(57)【要約】本出願は、一般的に免疫応答を増強することに関する。このような免疫応答は、ワクチン投与により惹起することができる。抗原に対する免疫応答を誘導および増強するための組成物および方法を提供する。該組成物および方法は、治療および予防への使用（免疫感作）のためのワクチン製剤および抗体の産生に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者における抗原に対する免疫応答を惹起させる方法であって、
配列番号１−６および１３、またはそれらのフラグメントからなる群から選択される配列と、少なくとも８０％の配列の同一性を有するアミノ酸配列を含む、少なくとも１つのポリペプチド；および
少なくとも１つの抗原；を投与すること
を含む前記方法。
【請求項２】
免疫応答が抗体を介した免疫応答である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
投与が被験者における抗原特異的抗体の力価を少なくとも２倍まで増加させる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
免疫応答が細胞性免疫応答である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ポリペプチドが樹状細胞を誘引する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ポリペプチドが未成熟な樹状細胞を誘引する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ポリペプチドおよび抗原を同時投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ポリペプチドおよび抗原を別々に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
配列番号１−６および１３からなる群から選択されるポリペプチドの少なくとも２つを投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ポリペプチドが、  配列番号１−６および１３からなる群から選択されるペプチド配列と、少なくとも８５％の配列の同一性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ポリペプチドが、  配列番号１−６および１３からなる群から選択されるペプチド配列と、少なくとも９０％の配列の同一性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ポリペプチドが、  配列番号１−６および１３からなる群から選択されるペプチド配列と、少なくとも９５％の配列の同一性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ポリペプチドが、  配列番号１−６および１３からなる群から選択されるペプチド配列と、少なくとも９９％の配列の同一性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ポリペプチドが、  配列番号１−６および１３からなる群から選択されるペプチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ポリペプチドが配列番号４を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ポリペプチドが配列番号４である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
ポリペプチドを持続的放出の医薬組成物中に製剤化する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
抗原が病原体由来のポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
病原体が肝炎またはインフルエンザである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
抗原が腫瘍抗原である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
投与がアジュバントを投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
アジュバントが、ミョウバン、不完全フロイントアジュバント、細菌きょう膜多糖、デキストラン、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ４０リガンド、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１８およびサイトカイン、またはそれらのフラグメントからなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
投与が多価担体を投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
多価担体をポリペプチド、抗原またはアジュバントに連結させる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
多価担体が、細菌きょう膜多糖、デキストランおよびポリヌクレオチドベクターからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
細菌きょう膜多糖が肺炎球菌（Pneumococci）、連鎖球菌（Streptococci）、髄膜炎菌（Meningococci）の多糖である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
投与が医薬的担体を投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
投与が固形腫瘍内に投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
投与が固形腫瘍周辺組織内への投与をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
投与が注射、吸入、経口である、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
投与が少なくとも２回の投与を行うことである、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
投与を同じ部位に行う、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
投与がポリペプチド送達の標的部位から離れた部位である、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
投与が、ポリペプチドを含むリポソームを投与することをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ポリペプチドの投与が、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
抗原の投与が、該抗原コードするポリヌクレオチドを投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
被験者がヒトである請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
以下の物質：
配列番号１−６および１３、またはそれらのフラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％の配列の同一性を有するアミノ酸配列を含む、少なくとも１つのポリペプチド；および
少なくとも１つの抗原
を含む組成物。
【請求項３９】
ポリペプチドが精製されている、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
配列番号１−６および１３、またはそれらのフラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも２つのポリペプチドを含む、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４１】
ポリペプチドを持続的放出の製剤中に含む、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４２】
医薬的に受容可能な担体をさらに含む、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４３】
医薬的に受容可能な担体がアジュバントである、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
医薬的に受容可能な担体が、水、オイル、生理食塩水、水性デキストロースおよびグリセロールからなる群から選択される、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４５】
配列番号７−１２および１４、またはそれらのフラグメントからなる群から選択される核酸配列と、少なくとも８０％の配列の同一性を有する少なくとも１つの配列を外因的に発現する細胞を含む組成物。
【請求項４６】
細胞が同種である請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
細胞が自己由来である請求項４５に記載の組成物。
【請求項４８】
腫瘍関連抗原をさらに含む、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４９】
細胞が癌細胞である、請求項４５に記載の組成物。
【請求項５０】
癌細胞が癌細胞株由来である、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５１】
癌細胞株がヒトの卵巣癌細胞株またはヒトの脳の癌細胞株である、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５２】
腫瘍関連抗原をさらに含む、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５３】
腫瘍関連抗原が自己由来細胞から得られたものである、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５４】
以下の物質：
少なくとも１つの腫瘍細胞；および
配列番号７−１２および１４、またはそれらのフラグメントからなる群から選択される核酸配列と少なくとも８０％の配列の同一性を有する、少なくとも１つの配列を外因的に発現する少なくとも１つの細胞
を含む組成物。
【請求項５５】
腫瘍細胞が原発性腫瘍細胞である、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５６】
腫瘍細胞が自己由来である、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５７】
腫瘍細胞が神経膠腫、神経膠芽腫、神経肉腫、星状細胞腫、黒色腫、乳癌細胞、または卵巣癌細胞である、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５８】
腫瘍細胞が癌細胞である、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５９】
ＳＨＡＡＧｔｉｄｅを外因的に発現する細胞が同種の細胞である、請求項５４に記載の組成物。
【請求項６０】
ポリヌクレオチドを外因的に発現する細胞が休止状態である、請求項５４に記載の組成物。
【請求項６１】
以下のもの：
配列番号１−６および１３、またはそれらのフラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％の配列の同一性を有する、少なくとも１つのポリペプチド、および医薬的に受容可能な担体、を含む医薬的組成物；ならびに
注射器；
を含むキット。
【請求項６２】
以下のもの：
配列番号７−１２および１４、またはそれらのフラグメントからなる群から選択される核酸配列と、少なくとも８０％の配列の同一性を有する、少なくとも１つのポリヌクレオチド、および医薬的に受容可能な担体、を含む医薬的組成物；ならびに
注射器；
を含むキット。
【請求項６３】
抗原がアレルゲンである、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、免疫応答、例えばワクチン接種により惹起される免疫応答の増強または調節に関する組成物および方法に関する。この組成物および方法は、治療および予防用のワクチン接種（免疫感作）のためのワクチン製剤、ならびに有用な抗体（例えば治療または診断に使用するためのモノクローナル抗体）産生に特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
背景
１９７９年に世界保健機構は天然痘が撲滅されたことを公表した−最初の天然痘ワクチン接種（牛痘に感染した乳しぼりの女性由来の膿）を幼い少年、James Phippsに投与してからほぼ２００年後のことであった。牛痘に接触した乳しぼりの女性はめったに天然痘にかからないことをEdward Jennerが発見したことにより、この少年の命を天然痘から救うことができた。このような危険な方法が成功したのは、牛痘が天然痘に分子レベルで類似していたからであった。Phippsの免疫系は天然痘の導入時に特異的反応を直ちに開始し、侵入異物をすばやく処理することができた。
【０００３】
それ以来、広範囲な多様な物質、例えば感染性微生物（細菌およびウイルス）、毒素、および腫瘍までもの感染を防ぐため、多くのワクチンが開発されてきた。１７９０年代以降著しい進歩にもかかわらず、有効なワクチンがないために多くの感染性物質が自由に感染しやすい人々を苦しめている。今日世界の多くの地域でクオリティーオブライフおよび経済的影響に打撃を与えている顕著な例は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である。ワクチンが存在する場合でさえ、基金、専門技術者および複数回投与の労力を入手できない人々および国々にとっては、しばしばこれらのワクチンを利用することができない。防御を獲得するために必要な投与回数のような必要なもののいかなる軽減も、より多くの人々へのワクチン接種（免疫感作）を促進することができるだろう。
【０００４】
ワクチン接種は、白血球（白血球（ＷＢＣ）：Ｔリンパ球およびＢリンパ球、単球、好酸球、好塩基球、および好中球）、リンパ組織およびリンパ管を含む免疫系を活用する。感染と戦うため、Ｂリンパ球およびＴリンパ球は体全体を循環しており、抗原提示細胞と相互作用して病原体を発見する。一度侵入異物が発見されると、細胞傷害性Ｔ細胞または外来物質に特異的な抗体を分泌するＢ細胞が感染部位に動員され、これを破壊する。ワクチン接種の概念は、病理を誘導する外来物質（例えば病原体または腫瘍）に個体を暴露させずに、宿主を防御する免疫応答と同じタイプの応答を引き起こすことである。このような免疫応答は、例えば細胞を介して（細胞性）および/または抗体に基づいて行われてよい。
【０００５】
外来侵入異物に対しての適応免疫応答において鍵となる役割を担うのは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えばマクロファージ、活性化されたＢ細胞および樹状細胞である。樹状細胞は免疫応答において得に重要である。未成熟または待機中の樹状細胞は上皮層内に存在しており、外来異物（抗原という）を貪食する。これらの樹状細胞は、外来物質により刺激された近くのマクロファージにより分泌される腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）により活性化される。これらの活性化された樹状細胞は、外来の抗原を載せてリンパ系を通って最も近傍のリンパ節に輸送される。そこで外来抗原をその抗原特異的な受容体が認識する待機中のナイーブ（抗原に暴露されていない）Ｔ細胞が活性化され、免疫系の活動の引き金となる。
