(57)【要約】細胞表面分子の発現、および微小環境における外部刺激に対する応答能に関して細胞がプロファイリングされる。外部刺激には、細胞−細胞相互作用、因子に対する応答等が含まれる。細胞は、固定化されたまたは部分的に拡散したプローブへの結合を通して、平面的または三次元的な基材上にアレイ化される。目的のプローブには、一分子または分子の組み合わせとしてアレイ化され得る、細胞表面分子に対する特異的結合パートナー、細胞応答を調節するよう作用するシグナリング・キュー、分化因子等が含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞をプロファイリングする方法であって、
細胞の集団をマイクロアレイと接触させる工程（マイクロアレイは、固体支持体の表面に安定的に会合したプローブのスポットのパターンを含み、スポットの密度は少なくとも500/cm2であってかつ10,000/cm2以下である）；および
部位特異的分析において該細胞に対する該プローブの効果を決定する工程
を含む方法。
【請求項２】
スポットの密度が少なくとも1000/cm2である、請求項1の方法。
【請求項３】
マイクロアレイが多数の異なるポリペプチド・プローブを含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
部位特異的分析が、マイクロアレイに結合した細胞の表現型の変化を決定する工程を含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
細胞集団が単一の細胞型を含む、請求項1記載の方法。
【請求項６】
細胞集団が複数の細胞型を含む、請求項1記載の方法。
【請求項７】
細胞型のうちの1個またはより多くが接触工程前に検出可能マーカーにより差次的に標識され、部位特異的分析が該マーカーの存在を検出する、請求項5記載の方法。
【請求項８】
細胞集団が単一の細胞型を含む、請求項1記載の方法。
【請求項９】
細胞が検出可能マーカーにより標識され、部位特異的分析が該マーカーの存在を検出する、請求項7記載の方法。
【請求項１０】
マイクロアレイが、細胞が結合するポリペプチドを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
マイクロアレイが、シグナリング・プローブを含む、1個またはより多くのスポットをさらに含む、請求項7記載の方法。
【請求項１２】
シグナリング・プローブが薬理学的活性を有する薬物の候補を含む、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
シグナリング・プローブがペプチド・ライブラリーを含む、請求項11記載の方法。
【請求項１４】
シグナリング・プローブが結合ペプチドと共プリントされる、請求項11記載の方法。
【請求項１５】
シグナリング・プローブが結合ペプチドに隣接している、請求項11記載の方法。
【請求項１６】
シグナリング・プローブが候補薬剤を含む、請求項11記載の方法。
【請求項１７】
シグナリング・プローブが、マイクロアレイに結合する細胞の能力の変化を引き起こし、部位特異的分析が、シグナリング・プローブの存在下または非存在下における、該アレイ中のポリペプチドに結合する細胞の能力を決定することを含む、請求項11記載の方法。
【請求項１８】
細胞が幹細胞または前駆細胞であり、マイクロアレイに結合した細胞の表現型の変化が、該細胞の分化、脱分化、または分化転換の検出を含む、請求項4記載の方法。
【請求項１９】
表現型の変化が細胞遊走の検出を含む、請求項4記載の方法。
【請求項２０】
表現型の変化が分泌タンパク質の検出を含む、請求項4記載の方法。
【請求項２１】
細胞集団が複数の細胞型を含み、表現型の変化が、2個またはより多くの異なる細胞型間の相互作用により誘導された変化の検出を含む、請求項4記載の方法。
【請求項２２】
細胞をプロファイリングする方法であって、
細胞の集団をマイクロアレイと接触させる工程（マイクロアレイは、固体支持体の表面に安定的に会合したポリペプチド・プローブのスポットのパターンを含み、スポットの密度は少なくとも500/cm2であってかつ10,000/cm2以下であり、ポリペプチドは、抗体またはそれらの断片以外である）；および
部位特異的分析において該細胞の該ポリペプチド・プローブとの結合を決定する工程を含む方法。
【請求項２３】
マイクロアレイが多数の異なるポリペプチド・プローブを含む、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
細胞集団が複数の細胞型を含む、請求項22記載の方法。
【請求項２５】
細胞型のうちの1個またはより多くが接触工程前に検出可能マーカーにより差次的に標識され、部位特異的分析が該マーカーの存在を検出する、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
細胞をプロファイリングする方法であって、
検出可能マーカーにより差次的に標識された複数の細胞型を含む細胞の集団をマイクロアレイと接触させる工程（マイクロアレイは、固体支持体の表面に安定的に会合したポリペプチド・プローブのスポットのパターンを含み、スポットの密度は少なくとも500/cm2であってかつ10,000/cm2以下である）；および
部位特異的分析において該細胞の該ポリペプチド・プローブとの差次的な結合を決定する工程
を含む方法。
【請求項２７】
固体支持体の表面に安定的に会合した抗体またはそれらの断片以外のポリペプチド・プローブのスポットのパターン（スポットの密度は少なくとも500/cm2であってかつ10,000/cm2以下である）、および該ポリペプチド・プローブに結合した細胞の集団とを含むマイクロアレイ。
【請求項２８】
固体支持体が三次元ゲルである、請求項27記載のマイクロアレイ。
【請求項２９】
固体支持体の表面に安定的に会合したポリペプチド・プローブのスポットのパターン（スポットの密度は少なくとも500/cm2であってかつ10,000/cm2以下である）、および該ポリペプチド・プローブに結合した、検出可能マーカーにより差次的に標識された複数の細胞型を含む細胞の集団とを含むマイクロアレイ。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
米国政府の支援
本発明は、米国国立衛生研究所（National Institutes of Health）より授与された契約HG009803の下で政府の支援を受けて作成された。米国政府は、本発明における一定の権利を有する。
【０００２】
序論
生細胞は、シグナリング経路、他の細胞との相互作用、構造的バリエーション、機能等を提供する独特の精巧な表面分子のセットを利用している。細胞表面受容体によって、細胞は、メッセージを探索し、それらを細胞および細胞外の微小環境と取り交わすことができる。細胞の挙動および運命は、内部の状態、ならびにそのような細胞表面分子により媒介される複雑な細胞−細胞相互作用および細胞−ECM相互作用の両方に強く依存している。シグナル伝達、およびそれに関連した分子は一種の生化学的言語を含む。いかなる多細胞生物においても、シグナル伝達メッセージが、組織の増殖、静止、死、および修復のような活性を調整している。
【０００３】
生物学的活性に関して化合物をスクリーニングする能力は、数十億ドルの産業である。多くの製薬会社が、治療標的の同定およびバリデーション、そしてリード化合物の同定および最適化に焦点を置いている。治療薬に加え、前駆細胞および幹細胞のような細胞の分化および発生を指図する化合物のスクリーニングにも、関心が寄せられている。ケモカイン、増殖因子、細胞死、白血球輸送等に関与している分子のような細胞の機能を指図するよう作用する因子も、大きく注目されている。
【０００４】
過去数年のゲノミクスおよびコンビナトリアル・ケミストリーのアプローチに起因した、可能性のある新たな標的および化学物質の数の爆発的増加によって、スクリーニング・プログラムには莫大な圧力がかかっている。有用薬物の同定に対する報いは莫大であるが、スクリーニングプログラムからのヒットの割合は一般に極めて低い。望ましい化合物スクリーニング法は、多くの個々の化合物が試験され得るような高いスループットを可能にし；かつスクリーニング・アッセイ法により生成した情報と化合物の薬学的有効性との間に良好な相関が存在するよう、生物学的に妥当な情報を提供することにより、この問題を解決する。
【０００５】
さらに、細胞生理学には、分裂したり接合したりする複数の経路、特異作用の実行の重複、および異なる経路の活性の修飾による一経路の変化に対する応答が含まれる。候補薬物がいかにして作用するか、そして所望の効果が存在するか否かを理解するためには、薬物が反応する標的タンパク質のみならず、タンパク質活性の阻害が所望の応答をもたらすか否かを知ることが必要である。作用機序、細胞の効果、および臨床上の性能の、より良好な、より迅速な、より効率的な予測を提供し得るスクリーニング・アッセイ法の開発は、多数の領域において極めて重要であり、そしてそれは本発明において解決される。
【０００６】
従って、（i）細胞の型および状態を同定し、（ii）細胞および細胞外の微小環境を調節し、 （iii）運命／挙動を再現可能に操作し、そして（iv）調節された環境の精巧なセットとの相互作用を分析する能力は、診断、治療、および研究の目的にとって極めて重要である。
【０００７】
関連出版物
タンパク質マイクロアレイは、国際特許出願国際公開広報第00/63701号に記載されている。米国特許第4,591,570号は、抗原の決定のための、抗体でコーティングされたスポットのマトリックスを開示している。抗体マイクロアレイを使用した細胞の免疫学的表現型決定（Immunophenotyping）は、Belovら（2001）Cancer Research 61：4483-4489において考察されている。明確なcDNAを発現する細胞のマイクロアレイは、Ziauddinら（2001）Nature 411：107-110において考察されている。
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
細胞表面分子の発現および微小環境における外部刺激に対する応答能に関して細胞がプロファイリングされる、細胞プロファイリングのための組成物および方法が提供される。外部刺激には、細胞−細胞相互作用、因子に対する応答等が含まれる。細胞は、固定化されたまたは部分的に拡散したプローブへの結合を通して、平面的または三次元的な基材上にアレイ化される。目的のプローブには、一分子または分子の組み合わせとしてアレイ化され得る、細胞表面分子に対する特異的結合パートナー、細胞応答を制御するよう作用するシグナリング・キュー（cues）、分化因子等が含まれる。その技術は、接着細胞および懸濁細胞の両方に適用され得る。アレイ化された後、それらの細胞は、特徴決定されてもよいし、または目的の刺激に対する応答を決定するのに十分な期間、培養維持されてもよい。
【０００９】
本発明の方法は、パラレルな多くの細胞表面マーカーの受動的および能動的なプロファイリング、特定の細胞型のプログラム化されたパターン化、任意の組み合わせおよび／または濃度で沈着させられ得る多様な固定化されたまたは拡散したキューによる細胞のハイスループットの刺激、その後の表現型の調査および／またはスクリーニング、ならびに細胞−細胞相互作用および細胞−ECM相互作用の研究を可能にする。
【００１０】
細胞の寸法に近い分解能および地形サイズで画定された位置に細胞を特異的に捕捉することができるため、プログラム化された細胞パターン化が可能となり、そして相互作用が調査され得るよう密接に異なる細胞型を並置させることが可能となる。これらの特色のため、細胞マイクロアレイは、細胞−細胞相互作用および細胞−ECM相互作用の研究、細胞遊走アッセイ法、分泌アッセイ法、ならびに能動的（active）および受動的（passive）なプロファイリング・アッセイ法に適している。マイクロアレイは、場合により、ウェル内にアレイを作出することにより、マルチウェル型プラットフォームへ取り込まれてもよい（ウェル内プリンティング）。
【００１１】
態様の詳細な説明
細胞プロファイリング・マイクロアレイは、細胞表面分子の発現および微小環境における外部刺激に対する応答能に関する、細胞の特徴決定を可能にする。外部刺激には、細胞−細胞相互作用、因子に対する応答等が含まれる。細胞は、固定化されたまたは部分的に拡散したプローブとの結合を通して平面的または三次元的な基材上にアレイ化される。アレイ化された後、それらの細胞は、特徴決定されてもよいし、または目的の刺激に対する応答を決定するのに十分な期間、培養維持されてもよい。
【００１２】
目的のプローブには、細胞表面分子に対する特異的結合パートナー、細胞応答を制御するよう作用するシグナリング・キュー、分化因子等が含まれ、それらは、一分子または分子の組み合わせとしてある範囲の濃度でアレイ化され得る。一般的には、マイクロアレイ上の各位置は、「結合プローブ」とも呼ばれ得る、細胞表面分子に対するポリペプチド特異的結合パートナーであるプローブを、少なくとも1個含む。プローブ分子を固体基材上に特異的な位置および量で置くことを意味するプローブの「プリンティング」は、多細胞構造のパターン化された組み立て、遊走、およびプログラミングを指図するために使用され得る。例えば、2個の別個の細胞型が、それらの相互作用が体系的に観察され得るよう、特定の物理的方向で並置され得る。
