(57)【要約】【解決すべき課題】ＣＡＳＴ遺伝子における多型により特徴付けられ、動物の肉質及び／又は成長の標識として使用できる新規な対立遺伝子を発見すること。【解決手段】本発明は、ＣＡＳＴ遺伝子における多型により特徴付けられる、新規な対立遺伝子を開示する。これらの対立遺伝子は、動物の遺伝子型を決定するのに使用できる。好ましい実施態様では、これらの対立遺伝子は、動物の肉質及び／又は成長の標識として使用できる。このような標識を同定する方法、及び所望の肉質及び／又は成長をより生じやすい動物を決定するために動物をスクリーニングし、好ましくはこれらの動物をさらに育種目的で選択する方法も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２のアミノ酸６６に、アスパラギン又はＢＬＡＳＴにより決定された場合のその等価物を有する、ＣＡＳＴ骨格筋タンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、次のもの
（ａ）配列番号：３、
（ｂ）高ストリンジェンシー条件下で、配列番号：３とハイブリッド形成する配列、又は、
（ｃ）配列番号：３と少なくとも約８０％の相同性を有する配列、
を一つ以上含むヌクレオチド配列。
【請求項２】
配列番号：２のアミノ酸２４９に、リジン又はＢＬＡＳＴにより決定された場合のその等価物を有する、ＣＡＳＴ骨格筋タンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、次のもの
（ａ）配列番号：５、
（ｂ）高ストリンジェンシー条件下で、配列番号：５とハイブリッド形成する配列、又は、
（ｃ）配列番号：５と少なくとも約８０％の相同性を有する配列、
を一つ含むヌクレオチド配列。
【請求項３】
配列番号：２のアミノ酸５０４に、トレオニン又はＢＬＡＳＴにより決定された場合のその等価物を有する、ＣＡＳＴ骨格筋配列をコードするヌクレオチド配列であって、次のもの
（ａ）配列番号：７、
（ｂ）高ストリンジェンシー条件下で、配列番号：７とハイブリッド形成する配列、又は、
（ｃ）配列番号：７と少なくとも約８０％の相同性を有する配列、
を一つ含むヌクレオチド配列。
【請求項４】
配列番号：２のアミノ酸６３８に、セリン又はＢＬＡＳＴにより決定された場合のその等価物を有する、ＣＡＳＴ骨格筋タンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、次のもの
（ａ）配列番号：９、
（ｂ）高ストリンジェンシー条件下で、配列番号：９とハイブリッド形成する配列、又は、
（ｃ）配列番号：９と少なくとも約８０％の相同性を有する配列、
を一つ含むヌクレオチド配列。
【請求項５】
ＣＡＳＴタンパク質を発現時にコードするヌクレオチド配列であって、該ＣＡＳＴタンパク質が、アミノ酸位置番号２４９のリジン、アミノ酸位置番号５０４のトレオニン、アミノ酸位置６３８のセリン、アミノ酸位置番号６６のアスパラギン、又は配列番号：４，６，８，若しくは１０のＢＬＡＳＴ比較により決定された場合のそれらの等価物の一つ以上により特徴付けられるものであるヌクレオチド配列。
【請求項６】
請求項５に記載のＣＡＳＴタンパク質。
【請求項７】
ＣＡＳＴ骨格筋タンパク質であって、次のもの
（ａ）配列番号：４、
（ｂ）同類置換により改変された配列番号：４の変異体、又は、
（ｃ）配列番号：４と少なくとも約８０％の相同性を有する配列、
を一つ含むアミノ酸配列を含むタンパク質。
【請求項８】
ＣＡＳＴ骨格タンパク質であって、次のもの
（ａ）配列番号：６、
（ｂ）同類置換により改変された配列番号：６の変異体、又は、
（ｃ）配列番号：６と少なくとも約８０％の相同性を有する配列、
を一つ含むアミノ酸配列を含むタンパク質。
【請求項９】
ＣＡＳＴ骨格タンパク質であって、次のもの
（ａ）配列番号：８、
（ｂ）同類置換により改変された配列番号：８の変異体、又は、
（ｃ）配列番号：８と少なくとも約８０％の相同性を有する配列、
を一つ含むアミノ酸配列を含むタンパク質。
【請求項１０】
ＣＡＳＴ骨格タンパク質であって、次のもの
（ａ）配列番号：１０、
（ｂ）同類置換により改変された配列番号：１０の変異体、又は、
（ｃ）配列番号：１０と少なくとも約８０％の相同性を有する配列、
を一つ含むアミノ酸配列を含むタンパク質。
【請求項１１】
動物の遺伝子型を決定する方法であって、
該動物から遺伝子物質の試料を採取する工程、
該試料中に存在するＣＡＳＴ遺伝子中に、多型により特徴付けられる対立遺伝子の存在を検定する工程、及び、
該対立遺伝子を該動物と相関させる工程
を含む方法。
【請求項１２】
該多型が、ＣＡＳＴ遺伝子産物のアミノ酸番号２４９におけるアルギニンからリジンへのアミノ酸変化、又は配列番号：２のＢＬＡＳＴ比較により決定された場合その等価物への変化を生じるものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
該多型が、ヌクレオチド位置８１２におけるアデニンからグアニンへの変化、又はその等価物への変化である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
該遺伝子型が、Ｈｐｙ１８８Ｉ多型である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
該多型が、ＣＡＳＴ遺伝子産物のアミノ酸番号５０４におけるアラニンからスレオニンへのアミノ酸変化、又は配列番号：２のＢＬＡＳＴ比較により決定された場合その等価物への変化を生ずるものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
該多型が、ヌクレオチド位置１９８０におけるアデニンからシトシンへの変化、又はその等価物への変化である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
該遺伝子型がＰｖｕII多型である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
該多型が、ＣＡＳＴ遺伝子のアミノ酸番号６３８におけるアルギニンからセリンへのアミノ酸変化、又は、配列番号：２のＢＬＡＳＴ比較により決定された場合その等価物への変化を生ずるものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
該多型が、ヌクレオチド位置１５７６におけるアデニンからグアニンへの変化、又はその等価物への変化である、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
該遺伝子がＡｃｉＩ多型である、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
該多型が、ＣＡＳＴ遺伝子のアミノ酸番号６６におけるセリンからアスパラギンへのアミノ酸変化、又は配列番号：２のＢＬＡＳＴ比較により決定された場合その等価物への変化を生ずるものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項２２】
該多型が、ヌクレオチド位置２６３におけるアデニンからグアニンへの変化又はその等価物への変化である、請求項１１に記載の方法。
【請求項２３】
該遺伝子型がＡｐａＬＩ多型である、請求項１１に記載の方法。
【請求項２４】
検定法の該工程が、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）分析、ミニ配列決定、ＭＡＬＤ−ＴＯＦ、ＳＩＮＥ、ヘテロ二本鎖分析、一塩基伸長法（one base extension methods）、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）、及び温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）から成る群より選択されるものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項２５】
該動物がブタである、請求項１１に記載の方法。
【請求項２６】
該動物がウシである、請求項１１に記載の方法。
【請求項２７】
該多型を含むＣＡＳＴ遺伝子又はその一部の量を増幅する工程をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２８】
該増幅が、Ｈｐｙ１８８Ｉ多型部位を含むＣＡＳＴ遺伝子の領域を増幅できる前向き及び逆向き配列プライマーを選択する工程を含むものである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
該前向き及び逆向きプライマーが、プライマー配列番号：１１及びプライマー配列番号：１２から選択され、これらに基づくものである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
該増幅が、ＰｖｕII多型部位を含むＣＡＳＴ遺伝子の領域を増幅できる前向き及び逆向き配列プライマーを選択する工程を含むものである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
該前向き及び逆向きプライマーが、プライマー配列番号：１３及びプライマー配列番号：１４から選択され、これらに基づくものである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
該増幅が、ＡｃｉＩ多型部位を含むＣＡＳＴ遺伝子の領域を増幅できる前向き及び逆向き配列プライマーを選択する工程を含むものである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
該前向き及び逆向きプライマーが、プライマー配列番号：１５及びプライマー配列番号：１６から選択され、これらに基づくものである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
該増幅が、ＡｐａＬＩ多型部位を含むＣＡＳＴ遺伝子の領域を増幅できる前向き及び逆向き配列プライマーを選択する工程を含むものである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
該前向き及び逆向きプライマーが、プライマー配列番号：１７及びプライマー配列番号：１８から選択され、これらに基づくものである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
肉質及び／又は成長の形質の改良を示す可能性がより高い動物を決定するため動物をスクリーニングする方法であって、該動物から物質の生体試料を採取する工程、該動物に、肉質及び／又は成長の形質の改良と関連する遺伝子型が存在することを検定する工程を含む方法であり、該遺伝子型が、
ａ）ＣＡＳＴ遺伝子における多型であって、該多型が、位置２４９のリジン、位置５０４のスレオニン、位置６３８のセリン、又は位置６６のアスパラギン、又は配列番号：２のＢＬＡＳＴ比較により決定された場合のそれらの等価物から成る群より選択される「位置におけるアミノ酸」により特徴付けられる多型、
によって特徴付けられるものである方法。
【請求項３７】
該多型が、位置８１２のグアニン、位置１９８０のシトシン、位置１５７６のグアニン、位置２６３のグアニン、又は配列番号：１のＢＬＡＳＴ比較により決定された場合のそれらの等価物を生じ且つそれらによって特徴付けられるものである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
肉質及び／又は成長の形質の好ましい組み合わせを有する動物を決定するために動物をスクリーニングする方法であって、動物に存在するＣＡＳＴの対立遺伝子を決定する工程、肉質及び／又は成長に影響することが知られた遺伝子の他の標識の対立遺伝子を決定する工程、及び、対立遺伝子の好ましい組み合わせを持つ動物を選択し、好ましくない組み合わせを持つ動物を排除する工程を含む方法であり、該対立遺伝子が、ＣＡＳＴ遺伝子中に、次のＨｐｙ１８８Ｉ、ＰｖｕII、ＡｃｉＩ、又はＡｐａＬＩ多型部位を一つ以上含む対立遺伝子を含むものである方法。
【請求項３９】
ＣＡＳＴ対立遺伝子の決定が、直接的か間接的かのいずれかでＣＡＳＴに結びついた少なくとも一つのＤＮＡ標識と関連する少なくとも一つの対立遺伝子の存在を決定する工程を含むものである、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
該ＤＮＡ標識がミクロサテライトである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
所望の肉質及び／又は成長を生ずる可能性のより高い動物を決定するために動物をスクリーニングする方法であって、
該動物から遺伝物質の試料を採取する工程、及び
肉質及び／又は成長の改良と関連する該動物の遺伝子型の存在について検定する工程
を含む方法であり、該遺伝子型が、次のもの
ａ）エキソン１３ドメイン１、エキソン２７ドメイン４、エキソン２２ドメイン３、又はエキソン６ドメインＬの領域の一つに位置する、ＣＡＳＴ遺伝子における多型、
により特徴付けられるものである方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して動物の間の遺伝的相違の検出に関する。より具体的には、本発明は動物における成長、肉質、及びその他のかかる経済的な形質の改良と結び付いた遺伝的な表現型を示す遺伝標識に関する。動物の遺伝子型分類及び選択におけるこれらの標識を用いるための方法及び組成物も、新規な配列に加えて開示する。
【０００２】
関連出願への相互参照
本出願は、２００２年１月９日に出願された仮出願第６０／３４７，２０９号の合衆国法典３５セクション１１９（ｅ）に基づく利益を主張する。
【０００３】
研究助成金関連
本発明は、少なくとも部分的にはＵＳＤＡ／ＣＲＥＳＳ契約番号２００１−３１２００−０６０１９（ＩＡＨＡＥＥＳプロジェクト番号ＩＯＷ０３６００）による援助を受けた。合衆国政府は本発明の一定の権利を所有することができる。
【背景技術】
【０００４】
遺伝的相違は、個々の動物間、並びに所望の特性を持つ動物を得るための育種技術によって開拓することができる品種間で存在する。例えば、チャイニーズ・ブリードは若年で思春期に達すること、及びその一腹仔数が多いことで知られ、アメリカン・ブリードはその成長速度が大きいことと脂肪の少なさで知られる。しかしながら、所望の形質を遺伝する可能性は少ないことが多く、表現型の変化に基づいて個体を選択する標準的な育種方法は、遺伝子の変わり易さ又は複雑な遺伝子相互作用が存在することを十分に考慮に入れたものではない。
【０００５】
いくつかのグループでは、ブタのＤＮＡの研究に制限断片長多型（ＲＦＬＰ）分析が用いられた。参照により本明細書にインコーポレートされるユングら（非特許文献１）は、ブタの二つの品種間の遺伝子の変わり易さを示すためにＲＦＬＰ技術を使用することを開示している。これらの品種では、ブタ白血球抗原（ＳＬＡ）Ｉ型遺伝子に対する多型が実証された。参照により本明細書にインコーポレートされるホーガンサンら（非特許文献２）は、中国産ブタに対するブタ主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）遺伝子の多型について報告しており、ＲＦＬＰ分析による実証も行った。参照により本明細書にインコーポレートされるユングら（非特許文献１）は、ある種の雄ブタにおけるＳＬＡＩ型遺伝子のＲＦＬＰ分析について報告している。この著者らは、この結果がブタＳＬＡ／ＭＨＣＩ型遺伝子と生産形質及び性能形質の間に関連性がありうることを示唆するものであると述べている。彼らはさらに、遺伝標識としてＳＬＡＩ型制限断片を使用することは将来的にはブタの成長能力を改良する可能性があるとも述べている。
【０００６】
特定の有利な遺伝的対立遺伝子を追跡する能力には、主要な効果を持つ遺伝子のためのＤＮＡ分子標識を同定するという新規で長期間を要する工程が含まれる。この標識は主要な効果を持つ一つの遺伝子に連結していたり、付加的な効果を持つ幾つかの遺伝子に連結していたりする。ＤＮＡ標識には次のようないくつかの利点がある。セグリゲーションが測定容易であり曖昧でないこと、そしてＤＮＡ標識が共優性であること、即ち、ヘテロ接合性動物及びホモ接合性動物が区別して同定できることである。一度標識系が確立されると、個々の幼児動物から又は胚からさえも組織試料もしくは血液試料を採取し得た後には、何時でもＤＮＡ標識を検定できるので、選択決定が極めて容易に成され得るであろう。
【０００７】
受容体遺伝子における遺伝的相違の使用は、選択のための貴重な標識系となってきた。例えば、ロスチャイルドらに付与された米国特許第５，５５０，０２４及び５，３７４，５２６は、より大きな一腹仔数と関連するブタのエストロゲン受容体遺伝子における多型を開示している。この開示は、参照により本明細書にインコーポレートされる。米国特許第５，９３５，７８４号は、より大きな一腹仔数及び全体的な生殖効率と関連するブタのプロラクチン受容体遺伝子における多型性標識を開示している。
【０００８】
生のブタ肉の品質は、多数の遺伝的要因及び非遺伝的要因の影響を受ける。後者には、農場、輸送、屠殺及び加工処理の諸条件が含まれる。肉科学者らはこれらの要因について相当量の研究を行い、相当な品質改良をもたらした。これらの研究の一部は動物の遺伝的背景にも費やされ、いくつかの研究は遺伝的要因の重要性を明らかにした。このことにより、産業界は動物の選択育種及び遺伝子技術の利用がブタ肉の品質の向上に重要な役割を果たし得ることを認識するようになった。
【０００９】
