(57)【要約】ヒト・リボヌクレオチド還元酵素Ｍ２サブユニットのプロモーター配列またはゲノム配列を含む単離核酸。対象者が細胞増殖に関連のある疾患に罹患しているか該疾患を発症するリスクがあるかどうかを判定する方法、細胞増殖に関連のある疾患を治療するための化合物を同定する方法、細胞増殖に関連のある疾患を治療する方法、かつ細胞増殖に関連のある疾患の治療法を開発する方法も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２と少なくとも６０％同一であるプロモーター配列、および
転写産物をコードするヌクレオチド配列
からなり、該プロモーター配列が該ヌクレオチド配列と作動可能なように連結していることを特徴とする単離核酸。
【請求項２】
前記プロモーター配列が配列番号２と少なくとも７０％同一である、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
前記プロモーター配列が配列番号２と少なくとも８０％同一である、請求項２に記載の核酸。
【請求項４】
前記プロモーター配列が配列番号２と少なくとも９０％同一である、請求項３に記載の核酸。
【請求項５】
前記プロモーター配列が配列番号２と少なくとも９５％同一である、請求項４に記載の核酸。
【請求項６】
前記プロモーター配列が配列番号２である、請求項５に記載の核酸。
【請求項７】
配列番号３と少なくとも６０％同一であるプロモーター配列、および
転写産物をコードするヌクレオチド配列
からなり、該プロモーター配列が該ヌクレオチド配列と作動可能なように連結していることを特徴とする単離核酸。
【請求項８】
前記プロモーター配列が配列番号３と少なくとも７０％同一である、請求項７に記載の核酸。
【請求項９】
前記プロモーター配列が配列番号３と少なくとも８０％同一である、請求項８に記載の核酸。
【請求項１０】
前記プロモーター配列が配列番号３と少なくとも９０％同一である、請求項９に記載の核酸。
【請求項１１】
前記プロモーター配列が配列番号３と少なくとも９５％同一である、請求項１０に記載の核酸。
【請求項１２】
前記プロモーター配列が配列番号３である、請求項１１に記載の核酸。
【請求項１３】
配列番号４と少なくとも８０％同一であるプロモーター配列、および
転写産物をコードするヌクレオチド配列
からなり、該プロモーター配列が該ヌクレオチド配列と作動可能なように連結していることを特徴とする単離核酸。
【請求項１４】
前記プロモーター配列が配列番号４と少なくとも９０％同一である、請求項１３に記載の核酸。
【請求項１５】
前記プロモーター配列が配列番号４と少なくとも９５％同一である、請求項１４に記載の核酸。
【請求項１６】
前記プロモーター配列が配列番号４である、請求項１５に記載の核酸。
【請求項１７】
配列番号１と少なくとも８６％同一である単離核酸。
【請求項１８】
配列番号１と少なくとも９０％同一である、請求項１７に記載の核酸。
【請求項１９】
配列番号１と少なくとも９５％同一である、請求項１８に記載の核酸。
【請求項２０】
配列番号１である、請求項１９に記載の核酸。
【請求項２１】
対象者が細胞増殖に関連のある疾患に罹患しているかまたは該疾患を発症するリスクを有するかどうかを判定する方法であって、
対象者からのゲノムＤＮＡを含む試験サンプルを用意すること、および
該試験サンプル中のＲＲＭ２ゲノムＤＮＡのレベルを測定すること
からなり、該試験サンプル中のＲＲＭ２ゲノムＤＮＡのレベルが正常サンプル中のレベルより高い場合、該対象者が細胞増殖に関連のある疾患に罹患しているかまたは該疾患を発症するリスクを有することが示される方法。
【請求項２２】
細胞増殖に関連のある疾患を治療するための化合物を同定する方法であって、
増幅したＲＲＭ２ゲノムＤＮＡを含む細胞と化合物を接触させること、および
ＲＲＭ２ゲノムＤＮＡのレベルを測定すること
からなり、該化合物の存在下でのＲＲＭ２ゲノムＤＮＡのレベルが、該化合物の不在下でのレベルより低い場合、該化合物が細胞増殖に関連のある疾患を治療するための候補であることが示される方法。
【請求項２３】
細胞増殖に関連のある疾患を治療するための化合物を同定する方法であって、
化合物を、配列番号２、３、または４のプロモーター配列と作動可能なように連結したマーカーヌクレオチド配列を含む核酸を備えた系と接触させること、および
該マーカーヌクレオチド配列の発現レベルを測定すること
からなり、該化合物の存在下での該マーカーヌクレオチド配列の発現レベルが、該化合物の不在下でのレベルと異なる場合、該化合物が細胞増殖に関連のある疾患を治療するための候補であることが示される方法。
【請求項２４】
前記系が、ＳＰ１、ｃ‐Ｅｔｓ、ＭＺＦ１、Ｅ２Ｆ、Ｌｙｆ‐１、ＧＡＴＡ‐Ｘ、ＨＳＦ２、ＡＰ‐１、ＣｄｘＡ、ＩＫ‐２、Ｓｏｘ‐５、ＳＲＹ、Ｂｒｎ‐２、ＨＮＦ‐１、ＳＴＡＴｘ、ＧＡＴＡ‐１、ＵＳＦ、Ｐｂｘ‐１、Ｏｃｔ‐１、ＧＡＴＡ‐２、ＣＲＥ‐Ｂｐ、またはＮｋｘ‐２をコードする核酸を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記系が、ＳＰ１、ｃ‐Ｅｔｓ、ＭＺＦ１、Ｅ２Ｆ、Ｌｙｆ‐１、ＧＡＴＡ‐Ｘ、ＨＳＦ２、ＡＰ‐１、ＣｄｘＡ、ＩＫ‐２、Ｓｏｘ‐５、ＳＲＹ、Ｂｒｎ‐２、ＨＮＦ‐１、ＳＴＡＴｘ、ＧＡＴＡ‐１、ＵＳＦ、Ｐｂｘ‐１、Ｏｃｔ‐１、ＧＡＴＡ‐２、ＣＲＥ‐Ｂｐ、またはＮｋｘ‐２ポリペプチドを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
細胞増殖に関連のある疾患を治療するための化合物を同定する方法であって、
化合物を、増幅したＲＲＭ２ゲノムＤＮＡを含みＲＲＭ１を発現している細胞と接触させること、および
該細胞中のＲＲＭ１のｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルを測定すること
からなり、該化合物の存在下でのＲＲＭ１のｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルが、該化合物の不在下でのレベルより低い場合、該化合物が細胞増殖に関連のある疾患を治療する
ための候補であることが示される方法。
【請求項２７】
細胞増殖に関連のある疾患を治療するための化合物を同定する方法であって、
化合物を、増幅したＲＲＭ２ゲノムＤＮＡを含みｐ５３Ｒ２を発現している細胞と接触させること、および
該細胞中のｐ５３Ｒ２のｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルを測定すること
からなり、該化合物の存在下でのｐ５３Ｒ２のｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルが、該化合物の不在下でのレベルより低い場合、該化合物が細胞増殖に関連のある疾患を治療するための候補であることが示される方法。
【請求項２８】
細胞増殖に関連のある疾患を治療するための化合物を同定する方法であって、
化合物を、増幅したＲＲＭ２ゲノムＤＮＡを含みＲＲＭ１を発現している細胞と接触させること、および
該細胞中のＲＲＭ１とＲＲＭ２の相互作用のレベルを測定すること
からなり、該化合物の存在下でのＲＲＭ１とＲＲＭ２の相互作用のレベルが、該化合物の不在下でのレベルより低い場合、該化合物が細胞増殖に関連のある疾患を治療するための候補であることが示される方法。
【請求項２９】
細胞増殖に関連のある疾患を治療するための化合物を同定する方法であって、
化合物を、増幅したＲＲＭ２ゲノムＤＮＡを含みＲＲＭ１およびｐ５３Ｒ２を発現している細胞と接触させること、および
該細胞中のＲＲＭ１とｐ５３Ｒ２の相互作用のレベルを測定すること
からなり、該化合物の存在下でのＲＲＭ１とｐ５３Ｒ２の相互作用のレベルが、該化合物の不在下でのレベルより低い場合、該化合物が細胞増殖に関連のある疾患を治療するための候補であることが示される方法。
【請求項３０】
細胞増殖に関連のある疾患を治療する方法であって、
ＲＲＭ２ゲノムＤＮＡが増幅している対象者を同定すること、および
該対象者においてＲＲＭ２ゲノムＤＮＡのレベルを低下させる有効量の化合物を該対象者に投与すること
からなる方法。
【請求項３１】
細胞増殖に関連のある疾患を治療する方法であって、
ＲＲＭ２ゲノムＤＮＡが増幅している対象者を同定すること、および
該対象者において配列番号２、３、または４のプロモーター配列からの転写を低下させる有効量の化合物を該対象者に投与すること
からなる方法。
【請求項３２】
細胞増殖に関連のある疾患を治療する方法であって、
ＲＲＭ２ゲノムＤＮＡが増幅している対象者を同定すること、および
該対象者においてＲＲＭ１のｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルを低下させる有効量の化合物を該対象者に投与すること
からなる方法。
【請求項３３】
前記化合物がＭＭＲ１に対する抗体である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
細胞増殖に関連のある疾患を治療する方法であって、
ＲＲＭ２ゲノムＤＮＡが増幅している対象者を同定すること、および
該対象者においてＲＲＭ２のｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルを低下させる有効量の化合物を該対象者に投与すること
からなる方法。
【請求項３５】
前記化合物がＭＭＲ２に対する抗体である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
細胞増殖に関連のある疾患を治療する方法であって、
ＲＲＭ２ゲノムＤＮＡが増幅している対象者を同定すること、および
該対象者においてｐ５３Ｒ２のｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルを低下させる有効量の化合物を該対象者に投与すること
からなる方法。
【請求項３７】
前記化合物がｐ５３Ｒ２に対する抗体である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
細胞増殖に関連のある疾患を治療する方法であって、
ＲＲＭ２ゲノムＤＮＡが増幅している対象者を同定すること、および
該対象者においてＲＲＭ１とＲＲＭ２の相互作用を低下させる有効量の化合物を該対象者に投与すること
からなる方法。
【請求項３９】
前記化合物がＭＭＲ１またはＭＭＲ２に対する抗体である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記化合物が配列番号５のペプチドである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
細胞増殖に関連のある疾患を治療する方法であって、
ＲＲＭ２ゲノムＤＮＡが増幅している対象者を同定すること、および
該対象者においてＲＲＭ１とｐ５３Ｒ２の相互作用を低下させる有効量の化合物を該対象者に投与すること
からなる方法。
【請求項４２】
前記化合物がＭＭＲ１またはｐ５３Ｒ２に対する抗体である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記化合物が配列番号５のペプチドである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
細胞増殖に関連のある疾患を治療する方法であって、
ＲＲＭ２ゲノムＤＮＡが増幅している対象者を同定すること、および
有効量のＲＲＭ２阻害剤を該対象者に投与してから、次に有効量のヌクレオチドまたはヌクレオシド類似体を該対象者に投与すること
からなる方法。
【請求項４５】
前記ＲＲＭ２阻害剤がヒドロキシ尿素である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記ヌクレオチド類似体がゲムシタビンである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
細胞増殖に関連のある疾患の治療法を開発する方法であって、
細胞増殖に関連のある疾患に罹患している複数の対象者を集めること、
有効量のＲＲＭ２阻害剤をそれぞれの対象者に投与すること、
該ＲＲＭ２阻害剤の投与の後にそれぞれ固有の時点で、有効量のヌクレオチドまたはヌクレオシド類似体をそれぞれの対象者に投与すること、および
該細胞増殖に関連のある疾患が最も強く阻害される最適の時点を選択すること
からなる方法。
【請求項４８】
前記対象者が増幅したＲＲＭ２ゲノムＤＮＡを有する、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＲＲＭ２阻害剤がヒドロキシ尿素である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記ヌクレオチド類似体がゲムシタビンである、請求項４９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト・リボヌクレオチド還元酵素Ｍ２サブユニットに関する。
【背景技術】
【０００２】
（連邦政府の支援を受けた研究または開発）
本出願は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）の助成ＣＡ７２７６７より一部資金提供を受けたものである。米国政府は、本出願において一定の権利を有する。
【０００３】
リボヌクレオチド還元酵素は、ＤＮＡ合成経路に関与する、高度に制御された酵素である。リボヌクレオチド還元酵素は、リボヌクレオシド二リン酸をＤＮＡの合成および修復に必要不可欠なデオキシリボヌクレオシド二リン酸へ新規に（ｄｅ  ｎｏｖｏ）変換する役割を担っている（非特許文献１および非特許文献２）。リボヌクレオチド還元酵素は、２つのサブユニット、Ｍ１およびＭ２からなる。Ｍ１は、酵素の制御に必要な１７０ｋＤａの二量体である（非特許文献３）。Ｍ２は、チロシンの遊離基および非ヘム鉄を含む８８ｋＤａの二量体である。
【非特許文献１】コーリー（Cory）およびサトウ（Sato）、１９８３年、モレキュラー・セルラー・バイオケミストリー誌（Mol Cell Biochem）第５３巻、ｐ．２５７〜２６６
【非特許文献２】テランダー（Thelander ）およびベルグ（Berg）、１９８６年、モレキュラー・セルラー・バイオケミストリー誌（Mol Cell Biochem）第６巻、ｐ．３４３３〜３４４２
【非特許文献３】チャン（Chang ）およびチェン（Cheng ）、１９７９年、キャンサー・リサーチ誌（Cancer Res）第３９巻、ｐ．５０８１〜５０８６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、単離されたヒト・リボヌクレオチド還元酵素Ｍ２サブユニット（ｈＲＲＭ２）遺伝子を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、新たに単離されたヒト・リボヌクレオチド還元酵素Ｍ２サブユニット（ｈＲＲＭ２）遺伝子のゲノム配列に関する。その１０．３ｋｂの配列（以下に示す配列番号１）を、ＧｅｎＢａｎｋに寄託した（アクセッション番号ＡＹ０３２７５０）。
【０００６】
【化１】
2005521418.tif 000002
2005521418.tif 000003
2005521418.tif 000004
2005521418.tif 000005
ｈＲＲＭ２遺伝子は、１０個のエクソンからなることが判明した。それぞれ３．４ｋｂおよび１．６５ｋｂのｍＲＮＡ転写産物に対応する、２つの転写開始部位を同定した。５’‐隣接領域の欠失を分析することによって、そのプロモーター活性が、２つのｈＲＲＭ２
転写産物の発現を駆動する２つの別々のプロモーターが存在するとの見方と一致することが示された。該２つのプロモーターの１つは、配列番号１の１９０８〜２３１０ｂｐに位置し、配列番号２で示され、もう１つは、配列番号１の２３６６〜２５６７ｂｐに位置し、配列番号３で示される。複合プロモーター（配列番号１の１９０８〜２５６７ｂｐ）は、配列番号４で示される。以下に示すように、ｈＲＲＭ２のプロモーター領域は、転写因子用の結合部位を多数含む。したがってこれらのプロモーターは、遺伝子発現を微調整する制御に有用である。