【０００６】
ワクチン接種は、弱毒化したまたは死滅させた感染物質にて達成することができるが、最も安全なワクチン接種は、外来物質により発現される、単離された抗原またはエピトープのの一部（subset）に対する免疫応答を引き起こさせるものである。しかしこのような抗原の多くはそれ自体では免疫原性が弱いか、または強い免疫応答を引き起こす能力はない。このような抗原の有効性を増強するため、しばしばワクチン組成物にアジュバントを添加する。アジュバントの例として、マイコバクテリアの死菌体の油性エマルジョン（完全フロイントアジュバント）、その他の死菌体（例えば百日咳菌(B.pertussis)）、細菌多糖、細菌熱ショックタンパク質、または細菌ＤＮＡを含む。これらアジュバントの多くは有効ではあるが、重大な炎症の原因となり、ヒトへの投与には適さない。
【０００７】
現在の免疫感作法は、すべての抗原、すべての個体に対して、または防御免疫のすべての形を惹起するために有効とはいえない。加えて多数の有用なアジュバントは小さく、主に抗体に関与する免疫に対して方向付けられており、細胞性免疫を意図してはいない。さらに免疫感作から、免疫系が被験者の防御を提供するまでにかなりのラグタイムがある。細胞性の応答ならびに抗体を誘導することのできる、改善されたワクチン組成物および/または有効で安全なアジュバントは、現在のワクチン接種の成果をおおいに助けることになるだろう。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
まとめ
１つの側面において本発明は、被験者、例えばヒトにおいて抗原に対する免疫応答を惹起するための方法、すなわち配列番号：１−６または１３（“ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ”）の配列の少なくとも一部を含むポリペプチドを抗原と共に被験者に投与する方法を提供する。このような免疫応答は抗体仲介性であってよく、投与時に抗原特異的な抗体の力価が少なくとも２倍に増加する。他の側面においてこの免疫応答は細胞仲介性であり、配列番号：１−６または１３の少なくとも一部を有するポリペプチドが、樹状細胞を含む多様な白血球を誘引および/または活性化する。
【０００９】
もう１つの側面において本発明は、配列番号：１−６または１３の配列の少なくとも一部を有するポリペプチドを、抗原と共に同時投与することにより、免疫応答を惹起する方法を提供する；他の側面において、抗原およびポリペプチドを別々に投与することができる。なお他の側面において、配列番号：１−６または１３の１つより多くのポリペプチドを、別々に、またはコンカテマーもしくは融合タンパク質として投与することができる。すべての場合において、配列番号：１−６または１３の変異型を使用することができる。同様に他の側面において、配列番号：１−６または１３の少なくとも一部を有するポリペプチドを、投与時または投与後に被験者によって発現されるように、発現可能なように連結させたポリヌクレオチド（配列番号：７−１２または１４）として投与することができる。同様に抗原もまた、投与後に発現されるようにポリヌクレオチドとして投与することができる。
【００１０】
もう１つの側面において投与する抗原は病原体、例えば肝炎、インフルエンザ、腫瘍抗原またはアレルゲン由来のポリペプチドである。
この方法はまた、持続的放出の製剤中に組み込んだ様々なＳＨＡＡＧｔｉｄｅ配列を含む組成物の使用を提供する。なお他の側面においてこの方法はまた、投与する組成物におけるアジュバントの使用を提供する。このようなアジュバントにはミョウバン、不完全フロイントアジュバント、細菌きょう膜多糖、細菌ＤＮＡ，デキストラン、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ４０リガンド、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１８もしくはサイトカイン、またはそれらのフラグメントを含む。
【００１１】
本発明の方法はまた、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅおよび抗原分子と共に多価担体を投与することを提供する。多価担体は、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチド、抗原またはアジュバントと連結させることができる。多価の担体の例として、細菌きょう膜多糖（例えば肺炎双球菌（Pneumococci）、連鎖球菌（Streptococci）、髄膜炎菌（Meningococci）の多糖）、デキストラン、およびポリヌクレオチドベクターを含む。
【００１２】
なお他の側面において本発明の方法は、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅおよび抗原分子と共に医薬的担体を投与することを提供する。
一部の側面において投与部位は、固形腫瘍またはこのような腫瘍の周辺組織を含む。投与は注射、吸入または経口を含むかなり多数の方法により達成することができる。座剤もまた使用することができる。
【００１３】
本発明の方法はまたＳＨＡＡＧｔｉｄｅを含む組成物の複数回の投与を提供する；投与はもちろん同じ部位にまたは異なる部位に行うことができる。一部の場合には投与部位をポリペプチドの送達部位から離すことができる。例えばリポソームにＳＨＡＡＧｔｉｄｅおよび抗原を含有させて、同様にリポソームが特定の組織または細胞を標的とすることのできる分子を組み込んで、投与してもよい。
【００１４】
さらなる側面において、本発明は少なくとも１つのＳＨＡＡＧｔｉｄｅを含むポリペプチドまたはそのフラグメント；および少なくとも１つの抗原を含む組成物を提供する。一部の側面においては、２つの異なるＳＨＡＡＧｔｉｄｅペプチドを使用してもよい。このような組成物は持続的放出の処方物中にて、処方してもよい。さらに本発明の組成物はまた、一部の場合にはアジュバントとしてもよい、医薬的に受容可能な担体を含んでもよい。その他の医薬的に受容可能な担体として、水、油、生理的食塩水、水性デキストロースおよびグリセロールを含む。
【００１５】
その他の側面において組成物は、ポリヌクレオチド、例えばＳＨＡＡＧｔｉｄｅ配列をコードするポリヌクレオチドを発現する細胞、細菌ベクター、またはウイルスベクターを含んでよい。細胞は同種または自己由来であってもよい。なおさらなる側面において組成物はまた、腫瘍関連抗原（自己由来細胞より得ることができる）、癌細胞、癌細胞株（例えばヒトの卵巣癌またはヒトの脳の癌）由来の細胞を含んでもよい。
【００１６】
もう１つの側面において本発明は、少なくとも１つの腫瘍細胞；および少なくとも１つのＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリヌクレオチド配列を外因的に発現する少なくとも１つの細胞、と共に製剤化した組成物を提供する。腫瘍細胞は、原発性、自己由来、または同種であってもよい。腫瘍細胞はまた神経膠腫、神経膠芽腫、神経肉腫、星状細胞腫、黒色腫、乳癌細胞、または卵巣癌細胞であってもよい。その他の側面において、腫瘍細胞は癌細胞である。
【００１７】
最後の側面において本発明は、少なくとも１つのＳＨＡＡＧｔｉｄｅ分子（ポリペプチドおよび/またはポリヌクレオチド）を組み込んだ医薬組成物および注射器を含むキットを提供する。
【００１８】
詳細な説明
本発明において、in vitro およびin vivoで免疫応答を調節および/または増強することのできる、ＣＣケモカインＣＣＬ２３、ＣＫβ８−１のスプライスバリアントの切断（truncation）変異体である、新規ペプチド（ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ）の１つのクラスを発見した。免疫応答を調節するとは、産生される免疫グロブリン（Ｉｇ群）のクラスおよびサブタイプ、ならびに感染部位に局在する細胞（例えば細胞傷害性Ｔ細胞、好酸球、およびマスト細胞）の数およびタイプに影響を与えることである。ＳＨＡＡＧｔｉｄｅの添加時に白血球内のカルシウムの流れが認められることから、これらのペプチドは受容体に対してリガンドとして作用する。ＳＨＡＡＧｔｉｄｅは、単球、好中球、および成熟樹状細胞（ｍＤＣ）、ならびに未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）を効率的に誘引する。ＣＫβ−１の関連分子であるＣＫβ８（ＣＣＬ２３、骨髄前駆体阻害因子１またはＭＰＩＦ−１としても知られている；９９アミノ酸残基）は、単球、樹状細胞および待機中のリンパ球を誘引する（Forssmann et al., 1997）が、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ配列をコードする選択的スプライシングされたエキソンを欠いている。ＣＫβ８の選択的スプライシングされた形であるＣＫβ８−１（１−１１６残基）は、ＣＫβ８と同様にＣＣＲ１受容体に対する機能的なリガンドである（Youn et al., 1998）。しかし、ＣＫβ８−１（１−１１６）はＳＨＡＡＧｔｉｄｅ配列を通してその機能を発揮してはいない。これらの観察を考慮して、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ配列はアジュバントおよび免疫調節物質として驚くほど有効である未知の機能的ペプチドを表す。
【００１９】
特定のメカニズムに拘束する意図はないが、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチドは、投与部位にＡＰＣを動員することにより免疫原に対する免疫応答を促進すると考えられる。免疫原（抗原）はＡＰＣにより摂取されて部分的に分解される。その後分解された抗原の断片が、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子に結合してＡＰＣの表面に提示される。近傍の神経節中の待機中のＴ細胞に提示されることで、細胞傷害性Ｔ細胞またはヘルパーＴ細胞の増殖が刺激される、またはＢ細胞による抗体の産生および分泌が活性化される。
【００２０】
ＳＨＡＡＧｔｉｄｅは有効な分子の標識として作用して免疫系の細胞を誘引するため、免疫応答が増強および/または調節される。ＳＨＡＡＧｔｉｄｅをワクチンに使用すると、通常ではこのような応答を惹起しない（または弱くしか惹起しない）抗原が応答を引き起こすように、免疫応答を増強する；ＳＨＡＡＧｔｉｄｅの使用はまた、その後のブースターの注射の必要性を低減することができる。ＳＨＡＡＧｔｉｄｅはまた、引き起こされる免疫応答のタイプを修飾することもできる。
【００２１】
本発明は、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅまたはＳＨＡＡＧｔｉｄｅをコードする核酸を含む組成物、およびそれらの予防的使用、ならびに病態を治療することを含む。ＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチド配列（配列番号：１）およびいくつかの活性なバリアント（配列番号：２−６）を表１および３に示す；配列番号１−６をコードするポリヌクレオチド配列を、各々表２（配列番号：７−１２）に示す。
【００２２】
【表１】
2005524719.tif 000002
【００２３】
【表２】
2005524719.tif 000003
【００２４】
ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ様の活性を有するＣＫβ８−１のもう１つの誘導体（ＣＫβ８−１（２５−１１６；配列番号：１３）を表３に示す；配列番号１３をコードするヌクレオチド配列を表４に示す。配列番号１および７に対応する配列を下線で示す。
【００２５】
【表３】
2005524719.tif 000004
【００２６】
【表４】
2005524719.tif 000005
【００２７】
配列番号１−１４の“母体となる”配列を、表５（配列番号１５；ＣＫβ８−１ポリペプチド）および表６（配列番号１６、ＣＫβ８−１ポリヌクレオチド）に示す。ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ配列を下線で示す。ＣＫβ８−１（配列番号１５）は、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ配列（配列番号１）を含んでいるのに、配列番号１と同じ活性をそれ自体に保有しないことに注目していただきたい。
【００２８】
【表５】
2005524719.tif 000006
【００２９】
【表６】
2005524719.tif 000007
【００３０】
ＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチドおよびポリヌクレオチドを含む組成物は、例えばワクチン接種に対する応答において、免疫応答を増強するための被験者への投与に適するものを含む。ＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチドおよび/またはＳＨＡＡＧｔｉｄｅヌクレオチドを含むキットもまた含まれる。このようなキットを利用して、例えば医薬的組成物の投与を促進してもよい。
【００３１】
本発明の方法は、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ（配列番号１−６、１３）またはＳＨＡＡＧｔｉｄｅ核酸（配列番号：７−１２、１４）の組成物を被験者に投与することを含む。
免疫応答の増強または調節のために使用する場合、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅはポリペプチドとしてまたはin vivoで発現されるポリヌクレオチドとして投与してもよい。このような方法をさらに促進するために、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチドを目的の抗原に（共有結合で、または非共有結合で）結合させてもよい。一部の場合、いずれかの形のＳＨＡＡＧｔｉｄｅを抗原の投与前または投与後に投与してもよい。ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ組成物を抗原（免疫原）組成物とは別に投与する場合も、これらの組成物は被験者の物理的に同じ場所に投与する。
【００３２】
本発明の方法は、免疫応答を増強、惹起、または調節する場合に、目的の免疫原を含むＳＨＡＡＧｔｉｄｅ組成物を投与することを含む。その他の方法において、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ組成物は、免疫原を含まずに投与してもよい。例えばＳＨＡＡＧｔｉｄｅ組成物を最初に投与し、続いて免疫原の第２の投与を、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチドを含んでまたは含まずに行う。一部の場合には免疫原を含む組成物を最初に投与し、続いてＳＨＡＡＧｔｉｄｅを含む組成物を投与する。異なる組成物は、同時に、短時間で逐次的に、または時間をおいて、例えば１時間から２週間またはそれ以上おいて投与してもよい。
【００３３】
