(57)【要約】本発明は、潜在的なプロテアーゼ活性を減少させることによって、安定性（特に、非冷蔵温度における安定性）の向上を示すＴ４エンドヌクレアーゼＶ組成物を提供するものである。また、潜在的なプロテアーゼ活性を検出する方法、及び、当該活性を減少させる方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ４エンドヌクレアーゼＶ組成物におけるプロテアーゼ不純物を検出する方法であって、
（i）水性緩衝液、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶ組成物の試料、及びレポーターペプチドを含む試験溶液を調製する工程、
（ii）当該試験溶液を、２５℃で少なくとも７日間培養する工程、及び、
（iii）工程（ii）の後にレポーターペプチドの分解を測定する工程、
を含む当該方法。
【請求項２】
前記試験溶液におけるＴ４エンドヌクレアーゼＶの濃度が０．０９５±０．０５ｍｇ／ｍｌである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記レポーターペプチドが、Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｌｙｓ（配列番号１）のアミノ酸配列を有する標識化レポーターペプチドである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
工程（iii）が、試験溶液の少なくとも一部をペプチド分離手順で処理し、及びレポーターペプチドの分解率をデンシメトリーによって測定することによって、工程（iii）が実行される、請求項１乃至３のいずれか１に記載の方法。
【請求項５】
Ｔ４エンドヌクレアーゼＶ組成物を調製する方法であって、
（Ａ）Ｔ４エンドヌクレアーゼＶを含有する水溶液を提供する工程、及び、
（Ｂ）当該水溶液を処理して、組成物のプロテアーゼ活性を減少させる工程、
を含み、
ここで、工程（Ｂ）の結果、当該組成物が、
（ａ）前記試験溶液におけるＴ４エンドヌクレアーゼＶの濃度が０．０９５±０．０５ｍｇ／ｍｌであり、
（ｂ）前記レポーターペプチドが、Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｌｙｓ（配列番号１）のアミノ酸配列を有する標識化レポーターペプチドであり、及び、
（ｃ）工程（iii）が、試験溶液の少なくとも一部をペプチド分離手順で処理し、及びレポーターペプチドの分解率をデンシメトリーによって測定することによって、工程（iii）が実行される（当該分解率は、プロテアーゼ活性である）、
請求項１に記載の方法を用いる測定により、１０パーセント未満のプロテアーゼ活性を有する、当該方法。
【請求項６】
工程（Ｂ）において、前記水溶液が、固体支持体に接続された四級アンモニウム部位によって処理される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
工程（Ｂ）において、前記水溶液がキレート剤によって処理される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
工程（Ｂ）において、前記水溶液が、固体支持体に接続された四級アンモニウム部位及びキレート剤によって処理される、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記組成物を、冷蔵よりも高く３０℃よりも低い温度において６ヶ月間貯蔵する更なる工程を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
請求項５乃至８のいずれか１に記載の方法によって調製されるＴ４エンドヌクレアーゼＶの組成物。
【請求項１１】
Ｔ４エンドヌクレアーゼＶを含む組成物であって、
当該組成物が１０パーセント未満のプロテアーゼ活性を有し、ここで、当該プロテアーゼ活性は請求項１に記載の方法であって、
（ａ）前記試験溶液におけるＴ４エンドヌクレアーゼＶの濃度が０．０９５±０．０５ｍｇ／ｍｌであり、
（ｂ）前記レポーターペプチドが、Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｌｙｓ（配列番号１）のアミノ酸配列を有する標識化レポーターペプチドであり、及び、
（ｃ）工程（iii）が、試験溶液の少なくとも一部をペプチド分離手順で処理し、及びレポーターペプチドの分解率をデンシメトリーによって測定することによって、工程（iii）が実行される（当該分解率は、プロテアーゼ活性である）、
当該方法により測定される、当該組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、２５℃で６ヶ月間の貯蔵の後においてＴ４エンドヌクレアーゼＶの初期活性の少なくとも１０パーセントを保持する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
Ｔ４エンドヌクレアーゼＶを含む組成物であって、当該組成物が、２５℃で６ヶ月間の貯蔵の後においてＴ４エンドヌクレアーゼＶの初期活性の少なくとも１０パーセントを保持する、当該組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、冷蔵より高い温度における貯蔵の間においても安定な酵素Ｔ４エンドヌクレアーゼＶの調製に関する。
【０００２】
米国薬局方第２４条において定義されているように、“低温（ｃｏｌｄ）”は“８℃（４６ｏＦ）以下の任意の温度”であり、“冷蔵室”は、“温度が２℃乃至８℃（３６ｏＦ乃至４６ｏＦ）に調節維持された冷所”である。従って、本明細書において、“冷蔵（ｒｅｆｒｉｇｅｒａｔｉｏｎ）”という語は、８℃（４６ｏＦ）以下温度について用いられる。
【０００３】
当該技術分野において公知なように、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶ（本明細書では、“Ｔ４エンドＶ”と呼ぶ）は、医薬、健康維持、及びその他の目的のために有用である。しかしながら、その用途は、冷蔵より高い温度において貯蔵する際の不安定性によって制限されてきた。本発明は、冷蔵よりも高い温度においても安定性を有するＴ４エンドＶを提供する方法を開示するものである。本発明は、また、（１）当該安定性を達成する工程において用いられる検定方法、及び（２）そのような安定性を示すＴ４エンドＶ組成物を提供する。
【背景技術】
【０００４】
米国特許第５，０７７，２１１号及び米国特許第５，２７２，０７９号（いずれも、タイトルは“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｅｎｚｙｍｅｓ”である）は、ＤＮＡ修復酵素を精製し、及び局所輸送のためにそれらをリポソームに封入（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｎｇ）する方法に関するものである。
【０００５】
米国特許第５，２９６，２３１号の“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｅｎｚｙｍｅｓ”は、ＤＮＡ修復酵素を精製し、及び局所輸送を目的としてそれらをｐＨ変化に感受性であるリポソームに封入する方法に関するものである。
【０００６】
米国特許第５，１９０，７６２号の“Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｏ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｓｋｉｎ  Ｃｅｌｌｓ”は、リポソーム中の生物活性タンパク質（酵素を含む）の皮膚細胞への用途に関するものである。
【０００７】