【０００７】
したがって本発明は、配列番号２、３または４と少なくとも６０％（６０％〜１００％の任意の割合、例えば７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％を含む）同一であるプロモーター配列、および転写産物をコードするヌクレオチド配列とを含む、単離核酸を特徴とする。該プロモーター配列は、該ヌクレオチド配列と作動可能なように連結されている。すなわち該ヌクレオチド配列の転写は該プロモーターの制御下にある。
【０００８】
「単離核酸」とは、その構造が天然に存在するいかなる核酸の構造とも、または天然に存在するゲノム核酸のいかなる断片の構造とも同一ではない核酸である。したがってこの用語には、例えば（ａ）天然に存在するゲノムＤＮＡ分子の一部分の配列を有するが、該ＤＮＡ分子を天然に存在する状態で有する生物体のゲノム中で該分子のその部分に隣接する両側のコード配列には隣接しないＤＮＡ；（ｂ）ベクター中または原核生物または真核生物のゲノムＤＮＡ中に取り込まれた核酸であって、結果として生じる分子が、任意の天然に存在するベクターまたはゲノムＤＮＡとは同一でないように取り込まれた核酸；（ｃ）ｃＤＮＡ、ゲノム断片、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により生じる断片、または制限酵素断片などの分離した分子；および（ｄ）ハイブリッド遺伝子、すなわち融合タンパク質をコードする遺伝子の一部分である組換えヌクレオチド配列が含まれる。
【０００９】
２つの核酸配列の「同一性の割合（％）」は、カーリンおよびアルトシュール（Karlin
and Altschul ）のアルゴリズム（１９９０年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ
ＵＳＡ  第８７巻、ｐ．２２６４〜２２６８に、カーリンおよびアルトシュール（Karlin and Altschul ）、１９９３年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  第９０巻、ｐ．５８７３〜５８７７のように変更を加えたもの）を使用して決定する。このようなアルゴリズムは、アルトシュール（Altschul）ら（１９９０年、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  第２１５巻、ｐ．４０３〜４１０）のＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴの核酸検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラムを用いて実施する。２つの配列間にギャップが存在する場合は、ギャップ付き（Ｇａｐｐｅｄ）ＢＬＡＳＴを、アルトシュール（Altschul）らの文献（１９９７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  第２５巻、ｐ．３３８９〜３４０２）に記載されたのと同様に使用する。ＢＬＡＳＴおよびギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを使用するときは、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴ）の初期設定パラメータを使用する。ワールドワイドウェブ（World Wide Wed）アドレスncbi.nlm.nih.gov. を参照のこと。
【００１０】
本発明は、配列番号１と少なくとも８６％（８６％〜１００％の任意の割合、例えば９０％、９５％、または１００％を含む）同一である単離核酸であって、例えば対象者中で増幅したＲＲＭ２遺伝子の検出、または細胞増殖に関連のある疾患を治療するための治療用化合物のスクリーニングに使用することが可能な単離核酸をも特徴とする。
【００１１】
ｈＲＲＭ２遺伝子は、ゲムシタビン耐性またはヒドロキシ尿素耐性のヒト鼻咽頭癌（ＫＢ）細胞中で増幅されることが発見された。したがって本発明は、対象者が細胞増殖に関連のある疾患（例えば癌）であるか、または同疾患を発症するリスクを有するかどうかを判断する方法を特徴とする。この方法は、対象者からのゲノムＤＮＡを含む試験サンプル（例えば、組織サンプルまたは体液サンプル）を用意すること、および該試験サンプル中
のＲＲＭ２ゲノムＤＮＡのレベルを、例えばサザンブロット分析によって測定することを含む。試験サンプル中のＲＲＭ２ゲノムＤＮＡのレベルが正常サンプル中のレベルより高い場合、このことは該対象者が細胞増殖に関連のある疾患であるか、または該疾患を発症するリスクを有することを示す。
【００１２】
本発明はさらに、細胞増殖に関連のある疾患を治療するための化合物を同定する方法を特徴とする。１例では、この方法は、増幅したＲＲＭ２ゲノムＤＮＡを含む細胞と化合物を接触させること、およびＲＲＭ２ゲノムＤＮＡのレベルを測定することを含む。化合物の存在下でのＲＲＭ２ゲノムＤＮＡのレベルが化合物の不在下でのレベルより低い場合、このことは該化合物が細胞増殖に関連のある疾患を治療するための候補であることを示す。
【００１３】
別の例では、本発明の方法は、化合物を、配列番号２、３、または４のプロモーター配列と作動可能なように連結されたマーカーヌクレオチド配列を含む核酸を含む系（例えば、細胞系または無細胞系）と接触させること、および該マーカーヌクレオチド配列の発現レベルを測定することを含む。化合物の存在下でのマーカーヌクレオチド配列の発現レベルが化合物の不在下でのレベルと異なる場合、このことは該化合物が細胞増殖に関連のある疾患を治療するための候補であることを示す。マーカーヌクレオチド配列は、例えばｈＲＲＭ２遺伝子、または任意の他の適切な遺伝子のコード領域であってよい。マーカーヌクレオチド配列の発現は、例えば転写産物のノーザンブロット分析、タンパク質のウエスタンブロット分析、またはタンパク質の活性アッセイを使用することによって測定することが可能である。本発明の系は、配列番号２、３、または４と相互作用する様々な転写因子、例えばＳＰ１、ｃ‐Ｅｔｓ、ＭＺＦ１、Ｅ２Ｆ、Ｌｙｆ‐１、ＧＡＴＡ‐Ｘ、ＨＳＦ２、ＡＰ‐１、ＣｄｘＡ、ＩＫ‐２、Ｓｏｘ‐５、ＳＲＹ、Ｂｒｎ‐２、ＨＮＦ‐１、ＳＴＡＴｘ、ＧＡＴＡ‐１、ＵＳＦ、Ｐｂｘ‐１、Ｏｃｔ‐１、ＧＡＴＡ‐２、ＣＲＥ‐Ｂｐ、またはＮｋｘ‐２をコードする核酸を含むことが可能である。あるいは本発明の系は、これらの因子そのものを１つまたは複数含むことが可能である。
【００１４】
さらに他の例では、本発明の方法は、増幅したＲＲＭ２ゲノムＤＮＡを有しリボヌクレオチド還元酵素Ｍ１サブユニット（ＲＲＭ１）またはｐ５３Ｒ２遺伝子を発現している細胞と化合物を接触させること、および該細胞中のＲＲＭ１またはｐ５３Ｒ２のｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルを測定することを含む。化合物の存在下でのＲＲＭ１またはｐ５３Ｒ２のｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルが化合物の不在下でのレベルより低い場合、このことは該化合物が細胞増殖に関連のある疾患を治療するための候補であることを示す。
【００１５】
さらに他の例では、本発明の方法は、増幅したＲＲＭ２ゲノムＤＮＡを有しＲＲＭ１およびｐ５３Ｒ２遺伝子を発現している細胞と化合物を接触させること、および細胞中のＲＲＭ１とＲＲＭ２、あるいはＲＲＭ１とｐ５３Ｒ２の相互作用のレベルを測定することを含む。化合物の存在下でのＲＲＭ１とＲＲＭ２、あるいはＲＲＭ１とｐ５３Ｒ２の相互作用のレベルが化合物の不在下でのレベルより低い場合、このことは該化合物が細胞増殖に関連のある疾患を治療するための候補であることを示す。
【００１６】
ＲＲＭ２ゲノムＤＮＡが増幅している対象者において細胞増殖に関連のある疾患を治療する方法も、本発明の範囲内にある。この方法は、対象者において、ＲＲＭ２ゲノムＤＮＡのレベル、配列番号２、３、もしくは４のプロモーター配列からの転写、ＲＲＭ１のｍＲＮＡもしくはタンパク質、ＲＲＭ２のｍＲＮＡもしくはタンパク質、ｐ５３Ｒ２のｍＲＮＡもしくはタンパク質、ＲＲＭ１とＲＲＭ２の相互作用、またはＲＲＭ１とｐ５３Ｒ２の相互作用を低下させる有効量の化合物を該対象者に投与することを含む。例えばＲＲＭ１、ＲＲＭ２、またはｐ５３Ｒ２タンパク質のレベルは、それぞれＲＲＭ１、ＲＲＭ２、
またはｐ５３Ｒ２に対する抗体を使用することにより低下させることが可能である。同様に、ＲＲＭ１とＲＲＭ２の間の相互作用は、ＲＲＭ１またはＲＲＭ２に対する抗体を使用することにより低下させることが可能であり、一方ＲＲＭ１とｐ５３Ｒ２の間の相互作用は、ＲＲＭ１またはｐ５３Ｒ２に対する抗体を使用することにより低下させることが可能である。ＲＲＭ１とＲＲＭ２の間の相互作用、またはＲＲＭ１とｐ５３Ｒ２の間の相互作用を、７アミノ酸ペプチドＦＴＬＤＡＤＦ（配列番号５）などの競合ペプチドまたはポリペプチドを使用することにより阻害することも可能である。
【００１７】
ＲＲＭ２ゲノムＤＮＡが増幅している対象者における細胞増殖に関連のある疾患を、有効量のＲＲＭ２阻害剤（例えばヒドロキシ尿素）を該対象者に投与してから、次に有効量のヌクレオチドまたはヌクレオシド類似体（例えばゲムシタビン）を該対象者に投与することによって治療することも可能である。
【００１８】
さらに本発明は、例えばＲＲＭ２ゲノムＤＮＡがすでに増幅している対象者において、細胞増殖に関連のある疾患の治療法を開発する方法を特徴とする。この方法は、細胞増殖に関連のある疾患に罹患している複数の対象者を集めること、各対象者に有効量のＲＲＭ２阻害剤を投与すること、ＲＲＭ２阻害剤の投与の後にそれぞれ固有の時点で有効量のヌクレオチドまたはヌクレオシド類似体を各対象者に投与すること、および細胞増殖に関連のある疾患が最も強く阻害される最適の時点を選択することを含む。
【００１９】
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細について、以下に添付の説明において述べる。本発明の他の特徴、目的、および利点は、発明を実施するための最良の形態、ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、ヒト・リボヌクレオチド還元酵素Ｍ２サブユニット遺伝子のゲノム配列の同定、およびこの配列が薬剤耐性の癌細胞において増幅されるという予期せぬ知見に基づいている。さらに、低用量のヒドロキシ尿素（ＨＵ。広範囲の抗腫瘍効果を有する、リボヌクレオチド還元酵素のＳ期特異的阻害剤）が、時間および順序依存式にゲムシタビン（Ｇｅｍ。デオキシシチジン類似体であり、その活性代謝産物ｄＦｄＣＴＰがＤＮＡ伸長を阻害し、細胞毒性作用を有する）の活性を増強することが見出された。予期せぬことに、この増強はｈＲＲＭ２のｍＲＮＡ、タンパク質、または活性の低下と関係がある。さらに、第Ｉ相試験から、ヒドロキシ尿素に続いてゲムシタビンをヒト患者に安全に投与することが可能であり、癌細胞に対する細胞毒性効果があることが実証された。
【００２１】
１態様では、本発明は、配列番号２、３または４と少なくとも６０％同一であるプロモーター配列、および該プロモーター配列と作動可能なように連結され、転写産物をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸を特徴とする。ヌクレオチド配列の発現は、該プロモーター配列によって指令される。
【００２２】
別の態様では、本発明は、配列番号１と少なくとも８６％同一である単離核酸を特徴とする。この核酸は、例えば細胞増殖に関連のある疾患を診断するため、あるいはこのような疾患の治療用化合物を同定するために有用である。
【００２３】
本発明の核酸は、当分野で知られている方法により、適切な宿主細胞中にＤＮＡを導入することによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現させることが可能である。例えば、核酸を組換え発現ベクター中に挿入することが可能である。様々な宿主発現ベクター系を使用して、本発明の核酸を発現させることが可能である。これらのベクター系には、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌などの微生物；組換え酵母菌発現ベクターで形質転換した酵母菌；および組換えウ
イルスまたはプラスミド発現ベクターを感染させたヒト細胞株が含まれるが、これらだけには限られない。組換えポリペプチドまたはその断片の単離および精製は、分取クロマトグラフィ、およびモノクローナルまたはポリクローナル抗体関連の免疫学的分離を含めた従来の手段によって行うことが可能である。
【００２４】
本発明は、細胞増殖に関連のある疾患を診断および治療し、かつこのような疾患を治療するための治療用化合物を同定するための方法も特徴とする。
本発明の診断法は、対象者（すなわち動物またはヒト）から調製したサンプル中のＲＲＭ２ゲノムＤＮＡのレベルを、正常な対象者、すなわち細胞増殖に関連のある疾患ではなく、該疾患を発症するリスクもない対象者から調製したサンプル中のレベルと比較することを含む。ＲＲＭ２ゲノムＤＮＡのレベルが高ければ、その対象者が細胞増殖に関連のある疾患に罹患しているか該疾患を発症するリスクがあることを示す。この方法を単独、あるいは他の手法と共に使用して、適切な対象者において細胞増殖に関連のある疾患を診断することが可能である。
【００２５】
遺伝子座の増幅は、当分野で知られている様々な方法によって検出することが可能である。例えば、遺伝子座のコピー数を、試験サンプルおよび対照サンプルから調製したゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅によって決定し比較することが可能である。遺伝子座の増幅を、サザンブロット分析によって同定することも可能である。中期染色体の伸展物へのＤＮＡ配列の蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）をさらに使用して、該ＤＮＡ配列の正確な染色体位置および染色体に存在する量を与えることが可能である。
【００２６】
本発明は、系（例えば、細胞系または無細胞系）において、ＲＲＭ２ゲノムＤＮＡのレベルを低下させ、配列番号１、２、もしくは３のプロモーター配列の制御下でマーカーヌクレオチド配列の発現を調節し、ＲＲＭ１もしくはｐ５３Ｒ２のｍＲＮＡもしくはタンパク質のレベルを低下させ、ＲＲＭ１とＲＲＭ２の相互作用のレベルを低下させ、あるいはＲＲＭ１とｐ５３Ｒ２の相互作用のレベルを低下させる化合物（例えばタンパク質、ペプチド、ペプチド擬似体、ペプトイド、抗体、または小分子）を同定し製造するための方法も提供する。このようにして同定した化合物は、例えば細胞増殖に関連のある疾患の予防および治療用に使用することが可能である。
【００２７】
本発明の候補化合物は、当分野で知られているコンビナトリアル・ライブラリー法における多数の手法のうち任意のものを使用して得ることが可能である。このようなライブラリーには、ペプチドライブラリー、ペプトイド・ライブラリー（ペプチドの機能を有するが、酵素分解に耐性がある新規な非ペプチド骨格を有する分子のライブラリー）；空間的にアドレス可能な並列の固相ライブラリーまたは溶液相ライブラリー；デコンボルーションまたは親和性クロマトグラフィによる選択により得られる合成ライブラリー；および「１ビーズ１化合物」ライブラリーがある。例えば、ツケルマン（Zuckermann）ら、１９９４年、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  第３７巻、ｐ．２６７８〜８５；およびラム（Lam ）、１９９７年、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ  第１２巻、ｐ．１４５を参照のこと。
【００２８】
