(57)【要約】本発明は、核酸ポリメラーゼ用の基質として末端−ホスフェ−ト−標識ヌクレオチドの使用に基づいた、試料中の核酸を検出する方法を記述する。本発明により提供される方法は、末端−ホスフェ−トに付加した比色色素、化学発光性のもしくは蛍光性の部分、質量タグもしくは電気化学的タグを有するところのヌクレオシドポリホスフェート、ジデオキシヌクレオシドポリホスフェート、またはデオキシヌクレオシドポリホスフェート類似体を利用する。核酸ポリメラーゼが基質としてこの類似体を用いるときには、酵素で活性化可能な標識は、ホスホリル転移の無機のポリホスフェ−ト副産物の上に存在するであろう。ホスファターゼを介するホスホリル転移のポリホスフェ−ト生成物の開裂は、その上に付加した標識における検出可能な変化に至る。ポリメラーゼアッセイをホスファターゼの存在下で実施するときには、ＤＮＡもしくはＲＮＡ合成のリアルタイムモニタリングおよび標的核酸の検出のための便利な方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸配列の存在を検出する方法であって、
ａ) 核酸ポリメラーゼ反応を実施し、当該反応がホスファターゼに実質的に無反応性である少なくとも一つのヌクレオチドおよび少なくとも一つの末端−ホスフェ−ト−標識ヌクレオチドの反応を含み、その反応は標識ポリホスフェ−トの生産をもたらす；
ｂ)当該標識ポリホスフェ−トがホスファターゼと反応して、検出可能な種を生産することを許容すること；および
ｃ)当該検出可能な種の存在を検出すること：
の工程を含む、方法。
【請求項２】
工程(ａ)がホスファターゼの存在下で当該ポリメラーゼ反応を実施することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
当該核酸配列がＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程(ａ)が別個の標識を持つ二つもしくはそれ以上の末端−ホスフェ−ト−標識ヌクレオチドの存在下で当該ポリメラーゼ反応を実施することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、当該標識が化学発光化合物、蛍光原色素、発色性色素、質量タグ、電気化学的タグおよびそれらの組合せからなる群から選択される酵素で活性化可能な標識である、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、当該末端−ホスフェ−ト−標識ヌクレオチドが式Ｉ：
【化１】
2005501567.tif 000029
[式中、Ｐ＝ホスフェ−ト(ＰＯ３)およびその誘導体、ｎは２もしくはそれより大であり；Ｙは酸素もしくは硫黄原子であり；Ｂは窒素含有の複素環式塩基であり；Ｓは非環式部分、炭素環式部分もしくは糖部分であり；Ｌは、天然または修飾ヌクレオチドの末端−ホスフェ−トにおいてホスフェートエステル、チオエステルもしくはホスホラミデート結合を形成するのに適当なヒドロキシル基、スルフヒドリル基またはアミノ基を含む酵素で活性化可能な標識であり；Ｐ−Ｌは、ホスフェ−トが除去されるときに、好ましくは独立して検出可能になるところのホスフェート化標識である]
により表され得る、方法。
【請求項７】
当該末端ホスフェ−ト−標識ヌクレオチドがポリホスフェ−ト鎖において四つもしくはそれ以上のホスフェ−ト基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
当該核酸配列を定量化する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
当該検出可能な種が核酸配列の量と実質的に比例する量で生産される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
当該核酸配列が天然のもしくは合成のオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
当該核酸配列が染色体もしくは染色体の部分である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
当該核酸配列がＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
当該ポリメラーゼ反応が少なくとも一つのＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼの存在下で核酸配列をインキュベートする工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
当該ポリメラーゼ反応において一つもしくはそれ以上のさらに別な検出試薬を含む工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
当該さらに別な検出試薬が当該検出可能な種から検出的に異なるところの応答の能力がある、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
当該さらに別な検出試薬が抗体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
請求項６に記載の方法であって、当該酵素で活性化可能な標識が化学発光化合物、蛍光原色素、発色性色素、質量タグ、電気化学的タグおよびそれらの組合せからなる群から選択される、方法。
【請求項１８】
請求項１に記載の方法であって、当該検出可能な種が色、蛍光放射、化学発光、質量変化、還元／酸化電位もしくはそれらの組み合わせからなる群から選択される性質により検出可能である、方法。
【請求項１９】
請求項６に記載の方法であって、当該ホスフェート化標識が蛍光原部分でありそして２−(５'−クロロ−２'−ホスホリルオキシフェニル)−６−クロロ−４−(３Ｈ)−キナゾリノン、フルオレセイン二ホスフェート、フルオレセイン３'(６')−Ｏ−アルキル−６'(３')−ホスフェート、９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル)ホスフェート、ホスフェート４−メチルウンベリフェリル、ホスフェートレゾルフィン、ホスフェート４−トリフルオロメチルウンベリフェリル、ホスフェートウンベリフェリル、ホスフェート３−シアノウンベリフェリル、ホスフェート９,９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル、ホスフェート６,８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリルおよびそれらの誘導体からなる群から選択される、方法。
【請求項２０】
請求項６に記載の方法であって、当該ホスフェート化標識がホスフェート５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル、ホスフェート３−インドキシル、ホスフェートｐ−ニトロフェニルおよびそれらの誘導体からなる群から選択される発色性部分である、方法。
【請求項２１】
当該化学発光化合物がホスファターゼで活性化された１,２−ジオキセタン化合物である、請求項６に記載の方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、当該１,２−ジオキセタン化合物がホスフェート２−クロロ−５−(４−メトキシスピロ[１,２−ジオキセタン−３,２'−(５−クロロ−)トリシクロ[３,３,１−１３,７]−デカン]−１−イル)−１−フェニル、クロロアダマント−２'−イリデンメトキシフェノキシホスフェート化ジオキセタン、３−(２'−スピロアダマンタン)−４−メトキシ−４−(３''−ホスホリルオキシ)フェニル−１,２−ジオキセタンおよびそれらの誘導体からなる群から選択される、方法。
【請求項２３】
請求項６に記載の方法であって、当該糖部分がリボシル、２'−デオキシリボシル、３'−デオキシリボシル、２',３'−ジデオキシリボシル、２',３'−ジデヒドロジデオキシリボシル、２'−アルコキシリボシル、２'−アジドリボシル、２'−アミノリボシル、２'−フルオロリボシル、２'−メルカプトリボシル、２'−アルキルチオリボシル、炭素環式、非環式および他の修飾糖からなる群から選択される、方法。
【請求項２４】
請求項６に記載の方法であって、当該塩基がウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、グアニン、７−デアザグアニン、ヒポキサンチン、７−デアザヒポキサンチン、アデニン、７−デアザアデニン、２,６−ジアミノプリンもしくはそれらの類似体からなる群から選択される、方法。
【請求項２５】
当該検出可能の種により作製されたスペクトルと既知のスペクトルとの比較により当該核酸配列を定量化する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
ＤＮＡ配列の存在を検出する方法であって、
ａ) 末端−ホスフェ−ト−標識ヌクレオチドの存在下で、ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施し、その反応は標識ポリホスフェ−トの生産をもたらす、；
ｂ)当該標識ポリホスフェ−トがホスファターゼと反応して、検出可能な種を生産することを許容すること；および
ｃ)当該検出可能な種の存在を検出すること：
の工程を含む、方法。
【請求項２７】
工程(ａ)がホスファターゼの存在下で当該ポリメラーゼ反応を実施することをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
