(57)【要約】  従って、本発明の目的は、細胞酸化的損傷によって引き起こされる状態を処置するために有効な組成物を提供することである。本発明の別の目的は、細胞酸化的損傷によって引き起こされる状態を処置するための治療効果を達成するに十分長い血液循環寿命を有するテンパミン（ｔｅｍｐａｍｉｎｅ）組成物を提供することである。細胞酸化的損傷によって引き起こされる状態を処置するためのテンパミンから構成される組成物が所望される。１つの実施形態において、このテンパミは、その血液循環半減期を延長するのに適切な小胞で投与される。例えば、テンパミンは、炎症または細胞増殖に対する有効な治療のための延長された血液循環半減期を提供するこのリポソームにローディングされる。
2005513104.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞酸化損傷から生じる状態の処置のための組成物であって、薬学的に受容可能な小胞で投与されたテンパミンを含む、組成物。
【請求項２】
前記薬学的に受容可能な小胞がリポソームである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
請求項２に記載の組成物であって、前記リポソームが、小胞形成脂質および約１〜２０モルパーセントの間の親水性ポリマーで誘導された脂質から構成される存在する、組成物。
【請求項４】
請求項３に記載の組成物であって、前記テンパミンが、一緒に封入されている対イオンの存在下での沈殿を達成するのに十分な濃度で前記リポソームの中に封入されている、組成物。
【請求項５】
前記リポソームは、コレステロールをさらに含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
前記小胞形成脂質が、水素付加ホスファチジルコリンである、請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
前記親水性ポリマーがポリエチレングリコールである、請求項３に記載の組成物。
【請求項８】
前記対イオンが、硫酸である、請求項４に記載の組成物。
【請求項９】
細胞に対する酸化損傷によって引き起される状態を処置する方法であって、該方法は、薬学的に受容可能な小胞中の治療有効量のテンパミンを細胞に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、前記投与する工程が、リポソームに封じ込まれた形態でにテンパミンを投与する工程を包含する、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、（ｉ）小胞形成脂質、（ｉｉ）約１〜２０の間のモルパーセントの親水性ポリマーで誘導化された脂質から構成される、リポソームを調製する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、前記調製する工程は、同時に封じ込められた対イオンの存在下の調製を達成するのに十分な濃度で前記リポソーム中に前記テンパミンを封じ込める工程を包含する、方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の方法であって、前記調製する工程が、前記小胞形成脂質水素付加ホスファチジルコリンから構成されるリポソームを調製する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１４】
請求項１１に記載の方法であって、前記調製する工程が、コレステロールを含むリポソームを調製する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１５】
請求項１１に記載の方法であって、前記調製する工程が、前記親水性ポリマーがポリエチレングリコールであるリポソームを調製する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１６】
請求項９に記載の方法であって、化学療法剤を同時投与する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、前記同時投与する工程は、親水性ポリマーで誘導化された小胞形成脂質リポソームに封じ込まれた第２の薬剤を同時投与する工程を包含する、方法。
【請求項１８】
請求項１６に記載の方法であって、前記第２の薬剤が、ドキソルビシンアナログ、ダウノルビシンアナログ、シスプラチンアナログ、タキソールアナログ、およびカンプトテシンアナログからなる群より選択される、方法。
【請求項１９】
化学療法活剤の化学療法活性を増強するための方法であって、化学療法剤で処置される被験体にテンパミンを投与する工程を包含する、方法。
【請求項２０】
前記投与する工程が、リポソームに封じ込まれたテンパミンを投与する工程を包含する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記化学療法剤が、リポソームに封じ込まれた形態で投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
請求項２０に記載の方法であって、前記リポソームが、以下：（ｉ）小胞形成脂質、（ｉｉ）約１〜２０の間のモルパーセントの親水性ポリマーで誘導化された脂質から構成される、方法。
【請求項２３】
請求項２０に記載の方法であって、前記テンパミンが、一緒に封入されている対イオンの存在下での沈殿を達成するのに十分な濃度で前記リポソームの中に封入されている、方法。
【請求項２４】
請求項１９に記載の方法であって、前記投与する工程は、アポトーシス性細胞死の数の増加を提供する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の酸化的損傷または細胞の酸化ストレスにより引き起こされる状態を処置するための、テンパミン（ｔｅｍｐａｍｉｎｅ）の治療的使用に関する。特定の実施形態において、本発明は、テンパミンを閉じ込めたリポソーム組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
１つ以上の不対電子を含み、独立して存在し得る種は、一般的にフリーラジカルといわれる。その反応性、起源、形成場所、親油性の程度、および潜在的な生物学的標的において異なる多数の型のフリーラジカルが存在する。近年、用語「活性酸素種」（ＲＯＳ）は、次亜塩素酸（ＨＯＣｌ）、一重項酸素（１Ｏ２）、および過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）のような分子を含むように適合されており、これらは、本来ラジカルではないが、細胞外環境および細胞内環境においてラジカル形成し得る（Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ，Ｂ．およびＧｕｔｔｅｒｉｄｇｅ，Ｊ．Ｍ．Ｃ（編），ＦＲＥＥ  ＲＡＤＩＣＡＬ  ＩＮ  ＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ、第２版、Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８９）。
【０００３】
ＲＯＳは、多くの生物学的プロセスに関与し、これらとしては、生化学的プロセスの調節、特定の酵素の作用の補助、ならびに細菌および損傷した細胞の除去および破壊が挙げられる（Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ，Ｂ．およびＧｕｔｔｅｒｉｄｇｅ，Ｊ．Ｍ．Ｃ（編），ＦＲＥＥ  ＲＡＤＩＣＡＬ  ＩＮ  ＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ第２版、Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８９）。フリーラジカルは、身体に不可欠であり、そして正常な環境下では、細胞内で酸化的化合物と還元的化合物との間に均衡が存在する（レドックス状態）。この均衡が、酸化的化合物が優勢になって損なわれる場合、酸化的ストレスが発生するといわれる（Ｐａｒｋｅら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｃｃｕｐ．Ｍｅｄ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｈｅａｌｔｈ  ９：３３１−３４０（１９９６）；Ｋｎｉｇｈｔ，Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｓｃｉ．２７  ：１１−２５（１９９７）；Ｓｔｏｈｓ，Ｊ．Ｂａｓｉｃ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６：２０５−  ２２８（１９９５））。酸化的ストレスは、酸化的傷害（例えば、大気汚染）または免疫応答により媒介される活性化好中球に特徴的な「酸化的バースト」の結果として発生し得る。酸化的ストレスの一定の供給源は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の産生の間のミトコンドリアにおける「電子漏出」を介する超酸化物アニオンの形成から生じる。超酸化物アニオンは、それ自体は非常に反応性であるわけではないが、高度に反応性のフリーラジカルおよびその他の酸化剤の形成を最終的に生じる事象の連鎖を開始し得る。これらの活性酸素種が、酵素抗酸化剤系および／または非酵素抗酸化剤系により制御されない場合、膜、ＤＮＡおよびタンパク質のような重要な細胞成分のインビボ酸化は、最終的に組織損傷および機能不全をもたらす結果となる。
【０００４】
活性酸素種（ＲＯＳ）は、多くの障害の発生に関与している。ＲＯＳは、アテローム硬化性（ａｒｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ）病変、種々の神経変性疾患の進展に関与し、そしてまた、てんかんエピソードに付随して、炎症において、種々の神経毒の作用の機構において、または薬物の副作用として産生される。
【０００５】
生体系における酸化的化合物と還元的化合物との間の均衡が重要であることは明らかである。この均衡を保つために、身体は、ＲＯＳを除去するかまたはＲＯＳの形成を防ぐ多数の保護的抗酸化剤機構を有する。インビボでＲＯＳにより生じた損傷を修復する機構も存在する。防御システムは、酵素抗酸化剤成分および非酵素抗酸化剤成分を含む。しかし、酸素関連種に関連する酸化的ストレスまたは毒性に対抗する方法および化合物の開発は、限られた成功しか享受していない。
【０００６】
酸化的ストレスに関連する２つの主要な病理学的状態は、細胞損傷および悪性疾患である。変性細胞損傷における活性酸素種（ＲＯＳ）の役割が研究されている（Ｓａｍｕｎｉ，Ａ．ら，Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２−１３：１８７−１９４（１９９１）；Ｓａｍｕｎｉ，Ａ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８７：１５２６−１５３０（１９９１）；Ｂｕｒｔｏｎ，Ｇ．Ｗ．ら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：６４７８−６４８５（１９８１））が、主要増殖におけるそれらの役割は、不明なままである（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｊ．Ｂ．ら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２９８：６２−７０（１９９１））。アポトーシスおよび癌が、反対の現象であることは受け入れられているが、ＲＯＳは、これらの両方において鍵となる役割を果たすことが示されている（Ｍａｔｅｓ，Ｊ．Ｍ．ら，Ｉｎｔ  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３２：１５７−１７０（２０００））。
【０００７】
がん細胞の多くの型が、変更された酸化剤レベルを有し（Ｗｉｓｅｍａｎ，Ｈ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１３：１７−２９（１９９６））、そしていくつかの腫瘍（膀胱、血液、腸、乳房、結腸直腸、肝臓、肺、腎臓、食道、卵巣、前立腺、および皮膚が挙げられる）は、酸化剤−抗酸化剤の不均衡に強く関連する。がん細胞における大量の活性酸素の中間体の生成は、いくつかの腫瘍の、変異し、抗プロテアーゼを阻害し、そして局所組織を損傷し、それにより腫瘍の異質性、浸潤、及び転移を促進する能力に寄与し得る（Ｍａｔｅｓ，Ｊ．Ｍ．ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３２：１５７−１７０（２０００）；Ｓｚａｔｒｏｗｓｋｉ，Ｔ．Ｐ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：７９４−７９８（１９９１））。酸化促進剤状態はまた、腫瘍細胞を、化学療法の間、正常細胞よりも生存に有利にする。例えば、高いＨ２Ｏ２濃度の存在は、異なる抗癌剤（エトポシド（ｅｔｏｐｓｉｄｅ）、ドキソルビシン、シスプラチン、タキソール、およびＡｒａＣ）の、アポトーシスを誘導する能力を阻害する（Ｓｈａｃｔｅｒ，Ｅ．ら，Ｂｌｏｏｄ．９６：３０７−３１３（２０００））。同様に、比較的低い濃度のＨ２Ｏ２（５０〜１００μＭ）は、化学療法薬エトポシド（ｅｔｏｐｓｉｄｅ）およびカルシウムイオノフォアＡ２３１８７によるアポトーシスの誘導を阻害する（Ｌｅｅ，Ｙ−Ｊ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１９７９２−１９７９８（１９９９））。Ｈ２Ｏ２の存在は、試験された薬物の全体の細胞傷害性を低減するだけでなく、アポトーシスから壊死へと細胞死の型をシフトさせる。アポトーシス死から壊死へのシフトは、重要である。なぜなら、アポトーシスを受ける細胞は、膜透過性バリアを失う前に単球誘導マクロファージにより認識され得、そして貪食され得るからである（同上）。対照的に、壊死細胞は、その内容物を細胞外空隙に漏出し始めて、従って炎症性応答（化学療法と干渉し得る）を誘導するまで貪食されない（Ｓａｖｉｌｌ，Ｊ．，ら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１４：１３１−１３６（１９９３））。