米国特許第５，３０２，３８９号の“Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  ＵＶ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｎｔａｃｔ  Ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ４  Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ”は、免疫系を保護するためのＴ４エンドＶを取り込んだＤＮＡ修復リポソームの使用に関するものである。
【０００８】
米国特許第５，３５２，４５８号の“Ｔａｎｎｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｕｓｉｎｇ  ＤＮＡ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ”は、タンニング（ｔａｎｎｉｎｇ）応答を増大させるためのＤＮＡ修復リポソームの使用に関するものである。
【０００９】
Ｗ．Ｌ．Ｃａｒｒｉｅｒ及びＲ．Ｂ．Ｓｅｔｌｏｗの“Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ  ｔｈａｔ  ｈａｓ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｔｏｗａｒｄ  ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ−ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ：ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ”、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１０２巻、１７８−１８６頁（１９７０年）には、Ｍ．ｌｕｔｅｕｓからのＴ４エンドヌクレアーゼＶに類似した酵素の精製が説明されている。当該酵素は、冷凍に対して不安定でかつ感受性が高いことが、１８０頁に記載されている。すなわち、“精製物の活性は、４℃で数週間安定である。その活性の５０％は冷凍により失われ、それより高い温度では非常に不安定である。例えば、３７℃では、３０分で全ての活性が失われる”と記載されている。当該活性は、子ウシ胸腺ＤＮＡの添加によって向上し得る。
【００１０】
Ｍ．Ｄｏｄｓｏｎ、Ｍ．Ｐｒｉｎｃｅ、Ｗ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ、及びＲ．Ｌｌｏｙｄの“Ｓｉｔｅｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  Ｔ４  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｖ  ｇｅｎｅ：ｄｉｓｐｅｎｓａｂｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｌｏｏｐ  ｒｅｇｉｏｎｓ”、Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２５５巻、１９−２９頁（１９９１年）では、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶタンパク質における特定部位の重要性の研究によって、酵素固有の折り畳み及び機能に不可欠なループ領域が明らかにされている。
【００１１】
Ｅ．Ｃ．Ｆｒｉｅｄｂｅｒｇ及びＪ．Ｊ．Ｋｉｎｇの“Ｄａｒｋ  ｒｅｐａｉｒ  ｏｆ  ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ−ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｂｙ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ４：ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｄｉｍｅｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｈａｇｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ”、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１０６巻、５００−５０７頁（１９７１年）には、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶの精製方法が記載されている。得られる酵素は不安定であり、子ウシ胸腺ＤＮＡと共に４℃で貯蔵することが推奨されている。最終的なフラクションは、“冷凍された場合には不安定であり、３％のポリエチレングリコール又はＤＮＡ（２０ｕｇ／ｍｌ）のいずれかの存在下において３℃で貯蔵される。当該酵素を４５℃で１０分間加熱することによって、その活性の約８０％が失われる”と記載されている（５０２頁）。
【００１２】
Ｋ．Ｍ．Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＲ．Ｓ．Ｌｌｏｙｄの“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔ４  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｖ”、Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１８３巻、１１７−１２１頁（１９８７年）には、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶの精製方法が記載されている。全ての操作は、特に指定がない限り、０−４℃において行うことが推奨されている。貯蔵する際の要件は記載されていない。
【００１３】
Ｙ．Ｎａｋａｂｅｐｐｕ及びＭ．Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉの“Ｐｈｙｓｉｃａｌ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ  ｄｉｍｅｒ  ＤＮＡ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ  ａｎｄ  ａｐｕｒｉｎｉｃ／ａｐｙｒｉｍｉｄｉｎｉｃ  ＤＮＡ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｒｅｐａｉｒ  ｏｆ  ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ−ｄａａｇｅｄ  ＤＮＡ”、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、７８巻、２７４２−２７４６頁（１９８１年）には、精製したＴ４エンドＶが、同一のポリペプチドにおいて、二量体特異的なグリコシラーゼ活性及びＡＰエンドヌクレアーゼ活性の両方を有することが記載されている。ＡＰ  ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性は、４２℃で非常に迅速に（５分以内に）失活し、一方、グリコシラーゼ活性は、当該温度において１分当り４％の速度で失われたと記載されている。
【００１４】
