(57)【要約】  本発明は、食餌（ｄｉａｒｙ）製品の形で供給されるカルシウム量の高い食餌の供給により、脂肪組織の低下を誘導する方法を提供する。なお、本発明の他の面では、カルシウムは炭酸カルシウム、ビタミンサプリメントのような食餌サプリメントの形で供給される。個体における［Ｃａ２＋］ｉのレベルを抑制する方法も提供されている。本発明は、脂質分解を刺激する方法、脂質生成を阻害する方法、および白色脂肪組織脱共役タンパク２（ＵＣＰ２）の発現を増加させる方法も提供する。本発明は、個体の中心温度を上昇させる方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ（１，２５−（ＯＨ）２−Ｄ）レセプターのアンタゴニストの投与を包含する個体における肥満を調節、減少、又は低下させる方法。
【請求項２】
前記アンタゴニストは、抗体を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アンタゴニストは、化学的化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記アンタゴニストは、１−，２５，ジヒドロキシビタミンＤである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ（１，２５−（ＯＨ）２−Ｄ）のアンタゴニストの投与を包含する、個体における肥満を調節、減少、又は低下させる方法。
【請求項６】
前記１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ（１，２５−（ＯＨ）２−Ｄ）のアンタゴニストが抗体である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ（１，２５−（ＯＨ）２−Ｄ）のアンタゴニストが化学的化合物である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記アンタゴニストは、１種類以上の可溶型の１，２５−（ＯＨ）２−Ｄのレセプターを含む請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
動物の体重の調節、特に体脂肪の調節はヒトおよび他の動物の健康および健康状態に非常に大きな影響を与える複雑な過程である。過剰の体重および／または過剰の体脂肪は、体重のやせた場合と比較して、冠状動脈疾患、発作および糖尿病を含む広い範囲の健康に関する問題と関係している。
【０００２】
アメリカ人全体の半分は太りすぎであると推定されている。アメリカ合衆国の中でも男性の２４％および女性の２７％は、軽度〜重度の肥満と定義されている。理想の体重基準を２０％超える個体は肥満とみなされる。肥満は、軽度（２０〜４０％基準を上回る）、中度（４１〜１００％基準を上回る）および重度（１００％より高い）に分類される。重度の肥満は比較的珍しく、肥満の個体全体の０．５％より少なく、人口全体の約０．１％である。
【０００３】
肥満はヒトだけの問題ではない。多くの動物もまた、肥満に関連した有害な結果を蒙っている。例えば、獣医学的治療を受けているネコのおよそ１０〜４０％は肥満であると報告されている。ネコの肥満に寄与する因子には、座りがちの生活スタイル、屋内へ閉じ込められた状態および去勢がある。肥満のネコは、変形性関節症、靭帯損傷、会陰の皮膚炎、糖尿病、心筋症および泌尿器系の症候群を含むある種の疾患に対してより大きなリスクを負っている。それゆえに、疾患のリスクを最小化するために健康的な体重を維持することが重要である（米国特許第６，０７１,５４４号を参照のこと）。
【０００４】
ヒトにおける肥満は、重度の肥満者に対する外科的手順（胃バイパス）から、軽度〜中程度の肥満者に対する食餌療法、行動の変更および投薬に到る様々な手段により、処置されている。中程度〜軽度の肥満の管理は、典型的には行動変更プログラムおよび、ある場合には予めパッケージされた食餌を提供する個人および商業的組織により行われている。医学界は、食餌処置が、医学的な管理の下で行われることを推奨している。
【０００５】
肥満に対する処置の範囲は、体重調節に関与する過程の複雑さおよびこれらの過程の現時点での理解の欠如を反映している。最近の報告は、ウイルスを肥満の潜在的原因因子として示している（Ｕ．Ｓ．Ｎｅｗｓ  ａｎｄ  Ｗｏｒｌｄ  Ｒｅｐｏｒｔ２０００年８月７日）。肥満への素因についての潜在的な遺伝的基礎の多くの報告もまた、存在する。Ｍｏｌｌらは、多くの集団で、肥満が少数の遺伝子座位により制御されているようであると報告している（Ｍｏｌｌら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．４９：１２４３（１９９１））。さらに、ヒトの双子の研究は、体重の制御における実質的な遺伝的な基本を強く示唆しており、推定およそ８０〜９０％の遺伝率である（Ｓｉｍｏｐｏｕｌｏｓ，Ａ．Ｐ．ａｎｄ  Ｃｈｉｌｄｓ，Ｂ．編，１９８９、「Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｏｂｅｓｉｔｙ」Ｗｏｒｌｄ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｎｄ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，６３，Ｓ．Ｋａｒｇｅｒ，Ｂａｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；Ｂｏｒｊｅｓｏｎ，Ｍ．，Ａｃｔａ．Ｐａｅｄｉａｔｒ．Ｓｃａｎｄ（１９７６）６５：２７９−２８７）。
【０００６】
肥満遺伝子産物である組換アグーチ（ａｇｏｕｔｉ）タンパク質は、様々な細胞でＣａ２＋の流入を刺激する。アグーチ（ａｇｏｕｔｉ）はまた、新規の脂質生成における重要な酵素である脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）の発現および活性を刺激し、Ｃａ２＋依存的な機構によって、ヒトおよびマウスの脂肪細胞における基底の、およびアンタゴニストに刺激された、脂肪分解を阻害する。これらの効果は、アグーチ（ａｇｏｕｔｉ）非存在下において、レセプターまたは電圧の仲介によるＣａ２＋チャネルの活性化のいずれかにより、模倣され得、そしてニフェジピンのようなＣａ２＋チャネルのアンタゴニストにより、阻害され得る。
【０００７】
最近のデータは、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ（１，２５−（ＯＨ）２−Ｄ）が、初代培養したヒトの脂肪細胞における有意かつ持続的な細胞内カルシウム濃度（［Ｃａ２＋］ｉ）の増加および対応する脂肪分解の阻害を引き起こすことを示した（Ｚｅｍｅｌら、ＦＡＳＥＢＪ．（２０００）１４：１１３２−１１３８）。食餌カルシウムの増加は、［Ｃａ２＋］ｉを抑制し、１，２５−（ＯＨ）２−Ｄを阻害し、そしてその後、脂肪分解の刺激および脂肪生成の阻害によって脂肪症を抑制する。これらの知見と一致して、ヒトにおける一日あたり４００ｍｇから１０００ｍｇへの食餌カルシウムの増加は、一年の過程にわたって、４．９ｋｇの体脂肪の減少をもたらす（Ｚｅｍｅｌら、ＦＡＳＥＢＪ．（２０００）１４：１１３２−１１３８）。食餌カルシウムはまた、食餌により誘導される脂肪症の発達を弱め、そして確立された肥満における体重の減少を促進し得る（Ｓｈｉ，Ｈ．ら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．（２０００）５５５．３（要約））。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
(発明の簡単な要旨)
本発明は、ヒトおよび他の動物における肥満を処置または、回避するための材料および方法を提供する。好都合なことに、本発明の材料および方法は、容易かつ効果的に、体重の減少を達成し、そして材料および／または体重の増加防止するために使われ得る。好ましい実施形態において、本発明の肥満制御による恩恵は、カルシウムが多い食餌を提供することにより、達成される。発明の一局面において、個体はカロリーを制限された食餌で維持される。
【０００９】
本発明の特定の実施形態において、カルシウムは乳製品の形態で供給される。本発明のなお別の局面では、カルシウムは、炭酸カルシウムまたはビタミンサプリメントのような食餌サプリメントの形で提供される。
【００１０】
本発明は、脂質分解を刺激する方法、脂質生成を阻害する方法、および白色脂肪組織脱共役タンパク質２（ＵＣＰ２）の発現を増加する方法も提供する。本発明は、肥満の診断方法、肥満を処置する方法および／または肥満をモニタリングする方法だけでなく、個体の中心温度を上昇させる方法も提供する。個体の［Ｃａ２＋］ｉのレベルを抑制する方法も提供する。
【００１１】
本発明はまた、体重増加を減少させる方法、および小児における脂肪症を減少させる方法を提供し、そして小児の食餌カルシウム消費量の増加によって小児の体重増加を制御する方法を提供する。
【００１２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ヒトおよび他の動物における肥満を処置するか、または、回避するための物質および方法を提供する。好都合なことに、本発明の物質および方法は、容易にならびに効率良く、体重の減少を達成する、および／または体重の増加を妨げるために用いられ得る。好ましい実施形態では、本発明の体重の利点は、カルシウム量の高い食餌を提供することにより達成される。
【００１３】
好ましい実施形態では、本発明は、カルシウムの摂取を増加することにより、ヒトまたは他の動物における脂肪組織の減少を誘導する方法を提供する。本発明の一つの局面では、カルシウムは、乳製品（例えば、牛乳、ヨーグルト、またはチーズ）の形態で提供される。本発明の別の局面では、カルシウムは、栄養サプリメント（例えば、炭酸カルシウムまたはビタミンサプリメント）の形態で提供される。本発明のさらに別の局面では、個体は、カロリーを制限された食餌を続けられる。
【００１４】
細胞内のカルシウム濃度（［Ｃａ２＋］ｉ）を減少させる方法、脂肪分解を刺激する方法、脂肪生成を阻害する方法、および白色脂肪組織脱共役タンパク２（ＵＣＰ２）の発現を増加させる方法もまた、提供される。本発明は、個体の中心温度を上昇させる方法（熱発生）もまた提供する。これらの方法はそれぞれ、個体により摂取されるカルシウムの量を増加させることにより、および、必要に応じて、個体のカロリー摂取を制限することにより実施される。
【００１５】
分娩後の女性において通常の体脂肪率を回復する、新規そして有利な方法もまた、提供される。そのような実施形態の一つでは、その方法は、最近子を産んだ個体を同定し、そしてその個体により消費される食餌性カルシウムの量を増加させることにより実施される。
【００１６】
初期の食餌療法の後の体重減少の反動を防止するか、または減少させる方法もまた、本発明により提供される。この方法は、以前の食餌の結果として体重を減少した個体を同定し、そしてその個体により消費される食餌性カルシウムの量を増加させることにより実施され得る。
【００１７】
個体により消費される食餌性カルシウムのレベルを増加させることにより、個体におけるカルシウム刺激（ｃａｌｃｉｔｒｏｐｈｉｃ）ホルモン（１，２５−（ＯＨ）２−Ｄ）のレベルを減少する方法もまた、提供される。
【００１８】
本発明は、小児により消費されるカルシウムの量を増加させることにより、小児における肥満のリスクを低減する方法もまた提供する。カルシウムの摂取は、例えば、乳製品または高レベルのカルシウムを含有する他の製品の小児による摂取を増加させることにより、達成され得る。
【００１９】
肥満を減少させる、軽減させる、または処置する方法も提供され、この方法は、治療的に効果的な量の１，２５−（ＯＨ）２−Ｄアンタゴニスト（例えば、食餌性カルシウム）の投与により、個体におけるカルシウム刺激ホルモン（１，２５−（ＯＨ）２−Ｄ）のレベルを低減させる工程を包含する。他の１，２５−（ＯＨ）２−Ｄアンタゴニストとしては、１，２５−（ＯＨ）２−Ｄ中和抗体；可溶性１，２５−（ＯＨ）２−Ｄレセプター；１，２５−（ＯＨ）２−Ｄレセプターを含む融合タンパク質（例えば、脂肪細胞を優先的に標的するＩｇ重鎖または部分に融合した可溶型の１，２５−（ＯＨ）２−Ｄレセプター；化学的化合物；およびカルシウムを含有する化合物（例えば、炭酸カルシウム）が挙げられる。
【００２０】
本発明はまた、治療的に効果的な量の１，２５−（ＯＨ）２−Ｄレセプターアンタゴニストの投与を包含する、個体における肥満を減少し、軽減させ、または処置する方法も提供する。そのようなアンタゴニストの例としては、レセプターのリガンド結合部位をブロックする抗体；レセプターアンタゴニストである化学的化合物；１，２５−（ＯＨ）２−Ｄレセプターに特異的に結合するが、レセプターの機能に拮抗する１，２５−（ＯＨ）２−Ｄの類似物、相同物、または異性体（例えば１，β，２５−ジヒドロキシビタミンＤ）が挙げられる。
【００２１】
本発明に従って個体に提供されるカルシウムは、例えば、乳製品（例えば、牛乳、脱脂粉乳、ヨーグルト、チーズ、カテージチーズ、アイスクリームまたはフローズンヨーグルト）、栄養サプリメント（例えば、カルシウム強化ビタミンおよびカルシウムを補填した液体）、カルシウムを補填した食糧、または、カルシウム量の多い他の食糧（例えば、サケ、豆、豆腐、ホウレンソウ、カブの葉、ケール、ブロッコリ、ワッフル、パンケーキ、またはピザ）の形を取り得る。
【００２２】
好ましい実施形態では、治療的に効果のある量の食餌性カルシウムが個体に提供される。食餌性カルシウムの治療的に効果のある量は、体重減少の誘導、体重増加の防止、および／または哺乳類における代謝による脂肪組織の消費の増加に十分なカルシウムの量である。
【００２３】