分子ライブラリーを合成するための方法の例は、当分野では、例えば：デウィット（DeWitt）ら、１９９３年、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  第９０巻、ｐ．６９０９；エルブ（Erb ）ら、１９９４年、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  第９１巻、ｐ．１１４２２；ツケルマン（Zuckermann）ら、１９９４年、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  第３７巻、ｐ．２６７８；チョー（Cho ）ら、１９９３年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  第２６１巻、ｐ．１３０３；カレル（Carrell ）ら、１９９４年、Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  第３３巻、ｐ．２０５９；カレル（Carell）ら、１９９４年、Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  第３３巻、ｐ．２０６１；およびギャロップ（Gallop）ら、１９９４年、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈ
ｅｍ  第３７巻、ｐ．１２３３中に見ることができる。
【００２９】
化合物のライブラリーは、溶液状で提供されてもよいし（例えばホーグテン（Houghten）、１９９２年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  第１３巻、ｐ．４１２〜４２１）、またはビーズ上（ラム（Lam ）、１９９１年、Ｎａｔｕｒｅ  第３５４巻、ｐ．８２〜８４）、チップ上（フォドー（Fodor ）、１９９３年、Ｎａｔｕｒｅ  第３６４巻、ｐ．５５５〜５５６）、細菌上（米国特許第５，２２３，４０９号明細書）、胞子上（米国特許第５，２２３，４０９号明細書）、プラスミド上（カル（Cull）ら、１９９２年、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  第８９巻、ｐ．１８６５〜１８６９）、もしくはファージ上（スコットおよびスミス（Scott and Smith ）、１９９０年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  第２４９巻、ｐ．３８６〜３９０；デブリン（Devlin）、１９９０年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  第２４９巻、ｐ．４０４〜４０６；クビラ（Cwirla）ら、１９９０年、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  第８７巻、ｐ．６３７８〜６３８２；フェリシ（Felici）、１９９１年、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  第２２２巻、ｐ．３０１〜３１０；および米国特許第５，２２３，４０９号明細書）に提供されてもよい。
【００３０】
系における、ＲＲＭ２ゲノムＤＮＡのレベルを低下させ、配列番号１、２、もしくは３のプロモーター配列の制御下でマーカーヌクレオチド配列の発現を調節し、ＲＲＭ１もしくはｐ５３Ｒ２のｍＲＮＡもしくはタンパク質のレベルを低下させ、ＲＲＭ１とＲＲＭ２の相互作用のレベルを低下させ、またはＲＲＭ１とｐ５３Ｒ２の相互作用のレベルを低下させる化合物を同定するために、その系を候補化合物と接触させ、ＲＲＭ２ゲノムＤＮＡのレベル、マーカーヌクレオチド配列の発現、ＲＲＭ１もしくはｐ５３Ｒ２のｍＲＮＡもしくはタンパク質のレベル、ＲＲＭ１とＲＲＭ２の相互作用のレベル、またはＲＲＭ１とｐ５３Ｒ２の相互作用のレベルを、候補化合物の不在下の場合と比較して評価する。細胞系では、細胞は、増幅したＲＲＭ２ゲノムＤＮＡを含む細胞（例えば癌細胞）でも、ＲＲＭ１、ＲＲＭ２、もしくはｐ５３Ｒ２を本来発現する細胞でも、または改変されて例えば異種プロモーターと融合したＲＲＭ１、ＲＲＭ２、もしくはｐ５３Ｒ２遺伝子を有する組換え核酸を発現する細胞であってもよい。マーカーヌクレオチド配列の発現を調べる場合、本発明の系は、配列番号２、３、もしくは４のプロモーター配列と相互作用する転写因子、例えばＳＰ１、ｃ‐Ｅｔｓ、ＭＺＦ１、Ｅ２Ｆ、Ｌｙｆ‐１、ＧＡＴＡ‐Ｘ、ＨＳＦ２、ＡＰ‐１、ＣｄｘＡ、ＩＫ‐２、Ｓｏｘ‐５、ＳＲＹ、Ｂｒｎ‐２、ＨＮＦ‐１、ＳＴＡＴｘ、ＧＡＴＡ‐１、ＵＳＦ、Ｐｂｘ‐１、Ｏｃｔ‐１、ＧＡＴＡ‐２、ＣＲＥ‐Ｂｐ、またはＮｋｘ‐２、またはこのような転写因子をコードする核酸を含むことが可能である。ＲＲＭ２ゲノムＤＮＡ、ＲＲＭ１とＲＲＭ２の相互作用、またはＲＲＭ１とｐ５３Ｒ２の相互作用のレベルが、候補化合物の存在下で、候補化合物不在の場合より低い場合、あるいは候補化合物の存在下でのマーカーヌクレオチド配列の発現が、候補化合物の不在下での発現とは異なる場合、その候補化合物は、細胞増殖に関連のある疾患の予防および治療用に有用であると同定される。
【００３１】
ＲＲＭ２ゲノムＤＮＡのレベルは、前に記載した方法、および当分野でよく知られている任意の他の方法によって測定することが可能である。
マーカーヌクレオチド配列、ＲＲＭ１、またはｐ５３Ｒ２の発現は、ｍＲＮＡレベルでもタンパク質レベルでも測定することが可能である。組織または体液サンプル中のｍＲＮＡレベルを測定する方法は、当分野で知られている。ｍＲＮＡレベルを測定するために、細胞を溶解させることが可能であり、溶解物中のｍＲＮＡ、または溶解物から精製もしくは半精製したＲＮＡ中のｍＲＮＡのレベルを、検出可能なように標識したＤＮＡもしくはＲＮＡプローブを使用するハイブリダイゼーション・アッセイ、および適切なオリゴヌクレオチド・プライマーを使用する定量または半定量ＲＴ‐ＰＣＲ法など（これらに限定されない）を含めた任意の様々な方法によって測定することが可能である。あるいは、定量または半定量ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション・アッセイを、例えば組織切片もしくは非溶解細胞の懸濁物と、検出可能なように（例えば蛍光もしくは酵素により）標識し
たＤＮＡもしくはＲＮＡプローブとを使用して行うことが可能である。ｍＲＮＡを定量化するための他の方法には、ＲＮＡ保護アッセイ（ＲＰＡ）およびＳＡＧＥがある。
【００３２】
組織または体液サンプル中のタンパク質レベルを測定する方法も、当分野で知られている。多くのこのような方法は、標的タンパク質に特異的に結合する抗体（例えば、モノクローナルまたはポリクローナル抗体）を使用する。このようなアッセイでは、前記抗体そのもの、または該抗体に結合する二次抗体を、検出可能なように標識することが可能である。あるいは、抗体をビオチンと結合させることが可能であり、検出可能なように標識したアビジン（ビオチンと結合するポリペプチド）を使用してビオチン化抗体の存在を検出することが可能である。当分野でよく知られているこれらの手法の組合せ（「多層サンドウィッチ」アッセイなど）を使用して、方法の感度を高めることが可能である。これらのタンパク質測定アッセイのいくつか（例えばＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロット）は細胞の溶解物に適用可能であり、他の方法（例えば免疫組織学的手法または蛍光フローサイトメトリー）は、組織学的切片または非溶解細胞の懸濁物に適用可能である。標識の量を測定する方法は標識の性質に依存し、当分野でよく知られている。適切な標識には、非限定的に、放射性核種（例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３Ｈ、または３２Ｐ）、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、またはβ‐ガラクトシダーゼ）、蛍光性の成分（moiety）もしくはタンパク質（例えば、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリスリン、ＧＦＰ、またはＢＦＰ）、または発光成分（例えば、米国カリフォルニア州パロアルト所在のクワンタム・ドット・コーポレーション（Quantum Dot Corporation ）によって供給されるＱｄｏｔ（商標）ナノ粒子）がある。他の適用可能なアッセイには、定量的免疫沈降アッセイまたは補体固定アッセイがある。
【００３３】
ＲＲＭ１とＲＲＭ２の相互作用のレベル、またはＲＲＭ１とｐ５３Ｒ２の相互作用のレベルは、当分野で知られている任意の方法、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏでの結合アッセイや酵母のハイブリッドシステムを使用することによって決定することが可能である。ＲＲＭ１、ＲＲＭ２およびｐ５３Ｒ２の結合ドメインを、例えば突然変異誘発により同定し、スクリーニング・アッセイに使用することが可能である。
【００３４】
本発明は、細胞増殖に関連のある疾患を予防および治療するための方法をさらに提供する。治療すべき対象者を、例えば対象者から調製したサンプル中のＲＲＭ２ゲノムＤＮＡのレベルを上記に記載した方法によって測定することにより、特定することが可能である。その対象者由来のサンプル中のＲＲＭ２ゲノムＤＮＡのレベルが、正常な対象者由来のサンプル中のレベルより高い場合、その対象者は、同対象者におけるＲＲＭ２ゲノムＤＮＡのレベル、配列番号１、２、もしくは３のプロモーター配列からの転写、ＲＲＭ１、ＲＲＭ２、もしくはｐ５３Ｒ２のｍＲＮＡまたはタンパク質のレベル、またはＲＲＭ１とＲＲＭ２、もしくはＲＲＭ１とｐ５３Ｒ２の相互作用のレベルを低下させる有効量の化合物を用いる治療の候補である。用語「治療する」とは、細胞増殖に関連のある疾患を有する対象者に、該疾患、該疾患の症状、該疾患に付随する病状、または該疾患になりやすい素因を、治癒させ、軽減し、緩和し、是正し、予防し、または改善する目的で、組成物を投与することとして定義される。「有効量」とは、治療を受ける対象者において、例えば上述のような医学的に望ましい結果を生み出すことが可能な組成物の量である。この方法は単独でも、あるいは他の薬剤または治療法と併用しても行うことが可能である。
【００３５】
ｉｎ  ｖｉｖｏの一手法では、治療用組成物（例えば、前述のように同定された化合物を含む組成物）を、対象者に投与する。一般には、化合物を薬剤として許容可能な担体（例えば生理食塩水）に懸濁させ、経口もしくは静脈内注入により投与、または皮下、筋肉内、クモ膜下、腹腔内、直腸内、膣内、鼻腔内、胃内、気管内、もしくは肺内に注射もしくは移植することになる。癌を予防および治療するために、化合物を癌組織に直接送達す
ることが可能である。
【００３６】
必要とされる用量は、投与経路の選択；配合物の性質；対象者の病気の性質；対象者の大きさ、体重、表面積、年齢、および性別；投与される他の薬剤；ならびに主治医の判断によって変わる。適切な用量は、０．０１〜１００．０ｍｇ／ｋｇの範囲である。必要とされる用量が広範囲にわたることは、利用可能な化合物の多様さ、および様々な投与経路の有効性の違いを鑑みれば予想されることであろう。例えば経口投与は、静脈内注射による投与よりも、高用量を必要とすることが予想されるであろう。これらの用量レベルの変動は、当分野で充分に理解されているように最適化のための標準的な日常の実証的手順を使用して調整することが可能である。適切な送達用媒体（例えばポリマー・ミクロ粒子または移植可能なデバイス）に化合物を封入することによって、送達（特に経口送達）の有効性を高めることが可能である。
【００３７】
別例として、アンチセンスＲＲＭ１、ＲＲＭ２、またはｐ５３Ｒ２ＲＮＡをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを、例えば当分野で知られているポリマー製で生分解性の微粒子もしくはマイクロカプセル送達用デバイスを使用することによって、対象者に送達することが可能である。
【００３８】
核酸の取り込みを達成するための他の方法は、標準的な方法によって調製したリポソームを使用することである。ベクターを単独でこれらの送達用媒体に取り込ませることも、組織特異的な抗体と共に同時に取り込ませることも可能である。あるいは、静電力または共有結合力によってポリ‐Ｌ‐リシンに結合させたプラスミドもしくは他のベクターから構成される、分子複合体を作製することも可能である。ポリ‐Ｌ‐リシンは、標的細胞上の受容体と結合することが可能なリガンドに結合する（クリスチアノ（Cristiano ）ら、１９９５年、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  第７３巻、ｐ．４７９）。あるいは、当分野で知られている組織特異的な転写制御要素（ＴＲＥ）を使用することによって組織特異的な標的化を実施することが可能である。「裸のＤＮＡ」（すなわち送達用媒体なし）の、筋肉内、真皮内、または皮下部位への送達は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの発現を実施するための他の手段である。
【００３９】
該当するポリヌクレオチド（例えば発現ベクター）では、アンチセンスＲＲＭ１、ＲＲＭ２、またはｐ５３Ｒ２ＲＮＡをコードする核酸配列は、プロモーターまたはエンハンサーとプロモーターの組合せに作動可能なように連結される。エンハンサーは、時間、位置、およびレベルの点で、発現の特異性を与える。プロモーターとは異なり、エンハンサーは、プロモーターが存在するのであれば、転写開始部位から様々な距離に位置していても機能することが可能である。エンハンサーは、転写開始部位の下流に位置することも可能である。
【００４０】
適切な発現ベクターには、プラスミドおよびウイルスベクター、例えばヘルペスウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、弱毒化ワクシニアウイルス、カナリアポックスウイルス、アデノウイルス、およびアデノ関連ウイルスなどがある。
【００４１】
ポリヌクレオチドは、薬剤として許容可能な担体に含めて投与することが可能である。薬剤として許容可能な担体は、動物またはヒトに投与するのに適した生物学的に適合性がある媒体、例えば生理食塩水またはリポソームである。ポリヌクレオチドの投与に関する好ましい用量は、約１０６〜１０１２コピーのポリヌクレオチド分子である。この用量を、必要に応じて繰り返し投与することが可能である。投与経路は、前に列挙した任意の経路であってよい。
【００４２】
ＲＲＭ１、ＲＲＭ２、またはｐ５３Ｒ２に対する抗体（モノクローナルまたはポリクロ
ーナル）を使用して、対象者中のＲＲＭ１、ＲＲＭ２、またはｐ５３Ｒ２タンパク質のレベルを低下させることも、ＲＲＭ１とＲＲＭ２、あるいはＲＲＭ１とｐ５３Ｒ２の相互作用のレベルを低下させることも可能である。用語「抗体」には、ＲＲＭ１、ＲＲＭ２、またはｐ５３Ｒ２タンパク質中に存在するエピトープ抗原決定基と結合することが可能な完全な分子およびその断片、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖなどが含まれる。モノクローナルおよびポリクローナル抗体、およびその断片を作製する方法は、当分野で知られている。例えば、ハーローおよびレーン（Harlow and Lane ）、１９８８年、「抗体：実験の手引き（Antibodies:A Laboratory Manual）」ニューヨーク所在のコールドスプリングハーバーラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory ）を参照のこと。
【００４３】
