する化合物のスクリーニング方法にも関する。これらの活性を調節する化合物はＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、蛋白質又は非蛋白性有機分子とすることができる。化合物は、ＣＲＬＲ及び／又はヒト化ＲＡＭＰ１受容体を夫々コードするＤＮＡもしくはＲＮＡの発現又はいずれかの蛋白質の機能を増減することを調節し得る。ＣＧＲＰ受容体をコードするＤＮＡもしくはＲＮＡの発現又はこの受容体の機能を調節する化合物は種々のアッセイにより検出することができる。アッセイは発現又は機能に変化があるか否かを決定する単純な「イエス／ノー」アッセイとすることができる。アッセイは試料の発現又は機能を標準試料中の発現又は機能レベルと比較することにより定量的に実施することができる。
【００９７】
以下、実施例により本発明を例証するが、種々の他の態様も当業者に自明であるので、以下の実施例は発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００９８】
種々の哺乳動物及びヒト化ＲＡＭＰ１ｃＤＮＡの特性決定
マーモセット及びカニクイザルＲＡＭＰ１ｃＤＮＡクローニング−ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して前頭脳ｃＤＮＡから部分マーモセットＲＡＭＰ１ｃＤＮＡとカニクイザルｃＤＮＡを単離した。ＰＣＲプライマーはヒトＲＡＭＰ１（５’−ＣＴＧＣＣＡＧＧＡＧＧＣＴＡＡＣＴＡＣＧ−３’［配列番号２５］及び５’−ＣＡＣＧＡＴＧＡＡＧＧＧＧＴＡＧＡＧＧＡ−３’［配列番号２６］）に基づいて設計した。増幅反応は４５秒９４℃、４５秒５８℃、１分７２℃を４０サイクルとし、ＰＬＡＴＩＮＵＭ  Ｔａｑ  ＰＣＲＣＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に製造業者が推奨しているプロトコールに従った。潜在エラーを防ぐために多重サブクローンを配列決定した。
【００９９】
発現構築物、キメラ及び突然変異誘発−ＣＲＬＲのヒト及びラットｃＤＮＡを５’ＮｈｅＩ及び３’ＮｏｔＩフラグメントとしてｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。ヒトＲＡＭＰ１（ｈＲＡＭＰ１）を発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。ラットＲＡＭＰ１（ｒＲＡＭＰ１）クローニングは参考資料として本明細書に組込むＯｌｉｖｅｒら，２００１，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １４：６１８−６２８の開示に従って実施した。ｃＤＮＡは５’ＮｏｔＩ及び３’ＢａｍＨＩフラグメントとしてｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。表３は種々の野生型哺乳動物ＲＡＭＰ１ヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。図４はヒトとマーモセット（Ｔｒｐ）、ラットとマウス（Ｔｒｐに突然変異誘発可能なＬｙｓ）及びブタ（Ｔｒｐに突然変異誘発可能なＡｒｇ）を含む残基７４の「ヒト化残基」によるアミノ酸配列のアラインメントを示す。図１はヒト、ラット及びマウスＲＡＭＰ１の全長アミノ酸配列のアラインメントを示す。
【０１００】
【表３】
2005503809.tif 000007
2005503809.tif 000008
【０１０１】
対応する天然ｃＤＮＡの制限フラグメントを使用して２種のヒト／ラットキメラＲＡＭＰ１ｃＤＮＡを構築した。キメラ１はクローニングベクターに位置するＮｈｅＩ部位と共にＢｓｇＩ制限部位を使用してｒＲＡＭＰ１の最初から６６個のアミノ酸をｈＲＡＭＰ１の対応するヌクレオチドで置換することにより構築した。キメラ２はクローニングベクターに位置するＮｈｅＩ部位と共にＳａｎＤＩＩ制限部位を使用してｒＲＡＭＰ１の最初から１１２個のアミノ酸をｈＲＡＭＰ１の対応するヌクレオチドで置換することにより同様に作製した。