Ｐ．Ｃ．Ｓｅａｗｅｌｌ、Ｅ．Ｃ．Ｆｒｉｅｄｂｅｒｇ、Ａ．Ｋ．Ｇａｎｅｓａｎ、及びＰ．Ｃ．Ｈａｎａｗａｌｔの「ＤＮＡ  Ｒｅｐａｉｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｃｅｓｕｒｅｓ」における“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｖ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ４”、１Ａ巻、１９８１年、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ（ニューヨーク）、第１９章：Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｖ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ４、２２９−２３６頁には、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶの精製方法が記載されている。全ての精製手順は、０℃で行うことが推奨されている。精製された酵素を室温で貯蔵することは推奨されていない。すなわち、２３５頁には、“透析ホスホセルロースのフラクションは、４℃で数ヶ月間貯蔵することができるが、冷凍によって失活する。いくつかの手順によるＴ４エンドヌクレアーゼの更なる精製が報告されているが、我々の実験では、十分に精製された酵素は、貯蔵において不安定である”と記載されている。
【００１５】
Ｄ．Ｙａｒｏｓｈ、Ａ．Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ、Ｌ．Ａｌａｓ、Ｃ．Ｐｏｔｔｅｎ、Ｐ．Ｗｏｌｆの“Ｐｈｏｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｏｐｉｃａｌ  ＤＮＡ  ｒｅｐａｉｒ  ｅｎｚｙｍｅｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ”、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ、６９巻、１３６−１４０頁（１９９９年）には、Ｔ４エンドＶの失活を、いくつかの試料について１０℃、２５℃、及び３７℃において測定したことが記載されている。当該酵素は、ＳＤＳ変性及び熱変性の後における特定の条件下で活性が回復することが記載されている。Ｔ４エンドヌクレアーゼＶの不安定性は、らせん間のヒンジ領域におけるタンパク質変性の容易さに依存するという仮説が提示されている。
【００１６】
Ｓ．Ｙａｓｕｄａ及びＭ．Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉの“Ｔ４  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｒｅｐａｉｒ  ｏｆ  ＤＮＡ”、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、６７巻、１８３９−１８４５頁（１９７０年）は、Ｔ４エンドＶの精製についての初めての記載であり、当該酵素が名付けられている論文である。酵素の貯蔵における要件は提示されていない。
【００１７】
Ｓ．Ｙａｓｕｄａ及びＭ．Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉの“Ｆｕｒｔｈｅｒ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ４  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｖ”、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ、４４２巻、１９７−２０７頁（１９７６年）には、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶの精製方法が記載されている。全ての手順は、０−４℃で行うことが推奨されている。ほとんどの実験で用いられている試料は、０℃で貯蔵されたものである（２０２頁参照）。当該酵素は不安定であると記載されている。すなわち、“エンドヌクレアーゼＶは、０℃で貯蔵した場合には比較的安定であるが、非常に熱に不安定であり、４０℃におけるプレインキュベーションでは８分以内にその活性の８０％を失う”と記載されている（２０３−２０４頁参照）。
【００１８】
上述のように、Ｔ４エンドＶの広範な使用に大きな障害となっているのは、冷蔵よりも高い温度においてその貯蔵が制限されることである。Ｔ４エンドＶを精製するために多くの方法が用いられてきており、それらには上記の引用文献に開示されている方法が含まれる。これらの方法には、ＥＤＴＡ等の金属キレート剤の使用及び／又はイオン交換クロマトグラフィーが含まれる。しかしながら、これらの方法の商業的な用途（例えば、２００リットル以上を発酵及び精製のための用途）により得られる生成物は、冷蔵又は冷凍して貯蔵しない限り、1週間以上安定であることはできない。
【００１９】
文献に示されている安定性についての研究は、冷蔵より高い温度におけるＴ４エンドＶの短い半減期を実証している。Ｔ４エンドＶの商業的供給者（例えば、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）は、付加的な経費にもかかわらず、常にこれらの酵素を冷蔵又は冷凍状態の下で出荷しており、さらに、冷凍状態で貯蔵することを推奨している。
【００２０】
本願の出願人であるＡｐｐｌｉｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  Ｄｅｒｍａｔｉｃｓの研究でも、精製Ｔ４エンドＶの製品は、一貫性がなくかつ制限された安定性を示すことがわかった。多くの製品を調査したところ、極端な不安定性から中程度の不安定性まで幅広い酵素安定性があることが判明した。商業サイズのバッチにおいて、活性の平均半減期は、冷蔵条件下において６ヶ月であり、室温では約３ヶ月であることがわかった。いくつかの製品では、冷蔵よりも高い温度で培養すると１週間未満で酵素活性が失われることがわかった。安定性のバラツキは、当該酵素の商業的用途において深刻な障害となる。Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙにおける上述の論文において、我々は、酵素の不安定性はタンパク質の変性に依存することを提案した。これは、タンパク質におけるループ領域のきちんとした折り畳みが酵素の安定性に不可欠なものであると記載しているＤｏｄｓｏｎらのＭｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９１年の論文（上記参照）によっても支持される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明は、冷蔵よりも高い温度（例えば、室温）において貯蔵することができるＴ４エンドＶ組成物を提供するものである。これは、潜在的（微量）プロテアーゼの除去及び／又はそのようなプロテアーゼ活性の阻害によって達成される。
【００２２】
別の側面では、本発明は、プロテアーゼ阻害剤、プロテアーゼ活性のデフレクター（ｄｅｆｌｅｃｔｏｒ）、又はプロテアーゼ活性のおとり（ｄｅｃｏｙ）を組成物中に取り込むことによって、冷蔵よりも高い温度においてＴ４エンドＶを貯蔵する方法を提供するものである。
【００２３】
本発明の更なる別の側面では、酵素の生産の間にプロテアーゼを除去することによって、或いは、標準的な精製の後に残存する微量のプロテアーゼ活性を除去するのに十分な量のプロテアーゼ特異的プロテアーゼ、プロテアーゼの自殺阻害剤、及び／又はプロテアーゼの化学的不活性剤を生産工程において取り込むことによって、冷蔵よりも高い温度において貯蔵することができるＴ４エンドＶが生産される。
【００２４】
さらに、本発明は、指示薬であるプロテアーゼ基質（レポーターペプチド）が試験サンプルと接触する時間を引き延ばしても検出されないような微量のプロテアーゼ活性を検出する方法を提供する。
【００２５】
方法に関する第一の態様において、本発明は、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶ組成物（例えば、全生産工程における中間体組成物、又は最終的に市販される組成物）におけるプロテアーゼ不純物を検出する方法であって、