工程(ａ)が別個の標識を持つ二つもしくはそれ以上の末端−ホスフェ−ト−標識ヌクレオチドの存在下で当該ポリメラーゼ反応を実施することをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法であって、当該標識が化学発光化合物、蛍光原色素、発色性色素、質量タグ、電気化学的タグおよびそれらの組合せからなる群から選択される酵素で活性化可能な標識である、方法。
【請求項３０】
請求項２６に記載の方法であって、当該末端−ホスフェ−ト−標識ヌクレオチドが式Ｉ：
【化２】
2005501567.tif 000030
[式中、Ｐ＝ホスフェ−ト(ＰＯ３)およびその誘導体、ｎは２もしくはそれより大であり；Ｙは酸素もしくは硫黄原子であり；Ｂは窒素含有の複素環式塩基であり；Ｓは非環式部分、炭素環式部分もしくは糖部分であり；Ｌは、天然または修飾ヌクレオチドの末端−ホスフェ−トにおいてホスフェートエステル、チオエステルもしくはホスホラミデート結合を形成するのに適当なヒドロキシル基、スルフヒドリル基またはアミノ基を含む酵素で活性化可能な標識であり；Ｐ−Ｌは、ホスフェ−トが除去されるときに、好ましくは独立して検出可能になるところのホスフェート化標識である]
により表され得る、方法。
【請求項３１】
当該末端−ホスフェ−ト−標識ヌクレオチドがポリホスフェ−ト鎖において四つもしくはそれ以上のホスフェ−ト基を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
当該ＤＮＡ配列を定量化する工程をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
当該検出可能な種が配列の量と実質的に比例する量で生産される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】
当該ＤＮＡ配列が天然のもしくは合成のオリゴヌクレオチドである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３５】
当該ＤＮＡ配列が染色体もしくは染色体の部分である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３６】
当該ポリメラーゼ反応がＤＮＡポリメラーゼの存在下でＤＮＡ配列をインキュベートする工程をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３７】
当該ポリメラーゼ反応において一つもしくはそれ以上のさらに別な検出試薬を含む工程をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３８】
当該さらに別な検出試薬が当該検出可能な種から検出的に異なるところの応答の能力がある、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
当該さらに別な検出試薬が抗体である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
請求項３０に記載の方法であって、当該酵素で活性化可能な標識が化学発光化合物、蛍光原色素、発色性色素、質量タグ、電気化学的タグおよびそれらの組合せからなる群から選択される、方法。
【請求項４１】
請求項２６に記載の方法であって、当該検出可能な種が色、蛍光放射、化学発光、質量変化、還元／酸化電位もしくはそれらの組み合わせからなる群から選択される性質により検出可能である、方法。
【請求項４２】
請求項３０に記載の方法であって、当該ホスフェート化標識が２−(５'−クロロ−２'−ホスホリルオキシフェニル)−６−クロロ−４−(３Ｈ)−キナゾリノン、フルオレセイン二ホスフェート、フルオレセイン３'(６')−Ｏ−アルキル−６'(３')−ホスフェート、９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル)ホスフェート、ホスフェート４−メチルウンベリフェリル、ホスフェートレゾルフィン、ホスフェート４−トリフルオロメチルウンベリフェリル、ホスフェートウンベリフェリル、ホスフェート３−シアノウンベリフェリル、ホスフェート９,９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル、ホスフェート６,８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリルおよびそれらの誘導体からなる群から選択される蛍光原部分である、方法。
【請求項４３】
請求項３０に記載の方法であって、当該ホスフェート化標識がホスフェート５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル、ホスフェート３−インドキシル、ホスフェートｐ−ニトロフェニルおよびそれらの誘導体からなる群から選択される発色性部分である、方法。
【請求項４４】
当該化学発光化合物がホスファターゼで活性化された１,２−ジオキセタン化合物である、請求項３０に記載の方法。
【請求項４５】
請求項４４に記載の方法であって、当該１,２−ジオキセタン化合物がホスフェート２−クロロ−５−(４−メトキシスピロ[１,２−ジオキセタン−３,２'−(５−クロロ−)トリシクロ[３,３,１−１３,７]−デカン]−１−イル)−１−フェニル、クロロアダマント−２'−イリデンメトキシフェノキシホスフェート化ジオキセタン、３−(２'−スピロアダマンタン)−４−メトキシ−４−(３''−ホスホリルオキシ)フェニル−１,２−ジオキセタンおよびそれらの誘導体からなる群から選択される、方法。
【請求項４６】
請求項３０に記載の方法であって、当該糖部分がリボシル、２'−デオキシリボシル、３'−デオキシリボシル、２',３'−ジデオキシリボシル、２',３'−ジデヒドロジデオキシリボシル、２'−アルコキシリボシル、２'−アジドリボシル、２'−アミノリボシル、２'−フルオロリボシル、２'−メルカプトリボシル、２'−アルキルチオリボシル、炭素環式、非環式および他の修飾糖からなる群から選択される、方法。
【請求項４７】
請求項３０に記載の方法であって、当該塩基がウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、グアニン、７−デアザグアニン、ヒポキサンチン、７−デアザヒポキサンチン、アデニン、７−デアザアデニン、２,６−ジアミノプリンもしくはそれらの類似体からなる群から選択される、方法。
【請求項４８】
当該検出可能の種により作製されたスペクトルと既知のスペクトルとの比較により当該ＤＮＡ配列を定量化する工程をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項４９】
核酸を定量化する方法であって、
(ａ) 核酸ポリメラーゼ反応を実施し、当該反応が、ホスファターゼに実質的に無反応性であるヌクレオチドおよび少なくとも一つの末端−ホスフェ−ト−標識ヌクレオチドの反応を含み、当該反応は標識ポリホスフェ−トの生産をもたらす；
(ｂ)当該標識ポリホスフェ−トがホスファターゼと反応して、検出可能な副産物種を当該核酸の量に実質的に比例する量で生産することを許容すること；
(ｃ)当該検出可能な種を測定すること；および
(ｄ)当該測定を既知の標準を用いて比較して、核酸の量を測定すること：
の工程を含む、方法。
【請求項５０】
工程(ａ)がホスファターゼの存在下で当該ポリメラーゼ反応を実施することをさらに含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
工程(ａ)が別個の標識を持つ二つもしくはそれ以上の末端−ホスフェ−ト−標識ヌクレオチドの存在下で当該ポリメラーゼ反応を実施することをさらに含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
請求項５１に記載の方法であって、当該標識が化学発光化合物、蛍光原色素、発色性色素、質量タグ、電気化学的タグおよびそれらの組合せからなる群から選択される酵素で活性化可能な標識である、方法。
【請求項５３】
請求項４９に記載の方法であって、当該末端−ホスフェ−ト−標識ヌクレオチドが式Ｉ：
【化３】
2005501567.tif 000031
[式中、Ｐ＝ホスフェ−ト(ＰＯ３)およびその誘導体、ｎは２もしくはそれより大であり；Ｙは酸素もしくは硫黄原子であり；Ｂは窒素含有の複素環式塩基であり；Ｓは非環式部分、炭素環式部分もしくは糖部分であり；Ｌは、天然または修飾ヌクレオチドの末端−ホスフェ−トにおいてホスフェートエステル、チオエステルもしくはホスホラミデート結合を形成するのに適当なヒドロキシル基、スルフヒドリル基またはアミノ基を含む酵素で活性化可能な標識であり；Ｐ−Ｌは、ホスフェ−トが除去されるときに、好ましくは独立して検出可能になるところのホスフェート化標識である]
により表され得る、方法。
【請求項５４】
当該末端ホスフェ−ト−標識ヌクレオチドがホスフェ−ト鎖において四つもしくはそれ以上のホスホリル基を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
当該ホスファターゼが当該ホスフェートエステル結合を変化して、当該検出可能な種を生産する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
請求項５３に記載の方法であって、当該糖部分がリボシル、２'−デオキシリボシル、３'−デオキシリボシル、２',３'−ジデオキシリボシル、２',３'−ジデヒドロジデオキシリボシル、２'−アルコキシリボシル、２'−アジドリボシル、２'−アミノリボシル、２'−フルオロリボシル、２'−メルカプトリボシル、２'−アルキルチオリボシル、炭素環式、非環式および他の修飾糖からなる群から選択される、方法。
【請求項５７】
