(57)【要約】    本発明は、ＧＬＰ−１受容体のアゴニストおよびグルカゴン受容体のアンタゴニストの双方として作用するポリペプチドを提供する。このようなポリペプチドは２型糖尿病またはその他の代謝障害を有する個体を治療するために有用である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号６〜３２より成る群から選ばれるポリペプチド、およびそれらの機能的に等価の断片、誘導体および変種。
【請求項２】
請求項１記載のポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド、またはその縮重変種。
【請求項３】
請求項２記載のポリヌクレオチドを含んでなるベクター。
【請求項４】
請求項３記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項５】
ａ）該ポリペプチドの発現のために適する条件下で請求項４記載の宿主細胞を培養し、そして
ｂ）宿主細胞培養よりポリペプチドを回収する
ことを含んでなるポリペプチドの産生方法。
【請求項６】
製剤学的に許容できるキャリヤと組み合わせて請求項１記載のポリペプチドを含んでなる薬剤組成物。
【請求項７】
治療に有効な遺伝子治療ベクターと組み合わせて請求項２記載のポリヌクレオチドを含んでなる遺伝子治療組成物。
【請求項８】
該ポリペプチドが配列番号２５により表される、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項９】
該ポリペプチドが配列番号２６により表される、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項１０】
該ポリペプチドが配列番号２７により表される、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１記載のポリペプチドに特異的に結合する精製された抗体。
【請求項１２】
ＧＬＰ−１受容体アゴニストであり且つグルカゴンアンタゴニストであるペプチドの治療的に有効な量を哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物内の代謝障害の治療方法。
【請求項１３】
ペプチドが配列番号６〜３２、およびそれらの機能的に等価の断片、誘導体および変種より成る群から選ばれる、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
ペプチドが、配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７より成る群から選ばれる、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
該代謝障害が２型糖尿病である、請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
治療的に有効な量が約０．１ｕｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇの範囲である、請求項１２記載の方法。
【請求項１７】
該代謝障害が耐糖能障害の前糖尿病状態である、請求項１２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＧＬＰ−１受容体のアゴニストおよびグルカゴン受容体のアンタゴニストの双方として作用する新規に特定されたポリペプチドおよびこのようなポリペプチドの治療目的のための使用に関する。さらに具体的には、本発明のポリペプチドは、グルコース依存の様式で膵臓ベータ細胞からのインスリン放出を促進しそして肝臓からのグルコースのグルカゴン媒介分泌を低下することに有用であり、これにより代謝障害、例えば糖尿病、高血糖症、空腹時グルコース障害（ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｆａｓｔｉｎｇ  ｇｌｕｃｏｓｅ）、耐糖能障害、糖尿病前期状態、および肥満症に罹患したそれらの個体のための選択治療方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、なかでも糖尿病患者内の上昇した血中グルコースレベル（血糖値）により現れるインスリン分泌障害を特徴とする。原因となる障害から、２群の大きい群：患者の膵島中でインスリン産生ベータ細胞を欠失した場合に発生するＩ型糖尿病（またはインスリン依存性糖尿病、ＩＤＤＭ）およびベータ細胞インスリン分泌障害および／またはインスリン作用の変化を有する患者に起きる２型糖尿病（または非インスリン依存性糖尿病、ＮＩＤＤＭ）に糖尿病が分類される。
【０００３】
１型糖尿病患者は、現在ではインスリンを用いて治療されるが、一方２型糖尿病患者の大部分は、ベータ細胞機能を刺激する薬剤またはインスリンに対する患者の組織感度を増強する薬剤を用いて治療できる。時間が経過すると、２型糖尿病患者のほぼ半数はこれら薬剤へのかれらの反応を失い、従ってインスリン治療を行わなければならない。２型糖尿病患者を治療するために現在使用される薬剤には、アルファ−グルコシダーゼ阻害剤（プレコース（ＰＲＥＣＯＳＥ）（ＴＭ）、ボグリボース（ＶＯＧＬＩＢＯＳＥ）ＴＭおよびミグリトール（ＭＩＧＬＩＴＯＬ）（ＴＭ）、インスリンセンシタイザー（例えばアヴァンディア（Ａｖａｎｄｉａ）ＴＭ、アクトス（Ａｃｔｏｓ）ＴＭおよびレズリン（Ｒｅｚｕｌｉｎ）ＴＭ）、インスリン分泌促進剤（スルホニル尿素（”ＳＦＵ”）およびＡＴＰ依存性Ｋ＋  チャンネルにより作用するその他の薬剤）、およびグルコファージ（ＧＬＵＣＯＰＨＡＧＥ）ＴＭ（メトホルミン（ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ）ＨＣｌ）が含まれる。
【０００４】
アルファ−グルコシダーゼ阻害剤：アルファ−グルコシダーゼ阻害剤は、消化管よりのグルコースの吸収を遅延させて食後グルコースの可動域を縮小させる。これらの薬剤は安全でありそして軽度ないし中度に罹患した糖尿病患者のための治療を提供する。しかし、消化器関係の副作用が文献に報告されそしてそれらの有効性を制限する。
【０００５】
インスリンセンシタイザー：インスリンセンシタイザーはインスリンへの身体の反応を増強する薬剤である。チオゾリジンジオン、例えばアヴァンディアＴＭおよびアクトスＴＭは、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）ガンマを活性化しそしてまだ完全には解明されていない一組の遺伝子の活性を調節する。肝臓への作用（例えば薬剤誘発肝臓毒性および高い肝臓酵素レベル）は、アヴァンディアＴＭおよびアクトスＴＭを用いる患者に顕著な問題とは認められない。そうではあるが、肝臓酵素試験が治療の最初の年は二ヵ月毎そしてその後も定期的に推奨される。アヴァンディアＴＭおよびアクトスＴＭ治療は、体液滞留、水腫および体重増加と関連する。アヴァンディアＴＭは鬱血性心不全との関係のためにインスリンとの同時使用には処方されない。この種類の最初の薬剤であるレズリンＴＭ（トログリタゾン（ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ））は、高い肝臓酵素レベルおよび薬剤誘発肝臓毒性のために撤回された。
【０００６】
インスリン分泌促進剤：スルホニル尿素（ＳＦＵ）および非スルホニル尿素のナテグリニド（Ｎａｔｅｇｌｉｎｉｄｅ）およびペパグリニド（Ｐｅｐａｇｌｉｎｉｄｅ）は、グルコース非依存性分泌を起こすＡＴＰ依存性カルシウムチャンネルを介して作用する。これらの薬剤は、軽度から中度の空腹時高血糖症を有する２型糖尿病のための標準治療方法である。インスリン分泌促進剤は、低血糖症、体重増加、および高い一次および二次無効性率（ｆａｉｌｕｒｅ  ｒａｔｅ）を誘発する可能性を含むという限界がある。最初に治療された患者の１０〜２０％は著しい治療効果を示さない（一次無効性）。二次無効性は、インスリン分泌促進剤を用いる治療の６カ月後に治療効果がさらに２０〜３０％低下することにより示される。５〜７年の治療の後にインスリン分泌促進剤応答患者の５０％にインスリン治療が必要である（非特許文献１）。ナテグリニドおよびペパグリニドは、一日に３回投与する必要がある速効型薬剤である。これらは、食後グルコースの調節のためにのみ使用され、空腹時グルコースの調節には使用されない。
【０００７】
グルコファージＴＭは、肝臓のグルコース放出を低下しそして末梢グルコース取り込みおよび利用を増加することにより血中グルコースを低下させるビグアニドである。この薬剤は、軽度および中度に罹患した患者内で血中グルコースを低下する際に有効であり、そして体重増加の副作用または低血糖症を誘発する可能性を持っていない。しかしグルコファージＴＭは、消化器障害および乳酸アシドーシスを含む多数の副作用を有する。グルコファージＴＭは、年齢７０歳を越える糖尿病患者および腎臓または肝臓機能障害を有する患者には禁忌を示す。最後に、グルコファージＴＭは、インスリン分泌促進剤として同様の一次および二次無効性を有する。
【０００８】
インスリン治療は、食事、運動の後に行われそして経口投与は血中グルコースを適切には調節できない。この治療はいくつかの欠点を有する：これは注入可能であり、これは低血糖症を誘発でき、そして体重増加を起こすことができる。インスリンを用いる低血糖症誘発の可能性は、低血糖症を調節できる範囲を制限する。
【０００９】
現在の治療を用いた場合の問題は、２型糖尿病治療のための新しい治療方法を要求する。具体的には、正常な（すなわちグルコース依存性）インスリン分泌を維持する新しい治療方法が必要とされる。膵臓中でのグルコース制御されたインスリン分泌の促進におけるグルカゴン様ペプチド−１（”ＧＬＰ−１”）の役割を考えると、ＧＬＰ−１受容体アゴニストは、このような疾患の治療において価値を有する可能性がある。さらに、グルカゴン受容体アンタゴニストは、肝臓グリコーゲン分解および糖質新生を促進することにより血漿グルコースを上昇させるグルカゴンの役割を考えると、２型糖尿病の治療に価値あることが証明されるに違いない。
【００１０】
ＧＬＰ−１およびグルカゴンは、構造的に近縁のペプチドホルモンのファミリー、すなわちグルカゴン／セクレチンファミリーの成員である。このファミリー内で、ＧＬＰ−１（７−３６）およびＧＬＰ−１（７−３７）（それぞれアミノ酸３０個およびアミノ酸３１個）およびグルカゴン（アミノ酸３０個）は、高度に相同なペプチドの集団を構成する。さらに、これらの２種のホルモンは、共通の前駆体であるプレプログルカゴンに起源し、これは組織特異的プロセシングにより、主として腸管内ではＧＬＰ−１そして膵臓内ではグルカゴンの産生に導く。これら２種のペプチドの受容体は、同族体（５８％一致）でありそしてＧ−タンパク質共役受容体のファミリーに属する。
【００１１】
ＧＬＰ−１およびグルカゴンの双方は、全身的グルコースホメオスタシスに主要な役割を有する。ＧＬＰ−１はグルコース依存性インスリン分泌により媒介される血漿グルコース濃度を低下し、一方グルカゴンは血漿グルコース濃度を上昇する。正常な血中グルコース濃度を維持するためのＧＬＰ−１およびグルカゴンの双方の重要な役割を考えると、ＧＬＰ−１受容体アゴニストおよびグルカゴン受容体アンタゴニストには相当に大きい興味がもたれる。臨床研究は、糖尿病患者内でインスリン分泌を促進しそして血漿グルコース濃度を正常化するＧＬＰ−１注入の能力を実証している。しかし、ＧＬＰ−１は急速に分解しそして身体内で著しく短い半減期を有する。さらに、ＧＬＰ−１は、その治療投与位置においてまたはその近傍で消化管運動の副作用を起こす。従って、ＧＬＰ−１自体は治療薬剤として著しい限界を有し、そして増強された安定性を有するペプチドの変性体が追求されている。ＧＬＰ−１受容体の非ペプチドアゴニストは現在まで報告されていない。
【００１２】
グルカゴンのペプチド類似体は、グルコースアンタゴニストとして作用しそして糖尿病ラット内で高血糖症を緩和することが特定された。しかし、前臨床開発を越えてはペプチドグルカゴンアンタゴニストは進まなかった。多数の構造的に異なる非ペプチドグルカゴン受容体アンタゴニストが科学文献および特許文献に報告されている。しかし、グルカゴン受容体の低分子阻害剤を特定する試みは、生体内では限られた成功を収めたにすぎなかった。臨床研究において活性であるとして知られるグルカゴン作用性の唯一のアンタゴニストは、ＢＡＹ  ２７−９９５５として同定された化合物である。グルカゴンアンタゴニズムの考えられる副作用は、低血糖症である。
【００１３】
ＧＬＰ−１受容体アゴニストまたはグルカゴン受容体アンタゴニストのいずれか単独の投与に関連する潜在的な副作用のために、組み合わせ治療は、副作用を低下する一方で血中グルコースの所望の低下を維持する長所を有する。しかし、同時投与は単一処方および双方のペプチドに適当な薬動力学的プロフィールを生成する投与方法を必要とする。これはこのような治療薬剤の開発に対する大きな障害であろう。
【００１４】
上記に基づいて、生体内でＧＬＰ−１アゴニストおよびグルカゴンアンタゴニストの双方として機能する単一の治療ペプチドには大きい可能性が存在する。
【非特許文献１】Ｓｃｈｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒａｃｔ．６：５３３−５４３、１９８９
【発明の開示】
【００１５】
本発明は、ＧＬＰ−１受容体のアゴニストおよびグルカゴン受容体のアンタゴニストの双方として機能しそしてＧＬＰ−１受容体アゴニストおよびグルカゴン受容体アンタゴニスト活性の双方を有する薬剤により改善できる疾患および病状の治療に有効である新規のポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドは、例えば、代謝障害、例えば低下した内因性インスリン分泌、特に２型糖尿病よりもたらされる障害を有する患者に対して、または耐糖能障害、インスリン分泌の軽度の変性を有する糖尿病前期または空腹時グルコース障害または肥満症を有する患者に対して新規の治療方法を提供する。
【００１６】