ＲＲＭ１とＲＲＭ２、あるいはＲＲＭ１とｐ５３Ｒ２の相互作用を阻害するために使用可能な他の化合物には、ＲＲＭ２のＣ末端のアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドがある。例えばＲＲＭ２のＣ末端の７‐アミノ酸ペプチド（ＦＴＬＤＡＤＦ、配列番号５）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒトＲＲに１０：１（ペプチド：酵素）の割合で加えると該酵素の活性を劇的に抑制することが見出された。Ｃ末端のこれら７‐アミノ酸を欠く切断型のＭ２サブユニットは、対応する巨大サブユニットＭ１との複合体を形成できないことが、さらに観察された。これらの結果は、この７‐アミノ酸ペプチドが、Ｍ１上の結合部位に関してＭ２と競合する可能性があることを示唆している。予想外なことに、このペプチドによるＲＲ活性の阻害は、ヒドロキシ尿素およびトリアピンなどの現在使用されているＲＲ阻害剤によって引き起こされる阻害を上回る。他の研究によって、７‐アミノ酸ペプチドの一部分（例えば５量体または３量体）も、ＲＲ活性を阻害可能であることが明らかになった。したがって、配列番号５のペプチドまたはその機能的均等物を使用して細胞増殖に関連のある疾患を治療する方法は、本発明の範囲内にある。配列番号５と機能的に均等であるペプチドまたはポリペプチドは、配列番号５より長くても短くてもよく、あるいは配列番号５の中に置換アミノ酸を含むことが可能であるが、ただし、それらのペプチドまたはポリペプチドは、ＲＲＭ１とＲＲＭ２、あるいはＲＲＭ１とｐ５３Ｒ２の相互作用を阻害することが可能であるとする。このようなペプチドまたはポリペプチドは、前述の方法または当分野でよく知られている任意の他の方法に従って、生成させて使用することが可能である。
【００４４】
さらに本発明は、細胞増殖に関連のある疾患に罹患している複数の対象者（例えばＲＲＭ２ゲノムＤＮＡが増幅している対象者）を集めること、有効量のＲＲＭ２阻害剤（例えばヒドロキシ尿素）、次に有効量のヌクレオチドまたはヌクレオシド類似体（例えばゲムシタビン）を、それぞれ固有の時点で各対象者に投与すること、および細胞増殖に関連のある疾患が最も強く阻害される最適時点を選択することによって、細胞増殖に関連のある疾患の治療法を開発する方法を提供する。ひとたび最適時点を特定すれば、その治療法を使用して適切な対象者において細胞増殖に関連のある疾患を治療することが可能である。
【００４５】
以下の具体的な実施例は、単なる例示的なものとして解釈すべきであり、決して本開示の残り部分をどのようにも限定するものと解釈すべきではない。さらに詳述しなくとも、当業者であれば本願明細書の記載に基づいて本発明をその最大限まで利用することができると考えられる。本願明細書中に列挙したすべての刊行物は、参照によりその全容を本願明細書に援用する。
【実施例１】
【００４６】
（ヒト・リボヌクレオチド還元酵素Ｍ２サブユニット遺伝子の特徴付け；ゲノム構造およびプロモーターの分析）
（材料および方法）
（１）ヒトＲＲＭ２ゲノムＤＮＡのクローニングおよび配列決定
ヒト胎盤ゲノムライブラリー（ヒューマンゲノムシステムズ（Human Genome Systems）
）を、ｈＲＲＭ２構造遺伝子に特異的な１対のプライマー：
ｈＲＲＭ２０４：５’ＡＴＴＴＡＧＡＡＧＴＣＡＧＣＡＴＣＣＡＡＧ３’、および
ｈＲＲＭ２０８：５’ＴＡＣＡＣＡＡＡＣＣＡＴＣＧＧＡＧＧＡＧＡＧＡＧ３’
を使用してスクリーニングした。３つの陽性クローン（クローン１３９９９、１４０００、および１４００１）を選択した後、制限酵素ＳａｃＩを使用して、選択したクローンから単離したＤＮＡを消化した。次いでサザンブロット分析を行った。６．２ｋｂおよび５．１ｋｂのバンドを同定し、ＰＣＮＴＲベクター（５’（登録商標）３’ゲノムシステムズ（Genome Systems））にサブクローニングした。これらのクローンを、それぞれＰ６．２およびＰ５．１と名づけた。両クローンについて配列決定を行い、完全長ｈＲＲＭ２ゲノムＤＮＡのゲノム配列地図を作製した。
【００４７】
（２）５’‐ＲＡＣＥによる転写開始部位の同定
標準的なプロトコルに従い、ヒトＫＢ細胞から全ＲＮＡを単離した。ＲＲＭ２のｍＲＮＡの５’末端に相当するｃＤＮＡクローンを、製造業者のプロトコル（ＢＲＬライフサイエンシズ（Lifesciences））に従い５’‐ＲＡＣＥによって得た。転写開始部位を同定するために使用したプライマーは、ｈＲＲＭ２のｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ｘ５９６１８）（パブロフ（Pavloff ）ら、１９９２年、ＤＮＡ  Ｓｅｑ  第２巻第４号、ｐ．２２７〜２３４）の３５８〜３３８位（ｈＲＲＭ２２５：５’ＧＧＣＴＣＣＴＧＧＡＡＧＡＴＣＣＴＣＣＴ３’）、および２４２〜２２５位（ｈＲＲＭ２３１：５’ＣＴＧＣＴＧＣＧＧＧＴＣＣＧＴＧＡＴ３’）に対応するものとした。
【００４８】
（３）ＲＲＭ２プロモーターおよびレポーター構築物の作製
配列番号１の１７８７〜２５８１ｂｐのｈＲＲＭ２遺伝子５’隣接領域を含む、ルシフェラーゼ・レポータープラスミドを、Ｅｒａｓｅ  Ａ  Ｂａｓｅ（登録商標）技法を使用して、Ｐ６．２サブ・クローンからの所定のＤＮＡ断片をｐＧＬ３‐ｂａｓｉｃ（商品名）ベクター（プロメガ（Promega ））中に挿入することによって構築した。
【００４９】
（４）細胞培養および一過性トランスフェクション
ヒト口咽頭癌ＫＢ細胞（米国微生物系統保存機関（American Type Culture Collection））を、プラスチック製の組織培養プレート上、１０％ウシ胎児血清ならびに１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよびストレプトマイシンを補ったＲＰＭＩ１６４０培地中で、５％二酸化炭素を含む湿潤雰囲気中で、３７℃で培養した。ＰＣ‐３ヒト前立腺癌細胞（米国微生物系統保存機関）を、同じ条件下で増殖させた。一過性トランスフェクションを、製造者の提案するプロトコル（ＢＲＬライフサイエンシズ）に従い、リポフェクチンを使用して行った。簡単に述べれば、６０ｍｍの細胞培養用ディッシュ中で細胞の密度を１×１０５個／ディッシュで培養し、５ｍｇ／ディッシュのレポータープラスミドを用いてトランスフェクションした。
【００５０】
（５）プロモーター活性の測定
挿入プロモーター断片からルシフェラーゼを発現するレポータープラスミドを用いて、細胞をトランスフェクションした。トランスフェクションの２日後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ・アッセイ・キット（プロメガ）を使用して照度計でルシフェラーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ活性は、タンパク質濃度の調整（バイオラッド（BioRad））により標準化した。プロモーターが挿入されていない元のｐＧＬ３‐ｂａｓｉｃプラスミド、ＳＶ４０プロモーターを含むＰＧＬ３プロモーター・プラスミド、およびＳＶ４０プロモーターとエンハンサー領域とを含むｐＧＬ３対照プラスミドを使用して、対照のトランスフェクションを行った。実験は２連で少なくとも３回行った。
【００５１】
（６）様々なヒト組織中における、ｈＲＲＭ２のｍＲＮＡ発現のノーザンブロット分析
様々なヒト組織（心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、および膵臓）由来のポリ
ＡｍＲＮＡを１レーンあたり約２ｍｇ結合させてある既製のナイロンフィルタを、米国カリフォルニア州パロアルト所在のクロンテック・ラボラトリーズ（Clontech Laboratories ）から得た。フィルタを、迅速ハイブリダイゼーション用の緩衝液（ストラタジーン（Stratagene））を使用してストリンジェントな条件下において、ｈＲＲＭ２の完全長ｃＤＮＡをプローブとして探査した（エン（Yen ）ら、１９９４年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  第５４巻、ｐ．３６８６〜３６９１）。
【００５２】
（７）化学療法剤処理およびＵＶ照射の後のｈＲＲＭ２の発現
ＰＣ‐３前立腺癌細胞を各化学療法剤のＩＣ５０用量で４８時間処理してから、該細胞よりＲＮＡを抽出した。ＤＮＡの損傷を駆動するために、ＫＢ細胞を２０００Ｊ／分のＵＶ照射に曝し、次いで正常な培養条件に戻した。次いでＲＮＡを様々な時点で抽出した。ゲル電気泳動を行い、２０ｍｇの全ＲＮＡを各レーンに載せた。分離したＲＮＡを膜に移し、前に記載したのと同様に、ｈＲＲＭ２の完全長ｃＤＮＡをプローブとして探査した。ブロットについては、ＲＮＡ搭載の内部対照として、ＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子をプローブとした探査も実施した。ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（商標）でブロットを定量化した。それぞれのレーンのバンドの強度を、ＧＡＰＤＨバンドの強度に対して正規化した。
【００５３】
（結果）
（１）ゲノムｈＲＲＭ２のクローニングおよび配列決定
以前の研究では、ＲＲＭ２遺伝子は、第２染色体（２ｐ２４‐ｐ２５）に局在していた。さらに、３個の偽遺伝子が他の染色体（１ｐ３１‐ｐ３３、１ｑ２１‐ｑ２３、およびＸｐ１１‐ｐ２ｌ）上で発見された（ヤン‐フェン（Yang‐Feng）ら、１９８７年、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  第１巻、ｐ．７７〜８６）。ＲＲＭ２構造遺伝子に特異的なプローブを使用してヒト胎盤ゲノムライブラリーをスクリーニングし、所望の遺伝子の一部分を含む３個のＰＡＣクローンを同定した。これらの断片をＰＣＮＴＲベクターにサブクローニングし、その全体を配列決定した。その遺伝子は、１０個のエクソンからなることが分かった。表１に示すイントロン／エクソン接合部は、スプライシングのコンセンサスシグナルに対応した。
【００５４】
【表１】
2005521418.tif 000006
３．４ｋｂおよび１．６５ｋｂの２つのｈＲＲＭ２のｃＤＮＡが同定されている。これ
らは同一のコード領域を含み、その非翻訳領域の長さのみが異なる。これらのｃＤＮＡは、ゲノム構造とアラインされることが示されている。ヒトＲＲＭ２遺伝子は、マウスＲＲＭ２遺伝子と有意な構造類似性を示すことが見出され、マウスＲＲＭ２遺伝子も１０個のエクソンからなる。
【００５５】
（２）５’‐ＲＡＣＥによる転写開始部位の同定
２つのｍＲＮＡ転写産物のプロモーター領域および転写開始部位を同定するために、プライマー伸長法および５’‐ＲＡＣＥを使用した。１．６５ｋｂのｍＲＮＡに対応する転写開始部位を、＋１（配列番号１の２５６７ｂｐに相当）と名付け、一方３．４ｋｂのｍＲＮＡの転写は、−１８７位（配列番号１の２３８０ｂｐに相当）で始まることが見出された。ここで＋１と名付けられた部位は、パブロフ（Pavloff ）ら（１９９２年、ＤＮＡ
Ｓｅｑ  第２巻第４号、ｐ．２２７〜２３４）によって発表されたＲＲＭ２配列中の＋１５１に対応する。手作業の読み取りによって第１の転写開始部位の上流にコンセンサスを有するＴＡＴＡボックスが発見されたが、このような部位は第２の転写開始部位の上流には発見されなかった。プロモーター領域のさらなる分析を、転写因子予測用のＴＲＡＮＳＦＡＣ（登録商標）ＭＡＴＲＩＸ  ＴＡＢＬＥと共に、ＴＦＳＥＡＲＣＨデータベースを使用して行った。いくつかの転写因子の、潜在的なＤＮＡ結合部位を同定した。コンセンサスを有する３つのＣＣＡＡＴボックスが、２つの転写開始部位の間の領域の−８２、−１０９、および−１３９位において発見され、さらにもう１つの部位が、さらに上流の−４３６位に存在することが見出された。プロモーター近隣領域のＣＣＡＡＴボックスは、ｈＲＲＭ２発現の活性化に関与していた（パークおよびレビン（Park and Levine ）、２０００年、Ｂｉｏｃｈｅｍ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ  第２６７巻、ｐ．６５１〜６５７）。ＳＰ１結合部位も、転写開始部位の決定において役割を果たすことが知られている。ＳＰ１結合部位と推定される部位が、−４８０位およびさらに上流の別のいくつかの位置に同定されている。転写因子結合部位と推定される他の部位には、ｃ‐Ｅｔｓ、ＭＺＦ１、Ｅ２Ｆ、Ｌｙｆ‐１、ＧＡＴＡ‐Ｘ、ＨＳＦ２、ＡＰ‐１、ＣｄｘＡ、ＩＫ‐２、Ｓｏｘ‐５、ＳＲＹ、Ｂｒｎ‐２、ＨＮＦ‐１、ＳＴＡＴｘ、ＧＡＴＡ‐１、ＵＳＦ（ｃ‐Ｍｙｃ）、Ｐｂｘ‐１、Ｏｃｔ‐１、ＧＡＴＡ‐２、ＣＲＥ‐Ｂｐ、およびＮｋｘ‐２部位がある。
【００５６】
（３）ｈＲＲＭ２プロモーターの特徴付け
ｈＲＲＭ２プロモーターをさらに特徴付けるために、いくつかの欠失構築物を作製してルシフェラーゼ遺伝子の転写を駆動した。これらの構築体は＋１位を経て伸び、−６５９、−５５７、−４５５、−２５７、−２３６、−２０４、−１８４、−１５６、−１０６、および−５５位に端点を有する。転写開始部位は＋１位と−１８７位の両方に見出されたので、長いほうの６個のプロモーター欠失構築物は両方の部位から転写を開始する能力を有し、一方短いほうの４個のプロモーター構築物は、下流の開始部位のみを有する。これらのレポーター構築物をＫＢ細胞へトランスフェクションした後の、相対的なルシフェラーゼ活性を測定した。−６５９までの欠失によって、ルシフェラーゼ発現がエンハンサー配列を完全に欠いたＳＶ４０プロモーターにより駆動されるｐＧＬ３プロモーター対照に匹敵するレベルで、ルシフェラーゼが発現されることが見出された。ルシフェラーゼ活性の低下は、−６５９と−２５７の間の欠失に関してはごく最小限であり、次いで、−２５７と−２３６の間の配列の欠失と共に活性の有意な低下が起こった。この領域内に転写因子に関する同定済みの結合部位は存在しないので、この活性の変化がそのような因子に起因する変化を反映しているとは考えられない。転写開始部位の上流が近似していることから示唆されるのは、この活性の低下が２つの別個のＲＲＭ２プロモーター領域が存在することを反映しており、−６５９と−２５７の間の領域は３．４ｋｂのＲＲＭ２のｍＲＮＡのプロモーターとして作用し、一方−２０４と＋１の間の領域は１．６５ｋｂのＲＲＭ２のｍＲＮＡのプロモーターとして作用する可能性があるということである。このことは、−２０４、−１８４、および−１５６に端点を有する欠失構築物に関して再び有意なプ
ロモーター活性が観察されるということにより支持される。ルシフェラーゼ活性は、−１５６と−１０６の間の配列の欠失により再び有意に低下するが、これはいくつかの重要な部位が失われたことを示唆している。ＤＮＡのこの区間内に２つのＣＣＡＡＴボックスが存在し、これらがこの活性の低下の原因である可能性がある。
【００５７】
（４）ヒト組織におけるｈＲＲＭ２のｍＲＮＡ転写産物の差異的発現
２つのｈＲＲＭ２転写産物が同定されており、それらが別々のプロモーターから発現されているようなので、これらが異なる発現パターンをもたらすかどうかをさらに調べた。２つの転写産物が組織特異的な形式で差異的に発現されるかどうかを調べるために、ノーザンブロット分析を使用して、様々なヒト組織中でのそれぞれの転写産物のレベルを測定した。調べた全ての組織において両方の型のｍＲＮＡが発現されたが、それらの相対的レベルは著しく異なっていた。胎盤、肺、および腎臓では、３．４ｋｂ型のｍＲＮＡが主要である。逆に、胸腺、精巣、結腸、および小腸では、１．６５ｋｂ型が優勢である。この遺伝子は、胸腺、小腸、結腸、および精巣では高レベルで発現され、肺および肝臓では低レベルで発現される。前立腺、骨格筋、脳および白血球組織では検出は非常に低いレベルであった。興味深いことに、心臓組織中で発見されたｈＲＲＭ２のｍＲＮＡの大きさは他のものよりもわずかに大きく、このことは差異的スプライシングまたは代替的（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ）転写を表しているのかもしれない。
【００５８】
（５）化学療法剤またはＵＶ処理によって誘導される、ｈＲＲＭ２のｍＲＮＡ発現の変化
