(57)【要約】識別されて発現するタンパク質の分析をパラレルで可能とするタンパク質アレイを開示する。このようなアレイを製造する方法、及び薬物及び治療上の分子を含め化学物質の影響をスクリーニング及び/又は評価するためのそれらの使用を記載する。アレイは、タンパク質と識別されて発現するタンパク質との間の相互作用を調節する化合物、ペプチド、又はタンパク質をスクリーニングするのに使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つのタンパク質分子で空間的に確定した位置で堆積する表面からなるタンパク質アレイであって、前記タンパク質分子が、識別されれて発現する一組のタンパク質の少なくとも一部を示すことを特徴とするタンパク質アレイ。
【請求項２】
識別されて発現する一組のタンパク質が、
（a）異なる細胞成分、例えば、核、又は細胞質において発現したタンパク質、
（ｂ）最終的に全体として細胞の外へ転位したタンパク質、即ち、分泌タンパク質、
（ｃ）発現レベルが、薬剤治療などの外部治療に応答して変えられたタンパク質、
（ｄ）発現レベルが、健康と病気の状態との間で変えられたタンパク質、
から誘導される請求項1記載のタンパク質アレイ。
【請求項３】
識別されて発現する一組のタンパク質は、健康と病気の状態との間で変えられるタンパク質から誘導される請求項２に記載のタンパク質アレイ。
【請求項４】
病気の状態が、癌、嚢胞性線維症、心臓病、神経性廃疾、前又は事後処理組織、腎臓病、多発性硬化症、及び変性疾患である請求項3記載のタンパク質アレイ。
【請求項５】
a)一組の識別されて発現したタンパク質から２又はそれ以上のタンパク質をコード化するDNAコード化配列を提供し、
ｂ）個々のタンパク質を提供するのに前記コード化配列を発現させて、
ｃ）前記タンパク質を精製し、かつ、
ｄ）アレイを得るために、前記タンパク質を空間的に定義された位置で表面上に堆積する工程からなるタンパク質アレイを製造する方法。
【請求項６】
工程ｃ）及びｄ）を、組み込まれた標識を経てアレイ上にタンパク質の同時精製及び単離によって、単一の工程に組み合わせる請求項５記載の方法。
【請求項７】
工程a）は、目的のコード化配列を同定するために、サブトラクション・ハイブリダイゼーションを使用することを含む請求項５又は６項に記載の方法。
【請求項８】
薬／化学物質／治療因子の効果をスクリーニング／評価する方法であって、前記薬／化学物質／治療因子を請求項１〜４項のいずれか1項に記載のアレイと接触させる工程からなる方法。
【請求項９】
アレイ上でタンパク質と選択的に相互作用するための能力用にペプチド又はタンパク質をスクリーニングする方法であって、
（i）識別されて発現したタンパク質のアレイを提供し、
（ii）前記アレイを、化合物、又はペプチド又はタンパク質と接触させて、
（iii）相互作用する相手を同定する工程からなる方法。
【請求項１０】
方法が、相互作用する相手の相互作用を定量する更なる工程iv)を含む請求項８又は9項に記載の方法。
【請求項１１】
タンパク質と識別されて発現したタンパク質との間の相互作用を選択的に調節する能力のために、化合物又はペプチド又はタンパク質をスクリーニングする方法であって、前記方法が、
（i）識別されて発現したタンパク質のアレイを提供し、
（ii）前記アレイを、化合物、又はペプチド又はタンパク質、及び興味のその他のタンパク質と、同時に、又は順に接触させて、
（iii）前記相互作用が、前記化合物、又はペプチド又はタンパク質の存在によって調節されるかどうかを決定する工程からなることを特徴とする方法。
【請求項１２】
前記方法が、相互作用の調節程度を定量化する追加の工程（iv）からなる請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
1以上の他のタンパク質、すなわち、2つ又はそれ以上のタンパク質からなるタンパク質ラフトの同時結合を補足及び測定するために、請求項１〜４のいずれか１つに記載された識別されて発現するタンパク質のアレイを使用する使用方法。
【請求項１４】
フェノタイプ−ゲノタイプ−結合抗体(ファージディスプレイ抗体)のライブラリーから抗体を選択する親和性表面として、請求項１〜4項のいずれか1項に記載の識別されて発現したタンパク質のアレイを使用する使用方法。
【請求項１５】
他の因子と前記タンパク質の相互作用におけるか、及び／又は前記識別されて発現したタンパク質の特性における翻訳後修飾の効果を決定するために、請求項１〜4項のいずれか1項に記載の識別されて発現したタンパク質のアレイの使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、同時に、識別されて発現したタンパク質の分析を可能とするタンパク質アレイに関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの高い処理能力方法が、与えられた細胞又は組織型内で、又は健康、疾患、薬剤処理細胞又は組織との間においてタンパク質の異なる発現パターンの目録を作るのに、最近使用されている。DNAマイクロアレイ[１]などの高い処理能力機能的ゲノム装置が、例えば、特異的疾患状態[1]と関連するトランスクリプトーム上の大量のデータの商事させるのに通常使用され、DNAアレイ技術に基づい迅速な診断方法がなお開発されている[２]。タンパク質レベルで、２−Dゲル電気泳動[３]は、異なる病理学上の状態又は細胞分画に存在又は不存在のタンパク質を同定又はリスト化するのに現在広く使用されている。興味の識別されて発現したタンパク質の群の例は、
