(57)【要約】本明細書において、新規ポリペプチドをコード化する核酸配列を開示する。本明細書においてまた、これらの核酸配列によりコード化されるポリペプチドおよびポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体、ならびに誘導体、変異体、突然変異体、または新規ポリペプチドのフラグメント、ポリヌクレオチド、またはポリペプチドに特異的な抗体を開示する。ベクター、宿主細胞、抗体およびポリペプチドおよびポリヌクレオチドを生成する方法、ならびに用いる方法もまた含まれる。本発明は、治療方法、診断方法、およびこれらのヒト核酸およびタンパク質のいずれかと関与する疾患の診断、処置、および予防方法をさらに開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２ｎ（ここでｎは１〜１０７の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列の成熟型を含む単離ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号：２ｎ（ここでｎは１〜１０７の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
【請求項３】
配列番号：２ｎ（ここでｎは１〜１０７の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
【請求項４】
ポリペプチドが配列番号：２ｎ（ここでｎは１〜１０７の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列中に１またはそれ以上の保存的置換を含むアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチド。
【請求項５】
該ポリペプチドが天然に存在する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
請求項１に記載のポリペプチドおよび担体を含む組成物。
【請求項７】
１またそれ以上の容器内に請求項６に記載の組成物を含むキット。
【請求項８】
ヒト疾病と関連する症候群を処置するための薬物の製造における療法剤の使用であって、疾病が請求項１に記載のポリペプチドと関連する病態から選択され、療法剤が請求項１に記載のポリペプチドを含むものである使用。
【請求項９】
試料中の請求項１に記載のポリペプチドの存在または量を測定する方法であって、
（ａ）該試料を用意すること；
（ｂ）該試料をポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体に導入すること；および
（ｃ）該ポリペプチドに結合する抗体の存在または量を測定すること、
これにより、該試料中のポリペプチドの存在または量を測定すること
を含む方法。
【請求項１０】
第１の哺乳類対象中の請求項１に記載のポリペプチドの発現の変化したレベルと関連する疾病の存在または素因を測定する方法であって、
ａ）第１の哺乳類対象由来の試料中のポリペプチドの発現のレベルを測定すること；および
ｂ）ステップ（ａ）の試料中の該ポリペプチドの発現を、該疾病を有さないかまたは素因を有さないことが知られている第２の哺乳類対象由来の対照試料に存在するポリペプチドの発現と比較すること、
ここで、対照試料と比較して第１の対象中のポリペプチドの発現のレベルの変化は、該疾病の存在または素因を示す、
を含む方法。
【請求項１１】
請求項１に記載のポリペプチドに結合する物質を同定する方法であって、
（ａ）該ポリペプチドを該物質に導入すること；および
（ｂ）該物質が該ポリペプチドに結合するか否かを測定すること、
を含む方法。
【請求項１２】
物質が細胞受容体または下流のエフェクターである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
病態の処置において使用するための潜在的治療物質を同定する方法であって、病態が請求項１に記載のポリペプチドの異常発現または異常生理的相互作用と関連し、
（ａ）請求項１に記載のポリペプチドを発現しかつポリペプチドに帰する性質または機能を有する細胞を用意すること；
（ｂ）細胞を候補物質を含む組成物と接触させること；および
（ｃ）物資がポリペプチドに帰する性質または機能を変化させるか否かを測定すること；
これにより、物質の存在下で観察される変化が、細胞を物質の非存在下で組成物と接触されるときに観察されなければ、物質が潜在的治療物質として同定される、
を含む方法。
【請求項１４】
請求項１に記載のポリペプチドと関連する病態の活性または潜在活性のモジュレーター、または素因をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験化合物を請求項１に記載のポリペプチドと関連する病態に対して増加したリスクのある被検動物に投与すること、ここで該被検動物は請求項１に記載のポリペプチドを組換え的に発現する；
（ｂ）該被検動物中の該ポリペプチドの活性をステップ（ａ）の化合物の投与後に測定すること；および
（ｃ）該被検動物中の該ポリペプチドの活性を該ポリペプチドを投与されていない対照動物中の該ポリペプチドの活性と比較すること、ここで該対照動物と比べて該被検動物中のポリペプチドの活性の変化は、試験化合物が請求項１に記載のポリペプチドと関連する病態の活性または潜在活性のモジュレーター、または素因であることを示す、
を含む方法。
【請求項１５】
該被検動物が、試験タンパク質導入遺伝子を発現するかまたはプロモーターの制御下で、野生型被検動物と比べて増加したレベルで該導入遺伝子を発現する組換え被検動物である（ここで該プロモーターは該導入遺伝子の天然の遺伝子プロモーターではない）、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１に記載のポリペプチドの活性を調節する方法であって、請求項１に記載のポリペプチドを発現する細胞試料を該ポリペプチドに結合する化合物と、ポリペプチドの活性を調節するのに十分な量で接触させることを含む方法。
【請求項１７】
請求項１に記載のポリペプチドと関連する病態を処置または予防する方法であって、請求項１に記載のポリペプチドを、かかる処置または予防が望まれる対象に対象中の病態を処置または予防するのに十分な量で投与することを含む方法。
【請求項１８】
対象がヒトである請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
哺乳類の病状を処置する方法であって、哺乳類に病状を改善するのに十分な量でポリペプチドを投与すること、ポリペプチドは、配列番号：２ｎ（ここでｎは１〜１０７の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なフラグメントを有するポリペプチドである、を含む方法。
【請求項２０】
配列番号：２ｎ（ここでｎは１〜１０７の整数である）からなる群から選択される核酸配列を含む単離核酸分子。
【請求項２１】
核酸分子が天然に存在する、請求項２０に記載の核酸分子。
【請求項２２】
核酸分子が配列番号：２ｎ−１（ここでｎは１〜１０７の整数である）からなる群から選択される核酸配列と１つのヌクレオチドにより異なる、核酸分子。
【請求項２３】
配列番号：２ｎ（ここでｎは１〜１０７の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの成熟型をコード化する単離核酸分子。
【請求項２４】
配列番号：２ｎ−１（ここでｎは１〜１０７の整数である）からなる群から選択される核酸を含む単離核酸分子。
【請求項２５】
該核酸分子が厳密な条件下で、配列番号：２ｎ−１（ここでｎは１〜１０７の整数である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズする、請求項２０に記載の核酸分子。
【請求項２６】
請求項２０に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項２７】
該核酸分子に作用可能に結合するプロモーターをさらに含む、請求項２６に記載のベクター。
【請求項２８】
請求項２６に記載のベクターを含む細胞。
【請求項２９】
請求項１に記載のポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体。
【請求項３０】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項２９に記載の抗体。
【請求項３１】
抗体がヒト化抗体である、請求項２９に記載の抗体。
【請求項３２】
試料中の請求項２０に記載の核酸分子の存在または量を測定する方法であって、
（ａ）該試料を用意すること；
（ｂ）該試料を該核酸分子に結合するプローブに導入すること；および
（ｃ）該核酸分子に結合する該プローブの存在または量を測定すること、
これにより、該試料中の核酸分子の存在または量を測定すること、
を含む方法。
【請求項３３】
核酸分子の存在または量が、細胞タイプまたは組織タイプのマーカーとして用いられる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
細胞タイプまたは組織タイプが癌性である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
第１の哺乳類対象中の請求項２０に記載の核酸分子の発現の変化レベルと関連する疾病の存在または素因を測定する方法であって、
ａ）第１の哺乳類対象由来の試料中の核酸の発現レベルを測定すること；および
ｂ）ステップ（ａ）の試料中の該核酸の発現レベルを、疾病を有さないかまたは素因を有さないことが知られている第２の哺乳類対象由来の対照試料に存在する核酸の発現レベルと比較すること；
ここで、対照試料と比較して第１の対象中の核酸の発現レベルの変化は疾病の存在または素因を示す、
を含む方法。
【請求項３６】
方法がポリペプチドの発現を導く条件下で細胞を培養することを含み、該細胞が配列番号：２ｎ−１（ここでｎは１〜１０７の整数である）からなる群から選択される核酸配列を含む単離核酸分子を含むベクターを含む、請求項１に記載のポリペプチドを産生する方法。
【請求項３７】
細胞が細菌細胞である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
細胞が昆虫細胞である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
細胞が酵母細胞である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
細胞が哺乳類細胞である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
方法がポリペプチドの発現を導く条件下で細胞を培養することを含み、該細胞が配列番号：２ｎ−１（ここでｎは１〜１０７の整数である）からなる群から選択される核酸配列を含む単離核酸分子を含むベクターを含む、請求項２に記載のポリペプチドを産生する方法。
【請求項４２】
細胞が細菌細胞である、請求項４１に記載のほ方法。
【請求項４３】
細胞が昆虫細胞である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
細胞が酵母細胞である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
細胞が哺乳類細胞である、請求項４１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、新規ポリペプチド、および細胞、組織、器官または生物の生化学的または生理学的応答の刺激に関する特性を有する、それらをコード化する核酸に関する。より具体的には、新規ポリペプチドは、新規遺伝子の遺伝子産物であり、またはその特異的生物学的活性フラグメントまたは誘導体である。使用の方法は、診断および予後アッセイ手法並びに広範な病理学的状態を処置する方法を包含する。
【０００２】
（本発明の背景技術）
真核細胞は、通常の条件下では細胞の維持および増殖を達成するために精妙にバランスを受けている、生化学的および生理学的方法を特色とする。そのような細胞が脊椎動物のような多細胞生物、またはさらに特別には哺乳類のような生物の構成要素であるとき、生化学的および生理学的方法の調節には精緻な情報伝達経路を伴う。しばしば、そのような情報伝達経路は、細胞外の情報伝達タンパク質、情報伝達タンパク質に結合する細胞性受容体、および細胞内に局在する情報伝達構成要素に関与する。
【０００３】
情報伝達タンパク質は、内分泌性エフェクター、パラクリンエフェクターまたはオートクリンエフェクターに分類され得る。内分泌性エフェクターは特定の器官により循環系中に分泌される情報伝達分子であり、これは次いで遠隔の標的器官または標的組織へと輸送される。標的細胞は内分泌性エフェクターの受容体を含み、内分泌性エフェクターが結合すると情報伝達カスケードが誘導される。パラクリンエフェクターには、互いに近傍にある分泌細胞と受容細胞、例えば同じ組織または器官内の２つの異なるクラスの細胞が関与する。あるクラスの細胞がパラクリンエフェクターを分泌し、これが次いで、例えば細胞外液を介する拡散により、第２のクラスの細胞に到達する。第２のクラスの細胞はパラクリンエフェクターに対する受容体を含有しており、エフェクターの結合は情報伝達カスケードを誘導し、これが対応する生化学的または生理学的作用を誘起する。オートクリンエフェクターは、オートクリンエフェクターを分泌する同じタイプの細胞が受容体をも含有していること以外は、パラクリンエフェクターと高度の類似性を有している。かくして、オートクリンエフェクターは、同じ細胞上でまた同じ近接する細胞上で受容体に結合する。次いで、結合過程は特色的な生化学的または生理学的作用をひき起こす。
【０００４】
情報伝達過程は細胞および組織に対し、これらに限定されない例として、細胞または組織の増殖の誘導、成長または増殖の抑制、細胞または組織の分化または成熟の誘導、および細胞または組織の分化または成熟の抑制を含む多様な影響をひき起こし得る。
【０００５】
多くの病理学的状態には、重要なエフェクタータンパク質の発現の調節不全が関与している。特定のクラスの病態においては、調節不全は、タンパク質エフェクターの合成および分泌の縮減または抑制レベルとして現れる。病理の他の種類では、非調節は、タンパク質エフェクターの合成および分泌の増加または上方調節レベルとして明示される。臨床現場において、対象が興味のあるタンパク質エフェクターレベルの増加または過多によりもたらされる異常に罹患していることを疑うことがある。それ故に、そのような対象由来の生物学的試料中の興味のあるタンパク質エフェクターのレベルをアッセイし、そしてそのレベルを非病態的状態に特色的なものと比較する必要がある。また、製造の産物としてタンパク質エフェクターを提供する必要性がある。その必要のある対象にエフェクターを投与することは、病理学的状態の処置に有用である。よって、興味あるタンパク質エフェクターの縮減または抑制レベルによってもたらされる病理学的状態の処置の方法のための必要性がある。加えて、興味のタンパク質エフェクターの増加または上方調節レベルによってもたらされる病理学的状態の処置の方法の必要性がある。
【０００６】
抗体は与えられた抗原に特異的に結合し、かつ同族抗原ではないとみなされる物質にはわずかに結合するか、または全く結合しない複鎖である。抗体は、軽鎖と呼ばれる２つの短鎖および重鎖と呼ばれる２つの長鎖からなる。これらの鎖は、一般に２つのクラスが存在するものから免疫グロブリンドメインドメインを構成する：鎖当たり１つの可変ドメイン、軽鎖の１つの定常ドメイン、および重鎖の３またはそれ以上の定常ドメイン。免疫グロブリン分子の抗原特異的部分は可変ドメインから生じる；１軽鎖および１重鎖の可変ドメインは、互いに関連して抗原結合部位を生成する。同族抗原または標的抗原に免疫特異的に結合する抗体は高親和性で結合する。または、それらは試料中の抗原の存在の特異的アッセイにおいて有用である。加えて、それらは抗原の活性を不活性化する潜在能力を有する。
【０００７】
それゆえ、かかる対象由来の生物学的試料中の該タンパク質エフェクターのレベルをアッセイして、そしてこのレベルを正常状態の特徴と比較する必要がある。特に、抗原に免疫特異的に結合する抗体の使用に基づくかかるアッセイに必要である。異常状態がエフェクターに免疫特異的に結合する抗体の使用に基づくエフェクターの上昇レベルまたは過剰レベルから生じる場合、タンパク質エフェクターの活性を阻害する必要がさらにある。従って、製造産物としての抗体の必要性がある。対象への抗体の投与に基づき該タンパク質エフェクターの上昇レベルまたは過剰レベルによりもたらされる異常状態の処置方法の必要性がある。
【０００８】
(発明の要約)
本発明は、配列番号：２ｎ（ｎは１〜１０７の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列の成熟型から選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドの発見に部分的に基づく。新規核酸およびポリペプチドは、本明細書においては、ＮＯＶＸまたはＮＯＶ１、ＮＯＶ２、ＮＯＶ３等、核酸およびポリペプチドと呼ばれる。これらの核酸およびポリペプチド、ならびにその誘導体、相同体、類似体およびフラグメントは以後総称して「ＮＯＶＸ」核酸またはポリペプチド配列と呼ばれる。
【０００９】
本発明は、配列番号：２ｎ（ｎは１〜１０７の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列の成熟型の変異体に部分的に基づく。ここで成熟型の任意のアミノ酸は、成熟型の配列中のアミノ酸残基の１５％より多くが変更されないという条件で変更されている。別の実施態様において、本発明は配列番号：２ｎ（ｎは１〜１０７の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、本発明はまた、配列番号：２ｎ（ｎは１〜１０７の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列の変異体を含む。ここで選択された配列において特定された任意のアミノ酸は、配列中のアミノ酸残基の１５％より多くが変更されないという条件で異なるアミノ酸に変更されている。本発明はまた、配列番号：２ｎ（ｎは１〜１０７の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列の成熟型の任意のフラグメント、またはこの群から選択される他のアミノ酸配列を含む。本発明はまた、最大１５％の残基が変更されているこれらの群由来のフラグメントを含む。
【００１０】
別の実施態様において、本発明は、配列番号：２ｎ（ｎは１〜１０７の整数である）からなる群から選択される配列の天然に存在する対立遺伝子変異体であるポリペプチドを包含する。これらの対立遺伝子変異体は、配列番号：２ｎ−１（ｎは１〜１０７の整数である）からなる群から選択される核酸配列から単一ヌクレオチドにより異なる核酸配列の翻訳物であるアミノ酸を含む。任意のアミノ酸が選択された配列において変更される変異体ポリペプチドは、保存的置換という条件で変更される。
【００１１】
別の実施態様において、本発明は、配列番号：２ｎ（ｎは１〜１０７の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、および医薬的に許容される担体を含む医薬組成物を含む。別の実施態様において、本発明は、この医薬組成物を１またはそれ以上の容器内に含むキットを含む。
【００１２】
別の実施態様において、本発明は、配列番号：２ｎ（ｎは１〜１０７の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと関連する病態から選択されるヒト疾病、疾患と関連する症状を処置する薬物の製造での治療剤の使用、ここで該治療剤はこの群から選択されるポリペプチドである、を含む。
【００１３】
別の実施態様において、本発明は、試料中に配列番号：２ｎ（ｎは１〜１０７の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの存在または量を測定する方法を含み、方法は、試料を用意すること；試料をポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体に導入すること；およびポリペプチドに結合する抗体の存在または量を測定すること、それにより、試料中のポリペプチドの存在または量を測定することを含む。
【００１４】
別の実施態様において、本発明は、第１の哺乳類対象中の配列番号：２ｎ（ｎは１〜１０７の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの変化レベルと関連する疾病の存在または素因を測定する方法を含み、方法は第１の哺乳類対象由来の試料中のポリペプチドの発現レベルを測定すること；およびこの試料中のポリペプチドの量を、疾病を有さないか、または素因を有さないことが知られている第２の哺乳類対象由来の対照試料に存在するポリペプチドの量と比較すること、ここで対照試料と比較して第１の対象中のポリペプチドの発現レベルの変化は疾病の存在または素因を示す、を含む。
【００１５】
別の実施態様において、本発明は、配列番号：２ｎ（ｎは１〜１０７の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する物質を同定する方法を含み、方法は、ポリペプチドを試薬に導入すること；および物質がポリペプチドに結合するか否かを測定することを含む。試薬は、細胞受容体または下流エフェクターであり得る。
【００１６】
別の実施態様において、本発明は病態の処置における使用の潜在的治療物質を同定する方法を含み、ここで病態は、配列番号：２ｎ（ｎは１〜１０７の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの異常発現または異常生理的相互作用に関係する。方法は、本発明のポリペプチドを発現し、かつポリペプチドに帰する特性または機能を有する細胞を用意すること；細胞を候補物質を含む組成物と接触させること；および物質がポリペプチドの帰する特性または機能を変化させる否かを測定すること；それにより、物質の存在下で観察される変化が、細胞が物質を欠く組成物を接触させるときに観察されなければ、物質は潜在的治療物質として同定される。
【００１７】
別の実施態様において、本発明は、配列番号：２ｎ（ｎは１〜１０７の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと関連する病態の潜在活性または素因のモジュレーターをスクリーニングする方法を含む。方法は、試験化合物を本発明のポリペプチドと関連する病態のリスクの増加した被検動物に投与すること、ここで被検動物は本発明のポリペプチドを組換え的に発現する；試験化合物の投与後に被検動物中のポリペプチドの活性を測定すること；および被検動物中のタンパク質の活性を、ポリペプチドを投与されていない対照動物中のポリペプチドの活性と比較すること、ここで対照動物と比べて被検動物中のポリペプチドの活性の変化は、試験化合物が本発明のポリペプチドと関連する病態の潜在活性または素因のモジュレーターであることを示す。組換え被検動物は、試験タンパク質導入遺伝子を発現するか、またはプロモーターの制御下で野生型被検動物と比べて増加したレベルで導入遺伝子を発現し得る。
【００１８】
別の実施態様において、本発明は、配列番号：２ｎ（ｎは１〜１０７の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの活性を調節する方法を含み、方法は、ポリペプチドを発現する細胞試料を、ポリペプチドの活性を調節するのに十分な量でポリペプチドに結合する化合物と共に導入することを含む。
【００１９】
別の実施態様において、本発明は、配列番号：２ｎ（ｎは１〜１０７の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと関連する病態を処置または予防する方法を含み、方法は、ポリペプチドをかかる処置または予防が望まれる対象に、対象中の病態を処置または予防するのに十分な量で投与することを含む。対象はヒトであり得る。
【００２０】
別の実施態様において、本発明は、哺乳類中の病状を処置する方法を含み、方法は、哺乳類にポリペプチドを、病状を変化させるのに十分量で投与することを含み、ここで、ポリペプチドは配列番号：２ｎ（ｎは１〜１０７の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはそれらの生物学的に活性なフラグメントである。
【００２１】
別の実施態様において、本発明は、配列番号：２ｎ（ｎは１〜１０７の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列の成熟型からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード化する核酸分子を含む単離核酸分子を含む；配列番号：２ｎ（ｎは１〜１０７の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列の成熟型の変異体は変更されている、ここで選択された配列の成熟型の任意のアミノ酸は、成熟型の配列中のアミノ酸残基の１５％より多くが変更されないという条件で異なるアミノ酸に変更されている；配列番号：２ｎ（ｎは１〜１０７の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列の変異体は変更されている、ここで選択された配列中の特定の任意のアミノ酸は、配列中のアミノ酸残基の１５％より多くが変更されないという条件で異なるアミノ酸に変更されている；配列番号：２ｎ（ｎは１〜１０７の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの少なくとも一部をコード化する核酸フラグメント、または選択された配列の任意のアミノ酸が配列中のアミノ酸残基の１０％より多くが変更されないという条件で、変更されるポリペプチドの変異体；および任意の核酸分子の相補体を含む。
【００２２】
別の実施態様において、本発明は、配列番号：２ｎ（ｎは１〜１０７の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード化する核酸配列を有する単離核酸分子を含み、ここで、核酸分子は天然に存在する対立遺伝子核酸変異体のヌクレオチド配列を含む。
【００２３】
別の実施態様において、本発明は、変異体ポリペプチドをコード化する、配列番号：２ｎ（ｎは１〜１０７の整数である）を与えられたアミノ酸配列の成熟型からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード化する核酸配列を含む単離ポリペプチドを含み、変異体ポリペプチドは天然に存在するポリペプチド変異体のポリペプチド配列を有する。
【００２４】
別の実施態様において、本発明は、配列番号：２ｎ（ｎは１〜１０７の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード化する核酸配列を有する単離核酸分子を含み、ここで、核酸分子は、配列番号：２ｎ−１（ｎは１〜１０７の整数である）からなる群から選択される核酸配列と単一ヌクレオチドにより異なる。
【００２５】
別の実施態様において、本発明は、配列番号：２ｎ（ｎは１〜１０７の整数である）を与えられたアミノ酸配列の成熟型からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード化する核酸配列を有する単離核酸分子を含み、ここで、核酸分子は、配列番号：２ｎ−１（ｎは１〜１０７の整数である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む；配列番号：２ｎ−１（ｎは１〜１０７の整数である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列中の１またはそれ以上のヌクレオチドが、選択された配列からなる群から選択されたものから、ヌクレオチドの１５％より多くが変更されないという条件で異なるヌクレオチドに変更されているヌクレオチド配列；配列番号：２ｎ−１（ｎは１〜１０７の整数である）からなる群から選択される配列の核酸フラグメント；および配列番号：２ｎ−１（ｎは１〜１０７の整数である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列中の１またはそれ以上のヌクレオチドが、選択された配列からなる群から選択されたものから、ヌクレオチドの１５％より多くが変更されないという条件で異なるヌクレオチドに変更されている核酸フラグメントが変更される。
【００２６】
別の実施態様において、本発明は、配列番号：２ｎ（ｎは１〜１０７の整数である）を与えられるアミノ酸配列の成熟型からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード化する核酸配列を有する単離核酸分子を含み、ここで、核酸分子は、厳密条件下で配列番号：２ｎ−１（ｎは１〜１０７の整数である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列、またはヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズする。
【００２７】
別の実施態様において、本発明は、配列番号：２ｎ（ｎは１〜１０７の整数である）を与えられたアミノ酸配列の成熟型からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード化する核酸配列を有する単離核酸分子を含み、ここで、核酸分子は、選択された配列のコード配列中の特定された任意のヌクレオチドが、選択された配列からなる群から選択されたものから、選択されたコード配列中のヌクレオチドの１５％より多くが変更されないという条件で変更されるヌクレオチド配列、またはそれらの任意のフラグメントを有する。
【００２８】
別の実施態様において、本発明は、配列番号：２ｎ（ｎは１〜１０７の整数である）を与えられるアミノ酸配列の成熟型からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード化する核酸配列を有する核酸分子を含むベクターを含む。このベクターは、核酸分子に作用可能に結合するプロモーターを有し得る。このベクターは細胞内に位置し得る。
【００２９】
別の実施態様において、本発明は、試料中に配列番号：２ｎ（ｎは１〜１０７の整数である）を与えられるアミノ酸配列の成熟型からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード化する核酸配列を有する核酸分子の存在または量を測定する方法を含み、方法は試料を用意すること；試料を核酸分子に結合するプローブに導入すること；および核酸分子に結合するプローブの存在または量を測定すること、それにより、試料中の核酸分子の存在または量を測定する、を含む。核酸の存在または量は細胞タイプまたは組織タイプのマーカーとして用いられる。細胞タイプは癌性であり得る。
【００３０】
別の実施態様において、本発明は、第１の哺乳類対象中の配列番号：２ｎ（ｎは１〜１０７の整数である）を与えられるアミノ酸配列の成熟型からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード化する核酸配列を有する核酸分子の変化レベルと関連する疾病の存在または素因を測定する方法を含み、方法は第１の哺乳類対象由来の試料中の核酸の量を測定すること；およびステップ（ａ）の試料中の核酸の量を、疾病を有さないまたは素因を有さないことが知られている第２の哺乳類対象由来の対照試料に存在する核酸の量と比較すること；ここで、対照試料と比較して第１の対象中の核酸のレベルの変化は疾病の存在または素因を示す、を含む。
【００３１】
本発明は、ＮＯＶＸポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体をさらに提供する。ＮＯＶＸ抗体は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、または完全にヒト抗体であり得る。好ましくは、抗体は、抗体に対するＮＯＶＸポリペプチドの結合について、１×１０−９未満の解離定数を有する。さらに好ましくは、ＮＯＶＸ抗体はＮＯＶＸポリペプチドの活性を中和する。
【００３２】
さらなる態様において、本発明は、ＮＯＶＸポリペプチドと関連するヒト疾病と関連する症状を処置する薬物の製造での治療剤の使用を提供する。好ましくは、治療剤はＮＯＶＸ抗体である。
【００３３】
なおさらなる態様において、本発明は、ＮＯＶＸ関連疾患を処置または予防する方法、哺乳類の病状を処置する方法、およびポリペプチドと関連する病態を、ＮＯＶＸ抗体を対象に疾患を処置または予防するのに十分な量で投与することにより処置または予防する方法を提供する。
【００３４】
特に定義しない場合、ここに使用する技術および具体的用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味である。本明細書で説明されるものと類似または同等の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、適当な方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許申請、特許、および他の参考文献は全体的な出典明示により本明細書の一部とする。抵触がある場合には本明細書が、定義を含め優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示的なものであって限定することを意図しない。
本発明の他の特性および利点は以下の発明の開示および請求項より明らかであろう。
【００３５】
（発明の開示）
本発明は、新規ヌクレオチドおよびそれによりコードされたポリペプチドを提供する。本発明は、新規核酸配列、それらのコードされたポリペプチド、抗体、および他の関連化合物を含む。本明細書において、配列を「ＮＯＶＸ核酸」または「ＮＯＶＸポリヌクレオチド」と総称し、対応するコードされたポリペプチドを「ＮＯＶＸポリペプチド」または「ＮＯＶＸタンパク質」と称する。別段の記述がない限り、「ＮＯＶＸ」は本明細書に開示される任意の新規配列を指すことを意味する。表１ＡにＮＯＶＸ核酸およびそれらのコードされたポリペプチドの要約を示す。
【００３６】
【表１】
2005528080.tif 000002
【００３７】
表Ａの続き
【表２】
2005528080.tif 000003
【００３８】
表Ａの続き
【表３】
2005528080.tif 000004
【００３９】
表Ａの続き
【表４】
2005528080.tif 000005
【００４０】
表ＡはＮＯＶＸポリペプチドの既知のタンパク質ファミリーとの相同性を示す。従って、表Ａの第１欄で特定されるＮＯＶＸに対応する本発明に従う核酸およりポリヌクレオチド、抗体および関連化合物は、例えば、表Ａの第５欄に特定される既知タンパク質ファミリーに関連する病変および疾患に関係する治療的応用および診断的応用において有用である。
【００４１】
ＮＯＶＸ配列と連関する病理、疾患、障害および状態などは、限定しないが、例えば以下のものを含む：心筋症、アテローム性動脈硬化症、高血圧、先天性心疾患、大動脈弁狭窄、心房中隔欠損症（ＡＳＤ）、房室（Ａ−Ｖ）管欠損、動脈管、肺動脈弁狭窄症、大動脈弁下部狭窄、心室中隔欠損症（ＶＳＤ）、弁疾患、結節硬化症、強皮症、肥満、肥満に連関する代謝妨害、移植、副腎白質萎縮症、先天性副腎過形成、前立腺癌、糖尿病、代謝障害、新生物；腺癌、リンパ腫、子宮癌、受胎能、血友病、凝固性亢進、特発性血小板減少性紫斑病、免疫不全、移植片対宿主疾患、ＡＩＤＳ、気管支喘息、クローン病；多発性硬化症、Albright遺伝性骨ジストロフィー（Ostoeodystrophy）、感染性疾患、食欲不振、癌連関悪液質、癌、神経変性性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害であって自己免疫障害を含むもの、造血障害、および種々の異常脂血症、代謝症候群Ｘおよび慢性疾患、および様々な癌、並びに移植、神経保護、および不妊のような状態、または再生（インビトロおよびインビボ）。
【００４２】
ＮＯＶＸ核酸およびそれらのコードされたポリペプチドは種々の応用および状況において有用である。本発明に従う種々のＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドは、前記タンパク質とのドメインおよび配列関連性の存在に従うタンパク質ファミリーの新規メンバーとして有用である。加えて、ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドを用いて、ＮＯＶＸポリペプチドが属するファミリーのメンバーであるタンパク質を同定し得る。
【００４３】
表Ａの第５欄で特定されるタンパク質ファミリーの他の既知のメンバーと一致して、本発明のＮＯＶＸポリペプチドは、そのようなタンパク質ファミリーの他のメンバーに相同性を示し、そしてそれらを特徴とするドメインを含有する。それぞれのＮＯＶＸについての配列関連性分析およびドメイン分析の詳細を実施例Ａに示す。
【００４４】
ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドを、ＮＯＶＸの活性または機能を阻害または促進する分子をスクリーニングするのに使用し得る。特に、本発明に従う核酸およびポリペプチドは、表Ａに掲げたタンパク質ファミリーと関連する疾患を調整または阻害する低分子の同定用の標的として使用され得る。
【００４５】
ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドはまた、特定の細胞タイプを検出にも有用である。ＮＯＶＸそれぞれに対する発現分析の詳細を実施例Ｃに示す。従って、本発明に従うＮＯＶＸ核酸、ポリペプチド、抗体および関連化合物は、正常組織対疾患組織、例えば、種々のがん、において異なる発現を有する種々の疾患の検出における診断的応用および治療的応用を有する。
本発明に従うＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドのさらに別の利用法が本明細書に開示される。
【００４６】
ＮＯＶＸクローン
ＮＯＶＸ核酸およびそれらのコードされたポリペプチドは、種々の応用および状況において有用である。本発明に従う種々のＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドは、上記該タンパク質と関連するドメインおよび配列の存在に従うタンパク質ファミリーの新規メンバーとして有用である。加えて、ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドを、ＮＯＶＸポリペプチドが所属するファミリーのメンバーであるタンパク質を同定するために使用し得る。
【００４７】
ＮＯＶＸ遺伝子およびそれらの対応するコードされたタンパク質は、例えば、タンパク質治療または遺伝子治療により、医学的状態を予防、処置または緩和するのに有用である。病態を、試料中の新規タンパク質の量を測定または新規遺伝子中の変異の存在を測定することにより診断し得る。ＮＯＶＸ遺伝子が最も高発現する組織に基づいて、それぞれのＮＯＶＸ遺伝子に対する特異的な使用を説明する。使用は、種々の疾患および障害を診断または処置するための産物を開発することを含む。
【００４８】
本発明のＮＯＶＸ核酸およびタンパク質は、潜在的な診断応用および治療応用、および研究ツールとして有用である。これらは、特異的または選択的核酸、またはタンパク質、診断マーカーおよび／または予後マーカーとして役立つことを含む。ここで核酸またはタンパク質の存在または量、ならびに以下のような潜在的な治療応用を評価する：（ｉ）タンパク質治療薬、（ｉｉ）低分子薬の標的、（ｉｉｉ）抗体の標的（治療的、診断的、薬のターゲティング／細胞毒性性抗体）、（ｉｖ）遺伝子治療（遺伝子送達／遺伝子手術）に有用な核酸、および（ｖ）インビトロおよびインビボでの組織再生を促進する組成物、（ｖｉ）生物学的防衛兵器。
【００４９】
一つの特定の実施態様では、本発明は、(ａ)配列番号２ｎ（ｎは１〜１０７の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ成熟型；(ｂ)配列番号２ｎ（ｎは１〜１０７の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ成熟型の変異体、但し、成熟型中の任意のアミノ酸は、成熟型の配列中のアミノ酸残基の１５％より多くが変更を受けない条件で異なるアミノ酸に変更されている；(ｃ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜１０７の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列；(ｄ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜１０７の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ変異体、但し、選択された配列で特定される任意のアミノ酸は、配列中のアミノ酸残基の１５％より多くが変更を受けない条件で異なるアミノ酸に変更されている；およびｅ）ａ）ないしｄ）のいずれかのフラグメント、からなる群から選択したアミノ酸配列を含有する単離ポリペプチドを含む。
【００５０】
もう一つの特別な実施態様では、本発明は、(ａ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜１０７の整数である）を与えられたアミノ酸配列を持つ成熟型；(ｂ)配列番号２ｎ（ｎは１〜１０７の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ成熟型の変異体であり、選択された配列の成熟型中の任意のアミノ酸が、成熟型の配列中のアミノ酸残基の１５％より多くが変更を受けない条件で異なるアミノ酸に変更されている、変異体；(ｃ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜１０７の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列；(ｄ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜１０７の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列の変異体であり、選択された配列中の特定されるアミノ酸が、配列中のアミノ酸残基の１５％より多くが変更を受けない条件で異なるアミノ酸に変更されている、変異体；および(ｅ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜１０７の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの少なくとも一部分、または選択された配列の任意のアミノ酸が、配列においてアミノ酸残基の１０％より多くが変更を受けないという条件で異なるアミノ酸に変更されている、ポリペプチドの任意の変異体をコードする核酸のフラグメント；および(ｆ) 核酸分子のいずれかの相補的分子、からなる群より選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離核酸分子を含む。
【００５１】
なおもう一つの特別な実施態様では、本発明は単離核酸分子を含む。ここで該核酸分子は、(ａ) 配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１０７の整数である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列；(ｂ) 配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１０７の整数である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列中で一つまたはそれ以上のヌクレオチドが、選択された配列からなる群から選択されるものから、ヌクレオチドの１５％より多くが変更を受けない条件で異なるヌクレオチドに変更されているヌクレオチド配列；(ｃ) 配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１０７の整数である）からなる群から選択される配列を持つ核酸フラグメント；および(ｄ) 配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１０７の整数である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列中で一つまたはそれ以上のヌクレオチドが、選択された配列からなる群から選択されるものから、ヌクレオチドの１５％より多くが変更を受けない条件で異なるヌクレオチドに変更されている核酸フラグメント、からなる群より選択したヌクレオチド配列を含む。
【００５２】
ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチド
本発明の一つの態様は、ＮＯＶＸポリペプチドまたはそれらの生物学的に活性な部分をコードする単離核酸分子に関する。また、本発明は、ＮＯＶＸをコードする核酸(例えば、ＮＯＶＸのｍＲＮＡ)を同定するためのハイブリダーゼーションプローブとしての使用に十分な核酸フラグメント、およびＮＯＶＸ核酸分子の増幅および／または変異用のＰＣＲプライマーとしての使用のためのフラグメントを含む。本明細書において使用する用語「核酸分子」とは、ＤＮＡ分子(例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ)、ＲＮＡ分子(例えば、ｍＲＮＡ)、ヌクレオチド類似体を用いて生成されたＤＮＡ類似体またはＲＮＡ類似体、およびそれらの誘導体、フラグメントおよび相同体を含むことを意図する。核酸分子は一本鎖でも二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００５３】
ＮＯＶＸ核酸は成熟ＮＯＶＸポリペプチドをコードし得る。本明細書において使用するように、本発明に開示するポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」型とは、天然に存在するポリペプチド、または前駆体、またはプロタンパク質の産物である。天然に存在するポリペプチド、前駆体またはプロタンパク質は、限定されない例として、対応する遺伝子によりコードされる全長遺伝子産物を含む。これに代えて、本明細書に説明するＯＲＦによりコードするポリペプチド、前駆体またはプロタンパク質として定義し得る。産物の「成熟」型は、限定されない例として、遺伝子産物を生じる細胞(例えば、宿主細胞)内で起こり得る一つまたはそれ以上の天然に存在するプロセシングステップの結果として生じる。ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」型を導くそのようなプロセシングステップの例として、ＯＲＦの開始コドンによりコードされるＮ末端メチオニン残基の切断、またはシグナルペプチドまたはリーダー配列のタンパク質分解的切断を挙げる。従って、残基１がＮ末端メチオニンである１〜Ｎの残基を有する前駆ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟型は、Ｎ末端メチオニン除去後に残存する残基２〜Ｎを有する。これに代えて、残基１〜残基ＭからＮ末端シグナル配列を切断する、残基１〜Ｎを有する前駆ポリペプチドまたはタンパク質より生じる成熟型は、残存する残基Ｍ＋１〜残基Ｎからの残基を有する。さらに本明細書において使用するように、ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」型はタンパク質分解による切断事象以外の翻訳後の工程により生じ得る。そのようなさらに別な方法は、限定されない例として、グリコシル化、ミリストイル化、またはリン酸化を含む。一般に、成熟ポリペプチドまたはタンパク質を、これらの方法のただ一つ、またはそれらのいずれかの組合せの操作によりもたらし得る。
【００５４】
本明細書において使用する用語「プローブ」は、好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド(ｎｔ)から約１００ｎｔの間、または特定の使用によっては約、例えば６，０００ｎｔもの長さである可変的長さの核酸配列を指す。プローブを、同一、類似、または相補的な核酸配列の検出に使用し得る。より長いプローブを天然または組換え供給源から一般的に得る。より長いプローブは、特異性が高くより短い長さのオリゴマーのプローブよりハイブリダイズするのが遅い。プローブは、一本鎖または二本鎖でもよく、そしてＰＣＲ、メンブレン−ベースのハイブリダイゼーション技術、またはＥＬＩＳＡ様技術において特異性を有するようにデザインされ得る。
【００５５】
本明細書において使用する用語「単離」核酸分子は、核酸の天然供給源に存在する他の核酸分子から分離された核酸である。好ましくは、「単離」核酸は、核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中で核酸に天然に隣接する配列(即ち核酸の５'末端および３'末端に位置する配列)を有しない。例えば、種々の実施態様において、単離ＮＯＶＸ核酸分子は、核酸が由来する細胞／組織(例えば、脳、心臓、肝臓、脾臓等)のゲノムＤＮＡ中の核酸分子に天然に隣接する約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０.５ｋｂ、０.１ｋｂ以下、またはそれ未満のヌクレオチド配列を含有し得る。さらに、ｃＤＮＡ分子のような「単離」核酸分子は、他の細胞性物質、培地、または化学的前駆物質または他の化学物質を実質的に含まなくてもよい。
【００５６】
本発明の核酸分子、例えば、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１０７の整数である）のヌクレオチド配列を有する核酸分子、またはこのヌクレオチド配列の相補物を、標準的分子生物学の技術および本明細書に示す配列情報を用いて単離し得る。配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１０７の整数である）の核酸配列の全てまたは一部をハイブリダイゼーションプローブとして用いて、標準的ハイブリダイゼーション技術およびクローニング技術(例えば、Sambrook, et al., (eds.), MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; and Ausubel, et al., (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, NY, 1993に記載されるように)を用いてＮＯＶＸ分子を単離し得る。
【００５７】
本発明の核酸は、鋳型としてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはこれに代えてゲノムＤＮＡを使用して標準的ＰＣＲ増幅技術にしたがって適切なオリゴヌクレオチドプライマーで増幅し得る。そのように増幅した核酸を、適切なベクターにクローニングし、ＤＮＡ配列分析により特徴づけ得る。さらに、ＮＯＶＸヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドを、標準合成技術、例えば自動ＤＮＡ合成装置の使用、により調製し得る。
【００５８】
本明細書において使用する用語「オリゴヌクレオチド」は、一連の連結するヌクレオチド残基を指す。短いオリゴヌクレオチド配列は、ゲノム配列またはｃＤＮＡ配列に基づき得るし、またはそれらからデザインし得る。そして短いオリゴヌクレオチド配列を使用して、特定の細胞または組織の同一、類似、または相補的ＤＮＡまたはＲＮＡの存在を増幅し、確認し、または明らかにする。オリゴヌクレオチドは、長さ約１０ｎｔ、５０ｎｔ、または１００ｎｔ、好ましくは長さ約１５ｎｔ〜３０ｎｔの核酸配列を含む。本発明の一つの実施態様では、長さ１００ｎｔ未満の核酸分子を含むオリゴヌクレオチドは、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１０７の整数である）の少なくとも６個の連続したヌクレオチド、またはそれらの相補物をさらに含む。オリゴヌクレオチドを、化学的に合成し、プローブとして使用し得る。
【００５９】
もう一つの実施態様では、本発明の単離核酸分子は、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１０７の整数である）に示すヌクレオチド配列、またはこのヌクレオチド配列の一部(例えば、ＮＯＶＸポリペプチドの生物学的に活性な部分をコードするプローブ、プライマー、またはフラグメントとして使用し得るフラグメント)の相補物である核酸分子を含む。配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１０７の整数である）を示すヌクレオチド配列に相補的である核酸分子は、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１０７の整数である）を示すヌクレオチド配列に十分に相補的であるものであり、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１０７の整数である）を示すヌクレオチド配列と殆どミスマッチなしでまたは全くミスマッチ無しで水素結合し得。そのため核酸分子は安定な二本鎖を形成する。
【００６０】
本明細書において使用する用語「相補的」は、核酸分子のヌクレオチド単位間のWatson-CrickまたはHoogsteen塩基対形成を指し、用語「結合」は、２個のポリペプチドまたは化合物、または関連するポリペプチドまたは化合物またはそれらの組合せ間の物理的相互作用または化学的相互作用を意味する。結合は、イオン、非イオン、ファン・デル・ワールス、疎水性相互作用等を含む。物理的相互作用は直接的または間接的であり得る。間接的相互作用は、他のポリペプチドまたは化合物の作用を介したまたはこれに因るものであり得る。直接的結合は、他のポリペプチドまたは化合物の作用を介したまたはこれに因り起こるのではなく、代わりに他の実質的な化学的仲介物無しで起こる相互作用を指す。
【００６１】
本明細書で提供する「フラグメント」は、核酸の場合特異的ハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な長さ、アミノ酸の場合にはエピトープの特異的認識に十分な長さである、少なくとも６個の(連続した)核酸または少なくとも４個の(連続した)アミノ酸の配列として定義され、そして全長より短いほとんどの或る一部である。フラグメントは、選択した核酸またはアミノ酸配列の任意の連続した部分から由来するものであり得る。
【００６２】
全長ＮＯＶＸのクローンを、ＡＴＧ翻訳開始コドンおよびインフレームの停止コドンを含有するとして同定する。ＡＴＧ開始コドンを欠く任意の開示するＮＯＶＸヌクレオチド配列は、それ故にれぞれのＮＯＶＸポリペプチドの切断（truncated）型Ｃ末端フラグメントをコードし、対応する全長ｃＤＮＡが開示する配列の５'方向へ伸長することを要求する。インフレームの停止コドンを欠く任意の開示するＮＯＶＸヌクレオチド配列は、同様にそれぞれのＮＯＶＸポリペプチドの切断型Ｎ末端フラグメントをコードし、対応する全長ｃＤＮＡが開示する配列の３'方向へ伸長することを要求する。
【００６３】
誘導体は、もとの化合物から直接、修飾によりまたは部分的置換によるいずれかで生成した核酸配列またはアミノ酸配列である。類似体は、もとの化合物に類似しているが同一ではない構造を有する核酸配列またはアミノ酸配列であり、例えば、それらは特定の成分または側鎖に関して天然化合物と異なっている。類似体は、合成であり得るし異なる進化起源を由来とし得るし、野生型と比較して類似または反対の代謝活性を有し得る。相同体は、異なる種を由来とする特定の遺伝子の核酸配列またはアミノ酸配列である。
【００６４】
誘導体および類似体は全長または全長以外であり得る。本発明の核酸またはタンパク質の誘導体または類似体は、同一サイズの核酸またはアミノ酸配列に亘って、または当分野において公知のコンピューター相同性プログラムによりアラインメントしたアラインメント配列と比較した際、種々の実施態様において、少なくとも約７０％、８０％、または９５％の同一性(好ましくは、８０〜９５％の同一性)で本発明の核酸またはタンパク質に実質的に相同である領域を含む分子、またはそれらのコードする核酸が本発明のタンパク質をコードする配列の相補物に厳密、中等度に厳密、または低い厳密度の条件下でハイブリダイズ可能である分子を含むが、これらに限定されない。例えば、Ausubel, et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, NY, 1993および以下を参照されたい。
【００６５】
「相同な核酸配列」または「相同なアミノ酸配列」またはそれらの変異体は、上述のようにヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルでの相同性を特徴とする配列を指す。相同なヌクレオチド配列は、ＮＯＶＸポリペプチドのアイソフォームをコードするこれらの配列を含む。アイソフォームを、例えばＲＮＡの選択的スプライシングの結果として同じ生物の異なる組織において発現し得る。これに代えて、アイソフォームを、異なる遺伝子によりコードし得る。本発明では、相同なヌクレオチド配列は、ヒト以外の種のＮＯＶＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、脊椎動物を含むが脊椎動物に限定されない。よって例えば、カエル、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、および他の生物を含む。相同なヌクレオチド配列はまた、本明細書に示すヌクレオチド配列の天然に存在する対立遺伝子変異体および突然変異体を含むが、これらに限定しない。しかしながら、相同なヌクレオチド配列は、ヒトＮＯＶＸタンパク質をコードする正確なヌクレオチド配列を含まない。相同な核酸配列は、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１０７の整数である）の保存的アミノ酸置換(下記参照)をコードする核酸配列ならびにＮＯＶＸの生物活性を有するポリペプチドを含む。ＮＯＶＸタンパク質の種々の生物学的活性を、以下に説明する。
【００６６】
ＮＯＶＸポリペプチドは、ＮＯＶＸ核酸のオープンリーディングフレーム(「ＯＲＦ」)によりコードされる。ＯＲＦは、ポリペプチドに潜在的に翻訳し得るヌクレオチドに対応する。ＯＲＦを含む一連の核酸を、停止コドンにより中断しない。全長タンパク質をコードする配列を表すＯＲＦは、ＡＴＧ「開始」コドンで始まり、３種の「停止」コドン即ちＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡの一つで終わる。本発明の目的のため、ＯＲＦは、開始コドン、停止コドン、またはその両方があってもなくてもよい、コード化配列の任意の部分であり得る。ＯＲＦを真正の細胞性タンパク質をコードする良好な候補として考えるために、最小限の要件、例えば、５０個のアミノ酸またはそれ以上をコードする一連のＤＮＡ、がしばしば定められる。
【００６７】
ヒトＮＯＶＸ遺伝子のクローニングから決定するヌクレオチド配列は、他の細胞タイプ、例えば他の組織由来のＮＯＶＸ相同体、ならびに他の脊椎動物由来のＮＯＶＸ相同体を同定および／またはクローニングする際の使用のためにデザインするプローブおよびプライマーの作成を可能にする。プローブ／プライマーは、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを典型的に含む。オリゴヌクレオチドは、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１０７の整数である）の少なくとも約１２、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０または４００個の連続したセンス鎖のヌクレオチド配列；または配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１０７の整数である）のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列；または配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１０７の整数である）の天然に存在する変異体に厳密な条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を典型的に含む。
【００６８】
ヒトＮＯＶＸヌクレオチド配列に基づくプローブを、同じタンパク質または相同タンパク質をコードする転写体またはゲノム配列を検出するのに使用し得る。種々の実施態様において、プローブは検出可能な標識がつけられており、例えば、標識は放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、または酵素のコファクターであり得る。かかるプローブは、対象由来の細胞試料中のあるＮＯＶＸコード化核酸のレベルを測定することによるように、あるＮＯＶＸタンパク質を誤って発現している細胞または組織を同定するための診断試験キットの一部として使用し得る、例えば、ＮＯＶＸのｍＲＮＡを検出するかまたはゲノムＮＯＶＸ遺伝子が変異または欠失をしたか否かを測定する。
【００６９】
「ＮＯＶＸポリペプチドの生物学的に活性な部分を有するポリペプチド」は、特定の生物学的分析において測定するような成熟型を含み、本発明のポリペプチドの活性に類似な、しかし必ずしも同一ではない活性を用量依存性の有無を問わず発揮するポリペプチドを指す。「ＮＯＶＸの生物学的に活性な部分」をコードする核酸フラグメントを、あるＮＯＶＸの生物活性(ＮＯＶＸタンパク質の生物活性を以下に説明する)を有するポリペプチドをコードする配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１０７の整数である）の一部を単離し、ＮＯＶＸタンパク質のコードする部分を発現し(例えば、インビトロ組換え発現により)、ＮＯＶＸのコードする部分の活性を評価するすることにより調製し得る。
【００７０】
ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチド変異体
本発明はさらに、遺伝子コードの縮重により配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１０７の整数である）に示すヌクレオチド配列と異なっており、従って配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１０７の整数である）に示すヌクレオチド配列によりコードするのと同じＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸分子を包含する。もう一つの実施態様では、本発明の単離核酸分子は、配列番号２ｎ（ｎは１〜１０７の整数である）に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【００７１】
配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１０７の整数である）に示すヒトＮＯＶＸヌクレオチド配列に加えて、ＮＯＶＸポリペプチドのアミノ酸配列に変化をもたらすＤＮＡ配列の多型が、集団(例えばヒトの集団)中に存在し得ることを当業者は理解する。ＮＯＶＸ遺伝子のかかる遺伝子多型は、天然の対立遺伝子変異に因り集団の中の個体間に存在し得る。本明細書において使用する用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」は、ＮＯＶＸタンパク質、好ましくは脊椎動物のＮＯＶＸタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)を含む核酸分子を指す。かかる天然の対立遺伝子変異は、ＮＯＶＸ遺伝子のヌクレオチド配列中に１〜５％の変異を典型的にもたらす。天然の対立遺伝子変異の結果でありＮＯＶＸポリペプチドの機能活性を変化しない任意のおよび全てのかかるヌクレオチド変異およびそこで得られるＮＯＶＸポリペプチド中のアミノ酸多型は、本発明の範囲内にあるものとする。
【００７２】
さらに、他の種由来のＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸分子、および従ってヒト配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１０７の整数である）とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、本発明の範囲内にあるものとする。本発明のＮＯＶＸｃＤＮＡの天然の対立遺伝子変異体および相同体に対応する核酸分子は、厳密なハイブリダイゼーション条件下で標準的なハイブリダイゼーション技術に従うハイブリダイゼーションプローブとしてヒトｃＤＮＡまたはその一部を用いて、本明細書に開示するヒトＮＯＶＸ核酸との相同性に基づいて単離し得る。
【００７３】
従って、もう一つの実施態様では、本発明の単離核酸分子は少なくとも６ヌクレオチド長であり、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１０７の整数である）のヌクレオチド配列を含む核酸分子に厳密な条件下でハイブリダイズする。もう一つの実施態様では、核酸は少なくとも１０、２５、５０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、２０００またはそれ以上のヌクレオチド長である。なおもう一つの実施態様では、本発明の単離核酸分子はコード化領域にハイブリダイズする。本明細書において用いる用語「厳密な条件下でハイブリダイズする」は、お互いに少なくとも約６５％相同なヌクレオチド配列がお互いに典型的にハイブリダイズしたままであるハイブリダイゼーション条件および洗滌条件を記載することを意図する。
【００７４】
相同体(即ち、ヒト以外の生物種由来のＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸)または他の関連配列(例えばパラログ)を、核酸のハイブリダイゼーションおよびクローニングの当分野において周知の方法を用いて特定のヒト配列の全部または一部をプローブとし、低度、中度、または高度に厳密なハイブリダイゼーションにより得られる。
【００７５】
本明細書において使用する用語「厳密なハイブリダイゼーション条件」は、プローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドが標的配列にハイブリダイズするが他の配列にはハイブリダイズしない条件を指す。厳密な条件は配列依存性であり、異なる環境で差がある。より長い配列は、より短い配列よりもより高温で特異的にハイブリダイズする。一般的に、厳密な条件を、一定のイオン強度およびｐＨにおいて、特定の配列の融解温度(Ｔｍ)より約５℃低いように選択する。Ｔｍは、標的配列と相補的なプローブの５０％が平衡時に標的配列にハイブリダイズする温度(規定のイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下で)である。標的配列はＴｍにおいて一般的に過剰に存在するので、プローブの５０％を平衡時に占める。典型的に、厳密な条件はｐＨ７.０〜８.３で塩濃度が約１.０Ｍナトリウムイオン未満、典型的には約０.０１〜１.０Ｍナトリウムイオン(または他の塩)であり、温度は短いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチド(例えば、１０ｎｔ〜５０ｎｔ)に対して少なくとも約３０℃であり、より長いプローブ、プライマーおよびオリゴヌクレオチドに対して少なくとも約６０℃である。厳密な条件を、フォルムアミドのような不安定化剤の添加によっても達成し得る。
【００７６】
厳密な条件は当業者に公知であり、Ausubel, et al., (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.に見出すことができる。好ましくは、条件は、互いに少なくとも６５％、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同な配列が互いに典型的にハイブリダイズしたままであるようなものである。厳密なハイブリダイゼーションの限定されない例は、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.５)、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０.０２％ＰＶＰ、０.０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０.０２％ＢＳＡおよび５００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む高塩緩衝液中６５℃でハイブリダイゼーションを行い、引き次いで０.２×ＳＳＣ、０.０１％ＢＳＡ中５０℃で１回またはそれ以上洗滌する。配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１０７の整数である）の配列に厳密な条件下でハイブリダイズする本発明の単離核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。本明細書において使用する用語「天然に存在する」核酸分子は、天然に(例えば、天然のタンパク質をコードする)存在する核酸配列を有するＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子を指す。
【００７７】
第２の実施態様では、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１０７の整数である）のヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはそれらのフラグメント、類似体または誘導体と中度に厳密な条件下でハイブリダイズする核酸配列を提供する。中度に厳密なハイブリダイゼーション条件の限定されない例は、６×ＳＳＣ、５×Reinhardtの溶液、０.５％ＳＤＳおよび１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ中５５℃でハイブリダイゼーションを行い、引き次いで１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中３７℃で１回またはそれ以上洗滌することである。使用され得る他の中度に厳密な条件は当分野内で周知である。例えば、Ausubel, et al. (eds.), 1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY, and Krieger, 1990; GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY.を参照されたい。
【００７８】
第３の実施態様では、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１０７の整数である）のヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはそれらのフラグメント、類似体または誘導体と低度に厳密な条件下でハイブリダイズする核酸配列を提供する。低度に厳密なハイブリダイゼーション条件の限定されない例は、３５％フォルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.５)、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０.０２％ＰＶＰ、０.０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０.２％ＢＳＡ、１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、１０％(ｗｔ／ｖｏｌ)硫酸デキストラン中４０℃でハイブリダイゼーションを行い、引き次いで２×ＳＳＣ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.４)、５ｍＭ ＥＤＴＡ、および０.１％ＳＤＳ中５０℃で１回またはそれ以上洗滌することである。使用し得る他の低度に厳密な条件(例えば種間ハイブリダイゼーションに使用する)は当分野において周知である。例えば、Ausubel, et al. (eds.), 1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY, and Kriegler, 1990; GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY.；Shilo and Weinberg, 1981. Proc Natl Acad Sci USA 78: 6789-6792を参照されたい。