（i）水性緩衝液（例えば、トリスＨＣｌ、ｐＨ８緩衝液）、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶ組成物の試料、及びレポーターペプチドを含む試験溶液を調製する工程、
（ii）当該試験溶液を、２５℃で少なくとも７日間（標準的な実験室条件の下で）培養する工程、及び、
（iii）工程（ii）の後にレポーターペプチドの分解を測定する工程、
を含む方法を提供する。
【００２６】
本発明の第一の方法における好ましい実施態様は、
（１）試験溶液におけるＴ４エンドヌクレアーゼＶの濃度が、０．０９５±０．０５ｍｇ／ｍｌであること、
（２）レポーターペプチドが標識化されたレポーターペプチドであって、そのアミノ酸配列が、Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｌｙｓ（すなわち、市販されているＰＲＯＭＥＧＡ  ＰＥＰＴＡＧ（商標）キットのＣ１レポーターペプチド（ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ、ＰＲＯＭＥＧＡ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）；配列番号１参照）であること、及び／又は、
（３）試験溶液の少なくとも一部をペプチド分離手順（例えば、アガロースゲル電気泳動）で処理し、及び、レポーターペプチドの分解率をデンシメトリー（例えば、蛍光標識を有するレポーターペプチドについてのゲルのデジタル化蛍光画像をコンピューター解析する）によって測定することによって、工程（iii）が実行されること、
によって特徴付けられる。
【００２７】
試験されるＴ４エンドヌクレアーゼＶ組成物の試料に加えて、好ましくは、陽性対照及び陰性対照も標準的な実験室手順に従って試験される。陽性対照は、試験に用いられる標識化レポーターペプチドを分解することが知られているプロテアーゼを含む。一方、陰性対照は、例えば、組成物の試料を含まない緩衝液及び標識化レポーターペプチドであることができる。
【００２８】
バイオアッセイ（例えば、酵素活性の定量）において慣用的であるように、工程（i）の試験溶液におけるレポーターペプチドの濃度は、陽性対照のプロテアーゼ活性が確実に検出され得るように選択される。例えば、配列番号１の好ましいＣ１レポーターペプチドの場合、試験溶液における適切なレポーターペプチド濃度には、０．０３ｍｇ／ｍｌ、０．０４ｍｇ／ｍｌ、０．０６ｍｇ／ｍｌ、及び０．０９５ｍｇ／ｍｌが含まれる。これらはいずれも、陽性対照（例えば、ＰＲＯＭＥＧＡ  ＰＥＰＴＡＧ（商標）キットと共に用いることが推奨されているアルカリ性プロテアーゼ陽性対照）におけるプロテアーゼ活性を確実に検出できる。Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＴｈｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．１８５、１−８頁、タイトル“Ｐｅｐ  Ｔａｇ（商標）Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ａｓｓａｙ”、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ、１９９４年１１月を参照されたい。もちろん、本発明の実施において、その他のレポーターペプチド濃度を用いることもできる。例えば、用いる特定のアッセイ条件下の陽性対照においてプロテアーゼの存在を確実に検出するのに十分高い濃度であることを条件に、０．０３乃至０．０９５ｍｇ／ｍｌ又は０．０４乃至０．０６ｍｇ／ｍｌ等の範囲における任意の濃度を用いることができる。後述する実施例で例示するように、好ましくは、レポーターペプチド／陽性対照／陰性対照の組合せは、用いるアッセイ条件下において、陽性対照ではレポーターペプチドの１００％が分解し、陰性対照では０％が分解する組合せである。
【００２９】
確実／有効なアッセイのためには、一般的に、試験溶液におけるレポーターペプチドの濃度は０．０３ｍｇ／ｍｌより高いべきである。
【００３０】
方法に関する第二の態様では、本発明は、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶ組成物（例えば、全生産工程における中間体組成物、又は最終的に市販される組成物）を調製する方法であって、
（Ａ）Ｔ４エンドヌクレアーゼＶを含有する水溶液を提供する工程（ここで、当該水溶液は、中間体の又は最終生成物の溶液であることができる）、及び、
（Ｂ）（例えば、固体支持体に接続された四級アンモニウム部位を用いること、及び／又はキレート試薬と共に四級アンモニウム部位を用いることにより）当該水溶液を処理して、組成物のプロテアーゼ活性を減少させる工程、
を含み、
ここで、工程（Ｂ）の結果、当該組成物は１０パーセント未満のプロテアーゼ活性を有し、当該プロテアーゼ活性は、上述のように（１）好ましいＴ４エンドヌクレアーゼＶ濃度、（２）好ましいレポーターペプチド、及び（３）好ましい分解率測定技術（そのように測定した分解率がプロテアーゼ活性である）を用いる本発明の第一の方法によって測定される、
当該方法を提供する。
【００３１】
生成物に関する第一の態様では、本発明は、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶを含む組成物であって、ここで、当該組成物は１０パーセント未満のプロテアーゼ活性を有し、当該プロテアーゼ活性は、上述のように（１）好ましいＴ４エンドヌクレアーゼＶ濃度、（２）好ましいレポーターペプチド、及び（３）好ましい分解率測定技術（そのように測定した分解率がプロテアーゼ活性である）を用いる本発明の第一の方法によって測定される、当該組成物を提供する。
【００３２】
生成物に関する第二の態様では、本発明は、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶを含む組成物（例えば、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶと、薬学的賦形剤を含有する水性キャリヤー等の適切なキャリヤーとの組成物）であって、ここで当該組成物が２５℃で６ヶ月間の貯蔵の後において初期活性の少なくとも１０パーセントを保持する、当該組成物を提供する。
【００３３】
図１は、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶの初期活性と減衰速度の関係を示すものである。このグラフは、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶの３つの試料における初期活性に対して安定度曲線の傾きをプロットしたものである。当該データは、安定度実験から得たものである。ここで、安定度曲線の傾きは、時間に対するＴ４エンドヌクレアーゼＶ活性のプロットをフィッティングした線形回帰直線の傾きであり、初期活性は、回帰方程式を酵素の生産日について解いた場合に得られた切片である。図１において、当該図のデータに対する回帰直線のフィッティングにおいて、Ｒ２値が０．９０９３である。
【００３４】
図２は、精製したＴ４エンドヌクレアーゼＶの試料におけるプロテアーゼ活性のアッセイの結果を示すものである。９つの酵素、陽性及び陰性対照を、それぞれ、Ａ１又はＣ１ペプチドと共に２５℃で３０分間、１８時間、１週間、又は２週間培養した（試験溶液におけるレポーターペプチドの濃度は、０．０４ｍｇ／ｍｌである）。プロテアーゼ活性は、アガロース電気泳動におけるペプチドの移動度の変化として検出した。蛍光記録条件の下で、各ゲルを撮影した。無傷のペプチド及び開裂断片（Ｆ１又はＦ２断片として表わしている）を示す。分解したペプチドのパーセンテージは、通常の画像解析により算出したものであり、それを図２に示す。
【００３５】