【００１３】
目的の結合プローブには、例えば細胞表面抗原と結合し得る抗体およびそれらの断片；接着分子；細胞外マトリックス成分；受容体リガンド；抗原を保持しているMHC構築物等が含まれる。結合メンバーの高い親和性および特異性は、表面抗原の発現レベルを反映する独特の細胞接着パターンをもたらす。ある範囲の細胞および結合メンバーにおいて、捕捉される細胞の数は同族タンパク質の発現レベルに比例するであろう。異なる細胞集団を差次的に予め標識した後、スライド上でインキュベートし、多色イメージングを行うことにより、細胞表面マーカーの発現の差に基づく細胞の識別が容易になる。
【００１４】
結合プローブに加え、シグナルを生成させるか、または細胞の増殖、表現型、生存可能性等に影響を与えるプローブが使用されてもよく、それらは、例えば、マイクロアレイ基材に結合させられてもよいし、基材上に部分的に拡散させられてもよいし、培地中に存在してもよい。「シグナリング・プローブ」とも呼ばれ得るそのようなプローブには、多様なポリペプチド、およびその他の生物学的活性を有する分子、例えばケモカイン、サイトカイン、増殖因子、分化因子、薬物、ポリヌクレオチド等が含まれる。結合プローブがシグナリング・プローブとしても作用してもよいことが、当業者には理解されるであろう。
【００１５】
細胞の調節された選択および位置を提供することにより、特定の表現型、発生経路、または活性化経路を提供するシグナル、微小環境、および条件が、特定の細胞型において、体系的かつ厳密に探究され得る。そのような経路には、例えば、タンパク質、その他の環境的キュー、直接的な細胞−細胞接触等による細胞の刺激が含まれ、目的の細胞間の双方向コミュニケーションも含まれ得る。プリントされるキューの自由な選択によって、インビボ対応物により示される必須の特色を模倣し、それにより細胞との相互作用を研究するための単純化されたモデル系として機能し得る、明確な微小環境の再構築が可能となる。プリントされるシグナリング・プローブの用量を調節することにより、特定の細胞型に関する活性化および応答の曲線が作出され、活性化後のイベントがイメージングされ得る。キューを体系的に混合することにより、特定の過程の協力作用構造が明らかとなり得、いくつかの一般的な規則が明らかとなる可能性がある。同様に、画定された天然に存在するシグナリング・キューの総合的なセットからパラレルにデータを収集することにより、細胞が利用している「言語」の理解が劇的に高まる可能性がある。目的の細胞には、多数の重要な過程を各々含んでいる極めて多様な型が含まれ、例えば、抗原、サイトカイン、もしくはその他の刺激により活性化された、または目的の組織へとホーミングしている免疫細胞；グリア細胞または血管細胞と相互作用している発生中のニューロン；受精後の初期発生経路を進んでいる胚性幹（ES）細胞；遊走および分化している幹細胞および癌細胞；アポトーシスを起こすよう誘導された癌細胞等が含まれる。
【００１６】
細胞−マイクロアレイには、細胞刺激および薬物発見のための既存のマルチウェル型アプローチに対する利点がある。マルチウェル・プレートにおいては、細胞は、包括的に適用された、一般的には可溶性である因子に曝され、そして細胞は、他のウェルにおいてセットアップされた条件を探索することができない。対照的に、マイクロアレイ・フォーマットは、細胞が自由に運動し、周囲のスポットにプリントされた近隣の環境を探索することができる、開放的な微小環境を支持する。開放的な微小環境の概念が、はるかに小さな地形サイズと組み合わせられることによって、細胞−マイクロアレイ・フォーマットは、特異的な細胞パターン化、ならびに局所的な細胞の刺激、遊走、分泌、細胞−細胞相互作用、および細胞−ECM相互作用のアッセイ法のための非常に優れた方法となる。
【００１７】
さらに、本発明の技術は、既存の表現型決定法より高いスループットを与え、より迅速で、より単純で、より安価である。細胞の外因性シグナルに対する応答能を利用するその技術は、細胞の選択的な捕捉、およびプローブにより媒介される細胞操作の使用を提供する、細胞操作のための独特の道具である。
【００１８】
本発明の方法は、細胞試料、例えば生検試料、血液試料等のプロファイリングおよび分類のための臨床的診断において有益である。幹細胞分化を特異的に方向付けまたは操作することが可能であり、薬物を所望の表現型に関してスクリーニングすることが可能である。さらに、本法は、細胞、例えば幹細胞、癌細胞等に存在する受動的および能動的なマーカーを検索するために使用され得る。
【００１９】
定義
本発明の方法を記載する前に、本発明が記載する特定の方法に制限されず、当然、変動し得ることを理解されたい。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書において使用される用語法は、特定の態様を記載することのみを目的とし、本発明を制限するものではないことも理解されたい。
【００２０】
ある範囲の値が提供される場合には、その範囲の上限と下限との間に入る値（特記しない限り、下限の単位の10分の1まで）、およびその記述された範囲の中のその他の任意の記述された値または間に入る値が、本発明に包含されることを理解されたい。これらの比較的小さな範囲の上限および下限は、独立に、その比較的小さな範囲に含まれることができ、記述された範囲の中に特別に排除される限度がある場合もある。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形の「一つの（a）」、「および（and）」、および「その（the）」には、特記しない限り、複数の支持対象が含まれる。
【００２１】
他に定義しない限り、本明細書において使用された技術用語および科学用語は、全て、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有している。本明細書に記載されたものと類似しているかまたは等価である任意の方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法および材料が以下に記載される。本明細書において言及された出版物は、全て、その出版物の引用に関連した方法および／または材料を開示し記載するために参照として本明細書に組み込まれる。
【００２２】
本明細書に記された出版物は、本願の出願日より前の開示のためにのみ提供される。本明細書は、先行発明のためそのような出版物に本発明が先行している権利を有しないことの承認として解釈されるべきではない。さらに、提供された出版物の日付は、実際の出版日とは異なる可能性があり、それらは、独立に確認される必要があるかもしれない。
【００２３】
基材
本発明のプローブが、自由な形状の予定された空間的アレイで付着させられ得る任意の表面。アレイは、単一プローブ型のデュプリケートを含む、予定された様式でパターン化された多数の異なるプローブを含み得る。
【００２４】
柔軟な基材および硬直な基材を含む多様な固体支持体または基材が、本発明の目的に適している。柔軟とは、支持体が、破壊されることなく屈曲、折り畳み、または類似の操作を施され得ることを意味する。柔軟な固体支持体の例には、アクリルアミド、ナイロン、ニトロセルロース、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレートのようなポリエステルのフィルム等が含まれる。また、細胞が、固定化されていてもまたは拡散していてもよいキューに完全または部分的に曝されながら、三次元環境に残留することを可能にするゲル（例えば、コラーゲン・ゲル、マトリゲル、およびECMゲル）も、含まれる。本明細書においては、そのような現実化を3Dアレイと呼ぶ。硬直な支持体とは、容易には屈曲しないものであり、ガラス、溶融シリカ、石英；プラスチック、例えばポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、それらの混和物等；金属、例えば金、白金、銀等、等を含む。さらに、硬直な支持体は、電気的な記録および刺激のための多電極アレイ、またはキューが分注され得るその他の任意の目的の構築物を取り込むこともできる。
【００２５】
誘導体化されたスライドおよびコーティングされたスライドは、特に重要である。そのようなスライドは、商業的に入手されてもよいし、または常法を使用して作製されてもよい。例えば、SuperAldehyde（商標）基材は、ガラス表面に共有結合的に付着した一次アルデヒド基を含有している。コーティングされたスライドには、ニトロセルロースのフィルム（FastSlides（商標）、Schleicher＆Schuell）、正の電荷を有するナイロン・メンブレン（CastSlides（商標）、Schleicher＆Schuell）、およびポリアクリルアミド・マトリックス（HydroGel（商標）、Packard Bioscience）等が含まれる。
【００２６】
基材は、フィルター、ファイバー、メンブレン、ビーズ、粒子、ディップスティック（dipstick）、シート、ロッド等を含む多様な外形をとり得るが、一般的には、平面的または三次元的なジオメトリーが好ましい。基材を製造するための材料は、非特異的結合が好ましい特定の場合を除き、理想的には、結合イベント中に低レベルの非特異的結合を示すべきである。
【００２７】
本発明の一つの態様において、基材は平面的な表面を含み、結合メンバーはアレイとして表面にスポットされる。基材上の結合メンバー・スポットは、任意の便利な形状であり得るが、多くの場合、円形、楕円形、卵形、またはその他の類似の曲線状の形状であろう。固体表面上のスポットの局所的な密度は、少なくとも約500/cm2、一般的には少なくとも約1000/cm2であり得るが、約10,000/cm2を超えず、一般的には5000/cm2を超えない。スポット間距離（中心から中心まで）は、一般的には約100μm〜約200μmである。スポットは支持体の表面の全域に、または表面上に、格子が形成されるような行列、円形パターン等のような任意の便利なパターンで配置され得るが、一般に、スポットのパターンは、固体支持体の表面の全域に、格子の形態で存在するであろう。
【００２８】
本発明の基材は、任意の便利な手段を使用して調製され得る。支持体を調製する一つの手段は、結合メンバーを合成し、次いで、支持体表面上にスポットとして沈着させることである。結合メンバーは、自動固相合成プロトコル、モノクローナル抗体培養、血清からの単離、組み換えタンパク質技術等のような任意の便利な方法論を使用して調製され得、そのような技術は当技術分野において既知である。次いで、調製された結合メンバーは、手動の技術、例えばマイクロピペット、インクジェット、ピン等、および自動プロトコルを含む、任意の便利な方法論を使用して、支持体上にスポットされ得る。特に重要であるのは、Beckman Biomek 2000（Beckman Instruments）のような自動スポッティング装置である。多数の接触式および非接触式マイクロアレイ・プリンターが入手可能となっており、基材上に結合メンバーをプリントするために使用され得る。例えば、非接触式プリンターは、Perkin Elmer（BioChip Arrayer（商標）、Packard）より入手可能である。接触式プリンターは、TeleChem International（Arraylt（商標））より商業的に入手可能である。非接触式プリンターは、軟質の／柔軟な表面との適合性が高いため、特に重要である。
【００２９】
基材上の結合メンバー・スポットの総数は、望ましい場合、異なる結合プローブの数および探究される条件、ならびに対照スポット、較正スポット等の数に依って変動し得る。一般に、支持体の表面上に存在するパターンは、少なくとも約10個の別個のスポット、一般的には少なくとも約200個の別個のスポット、より一般的には少なくとも約500個の別個のスポットを含むと考えられる。ここで、スポットの数は、50,000またはより高くてもよいが、一般的には約25,000個の別個のスポットは越えず、より一般的には約15,000個の別個のスポットを越えないと考えられる。別個のプローブ組成物は、各々、結果の内部相関を提供するため、デュプリケートまたはそれ以上（一般的には、少なくとも5レプリカ）で存在しうる。また、（幹細胞の運命の操作、および細胞の群が増殖し数個のスポットを占拠する傾向があるその他の場合のような）いくつかの課題については、各々が数個の同一スポットを含むブロックを複製することが望ましい。
【００３０】
（好ましくは平らな表面を有する）マルチウェル・プレートの表面上にプリントすることにより、アレイ・アプローチの利点を、マルチウェル・アプローチの利点と組み合わせることが可能となる。標準的なマイクロアレイヤー（microarrayers）におけるチップ間の間隔は、384ウェルプレートおよび96ウェルプレートの両方と適合性であるため、数個のウェルに各ロードを同時にプリントすることが可能である。ウェルへのプリンティングは、接触式技術および非接触式技術の両方を使用して行うことができ、後者は平らでないマルチウェル・プレートにも適合性である。
【００３１】