【００７９】
保存的突然変異
集団中に存在し得るＮＯＶＸ配列の天然に存在する対立遺伝子変異に加えて、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１０７の整数である）のヌクレオチド配列中に変異により変換を導入することができ、それによってＮＯＶＸタンパク質の機能活性を変えること無しに、コードするＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列の変化を導くことができることを当業者はさらに理解する。例えば、「非必須」アミノ酸残基でアミノ酸置換に導くヌクレオチド置換を、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１０７の整数である）の配列中で行い得る。「非必須」アミノ酸残基は、ＮＯＶＸタンパク質の野生型の配列をそれらの生物活性を変化させることなく変えることのできる残基であるが、一方で「必須」アミノ酸残基をそのような生物活性に必要とする。例えば、本発明のＮＯＶＸタンパク質中で保存するアミノ酸残基を、特に変換に耐えられないと予想する。保存的置換が行われ得るアミノ酸は当分野内で周知である。
【００８０】
本発明のもう一つの態様は、活性に必須でないアミノ酸残基中に変化を含有するＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸分子に関する。かかるＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１０７の整数である）とアミノ酸配列において異なっているが、生物活性を依然保持している。一つの実施態様では、単離核酸分子はタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここでタンパク質は、配列番号２ｎ（ｎは１〜１０７の整数である）のアミノ酸配列と少なくとも約５０％相同であるアミノ酸配列を含む。好ましくは、核酸分子によりコードするタンパク質は、配列番号２ｎ（ｎは１〜１０７の整数である）に少なくとも約７０％相同であり；さらに好ましくは、配列番号２ｎ（ｎは１〜１０７の整数である）に少なくとも約８０％相同であり；それよりさらにより好ましくは、配列番号２ｎ（ｎは１〜１０７の整数である）に少なくとも約９０％相同であり；最も好ましくは、配列番号２ｎ（ｎは１〜１０７の整数である）に少なくとも約９５％相同である。
【００８１】
配列番号２ｎ（ｎは１〜１０７の整数である）のタンパク質に相同なあるＮＯＶＸタンパク質をコードする単離核酸分子を、１個またはそれ以上のアミノ酸の置換、付加または欠失をコードするタンパク質内に導入するように配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１０７の整数である）のヌクレオチド配列の中に１個またはそれ以上のヌクレオチドの置換、付加または欠失を導入することにより創成し得る。
【００８２】
突然変異を、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１０７の整数である）の中に、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ仲介性突然変異誘発のような、標準的技術により導入し得る。好ましくは、保存的アミノ酸置換を、予想する１個またはそれ以上の非必須アミノ酸残基において行う。「保存的アミノ酸置換」は、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えるアミノ酸残基中の一つである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーを当分野内で定義された。これらのファミリーは、塩基性側鎖をもつアミノ酸(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖をもつアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、電荷のない側鎖をもつアミノ酸(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、無極性側鎖をもつアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ位側鎖をもつアミノ酸(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)、ならびに芳香族側鎖をもつアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を含む。従って、ＮＯＶＸタンパク質中に予想する非必須アミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基で置換する。これに代えて、もう一つの実施態様では、突然変異を、飽和突然変異誘発のように、あるＮＯＶＸコード化配列の全部または一部に沿って無作為に導入し得るし、得られた突然変異体をＮＯＶＸの生物学的活性についてスクリーニングして活性を保持する変異体を同定し得る。配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１０７の整数である）の突然変異誘発に引き続いて、コードされたタンパク質を当分野において公知の任意の組換え技術で発現し、タンパク質の活性を測定し得る。
【００８３】
アミノ酸ファミリーの関連性を、側鎖の相互作用に基づいても決定し得る。置換したアミノ酸は、十分に保存された「強い」残基または十分に保存された「弱い」残基であり得る。保存したアミノ酸残基の「強い」群は、次の群のいずれか一つであり得る：ＳＴＡ、ＮＥＱＫ、ＮＨＱＫ、ＮＤＥＱ、ＱＨＲＫ、ＭＩＬＶ、ＭＩＬＦ、ＨＹ、ＦＹＷであり、ここでアミノ酸の一文字表記は、互いに置換し得るアミノ酸でグル−プ分けする。同様に、保存した残基の「弱い」群は、次のいずれか一つであり得る：ＣＳＡ、ＡＴＶ、ＳＡＧ、ＳＴＮＫ、ＳＴＰＡ、ＳＧＮＤ、ＳＮＤＥＱＫ、ＮＤＥＱＨＫ、ＮＥＱＨＲＫ、ＨＦＹであり、ここでそれぞれの群の文字はアミノ酸の一文字表記を表す。
【００８４】
一つの実施態様では、変異ＮＯＶＸタンパク質を、(i)他のＮＯＶＸタンパク質、他の細胞表面タンパク質またはそれらの生物学的活性部位と相互作用するタンパク質：タンパク質を形成する活性、(ii)変異ＮＯＶＸタンパク質とあるＮＯＶＸリガンド間の複合体形成、または(iii)細胞内標的タンパク質またはそれらの生物学的活性部位に結合する変異ＮＯＶＸタンパク質の活性についてアッセイし得る；(例えば、アビジンタンパク質)。
なおもう一つの実施態様では、変異ＮＯＶＸタンパク質を、特定の生物学的機能を調節する活性(例えば、インスリン分泌の調節)についてアッセイし得る。
【００８５】
干渉ＲＮＡ
本発明のある態様において、ＮＯＶＸ遺伝子発現は、ＲＮＡ干渉により減少され得る。当分野において良く知られている方法は、ＮＯＶＸ遺伝子の発現産物が５’非翻訳領域（ＵＴ）領域、ＯＲＦ、または３’ＵＴ領域を含むＮＯＶＸ遺伝子転写物の少なくとも１９〜２５ｎｔ長のセグメントに相補的であるｓｉＲＮＡヌクレオチド配列由来の特異的２本鎖により標的とされるところの遺伝子サイレンシングを仲介する短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。例えば、ＰＣＴ出願、ＷＯ００／４４８９５、ＷＯ９９／３２６１９、ＷＯ０１／７５１６４、ＷＯ０１／９２５１３、ＷＯ０１／２９０５８、ＷＯ０１／８９３０４、ＷＯ０２／１６６２０、およびＷＯ０２／２９８５８、これらは全体として参考により本明細書により取り込まれる。標的遺伝子は、ＮＯＶＸ遺伝子、またはＮＯＶＸ遺伝子の上流または下流のモジュレーターであり得る。ＮＯＶＸ遺伝子の上流または下流のモジュレーターの非制限の例は、例えば、ＮＯＶＸ遺伝子に結合する転写因子、ＮＯＶＸポリペプチドと相互作用するキナーゼまたはホスファターゼ、およびＮＯＶＸ制御経路に関与するポリペプチドを含む。
【００８６】
本発明の方法によると、ＮＯＶＸ遺伝子発現は、短い干渉ＲＮＡを用いてサイレンシングされる。本発明によるＮＯＶＸポリヌクレオチドはｓｉＲＮＡを含む。かかるＮＯＶＸ  ｓｉＲＮＡは、ＮＯＶＸポリヌクレオチド配列を用いて、例えば、Drosophila抽出のようなものだがこれに制限されない、細胞フリーシステムでのＮＯＶＸリボポリヌクレオチド配列のプロセッシングにより、またはＮＯＶＸ配列に対するヌクレオチド配列相同体の化学合成により、得られる。例えば、Tuschl, Zamore, Lehmann, Bartel and Sharp (1999), Genes & Dev. 13: 3191 3197を参照されたい。これは全体として参考により本明細書に取り込まれる。合成されると、通常の０．２μＭのスケールのＲＮＡ合成は、約１ｍｇのｓｉＲＮＡを提供し、それは２４穴組織培養プレートフォーマットを用いる１０００の形質導入実験に十分である。
【００８７】
最も効果的なサイレンシングは、２ｎｔの３’オーバーハングを有するようにペアーとされた、一般に２１ｎｔセンス鎖および２１ｎｔアンチセンス鎖で観察される。２ｎｔの３’オーバーハングの配列は、ｓｉＲＮＡ標的認識の特異性に対して別に僅かに帰する。特異性への貢献は、第１のペアー塩基に隣接する未ペアーのヌクレオチドに対して位置する。ある実施態様において、３’オーバーハングのヌクレオチドは、リボヌクレオチドである。代わりの実施態様において、３’オーバーハングのヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドである。３’オーバーハングの２’−デオキシリボヌクレオチドを用いることは、リボヌクレオチドを用いるのと同様に効果的であるが、デオキシリボヌクレオチドはしばしば合成するのに割安であり、かつ最もよりヌクレアーゼ耐性であるように思われる。
【００８８】
本発明の熟慮された組換え発現ベクターは、両方の発現を（ＤＮＡ分子の転写により）可能とする形でＮＯＶＸ配列に隣接する作用可能に結合した制御配列を含む発現ベクターにクローン化されたＮＯＶＸ  ＤＮＡ分子を含む。ＮＯＶＸｍＲＮＡに対するアンチセンスであるＲＮＡ分子は、第１のプロモーター（例えば、クローンＤＮＡの３’プロモーター配列）により転写され、およびＮＯＶＸｍＲＮＡのセンス鎖であるＲＮＡ分子は第２のプロモーター（例えば、クローン化ＤＮＡの５’プロモーター配列）により翻訳される。センス鎖およびアンチセンス鎖はインビボでハイブリダイズして、ＮＯＶＸ遺伝子のサイレンシングのためのｓｉＲＮＡ構造物を生成する。または、２つの構造物を用いて、ｓｉＲＮＡ構造物のセンス鎖およびアンチセンス鎖を生成する。最終的に、クローンＤＮＡは、単一転写物が標的遺伝子または遺伝子由来のセンス配列および相補的アンチセンス配列を両方有する、２次構造を有する構造物をコード化することができる。この実施態様の実施例において、ヘアピンＲＮＡｉ産物は、標的遺伝子の全部分または一部分に相同である。別の実施例において、ヘアピンＲＮＡｉ産物はｓｉＲＮＡである。ＮＯＶＸ配列に隣接する制御配列は、発現が独立して、または時間的方法または空間的方法で調節され得るように、同一であり得るかまたは異なり得る。
【００８９】
特定の実施態様において、ｓｉＲＮＡは、ＮＯＶＸ遺伝子鋳型を例えば核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）Ｕ６由来のＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩまたはヒトＲＮａｓｅ  Ｐ  ＰＮＡ  Ｈ１を含有するベクターにクローニングすることにより細胞内で転写される。ベクターシステムの１実施例は、GeneSuppressor［登録商標］ＲＮＡ干渉キット（Imgenexから市販されている）である。Ｕ６およびＨ１プロモーターはＰｏｌ  ＩＩＩプロモーターのタイプＩＩＩクラスのメンバーである。Ｕ６様プロモーターの＋１ヌクレオチドはいつもグアノシンである一方、Ｈ１プロモーターの＋１ヌクレオチドはアデノシンである。これらのプロモーターの終結シグナルは、５連続チミジンにより定義される。転写物は典型的に、第２のウリジンの後切断される。この位置での切断は、合成ｓｉＲＮＡの３’オーバーハングに類似する発現ｓｉＲＮＡの３’ＵＵオーバーハングを生成する。４００ヌクレオチド長未満の配列はこのプロモーターにより転写され得る。それ故、それらは理想的には、例えば約５０ヌクレオチドＲＮＡステム−ループ転写物中のおよそ２１ヌクレオチドｓｉＲＮＡの発現にふさわしい。
【００９０】
ｓｉＲＮＡベクターは、発現の長期ノックダウンが必要な合成ｓｉＲＮＡを超える利点を有するようである。ｓｉＲＮＡ発現ベクターで形質導入された細胞は、定常に長期ｍＲＮＡ阻害を経験し得る。対照的に、細胞該合成ｓｉＲＮＡで形質導入された細胞は典型的には、７日または細胞分割の１０ラウンド以内のｍＲＮＡ抑制から回復する。ｓｉＲＮＡ発現ベクターの長期遺伝子サイレンシング能力は遺伝子療法での応用法を提供する。
【００９１】
一般に、ｓｉＲＮＡはＤＩＣＥＲと呼ばれるＡＴＰ依存性リボヌクレアーゼにより長いｄｓＲＮＡから切り取られている。ＤＩＣＥＲは、エンドヌクレアーゼ特異的エンドヌクレアーゼのＲＮａｓｅ  ＩＩＩファミリーのメンバーである。ｓｉＲＮＡは、細胞内タンパク質と共にエンドヌクレアーゼ複合体内に位置する。Drosophilaのインビトロの研究で、ｓｉＲＮＡ／タンパク質複合体（ｓｉＲＮＡ）が次に第２の酵素複合体に移される。それは、ＤＩＧＥＲとは異なるエンドヌクレアーゼを含有するサイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を誘導するＲＮＡと呼ばれる。ＲＩＳＣは、アンチセンスｓｉＲＮＡ鎖によりコード化される配列を用いて、相補的配列のｍＲＮＡを発見しかつ破壊する。従って、ｓｉＲＮＡは、リボヌクレアーゼを制限するガイドとして振る舞い、２つのｓｉＲＮＡ鎖の１つに相補的なｍＲＮＡのみを切断する。
【００９２】
ｓｉＲＮＡにより標的とされるべきＮＯＶＸ  ｍＲＮＡは一般に、開始コドンの５０〜１００ｎｔ下流から始まる必要なＮＯＶＸ配列から選択される。または、開始コドンの近くの５’または３’ＵＴＲおよび領域は用いられ得るが、これらが制御タンパク質結合部位においてより豊富であり得るので、一般に避けられる。ＵＴＲ結合タンパク質および／または翻訳開始複合体は、ｓｉＲＮＡおよび／またはＲＩＳＣエンドヌクレアーゼ複合体の結合と干渉し得る。選択ｓｉＲＮＡ配列についての最初のＢＬＡＳＴ相同性検索は、利用可能なヌクレオチド配列ライブラリーに対してなされ、たった１つの遺伝子が標的とされることを確認する。ｓｉＲＮＡ２本鎖による標的認識の特異性は、ｓｉＲＮＡ２本鎖の対領域に位置する単一点変異が標的ｍＲＮＡの減少を消滅するのに十分であることを示す。Elbashir et al. 2001 EMBO J. 20(23):6877 88を参照されたい。それ故熟慮して、必要な遺伝子を標的とする場合、ＳＮＰ、多型性、対立遺伝子変異体または種特異的バリエーションを提供する。
【００９３】
ある実施態様において、完全なＮＯＶＸ  ｓｉＲＮＡ実験は適切な負の対照を含む。負の対照ｓｉＲＮＡは一般に、ＮＯＶＸ  ｓｉＲＮＡと同一のヌクレオチド組成物を有するが、ゲノムに対して相同である重要な配列を欠く。典型的には、ＮＯＶＸ  ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列を混ぜるし、かつそれが他の遺伝子に対して相同性を欠くことを確認するための相同性検索を行う。
【００９４】
２つの独立ＮＯＶＸ  ｓｉＲＮＡ２本鎖を用いて、標的ＮＯＶＸ遺伝子をノックダウンし得る。このことは、サイレンシング効果の特異性を制御するのを助ける。加えて、２つの独立遺伝子の発現は、等しい濃度の異なるＮＯＶＸ  ｓｉＲＮＡ２本鎖、例えば、ＮＯＶＸ  ｓｉＲＮＡおよびＮＯＶＸ遺伝子またはポリペプチドのレギュレーターのためのｓｉＲＮＡを用いることにより同時にノックダウンされ得る。タンパク質と関連するｓｉＲＮＡの利用可能性は、標的ｍＲＮＡアクセス可能性より制限されていると信じられている。
【００９５】
標的ＮＯＶＸ領域は典型的には、１９（Ｎ１９）残基（例えば、ＡＡ（Ｎ１９）ＴＴ）のスペーサー領域により分けられる２つのアデニン（ＡＡ）および２つのチミジン（ＴＴ）の配列である。望まれるスペーサー領域は、約３０％〜７０％のＧ／Ｃ含有率を有し、そしてより好ましくは５０％である。配列ＡＡ（Ｎ１９）ＴＴが標的配列に存在しないと、選択的標的領域はＡＡ（Ｎ２１）となる。ＮＯＶＸセンスｓｉＲＮＡの配列は、（Ｎ１９）ＴＴまたはＮ２１にそれぞれ対応する。後者の場合、ＴＴに対するセンスｓｉＲＮＡの３’末端の変換は、かかる配列がＮＯＶＸポリヌクレオチドを天然に生じないなら、実行され得る。この配列の変換の根拠は、センスおよびアンチセンス３’オーバーハングの配列組成に関して対称性２本鎖を生成することである。対称性３’オーバーハングは、ｓｉＲＮＡが、ｓｉＲＮＡを切断するセンスおよびアンチセンス標的ＲＮＡのおよそ等しい率で形成されることを確認することを助ける。例えば、Elbashir, Lendeckel and Tuschl (2001). Genes & Dev. 15: 188 200を参照されたい。これは全体として参考により取り込まれるｓｉＲＮＡ２本鎖のセンス配列のオーバーハングの修飾は、アンチセンスｓｉＲＮＡ鎖ガイド標的認識として標的ｍＲＮＡ認識に作用することを予想されない。
【００９６】
またはＮＯＶＸ標的ｍＲＮＡが適当なＡＡ（Ｎ２１）配列を含有しないと、配列ＮＡ（Ｎ２１）について検索し得る。さらに、センス鎖およびアンチセンス鎖の配列は、アンチセンスｓｉＲＮＡの３’ヌクレオチドの配列が特異性に寄与しないと信じられているので、６’（Ｎ１９）ＴＴとして依然合成され。アンチセンスまたはリボザイム技術と違って、標的ｍＲＮＡの２次構造はサイレンシングに強い影響を有すると思われていない。Harborth, et al. (2001) J. Cell Science 114: 4557 4565を参照されたい。これは全体として参考により取り込まれる。
【００９７】
ＮＯＶＸ  ｓｉＲＮＡ２本鎖の形質導入は、標準的核酸形質導入法、例えばOLIGOFECTAMINE試薬（Invitrogenから市販）を用いて成し遂げられ得る。ＮＯＶＸ遺伝子サイレンシングについてのアッセイは一般に、形質導入後約２日で実行される。ＮＯＶＸ遺伝子サイレンシングが、野生型およびサイレンシング化されたＮＯＶＸフェノタイプの比較解析を可能とする形質導入試薬の非存在下で全く観察されない。特定の実施態様において、２４穴プレートの１穴に対して、約０．８４μｇのｓｉＲＮＡ２本鎖で一般的に十分である。細胞は前日に典型的にまかれ、そして約５０％の密集度で形質導入される。細胞培地および条件の選択は、当業者にとって日常的なことであって、細胞タイプで代えられる。形質導入効率は細胞タイプに依存し得るが、継代回数および細胞の密集度にも依存する。時間およびｓｉＲＮＡリポゾーム複合体（例えば、転倒混和対ボルテックス）の形成方法がまた決定的である。低い形質導入効率は、ＮＯＶＸサイレンシングの失敗の最も高頻度の原因である。形質導入効率は、用いられるべきそれぞれの新たな細胞株について注意深く調べられる必要がある。好ましい細胞は哺乳類由来のものであり、より好ましくはラットまたはマウスのようなげっ歯類由来であり、そして最も好ましくはヒト由来である。治療的処置のため用いられる場合、細胞は優先的に自己のものであるが、自己でない細胞供給源がまた本発明の範囲内として熟慮される。
【００９８】
対照実験について、０．８４μｇの１本鎖センスＮＯＶＸ  ｓｉＲＮＡの形質導入は、ＮＯＶＸサイレンシングに作用せず、および０．８４μｇアンチセンスｓｉＲＮＡは０．８４μｇの２本鎖ｓｉＲＮＡと比較して弱いサイレンシング作用を有する。対照実験は、野生型およびサイレンシング化されたＮＯＶＸフェノタイプの比較解析を再び可能とする。転写効率を制御するため、普通のタンパク質の標的化は、例えば、ラミンＡ／Ｃの標的化またはＣＭＶ由来のＥＧＦＰ発現プラスミド（例えば、Clontechから市販）の形質導入で典型的に行われる。上記の例において、細胞中のラミンＡ／Ｃノックダウンのフラクションの測定は、免疫蛍光抗体法、ウェスタンブロット、ノーザンブロットのような技術またはタンパク質発現または遺伝子発現の他の類似のアッセイにより翌日測定される。ラミンＡ／Ｃモノクローナル抗体はSanta Cruz Biotechnologyから得ることができる。
【００９９】
細胞中の標的ＮＯＶＸポリヌクレオチドの存在量および半減期（またはターンオーバー）に依存して、ノックダウンフェノタイプは、１〜３日後、またはさらに後に明らかになり得る。ＮＯＶＸノックダウンフェノタイプが観察されない場合、ＮＯＶＸポリヌクレオチドの欠乏が、免疫蛍光抗体法またはウエスタンブロッティングにより観察され得る。ＮＯＶＸポリヌクレオチドが３日後に依然大量であるなら、細胞は分けられて再形質導入のための新しい２４穴プレートに移される必要がある。標的タンパク質のノックダウンが観察されないなら、標的ｍＲＮＡ（ＮＯＶＸまたはＮＯＶＸ上流遺伝子または下流遺伝子）が形質導入ｓｉＲＮＡ２本鎖により効果的に破壊されたか否かを解析することが望まれる。形質導入後２日で、全ＲＮＡが調製され、標的特異的プライマーを用いて逆転写され、そしてｍＲＮＡの増幅を制御するために少なくとも１エクソとエクソンとの結合を覆うプライマー対でＰＣＲ増幅される。標的とされていないｍＲＮＡのＲＴ／ＰＣＲはまた対照として必要とされる。標的タンパク質の依然検出不可能な欠乏であるｍＲＮＡの効果的な欠乏は、安定的ＮＯＶＸタンパク質の多量の貯蔵が細胞内に存在し得ることを示すことができる。十分長いインターバルでの複数回の形質導入は、標的タンパク質が最終的に、フェノタイプが明らかになる点に対して欠乏するまで必要であり得る。複数回の形質導入ステップが要求されると、細胞は形質導入後２〜３日で分けられる。細胞は分けられた後直ちに形質導入され得る。
【０１００】
本発明の工夫に富んだ治療方法は、増加または異常ＮＯＶＸ発現または活性を補うための治療としてＮＯＶＸ  ｓｉＲＮＡを投与することを熟慮する。ＮＯＶＸリボポリヌクレオチドを得て、ｓｉＲＮＡフラグメン内に処理されるか、またはＮＯＶＸ  ｓｉＲＮＡが上述のように合成される。ＮＯＶＸ  ｓｉＲＮＡは、上述のように既知の核酸形質導入技術を用いて細胞または組織に投与される。ＮＯＶＸ遺伝子に特異的なＮＯＶＸ  ｓｉＲＮＡは減少するか、または減少ＮＯＶＸポリペプチド産物を導くＮＯＶＸ転写産物をノックダウンし、細胞または組織中の減少ＮＯＶＸポリペプチド活性を結果として生じる。
【０１０１】
本発明はまた、分解タンパク質のｍＲＮＡ（タンパク質をコード化するｍＲＮＡ）を標的とするＲＮＡｉ構造物を個体に投与することを含む個体中におけるＮＯＶＸタンパク質の存在と関連する疾病または状態を処置する方法を包含する。特異的ＲＮＡｉ構造物はｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡないに処理される２本鎖遺伝子産物を含む。処置において、標的タンパク質は生成されず、処置の非存在下にある範囲に生成されない。
【０１０２】
ＮＯＶＸ遺伝子の機能が既知のフェノタイプと相関しない場合、健康個体由来の細胞または組織の対照試料は、ＮＯＶＸ発現レベルを測定する参考標準を提供する。発現レベルは、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロッティング、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ等の記載されるアッセイを用いて測定される。細胞または組織の対象試料は、哺乳類、好ましくは疾病に罹患しているヒト対象から得られる。ＮＯＶＸリボポリヌクレオチドを用いて、ＮＯＶＸ遺伝子産物に特異的なｓｉＲＮＡ構造物を生成する。これらの細胞または組織は、ＮＯＶＸ  ｓｉＲＮＡのものを細胞または組織に投与することにより、細胞または組織への核酸の形質導入について記載された方法で処理され、かつＮＯＶＸポリペプチドまたはポリヌクレオチド発現での変化は、記載のアッセイを用いて、対照試料と比べて対象試料において観察される。このＮＯＶＸ遺伝子ノックダウンアプローチは、処置された対象試料中のＮＯＶＸマイナス（ＮＯＶＸ）フェノタイプの迅速測定方法を提供する。従って処置対象試料において観察されるＮＯＶＸフェノタイプは、処置の間の疾病状態の経過のモニタリングのマーカーとして働く。
【０１０３】
特定の実施態様において、ＮＯＶＸ  ｓｉＲＮＡは治療法において用いられる。ＮＯＶＸ  ｓｉＲＮＡの生成方法および使用方法は当業者に既知である。技術の例を以下に提供する。
【０１０４】
ＲＮＡ産物
ＮＯＶＸのセンスＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）およびアンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）は、ＲＮＡ発現ベクターでの転写のような既知の方法を用いて生成される。最初の実験において、センスおよびアンチセンスＲＮＡはそれぞれ約５００塩基長である。２０ｍＭ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭ  Tris-HCl（ｐＨ７．５）中の生成ｓｓＲＮＡおよびａｓＲＮＡ（０．５μＭ）を９５℃で１分間加熱し、次に冷却して室温で１２〜１６時間アニーリングさせた。ＲＮＡを沈殿させて溶解バッファー（以下）に再懸濁させる。アニーリングをモニターするために、ＲＮＡをＴＢＥバッファーにおいて２％アガロースゲル中で電気泳動させて、そしてエチジウムブロマイドで染色する。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y. (1989)を参照。
【０１０５】
可溶化物の調製
無処理のウサギ網状赤血球可溶化物（Ambion）は、製造元の指示書により集められる。ｄｓＲＮＡはｍＲＮＡの添加に先立ち、可溶化物中で３０℃で１０分間インキュベートされる。ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡは加えられ、そしてインキュベーションがさらに６０分間続けられる。２本鎖ＲＮＡおよびｍＲＮＡのＭ比は約２００：１である。ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡは放射性標識され（既知の技術を用いる）そしてその安定性がゲル電気泳動によりモニターされる。
【０１０６】
同一条件でなされる並行実験において、２本鎖ＲＮＡはまず３２Ｐ  ＡＴＰで放射性標識される。反応は、２ＸプロテイナーゼＫバッファーの添加により止められ、上述のように除タンパクされる（Tuschl et al., Genes Dev., 13:3191 3197 (1999)）。産物は、適当なＲＮＡ鎖を用いる１５％または１８％のポリアクリルアミドシークエンシングゲルでの電気泳動により分析される。放射性活性についてゲルをモニタリングすることにより、２本鎖ＲＮＡ由来の１０〜２５ｎｔＲＮＡの天然産物が測定され得る。
【０１０７】
約２１〜２３ｂｐの２本鎖ＲＮＡのバンドはとらえにくい。ＮＯＶＸ転写を抑制するこの２１〜２３ｍｅｒの作用が、５０ｎｍｏｌの２本鎖２１〜２３ｍｅｒをそれぞれのアッセイで用いる上述の同一のウサギ網状赤血球アッセイを用いて、インビトロでアッセイする。これらの２１〜２３ｍｅｒの配列は次に、標準的核酸配列決定技術を用いて測定される。
【０１０８】
ＲＮＡ調製
上で測定された配列に基づく２１ｎｔのＲＮＡは、促進ＲＮＡホスホラミダイトおよびチミジンホスホラミタイド（Proligo, Germany）を用いて化学的に合成される。合成オリゴヌクレオチドは除タンパクされてゲル精製され（Elbashir, Lendeckel, & Tuschl, Genes & Dev. 15, 188 200 (2001)）、Sep Pak C18カートリッジ（Waters, Milford, Mass., USA）精製が続く（Tuschl, et al., Biochemistry, 32:11658 11668 (1993)）。
【０１０９】
これらのＲＮＡ（２０μＭ）１本鎖は、アニーリングバッファー（１００ｍＭ  酢酸カリウム、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、２ｍＭ  酢酸マグネシウム）中で１分間９０℃でインキュベートされ、１時間３７℃でのインキュベートが続く。
【０１１０】
細胞培養
ＮＯＶＸを調節的に発現するための当分野で既知の細胞培養は、標準条件を用いて増殖される。形質導入前２４時間においておよそ８０％の密集度で、細胞はトリプシン処理されて、抗体を含まない新しい培地で１：５で希釈され（１〜３×１０５細胞／ｍｌ）、２４穴プレート（５００μｌ／穴）に移される。形質導入は市販のリポフェクタミンキットを用いて行われ、そしてＮＯＶＸ発現は正および負の対照をともなう標準技術を用いてモニターされる。正の対照は天然にＮＯＶＸを発現する細胞である一方で、負の対照はＮＯＶＸを発現しない細胞である。３’末端をオーバーハングする塩基対２１および２２ｎｔのｓｉＲＮＡは、可溶化および細胞培養での効果的な配列特異的ｍＲＮＡの分解を仲介する。インビトロ哺乳類培養での抑制の効果的な濃度は、２５ｎＭ〜１００ｎＭの間の最終濃度である。このことは、ｓｉＲＮＡが、通常のアンチセンスまたはリボザイム遺伝子標的実験で適用される濃度のいくつかのオーダーである濃度で効果的であることを示す。
【０１１１】
上述の方法は、ＮＯＶＸ  ｓｉＲＮＡ配列の減少およびインビトロでの抑制のためのかかるｓｉＲＮＡの使用の両方のための方法を提供する。インビボ抑制は、よく知られたインビボ形質導入または遺伝子治療形質導入技術を用いて同一ｓｉＲＮＡで行われ得る。
【０１１２】
アンチセンス核酸
本発明のもう一つの態様は、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１０７の整数である）のヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはそれらのフラグメント、相同体または誘導体、とハイブリダイズ可能なまたは相補的な単離アンチセンス核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的な(例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード化鎖に相補的な、またはｍＲＮＡ配列に相補的な)ヌクレオチド配列を含む。特別な態様では、少なくとも約１０、２５、５０、１００、２５０、または５００のヌクレオチドまたは全ＮＯＶＸコード化鎖に相補的な配列、またはそれらの一部のみにを含むアンチセンス核酸分子を提供する。配列番号２ｎ（ｎは１〜１０７の整数である）のあるＮＯＶＸタンパク質のフラグメント、相同体、誘導体および類似体をコードする核酸分子、または配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１０７の整数である）のあるＮＯＶＸ核酸配列に相補的なアンチセンス核酸を加えて提供する。
【０１１３】
一つの実施態様では、アンチセンス核酸分子は、あるＮＯＶＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコード化鎖の「コード化領域」に対するアンチセンスである。用語「コード化領域」は、アミノ酸残基に翻訳するコドンを含むヌクレオチド配列の領域を指す。もう一つの実施態様では、アンチセンス核酸分子は、ＮＯＶＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコード化鎖の「非コード化領域」に対するアンチセンスである。用語「非コード化領域」は、アミノ酸に翻訳しないコード化領域に隣接する５'配列および３'配列を指す(即ち、５'非翻訳領域および３'非翻訳領域とも呼ぶ)。
【０１１４】
本明細書に開示するＮＯＶＸタンパク質をコードするコード化鎖の配列を与えると、本発明のアンチセンス核酸をWatsonとCrickまたはHoogsteenの塩基対の規則にしたがってデザインし得る。アンチセンス核酸分子は、ＮＯＶＸのｍＲＮＡの全コード化領域と相補的であり得るが、さらに好ましくは、ＮＯＶＸのｍＲＮＡのコード化または非コード化領域の一部のみに対するアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＮＯＶＸのｍＲＮＡの翻訳開始部位を囲む領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、長さ約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ヌクレオチドであり得る。本発明のアンチセンス核酸を、当分野において公知の手順を用いる化学合成または酵素ライゲーション反応を用いて構築し得る。例えば、アンチセンス核酸(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド)は、天然に存在するヌクレオチドまたは分子の生物学的安定性を増加またはアンチセンス核酸とセンス核酸の間で形成する二本鎖の物理的安定性を増加するようデザインした様々に修飾したヌクレオチドを用いて、化学合成し得る(例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジンで置換したヌクレオチドを使用しうる)。
【０１１５】
アンチセンス核酸を作成に使用し得る修飾ヌクレオチドの例として以下のものを挙げる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルクエノシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２,２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、５−メトキシウラシル、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸(ｖ)、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、ウラシル−５−オキシ酢酸(ｖ)、５−メチル−２−チオウラシル、３−(３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル)ウラシル、(ａｃｐ３)ｗ、および２、６−ジアミノプリン。これに代えて、アンチセンス核酸を、核酸がアンチセンスの配向(即ち、挿入した核酸から転写したＲＮＡが、興味ある標的核酸に対するアンチセンスの配向であり、以下の小節でさらに説明する)においてサブクローニングする発現ベクターを使用して生物学的に生産し得る。
【０１１６】
本発明のアンチセンス核酸分子を、それらがあるＮＯＶＸタンパク質をコードする細胞性ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズまたは結合し、それにより(例えば、転写および／または翻訳を阻害することにより)タンパク質発現を阻害するように典型的に対象に投与するか、または組織で作成する。ハイブリダイゼーションは、安定な二本鎖を形成する従来のヌクレオチドの相補性によるものでもあり得る。または、例えば、ＤＮＡ二本鎖に結合するアンチセンス核酸の場合には、二本鎖の大溝での特異的相互作用を介するものであり得る。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例として、組織部位への直接の注射を挙げる。これに代えて、アンチセンス核酸分子を、選択した細胞標的へ修飾しそこで全身性に投与し得る。例えば、全身性投与のために、アンチセンス分子を、選択した細胞表面上に発現する受容体または抗原に特異的に結合するように(例えば、ペプチドにアンチセンス核酸分子を連結させることまたは細胞表面受容体または抗原に結合する抗体により)修飾し得る。アンチセンス核酸分子をまた、本明細書に説明するベクターを用いて細胞に送達し得る。十分な核酸分子を送達するために、アンチセンス核酸分子を強力なｐｏｌＩＩプロモーターまたはｐｏｌＩＩＩプロモーターの調節下に置くベクター構造が好ましい。
【０１１７】
なおもう一つの実施態様では、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補的ＲＮＡと特異的二本鎖ハイブリッドを形成し、これは通常のβユニットとは反対で鎖が互いに並行に走行する。例えば、Gaultier, et al., 1987. Nucl. Acids Res. 15: 6625-6641を参照されたい。アンチセンス核酸分子はまた、２'−ｏ−メチルリボヌクレオチド(例えば、Inoue, et al. 1987. Nucl. Acids Res. 15: 6131-6148を参照)またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体(例えば、Inoue, et al., 1987. FEBS Lett. 215: 327-330を参照)を含み得る。
【０１１８】
リボザイムおよびＰＮＡ部分
核酸の修飾は、非限定的な例として、修飾した塩基、および糖リン酸主鎖を修飾または誘導した核酸を挙げる。これらの修飾を少なくとも部分的に行い、例えば対象への治療応用において核酸へ結合するアンチセンスとして使用し得るように修飾した核酸の化学的安定性を増強する。
【０１１９】
一つの実施態様では、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、それらが相補的領域を有するｍＲＮＡのような一本鎖核酸を切断する能力のあるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒活性ＲＮＡ分子である。従って、リボザイム(例えば、Haselhoff and Gerlach 1988. Nature 334: 585-591に記載されているようなハンマーヘッドリボザイム)を使用して、ＮＯＶＸのｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断し、それによりＮＯＶＸのｍＲＮＡの翻訳を阻害し得る。ＮＯＶＸをコードする核酸に対する特異性を有するリボゾームは、本明細書に開示するあるＮＯＶＸｃＤＮＡのヌクレオチド配列(即ち、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１０７の整数である）)に基づいてデザインし得る。例えば、その中で活性部位のヌクレオチド配列がＮＯＶＸをコードするｍＲＮＡ中で切断し得るヌクレオチド配列に相補的であるTetrahymenaＬ−１９ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体を構築し得る。例えば、Cech, et al.の米国特許第４,９８７,０７１号およびCech, et al.の米国特許第５,１１６,７４２号を参照されたい。ＮＯＶＸｍＲＮＡをまた、ＲＮＡ分子のプールから特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡを選択するのに使用し得る。例えば、Bartel et al., (1993) Science 261:1411-1418を参照されたい。
【０１２０】
一方、ＮＯＶＸ遺伝子発現は、ＮＯＶＸ核酸の調節領域(例えば、ＮＯＶＸプロモーターおよび／またはエンハンサー)に相補的なヌクレオチド配列を標的とすることで阻害し、標的細胞中のＮＯＶＸ遺伝子の転写を阻止するトリプルヘリカル構造を形成し得る。例えば、Helene, 1991. Anticancer Drug Des. 6: 569-84; Helene, et al. 1992. Ann. N.Y. Acad. Sci. 660: 27-36; Maher, 1992. Bioassays 14: 807-15を参照されたい。
【０１２１】
種々な実施態様において、ＮＯＶＸ核酸を塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格部分において修飾し、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは溶解度を改善し得る。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸骨格を修飾して、ペプチド核酸を生成し得る。例えば、Hyrup, et al., 1996. Bioorg Med Chem 4: 5-23を参照されたい。本明細書において使用する用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、デオキシリボースリン酸骨格を擬似ペプチド骨格で置換し、４個の核酸塩基のみを保持する核酸模倣体(例えばＤＮＡ模倣体)を指す。ＰＮＡの中性骨格は、低イオン強度の条件下でＤＮＡおよびＲＮＡへの特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることを示す。ＰＮＡオリゴマーの合成を、Hyrup, et al., 1996. supra; Perry-O'Keefe, et al., 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 14670-14675に記載されているように、標準固相ペプチド合成プロトコールを用いて実施し得る。
【０１２２】
ＮＯＶＸのＰＮＡを治療的応用および診断的応用に使用し得る。例えば、ＰＮＡを、例えば転写または翻訳停止を誘導することまたは複製を阻害することにより、遺伝子発現の配列特異的調整のためのアンチセンスまたは抗原薬剤として使用し得る。ＮＯＶＸのＰＮＡはまた、例えば、遺伝子中の単塩基対変異の分析(例えば、ＰＣＲ固定を指示するＰＮＡ；他の酵素、例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ、との組合せで使用し得る人工的制限酵素として(Hyrup, et al., 1996.supraを参照)；またはＤＮＡ配列およびハイブリダイゼーションのプローブまたはプライマーとして(Hyrup, et al., 1996, supra; Perry-O'Keefe, et al., 1996. supraを参照))にも使用し得る。
【０１２３】
もう一つの実施態様では、ＮＯＶＸのＰＮＡを修飾して、例えば、ＰＮＡに親油性なまたは他の補助的な基をＰＮＡに結合することにより、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの生成により、またはリポソームまたは当分野において公知の他の薬剤送達技術の使用によりそれらの安定性または細胞への取り込みを増強し得る。例えば、ＰＮＡとＤＮＡの有益な性質を結合し得るＮＯＶＸのＰＮＡ−ＤＮＡキメラを生成し得る。かかるキメラは、ＤＮＡ認識酵素(例えば、ＲＮａｓｅ ＨおよびＤＮＡポリメラーゼ)がＤＮＡ部分と相互作用し、一方でＰＮＡ部分が結合高親和性および結合高特異性を提供することを可能にする。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基結合、ヌクレオチド塩基間の結合数および配向について選択した適当な長さのリンカーを使用して結合し得る(Hyrup, et al., 1996. supraを参照)。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成を、Hyrup, et al., 1996. supra and Finn, et al., 1996. Nucl Acids Res 24: 3357-3363に記載のように実施し得る。例えば、ＤＮＡ鎖を、標準ホスホラミダイトカップリング化学反応を使用して固相支持体上で合成し得る。そして修飾したヌクレオシド類似体、例えば、5'-(4-メトキシトリチル)アミノ-5'-デオキシチミジンホスホラミダイトをＰＮＡとＤＮＡの５'末端間で使用し得る。例えば、Mag, et al., 1989. Nucl Acid Res 17: 5973-5988を参照されたい。次いで、ＰＮＡモノマーを段階的にカップリングし、５'ＰＮＡセグメントおよび３'ＤＮＡセグメントを有するキメラ分子を生成する。例えば、Finn, et al., 1996. supraを参照されたい。これに代えて、キメラ分子を５'ＤＮＡセグメントおよび３'ＰＮＡセグメントで合成することもできる。例えば、Petersen, et al., 1975. Bioorg. Med. Chem. Lett. 5: 1119-11124を参照されたい。
【０１２４】
他の実施態様では、オリゴヌクレオチドは、ペプチドのような添付群(例えば、インビボにおいて宿主細胞レセプターを標的とするため)、または細胞膜(例えば、Letsinger, et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 6553-6556; Lemaitre, et al., 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 648-652; ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０を参照)または血液脳関門(例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４を参照)を横切る輸送を促進する薬剤を含み得る。加えて、オリゴヌクレオチドを、ハイブリダイゼーション誘発性切断剤(例えば、Krol, et al., 1988. BioTechniques 6:958-976を参照)または挿入剤(例えば、Zon, 1988. Pharm. Res. 5: 539-549を参照)で修飾し得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドを、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発性架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発性切断剤等に複合し得る。
【０１２５】
ＮＯＶＸポリペプチド
本発明に従うポリペプチドは、配列が配列番号２ｎ（ｎは１〜１０７の整数である）において提供するＮＯＶＸポリペプチドのアミノ酸配列を含有するポリペプチドを含む。本発明はまた、その任意の残基が、配列番号２ｎ（ｎは１〜１０７の整数である）に示す対応する残基から変換し得る一方で、そのＮＯＶＸ活性および生理機能を保持するタンパク質、またはそれらの機能的フラグメントを依然コードする変異タンパク質または変種タンパク質を含む。
【０１２６】
一般に、ＮＯＶＸ様機能を保持するあるＮＯＶＸ変異体は、配列中の特定部位の残基を他のアミノ酸で置換する任意の変異体を含み、親タンパク質の２個の残基間にもう一残基または複数残基を挿入する可能性ならびに親配列から１個またはそれ以上の残基を欠失する可能性をさらに含む。任意のアミノ酸の置換、挿入または欠失を本発明に包含する。好ましい状況では、置換は上で定義した保存的置換である。
【０１２７】
本発明の一つの態様は、単離ＮＯＶＸタンパク質およびそれらの生物活性部分、またはそれらの誘導体、フラグメント、類似体、または相同体に関する。また、抗ＮＯＶＸ抗体産生用の免疫源としての使用に適当なポリペプチドフラグメントも提供し得る。一つの実施態様では、細胞または組織供給源から標準タンパク質精製技術を使用する適当な精製スキームにより天然のＮＯＶＸタンパク質を単離し得る。もう一つの実施態様では、ＮＯＶＸタンパク質を、組換えＤＮＡ技術により生産する。組換え発現に代えて、あるＮＯＶＸタンパク質またはポリペプチドを、標準ペプチド合成技術を使用して化学的に合成し得る。
【０１２８】
「単離」または「精製」ポリペプチドまたはタンパク質またはそれらの生物活性部分は、ＮＯＶＸタンパク質の由来する細胞供給源または組織供給源の細胞性物質または他の混入タンパク質を実質的に含まず、または化学的に合成したと際化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。「細胞性物質が実質的に含まれていない」という用語は、タンパク質を単離または組換え的に生産した元の細胞の細胞成分からタンパク質を分離したＮＯＶＸタンパク質の標本を含む。一つの実施態様では、「細胞原料が実質的に含まれていない」という用語は、約３０％(乾燥重量比)未満の非ＮＯＶＸタンパク質(ここでは「混入タンパク質」とも言う)、さらに好ましくは約２０％未満の非ＮＯＶＸタンパク質、なおさらに好ましくは約１０％未満の非ＮＯＶＸタンパク質、そして最も好ましくは約５％未満の非ＮＯＶＸタンパク質を有するＮＯＶＸタンパク質の標本を含む。ＮＯＶＸタンパク質またはそれらの生物活性部分を組換え的に生産する際には、それはまた、好ましくは培地を実質的に含まず、即ち、培地はＮＯＶＸタンパク質標本の容積の約２０％未満、さらに好ましくは約１０％未満、そして最も好ましくは５％未満を表す。
【０１２９】
「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という用語は、ＮＯＶＸタンパク質の標本を含み、ここでタンパク質を、タンパク質の合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質から分離する。一つの実施態様では、「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という用語は、約３０％未満(乾燥重量比)の化学的前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質、さらに好ましくは約２０％未満の化学的前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質、なおさらに好ましくは約１０％未満の化学的前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質、および最も好ましくは約５％未満の化学的前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質を有するＮＯＶＸタンパク質の標本を含む。
【０１３０】
ＮＯＶＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、全長ＮＯＶＸタンパク質より少ないアミノ酸を含有しＮＯＶＸタンパク質の少なくとも一つの活性を示すＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列(例えば、配列番号２ｎ(ｎは１〜１０７の整数である)に十分相同なアミノ酸配列またはＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列)に由来するアミノ酸配列を含むペプチドを含む。典型的に、生物学的に活性な部分は、ＮＯＶＸタンパク質の少なくとも一つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。あるＮＯＶＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば１０、２５、５０、１００またはそれ以上のアミノ酸残基の長さのポリペプチドであり得る。
【０１３１】
さらに、タンパク質の他の領域が欠失した他の生物学的に活性な部分を、組換え技術で調製しそして天然のＮＯＶＸタンパク質の機能活性の一つまたはそれ以上について評価し得る。
【０１３２】
一つの実施態様では、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２ｎ(ｎは１〜１０７の整数である)に示すアミノ酸配列を有する。他の実施態様では、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２ｎ(ｎは１〜１０７の整数である)に実質的に相同であり、配列番号２ｎ(ｎは１〜１０７の整数である)のタンパク質の機能活性を保持するが、なお以下に詳述するように天然の対立遺伝子の変異体または変異に因りアミノ酸配列を異にする。従って、もう一つの実施態様では、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２ｎ(ｎは１〜１０７の整数である)のアミノ酸配列と少なくとも約４５％相同なアミノ酸配列を含み、配列番号２ｎ(ｎは１〜１０７の整数である)のＮＯＶＸタンパク質の機能活性を保持するタンパク質である。
【０１３３】
２個またはそれ以上の配列間の相同性を測定すること
２個のアミノ酸配列または２個の核酸の相同性の割合を測定するために、配列を至適な比較目的でアラインメント(例えば、ギャップを、２番目のアミノ酸または核酸配列と至適なアラインメントになるように第１のアミノ酸配列または核酸配列の中に入れ得る)。対応するアミノ酸部位または核酸部位におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを次いで比較する。第１の配列の部位を、第２の配列の対応する部位と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占めると、両分子はその部位において相同である(即ち、本明細書において使用するように、アミノ酸または核酸の「相同性」はアミノ酸または核酸の「同一性」と同等である)。
【０１３４】
核酸配列の相同性を、２個の配列間の同一性の程度として測定し得る。相同性は、ＧＣＧプログラムパッケージに提供されるＧＡＰソフトウエアのような、当分野において公知のコンピュータープログラムを使用して測定し得る。Needleman and Wunsch, 1970. J Mol Biol 48: 443-453を参照されたい。以下のセッティング：ＧＡＰ生成ペナルティー５．０またはＧＡＰ伸長ペナルティー０．３で、ＧＣＧ ＧＡＰソフトウエアを使用して、上述の類似核酸配列のコード化領域は、配列番号２ｎ−１(ｎは１〜１０７の整数である)に示すＤＮＡ配列のＣＤＳ(コード化)部分と好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性の程度を示す。
【０１３５】
用語「配列同一性」は、２個のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列が比較の特定領域に亘って残基毎に同一である程度を指す。用語「配列同一性の百分率」を、比較の領域に亘って至適にアラインメントした２個の配列を比較し、一致部位の数を求め同一の核酸塩基(例えば、核酸の場合には、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ)が両方の配列中に存在する部位数を測定して、一致部位の数を比較領域の部位の総数(即ち、ウインドウサイズ)で除し、商を１００倍して、配列同一性の百分率を得ることにより計算しうる。本明細書において使用する用語「実質的同一性」は、ポリヌクレオチド配列の特性を意味する。ここでポリヌクレオチドは、比較領域に亘って標準配列と比較して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、およびしばしば９０〜９５％の配列同一性、さらに通常には少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。
【０１３６】
キメラおよび融合タンパク質
本発明はまた、ＮＯＶＸ「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」を提供する。本明細書において使用するように、あるＮＯＶＸ「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、非ＮＯＶＸポリペプチドに作動し得るように連結したあるＮＯＶＸポリペプチドを含む。「ＮＯＶＸポリペプチド」は、配列番号２ｎ(ｎは１〜１０７の整数である)のあるＮＯＶＸタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す一方で、「非ＮＯＶＸポリペプチド」は、ＮＯＶＸタンパク質と実質的に相同でないタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチド、例えば、ＮＯＶＸタンパク質と異なり同一または異なる生物由来であるタンパク質を指す。あるＮＯＶＸ融合タンパク質内では、ＮＯＶＸポリペプチドはあるＮＯＶＸタンパク質の全部または一部に対応し得る。一つの実施態様では、あるＮＯＶＸ融合タンパク質はあるＮＯＶＸタンパク質の少なくとも一つの生物学的に活性な部分を含む。もう一つの実施態様では、あるＮＯＶＸ融合タンパク質は、あるＮＯＶＸタンパク質の少なくとも二つの生物学的に活性な部分を含む。なおもう一つの実施態様では、あるＮＯＶＸ融合タンパク質は、あるＮＯＶＸタンパク質の少なくとも三つの生物学的に活性な部分を含む。融合タンパク質内では、用語「作動し得るように連結した」は、ＮＯＶＸポリペプチドおよび非ＮＯＶＸポリペプチドがお互いにインフレームで融合していることを示すものとする。非ＮＯＶＸポリペプチドを、ＮＯＶＸポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合し得る。
【０１３７】
一つの実施態様では、融合タンパク質は、ＧＳＴ−ＮＯＶＸ融合タンパク質である。ここでＮＯＶＸ配列がＧＳＴ(グルタチオンＳ転移酵素)のＣ末端に融合する。そのような融合タンパク質は、組換えＮＯＶＸポリペプチドの精製を容易にし得る。
【０１３８】
もう一つの実施態様では、融合タンパク質は、そのＮ末端に異種のシグナル配列を含有するあるＮＯＶＸタンパク質である。特定の宿主細胞(例えば、哺乳類の宿主細胞)において、ＮＯＶＸの発現および／または分泌を異種シグナル配列の使用を介して増強し得る。
【０１３９】
なおもう一つの実施態様では、融合タンパク質は、ＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質である。ここでＮＯＶＸ配列は、免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバー由来の配列と融合している。本発明のＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質を、医薬組成物中に組み入れ、対象に投与し、細胞上でのＮＯＶＸリガンドとあるＮＯＶＸタンパク質との相互作用を阻害し、それによりインビボでのＮＯＶＸ仲介性の情報伝達を抑制し得る。ＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質を使用して、あるＮＯＶＸと同種のリガンドの生物学的利用性に影響を及ぼし得る。ＮＯＶＸリガンド／ＮＯＶＸ相互作用の阻害は、増殖および分化障害の処置ならびに細胞生存を調整(例えば増強または阻害)のために治療上有用であり得る。さらに、本発明のＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質を使用して、対象中で抗ＮＯＶＸ抗体を生産し、ＮＯＶＸリガンドを精製し、そしてスクリーニングアッセイにおいて、ＮＯＶＸのあるＮＯＶＸリガンドとの相互作用を阻害する分子を同定し得る。
【０１４０】
本発明のＮＯＶＸキメラタンパク質または融合タンパク質を、標準組換えＤＮＡ技術により生産し得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを、例えば、連結のための平滑末端化または互い違い末端を用いること、適切な末端を提供するための制限酵素による切断、適切に粘着末端の充填、望ましくない結合を防止するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的結合などの従来の方法にしたがってインフレームで一緒に連結する。もう一つの実施態様では、融合遺伝子を、自動ＤＮＡ合成機を含む従来の技術により合成し得る。これに代えて、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を、２個の連続する遺伝子フラグメント間で相補的なオーバーハングを生じるアンカープライマーを用いて行い、それらを引き続いてアニールし、再増幅して、キメラ遺伝子配列を生成し得る(例えば、Ausubel, et al. (eds.) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, 1992を参照)。さらに、融合部分を既にコードする多くの発現ベクター(例えば、ＧＳＴポリペプチド)が市販されている。ＮＯＶＸをコードする核酸を、融合部分がＮＯＶＸタンパク質にインフレームで結合するように、そのような発現ベクターの中にクローン化することができる。
【０１４１】
ＮＯＶＸアゴニストおよびアンタゴニスト
本発明はまた、ＮＯＶＸアゴニスト(即ち、ミメティクス)またはＮＯＶＸアンタゴニストのいずれかとして機能するＮＯＶＸタンパク質の変異体を含む。ＮＯＶＸタンパク質の変異体は、突然変異(例えば、ＮＯＶＸタンパク質の点突然変異または切断)により生成し得る。ＮＯＶＸタンパク質のアゴニストは、天然に存在する形のＮＯＶＸタンパク質と実質的に同一な生物学的諸活性またはそのサブセットを保持する。ＮＯＶＸタンパク質のアゴニストは、例えば、ＮＯＶＸタンパク質を含む、細胞の情報伝達カスケードの下流または上流メンバーに拮抗的に結合することにより、天然に存在する形のＮＯＶＸタンパク質の一つまたはそれ以上の活性を阻害し得る。従って、特異的な生物学的作用を、限定された機能を有する変異体での処置により発揮することができる。一つの実施態様では、天然に存在する形のタンパク質の生物学的活性のサブセットを有する変異体による対象の処置は、天然に存在する形のＮＯＶＸタンパク質による処置と比べて対象における副作用がより少ない。
【０１４２】
ＮＯＶＸアゴニスト(即ちミメティック)またはＮＯＶＸアンタゴニストのどちらかとして機能するＮＯＶＸタンパク質の変異体は、ＮＯＶＸタンパク質の突然変異体(例えば切断突然変異体)の組換えライブラリーをＮＯＶＸタンパク質アゴニストまたはアンタゴニスト活性についてスクリーニングすることにより同定し得る。一つの実施態様では、ＮＯＶＸ変異体の変化に富むライブラリーを、核酸レベルでの組換え（コンビナトリアル）変異誘発によって生成し、そして変化に富む遺伝子ライブラリーによりコードする。ＮＯＶＸ変異体の変化に富むライブラリーは、例えば、潜在的ＮＯＶＸ配列の縮重したセットが個別のポリペプチドとして発現可能であるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素的に連結することにより、またはこれに代えて、その中にＮＯＶＸ配列のセットを含有するさらに大きい融合タンパク質(例えば、ファージディスプレー用に)のセットとして、生成し得る。縮重したオリゴヌクレオチド配列から潜在的ＮＯＶＸ変異体のライブラリーを使用して生成し得る種々の方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成を自動ＤＮＡ合成機により行い、次いで、合成遺伝子を適切な発現ベクター内に連結し得る。遺伝子の縮重セットの使用は、潜在的ＮＯＶＸ配列の所望のセットをコードする配列の全ての、一つの混合物の提供を可能にする。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は当分野内において周知である。例えば、Narang, 1983. Tetrahedron 39: 3; Itakura, et al., 1984. Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura, et al., 1984. Science 198: 1056; Ike, et al., 1983. Nucl. Acids Res. 11: 477を参照されたい。
【０１４３】
ポリペプチドライブラリー
加えて、ＮＯＶＸタンパク質コード化配列のフラグメントライブラリーを用いて、ＮＯＶＸタンパク質の変異体のスクリーニングおよびそれに続く選択のためにＮＯＶＸフラグメントの変化に富む集団を生成し得る。一つの実施態様では、コード化配列フラグメントのライブラリーを、あるＮＯＶＸコード化配列の二本鎖ＰＣＲ断片を、ニッキングが分子あたりたった約１回生じる条件でヌクレアーゼ処置し、二本鎖ＤＮＡを変性させ、ＤＮＡを異なるニッキング産物由来のセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成し、Ｓ１ヌクレアーゼの処理で再生成した二重らせんから単鎖部分を除去し、そして得られたフラグメントライブラリーを発現ベクターに連結することにより、生成し得る。この方法によって、ＮＯＶＸタンパク質の種々のサイズのＮ末端または内部フラグメントをコードする発現ライブラリーを誘導し得る。
【０１４４】
点突然変異または切断により作成した組換え（コンビナトリアル）ライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングする、および選択した性質を有する遺伝子産物のためにｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする種々の技術は、当分野において公知である。かかる技術は、ＮＯＶＸタンパク質の組換え（コンビナトリアル）突然変異誘発により生成した遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適用可能である。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするハイスループット分析に適用可能な最も広く使用する技術は、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングし、得られたベクターライブラリーで適切な細胞を形質転換すること、そして、所望の活性の検出がその生産物を検出する遺伝子をコードするベクターの単離を容易する条件で、組換え（コンビナトリアル）遺伝子を発現することを典型的に含む。ライブラリー中の機能的変異の頻度を増大する新しい技術である繰り返しアンサンブル変異誘発(ＲＥＭ)をスクリーニングアッセイと組み合わせて使用して、ＮＯＶＸ変異体を同定し得る。例えば、Arkin and Youvan, 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7811-7815; Delgrave, et al., 1993. Protein Engineering 6:327-331を参照されたい。
【０１４５】
抗ＮＯＶＸ抗体
ＮＯＶＸタンパク質、またはＮＯＶＸタンパク質のフラグメントに対する抗体は本発明に含まれる。本明細書において使用する用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン(Ｉｇ)分子の免疫学的に活性な部分、即ち、抗原に特異的に結合する(と免疫学的に反応する)抗原結合部位を含有する分子を指す。かかる抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ' およびＦ(ａｂ')2フラグメントならびにＦａｂ発現ライブラリーが挙げるが、これらに限定しない。一般に、ヒトから得る抗体分子は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤのクラスのいずれかに関し、これらは分子中に存在するＨ鎖の性質によりお互いに異なる。特定のクラスは、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2およびその他のような、サブクラスを同様に有する。さらに、ヒトにおいて、Ｌ鎖は、ｋ鎖またはλ鎖であり得る。本明細書における抗体への参照は、ヒト抗体種の全てのそのようなクラス、サブクラスおよびタイプへの参照を含む。
【０１４６】
抗原として使用することを意図した本発明の単離タンパク質、またはその部分またはフラグメントを免疫源として使用しポリクローナルおよびモノクローナル抗体調製の標準的技術を使用し、抗原に免疫特異的に結合する抗体を生成し得る。全長のタンパク質を使用し得るが、またはこれに代えて、本発明は、免疫源として使用するための抗原の抗原性ペプチドフラグメントを提供する。抗原性ペプチドフラグメントは、配列番号２ｎ(ｎは１〜１０７の整数である)に示すアミノ酸配列のような全長タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも６個のアミノ酸残基を含み、そしてペプチドに対して育成した抗体が、エピトープを含有する全長タンパク質または任意のフラグメントと特異的な免疫複合体を形成するようそのエピトープを包含する。好ましくは、抗原性ペプチドは、少なくとも１０個のアミノ酸残基、または少なくとも１５個のアミノ酸残基、または少なくとも２０個のアミノ酸残基、または少なくとも３０個のアミノ酸残基を含む。抗原性ペプチドにより包含する好ましいエピトープは、表面に局在するタンパク質領域であり；これらは通常親水性領域である。
【０１４７】
本発明の特定の実施態様において、抗原性ペプチドにより包含される少なくとも一つのエピトープは、タンパク質の表面に局在するＮＯＶＸ領域、例えば、親水性領域である。ヒトＮＯＶＸタンパク質配列の疎水性分析は、ＮＯＶＸポリペプチドのどの領域が特に親水性であり、したがって抗体生産を目標とするために有用な表面残基をコードする可能性が高いかを示す。抗体生産を目標とするための手段として、親水性および疎水性領域を示すハイドロパシープロットを、例えば、どちらもフーリエ変換を用いるかまたは用いないで、Kyte DoolittleまたはHopp Woods方法を含む当分野において周知の任意の方法で生成し得る。例えば、Hopp and Woods, 1981, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78: 3824-3828; Kyte and Doolittle 1982, J. Mol. Biol. 157: 105-142(いずれも全体的な出典明示により本明細書の一部とする)を参照されたい。抗原性タンパク質またはその誘導体、フラグメント、類似体または相同体内の一つまたはそれ以上のドメインに特異的である、抗体はまた、本明細書において提供する。
【０１４８】
用語「エピトープ」には、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合し得る全てのタンパク質決定基(部位）が含まれる。エピトープ様決定基（部位）は、通常、化学的に活性な分子（例えば、アミノ酸もしくは糖側鎖など）表面群を含み、通常、特定の三次元的構造特性、に加えて特定電荷特性を示す。あるＮＯＶＸポリペプチドまたはそれらのフラグメントは、少なくとも１つの抗原エピトープを持つ。アッセイ（例えば、当業者には既知のラジオリガンド結合アッセイまたは類似のアッセイ）によって測定されるような、平衡結合定数ＫＤが、＜１μＭ、好ましくは＜１００ｎＭ、より好ましくは＜１０ｎＭ、もっとも好ましくは＜１００ｐＭ〜約１ｐＭである場合、本発明の抗ＮＯＶＯＸ抗体は、抗原ＮＯＶＸに特異的に結合するという。
【０１４９】
本発明のタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、類似体、相同体、またはオーソログを、これらのタンパク質成分に免疫特異的に結合する抗体の生成において免疫源として利用することができる。
【０１５０】
当分野内において公知の種々の方法を、本発明のタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、類似体、相同体、またはオーソログ、に対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体の生産に使用し得る(例えば、Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E, and Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYを出典明示により本明細書の一部とする)を参照されたい。これらの抗体の幾つかについて以下に考察する。
【０１５１】
ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体の生産には、種々の適当な宿主動物(例えばウサギ、ヤギ、マウス、または他の哺乳類)を、天然タンパク質、その合成変異体、または前述の誘導体を1回またはそれ以上注射して免疫を行い得る。適切な免疫原性製剤としては、例えば、天然に存在する免疫原性タンパク質、免疫原性タンパク質を代表する化学的に合成したポリペプチド、または組換え的に発現した免疫原性タンパク質を挙げ得る。さらに、タンパク質を、免疫する哺乳類において免疫原性であることが知られている第２のタンパク質と複合体を形成してもよい。かかる免疫原性タンパク質の例としては、キーホールリンペットヘモシニアン、血清アルブミン、ウシサイログロブリンおよび大豆トリプシン阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。製剤はさらにアジュバントを含有し得る。免疫応答を増大するために使用する種々のアジュバントとしては、フロイントの(完全および不完全)アジュバント、鉱物ゲル(例えば水酸化アルミニウム)、界面活性剤(例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、ジニトロフェノール等)、カルメット-ゲラン杆菌およびコリネバクテリウム-パルヴムのようなヒトに使用可能なアジュバント、または類似の免疫促進剤が挙げられるが、これらに限定されない。使用し得るアジュバントのさらに別な例としては、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント(モノホスホリルリピドＡ、合成ジコリノミコール酸トレハロース)を挙げ得る。
【０１５２】
免疫原性タンパク質に対するポリクローナル抗体を、哺乳類から(例えば、血液から)単離して、免疫血清中の主としてＩｇＧ画分を提供するプロテインＡまたはプロテインＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーのような、公知の技術を用いてさらに精製し得る。引き続いて、またはこれに代えて、求める免疫グロブリンの標的である特異的抗原、またはそのエピトープ、をカラム上に固相化して、イムノアフィニティークロマトグラフィーにより免疫特異的抗体を精製し得る。免疫グロブリンの精製を、例えば、D. Wilkinson (The Scientist, published by The Scientist, Inc., Philadelphia PA, Vol. 14, No. 8 (April 17, 2000), pp. 25-28)により考察する。
【０１５３】
モノクローナル抗体
本明細書において使用する用語「モノクローナル抗体」(ＭＡｂ)または「モノクローナル抗体組成物」は、特徴的なＬ鎖遺伝子産物および特徴的なＨ鎖遺伝子産物より成る抗体分子の１分子種のみを含有する抗体分子の集団を指す。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域(ＣＤＲ)は、集団の全ての分子において同一である。従って、ＭＡｂは、それに対する特徴的な結合活性を特徴とする抗原の特定のエピトープと免疫反応する能力がある抗原結合部位を含有する。
【０１５４】
モノクローナル抗体を、Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)により記載するような、ハイブリドーマ方法を用いて調製し得る。ハイブリドーマ方法では、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物を典型的に免疫化剤で免疫することにより、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生産するかまたは生産する能力のあるリンパ球を誘発する。これに代えて、リンパ球をインビトロで免疫することができる。
【０１５５】
免疫化剤としては典型的に、タンパク質抗原、それらのフラグメントまたはその融合タンパク質が挙げられる。一般的に、ヒト由来の細胞を所望するならば、末梢血リンパ球を使用し、またはヒト以外の哺乳類源を所望するならば、脾臓細胞またはリンパ節細胞を使用するかのいずれかである。次いで、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて不死化細胞株と融合し、ハイブリドーマ細胞を生成する（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103）。不死化細胞株は通常、形質転換した哺乳類細胞、特にげっ歯類、ウシまたはヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラットまたはマウスの骨髄腫細胞株を使用し得る。ハイブリドーマ細胞を、融合していない不死化細胞の増殖または生存を阻害する一つまたはそれ以上の物質を好ましくは含有する適切な培地中で培養し得る。例えば、親細胞が、酵素ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ)を欠くならば、ハイブリドーマ用の培地は典型的に、その物質がＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を阻止する、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む(“ＨＡＴ培地”)。
【０１５６】
好ましい不死化細胞株は、効率的に融合し、選択した抗体生産細胞による抗体の高レベル発現を支持し、そしてＨＡＴ培地のような培地に感受性のあるものである。さらに好ましい不死化細胞株は、例えば、Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Californiaおよびthe American Type Culture Collection, Manassas, Virginiaから入手し得るマウス骨髄腫細胞株である。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株はまた、ヒトモノクローナル抗体の生産用に記載する（Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63）。
【０１５７】
ハイブリドーマが培養する培地を次いで、抗原に対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイし得る。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生産したモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降によりまたはラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)または酵素結合免疫吸着検査法(ＥＬＩＳＡ)のような、インビトロ結合アッセイによって測定する。そのような技術またはアッセイは当分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性を、例えば、Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)のScatchard分析により測定し得る。標的抗原に対して高度の特異性および高い結合親和性を有する抗体を同定することは、モノクローナル抗体の治療的応用において特に重要な目的である。
【０１５８】
所望のハイブリドーマ細胞を同定した後、クローンを限界希釈法でサブクローン化して、標準方法で増殖し得る(Goding,1986)。この目的のための適当な培地としては、例えば、Dulbecco's Modified Eagle's Medium培地およびＲＰＭＩ−１６４０培地を挙げ得る。これに代えて、ハイブリドーマ細胞を哺乳類中で腹水としてインビボで増殖し得る。
【０１５９】
サブクローンにより分泌したモノクローナル抗体を、培地または腹水から、例えば、プロテイン−Ａセファローズ、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーのような従来の免疫グロブリン精製手順により単離または精製し得る。
【０１６０】
モノクローナル抗体をまた、米国特許第４,８１６,５６７号に記載するような組換えＤＮＡ方法により作り得る。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡを、従来の手順を使用して(例えば、マウス抗体のＨ鎖およびＬ鎖をコードする遺伝子に特異的に結合する能力のある、オリゴヌクレオチドプローブを使用することにより)容易に単離し配列決定し得る。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。一旦単離すれば、ＤＮＡを発現ベクター中に配置し、それを次いでサルのＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、またはそうしなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞のような宿主細胞中に形質移入して、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を取得し得る。ＤＮＡをまた、例えば相同なマウスの配列の代わりにヒトのＨ鎖およびＬ鎖の通常ドメインに対するコード化配列を置換することにより(米国特許第４,８１６,５６７号; Morrison, Nature 368, 812-13 (1994))、または非免疫グロブリンペプチドに対するコード化配列の全部または一部を免疫グロブリンのコード化配列に共有結合することにより、修飾し得る。そのような非免疫グロブリンポリペプチドを、本発明の抗体の通常ドメインに対して置換することができるか、または本発明の抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインに対して置換して、キメラ２価抗体を創成することができる。
【０１６１】
ヒト化抗体
本発明のタンパク質抗原に対する抗体はさらに、ヒト化抗体またはヒト抗体を含む。これらの抗体は、投与した免疫グロブリンに対してヒトによる免疫応答を惹き起こすことなくヒトに投与するのに適している。抗体のヒト化型は、主としてヒト免疫グロブリンの配列より成って、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそれらのフラグメント(Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２または抗体の他の抗原結合サブ配列)である。ヒト化は、Winterまたは共同研究者(Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988))の方法にしたがって、げっ歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列で置換することにより、実施し得る。(また、米国特許第５,２２５,５３９号を参照)場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレーム枠の残基を対応する非ヒト残基により置換し得る。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体またはＣＤＲまたはフレーム枠配列にも見出さない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は少なくとも一つ、また典型的には二つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ここでＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、そしてフレーム枠領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体は至適にはまた、免疫グロブリンの通常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部を含む(Jones et al., 1986; Riechmann et al., 1988; and Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992))。
【０１６２】
ヒト抗体
完全なヒト抗体は、ＣＤＲを含むＬ鎖およびＨ鎖の全配列がヒトの遺伝子より生じる、抗体分子に本質的に関する。かかる抗体は本明細書では、「ヒト抗体」または「完全なヒト抗体」と呼称する。ヒトモノクローナル抗体を、トリオーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4: 72を参照)およびＥＢＶハイブリドーマ技術により調製し、ヒトモノクローナル抗体を生産し得る(Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96を参照)。ヒト化モノクローナル抗体を、本発明の実施に利用し得て、そしてヒトハイブリドーマを用いて(Cote, et al., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030を参照)またはヒトＢ細胞をインビトロでEpstein Barrウイルスにより形質転換することによって(Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96を参照)生産し得る。
【０１６３】
加えて、ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリー(Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991))を含むさらに別な技術を用いて生産し得る。同様に、ヒト抗体を、ヒト免疫グロブリンの遺伝子座をトランスジェニック動物、例えば、マウスに導入することによって作り得る。ここで内在性免疫グロブリン遺伝子を部分的にまたは完全に不活化する。チャレンジによって、遺伝子再配列、アセンブリー、および抗体レパトリ−を含む全ての面でヒトにおいて見られるのと非常に良く似たヒト抗体生産を観察する。このアプローチは、例えば、米国特許第５,５４５,８０７号; ５,５４５,８０６号; ５,５６９,８２５号; ５,６２５,１２６号; ５,６３３,４２５号; ５,６６１,０１６号、ならびに Marks et al. (Bio/Technology 10, 779-783 (1992))、Lonberg et al. (Nature 368 856-859 (1994))、Morrison ( Nature 368, 812-13 (1994))、Fishwild et al,( Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996))、Neuberger (Nature Biotechnology 14, 826 (1996))、 Lonberg and Huszar (Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995))に記載されている。
【０１６４】
ヒト抗体を、抗原によるチャレンジに応答して動物の内在性抗体ではなく完全なヒト抗体を生産するように修飾したトランスジェニック非ヒト動物を用いて、付加的に生産し得る(ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／０２６０２を参照)。非ヒト宿主中の免疫グロブリンＨ鎖およびＬ鎖をコードする内在性遺伝子を無能にし、そしてヒト免疫グロブリンのＨ鎖およびＬ鎖をコードする活性遺伝子座を宿主のゲノムの中に挿入する。ヒトの遺伝子を、例えば、必要なヒトＤＮＡセグメントを含有する酵母の人工染色体を用いて組み入れ得る。全ての所望の修飾を提供する動物は次いで、修飾の全相補物より少ない相補物を含有する中間トランスジェニック動物を交雑育種することにより子孫として得られる。そのような非ヒト動物の好ましい実施態様はマウスであり、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９６／３４０９６号に開示されているようにXenomouse[登録商標]と呼称する。この動物は、完全なヒト免疫グロブリンを分泌する、Ｂ細胞を生産する。抗体は、興味のある免疫原で免疫後、動物から、例えば、ポリクローナル抗体の標本として、直接得ることも、またはこれに代えて、モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマのような、動物由来の不死化Ｂ細胞から得ることもできる。これに加えて、ヒトの可変領域を持つ免疫グロブリンをコードする遺伝子を回収し、発現して、抗体を直接得ることもでき、またはさらに修飾して、例えば、単鎖Ｆｖ分子のような抗体の類似体を得ることができる。
【０１６５】
内在性免疫グロブリンのＨ鎖の発現を欠失する、マウスとして例証した、非ヒト宿主を生産する方法の実施例は、米国特許第５,９３９,５９８号、に開示されている。それは、遺伝子座の再配列を阻止するためにそして再配列した免疫グロブリンＨ鎖の遺伝子座の転写物生成を阻止するために、胚性幹細胞中の少なくとも一つの内在性Ｈ鎖の遺伝子座からＪセグメントを欠失させ、この欠失は選択マーカーをコードする遺伝子を含有するターゲティングベクターによりもたらされ、そして体細胞または胚細胞が選択マーカーをコードする遺伝子を含有するトランスジェニックマウスを胚性幹細胞から生産することを含む方法により得られる。
【０１６６】
ヒト抗体のような興味のある抗体を生産する方法は、米国特許第５,９１６,７７１号、に開示されている。それは、Ｈ鎖をコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを一つの培養哺乳類宿主細胞に導入すること、Ｌ鎖をコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターをさらに別な哺乳類宿主細胞に導入すること、および２個の細胞を融合してハイブリッド細胞を生成することを含む。ハイブリッド細胞は、Ｈ鎖およびＬ鎖を含有する抗体を発現する。
【０１６７】
この手順のさらなる改良において、免疫原上の臨床的に関係のあるエピトープを同定する方法、および関係のあるエピトープに高親和性で免疫特異的に結合する抗体を選択する相関的方法が、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／５３０４９に開示されている。
【０１６８】
Ｆａｂフラグメントおよび単鎖抗体
本発明にしたがって、技術を、本発明の抗原タンパク質に特異的な単鎖抗体の生産に適合することができる(例えば米国特許第４,９４６,７７８号を参照)。加えて、方法を、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築に適合し(例えば、Huse, et al., 1989 Science 246: 1275-1281、を参照)、タンパク質またはその誘導体、フラグメント、類似体または相同体に対して所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ効果的な同定を可能し得る。タンパク質抗原に対するイディオタイプを含有する抗体フラグメントを、当分野において公知の技術により生産し得て、それは、(i)抗体分子のペプシン消化により生産するＦ(ａｂ')２フラグメント；(ii)Ｆ(ａｂ')２フラグメントのジスルフィド架橋を還元して得られるＦａｂフラグメント；(iii)抗体分子をパパインおよび還元剤で処置して生成するＦａｂフラグメント；ならびに(iv)Ｆｖフラグメントを含むが、これらに限定されない。
【０１６９】
二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる抗原に結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトのまたはヒト化の抗体である。本明細書においては、結合特異性の一つは本発明の抗原タンパク質に対するものである。２番目の結合標的は、任意の他の抗原であって、有利に細胞表面タンパク質または受容体または受容体サブユニットである。
【０１７０】
二重特異性抗体の作成方法は当分野において公知である。伝統的に、二重特異性抗体の組換え生産は、２個のＨ鎖が異なる特異性を有する２個の免疫グロブリンＨ鎖／Ｌ鎖対の共発現に基づく(Milstein and Cuello, Nature, 305:537-539 (1983))。免疫グロブリンＨ鎖およびＬ鎖のランダムな組合せのため、これらのハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生産し、そのうちの一つだけが正しい２重特異性構造を有する。正しい分子の精製は通常、アフィニティークロマトグラフィーにより行う。類似の方法が、１９９３年５月に公開されたＷＯ９３／０８８２９およびTraunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)に開示されている。
【０１７１】
所望の結合特異性を持つ抗体の可変ドメイン(抗体−抗原結合部位)を、免疫グロブリンの通常ドメイン配列に融合し得る。融合は、好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリンＨ鎖の通常ドメインと共にある。少なくとも融合の一つの中に存在するＬ鎖結合に必要な部位を含有する第１のＨ鎖通常領域(ＣＨ１)を有することが好ましい。免疫グロブリンＨ鎖の融合をコードするＤＮＡ、および所望ならば、免疫グロブリンＬ鎖を別々の発現ベクター中に挿入し適当な宿主生物中に形質移入する。二重特異性抗体のさらなる詳細については、例えば、Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
【０１７２】
ＷＯ９６／２７０１１に記載されたもう一つのアプローチによれば、一対の抗体分子間の境界面を改変して、組換え細胞培地から回収するヘテロダイマーの百分率を最大にし得る。好ましい境界面は、抗体の通常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子の境界面の一つまたはそれ以上の小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖(例えばチロシンまたはトリプトファン)で置換する。大きな側鎖(複数を含む)と同一または類似のサイズの代償的な「空隙」を、大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの(例えばアラニンまたはスレオニン)で置換することにより第２の抗体分子の境界面に生成する。これは、ホモダイマーのような他の望ましくない最終産物以上にヘテロダイマーの収量を増加する機構を提供する。
【０１７３】
二重特異性抗体を、抗体の全長または抗体フラグメント(例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製することができる。抗体フラグメントから二重特異性抗体を生成する技術は文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体フラグメントを、化学的結合を用いて調製することができる。Brennan et al., Science 229:81 (1985)は、完全な抗体をタンパク質分解酵素で切断してＦ(ａｂ')２フラグメントを生成する手順を記載する。これらのフラグメントをジチオール錯化剤の亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元して、隣接するジチオールを安定化させて、分子間ジスルフィド形成を阻止する。次いで、生成したＦａｂ'フラグメントをチオニトロ安息香酸(ＴＮＢ)誘導体に変換する。次いで、Ｆａｂ'−ＴＮＢの一つをメルカプトエチルアミンとの還元によりＦａｂ'−チオールに再変換し、そして等量の他のＦａｂ'−ＴＮＢ誘導体と混合して、二重特異性抗体を生成する。生成した二重特異性抗体を酵素の選択的固定化剤として使用し得る。
【０１７４】
これに加えて、Ｆａｂ'フラグメントを大腸菌から直接回収して、化学的にカップリングして、二重特異性抗体を生成し得る。Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)は、完全にヒト化した二重特異性抗体のＦ(ａｂ')２分子の生産を記載している。それぞれのＦａｂ'フラグメントを大腸菌から別々に分泌し、インビトロで指向性化学カップリングに供して、二重特異性抗体を形成した。従って形成した二重特異性抗体を、ＥｒｂＢ２受容体を過剰発現する細胞および正常ヒトＴ細胞に結合することができ、ならびにヒト乳腺腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の溶解活性を誘発することができた。
【０１７５】
組換え細胞培地から直接二重特異性抗体を作成し単離する種々の技術をまた記載する。例えば、二重特異性抗体をロイシンジッパーを用いて生産する。Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓタンパク質およびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーを遺伝子融合により二つの異なる抗体のＦａｂ'部分に結合した。抗体のホモダイマーをヒンジ領域において還元して、モノマーを形成し、次いで再酸化して、抗体のヘテロダイマーを形成した。この方法をまた、抗体のホモダイマーの生産に利用することができる。Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)により記載されている「diabody」技術は、二重特異性抗体フラグメント作成のさらに別の機構を提供する。フラグメントは、リンカーによりＬ鎖可変領域(ＶＬ)に連結したＨ鎖可変領域(ＶＨ)を含むが、リンカーが短いため同じ鎖の上の２個のドメイン間での対形成を可能にしない。したがって、一つのフラグメントのＶＨおよびＶＬドメインは強制的にもう一つのフラグメントの相補的なＶＬおよびＶＨドメインと対を形成し、それにより二つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)のダイマーの使用による二重特異性抗体フラグメント作成のもう一つの戦略がまた報告されている。Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
【０１７６】
３価以上の結合価をもつ抗体も考得る。例えば、３重特異性抗体を調製し得る。例えば、Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)。
典型的な二重特異性抗体は、少なくとも一つが本発明のタンパク質抗原に由来する二つの異なるエピトープに結合し得る。これに代えて、免疫グロブリン分子の抗−抗原アームを、白血球上でＴ細胞受容体分子(例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８またはＢ７)またはＦｃγＲＩ(ＣＤ６４)、ＦｃγＲＩＩ(ＣＤ３２)およびＦｃγＲＩＩＩ(ＣＤ１６)のような、ＩｇＧに対するＦｃ受容体(Ｆｃγ)のような誘発性分子に結合するアームと組み合わせて、特定の抗原を発現する細胞に対する細胞性防御機構に焦点を当て得る。二重特異性抗体をまた使用して、特定の抗原を発現している細胞に細胞障害性物質を指向し得る。これらの抗体は、抗原結合アームおよび細胞障害性薬剤またはＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡまたはＴＥＴＡのような放射性核種キレート化剤と結合するアームを所有する。興味のあるもう一つの二重特異性抗体は、本明細書に説明するタンパク質抗原と結合して、さらに組織因子(ＴＦ)と結合する。
【０１７７】
ヘテロ複合抗体
ヘテロ複合抗体はまた本発明の範囲内にある。ヘテロ複合抗体は、共有結合で結合した二つの抗体より成る。そのような抗体は、例えば、好ましくない細胞に免疫系の細胞を標的化するため(米国特許第４,６７６,９８０号)、およびＨＩＶ感染の処置のため(ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９)に提案されている。これらの抗体を、架橋剤を伴うものを含むタンパク質合成化学の既知の方法を用いてインビトロで調製し得ると考えられている。例えば、ジスルフィド交換反応を使用してまたはチオエーテル結合を形成することより、イムノトキシンを構築することができる。この目的のために適当な試薬の例としては、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデートならびに、例えば、米国特許第４,６７６,９８０号に開示されているものを挙げ得る。
【０１７８】
エフェクター機能工学
例えば、がんの処置における抗体の有効性を増強するために、本発明の抗体をエフェクター機能に関して修飾することが望ましい。例えば、システイン残基(複数を含む)をＦｃ領域に導入し、それによりこの領域における鎖間ジスルフィド結合形成を可能にし得る。かくして生成したホモダイマーの抗体は、改善した内部移行能および／または増強した補体仲介性細胞殺害ならびに抗体依存性細胞障害作用(ＡＤＣＣ)を有し得る。Caron et al., J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992) and Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)を参照されたい。増強した抗腫瘍活性を持つホモダイマー抗体はまた、Wolff et al. Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993)に記載されているように、ヘテロ２機能性架橋剤を用いて調製し得る。これに代えて、２重のＦｃ領域を有して、それにより増強した補体依存性細胞溶解およびＡＤＣＣ能を有する抗体を工学操作することができる。Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989)を参照されたい。
【０１７９】
免疫複合体
本発明はまた、化学療法剤、毒素(例えば、細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素的に活性な毒素、またはそれらのフラグメント)または放射性同位体(即ち、放射性複合体)のような細胞毒性物質と複合した抗体を含む免疫複合体に関する。
【０１８０】
そのような免疫複合体の生成に有用な化学療法剤を上述する。使用できる酵素的に活性な毒素およびそれらのフラグメントとしては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性フラグメント、内毒素Ａ鎖(Pseudomonas aeruginosa由来)、リシンＡ鎖、アビリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファサルシン、Aleurites fordii(シナアブラギリ)タンパク質、ディアンティンタンパク質、Phytolaca americanaタンパク質(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ)、momoridica charantia(ツルレイシ)阻害剤、クルシン、クロチン、sapaonaria officinalisc阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、リストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセンが挙げられる。種々の放射性核種を放射性複合抗体の生産に利用できる。例として、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙおよび１８６Ｒｅを挙げ得る。
【０１８１】
抗体と細胞障害性薬剤との複合体を、Ｎ−サクシンイミジル−３−(２−ピリジルジチオール)プロピオネート(ＳＰＤＰ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステルの２機能性誘導体(ジメチルアジピイミデートＨＣＬのような)、活性エステル(ジサクシンイミジルスベレートのような)、アルデヒド(グルタルアルデヒドのような)、ビスアジド誘導体(ビス−(ｐ−アジドベンゾイル)−ヘキサンジアミンのような)、ビスジアゾニウム誘導体(ビス−(ｐ−ジアゾニウムベンゾイル)−エチレンジアミンのような)、ジイソシアネート(トリエン２、６−ジイソシアネートのような)、およびビス活性フッ素化合物(１,５−ジフルオロ２,４−ジニトロベンゼンのような)のような種々の２機能性タンパク質カップリング剤を用いて作る。例えば、リシン免疫毒素を、Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987)に記載のように調製することができる。炭素１４で標識した１−イソチオシアナートベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸(ＭＸ−ＤＴＰＡ)は、放射性ヌクレオチドを抗体に結合するための典型的なキレート化剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。
【０１８２】
もう一つの実施態様では、抗体を、腫瘍をプレターゲティンブのための「受容体」(ストレプトアビジンのような)に結合することができて、そこでは抗体−受容体複合体を患者に投与し、引き続いて未結合の複合体を除去剤を用いて血液循環から除去し、次いで今度は細胞障害性薬剤に複合した「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
【０１８３】
イムノリポソーム
本明細書で開示される抗体をまた、イムノリポソームとして処方することができる。抗体を含有するリポソームリポソームは、Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl  Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); ならびに米国特許第４,４８５,０４５号および第４,５４４,５４５号に記載されているような、当分野において公知の方法で調製する。増大した循環時間を持つリポソームリポソームは、米国特許第５,０１３,５５６号に開示されている。
【０１８４】
特に有用なリポソームリポソームを、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥＧ−ＰＥ)を含む脂質組成物を用いて逆相蒸発法により生成し得る。リポソームリポソームを定められた孔径のフィルターを通して押し出して、所望の直径のリポソームリポソームを得る。本発明の抗体のＦａｂ'フラグメントを、Martin et al ., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982)に記載されるように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームリポソームに結合し得る。化学療法剤(ドキソルビシンのような)を任意にリポソーム内に含有する。Gabizon et al., J. National Cancer Inst., 81(19): 1484 (1989)を参照されたい。
【０１８５】
本発明のタンパク質に対して指向される抗体の診断応用
１実施態様では、所望の特異性を保有する抗体のスクリーニングのための方法は限定しないが、エライザ（ＥＬＩＳＡ）および他の当業者既知免疫学的介在技法を含む。具体的実施態様では、ＮＯＶＸタンパク質の特定のドメインに特異的である抗体の選択は、そのようなドメインを保有するＮＯＶＸタンパク質のフラグメントに結合するハイブリドーマの生成によって容易化される。かくして、ＮＯＶＸタンパク質、その誘導体、フラグメント、類似体、または相同物に特異的で合える抗体をまたここに提供する。
【０１８６】
本発明のＮＯＶＸタンパク質に対して指向化された抗体を、ＮＯＶＸタンパク質の局在化及び／または定量に関する当業界内既知方法で使用し得る（例えば適当な生理学的試料内のＮＯＶＸタンパク質のレベルの測定における使用のため、診断方法における使用のため、タンパク質の画像化における使用のためなど）。所定の実施態様では、ＮＯＶＸ、その誘導体、フラグメント、類似体または相同物に特異的な抗体であって、抗体由来抗原結合ドメインを含むものは、薬理学的活性化合物として利用する（以後「治療剤」と称する）。
【０１８７】
本発明のＮＯＶＸタンパク質に対して特異的な抗体を（例えばモノクローナルまたはポリクローナル抗体）、イムノアフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降のような標準的な技術により、ＮＯＶＸポリペプチドを単離するために使用し得る。ＮＯＶＸポリペプチドへの抗体を、細胞由来の天然タンパク質および宿主細胞で発現する組換え的に生産したＮＯＶＸ抗原の精製を容易にし得る。さらに、そのような抗ＮＯＶＸ抗体を使用して、抗原性ＮＯＶＸタンパク質の存在量または発現パターンを評価するために抗原性ＮＯＶＸタンパク質(例えば、細胞溶解物または細胞上清中の)を検出することができる。ＮＯＶＸタンパク質に対して指向した抗体を診断的に使用して、例えば、与えられた処置法の有効性を測定するために臨床検査の手順の一環として組織中のタンパク質レベルをモニターすることができる。抗体を検出可能な物質にカップリング(即ち物理的に連結)することにより、検出を促進し得る。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、配合群、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質を挙げる。適当な酵素の例としては、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼおよびアセチルコリンエステラーゼを挙げ得る；適当な配合群の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを挙げ得る；適当な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレッセイン、フルオレッセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレッセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリスリンを挙げ得る；発光物質の例としては、ルミノールを挙げ得る；生物発光物質の例としてはルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンを挙うるし、適当な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈを挙げ得る。
【０１８８】
抗体治療法
ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化および完全なヒト抗体を含む本発明の抗体を治療薬として使用し得る。そのような薬剤を一般的に、対象の疾患または病変の治療または予防に使用する。抗体製剤、好ましくはその標的抗原に対して高い特異性および高い親和性を有するものを対象に投与して、一般的に標的への結合に因る効果を有する。そのような効果は、与えた抗体分子と問題とする標的抗原との間の相互作用の特異的性質に依存する２種類のうちの一つである。第１の場合では、抗体の投与は、標的の本来結合する内在性リガンドとの結合を阻止または阻害し得る。この場合には、抗体は標的に結合して、リガンドがエフェクター分子として作用する、天然に存在するリガンドの結合部位をマスクする。かくして、受容体はリガンドが役割を担う情報伝達経路を仲介する。
【０１８９】
これに代えて、作用は、抗体が標的分子上のエフェクター結合部位への結合により生理的結果を誘発するものであり得る。この場合には、疾患または病変においては存在しないかまたは欠陥のあり得る内在性リガンドを有する受容体である標的を、代替のエフェクターリガンドとしての抗体と結合して、受容体に基づく情報伝達事象を受容体により開始する。
【０１９０】
本発明の抗体の治療的に有効な量は一般的に、治療目的を達成するのに必要とされる量に関する。上述のように、これは、特定の場合には標的の機能を阻害し、そして他の場合には生理的応答を促進する抗体およびその標的抗原との間の結合相互作用であり得る。投与に必要な量はさらに、特定の抗原に対する抗体の結合親和性に依存するし、そしてまた投与した抗体が投与した対象の自由体積から除去し得る速度に依存する。本発明の抗体または抗体フラグメントの治療的に有効な投与量の通常の範囲は、限定されない例として、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。通常の投与回数は、例えば、１日２回から１週１回の範囲であり得る。
【０１９１】
抗体の医薬組成物
本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体、ならびに本明細書に開示するスクリーニングアッセイにより同定する他の分子を、医薬組成物の形で種々の障害の処置のために投与し得る。そのような組成物の調製に関与する原理および考慮事項、ならびに成分の選択の指針は、例えば、The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed. (Alfonso R. Gennaro, et al., editors) Mack Pub. Co., Easton, Pa. : 1995、Drug Absorption Enhancement : Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends,  Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa.,  1994、および Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4), 1991, M. Dekker,  New Yorkに提供されている。
【０１９２】
抗原タンパク質が細胞内にあり、完全な抗体を阻害剤として使用するならば、内部移行性抗体が好ましい。しかしながら、リポソームを使用して、抗体または抗体フラグメントを細胞内に送達し得る。抗体フラグメントを使用する場合には、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最も小さな阻害フラグメントが好ましい。例えば、抗体の可変領域の配列に基づいて、標的タンパク質の配列に結合する能力を保持するペプチド分子をデザインし得る。そのようなペプチドを、化学的および／または組換えＤＮＡ技術により合成し得る。例えば、Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)を参照されたい。本明細書における処方はまた、処置する特定の適応のために必要なニつ以上の活性化合物、好ましくはお互いに悪影響を及ぼし合わない相補的活性を持つものを含有し得る。これに代えて、またはこれに加えて、組成物は、その機能を増強する薬剤、例えば、細胞障害性薬剤、サイトカイン、化学療法剤、または増殖阻害剤を含有していてもよい。そのような分子は好都合には、意図する目的にとって効果的な量で組み合わされて存在する。
【０１９３】
活性成分を、例えば、コアセルベーション技術または界面重合により調製したマイクロカプセル中で、例えば、ハイドロキシメチルセルローズまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−(メチルメタクリレート)マイクロカプセル中で、それぞれ、コロイド状薬送達システム(例えば、リポソーム、アルブミン小球体、ミクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル)中に、またはマクロエマルジョン中に閉じ込め得る。
【０１９４】
インビボ投与に使用する製剤は無菌でなければならない。このことを、無菌ろ過膜によるろ過により容易に達成する。
徐放性製剤を調製することができる。徐放性製剤の適当な例としては、抗体を含有する固相の疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、そのマトリックスは、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルのような造形品の形をしている。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ハイドロゲル(例えば、ポリ(２−ヒドロキシエチル−メタクリレート)、またはポリ(ビニルアルコール)、ポリラクチド(米国特許第３,７７３,９１９号)、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌグルタミン酸エステルの共重合体、非分解性エチレン−ビニルアセテート、LUPRON DEPOT[登録商標](乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸リュープロリドより成る注射用マイクロスフェア)のような分解性乳酸−グリコール酸共重合体が挙げられる。酢酸エチレンビニルおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーは１００日間に亘って分子を放出することができるが一方、特定のヒドロゲルはより短期間でタンパク質を放出する。
【０１９５】
ＥＬＩＳＡアッセイ
アナライトのタンパク質を検出する薬剤は、アナライトのタンパク質に結合する能力のある抗体、好ましくは検出可能な標識を持つ抗体である。抗体は、ポリクローナルでもよく、またはさらに好ましくはモノクローナルであり得る。完全な抗体またはそのフラグメント(例えば、ＦａｂまたはＦ(ａｂ)２)を使うことができる。用語「標識」とは、プローブまたは抗体に関して、プローブまたは抗体に検出可能な物質をカップリングする(即ち、物理的に連結する)ことによるプローブまたは抗体の直接標識、ならびに直接に標識するもう一つの薬剤との反応性によるプローブまたは抗体の間接標識を包含するものとする。間接標識の例としては、蛍光標識した第２抗体を用いた第１抗体の検出および蛍光標識ストレプトアビジンで検出できるようにＤＮＡプローブをビオチンで末端標識することが挙げられる。用語「生物学的試料」とは、対象から単離した組織、細胞および生物学的流体、ならびに対象内に存在する組織、細胞および流体を含むものとする。それ故に、用語「生物学的試料」の範囲には血液および血清、血漿、またはリンパ液を含む血液のフラクションまたは成分を含み得る。即ち、本発明の検出法を使用して、生物学的試料中のアナライトのｍＲＮＡ、タンパク質またはゲノムＤＮＡをインビトロならびにインビボで検出することができる。例えば、アナライトのｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイツハイブリダイゼーションを挙げ得る。アナライトのタンパク質のインビトロ検出技術としては、酵素結合免疫吸着検査法(ＥＬＩＳＡ)、ウエスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光を挙げ得る。アナライトのＤＮＡのインビトロ検出技術としては、サザンハイブリダイゼーションを挙げ得る。イムノアッセイを実施する手順は、例えば、「ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology」, Vol. 42, J. R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995、「Immunoassay」, E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996、および「Practice and Thory of Enzyme Immunoassays」, P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985に記載されている。さらに、アナライトのタンパク質のインビボ検出のための技術は、標識化した抗アナライトタンパク質抗体を対象に導入することを含む。例えば、対象中での存在または局在が標準的な造影技法で検出できる放射性マーカーで、抗体を標識し得る。
【０１９６】
ＮＯＶＸ組換え発現ベクターおよび宿主細胞
本発明のもう一つの態様は、ＮＯＶＸタンパク質またはその誘導体、フラグメント、類似体または相同体をコードする核酸を含有するベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書において使用する用語「ベクター」とは、それに結合しているもう一つの核酸を運搬する能力のある核酸分子を指す。ベクターの一つのタイプは「プラスミド」であり、これは、さらに別なＤＮＡセグメントが結合した環状の二重鎖ＤＮＡループを指す。ベクターのもう一つのタイプはウイルスベクターであり、ここではさらに別なＤＮＡセグメントをウイルスゲノムの中に結合し得る。特定のベクターは、それらを導入した宿主細胞中で自律増幅することができる(例えば、細菌の複製起点を持つ細菌のベクターおよび哺乳類のエピゾームベクター)。他のベクター(例えば、哺乳類の非エピゾームベクター)は、宿主細胞中への導入に際し宿主細胞のゲノム中に組み込まれて、それにより宿主ゲノムと一緒に複製し得る。さらに、特定のベクターは、それらが作動し得るように連結した遺伝子の発現を指示する能力がある。そのようなベクターを、本明細書において「発現ベクター」と呼称する。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターはしばしばプラスミドの形をしている。プラスミドはベクターの最も通常に使用する形態であるので、本明細書においては、「プラスミド」および「ベクター」は互換的に使用し得る。しかしながら、本発明は、同等の機能を有するウイルスベクター(例えば、複製能を欠いたレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)のような他の形の発現ベクターを含むこととする。
【０１９７】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中における核酸の発現に適した形での本発明の核酸を含み、これは組換え発現ウイルスを、発現に使用する宿主細胞に基づいて選択した発現すべき核酸配列に作動し得るように連結した一つまたはそれ以上の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクター内において、「作動し得るように連結した」とは、興味のある核酸配列が核酸配列の発現を可能にする様式で(例えばインビトロ転写／翻訳システムでまたはベクターを宿主細胞に導入する場合には宿主細胞中で)調節配列に結合していることを意味するものとする。
【０１９８】
用語「調節配列」とは、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御要素(例えば、ポリアデニル化シグナル)を含むものとする。そのような調節配列は、例えば、Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)に記載されている。調節配列としては、多くのタイプの宿主細胞中でヌクレオチド配列の構成的発現を指示するものおよび特定の宿主細胞中でのみヌクレオチド配列の発現を指示するもの(例えば、組織特異的調節配列)を挙げ得る。発現ベクターのデザインが、形質転換する宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベル等のような要因に依存し得ることを当業者は理解する。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入して、それにより本明細書に説明するように核酸によりコードする融合タンパク質またはペプチドを含むタンパク質またはペプチド(例えば、ＮＯＶＸタンパク質、ＮＯＶＸタンパク質の突然変異型、融合タンパク質等)を生産し得る。
【０１９９】
本発明の組換え発現ベクターを、原核のまたは真核の細胞中におけるＮＯＶＸタンパク質発現用にデザインし得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質を、Escherichia coliのような細菌細胞、昆虫細胞(バキュロウイルス発現ベクターを使用して)、酵母細胞または哺乳類細胞中で発現し得る。適当な宿主細胞は、Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)においてさらに考察されている。これに代えて、組換え発現ベクターを、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いてインビトロで転写して、翻訳し得る。
【０２００】
真核細胞中におけるタンパク質の発現は最もしばしば、Escherichia coli中で融合タンパク質または非融合タンパク質のどちらかの発現を指示する構成的または誘導性プロモーターを含有するベクターを用いて行われる。融合ベクターは、その中にコードしたタンパク質に多数のアミノ酸を、通常には組換えタンパク質のアミノ末端に付加する。そのような融合ベクターは典型的に三つの目的に役立つ：(i)組換えタンパク質の発現を増大するため；(ii)組換えタンパク質の溶解性を増加するため；および(iii)アフィニティークロマトグラフィーにおけるリガンドとして作用することにより組換えタンパク質の精製を助けるため。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解による切断部位を融合部分および組換えタンパク質の接合部に導入して、融合部分から組換えタンパク質の分離に引き続いて融合タンパク質の精製を可能にする。そのような酵素、およびそれらと同種の認識配列としては、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ、トロンビンおよびエンテロキナーゼを挙げ得る。典型的な融合発現ベクターとしては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡをそれぞれ標的組換えタンパク質に融合させるｐＧＥＸ(Pharmacia Biotech Inc; Smith and Johnson, 1988. Gene 67: 31-40)、ｐＭＡＬ (New England Biolabs, Beverly, Mass.)およびｐＲＩＴ５ (Pharmacia, Piscataway, N.J.) を挙げ得る。
【０２０１】
適当な誘導性非融合E. coli発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ(Amrann et al., (1988) Gene 69:301-315)およびｐＥＴ１１ｄ (Studier et al., GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89)を挙げ得る。
【０２０２】
E. coliにおけるタンパク質発現を最大にする一つの戦略は、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力を障害した宿主細胞中でタンパク質を発現することである。Gottesman, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 119-128を参照されたい。もう一つの戦略は、それぞれのアミノ酸に対する個別のコドンをE. coliで優先的に使用するものとなるように、発現ベクターに挿入する核酸の核酸配列を変更することである(例えば、Wada, et al., 1992. Nucl. Acids Res. 20: 2111-2118を参照)。本発明の核酸配列のそのような変更は標準的ＤＮＡ合成技法により行い得る。
【０２０３】
もう一つの実施態様では、ＮＯＶＸ発現ベクターは酵母の発現ベクターである。酵母のSaccharomyces cerivisae中の発現ベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１ (Baldari, et al., 1987. EMBO J. 6: 229-234)、ｐＭＦａ(Kurjan and Herskowitz, 1982. Cell 30: 933-943)、ｐＪＲＹ８８ (Schultz et al., 1987. Gene 54: 113-123)、ｐＹＥＳ２(Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.)、およびｐｉｃＺ(InVitrogen Corp, San Diego, Calif.)を挙げ得る。
【０２０４】
これに代えて、ＮＯＶＸをバキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞中で発現し得る。培養昆虫細胞(例えば、ＳＦ９細胞)中でのタンパク質発現に利用可能なバクロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ(Smith, et al., 1983. Mol. Cell. Biol. 3: 2156-2165) およびｐＶＬシリーズ(Lucklow and Summers, 1989. Virology 170: 31-39)を挙げ得る。
【０２０５】
なおもう一つの実施態様では、本発明の核酸を、哺乳類の発現ベクターを用いて哺乳類細胞中で発現し得る。哺乳類の発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８(Seed, 1987. Nature 329: 840)およびｐＭＴ２ＰＣ(Kaufman, et al., 1987. EMBO J. 6: 187-195)を挙げ得る。哺乳類細胞中で使用するときには、発現ベクターの制御機能はしばしば、ウイルスの調節要素により提供される。例えば、普通に使用するプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０に由来する。原核のおよび真核の細胞両方にとって適当な他の発現系については、例えば、Chapters 16 and 17 of Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989を参照されたい。
【０２０６】
もう一つの実施態様では、組換え哺乳類表現ベクターは、特定の細胞タイプ中で優先的に核酸の発現を指示する能力がある(例えば、組織特異的調節要素を核酸を発現するために使用する)。組織特異的調節要素は当分野において公知である。適当な組織特異的プロモータの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター(肝臓特異的；Pinkert, et al., 1987. Genes Dev. 1: 268-277)、リンパ系特異的プロモーター(Calame and Eaton, 1988. Adv. Immunol. 43: 235-275)、特にT細胞受容体(Winoto and Baltimore, 1989. EMBO J. 8: 729-733)および免疫グロブリン (Banerji, et al., 1983. Cell 33: 729-740; Queen and Baltimore, 1983. Cell 33: 741-748)のプロモーター、ニューロン特異的プロモーター(例えば、ニューロフィラメントプロモーター; Byrne and Ruddle, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477)、膵臓特異的プロモーター(Edlund, et al., 1985. Science 230: 912-916)、ならびに乳腺特異的プロモーター(例えば、乳漿；米国特許第４,８７３,３１６号及びヨーロッパ出願公開第２６４,１６６号)を挙得る。例えば、マウスのｈｏｘプロモーター(Kessel and Gruss, 1990. Science 249: 374-379)およびα−フェトプロテインプロモーター(Campes and Tilghman, 1989. Genes Dev. 3: 537-546)の発生的に調節されるプロモーターも包含する。
【０２０７】
本発明はさらに、発現ベクターの中にアンチセンスの配向でクローン化した本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。即ち、ＤＮＡ分子は、ＮＯＶＸｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現(ＤＮＡ分子の転写による)を可能にするような様式で、調節配列に機能し得るように結合する。種々の細胞タイプ中のアンチセンスＲＮＡ分子の連続的発現を指示するアンチセンスの配向にクローン化した核酸に機能し得るように結合した調節配列、例えば、ウイルスのプロモーターおよび／またはエンハンサーを選択することができるか、またはアンチセンスＲＮＡの組織特異的または細胞タイプ特異的な構成的発現を指示する調節配列を選択することができる。アンチセンス発現ベクターは、ベクターを導入した細胞タイプにより活性を決定する高効率調節領域の制御下で、アンチセンス核酸を生産する組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒化ウイルスの形であり得る。アンチセンス遺伝子を用いた遺伝子発現の調節の考察については、例えば、Weintraub, et al., 「Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis」 Reviews-Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986を参照されたい。
【０２０８】
本発明のもう一つの態様は、本発明の組換え発現ベクターを導入する宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」を、本明細書においては互換的に使用する。そのような用語は、特定の対象の細胞のみならずそのような細胞の子孫または潜在的子孫をまた指すことを理解する。突然変異または環境の影響により後の世代に特定の修飾が生じるかもしれないため、そのような子孫は、実際には親細胞と同一ではないかもしれないが、本明細書において使用する用語の範囲内になお含まれる。
【０２０９】
宿主細胞は任意の原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質を、E. coliのような細菌細胞、昆虫細胞、酵母または哺乳類細胞(チャイニーズハムスター卵巣細胞(ＣＨＯ)またはＣＯＳ細胞)のような細菌の細胞中で発現することができる。他の適当な宿主細胞は当業者に周知である。
【０２１０】
ベクターＤＮＡを、従来の形質転換または形質移入技術により原核細胞または真核の細胞の中に導入することができる。本明細書において使用する用語「形質転換」および「形質移入」とは、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介性形質移入、リポフェクション、またはエレクトロポレーションを含む外来の核酸(例えばＤＮＡ)を宿主細胞に導入するために当分野で認める種々の技術を指すものとする。宿主細胞を形質転換しまたは形質移入するための適当な方法は、MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)および他の実験室マニュアルに見出すことができる。
【０２１１】
哺乳類細胞の安定的な形質移入については、使用される発現ベクターおよび形質移入の技法に依存して、細胞のごく小数のフラクションが外来性ＤＮＡをそのゲノムの中に組み込み得る。これらの組み込み体を同定し選択するために、選択可能なマーカー(例えば、抗生物質に対する抵抗性)が一般的に、興味のある遺伝子と一緒に宿主細胞に導入される。種々の選択可能なマーカーとしては、Ｇ４１８,ハイグロマイシンおよびメトトレキセートのような薬剤に抵抗性を与えるものが挙げられる。選択可能なマーカーをコードする核酸を、ＮＯＶＸをコードするものと同一のベクター上で宿主細胞に導入することができか、または別のベクター上で導入することもできる。導入された核酸で安定に形質移入された細胞は、薬剤選択により同定されることができる(例えば、選択可能なマーカーを組み込んでいる細胞は生き残る一方で、他の細胞は死ぬ)。
【０２１２】
培地中の原核細胞または真核細胞のような本発明の宿主細胞を用いて、ＮＯＶＸタンパク質を生産する(即ち、発現する)ことができる。したがって、本発明は、本発明の宿主細胞を用いるＮＯＶＸタンパク質の生産方法をさらに提供する。一つの実施態様では、その方法は、本発明の宿主細胞(その中にＮＯＶＸタンパク質をコードする組換え発現ベクターを導入する)を、ＮＯＶＸタンパク質を生産するような適当な培地中で培養することを含む。もう一つの実施態様では、その方法は、培地または宿主細胞からＮＯＶＸタンパク質を単離することをさらに含む。
【０２１３】
トランスジェニックＮＯＶＸ動物
本発明の宿主細胞をまた使用して、非ヒトトランスジェニック動物を生産し得る。例えば、一つの実施態様では、本発明の宿主細胞は、その中にＮＯＶＸタンパク質コード化配列を導入する受精卵母細胞または胚性幹細胞である。次いで、そのような宿主細胞を使用して、その中で外来性のＮＯＶＸ配列をゲノムの中に導入する非ヒトトランスジェニック動物、またはその中で内在性のＮＯＶＸ配列を変更する相同な組換え動物を創成することができる。そのような動物は、ＮＯＶＸタンパク質の機能および／または活性の研究にならびにＮＯＶＸタンパク質活性のモジュレーターの同定および／または評価に有用である。本明細書において使用する「トランスジェニック動物」とは、その中で動物の一つまたはそれ以上の細胞が導入遺伝子を含む非ヒト動物、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはラットまたはマウスのようなげっ歯類である。トランスジェニック動物の他の例としては、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両棲類等を挙げ得る。導入遺伝子は、それからトランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムの中に取り込まれ、そして成熟動物のゲノム内に残存して、それによりトランスジェニック動物の一つまたはそれ以上の細胞タイプまたは組織中におけるコード化遺伝子産物の発現を指令する外来性ＤＮＡである。本明細書において使用する「相同の組換え動物」とは、その中で内在性ＮＯＶＸ遺伝子が内在性遺伝子および、動物の細胞、例えば、動物の胚細胞の中に動物の発生前に導入された外来性ＤＮＡ分子との間で相同組換えにより変更した非ヒト動物、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはマウスである。
【０２１４】
本発明のトランスジェニック動物は、ＮＯＶＸをコードする核酸を受精卵母細胞の雄性前核の中に(例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染により)導入して、卵母細胞を偽妊娠雌性仮親動物の体内で発生することを可能にすることにより、創成することができる。配列番号２ｎ−１(ｎは１〜１０７の整数である)のヒトＮＯＶＸｃＤＮＡ配列を、非ヒト動物のゲノム内に導入遺伝子として導入することができる。これに代えて、マウスＮＯＶＸ遺伝子のようなヒトＮＯＶＸ遺伝子の非ヒト相同体を、ヒトＮＯＶＸのｃＤＮＡとのハイブリダイゼーション(上にさらに詳述)に基づいて単離して、導入遺伝子として使用し得る。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルもまた、導入遺伝子の発現効率を増加するために導入遺伝子中に含み得る。組織特異的調節配列をＮＯＶＸ導入遺伝子に機能し得るように結合して、特定の細胞にＮＯＶＸタンパク質の発現を指示し得る。胚の操作およびマイクロインジェクションによる、トランスジェニック動物、特にマウスのような動物の作成方法は当分野において従来的となってきており、例えば、米国特許第４,７３６,８６６号; ４,８７０,００９号; および４,８７３,１９１号;ならびにHogan, 1986. In: MANIPULATING THE MOUSE EMBRYO, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.に記載されている。類似の方法を他のトランスジェニック動物の生産に用い得る。初代トランスジェニック動物を、ゲノム内のＮＯＶＸ導入遺伝子の存在および／または動物の組織または細胞中におけるＮＯＶＸｍＲＮＡの発現に基づいて、同定し得る。次いで、初代トランスジェニック動物を、導入遺伝子を保持する追加的動物の繁殖に使用し得る。さらに、ＮＯＶＸタンパク質をコードする導入遺伝子を保持するトランスジェニック動物を使用して、他の導入遺伝子を保持するさらに別なトランスジェニック動物を繁殖し得る。
【０２１５】
相同の組換え動物を創成するために、その中に欠失、付加または置換を導入していて、それによりＮＯＶＸ遺伝子を変化させる例えば機能的に破壊するあるＮＯＶＸ遺伝子の少なくとも一部を含有するベクターを調製する。ＮＯＶＸ遺伝子は、ヒト遺伝子(例えば配列番号２ｎ−１(ｎは１〜１０７の整数である)のｃＤＮＡ)であり得るが、さらに好ましくはヒトＮＯＶＸ遺伝子の非ヒト相同体である。例えば、配列番号２ｎ−１(ｎは１〜１０７の整数である)のヒトＮＯＶＸ遺伝子のマウス相同体を使用して、マウスゲノム中の内在性ＮＯＶＸ遺伝子を変更するのに適する相同組換えベクターを構築することができる。一つの実施態様では、ベクターを、相同組換えにより、内在性遺伝子を機能的に破壊する(即ち、もはや機能的なタンパク質をコードしない；「ノックアウト」ベクターとも呼称する)ようにデザインする。
【０２１６】
これに代えて、ベクターは、相同組換えにより内在性ＮＯＶＸ遺伝子を変異するかまたは他のように変更するが、依然機能性タンパク質をコードする(例えば、上流の調節領域を変更してそれにより内在性ＮＯＶＸタンパク質の発現を変更する)ようにデザインし得る。相同組換えベクターでは、ＮＯＶＸ遺伝子の変更したタンパク質は、ＮＯＶＸ遺伝子のさらに別な核酸により５'末端または３'末端に隣接して、ベクターにより保持する外来性ＮＯＶＸ遺伝子および胚性幹細胞中の内在性ＮＯＶＸ遺伝子の間で相同組換えが起こることを可能にする。さらに別な隣接ＮＯＶＸ核酸は、内在性遺伝子と成功裏に相同組換えが起きるように十分な長さを持つ。典型的には、数キロ塩基の隣接ＤＮＡ(５'末端および３'末端の両方とも)をベクターに含み得る。相同組換えベクターの記載については、例えば、Thomas, et al., 1987. Cell 51: 503を参照されたい。次いで、ベクターを胚性幹細胞株に(例えば、エレクトロポレーションにより)導入し、そしてその中で導入したＮＯＶＸ遺伝子を内在性ＮＯＶＸ遺伝子と相同的に組み換えた細胞を選択する。例えば、Li, et al., 1992. Cell 69: 915を参照されたい。
【０２１７】
次いで、選択した細胞を動物(例えば、マウス)の胚盤胞の中に注入して、凝集キメラを形成する。例えば、Bradley, 1987. In: TERATOCARCINOMAS AND EMBRYONIC STEM CELLS: A PRACTICAL APPROACH, Robertson, ed. IRL, Oxford, pp. 113-152を参照されたい。次いで、キメラ胚を適当な偽妊娠雌性仮親動物に植え込んで、胚を満期出産する。生殖細胞内に相同組換えしたＤＮＡを保持している子孫を用いて、その中で動物の全ての細胞が、導入遺伝子の生殖系列を介した伝達により相同組換えＤＮＡを含有する動物を繁殖させることができる。相同組換えベクターおよび相同組換え動物を構築する方法は、Bradley, 1991. Curr. Opin. Biotechnol. 2: 823-829; ＰＣＴ国際公開第: ＷＯ９０／１１３５４号；ＷＯ９１／０１１４０号；ＷＯ９２／０９６８号;およびＷＯ９３／０４１６９号にさらに記載される。
【０２１８】
