(57)【要約】  本発明はクルシアノン異性体およびその使用法に関し、とりわけ薬剤または薬物活性成分として、とりわけ腫瘍または癌疾病、同じくウイルス病の予防または治療（治癒）処置のための薬物を産生するための使用法に関する。  前記化合物は細胞分裂抑制剤および抗ウイルス剤（ウイルス増殖抑制剤）に使用できる。前記化合物は、とりわけトポイソメラーゼインヒビターおよびテロメラーゼインヒビターとして作用し、またＭＡＰキナーゼシグナル伝達でのレギュレーターとして作用する。前記化合物は、かくして腫瘍または癌細胞およびウイルスの増殖機構において細胞水準で干渉することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）
2005509670.tif 000020
の化合物、及びその生理許容塩、水和物、異性体、とりわけ構造異性体、互変異性体及び立体異性体、誘導体、プロドラッグ及び又は代謝産物であることを特徴とする一つの化合物。
【請求項２】
下記の立体配置
2005509670.tif 000021
であることを特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項３】
疾病の予防及び又は治療処置のための前に定義の一般式（Ｉ）の化合物、及び又はその生理許容塩、水和物、異性体、とりわけ構造異性体、互変異性体及び立体異性体、誘導体、プロドラッグ及び代謝産物であることを特徴とする一つの化合物。
【請求項４】
活性薬剤成分及び又は薬物の活性薬剤成分としての前に定義の一般式（Ｉ）の化合物、及び又はその生理許容塩、水和物、異性体、とりわけ構造異性体、互変異性体及び立体異性体、誘導体、プロドラッグ及び代謝産物であることを特徴とする一つの化合物。
【請求項５】
前に定義の一般式（Ｉ）の化合物、及び又はその生理許容塩、水和物、異性体、とりわけ構造異性体、互変異性体及び立体異性体、誘導体、プロドラッグ及び代謝産物である一つの化合物であって、新生物及び又は癌疾病、とりわけ一次腫瘍及び転移及び又は前癌（癌の初期段階）、とりわけ腸癌（結腸癌）、乳癌（乳房癌）、卵巣癌、子宮癌、肺癌、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、骨癌、皮膚癌、カポージ肉腫、脳腫瘍、筋肉腫、神経芽腫、リンパ腫及び白血病などの予防及び又は治療処置のためのものであることを特徴とする化合物。
【請求項６】
前に定義の一般式（Ｉ）の化合物、及び又はその生理許容塩、水和物、異性体、とりわけ立体異性体、互変異性体及び構造異性体、誘導体、プロドラッグ及び代謝産物である一つの化合物であって、とりわけトポイソメラーゼ及び又はテロメラーゼ阻害のための請求項１乃至５のいずれか１項記載の化合物。
【請求項７】
前に定義の一般式（Ｉ）の化合物、及び又はその生理許容塩、水和物、異性体、とりわけ構造異性体、互変異性体及び立体異性体、誘導体、プロドラッグ及び代謝産物である一つの化合物であって、ウイルス病の予防及び又は治療処置のためのものであることを特徴とする化合物。
【請求項８】
前に定義の一般式（Ｉ）の化合物、及び又はその生理許容塩、水和物、異性体、とりわけ構造異性体、互変異性体及び立体異性体、誘導体、プロドラッグ及び代謝産物である一つの化合物であって、ＭＡＰキナーゼシグナル伝達内でレギュレーターとして機能することを特徴とする化合物。
【請求項９】
前に定義の一般式（Ｉ）の化合物、及び又はその生理許容塩、水和物、異性体、とりわけ構造異性体、互変異性体及び立体異性体、誘導体、プロドラッグ及び代謝産物である一つの化合物であって、全身又は局所使用されることを特徴とする請求項１乃至８いずれか１項記載の化合物。
【請求項１０】
一つの薬剤組成物又は薬物、とりわけ細胞分裂抑制組成物又は抗ウイルス組成物であって、前に定義の一般式（Ｉ）の化合物及び又はその生理許容塩、水和物、異性体、とりわけ構造異性体、互変異性体及び立体異性体、誘導体、プロドラッグ及び代謝産物である化合物、ならびに薬理許容必須無毒担体又は賦形剤を含むことを特徴とする薬剤組成物又は薬物。
【請求項１１】
請求項１０記載の一つの薬剤組成物又は薬物であって、前に定義の一般式（Ｉ）の化合物、及び又はその生理許容塩、水和物、異性体、とりわけ構造異性体、互変異性体及び立体異性体、誘導体、プロドラッグ及び代謝産物の治療有効量を含むことを特徴とする薬剤組成物又は薬物。
【請求項１２】
全身又は局所への使用を特徴とする請求項１０または１１記載の一つの薬剤組成物又は薬物。
【請求項１３】
一つの薬剤配合物、とりわけ細胞分裂抑制配合物であって、ここでそれが
（Ａ）前に定義の一般式（Ｉ）の化合物、及び又はその生理許容塩、水和物、異性体、とりわけ構造異性体、互変異性体及び立体異性体、誘導体、プロドラッグ及び代謝産物の化合物、及び
（Ｂ）更に少なくとも１個の化学治療薬、とりわけプロテインキナーゼインヒビター、望ましくはＭＡＰキナーゼインヒビター
を含むことを特徴とする薬剤配合物。
【請求項１４】
請求項１３記載の薬剤配合物であって、ここで成分（Ａ）及び（Ｂ）が機能ユニット、とりわけ調合物、混和物、または混合物の状態で存在するか、あるいは相互に（空間的に）離れて他のものとして存在するかのいずれかであることを特徴とする薬剤配合物。
【請求項１５】
請求項１３または１４記載の薬剤配合物であって、ここで成分（Ａ）又は（Ｂ）を同時、又は別途連続して使用出来又は投与出来ることを特徴とする薬剤配合物。
【請求項１６】
請求項１３乃至１５のいずれか１項記載の薬剤配合物であって、ここで成分（Ａ）及び（Ｂ）のそれぞれ治療有効量を含むことを特徴とする薬剤配合物。
【請求項１７】
全身又は局所に使用することを特徴とする請求項１３乃至１６のいずれか１項記載の薬剤配合物。
【請求項１８】
前に定義の一般式（Ｉ）の化合物及び又はその生理許容塩、水和物、異性体、とりわけ構造異性体、互変異性体及び立体異性体、誘導体、プロドラッグ及び代謝産物である化合物の一つの使用法であって、ここで新生物及び又は癌疾病の予防又は治療処置のための薬物を産生することを特徴とする使用法。
【請求項１９】
請求項１８記載の使用法であって、ここで新生物及び又は癌疾病、とりわけ一次腫瘍及び転移、及び又は前癌（癌の初期段階）の予防及び又は治療処置のためのものであることを特徴とする使用法。
【請求項２０】
請求項１８又は１９記載の使用法であって、ここで良性又は悪性腫瘍の予防及び又は治療処置のためのものであることを特徴とする使用法。
【請求項２１】
請求項１８乃至２０のいずれか１項記載の使用法であって、ここで腸癌（結腸癌）、乳癌（乳房癌）、卵巣癌、子宮癌、肺癌、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、骨癌、皮膚癌、カポージ肉腫、脳腫瘍、筋肉腫、神経芽腫、リンパ腫及び白血病の予防及び又は治療処置のためのものであることを特徴とする使用法。
【請求項２２】
請求項１８乃至２１のいずれか１項記載の使用法であって、ここで前に定義の一般式（Ｉ）の化合物、及び又はその生理許容塩、水和物、異性体、とりわけ構造異性体、互変異性体及び立体異性体、誘導体、プロドラッグ及び代謝産物が、全身及び又は局所に投与されることを特徴とする使用法。
【請求項２３】
請求項１８乃至２２のいずれか１項記載の使用法であって、ここで前に定義の一般式（Ｉ）の化合物、及び又はその生理許容塩、水和物、異性体、とりわけ構造異性体、互変異性体及び立体異性体、誘導体、プロドラッグ及び代謝産物が腫瘍及び又は癌細胞の細胞増殖及び細胞分裂を阻害及び又は停止をもたらすことを特徴とする使用法。
【請求項２４】
請求項１８乃至２３のいずれか１項記載の使用法であって、ここで前に定義の一般式（Ｉ）の化合物、及び又はその生理許容塩、水和物、異性体、とりわけ構造異性体、互変異性体及び立体異性体、誘導体、プロドラッグ及び代謝産物が、腫瘍及び又は癌細胞のＤＮＡの破壊を誘導することを特徴とする使用法。