請求項５３に記載の方法であって、当該塩基がウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、グアニン、７−デアザグアニン、ヒポキサンチン、７−デアザヒポキサンチン、アデニン、７−デアザアデニン、２,６−ジアミノプリンもしくはそれらの類似体からなる群から選択される方法。
【請求項５８】
請求項５３に記載の方法であって、当該酵素で活性化可能な標識が化学発光化合物、蛍光原色素、発色性色素、質量タグ、電気化学的タグおよびそれらの組合せからなる群から選択される、方法。
【請求項５９】
請求項５３に記載の方法であって、当該検出可能な種が色、蛍光放射、化学発光、質量変化、還元／酸化電位もしくはそれらの組み合わせからなる群から選択される性質により検出可能である、方法。
【請求項６０】
ＤＮＡ配列を定量化する方法であって、
(ａ)末端−ホスフェ−ト−標識ヌクレオチドの存在下で、ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施し、当該反応は標識ポリホスフェ−トの生産をもたらす；
(ｂ)当該標識ポリホスフェ−トがホスファターゼと反応して、検出可能な副産物種を、当該ＤＮＡ配列の量に実質的に比例する量で生産することを許容すること；
(ｃ)当該検出可能な種を測定すること；および
(ｄ)当該測定を既知の標準を用いて比較して、ＤＮＡの量を測定すること：
の工程を含む、方法。
【請求項６１】
工程(ａ)がホスファターゼの存在下で当該ポリメラーゼ反応を実施することをさらに含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
工程(ａ)が別個の標識を持つ二つもしくはそれ以上の末端−ホスフェ−ト−標識ヌクレオチドの存在下で当該ポリメラーゼ反応を実施することをさらに含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
請求項６２に記載の方法であって、当該標識が化学発光化合物、蛍光原色素、発色性色素、質量タグ、電気化学的タグおよびそれらの組合せからなる群から選択される酵素で活性化可能な標識である、方法。
【請求項６４】
請求項６０に記載の方法であって、当該末端−ホスフェ−ト−標識ヌクレオチドが式Ｉ：
【化４】
2005501567.tif 000032
[式中、Ｐ＝ホスフェ−ト(ＰＯ３)およびその誘導体、ｎは２もしくはそれより大であり；Ｙは酸素もしくは硫黄原子であり；Ｂは窒素含有の複素環式塩基であり；Ｓは非環式部分、炭素環式部分もしくは糖部分であり；Ｌは、天然または修飾ヌクレオチドの末端−ホスフェ−トにおいてホスフェートエステル、チオエステルもしくはホスホラミデート結合を形成するのに適当なヒドロキシル基、スルフヒドリル基またはアミノ基を含む酵素で活性化可能な標識であり；Ｐ−Ｌは、ホスフェ−トが除去されるときに、好ましくは独立して検出可能になるところのホスフェート化標識である]
により表され得る、方法。
【請求項６５】
当該末端−ホスフェ−ト−標識ヌクレオチドがポリホスフェ−ト鎖において四つもしくはそれ以上のホスホリル基を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
当該ホスファターゼが当該ホスフェートエステル結合を変化して、当該検出可能な種を生産する、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
請求項６４に記載の方法であって、当該糖部分がリボシル、２'−デオキシリボシル、３'−デオキシリボシル、２',３'−ジデオキシリボシル、２',３'−ジデヒドロジデオキシリボシル、２'−アルコキシリボシル、２'−アジドリボシル、２'−アミノリボシル、２'−フルオロリボシル、２'−メルカプトリボシル、２'−アルキルチオリボシル、炭素環式、非環式および他の修飾糖からなる群から選択される、方法。
【請求項６８】
請求項６４に記載の方法であって、当該塩基がウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、グアニン、７−デアザグアニン、ヒポキサンチン、７−デアザヒポキサンチン、アデニン、７−デアザアデニン、２,６−ジアミノプリンもしくはそれらの類似体からなる群から選択される方法。
【請求項６９】
請求項６４に記載の方法であって、当該酵素で活性化可能な標識が化学発光化合物、蛍光原色素、発色性色素、質量タグ、電気化学的タグおよびそれらの組合せからなる群から選択される、方法。
【請求項７０】
請求項６０に記載の方法であって、検出可能な種が色、蛍光放射、化学発光、質量変化、還元／酸化電位もしくはそれらの組み合わせからなる群から選択される性質により検出可能である、方法。
【請求項７１】
核酸配列中で単一のヌクレオチドの同一性を決定する方法であって、
(ａ)少なくとも一つの末端−ホスフェ−ト−標識ヌクレオチドの存在下で、核酸ポリメラーゼ反応を実施し、その反応は標識ポリホスフェ−トの生産をもたらす；
(ｂ)当該標識ポリホスフェ−トがホスファターゼと反応して、検出可能な種を生産することを許容すること；
(ｃ)当該検出可能な種の存在を検出すること；および
(ｄ)組み込まれたヌクレオシドを同定すること：
の工程を含む、方法。
【請求項７２】
工程(ａ)がホスファターゼの存在下で当該ポリメラーゼ反応を実施することをさらに含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
当該末端ホスフェ−ト−標識ヌクレオチドがポリホスフェ−ト鎖において四つもしくはそれ以上のホスフェート基を含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
工程(ａ)が別個の標識を持つ二つもしくはそれ以上の末端−ホスフェ−ト−標識ヌクレオチドの存在下で当該ポリメラーゼ反応を実施することをさらに含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７５】
核酸配列の存在を検出する方法であって、
(ａ)ポリホスフェ−ト鎖中に四つもしくはそれ以上のホスフェ−ト基を有する少なくとも一つの末端−ホスフェ−ト−標識ヌクレオチドの存在下で、核酸ポリメラーゼ反応を実施し、その反応は標識ポリホスフェ−トの生産をもたらす；および
(ｂ)当該標識ポリホスフェ−トを検出すること：
の工程を含む、方法。
【請求項７６】
工程(ａ)が別個の標識を持つ二つもしくはそれ以上の末端−ホスフェ−ト−標識ヌクレオチドの存在下で当該ポリメラーゼ反応を実施することをさらに含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
核酸配列の存在を検出する方法であって、
(ａ)ポリホスフェ−ト鎖中に四つもしくはそれ以上のホスフェ−ト基を有する少なくとも一つの末端−ホスフェ−ト−標識ヌクレオチドの存在下で、核酸ポリメラーゼ反応を実施し、その反応は標識ポリホスフェ−トの生産をもたらす；
(ｂ)当該標識ポリホスフェ−トがホスファターゼと反応して、検出可能な種を生産することを許容すること；および
(ｃ)当該検出可能な種の存在を検出すること：
の工程を含む、方法。
【請求項７８】
工程(ａ)がホスファターゼの存在下で当該ポリメラーゼ反応を実施することをさらに含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
当該核酸配列を定量化する工程をさらに含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
工程(ａ)が別個の標識を持つ二つもしくはそれ以上の末端−ホスフェ−ト−標識ヌクレオチドの存在下で当該ポリメラーゼ反応を実施することをさらに含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項８１】
核酸配列中の単一ヌクレオチドの同一性を決定する方法であって、
(ａ)ポリホスフェ−ト鎖中に四つもしくはそれ以上のホスフェ−ト基を有する少なくとも一つの末端−ホスフェ−ト−標識ヌクレオチドの存在下で、核酸ポリメラーゼ反応を実施し、その反応は標識ポリホスフェ−トの生産をもたらす；
(ｂ)当該標識ポリホスフェ−トがホスファターゼと反応して、検出可能な種を生産することを許容すること；
(ｃ)当該検出可能な種の存在を検出すること；および
(ｄ)組み込まれたヌクレオシドを同定すること
の工程を含む、方法。
【請求項８２】
工程(ａ)がホスファターゼの存在下で当該ポリメラーゼ反応を実施することをさらに含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
核酸検出キットであって、
(ａ)式：
【化５】
2005501567.tif 000033
[式中、Ｐ＝ホスフェ−ト(ＰＯ３)およびその誘導体、ｎは２もしくはそれより大であり；Ｙは酸素もしくは硫黄原子であり；Ｂは窒素含有の複素環式塩基であり；Ｓは非環式部分、炭素環式部分もしくは糖部分であり；Ｌは、天然または修飾ヌクレオチドの末端−ホスフェ−トにおいてホスフェートエステル、チオエステルもしくはホスホラミデート結合を形成するのに適当なヒドロキシル基、スルフヒドリル基またはアミノ基を含む酵素で活性化可能な標識であり；Ｐ−Ｌは、ホスフェ−トが除去されるときに、好ましくは独立して検出可能になるところのホスフェート化標識である]
にしたがう少なくとも一つもしくはそれ以上の末端−ホスフェ−ト−標識ヌクレオチド；
(ｂ)ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼおよび逆転転写酵素からなる群から選択される少なくとも一つの酵素；および
(ｃ)ホスファターゼ
を含む、キット。
【請求項８４】
当該末端ホスフェ−ト−標識ヌクレオチドがポリホスフェ−ト鎖において四つもしくはそれ以上のホスフェート基を含む、請求項８３に記載のキット。