もう一つの実施態様では、導入遺伝子の調節発現を可能にする選択したシステムを含有する非ヒトトランスジェニック動物を生産し得る。そのようなシステムの一つの例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムである。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムの記載については、例えば、Lakso, et al., 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6232-6236を参照されたい。リコンビナーゼシステムのもう一つの例は、Saccharomyces cerevisiaeのＦＬＰリコンビナーゼシステムである。O'Gorman, et al., 1991. Science 251:1351-1355を参照されたい。もしｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムを用いて導入遺伝子の発現を調節するならば、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択したタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含有する動物が必要となる。そのような動物は、例えば、一つは選択したタンパク質をコードする導入遺伝子を含有し、他はリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含有する二つのトランスジェニック動物を交配させることによる「ダブル」トランスジェニック動物の構築により提供し得る。
【０２１９】
本明細書に説明した非ヒトトランスジェニック動物のクローンはまた、Wilmut, et al., 1997. Nature 385: 810-813に記載された方法にしたがって生産することができる。略述すれば、トランスジェニック動物から細胞(例えば体細胞)を単離し、誘導して、増殖サイクルから抜け出てＧ０期に入ることができる。次いで、静止細胞を、例えば、電気パルスの使用により静止細胞を単離したのと同じ種類の動物由来の脱核した卵母細胞と融合することができる。次いで、再構成した卵母細胞を、それを桑実胚または胚盤胞にまで発生させて、次いで擬妊娠雌性仮親動物に導入するように培養する。この雌性仮親動物から生まれた子孫は、細胞(例えば体細胞)を単離する動物のクローンである。
【０２２０】
医薬組成物
本発明のＮＯＶＸ核酸分子、ＮＯＶＸタンパク質、抗−ＮＯＶＸ抗体(本明細書では「活性化合物」ともいう)、ならびにそれらの誘導体、フラグメント、類似体および相同体を投与に適する医薬組成物の中に組込み得る。典型的に、そのような組成物は核酸分子、タンパク質または抗体およびおよび医薬的に許容され得る担体を含む。本明細書において使用する「医薬的に許容され得る担体」とは、医薬品投与に適合する任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌および抗かび剤、等張および吸収遅延剤等を含むことを意図する。適当な担体は、この分野で標準的な参照テキストであるRemingtonの薬剤学の最新版(出典明示により本明細書の一部とする)に記載されている。そのような担体または賦形剤の好ましい例としては、水、食塩水、フィンガー溶液、ブドウ糖溶液および５％ヒト血清アルブミンを挙げるが、それらに限定しない。リポソームおよび脂肪油のような非水溶性ビークルもまた使用する。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤は当分野において周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物に適合しない限りでなければ、組成物内のそれらの使用を意図する。補助的な活性化合物をまた、組成物の中に組込み得る。
【０２２１】
本発明の医薬組成物を、その意図する投与経路に適合するように処方する。投与経路の例としては、非経口の、例えば、静脈の、皮内の、皮下の、経口の(例えば、吸入)、経皮の(即ち局所の)、経粘膜のおよび直腸の投与を挙げ得る。非経口の、皮内のまたは皮下の応用に使用する溶液または懸濁液としては、以下の成分を挙げることができる：注射用水のような無菌賦形剤、食塩水溶液、脂肪油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)のようなキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩のような緩衝剤、ならびに塩化ナトリウムまたはブドウ糖のような等張性を調整する薬剤。塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基を用いてｐＨを調整することができる。非経口性製剤を、ガラスまたはプラスチックで作るアンプル、使い捨て注射器、または多回使用バイアルの中に封入し得る。
【０２２２】
注射用に適する医薬組成物としては、無菌水溶液(水溶性である場合)または分散液および無菌注射用の溶液または分散液の必要に応じて調合する製剤用の無菌粉末を挙げ得る。静脈投与のためには、適当な担体としては、生理食塩水、静菌性水、Cremophor EL[登録商標] (BASF, Parsippany, N.J.)またはリン酸緩衝食塩水(ＰＢＳ)を挙げ得る。全ての場合において、組成物は無菌でなければならず、容易に注射できる程度に流動性であるべきである。それは製造および保管の条件下で安定でなければならず、そして細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセリン、プロピレングリコールおよび液性ポリエチレングリコール等)ならびにそれらの適当な混合液を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性を、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散液の場合には必要な粒子径の維持により、および界面活性剤の使用により、保持し得る。微生物作用の保護は、種々の抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等、により達成される。多くの場合に、組成物中に、等張性薬剤、例えば、砂糖、マニトールのようなポリアルコール、ソルビトール、塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成剤の吸収の延長は、組成物中に吸収を遅延する薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含むことによりもたらせ得る。
【０２２３】
無菌注射用溶液を、適切な溶媒の中に一つまたは上で列挙した成分の組合せと共に必要な量で活性化合物(例えば、あるＮＯＶＸタンパク質または抗ＮＯＶＸ抗体)を組み込み、ついでろ過滅菌を行なうことにより調製することができる。一般的に、分散液は、基本的な分散媒体および上で列挙したものから必要な他の成分を含有する無菌ビークルの中に活性化合物を組み込むことにより調製することができる。無菌注射用溶液の調製のための無菌粉末の場合には、調製方法は、活性成分の粉末プラス前もって無菌ろ過されたその溶液からの任意のさらに別の望ましい成分の粉末を生成する真空乾燥および凍結乾燥である。
【０２２４】
一般的に、経口の組成物は、不活性賦形剤または食用の担体を含む。それらをゼラチンカプセル中に封入するかまたは錠剤に打錠することができる。経口治療投与の目的には、活性化合物を添加物と共に組込んで錠剤、トローチまたはカプセルの形状で使用することができる。経口の組成物をまた、うがい薬としての使用のために液体担体を用いて調製し得るが、そこでは液体担体中の化合物を経口的に塗布し、さっと取り除いて、吐き出すか飲み込む。薬学的に適合する結合剤、おおび／またはアジュバント材料を組成物の一部として含み得る。錠剤、丸剤、カプセル、トローチ等は任意の以下の成分または同様な性質を持つ化合物を含有し得る：微結晶セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンのような結合剤；デンプンまたは乳糖のような添加剤、アルギン酸、プリモゲルまたはコーンスターチのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはステロートのような滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素のような滑り剤；ショ糖またはサッカリンのような甘味剤；またはハッカ、サルチル酸メチル、オレンジ香料のような着香剤。
【０２２５】
吸入による投与のためには、化合物を、適当な噴射剤、例えば二酸化炭素のようなガスを含有する加圧容器またはディスペンザー、またはネブライザーからエアゾールスプレイの形式で送達し得る。
【０２２６】
全身的投与はまた、経粘液または経皮手段により得る。経粘液または経皮投与のためには、透過すべきバリアーに適切な浸透剤を処方に使用する。そのような浸透剤は当分野において一般的に公知であり、そして、例えば、経粘液投与のためには、洗剤、胆汁酸塩、フシジン酸誘導体を挙げ得る。経粘液投与は鼻腔スプレーまたは坐剤の使用により達成され得る。経皮投与のためには、活性化合物は、当分野において一般的に公知であるように、軟膏、軟膏剤、ゲルまたはクリームの中に処方される。
【０２２７】
化合物をまた、直腸送達のために坐薬(例えば、ココアバターおよび他のグリセリドのような従来の坐剤用基材と共に)または保持浣腸剤の形式で調製し得る。
【０２２８】
一つの実施態様において、活性化合物を、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤のように、化合物を身体からの迅速な排泄から防止する担体と共に調製する。酢酸エチレンビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ酢酸のような、生物分解性で生体適合性のポリマーを使用し得る。そのような製剤を調製する方法は当業者に明らかである。材料はまた、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals, Inc.から市販で入手可能である。リポソームの懸濁液(モノクローナル抗体を持つ感染した細胞からウイルス抗体に至って標的化したリポソームを含む)をまた、医薬的に許容され得る担体として使用することができる。これらを、例えば米国特許第４,５２２,８１１号に記載のように、当業者に公知の方法に従い調製し得る。
【０２２９】
投与の容易さおよび投与量の均一性のために、経口性または非経口性の組成物を単位投与剤型で処方することが特に有益である。本明細書で使用する単位投与剤型とは、処置する対象に対して単一の投与量として適する物理学的に分離した単位を指し；それぞれの単位は、必要な薬学的な担体と一緒に望ましい治療効果を生じるように計算した予め決められた量の活性化合物を含有する。本発明の単位投与剤型の規格は、活性化合物の特異な特色および達成するべき特別な治療効果、ならびにそのような活性化合物を個体の処置のために配合する当分野に固有の制限により指示されかつ直接に依存する。
【０２３０】
本発明の核酸分子をベクターの中に挿入して遺伝子治療ベクターとして使用することができる。遺伝子治療ベクターを、例えば、静脈注射、局所投与により(例えば、米国特許第５,３２８,４７０号を参照)または走触性注射(例えば、Chen, et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3054-3057を参照)により送達し得る。遺伝子治療ベクターの医薬製剤は、許容される賦形剤の中に遺伝子治療ベクターを含むか、またはその中に遺伝子治療ベクターを埋め込んだ持続性マトリックスを含み得る。これに代えて、完全な遺伝子治療ベクターを組換え細胞、例えばレテロウイルスベクターから無傷で生産し得る場合には、医薬製剤は遺伝子送達システムを生産する一つまたはそれ以上の細胞を含み得る。
医薬製剤を、投与指示書と共に、容器、パックまたはディスペンサーの中に含み得る。
【０２３１】
スクリーニングおよび検出の方法
以下に詳述するように、本発明の単離核酸分子を使用して、ＮＯＶＸタンパク質を発現し(例えば、遺伝子治療応用において宿主細胞中で組換え発現ベクターを介して)、ＮＯＶＸｍＲＮＡ(例えば、生物学的試料中の)またはＮＯＶＸ遺伝子中の遺伝的欠損を検出し、そしてＮＯＶＸ活性を調整することができる。加えて、ＮＯＶＸタンパク質を用いて、ＮＯＶＸタンパク質の活性または発現を調整する薬または化合物をスクリーニングし、ならびにＮＯＶＸタンパク質の不十分なまたは過剰な生産、またはＮＯＶＸの野生型タンパク質と比較して低下または異常な活性を有するＮＯＶＸタンパク質型の生産を特徴とする疾患(例えば；糖尿病(インスリン放出を調節する)；肥満(脂質に結合し輸送する)；肥満に関連した代謝障害、代謝的シンドロームＸならびに慢性障害および種々のがんに随伴する食欲不振および消耗性障害、ならびに感染性疾患(抗微生物活性を有する)および種々の異脂肪血症を処置し得る。加えて、本発明の抗ＮＯＶＸ抗体を使用して、ＮＯＶＸタンパク質を検出しかつ単離し、そしてＮＯＶＸ活性を調整し得る。なおさらなる態様では、本発明を方法で使用して、食欲、栄養の吸収および代謝基質の処分を正および負の両方の様式で影響させることができる。
本発明はさらに、本明細書に説明するスクリーニングアッセイで同定する新規な薬剤および上述の処置のためのそれらの使用に関する。
【０２３２】
スクリーニングアッセイ
本発明は、モジュレーター、即ち、ＮＯＶＸタンパク質に結合するか、または、例えばＮＯＶＸタンパク質の発現またはＮＯＶＸタンパク質の活性に促進的または阻害的作用を有する候補または試験化合物または薬剤(例えば、ペプチド、ペプチドミメティクス、低分子または他の薬)を同定する方法(本明細書では「スクリーニングアッセイ」とも呼称する)を提供する。本発明はまた、本明細書に説明するスクリーニングアッセイにおいて同定した化合物を含む。
【０２３３】
一つの実施態様では、本発明は、膜結合型のあるＮＯＶＸタンパク質またはポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分に結合するかまたは活性を調整する候補または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物を、生物学的ライブラリー；空間的にアドレス参照可能な並列の固相または液相ライブラリー；デコンボリューションを必要とする合成的ライブラリー方法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー方法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー方法：を含む、当分野において周知のコンビナトリアルライブラリーにおける数多くのアプローチのいずれを用いても得られる。生物学的ライブラリーのアプローチはペプチドライブラリーに限定される一方で、他の４種のアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の低分子ライブラリーに適用可能である。例えば、Lam, 1997. Anticancer Drug Design 12: 145を参照されたい。
【０２３４】
本明細書において使用する「低分子」とは、約５ｋＤ未満の、最も好ましくは約４ｋＤ未満の分子量を有する組成物を指す。低分子は、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチドミメティクス、炭水化物、脂質または他の有機のまたは無機の分子であり得る。化学的および／または、真菌、細菌、または藻類の抽出物のような、生物学的混合物は当分野において公知であり、本発明の任意のアッセイを用いてスクリーニングすることができる。
【０２３５】
分子ライブラリー合成方法の例を、例えば、DeWitt, et al., 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6909、Erb, et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 11422、Zuckermann, et al., 1994. J. Med. Chem. 37: 2678、Cho, et al., 1993. Science 261: 1303; Carrell, et al., 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059、Carell, et al., 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061、およびGallop, et al., 1994. J. Med. Chem. 37: 1233における当分野に見出し得る。
【０２３６】
化合物のライブラリーを、溶液中で(例えば、Houghten, 1992. Biotechniques 13: 412-421)、またはビーズ上で(Lam, 1991. Nature 354: 82-84)、チップ上で(Fodor, 1993. Nature 364: 555-556)、バクテリア(Ladner, 米国特許第５,２２３,４０９号)、胞子 (Ladner, 米国特許第５,２３３,４０９号)、プラスミド (Cull, et al., 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-1869)上でまたはファージ上で(Scott and Smith, 1990. Science 249: 386-390; Devlin, 1990. Science 249: 404-406、Cwirla, et al., 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 6378-6382、Felici, 1991. J. Mol. Biol. 222: 301-310、Ladner, 米国特許第５,２３３,４０９号)で提供し得る。
【０２３７】
ある実施態様では、アッセイは細胞に基づくアッセイであり、そこでは膜結合型のＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面に発現する細胞を試験化合物と接触させ、そして試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質に結合する能力を測定する。細胞は、例えば、哺乳類由来または酵母細胞であり得る。試験化合物がＮＯＶＸタンパク質に結合する能力を測定することは、例えば、試験化合物を放射性同位元素または酵素標識とカップリングして、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分への試験化合物の結合を、複合物中の標識化合物を検出することにより測定できるようにする。例えば、試験化合物を、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３Ｈで直接的にまたは間接的に標識し、そして放射性同位元素を放射線放射の直接計数またはシンチレーション計数により検出する。これに代えて、試験化合物を、例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼにより酵素的に標識し、そして適切な基質の生産物への変換の測定により酵素標識を検出する。ある実施態様では、アッセイは、膜結合型のＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面に発現する細胞を、ＮＯＶＸに結合する既知の化合物と接触して、アッセイ混合物を形成して、アッセイ混合物を試験化合物と接触し、そして試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することを含むが、そこでは試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することは、試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分に、既知化合物と比較して優先的に結合する能力を測定することを含む。
【０２３８】
もう一つの実施態様では、アッセイは細胞に基づくアッセイであり、膜結合型のＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面に発現する細胞を試験化合物と接触し、そして試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を調整する(例えば促進または阻害する)能力を測定することを含む。試験化合物がＮＯＶＸまたはその生物学的に活性な部分の活性を調整する活性を測定することは、例えば、ＮＯＶＸタンパク質があるＮＯＶＸの標的分子と結合するかまたは相互作用をする能力を測定することにより達成し得る。本明細書において使用する「標的分子」とは、自然界であるＮＯＶＸタンパク質が結合または相互作用する分子、例えば、あるＮＯＶＸと相互作用するタンパク質を発現する細胞表面の分子、２番目の細胞表面の分子、細胞外の環境中の分子、細胞膜の内側表面と会合している分子または細胞質の分子である。ＮＯＶＸの標的分子は、非ＮＯＶＸ分子または本発明のあるＮＯＶＸタンパク質またはポリペプチドであり得る。一つの実施態様では、あるＮＯＶＸの標的分子は、細胞外のシグナル(例えば、膜結合ＮＯＶＸ分子への化合物の結合により発生するシグナル)を細胞膜を通してかつ細胞内への伝達を促進する情報伝達経路の成分である。標的は、例えば、触媒活性を有する２番目の細胞内タンパク質または下流のシグナル分子とＮＯＶＸとの会合を促進するタンパク質であり得る。
【０２３９】
ＮＯＶＸタンパク質をあるＮＯＶＸの標的分子と結合するかまたは相互作用をする能力を測定することは、直接的な結合を測定する上述の方法の一つにより達成し得る。一つの実施態様では、ＮＯＶＸタンパク質があるＮＯＶＸの標的分子と結合または相互作用する能力を測定することは、標的分子の活性を測定することにより達成することができる。例えば、標的分子の活性を、標的の細胞性第二のメッセンジャー(即ち、細胞内Ｃａ２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ３等)の誘導を検出すること、適切な基質に対する標的の触媒／酵素活性を検出すること、受容体遺伝子(検出可能なマーカー、例えば、ルシフェラーゼ、をコードする核酸に機能し得るように結合したＮＯＶＸ応答性調節要素を含む)の誘導を検出すること、または細胞応答、例えば、細胞の生存、細胞の分化、または細胞の増殖、を検出することにより測定し得る。
【０２４０】
なおもう一つの実施態様では、本発明のアッセイは無細胞アッセイであって、あるＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物と接触し、そして試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分と結合する能力を測定することを含む。ＮＯＶＸタンパク質への試験化合物の結合を、上述のように、直接的または間接的のどちらかで測定することができる。一つのそのような実施態様では、アッセイは、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分をＮＯＶＸと結合する既知の化合物と接触して、アッセイ混合物を形成すること、アッセイ混合物を試験化合物と接触すること、および試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することを含むが、そこでは試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することは、試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分に既知化合物と比較して優先的に結合する能力を測定することを含む。
【０２４１】
なおもう一つの実施態様では、アッセイは、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性なタンパク質を試験化合物と接触し、そして試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性なタンパク質の活性を調整する(例えば促進または阻害する)能力を測定することを含む無細胞アッセイである。ＮＯＶＸの活性を調整する試験化合物の能力を測定することは、例えば、ＮＯＶＸタンパク質があるＮＯＶＸの標的分子に結合する活性を直接な結合を測定するために上述した方法の一つにより達成することができる。さらに別の実施態様では、試験化合物がＮＯＶＸタンパク質の活性を調節する能力を測定することは、ＮＯＶＸタンパク質がさらにあるＮＯＶＸの標的分子を調整する能力を測定することにより達成することができる。例えば、適切な基質に対する標的分子の触媒／酵素活性を上述のように測定することができる。
【０２４２】
なおもう一つの実施態様では、無細胞アッセイは、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分をＮＯＶＸタンパク質と結合する既知の化合物と接触して、アッセイ混合物を形成すること、アッセイ混合物を試験化合物と接触すること、そして試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することを含むが、そこでは試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することは、ＮＯＶＸタンパク質があるＮＯＶＸの標的分子に優先的に結合するかまたはその活性を調整する能力を測定することを含む。
【０２４３】
本発明の無細胞アッセイは、可溶性型または膜結合型のＮＯＶＸタンパク質の両方に使用することができる。膜結合型のＮＯＶＸタンパク質を含む無細胞アッセイの場合には、膜結合型のＮＯＶＸタンパク質を溶液中に維持するように、可溶化剤を利用するのが望ましい。そのような可溶化剤の例としては、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ[登録商標]Ｘ-１００、Ｔｒｉｔｏｎ[登録商標]Ｘ-１１４、Ｔｈｅｓｉｔ[登録商標]、イソトリデシポリ(エチレングリコールエーテル)ｎのような非イオン性界面活性剤、Ｎ−ドデシル−Ｎ,Ｎ−ジメチル−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−(３−クロルアミドプロピル)ジメチルアミニオール−１−プロパンスルホネート(ＣＨＡＰＳ)、または３−(３−クロルアミドプロピル)ジメチルアミニオール−２ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート(ＣＨＡＰＳＯ)を挙げ得る。
【０２４４】
本発明の上記のアッセイ法の二つ以上の実施態様において、ＮＯＶＸタンパク質またはその標的分子を固相化して、一つまたは両方のタンパク質の非複合型から複合型の分離を容易にし、ならびにアッセイの自動化に適合することができる。試験化合物のＮＯＶＸタンパク質への結合、または候補化合物存在下および非存在下でのＮＯＶＸタンパク質と標的分子との相互作用は、反応物質を含有するのに適する任意の容器において達成することができる。そのような容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管、およびマイクロ遠心チューブを挙げ得る。一つの実施態様では、一つまたは両方のタンパク質をマトリックスに結合することを可能にするドメインを付加する融合タンパク質を提供し得る。例えば、ＧＳＴ−ＮＯＶＸ融合タンパク質またはＧＳＴ−標的融合タンパク質をグルタチオンセファローズビーズ(Sigma Chemical, St. Louis, MO)またはグルタチオンで誘導体化したマイクロタイタープレート上に吸着し、これを次いで試験化合物、または試験化合物および非吸着標的タンパク質またはＮＯＶＸタンパク質のどちらかと結合し、そして混合物を複合体形成を促進する条件下で(例えば、塩およびｐＨに関して生理的な条件で)インキュベートする。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレート穴を洗滌して、非結合成分を全て除去し、ビーズの場合にはマトリックスを固定化し、複合体を例えば上述のように、直接的にまたは間接的に測定する。これに代えて、複合体をマトリックスから解離し、そしてＮＯＶＸタンパク質の結合または活性レベルを標準的技術を用いて測定することもできる。
【０２４５】
マトリックス上にタンパク質を固定化する他の技術をまた、本発明のスクリーニングアッセイに使用し得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質またはその標的分子のいずれかをビオチンおよびストレプトアビジンの結合を利用して固定化することができる。ビオチニル化ＮＯＶＸタンパク質または標的分子をビオチン−ＮＨＳ(Ｎ−ヒドロキシ−サクシンイミド)から当分野内で周知の技術(例えば、ビオチニル化キット、Pierce Chemicals, Rockford, Ill.)を用いて調製して、ストレプトアビジンをコーティングした９６穴プレート(Pierce Chemical)の穴に固定化することができる。これに代えて、ＮＯＶＸタンパク質または標的分子と反応性であるが、ＮＯＶＸタンパク質のその標的タンパク質への結合を妨害しない抗体をプレートの穴に誘導体化して、非結合標的またはＮＯＶＸタンパク質を抗体との結合により穴に捕捉することができる。そのような複合体を検出する方法としては、ＧＳＴ−固定化複合体について上述したものに加えて、ＮＯＶＸタンパク質または標的分子と反応する抗体を用いる複合体の免疫検出、ならびにＮＯＶＸタンパク質または標的分子に関連した酵素活性を検出することに依存する酵素結合アッセイを挙げ得る。
【０２４６】
もう一つの実施態様では、ＮＯＶＸタンパク質発現のモジュレータを、細胞を候補化合物と接触し、細胞中のＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を測定する方法で同定する。候補化合物の存在下でのＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを、候補化合物の非存在下でのＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルと比較する。次いで、候補化合物を、この比較に基づいてＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質のモジュレータとして同定し得る。例えば、ＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を候補化合物の存在下での方がその非存在下でよりも多い(即ち統計的に優位に多い)ときには、候補化合物を、ＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質発現の促進剤として同定する。これに代えて、ＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が候補化合物の存在下での方がその非存在下でよりも少ない(即ち統計的に優位に少ない)ときには、候補化合物を、ＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質発現の阻害剤として同定する。細胞中のＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のレベルを、ＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質を検出するために本明細書で説明する方法により測定することができる。
【０２４７】
本発明のなおもう一つの態様では、ＮＯＶＸタンパク質は２ハイブリッドアッセイまたは３ハイブリッドアッセイ(例えば米国特許第5,283,317号、Zervos, et al., 1993. Cell 72: 223-232、Madura, et al., 1993. J. Biol. Chem. 268: 12046-12054、Bartel, et al., 1993. Biotechniques 14: 920-924、Iwabuchi, et al., 1993. Oncogene 8: 1693-1696、および Brent 第ＷＯ９４／１０３００号を参照)おける「ベイトタンパク質」として使用して、ＮＯＶＸと結合または相互作用をしてＮＯＶＸ活性を調整する他のタンパク質(「ＮＯＶＸ結合タンパク質」または「ＮＯＶＸ−ｂｐ」)を同定し得る。そのようなＮＯＶＸ結合タンパク質はまた、例えば、ＮＯＶＸ経路の上流または下流の要素としてＮＯＶＸタンパク質によるシグナルの増幅に関与する可能性が高い。
【０２４８】
２ハイブリッドシステムは、分離可能なＤＮＡ結合および活性化ドメインより成る殆どの転写因子のモジュール構成的性質に基づく。略述すれば、アッセイには２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。１つの構築物においては、ＮＯＶＸをコードする遺伝子を既知の転写因子(例えば、ＧＡＬ−４)のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合する。他の構築物においては、未同定のタンパク質(「プレイ」または「試料」)をコードするＤＮＡ配列ライブラリー由来のＤＮＡを、既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合する。もし「ベイト」および「プレイ」タンパク質がインビボで相互作用してＮＯＶＸ依存性複合体を形成することができれば、転写因子のＤＮＡ結合および活性化ドメインを近くに引き寄せ得る。この近接は、転写因子に応答性の転写調節部位に機能し得るように結合したレポーター遺伝子(例えば、ＬａｃＺ)の転写を可能にする。レポーター遺伝子の発現を検出し、機能的転写因子を含有する細胞コロニーを単離し、そしてこれを用いてＮＯＶＸと相互作用するタンパク質をコードするクローン化遺伝子を得ることができる。
本発明はさらに前述のスクリーニングアッセイにより同定する新規薬剤および本明細書に説明する処置へのその使用に関する。
【０２４９】
検出アッセイ
本明細書で同定するｃＤＮＡの一部またはフラグメント(および対応する完全な遺伝子配列)をポリヌクレオチド試薬として種々の方式で使用することができる。例として、限定は無しに、これらの配列を：(i)染色体上にそれぞれの遺伝子をマップし；かくして遺伝的疾患に関連した遺伝子領域を位置決定する；(ii)微量の生物学的試料から個体を同定する(組織タイピング)；および(iii)生物学的試料の法医学的同定を助けるために用い得る。これらの応用の幾つかを以下のサブセクションで説明する。
【０２５０】
染色体マッピング
一旦遺伝子の配列(または配列の一部)を単離すれば、この配列を用いて、染色体上の遺伝子の位置をマップすることができる。この方法を染色体マッピングと呼ぶ。したがって、配列番号２ｎ−１(ｎは１〜１０７の整数である)であるＮＯＶＸ配列の一部またはフラグメント、またはそれらのフラグメントまたは誘導体を用いて、染色体上のＮＯＶＸ遺伝子の位置をそれぞれマップし得る。染色体へのＮＯＶＸ配列のマッピングは、これらの配列を疾患に関連する遺伝子と相関づける重要な第一歩である。
【０２５１】
略述すれば、ＮＯＶＸ遺伝子を、ＮＯＶＸ配列からＰＣＲプライマー(好ましくは１５−２５ｂｐ長)を調製することにより染色体にマップし得る。ＮＯＶＸ配列のコンピューター分析を使用して、そのため増幅プロセスを複雑にする、ゲノムＤＮＡ中の二つ以上のエキソンに亘らないプライマーを迅速に選択し得る。次いで、これらのプライマーを、個別のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用し得る。ＮＯＶＸ配列に対応するヒト遺伝子を含有するそれらのハイブリッドのが、増幅したフラグメントを生成する。
【０２５２】
体細胞ハイブリッドは、異なる哺乳類由来の体細胞(例えば、ヒトおよびマウスの細胞)を融合することにより調製する。ヒトおよびマウスの細胞のハイブリッドが増殖し、分裂するうちに、それらはヒト染色体をランダムな順序で徐々に欠失するが、マウスの染色体を保持する。特定の酵素を欠くためマウス細胞は増殖できないが、ヒト細胞は増殖できる培地を用いることにより、必要とする酵素をコードする遺伝子を含有する一つのヒト染色体を保持する。種々の培地を使用することにより、ハイブリッド細胞株のパネルを樹立し得る。パネル中のそれぞれの細胞株は、単一のヒト染色体または少数のヒト染色体、および完全なセットのマウス染色体を含有し、個別の遺伝子を特定のヒト染色体に容易にマップすることを可能にする。例えば、D'Eustachio, et al., 1983. Science 220: 919-924を参照されたい。ヒト染色体のフラグメントのみを含有する体細胞ハイブリッドをまた、転座および欠失を持つヒト染色体を用いることにより生産し得る。
【０２５３】
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の配列を特定の染色体に対応付ける迅速な手順である。単一のサーマルサイクラーを用いて、１日に３個以上の配列を対応付けることが可能である。ＮＯＶＸ配列を用いてオリゴヌクレオチドプライマーをデザインすることにより、特定の染色体由来のフラグメントのパネルを用いて細かな局在部位の特定化を達成し得る。
【０２５４】
分裂中期の染色体スプレッドへのＤＮＡ配列の蛍光インシツハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)をさらに用いて、正確な染色体上の位置を１ステップで提供し得る。染色体スプレッドを、コルセミドのような紡錘体を破壊する化学物質により細胞分裂を分裂中期でブロックされている細胞を用いて作成し得る。染色体を短時間トリプシンで処理し、次いでギムザ染色し得る。明暗のバンドのパターンがそれぞれの染色体上に出現し、それにより染色体を個別に同定し得る。ＦＩＳＨ技術を５００または６００塩基と短いＤＮＡ配列で使用し得る。しかしながら、１,０００塩基より大きなクローンは、簡単な検出に十分なシグナル強度で特定の染色体上の位置に結合する可能性がより高い。好ましくは１,０００塩基、そしてさらに好ましくは２,０００塩基が合理的な時間に良好な結果を得るのに十分である。この技術の総説については、Verma, et al., HUMAN CHROMOSOMES: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES (Pergamon Press, New York 1988を参照されたい。
【０２５５】
染色体マッピング用の試薬を個別に使用して、単一の染色体またはその染色体上の単一の部位を標識すること、または試薬のパネルを複数の部位および／または複数の染色体を標識するために使用し得る。遺伝子の非コード化領域に対応する試薬が実際には、マッピングの目的には好ましい。コード化領域を遺伝子ファミリー内で保存する可能性がより高く、かくして染色体マッピングの間に交叉ハイブリダイゼーションのチャンスが増大する。
【０２５６】
一旦配列を正確な染色体上の位置にマッピングすると、染色体上の配列の物理的な位置を遺伝子マップのデータと関連づけ得る。そのようなデータを、例えば、in McKusick, MENDELIAN INHERITANCE IN MAN (Hopkins University Welch Medical Libraryを通してオンラインで入手可能)に見出す。同じ染色体部位にマッピングした遺伝子と疾患との間の関係を、次いで、例えば、Egeland, et al., 1987. Nature, 325: 783-787に記載する関連分析(物理的に隣接している遺伝子の同時遺伝)により同定し得る。
【０２５７】
さらに、ＮＯＶＸ遺伝子に関連した疾患に罹患している個体と罹患していない個体の間のＤＮＡ配列の差を測定し得る。もし変異を罹患している個体のいくらかまたは全部で観察するが、罹患していない個体のいずれでも観察しないならば、変異は特定の疾患の原因剤である可能性が高い。罹患した個体と罹患していない個体の比較は一般的に、まず染色体スプレッドから視認可能な欠失または転座のような染色体の目に見える構造変化、またはそのＤＮＡ配列に基づくＰＣＲの使用で検出可能な構造変化の探索を伴う。最後に、数人の個体由来の遺伝子の完全なシークエンシングを行って、変異の存在を確認し、そして変異を多型性と区別し得る。
【０２５８】
組織タイピング
本発明のＮＯＶＸ配列をまた使用して、微量な生物学的試料から個体を同定し得る。この技術では、個体のゲノムＤＮＡを一つまたはそれ以上の制限酵素で消化して、サザンブロット上でプローブ結合し、同定用のユニークなバンドを生成する。本発明の配列は、ＲＦＬＰ(制限断片長多型、米国特許第５,２７２,０５７号に記載)のさらに別なＤＮＡマーカーとして有用である。
【０２５９】
さらに、本発明の配列を使用して、個体のゲノムの選択した部分の実際の塩基ごとのＤＮＡ配列を測定するさらに別な技術を提供し得る。かくして、本明細書に説明したＮＯＶＸ配列を用いて、配列の５'末端および３'末端から二つののＰＣＲプライマーを調製し得る。次いで、これらのプライマーを用いて、個体のＤＮＡを増幅し、引き続いてこれをシークエンシングし得る。
【０２６０】
それぞれの個体は、対立遺伝子の違いによるそのようなＤＮＡの特徴的セットを有するため、この様式で調製した個体由来の対応するＤＮＡ配列のパネルは、特徴的個体の同定を提供し得る。本発明の配列を使用して、個体および組織由来のそのような同定配列を得ることができる。本発明のＮＯＶＸ配列は、ヒトゲノムの部分を特徴的に表現する。対立遺伝子の変異は、これらの配列のコード化領域中にある程度起こり、そして非コード化領域中にはより大きな程度で起こる。個別のヒト間の対立遺伝子の変異は、５００塩基に約１個の頻度で起こるとみつもられる。対立遺伝子変異の多くは、制限断片長多型(ＲＦＬＰ)を含む単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)に因る。
【０２６１】
本明細書に説明する配列のそれぞれを、個体由来のＤＮＡを同定の目的で比較し得る標準として、ある程度、使用し得る。非コード化領域にはより多くの遺伝子多型が起こるため、個体を識別するにはより少ない配列が必要である。非コード化配列は、それぞれが１００塩基の非コード化増幅配列を生じる多分１０〜１,０００個のプライマーのパネルにより個体の明白な同定を無理なく提供し得る。もし配列番号２ｎ−１(ｎは１〜１０７の整数である)の配列のような予想するコード化配列を使用すれば、明白な個体の同定のためのさらに適切なプライマーの数は５００〜２,０００である。
【０２６２】
予測医学
本発明はまた、診断アッセイ、予後アッセイ、薬理ゲノミクス、および臨床試験のモニタリングを予後的(予測的)目的で使用し、それにより個体を予防的に処置する、予測医学の分野に関する。したがって、本発明の１つの態様は、ＮＯＶＸタンパク質および／または核酸の発現ならびにＮＯＶＸ活性を生物学的試料(例えば、血液、血清、細胞、組織)との関連で測定して、それにより個体が異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または障害に罹患しているか、または障害を発症するリスクを有しているか否かを測定するための診断アッセイに関する。障害としては、代謝障害、糖尿病、肥満、感染性疾患、食欲不振、がん関連悪液質、がん、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、および造血障害、ならびに種々の異脂肪血症、肥満に伴う代謝障害、代謝性シンドロームＸならびに慢性疾患および種々のがんに関連した消耗性疾患を挙げ得る。本発明はまた、個体がＮＯＶＸタンパク質、核酸の発現または活性に関連した障害を発症するリスクを有しているか否かを測定するための予後的(予測的)アッセイを提供する。例えば、あるＮＯＶＸ遺伝子の突然変異を生物学的試料中でアッセイし得る。そのようなアッセイを、予後的または予測的目的に使用し、それによりＮＯＶＸタンパク質、核酸の発現または生物学的活性を特徴とするかまたはこれと関連する障害の発生に先立って個体を予防的に処置し得る。
【０２６３】
本発明のもう一つの態様は、個体におけるＮＯＶＸタンパク質、核酸発現または活性を測定し、それによりその個体にとって適切な治療的または予防的な薬剤を選択する方法(本明細書では「薬理ゲノミクス」と呼称する)を提供する。薬理ゲノミクスは、個体の遺伝子型に基づいた個体の治療的または予防的処置のための薬剤(例えば薬)の選択を可能にする(例えば、個体の遺伝子型を検査して、個体が特定の薬剤に応答する能力を測定する)。
【０２６４】
本発明のなおもう一つの態様は、薬剤(例えば、薬、化合物)が臨床試験においてＮＯＶＸの発現または活性に与える影響をモニタリングすることに関する。
これらおよび他の薬剤については以下のセクションで詳細に説明する。
【０２６５】
診断的アッセイ
生物学的試料中におけるＮＯＶＸの存在または非存在を検出する例示的な方法は、被験対象から生物学的試料を得ること、および生物学的試料をＮＯＶＸタンパク質またはＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸(例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ)を検出する能力のある化合物または薬剤と接触し、ＮＯＶＸの存在が生物学的試料中で検出できるようにすることを伴う。ＮＯＶＸｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの検出用の薬剤は、ＮＯＶＸｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡとハイブリダイズする能力のある標識核酸プローブである。核酸プローブは、例えば、配列番号２ｎ−１(ｎは１〜１０７の整数である)の核酸のような全長ＮＯＶＸ核酸、または少なくとも１５、３０、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチド長でそして厳密な条件下でＮＯＶＸｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドの一部である。本発明の診断的アッセイにおいて使用するための他の適当なプローブを本明細書で説明する。
【０２６６】
ＮＯＶＸタンパク質検出用の薬剤は、ＮＯＶＸタンパク質に結合する能力のある抗体、好ましくは検出可能な標識を持つ抗体である。抗体は、ポリクローナル、またはさらに好ましくはモノクローナルであり得る。インタクトな抗体、またはそのフラグメント(例えば、ＦａｂまたはＦ(ａｂ')２)を使用し得る。プローブまたは抗体に関する用語「標識」とは、検出可能な物質をプローブまたは抗体にカップリングする(即ち物理的に連結する)ことによりプローブまたは抗体を直接的に標識すること、ならびに直接標識したもう一つの試薬との反応性によりプローブまたは抗体を間接的に標識することを包含する。間接的な標識の例としては、蛍光標識した第２抗体を用いた第１抗体の検出、および蛍光標識したストレブトアビジンで検出し得るように、ビオチンでＤＮＡプローブを末端標識することを挙げ得る。用語「生物学的試料」とは、対象から単離した組織、細胞および生物学的流体、ならびに対象内に存在する組織、細胞および流体を含む。即ち、本発明の検出法を使用して、インビトロおよびインビボで生物学的試料中のＮＯＶＸｍＲＮＡ、タンパク質、またはゲノムＤＮＡを検出し得る。例えば、ＮＯＶＸｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインシツハイブリダイゼーションを挙げ得る。ＮＯＶＸタンパク質を検出するためのインビトロ技術としては、酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)、ウエスタンブロット、免疫沈降、および免疫蛍光を挙げ得る。ＮＯＶＸゲノムＤＮＡを検出するためのインビトロ技術としては、サザンハイブリダイゼーションを挙げ得る。さらに、ＮＯＶＸタンパク質を検出するためのインビボ技術は、対象中へ標識抗ＮＯＶＸ抗体を導入することを含む。例えば、抗体を、対象中のその存在および位置を標準造影技術で検出し得る放射活性マーカーで標識することができる。
【０２６７】
一つの実施態様では、生物学的試料は被験対象由来のタンパク質分子を含有する。これ代えて、生物学的試料は、被験対象由来のｍＲＮＡ分子または被験対象由来のゲノムＤＮＡ分子を含有し得る。好ましい生物学的試料は、対象より従来の手段で単離した末梢血白血球試料である。
【０２６８】
もう一つの実施態様では、方法は、対照対象から対照の生物学的試料を得ること、対照試料をＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出する能力のある化合物または薬剤と、ＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を生物学的試料中で検出するように接触すること、および対照試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を試験試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡと比較することをさらに伴う。
【０２６９】
本発明はまた、生物学的試料中のＮＯＶＸの存在を検出するキットを包含する。例えば、キットは：生物学的試料中のＮＯＶＸタンパク質またはｍＲＮＡを検出する能力のある標識化合物または薬剤；試料中のＮＯＶＸの量を測定する手段；および試料中のＮＯＶＸの量を標準と比較する手段を含み得る。化合物および薬剤を適当な容器中に包装し得る。キットは、ＮＯＶＸタンパク質または核酸を検出するキットの使用のための使用説明書をさらに含み得る。
【０２７０】
予後アッセイ
さらに、本明細書に説明する診断方法を利用して、異常ＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または障害を有するかまたは発症するリスクにある対象を同定し得る。例えば、先行の診断アッセイおよび以下のアッセイのような、本明細書で説明するアッセイを利用して、ＮＯＶＸタンパク質、核酸の発現または活性に関連した障害を有するかまたは発症するリスクにある対象を同定し得る。これに代えて、予後アッセイを利用して、疾患または障害を有するかまたは発症するリスクにある対象を同定し得る。かくして、本発明は、試験試料を対象から得て、そして異常なＮＯＶＸタンパク質または核酸(例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ)を検出する異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または障害を同定する方法を提供し、そこではＮＯＶＸタンパク質または核酸の存在は、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または障害を有するかまたは発症するリスクにある対象に対する診断になる。本明細書において使用する「試験試料」とは、興味のある対象から得られる生物学的試料を指す。例えば、試験試料は生物学的流体(例えば血清)、細胞試料、または組織であり得る。
【０２７１】
さらに、本明細書に説明する予後アッセイを使用して、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または障害を処置するために、対象に薬剤(例えばアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチドミメティック、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子、または他の医薬候補物)を投与することができるか否かを決定し得る。例えば、そのような方法を使用して、対象の疾患を薬剤により有効に処置するか否かを決定し得る。かくして、本発明は、試験試料を得て、ＮＯＶＸタンパク質または核酸を検出する異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した障害を薬剤により対象を有効に処置し得るか否かを決定する方法を提供する(例えば、そこではＮＯＶＸタンパク質または核酸の存在は、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した障害を処置するために薬剤を投与され得る対象に対する診断になる)。
【０２７２】
本発明の方法をまた使用してあるＮＯＶＸ遺伝子中の遺伝的損傷を検出し、それにより損傷のある遺伝子を有する対象が異常な細胞増殖および／または分化を特徴とする障害のリスクにあるか否かを決定し得る。種々の実施態様において、これらの方法は、対象由来の細胞試料中において、あるＮＯＶＸタンパク質をコードする遺伝子の完全性に影響を及ぼす少なくとも一つの変更、またはＮＯＶＸ遺伝子の誤発現を特徴とする遺伝的損傷の存在または不在の検出を含む。例えば、そのような遺伝的損傷を、(i)あるＮＯＶＸ遺伝子からの一つまたはそれ以上のヌクレオチドの欠失；(ii)あるＮＯＶＸ遺伝子への一つまたはそれ以上のヌクレオチドの付加；(iii)あるＮＯＶＸ遺伝子の一つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換、(iv)あるＮＯＶＸ遺伝子の染色体再編成、(v)あるＮＯＶＸ遺伝子のｍＲＮＡ転写物レベルの変化、(vi)ゲノムＤＮＡのメチル化パターンのようなあるＮＯＶＸ遺伝子の異常修飾、(vii)あるＮＯＶＸ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、(viii)あるＮＯＶＸタンパク質の非野生型レベル、(ix)あるＮＯＶＸ遺伝子の対立遺伝子欠失、および(ｘ)あるＮＯＶＸタンパク質の不適切な翻訳後修飾の少なくとも一つの存在の確認により検出し得る。本明細書に説明するあるＮＯＶＸ遺伝子の損傷を検出するために使用し得る当分野において公知の多数のアッセイ技術が存在する。好ましい生物学的試料は、対象から従来の手段で単離した末梢血白血球試料である。しかしながら、例えば、頬粘膜細胞を含む有核細胞を含有する任意の生物学的試料を使用し得る。
【０２７３】
特定の実施態様では、損傷の検出は、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ ＰＣＲのようなポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)(例えば米国特許第４,６８３,１９５号および第４,６８３,２０２号を参照)におけるかまたはこれに代えて、連結連鎖反応(ＬＣＲ)(例えば、Landegran, et al., 1988. Science 241: 1077-1080、およびNakazawa, et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 360-364を参照)におけるプローブ／プライマーの使用を伴うが、後者はＮＯＶＸ遺伝子中の点突然変異検出に特に有用であり得る(Abravaya, et al., 1995. Nucl. Acids Res. 23: 675-682を参照)。この方法は、患者から細胞試料を集め、試料の細胞から核酸(例えば、ゲノム、ｍＲＮＡまたは両方)を単離し、ＮＯＶＸ遺伝子(もし存在するならば)のハイブリダイゼーションおよび増幅が起きるような条件下で、あるＮＯＶＸ遺伝子と特異的にハイブリダイズする一つまたはそれ以上のプライマーと核酸試料を接触し、そして増幅産物の存在または不在を検出し、または増幅産物のサイズを検出し、そして対照試料と長さを比較するステップを含み得る。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、本明細書に説明する変異の検出に使用する任意の技術と一緒に予備的増幅ステップとして使用するのが望ましい。
【０２７４】
さらに別な増幅法としては：自己保持配列複製(Guatelli, et al., 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878を参照)、転写増幅システム(Kwoh, et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173-1177を参照); Ｑβレプリカーゼ(Lizardi, et al, 1988. BioTechnology 6: 1197を参照)、または任意の他の核酸増幅法に引き続いて当業者に周知の技術を用いる増幅分子の検出を挙げ得る。これらの検出スキームは、核酸分子がごく少数で存在するならば、そのような分子の検出に特に有用である。
【０２７５】
さらに別の実施態様では、試料細胞由来のあるＮＯＶＸ遺伝子中の変異を、制限酵素切断パターンの変化により同定し得る。例えば、試料および対照のＤＮＡを単離し、増幅し(任意に)、一つまたはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼで処理し、そしてフラグメントのサイズをゲル電気泳動で測定して比較する。試料と対照のＤＮＡ間のフラグメントサイズの差は試料ＤＮＡ中の変異を示す。さらに、配列特異的リボザイム(例えば、米国特許第５,４９３,５３１号を参照)を使用して、リボザイム切断部位の発生または消失により特異的な変異の存在を評価し得る。
【０２７６】
他の実施態様では、ＮＯＶＸ中の遺伝的突然変異は、試料および対照の核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡを数百または数千個のオリゴヌクレオチドプローブを含有する高密度アレイにハイブリダイズすることにより同定することができる。例えば、Cronin, et al., 1996. Human Mutation 7: 244-255、Kozal, et al., 1996. Nat. Med. 2: 753-759を参照されたい。例えば、ＮＯＶＸ中の遺伝的変異を、上述のCronin, et al.に記載するように光を発生するＤＮＡプローブを含有する２次元アレイ中で同定し得る。略述すれば、プローブの１番目のハイブリダイゼーションアレイを用いて、試料と対照中の長い一続きのＤＮＡをスキャンして、一連の重なり合うプローブの線形アレイを作成することにより配列間の塩基変化を同定し得る。このステップは点突然変異の同定を可能にする。これに、検出した全ての変異体または突然変異に相補的なさらに小さな特別のプローブアレイを用いることにより特定の変異の特徴化を可能にする２番目のハイブリダイゼーションを行う。それぞれの変異アレイは、一つは野生型遺伝子に相補的で、他は突然変異遺伝子に相補的な並行なプローブのセットから成る。
【０２７７】
なおもう一つの実施態様において、当分野において公知の種々のシークエンシング反応のいずれかを使用してＮＯＶＸ遺伝子を直接にシークエンシングして、試料のＮＯＶＸの配列を対応する野生型(対照)配列と比較することにより変異を検出し得る。シークエンシング反応の例としては、Maxim and Gilbert, 1977. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 560またはSanger, 1977. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463により開発された技術に基づくものを挙げ得る。質量分析によるシークエンシング(例えば、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９４／１６１０１号; Cohen, et al., 1996. Adv. Chromatography 36: 127-162およびGriffin, et al., 1993. Appl. Biochem. Biotechnol. 38: 147-159を参照)を含む種々の自動化シークエンシング方法のいずれも診断アッセイの実施に際して利用され得ることをまた考え得る(例えば、Naeve, et al., 1995. Biotechniques 19: 448を参照)。
【０２７８】
ＮＯＶＸ遺伝子中の変異を検出する他の方法としては、切断剤からの保護を用いてＲＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖中のミスマッチ塩基を検出する方法を挙げ得る。例えば、Myers, et al., 1985. Science 230: 1242を参照されたい。一般に、「ミスマッチ切断」の当分野の技術は、野生型ＮＯＶＸ配列を含有する(標識した)ＲＮＡまたはＤＮＡを、組織試料より得る潜在的突然変異体のＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズすることにより形成したヘテロ二重鎖を提供することから始まる。二重鎖を、対照および試料の鎖の間の塩基のミスマッチのために存在する二重鎖の単鎖領域を切断する薬剤で処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖をＲＮａｓｅで処理し、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドはＳ１ヌクレアーゼで処置し、ミスマッチ領域を酵素的に処理し得る。他の実施態様では、ミスマッチ領域を消化するために、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡの二重鎖のどちらかをヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムおよびピペリジンで処理し得る。ミスマッチ領域の処理の後、得られた材料を次いで変性ポリアクリルアミドゲル上でサイズにより分離して変異の部位を決定する。例えば、Cotton, et al., 1988. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4397、Saleeba, et al., 1992. Methods Enzymol. 217: 286-295を参照されたい。一つの実施態様では、対照のＤＮＡまたはＲＮＡを検出用に標識し得る。
【０２７９】
なおもう一つの実施態様では、ミスマッチ切断反応は、細胞の試料より得られたＮＯＶＸｃＤＮＡ中で点突然変異を検出しマッピングするために、規定したシステム中で二重鎖ＤＮＡ中のミスマッチ塩基対を認識する一つまたはそれ以上のタンパク質(いわゆる「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素)を使用する。例えば、E. coliのｍｕｔＹ酵素はＧ／ＡミスマッチのＡを切断し、そしてＨｅＬａ細胞からのチミジンＤＮＡグリコシダーゼはＧ／ＴミスマッチのＴを切断する。例えば、Hsu, et al., 1994. Carcinogenesis 15: 1657-1662を参照されたい。例示的な実施態様によれば、あるＮＯＶＸ配列、例えば、野生型ＮＯＶＸ配列に基づくプローブを、試験細胞(複数を含む)由来のｃＤＮＡまたは他のＤＮＡ産物とハイブリダイズする。この二重鎖をＤＮＡミスマッチ修復酵素で処理して、切断生産物をもしあれば電気泳動のプロトコール等から検出し得る。例えば、米国特許第５,４５９,０３９号を参照されたい。
【０２８０】
他の実施態様では、電気泳動上の移動度の変化を用いて、ＮＯＶＸ遺伝子の突然変異を同定する。例えば、単鎖コンフォーメーション多型(ＳＳＣＰ)を使用して、突然変異体および野生型核酸の間の電気泳動移動度の差を検出し得る。例えば、Orita, et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 86: 2766、Cotton, 1993. Mutat. Res. 285: 125-144、Hayashi, 1992. Genet. Anal. Tech. Appl. 9: 73-79を参照されたい。試料および対照のＮＯＶＸ核酸の単鎖ＤＮＡフラグメントを変性し、復元することを可能にする。単鎖核酸の二次構造は配列により異なり、電気泳動上の移動度のそこで得る変化はたとえ１個の塩基変化の検出をも可能にする。ＤＮＡフラグメントを標識プローブで標識または検出し得る。アッセイの感度を、２次構造が配列変化により感受性であるＲＮＡ(ＤＮＡよりもむしろ)を使用することにより増大し得る。一つの実施態様では、主題の方法は、ヘテロ二重らせん分析を利用して、電気泳動の移動度の変化に基づいて二重らせんへテロ二重鎖分子を分離する。例えば、Keen, et al., 1991. Trends Genet. 7: 5を参照されたい。
【０２８１】
なおもう一つの実施態様では、ある勾配の変性剤を含有するポリアクリルアミドゲル中での突然変異体または野生型フラグメントの移動を、変性濃度勾配ゲル電気泳動(ＤＧＧＥ)を用いてアッセイする。例えば、Myers, et al., 1985. Nature 313: 495を参照されたい。ＤＧＧＥを分析法として使用する際、ＤＮＡを修飾し、例えば、凡そ４０ｂｐの高融点ＧＣ富化ＤＮＡのＧＣクランプをＰＣＲで付加することにより、それが完全に変性しないことを保証する。さらなる実施態様では、変性勾配に代えて温度勾配を使用して、対照および試料のＤＮＡの移動度の差を同定する。例えば、Rosenbaum and Reissner, 1987. Biophys. Chem. 265: 12753を参照されたい。
【０２８２】
点突然変異を検出するための他の技術の例として、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長を挙げ得るが、これらに限定しない。例えば、既知の変異を中央に置いたオリゴヌクレオチドプライマーを調製し、次いで完全なマッチが見られる場合にのみハイブリダイゼーションを認める条件下で、標的ＤＮＡとハイブリダイズする。例えば、Saiki, et al., 1986. Nature 324: 163、Saiki, et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6230を参照されたい。オリゴヌクレオチドをハイブリダイズ用膜に付着して、標識した標的ＤＮＡとハイブリダイズする際、そのような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ増幅した標的ＤＮＡまたはある数の異なる突然変異体とハイブリダイズする。
【０２８３】
これに代えて、選択的ＰＣＲ増幅に基づく対立遺伝子特異的増幅技術を本発明と一緒に使用し得る。特異的増幅のためのプライマーとして使用するオリゴヌクレオチドは、興味のある変異を分子の中央で(増幅がディファレンシャルハイブリダイゼーションに依存するように；例えば、Gibbs, et al., 1989. Nucl. Acids Res. 17: 2437-2448を参照)または適切な条件下で、ミスマッチがポリメラーゼ伸長を阻止または低減できる(例えば、Prossner, 1993. Tibtech. 11: 238を参照)一つのプライマーの３'最末端において保持していてもよい。加えて、切断に基づく検出を創成するために、変異の領域に新規制限部位を導入するのが望ましい。例えば、Gasparini, et al., 1992. Mol. Cell Probes 6: 1を参照されたい。特定の実施態様では、増幅はまた、増幅のためのＴａｑリガーゼを使用して実施され得ることを予想する。例えば、Barany, 1991. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 189を参照されたい。このような場合には、５'末端配列の３'末端に完全なマッチがある場合にのみ連結が起こり、増幅の存在または不在を調べることにより特定の部位における既知の変異の存在を検出することを可能にする。
【０２８４】
本明細書に説明する方法を、例えば、本明細書に説明する少なくとも１つのプローブ核酸または抗体試薬を含むプレパック診断キットを利用することにより実施し得る。これを、例えば、臨床の場においてＮＯＶＸ遺伝子の関与する疾患または疾病の症状を示すかまたは家族歴のある患者を診断するのに簡便に使用し得る。
【０２８５】
さらに、ＮＯＶＸを発現する任意の細胞タイプまたは組織、好ましくは末梢血白血球を本明細書に説明した予後アッセイに利用し得る。しかしながら、例えば、頬粘膜細胞の有核細胞を含む任意の生物学的試料を使用し得る。
【０２８６】
薬理ゲノミクス
本明細書に説明したスクリーニングアッセイにより同定するようなＮＯＶＸ活性(例えば、ＮＯＶＸ遺伝子発現)に促進的または阻害的効果を有する薬剤またはモジュレータを個体に投与し、障害を(予防的にまたは治療的に)処置することができる。障害としては、限定しないが、表Ａに要約するような代謝障害、糖尿病、肥満、感染性疾患、食欲不振、がん関連悪液質、がん、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、および造血障害、ならびに種々の異脂肪血症、肥満に伴う代謝障害、慢性疾患および種々のがんに関連した代謝性シンドロームＸならびに消耗性疾患を挙げ得る。そのような処置と一緒に、個体の薬理ゲノミクス(即ち、個体の遺伝子型および外来性化合物または薬に対するその個体の応答との間の関係の研究)を考慮し得る。治療薬の代謝の差は、薬理学的に活性な薬の用量と血中濃度の関係を変えることにより、重症の毒性または治療の失敗をもたらし得る。かくして、個体の薬理ゲノミクスは、個体の遺伝子型の考慮に基く予防的または治療的処置ための有効な薬剤(例えば薬)の選択を許容する。そのような薬理ゲノミクスをさらに用いて、適切な投与量および治療方法を決定し得る。したがって、個体のＮＯＶＸタンパク質の活性、ＮＯＶＸ核酸の発現、またはＮＯＶＸ遺伝子の変異の含量を測定し、それにより個体の治療的処置または予防的処置に適切な薬剤(複数を含む)を選択し得る。
【０２８７】
薬理ゲノミクスは、罹患した人における変化した薬剤分布および異常な作用に因る薬への応答における臨床的に優位な遺伝的変異を取り扱う。例えば、Eichelbaum, 1996. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., 23: 983-985; Linder, 1997. Clin. Chem., 43: 254-266を参照されたい。一般に、二つのタイプの薬理遺伝学的異常を区別し得る。薬が身体に作用する方式を変える単一の因子として伝達する遺伝的異常(変化した薬剤作用)または身体が薬に作用する方式を変える単一因子として伝達する遺伝的異常(変化した薬物代謝)がある。これらの薬理遺伝学的異常は、稀な欠陥または多型性のどちらかとして生じ得る。例えば、グルコース−６−リン酸脱水素酵素(Ｇ６ＰＤ)欠乏症は、よくみられる遺伝性酵素異常症であり、そこでは主な臨床的合併症は、酸化剤の薬(抗マラリア剤、スルホンアミド剤、鎮痛剤、ニトロフラン類)摂取後またはソラマメ摂食後の溶血である。
【０２８８】
例示的実施態様として、薬の代謝酵素の活性は、薬の作用の強度および持続の両者の主たる決定因子である。薬の代謝酵素の遺伝的多型性(例えば、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２(ＮＡＴ２)ならびにチトクローム妊娠帯前駆タンパク質酵素のＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９)の発見は、なぜ或る患者は標準かつ安全用量の薬物摂取後に期待した薬の効果を得られないかまたは過大な薬の応答および重篤な毒性を示すのかについての説明を提供する。これらの多型性を、人口集団で高代謝群(ＥＭ)および低代謝群(ＰＭ)の２つの表現型で表現する。ＰＭの存在比率は異なる集団間で異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は高度に多型性で、そして幾つかの変異が、機能的なＣＹＰ２Ｄ６の不在をもたらすＰＭを同定する。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９の低代謝群は、標準的な用量の投与を受けた際、極めて頻繁に過剰な薬の応答および副作用を経験する。代謝物が活性な治療成分であるならば、ＣＹＰ２Ｄ６が生成する代謝物モルヒネにより仲介するコデインの鎮痛作用について実証するように、ＰＭは治療応答を示さない。それと全く正反対なのが、標準の用量に応答しないいわゆる超高速代謝群である。最近、超高速代謝群の分子的根拠をＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅に因ると確認する。
【０２８９】
従って、個体のＮＯＶＸタンパク質の活性、ＮＯＶＸ核酸の発現、またはＮＯＶＸ遺伝子の変異含量を測定し、それにより個体の治療的処置または予防的処置のために適切な薬剤(複数を含む)を選択し得る。加えて、薬理遺伝学的研究を用いて、薬の代謝酵素をコードする遺伝子多型の対立遺伝子の遺伝子型決定を、個体の薬の応答性の表現型の同定に応用し得る。この知識を投与量および薬の選択に応用する際、本明細書で説明する例示的スクリーニングアッセイの一つにより同定したモジュレータのようなＮＯＶＸモジュレータで対象を処置する際に、有害作用または治療失敗を避け、かくして治療的または予防的効率を増強し得る。
【０２９０】
臨床試験の作用モニタリング