異なる細胞成分、例えば、核、又は細胞質において発現したタンパク質；
最終的に全体として細胞の外へ転位したタンパク質、即ち、分泌タンパク質；
発現レベルが、薬剤治療などの外部治療に応答して変えられたタンパク質；
発現レベルが、健康と病気の状態との間で変えられたタンパク質、を含む。
【０００３】
しかしながら、どの時点においても、組織又は細胞成分からなるタンパク質のリストは、疾患又は特異的細胞フェノタイプ／機能においてタンパク質プレーヤーとの集合を可能とする一方、それは、疾患又は機能と比較した相互作用、活性及び経路上の如何なる機能的データの単離も提供していない。
【０００４】
異なるタンパク質発現の正確なフェノタイプ因果関係を説明するのに有益な少量の当該機能的データがあり、それは、結局のところこの情報を明らかにする、プロテオミクスとして知られた組織の細胞のタンパク質コンプリメントの研究である。その後必要とされるものは、相対的なタンパク質発現レベルばかりでなく、識別されて発現したタンパク質の機能的効果又は因果関係であるが、タンパク質は、相次いで連続した方法で機能に対して典型的に分析されるので、現在、高い処理能力で後者を提供する方法が存在しない。
【０００５】
現在、識別されて発現したタンパク質は、2次元ゲル電気泳動によって同定することができる。この技術は、タンパク質の存在及び不存在、及び相対的タンパク質発現レベルについての情報を提供するが、それぞれ識別されて発現した分子の役割に関する機能的情報を提供しない。さらに、この技術は、低コピー数で発現されたタンパク質の検出ができず[４]、多くのタンパク質は、現在の染色技術によってゲルにおいて識別されて発現した分子を可視化する際の制限のために検出することができない。質量分光分析によってさえ、タンパク質の少量の同定は、タンパク質が検出できないなら不可能であり、したがって、識別された発現したものとして同定されない。
【０００６】
識別されて発現したタンパク質が一旦同定されれば、タンパク質―タンパク質相互作用は、酵母２ハイブリッド法を使用して一つずつ研究することができる[Y2H;  ref 5]。Y２Hは、識別されて発現する経路の総合的な画像を作るのにいくつかの欠点を有する。現在、Y2Hは、同時に一つの「バイト(おとり)」タンパク質に対して相互作用するものを同定するのに使用することができる。これは、相対的に少ない数のタンパク質への入力を制限し、それゆえ、プロテオーム規模の実験を不可能とする。さらなる個別の相互作用に影響を与える可能性があるそれら間で形成可能なタンパク質複合体を同定するために、同様の実験においていくつかのタンパク質バイトをスクリーニングすることも不可能とするので、T2Hは、多重化も不可能である。加えて、「バイト」への結合をスクリーニングするいずれの非酵母タンパク質は、発現や次の相互作用が酵母において生じるようなそれらの自然の状態で分析することは不可能である。結局、Y2Hは、タンパク質―タンパク質相互作用をブロック又は拮抗する全体の研究に従わない。このタイプの研究は、薬剤発見の識別されて発現するタンパク質経路の重要性を分析するために本質的判定基準である。タンパク質―タンパク質相互作用を破壊する小さい分子は、この場合において独立した方法によってアッセイしなければならない。
【０００７】
プルダウンアッセイ／免疫沈降法は、タンパク質―タンパク質相互作用を研究するのに使用することができる。テストタンパク質は、生体外又は生体内で親和性標識化されて、その後、結合同定用にそれらのタグによって沈殿前に溶液内又は細胞内で他のタンパク質と相互作用を可能とする[６]。この方法は、一度にY2Hへ追加の情報を提供する多くの相互作用タンパク質パートナー(複合体)の同定を可能にするが、それは、システムの処理能力を制限する細胞系アッセイも要求する。実験が、全細胞の内容内で行われ、テスト分子の局所的トラフィッキングの分解及び／又は失敗は、相互作用するタンパク質との接触を防止するので、結局、プルダウンアッセイ又は免疫沈降は、観察された相互作用でのペプチド又は抗体の影響について制御された試験が不可能である。
【０００８】
多くの最近の文献[例えば、参照文献7]は、機能的タンパク質のアレイは、個々のアレイ部が同じ条件下で同時にスクリーニングされることを可能とすることを示している。これは、他の技術と比較して非常にパラレルかつ迅速な実験を可能とし、多くのタンパク質に渡る直接的な同様の結果を導く。これらの品質は、他の方法において絶対的な細胞区画化を、これらのタンパク質コレクションを個々のタンパク質及びそれゆえ個々のアッセイの中へ効率的に分割する、タンパク質の機能用の他のアッセイ、例えば、Y2H及び免疫沈降/プルダウンなどから離れたタンパク質アレイを設定する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明のアレイのインテロゲイションから得られた結果は、定量的であり(例えば、結合又は触媒コンスタントKD＆KMを測定すること)、準定量的であり(例えば、タンパク質量に対して結合する量を標準化すること)、定性的である(例えば、機能vs 非機能)。リガンドを幾らかの濃度で加えられた場所で複製アレイ用のシグナルを定量化することによって、スポットにおけるタンパク質の結合親和性及び活性濃度の両方を決定することができる。正確に、同様の手法は、検定されたタンパク質への薬の結合を測定するのに使用することができる。