ＤＮＡレベルでの情報は、特定の主要遺伝子を固定する助けとなり得るが、それはわれわれが既に選択している定量的形質の選択の助けにもなり得る。表現型のデータに加えて分子情報は選択の精度を高めることができ、従って選択応答を高めることができる。このような標識依存選択（ＭＡＳ）プログラムにおける過剰応答の大きさは、理論的な観点から多数の研究者らにより考察されてきた。一般的に言えば、ＭＡＳは遺伝性の低い形質及び表現型を測定するのに費用がかかる形質についてはより有用である。肉質及び／又は成長などの形質は、通常はこの方法では考慮されないが、それでもこれらの形質に標識を用いることには明らかな利点がある。例えば、ミューウィッセンとゴダードは、異なる種類の形質に対するＭＡＳの影響を考察した。形質を屠殺後に測定した場合、肉質などの形質について影響が最大となった。標識情報を組み込むことにより６４％までの付加的応答が得られるであろう。この数字は、生きた動物で測定できる成長形質については比較的小さく、８％であった。しかしながら、一度この関連性を実証すれば、動物を表現型的にテスト又は選択する（以下参照）前にこの標識情報を使用することができ、この状況では３８％までの応答が予測された。
【００１０】
実際、経済的形質を遺伝的に改良するための最良の取り組みは、選択を受ける集団内で関連するＤＮＡ標識を直接見つけ出すことである。表現系の測定は、育種機関の核集団から得られる一部の動物について継続的に実施することができる。このような形質は大抵、屠殺後にしか完全に評価できないため、選び集められた動物からデータを集めなければならず、潜在的な育種動物についてのデータを得ることができない。
【００１１】
この表現型のデータは、関連するＤＮＡ標識の検出を可能にするため、及び実験集団を用いて同定された標識の正当性を検証するため、又は候補の遺伝子を試験するために集められる。次いで重要な標識又は遺伝子を選択工程に直接含めることができる。分子情報の利点は、育種動物が極めて若い段階で既にその情報を得ることができるということであり、これは成長能力試験が完了する前に動物をＤＮＡ標識に基づいてあらかじめ選択できることを意味する。これは、試験及び選択システム全体にとって大きな利点である。
【非特許文献１】ユングら，Theor. Appl. Genet.,77: 271-274, 1989。
【非特許文献２】ホーガンサンら，Abstract for Annual Meeting of Midwestern Section of the American Society of Animal Science, 1990年3月26日〜28日。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
前述のことから、遺伝子レベルで改良された特性を有する動物を同定し選択することにより動物の経済的に利益をもたらす特性を改良するために用いることができる標識を同定する必要があることが理解できる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の一つの目的は、肉質及び／又は成長などの好ましい経済的特性を示すカルパスタチン（ＣＡＳＴ）遺伝子に基づく遺伝標識、又は該カルパスタチン内の遺伝標識を提供することである。
【００１４】
本発明の別の一目的は、これらの遺伝標識の存在を決定するための検定法を提供することである。
【００１５】
本発明のさらなる一目的は、所望の形質の選択法及び育種法の精度を高める動物評価法を提供することである。
【００１６】
本発明のまた別の一目的は、標識の存在の決定を大きく促進させるＰＣＲ増幅試験を提供することである。
【００１７】
本発明のさらなる目的及び利点は、以下の明細書に部分的に記載され、該明細書から部分的には明らかとなり、又は本発明の実施によって会得されるであろう。本発明の目的及び利点は、付属の特許請求の範囲で具体的に指摘される手段及び組み合わせにより達成されるであろう。
【００１８】
発明の概要
本発明は、動物を遺伝的に分類するのに有用なカルパスタチン遺伝子即ちＣＡＳＴ遺伝子の代わりの遺伝子型の発見に関する。これらの遺伝子型は育種において系統を追跡するのに用いても良く、また好ましい実施態様では、この新規な遺伝子型は選択されたり排除されたりする表現型の相違と結び付いた遺伝標識として用いても良い。さらに一層好ましい実施態様では、表現型の相違は肉質と成長の形質である。この遺伝子が種の間でそして動物の間で保存される程度において、本明細書で開示されるこれらの異なる対立遺伝子は、ウシ、ヒツジ、ニワトリなどの他の経済的動物又は食肉生産動物におけるこの遺伝子の変わり易さと相関することも予測される。
【００１９】
本明細書に具体的に示し広く述べたように、本発明の目的を達成するため、及び本発明の目的に従って、本発明は遺伝子的に動物を分類する方法、好ましくは有利な肉質及び／又は成長の形質をもつ可能性がより高い動物を決定するため、又は好ましくない成長の形質及び／又は肉質形質を示す対立遺伝子を有するブタを選択的に排除するために動物をスクリーニングする方法を提供する、もう一つの遺伝子型の発見を提供する。本明細書で用いるとき、「有利な成長若しくは肉質の形質」とは、多数の測定可能な肉質又は成長の形質の一つで所与集団の平均に優る有意の改良（増加又は減少）を意味し、従ってこの情報は、肉質及び／又は成長について最適化された均一集団を得るために育種で使用することができ、この情報には所望の特性に応じて一部の形質の増加又は他の形質の減少が含まれることがある。肉質について考慮され得るこれらの要因には、次のものが含まれるがこれらに限定されない。
ロイン・ミノルタ・ライトネス（Ｌ*）：４３〜４７単位（暗い色から明るい色へ）の範囲が許容可能であるが、４３のＬ*がより良い。即ち、より経済性が高く、通常この範囲にある（これは市場に依存して良い。例えば日本では黒いブタの方が好ましい）。
ロイン・ジャパニーズ・カラー・スコア（ＪＣＳ）：２．５〜５．０単位（明るい色から暗い色へ）の範囲が許容可能であるが、３〜４のＪＣＳがより良い。
ロイン・霜降り（筋肉内脂肪のレベル）：一般に、霜降りの程度が高い方が良い。霜降りは肉を食する際の品質特性の改良と関連するためである。
ロインｐＨ（死後２４時間で測定した肉の絶対酸性度。この特性はブタ肉の品質の単一の最も重要な形質である）：５．５０〜５−８０が望ましいが、肉の色及び（低い）清浄にプラスに影響するので、５．８０がより良い。
ハム・ミノルタ・ライトネス（Ｌ*）：４３〜５２単位の範囲が許容可能であるが、低い（４３）方がより良い。
ハムｐＨ：高い方、即ち５．８０がより良い。
肉汁損失又は清浄：１％〜３％の範囲が許容可能であるが、低い方がより良い。
【００２０】
肉質のこれらの尺度は、当業者らに一般に受け入れられているものの例である。肉質の形質を概観するには、次の文献を参考にできる。ソスニキ，Ａ．Ａ．，Ｅ．Ｒ．ウィルソン，Ｅ．Ｂ．シャイス，Ａ．デフリース，1998「高品質のブタ肉を生産するための費用効率の高い方法はあるか」，Reciprocal Meat Conference Proceedings, Vol. 51。
【００２１】
成長は、平均毎日増加、屠殺時体重などのいくつかの標準的な手段のいずれかで測定できる。
【００２２】
こうして、本発明は有利な肉質及び／又は成長を実現する可能性がより高いブタ、及び／又は有利な肉質及び／又は成長を実現する可能性がより低いブタを同定するためにブタをスクリーニングして、最良の肉質及び／又は成長のために育種技術及び選択技術を最適化する方法を提供する。
【００２３】
これらの形質を検定する方法は、一般に、１）ブタから生体試料を得る工程、及び２）（工程１）で得られたゲノムＤＮＡ又はタンパク質を分析してどのＣＡＳＴ対立遺伝子（単数又は複数）が存在するのかを決定する工程を含む。この方法には、これらの標識のそれぞれの利点を最大限に発揮させるべく、ＣＡＳＴ遺伝子における一連の多型を選択もしくは同定計画に組み合わせることを可能にするハプロタイプのデータが含まれる。
【００２４】
該多型のいくつかは、ＣＡＳＴタンパク質のアミノ酸組成における変化を含むので、検定法はこのＣＡＳＴタンパク質のアミノ酸組成を確認する工程をも含む。この種の方法又は精製及び分析の方法には、通常、蛍光標識抗体を含む手段によるタンパク質の単離、タンパク質の分離及び精製（即ち、逆相ＨＰＬＣシステムによるもの）、及び存在するアミノ酸配列を同定するための自動化タンパク質シーケンサの使用が含まれる。この検定のための実験計画は標準的なものであり、当分野で知られており、アウスベルら（編），「分子生物学における簡単なプロトコル」４版、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ，1999に開示されている。
【００２５】
好ましい実施態様では、遺伝子試料を分析する。端的に述べると、遺伝物質の試料は動物から採取し、その試料を分析して、その遺伝子型に応じて改良された肉質及び／又は成長の形質又はその両方の形質と相関するＣＡＳＴ遺伝子における多型の存在又は非存在を決定する。
【００２６】
当業者らには良く知られているように、配列の相違について核酸分子を比較する場合には様々な技術を用いることができる。これらの技術には、例を挙げれば、制限断片長多型分析、ヘテロ二本鎖分析、一本鎖高次構造多型分析、変性勾配電気泳動、及び温度勾配電気泳動が含まれる。
【００２７】
好ましい実施態様では、この多型は制限断片長多型であり、この検定法は、単離された遺伝子物質からＣＡＳＴ遺伝子を同定する工程、その遺伝子を制限酵素と接触させて該遺伝子を種々の長さの制限断片とする工程、該制限断片を電気泳動若しくはＨＰＬＣ分離などにより分離して制限パターンを形成する工程、及び所望の標識を持つこと又は所望の標識を持たないことが知られているＣＡＳＴ遺伝子に由来するその結果得られる制限断片パターンを比較する工程を含む。もし動物がこの標識に対して陽性反応を示せば、この動物を繁殖計画に含めることを検討できる。もしこの動物が該標識遺伝子型について陽性反応を示さなければ、この動物をグループから排除し別のことに使用することができる。ハプロタイプデータの使用も、肉質及び／又は成長の異なる側面に対する複数の対立遺伝子のスクリーニングに組み込むことができる。
【００２８】
最も好ましい実施態様では、該遺伝子は、多型を含むこの遺伝子の特定の領域を増幅するためプライマーとＤＮＡポリメラーゼを用いてこれを単離する。次に、増幅した領域を制限酵素で消化し、断片を再び分離する。ＲＦＬＰパターンは、その断片を単純に染色するか又は増幅に用いるプライマー若しくはヌクレオシド三リン酸を標識化することにより、可視化する。
【００２９】
別の実施態様では、本発明は、ある特定の集団における、肉質及び／又は成長に対する遺伝標識を同定する方法を含む。同一の血統又は交雑種又は遺伝的に類似する血統の動物の雄と雌を交配させ、各々のブタの肉質及び／又は成長を測定する。各ブタのＣＡＳＴ遺伝子における多型を同定し、肉質及び／又は成長と関連付ける。多型の測定にはＲＦＬＰ分析を用いるのが好ましい。
【００３０】
別の実施態様では、本発明はブタ以外の任意の特定の経済的な動物において肉質及び／又は成長に対する遺伝標識を同定する方法を含む。異なる動物間でこの遺伝子が高度に保存されるという性質に基づき、及びこれらの高度に保存される領域内の多型の位置に基づき、本明細書で述べるような型どおりの試験だけで、この標識を異なる動物種に適用して、本明細書の教示に基づき、肉質及び／又は成長について選択することができると予測される。同一の血統又は交雑種又は遺伝的に類似する血統の動物の雄と雌を交配させ、個々の動物の肉質及び／又は成長を測定し、相互に関連付ける。配列が入手可能な他の動物については、配列のＢＬＡＳＴ比較を用いて、特定の対立遺伝子が本明細書で開示するものと類似するか否かを確認することができる。この類似の多型は、他の動物及び他の近縁の遺伝子中に存在するものである。用語「類似の多型」とは、ＢＬＡＳＴ比較により決定するとき、本明細書で開示されたもののいずれかと同じ多型であるものとする。
【００３１】
次の用語は、二つ以上の核酸若しくはポリヌクレオチドの間の配列関係を記述するのに用いられる。即ち、（ａ）「参照配列」、（ｂ）「比較窓」、（ｃ）「配列同一性」、（ｄ）「配列同一性のパーセンテージ」、及び（ｅ）「実質的同一性」である。
【００３２】
（ａ）本明細書で用いるとき、「参照配列」とは、配列比較の基準として用いられる規定された配列である。本発明では参照ＣＡＳＴ配列である。参照配列は、特定された配列の部分集合であってもその全体であっても良い。例えば、全長のｃＤＮＡ配列若しくは遺伝子配列のセグメント、又は完全なｃＤＮＡ配列若しくは遺伝子配列である。
【００３３】
（ｂ）本明細書で用いるとき、「比較窓」にはポリヌクレオチド配列の特定された連続するセグメントへの言及が含まれる。ここでポリヌクレオチド配列は参照配列と比較される場合があり、比較窓内のポリヌクレオチド配列の部分は、この二つの配列の最適整列に対する参照配列（付加や欠失を含まない）と比較されると、付加又は欠失（即ちギャップ）を含むことがある。一般に、比較窓は少なくとも２０の連続したヌクレオチド長であり、任意選択的に３０、４０、５０、１００、又はそれ以上の長さになることが可能である。ポリヌクレオチド配列にギャップを含めることによる参照配列への類似性が高くなるのを避けるために、通常はギャップペナルティを導入して適合の数から差し引くことは、当業者らに理解されている。
【００３４】
比較のために配列を整列する方法は、当分野では良く知られている。比較のための配列の最適整列化は、スミスとウォーターマン，Adv. Appl. Math. 2:482（1981）の局所的ホモロジー・アルゴリズムにより、ニードルマンとヴンシュ，J. Mol. Biol. 48: 443（1970）のホモロジー整列アルゴリズムにより、ピアソンとリップマン，Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 2444（1988）の類似調査法により、これらのアルゴリズムをコンピュータで実行することにより、行うことができる。これらのコンピュータ化されたアルゴリズムには、次のものが含まれるが、これらに限定されない。インテリジェネティクス（マウンテンビュー，カリフォルニア州）によるＰＣ／Ｇｅｎｅプログラムに含まれるＣＬＵＳＴＡＬ、ジェネティクス・コンピュータ・グループ（ＧＣＣ）（５７５サイエンスＤｒ．，マディソン，ウィスコンシン州，米国）のウィスコンシン・ジェネティクス・ソフトウェア・パッケージに含まれるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡである。ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、ヒギンズとシャープ，Gene 73: 237-244（1988）、ヒギンズとシャープ，CABIOS 5: 151-153（1989）、コルペら，Nucleic Acids Research 16: 10881-90（1988）、フアンら，Computer Applications in the Biosciences 8: 155-65（1992）、及びピアソンら，Methods in Molecular Biology 24: 307-331（1994）により、十分に記述されている。データベース類似調査に利用できるＢＬＡＳＴファミリーのプログラムには次のものが含まれる。ヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチド照会配列用のＢＬＡＳＴＮ、タンパク質データベース配列に対するヌクレオチド照会配列用のＢＬＡＳＴＸ、タンパク質データベース配列に対するタンパク質照会配列用のＢＬＡＳＴＰ、ヌクレオチドデータベース配列に対するタンパク質照会配列用のＴＢＬＡＳＴＮ、及びヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチド照会配列用のＴＢＬＡＳＴＸ。Current Protocols in Molecular Biology, 第１９章、アウスベルら編，グリーン・パブリッシング・アンド・ウィリー−インターサイエンス，ニューヨーク州（1995）を参照。
【００３５】
特に断らない限り、本明細書で提供する配列同一性／類似性の数値は、ＢＬＡＴ２．０スイートのプログラムでデフォルトのパラメータを用いて得られた数値を指す。アルチュールら，Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402（1977）。アルチュールら，Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402（1977）。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、例えばナショナル・センター・フォア・バイオテクノロジー−インフォメーション（全米バイオテクノロジー情報センター）（ HYPERLINK "http://www.hcbi.nlm.nih.gov/" http://www.hcbi.nlm.nih.gov/）経由で公的に入手できる。
【００３６】
このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列させた場合、ある陽性値の閾値得点Ｔに合致するか又はこの閾値得点Ｔを満たす、照会配列内にある長さＷの短いワードを同定することにより、高得点の配列対（ＨＳＰ）をまず同定する工程を含む。Ｔは隣接ワード得点閾値と呼ばれる（アルチュールら，上述）。この最初の隣接ワードの照合適合（hit）は、隣接ワードを含むより長いＨＳＰを見つけ出すための検索を開始するきっかけとなる。次にこのワードの照合適合を、累積整列得点が増加する限り、各配列の両方向に進めていく。累積得点は、ヌクレオチド配列について、パラメータＭ（適合残基対に対する報奨点、常に＞０）及びＮ（不適合残基対に対する罰則点、常に＜０）を用いて計算する。アミノ酸配列については、得点マトリックスを用いて累積得点を計算する。各方向へワードの照合適合を進めることは、次の場合に停止される。累積整列得点が、その最大に達した値から量Ｘだけ減少した場合、負の点数となる残基整列が一つ又は複数累積したために、累積得点がゼロ以下になった場合、又は、いずれかの配列が末端に達した場合である。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータ、Ｗ、Ｔ、及びＸは、整列の感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルト値としてワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、遮断値１００、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムはデフォルト値としてワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２の得点マトリックス（ヘニコフとヘニコフ（1989）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915を参照）を使用する。