ＮＯＶＸの発現または活性(例えば、異常な細胞増殖および／または分化を調整する活性)に対する薬剤(例えば、薬、化合物)の影響をモニタリングすることは、基礎的な薬のスクリーニングに応用できるだけでなく、また臨床試験にも応用できる。例えば、本明細書に説明したようにスクリーニングアッセイにより、ＮＯＶＸ遺伝子発現、タンパク質レベルを増加し、またはＮＯＶＸ活性を上方調節すると決定した薬剤の有効性を、低下したＮＯＶＸ遺伝子発現、タンパク質レベル、または下方制御されたＮＯＶＸ活性を示す対象の臨床試験でモニターし得る。これに代えて、ＮＯＶＸ遺伝子発現、タンパク質レベルを減少し、またはＮＯＶＸ活性を下方調節すると決定した薬剤の有効性を、増加したＮＯＶＸ遺伝子発現、タンパク質レベル、または上方制御したＮＯＶＸ活性を示す対象の臨床試験でモニターし得る。そのような臨床試験において、ＮＯＶＸ、および、好ましくは、例えば、細胞増殖または免疫障害に関係する他の遺伝子の発現または活性を、特定の細胞の免疫応答性の「読み出し」またはマーカーとして使用し得る。
【０２９１】
限定しない例として、ＮＯＶＸ活性(例えば、本明細書で説明するスクリーニングアッセイで同定する)を調整する薬剤(例えば、化合物、薬または低分子)を用いた処置により細胞中で調整するＮＯＶＸを含む遺伝子を同定し得る。従って、細胞増殖障害に対する薬剤の効果を、例えば、臨床試験において検討するために、細胞を単離してＲＮＡを調製し、そして障害に関連すると思うＮＯＶＸおよび他の遺伝子の発現レベルを分析し得る。遺伝子発現レベル(即ち、遺伝子発現パターン)を、本明細書に説明するようにノーザンブロット分析またはＲＴ−ＰＣＲにより、またはこれに代えて本明細書で説明する方法の一つにより生産したタンパク質の量を測定することにより、またはＮＯＶＸまたは他の遺伝子の活性レベルを測定することにより、定量することができる。この様式においては、遺伝子発現パターンは、薬剤に対する細胞の生理学的応答を示すマーカーとしての役割を果たす。したがって、薬剤による個体の処置の前および処置中の種々の時点で、この応答状態を測定し得る。
【０２９２】
一つの実施態様において、本発明は、薬剤(例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、タンパク質、ペプチド、ペプチドミメティック、核酸、低分子、または本明細書で説明するスクリーニングアッセイで同定した他の薬候補物)で対象を処置することの有効性をモニターする方法を提供し、その方法は、(i)薬剤投与前に対象から投与前試料を得て、(ii)投与前試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現レベルを検出し、(iii)対象から一つまたはそれ以上の投与後の試料を得て、(iv)投与後の試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性レベルを検出し、(v)投与前の試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性レベルを投与後のひとつまたは複数の試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡと比較し、そして(vi)それにしたがって対象への薬剤の投与を変更するステップを含む。例えば、ＮＯＶＸの発現または活性を検出したより高レベルに増加するためには、即ち、薬剤の有効性を増加するためには、薬剤の増加した投与が望ましい。これに代えて、ＮＯＶＸの発現または活性を検出したより低レベルに減少する、即ち、薬剤の有効性を減少するためには、薬剤の減少した投与が望ましい。
【０２９３】
処置方法
本発明は、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患のリスクにある(感受性)かまたは疾患を有する対象を処置する予防的方法および治療的方法の両方を提供する。障害としては、心筋症、アテローム性動脈硬化症、高血圧、先天性心疾患、大動脈弁狭窄、心房中隔欠損症(ＡＳＤ)、房室(Ａ−Ｖ)管欠損、動脈管、肺動脈弁狭窄、大動脈弁下部狭窄、心室中隔欠損症(ＶＳＤ)、弁疾患、結節硬化症、強皮症、肥満、移植、副腎白質萎縮症、先天性副腎過形成、前立腺がん、新生物、腺がん、リンパ腫、子宮がん、受胎能、血友病、凝固性亢進、特発性血小板減少性紫斑病、免疫不全症、移植片対宿主病、ＡＩＤＳ、気管支喘息、クローン病；多発性硬化症、アルブライト遺伝性骨ジストロフィーの処置ならびに類似の他の疾患、障害および異常を挙げ得、前列挙のこれらの疾患、障害および状態に限定しないが、より具体的には表Ａに要約されるもののような、ＮＯＶＸタンパク質の相同物と連関するそれらの疾患、障害または状態を含むものである。
これらの処置法を以下にさらに詳細に考察する。
【０２９４】
疾患および障害
増加したレベル(疾患または障害に罹患していない対象と比べて)または生物学的活性を特徴とする疾患および障害を、活性に拮抗する(即ち、低下するかまたは阻害する)治療薬で処置し得る。活性に拮抗する治療薬を、治療的様式または予防的様式で投与し得る。利用し得る治療薬としては、(i)前述のペプチド、またはその類似体、誘導体、フラグメントまたは相同体；(ii)前述のペプチドに対する抗体；(iii)前述のペプチドをコードする核酸；(iv)アンチセンス核酸および前述のペプチドの内在的機能を相同組換えにより「ノックアウト」するのに使用する「機能障害性」である核酸(即ち、前述のペプチドに対するコード化配列のコード化配列内への異種挿入に因る)の投与(例えば、Capecchi, 1989. Science 244: 1288-1292を参照)；または(v)前述のペプチドおよびその結合相手との相互作用を変化するモジュレータ(即ち、本発明のさらに別なペプチドのミメティックまたは本発明のペプチドに特異的な抗体を含む阻害剤、アゴニスト、アンタゴニスト)を挙げ得るが、これらに限定しない。
【０２９５】
減少したレベル(疾患または障害に罹患していない対象と比べて)または生物学的活性を特徴とする疾患および障害を、活性を増加する(即ち、アゴニストである)治療薬で処置し得る。活性を上方制御する治療薬を、治療的様式または予防的様式で投与し得る。利用し得る治療薬としては、前述のペプチド、またはその類似体、誘導体、フラグメント、または相同体；またはバイオアベイラビリティーを増加するアゴニストを挙げ得るが、これらに限定しない。
【０２９６】
増加または減少したレベルを、患者の組織試料(例えば、生検組織から)を得て、インビトロでＲＮＡまたはペプチドのレベル、発現したペプチド(または前述のペプチドのｍＲＮＡ)の構造および／または活性をアッセイすることにより、ペプチドおよび／またはＲＮＡを定量することにより容易に検出し得る。当分野内で周知の方法としては、イムノアッセイ(例えば、ウエスタンブロット分析、免疫沈降とそれに引き続くドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)ポリアクリルアミドゲル電気泳動、免疫細胞化学、等)および／またはｍＲＮＡ発現を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイ(例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、インシツハイブリダイゼーション、等)を挙げ得るが、これらに限定しない。
【０２９７】
予防的方法
一つの態様では、異常なＮＯＶＸ発現または少なくともあるＮＯＶＸ活性を調整する薬剤を対象に投与することにより、本発明は、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または異常を、対象において予防する方法を提供する。異常なＮＯＶＸの発現または活性が原因または一因となって生じる疾患のリスクを有する対象を、例えば、本明細書で説明するように診断的アッセイまたは予後的アッセイのいずれかまたはそれらの組合せによって同定し得る。疾患または障害を予防し、または、これに代えて、その進行を遅らせるようにＮＯＶＸ異常に特徴的な症状の出現に先立って予防的薬剤の投与を行い得る。ＮＯＶＸ異常のタイプに依存して、例えば、あるＮＯＶＸアゴニストまたはＮＯＶＸアンタゴニストである薬剤を対象の処置に使用し得る。適切な薬剤を、本明細書で説明するスクリーニング法に基づいて決定することができる。本発明の予防的方法をさらに以下のサブセクションで考察する。
【０２９８】
治療的方法
本発明のもう一つの態様は、治療目的のためにＮＯＶＸの発現または活性を調整する方法に関する。本発明の調整方法は、細胞を細胞に関連するＮＯＶＸタンパク質活性の一つまたはそれ以上の活性を調整する薬剤と接触することを含む。ＮＯＶＸタンパク質活性を調整する薬剤は、核酸またはタンパク質、あるＮＯＶＸタンパク質の天然に存在する同属のリガンド、ペプチド、あるＮＯＶＸペプチドミメティック、または低分子のような本明細書に説明する薬剤であり得る。一つの実施態様では、薬剤は一つまたはそれ以上のＮＯＶＸタンパク質活性を促進する。そのような促進的薬剤の例としては、活性なＮＯＶＸタンパク質および細胞中に導入したＮＯＶＸをコードする核酸分子を挙げ得る。もう一つの実施態様では、薬剤は一つまたはそれ以上のＮＯＶＸタンパク質活性を阻害する。そのような阻害的薬剤の例としては、アンチセンスＮＯＶＸ核酸分子および抗−ＮＯＶＸ抗体を挙げ得る。これらの調整方法は、インビトロで(例えば、細胞を薬剤と共に培養することにより)または、これに代えて、インビボで(例えば、薬剤を対象に投与することにより)実施し得る。このように、本発明はあるＮＯＶＸタンパク質または核酸分子の異常な発現または活性を特徴とする疾患または障害に罹患した個体を処置する方法を提供する。一つの実施態様では、その方法は、薬剤(例えば、本明細書で説明するスクリーニングアッセイで同定した薬剤)またはＮＯＶＸの発現または活性を調整する(例えば、上方制御または下方制御する)薬剤の組合せを投与することを伴う。もう一つの実施態様では、その方法は減少または異常なＮＯＶＸの発現または活性を補償するための治療としてあるＮＯＶＸタンパク質または核酸分子を投与することを伴う。
【０２９９】
ＮＯＶＸが異常に下方制御されているかおよび／または増加したＮＯＶＸ活性が有益な効果を有すると思われる状況では、ＮＯＶＸ活性を促進することが望ましい。そのような状況の一つの例は、対象が異常な細胞増殖および／または分化(例えば、がんまたは免疫関連疾患)を特徴とする障害を有する場合である。そのような状況のもう一つの例は、対象が妊娠性疾患(例えば、子癇前症)を有する場合である。
【０３００】
治療薬の生物学的効果の測定
本発明の種々の実施態様において、適切なインビトロまたはインビボアッセイを実施して、特定の治療薬の効果およびその投与を罹患している組織の処置に適応があるか否かを決定する。
【０３０１】
種々の特定の実施態様において、患者の障害に関与する代表的なタイプ(複数を含む)の細胞についてインビトロアッセイを実施して、投与した治療薬が細胞タイプに所望の効果を発揮するかどうかを測定し得る。治療に使用する化合物を、ヒト対象での試験に先立って、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギ等を限定することなく含む適切な動物モデルシステムで試験し得る。同様に、インビボ試験でも、ヒト対象への投与に先立って、当分野において公知の動物モデルシステムのいずれかを使用し得る。
【０３０２】
本発明の組成物の予防的使用および治療的使用
本発明のＮＯＶＸ核酸およびタンパク質は：代謝性障害、糖尿病、肥満、感染性疾患、食欲不振、癌関連、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、造血障害、ならびに種々の異脂肪血症、肥満に伴う代謝障害、代謝性シンドロームＸならびに慢性疾患および種々のがんに関連した消耗性疾患を限定することなく、含み、種々の障害に関連する潜在的で予防的応用および治療的応用に有用である。
【０３０３】
例として、本発明のＮＯＶＸタンパク質をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療に有用であり得、そしてタンパク質は、それを必要とする対象に投与する際に有用であり得る。非限定的な例として、本発明の組成物は、限定しないがここに列挙のものを含む疾患、障害または状態などに罹患する対象の処置のための効験を有するであろう。
【０３０４】
ＮＯＶＸタンパク質をコードする新規核酸、および本発明のＮＯＶＸタンパク質の両方、またはそれらのフラグメントはまた、核酸またはタンパク質の存在または量を評価する診断的応用にも有用であり得る。さらなる使用は、抗細菌分子(即ち、或るペプチドは抗細菌的性質を有することが見出されている)としてであるかもしれない。これらの物質は、治療的または診断的方法に使用するための本発明の新規物質に免疫特異的に結合する抗体の作成にさらに有用である。
本発明を、以下の実施例でさらに記載し、これらはクレームに記載の発明の範囲を限定しない。
【０３０５】
実施例
実施例Ａ．ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列、および相同性データ
実施例１．
ＮＯＶ１クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表１Ａに示す。
【表５】
2005528080.tif 000006
【０３０６】
表１Ａの続き
【表６】
2005528080.tif 000007
【０３０７】
表１Ａの続き
【表７】
2005528080.tif 000008
【０３０８】
表１Ａの続き
【表８】
2005528080.tif 000009
【０３０９】
ＮＯＶ１ａタンパク質のさらなる解析により、表１Ｂに示す以下の特性が得られた。
【表９】
2005528080.tif 000010
【０３１０】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ１ａタンパク質の検索により、表１Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表１０】
2005528080.tif 000011
【０３１１】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ１ａのタンパク質は、表１ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表１１】
2005528080.tif 000012
【０３１２】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ１ａタンパク質は表１Ｅに示すドメインを含有すると予想される。
【表１２】
2005528080.tif 000013
【０３１３】
実施例２．
ＮＯＶ２クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表２Ａに示す。
【表１３】
2005528080.tif 000014
【０３１４】
表２Ａの続き
【表１４】
2005528080.tif 000015
【０３１５】
表２Ａの続き
【表１５】
2005528080.tif 000016
【０３１６】
表２Ａの続き
【表１６】
2005528080.tif 000017
【０３１７】
表２Ａの続き
【表１７】
2005528080.tif 000018
【０３１８】
前記タンパク質配列の配列比較により、表２Ｂに示す以下の配列関係が得られた。
【表１８】
2005528080.tif 000019
【０３１９】
ＮＯＶ２ａタンパク質のさらなる解析により、表２Ｃに示す以下の特性が得られた。
【表１９】
2005528080.tif 000020
【０３２０】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ２ａタンパク質の検索により、表２Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表２０】
2005528080.tif 000021
【０３２１】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ２ａのタンパク質は、表２ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表２１】
2005528080.tif 000022
【０３２２】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ２ａタンパク質は表２Ｆに示すドメインを含有すると予想される。
【表２２】
2005528080.tif 000023
【０３２３】
実施例３．
ＮＯＶ３クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表３Ａに示す。
【表２３】
2005528080.tif 000024
【０３２４】
表３Ａの続き
【表２４】
2005528080.tif 000025
【０３２５】
表３Ａの続き
【表２５】
2005528080.tif 000026
【０３２６】
表３Ａの続き
【表２６】
2005528080.tif 000027
【０３２７】
前記タンパク質配列の配列比較により、表３Ｂに示す以下の配列関係が得られた。
【表２７】
2005528080.tif 000028
【０３２８】
ＮＯＶ３ａタンパク質のさらなる解析により、表３Ｃに示す以下の特性が得られた。
【表２８】
2005528080.tif 000029
【０３２９】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ３ａタンパク質の検索により、表３Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表２９】
2005528080.tif 000030
【０３３０】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ３ａのタンパク質は、表３ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表３０】
2005528080.tif 000031
【０３３１】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ３ａタンパク質は表３Ｆに示すドメインを含有すると予想される。
【表３１】
2005528080.tif 000032
【０３３２】
実施例４．
ＮＯＶ４クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表４Ａに示す。
【表３２】
2005528080.tif 000033
【０３３３】
表４Ａの続き
【表３３】
2005528080.tif 000034
【０３３４】
前記タンパク質配列の配列比較により、表４Ｂに示す以下の配列関係が得られた。
【表３４】
2005528080.tif 000035
【０３３５】
ＮＯＶ４ａタンパク質のさらなる解析により、表４Ｃに示す以下の特性が得られた。
【表３５】
2005528080.tif 000036
【０３３６】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ４ａタンパク質の検索により、表４Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表３６】
2005528080.tif 000037
【０３３７】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ４ａのタンパク質は、表４ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表３７】
2005528080.tif 000038
【０３３８】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ４ａタンパク質は表４Ｆに示すドメインを含有すると予想される。
【表３８】
2005528080.tif 000039
【０３３９】
実施例５．
ＮＯＶ５クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表５Ａに示す。
【表３９】
2005528080.tif 000040
【０３４０】
表５Ａの続き
【表４０】
2005528080.tif 000041
【０３４１】
表５Ａの続き
【表４１】
2005528080.tif 000042
【０３４２】
表５Ａの続き
【表４２】
2005528080.tif 000043
【０３４３】
前記タンパク質配列の配列比較により、表５Ｂに示す以下の配列関係が得られた。
【表４３】
2005528080.tif 000044
【０３４４】
ＮＯＶ５ａタンパク質のさらなる解析により、表５Ｃに示す以下の特性が得られた。
【表４４】
2005528080.tif 000045
【０３４５】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ５ａタンパク質の検索により、表５Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表４５】
2005528080.tif 000046
【０３４６】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ５ａのタンパク質は、表５ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表４６】
2005528080.tif 000047
【０３４７】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ５ａタンパク質は表５Ｆに示すドメインを含有すると予想される。
【表４７】
2005528080.tif 000048
【０３４８】
実施例６．
ＮＯＶ６クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表６Ａに示す。
【表４８】
2005528080.tif 000049
【０３４９】
表６Ａの続き
【表４９】
2005528080.tif 000050
【０３５０】
表６Ａの続き
【表５０】
2005528080.tif 000051
【０３５１】
前記タンパク質配列の配列比較により、表６Ｂに示す以下の配列関係が得られた。
【表５１】
2005528080.tif 000052
【０３５２】
ＮＯＶ６ａタンパク質のさらなる解析により、表６Ｃに示す以下の特性が得られた。
【表５２】
2005528080.tif 000053
【０３５３】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ６ａタンパク質の検索により、表６Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表５３】
2005528080.tif 000054
【０３５４】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ６ａのタンパク質は、表６ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表５４】
2005528080.tif 000055
【０３５５】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ６ａタンパク質は表６Ｆに示すドメインを含有すると予想される。
【表５５】
2005528080.tif 000056
【０３５６】
実施例７．
ＮＯＶ７クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表７Ａに示す。
【表５６】
2005528080.tif 000057
【０３５７】
表７Ａの続き
【表５７】
2005528080.tif 000058
【０３５８】
前記タンパク質配列の配列比較により、表７Ｂに示す以下の配列関係が得られた。
【表５８】
2005528080.tif 000059
【０３５９】
ＮＯＶ７ａタンパク質のさらなる解析により、表７Ｃに示す以下の特性が得られた。
【表５９】
2005528080.tif 000060
【０３６０】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ７ａタンパク質の検索により、表７Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表６０】
2005528080.tif 000061
【０３６１】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ７ａのタンパク質は、表７ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表６１】
2005528080.tif 000062
【０３６２】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ７ａタンパク質は表７Ｆに示すドメインを含有すると予想される。
【表６２】
2005528080.tif 000063
【０３６３】
実施例８．
ＮＯＶ８クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表８Ａに示す。
【表６３】
2005528080.tif 000064
【０３６４】
表８Ａの続き
【表６４】
2005528080.tif 000065
【０３６５】
表８Ａの続き
【表６５】
2005528080.tif 000066
【０３６６】
前記タンパク質配列の配列比較により、表８Ｂに示す以下の配列関係が得られた。
【表６６】
2005528080.tif 000067
【０３６７】
ＮＯＶ８ａタンパク質のさらなる解析により、表８Ｃに示す以下の特性が得られた。
【表６７】
2005528080.tif 000068
【０３６８】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ８ａタンパク質の検索により、表８Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表６８】
2005528080.tif 000069
【０３６９】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ８ａのタンパク質は、表８ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表６９】
2005528080.tif 000070
【０３７０】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ８ａタンパク質は表８Ｆに示すドメインを含有すると予想される。
【表７０】
2005528080.tif 000071
【０３７１】
実施例９．
ＮＯＶ９クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表９Ａに示す。
【表７１】
2005528080.tif 000072
【０３７２】
ＮＯＶ９ａタンパク質のさらなる解析により、表９Ｂに示す以下の特性が得られた。
【表７２】
2005528080.tif 000073
【０３７３】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ９ａタンパク質の検索により、表９Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表７３】
2005528080.tif 000074
【０３７４】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ９ａのタンパク質は、表９ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表７４】
2005528080.tif 000075
【０３７５】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ９ａタンパク質は表９Ｅに示すドメインを含有すると予想される。
【表７５】
2005528080.tif 000076
【０３７６】
実施例１０．
ＮＯＶ１０クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表１０Ａに示す。
【表７６】
2005528080.tif 000077
【０３７７】
ＮＯＶ１０ａタンパク質のさらなる解析により、表１０Ｂに示す以下の特性が得られた。
【表７７】
2005528080.tif 000078
【０３７８】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ１０ａタンパク質の検索により、表１０Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表７８】
2005528080.tif 000079
【０３７９】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ１０ａのタンパク質は、表１０ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表７９】
2005528080.tif 000080
【０３８０】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ１０ａタンパク質は表１０Ｅに示すドメインを含有すると予想される。
【表８０】
2005528080.tif 000081
【０３８１】
実施例１１．
ＮＯＶ１１クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表１１Ａに示す。
【表８１】
2005528080.tif 000082
【０３８２】
ＮＯＶ１１ａタンパク質のさらなる解析により、表１１Ｂに示す以下の特性が得られた。
【表８２】
2005528080.tif 000083
【０３８３】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ１１ａタンパク質の検索により、表１１Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表８３】
2005528080.tif 000084
【０３８４】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ１１ａのタンパク質は、表１１ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表８４】
2005528080.tif 000085
【０３８５】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ１１ａタンパク質は表１１Ｅに示すドメインを含有すると予想される。
【表８５】
2005528080.tif 000086
【０３８６】
実施例１２．
ＮＯＶ１２クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表１２Ａに示す。
【表８６】
2005528080.tif 000087
【０３８７】
前記タンパク質配列の配列比較により、表１２Ｂに示す以下の配列関係が得られた。
【表８７】
2005528080.tif 000088
【０３８８】
ＮＯＶ１２ａタンパク質のさらなる解析により、表１２Ｃに示す以下の特性が得られた。
【表８８】
2005528080.tif 000089
【０３８９】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ１２ａタンパク質の検索により、表１２Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表８９】
2005528080.tif 000090
【０３９０】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ１２ａのタンパク質は、表１２ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表９０】
2005528080.tif 000091
【０３９１】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ１２ａタンパク質は表１２Ｆに示すドメインを含有すると予想される。
【表９１】
2005528080.tif 000092
【０３９２】
実施例１３．
ＮＯＶ１３クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表１３Ａに示す。
【表９２】
2005528080.tif 000093
【０３９３】
ＮＯＶ１３ａタンパク質のさらなる解析により、表１３Ｂに示す以下の特性が得られた。
【表９３】
2005528080.tif 000094
【０３９４】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ１３ａタンパク質の検索により、表１３Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表９４】
2005528080.tif 000095
【０３９５】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ１３ａのタンパク質は、表１３ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表９５】
2005528080.tif 000096
【０３９６】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ１３ａタンパク質は表１３Ｅに示すドメインを含有すると予想される。
【表９６】
2005528080.tif 000097
【０３９７】
実施例１４．
ＮＯＶ１４クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表１４Ａに示す。
【表９７】
2005528080.tif 000098
【０３９８】
前記タンパク質配列の配列比較により、表１４Ｂに示す以下の配列関係が得られた。
【表９８】
2005528080.tif 000099
【０３９９】
ＮＯＶ１４ａタンパク質のさらなる解析により、表１４Ｃに示す以下の特性が得られた。
【表９９】
2005528080.tif 000100
【０４００】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ１４ａタンパク質の検索により、表１４Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表１００】
2005528080.tif 000101
【０４０１】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ１４ａのタンパク質は、表１４ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表１０１】
2005528080.tif 000102
【０４０２】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ１４ａタンパク質は表１４Ｆに示すドメインを含有すると予想される。
【表１０２】
2005528080.tif 000103
【０４０３】
実施例１５．
ＮＯＶ１５クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表１５Ａに示す。
【表１０３】
2005528080.tif 000104
【０４０４】
ＮＯＶ１５ａタンパク質のさらなる解析により、表１５Ｂに示す以下の特性が得られた。
【表１０４】
2005528080.tif 000105
【０４０５】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ１５ａタンパク質の検索により、表１５Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表１０５】
2005528080.tif 000106
【０４０６】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ１５ａのタンパク質は、表１５ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表１０６】
2005528080.tif 000107
【０４０７】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ１５ａタンパク質は表１５Ｅに示すドメインを含有すると予想される。
【表１０７】
2005528080.tif 000108
【０４０８】
実施例１６．
ＮＯＶ１６クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表１６Ａに示す。
【表１０８】
2005528080.tif 000109
【０４０９】
表１６Ａの続き
【表１０９】
2005528080.tif 000110
【０４１０】
表１６Ａの続き
【表１１０】
2005528080.tif 000111
【０４１１】
前記タンパク質配列の配列比較により、表１６Ｂに示す以下の配列関係が得られた。
【表１１１】
2005528080.tif 000112
【０４１２】
ＮＯＶ１６ａタンパク質のさらなる解析により、表１６Ｃに示す以下の特性が得られた。
【表１１２】
2005528080.tif 000113
【０４１３】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ１６ａタンパク質の検索により、表１６Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表１１３】
2005528080.tif 000114
【０４１４】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ１６ａのタンパク質は、表１６ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表１１４】
2005528080.tif 000115
【０４１５】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ１６ａタンパク質は表１６Ｆに示すドメインを含有すると予想される。
【表１１５】
2005528080.tif 000116
【０４１６】
実施例１７．
ＮＯＶ１７クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表１７Ａに示す。
【表１１６】
2005528080.tif 000117
【０４１７】
表１７Ａの続き
【表１１７】
2005528080.tif 000118
【０４１８】
前記タンパク質配列の配列比較により、表１７Ｂに示す以下の配列関係が得られた。
【表１１８】
2005528080.tif 000119
【０４１９】
ＮＯＶ１７ａタンパク質のさらなる解析により、表１７Ｃに示す以下の特性が得られた。
【表１１９】
2005528080.tif 000120
【０４２０】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ１７ａタンパク質の検索により、表１７Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表１２０】
2005528080.tif 000121
【０４２１】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ１７ａのタンパク質は、表１７ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表１２１】
2005528080.tif 000122
【０４２２】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ１７ａタンパク質は表１７Ｆに示すドメインを含有すると予想される。
【表１２２】
2005528080.tif 000123
【０４２３】
実施例１８．
ＮＯＶ１８クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表１８Ａに示す。
【表１２３】
2005528080.tif 000124
【０４２４】
表１８Ａの続き
【表１２４】
2005528080.tif 000125
【０４２５】
前記タンパク質配列の配列比較により、表１８Ｂに示す以下の配列関係が得られた。
【表１２５】
2005528080.tif 000126
【０４２６】
ＮＯＶ１８ａタンパク質のさらなる解析により、表１８Ｃに示す以下の特性が得られた。
【表１２６】
2005528080.tif 000127
【０４２７】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ１８ａタンパク質の検索により、表１８Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表１２７】
2005528080.tif 000128
【０４２８】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ１８ａのタンパク質は、表１８ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表１２８】
2005528080.tif 000129
【０４２９】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ１８ａタンパク質は表１８Ｆに示すドメインを含有すると予想される。
【表１２９】
2005528080.tif 000130
【０４３０】
実施例１９．
ＮＯＶ１９クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表１９Ａに示す。
【表１３０】
2005528080.tif 000131
【０４３１】
前記タンパク質配列の配列比較により、表１９Ｂに示す以下の配列関係が得られた。
【表１３１】
2005528080.tif 000132
【０４３２】
ＮＯＶ１９ａタンパク質のさらなる解析により、表１９Ｃに示す以下の特性が得られた。
【表１３２】
2005528080.tif 000133
【０４３３】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ１９ａタンパク質の検索により、表１９Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表１３３】
2005528080.tif 000134
【０４３４】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ１９ａのタンパク質は、表１９ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表１３４】
2005528080.tif 000135
【０４３５】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ１９ａタンパク質は表１９Ｆに示すドメインを含有すると予想される。
【表１３５】
2005528080.tif 000136
【０４３６】
実施例２０．
ＮＯＶ２０クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表２０Ａに示す。
【表１３６】
2005528080.tif 000137
【０４３７】
表２０Ａの続き
【表１３７】
2005528080.tif 000138
【０４３８】
表２０Ａの続き
【表１３８】
2005528080.tif 000139
【０４３９】
前記タンパク質配列の配列比較により、表２０Ｂに示す以下の配列関係が得られた。
【表１３９】
2005528080.tif 000140
【０４４０】
ＮＯＶ２０ａタンパク質のさらなる解析により、表２０Ｃに示す以下の特性が得られた。
【表１４０】
2005528080.tif 000141
【０４４１】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ２０ａタンパク質の検索により、表２０Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表１４１】
2005528080.tif 000142
【０４４２】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ２０ａのタンパク質は、表２０ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表１４２】
2005528080.tif 000143
【０４４３】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ２０ａタンパク質は表２０Ｆに示すドメインを含有すると予想される。
【表１４３】
2005528080.tif 000144
【０４４４】
実施例２１．
ＮＯＶ２１クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表２１Ａに示す。
【表１４４】
2005528080.tif 000145
【０４４５】
表２１Ａの続き
【表１４５】
2005528080.tif 000146
【０４４６】
表２１Ａの続き
【表１４６】
2005528080.tif 000147
【０４４７】
表２１Ａの続き
【表１４７】
2005528080.tif 000148
【０４４８】
表２１Ａの続き
【表１４８】
2005528080.tif 000149
【０４４９】
ＮＯＶ２１ａタンパク質のさらなる解析により、表２１Ｂに示す以下の特性が得られた。
【表１４９】
2005528080.tif 000150
【０４５０】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ２１ａタンパク質の検索により、表２１Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表１５０】
2005528080.tif 000151
【０４５１】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ２１ａのタンパク質は、表２１ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表１５１】
2005528080.tif 000152
【０４５２】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ２１ａタンパク質は表２１Ｅに示すドメインを含有すると予想される。
【表１５２】
2005528080.tif 000153
【０４５３】
実施例２２．
ＮＯＶ２２クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表２２Ａに示す。
【表１５３】
2005528080.tif 000154
【０４５４】
表２２Ａの続き
【表１５４】
2005528080.tif 000155
【０４５５】
表２２Ａの続き
【表１５５】
2005528080.tif 000156
【０４５６】
ＮＯＶ２２ａタンパク質のさらなる解析により、表２２Ｂに示す以下の特性が得られた。
【表１５６】
2005528080.tif 000157
【０４５７】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ２２ａタンパク質の検索により、表２２Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表１５７】
2005528080.tif 000158
【０４５８】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ２２ａのタンパク質は、表２２ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表１５８】
2005528080.tif 000159
【０４５９】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ２２ａタンパク質は表２２Ｅに示すドメインを含有すると予想される。
【表１５９】
2005528080.tif 000160
【０４６０】
実施例２３．
ＮＯＶ２３クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表２３Ａに示す。
【表１６０】
2005528080.tif 000161
【０４６１】
ＮＯＶ２３ａタンパク質のさらなる解析により、表２３Ｂに示す以下の特性が得られた。
【表１６１】
2005528080.tif 000162
【０４６２】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ２３ａタンパク質の検索により、表２３Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表１６２】
2005528080.tif 000163
【０４６３】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ２３ａのタンパク質は、表２３ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表１６３】
2005528080.tif 000164
【０４６４】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ２３ａタンパク質は表２３Ｅに示すドメインを含有すると予想される。
【表１６４】
2005528080.tif 000165
【０４６５】
実施例２４．
ＮＯＶ２４クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表２４Ａに示す。
【表１６５】
2005528080.tif 000166
【０４６６】
表２４Ａの続き
【表１６６】
2005528080.tif 000167
【０４６７】
前記タンパク質配列の配列比較により、表２４Ｂに示す以下の配列関係が得られた。
【表１６７】
2005528080.tif 000168
【０４６８】
ＮＯＶ２４ａタンパク質のさらなる解析により、表２４Ｃに示す以下の特性が得られた。
【表１６８】
2005528080.tif 000169
【０４６９】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ２４ａタンパク質の検索により、表２４Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表１６９】
2005528080.tif 000170
【０４７０】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ２４ａのタンパク質は、表２４ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表１７０】
2005528080.tif 000171
【０４７１】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ２４ａタンパク質は表２４Ｆに示すドメインを含有すると予想される。
【表１７１】
2005528080.tif 000172
【０４７２】
実施例２５．
ＮＯＶ２５クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表２５Ａに示す。
【表１７２】
2005528080.tif 000173
【０４７３】
表２５Ａの続き
【表１７３】
2005528080.tif 000174
【０４７４】
前記タンパク質配列の配列比較により、表２５Ｂに示す以下の配列関係が得られた。
【表１７４】
2005528080.tif 000175
【０４７５】
ＮＯＶ２５ａタンパク質のさらなる解析により、表２５Ｃに示す以下の特性が得られた。
【表１７５】
2005528080.tif 000176
【０４７６】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ２５ａタンパク質の検索により、表２５Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表１７６】
2005528080.tif 000177
【０４７７】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ２５ａのタンパク質は、表２５ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表１７７】
2005528080.tif 000178
【０４７８】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ２５ａタンパク質は表２５Ｆに示すドメインを含有すると予想される。
【表１７８】
2005528080.tif 000179
【０４７９】
実施例２６．
ＮＯＶ２６クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表２６Ａに示す。
【表１７９】
2005528080.tif 000180
【０４８０】
ＮＯＶ２６ａタンパク質のさらなる解析により、表２６Ｂに示す以下の特性が得られた。
【表１８０】
2005528080.tif 000181
【０４８１】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ２６ａタンパク質の検索により、表２６Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表１８１】
2005528080.tif 000182
【０４８２】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ２６ａのタンパク質は、表２６ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表１８２】
2005528080.tif 000183
【０４８３】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ２６ａタンパク質は表２６Ｅに示すドメインを含有すると予想される。
【表１８３】
2005528080.tif 000184
【０４８４】
実施例２７．
ＮＯＶ２７クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表２７Ａに示す。
【表１８４】
2005528080.tif 000185
【０４８５】
表２７Ａの続き
【表１８５】
2005528080.tif 000186
【０４８６】
前記タンパク質配列の配列比較により、表２７Ｂに示す以下の配列関係が得られた。
【表１８６】
2005528080.tif 000187
【０４８７】
ＮＯＶ２７ａタンパク質のさらなる解析により、表２７Ｃに示す以下の特性が得られた。
【表１８７】
2005528080.tif 000188
【０４８８】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ２７ａタンパク質の検索により、表２７Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表１８８】
2005528080.tif 000189
【０４８９】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ２７ａのタンパク質は、表２７ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表１８９】
2005528080.tif 000190
【０４９０】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ２７ａタンパク質は表２７Ｆに示すドメインを含有すると予想される。
【表１９０】
2005528080.tif 000191
【０４９１】
実施例２８．
ＮＯＶ２８クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表２８Ａに示す。
【表１９１】
2005528080.tif 000192
【０４９２】
前記タンパク質配列の配列比較により、表２８Ｂに示す以下の配列関係が得られた。
【表１９２】
2005528080.tif 000193
【０４９３】
ＮＯＶ２８ａタンパク質のさらなる解析により、表２８Ｃに示す以下の特性が得られた。
【表１９３】
2005528080.tif 000194
【０４９４】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ２８ａタンパク質の検索により、表２８Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表１９４】
2005528080.tif 000195
【０４９５】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ２８ａのタンパク質は、表２８ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表１９５】
2005528080.tif 000196
【０４９６】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ２８ａタンパク質は表２８Ｆに示すドメインを含有すると予想される。
【表１９６】
2005528080.tif 000197
【０４９７】
実施例２９．
ＮＯＶ２９クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表２９Ａに示す。
【表１９７】
2005528080.tif 000198
【０４９８】
表２９Ａの続き
【表１９８】
2005528080.tif 000199
【０４９９】
ＮＯＶ２９ａタンパク質のさらなる解析により、表２９Ｂに示す以下の特性が得られた。
【表１９９】
2005528080.tif 000200
【０５００】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ２９ａタンパク質の検索により、表２９Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表２００】
2005528080.tif 000201
【０５０１】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ２９ａのタンパク質は、表２９ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表２０１】
2005528080.tif 000202
【０５０２】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ２９ａタンパク質は表２９Ｅに示すドメインを含有すると予想される。
【表２０２】
2005528080.tif 000203
【０５０３】
実施例３０．
ＮＯＶ３０クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表３０Ａに示す。
【表２０３】
2005528080.tif 000204
【０５０４】
表３０Ａの続き
【表２０４】
2005528080.tif 000205
【０５０５】
ＮＯＶ３０ａタンパク質のさらなる解析により、表３０Ｂに示す以下の特性が得られた。
【表２０５】
2005528080.tif 000206
【０５０６】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ３０ａタンパク質の検索により、表３０Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表２０６】
2005528080.tif 000207
【０５０７】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ３０ａのタンパク質は、表３０ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表２０７】
2005528080.tif 000208
【０５０８】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ３０ａタンパク質は表３０Ｅに示すドメインを含有すると予想される。
【表２０８】
2005528080.tif 000209
【０５０９】
実施例３１．
ＮＯＶ３１クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表３１Ａに示す。
【表２０９】
2005528080.tif 000210
【０５１０】
ＮＯＶ３１ａタンパク質のさらなる解析により、表３１Ｂに示す以下の特性が得られた。
【表２１０】
2005528080.tif 000211
【０５１１】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ３１ａタンパク質の検索により、表３１Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表２１１】
2005528080.tif 000212
【０５１２】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ３１ａのタンパク質は、表３１ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表２１２】
2005528080.tif 000213
【０５１３】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ３１ａタンパク質は表３１Ｅに示すドメインを含有すると予想される。
【表２１３】
2005528080.tif 000214
【０５１４】
実施例３２．
ＮＯＶ３２クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表３２Ａに示す。
【表２１４】
2005528080.tif 000215
【０５１５】
前記タンパク質配列の配列比較により、表３２Ｂに示す以下の配列関係が得られた。
【表２１５】
2005528080.tif 000216
【０５１６】
ＮＯＶ３２ａタンパク質のさらなる解析により、表３２Ｃに示す以下の特性が得られた。
【表２１６】
2005528080.tif 000217
【０５１７】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ３２ａタンパク質の検索により、表３２Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表２１７】
2005528080.tif 000218
【０５１８】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ３２ａのタンパク質は、表３２ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表２１８】
2005528080.tif 000219
【０５１９】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ３２ａタンパク質は表３２Ｆに示すドメインを含有すると予想される。
【表２１９】
2005528080.tif 000220
【０５２０】
実施例３３．
ＮＯＶ３３クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表３３Ａに示す。
【表２２０】
2005528080.tif 000221
【０５２１】
表３３Ａの続き
【表２２１】
2005528080.tif 000222
【０５２２】
表３３Ａの続き
【表２２２】
2005528080.tif 000223
【０５２３】
前記タンパク質配列の配列比較により、表３３Ｂに示す以下の配列関係が得られた。
【表２２３】
2005528080.tif 000224
【０５２４】
ＮＯＶ３３ａタンパク質のさらなる解析により、表３３Ｃに示す以下の特性が得られた。
【表２２４】
2005528080.tif 000225
【０５２５】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ３３ａタンパク質の検索により、表３３Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表２２５】
2005528080.tif 000226
【０５２６】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ３３ａのタンパク質は、表３３ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表２２６】
2005528080.tif 000227
【０５２７】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ３３ａタンパク質は表３３Ｆに示すドメインを含有すると予想される。
【表２２７】
2005528080.tif 000228
【０５２８】
実施例３４．
ＮＯＶ３４クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表３４Ａに示す。
【表２２８】
2005528080.tif 000229
【０５２９】
表３４Ａの続き
【表２２９】
2005528080.tif 000230
【０５３０】
前記タンパク質配列の配列比較により、表３４Ｂに示す以下の配列関係が得られた。
【表２３０】
2005528080.tif 000231
【０５３１】
ＮＯＶ３４ａタンパク質のさらなる解析により、表３４Ｃに示す以下の特性が得られた。
【表２３１】
2005528080.tif 000232
【０５３２】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ３４ａタンパク質の検索により、表３４Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表２３２】
2005528080.tif 000233
【０５３３】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ３４ａのタンパク質は、表３４ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表２３３】
2005528080.tif 000234
【０５３４】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ３４ａタンパク質は表３４Ｆに示すドメインを含有すると予想される。
【表２３４】
2005528080.tif 000235
【０５３５】
実施例３５．
ＮＯＶ３５クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表３５Ａに示す。
【表２３５】
2005528080.tif 000236
【０５３６】
ＮＯＶ３５ａタンパク質のさらなる解析により、表３５Ｂに示す以下の特性が得られた。
【表２３６】
2005528080.tif 000237
【０５３７】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ３５ａタンパク質の検索により、表３５Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表２３７】
2005528080.tif 000238
【０５３８】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ３５ａのタンパク質は、表３５ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表２３８】
2005528080.tif 000239
【０５３９】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ３５ａタンパク質は表３５Ｅに示すドメインを含有すると予想される。
【表２３９】
2005528080.tif 000240
【０５４０】
実施例３６．
ＮＯＶ３６クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表３６Ａに示す。
【表２４０】
2005528080.tif 000241
【０５４１】
ＮＯＶ３６ａタンパク質のさらなる解析により、表３６Ｂに示す以下の特性が得られた。
【表２４１】
2005528080.tif 000242
【０５４２】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ３６ａタンパク質の検索により、表３６Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表２４２】
2005528080.tif 000243
【０５４３】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ３６ａのタンパク質は、表３６ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表２４３】
2005528080.tif 000244
【０５４４】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ３６ａタンパク質は表３６Ｅに示すドメインを含有すると予想される。
【表２４４】
2005528080.tif 000245
【０５４５】
実施例３７．
ＮＯＶ３７クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表３７Ａに示す。
【表２４５】
2005528080.tif 000246
【０５４６】
ＮＯＶ３７ａタンパク質のさらなる解析により、表３７Ｂに示す以下の特性が得られた。
【表２４６】
2005528080.tif 000247
【０５４７】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ３７ａタンパク質の検索により、表３７Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表２４７】
2005528080.tif 000248
【０５４８】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ３７ａのタンパク質は、表３７ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表２４８】
2005528080.tif 000249
【０５４９】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ３７ａタンパク質は表３７Ｅに示すドメインを含有すると予想される。
【表２４９】
2005528080.tif 000250
【０５５０】
実施例３８．
ＮＯＶ３８クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表３８Ａに示す。
【表２５０】
2005528080.tif 000251
【０５５１】
表３８Ａの続き
【表２５１】
2005528080.tif 000252
【０５５２】
表３８Ａの続き
【表２５２】
2005528080.tif 000253
【０５５３】
表３８Ａの続き
【表２５３】
2005528080.tif 000254
【０５５４】
ＮＯＶ３８ａタンパク質のさらなる解析により、表３８Ｂに示す以下の特性が得られた。
【表２５４】
2005528080.tif 000255
【０５５５】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ３８ａタンパク質の検索により、表３８Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表２５５】
2005528080.tif 000256
【０５５６】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ３８ａのタンパク質は、表３８ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表２５６】
2005528080.tif 000257
【０５５７】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ３８ａタンパク質は表３８Ｅに示すドメインを含有すると予想される。
【表２５７】
2005528080.tif 000258
【０５５８】
実施例３９．
ＮＯＶ３９クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表３９Ａに示す。