各スポットに存在する結合メンバーの量は、アレイが利用されるアッセイ法において適切な細胞の結合を提供するのに十分なものである。スポットは、一般的には全体的な円形の寸法を有し、その直径は、約10〜5,000μm、一般的には約20〜1000μm、より一般的には約50〜500μmの範囲であろう。結合メンバーは、約0.0025〜約10μg/mlの濃度で溶液中に存在し、結合曲線等を決定するために段階希釈され得る。
【００３２】
結合メンバーまたは結合プローブ
本明細書において使用されるように、分子のうちの一方（即ち、第一の結合メンバー）が、化学的または物理的な手段により、他方の分子（即ち、第二の結合メンバー）と特異的に結合するような結合対、即ち2個の分子、一般的には2個の異なる分子のメンバーをさす。特異的結合対の相補メンバーは、リガンドと受容体；または受容体とカウンターレセプターと呼ばれる場合もある。本発明の目的のため、2個の結合メンバーは、例えばアッセイ法が既知の結合対の会合を妨害する化合物の検出するためのものである場合には、相互に会合することが既知のものであり得る。または、目的の化合物に対する結合パートナーであると推測される候補化合物が使用されてもよい。
【００３３】
重要な特異的結合対には、炭水化物とレクチン；相補的なヌクレオチド配列；ペプチド・リガンドと受容体；エフェクターと受容体分子；ホルモンとホルモン結合タンパク質；酵素補因子と酵素；酵素阻害剤と酵素等が含まれる。特異的結合対には、最初の特異的結合メンバーの類似体、誘導体、および断片が含まれ得る。例えば、受容体とリガンドの対には、ペプチド断片、化学的に合成されたペプチド模倣体（peptidomimetic）、標識されたタンパク質、誘導体化されたタンパク質等が含まれうる。細胞外マトリックスに見出されるものを含む、ポリペプチド、糖タンパク質、およびプロテオグリカンに結合するプローブは、特に重要である。本発明のいくつかの態様において、結合プローブは、抗体または抗体断片以外のポリペプチドである。
【００３４】
シグナリング・プローブ
シグナリング・プローブは、特異的な細胞結合のための薬剤として使用されてもよいし、または結合プローブと共に提供されてもよい。細胞における表現型の変化を誘発することができる任意の分子が、シグナリング・プローブとして使用され得る。シグナリング・プローブは、他の細胞型の産物（例えば、疾患に関連した、または正常な状況もしくは発生中に分泌される、発現されたタンパク質）であってもよいし、ECMに関連した化合物であってもよいし、天然に存在する因子をシミュレートする化合物であってもよいし、細胞の断片であってもよいし、膜を含まない、もしくはミクロソームの一部としての表面膜タンパク質等であってもよい。
【００３５】
シグナリング・プローブは、個々に使用されてもよいし、または組み合わせて使用されてもよい。例示的な天然に存在する因子には、天然起源から単離されてもよいし、または組み換え技術もしくは合成により作製されてもよいサイトカイン、ケモカイン、分化因子、増殖因子、可溶性受容体、ホルモン、プロスタグランジン、ステロイド等、他の化合物または細胞型の作用を模倣する化合物、例えば標的受容体のリガンドとして作用する合成薬のような因子と同様に作用する、もしくは因子を模倣する抗体が含まれる。例えば、T細胞受容体の場合、抗原提示細胞により抗原からプロセシングされ提示されたオリゴペプチドの作用等が利用され得る。関連因子のファミリーが、単一の呼称、例えば、IL-1、VEGF、IFN等で呼ばれる場合には、単一の記載に、その群のメンバーのうちの1個または数個または全てが含まれるものとする。化合物は、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、それらの誘導体、構造的類似体、または組み合わせを含む生体分子間に見出される。
【００３６】
シグナリング・プローブには、サイトカイン、ケモカイン、およびその他の因子、例えば増殖因子が含まれ、そのような因子には、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、TGF、FGF、EGF、TNF-α、GH、コルチコトロピン、メラノトロピン（melanotropin）、ACTH等、細胞外マトリックス成分、インテグリンおよびアドヘシン（adhesin）のような表面膜タンパク質、ならびにインビボで標的細胞またはそれらの周囲の環境により発現されるその他の成分が含まれる。成分には、可溶性の、もしくは固定化された、組換えの、もしくは精製された受容体、または受容体に対する抗体もしくはリガンド模倣体（mimetic）も含まれ得る。
【００３７】
薬理学的活性を有する薬物、遺伝学的活性を有する分子等も含まれる。重要な化合物には、化学療法剤、抗炎症性剤、ホルモンまたはホルモン・アンタゴニスト、イオンチャネル修飾剤、および向神経活性剤が含まれる。本発明のための結合対メンバーとして適当な化合物の例は、The Pharmacological Basis of Therapeutics、GoodmanおよびGilman、McGraw- Hill、New York、New York（1993）の、セクション：Drugs Acting at Synaptic and Neuroeffector Junctional Sites；Drugs Acting on the Central Nervous System；Autacoids：Drug Therapy of Inflammation；Water,Salts and lons；Drugs Affecting Renal Function and Electrolyte Metabolism；Cardiovascular Drugs；Drugs Affecting Gastrointestinal Function；Drugs Affecting Uterine Motility；Chemotherapy of Parasitic Infections；Chemotherapy of Microbial Diseases；Chemotherapy of Neoplastic Diseases；Drugs Used for Immunosuppression；Drugs Acting on Blood-Forming organs；Hormones and Hormone Antagonists；Vitamins,Dermatology；およびToxicology（全て、参照として本明細書に組み込まれる）に記載されている。毒素、生物兵器、または化学兵器も含まれる。例えば、Somani,S.M.（編）、「Chemical Warfare Agents」、Academic Press、New York、1992を参照のこと。
【００３８】
細胞
本発明のアッセイ法において使用するための細胞は、生物、生物に由来する単一の細胞型であってもよいし、またはインビボ状況に典型的であるような、細胞型の混合物であってもよいが、特定の環境、例えば血管組織、肝臓、脾臓、心筋、脳組織等に存在する異なる細胞であってもよい。
【００３９】
本発明は、単一の細胞型または細胞系であり得る初代細胞、正常細胞系、形質転換細胞系、形質導入細胞、および培養細胞、またはそれらの組み合わせを含む、任意の細胞型に使用するのに適している。アッセイ法において、培養細胞は、天然に存在する対応物において応答を誘発する刺激に対する応答能を維持し得る。培養細胞は、5代目以降、時には10代目以降のものであり得る。これらは、全ての起源、特に哺乳動物、種に関しては例えばヒト、サル、げっ歯動物等に由来しうるが、植物、真菌等；組織起源、例えば心臓、肺、肝臓、脳、血管、リンパ節、脾臓、膵臓、甲状腺、食道、腸、胃、胸腺等のような、その他の細胞起源も、いくつかの場合においては重要である可能性がある。
【００４０】
さらに、遺伝学的機能の獲得または喪失を提供するため、例えば組換え遺伝子のトランスフェクションもしくは形質導入により、またはアンチセンス技術により遺伝学的に改変された細胞が、本発明において利用され得る。遺伝学的に修飾された細胞を作製するための方法は、当技術分野において既知であり、例えば「Current Protocols in Molecular Biology」、Ausubelら編、John wiley＆Sons、New York、NY、2000を参照のこと。遺伝学的改変は、一般的には相同的組み換えにより標的遺伝子の発現をノックアウトする欠失を起こすノックアウトであってもよいし；または、細胞に通常は存在しない遺伝子配列を安定的に導入するノックインであってもよい。
【００４１】
部位特異的組換え、アンチセンスの発現、またはドミナント・ネガティブ変異等を含む、ノックアウトを達成するための多様な方法が、本発明において使用され得る。ノックアウトは、遺伝子ターゲティングの場合、内因性遺伝子の対立遺伝子の一方または両方の機能の部分的または完全な欠損を有する。好ましくは、標的遺伝子産物の発現は、分析される細胞において検出不可であるかまたは有意でない。これは、コーディング配列の破壊の導入、例えば1個またはより多くの終止コドンの挿入、DNA断片等の挿入等、コーディング配列の欠失、コーディング配列の終止コドンへの置換等により達成され得る。いくつかの場合、導入された配列は、最終的にはゲノムから欠失させられ、元の配列に対する正味の変化を残す。
【００４２】
異なるアプローチが、「ノックアウト」を達成するために使用されてもよい。非コーディング領域、特にプロモーター領域、3'制御配列、エンハンサーの欠失、または標的遺伝子の発現を活性化する遺伝子の欠失を含む、元の遺伝子の全部または一部の染色体欠失が誘導され得る。機能的ノックアウトが、元の遺伝子の発現を阻止するアンチセンス構築物の導入により達成されてもよい。「ノックアウト」には、例えば、標的遺伝子改変を促進する物質への動物の曝露、標的遺伝子部位（例えば、Cre-lox系のCre）における組み換えを促進する酵素の導入、または標的遺伝子改変を指図するためのその他の方法により標的遺伝子の改変が起こるような、条件付きノックアウトも含まれる。
【００４３】
遺伝子構築物は、リン酸カルシウム・トランスフェクション、ウィルス感染、マイクロインジェクション、または小胞融合を含む、多数の任意の経路により、組織または宿主細胞へ導入され得る。Furthら（1992）、Anal Biochem 205：365-368により記載されたようなジェット注射が、筋肉内投与のため使用され得る。DNAは金微粒子上にコーティングされ、粒子砲撃装置、または文献（例えば、Tangら（1992）、Nature 356：152-154参照）に記載されるように「遺伝子銃」により、皮内に送達されうる。この場合、DNAは微小発射体（microprojectiles）にコーティングされ、次いで細胞へ砲撃される。
【００４４】
本発明の発明において有益な細胞型には、幹細胞および前駆細胞、例えば胚性幹細胞、造血幹細胞、間葉幹細胞、神経冠細胞等、内皮細胞、筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、間葉細胞、上皮細胞；Th1 T細胞、Th2 T細胞、Th0 T細胞、細胞障害性T細胞のようなT細胞；B細胞、プレB細胞等を含むリンパ球；単球；樹状細胞；好中球；およびマクロファージ；ナチュラルキラー細胞；肥満細胞等のような造血細胞；脂肪細胞、胸腺、内分泌腺、膵臓、ニューロン、グリアのような脳のような特定の器官に関連した細胞、星状細胞、デンドロサイト（dendrocyte）等、ならびにそれらの遺伝学的に改変された細胞が含まれる。造血細胞は、炎症過程、自己免疫疾患等に関連し、内皮細胞、平滑筋細胞、心筋細胞等は、心臓血管疾患に関連し；ほぼ全ての型の細胞が、肉腫、癌腫、およびリンパ腫のような新形成に関連し；肝細胞は肝臓病；腎細胞は腎臓病等に関連し得る。
【００４５】
細胞は、種々の型の形質転換細胞または新生物細胞、例えば種々の細胞起源の癌腫、種々の細胞型のリンパ腫等であってもよい。アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Manassas,VA）は、150を超える異なる種からの4,000を超える細胞系、700のヒト癌細胞系を含む950を超える癌細胞系を収集し、それらを利用可能にしている。国立癌研究所（National Cancer Institute）は、ヒト腫瘍細胞系の大きなパネルからの臨床的、生化学的、および分子的なデータを編集しており、これらは、ATCCまたはNCIより入手可能である（Phelpsら（1996）Journal of Cellular Biochemist Supplement 24：32-91）。個々の細胞系から自発的に派生した、または所望の増殖もしくは応答特徴のため選択された異なる細胞系も含まれ；類似した腫瘍型に由来するが別個の患者または部位に由来する複数の細胞系も含まれ得る。
【００４６】
細胞は、非接着細胞、例えば単球、T細胞、B細胞を含む血球；腫瘍細胞等であってもよいし、または接着細胞、例えば上皮細胞、内皮細胞、神経細胞等であってもよい。接着細胞をプロファイリングするためには、プローブ分子を認識しそれと結合する能力が維持されるような様式で、接着している基材およびその他の細胞からそれらを解離させなければならない。プロテアーゼ消化等を含む、細胞を解離させる方法は、技術分野において既知である。好ましくは、解離法は無酵素解離培地を使用する。