図３は、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶの安定性に対するプロテアーゼ活性の関係を示すものである。プロテアーゼ活性の異なる（試料Ｈは１００％、試料Ｉは３８％）２つのＴ４エンドヌクレアーゼＶ試料について、活性のアッセイによって検出した、１４℃で５日後に損失したＴ４エンドヌクレアーゼＶ活性のパーセンテージを比較した（試料Ｈは８１％、試料Ｉは４１％であった）。２つの試料の相違点は、試料Ｉは１本鎖ＤＮＡ溶出ピークの中心部分から調製されたのに対し、試料Ｈは当該溶出ピークの中心部分に隣接する部分から調製されたことである。プロテアーゼ活性は、試験溶液中で０．０６ｍｇ／ｍｌの濃度のＣ１ペプチドを用いて測定した。
【００３６】
図４は、ＥＤＴＡによるプロテアーゼ活性の部分的阻害を示すものである。Ｔ４エンドＶの２つの試料（試料Ｃ及び試料Ｉ）について、ＥＤＴＡ無し及びＥＤＴＡの濃度を増加させた場合のプロテアーゼ活性を試験した。試験溶液中で０．０６ｍｇ／ｍｌの濃度のＡ１ペプチドを用いた場合には、いずれの試料もプロテアーゼ活性を示さなかった。同じ濃度のＣ１ペプチドを用いたアッセイでは、試料Ｃが試料Ｉよりも低いプロテアーゼ活性を有し、さらに、それがＥＤＴＡの添加によって完全に阻害されることが判明した。試料Ｉは、ＥＤＴＡによって部分的に阻害されてはいるが、それより大きいプロテアーゼ活性を有する。
【００３７】
図５は、高速Ｑ−セファロース（ＦＦＱＳ）によるプロテアーゼ活性の部分的除去を示すものである。粗Ｔ４エンドヌクレアーゼＶ溶解液をＱ−セファロースのカラムに通した。そのプロテアーゼ活性を、２４時間培養したＡ１及びＣ１ペプチドを用いて比較した。試験溶液中のレポーターペプチドの濃度は、それぞれ０．０４ｍｇ／ｍｌである。カラムに通す前には、試料はいずれのペプチドにもプロテアーゼ活性を有していたが、カラムに通した後は、当該プロテアーゼが大きく減少した。
【００３８】
図６は、ＥＤＴＡを含み、かつＦＦＱＳを通したＴ４エンドヌクレアーゼＶ試料におけるプロテアーゼ活性の除去を示すものである。３．４ｍＭのＥＤＴＡ存在下で精製しＦＦＱＳを通したＴ４エンドヌクレアーゼＶのプロテアーゼ活性を、２５℃及び３７℃で１週間の条件でアッセイした。試験溶液中におけるＣ１ペプチドの濃度は、０．０４ｍｇ／ｍｌである。試料Ｉに比べて大きな減少が観測された。
【００３９】
図７は、プロテアーゼ除去後の２５における安定性を示すものである。ＦＦＱＳによるプロテアーゼ除去及びＥＤＴＡによる阻害を用いて調製したＴ４エンドヌクレアーゼＶ試料（試料Ｋ）について、冷蔵温度（４℃）及び室温（２５℃）において１週間の条件における安定性をアッセイした。これらの２つの温度において貯蔵した酵素の比活性（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）に相違は検出されなかった（ｐ＞０．０５）。
【００４０】
図８は、３．４ｍＭのＥＤＴＡを取り込み、Ｑ−セファロースのカラムを通して調製したＴ４エンドＶ（試料Ｍ）が、ＥＤＴＡやＱ−セファロース処理のされていないバッチ（試料Ｈ及び試料Ｉ）及びＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）から市販されているＴ４エンドＶのバッチよりも大幅に少ないプロテアーゼを含有することを示すものである。試料をＣ１ペプチドと共に２５℃及び３７℃で２日間培養することによって、プロテアーゼアッセイを行った。試験溶液におけるＣ１ペプチドの濃度は、０．０３ｍｇ／ｍｌである。
【００４１】
上記の図面は、本明細書に取り込まれてその一部を構成するものであり、本発明の原理を説明する詳細な説明と共に、本発明の好ましい実施態様を例証するものである。当然ながら、これらの図面及び詳細な説明は、本発明の説明のみを目的とするものであって、本発明を限定するものではない。
【００４２】
図２、４−６、及び８において示している“％分解率”は、以下に示す通常の手順で求めたものである。（１）（ａ）無傷のペプチド（Ｄｉｎｔａｃｔ）及び（ｂ）全ての断片におけるそれぞれのウェル（ゲルにおける各カラム）についてデンシトメトリー値を求める；（２）断片のデンシトメトリー値の合計（Ｄｓｕｍ）を計算する；（３）Ｄｓｕｍ／（Ｄｓｕｍ＋Ｄｉｎｔａｃｔ）の比を算出する。従って、分解率は、１００・Ｄｓｕｍ／（Ｄｓｕｍ＋Ｄｉｎｔａｃｔ）である。
【００４３】
その後、試料について観測されたプロテアーゼ活性が内因性のプロテアーゼによるものであって、実験操作の間に取り込まれた不純物によるものでないことを確認するために、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶ調合物の試料についての分解率値を陰性対照について得られた分解率の値と比較した。この目的のために用いた陰性対照の値は図６に示しているが、当該陰性対照は、本来そうあるべき０％の分解率ではなく、高い分解率を示した（２５℃及び３７℃において、それぞれ７２％及び３８％）。これらの高い分解率は、陰性対照の調製に用いた水に起因するものであり、増加した微生物数及び他の水試料よりも高いプロテアーゼ活性を有することが判明した。それゆえ、以降の実験ではこれを使用せず、廃棄した。
【００４４】
本発明の詳細な説明
上述したように、本発明は、組成物から潜在的なプロテアーゼを除去することにより、冷蔵よりも高い温度において貯蔵することができるＴ４エンドＶ組成物を提供するものである。
【００４５】
精製Ｔ４エンドヌクレアーゼＶの３つの試料について、４℃の貯蔵の間おける時間に対する活性のプロットを解析することにより、プロテアーゼの役割、特に、最も少量のプロテアーゼ活性に対してさえＴ４エンドＶが有する並外れた感度を見出した。これらのプロットから、酵素活性の初期値が変化するだけでなく、その安定性も変化することが判明した。これは、当該安定性が酵素固有のものであると考える場合には予期せぬものである。
【００４６】
これらのプロットの回帰分析によって、酵素の減衰速度（傾き）は、活性の初期量（切片）に正比例するということがわかった。言い換えるならば、Ｔ４エンドＶの任意のバッチについて、その減衰速度は、活性の初期値から予測し得るのである。この相関に基づくと、貯蔵の間にＴ４エンドＶ活性を崩壊させる１の因子が、同時に、初期の活性レベルをもコントロールすると仮定することができ、さらに、当該因子は、Ｔ４エンドＶ調合物におけるプロテアーゼ活性であると仮定することができる。
【００４７】
プロテアーゼ活性がＴ４エンドＶの安定性を制限するという上記仮説を検証するために、標準的なプロテアーゼ活性アッセイ、すなわち、ＰＲＯＭＥＧＡ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）のＰＥＰＴＡＧ（商標）アッセイを用いてＴ４エンドＶ試料を分析した。当該アッセイにおいて、末端に蛍光標識を有するペプチドを試験試料と共に培養し、その後、当該ペプチドを電気泳動させた。プロテアーゼ活性がペプチドを開裂させるならば、その短さ及び／又は電荷の変化によって、当該末端標識化されたペプチドの泳動が変化するであろう。異なる長さ及びアミノ酸配列を有する２つの試験ペプチドを用いて、幅広い範囲のプロテアーゼを検出した。
【００４８】
生産者によって推奨されている標準的なアッセイ手順（これには、試験試料をペプチドと共に３０分間培養することが含まれる）を行ったが、Ａ１ペプチド（アミノ末端標識化）又はＣ１ペプチド（カルボキシ末端標識化）のいずれかを用いた９つの精製Ｔ４エンドＶ調合物のいずれにおいても、プロテアーゼ活性は検出されなかった。同様に、ペプチドとの培養時間を３０分から１８時間に延ばした場合においても、プロテアーゼ活性は検出されなかった。さらに、上記９つの調合物をＡ１ペプチドと共に１週間又は２週間培養した場合でも、依然としてプロテアーゼ活性は検出されなかった。しかしながら、Ｃ１ペプチドと共に１週間又は２週間培養した後のＴ４エンドＶ調合物には、９つともプロテアーゼ活性が観測された。
【００４９】