１，２５−（ＯＨ）２−Ｄレセプターを含む融合タンパク質は、当該分野において、公知の方法に従って作製され得る。融合タンパク質の典型的な例は、Ｃａｐｏｎらの教示に従ってＩｇ重鎖に融合した可溶型の１，２５−（ＯＨ）２−Ｄレセプターを含む（米国特許第５，５６５，３３７５号および５，３３６，６０３号、これにより、それら全体が参照として援用される）。他の実施形態では、少なくとも一つの１，２５−（ＯＨ）２−Ｄレセプター（Ｎｅｍｅｒｅら，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．（１９９８）１３：１３５３−５９；Ｆｌｅｅｔら，Ｎｕｔｒ．Ｒｅｖ．（１９９９）５７：６０−６４）が、例えばアシル化刺激タンパク質（ＡＳＰ）（Ｋａｌａｎｔら，Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｍｅｄ．（１９９５）１８（Ｓｕｐｐ．Ｂ：Ｂ１０）；Ｍａｓｌｏｗｓｋａら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｂｅｓｉｔｙ（１９９８）２２：Ｓ１０８；Ｍａｓｌｏｗｓｋａら，Ａｃｙｌａｔｉｏｎ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＳＰ）：Ｒｏｌｅ  ｉｎ  Ａｄｉｐｏｓｅ  Ｔｉｓｓｕｅ，ｉｎ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｏｂｅｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅｒｃｈ：８，（１９９９）,編.Ｂ．Ｇｕｔ−Ｇｒａｎｄ  ａｎｄ  Ｇ．Ａｉｌｈａｕｄ，Ｊｏｈｎ  Ｌｉｂｂｅｙ  ＆  Ｃｏ．）を用いて優先的に脂肪細胞に向けられるリポソームに組み入れられる。他の実施形態では、可溶型の１，２５−（ＯＨ）２−Ｄレセプターが、ＡＳＰのような脂肪細胞標的薬剤と結合され得る。可溶型の１，２５−（ＯＨ）２−Ｄレセプターは、当該分野において公知の方法に従ってビタミンＤレセプターの膜結合型から生成され得る。１つ以上の可溶型の１，２５−（ＯＨ）２−Ｄレセプターの、１つ以上の脂肪細胞標的薬剤への結合は、組換えにより、または、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）により販売されているような化学的架橋化合物を用いて、成し遂げられ得る。
【００２４】
「個体」という用語は、鳥類、哺乳類、爬虫類起源の動物を含む。開示した方法から恩恵を受ける哺乳類の種は、類人猿、チンパンジー、オランウータン、ヒト、サル；イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ベトナムだるまブタ（Ｖｉｅｔｎａｍｅｓｅ  ｐｏｔ−ｂｅｌｌｉｅｄ  ｐｉｇｓ）、ウサギ、フェレットのような飼育動物（ペット）；ウシ、バッファロー、バイソン、ウマ、ロバ、ブタ、ヒツジ、およびヤギのような飼育家畜；クマ、ライオン、トラ、ヒョウ、ゾウ、カバ、サイ、キリン、レイヨウ、ナマケモノ、ガゼル、シマウマ、ヌー、プレーリードッグ、コアラ、カンガルー、オポッサム、アライグマ、パンダ、ジャイアントパンダ、ハイエナ、アザラシ、トドおよびゾウアザラシのような典型的には動物園で見られるような外国産の動物を含み、およびそれらに限られない。爬虫類は、ワニ（ａｌｌｉｇａｔｏｒ）、ワニ（ｃｒｏｃｏｄｉｌｅ）、ウミガメ、淡水性のカメ、ヘビ、イグアナ、および／または他のトカゲ類を含み、およびそれらに限られない。鳥類の種は、ニワトリ、シチメンチョウ、ハト、ウズラ、オウム、コンゴウインコ、ハト、ギニアメンドリ、ボタンインコ、小型のインコ、フラミンゴ、ワシ、タカ、ハヤブサ、コンドル、ダチョウ、クジャク、アヒルおよびハクチョウを含み、およびそれらに限られない。
【００２５】
上で述べた方法の各々は、さらに個体のカロリー摂取を制限する工程を包含する。さらに、高レベルのカルシウムを含む食餌が、食餌計画に基づいて個体に提供され得る。食餌は、通常のもしくは計画された基準に基づいてまたは個体の要求に基づいて、個体に提供される。
【００２６】
本発明の方法はさらに、個体の食餌の摂取の分析を包含し得る。この分析は、食餌の摂取に関する質問票に、または個体により完了した食餌記録票に記録されたものとして、個体により消費された食物の分析により成し遂げられ得る。記録票または質問票は、電子的な形態または紙の形態であり得る。
【００２７】
食餌の摂取情報は、ヒトに個々の質問をすることによりあるいはインターネットを通して得られ得る。本発明のこの局面では、食餌習慣および／または食物消費に関する質問が個人に与えられ得る。質問は、インターネットにより伝送され得る。あるいは、書式または食餌記録票が、インターネットにより消費者に伝送され得る。発明のいずれの局面でも、個体により記録された情報は、インターネットを使用してウェブサイトに返信され得る。食餌の摂取は、インターネットを通して個体から情報を受けるコンピューターにより分析され得る。
【００２８】
個体の食餌の摂取の分析は、個体による食物消費に関連したデータの入力の後、コンピューターにより行われる。個体により消費された食物、ならびにその量が、食物の栄養価を含む、データベースと比較され、そして個体の食餌の栄養組成が提供される。個体により摂取された食物の栄養組成の分析の後、個体により消費されたカルシウムの量が提供される。個体により消費されたカルシウムの量の増加、ならびに、食餌性カルシウム源に関する推奨は、体重減少を最も効果的にする、または誘導することが見出されたカルシウム量と消費したカルシウム量を比較するデータベースから提供される。
【００２９】
いくつかの例では、個体のカロリーの摂取は調整され得ず、カロリーの摂取は適宜に行われ得る。他の例では、食餌プランの一部として個体のカロリー摂取を減少させることが望ましいとされ得る。１つの実施形態では、個体のカロリー摂取の範囲は、性別を基礎としている。カロリー摂取は、一日あたり約２００〜約２５００ｋｃａｌの範囲であり得る。好ましい実施形態では、カロリー摂取量の範囲は、一日あたりおよそ３００〜２４００ｋｃａｌで、好ましくは一日あたり５００〜２２００ｋｃａｌで、より好ましくは一日あたり７００〜２０００ｋｃａｌで、さらに好ましくは一日あたり９００〜１７００ｋｃａｌで、最も好ましくは一日あたり１１００〜１５００ｋｃａｌである。
【００３０】
個体の体重をキログラム（ｋｇ）単位で得、この値をメーター単位で表した個体の身長で割ることにより、体重の身長に対する比が計算され得る。あるいは、個体の体重の身長に対する比は、ポンド（ｌｂｓ）で表した個体の体重に７０３を掛け、この値を個体の身長（インチ(ｉｎ）単位で）の平方で割ることにより得られ得る。これらの割合は、代表的にはＢＭＩと呼ばれる。したがって、ＢＭＩ＝ｋｇ／ｍ２またはＢＭＩ＝（ｌｂｓ．×７０３）／（ｉｎ）２である。
【００３１】
肥満の測定値としてＢＭＩを使用する場合には、ＢＭＩの値が２５．０から２９．９の間にある場合には個体は過体重とみなされる。ＢＭＩの値が３０．０より大きいまたは３０．０と等しい時、肥満と定義される。世界保健機構はＢＭＩの値を次のように割り当てている：２５．０〜２９．９、グレードＩの肥満（中程度の過体重）；３０〜３９．９、グレードＩＩの肥満（重度の過体重）；および４０．０またはそれより高い、グレードＩＩＩの肥満（巨大な／病的な肥満）。体重表を用いて、肥満は軽度（２０〜４０％過体重）、中程度（４１〜１００％過体重）および重度（１００％より高い）過体重として分類されている。理想の体重指標を２０％上回る個体は肥満とみなされる。理想体重を１〜１９．９％超える個体は太りすぎと分類される。
【００３２】
標準体重、または、必要に応じて、体重の身長に対する標準の比を維持する恩恵に関する情報、カルシウムを高濃度で含む食餌計画、および高カルシウム食餌の恩恵を開示する印刷物は、必要に応じて、電子的形態または印刷された形態で提供され得、そしてデータベースに保存され得る。
【００３３】
本発明のさらなる局面は、カルシウムを製品に提供することにより、良い健康状態を促進する方法であって、ここでその製品の提供が、肥満の制御に対するカルシウムの消費の恩恵に関する情報を伴う、方法を提供する。提供されるカルシウム含有製品は、例えば、シリアル、牛乳および他の乳製品、野菜、ならびにもともとカルシウムの多いまたはカルシウムを強化した他の食品のような、食餌製品であり得る。カルシウムを有する製品はまた、例えば、錠剤または液体のような形の食餌サプリメントでもあり得る。
【００３４】
肥満の制御に関して、カルシウムの消費の恩恵に関する情報は、代表的には、例えば、カルシウムの消費が体重の減少および／または体重増加の防止に関係しているという、文書による説明または口頭による説明を含む。この情報は、カルシウム含有製品の潜在的な購入者および／または使用者が、カルシウムを有する製品の消費が、体重の減少を引き起こすか、または体重増加を低減させるということ、および製品の使用による体重減少、または体重増加の低減が、少なくとも一部は、製品に存在するカルシウムに直接的に起因することを理解できるように、そのような仕方で提示される。
【００３５】
本発明に従って、カルシウムを含む製品の肥満のコントロールによる恩恵に関する情報は、直接製品に添付し得る。従って、情報は例えば、シリアルの箱、牛乳の容器、チーズのパッケージ、またはアイスクリームの箱に印刷され得る。情報は、また、例えば新聞、雑誌、ダイレクトメール、ラジオ、テレビ、インターネット、および屋外広告を含む幅広い伝達ルートを通しても配布され得る。他の配布通路は、言葉による伝達、パンフレットの配布、印刷媒体、オーディオテープ、磁気媒体、デジタル媒体、視聴覚媒体、広告、電子メール、点字、電子媒体、バナー広告（インターネットバナー広告および飛行機が曳航する垂幕）、ファイバーオプティクス、およびレーザー光によるショーを含む。好ましい実施形態は、そのようにして配布された、体重減少に関するカルシウムの恩恵についての情報は、カルシウムによる肥満コントロールの恩恵を受けるために摂取され得るカルシウムを含む特定の製品を同定する。特定の製品は例えば、商標により同定され得る。
【００３６】
好ましい実施形態において、肥満をコントロールするカルシウムの恩恵は特定のカルシウム含有製品の供給者により、伝達される。この供給者は例えば、製品の商標の所有者であり得る。カルシウムの肥満のコントロールの恩恵に関する情報もまた、カルシウムを含む一般的な種類の製品の恩恵をも表し得る。このように、この情報は例えば、カルシウムを含む乳製品の肥満をコントロールする恩恵を表し得る。この情報は、例えば同業組合により、配布されてもよい。同様に、この情報は、カルシウムを含む食餌サプリメントの肥満をコントロールする恩恵を描いても良い。
【００３７】
本発明に従って供給される、肥満をコントロールする情報は、カルシウムに起因し得るか、またはカルシウムを含む製品の他の成分に起因し得る、他の健康に関する恩恵に関連した情報を伴ってか、または伴わずに提供され得る。このように、肥満をコントロールする情報は、骨粗鬆症に関するカルシウムの恩恵に関する情報をつけ加えてもよい。
【００３８】
特定の例において、カルシウムの肥満をコントロールする恩恵についての情報は、カルシウムを含む製品またはある種類の製品の販売において経済的興味を有する商業実体により実施される。これはまた、例えば、特定の患者に、特定の製品の商標に言及することなく、カルシウム量の高い食餌についての医学的な助言を提供する医師には特有のものではない。これはまた、カルシウムの肥満コントロールに関する恩恵を評価する調査を記載する科学論文を典型的に含むものでもない。
【００３９】
本発明はまた、脂肪組織の代謝による消費を刺激するのに役立つ製造の記事も提供する。そのような製造の記事は、典型的には、食料品と、高カルシウムの肥満をコントロールする利点を明らかにする印刷物とを含む。本発明の一局面において、印刷物は、パンフレット、パッケージに差しはさんだもの、または、パッケージの一部としての形でもよい。本発明の他の局面においては、情報は食料品に浮出しされても、または印刷してもよい。そのようにして供給された情報としては、食料品中に含まれるカルシウムの量、脂肪組織の代謝による減少に必要な、推奨カルシウム摂取レベル、推奨ＢＭＩ値、または個体の推奨身長および体重が挙げられ得る。食料品は、固体でもまたは液体でもよい。本発明の一局面において、増加したカルシウムレベルが、肥満の処置のための、または脂肪組織の代謝による消費の刺激のための食餌サプリメントとして供給される。本発明のこの局面では、液体は、その液体に含まれるカルシウムの量を示すために、色で記号化されていてもよい。例としては、そこに含まれるカルシウム量を示すために、食品着色添加剤が液体に入れられる。緑色の液体は、一回当たり１００ｍｇのカルシウムを含み得、黄色の液体は一回当たり２００ｍｇのカルシウムを含み得、および赤紫色の液体は一回当たり５００ｍｇのカルシウムを含み得る。
【実施例】
【００４０】
（実施例１−食餌カルシウムによる肥満の調節）
（材料および方法）
（ヒト脂肪細胞の単離および培養）
ヒト皮下脂肪組織を、腹部の形成外科治療を受けた代謝障害の履歴のない患者から得た。脂肪細胞を、前に記載したように、洗浄し、切り刻み、コラーゲナーゼ消化し、およびろ過することにより、単離し、１％のウシ胎仔血清、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）およびゲンタマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地で培養した。細胞を、懸濁液の中で培養し、毎日取り替えられる培養培地の表面で薄い層の形で維持した。細胞を、単離の約７２時間後に研究し、研究の前に血清を欠乏させた。
【００４１】
（動物および食餌）