【００４７】
微小環境
細胞の微小環境または環境には、細胞、培地、因子、時間、および温度が包含される。環境には、薬物およびその他の化合物、特定の大気条件、pH、塩組成、無機質等も含まれ得る。細胞の培養は、典型的には、例えば加湿された92〜95％空気／5〜8％CO2雰囲気を含有しているインキュベーター内で、37℃で、無菌環境で実施される。細胞培養は、ウシ胎仔血清のような不明確な生物学的液体を含有している栄養素混合物、または完全に画定された無血清の培地において実施され得る。多様な培養培地が当技術分野において既知であり、商業的に入手可能である。
【００４８】
表現型
入力変数に対する細胞の応答を決定するため、カルシウム流動、BrdU取り込み、内因性レポーター、トランスジーン・レポーター、代謝的レポーターの発現、（例えば、電圧感受性色素による）電気的活性、細胞産物の放出、細胞運動性、サイズ、形状、生存可能性、および結合等を含む、様々な細胞出力が査定され得る。（細胞が3Dゲル内に埋め込まれている場合のような）いくつかの場合においては、局所的なpHレベルまたは02およびCO2の濃度すらアッセイされ得る。一般に、分析は部位特異的な決定を提供する。即ち、スポットに局在している細胞が、細胞が局在しているスポットと相関する表現型に関して、個々に、またはスポット特異的に分析される。
【００４９】
シグナリング・プローブまたは微小環境に応答した細胞の表現型は、細胞の様々な面の変化を通して、一般的には、細胞の定量可能な特徴であるパラメーターを通して検出され得る。特徴には、細胞の形態学、増殖、生存可能性、目的の遺伝子の発現、他の細胞との相互作用が含まれ、定量可能なパラメーター、正確に測定され得るパラメーターの変化が含まれる。
【００５０】
パラメーターは、細胞表面決定因子、受容体、タンパク質、またはそれらのコンフォメーション修飾物もしくは翻訳後修飾物、脂質、炭水化物、有機もしくは無機の分子、核酸、例えばmRNA、DNA等、またはそのような細胞成分に由来する一部、またはそれらの組み合わせを含む、任意の細胞成分または細胞産物であり得る。パラメーターは、定量的読み取りを提供し、いくつかの場合においては半定量的または定性的な結果を提供する。読み取りは、単一の決定された値を含みうり、または平均、中央値、分散等を含みうる。可変性が予想され、試験パラメーターのセットの各々に関する値の範囲が、単一の値を提供するために使用される通常の統計法と共に標準的な統計法を使用して得られると考えられる。
【００５１】
目的のパラメーターには、細胞質の、細胞表面の、または分泌型の生体分子、多くの場合には、生体高分子、例えばポリペプチド、多糖、ポリヌクレオチド、脂質等の検出が含まれる。細胞表面分子および分泌型分子は、細胞コミュニケーションおよび細胞エフェクター応答を媒介し、容易にアッセイされ得るため、有用なパラメーターの型である。一つの態様において、パラメーターには、特異的エピトープが含まれる。エピトープは、多くの場合、特異的なモノクローナル抗体または受容体プローブを使用して同定される。いくつかの場合、エピトープを含む分子体は、2個またはより多くの物質に由来し、画定された構造を含む。その例には、異種二量体インテグリンに関連したコンビナトリアルに決定されたエピトープが含まれる。パラメーターは、特異的に修飾されたタンパク質またはオリゴ糖、例えばSTAT転写タンパク質のようなリン酸化タンパク質；または硫酸化オリゴ糖、または炭水化物構造シアリル・ルイスx、セレクチン・リガンドの検出であってもよい。
【００５２】
パラメーターは、特異的なモノクローナル抗体、またはリガンドもしくは受容体と結合する決定因子により画定され得る。パラメーターには、CD抗原（CD1〜CD247）のような細胞表面分子、インテグリンを含む細胞接着分子、CLAおよびシアリル・ルイスxのようなセレクチン・リガンド、ならびに細胞外マトリックス成分の存在が含まれうる。パラメーターには、IL-2、IL-4、IL-6、増殖因子等を含む、リンホカイン、ケモカイン等のような分泌型産物の存在も含まれ得る。
【００５３】
プロファイリング法
受動プロファイリング
受動プロファイリング法においては、接着細胞または非接着細胞であり得る細胞の懸濁物が、結合プローブ分子のマイクロアレイに結合させられる。前記のような懸濁細胞集団が、結合したプローブを含むマイクロアレイに添加される。その懸濁物は、カバーのない基材、もしくはカバーグラス下の基材、または固定された容積の「ハイブリダイゼーション」もしくは「染色」もしくは「潅流」チャンバーへ適用される。受動的プロファイリング・アッセイ法において、プローブは、十分に強力かつ特異的に細胞と相互作用することができる、任意の型の分子であり得る。一つの態様において、プローブは抗体またはそれらの断片である。もう一つの態様において、プローブは、細胞接着分子（CAM）および細胞外マトリックス（ECM）成分、例えばラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン、ビトロネクチン、テネイシン、リストリクチン（restrictin）、ヒアルロン酸等、サイトカイン；増殖因子等を含む、抗体以外のポリペプチドである。インキュベーション時間は、細胞がプローブに結合するのに十分なものであるべきである。一般に、約4分〜1時間で十分であり、一般的には、20分で充分である。
【００５４】
多くのアッセイ法は生細胞を用いて実施されるが、受動アッセイ法は固定細胞を用いても実施され得る。様々な濃度のPFA、グルタルアルデヒド、メタノール、酢酸等のような試薬で固定された細胞が、単独で、または非固定細胞と比較して使用され得る。
【００５５】
インキュベーションの後、不溶性支持体は一般に非特異的に結合した細胞を除去するため、細胞の生存可能性および結合の特異性を維持する任意の培地、例えばDMEM、イスコブ（Iscove）培地、（Ca＋＋およびMg＋＋を含む）PBS等で洗浄される。洗浄回数は、各洗浄後に非特異的結合の程度を観察することにより、各々の適用および細胞型について実験的に決定されるべきである。通常、1〜6回の洗浄が、試料中に存在する非特異的に結合した細胞を徹底的に洗浄するため十分な容積で利用されるであろう。
【００５６】
受動プロファイルは、絶対的であってもよいしまたは差次的であってもよい。絶対プロファイルにおいては、単一の細胞型がマイクロアレイに添加され、結合した細胞の数が検出される。占拠されたスポットは、結合プローブに対応する細胞表面マーカーの存在を意味する。ある範囲の細胞およびプローブの濃度では、発現レベルが高いほど捕捉される細胞の数も多くなる。しかしながら、絶対プロファイルはスポットおよびスライドに関連した変動の影響を受けやすい。
【００５７】
差次的プロファイルとは、2個またはより多くの細胞型／集団が、異なる標識で予め標識され、組み合わせられ、単一のスライドに適用され、そこでプローブ分子との結合に関して競合する競合アッセイ法である。洗浄後、スライドは、スキャンされ、各細胞型について存在する標識の相対数に関してスコア化される。
【００５８】
各型からの結合した細胞の存在を検出するためには、多様な方法が使用され得る。絶対アッセイ法においては、細胞は全く標識されなくてもよいし、または検出可能標識で標識され、結合した標識の量が直接測定されてもよい。差次的アッセイ法においては、標識された細胞が、差次的に標識されたまたは未標識の細胞と混合され、読み取りは、所定の標識を含む（または標識を含まない）ピクセルの相対数または所定の標識を含む（または標識を含まない）細胞の相対数のいずれかに基づき得る。さらにもう一つの態様においては、細胞自体は標識されず、細胞型特異的な標識された二次試薬が、各型からの細胞の相対数を定量するため、または細胞の表現型を決定するために添加される。いくつかの場合において、細胞は定量的に測定されず、形態学、接着等のような表現型の変動に関して観察されると考えられる。
【００５９】
結合した細胞の直接測定を許容する標識の例には、3Hまたは125Iのような放射標識、蛍光物質、色素、ビーズ、化学発光物質、コロイド粒子等が含まれる。フルオレセインイソチオシアネート（FITC）；ローダミンおよびローダミン誘導体；テキサスレッド；フィコエリトリン；アロフィコシアニン；6-カルボキシフルオレセイン（6-FAM）；2',7□-ジメトキシ-4□,5□-ジクロロ-6-カルボキシフルオレセイン（JOE）；6-カルボキシ-X-ローダミン（ROX）；6-カルボキシ-2□,4□,7□,4,7-ヘキサクロロフルオレセイン（HEX）；5-カルボキシフルオレセイン（5-FAM）；N,N,N□,N□-テトラメチル-6-カルボキシローダミン（TAMRA）；スルホン化ローダミン；Cy3；Cy5等を含む、適当な蛍光色素は、技術分野において既知である。
【００６０】
細胞マイクロアレイは、例えば単純な光学顕微鏡検、走査型レーザー顕微鏡、蛍光測定、修飾型ELISAプレート・リーダー等を使用することにより、細胞の結合を検出するためスキャンされ得る。例えば、走査型レーザー顕微鏡は、使用された各フルオロフォアのための適切な励起線を使用して別々のスキャンを実施することができる。次いで、スキャンから生成したデジタル画像が、後の分析のために組み合わせられる。特定のアレイ・エレメントについて、一方の標識を含む蛍光シグナルの比率が、他方の標識DNAからの蛍光シグナルと比較され、相対存在量が決定される。
【００６１】
目的の特定の受動プロファイルは、T細胞の分析である。MHCによる抗原提示を提供するMHC単量体、四量体、ペプチドが負荷されたダイマー（Dimer）X（BD-Pharmingen）等のアレイが、抗原特異的T細胞の直接的なハイスループットの診断／分析のためマイクロアレイ化され得る。ペプチドを保持している構築物が、基材上にプリントされ、目的のT細胞試料に結合させられ得る。（例えば、低流速蠕動ポンプ、およびGrace Biolabs製のCoverWell（商標）潅流チャンバーのような、入口および出口を含む密封されたインキュベーション・チャンバーを使用して）プリントされた領域に、徐々に試料を循環させることにより、抗原特異的T細胞の稀少な集団が表面上の標的を見出す確率を高めることにより、感度を増加させることができる。感度を増加させるためのその他の手段は、異なる抗原保持構築物に沿って流れを案内するためテンプレート付きのチャンバーを利用すること、および／または流れの方向に垂直な方向で各構築物の同一スポットの数を増加させると思われる。
【００６２】
能動プロファイリング（AP）および機能的結合アッセイ法（FBA）
APアッセイ法においては、所定のマーカーの存在が、その活性化のフィンガープリントをアッセイすることにより間接的に検出される。FBAとは、プリントされたキュー（シグナリング・プローブ）が、共スポットされたキュー（結合プローブ）への細胞の結合を能動的に誘導するAPの特定の型である。この場合、活性化に関与している受容体の存在が、細胞結合の誘導または増強によりアッセイされる。FBAは、特定のECM成分またはCAMへの細胞の結合を増強し得るキュー；特定のキューによる活性化の後に細胞が結合し得るECMおよびCAMのスクリーニングに使用され得る。
【００６３】
受動プロファイリングと同様に、機能的結合アッセイ法は、絶対的に実施されてもよいし、または差次的に実施されてもよい。しかしながら、受動プロファイリングとは異なり、機能的結合アッセイ法においては、結合プローブが、付加的な刺激キューと共スポットされるか、または刺激キューと並置される（例えば、刺激キューは隣接スポット上に存在する）。必ずしも結合の誘導または増強を含まない能動プロファイリングの他の例には、所定のシグナリング・プローブを含有しているスポット上の1個またはより多くの細胞パラメーターの、そのシグナリング・プローブを含有していないスポットに対する任意のアッセイ可能な変化が含まれる。例えば、特定の増殖因子受容体の存在が、対応する増殖因子を含有しているスポットのみにおける細胞増殖の再現性のある増加から推量され得る。
【００６４】
いくつかの結合プローブは、細胞応答も誘発することが、当業者には理解されると考えられる。結合が、もう一つのレポーターにより検出され得る様式で受容体またはその他のマーカーを刺激または阻止する場合には、抗体すら、能動プロファイリング・アッセイ法に関して効果的に使用され得る。例えば、T細胞は、共プリントされたCD3およびCD28により刺激され得、その後にCD69のアップレギュレーションが起こり、次いで、それが、CD3のみまたはCD28のみのスポットと比較した、組み合わせられたCD3およびCD28のスポットにおける細胞の免疫染色により検出され得る。この場合、2個のマーカーのうちの1個（例えば、CD28）のレベルが、対応する抗体に細胞を捕捉するのに十分でない場合（その場合、細胞は、組み合わせスポットおよびCD3スポットにのみ結合し、CD69アップレギュレーションは、CD3のみのスポットと比較した、組み合わせスポットにおけるアップレギュレーションをさす）ですら、組み合わせスポットにおけるCD69のアップレギュレーションが、細胞表面上にCD3およびCD28の両方が存在することを示すであろう。
【００６５】