当該潜在的プロテアーゼ活性を検出するためのアッセイ方法の発見は、Ｔ４エンドＶ組成物の一貫しない安定性を理解するために重要な前進であった。それは、他の方法では検出できない酵素の精製調合物におけるプロテアーゼ活性の同定が可能となるからである。
【００５０】
その後、２つのＴ４エンドＶ調合物について、プロテアーゼ活性を分析し、それらの調合物の安定性と比較した。時間に対する酵素活性の曲線の傾きが、プロテアーゼ活性と相関することがわかった。詳細には、最も高いプロテアーゼ活性を有する試料が最も不安定であり、最も低いプロテアーゼ活性を有する試料が最も安定であった。
【００５１】
当該発見は、本発明の根底を成すものである。なぜならば、それは、数週間及び数ヶ月に渡って機能し得る微量のプロテアーゼ活性を測定し除去するすることによって、Ｔ４エンドＶの安定性及び酵素製品の一貫性（ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ）を改善できることを意味するからである。言い換えると、これによって、冷蔵よりも高い温度における貯蔵が可能となり、それゆえ、Ｔ４エンドＶの商業的価値を増大させること可能となる。
【００５２】
より具体的には、推奨される貯蔵温度を室温まで広げることによって、Ｔ４エンドＶ等の酵素をより商業的に有用なものとすることができる。商業規格は６ヶ月乃至３年間であり、すなわち、この期間の間、酵素は、室温（すなわち、３０℃までの温度）で貯蔵された場合でも規格（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）の範囲内に維持されなければならない。
【００５３】
本明細書中で述べるように、Ｔ４エンドＶの場合、プロテアーゼ活性を除去することにより当該室温における貯蔵を達成することができる。プロテアーゼは、タンパク質を分解する酵素である。それらは、非特異的にほぼ全てのタンパク質を攻撃し、或いは、特定のタンパク質又はペプチド連鎖に対し特異的であることができる。プロテアーゼの種類は、自然界における複数のプロテアーゼ混合物中でしばしば見出される。場合によっては、酵素は冷却又は冷凍に敏感であると報告されているが、これは、解凍工程が高温（ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）で行われる間に機能する時間がある、調合物中のプロテアーゼ不純物に起因するものである。
【００５４】
プロテアーゼは、多くの場合、二価イオンを補因子として用いることにより活性化される。それゆえ、ＥＤＴＡのキレート効果によって、プロテアーゼ活性を減少させることができる。一般に、ＥＤＴＡは、０．１乃至０．５重量％の濃度において、生化学における有用なキレート剤として用いられている。ＥＤＴＡは、最終生成物中に残存することができ、或いは、所望ならば除去することもできる。構造的に及び機能的にＥＤＴＡと類似するいくつかの化合物が存在し、それらは、例えば、ＥＧＴＡ及びエルゴチオネイン等である。本発明において、キレート剤の濃度は、潜在的なプロテアーゼ活性を著しく減少させる（例えば、少なくとも５０％、好ましくは８０％、最も好ましくは９０％減少させる）のに十分な濃度であるべきである。
【００５５】
プロテアーゼ活性を減少させる更なる方法は、プロテアーゼの活性部位又は機械的機能を阻害し又はブロックするような分子を用いることである。それらは、プロテアーゼに特異的であるか、又は広域の阻害剤であることができる。そのような分子には、フェニルメチルスルホニルフルオライド及びロイペプチンが含まれる。好ましいプロテアーゼ阻害剤は、無毒性で、低濃度でも活性であり、安価であり、さらに、Ｔ４エンドＶ酵素の活性を阻害しないものである。当該阻害剤は、プロテアーゼを除去せずに、むしろそれだけを阻害する。それゆえ、それらは、用いられる際、最終的な酵素調合物中に含まれる（ただし、キレート剤は最終調合物から除去できることに留意されたい。それは、プロテアーゼ補因子（例えば、二価イオン）がキレート剤と共に除去され、その結果、プロテアーゼ活性が減少するからである）。キレート剤の場合と同様に、阻害剤の濃度は、潜在的なプロテアーゼ活性を著しく減少させる（例えば、少なくとも５０％、好ましくは８０％、最も好ましくは９０％減少させる）のに十分な濃度であるべきである。
【００５６】
Ｔ４エンドＶ組成物におけるプロテアーゼ活性を減少させるための好ましい手段は、プロテアーゼを四級アンモニウム基（“Ｑ”基）に結合させることによって除去することである。当該除去は、Ｑに基づくクロマトグラフィー媒体、例えば、Ｑ−セファロース及び高速Ｑ膜等の手段によって達成できる。簡略化するために、本明細書では、四級アンモニウム部位と類似のアニオン交換特性を有する全てのアフィニティー結合媒体について、“Ｑ”及び“Ｑ−”という略語を用いる。これらの媒体は、カラムクロマトグラフィー、バッチ攪拌、又は固体支持体の形態において用いることができる。
【００５７】
Ｑ−結合に対するプロテアーゼの親和性が、Ｑ−結合に対するＴ４エンドＶの親和性よりも大きくなるようにクロマトグラフィーの条件を選択する場合、プロテアーゼを含まない酵素は、流動（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）フラクション中に存在する。一方、Ｑ−結合に対するプロテアーゼの親和性がＴ４エンドＶのものより小さい場合には、プロテアーゼ活性が流動フラクション中に存在することとなり、プロテアーゼを含まないＴ４エンドＶは、塩或いはｐＨ又はカオトロピック試薬を用いてＱ−結合マトリックスから流出させることができる。最も望ましい方法は、容易に洗浄できる安価なクロマトグラフィー媒体を用いるものであって、及び、Ｔ４エンドＶが流出し、プロテアーゼが保持されるような方法である。好ましくは、Ｑ−結合は、Ｔ４エンドＶ組成物における潜在的なプロテアーゼ活性を著しく減少させる（例えば、少なくとも５０％、好ましくは８０％、最も好ましくは９０％減少させる）。
【００５８】
Ｔ４エンドＶ組成物におけるプロテアーゼ活性を減少又は除去するために、いくつかのその他の方法を用いることもできる。分子シャペロンは、種々の酵素と結合し、細胞内における変性及びその他の障害から当該酵素を保護するタンパク質分子である。シャペロン又はプロテアーゼに対するその他の物理的保護剤を用いて、Ｔ４エンドＶの安定性を増大させることができる。最も望ましいシャペロンは、安価で、無害であって、Ｔ４エンドＶの活性を阻害しないものである。おとり基質タンパク質及び自殺プロテアーゼ基質を用いて、プロテアーゼを吸収し、隔離し、又は破壊することができる。プロテアーゼが除去され得るので、これらの方法は、プロテアーゼ活性を破壊するという利点を有する。好ましいおとり基質及び自殺基質は、効果的で、安価で、無毒であり、かつ容易に除去できるものである。ここでも、これらの方法は、潜在的なプロテアーゼ活性の著しい減少（例えば、少なくとも５０％、好ましくは８０％、最も好ましくは９０％の減少）を達成するべきである。
【００５９】
ＥＤＴＡ、Ｑ−結合、又はその他の任意の方法をそれぞれ単独で用いる場合には、プロテアーゼ活性を完全には除去できないが、これらのうちのいずれか又は組合せて用いることによって、冷蔵よりも高い温度で貯蔵可能なＴ４エンドＶ組成物を得ることができる。
【００６０】
本発明の実施において用いられるＴ４エンドＶは、抽出物の状態で、或いは、プロテアーゼを含有する供給原料から調製された半精製又は精製状態で存在することができる。当該酵素は、植物を含む、原核細胞又は真核細胞から発酵され得る。最終的なＴ４エンドＶ組成物は、医薬及び化粧品分野において慣用されている種々の成分、例えば、賦形剤、抗菌剤、充填剤（ｂｕｌｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、着色剤等を含むことができる。典型的には、本発明のＴ４エンドＶ組成物は、人体や動物に対する局所用調合薬において用いられる。好ましくは、Ｔ４エンドＶ組成物は、酵素を封入するリポソームを含む。上述の米国特許（これの関連部分は、引用により本明細書中に取り込まれる）では、本発明のＴ４エンドＶ組成物についての種々の好ましい用途が説明されている。