本発明の一つの観点は、配列番号６〜３２より成る群より選択されたポリペプチド、ならびに配列番号６〜３２に記載のポリペプチドと本質的に同様のレベルでＧＬＰ−１受容体のアゴニストおよびグルカゴン受容体のアンタゴニストの双方として機能するポリペプチドの断片、誘導体および変種（ｖａｒｉａｎｔ）である（集合的に「本発明のポリペプチド」）。
【００１７】
本発明の別の態様には、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびポリペプチドを組換え的に発現するために必要な付随（ａｔｔｅｎｄａｎｔ）ベクターおよび宿主細胞が含まれる。
【００１８】
本発明のさらに別の態様は、ヒトを含む哺乳動物内で本発明のポリペプチドにより影響を受ける糖尿病および／またはその他の疾患または病状の治療の方法を提供する。この方法は、哺乳動物に本発明のいずれかのポリペプチドの治療的有効量を投与することを含む。
【００１９】
本発明は、本発明のポリペプチドを製造する組換えおよび合成方法も提供する。
［好ましい実施態様の詳細な説明］
【００２０】
本発明は、ＧＬＰ−１受容体のアゴニストおよびグルカゴン受容体のアンタゴニストの双方として機能する新規のポリペプチド、ならびにそれらの断片、誘導体、変種、および類似体を提供する。本発明のポリペプチドは、生体内で、糖尿病、高血糖症、耐糖能障害、空腹時グルコース障害、および肥満症などの疾患または病状の予防および／または治療においてＧＬＰ−１受容体アゴニストおよびグルカゴン受容体アンタゴニストの双方として機能する。
【００２１】
ＧＬＰ−１およびグルカゴンは、構造的に関連するペプチドホルモン、すなわちグルカゴン／セクレチンファミリーのファミリーの成員である。下記の比較アライメント表は、一次構造の関連性を示す。
【００２２】
【表１】
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【００２３】
アミノ酸の一文字略号は、ズベイ、生化学、第二版（Ｚｕｂａｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｄ．ｅｄ．，１９８８，ＭｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ）第３３ページに見いだすことができる。これらのポリペプチドは、全身的グルコースホメオスタシスに関係する。ＧＬＰ−１は血漿グルコース濃度を低下し、一方グルカゴンは血漿グルコース濃度を上昇する。
【００２４】
膵臓内でのグルコース調節インスリン分泌を促進するＧＬＰ−１の役割を考えると、ＧＬＰ−１受容体アゴニストは代謝障害およびその他の疾患の治療において潜在的な価値がある。さらに、グルタゴン受容体アンタゴニストも、肝臓グルコース分解およびグルコース新生を刺激することによる血漿グルコースの上昇におけるグルカゴンの役割を考えると、疾患治療において価値があることが証明されるに違いない。しかし、これらの事実単独では、著しい副作用を誘発しない生体内でのグルコース低下を保証しない。
【００２５】
本発明は、ＧＬＰ−１受容体アゴニストおよびグルカゴン受容体アンタゴニストの双方である新規のポリペプチドを提供する。理論には制約されないで、我々は本発明のポリペプチドが、グルコース依存性の様式で膵臓ベータ細胞よりのインスリン放出を促進することにより生体内のグルコースレベルを低下でき、一方同時に肝臓よりのグルコースのグルカゴン媒介分泌を低下すると信じる。
【００２６】
ＧＬＰ−１受容体アゴニストおよびグルカゴン受容体アンタゴニストポリペプチド
本発明のポリペプチドは、ＧＬＰ−１受容体アゴニストおよびグルカゴン受容体アンタゴニストの双方として機能する。このようなポリペプチドのＧＬＰ−１受容体アゴニスト成分は、ＧＬＰ−１受容体活性化のための１回またはそれ以上の生体外または生体内アッセイにおいてＧＬＰ−１受容体を活性化する。このようなアッセイの例は、ＲＩＮｍ５Ｆ細胞内のｃＡＭＰの誘導のための生体外アッセイ、膵臓β−細胞よりのインスリン分泌の誘導のための生体外アッセイ、血漿グルコースレベルの低下のための生体内アッセイ、および下記の具体的実施例に記載されたような血漿インスリンレベルにおける上昇のための生体内アッセイを含むが、これらに限定はされない。
【００２７】
本発明のポリペプチドは、グルカゴン受容体アンタゴニスト活性化の阻害のための１回またはそれ以上の生体外または生体内アッセイにおいて、グルカゴン受容体アンタゴニスト活性も示す。このようなアッセイの例は、細胞ｃＡＭＰ内のグルカゴン媒介増加の阻害を測定するための生体外アッセイ、例えば培養された肝細胞よりのグルカゴン媒介グルコース放出の阻害を測定するための生体外アッセイ、または下記の具体的実施例に記載されたようなグルカゴンで促進されたグルコース産生のための生体内アッセイを含むが、これらに限定はされない。
【００２８】
本発明の好ましいポリペプチドは、（１）配列番号６〜３２および（２）配列番号６〜３２に示したいずれかのポリペプチドと本質的に同様のレベルにおいてＧＬＰ−１受容体のアゴニストおよびグルカゴン受容体のアンタゴニストの双方として機能するそれらの断片、誘導体、変種、および類似体より成る群より選択される。
【００２９】
本発明のポリペプチドは、天然に存在するポリペプチド、組換えポリペプチド、または合成ポリペプチドであってもよい。
【００３０】
断片、誘導体、変種、および類似体
断片、誘導体、変種、および類似体ポリペプチドは、例えば配列番号６〜３２に示すポリペプチドと本質的に同様の生物学的機能または活性を保持する。「本質的に同様の生物学的機能または活性」とは、比較する全長ポリペプチドの同様の生物学的活性の約３０％から１００％まで（すなわち、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％）またはこれらを越えることである。
【００３１】
誘導体
誘導体には、追加の構造および／または機能を提供するために化学的に修飾された本発明のポリペプチドが含まれる。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または脂肪酸は、ポリペプチドにその半減期を改善するために添加できる。標的特異性または追加の活性を与える融合ポリペプチドも以下にさらに詳細に記載するように構築できる。
【００３２】
誘導体は、天然プロセス、例えば翻訳後プロセシング、または化学修飾技術のいずれかにより修飾でき、これら双方共に当該技術分野では周知である。修飾は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖、およびアミノまたはカルボキシル末端を含むポリペプチド内のあらゆる場所で起きることができる。同様の形式の修飾が、与えられたポリペプチド内の数個の部位で同一または異なる程度で存在してもよいことが認められる。また、変種は、１種またはそれ以上の異なる修飾の形式を含んでもよい。ポリペプチドは、例えばユビキチン化の結果として分枝してもよく、そしてそれらは分枝のあるなしにかかわらず環状であってもよい。
【００３３】
その他の化学修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合付加、ヘム領域の共有結合付加、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合付加、脂質または脂質誘導体の共有結合付加、ホスホチジルイノシトールの共有結合付加、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、製剤、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ＰＥＧ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化（ｓｅｌｅｎｏｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ媒介付加、例えばアルギニル化、およびユビキチン化が含まれる（例えばＴ．Ｅ．クレイトン「タンパク質、構造および分子的性質」第２版（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，２ｎｄ．ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３））；「タンパク質の翻訳後共有結合修飾」、Ｂ．Ｃ．ジョンソン編集、１〜１２ページ（Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｇｓ１−１２（１９８３））；サイフターら（Ｓｅｉｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８２：６２６−４６（１９９０））；ラッタンら（Ｒａｔｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３：４８−６２，１９９２）参照）。
【００３４】
誘導体には、それらの薬剤動力学的プロフィールを改善するために、他のポリペプチド、例えばヒト血清アルブミンと融合させた成熟ポリペプチドも含まれる。２個のポリペプチドの融合は、当該技術分野の熟練者には公知のいかなる手段によってでも達成できる。例えば、ヒト血清アルブミンをコードするＤＮＡおよび本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、当該技術分野の熟練者には公知のいかなる哺乳動物発現ベクター内にもクローニングできる。他のポリペプチドに対して本発明のポリペプチドのＮ−末端の位置が好ましく、それは遊離Ｎ−末端ヒスチジンがＧＬＰ−１受容体活性のために要求されると考えられるからである（カワ（Ｋａｗａ，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  Ａｐｒ；１２４（４９）：１７６８−７３，１９８９））。得られた組換え融合タンパク質は、次いで適当な細胞系統、例えばＨＫＢまたはＣＨＯをベクターを用いて形質転換し、そして融合タンパク質を発現して発現できる。
【００３５】
好ましい誘導体には、ＰＥＧ部分（ｍｏｉｅｔｙ）または脂肪酸部分が結合された本発明のポリペプチド（配列番号６〜３２）が含まれる。ＰＥＧ部分は、例えば２２ｋＤａを越える分子量、好ましくは２５ｋＤａから１００ｋＤａの間の分子量を有するＰＥＧ（例えば２５、３０、３５、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ｋＤａ）、さらに好ましくは３５ｋＤａと４５ｋＤａとの間の分子量（例えば、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、または４５ｋＤａ）であることができる。このようなＰＥＧ化ポリペプチドの例は、配列番号１９または２５の位置３１にあるシステイン残基に結合した２２ｋＤａＰＥＧ部分を含むものである。配列番号２０および２６ならびに表２参照。あるいは、４３ｋＤａ  ＰＥＧ部分は、配列番号２５の位置３１にあるシステイン残基に結合してもよい。配列番号２７および表２参照。ＰＥＧ部分は、当該技術分野では周知の方法により本発明のポリペプチドのシステイン残基に付加でき、例えば実施例１９参照。
【００３６】
その他の好ましい誘導体は、ポリペプチドに結合した脂肪酸部分を有する。脂肪酸部分は例えばＣ１２とＣ２０との間、好ましくはＣ１４とＣ１８との間の脂肪酸、そして最も好ましくはＣ１６脂肪酸であることができる。このようなポリペプチドの例は、配列番号２８〜３２であり、これらはペプチド内のリシン残基に結合したＣ１６脂肪酸（パルミチン酸）部分を含む。表２参照。脂肪酸部分は、当該技術分野では周知の方法、例えば脂肪酸アシル化により本発明のポリペプチドのリシン残基に付加できる（ナゼンら（Ｋｎｕｄｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４３：１６６４−１６６９，２０００））。
変種
変種とは、配列番号６〜３２に示したアミノ酸配列に関して１個またはそれ以上のアミノ酸配列変化を有する本発明のポリペプチドである。変種は、修飾されたペプチド結合、すなわちペプチド同配体（ｉｓｏｓｔｅｒ）により互いに結合したアミノ酸を有することもでき、そして２０種の天然に存在するアミノ酸以外のアミノ酸を含んでもよい。
【００３７】
好ましくは、変種は１種またはそれ以上の保存的アミノ酸置換（すなわち１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個置換）を好ましくは非本質的アミノ酸残基に含む。「非本質的」アミノ酸残基とは、タンパク質の生物学的活性を変更することなくその野生型配列から変更できる残基であり、一方、「本質的」アミノ酸残基は、生物学的活性のために要求される。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されたものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝側鎖（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。非保存的置換は、保存されたアミノ酸残基に対してまたは保存されたタンパク質ドメイン内に存在するアミノ酸残基に対しては行われてはならない。
【００３８】
保存的アミノ酸置換は、好ましくは配列番号３４に示すコンセンサスポリペプチドの位置１１、１２、１６、１７、または１８にある。位置１１では、好ましくはＲ、Ｓ、Ａ、Ｋ、Ｇ、またはＴ、そしてさらに好ましくはＲ、Ａ、Ｇ、またはＳである。位置１２では好ましくはＫ、Ｎ、Ｒ、Ｈ、Ａ、ＳまたはＱそしてさらに好ましくはＫ、Ａ、Ｓ、またはＮである。位置１６では好ましくはＫ、Ｒ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、またはＨ、そしてさらに好ましくはＫ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ａ、Ｓ、またはＮである。位置１７では好ましくはＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｙ、Ｖ、Ｗ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、またはＧそしてさらに好ましくはＲ、Ａ、Ｌ、Ｍ、Ｖ、Ｓ、Ｈ、Ｅ、またはＱであり、位置１８では好ましくはＫ、Ｒ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｙ、Ｖ、Ｍ、Ａ、Ｇ、またはＨそしてさらに好ましくはＫ、Ｒ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、ＹまたはＡである。位置１１、１２、１６、１７、および１８におけるすべての可能な置換の組み合わせは、これらの位置の１個、２個、３個、または４個のいずれかにおける非置換を含んで、明確に予見される。