シグナリング・プローブは、特定の結合プローブへの細胞の結合を増強する能力に関して、および／または表現型のその他の変化に関して検出され得る。例えば、シグナリング・プローブは、細胞表面マーカーの発現を誘導するかもしれない。出発細胞集団は対応物結合プローブと結合することができず、シグナリング・プローブに応答した細胞は、結合するであろう。
【００６６】
能動プロファイリング・アッセイ法の結果は、絶対的または差次的なスコアとして読み取られ得る。重要な読み取りには、刺激後のカルシウム流動、レポーター遺伝子を含むマーカーおよび細胞表面受容体の発現の変化、増殖速度の変化に対応したBrdU取り込みの変化、電気的活性の誘導後の電圧感受性色素のパルス、細胞運動性の変化等が含まれる。
【００６７】
能動プロファイリング・アッセイ法の一つの態様は、捕捉分子と共に、または捕捉分子なしでプリントすることによる、薬物候補の活性に関するスクリーニングである。候補薬剤には、前記のような細胞内で作用する薬剤および細胞表面で作用する薬剤が含まれる。細胞との相互作用を改良するため、候補薬剤は、フィルム・コーティング・スライドまたは3Dゲルにプリントされ得る。薬剤の徐放は、ポリマー・ゲルから活性薬剤を放出する混合物をプリントすることにより、または活性薬剤を表面に接続するためのリンカーの遅い加水分解により、達成され得る。
【００６８】
いくつかの態様において、候補薬剤は、特異的に薬剤と相互作用する結合プローブ、受容体等であり得るポリペプチド担体に結合される。例えば、ステロイド化合物は、それらの適切な担体タンパク質、例えばレチノール結合タンパク質、コルチコステロイド結合タンパク質、チロキシン結合タンパク質等と共に提示され得る。
【００６９】
スクリーニングされ得る候補薬剤には、ペプチド・ライブラリーのアレイが含まれる。シグナリング機能および／または結合機能を提供し得るペプチドが、ランダムな配列、シャフリングされた配列、ランダムに変異させられた既知の配列等であり得るアレイ化されたライブラリーに細胞を曝すことにより試験される。反応性側鎖は固定化前に保護され、細胞を適用する直前に脱保護され得る。ペプチドは、直接的に基材に結合させられてもよいし、または一方の末端に付着させられたリンカー、担体タンパク質と結合したリンカー等を介して基材に結合させられてもよい。ペプチドは、基材上で直接合成されてもよい（例えば、米国特許第5,143,854号参照）
【００７０】
遊走アッセイ法
能動プロファイリングの一つの面は、遊走アッセイ法である。遊走アッセイ法においては、推定化学誘引キューが捕捉分子の隣に、および／または捕捉分子と一緒にプリントされる。細胞の遊走が検出され、化合物が、そのような遊走を指図する能力に関してスコア化される。一つの態様においては、近隣のケモカイン、例えばSDF-1を含有しているスポットへ向かう；および／またはケモカイン勾配の上方へ向かう細胞の定方向移動。そのような勾配は、ケモカイン濃度をスポット毎に増加させることにより、および／またはプリントされたタンパク質の拡散を支持する基材（例えば、「VITROGEN 100」のような商業的に入手可能なコラーゲン・ゲル）上へのプリンティングにより、セットされ得る。ケモカインは、捕捉部分と共にプリントされてもよいし、またはそうでなくてもよい。また、細胞を、三次元ゲル内に、結合プローブにより特異的に固定化するか、またはパターン化せずに増殖させ、後に、そのゲルにケモカイン領域をプリントしてもよい。
【００７１】
ハイスループット遊走アッセイ法のためのもう一つの態様においては、二つのECMゲル層の上に目的の細胞が置かれる。ここで、上層は極めて薄く、約0.05〜約0.2mmの厚さを有し、下層は、比較的厚く、約3mm〜約5mmの厚さを有する。候補化学誘引物質の3Dアレイが、層のうちの一方にプリントされ、拡散した化学誘引物質に応答して起こる層内の細胞の遊走がスコア化される。化学誘引物質の上方拡散が存在する場所は、下方への細胞遊走を刺激すると思われる。下方へ遊走する細胞は、下層へと移動する思われる。そして、各因子の走化活性が、その因子に対応する部分において移動した細胞の数によりスコア化される。または、細胞は、プリントされた厚い層の下に位置する空の薄い層の下に置かれる。薄い層は、走化性薬剤に応答した細胞が通過することができる他の層（例えば、標準的な遊走アッセイ法において通常使用されているトランスウェル（transwell）フィルター）に交換されてもよい。
【００７２】
プリントされた領域の外への細胞の遊走および展開は、付着および遊走に必要とされ得るECM成分の分泌に関連している。そのような分泌は、分泌され得る特定の成分に対する標準的な免疫染色により局所的に分析され得る。
【００７３】
細胞−細胞相互作用アッセイ法
画定された位置に任意の型の細胞を特異的に捕捉する能力、および細胞の直径もしくはその数倍というオーダーの地形サイズを有するパターン化表面を形成する能力は、2個またはより多くの異なる細胞型を並置し、それらの相互作用を研究するために使用され得る。共通の結合プローブをプリントすることにより、または2個またはより多くの細胞型特異的な結合プローブを共プリントすることにより、異なる細胞が同一スポット内に固定化され得る。または、細胞型特異的な結合プローブを使用して、別々の近隣のスポットに細胞を固定化することもできる。細胞型特異的な捕捉分子が既知でない場合には、適当な結合パートナーを決定するため、絶対的または差次的なプロファイリング実験において、細胞をスクリーニングすることができる。
【００７４】
近隣のスポットへ別個の細胞型を並置するためには、各スポットが1個の細胞型のみを含むよう、それらの集団を解離させることが必要であるかもしれない。これは、（形態学、マーカー・プロファイル、またはその他の適当な方法により判断されるような）これらの集団を解離させる結合プローブに関してスクリーニングするため、細胞型特異的結合パートナーの一次スクリーニングを実施することにより達成され得る。例えば、独特であると推定される内皮マーカーに対する抗体のセット、およびニューロン／神経膠特異的マーカーに関するもう一つのセットを含む抗体アレイに細胞を曝すことにより、神経前駆細胞および血管前駆細胞の混合物を解離させることができる。次いで、最適の解離を提供するこれらのセット内の結合プローブを見出すために、スライドが、各セットからの少なくとも一つの抗体で同時に染色され得る。次いで、これらの結合プローブは、もう一つのアレイに所望のパターンでプリントされ、従って神経前駆細胞および内皮前駆細胞の同時の解離および並置のために使用される。続いて、細胞が共培養され、並置された細胞が、同一スライド上に捕捉され培養された非並置細胞と比較され得る。別のアプローチにおいて、非接触式プリンティング技術を使用して、近隣のスポットに異なる細胞型をプリントすることもできる。
【００７５】
受動的または能動的であり得る、もう一つの目的とする特定のプロファイルには、遅延型の細胞パターン化が含まれる。そのような場合、それら細胞は、直ちには結合プローブと結合せず、ある期間、例えば約12時間、24時間、または数日にわたり培養物中で維持された場合、次第にスポットと結合するようになると考えられる。これは、例えば局所環境に応答して起こる細胞表現型の変化によるかもしれないし、または低レベルの結合によるかもしれない。遅延型のパターン化は、非特異的反応性の表面において、細胞がプリンティング前にゲル内で培養されるECMゲル・アレイにおいて、または既にプリントされたキューの近傍に細胞が分注される場合にも起こりうる。
【００７６】
細胞運命操作
一つの面において、能動プロファイリングは、細胞分化に対する薬剤の効果を検出する。そのようなアッセイ法に適している細胞には、多様な前駆細胞および幹細胞が含まれる。重要な幹細胞には、造血幹細胞およびそれらから派生した前駆細胞 （米国特許第5,061,620号）；神経冠幹細胞（Morrisonら（1999）Cell 96：737-749参照）；胚性幹（ES）細胞；間葉幹細胞；中胚葉幹細胞等が含まれる。他の重要な造血「前駆」細胞には、リンパ系統に方向付けられた細胞、例えば未熟なT細胞およびB細胞の集団が含まれる。肝臓、神経細胞、膵細胞等のための前駆細胞も、画定されている。プロファイリングにより、分化、脱分化、および分化転換のイベントを指図しうる分子もスクリーニングされ得る。特に、ES細胞分化のコントロールは、再生医学、および哺乳動物発生の極初期の段階の理解の両方にとって特に重要である。発生における共通のテーマは、細胞運命決定に対する局所的なモルフォゲンの影響である。本発明の方法は、それらの局所的な（不連続または連続的な）勾配および領域（それらに目的の細胞が曝され、次いでプロファイリングされ得る）を構築することにより、濃縮され精製されたモルフォゲン（例えば、Notch、BMP-4、Wnt-1、bFGF、Shh、それらの修飾型、それらのファミリーのその他のメンバー等）の作用を厳密かつ系統的に探究するための手段を提供する。それは、それらの固定化、マトリックス成分もしくは混合物との会合、または相互の会合の効果を調査するためにも使用され得る。
【００７７】
局所効果は、固定化された（膜結合またはECM結合）シグナリング・プローブ；隣接した細胞から分泌された高い局所濃度のキュー；異なる濃度のシグナリング・プローブ；シグナリング・プローブの組み合わせに対する差次的な細胞応答等によって得られ得る。細胞マイクロアレイ・プラットフォームは、極めてハイスループットな様式でそれらのシナリオを模倣する独特の機会を提示する。従って、例えば、固定化されたまたは拡散したモルフォゲン、例えばShh、FGF、Wnt、Notch、TGF等、およびその他の多くのサイトカイン／増殖因子／ホルモンの領域が、一般的には結合プローブ、例えばCAM、ECM成分等と組み合わせられて、自由な組み合わせおよび濃度で沈着させられ得る。または、幹細胞または前駆細胞は、結合プローブの使用が必要でない（より詳細に後述される）三次元マトリックスに埋め込まれてもよい。
【００７８】
マイクロアレイに沈着させられ得る付加的な因子は、条件培地および細胞断片である。未分化ES細胞を、そのようなアレイ上で培養し、所望の分化表現型の出現にとって必要なスポット（結合）および培地（未結合）の条件に関してスクリーニングすることができる。分化表現型は、形態学的特質、例えばニューロン分化の場合には精巧なニューロン突起の出現、筋細胞に関しては細胞収縮等として；系統調節レポーター遺伝子により；系統限定マーカーのセットによる染色により；そして培養細胞の表現型を決定するために使用される標準的な読み取りのうちのいずれかにより、検出され得る。
【００７９】
形態学的読み取りおよび系統調節レポーター遺伝子読み取りの両方が、スキャニング能を有し、適正な環境調節システムを装備している生細胞用の商業的に入手可能な系（例えばAxon Instruments「ImageXress」系）を使用して、継続的にリアルタイムでモニタリングされ、および／または微速度で記録され得る。
【００８０】
前記のフォーマットに加え、本発明のアッセイ法は、三次元ゲル、例えば「VITROGEN 100」コラーゲン・ゲル（Cohesion Technologies,Inc）のようなECMゲルを使用することができる。プローブは、細胞が予め埋め込まれているゲルにプリントされてもよいし；シグナリング・プローブが結合プローブと一緒にプリントされ、その後に細胞の曝露および未付着細胞の洗浄が行われてもよい。または、（ゲルが適切に水和されることを条件として）細胞がシグナリング・プローブと一緒にプリントされてもよい。
【００８１】
ゲルへのプリンティングは、非接触式の微量分注システム、例えばパッカード・バイオサイエンス（Packard Bioscience）の「Biochip Arrayer」により実施され得る。そのようなシステムは、非暴力的な分注メカニズム（圧電スリーブの収縮）を利用する。チップの開口部は比較的広く、例えば少なくとも約75μmであり、300nlを越える容積の液滴をまかなう。分注された各液滴の容積（0.350nL）は、目的のシグナリング・プローブと一緒に細胞を沈着させることを可能にする。ポジショニング・カメラは、プローブおよび細胞が後の段階で局所的に添加されることを可能にしうる。
【００８２】
プリンティングのための基材としての三次元アレイおよびいくつかのフィルム・コーティング・スライドは、細胞に対する勾配の効果を分析することができるシグナリング・プローブの拡散を可能にする。プリントされたプローブは、拡散し、重要であるかもしれない連続的な勾配を形成する。
【００８３】
ES細胞は、プリントされていない「VITROGEN」コラーゲン・ゲルの表面に適用され洗浄されてもよいし、または、それらをゲル化（原繊維形成）前のゲルの中和された液相と混合し、4℃から37℃へ温度を上昇させることによりゲル化を開始させ、そして標準的なES培地中で（固体）ゲルを培養することにより、その中で培養されてもよい。
【００８４】
本発明の方法において利用される薬剤は、キットに含まれて提供されてもよく、そのキットは使用説明書をさらに含みうる。そのようなキットは、プリントされたマイクロアレイを含みうる。そのキットは、さらに、細胞、細胞表現型の変化をモニタリングするためのアッセイ法試薬、シグナリング・プローブ等を含みうる。  