【請求項２５】
前に定義の一般式（Ｉ）の化合物、及び又はその生理許容塩、水和物、異性体、とりわけ立体異性体、互変異性体及び構造異性体、誘導体、プロドラッグ及び代謝産物が、トポイソメラーゼインヒビター及び又はテロメラーゼインヒビターとして使用されることを特徴とする使用法。
【請求項２６】
請求項１８乃至２５のいずれか１項記載の使用法であって、ここで前に定義された一般式（Ｉ）の化合物、又はその生理許容塩、水和物、異性体、とりわけ構造異性体、互変異性体及び立体異性体、誘導体、プロドラッグ及び代謝産物が、更に少なくとも１個の化学療法薬、とりわけプロテインキナーゼインヒビター、望ましくはＭＡＰキナーゼインヒビターと併用されることを特徴とする使用法。
【請求項２７】
請求項２６記載の使用法であって、ここで一方で前に定義された一般式（Ｉ）の化合物、及び又はその生理許容塩、水和物、異性体、とりわけ構造異性体、互変異性体及び立体異性体、誘導体、プロドラッグ及び代謝産物と、更に少なくとも１個の化学治療薬とが、同時に又は別個に連続して使用され、又は投与されることを特徴とする使用法。
【請求項２８】
前に定義の一般式（Ｉ）の化合物、及び又はその生理許容塩、水和物、異性体、とりわけ構造異性体、互変異性体及び立体異性体、誘導体、プロドラッグ及び代謝産物である化合物の一つの使用法であって、ウイルス疾病の予防及び又は治療処置のための薬物を産生するために使用されることを特徴とする使用法。
【請求項２９】
前に定義の一般式（Ｉ）の化合物、及び又はその生理許容塩、水和物、異性体、とりわけ構造異性体、互変異性体及び立体異性体、誘導体、プロドラッグ及び代謝産物である化合物の一つの使用法であって、ＭＡＰキナーゼシグナル伝達内でレギュレーターとして使用されることを特徴とする使用法。
【請求項３０】
請求項１８乃至２９のいずれか１項記載の使用法であって、ここで前に定義された一般式（Ｉ）の化合物が、全身又は局所に投与されることを特徴とする使用法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１−ベンゾイル−８，８−ジメチル−２−ヒドロキシ−３，５，７−トリス（３−メチル−２−ブテニル）ビシクロ［３．３．１］ノン−２−エン−４，９−ジオン、およびその生理許容塩，水和物，異性体とりわけ立体異性体，互変異性体および構造異性体、誘導体、プロドラッグおよび代謝産物に関し、またとりわけ新生物または癌疾病およびウイルス性疾患の予防及び又は治療（治癒）処置のための薬物を産生するための特に活性薬剤成分または薬物の活性成分の使用法に関する。本発明は、同様に薬物又は薬剤組成物、とりわけ本化合物を含有する細胞分裂抑制剤及び抗ウイルス組成物（ウイルス増殖抑制剤）に関する。
【０００２】
新生物又は癌疾病は、単一の病理状態ではなく、数多くの異なる型の悪性疾病の属名である。体内の事実上すべての組織は、癌変性を起こし得るし、時にはいくつか異なる型のものも生じさせる。各疾患のそれぞれは独自の特性を持つ。これらの疾病に至る原因はしばしば非常に異種のものである。
【０００３】
こうした多様性にも拘わらず、事実上すべての腫瘍と癌変性は、非常に類似した基本的分子細胞プロセスを通して生じる。過去２０年の研究により、分子レベルでの発癌と腫瘍形成のもっとも基本的なプロセスに関する知識は驚くべき進歩を見た。
【０００４】
遺伝情報は、細胞核内の染色体のＤＮＡ分子により伝えられる。いずれも細胞の全資質のほんの小さな分画であると見做される２個のクラスの遺伝子が、癌の増殖に基本的な役割を果たす。つまり特に、原癌遺伝子（プロトオンコジーン、癌遺伝子前駆体）と癌抑制遺伝子（腫瘍を抑制する遺伝子）である。通常の形態では、それらは細胞の生活環を指向する。それは細胞が増大し、必要とあれば分裂するプロセスの複雑な配列を制御する。原癌遺伝子は細胞増殖を促進し、一方それは癌抑制遺伝子により進行を遅くする。これらの２クラスの遺伝子は、いずれもヒト腫瘍における無制御な細胞増殖プロセスの大部分の原因となる。例えば、もしも原癌遺伝子が調節領域または構造領域で突然変異すると、次いであまりにも多くの成長促進タンパク質の産生を見たり、または後者が過大に活性であったりすることがある。原癌遺伝子は、癌を促進する遺伝子となり、細胞が過大に増殖するよう刺激する。これに対して、癌抑制遺伝子は、それが突然変異で不活性化される場合には、癌の増殖に寄与する。その結果細胞は、機能することができる抑制タンパク質、かくして不適切な増殖からそれを正常に抑制する重大な増殖抑制物質を失う。
【０００５】
無制限の増殖に対する緊急対応機構が、正常体細胞に組み込まれており、これはすべての細胞分裂を記録し、またある数の世代に到達後に停止するある種の係数器を含んでいる。ほぼ予測可能なある程度の数の細胞分裂または倍増が行われた後、正常細胞の増殖は停止する。このプロセスは細胞の老化またはセネセンスとして引用される。
【０００６】
細胞の老化またはセネセンスのプロセスに対する分子レベルで原因となるものは、テロメアと呼ばれる染色体末端にあるＤＮＡ断片である。それは言ってみれば、どれだけ多くの増殖サイズを細胞集団が経験するかを記録し、特定時間後にセネセンスすなわちクリーゼを開始する。このようにして、それは細胞集団が制限なく増殖する能力を限定する。もっとも健全なヒト細胞では、染色体がそれぞれ細胞分裂で複製される時に、テロメアは小片により短くされる。それが特定の臨界長まで収縮すると、それがセネセンスの段階に細胞が入るというシグナルである。もし細胞がこの警告を無視すると、テロメアは更に短くなり、最後にクリーゼが起こる。テロメアが極端に短くなると、染色体は、相互に結合するか断片化し、誘導された遺伝的混沌は細胞にとって致死的となる。
【０００７】
正常細胞における老化またはセネセンスプロセス、すなわち、正常細胞が当然支配される分裂する能力の減退は、かくして各細胞分裂のテロメア末端で約５０乃至２００個のＤＮＡヌクレオチドを損耗する正常致死細胞の染色体に依存する。これらの末端ヌクレオチド（テロメア）の損耗は、細胞分裂数を記録するある種の有系分裂時計の機能を持つ。テロメアの保持は、セネセンスプロセスを逃れ無限に分裂できるためには細胞にとって必要であるようにみえる。
【０００８】
前記の保護機能は、大抵の癌及び腫瘍細胞において、とりわけテロメラーゼと呼ばれる酵素合成の指示を含む遺伝子の活性化により変性コースの間に不活化される。この酵素は、そうしなければ短くなるテレメア部分を系統的に補充し、絶えずそれを維持し、細胞が事実上制限なく更に分裂できるようにする。かくして大抵の新生物及び癌疾病では、細胞の不死は、テロメラーゼの作用による短くはあるが安定したテロメアの保持に起因する。これから生じる細胞の潜在的な不死は、いくつかの点で望ましくない。まずそれは、腫瘍が徐々に非常に巨大化する可能性に寄与し、また第２に、それは前癌または既になっている真性癌細胞に更なる突然変異を累積する時間を提供し、その突然変異は増殖し、他の組織に侵入し、最後に転移する能力を増加する。
【０００９】
変性細胞の無限の細胞増殖が、テロメラーゼの損なわれた調節に基づくすべての新生物疾病の約８０％に基づくものであることが発見された。従って、テロメラーゼインヒビターを経由する新生物または癌疾病の処置は、これらの疾病に可能な見込みのある治療を行うことができるようにみえる。従って、多くの試みが、テロメラーゼを阻害する活性成分を開発するために従来の技術で行われている。
【背景技術】
【００１０】