【０００８】
癌治療における抗酸化剤（例えば、α−トコフェロール、デスフェラール、およびニトロキシド）の使用が、探索されてきた（Ｃｈｅｎｅｒｙ，Ｒ．ら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：１２３３−１２４１（１９９７）；Ｓｈａｃｔｅｒ，Ｅ．ら，Ｂｌｏｏｄ．９６：３０７−３１３（（２０００））。しかし、遊離形態で投与された場合の抗酸化剤の迅速なクリアランスおよび血漿中のそれらの化学的分解により、インビボでのそれらの有効性は制限されている。
【０００９】
治療剤の血液循環の長期化に対する種々のアプローチ（例えば、薬物をポリマー鎖で改変すること（米国特許第４，１７９，３３７号）が存在する。別のアプローチは、リポソーム中に薬物をトラップすることである。有効な治療のために、高濃度の治療剤をリポソーム中にローディングすることが望ましい。また、その薬剤のリポソームからの漏出速度は遅くあるべきである。トラップした薬物を有するリポソームを調製するために利用可能な種々の薬物ローディング方法が存在し、この方法としては、受動的トラップ（ｐａｓｓｉｖｅ  ｅｎｔｒａｐｍｅｎｔ）および能動的遠隔ローディング（ａｃｔｉｖｅ  ｒｅｍｏｔｅ  ｌｏａｄｉｎｇ）が挙げられる。この受動的トラップ法は、リポソーム中に高濃度の親油性薬物をトラップするため、および高水溶性を有する薬物をトラップするために最も適している。
【００１０】
イオン化可能な疎水性薬物または両親媒性薬物の場合、その薬物をリポソームへ膜貫通イオン勾配に逆らってローディングすることにより、より多くの薬物ローディング効率が、達成され得る（Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｊ．Ｗ．ら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ４５５：２６９−２７１（１９７６）；Ｃｒａｍｅｒ，Ｊ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ７５（２）：２９５−３０１（１９７７））。このローディング方法は、一般的に、遠隔ローディングといわれ、代表的には、低い内側／高い外側イオン勾配（しばしば、ｐＨ勾配）を有するように調製したリポソームの懸濁液に薬物を添加することによりローディングされる、イオン化可能アミン基を有する薬物を伴う。
【００１１】
しかし、遠隔ローディングに関連する問題が認識されており、１つは、全てのイオン化可能な薬物が、イオン勾配に応じてリポソーム中に蓄積されるわけではないことである（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ，Ａ．ら，米国特許第５，３８０，５３２号；Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｄ．ら，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄｓ  ５３：３７−４６（１９９０））。別の問題は、リポソーム中に蓄積するいくつかの薬剤が、蓄積後に迅速に放出されることである。なお別の問題は、首尾良くローディングされ、インビトロではリポソーム中に維持されるいくつかの薬剤は、インビボではそのリポソームからの高い漏出速度を有し、このことにより、リポソームにトラップされた形態にある薬剤の投与の利点がなくなってしまうことである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
（発明の要旨）
従って、本発明の目的は、細胞酸化的損傷によって引き起こされる状態を処置するために有効な組成物を提供することである。
【００１３】
本発明の別の目的は、細胞酸化的損傷によって引き起こされる状態を処置するための治療効果を達成するに十分長い血液循環寿命を有するテンパミン（ｔｅｍｐａｍｉｎｅ）組成物を提供することである。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、テンパミンの投与によって酸化的ストレスまたは酸化的損傷から生じる状態を処置する方法を提供することである。
【００１５】
本発明のなお別の目的は、リポソームにトラップされた形態にあるテンパミンから構成される組成物を提供することである。
【００１６】
本発明のなお別の目的は、テンパミンの同時投与による化学療法剤の化学療法効果を増強する方法を提供することである。
【００１７】
本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、以下の発明の詳細な説明が添付の図面とともに読まれる場合に、より完全に理解される。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
用語「窒素酸化物」とは、本明細書中において、安定な窒素酸化物フリーラジカル、その前駆物質、およびその誘導体を記載するために使用され、この誘導体は、酸素原子がヒドロキシル基で置換されており水素ハライド形態で存在する、対応するヒドロキシルアミン誘導体を包含する。本明細書中に記載される窒素酸化物において、窒素酸化物の不対電子は、部分的に安定である。なぜなら、その窒素核が、強い電子ドナーで置換されている２つの炭素原子に結合されているからである。Ｎ−Ｏ結合の酸素における部分的負電荷により、この２つの隣接炭素原子は、一緒になって、上記窒素核上の不対電子を局在化させる。窒素酸化物は、複素環式構造または直鎖状構造のいずれかを有し得る。基本的基準は、安定なフリーラジカルである。
【００１９】
用語「プロトン化可能なアミンを有する窒素酸化物」は、少なくとも１つの水素プロトンを受容可能である一級アミン、二級アミン、または三級アミンを有する、窒素酸化物を意図する。
【００２０】
「ＴＭＮ」とは、本明細書中で使用される場合、テンパミンを指す。
【００２１】
（ＩＩ．窒素酸化物）
ピペリジン窒素酸化物は、化学的に安定なｎ，ｎ−二置換＞ＮＯ＊ラジカルである。図１Ａ〜１Ｃは、テンポの化学構造（図１Ａ）、テンポールの化学構造（図１Ｂ）およびテンパミンの化学構造（図１Ｃ）を示す。これらの環状ラジカルは、細胞透過性であり、非毒性であり、かつ非免疫原性である（Ａｆｚａｌ，Ｖ．ら、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｒａｉｏｌ．１９：５４９〜５５２（１９８４）；Ａｎｋｅｌ，Ｅ．Ｇ．ら、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．４０：４９５〜４９８（１９８７）；ＤｅＧｒａｆｆ，Ｗ．Ｇ．ら、Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｏｌ．Ｍｕｔａｇｅｎ．１９：２１〜２６（１９９２））。抗酸化剤のうち、窒素酸化物は、主に酸化剤であり還元剤ではないその作用様式が、普通ではない（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｊ．Ｂ．ら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２９８：６２〜７０（１９９１）；Ｓａｍｕｎｉ，Ａ．ら、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２〜１３：１８７〜１９４（１９９１））。これらはまた、少なくとも部分的に再生される能力を有する（同書）。窒素酸化物は、以下のいくつかの機構を介してその抗酸化剤活性を発揮する：還元金属イオンのＳＯＤ模倣酸化、超原子価金属の還元、およびラジカル鎖反応の中断（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｊ．Ｂ．ら、Ｔｅｍｐｏｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２９８：６２〜７０（１９９１）；Ｓａｍｕｎｉ，Ａ．ら、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２〜１３：１８７〜１９４（１９９１）；Ｋｒｉｓｈｎａ，Ｍ．Ｃ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．８９：５５３７〜５５４１（１９９２））。
【００２２】
窒素酸化物は、その両親媒性およびラジカルとしての化学的安定性に起因して、スピン標識として広範に使用される（Ｋｏｃｈｅｒｇｉｎｓｋｙ，Ｎ．おおびＳｗａｒｔｚ，Ｈ．Ｍ．，ＮＩＴＲＯＸＩＤＥ  ＳＰＩＮ  ＬＡＢＥＬＳ：ＲＥＡＣＴＩＯＮＳ  ＩＮ  ＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ：ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５））。窒素酸化物の常磁性は、酸化または還元された場合に失われ、そのＥＰＲシグナルは消失する。窒素酸化物は、図２に示されるように、ヒドロキシルアミンへと還元され得、そしてオキソ−アンモニウムカチオンへと酸化され得る。ヒドロキシルアミンへのインビボでのこの迅速な還元および血液からの迅速なクリアランスは、治療剤としてその効果を制限する。
【００２３】
遊離テンパミンの電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）シグナルが、図３に示される。遊離テンパミンは、ｎ−オクタノール溶液および水溶液の両方において十分に規定されたピークを生じる。ピーク面積（または高さ）は、水相およびｎ−オクタノールにおけるテンパミン濃度に比例する。両方の溶媒におけるテンパミン濃度は、この２つの溶媒（ｎ−オクタノールおよび水）の各々において、テンパミンの較正曲線から決定された。
【００２４】
（Ａ．テンパミンのインビトロ細胞傷害性）
本発明を支持して実施される研究において、テンパミンは、抗増殖活性または細胞抗増殖活性を示すか否かを決定するために、インビトロで試験された。実施例１に記載されるように、テンパミンの細胞傷害性が、３つの細胞株（ＭＣＦ−７（ヒト乳腺癌）、Ｍ−１０９Ｓ（ドキソルビシン感受性ヒト乳癌）、およびＭ−１０９Ｒ（ドキソルビシン耐性ヒト乳癌））に関して決定された。細胞増殖に対する遊離テンパミンの効果が、実施例１Ｂに記載されるようなメチレンブルーアッセイによって決定された。
【００２５】
図４は、種々の用量のテンパミン（黒丸）およびテンポール（白丸）におけるインビトロでのＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞の生存％を比較するプロットである。この細胞は、窒素酸化物に７２時間曝露した後に分析された。テンパミン細胞増殖阻害活性およびテンポール細胞増殖阻害活性は、同様の大きさであった。テンパミンのＩＣ５０は２１０μＭであり、テンポールのＩＣ５０は３２０μＭであった。
【００２６】
別の研究において、ＭＣＦ−７細胞株が、テンパミンによる増殖阻害機構を調査するために使用された。未処理細胞およびテンパミン処理細胞（２４時間暴露）が、メロシアニン−５４０と接触された。メロシアニン−５４０は、ホスファチジルセリンに選択的に結合する。これは、アポトーシス開始時に細胞の外部表面に現れ、従ってアポトーシスマーカーのうちの１つである（Ｒｅｉｄ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９２：４３（１９９６））。メロシアニン−５４０との相互作用の後、細胞は、下記の方法の節において記載されるようなフローサイトメトリーによって分析された。その結果が、図５Ａ〜５Ｂに示され、未処理コントロール細胞のＦＡＣｓｃａｎが図５Ａに示され、１ｍＭテンパミンで２４時間処理した細胞のＦＡＣｓｃａｎが図５Ｂに示される。２４時間処理期間後、細胞はトリプシン処理され、メロシアニン−５４０で染色され、そしてフローサイトメトリーにより分析された。図５Ａ〜５ＢにおいてＭ１により示される領域は、蛍光標識アポトーシス細胞を示す。このスキャンは、テンパミン処理なしでは１４％が蛍光標識されるのに対し、テンパミン処理後の細胞のほとんど（７７％）が、蛍光標識されたことを示す。この結果は、テンパミンが、アポトーシス誘導を介して癌細胞を死滅させることを示す。
【００２７】