【００１０】
例えば、リガンド及びタンパク質との間の相互作用の親和性、及びそれぞれ、そのリガンドの結合部位の数を記載する定量的な結果、KD及びBmaxは、タンパク質アレイデータから誘導することができる。手短に言えば、定量化されるか、又はそれぞれ個々のタンパク質スポットへのリガンド結合の相対的な量は、検定溶液においてリガンドの異なる濃度で測定することができる。タンパク質の量と結合リガンドとの間の線形関係を仮定すると、検定において使用されるリガンド濃度の範囲に渡る各スポットに結合するリガンドの(相対的な)量は、式１、再配列又は誘導に適合させることができる。
【００１１】
結合リガンド＝Bmax/((KD/[L]+1)               式１
[L]＝検定に使用されたリガンドの濃度
【００１２】
相互作用において化合物による阻害の見通し（IC50 ）は、複製タンパク質アレイアッセイで測定することもできる。
【００１３】
識別されて発現したタンパク質は、特別な臨床的及び薬剤的関連性を有することが可能な、与えられた細胞、組織又は器官でのタンパク質のすべてのコレクションの特異的サブセットを表す。当該一組のタンパク質に渡るいずれかの重要な配列、構造又は機能の類似性はないようであり、その結果、このタンパク質群からなるタンパク質アレイは、薬剤標的同定、検証プロセス、薬剤選択スクリーニング、及び識別されて発現したタンパク質―タンパク質相互作用マップの図表における潜在的用途を有する非常に多目的なツールを示すであろう。しかしながら、
それらが、もしそれらの天然の機能のすべての側面、例えば、アレイが以前に記載されておらず、多くの本質的理由（、すなわち、
i) 機能的形成におけるタンパク質のアレイは、それが、発現され、精製された機能的タンパク質の適当なコレクションを最初に発生させる能力に全体として依存するので、機能的形成におけるタンパク質のアレイは、大量の数に対してほとんど拡大することができない;
ii) 伝統的に、これは、識別されて発現するタンパク質の同定の従来技術を要求し、これは、それ自体、完全に知られていない； 
iii) サブトラクション・ハイブリダイゼーションなどの方法は、識別制御された転写での発現試験と組み合わせられない；
iv) ２−Dゲル電気泳動方法を使用して単離されたタンパク質は、分離工程中に典型的に変性される。機能を保存するためのそのようなタンパク質の再度の折りたたみは、典型的に、各タンパク質が、もし再度の折りたたみを可能でないなら、かなり特異的な折りたたみ条件を要求するので、かなりの処理能力のフォーマットにおいても成功しないようである；
ｖ）識別されて発現したタンパク質の高い処理能力カラム系精製は、記載されていない；
vi) いずれにしても、（iii）、(iv)、又は(v)によって得られたタンパク質は、それらが、機能を損なうことなしに、単一の表面に免疫されることが可能な、例えば、親和性タグなどの共通の処理を欠くであろう；）、に対して従来技術から自明でないなどがないなら、多くを維持するように、実行すべき当該用途に対して、アレイ上の識別されて発現したタンパク質は、正確に折りたたまれることが必要である。
【００１４】
生体外で、アレイフォーマットにおいて、タンパク質相互作用をスクリーニングすることは、証明されている。その最も簡単なマイクロアレイは、溶液からタンパク質を捕捉するために免疫グロブリン分子から生成される[8−10]。これらの抗原アレイは、ELISAアッセイの小型化を提供し、例えば、細胞溶解物、血清サンプル、又はリコンビナントタンパク質混合物などの高い処理能力分析を可能とする。タンパク質アレイタイプの第二の例は、血清サンプルにおけるオート抗体を同定するのに使用される抗原アレイである[１１]。これらの場合において、抗原は、変性表面上で配置され、抗体結合に有益なすべての直線状のエピトープを作るが、配置した分子の自然の形態を破壊しない。タンパク質が配置され正確な折りたたみと機能を維持するタンパク質アレイの2つの例が最近記載された。最初の例において、チップ上のプロテオームが、相対的に小さい酵母ゲノムに対して作られ[１２]、研究者がそれらの天然のコンフォメーションにおいてタンパク質へ結合することに基づく活性の同定を可能とする。第2の例において、タンパク質キナーゼも作られる[８]。加えて、N末端又はC末端で特異的に標識化され、ランダムに選択された機能的タンパク質のアレイが作られ、DNAなどの相互作用する相手を同定するのに調査され、小さい分子が記載されている[13]。おりたたまれ、識別されて発現したタンパク質のアレイについては記載がない。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