【００８５】
以下の実施例は、本発明を作成し使用するための方法の完全な開示および説明を当業者に提供するために示され、本発明と見なされるものの範囲を制限するためのものではない。使用された数値（例えば、量、温度、濃度等）に関しては正確さを保証するよう努力がなされたが、いくつかの実験誤差および偏差は斟酌されるべきである。特記しない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、そして圧力は大気圧またはほぼ大気圧である。
【００８６】
実施例
実施例1
細胞プロファイリング・アレイの調製
結合プローブが、細胞表面上に存在する分子と強力かつ特異的に結合することができるタンパク質であり、シグナリング・プローブが、細胞の結合プローブとの結合を能動的に誘導または増強することができるタンパク質であるようなタンパク質マイクロアレイを、異なる結合プローブおよびシグナリング・プローブを使用して組み立てた。シグナリング・プローブの使用がプロファイリング・アッセイ法の範囲をはるかに越えていること、および結合プローブがシグナリング・プローブとして機能することが見い出され得ることに注意すること。次いで、細胞の特異的結合および空間的分布を提供するため、細胞がアレイ上でインキュベートされる。
【００８７】
方法
アレイの調製：全てグリセロールを含まないPBSバッファーで希釈された（スポッティング溶液へのグリセロールの添加は、スポットの乾燥を遅らせ、そしていくつかのプリントされたタンパク質の安定性を改良する可能性がある）、0.01μg/μl〜0.5μg/μlの範囲の濃度の、以下のタンパク質：ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン、ゼラチン、ビトロネクチン、テネイシン、リストリクチン（restrictin）、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、これらのECM成分全ての混合物、rhICAM-1、rhVCAM-1、rhSDF-1αおよびrhVCAM-1の混合物、抗ヒトCD2、抗ヒトCD3、抗ヒトCD4、抗ヒトCD28、抗ヒトCD45、抗ヒトCD58、抗ヒトCD44、抗ヒトCD29、抗ヒトCD95L、抗ヒトCD104、抗ヒトCD123、抗CCR7、抗α4β7インテグリン、β-NGF、ならびにbFGFの溶液を調製した。タンパク質は、SuperAldehydeガラススライド上にスポットされた。
【００８８】
タンパク質−細胞−アレイ作業について、SuperAldehydeスライドは、一般的には、プリンティング前またはプリンティング後の処理なしに良好に機能した（ただし、SuperAldehydeスライドに非特異的に粘着する傾向を有するいくつかの細胞型は、PBS＋1〜2％BSAによるプリント後ブロッキングを必要とする場合がある）。また、未結合プローブの除去を保証するため、スライドは、PBS＋0.5％トゥイーン（Tween）20で、30分間、3回洗浄されてもよい。ハイドロゲル（HydroGel）スライドは、さらに、基材中に存在する保存剤を除去するための（そして、一貫した均一な基材条件を保証するための）前処理、およびタンパク質を固定化するための後処理を必要とする。HydroGelスライドの前処理および後処理は、HydroGelプロトコル・ガイドに記載されている通りに実施した。
【００８９】
タンパク質は、384ウェルマイクロタイター・プレートで調製した。単一アレイ上のタンパク質は、プリンティング計画に依って、同一であってもよいし、または異なっていてもよい。プリンティングは、主として所望のプリント面積（それは、利用可能な細胞の量により制限される）に依存して、そしてプリントすべき異なる試料の数にも依存して、8〜32チップのプリント・ヘッドを用いて実施した。プリントされたスポットの典型的な局所密度は、3265/cm2（スポット間距離175μm）であり、最大密度は4444/cm2（150μm）であった。そのアレイを、気密容器内に密閉した。それらは、短期保存（およそ1〜2ヶ月）の場合には4℃で保管し、またはそれより長期に保存する場合には凍結させることができる。
【００９０】
スポット群の位置を示すため、スライドの裏に、ダイヤモンド・スクライバーまたは消去不可能なマーカーで印をつけた。いくつかの場合には、プリントされたCy5結合BSA（0.2μg/μl）、および（細胞が多数結合することが既知であった）陽性対照スポットを、座標系として使用した。
【００９１】
実施例2
懸濁細胞のプロファイリング
懸濁細胞の絶対的および差次的な（受動）プロファイリング
図1に示されるように、受動プロファイリングのための二つの異なるスキーム（絶対的および差次的）が使用される。絶対プロファイリング（上二つのパネル）においては、各細胞型を、「プローブ」分子：CD2、CD3、CD4、CD28、およびCD45のアレイがプリントされたスライド上で別々にインキュベートした。非特異的結合の洗浄除去の後、スライドを単純な光学顕微鏡検によりイメージングし、スポットされた各領域を、付着した細胞の数に関してスコア化する。占拠されたスポットは、基材上に存在するプローブへ細胞試料が特異的に結合すること、即ち、細胞が、プローブの同族受容体または特異的結合パートナーを発現していることを示す。ある範囲の細胞およびプローブの濃度で、捕捉される細胞の数は、特異的結合パートナーの発現レベルに比例する。絶対スキームは、不均一なプリンティング、プローブ分子の質、およびスライド処理による影響を受けやすい。
【００９２】
差次的プロファイリングにおいては、スポットおよびスライドに関連したバリエーションは低下する。2個またはより多くの細胞型／集団を、異なる色素マーカーで予め標識する。2個の集団を組み合わせ、単一のスライドに適用し、そこで、それらが同一プローブ分子上で競合する。洗浄除去の後、スライドを市販の蛍光スキャナでスキャンし、一方の色の他方の色に対するピクセルの相対数に関してスコア化する。
【００９３】
図1には、ジャーカット（Jurkat）細胞の2個の異なる株、および0.09％（w/v）アジ化ナトリウム（アルデヒド・スライドおよびHydroGelコーティング・スライドと適合性）を含むPBS溶液中0.25μg/μlの濃度でアルデヒド・スライド（Telechem「SuperAldehyde」）上にプリントされた5個のプローブ分子（ヒトCD抗原に対する抗体、BD-Pharmingenより商業的に入手可能）の絶対的（上パネル）および差次的（下パネル）なプロファイリングが示されている。各々の場合において、細胞をRPMI＋1％BSAに懸濁させ、37Cおよび5％C02で10分間、カバーまたはインキュベーション・チャンバーなしでトリプリケートで（即ち、3個の別々のスライド上で）インキュベートし、各スライドを、室温でPBSの大きなチャンバー内で3〜5回穏和に前後に動かすことにより洗浄した。
【００９４】
差次的プロファイリング実験（着色イメージ）においては、2個の異なる細胞集団を、遊離アミン基と非特異的に反応するCy3色素およびCy5色素（Amersham、単反応性（mono-reactive）CyDye）で予め標識した。細胞を標識するため、各乾燥色素（Cy3およびCy5）の一部（供給された色素バイアルの10分の1）を、DDW 10μlに再懸濁させ、CMF PBS（37℃）中の細胞（107個/ml）250μlへ添加した。標識反応をインキュベーター内で10分間実施し、その後、細胞をCMF PBSで2回洗浄し、1％BSAを含有しているRMPIに再懸濁させた。Cy3およびCy5で標識された細胞の濃度を調和させ、次いで、一部を抽出し、スライドへ（トリプリケートで）適用した。非特異的結合の除去の後、スライドを600rpmでの2.5分間の遠心分離 （Beckman CS-6R遠心分離機）により乾燥させ、標準的な蛍光スライド・スキャナー（AXON Instruments「GenePix 4000B」）で5μmの解像度でスキャンした。
【００９５】
絶対アッセイ法においても差次的アッセイ法においても、付着パターンは、株特異的であり、再現性があり、相互に矛盾がなかった。
【００９６】
実施例3
神経およびグリアの接着性前駆細胞の付着およびプロファイリング
接着細胞を用いた細胞アレイ・プロファイリングを使用するには、まず、プローブ分子を認識しそれと結合する能力を損なうことなく細胞を解離させることが必要である。（例えば、Specialty Media「Enzyme Free dissociation solution,PBS based」を使用した）細胞の無酵素解離は、ヒト神経／グリア前駆細胞の初代培養物、ヒト髄芽腫脳腫瘍細胞系、およびマウス胚性幹（mES）細胞を含む、試験された全ての細胞型において有効であることが示されている。極めて大きい細胞を用いたプロファイリング法も使用した。例えば、スライド上に展開する神経前駆細胞の直径は、スポット直径にほぼ等しくなり得る。しかし、解離直後の細胞は、単一スポットが10個超の細胞を収容し得る程、十分に円形でコンパクトである。
【００９７】
図2は、捕捉された細胞の長期生存可能性および運動性を損なうことのない、大きな単層細胞の受動プロファイリングを示す。およそ5×105個のヒト（新生児）グリア／神経前駆細胞を、5分間、無酵素解離溶液（Specialty Media）を使用して非酵素的に解離させ、DMEM／F12／PS＋10％BITに再懸濁させ、いくつかの抗体、細胞接着分子（CAM）、および細胞外マトリックス（ECM）成分がプリントされた「SuperAldehydeスライド」（TeleChem Inc.）スライド上でインキュベートした。スポット間隔は175μmである。20分間のインキュベーション期間の後、スライドを、非特異的結合を除去するためDMEMチャンバーで洗浄し、明確な培地（DMEM／F12／PSF＋10％BIT＋20ng/ml EGF、およびbFGF）中で48時間再インキュベートした。
【００９８】
図2には、抗ヒトCD58（LFA-3）のスポット5個を含有しているアレイの単一部分の三つの時点が示されている。この間、細胞は、展開し、遊走し、より分化した形態学を獲得した。これは、抗体を介した細胞の特異的な付着が、生存可能性および健康を維持し、周辺を運動し、（近隣のスポットを含む）環境を探究し、分化し、そしてECM成分を分泌する能力を妨害しないことを示している。
【００９９】
これらの結果は、特異的な細胞パターン化に基づく細胞−細胞相互作用アッセイ法の実行可能性を証明している。遊走アッセイ法（例えば、近隣のスポットにプリントされた化学誘引物質の方へ運動する細胞） および分泌アッセイ法 （所定の細胞型により分泌され得る特定のECM成分および／またはその他の物質に関してスライドが染色される）のようなその他の型のアッセイ法も想到され得る。
【０１００】
実施例4
マウスES細胞のパターン化された付着および維持
非酵素的に解離させられたR1マウスES細胞は、0.25μg/μlの抗マウスCD29（抗インテグリンβ1）を介して捕捉された場合ですら、長期生存可能性およびスポットへの分配能を損なうことなく、様々な抗体、ECM成分、およびCAMに固定化された。
【０１０１】
図3には、ラミニン（0.59μg/μl）およびLIF（10μg/ml）の4：1混合物を含有している同一スポットに結合した8×4個のESクラスターが示されている。写真は、スライドへの初期細胞捕獲の21時間後に撮られた。スポット間隔は175μmである。未分化mES細胞を、無酵素解離溶液（Specialty Media）で15分間解離させ、DMEM／F12／PS＋10％BITに再懸濁させ、「SuperAldehydeスライド」（Telechem Inc.）上で20分間インキュベートし、スライドへの非特異的な結合を除去するためDMEMの大きなチャンバーで洗浄した。次いで、スライドを、商業的に入手可能な無血清培地（ギブコ（Gibco）「ノックアウト（Knockout）DMEM」＋15％「ノックアウト血清代替添加物（Knockout Serum Replacement）」＋1×非必須アミノ酸＋1×L-グルタミン＋1×PS）へ移し、細胞をその中で2週間培養した。その間、クラスターは増殖し、接続されて比較的未分化な細胞の巨大なクランプを形成し、最終的には分化細胞となった（これらの後期段階の例は図12に示される）。
【０１０２】
実施例5
機能的結合アッセイ法を介した懸濁細胞の能動プロファイリング
機能的結合アッセイ法（FBA）は、受容体活性化に基づくプロファイリング・アッセイ法の一つの型である。この型のアッセイ法は、極めて詳細かつ体系的に細胞−ECM相互作用を研究するのに有用である。それは、例えば入手可能な抗体が存在しない場合、または結合パートナーの発現レベルが低すぎる場合、標準的な受動アッセイ法において検出され得ないマーカーを検出するのにも有用である。FBAは、特定のECM成分および／またはCAMへの細胞の結合を増強する目的のキューの能力を試験する。これは、様々な濃度の目的の（シグナリング）キューと共にアレイ上に共プリントされた、様々な濃度のCAMおよび／またはECM成分に目的の細胞を曝すことにより行われる。マイクロアレイ技術は、単一スライド上での多くのCAM−キュー対の調査を可能にする。
【０１０３】