かくして例えば、ＷＯ  ００／７４６６７  Ａ２は、テロメラーゼインヒビター（例えば、ＡＺＴ）を、癌処置のためのテロメア破壊を誘導する活性成分（例えばパクリタキセル）と併用する使用法を提案している。ＷＯ  ９９／６５８７５  Ａ１およびＵＳ−Ａ−５  ８６３  ９３６は、癌疾病の治療のために、テロメラーゼインヒビターとして特異的な複素二環式系の使用を提案する。ヨーロッパ特許公報明細書ＥＰＯ  ０  ９３８  ８９７  Ａ１に記載されたカテコール誘導体は、癌処置のためのテロメラーゼインヒビターとして使用可能であると言われている。
【００１１】
腫瘍または癌細胞増殖の分子または細胞レベルで他の機構により介入するために、従来の技術でいろいろな試みがなされている。かくして、新生物または癌疾病は、ＤＮＡのアルキル化を経由して最終的に腫瘍または癌細胞のＤＮＡの直接の損傷を誘導する数多くのアルキル化薬剤（例えはシクロホスファミド、イホスファミド、カルムスチン、クロラムブシルなど）を採用することにより、最新式の技術で処置される。同様に腫瘍または癌治療に使用されるのは、ＤＮＡトポイソメラーゼの阻害を経由して腫瘍または癌細胞の複製を阻害する物質（例えばカムトセチシン  ９−アミノカプトテシン、イリノテカン、トポテカン、ドキソルビシンなどである（例えばクライブ・ページ他，インテグレーテッド・ファーマコロジー，モスビー，１９９７年を参照のこと）。一方アルキル化活性成分の他に、臨床使用でのいくつかのトポイソメラーゼインヒビターが存在するけれども、現在の所テロメラーゼを阻害し、またはトポイソメラーゼとテロメラーゼの阻害の性質を組み合わせる各種腫瘍の処置のために臨床使用する活性成分は存在しない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
かくして本発明の目的は、新生物および癌疾病、また適切である場合には他の疾病（例えばウイルス疾病）などの処置に特に適した活性成分と薬物を見出し提供することである。
【００１３】
出願人は、意外なことに、下記の一般式（Ｉ）
【００１４】
2005509670.tif 000002
【００１５】
およびその生理許容塩、水和物、異性体、とりわけ立体異性体、互変異性体および構造異性体、誘導体、プロドラッグおよび代謝産物などの化合物が、新生物および癌疾病の予防およびまたは治療（治癒）処置に特に適していることを発見した。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
かくして本発明は、一般式（Ｉ）の前記化合物と、その生理許容塩、水和物、異性体、とりわけ立体異性体、互変異生体および構造異性体、誘導体、プロドラッグおよび代謝産物で新生物およびまたは癌疾病、とりわけヒトおよび動物、すなわちヒトおよび獣医の医療セクター両方に属する疾病のための前記化合物の使用に関する。
【００１７】
一般式（Ｉ）の化合物の生理許容塩は、例えば鉱酸、カルボン酸またはスルフォン酸の塩である。とりわけ望ましい例は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、メタンスルフォン酸、エタンスルフォン酸、トルエンスルフォン酸、ベンゼンスルフォン酸、ナフタレンジスルフォン酸、酢酸、プロピオン酸、乳酸、酒石酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、または安息香酸の塩である。しかし従来の塩基との塩も生理許容塩として言及されるべきであろうし、それは例えばアルカリ金属塩（例えばナトリウムまたはカリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えばカルシウムまたはマグネシウム塩）またはアンモニアまたは有機アミンから誘導されるアンモニウム塩、例えばジエチルアミン、トリエチルアミン、エチルジイソプロピルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ−メチルモルフォリン、ジヒドロアビエチルアミン、１−エフェナミンまたはメチルピペリジンである。
【００１８】
本発明は、更に一般式（Ｉ）の化合物の水和物を含む。本発明に基づく水和物として引用される前記一般式（Ｉ）の化合物の形態は、固体状態または液体状態で水との水化作用で分子化合物（水和物）を形成するものである。水和物では、特殊な水素結合で水分子は分子間力により付着される。固体水和物は化学量論または非化学量論比で所謂結晶化としての水を含み、水分子はその結合状態に関連して等量である必要はない。水和物の例はセスキ水和物、モノ水和物、ジ水和物、トリ水和物などである。本発明に基づき同じように適するものは、一般式（Ｉ）の化合物の塩の水和物である。
【００１９】
本発明は更に、一般式（Ｉ）の化合物の異性体を含む。本発明の目的のための異性体の概念は、異性のすべて可能な形態の包括的な称呼として使用される。本発明に含まれる異性体の限定されない例は、とりわけ立体異性体、互変異性体および構造異性体である。
【００２０】
かくして、一般式（Ｉ）の化合物は、置換パターンに依存して、異性体形態、とりわけ立体異性体として、例えば像と鏡像に関係する立体異性体（鏡像異性体）、あるいは像と鏡像に関係しない立体異性体（ジアステレオマー）として生じる。本発明は、一般式（Ｉ）の化合物のすべての立体異性体形態、すなわち鏡像異性体とジアステレオマー両方、同じくそのそれぞれの混合体を含む。鏡像異性体形態は、ジアステレオマーと全く同じように、それ自身既知のやり方で立体異性的に均一な構造成分に分離することができる。
【００２１】
一般式（Ｉ）の化合物は、更に構造異性体、とりわけ位置異性体（置換異性体）として存在することもある。これは当業者には既知のものであり、このような化合物は本発明の範囲内に同じく含まれる。
【００２２】
一般式（Ｉ）の化合物は、更に互変異性体形態でも存在する。これは当業者にとっては既知のものであり、このような化合物は本発明の範囲内に同じく含まれる。互変異性体形態の例は、例えば以下のケト−エノール互変異性体である。
【００２３】
2005509670.tif 000003
【００２４】
一般式（Ｉ）の化合物は、相互に平衡で存在する複数のケト−エノール互変異性体の一つである。
【００２５】
2005509670.tif 000004
【００２６】
本発明は、更に一般式（Ｉ）の化合物の誘導体を含む（例えばエーテル、例えば互変異性体（Ｉ′）および（Ｉ″）のアルキル化などで得られるメチルエーテルなどのアルキルエーテルである）。本発明に基づき、とりわけ望ましい一般式（Ｉ）の化合物の誘導体は、ペジル化誘導体（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）、とりわけポリアルキレングリコールエーテル、望ましくは互変異性体形態（Ｉ′）および（Ｉ″）のポリエチレングリコールエーテル（ＰＥＧエーテル）である。更に化学的修飾は、とりわけ置換体に関連して（例えば側基の誘導体化により）可能である。
【００２７】
本発明は、同じくまた一般式（Ｉ）の化合物のプロドラックおよび代謝産物を含む。プロドラッグとして本発明に基づき引用される前記一般式（Ｉ）の化合物の形態は、それ自身生物活性または不活性であるが、（例えば、代謝、ソルボリシス（加溶媒分解）またはその他の方法で）適切な生物活性形態に転換できるものである。本発明に基づき代謝産物として引用される一般式（Ｉ）の化合物の産物は、とりわけ代謝で生じ、または代謝で形質転換されるものである。
【００２８】
一般式（Ｉ）の化合物は天然産物であり、カリブミツバチのプロポリス抽出物からクロマトグラフ除去で獲得することができる。プロポリスは暗黄色から青茶色のものであり、指先で柔らかくすることができ、芳香性バルサムの香りを持つ樹脂状塊であり、花芯から特にミツバチにより集められ蜂の巣の壁の上塗りに使用され、蜂の巣の強化のために使用されるものである。プロポリスは非常に複雑な化学構造を有しており、その組成はそれぞれの土地の植物相に依存する。プロポリスは２００種以上の異なる化学物質を含有し、それは相対的に大きい割合のろうと樹脂、精油と芳香油、および数多くの他の化学物質、例えばフラボノイド、カフェイン酸誘導体、およびカリブプロポリスの場合は一般式（Ｉ）の化合物を含む。