それゆえ、なお、識別されて発現したタンパク質の機能的研究に対する高い処理能力のツールがなく、同時にこれらの機能での薬物分子の効果をアッセイするツールもない。識別されて発現するタンパク質の数が、1000個でないにしても100個に達するので、実施するのに抗体、ゲル又はビーズを要求しない機能分析の高度な平行方法が必要である。本発明は、タンパク質アレイに基づき特異的薬物標的同定及び検証及び薬物選択性用の用途を有するであろう。加えて、用途は、相互作用する種、例えば、他のタンパク質をスクリーニングして、識別されて発現するタンパク質経路を同定することを含むであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、特異的疾患状態又は細胞区画のプロテオミックフットプリントを共に表すタンパク質のコレクションである。前記コレクションにおいて個々のタンパク質は、親和性標識化され、精製され、折りたたまれたコンフォメーションとなる。加えて、個々のタンパク質の折りたたまれた状態が、不安定にならないように、個々のタンパク質は、空間的に分離されて、アレイフォーマットにおいて表面へ特異的に固定化される。
【００１７】
それゆえ、第一の側面において、本発明は、少なくとも２つのタンパク質分子で空間的に確定した位置で堆積する表面からなるタンパク質アレイであって、前記タンパク質分子が、識別されれて発現する一組のタンパク質の少なくとも一部を示すことを特徴とするタンパク質アレイを提供する。
【００１８】
既にこの明細書で示したように、識別されて発現するタンパク質のこのような群の例は、
異なる細胞成分、例えば、核、又は細胞質において発現したタンパク質、
最終的に全体として細胞の外へ転位したタンパク質、即ち、分泌タンパク質、
発現レベルが、薬剤治療などの外部治療に応答して変えられたタンパク質、
発現レベルが、健康と病気の状態との間で変えられたタンパク質、を含む。
【００１９】
ここで明らかにされたタンパク質アレイは、表面のパターンにおいてタンパク質分子の空間的に決定された配列である。好ましくはタンパク質分子は、直接的に又は間接的に表面へ接着される。この接着は、非特異的とすることができる(例えば、表面上の物理吸着、又は非特異的相互作用の形成によって)。好ましい実施態様において、タンパク質分子は、それぞれのタンパク質分子へ付加された共通のマーカー分子を通して表面へ取り付けられる。好ましい実施態様において、タンパク質分子は、表面へ拘束された担体又はリポソームの中へ組み込むことができる。
【００２０】
本発明のアレイへ取り付けれたタンパク質の数は、少なくともある程度は、自然に生じるか、又は十分な実験、商業的か又は臨床的関心のタンパク質の数によって決定されるであろう。１又は２つのタンパク質を運搬するアレイは、調査するものの使用となるであろう。しかしながら、実際には、高度な処理能力アッセイ用の当該アレイの適合性を利用するために、１〜10000、１〜1000、１〜500、１〜400、１〜300、１〜200、１〜100、１〜75、１〜50、１〜25、１〜10、１〜５の当該タンパク質がアレイ上に存在すると予想される。
【００２１】
ここで定義された表面は、化学的処理によって皮膜され／誘導されることが可能か又は不可能なフラット又は型に併せた領域である。例えば、この領域は、ガラススライド、当該技術において知られた、例えば、磁気化、誘導化及び／または標識化ビーズなどの、1又はそれ以上のビーズ、ポリプロピレン又はポリスチレンスライド、ポリプロピレン又はポリスチレンマルチウエルプレート、金、シリカ又は金属対象物、ニトロセルロース、PVDF、ナイロン、又はホスホセルロースからなる膜とすることができる。
【００２２】
ビーズを使用するとき、個々のタンパク質、一組のタンパク質、又は変異体タンパク質のプール(例えば、興味のタンパク質が存在するかもしれないタンパク質の群を最初に同定するためのショットガンスクリーニング用；当該群は、その後、分離され、調査される。(コンビナトリアル・ケミストリーの技術において既知のプーリング方法に対するアナログ))を、個々のビーズに取り付けてアレイの空間的定義又は分離を提供することができる。ビーズを、その後、パラレルではないが、区分した方法、例えば、マイクロ炊いたープレートのウエル上又は別の試験チューブにおいて別々にアッセイすることができる。
【００２３】
それゆえ、本発明による表面からなるタンパク質アレイは、異なるタンパク質を運搬するビーズなど、一連の別々の固相表面として存在することができ、アレイは、実験において空間的に定義されたパターン又は別の表面の配列によって形成される。
【００２４】
好ましくは、表面皮膜は、非特異的タンパク質吸収に抵抗することが可能である。表面皮膜は、天然においてポーラス又は非ポーラスとすることができる。加えて、好ましい実施態様において、表面皮膜は、直接的又は間接的のいずれかで各タンパク質分子上でマーカー分子との特異的相互作用を提供する(例えば、表面へ結合するタンパク質又はペプチド又は核酸を通じて)。当該技術で既知のマイクロアレイまたはマイクロウエルフォーマットにおける表面、および多数の表面を使用することができる。
【００２５】
一般に、タンパク質アレイの個々の部材は、それぞれが、それらを固定化することができる同一の親和性タグを含み、それによって、表面との非特異的接触を通じて整列されたタンパク質の機能を不安定化させるリスクを最小化する。
【００２６】