腫瘍および癌に対する免疫応答を促進および/または調節するため、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ組成物は異常な成長の部位にまたは直接組織（すなわち腫瘍）内に投与する。その後腫瘍および癌の抗原は、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅに動員または活性化された白血球、例えば樹状細胞により検出される。これらの抗原に対して免疫応答を引き起こすことにより、腫瘍および癌は体による攻撃を受け、縮小または末梢される。このようにこれらの方法は、コントロールされていないまたは異常な細胞の成長を伴う状態、例えば腫瘍および癌への治療を提示する。腫瘍および癌に対する免疫応答はまた、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅと共に単離されたポリペプチド腫瘍抗原を投与することにより、促進および/または調節してもよい。ＳＨＡＡＧｔｉｄｅは抗原とコンジュゲーションさせても、させなくてもよい。
【００３４】
新規方法および新規試薬を、治療および予防の免疫感作（すなわち摘要免疫応答および/または自然免疫応答の意図的な惹起、増強、強化または調節）のために今回提供する。従来の免疫方法に優る著しい利点として以下の１項またはそれ以上を含む：
・  免疫原投与後の増進された免疫応答、
・  少量の免疫原（例えば毒素または病原体）または習性的に強い免疫応答を引き起こさない抗原に対するより高い感受性、および
・  より有効な抗腫瘍治療。
【００３５】
現行のワクチンは多くの病原物質に対して有効であるが、一部の危険な病原体（例えばＨＩＶ、癌細胞および腫瘍細胞等）についてはいまだに適切なワクチンが得られていない。一部の場合、この困難さは外来抗原候補の特性、例えばＨＩＶ糖タンパク質（例えばｇｐ１２０）の不溶性または腫瘍抗原の免疫原性の低さに部分的には起因する。したがって免疫応答を増強および/または調節する組成物は、新たな有効なワクチンを調製するのに役立つことだろう。
【００３６】
ＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチドは、ＣＫβ８−１ケモカインのスプライスバリアントの切断型である。ケモカインはＴリンパ球、好中球、単球およびマクロファージの動員および活性化のための分子標識として作用し、病原体との戦いの場の旗印となる。４０種より多くの小さなペプチド（７−１０ｋＤ）の群であるケモカインは、Ｇタンパク質とカップルしたシグナル伝達カスケードを通してシグナルを発し、それらの化学的誘引(chemotractant)機能および化学的刺激(chemostimulant)機能を仲介するＷＢＣ上に発現される受容体と結合する。受容体は１つ以上のリガンドと結合してもよい；例えば受容体ＣＣＲ１は、ＲＡＮＴＥＳ（regulated on activation normal T cell expressed（発現される正常なＴ細胞の活性化を制御する））、ＭＩＰ−１α（macrophage inflammatory protein（マクロファージ炎症タンパク質））およびＭＩＰ−１βのケモカインと結合する。今日までに２４種のケモカイン受容体が知られている。ケモカインの純粋な数、複数のリガンド結合受容体、およびＷＢＣ上の異なる受容体の特性により、きちんとコントロールされた特異的な免疫応答が可能になる（Rossi and Zlotnik, 2000）。ケモカインの活性をそれらの対応する受容体を調節することによりコントロールすることができれば、関連する炎症および免疫学的疾患を治療し、臓器および組織の移植も可能になる。
【００３７】
ＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチドの活性を利用して、例えばワクチン接種で惹起される免疫応答を増強および/または調節することができる。すなわち免疫応答の活力、および/または強度、および/または質が高められる。例えば抗原特異的な抗体の早期の出現、および/または高い力価、および/またはアビディティーが、活発な免疫応答を示す。強度は従来のワクチン接種の方法と比較して、少なくとも２倍から１０倍、または１００倍にさえ増強される。免疫応答の質の増強または調節には、免疫原への高いアフィニティーの抗体産生、および/または好ましい免疫グロブリンのクラス、例えばＩｇＧ群のより高濃度の産生を含む。免疫応答の質の調節にはまた、サイトカインおよび/またはケモカインおよび/またはそれらの産生する同時に刺激する(co-stimulatory)分子の異なるサブセットにより識別される、Ｔリンパ球の異なるサブセットの誘導を含む。免疫応答の質の調節はまた、抗原特異的な細胞傷害性Ｔ細胞および/または異なるイソタイプの抗体の誘導を含む。
【００３８】
遺伝子（および関連する核酸）およびそれらのコードするタンパク質とを区別するため、遺伝子に関する略語を斜体（または下線）文字で示し、タンパク質に関する略語は斜体としないものとする。したがってＳＨＡＡＧｔｉｄｅ（斜体）またはＳＨＡＡＧｔｉｄｅは、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅをコードする核酸配列をいう。
【００３９】
“コントロール配列”は、特定の宿主生物体において機能可能なように連結されたコード配列の発現を可能にするＤＮＡ配列である。原核細胞のコントロール配列は、プロモーター、オペレーター、およびリボソーム結合部位を含む。真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用する。
【００４０】
核酸は別の核酸配列と機能的な関係に配置される場合、“機能可能なように連結”される。例えばプロモーターまたはエンハンサーが配列の転写に影響を及ぼす場合は、それはコード配列に機能可能なように連結されており、またはリボソーム結合部位が翻訳を促進する位置に配置されている場合には、それはコード配列に機能可能なように連結されている。
【００４１】
“単離された”核酸分子は、天然で発見される状態から精製され、少なくとも１つの不純物の核酸分子から分離されている。単離されたＳＨＡＡＧｔｉｄｅ分子は、細胞中に存在する場合の限定的なＳＨＡＡＧｔｉｄｅとは区別される。
【００４２】
単離されたＳＨＡＡＧｔｉｄｅ核酸分子は、配列番号７−１２、１４で示される核酸配列の相補鎖である核酸分子、またはこの核酸配列の一部分を含む。“相補的核酸分子”は、ミスマッチがほとんどなく水素結合が形成され、安定な二本鎖を形成するような、ある配列、例えば配列番号７−１２に対して十分に相補的である核酸分子である。“相補的”は、ヌクレオチド間のWatson-CrickまたはHoogsteenの塩基対をいう。
【００４３】
“誘導体”は、天然の化合物から直接形成される、または修飾もしくは部分的な置換により形成されるかのいずれかである核酸配列（またはアミノ酸配列）である。“類似体”は、天然化合物と類似しているが同一ではない構造を有するが、ある成分または側鎖に関して天然化合物とは異なる、核酸配列またはアミノ酸配列である。類似体は合成してもよく、または異なる進化の源から得てもよい。相同体は、異なる種に由来する特定の遺伝子の核酸配列またはアミノ酸配列である。
【００４４】
誘導体または類似体が修飾された核酸またはアミノ酸を含む場合、その誘導体および類似体は完全長、または完全長以外の分子であってもよい。ＳＨＡＡＧｔｉｄｅの核酸またはタンパク質の誘導体または類似体は、同一サイズの核酸配列またはアミノ酸配列に対して、または相同性アルゴリズムにより整列を行った整列させた配列と比較した時に、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅの核酸またはタンパク質と少なくとも約７０％、８０％、または９５％の同一性により実質的に相同な領域を含む分子を含む、またはそれをコードする核酸は、ストリンジェント、中程度にストリンジェント、もしくは低いストリンジェントの条件下で（Ausubel et al., 1987）、上述のタンパク質をコードする配列の相補鎖とハイブリダイズすることのできるが、これに限定されない。
【００４５】
“相同な”ヌクレオチド配列は、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅのイソフォームをコードしている配列をコードする。ＳＨＡＡＧｔｉｄｅに関して、相同なヌクレオチド配列は、ヒト以外の種、例えば脊椎動物、例えばカエル、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシおよびウマのＳＨＡＡＧｔｉｄｅをコードするヌクレオチド配列を含む。相同なヌクレオチド配列はまた、ヌクレオチド配列の天然に起こる対立遺伝子の変異および突然変異を含む。しかし相同のヌクレオチド配列は、ヒトＳＨＡＡＧｔｉｄｅをコードするヌクレオチド配列そのものは含まない。相同なヌクレオチド配列は、保存的なアミノ酸の置換、ならびにＳＨＡＡＧｔｉｄｅの生物学的活性を保有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。
【００４６】
配列番号７−１２、１４に示したＳＨＡＡＧｔｉｄｅ配列に加えて、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅのアミノ酸配列を変化させるＤＮＡ配列多型も１つの母集団内に含めてもよい。例えば個体間の対立遺伝子の変異は、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅの遺伝子多型を表すものとする。“遺伝子”および“組換え遺伝子”という用語は、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ、好ましくは脊椎動物のＳＨＡＡＧｔｉｄｅをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む核酸分子をいう。このような天然の対立遺伝子の変異は、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅにおいて典型的には１−５％の変異度に帰着し得る。“ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ変異型ポリヌクレオチド”  または“ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ変異型核酸配列”は、（１）完全長の天然のＳＨＡＡＧｔｉｄｅをコードする核酸配列と少なくとも約８０％の核酸配列の同一性を有する、（２）シグナルペプチドを含まない完全長の天然のＳＨＡＡＧｔｉｄｅ、または（３）完全長のＳＨＡＡＧｔｉｄｅのあらゆる他のフラグメントである、活性なＳＨＡＡＧｔｉｄｅをコードする核酸分子を意味する。通常、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ変異型ポリヌクレオチドは、完全長の天然のＳＨＡＡＧｔｉｄｅをコードする核酸配列と、少なくとも約８０％の核酸配列の同一性を有する、より好ましくは少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％の核酸配列の同一性、なおより好ましくは少なくとも約９９％の核酸配列の同一性を有するものとする。ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ変異型ポリヌクレオチドは、シグナルペプチドを含まない完全長の天然のＳＨＡＡＧｔｉｄｅ、または完全長のＳＨＡＡＧｔｉｄｅのあらゆる他のフラグメントをコードすることができる。変異型は天然のヌクレオチド配列を包含しない。
【００４７】
通常ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ変異型ポリヌクレオチドは少なくとも約３０ヌクレオチドの長さ、しばしば少なくとも約６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０、２７０、３００、４５０、６００ヌクレオチドの長さ、より頻繁には少なくとも約９００ヌクレオチドの長さ、またはそれ以上である。
【００４８】
当明細書で同定されたＳＨＡＡＧｔｉｄｅをコードする核酸についての “核酸配列の同一性のパーセント（％）”は、目的の候補配列中のヌクレオチドと同一の、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ中のヌクレオチドのパーセントとして定義し、配列を整列し、必要であればギャップを導入して、最大パーセントの配列同一性を達成した後に決定する。核酸配列の同一性の％を決定することを目的とする整列は、当該技術分野の技術の範疇の様々な方法で、例えば公開されている入手可能なコンピューターソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを用いて達成することができる。当業者は、比較する配列の全長にわたり最大の整列を達成するために必要なあらゆるアルゴリズムを含む、整列を測定するための適当なパラメータを決定することができる。
【００４９】
ヌクレオチド配列を整列させる場合、与えられた核酸配列Ｄに対する与えられた核酸配列Ｃの核酸配列同一性％（あるいは、与えられた核酸配列Ｄに対して、ある核酸配列同一性％を有するまたは含む、与えられた核酸配列Ｃと表すこともできる）は、以下のように計算することができる：
核酸配列同一性％＝Ｗ/Ｚ・１００  
ここで
Ｗは、ＣおよびＤの配列整列プログラムまたはアルゴリズムの整列により完全マッチとしてスコアされたヌクレオチドの数である
そして
Ｚは、Ｄ中のヌクレオチドの総数である。
【００５０】
核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと等しくない場合、Ｄに対するＣの核酸配列同一性％は、Ｃに対するＤの核酸配列同一性％と等しくならない。
（ストリンジェンシー）
相同体（すなわちヒト以外の種由来のＳＨＡＡＧｔｉｄｅをコードする核酸）または他の関連する配列（例えばパラログ）は、核酸のハイブリダイゼーションおよびクローニングに関する当該技術分野に公知の方法を用いて、プローブとしての特定のヒトの配列のすべてまたは一部との、低い、中程度の、または高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションにより得ることができる。
【００５１】
相補的なフラグメントとハイブリダイズするための一本鎖ＤＮＡの特異性は、反応条件の“ストリンジェンシー”により決定される。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーが増すと、ＤＮＡ二本鎖を形成する傾向が低下する。核酸のハイブリダイゼーション反応において、特異的なハイブリダイゼーションが起こりやすいように（高いストリンジェンシー）ストリンジェンシーを選択することができ、この場合は例えばライブラリーからの完全長のクローンの同定に使用することができる。より特異性の低いハイブリダイゼーション（低いストリンジェンシー）を使用して、関連はするがそのものではない（相同であるが同一ではない）ＤＮＡ分子またはＤＮＡ断片を同定することができる。
【００５２】
ＤＮＡ二本鎖は以下の各条件により安定化される：すなわち（１）相補的塩基対の数、（２）塩基対のタイプ、（３）反応混合液の塩濃度（イオン強度）、（４）反応温度、および（５）ある種の有機溶媒、例えばＤＮＡ二本鎖の安定性を低下させるホルムアミドの存在、があげられる。一般にプローブが長いほど、適当なアニーリングに必要な温度はより高温になる。共通のアプローチは温度を変化させることである：より高い相対温度は、結果的によりストリンジェントな反応条件になる。（Ausubel et al., 1987）は、ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーについての見事な説明を提供している。
【００５３】