【００３９】
変種には、変異誘発によりアミノ酸配列が異なるポリペプチドも含まれる。ＧＬＰ−１受容体アゴニストおよびグルカゴン受容体アンタゴニストの双方として機能する変種は、変異体のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングして同定でき、例えば１個またはそれ以上の位置（すなわち１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０位置）における保存的置換を有するポリペプチドの異性体は当該技術分野では周知であり、そして下記の具体的実施例中に記載の方法を用いてＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性およびグルカゴン受容体アンタゴニスト活性についてスクリーニングできる。
【００４０】
類似体
類似体にはプロポリペプチドが含まれ、ここでプロポリペプチドには本発明のポリペプチドのアミノ酸配列が含まれる。本発明の活性ポリペプチドは、天然の生体内プロセスにより、または当該技術分野では周知のプロセスまたは操作、例えば酵素または化学的切断によりプロポリペプチド分子中の付加アミノ酸より切断できる。
【００４１】
断片
断片は、本発明のポリペプチドの全長より短く、誘導体の全長、変種または類似体を含み、これはＧＬＰ−１受容体アゴニストおよびグルカゴン受容体アンタゴニスト活性を有する。
【００４２】
ポリヌクレオチド
本発明のポリペプチドをコードするどのポリヌクレオチド配列もポリペプチドを発現するために使用できる。ポリヌクレオチドは、ポリペプチドのためのコーディング配列のみより成ることができるかまたは追加のコーディング／非コーディング配列を含むことができる。
【００４３】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、当該技術分野では周知の化学的方法を用いてその全部または一部分として合成できる（例えばカルザースら（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２１５−２３，１９８０）；ホーンら（Ｈｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２２５−３２，１９８０）参照）。ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、次いでポリペプチドを発現するために発現ベクター内にまたはポリヌクレオチドを増殖するためにクローニングベクター内にクローニングできる。
【００４４】
当該技術分野の専門家により理解されるように、非−天然存在コドンを有するポリペプチドコード化ヌクレオチド配列を生成すると有利であろう。例えば、特定の原核生物または真核生物宿主により好まれるコドンは、ポリペプチド発現の速度を増加するためにまたは所望の性質、例えば天然に存在する配列より産生した転写物のものより長い半減期を有するＲＮＡ転写物を生成するために選択できる。
【００４５】
本明細書中で開示したヌクレオチド配列は、ポリペプチドまたはｍＲＮＡ産物のクローニング、処理、および／または発現を調節する改変を含み、これらに限定はされないさまざまな理由のためにポリペプチド−コード化配列を改変するために当該技術分野では一般に公知の方法を用いて操作できる。遺伝子断片および合成オリゴヌクレオチドのランダム断片化およびＰＣＲ再アセンブリーによるＤＮＡシャフリングが、ヌクレオチド配列を操作するために使用できる。例えば、部位特異性変異誘発は新規の制限部位を挿入し、グリコシル化パターンを改変し、コドン優先性を変化し、スプライス変種を産生し、変異を導入するなどのために使用できる。
【００４６】
ベクター
本発明は、本発明のポリペプチドをコードする１種またはそれ以上のヌクレオチド配列を含んでなるクローニングおよび発現ベクターも含む。ヌクレオチド配列は、正または逆方向に挿入できる。ＤＮＡ配列を種々の方法でベクター内に挿入してもよい。一般に、ＤＮＡ配列は当該技術分野では公知でありそしてサンブルックら「分子クローニング：実験室マニュアル」第二版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ．ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９））に記載の方法により適当な制限エンドヌクレアーゼ部位内に挿入される。このような方法およびその他の方法は、当該技術分野の熟練者の専門範囲に入ると考えられる。
【００４７】
クローニングベクターの例には、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＳｐｏｒｔ、およびｐＣＲＩＩが含まれるが、これらに限定はされない。
【００４８】
本態様の好ましい観点では、発現ベクターは、例えばコーディング配列に操作的に連結するプロモーターを含む制御配列をさらに含んでなる。適合する発現ベクターおよびプロモーターの多数が当該技術分野の専門家には公知でありそして商業的に入手できる。下記の発現ベクターは、例示として挙げるものである。細菌発現ベクターには、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ））、ｐＢＳ、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ、ｐＢｓＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））、ｐＴＲＣ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ＰＲＩＴ５（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））が含まれるが、これらに限定はされない。真核生物発現ベクターには、ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（ストラタジーン）、ｐＳＶＫ３、ｐＰＢＶ、ｐＭＳＧ、ＰＳＶＬ（ファルマシア）が含まれるが、これらに限定はされない。しかしあらゆるその他のクローニングまたは発現ベクターも、複製可能であって所望の宿主内で生存可能な限り使用してもよい。プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフェニコール  トレンスフェラーゼ）発現ベクターまたは選択可能なマーカーを有するその他のベクターを用いてあらゆる所定の遺伝子より選択できる。２種の適合するベクターはｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７である。具体的な名前を挙げる細菌プロモーターには、ｌａｃｉ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰＲ  、ＰＬ  およびｔｒｐが含まれる。真核生物プロモーターには、ＣＭＶ最初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルスよりのＬＴＲ、およびマウスメタロチオネイン−Ｉが含まれる。適合するベクターおよびプロモーターの選定は、当該技術分野の通常の技術のレベル内に十分に入る。
【００４９】
発現ベクターは、翻訳開始、転写終止、および増幅発現のために適する配列のためのリボソーム結合部位も含むことができる。発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型形質、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼまたは真核生物細胞培養のためのネオマイシン耐性、または例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内培養のためにテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性などを与えるための遺伝子を含むことができる。
【００５０】
ライブラリー
一つの態様では、変種のライブラリーは、核酸レベルで組み合わせ変異誘発により産生されそして変化を与えられた（ｖａｒｉｅｇａｔｅｄ）遺伝子ライブラリーによりコードされる。変種のライブラリーは、例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を、潜在的な変種アミノ酸配列の縮重した組を個別のポリペプチドとしてまたは、その代わりに、その中に配列の組を含むさらに大きい融合タンパク質（例えばファージディスプレイ）の組として発現可能であるように遺伝子配列内に酵素的に結合することにより産生できる。
【００５１】
縮重オリゴヌクレオチドより潜在的な変種のライブラリーを産生するために使用できる種々の方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成は自動ＤＮＡ合成装置で行うことができ、次いで合成遺伝子を適当な発現ベクター内に結合する。遺伝子の縮重した組の使用は、一つの混合物内で、潜在的な類似配列の所望の組をコードするすべての配列を提供することを可能とする。縮重オリゴヌクレオチドを合成するための方法は、当該技術分野では公知である（例えばナラン（Ｎａｒａｎｇ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３９：３（１９８３））；イタクラ（Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３（１９８４））；イタクラら（Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６（１９８４））；イケら（Ｉｋｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１１：４７７．１９８３）参照）。
【００５２】
点変異または末端切断により作製された組み合わせライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするためおよび選定された性質を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために、当該技術分野では数種の技術が公知である。このような技術は、本発明のポリペプチドの組み合わせ変異誘発により産生した遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適用できる。大きい遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための高処理速度分析になじみやすい最も広範に使用される技術には、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクター内にクローニングし、得られたベクターのライブラリーを用いて適当な細胞を形質転換し、そして所望活性の検出が産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を容易とする条件下で組み合わせ遺伝子を発現することが典型的には含まれる。ライブラリー内の機能性変異物の頻度を増加する技術である再帰性アンサンブル（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  ｅｎｓｅｍｂｌｅ）変異誘発（ＲＥＭ）は、所望の変種を特定するためのスクリーニングアッセイと組み合わせて使用できる。
【００５３】
宿主細胞
本発明は、上記のベクターを含む宿主細胞も提供する。宿主細胞は、高級真核生物細胞、例えば哺乳動物細胞、または低級真核生物細胞、例えば酵母細胞であることができる。あるいは、宿主細胞は原核生物細胞、例えば細菌細胞であることもできる。
【００５４】
宿主細胞は、本発明のクローニングまたは発現ベクターを用いて遺伝子的に操作できる（形質導入、形質転換、またはトランスフェクション）。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、またはファージの形であってもよい。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化または形質転換物を選択するために適するように修正された慣用の栄養媒体内で培養されることができる。適当な培養条件、例えば温度およびｐＨの選択は、通常の熟練者の技術の範囲内に十分入る。
【００５５】
適当な宿主の代表的な例には、細菌細胞、例えば大腸菌、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）；真菌細胞、例えば酵母、昆虫細胞、例えばショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２およびスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９、哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳまたはボウズメラノーマ（Ｂｏｗｅｓ  ｍｅｌａｎｏｍａ）が含まれるが、これらに限定はされない。適当な宿主の選定は、本明細書中の教示より当該技術分野の専門家の範囲内であると考える。
【００５６】