インビボでの肥満の調節における食餌カルシウムの役割を評価するために、ａＰ２プロモーターの制御下でアグーチ（ａｇｏｕｔｉ）を特に脂肪細胞で発現するトランスジェニックマウスを研究した。これらの動物は、ヒトで見られるものと類似した普通のレプチンの発現パターンおよび活性を示し、ヒトのアグーチ（ａｇｏｕｔｉ）発現パターン（脂肪細胞特異的な）を示す。これらのマウスは、標準的ＡＩＮ−９３Ｇ食餌で肥満しないが、インスリンの投与または高ショ糖食餌のいずれかにより誘導される高インスリン血症に応答して肥満になるという点で、食餌により誘導される肥満の有用なモデルである。本発明者らの集団のオスのａＰ２−アグーチ（ａｇｏｕｔｉ）トランスジェニック動物に、６週齢にて、最適に満たないカルシウム（０．４％）、単一炭水化物源としてのショ糖、および豚脂でエネルギーの２５％まで増加した脂肪を含む、改変型ＡＩＮ９３−Ｇ食餌を与えた。それらを次のような４つのグループに無作為化した。基本となるグループは何の改変もせずに、この食餌を継続した。高カルシウムグループには、食餌によるカルシウムを３倍の１．２％まで増加するために、炭酸カルシウムを補填した基本食餌を与えた。中乳製品食餌は、タンパク質の２５％が脱脂粉乳に置き換えられ、食餌によるカルシウムは１．２％に増加した。および高乳製品グループは５０％のタンパク質が脱脂粉乳に置き換えられ、カルシウムは２．４％に増加した。食料の摂取および排出を毎日測定し、動物は週に一度体重を量る。６週間の給餌期間の結果、動物をイソフルランによる麻酔下で、しゃ血により殺し、グルコースおよびインシュリンの測定のために心臓穿刺を介して、血液を集めた。脂肪パッド（精巣上体の、腎周の、腹部の、肩甲下の）を解剖し、ただちに重量を量り、液体窒素で凍結させ、−８０℃で保存する。脂肪酸合成酵素の活性およびｍＲＮＡのレベルを腹部の脂肪で測定した。
【００４２】
（中心温度）
中心温度と、良好なエネルギーから体重への転換効率におけるなんらかの減少が増加した熱発生を伴っているかどうかを決定するための間接的な、代謝指標として用いた。温度は、熱電対（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、  Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、  ＯＨ）により測定した。プローブは、それぞれの動物の直腸に一定の長さ（１．８ｃｍ）で挿入した。安定化（１０秒）後、温度を５秒毎に３０秒間記録した。全ての温度測定は午前８時から９時の間に行った。
【００４３】
（細胞内カルシウム（ヒト脂肪細胞））
細胞内Ｃａ２＋を、前述のように蛍光測定により測定した。細胞をフラ−２−アセトキシメチルエステル（１０μＭ）を入れたＨＥＰＥＳ緩衝塩溶液で、暗黒下で連続的に振とうしながら３７℃で４５分間洗浄した。その後、細胞を３回すすぎ、再懸濁し、細胞内Ｃａ２＋を、二重励起（３４０ｎｍおよび３８０ｎｍ）／単一放射（５１０ｎｍ）蛍光光度法を用いて測定した。安定したベースラインの確立後、１，２５−（ＯＨ）２−Ｄまたは副甲状腺ホルモン（１０ｐＭ〜１００ｎＭ）またはそれぞれのビヒクルに対する応答を測定した。ディジトニン（２５μＭ）およびＴｒｉｓ／ＥＧＴＡ（１００ｍＭ、ｐＨ８．７）を、最終的な細胞内Ｃａ２＋を計算するための較正のために用いた。
【００４４】
（脂肪分解）
脂肪細胞をフォルスコリン（１μＭ）の存在下または非存在下で、４時間インキュベートした。培養培地へのグリセロール放出を、脂肪分解を評価するために測定した。グリセロール放出データを細胞タンパク質量について標準化した。
【００４５】
（脂肪酸合成酵素活性およびｍＲＮＡレベル）
死後ただちに、脂肪細胞を単離し、脂肪酸合成酵素活性を、ＮＡＤＰＨの酸化速度を測定することにより、細胞質ゾル抽出物中で測定した。酵素活性を、クマシーブルー色素を用いてタンパク質補正した。
【００４６】
全ＲＮＡを塩化セシウム密度勾配、電気泳動し、抽出し、ノーザンブロット分析に供し、標準的方法を使用して、マウス脂肪酸合成酵素に対する放射標識ｃＤＮＡプローブを用いてハイブリダイズした。オートラジオグラフを濃度測定することにより定量化し、全てのブロットをストリッピングし、ローディングコントロールとしてβ−アクチンを用いて再プロービングした。
【００４７】
（統計分析（インビトロデータおよび動物データ））
全てのデータは平均値±標準偏差として表している。データは、実施した比較の数に依存して、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）またはｔ検定により統計的有意性を評価した。複数の比較を含むすべてのデータセットを、ＡＮＯＶＡにより分析し、その後、ＳＰＳＳ−ＰＣ（Ｖ．８．０）用いた最小有意差を検査することにより、いちじるしく異なるグループの平均値を分離した。
【００４８】
（ＮＨＡＮＥＳＩＩＩによる分析）
集団レベルで体の組成を調節することにおける、食餌カルシウムの役割を規定するのに、動物の観察が関連しているかどうか決めるために、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｓｕｒｖｅｙ（ＮＨＡＮＥＳＩＩＩ）のデータのセットの分析を行った。この大きなクロスセクション調査は１９８８年から１９９４年の間行われた。その後、２ヶ月齢を超えるアメリカ合衆国の制度化していない一般市民集団構成を示すように設計された複雑な４段階確率サンプリングスキームが行われた。その研究（インタビュー、健康診断、および研究所の試験）の３つの局面全てを完了した成人のみが、このデータ分析に含まれた。完全で使用できる身体の組成データ／人体計測データを提供できない場合（例えば、切断患者およびギプスをした個体）、インシュリンを使用した場合、または妊娠している場合、最近妊娠した場合、あるいは最近授乳中である場合、回答者はこの分析から除外した。身体の組成は、Ｓｅｇａｌに由来する回帰分析を用いて計算した体脂肪率を伴う身体検査の間に集めた人体測定データおよび生物電気インピーダンスデータを用いて評価した。
【００４９】
体脂肪率のオッズ比および９５％の信頼区間を、ＳＵＤＡＡＮ（Ｓｈａｈら、ＳＵＤＡＡＮ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ，Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０（１９９６））を用いたＲｏｕｓｔの分散推定法を用いて多重ロジスティック回帰分析により推定した。全てのパラメーターに対する点推定値を、それぞれの集団分布を反映して加重値を与えた。分散は、複雑なサンプリング設計を考慮するためにＳＵＤＡＡＮを用いて計算した。分析は、男性と女性とで分けて行い、全てのオッズ比を、年齢をこの継続変数として含めることにより、年齢について調節した。このモデルに含めた他の共分散は、カロリー摂取、人種／民族、および活動レベルである。調査サンプルの特徴は表１および２に示す。
【００５０】
【表１】
2005513058.tif 000002
【００５１】
【表２】
2005513058.tif 000003
（結果）
図１は１，２５−（ＯＨ）２−Ｄおよび副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）の両方がヒト脂肪細胞の初期培養において、明らかな、持続的な細胞内Ｃａ２＋の増加（Ｐ＜０．００１：１，２５−（ＯＨ）２−Ｄに対してＥＣ５０〜５０ｐＭおよびＰＴＨに対して１０ｎＭ）を刺激することを示す。１，２５−（ＯＨ）２−Ｄ処理はまた、ヒト脂肪細胞におけるフォルスコリンによって刺激された脂肪分解に対する著しい阻害（８３％）をもたらす（Ｐ＜０．００１）（図２）。ＰＴＨ処理は、結果としてアデニルシクラーゼの活性化をともなって起こる可能性の高い、細胞内Ｃａ２＋の反応の刺激にもかかわらず、脂肪分解に対して小さな効果しかもたらさない（データは示していない）。
【００５２】
高脂肪／高ショ糖の基本食餌で処理したａＰ２トランスジェニック−アグーチ（ａｇｏｕｔｉ）マウスは２４％体重が増加し、高カルシウムによるもの、および中程度の食餌によるものはそれぞれ２６％および２９％体重が減少した（Ｐ＜０．０４）。そして、乳製品の多い食餌によるものはさらに３９％体重が減少した（Ｐ＜０．０４；図３）。これらの違いは食物の摂取におけるどのような違いもないにも関わらず、生じる。間接的な代謝の指標である中心温度の測定は、３つ全ての高カルシウムグループの食餌に応答して中心温度がおよそ０．５℃増加した（Ｐ＜０．０３；図４）というこれらの観察結果を反映している。食物の摂取における違いがないことと結びついた、この増加は、エネルギーの貯蔵から熱発生へのエネルギーの代謝効率における変化を示している。
【００５３】
エネルギーの代謝における変化は、栄養分およびホルモンによる調節に高い感受性を示す、新規の脂質生成における重要な酵素である、脂肪酸合成酵素の研究で明らかになった。基本の食餌は脂肪酸合成酵素活性の２．６倍の増加を引き起こした。そしてこの効果は３つ全ての高カルシウム食餌により、かなり弱められる（Ｐ＜０．００２；図５Ａ）。食餌は脂肪細胞脂肪酸合成ｍＲＮＡにおける、それに対応した減少、そして高カルシウム食餌では２７％の減少、および乳製品が中程度および高い食餌では５１％の減少を引き起こす（Ｐ＜０．０１；図５Ｂ）。脂肪細胞における脂肪分解は、脂肪酸合成酵素の反応と逆の様式で、食餌の処理に反応している。基本の食餌は脂質分解の著しい抑制（６７％）（Ｐ＜０．０００１）を引き起こした。；しかしながら、脂質分解は高カルシウムの食餌により３から５．２倍刺激され、高カルシウムの食餌による効果に比べて乳製品の多い食餌による効果はより大きかった（Ｐ＜０．０１５；図５Ｃ）。食餌処理した６週間後の脂肪体の評価はこれらの発見に対するさらなる支持を提供する。表３は３つの高カルシウムの食餌全てが精巣上体、腹部、腎周および肩甲下の脂肪組織区画の塊における３６％の減少を引き起こした（Ｐ＜０．００１）ことを示す。精巣上体および肩甲下の脂肪体は３つの食餌全てによりおよそ５０％減少し、一方、腹部の脂肪体は高濃度のカルシウムの食餌より、乳製品が中程度および高い食餌ではより大きな減少を示した（Ｐ＜０．００１；表３）。
【００５４】
【表３】
2005513058.tif 000004
血漿のブドウ糖およびインスリンの連続した測定は、基本となる高脂肪／高ショ糖／低カルシウムの食餌の糖尿病誘発効果を示し、空腹時のショ糖の９８±１０から１３０±１１ｍｇ／ｄｌ（Ｐ＜０．０２）の増加、およびそれに対応した高インスリン血症の補償効果を伴った。これらの増加は、高カルシウムおよび中程度の乳製品の食餌により弱められ、高乳製品の食餌により妨げられた（図６）。
【００５５】
表４はＮＨＡＮＥＳＩＩＩのデータ分析を要約している。エネルギー吸収、運動量、年齢、人種および民族を制御した後、成人女性における、体脂肪が最も高い４分の１のヒトの見込みの割合は、第１のカルシウムの摂取について１．００から著しく減少し、２番目、３番目および４番目のグループはそれぞれ０．７５、０．４０および０．１６まで減少した（複合的なＲ２＝０．２０；Ｐ＝０．０００９）。同様に、男性の回帰モデルは、カルシウム摂取および乳製品と体脂肪との間で逆の関係を示したが、（複合的なＲ２＝０．４０；Ｐ＝０．０００６）カルシウムを摂取する４分の１のグループの相対的なリスク（見込みの割合）における比較的用量依存的な減少は、モデルからは明らかではなかった。
【００５６】
【表４】
2005513058.tif 000005
（実施例２−脂肪細胞の細胞外カルシウム、脂質代謝および体重ならびに脂肪減少に対する食餌によるカルシウムの効果）
（試料と方法）
（動物と食餌）
ａＰ２−アグーチトランスジェニック（ａＰ２−Ａ）マウスをこの研究における動物モデルとして使用した。これらの動物の特性は以前に記述されている（Ｍｙｎａｔｔら（１９９７））。これらのトランスジェニックマウスは脂肪細胞特異的なヒトのアグーチ（ａｇｏｕｔｉ）発現パターンに類似して、ａＰ２プロモーターの制御下で脂肪組織において特異的に正常のアグーチ（ａｇｏｕｔｉ）タンパク質を発現する（Ｍｙｎａｔｔら（１９９７））。これらのマウスは、標準のＡＩＮ９３−Ｇ食餌により肥満にならないが、外因性のインスリン投与（Ｍｙｎａｔｔら（１９９７））あるいは高ショ糖食餌（Ｚｅｍｅｌら（１９９９））のいずれかにより誘導される高インスリン血症に反応して肥満になるので、食餌により誘導される肥満の研究のためのモデル動物として有用である。
【００５７】
この研究を２つの６週のステージに分けた。最初のステージでは、６０匹の６週令のオスのａＰ２マウスを、ほぼ最適量のカルシウム（０．４％）、唯一の炭水化物源としてショ糖、および脂肪をエネルギーの２５％まで増加させるために豚脂を加えた、改変したＡＩＮ  ９３−Ｇ食餌上に置いた。この低濃度のカルシウム／高脂肪／高ショ糖の食餌に誘導される、これらの動物における肥満を評価するために、本発明者らは５日毎に体重をモニタリングし、および８匹の代表的なマウスを最初の６週の基本的な食餌の投与の後、脂肪体の測定および脂肪細胞の［Ｃａ２＋］ｉの測定のために安楽死させた。第２の６週のステージでは食餌による肥満を示す、残りのマウスをランダムに５つのグループに割り当てた。１つのグループは適宜に、改変を行わない同じ低カルシウム（０．４％）の食餌を継続し、他の４つのグループは以下のようにエネルギーを制限（適宜に７０％）して維持した。基本的な制限をした群のマウスをＫｃａｌ制限した低カルシウム（０．４％）の基本的な食餌上に置いた。高カルシウムの、エネルギーを制限したグループには、カルシウムを１．２％に増加して補充した基本食を与えた。中程度の食餌および高栄養の食餌と名付けた２つのさらなるグループは、２５または５０％のいずれかのタンパク質を脱脂粉乳で置き換え、食餌全体のカルシウム量をそれぞれ１．２または２．４％に増加することにより、改変した基本的な食餌を与えられた。食餌は毎日与えられ、そして体重は５日毎にチェックした。２番目のステージの終わりに全てのマウスをビュータネイシア（ｂｅｕｔｈａｎａｓｉａ）（フェニトインを添加し、濃縮したペントバルビタール）を用いて安楽死させ、およびインスリンおよびブドウ糖の測定のために心臓に穴を開けることによって血液を得た。脂肪体（精巣上体、腎周、腹部、および肩甲下）を切除し、ただちに重量を測定し、液体窒素中で凍結し、その後−８０℃で保管した。脂肪酸合成酵素活性およびｍＲＮＡの量は腹部の脂肪で測定した。