“ストリンジェントな条件”下でハイブリダイズさせることとは、互いに少なくとも６０％相同なヌクレオチド配列がハイブリダイズして維持されている、ハイブリダイゼーションのプロトコルをいう。一般にストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度およびｐＨでの特異的な配列の融解温度（Ｔｍ）より約５℃低い温度となるように選択される。Ｔｍは、標的配列に相補的なプローブの５０％が標的配列と平衡状態でハイブリダイズしている温度（定義されたイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度にて）である。標的配列は一般に過剰に存在するため、Ｔｍではプローブの５０％が平衡状態で占有される。
【００５４】
（ａ）高いストリンジェンシー
“ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件”は、プローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドが標的配列とのみハイブリダイズすることのできる条件である。ストリンジェントな条件は配列に依存し、したがって異なる。ストリンジェントな条件は以下を含む：すなわち（１）低イオン強度および高温の洗浄（例えば１５ｍＭ塩化ナトリウム、１．５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、５０℃にて）；（２）ハイブリダイゼーション中の変性剤（例えば５０％（ｖ/ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリドン、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５；７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウム、４２℃にて）；または（３）５０％ホルムアミド、が挙げられる。洗浄は典型的にはまた、５Ｘ  ＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５ｘ  Denhardt’s溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ/ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストラン中で４２℃にて、その後０．２ｘ  ＳＳＣ（塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム）中で４２℃にて、および５０％ホルムアミド中で５５℃での洗浄を行い、続いてＥＤＴＡを含む０．１ｘ  ＳＳＣからなる高いストリンジェンシーの洗浄を５５℃にて行う。好ましくはこの条件は、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の互いに相同な配列が、典型的には互いにハイブリダイズした状態を維持するような条件である。これらの条件は例として提示しており、限定することを意味するものではない。
【００５５】
（ｂ）中程度のストリンジェンシー
“中程度にストリンジェントな条件”は、ポリヌクレオチドが配列番号７−１２、１４の完全体、フラグメント、誘導体または類似体とハイブリダイズするような、より低ストリンジェントな洗浄溶液およびハイブリダイゼーションの条件(Sambrook, 1989)を使用する。一例として、６Ｘ  ＳＳＣ、５Ｘ  Denhardt’s溶液、０．５％ＳＤＳ、および１００ｍｇ/ｍｌの変性したサケ精子ＤＮＡ中ので５５℃でのハイブリダイゼーション、続いて１Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で３７℃での１回またはそれ以上の洗浄を行う。温度、イオン強度等は、実験の因子、例えばプローブの長さに適応させて調整することができる。他の中程度のストリンジェンシーの条件については、（Ausubel et al., 1987; Kriegler, 1990）に記載されている。
【００５６】
（ｃ）低いストリンジェンシー
“低いストリンジェントな条件”は、ポリヌクレオチドが配列番号７−１２、１４の完全体、フラグメント、誘導体または類似体とハイブリダイズするような、中程度のストリンジェンシーより低ストリンジェントな洗浄溶液およびハイブリダイゼーションの条件を使用する。低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、３５％ホルムアミド、５Ｘ  ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％ＰＶＰ、０．０２％フィコール、０．２％ＢＳＡ、１００ｍｇ/ｍｌの変性させたサケ精子ＤＮＡ、１０％（ｗｔ/ｖｏｌ）硫酸デキストラン中の４０℃でのハイブリダイゼーション、続いて２Ｘ  ＳＳＣ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．１％ＳＤＳ中の５０℃での１回またはそれ以上の洗浄がある。低ストリンジェンシーの他の条件、例えば異種間のハイブリダイゼーションの条件は、（Ausubel et al., 1987; Kriegler, 1990; Shilo and Weinberg, 1981）に十分に記載されている。
【００５７】
天然に発生するＳＨＡＡＧｔｉｄｅの対立遺伝子の変異型に加えて、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ機能は変わらないがＳＨＡＡＧｔｉｄｅをコードするアミノ酸配列中に変化を生じる、配列番号７−１２、１４中の突然変異により、変化を導入することができる。例えば、“必須ではない”アミノ酸残基でのアミノ酸の置換をもたらすヌクレオチドの置換は、配列番号３または４の配列にて作成することができる。“必須ではない”アミノ酸残基は、生物学的活性を変えずにＳＨＡＡＧｔｉｄｅの野生型の配列を変えることのできる残基であるが、“必須の”アミノ酸残基はこのような生物学的活性に必要である。例えば本発明のＳＨＡＡＧｔｉｄｅ中に保存されているアミノ酸残基は、特に変化に適応できないと予測される。保存的置換を行うことのできるアミノ酸は、当該技術分野でよく知られている。
【００５８】
有用な保存的置換を表Ａの“好ましい置換”に示す。１つのクラスのアミノ酸を同じタイプの別のアミノ酸で置き換える保存的置換は、その置換が材料による化合物の生物学的活性の変化をきたさない限り、本発明の範疇に入る。このような置換が生物学的活性に変化をきたす場合、その時には代表例として表Ｂに示したより実質的な変化を導入して、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチドの生物学的活性について産生物のスクリーニングを行う。
【００５９】
【表７−１】
2005524719.tif 000008
【００６０】
【表７−２】
2005524719.tif 000009
【００６１】
以下の項目、（１）ポリペプチド骨格構造、例えばβシートまたはαヘリックスの立体配座、（２）荷電、（３）疎水性、または（４）標的部位の側鎖の嵩高さ、に影響を及ぼす非保存的置換は、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチドの機能を修飾し得る。表Ｂに示したように共通する側鎖の特性に基づいて、残基をグループ分けする。非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスに交換してしまうことになる。置換は保存的置換部位に、またはより好ましくは非保存的な部位に導入してもよい。
【００６２】
【表８】
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【００６３】
変異型ポリペプチドは、当該技術分野で知られている方法、例えばオリゴヌクレオチドを介しての（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャン法、およびＰＣＲ突然変異誘発を用いて作成することができる。部位特異的突然変異誘発（Carter, 1986; Zoller and Smith, 1987）、カセット式突然変異誘発、制限酵素選択（restriction selection）突然変異誘発（Wells et al., 1985）または他の公知の技術をクローン化したＤＮＡに行い、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ変異型ＤＮＡを作成することができる（Ausbel et al.,1987; Sambrook, 1989）。
【００６４】
“単離された”または“精製された”ポリペプチド、タンパク質または生物学的に活性なフラグメントは、その天然環境の成分から分離および/または回収される。単離されたポリペプチドは、遺伝工学による細胞において異種起源から発現させたもの、またはin vitroで発現させたものを含む。
【００６５】
不純物成分として、典型的にはポリペプチドの診断的または治療的使用を妨げると思われる物質を含む。実質的に単離されているためには、調製物は、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅではない不純物質（不純物）を乾燥重量で３０％未満しか含まない、より好ましくは不純物を２０％未満、１０％未満、そして最も好ましくは５％未満しか含まないものとする。
【００６６】
目的のポリペプチドおよびフラグメントは、当該技術分野のあらゆる公知の方法により、例えばベクター、例えば細菌、ウイルスおよび真核細胞、を介しての発現により作製することができる。加えて、in vitroの合成、例えばペプチドの合成もまた使用することができる。
【００６７】
“活性な”ポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントは、表１および３に示したＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチドの活性と必ずしも同一でなくてもよいが、類似の生物学的および/または免疫学的活性を保持している。免疫学的活性は、免疫応答の惹起または増強におけるＳＨＡＡＧｔｉｄｅの実際の生物学的役割ではなく、ポリペプチド自体についてここで議論している文脈において、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ抗原のエピトープに対する特異的抗体がＳＨＡＡＧｔｉｄｅに結合することにおけるＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチドの１つの側面をいう。生物学的活性は、天然のＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチドに起因する阻害または刺激のいずれかの機能をいう。ＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチドの生物学的活性は、例えば走化性、免疫応答の誘発、増幅、または手助けを含む。投与依存性を含むまたは含まない特定の生物学的アッセイ（実施例参照）を用いて、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ活性を決定することができる。ＳＨＡＡＧｔｉｄｅの生物学的活性な部分をコードする核酸フラグメントは、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅの生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を単離し、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅのコードされた部分を発現させ（例えばin vitroの組換え発現により）、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチドのコードされた部分の活性を評価することにより、調製することができる。
【００６８】
一般にＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチド様の機能を保持しているＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチド変異体は、配列の特定の位置の残基が他のアミノ酸で置換されているあらゆる変異体を含み、さらに元のタンパク質の２つの残基間に付加的な１つまたは複数の残基が挿入されている可能性、ならびに元の配列から１つまたはそれ以上の残基を欠失している可能性を含む。あらゆるアミノ酸の置換、挿入、または欠失は本発明に包含される。好ましい環境において、この置換は上に定義したような保存的置換である。
【００６９】
“ＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチド変異体”は、少なくとも以下を有する活性なＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチドを意味する、すなわち：（１）完全長のＳＨＡＡＧｔｉｄｅ配列と約７０％のアミノ酸配列の同一性、または（２）完全長のＳＨＡＡＧｔｉｄｅ配列のあらゆるフラグメント、を有するものとする。例えばＳＨＡＡＧｔｉｄｅ変異体は、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が配列番号１−６、１３の配列のＮ末端またはＣ末端で付加または欠失されているＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチドを含む。ＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチド変異体は、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチド配列との少なくとも約７０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約７１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％のアミノ酸配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するものとする。
【００７０】
“アミノ酸配列同一性パーセント（％）”は、２つの配列を整列させた際に、候補配列における、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ配列中のアミノ酸残基と同一なアミノ酸残基のパーセンテージとして定義する。アミノ酸同一性％を決定するため、配列を整列させ、必要であればギャップを導入して配列の最大の同一性％を達成する；保存的置換は配列の同一部分とみなさない。同一性パーセントを決定するためのアミノ酸配列の整列法は、当業者に公知である。公開されている入手可能なコンピューターソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ２またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを用いてポリペプチド配列を整列することができる。比較する配列の全長にわたり最大の整列を達成するために必要なあらゆるアルゴリズムを含む、整列を測定するためのパラメータを決定することができる。
【００７１】
アミノ酸配列を整列させる場合、与えられたアミノ酸配列Ｂに対する与えられたアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと同一の、あるアミノ酸配列同一性％を有するまたは含む、与えられたアミノ酸配列Ａとして表すこともできる）は、以下のように計算することができる：
アミノ酸配列同一性％＝Ｘ/Ｙ・１００  
ここで
Ｘは、ＡおよびＢの配列整列プログラムまたはアルゴリズムの整列により完全マッチとしてスコアされたアミノ酸残基の数である
そして
Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である。
【００７２】
アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡのアミノ酸配列同一性％は、Ａに対するＢの核酸配列同一性％とは等しくならない。
（キメラポリペプチドおよび融合ポリペプチド）
融合ポリペプチドは発現の研究、細胞の局在化、バイオアッセイ、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅの精製において、そして重要なことにはこのペプチドを目的の抗原と融合させてもよい場合の、アジュバントへの適用において有用である。ＳＨＡＡＧｔｉｄｅの“キメラポリペプチド”または“融合ポリペプチド”は、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅではないポリペプチドと融合させたＳＨＡＡＧｔｉｄｅを含む。ＳＨＡＡＧｔｉｄｅではないポリペプチドは、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ（配列番号１−６、１３）と実質的に相同ではない。ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ融合ポリペプチドは、いかなる数の生物学的活性部分をも含む、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ全体のあらゆる部分を含んでもよい。一部の宿主細胞では、異種のシグナル配列の融合がＳＨＡＡＧｔｉｄｅの発現および/または分泌を改善し得る。
【００７３】
融合相手を利用して、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅを治療に適合させることができる。ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ−Ｉｇ融合ポリペプチドを免疫原として使用して、被験者の体内で抗ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ  Ａｂｓを産生させ、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅリガンドを精製し、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅと他の分子との相互作用を阻害する分子をスクリーニングすることができる。加えて目的の抗原との融合を用いて、ワクチン接種/免疫化の方法を促進することができる。
【００７４】
融合ポリペプチドは、組換え法を用いて容易に作成することができる。ＳＨＡＡＧｔｉｄｅをコードする核酸を、非ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ、例えば免疫化する（複数の）抗原をコードする核酸、とインフレーム（in-frame）で、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅのＮＨ２−またはＣＯＯ−末端または配列中に融合させることができる。融合遺伝子はまた、自動ＤＮＡ合成装置を含む従来技術により合成することもできる。２つの連続する遺伝子フラグメント間の相補的なオーバーハングを生じるアンカープライマーを用いてのＰＣＲ増幅は、続いてのアニーリングおよび増幅によりキメラ遺伝子配列を作製することができる（Ausubel et al., 1987）。融合部分にインフレームのＳＨＡＡＧｔｉｄｅのサブクローニングを促進する多くのベクターを、市販で入手することができる。
【００７５】
（ミメティック）
ＳＨＡＡＧｔｉｄｅのポリペプチドミメティックもまた使用することができる。“ミメティック”および“ペプチドミメティック”という用語は、実質的にＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチドと同じ構造的および/または機能的特徴を有する、化学的合成化合物をいう。ミメティックは、合成されたアミノ酸の非天然類似体から全て構成される、または部分的に天然のペプチドアミノ酸と部分的にアミノ非天然酸類似体とのキメラ分子からなるかのいずれかとすることができる。ミメティックはまた、天然のアミノ酸の保存的置換のいかなる量も組み込むことができる。ポリペプチドミメティック組成物は、典型的には以下の３つの構造群からなる、天然ではない構造成分のあらゆる組み合わせを含有することができる：その構造群として（ａ）天然のアミド結合（“ペプチド結合”）の結合方法以外の連結基の残基；（ｂ）天然に発生するアミノ酸残基に代わる天然ではない残基；または（ｃ）二次構造の擬態を誘導する残基、すなわち二次構造、例えばβターン、γターン、βシート、αヘリックス立体配座等を誘導または安定化する残基、などが挙げられる。
【００７６】
ポリペプチド残基の全てまたは一部が天然のペプチド結合以外の化学的方法により結合している場合、そのポリペプチドはミメティックと特徴付けることができる。個々のペプチドミメティックの残基は、ペプチド結合、その他の化学的結合、またはカップリングの方法により、例えばグルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ニ官能マレイミド、Ｎ，Ｎ’−ジクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）またはＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）により結合することができる。従来のアミド結合（“ペプチド結合”）の結合方法に代わることのできる連結基として、例えばケトメチレン（例えば−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−に対応する−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−）、アミノメチレン（ＣＨ２−ＮＨ）、エチレン、オレフィン（ＣＨ＝ＣＨ）、エーテル（ＣＨ２−Ｏ）、チオエーテル（ＣＨ２−Ｓ）、テトラゾール（ＣＮ４−）、チアゾール、レトロアミド、チオアミド、またはエステルを含む（Spatola (1983)Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins（アミノ酸、ペプチドおよびタンパク質の化学および生化学）第７巻、pp267-357、”Peptide Backbone Modifications”（ペプチド骨格の修飾）、Marcell Dekker, NY）。
【００７７】
ポリペプチドはまた、天然に存在するアミノ酸残基に代わり、全てまたは一部の天然ではない残基を含むことにより、ミメティックと特徴付けることができる。天然ではない残基、ならびにアミノ酸の各クラスに関する適当な置換（表Ｂ）は、よく知られている。例えば芳香族アミノ酸のミメティックは、例えばＤ−またはＬ−ナフチルアラニン；Ｄ−またはＬ−フェニルグリシン；Ｄ−またはＬ−２チエニルアラニン；Ｄ−またはＬ−１、−２、３−または４−ピレニルアラニン等で置き換えることにより作製することができる。
【００７８】
他のミメティックは、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化；セリン残基またはトレオニン残基のヒドロキシル基のリン酸化；リジン、アルギニンおよびヒスチジンのαアミノ基のメチル化；Ｎ末端アミンのアセチル化；主鎖のアミド残基のメチル化またはＮ−メチルアミノ酸による置換；またはＣ末端カルボキシル基のアミド化により作製されるものを含む。天然のポリペプチドの成分はまた、反対のキラリティーをもつアミノ酸またはペプチドミメティック残基により置き換えることもできる。
【００７９】
ミメティックはまた、構造的にミメティックな残基、特に二次構造、例えばβターン、βシート、αヘリックス構造、γターン等を誘導または擬態する残基を含有する組成物を含む。例えばペプチド中でのＤ−アミノ酸；Ｎ−α−メチルアミノ酸；Ｃ−α―メチルアミノ酸；またはデヒドロアミノ酸による天然のアミノ酸残基の置換は、βターン、γターン、βシートまたはαヘリックス立体配座を誘導または安定化させることができる。
【００８０】
（環式ペプチド）
一部の場合、環式ＳＨＡＡＧｔｉｄｅペプチドは有利となり得る。ＳＨＡＡＧｔｉｄｅを環式化するため、ペプチドに含まれるシステイン残基を酸化してＳ−Ｓダイマーまたはより大きなポリマー（トリマー等）を酸化により形成することができる。ペプチド中の互いに遠位に位置する２つのシステインを酸化して、１つまたはそれより多くの機能的なアミノ酸配列を含む環式ペプチドを調製することができる。
【００８１】
本発明の実践
（ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ活性を実証するアッセイ）
（ａ）in vitroアッセイ
ＳＨＡＡＧｔｉｄｅは、アジュバントとして使用する際に一定の特性を有する；すなわち免疫応答を増強、惹起または調節する。ＳＨＡＡＧｔｉｄｅのその他の活性として、ホルミルペプチド受容体様−１（formyl-peptide receptor-like-1）（ＦＰＲＬ１）受容体を発現する細胞を含むある種の細胞における走化性の誘導を含む活性が知られている。in vitroの走化性（細胞の遊走）のアッセイを用いて、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅの走化性の特性を同定することができる。このようなアッセイは、多孔性膜を用いて候補の化学誘引物質から細胞を物理的に分離して、膜の一方から他方への細胞の遊走をアッセイすることにより、細胞の遊走を示す。例として従来の細胞遊走アッセイ、例えばChemoTx（登録商標）システム（NeuroProbe, Rockville, MD; (Goodwin, 米国特許５，２８４，７５３号、１９９４年)）または他のあらゆる適切な装置またはシステム（Bacon et al., 1988; Penfold et al., 1999）を使用することができる。標的受容体を発現する細胞を集める。候補化合物、例えばＳＨＡＡＧｔｉｄｅペプチドまたはその他のケモカイン/ケモカイン様化合物を、バッファー中の系列希釈により通常一連の濃度にて調製する。濃度範囲は典型的には０．１ｎＭと１０ｍＭの間とするが、検査する化合物により多様となる。
【００８２】
細胞の遊走アッセイを始めるため、様々な濃度の候補化合物の溶液を細胞遊走装置の低いほうのチャンバーに加え、細胞懸濁液を多孔性膜（細胞のタイプおよび細胞のサイズに依存して約３μｍから約５μｍ）で分離する高いほうのチャンバーに加える。細胞を、過湿した組織培養インキュベーター中で６０分から１８０分間、培養条件（ヒト細胞に関しては約３７℃）下でインキュベーションする。インキュベーション時間は細胞のタイプに依存し、必要な場合は経験的に決定することができる。
【００８３】
アッセイ終了後、装置の高いほうのチャンバーの遊走していない細胞を、ゴムベラまたは他の手動の方法、酵素的にまたは化学的に、例えばＥＤＴＡ溶液およびＥＧＴＡ溶液を用いて除去する。２つのチャンバーを分離する膜を装置から外し、ダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水（ＤＰＢＳ）または水ですすぐ。次に低いほうのチャンバーに遊走した細胞数を決定する。バックグラウンド（走化性化合物または候補化合物を含まない）以上のレベルの細胞の遊走が、候補化合物が検査した細胞に対して走化性であることを示す。
【００８４】
候補化合物が約１ｐＭから約１μｍ（例えば約１ｎＭと５００ｎＭの間、例えば１ｎＭ，約１０ｎＭ、約１００ｎＭ、または約１ｐｇ/ｍｌと約１０μｇ/ｍｌの間、例えば約１ｎｇ/ｍｌと１μｇ/ｍｌの間、例えば約１０ｎｇ/ｍｌ、約１００ｎｇ/ｍｌもしくは約１μｇ/ｍｌ）の濃度で、ネガティブコントロールの少なくとも２倍から８倍またはそれより多くまで、細胞を誘引していれば、この化合物は特定の細胞タイプに対して走化性があると考慮される。
【００８５】
（ｂ）in vivoのアッセイ
化合物の走化性の特性は動物、例えば哺乳類、例えばヒト以外の霊長類およびマウスで決定することができる。１つのin vivoのアッセイにおいて、候補化合物（例えばＰＢＳ中２−２０μｇ）を皮内注射にて投与する。約２４から約９６時間またはそれ以上の後、細胞の浸潤の存在の有無をルーチーンの組織学的技術を用いて決定する。浸潤物が存在している場合には、細胞をタイプ（単球、好中球、樹状細胞、等）により同定し定量する。
【００８６】
（ＳＨＡＡＧｔｉｄｅの治療への適用）
（ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ組成物）
ＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチド（配列番号１−６、１３）または誘導体、類似体等は、組成物、例えば免疫応答を惹起、増強または調節するために使用する組成物中にて投与することができる；１つまたはそれより多くのＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチド（配列番号１−６、１３）を含んでもよい。この組成物は目的の抗原を含んでもよい；しかし、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチドはそれ自体で投与してもよい。一部の態様ではＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチドは、他の分子、例えばポリペプチドまたは多糖の免疫原を含有する他の投与に連続して投与する。
【００８７】
１つの側面において本発明の方法は、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ組成物に加えて、１つの免疫原の投与を伴う。これらの組成物は被験者の同じ物理的部位に投与する。例えばこの免疫原をＳＨＡＡＧｔｉｄｅ組成物と組み合わせて、それらの混合物を一緒に投与（例えば注射）してもよい。あるいはこの組成物および抗原を別々に被験者の同じ領域に投与する（例えば同じ部位に注射する、同じ部位に局所的に投与する、等）。異なる組成物は異なる時間に投与する。
【００８８】
ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ組成物はまた、抗原を伴わずに投与する（例えば癌細胞への免疫応答を惹起させるための固形腫瘍内への注射、または固形腫瘍の周辺組織内、例えば固形腫瘍から２ｃｍ以内への注射）ことができる。特定のメカニズムに拘束する意図はないが、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅは内因性（例えば腫瘍）の抗原への免疫応答を、投与部位へのＡＰＣの動員により促進すると考えられる。
【００８９】
ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ組成物はさらに賦形剤または担体を含んでもよい。ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ組成物はまた、１つまたはそれ以上の免疫原（抗原；すなわち免疫応答を誘導、増強または調節することが望まれる抗原）を含んでもよい。
【００９０】
ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ組成物は、従来のアジュバントを含んでもよい。従来のアジュバントは典型的には可溶性タンパク質の抗原を粒子状物質に変換する。従来のアジュバントは、フロイント不完全アジュバント、フロイント完全アジュバント、Ｍｅｒｃｋ６５、ＡＳ−２、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、およびリゾレシチンのような界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、およびジニトロフェノールを含む。その他の有用なアジュバントとして、細菌きょう膜多糖、デキストラン、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ４０リガンド、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１８またはサイトカイン、または細菌ＤＮＡフラグメントを含むが、これに限定されない。
【００９１】
（抗原）
１つの側面において、本発明は抗原、例えば予め決定されたまたは特定された抗原に対する免疫応答を惹起または増強する方法を提供する。抗原は抗体と反応する分子である。一部の態様において抗原は免疫原である。一部の態様において抗原はタンパク質の担体に連結させる。例えばＳＨＡＡＧｔｉｄｅおよび抗原を、例えば融合タンパク質、化学的架橋、または例えばビオチンとストレプトアビジンのような複合体により、物理的に連結させることができる。
【００９２】
抗原（免疫原）は典型的にはペプチド、ポリペプチド、化学的化合物、微生物病原体、細菌（例えば生きている、弱毒化した、または不活性化した細菌）、ウイルス（不活性化したウイルス粒子、修飾した生きているウイルス粒子、および組換えウイルス粒子）、組換え細胞、糖タンパク質、リポタンパク質、糖ペプチド、リポペプチド、変性毒素、炭水化物、腫瘍特異的抗原、およびその他の病原体の免疫原性成分である。２つまたはそれ以上の抗原の混合物を使用してもよい。抗原は精製してもよい。一部の態様において、抗原はＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチドと（共有結合または非共有結合により）結合させてもよい。
【００９３】
本発明を使用して、暴露の前に外因性の外来感染性病原体物質からの防御を提供する。加えて本発明を使用して、人がすでに暴露されている外因性の外来病原体に対して、またはその人が暴露されたことを示す症状に対して、治療効果を提供することができる。本発明を使用して、黒色腫、肺癌、甲状腺がん、乳癌、腎細胞癌、扁平上皮細胞癌、脳腫瘍、および皮膚癌を含む癌を治療することができるが、これに限定されない。例えばこの抗原は、腫瘍に関連する抗原（腫瘍特異的抗原）であってもよい。腫瘍抗原は分子、特に細胞表面タンパク質であり、非腫瘍細胞と比較して腫瘍細胞において特異に発現される。
【００９４】
予防への使用として、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅを含む組成物を（例えば免疫原と共に）被験者に投与する。治療への使用として、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅを含む組成物は、一度疾患が検出され、診断され、または治療さえされた後、例えば腫瘍の外科的切除後、に被験者に投与する。
【００９５】
本発明の例示的な抗原またはワクチン成分は、微生物病原体由来の抗原を含む。例えば細菌［例えば百日咳（百日咳菌(Bordetella pertussis)、不活性化した全菌体）；コレラ（コレラ菌(Vibrio cholerae)、全死菌体）；髄膜炎（髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、菌体由来の多糖）；ライム病（Borrelia burgdorferi、リポタンパク質ＯｓｐＡ）；ヘモフィルスＢ（Ｂ型インフルエンザ菌(Haemophilus influenza B ) 多糖、破傷風菌コンジュゲーションまたはＯｍｐＣ）；肺炎（肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)きょう膜多糖；腸チフス（腸チフス菌(Salmonella typhi)多糖ワクチン、全死菌体］、インフルエンザウイルス；Ａ型肝炎；Ｂ型肝炎；Ｃ型肝炎；麻疹；風疹ウイルス；流行性耳下腺炎；狂犬病；ポリオウイルス；日本脳炎ウイルス；ロタウイルス；水痘;の不活性化したウイルス粒子、修飾した生きているウイルス粒子、および組換えウイルス粒子を含むウイルス］、ジフテリア（ジフテリア菌(Corynebacterium diphtheriae)）および破傷風（破傷風菌(Clostridium tetani)）を含む。
【００９６】
（ポリヌクレオチド走化性組成物）
ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ、抗原、またはその双方は、in situでポリペプチドが産生されるようにポリヌクレオチドとして送達してもよい。裸のポリヌクレオチドの場合、ポリヌクレオチドを担体、例えば細胞内に効率的に輸送される生体内で分解可能なビーズ上にコーティングすることにより、細胞による取り込みを増加させることができる。このようなワクチンにおいてポリヌクレオチドは、核酸発現系、細菌およびウイルスの発現系を含む様々な送達システムのいずれかに組み込んでもよい。
【００９７】
生物体から生物体へ遺伝物質を往復（shuttle）させるために使用するベクターは、２つの一般的なクラスに別けることができる：クローニングベクターは、適当な宿主細胞の増殖に必須ではない領域で、そこに外来ＤＮＡを挿入することのできる領域をもつ、複製するプラスミドまたはファージである；外来ＤＮＡは、あたかもそれがベクターの一成分であるかのように複製、増殖される。発現ベクター（例えばプラスミド、酵母、または動物のウイルスゲノム）は、外来ＤＮＡ、例えばＳＨＡＡＧｔｉｄｅを転写、翻訳する目的で、宿主の細胞または組織中に外来の遺伝子物質を導入するために使用する。発現ベクターにおいて導入されるＤＮＡは、挿入されたＤＮＡを転写するように宿主細胞にシグナルを送るプロモーターのような要素に、機能可能なように連結させる。特定の因子に反応して遺伝子の転写をコントロールする誘導可能なプロモーターは、ことのほか有用となり得る。誘導可能なプロモーターに対して機能可能なように連結されたＳＨＡＡＧｔｉｄｅおよび/または抗原ポリヌクレオチドは、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅおよび/または抗原ポリペプチドまたはフラグメントの発現をコントロールすることができる。古典的な誘導可能なプロモーターの例は、α−インターフェロン、熱ショック、重金属イオン、および、例えばグルココルチコイドのようなステロイド（Kaufman, 1990）、およびテトラサイクリンに応答するものを含む。他の望ましい誘導可能なプロモーターとして、コンストラクトが導入されている細胞には内因性ではないが、誘導物質を外因的に供給するとこれらの細胞内で応答する物を含む。一般に有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドである。しかし発現ベクターの他の形、例えばウイルスベクター（例えば複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）も考慮することができる。
【００９８】
ベクターの選択は、使用する生物体または細胞、およびベクターの所望の行く末により決定される。ベクターは標的細胞内で１回複製させてもよく、または“自殺”ベクターとしてもよい。一般にベクターはシグナル配列、複製開始点、マーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、および転写終結配列を含む。
【００９９】
（ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ（斜体）および免疫原（抗原）の投与）
ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ組成物は１つもしくはそれ以上の抗原、または抗原をコードするポリヌクレオチドを含有してもよい。抗原はＳＨＡＡＧｔｉｄｅと組み合わせて（すなわち同一の混合物中で）投与することができる。あるいはこれらを別々に投与することができる。１つの側面において本発明は、１つまたはそれより多くの抗原（または抗原をコードするポリヌクレオチド）および１つまたはそれより多くのＳＨＡＡＧｔｉｄｅ（またはＳＨＡＡＧｔｉｄｅをコードするポリヌクレオチド）を組み合わせて、被験者に投与される免疫感作の方法を提供する。抗原またはＳＨＡＡＧｔｉｄｅは、送達ビヒクル、例えば生理学的に受容可能な賦形剤中にて投与してもよい。
【０１００】
抗原はＳＨＡＡＧｔｉｄｅ組成物と同時に投与してもよい、または抗原およびＳＨＡＡＧｔｉｄｅ組成物を異なる時間に、典型的には同じ部位に投与する。例えば走化性組成物（抗原を含まない）を、抗原の投与前の約１５分および約９６時間の間に、より頻繁には抗原の投与前の約１５分および約４８時間の間に、より頻繁には２４時間および９６時間の間に、しばしば約４８時間および７２時間の間、または７２時間および９６時間の間に投与することができる。
【０１０１】
ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ組成物および抗原組成物を被験者の同一部位に注射する場合、好ましくは注射は、体の二次元表面上の互いに２ｃｍ以内、好ましくは互いに１ｃｍ以内または好ましくは０．５ｃｍ以内とする。投与はまた、類似の深さおよび同じ組織層に行わうべきである。筋肉内注射では深さをより正確にモニターして、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅおよび抗原を、互いに２ｃｍ以内、好ましくは１ｃｍ以内、より好ましくは０．５ｃｍ以内の三次元的に等しい位置に行うべきである。注射部位は、医師の助けとなるよう、消えないインクでマークすることができる。
【０１０２】
組成物は１回の用量（投与）で与えてもよい。しかし初回の投与に続いてブースター投与を行ってもよい。例えばＳＨＡＡＧｔｉｄｅ組成物は、しばしば抗原と組み合わせて（例えば同時投与により）複数回の用量で投与する。ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ組成物（所望により抗原を含む）は１回、２回、３回、またはそれより多くの回数で投与してもよい。被験者に投与する用量の回数は、抗原、疾患の程度、およびＳＨＡＡＧｔｉｄｅ組成物に対する被験者の反応に依存する。本発明の範疇において用量の適切な回数として、予め決定された抗原に対して動物を免疫感作するために必要なあらゆる回数を含む。
【０１０３】
ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ組成物および抗原の２回目の投与（ブースター）は、初回投与後約７日および１年の間に与えることができる。初回と２回目の投与間の時間は、初回投与後１４日から６ヶ月、２１日および３ヶ月の間、しばしば約２８日および２ヶ月の間とすることができる。３回目の投与（２回目のブースター）は、初回投与後約１４日および１０年の間、例えば約１４日および３年の間、しばしば約２１日および１年の間、より頻繁には約２８日および６ヶ月の間に与えることができる。その後のブースターは２週間の間隔をおいて、または１ヶ月、３ヶ月、または６ヶ月から１０年の間隔をおいて投与することができる。
【０１０４】
様々なワクチンの投与量および投与計画を、容易に発展させることができる；投与に関する本発明のＳＨＡＡＧｔｉｄｅ、抗原、またはＳＨＡＡＧｔｉｄｅおよび抗原のいくつかの組み合わせの有効な用量および投与回数の決定もまた、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１０５】
（有効な用量）
典型的には、抗原に対して動物を免疫感作するのに十分なＳＨＡＡＧｔｉｄｅおよび抗原の量（すなわち“免疫学的に有効な用量”または“治療上有効な用量”）を、被験者に投与することになる。“免疫学的に有効な用量”を達成するために適する量は、部分的にはＳＨＡＡＧｔｉｄｅおよび抗原の組成物、投与法、治療する疾患の段階および重症度、被験者の体重および一般的健康状態、および処方する医師または他の資格者の判断に依存することになる。
【０１０６】
抗原およびＳＨＡＡＧｔｉｄｅの有効な用量は、免疫応答の誘導を達成するための動物モデルにおいて処方することができる；このようなデータを用いて、動物のデータに基づいたヒトへの投与を容易に至適化することができる（実施例参照）。ＳＨＡＡＧｔｉｄｅがポリペプチドである場合、用量は典型的には約１ｆｇおよび約１００μｇの間、しばしば約１ｐｇおよび約１００μｇの間、より頻繁には約１ｎｇおよび約５０μｇの間、通常約１００ｎｇおよび約５０μｇの間であろう。一部の態様において用量は、被験者の体重１ｋｇ当たり約１ｆｇおよび約１００μｇの間、被験者の体重１ｋｇ当たりしばしば約１ｐｇおよび約１００μｇの間、より頻繁には約１ｎｇおよび約５０μｇの間、通常約１００ｎｇおよび約５０μｇの間とする。
【０１０７】
抗原の量は、その抗原の同一性および特性に伴い多様となる。ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ組成物は、１つまたはそれより多くの抗原および１つまたはそれより多くのＳＨＡＡＧｔｉｄｅを、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ対抗原で、約１：１０００またはそれ以上のモル比または重量比で含むことができる。他の有用な比率は約１：１０および１：１０００の間、約１：１０および１：１０００の間、または１：１０００より大である。組成物中の抗原対ＳＨＡＡＧｔｉｄｅの比率は約１：１０および１０：１の間で変化させることができる。
【０１０８】
（担体、賦形剤、従来のアジュバント、投与法）
本発明のＳＨＡＡＧｔｉｄｅを含む組成物は、様々な方法および様々な形で投与してもよい。ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ組成物は担体および賦形剤、例えばバッファー、炭水化物、マンニトール、タンパク質、ポリペプチド、またはグリシンのようなアミノ酸、抗酸化剤、静菌剤、キレート剤、懸濁剤、増粘剤、および/または保存剤；水、オイル、生理食塩水、水性デキストロースおよびグリセロール溶液、生理的状態に近づけるために必要とされるその他の医薬的に受容可能な補助的物質、例えばバッファー剤、等張剤(tonicity adjusting agents)、湿潤剤、等を含むことができる。従来のアジュバントをまた組成物中に組み込ませてもよい。
【０１０９】
あらゆる適切な担体を使用して本発明の組成物を投与してもよいが、担体のタイプは投与方法に依存して多様となるであろう。化合物はまたリポソーム中に封入してもよい。生体内で分解可能なミクロスフェアは、一部の場合担体として好都合である；例えば（Tice et al., 米国特許５，９４２，２５２号、１９９９年）に記載されている場合である。
【０１１０】
組成物の滅菌、例えば従来技術または滅菌フィルターにより行われる滅菌は望ましい。得られる水溶液はそのままで、または凍結乾燥して使用するように梱包することができる。
【０１１１】
本発明のＳＨＡＡＧｔｉｄｅ組成物は、注射（例えば皮内、皮下、筋肉内、腹腔内等）による、吸入による、局所投与による、座剤による、経皮パッチを使用することによる、または経口による方法を含む、様々な方法で投与してもよい。
【０１１２】