その後、アレイフォーマットは、識別されて発現するタンパク質のコレクションが、例えば、タンパク質との相互作用を同定するために、かなり同時に広範な範囲の機能的アッセイを行われることを可能とする。特に、アレイは、同時に数百又は数千のタンパク質に渡るこれらの相互作用をブロック又は拮抗することができる個々の存在をスクリーニングするためのツールを提供する。
【００２７】
識別されるディスプレイアレイを尽くす可溶な、精製され、かつ固定化されたタンパク質のコレクションは、いくつかの方法において生じさせることができる。サブトラクション・ハイブリダイゼーションなどの転写分析、又はｃDNAマイクロアレイ分析、又は二次元電気泳動などのプロテオミック分析後、識別されて発現したｃDNA又はタンパク質は、その後、それらの配列によって潜在的に同定することができる。その後、従来のクローニングを検定用のタンパク質としてそれらの遺伝子を発現させるのに使用することができる。あるいは、参照例１３において述べたような方法は、配列独立クローニングおよびサブトラクションｃDNAライブラリーの発現用に使用することができる。後者の方法は、識別されて発現した遺伝子又はタンパク質の同定の従来知識に頼らない。それゆえ、識別されて発現したｃDNAは、当該技術であるサブトラクション・ハイブリダイゼーションなどの多数の方法によって容易に単離することができるので、それは、意図組の標識化され、精製され、折りたたまれた識別されて発現するタンパク質(およびいずれかの当該セットからなるアレイ)を、例えば、いずれかの与えられた疾患、又は薬物治療細胞又は組織から、発生させるのに明確に使用することができる。加えて、分泌したタンパク質のコレクションをコード化するｃDNAは、当該技術で既知のシグナルトラップシステムを使用して単離することができる。
【００２８】
サブトラクション・ハイブリダイゼーションは、一組の識別されて発現するｃDNAを単離する1つの好ましい方法を示し、特に、上部及び下部制御されたタンパク質の両方の同定を容易に可能とする。
【００２９】
ここで述べた方法は、リコンビナントタンパク質発現宿主を使用するのを制限しない。当該技術において、バクテリア、酵母、ショウジョウバエ（Drosophia） spp.又は哺乳類細胞を含む異なる発現宿主の範囲は、親和性標識に対してフレームに融合した識別されて発現するｃDNAを含むベクター(プラスミド又はウイルス)で変換することができる。タンパク質は、それらの正確な折りたたみを維持するために、固体表面上でそのような方法において堆積されるべきであるが、同様に、タンパク質アレイの構成は、使用される親和性標識のタイプ又は数によって束縛されない。
【００３０】
精製され、分離したタンパク質スポットのアレイを作るために、細胞溶解物は、表面へ直接的に堆積することができ、一つの工程で親和性標識を経て精製及び固定化を行い、アレイを作ることができる。あるいは、タンパク質を第一の親和性標識を経て精製することができ、その後、第二の標識を通じて固定化用に検定することができる。
【００３１】
本発明のタンパク質アレイは、粗い細胞溶解物、他の(個々の)タンパク質、核酸又は小さい分子／薬物などの潜在的に相互作用する相手を調査することができ、以前に知られた相互作用を同定することができる。ディファレンシャルディスプレイタンパク質アレイ法は、相互作用の検出及び特徴を蛍光、比色分析、及びケミルミネセンス技術(マイクロアレイフォーマット)によって可能とする。加えて、アレイは、アレイ上の識別されて発現するタンパク質と相互作用する各タンパク質が、質量分析(マイクロウエルプレートフォーマット)、及び表面プラスモン共鳴方法（流体光学チャンバーフォーマット）によって同定することを可能とする個々に非常に精製されたタンパク質を、アレイは含む。本方法は、フォーマット依存性ではなく、アッセイにおいて抗体、ビーズ、ゲル、又はリコンビナント宿主組織を要求せず、現状の方法から分離される。
【００３２】
それゆえ、第二の側面において、本発明は、以下の工程：すなわち、
一組の識別されて発現したタンパク質から２又はそれ以上のタンパク質をコード化するDNAコード化配列を提供し、
個々のタンパク質を提供するのに前記コード化配列を発現させて、
前記タンパク質を精製し、かつ、
アレイを得るために、前記タンパク質を空間的に定義された位置で表面上に堆積する工程からなる。
【００３３】
それゆえ、それらが機能 (折りたたみ及び可溶性) を維持するように、タンパク質の機能分析のために、二次元ゲル電気泳動、サブトラクション・ハイブリダイゼーション、又はDNAマイクロアレイ実験からの情報を利用して、分離した細胞成分において発現するか、細胞タンパク質のを分泌する通常の組織の細胞又は遺伝子において転写されない病気の組織又は細胞において転写された遺伝子を同定すること、及び、タンパク質アレイフォーマットを使用して、これらの方法を通じて同定されたコード化タンパク質をディスプレイすることは、「識別されて発現する遺伝子のプロテオミックフットプリン」でのかなりのパラレル実験を行うことを可能とする。
【００３４】