【００３７】
配列同一性のパーセンテージの計算に加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは二つの配列間の類似性の統計的分析も実行する（例えば。カーリンとアルチュール，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787（1993）を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより得られる類似性の一つの尺度は最小和確立（Ｐ（Ｎ））であり、これにより二つのヌクレオチド配列間又はアミノ酸配列間の適合が偶然起こり得る確率の指標が得られる。
【００３８】
ＢＬＡＳＴ検索は、タンパク質が無作為配列としてモデル化できると仮定している。しかしながら、現実のタンパク質の多くは、ホモポリマー領域、短周期反復、又は一つ以上のアミノ酸の濃縮領域であるかもしれない非無作為配列の領域を含む。このような複雑性が低い領域は、そのタンパク質の他の領域が全く類似性のないものであったとしても、無関係なタンパク質間で整列されることがある。いくつかの低複雑性フィルタープログラムを採用して、このような低複雑性の整列を減少させることができる。例えば、ＳＥＧ（ウートンとフェデルヘン，Comput. Chem., 17: 149-163（1993））及びＸＮＵ（クラヴリーとステーツ，Comput. Chem., 17: 191-201（1993））の低複雑性フィルターを単独で又は組合わせて使用することができる。
【００３９】
（ｃ）本明細書で用いるとき、二つの核酸配列又はポリペプチド配列との関連において用いる「配列同一性」又は「同一性」は、ある特定の比較窓上で最大対応するように整列された場合に同一となる二つの配列中の残基への言及を含む。配列同一性のパーセンテージがタンパク質について用いられた場合、同一でない残基の位置がしばしば同類アミノ酸置換だけ異なっていることが認められる。この場合、アミノ酸残基は類似の化学的性質（例えば、電荷又は疎水性）を有する他のアミノ酸残基の代わりとして置換され、従ってこの分子の機能的特性は変化しない。配列が同類置換で異なる場合には、配列同一性のパーセンテージは、置換の保存的性質を修正するため、上方に調節されることがある。このような同類置換だけ異なる配列は、「配列類似性」又は「類似性」を有すると言う。この調節を行う手段は、当業者らによく知られている。通常、これは同類置換を完全不適合ではなく部分不適合として評点することを含み、従って配列同一性のパーセンテージが高くなる。従って、例えば、同一のアミノ酸に１点を与え、非保存的置換を０点とする場合、同類置換には０点と１点の間の得点を与える。同類置換の評点は、例えばＰＣ／ＧＥＮＥ（インテリジェネティクス，マウンテンビュー，カリフォルニア州，米国）プログラムで実践されているような、例えばマイヤースとミラー，Computer Applic. Biol. Sci., 4: 11-17（1988）のアルゴリズムに基づいて計算される。
【００４０】
（ｄ）本明細書で用いるとき、「配列同一性のパーセンテージ」は、比較窓上で最適に整列させた二つの配列を比較することにより決定した数値を意味する。ここで、この二つの配列の最適整列に対する参照配列（付加又は欠失を含まない）と比較すると、この比較窓内のポリヌクレオチド配列部分は、付加又は欠失（即ち、ギャップ）を含むことがある。このパーセンテージは、同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が両方の配列で生じる位置の数を決定して適合位置の数を求め、この適合位置の数を比較窓内の位置の総数で割り、その結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを求めることにより計算する。
【００４１】
（ｅ）（Ｉ）ポリヌクレオチド配列の「実質的同一性」という用語は、あるポリヌクレオチドが、標準的なパラメータを用いて記述された整列プログラムの一つを用いて参照配列と比較した場合に、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。当業者は、二つのヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質の対応する同一性を決定する場合、コドン縮重、アミノ酸類似性、読取枠配置などを考慮に入れることでこれらの数値を適正に調節できることを認識する。これらを目的とするアミノ酸配列の実質的同一性は、通常は少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を意味する。
【００４２】
これらのプログラム及びアルゴリズムにより、標的遺伝子中のある特定の多型と本明細書に記載されたものとの類似を確認することができる。この多型が他の動物内にも存在することが予測され、そして本明細書に開示されていない動物における、本明細書の教示を用いたパラメータの単なる型どおりの最適化を含むこの多型の使用が予測される。
【００４３】
代替ＤＮＡ標識の特異的な対立遺伝子と、ある特定の形質と関連することが既に知られている特定の遺伝子（例えば、本明細書で議論されたＣＡＳＴ遺伝子）と結び付くことが知られているＤＮＡ標識の対立遺伝子との間の連結を確立することも可能である。従って、ＣＡＳＴ遺伝子を取り上げている現在の状況では、代替的染色体標識の特定の対立遺伝子の選択を通じてＣＡＳＴに結び付く標識の特定の対立遺伝子を選択することにより、間接的に、所望の肉質及び／又は成長を生じる可能性が高い動物を選択すること、或いは望ましくない肉質及び／又は成長を生じる可能性の高いブタを排除することが、少なくとも短期間で可能となるであろう。本明細書で用いるとき、用語「遺伝標識」は、多型に関連するタンパク質の変化を検定する何らかの手段によって開示された多型を含むだけでなく、それが標識と連結しているならば、ミクロサテライトの使用、又は該標識が示す原因性タンパク質の変化を検定する別の手段の使用さえも含み、そして動物の肉質及び／又は成長に影響を与えるためにこれらを使用することを含む。
【００４４】
本明細書で用いるとき、特定の多型を、ある特定の制限酵素の名称で指し示すことがよくある。これは、その部位を同定できる唯一の方法がその制限酵素を使用することによるものであるということを意味する意図ではない。ある特定の多型を同定するために使用できる他の制限酵素を同定するために当業者が利用できるデータベースや情報資源が多数ある。例えば HYPERLINK "http://darwin.bio.geneseo.edu" http://darwin.bio.geneseo.eduでは、同定すべき配列や多型の分析ための制限酵素が得られる。実際、本明細書の教示で開示されるように、制限酵素を含みこそしないが、同一の遺伝子型若しくは代替的プロテオーム型を検定する代替法を用いて、ある特定の多型又は対立遺伝子を同定する方法は無数にある。
【００４５】
本発明のさらに別の実施態様では、新規なブタ・ヌクレオチド配列を同定し、どれがブタＣＡＳＴをコードするかを開示する。ブタＣＡＳＴ遺伝子のｃＤＮＡだけでなく、いくつかのイントロンＤＮＡ配列も開示する。これらの配列は、本発明のＳＮＰを検定するためのプライマーの設計のために、又は組換えＣＡＳＴの生産のために使用しうる。本発明は、これらの配列だけでなく、保存的に改変されたそれらの変異体、並びに開示された配列と高ストリンジェンシー条件下でハイブリッド形成する配列を含むことを意図する。本明細書で用いるとき、用語ＣＡＳＴは、これらの保存的に改変された変異体だけでなく、そのハイブリッド形成する配列をも含むと解釈すべきである。
【００４６】
用語「保存的に改変された変異体」は、アミノ酸配列と核酸配列の両方に当てはまる。具体的核酸配列の場合、保存的に改変された変異体とは、同一のアミノ酸配列をコードする又は該アミノ酸配列の保存的に改変された変異体をコードする核酸を指す。遺伝暗号の縮重のため、機能的に同一な多数の核酸が如何なる所与タンパク質をもコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵはいずれもアミノ酸アラニンをコードする。従って、コドンでアラニンが指定される全ての位置で、そのコドンはコードされたポリペプチドを改変することなく、記述された対応するコドンの何れにも改変することが可能である。このような核酸の変異は「沈黙変異（ｓｉｌｅｎｔ  ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ）」であり、保存的に改変された変異の一種を表している。ポリペプチドをコードする本明細書の全ての核酸配列は、遺伝子暗号を参照することにより、核酸の可能な沈黙変異体の全てを記述する。当業者は、核酸内の各コドン（通常はメチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧ、及び、通常はトリプトファンに対する唯一のコドンであるＵＧＧを除く）を改変すると機能的に同一な分子が得られることを認識する。従って、本発明のポリペプチドをコードする核酸の各々の沈黙変異は、各々の記述されたポリペプチド配列において潜在的に含まれており、本発明の範囲内にある。
【００４７】
アミノ酸配列については、単一のアミノ酸を、又はコードされた配列中のある小さなパーセンテージのアミノ酸を、改変、付加又は欠失させる、核酸配列、ペプチド配列、ポリペプチド配列、又はタンパク質配列への個々の置換、欠失又は付加は、この改変が結果的にあるアミノ酸の化学的に類似するアミノ酸との置換となる場合には、「保存的に改変された変異体」であることを、当業者は認識する。従って、１から１５までから成る整数群から選択された如何なる数のアミノ酸残基も、このように改変することができる。こうして、例えば、１、２、３、４、５、７、又は１０の改変を行うことができる。保存的に改変された変異体は、誘導前の改変していないポリペプチド配列と類似した生物学的活性を示すのが普通である。例えば、基質特異性、酵素活性、又はリガンド／受容体結合は、一般的にはその天然の基質に対する天然のタンパク質の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％である。機能的に類似するアミノ酸を生じる同類置換の表は、当分野で良く知られている。
【００４８】
次の六つの各グループは、それぞれ互いに同類置換となるアミノ酸を含む。
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、及び
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
クレイトン（1984）プロテインズ  Ｗ．Ｈ．フリーマン・アンド・カンパニーも参照のこと。
【００４９】
特定された核酸については、「コードする」又は「コードされた」とは、特定されたタンパク質に翻訳するための情報を含むことを意味する。タンパク質をコードする核酸は、その核酸の翻訳領域内に非翻訳配列（例えば、イントロン）を含んでも良く、又はそのような非翻訳介在配列を欠いていてもよい（例えば、ｃＤＮＡ中におけるようなもの）。タンパク質をコードする情報は、コドンを用いて特定される。通常、アミノ酸配列は「普遍的」遺伝子暗号を用いて、核酸によりコードされる。しかしながら、一部の植物、動物、及び真菌のミトコンドリア、細菌マイコプラズマ・カプリコラム、又は線虫のマクロヌクレアス（Macronucleus）に存在するような普遍的暗号の変異型が、核酸がそれらの中で発現したときに用いられることがある。
【００５０】
用語「ストリンジェント条件」又は「ストリンジェントハイブリッド形成条件」は、プローブが、他の配列とハイブリッド形成するよりも検出可能な程度により高度に（例えば、少なくとも背景の２倍で）その標的配列とハイブリッド形成する条件への言及を含む。ストリンジェント条件は配列依存性であり、異なる状況では異なってくる。ハイブリッド形成条件及び／又は洗浄条件のストリンジェンシーを制御することにより、そのプローブに１００％相補的な標的配列を同定できる（相同的プロービング）。または、より低度の類似性を検出できるように、配列中の一部の不適合を許容するようにストリンジェンシー条件を調節することもできる（非相同的プロービング）。一般的に、プローブは約１０００ヌクレオチド長より短く、任意選択的には５００ヌクレオチド未満の長さでもよい。
【００５１】
通常、ストリンジェント条件は、ｐＨが７．０から８．３で、塩の濃度が約１．５ＭのＮａイオンより低く、通常は０．０１から１．０ＭのＮａイオン濃度（又は他の塩）であり、且つ温度は短いプローブ（例えば、１０から５０ヌクレオチド）では少なくとも約３０度、長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドより大きい）では少なくとも約６０度という条件である。ストリンジェント条件は、ホルムアミドなどの不安定化物質を添加して達成しても良い。例示的な低ストリンジェンシー条件は、３０から３５％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝液を用いる３７℃でのハイブリッド形成、且つ、１×〜２×のＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０ＭのＮａＣｌ／０．３Ｍのクエン酸三ナトリウム）中での５０から５５℃での洗浄を含む。例示的な中ストリンジェンシー条件は、４０から４５％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳにおける３７℃でのハイブリッド形成、且つ、０．５×〜１×のＳＳＣ内での５５から５０℃での洗浄を含む。例示的な高ストリンジェンシー条件は、５０％のホルムアミド、１ＭのＮａｃｌ、１％ＳＤＳにおける３７℃のハイブリッド形成、且つ、０．１×ＳＳＣ内での６０から６５℃での洗浄を含む。
【００５２】
特異性は、通常ハイブリッド形成後洗浄の関数であり、重要な要因は最終洗浄溶液のイオン強度と温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドについては、Ｔmはメインコスとウォール，Anal. Biochem., 138: 267-284（1984）の方程式から近似できる。即ち、Ｔm＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ホルムアミド）−５００／Ｌ。式中、Ｍは一価のカチオンのモル濃度、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシンヌクレオチドとシトシンヌクレオチドのパーセンテージ、％ホルムアミドはハイブリッド形成溶液中のホルムアミドのパーセンテージ、Ｌは塩基対を形成しているハイブリッドの長さである。Ｔmは、相補的標的配列の５０％が完全に適合するプローブとハイブリッド形成する（定められたイオン強度とｐＨにおける）温度である。Ｔmは不適合１％につき約１℃低下する。従って、Ｔm、ハイブリッド形成及び／又は洗浄条件は、所望の同一性の配列とハイブリッド形成するように調節できる。例えば、≧９０％の同一性を有する配列を求めるのであれば、Ｔmは１０℃下げることができる。一般に、ストリンジェント条件は、定められたイオン強度とｐＨで、その特定の配列とその相補体との熱融点（Ｔm）よりも約５℃低くなるように選択される。しかしながら、厳しいストリンジェント条件では熱融点（Ｔm）よりも１，２，３又は４℃低いハイブリッド形成及び／又は洗浄が利用でき、中度のストリンジェント条件では熱融点（Ｔm）よりも６，７，８，９又は１０℃低いハイブリッド形成及び／又は洗浄が利用でき、低ストリンジェンシー条件では熱融点（Ｔm）よりも１１，１２，１３，１４，１５又は２０℃低いハイブリッド形成及び／又は洗浄が利用できる。この方程式、ハイブリッド形成用組成物及び洗浄用組成物、及び所望のＴmを使用すれば、当業者らはハイブリッド形成溶液及び／又は洗浄溶液のストリンジェンシーにおける変化が本質的に説明されることを理解するであろう。不適合の所望の温度が４５℃（水溶液）又は３２℃（ホルムアミド溶液）より低いＴmという結果になれば、より高い温度が使用できるようにＳＳＣ濃度を上げることが好ましい。核酸のハイブリッド形成の詳しい手引きは、ティッセン，Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology − Hybridization with Nucleic Acids Probes, 第Ｉ部，２章，アウスベルら（編），グリーンパブリッシング・アンド・ワイリー−インターサイエンス，ニューヨーク州（1995）に記載がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５３】