注射で投与する場合、組成物は水溶液、好ましくは生理学的に適合性のあるバッファー、例えばハンクス液、リンガー液、または生理学的な生理食塩水バッファー中に処方してもよい。この溶液は製剤化剤、例えば懸濁剤、安定剤および/または分散剤を含んでもよい。あるいは走化性組成物は使用前に、適切なビヒクル、例えば滅菌した発熱物質を含まない水で調製するための粉末の形としてもよい。吸入送達用の組成物は、加圧されたパックからのエアゾールスプレー、または適切な噴霧剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、二酸化炭素またはその他の適切なガスを使用するネブライザーとしてもよい。加圧されたエアゾールの場合、投与ユニットは計量された量を送達するためのバルブを提供することにより決定してもよい。吸入器（inhalerまたはinsufflator）に使用するための、例えばゼラチンの、カプセルおよびカートリッジは、タンパク質および適切な粉末ベース、例えばラクトースまたはスターチ、の粉末混合物を含有して処方してもよい。局所投与の場合組成物は、当該技術分野で公知のような溶液、ゲル、軟膏、クリーム、懸濁液等として処方してもよい。一部の態様において、投与は経皮パッチの手段による。座剤組成物はまた、従来の座剤ベースに処方してもよい。
【０１１３】
投与が経口の場合、組成物は医薬的に受容可能な担体と組成物を組み合わせることにより、容易に製剤化することができる。固体の担体には、マンニトール、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム等を含む；このような担体は、経口摂取用の、錠剤、ピル、ドラジェー、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等の形をとることができる。この様な製剤は、粉末、カプセルおよび錠剤としてもよい；適切な賦形剤は、充填剤、例えば砂糖、セルロース調製物、顆粒化剤、および結合剤を含む。
【０１１４】
核酸分子、例えばＳＨＡＡＧｔｉｄｅをコードする分子を、ベクター中に挿入し、遺伝子療法のベクターとして使用することができる。遺伝子療法の技術は近年目覚しく進歩し、すばらしい成功を治めている（Meikle, 2002）。遺伝子療法のベクターは、例えば静脈内注射、局所投与により（Nabel and Nabel, 米国特許第５，３２８，４７０号、１９９４年）、または定位の注射（Chen et al., 1994）により、被験者に送達することができる。遺伝子療法ベクターの医薬的調製物は、受容可能な希釈剤を含むことができる、または遺伝子送達ビヒクルを包埋する徐放性マトリックスを含むことができる。あるいは完全な遺伝子送達ベクターを組換え細胞、例えばレトロウイルスベクター、から完全な形で産生させることができる場合には、医薬的調製物は遺伝子送達系を産生する１つまたはそれより多くの細胞を含むことができる。
【０１１５】
その他の好都合な担体として、多価担体、例えば細菌きょう膜多糖、デキストランまたは遺伝子工学によるベクターを含む。加えて持続的放出の処方物は、例えばＳＨＡＡＧｔｉｄｅ分子および/または抗原を含み、持続的放出の製剤物質を用いない場合には、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅおよび/または抗原が被験者の全身から排除される、または分解されてしまうような長期間にわたり、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅおよび/または抗原の放出が可能とする。
【０１１６】
（モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体産生のためのワクチン接種）
結合フラグメント（例えばＦ（ａｂ）２）および一本鎖のバージョンを含む、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の作製法はよく知られている。しかし多くの抗原は適当な抗体応答を引き起こすことができない。１つの態様において、本発明のＳＨＡＡＧｔｉｄｅおよび抗原を含む組成物を動物に投与し、それによりその動物の体内で免疫応答を誘導または増強させる。ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体をその後標準的な技術により調製する。
【０１１７】
（自然免疫応答の刺激）
もう１つの側面において本発明の組成物を被験者に投与して、自然免疫応答を刺激する。自然免疫応答は病原体に対する体の最初の防御であり、ＡＰＣを含む様々な細胞により惹起される。これらの細胞は、外来源の分子（例えば細菌およびウイルスの核酸、タンパク質、炭水化物）を認識する表面および細胞質の受容体を発現する。これらのシグナルを察知して、樹状細胞およびマクロファージが、未成熟の樹状細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞、および顆粒球のような細胞を攻撃部位に誘引するサイトカイン（インターフェロン、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−１２を含む）およびケモカインの放出を含む防御応答を惹起する。
【０１１８】
本発明の組成物を使用して、樹状細胞およびその他の細胞を投与部位に誘引することができるが、体が適応応答を起こしている間に、非特異的防御を行う自然免疫応答の要素を惹起するようにこれらの細胞を刺激することもまたできる。例えばＳＨＡＡＧｔｉｄｅ組成物は、例えばバイオテロリズムにおいて不運にも適用される例を含む、予想される感染への暴露の前または後に（抗原を含まずに）投与される。もう１つの態様においてＳＨＡＡＧｔｉｄｅは、“外来”分子（例えば細菌またはウイルスの核酸、タンパク質、炭水化物、またはそれらのエレメントを擬態する合成エレメント）とともに投与する。
【０１１９】
（キット）
１つの側面において本発明は、パッケージまたは容器中に以下の１つまたはそれより多くを含むキットを提供する：（１）本発明のＳＨＡＡＧｔｉｄｅ組成物；（２）医薬的に受容可能なアジュバントまたは賦形剤；（３）抗原（例えば生物学的に純粋な抗原）；（４）投与用のビヒクル、例えば注射器；（５）投与用の使用説明書。
【０１２０】
キットを供給する際、組成物の異なる成分を別々の容器に梱包し、使用直前に混合してもよい。成分をこのように別々に梱包することで、活性を失わずに長期間の保存を可能にし得る。
【０１２１】
キットに含まれる試薬は、異なる成分の耐用期間が保存され、容器の材料によって吸着されたり変化したりしないような、あらゆる種類の容器にて供給することができる。例えば封入ガラスアンプルは、凍結乾燥のＳＨＡＡＧｔｉｄｅポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、または中性の不活性ガス、例えば窒素下で封入したバッファーを含有してもよい。アンプルはあらゆる適切な材料、例えばガラス、有機ポリマー、例えばポリカーボネート、ポリスチレン等；セラミック、金属、または類似の試薬を保持するために典型的に使用されるその他のあらゆる材料からなってもよい。適切な容器の他の例は、アンプルと類似の材質から製作することのできる単純な形のビン、および、例えばアルミニウムまたは合金の箔で裏打ちされた内部を含んでなってもよい袋を含む。その他の容器として、試験管、バイアル、フラスコ、ビン、注射器、等を含む。容器は滅菌したアクセス口を有することができる、例えば皮下注射針で貫通することのできるストッパーのあるビンとすることができる。他の容器は、取り除いた時に複数の成分を混合できる、容易に除去できる膜により分離されている２つの部分を有していてもよい。除去できる膜はガラス、プラスチック、ゴム等であってもよい。
【０１２２】
キットはまた、使用説明書と共に供給することができる。使用説明は、紙または他の材質に印刷してもよいし、および/または電気的に読み取れるメディア、例えばフロッピーディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、Ｚｉｐディスク、ビデオテープ、オーディオテープ、等として供給することもできる。詳細な使用説明は物理的にもキットに添付しなくてもよい；代わりにユーザーが、キットの製造元または販売元の特定するインターネットのウェブサイトにて指示を受ける、または電子メールとして供給することができる。
【０１２３】
以下の実施例は、本発明を説明するために提示しており、いかなる方法で限定することも意味するものではない。
【実施例】
【０１２４】
実施例
実施例１  方法
他に記載がない場合、試薬はSigma Chemical Co. (St. Louis, MO)より入手した。
【０１２５】
（ＳＨＡＡＹｔｉｄｅ（配列番号４）ペプチドの調製）  配列番号４のペプチド“ＳＨＡＡＹｔｉｄｅ”は、化学的に合成、精製された（Phoenix Pharmaceuticals; Belmont, CA）。この材料をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に約１ｍｇ/ｍｌの濃度で懸濁し、−２０℃で保存した。
【０１２６】
（酵素結合免疫吸着検定法(Enzyme-linked immunosorbent assays)（ＥＬＩＳＡ））  まず９６ウェルＵ底型のプラスチックディッシュを、１ウェル当たり１００μｌ  ＰＢＳ中の１μｇ  オボアルブミン（ＯＶＡ）にて、オーバーナイト、コーティングした。翌日ディッシュをＰＢＳですすぎ、５％  ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＰＢＳでブロックし、再びＰＢＳですすいだ。実験動物由来の血漿サンプル（以下参照）を１０２から１０５倍に希釈して、ディッシュに２時間加え、その後ディッシュを再びＰＢＳですすいだ。次にディッシュをビオチン化したヤギ抗サルＩｇＧ検出抗体と共にインキュベーションした後、ＰＢＳですすぎ、ストレプトアビジンをリンクさせた西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ）と共にインキュベーションした。ＰＢＳで最後のすすぎを行った後、ＨＲＰ基質の２，２’−アジノビス［３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸］−ニアンモニウム塩を加えた。発色は、ＥＬＩＳＡプレートリーダーにて４０５ｎｍで測定し、光学密度（ＯＤ）ユニットを任意の“抗体ユニット”に変換した。この場合１ユニットは、ＯＶＡを注射したマウスより採取したＯＶＡ特異的抗体を含有する腹水の系列希釈液により得られた標準曲線の、最大の応答の５０％を示す血漿の希釈の逆数として定義する。
【０１２７】
（樹状細胞の精製）  実質的に精製された樹状細胞（成熟または未成熟の細胞の亜集団を含む）を調製することができる。樹状細胞の亜集団には以下を含む：（１）未成熟の末梢血単球に由来する細胞、（２）成熟した末梢血単球に由来する細胞、および（３）ＣＤ３４を発現する前駆体に由来する細胞。
【０１２８】
ヒトまたはマカークの様々な発達段階の樹状細胞は、特異的なサイトカインを用いてＣＤ１４を発現する血液前駆体より培養中で作成することができる。別の系列の樹状細胞は、臍帯血または骨髄由来のＣＤ３４を発現する前駆細胞から分化させることができる。最後に末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）由来の未成熟および成熟の樹状細胞もまた、作成することができる（Bender et al., 1996）。成熟した樹状細胞はマクロファージの条件培地および二本鎖ＲＮＡ−ポリ（Ｉ：Ｃ）の刺激を用いて作成することができる（Cella et al., 1999; Romani et al., 1996; Verdijk et al., 1999）。
【０１２９】
樹状細胞の集団が単離されたことを確認するには、樹状細胞の成熟化の間のケモカイン受容体の発現の著しい変化を利用して、細胞の段階を同定し確認することができる（Campbell et al., 1998; Chan et al., 1999; Dieu et al., 1998; Kellermann et al., 1999）。例えば作成された成熟樹状細胞は細胞マーカーおよび蛍光標示式細胞分画（ＦＡＣＳ）を用いることにより特徴付けることができる。産生した(generated)樹状細胞は、未成熟な樹状細胞より、細胞表面上により高レベルのＭＨＣクラスＩＩを発現する。ＣＤ８０、ＣＤ８３およびＣＤ８６の発現もまたアップレギュレートされる。ケモカイン受容体の発現もまた成熟化の間に劇的に変化する；例えばＣＣＲ１およびＣＣＲ５は成熟細胞ではダウンレギュレートされるが、ＣＣＲ７はアップレギュレートされる。機能的な特徴もまた、細胞のタイプを確認するために活用することができる。例えば成熟樹状細胞は、抗原を効率的に取り込むことができないが、ナイーブＴ細胞およびＢ細胞の増殖を刺激する能力は獲得している。成熟樹状細胞はまたそれらの遊走の性質も変化し、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２およびＣＣＲ５のリガンドに反応しないが、ＣＣＲ７リガンドには新たに反応するようになる。
【０１３０】
実施例２  ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ変異型（配列番号２）は樹状細胞を誘引する
本実施例は、樹状細胞を誘引するいくつかのケモカインおよびＳＨＡＡＹｔｉｄｅ（配列番号２）の能力を実証する、in vivoのアッセイについて述べる。
【０１３１】
以下のケモカイン：ｖＭＣＫ−２、ｍＣ１０およびＧＭ−ＣＦＳはR&D Systems (Minneapolis, MN)より入手した。以下のペプチド：ＳＨＡＡＹｔｉｄｅ（配列番号４）、ＳＨＡＡＧｔｉｄｅ変異型（配列番号）のいくつかの構造的に修飾されたペプチド（すなわちＭＰＲ−Ｃｙｓを連結させた環式化により環式化した）、コントロールペプチド（配列番号１７、Gly Ala Ala His Ser Leu Thr Met Gln Pro Gly Ile Lys Arg Arg Trp Leu Met）、１：１または１：４のいずれかの比率でＯＶＡとランダムにコンジュゲーションさせたもの（ＭＢＳカップリング法による）、およびＣ末端でＯＶＡとコンジュゲーションさせたもの（Ｃ末端、システインを付加により作成）、およびＳＨＡＡＧｔｉｄｅ変異型（配列番号２）は、Phoenix Pharmaceuticals (San Carlos, CA)にて合成した。３つの別々の実験において、ケモカインまたはペプチド（ＰＢＳ中の２μｇまたは２０μｇ）を、ＢＡＬＢ/ｃまたはＣ５７Ｂ１/６マウス(Jackson Laboratory; Bar Harbor, Maine)に皮内注射した。各実験において１頭のマウスにはネガティブコントロールとしてＰＢＳのみを注射した。注射後様々な時間にマウスを安楽死させ、注射部位周囲の領域を採取し免疫学的に検討した。凍結した切片を樹状細胞の特異的分子を認識する抗ＤＥＣ−２０５抗体（Bio-Whittaker Molecular Applications; Rockland, ME）で染色した（Kraal et al., 1986）。相対的な染色を０から５のスケールで数値化して各切片を表示した（０、なし；１、微量；２、軽度、３、中程度；４、重度）。結果を表７、８および９に示す。
【０１３２】
表７、８および９に示したように、ｖＭＣＫ−２、Ｃ１０、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＨＡＡＹｔｉｄｅ（配列番号４）、および投与されたすべての形のＳＨＡＡＧｔｉｄｅは、ＤＥＣ−２０５で標識された細胞の顕著な浸潤を示した。
【０１３３】
【表９】
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【０１３４】
【表１０】
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【０１３５】
【表１１】
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【０１３６】
実施例３  ＳＨＡＡＹｔｉｄｅ（配列番号４）のアカゲザルへの投与