【００６１】
以下の非限定的な実施例によって、本発明の用途及び種々の有用で新規な特長が更に理解されるであろう。
【実施例１】
【００６２】
当該実施例は、標準的なアッセイではプロテアーゼ活性を検出できないような場合であっても、Ｔ４エンドＶ酵素の安定性と初期活性の関係がプロテアーゼ活性の存在の指標となることを実証するものである。
【００６３】
当該関係は、初期酵素活性に対して酵素活性の損失の傾きをプロットしたときの、３以上の酵素調合物試料についてのプロットにおいて見ることができる。
【００６４】
殺菌灯による４０Ｊ／ｍ２のＵＶ−Ｃで照射した２００μｇ／ｍｌのプラスミドｐＭＪＲ１５６０の基質を調製し、２００μｇ／ｍｌの未照射プラスミドｐＳＶ２ｎｅｏと混合することによって、Ｔ４エンドヌクレアーゼの活性を測定した。その後、１０μｌの当該基質を、５０ｍＭのトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８）と１０ｍＭのＥＤＴＡ中における３つのＴ４エンドヌクレアーゼＶタンパク質試料のそれぞれと混合した。当該試料は、米国特許第５，０７７，２１１号に記載の方法によって精製したものである（特に示さない限り、本明細書におけるその他全ての試料も、当該方法を用いて調製した）。３７℃で６０分間培養した後、０．８％の中性アガロースゲル上でＤＮＡを分析した。
【００６５】
基質は、２つのスーパーコイルバンドとして移動する。ここで、照射された小さいｐＭＪＲ１５６０プラスミドは、より大きなｐＳＶ２ｎｅｏプラスミドよりも速く移動した。Ｔ４エンドヌクレアーゼＶがＵＶ照射されたスーパーコイルプラスミドｐＭＪＲ１５６０と反応した後、得られた開環状プラスミドは、ｐＳＶ２ｎｅｏプラスミドよりもゆっくり移動した。スーパーコイル位置で移動したｐＭＪＲ１５６０プラスミドの割合の合計は、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶ活性の逆指標（ｉｎｖｅｒｓｅ  ｍｅａｓｕｒｅ）である。１の“ヒット（ｈｉｔ）”は、スーパーコイルプラスミド量を３７％まで減少させる酵素活性の量である。活性の単位は、基質混合物１００μｇに対するヒット数に等しい。個別の活性は、酵素１μｇ当りの個数である。
【００６６】
４℃における貯蔵の間に、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶの３つの試料をアッセイした。データは、日数に対する正味のｐＭＪＲのヒット数（未照射のｐＳＶ２ｎｅｏプラスミド対照におけるヒット数を引き算したもの）をプロットしたものである。５ヶ月間の複製（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）における１週間ごとの測定によるプロットから、回帰線をフィッティングした。傾きは安定度曲線の傾きであり、各回帰は生産の起算日における活性について解いた。安定度曲線の傾きを、初期活性に対してプロットした。
【００６７】
結果を図１に示す。得られたプロットは、傾きと初期活性の直線関係を示すものであり、適合度は０．９０９３である。
【実施例２】
【００６８】
プロテアーゼ活性に対する標準的なアッセイ（例えば、ＰＲＯＭＥＧＡ  ＰＥＰＴＡＧ（商標）キット）では、５０ｍＭのトリスＨＣＬでｐＨ８に緩衝化されたの全反応液１０μｌにおいて、１μｌのＡ１及びＣ１基質のそれぞれを５μｌの試料と共に室温で３０分間培養し、その後、１％亜画ローズゲルにおいて生成物を分析するよう指示されている。陽性対照として、２０ｎｇ／μｌのアルカリ性プロテアーゼ溶液２．５μｌ（すなわち、５０ｎｇのアルカリ性プロテアーゼ）を用いた。
【００６９】
これらの条件下で、３０分間及び１８時間においてアッセイしたが、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶの９つの試料では、プロテアーゼ活性は検出されなかった（図２）。その後、基質と酵素試料の培養を１又は２週間まで延長した。この場合であっても、Ａ１ペプチドは、依然としてプロテアーゼ活性を示さなかった。しかしながら、Ｃ１ペプチドは、Ｔ４エンドＶにおいてプロテアーゼ活性を示した（図２）。
【実施例３】
【００７０】
同一のゲルろ過工程の中間体から２つのＴ４エンドＶ試料を調製したが、それらは、カラムからの溶出に基づいて２つの部分に分けた。溶出ピークの中心部分のものを試料Ｉとし、溶出ピークに隣接するフラクションの組合せを試料Ｈとした。
【００７１】
実施例２で説明したプロテアーゼ活性について、及び実施例１で説明した酵素活性の損失（２５℃３週間において失われた酵素活性の割合）について、試料を比較した。図３に示すように、試料Ｈは、非常に高いプロテアーゼ活性、それと同時に、非常に大きいの酵素活性損失を示した。試料Ｉは、非常に低いプロテアーゼ活性、それと同時に、非常に小さい酵素活性損失を示した。しかしながら、当該酵素活性の損失は、非冷蔵貯蔵のためにはなおも大きすぎるものである。このことは、また、Ｔ４エンドＶ酵素試料の非一貫性の原因を示唆するものでもある。隣接領域におけるプロテアーゼ活性が高いので、プロテアーゼ活性の総量は、中心の溶出ピークの両側において捕集された量に依存する。従って、非常に類似した調合物であっても、捕集された溶出液に含まれている隣接領域の量における極わずかな変化によって異なる安定性を有する場合が生じ得ることになる。
【実施例４】
【００７２】
当該実施例は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を用いて、Ｔ４エンドＶ調合物におけるプロテアーゼ活性を阻害した場合について例証するものである。高い及び低いプロテアーゼ活性を有する２つの試料を選択した（図４）。プロテアーゼ活性についての７日間培養アッセイ（実施例２参照）において、試料Ｃは、２５℃でＣ１ペプチドの２８％しか分解しなかったのに対し、試料Ｉは当該ペプチドの１００％が分解された。試料Ｃでは、０．１％乃至１．５％（ｗ／ｖ）のＥＤＴＡの添加によって、プロテアーゼ活性が著しく減少した。一方、試料Ｉでは、０．１％乃至１．５％のＥＤＴＡの添加によって、Ｃ１ペプチドの開裂が約５０％減少したのみであった。Ａ１ペプチドは、当該プロテアーゼ及びＴ４エンドＶ溶液のプロテアーゼによる分解を実質的に示さないので、当該挙動も示さなかった。
【実施例５】
【００７３】
当該実施例は、アニオン交換クロマトグラフィーを用いて、酵素の精製の間にプロテアーゼを除去する場合について例証するものである。高速Ｑ−セファロース（ＢＩＯＲＡＤ、ＣＡ州Ｒｉｃｈｍｏｎｄ）を１リットルの液体クロマトグラフィー用円筒型カラムに充填し、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．８）で平衡化した。Ｔ４エンドヌクレアーゼＶを含む細胞溶解液２００ｍｌを２つに分け、それぞれをＦＦＱＳカラム通した。溶出液を捕集した。次の使用の前には、塩及び１ＭのＮａＯＨを用いてカラムを洗浄した。
【００７４】
図５は、当該処理によって、２４時間のプロテアーゼアッセイにおけるプロテアーゼ活性が大きく減少したことを示している。溶解液は、ろ過（ＦＦＱＳ−Ｐｒｅ−０．２μｍのろ過）の前、及びカラムに装入（ＦＦＱＳ−Ｌｏａｄ）直前のろ過後のいずれにおいてもプロテアーゼ活性を有していた。しかしながら、酵素活性を含む流出フラクションは、プロテアーゼ活性の大きな減少を示した（すなわち、プロテアーゼは、ＦＦＱＳに結合したままであった）。これは、Ａ１及びＣ１ペプチドのいずれの場合にも観測された。溶解液の不純状態及びタンパク質の高い濃度によって、当該レポーターペプチドは、プロテアーゼ活性を検出することができた。同様の理由で、２４時間の培養はプロテアーゼ活性を示した。
【実施例６】
【００７５】