【０１０２】
Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を製造業者の指示に従って使用することによりラットＲＡＭＰ１部位特異的突然変異誘発を実施した。２種の相補的突然変異体オリゴヌクレオチドプライマー（５’−ＣＴＣＡＣＴＣＡＣＴＧＣＡＣＣＴＧＧＣＴＣＧＴＧＧＣＡＡＡＣＡＡＧ−３’［配列番号２７］及び５’−ＣＴＴＧＴＴＴＧＣＣＡＣＧＡＧＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＴＧＡＧＴＧＡＧ−３’［配列番号２８］）と鋳型としてｒＲＡＭＰ１発現ベクター構築物を使用してｒＲＡＭＰ１の７４位のリジンを対応するヒト／マーモセットアミノ酸トリプトファンで置換した。この突然変異はトリプトファンに対応するコドンＴＧＧを置換（ｒＫ７４ＷＲＡＭＰ１）することにより実施した。全構築物を各方向１００％で双方向配列決定した。
【０１０３】
細胞培養とＤＮＡトランスフェクション−４．５ｇ／Ｌグルコース、１ｍＭピルビン酸ナトリウム及び２ｍＭグルタミンを加えたＤＭＥＭに１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、１００単位／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／Ｌストレプトマイシンを加え、３７℃、湿度９５％に維持して２９３ＥＢＮＡ細胞を培養した。ＨＢＳＳ中０．１％ＥＤＴＡの存在下に０．２５％トリプシンで処理して細胞をサブクローニングした。
【０１０４】
トランスフェクションの２４時間前に細胞を５００ｃｍ２プレートに２．０×１０７／プレートで播種した。翌日、トランスフェクションの１時間前に皿に新鮮な培養培地を再補充した。ＤＮＡ６０μｇ／プレートとＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１８０μｇ／プレートを加えることによりトランスフェクションを実施した。哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１に担持したＣＲＬＲとＲＡＭＰ１のｃＤＮＡを等量でコトランスフェクトした。トランスフェクションカクテルを培地に直接加え、この混合物を２４時間後に新鮮な培地に交換した。トランスフェクションから４８時間後に膜の細胞を回収した。
【０１０５】
膜調製物及び放射性リガンド結合試験−一過的にトランスフェクトした２９３ＥＢＮＡ細胞をＰＢＳで１回洗浄し、５０ｎＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び完全プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を含む回収用緩衝液で回収した。細胞懸濁液を実験室ホモジナイザーで破壊し、４８０００ｇで遠心分離して膜を分離した。２５０ｍＭスクロースを加えた回収用緩衝液にペレットを再懸濁した。膜を−７０℃でアリコートとして保存した。
【０１０６】
結合アッセイでは、１０ｐＭ１２５Ｉ−ｈＣＧＲＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を含む総容量１ｍＬの結合用緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．２％ＢＳＡ）中で膜１．５〜２５μｇ（受容体発現レベルによる）を室温で３時間インキュベートした。１２５Ｉ−ｒＣＧＲＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用しても同様の結果が得られた。０．５％ポリエチレンイミンで予めブロックしておいたＧＦ／Ｂ６ウェルフィルターで濾過することによりインキュベーションを終了した。