２つのさらなる細胞株Ｍ−１０９ＳおよびＭ−１０９Ｒに対するテンパミン細胞傷害性は、同様の細胞傷害性値を有し、テンパミンのＩＣ５０は、約７００μＭであり、ＭＣＦ−７細胞のＩＣ５０（２１０μＭ）よりも顕著に大きかった。
【００２８】
この細胞傷害性データは、遊離形態のテンパミンが、治療活性を有することを示す。テンパミンは、乳癌細胞の細胞増殖を阻害するに有効であった。この増殖阻害は、アポトーシスによって達成された。これは、背景の節において考察したとおり、望ましい。なぜなら、アポトーシスを受ける細胞は、単球由来マクロファージによって認識されて貪食されて、その後、膜透過性バリアを失い得るからである。対照的に、壊死によって死んだ細胞は、内容物を細胞外空間に漏出し始め、従って、炎症応答（これは、化学療法を妨害し得る）を誘導するまでは、貪食されない。
【００２９】
（ＩＩＩ．テンパミンリポソーム組成物）
従って、本発明は、１つの局面では、酸化的損傷によって引き起こされる状態を処置するに有効な組成物を包含する。この組成物は、薬学的に受容可能な媒体中に、細胞の酸化的損傷または酸化的ストレスに関連した症状を逆転または改善するに有効な量のテンパミンを含む。図１１に関して以下に記載されるように、遊離形態のテンパミンは、他のニトロキシドと同様に、短い血中循環寿命（ｔ１／２）を有する。それゆえ、テンパミンがその血中循環寿命を延長するために処方されるテンパミン組成物を提供することが望ましい。適切な（例えば、この化合物の周囲にポリマー鎖または脂質鎖のコーティングを提供する）種々の処方物が存在する。本発明の好ましい実施形態では、テンパミンは、リポソーム中に封入される。ここで記載される研究では、リポソームに封入されたテンパミンを特徴付けして、テンパミンのカプセル化パーセント、テンパミンのインビトロ放出速度、およびインビトロ血漿安定性を決定した。なお他の研究では、このリポソームのインビボ血漿クリアランス、組織分布および放出速度を決定した。
【００３０】
（Ａ．リポソーム組成物）
本発明の組成物における使用に適切なリポソームとしては、小胞形成脂質から主に構成されるリポソームが挙げられる。小胞形成脂質は、リン脂質によって例示され、水中で自然に二重層の小胞を形成する。このリポソームはまた、この脂質二重層に組み込まれた他の脂質を含み得、その疎水性部分は、内部の二重層膜の疎水性領域と接触しており、ヘッド基部分は、二重層膜の外部の極性表面を向いている。
【００３１】
この小胞形成脂質は、好ましくは、２つの炭化水素鎖（代表的にアシル鎖）および極性もしくは非極性のいずれかのヘッド基を有する脂質である。種々の合成小胞形成脂質および天然に存在する小胞形成脂質（リン脂質（例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、およびスフィンゴミエリン）が挙げられる）が存在し、ここで、この２つの炭化水素鎖は、代表的に、約１４〜２４個の間の炭素原子長であり、種々の程度の不飽和を有する。アシル鎖が種々の程度の飽和を有する、上記の脂質およびリン脂質は、商業的に入手されてもよく、公開された方法に従って調製されてもよい。他の適切な脂質としては、糖脂質およびステロール（例えば、コレステロール）が挙げられる。
【００３２】
カチオン性脂質（モノカチオン性およびポリカチオン性）もまた、本発明のリポソームにおける使用に適切であり、ここで、このカチオン性脂質は、脂質組成物の微量成分として含まれてもよく、または主要成分または唯一の成分として含まれてもよい。このようなカチオン性脂質は代表的に、親油性部分（例えば、ステロール、アシル鎖またはジアシル鎖）を有し、そしてこの脂質は、全体として正味で正の電荷を有する。好ましくは、この脂質のヘッド基は、正の電荷を保有する。モノカチオン性脂質の例としては、以下が挙げられる：１，２−ジオレイルオキシ−３−（トリメチルアミノ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）；Ｎ−［１−（２，３，−ジテトラデシルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）；Ｎ−［１−（２，３，−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）；Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；３β［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）；およびジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）。
【００３３】
ポリカチオン性脂質の例としては、結合したモノカチオン性脂質およびポリカチオン性部分について上記に記載したような同様の親油性（ｌｉｐｏｐｈｏｌｉｃ）基を有する脂質が挙げられる。例示的なポリカチオン性部分としては、スペルミンもしくはスペルミジン（ＤＯＳＰＡおよびＤＯＳＰＥＲによって例示されるような）、またはペプチド（例えば、ポリリジン）または他のポリアミン脂質が挙げられる。例えば、中性脂質（ＤＯＰＥ）は、ポリリジンを用いて誘導体化されて、カチオン性脂質を形成し得る。
【００３４】
カチオン性小胞はまた、中性脂質（例えば、ジオレオイルホスファチオジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）またはコレステロール）を含み得る。これらの脂質は、時々、ヘルパー脂質と呼ばれる。
【００３５】
小胞形成脂質は、血清におけるリポソームの安定性を制御するため、およびリポソーム内のトラップされた薬剤の放出の速度を制御するために、特定の程度の流動性または剛性を達成するように選択され得る。ゲル（固体の規則的な）相または液晶（液体の不規則な）二重層で、より剛性の脂質二重層を有するリポソームは、比較的剛性の脂質、例えば、比較的高い相転移温度（例えば、室温より上、より好ましくは、体温より上、８０℃まで）を有する脂質の組み込みによって達成される。剛性の（すなわち、飽和な）脂質は、脂質二重層におけるより大きな膜剛性に寄与する。他の脂質成分（例えば、コレステロール）はまた、液体二重層構造で膜剛性に寄与することが公知であり、膜を含まない容積を減少し得、それによって、膜浸透性を減少し得る。
【００３６】
脂質流動性は、比較的流動性の脂質（代表的には、比較的低い液体−液晶相転移温度（例えば、室温または室温以下、より好ましくは、体温または体温以下）を有する脂質相を有する流動性の脂質）の組み込みによって達成される。
【００３７】
リポソームはまた、親水性ポリマーで誘導体化される小胞形成脂質を含む。例えば、米国特許第５，０１３，５５６号およびＷＯ９８／０７４０９（これらは、本明細書によって参考として援用される）に記載されるように、このような親水性ポリマーは、リポソーム脂質二重層膜の内側表面と外側表面の両方に、親水性ポリマー鎖の表面コーティングを提供する。親水性ポリマー鎖の最も外側の表面コーティングは、インビボで長い血液循環寿命を有するリポソームを提供するのに効果的である。親水性ポリマー鎖の内側コーティングは、リポソームの水性区画内に（すなわち、脂質二重層の間に）、そして中心コア区画内に伸長し、そして任意のトラップされる薬剤と接触する。親水性ポリマーを用いる誘導体化に適切な小胞形成脂質としては、上に列挙される脂質のいずれか、特に、リン脂質（例えば、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ））が挙げられる。
【００３８】
小胞形成脂質を用いる誘導体化に適切な親水性ポリマーとしては、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレングリコール、およびポリアスパルトアミドが挙げられる。ポリマーは、ホモポリマーとして、またはブロックもしくはランダムコポリマーとして使用され得る。
【００３９】
好ましい親水性ポリマー鎖は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり、好ましくは、約５００ドルトン（ｇ／モル）と１２，０００ドルトンとの間、より好ましくは、約５００ドルトンと約５，０００ドルトンとの間、最も好ましくは、約１，０００ドルトン〜約５，０００ドルトンの間の分子量を有するＰＥＧ鎖としてである。ＰＥＧのメトキシカップアナログまたはエトキシキャップアナログもまた、好ましい親水性ポリマー（種々のポリマーサイズ（例えば、１２０〜２０．０００ドルトン）で市販される）である。
【００４０】
親水性ポリマーを用いて誘導体化される小胞形成脂質の調製は、例えば、米国特許第５，３９５，６１９号に記載されている。このような誘導体化脂質を含むリポソームの調製はまた、記載され、ここで、代表的に、１〜２０モル％の間のこのような誘導体化脂質がリポソーム処方物中に含まれる。親水性ポリマーが、脂質に安定に連結され得るか、または不安定な連結を介して連結され得る（この不安定な連結によって、コーティングされたリポーソームが、ポリマー鎖のコーティングを流し得る）（なぜなら、これらは、血流で、または刺激に応答して循環するからである）（例えば、米国特許第６，０４３，０９４号（本明細書において参考として援用される）に記載されている）ことが理解される。
【００４１】
（Ｂ．リポソーム調製物）
本発明において、リポソームを調製する好ましい方法は、遠隔装填による。本発明を支持して実施された研究において、例示的な窒素酸化物テンパミン（ｔｅｍｐａｍｉｎｅ）が、当該分野で記載され（米国特許第５，１９２，５４９号）、そして実施例２に記載されるように、イオン濃度勾配に対して遠隔装填することによって予め形成されたリポソーム内に装填された。遠隔装填手順において、薬物は、他の装填方法で達成され得るよりもかなり高い濃縮レベルで、リポソーム内水性区画に蓄積する。
【００４２】
リモートローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）における使用のための、リポソーム二重層を横切るイオン勾配を有するリポソームは、種々の技術によって調製され得る、代表的な手順は、上記のとおりであり、ここで、リポソーム−形成脂質の混合物が、適切な有機溶媒中に溶解され、そして容器内でエバポレートされて薄膜を形成する。次いで、この薄膜は、リポソーム内部空間に水相を形成する溶質種を含有する水性媒体で被覆される。
【００４３】
リポソーム形成後、その小胞は、公知の方法に従って、選択領域内のリポソームのサイズ分布を達成するようにサイズ決定され得る。このリポソームは、好ましくは、０．０４μｍと０．２５μｍとの間の選択されたサイズ範囲に均一にサイズ決定される。小さい単層小胞（ＳＵＶ）（代表的には、０．０４μｍ〜０．０８μｍの範囲内である）は、リポソームの広範な超音波処理または均質化によって、調製され得る。約０．０８ミクロン〜０．４ミクロンの間の選択範囲内のサイズを有する、均一にサイズ決定されたリポソームは、例えば、ポリカーボネート膜または他に規定される孔サイズの膜（０．０３ミクロン〜０．５ミクロン、代表的には、０．０５ミクロン、０．０８ミクロン、０．１ミクロンまたは０．２ミクロンの範囲の選択された均一な孔サイズを有する）を通した押出によって、生成され得る。この膜の孔サイズは、その膜を通した押出によって生成されるリポソームの最大サイズにおよそ対応しており、特に、この調製物は、同じ膜を通して２回押出される。このサイズ決定は、好ましくは、本来の脂質水和緩衝液中で行われ、この結果、このリポソーム内部空間は、初期リポソームプロセシング工程全体を通してこの媒体を保持する。
【００４４】
サイズ決定後、このリポソームの外部媒体は、このリポソーム膜を横切るイオン勾配を作製するために処理される。このイオン勾配は、代表的に、内側低濃度勾配／外側高濃度勾配である。これは、種々の方法において（例えば、（ｉ）外部媒体の希釈、（ｉｉ）所望の最終媒体に対する透析、（ｉｉｉ）例えば、所望の媒体に対してＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０を使用する、モレキュラーシーブクロマトグラフィー、または（ｉｖ）高速遠心分離および所望の最終媒体中へのペレット化した（ｐｅｌｌｅｔｅｄ）リポソームの再懸濁によって）、なされ得る。選択される外部媒体は、現在考慮されているように、勾配形成の機構および所望の外部ｐＨに依存する。
【００４５】
イオン勾配を作製するための最も単純なアプローチにおいて、水和した、サイズ決定されたリポソームは、選択された内部媒体ｐＨを有する。このリポソームの懸濁液は、所望の最終ｐＨに到達するまで中和されるか、または所望の外部ｐＨを有する緩衝液でその外部相緩衝液を交換するために上記のように処理される。例えば、本来の媒体は、選択された緩衝液（例えば、グルタミン酸緩衝液またはリン酸緩衝液）中、５．５のｐＨを有し得、そしてその最終媒体は、同じ緩衝液または異なる緩衝液中、８．５のｐＨを有し得る。この内部媒体および外部媒体は、好ましくは、例えば、緩衝液、塩、または低分子量溶質（例えば、スクロース）の濃度の適切な調節によって、ほぼ同じ浸透圧モル濃度を含むように選択される。
【００４６】