【００５８】
（中心温度）
中心温度を間接的な代謝の指標として用いて、食餌によるカルシウムが、エネルギーの消費に大きく寄与している熱発生の増加に関連したエネルギー代謝を調節するか否かを決定した。温度は熱電対（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、  Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、Ｏｈｉｏ）により毎週測定した（Ｋｉｍら（１９９６））。プローブをそれぞれのマウスの直腸に一定の長さ（１．８ｃｍ）で挿入した。安定化（１０秒）後、温度を５秒毎に３０秒間記録した。全ての中心温度測定を午前８時から９時の間に行った。
【００５９】
（マウスの脂肪細胞内のＣａ２＋［Ｃａ２＋］ｉの測定）
単離したマウスの脂肪細胞をマウスの腹部の脂肪の塊から、以前記載された方法（Ｓｈｉら（１９９９））を少し修正して、調整した。簡潔に言えば、脂肪組織はまずＨａｎｋ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを用いて数回洗浄し、小さな断片に刻み、そして０．８ｍｇ／ｍｌのＩ型コラゲナーゼで、３７℃のウォーターバスで３０分間振とうし、分解する。次いで、脂肪細胞を滅菌した５００μｍのナイロンメッシュでろ過し、１％の胎児のウシ血清を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）で培養した。細胞は懸濁液で培養し、細胞の回収のために２時間培養培地の上にある薄い層で維持した。
【００６０】
単離されたマウスの脂肪細胞中の［Ｃａ２＋］ｉを、フラ−２による２つの波長の蛍光画像化システムを用いて測定した。［Ｃａ２＋］ｉの測定の前に、脂肪細胞を、血清を含まない培地で２時間、前培養し、以下の成分（ｍｍｏｌ／Ｌ）を含むＨｅｐｅｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）でリンスした。：ＮａＣｌ  １３８，  Ｃａｃｌ２１．８  ＭｇＳＯ４  ０．８，  ＮａＨ２ＰＯ４  ０．９，  ＮａＨＣＯ３  ４，  ブドウ糖５，  グルタミン６，  Ｈｅｐｅｓ２０，およびウシ血清アルブミン１％。脂肪細胞を５％のＣＯ２を含む暗黒下のインキュベーター中で、フラ−２−アセトキシメチルエステル（ＡＭ）（１０μＭ）を入れた同じバッファーに３７℃で１時間ロードした。細胞外の色素を取り除くために、脂肪細胞をＨＢＳＳで３回リンスし、次いで、細胞質のフラ−２ＡＭを完全に加水分解するために、室温でさらに３０分、後培養した。脂肪細胞の薄い層をカバーガラス（Ｐ３５Ｇ−０−１４−Ｃ、ＭａｔＴｅｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を有する３５ｍｍの皿に置いた。色素をロードした細胞を伴った容器をＣｏｈｕ  ４９１５  ＣＣＤカメラのついたＮｉｋｏｎ  ＴＭＳ−Ｆ逆（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）蛍光顕微鏡のステージに取り付けた。蛍光画像を５２０ｎＭの波長の放射を有する３４０ｎＭおよび３８０ｎＭの励起波長で交互に捕捉した。［Ｃａ２＋］ｉを前述の比率の計算式を用いて計算した（Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚら（１９８５））。
【００６１】
（脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）の活性のアッセイ）
ＦＡＳ活性を以前に記載のように、マウスの脂肪組織の、粗細胞質ゾル抽出物において分光光度計により決定した（Ｊｏｎｅｓら（１９９７））。マウスの腹部の脂肪体を１ｍｍｏｌ／Ｌのエチレンジアミン四酢酸、１ｍｍｏｌ／Ｌのジチオスレイトール（ＤＴＴ）および１００μｍｏｌ／Ｌのフェニルメチルスルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ）（ｐＨ７．４）を含む、２５０ｍｍｏｌ／Ｌのショ糖溶液中でホモジナイズされる。ホモジネートを、１８，５００ｇで１時間遠心分離し、沈殿をＮＡＤＰＨの酸化割合を測定するのに用いた。
【００６２】
（脂肪分解のアッセイ）
マウスを屠殺後、マウスの腎周の脂肪組織をただちに切除し、４時間インキュベートした。培養培地に放出されたグリセロールを以前に記載のように（Ｂｏｏｂｉｓら（１９８３）)、脂質分解の指標として、前述の工程の酵素による蛍光光度法を用いて決定した。
【００６３】
（ノーザンブロット解析）
ノーザンブロット解析を記載のように（Ｓｈｉら（１９９９））行った。マウスの腹部脂肪組織から得た総ＲＮＡを、ＣｓＣｌ２の濃度勾配による遠心分離を用いて抽出し、１％アガロースゲルで電気泳動し、ナイロンメンブレン（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）に移した。メンブレンを、ランダムプライマー法を用いて放射標識した脱共役タンパク質２（ＵＣＰ２）またはＦＡＳ  ｃＤＮＡプローブでハイブリダイズした。結合しなかったプローブを室温で２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで３０分間、および５５℃で０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで４５分間、膜をリンスすることで除去した。最終的に、膜は−８０℃でＸ線フィルム（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）に感光した。全ての膜をはがし、ロードコントロールとしてのβ−アクチンで再プローブした。
【００６４】
（統計的解析）
全てのデータは平均±標準偏差として表し、統計的有意性についてはＳＰＳＳ（ＳＰＳＳＩｎｃ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）を用いて分散分析（ＡＮＯＶＡ）により評価する。ｐ値＜０．０５は有意であると考えられる。
【００６５】
（結果）
ａＰ２−アグーチ（ａｇｏｕｔｉ）トランスジェニック（ａＰ２−ａ）マウスにおける食餌に誘導される肥満の動物モデルを確立するために、マウスを低カルシウム（０．４％）／高脂肪／高ショ糖の食餌下に６週間置いた。ａＰ２−ａマウスへのこの食餌の投与は、脂肪細胞における［Ｃａ２＋］ｉの２倍の増加（１２８±１８対２６７±１５ｎＭ，ｐ＜０．００１、下のパネル、図７）を引き起こし、それに対応する２７％の体重の増加（ｐ＜０．００１、上のパネル、図７）および脂肪体全体における２倍の増加（ｐ＜０．００１、真ん中のパネル、図７）も引き起こした。このことは、食餌により誘導される脂肪細胞の［Ｃａ２＋］ｉの調節異常がａＰ２−ａマウスにおける肥満と関連していることを示す。
【００６６】
カロリーを制限された肥満ａＰ２−ａマウスにおける体重減少を促進する、食餌によるカルシウムの役割を評価した。これらの肥満ａＰ２−ａマウスは同じ低カルシウムの基本食のもとで適宜に育てるか、乳製品またはＣａＣＯ３を食餌によるカルシウム補填源として添加した、または添加していない、エネルギーを制限した（適宜に７０％）食餌のもとで育てた。図８はエネルギーの制限された基本的な低カルシウムの食餌で育てたマウス由来の脂肪細胞の［Ｃａ２＋］ｉが適宜な食餌の下での動物の高くなったレベルと同じレベルで残っているのに対して、高カルシウム食餌（ＣａＣＯ３に由来する１．２％のＣａ２＋）、中程度の乳製品を含む食餌（タンパク質の２５％を置き換えた脱脂粉乳に由来する１．２％のＣａ２＋）、および乳製品の多い食餌（タンパク質の５０％を置き換えた脱脂粉乳に由来する２．４％のＣａ２＋）、を含む３つのカルシウムを含む食餌全てが、脂肪細胞の［Ｃａ２＋］ｉの５０％の減少を引き起こしたことを描いている（ｐ＜０．００１、図８）。
【００６７】
食餌によるカルシウムに誘導される脂肪細胞の［Ｃａ２＋］ｉの減少が体重の減少および脂肪体の減少を容易にするかどうかについての試験が行われた。図８に示すように、エネルギーの制限は、適宜に処理した群に比較して、１１％の体重の減少（ｐ＜０．００１、図８）を引き起こした。しかしながら、１９％、２５％、２９％の著しく大きな体重の減少はそれぞれ高カルシウム、中程度の乳製品、乳製品の多い群で観察された（基本のエネルギー制限した群に比較してｐ＜０．０１、図８）。このことと一致して、高カルシウムの食餌が４２％の減少を引き起こし（ｐ＜０．００１、図８）、さらに中程度および高乳製品の食餌によってそれぞれ６０％および６９％減少した（基本のエネルギーを制限した群に対してｐ＜０．００１、図８）のに対して、エネルギーの制限は、基本となる適宜に食餌を与えた群に比較して、脂肪体の８％の減少しか引き起こさなかった。
【００６８】
図９は高カルシウムの食餌が脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）の活性の３５％の減少（基本のエネルギーを制限した群に対してｐ＜０．０５）を引き起こし、さらに、中程度および高乳製品の食餌により、それぞれ６３％および６２％減少した（ｐ＜０．０５）ことを示す。同様に、３つの高カルシウム食餌は、高カルシウム食餌下、中程度の乳製品の食餌下、高乳製品の食餌下でそれぞれ、脂肪細胞のＦＡＳｍＲＮＡの６１％、７２％および８１％の対応する減少を引き起こした（エネルギーを制限した群に対してｐ＜０．０５、図９）。食餌によるカルシウムの増加はそれに対応して脂質分解の増加も引き起こした。基本となるエネルギーを制限した食餌は脂肪細胞の脂質分解に影響しなかったが、高カルシウムの食餌は脂質分解に７７％の刺激を引き起こし（ｐ＜０．０５。図９）、さらに中程度の乳製品および高乳製品の食餌の群では２倍増加した（基本のエネルギーを制限した群に対してｐ＜０．０５、図９）。減少した脂質生成と結びついた脂質分解の増加は、エネルギー代謝の効率がエネルギーの蓄積からエネルギーの消費へと変化している代謝状態を表し得る。
【００６９】
エネルギー代謝におけるこの変化はさらに、食餌のカルシウムにより誘導される中心温度の上昇によっても、確認した。基本の、エネルギーを制限した食餌は中心温度に影響しなかったのに対して、３つの高カルシウムを含む食餌は全て、高カルシウム、中程度の乳製品および高乳製品の食餌によるそれぞれ０．４８℃、０．５７℃、０．６７℃の上昇を伴って（ｐ＜０．０５）、中心温度に刺激的効果を及ぼした。上昇した中心温度の基本となる、可能な生理学的な原理は脱共役タンパク２（ＵＣＰ２）の発現である。この発現は熱発生に関係があり（Ｆｌｅｕｒｙら、（１９９７）；Ｇｉｍｅｎｏら（１９９７））、３つ全ての高カルシウム食餌により白色脂肪組織で８０％の増加を伴ってアップレギュレートされた（ｐ＜０．０５、図１０）。このことは食餌のカルシウムはまた、熱発生に関連したエネルギー代謝を調節し得ることを示している。従って、熱発生の増加と結びついた、調和して働いている脂質分解のアップレギュレーションおよび脂質生成のダウンレギュレーションは、高カルシウム食餌による、エネルギーの蓄積からエネルギーの消費へのエネルギー代謝の変化に役立ち得る。
【００７０】
基本となる低カルシウムの食餌は、血漿のインスリンレベルを２倍増加させる、高インスリン血症的な効果を及ぼす（ｐ＜０．００１、図１１）。エネルギーの制限自体は血漿のインスリンをおよそ５０％減少させたのに対して、この基本的な食餌で適宜に育てたマウスは維持されたレベルの高インスリン血症状態を示した。さらなる減少に対して、はっきりとした傾向はないけれども、高カルシウムの食餌は、インスリンの量にはさらにひどく影響はしなかった（図１１）。
【００７１】
（実施例３−高カルシウムの食餌の投与方法）
本発明は肥満の診断、処置および／または監視するのに役立つ方法を提供する。本発明の１つの方法は次の工程を包含する：
１．個体の体重を求め、および必要に応じて、個体の身長を求めること；
２．個体の体重または、必要に応じて、体重／身長の比を確立した水準と比較すること；
３．必要に応じて、個体の肥満を分類すること；
４．必要に応じて、正常な体重、または正常な体重／身長の比を維持することの恩恵に関連した情報を個体に提供すること；および
５．個体への高レベルのカルシウムを含む食餌計画の提供、および高濃度のカルシウムを含む食餌による、肥満を調整する恩恵を明らかにする印刷物の必要に応じた、提供。
【００７２】
本発明は肥満を診断し、処置し、および／または監視する、コンピューターで実行される方法も提供する。本発明のこの実施形態の方法は次の工程を含み得る：
１．個体の体重および必要に応じて、身長を決定し、これらの値をコンピューターシステムにインプットすること；
２．必要に応じて、個体の体重／身長の比を計算すること；
３．個体の体重、または必要に応じて、体重／身長の比を、コンピューターで利用できる、体重および／または体重／身長のデータベースに含まれる確立した水準と比較すること；
４．必要に応じて、個体の肥満を分類すること；
５．必要に応じて、個体に、正常な体重または必要に応じて、正常な体重／身長の比を維持することによる恩恵に関する情報を提供すること；および
６．個体に高レベルのカルシウムを含む食餌計画を提供すること、および高濃度のカルシウムを含む食餌の、肥満を調整する恩恵を明らかにする印刷物を必要に応じて、提供すること。
７．必要に応じて、個体の経過を監視すること。
【００７３】
本発明はコミュニケーションネットワークを通して、肥満を診断し、処置し、および／または監視する、コンピューターで実行される方法も提供する。本発明のこの実施形態の方法は次の工程を含み得る：