ｈＲＲＭ２の転写を駆動する２つのプロモーターの存在は、様々な細胞事象に応答して発現を制御する多数の手段を備える必要性を表す可能性もある。特にｈＲＲＭ２は、細胞周期全体の発現レベルを調節するための１組の制御因子と、ＤＮＡの損傷に応答して発現を制御するための別の手段とを必要とする可能性がある。この可能性を検討するために、様々な化学療法剤およびＵＶ照射の、ｈＲＲＭ２の２つの型のｍＲＮＡの相対的発現レベルに対する影響を調べた。ＰＣ‐３前立腺癌細胞を、それぞれの化学療法剤のＩＣ５０用量で４８時間処理し、ＲＮＡを抽出してノーザンブロットによって調べた。薬剤処理した細胞中の各型のｈＲＲＭ２  ｍＲＮＡの発現を、非処理細胞中のレベルとの相対比として測定した。インターフェロンを用いた処理によって、いずれのｍＲＮＡもわずかに上方制御され、一方ヌクレオチド類似体のフルダラビンで処理した細胞では、いずれのｍＲＮＡに対する制御も見出されなかった。トポイソメラーゼＩ阻害剤であるＣＰＴ‐１１で処理した細胞はいずれの型のｍＲＮＡも有意に下方制御したが、１．６５ｋｂのｍＲＮＡが主であった。微小管阻害剤であるタキソールを用いた処理によって、いずれのｍＲＮＡのレベルについても非処理細胞と比べて下方制御作用が示された。ｈＲＲＭ２の発現は、いくつかのこれらの薬剤によって明らかに影響を受けたが、その影響は１つの型のｍＲＮＡに特異的なものではなかった。その代わりに、いずれの転写産物においても発現レベルの変化が表れた。
【００５９】
ｈＲＲＭ２発現のレベルに対するＤＮＡ損傷の影響をさらに詳細に調べるために、細胞をＵＶ照射に曝し、次いでＲＮＡを６、２４、および４８時間後に細胞から抽出した。ＵＶ処理後のｈＲＲＭ２の各ｍＲＮＡの量を、非処理細胞中のレベルと比較して測定する。この場合も、いずれの型のｈＲＲＭ２  ｍＲＮＡもＵＶ処理により同じように影響を受ける。発現は６時間後に有意に増大し、その後そのレベルは２４時間までに低下して非処理細胞中で見られるレベルにまで戻り、次いで４８時間の時点で有意に低下する。６時間後の誘導レベルから、下流のプロモーターが優先的に制御される可能性が示唆される。
【実施例２】
【００６０】
（薬剤耐性の機構を担う染色体の相同染色領域における、ヒト・リボヌクレオチド還元酵素Ｍ２サブユニット遺伝子の増幅と転写制御）
（物質および方法）
（１）細胞
ヒト口咽頭癌ＫＢ細胞（米国バージニア州マナッサス所在の米国微生物系統保存機関）を、プラスチック製の組織培養プレート中、１０％ウシ胎児血清を補ったＲＰＭＩ１６４０培地で、５％ＣＯ２中３７℃で増殖させた。ゲムシタビン耐性クローン（ＫＢＧｅｍ）を、ゲムシタビン濃度を漸増して段階的に曝すことによって選択した。このクローン化した細胞株を選択し、８ｍＭのゲムシタビンの存在下で維持した。野生型ＫＢ（ＫＢｗｔ）細胞のＩＤ５０は０．３ｍｍであり、一方ＫＢＧｅｍクローンは３２．３ｍｍのＩＤ５０を有する（ゴーン（Goan）ら、１９９９年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  第５９巻、ｐ．４２０４〜４２０７）。ヒドロキシ尿素耐性クローン（ＫＢＨＵＲ）は、ＨＵの存在下で段階式に順次選択した。このクローン化した細胞株を、１ｍＭのＨＵの存在下で選択した（エン（Yen ）ら、１９９４年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  第５４巻、ｐ．３６８６〜３６９１）。コンタミネーションを避けるために、これら２つのクローンを異なる担当者および施設によって別々に選択および維持した。
【００６１】
（２）プローブ、プライマー、およびＰＣＲ
ＲＲのヒトＭ２サブユニットのゲノム配列は公開されている（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ０３２７５０）（ツォー（Zhou）ら、２００１年、Ｃｙｔｏｇｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ  第９５巻、ｐ．５２〜５９）。ｈＲＲＭ２のプロモーター領域を増幅するために、公開されているゲノム配列に基づいて以下のＰＣＲプライマー：
ＰＡＣ６２１：５’ＧＡＴＣＧＣＴＴＧＡＴＡＣＣＡＡＣＣＴＧＧＧ３’、
ＰＡＣ６２４：５’ＧＧＣＣＡＣＧＣＣＧＡＣＡＴＧＡＣＴＣＡ３’、
ＰＡＣ６２１０：５’ＴＣＣＣＴＧＧＧＡＧＡＴＧＧＡＴＧＣ３’、
ＰＡＣ６２１１：５’ＡＡＧＣＣＴＧＧＡＡＡＡＣＧＣＴＣＣ３’、
ＰＡＣ６２２８：５’ＴＣＣＣＧＴＡＧＴＴＴＧＡＡＧＧＴＴＴＡＣＡＡ３’、および
ＨＲＭ２２８：５’ＡＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＣＴＴＴＡＡＡＴＣＴＣ３’
を設計した。
【００６２】
ホット・スタートＰＣＲ技法を使用した（米国カリフォルニア州所在のキアゲン（Qiagen））。この反応は、９５℃、１５分間の加熱で開始し、次に９４℃で４０秒間、５５℃で４０秒間、および７２℃で２分間を３５サイクル、その後７２℃で７分間の最終インキュベーションであった。
【００６３】
（３）ＲＲＭ２のｍＲＮＡおよびノーザンブロット分析
対数増殖期の細胞、または以前に記載されたような特定の条件（ゴーン（Goan）ら、１９９９年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  第５９巻、ｐ．４２０４〜４２０７）で増殖期にある細胞から、全ＲＮＡを抽出した。該ＲＮＡをホルムアルデヒド‐アガロースゲルで分離し、Ｈｙｂｏｎｄ‐Ｎ（商品名）膜（米国イリノイ州アーリントン所在のアメリカン（American）上にブロッティングした。ｈＲＲＭ２を検出するための放射性プローブを、前に報告されたのと同様に作製した（ゴーン（Goan）ら、１９９９年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  第５９巻、ｐ．４２０４〜４２０７）。内部対照としてＧＡＰＤＨを使用した。ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で行った。１分間のＵＶ光によって、ＲＮＡを膜に架橋させた。ロシュ（Ｒｏｃｈｅ、米国インディアナ州インディアナポリス所在）のランダムプライミングプローブキットを使用して、プローブを標識した。ブロットを、６８℃で１時間３２Ｐ標識プローブとハイブリダイズさせた。２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで２回、および０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで２回洗浄した後、膜を−７０℃で１８〜４８時間、増感スクリーンとともにＫｏｄａｋ  ＸＡＲ‐５フィルム（米国ニューヨーク州ロチェスター所在のイーストマンコダック（Eastman Kodak ））に感光させるか、あるいはＰｈｏｓｐｈｏＩｍａｇｅｒ（登録商標）スクリーンに１８時間感光させ、次いでＰｈｏｓｐｈｏＩｍａｇｅｒによってスキャンした。
【００６４】
（４）ＲＲＭ２タンパク質およびウエスタンブロット分析
各クローンからのタンパク質抽出物を、等量のタンパク質を載せた１０％ＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって分離した。電気泳動の後に、タンパク質をＰＶＤＦ膜（アメリカンファルマシアバイオテク（American Pharmacia Biotech））にトランスファーした。サンタクルーズ・バイオテクノロジー・インコーポレイテッド（Santa Cruz Biotechnology, Inc.）から購入したヤギ抗ヒトＲＲＭ２ポリクローナル抗体（ＳＣ‐１０８４４：Ｒ２（Ｎ‐１８））を、ウエスタンブロット分析用に使用した。α‐チューブリン抗血清を内部対照として使用した。
【００６５】
（５）ゲルシフトアッセイ
ａ．核タンパク質の抽出
１×１０７個の細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、４００ｍｌの緩衝液Ａ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、１０ｍＭのＫＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＤＴＴおよび０．５ｍＭのＰＭＳＦ）に１５分間懸濁させた。２５ｍｌのＮｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ４０を加えた後、細胞のペレットを１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、１０秒間渦流攪拌することによって混合し、８，０００〜１０，０００ｒｐｍ、４℃で３０秒間遠心分離した。ペレットを５０ｍｌの緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、０．４ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＤＴＴおよび１ｍＭのＰＭＳＦ）に再懸濁し、４℃で１５分間激しく振蕩した。次いで抽出物を１５分間遠心分離にかけ（１０，０００ｒｐｍ、４℃）、上清（約５５ｍｌ）を回収し、−８０℃で保存した。
【００６６】
ｂ．ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成した二本鎖ＤＮＡ断片のＤＮＡ配列
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成した二本鎖ＤＮＡ断片のＤＮＡ配列は、以下：
ＳＰ１：５’ＡＴＴＣＧＡＴＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＣ３’、
ＡＰ‐１（ｃ‐ｊｕｎ）：５’ＣＧＣＴＴＧＡＴＧＡＧＴＣＡＧＣＣＧＧＡＡ３’、
ＡＰ‐２：５’ＧＡＴＣＧＡＡＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＧＣＧＧＣＣＣＧＴ３’、
ＮＦ‐ｋＢ：５’ＡＧＴＴＧＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＡＧＧ３’、
ＯＣＴ１：５’ＴＧＴＣＧＡＡＴＧＣＡＡＡＴＣＡＣＴＡＧＡＡ３’、および
ＣＲＥＢ：５’ＡＧＡＧＡＴＴＧＣＣＴＧＡＣＧＴＣＡＧＡＧＡＧＣＴＡＧ３’
の通りである。
【００６７】
ｃ．コンセンサスオリゴヌクレオチドの末端標識
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成した二本鎖ＤＮＡ断片を、標準的なプロトコルに従い、Ｔ４ポリヌクレオチド・キナーゼを使用してγ‐３２Ｐ  ＡＴＰで標識した。取り込まれなかったヌクレオチドは、Ｍｉｃｒｏ‐Ｂｉｏ‐ｓｐｉｎ（登録商標）Ｐ‐３０スピン・カラム（バイオラッド（Bio ‐Rad ））を使用して除去した。
【００６８】
ｄ．ＤＮＡ‐タンパク質結合およびゲルシフト
４％のグリセロール、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ｍＭのＤＴＴ、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ７．５）および０．０５ｍｇ／ｍｌのポリ（ｄＩ‐ｄＣ）からなる結合用緩衝液中でＤＮＡ‐タンパク質結合反応を実施した。核の溶解物を、１０分間室温でプレインキュベーションした。次いで末端標識したプローブを加え、さらに２０分間室温でインキュベーションした。ＤＮＡ‐タンパク質複合体を、０．５×ＴＢＥ中の６％のＤＮＡ遅延ゲル（インビトロジェン（Invitrogen））で、２５０ボルトで１時間分離させた。乾燥させたゲルをＰｈｏｓｐｈｏＩｍａｇｅｒで分析した。
【００６９】
（６）スペクトル核型分析
マーカー染色体を同定するために、２４色のスペクトル核型分析（ＳＫＹ）を行った。新たにハーベストした材料（試験サンプル）または細胞ペレットの残り（バリデーションサンプル）を使用してスライドを調製し、室温で一晩保存した。細胞質を欠く分裂中期細胞の調製およびスライドの準備を２４時間以内の分析時間にとどめ、人為的に劣化させなければ、最良のスペクトル核型分析結果が得られた。ハイブリダイゼーション前に、スライドを、０．１ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡを２×ＳＳＣ（ｐＨ７．０）に溶かしたもので処理し（３７℃、４５分間）、ペプシン（米国ミズーリ州セントルイス所在のシグマ（Sigma ））（０．０１ＮのＨＣｌに溶かして６ｍｇ／ｍｌとしたもの、３７℃）で１分間消化し、ホルムアルデヒド（１×ＰＢＳ／５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２に溶かして１％としたもの、室温）中で１０分間固定した。スライドは、７０％ホルムアミド／２×ＳＳＣ、ｐＨ７．０中において、７２℃で２分間変性させた。ＳＫＹ用の染色物を７２℃で５分間変性させ、３７℃で１時間プレアニーリングさせた。変性プローブを変性スライドに施し、３７℃で４８時間インキュベートした。ハイブリダイゼーション後の洗浄は、プローブの製造者の教示書に従って行った。核および分裂中期の染色体を、ＤＡＰＩを用いて対比染色した。分裂中期の画像、を捕え、１５０ＷのキセノンＵＶ光源を備えたツァイス（Zeiss ）のＡｘｉｏｐｌａｎ（商標）２顕微鏡に取り付けた、ＳＫＹ観察用細胞遺伝学ワークステーション（SKY vision cytogenetic workstation）（アプライドスペクトラルイメージング（Applied Spectral Imaging））で分析した。５つの蛍光色素：スペクトルオレンジ（Spectrum Orange ）、テキサスレッド（Texas Red ）、Ｃｙ５、スペクトルグリーン（Spectrum Green）、およびＣｙ５．５をＳＫＹの組合せ標識に使用した。研究を開始する前に、蛍光シグナルの弱さや光学システムの調整不良によって生じる不適切な結果を軽減するために装置の調整を行った（ガリニ（Garini）ら、１９９９年、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  第３５巻、ｐ．２１４〜２２６）。それぞれのクローンに関して、ＧＴＧバンド法で２０個以上の分裂中期細胞を分析した。スペクトル核型分析を検証するために、５〜２０個の分裂中期細胞を分析した。
【００７０】
（７）ＦＩＳＨ分析
標準的なＦＩＳＨ分析を行って、矛盾する結果について検証した。以下のプローブを使用した：第１６、第１７、および第２０染色体用の染色体計数用サテライトＤＮＡプローブ（米国イリノイ州ダウナーズグローブ所在のヴァイシス（Vysis ））；第３、第６、第７、第９、および第１１染色体用の全染色体染色用プローブ（米国メリーランド州ガイザーバーグ所在のオンコル（Oncor ））；ＢＣＬ２用のＹＡＣ（ＹＡ１５３Ａ６）（米国マサチューセッツ州ボストン所在のハーバード医科大学（Harvard Medical School）のゲイリー・エイ・シルバーマン博士（Dr.Gary A.Silverman ）より提供）、ＡＭＬ１用のＹＡＣ（８１２ｆ１１）（米国ニューヨーク州バッファロー所在のエレノア・ルーズベルトがんセンター（Eleanor Roosevelt Cancer Center ）のキャサリン・ガーディナー博士（Dr.Katherine Gardiner ）より提供）を含めた領域特異的プローブ、染色体腕１２ｐおよび１２ｑに特異的な染色用プローブ（米国メリーランド州ロックビル所在のＡＬテクノロジーズ（AL Technologies ））、染色体腕１９ｑテロメア・プローブ（ヴァイシス）、転座プローブ（オンコル）、第２２染色体ＢＣＲプローブ（オンコル）、およびＭＹＣＮ遺伝子座特異的プローブ（オンコル）。市販のプローブを使用するすべてのＦＩＳＨ手法は、製造者のプロトコルに従った。ＹＡＣを用いるＦＩＳＨ分析にはホルムアミドによるハイブリダイゼーション後の洗浄を使用した（米国イリノイ州所在のアプライドスペクトラルイメージ（Applied Spectral Image））。
【００７１】
（８）同調実験
ＫＢｗｔおよびＫＢＧｅｍおよびＫＢＨＵＲクローンを、細胞を飢餓条件（０．２５％血清で９６時間）で増殖させてから正常な増殖条件（１０％ＦＢＳを用いる）に戻すことによって同調させた。血清含有培地に戻した後の所定の時点で、０．５〜１×１０８個の細胞をハーベストし、上述のようにノーザンブロット分析用に全ＲＮＡを抽出した。
【００７２】
（結果）
（１）染色体の相同染色領域における、増幅ｈＲＲＭ２配列の検出