これは、また、「オンーアレイ」プルダウン及びそれぞれのアレイ部材に対する相手と結合する多数のタンパク質の同定を可能とする。単一又は複雑な混合物の一又は多くのタンパク質の結合は、含まれる多数のタンパク質が、例えば、マルチタンパク質複合体などが、単一のアレイを経て識別されて発現したタンパク質と結合し、同定されることを可能とする。当該相互作用を破壊するか又は拮抗する新規化学的構成要素の影響を、同様の実験条件下で数百又は数千のタンパク質上で同時スクリーニングすることも可能である。
それゆえ、第三の側面において、本発明は、薬／化学物質／治療因子の効果をスクリーニング／評価する方法であって、前記薬／化学物質／治療因子を本発明のアレイと接触させる工程からなる方法を提供する。
【００３５】
実施例１
シングルペプチド配列を含む識別されて発現したｃDNAは、パラレル分析と両立するフォーマットにおいて発現し、整列する。ここで述べた方法は、プラスミドにおいて構築されたレポーター遺伝子へフレームで融合するゲノムDNAの小断片を含むプラスミドライブラリーと、酵母又は哺乳類発現宿主の形成を含む。レポータータンパク質が発現され、細胞の外へ転座したとき、それは、検出することができ、同定されたシグナルペプチドと関連する遺伝子をタンパク質アレイ用に同定し、クローン化し、発現させることができる。
【００３６】
シグナルペプチドトラップ
ｃDNAのサンプル(ライブラリー又は直接的合成源由来の)は、超音波分解によって断片化し、適当な酵素修飾を使用して平滑末端化し、全体を発現ベクター中にクローン化した。このプラスミドは、レポータタンパク質、例えば、転化酵素、又はプラスミノーゲン等を含む。リポーター遺伝子は、もし、フレームにおいてクローン化したｃDNAの断片と融合するならタンパク質として発現する。シグナルペプチド配列が、クローン化した断片内で含まれるなら、その後タンパク質は、適当なアッセイを使用して転写された発現宿主細胞の外部へ分泌されたとき検出することができる[１５]。
【００３７】
分泌されたタンパク質用の全長ｃDNAの捕獲
シグナルペプチドを含むcDNA断片は、相当する全長ｃDNAをｃDNAライブラリーから製造者の指示に従うClonCapture cDNA Selection kit(Clontech)を使用して捕獲するのに使用される。その後、捕獲されたプラスミドライブラリーは、XL-1ブルー大腸菌の転換を通じて増幅され、その後、プラスミドが抽出される(Qiagen Maxi Plasmid Purification kit)。
【００３８】
可溶性、リコンビナント分泌タンパク質の発現
全長ｃDNAクローンは、上述のように捕獲される。参照例１３において述べた手順をその後、分泌されたタンパク質セットをコード化するプールされたプラスミドライブラリー上で実行し、最終ライゲション混合物をXL-1ブルー大腸菌の転換によって回復する。分泌されたタンパク質は、新しいライブラリーにおいてC末端グリーン蛍光タンパク質―ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質[GFP-BCCP,参照例16及び17]標識DNA配列への融合としてコード化される。制限消化[１４]を、その後行い、新規に挿入された挿入物を標識をコード化するDNAと共に、ライブラリーベクタから除去し、これらをその後、酵母細胞下部において使用するため適当な発現ベクターの中へライゲートする(方向性をもって)。ひとたび形質転換すれば、これらリコンビナント宿主細胞は、適当な条件の下で誘導され、タンパク質標識タンパク質を発現するこれらのクローンが同定される。分泌され、標識されたタンパク質は、その後、精製され、細胞培養から一工程でアレイ中へ固定化される。(下記参照)
【００３９】
実施例２
人の胸腫瘍組織ｃDNAの一組のサブトラクトからのタンパク質は、パラレル機能分析用に適当なフォーマットで配置される。ここで記載した方法は、参照文献１３に記載された方法を使用して親和性標識へフレームにおいて融合する識別されて発現するｃDNAを含むプラスミドライブラリーと細菌発現宿主との形質転換を伴う。タンパク質は、発現したとき、折りたたまれ、活性を維持する。細胞溶解物は、固体表面上へ堆積し、一つの工程で親和性標識を経て精製及び固定化を行い、識別されて発現したタンパク質のアレイを作る。
【００４０】
胸腫瘍及び通常の腫瘍組織ｃDNAのサブトラクションハイブリダイゼーション
女性胸腫瘍組織(侵攻的管状悪性腫瘍)から全RNA(1μｇ)及び適合した通常の胸組織（AMS  Biotech）を使用し、第一のストランドｃDNAを、製造者の指示にしたがって、SMART  ｃDNA  Synthesis  Kit(Clontech)を使用して合成した。その後、PCR Select Subtractive Hybridization kit(Clontech)を使用して、「テスター」として胸腫瘍ｃDAN及び「ドライバー」として通常組織のｃDNA、及びその逆（コントロール試験として）を用いて、製造者の指示に従って、一組のｃDNAサブトラクトを発生されるためにサブトラクション・ハイブリダイゼーションを行った。
【００４１】
サブトラクションのテスト効率