【００２９】
選択肢として、一般式（Ｉ）の化合物は、クルシアシー・グティフェレー科（ビワモドキ下綱、ツバキ目、オトギリソウ科）の各種クルシア種の植物樹液または樹脂から、例えばクルシア・グランディフローラ，クルシア・ロゼアまたはクルシア・レンゲリオイデスから（例えば樹脂、ラテックス、薬、花などから）直接分離することができる。各種クルシア種の植物樹液または樹脂からクルシアノンまたはクルシアノン誘導体を除去するためには、一般的な方法、および下記の文献を参照することができ、後者のこれらの文献は、すべての内容がここで引用例とて組み込まれている：Ａ．Ｊ．マルセーオリ他「化学の見地からの微生物、ミツバチ、およびクルシアフローラル樹脂および油の生態系」ピュア・アプライド・ケミストリー，７０巻：１１号、２１１６ページ以降（１９９８）；Ｃ．Ｍ．Ａ．ドゥ・オリベイラ他「３個のクルシア種のフローラル樹脂から得る２個のポリイソプレニル化ベンゾフェノン」植物化学、５０巻（１９９９），１０７３−１０７９ページ、およびＡ．Ｌ．Ｍ．ポルト他「クルシアフローラル樹脂からのポリイソプレニル化ベンゾフェノン」植物化学、５５巻（２０００），７５５−７６８ページ；Ｌ．Ｅ．マッキャンドリッシュ他「ビシクロ［３．３．１］ノナン−２，４，９−トリオンの２個の誘導体の構造．天然産物：クルシアノン，Ｃ３３Ｈ４２Ｏ４およびトリメチル化カテキン酸、Ｃ１８Ｈ２０Ｏ６」Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．（１９７６），Ｂ３２，１７９３−１８０１ページ，Ｍ．Ｈ．サントス他「レーディア・ガルドネリアーナ（バクパリ；金線挑属）から抽出された化学成分の細菌病原体への効果（Ｅｆｅｉｔｏ  ｄｅ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｉｎｔｅｓ  ｑｕｉｍｉｃｏｓ  ｅｘｔｒａｉｄｏｓ  ｄｏ  ｆｒｕｔｏ  ｄｅ  Ｒｈｅｅｄｉａ  ｇａｒｄｎｅｒｉａｎａ  （ｂａｃｕｐａｒｉ）  ｓｏｂｒｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｓ  ｐａｔｏｇｅｎｉｃａｓ）」ブラジリアン・ジャーナル・オブ・ファーマス−ティカルス・サイエンス（Ｒｅｖｉｓｔａ  Ｂｒａｓｉｌｅｉｒａ  ｄｅ  Ｃｉｅｎｃｉａｓ  Ｆａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｓ），３５巻，２号，７−１２月号、１９９９年、２９７−３０１ページ；「エピクルシアノン：ビシクロ［３．３．１］ノナン−２，４，９−トリオンの新天然産物誘導体」Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．（１９９８），Ｃ５４，１９９０−１９９２ページ；Ｆ．デル・モナーシュ他，「クルシア・サンディエンシスから得るプレニル化ベンゾフェノン」植物化学，３０巻，６号，２００３−２００５ページ。
【００３０】
しかし、一般式（Ｉ）の化合物を純粋物質として単離しまたは合成することは、今日までなされていなかった。本発明の出願人は、初めてこれに成功した。
【００３１】
全く意外なことに、その生理許容塩、水和物、異性体とりわけ立体異性体、互変異性体および構造異性体、誘導体、プロドラッグおよび代謝産物を含む一般式（Ｉ）の化合物は、これまでに予測できず、従ってすべての種類のとりわけ癌または新生物疾病、更にすべての型のウイルス疾病の予防およびまたは処置に適する価値ある範囲の薬理効果を示すことを出願人は発見した。
【００３２】
その生理許容塩、水和物、異性体、とりわけ立体異性体、互変異性体および構造異性体、誘導体、プロドラッグおよび代謝産物を含む一般式（Ｉ）の化合物は、従って望ましくは新生物および癌疾病の予防およびまたは処置（細胞分裂抑制剤）またはウイルス疾病の予防およびまたは処置（抗ウイルス組成物またはウイルス増殖抑制薬）のための薬物に使用することができる。かくして本発明は、更に薬剤組成物または薬物、とりわけ細胞分裂抑制剤または抗ウイルス組成物（ウイルス増殖抑制剤）に関し、これは前に定義の一般式（Ｉ）の化合物、およびまたはその生理許容塩、水和物、異性体、とりわけ立体異性体、互変異性体および構造異性体、誘導体、プロドラッグおよび代謝産物を、治療有効量で、また薬理許容必須非毒性担体または賦形剤を共に含む。
【００３３】
一般式（Ｉ）の化合物は、なかでもトポイソメラーゼインヒビター、とりわけトポイソメラーゼＩのインヒビターとして作用することを出願人は意外にも発見した。更にそれはまた、テロメラーゼ阻害効果を一般的に示す。究極的には、本発明に基づき使用される一般式（Ｉ）の化合物は、腫瘍および癌細胞の破壊を誘導する。
【００３４】
本発明に基づき使用される一般式（Ｉ）の化合物のトポイソメラーゼ阻害効果とテロメラーゼ阻害効果は、従来の技術で既知の化合物よりも著しく高い。かくして例えば、一般式（Ｉ）の化合物は、試験管内試験で従来の治療薬（例えばトポテカン）よりもかなり強力なトポイソメラーゼ阻害を示している。加えて一般式（Ｉ）の化合物は、ＭＡＰキナーゼシグナル伝達内での調節により作用する。
【００３５】
一般式（Ｉ）の化合物が、トポイソメラーゼとテロメラーゼの阻害の性質を結合するという事実は、すべての型の新生物および癌疾病（一次腫瘍、転移、前癌または癌の初期段階、良性および悪性腫瘍、など）の予防および治療（治癒）への使用に関連して、価値ある性質と特別な適応性のあることを示している。これとは逆に、単一分子内で一方でトポイソメラーゼ、他方ではテロメラーゼを阻害する性質を組合せた活性成分および産物は、従来の技術では存在していない。
【００３６】
本発明に基づき使用される一般式（Ｉ）の活性成分は、抗腫瘍作用だけでなく追加として更に抗転移作用も示している。
【００３７】
本発明に基づき使用される一般式（Ｉ）の活性成分は、既定の化学治療薬には限定された抵抗を示す癌腫瘍に対しても、驚くべきほどに予期しない良い細胞分裂抑制効果を示している。更に一般式（Ｉ）の活性成分に対する抵抗も見られなかった。また本発明に基づき使用された一般式（Ｉ）の活性成分は、既に確立している薬物または化学治療薬との何ら交差抵抗性を示さないという利点を有している。
【００３８】
一般式（Ｉ）の化合物がその処置のために使用できる新生物および癌疾病の限定されない例として引用される疾病は、以下のものである：腸癌（結腸癌）、乳癌（乳房癌）、卵巣癌、子宮癌、肺癌、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、骨癌、皮膚癌、カポージ肉腫、脳腫瘍、筋肉腫、神経芽腫（例えば網膜芽腫）、リンパ腫および白血病。
【００３９】
一般式（Ｉ）の化合物およびまたはその生理許容塩、水和物、異性体、とりわけ立体異性体、互変異性体および構造異性体、誘導体、プロドラッグおよび代謝産物を、少なくとも更に１個の化学治療薬、とりわけプロテインキナーゼインヒビター、望ましくはＭＡＰキナーゼインヒビターと組合せて使用または投与すると、ある場合には有利であることを出願人は発見した。とりわけ癌および新生物疾病の治療で良い結果が達成されたのは、一方で一般式（Ｉ）の化合物およびまたはその生理許容塩、水和物、異性体、とりわけ立体異性体、互変異性体および構造異性体、誘導体、プロドラッグおよび代謝産物、または他方でプロテインキナーゼインヒビター、望ましくはＭＡＰキナーゼインヒビターとの組合せで達成することができる。このような組合せは驚くばかりの相乗効果を発揮する。
【００４０】
かくして本発明は、更に薬剤配合物、とりわけ細胞分裂抑制配合物に関し、それは以下のものを含む。