ＫＢｗｔ細胞株は、３つの「Ａ群」染色体の短腕上にｈＲＲＭ２のハイブリダイゼーションシグナルを有する３倍体（３ｎ）に近いことが見出された。ＤＡＰＩ染色によって、「Ａ群」染色体はヒトの第２染色体と同定された。スペクトルグリーンで標識したｈＲＲＭ２  ＰＡＣ  ＤＮＡプローブは、有糸分裂細胞の染色体２ｐの２４‐２５上にシグナルを示した。ｈＲＲＭ２遺伝子の遺伝子コピー数を、これらの細胞の３倍体レベルに補正した。ｈＲＲＭ２遺伝子配列の増幅は、ＫＢｗｔ細胞では観察されなかった。第２染色体短腕の同腕染色体は、分裂中期細胞（ｎ＝１０）にも分裂間期の核（ｎ＝５０）にも観察されなかった。
【００７３】
ＫＢＧｅｍクローンの部分的Ｇバンド分析から、ほぼ３倍体の様相の範囲であることが示された。ハイブリダイゼーションシグナルは、形態学的に正常な２つの第２染色体、第２染色体短腕の同腕染色体またはｉ（２）（ｐ１０）、およびマーカー染色体上の高度に増幅された領域に局在していた。マーカー染色体を同定するために、２４色のスペクトル核型分析（ＳＫＹ）を行った。ＳＫＹ染色によって、マーカー染色体が第１３染色体の誘導体であることが示された。ＩＳＣＮの１９９５年の命名法を使用して、ｈｓｒを有する第１３染色体誘導体を、
【００７４】
【化２】
2005521418.tif 000007
と記載することが可能である。さらに、ＫＢＨＵＲクローンの部分的Ｇバンド分析によって、Ｉ（２ｐ）に由来すると思われる高度に増幅されたマーカー染色体を伴うほぼ３倍体であることが示された。ＳＫＹ染色によって、マーカー染色体は第５染色体の物質も含むことが示された。第５染色体の染色用プローブを使用するＦＩＳＨによって、ｄｅｒ（２）マーカー染色体の先端に第５染色体の物質が確認された。このマーカーに関して考えられる命名は、
【００７５】
【化３】
2005521418.tif 000008
である。
（２）ｈＲＲＭ２の遺伝子増幅は、ｈｓｒの増幅と相関関係を有する
ｈｓｒの増幅を示す細胞遺伝学的実験の結果を確認するための試みにおいて、ＰＣＲを行ってｈＲＲＭ２プロモーター領域の増幅を検出した。ｈＲＲＭ２の有意で高度な増幅が、ＫＢＧｅｍクローンおよびＫＢＨＵＲクローンに関して実証された。この結果は、プロモーター領域を含めたｈＲＲＭ２遺伝子の増幅が原因で、ＫＢＧｅｍおよびＫＢＨＵＲクローンではＫＢｗｔ細胞に比べて転写レベルが高くなっている可能性を示唆する。それぞれの細胞株からのＰＣＲ産物を配列決定したところ、増幅したＤＮＡ領域中には突然変異は見られなかった。
【００７６】
（３）ＫＢＧｅｍおよびＫＢＨＵＲクローンにおける、ｈＲＲＭ２のｍＲＮＡおよびタンパク質発現
観察されたｈＲＲＭ２遺伝子の増幅が高い遺伝子発現をもたらしたかどうかを判定するために、全ＲＮＡをそれぞれの細胞系から抽出し、ノーザンブロットにより分析してｈＲＲＭ２のｍＲＮＡ発現のレベルを測定した。２つの型のｈＲＲＭ２  ｍＲＮＡ（３．４ｋ
ｂおよび１．６５ｋｂ）がＭ２プローブによって検出された。ＫＢＧｅｍおよびＫＢＨＵＲクローンでは、ＫＢｗｔ細胞株と比較してｈＲＲＭ２のｍＲＮＡが有意に高く発現していた。この知見は、以前に公表された結果（ゴーン（Goan）ら、１９９９年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  第５９巻、ｐ．４２０４〜４２０７）と一致した。ＫＢＧｅｍおよびＫＢＨＵＲクローンは、ＫＢｗｔのレベルより３０倍高いレベルで１．６５ｋｂ型のｈＲＲＭ２
ｍＲＮＡを発現した。ＫＢＧｅｍクローンおよびＫＢＨＵＲクローンにおける、３．４ｋｂ型のｈＲＲＭ２  ｍＲＮＡの発現は、ＫＢｗｔと比べて２５倍増大した。１．６５ｋｂのｍＲＮＡは、下流のＰ１プロモーターからの転写に対応し、３．４ｋｂのｍＲＮＡは、上流のＰ２プロモーターから開始される発現に対応する（ツォー（Zhou）ら、２００１年、Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ  第９５巻、ｐ．５２〜５９）。ｈＲＲＭ２タンパク質の量を決定するために、ＫＢｗｔ、ＫＢＧｅｍおよびＫＢＨＵＲから抽出した等量の全タンパク質を、ウエスタンブロットにより分析した。Ｍ２タンパク質の分子量は、４４ｋＤである。定量化、ａ‐チューブリンに対する正規化の後、ＫＢＧｅｍはＫＢｗｔの１０．２倍の増大を示し、ＫＢＨＵＲはＫＢｗｔの１１．３倍の増大を示した。
【００７７】
（４）同調実験におけるｈＲＲＭ２遺伝子の転写
ｈＲＲＭ２のｍＲＮＡの代謝についてさらに理解するために、ｈＲＲＭ２のｍＲＮＡの転写速度を、血清‐同調したＫＢｗｔ、ＫＢＧｅｍおよびＫＢＨＵＲクローンにおいてさらに調べた。０．２５％ＦＢＳ中で９６時間の血清飢餓によって同調させた細胞から全ＲＮＡを単離した。次いで細胞を１０％ＦＢＳの入った正常な増殖条件に戻した。正常な増殖条件に戻した後４時間から１２時間の間の所定の時点で、それぞれの細胞株に関して全ＲＮＡを調べた。ＫＢｗｔ細胞では発現の誘導はほとんどなかったが、ＫＢＧｅｍおよびＫＢＨＵＲクローンにおけるｈＲＲＭ２転写の速度は４時間まで著しく増大し、８〜１２時間まで増大し続けた。ＫＢｗｔ細胞と比較すると、ＫＢＧｅｍおよびＫＢＨＵＲクローンは、４時間の時点で５倍を超えるｈＲＲＭ２のｍＲＮＡを発現した。８時間後、耐性クローンは野生型の対照より１０倍高い発現を示した。１２時間の時点では、ＫＢＧｅｍおよびＫＢＨＵＲクローンは、ＫＢｗｔのレベルより２０〜２５倍高いレベルでｈＲＲＭ２を発現した。これらのクローンでは、３．４ｋｂのｍＲＮＡ発現が、４時間および８時間の時点で１．６５ｋｂのｍＲＮＡの発現と等しかったが、１２時間の時点では、１．６５ｋｂのｍＲＮＡが、両方の耐性クローンにおいて著しく過剰発現した。ＫＢＨＵＲクローンに関して以前に報告されたように、ｈＲＲＭ２のｍＲＮＡおよびタンパク質の過剰発現によって、ＫＢｗｔ細胞の１５倍の、ＨＵに対する耐性増大がもたらされている（エン（Yen ）ら、１９９４年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  第５４巻、ｐ．３６８６〜３６９１；およびツォー（Zhou）ら、１９９５年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  第５１巻、ｐ．１３２８〜１３３３）。ＫＢＧｅｍクローンの耐性の機構は、ｄＣＴＰ蓄積量の増大から生じることが示されている（ゴーン（Goan）ら、１９９９年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．第５９巻、ｐ．４２０４〜４２０７）。このクローンでは、ｈＲＲＭ２の過剰発現、およびその後のＲＲ活性の増大によって、細胞中のｄＣＴＰ濃度の増大がもたらされる。その結果、利用可能なｄＣＴＰが、活性型ＧｅｍであるｄＦｄＣＴＰと競合することが可能であり、耐性の１０倍の増大がもたらされる。
【００７８】
（５）増幅したｈＲＲＭ２プロモーター領域と結合する転写因子
増幅だけで転写の増大がもたらされるであろうことが予想されるが、転写因子の利用性および結合の変化が、これらのクローンにおけるｈＲＲＭ２発現の制御をさらに変える可能性がある。ｈＲＲＭ２遺伝子の増幅がこの薬剤耐性クローンにおいて転写制御の変化をもたらすかどうかを判定するために、転写因子とｈＲＲＭ２プロモーター内の所定部位の結合を調べた。ＫＢｗｔ、ＫＢＧｅｍおよびＫＢＨＵＲの核抽出物中に存在する転写因子と、転写因子のコンセンサスオリゴヌクレオチドとの結合を調べた。ゲルシフトアッセイを、ＡＰ‐１、Ｓｐ１、ＡＰ‐２、ＣＲＥＢ、ＮＦ‐ｋＢおよびＯＣＴ１のコンセンサス結合配列（ブリッグス（Briggs）ら、１９８６年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  第２３４巻、ｐ．４
７；リー（Lee ）ら、１９８７年、Ｃｅｌｌ  第４９巻、ｐ．７４１；およびレナード（Lenardo ）ら、１９８９年、Ｃｅｌｌ  第５８巻、ｐ．２２７）のオリゴヌクレオチドを使用して行ったが、これらの転写因子はｈＲＲＭ２ゲノム配列の分析に基づいて選択した（ツォー（Zhou）ら、２００１年、Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ
第９５巻、ｐ．５２〜５９）。ＫＢｗｔ、ＫＢＧｅｍおよびＫＢＨＵＲ核抽出物中のこれらの転写因子の相互作用によって、様々なＤＮＡ‐タンパク質結合パターンが示された。ＫＢＧｅｍクローンはＳｐ１に関して特有な結合パターンを示したが、この場合ＫＢＧｅｍサンプルをＫＢｗｔサンプルと比較すると、追加のバンドが容易にはっきり見える。さらに、この追加のバンドは非標識Ｓｐ１オリゴヌクレオチドとの競合によって失われ、その結合が特異的であることが示唆された。ＮＦ‐ｋＢに関する他の結合も示された。ＫＢＧｅｍサンプルはＮＦ‐ｋＢゲル上に追加のバンドを示し、このバンドは競合によって失われた。ＫＢＧｅｍクローンは、ＡＰ‐１、ＡＰ‐２、ＣＲＥＢ、およびＯＣＴ１に関してはＫＢｗｔと比較して異なる結合パターンは示さなかった。しかしながら、ＡＰ‐１に関しては、ＫＢＧｅｍクローンはＫＢｗｔより弱い結合を示した。これに対し、ＡＰ‐２、ＣＲＥＢ、およびＯＣＴ１の結合は、ＫＢｗｔよりもＫＢＧｅｍクローンに関してより強力であった。ＫＢＨＵＲクローンに関しては、ＫＢｗｔまたはＫＢＧｅｍと比較すると、調べたほぼすべての転写因子について異なるＤＮＡ‐タンパク質複合体が見られた。各例において、ＫＢｗｔおよびＫＢＧｅｍに関して見られるバンドよりも、移動の遅いバンドが形成された。この移動の遅いバンドは、すべてのゲル上で同定可能であった。この結果は、ＫＢＨＵＲは、ＤＮＡと結合すると大きなタンパク質複合体を形成する可能性がある、ＫＢｗｔとは異なる転写因子によって制御されるという仮説を支持している。非標識オリゴヌクレオチドとの競合によって、ＡＰ‐２およびＯＣＴ‐１以外のすべての因子の結合特異性がさらに確認された。この知見から、ＫＢＨＵＲクローンが、ＡＰ‐１、Ｓｐ１、ＣＲＥＢおよびＮＦ‐ＫＢに関して特異的結合の特有なパターンを示すことが示唆される。これらの知見から、ＫＢＨＵＲとＫＢＧｅｍのいずれも増幅したｈＲＲＭ２遺伝子に由来するｈＲＲＭ２  ｍＲＮＡを過剰発現するが、転写因子による発現の制御は変化しているということも示唆される。
【実施例３】
【００７９】
（ヒトＫＢ細胞におけるヒドロキシ尿素およびゲムシタビンの組み合わせについての時間および順序依存性）
（材料および方法）
（１）細胞
ヒト口咽頭癌ＫＢ細胞（米国微生物系統保存機関）を、プラスチック製の組織培養プレート中、１０％ウシ胎児血清を補ったＲＰＭＩ１６４０培地において、５％二酸化炭素を含む湿潤雰囲気中３７℃で培養した。すべてのＧｅｍの試験において、増殖培地を透析してプリンおよびピリミジンを除去した。すべての試験において、ＨＵを濃度０．１ｍＭとして増殖培地に含め、一方Ｇｅｍは濃度０．３μＭとした。
【００８０】
（２）鋳型、プライマー、放射性物質
鋳型およびプライマーはすべて、シティ・オブ・ホープ（City of Hope）の施設において合成した。３Ｈ‐ｄＡＴＰおよび３Ｈ‐ｄＴＴＰは、モラベック・バイオケミカルズ（Moravek Biochemicals）から購入した。３Ｈ‐Ｇｅｍは、モラベック（Moravek ）でカスタム標識した。
【００８１】
（３）コロニー形成アッセイ
ＨＵおよび／またはＧｅｍで様々な時間処理したＫＢ細胞のコロニー形成能力を測定した。等数の対数増殖期の細胞を、所定の時間ＨＵおよび／またはＧｅｍで処理し、次いで既述（ツォー（Zhou）ら、１９９８年、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏ  第５５巻、ｐ．１６５７〜１６６５）と同様に、６ウエルの組織培養用ディッシュに播種した。３７
℃で８世代のインキュベーションの後に、それぞれのサンプルについてコロニー（少なくとも５０の細胞からなる）の数を計数した。
【００８２】
（４）３Ｈ‐２’‐デオキシシチジンおよび３Ｈ‐ＧｅｍのＤＮＡへの取り込みの測定
５×１０５個の細胞を３５ｍｍディッシュに接種し、次いで０．１ｍＭのＨＵで処理した。所定の時点で７μｌの３Ｈ‐２’‐デオキシシチジンまたは４μｌの３Ｈ‐Ｇｅｍを加え、プレートを、５％二酸化炭素を含む湿潤雰囲気中において３７℃で３０分間インキュベートした。次いでプレートをハーベストし、ＤＮＡを精製し、ＤＮＡの濃度を測定し、１０μｇのＤＮＡを５ｍｌのＥｃｏｓｃｉｎｔ（商標）Ａに懸濁させ、ベックマン（Beckman ）ＬＳ５０００ＣＥ液体シンチレーションカウンターを使用して放射活性を測定した。
【００８３】
（５）ノーザンブロット分析
対数増殖期の細胞から、既述（エン（Yen ）ら、１９９４年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  第５４巻、ｐ．３６８６〜３６９１）のようにして全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡをホルムアルデヒド‐アガロースゲル電気泳動にかけ、Ｈｙｂｏｎｄ‐Ｎ膜上にブロッティングした。ハイブリダイゼーションは、既述（ツォー（Zhou）ら、１９９８年、Ｂｉｏｃｈｅｍ
Ｐｈａｒｍａｃｏ  第５５巻、ｐ．１６５７〜１６６５）と同様に作製した放射性プローブを使用してストリンジェントな条件下で行った。
【００８４】
（６）ウエスタンブロット分析
それぞれのクローンからのタンパク質抽出物（等量のタンパク質（１００μｇ）を含む）を１４％ＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって分離し、次いでＰＶＤＦ膜（アマシャムファルマシアバイオテク（Amersham Pharmacia Biotech））にトランスファーした。トランスファー後、該ＰＶＤＦ膜は検出まで１％Ｉ‐ｂｌｏｃｋ（商標）（アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems））のブロッキング緩衝液中に浮遊させておいた。ヤギ抗ヒトＲＲＭ２ポリクローナル抗体（サンタクルーズバイオテクノロジー・インコーポレイテッド（Santa Cruz Biotechnology,Inc. ）（ＳＣ‐１０８４４：Ｒ２（Ｎ‐１８））およびα‐チューブリン抗血清（内部対照）（サンタクルーズバイオテクノロジー・インコーポレイテッド）を、１％のＩ‐ｂｌｏｃｋ（商標）試薬および０．１％のＴｗｅｅｎ（商標）‐２０界面活性剤（アプライドバイオシステムズ）を含むブロッキング緩衝液で１：２００に希釈した。ＰＶＤＦ膜を前述の緩衝液と共に室温で４５分間インキュベートした。０．５％のＩ‐ｂｌｏｃｋ（商標）を含むブロッキング緩衝液で６回洗浄した後、該ＰＶＤＦ膜を、アルカリホスファターゼと結合した二次抗体（ウシ抗ヤギ抗体、サンタクルーズ）を１：２０００希釈として含んだ１％Ｉ‐ｂｌｏｃｋ（商標）ブロッキング緩衝液と共に３０〜６０分間、再度インキュベートした。０．５％のＩ‐ｂｌｏｃｋ（商標）ブロッキング緩衝液およびアッセイ用緩衝液（２００ｍＭのＴｒｉｓ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２）で洗浄した後、ＰＶＤＦ膜にＣＳＰＤ（登録商標）Ｒｅａｄｙ‐ｔｏ‐Ｕｓｅ基質溶液（アプライドバイオシステムズ）を薄層となるように載せ、５分間インキュベートし、次いでＸ線フィルムに３分間感光させた。
【００８５】
（７）ｉｎ  ｖｉｖｏでのＲＲ活性のアッセイ
１×１０６個の細胞を６０ｍｍディッシュ中に二連で播種した。細胞を０．１ｍＭのＨＵで処理し、所定の時点でハーベストした。細胞に浸透性を付与するために、細胞を溶液Ａ（１５０ｍＭのスクロース、８０ｍＭのＫＣＬ、３５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、５ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．４、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのＣａＣｌ２）中で２回洗浄し、０．２５ｍｇ／ｍｌのリゾレシチンを含む５００μｌの冷たい溶液Ａに再懸濁し、４℃で１分間インキュベートした。リボヌクレオシド二リン酸の還元およびＤＮＡ合成の活性を測定するために、浸透性を付与した１×１０６個の細胞を、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、８ｍＭのジチオスレイトール、０．０