【請求項８５】
請求項８３に記載のキットであって、当該糖部分がリボシル、２'−デオキシリボシル、３'−デオキシリボシル、２',３'−ジデオキシリボシル、２',３'−ジデヒドロジデオキシリボシル、２'−アルコキシリボシル、２'−アジドリボシル、２'−アミノリボシル、２'−フルオロリボシル、２'−メルカプトリボシル、２'−アルキルチオリボシル、炭素環式、非環式および他の修飾糖からなる群から選択される、キット。
【請求項８６】
請求項８３に記載のキットであって、当該塩基がウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、グアニン、７−デアザグアニン、ヒポキサンチン、７−デアザヒポキサンチン、アデニン、７−デアザアデニン、２,６−ジアミノプリンもしくはそれらの類似体からなる群から選択されるキット。
【請求項８７】
請求項８３に記載のキットであって、当該酵素で活性化可能な標識が化学発光化合物、蛍光原色素、発色性色素、質量タグ、電気化学的タグおよびそれらの組合せからなる群から選択される、キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
(関連出願)
本出願は、２００１年８月２９日に出願した、米国仮出願第６０／３１５,７９８号の表題３５§１１９(ｅ)の下で優先権の恩典を主張する。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、核酸ポリメラーゼのための基質として三つもしくはそれ以上のホスフェ−トを含む末端−ホスフェ−ト−標識ヌクレオチドの使用に基づいて、試料中でポリヌクレオチドを検出する方法に一般的に関する。使用される標識は、酵素で活性化可能であって、化学発光性の、蛍光性の、電気化学的なおよび発色性の部分ならびに質量タグを含む。
【０００３】
（背景技術）
高度の特異性および感度を持って試料中で特異的な核酸もしくはアナライトを検出する方法は公知である。そのような方法は一般的に、特異的な標的配列もしくはアナライトの存在に基づいて核酸配列を先ず増幅することを必要とする。増幅に引き続いて、増幅された配列が検出されて、定量化される。核酸のための従来の検出システムには、蛍光性の標識の検出、蛍光性の酵素−結合検出システム、抗体−仲介標識検出および放射性標識の検出が含まれる。
【０００４】
現在広く使用される検出方法の一つの不利点は、最終の標識生成物もしくは副産物から標識出発材料を分離する必要である。そのような分離は一般的に、検出のためにゲル電気泳動もしくは標的配列の膜の上への固定化を必要とする。さらに、そこには、検出のために必要な数多くの試薬および／もしくはインキュベーション工程がしばしばある。
【０００５】
ＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼは、トリホスフェ−ト部分のガンマ位置におけるかもしくは代わりに修飾を持つヌクレオシドを認識して、利用することができることが知られている。種々のポリメラーゼがガンマ−修飾ヌクレオチド三ホスフェート(ＮＴＰの)を認識して、利用する能力は、ガンマホスフェ−トに付加した部分に依存して変わるように見えることがさらに公知である。一般に、ＲＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼよりさらに無差別である。
【０００６】
ガンマ−ホスフェ−トで修飾したヌクレオチドの存在下でＲＮＡポリメラーゼからＲＮＡ合成をモニターするための比色アッセイは以前に報告されている。この先行報告においては、ＲＮＡポリメラーゼ反応は、ガンマ−ホスフェ−トにおいてジニトロフェニル基で修飾した、ガンマ−修飾のアルカリ性ホスファターゼ耐性のヌクレオチド三ホスフェートの存在下で実施された。ＲＮＡポリメラーゼ反応が、単なるヌクレオチド三ホスフェートおよびホモポリマー性鋳型としてこのガンマ−修飾のＮＴＰの存在下で実施されたときには、ＲＮＡポリメラーゼが修飾ＮＴＰを認識して、利用することが出来たことが見出された。さらに、ポリメラーゼ反応が、発色性ｐ−ニトロフェニレートへのホスホリル転移のｐ−ニトロフェニルピロホスフェートのアルド−生成物を消化した、アルカリ性ホスファターゼの存在下で実施されたときには、吸光度の増加が報告された。この検出方法の不利点は、アルカリ性ホスファターゼの存在下で実施される、リアルタイム比色アッセイは、ホモポリマー性鋳型でもって単に働くことである。
【０００７】
それ故に、ヘテロポリマー性鋳型の存在下でＲＮＡを検出する方法を提供することは恩恵をもたらして、その方法は、アルカリ性ホスファターゼに実質的に無反応性である単なるヌクレオチドとして、単一の末端−ホスフェ−ト修飾のヌクレオチドを使用することに限定されないであろう。これは、ヘテロポリマー性鋳型を用いるＲＮＡ合成のリアルタイムモニタリングのための単一管アッセイを許容するであろう。
【０００８】
末端−ホスフェ−ト上の標識の同一性を変えて、ＲＮＡポリメラーゼによるさらに良い認識および利用を許容する、ＲＮＡのための同様なアッセイを提供することはさらに恩恵をもたらすであろう。さらに、単に簡単で日常的な計測器が検出に必要とされるであろう、化学発光性のおよび蛍光性の検出、質量もしくは還元電位による分析を、ならびに改良された比色性の検出を許容するように、末端−ホスフェ−ト上の標識を変えられるかもしれないことが望ましい。
【０００９】
末端位置における部分の同一性がヌクレオチドに対するＤＮＡポリメラーゼの特異性に大きく影響し得る、末端で修飾したヌクレオチドの認識および利用に関してＤＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼより少なく無差別であると当分野で公知であるとすると、ＤＮＡポリメラーゼ活性をモニターすることによりＤＮＡを検出するための非−放射性方法を提供することが高度に望まれるであろう。さらに、ＤＮＡの合成および検出がリアルタイムモニタリングのための単一管アッセイで達成され得ることならびにクレオチド基質の末端−ホスフェ−トにおける標識が、化学発光性の、蛍光性の、および比色性の検出ならびに質量もしくは還元電位による分析を包含し得ることが望まれるであろう。
【００１０】
(本発明の概要)
本発明は、核酸配列の存在を検出する方法であって、ａ) 核酸ポリメラーゼ反応を実施し、反応がホスファターゼに実質的に無反応性である少なくとも一つのヌクレオチドおよび少なくとも一つの末端−ホスフェ−ト−標識ヌクレオチドの反応を含み、その反応は標識ポリホスフェ−トの生産をもたらす；ｂ)標識ポリホスフェ−トがホスファターゼと反応して、検出可能な種を生産することを許容すること；およびｃ)検出可能な種の存在を検出すること：の工程を含む方法を提供する。現行の発明におけるホスファターゼの定義には、ホスフェートモノエステル、ポリホスフェ−トおよび無機のホスフェ−トを放出するヌクレオチドを開裂するところの任意の酵素が含まれる。本発明の文脈において、この酵素は、末端標識ヌクレオシドホスフェ−トを開裂しない(即ち、末端−ホスフェ−ト−標識ヌクレオチドはホスファターゼに実質的に無反応性である)。本明細書中で提供されるホスファターゼの定義には、限定するものではないが、アルカリ性ホスファターゼ(ＥＣ３.１.３.１)および酸性ホスファターゼ(ＥＣ３.１.３.２)が特異的に含まれる。現行の発明におけるヌクレオチドの定義には、天然もしくは修飾ヌクレオシドホスフェ−トが含まれる。
【００１１】
本発明は、ＤＮＡ配列の存在を検出する方法であって、ａ)末端−ホスフェ−ト−標識ヌクレオチドの存在下で、ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施し、その反応は標識ポリホスフェ−トの生産をもたらす；ｂ)標識ポリホスフェ−トがホスファターゼと反応して、検出可能な種を生産することを許容すること；およびｃ)検出可能な種の存在を検出すること：の工程を含む、方法をさらに提供する。
【００１２】
また、核酸配列の存在を検出する方法であって、(ａ)ポリホスフェ−ト鎖中に四つもしくはそれ以上のホスフェ−ト基を有する少なくとも一つの末端−ホスフェ−ト−標識ヌクレオチドの存在下で、核酸ポリメラーゼ反応を実施し、その反応は標識ポリホスフェ−トの生産をもたらす；および(ｂ)標識ポリホスフェ−トを検出すること：の工程を含む、方法が提供される。
【００１３】
加えて、本発明は、核酸配列の存在を検出する方法であって、(ａ)ポリホスフェ−ト鎖中に四つもしくはそれ以上のホスフェ−ト基を有する少なくとも一つの末端−ホスフェ−ト−標識ヌクレオチドの存在下で、核酸ポリメラーゼ反応を実施し、その反応は標識ポリホスフェ−トの生産をもたらす；(ｂ)標識ポリホスフェ−トがホスファターゼと反応して、検出可能な種を生産することを許容すること；および(ｃ)検出可能な種の存在を検出すること：の工程を含む、方法に関する。
【００１４】
本発明のさらなる態様は、核酸を定量化する方法であって、(ａ) 核酸ポリメラーゼ反応を実施し、反応が、ホスファターゼに実質的に無反応性であるクレオチドおよび少なくとも一つの末端−ホスフェ−ト−標識ヌクレオチドの反応を含み、その反応は標識ポリホスフェ−トの生産をもたらす；(ｂ)標識ポリホスフェ−トがホスファターゼと反応して、検出可能な副産物種を核酸の量に実質的に比例する量で生産することを許容すること；(ｃ)検出可能な種を測定すること；および(ｄ)測定を既知の標準を用いて比較して、核酸の量を測定すること：の工程を含む、方法に関する。
【００１５】