当該実施例は、Ｑ−セファロースによりプロテアーゼを除去する工程、及びＥＤＴＡを用いて残存プロテアーゼを阻害する工程を組合せることによって、実質的にプロテアーゼ活性を有しない純粋な酵素調合物が得られることを例証するものである。
【００７６】
米国特許５，０７７，２１１号に記載の方法、それに加え更なる２つの工程、すなわち、セル溶解の後のＱ−セファロース処理工程、及びその後の精製工程における３．４ｍＭのＥＤＴＡ添加を用いてＴ４エンドヌクレアーゼＶを調製した。
【００７７】
基本的な精製工程における１本鎖ＤＮＡカラムから溶出した２つのプールを捕集した。それぞれについて、２５℃又は３７℃で７日間、プロテアーゼ活性をアッセイした（図６）。比較用の標準試料ＩはＣ１基質の分解を示した。一方、ＥＤＴＡ及びＱ−セファロース処理を含む本発明の方法から得られたＴ４エンドヌクレアーゼの２つのバッチは、ペプチドの分解をほとんど示さなかった。
【実施例７】
【００７８】
実施例６の手法を用いてＴ４エンドＶの試料（試料Ｋ）を調製した。その後、最終生成物について、冷蔵条件（４℃）における安定性に対する室温（２５℃）における安定性を検証した。統計分析によると、７日間の貯蔵の後においても、タンパク質の比活性に違いは見られなかった（図７参照）。
【００７９】
同様の方法により別のＴ４エンドＶ試料（試料Ｌ）を調製し、プロテアーゼの除去／阻害を行うことなく調整したＴ４エンドＶ（図２の試料Ｇ）と最終生成物とを比較した。当該酵素を２５℃に保ち、表１に示す時間でアッセイした。各時間における活性を、初期の活性と比較した。１週間培養した後のプロテアーゼを含む調合物（すなわち、図２の試料Ｇ）では、Ｔ４エンドＶ活性は検出されなかった。プロテアーゼを減少させた調合物では、１週間後、Ｔ４エンド活性が減少し（ただし、観測可能なものであった）、以降の３週間の間に活性はそれ以上失わなかった。
【００８０】
Ｑ−セファロースのカラムに抽出液を通し、精製工程において３．４ｍＭのＥＤＴＡを取り込んだ実施例６に記載の手順を用いて、Ｔ４エンドＶ試料（試料Ｍ）を調製した。Ｔ４エンドＶの試料Ｈ及びＩは、Ｑ−セファロースもＥＤＴＡも用いずに調製したものである。Ｔ４エンドＶの市販品は、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（ＷＩ州Ｍａｄｉｓｏｎ）から入手したものである。その後、Ｃ１ペプチド基質と共に２５℃及び３７℃で２日間の培養の間に、これらの試料のプロテアーゼ活性を検証した（図８参照）。ＥＰＩＣＥＮＴＲＥから入手したＴ４エンドＶが低濃度であったため、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ調合物についてのアッセイにおける酵素濃度は、本発明の好ましいプロテアーゼアッセイについて上述した濃度の約１０分の１であった。３７℃で試験を行った場合、ＥＤＴＡ及びＱ−セファロースを用いて調製したＴ４エンドの試料Ｍは、検出可能なプロテアーゼを含有していなかった。一方、同様の条件下において、ＥＤＴＡ及びＱ−セファロースを用いずに調製したＴ４エンドＶの試料Ｈ及びＩは、低いが、しかし明確に検出可能なプロテアーゼ活性を有していた。さらに、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥから市販されているＴ４エンドＶのバッチは、非常に高いプロテアーゼ活性を有していた。２５℃で２日間培養して試験した場合には、プロテアーゼ活性は検出できなかった。
【００８１】
本明細書では、本発明の好ましい実施態様及びその他の実施態様について説明してきたが、当該技術分野における当業者には、本願特許請求の範囲で定められる本発明の範囲から逸脱することなく更なる実施態様も理解できるであろう。
【００８２】
【表１】
2005503806.tif 000002
【００８３】
【化１】
2005503806.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】図１は、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶの初期活性と減衰速度の関係を示すものである。
【図２】図２は、精製したＴ４エンドヌクレアーゼＶの試料におけるプロテアーゼ活性のアッセイの結果を示すものである。
【図３】図３は、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶの安定性に対するプロテアーゼ活性の関係を示すものである。
【図４】図４は、ＥＤＴＡによるプロテアーゼ活性の部分的阻害を示すものである。
【図５】図５は、高速Ｑ−セファロース（ＦＦＱＳ）によるプロテアーゼ活性の部分的除去を示すものである。
【図６】図６は、ＥＤＴＡを含み、かつＦＦＱＳを通したＴ４エンドヌクレアーゼＶ試料におけるプロテアーゼ活性の除去を示すものである。
【図７】図７は、プロテアーゼ除去後の２５における安定性を示すものである。
【図８】図８は、３．４ｍＭのＥＤＴＡを取り込み、Ｑ−セファロースのカラムを通して調製したＴ４エンドＶ（試料Ｍ）が、ＥＤＴＡやＱ−セファロース処理のされていないバッチ（試料Ｈ及び試料Ｉ）及びＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）から市販されているＴ４エンドＶのバッチよりも大幅に少ないプロテアーゼを含有することを示すものである。
【図１】
2005503806.tif 000004
【図２】
2005503806.tif 000005
【図３】
2005503806.tif 000006
【図４】
2005503806.tif 000007
【図５】
2005503806.tif 000008
【図６】
2005503806.tif 000009
【図７】
2005503806.tif 000010
【図８】
2005503806.tif 000011
【国際公開パンフレット】
2005503806.tif 000012
2005503806.tif 000013
2005503806.tif 000014
2005503806.tif 000015
2005503806.tif 000016
2005503806.tif 000017
2005503806.tif 000018
2005503806.tif 000019
2005503806.tif 000020
2005503806.tif 000021
2005503806.tif 000022
2005503806.tif 000023
2005503806.tif 000024
2005503806.tif 000025
2005503806.tif 000026
2005503806.tif 000027
2005503806.tif 000028
2005503806.tif 000029
2005503806.tif 000030
2005503806.tif 000031
2005503806.tif 000032
2005503806.tif 000033
2005503806.tif 000034
2005503806.tif 000035
2005503806.tif 000036
2005503806.tif 000037
2005503806.tif 000038
2005503806.tif 000039
2005503806.tif 000040
2005503806.tif 000041
2005503806.tif 000042
2005503806.tif 000043
2005503806.tif 000044
2005503806.tif 000045
2005503806.tif 000046
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005503806.tif 000047
【国際調査報告】
2005503806.tif 000048
2005503806.tif 000049