６ｍＭのＦｅＣｌ３、７．５ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．４、０．７５ｍＭのＣａＣｌ２、１０ｍＭのホスホエノールピルビン酸、０．２ｍＭの３Ｈ‐ｒＣＤＰ、０．２ｍＭのｒＧＤＰ、０．２ｍＭのｒＡＤＰ、０．２ｍＭのｄＴＤＰの３００μｌ中において、３７℃で１０分間インキュベートした。インキュベーションの後、１５０μｌの該懸濁混合物を取り分けて２つのサンプルとし、３０μｌの６０％過塩素酸／０．１％ピロリン酸ナトリウムと混合させた。氷上で１５分間インキュベートした後、１ｍｌのｄｄＨ２Ｏを加えて混合物を希釈し、次いでそれを遠心分離して全ての酸不溶物質を沈殿させた。ペレットを０．１ｍｌの０．２ＮのＮａＯＨを用いて抽出し、３７℃で３０分間インキュベートした。７５μｌの分割試料（アリコート）を５ｍｌのＥｃｏｓｃｉｎｔ  Ａに懸濁させ、ベックマンＬＳ５０００ＣＥ液体シンチレーションカウンターを使用して、放射活性を測定した。
【００８６】
（８）ｄＮＴＰの単離
ＨＵおよび／またはＧｅｍを用いて所定の時点で処理した後、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄し、生細胞数をトリパンブルー色素排除によって計数した。細胞を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、短時間の遠心分離によってペレット状にした。細胞のペレットを１００μｌの１５％のトリクロロ酢酸と混合し、氷上に１０分間置いた。次いでそれを５分間遠心分離にかけて、上清を回収した。フレオン（登録商標）／トリオクチルアミン（５５％：４５％）の２つの５０μｌずつの分割試料を用いて、ｄＮＴＰを抽出した。それぞれ遠心分離した後、上清を確保した。それぞれのサンプルの５μｌ分割試料を使用して、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ濃度を調べた。それぞれの測定は、二連で行った（ツォー（Zhou）ら、１９９８年、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏ  第５５巻、ｐ．１６５７〜１６６５）。
【００８７】
（９）ｄＮＴＰの蓄積アッセイ
未知のｄＮＴＰの蓄積によって生じたＤＮＡ合成の量を測定するこのアッセイを、シェルマン（Sherman ）およびフィフェ（Fyfe）の方法に従って記述（ツォー（Zhou）ら、１９９８年、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏ  第５５巻、ｐ．１６５７〜１６６５；ならびにシェルマンおよびフィフェ、１９８９年、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  第１８０巻、ｐ．２２２〜２２６）のように実施した。反応混合物は、５０ｍＭのＴｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＤＴＴ、０．２５μＭの鋳型／プライマー、１．２５μＭの３Ｈ‐ｄＡＴＰ（ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰアッセイ用）、または３Ｈ‐ｄＴＴＰ（ｄＡＴＰアッセイ用）、および０．２単位のＳｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）（２．０）を、合計体積５０μｌ中に含んでいた。ＤＮＡ合成を２０分間室温で進行させてから反応を停止させ、４０μｌの反応混合物をワットマン（Whatman ）ＤＥ８１イオン交換紙（直径２．４ｃｍ）にスポットした。この紙を乾燥させ、５％Ｎａ２ＨＰＯ４で洗浄し（３×１０分間）、蒸留水で１回、および９５％エタノールで１回すすいだ。サンプルを液体シンチレーションカウンターで計数し、０．２５、０．５、および１．０ｐｍｏｌ／μｌのそれぞれのｄＮＴＰの存在下で調製した標準サンプルと比較した。
【００８８】
（１０）細胞周期の分析
細胞周期の分析を、米国シティ・オブ・ホープ国立医療センター（City of Hope National Medical Center）のフローサイトメトリー用の主要設備において行った。細胞周期の各期の細胞の割合を、ＭｏｄＦｉｔ（商標）ソフトウェアによって分析した。プロトコルの概要を以下に記す。細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで２回洗浄し、１ｍｌのＰＢＳに再懸濁させた。７ｍｌの０．５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ２．３５）を加え、サンプルは一晩室温で暗所に保存した。２日目に、細胞を４℃の暗所環境に置いた。３日目に、細胞を遠心して集め、クエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）に再懸濁させ、細胞濃度１×１０６個／ｍｌに調整した。翌日、細胞を遠心して集め、１ｍｌのＢＳＡ‐Ｈ（０．１％のＢＳＡを含
むＰＢＳ緩衝液）に再懸濁させた。１５０μｇのＲＮａｓｅ  Ａ（ＤＮａｓｅ含まず）を該溶液に加え、細胞を３７℃で３０分間インキュベートした。細胞をＢＳＡ‐Ｈで１回洗浄し、ペレットを１ｍｌの１００μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム（ＰＩ）に再懸濁させ、一晩室温で暗所に保存した。翌日、細胞をフローサイトメトリーによって分析した（ガオ（Gao ）ら、１９９８年、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏ  第５６巻、ｐ．１０５〜１１２）。
【００８９】
（結果）
（１）ＨＵおよびＧｅｍによる様々な処理時間および処理順序のＫＢ細胞に及ぼす影響
ＨＵおよび／またはＧｅｍで処理したＫＢ細胞のコロニー形成能力を、ＫＢ細胞のＩＤ５０濃度を使用してアッセイした。ＫＢ細胞を０．１ｍＭのＨＵに曝した。０．３μＭのＧｅｍをＨＵ処理の２〜２４時間後に加え、次いで細胞をそれらのコロニー形成能力に関してアッセイした。細胞をＨＵまたはＧｅｍのみで処理すると、コロニー形成は未処理の対照群の約５０％に低下した。ＨＵおよびＧｅｍを一緒に、あるいは２時間離して加えると、コロニー形成能力はＨＵまたはＧｅｍ単独の場合と同等であった。ＧｅｍをＨＵ処理の開始後４時間で増殖培地に加えると、著しく高い阻害が観察された。ＨＵに曝した８時間後にＧｅｍを加えると、コロニー形成能力は最下点に達した。これらの条件下では、未処理細胞と比較して、コロニー形成は８６％低下した。コロニー形成能力の阻害は、処理を１２〜２４時間隔てると徐々に弱まったが、いずれかの薬剤のみの場合よりもいくらかの増強を示し続けた。
【００９０】
（２）放射標識されたＧｅｍおよびＣＤＰのＤＮＡへの取り込みに対するＨＵの影響
ＨＵで処理したＫＢ細胞のＤＮＡへの３Ｈ標識Ｇｅｍの取り込みを測定した。ＨＵ処理の４時間後にＫＢ細胞にＧｅｍを加えると、ＧｅｍおよびＨＵを同時に加えたときの３倍を超える３Ｈ標識ＧｅｍがＤＮＡ中に取り込まれた。Ｇｅｍを加える前にＨＵで８時間処理することによって、取り込み速度が対照より６倍高くなった。処理間の隔たりが１２、１６、および２４時間に増大するにつれ、ＤＮＡ中に取り込まれる３Ｈ標識Ｇｅｍの量は、Ｇｅｍのみの場合に見られたレベルよりわずかに高いだけのレベルに戻った。様々な組合せの処理後にＤＮＡに取り込まれた３Ｈ標識Ｇｅｍの量は、コロニー形成能力の阻害と密接に対応しており、ＧｅｍのＤＮＡへの取り込みの増大が、コロニー形成細胞数の低下によって測定される細胞毒性の増大と直接関係があることが示唆される。３Ｈ標識ＣＤＰの取り込みは対照として測定したが、アッセイしたいずれの処理スケジュールについても有意な変動はみられなかった。
【００９１】
（３）ＫＢ細胞中のヒト・リボヌクレオチド還元酵素Ｍ２サブユニットに関するノーザンブロットおよびウエスタンブロット
ｈＲＲＭ２の発現はＲＲ活性と関係があり、ＨＵの標的となるので、ＨＵに曝すことによって、ｈＲＲＭ２のｍＲＮＡの発現の変化がもたらされる可能性があると仮定した。ノーザンブロット分析を使用して、様々な時点でＨＵに曝した後のｈＲＲＭ２  ｍＲＮＡのレベルを測定した。対数増殖期のＫＢ細胞を０．１ｍＭのＨＵに曝し、０、２、４、８、１２、１６および２４時間後にハーベストした。細胞の全ＲＮＡを抽出し、ノーザンブロットによって分析した（１レーン当たり２０μｇ）。完全長ｈＲＲＭ２サブユニットのｃＤＮＡ配列からなるＰＣＲ産物をプローブとして使用した。検出したＲＮＡの量をｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（商標）によって測定し、結果を同じブロット上で検出したＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの量に対して正規化した。ｈＲＲＭ２のｍＲＮＡの量は、２時間後に未処理サンプルと比べて２０％低下し、次いで４時間の時点で対照レベルの６０％に低下した。ＨＵに曝した後８時間以降は、ｈＲＲＭ２  ｍＲＮＡの回収量は８〜１２時間で回復し、１６時間では低下し、次いで２４時間まで同じレベルに留まった。この現象をさらに確かめるために、ｈＲＲＭ２発現のウエスタンブロット分析を行った。ｈＲＲＭ２タンパク質の発現パターンは、４時間の時点で低下しその後発現が高まることを示すノーザンブ
ロットと類似していた。
【００９２】
（４）ＲＲ活性のアッセイ
ｉｎ  ｖｉｖｏでのＲＲ活性のアッセイを、上述と同じ時点において実施した。ＲＲ活性はＨＵに曝した４時間後に対照の６０％に低下したが、８時間の地点で対照のレベルまで回復し、１６時間ではわずかに増大し、次いで２４時間では同じレベルに留まっていた。これらの結果は、ｈＲＲＭ２のｍＲＮＡおよびタンパク質の発現について観察されたレベルと一致する。
【００９３】
（５）細胞内のｄＮＴＰ蓄積の分析
ＫＢ細胞内のｄＮＴＰの蓄積に対するＨＵの影響を評価するために、それぞれのｄＮＴＰの蓄積を、「材料および方法」に記載したようにして測定した。ｄＡＴＰおよびｄＣＴＰは、４つのｄＮＴＰ蓄積の中でＨＵによる阻害を最も受けやすかった。これらの細胞内蓄積の低下は、ＨＵに曝した１時間後に始まった。この低下は続き、ｄＣＴＰの蓄積は４時間で対照の約１５％という最下点に達した。ｄＡＴＰの蓄積は、８時間後に最下点に達した。ＨＵ曝露後８〜２４時間の第２段階では、ｄＡＴＰおよびｄＣＴＰの蓄積は、出発時のレベルの約８０％まで徐々に回復した。しかしながら、ｄＴＴＰおよびｄＧＴＰの蓄積は時間を経ても著しく変動することはなかった。ｄＣＴＰおよびｄＡＴＰの蓄積の低下と回復は、コロニー形成実験の結果と対応していた。ＨＵ曝露後２〜４時間に観察されたｈＲＲＭ２のｍＲＮＡおよびタンパク質の初期の低下は、４時間後に見られたｄＣＴＰおよびｄＡＴＰの蓄積の急速な低下の原因であると思われ、一方その後のｈＲＲＭ２のｍＲＮＡおよびタンパク質の過剰発現により必要とされる活性が供給されて、ｄＣＴＰおよびｄＡＴＰのレベルを徐々に回復させることが可能であると思われる。
【００９４】
（６）細胞周期の分析
ＨＵとＧｅｍの間の時間および順序依存性の相互作用についてさらに調べるために、ＨＵの細胞周期に対する影響を検討した。Ｓ期の細胞の割合は、ＨＵ曝露後４〜８時間でほぼ２倍になり、一方Ｇ２／Ｍ期の細胞の割合は低下し、Ｇ１期の細胞の割合は安定状態が続いた。処理の８時間後に、Ｓ期の細胞の分画は、未処理細胞と比べて著しく増大したままの状態であった。Ｇｅｍの機能にはＤＮＡ合成が必要なので、ＨＵ曝露後４〜８時間にＳ期の細胞の割合が増大することがＧｅｍの機能を高める可能性がある。
【実施例４】
【００９５】
（ゲムシタビンと組み合わせたヒドロキシ尿素の時間および順序依存性についての第１相薬物動力学的試験：カリフォルニア癌協会（CALIFORNIA CANCER CONSORTIUM) による治験）
（患者および方法）
（１）患者の選択
１９９８年２月から１９９９年１０月の間に、２７人の患者がこの臨床第１相試験に参加した。すべての患者が、事前の化学療法では応答がないか、または「標準的な」化学療法が存在しない、組織学的に確認済みの進行した悪性腫瘍を有していた。患者は、カルノフスキーの全身状態（Karnofsky performance status）が６０％以上、年齢１８才以上、予命が少なくとも２カ月、血清クレアチニンが２．０ｍｇ／ｄｌ以下または２４時間のクレアチニン・クリアレンスが５０ｍｌ／分以上との定義により腎機能が適切であり、好中球の絶対数（ＡＮＣ）が１２００／ｄｌより高く血小板数が１００，０００／μｌ以上との定義により骨髄機能が適切であり、ならびに血清ビリルビンが３．０ｍｇ／ｄｌ以下でアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼおよびアラニンアミノトランスフェラーゼが正常な上限値の５倍以内であるとの定義により肝機能が適切でなければならないこととした。事前の放射線照射または化学療法は、このプロトコルによる治療開始の少なくとも４週間前に完了していなければならないとした。事前に受けた化学療法の数には制限なしとし
た。妊娠している女性患者は除外した。すべての患者は、十分な説明を受けて自発的に同意しており、米国シティ・オブ・ホープ国立医療センターの施設内治験審査委員会（Institutional Review Board）によって精査および承認済みの同意書にサインした。この治験は、米国国立がん研究所（National Cancer Institute ）（ＮＣＩ）の癌治療評価プログラム（Cancer Therapy Evaluation Program ）によっても承認された。
【００９６】
（２）事前治療の評価
すべての患者は、体重の記録、カルノフスキーの全身状態、測定可能または評価可能な疾患の存在の評価、基本的な臨床血液検査、胸部Ｘ線撮影、心電図、尿分析、徴候がある場合は妊娠検査、ならびに測定可能または評価可能な疾患を記録するための、コンピュータによる胸部、腹部、および必要に応じて骨盤の断層スキャンを含めた、完全な病歴および身体検査を受けた。測定可能な疾患を有する患者は、測定可能な疾患を分析するために、治療２サイクル後に再度Ｘ線撮影を受けるものとした。
【００９７】
（３）治療計画
各サイクルの第１日および第８日に、ヒドロキシ尿素５００ｍｇを６時間毎に４回経口投与した。ゲムシタビンを、４回目のヒドロキシ尿素投与の６時間後（すなわち第２日および第９日）に、３０分間の注入として投与した。患者は、化学療法を受けるために第８日目に血小板数が７５，０００／μｌ以上、かつＡＮＣが１，０００／ｄｌ以上であることを要件とした。患者は、外来患者として化学療法を受けた。顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ‐ＣＳＦ）を、第１サイクルを含めたすべての療法サイクルの１０日目の最初に投与した。Ｇ‐ＣＳＦはヒドロキシ尿素／ゲムシタビン投与の終了２４時間後に、１日１回の皮下注射として１日当たり５μｇ／ｋｇの用量で開始し、少なくとも７日間かつ白血球数が１０，０００／μｌを超えるまで続けた。
【００９８】
（４）用量制限毒性および最大耐用量の定義
血液学的な用量制限毒性（ＤＬＴ）は、第８日における血小板数が７５，０００／μｌ未満または２５，０００／μｌ未満の血小板数が７日以上続くこと、第８日におけるＡＮＣが１，０００／μｌ未満または５００／μｌ未満のＡＮＣが７日以上続くことと定義した。肝臓のＤＬＴは、ビリルビン４．５〜６．０ｍｇ／ｄｌまたはトランスアミナーゼが正常の８．０〜２０．０倍（グレード３）、および６．０ｍｇ／ｄｌを超えるビリルビンまたはトランスアミナーゼが正常の２０．０倍を超えること（グレード４）として定義した。他の毒性は、ＮＣｌの一般毒性基準第１版（Common Toxicity Criteria Version 1.0）に従って等級付けした。用量の増加および最大耐用量（ＭＴＤ）の決定は、第１のサイクルで生じたＤＬＴに基づいて実施した。ＭＴＤは、少なくとも６人の患者をその用量で治療し、彼らが毒性に関して評価可能であったときに、患者０人または１人だけがＤＬＴを経験した、試験した中の最高用量として定義した。許容不可能な毒性により治療の中断を必要とするか、患者が中断を求めるか、または疾患が進行することがないかぎりは、患者は追加の治療サイクルを受けた。