別の一般的なアプローチにおいて、この勾配は、リポソーム中、選択されたイオノフォアを含めることによって生成される。例示のために、リポソーム二重層にバリノマイシンを含むように調製されたリポソームは、カリウム緩衝液中で調製され、サイズ決定され、次いでナトリウム緩衝液で交換され、カリウム内側勾配／ナトリウム外側勾配が作製される。次いで、内部から外部方向のカリウムイオンの移動は、リポソーム膜を横切る負に帯電した電荷に応答したプロトンのリポソームへの移動におそらく起因して、内側のより低いｐＨ勾配／外側のより高いｐＨ勾配を生じる（Ｄｅａｍｅｒ，Ｄ．Ｗ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ２７４：３２３（１９７２））。
【００４７】
別のより好ましいアプローチにおいて、薬物ローディングのために使用されるプロトン勾配は、例えば、米国特許第５，１９２，５４９号に記載されるように、リポソーム膜を横切るアンモニウムイオン勾配を作製することによって生成される。このリポソームは、アンモニウム塩、代表的には、０．１Ｍ〜１．３Ｍのアンモニウム塩（例えば、適切なｐＨ（例えば、５．５〜７．５）のアンモニウム塩）を含有する水性緩衝液中で調製される。この勾配はまた、硫酸化ポリマー（例えば、デキストラン硫酸アンモニウムまたはヘパラン硫酸）を使用することによって生成され得る。リポソーム形成およびサイズ決定後、外部媒体は、１つの欠損アンモニウムイオン（例えば、同じ緩衝液であるが、硫酸アンモニウムが、ＮａＣｌまたはリポソームの内側および外側に類似の浸透圧モル濃度を与える糖によって置き換えされている緩衝液）と交換される。
【００４８】
図６は、アンモニウムイオン勾配に対して、ニトロキシドテンパミン（ｎｉｔｏｒｉｘｉｄｅ  ｔｅｍｐａｍｉｎｅ（ＴＭＮ））をリポソーム１０にロードする際の例示的なイオン化事象を示す。リポソーム形成後、このリポソームの内側のアンモニウムイオンは、アンモニアおよびプロトンと平衡である。アンモニアは、リポソーム二重層に浸透し得、このリポソームから内部に補充され得る。アンモニアの補充は、リポソーム内の平衡を左方向に連続的にシフトさせ、プロトンを生成する。
【００４９】
ニトロキシドは、酸化防止剤をイオン勾配リポソームの懸濁液に加えることによってこのリポソーム内にロードされ、そしてこの懸濁液は、化合物が外部媒体からこのリポソームへと通過するのを可能にするのに有効な条件下で処理される。薬物ローディングに適切なインキュベーション条件は、（ｉ）代表的には、非荷電形態の化合物の、リポソーム内への拡散を可能にし、そして（ｉｉ）好ましくは、高い薬物ローディング濃度（例えば、カプセル化された２〜５００ｍＭの薬物、より好ましくは、２〜２００ｍＭの間の薬物）をもたらす、インキュベーション条件である。
【００５０】
ローディングは、好ましくは、リポソーム脂質の相転移温度より高い温度で実施される。従って、飽和リン脂質で主に形成されるリポソームについて、ローディング温度は、６０℃以上の高さであり得る。ローディング期間は、リポソーム二重膜に対する薬物の透過性、温度、ならびにリポソーム脂質および薬物の相対濃度に依存して、代表的には１〜１２０分の間である。
【００５１】
リポソーム濃度、添加される化合物の外部濃度およびイオン勾配を適切に選択して、実質的に全ての化合物が、リポソーム中にローディングされ得る。例えば、３単位のｐＨ勾配（または可能性としては、アンモニウムイオン勾配を使用するこのような勾配）を用いて、薬物の最終的な内部濃度：外部濃度は、約１０００：１である。計算された内部リポソーム容積およびローディング薬物の最大濃度を知ることによって、リポソーム中への実質的に全てのローディングをもたらす、外部媒体中の薬物の量を選択し得る。
【００５２】
あるいは、薬物ローディングが、遊離薬物の外部媒体を実質的に使い果たすのに有効でない場合、薬物ローディング後にリポソーム懸濁物が処理されて、非カプセル化薬物を除去し得る。遊離薬物は、例えば、モレキュラーシーブクロマトグラフィー、透析または遠心分離によって、除去され得る。
【００５３】
本発明を支持して実施された研究において、６種のリポソーム処方物を調製し、テンパミン（ｔｅｍｐａｍｉｎｅ）をローディングした。表１は、各処方物についての脂質組成、リポソームのサイズおよび型、ならびに脂質に対する薬物の比率を要約する。リポソームの調製は、実施例２に記載される。
【００５４】
【表１】
2005513104.tif 000003
【００５５】
１ＥＰＣ、卵ホスファチジルコリン、Ｔｍ＝−５℃；ＨＰＣ、水素化大豆ホスファチジルコリン、Ｔｍ＝＋５２℃；Ｃｈｏｌ、コレステロール、２０００ＰＥＧ−ＤＳＰＥ、Ｎ−カルバミル−ポリ−（エチレングリコールメチルエーテル）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミントリエチルアンモニウム塩、ＰＥＧ部分の平均分子量は、２０００Ｄａであった。
２ＭＬＶ＝多層膜小胞、ＬＵＶ＝大きい単層膜小胞。
【００５６】
テンパミン遠隔ローディングプロセスの反応速度論を、ＥＰＲおよびＣＶを使用するローディングプロセスのいくつかの間に試験した。ＥＰＲおよびＣＶの測定を、５分、１０分、３０分および６０分の間隔で、遠隔ローディングプロセスの間に実施した。図７は、リポソームへのカプセル化の前（点線）および後（実線）の、テンパミンの電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）信号を示す。図８は、リポソームへのカプセル化の前（点線）および後（実線）の、テンパミンのサイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）信号を示す。これらの図から理解され得るように、ローディングの５分後に、テンパミン信号は、劇的に変化した。スペクトルは一定のままであり、そしてより長い時点では、さらなる変化は観察されなかった（データ示さず）。これらの結果は、リポソーム中にテンパミンをローディングするプロセスが迅速であり、約５分までにほぼ完全なローディングが得られることを示唆する。
【００５７】
（ＩＶ．リポソームのインビトロでの特徴）
（Ａ．分配係数）
テンパミンのｎ−オクタノール／水分配係数（Ｋｐ）を、以前に記載された手順（Ｓａｍｕｎｉ，Ａ．ら、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ．、２２：１１６５（１９９７））に従って測定して、リポソームにおけるその相分布を概算した。分配係数を、２．０ｍＭおよび２０．０ｍＭのテンパミン濃度で、そして異なる濃度の硫酸アンモニウム（２０〜４００ｍＭ）で、種々のｐＨレベル（ｐＨ４．０、７．０および１０．６）で測定した。各相の容積は、１ｍｌであった。結果を表２に示す。
【００５８】
（表２）
（異なるｐＨでのｎ−オクタノール／水相間のテンパミン分布）
【００５９】
【表２】
2005513104.tif 000004
【００６０】
酸性および中性のｐＨで、高い硫酸アンモニウム濃度は、水相の方にＫｐをシフトさせる。アルカリ性のｐＨで、硫酸アンモニウム濃度の上昇は、ｎ−オクタノールの方にＫｐをシフトさせる。このことは、酸性および中性のｐＨで、テンパミンは、硫酸イオンと複合体を形成することを示す。なぜなら、そうでなければ、硫酸アンモニウムイオンは、極性の低い相へと、両親媒性分子をシフトさせるからである（Ｓｔａｎｄａｌ，Ｓ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉ．、２１２：３３（１９９９））。これらのデータはまた、より低いｐＨ値で、テンパミンは、水相中に濃縮されることを示す。このことは、テンパミンが弱塩基性であり、そして酸性および中性のｐＨでは、テンパミンは正に荷電するという事実と一致する。
【００６１】
類似の化学構造を有する（ＴＥＭＰＯ、ＴＥＭＰＯＬ）が、荷電したアミノ基を有さないピペレジン（ｐｉｐｅｒｅｄｉｎｅ）窒素酸化物は、水相よりもｎ−オクタノールに対して、かなり高い親和性を有する（Ｓａｍｕｎｉ，Ａ．ら、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ．、２２：１１６５（１９９７））。
【００６２】
別の研究において、脂質二重層と水相との間でのテンパミンの分配を決定した。脂質二重層／水相分布を、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ中の、相を分離する透析膜を使用して実施した（Ｓａｍｕｎｉ，Ａ．ら、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ．、２２：１１６５（１９９７））。０．１５Ｍ  ＮａＣｌ水相を上回った脂質二重層に対するテンパミンの傾向は存在せず、そしてテンパミンの分布は、リポソーム調製物（１０％卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）（ｗ／ｖ））と０．１５Ｍ  ＮａＣｌとの間で等しかった（データ示さず）。このことは、中性（ＥＰＣ）リポソーム膜への感知可能なテンパミンの吸着は存在せず、そして硫酸アンモニウム勾配が存在しない場合には、リポソームへの有意なテンパミン透過は存在しないことを示す。
【００６３】
（Ｂ．％カプセル化）
リポソーム中にカプセル化されたテンパミンの量を、実施例３に記載されるように、ＥＰＲを使用して決定した。図７から理解され得るように、カプセル化されたテンパミンのＥＰＲプロフィール（実線）は、水溶液中の同一の量の遊離テンパミン（点線）よりも、かなり広く、そしてより低い強度であった。データを、表３に要約する。
【００６４】
（表３）
（硫酸アンモニウム勾配ありなしでのリポソーム調製物におけるテンパミン（ｔｅｍｐａｍｉｎｅ）（ＴＭＮ）のパーセントカプセル化）
【００６５】
【表３】
2005513104.tif 000005
【００６６】
１「−」は、上欄の項目が、含まれなかったことを示す。
２「＋」は、上欄の項目が、含まれたことを示す。
３計算の例：
１．テンパミン含まず＝３．８−２．４＝１．４；
２．ＴＭＮリポソーム（クエンチされず）＝８．７−１．４＝７．３；
３．パーセントカプセル化＝１００×７．３／８．７×１００＝８４．１；
クエンチング因数＝７．４／２．４＝３。
【００６７】
これらの研究は、遠隔ローディング手順の間のテンパミン損失が存在しないことを示す。ニゲリシンの添加後のテンパミン信号および同じ濃度の遊離テンパミンの信号が同一であるという事実によって示されるように、ニゲリシン（ｎｉｇｅｒｉｃｉｎ）は、リポソームからの全てのテンパミンを放出する。式４（実施例３を参照のこと）を使用して、クエンチング因数は、約３であると計算された。研究はまた、ＥＰＲ機能アッセイによって証明されるように、テンパミンが活性であることを示す。
【００６８】
（Ｃ．リポソームからのテンパミン放出動力学）
２１日の期間にわたって、タマゴホスファチジルコリン（ＥＰＣ）または水素化ダイズホスファチジルコリン（ＨＰＣ）のいずれかから構成されるリポソームの懸濁物からのテンパミンの放出を、実施例４に記載されるようにモニターした。テンパミンの水性外部媒体への放出を、３つの温度（４℃、２５℃、および３７℃）で決定した。ＥＰＣから構成されるリポソームについての結果を、図９Ａに示し、ＨＰＣから構成されるリポソームについての結果を、図９Ｂに示す。
【００６９】
図９Ａに示されるように、４℃（正方形）で１０日後に、２０％未満の閉じ込められたテンパミンが、２５℃（白丸）での５０％の損失および３７℃（黒丸）での７０％より高い損失と比べて、リポソームから漏出した。４℃で３週間後、７０％より多くがカプセル化されたままであったのに対して、２５℃では、１０％未満がカプセル化されたままであった。３７℃で、カプセル化されたテンパミンは、３週間後には、カプセル化されていなかった。テンパミン放出の活性化エネルギー（Ｅａ）は、７１ＫＪ／ｍｏｌｅであった。
【００７０】
図９Ｂに示されるように、ＨＰＣリポソームからのテンパミンの放出は、ＥＰＣリポソームからの放出よりもかなり遅かった。ＨＰＣリポソームについて１０％未満の漏出が、１０日後に、４℃（正方形）、２５℃（白丸）、および３７℃で観察された。３週間後、４℃では、漏出は観察されず；２５℃では１０％未満であり、そして３７℃では、５０％未満が漏出した。テンパミン放出の活性化エネルギー（Ｅａ）は、４３ＫＪ／ｍｏｌｅであった。
【００７１】
テンパミンのリポソームからの放出の後のＥＰＲ信号の全回復は、テンパミンが、完全に機能的な安定な基の形態で放出されることを示す。ＣＶデータ（上記）およびＥＰＲ結果の両方は、テンパミンが、リポソームから放出された後、抗酸化剤活性を損失しないことを示す。
【００７２】
図９Ａ〜９Ｂに示されるデータから明らかであるように、閉じ込められたテンパミンの放出速度は、マトリクス脂質のＴｍによって影響された。一般的に、ＨＰＣに対する放出速度は、ＥＰＣに対する放出速度よりも低く、大きな単層小胞（ＬＵＶ）に対する放出速度より多層小胞（ＭＬＶ）に対する放出速度の方が低かった。表１に示される他のリポソーム処方物について、２ヶ月後、パーセントカプセル化は、以下の順（Ｖ＞ＶＩ＞ＩＩＩ＞ＩＶ（ここで、ローマ数字は、表１中の処方物番号を示す））であり、ここで、パーセントカプセル化は、これらの処方物に対してそれぞれ、８５％＞７５％＞７２％＞５３％であった。
【００７３】
（Ｄ．リポソームの安定性）
生理食塩水およびヒト血漿におけるリポソームの安定性を、ヒト血漿または０．１５ＭのＮａＣｌを用いてのいずれかで、リポソームの懸濁物を１０ｍＭの初期濃度から１ｍＭのテンパミンまで希釈することによって決定した。希釈したリポソームを、３７℃で１５時間インキュベートした。パーセントカプセル化テンパミンを、実施例３に記載されるように決定した。コントロールリポソーム懸濁物を、０．１５ＭのＮａＣｌで１ｍＭテンパミンまで希釈して、即時（時間０）測定した。