終濃度１００ｎＭのｈＣＧＲＰ（ペプチドアッセイの場合）又は３００ｎＭのＢＩＢＮ４０９６ＢＳ（小分子アッセイの場合）を使用して非特異的結合を測定した。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍを使用してデータを分析した。用量応答曲線をプロットし、式ｙ＝（（ａ−ｄ）／（１＋（ｘ＋ｃ）ｂ）＋ｄ（式中、ｙ＝応答、ｘ＝用量、ａ＝最大応答、ｄ＝最小応答、ｃ＝変曲点及びｂ＝傾き）により定義される４パラメーターフィットによりＩＣ５０値を決定した。表４〜６に報告するデータは１回の実験として示しているが、２〜３回反復実験を表す。
【０１０７】
ウェスタンブロッティング−ｒＣＲＬＲを発現する膜をエンドグリコシダーゼＦ１又はペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）で別々に３７℃で一晩処理した。蛋白質ゲルローディングバッファーの添加後に試料を７０℃に１０分間加熱した後、４〜１２％勾配ＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にロードした。電気泳動後に、分離した蛋白質を０．４５μｍニトロセルロース膜に移した。アフィニティー精製ウサギ抗ラットＣＲＬＲ（Ａｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）と共にＷｅｓｔｅｒｎＢｒｅｅｚｅ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してラットＣＲＬＲを検出した。
【０１０８】
結果−ＣＧＲＰ受容体の小分子アンタゴニストは種特異的薬理特性を示すことが示されている（Ｄｏｏｄｓら，２０００，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１２９，４２０−４２３；Ｅｄｖｉｎｓｓｏｎら，２００１，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４１５：３９−４４；Ｈａｓｂａｋら，２００１，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１３３：１４０５−１４１３）。蛋白質配列アラインメントの結果、ヒトとラットのＣＲＬＲは９１％相同であるが、ヒトとラットのＲＡＭＰ１は７１％しか相同でないことが判明した。ＢＩＢＮ４０９６ＢＳはラット受容体よりもヒトＣＧＲＰ受容体に対する親和性が２００倍であると報告されている（Ｄｏｏｄｓら，前出）。この所見は薬理的相違がどちらかの蛋白質の配列不一致に起因するか又はＣＲＬＲ配列とＲＡＭＰ１配列の両者の相違の複合効果に起因することを示唆した。まず種選択性がＣＲＬＲ自体に起因するのか、あるいはその補助蛋白質ＲＡＭＰ１に起因するのかを調べるために、２９３ＥＢＮＡ細胞でヒトＣＲＬＲをコードするｃＤＮＡをラットＲＡＭＰ１と一過的にトランスフェクトし、逆にヒトＲＡＭＰ１をラットＣＲＬＲとトランスフェクトすることによりハイブリッドヒト／ラットＣＧＲＰ受容体を作製した。細胞を回収し、後期競合リガンド結合実験に備えて細胞膜を調製した。予想通り、小分子アンタゴニストである化合物１とＢＩＢＮ４０９６ＢＳはトランスフェクトしたヒトＣＧＲＰ受容体に比較してｒＣＲＬＲ／ｒＲＡＭＰ１に対する親和性が低かった（表４；ＢＩＢＮ４０９６ＢＳと化合物１及び２の構造については図２参照）。他方、ペプチドアンタゴニストであるＣＧＲＰ８−３７はヒトとラットからのＣＧＲＰ受容体に対して同等の親和性を示し、夫々ＩＣ５０値２．８及び２．０ｎＭであった。ｒＣＲＬＲ／ｒＲＡＭＰ１を発現する２９３ＥＢＮＡ膜では、１２５Ｉ−ＣＧＲＰ結合は化合物１とＢＩＢＮ４０９６ＢＳにより夫々ＩＣ５０値１５，０００及び６．９ｎＭで阻害された。他方、組換え発現させたｒＣＲＬＲ／ｈＲＡＭＰ１は化合物１とＢＩＢＮ４０９６ＢＳに対して夫々ＩＣ５０１９０及び０．４１ｎＭのヒト様薬理活性を示した（表４）。同様に、ｈＣＲＬＲ／ｒＲＡＭＰ１に対する化合物１とＢＩＢＮ４０９６ＢＳのＩＣ５０値は天然ラット受容体で観察される値と同等であった。これらの結果から、ＲＡＭＰ１がヒト及びラットＣＧＲＰ受容体に対するＢＩＢＮ４０９６ＢＳと化合物１の親和性を決定することが判明した。これらのハイブリッド受容体におけるＣＲＬＲの種起源は小分子アンタゴニスト親和性に殆ど又は全く影響がなかった。