ここに、本発明の上に言及した実施態様について詳細に述べる。これは以下の実施例と共に本発明の原理を説明するのに役立つ。
【００５４】
哺乳動物の骨格筋と心筋においては、カルシウム依存性プロテイナーゼは、筋原線維タンパク質と細胞骨格タンパク質の限定的加水分解を調節し、筋線維の細胞内構造を維持するプロセスに関与してきた。筋ジストロフィーなどの多くの筋肉疲労疾病は、カルパイン(カルシウム依存性システインプロテアーゼ）活性の変化を伴う。カルパスタチン（ＣＡＳＴ）は、カルパインと共発現する、カルパイン特異的内因性タンパク質阻害物質である。ＣＡＳＴは、生体組織中で筋タンパク質分解に関与すると仮定されており、肉の死後の軟化に重要な役割を果たすことも分かってきた。異なる組織から単離されたカルパスタチンは、遺伝子転写物の選択枝のあるスプライシング並びに翻訳後プロセシングのために、大きさが不均一である。カルパスタチンの多様性の生理学的な重要性は分かっていないが、細胞内区画化又はカルパイン・アイソフォームに対する阻害物質特異性の相違に関連があると仮定されている。ＣＡＳＴタンパク質には四つのドメインがあり、それぞれが阻害機能を有する。
【００５５】
本発明に基づき、出願人らは動物の成長と肉質の改良と相関性があるＣＡＳＴ遺伝子の異なる対立遺伝子をいくつか同定した。出願人らは、新規なブタ骨格ｃＤＮＡ配列も同定した。
【００５６】
図１ａは、カルパスタチンｃＤＮＡ配列である配列番号：１を表し、そして本発明の代替的多型（配列番号：３，５，７及び９）を表す。図１ｂは、代替型（配列番号：４，６，８及び１０）を示すブタ骨格ＣＡＳＴのアミノ酸配列である配列番号：２を表す。これらの新たな標識は肉の身の締り具合、多汁性、肉の柔らかさ、平均インストロン力、平均ドリップ損失、屠殺前の体重、ロイン重量、ロインｐＨとハムｐＨ、ｈｐｒｏ肉（ヘネシー・プローブ・ロイン深度）と相関することが分かった。本発明によれば、これらの多型とこれらの形質（単数又は複数）との関連は、遺伝標識に、動物寿命の初期において有利な肉質及び又は成長を有する特定の品種若しくは遺伝的系列若しくは動物を同定することを可能とさせる。
【００５７】
本発明に基づいて同定される一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）の一つは、ＣＡＳＴ遺伝子のエキソン１３ドメイン１（配列番号：５と６）（図１、ｃＤＮＡ配列の位置８１２）で、アルギニンコドン（ＡＡＡ、対立遺伝子２）からリジン（ＡＧＡ、対立遺伝子１）への転換を示す。この多型は、主観的な多汁性、身の締り具合、インストロン力、ドリップ損失、調理損失、もろさ、繊維度、粘度（guminess）、硬度、支持、ロインｍｉｎｌ、ロインｐＨ、試験日数、ハムｍｉｎｌ、骨抜きロイン重量、ＬＤＧ、及びＴＤＧに効果を持つことが分かった。生体１日増加体量、試験時の１日増加体量、及びテスト終了時の重量を含む成長形質ともいくつかの関連があった。本発明の一つの実施態様に基づき、制限酵素Ｈｐｙ１８８Ｉを用いて、遺伝子試料中にこれらの特定の対立遺伝子のいずれかが存在することを同定するためのＰＣＲ−ＲＦＬＰ試験を発展させた。
【００５８】
本発明に基づいて同定されたさらに別の一塩基多型は、ＣＡＳＴ遺伝子（配列番号：９及び１０）（図１、ｃＤＮＡ配列の位置１９８０）のエキソン２８（ドメイン４）におけるアルギニンコドン（ＡＧＡ）からセリンコドン（ＡＧＣ、対立遺伝子１）への変化を表す。この位置での変化は、主観的な多汁性、身の締り具合、インストロン力、ドリップ損失、もろさ（cumbliness）、繊維度、粘度（guminess）、硬度、支持、ロインｍｉｎｌ、ロインｐＨ、ｈｐｒｏ肉、アロカ背脂、試験日数、ドリップのパーセンテージ、ＵＳ＿ＭＤ、及びハム重量中の骨と相関した。生体一日増加体量、試験時の１日増加体量、ヘネシー・プローブ・ロイン深度、及び試験終了時の重量などの成長形質とも関連があった。本発明の一つの実施態様によれば、制限酵素ＰｖｕIIを用いて、遺伝子試料中にこれらの特定の対立遺伝子の一つが存在することを同定するため、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ試験を発展させた。
【００５９】
本発明に基づいて同定された別の一塩基多型は、ＣＡＳＴ遺伝子（配列番号：７及び８）（図１、ｃＤＮＡ配列の位置１５７６）のエキソン２２（ドメイン３）におけるスレオニンコドン（ＡＣＴ、対立遺伝子Ｉ）からアラニンコドン（ＧＣＴ）への変化を表す。本発明のさらに別の実施態様により、制限酵素ＡｃｉＩを用いて、遺伝子試料中にこれらの特定の対立遺伝子の一つが存在することを同定するため、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ試験を発展させた。
【００６０】
本発明に基づいて同定されたまた別の一塩基多型は、ＣＡＳＴ遺伝子（配列番号：３及び４）（図１、ｃＤＮＡ配列の位置２６３）のエキソン６（ドメインＬ）における、アスパラギンコドン（ＡＡＴ、対立遺伝子１）からセリンコドン（ＡＧＴ）への変化を生じる。この多型についての試験は、制限酵素ＡｐａＬＩを用いて開発された。この多型はＨｐｙ１８８Ｉ標識とは完全連鎖不均衡（complete linkage disequilibrium)であることが分かった。本発明に基づき、同一コドン内の多型がウシにも存在することも分かった。図６は、Ｂｏｓタウルス（ウシ）とＳｕｓスクローファ（ブタ）のエキソン６配列のクラスタルＬ整列を示す。この遺伝子の高度保存性のため、本明細書で開示される多型、特に該遺伝子のコード領域中に存在する全ての多型が、他の動物、品種、系統、又は集団に存在することが予測される。
【００６１】
さらに、ハプロタイプ分析を実施して、ＣＡＳＴ遺伝子内で同定された標識であってそれらの潜在的な効果の検出を可能にするのに十分有益な情報を持つ標識の好ましい組み合わせを同定した。
【００６２】
従って本発明は、動物における経済的価値のある形質に対する遺伝標識に関する。これらの標識は、肉質及び／又は成長の形質に顕著に関連する対立遺伝子を表し、従って、そのように相関するＣＡＳＴ遺伝子中の多型が存在するか又は存在しないかを同定することにより繁殖させた場合に所望の肉質及び／又は成長（これらの一つ又は全てのレベル）を生産する可能性のより高いものを決定するために、動物をスクリーニングする方法を提供する。
【００６３】
従って本発明は、ある特定の動物、血統、系列、集団、又はグループの動物における遺伝標識、及びこれらの標識を同定する方法に関する。この遺伝標識と方法により、該動物は所望の肉質及び／又は成長を持つ肉を生じる可能性が高くなる。
【００６４】
これらの標識が存在するか存在しないかを同定するには、例えば、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ)分析、塩基切断配列走査（ＢＥＳＳ）、ＲＦＬＰ分析、ヘテロ二本鎖分析、変性勾配ゲル電気泳動、及び温度勾配電気泳動、対立遺伝子ＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応直接配列決定、ミニ配列決定、核酸ハイブリダイゼーション、ＣＡＳＴ遺伝子又はＣＡＳＴ遺伝子の他の連結配列のミクロ−アレイ型検出を含む方法のいずれを用いて良い。また、本発明の範囲には、この多型の存在下で生ずるタンパク質高次構造変化又はタンパク質配列変化を検定する方法が含まれる。この多型は突然変異の結果であってもよく又はそうでなくてもよいが、この多型はこの変化の存在を示すものであり、その表現型の相違についての遺伝子の基礎若しくはタンパク質の基礎が検定されればよい。
【００６５】
以下は、本発明の多型の検定に利用できる技術の全体的な概要である。
【００６６】
本発明では、遺伝子物質の試料は動物から得る。試料は、血液、組織、精液などから得ることができる。一般に、抹消血細胞を供給源として使用し、遺伝子物質はＤＮＡである。分析に十分な量のＤＮＡを得るために、十分な量の細胞を採取する。この量は、当業者らには周知であるか又は当業者らが容易に決定できるものである。このＤＮＡは、当業者らに知られた技術により、血液細胞から単離される。
【００６７】
核酸の単離と増幅
ゲノムＤＮＡの試料は、無傷の間期核若しくは中期細胞を有する唾液、頬細胞、毛根、血液、臍帯血、羊水、間質液、腹膜液、絨毛膜絨毛、及び他の適切な細胞若しくは組織試料を含む、何らかの便宜的な供給源から単離される。これらの細胞は、新鮮な器官若しくは保存された器官から、又は組織試料若しくは生検からなどの固体組織から得ることができる。この試料は、天然では生体物質とは混合されない、保存剤、抗凝血剤、緩衝液、固定剤、栄養物、抗生物質などの化合物を含むことが可能である。
【００６８】
これらの種々の供給源からゲノムＤＮＡを単離する方法は、例えば、カービー，ＤＮＡフィンガープリント法入門，Ｗ．Ｈ．フリーマン＆Ｃｏ．ニューヨーク（1992）に記載されている。ゲノムＤＮＡは、培養済みの一次又は二次細胞培養から、又は前述の組織試料のいずれかから誘導される形質転換した細胞株からも単離できる。
【００６９】
動物ＲＮＡの試料も使用できる。ＲＮＡは上掲のサムブルックらに記載されているように、ＣＡＳＴ遺伝子を発現する組織から単離できる。ＲＮＡは、総細胞性ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ポリＡ＋ＲＮＡ、又はこれらの任意の組み合わせである可能性がある。最良の結果を得るためにはＲＮＡは精製するが、未精製の細胞質ＲＮＡであっても良い。ＲＮＡは逆転写してＤＮＡを形成することもでき、このＤＮＡは次いで、ＰＣＲがＲＮＡ転写物の特定の集団を間接的に増幅するように、増幅の鋳型として使用される。例えば、サムブルック（上掲）、カワサキら，ＰＣＲ技法，第８章（1992）（上掲）、ベルグら，Hum. Genet. 85: 655-658（1990）を参照。
【００７０】
ＰＣＲ増幅
増幅の最も一般的な手段は、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、第４，９６５，１８８号に記載のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。これらはそれぞれ、参照により本明細書にインコーポレートされる。ＰＣＲを血液細胞中の標的領域の増幅に用いる場合には、ヘパリン化された全血を他の試料とは隔離して保存された密封真空チューブの中に採取し、清潔な手袋を用いて処理すべきである。最良の結果を得るためには、血液は採取直後に処理すべきである。それが不可能であれば、使用するまで密封容器の中で４℃に保つべきである。他の生理学的液体中の細胞も検定することがある。これらの液体のいずれかを使用する場合も、その液体中の細胞は遠心分離により該液体成分から分離すべきである。
【００７１】
組織は、無菌の使い捨て外科用メスと無菌針（若しくは外科用メス二本）を用いて、５ｍｍペトリ皿内で粗く切り刻むべきである。組織切片からパラフィンを取り除くための手順は、当業者らに周知の種々の専門的なハンドブックに記載されている。
【００７２】
試料中の標的核酸配列をＰＣＲで増幅するためには、これらの配列を増幅系の構成要素と接触させなければならない。標的ＤＮＡを単離する一つの方法は、比較的大きな試料に役立つ粗抽出である。簡潔に述べれば、血液試料からの単核細胞、羊水からの羊水細胞、培養した絨毛膜絨毛細胞などを、標準的な手順で無菌のフィコール−ハイパック勾配上に重層して単離する。間期細胞を採取し、滅菌リン酸緩衝食塩水中で３回洗浄した後、ＤＮＡを抽出する。末梢血リンパ球から得たＤＮＡを試験する場合は、浸透圧ショック（蒸留水で１０秒間、該ペレットを処理）が示唆され、最初の洗浄後に残存赤血球が見える場合は、その後さらに２回洗浄する。これは、ヘモグロビンが持ち込むヘム基のＰＣＲ反応に対する阻害効果を防止する。ＰＣＲ試験が試料採取直後に行われない場合には、１０6細胞の部分標本を無菌エッペンドルフ管内でペレット化し、使用するまで乾燥ペレットを−２０℃で凍結することができる。
【００７３】
この細胞は、１００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを補充した緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、０．５％のツイーン２０、０．５％のＮＰ４０）中に再懸濁する（１００μｌにつき１０6有核細胞）。５６℃で２時間インキュベートした後、該細胞を９５℃まで１０分間加熱してプロテイナーゼＫを失活させ、直ちに湿氷中に移動させる（急冷）。大きな凝集物が存在する場合には、同じ緩衝液中でもう一度消化サイクルを行うべきである。この抽出物の１０μｌを増幅に用いる。
【００７４】
組織、例えば絨毛膜絨毛細胞やコンフルーエントまで培養された細胞からＤＮＡを抽出する場合、プロテイナーゼＫを含む上述の緩衝液の量は組織試料の量に応じて変更してよい。この抽出物を、５０〜６０℃で４〜１０時間インキュベートし、その後９５℃で１０分間インキュベートしてプロテイナーゼを失活させる。インキュベーションがより長い場合は、新鮮なプロテイナーゼＫを元の濃度で約４時間後に添加すべきである。
【００７５】
試料が少数の細胞を含む際は、抽出はヒグチ，「ＰＣＲ試料の単純かつ迅速な調製」（ＰＣＲテクノロジー，エーリック，Ｈ．Ａ．（編），ストックトン・プレス，ニューヨーク州）に記載の方法で実施して良い。この方法は、参照により本明細書にインコーポレートされる。ＰＣＲは、骨髄や末梢血の培養物から得られる個々のコロニーに由来する極めて少数の細胞（１０００〜５０００）中の標的領域を増幅するのに利用できる。この試料中の細胞は、２０μｌのＰＣＲ溶解緩衝液（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、２．５ｍＭのＭｇＣｌ2、０．１ｍｇ／ｍｌのゼラチン、０．４５％のＮＰ４０、０．４５％のツイーン２０）中に懸濁し、使用するまで凍結する。ＰＣＲを実施する際に、０．６μｌのプロテイナーゼＫ（２ｍｇ／ｍｌ）をＰＣＲ溶解緩衝液中の該細胞に添加する。次にこの試料を約６０℃まで加熱し、１時間インキュベートする。該試料を９５℃まで１０分間加熱してプロテイナーゼＫを失活させ、次いで氷上で冷却することにより、消化を停止する。
【００７６】
ＰＣＲのためにＤＮＡを抽出する比較的容易な手順は、ミラーら，Nucleic Acids Res. 16: 1215（1988）に記載の方法（参照により本明細書にインコーポレートされる）を応用した塩析法である。単核細胞は、フィコール−ハイパック勾配上で分離する。この細胞を３ｍｌの溶解緩衝液（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、４００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＮａ2ＥＤＴＡ、ｐＨ８．２）中に再懸濁する。プロテイナーゼＫ２０ｍｇ／ｍｌ溶液の５０μｌと２０％ＳＤＳ溶液の１５０μｌを該細胞に添加し、３７℃で一晩インキュベートする。インキュベーションの間、管を振ると、試料の消化が促進される。一晩インキュベートした後、プロテイナーゼＫの消化が不完全な（依然として断片が見える）場合は、該溶液に２０ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ溶液５０μｌをさらに混合し、穏和に振盪しながら又は回転台上で、さらに一晩３７℃でインキュベートする。適切に消化した後、６ＭのＮａＣｌ溶液を１ｍｌ該試料に添加し、激しく混ぜ合わせる。その結果得られる溶液を、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離する。そのペレットは沈殿した細胞タンパク質を含むが、一方その上清はＤＮＡを含む。この上清を４ｍｌのイソプロパノールを含む１５ｍｌ容の管に移す。この管の内容物を、水相とアルコール相が混ざり白色のＤＮＡ沈殿物が生じるまで穏和に混合する。このＤＮＡ沈殿物を取り出し、７０％エタノール溶液中に浸漬し、穏和に混合する。このＤＮＡ沈殿物をエタノールから取り出し、風乾する。この沈殿物を蒸留水中に入れ、溶解させる。
【００７７】
ＰＣＲ用に高分子量のＤＮＡを抽出するためのキットには、ゲノム単離キットＡ．Ｓ．Ａ．Ｐ．（ベーリンガーマンハイム，インディアナポリス，インディアナ州）、ゲノムＤＮＡ単離システム（ギブコＢＲＬ，ゲーサーズバーグ，メリーランド州）、Ｅｌｕ−ＱｕｉｋＤＮＡ精製キット（シュライヒャー＆シュール，キーン，ニューハンプシャー州）、ＤＮＡ抽出キット（ストラタジーン，ラホーラ，カリフォルニア州）、ターボゲン単離キット（インビトロゲン，サンディエゴ，カリフォルニア州）などが含まれる。本発明の方法を実践する前に、ＤＮＡを精製するためにこれらのキットを製造元の指示に従って使用することは、一般に許容できる。
【００７８】
抽出したＤＮＡの濃度と純度は、希釈した部分標本の２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにおける吸光度を分光学的に分析して測定できる。ＤＮＡの抽出後、ＰＣＲ増幅を進めて良い。ＰＣＲの各サイクルの最初の工程は、プライマー伸長により形成される核酸二本鎖の分離を含む。この二本鎖を分離すると、ＰＣＲの次の工程は、標的配列に隣接するプライマーと分離した二本鎖とのハイブリッド形成を含む。これらのプライマーを次に伸長させて該標的鎖の相補的コピーを形成する。ＰＣＲ増幅を成功させるためには、二本鎖配列に沿って各プライマーがハイブリッド形成する位置が、鋳型（相補体）から分離されたときに一方のプライマーから合成された伸長産物が他方のプライマーの伸長の鋳型として役立つような位置になるように、プライマーを設計する。変性、ハイブリッド形成、及び伸長のサイクルは、所望の量の増幅核酸を得るのに必要な回数だけ反復される。
【００７９】