宿主細胞内への構築物の導入は、例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、またはエレクトロポレーション（デービスら（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９８６））により行うことができる。宿主細胞内の構築物は、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を産生するように慣用の方法により使用できる。
【００５７】
タンパク質発現
成熟タンパク質は、適当なプロモーターの制御の下で哺乳動物細胞、酵母、細菌、またはその他の細胞内に発現できる。無細胞翻訳系は、本発明のＤＮＡ構築物より誘導されたＲＮＡを用いてこのようなタンパク質を産生するためにも使用できる。原核生物および真核生物宿主に用いる使用のために適するクローニングおよび発現ベクターは、上記およびサンブルックら「分子クローニング：実験室マニュアル」第二版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ．ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９））中に記載されている。
【００５８】
高級真核動物による本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、発現ベクター内にエンハンサー配列を挿入することにより増加できる。エンハンサーはＤＮＡのシス作用性エレメントであり、通常約１０〜３００ｂｐであり、これらはその転写を増加するためにプロモーターに作用する。その例には、転写開始点の後期側におけるＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側にけるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが含まれる。一般に、組換え発現ベクターは、宿主細胞の形質転換を可能とする複製および選択可能なマーカーの開始点を含み、例えば大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子およびＳ．セレヴィシエ（ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＴＲＰ１遺伝子、および下流構造配列の転写を指示する高度に発現された遺伝子より誘導されたプロモーターである。このようなプロモーターは、解糖酵素、なかでも例えば３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質をコードするオペロンより誘導できる。異種構造配列は翻訳開始および終止配列ならびに好ましくは翻訳されたタンパク質の周辺腔または細胞外培地内への分泌を指示できるリーダー配列と一緒に適切に同期してアセンブルされる。場合により、異種配列は所望の特性、例えば発現された組換え産物の安定化または単純化された精製を付与するＮ−末端決定ペプチドを含む融合タンパク質をコードできる。
【００５９】
適合する宿主株の形質転換および適当な細胞密度への宿主株の増殖の後、選択されたプロモーターは適当な手段（例えば温度変更または化学的誘導）により抑制され、そして細胞は、一定期間培養される。細胞は典型的には遠心分離により採取されそして物理的または化学的手段により破壊される。得られた粗抽出液はさらに精製するために保存される。タンパク質の発現に使用される微生物細胞は、冷凍−解凍サイクル、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含むいかなる慣用手段でも破壊できる。
【００６０】
種々の哺乳動物細胞培養系も組換えタンパク質を発現するために使用できる。哺乳動物細胞系の例には、グルツマン（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｃｅｌｌ  ２３：１７５（１９８１））に記載されたサル腎臓繊維芽細胞のＣＯＳ−７系統、および適合性のベクターを発現できるその他の細胞系統、例えばＣ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＨＢＫ細胞系統が含まれる。
【００６１】
タンパク質精製
本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈降、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水相互作用性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを含む当該技術分野では周知の方法により、組換え細胞培養液から回収および精製されてもよい。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、最終精製工程として使用できる。
【００６２】
本発明のポリペプチドは、下記の具体的な実施例に記載のようにして好都合に分離できる。精製されたポリペプチドは、少なくとも純度７０％、すなわち単離されたポリペプチドは細胞物質を本質的に含まずそして非ポリペプチド物質約３０％（質量基準）以下を有する。好ましくは、調製物は純度８５％〜９９％（すなわち、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９６、９７、９８、および９９％）である。調製物の純度は、当該技術分野で公知のあらゆる手段、例えばＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電機泳動、質量分光分析および液体クロマトグラフィーにより評価できる。
【００６３】
翻訳後修飾
組換え産生操作に使用された宿主に応じて、本発明のポリペプチドは哺乳動物またはその他の真核生物炭水化物を用いてグリコシル化されてもよくまたは非グリコシル化であってもよい。本発明のポリペプチドは、最初のメチオニンアミノ酸残基を含んでもよい。
【００６４】
化学分析
あるいは、本発明のポリペプチドは、そのアミノ酸配列を合成するための化学方法、例えば固相技術を用いる直接ペプチド合成を用いて作製できる（例えばメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５，２１４９−２１５４，１９６３）；ロバージら（Ｒｏｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９，２０２−２０４，１９９５）参照）。ポリペプチド合成は、手作業または自動化を用いて行うことができる。自動合成は、例えばアプライド  バイオシステムズ４３１Ａペプチド合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３１Ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）、パーキン−エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて行うことができる。場合により、ポリペプチドの断片を分離して合成しそして化学的方法を用いて組み合わせて分子全長を生成することができる。
【００６５】
新たに合成されたポリペプチドは、分取式高速液体クロマトグラフィー（例えばクレイトン「タンパク質：構造および分子原理」（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８３）により本質的に精製できる。本発明の合成ポリペプチドの組成は、アミノ酸分析または例えばエドマン（Ｅｄｍａｎ）分解法による配列決定により確認できる（上記のクレイトンの文献参照）。さらに、ポリペプチドのアミノ酸配列のいかなる部分も、直接合成の間に改変および／または他のタンパク質からの配列を用いる化学的方法と組み合わせて、変種ポリペプチドまたは融合ポリペプチドを産生できる。
【００６６】
薬剤的利用
本発明のポリペプチドは、２型糖尿病（非インスリン依存性糖尿病）の治療のためおよび／または耐糖能障害、空腹時グルコース障害、低血糖症、および／または２型糖尿病の進行に伴う肥満症を有する患者を予防するために使用できる。
【００６７】
薬剤組成物
本発明のポリペプチドは、非経口投与のための薬剤組成物を形成するために適当な薬剤キャリヤと組み合わせてもよい。このような組成物は、ポリペプチドの治療的に有効な量および薬剤的に許容できるキャリヤまたは賦形剤を含んでなる。薬剤的に許容できるキャリヤには、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノールおよびそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定はされない。処方は投与の方法に適しなければならない。
【００６８】
薬剤組成物は、都合の良い様式、例えば経口、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻内、または皮膚内経路により投与してもよい。薬剤組成物は、特定の徴候の治療および／または予防のために有効な量で投与される。適当な投与量は、１日あたりに活性ポリペプチド（すなわちＰＥＧまたは脂肪酸部分の質量を含まない）少なくとも約３．５ｎｇ／ｋｇ（体重）から約１００μｇ／ｋｇ（体重）までの範囲である。多くの場合に、投与量は投与経路、症状などを考慮して一日あたりに約０．１μｇ／ｋｇ（体重）から約３５μｇ／ｋｇ（体重）まで（すなわち、０．１、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、および３５μｇ／ｋｇ）である。これらの数字は、生体内でのペプチドの生物学的利用能を考慮に入れていず、その場合には所望の有効投与量を達成するためにより多量またはより少量を使用してもよい。投与量の決定は通常の熟練者の技能の範囲内でありそして日常的なスクリーニングのみを要求する。
【００６９】
本発明のポリペプチドは、糖尿病、空腹時グルコース障害、耐糖能障害、高血糖症、および肥満症の治療に有用なその他の薬剤と組み合わせて使用してもよい。適合する薬剤には、インスリン分泌促進剤、インスリンセンシタイザー、およびメトホルミンＨＣｌが含まれる。
【００７０】
キット
本発明は、本発明の薬剤組成物の１種またはそれ以上の成分と共に充填した１個またはそれ以上の容器を含んでなる薬剤包装またはキットも提供する。薬剤または生物学的製品の製造、使用または販売を統制する政府当局により規定され、そして当局による承認を反映した書式による注意書きを包装またはキットに添付できる。
【００７１】
遺伝子治療
本発明のポリペプチドは生体内で発現されてもよく、これは「遺伝子治療」と呼ばれることも多い。従って、例えば、細胞は生体外でポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を用いて操作されそして操作された細胞は次いでポリペプチドを用いて治療されるべき患者に提供されてもよい。このような方法は、当該技術分野では周知である。例えば、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子の使用による当該技術分野で公知の方法により細胞を操作してもよい。
【００７２】
好ましい態様では、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡは糖尿病のような障害のための遺伝子治療に使用される。この態様に従い、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを用いる遺伝子治療は、診断が必要であるか、それと同時であるか、またはその直後に患者に提供される。
【００７３】
遺伝子治療を用いるポリペプチドの局所送達は、標的領域、すなわち膵臓へ治療薬剤を送るであろう。例えば、膵臓特異性プロモーターは、ベータ−細胞腫瘍マウスモデルを創成するために使用された（ハナハン（Ｈａｎａｈａｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５（６０１５）：１１５−２２，１９８５））。
【００７４】
生体外および生体内の双方の遺伝子治療方法体系が意図されている。特定された細胞集団に潜在的な治療遺伝子を転移するための数種の方法が知られている。例えばマリガン（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−３１，１９９３）参照。これらの方法は下記を含む。
【００７５】
１）直接遺伝子転移。例えばウルフら（Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｄｉｒｅｃｔ
Ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｉｎｔｏ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７：１４６５−６８，１９９０）参照。
【００７６】
２）リポソーム−媒介ＤＮＡ転移。例えばカプレンら（Ｃａｐｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＣＦＴＲ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｔｏ  Ｔｈｅ  Ｎａｓａｌ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  Ｏｆ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ｃｙｓｔｉｃ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．３；３９−４６，１９９５）；クリスタル（Ｃｒｙｓｔａｌ，”Ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ  Ａｓ  Ａ  Ｄｒｕｇ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．１：１５−１７，１９９５）；ガオおよびフアン（Ｇａｏ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，”Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｃａｔｉｏｎｉｃ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｆｏｒ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ，”Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７９：２８０−８５，１９９１）参照。