本発明は、ＤＮＡ配列を定量化する方法であって、(ａ)末端−ホスフェ−ト−標識ヌクレオチドの存在下で、ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施し、その反応は標識ポリホスフェ−トの生産をもたらす；(ｂ)標識ポリホスフェ−トがホスファターゼと反応して、検出可能な副産物種をＤＮＡ配列の量に実質的に比例する量で生産することを許容すること；(ｃ)検出可能な種を測定すること；および(ｄ)測定を既知の標準を用いて比較して、ＤＮＡの量を測定すること：の工程を含む、方法にさらに関する。
【００１６】
本発明のもう一つの態様は、核酸配列中で単一のヌクレオチドの同一性を決定する方法であって、(ａ)少なくとも一つの末端ホスフェ−ト−標識ヌクレオチドの存在下で、核酸ポリメラーゼ反応を実施し、その反応は標識ポリホスフェ−トの生産をもたらす；(ｂ)標識ポリホスフェ−トがホスファターゼと反応して、検出可能な種を生産することを許容すること；(ｃ)検出可能な種の存在を検出すること；および(ｄ)組み込まれたヌクレオシドを同定すること：の工程を含む、方法に関する。
【００１７】
また、核酸配列中で単一のヌクレオチドの同一性を決定する方法であって、以下の工程：(ａ)ポリホスフェ−ト鎖中に四つもしくはそれ以上のホスフェ−ト基を有する少なくとも一つの末端−ホスフェ−ト−標識ヌクレオチドの存在下で、その反応は標識ポリホスフェ−トの生産をもたらす、核酸ポリマー反応を実施すること；(ｂ)標識ポリホスフェ−トがホスファターゼと反応して、検出可能な種を生産することを許容すること；(ｃ)当該検出可能な種の存在を検出すること；および(ｄ)組み込まれたヌクレオシドを同定すること、を含む、方法が提供される。
【００１８】
本発明はさらに、核酸検出キットであって、そのキットが、
(ａ)下の式Ｉ：
【化１】
2005501567.tif 000002
[式中、Ｐ＝ホスフェ−ト(ＰＯ３)およびその誘導体、ｎは２もしくはそれより大であり；Ｙは酸素もしくは硫黄原子であり；Ｂは窒素含有の複素環式塩基であり；Ｓは非環式部分、炭素環式部分もしくは糖部分であり；Ｌは、天然または修飾ヌクレオチドの末端−ホスフェ−トにおいてホスフェートエステル、チオエステルもしくはホスホラミデート結合を形成するのに適当なヒドロキシル基、スルフヒドリル基またはアミノ基を含む酵素で活性化可能な標識であり；Ｐ−Ｌは、ホスフェ−トが除去されるときに、好ましくは独立して検出可能になるところのホスフェート化標識である]
にしたがう少なくとも一つもしくはそれ以上の末端−ホスフェ−ト−標識ヌクレオチド；
(ｂ)少なくとも一つのＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼもしくは逆転転写酵素；
および
(ｃ)ホスファターゼ
を含む、キットをさらに含む。
【００１９】
(好ましい実施態様の詳細な説明)
本明細書中で定義される際には、用語“ヌクレオシド”とは、炭素環式のもしくは非環式の部分のような、糖または糖代用品（sugar substitute）に結合したプリン、デアザプリン、ピリミジンまたは修飾塩基を、１'位置または同等な位置に含む化合物であって、２'−デオキシおよび２'−ヒドロキシル、ならびに２',３'−ジデオキシ形ならびに他の置換を含む。
【００２０】
本明細書中で使用される際には、用語“ヌクレオチド”とは、エステル化部位がペントース糖のＣ−５位置に付加したヒドロキシル基に典型的には対応する、ヌクレオシドのホスフェートエステルを指す。
【００２１】
用語“オリゴヌクレオチド”には、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド等を含む、ヌクレオチドの線状オリゴマーもしくはそれらの誘導体が含まれる。本明細書を通じて、オリゴヌクレオチドが文字の配列により表されるときは何時でも、ヌクレオチドは、左から右に５'→３'の順序にあって、そこでは、別に指示が無い限り、Ａはデオキシアデノシンを意味し、Ｃはデオキシシチジンを意味し、Ｇはデオキシグアノシンを意味し、そしてＴはチミジンを意味する。
【００２２】
用語“プライマー”とは、ユニークな核酸配列に特異的な方式でアニールして、そのユニークな配列の増幅を許容するところの線状オリゴヌクレオチドを指す。
【００２３】
語句“標的核酸配列”等とは、その配列の同一性、またはヌクレオシドの順番もしくは位置が本発明の一つもしくはそれ以上の方法により決定される、核酸を指す。
【００２４】
本発明は、便利なアッセイがＲＮＡもしくはＤＮＡ合成を核酸ポリメラーゼ活性を介してモニターするために用いられる、試料中でポリヌクレオチドを検出する方法に関する。ＲＮＡおよびＤＮＡポリメラーゼは、ヌクレシド三ホスフェート(ＮＴＰ)もしくはデオキシヌクレオシド三ホスフェート(ｄＮＴＰ)から成長するオリゴヌクレオチド鎖の３'ヒドロキシルへのヌクレオシド一ホスフェートの転移を介してオリゴヌクレオチドを合成する。この反応を駆動する力は、酸無水物結合の開裂および無機のピロホスフェ−トの付随する形成である。本発明は、ヌクレオチドの末端−ホスフェ−トの構造的修飾はポリメラーゼ反応において機能するその能力を破棄しないという発見を利用する。オリゴヌクレオチドの合成反応は、ヌクレオチドのα−およびβ−ホスホリル基においてのみ直接な変化を伴い、末端ホスフェ−ト位置における修飾を持つヌクレオチドを核酸ポリメラーゼ反応のための基質として貴重であるようにさせる。
【００２５】
特定の実施態様において、ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩもしくはＩＩＩまたはＤＮＡポリメラーゼα、β、γ、または末端デオキシヌクレオチジル転移酵素もしくはテロメラーゼのような、ＤＮＡポリメラーゼである。他の実施態様において、適当なポリメラーゼには、限定するものではないが、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ、プライマーゼ、もしくはＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ(逆転転写酵素)が含まれる。
【００２６】
本発明により提供される方法は、末端−ホスフェ−トに付加した電気化学的標識、質量タグ、または比色性色素、化学発光性のもしくは蛍光性の標識を持つデオキシヌクレオシドポリホスフェート、ジデオキシヌクレオシドポリホスフェート、炭素環式のヌクレオシドポリホスフェート、もしくは非環式のヌクレオシドポリホスフェート類似体のような、ヌクレオシドポリホスフェートを利用する。核酸ポリメラーゼがこの類似体を基質として用いるときには、酵素で活性化可能な標識は、ホスホリル転移の無機のポリホスフェ−ト副産物上に存在するであろう。ホスファターゼを介するホスホリル転移のポリホスフェ−ト生成物の開裂は、その上に付加した標識中で検出可能な変化に至る。ＲＮＡおよびＤＮＡポリメラーゼは、修飾した末端ホスホリル基を持つヌクレオチドを認識することができる一方で、本発明者等はこの出発材料はホスファターゼのための鋳型ではないことを決定していることが注目される。下の反応式は、本発明の方法において最も関連する分子；即ち、末端−ホスフェ−ト−標識ヌクレオチド、標識ポリホスフェ−ト副産物および酵素で活性化された標識、を示す。
【化２】
2005501567.tif 000003
【００２７】
上の反応式において、ｎは１もしくはそれより大であり、Ｒ１およびＲ２は独立してＨ、ＯＨ、ＳＨ、ＳＲ、ＯＲ、Ｆ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ、Ｎ３、ＮＨＲもしくはＮＨ２であり；Ｂはヌクレオチド塩基もしくは修飾複素環式塩基であり；ＸはＯ、ＳもしくはＮＨであり；ＹはＯ、ＳもしくはＢＨ３であり；そしてＬは、発色性の、蛍光原の、化学発光の分子、質量タグ、電気化学的タグであり得るところのホスファターゼで活性化可能な標識である。質量タグは、質量の相違により他の成分から容易に識別可能であるところの質量スペクトル法に適当な小分子量部分である。電気化学的タグは、容易に酸化可能なもしくは還元可能な種である。ｎが２もしくはそれより大であるときには、ヌクレオチドは、ｎが１であるときよりポリメラーゼに対して顕著にさらに良い基質であることが発見されている。それ故に、好ましい実施態様において、ｎは２，３もしくは４であり；Ｒ１およびＲ２は独立してＨもしくはＯＨであり；ＸおよびＹはＯであり；Ｂはヌクレオチド塩基であり；そしてＬは、発色性の、蛍光原のもしくは化学発光の分子である。
【００２８】
本明細書中で提供される核酸配列の存在を検出する方法の一つの実施態様において、工程は、(ａ) 核酸ポリメラーゼ反応を実施し、反応が一つの末端−ホスフェ−ト−標識ヌクレオチドに加えて、ホスファターゼに実質的に無反応性である少なくとも一つのヌクレオチドを含み、ポリメラーゼ反応が標識ポリホスフェ−トの生産をもたらす；ｂ)標識ポリホスフェ−トが、ホスフェートエステルを加水分解するのに適当なホスファターゼと反応して、検出可能な種を生産することを許容すること；およびｃ)適当な手段により検出可能な種の存在を検出することを含む。この実施態様において、核酸ポリメラーゼ反応のために用いられる鋳型は、ヘテロポリマー性のもしくはホモポリマー性の鋳型であり得る。末端−ホスフェ−ト−標識ヌクレオチドとは、ヌクレオシド一ホスフェートの組み込みに引き続いて付随的に放出された標識ホスフェ−トがホスファターゼと反応して、検出可能な種を生産し得ることを本明細書を通して意味する。ホスファターゼに実質的に無反応性である反応に含まれる他のヌクレオチドは、例えば、検出可能な種の生産に至らない部分により末端−ホスフェ−トにおいてブロックされ得る。この特別な実施態様において検出のための核酸には、ＲＮＡ、天然のもしくは合成のオリゴヌクレオチド、ミトコンドリアのまたは染色体のＤＮＡが含まれ得る。
【００２９】