１．必要に応じて、データをウェブページにインプットすることにより、個体から体重を得ること、および身長のデータを得ること；
２．コミュニケーションネットワークに接続したコンピューターで個体の体重／身長の比を必要に応じて、計算すること；
３．個体の体重または、必要に応じて、体重／身長の比を、上記コンピューターで利用できる、体重および／または体重／身長のデータベースに含まれる確立した水準と比較すること；
４．必要に応じて、個体の肥満を分類すること；
５．必要に応じて、個体に、正常な体重または必要に応じて、正常な体重／身長の比を維持することによる恩恵に関する情報を提供すること；および
６．個体に高レベルのカルシウムを含む食餌計画を提供すること、および高濃度のカルシウムを含む食餌の、肥満を調整する恩恵に関する情報を必要に応じて、提供すること。
【００７４】
この方法はさらに個体によってインプットされた体重および身長の値が正確であるという確認を要求する工程も提供し得る。その方法はまた、肥満の分類、または、個体に高レベルのカルシウムを含む食餌計画を提供することにより、正常な体重、および／または必要に応じて、正常な体重／身長の比を維持することによる恩恵に関する情報、および／または個体の要求時のみに、高濃度のカルシウムを含む食餌の個体への恩恵に関する情報も提供し得る。コミュニケーションネットワークはインターネット、イントラネット、ＬＡＮ、ＷＡＮ、実在のプライベートネットワーク、または電子的に接続した２つ以上のコンピューターであり得る。
【００７５】
（実施例４−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３によるヒト脂肪細胞の代謝の調整）
（試料と方法）
（ヒト脂肪細胞の培養）
ヒトの脂肪細胞の細胞系列および最初に培養したヒトの脂肪細胞を双方ともこの研究の細胞モデルとして用いた。ヒトの脂肪細胞の細胞系列はＺｅｎ−Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，ＮＣ）から得たヒトの前脂肪細胞から分化した。ヒトの前脂肪細胞を１０％のウシの胎児の血清（ＦＢＳ）、１５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓおよび３０，０００細胞／ｃｍ２の濃度の抗生物質を含む、Ｄｕｌｂｅｃｃｏにより改良されたＥａｇｌｅの培地（ＤＭＥＭ）／ＨａｍのＦ−１０培地（Ｆ−１０）（１：１、ｖ／ｖ）に接種した。前脂肪細胞のコンフルエントな単一層は１５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、３％  ＦＢＳ、３３μＭ  ビオチン、１７μＭ  パントテン酸塩、１００ｎＭインスリン、０．２５ｍＭ  メチルイソブチルキサンチン（ＭＩＸ）、１μＭ  デキサメタゾン、１μＭ  ＢＲＬ４９６５３および抗生物質を補充したＤＭＥＭ／Ｆ−１０（１：１、ｖ／ｖ）培地からなる標準的な分化培地により、分化を誘導した。前脂肪細胞をこの分化培地中で３日間維持し、その後、ＢＲＬ４９６５３およびＭＩＸを取り除いた脂肪細胞培地中で培養した。培養物を２〜３日毎に取り替えた（Ｓｈｉ、Ｈ．ら、「Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ａｄｉｐｏｃｙｔｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ」、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．（２０００）３巻ｐｐ７５〜８２）。
【００７６】
初代培養したヒトの脂肪細胞は既知の代謝異常履歴のない、腹部形成外科治療を受けた患者から得たヒトの皮下脂肪組織に由来した。このプロトコルはＨｕｍａｎ  ＳｕｂｊｅｃｔのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ＢｏａｒｄおよびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＴｅｎｎｅｓｓｅｅのＣｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｔｉｃｉｐａｔｉｏｎにより認可されていた。脂肪細胞を（Ｓｈｉ、Ｈ．ら「Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｕｌｆｏｎｙｌｕｒｅａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ａｄｉｐｏｃｙｔｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ」ＦＡＳＥＢ．Ｊ．（１９９９）１３巻ｐｐ．１８３３〜３８）の教示に従って単離した。簡単に説明すると、脂肪組織を最初にＨａｎｋの緩衝塩溶液で数回洗浄し、小さな断片に切り刻み、その後、３７℃のウォーターバスで３０分間振とうすることにより、１ｍｇ／ｍｌの１型コラゲナーゼで分解した。脂肪細胞をその後、滅菌した５００μｍのナイロンメッシュでろ過し、１％のウシの胎児の血清（ＦＢＳ）、１００ＵＩ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを補充したＤｕｌｂｅｃｃｏにより改良されたＥａｇｌｅの培地（ＤＭＥＭ）で培養した。細胞を懸濁液中で培養し、毎日取り替える、培養培地の表面の、薄い層の形で維持した。細胞はこの培養条件下で７日間生存し続け、代謝反応できる。
【００７７】
（ヒトの脂肪細胞の細胞内Ｃａ２＋（［Ｃａ２＋］ｉ）の測定）
ヒトの前脂肪細胞の［Ｃａ２＋］ｉをフラ−２による２つの波長の蛍光像システム（Ｓｈｉ、Ｈ．ら、「Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ａｄｉｐｏｃｙｔｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ」、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．（２０００）３巻ｐｐ７５〜８２）を用いて測定した。前脂肪細胞を、カバーガラス（Ｐ３５Ｇ−０−１４−Ｃ、ＭａｔＴｅｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を備える３５ｍｍのディッシュでプレートし、そして分化した。［Ｃａ２＋］ｉの測定の前に、細胞を無血清培地で一晩、前インキュベートし、次の成分（ｍＭ）：ＮａＣｌ  １３８、ＣａＣｌ２  １．８、ＭｇＳＯ４  ０．８、ＮａＨ２ＰＯ４  ０．９、ＮａＨＣＯ３４、グルコース５、グルタミン６、Ｈｅｐｅｓ２０およびウシ血清アルブミン１％を含むＨｅｐｅｓ緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ）でリンスした。
【００７８】
細胞を、同じバッファー中のフラ−２  アセトキシメチルエステル（ＡＭ）（１０μＭ）とともに、３７℃２時間、５％のＣＯ２を含む暗所インキュベーターに入れた。細胞外の色素を除去するために、細胞をＨＢＳＳで３回リンスし、その後、細胞質のフラ−２ＡＭの完全な加水分解のために、室温でさらに１時間、後インキュベートした。色素を入れたセルを伴ったディッシュをＣｏｈｕ  ４９１５  ＣＣＤカメラのついたＮｉｋｏｎ  ＴＭＳ−Ｆ蛍光倒立顕微鏡のステージにすえつけた。蛍光像を５２０ｎＭの発光波長を伴った３４０ｎＭおよび３８０ｎＭの２つの励起波長で交互に捉えた。安定したイメージのベースラインの確立の後、１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３およびその膜レセプターの（ｍＶＤＲ）アゴニストである１α，２５−ジヒドロキシルミステロール３（１α，２５−（ＯＨ）２−ルミステロール３）に対する反応を決定した。［Ｃａ２＋］ｉをＧｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚによって記載された、比率の計算式を用いて計算した（Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚ、Ｇ．ら「Ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａ２＋  ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｇｒｅａｔｌｙ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８５）２６０巻ｐｐ．３４４０〜５０）。それぞれの分析で８〜１０の代表的な全細胞の反応を評価した。イメージを、ＩｎＣｙｔＩｍ２ヴァージョン４．６２イメージングソフト（Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ、Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ、ＯＨ）を用いて分析した。イメージを溶液中での較正曲線を作るためにフラ−２カルシウム画像化較正キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて較正した。その後、［Ｃａ２＋］ｉのレベルの最大値および最小値を測定するために、ディジトニン（２５μＭ）およびｐＨ８．７  Ｔｒｉｓ−ＥＧＴＡ（１００ｍＭ）を用いて細胞の較正を行った。
（脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）およびグリセロール−３−リン酸  デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤＨ）活性のアッセイ）
ＦＡＳとＧＰＤＨの活性はヒトの脂肪細胞の粗製細胞質抽出物から分光光度計により決められた（Ｓｈｉ，Ｈ．ら、「Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｕｌｆｏｎｙｌｕｒｅａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ａｄｉｐｏｃｙｔｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ」ＦＡＳＥＢ．Ｊ．（１９９９）１３巻  ｐｐ．１８３３〜３８）。ヒト脂肪細胞を、１ｍｍｏｌ／Ｌのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１ｍｍｏｌ／Ｌのジチオスレイトール（ＤＴＴ）および１００μｍｏｌ／Ｌのフェニルメチルスルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ）（ｐＨ７．４）を含む、２５０ｍｍｏｌ／Ｌのショ糖溶液中でホモジェナイズした。ホモジェネートを、１８，５００×ｇで１時間遠心分離し、沈殿（ｉｎｆｒａｎａｔａｎｔ）をＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨそれぞれの酸化速度を測定するのに用いた。
【００７９】
（脂質分解アッセイ）
培養培地に放出されたグリセロールを、脂質分解の指標として、以前に記載されたように、一段階の酵素による蛍光光度法を用いて測定した（Ｘｕｅ，Ｂ．Ｚ．ら「Ｔｈｅ  ａｇｏｕｔｉ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｌｉｐｏｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ  ｖｉａ  ａ  Ｃａ２＋−ｄｅｐｅｎｎｄｅｎｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ」、ＦＡＳＥＢ．Ｊ．（１９９８）１２巻ｐｐ．１３９１−１３９６；Ｂｏｏｂｉｓ，Ｌ．Ｈ．ら「Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｉｎ  ２０μｌ  ｏｆ  ｐｌａｓｍａ」、Ｃｌｉｎ．Ｃｌｉｍ．Ａｃｔａ．（１９８３）１３２巻ｐｐ．１７３−９）。
【００８０】
（ノーザンブロット解析）
ノーザンブロット解析は以前に記載されたように行った（Ｓｈｉ，Ｈら「Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｕｌｆｏｎｙｌｕｒｅａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ａｄｉｐｏｃｙｔｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ」、ＦＡＳＥＢ．Ｊ．（１９９９）１３巻  ｐｐ．１８３３〜３８）。ヒトの脂肪組織から得た総ＲＮＡを、ＣｓＣｌ２の濃度勾配による遠心分離を用いて抽出し、１％アガロースゲルで電気泳動し、ナイロン膜（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）に移した。膜を、ランダムプライマー法を用いて放射性同位元素標識したＦＡＳのｃＤＮＡプローブとハイブリダイズした。結合しなかったプローブは室温で２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで３０分間、および５５℃で０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで４５分間、膜を洗浄することで除去した。最終的に、膜を−８０℃でＸ線フィルム（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）に感光した。全ての膜をはがし、電気泳動のコントロールとしてのβ−アクチンで再プローブした。ブロット画像をＣＣＤカメラおよび電子トランスイルミネーター（ｔｒａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒ）（ＵＬＴＲＡ−ＬＵＭ，Ｉｎｃ．Ｐａｒａｍｏｕｎｔ，ＣＡ）を備え、ＤｉｇｉＰｉｘ  １２６０ＴＭ画像システムを用いてとらえた。これらの画像の定量的分析にはＺＥＲＯ−Ｄｓｃａｎ  ソフトウェア（Ｓｃａｎａｌｙｔｉｃｓ，Ｉｎｃ，Ｆａｉｒｆａｘ，ＶＡ）を用いた。