【００７７】
３）レトロウイルス−媒介ＤＮＡ転移。例えばケイら（Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｏｆ  Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ  Ｂ：Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  Ｐａｒｔｉａｌ  Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  Ｉｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ−Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  Ｄｏｇｓ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１１７−１９，１９９３）；アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，”Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：８０８−１３，１９９２）参照。
【００７８】
４）ＤＮＡウイルス−媒介ＤＮＡ転移。このようなＤＮＡウイルスには、アデノウイルス（好ましくはＡｄ−２またはＡｄ−５を基とするベクター）、ヘルペスウイルス（好ましくは単純疱疹ウイルスを基とするベクター）、およびパルボウイルス（好ましくは「欠陥」または非−自律性パルボウイルスを基とするベクター、さらに好ましくはアデノ随伴ウイルスを基とするベクター、最も好ましくはＡＡＶ−２を基とするベクター）。例えばアリら（Ａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  ＤＮＡ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  Ａｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，”Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：３６７−８４，１９９４）；米国特許第４，７９７，３６８号明細書、および米国特許第５，１３９，９４１号明細書参照。
【００７９】
遺伝子治療ベクター系
関係する遺伝子を転移するための特定のベクター系の選択は、さまざまな因子に依存する。一つの重要な因子は、標的細胞集団の性質である。レトロウイルスベクターは広範に研究されそして多数の遺伝子治療用途に使用されているが、これらのベクターは一般に非−分裂細胞を感染するためには不適である。さらに、レトロウイルスは発癌の可能性を有する。しかし、レンチウイルスベクターの分野における最近の発展は、これらの限界の一部を回避するであろう。例えばナルディニら（Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：２６３−７，１９９６）参照。
【００８０】
熟練者は、本発明のポリペプチドをコードするあらゆる適合する遺伝子治療ベクターがこの態様に従って使用できることを認めるであろう。このようなベクターを構築するための技術は公知である。例えばアンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３９２
２５−３０，１９９８）；ヴェルマおよびソニア（Ｖｅｒｍａ  ａｎｄ  Ｓｏｎｉａ，Ｎａｔｕｒｅ  ３８９  ２３９−２４２，１９９８）参照。標的部位へのベクターの導入は、公知の技術を用いて達成されるであろう。
【００８１】
適当な遺伝子治療ベクターは１個またはそれ以上のプロモーターを含む。使用してもよい適当なプロモーターには、ウイルスプロモーター（例えばレトロウイルスＬＴＲ、ＳＶ４０プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、呼吸シンシチアウイルスプロモーター、Ｂ１９パルボウイルスプロモーター、およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター：ミラーら（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ７（９）：９８０−９９０，１９８９）に記載、細胞プロモーター（例えばヒストンｐｏｌ  ＩＩＩ、およびβ−アクチンプロモーター）、および誘導性プロモーター（例えばＭＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモーター、および熱ショックプロモーター）が含まれるが、これらに限定はされない。適合するプロモーターの選択は、本明細書中に含まれる教示より当該技術分野の熟練者には明らかであろう。
【００８２】
レトロウイルス
上記のレトロウイルスプラスミドベクターが誘導されるレトロウイルスには、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、例えばラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳ガンウイルスなどのレトロウイルスが含まれるが、これらに限定はされない。一つの態様では、レトロウイルスプラスミドベクターはモロニーマウス白血病ウイルスより誘導される。
【００８３】
レトロウイルスプラスミドベクターは、パッケージング細胞系統を形質導入してプロジューサー細胞系統を形成するために使用される。トランスフェクションされてもよいパッケージング細胞の例には、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、ψ−２、ψ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ψＣＲＥ、ψＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２、およびミラー（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１：５−１７，１９９０）に記載のＤＡＮ細胞系統が含まれるが、これらに限定はされない。ベクターは、当該技術分野で既知のあらゆる手段を介してパッケージング細胞を形質導入してもよい。このような手段には、エレクトロポレーション、リポソーム使用、およびＣａＰＯ４  沈降が含まれるが、これらに限定はされない。一つの別方法では、レトロウイルスプラスミドベクターはリポソーム内にカプセル化、または脂質にカプリングされ、次いで宿主に適用されてもよい。プロジューサー細胞系統は、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含む感染性レトロウイルスベクター粒子を生成する。次いで、このようなレトロウイルスベクター粒子を生体外または生体内のいずれかで真核生物細胞に形質導入するために使用してもよい。形質導入された真核生物細胞は、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を発現するであろう。形質導入できる真核生物細胞には、胚幹細胞、胚ガン細胞、ならびに造血幹細胞、肝細胞、繊維芽細胞、筋芽細胞、角質細胞、上皮細胞、および喘息内皮細胞が含まれるが、これらに限定はされない。
【００８４】
アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス
アデノウイルスは、これらが広い宿主範囲を有し、休止または終末分化細胞、例えばニューロンまたは肝細胞に感染でき、そして本質的に発癌性とは認められないという利点を有する。例えばアリら（Ａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，３６７ページ）参照。アデノウイルスは、宿主ゲノム内に組み込まれるとは認められない。これらが染色体外に存在するので、挿入変異誘発の危険は大幅に低下する。アリら（Ａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，３７３ページ）。
【００８５】
アデノ随伴ウイルスは、アデノウイルスに基づくベクターと同様の利点を示す。しかし、ＡＡＶはヒト染色体１９上で部位特異性組込みを示す（アリら（Ａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，３７７ページ））。
【００８６】
トランスカリオティック（ｔｒａｎｓｋａｒｙｏｔｉｃ）治療
別の遺伝子治療の方法は、患者への再導入の後に関連するタンパク質を産生するために休止染色体遺伝子を誘導するために生体内で患者の細胞を処理する「トランスカリオティック治療」である。トランスカリオティック治療では、活性化のために必要な通常の遺伝子補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を個体が有すると考える。トランスカリオティック治療は、新生の遺伝子を活性化できるプロモーターまたは他の外因性調節配列を生体外で患者の細胞の染色体ＤＮＡ内に導入し、活性タンパク質産生細胞を培養および選択し、次いでそれらが完全に確立されるという意図で活性化細胞を患者内に再度導入することを含む。次いで、「遺伝子活性化」細胞はいくらかの重要な時間、多分患者の生涯の長さにわたって関係するタンパク質を産生する。米国特許第５，６４１，６７４号明細書および米国特許第５，７３３，７６１号明細書は、この概念を詳細に開示している。
【００８７】
本発明がさらに良く理解されるために、下記の実施例を記載する。これらの実施例は、例示の目的のみであり、そしていかなる様式でも本発明の範囲を限定すると考えれはならない。本開示内に引用されたすべての特許、特許出願、および文献は、引用することによりその全体を本明細書中に組み込まれる。
【実施例１】
【００８８】
ペプチド合成方法
下記の一般手順を本発明のポリペプチドの一部を合成するために利用した。ペプチド合成は、ＦＭＯＣ／ｔ−ブチル戦略（マイケル  Ｗ．ペニントンおよびベン  Ｍ．ダンによるペプチド合成プロトコール（１９９４）、第３５巻（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（１９９４），Ｖｏｌｕｍｅ３５  ｂｙ  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｗ．Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｂｅｎ  Ｍ．Ｄｕｎｎ））により、連続流通条件下、ラップポリマーＰＥＧポリスチレン樹脂（ラップ−ポリマー、チュービンゲン（Ｒａｐｐ−Ｐｏｌｙｍｅｒｅ，Ｔｕｂｉｎｇｅｎ、ドイツ））を用いて行った。合成が完了すると、ペプチドを樹脂から切断しそしてＴＦＡ／ＤＤＴ／Ｈ２  Ｏ／トリイソプロピルシラン（８８／５／５／２）を用いて脱保護した。冷ジエチルエーテルを用いてペプチドを切断カクテルから沈降させた。沈降物を冷エーテルを用いて３回洗浄し次いで冷凍乾燥の前に５％酢酸中に溶かした。ペプチドの真正性は、アセトニトリル０％から１００％の勾配を有する３％ＴＦＡを含む水／アセトニトリルを用いるウオーターズ  アライアアンス（ＡＬＬＩＡＮＣＥ）（ＴＭ）システム（ウオーターズ社（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔ
ｉｏ  ｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ））上のＹＭＣ−パックＯＤＳ−ＡＱカラム（ワイエムシー社（ＹＭＣ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＮＣ））上の逆相クロマトグラフィーにより、そしてＶＯＹＡＧＥＲ  ＤＥＴＭ  ＭＡＬＤＩ質量分光分析計（モデル５−２３８６−００、パーセティヴ  バイオシステムズ社（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）上のＭＡＬＤＩ質量分光分析により確認した。マトリックス緩衝液（５０／５０ｄＨ２  Ｏ／アセトニトリル、３％ＴＦＡ含有）ペプチド試料をマトリックス緩衝液１／１に加えた。９５％を越えるという純度基準を満たしていないこれらのペプチドは、ウオーターズ  デルタ  プレップ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｄｅｌｔａ  Ｐｒｅｐ）４０００ＨＰＬＣシステム（ウオーターズ社、Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）上の逆相クロマトグラフィーにより精製した。
【実施例２】
【００８９】
ペプチドクローニング
本発明のポリペプチドおよびその変異体を発現するための確定した方法を確立するために、モノマー状ペプチドとＧＳＴを分離する単一の第Ｘａ因子認識部位を有するＧＳＴに、Ｃ−末端においてポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をクローニングする。産生されるべきペプチドのＤＮＡ配列に融合された第Ｘａ因子認識部位をコードする遺伝子は、クローニングされるべきポリヌクレオチドのＤＮＡ配列に対して直接５’にあるＢａｍＨＩまたはＥｃｏＲＩ制限酵素部位を含む２個の重複した一本鎖ＤＮＡ断片（７０〜９０量体）をハイブリダイズし、次いでＤＮＡポリメラーゼ（ライフ・テクノロジー社（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）の大きい断片を介する反対鎖のＤＮＡ合成により合成した。
【００９０】