【表２５８】
2005528080.tif 000259
【０５５９】
表３９Ａの続き
【表２５９】
2005528080.tif 000260
【０５６０】
前記タンパク質配列の配列比較により、表３９Ｂに示す以下の配列関係が得られた。
【表２６０】
2005528080.tif 000261
【０５６１】
ＮＯＶ３９ａタンパク質のさらなる解析により、表３９Ｃに示す以下の特性が得られた。
【表２６１】
2005528080.tif 000262
【０５６２】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ３９ａタンパク質の検索により、表３９Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表２６２】
2005528080.tif 000263
【０５６３】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ３９ａのタンパク質は、表３９ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表２６３】
2005528080.tif 000264
【０５６４】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ３９ａタンパク質は表３９Ｆに示すドメインを含有すると予想される。
【表２６４】
2005528080.tif 000265
【０５６５】
実施例４０．
ＮＯＶ４０クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表４０Ａに示す。
【表２６５】
2005528080.tif 000266
【０５６６】
ＮＯＶ４０ａタンパク質のさらなる解析により、表４０Ｂに示す以下の特性が得られた。
【表２６６】
2005528080.tif 000267
【０５６７】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ４０ａタンパク質の検索により、表４０Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表２６７】
2005528080.tif 000268
【０５６８】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ４０ａのタンパク質は、表４０ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表２６８】
2005528080.tif 000269
【０５６９】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ４０ａタンパク質は表４０Ｅに示すドメインを含有すると予想される。
【表２６９】
2005528080.tif 000270
【０５７０】
実施例４１．
ＮＯＶ４１クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表４１Ａに示す。
【表２７０】
2005528080.tif 000271
【０５７１】
表４１Ａの続き
【表２７１】
2005528080.tif 000272
【０５７２】
ＮＯＶ４１ａタンパク質のさらなる解析により、表４１Ｂに示す以下の特性が得られた。
【表２７２】
2005528080.tif 000273
【０５７３】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ４１ａタンパク質の検索により、表４１Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表２７３】
2005528080.tif 000274
【０５７４】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ４１ａのタンパク質は、表４１ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表２７４】
2005528080.tif 000275
【０５７５】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ４１ａタンパク質は表４１Ｅに示すドメインを含有すると予想される。
【表２７５】
2005528080.tif 000276
【０５７６】
実施例４２．
ＮＯＶ４２クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表４２Ａに示す。
【表２７６】
2005528080.tif 000277
【０５７７】
表４２Ａの続き
【表２７７】
2005528080.tif 000278
【０５７８】
ＮＯＶ４２ａタンパク質のさらなる解析により、表４２Ｂに示す以下の特性が得られた。
【表２７８】
2005528080.tif 000279
【０５７９】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ４２ａタンパク質の検索により、表４２Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表２７９】
2005528080.tif 000280
【０５８０】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ４２ａのタンパク質は、表４２ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表２８０】
2005528080.tif 000281
【０５８１】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ４２ａタンパク質は表４２Ｅに示すドメインを含有すると予想される。
【表２８１】
2005528080.tif 000282
【０５８２】
実施例４３．
ＮＯＶ４３クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表４３Ａに示す。
【表２８２】
2005528080.tif 000283
【０５８３】
表４３Ａの続き
【表２８３】
2005528080.tif 000284
【０５８４】
ＮＯＶ４３ａタンパク質のさらなる解析により、表４３Ｂに示す以下の特性が得られた。
【表２８４】
2005528080.tif 000285
【０５８５】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ４３ａタンパク質の検索により、表４３Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表２８５】
2005528080.tif 000286
【０５８６】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ４３ａのタンパク質は、表４３ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表２８６】
2005528080.tif 000287
【０５８７】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ４３ａタンパク質は表４３Ｅに示すドメインを含有すると予想される。
【表２８７】
2005528080.tif 000288
【０５８８】
実施例４４．
ＮＯＶ４４クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表４４Ａに示す。
【表２８８】
2005528080.tif 000289
【０５８９】
表４４Ａの続き
【表２８９】
2005528080.tif 000290
【０５９０】
表４４Ａの続き
【表２９０】
2005528080.tif 000291
【０５９１】
前記タンパク質配列の配列比較により、表４４Ｂに示す以下の配列関係が得られた。
【表２９１】
2005528080.tif 000292
【０５９２】
ＮＯＶ４４ａタンパク質のさらなる解析により、表４４Ｃに示す以下の特性が得られた。
【表２９２】
2005528080.tif 000293
【０５９３】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ４４ａタンパク質の検索により、表４４Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表２９３】
2005528080.tif 000294
【０５９４】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ４４ａのタンパク質は、表４４ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表２９４】
2005528080.tif 000295
【０５９５】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ４４ａタンパク質は表４４Ｆに示すドメインを含有すると予想される。
【表２９５】
2005528080.tif 000296
【０５９６】
実施例４５．
ＮＯＶ４５クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表４５Ａに示す。
【表２９６】
2005528080.tif 000297
【０５９７】
表４５Ａの続き
【表２９７】
2005528080.tif 000298
【０５９８】
表４５Ａの続き
【表２９８】
2005528080.tif 000299
【０５９９】
前記タンパク質配列の配列比較により、表４５Ｂに示す以下の配列関係が得られた。
【表２９９】
2005528080.tif 000300
【０６００】
ＮＯＶ４５ａタンパク質のさらなる解析により、表４５Ｃに示す以下の特性が得られた。
【表３００】
2005528080.tif 000301
【０６０１】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ４５ａタンパク質の検索により、表４５Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表３０１】
2005528080.tif 000302
【０６０２】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ４５ａのタンパク質は、表４５ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表３０２】
2005528080.tif 000303
【０６０３】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ４５ａタンパク質は表４５Ｆに示すドメインを含有すると予想される。
【表３０３】
2005528080.tif 000304
【０６０４】
実施例４６．
ＮＯＶ４６クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表４６Ａに示す。
【表３０４】
2005528080.tif 000305
【０６０５】
ＮＯＶ４６ａタンパク質のさらなる解析により、表４６Ｂに示す以下の特性が得られた。
【表３０５】
2005528080.tif 000306
【０６０６】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ４６ａタンパク質の検索により、表４６Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表３０６】
2005528080.tif 000307
【０６０７】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ４６ａのタンパク質は、表４６ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表３０７】
2005528080.tif 000308
【０６０８】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ４６ａタンパク質は表４６Ｅに示すドメインを含有すると予想される。
【表３０８】
2005528080.tif 000309
【０６０９】
実施例４７．
ＮＯＶ４７クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表４７Ａに示す。
【表３０９】
2005528080.tif 000310
【０６１０】
表４７Ａの続き
【表３１０】
2005528080.tif 000311
【０６１１】
表４７Ａの続き
【表３１１】
2005528080.tif 000312
【０６１２】
表４７Ａの続き
【表３１２】
2005528080.tif 000313
【０６１３】
表４７Ａの続き
【表３１３】
2005528080.tif 000314
【０６１４】
表４７Ａの続き
【表３１４】
2005528080.tif 000315
【０６１５】
表４７Ａの続き
【表３１５】
2005528080.tif 000316
【０６１６】
表４７Ａの続き
【表３１６】
2005528080.tif 000317
【０６１７】
表４７Ａの続き
【表３１７】
2005528080.tif 000318
【０６１８】
表４７Ａの続き
【表３１８】
2005528080.tif 000319
【０６１９】
表４７Ａの続き
【表３１９】
2005528080.tif 000320
【０６２０】
表４７Ａの続き
【表３２０】
2005528080.tif 000321
【０６２１】
表４７Ａの続き
【表３２１】
2005528080.tif 000322
【０６２２】
表４７Ａの続き
【表３２２】
2005528080.tif 000323
【０６２３】
表４７Ａの続き
【表３２３】
2005528080.tif 000324
【０６２４】
表４７Ａの続き
【表３２４】
2005528080.tif 000325
【０６２５】
表４７Ａの続き
【表３２５】
2005528080.tif 000326
【０６２６】
表４７Ａの続き
【表３２６】
2005528080.tif 000327
【０６２７】
表４７Ａの続き
【表３２７】
2005528080.tif 000328
【０６２８】
表４７Ａの続き
【表３２８】
2005528080.tif 000329
【０６２９】
表４７Ａの続き
【表３２９】
2005528080.tif 000330
【０６３０】
表４７Ａの続き
【表３３０】
2005528080.tif 000331
【０６３１】
表４７Ａの続き
【表３３１】
2005528080.tif 000332
【０６３２】
表４７Ａの続き
【表３３２】
2005528080.tif 000333
【０６３３】
前記タンパク質配列の配列比較により、表４７Ｂに示す以下の配列関係が得られた。
【表３３３】
2005528080.tif 000334
【０６３４】
ＮＯＶ４７ａタンパク質のさらなる解析により、表４７Ｃに示す以下の特性が得られた。
【表３３４】
2005528080.tif 000335
【０６３５】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ４７ａタンパク質の検索により、表４７Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表３３５】
2005528080.tif 000336
【０６３６】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ４７ａのタンパク質は、表４７ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表３３６】
2005528080.tif 000337
【０６３７】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ４７ａタンパク質は表４７Ｆに示すドメインを含有すると予想される。
【表３３７】
2005528080.tif 000338
【０６３８】
実施例４８．
ＮＯＶ４８クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表４８Ａに示す。
【表３３８】
2005528080.tif 000339
【０６３９】
表４８Ａの続き
【表３３９】
2005528080.tif 000340
【０６４０】
表４８Ａの続き
【表３４０】
2005528080.tif 000341
【０６４１】
表４８Ａの続き
【表３４１】
2005528080.tif 000342
【０６４２】
表４８Ａの続き
【表３４２】
2005528080.tif 000343
【０６４３】
前記タンパク質配列の配列比較により、表４８Ｂに示す以下の配列関係が得られた。
【表３４３】
2005528080.tif 000344
【０６４４】
ＮＯＶ４８ａタンパク質のさらなる解析により、表４８Ｃに示す以下の特性が得られた。
【表３４４】
2005528080.tif 000345
【０６４５】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ４８ａタンパク質の検索により、表４８Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表３４５】
2005528080.tif 000346
【０６４６】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ４８ａのタンパク質は、表４８ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表３４６】
2005528080.tif 000347
【０６４７】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ４８ａタンパク質は表４８Ｆに示すドメインを含有すると予想される。
【表３４７】
2005528080.tif 000348
【０６４８】
実施例４９．
ＮＯＶ４９クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表４９Ａに示す。
【表３４８】
2005528080.tif 000349
【０６４９】
表４９Ａの続き
【表３４９】
2005528080.tif 000350
【０６５０】
表４９Ａの続き
【表３５０】
2005528080.tif 000351
【０６５１】
表４９Ａの続き
【表３５１】
2005528080.tif 000352
【０６５２】
表４９Ａの続き
【表３５２】
2005528080.tif 000353
【０６５３】
表４９Ａの続き
【表３５３】
2005528080.tif 000354
【０６５４】
前記タンパク質配列の配列比較により、表４９Ｂに示す以下の配列関係が得られた。
【表３５４】
2005528080.tif 000355
【０６５５】
ＮＯＶ４９ａタンパク質のさらなる解析により、表４９Ｃに示す以下の特性が得られた。
【表３５５】
2005528080.tif 000356
【０６５６】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ４９ａタンパク質の検索により、表４９Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表３５６】
2005528080.tif 000357
【０６５７】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ４９ａのタンパク質は、表４９ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表３５７】
2005528080.tif 000358
【０６５８】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ４９ａタンパク質は表４９Ｆに示すドメインを含有すると予想される。
【表３５８】
2005528080.tif 000359
【０６５９】
実施例５０．
ＮＯＶ５０クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表５０Ａに示す。
【表３５９】
2005528080.tif 000360
【０６６０】
ＮＯＶ５０ａタンパク質のさらなる解析により、表５０Ｂに示す以下の特性が得られた。
【表３６０】
2005528080.tif 000361
【０６６１】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ５０ａタンパク質の検索により、表５０Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表３６１】
2005528080.tif 000362
【０６６２】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ５０ａのタンパク質は、表５０ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表３６２】
2005528080.tif 000363
【０６６３】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ５０ａタンパク質は表５０Ｅに示すドメインを含有すると予想される。
【表３６３】
2005528080.tif 000364
【０６６４】
実施例Ｂ：ＮＯＶＸクローンの配列決定法および同定
1.GeneCalling（登録商標）技術：これはCuraGenで開発され、Shimketsら「Gene expression analysis by transcript profiling coupled to a gene database query」Nature Biotechnology 17：198-803（1999）に記載の、2以上の試料間の遺伝子発現の差のプロファイリングを実施する特許方法である。ｃＤＮＡは種々のドナー由来の複数の組織種、正常状態および病的状態、生理的状態、ならびに発達段階に相当する種々のヒト試料から得た。試料は全組織、一次細胞または組織培養した一次細胞または細胞株として得た。細胞および細胞株は遺伝子発現を調節する生物因子または化学薬品、例えば、成長因子、すなわちケモカインまたはステロイドで処理しておいてもよい。次いで、このような由来のcDNAを最大120対までの制限酵素で消化し、各対の制限酵素に特異的なリンカー-アダプター対を適当な末端に連結した。制限消化による特有のｃＤＮＡ遺伝子断片の混合物が生じる。限定ＰＣＲ増幅は、一方のプライマーはビオチニル化され、他方は蛍光標識されているリンカー・アダプター配列と相同なプライマーで実施する。二重標識された物質を単離し、蛍光標識された一本鎖をキャピラリーゲル電気泳動によって分離する。コンピューターアルゴリズムで各制限消化について実験群および対照群から得た電気泳動図を比較する。これとさらなる配列由来情報を用い、種々の遺伝子データベースを用いて発現に差のある各遺伝子断片の同一性を予測する。遺伝子断片の同一性はさらなる遺伝子特異的競合PCRによって、またはこの遺伝子断片の単離および配列決定によって確認する。
【０６６５】
2.SeqCalling（登録商標）技術：ｃＤＮＡは種々のドナー由来の複数の組織種、正常状態および病的状態、生理的状態、ならびに発達段階に相当する種々のヒト試料から得た。試料は全組織、一次細胞または組織培養した一次細胞または細胞株として得た。細胞および細胞株は遺伝子発現を調節する生物因子または化学薬品、例えば、成長因子、すなわちケモカインまたはステロイドで処理しておいてもよい。次いで、このような由来のｃＤＮＡをCuraGen社の特許SeqCalling技術を用いて配列決定した。配列トレースは手作業で評価し、必要に応じて修正のために編集した。すべての試料からのｃＤＮＡ配列をともにアセンブルし、これは公開ヒト配列を含む場合もあり、バイオインフォマティックプログラムを用いて各アセンブリーの共通配列を得た。各アセンブリーはCuraGen社のデータベースに含まれている。配列は別の構成要素との同一性の程度が５０ｂｐにわたって少なくとも９５％である場合、アセンブリーの構成要素として含めた。各アセンブリーは遺伝子またはその一部に相当し、スプライシング型単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、挿入、欠失およびその他の配列変異体などの変異体に関する情報を含む。
【０６６６】
3.PathCalling（登録商標）技術：ＮＯＶＸ核酸配列はツーハイブリッド・アプローチによるｃＤＮＡライブラリーの実験室スクリーニングから導かれる。全長ＤＮＡ配列、または配列の一部のいずれかをカバーするｃＤＮＡ断片が、双方とも配列決定される。インシリコ予測はCuraGenの特許配列データベースまたは公開されているヒト配列データベースで入手可能な配列に基づいたものであり、全長DNA配列またはそのある一部のいずれかが提供される。
【０６６７】
実験室スクリーニングは以下に要約した方法を用いて実施した：
ｃＤＮＡライブラリーは種々のドナー由来の複数の組織種、正常状態および病的状態、生理的状態、ならびに発達段階に相当する種々のヒト試料から得た。試料は全組織、一次細胞または組織培養した一次細胞または細胞株として得た。細胞および細胞株は遺伝子発現を調節する生物因子または化学薬品、例えば、成長因子、すなわちケモカインまたはステロイドで処理しておいてもよい。次いで、このような由来のｃＤＮＡを適当なツーハイブリッド・ベクター（Ｇａｌ４活性化ドメイン（Gal4-AD）融合物）へ指向的にクローニングした。次いで、かかるｃＤＮＡライブラリーならびにClontech（Palo Alto, CA）より市販のｃＤＮＡライブラリーを大腸菌（E.coli）からCuraGen社特許酵母株（その全文を出典明示により本明細書の一部とする、米国特許第6,057,101号および6,083,693号に開示）へ移した。
【０６６８】
CuraGen社特許ヒト配列ライブラリーのＧａｌ４結合ドメイン（Gal4-BD）融合物を用いて複数のＧａｌ４−ＡＤ融合物ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、その結果、その各々でＧａｌ４−ＡＤ融合物が個々のｃＤＮＡを含む酵母株二倍体を選択された。各試料をｃＤＮＡ挿入境界で非特異的プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅した。かかるＰＣＲ産物を配列決定した;配列トレースは手作業で評価し、必要に応じて修正のために編集した。すべての試料からのｃＤＮＡ配列をともにアセンブルし、これは公開ヒト配列を含む場合もあり、バイオインフォマティックプログラムを用いて各アセンブリーの共通配列を得た。各アセンブリーはCuraGen社のデータベースに含まれている。配列は別の構成要素との同一性の程度が５０ｂｐにわたって少なくとも９５％である場合、アセンブリーの構成要素として含めた。各アセンブリーは遺伝子またはその一部に相当し、スプライシング型単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、挿入、欠失およびその他の配列変異体などの変異体に関する情報を含む。
【０６６９】
物理的クローン：全オープンリーディングフレームをカバーする、スクリーニング手順により得たｃＤＮＡ断片を、ｃＤＮＡライブラリーの作製に用いたｐＡＣＴ２プラスミド（Clontech）に組み換えＤＮＡとしてクローニングする。この組換えプラスミドを宿主へ挿入し、CuraGen社特許酵母株Ｎ１０６’およびＹＵＬＨ（米国特許第6,057,101号および第6,083,693号）の双方の結合によるスクリーニング手順の間に生じた酵母ハイブリッド二倍体によって選択する。
【０６７０】
4.ＲＡＣＥ：ｃＤＮＡ末端の迅速増幅（ＲＡＣＥ）などのポリメラーゼ連鎖反応に基づく技術を用いて本発明のｃＤＮＡの予測配列を単離または完成した。通常、1以上のヒト試料から複数のクローンを配列決定して断片の配列を導く。種々のドナー由来の種々のヒト組織試料をＲＡＣＥ反応に用いた。これらの手順から得られた配列を、前節に記載のSeqCallingアセンブリープロセスに含めた。
【０６７１】
5.エクソン結合：本発明で同定されたＮＯＶＸ標的配列をエクソン結合プロセスに付して配列を確認した。ＰＣＲプライマーはフォワードプライマーについては入手可能な最も上流の配列で、リバースプライマーについては入手可能な最も下流の配列で開始することによって設計した。いずれの場合にも、特有かまたは選択性の高いのいずれかである好適な配列に出会うまで、あるいは、リバースプライマーの場合には、停止コドンに達するまで、それぞれの末端からコード配列に向かって内へ進んで配列を調べた。かかるプライマーは全長ｃＤＮＡインシリコ予測、標的配列のＤＮＡまたはタンパク質配列の一部（1以上のエクソン）に基づいて、あるいは予測されたエクソンの、他の種由来の密接に関連したヒト配列との翻訳後相同性によって設計した。次いで、これらのプライマーをヒトｃＤＮＡの以下のプール：副腎、骨髄、脳-扁桃体、脳-小脳、脳-海馬、脳-黒質、脳-視床、脳-全体、胎児脳、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肺、心臓、腎臓、リンパ腫-Raji、乳腺、膵臓、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管、子宮を基にしたＰＣＲ増幅に用いた。通常、得られたアンプリコンをゲル精製し、クローニングして重複性が高くなるまで配列決定する。エクソン結合から得られたＰＣＲ産物をInvitrogen製のｐＣＲ２．１ベクターにクローニングした。得られた細菌クローンはｐＣＲ２．１ベクターにクローニングされた全オープンリーディングフレームをカバーする挿入部分を有する。全クローンから得られた配列はそれら自身を用いて、CuraGen社のデータベースにあるその他の断片を用いて、および公開されているＥＳＴを用いてアセンブルした。断片およびＥＳＴはそのアセンブリーの別の構成要素とのその同一性の程度が５０ｂｐにわたって少なくとも９５％である場合、アセンブリーの構成要素として含めた。さらに、配列トレースを手作業で評価し、必要に応じて修正のために編集した。これらの手順により本明細書で報告される配列が提供される。
【０６７２】
6.物理的クローン：相同性によってエクソンを予測し、標準的な遺伝子規則を用いてイントロン/エクソンの境界を決定した。エクソンをさらに選択し、複数のＢＬＡＳＴ（例えば、tBlastN、BlastX、およびBlastN）検索、また、場合によっては、GeneScanおよびGrailを用いる類似性測定によって正確なものにした。遺伝子配列をさらに規定し、かつ、完成するために、利用可能な場合には、公開データベースおよび専売データベース双方由来の発現配列も加えた。次いで、明らかな不整合に関してDNA配列を手作業で修正した結果、全長タンパク質をコードする配列が得られた。
【０６７３】
全オープンリーディングフレームをカバーする、エクソン結合によって得られたＰＣＲ産物をInvitrogen製のｐＣＲ２．１ベクターにクローニングして発現およびスクリーニング目的に用いるクローンを準備した。
【０６７４】
実施例Ｃ：種々の細胞および組織におけるクローンの量的発現解析
種々のクローンの量的発現を、リアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴＱ−ＰＣＲ）を用い、種々の正常および病理由来細胞、細胞株および組織由来のRNA試料を含むマイクロタイタープレートを用いて評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲはApplied Biosystems ABI PRISM（登録商標）7700またはABI PRISM（登録商標）7900 HT Sequence Detection Systemで実施した。試料の種々の収集物をプレート上でアセンブルし、パネル1（正常組織および癌細胞株を含む）、パネル2（正常および癌供給源組織に由来する試料を含む）、パネル3（癌細胞株を含む）、パネル4（正常組織由来の細胞および細胞株ならびに炎症症状と関連している細胞を含む）、パネル5D/5I（代謝病に重点をおいたヒト組織および細胞株を含む）、ＡＩ_包括的_パネル（正常組織、および自己炎症性疾患由来の試料を含む）、パネルＣＮＳＤ．０１（正常脳および患部脳由来の試料を含む）およびＣＮＳ_神経変性_パネル（正常脳およびアルツハイマー病の脳由来の試料を含む）と称した。
【０６７５】
全試料由来のＲＮＡの完全性は、２８Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡ染色強度比をガイド（２：１〜２．５：１、２８Ｓ：１８Ｓ）として用いるアガロースゲル電気泳動図の視覚的評価によって質に関して、および分解産物を示唆するであろう低分子量ＲＮＡの不在に関して制御する。試料は単一エクソンの長さにわたって増幅するよう設計したプローブおよびプライマーセットを用いる、逆転写酵素の不在下でのＲＴＱ−ＰＣＲ反応実施によってゲノムＤＮＡ混入に対して制御する。
【０６７６】
最初に、このＲＮＡ試料を恒常的発現遺伝子（例えば、β-アクチンおよびＧＡＰＤＨ）などの参照核酸に対して標準化した。標準化したＲＮＡ（5μl）をｃＤＮＡへ変換し、ワンステップＲＴ−ＰＣＲ Master Mix試薬（Applied Biosystems；カタログ番号4309169）および遺伝子特異的プライマーを製造者の使用説明書に従って用いるＲＴＱ−ＰＣＲにより解析した。
【０６７７】
他の場合には、標準化していないＲＮＡ試料をSuperscript II（Invitrogen社;カタログ番号18064-147）およびランダム・ヘキサマーを製造者の使用説明書に従って用いて一本鎖ｃＤＮＡ（ｓｓｃＤＮＡ）へ変換した。全ＲＮＡを最大１０μｇ含む反応を２０μｌの容量で実施し、４２℃で60分間インキュベートした。この反応は最終容量100μlにおいて50μgの全ＲＮＡまでスケールアップしてもよい。次いで、ｓｓｃＤＮＡ試料を1×TaqMan（登録商標）Universal Master mix（Applied Biosystems;カタログ番号4324020）を製造者の使用説明書に従って用いて従前に記載の参照核酸に対して標準化した。
【０６７８】
プローブおよびプライマーはApplied BiosystemsのPrimer Expressソフトウェアパッケージ（アップルコンピューターのマッキントッシュパワーPC第1版）または標的配列インプットとして用いる類似のアルゴリズムに従って各アッセイ用に設計した。デフォルト設定を反応条件に用い、以下のパラメーターをプライマー選択の前に設定した：プライマー濃度=250nM、プライマー融解温度（Ｔｍ）範囲=58〜60℃、プライマーの最適Ｔｍ=59℃、最大プライマー差=2℃、プローブは5'Gを含まない、プローブTmはプライマーTmより10℃高くなくてはならない、アンプリコンサイズは75bp〜100bp。選択したプローブおよびプライマー（以下参照）をSynthegen（Houston, TX, USA）によって合成した。プローブをHPLCで2回精製して結合していない色素を除去し、質量分析によって評価し、レポーターおよびクエンチャー色素のプローブの5'および3'末端それぞれとの結合を確認した。最終濃度は、フォワードおよびリバースプライマーは各900nM、プローブは200nMとした
【０６７９】
ＰＣＲ条件：ＲＮＡ試料を扱う場合には、各組織および各細胞株由来の標準化ＲＮＡを96ウェルまたは384ウェルＰＣＲプレート（Applied Biosystems）のいずれかの各ウェルにスポットした。ＰＣＲカクテルは単一の遺伝子特異的プローブおよびプライマーセット、または2つのマルチプレックス化したプローブおよびプライマーセット（標的クローンに特異的なセットおよび標的プローブについてマルチプレックス化した別の遺伝子特異的セット）のいずれかを含んでいた。ＰＣＲ反応はTaqMan（登録商標）ワンステップＲＴ−ＰＣＲ Master Mix（Applied Biosystems，カタログ番号4313803）を製造者の使用説明書に従って用いて設定した。48℃で30分間の逆転写、次いで、以下の増幅/ＰＣＲサイクル：95℃10分間、その後95℃15秒を40サイクル、60℃で1分間を実施した。結果は、任意の試料とΔＣＴ力について2で表される最低のＣＴ値を持つ試料間のＲＮＡ濃度に差に関して、ログスケールを用いてＣＴ値（任意の試料が蛍光の閾値を通過するサイクル）として記録した。次いで、相対発現パーセントがこのRNA差異の逆数をとり、100を掛けることによって得られる。
【０６８０】
ｓｓｃＤＮＡ試料を扱う場合には、標準化したｓｓｃＤＮＡをＲＮＡ試料について前記の通り用いた。1または2セットのプローブおよびプライマーを含むＰＣＲ反応を1×TaqMan（登録商標）Universal Master mix（Applied Biosystems；カタログ番号4324020）を製造者の使用説明書に従って用いて、前記の通り設定した。ＰＣＲ増幅は以下のように実施した：95℃で10分、次いで95℃で15秒の40サイクル、60℃で1分。結果は前記のように解析し、処理した。
【０６８１】
パネル１、１．１、１．２、および１．３Ｄ
パネル１、１．１、１．２および１．３Ｄのプレートには2の対照ウェル（ゲノムＤＮＡ対照および化学対照）および種々の試料由来のｃＤＮＡを含む94のウェルが含まれる。これらのパネルの試料は2つのクラス：培養細胞株由来の試料および一次正常組織由来の試料に分類される。細胞株は以下の種類の癌：肺癌、乳癌、黒色腫、結腸癌、前立腺癌、CNS癌、扁平上皮癌腫腫、卵巣癌、肝臓癌、腎臓癌、胃癌および膵臓癌に由来する。これらのパネルで用いる細胞株は培養細胞株の宝庫であるAmerican Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）を通じて広く入手可能であり、ＡＴＣＣの推奨する条件を用いて培養した。これらのパネルに見出される正常組織は単一の成人個体または胎児のすべての主要器官系に由来する試料に含まれる。これらの試料は以下の器官：成人骨格筋、胎児骨格筋、成人心臓、胎児心臓、成人腎臓、胎児腎臓、成人肝臓、胎児肝臓、成人肺、胎児肺、脳の種々の領域、脾臓、骨髄、リンパ節、膵臓、唾液腺、下垂体、副腎、脊髄、胸腺、胃、小腸、結腸、膀胱、気管、乳房、卵巣、子宮、胎盤、前立腺、精巣および脂肪に由来する。
【０６８２】
パネル１、１．１、１．２および１．３Ｄの結果では、以下の略語が用いられる：
ca.=癌腫
*=転移により確立されたもの
met=転移
s cell var=小細胞変異体
non-s=non-sm=非小細胞性
squam=扁平上皮
pl. eff=pl effusion=胸膜浸出液
glio=神経膠腫
astro=星細胞腫
neuro=神経芽細胞腫
【０６８３】
一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．４、ｖ１．５およびｖ１．６
パネル１．４、ｖ１．５およびｖ１．６のプレートには2の対照ウェル（ゲノムＤＮＡ対照および化学対照）および種々の試料由来のｃＤＮＡを含む94のウェルが含まれる。パネル１．４、ｖ１．５およびｖ１．６の試料は2つのクラス：培養細胞株由来の試料および一次正常組織由来の試料に分類される。細胞株は以下の種類の癌：肺癌、乳癌、黒色腫、結腸癌、前立腺癌、ＣＮＳ癌、扁平上皮癌腫腫、卵巣癌、肝臓癌、腎臓癌、胃癌および膵臓癌に由来する。パネル１．４、ｖ１．５およびｖ１．６で用いる細胞株は培養細胞株の宝庫であるAmerican Type Culture Collection （ＡＴＣＣ）を通じて広く入手可能であり、ＡＴＣＣの推奨する条件を用いて培養した。パネル１．４、ｖ１．５およびｖ１．６に見出される正常組織は2〜5の異なる成人個体または胎児のすべての主要器官系に由来する試料のプールに含まれる。これらの試料は以下の器官：成人骨格筋、胎児骨格筋、成人心臓、胎児心臓、成人腎臓、胎児腎臓、成人肝臓、胎児肝臓、成人肺、胎児肺、脳の種々の領域、脾臓、骨髄、リンパ節、膵臓、唾液腺、下垂体、副腎、脊髄、胸腺、胃、小腸、結腸、膀胱、気管、乳房、卵巣、子宮、胎盤、前立腺、精巣および脂肪に由来する。略語はパネル１、１．１、１．２および１．３Ｄについて記載した通り。
【０６８４】
パネル２Ｄ、２．２、２．３および２．４
パネル２Ｄ、２．２、２．３および２．４のプレートには概ね2の対照ウェルおよび米国国立癌研究所（the National Cancer Institute）のCooperative Human Tissue Network（ＣＨＴＮ）またはNational Disease Research Initiative（ＮＤＲＩ）と密接な協力関係を持つ医師により入手したか、あるいはArdaisまたはClinomicsから得たヒト組織から単離した、ＲＮＡまたはｃＤＮＡから成る94の試験試料が含まれる。この組織はヒト悪性腫瘍に由来し、示される場合には、多くの悪性組織が腫瘍とまさに隣接した非癌性組織から得られた「対応辺縁」を含む。これらを正常な隣接組織と称し、下記の結果では「ＮＡＴ」と示す。腫瘍組織および「対応縁部」は2人の独立した病理学者によって（外科病理学者およびさらにNDRI/CHTN/Ardais/Clinomicsの病理学者によって）評価されている。悪性腫瘍のない組織（正常組織）由来の非対応RNA試料もArdaisまたはClinomicsより入手した。この分析により腫瘍の分化の程度に関する全体的な組織病理学的評価が提供される。さらに、ほとんどの試料が患者の臨床段階に関する情報を提供する最初の外科病理学報告書を包含する。これら対応縁部は外科手術域を取り囲む（すなわち、最も近くに隣接する）組織（表ＲＲでは正常隣接細胞という語から「ＮＡＴ」と表す）から採取されている。さらに、ＲＮＡおよびｃＤＮＡ試料を高齢者または急死した被害者（事故など）に行なわれた検死解剖より得た種々のヒト組織から得た。これらの組織は病気にかかっていないと確認され、Clontech（Palo Alto, CA）、Research Genetics、およびInvitrogenなどの種々の商業ソースから購入した。
【０６８５】
ＨＡＳＳパネルｖ１．０
ＨＡＳＳパネルｖ１．０プレートは93のｃＤＮＡ試料および2の対照に含まれる。詳しくは、これらの試料のうち81が、血清飢餓、アシドーシスおよび無酸素に異なる期間付された培養ヒト癌細胞株ならびにこれらの処置の対照に由来し、3試料がヒト一次細胞、9試料が悪性脳癌（4の髄芽細胞腫および5の膠芽細胞腫））、ならびに2が対照である。ヒト癌細胞株はＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）より入手し、以下の組織群：乳癌、前立腺癌、膀胱癌腫、膵臓癌、およびＣＮＳ癌細胞株に分類される。これらの癌細胞はすべて標準の推奨される条件下で培養する。用いた処置（血清飢餓、アシドーシスおよび無酸素）はこれまでに科学論文で公開されている。ヒト一次細胞はClonetics（Walkersville, MD）より入手し、Cloneticsの推奨する培地および条件で増殖させた。悪性脳癌試料は共同研究（Henry Ford Cancer Center）の一環として入手し、CuraGenが試料を受け取る前に病理学者によって評価されている。標準的な手順を用いてＲＮＡをこれらの試料から調製した。ゲノム対照および化学対照ウェルについては既に記載した。
【０６８６】
ＡＲＤＡＩＳパネルv1.0
ＡＲＤＡＩＳパネルｖ１．０のプレートには概ね2の対照ウェルおよびArdais社と密接な協力関係を持つ医師により入手したヒト組織から単離したRNAからなる22の試験試料を含む。組織はヒト肺悪性腫瘍、（肺腺癌または肺扁平上皮癌腫）に由来し、示される場合には、多くの悪性組織は腫瘍とまさに隣接した非癌性組織から得られる「対応縁部」を含む。これら対応縁部は以下の結果では外科手術域を取り囲む（すなわち、最も近くに隣接する）組織（正常隣接細胞という語から「ＮＡＴ」と呼ばれる）から採取されている。腫瘍組織および「対応縁部」は独立した病理学者によって（外科病理学者およびさらにArdaisの病理学者によって）評価されている。肺由来の非対応悪性および非悪性のＲＮＡ試料もArdaisより入手した。Ardaisからのさらなる情報により腫瘍分化の程度および段階に関する全体的な組織病理学的評価を提供される。さらに、ほとんどの試料が患者の臨床段階に関する情報を提供する最初の外科病理学報告書を包含する。
【０６８７】
パネル  ３Ｄ、３．１および３．２
パネル３Ｄ、３．１および３．２のプレートは94のｃＤＮＡ試料および2の対照試料に含まれる。詳しくは、これらの試料のうち92が培養ヒト癌細胞株に由来し、2試料がヒト一次小脳組織に由来し2が対照である。ヒト細胞株は概ねＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）、ＮＣＩまたはドイツ腫瘍細胞バンク（German tumor cell bank）より入手し、以下の組織群：舌の扁平上皮癌腫、乳癌、前立腺癌、黒色腫、類表皮癌腫、肉腫、膀胱癌腫、膵臓癌、腎臓癌、白血病/リンパ腫、卵巣/子宮/子宮頸癌、胃癌、結腸癌、肺癌およびＣＮＳ癌細胞株に分けられる。さらに、２つの独立した小脳の試料がある。これらの細胞はすべて標準の推奨された条件下で培養し、標準的な手順を用いてRNAを抽出した。パネル３Ｄ、３．１、３．２、１、１．１、１．３Ｄ、１．４、１．５および１．６中の細胞株は科学文献で用いられる最も一般的な細胞株である。
【０６８８】
パネル４Ｄ、４Ｒ、および４．１Ｄ
パネル４は96ウェルプレート（対照ウェル2、試験試料94）に、炎症症状に関連する種々のヒト細胞株または組織から単離したＲＮＡ（パネル４Ｒ）またはｃＤＮＡ（パネル４Ｄ/４．１Ｄ）からなる試料を含む。結腸および肺（Stratagene, La Jolla, CA）ならびに胸腺および腎臓（Clontech）などの対照正常組織由来の全RNAを用いた。肝硬変患者より得た肝臓組織および狼瘡患者より得た腎臓由来の全ＲＮＡはBioChain（BioChain Institute, Inc., Hayward, CA）より入手した。クローン病および潰瘍性大腸炎であると診断された患者由来のＲＮＡ調製用の腸組織はNational Disease Research Interchange（ＮＤＲＩ）（Philadelphia, PA）より入手した。
【０６８９】
星細胞、肺繊維芽細胞、皮膚繊維芽細胞、冠状動脈平滑筋細胞、細気管支上皮、気管支上皮、皮膚微小血管内皮細胞、肺微小血管内皮細胞、ヒト肺大動脈内皮細胞、ヒト臍静脈内皮細胞はすべてClonetics（Walkersville, MD）より購入し、これらの細胞種用にCloneticsが提供する培地で増殖させた。これらの一次細胞種は指示された通り、種々のサイトカインまたはサイトカインの組み合わせを用いて6および/または12〜14時間で活性化した。以下のサイトカインを用いた;約1〜5ng/mlのIL-1β、約5〜10ng/mlのTNFα、約20〜50ng/mlのIFNγ、約5〜10ng/mlのIL-4、約5〜10ng/mlのIL-9、約5〜10ng/mlのIL-13。内皮細胞は0.1%血清を含むCloneticsの基本培地での培養によって種々の期間飢餓とすることもあった。
【０６９０】
単核球をFicollを用いてCuraGen社の社員の血液から調製した。LAK細胞をこれらの細胞からDMEM 5%FCS（Hyclone）、100μM非必須アミノ酸（Gibco/Life Technologies, Rockville, MD）、1mMピルビン酸ナトリウム（Gibco）、メルカプトエタノール5.5x10-5M（Gibco）、および10mM Hepes（Gibco）およびインターロイキン2で4〜6日培養することで調製した。次いで、細胞を、10〜20ng/ml PMAおよび1〜2μg/ml イオノマイシン、5〜10ng/mlのIL-12、20〜50ng/mlのIFNγおよび5〜10ng/mlのIL-18で6時間活性化させた。場合によっては、単核球をDMEM 5% FCS（Hyclone）、100μM非必須アミノ酸（Gibco）、1mMピルビン酸ナトリウム（Gibco）、メルカプトエタノール5.5x10-5M（Gibco）、および約5μg/mlのPHA（フィトヘムアグルチニン）またはPWM（ポークウィードマイトジェン）を含む10mM Hepes（Gibco）で4〜5日間培養した。試料はRNA調製用に24、48および72時間で採取した。MLR（混合リンパ球反応）試料は二人のドナーより血液を採取し、Ficollを用いて単核球を単離し、単離した単核球をDMEM 5% FCS（Hyclone）、100μM非必須アミノ酸（Gibco）、1mMピルビン酸ナトリウム（Gibco）、メルカプトエタノール（5.5x10-5M）（Gibco）、および10mM Hepes （Gibco）に約2x106細胞/mlの最終濃度で1：1混合することで得た。MLRを培養し、試料をRNA調製用に1〜7日間の範囲の種々の時点で取り出した。
【０６９１】
単球は、CD 14 Miltenyiビーズ、ポジティブVS選択カラムおよびVario Magnetを製造者の使用説明書に従って用いて単核球から単離した。単球はDMEM 5%ウシ胎児血清（FCS）（Hyclone, Logan, UT）、100μM非必須アミノ酸（Gibco）、1mMピルビン酸ナトリウム（Gibco）、メルカプトエタノール5.5x10-5M（Gibco）、および10mM Hepes（Gibco）、50ng/ml GMCSFおよび5ng/ml IL-4での5〜7日間の培養によって樹状細胞へ分化した。マクロファージはDMEM 5%FCS（Hyclone）、100μM非必須アミノ酸（Gibco）、1mMピルビン酸ナトリウム（Gibco）、メルカプトエタノール5.5x10-5M（Gibco）、10mM Hepes（Gibco）および10%AB型ヒト血清または約50ng/mlのMCSFで単球を5〜7日間培養して調製した。単球、マクロファージおよび樹状細胞はまた、100ng/mlのリポ多糖（LPS）で6および12〜14時間刺激した。樹状細胞も10μg/mlの抗CD40モノクローナル抗体（Pharmingen）で6および12〜14時間刺激した。
【０６９２】
ＣＤ４リンパ球、ＣＤ８リンパ球およびＮＫ細胞もＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ５６Miltenyiビーズ、ポジティブVS選択カラムならびにVario Magnetを製造者の使用説明書に従って用いて単核球から単離した。ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯ  ＣＤ４リンパ球はＣＤ８、ＣＤ５６、ＣＤ１４およびＣＤ１９ Miltenyiビーズおよびポジティブ選抜を用いてＣＤ８、ＣＤ５６、ＣＤ１４およびＣＤ１９細胞の単核球を枯渇させて単離した。次いでＣＤ４５ＲＯビーズを用いてＣＤ４５ＲＯ  ＣＤ４リンパ球をＣＤ４５ＲＡ  ＣＤ４リンパ球である残存する細胞とともに単離した。ＣＤ４５ＲＡ  ＣＤ４、ＣＤ４５ＲＯ  ＣＤ４およびＣＤ８リンパ球を、DMEM 5%FCS（Hyclone）、100μM非必須アミノ酸（Gibco）、1mMピルビン酸ナトリウム（Gibco）、メルカプトエタノール5.5x10-5（Gibco）、および10mM Hepes（Gibco）に入れ、ＰＢＳ中0.5μg/ml抗ＣＤ２８（Pharmingen）および3ug/ml抗ＣＤ３（OKT3, ATCC）で一晩コーティングしておいたFalcon6ウェル組織培養プレートの上に106個細胞/mlでプレーティングした。6時間後及び24時間後に、ＲＮＡ調製のためこの細胞を回収した。慢性的に活性化したＣＤ８リンパ球を調製するため、本発明者らは単離したＣＤ８リンパ球を4日間、抗ＣＤ２８および抗ＣＤ３コーティングプレート上で活性化し、次いで細胞を回収し、これらをDMEM 5%FCS（Hyclone）、100μM非必須アミノ酸（Gibco）、1mMピルビン酸ナトリウム（Gibco）、メルカプトエタノール5.5x10-5M（Gibco）、および10mM Hepes（Gibco）、およびIL-2で拡大した。次いで、拡大したＣＤ８細胞を再び抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８が結合したプレートで4日間活性化させ、前と同様に拡大した。第2の活性化の6および24時間後に、ならびに第2の拡大培養の4日後にＲＮＡを単離した。単離したＮＫ細胞はDMEM 5%FCS（Hyclone）、100μM非必須アミノ酸（Gibco）、1mMピルビン酸ナトリウム（Gibco）、メルカプトエタノール5.5x10-5M（Gibco）、および10mM Hepes（Gibco）およびIL-2で4〜6日間培養し、その後RNAを調製した。
【０６９３】
B細胞を得るために、扁桃をＮＤＲＩより入手した。扁桃を滅菌した解剖用鋏で細かく切断した後、篩にかけた。次いで扁桃細胞を沈降させ、DMEM 5%FCS（Hyclone）、100μM非必須アミノ酸（Gibco）、1mMピルビン酸ナトリウム（Gibco）、メルカプトエタノール5.5x10-5M（Gibco）、および10mM Hepes（Gibco）で、106細胞/mlに再懸濁した。細胞を活性化させるため、本発明者らは5ug/mlのPWMまたは約10μg/mlの抗ＣＤ４０（Pharmingen）ならびに5〜10ng/mlのIL-4を用いた。ＲＮＡ調製用に24、48および72時間で細胞を回収した。
【０６９４】
一次および二次Th1/Th2およびTr1細胞を調製するため、6ウェルFalconプレートを10μg/ml抗ＣＤ２８（Pharmingen）および2μg/ml OKT3（ＡＴＣＣ）で一晩コーティングし、次いでPBSで2回洗浄した。臍帯血ＣＤ４リンパ球（Poietic Systems, German Town, MD）をDMEM 5%FCS（Hyclone）、100μM非必須アミノ酸（Gibco）、1mMピルビン酸ナトリウム（Gibco）、メルカプトエタノール5.5x10-5M（Gibco）、10mM Hepes（Gibco）およびIL-2（4ng/ml）で105〜106細胞/mlで培養した。IL-12（5ng/ml）および抗IL4（1μg/ml）をTh1に直接用い、他方IL-4（5ng/ml）および抗IFNγ（1μg/ml）をTh2に直接用い、5ng/mlのIL-10をTr1に直接用いた。4〜5日後、活性化したTh1、Th2およびTr1リンパ球をDMEMで一度洗浄し、DMEM 5%FCS（Hyclone）、100μM非必須アミノ酸（Gibco）、1mMピルビン酸ナトリウム（Gibco）、メルカプトエタノール5.5x10-5M（Gibco）、10mM Hepes（Gibco）およびIL-2（1ng/ml）で4〜7日間拡大した。この後、活性化したTh1、Th2およびTr1リンパ球を前記のように抗CD28/OKT3およびサイトカインで5日間再刺激したが、アポトーシスを防ぐため抗ＣＤ９５Ｌ（1μg/ml）を添加した。4〜5日後、Th1、Th2およびTr1リンパ球を洗浄し、次いで再びIL-2で4〜7日間拡大した。活性化したTh1およびTh2リンパ球をこのように最大3サイクル間維持した。抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８モノクローナル抗体が結合したプレートでの第2および第3の活性化、ならびにインターロイキン2での第2および第3の拡大培養への4日間の6および24時間後、RNAを一次および二次Th1、Th2およびTr1より調製した。
【０６９５】
以下の白血球細胞株：Ramos、EOL-1、KU-812はＡＴＣＣより入手した。EOL細胞はさらに0.1mM dbcAMPで5x105細胞/mlにて、3日毎に培地を交換し、細胞濃度を5×105細胞/mlに調整しながら、8日間培養して分化させた。これらの細胞の培養には、本発明者らはDMEMまたはRPMI（ATCCの推奨するもの）を5% FCS（Hyclone）、100μM非必須アミノ酸（Gibco）、1mMピルビン酸ナトリウム（Gibco）、メルカプトエタノール5.5x10-5M（Gibco）、10mM Hepes（Gibco）を添加して用いた。RNAは休止細胞または10ng/mlのPMAおよび1μg/mlのイオノマイシンで6および14時間活性化させた細胞のいずれかから調製した。ケラチノサイト株CCD106および気道上皮腫瘍（airway epithelial tumor）株NCI-H292もATCCより入手した。双方ともDMEM 5%FCS（Hyclone）、100μM非必須アミノ酸（Gibco）、1mMピルビン酸ナトリウム（Gibco）、メルカプトエタノール5.5x10-5M（Gibco）、および10mM Hepes（Gibco）で培養した。CCD1106細胞は約5ng/ml TNFαおよび1ng/ml IL-1βで6および14時間活性化させ、他方、NCI-H292細胞は以下のサイトカイン：5ng/ml IL-4、5ng/ml IL-9、5ng/ml IL-13および25ng/ml IFNγで6および14時間活性化させた。
【０６９６】
これらの細胞株および血液細胞については、RNAはトリゾール（Gibco BRL）を用いて約107細胞/mlに溶解させることによって調製した。便宜には、1/10容量のブロモクロロプロパン（Molecular Research Corporation）をＲＮＡ試料へ加え、ボルテックス処理をして室温にて10分後、チューブをSorvall SS34 ローターにて14,000rpmで回転させた。水相を回収し、15ml Falcon Tubeの中に入れた。等量のイソプロパノールを加え、-20℃にて一晩静置した。沈殿したRNAをSorvall SS34ローターにて9,000rpmで15分間沈降させ、70%エタノールで洗浄した。ペレットを300μlのＲＮＡｓｅを含まない水に再び溶解し、35μlのバッファー（Promega）、5μl DTT、7μl RNAsinおよび8μlのDNアーゼを加えた。チューブを37℃で30分間インキュベートして混入しているゲノムDNAを除去し、フェノールクロロホルムで1回抽出し、1/10容量の3M酢酸ナトリウムおよび2容量の100%エタノールで再び沈殿させた。RNAを沈降させ、RNアーゼを含まない水に入れた。RNAは-80℃で保存した。
【０６９７】
ＡＩ_包括的_パネル_ｖ１．０
ＡＩ_包括的_パネル_ｖ１．０のプレートには2の対照ウェルならびに、Backus HospitalおよびClinomics（Frederick, MD）より入手した外科および検死解剖ヒト組織から単離したcDNAを含む89の試験試料が含まれる。全RNAはCuraGenの施設内のBackus Hospitalより得た組織試料から抽出した。他の組織由来の全ＲＮＡはClinomicsより入手した。
【０６９８】
滑液、滑膜、骨および軟骨をはじめとする関節組織はBackus Hospitalで人工膝関節または人工股関節置換術を受けている患者より得た。単離したＲＮＡが確実に最適な品質のものであり退化しないように組織試料は液体窒素中で直ちに急速冷凍させた。骨関節症および慢性関節リウマチの関節組織のさらなる試料をClinomicsより入手した。正常な対照組織はClinomicsより提供されたもので、外傷被害者の検死解剖の際に入手した。
【０６９９】
乾癬組織および隣接した対応組織の外科試料はClinomicsより全ＲＮＡとして提供された。25〜47歳の間の2名の男性および2名の女性患者を選択した。試料を単離する時に処方薬を服用していた患者はいなかった。
【０７００】
潰瘍性大腸炎およびクローン病の患者より得た患部結腸の外科試料および隣接する対応組織をClinomicsより入手した。41〜69歳の間の3名の女性および3名の男性クローン病患者より得た腸管組織を用いた。2名の患者は薬を処方されていなかったが、他の者はデキサメタゾン、フェノバルビタール、またはタイレノールを服用していた。潰瘍性大腸炎組織は3名の男性および4名の女性患者より得た。患者のうち4名はレヴィッド（lebvid）を、そして2名はフェノバルビタールを服用していた。
【０７０１】
疾病のない、または肺気腫、喘息またはＣＯＰＤを患う外傷被害者より得た検死解剖肺組織由来の全ＲＮＡをClinomicsより購入した。40〜70歳の範囲の肺気腫患者および全員が喫煙者であり、この年齢範囲はタバコが関連している肺気腫の患者に主眼を置き、かつ、α-1抗トリプシン欠乏症の患者を避けるために選択した。喘息患者は36〜75歳にわたり、COPDも有するおそれのある患者を避けるため喫煙者を除外した。ＣＯＰＤ患者は35〜80歳にわたり、喫煙者と非喫煙者の双方が含まれていた。ほとんどの患者がコルチコステロイドおよび気管支拡張薬を服用していた。
【０７０２】
ＡＩ_包括的_パネル_ｖ１．０パネルで組織の同定に用いた標識では、以下の略語が用いられている：
AI=自己免疫
Syn=滑液の
Normal=明白な疾病なし
Rep22/Rep20=個々の患者
RA=慢性関節リウマチ
Backus=Backus病院提供
OA=骨関節症
（SS）（BA）（MF）=個々の患者
Adj=隣接組織
Match control=隣接組織
- M=男性
- F=女性
COPD=慢性閉塞性肺疾患
【０７０３】
パネル５Ｄおよび５Ｉ
パネル５Ｄおよび５Ｉのプレートには2の対照ウェルならびに代謝病に重点を置いてヒト組織および細胞株から単離した種々のｃＤＮＡが含まれる。代謝組織は妊娠糖尿病（Gestational Diabetes）研究に加わっている患者より得た。細胞はヒト間葉幹細胞由来の脂肪細胞の分化における様々の段階の間で得た。ヒト膵島も得た。
【０７０４】
妊娠糖尿病研究では被検者は若い（18〜40歳）かまたは慣例の（選択性の）帝王切開をうけている妊娠糖尿病であるか、そうでない健常な女性である。乳児出産後の外科的切開が修復された/閉じられる際、各外科レベルの終了処理中に産科医が露出した代謝組織の小試料（<1cc）を摘出した。生検物質を摘出から5分以内に滅菌した生理食塩水ですすぎ、水分を吸い取って急速冷凍した。次いで組織を液体窒素で瞬間冷凍させ、滅菌したネジ蓋式のチューブに個別に保存し、発送用またはCuraGen社が回収するようにドライアイス上で維持した。注目する代謝組織としては子宮壁（平滑筋）、内臓脂肪、骨格筋（直筋）および皮下脂肪が挙げられる。患者の概要は以下の通り：
患者2：糖尿病のラテンアメリカ人、過体重、インスリンを常用していない
患者7-9：糖尿病でない白人で肥満（BMI>30）
患者10：糖尿病のラテンアメリカ人、過体重、インスリンを常用
患者11：糖尿病でないアフリカ系アメリカ人で過体重
患者12：糖尿病のラテンアメリカ人、インスリンを常用
【０７０５】
脂肪細胞の分化を、2つの複製しかないドナー３Ｕを除き、3連でOsirus（Clonetics/BioWhittakerの一部門）から得たドナー前駆細胞内で誘導した。Cloneticsの科学者らはCuraGenのためにMark F. Pittengerらに見出された公開プロトコール、Multilineage Potential of Adult Human mesenchymal Stem Cells Science Apr 2 1999：143-147に基づいてヒト間葉幹細胞（HuMSC）を単離し、増殖させ、分化させた。CloneticsはｍＲＮＡ単離および二本鎖ｃＤＮＡ生成に好適なトリゾール溶解物または凍結ペレットを提供した。各ドナーの概要は以下の通り：
ドナー2および3U： 間葉幹細胞、未分化の脂肪
ドナー2および3AM：脂肪、分化途中の脂肪
ドナー2および3AD：脂肪、分化した脂肪
【０７０６】
ヒト細胞株は概ねＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）、ＮＣＩまたはドイツ腫瘍細胞バンク（German tumor cell bank）より入手し、以下の組織群：腎臓近位尿細管、子宮平滑筋細胞、小腸、肝臓HepG2癌細胞、心臓一次間質細胞、および副腎皮質腺腫細胞に分類される。これらの細胞はすべて標準の推奨された条件下で培養し、標準的な手順を用いてＲＮＡを抽出した。すべての試料はCuraGenで処理して一本鎖ｃＤＮＡを得た。
【０７０７】
パネル５Ｉはこれまでに記載のすべての試料を含み、マイアミ医科大学（University of Miami School of Medicine）の糖尿病研究所（Diabetes Research Institute）から得た５８歳の女性患者の膵島をさらに加えた。島組織は外部ソースで全ＲＮＡに処理され、パネル５Ｉに加えるためCuraGenに届けられた。
【０７０８】
５Ｄおよび５Ｉパネルで組織の同定に用いた標識では、以下の略語が用いられている：
GO脂肪=大網脂肪
SK=骨格筋
UT=子宮
PL=胎盤
AD=分化した脂肪
AM=分化途中の脂肪
U=未分化の幹細胞
【０７０９】
パネルＣＮＳＤ．０１
パネルＣＮＳＤ．０１のプレートは2の対照ウェルおよびハーバード脳組織資源センター（Harvard Brain Tissue Resource Center）より得た検死解剖ヒト脳組織から単離したcDNAからなる94の試験試料が含まれる。脳は死後4〜24時間にドナーの頭蓋冠から摘出され、神経解剖学者によって区分化され、液体窒素蒸気中で-80℃にて凍結されている。すべての脳は神経病理学者によって区分化されて調べられ、明確に関連している神経病理学について診断が確認されている。
【０７１０】
疾病診断は患者の記録から取られている。パネルには以下の診断：アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、進行性核上麻痺、鬱病の各々からの2つの脳、および「正常対照」が含まれる。これらの脳の各々の中には、以下の領域が示されている：帯状回、側頭極、淡蒼球、黒質、ブロードマン野4（一次運動帯）、ブロードマン野7（頭頂皮質）、ブロードマン野9（前前頭皮質）、およびブロードマン野17（後頭皮質）。すべての患者ですべての脳の領域が示されるわけではなく、ハンチントン舞踏病は一つには淡蒼球での神経変性を特徴とし、従ってハンチントン舞踏病と確認された患者からこの領域を得ることは不可能である。同様にパーキンソン病は黒質の変性を特徴とし、この領域を得るのが一層困難となる。正常な対照脳は神経病理学に関して調べられ、神経変性に一致する病理がないとわかったものである。
【０７１１】
ＣＮＳパネルで組織の同定に用いた標識では、以下の略語が用いられている：
PSP=進行性核上麻痺
Sub Nigra=黒質
Glob Palladus=淡蒼球
Temp Pole=側頭極
Cing Gyr=帯状回
BA 4=ブロードマン野4
【０７１２】
パネル_ＣＮＳ_神経変性_ｖ１．０
パネル_ＣＮＳ_神経変性_ｖ１．０のプレートには2の対照ウェルならびにハーバード脳組織資源センター（Harvard Brain Tissue Resource Center）（McLean Hospital）およびヒト脳・脊髄液資源センター（Human Brain and Spinal Fluid Resource Center）（VA Greater Los Angeles Healthcare System）から入手した検死解剖ヒト脳組織から単離したcDNAからなる47の試験試料が含まれる。脳は死後4〜24時間にドナーの頭蓋冠から摘出され、神経解剖学者によって区分化され、液体窒素蒸気中で-80℃にて凍結されている。すべての脳は神経病理学者によって区分化されて調べられ、明確に関連する神経病理学について診断が確認されている。
【０７１３】
疾病診断は患者の記録から取られている。パネルには6のアルツハイマー病（ＡＤ）患者由来の脳、および8の死亡前に痴呆の徴候を示さなかった「正常対照」由来の脳を含む。8の正常対照脳は2種類：痴呆およびアルツハイマー病のような病状のない対照（対照）および痴呆はないが重篤なアルツハイマー病のような病状の徴候のある対照、（詳しくは0〜3段階のレベル3と評価される老人斑量；0=斑の徴候なし、3=重篤なAD老人斑量）に分けられる。これらの脳の各々の中には、以下の領域が示されている：海馬、側頭皮質（ブロードマン野21）、頭頂皮質（ブロードマン野7）、および後頭皮質（ブロードマン野17）。これらの領域はＡＤにおけるすべての段階の神経変性を包含するよう選択した。海馬はＡＤにおいて初期ならびに重篤な神経損失領域である；側頭皮質はＡＤにおいて海馬の後に神経変性を示すと知られている；頭頂皮質はこの疾病の最終段階で適度の神経細胞死を示す；後頭皮質はＡＤで残される、従ってＡＤ患者内で「対照」領域として役割を果たす。すべての患者ですべての脳領域が示されているわけではない。
【０７１４】
パネル_ＣＮＳ_神経変性_ｖ１．０で組織の同定に用いた標識では、以下の略語が用いられている：
AD=アルツハイマー病脳；検死解剖に際し患者は痴呆でADのような病理を示した
Control=対照脳；神経病理学を示さない痴呆でない患者
Control（Path）=対照脳；痴呆でないが重篤なADのような病理を示す患者
SupTemporal Ctx=上側頭皮質
Inf Temporal Ctx=下側頭皮質
【０７１５】
Ａ．ＣＧ１０５４７２−０１：ＫＩＡＡ０５７５／Ｇｒｅｂ１
遺伝子ＣＧ１０５４７２−０１の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ３０４１、Ａｇ３０４２、Ａｇ４３０１およびＡｇ４３００を用いて評価し、表ＡＡ、ＡＢ、ＡＣおよびＡＤに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＨ、ＡＩ、ＡＪおよびＡＫに示す。
【０７１６】
【表３６４】
2005528080.tif 000365
【０７１７】
【表３６５】
2005528080.tif 000366
【０７１８】
【表３６６】
2005528080.tif 000367
【０７１９】
【表３６７】
2005528080.tif 000368
【０７２０】
【表３６８】
2005528080.tif 000369
【０７２１】
表ＡＥの続き
【表３６９】
2005528080.tif 000370
【０７２２】
【表３７０】
2005528080.tif 000371
【０７２３】
表ＡＦの続き
【表３７１】
2005528080.tif 000372
【０７２４】
【表３７２】
2005528080.tif 000373
【０７２５】
表ＡＧの続き
【表３７３】
2005528080.tif 000374
【０７２６】
表ＡＧの続き
【表３７４】
2005528080.tif 000375
【０７２７】
【表３７５】
2005528080.tif 000376
【０７２８】
表ＡＨの続き
【表３７６】
2005528080.tif 000377
【０７２９】
【表３７７】
2005528080.tif 000378
【０７３０】
表ＡＩの続き
【表３７８】
2005528080.tif 000379
【０７３１】
表ＡＩの続き
【表３７９】
2005528080.tif 000380
【０７３２】
【表３８０】
2005528080.tif 000381
【０７３３】
表ＡＪの続き
【表３８１】
2005528080.tif 000382
【０７３４】
【表３８２】
2005528080.tif 000383
【０７３５】
ＣＮＳ_神経変性_ｖ１．０概要：Ａｇ４３００／Ａｇ４３０１  このパネルは、個々の独立した群の脳における低レベルでのこの遺伝子の発現を確かにする。しかしながら、この遺伝子の差のある発現は、アルツハイマー病の死後脳とこの実験の痴呆のない対照のものとの間で検出されない。中枢神経系疾患の処置でのこの遺伝子の潜在的な有用性の考察のため、パネル１．４を参照されたい。
【０７３６】
一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．４概要：Ａｇ４３００  この遺伝子の最も高発現は、乳癌ＭＣＦ−７細胞株で検出される（ＣＴ＝２５）。この遺伝子はＧｒｅｂ１タンパク質をコードする。この遺伝子の高発現は、ＭＣＦ−７でのエストロゲン応答でアップレギュレートされる（Ghosh et al., 2000, Cancer Res 60(22):6367-75, PMID: 11103799）。加えて、この遺伝子の高レベルから中レベルの発現はまた、黒色腫、卵巣癌、乳癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、大腸癌、および乳癌由来の多くの細胞株で見られる。それゆえ、この遺伝子の発現は、これらの癌の検出のための診断マーカーとして用いられ得る。さらに、この遺伝子の治療的調節は、これら癌の処置で有用であり得る。
【０７３７】
代謝機能または内分泌機能を有する組織の間で、この遺伝子は、膵臓、脂肪、副腎、下垂体、骨格筋、心臓、胎児の肝臓および消化管で中レベルで発現する。それゆえ、この遺伝子活性の治療的調節は、肥満および糖尿病のような内分泌／代謝関連疾患の処置で有用となり得る。
【０７３８】