受動プロファイリングと同様に、FBAを介した能動プロファイリングは、（それぞれ図4および5に示されるように）絶対的または差次的に実施され得る。図4のFBAは、ケモカイン（rhSDF-1α、R＆D Systems）の希釈系列と共スポットされた細胞接着分子（rhVCAM-1、R＆D Systems）へのジャーカットT細胞の用量依存的な結合を示している。SDFは、T細胞上の細胞表面インテグリンを活性化し、それにより、プリントされたVCAMへのそれらの結合を増強する（図5も参照のこと）。図4に示されているのは、SDFの2倍希釈物と共スポットされた、またはSDFなしでスポットされた所定の濃度のVCAM（0.055μg/μl）を含むスポットの5×4アレイへ付着した細胞クラスターである（スポット間隔は175μmである）。SDFのみを含むスポットもスライド上に存在したが、それらには細胞が見出されなかった。各カラムは異なるSDF希釈物に相当し、1×SDF＝37.5μM（3％血清を含有しているRPMI中に供給）である。VCAMおよびSDFは1：1比率で共スポットされた（各々2.5μlがプリントされたウェルにロードされた）ため、それらの最終濃度は上記濃度の半分（即ち、それぞれ0.0275μg/μlおよび18.75μM）であることに注意すること。
【０１０４】
この実施例においては、標準的な接触式プリンティング技術を使用して、薄いポリアクリルアミド・フィルムでコーティングされたスライド（「HydroGel」スライド、Packard Biosciences）にSDFおよびVCAMを沈着させた。（プローブ固定化から16時間後のPBS＋0.5％トゥイーンによる洗浄を除き）製造業者の指示に従い、スライドのプリンティング前の前処理および後処理を行った。一般的には、「HydroGelスライド」は、「SuperAldehyde」スライドと比較して、より低い非特異的結合（即ち、より低いバックグラウンド）を与えるが、感度も低い。さらに、「SuperAldehyde」スライドの方が、細胞がよく展開し、より長期間、付着を維持する。基材の選択は課題に依存する。その他の商業的に入手可能なフィルム基材は、ニトロセルロース・コーティング「FastSlides」および正の電荷を有するナイロン「CastSlides」（いずれも、Schleicher＆Schuell製）である。
【０１０５】
細胞を、RPMI＋1％BSAに再懸濁させ、6分間スライドに適用し、わずかに加温されたRPMIのチャンバーで穏和に洗浄し、4％PFA（4C）で固定した。SDFおよびVCAMの濃度の選択は、主として細胞の型および密度に依存し、扱っている課題にも依存する。例えば、ジャーカット細胞の結合曲線を構築するための典型的な範囲は、0.01〜0.1μg/μlのVCAMおよび0.2〜40μM SDFであるべきである（より高いVCAM用量は、非SDF依存性の結合をもたらすであろう）。結合曲線は、付着した細胞の数をスポットされた試薬の少なくとも1つの濃度と関係付ける（例えば、図6を参照のこと）。これらの範囲内で、結合は、SDFおよびVCAMの両方の単調増加関数である。ジャーカット細胞が、固定なしで SuperAldehydeスライド上でVCAMスポットにより捕捉され、RPMI＋15％FBS＋1×PS中でインキュベートされた場合、細胞は増殖し続け、絶えず自己のクローンを溶液中へ放出し、スポットは、結合した細胞で占拠され続ける（結合した細胞が離脱しないよう、過度に激しく培養皿を振とうしないよう注意すべきである）。数百個という低いスポット上の細胞数から出発し、1〜2週間後には数百万個の細胞を含むディッシュが見出された。
【０１０６】
差次的機能アッセイ法は、図5に示される。データは、スポットされたSDF-1αシグナルに対する差次的な応答を明らかにしている。SDFと、rhVCAM-1（上パネル）またはrhICAM-1（中央パネル）いずれかとの混合物（各混合物について10個のレプリカ）を、陽性対照抗体スポット（下パネル）と一緒に、同一スライドにプリントした。そのスライドを、それぞれCy5およびCy3で予め標識された百日咳毒素処理ジャーカットT細胞（赤）および未処理対照ジャーカットT細胞（緑）の抽出された集団と共に6分間インキュベートした。処理細胞は、200ng/mlの百日咳毒素（PTx）（LIST BIOLOGICAL LABORATORIES,INCより入手可能）と共に5時間プレインキュベートした。
【０１０７】
RPMIで温和に洗浄した後、結合した細胞を4％PFA（4C）で15分間固定し、10分間PBSで再び洗浄し、遠心分離乾燥させ、5μmの解像度でスキャンした。各領域には、所定の希釈率のSDFおよびVCAMまたはSDFおよびICAMを含む同一スポット（スポット間隔175μm）へ付着した細胞クラスター10個が示されている（1×SDF、1×ICAM、および1：27×VCAMの最終濃度は、それぞれ18.75μM、0.25μg/μl、および0.0275μg/μlである）。最も下のパネルは、（0.5μg/μl）抗CD45（BD-Pharmingen）への両細胞集団の陽性対照付着として機能する。PTxによる細胞の前処理は、Giタンパク質の不活化を誘導し、結果的に、細胞表面インテグリンの活性化を介したT細胞のVCAMへの結合のSDF-1αによる増強を妨害する。「オンスポット（on-spot）」のSDFシグナリングがスライド上で起こる場合には、図5の上二つのパネルに示されるように、SDF含有スポットにおいて未処理細胞が処理細胞を競合排除（out-compete）する（緑ピクセルより赤ピクセルが多くなる）と予想される。
【０１０８】
対照的に、陽性対照（CD45）スポットにおいては、赤ピクセルおよび緑ピクセルがほぼ等しく提示されており、このことは、得られたSDF含有スポットへの差次的な結合が、赤細胞と緑細胞との数の有意差によるのではないことを示している。そのような対照スポットは、細胞提示の相対的な差に関して結果を規準化するために使用され得る。従って、この実験は、インテグリン活性化、従って細胞捕獲における固定化されたSDFの関与を明らかに支持している。
【０１０９】
ケモカインにより媒介されるインテグリン活性化、およびその後の細胞捕獲は、インビボのリンパ球輸送における二つの必須の工程である。リンパ球輸送は、血管内皮細胞により提示されたケモカインおよび付着キューにより案内される。上記の機能的結合アッセイ法は、キューの提示における内皮壁の「役割を果たす」ことにより、これらの工程を模倣する。インテグリン活性化およびその後の細胞捕獲というインビボの過程は、5分以内に起こり、アッセイ法もまたそうであることに注意すること。
【０１１０】
実施例6
接着性マウスES細胞を用いた機能的結合アッセイ法
様々な接着分子および増殖因子へのmES細胞の接着を試験することにより、サイトカインrhLIF（Chemicon、「LIF1010」）が、未分化mES細胞のEカドヘリン／FCキメラへの結合を増強しうることが見出された。この実施例においては、スライドに、EカドヘリンとLIF、OSM、およびIL6との混合物をプリントした。スポットされた混合物の中のEカドヘリンおよび1×LIFの（最終）濃度は、それぞれ0.2μg/μlおよび0.002μg/μlであった。未分化mES細胞を、無酵素解離溶液（SpecialtyMedia）を使用して19分間徹底的に解離させ、2mlのインキュベーション溶液（DMEM／F12／PS＋BIT＋1×セレン）に再懸濁させた。細胞懸濁物（5.8×106個／ml）480μlを「SuperAldehyde」スライド上のプリントされた領域（およそ324mm2）に適用し、15分間インキュベートした（効果は、一般的には10分以内に観察される）。インキュベーション後、わずかに加温されたDMEMチャンバー（およそ30C）でスライドを洗浄した。
【０１１１】
得られた付着パターンは、用量依存的なLIFにより媒介されるEカドヘリン結合の増強を明らかに証明している（図6に示される）。この特定の実施例において、Eカドヘリン単独、LI単独、またはEカドヘリン-OSM、およびEカドヘリン-IL6のスポットには、結合が観察されなかった。他のいくつかの場合には、Eカドヘリン（LIFなし）への弱い結合が観察され得たが、結合は共スポットされたLIFによって常に増強された。LIF成分のスポット混合物全体への寄与は無視し得る程度のものであるため、全タンパク質濃度は全てのLIF希釈物に関して概ね同じままである。図6の結合曲線は、同一スライド上の二つのレプリカ（領域＃5および13）から構築された。エラーバーは、10個の同一スポットに結合する細胞の数のスポット間変動から推定された。
【０１１２】
興味深いことに、200μg/ml（100×）の可溶性LIFへ細胞を曝した場合、低用量のプリントされたLIFを含有しているスポットへの結合は有意に増加しなかった。従って、その効果は、異常に高いLIF濃度（約5000μm2に限局されたおよそ5ng）および／または固定化されたLIFおよび／または偏向したLIF曝露を必要とするのかもしれない。
【０１１３】
E-カドヘリンは、未分化mES細胞上に発現していることが知られており、（各細胞上に表現したE-カドヘリン間の）同種親和性相互作用を介してクランプ形成の少なくとも一部を担っていると考えられている。カドヘリンは、細胞−細胞接着の主要なファミリーを形成しており、その発現動力学は発生中の組織解離と強く相関している。インテグリンと比較すると、それらの活性化は未だほとんど不明である。従って、ここに記載されたLIFとEカドヘリンとの間の新規の相互作用は、特に重要である。
【０１１４】
この現象の基本メカニズムをさらに検討するため、転写の阻止および正準LIFシグナリング経路の阻害が、どのようにES細胞のE-カドヘリンへの結合の増強に影響を与えるかを試験した（図7に示される）。解離させた未分化mES細胞を、短く20分間高用量（それぞれ50μg/ml（10×）および1mM（20×））のアクチノマイシンD（転写阻害剤）およびAG490（基質結合部位と結合することによりRTKを阻止し、従ってJak-2のLIF受容体およびgp130細胞質ドメインとの結合を阻害する）（いずれの薬物も、CALBIOCHEM製である）により処理した。次いで、処理細胞および未処理（対照）細胞を、Eカドヘリン-LIF希釈物のレプリカがプリントされた（分離された）スライドに適用した。得られた結合パターンは、転写阻害は結合細胞数の有意な低下をもたらさなかったが（下の対照に対する左上）、LIF経路の阻止は結合を完全に阻害したことを示している（右上）。これらの結果は、LIFシグナリングが転写非依存性の経路によりEカドヘリン活性化を担っていることを示唆する。
【０１１５】
総合すると、FBAの結果は、シグナリング分子および捕捉分子の両方が、機械的なプリンティングの後にスライド上で活性を維持している、という重要な証拠を提示する。試験された2個の結合増強剤（SDFおよびLIF）は、異なるメカニズムおよび異なる受容体の型を通してシグナル伝達することに注意すること。FBAの結果は、さらに、異なる様式で応答するよう近隣の細胞集団を誘導するであろう局所的、明確、定量的な指示を細胞に提供するために、プリントされた微小環境を使用することができる、より一般的な概念を証明している。この原理は、他の多くのシグナル伝達経路にも適用され得る。
【０１１６】
実施例7
マウスES細胞の長期的なスポット指向パターン化
スライドへの高い非特異的結合が存在する場合にも、細胞は、培養時間の後にプリントされたキューの上でクラスター形成することができる。図8に示されているのは、200μmのスポット間隔でセル・アソシエート社（CEL Associate Inc.）製のシリル化スライドにプリントされた4：1ラミニンおよびβ-NGF（それぞれ0.59および0.2μg/μl）の5×3個の同一スポットを含有している同一領域の二つの時点（初期インキュベーションから4時間後および35時間後）である。これは、アルデヒド・スライドであってもよいが、このスライドへの非特異的な結合は、「SuperAldehyde」スライドよりも高くなり得る。シリル化スライド上のmESのこの特定の実施例において、細胞は、最初は、スライド全体にランダムに散在し、秩序のある細胞クラスターは観察され得なかった（左イメージ）。しかしながら、B27血清代替添加物が補足されたギブコの「NeuroBasal培地」で35時間培養した後、細胞は、ラミニンに基づくスポット上でクラスター形成するようになった（右イメージ）。さらに、残りのバックグラウンド細胞は、スポット内のものとは異なる形態学を獲得した。同様の結果は、他の培養条件、および異なるスポット組成物でも得られた。
【０１１７】
例えば、ギブコの血清代替添加物に基づく製剤（「ノックアウト血清代替添加物」、非必須アミノ酸、L-グルタミン、およびPSを含む「ノックアウトDMEM」）を培養培地として使用した場合にも、細胞は、スポット上でクラスター形成するようになったが、バックグラウンド細胞は消失した。細胞は、スポットされたキューの化学誘引特性のためにそれらのキューへ向かって遊走するのかもしれないし、または周辺を運動しスポット上に捕獲されるのかもしれない。いずれにせよ、上記の実施例は、自己パターン化のための別のスキームを証明している。
【０１１８】
実施例8
「オンスライド」の培地依存性のmES細胞の分化