【００７４】
結果を図１０に要約し、これは、脂質組成（略語について表１を参照のこと）およびリポソームサイズの関数として、４つのテンパミンローディングリポソーム処方物のパーセントカプセル化および安定性を示す。リポソーム調製の直後（点線の棒）、生理食塩水中４℃で２ヶ月の保存後（網掛け棒）、生理食塩水中で１５時間の保存後（横縞の棒）、および血漿中３７℃で１５時間の保存後（白抜き棒）のテンパミンのパーセントカプセル化を示す。ＨＰＣ：Ｃｈｏｌ：２０００ＰＥＧ−ＤＳＰＥリポソーム処方物とＥＰＣ：Ｃｈｏｌ：２０００ＰＥＧ−ＤＳＰＥリポソーム処方物とを比較することによって示されるように、一般的に、ＭＬＶからの漏出は、０．１５ＭのＮａＣｌと比べて、血漿によって変更されなかった。ＨＰＣベースのリポソームの安定性とＥＰＣベースのリポソームの安定性との間の差は、大きな単層小胞（ＬＵＶ）と比較した場合、かなり大きかった。両方の種類の処方物（ＨＰＣベースまたはＥＰＣベース）について、リポソーム外媒体が、血漿または生理食塩水であった場合、ＬＵＶからのテンパミンの漏出において差が存在した。生理食塩水中での５６％の漏出に比べて、血漿中で９２％漏出が観測されたＥＰＣベースのリポソームについて見られるように、３７℃で、血漿中での漏出は、生理食塩水における漏出より大きかった。ＨＰＣベースのリポソームについて、生理食塩水中での１５％漏出に比べて、血漿中での２９％漏出が観測された。しかし、驚いたことに、マウス血漿における薬物動態学研究は、親水性ポリマー鎖および堅い脂質マトリクス（例えば、ＨＰＣ）を有するリポソーム中に閉じ込められたテンパミンが、増加した（延長された）循環寿命を有したことを示した。以下の節に記載されるように、これらの研究は、血漿中のテンパミンの半減期が、数分から約６時間まで延長されたことを示す。
【００７５】
（Ｖ．インビボにおけるリポソームの特徴付け）
現在までに、テンパミンがまた抗悪性腫瘍活性を有することは示されていなかった。インビボにおいて、テンパミンが首尾良くリポソーム内にロードされ、保持され得るかどうかも不明である。遠隔性のローディングおよび保持は望ましい。なぜなら、遠隔性のローディングは閉じ込められた容量にほとんど無関係に、リポソーム内の水性相中に薬物の高い含量を達成するためである。高い薬物ローディングは、腫瘍において噴出および蓄積し得る小単層リポソーム（ＳＵＶ）の使用を可能にする。この節において、テンパミンが抗悪性腫瘍活性を有し、ＳＵＶ中にロードおよび保持され、インビボにおいて有効な腫瘍処置のための血液循環寿命を高め得ることを示す、本発明を指示して実施された研究が記載される。
【００７６】
（Ａ．リポソーム包括テンパミンの薬物動態および生体分布）
リポソーム包括テンパミンおよび遊離テンパミンの薬物動態および生体分布を、健康なマウスおよび腫瘍を有するマウスにおいて決定した。実施例５に詳述されるように、正常ＢＡＬＢ／ｃマウスおよび皮下にＣ２６腫瘍細胞（１０６細胞／マウス）の移植片を有するＢＡＬＢ／ｃマウスに、静脈内注入により１ｋｇあたり１８ｍｇ（１０５μモル）のリポソーム包括テンパミンまたは遊離テンパミンを与えた。このリポソーム処方物は脂質標識を含み、リポソーム脂質の分布解析を可能にする。血中、および組織中のテンパミンレベルを、方法の節に記載するＥＰＲ技術を使用して測定した。
【００７７】
マウスに投与した後の遊離テンパミンおよびリポソーム包括テンパミンの薬物動態パラメータを表４に示す。正常なマウスと腫瘍を有するマウスの間で、テンパミンの排泄時間および組織分布において明らかな差異はなかったので、腫瘍を有するマウスの結果のみを示した。
【００７８】
【表４】
2005513104.tif 000006
【００７９】
図１１は、１ｋｇあたり１８ｍｇ（１０５μモル）の遊離形態（黒丸）でかまたはリポソーム包括形態（白丸）でのテンパミンの静脈内投与後の時間の関数としての血漿排泄（注入した用量の割合）を示すプロットである。表４の半減期（Ｔ１／２）を比較することによって、そして図１１に示す排泄特徴を比較することによって示されるように、遊離テンパミンの排泄は、リポソーム包括テンパミンと比較して速かった。分布容積（Ｖｓｓ）の減少は、ポリマー鎖のコーティングを有するリポソーム中にテンパミンをロードすることによって達成された。リポソーム包括テンパミンのＶｓｓは１．５２ｍｌであり、マウスの血漿の実際の量よりもわずかに大きかった。このことは、注入後にリポソーム包括テンパミンが血漿コンパートメントに保持され、末梢コンパートメントに移送されないことを示唆する。
【００８０】
体内分布解析の結果を図１２Ａ〜１２Ｆに示す。テンパミン（注入された用量の割合）（白丸）およびリポソームの脂質標識（黒丸）の、血漿中含量（図１２Ａ）、肝臓中含量（図１２Ｂ）、脾臓中含量（図１２Ｃ）、腎臓中含量（図１２Ｄ）、肺中含量（図１２Ｅ）および腫瘍中含量（図１２Ｆ）を示す。この研究において、マウスあたり２μモルのリポソーム包括テンパミンおよびマウスあたり１４μモルのリン脂質を、マウスに静脈内注入した。
【００８１】
図１２Ａは、リポソーム脂質およびリポソーム包括テンパミンが類似したパターンで血漿中から排泄されたことを示す。最初の８時間で放射活性の低下が観察され、その後、最後の４８時間の時点まで、排泄速度が減速した。
【００８２】
図１２Ｂ〜１２Ｆは、リポソーム包括テンパミンおよび脂質標識の組織分布を示す。一般に、遊離テンパミンの追跡は、注入後１時間および４時間に肝臓および脾臓において観察された。他の臓器において、４時間の時点でのテンパミンのレベルは、検出最小量（０．１μＭ）を下回った。従って、図１２Ｂ〜１２Ｆに示される組織分布の結果は、リポソーム包括テンパミンのみについてである。肝臓におけるテンパミンレベルは、注入後１〜８時間の間安定であった（図１２Ｂ、白丸）。２４時間で、テンパミンレベルは初期レベル（１時間での）の２５％に落下し、４８時間後には、初期レベルの７．５％が検出可能であった。注入後の最初の８時間の肝臓における初期安定テンパミン濃度は、肝臓におけるリポソーム包括テンパミンの定常蓄積に帰属し得る。脂質標識［３Ｈ］コレステリルヘキサデシルエーテル（黒丸）の濃度は、４８時間の試験期間にわたって、連続して増加した。
【００８３】
図１２Ｃは、脾臓におけるリポソーム包括テンパミン（ｔｅｍｐａｍｉｎｅ）の分布（白丸）およびリポソーム標識の分布（黒丸）を示す。テンパミンレベルは、経時的に減少し、血漿からのテンパミン排除の性質と類似する。これは、脾臓中の遅延したテンパミン蓄積がなかったことを示す。時間の関数としての脂質濃度（黒丸）は、肝臓に関して説明した脂質濃度と似ていた。
【００８４】
腎臓におけるテンパミンレベルは、図１２Ｄ（白丸）で示されるように、時間をかけて減少した。このことは、腎臓中でテンパミン蓄積が生じなかったことを示す。腎臓中の脂質濃度（黒丸）は、全ての試験時点で相対的に一定であった。このことは、この器官においてリポソームは蓄積するが、肝臓および脾臓における蓄積よりも小さな程度であることを示す。
【００８５】
最も高い濃度のテンパミンは、図１２Ｅ（白丸）に示されるように、肺において見出された。２００ｎｍｏｌ／ｇ組織の注射後１時間で、組織を測定した。そのレベルは、投与後４時間までに、このレベルの５０％に落ち、残りの試験時間にわたる緩やかな減少を伴った。肺テンパミン濃度の低下は、注射後最初の２４時間の間は、血漿中のテンパミンレベルの低下よりも遅かった。このことは、この時間間隔の間に、肺においていくらかのテンパミン蓄積があったことを示唆する。
【００８６】
図１２Ｆは、腫瘍組織におけるテンパミン濃度（白丸）および脂質濃度を示す。テンパミンのレベルは、注射（１ｇの組織に対し４２ｎｍｏｌｅ）後１〜８時間の間、腫瘍組織において安定なままであった。投与後２４時間で、その濃度は、１ｇの組織に対し約１８ｎｍｏｌｅに減少した。４８時間の時点まで、そのレベルは１ｇの組織に対し約４ｎｍｏｌｅであった。腫瘍におけるテンパミン排除は、全ての他の試験組織よりも遅く、初期レベル（１〜８時間での量）の１０％が注射の４８時間後になお存在する。標識した脂質（黒丸）に関して、持続的な放射活性の蓄積が、試験時間にわたって観察された。このことは、リポソームは腫瘍組織中に遊出かつ蓄積することを示す。
【００８７】
リポソームからの薬物の漏出／放出は、リポソームに対する薬物のモル比における変化から生じ得る（Ａｍｓｅｌｅｍ，Ｓ．，ら，Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ，６４：２１９（１９９３））。この技術は、血漿におけるリポソームからのテンパミンの放出を定量するために使用され、そしてその結果は、図１３Ａ〜１３Ｆに示される。これらの図は、注射後の様々な時間で、血漿（図１３Ａ）、肝臓（図１３Ｂ）、脾臓（図１３Ｃ）、肝臓（図１３Ｄ）、肺（図１３Ｅ）、および腫瘍（図１３Ｆ）中の、リン脂質に対するテンパミンの割合を示す。
【００８８】
血漿において（図１３Ａ）、注射後１時間以内に、ロードしたテンパミンの約３０％がリポソームから血漿中に漏出した。初期突発後、注射後１時間〜８時間の間の顕著な薬物漏出はなかった。このことは、テンパミン排除率および［３Ｈ］コレステリルエーテルの排除率が同じであることを示唆する。８時間後、テンパミンのゆっくりとした漏出が認められた。テンパミンリポソーム運搬における初期の急な落下にも関わらず、少なくとも８時間のリポソーム中の安定かつ高い量のテンパミンは、注射後のこのように早い時期の間、器官に対するインタクトなリポソーム包括テンパミンの一定の供給を提供する。
【００８９】
図１３Ｂ〜１３Ｆは、様々な器官における、脂質に対するテンパミンの割合を示す。図１３Ｂに見られるように、肝臓中の漏出速度は、注射後最初の８時間の間は遅く、そして８〜２４時間の間はより速かった。脾臓において（図１３Ｃ）、漏出は、注射後最初の４時間は遅く、次いで加速度的であった。腎臓において（図１３Ｄ）、漏出割合は、試験時間にわたって相対的に一定であった。肺において（図１３Ｅ）、他の器官と比較して、漏出は相対的に遅かった。腫瘍組織において（図１３Ｆ）、漏出は、注射後最初の４時間は速く、そしてその後は（他の器官に関連して）遅くなった。
【００９０】
（ＶＩ．テンパミン組成物の有用性）
上記の考察のように、活性酸素種（ＲＯＳ）は、細胞および組織に対して回復不能な損傷を引き起こし得る。多くの型の癌細胞は、異常な酸化剤レベルを有し（Ｗｉｓｅｍａｎ，Ｈ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１３：１７−２９（１９９６））、そして酸化剤−抗酸化剤不均衡と強く関連したいくつかの腫瘍としては、膀胱、血液、腸、乳房、結腸、直腸、肝臓、肺、腎臓、食道、卵巣、前立腺、および皮膚が挙げられる。癌細胞における、大量の活性酸素中間体の発生は、いくつかの腫瘍が変異し、抗蛋白分解酵素を阻害し、そして局所組織を損傷する能力に寄与し得、それにより腫瘍の異質性、浸潤および転移を促進する。従って、本発明は、細胞増殖により特徴付けられる状態の処置のため、テンパミン単独、または他の化学療法剤との組み合わせにおけるテンパミンの使用を検討する
炎症（慢性および急性の両方）は、ＲＯＳより生じる損傷と関連した別の症状である。急性炎症より生じる状態としては、ＵＶが起こした皮膚損傷、非ステロイド性抗炎症剤が起こした潰瘍性大腸炎、ならびに細菌性肺損傷または腐食性肺損傷が挙げられる。慢性炎症プロセスが関わる症状の例は、表５に示す。
【００９１】
（表５）
【００９２】
【表５】
2005513104.tif 000007
【００９３】
関節炎は、たいてい関節に生じるが、これは、慢性炎症プロセスの例である。本発明を支持して実施される他の研究において、リポソーム包括テンパミンが炎症性組織に標的化する能力が、ラットのアジュバント関節炎（ＡＡ）モデルを使用して評価した。ＡＡは、ラットにおける感受性系統（例えば、Ｌｅｗｉｓ系統（ＵｌｍａｎｓｋｙおよびＮａｐａｒｓｔｅｋ，Ｅｕｒ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５（４）：９５２−９５７，１９９５））にて誘導され得るＴ細胞媒介性自己免疫疾患である。ラットにおけるＡＡは、慢性関節リウマチおよび強直性脊椎炎の実験モデルとして、ならびに抗炎症性薬および／または免疫抑制性薬の試験のために、通常使用される（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．，ＭｃＣａｒｔｙ  Ｄ．Ｊ編、ＡＲＴＨＲＩＴＩＳ  ＡＮＤ  ＡＬＬＩＥＤ  ＣＯＮＤＩＴＩＯＮＳ，第９版，Ｌｅａ  ＆  Ｆｅｂｉｇｅｒ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ｐ．３０８，１９７９）。
【００９４】
ＡＡモデルを使用する研究が、実施例６に記載される。この研究において、ＡＡをフロイントアジュバント中の細菌の注入によって雄性ラットに導入した。テンパミンを含むリポソームを、硫酸アンモニウム勾配に対してテンパミンを遠隔ロードすることによって実施例５Ａに記載されるように調製した。そのリポソームを、ＡＡの誘導の２２日後に健常なラットおよび関節炎のラットへ注入により投与した。規則的な時間間隔で、リポソームの投与後に、血漿サンプルおよび組織サンプルを、体内分布および薬物速度論を決定するために取り出した。その結果が表６Ａ〜６Ｂに要約される。