本発明は、ＤＮＡ配列の存在を検出する方法であって、(ａ)末端−ホスフェ−ト−標識ヌクレオチドの存在下で、ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施し、その反応は標識ポリホスフェ−トの生産をもたらす；(ｂ)標識ポリホスフェ−トがホスファターゼと反応して、検出可能な種を生産することを許容すること；および(ｃ)当該検出可能な種の存在を検出すること：の工程を含む、方法をさらに提供する。検出のためのＤＮＡ配列には、細胞から分離されたＤＮＡ、重亜硫酸塩で処理されたメチル化ＤＮＡのような化学的に処理されたＤＮＡまたは当分野で既知な方法にしたがい化学的にもしくは酵素的に合成されたＤＮＡが含まれ得る。そのような方法には、ＰＣＲならびに「ＤＮＡ構造パートＡ：ＤＮＡの合成および物理分析」、Lilley, D.M.J. and Dahlberg, J.E. (Eds.), Methods Enzymol., 211, Academic Press, Inc., New York (1992)[出典明示により本明細書の一部とする]、に記載されているものが含まれる。ＤＮＡ配列にはさらに、染色体のＤＮＡおよび天然のもしくは合成のオリゴヌクレオチドが含まれ得る。ＤＮＡは二本−もしくは一本−鎖のどちらかであり得る。
【００３０】
本発明の方法はさらに、ポリメラーゼ反応において一つもしくはそれ以上のさらに別な検出試薬を含む工程を含み得る。さらに別な検出試薬は、検出可能な種から検出的に異なるところの応答の能力があり得る。例えば、さらに別な検出試薬は抗体であり得る。
【００３１】
ポリメラーゼ反応において基質としての添加のために適当なヌクレオチドには、デオキシリボヌクレオシドポリホスフェート、リボヌクレオシドポリホスフェート、ジデオキシヌクレオシドポリホスフェート、炭素環式のヌクレオシドポリホスフェート、および非環式のヌクレオシドポリホスフェートならびにそれらの類似体を、限定するものではないが、含むような、ヌクレオシドポリホスフェートが含まれる。特別に望ましいのは、末端ホスフェ−トが標識されている、ポリホスフェ−ト鎖中に３，４もしくは５個のホスフェ−ト基を含むヌクレオチドである。
【００３２】
ポリホスフェ−ト鎖中に四つもしくはそれ以上のホスフェ−トを有する末端−ホスフェ−ト−標識ヌクレオチドを含む実施態様において、ホスホリル転移の標識ポリホスフェ−ト副産物は、ホスファターゼ処置の使用無しに検出されえることは本発明の意図の内にあることが注目される。例えば、天然もしくは修飾ヌクレオシド塩基、特にグアニン、は蛍光マーカーの失活を引き起こすことができることは公知である。それ故に、末端−ホスフェ−ト−標識ヌクレオチドにおいては、標識は、塩基により部分的に失活させられ得る。ヌクレオシド一ホスフェートの組み込みで、標識ポリホスフェ−ト副産物は、その強化された蛍光により検出され得る。これに代えて、標識ポリホスフェ−ト生成物を、蛍光、色、化学発光もしくは電気化学的検出による同定の前にクロマトグラフ的分離方法により物理的に分離することが可能である。加えて、質量スペクトル法を用いて、質量の相違により生成物を検出できるかもしれない。
【００３３】
本発明の方法は、少なくとも一つのＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼの存在下でポリメラーゼ反応を実施することを含み得る。適当な核酸ポリメラーゼにはまた、プライマーゼ、テロメラーゼ、末端デオキシヌクレオチジル転移酵素および逆転転写酵素が含まれ得る。核酸鋳型が、ポリメラーゼ反応が起こるために必要とされ得て、ポリメラーゼ反応溶液に添加され得る。本発明の検出方法における工程(ａ)、(ｂ)および(ｃ)の全ては、単一の均一な反応混合液を用いて同時に行い、ならびに逐次的に行えるかもしれないことが期待される。
【００３４】
核酸ポリメラーゼ反応がポリメラーゼを利用する増幅方法を含み得ることは、本発明の意図内に十分ある。そのような方法の例には、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)、ローリングサークル増幅(ＲＣＡ)および核酸配列ベースの増幅(ＮＡＳＢＡ)が含まれる。例えば、標的分子がＤＮＡのような核酸ポリマーであるところでは、それは、アデニン、チミン、シトシン、グアニンもしくは他の窒素複素環式塩基のようなガンマ−ホスフェ−ト標識ヌクレオチド塩基のＤＮＡ分子内へのＰＣＲ組み込みにより検出され得る。ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)方法は、Saiki et al in Science Vol. 239, page 487, 1988, Mullis et al、米国特許第４,６８３,１９５and by Sambrook, J. et al. (Eds.)、「分子クローニング、第二版」、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1980), Ausubel, F.M. et al. (Eds.)、「分子生物学における現行の実験計画」、John Wiley & Sons, Inc., NY (1999), and Wu, R. (Ed.)、「組み換えＤＮＡ方法論ＩＩ、発酵学における方法」、Academic Press, Inc., NY, (1995)、により記載されている。ＰＣＲを用いて、ＤＮＡのような検出のための標的核酸は、それをＰＣＲ試薬および適切なプライマーを含有する反応容器の中に直接に置くことにより増幅される。典型的には、標的核酸の少なくとも部分に配列で相補的であるプライマーが選択される。
【００３５】
本発明の方法の工程(ａ)を実施するのに適当な核酸ポリメラーゼ反応は、核酸配列を増幅する種々のＲＣＡ方法をさらに含み得ることが注目される。例えば、Lizardi, Paul Mへの米国特許第５,８５４,０３３号[出典明示により本明細書の一部とする]、に開示されたものが有用である。ポリメラーゼ反応は、システムが、ＤＮＡでなく、ＲＮＡの増幅を伴い、そして増幅は同温であり、一つの温度(４１℃)で起こる、核酸配列ベースの増幅(ＮＡＳＢＡ)をさらに含み得る。標的ＲＮＡのＮＡＳＢＡによる増幅は、試料の標的ＲＮＡに向けて指向されたオリゴヌクレオチドプライマーと一緒に三つの酵素：逆転転写酵素、Rnase  ＨおよびＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、の調和した活性を伴う。これらの酵素は、四つの工程：拡張、分解、ＤＮＡ合成および環状ＲＮＡ増幅、において標的一本鎖ＲＮＡの指数的増幅に触媒作用を及ぼす。
【００３６】
ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＣＡおよびＮＡＳＢＡの方法は一般的に、標的核酸の初期量を増幅生成物の定量化により間接的に測定することを必要とする。典型的には、増幅生成物は、アガロースゲル上の電気泳動を介して出発材料から先ず分離されて、成功的な増幅を確認して、次いで、蛍光標識の検出、酵素−結合検出システム、抗体−仲介標識検出および放射性標識の検出のような、核酸のための従来の検出システムのいずれかを用いて定量化される。対照的に、本方法は、これらの生成物を検出できる前に出発材料からポリメラーゼ反応の生成物を分離する必要を除外する。例えば、本発明においては、レポーター分子(蛍光性の、化学発光性のもしくは発色性の)または他の有用な分子を、ホスフェ−ト付加によりマスクされたときには特定の条件下で検出可能でないような方式で、ヌクレオチドに付加させる。しかしながら、成長するオリゴヌクレオチド鎖の中にヌクレオチドの組み込みおよび反応液のホスファターゼ処理に引き続いては、これらの条件下で標識は検出可能である。例えば、もしも１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン(ＤＤＡＯ)の三重環構造の側上のヒドロキシル基がヌクレオチドの末端−ホスフェ−ト位置に付加されるならば、ＤＤＡＯは６５９ｎｍにおいて蛍光を放たない。一旦ヌクレオシド一ホスフェートがＤＮＡの中に組み込まれると、他の生成物である、ＤＤＡＯポリホスフェート(これもまた６５９ｎｍにおいて蛍光を放たない)がホスファターゼに対する基質である。一旦脱ホスフェート化して、ＤＤＡＯを形成すると、色素部分は６５９ｎｍにおいて蛍光性にかつそれ故に検出可能になるであろう。ポリホスフェ−ト生成物の特異的分析を、出発材料から反応生成物を分離する必要を除外して、ポリメラーゼ反応溶液中で行うことができる。この方式は、分光光度計のような日常的な計測器を用いて、検出および、任意に、ポリメラーゼ反応の間に形成される核酸の定量化を許容する。
【００３７】
上述の方法において、ポリメラーゼ反応工程はさらに、標識ポリホスフェ−ト副産物を検出可能な標識へ転化するところのホスファターゼの存在下でポリメラーゼ反応を実施することを含み得る。それ自体で、検出可能種の形成の連続的モニタリングを許容する便利なアッセイが、核酸配列の存在を検出するために確立される。これは、その中で単一の管の中で実施できる均一系アッセイフォーマットを表す。
【００３８】
上述のアッセイ方法の一つのフォーマットには、限定するものではないが、検出可能な種、例えば、末端−ホスフェ−ト−修飾ＡＴＰを生産する能力がある末端−ホスフェ−ト−標識ヌクレオチドの単一タイプの存在下でポリメラーゼ反応を実施することが含まれ得て、そこでは全ての他のヌクレオチドはホスファターゼに実質的に無反応性であるが、非−検出可能種を生成する。
【００３９】