【０１０９】
【表４】
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【０１１０】
ＲＡＭＰは大きな細胞外Ｎ末端ドメインと単一膜貫通（ＴＭ）ドメインを含むと予想される補助蛋白質である。ＢＩＢＮ４０９６ＢＳと化合物１の親和性の決定に直接関与するＲＡＭＰ１の領域を解明するために、ヒト／ラットＲＡＭＰ１キメラを作製した。キメラ１はｒＲＡＭＰ１の最初から６６個のアミノ酸を対応ｈＲＡＭＰ１配列で置換することにより作製した（図３）。逆にｒＲＡＭＰ１の最初から１１２個のアミノ酸をヒト配列で置換してキメラ２を作製した。これらの構築物をその後、上記と同様の実験で一過的トランスフェクションに使用した。キメラ１とｒＣＲＬＲを発現する膜では、１２５Ｉ−ｈＣＧＲＰ結合は化合物１とＢＩＢＮ４０９６ＢＳにより夫々ＩＣ５０値９，０００及び４．８ｎＭで阻害された（表５）。これらの結果はｒＣＲＬＲ／ｒＲＡＭＰ１に得られる結果に似ていた。他方、ｒＣＲＬＲをキメラ２と同時発現させると、得られたＩＣ５０はｈＣＲＬＲ／ｈＲＡＭＰ１で得られる結果と似ていた。以上の試験からＲＡＭＰ１の細胞外ドメインのアミノ酸６６〜１１２がＣＲＬＲ／ＲＡＭＰ１に対するＢＩＢＮ４０９６ＢＳと化合物１の親和性の調節に関与していることが示された。
【０１１１】
【表５】
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【０１１２】
ＣＧＲＰ受容体薬理特性を決定する重要な領域としてＲＡＭＰ１のアミノ酸６６〜１１２が同定されたことから、種選択性は特定アミノ酸残基に関係があると考えられる。部分マーモセットＲＡＭＰ１ｃＤＮＡをクローニングし、配列をヒト由来配列及び他の入手可能なＲＡＭＰ１配列と比較した。蛋白質配列アラインメントの結果、ヒトとマーモセットでは一致するが、ラット、マウス及びブタに存在するものとは相違する１４残基が明らかになった（図４）。ヒトとマーモセットの配列はアミノ酸７４にトリプトファンを含んでいたが、他の３種には塩基性残基が存在していたので、アミノ酸７４を潜在的突然変異誘発ターゲットとしてターゲティングした。その後、ｒＲＡＭＰ１の７４位のリジンを対応するヒト／マーモセットアミノ酸トリプトファンで置換した。この構築物を次にｒＣＲＬＲと共に２９３ＥＢＮＡ細胞に同時トランスフェクトした。競合結合実験の結果、ｒＣＲＬＲとｒＫ７４ＷＲＡＭＰ１の同時発現によりヒト様受容体薬理特性を救済できることが示された（表６）。ｒＣＲＬＲ／ｒＫ７４ＷＲＡＭＰ１に対するＢＩＢＮ４０９６ＢＳのＩＣ５０はｈＣＲＬＲ／ｈＲＡＭＰ１に観測される値と同等であり、夫々０．０８ｎＭと０．０２ｎＭであり、天然ラット受容体に対する親和性である５．５ｎＭよりも著しく強力であった。化合物２でも同様の傾向が観察された。化合物１は、ＲＡＭＰ１突然変異体における恐らくジブロモチロシル部分とトリプトファンの有利な相互作用により、ｒＣＲＬＲ／ｒＫ７４ＷＲＡＭＰ１に対する親和性が天然ヒト受容体に対する親和性の＞１０倍であった。これらの結果は、ＣＧＲＰ受容体に対するこれらの小分子アンタゴニストがＲＡＭＰ１のアミノ酸７４の種類に強く影響されることを示唆した。
【０１１３】
【表６】
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【０１１４】