【００４１】
（Ａ）前に定義の一般式（Ｉ）の化合物、およびたまはその生理許容塩、水和物、異性体、とりわけ立体異性体、互変異性体および構造異性体、誘導体、プロドラッグおよび代謝産物、
ならびに
（Ｂ）少なくとも更に１個の化学治療薬、とりわけプロテインキナーゼインヒビター、望ましくはＭＡＰキナーゼインヒビター。
【００４２】
本発明の配合物の個々の成分（Ａ）および（Ｂ）は、同時または別個連続して使用または投与することができる。薬剤配合物は、機能ユニットとしてとりわけ調合物、または混和物あるいは混合物の形で、もしくはお互いに（空間的に）別個の形のいずれかで成分（Ａ）と（Ｂ）を含む。
【００４３】
プロテインキナーゼインヒビターは、その名称が示すように、プロテインキナーゼ、すなわちγ−リン酸基をチロシンまたはセリンおよびトレオニン側鎖に移転する酵素の活性に関して阻害効果を持つ。とりわけ新生物および癌疾病について本発明の薬剤配合物および発明の配合物治療に適しているものは、すべての型のプロテイキナーゼインヒビター、例えば従来の技術で既知のすべてのプロテインキナーゼインヒビターである（例えば、スタウロスポリン、２′−アミノ−３′−メトキシフラボン、１，４−ジアミノ−２，３−ジシアノ−１，４−，［２−アミノフェニルチオ］ブタジエン、スミス・クライン・ビーチャム社のＳＢ  ２０３５８０など）。これらの場合には、相乗効果を観察することができる。
【００４４】
新生物および癌疾病について本発明の薬剤配合物および本発明の配合物治療にとっては、ＭＡＰキナーゼインヒビターを使用することが特に望ましい。ＭＡＰキナーゼインヒビターは、その名称が示すように、ＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰ＝ミトゲン活性他タンパク質）、すなわち有系分裂の間とりわけ活性であり、また末端リン酸塩残基をヌクレオチドトリホスフェートから適切な基質に転移する酵素であるＭＡＰキナーゼの活性に関連して阻害効果を持つ。このように、ＭＡＰキナーゼインヒビターは有系分裂を妨げ、かくして癌および腫瘍細胞の分裂を妨げる。とりわけ新生物および癌疾病において、本発明の薬剤配合物および本発明の配合物治療に適したものは、すべの型のＭＡＰキナーゼインヒビター、例えば従来の技術で既知のすべてのＭＡＰキナーゼインヒビターである。本発明に基づき使用できるＭＡＰキナーゼインヒビターの例は下記の刊行物で例として言及されているが、その全内容は引用文献としてここに組み込まれている。すなわち、ＷＯ  ９９／３２１１１  Ａ，ＷＯ  ９９／６４４００  Ａ，ＷＯ  ９８／５２９４１  Ａ，ＷＯ  ９８／５２９３７  Ａ，ＷＯ  ９７／４４４６７  Ａ，ＷＯ  ９８／２７０９８  Ａ，ＷＯ  ９８／５２５５８  Ａ，Ｗ９８／５２９４０  Ａ，ＷＯ  ９９／３２１１０  Ａ，ＷＯ  ９９／３２４６３  Ａ，ＷＯ  ９９／５８５０２  Ａ，ＷＯ  ９９／５８５２３  Ａ  および  ＷＯ  ９９／００３５７  Ａである。
【００４５】
出願人は更に、思いがけなくも一般式（Ｉ）の前記化合物が、ＭＡＰキナーゼシグナルに伝達内で調節活動を示し、すなわちＭＡＰキナーゼシグナル伝達内でレギュレーターとして作用していることを発見した。
【００４６】
一般式（Ｉ）の化合物は、更にウイルス疾病の処置のため、また抗ウイルス組成物（ウイルス増殖抑制物質）（例えばヘルペス病またはＨＩＶの処置）のための薬理活性成分として適している。かくして本発明は、すべての型のウイルス疾病の予防およびまたは治療（治癒）処置のための前に定義された一般式（Ｉ）の化合物、およびその生理許容塩、水和物、異性体、とりわけ立体異性体、互変異性体および構造異性体、誘導体、プロドラッグおよび代謝産物の使用法に関する。
【００４７】
本発明は更にヒトまたは動物の体の疾病、とりわけすべての型の新生物および癌疾病またはウイルス疾病の予防およびまたは処置のために、その生理許容塩、水和物、異性体、とりわけ立体異性体、互変異性体および構造異性体、誘導体、プロドラッグおよび代謝産物を含む一般式（Ｉ）の化合物を治療有効用量で、更に適当であれば更なる活性成分、とりわけ化学治療薬（例えばＭＡＰキナーゼインヒビターなどのプロテインキナーゼインヒビター）と併用する使用方法に関する。
【００４８】
本発明に基づき採用される活性成分または活性成分配合物は、処置される疾病の性質に基づいて全身にまたは別途局所に、とりわけ局所に投与される。
【００４９】
本発明に基づき採用される活性成分または活性成分配合物の投与に適するものは、すべて従来の投与形態のものである。可能な投与の例は、経口、舌側、舌下、頬、直腸または非経口（すなわち腸管を避けるもので、静脈内、動脈内、心臓内、皮内、皮下内、経皮内、腹腔内または筋肉内）のものであり、その内でも径口および静脈内投与がとりわけ適している。経口投与は特に望ましい。局所使用（例えば黒色腫の処置）も可能である。
【００５０】
本発明に基づく使用のために、活性成分または活性成分配合物は、非被覆錠剤、被覆錠剤、ピル、顆粒、エアロゾル、シロップ、乳剤、懸濁剤、溶液、軟膏、クリームおよびゲルなどすべての型で、とりわけ不活性の基本的に無毒の薬理許容担体または溶媒を使用し、既知のやり方で従来の調製物に転換される。使用される活性成分または活性成分配合物を、言わばリポソーム「パッケージ」に導入し、あたかもそれがリポソームに包埋されまたはカプセルに包まれ、あるいは代りに選択肢として更に修飾され（例えばＰＥＧでエステル化され）ることも可能である。この関連で、本発明に基づき採用される活性成分または活性成分配合物は、治療有効濃度で、とりわけ全混合物の約０．０００１乃至約９９％の重量で、望ましくは約０．０１乃至約９５％の重量の濃度で、すなわち指示または望ましい用量範囲を達成するのに十分な量で存在することができる。しかし体重または投与のルートの型、薬物に対する個体の応答、調製物の型および投与が行われる時間間隔などの関数として、前記の量から外れることも必要な場合がある。かくしてある場合には、前記の最小量より以下の量で済ませる場合もあり、また他の場合には、その上限を越えることもある。より多い量が投与される場合には、その決められた期間、例えば１日にわたりその増加した量を複数の用量にわけて投与することが望ましい。
【００５１】
調製物は、例えば活性成分または活性成分配合物を溶媒（例えばヒマ油などの油）、およびまたは担体、適切であるなら乳化剤およびまたは分散剤、使用可能であれば、例えば水が希釈剤として使用され、適切ならば補助溶媒として有機溶媒などで拡張して生産することができる。
【００５２】
投与の様式に依存して、効果的な成果を達成するために、体重ｋｇ当たり約０．０００１乃至約５００ｍｇ、とりわけ体重ｋｇ当たり約０．０００１乃至約１００ｍｇ、望ましくは体重ｋｇ当たり０．０１乃至５０ｍｇの量で本発明に基づき採用される活性成分又は活性成分配合物を投与することが有利であることが証明された。しかしとりわけ体重、または投与のルート、調製物の型および投与が行われる時間などの関数として、適切であれば前記の量から外れることが必要な場合もある。かくしてある場合には、前記の最小量で投与すれば十分な場合もあり、一方他の場合には、前記の上限量を越えねばならないこともある。多い量が投与される場合には、それを定められた期間に、例えばまる１日にわたり、とりわけ例えば複数の単一用量または連続投与（例えば連続輸液）などに分割して行うことが得策である。慢性治療への（例えば錠剤形態での）使用も同様に可能である。
【００５３】
本発明の更なる改良、修飾および変更は、本発明の範囲を外れることなく詳細な説明を読むことにより当業者が直接同定し、かつ実施することができる。
【００５４】
本発明は下記の実施例により説明されるが、しかしそれは決して本発明を限定するものでないことは言うまでもない。