ＰＣＲ増幅の特に有用な実施態様では、二本鎖分離は、二本鎖の変性を生じるがポリメラーゼの不可逆的変性を生じない程度に十分に高い温度で十分な時間、反応物を加熱することにより達成できる（米国特許第４，９６５，１８８号を参照。これは参照により本明細書にインコーポレートされる）。通常、熱変性は約８０℃から１０５℃までの範囲の温度で数秒から数分の範囲の時間を含む。しかしながら、二本鎖分離は、物理的、化学的、又は酵素的手段を含む任意の適切な変性方法で達成できる。二本鎖分離は、例えばヘリカーゼにより、又はヘリカーゼ活性を示すことができる酵素により誘導しても良い。例えば酵素ＲｅｃＡは、ＡＴＰの存在下でヘリカーゼ活性を有する。ヘリカーゼによる二本鎖の分離に適した反応条件は、当分野で知られている（クーン  ホフマン−バーリング，1978，CSH-Quantitative Biology，43: 63-67、ラディング，1982，Ann. Rev. Genetics 16: 405-436参照。いずれも参照により本明細書にインコーポレートされる）。
【００８０】
ＰＣＲにおけるプライマーの鋳型依存性伸長は、適当な塩、金属カチオン、及びｐＨ緩衝系から成る反応媒体中で、４種の適当量のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（通常は、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＴＴＰ）の存在下で重合剤により触媒される。適切な重合剤は、鋳型依存性ＤＮＡ合成を触媒することが知られている酵素である。場合によっては、この標的領域は、細胞によって発現されるタンパク質の少なくとも一部をコードすることがある。この場合、ｍＲＮＡがこの標的領域の増幅に用いられることがある。または、ＰＣＲを、更なる増幅のためにＲＮＡ由来のｃＤＮＡライブラリーを形成させるのに使用することができる。そのプライマー伸長のための最初の鋳型はＲＮＡである。ＲＮＡ鋳型から相補的なコピーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列を合成するのに適切な重合剤は、トリ骨髄芽球症ウイルスＲＴ、モロニーネズミ白血病ウイルスＲＴ、又はサーマス・サーモフィルス（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、パーキンエルマー・シータス社から市販されている、逆転写酵素活性を持つ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼなどの逆転写酵素（ＲＴ）である。通常、ゲノムＲＮＡ鋳型は、最初の逆転写工程後の最初の変性工程の間に熱分解され、ＤＮＡ鋳型のみが残る。ＤＮＡ鋳型と共に用いる適切なポリメラーゼには、例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ又はそのクレノー断片、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、及び、パーキンエルマー・シータス社から市販されている、サーマス・アクアティカスから単離された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであるＴａｑポリメラーゼが含まれる。後者の酵素は、核酸の増幅や配列決定に広く使用されている。Ｔａｑポリメラーゼを使用するための反応条件は、当分野で知られており、ゲルファント，1989，PCR Technology（上掲）に記載されている。
【００８１】
対立遺伝子特異的ＰＣＲ
対立遺伝子特異的ＰＣＲは、変異又は多型の存在下又は非存在下で異なる標的領域の間を識別する。この標的配列の一定の対立遺伝子に対してのみ結合するＰＣＲ増幅プライマーが選択される。この方法は、ギブス，Nucleic Acid Res. 17: 12427-2448（1989）に記載されている。
【００８２】
対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドスクリーニング法
更なる診断的スクリーニング法は、サイキら，Nature 324: 163-166（1986）に記載の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）スクリーニング法を利用する。一つ以上の塩基対不適合を持つオリゴヌクレオチドが、特定の対立遺伝子について形成される。ＡＳＯスクリーニング法は、変異型標的ゲノムＤＮＡ又はＰＣＲ増幅ＤＮＡと突然変異体でないオリゴヌクレオチドの間の不適合を検出し、突然変異オリゴヌクレオチドに関するオリゴヌクレオチドの結合の減少を明らかにする。低ストリンジェンシーでこの対立遺伝子の両方の多型に結合するが、高ストリンジェンシーでは対応する対立遺伝子に結合するオリゴヌクレオチドプローブを設計することができる。または、本質的に二値の応答が得られる。即ち、標的遺伝子の変異型に対応するＡＳＯが、その対立遺伝子とハイブリッド形成するが、野性型対立遺伝子とはハイブリッド形成しないストリンジェンシー条件を考案することができる。
【００８３】
リガーゼ媒介対立遺伝子検出法
試験対象であるＤＮＡの標的領域は、リガーゼ媒介対立遺伝子検出により、影響を受けていないファミリーメンバー及び影響を受けたファミリーメンバーの標的領域と比較することができる。ランデグレンら，Science 241: 107-1080（1988）参照。リガーゼは、ウーら，Genomics 4: 560-569（1989）に記載の連結増幅反応における点突然変異の検出にも用いられることがある。この連結増幅反応（ＬＡＲ）は、ウー（上掲）及びバラニー，Proc. Nat. Acad. Sci. 88: 189-193（1990）に記載されたような鋳型依存性連結の逐次反復を用いた、特定のＤＮＡ配列の増幅を利用する。
【００８４】
変性勾配ゲル電気泳動
ポリメラーゼ連鎖反応を用いて形成された増幅産物は、変性勾配ゲル電気泳動を用いて分析できる。異なる対立遺伝子は、異種配列依存性の融解特性及び溶液中でのＤＮＡの電気泳動移動に基づいて同定できる。ＤＮＡ分子は、融解ドメインと呼ばれるセグメントで、温度の上昇若しくは変性の条件下で融解する。融解ドメインはそれぞれ、異なった、塩基特異的融解温度（ＴＭ）で協同して融解する。融解ドメインは、少なくとも２０塩基対の長さであり、数百塩基対の長さにまで至ることがある。
【００８５】
配列特異的融解ドメインの相違に基づく対立遺伝子間の識別は、アーリック編，「ＰＣＲ技法、ＤＮＡ増幅の原理と適用」，Ｗ．Ｈ．フリーマン・アンドＣｏ．，ニューヨーク州（1992）の７章に記載されているポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて評価することができる。この文献の内容は、参照により本明細書にインコーポレートされる。
【００８６】
一般に、変性勾配ゲル電気泳動で分析すべき標的領域は、標的領域に隣接するＰＣＲプライマーを用いて増幅する。増幅したＰＣＲ産物は、マイヤーズら，Meth. Enzymol. 155: 501-527（1986）、及びマイヤーズら，Ｋ．デービーズ編「ゲノム分析、実践的アプローチ」，ＩＲＬプレス・リミティッド，オックスフォード，pp. 95-139（1988）に記載されているような、線形変性勾配を持つポリアクリルアミド・ゲルに適用される。この文献の内容は、参照により本明細書にインコーポレートされる。この電気泳動系は、標的配列の融解ドメインのＴｍより僅かに低い温度に維持される。
【００８７】
変性勾配ゲル電気泳動法の代替法では、アーリック（上掲）の７章に記載されているように、この標的配列を、ＧＣクランプと呼ばれるひと続きのＧＣヌクレオチドに最初に付着させる。ＧＣクランプ中のヌクレオチドの少なくとも８０％が、グアニンかシトシンのどちらかであるのが好ましい。このＧＣクランプは、少なくとも３０塩基の長さであるのが好ましい。この方法は、高Ｔｍを持つ標的配列に特に適している。
【００８８】
一般に、標的領域は、上で述べたようにポリメラーゼ連鎖反応により増幅される。オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーの一つは、その５’末端に少なくとも３０塩基のＧＣが豊富な配列であるＧＣクランプ領域を保持しており、この領域は、増幅の間に該標的領域の５’末端に組み込まれる。その結果生じる増幅された増幅領域を、上述の変性勾配条件下で電気泳動ゲル上を走行させる。単一の塩基変化だけ異なるＤＮＡ断片は、別の位置までゲル中を移動し、これは臭化エチジウム染色で可視化されうる。
【００８９】
温度勾配ゲル電気泳動
温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）は、変性勾配が化学変性剤の濃度の相違の替わりに温度の相違によって作られるという点を除いては、変性勾配ゲル電気泳動と同じ基本原理に基づく。標準的ＴＧＧＥは、電気泳動経路に沿って伸びる温度勾配を有する電気泳動装置を利用する。試料が、均一な濃度の化学変性剤を含むゲルの中を通って移動するにつれ、該試料は温度の上昇に遭遇する。ＴＧＧＥの代替法、即ち、時間的温度勾配ゲル電気泳動（ＴＴＧＥ又はｔＴＧＧＥ）は、電気泳動ゲル全体の温度を定常的に上昇させて同様の結果を得る。試料がゲルの中を通って移動するにつれ、ゲル全体の温度が上昇し、これにより、試料がゲル中を通って移動するにつれ、該試料が温度の上昇に遭遇することとなる。ＧＣクランプの組込みを伴うＰＣＲ増幅を含む試料の調製及び産物の可視化は、変性勾配ゲル電気泳動と同様である。
【００９０】
一本鎖高次構造多型分析
ＣＡＳＴ遺伝子座にある標的配列又は対立遺伝子は、一本鎖高次構造多型分析を用いて識別することができる。これは、オリタら，Proc. Nat. Acad. Sci. 85: 2766-2770（1989）に記載されているように、一本鎖ＰＣＲ産物の電気泳動移動における変化で塩基の相違を同定する。増幅したＰＣＲ産物は、上述のように形成でき、加熱またはその他の方法で変性させて、一本鎖増幅産物を形成することができる。一本鎖核酸は、部分的に塩基配列に依存する二次構造を再生又は形成することがある。従って、一本鎖増幅産物の電気泳動の移動度により、対立遺伝子間又は標的配列間の塩基配列の相違を検出することができる。
【００９１】
不適合塩基対の化学的又は酵素による切断
標的配列間の相違は、グロンプら，Am. J. Hum. Genet. 48: 212-222（1991）に記載されているように、不適合塩基対の差別的化学切断により検出することもできる。別の方法では、標的配列間の相違は、ネルソンら，Nature Genetics 4: 11-18（1993）に記載されているように、不適合塩基対の酵素による切断で検出できる。簡単に述べれば、動物由来の遺伝子物質、及び表現型的に相違するファミリーメンバーは、不適合がないヘテロハイブリッドＤＮＡ二本鎖を形成するのに用いることができる。本明細書で用いるとき、「ヘテロハイブリッド」とは、一つの動物由来のＤＮＡの一本の鎖、及び、通常は目的の形質についての表現型で異なる別の動物由来の第二のＤＮＡ鎖を含むＤＮＡ二本鎖を意味する。不適合を含まないヘテロハイブリッドについて陽性の選択をすると、ＣＡＳＴ多型と関連がありうる小さな挿入、欠失、又はその他の多型を決定することが可能となる。
【００９２】
非ゲルシステム
他の可能な技法には、ＴａｑＭａｎ（登録商標）（パーキンエルマー）などの非ゲルシステムが含まれる。このシステムでは、問題の突然変異に隣接し、該領域のＰＣＲ増幅を可能にするオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーが設計される。次に、該遺伝子の異なる対立遺伝子間で変化を受ける塩基を含む領域とハイブリッド形成するように第三のオリゴヌクレオチドプローブを設計する。このプローブは、５’末端と３’末端の両方を、蛍光色素で標識する。これらの色素は、相互に近接しているとそれらの一方の蛍光が他方により消光されて検出できなくなるように選択される。このプローブに関して、鋳型の５’に位置するＰＣＲプライマーからのＴａｑ・ＤＮＡポリメラーゼによる伸長により、Ｔａｑ・ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によりアニーリングされたプローブの５’末端に付着した色素の切断が生じる。これは消光効果を除去して、該プローブの３’末端にある色素由来の蛍光の検出を可能にする。異なるＤＮＡ配列の識別は、プローブと鋳型分子とのハイブリッド形成が完全でない場合、即ち、何らかの形の不適合がある場合は、色素の切断は生じないという事実によって可能となる。従って、該オリゴヌクレオチドプローブのヌクレオチド配列が、それが結合する鋳型分子と完全に相補的な場合に限り、消光は除去されることとなる。反応混合物は、それぞれが存在するかも知れない異なる対立遺伝子に対して設計された二つの異なるプローブ配列を含むことが可能であり、こうして一つの反応で両方の対立遺伝子の検出を可能とする。
【００９３】
また別の技法には、蛍光の触媒による遊離に依存する等温増幅を含むインベーダー検定が含まれる。サードウェーブ・テクノロジー、 HYPERLINK "http://www.twt.com" www.twt.comを参照のこと。
【００９４】
ＰＣＲに基づかないＤＮＡ診断法
ＣＡＳＴに連結するＤＮＡ配列の同定は、増幅工程なしで、動物及びファミリー構成員における制限断片長多型などの多型に基づいて行うことができる。ハイブリダイゼーションプローブは、一般に、相補的塩基対形成により標的核酸の全て又は一部と結合するオリゴヌクレオチドである。プローブは、通常はハイブリッド形成のストリンジェンシー条件に応じて、プローブ配列との完全な相補性を持たない標的配列に結合する。このプローブは、このプローブの存在又は非存在を検定することにより標的配列の存在又は非存在を検出できるように、直接または間接的に標識することが好ましい。直接標識法には、３２Ｐや３５Ｓなどのような、放射性同位元素による標識が含まれる。間接標識法には、蛍光タグ、アビジン又はストレプトアビジンに結合しうるビオチン複合体、又はペプチド若しくはタンパク質タグが含まれる。可視検出法には、光ルミネセンス、テキサスレッド、ローダミン及びその誘導体、赤色ロイコ色素（red leuco dye）、及び、3,3',5,5' −テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、フルオレセイン、及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなど、または西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどが含まれる。
【００９５】
ハイブリダイゼーションプローブには、ＣＡＳＴが存在し、従って、制限断片長多型、高頻度可変領域、反復要素、又は可変性縦列重複配列数を含む、ＣＡＳＴに連結する遺伝標識を規定するブタ染色体とハイブリッド形成できる任意のヌクレオチド配列が含まれる。ハイブリダイゼーションプローブは、任意の遺伝子若しくは適切な類似体であり得る。さらに適したハイブリダイゼーションプローブには、染色体の関連領域に位置づけられることで知られるｃＤＮＡ又は遺伝子のエキソン断片又はその一部が含まれる。
【００９６】
本発明に基づいて用いられる、好ましい縦列反復ハイブリダイゼーションプローブは、高ストリンジェンシーハイブリッド形成条件で特定の遺伝子座にある少数の断片を認識するプローブ、又はストリンジェンシー条件がより低い場合に該遺伝子座で多数の断片を認識するプローブである。
【００９７】
一つ又は複数の追加の制限酵素、及び／又はプローブ、及び／又はプライマーを使用することができる。追加される、酵素、構築されたプローブ、及びプライマーは、当業者らによる型通りの実験で決定することができ、本発明の範囲内にあるものと意図される。
【００９８】
本明細書に記載の方法は、単一の制限酵素及び一組のプライマーの使用に関するものであるが、これらの方法はそれらに限定されない。必要であれば、一つ以上の追加の制限酵素、及び／又はプローブ、及び／又はプライマーを使用することができる。実際、ある状況では、特定のハプロタイプを与える標識の組み合わせを使用することが好ましい。追加の酵素、構築されたプローブ及びプライマーは、本明細書で提供及びインコーポレートされた教示と組合わせて、型通りの実験により決定することができる。
【００９９】
本発明に基づき、肉質及び／又は成長と関連のあるＣＡＳＴ遺伝子の多型を同定した。この標識の存在又は非存在は、一つの実施態様では、制限エンドヌクレアーゼを用いるＰＣＲ・ＲＦＬＰ分析で検定しても良い。そして増幅プライマーは、該多型を取り巻く領域における相同性が高いため、類似のヒト、ブタ、又はその他のＣＡＳＴ配列を用いて設計しても良く、又は、ＧｅｎＢａｎｋに例示されているような既知のＣＡＳＴ遺伝子配列データを用いて設計しても良く、又は本明細書の教示や参照文献に基づいて、近くを取り囲む遺伝子の連鎖データから得られる配列から設計することすらある。多型を取り囲む配列をこの多型のすぐ隣に隣接する配列から得られる約４〜３０の連続した塩基のプライマーをポリメラーゼ連鎖反応と関連させて使用すると、所望の制限酵素で処理する前に該領域を大幅に増幅する、別のＰＣＲテストの開発が容易になる。このプライマーは、正確に相補的である必要はなく、実質的に等価な配列も許容できる。ＰＣＲによる増幅のためのプライマーの設計は当業者らに知られており、アウスベル（編），「分子生物学の簡単なプロトコル、第４版」，ジョン・ワイリー・アンド・サンズ，1999で詳細に論じられている。以下に、プライマーの設計について簡単に説明する。
【０１００】
プライマー設計戦略