腫瘍関連ｃDNA断片の一組のサブトラクトを、全体をTOPO  TAクローニングベクター（Invitorogen）中にクローン化した。XL1ブルー大腸菌（Stratagene）をライゲーション混合物と形質転換し、100個のｃDNAクローンを選別し、プラスミドを抽出し(Qiagen Mini Plasmid Purification ki)、cDNA挿入物を、M13リバースユニバーサルプライマー(LARK Technolosies, U.K.)を使用して配列化した。ハウスキーピング遺伝子、ブルコース３ホフフェートデヒドロゲナーゼのPCR増幅を、一組のサブトラクトｃDNAから、G3PDH特異的プライマーを使用して、標準条件下、すなわち、95℃で1分、その後95℃で30秒、58℃で30秒、68℃で1分30秒のサイクルの数を変えて行うことができる。アンプリコンを１．２％アガロースゲル電気泳動によって分析する(図1)。サザンブロッティング(細菌コロニーブロッティングの標準的技術を使用した)は、通常の胸組織及び胸腫瘍組織ｃDNAプール(標的；図２)においてサブトラクトされた一組のｃDNA(プローブとして設計された)の不在を評価するのに使用される。
【００４２】
全長胸腫瘍関連ｃDNAクローンの捕獲
ｃDNA断片の一組のサブトラクトを、相当する全長ｃDNAを人心臓ｃDNAライブラリー(Clontech)及び人胸腫瘍ｃDNAプラスミドライブラリー(未公開)から、ClonCapture cDNA Selection kit(Clontech)を使用して捕獲するのに使用する。捕獲したプラスミドライブラリーは、その後、XL−１ブルー大腸菌の形質転換を通じて増幅され、その後、プラスミドを抽出する(Qiagen Maxi Plasmid Purification kit)。
【００４３】
標識化され折りたたまれた胸腫瘍関連タンパク質のクローニングと発現
実験１
サブトラクトした胸腫瘍ｃDNAプラスミドライブラリーは、XL−１ブルー大腸菌を形質転換するのに使用する。384個の細菌コロニーをランダムに選択し、ｃDNA挿入物を制限酵素長多型（１４、データ示さず）によって分析することができる。この例において、RFLPパターンに基づいて、96個の異なるｃDNAクローンを選択氏、参照例１３に記載した手順を行った(個別に)。各生じた修飾ｃDNAは、ｐI FM101−A、−B及びーCに設計された３つのプラスミドベクターの等モルプールを適当に調製してライゲーションによってクローン化し、これらのベクターは、それぞれ、C末端グリーン蛍光タンパク質―ビオチンカルボキシル運搬タンパク質[GFP-BCCP：参照例16及び17]標識DNA配列を、それらの共通３‘クローニング部位に相対的な特異的リーディングフレームにおいて含む(すなわち、共通３’クローニング部位に相対的なGFP-BCCP標識のすべての３つの可能なリーディングフレームがこれらの３つのベクターのプールにおいて表示される。)。各ライゲーションからDNAをその後、使用し、大腸菌XL-1ブルーへ形質転換する。固体培地上で一昼夜成長させた後、タンパク質発現を30℃でおよそ4時間IPTGを加えることによって誘導することができる。グリーン蛍光コロニー(可溶性、GFP−BCCP-標識癒合の発現を示す)を選別し、プラスミドをｃDNA挿入物のPCR増幅に供する(プラスミド特異的プライマーを使用して)。ユニバーサルM13ラバースプライマーを使用するDNA配列化は、クローン化されたｃDNAを同定するのに使用される。
【００４４】
実験２
完全にサブトラクトした胸腫瘍ｃDNAプラスミドライブラリーをXL−１ブルー大腸菌を形質転換するのに使用する。この例において、３×10５細菌コロニーを寒天プレートから擦り取り、混合して、プラスミドを抽出した(Qiagen Maxi Plasmid Purification Kit)。参照例１３に記載した手順が、プールされたプラスミドライブラリーで実行され、最終らいゲーション混合物をXL-1ブルー大腸菌を形質転換するのに使用した。２４４個のグリーン蛍光コロニーを選別した（全部で9760個のグリーン蛍光コロニーから）。サザンブロッティングは、244個の細菌コロニー[14]から８個の共通遺伝子からなるプローブを用いてコロニー上で行う。184個の異なるｃDNAクローンが、統一され、PCRを使用して、その後アガロースゲル上でサイズ化されたｃDNA挿入物を増幅した。＞300bpのｃDNAを含む57個のｃDNAクローンを同定した。全数のコロニーへの推定は、全ライブラリーが、GFP-BCCP標識へフレーム内で融合した＞１２．５ｋDaの可溶性タンパク質を発現する2,262コロニーを含むことを示した。
【００４５】
タンパク質のウエスタンブロッティング[１４]は、両方の確認された実験、この例において、＞１２．５ｋDa の82個の可溶性ビオチニル化タンパク質の発現において最終ｃDNAクローンから発現した。これらｃDNAの最終DNA配列は(表１)、ユニバーサルM13リバースプライマーを使用して行う。
【００４６】
識別されて発現するタンパク質の分析