異なる量（１００μｌ  ＰＢＳ中８、２０、または６０μｇ）の異なるポリペプチド（表１０参照）を麻酔下でアカゲザルに皮内注射した。２４および４８時間後に６ｍｍ皮膚パンチ生検を無菌技術にて採取し、二分した。一方の生検サンプルはＯＣＴ化合物中に包埋し、液体窒素中で瞬間凍結し、−７０℃で保存した。他方のサンプルはホルマリンに漬け、パラフィンワックス中に包埋した；その後マイクロトームで切り出した切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、顕微鏡下で皮膚内への細胞の浸潤を観察した（表１０）。ネガティブコントロールとして、いかなるポリペプチドも含まないＰＢＳをサルに注射した。
【０１３７】
単核細胞の浸潤を０から５のスコアで表した：０、真皮を通して非常に軽度の血管周囲の単核球の炎症性浸潤；１、真皮を通して認められる軽度の血管周囲の単核球の炎症性浸潤；２、真皮を通して認められる軽度/中程度の血管周囲の単核球の炎症性浸潤；３、真皮を通して認められる中程度の血管周囲の単核球の炎症性浸潤；４、真皮を通して認められる広範囲の血管周囲の単核球の炎症性浸潤；５、真皮を通して認められる鮮紅色の血管周囲の単核球の炎症性浸潤。中間のスコアは、例えば“２/３”は２および３の間のスコアを表すものとして示す。
【０１３８】
表１０に示したように、２０μｇのＳＨＡＡＹｔｉｄｅ（配列番号４）は、２頭の動物の１頭に中程度の強さの浸潤をもたらした。ｖＭＣＫ−２は細胞の劇的な浸潤をもたらした。２０μｇの投与は、６０μｇおよび８μｇの投与に比較してより多くの浸潤をもたらした。ｖＭＩＰ−１は、検査したすべての用量で軽度の浸潤をもたらした。より低濃度のケモカインを使用した類似の実験とは反対に、ｍＣ１０は今回の実験では、浸潤はわずかのみから全く認められないという結果を示した。ＶＫＢ８−１は、今回の実験では浸潤は認められなかった。
【０１３９】
【表１２】
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【０１４０】
実施例４  浸潤している細胞の同定
実施例３で認められた浸潤している細胞（表１０）のアイデンティティをより確実に定義するため、同じサンプルを異なる細胞のタイプに特異的な複数の抗体を用いて免疫組織化学的に分析した。これらの抗体として以下を含む：ＣＤ６８（マクロファージ、好中球および樹状細胞上に発現される）、ＭＨＣ  ＩＩ（抗原提示細胞、例えばマクロファージおよび樹状細胞）、ＨＡＭ−５６（マクロファージ）、fascin（樹状細胞、内皮細胞および表皮細胞）、エラスターゼ（好中球）、サイトケラチン（表皮細胞）、ＣＤ３（Ｔ細胞）、ＣＤ２０（Ｂ細胞）、およびＣＤ１ａ（ランゲルハンス細胞）。
【０１４１】
ｖＭＣＫ−２を注射した皮膚サンプルは、主として好中球および、マクロファージおよび樹状細胞を含む抗原提示細胞を含んでいた。ｍＣ１０を注射した皮膚サンプルは、主としてマクロファージおよび樹状細胞を含む抗原提示細胞を含んでいたが、好中球はわずかしかなかった。ｖＭＩＰ−１を注射した皮膚サンプルは、わずかに樹状細胞を伴うが主として好中球およびマクロファージを含んでいた。３種のケモカインの各皮膚サンプルにおいて、Ｔ細胞はわずかのみ、Ｂ細胞は全く認められなかった。
【０１４２】
実施例５  アカゲザルにおけるＳＨＡＡＹｔｉｄｅ（配列番号４）のアジュバントの活性
ＳＨＡＡＹｔｉｄｅ（配列番号４）ならびにケモカインｍＣ１０およびｖＭＣＫ−２は、注射部位に樹状細胞を含むＡＰＣを動員したため、これらのペプチドを、同時に注射した外来抗原に対する免疫応答を増強する免疫感作アジュバントとして作用するそれらの能力について検査を行った。１群当たり３頭のサルとする５群のサルに、ニワトリオボアルブミン（ＯＶＡ）を抗原として皮内注射した。第１群のサルにはＯＶＡのみを、第２群には、標準的なアジュバントである不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）と１：１でエマルジョン化したＯＶＡを投与した。第３群にはＯＶＡ、ＩＦＡ、およびｖＭＣＫ−２を、第４群にはＯＶＡ、ＩＦＡ、およびｍＣ１０；そして第５群にはＯＶＡ、ＩＦＡ、および配列番号４を投与した。製剤（２ｍｇ  ＯＶＡおよび１６μｇ  ポリペプチドを含む）は、皮膚内に１００μｌで注射した。末梢血１０ｍｌを各サルから１週間に２回、３週間採血し、その後血液サンプルをフィコールを用いて遠心し、赤血球および顆粒球を除去した。血漿上清をサンドイッチＥＬＩＳＡにより分析し、抗ＯＶＡ抗体のレベルをＯＶＡをコートしたプラスチックディッシュおよびビオチン化した抗サルＩｇＧ検出抗体を用いて決定した。“抗体ユニット”（実施例１参照）にて報告した結果を表１１に示す。報告された数値は、１５頭のサルの血漿中の抗体ユニット/ｍｌで表した、ＯＶＡ特異的ＩｇＧのレベルを示す。各横枠は、免疫後の時間にわたる個々のサルの応答を示す。
【０１４３】
【表１３】
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【０１４４】
表１１に示したように、ＯＶＡおよびＩＦＡを注射したサルは、第１２日に始まる血中の抗ＯＶＡ  ＩｇＧの産生により実証されたように、ＯＶＡに対して顕著な抗体反応を引き起こした。比較すると、ＯＶＡ、ｍＣ１０およびＩＦＡ、またはＯＶＡ、ｓｈａａｇおよびＩＦＡを注射したサルにおけるＯＶＡ特異的ＩｇＧのレベルは、それぞれｍＣ１０または配列番号４を与えていないサルの値に比して、かなり高かった。
【０１４５】
実施例６  マウスにおけるＳＨＡＡＹｔｉｄｅ（配列番号４）のアジュバントの活性
ＢＡＬＢ/ｃマウスに１００μｌ中のＯＶＡ  １０μｇ（表１２）または５００μｇ（表１３）にて処方物を投与したことを除いて、実施例５に述べた実験を繰り返し行った。ＩＦＡは使用しなかった。
【０１４６】
ＢＡＬＢ/ｃマウスには、ＳＨＡＡＹｔｉｄｅ（配列番号４）を含むまたは含まないＯＶＡを、第０日および第２１日に腹腔内（表１２）、または第０日および第１４日に皮下（表１３）のいずれかにて与えた。指示されたタイムポイントで血液サンプルを採取した。ＩｇＧレベルを示す、抗体ユニットで報告した結果を表１２および１３に示す。
【０１４７】
【表１４−１】
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【０１４８】
【表１４−２】
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【０１４９】
【表１５】
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【０１５０】
実施例７  ＳＨＡＡＹｔｉｄｅ（配列番号４）は、アカゲザルにおいて惹起される異なるタイプの免疫応答に対して異なる調節効果を示す
哺乳類において、パラメータ、例えば抗原の用量、処方物、投与経路、およびアジュバントのタイプを変えることにより、異なるタイプの免疫応答を誘導することができる。例えばヒトまたは実験動物におけるワクチン接種の目的に、アジュバントのミョウバンを使用すると、惹起される免疫応答はＩｇＧ１およびＩｇＧＥクラスの抗体に支配され、細胞傷害性Ｔ細胞の産生はわずかしか認められず、好酸球およびマスト細胞の増加が認められる。反対に、より強いアジュバント、例えば完全または不完全フロイントアジュバントを使用すると、細胞傷害性Ｔ細胞およびＩｇＧ２抗体の出現を含む、より広範囲の免疫応答が観察される。ＳＨＡＡＹｔｉｄｅ（配列番号４）が、異なる様式の異なるタイプの免疫応答に奏効するかどうかを決定するため、ＳＨＡＡＹｔｉｄｅ（配列番号４）を含む場合および含まない場合（コンジュゲーションしていない場合、またはＯＶＡと直接コンジュゲーションした場合のいずれか）の、ＩＦＡアジュバントまたはミョウバンアジュバントのいずれかにおいて調剤されたＯＶＡで、アカゲザルに免疫感作を行った。結果を表１４に示し、抗体ユニットとして報告する。
【０１５１】
【表１６−１】
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【０１５２】
【表１６−２】
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【０１５３】
ＳＨＡＡＹｔｉｄｅ（配列番号４）の同時投与は、ＩＦＡを伴うＯＶＡの応答は低減しなかったが、ＯＶＡ＋ミョウバンにより誘導されるＩｇＧ反応を劇的に減少させた。これらのデータは、ＳＨＡＡＹｔｉｄｅ（配列番号４）がミョウバンアジュバントにおいて投与された抗原に対する免疫応答をダウンレギュレートする能力があるが、ＩＦＡアジュバントにおいて投与された同じ抗原に対してはダウンレギュレートしないことを示す。したがって、ＳＨＡＡＹｔｉｄｅ（配列番号４）は免疫調節物質として使用することができる。
【０１５４】
実施例８（計画中）  候補分子の走化性特性を決定する方法
走化性のアッセイを行うため、特異的な細胞のタイプ、例えば樹状細胞（未成熟または成熟）に対する走化性の候補物質または公知の物質の２９μｌを０、１、１０および１００ｎＭで、９６ウェル走化性チャンバー（Neuroprobe; Gaitherburg, MD）の低い方のチャンバーのウェルに注入する。７日目の未成熟な樹状細胞を採集し、走化性バッファー（Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を含むハンクスの平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ；Invitrogen, Carlsbad, CA）中の０．１％ＢＳＡ）で１回洗浄し、走化性バッファー中に５ｘ１０６細胞数/ｍｌで再懸濁させる。細胞２０μｌをフィルターにのせる。チャンバーを３７℃で９０分間インキュベートする。フィルター上部の遊走していない細胞をゴムベラを用いて除去することにより、遊走を終了させる。フィルターを外し、ダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水（ＤＰＢＳ；Hyclone, Darra, Queensland, Australia）ですすぎ、細胞染色、例えばＨｅｍａ３染色キット（Fisher Scientific; Tustin, CA）またはCyQuantアッセイ（Molecular Probes; Eugene, OR）、核酸含有量を測定する蛍光染色法、および顕微鏡観察により、遊走した細胞を定量する。低い方のチャンバーを顕微鏡で調べ、どのような細胞がウェル内に遊走したかを決定する。ウェル内に有意な細胞数が存在している場合は、ウェルならびにフィルター内の定量を行う。遊走の強度は、化学誘引物質を含むウェルおよび走化性バッファーのみのウェル間での吸収の比率として算出する。
【０１５５】
実施例９（計画中）  感染性疾患に対する全身および/または粘膜の免疫応答の増強または調節において、ＡＰＣケモタキシンを評価する方法
複数群のマウスに、皮下、皮内、鼻腔内に、または他のあらゆる方法のいずれかにより、ウイルス、細菌、または研究下の寄生虫の用量を変えて、典型的な免疫感作計画を用いて、例えば第０、７および１４日に、アジュバントを含んでもよい適当な処方物中の微生物と同時投与するＡＰＣケモタキシンを含む場合または含まない場合での注射を行う。血清および/または粘膜分泌物を、ＥＬＩＳＡによる抗原特異的な抗体の分析のため、第−７、０、７、１４、２１、２８および３５日に採集する。マウスは異なる時間間隔で標準的な方法を用いて屠殺する（例えば最後の免疫感作後に屠殺し、免疫部分に存在する、抗原特異的抗体を形成する細胞および抗原特異的Ｔ細胞の反応（細胞傷害性Ｔ細胞およびヘルパーＴ細胞の双方の集団）を定量する）。
【０１５６】
実施例１０（計画中）  癌免疫療法計画における抗腫瘍免疫の増強または調節において、ＡＰＣケモタキシンを評価する方法
多くの腫瘍細胞が独自の腫瘍関連抗原を発現するが、これらの抗原はおしなべて抗原性の弱い免疫原であり、腫瘍の進行中に強力な抗腫瘍免疫を引き起こすことはできない。防御的な抗腫瘍免疫を増強させるための、ＡＰＣケモタキシン、例えばＳＨＡＡＹｔｉｄｅ（配列番号４）の能力は、マウスにおける癌免疫療法のモデルシステムを用いて評価することができる（ＲＥＦ？）。このモデルにおいてマウスには、実験的なタンパク質抗原ＯＶＡ（ATTC; no.CRL-2113（ニワトリＯＶＡ  ＥＬ４トランスフェクタント））を予めトランスフェクトしておいた（ＳＥＱ）同系の胸腺腫（ＥＬ４細胞；American Type Tissue Collection (ATTC); Manassas, VA; no. TIB-39）を移植する。さらに介入しなくても腫瘍は増殖し、結果的にマウスを死亡させてしまう。ＯＶＡをトランスフェクトした胸腺腫細胞を攻撃する抗原特異的免疫応答を誘導するため、アジュバント中に製剤化したＯＶＡにて動物にワクチン接種を行うことにより、少なくとも部分的には動物を防御することができる（ＲＥＦ？）。このモデルは、防御的抗腫瘍免疫の増強または調節における、アジュバントの相対的効能を評価するために有効である。このモデルのポジティブコントロールとして以下のアジュバント：ＣＦＡ、ＩＦＡ、ミョウバン、およびＧＭ−ＣＳＦを含む。癌の免疫療法計画を増強するＡＰＣケモタキシンの能力は、これらの公知のアジュバントと比較することにより評価することができる。
【０１５７】
実施例１１（計画中）  アレルゲンに誘発される病理を軽減するための、アレルゲン特異的免疫応答を調節するＡＰＣケモタキシンの能力を評価する方法
喘息の動物モデルは、標準的な免疫感作により実験的な抗原（例えばＯＶＡ）にげっ歯動物を感作させ、その後同じ抗原をげっ歯動物の肺にエアゾール投与して導入することにより、誘導することができる。各群１０頭のげっ歯動物を含む、３つのシリーズのげっ歯動物群に、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の１００μｇ  ＯＶＡを、ＩｇＥ選択的アジュバント、例えば水酸化アルミニウム（“ミョウバン”アジュバント）と共に、１回腹腔内注射することにより、第０日に実際に感作を行う。ＩｇＥ反応のピーク時の感作後第１１日、動物をPlexiglasチャンバーに入れ、超音波ネブライザー（De Vibliss Co.; Somerset, Pennsylvania）を用いて３０分間、エアゾール化したＯＶＡ（１％）で攻撃する。第１のシリーズのマウスには初回感作時、およびその後の異なる投与計画時に、エアゾール化したＯＶＡの攻撃まで、腹腔内にリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）およびＴｗｅｅｎ０．５％を付加的に与える。第２のシリーズは、初回感作時、およびその後の異なる投与計画時に、エアゾール化ＯＶＡの攻撃まで、腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内、経口、またはあらゆるその他の投与法のいずれかにてＡＰＣケモタキシンの異なる用量を与えるマウスの複数の群からなる。第３のシリーズのマウスはポジティブコントロールとし、初回感作時、およびその後にお異なる投与計画時に、エアゾール化ＯＶＡの攻撃まで、腹腔内にマウスＩＬ−１０、腹腔内に抗ＩＬ−４抗体、または腹腔内に抗ＩＬ−５抗体のいずれかにて治療を行う複数の群からなる。
【０１５８】
動物はその後、エアゾール化ＯＶＡの攻撃後の異なるタイムポイントで、肺の機能、気管支肺胞の洗浄（ＢＡＬ）における細胞の浸潤、肺の組織学的検査、および血清ＯＶＡ特異的ＩｇＥ力価の測定について分析を行う。
【０１５９】
【表１７−１】
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【０１６０】
【表１７−２】
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【０１６１】
【表１７−３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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