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法の使用の増加は、ＰＣＲ用のプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドの設計又は選択を支援するためのプログラムが多数開発される刺激となった。インターネットから自由に入手できるこのようなプログラムの例を四つ挙げる。即ち、ホワイトヘッド・インスティチュートのマークデーリーとスティーブリンカーンによるＰＲＩＭＥＲ（ＵＮＩＸ、ＶＭＳ、ＤＯＳ、及びマッキントッシュ）、セントルイスにあるワシントンユニバーシティのフィルグリーンとラディアナヒラーによるオリゴヌクレオチド選択プログラム（ＯＳＰ）（ＵＮＩＸ、ＶＭＳ、ＤＯＳ、及びマッキントッシュ）、ヨシによるＰＧＥＮ（ＤＯＳのみ）、及びユニバーシティ・オブ・ウィスコンシンのビルエンゲルスによるアンプリファイ（マッキントッシュのみ）である。一般にこれらのプログラムは、小さな既知の反復配列要素を探し出し、次に推定プライマーの長さ及びＧＣ含量を分析してそのＴmを最適化することにより、ＰＣＲプライマーの設計を支援する。市販のソフトウェアも入手可能であり、プライマー選択手順は、最も汎用的な配列分析パッケージ類に急速に含まれつつある。
【０１０１】
配列決定用及びＰＣＲ用のプライマー
配列決定用プライマー又はＰＣＲ用プライマーのいずれかとして用いられるオリゴヌクレオチドを設計するには、標的を特異的に認識する適当な配列を選択し、次いでそのオリゴヌクレオチドが安定な二次構造を持つ可能性を排除するため、配列を試験することが必要となる。この配列中の逆方向反復は、上で述べたもの（「核酸構造の予測」を参照）のような反復同定プログラムやＲＮＡ折り畳みプログラムを用いて同定することができる。可能性のあるステム構造が観察されれば、このプライマーの配列をいずれかの方向に数ヌクレオチド分移動させて、予測される二次構造を最小限にすることができる。このオリゴヌクレオチドの配列は、適切なベクターと挿入ＤＮＡの両方の鎖の配列との比較もすべきである。明らかに、配列決定用プライマーは該標的ＤＮＡに対し一個の適合しか持つべきでない。所望しない標的ＤＮＡ配列との不適合を一つしか含まないプライマーを排除するのが賢明でもある。ゲノムＤＮＡを増幅させるのに用いられるＰＣＲプライマーについては、該プライマー配列をＧｅｎＢａｎｋデータベース内の配列と比較して、重要な適合が生じるか否かを決定するべきである。もし該オリゴヌクレオチドが既知のＤＮＡ配列のいずれかに存在する場合、又はより重要なことに、既知の反復要素のいずれかに存在する場合には、このプライマー配列は変更すべきである。
【０１０２】
本発明の方法及び材料は、動物ＤＮＡを評価し、個々の動物を遺伝子で分類し、及び動物における遺伝的差異を検出するために、より汎用的に使用しても良い。とりわけ、ゲノムＤＮＡの試料は、多型がＣＡＳＴ遺伝子中に存在するかどうかを確認するため、一つ以上の対照を参照して評価しても良い。ＣＡＳＴ遺伝子についてＲＦＬＰ分析を行い、その結果を対照と比較することが好ましい。この対照とは、既知のＣＡＳＴ遺伝子多型を持つ別の動物のＣＡＳＴ遺伝子をＲＦＬＰ分析した結果である。同様に、ある動物のＣＡＳＴ遺伝子型は、そのゲノムＤＮＡの試料を採取し、該ＤＮＡ中のＣＡＳＴ遺伝子のＲＦＬＰ分析を行い、その結果を対照と比較して決定してもよい。この場合も、その対照は別の動物のＣＡＳＴ遺伝子をＲＦＬＰ分析した結果である。この結果は、その動物のＣＡＳＴ遺伝子中の多型（単数又は複数）を特定することにより、その動物を遺伝的に分類する。最終的に、少なくとも二つの動物からゲノムＤＮＡの試料を採取し、そのＣＡＳＴ遺伝子中に多型が存在するか存在しないかを同定し、そしてその結果を比較して系統を追跡し、動物を追跡するなどすることにより、動物間の遺伝的相違が検出できる。
【０１０３】
これらの検定法は、上で論じたような、肉質及び／又は成長に関する遺伝標識の同定、一腹仔数などのような他の特性と相関しうるＣＡＳＴ遺伝子中の他の多型の同定、及びブタの遺伝子型や表現型の全般的な科学的分析に有用である。
【０１０４】
本明細書の実施例及び方法はある多型を有すると同定されたある種の遺伝子を開示する。この多型はそれを保持する動物の肉質及び／又は成長に効果を及ぼす有益な形質と肯定的か否定的かのいずれかで関連する。遺伝子内に多型が存在することの同定は、一定の対立遺伝子型内にある制限部位を生じる一塩基代替物によってなされることがしばしばである。しかしながら、本明細書で実証し論じられるように、ある種の対立遺伝子はそれと関連する幾つかの塩基変化を持つことがあり、そのどれが同じ多型（対立遺伝子）を示すものであるかを検定できる。さらに、本明細書で開示された多型に他の遺伝マーカー又は遺伝子が連結することがあり、そのために検定が他の遺伝子又は遺伝子断片の同定を含むことがあるが、これは最終的には同じ多型についての動物の遺伝的特性に依存するものである。本明細書で開示された対立遺伝子の相違に基づいて動物を分類し同定する如何なる検定も、本発明の範囲内に含まれるものであると意図される。
【０１０５】
当業者は、多型が同定され、ある特定の形質との相関性が確立されると、この多型について動物の遺伝子型を特定する方法が多数あることを理解するであろう。このような代替試験法の設計は、単に当業者らに知られたパラメータの最適化であるに過ぎず、本明細書で十分に説明したように、本発明の範囲内にあるものと意図される。
【実施例１】
【０１０６】
ＣＡＳＴＨｐｙ１８８I ＰＣＲ−ＲＦＬＰ試験
Ｈｐｙ１８８Ｉ多型
エキソン：１３（ドメイン１）
非同義変化：Ａｒｇ−Ｌｙｓ
対立遺伝子１−Ｌｙｓ（Ｋ）−ＡＡＡ
対立遺伝子２−Ａｒｇ（Ｒ）−ＡＧＡ
【０１０７】
プライマー
ＣＩ４Ｆ２：5'AAA TCT ACT GGA GAG GTT TTG AA 3' 配列番号：１１
ＣＩ４Ｒ２：5'GAC TTC TCC CGA ATC AGT TCC 3'  配列番号：１２
【０１０８】
ＰＣＲ条件
混合物１
１０×ＰＣＲ緩衝液                        １．０μｌ
ＭｇＣｌ2（１５ｍＭ）                    １．０μｌ
ｄＮＴＰｓ（２ｍＭ）                      １．０μｌ
ＣＩ４Ｆ２プライマー（１０ｐｍ／μｌ）    ０．２５μｌ
ＣＩ４Ｒ２プライマー（１０ｐＭ／μｌ）    ０．２５μｌ
Ｔａｑポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）          ０．０７μｌ
ｄｄＨ2 ０                                ５．４３μｌ
ゲノムＤＮＡ                              １μｌ
【０１０９】
混合物１とＤＮＡを反応管中で混合する。鉱物油を重層する。次のＰＣＲプログラムを実行する。即ち、９４℃で４分、ついで９４℃で４５秒、５４℃で４５秒、７２℃で３０秒のサイクルを３５回、次に７２℃で１２分で最後の伸長を行う。
【０１１０】
このＰＣＲの３μｌを２％アガロースゲル上でチェックして増幅を確認する。産物の大きさは１８２ｂｐである。
【０１１１】
Ｈｐｙ１８８Ｉの消化：
１Ｘ
容量（μｌ）
ＮＥＢ緩衝液４  １０Ｘ*               １．０
Ｈｐｙ１８８Ｉ（１０単位／ｌ）        ０．４
ｄｄ水                                ５．６
混合物最終容量                        ７．０
*ＮＥＢ
【０１１２】
・７μｌのＨｐｙ１８８Ｉ混合物をとり、３μｌのＰＣＲ産物を添加する。
・３７℃でインキュベートする。
【０１１３】
ゲル電気泳動：
・２μｌのオレンジＧローディング液を添加し、４．０％のＮｕｓｉｅｖｅ／Ｍｅ（３：１）アガロース上に載せる。
・１５０Ｖで走らせる。産物は約３０分間で分離すべきである。
バンドのパターンと多型周囲の配列の予測を図２に示す。
【０１１４】
ＣＡＳＴＰｖｕIIＰＣＲ−ＲＦＬＰ試験
ＰｖｕII多型
エキソン：２７（ドメイン４）
非同義変化：Ａｒｇ−Ｓｅｒ
対立遺伝子１−Ａｒｇ（Ｒ）−ＡＧＡ
対立遺伝子２−Ｓｅｒ（Ｓ）−ＡＧＣ
【０１１５】
プライマー
ＣＳ２６Ｆ：5'AGG GCA AAT CAA CGA AGC CAC 3'  配列番号：１３
Ｃ２７Ｒ２：5'CCT TTG TTG TGT TCT CTG AGG 3'  配列番号：１４
【０１１６】
ＰＣＲ条件
混合物１
１０×ＰＣＲ緩衝液                        １．０μｌ
ＭｇＣｌ2（１５ｍＭ）                    １．０μｌ
ｄＮＴＰｓ（２ｍＭ）                      １．０μｌ
ＣＳ２６Ｆプライマー（１０ｐｍ／μｌ）    ０．２５μｌ
Ｃ２７Ｒ２プライマー（１０ｐｍ／μｌ）    ０．２５μｌ
Ｔａｑポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）          ０．０７μｌ
ｄｄＨ2 Ｏ                                ５．４３μｌ
ゲノムＤＮＡ                              １μｌ
【０１１７】
混合物１とＤＮＡを反応管中で混合する。鉱物油を重層する。次のＰＣＲプログラムを実行する。即ち、９４℃で４分、ついで９４℃で４５秒、５４℃で４５秒、７２℃で３０秒のサイクルを３５回、次に７２℃で１２分の最後の伸長を行う。
【０１１８】
このＰＣＲの３μｌを２％アガロースゲル上でチェックして、増幅を確認する。産物の大きさは５３９ｂｐである。
【０１１９】
ＰｖｕII消化：
１Ｘ
容量（μｌ）
ＮＥＢ緩衝液２  １０Ｘ*               １．０
ＰｖｕII（１０単位／ｌ）                ０．４
ｄｄ水                                ５．６
混合物最終容量                        ７．０
*ＮＥＢ
【０１２０】
・７μｌのＰｖｕII混合物をとり、３μｌのＰＣＲ産物を添加する。
・３７℃でインキュベートする。
【０１２１】
ゲル電気泳動：
・２μｌのオレンジＧローディング液を添加し、４．０％のＮｕｓｉｅｖｅ／Ｍｅ（３：１）アガロース上に載せる。
・１５０Ｖで走らせる。産物は約３０分間で分離すべきである。
【０１２２】
図３は、バンドのパターンとＰｖｕII多型の周囲の配列の予測を示す。
【０１２３】
ＣＡＳＴＡｃｉＩＰＣＲ−ＲＦＬＰ試験
ＡｃｉＩ多型
エキソン：２２（ドメイン３）
非同義変化：Ｔｈｒ−Ａｌａ
対立遺伝子１−Ｔｈｒ（Ｔ）−ＡＣＴ
対立遺伝子２−Ａｌａ（Ａ）−ＧＣＴ
【０１２４】
プライマー
ＣＳ２２Ｆ：5'AGA CTT CGT CCT TGA TGC TTT G 3'  配列番号：１５
ＣＳ２２Ｒ：5'TAA TGG CTA TGA TGG GTT GAG G 3'  配列番号：１６
【０１２５】
ＰＣＲ条件
混合物１
１０×ＰＣＲ緩衝液                        １．０μｌ
ＭｇＣｌ2（１５ｍＭ）                    １．０μｌ
ｄＮＴＰｓ（２ｍＭ）                      １．０μｌ
ＣＳ２２Ｆプライマー（１０ｐｍ／μｌ）    ０．２５μｌ
ＣＳ２２Ｒプライマー（１０ｐｍ／μｌ）    ０．２５μｌ
Ｔａｑポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）          ０．０７μｌ
ｄｄＨ2Ｏ                                ５．４３μｌ
ゲノムＤＮＡ                              １μｌ
【０１２６】
混合物１とＤＮＡを反応管中で混合する。鉱物油を重層する。次のＰＣＲプログラムを実行する。即ち、９４℃で４分、ついで９４℃で４５秒、５４℃で３５秒、７２℃で３０秒のサイクルを３５回、次に７２℃で１２分の最後の伸長を行う。
【０１２７】
このＰＣＲの３μｌを２％アガロースゲル上でチェックして、増幅を確認する。産物の大きさは１９６ｂｐである。
【０１２８】
ＡｃｉＩ消化：
１Ｘ
容量（μｌ）
ＮＥＢ緩衝液３  １０Ｘ*               １．０
ＡｃｉＩ（１０単位／ｌ）              ０．４
ｄｄ水                                ５．６
混合物最終容量                        ７．０
*ＮＥＢ
【０１２９】
・７μｌのＡｃｉＩ混合物をとり、３μｌのＰＣＲ産物を添加する。
・３７℃でインキュベートする。
【０１３０】
ゲル電気泳動：
・２μｌのオレンジＧローディング液を添加し、４．０％のＮｕｓｉｅｖｅ／Ｍｅ（３：１）アガロース上に載せる。
・１５０Ｖで走らせる。産物は約３０分間で分離すべきである。
【０１３１】
図４は、バンドのパターンとＣＡＳＴ−ＡｃｉＩ多型の周囲の配列の予測を示す。
【０１３２】
ＣＡＳＴＡｐａＬＩＰＣＲ−ＲＦＬＰ試験
ＡｐａＬＩ多型
エキソン：６（ドメインＬ）
非同義変化：Ｓｅｒ−Ａｓｎ
対立遺伝子１−Ａｓｎ（Ｎ）−ＡＡＴ
対立遺伝子２−Ｓｅｒ（Ｓ）−ＡＧＴ
【０１３３】
プライマー
Ｃ２８２Ｆ：5'GTA AAG CCA AAG GAA CAC CCA G 3'（配列番号：１７）
Ｃ２８ＭＲ：5'TTT TTA TTT CTC TGA TGT TGG CTG TGC A 3'（配列番号：１８）
【０１３４】
ＰＣＲ条件
混合物１
１０×ＰＣＲ緩衝液                        １．０μｌ
ＭｇＣｌ2（１５ｍＭ）                    １．０μｌ
ｄＮＴＰｓ（２ｍＭ）                      １．０μｌ
Ｃ２８２Ｆプライマー（１０ｐｍ／μｌ）    ０．２５μｌ
Ｃ２８ＭＲプライマー（１０ｐｍ／μｌ）    ０．２５μｌ
Ｔａｑポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）          ０．０７μｌ
ｄｄＨ2Ｏ                                ５．４３μｌ
ゲノムＤＮＡ                              １μｌ
【０１３５】
混合物１とＤＮＡを反応管中で混合する。鉱物油を重層する。次のＰＣＲプログラムを実行する。即ち、９４℃で４分、ついで９４℃で４５秒、５４℃で６０秒、７２℃で５０秒のサイクルを３５回、次に７２℃で１２分の最後の伸長を行う。
【０１３６】
このＰＣＲの２μｌを２％アガロースゲル上でチェックして、増幅を確認する。産物の大きさは５３５ｂｐである。
【０１３７】
ＡｐａＬＩ消化：
逆向きプライマー（Ｃ２８ＭＲ）は、元のｃＤＮＡ配列と比較して改変（工学的に操作）し、その対立遺伝子を区別できるようにするため、ＡｐａＬＩ制限部位を追加した。
【０１３８】
１Ｘ
容量（μｌ）
ＮＥＢ緩衝液４  １０Ｘ                １．０
ＡｐａＬＩ（１０単位／ｌ）            ０．４
ＢＳＡ  １００Ｘ                      ０．１
ｄｄ水                                ５．５
混合物最終容量                      ７．０
【０１３９】
・７μｌのＡｐａＬＩ混合物をとり、３μｌのＰＣＲ産物を添加する。
・３７℃でインキュベートする。
【０１４０】
ゲル電気泳動：
・２μｌのオレンジＧローディング液を添加し、４．０％のＮｕｓｉｅｖｅ／Ｍｅ（３：１）アガロース上に載せる。
・１５０Ｖで走らせる。産物は約３０分間で分離すべきである。
【０１４１】
図５は、バンドのパターンとＣＡＳＴ・ＡｐａＬＩ多型の周囲の配列の予測を示す。
【実施例２】
【０１４２】
Ａ．ＣＡＳＴ連鎖地図作成
連鎖地図作成のため、既にアーネストら（1998）により報告されているＣＡＳＴ−ＭｓｐＩ標識を用いてＢ×Ｙリソースファミリー（マーレクら，2001）の遺伝子型を決定し、ＣＲＩ−ＭＡＰプログラム（グリーンら，1990）を用いて二点及び多点連鎖解析を行った。
【０１４３】
連鎖解析の結果は、ＣＡＳＴ遺伝子がＳＳＣ２上の５つの標識に有意に連結することを示した（この二点組換え頻度及びＬＯＤスコアを括弧内に示す）。即ち、ＳＷ７６６（０．０２，１１２．９２）、ＳＷ１４０８（０．１２，６７．３４）、ＳＷ２１５７（０．１５，２５．９９）、ＳＷ１８４４（０．２７，１３．１６）及びＳＷ２４４５（０．３１，１１．３６）である。これらの結果と多点連鎖解析から、ＣＡＳＴ遺伝子はＳＷ７６６とＳＷ１４０８の間、約７３．１コーサンビー（Ｋｏｓａｍｂｉ）ｃＭに位置する可能性が最も高いことが示される。
【０１４４】
Ｂ．多型の発見
本発明者らは、ブタのプラント／屠殺場（abbatoir）（２４時間）のロイン・ミノルタ、保水力、及び硬度における表現型の変化（マーレクら，2001）の原因となる原因性多型を見出すために、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、及びＢ×ＹＦ3世代ファミリー由来の試料、並びにデュロック・ブタ品種とメイシャン・ブタ品種由来の試料を分析して、ＣＡＳＴ遺伝子全体の配列決定を行った。ＣＡＳＴコード領域全体の配列決定に用いられたプライマーは、ＣＡＳＴ心臓イソ型の公表されているｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍ２０１６０）に基づいて設計されたものである。４つの非同義置換が見つかった（図１参照）。
【０１４５】
非同義多型：
１．ＣＡＳＴ−ＨＰＹ１８８Ｉ
ＡＧＡ−ＡＡＡ：Ａｒｇ−Ｌｙｓ、位置，エキソン１３（ドメイン１）、
ブタ：Ａｒｇ／Ｌｙｓ、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ヒト及びマウス、オナガザル：Ａｒｇ。２．ＣＡＳＴ−ＡＣｉＩ
ＡＣＴ−ＧＣＴ：Ｔｈｒ−Ａｌａ、位置，エキソン２２（ドメイン３）、
ブタ：Ａｌａ／Ｔｈｒ、ウサギ，ヒト：Ａｌａ、ヒツジ及びウシ：Ｔｈｒ、マウス：Ｉｌｅ。
３．ＣＡＳＴ−ＰｖｕII
ＡＧＡ−ＡＧＣ：Ａｒｇ−Ｓｅｒ、位置，エキソン２７（ドメイン４）、
ブタ：Ａｒｇ／Ｓｅｒ、ウサギ、ウシ、ヒト、マウス：Ｓｅｒ。