興味深いことに、この遺伝子は、成人の肝臓（ＣＴ＝３５．９）と比較して胎児でずっと高レベル（ＣＴ＝２９．６）で発現する。この知見は、この遺伝子の発現を用いて成人の肝臓から胎児の肝臓を区別し得ることを示す。加えて、胎児でのこの遺伝子の相対過剰発現は、タンパク質産物が胎児での肝臓成長または発達を増強し得るし、従って成人での再生能力でも働きうることを示す。それゆえ、この遺伝子によりコード化されるタンパク質の治療的調節は、肝臓関連疾患の処置で有用であり得る。
【０７３９】
この遺伝子の高発現はまた、成人の肺で検出される（ＣＴ＝２６）。この遺伝子の発現は、胎児の肺と比較して成人の肺でより高い（ＣＴ＝３１）。それゆえ、この遺伝子の発現を用いて、成人の肺と胎児の肺とを区別し得る。
【０７４０】
加えて、この遺伝子は、扁桃体、海馬、黒質、視床、小脳、大脳皮質、および脊髄の全領域で中レベルで発現する。それゆえ、この遺伝子産物の治療的調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、てんかん、多発性硬化症、総合失調症およびうつ病のような中枢神経系疾患の処置で有用であり得る。
【０７４１】
パネル１．３Ｄ概要：Ａｇ３０４１／Ａｇ３０４２  同一プローブとプライマーのセットでの２度の実験は、優位に一致する。この遺伝子の最も高発現は、乳癌ＭＣＦ−７細胞株で検出される（ＣＴ＝２６．９）。この遺伝子の中レベルから低レベルの発現はまた、卵巣癌、乳癌、肺癌、肝臓癌、および脳腫瘍の細胞株、および脳、および脂肪、骨格筋、胎児の心臓、副腎および下垂体のような代謝機能および内分泌機能を有する組織で見られる。この遺伝子の有用性のさらなる考察のため、パネル１．４を参照されたい。
【０７４２】
パネル２．２概要：Ａｇ３０４１  この遺伝子の最も高発現は、正常子宮で検出される（ＣＴ＝３０．９）。この遺伝子の中レベルから低レベルの発現はまた、癌および正常両方の前立腺、乳および子宮で見られる。それゆえ、この遺伝子の治療的調節は、これらの癌の処置で有用であり得る。
【０７４３】
パネル３Ｄ概要：Ａｇ３０４１  この遺伝子の最も高発現は、神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞株で検出される（ＣＴ＝３２．９）。加えて、この遺伝子の中レベルから低レベルの発現はまた、小細胞性肺癌、ＢおよびＴ細胞リンパ腫、およびウィルムス腫瘍由来の癌細胞株で見られる。Ａｇ４３００  この遺伝子の最も高発現は、肺癌細胞株および黒色腫細胞株で見られる（ＣＴ＝３１．７）。
【０７４４】
それゆえ、この遺伝子の治療的調節は、神経芽細胞腫、小細胞性肺癌、Ｂ細胞およびＴ細胞リンパ腫およびウィルムス腫瘍の処置で有用であり得る。
【０７４５】
パネル４．１Ｄ概要：Ａｇ４３０１  この遺伝子の最も高発現は、好酸球で検出される（ＣＴ＝３０．７）。差の有る遺伝子発現は、ホルボールエステルおよびイオノマイシンにより刺激されたＥＯＬ−１細胞でのものを超えて、休止条件下で好酸球細胞株ＥＯＬ−１で観察される（ＣＴ＝３９）。従って、この遺伝子は、好酸球機能で関与しうる。活性を刺激するこのタンパク質に対して生じる抗体は、好酸球の減少、および喘息およびＴ細胞介在性免疫疾患および炎症疾患の処置で有用であり得る。
【０７４６】
この遺伝子の中レベルの発現はまた、腎臓で検出される。それゆえ、この遺伝子の治療的調節は、ループスおよび糸球体腎炎を含む腎臓関連疾患で有用であり得る。
【０７４７】
Ａｇ４３００  この遺伝子の発現は、このパネルの全試料にわたって低い／検出できない（ＣＴ＞３５）（データは示していない）。
【０７４８】
パネル４Ｄ概要：Ａｇ３０４１／Ａｇ３０４２  この遺伝子での２度の実験結果は含まれていない。アンププロットは、この実施で実験的困難さが存在することを示す（データはしめしていない）。
【０７４９】
一般的腫瘍学スクリーニングパネル_ｖ_２．４概要：Ａｇ３０４２／Ａｇ４３００／Ａｇ４３０１  異なるプローブとプライマーのセットでの３回の実験は、優位な一致となる。この遺伝子の最も高発現は、転移性黒色腫で検出される（ＣＴ＝２５〜２５．９）。加えて、この遺伝子の中発現から高発現はまた、肺癌、前立腺癌、腎臓癌で検出される。従って、この遺伝子の発現は、転移性黒色腫、肺癌、前立腺癌および腎臓癌の検出のための診断マーカーとして用いられ得る。
【０７５０】
Ｂ．ＣＧ１０６４１７−０１：フォンウイルブランド因子様タンパク質
遺伝子ＣＧ１０６４１７−０１の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ４４７０を用いて評価し、表ＢＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＢＢ、ＢＣ、ＢＤ、ＢＥおよびＢＦに示す。
【０７５１】
【表３８３】
2005528080.tif 000384
【０７５２】
【表３８４】
2005528080.tif 000385
【０７５３】
表ＢＢの続き
【表３８５】
2005528080.tif 000386
【０７５４】
【表３８６】
2005528080.tif 000387
【０７５５】
【表３８７】
2005528080.tif 000388
【０７５６】
表ＢＤの続き
【表３８８】
2005528080.tif 000389
【０７５７】
【表３８９】
2005528080.tif 000390
【０７５８】
表ＢＥの続き
【表３９０】
2005528080.tif 000391
【０７５９】
【表３９１】
2005528080.tif 000392
【０７６０】
ＡＩ_包括的パネル_ｖ１．０概要：Ａｇ４４７０  これらの結果は、細胞におけるこの遺伝子の発現が免疫応答で関与することを確かにする。この遺伝子の最も高発現は、正常肺で見られる（ＣＴ＝３０．５）。炎症でのこの遺伝子の有用性の考察のため、パネル４Ｄを参照されたい。
【０７６１】
ＣＮＳ_神経変性_ｖ１．０概要：Ａｇ４４７０  このパネルは、アルツハイマー病でのこの遺伝子の差のない発現を示す。しかしながら、このプロフィールは、脳における中レベルだが優位なレベルでのこの遺伝子の発現を確かにする。それゆえ、この遺伝子の発現または機能の治療的調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、総合失調、多発性硬化症、脳卒中およびてんかんのような神経性疾患の処置で有用であり得る。
【０７６２】
一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．４概要：Ａｇ４４７０  この遺伝子の最も高発現は、胎児および成人の肝臓、および大腸癌、腎臓癌および肺癌由来の細胞株でみられる中レベルの発現と共に、肝臓癌細胞株で見られる（ＣＴ＝３０）。従って、この遺伝子の発現を用いて、このパネルの他の試料から肝臓由来組織を区別し得る。
【０７６３】
パネル４．１Ｄ概要：Ａｇ４４７０  この実験のこの遺伝子の最も高発現は、ＩＬ−４で処理された皮膚線維芽細胞で検出される（ＣＴ＝３０）。加えて、この実験は、休止好中球での低レベルだが優位なレベルでの発現を示す（ＣＴ＝３２．２）。加えて、この遺伝子は、ＩＦＮγで刺激された皮膚線維芽細胞、活性化肺線維芽細胞、ＨＰＡＥＣ、肺および皮膚の微小血管、活性化小気道および気管支上皮、活性化ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞、急性活性化Ｔ細胞、および活性化Ｂ細胞において中レベルで発現する。Ｔ細胞、活性化Ｂ細胞および肺および皮膚の細胞でのこれらのレベルの発現に基づき、この遺伝子産物の機能をブロックする治療は、活性化Ｂ細胞が、異常免疫応答の発生、およびクローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、ＣＯＰＤ、喘息、アレルギー、肺気腫、関節リウマチ、乾癬を含む、Ｔ細胞介在性疾患の処置において抗原を提示する、自己免疫疾患および炎症性疾患の患者の症状を改善または除去する治療として有用であり得る。活性化Ｂ細胞が、異常免疫応答の発生、およびクローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、ＣＯＰＤ、喘息、アレルギー、肺気腫、関節リウマチ、乾癬を含む、Ｔ細胞介在性疾患の処置において抗原を提示する。
【０７６４】
一般的腫瘍学スクリーニングパネル_ｖ_２．４概要：Ａｇ４４７０  この遺伝子の最も高発現は、腎臓癌で見られる（ＣＴ＝３０）。加えて、この遺伝子は、肺癌および腎臓癌で、対応正常隣接組織より高く発現する。従って、この遺伝子の発現は、これらの癌のマーカーとして用いられ得る。さらに、この遺伝子産物の発現または機能の治療的調節は、肺癌および腎臓癌の処置で有用であり得る。
【０７６５】
Ｃ．ＣＧ１０６４１７−０４：フォンウイルブランド因子様タンパク質
遺伝子ＣＧ１０６４１７−０４の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ１２９４ｂ、Ａｇ７４６、Ａｇ９０５およびＡｇ４７２６を用いて評価し、表ＣＡ、ＣＢ、ＣＣおよびＣＤに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＣＥ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＨ、ＣＩ、ＣＪおよびＣＫに示す。
【０７６６】
【表３９２】
2005528080.tif 000393
【０７６７】
【表３９３】
2005528080.tif 000394
【０７６８】
【表３９４】
2005528080.tif 000395
【０７６９】
【表３９５】
2005528080.tif 000396
【０７７０】
【表３９６】
2005528080.tif 000397
【０７７１】
表ＣＥの続き
【表３９７】
2005528080.tif 000398
【０７７２】
【表３９８】
2005528080.tif 000399
【０７７３】
表ＣＦの続き
【表３９９】
2005528080.tif 000400
【０７７４】
【表４００】
2005528080.tif 000401
【０７７５】
表ＣＧの続き
【表４０１】
2005528080.tif 000402
【０７７６】
【表４０２】
2005528080.tif 000403
【０７７７】
表ＣＨの続き
【表４０３】
2005528080.tif 000404
【０７７８】
表ＣＨの続き
【表４０４】
2005528080.tif 000405
【０７７９】
【表４０５】
2005528080.tif 000406
【０７８０】
表ＣＩの続き
【表４０６】
2005528080.tif 000407
【０７８１】
表ＣＩの続き
【表４０７】
2005528080.tif 000408
【０７８２】
【表４０８】
2005528080.tif 000409
【０７８３】
表ＣＪの続き
【表４０９】
2005528080.tif 000410
【０７８４】
表ＣＪの続き
【表４１０】
2005528080.tif 000411
【０７８５】
【表４１１】
2005528080.tif 000412
【０７８６】
表ＣＫの続き
【表４１２】
2005528080.tif 000413
【０７８７】
表ＣＫの続き
【表４１３】
2005528080.tif 000414
【０７８８】
ＡＩ_包括的パネル_ｖ１．０概要：Ａｇ１２９４ｂ  このパネルでのこの遺伝子の発現は、細胞でのこの遺伝子の発現が免疫応答に関与することを確かにする。この遺伝子の最も高発現は、正常肺で見られる（ＣＴ＝３０．５）。炎症でのこの遺伝子の有用性の考察のため、パネル４Ｄを参照されたい。
【０７８９】
ＣＮＳ_神経変性_ｖ１．０概要：Ａｇ１２９４ｂ／Ａｇ４７２６  異なるプローブとプライマーのセットでの２度の実験は、妥当な一致となる結果を生じる。このパネルは、アルツハイマー病でのこの遺伝子の差のない発現を示す。しかしながら、このプロフィールは、脳における低レベルだが優位なレベルでのこの遺伝子の発現を確かにする。それゆえ、この遺伝子の発現または機能の治療的調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、総合失調、多発性硬化症、脳卒中およびてんかんのような神経性疾患の処置で有用であり得る。
【０７９０】
一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．４概要：Ａｇ４７２６  この遺伝子の最も高発現は、胎児および成人の肝臓、および大腸癌、腎臓癌および肺癌由来の細胞株で見られる中レベルの発現と共に、肝臓癌細胞株で見られる（ＣＴ＝３０）。従って、この遺伝子の発現を用いて、このパネルの他の試料から肝臓由来組織とを区別し得る。
【０７９１】
パネル１．２概要：Ａｇ７４６  同一プローブとプライマーのセットでの２度の実験は、肝臓癌細胞株でのこの遺伝子の最も高発現（ＣＴ＝２７）と共に、優位な一致となる結果を生じる。高レベルの発現はまた、胎児および成人の肝臓組織、大腸癌細胞株、および肺癌細胞株で見られる。従って、この遺伝子の発現を用いて、このパネルの他の試料から肝臓、大腸癌細胞株および肺癌細胞株由来試料を区別し得る。この遺伝子の発現はまた、大腸癌および肺癌の存在を検出するための診断マーカーとして用いられ得る。
【０７９２】
中発現はまた、胎児の脳、胎盤、および内皮細胞で見られる。
【０７９３】
パネル２Ｄ概要：Ａｇ７４６  同一プローブとプライマーのセットでの２度の実験は、肝臓癌におけるこの遺伝子の最も高発現（ＣＴ＝３１）と共に、優位な一致となる結果を生じる。肝臓由来組織での顕著な発現は、パネル１．２での結果と一致する。中レベルの発現はまた、卵巣癌および腎臓癌由来試料で明白である。さらに、この遺伝子の発現は、正常隣接組織でよちこれらの癌でより高い。従って、この遺伝子の発現を用いて、このパネルの肝臓由来試料と他の試料とを区別し得るし、かつ肝臓癌、腎臓癌、および卵巣癌の存在を検出するマーカーとして用いられ得る。さらに、この遺伝子の発現または機能の治療的調節は、肝臓癌、腎臓癌および卵巣癌の処置で効果的であり得る。
【０７９４】
パネル４．１Ｄ概要：Ａｇ１２９４ｂ／Ａｇ４７２６  ３つの異なるプローブとプライマーのセットでの３度の実験結果は、ＩＬ−４で処置された皮膚線維芽細胞のこの実験でのこの遺伝子の最も高発現（ＣＴ＝３０）と共に、パネル４Ｄの発現プロフィールと一致する。加えて、この実験は、パネル４Ｄではない試料である、休止好中球において低レベルだが優位なレベルでの発現を示す（ＣＴ＝３３．２）。炎症でのこの遺伝子の有用性の考察のため、パネル４Ｄを参照されたい。
【０７９５】
パネル４Ｄ概要：Ａｇ１２９４ｂ  同一プローブとプライマーのセットでの２度の実験は、ＩＬ−４で処置された皮膚線維芽細胞でのこの遺伝子の最も高発現（ＣＴ＝３０）と共に、優位な一致となる結果を生じる。加えて、この遺伝子は、ＩＦＮγで刺激された皮膚線維芽細胞、活性化肺線維芽細胞、ＨＰＡＥＣ、肺および皮膚の微小血管、活性化小気道および気管支上皮、活性化ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞、急性に活性かされたＴ細胞、および活性化Ｂ細胞で中レベルで発現する。
【０７９６】
Ｔ細胞、活性化Ｂ細胞、および肺および皮膚の細胞でのこれらのレベルの発現に基づき、この遺伝子産物の機能をブロックする治療は、活性化Ｂ細胞が異常免疫応答の発生、およびクローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、ＣＯＰＤ、喘息、アレルギー、肺気腫、関節リウマチ、または乾癬を含む、Ｔ細胞介在性疾患の処置において抗原提示する、自己免疫疾患および炎症性疾患の患者の症状を改善または除去する治療法として有用であり得る。
【０７９７】
Ｄ．ＣＧ１０８９０１−０３：サイトカイン前駆体
物理的クローンの全長ＣＧ１０８９０１−０３の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ６８８９を用いて評価し、表ＤＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＤＢに示す。
【０７９８】
【表４１４】
2005528080.tif 000415
【０７９９】
【表４１５】
2005528080.tif 000416
【０８００】
表ＤＢの続き
【表４１６】
2005528080.tif 000417
【０８０１】
一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．６概要：Ａｇ６８８９  この遺伝子の高発現は、胎盤に制限される。従って、この遺伝子の発現は、他の試料から胎盤を区別するマーカーとして用いられ得る。この遺伝子は、膜アンカーモティーフを欠き、かつ分泌される３４ｋＤａの糖タンパク質をコード化するＥＢＶ誘導遺伝子３（ＥＢＩ３）のスプライスバリアントをコードする。ＥＢＩ３は、扁桃腺組織の濾胞性区域間の散在性細胞により、脾臓組織の濾胞性領域の周囲の類洞と関連する細胞により、そして胎盤のシンシチウム栄養芽層により非常に高レベルで発現するとわかっている（Devergne et al., 1996, J. Virol. 70: 11431153, PMID:8551575）。加えて、ＥＢＩ３レベルは、妊婦由来の血清で強くアップレギュレートされ、妊娠期間で徐々に増加される。ＥＢＩ３は、胎児と母親の関係の重要な免疫調節因子であり、ＮＫ細胞調節におそらく関与する（Devergne et al., 2001, Am J Pathol 2001 Nov;159(5):176376, PMID: 11696437）。従って、この遺伝子またはこの遺伝子によりコード化されるＥＢＩ３タンパク質の治療的調節は、胎盤または妊娠関連疾患の処置で有用で有り得る。
【０８０２】
Ｅ．ＣＧ１０８９０１−０４：サイトカイン前駆体
物理的クローンの全長ＣＧ１０８９０１−０４の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ７０３３を用いて評価し、表ＥＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＥＢおよびＥＣに示す。
【０８０３】
【表４１７】
2005528080.tif 000418
【０８０４】
【表４１８】
2005528080.tif 000419
【０８０５】
表ＥＢの続き
【表４１９】
2005528080.tif 000420
【０８０６】
【表４２０】
2005528080.tif 000421
【０８０７】
表ＥＣの続き
【表４２１】
2005528080.tif 000422
【０８０８】
一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．６概要：Ａｇ７０３３  この遺伝子の発現は、胎盤に制限される。従って、この遺伝子の発現は、他の試料から胎盤を区別するマーカーとして用いられ得る。この遺伝子は、膜アンカーモティーフを失っていてる３４ｋＤａの糖タンパク質であるＥＢＶ誘導遺伝子３（ＥＢＩ３）のスプライスバリアントをコードし、そして分泌される。ＥＢＩ３は、扁桃腺組織の濾胞性区域間の散在性細胞、脾臓組織の濾胞性領域の周囲の類洞と関連する細胞、および胎盤のシンシチウム栄養芽層により高レベルでインビボで発現するとわかっている（Devergne et al., 1996, J. Virol. 70: 11431153, PMID:8551575）。加えて、ＥＢＩ３のレベルは、妊婦由来の血清で強くアップレギュレートされ、そして妊娠期間で徐々に増加する。ＥＢＩ３は、胎児と母親との関係の重要な免疫調節因子であり、おそらくＮＫ細胞の調節に関与する（Devergne et al., 2001, Am J Pathol 2001 Nov;159(5):176376, PMID: 11696437）。従って、この遺伝子またはこの遺伝子によりコード化されるＥＢＩ３タンパク質の治療的調節は、胎盤または妊娠関連疾患の処置で有用で有り得る。
【０８０９】
パネル４．１Ｄ概要：Ａｇ７０３３  この遺伝子の高発現は、ＰＭＡ／イオノマイシンで活性化された好塩基球に制限される（ＣＴ＝２７．９）。好塩基球は、アレルゲンに対する応答でヒスタミンおよび他の生物学的変更因子を放出し、かつ喘息および超過敏反応の病態で重要な働きをする。それゆえ、この遺伝子によりコード化される推定タンパク質に対してデザインされた療法は、これらの疾患での好塩基球機能をブロックすることにより炎症を減少または除去し得る。加えて、これらの細胞は、喘息、クローン病、および潰瘍性大腸炎のような様々な炎症性の肺疾患および腸疾患において関与する炎症細胞の妥当なモデルである。それゆえ、この遺伝子産物の機能を調節する治療は、喘息、クローン病、および潰瘍性大腸炎を病む患者の症状を改善または除去し得る。
【０８１０】
Ｆ．ＣＧ１２６１２９−０２：上皮分化因子（ＰＥＤＦ）（セリンまたはシステインプロテイナーゼインヒビター）
物理的クローンの全長ＣＧ１２６１２９−０２の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ７０３９を用いて評価し、表ＦＡに記載した。
【０８１１】
【表４２２】
2005528080.tif 000423
【０８１２】
一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．６概要：Ａｇ７０３９  この遺伝子の発現は、このパネルの全試料にわたって低い／検出できない（ＣＴ＞３５）（データは示していない）。
【０８１３】
Ｇ．ＣＧ１４２２０２−０３：ＣＲＬ−２
物理的クローンの全長ＣＧ１４２２０２−０３の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ４５３０を用いて評価し、表ＧＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＧＢおよびＧＣに示す。
【０８１４】
【表４２３】
2005528080.tif 000424
【０８１５】
【表４２４】
2005528080.tif 000425
【０８１６】
表ＧＢの続き
【表４２５】
2005528080.tif 000426
【０８１７】
【表４２６】
2005528080.tif 000427
【０８１８】
表ＧＣの続き
【表４２７】
2005528080.tif 000428
【０８１９】
ＣＮＳ_神経変性_ｖ１．０概要：Ａｇ４５３０  この遺伝子の発現は、このパネルの全試料にわたって低い／検出できない（ＣＴ＞３５）（データは示していない）。
【０８２０】
一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．４概要：Ａｇ４５３０  この遺伝子の最も高発現は、肺癌ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞株で検出される（ＣＴ＝２７．７）。加えて、この遺伝子の中レベルの発現はまた、黒色腫、乳癌、膵臓癌、肺癌、腎臓癌、脳腫瘍および大腸癌由来の癌細胞株で見られる。従って、この遺伝子の発現は、これらの癌の存在を検出するための診断マーカーとして用いられ得る。さらに、この遺伝子の治療的調節は、黒色腫、肺癌、乳癌、大腸癌、腎臓癌、膵臓癌および脳腫瘍の処置で有用であり得る。
【０８２１】
代謝機能または内分泌機能を有する組織の間で、この遺伝子は、膵臓、脂肪、甲状腺、心臓、胎児の肝臓、および消化管において中レベルから低レベルで発現する。それゆえ、この遺伝子活性の治療的調節は、肥満および糖尿病のような内分泌／代謝関連疾患の処置で有用となり得る。
【０８２２】
興味深いことに、この遺伝子は、成人の肝臓（ＣＴ＝４０）と比較して胎児でより高いレベルで発現する。この知見は、この遺伝子の発現を用いて成人の肝臓から胎児の肝臓を区別し得ることを示す。加えて、胎児でのこの遺伝子の相対過剰発現は、タンパク質産物が胎児での肝臓成長または発達を増強し得るし、従って成人での再生能力でも働きうることを示す。それゆえ、この遺伝子によりコード化されるタンパク質の治療的調節は、肝臓関連疾患の処置で有用であり得る。
【０８２３】
パネル４．１Ｄ概要：Ａｇ４５３０  この遺伝子の最も高発現は、ＰＭＡ／イオノマイシンで処理した好酸球で検出される（ＣＴ＝２６．４）。この遺伝子の発現は、休止好酸球と比較して活性化好酸球でより高い（ＣＴ＝３４．３）。従って、この遺伝子の発現を用いて、休止好酸球と活性化好酸球とをこのパネルで用いられた他の試料から区別し得る。加えて、活性化好酸球でのこの遺伝子の発現は、好酸球機能でのこの遺伝子の働きを示す。それゆえ、抗体または低分子薬の使用を介したこの遺伝子の治療的調節は、喘息およびアレルギーを含むＴ細胞介在自己免疫および炎症性疾患、および寄生虫感染症の好酸球を含む造血疾患の処置において有用であり得る。
【０８２４】
加えて、この遺伝子の低レベルから中レベルの発現はまた、多数の条件下で調製されたＴリンパ球、ならびに樹状細胞、単球、マクロファージ、好中球および皮膚線維芽細胞のような炎症性疾患および自己免疫疾患に関与する異なる活性化細胞で検出される。樹状細胞およびマクロファージは、その機能が正常免疫応答の開始および維持に極めて重要である、強力な抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。自己免疫および炎症はまたこの機能の抑制により減少し得る。それゆえ、この遺伝子産物の機能に拮抗する低分子薬および抗体は、エリテマトーデス、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、ＣＯＰＤ、喘息、肺気腫、関節リウマチ、または感染のような自己免疫疾患および炎症性疾患のいくつかのタイプを病む患者の症状を改善または除去し得る。
【０８２５】
Ｈ．ＣＧ１４２６２１−０１：推定膜タンパク質
遺伝子ＣＧ１４２６２１−０１の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ７５７０を用いて評価し、表ＨＡに記載した。
【０８２６】
【表４２８】
2005528080.tif 000429
【０８２７】
ＣＮＳ_神経変性_ｖ１．０概要：Ａｇ７５７０  この遺伝子の発現は、このパネルの全試料にわたって低い／検出できない（ＣＴ＞３５）（データは示していない）。
【０８２８】
パネル４．１Ｄ概要：Ａｇ７５７０  この遺伝子の発現は、このパネルの全試料にわたって低い／検出できない（ＣＴ＞３５）（データは示していない）。
【０８２９】
Ｉ．ＣＧ１４２７６１−０１：組織適合性１３に類似
遺伝子ＣＧ１４２７６１−０１の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ７６２３を用いて評価し、表ＩＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＩＢおよびＩＣに示す。
【０８３０】
【表４２９】
2005528080.tif 000430
【０８３１】
【表４３０】
2005528080.tif 000431
【０８３２】
【表４３１】
2005528080.tif 000432
【０８３３】
表ＩＣの続き
【表４３２】
2005528080.tif 000433
【０８３４】
ＣＮＳ_神経変性_ｖ１．０概要：Ａｇ７６２３  このパネルは、個々の独立した群の脳における低レベルでのこの遺伝子の発現を確かにする。この遺伝子は、アルツハイマー病患者の側頭皮質でダウンレギュレートされることが分かる。それゆえ、この遺伝子またはタンパク質産物のアップレギュレーション、またはこの受容体の特異的作用物質での処置は、痴呆、記憶喪失、およびこの疾患と関連する神経細胞死の治療において有用であり得る。
【０８３５】
パネル４．１Ｄ概要：Ａｇ７６２３  この遺伝子の最も高発現は、ＬＰＳで処理された単球で検出される（ＣＴ＝３２．３）。この遺伝子の発現は、休止単球と比較して刺激された単球でより高い（ＣＴ＝３８）。従って、この遺伝子の発現を用いて活性化単球と休止単球とを区別し得る。加えて、病原での活性化で、ＬＰＳまたは単球が、組織傷害部位へ遊走しそして炎症性サイトカインの放出により、自然免疫および特異的免疫の原因となる。該放出は炎症性過程の原因となる。それゆえ、この遺伝子の発現またはこの遺伝子によりコード化されるタンパク質の治療的調節は、単球の動員および炎症性過程の開始に寄与しうるし、喘息、アレルギー、炎症性腸疾患、エリテマトーデス、または関節リウマチの様な自己免疫疾患および炎症性疾患に罹患する患者の症状を改善し得る。
【０８３６】
加えて、この遺伝子の低レベルの発現はまた、ＮＣＩ−Ｈ２９２、冠状動脈、ＳＭＣ、活性化マクロファージおよび肺線維芽細胞で見られる。それゆえ、この遺伝子または該タンパク質産物の治療的調節は、喘息、乾癬、関節炎、アレルギー、ＣＯＰＤおよび肺気腫の処置で有用であり得る。
【０８３７】
Ｊ．ＣＧ１４４１９３−０１：分泌リンタンパク質２４前駆体
物理的クローンの全長ＣＧ１４４１９３−０１の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ７０４０を用いて評価し、表ＪＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＪＢに示す。
【０８３８】
【表４３３】
2005528080.tif 000434
【０８３９】
【表４３４】
2005528080.tif 000435
【０８４０】
表ＪＢの続き
【表４３５】
2005528080.tif 000436
【０８４１】
一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．６概要：Ａｇ７０４０  優位な発現は、胎児の肝臓においてのみ検出される（ＣＴ＝３３．８）。興味深いことに、この遺伝子は、成人の肝臓組織（ＣＴ＝４０）と比較して、胎児でずっと高いレベルで発現する。この知見は、この遺伝子の発現を用いて胎児の供給源と成人の供給源とを区別し得ることを示す。加えて、胎児の肝臓でのこの遺伝子の相対的過剰発現は、タンパク質産物が胎児で肝臓成長または発達を増強させ得ること、従って成人の再生能力で働いて、肝臓塊および／または機能を回復させ得る。それゆえ、この遺伝子によりコード化されるタンパク質の治療的調節は、肝硬変および線維症を含む肝臓関連疾患の処置で有用であり得る。
【０８４２】
Ｋ．ＣＧ１４４８８４−０２：Ｂリンパ球活性化マーカー芽球−１前駆体
物理的クローンの全長ＣＧ１４４８８４−０２の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ４３９０を用いて評価し、表ＫＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＫＢおよびＫＣに示す。
【０８４３】
【表４３６】
2005528080.tif 000437
【０８４４】
【表４３７】
2005528080.tif 000438
【０８４５】
表ＫＢの続き
【表４３８】
2005528080.tif 000439
【０８４６】
【表４３９】
2005528080.tif 000440
【０８４７】
表ＫＣの続き
【表４４０】
2005528080.tif 000441
【０８４８】
ＣＮＳ_神経変性_ｖ１．０概要：Ａｇ４３９０  この遺伝子の発現は、このパネルの全試料にわたって低い／検出できない（ＣＴ＞３５）（データは示していない）。
【０８４９】
一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．４概要：Ａｇ４３９０  この遺伝子の最も高発現は、胸腺で検出される（ＣＴ＝２９．４）。この遺伝子によりコード化されたタンパク質は、それゆえＴ細胞成熟で重要な働きをし得る。この遺伝子によりコード化されたタンパク質に対してデザインされた低分子療法、または抗体療法を用いて、免疫機能（Ｔ細胞成熟）を調節し得るし、組織移植、ＡＩＤＳの処置または化学療法後の免疫再構成で重要であり得る。
【０８５０】
この遺伝子の中レベルから低レベルの発現はまた、膵臓、脂肪、副腎、甲状腺、下垂体、骨格筋、心臓、肝臓および消化管を含む代謝機能／内分泌機能を有する組織で見られる。それゆえ、この遺伝子活性の治療的調節は、肥満および糖尿病のような内分泌／代謝関連疾患の処置で有用となり得る。
【０８５１】
興味深いことに、この遺伝子は、成人の肺（ＣＴ＝３６）と比較して胎児でずっと高レベル（ＣＴ＝３１）で発現する。この知見は、この遺伝子の発現を用いて成人の肺から胎児の肺を区別し得ることを示す。加えて、胎児組織でのこの遺伝子の相対的過剰発現は、タンパク質産物が胎児の肺成長または発達を増強し得るし、従ってまた、成人での再生能力で働き得ることを示す。それゆえ、この遺伝子によりコード化されるタンパク質の治療的調節は、肺関連疾患の処置で有用であり得る。
【０８５２】
パネル４．１Ｄ概要：Ａｇ４３９０  この遺伝子は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＬＡＫ細胞、樹状細胞、単球およびマクロファージを含む血液細胞で主に発現するとみられる。この遺伝子は、マイトジェンで刺激されたヒトリンパ球で主に発現する活性化関連細胞表面糖タンパク質であるＢＬＡＳＴ１に相同性を有するタンパク質をコード化する。パネル１．４の血液細胞および胸腺でのこの遺伝子の発現は該特性と一致する。この遺伝子の最も高発現は、ＬＰＳで処理した単球で見られる（ＣＴ＝２６）。病原での活性化で、ＬＰＳ、単球は、組織傷害部位への遊走および炎症性サイトカインの放出により自然免疫および特異的免疫の原因となる。この放出は炎症性過程の原因となる。それゆえ、この転写物によりコード化されるタンパク質の発現の調節は、単球の動員および炎症性過程の開始に関与し、そして喘息、アレルギー、炎症性腸疾患、エリテマトーデス、または関節リウマチのような自己免疫疾患および炎症性疾患に罹患する患者の症状を改善し得る。
【０８５３】
Ｌ．ＣＧ１４５１９８−０１：新規分泌タンパク質
物理的クローンの全長ＣＧ１４５１９８−０１の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ６９４３を用いて評価し、表ＬＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＬＢに示す。
【０８５４】
【表４４１】
2005528080.tif 000442
【０８５５】
【表４４２】
2005528080.tif 000443
【０８５６】
表ＬＢの続き
【表４４３】
2005528080.tif 000444
【０８５７】
一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．６概要：Ａｇ６９４３  この遺伝子の最も高発現は、乳癌細胞株で見られる（ＣＴ＝２７．８）。この遺伝子は、脳腫瘍細胞株、大腸癌細胞株、胃癌細胞株、肺癌細胞株、乳癌細胞株、卵巣癌細胞株、および黒色腫細胞株で見られる中発現と共に、このパネルで遍在性に発現する。この発現プロフィールは、細胞生存および細胞増殖でのこの遺伝子産物の働きを示す。この遺伝子産物の調節は、癌の処置で有用であり得る。
【０８５８】
加えて、この遺伝子は、胎児の肺組織（ＣＴ＝３０）において、成人の対応物での発現（ＣＴ＝３３）と比較して非常に高レベルで発現する。従って、この遺伝子の発現を用いて、この組織の胎児の供給源と成人の供給源とを区別し得る。
【０８５９】
代謝機能を有する組織の間で、この遺伝子は、下垂体、脂肪、副腎、膵臓、甲状腺、および成人および胎児の骨格筋、心臓、および肝臓において中レベルから低レベルで発現する。これら組成機間でのこの広範な発現は、この遺伝子産物が正常神経内分泌機能および正常代謝機能で働き得ること、およびこの遺伝子の非制御発現が神経内分泌疾患または肥満および糖尿病のような代謝性疾患の一因となり得ることを示す。
【０８６０】
この遺伝子はまた、海馬、視床、黒質、扁桃体、小脳および大脳皮質を含むＣＮＳで中レベルで発現する。それゆえ、この遺伝子の発現または機能の治療的調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、総合失調、多発性硬化症、脳卒中およびてんかんのような神経性疾患の処置で有用であり得る。
【０８６１】
Ｍ．ＣＧ１４５６５０−０１およびＣＧ１４５６５０−０２＊レクチンＣタイプドメインタンパク質
物理的クローンの全長ＣＧ１４５６５０−０１およびＣＧ１４５６５０−０２の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ６５３１、Ａｇ７０９４、Ａｇ７３９７、およびＡｇ７４７８を用いて評価し、表ＭＡ、ＭＢ、ＭＣおよびＭＤに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＭＥ、ＭＦおよびＭＧに示す。Ａｇ７０９４はＣＧ１４５６５０−０２に特異的であり、かつＡｇ７３９７はＣＧ１４５６５０−０１に特異的であることに注意されたい。
【０８６２】
【表４４４】
2005528080.tif 000445
【０８６３】
【表４４５】
2005528080.tif 000446
【０８６４】
【表４４６】
2005528080.tif 000447
【０８６５】
【表４４７】
2005528080.tif 000448
【０８６６】
【表４４８】
2005528080.tif 000449
【０８６７】
表ＭＤの続き
【表４４９】
2005528080.tif 000450
【０８６８】
表ＭＤの続き
【表４５０】
2005528080.tif 000451
【０８６９】
表ＭＤの続き
【表４５１】
2005528080.tif 000452
【０８７０】
表ＭＤの続き
【表４５２】
2005528080.tif 000453
【０８７１】
【表４５３】
2005528080.tif 000454
【０８７２】
表ＭＥの続き
【表４５４】
2005528080.tif 000455
【０８７３】
【表４５５】
2005528080.tif 000456
【０８７４】
表ＭＦの続き
【表４５６】
2005528080.tif 000457
【０８７５】
表ＭＦの続き
【表４５７】
2005528080.tif 000458
【０８７６】
ＡＩ_包括的パネル_ｖ１．０概要：Ａｇ７３９７／Ａｇ７４７８  異なるプローブとプライマーのセットでの２度の実験は、骨関節炎の骨試料で検出される最も高発現（ＣＴ＝２７〜２９）と共に、優位な一致となる結果を生じる。低発現だが優位な発現は、乾癬およびＯＡ試料由来の試料群での若干高い発現と共に、このパネルの多くの試料で見られる。従って、この遺伝子は、これらの疾患の病因および／または処置で関与しうる。
【０８７７】
Ａｇ７０９４  この遺伝子の低レベルの発現は、１つの潰瘍性大腸炎試料で検出される（ＣＴ＝３３．３）。興味深いことに、この遺伝子の発現は、対応正常試料での発現（ＣＴ＝４０）と比較して、大腸炎試料でより高い。それゆえ、この遺伝子の発現は、潰瘍性大腸炎の存在を検出するマーカーとして用いられ得るし、またこの遺伝子または該タンパク質産物の治療的調節は、潰瘍性大腸炎の処置で有用であり得る。
【０８７８】
一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．６概要：Ａｇ７３９７  検出可能なレベルの発現は、胎児の肺、膀胱、胸腺、大腸癌、および小腸に制限される（ＣＴ＝３４〜３５）。Ａｇ６５３１  この遺伝子の発現は、このパネルの全試料で低い／検出できない（ＣＴ＞３５）。（データは示していない）。 
【０８７９】
パネル４．１Ｄ概要：Ａｇ７３９７／Ａｇ７４７８  ２つの異なるプローブとプライマーのセットでの２度の実験は、休止好中球で検出される最も高発現と優位に一致する結果を生じる（ＣＴ＝３０〜３１）。加えて、顕著な発現は、樹状細胞、マクロファージ、単球、およびＬＡＫ細胞で見られる。この転写物は、活性化好中球でダウンレギュレートされるように思われ、このことはこの遺伝子によりコード化されるタンパク質が休止好中球により産生されるが、活性化好中球では産生されないことを示す。従って、この遺伝子の発現を用いて、休止好中球と活性化好中球とを区別し得る。さらにこの遺伝子産物は、これらの炎症細胞の活性化を減少させ得るし、かつクローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、ＣＯＰＤ、喘息、肺気腫、関節リウマチ、エリテマトーデス、または乾癬患者の症状を改善または除去するためのタンパク質療法として有用であり得る。加えて、この遺伝子産物の調節は、ＡＩＤＳまたは他の免疫不全患者での免疫応答の増加において効果的であり得る。Ａｇ６５３１／Ａｇ７０９４  この遺伝子の発現は、このパネルの全試料で低い／検出できない（ＣＴ＞３５）（データは示していない）。
【０８８０】
Ｎ．ＣＧ１４５９７８−０１：膜タンパク質を含有するＤＵＦ２２１ドメイン
遺伝子ＣＧ１４５９７８−０１の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ７５９６を用いて評価し、表ＮＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＮＢおよびＮＣに示す。
【０８８１】
【表４５８】
2005528080.tif 000459
【０８８２】
【表４５９】
2005528080.tif 000460
【０８８３】
【表４６０】
2005528080.tif 000461
【０８８４】
表ＮＣの続き
【表４６１】
2005528080.tif 000462
【０８８５】
ＣＮＳ_神経変性_ｖ１．０概要：Ａｇ７５９６  このパネルは、アルツハイマー病でのこの遺伝子の差のない発現を示す。しかしながら、このプロフィールは、皮質および海馬を含む脳における中レベルでのこの遺伝子の発現を確かにする。それゆえ、この遺伝子の発現または機能の治療的調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、総合失調症、多発性硬化症、脳卒中および転換のような神経性疾患の処置で有用であり得る。
【０８８６】
パネル４．１Ｄ概要：Ａｇ７９５６  この遺伝子の最も高発現は、ＬＰＳで処理された樹状細胞で見られる（ＣＴ＝３１．８）。中レベルの発現は、パネルの多くの試料、およびＩＬ−４、ＩＬ−９、ＩＬ−１３およびＩＦＮγで活性化されたＮＣＩ−Ｈ２９２粘膜表皮細胞ならびに無処理ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞、ＩＬ−４、ＩＬ−９、ＩＬ−１３およびＩＦＮγで活性化された肺線維芽細胞および皮膚線維芽細胞、ヒト肺大動脈内皮細胞（処理および無処置）、小軌道上皮（処理および無処理）、処理気管支上皮および肺および皮膚の微小血管内皮細胞（処理および無処理）を含む肺および皮膚由来細胞で見られる。肺および皮膚由来の細胞または肺および皮膚内の細胞でのこの遺伝子の発現は、この遺伝子が正常状態ならびにＣＯＰＤ、喘息、アレルギー、乾癬および肺気腫を含疾患状態および炎症性肺および皮膚疾患に関与し得る。 
【０８８７】
Ｏ．ＣＧ１４５９９７−０１：ショウジョウバエＦＲＹ遺伝子に類似
遺伝子ＣＧ１４５９９７−０１の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ７５５７を用いて評価し、表ＯＡに記載した。
【０８８８】
【表４６２】
2005528080.tif 000463
【０８８９】
ＣＮＳ_神経変性_ｖ１．０概要：Ａｇ７５５７  この遺伝子の発現は、このパネルの全試料にわたって低い／検出できない（ＣＴ＞３５）（データは示していない）。
【０８９０】
パネル４．１Ｄ概要：Ａｇ７５５７  この遺伝子の発現は、このパネルの全試料にわたって低い／検出できない（ＣＴ＞３５）（データは示していない）。
【０８９１】
Ｐ．ＣＧ１４６１１９−０１：パピリン（PAPILIN）
遺伝子ＣＧ１４６１１９−０１の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ７５７１を用いて評価し、表ＰＡに記載した。
【０８９２】
【表４６３】
2005528080.tif 000464
【０８９３】
ＣＮＳ_神経変性_ｖ１．０概要：Ａｇ７５７１  この遺伝子の発現は、このパネルの全試料にわたって低い／検出できない（ＣＴ＞３５）（データは示していない）。
【０８９４】
パネル４．１Ｄ概要：Ａｇ７５７１  この遺伝子の発現は、このパネルの全試料にわたって低い／検出できない（ＣＴ＞３５）（データは示していない）。
【０８９５】
Ｑ．ＣＧ１４６２０２−０１：膜関連レクチンタイプ
物理的クローンの全長ＣＧ１４６２０２−０１の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ７０４７を用いて評価し、表ＱＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＱＢに示す。
【０８９６】
【表４６４】
2005528080.tif 000465
【０８９７】
【表４６５】
2005528080.tif 000466
【０８９８】
表ＱＢの続き
【表４６６】
2005528080.tif 000467
【０８９９】
一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．６概要：Ａｇ７０４７  この遺伝子の最も高発現は、胎盤で検出される（ＣＴ＝２９）。この遺伝子の中レベルから低レベルの発現はまた、膵臓、脂肪、副腎、甲状腺、下垂体、骨格筋、心臓、肝臓、および消化管を含む、代謝機能／内分泌機能を有する組織で見られる。それゆえ、この遺伝子活性の治療的調節は、肥満および糖尿病のような内分泌／代謝関連疾患の処置で有用となり得る。中レベルの発現はまた、大腸癌由来試料で見られる。従って、この遺伝子の発現または機能の治療的調節は、大腸癌の処置で有用であり得る。
【０９００】
加えて、この遺伝子の中レベルの発現はまた、胎児の脳および小脳で検出される。従って、この遺伝子の治療的調節は、失調症および自閉症のような神経性疾患の処置で有用であり得る。
【０９０１】
興味深いことに、この遺伝子は、成人の肺（ＣＴ＝３４）と比較して胎児でずっと高いレベル（ＣＴ＝３０）で発現する。この知見は、この遺伝子の発現を用いて成人の肺から胎児の肺を区別し得ることを示す。加えて、胎児組織でのこの遺伝子の相対的過剰発現は、タンパク質産物が胎児での肺成長または発達を増強し得るし、従ってまた、成人での回復能力で働き得ることを示す。それゆえ、この遺伝子によりコード化されるタンパク質の治療的調節は、肺関連疾患の処置で有用であり得る。
【０９０２】
Ｒ．ＣＧ１４６２５０−０２：新規膜タンパク質
物理的クローンの全長ＣＧ１４６２５０−０２の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ７５６６を用いて評価し、表ＲＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＲＢに示す。
【０９０３】
【表４６７】
2005528080.tif 000468
【０９０４】
【表４６８】
2005528080.tif 000469
【０９０５】
ＣＮＳ_神経変性_ｖ１．０概要：Ａｇ７５６６  この遺伝子の低レベルの発現は、アルツハイマー病患者由来の試料に制限される（ＣＴ＝３４．５）。従って、この遺伝子の発現は、このパネルで用いられた他の試料からこの試料を区別するのに有用であり得る。
【０９０６】
パネル４．１Ｄ概要：Ａｇ７５６６  この遺伝子の発現は、このパネルの全試料にわたって低い／検出できない（ＣＴ＞３５）（データは示していない）。
【０９０７】
Ｓ．ＣＧ１４６６２５−０１：タイプＩＩＩａ膜タンパク質
物理的クローンの全長ＣＧ１４６６２５−０１の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ７０５２を用いて評価し、表ＳＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＳＢに示す。
【０９０８】
【表４６９】
2005528080.tif 000470
【０９０９】
【表４７０】
2005528080.tif 000471
【０９１０】
表ＳＢの続き
【表４７１】
2005528080.tif 000472
【０９１１】
一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．６概要：Ａｇ７０５２  この遺伝子の最も高発現は、胃癌細胞株で見られる（ＣＴ＝２８）。この遺伝子は、脳腫瘍細胞株、大腸癌細胞株、胃癌細胞株、肺癌細胞株、乳癌細胞株、卵巣癌細胞株、および黒色腫細胞株での中発現と共に、このパネルで広く発現する。この発現プロフィールは、細胞生存および細胞増殖でのこの遺伝子産物の働きを示す。 この遺伝子産物の調節は、癌の処置で有用であり得る。
【０９１２】
代謝機能を有する組織の間で、この遺伝子は、下垂体、脂肪、副腎、膵臓、甲状腺、および成人および胎児の骨格筋、心臓、および肝臓において中レベルから低レベルで発現する。これら組成機間でのこの広範な発現は、この遺伝子産物が正常神経内分泌機能および正常代謝機能で働き得ること、およびこの遺伝子の非制御発現が神経内分泌疾患または肥満および糖尿病のような代謝性疾患の一因となり得ることを示す。
【０９１３】
この遺伝子はまた、海馬、視床、黒質、扁桃体、小脳および大脳皮質を含むＣＮＳで中レベルで発現する。それゆえ、この遺伝子の発現または機能の治療的調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、総合失調、多発性硬化症、脳卒中およびてんかんのような神経性疾患の処置で有用であり得る。
【０９１４】
Ｔ．ＣＧ１４６６２５−０２：タイプＩＩＩａ膜タンパク質
物理的クローンの全長ＣＧ１４６６２５−０２の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ６９３９を用いて評価し、表ＴＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＴＢに示す。
【０９１５】
【表４７２】
2005528080.tif 000473
【０９１６】
【表４７３】
2005528080.tif 000474
【０９１７】
表ＴＢの続き
【表４７４】
2005528080.tif 000475
【０９１８】
一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．６概要：Ａｇ６９３９  この遺伝子の最も高発現は、乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株で検出される（ＣＴ＝３２）。この遺伝子の中レベルの発現はまた、膵臓癌、胃癌、大腸癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、黒色腫および脳腫瘍由来の癌細胞株の群で見られる。従って、この遺伝子の発現は、これら癌の存在を検出するマーカーとして用いられ得る。さらに、この遺伝子の発現または機能の治療的調節は、膵臓癌、胃癌、大腸癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、黒色腫および脳腫瘍の処置で効果的であり得る。
【０９１９】
この遺伝子の低レベルの発現はまた、精巣、前立腺、卵巣、気管、胎児の肝臓、大腸、小腸、リンパ節、小脳、甲状腺および副腎により代表される正常組織由来の試料で見られる。それゆえ、この遺伝子または該タンパク質産物の治療的調節は、これらの組織と関連する疾患の処置で有用であり得る。
【０９２０】
Ｕ．ＣＧ１４７２８４−０１：カドヘリン−６前駆体
物理的クローンの全長ＣＧ１４７２８４−０１の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ７５６７を用いて評価し、表ＵＡに記載した。
【０９２１】
【表４７５】
2005528080.tif 000476
【０９２２】
ＣＮＳ_神経変性_ｖ１．０概要：Ａｇ７５６７  この遺伝子の発現は、このパネルの全試料にわたって低い／検出できない（ＣＴ＞３５）（データは示していない）。
【０９２３】
パネル４．１Ｄ概要：Ａｇ７５６７  この遺伝子の発現は、このパネルの全試料にわたって低い／検出できない（ＣＴ＞３５）（データは示していない）。
【０９２４】
Ｖ．ＣＧ１４８２２１−０１およびＣＧ１４８２２１−０２：新規ＴｍＭＰを含有するクローディンドメイン
遺伝子ＣＧ１４８２２１−０１および物理的クローン全長の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ５６２５を用いて評価し、表ＶＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＶＢ、ＶＣおよびＶＤに示す。
【０９２５】
【表４７６】
2005528080.tif 000477
【０９２６】
【表４７７】
2005528080.tif 000478
【０９２７】
【表４７８】
2005528080.tif 000479
【０９２８】
表ＶＣの続き
【表４７９】
2005528080.tif 000480
【０９２９】
【表４８０】
2005528080.tif 000481
【０９３０】
表ＶＤの続き
【表４８１】
2005528080.tif 000482
【０９３１】
ＣＮＳ_神経変性_ｖ１．０概要：Ａｇ５６２５  このパネルは、アルツハイマー病でのこの遺伝子の差のない発現を示す。しかしながら、このプロフィールは、脳における中レベルでのこの遺伝子の発現を確かにする。中枢神経系でのこの遺伝子の有用性の考察のため、パネル１．５を参照されたい。
【０９３２】
一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．５概要：Ａｇ５６２５  この遺伝子の最も高発現は、肺癌細胞株で見られる（ＣＴ＝２９．４）。この遺伝子は、脳腫瘍細胞株、大腸癌細胞株、胃癌細胞株、肺癌細胞株、卵巣癌細胞株、および黒色腫細胞株で見られる中発現と共に、このパネルで広く発現する。この発現プロフィールは、細胞生存および細胞増殖でのこの遺伝子産物の働きを示す。この遺伝子は、タイトジャンクションに不可欠な成分であるタンパク質ファミリーである、クローディンドに相同性を有するタンパク質をコード化する。該ファミリーのメンバーは、膵臓癌および大腸癌でアップレギュレートされると見られ、前者においては、該疾患の処理の新規標的であると見られる（Michl P. Gastroenterology 2001 Sep;121(3):67884; Miwa, N. Oncol Res 2001;12(1112):46976）。それゆえ、このタンパク質の発現または機能の治療的調節は、これらの癌の処置において有用であり得る。
【０９３３】
代謝機能を有する組織の間で、この遺伝子は、下垂体、脂肪、副腎、膵臓、甲状腺、胎児の肝臓、および成人および胎児の骨格筋および心臓において低レベルだが優位なレベルで発現する。これら組成機間でのこの広範な発現は、この遺伝子産物が正常神経内分泌機能および正常代謝機能で働き得ること、およびこの遺伝子の非制御発現が神経内分泌疾患または肥満および糖尿病のような代謝性疾患の一因となり得ることを示す。
【０９３４】
この遺伝子はまた、海馬、視床、黒質、扁桃体、小脳および大脳皮質を含むＣＮＳで低レベルだが優位なレベルで発現する。クローディンド１１は、ＣＮＳミエリンの成分であるとい見られ、そしてシグナル伝達経路を介した成長および分化のい制御に関与している。さらに、クローディン１１が、自己免疫脱髄性疾患の発生の原因である自己免疫原に関与し得ることを示す証拠が示された（Bronstein JM. J Neurosci Res 2000 Mar 15;59(6):70611）。それゆえ、この推定クローディンの発現または機能の治療的調節は、多発性硬化症のような脱髄性疾患の処置およびＣＮＳの正常機能を維持する際に有用であり得る。
【０９３５】
パネル４．１Ｄ概要：Ａｇ５６２５  この遺伝子の最も高発現は、ＩＬ−２で処理されたＮＫ細胞で見られる（ＣＴ＝２９）。この知見は、この遺伝子の治療的調節がウイルス性または細菌性の細胞内感染の処置で有用であり得る。
【０９３６】
Ｗ．ＣＧ１４９３３２−０１：インターフェロンで誘導された膜貫通型タンパク質（１−８Ｕ）様
遺伝子ＣＧ１４９３３２−０１の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ７５８０を用いて評価し、表ＷＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＷＢおよびＷＣに示す。
【０９３７】
【表４８２】
2005528080.tif 000483
【０９３８】
【表４８３】
2005528080.tif 000484
【０９３９】
【表４８４】
2005528080.tif 000485
【０９４０】
表ＷＣの続き
【表４８５】
2005528080.tif 000486
【０９４１】
ＣＮＳ_神経変性_ｖ１．０概要：Ａｇ７５８０  このパネルは、アルツハイマー病でのこの遺伝子の差のない発現を示す。しかしながら、このプロフィールは、海馬および皮質を含む、脳における中レベルでのこの遺伝子の発現を確かにする。それゆえ、この遺伝子の発現または機能の治療的調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、総合失調症、多発性硬化症、脳卒中および転換のような神経性疾患の処置で有用であり得る。
【０９４２】
パネル４．１Ｄ概要：Ａｇ７５８０  この遺伝子の最も高発現は、ＩＬ−２で処理されたＮＫ細胞で見られる。中レベルから低レベルの発現は、ＴＮＦαで処理および休止皮膚線維芽細胞、ＴＮＦ−αおよびＬＰＳ処理好中級、活性化１次および２次Ｔ細胞、およびＬＡＫ細胞を含む、このパネルの多くの試料で見られる。この発現は、この遺伝子の発現または機能の調節がこれらの細胞タイプと関連する機能の変化を導き得るし、かつ喘息、アレルギー、炎症性腸疾患、エリテマトーデス、乾癬、関節リウマチ、および骨関節炎を病む患者の症状の改善を導き得ることを示す。
【０９４３】
Ｘ．ＣＧ１４９６４９−０１：タイプＩＩＩＡ膜タンパク質
遺伝子ＣＧ１４９６４９−０１の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ７５６８を用いて評価し、表ＸＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＸＢおよびＸＣに示す。
【０９４４】
【表４８６】
2005528080.tif 000487
【０９４５】
【表４８７】
2005528080.tif 000488
【０９４６】
【表４８８】
2005528080.tif 000489
【０９４７】
表ＸＣの続き
【表４８９】
2005528080.tif 000490
【０９４８】
ＣＮＳ_神経変性_ｖ１．０概要：Ａｇ７５６８  このパネルは、個々の独立した群の脳における低レベルでのこの遺伝子の発現を確かにする。この遺伝子は、明らかにアルツハイマー病患者の側頭皮質で若干アップレギュレートされる。それゆえ、この遺伝子の発現または機能の治療的調節は、神経細胞死を減少させ得るし、かつこの疾患の処置で有用であり得る。
【０９４９】
パネル４．１Ｄ概要：Ａｇ７５６８  この遺伝子の最も高発現は、ＩＬ−９で処理されたＮＣＩ−Ｈ２９２細胞で見られる（ＣＴ＝３１．２）。加えて、この遺伝子はまた、健康および疾患での免疫応答での広範な優位な細胞タイプで中レベルから低レベルで発現する。これらの細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、内皮細胞、マクロファージ／単球、および末梢血単核球細胞ファミリーのメンバー、ならびに肺および皮膚由来の上皮細胞および線維芽細胞、および大腸、肺、胸腺および腎臓により代表される正常組織のメンバーを含む。発現の遍在パターンは、この遺伝子産物がこれらおよび他の細胞タイプおよび組織のホメオスタシス過程で関与しうることを示す。このパターンは、細胞生存および細胞増殖での遺伝子産物の働きを示す。それゆえ、機能的療法での遺伝子産物の調製は、これら細胞タイプと関連する機能の変化を導き得るし、かつ喘息、アレルギー、炎症性腸疾患、エリテマトーデス、乾癬、関節リウマチ、および骨関節炎のような自己免疫疾患および炎症性疾患を病む患者の症状の改善を導き得る。
【０９５０】
Ｙ．ＣＧ１４９６８０−０１およびＣＧ１４９６８０−０２：前立腺癌過剰発現遺伝子１
遺伝子ＣＧ１４９６８０−０２および変異体ＣＧ１４９６８０−０１の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ４８７０およびＡｇ５２８０を用いて評価し、表ＹＡおよびＹＢに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＹＣ、ＹＤ、ＹＥおよびＹＦに示す。Ａｇ５２８０がＣＧ１４９６８０−０２に特異的であることに注意されたい。
【０９５１】
【表４９０】
2005528080.tif 000491
【０９５２】
【表４９１】
2005528080.tif 000492
【０９５３】
【表４９２】
2005528080.tif 000493
【０９５４】
表ＹＣの続き
【表４９３】
2005528080.tif 000494
【０９５５】
表ＹＣの続き
【表４９４】
2005528080.tif 000495
【０９５６】
【表４９５】
2005528080.tif 000496
【０９５７】
表ＹＤの続き
【表４９６】
2005528080.tif 000497
【０９５８】
【表４９７】
2005528080.tif 000498
【０９５９】
表ＹＥの続き
【表４９８】
2005528080.tif 000499
【０９６０】
【表４９９】
2005528080.tif 000500
【０９６１】
表ＹＦの続き
【表５００】
2005528080.tif 000501
【０９６２】
ＡＩ_包括的パネル_ｖ１．０概要：Ａｇ５２８０  同一プローブとプライマーでの２度の実験は、優位な一致となる結果を生じる。最も高発現は、乾癬に隣接する正常組織由来の試料である（ＣＴ＝３３）。低レベルの発現はまた、骨関節炎の骨試料で見られる。
【０９６３】
ＣＮＳ_神経変性_ｖ１．０概要：Ａｇ５２８０  この遺伝子の発現は、このパネルの全試料で低い／検出できない（ＣＴ＞３５）。
【０９６４】
一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．５概要：Ａｇ４８７０  この遺伝子の最も高発現であるＰＢ３９相同体は胎児の肝臓において見られる（ＣＴ＝２５．６）。優位なレベルの発現はまた、肺癌、胃癌、腎臓癌、肝臓癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、黒色腫および脳腫瘍由来の細胞株において見られる。増殖性試料の該発現は、細胞増殖および細胞成長でのこの遺伝子の働きを示す。このことは、前立腺癌および成長および分化する組織でアップレギュレートされることを示すデータと一致する。従って、この遺伝子の発現を用いて、このパネルのこれら試料と他の試料とを区別し得るし、かつこれらの癌の存在を検出するマーカーとして用いられ得る。さらに、この遺伝子の発現または機能の治療的調節は、これらの癌の処置で効果的であり得る。
【０９６５】
参考文献： 
Cole KA, Chuaqui RF, Katz K, Pack S, Zhuang Z, Cole CE, Lyne JC, Linehan WM, Liotta LA, Emmert-Buck MR. cDNA sequencing and analysis of POV1 (PB39): a novel gene up-regulated in prostate cancer. Genomics 1998 Jul 15;51(2):282-7 
Stuart RO, Pavlova A, Beier D, Li Z, Krijanovski Y, Nigam SK. EEG1, a putative transporter expressed during epithelial organogenesis: comparison with embryonic transporter expression during nephrogenesis. Am J Physiol Renal Physiol 2001 Dec;281(6):F1148-56 
【０９６６】
腫瘍学_細胞_株_スクリーニング_パネル_ｖ３．１概要：Ａｇ４８７０  この遺伝子の最も高発現は、骨髄性白血病細胞株で見られる（ＣＴ＝２７．２）。中レベルの発現は、大腸癌、胃癌、および肺癌、白血病およびリンパ腫由来の試料を含む、このパネルの他の細胞株試料で見られる。癌でのこの遺伝子の有用性の考察のため、パネル１．５を参照されたい。
【０９６７】
パネル４．１Ｄ概要：Ａｇ５２８０  顕著な発現は、好塩基球細胞株ＫＵ−８１２由来の２つの試料において見られる（ＣＴ＝３２．５）。好塩基球は、アレルゲンに反応してヒスタミンおよび他の生物学的模倣物を放出し、そして喘息および過敏性反応の病態で重要な働きをする。それゆえ、この遺伝子によりコード化された推定タンパク質に対してデザインされた治療法は、疾患において好塩基球の機能のブロックにより炎症を改善、または阻害し得る。加えて、これらの細胞は、喘息、クローン病、および潰瘍性大腸炎のような様々な遠背陽性肺疾患および腸疾患に関与する炎症性細胞の適切なモデルである。それゆえ、この遺伝子の発現を用いて、このパネルのこれら試料と他の試料とを区別し得るし、かつこれらの細胞のマーカーとして用いられ得る。さらに、この遺伝子産物の機能を調節する療法は、喘息、クローン病、および潰瘍性大腸炎を病む患者の症状を改善または減少しうる。
【０９６８】
Ｚ．ＣＧ１４９７７７−０２：システインＤ前駆体
物理的クローンの全長ＣＧ１４９７７７−０２の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ６９０３を用いて評価し、表ＺＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＺＡに示す。
【０９６９】
【表５０１】
2005528080.tif 000502
【０９７０】
一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．６概要：Ａｇ６９０３  この遺伝子の発現は、このパネルの全試料で低い／検出できない（ＣＴ＞３５）。
【０９７１】
ＡＡ．ＣＧ１５０００５−０１：グルタミン酸結合タンパク質
遺伝子ＣＧ１５０００５−０１の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ５６３３を用いて評価し、表ＡＡＡに記載した。
【０９７２】
【表５０２】
2005528080.tif 000503
【０９７３】
ＡＩ_包括的パネル_ｖ１．０概要：Ａｇ５６３３  この遺伝子の発現は、このパネルの全試料で低い／検出できない（ＣＴ＞３５）。
【０９７４】
ＣＮＳ_神経変性_ｖ１．０概要：Ａｇ５６３３  この遺伝子の発現は、このパネルの全試料で低い／検出できない（ＣＴ＞３５）。
【０９７５】
一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．５概要：Ａｇ５６３３  アンププロットは、この実施に実験的な困難さがあったことを示し、該データからは結論は得られない（データは示していない）。
【０９７６】
パネル４．１Ｄ概要：Ａｇ５６３３  この遺伝子の発現は、このパネルの全試料で低い／検出できない（ＣＴ＞３５）。
【０９７７】
パネル５Ｄ概要：Ａｇ５６３３  この遺伝子の発現は、このパネルの全試料で低い／検出できない（ＣＴ＞３５）。
【０９７８】
パネルＣＮＳ_１．１概要：Ａｇ５６３３  この遺伝子の発現は、このパネルの全試料で低い／検出できない（ＣＴ＞３５）。
【０９７９】
ＡＢ．ＣＧ１５０１８９−０１：アセチルＬＤＬ受容体
遺伝子ＣＧ１５０１８９−０１の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ３１８３およびＡｇ３７２を用いて評価し、表ＡＢＡおよびＡＢＢに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＡＢＣ、ＡＢＤ、ＡＢＥ、ＡＢＦ、ＡＢＧおよびＡＢＨに示す。
【０９８０】
【表５０３】
2005528080.tif 000504
【０９８１】
【表５０４】
2005528080.tif 000505
【０９８２】
【表５０５】
2005528080.tif 000506
【０９８３】
表ＡＢＣの続き
【表５０６】
2005528080.tif 000507
【０９８４】
【表５０７】
2005528080.tif 000508
【０９８５】
表ＡＢＤの続き
【表５０８】
2005528080.tif 000509
【０９８６】
【表５０９】
2005528080.tif 000510
【０９８７】
表ＡＢＥの続き
【表５１０】
2005528080.tif 000511
【０９８８】
【表５１１】
2005528080.tif 000512
【０９８９】
表ＡＢＦの続き
【表５１２】
2005528080.tif 000513
【０９９０】
【表５１３】
2005528080.tif 000514
【０９９１】
【表５１４】
2005528080.tif 000515
【０９９２】
一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．４概要：Ａｇ３１８３  この遺伝子の最も高発現は、黒色腫細胞株で見られる（ＣＴ＝３１．５）。顕著な発現は、卵巣、黒色腫、および脳細胞由来の細胞株の群で見られる。従って、この遺伝子の発現を用いて、このパネルのこれらの試料と他の試料とを区別し得るし、かつこれらの癌を検出するマーカーとして用いられ得る。さらに、この遺伝子の発現または機能の治療的調節は、卵巣癌、黒色腫および脳腫瘍の処置で有用であり得る。
【０９９３】
パネル１概要：Ａｇ４３３７  この遺伝子の最も高発現は、卵巣癌ＯＶＣＡＲ−８細胞株で検出される（ＣＴ＝２６．５）。この遺伝子の高レベルから中レベルの発現はまた、肝臓癌、胃癌、大腸癌、肺癌、腎臓癌、乳癌、卵巣癌、黒色腫、および脳腫瘍由来の癌細胞株の群で見られる。それゆえ、この遺伝子の治療的調節は、これらの癌の処置で有用であり得る。
【０９９４】
代謝機能または内分泌機能を有する組織の間で、この遺伝子は、膵臓、脂肪、副腎、甲状腺、下垂体、骨格筋、心臓、および成人および胎児の肝臓において高レベルから中レベルで発現する。それゆえ、この遺伝子活性の治療的調節は、肥満および糖尿病のような内分泌／代謝関連疾患の処置で有用となり得る。
【０９９５】
加えて、この遺伝子は、扁桃体、海馬、黒質、視床、小脳、大脳皮質、および脊髄の全領域で中レベルで発現する。それゆえ、この遺伝子産物の治療的調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、てんかん、多発性硬化症、総合失調症およびうつ病のような中枢神経系疾患の処置で有用であり得る。
【０９９６】
パネル１．３Ｄ概要：Ａｇ３１８３  この遺伝子の最も高発現は、胎児の腎臓で見られる（ＣＴ＝３２．２）。加えて、顕著な発現は、黒色腫、および脳腫瘍細胞株由来の細胞株の群で見られる。癌でのこの遺伝子の有用性の考察のため、パネル１を参照されたい。別の実験（実施167966980）において、アンププロットはこの実施に実験的困難さがあったことを示し、それゆえ、このデータから結論は得られていない（データは示していない）。
【０９９７】
パネル４Ｄ概要：Ａｇ３１８３  この遺伝子の最も高発現は、休止ＣＤ４細胞（ＣＴ＝４０）と比較して、活性化された肺線維芽細胞で検出される（ＣＴ＝３１．９）。この遺伝子は、休止および処置された線維芽細胞、内皮細胞および上皮細胞および活性化未感作Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ細胞、ＣＴ＝３３．６）で発現する。さらに、活性化記憶Ｔ細胞（ＣＤ４５ＲＯ  ＣＤ４リンパ球）またはＣＤ４  Ｔｈ１またはＴｈ２細胞（ＣＴ＞３７）において、この遺伝子の発現は強くダウンレギュレートされ、このことは未感作Ｔ細胞の分化または活性化でのこの推定タンパク質の働きを示す。次に、活性化Ｔ細胞は、サイトカインおよびケモカインの分泌、Ｂ細胞の活性化およびＢ細胞の抗体産生の誘導、および炎症性部位への他のＴ細胞を含むリンパ球の血管外遊走により炎症過程を開始する。それゆえ、この遺伝子産物の行為を阻害する治療法は、組織移植への反応でのＴ細胞活性化をブロックし得るし、拒絶反応を改善またはブロックし得る。該治療的薬物はまた、活性化Ｔ細胞が中心的に働く、喘息／アレルギー、乾癬、関節炎および糖尿病の炎症を改善または予防し得る。この遺伝子の発現はまた、未感作活性化Ｔ細胞を同定するための診断または実験ツールとして働き、そして、より分化した活性化Ｔ細胞（記憶Ｔ細胞）からそれらを識別し得る。
【０９９８】
参考文献： 
Study of LDL and acetylated LDL endocytosis by mononuclear cells in HIV infection. Juompan L, Puel J, Fournie GJ, Benoist H Biochim Biophys Acta 1995 Aug 15;1272(1):21-8. 