【実施例】
【００５５】
カリブミツバチのプロポリス抽出物から得た１−ベンゾイル−８，８−ジメチル−２−ヒドロキシ−３，５，７−トリス（３−メチル−２−ブテニル）ビシクロ［３．３．１］ノン−２−エン−４，９−ディオン
【００５６】
2005509670.tif 000005
【００５７】
一般式（Ｉ）の化合物の単離およびその生理活性が以下で説明される。
【００５８】
一般式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ′）および（Ｉ″）の構造で、互変平衡に存在する：
【００５９】
2005509670.tif 000006
【００６０】
しかし、分かりやすくするために、以下で式（Ｉ）の化合物のみに言及することにする。
【００６１】
プロポリス溶液の調製
カリブ諸島の蜂の巣から集められたプロポリスはエタノールで溶解され、不溶性ろうは濾過で除去される。定められた量が乾燥され、生成する粉体はエタノールで定められた濃度で再懸濁される。溶液は室温で貯蔵され、光をあてないようにする。
【００６２】
プロポリス溶液の半調製ＨＰＬＣ分留
分留がヴァーターズ・ゲーエムベーハー（エッシュボーン）から供給されたＲＰ−ＨＰＬＣシステムで行われる（ヴァーターズ・ザ・セパレーター・モジュール・アライアンス  ２６９０，ヴァーターズ  ＰＤＡ  ９９６  デテクトール，ヴァーターズ・ミレニアム・クロマトグラフィ・マネージャー）。分留はマシュレー−ネージェルにより供給された分離塔（ヌクレオシル１００−７  Ｃ１８，２５０×２１ｍｍ）で、４０℃で勾配システムを用いて行われる（表１）。水相は、０．０１Ｍのギ酸アンモニウム溶液より成る（ｐＨ＝７．００）。
【００６３】
【表１】
2005509670.tif 000007
【００６４】
この方法で得られたそれぞれ８ｍｌ（２分）のフラクションは乾燥され、メタノールで再懸濁され、室温で光をあてないようにして貯蔵される。
【００６５】
個々のフラクションの細胞毒性が培地で比較される量を希釈し、以下で述べるＳＲＢ検定で調べることにより試験される。なかんずく使用される標的細胞は、ヒト起原の腸癌細胞系（ＨＣＴ８  ＷＴ）である。
【００６６】
細胞毒フラクションの精製
ＳＤＲ検定で細胞毒性を持つフラクションは、更なる精製を受ける。この目的のために、勾配溶出システムを精製されるフラクションの極性に適応させる。更新された分留と、ＳＲＢ検定で調製ＲＰ−ＨＰＬＣにより得られるフラクションの試験の後、均質な物質（Ｉ）を分離することができる。物質（Ｉ）の純度はＵＶ分光データにより示される（図１ｂ）。修飾Ｃ１８相（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ）で充填されたヴァーターズ対称カラムが、分析用分離カラムとして選択される。この結果は図１ａで示される。
【００６７】
図１ａは、前述のように、２５４ｎｍ，フローレート＝１ｍｌ／ｍｉｎ，Ｔ＝４０℃、勾配システムで分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ（純度試験）から得た物質（Ｉ）の代表的なクロマトグラムを示す。上部の線はメタノールの濃度（％）に対応し、中心の線は水相の濃度に一致する。アセトニトリルの濃度（％）は５％で一定に保持される（下部の線）。
【００６８】
図１ｂは、図１ａで示された分析のＰＤＡデータを示す。物質（Ｉ）は均質フラクションとして獲得される。これらの溶離条件の下でのＵＶスペクトルが２個の最大値（２５４ｎｍと３０８ｎｍ）を示す。
【００６９】
構造の解明
一般式（Ｉ）の化合物の最初の単離と特徴付けは、更なる変性または誘導体化（例えばジアゾメタンなどによるもの）なしで行われる。（カリブで集められた）プロポリスのエタノール抽出物は、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析により前に記載の通り精製することができ、その手段により更なるＮＭＲ分光研究に、とりわけ十分な高純度でその非誘導体形態で初めて式（Ｉ）の化合物を提供することが可能となる（＞９８％；ＬＣ−ＭＳ；ＬＣ−ＰＤＡによるＵＶ分光研究；ＭＳ）。
【００７０】
その構造の更なる確認のために、式（Ｉ）の化合物は、ジアゾメタンとの反応で対応するメチルエーテルに転換される。Ｏ−メチル化合物は４０／６０比で単離（ＲＰ−ＨＰＬＣ）される。
【００７１】
ＮＭＲ研究の結果（１Ｈ−ＮＭＲ，１３Ｃ−ＮＭＲ，ＤＥＰＴ１３５，ＤＥＰＴ９０，ＨＭＱＣ，ＨＭＢＣ，Ｈ，Ｈ−ＣＯＳＹ９０（ｇｓ），１Ｄ−ＮＯＥ差スペクトル）は以下の表で示される。
・ＤＥＰＴ＝Ｄｉｓｔｏｒｔｉｏｎｌｅｓｓ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｂｙ  Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ．
・ＣＯＳＹ＝ＣＯｒｒｅｌａｔｅｄ  ＳｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐＹ．
これは一般に１Ｈ，１Ｈ−ＣＯＳＹを意味し、「発明者」に因んでジーナー実験と呼ばれ、ＮＭＲの歴史ではその最初の２Ｄパルスシーケンスを示している。
・ＨＭＱＣ＝Ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ．
・ＨＭＢＣ＝Ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｂｏｎｄ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ．
・ＮＯＥ＝Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｏｖｅｒｈａｕｓｅｒ  Ｅｆｆｅｃｔ．
【００７２】
図１ｃ，１ｄおよび１ｅは、化合物（Ｉ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである（測定周波数：５００ＭＨｚ，溶媒：ＣＤ３ＯＤ）。
【００７３】
図１ｆは、化合物（Ｉ）の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す（測定周波数：１２５ＭＨｚ，溶媒：ＣＤ３ＯＤ）。
【００７４】
図１ｇは、化合物（Ｉ）の１３Ｃ−ＤＥＰＴスペクトルを示す（測定周波数：１２５ＭＨｚ，溶媒：ＣＤ３ＯＤ）；ＣＨｓとＣＨ３ｓは上向きであり、一方ＣＨ２ｓは下降に向かう。
【００７５】
図１ｈ，１ｉ，１ｊおよび１ｋは、化合物（Ｉ）のＨ，Ｈ−ＣＯＳＹスペクトルである（測定周波数：５００ＭＨｚ，溶媒：ＣＤ３ＯＤ）。
【００７６】
図１１乃至１ｒは、化合物（Ｉ）のＨＭＢＣスペクトルである（測定周波数：１２５ＭＨｚ，溶媒：ＣＤ３ＯＤ）。
【００７７】
【表１ａ】
2005509670.tif 000008
【００７８】
2005509670.tif 000009
【００７９】
従って、式（Ｉ）または（Ｉ′）あるいは（Ｉ″）は、シグナルの化学移動、および炭素原子２および４の１３Ｃシグナルの幅の両方で確認されるように、ケト−エノール平衡状態で存在する。
【００８０】
2005509670.tif 000010
【００８１】
【表１ｂ】
2005509670.tif 000011
【００８２】
2005509670.tif 000012
【００８３】
2005509670.tif 000013
【００８４】
【表１ｃ】
2005509670.tif 000014
【００８５】
2005509670.tif 000015
【００８６】
2005509670.tif 000016
【００８７】
絶対配置
前に記載のＮＭＲデータを基礎にして、下部の絶対配置を一般式（Ｉ）の化合物に特定することが可能となった。