【００９５】
（表６Ａ）健常なラットにおける（ＥＰＲ測定に基づいた）リポソーム包括テンパミンおよび（放射能測定に基づいた）リポソームの回復
【００９６】
【表６Ａ】
2005513104.tif 000008
【００９７】
（表６Ｂ）関節炎のラットにおける（ＥＰＲ測定に基づいた）リポソーム包括テンパミンおよび（放射能測定に基づいた）リポソームの回復
【００９８】
【表６Ｂ】
2005513104.tif 000009
【００９９】
遊離テンパミンの注入の４時間後、血漿中および試験された組織中のテンパミンの量は、健常なラットおよび関節炎のラットにおいて検出限界（＜０．５μＭ）より少なかった（データ示さず）。対照的に、リポソーム包括形態で注入される場合、同じ用量のテンパミンは、投与４時間後の血液中に存在する、健常なラットにおいて約４１μＭ（注入された用量のうちの２３％）および関節炎のラットにおいて５３μＭ（注入された用量のうちの３０％）を生じる。注入後２４時間において、注入された用量のうちの４％が、関節炎のラットの血漿中に存在した（表６Ｂ）。微量のリポソーム包括テンパミンを、注入後４時間目および２４時間目に肝臓、脾臓および腎臓において検出した。
【０１００】
健常なラットおよび関節炎のラットにおける炎症性組織へ選択的に溢出するテンパミンを含むリポソームの能力を比較した。その比較は図１４に示される。健常なラットおよび関節炎のラットにおけるリポソームの組織分布および血漿クリアランス速度もまた決定した。その結果を図１５Ａ〜１５Ｂに示す。
【０１０１】
図１４は、健常なラット（黒丸）および誘導されたアジュバント関節炎を有するラット（白丸）において、組織１グラムあたりの（放射性脂質マーカーを使用して測定される）リポソームリン脂質の量（ナノモル）を示す。健常なラットの足に対して２倍〜４倍高い関節炎のラットの炎症性の足へのリポソームの溢出が、すべての時点において観察された。炎症性の足におけるリポソーム濃度は、２４時間から約７２時間までおおよそ変化しないままであった（約２２０μｇ脂質／ｇ組織；２９３μモル脂質／ｇ組織；７％注入用量／足）。健常なラットの足におけるリポソーム濃度は、４８時間目で最大だった（１００μｇ／ｇ組織または２％注入用量／足）。
【０１０２】
図１５Ａ−１５Ｂは、テンパミン（ｔｅｍｐａｍｉｎｅ）投与後４時間（点を打った棒）、２４時間（斜線の棒）、４８時間（水平のストライプ）および７２時間（白い棒）にて、健康なラットにおける（図１５Ａ）、および誘導されたアジュバント関節炎を有するラット（図１５Ｂ）における、リポソームに封入されたテンパミンのｎｍｏｌリン脂質（ＰＬ）／グラム組織として、細胞分布を示す棒グラフである。炎症を起こした足における上昇したリポソーム濃度とともに、関節炎ラットの皮膚、腎臓、肺、および脾臓のリポソーム濃度は、健康なラットのこれらの組織におけるリポソーム濃度よりも低く、関節炎ラットにおけるリポソームが、炎症部位で受動的に標的化され、蓄積されることを示唆した。
【０１０３】
健康なラットおよび関節炎ラットの両方において、リポソームに捕捉されたテンパミンのクリアランス速度は、遊離のテンパミンより著しく長く、ＷｉｎＮｏｌｉｎ分析ソフトウェアを用いて計算したところ、健康なラットにおける半減期（ｔ１／２）は２３時間であり、関節炎ラットにおける半減期（ｔ１／２）は２５時間であった。
【０１０４】
（Ａ．組み合わせ療法）
さらに別の局面において、本発明は、化学療法剤と組み合わせたテンパミンの投与を企図する。本発明を支持して実施された研究において、他の化学療法剤と相乗的に作用するテンパミンの能力が、証明された。ドキソルビシンは、モデルとなる化学療法剤として選択された。テンパミンによるドキソルビシン細胞傷害性の増強が、実施例１Ａに記載されるように、３つの細胞株において試験された。実施例１Ｂに記載されるとおりの細胞傷害性アッセイが、使用された。細胞株の２つ、ＭＣＦ−７およびＭ−１０９Ｓは、ドキソルビシン感受性株であり、１つの細胞株、Ｍ−１０９Ｒは、ドキソルビシン耐性であった。ＭＣＦ−７株は、テンパミンに、より感受性である（１００μＭの７５％の増殖抑制を引き起こした）が、しかしＭ−１０９Ｓ細胞よりは、ドキソルビシンに感受性でない。結果を表７に要約する。
【０１０５】
表７
種々の細胞株に対するドキソルビシンのＩＣ５０（μＭ）に対するテンパミン濃度の効果
【０１０６】
【表７】
2005513104.tif 000010
【０１０７】
ＭＣＦ−７細胞においては、ドキソルビシンのＩＣ５０値は、１００μＭ  ＴＭＮが存在すると、大きさが１桁減少した。Ｍ−１０９Ｓ細胞において、１００μＭ〜２００μＭのテンパミンの添加は、ドキソルビシンの観察されたＩＣ５０を５０％まで減少させた。Ｍ−１０９Ｒ細胞において、２００μＭテンパミンの添加は、ドキソルビシンへの細胞感受性を高めた。
【０１０８】
要約すると、比較的低いテンパミン濃度が、ドキソルビシンへの細胞感受性を増加させるのに必要だった。テンパミンおよびドキソルビシンを用いた細胞の組み合わせ処置は、ドキソルビシンのＩＣ５０を著しく減少させた。これは、細胞を、低い、非細胞傷害性濃度（１００μＭ）のテンパミンに曝した場合、特に観察された。
【０１０９】
前記のことより、本発明の種々の目的および特徴が、どのように満たされるのかが分かり得る。ピペリジンニトロキシドであるテンパミンは、細胞の成長および増殖を阻害するのに効果的な薬剤として治療的活性を有する。単独でまたはリポソームのような血中循環時間を延長するのに適切な小胞中で投与される、この化合物は、腫瘍または炎症領域のような、罹患の部位に浸潤することが出来る。特に、リポソ−ム中に封入された薬物（ここで、薬物は、血管外遊出のために十分小さなリポソーム中で高い薬物／脂質比にてローディングされる）の送達は、酸化的損傷によって引き起こされる状態の処置のために組成物を提供する。テンパミンもまた、ドキソルビシンのような他の治療剤の活性を高めるのに効果的である。
【実施例】
【０１１０】
（ＶＩＩ．実施例）
以下の実施例は、本明細書中に記載される本発明をさらに例示し、そして本発明の範囲を限定する意図は全くない。
【０１１１】
（材料）
２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−４−アミノ−１−オキシル（４−アミノ−ｔｅｍｐｏと呼ばれるテンパミン）フリーラジカル、９７％を、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ，ＵＳＡ）より購入された。卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣＩ）および水素化ダイズホスファチジルコリン（ＨＰＣ）を、Ｌｉｐｏｉｄ  ＫＧ（Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。Ｎ−カルバミル−ポリ−（エチレングリコールメチルエーテル）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミントリエチルアンモニウム塩（２０００ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）（このポリエチレン部分は、２０００Ｄａの分子量を有する）を、従来通り調製した。コレステロールを、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から入手した。Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０を、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）から入手した。ｔｅｒｔ−ブタノ−ルを、ＢＤＨ，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫから購入した。フルオレセインホスファチジルエタノールアミンを、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ，ＵＳＡ）から入手した。他の化学物質（緩衝液を含む）を、Ｓｉｇｍａから入手した。透析膜（透析チュービング−ビスキング（大きさ６−２７／３インチ）を、Ｍｅｄｉｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）から入手した。の可能な最も低いレベルの全ての有機炭素および無機イオンを提供する、精製水（ＷａｔｅｒＰｒｏ  ＰＳ  ＨＰＬＣ／Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄモデル，Ｌａｂｃｏｎｃｏ，Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ，ＭＯ，ＵＳＡ）を、水に基づく全ての調製物において使用した。
【０１１２】
（方法）
（１．電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）測定）
ＥＰＲ分光計測は、ＪＥＳ−ＲＥ３Ｘ  ＥＰＲ分光計（ＪＥＯＬ  Ｃｏ．，日本）（Ｆｕｃｈｓ，Ｊら、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，２２：９６７−９７６（１９９７））を使用して、テンパミン（ｔｅｍｐａｍｉｎｅ）濃度を検出するために採用した。サンプルを、シリンジによって、内径０．８１ｍｍおよび壁厚０．０５ｍｍのガス透析テフロン（登録商標）キャピラリーチューブ（Ｚｅｕｓ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｒａｒｉｔａｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）に抜き取った。キャピラリーチューブを、両端の解放した内径２．５ｍｍの水晶管に挿入し、そしてＥＰＲ穴に配置した。ＥＰＲスペクトルを、中心場を３２９ｍＴ、１００ｋＨＺ変調周波数、０．１ｍＴ変調振幅および非飽和マイクロウェーブパワーで記録した。ＥＰＲ測定直前に、ローディングされたリポソームを、適したテンパミン濃度範囲（０．０２〜０．１ｍＭ）になるよう０．１５Ｍ  ＮａＣｌで希釈した。本実験は、空気下、室温で実施した。これは、テンパミンの活性を決定するための機能的なアッセイである。
【０１１３】
（２．サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）測定）
全てのサイクリックボルタンメトリーを、−２００ｍＶと１．３Ｖとの間で実施した。
【０１１４】
測定をｐＨ７．４のリン酸緩衝化生理食塩水中で実施した。３電極システムを、実験を通じて使用した。作用電極は、直径３．３ｍｍのガラス状炭素ディスク（ＢＡＳ  ＭＦ−２０１２、Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗ．Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＩＮ、ＵＳＡ）であった。補助電極は、プラチナワイヤーでありまた、照合電極は、Ａｇ／ＡｇＣｌ（ＢＡＳ）であった。作用電極は、各測定の前に磨きキット（ＢＡＳ  ＰＫ−１）（Ｋｏｈｅｎ，Ｒら、Ａｒｃｈ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．Ｇｅｒｉａｔｒ．，２４：１０３−１２３、（１９９６））を使用して磨いた。ＣＶ測定直前にサンプルを、最適のテンパミン濃度範囲（０．０５〜０．２ｍＭ）に緩衝化液を用いて希釈した。実験は、空気下、室温で実施した。ＣＶアッセイは、機能的アッセイである。
【０１１５】
（実施例１）
（Ａ．遊離テンパミンのインビボ試験）
（細胞株および培養条件）
ＭＣＦ−７（ヒト乳腺癌）、Ｍ−１０９Ｓ（ドキソルビシン感受性ヒト乳癌）およびＭ−１０９Ｒ（ドキソルビシン耐性ヒト乳癌）をＲＰＩＭ培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂｅｉｔ  ＨａＥｍｅｋ、Ｉｓｒａｅｌ）中に保持し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を補った。細胞株は、３７℃、湿潤５％ＣＯ２大気相の標準的培養条件下で維持した。
【０１１６】
（Ｂ．細胞毒性アッセイ）
細胞増殖に対するテンパミンの影響を、メチレンブルーアッセイ（Ｈｏｒｏｗｉｔｚ，Ａ．Ｔ．、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１１０９：２０３（１９９２））によって決定した。簡単に、細胞を９６ウエルプレート上に播種し（ウエルあたり６×１０３細胞の密度のＭＣＦ細胞ならびにウエルあたり１．５×１０３細胞の密度のＭ−１０９ＳおよびＭ−１０９Ｒ）、そして異なるテンパミン濃度で処理する前に２４時間の間、成長させた。テンパミン（５×１０−５〜４×１０−４）の添加の後、細胞を４日間、培地を交換することなくＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ中でインキュベートした。次に、細胞を２．５％グルタルアルデヒドで固定し、メチレンブルーで染色し、そして分光光度法的にアッセイした。
【０１１７】
（Ｃ．アポトーシスの検出）
アポトーシスをフローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ）により評価した。１×１０６個の細胞を、培地から取り除き、ＰＢＳで洗浄し、そしてメロシアニン−５４０（Ｒｅｉｄ，Ｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９２：４３（１９９６））で染色した。簡単に、細胞ペレットを、５００μｌのＰＢＳで再懸濁した。１ｍｇ／ｍｌ溶液のメロシアニン−５４０の２．５μｌを細胞に添加し、暗所、室温で２分間、インキュベートした。細胞を洗浄し、１ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、そして直ちに、蛍光活性化細胞選別フローサイトメトリー（Ｖａｎｔａｇｅ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｒｕｎｔｈｅｒｆｏｒｄ、ＮＪ、ＵＳＡ）を実行した。
【０１１８】
（実施例２）
（リポソーム調製）
（Ａ．リポソーム形成）
リポソームを、脂質をｔｅｒｔ−ブタノール中で溶かすことによって調製し（６個の処方物の各々において使用される脂質についての表１を参照のこと）、一晩、凍結乾燥した。乾燥脂質粉末を、硫化アンモニウム溶液（１５０ｍＭ）で再懸濁した。再水和を、基質脂質のＴｍ（ＨＰＣについて５２．２℃およびＥＰＣについて−５℃（Ｍａｒｓｈ，Ｄ．、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ、５７：１０９−１２０（１９９１））より上で実施した。再水和を、多層小胞（ＭＬＶ）を形成するよう連続攪拌状況下で実施した。水和媒体の容量を、１０％（ｗ／ｖ）脂質濃度を得るために調製した。大きな単層小胞（ＬＵＶ）を、ＬｉｐｏｓｏＦａｓｔ−Ｂａｓｉｃ  ｄｅｖｉｃｅ（ＡＶＥＳＴＩＮ、Ｏｔｔａｗａ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）を使用して、０．１μｍの孔サイズのフィルター（Ｐｏｒｅｔｉｃｓ、Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を通したＭＬＶの抽出物によって調製した。調製におけるリポソームサイズの分布を、Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ｍｏｄｅｌ  Ｎ４  ＳＤ）ｓｕｂｍｉｃｒｏｎ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ａｎａｌｙｚｅｒを使用して、光子相関分光学によって測定した。１２００±２００ｎｍおよび１００±１０ｎｍのサイズ分布を、それぞれＭＬＶおよびＬＵＶについて得た。本研究において使用されるリポソーム形態は、表１に要約する。
【０１１９】
（Ｂ．アンモニウムスルフェート勾配の形成）
Ａｍｓｅｌｅｍら（Ｊ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．、２：９３−１２３（１９９２））の透析の手順を、利用した。簡潔には、この手順は、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ＝５．２）の１００容量に対する２回の連続的な透析交換および０．１５Ｍ  ＫＣｌ（ｐＨ＝６．７）の１００容量に対する第三の透析交換を使用した。硫酸アンモニウムを、１００〜１０００の範囲で外部媒体を越えてリポソームの内側に［（ＮＨ４）２ＳＯ４］の所望の勾配を与えるのに、十分な濃度で溶解した。
【０１２０】
（Ｃ．テンパミンでロードするリポソーム）
濃縮したテンパミンアルコール溶液（７０％エタノール中に０．８ｍｌの２５ｍＭテンパミン）を、１０ｍｌのリポソーム懸濁液に加えた。この最終溶液は、５．６％エタノールおよび２ｍＭテンパミンを含んだ。ローディングを、マトリックス脂質のＴｍ上で実施した。ローディングを、４℃で透析を使用する非カプセル化テンパミンの除去によって特定の時間で終えた。ローディングの有効性を、以下に記載するように決定した。
【０１２１】
（実施例３）
（テンパミンのパーセントカプセル化）
実施例２に従って調製されたリポソームの包括されたテンパミンの量を、以下の手順によって決定した。最初に、ローディング後リポソーム調製物におけるテンパミンの総量（ＴＭＮｍｉｘ）を、測定した。次いで、フェリシアン化カリウム、遊離（非リポソームの）テンパミンのシグナルを除去するＥＰＲ広幅化薬剤の存在下での、ローディング後リポソーム調製物におけるテンパミンの量を、測定した。残ったシグナルは、リポソーム中のテンパミン（ＴＭＮｌｉｐｏｓｏｍｅ（ｑｕｅｎｃｈｅｄ）のシグナルである。リポソーム内のテンパミン濃度が高い場合、このスペクトルを広げ、互いに近接したテンパミン粒子の間のスピン相互作用に起因するそのＥＰＲシグナルのクエンチングを誘導した。次いで、ニゲリシン（ｎｉｇｅｒｉｃｉｎ）によってリポソームからテンパミンを放出した後のテンパミンの総量（ＴＭＮｎｉｇｅｒｉｃｉｎ）を、測定した。このシグナルは、ローディングのために使用されるテンパミンの総量と同じであり（ＴＭＮｎｉｇｅｒｉｃｉｎ＝ＴＭＮｔｏｔａｌ）、そして完全に脱クエンチされている。硫酸アンモニウム勾配を低下させ、そして全てのテンパミンを放出する場合、ＴＭＮｌｉｐｏｓｏｍｅ（ｎｏｔ  ｑｕｅｎｃｈｅｄ）は、リポソームテンパミンのシグナルを表わす。
【０１２２】
パーセントカプセル化およびクエンチング因子を、以下のように計算した。
【０１２３】
ＴＭＮｆｒｅｅ＝ＴＭＮｍｉｘ−ＴＭＮｌｉｐｏｓｏｍｅｓ（ｑｕｅｎｃｈｅｄ）                  （１）
ＴＭＮｌｉｐｏｓｏｍｅｓ（ｎｏｔ  ｑｕｅｎｃｈｅｄ）＝ＴＭＮｎｉｇｅｒｉｃｉｎ−ＴＭＮｆｒｅｅ  （２）
パーセントカプセル化＝１００×ＴＭＮｌｉｐｏｓｏｍｅ（ｎｏｔ  ｑｕｅｎｃｈｅｄ）／ＴＭＮｎｉｇｅｒｉｃｉｎ          （３）
クエンチング因子＝ＴＭＮｌｉｐｏｓｏｍｅ（ｎｏｔ  ｑｕｅｎｃｈｅｄ）／ＴＭＮｌｉｐｏｓｏｍｅ（ｑｕｅｎｃｈｅｄ）              （４）
このデータを、表３に示す。
【０１２４】
（実施例４）
（リポソームからのテンパミン放出）
上記のように調製された、卵子ホスファチジルクロリン（ＥＰＣ）ベースのリポソームからおよび水素化ダイズホスファチジルクロリン（ＨＰＣ）ベースのリポソームからのテンパミンの放出は、３つの異なる温度：４℃、２５℃および３７℃で２１日間行われた。リポソーム分散媒体のｐＨは、約５．５であった。リポソーム懸濁液から、アリコートを、規定された時間でとり、そして非カプセル化テンパミンを、Ｓｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ５０カラムを使用してゲルろ過によって除去した。リポソームを、試験管の中に置き、そして特定温度で保存した。
【０１２５】
ＥＰＲ測定前、全てのサンプルを、室温（２３℃）にした。各サンプルを、最初にフェリシアン化カリウムを用いず測定し、次いでフェリシアン化カリウム、ＥＰＲ広幅化薬剤（これは、ゲルろ過工程の後、リポソームから漏出したテンパミンから生じる外部テンパミンシグナルを排除する）を用いて測定した。パーセントカプセル化を、実施例３において示された方程式１〜３を使用して計算した。この結果を、図９Ａ〜図９Ｂにおいて示した。
【０１２６】
（実施例５）
（リポソーム包括テンパミンのインビトロ試験）
（Ａ．リポソーム調製）
立体的に安定化されたリポソームは、ＨＰＣ：Ｃｈｏｌ：２０００ＰＥＧ−ＤＳＰＥ；５４：４１：５のモル比からなり、そして［３Ｈ］コレステロールエーテルの痕跡量（１００μＣｉ／８００μｍｏｌリン脂質）を、Ｇａｂｉｚｏｎら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５４：９８７（１９９４））によって記載されたように調製した。簡潔に、脂質成分を、ｔｅｒｔ−ブタノールに溶解し、次いで［３Ｈ］コレステロールエーテルを、加えた。「ドライケーク」を、一晩の凍結乾燥によって形成した。水和媒体は、０．２５Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ５．７）からなった。水和を、６０℃（マトリックス脂質のＴｍより上）で力強いボルテックス下で実施した。リポソームを、高圧力噴出デバイス（Ｌｉｐｅｘ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ、Ｃａｎａｄａ）を使用して細孔サイズ（０．４、０．２、０．１、０．０８、０．０５μｍ）を徐々に減少する二重ポリカルボネート膜を通して６０℃での噴出によって縮小した。噴出されたリポソームを、４℃で０．１５Ｍ  ＮａＣｌの１００倍の容量（２４時間にわたって４交換）に対して透析した。
【０１２７】
テンパミンを、硫酸アンモニウム勾配によってリポソーム中に活発にロードした。ローディングを、６０℃、すなわちマトリックス脂質のＴｍより上、で実施し、そして温度を減少することによって所望の時間で止めた。リポソームテンパミン調製物を、０．２μｍ細孔フィルターを通してろ過することによって滅菌し、４℃にて保存した。
【０１２８】
リン脂質濃度を、Ｂａｒｔｌｅｔｔの手順（Ｂａｒｅｎｈｏｌｚ、Ｙ．ら、ＬＩＰＯＳＯＭＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、Ｇ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ（編）、第二版、第Ｉ巻、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ｐｐ．５２７−６１６、（１９９３））の改変を使用して決定した。［３Ｈ］クロロエステリルヘキサデシルエーテルを、β計数（ＫＯＮＴＲＯＮ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｃｏｕｎｔｅｒ）によって測定した。組織および血漿中のテンパミン濃度を、方法の節において上記したように、電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）によって測定した。調製物におけるリポソームサイズの分布を、Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ｍｏｄｅｌ  Ｎ４  ＳＤ、サブミクロン粒子分析器）を使用して光子相関分光法によって測定した。リポソーム調製後のリン脂質損失は２８％であり、この損失のほとんどが、噴出の間に生じた。ロードされたテンパミンの量を、上記したようなＥＰＲ法を使用して計算した。ロードされたテンパミン：得られたリン脂質モル比は、約０．１４であった。平均の小胞サイズは、８８±１５ｎｍであった。
【０１２９】
（Ｂ．生分配研究）
Ａｎｉｍａｌ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｈｏｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｅｂｒｅｗ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、Ｉｓｒａｅｌ）を通じて得られた８〜１２週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスを、この研究全体を通して使用した。動物を、食物および水を自由に与えて、Ｈａｄａｓｓａｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒに保管した。全ての手順は、Ｈｅｂｒｅｗ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙおよびＨａｄａｓｓａｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＯｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  ＣａｒｅおよびＵｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｅｅによって求められた基準に従った。各マウスの左側腹に腫瘍細胞（１×１０６Ｃ２６細胞）の接種物の一つを皮下注入した。接種の後一週間、遊離形態のテンパミン０．３６ｍｇ（２．１μｍｏｌｅ）／マウス（１８ｍｇ（１０５μｍｏｌｅ）／ｋｇ体重）またはリポソーム包括テンパミンを、尾の静脈を通じて静脈内（ｉ．ｖ．）ボーラスによって注入した。脂質用量は、１１ｍｇ（１４．７μｍｏｌｅ）／マウス（３７７ｍｇ（５１４μｍｏｌｅ）／ｋｇ体重）であった。注入の１時間後、４時間後、８時間後、２４時間後、および４８時間で、この動物を、エーテル吸入を用いて麻酔し、眼の摘出によって出血させ、そして肝臓、肺、脾臓、腎臓および腫瘍の除去のため、直ちに屠殺した。各時間点は、３匹マウスからなった。血漿を、遠心分離によって分離した。
【０１３０】
Ｃ．サンプル調製