それぞれのポリヌクレオチドのために選択されたＤＮＡ配列は、それぞれのペプチドの設計されたアミノ酸配列の逆翻訳に基づいた。ある場合には、ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、上記の方法によりすでに作製されたポリヌクレオチドのＰＣＲ変異誘発（ピカードら（Ｐｉｃａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２２：２５８７−９１，１９９４）；サンブルックら「分子クローニング：実験室マニュアル」第二版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ））により産生される。次いで二本鎖産物をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩにより消化しそしてこれもＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩにより切断されたｐＧＥＸ−６Ｐ−１（アマーシャム  ファルマシア  バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）内に結合した。
【００９１】
例えば、配列番号７と同定されたポリペプチドのＤＮＡ配列をｐＧＥＸ−６Ｐ−１内にクローニングすると、下記のポリペプチド配列がグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）：ＩＥＧＲＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＡＫＹＬＤＡＲＲＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧ（配列番号３３）との融合物として発現され、ここで最初の４個のアミノ酸、ＩＥＧＲが第Ｘａ因子認識部位でありそして残りの３１個のアミノ酸は配列番号７として同定されたアミノ酸配列である。
【００９２】
配列番号７として同定されたポリペプチドをコードする核酸配列の最初および最後の６個のヌクレオチドは、ｐＧＥＸ６Ｐ−１プラスミド内にクローニングするために使用された制限酵素部位（ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ）を表す（図１）。ＥｃｏＲＩ部位（”ＧＡＡＴＴＣ”）の直前の”ＴＡＡＴＧＡ”配列は、２個の終止コドンをコードする。ＤＮＡ配列の残部は、配列番号７融合配列として同定された第Ｘａ因子ポリペプチドをコードする。
【実施例３】
【００９３】
ペプチド組換え体発現および精製
プラスミドを含むＧＳＴ−ペプチド融合を用いて形質転換したＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））をＯＤ６００  が０．６〜１．０に達するまで３７℃で培養しそして２時間、３７℃で１ｍＭ  ＩＰＴＧ（ライフ  テクノロジーズ）により誘導した。細胞２リットルを７，７００ｘｇで１５分間スピンし、そして−２０℃で貯蔵した。細胞ペレットを細胞懸濁液が均質となるまで、８０ｍｌ  Ｂ−ＰＥＲ細菌タンパク質抽出剤（カタログ番号７８２４８、ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ））および１ｘ完全プロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））中に再懸濁した。均質混合物を穏やかに室温で１０分間振とうした。リソソームおよびＤｎａｓｅ  Ｉを最終濃度それぞれ２００μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌとなるまで加えてタンパク質をさらに可溶化しそしてそれぞれ粘度を低下させた。混合物をさらに５分間インキュベーションした。細胞残さを２７，０００で２０分間遠心沈殿させた。上清を洗浄前のグルタチオン・セファロース（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）４Ｂ樹脂（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））２ｍＬと振とう機上、４℃で混合した。樹脂を１，５００ｇで１５分間遠心沈殿し、空のポリ−プレプ（Ｐｏｌｙ−Ｐｒｅｐ）クロマトグラフィーカラム（バイオ−ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））内に充填し、３０ｍＬ  ＰＢＳ、次いで第Ｘａ因子緩衝液（１ｍＭ  ＣａＣＯ３  、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、および５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）１０ｍＬを用いて洗浄した。第Ｘａ因子緩衝液１ｍＬ中の第Ｘａ因子（ファルマシア）６０単位を用い、一晩、４℃でペプチドをカラムから切断した。次いでこれらの溶出液をＣ１８ＨＰＬＣ（ベックマン  システム  ゴールド（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｇｏｌｄ））上で、2 ｍＬループを用いそして下記のプログラムにより１ｍＬ／分の流量で流した：緩衝液Ａ（０．１％ＴＦＡ／Ｈ２  Ｏ）５分間、１００％緩衝液Ｂ（０．１％ＴＦＡ／ＡＣＮ）までの勾配３０分間、緩衝液Ａ１０分間、勾配１０分間、および緩衝液Ａ１０分間。ピーク画分（それぞれ０．５ｍＬ）を捕集しそして１０−２０％トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）−ＳＤＳゲル電機泳動によりスクリーニングした。それぞれのペプチドの真正性は、アミノ酸配列より予測される質量を用いる質量分析により確認した。典型的な収量は、大腸菌カルチャーリットルあたりに遊離ペプチド約５０μｇであった。組換えペプチドは、それらの合成物と同一の活性を有することが証明された。
【００９４】
下記の表２は、以上に考察したペプチド合成プロトコール（実施例１）に従い、または上記の組換えにより作製した一部の選択されたポリペプチドを含む。
【００９５】
【表２】
2005508639.tif 000004
【００９６】
（ＦＡ）：リシン残基に結合したＣ１６パルミチン酸
（２２ｋＤ）：システイン残基に結合した２２ｋＤ  ＰＥＧ
（４３ｋＤ）：システイン残基に結合した４３ｋＤ  ＰＥＧ
【実施例４】
【００９７】
ＲＩＮｍ５Ｆ細胞膜の調製
ＲＩＮｍ５Ｆ細胞のフラスコをＰＢＳを用いて洗浄し、プロテアーゼ阻害剤（ＨＥＳ）を含む２０ｍＬ  Ｈｅｐｅｓ−１ｍＭ  ＥＤＴＡ−２５０ｍＭスクロース緩衝液中にかき落とし、ダウンス（ｄｏｕｎｃｅ）ホモジナイザー中でホモジナイズし、次いで２３ゲージ針を通して再懸濁を反復した。破壊されなかった細胞および核を５００ｘｇの遠心分離５分間で除去した。ペレットを２３ゲージ針を用いてＨＥＳ緩衝液中に再懸濁しそして遠心分離を反復した。２回のスピンよりの上清を一緒にし、そして４０，０００ｘｇで２０分間遠心分離した。得られた細胞膜ペレットを２３ゲージ針、次いで２５ゲージ針を用いてＨＥＳ緩衝液中に再懸濁した。膜は−８０℃で使用するまで保管した。
【実施例５】
【００９８】
ラット肝臓からの細胞膜の調製
ラットを屠殺しそして肝臓を取り出して氷冷ＴＥＳ緩衝液（プロテアーゼ阻害剤を含む２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２５５ｍＭスクロース）に入れた。肝臓の湿潤質量を測定しそして組織を５体積の氷冷ＴＥＳ緩衝液中で細分しそしてポリトロン（ｐｏｌｙｔｒｏｎ）を用いてスラリーを調製した。すべての緩衝液およびスピン液を４℃に保持した。スラリーを手持ち型ダウンスホモジナイザーの３ストロークを用いてさらにホモジナイズした。ホモジネートを数層のチーズクロースを通しそして２５，０００ｘｇで１０分間スピンした。ペレットを２２．１ｍｌＴＥＳ中で手持ち型ダウンスホモジナイザーの１０ストロークを用いてホモジナイズした。ＴＥ中の２．４Ｍスクロース２７．９ｍＬを加え、そして良く混合した。ホモジネートを数本の試験管に分配し、そしてそれぞれの試験管の上にＴＥＳ緩衝液７ｍＬを加えた。試験管を１２０，０００ｘｇで６０分間スピンした。細胞膜をスピンの間に形成された界面から取り去り、ＴＥＳ中で希釈しそして２００，０００ｘｇで１５分間のスピンを用いて濃縮した。得られたペレットを９．８ｍＬＴＥＳ緩衝液中で再度ホモジナイズし、２．４ｍスクロース１０．３ｍｌと一緒にし、ＴＥＳ  ７ｍＬを上に加え、そして１８０，０００ｘｇで３０分間遠心分離した。細胞膜を界面から取り出し、ＴＥＳ緩衝液を用いて希釈し、そして２００，０００ｘｇ、１５分間遠心分離して捕集した。最終ペレットをＴＥＳ中に再懸濁した。細胞膜を使用するまで−８０℃で保管した。
【実施例６】
【００９９】
ラット肝細胞の調製
ベリーおよびフレンド（Ｂｅｒｒｙ  ａｎｄ  Ｆｒｉｅｎｄ（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４３：５０６，１９６９））の変更方法に従って肝細胞を単離した。飼育（ｆｅｄ）した雄ウイスター（Ｗｉｓｔｅｒ）ラットをナトリウムペントバルビタール（５５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を用いて麻酔した。肝臓灌流装置のトレー上にラットを寝かせ（３７℃）、そしてその四肢を実験用テープで固定した。腹（ｖｅｎｔｒｉｃａｌ）表面を７０％アルコールを用いて洗浄し、そして腹腔を鋏を用いて切開して肝臓、門脈、肝動脈および後大静脈を暴露させた。３個の臓器の回りをゆるく結さつした。門脈内にカニューレを挿入しそして結さつを用いて固定した。肝動脈および肝臓下の後大静脈を結さつを用いて縛った。灌流ポンプを始動し、そして緩衝液を逃出させそしてラットを除血するために直ちに下行動脈を切断した。胸腔を手早く開けて心臓を暴露した。心臓を通って上大静脈内にカニューレを挿入しそして肝臓を通る緩衝液の循環を完全にするために心臓を結さつを用いて固定した。５〜１０％ヒツジＲＢＣを含むクレブス−ヘンゼライト（Ｋｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ）緩衝液で肝臓に灌流しそしてその場で流量１４ｍｌ／分で一定の９５％Ｏ２  ／５％ＣＯ２  流中に置いた。非循環系内で５分間これを灌流し次いで再循環系（３０ｍｇコラゲナーゼを含む）によりさらに３０分間灌流した。次いで肝臓を取り外し、プラスチックビーカー内で鋏を用いて細分しそしてナイロンふるいを通して濾過した。肝細胞を残さから一連の緩衝液洗浄および遠心分離（６９０ｒｐｍ、室温、９０秒間）により分離した。細胞の試料を緩衝液を用いて希釈し、０．４％トリパン・ブルー（Ｔｒｙｐａ
ｎ  Ｂｌｕｅ）を用いて染色しそして計数した。細胞の残りは緩衝液を用いて希釈してそれぞれのアッセイに適合する密度とした。
【実施例７】
【０１００】
ラット膵島単離のプロトコール
スプラーグ・ドーレイ（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）ラット（２７５−３２０ｇ）をドナー膵島の供給元として使用した。要約すると、冷間再構成リベラーゼ（Ｌｉｂｅｒａｓｅ）ＲＩ（ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｈｅｉｍ）１０ｍｌを用いて膵臓を充満させ、採取し、そして追加の酵素溶液５ｍＬを用いて水浴中で３０分間インキュベーションした。組織懸濁液を冷１０％ＦＢＳ／ハンクス（Ｈａｎｋｓ）緩衝液（ジブコ（Ｇｉｂｃｏ））を用いて２回洗浄し、８ｍｌ２５％フィコール（ｆｉｃｏｌ）（シグマ（Ｓｉｇｍａ））中に再懸濁し、次いでそれぞれ２３％、２０％および１１％フィコールそれぞれ５ｍＬを用いて層分けした。遠心分離後の２０％層内の膵島を取り出し、冷１０％ＦＢＳ／ハンク緩衝液を用いて２回洗浄しそして１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０媒体（シグマ）中に再懸濁した。
【実施例８】
【０１０１】
ＲＩＮｍ５Ｆ細胞細胞膜内のＧＬＰ−１受容体へのペプチドの競合結合
ＲＩＮｍ５Ｆ膜内のＧＬＰ−１受容体への本発明のポリペプチドおよびポリペプチド断片、変種、および類似体の競合結合のＩＣ５０値は、典型的には少なくとも約０．０１ｎＭから約２０ｎＭまで（すなわち、０．０１、０．１、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ｎＭ）である。本発明のポリペプチド誘導体のＩＣ５０値は、典型的には少なくとも約０．０１ｎＭから約５００ｎＭまで（すなわち、０．０１、０．１、１、１０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ｎＭ）である。
【０１０２】
ＲＩＮｍ５Ｆ細胞細胞膜への本発明の一部のポリペプチドの競合結合を下記のようにして測定した。９６ウエルＧＦ／Ｃ濾過プレート（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ））を少なくとも１時間、０．３％ＰＥＩを用いてブロックしそして２０ｍＭトリス、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、および１ｍｇ／ｍｌバシトラシンより成る結合緩衝液を用いて２回洗浄した。結合緩衝液中で希釈したＲＩＮｍ５Ｆ細胞細胞膜５μｇを、０．０５μＣｉ  １２５Ｉ標識ＧＬＰ−１および１ｘ１０−１２  〜１ｘ１０−５Ｍの範囲のペプチド濃度と一緒にそれぞれのウエルに加えた。室温で６０分間インキュベーションの後、１ｍｇ／ｍｌＢＳＡを含む氷冷ＰＢＳを用いてプレートを３回洗浄した。プレートを乾燥し、シンチレーション剤をそれぞれのウエルに加え、そしてウエルあたりのｃｐｍをウォラック・マイクロベータ（Ｗａｌｌａｃ  Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ）カウンターを用いて測定した。
【０１０３】