もう一つのアッセイフォーマットでは、二つ以上のタイプの末端−ホスフェ−ト−標識ヌクレオチドの存在下でポリメラーゼ反応を実施し得て、それぞれのタイプはユニークに検出可能な種を生産する能力がある。例えば、アッセイは、ホスホリル転移の無機ポリホスフェ−ト副産物から酵素的に遊離されたときに、第一の波長で光を放射する第一の標識に関連するところの第一のヌクレオチド(例えば、アデニンポリホスフェート)および第二の波長で光を放射する第二の標識に関連するところの第二のヌクレオチド(例えば、グアノシンポリホスフェート)を含み得る。望ましくは、第一および第二波長の放射は、実質的に少ないかまったく無い重複を有する。ヌクレオシド配列情報に基づく多重の同時アッセイが、それ故に、ポリホスフェ−トから放出される特別な標識に基づいて誘導され得ることは本発明の意図の内にある。
【００４０】
上述の核酸配列の存在を検出する方法の一つの態様において、末端−ホスフェ−ト−標識ヌクレオチドは、以下の構造(式Ｉ)：
【化３】
2005501567.tif 000004
[式中、Ｐ＝ホスフェ−ト(ＰＯ３)およびその誘導体、ｎは２もしくはそれより大であり；Ｙは酸素もしくは硫黄原子であり；Ｂは窒素含有の複素環式塩基であり；Ｓは非環式部分、炭素環式部分もしくは糖部分であり；Ｌは、天然または修飾ヌクレオチドの末端−ホスフェ−トにおいてホスフェートエステル、チオエステルもしくはホスホラミデート結合を形成するのに適当なヒドロキシル基、スルフヒドリル基またはアミノ基を含む酵素で活性化可能な標識であり；Ｐ−Ｌは、ホスフェ−トが除去されるときに、好ましくは独立して検出可能になるところのホスフェート化標識である]
により表され得る。
【００４１】
本発明の方法の目的には、有用な炭素環式部分は、Ferraro, M. and Gotor, V. in Chem Rev. 2000, volume 100, 4319-48、により記載されている。適当な糖部分は、Joeng, L.S. et al., in J Med. Chem. 1993, vol. 356, 2627-38; by Kim H.O. et al., in J Med. Chem. 193, vol. 36, 30-7; and by Eschenmosser A., in Science 1999, vol. 284, 2118-2124、により記載されている。さらに、有用な非環式部分は、Martinez, C.I., et al., in Nucleic Acids Research 1999, vol. 27, 1271-1274; by Martinez, C.I., et al., in Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 1997, vol. 7, 3013-3016;およびTrainer, G.Lへの米国特許第５,５５８,９１号、により記載されている。これらの部分の構造は下に示されるが、そこでは、全ての部分について、ＲはＨ、ＯＨ、ＮＨＲ、Ｆ、Ｎ３、ＳＨ、ＳＲ，ＯＲ、低級アルキルおよびアリ−ルであり得て；糖部分について、ＸおよびＹは独立してＯ、ＳもしくはＮＨであり；そして非環式部分について、Ｘ＝Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＮＲである。
【化４】
2005501567.tif 000005
【化５】
2005501567.tif 000006
【化６】
2005501567.tif 000007
【００４２】
特定の実施態様において、式Ｉにおける糖部分は、以下：リボシル、２'−デオキシリボシル、３'−デオキシリボシル、２',３'−ジデヒドロジデオキシリボシル、２',３'−ジデオキシリボシル、２'−もしくは３'−アルコキシリボシル、２'−もしくは３'−アミノリボシル、２'−もしくは３'−フルオロリボシル、２'−もしくは３'−メルカプトリボシル、２'−もしくは３'−アルキルチオリボシル、非環式、炭素環式および他の修飾糖、から選択され得る。
【００４３】
さらに、式Ｉにおいて、塩基には、ウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、グアニン、７−デアザグアニン、ヒポキサンチン、７−デアザヒポキサンチン、アデニン、７−デアザアデニン、２,６−ジアミノプリンもしくはそれらの類似体が含まれ得る。
【００４４】
末端−ホスフェ−ト−標識ヌクレオチドにおいて末端−ホスフェ−ト位置に付加した標識は、１,２−ジオキセタン化学発光化合物、蛍光原色素、発色性色素、質量タグおよび電気化学的タグからなる群から選択され得る。これは、検出可能な種を、色、蛍光放射、化学発光、質量変化、電気化学的検出もしくはそれらの組み合わせのいずれか一つの存在により、検出可能にさせる。
【００４５】
式Ｉにおいてホスフェート化標識が蛍光原部分であるところでは、それは、以下(全てホスフェートモノエステルとして示される)の一つから望ましくは選択される：ＥＬＦ９７の商品名(Molecular Probes, Inc.)で発売される、２−(５'−クロロ−２'−ホスホリルオキシフェニル)−６−クロロ−４−(３Ｈ)−キナゾリノン、フルオレセイン二ホスフェート(テトラアンモニウム塩）、フルオレセイン３'(６')−Ｏ−アルキル−６'(３')−ホスフェート、９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル)ホスフェート(ジアンモニウム塩)、ホスフェート４−メチルウンベリフェリル(遊離酸)、ホスフェートレゾルフィン、ホスフェート４−トリフルオロメチルウンベリフェリル、ホスフェートウンベリフェリル、ホスフェート３−シアノウンベリフェリル、ホスフェート９,９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル、ホスフェート６,８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリルおよびそれらの誘導体。
これらの色素の構造は以下に示される：
【化７】
2005501567.tif 000008
２−(５'−クロロ−２'−ホスホリルオキシフェニル)−６−クロロ−４−(３Ｈ)−キナゾリノン
【化８】
2005501567.tif 000009
フルオレセインジホスフェート        フルオレセイン３’（６’）−Ｏ−アルキルー６’（３’）−フォスフェート
【化９】
2005501567.tif 000010
９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル)ホスフェート(ジアンモニウム塩)
【化１０】
2005501567.tif 000011
４−メチルウンベリフェリルホスフェート
【化１１】
2005501567.tif 000012
６,８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリルホスフェート
【化１２】
2005501567.tif 000013
４−トリフルオロメチルウンベリフェリルホスフェート
【化１３】
2005501567.tif 000014
ウンベリフェリルホスフェート
【化１４】
2005501567.tif 000015
３−シアノウンベリフェリルホスフェート
【化１５】
2005501567.tif 000016
レゾルフィンホスフェート
【化１６】
2005501567.tif 000017
９,９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イルホスフェート
【００４６】
上の式Ｉにおいてホスフェート化標識部分が発色性部分であるところでは、それは、以下：５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート、３−インドキシルホスフェート、ｐ−ニトロフェニルホスフェートおよびそれらの誘導体、から選択される。これらの発色性色素の構造は、モノエステルホスフェートとして以下に示される。
【化１７】
2005501567.tif 000018
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート(二ナトリウム塩)
【化１８】
2005501567.tif 000019
３−インドキシル(二ナトリウム塩) ホスフェート
【化１９】
2005501567.tif 000020
ｐ−ニトロフェニルホスフェート
【００４７】
末端−ホスフェ−ト位置における部分はさらに、ホスファターゼ−活性化１,２−ジオキセタン化合物であることが望まれる、化学発光物質であり得る。１,２−ジオキセタン化合物には、限定するものではないが、ＣＤＰ−Starの商品名(Tropix, Inc., Bedford, MA)で発売される、ホスフェート２−クロロ−５−(４−メトキシスピロ[１,２−ジオキセタン−３,２'−(５−クロロ−)トリシクロ[３,３,１−１３,７]−デカン]−１−イル)−１−フェニル二ナトリウム、ＣＳＰＤの商品名(Tropix)で発売される、クロロアダマント−２'−イリデンメトキシフェノキシホスフェート化ジオキセタン、ＡＭＰＰＤの商品名(Tropix)で発売される、３−(２'−スピロアダマンタン)−４−メトキシ−４−(３''−ホスホリルオキシ)フェニル−１,２−ジオキセタンが含まれる。これらの市販のジオキセタン化合物の構造は、米国特許第５,５８２,９８０号、第５,１１２,９６０号および第４,９７８,６１４号[出典明示により本明細書の一部とする]に、それぞれ、開示されている。
【００４８】
上で説明した方法はさらに、核酸配列を定量化する工程を含み得る。関連する態様において、検出可能の種を、増幅された核酸配列の量に実質的に比例する量で生産し得る。核酸配列を定量化する工程を、検出可能の種により作製されたスペクトルと既知のスペクトルとの比較により行うように望まれる。
【００４９】