【００９９】
（５）薬物動態学的方法
血漿中ゲムシタビンを測定するための血液サンプルを、第１サイクルの第２日および第９日に採取した。サンプルは以下の時間：ゲムシタビンの前、３０分間注入の終了直前、および注入終了の５、１０、１５、３０、および４５分後、に採取した。血液サンプルはヘパリン処理したチューブに採取し、遠心分離（３０分以内）による血漿の分離が可能になるまで氷上に置いた。血漿を、シチジンデアミナーゼを阻害するためのテトラヒドロウリジンの入ったポリプロピレンチューブに移し、分析まで−７０℃に保存した。
【０１００】
血漿中のゲムシタビンを、米国シティ・オブ・ホープの分析薬理学中央施設（City of Hope Analytical Pharmacology Core Facility）において開発および検証された新規な逆
相ＨＰＬＣアッセイによって測定した。内部標準（ＩＳ）である２’３’‐ジデオキシシチジン（米国ミズーリ州セントルイス所在のシグマケミカルカンパニー（Sigma Chemical
Company）を加えた後に、１ｍｌの芳香族スルホン酸カートリッジ（米国ニュージャージー州フィリップスバーグ所在のジェイティーベイカー（JT Baker））を使用する固相抽出によって、血漿からゲムシタビンを抽出した。ゲムシタビンとＩＳの分離は、２５×４．６ｍｍのＣ１８カラム（米国カリフォルニア州フラートン所在のベックマンインスツルメンツ（Beckman Instruments ））で、５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０に含めた２〜２０×メタノールからなる移動相を用いる流速１ｍｌ／分のグラジエント溶出によって実施した。２７５ｎｍでのＵＶ吸光度によって検出を行った。２００〜１０，０００ｎｇ／ｍｌの範囲のゲムシタビンについて標準曲線は直線状であった。標準曲線の範囲全体にわたる日間および日内の変動係数は１０％未満であり、その精度は±７％であった。アッセイの定量の下限は、５ｎｇ／ｍｌであった。
【０１０１】
血漿ゲムシタビンのデータは、ＡＤＡＰＴ  ＩＩソフトウェア（米国カリフォルニア州ロサンゼルス所在のユーエスシーバイオメディカルシミュレーションズリソース（USC Biomedical Simulations Resource ））を使用するコンパートメント法によって分析した。一次減衰（first-order elimination ）を伴う２コンパートメントモデルにデータをフィッティングした。二次的な薬物動態パラメータ（ＣＬｓｙｓ、Ｖ、およびｔ１／２）を決定し、患者内および患者間で比較した。
【０１０２】
（６）統計学的方法
この試験を標準的な臨床第１相試験として指定し、組み合わせて投与したヒドロキシ尿素とゲムシタビンの、ＭＴＤおよびＤＬＴを確定させた。投与の概要は、治療の項で概説する。第２日および第９日に測定した二次的な薬物動態パラメータは、対応のある両側ｔ検定を使用して比較した。
【０１０３】
（結果）
（１）患者の特性
この試験に登録したのは、２７人の患者（女性１２人、男性１５人）であり、８０サイクルの治療を行った（表２）。平均年齢（median age）は５５．４才であり（２７〜７６才の範囲）、カルノフスキーの全身状態の平均は８０％（６０〜１００％の範囲）であった。主な腫瘍の種類は：結腸または直腸の腺癌（４人）、膵臓癌（４人）、非小細胞肺癌（３人）、ならびに頭部および頚部癌（扁桃および咽頭）（３人）が含まれていた。５人の患者は事前に化学療法を受けておらず、他の患者は１〜５回の事前の化学療法を受けていた；１１人の患者（４１％）は事前に放射線照射を受けていた。患者の特性を表２にまとめる。
【０１０４】
【表２】
2005521418.tif 000009
（２）患者の評価可能性
２７人の患者の中で、２４人が応答に関して評価可能であり、２３人が毒性およびＭＴＤの決定に関して評価可能であった。第２日および第９日のゲムシタビン２５０ｍｇ／ｍ２用量について、ＤＬＴのために１人の患者のサイクル１が継続できなくなった。結果として、その患者では治療のサイクルが終了せず、応答に関して評価不能であった。ゲムシタビン７５０ｍｇ／ｍ２用量については、１人の患者が胸膜滲出のために完全なサイクルを受けられないため元の治療に戻され、毒性および応答のいずれに関しても評価不能となった。この用量の別の患者は、グレード３の発疹のためにサイクル１の第８日および第９日の治療を受けなかったが、第２サイクルは完了した。この患者は毒性の評価では元の治療に戻されたが、応答の評価に含められた。８７５ｍｇ／ｍ２用量では、１人の患者が尿管感染のためにサイクル１の第８日および第９日に治療を受けなかったが、最終的には５つのサイクルを完了した。この患者も毒性の評価では元の治療に戻されたが、応答の評価には含められた。同様に、１，０００ｍｇ／ｍ２用量で、１人の患者が尿管感染のためにサイクル１の第８日および第９日の治療を受けなかったが、第２サイクルは完了した。この患者も応答の評価に含められたが、毒性の評価には含まれなかった。同じ用量の１人の患者は１つのサイクルを完了し、毒性の評価に関して評価可能であったが、応答の評価に関して測定可能な疾患は有していなかった。残りの患者は、毒性と応答の両方に関して評価可能であった。
【０１０５】
（３）治療法の毒性
第１サイクルについて治療を受けた患者数および毒性を表３にまとめる。全体的に、骨髄抑制がＤＬＴであった。ＤＬＴ（グレード４の好中球減少症）が１，０００ｍｇ／ｍ２のゲムシタビン用量において２人の患者で観察された後、８７５ｍｇ／ｍ２の用量レベルを試験した。８７５ｍｇ／ｍ２では、グレード３の好中球減少症が第８日に１人の患者で発症し、グレード４の好中球減少症が他の患者で発症した。したがって、薬剤のこの組合
せにおけるゲムシタビンのＭＴＤは、第２日および第９日では７５０ｍｇ／ｍ２であると推定された。ＭＴＤ用量で治療した８人の患者の詳細な毒性プロファイルを表４に示す。
【０１０６】
【表３】
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【０１０７】
【表４】
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この治療群における１つのＤＬＴは、患者７のグレード４の好中球減少症であった。胸膜滲出、腹水、および肝臓結節を有する患者５（原発部位は胆嚢）において、胃腸の毒性が該薬剤に起因する可能性は低い。
【０１０８】
（４）治療への応答
この試験では、２４人の患者が応答（用量レベルにより表３に要約）に関して評価可能であった。原発部位不明（後腹膜腫瘍およびアデノパシー）の１人の患者は、２１カ月の間に部分的な応答があった。この患者は、７５０ｍｇ／ｍ２ゲムシタビンの治療を受けた。他の１２人の患者（５０％）の疾患は安定しており、３人は頭部および頚部癌、２人は肺癌、２人は膵臓癌、１人は前立腺癌、３人は結腸癌、１人は乳癌であった。疾患が安定
していた患者４人を８７５ｍｇ／ｍ２、３人を７５０ｍｇ／ｍ２、３人を２５０ｍｇ／ｍ２、および１人ずつを１，０００ｍｇ／ｍ２および５００ｍｇ／ｍ２のゲムシタビンで治療した。疾患が安定していた１２人の患者の中で、４人は１５カ月を越えて生存し、３人は最終評価時、最初の治療の日付から３３カ月、７カ月および５カ月の時点で生存していた。残りの１１人の患者では、２カ月以内に進行性疾患が進行した。
【０１０９】
（５）ゲムシタビンの薬物動態
第２日のゲムシタビンの薬物動態を１７人の患者について試験し、その１７人の患者のうち１４人の第２日および第９日についてのデータは評価可能であった。血漿ゲムシタビンのデータは、一次減衰を伴う２コンパートメントモデルによって最も良く記述された。第２日に測定した、ゲムシタビンの二次的な薬物動態パラメータを表５にまとめる。
【０１１０】
【表５】
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この治験において評価したＣＬｓｙｓ、Ｖｃおよびｔ１／２の平均値は、単剤のゲムシタビン、および他の抗癌剤と組み合わせて使用したゲムシタビンのいずれに関しても、以前に発表されたデータ（ベノック（Venook）ら、２０００年、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  第１８巻、ｐ．２７８０〜２７８７；ペレツ‐マンガ（Perez ‐Manga ）ら、２０００年、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  第１８巻、ｐ．２５４５〜２５５２；およびブハルガバ（Ｂｈａｒｇａｖａ）ら、２００１年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  第４８巻、ｐ．９５〜１０３）と良く一致する。ここで使用した用量の範囲内では、投与したゲムシタビン用量のＣＬｓｙｓに対する明らかな影響はなかった。さらに、ゲムシタビンのＣＬｓｙｓは、１つの用量レベル内で約６倍変化した。
【０１１１】
表６には、第２日および第９日の両日に患者について測定した二次的なパラメータをまとめる。
【０１１２】
【表６】
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第２日および第９日に測定したゲムシタビンの薬物動態パラメータには、有意な差異は見られなかった。しかしながら、第９日の薬物動態パラメータは、第２日の結果から予測することは不可能であり、患者間に著しい差のあることが浮き彫りとなった。
【０１１３】
（他の実施形態）
本願明細書中に開示するすべての特徴を組み合わせにより任意の組合せとすることが可能である。本願明細書中に開示するそれぞれの特徴は、同一、均等、あるいは類似の目的を果たす他の特徴で置き換えることが可能である。したがって、特に明記しない限り、開示するそれぞれの特徴は、一般的な一連の均等または類似の特徴の単なる１例にすぎない。
【０１１４】
以上の記載から、当業者であれば本発明の不可欠な特性を容易に確かめることが可能であり、かつ本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な用途および条件に適合させるべく本発明の様々な変更形態および変形形態を作製することが可能である。したがって、他の実施形態も添付の特許請求の範囲の範囲内にある。
【配列表】
2005521418000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成16年12月1日(2004.12.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
（ヒト・リボヌクレオチド還元酵素Ｍ２サブユニット遺伝子の特徴付け；ゲノム構造およびプロモーターの分析）
（材料および方法）
（１）ヒトＲＲＭ２ゲノムＤＮＡのクローニングおよび配列決定
ヒト胎盤ゲノムライブラリー（ヒューマンゲノムシステムズ（Human Genome Systems））を、ｈＲＲＭ２構造遺伝子に特異的な１対のプライマー：
ｈＲＲＭ２０４：５’ＡＴＴＴＡＧＡＡＧＴＣＡＧＣＡＴＣＣＡＡＧ３’（配列番号：６）、および
ｈＲＲＭ２０８：５’ＴＡＣＡＣＡＡＡＣＣＡＴＣＧＧＡＧＧＡＧＡＧＡＧ３’（配列番号：７）
を使用してスクリーニングした。３つの陽性クローン（クローン１３９９９、１４０００、および１４００１）を選択した後、制限酵素ＳａｃＩを使用して、選択したクローンから単離したＤＮＡを消化した。次いでサザンブロット分析を行った。６．２ｋｂおよび５．１ｋｂのバンドを同定し、ＰＣＮＴＲベクター（５’（登録商標）３’ゲノムシステムズ（Genome Systems））にサブクローニングした。これらのクローンを、それぞれＰ６．２およびＰ５．１と名づけた。両クローンについて配列決定を行い、完全長ｈＲＲＭ２ゲノムＤＮＡのゲノム配列地図を作製した。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
（２）５’‐ＲＡＣＥによる転写開始部位の同定
標準的なプロトコルに従い、ヒトＫＢ細胞から全ＲＮＡを単離した。ＲＲＭ２のｍＲＮＡの５’末端に相当するｃＤＮＡクローンを、製造業者のプロトコル（ＢＲＬライフサイエンシズ（Lifesciences））に従い５’‐ＲＡＣＥによって得た。転写開始部位を同定するために使用したプライマーは、ｈＲＲＭ２のｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ｘ５９６１８）（パブロフ（Pavloff ）ら、１９９２年、ＤＮＡ  Ｓｅｑ  第２巻第４号、ｐ．２２７〜２３４）の３５８〜３３８位（ｈＲＲＭ２２５：５’ＧＧＣＴＣＣＴＧＧＡＡＧＡＴＣＣＴＣＣＴ３’、配列番号：８）、および２４２〜２２５位（ｈＲ
ＲＭ２３１：５’ＣＴＧＣＴＧＣＧＧＧＴＣＣＧＴＧＡＴ３’、配列番号：９）に対応するものとした。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
（２）プローブ、プライマー、およびＰＣＲ
ＲＲのヒトＭ２サブユニットのゲノム配列は公開されている（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ０３２７５０）（ツォー（Zhou）ら、２００１年、Ｃｙｔｏｇｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ  第９５巻、ｐ．５２〜５９）。ｈＲＲＭ２のプロモーター領域を増幅するために、公開されているゲノム配列に基づいて以下のＰＣＲプライマー：
ＰＡＣ６２１：５’ＧＡＴＣＧＣＴＴＧＡＴＡＣＣＡＡＣＣＴＧＧＧ３’（配列番号：１０）、
ＰＡＣ６２４：５’ＧＧＣＣＡＣＧＣＣＧＡＣＡＴＧＡＣＴＣＡ３’（配列番号：１１）、
ＰＡＣ６２１０：５’ＴＣＣＣＴＧＧＧＡＧＡＴＧＧＡＴＧＣ３’（配列番号：１２）、
ＰＡＣ６２１１：５’ＡＡＧＣＣＴＧＧＡＡＡＡＣＧＣＴＣＣ３’（配列番号：１３）、
ＰＡＣ６２２８：５’ＴＣＣＣＧＴＡＧＴＴＴＧＡＡＧＧＴＴＴＡＣＡＡ３’（配列番号：１４）、および
ＨＲＭ２２８：５’ＡＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＣＴＴＴＡＡＡＴＣＴＣ３’（配列番号：１５）
を設計した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
ｂ．ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成した二本鎖ＤＮＡ断片のＤＮＡ配列
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成した二本鎖ＤＮＡ断片のＤＮＡ配列は、以下：
ＳＰ１：５’ＡＴＴＣＧＡＴＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＣ３’（配列番号：１６）、
ＡＰ‐１（ｃ‐ｊｕｎ）：５’ＣＧＣＴＴＧＡＴＧＡＧＴＣＡＧＣＣＧＧＡＡ３’（配列番号：１７）、
ＡＰ‐２：５’ＧＡＴＣＧＡＡＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＧＣＧＧＣＣＣＧＴ３’（配列番号：１８）、
ＮＦ‐ｋＢ：５’ＡＧＴＴＧＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＡＧＧ３’（配列番号：１９）、
ＯＣＴ１：５’ＴＧＴＣＧＡＡＴＧＣＡＡＡＴＣＡＣＴＡＧＡＡ３’（配列番号：２０）、および
ＣＲＥＢ：５’ＡＧＡＧＡＴＴＧＣＣＴＧＡＣＧＴＣＡＧＡＧＡＧＣＴＡＧ３’（配列番号：２１）
の通りである。


【国際調査報告】
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