ペプチドのそれぞれの濃度において膜に結合した  １２５Ｉカウントの数をプロットしそしてプリズム（Ｐｒｉｚｍ）ソフトウエアを用いる非線型回帰により分析してＩＣ５０を決定した。表２に開示したポリペプチドは、ＲＩＮｍ５Ｆ細胞より単離した細胞膜内に存在するＧＬＰ−１受容体に１．４ｎＭと２４８ｎＭの間のＩＣ５０値で結合した（３回の試験の最小より決定）。ＩＣ５０は、標識されたＧＬＰ−１（７−３６）（配列番号２）の最大結合が５０％低下するポリペプチドの濃度である。
【実施例９】
【０１０４】
ラット肝臓細胞膜内のグルカゴン受容体へのペプチドの競合結合
ラット肝臓膜中のグルカゴン受容体への本発明のポリペプチドおよびポリペプチド断片、変種、および類似体の競合結合のＩＣ５０値は、典型的には少なくとも約０．１ｎＭから約１０００ｎＭまで（すなわち、０．１、１、１０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、または１０００ｎＭ）である。
【０１０５】
ラット肝臓細胞膜への本発明の一部のポリペプチドの競合結合を下記のようにして測定した。９６ウエルＧＦ／Ｃ濾過プレート（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ））を少なくとも１時間、０．３％ＰＥＩを用いてブロックしそして２０ｍＭトリス、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、および１ｍｇ／ｍｌバシトラシンより成る結合緩衝液を用いて２回洗浄した。結合緩衝液中で希釈したラット肝臓細胞膜３μｇを、０．０５μＣｉ  １２５Ｉ標識グルカゴンおよび１ｘ１０−１２  〜１ｘ１０−５Ｍの範囲のペプチド濃度と一緒にウエルあたりに加えた。室温で６０分間インキュベーションの後、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含む氷冷ＰＢＳを用いてプレートを３回洗浄した。プレートを乾燥し、シンチレーション剤をそれぞれのウエルに加え、そしてウエルあたりのｃｐｍをウォラック・マイクロベータカウンターを用いて測定した。
【０１０６】
ペプチドのそれぞれの濃度における膜に結合した  １２５Ｉカウントの数をプロットしそしてプリズムソフトウエアを用いる非線型回帰により分析してＩＣ５０を決定した。表２に開示したポリペプチドは、ラット肝臓より単離した細胞膜内に存在するグルカゴン受容体に１１．７ｎＭと７２６ｎＭの間のＩＣ５０値で結合した（３回の試験の最小より決定）。ＩＣ５０は、標識されたグルカゴンの最大結合が５０％低下するポリペプチドの濃度である。
【実施例１０】
【０１０７】
環状ＡＭＰシンチレーションプロキシミティー（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ）アッセイ（ＳＰＡ）を用いるＧＬＰ−１受容体を介するペプチド信号伝達の測定
本発明のポリペプチドおよびポリペプチド断片、変種、および類似体について、ｃＡＭＰシンチレーションプロキシミティーアッセイにおけるＧＬＰ−１受容体の「活性化」は、少なくとも約４％から約１０００％まで（すなわち、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００％）の相対効力（ｐｏｔｅｎｃｙ）を有する天然のＧＬＰ−１（７−３６）（配列番号２）により誘導される最大活性の少なくとも約８０％から約２００％まで（すなわち、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、または２００％）である最大活性の誘導である。本発明のポリペプチド誘導体について、ｃＡＭＰシンチレーションプロキシミティーアッセイにおけるＧＬＰ−１受容体の「活性化」とは、少なくとも約０．５％から約１０００％まで（すなわち、０．５、１、１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００％）の相対効力を有する本来のＧＬＰ−１（７−３６）（配列番号２）により誘導される最大活性の少なくとも約８０％から約２００％まで（すなわち、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、または２００％）である最大活性の誘導である。「相対効力」とは、天然のＧＬＰ−１（７−３６）（配列番号２）のＥＣ５０を本発明のポリペプチドのＥＣ５０で割って１００倍したものである。「ＥＣ５０」とは、最大活性の５０％が達成されるポリペプチドの濃度である。
【０１０８】
ｃＡＭＰシンチレーションプロキシミティーアッセイを用いる本発明の一部のポリペプチドについてのＧＬＰ−１受容体のペプチド信号伝達は下記のように測定された。ＲＩＮｍ５Ｆ細胞を１．５ｘ１０５  細胞／ウエルで９６−ウエルプレート（コスター（Ｃｏｓｔａｒ））内にプレーティングしそしてＲＰＭＩ  １６４０、５％ＦＢＳ、抗生物質／抗真菌物質（ジブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）中で２４時間、３７℃で培養した。培地を取り除きそして細胞をＰＢＳを用いて２回洗浄した。１％ＢＳＡおよび１００μＭ  ＩＢＭＸを含むＨｅｐｅｓ−ＰＢＳ中で１５分間、３７℃で、１ｘ１０−１２  〜１ｘ１０−５Ｍの範囲内のペプチド濃度で細胞をインキュベーションした。脂肪酸と結合したペプチドのアッセイのために、インキュベーション緩衝液からＢＳＡを除いた。インキュベーション緩衝液を取り除き、そして細胞をｃＡＭＰシンチレーションプロキシミティーアッセイ（ＳＰＡ）直接スクリーニングアッセイシステム（アマーシャム  ファルマシア  バイオテク社、Ｐｉｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）と一緒に提供される溶菌試薬中で細胞を溶菌した。溶菌液中に存在するｃＡＭＰの量（ｐｍｏｌで表す）は、このキットと共に提供された指示に従って決定した。
【０１０９】
ペプチドのそれぞれの濃度で産生されるｃＡＭＰの量（ｐｍｏｌで表す）をプロットし、そしてプリズムソフトウエアを用いる非回帰法により分析してそれぞれのペプチドについてＥＣ５０を決定した。表２に開示したポリペプチドに対するＧＬＰ−１受容体活性化のための平均相対効力値は、０．６％から７６．１％までであった。誘導された最大活性は、本来のペプチドＧＬＰ−１（７−３６）（配列番号２）の８３％〜１３２％の範囲であった（３回の試験の最小より決定）。表４参照。
【実施例１１】
【０１１０】
環状ＡＭＰシンチレーションプロキシミティーアッセイ（ＳＰＡ）を用いるグルカゴン受容体を介するペプチド信号伝達の測定
本発明のポリペプチドおよびポリペプチド断片、変種、および類似体について、ｃＡＭＰシンチレーションプロキシミティーアッセイにおけるグルカゴン受容体の「活性化」は、少なくとも約０．００１％から約５％まで（すなわち、０．００１、０．０１、０．１、１、２、３、４、または５％）の相対効力を有する天然のグルカゴン（配列番号１）により誘導される最大活性の少なくとも約０％から約７５％まで（すなわち、０、１０、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、または７５％）である最大活性の誘導である。本発明のポリペプチド誘導体について、ｃＡＭＰシンチレーションプロキシミティーアッセイにおけるグルカゴン受容体の「活性化」とは、少なくとも約０．００１％から約１％まで（すなわち、０．００１、０．０１、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、または１％）の相対効力を有する天然のグルカゴン（配列番号１）により誘導される最大活性の少なくとも約０％から約４０％まで（すなわち、０、１、１０、２０、３０、または４０％）である最大活性の誘導である。「相対効力」とは、天然のグルカゴン（配列番号１）のＥＣ５０を本発明のポリペプチドのＥＣ５０で割って１００倍したものである。「ＥＣ５０」とは、最大活性の５０％が達成されるポリペプチドの濃度である。
【０１１１】
ｃＡＭＰシンチレーションプロキシミティーアッセイを用いる本発明の一部のポリペプチドについてのグルカゴン受容体のペプチド信号伝達は下記のように測定された。新たに単離したラット肝細胞を７．５ｘ１０４  細胞／ウエルまたは２ｘ１０５  細胞／ウエルで１％ＰＢＳおよび１００μＭ  ＩＢＭＸを含むＨｅｐｅｓ−炭酸水素塩−ＰＢＳ中で９６−ウエルプレート内にプレーティングした。５％ＣＯ２  ／９５％Ｏ２  環境中、３７℃で１０分間の平衡化の後、１ｘ１０−１２  〜１ｘ１０−５Ｍの範囲内の濃度のペプチドをさらに１５分間で加えた。プレートを短時間で遠心分離し、インキュベーション緩衝液を除き、そして細胞をｃＡＭＰシンチレーションプロキシミティーアッセイ（ＳＰＡ）直接スクリーニングアッセイシステム（アマーシャム  ファルマシア  バイオテク社、Ｐｉｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）と共に提供される溶菌試薬中で細胞を溶菌した。
【０１１２】
溶菌液中に存在するｃＡＭＰの量（ｐｍｏｌで表す）は、このキットと一緒に提供された指示に従って決定した。ペプチドのそれぞれの濃度で産生されるｃＡＭＰの量（ｐｍｏｌで表す）をプロットし、そしてプリズムソフトウエアを用いる非回帰法により分析してそれぞれのペプチドについてＥＣ５０を決定した。本発明のポリペプチドに対するグルカゴン受容体活性化のための平均相対効力値（５０％反応におけるグルカゴン濃度のペプチド濃度（ＥＣ５０）に対する比ｘ１００、３回の試験の最小より決定）は、５％未満であった。最大活性は、天然のペプチドグルカゴン２８．３％〜７１．３％の範囲で誘導された（３回の試験の最小より決定）。
【０１１３】
グルカゴン活性を阻害するハイブリッドペプチドの能力は以下のようにして測定された：３７℃、５％ＣＯ２  ／９５％Ｏ２  環境内で１０分間の平衡化の後、１０μＭペプチドを細胞に加え、直後に１５分間、グルカゴン準最大（ｓｕｂｍａｘｉｍａｌ）濃度とした。細胞を溶菌しそしてｃＡＭＰを上記のようにして決定した。
【０１１４】
それぞれのデータ点から非刺激肝細胞内で産生されたｃＡＭＰの量を差し引いた後、阻害百分率は以下のようにして算出した：阻害百分率は、準最大グルカゴン単独の存在下で産生されたｃＡＭＰの量から、準最大グルカゴンおよび１０μＭペプチドの存在下で産生されたｃＡＭＰの量を差し引き、準最大グルカゴン単独の存在下で産生されたｃＡＭＰの量で割りそして１００倍する。表２に開示したポリペプチドによるグルカゴン活性の平均阻害百分率は、１１．３％と５９％との間であった（３回の試験の最小より決定）。表４参照。
【実施例１２】
【０１１５】
ラット肝細胞からのグルカゴン放出の測定
ラット肝細胞からのグルコース放出により測定されるグルカゴン媒介グルコース産生の阻害は、典型的には少なくとも約２０％阻害から約１００％阻害まで（すなわち、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％）である。
【０１１６】
本発明の一部のポリペプチドによるグルカゴン媒介グルコース産生の阻害は、下記のようにして測定された。ラット肝細胞を平底９６ウエルプレート（２ｘ１０５  ／１００μｌ／ウエル）内に加えそして一定の振とうおよび９５％Ｏ２  ／５％ＣＯ２  流下で１０分間、３７℃インキュベーター内で予備インキュベーションした。肝細胞は、ペプチドを含むかまたは含まないグルカゴンを加えた後、さらに３０分間インキュベーションした。次いで１５％過塩素酸を用いて細胞を溶菌しそして２６００ｒｐｍ、４℃で１５分間、プレートをスピンした。上清を１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２．５Ｎ  ＫＯＨ（４５：５５）を用いて中和しそして再度スピンした。得られた上清をヘキソキナーゼおよびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを用いてグルコースについて分析し（「酵素分析方法」Ｈ．Ｄ．ベルマイヤー編集（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｈ．Ｕ．Ｂｅｒｍｅｙｅｒ，Ｅｄ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ））そしてｆＭＡＸプレートリーダー（モレキュラー・デバイセズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ））上でＡ３４０  を読み取った。
【０１１７】
グルコース産生量は、それぞれのデータ点より非刺激肝細胞内で産生されたグルコースの量を差し引いて算出しそして阻害百分率を算出した。阻害百分率は１ｎＭグルカゴン単独の存在で産生されたグルコースの量から１ｎＭグルカゴンおよび１００ｎＭペプチドの存在で産生されたグルコースの量を差し引き、１ｎＭグルカゴン単独の存在で産生されたグルコースの量で割り、そして１００倍したものである。配列番号６に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドは３回の試験から決定するとグルカゴン媒介グルコース産生を４７％阻害した。表２参照。
【実施例１３】
【０１１８】
灌流ラット膵島によるインスリン分泌の測定
このアッセイにおける灌流ラット膵島によるインスリン分泌の増加は、少なくとも１．５倍の増加である。本発明のポリペプチドのＧＬＰ−１受容体アゴニスト成分は、灌流膵島よりのインスリン分泌を少なくとも１．５倍から約１０倍まで（すなわち、１．５、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、または１０倍）増加する。
【０１１９】