図9に示された実施例は、比較的均一で、再現性のある、培地依存的なmES細胞の分化誘導能を証明している。まず、未分化のR1 mES細胞（18代目）を使用した。実験前に、標準的な方法に従って細胞を培養し継代した。簡単に説明すると、DMEM、15％FBS、1×（1000U/ml）hLIF（Chemicon、LIF1010）、1×L-グルタミン、1×非必須アミノ酸、1×ピルビン酸ナトリウム、10μM β-メルカプトエタノール、および1×PSが毎日補給された1％ゼラチン・コーティング・ディッシュで細胞を培養した。トリプシン−EDTA溶液を使用して、一日おきに1：5に細胞を分割した。
【０１１９】
その細胞を、Eカドヘリン-LIFスポット上に固定化した。固定化は以下のように実施された：細胞を、17分間徹底的に解離させた（Specialty Media Enzyme-Free Dissociation Solution）。それらを、2.4mlのインキュベーション溶液（DMEM／F12／PS＋10％BIT＋1×,0.67μg/mlセレン）に再懸濁させ（2.8×106個／ml）、12分間スライド上でインキュベートし（450μl）、大型のわずかに加温されたDMEMチャンバーで洗浄した。
【０１２０】
（「SuperAldehyde」スライド上の）固定化された細胞を、（i）生存可能性および分化を支持することが見出された特別な製剤である、スライド上のmES細胞生存を支持するための画定培地（上四つのイメージ全て）、および（ii）レチノイン酸が補足されたギブコ製の無血清型培地製剤（下イメージ）と共に42.5時間培養した。画定培地は、以下の通りであった：10％BSA-インスリン-トランスフェリン溶液（Stem Cell Technologies製の「BIT9500」）、各20ng/mlのEGFおよびbFGF、0.67μg/ml（1×）セレン、1×L-グルタミン、1×非必須アミノ酸溶液、および1×Pen/Strep（PS）が補足された「ノックアウトDMEM」（GIBCO製）。培地（ii）は以下の通りであった：15％「ノックアウト血清代替添加物」、50μM（100×）All-trans（エタノール溶解）レチノイン酸（RA）（SIGMA製）、1×非必須アミノ酸、1×L-グルタミン、および1×PSを含む「ノックアウトDMEM」。
【０１２１】
形態学から判断して、得られた細胞型は、培地依存的に分化する。より重要なこととして、所定の培地について、得られる細胞は、比較的均一で、系統的に制限されているように見える。実際、下イメージの細胞は上皮細胞と類似しており、上イメージのものは劇的に異なり、神経／グリア前駆細胞に類似しているように見える。スライド上でそのような分化を得るためには、細胞が最終的にいくつかの異なる系統の細胞へと自発的に分化するような、大きな細胞クランプの形成を回避しつつ細胞生存を可能にするであろう条件を見出さなければならない（典型的な例については図12を参照のこと）。
【０１２２】
各スポット内の初期細胞数は、10〜15個に低下させ（それより多くの細胞を充填すると、細胞間のクロストークが増加し、それより少ない細胞を充填すると、生存可能性および／またはスライド上の保持が損なわれる可能性がある）、そして（ii）分化を促進する／分化にとって好都合であると思われる基材およびスポット組成物（即ち、SuperAldehydeスライドおよび4：1 Eカドヘリン-LIFスポット、それぞれ最終濃度0.2μg/μlおよび0.002μg/μl）を見出す。（理想的には特定の系統へのバイアスなしに）細胞生存を支持し分化を促進することができる画定最小培地の選択も、極めて重要である。上に示された実施例（上四つのイメージ）は、一つのそのような培地の使用を証明している。DMEM／Fl2／BITおよびニューロベイサル（neuroBasal）-B27に基づく培地が、EGFおよびFGFのような一般的な増殖因子の存在下または非存在下で、細胞の壊死またはアポトーシスのいずれかをもたらしたことに注意すること。
【０１２３】
実施例9
「オンスライド」のスポット依存性のmES細胞の分化
図10に示されたデータは、再現可能にスポット依存的にmES細胞の分化を誘導する細胞アレイの能力を証明している。それは、単一（SuperAldehyde）スライド上で異なるスポット組成物で培養された、（図10のような）最初は未分化であったmES細胞が、形態学的に別個の細胞型へ転換し得ることを示している。血清代替添加物に基づく培地を用いて、図10に記載されるような実験を実施した。
【０１２４】
ここで、0.59μg/μlでスポットされたラミニンに捕捉された細胞（左イメージ）は、増殖中の極めて未分化なクランプを形成したが、Eカドヘリン-LIFに付着したもの（右イメージ）は、有系分裂後の上皮に類似した細胞である。対照的に、同一スポット上の細胞クラスターは均一に見える。この実施例は、局所的な微小環境を細胞運命操作のために使用することの実行可能性を証明している。簡単なアプローチは、（i）解離された未分化mES細胞を、1個または複数のECM成分（ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン、ビトロネクチン等）と一緒にシグナリング・キュー（増殖因子、サイトカイン、ホルモン）を含有しているスポットに固定化すること、（ii）最大数週間、異なるトライアル培地を用いて各スライド上で細胞を培養すること、および（iii）免疫染色またはその他の標準的な読み取りにより所望の表現型に関してスクリーニングすることであると考えられる。単一のまたは連続的なプリントの実行で、数十〜数百の同一スライドがプリントされ得ることに注意すること。従って、多くの同一スライドの利用可能性は、「第三の次元」における異なる培地の探究を可能にする。また、これはいずれもmES細胞に特別ではないことにも注意すること。従って、同一の戦略が、hES細胞にも適用され得るし、またはhNSCを例えばドーパミン作動性ニューロンへと分化させるためにも適用され得る。
【０１２５】
実施例10
mES細胞の調節されない増殖および複数の系統への自発的な分化
図11に示された二つの例は、図9および10に示された同一の細胞型の広範囲の発生能力を証明する。R1 mES細胞を、図10に記載されたようにしてシリル化スライドに固定化した。次いで、そのスライドを、0.5μM all-trans RAおよび0.5％ DMSOを含有している血清代替添加物に基づく培地中で1日インキュベートした後、RAおよびDMSOを培地から除去した。続いて、2〜3日毎に培地を交換し、16日後に4％PFAで細胞を固定した。
【０１２６】
（細胞が限定された増殖および制限された分化を示した）先の実施例に対する主要な差違は、使用されたスライドの型（SuperAldehydeに対しシリル化）、およびスライドに最初に適用された細胞の密度（ここではおよそ324mm2に4.5×106個。それに対し、図9では同様の面積に1.5×106個）であった。さらに、SuperAldehydeと比較して高いシリル化スライドの反応性のため、洗浄後にシリル化スライド上に残存していた細胞の実際の密度は、図9に示された対応する実施例よりもはるかに高かった。
【０１２７】
図11に示されているのは、ニューロン（β−チューブリンIII型）、平滑筋、および内皮（レクチン）のマーカーに関して染色され、共焦点顕微鏡検によりイメージングされた単一スライドからのいくつかの領域である。上六つのイメージに出現した構造は、0.59μg/μlラミニンおよび0.2μg/μl β-NGFの4：1混合物を含有しているスポット上に捕捉された最初は未分化であった細胞に起因したものである。下三つのイメージは、0.59μg/μl ラミニン、50μM（DMSO溶解）レチノイン酸、および0.2μg/μl アクチビン-Aの4：1：1混合物を含有しているスポット上に形成された組織の塊の3個の異なる焦平面（下がスライド表面に最も近い）を明らかにしている。2個の異なるスポット組成物で形成された構造は、相互に極めて異なっているが、両方の組織は、明らかにニューロン、平滑筋、および内皮細胞に関して陽性に染色された（但し、異なる分布で）。同様に、（同一スライド上の）増殖因子およびラミニンのその他の組み合わせは、多少異なる細胞分布をもたらし、巨大なクランプ内のそれらの大部分は、下三つのイメージに示されたものと類似していた。全ての混合物の十分な独立のレプリカをプリントすることにより、特定のスポット混合物が、得られる細胞分布に影響を及ぼす程度を決定することが可能である。
【０１２８】
実施例11
プリントされたサイトカインによる細胞増殖の増強
以下の実施例は、（捕捉／にかわ分子と一緒にプリントされた）固定化されたサイトカイン／増殖因子が、標準的なBrdU取り込みアッセイ法により認められるような細胞増殖に影響を及ぼし得ることを示す。図12に示されているのは、rhLIFと共にまたはrhLIFなしで（それぞれ右および左のイメージ）、3個のECM成分（1mg/mlコラーゲン、1mg/mlゼラチン、および0.59mg/mlラミニン）に付着した（ヒト）髄芽腫細胞クラスターである。細胞を、無血清培地（DMEM／F12／BIT／PSF＋20ng/ml EGFおよび20ng/ml PDGF）中で増殖させ、10分間非酵素的に解離させ、10分間増殖因子およびECM成分の様々な混合物がプリントされた SuperAldehydeスライドに適用し（650mm2に1.5×106個の細胞）、DMEMで洗浄した。2日間の培養後、1×BrdUを培地に8時間添加し、その後、細胞を、4％PFAで固定し、BrdU（青）および（β-チューブリンIII型−緑）に関して染色した。図13に記載された三つの例は、全て、LIFを含有していなかったスポットと比べて、LIFを含有していたスポットにおいてBrdUを取り込んだ細胞の数が増加したことを示している。
【０１２９】
実施例12
ヒト髄芽腫の分化マーカー・プロファイルのスポット依存的な変化
細胞の異なる微小環境との相互作用は、異なる細胞運命決定をもたらし得る。異なる細胞運命は、様々な分化マーカーに対して染色された場合の色プロファイルの変化として認められ得る。図13に示されているのは、異なる増殖因子（bFGF、NGF、TGF-β、およびShh）が補足されたコラーゲンIV型（1mg/ml）に付着した（SuperAldehydeスライド上の）髄芽腫細胞クラスターの四つの10×蛍光イメージである。細胞を（図11に関して記載されたような）画定培地で2日間培養し、4％PFAで固定し、以下の分化マーカー：グリア（GFAP−青）、ニューロン（β-チューブリンIII型−緑）、および未熟神経前駆細胞（ネスチン−赤）に対する抗体で染色した。スキャンされたイメージは、4個のスポット混合物の各々が、別個の色プロファイルを有することを示している。これらの混合物のうちの3個（即ち、bFGF、NGF、およびShh）において、クラスターは類似したサイズを有しており、従って、色プロファイルの変化がクラスター・サイズの差によるものである可能性は低い。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】懸濁細胞の絶対的および差次的な（受動）プロファイリング。
【図２】接着細胞（ヒトのSVZ由来の神経およびグリアの前駆細胞）の特異的な付着、プロファイリング、および維持。新生児SVZに由来するヒトの神経およびグリアの前駆細胞の、特異的なab（α-ヒトCD58）により媒介された接着および維持。
【図３】マウスES細胞のパターン化された接着および維持。
【図４】機能的結合アッセイ法（FBA）を介した懸濁細胞の能動プロファイリング。
【図５】懸濁細胞の能動差次的プロファイリング。
【図６】接着（マウスES）細胞を用いた機能的結合アッセイ法および新規の相互作用の発見。
【図７】ES細胞のE-カドヘリンとの結合の増強に対する（i）転写の阻止および（ii）LIFシグナル伝達阻害の効果。
【図８】マウスES細胞のスポット指向クラスター形成。
【図９】「粘着性」表面におけるマウスES細胞の長期的なスポット指向パターン化。
【図１０】「オンスライド」のスポット依存性のmES細胞の分化。
【図１１】mES細胞の調節されない増殖および複数の系統への自発的な分化。
【図１２】プリントされたサイトカインによるヒト髄芽腫細胞増殖の増強。
【図１３】ヒト髄芽腫の分化マーカー・プロファイルのスポット依存的な変化。
【図１】
2005514617.tif 000002
【図２】
2005514617.tif 000003
【図３】
2005514617.tif 000004
【図４】
2005514617.tif 000005
【図５】
2005514617.tif 000006
【図６】
2005514617.tif 000007
【図７】
2005514617.tif 000008
【図８】
2005514617.tif 000009
【図９】
2005514617.tif 000010
【図１０】
2005514617.tif 000011
【図１１】
2005514617.tif 000012
【図１２】
2005514617.tif 000013
【図１３】
2005514617.tif 000014
【国際調査報告】
2005514617.tif 000015
2005514617.tif 000016
2005514617.tif 000017