ＲＡＭＰの立証されている機能の１つはＣＲＬＲの正しい細胞表面ターゲティングを確保することである。ラットＣＧＲＰ受容体のグリコシル化状態は従来特性決定されておらず、更に、ラットとヒトのＲＡＭＰ１はＣＲＬＲのグリコシル化を異なるものとし、この効果がアンタゴニスト親和性に観察される相違を決定したという可能性があったので、グリコシル化の機能的意義を検討した。ｒＣＲＬＲに対する抗体と脱グリコシル化酵素を使用し、ラット又はヒトＲＡＭＰ１に関連するｒＣＲＬＲのグリコシル化状態を調べた。競合結合実験から得られた膜（ｒＣＲＬＲ／ｒＲＡＭＰ１、ｒＣＲＬＲ／ｈＲＡＭＰ１及び対照ｒＣＲＬＲ／ｐｃＤＮＡ３．１）をペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅＦ）とエンドグリコシダーゼＦ１（ＥｎｄｏＦ１）で処理した。ＰＮＧａｓｅＦは成熟糖蛋白質の加水分解を触媒し、ＥｎｄｏＦ１はＮ結合高マンノースとハイブリッドオリゴ糖を分解するが、複雑なオリゴ糖は分解しない。従って、グリコシル化受容体の分子量はＰＮＧａｓｅＦ処理後に低下し、複雑なグリコシル化をもつ受容体はＥｎｄｏＦ１で分解できない。ｒＣＲＬＲをヒト又はラットＲＡＭＰ１と同時発現させると、５５及び６８ｋＤａのＭｒ種が生産され、ＰＮＧａｓｅＦ処理後に単一４２ｋＤａ種に還元された（図５）。更に、６８ｋＤａ種はＥｎｄｏＦ１分解に対するその耐性により立証されるように、成熟糖蛋白質であった。負の対照ｒＣＲＬＲ単独は恐らくトランスフェクトしたＣＲＬＲと低レベルの内在ＲＡＭＰ１の相互作用に起因するバックグラウンドレベルの５５ｋＤａ種を生じた。５５ｋＤａ種は受容体のコアグリコシル化形態に相当すると思われる。これらの結果から、ヒト又はラットＲＡＭＰ１をラットＣＲＬＲと同時発現させると、同等レベルの複雑なグリコシルを生じることが示唆された。
【実施例２】
【０１１５】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＰＣＲプライマーを使用してマウス脳ｃＤＮＡからＣＲＬＲ用マウスｃＤＮＡを分離した。
【０１１６】
Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ２０９９０５に基づいて（５’−ＴＡＧＣＴＡＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＡＡＡＡＡＧＣＡＴＡＴＡＣ［配列番号２９］と５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＡＴＣＣＡＡＴＣＴＴＴＴＧＧＣ−３’［配列番号３０］）を設計した。改変５’ＮｈｅＩ及び３’ＢａｍＨＩ部位を利用して発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。ＰＣＲを使用してマウス脳ｃＤＮＡからＲＡＭＰ１のマウスｃＤＮＡを単離した。公開されているマウスＲＡＭＰ１配列（Ｋｎｕｔら，２０００，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１６２：２５−４３）に基づいてＰＣＲプライマー（５’−ＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＧＧＧＧＣＴＣＴＧＣＴＴＧＣＣＡＴＧ−３’［配列番号３１］及び５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＣＡＴＣＡＣＣＴＧＧＧＡＴＡＣＣＴＡＣ−３’［配列番号３２］）を設計した。改変５’ＮｏｔＩ及び３’ＢａｍＨＩ部位を利用して発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。実施例１で使用したと同一方法によりマウスＲＡＭＰ１部位特異的突然変異誘発を実施した。マウスＲＡＭＰ１発現ベクター構築物を鋳型として使用し、２種の相補的突然変異体オリゴヌクレオチドプライマー（５’−ＧＣＴＣＡＣＴＴＡＣＴＧＣＡＣＣＴＧＧＣＡＣＧＴＧＧＣＧＣＡＣＡＣＧ［配列番号３３］及び５’−ＣＧＴＧＴＧＣＧＣＣＡＣＧＴＧＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＴＡＡＧＴＧＡＧＣ［配列番号３４］）を使用した。この突然変異はマウスリジンコドン（ＡＡＧ）の１及び２位のＴＧをトリプトファンコドンＴＧＧ（ｍＫ７４Ｗ  ＲＡＭＰ１）に置換することにより実施した。実施例１と同様に細胞培養、ＤＮＡトランスフェクション、膜調製及び放射性リガンド結合試験を実施した。