【００８１】
（統計的解析）
全てのデータを平均値±標準偏差として表した。データは一元配置分散解析（ＡＮＯＶＡ）により、統計的有意性を評価した。および有意に異なる群の平均値をＳＰＳＳ（ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）を用いた最小有意差（ＬＳＤ）検定により、分類した。ｐ値＜０．０５を有意とみなす。
【００８２】
（結果）
１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３の脂肪細胞カルシウムシグナル伝達に対する直接的な効果を決定するために、１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３に対する［Ｃａ２＋］ｉの反応を評価した。図１２Ａ−Ｂは１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３がヒト脂肪細胞における［Ｃａ２＋］ｉの著しい増加を用量依存的様式で（ｐ＜０．０５）誘導することを示した。この反応は、膜ビタミンＤレセプター（ｍＶＤＲ）の特異的アゴニストである１α，２５−ジヒドロキシルミステロール３（１α，２５−（ＯＨ）２−ルミステロール３）により、同様の反応が起こった。１α，２５−（ＯＨ）２−ルミステロール３はヒト脂肪細胞における［Ｃａ２＋］ｉの用量依存的な著しい増加を引き起こした（ｐ＜０．０５、図１２Ｃ−Ｄ）。それに対して、これらの効果はｍＶＤＲの特異的アンタゴニストである、１β，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（１β，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３）によるヒト脂肪細胞の前処理により、完全に妨げられた（図１２Ｅ−Ｆ）。
【００８３】
脂質代謝の調節における１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３の役割を調べるために、本発明者らはＦＡＳおよびＧＰＤＨを脂質生成マーカーとして用い、グリセロールの放出を脂質分解のマーカーとして用いて、ヒト脂肪細胞を１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３およびそのｍＶＤＲアゴニストおよびアンタゴニストで処理した。１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３（５ｎＭ）は４８時間後、脂肪細胞のＦＡＳ活性の４０％の増加を引き起こした（ｐ＜０．０５、図１３Ａ）。それに対して、１α，２５−（ＯＨ）２−ルミステロール３はＦＡＳ活性を２．５倍増加させるという、より大きな効果を及ぼした（ｐ＜０．００１、図１３Ａ）。しかしながら、１β，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３によるヒト脂肪細胞の前処理はこのＦＡＳの刺激を完全に妨げた（図１３Ａ）。１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３および１α，２５−（ＯＨ）２−ルミステロール３処理によりそれぞれ２倍および２．５倍の増加を伴った、ＦＡＳ  ｍＲＮＡの発現に対する類似の刺激が観察された（ｐ＜０．００１、図１３Ｂ）。それに対して、この刺激は１β，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３により完全にブロックされた。このことと一致して、１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３（５ｎＭ）はヒト脂肪細胞のＧＰＤＨ活性における５０％の増加を刺激した（ｐ＜０．０５、図１４）。それに対して、１α，２５−（ＯＨ）２−ルミステロール３処理により、著しく大きな２．８倍の刺激が見られた（ｐ＜０．００１、図１４）。１β，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３は１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３に刺激されるＧＰＤＨの活性に対して小さな効果しか及ぼさないが、１α，２５−（ＯＨ）２−ルミステロール３に刺激されるＧＰＤＨ活性を著しく阻害する（図１４）。
【００８４】
脂肪細胞の脂質分解は１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３およびそのアゴニストに脂質生成とは逆の様式で応答した。図１５Ａは１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３が脂肪細胞の基本的な脂質分解に対して３５％の減少を伴った阻害効果を及ぼす（ｐ＜０．０５）ことを示す。より大きな５０％の阻害は１α，２５−（ＯＨ）２−ルミステロール３処理により見られた（ｐ＜０．０１、図１５Ａ）。逆に、この阻害は１β，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３前処理により、完全に妨げられた。同様に、イソプロテノールによるヒト脂肪細胞の前処理は脂質分解の３．２倍の増加を引き起こした（ｐ＜０．００１、図１５Ｂ）。それに対して、１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３および１α，２５−（ＯＨ）２−ルミステロール３はイソプロテノールに刺激された脂質分解をそれぞれ５６％および５３％阻害した（ｐ＜０．００１、図１５Ｂ）。１β，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３による前処理は、この１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３および１α，２５−（ＯＨ）２−ルミステロール３による、イソプロテノールに刺激された脂質分解に対する阻害効果を妨げた（図１５Ｂ）。
【００８５】
データはカルシウム刺激（ｃａｌｃｉｔｒｏｐｈｉｃ）ホルモン１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３が脂肪細胞のＣａ２＋シグナル伝達の調節に役割を持っていることを示している。そのことにより、脂質生成および脂質分解に対して調和した制御をもたらす。これらのデータは１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３が、脂肪組織におけるエネルギー恒常性の調節に新しい役割を持っていること、および（脂肪細胞のエネルギー代謝を調節する）媒介性シグナル伝達経路１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３が、肥満における薬理学的および／または栄養学的な介入の開発に適した標的であることを意味している可能性があることを示している。
【００８６】
データは１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３が脂肪細胞で非遺伝子的な反応（ｎｏｎ−ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｃｔｉｏｎ）を引き起こし、その結果、［Ｃａ２＋］ｉの刺激、およびそれに対応した脂質代謝の調節を引き起こしたこと示している。１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３はＦＡＳの発現を調節するが、これはＦＡＳの発現に対する直接的な効果というよりは、１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３により引き起こされた［Ｃａ２＋］ｉの増加のためである。だから、この効果は、ｍＶＤＲのアゴニストにより模倣され、ｍＶＤＲアンタゴニストによりブロックされる。さらに、本発明者らは以前、相応してＦＡＳの発現を調節する［Ｃａ２＋］ｉの、調節を示した（Ｋｉｍ，Ｊ．Ｈ．ら「Ａｇｏｕｔｉ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｌｃｉｕｍ．  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ」、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．（１９９７）２７２巻  ｐｐＥ３７９〜Ｅ３８４；Ｚｅｍｅｌ，Ｍ．Ｂ．ら「Ａｇｏｕｔｉ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｌｃｉｕｍ：ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｖｉａｂｌｅ  ｙｅｌｌｏｗ  ｍｉｃｅ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．（１９９５）９２巻  ｐｐ４７３３〜４７３７；Ｊｏｎｅｓ、Ｂ．Ｈ．ら「Ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｉｐｏｃｙｔｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｂｙ  ａｇｏｕｔｉ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｐａｒａｃｒｉｎｅ  ａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｙｅｌｌｏｗ  ｍｏｕｓｅ  ｏｂｅｓｉｔｙ」、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９６）２７０巻  ｐｐＥ１９２〜Ｅ１９６；Ｘｕｅ，Ｂ．Ｚ．ら「Ｔｈｅ  ａｇｏｕｔｉ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｌｉｐｏｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ  ｖｉａ  ａ  Ｃａ２＋−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｍｅｃｈａｎｉｓｍ」ＦＡＳＥＢ．Ｊ．（１９９８）１２巻  ｐｐ１３９１〜１３９６）。
【００８７】
１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３のアナログは遺伝子的（ｇｅｎｏｍｉｃ）または非遺伝子的（ｎｏｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ）な生物的反応を生み出す能力に関して広く調べられてきた（Ｂｏｕｉｌｌｏｎ，Ｂら「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ」Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖ．（１９９５）１６巻、ｐｐ２００〜５７；Ｎｏｒｍａｎ，Ａ．Ｗ．、「Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  １α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３:ｐａｓｔ，ｐｒｅｓｅｎｔ，ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ」Ｊ．Ｂｏｎｅ．Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．（１９９８）１３巻、ｐｐ１３６０〜１３６９。いくつかの報告（Ｎｏｒｍａｎ，Ａ．Ｗ．ら「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ６−ｓ−ｃｉｓ−  ａｎｄ  ６−ｓ−ｔｒａｎｓ−  ｌｏｃｋｅｄ  ａｎａｌｏｇｓ  ｏｆ  １α，２５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ３  ｉｎｄｉｃａｔｅｓ  ｔｈａｔ  ｔｈｅ  ６−ｓ−ｃｉｓ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｓ  ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｎｏｎｇｅｎｏｍｉｃ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｎｄ  ｔｈａｔ  ｎｅｉｔｈｅｒ  ６−ｓ−ｃｉｓ−  ｎｏｒ  ６−ｓ−ｔｒａｎｓ−  ｌｏｃｋｅｄ  ａｎａｌｏｇｓ  ａｒｅ  ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ  ｆｏｒ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ」Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉ．（１９９７）１１巻  ｐｐ１５１８〜３１；Ｄｕｓｓｏ，Ａ．Ｓ．ら「Ｏｎ  ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ  ａｎａｌｏｇｓ」  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（１９９１）１２８巻  ｐｐ１６８７〜９２）は１α，２５−ジヒドロキシルミステロール３ような１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３の、６−ｓ−ｃｉｓに固定された（６−ｓ−ｃｉｓ−ｌｏｃｋｅｄ）アナログは、ｍＶＤＲに結合することによる、Ｃａ２＋の流入の刺激を含む非遺伝子的（ｎｏｎ−ｇｅｎｏｍｉｃ）な作用に特異的であることを示した。