本発明の一部のペプチドにより媒介される灌流ラット膵島のインスリン分泌は以下のようにして測定された。それらのペプチドにより刺激されたインスリン放出の２相反応は、膵島灌流により試験した。５０個の膵島を灌流室内に配置しそして３ｍＭグルコースを含むＨＥＰＥＳ−ＫＲＢを３７℃で灌流した。６０分後に、ペプチド（５０ｎＭ）を含むか含まない８ｍＭグルコースを含む緩衝液に膵島を暴露しそしてさらに３０分間灌流した。灌流液の画分をインスリン測定のために１または５分間隔で捕集した。インスリンはＥＬＩＳＡキット（アルプコ・ディアグノスティックス（Ａｌｐｃｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｗｉｎｄｈａｍ，ＮＨ））を用いて測定した。５０ｎＭの濃度において、配列番号６に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドは灌流膵島細胞からのインスリン分泌を約２倍増加し、これは５０ｎＭ  ＧＬＰ−１により達成されたものと同等である。
【実施例１４】
【０１２０】
分散ラット膵島細胞よりのインスリン分泌の測定
分散ラット膵島細胞よりのインスリン分泌の増加は、このアッセイにおいて少なくとも１．５倍の増加である。本発明のこのようなポリペプチドのＧＬＰ−１受容体アゴニスト成分は、分散膵島細胞よりのインスリン分泌を少なくとも１．５倍から約１０倍（すなわち、１．５、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、または１０倍）増加した。
【０１２１】
本発明の多数のペプチドにより媒介される分散ラット膵島のインスリン分泌は以下のようにして測定された。ランゲルハンス島をＳＤラット（２００〜２５０ｇ）よりコラゲナーゼを用いる消化方法により単離した。分散膵島細胞をトリプシンを用いる処理を介して調製し、９６穴Ｖ底プレート内に接種しそしてペレット化した。細胞を一晩、培地内で培養した。培地を吸引除去しそして細胞を３ｍＭグルコースを含むクレブス−リンゲル−ヘペス（Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ−ＨＥＰＥＳ）緩衝液を用いて３７℃で３０分間予備培養した。予備培養緩衝液を取り除きそして細胞をペプチドを含むかまたは含まない適当なグルコース濃度（例えば８ｍＭ）を含むクレブス−リンゲル−ヘペス緩衝液を用いて適当な時間、３７℃で刺激した。一部の試験では、適当な濃度のＧＬＰ−１も含まれた。上清の一部分を取り出しそしてそのインスリン含有量をＳＰＡにより測定した。結果は対照に対する倍率（ＦＯＣ）として表した。５０ｎＭの濃度において、配列番号２７に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドは分散膵島細胞からのインスリン分泌を約３倍増加した。表２参照。
【実施例１５】
【０１２２】
飼育ウイスターラット内のグルカゴン−刺激グルコース産生の測定
本アッセイにおけるグルカゴン刺激グルコース産生の阻害は、少なくとも２０％の阻害である。本発明のポリペプチドのグルカゴン受容体アンタゴニスト成分は、血中グルコース内のグルカゴン媒介上昇を阻害し、飼育ウイスターラットにおけるグルカゴン刺激グルコース産生により測定して少なくとも２０％阻害から約１００％阻害まで（すなわち、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％）である。
【０１２３】
本発明の一部のポリペプチドによる飼育ウイスターラットにおけるグルカゴン刺激グルコース産生は、以下のようにして測定された。雄ウイルターラットをイソフランガスを用いて軽く麻酔し、グルコメーター（Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ）を用いて血中グルコースのために尾より採血し、次いでビヒクル（０．９％生理食塩水＋１％ヒトアルブミン）、グルカゴン０．２９ｎｍｏｌ／ｋｇ、本発明のポリペプチド１ｎｍｏｌ／ｋｇまたはグルカゴン＋本発明のポリペプチドのいずれかの尾静脈内への注入を行った。麻酔を止めそして覚醒したラットを１０、２０および３０分後に再度尾採血した。
【０１２４】
グルコース阻害は、基礎グルコースレベル（ｄＡＵＣ）を差し引いた後のグルコース曲線下面積を分析して決定した。阻害百分率は、０．３ｎｍｏｌ／ｋｇグルカゴン単独により産生されたグルコースの量から１ｎｍｏｌ／ｋｇハイブリッドペプチドの存在下で０．３ｎｍｏｌ／ｋｇグルカゴンにより産生されたグルコースの量を差し引き、０．３ｎｍｏｌ／ｋｇグルカゴン単独により産生されたグルコースの量で割りそして１００倍したものと定義される。
【０１２５】
グルカゴン単独では血中グルコースレベルを上昇し、一方本発明のペプチド単独では血中グルコースレベルに影響がなかった。配列番号６に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドは、血中グルコースにおけるグルカゴン媒介上昇を６３％阻害した。表２参照。
【実施例１６】
【０１２６】
飼育Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおけるグルカゴン刺激グルコース産生の測定
本アッセイにおけるグルカゴン刺激グルコース産生の阻害は、少なくとも約２０％の阻害である。好ましくは、本発明のポリペプチドのグルカゴン受容体アンタゴニスト成分は、マウス中の血中グルコース内のグルカゴン媒介上昇を阻害し、飼育Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおけるグルカゴン刺激グルコース産生により測定して約２０％阻害から約１００％阻害まで（すなわち、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％）である。
【０１２７】
本発明の一部のポリペプチドによる飼育Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおけるグルカゴン刺激グルコース産生は、以下のようにして測定された。飼育雄Ｂａｌｂ／Ｃマウスにビヒクル（０．９％生理食塩水＋１％ヒトアルブミン）または１００μｇ／ｋｇ誘導化ポリペプチドをグルカゴン投与の１７時間前に皮下注入により与えた。次の日にマウスを２時間絶食し、次いで尾静脈内に１０μｇ／ｋｇグルカゴンまたはビヒクルの静脈内注入した。グルカゴン注入の直前および再度１５分後にグルコメーターを用いるグルコース測定のためにマウスの尾から採血した。
【０１２８】
それぞれのマウスについて１５分間でのグルコースの変化を算出した。次いで、ビヒクル処理群中のグルコースの平均変化を処理群内のそれぞれのマウスについてグルコースにおける変化から差し引いてグルカゴンによるグルコースの変化を得た。阻害百分率は、１０μｇ／ｋｇグルカゴン単独により産生されたグルコースの量から１００μｇ／ｋｇハイブリッドペプチドの存在下での１０μｇ／ｋｇグルカゴンにより産生されたグルコースの量を差し引き、１００μｇ／ｋｇグルカゴン単独により産生されたグルコースの量で割りそして１００倍したものと定義される。表３参照。
【０１２９】
【表３】
2005508639.tif 000005
【実施例１７】
【０１３０】
絶食ウイスターラットにおける生体内耐糖能試験（ＩＶＧＴＴ）の間の血漿インスリンレベル増加測定
本アッセイにおける血漿インスリンレベルの増加は、少なくとも２倍の増加である。好ましくは、本発明のポリペプチドのＧＬＰ−１受容体アゴニスト成分は、絶食ウイスターラットにおける生体内耐糖能試験の間の血漿インスリンレベルの増加により測定したラット内のインスリン分泌が約２倍より約５倍まで、さらに好ましくは約２倍より約１０倍まで、そしてそれよりさらに好ましくは約２倍より約２０倍まで（すなわち、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０倍）増加する。
【０１３１】
本発明の一部のポリペプチドによる絶食ウイスターラットにおける生体内耐糖能試験の間の血漿インスリンレベルは、以下のようにして測定した。雄ウイスターラットを一晩絶食し次いでイソフランガスを用いて麻酔した。ラットにグルコース０．４ｇ／ｋｇと、ビヒクル（０．９％生理食塩水＋１％アルブミン）またはＧＬＰ−１  １ｎｍｏｌ／ｋｇ（陽性対照）または本発明のポリペプチド１ｎｍｏｌ／ｋｇのいずれかを加えて尾部静脈注入した。ラットは１分後にアイブレッド（ｅｙｅ−ｂｌｅｄ）しそしてＥＬＩＳＡキット（アルプコ  ディアグノスティックス（Ｗｉｎｄｈａｍ，ＮＨ））を用いてインスリンについて血漿をアッセイした。１ｎｍｏｌ／ｋｇの濃度において、配列番号６に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドはインスリン分泌を３〜４倍促進し、これはＧＬＰ−１  １ｎｍｏｌ／ｋｇにより達成される値と同等であった。表２参照。
【実施例１８】
【０１３２】
ラットまたはマウスにおける腹腔内耐糖能試験（ＩＰＧＴＴ）に対する本発明のペプチドの効果
このアッセイにより測定される血中グルコースレベルの低下は、少なくとも約１０％の低下である。好ましくは、本発明のポリペプチドのＧＬＰ−１受容体アゴニスト成分は、ラットまたはマウスにおける腹腔内耐糖能試験により測定したラットまたはマウスにおける血中グルコースレベルが約１０％より約６０％まで、さらに好ましくは約１０％より約８０％まで、そしてそれよりさらに好ましくは約１０倍より約１００倍まで（すなわち、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％）の低下である。
【０１３３】
本発明の一部のポリペプチドによるラットまたはマウスにおける腹腔内耐糖能試験の間の血中グルコースレベルは、以下のようにして測定した。皮下投与された場合の本発明のポリペプチドの生体内活性をラットまたはマウスについて試験した。一晩絶食したラットまたはマウスに対照またはペプチド（１００μｇ／ｋｇ）を皮下注入して与えた。基礎血中グルコースは、ペプチド投与の前または誘導化ペプチドの投与後３または１７時間に測定し、そしてラットまたはマウスにグルコース２ｇ／ｋｇを腹腔内投与した。血中グルコースは、再度、ラットでは１５、３０および６０分後またはマウスでは３０および６０分後に測定した。
【０１３４】
本発明のペプチドは、ＩＰＧＴＴの後のビヒクルと比較して血中グルコースレベルを著しく低下、すなわち、グルコースＡＵＣで１３％〜５４％低下した。これは、ペプチドが長期的なグルコース低下活性および長期的な半減期を生体内で有することを証明する。ＧＬＰ−１は生体内で著しく短い半減期（１０分未満）を有する。ペプチド投与の３時間後でも血中グルコースを低下する本発明のペプチドの能力は、ペプチドがこの時点で循環系内に存在し従ってＧＬＰ−１と比較して長い半減期を有することの明確な証拠である。
【実施例１９】
【０１３５】
ペプチドＰＥＧ化
ＰＥＧ化は、当該技術分野の熟練者には公知のいかなる方法によっても行うことができる。しかし、本実施例では、唯一のシステイン変異をペプチド内に導入し次いでペプチドのスルホヒドリルとメトキシ−ＰＥＧ−マレインイミド試薬（インヘイル／シアウオーター（Ｉｎｈａｌｅ／Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ）のマレインイミド基との間の安定なチオエーテル結合を介してシステインをＰＥＧ化してＰＥＧ化を行った。ペプチドのＣ−末端に唯一のシステインを導入してＰＥＧ化による活性の考えられる低下を最小化することが好ましい。
【０１３６】
具体的には、ｍＰＥＧ−ｍａｌ（分子量２２ｋＤおよび４３ｋＤ）試薬の２倍モル量過剰をペプチド（例えば、ペプチドのＣ−末端にシステイン変異を有する配列番号２５）１ｍｇに加え、そしてｐＨ６の反応緩衝液（０．１Ｍ  リン酸ナトリウム／０．１Ｍ  ＮａＣｌ／０．１Ｍ  ＥＤＴＡ）中に溶かした。室温で０．５時間経過後、ＤＴＴまたは遊離システインの２倍モル量過剰をｍＰＥＧ−ｍａｌに加えて反応を停止した。ペプチド−ＰＥＧ−ｍａｌ反応混合物をカチオン交換カラムに加えて残留ＰＥＧを除去し次いでゲル濾過カラムに加えて残留遊離ペプチドを除去した。ＰＥＧ化された部位の純度、質量、および数は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光分析により決定した。小型の方のＰＥＧ（例えば線型２２ｋｄ  ＰＥＧ）を用いるＰＥＧ化はペプチドの活性の低下が少ないようであり、一方大型の方のＰＥＧ（例えば分枝した４３ｋｄ  ＰＥＧ）を用いるＰＥＧ化は活性を低下させる傾向がある。しかし、より大型の方のＰＥＧは血漿半減期をさらに延長して１週間に１回の注入が可能となる（ハリスら（Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ：Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ  ４０：５３９−５５１，２００１））。
【実施例２０】
【０１３７】
ＧＬＰ−１受容体アゴニストおよびグルカゴン受容体アンタゴニストポリペプチドの相対効力
表４に表示したポリペプチドのＧＬＰ−１結合（ＩＣ５０値）を実施例８記載のようにして決定した。相対効力値およびＧＬＰ−１活性百分率を実施例１０の記載のようにして算出した。ラットまたはマウスに１００μｇ／ｋｇのペプチドを投与しそして投与３時間後にグルコースレベルの低下を実施例１８記載の腹腔内耐糖能試験（ＩＰＧＴＴ）により決定した。表４参照。
【０１３８】
表４に表示したポリペプチドの肝臓膜結合（ＩＣ５０値）を実施例９記載のようにして決定した。グルカゴン刺激ｃＡＭＰ増加の阻害百分率は実施例１１記載のようにして決定した。ラットまたはマウスに１００μｇ／ｋｇのペプチドを投与しそして投与１７時間後にグルコースレベルの低下を実施例１５および１６記載の方法により決定しそして表４に報告した。本発明のポリペプチドは生体内でＧＬＰ−１受容体アゴニストおよびグルカゴン受容体アンタゴニストとして機能する。
【０１３９】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】図１は、ＧＳＴ−ペプチド融合ポリヌクレオチドコーディング配列を含む典型的なプラスミドの制限地図である。
【配列表】
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【図１】
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【国際調査報告】
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