４．ＣＡＳＴ−ＡｐａＬＩ
ＡＧＴ−ＡＡＴ：Ｓｅｒ−Ａｓｎ、位置，エキソン６（ドメインＬ）
【０１４６】
工学操作したＣＡＳＴ−ＡｐａＬＩ・ＳＮＰは重要である。何故なら、ヒトのゲノム配列に基づいてその間に約１１ｋｂの距離があるとしてさえも、それはＣＡＳＴ−Ｈｐｙ１８８Ｉと完全な連鎖不平衡にあるからである。この事実は、異なる商業ラインからの２００を超える動物の遺伝子型を決定をすることにより明らかになった。ＣＡＳＴ−ＡｐａＬＩ・ＳＮＰは、肉の柔らかさに何らかの効果を持つＣＡＳＴ−Ｈｐｙ１８８Ｉを置換することができた。
【０１４７】
ヒトのカルパスタチンの反復多ドメイン構造が、タカノ及びマキ，1999に開示されており、この開示は参照により本明細書にインコーポレートされる。
【０１４８】
ＣＡＳＴＰｖｕIIとＡｃｉＩは、サブドメインの極めて保存的な領域に存在する。ＣＡＳＴＨｐｙ１８８Ｉは、ドメイン１のサブドメインＣの第二部分のエキソン１３（ＴＶＲＳＡＡＰ）にある。これらの４つのドメインは全て、独立して阻害機能を有する（マキら，1987、エモリら，1988）。サブドメインＢは阻害センターである（マら，1993）。サブドメインＡ及びＣは、ＣＡＳＴの阻害活性の潜在能力にとって重要である（マキら，1988、カワサキら，1989、ウエモリら，1990）。マら（1994）は阻害センター（サブドメインＢ）における１個の突然変異、又はサブドメインＡ又はＣにおける１個の突然変異（阻害活性の可能性に関与する）ですら、ＣＡＳＴ活性に影響を与えることを報告した。
【実施例３】
【０１４９】
ブタにおけるＣＡＳＴ非同義多型と肉質及び成長の形質間の関連性分析
本発明者らは、発見したそれぞれの非同義多型についてのＰＣＲ−ＲＦＬＰ試験を設計し、次の資源に由来する試料の遺伝子型を決定した。
ａ）Ｂ×ＹファミリーのＦ2世代。
ｂ）屠殺の０，６，及び２４時間後に測定した背最長筋（Longisimus dorsi muscle）からのカルパスタチン活性のデータがある、デュロックのＤＮＡ試料１４個。
ｃ）肉質のデータがある、Ｆ１世代のデュロック×ヨークシャー交雑種の試料６４個。
ｄ）次の三つのＰＩＣ商用集団：ラージホワイト、及び、デュロックの合成による系統、並びに混成系統。
【０１５０】
ａ）ＣＡＳＴがマッピングされる部位にＱＴＬを持つ形質と、ＣＡＳＴ−Ｈｐｙ１８８Ｉ置換及びＣＡＳＴ−ＰｖｕII置換の間の関連性研究に、Ｂ×ＹファミリーのＦ2世代を用いた（表２及び１５）。ＣＡＳＴ−ＡｃｉＩは、この集団では多型性ではなかった。この多型は、メイシャン品種では極めて有益であることが分かった。その結果を表２に示す。この表は、ＣＡＳＴ・Ｈｐｙ１８８Ｉについて、１１（ＫＫ）遺伝子型が、より硬度が低く、肉汁がより多く、より柔らかくて噛みやすく、インストロン力の平均値がより低い肉と関連があることを示す。ＣＡＳＴ・ＰｖｕII関連性研究についても、同様の結果が得られる（表１５）。
【０１５１】
測定した形質に真実の効果があるのはどの多型なのかを分析できるようにするため、ハプロタイプ分析を行った。三つのハプロタイプが存在する。即ち、ハプロタイプ１はＨｐｙ１８８Ｉ−１とＰｖｕII−１、ハプロタイプ２はＨｐｙ１８８Ｉ−２とＰｖｕII−１、ハプロタイプ３はＨｐｙ１８８Ｉ−２とＰｖｕII−２（表１６）である。多汁性、インストロン力、及び咀嚼スコアに対するハプロタイプ１とハプロタイプ３の効果には、有意な差異がある。ハプロタイプ３は、より高い平均インストロン力と関係があり、その肉はより柔らかくなくそしてより高い咀嚼スコアを有する。硬度については、ハプロタイプ１と２の効果の間、及びハプロタイプ２と３の効果の間で有意な差異があり、どちらの部位もこの形質の表現型変化に関与している。
【０１５２】
ＮｅｔＰｈｏｓ２ソフトウェアを用いて、ＰＫＡ（ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ）が認識する、可能性のあるカルパスタチンリン酸化基質の予測分析を行った。ＰＫＡはカルパスタチンをリン酸化し、それを核付近で凝集する（アルベルナら，2001）。同著者らは、この細胞内可逆性のメカニズムが細胞質ゾルのＣＡＳＴのレベルを調節すると考える。これに基づけば、カルパイン（ｃａｌｐａｉｎｓ）は、恐らくはその不活性化の初期の段階で、カルパスタチン阻害を免れることができるであろう。この予測分析により、ＰｖｕIIとｅＡｐａＬＩが、二つのリン酸化コンセンサス配列に影響を与え、そして最終的にカルパスタチンの局在化及びカルパイン（ｃａｌｐａｉｎｓ）阻害能力に変化を与える可能性があることが明らかになった。
【０１５３】
ＣＡＳＴＡｐａＬＩは、ヒトＣＡＳＴゲノムＤＮＡ配列に基づき、約１１ｋｂ離れた距離にあるにも関わらず、Ｈｐｙ１８８Ｉと連鎖不平衡の状態にある。実際に両者の遺伝子型を決定するために、これらのＳＮＰの一つに対する試験を用いることができる。
【０１５４】
【表２】
2005521386.tif 000002
【０１５５】
ｂ）０，６及び２４時間時点でのＣＡＳＴ活性データがある１４のデュロックＤＮＡ試料を全て、ＣＡＳＴ−Ｈｐｙ１８８ＩとＣＡＳＴ−ＰｖｕIIについて遺伝子型を決定した。二つの遺伝子型クラスにほぼ同数の動物を有するＨｐｙ１８８Ｉの場合は、平均値の間に２４時間時点で遺伝子型１１が有利であるという僅かな差異が認められた（表３、図６）。同じ多型について、０時間と６時間時点でのＣＡＳＴ活性に関しては遺伝子型１１と１２の間に差異はなかった。ＣＡＳＴ−ＡｃｉＩ多型はこの試料の集合では有益ではなかった。図６を参照のこと。
【０１５６】
【表３】
2005521386.tif 000003
【０１５７】
ｃ）肉質データのある、Ｆ1世代のデュロック×ヨークシャー交雑種由来の試料６４個全ての遺伝子型を、ＣＡＳＴ−Ｈｐｙ１８８Ｉ及びＰｖｕII多型について決定した。この試料の集合では、ＣＡＳＴ−ＡｃｉＩ多型は有益ではなかった。
【０１５８】
硬さ（ｐ＝０．０９３６）、１日の平均肉汁損失（ｐ＝０．０７０１）及び３日時点（Ｐ＝０．０３１５）と５日時点（Ｐ＝０．００４５）でのＷＢＳ力とＣＡＳＴ−Ｈｐｙ１８８Ｉ多型の間の関連性を検出した（表４）。この多型の遺伝子型と前述の形質の間に有意な関連性が検出された。最も関連性が高かったのは、５日時点でのＷＢＳ力（Ｐ＝０．００４５）であった。７日時点を除き、この形質の最高の変動は５日時点であり、ＣＡＳＴ−Ｈｐｙ１８８Ｉが肉の柔らかさに最終的な効果を持つＣＡＳＴ活性と関連する可能性がある。
【０１５９】
【表４】
2005521386.tif 000004
【０１６０】
【表４−１】
2005521386.tif 000005
【０１６１】
ＣＡＳＴ−ＰｖｕII多型と、サーロイン％パージ（Ｐ＝０．０１２１）及び５日時点でのＷＢＳ力（Ｐ＝０．０２５）との間で関連性が検出された（表５）。遺伝子型２２の動物が２頭しかいなかったため、遺伝子型１１と遺伝子型１２の間の差異に注意を向けた。５日時点のＷＢＳ力（全体のＰ値＝０．００４５）について、本発明者らは遺伝子型１１と遺伝子型１２の間で有意な差異を検出した（ｐ＜０．０１）。
【０１６２】
【表５】
2005521386.tif 000006
【０１６３】
【表５−１】
2005521386.tif 000007
【０１６４】
ｄ）Ｂ×ＹファミリーのＦ2世代を用いて得た有意な結果のいくつかを検証するため、関連性研究に幾つかのＰＩＣ商用集団を用いた。本発明者らが用いた試料には、肉質、体組成及び成長の形質についてのデータがある。これらの試料については、インストロン力のデータはなかったが、硬さ（主観的なスコア）並びにドリップのパーセンテージのデータはあった。今回もＣＡＳＴ−Ｈｐｙ１９９Ｉ標識とＣＡＳＴ−ＰｖｕII標識のみを用いた。ＣＡＳＴＡｃｉＩは、関連性研究をするには多型として十分ではなかった（表６参照）。
【０１６５】
【表６】
2005521386.tif 000008
【０１６６】
ラージホワイトに基づく系統では、有意な関連性がいくつか見られた（表７と表８）。両方の標識について、硬さはＢ×Ｙ集団と同様の傾向があった。１１（ＫＫ）ＣＡＳＴＨｐｙ１８８Ｉ遺伝子型は、より高いドリップパーセンテージと関連する。ＣＡＳＴ−ＰｖｕII遺伝子型の効果も同様の傾向にある。他の形質については、遺伝子型２２（両方の標識について）が、より遅い成長速度と関連し、１１よりも痩せている。両方の標識について、体重１日増加試験（ＴＤＧ）とＵＳ−筋深度（ＵＳ＿ＭＤ）に関する遺伝子型の間で有意な差異がある。
【０１６７】
【表７】
2005521386.tif 000009
【０１６８】
【表８】
2005521386.tif 000010
【０１６９】
相互作用を伴うものと伴わないものの両方の標識を含むジョイント分析では、幾つかの関連性が示唆される。骨抜きロイン体重（Ｐ＝０．０３）、ロインｐＨ（０．０４）及びハムｐＨ（０．０２）についてのみ、相互作用が検出されるが、このクラスの四つにおける個体の数が極めて低いため、何らかの結論を引き出すことが難しい。このモデルの両方の遺伝子型を含め、全体的な確率、はＨｐｙ１８８ＩについてはＵＳ＿ＭＤが、及びＰｖｕIIについては、ロインｍｉｎｂ、ＬＭｐｒｃｔ、ＵＳ＿ＭＤがそれぞれ＜０．１０であった。
【０１７０】
デュロック合成系統では、いくつかの有意な関連性が見られた（表９と１０）。両標識について、最も重要な関連性はドリップ・パーセンテージであった。即ち、ＰｖｕIIでＰ＝０．００４、及びＨｐｙ１８８ＩでＰ＝０．０３であった。ホモ接合体クラスにおけるＬＳ平均間の差異は、ＰｖｕIIで１．５６％、Ｈｐｙ１８８Ｉで０．７４％であった。
【０１７１】
ＣＡＳＴ−Ｈｐｙ１８８Ｉに対する混成系統において、硬さについての重要な関連性が検出された（表１１）。遺伝子型１１は、ラージホワイト集団（両標識）、及びＢ×Ｙ（ＣＡＳＴ−Ｈｐｙ１８８Ｉ）、及びＣＡＳＴ−Ｈｐｙ１８８Ｉに対するＦ１世代デュロック×ヨークシャーについては、より硬くないことと関連がある。
【０１７２】
ＣＡＳＴ−ＰｖｕIIでは、ｈ＿ｂｉｎｗｔ（ハムの骨含有重量）について興味深い関連性が見つかった。即ち、遺伝子型１１はより高い値と関連性があった（表１２）。ｈｐｒｏ肉（ヘネシー・プローブ・ロイン深度）についても、遺伝子型１１が最も高い値を持つという関連性が検出された。この関連性は、同系統におけるハプロタイプ分析でも確認された（差異のＰはハプロタイプ２と３の間で０．０６であり、これらの間の差異はＰｖｕII部位によるものである）。
【０１７３】
系統全体で、ＣＡＳＴＨｐｙ１８８Ｉについては、硬さ（０．０７）（遺伝子型１１−Ｂ×ＹＦ２集団と同様により硬くない）、ハムｍｉｎｌ（Ｐ＝０．０５）、ｈｐｒｏリブ（ｐ＝０．１４）、ｅｎｄｗｔ（Ｐ＝０．０２）、ＬＤＧ（Ｐ＝０．０６）、ＴＤＧ（０．０４）及びＵＳ＿ＭＤ（Ｐ＝０．０５）に対する何らかの関連性が検出された。
【０１７４】
最後の四つの形質については同じ関連性が観察され、それらはラージホワイト集団で得られたのと同様の傾向にあった（表１３）
【０１７５】
ＣＡＳＴ−ＰｖｕIIについては、ロインｍｉｎｂ（０．００１）、ハムｍｉｎａ（Ｐ＝０．０１）、ｅｎｄｗｔ（Ｐ＝０．０３）、ＬＤＧ（Ｐ＝０．１３）及びＴＤＧ（０．１２）に対して何らかの関連性が観察され、最後の三つの形質については同様の関連性が観察され、ラージホワイト集団、並びにＣＡＳＴＨｐｙ１８８Ｉに対する系統全体分析で得られたのと同様の傾向であった（表１４）。
【０１７６】
【表９】
2005521386.tif 000011
【０１７７】
【表１０】
2005521386.tif 000012
【０１７８】
【表１１】
2005521386.tif 000013
【０１７９】
【表１２】
2005521386.tif 000014
【０１８０】
【表１３】
2005521386.tif 000015
【０１８１】
【表１４】
2005521386.tif 000016
【０１８２】
各集団のハプロタイプ分析により、いくつかの興味深い関連性が明らかになった。この分析により、異なる多型の効果を推定することが可能になる。これを行うため、我々は部位それぞれの効果が検出できるように、一つの多型部位のみで異なるハプロタイプの効果の相違に関心を置く。例えば、三つのハプロタイプがあるデュロック合成系統及び混成系統では、ハプロタイプ２（２−１）とハプロタイプ３（２−２）の唯一の相違は、ＰｖｕII部位にある。この方法で、ＰｖｕII多型の潜在的効果を推定することができる。要約すると、ハプロタイプ分析に基づいて本発明者らは次の効果を明らかにした（０．１０より低い差異のＰ値を考慮する）。
【０１８３】
ＣＡＳＴＨｐｙ１８８Ｉは次のものに効果を及ぼす（又はＱＴＬと連鎖不均衡である）：ロインｍｉｎｌ（ラージホワイト）、ロインｐＨ（ラージホワイト）、試験日数（ラージホワイト）、ハムｍｉｎｌ（ラージホワイト、全系統）、骨抜きロイン重量（デュロック）、硬さ（混成）、ＬＤＧ（混成、全系統）、ＴＤＧ（全系統）。
【０１８４】
ＣＡＳＴ−ＰｖｕIIは次のものに効果を及ぼす（又はＱＴＬと連鎖不均衡である）：
ロインｍｉｎｌ（ラージホワイト、デュロック及び全系統）、ロインｐＨ（ラージホワイト）、ｈｐｒｏ肉（ラージホワイト、全系統）、アロカ背脂（ラージホワイト）、試験日数（ラージホワイト）、ドリップ・パーセンテージ（デュロック）、ＵＳ＿ＭＤ（混成）及びハムの骨含有重量（混成）。
【０１８５】
ＣＡＳＴＨｐｙ１８８ＩとＰｖｕIIは、共に次のものに効果を及ぼす（又はＱＴＬと連鎖不均衡である）：
％ドリップ損失。両系統にハプロタイプが三つしか存在しないので、効果のより良い推定を試みるため、デュロックと混成系統の両方を含めて分析を行った。ハプロタイプ１とハプロタイプ３の間で高度に有意なドリップ損失パーセント（デュロック同様に、より高い）の差異が得られた（表１７）。ハプロタイプ３は、他の分析に基づいて予測されるように、より高いドリップ損失と関連性がある。またハプロタイプ２とハプロタイプ３の間では、やはりデュロック集団と類似の有意な相違が明らかになった、これはＰｖｕII単独の効果を示唆する。対立遺伝子２が両方の部位に存在する（ハプロタイプ３）場合は、ドリップ損失パーセントの変化が有意である。ハプロタイプの結果と単一の関連性研究を比較すると、表現型の変化において同様の傾向が得られた。例えば硬さの場合、対立遺伝子ＣＡＳＴ−Ｈｐｙ１８８Ｉは対立遺伝子２と比べて硬さの程度がより低いことと関連する。同様の結果がハプロタイプ分析で明らかになった。同じ状況がもう一つの形質、即ち、ＣＡＳＴ−ＰｖｕII多型についてデュロック集団で明らかにされた強い関連性を持つドリップ・パーセンテージ、にも当てはまる。（既に述べたとおり、ここではハプロタイプ間の相違それもＰ＜０．１０の相違のみを考慮に入れた相違に基づく効果のみを検討する）。
【０１８６】
【表１５】
2005521386.tif 000017
【０１８７】
【表１６】
2005521386.tif 000018
【０１８８】
【表１７】
2005521386.tif 000019
【実施例４】
【０１８９】
カルパスタチン遺伝子内で発見されたこれらの標識の肉質及び成長の形質への効果をさらに実証するため、別のブタ集団でその効果を試験した。
【０１９０】
１．肉質のデータ群Ａ
三つの商用集団又は系統で、表現型のデータ(肉質、体組成、及び成長の形質）を収集した。ＣＡＳＴ遺伝子型と表現型形質における変化の間の関連性を決定するため、統計的分析を行った。
【０１９１】
ＣＡＳＴ多型と検討した形質の間の関連性は、混合モデル手法（ＳＡＳ（登録商標）手法ＭＩＸＥＤ，ＳＡＳインスティチュートＩｎｃ．，カリー，ノースカロライナ州）を用いて、ランダム効果として種雄を含み、固定効果として屠殺日と標識遺伝子型(単数又は複数）を常に含むモデルで試験した。系統全体の分析のための固定効果として、系統を追加した。性別及び農場は含まれなかった。全ての形質はメスについてのみ測定したものであり、各屠殺日で示された農場が１つだけであったからである。雄はこの分析のこの部分では使わなかったが、Ｂ×Ｙでの本発明者らの結果は遺伝子型の影響による性別の差はないことを示唆している（実施例３参照）。
【０１９２】
関連性分析に用いた動物の数は、測定した形質によって変化した。それを表に示す。
【０１９３】
二つの標識（ＣＡＳＴＨｐｙ１８８ＩとＣＡＳＴＰｖｕII）について、ラージホワイト系統の、関連する肉質と成長の形質の結果を表１と２に示す。
【０１９４】
これらの試料は、インストロン力のデータを含まないが、硬さ（主観的スコア）とドリップ・パーセンテージは記録されていた。両方の標識について、硬さはＢ×Ｙ集団で観察したのと同じ傾向（実施例３）、即ち、遺伝子型１１がより低い硬さと関連するという傾向（低い値が好ましいと考えられる）を示す。この相違は、統計的な有意性（ＣＡＳＴＨｐｙ１８８Ｉでｐ＝０．３６）には届かなかったが、これは強力とは言えない尺度である主観的スコアである。しかしながら、この傾向は予測した方向であり、記録される数が大きくなれば有意な相違になると予測される。遺伝子型２２（両標識についての）は遺伝子型１１及び１２よりも遅い成長速度と関連し、この遺伝子型の動物はより痩せている傾向がある。
【０１９５】
デュロック系集団での結果を表３と４に示す。ヘネシー・プローブ・ロイン深度（遺伝子系１１は最小二乗（ＬＳ）平均値がより高いことに関連した）の両方の標識について、遺伝子系１１が低い値の場合は、ＣＡＳＴ−ＰｖｕII及び霜降り（Ｐ＝０．０１０）の両方の標識について有意な関連性が見つかった。
【０１９６】
三つめの集団は、元は数種の異なる品種を交配させて作った合成集団又は混成集団であった。結果を表５、６に示す。ＣＡＳＴ−Ｈｐｙ１８８Ｉでは、硬さについて、高度に有意な関連性が検出された（Ｐ＝０．００５１、表５）。遺伝子型１１は、Ｂ×ＹＦ2実験（実施例３参照）やこの実施例の別の集団と全く同じように、より低い硬さと関連する。ＣＡＳＴ−ＰｖｕIIでは、再びヘネシー・プローブ・ロイン深度について高度に有意な関連性が発見された（遺伝子型１１はＬＳ値がより高い：Ｐ＝０．００６）（表６）。ドリップ損失も、両標識について遺伝子型１１でより低い傾向にある。この相違は、ＣＡＳＴＨｐｙ１８８Ｉ（Ｐ＝０．０３）について、統計的に有意である。