【００８８】
2005509670.tif 000017
【００８９】
細胞培養
ヒト起原の６個の明白に特徴付けられた腫瘍細胞系（天然細胞系および耐性サブクローンに転換されたもの）および２個の非腫瘍細胞系が更なる研究のために使用される（表２）。
【００９０】
【表２】
2005509670.tif 000018
【００９１】
ＳＲＢ検定
細胞系の物質（Ｉ）に対する感度は、所謂スルホロダミンＢ（ＳＲＢ）検定で決定される。これは確固として高度に再生可能な標準方法であり、例えばＮＣＩ（ナショナル・キャンサー・インスティチュート，アメリカ合衆国）でも確立されている（スキーハン他、１９９０）。
【００９２】
検定結果は表３で示される。細胞増殖を５０％（半対数用量対効果プロットから決定されたＩＣ５０）阻害する物質（Ｉ）の濃度が示されている。表３で示された結果は、少なくとも３個の独立した実験の平均値と標準偏差である。示唆された細胞分裂抑制剤に対する交差抵抗はない。非腫瘍細胞系（３Ｔ３およびＭＣＲ５系線維芽細胞）に対する物質（Ｉ）の細胞毒性はかなり低いことを示している。
【００９３】
【表３】
2005509670.tif 000019
【００９４】
トポイソメラーゼ阻害についての研究
物質（Ｉ）のトポイソメラーゼＩに対する作用は、所謂トポＩ巻戻し検定を実行することで研究される。この検定は、トポイソメラーゼＩによりねじれｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡ二量体のＡＴＰ非依存性巻戻しに基づくものである。ねじれた形と巻戻され緩んだ形の２個の異なるプラスミドＤＮＡの位相形態は、本研究でアガロースゲルにより分離される。酵素トポイソメラーゼＩは、この目的のために腫瘍細胞系の細胞核抽出物から獲得される。
【００９５】
細胞核抽出物の獲得
細胞核は、ダンクス他の手で修飾されたサリバンの方法により獲得される。
【００９６】
物質（Ｉ）によるトポイソメラーゼＩ活性の阻害
図３（カラム１：対照）で示されるように、ひどくねじれたｐＢＲ３２２２プラスミドＤＮＡ二量体（負の対照）を緩やかな位相体（正の対照）に転換するために、そこで存在するトポイソメラーゼＩと共に１６０ｎｇの細胞核抽出物が必要とされる。物質（Ｉ）は１００μｇ／ｍｌの濃度で、トポイソメラーゼＩ活性１００％を阻害する。これは５０％までで対応する細胞系の腫瘍増殖を阻害するために必要な濃度の２０倍に対応する（ＩＣ５０、表３）。例えばトポテカンの試験管内阻害活性でのデータの比較は、この物質で必要とされるＩＣ５０の１０００倍であることを示し、この物質は既に臨床的に確立されている。図３は物質（Ｉ）によるトポイソメラーゼ（Ｉ）活性の阻害を示す。
【００９７】
細胞周期の分析
物質（Ｉ）の細胞増殖に対しての今日まで記載された効果を、同じように細胞周期の変化により示すことができる。ツギタ  Ｍ他の適用した方法によるフローサイトメトリー研究がこの分析のために使用される。
【００９８】
指数関数的に増殖するＨＣＴ８  ＷＴ腸癌細胞が、決定されたＩＣ５０濃度で２４時間物質（Ｉ）で処理され、次いで細胞はＢｒｄＵで保温される。メタノールで固定された細胞は、ＤＮＡ鎖を変性するために洗剤（トリトンＸ−１００／ＨＣｌ）での処理を受ける。蛍光標識抗体（抗−ＢｕｄＵ  ｍＡｂ，ＦＩＴＣ標識）で保温された後、第２蛍光染料（ＰＩ，ヨー化プロジウム）が加えられる。
【００９９】
ＤＮＡ容量（ヨー化プロピジウム蛍光）と溶解されたＢｒｄＵの量（ＦＩＴＣ蛍光）が、コールターフローサイトメーター（コールターＥＰＩＣＳ  ＸＬ）を用いて決定される。その例が図４ａと４ｂで示される。
【０１００】
図４ａと４ｂは、物質（Ｉ）で未処理のもの（対照、図４ａ）と処理したもの（ＩＣ５０，２４時間、図４ｂ）を含むＢｒｄＵとＰＩのＨＣＴ８  ＷＴ細胞のＤＮＡへの取り込みを示す。描かれた結果は、ｎ＝３の独立した実験を表している。
【０１０１】
物質（Ｉ）での処理が合成相の阻害に導くことは明らかである。これはＤＮＡ容量についての各図（図４ａおよび４ｂ，ＢｒｄＵとり込み）から明白である。
【０１０２】
ＤＮＡ分解の分析
物質（Ｉ）によるＤＮＡの分解を示す研究が、気管支癌（Ｈ４６０  ＷＴ）および結腸直腸癌（ＨＴ２９  ＷＴ）のヒト細胞の例により実施された。物質（Ｉ）で何回となく細胞を処理された後単離されたＤＮＡは、ゲル電気泳動でこの目的のために分析された。
【０１０３】
ＤＮＡ二本鎖の破損の確認は、１４Ｃ標識ＤＮＡで行われる。この目的のために、［１４Ｃ］ｄ−チミジン標識細胞が各種濃度の物質（Ｉ）で処理される。ＤＮＡはチーア・チャオ他の適応される方法で単離される。
【０１０４】
ジーンカント分光光度計を使用して単離されたＤＮＡの量と純度を決定した後、比較可能な量のＤＮＡは、アガロースゲルを用いてフラクションにされる。ゲル電気泳動でフラクションにされたＤＮＡは、臭化エチジウムで続いて染色される。
【０１０５】
透過照明装置（３０２ｎｍ）上で、電場で移動しなかった無傷ＤＮＡは、フラグメントＤＮＡから分離され、かくして抽出によりゲルに移動する。単離されたゲルとＤＮＡフラグメントは、塩酸の存在下で８０℃で液化される。シンチレーターの追加後に、液体シンチレーションメーター（ＴＲＩ−ＣＡＲＢ２１００ＲＴ）を用いて放射能を測定することができる。測定された放射能は分当り壊変（ｃｐｍ）で示される。
【０１０６】
図５は、気管支癌細胞ＣＨ４８０  ＷＴ）を６時間保温後に、物質（Ｉ）による二本鎖破損の誘導を示している。図５は６時間物質（Ｉ）での処理で誘導される［１４Ｃ］ｄ−Ｔｈｙ標識Ｈ４６０  ＷＴ細胞で検出されたＤＮＡ二本鎖の破損を示している。この結果は、ｎ＝３の独立した実験からの平均値と標準偏差を表している。
【０１０７】
腫瘍細胞を１０回まで決められたＩＣ５０濃度で６時間のコースで処理すると、著しい量の二本鎖の破損を誘導し、これはＩＣ５０濃度においてすら明らかに腫瘍細胞により十分には修飾されず、かくして細胞死を誘導する。
【０１０８】
図６は、腫瘍細胞のＤＮＡで二本鎖の破損を誘導する更なる例でもあり、この場合細胞は結腸直腸腫瘍の細胞（ＨＴ２９  ＷＴ）である。気管支癌細胞系に関しては、腫瘍細胞の修復機構では修復することのできないかなりの量の二本鎖破損の明らかな誘導があり、最終的には腫瘍細胞の計画された細胞死であるアポトーシスを誘導するのに寄与する要因を表す。
【０１０９】
ヒトテロメラーゼに対する物質（Ｉ）の阻害活性の確認
ヒトテロメラーゼに対する物質（Ｉ）の作用は、Ｎ．Ｗ．キム他の方法に基づいて、所謂テロメア反復増幅法（ＴＲＡＰ）エリザを実行することにより確認される。
【０１１０】
この方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用を基礎とする。これは、第一段階として、数多くの（ＧＧＴＴＡＧ）のモチーフが、テロメラーゼ活性によりビオチン標識オリゴヌクレオチド（ＴＳ＝テロメラーゼ基質）の３′末端へ付加することを伴う。第二段階では、このようにして伸長された産物は、ＴＳおよびＲＰ（Ｒ＝逆）プライマーを用いるＰＣＲ法により増幅される。このようにして、６塩基の増分（もとの大きさ＝５０ヌクレオチド）産物の「はしご」が生成される。増幅の間に、ＤＮＰ標識ｄＣＴＰはＰＣＲ産物に組み込まれる。サンドイッチ−エリザ法を用いる合成テロメラーゼ産物の検出と計量は、テロメラーゼ酵素活性の尺度となる。
【０１１１】
テロメラーゼ産物はビオチン標識ＴＳプライマーを運搬し、前もってアビジンで被覆されたマイクロタイタ平板表面に結合する。ＰＯＤに接合された抗ＤＩＧ抗体は、増幅の間に組み込まれたＤＮＰ標識ヌクレオチドに結合する。基質ＴＭＢの追加の後、テロメラーゼ活性は、酵素ＰＯＤによる色彩反応の開始を経由して蛍光分光により視覚化される。この場合、測定された吸光度は、テロメラーゼ活性にそのまま比例する。