質的対照実験は、最初のサブトラクションプロセス及び次の修飾が、そのいくつかは胸腫瘍と関連するｃDNAの多様なコレクションを産生することを確認する。サブトラクトしたライブラリーの分析は、それがいずれかの方向で行われたとき、サブトラクション・ハイブリダイゼーション後に、ハウスキーピング遺伝子G3PDHをコード化する非常に小さいｃDNAが残存することを初めて明らかにするので、サブトラクションの効率は高い(図１)。これは、18サイクルだけのPCR増幅の後、両方の未サブトラクトサンプルにおいて検出されるこのｃDNAの開始量に匹敵する。第二に、胸腫瘍ｃDNA由来の通常のｃDNAサブトラクションは、いずれの重要なバイアスを誘導せず、DNAとして配列(データ示さず)は、６％の胸腫瘍サブトラクトｃDNAの一組が余分である(即ち、一度以上出現する)ことを明らかにする。サザンブロッティングは、一組の胸腫瘍サブトラクトｃDNAにおける大部分のｃDNAが、予想されたように、開始する胸腫瘍ｃDNAサンプルにおいて過剰十分である一方、いくつかのｃDNAは、腫瘍ｃDNAサンプルへ特異的であることを確認する(図２)。可溶性、標識化タンパク質(実験1及び２から誘導される)を発現した56個の特有のDNA配列分析は、BCL様2遺伝子[１８]及び低酸素誘導性の遺伝子１[１９]、及び当該I.M.A.G.E.ｃDNAクローン及び未知／未公表遺伝子などの現在有益な機能又は疾患関連情報がないいくつかのタンパク質などの癌に関連して既知の種々のタンパク質を明らかにする。識別されてディスプレイされた一組において後者のタンパク質の出現は、いくつかの以前に特徴付けられていない遺伝子上の情報へ直ちに寄与し、この病理学の内容においてコード化するタンパク質の機能的アッセイを可能とする。
【００４７】
可溶性、リコンビナントタンパク質の配列化
上述の両方に記載された実施例1及び２は、親和性標識を経て固定化用に適切に直接的な形態において、固体表面上の空間的に定義されたアレイ中に、可溶性で発現され、折りたたまれた、C末端標識され、識別されて発現するタンパク質のコレクションを作る。これらのタンパク質は、パラレルにおいて発現され、細胞溶解物は、捕獲部材上の高密度タンパク質アレイを組み立てるための親和性捕獲表面上の標識化したタンパク質を直接的に捕獲するのに使用される。
【００４８】
機能的アッセイは、例えば、DNA結合、タンパク質結合、小分子結合、薬物結合、及び修飾の影響、例えば、タンパク質融合上のホスホリル化などを評価するのに行われる。ポジティブな「ヒット」をコード化するプラスミドDNAは、その後、タンパク質の同定を決定するために配列化させることができる。
【００４９】
実施例３：CFTR(胆嚢の繊維化膜貫通型レセプター)と相互作用するタンパク質を同定する際に識別されて発現するタンパク質アレイの使用
腸の生体検査は、ｄ５０８突然変異体の無CF、非CF及び残基CF（ｄ５０８突然変異体）から得られた。RNAは、その後、これらのライブラリーから抽出され、第一のストランド及びｃDNAライブラリーを調製する。サブトラクション・ハイブリダイゼーションを、その後、行い(ここで既に記載したように)、以下のプロテオームを発生させる。すなわち、
１．  サブトラクトした無CF／非CFアレイ
２．  サブトラクトした残基CF／非CFアレイ
３．  サブトラクトした無CF／残基CFアレイ
【００５０】
これらのアレイの1又はそれ以上は、ポジティブ対照例として細胞タンパク質と結合するのに既知のCFTRから誘導された１又はそれ以上のペプチドとプローブ化することができる。
【００５１】
参照例
2005521056.tif 000002
2005521056.tif 000003
【００５２】
【表１】
2005521056.tif 000004
通常の胸組織ｃDNAに対するサブトラクション・ハイブリダイゼーション後に、胸腫瘍関連ｃDNAから発現させた可溶性タンパク質
【図面の簡単な説明】
【００５３】
本発明は、以下の図面を参照して説明される。
【図１】図１は、ハウスキーピング遺伝子、グルコース３ホスフェートデヒドロゲナーゼ（G3PDH）ｃDNAサブトラクションの効率の分析を示す。ｃDNAサブトラクションは、胸腫瘍ｃDMA及び通常の組織ｃDNAの両方において、DRIVER集団として他のプレゼンテーションによって行った。残存するサブトラクションｃDNAをG3PDHの除去用に(効率が高いかどうかを予想する)サブトラクトされたものをPCR増幅によって(及び比較用に未サブトラクトｃDNAのもの)、G3PDH特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、セミ定量結果を出すための増幅サイクルの数を変えて、分析した。特異的G3PDHアンプリコンが示された。
【図２】図２は、通常の胸組織（A）及び胸腫瘍組織（B）におけるサブトラクトされた胸腫瘍ｃDNAクローンの表示のサザンブロッティングによる分析を示す。384個のサブトラクトされた胸腫瘍ｃDNAクローンを含む大腸菌コロニーは、ナイロン膜上に堆積されて、アガロースプレート上で一昼夜37℃で成長する。膜は、以下の標準的なプロトコールに従って行い(原料と方法参照)、その後、サザンブロットを、通常又は腫瘍組織から生じたDIG標識ｃDNAでプローブ化した。ストリンジェント洗浄後、ブロットをECL試薬（Amersham  Biosciences、UK）を使用して、展開し、ｘ線フィルムへ露光した。一方、ボックスは、通常の胸組織と比較して胸腫瘍組織において、独占的に非常に発現したcDNAクローンを示す。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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