それに対して、このアナログはｎＶＤＲに対して低い結合親和力を示し、遺伝子的（ｇｅｎｏｍｉｃ）な経路を活性化しない。さらに、１β，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３は、１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３または１α，２５−ジヒドロキシルミステロール３により引き起こされる、即時の生理学的な反応をブロックする。しかし、ｎＶＤＲに対しては効果がない（Ｎｏｒｍａｎ，Ａら「Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ  ｔｈａｔ  １β，２５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ３  ｉｓ  ａｎ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｏｎｇｅｎｏｍｉｃ  ｂｕｔ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｈｒｅｅ  Ａ−ｒｉｎｇ  ｄｉａｓｔｅｒｅｏｍｅｒｓ  ｏｆ  １α，２５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ３」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９３）２６８巻  ｐｐ２００２２〜３０；Ｎｏｒｍａｎ，  Ａ．Ｗ．ら  「１β，２５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ３  ｉｓ  ａｎ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｏｆ  １α，２５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ３  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃａｌｔａｃｈｉａ  （ｔｈｅ  ｒａｐｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）」，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．（１９９２）１８９巻  ｐｐ１４５０〜５６）。それゆえに、１α，２５−ジヒドロキシルミステロール３は、非遺伝子的（ｎｏｎ−ｇｅｎｏｍｉｃ）な作用の特異的なアゴニストである。それに対して、１β，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３は非遺伝子的（ｎｏｎ−ｇｅｎｏｍｉｃ）な作用の特異的なアンタゴニストである。１α，２５−ジヒドロキシルミステロール３が脂肪細胞の［Ｃａ２＋］ｉの調節および、それに対応する脂質代謝により強力な効果を及ぼすこと、および、１β，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３がこれらの効果を完全にブロックしたことは、注目すべきである。このことは、１α，２５−ジヒドロキシルミステロール３がｍＶＤＲのみに作用し、脂肪細胞で非遺伝子的（ｎｏｎ−ｇｅｎｏｍｉｃ）な作用を生み出すのに対して、１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３はｍＶＤＲおよびｎＶＤＲの双方を標的とし、シグナル応答で互いに相互作用し、脂質代謝の調節に影響し得る、非遺伝子的（ｎｏｎ−ｇｅｎｏｍｉｃ）および遺伝子的（ｇｅｎｏｍｉｃ）な作用を仲介することを示唆する。これらのデータはさらに、ｍＶＤＲを介した１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３媒介性の非遺伝子的（ｎｏｎ−ｇｅｎｏｍｉｃ）な作用が、脂肪細胞の脂質生成および脂質分解の調節において主要な役割を果たし得ることを示している。
【００８８】
１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３のシグナル伝達経路による、脂肪細胞の代謝の調節は、インビボの肥満の発生において重要な役割を果たし得る。いくつかの証拠は、肥満のヒトでは、循環する１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３のレベルが上昇していることを示している（Ａｎｄｅｒｓｅｎ，  Ｔ．ら，「Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｈｙｐｅｒｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄｉｓｍ  ｏｆ  ｍｏｒｂｉｄ  ｏｂｅｓｉｔｙ  ｒｅｇｒｅｓｓｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ」，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ（１９８８）３７巻  ｐｐ４２５〜８）；Ｂｅｌｌ，Ｎ．Ｈ．ら「Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ−ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｏｂｅｓｅ  ｓｕｂｊｅｃｔｓ」，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ（１９８５）７６巻  ｐｐ３７０〜３；Ｂｅｌｌ，Ｎ．Ｈ．ら「Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｂａｂｌｅ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ２５−ｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ」，Ｊ．Ｂｏｎｅ．Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．（１９８８）３巻  ｐｐ４８９〜９５；Ｅｐｓｔｅｉｎ，Ｓら「Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｔｈａｔ  ｏｂｅｓｉｔｙ  ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｔｈｅ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ−ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｂｌａｃｋｓ」Ｊ．Ｂｏｎｅ．  Ｍｉｎｅｒ．  Ｒｅｓ．（１９８６）１巻  ｐｐ１８１〜４）。従って、脂肪細胞のエネルギー恒常性を調節するにあたって、１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３媒介性のシグナル伝達経路は、肥満における薬理学的および／または栄養学的な介入の開発に適した標的であることを意味し得る。これまでの研究は食餌カルシウムの増加が１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３のレベルを抑制することを示してきた（Ｒｅｓｎｉｃｋ，Ｌ．，「Ｔｈｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｏｎｉｃ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａｌｌｉｅｄ  ｃｌｉｎｉｃ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ」Ｐｒｏｇ．  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｄｉｓ．（１９９９）４２巻  ｐｐ．１〜２２；Ｓａｎｃｈｅｚ，Ｍ．ら「Ｏｒａｌ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｉｎｔｒａｐｌａｔｅｌｅｔｆｒｅｅ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ  ｐａｔｉｅｎｔｓ」Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ（１９９７）２９巻、ｐｐ．５３１〜６）。従って、本発明者らは食餌のカルシウムによる１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３の抑制が脂肪細胞の［Ｃａ２＋］ｉを減少し、それにより、脂質生成および脂質分解に対する調節された支配により、トリグリセリドの蓄積を阻害するという仮説を試した。本発明者らのデータは、食餌のカルシウムの増加による１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３の抑制が、脂肪細胞の細胞内Ｃａ２＋を減少し、脂質分解を刺激し、脂質生成を阻害し、脂肪細胞の脱共役タンパク２（ＵＣＰ２）の発現を増加し、そしてａＰ２−アグーチ（ａｇｏｕｔｉ）トランスジェニックマウスの中心温度の増加を示すこと、ならびに、食餌によるカルシウムが、食餌により誘導される肥満を減少する��けでなく、体重減少およびカロリーの制限に次ぐ脂肪体の減少もまた加速することを示した（Ｚｅｍｅｌ，Ｍ．Ｂ．ら「Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｉｐｏｓｉｔｙ  ｂｙ  ｄｉｅｔａｒｙ  ｃａｌｃｉｕｍ」、ＦＡＳＥＢ．Ｊ．（２０００）１４巻  ｐｐ１１３２〜３８；Ｓｈｉ，Ｈ．ら「Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｄｉｅｔａｒｙ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｏｎ  ａｄｉｐｏｃｙｔｅ  ｌｉｐｉｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｎｅｒｇｙ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ａＰ２−ａｇｏｕｔｉ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ」ＦＡＳＥＢ．Ｊ．ｅｘｐｒｅｓｓ  ａｒｔｉｃｌｅ  １０．１０９６／ｆｊ．００〜０５８４ｆｊｅ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  Ｄｅｃ．８，２０００）。
【００８９】
データは、１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３が脂肪細胞のＣａ２＋シグナル伝達を調節し、および結果的に、脂質生成および脂質分解に対する調節された支配を及ぼすことを示唆している。このように、１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３誘導性［Ｃａ２＋］ｉの直接的な阻害は、食餌のカルシウムによる反肥満効果に寄与する。およびｍＶＤＲに調節された
非遺伝子的（ｎｏｎ−ｇｅｎｏｍｉｃ）な経路は、肥満における治療的介入の開発のための重要な標的である。
【００９０】
本明細書に記載された実施例および実施形態は単に例示目的であること、およびこれらの実施例および実施形態を考慮して様々な改変および変更が当業者に対して示唆され、この出願および添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲に含まれるべきであることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１Ａ】図１Ａはヒトの脂肪細胞における細胞内カルシウムに対する１，２５−（ＯＨ）２−Ｄの効果（左パネル）および副甲状腺ホルモンの効果（右パネル）を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂはヒトの脂肪細胞における細胞内カルシウムに対する１，２５−（ＯＨ）２−Ｄの効果（左パネル）および副甲状腺ホルモンの効果（右パネル）を示す。
【図２】図２は、ヒトの脂肪細胞におけるフォルスコリン刺激された脂肪分解に対する１，２５−（ＯＨ）２−Ｄの効果を示す。フォルスコリン処理により、グリセロールの放出量は約２倍に増加した。データは、フォルスコリン処理群について１００％に正規化して、示す（ｎ＝６／群；ｐ＜０．００１）。
【図３】図３は、ａＰ２プロモーターの制御下で、脂肪組織においてアグーチ（ａｇｏｕｔｉ）を発現するトランスジェニックマウスの６週間の体重増加に対するカルシウムおよび乳製品の効果を示す。
【図４】図４は、ａＰ２プロモーターの制御下で、脂肪組織でアグーチ（ａｇｏｕｔｉ）を発現するトランスジェニックマウスの中心温度に対するカルシウムおよび乳製品の効果を示す。
【図５】図５Ａ〜Ｃは、脂肪細胞の脂肪酸シンターゼ活性（上パネル）、脂肪酸シンターゼｍＲＮＡ（中パネル）に対するカルシウムおよび乳製品の効果のデータが、ａＰ２プロモーターの制御下で脂肪組織でアグーチ（ａｇｏｕｔｉ）を発現するトランスジェニックマウスにおける脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ対アクチンの比）および脂質分解として表現されることを示す。データは、平均±標準偏差（ｎ＝１０／群）として示されている。統計的有意性はそれぞれのパネルに示されるとおりである。