【０１１７】
競合結合実験の結果、ｍＣＲＬＲとｍＫ７４ＷＲＡＭＰ１の同時発現によりヒト様受容体薬理特性を救済できることが立証された（表７）。ｍＣＲＬＲ／ｍＫ７４ＷＲＡＭＰ１に対するＢＩＢＮ４０９６ＢＳのＩＣ５０はｈＣＲＬＲ／ｈＲＡＭＰ１に観測される値と同等であり、夫々０．１ｎＭと０．０２ｎＭであり、天然ラット受容体に対する親和性である８．５ｎＭよりも著しく強力であった。化合物２でも同様の傾向が観察された。化合物１のｍＣＲＬＲ／ｍＫ７４ＷＲＡＭＰ１に対する親和性はｒＣＲＬＲ／ｒＫ７４ＷＲＡＭＰ１受容体の場合と同様に天然ヒト受容体に対する親和性の＞１０倍であった。
【０１１８】
【表７】
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【０１１９】
本発明は本明細書に記載する特定態様により範囲を制限されない。実際に、本明細書に記載する態様に加えて本発明の種々の変形が以上の記載から当業者に自明である。このような変形も特許請求の範囲に含むものとする。
【０１２０】
本明細書には種々の刊行物を引用したが、その開示内容全体を参考資料として本明細書に組込む。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】ヒト、ラット及びマウス野生型ＲＡＭＰ１蛋白質配列のアミノ酸アラインメントを示す。マウス及びラット配列等の哺乳動物ＲＡＭＰ１蛋白質配列のヒト化のターゲットアミノ酸はアミノ酸残基７４（斜体で示す）である。
【図２】ＣＧＲＰアンタゴニストとしてＢＩＢＮ４０９６ＢＳ、化合物１及び化合物２の化学構造を示す。
【図３】構築したＲＡＭＰ１キメラとＲＡＭＰ１突然変異誘発を示す。キメラ１はラットＲＡＭＰ１の最初から６６個のアミノ酸をヒト配列で置換することにより構築した。キメラ２はラットＲＡＭＰ１の最初から１１２個のアミノ酸をヒトＲＡＭＰ１に由来するアミノ酸で置換することにより同様に作製した。斜線領域はヒトＲＡＭＰ１配列を表し、残りの白領域はラットペプチド配列を表す。ラットＲＡＭＰ１の７４位を突然変異誘発し、単一ＲＡＭＰ１点突然変異体を作製した。
【図４】ヒト、マーモセット、ラット及びブタに由来するＲＡＭＰ１のアミノ酸６６〜１１２のアラインメントを示す。実施例１に記載するように部分マーモセットＲＡＭＰ１クローンを作製した。
【図５】ｒＲＡＭＰ１（ラットＲＡＭＰ１）及びｈＲＡＭＰ１（ヒトＲＡＭＰ１）と同時発現させたｒＣＲＬＲのウェスタンブロット分析を示す。空ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１）をトランスフェクトしたｒＣＲＬＲを含む競合結合実験からの膜をペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（Ｆ）、エンドグリコシダーゼＦ１（Ｆ１）で処理するか、又は酵素処理しなかった。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、抗ラットＣＲＬＲ抗体でウェスタンブロット分析した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005503809.tif 000078
【国際調査報告】
2005503809.tif 000079
2005503809.tif 000080