【０９９９】
パネル５Ｄ概要：Ａｇ３１８２  この遺伝子の最も高発現は、間葉系幹細胞で見られる（ＣＴ＝３４．２）。低レベルだが優位なレベルの発現はまた、パネル１での発現と一致して、脂肪組織で見られる。代謝性疾患でのこの遺伝子の考察のため、パネル１を参照されたい。
【１０００】
一般的腫瘍学スクリーニングパネル_ｖ_２．４概要：Ａｇ３１８３  発現は、肺癌試料において見られる（ＣＴ＝３４．９）。従って、この遺伝子の発現を用いて、このパネルのこの試料と他の試料とを区別し得るし、かつ肺癌の存在を検出するマーカーとして用いられ得る。さらに、この遺伝子の発現または機能の治療的調節は、肺癌の処置で効果的であり得る。
【１００１】
ＡＣ．ＣＧ１５０２６７−０１：タイプＩａ膜タンパク質
遺伝子ＣＧ１５０２６７−０１の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ７５６０を用いて評価し、表ＡＣＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＡＣＢおよびＡＣＣに示す。
【１００２】
【表５１５】
2005528080.tif 000516
【１００３】
【表５１６】
2005528080.tif 000517
【１００４】
【表５１７】
2005528080.tif 000518
【１００５】
表ＡＣＣの続き
【表５１８】
2005528080.tif 000519
【１００６】
ＣＮＳ_神経変性_ｖ１．０概要：Ａｇ７５６０  この遺伝子の差のある発現は、アルツハイマー病の死後脳とこの実験の痴呆のない対照のものとで検出されない。しかしながら、このパネルは、個々の独立した群の脳における低レベルでのこの遺伝子の発現を確かにする。それゆえ、この遺伝子産物の治療的調節は、パーキンソン病、てんかん、多発性硬化症、総合失調症およびうつ病のような中枢神経系疾患の処置で有用であり得る。
【１００７】
パネル４．１Ｄ概要：Ａｇ７５６０  この遺伝子の最も高発現は、腎臓で検出される（ＣＴ＝３３．８）。それゆえ、この遺伝子の発現を用いて、このパネルの他の試料から腎臓由来試料を区別し得るし、かつ腎臓組織のマーカーとして用いられ得る。加えて、この遺伝子の発現または機能の治療標的化は、腎臓機能を調節し得るし、かつループスおよび糸球体腎炎を含む腎臓に作用する炎症性疾患または自己免疫疾患の処置で重要であり得る。
【１００８】
この遺伝子の低レベルだが優位なレベルの発現はまた、休止星状膠細胞で見られる。それゆえ、この遺伝子またはコード化されるタンパク質の治療的調節は、多発性硬化症またはＣＮＳの他の炎症性疾患の処置で重要であり得る。
【１００９】
ＡＤ．ＣＧ１５０３６２−０１：オトフェリン（OTOFERLIN）
遺伝子ＣＧ１５０３６２−０１の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ５６８４を用いて評価し、表ＡＤＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＡＤＢに示す。
【１０１０】
【表５１９】
2005528080.tif 000520
【１０１１】
【表５２０】
2005528080.tif 000521
【１０１２】
表ＡＤＢの続き
【表５２１】
2005528080.tif 000522
【１０１３】
ＣＮＳ_神経変性_ｖ１．０概要：Ａｇ５６８４  この遺伝子の発現は、このパネルの全試料にわたって低い／検出できない（ＣＴ＞３４．８）（データは示していない）。
【１０１４】
一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．５概要：Ａｇ５６８４  アンププロットは、この実施に実験的な困難さがあったことを示し、該データからは結論は得られない（データは示していない）。
【１０１５】
パネル４．１Ｄ概要：Ａｇ５６８４  この遺伝子の最も高発現は、ＩＬ−１４で処理されたＮＣＩ−Ｈ２９２細胞株で検出される（ＣＴ＝３０．４）。この遺伝子はまた、ムチンを産生するヒト気道上皮細胞株である、処理および無処理のＮＣＩ−Ｈ２９２細胞株の集団で発現する。粘液の過剰産生は、気管支喘息およびＣＯＰＤ試料の重要な特徴である。この遺伝子はまた、イオノマイシンで処理したRamosＢ細胞、活性化ＨＵＶＥＣ細胞、活性化気管支上皮および小気道上皮、休止肺線維芽細胞、冠状動脈ＳＭＣおよびケラチノサイトでより低レベルだが優位なレベルで発現する。それゆえ、この遺伝子によりコード化されたタンパク質でデザインされた治療法は、ＣＯＰＤ、喘息およびアレルギーおよび肺気腫の肺上皮で炎症により引き起こされる症状を改善しまたは除去する。
【１０１６】
ＡＥ．ＣＧ１５０６３７−０２：Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ１Ｂ前駆体
物理的クローンの全長ＣＧ１５０６３７−０２の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ７１２６を用いて評価し、表ＡＥＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＡＥＢに示す。
【１０１７】
【表５２２】
2005528080.tif 000523
【１０１８】
【表５２３】
2005528080.tif 000524
【１０１９】
表ＡＥＢの続き
【表５２４】
2005528080.tif 000525
【１０２０】
ＣＮＳ_神経変性_ｖ１．０概要：Ａｇ７１２６  この遺伝子の発現は、このパネルの全試料にわたって低い／検出できない（ＣＴ＞３５）（データは示していない）。
【１０２１】
パネル４．１Ｄ概要：Ａｇ７１２６  この遺伝子の最も高発現は、樹状細胞で検出される（ＣＴ＝３２）。この遺伝子の中レベルから低レベルの発現は、休止および活性化樹状細胞、および胸腺に制限される。樹状細胞は、開始の中心的機能でありかつ正常免疫応答を維持する、強力な抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。自己免疫および炎症は当該機能により改善され得る。それゆえ、この遺伝子によりコード化されたタンパク質の治療的調節は、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、ＣＯＰＤ、喘息、肺気腫、関節リウマチ、エリテマトーデス、または乾癬のような自己免疫疾患および炎症性疾患の処置で重要であり得る。
【１０２２】
ＡＦ．ＣＧ１５０６９４−０１：ミクロフィブリル関連糖タンパク質２前駆体
物理的クローンの全長ＣＧ１５０６９４−０１の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ７１４４を用いて評価し、表ＡＦＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＡＦＢおよびＡＦＣに示す。
【１０２３】
【表５２５】
2005528080.tif 000526
【１０２４】
【表５２６】
2005528080.tif 000527
【１０２５】
【表５２７】
2005528080.tif 000528
【１０２６】
表ＡＦＣの続き
【表５２８】
2005528080.tif 000529
【１０２７】
ＣＮＳ_神経変性_ｖ１．０概要：Ａｇ７１４４  このパネルは、個々の独立した群の脳における低レベルでのこの遺伝子の発現を確かにする。この遺伝子は、アルツハイマー病患者の側頭皮質で若干アップレギュレートされることが分かる。それゆえ、この遺伝子の発現または機能の治療的調節は、神経細胞死を減少させ得るし、かつこの疾患の処置で有用であり得る。
【１０２８】
パネル４．１Ｄ概要：Ａｇ７１４４  この遺伝子の最も高発現は、休止冠状動脈ＳＭＣおよび活性化冠状動脈ＳＭＣで検出される（ＣＴ＝２８）。この遺伝子の中レベルの発現はまた、星状膠細胞、ケラチノサイト、粘膜表皮ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞、活性化された気管支および小気道上皮、および皮膚線維芽細胞で見られる。加えて、この遺伝子の低レベルの発現はまた、大腸および胸腺で見られる。それゆえ、抗体または低分子薬の使用を介したこの遺伝子または該タンパク質産物の治療的調節は、喘息、アレルギー、炎症性腸疾患、エリテマトーデス、乾癬、関節リウマチ、骨関節炎、多発性硬化症、およびＣＮＳの他の炎症性疾患のような自己免疫疾患および炎症性疾患の処置で有用であり得る。
【１０２９】
ＡＧ．ＣＧ１５１０６９−０１：膜タンパク質ＡＫ０２７０５６．１
遺伝子ＣＧ１５１０６９−０１の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ７５６２を用いて評価し、表ＡＧＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＡＧＢおよびＡＧＣに示す。
【１０３０】
【表５２９】
2005528080.tif 000530
【１０３１】
【表５３０】
2005528080.tif 000531
【１０３２】
【表５３１】
2005528080.tif 000532
【１０３３】
表ＡＧＣの続き
【表５３２】
2005528080.tif 000533
【１０３４】
ＣＮＳ_神経変性_ｖ１．０概要：Ａｇ７５６２  このパネルは、個々の独立した群の脳における低レベルでのこの遺伝子の発現を確かにする。この遺伝子は、アルツハイマー病の側頭皮質でアップレギュレートされることが分かる。それゆえ、この遺伝子の発現または機能の治療的調節は、神経細胞死を減少させ得るし、かつこの疾患の処置で有用であり得る。
【１０３５】
パネル４．１Ｄ概要：Ａｇ７５６２  この遺伝子の最も高発現は、α＋ＩＬ−１βで処理されたＨＰＡＥＣで検出される（ＣＴ＝３２．２）。この遺伝子の中レベルから低レベルの発現はまた、好酸球、肺微小血管の内皮細胞、好塩基球、ＨＰＡＥＣ、および活性化肺線維芽細胞で見られる。それゆえ、低分子薬または抗体の使用を介したこの遺伝子または該タンパク質産物の治療的調節は、喘息、アレルギー、炎症性腸疾患、エリテマトーデス、乾癬、関節リウマチ、および骨関節炎のような自己免疫疾患および炎症性疾患の処置で有用であり得る。
【１０３６】
ＡＨ．ＣＧ１５１１８９−０１：タイプＩＩＩｂ膜タンパク質
遺伝子ＣＧ１５１１８９−０１の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ７５６１を用いて評価し、表ＡＨＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＡＨＢおよびＡＨＣに示す。
【１０３７】
【表５３３】
2005528080.tif 000534
【１０３８】
【表５３４】
2005528080.tif 000535
【１０３９】
【表５３５】
2005528080.tif 000536
【１０４０】
表ＡＨＣの続き
【表５３６】
2005528080.tif 000537
【１０４１】
ＣＮＳ_神経変性_ｖ１．０概要：Ａｇ７５６１  この遺伝子の差のある発現は、アルツハイマー病の死後脳とこの実験の痴呆のない対照のものとで検出されない。しかしながら、このパネルは、個々の独立した群の脳における低レベルでのこの遺伝子の発現を確かにする。それゆえ、この遺伝子産物の治療的調節は、パーキンソン病、てんかん、多発性硬化症、総合失調症およびうつ病のような中枢神経系疾患の処置で有用であり得る。
【１０４２】
パネル４．１Ｄ概要：Ａｇ７５６１  この遺伝子の最も高発現は、活性化２次Ｔｈ２細胞で検出される（ＣＴ＝２９．３）。この遺伝子は、健康および疾患での免疫応答において広範な優位な細胞タイプで中レベルから低レベルで発現する。これらの細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、内皮細胞、マクロファージ／単球、および末梢血単核球細胞ファミリーのメンバー、ならびに肺および皮膚由来の上皮細胞および線維芽細胞、および大腸、肺、胸腺および腎臓により代表される正常組織のメンバーを含む。発現のこの遍在パターンは、この遺伝子産物がこれらおよび他の細胞タイプおよび組織のホメオスタシス過程で関与しうることを示す。それゆえ、機能的療法での遺伝子産物の調製は、これら細胞タイプと関連する機能の変化を導き得るし、かつ喘息、アレルギー、炎症性腸疾患、エリテマトーデス、乾癬、関節リウマチ、および骨関節炎のような自己免疫疾患および炎症性疾患を病む患者の症状の改善を導き得る。
【１０４３】
ＡＩ．ＣＧ１５１８０１−０１：オクルディン（Occludin）様膜タンパク質
遺伝子ＣＧ１５１８０１−０１の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ７５６３を用いて評価し、表ＡＩＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＡＩＢに示す。
【１０４４】
【表５３７】
2005528080.tif 000538
【１０４５】
【表５３８】
2005528080.tif 000539
【１０４６】
表ＡＩＢの続き
【表５３９】
2005528080.tif 000540
【１０４７】
ＣＮＳ_神経変性_ｖ１．０概要：Ａｇ７５６３  この遺伝子の発現は、このパネルの全試料にわたって低い／検出できない（ＣＴ＞３５）（データは示していない）。
【１０４８】
パネル４．１Ｄ概要：Ａｇ７５６３  この遺伝子の最も高発現は、ＴＮＦα＋ＩＬ−１βで処理された小気道上皮で見られる（ＣＴ＝３４）。それゆえ、この遺伝子の発現を用いて、このパネルの他の組織から活性化された小気道上皮を区別し得る。加えて、この遺伝子の低レベルの発現はまた、ムチンを産生するヒト気道上皮細胞株である、サイトカインで活性化されたＮＣＩ−Ｈ２９２細胞で見られる。それゆえ、低分子療法の使用を介したこの遺伝子によりコード化されたタンパク質の発現または活性の調節は、喘息、ＣＯＰＤ、および肺気腫の処置で有用であり得る。
【１０４９】
ＡＪ．ＣＧ１６５９６１−０１およびＣＧ１６５９６１−０２：２次性輸送体関連膜タンパク質３
物理的クローンの全長ＣＧ１６５９６１−０１および変異体ＣＧ１６５９６１−０２の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ７５６９を用いて評価し、表ＡＪＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＡＪＢおよびＡＪＣに示す。物理的クローンＣＧ１６５９６１−０１全長および変異体ＣＧ１６５９６１−０２の発現を、表ＡＪＡに記載のプライマー−プローブのセットを用いて評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＡＪＢおよびＡＪＣに示す。ＣＧ１６５９６１−０１が、遺伝子配列の予測を確かにするＣＧ１６５９６１−０２遺伝子の物理的クローン全長を表すことに注意されたい。
【１０５０】
【表５４０】
2005528080.tif 000541
【１０５１】
【表５４１】
2005528080.tif 000542
【１０５２】
【表５４２】
2005528080.tif 000543
【１０５３】
表ＡＪＣの続き
【表５４３】
2005528080.tif 000544
【１０５４】
ＣＮＳ_神経変性_ｖ１．０概要：Ａｇ７５６９  この遺伝子の差のある発現は、アルツハイマー病の死後脳とこの実験の痴呆のない対照のものとで検出されない。しかしながら、このパネルは、個々の独立した群の脳における低レベルでのこの遺伝子の発現を確かにする。それゆえ、この遺伝子産物の治療的調節は、パーキンソン病、てんかん、多発性硬化症、総合失調症およびうつ病のような中枢神経系疾患の処置で有用であり得る。
【１０５５】
パネル４．１Ｄ概要：Ａｇ７５６９  この遺伝子の最も高発現は、ＴＮＦαで処理された皮膚線維芽細胞で検出される（ＣＴ＝２９．９）。この遺伝子は、健康および疾患での免疫応答において広範な優位な細胞タイプで中レベルから低レベルで発現する。これらの細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、内皮細胞、マクロファージ／単球、および末梢血単核球細胞ファミリーのメンバー、ならびに肺および皮膚由来の上皮細胞および線維芽細胞、および大腸、肺、胸腺および腎臓により代表される正常組織のメンバーを含む。発現のこの遍在パターンは、この遺伝子産物がこれらおよび他の細胞タイプおよび組織のホメオスタシス過程で関与しうることを示す。それゆえ、機能的療法での遺伝子産物の調製は、これら細胞タイプと関連する機能の変化を導き得るし、かつ喘息、アレルギー、炎症性腸疾患、エリテマトーデス、乾癬、関節リウマチ、および骨関節炎のような自己免疫疾患および炎症性疾患を病む患者の症状の改善を導き得る。
【１０５６】
ＡＫ．ＣＧ５１５９５−０３およびＣＧ５１５９５−０６およびＣＧ５１５９５−０７：トロンボスポンジン関連タンパク質
遺伝子ＣＧ５１５９５−０６および変異体ＣＧ５１５９５−０３およびＣＧ５１５９５−０７の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ８１５およびＡｇ１２７を用いて評価し、表ＡＫＡおよびＡＫＢに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＡＫＣ、ＡＫＤ、ＡＫＥ、ＡＫＦ、ＡＫＧ、ＡＫＨ、ＡＫＩおよびＡＫＪに示す。Ａｇ１２７はＣＧ５１５９５−０６およびＣＧ５１５９５−０７にのみ特異的であることに注意されたい。
【１０５７】
【表５４４】
2005528080.tif 000545
【１０５８】
【表５４５】
2005528080.tif 000546
【１０５９】
【表５４６】
2005528080.tif 000547
【１０６０】
表ＡＫＣの続き
【表５４７】
2005528080.tif 000548
【１０６１】
【表５４８】
2005528080.tif 000549
【１０６２】
表ＡＫＤの続き
【表５４９】
2005528080.tif 000550
【１０６３】
【表５５０】
2005528080.tif 000551
【１０６４】
表ＡＫＥの続き
【表５５１】
2005528080.tif 000552
【１０６５】
表ＡＫＥの続き
【表５５２】
2005528080.tif 000553
【１０６６】
【表５５３】
2005528080.tif 000554
【１０６７】
表ＡＫＦの続き
【表５５４】
2005528080.tif 000555
【１０６８】
【表５５５】
2005528080.tif 000556
【１０６９】
表ＡＫＧの続き
【表５５６】
2005528080.tif 000557
【１０７０】
【表５５７】
2005528080.tif 000558
【１０７１】
表ＡＫＨの続き
【表５５８】
2005528080.tif 000559
【１０７２】
【表５５９】
2005528080.tif 000560
【１０７３】
表ＡＫＩの続き
【表５６０】
2005528080.tif 000561
【１０７４】
表ＡＫＩの続き
【表５６１】
2005528080.tif 000562
【１０７５】
【表５６２】
2005528080.tif 000563
【１０７６】
ＡＩ_包括的パネル_ｖ１．０概要：Ａｇ８１５  この遺伝子の最も高発現は、潰瘍性大腸炎の対照試料で検出される（ＣＴ＝２７．６）。この遺伝子はこのパネルで広範な発現を示す。この遺伝子の中レベルから低レベルの発現は、正常および関節炎／関節リウマチの骨、軟骨、滑膜由来および滑液試料、正常肺、ＣＯＰＤ肺、肺気腫、アトピー性喘息、喘息、アレルギー、クローン病（正常一致対照および疾患）、潰瘍性大腸炎（正常一致対照および疾患）、および乾癬（正常一致対照および疾患）由来の試料で感出される。それゆえ、この遺伝子産物の治療的調節は、乾癬、アレルギー、喘息、炎症性腸疾患、関節リウマチ、および骨関節炎を含む、自己免疫疾患および炎症性疾患と関連する症状／状態を改善し得る。
【１０７７】
別の実験（実施249247531）のアンププロットは、この実施での実験的困難さを示し、該データから得られる結果はない。
【１０７８】
パネル１概要：Ａｇ１２７  この遺伝子の最も高発現は、胎盤で検出される（ＣＴ＝２５．４）。この遺伝子の高発現はまた、精巣および子宮で見られる。それゆえ、この遺伝子の治療的調節は、生殖疾患および不妊の処置で有用であり得る。
【１０７９】
この遺伝子の中レベルの発現はまた、膵臓癌、黒色腫、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、および脳腫瘍由来の癌細胞株の群で見られる。従って、低分子薬または抗体の使用を介したこの遺伝子の発現または機能の治療的調節は、膵臓癌、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、および脳腫瘍の処置で効果的であり得る。
【１０８０】
代謝機能または内分泌機能を有する組織の間で、この遺伝子は、膵臓、副腎、甲状腺、下垂体、心臓、肝臓および消化管において中レベルで発現する。それゆえ、この遺伝子活性の治療的調節は、肥満および糖尿病のような内分泌／代謝関連疾患の処置で有用となり得る。
【１０８１】
加えて、この遺伝子は、扁桃体、海馬、黒質、視床、小脳、大脳皮質、および脊髄の全領域で中レベルで発現する。それゆえ、この遺伝子産物の治療的調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、てんかん、多発性硬化症、総合失調症およびうつ病のような中枢神経系疾患の処置で有用であり得る。
【１０８２】
パネル１．２概要：Ａｇ８１５  同一プローブとプライマーでの２度の実験はよく一致する。この遺伝子の最も高発現は、胎盤および大脳皮質で検出される（ＣＴ＝２４〜２５．６）。加えて、この遺伝子の発現は、脳、膵臓、副腎、甲状腺、下垂体、心臓、肝臓および消化管、内皮細胞のような代謝機能／内分泌機能を有する組織、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、および脳腫瘍由来の癌細胞株で見られる。このパターンは、パネル１で見られる発現と相関する。この遺伝子の有用性のさらなる考察のため、パネル１を参照されたい。
【１０８３】
パネル１．３Ｄ概要：Ａｇ８１５  この遺伝子の最も高発現は、大脳皮質で検出される（ＣＴ＝２７．４）。加えて、この遺伝子の発現は、脳、脂肪、膵臓、副腎、甲状腺、下垂体、心臓、肝臓、および消化管のような代謝機能／内分泌機能を有する組織、内皮細胞、および胃癌、大腸癌、肺癌、卵巣癌、および脳腫瘍由来の癌細胞株で見られる。このパターンは、パネル１で見られる発現と相関する。この遺伝子の有用性のさらなる考察のため、パネル１を参照されたい。
【１０８４】
この遺伝子の優位な発現はまた、胎児の骨格筋で検出される。興味深いことに、この遺伝子は、成人の骨格筋（ＣＴ＝３４）と比較して胎児でずっと高レベル（ＣＴ＝２９）で発現する。この知見は、この遺伝子の発現を用いて成人の骨格筋から胎児の骨格筋を区別し得ることを示す。加えて、胎児の骨格筋でのこの遺伝子の相対的過剰発現は、タンパク質産物が胎児の筋肉成長または発達を増強し得るし、従ってまた成人での回復能力で働き得ることを示す。それゆえ、この遺伝子によりコード化されるＧＰＣＲの治療的調節は、筋肉関連疾患の処置で有用であり得る。さらに特異的に、この遺伝子によりコード化されるタンパク質での弱い筋肉または障害性筋肉の処置は、筋肉塊または機能を回復させ得る。
【１０８５】
パネル２Ｄ概要：Ａｇ８１５  この遺伝子の最も高発現は、腎臓癌で検出される（ＣＴ＝２８．３）。興味深いことに、この遺伝子の発現は、腎臓癌と比較して正常腎臓試料と強く関連する。加えて、この遺伝子の中レベルから低レベルの発現はまた、大腸癌、前立腺癌、肺癌、乳癌、肝臓癌、膀胱癌、卵巣癌、胃癌で見られる。それゆえ、抗体および低分子薬の使用を介したこの遺伝子または該タンパク質産物の治療的調節は、腎臓癌、大腸癌、前立腺癌、肺癌、乳癌、肝臓癌、膀胱癌、卵巣癌、胃癌の処置で有用であり得る。
【１０８６】
パネル３Ｄ概要：Ａｇ８１５  この遺伝子の最も高発現は、肺癌細胞株で検出される（ＣＴ＝２９．６）。この遺伝子の中レベルの発現はまた、肺癌、膵臓癌、子宮癌、脳腫瘍および大腸癌由来の多くの細胞株で見られる。それゆえ、この遺伝子の発現は、これらの癌の存在を検出するマーカーとして用いられ得る。さらに、この遺伝子の治療的調節は、これら癌の処置で有用であり得る。
【１０８７】
パネル４Ｄ概要：Ａｇ８１５  同一プローブ−プライマーのセットでの２度の実験は、よく一致する。この遺伝子の最も高発現は、胸腺で検出される（ＣＴ＝２７．７〜２８）。この遺伝子の中レベルの発現はまた、ＨＵＶＥＣ、肺および皮膚の微小血管ＥＣ細胞、およびＨＰＥＡＣ細胞を含む上皮細胞でみられる。加えて、この遺伝子の中レベルから低レベルの発現はまた、肝硬変、ループス腎臓、正常大腸、肺、および腎臓試料で見られる。それゆえ、機能的療法での遺伝子産物の調節は、これら内皮細胞と関連する機能の変化を導き得るし、かつ喘息、アレルギー、炎症性腸疾患、エリテマトーデス、乾癬、間接リウマチ、骨関節炎および肝硬変のような自己免疫疾患および炎症性疾患を病む患者の症状の改善を導き得る。
【１０８８】
パネル５島概要：Ａｇ８１５  この遺伝子の最も高発現は、非糖尿病および肥満の患者の胎盤で検出される（ＣＴ＝２８）。この遺伝子の中レベルの発現は、糖尿病患者および糖尿病でない患者の胎盤、子宮、脂肪、腎臓および小腸で主に見られる。この遺伝子の有用性のさらなる考察のため、パネル１を参照されたい。
【１０８９】
ＡＬ．ＣＧ５７２０９−０２およびＣＧ５７２０９−０３：ＥＭＲ１ホルモン受容体
遺伝子ＣＧ５７２０９−０２の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ６３４３を用いて評価し、表ＡＬＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＡＬＢ、ＡＬＣ、ＡＬＤ、ＡＬＥおよびＡＬＦに示す。
【１０９０】
【表５６３】
2005528080.tif 000564
【１０９１】
【表５６４】
2005528080.tif 000565
【１０９２】
表ＡＬＢの続き
【表５６５】
2005528080.tif 000566
【１０９３】
【表５６６】
2005528080.tif 000567
【１０９４】
【表５６７】
2005528080.tif 000568
【１０９５】
表ＡＬＤの続き
【表５６８】
2005528080.tif 000569
【１０９６】
【表５６９】
2005528080.tif 000570
【１０９７】
表ＡＬＥの続き
【表５７０】
2005528080.tif 000571
【１０９８】
【表５７１】
2005528080.tif 000572
【１０９９】
ＡＩ_包括的パネル_ｖ１．０概要：Ａｇ６３４３  この遺伝子の最も高発現は、骨関節炎（ＯＡ）骨で検出される（ＣＴ＝２９．３）。この遺伝子の低レベルから中レベルの発現は、骨関節炎（ＯＡ）骨および隣接骨、ならびにＯＡ軟骨、およびＯＡ滑液試料由来の試料で検出される。中レベルの発現は、関節リウマチ患者由来の軟骨、骨、滑膜、および滑液試料で検出される。この遺伝子の優位な発現は、軟骨、滑膜、骨または滑液細胞の正常試料で検出されない。低レベルから中レベルの発現はまた、ＣＯＰＤ肺、肺気腫、喘息、クローン病（正常対応対照および疾患）、潰瘍性大腸炎（正常対応対照および疾患）、および乾癬（正常対応対照および疾患）で見られる。それゆえ、この遺伝子産物の治療的調節は、乾癬、アレルギー、喘息、炎症性腸疾患、関節リウマチ、および骨関節炎を含む、自己免疫疾患および炎症性疾患と関連する症状／状態を改善し得る。
【１１００】
ＣＮＳ_神経変性_ｖ１．０概要：Ａｇ６３４３  この遺伝子の最も高発現は、アルツハイマー病由来の海馬試料で検出される（ＣＴ＝３２．２）。この遺伝子の中レベルから低レベルの発現はまた、いくつかのアルツハイマー病の側頭皮質で見られる。それゆえ、この遺伝子の治療的調節は、アルツハイマー病の処置で有用であり得る。
【１１０１】
一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．５概要：Ａｇ６３４３  この遺伝子の最も高発現は、脾臓で検出される（ＣＴ＝３１．４）。この遺伝子の中レベルから低レベルの発現はまた、胸腺、胎児の肺および胎児の肝臓で見られる。これらの組織は、単球または単球由来細胞タイプを含有し得る。この遺伝子は、ＥＭＲ１ホルモン受容体前駆体（ヒトＦ４／８０相同体）をコードする。ＥＭＲ１は、７膜貫通型セグメントを有するホルモン受容体ファミリーのメンバーである。加えて、ムチン様、単一期間、接着特性を有する複合的膜糖タンパク質を連想する、セリン／スレオニンリッチのドメインにより膜貫通型セグメントから分けられたＮ末端の６つのｅｇｆ様モジュールを有する（Baud et al., 1995, Genomics 26(2):334-44, PMID: 7601460）。ＥＭＲ１は、骨髄単球性の系統細胞により異常発現されるとわかっている（McKnight AJ, Gordon S., 1998, J Leukoc Biol 63(3):271-80, PMID: 9500513）。タンパク質のＥＢＲファミリーのメンバーであるＥＭＲ３の潜在的役割は、免疫応答および炎症反応での骨髄性細胞と骨髄性細胞の相互作用において示された。それゆえ、この分子に対して指定された抗体および低分子薬の使用を介したこの遺伝子によりコード化されたＥＭＲ１の治療的調節は、単球活性化または炎症組織への血管外遊走を阻害しうるし、そして喘息および関節リウマチを含む多くの炎症性疾患の処置に重要であり得る。
【１１０２】
代謝機能または内分泌機能を有する組織の間で、この遺伝子は、脂肪、副腎、および肝臓において低レベルで発現する。加えて、この遺伝子の発現は、無調節であることがCuraGenのGeneCalling研究でわかった。それは、高脂肪食を与えられた後、糖尿病および肥満を発生するマウスの脂肪組織においてアップレギュレートされる。この遺伝子によりコード化されるＥＭＲ１受容体は、脂肪組織でのＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびレジスチンの誘導および放出を導く経路に関与し得る。該分子は、インスリン抵抗性の促進に関与すると知られ、肥満と関連する（Holst D, Grimaldi PA, 2002, Curr Opin Lipidol. 13(3):241-5, PMID: 12045392; Greenberg et al., 2002, Eur J Clin Invest. 32 Suppl 3:24-34, PMID: 12028372）。それゆえ、この遺伝子活性の治療的調節は、肥満および２型糖尿病を含む糖尿病のような内分泌／代謝関連疾患の処置において有用となりうる。
【１１０３】
興味深いことに、この遺伝子は、成人の肝臓および肺（ＣＴ＝３４〜４０）と比較して胎児でずっと高いレベル（ＣＴ＝３１．７〜３２．９）で発現する。この知見は、この遺伝子の発現を用いて成人の組織から胎児の組織を区別し得ることを示す。加えて、胎児組織でのこの遺伝子の相対的発現は、タンパク質産物が肝臓および肺の成長または発達を増強し得るし、従ってまた、成人の再生能力で働き得ることを示す。それゆえ、この遺伝子によりコード化されるタンパク質の治療的調節は、肝臓および肺関連疾患の処置で有用であり得る。
【１１０４】
加えて、この遺伝子は、脳全体で低レベルで発現する。それゆえ、この遺伝子産物の治療的調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、てんかん、多発性硬化症、総合失調症、およびうつ病のような神経性疾患の処置で有用であり得る。
【１１０５】
パネル４．１Ｄ概要：Ａｇ６３４３  この遺伝子の最も高発現は、ＬＰＳで処理された単球で検出される（ＣＴ＝２７．３）。この遺伝子の発現は、休止単球（ＣＴ＝３１．６）と比較して活性化単球でアップレギュレートされる。それゆえ、この遺伝子の発現を用いて、このパネルで用いられる休止から活性化された単球と他の試料とを区別し得る。ＬＰＳ処理単球細胞でのこの遺伝子の発現は、それが、適応する免疫につながる自然免疫および炎症反応の開始で中心的に働くことを示す。この遺伝子の低レベルから中レベルの発現は、好中球、好酸球、ＰＢＭＣ、２方法ＭＬＲ、活性化記憶Ｔ細胞、およびＣＤ４リンパ球においても見られる。それゆえ、モノクローナル抗体または低分子薬の適用を介したこの遺伝子またはその産物の調節は、炎症の初期段階を改善または予防し、そして乾癬、喘息、炎症性腸疾患、関節リウマチ、骨関節炎、および他の肺の炎症性疾患の様な様々な炎症性疾患を改善しうる。この遺伝子の有用性のさらなる考察のためパネル１．５を参照されたい。
【１１０６】
パネル５島概要：Ａｇ６３４３  この遺伝子の低発現は、小腸由来試料に制限される（ＣＴ＝３４．８）。それゆえ、この遺伝子の発現を用いて、このパネルの他の組織からこの試料を区別し得る。この遺伝子の有用性のさらなる考察のためパネル１．５を参照されたい。
【１１０７】
ＡＭ．ＣＧ９７７１５−０１：膜貫通型タンパク質ＰＴ２７
物理的クローンの全長ＣＧ９７７１５−０１の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ３８４０を用いて評価し、表ＡＭＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＡＭＢ、ＡＭＣ、ＡＭＤ、ＡＭＥおよびＡＭＦに示す。
【１１０８】
【表５７２】
2005528080.tif 000573
【１１０９】
【表５７３】
2005528080.tif 000574
【１１１０】
表ＡＭＢの続き
【表５７４】
2005528080.tif 000575
【１１１１】
【表５７５】
2005528080.tif 000576
【１１１２】
表ＡＭＣの続き
【表５７６】
2005528080.tif 000577
【１１１３】
【表５７７】
2005528080.tif 000578
【１１１４】
表ＡＭＤの続き
【表５７８】
2005528080.tif 000579
【１１１５】
【表５７９】
2005528080.tif 000580
【１１１６】
【表５８０】
2005528080.tif 000581
【１１１７】
一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．４概要：Ａｇ３８４０  この遺伝子の最も高発現は、乳癌Ｔ４７Ｄ細胞株で検出される（ＣＴ＝２５．３）。この遺伝子の高レベルの発現はまた、膵臓癌、胃癌、大腸癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、黒色腫および脳腫瘍由来の癌細胞株の群で見られる。従って、この遺伝子の発現は、これら癌の存在を検出するマーカーとして用いられ得る。さらに、この遺伝子の発現または機能の治療的調節は、膵臓癌、胃癌、大腸癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、黒色腫および脳腫瘍の処置で効果的であり得る。
【１１１８】
代謝機能または内分泌機能を有する組織の間で、この遺伝子は、膵臓、脂肪、副腎、甲状腺、下垂体、骨格筋、心臓、肝臓および消化管において中レベルから高レベルで発現する。それゆえ、この遺伝子活性の治療的調節は、肥満および糖尿病のような内分泌／代謝関連疾患の処置で有用となり得る。
【１１１９】
加えて、この遺伝子は、扁桃体、海馬、黒質、視床、小脳、大脳皮質、および脊髄を含む調べられた中枢神経系の全領域において高レベルで発現する。それゆえ、この遺伝子産物の治療的調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、てんかん、多発性硬化症、総合失調症およびうつ病のような中枢神経系疾患の処置で有用であり得る。
【１１２０】
興味深いことに、この遺伝子は、成人の肝臓（ＣＴ＝３２．７）と比較して、胎児でずっと高レベル（ＣＴ＝２８．７）で発現する。この知見は、この遺伝子の発現を用いて成人の肝臓から胎児の肝臓を区別し得ることを示す。加えて、胎児組織でのこの遺伝子の相対的過剰発現は、タンパク質産物が胎児の肝臓の成長または発達を増強し得るし、従ってまた、成人の回復能力で働き得ることを示す。それゆえ、この遺伝子によりコード化されるタンパク質の治療的調節は、肝臓関連疾患の処置で有用であり得る。
【１１２１】
腫瘍学_細胞_株_スクリーニング_パネル_ｖ３．１概要：Ａｇ３８４０  この遺伝子の最も高発現は、赤白血病ＴＦ−１細胞株で検出される（ＣＴ＝２６．６）。この遺伝子は、このパネルの全癌細胞株および正常試料で広範な発現を示す。このパターンは、一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．４での発現プロフィールと一致し、かつ細胞生存および細胞増殖での遺伝子産物での働きも示す。 この遺伝子の有用性のさらなる考察のためパネル１．４を参照されたい。
【１１２２】
パネル４．１Ｄ概要：Ａｇ３８４０  この遺伝子の最も高発現は、ＴＮＦαおよびＩＬ−１βで処理されたＨＰＡＥＣ細胞で検出される（ＣＴ＝２７．８）。この遺伝子は、健康および疾患での免疫応答の広範な優位な細胞タイプにおいて高レベルから中レベルで発現する。これらの細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、内皮細胞、マクロファージ／単球、および末梢血単核球細胞ファミリーのメンバー、ならびに肺および皮膚由来の上皮細胞および線維芽細胞、および大腸、肺、胸腺および腎臓により代表される正常組織のメンバーを含む。発現の遍在パターンは、この遺伝子産物がこれらおよび他の細胞タイプおよび組織のホメオスタシス過程で関与しうることを示す。このパターンは、一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．４での発現プロフィールと一致し、かつ細胞生存および細胞増殖での遺伝子産物での働きも示す。それゆえ、機能的療法での遺伝子産物の調製は、これら細胞タイプと関連する機能の変化を導き得るし、かつ喘息、アレルギー、炎症性腸疾患、エリテマトーデス、乾癬、関節リウマチ、および骨関節炎のような自己免疫疾患および炎症性疾患を病む患者の症状の改善を導き得る。
【１１２３】
パネル５Ｄ概要：Ａｇ３８４０  この遺伝子の最も高発現は、分化途中の脂肪組織および分化脂肪組織で検出される（ＣＴ＝２９．４）。この遺伝子は、パネル１．４で見られるパターンと対応する、このパネルでの広範な発現を示す。この遺伝子の有用性のさらなる考察のためパネル１．４を参照されたい。
【１１２４】
一般的腫瘍学スクリーニングパネル_ｖ_２．４概要：Ａｇ３８４０  この遺伝子の最も高発現は、悪性大腸癌試料で検出される（ＣＴ＝２６．６）。この遺伝子の発現は、大腸、肺、黒色腫、膀胱、前立腺および腎臓由来の正常および癌試料の両方で見られる。興味深いことに、この遺伝子の発現は、対応正常隣接組織と比較して癌試料で常に高い。それゆえ、この遺伝子の発現は、大腸癌、肺癌、膀胱癌、前立腺癌、および腎臓癌の存在を検出する診断マーカーとして用いられ得る。さらに、この遺伝子または該タンパク質産物の治療的調節は、大腸癌、肺癌、黒色腫、膀胱癌、および腎臓癌の処置で有用であり得る。
【１１２５】
実施例Ｄ：ＮＯＶＸ核酸配列中の単一ヌクレオチド多型の同定
変異体配列も本願に含まれる。変異体配列には単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を含み得る。ＳＮＰは、場合によって、ＳＮＰを含むヌクレオチド配列がｃＤＮＡとして起こることを示すため「ｃＳＮＰ」と称される。ＳＮＰはいく通りかの方法で生じ得る。例えば、ＳＮＰは多型部位でのあるヌクレオチドの別のものとの置換によるものであり得る。かかる置換はトランジションまたはトランスバーションのいずれかであり得る。ＳＮＰはまた参照対立遺伝子と比べて、ヌクレオチドの欠失またはヌクレオチドの挿入からも生じ得る。この場合、この多型部位とはある対立遺伝子が別の対立遺伝子の特定のヌクレオチドに関してギャップを有する部位である。遺伝子内に生じるＳＮＰは、ＳＮＰの位置にある遺伝子によってコードされるアミノ酸の変更をもたらす場合がある。遺伝暗号の重複性の結果としてＳＮＰを含むコドンが同じアミノ酸をコードする場合、遺伝子内のＳＮＰがサイレントである場合もある。遺伝子の領域外で、または遺伝子のイントロン内で生じるＳＮＰはタンパク質のどのアミノ酸配列にも変化をもたらさないが、発現パターンの調節の変更をもたらす場合がある。例として、時間的発現、生理的応答調節、細胞種発現調節、発現強度、および転写されたメッセージの安定性の変更が挙げられる。
【１１２６】
エクソン結合プロセスによって得られたSeqCallingアセンブリーを以下の基準を用いて選択し、伸長させた。最初の配列または伸長させた配列の全てまたは部分に対し98%の同一性を持つ領域を有するゲノムクローンを、ヒトゲノムデータベースをクエリーするのに適切な配列を用いてBLASTN検索によって同定した。この同一性がこれらのクローンがこれらSeqCallingアセンブリーのゲノム座位を含むことを示すことから、得られたゲノムクローンをさらなる解析のために選択した。これらの配列は推定コード領域ならびに既知DNAおよびタンパク質配列との類似性に関して解析した。これらの解析に用いたプログラムとしては、Grail、Genscan、BLAST、HMMER、FASTA、Hybridおよびその他の適切なプログラムが挙げられる。
【１１２７】
さらなるゲノム領域を、選択したSeqCallingアセンブリーがそれらの領域についてマッピングするということでいくつか同定しておいてもよい。かかるSeqCalling配列は相同性またはエクソン予測により規定される領域と重複していてもよい。また、断片の位置が類似性または当初の予測配列に含まれていたエクソン予測により同定されるゲノム領域の近傍にあったという理由でこれらを含めてもよい。このように同定された配列を手作業でアセンブルし、次いでCuraGen社のヒトSeqCallingデータベースから得られる1以上のさらなる配列を用いて伸長しておいてもよい。含めるのに好適なSeqCalling断片を、CuraTools（商標）プログラムSeqExtendにより、または解析したゲノムクローンの適当な領域へマッピングするSeqCalling断片の同定により同定した。
【１１２８】
次いで、本明細書に開示された最終配列を導くため、前記手順により規定される領域を手作業で統合し、例えば、元の断片中でミスコールされた塩基から、または予測されるエクソン結合部、EST位置と配列類似性領域との間の矛盾から生じ得た明らかな不一致を訂正した。必要であれば、SeqCallingアセンブリーおよびゲノムクローンを同定および解析するプロセスを繰り返して全長配列を導いた（Alderbornら, Determination of Single Nucleotide Polymorphisms by Real-time Pyrophosphate DNA Sequencing. Genome Research. 10（8）1249-1265,2000）。
【１１２９】
変異体は個々に報告されるが、変異体の全てまたは選択サブセットのいずれの組み合わせも本発明の考慮されるNOVXの実施形態として含まれる。
【１１３０】
ＮＯＶ１ａ  ＳＮＰデータ：
ＮＯＶ１ａは１変異体を有し、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の変異位置は配列番号：１および２によりそれぞれ番号付けられている。ＮＯＶ１ａ変異体のヌクレオチド配列は表５１Ａに示す様に異なっている。
【表５８１】
2005528080.tif 000582
【１１３１】
ＮＯＶ２ｂ  ＳＮＰデータ：
ＮＯＶ２ｂは１変異体を有し、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の変異位置は配列番号：５および６によりそれぞれ番号付けられている。ＮＯＶ２ｂ変異体のヌクレオチド配列は表５１Ｂに示す様に異なっている。
【表５８２】
2005528080.tif 000583
【１１３２】
ＮＯＶ４ｃ  ＳＮＰデータ：
ＮＯＶ４ｃは１変異体を有し、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の変異位置は配列番号：２１および２２によりそれぞれ番号付けられている。ＮＯＶ４ｃ変異体のヌクレオチド配列は表５１Ｃに示す様に異なっている。
【表５８３】
2005528080.tif 000584
【１１３３】
ＮＯＶ５ｂ  ＳＮＰデータ：
ＮＯＶ５ｂは１変異体を有し、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の変異位置は配列番号：２７および２８によりそれぞれ番号付けられている。ＮＯＶ５ｂ変異体のヌクレオチド配列は表５１Ｄに示す様に異なっている。
【表５８４】
2005528080.tif 000585
【１１３４】
ＮＯＶ６ｂ  ＳＮＰデータ：
ＮＯＶ６ｂは１変異体を有し、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の変異位置は配列番号：３１および３２によりそれぞれ番号付けられている。ＮＯＶ６ｂ変異体のヌクレオチド配列は表５１Ｅに示す様に異なっている。
【表５８５】
2005528080.tif 000586
【１１３５】
ＮＯＶ８ｂ  ＳＮＰデータ：
ＮＯＶ８ｂは１変異体を有し、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の変異位置は配列番号：３９および４０によりそれぞれ番号付けられている。ＮＯＶ８ｂ変異体のヌクレオチド配列は表５１Ｆに示す様に異なっている。
【表５８６】
2005528080.tif 000587
【１１３６】
ＮＯＶ１０ａ  ＳＮＰデータ：
ＮＯＶ１０ａは１変異体を有し、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の変異位置は配列番号：４５および４６によりそれぞれ番号付けられている。ＮＯＶ１０ａ変異体のヌクレオチド配列は表５１Ｇに示す様に異なっている。
【表５８７】
2005528080.tif 000588
【１１３７】
ＮＯＶ１４ｂ  ＳＮＰデータ：
ＮＯＶ１４ｂは１変異体を有し、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の変異位置は配列番号：５７および５８によりそれぞれ番号付けられている。ＮＯＶ１４ｂ変異体のヌクレオチド配列は表５１Ｈに示す様に異なっている。
【表５８８】
2005528080.tif 000589
【１１３８】
ＮＯＶ１５ａ  ＳＮＰデータ：
ＮＯＶ１５ａは１変異体を有し、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の変異位置は配列番号：５９および６０によりそれぞれ番号付けられている。ＮＯＶ１５ａ変異体のヌクレオチド配列は表５１Ｉに示す様に異なっている。
【表５８９】
2005528080.tif 000590
【１１３９】
ＮＯＶ１７ａ  ＳＮＰデータ：
ＮＯＶ１７ａは１変異体を有し、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の変異位置は配列番号：７１および７２によりそれぞれ番号付けられている。ＮＯＶ１７ａ変異体のヌクレオチド配列は表５１Ｊに示す様に異なっている。
【表５９０】
2005528080.tif 000591
【１１４０】
ＮＯＶ２０ａ  ＳＮＰデータ：
ＮＯＶ２０ａは１変異体を有し、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の変異位置は配列番号：８５および８６によりそれぞれ番号付けられている。ＮＯＶ２０ａ変異体のヌクレオチド配列は表５１Ｋに示す様に異なっている。
【表５９１】
2005528080.tif 000592
【１１４１】
ＮＯＶ２１ａ  ＳＮＰデータ：
ＮＯＶ２１ａは１変異体を有し、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の変異位置は配列番号：８９および９０によりそれぞれ番号付けられている。ＮＯＶ２１ａ変異体のヌクレオチド配列は表５１Ｌに示す様に異なっている。
【表５９２】
2005528080.tif 000593
【１１４２】
ＮＯＶ２４ａ  ＳＮＰデータ：
ＮＯＶ２４ａは１変異体を有し、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の変異位置は配列番号：９５および９６によりそれぞれ番号付けられている。ＮＯＶ２４ａ変異体のヌクレオチド配列は表５１Ｍに示す様に異なっている。
【表５９３】
2005528080.tif 000594
【１１４３】
ＮＯＶ２７ｂ  ＳＮＰデータ：
ＮＯＶ２７ｂは１変異体を有し、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の変異位置は配列番号：１１１および１１２によりそれぞれ番号付けられている。ＮＯＶ２７ｂ変異体のヌクレオチド配列は表５１Ｎに示す様に異なっている。
【表５９４】
2005528080.tif 000595
【１１４４】
ＮＯＶ２８ａ  ＳＮＰデータ：
ＮＯＶ２８ａは１変異体を有し、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の変異位置は配列番号：１１３および１１４によりそれぞれ番号付けられている。ＮＯＶ２８ａ変異体のヌクレオチド配列は表５１Ｏに示す様に異なっている。
【表５９５】
2005528080.tif 000596
【１１４５】
ＮＯＶ２９ａ  ＳＮＰデータ：
ＮＯＶ２９ａは１変異体を有し、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の変異位置は配列番号：１１７および１１８によりそれぞれ番号付けられている。ＮＯＶ２９ａ変異体のヌクレオチド配列は表５１Ｐに示す様に異なっている。
【表５９６】
2005528080.tif 000597
【１１４６】
ＮＯＶ３０ａ  ＳＮＰデータ：
ＮＯＶ３０ａは１変異体を有し、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の変異位置は配列番号：１１９および１２０によりそれぞれ番号付けられている。ＮＯＶ３０ａ変異体のヌクレオチド配列は表５１Ｑに示す様に異なっている。
【表５９７】
2005528080.tif 000598
【１１４７】
ＮＯＶ３２ａ  ＳＮＰデータ：
ＮＯＶ３２ａは１変異体を有し、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の変異位置は配列番号：１２３および１２４によりそれぞれ番号付けられている。ＮＯＶ３２ａ変異体のヌクレオチド配列は表５１Ｒに示す様に異なっている。
【表５９８】
2005528080.tif 000599
【１１４８】
ＮＯＶ３２ｂ  ＳＮＰデータ：
ＮＯＶ３２ｂは１変異体を有し、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の変異位置は配列番号：１２５および１２６によりそれぞれ番号付けられている。ＮＯＶ３２ｂ変異体のヌクレオチド配列は表５１Ｓに示す様に異なっている。
【表５９９】
2005528080.tif 000600
【１１４９】
ＮＯＶ３９ｂ  ＳＮＰデータ：
ＮＯＶ３９ｂは１変異体を有し、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の変異位置は配列番号：１４９および１５０によりそれぞれ番号付けられている。ＮＯＶ３９ｂ変異体のヌクレオチド配列は表５１Ｔに示す様に異なっている。
【表６００】
2005528080.tif 000601
【１１５０】
ＮＯＶ４２ａ  ＳＮＰデータ：
ＮＯＶ４２ａは１変異体を有し、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の変異位置は配列番号：１５５および１５６によりそれぞれ番号付けられている。ＮＯＶ４２ａ変異体のヌクレオチド配列は表５１Ｕに示す様に異なっている。
【表６０１】
2005528080.tif 000602
【１１５１】
ＮＯＶ４３ａ  ＳＮＰデータ：
ＮＯＶ４３ａは１変異体を有し、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の変異位置は配列番号：１５７および１５８によりそれぞれ番号付けられている。ＮＯＶ４３ａ変異体のヌクレオチド配列は表５１Ｖに示す様に異なっている。
【表６０２】
2005528080.tif 000603
【１１５２】
ＮＯＶ４４ａ  ＳＮＰデータ：
ＮＯＶ４４ａは１変異体を有し、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の変異位置は配列番号：１５９および１６０によりそれぞれ番号付けられている。ＮＯＶ４４ａ変異体のヌクレオチド配列は表５１Ｗに示す様に異なっている。
【表６０３】
2005528080.tif 000604
【１１５３】
ＮＯＶ４７ｄ  ＳＮＰデータ：
ＮＯＶ４７ｄは１変異体を有し、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の変異位置は配列番号：１８１および１８２によりそれぞれ番号付けられている。ＮＯＶ４７ｄ変異体のヌクレオチド配列は表５１Ｘに示す様に異なっている。
【表６０４】
2005528080.tif 000605
【１１５４】
ＮＯＶ４８ｃ  ＳＮＰデータ：
ＮＯＶ４８ｃは１変異体を有し、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の変異位置は配列番号：２０５および２０６によりそれぞれ番号付けられている。ＮＯＶ４８ｃ変異体のヌクレオチド配列は表５１Ｙに示す様に異なっている。
【表６０５】
2005528080.tif 000606
【１１５５】
ＮＯＶ５０ａ  ＳＮＰデータ：
ＮＯＶ５０ａは１変異体を有し、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の変異位置は配列番号：２１３および２１４によりそれぞれ番号付けられている。ＮＯＶ５０ａ変異体のヌクレオチド配列は表５１Ｚに示す様に異なっている。
【表６０６】
2005528080.tif 000607
【１１５６】
その他の実施形態
特定の実施形態が本明細書中で詳細に開示されているが、これは単に説明目的のための例としてなされたものであり、以下に添付の特許請求の範囲について限定しようとするものではない。特に、特許請求の範囲で定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく本発明に種々の置換、変更、および改変がなされ得ることを発明者らは考慮している。核酸出発物質、注目するクローン、またはライブラリーの種類の選択は、本明細書に記載の実施形態の知識を有する当業者であれば慣例の問題であると考えられる。その他の態様、利点、および改変は以下の特許請求の範囲内にあると考えられる。示した特許請求の範囲は本明細書で開示される発明を代表するものである。別の特許請求されていない発明も考慮される。出願人らは後の特許請求の範囲においてかかる発明を追求する権利を留保する。
【手続補正書】
【提出日】平成16年6月3日(2004.6.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2005528080000001.app
【国際調査報告】
2005528080.tif 000608
2005528080.tif 000609
2005528080.tif 000610
2005528080.tif 000611