【図６】図６Ａ〜Ｂは、ａＰ２プロモーターの制御下で、脂肪組織でアグーチ（ａｇｏｕｔｉ）を発現するトランスジェニックマウスにおける空腹時の血漿中のグルコースレベルおよびインシュリンレベルに対するカルシウムおよび乳製品の効果を示す。上のパネルは、インシュリンレベルを示し、下のパネルはグルコースを示す。
【図７】図７Ａ〜Ｃは、ａＰ２−アグーチ（ａｇｏｕｔｉ）トランスジェニックマウスにおける６週の基底の低カルシウム（０．４％）、高脂肪、高ショ糖の食餌の消費による体重への効果（上パネル）、全脂肪体塊への効果（中パネル）および基底脂肪細胞の［Ｃａ２＋］ｉに対する効果（下パネル）を示している。データは、平均±ＳＥとして示されている（ｎ＝８）。＊投与前に対してｐ＜０．００１。
【図８】図８Ａ〜Ｃは、６週間の高濃度のカルシウム食餌の投与の、エネルギー制限下（随意の７０％）のａＰ２−アグーチ（ａｇｏｕｔｉ）トランスジェニックマウスにおける体重減少に対する効果（図８Ａ、上パネル）、脂肪体塊に対する効果（図８Ｂ、中パネル）、基底脂肪細胞の［Ｃａ２＋］ｉに対する効果（図８Ｃ、下パネル）を示している。データは、平均±ＳＥとして示される（ｎ＝８）。
【図９】図９Ａ〜Ｃは、６週間の高濃度のカルシウム食餌の投与の、エネルギー制限下（随意の７０％）のａＰｅ−アグーチ（ａｇｏｕｔｉ）トランスジェニックマウスにおける脂肪酸シンターゼ活性に対する効果（図９Ａ、上パネル）、脂肪酸シンターゼｍＲＮＡに対する効果（図９Ｂ、中パネル）および脂肪分解に対する効果（図９Ｃ、下パネル）を示している。グリセロールの放出を、脂肪分解を測定するのに用いる。データは平均±ＳＥで示した（ｎ＝８）。
【図１０Ａ】図１０Ａは６週間の高濃度のカルシウム食餌の投与の、エネルギー制限下（随意の７０％）のａＰ２−アグーチ（ａｇｏｕｔｉ）トランスジェニックマウスの腹部脂肪組織脱共役タンパク質２（ＵＣＰ２）の発現に対する効果を示している。上パネル（図１０Ａ）：８回の複製の代表的なノーザンブロット
【図１０Ｂ】図１０Ｂは６週間の高濃度のカルシウム食餌の投与の、エネルギー制限下（随意の７０％）のａＰ２−アグーチ（ａｇｏｕｔｉ）トランスジェニックマウスの腹部脂肪組織脱共役タンパク質２（ＵＣＰ２）の発現に対する効果を示している。下パネル（図１０Ｂ）：アクチンｍＲＮＡ濃度単位あたりのＵＣＰ２の定量的分析。データは平均±ＳＥとして示す（ｎ＝８）。＊基本食餌に対してｐ＜０．０５。
【図１１】図１１は、血漿のインシュリンレベルに対する、食餌のカルシウムの効果を示す。データは平均±ＳＥで示す（ｎ＝８）。＊基本的な食餌処理の前に対してｐ＜０．００１；＋随意に対してｐ＜０．００１。
【図１２−１】図１２Ａ〜Ｆは１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３の、脂肪細胞Ｃａ２＋シグナル伝達および［Ｃａ２＋］ｉの１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３に対する応答への直接的な効果を示している。図１２Ａ〜Ｂは、１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３がヒトの脂肪細胞における［Ｃａ２＋］ｉの用量依存的な様式での増加を誘導したことを示している（ｐ＜０．０５）。この作用は、膜のビタミンＤレセプター（ｍＶＤＲ）に対する特異的なアゴニストである１α，２５−ジヒドロキシルミステロール３（１α，２５−（ＯＨ）２ルミステロール３）によって模倣された。１α，２５−（ＯＨ）２ルミステロール３は、ヒトの脂肪細胞で明白に用量応答的な［Ｃａ２＋］ｉの増加（ｐ＜０．０５，図１２Ｃ〜Ｄ）をもたらした。それに対して、これらの効果は、ヒトの脂肪細胞を、ｍＶＤＲの特異的なアンタゴニストである１β，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（１β，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３）で前処理することにより、完全に妨げられた（図１２Ｅ〜Ｆ）。
【図１２−２】図１２Ａ〜Ｆは１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３の、脂肪細胞Ｃａ２＋シグナル伝達および［Ｃａ２＋］ｉの１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３に対する応答への直接的な効果を示している。図１２Ａ〜Ｂは、１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３がヒトの脂肪細胞における［Ｃａ２＋］ｉの用量依存的な様式での増加を誘導したことを示している（ｐ＜０．０５）。この作用は、膜のビタミンＤレセプター（ｍＶＤＲ）に対する特異的なアゴニストである１α，２５−ジヒドロキシルミステロール３（１α，２５−（ＯＨ）２ルミステロール３）によって模倣された。１α，２５−（ＯＨ）２ルミステロール３は、ヒトの脂肪細胞で明白に用量応答的な［Ｃａ２＋］ｉの増加（ｐ＜０．０５，図１２Ｃ〜Ｄ）をもたらした。それに対して、これらの効果は、ヒトの脂肪細胞を、ｍＶＤＲの特異的なアンタゴニストである１β，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（１β，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３）で前処理することにより、完全に妨げられた（図１２Ｅ〜Ｆ）。
【図１２−３】図１２Ａ〜Ｆは１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３の、脂肪細胞Ｃａ２＋シグナル伝達および［Ｃａ２＋］ｉの１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３に対する応答への直接的な効果を示している。図１２Ａ〜Ｂは、１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３がヒトの脂肪細胞における［Ｃａ２＋］ｉの用量依存的な様式での増加を誘導したことを示している（ｐ＜０．０５）。この作用は、膜のビタミンＤレセプター（ｍＶＤＲ）に対する特異的なアゴニストである１α，２５−ジヒドロキシルミステロール３（１α，２５−（ＯＨ）２ルミステロール３）によって模倣された。１α，２５−（ＯＨ）２ルミステロール３は、ヒトの脂肪細胞で明白に用量応答的な［Ｃａ２＋］ｉの増加（ｐ＜０．０５，図１２Ｃ〜Ｄ）をもたらした。それに対して、これらの効果は、ヒトの脂肪細胞を、ｍＶＤＲの特異的なアンタゴニストである１β，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（１β，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３）で前処理することにより、完全に妨げられた（図１２Ｅ〜Ｆ）。
【図１３−１】図１３Ａ〜Ｂは、ＦＡＳおよびＧＰＤＨを脂質生成のマーカーとして、そしてグリセロールの放出を脂質分解の指標として用いた、１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３の効果を示す。１α，２５−（ＯＨ）２ルミステロール３がＦＡＳの活性において２．５倍の強さのより強い効果を発揮する（ｐ＜０．００１、図１３Ａ）のに対して、１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３（５ｎＭ）は４８時間にわたり、脂肪細胞のＦＡＳ活性の４０％の増加を引き起こした（ｐ＜０．０５、図１３Ａ）。しかしながら、ヒトの脂肪細胞を１β，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３で前処理すると、このＦＡＳの刺激は完全に妨げられた（図１３Ａ）。同様の刺激は、ＦＡＳｍＲＮＡの発現で見られ、１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３処理で２倍、そして１α，２５−（ＯＨ）２ルミステロール３処理で２．５倍それぞれ増加したが（ｐ＜０．００１、図１３Ｂ）、この刺激は、１β，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３により完全に阻害された。
【図１３−２】図１３Ａ〜Ｂは、ＦＡＳおよびＧＰＤＨを脂質生成のマーカーとして、そしてグリセロールの放出を脂質分解の指標として用いた、１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３の効果を示す。１α，２５−（ＯＨ）２ルミステロール３がＦＡＳの活性において２．５倍の強さのより強い効果を発揮する（ｐ＜０．００１、図１３Ａ）のに対して、１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３（５ｎＭ）は４８時間にわたり、脂肪細胞のＦＡＳ活性の４０％の増加を引き起こした（ｐ＜０．０５、図１３Ａ）。しかしながら、ヒトの脂肪細胞を１β，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３で前処理すると、このＦＡＳの刺激は完全に妨げられた（図１３Ａ）。同様の刺激は、ＦＡＳｍＲＮＡの発現で見られ、１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３処理で２倍、そして１α，２５−（ＯＨ）２ルミステロール３処理で２．５倍それぞれ増加したが（ｐ＜０．００１、図１３Ｂ）、この刺激は、１β，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３により完全に阻害された。
【図１４】図１４は、ヒトの脂肪細胞のＧＰＤＨ活性に対する１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３、１α，２５−（ＯＨ）２ルミステロール３および１β，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３の効果を示す（ｐ＜０．０５）。
【図１５Ａ】図１５Ａ〜Ｂは脂肪細胞の脂質分解が、脂質生成と逆の様式で１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３とそのアゴニストに応答したことを示している。図１５Ａは、１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３が脂肪細胞の脂質分解に対して、３５％の減少（ｐ＜０．０５）で阻害効果を及ぼすことを示している。より大きな５０％の阻害は、１α，２５−（ＯＨ）２ルミステロール３による処理により、見出された（ｐ＜０．０１、図１５Ａ）。逆にこの阻害は、１β，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３での前処理により、完全に防止された。同様に、１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３および１α，２５−（ＯＨ）２ルミステロール３は、イソプロテレノールに刺激された脂質分解をそれぞれ５６％および５３％阻害した（ｐ＜０．００１、図１５Ｂ）のに対して、ヒトの脂肪細胞に対するイソプロテレノール処理は、脂質分解を３．２倍増加させた（ｐ＜０．００１、図１５Ｂ）。１β，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３による前処理は、この１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３および１α，２５−（ＯＨ）２ルミステロール３の、イソプロテレノールに刺激される脂質分解に対する阻害効果を妨げた（図１５Ｂ）。
【図１５Ｂ】図１５Ａ〜Ｂは脂肪細胞の脂質分解が、脂質生成と逆の様式で１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３とそのアゴニストに応答したことを示している。図１５Ａは、１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３が脂肪細胞の脂質分解に対して、３５％の減少（ｐ＜０．０５）で阻害効果を及ぼすことを示している。より大きな５０％の阻害は、１α，２５−（ＯＨ）２ルミステロール３による処理により、見出された（ｐ＜０．０１、図１５Ａ）。逆にこの阻害は、１β，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３での前処理により、完全に防止された。同様に、１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３および１α，２５−（ＯＨ）２ルミステロール３は、イソプロテレノールに刺激された脂質分解をそれぞれ５６％および５３％阻害した（ｐ＜０．００１、図１５Ｂ）のに対して、ヒトの脂肪細胞に対するイソプロテレノール処理は、脂質分解を３．２倍増加させた（ｐ＜０．００１、図１５Ｂ）。１β，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３による前処理は、この１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３および１α，２５−（ＯＨ）２ルミステロール３の、イソプロテレノールに刺激される脂質分解に対する阻害効果を妨げた（図１５Ｂ）。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【国際調査報告】
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