器官中の、全テンパミン濃度（カプセル化したおよび遊離型の）を測定するために、リポソームを２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（１：２、器官：Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液）中のＰｏｌｙｔｒｏｎホモジナイザー（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ，Ｌｕｔｚｅｒｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）における均質化によって可溶化した。脂質膜を破壊するために、均質化混合物を数回、冷却および加温した（Ｂａｒｅｎｈｏｌｚ，Ｙら、ＬＩＰＯＳＯＭＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，Ｇ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ（著）、第２版、第１巻、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、５２７頁〜６１６頁（１９９３））。試験サンプル中で１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００にするために、血漿サンプルを２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と１：１で混合し、そしてまた、数回、冷却および加温した。これらの条件は、インタクトのリポソームから、閉じ込めたテンパミン全ての放出を達成するために効果的である。
【０１３１】
窒素酸化物＋ヒドロキシアミンの全体の濃度を決定することに関しては、最終濃度２ｍＭ〜３ｍＭ（試験組織に依存する）のフェリシアン化カリウムを全てのサンプル（原形質および組織ホモジネート）に添加し、ヒドロキシアミンを酸化してインタクトな窒素酸化物にした。
【０１３２】
Ｄ．血漿か器官のどちらかにおける［３Ｈ］コレステリルヘキサデシルの測定
第Ｆ節で上記されるように調節したサンプルから、２連の１００μｌをＳａｍｐｌｅ  Ｏｘｉｄｉｚｅｒ（Ｍｏｄｅｌ３０７、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．，Ｍｅｒｉｄｉｅｎ，ＣＴ）で酸化させ、そして一晩冷暗所に置いた。その後、サンプルをβ−計数（ＫＯＮＴＲＯＮ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｃｏｕｎｔｅｒ）によって測定した。
【０１３３】
（実施例６）
（関節炎の処置のためのテンパミン封入リポソーム）
（Ａ．動物）
雌のＬｅｗｉｓラット（１６０〜１８０ｇ）を、Ｈａｒｌａｎ  ＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮから購入した。それらを制御された環境に収容し、標準げっ歯類用固形飼料および水を提供した。
【０１３４】
アジュバント関節炎（ａｄｊｕｖｅｎｔ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）（ＡＡ）を、鉱油中のマイコバクテリア（Ｆｒｅｕｎｄアジュバント）の単回皮内注射によって誘導した。アジュバント関節炎に感受性のあるラットの系統において、注射部位における非特異的初期炎症が、注射後約１０日続き、続いて、多発性関節炎または続発性特異的炎症が散在した。Ｌｅｗｉｓ系統のラット（ＡＡに対して非常に感受性がある）に、Ｆｒｅｕｎｄの完全アジュバント（ＦＣＡ）（Ｄｉｆｃｏ）中の１ｍｌのマイコバクテリアヒト型結核菌Ｈ３７Ｒａ（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ，米国）を、尾の付け根の皮下に注射した。足の最大膨張は、２０〜２７日間生じた。
【０１３５】
（Ｂ．リポソーム）
リポソームを実施例５Ａに記載のように調製した。
【０１３６】
（Ｃ．生体分布および薬物速度論）
テンパミンを含まないリポソームまたはテンパミン封入リポソームを、Ｆｒｅｕｎｄの完全アジュバント（最大膨張）の注射後２２日目に、健常なラットおよび関節炎ラットに注射した。テンパミンを１．８ｍｇ／ｋｇ（１０．５μｍｏｌ／ｋｇ）の用量で投与した。注射されたリポソームのリン脂質濃度は、４２ｍｇ／ｋｇ（５６μｍｏｌ／ｋｇ）であった。注射後４時間、２４時間、４８時間および７２時間において、各試験グループ中の数匹のラットを屠殺し、そしてそれらの血漿、肝臓、腎臓、脾臓、および肺を、リポソームマーカー［３Ｈ］コレステリルヘキサデイルエーテル（全組織中）についてはＳａｍｐｌｅＯｘｉｄｉｓｅｒ（Ｍｏｄｅｌ３０７，Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ）を使用して、そしてテンパミン（リポソームを可溶化させるための２％のＴｒｉｔｏｎの添加による組織ホモジネート中）についてはＪＥＳ−ＲＥ３Ｘ  ＥＰＲ分光計（ＪＥＯＬ  Ｃｏ．，日本）を使用して試験した。皮膚および足を、リポソームマーカーの存在について試験した。結果を表６Ａ−６Ｂに示す。
【０１３７】
本発明は、特定の実施形態に関して記載されているが、種々の変化および改変が、本発明から逸脱することなくなされ得ることは当業者に対して明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】図１Ａ〜１Ｃは、ピペリジンニトロキシドであるテンポ（ｔｅｍｐｏ）（図１Ａ）、テンポール（ｔｅｍｐｏｌ）（図１Ｂ）、およびテンパミン（図１Ｃ）の化学構造を示す。
【図２】図２は、そのニトロキシドアミノキシル（ａｍｉｎｏｘｙｌ）部分の酸化還元状態を示す。
【図３】図３は、テンパミンの代表的な電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）シグナルを示す。
【図４】図４は、種々の濃度のテンパミン（黒丸）またはテンポール（白丸）に曝して７２時間後のＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞の％生存をのプロットである。
【図５】図５Ａ〜５Ｂは、緩衝液中のＭＣＦ−７癌細胞（コントロール、図５Ａ）およびテンパミン（１ｍＭ）で２４時間処理したＭＣＦ−７癌細胞（図５Ｂ）の、トリプシン処理し、ｍｅｒｏｃｙａｎｉｎｅ−５４０で染色し、次いでフローサイトメトリーで分析した、フローサイトメトリー走査である。Ｍ１により示される領域は、蛍光標識されたアポトーシス細胞を示す。
【図６】図６は、アンモニウムイオン勾配に逆らって、リポソームへの例示的なニトロキシドテンパミン（ＴＭＮ）をローディングするにあたってのイオン化事象を例示する。
【図７】図７は、リポソームへのカプセル化前（破線）およびカプセル化後（実線）のテンパミンの電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）シグナルを示す。
【図８】図８は、リポソームへのカプセル化前（破線）およびカプセル化後（実線）のテンパミンのサイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）シグナルを示す。
【図９】図９Ａ〜９Ｂは、４℃（四角）、２５℃（白丸）および３７℃（黒丸）での卵ホスファチジルコリンから調製されたテンパミンの漏出（図９Ａ）および水素付加ダイズホスファチジルコリンから調製されたテンパミンの漏出（図９Ｂ）を示すプロットである。
【図１０】図１０は、脂質組成およびリポソームサイズの関数としての４種類のテンパミンローディングリポソーム処方物の％カプセル化および安定性を示すプロットである。リポソーム調製直後（点描棒）、４℃で生理食塩水中２ヶ月保存後（陰影線付き棒）、生理食塩水中１５時間保存後（横縞棒）、および３７℃で血漿中１５時間後（白棒）のテンパミンの％カプセル化を示す。
【図１１】図１１は、遊離テンパミンまたはリポソームにトラップしたテンパミンを１８ｍｇ（１００μｍｏｌｅ）／ｋｇ静脈投与した後の時間の関数としての、遊離テンパミン（黒丸）およびリポソームにトラップしたテンパミン（白丸）の血漿排除を示すプロットである。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｆは、マウスの血漿（図１２Ａ）、肝臓（図１２Ｂ）、脾臓（図１２Ｃ）、腎臓（図１２Ｄ）、肺（図１２Ｅ）、および腫瘍（図１２Ｆ）中に注入した後の時間の関数としての、リポソームにトラップしたテンパミンを静脈内注入したマウスにおけるリポソームにトラップしたテンパミン（白丸）およびリポソーム脂質標識（黒丸）の分布を示すプロットである。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｆは、種々の注射後時間における、血漿（図１３Ａ）、肝臓（図１３Ｂ）、脾臓（図１３Ｃ）、腎臓（図１３Ｄ）、肺（図１３Ｅ）および腫瘍（図１３Ｆ）におけるテンパミン  対  リン脂質比を示すプロットである。
【図１４】図１４は、トラップされたテンパミンを含むリポソームを健康なラット（黒丸）および誘導性アジュバント関節炎を有するラット（白丸）に投与した後の組織１ｇあたりのリポソームリン脂質の量を示すプロットである。
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｂは、４時間（点描棒）、２４時間（陰影線付き棒）、４８時間（横縞棒）および７２時間（白棒）での、健康なラット（図１５Ａ）および誘導性アジュバント関節炎を有するラット（図１５Ｂ）における組織１ｇあたりのｎｍｏｌｅリン脂質（ＰＬ）として調べた、リポソームにトラップされたテンパミンの組織分布を示す棒グラフである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2005513104.tif 000021
【図９】
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【図１０】
2005513104.tif 000023
【図１１】
2005513104.tif 000024
【図１２】
2005513104.tif 000025
【図１３】
2005513104.tif 000026
【図１４】
2005513104.tif 000027
【図１５】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年6月22日(2004.6.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞酸化損傷から生じる状態の処置のための組成物であって、該組成物は、リポソームを含み、該リポソームは、以下：
（ｉ）小胞形成脂質、（ｉｉ）親水性ポリマーで誘導体化された約１〜２０の間のモルパーセントの脂質、および（ｉｉｉ）該リポソーム中に封入されているテンパミン
から構成される、
組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物であって、前記テンパミンが、一緒に封入されている対イオンの存在下での沈殿を達成するのに十分な濃度で前記リポソームの中に封入されている、組成物。
【請求項３】
前記リポソームが、コレステロールをさらに含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記小胞形成脂質が、水素付加ホスファチジルコリンである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記親水性ポリマーがポリエチレングリコールである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記対イオンが、スルフェートである、請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
細胞に対する酸化損傷によって引き起される状態を処置する用途のための組成物であって、該組成物は、請求項１〜６のいずれか１項に記載のリポソームを含む、組成物。
【請求項８】
化学療法剤と併用される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
請求項８に記載の組成物であって、前記化学療法剤が、親水性ポリマーで誘導体化された小胞形成脂質から構成されるリポソーム中に封入されている、組成物。
【請求項１０】
請求項８または９に記載の組成物であって、前記化学療法剤が、ドキソルビシンアナログ、ダウノルビシンアナログ、シスプラチンアナログ、タキソールアナログ、およびカンプトテシンアナログからなる群より選択される、組成物。
【請求項１１】
化学療法活剤の化学療法活性を増強する用途のための組成物であって、該組成物は、薬学的に受容可能なビヒクルで投与されるテンパミンを含む、組成物。
【請求項１２】
前記ビヒクルがリポソームである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１または１２に記載の組成物であって、ここで、前記化学療法剤はリポソーム封入形態で投与される、組成物。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載の組成物であって、前記リポソームは、以下：（ｉ）小胞形成脂質、（ｉｉ）親水性ポリマーで誘導体化された約１〜２０の間のモルパーセントの脂質から構成される、組成物。
【請求項１５】
請求項１２に記載の組成物であって、前記テンパミンが、一緒に封入されている対イオンの存在下での沈殿を達成するのに十分な濃度で前記リポソームの中に封入されている、組成物。
【国際調査報告】
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