【０１１２】
テロメラーゼの活性に対する物質（Ｉ）の効果
テロメラーゼに対する物質（Ｉ）の効果を確認するために、ＤＮＡポリメラーゼに対する物質（Ｉ）の効果を除外しなければならない。内部対照としてのＴＳＲ８での予備実験において、各種の濃度水準での物質（Ｉ）の効果は除外された。
【０１１３】
ＴＳＲ８鋳型の増幅はＤＮＡポリメラーゼにのみ依存する。この酵素のすべてのインヒビターは、基質を使用して検出することができる。
【０１１４】
図７はＴＳＲ８鋳型での予備実験の結果を示す。実験は３組で行われる。図７は、たとえ物質（Ｉ）の最大濃度、５０μｇ／ｍｌで採用されても、Ｔａｑポリメラーゼの著しい阻害に導かれるものではないことを示している。
【０１１５】
物質（Ｉ）によるテロメラーゼ阻害を研究する実験が図８で示される。１０μｇ／ｍｌと５０μｇ／ｍｌの濃度で観察されている。図８はＴＲＡＰ検定：つまり物質（Ｉ）による結腸癌（ＨＣＴ８  ＷＴ）の細胞から得られたヒトテロメラーゼの用量依存型阻害を示している。この結果、３個の独立実験の平均値と標準偏差を表す。
【０１１６】
ＥＲＫ１／２のリン酸化（ＭＡＰキナーゼ経路）
ある種のシグナル伝達経路のリン酸化は、細胞増殖と遺伝子発現の調節で基本的な役割を果す。タンパク質ＥＲＫ１／２（ＭＡＰキナーゼ）は、ＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路に属する。
【０１１７】
ヒト結腸癌細胞（ＨＣＴ８  ＷＴ）の物質（Ｉ）での処理は、このタンパク質のリン酸化に導き、それはウエスタンブロット分析で検出される（図９）。図９はＥＲＫ１／２タンパク質のウエスタンブロット分析を示す。負荷された対照は下部の線に含まれる。
【０１１８】
物質（Ｉ）での細胞の処理はＥＲＫ１／２タンパク質の用量依存型リン酸化に導く。ＩＣ５０に対応する用量でおいてすら、物質（Ｉ）によるリン酸化を示すことで可能である。このプロセスの結果として、−活性化として今日まで文献で理解されるものとして−腫瘍細胞は細胞周期制御装置に引き渡され、これは実行される細胞周期分析で示される（前掲）。
【０１１９】
物質（Ｉ）によるＥＲＫ１／２で得られる結果がどれだけＥＲＫ１／２インヒビターの付加により抵抗することができるかという、これらの発見を検証するために、同時培養実験が物質（Ｉ）と特異的なＥＲＫ１／２インヒビター（ＭＡＰキナーゼインヒビター）で実行される。この場合腫瘍細胞、例えば結腸癌細胞（ＨＣＴ８  ＷＴ）は両活性成分の異なった用量でそれぞれ２４時間同時培養される（図１０）。図１０は、物質（Ｉ）と特異的ＥＲＫ１／２インヒビター（ＭＡＰキナーゼインヒビター）での細胞毒性についての同時培養実験を表す。ＨＣＴ８  ＷＴ細胞は同時培養された。示された点は、相互に２個の活性成分の対応する比（それぞれＩＣ５０濃度の％）を示す。
【０１２０】
しかし、このようにして行われた本実験は、いずれかの用量比で測定された細胞毒性を廃止するまでには到っていない。むしろ逆に、２個の活性成分の同時培養に対する著しい相乗効果が明らかとなる。
【０１２１】
すべての用量組合せは角二等分線以下にあり、かくして不明確ではない相乗効果の範囲内にある。物質（Ｉ）のＩＣ５０濃度３０％と特異的ＥＲＫ１／２インヒビターのＩＣ５０濃度３０％の活性成分濃度の配合物は、結腸癌から単離された腫瘍細胞（ＨＣＴ８  ＷＴ）の増殖の阻害に導くものとなる。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１ａ】物質（Ｉ）の代表的なクロマトグラムを示す図
【図１ｂ】物質（Ｉ）の図１ａで示された分析のＰＤＡデータを示す図
【図１ｃ】物質（Ｉ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図
【図１ｄ】物質（Ｉ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図
【図１ｅ】物質（Ｉ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図
【図１ｆ】物質（Ｉ）の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図
【図１ｇ】物質（Ｉ）の１３Ｃ−ＤＥＰＴスペクトルを示す図
【図１ｈ】物質（Ｉ）のＨ，Ｈ−ＣＯＳＹスペクトルを示す図
【図１ｉ】物質（Ｉ）のＨ，Ｈ−ＣＯＳＹスペクトルを示す図
【図１ｊ】物質（Ｉ）のＨ，Ｈ−ＣＯＳＹスペクトルを示す図
【図１ｋ】物質（Ｉ）のＨ，Ｈ−ＣＯＳＹスペクトルを示す図
【図１ｌ】物質（Ｉ）のＨＭＢＣスペクトルを示す図
【図１ｍ】物質（Ｉ）のＨＭＢＣスペクトルを示す図
【図１ｎ】物質（Ｉ）のＨＭＢＣスペクトルを示す図
【図１ｏ】物質（Ｉ）のＨＭＢＣスペクトルを示す図
【図１ｐ】物質（Ｉ）のＨＭＢＣスペクトルを示す図
【図１ｑ】物質（Ｉ）のＨＭＢＣスペクトルを示す図
【図１ｒ】物質（Ｉ）のＨＭＢＣスペクトルを示す図
【図３】物質（Ｉ）によるトポイソメラーゼ活性の阻害を示す図
【図４ａ】ＨＣＴ８  ＷＴ細胞ＤＮＡのＢｒｄＵおよびＰＩ取り込みを示す図（物質（Ｉ）未処理の対照）
【図４ｂ】ＨＣＴ８  ＷＴ細胞ＤＮＡのＢｒｄＵおよびＰＩ取り込みを示す図（物質（Ｉ）で処理済みのもの）
【図５】物質（Ｉ）の処理による二本鎖破損の誘導を示す図
【図６】物質（Ｉ）の処理による二本鎖破損の誘導を示す図
【図７】ＴＳＲ８鋳型での予備実験を示す図
【図８】テロメラーゼ阻害についてのＴＲＡＰ検定の結果を示す図
【図９】ＥＲＫ１／２タンパク質のウエスタンブロット分析結果を示す図
【図１０】物質（Ｉ）および特異的ＥＲＫ１／２インヒビターの細胞毒性に関する同時培養実験結果を示す図
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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【図１ｆ】
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【図１ｇ】
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【図１ｈ】
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【図１ｉ】
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【図１ｊ】
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【図１ｋ】
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【図１ｌ】
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【図１ｍ】
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【図１ｎ】
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【図１ｏ】
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【図１ｐ】
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【図１ｑ】
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【図１ｒ】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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