【０１９７】
この標識の効果の推定を改良するため、同一モデルを用いて（集団による遺伝子型の有意な相互作用の証拠がないため、これは妥当であるとみなされた）全集団からのデータを合わせて分析した（表７、８）。
【０１９８】
両方の標識について最も有意な関連性は、（個々の結果から予測されるとおり）「硬さ」との関連性であった。遺伝子型のＬＳ平均値（ｐ＜０．０５）の間にも有意な相違がある。ＣＡＳＴＰｖｕIIのホモ接合遺伝子型の間には０．２６単位の相違があり、ＣＡＳＴＨｐｙ１８８Ｉでは０．１３単位の相違がある。そして、ここでも遺伝子型１１は、両方の標識で、より低い「硬さ」と関連した（表７、８）。
【０１９９】
【表１】
2005521386.tif 000020
【０２００】
【表２】
2005521386.tif 000021
【０２０１】
【表３】
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【０２０２】
【表４】
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【０２０３】
【表５】
2005521386.tif 000024
【０２０４】
【表６】
2005521386.tif 000025
【０２０５】
【表７】
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【０２０６】
【表８】
2005521386.tif 000027
【０２０７】
ハプロタイプ分析
両標識の効果を評価するため、ハプロタイプを構築し、分析を繰り返した。次の三つの一般的なハプロタイプが同定された。即ち、１（１＿１）、２（２＿１）、及び３（２＿２）である。この三つの置換を組み合わせた効果を、ハプロタイプ置換効果として評価した。ハプロタイプ間の差異（ｃｏｎｔｒａｓｔ）は、種雄（無作為）、屠殺日、及び問題のハプロタイプを０、１、又は２コピー有する動物に対応して値、−１、０及び１を持つ各ハプロタイプに対する一つの変数を含むモデルから、評価した。ハプロタイプ置換効果は、恣意的に０と設定したハプロタイプ３の効果からの偏差として表した。
【０２０８】
各集団及び全系統に関するハプロタイプ分析により、いくつかの興味深い関連性が明らかになった（表９）。ハプロタイプ１と２の間の相違はＨｐｙ１８８Ｉ部位の効果を反映しており、ハプロタイプ２と３の間の相違はＰｖｕII部位によるものである。要するに、ハプロタイプ分析に基づき、本発明者らは次の効果を明らかにした（０．１０より低い差異のＰ値を考慮する）。
【０２０９】
ＣＡＳＴＨｐｙ１８８Ｉは次のものに影響を与える（又はＱＴＬと連鎖不均衡である）：
試験日数（ラージホワイト）、ヘネシー・プローブ背脂の厚み、アロカ背脂（デュロック）、硬さ（混成−Ｐ＝０．０００８）、生涯１日増加体重（ＬＤＧ）（デュロック、全系統）、ヘネシー・プローブ・リブの厚み（混成、全系統）、試験中の１日増加体重（ＴＤＧ）（デュロック、全系統）及び試験終了時の体重（デュロック、全系統）。
【０２１０】
ＣＡＳＴ−ＰｖｕIIは次のものに影響を与える（又はＱＴＬと連鎖不均衡である）：
ヘネシー・プローブ・ロイン深度（ラージホワイト、混成）、アロカ背脂（ラージホワイト）、試験日数（ラージホワイト）、生涯１日増加体重（デュロック）、試験中の１日増加体重（デュロック）と試験終了時の体重（デュロック）、ヘネシー・プローブ背脂の厚み（デュロック）、ヘネシー・プローブ・リブの厚み、試験終了時の筋深度、及び屠殺体の赤身肉％（混成）。
【０２１１】
両標識は次のものに影響を与える：
霜降り（混成）、ドリップ損失のパーセンテージ（混成、Ｐ＝０．０４、ハプロタイプ１はより低い置換効果と関連する）、ヘネシー・プローブ・ロイン深度（混成、Ｐ＝０．００８、ハプロタイプ１は高い置換効果と関連する、デュロック、ハプロタイプ１はより高い置換効果と関連する）、硬さ（全て、Ｐ＝０．０６、ハプロタイプ１はより低い置換効果と関連する）、生涯１日増加体重（ラージホワイト）、試験中の１日増加体重（ラージホワイト）と試験終了時の体重（ラージホワイト：Ｐ＝０．００９、ハプロタイプ１はより高い置換効果と関連する。全系統：Ｐ＝０．０７、ハプロタイプ１はより高い置換効果と関連する）、屠殺体の赤身肉％（混成）、及び試験終了時の筋深度（ラージホワイト）。
【０２１２】
【表９】
2005521386.tif 000028
【０２１３】
ハプロタイプの結果と一標識関連性の結果とを比較すると、有意な形質について予測されたように表現型の変化と同じ傾向を見ることができる。例えば、硬さの場合、対立遺伝子ＣＡＳＴ−Ｈｐｙ１８８Ｉは、対立遺伝子２と比べて硬さが低いことと関連する。同様の結果がハプロタイプ分析で明らかにされた。ハプロタイプ１も、Ｂ×Ｙ集団において好ましいハプロタイプであることが見いだされた（実施例３参照）。
【０２１４】
形質の説明−データ群Ａ
硬さ−ロイン硬さの主観的スコア（１から３）−低い方が良い。
ドリップ損失のパーセンテージ（Ｄｒｐｐｒｃｔ）−４８時間での最長筋からの水分損失量−低い方が良い。
ヘネシー・プローブ・ロイン深度（ｈｐｒｏ肉）−高い方が良い。
試験終了時の筋深度（ｕｓ＿ｍｄ）−高い方が良い。
試験中の１日増加体重（ＴＤＧ）−ｇ／日−高い方が良い。
生涯１日増加体重（ＬＤＧ）−ｇ／日−高い方が良い。
試験終了時の体重（ｅｎｄｗｔ）。
屠殺体の赤身肉％（ＬＭｐｒｃｔ）。
試験日数（日）。
ヘネシー・プローブ背脂の厚み（ｈｐｒｏ肉）。
アロカ背脂（ａｌｏｃ＿ｆ）−背脂の厚みｐ２位置。
ヘネシー・プローブ・リブの厚み（ｈｐｒｏリブ）。
【０２１５】
２．肉質データ群Ｂ
この研究のために試料を採取した個体は３種以上の純系を含む交雑種から生じる、一般的な商用（屠殺ブタ）ブタである。動物は、商業用屠殺場で採取した。いくつかの主観的な及び主観的でない肉質の形質について、表現型のデータを集めた。各個体から得たロインは、屠殺体が主要部にカットされた日から正確に１４日間熟成させた。熟成の１４日後、パージ損失、調理損失、ドリップ損失、水分％、筋内脂肪％（ＩＭＦ）及び剪断力を測定した。
【０２１６】
個々の標識を分析するため、固定効果として産物（種雄系統と母親系統の組み合わせ）を用いる線形モデルを用いた。固定効果として遺伝子型を入力し、最小二乗平均を求めた。単一標識関連分析では、柔らかさ、及び柔らかさに関連する形質について、有意な関連性が明らかになった。
【０２１７】
ＣＡＳＴＨｐｙ１８８Ｉは次のものに影響を与える：
調理損失＿％（Ｐ＝０．０００４、遺伝子型１１は最小二乗平均値がより低い、ホモ接合体のＬＳ平均値の間には４．２６％の相違がある）、水分％（Ｐ＝０．０８、１１はＬＳ平均値がより低い）、主観的な多汁性と柔らかさのスコア（Ｐ＝０．０６〜０．０７、遺伝子型１１は値がより高い）。ホモ接合体間の剪断力（Ｐ＝０．１６）の相違に及ぼす効果＝０．２３についての証拠もある（表１０）。
【０２１８】
ＣＡＳＴ−ＰｖｕIIは次のものに影響を与える：
ロインｐＨ（Ｐ＝０．０６）と多汁性のスコア（Ｐ＝０．０４、遺伝子型１１はＬＳ平均値がより高い）（表１１）。
【０２１９】
【表１０】
2005521386.tif 000029
【０２２０】
【表１１】
2005521386.tif 000030
【０２２１】
ハプロタイプ分析
三つの一般的なハプロタイプ、１、２、３を同定した。三つの置換を組み合わせた効果を、ハプロタイプ置換効果として評価した。産物（種雄と母親の組み合わせ）を固定効果として線状モデルを用いた。ハプロタイプ間の差異は、問題のハプロタイプを０、１、又は２コピー有する動物に対応して数値、−１、０及び１を用い、各ハプロタイプに対し一つの変数を用いるモデルから評価した。ハプロタイプ置換効果は、恣意的に０に設定したハプロタイプ３の効果からの偏差として表した（表１２）。
【０２２２】
ＣＡＳＴＨｐｙ１８８Ｉは次のものに影響を与える：
剪断力（Ｐ＝０．０４、ハプロタイプ１は置換効果がより低い）、調理損失（Ｐ＝０．０００４、ハプロタイプ１は置換効果がより低い）。
【０２２３】
両標識は次のものに影響を与える：
調理損失（Ｐ＝０．００２、ハプロタイプ１は置換効果がより低い）、主観的な柔らかさ（Ｐ＝０．０９、ハプロタイプ１はより高い置換効果と関連する）及び多汁性のスコア（Ｐ＝０．００８、ハプロタイプ１は置換効果がより高い）。
【０２２４】
【表１２】
2005521386.tif 000031
【０２２５】
形質の説明−データ群Ｂ
調理損失％−１４日熟成後の最長筋を８０度で測定。
多汁性−咀嚼の結果として口の中で感じられる水分（主観的）。
柔らかさ−ロイン試料を噛み切るのに必要な力（主観的）。
剪断力−あぶったチョップの柔らかさを測定したもの−低い方が良い。
【０２２６】
３．肉質データ群Ｃ
この群は、１０種の異なる商用系統からの未経産雌豚を含む。多汁性、繊維度などに始まり、容認で終る、何種類もの感覚及びテクスチャーの形質を含む、多数の肉質の形質を測定した。
【０２２７】
個々の標識関連分析については、固定効果として系統と屠殺日、ランダム効果として種雄を用い混合モデルを使用した。固定効果として遺伝子型を入力し、最小二乗平均を求めた。（表１３、１４）。単一標識関連分析により、次のような有意な関連性が明らかになった。
【０２２８】
ＣＡＳＴＨｐｙ１８８Ｉは次のような感覚と風合いの形質に影響を与える：
もろさ（Ｐ＝０．０５、遺伝子型１１はより高いＬＳ平均値と関連する）と繊維度（Ｐ＝０．０３、遺伝子型１１は数値がより低い）。調理損失は有意ではなかった（Ｐ＝０．１８）が、遺伝子型１１は数値がより低く、ホモ接合体間の相違はより有意に近い（Ｐ＜０．１０）。
【０２２９】
ＣＡＳＴ−ＰｖｕIIは次のものに影響を与える：
筋肉内脂肪（中臀筋）（Ｐ＝０．０４、遺伝子型１１は有意に脂肪が少ない）及び硬さ（Ｐ＝０．００５）。
【０２３０】
【表１３】
2005521386.tif 000032
【０２３１】
【表１４】
2005521386.tif 000033
【０２３２】
ハプロタイプ分析
三つの一般的なハプロタイプ、１、２、３を同定した。この三つの置換の組み合わせ効果をハプロタイプの置換効果として評価した。系統と屠殺日を固定効果とし、そして種雄をランダム効果として混合モデルを用いた。ハプロタイプ間の相違は、問題のハプロタイプを０、１、又は２コピー有する動物に対応して数値−１、０及び１を持つ各ハプロタイプに対する一つの変数を用いたモデルから評価した。ハプロタイプ置換効果は、恣意的に０に設定したハプロタイプ３の効果からの偏差として表した（表１５）。ハプロタイプ効果間の相違に基づき、本発明者らはいくつかの肉質の形質に対する各標識の効果を明らかにすることができた。それはハプロタイプ効果間の相違に基づき別々に帰属される。
【０２３３】
ＣＡＳＴＨｐｙ１８８Ｉは幾つかの感覚及びテクスチャーの形質に影響を与える：
硬さ（Ｐ＝０．０４）、もろさ（Ｐ＜０．０００１、ハプロタイプ１はより高い置換効果と関連する）、多汁性（Ｐ＝０．０７、ハプロタイプ１は置換効果がより高い）、繊維度（Ｐ＝０．００３）、容認（Ｐ＝０．００５）、粘度（Ｐ＝０．０２）、調理損失（Ｐ＝０．１１、ハプロタイプ１は置換効果がより低い）。
【０２３４】
ＣＡＳＴ−ＰｖｕIIは次のものに影響を与える：
硬さ（Ｐ＝０．０００５）、もろさ（Ｐ＝０．０００５）、繊維度（Ｐ＝０．０２）、容認（Ｐ＝０．００３）及び粘度（Ｐ＝０．０２）
【０２３５】
【表１５】
2005521386.tif 000034
【０２３６】
形質の説明−データ群Ｃ
調理損失−最長筋を８０℃で測定−低い方が良い。
筋肉内脂肪（ＩＭＦＧｍ）−ＮＩＧ中臀筋により測定。
硬さ−ロイン試料を噛み切るのに必要な力−低い方が良い。
繊維度−物質が分離できる容易さで測定したテクスチャー特性−低い方が良い。
多汁性−咀嚼の結果として口の中で感じられる水分−高い方が良い。
許容性、又は容認：肯定的な態度で特徴付けられる経験−高い方が良い。
もろさ−咀嚼の間に物質がより小さな小片に容易に分離できることで特徴付けられるテクスチャーの特性−高い方が良い。
粘度−硬さ×粘着性の積として定義される−低い方が良い。
【０２３７】
これらの結果は、ＣＡＳＴＨｐｙ１８８Ｉ及びＣＡＳＴＰｖｕII多型が、柔らかさ及び／又は関連のある肉質の形質の選択プログラムにおける標識として有用であることを示す発見（実施例３）をさらに支持する。ハプロタイプ１は多汁性、柔らかさ及び硬さについての好ましいハプロタイプである。ＣＡＳＴＨｐｙ１８８Ｉは、ＰｖｕIIよりも僅かに効果が大きいようである。
【０２３８】
さらに、幾つかの集団の分析及び全系統の分析では、成長／ロイン深度に対する諸効果がある（データ群Ａ）。ハプロタイプ１は、より速い成長と関連する。これらの効果は、タンパク質代謝回転に及ぼすカルパスタチン／カルパイン系の効果と関連があるか、又は、直接これらの形質に影響を与える他の遺伝子座との連鎖不均衡を反映している可能性がある。これらの形質を選択するため、（連鎖不均衡を介して）ＣＡＳＴ標識を利用することが可能である。
【０２３９】
混成系統及び系統横断的分析（データ群Ａ）では、硬さについて有意な効果が見つかった。ハプロタイプ１は、硬さについてのより低い置換効果と関連し、同じハプロタイプがＢ×ＹＦ2資源集団における好ましいハプロタイプであることも分かった（実施例３）。
【０２４０】
混成系統（データ群Ａ）では、ドリップ損失について有意な効果が見いだされた。この特定の形質に対する関連性の兆候は、他の系統／データ群でも見いだされた。
【０２４１】
肉質データ群Ｂでは、調理損失に対する極めて有意な効果が明らかになり、インストロン力及び主観的な柔らかさの尺度での有意な相違が明らかになった。ハプロタイプ分析を用いて、本発明者らは、ホモ接合体クラスの間での、調理損失における５．２９％という高度に有意な相違を検出できた。
【０２４２】
両標識は、Ｃ群の肉質についての柔らかさ、及び柔らかさに関連するいくつかの尺度に対する有意な効果を有する。これらの形質の一つ、例えば許容性について、最も悪いハプロタイプと最も良いハプロタイプの置換効果の間で、高度に有意な相違が明らかになった。
【０２４３】
一般に、ハプロタイプ１は、より柔らかくて多汁な肉、調理損失や硬さがより低く、より受け入れられるブタ肉と関連し、従って、改良された肉質を選択するのに利用することができる。
【０２４４】
本明細書で引用した文献は全て、参照によりその全体が本明細書にインコーポレートされる。これは、以下のものを含むが、これらに限定されない。
【０２４５】
引用文献
１．  アルベルナ，Ｍ．，デチュリオ，Ｒ．，パサラッカ，Ｍ．，サラミーノ，Ｆ．，ポンテレモーリ，Ｓ．，メローニ，Ｅ．，2001，「細胞内カルパスタチンの局在化の変化は、可逆性リン酸化反応により媒介される」，Biochem. J.，354, 25-30（2001）。
２．  アーンスト  Ｃ．Ｗ．，ロビック  Ａ．，ヤーレ  Ｍ．，ワン  Ｌ．，ロスチャイルド  Ｍ．Ｆ．，「ブタ染色体2q2.1-q2.4.へのカルパスタチンと３つのマイクロサテライトの位置付け」，Anim. Genet. 29: 212-215（1998）。
３．  マ，Ｈ．，ヤン，Ｈ．Ｑ，タカノ，Ｅ．，ハタナカ，Ｍ．，マキ，Ｍ．，「カルパスタチンのプロテイナーゼ阻害領域内のアミノ末端保存領域は、プロテイナーゼのカルモジュリン様の領域との相互作用によりそのカルパイン阻害活性を高める」，J. Biol. Chem. 268: 24430-24436（1994）。
４．  マーレク  Ｍ．，Ｊ．Ｃ．Ｍ．デッカース，Ｈ．Ｋ．リー，Ｔ．Ｊ．バース，Ｋ．プルーサ，Ｅ．ハフ−ロナガン，Ｍ．Ｆ．ロスチャイルド，「ブタの経済的形質に影響を与える染色体領域を同定するための分子ゲノム走査分析ＩＩ。肉と筋肉の組成」，Mammalian Genome 12, 637-645（2001）。
【図面の簡単な説明】
【０２４６】
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する添付の図は、本発明の一つの実施態様を図解し、説明と共に本発明の原理を説明するのに役立つ。
【図１ａ】図１ａは、本発明の多型を含む、ブタの骨格カルパスタチンｃＤＮＡ配列である。
【図１ｂ】図１ｂは、アミノ酸配列である。
【図２ａ】図２ａは、Ｈｐｙ１８８Ｉ多型に対する異なる遺伝子型のバンドパターンを予測した略図である。
【図２ｂ】図２ｂは、Ｈｐｙ１８８Ｉ多型の周囲の配列である（配列番号：２１）。
【図３ａ】図３ａは、ＰｖｕII多型に対する異なる遺伝子型のバンドパターンを予測した略図である。
【図３ｂ】図３ｂは、ＰｖｕII多型の周囲の配列である（配列番号：２２）。
【図４ａ】図４ａは、ＡｃｉＩ多型に対する異なる遺伝子型のバンドパターンを予測した略図である。
【図４ｂ】図４ｂは、ＡｃｉＩ多型の周囲の配列である（配列番号：２３）。
【図５ａ】図５ａは、ＡｐａＬＩ多型に対する異なる遺伝子型のバンドパターンを予測した略図である。
【図５ｂ】図５ｂは、ＡｐａＬＩ多型の周囲の配列である（配列番号：２４、２５）。
【図６】図６は、２４時間時点のカルパスタチン（calpastin)活性とＣＡＳＴＨｐｙ１８８Ｉ遺伝子型１１と１２を示すグラフである。
【図７】図７は、クラスタルＬプログラムを用いた、エキソン６多型に対するＢｏｓタウルス（配列番号：１９）配列とＳｕｓスクローファ（配列番号：２０）配列間の配置である。多型は互いに同じコドン内にある。Ｂｏｓタウルスのヌクレオチド変化は、第二ヌクレオチドの三重コドン内にあり、Ｓｕｓスクローファでは、変化は最後のヌクレオチド三重コドン内にある。どちらの変化も同類アミノ酸置換の結果生じるものである。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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