一つの実施態様において、本発明は、核酸を定量化する方法であって、(ａ)ポリメラーゼ反応が、少なくとも一つの末端−ホスフェ−ト−標識ヌクレオチドに加えて、ホスファターゼに実質的に無反応性である少なくとも一つのヌクレオチドの反応を含み、その反応は標識ポリホスフェ−トの生産をもたらす、核酸ポリメラーゼ反応を実施すること；(ｂ)標識ポリホスフェ−トがホスファターゼと反応して、検出可能な副産物種を定量化されるべき核酸の量に実質的に比例する量で生産することを許容すること；(ｃ)検出可能な種を測定すること；および(ｄ)既知の標準を用いて測定を比較して、核酸の量を決定する：工程を含む、方法を提供する。核酸を定量化する方法のこの実施態様において、定量化されるべき核酸はＲＮＡであり得る。核酸はさらに、天然のもしくは合成のオリゴヌクレオチド、染色体ＤＮＡ，またはＤＮＡであり得る。
【００５０】
本発明はさらに、核酸を定量化する方法であって、(ａ)反応が標識ポリホスフェ−トの生産をもたらす、末端−ホスフェ−ト−標識ヌクレオチドの存在下で核酸ポリメラーゼ反応を実施すること；(ｂ)標識ポリホスフェ−トがホスファターゼと反応して、検出可能な副産物種を定量化されるべき核酸配列の量に実質的に比例する量で生産することを許容すること；(ｃ)検出可能な種を測定すること；および(ｄ)既知の標準を用いて測定を比較して、核酸の量を測定する：工程を含む、方法を提供する。この実施態様において、定量化のための核酸配列には、天然のもしくは合成のオリゴヌクレオチド、または染色体ＤＮＡを含む細胞から単離されたＤＮＡが含まれ得る。
【００５１】
上で説明した核酸配列を定量化する工程のいずれにおいても、ポリメラーゼ反応工程はさらに、ホスファターゼの存在下でポリメラーゼ反応を実施することを含み得る。この明細書において早く説明したように、これは核酸ポリメラーゼ活性のリアルタイムモニタリング、およびそれ故に、定量化のための標的核酸配列のリアルタイム検出を許容するであろう。
【００５２】
本明細書中で提供された核酸配列を定量化する方法に有用な末端−ホスフェ−ト−標識ヌクレオチドは、上で示した式Ｉにより表され得る。酵素で活性化可能な標識は、検出可能の種を生成するような方式で、標識および天然もしくは修飾ヌクレオチドの末端−ホスフェ−トの間のホスフェートエステル結合を変更するところのホスファターゼの酵素活性を通して検出可能になる。検出可能の種は、色、蛍光放射、化学発光、質量変化、電気化学的電位のいずれか一つもしくはそれらの組み合わせの存在により検出可能である。上ですでに説明したように、酵素で活性化可能な標識は、１,２−ジオキセタン化学発光化合物、蛍光原色素、発色性色素、質量タグおよび電気化学的タグもしくはそれらの組み合わせであり得る。適当な標識は上で説明したものと同一である。
【００５３】
実施例の項でさらに詳細に説明されるであろうように、本発明は、標的核酸配列における単一のヌクレオチドの同一性を決定する方法を提供する。これらの方法は、(ａ)少なくとも一つの末端−ホスフェ−ト−標識ヌクレオチドの存在下で、その反応は標識ポリホスフェ−トの生産をもたらす、核酸ポリメラーゼ反応を実施すること；(ｂ)標識ポリホスフェ−トがホスファターゼと反応して、検出可能な種を生産することを許容すること；(ｃ)検出可能な種の存在を検出すること；および(ｄ)組み込まれたヌクレオシドを同定すること：の工程を含む。望まれる実施態様において、末端−ホスフェ−ト−標識ヌクレオチドは、ポリホスフェ−ト鎖の中に四つもしくはそれ以上のホスフェ−トを含む。
【００５４】
本発明のもう一つの態様は、核酸検出キットであって、
(ａ)下の式Ｉ：
【化２０】
2005501567.tif 000021
[式中、Ｐ＝ホスフェ−ト(ＰＯ３)およびその誘導体、ｎは２もしくはそれより大であり；Ｙは酸素もしくは硫黄原子であり；Ｂは窒素含有の複素環式塩基であり；Ｓは非環式部分、炭素環式部分もしくは糖部分であり；Ｌは、天然または修飾ヌクレオチドの末端−ホスフェ−トにおいてホスフェートエステル、チオエステルもしくはホスホラミデート結合を形成するのに適当なヒドロキシル基、スルフヒドリル基またはアミノ基を含む酵素で活性化可能な標識であり；Ｐ−Ｌは、ホスフェ−トが除去されるときに、好ましくは独立して検出可能になるところのホスフェート化標識である]
にしたがう少なくとも一つもしくはそれ以上の末端−ホスフェ−ト−標識ヌクレオチド；
(ｂ)少なくとも一つのＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼもしくは逆転転写酵素；
および
(ｃ)ホスファターゼ
を含む、キットに関する。
【００５５】
キットに含まれる末端−ホスフェ−ト−標識ヌクレオチド中の砂糖部分には、限定するものではないが、リボシル、２'−デオキシリボシル、３'−デオキシリボシル、２',３'−ジデヒドロジデオキシリボシル、２',３'−ジデオキシリボシル、２'−もしくは３'−アルコキシリボシル、２'−もしくは３'−アミノリボシル、２'−もしくは３'−フルオロリボシル、２'−もしくは３'−メルカプトリボシル、２'−もしくは３'−アルキルチオリボシル、非環式、炭素環式および他の修飾糖が含まれる。
【００５６】
塩基は、限定するものではないが、ウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、グアニン、７−デアザグアニン、ヒポキサンチン、７−デアザヒポキサンチン、アデニン、７−デアザアデニン、および２,６−ジアミノプリンならびにそれらの類似体であり得る。
【００５７】
さらに、上で説明したように、酵素で活性化可能な標識は、１,２−ジオキセタン化学発光化合物、蛍光原色素、発色性色素、質量タグおよび電気化学的タグもしくはそれらの組み合わせであり得る。ヌクレオチドの末端−ホスフェ−ト位置において結合に適当な化合物は、上で説明したものと同一である。
【００５８】
(実施例)
実施例１
γ−(４−トリフルオロメチルクマリニル)ｄｄＧＴＰ(γＣＦ３クマリン−ｄｄＧＴＰ)の作成
ｄｄＧＴＰ(４６.４ｍＭ溶液２００μｌ、＞９６％純度)を無水のジメチルホルムアミド(ＤＭＦ、２×０.５ｍｌ)と共に共蒸発した。これに、ジシクロヘキシルカルボジイミド(ＤＣＣ、９.６ｍｇ、５当量)を加えて、混合液を再び無水のＤＭＦ(０.５ｍｌ)と共に共蒸発した。残渣を無水のＤＭＦ(０.５ｍｌ)中に取って、混合液を終夜攪拌させた。なお約２０％の未環化トリホスフェ−トがあった(環化トリメタホスフェ−トのカラム上での加水分解からかもしれない)。混合液にもう一つのＤＣＣ２当量を加えて、２時間攪拌後に、７−ヒドロキシ−４−トリフルオロメチルクマリン(４−トリフルオロメチルウンベリフェロン、４２.７ｍｇ，２０当量)およびトリエチルアミン(２０μｌ、２０当量)を加えて、混合液を室温で攪拌した。２日後に、ＨＰＬＣ(１５分間で０.１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム(ＴＥＡＡ)中の０〜３０％アセトニトリル、５分間で３０〜５０％アセトニトリル、１０分間で５０〜１００％アセトニトリル、Ｃ１８  ３.９×１５０ｍｍカラム、流速１ｍｌ／分)は、９.７分に新しい生成物および出発の環状トリホスフェ−トを示した(２５４ｎｍで７７対５の比率)。混合液をもう１日間攪拌させた。Ｐ−３１  ＮＭＲは、反応混合液の主要成分としてガンマ標識ヌクレオチド−三ホスフェートを示した。反応混合液をロータリーエバポレーター上で濃縮した。残渣を水(５×１ｍｌ)で抽出した。ＨＰＬＣは、２５４ｎｍで８２％および３３５ｎｍで８１％の純度を示した。合併した水溶液をロータリーエバポレーター上で濃縮して、水(１ｍｌ)中に再溶解した。それを、Ｃ１８  １インチ×３００ｍｍカラム上で、３０分間で０.１Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウム(ＴＥＡＢ、ｐＨ８.３)中の０〜３０％アセトニトリル、１０分間で３０〜５０％アセトニトリル、流速１５ｍｌ／分を用いて精製した。生成物のピークを３つのフラクションに採取した。フラクション１を、ＣＯ２を吹き込むことによりＴＥＡＢ緩衝液のｐＨを６.７に減少した以外は、上と同一の分取ＨＰＬＣ法を用いて再精製した。生成物のピークを濃縮して、ＭｅＯＨ(２回)および水(１回)と共に共蒸発した。試料を水１ｍｌ中に溶解した。ＨＰＬＣは、２５４および３３５ｎｍにおいて＞９９％の純度を示した。ＵＶは、３２２ｎｍにおいて１１,０００の吸光係数(７−ヒドロキシ−４−トリフルオロメチルクマリンのベータガラクトシド誘導体、Molecular Probesカタログ、について報告された)を仮定して、２.２ｍＭの濃度を示した。ＭＳ：Ｍ−＝７０２.１８(計算値７０２.３１)、ＵＶλＡ＝２５３，２７６および３２２ｎｍ。ｄｄＧＴＰのガンマホスフェ−トに付加したトリフルオロクマリン色素は、３２２ｎｍの励起極大および約４１５ｎｍの照射極大をもって蛍光性である。遊離のクマリン色素を放出するホスフェートエステルの加水分解で、スペクトルは約３８５ｎｍの励起極大および約５０２ｎｍの照射極大をもって変化する。この変化は、簡単な蛍光測定もしくは色の変化により容易に検出される。ガンマヌクレオチドの合成は、Arzumanov, A. et al. in J Biol Chem (1996) Oct 4; 271 (40): 24389-94、により一般的に記述されている。
【化２１】
2005501567.tif 000022
γ−(４−トリフルオロメチルクマリニル)ジデオキシグアノシン−５'−三ホスフェート  (γＣＦ３クマリン−ｄｄＧＴＰ)
【００５９】
実施例２
γ−(３−シアノクマリニル)ｄｄＡＴＰ(γＣＮクマリン−ｄｄＡＴＰ)の作成
ｄｄＡＴＰ(８９ｍＭ溶液１００μｌ、＞９６％)を無水のＤＭＦ(２×１ｍｌ)と共に共蒸発した。これに、ＤＣＣ(９.２ｍｇ、５当量)を加えて、混合液を再び無水のＤＭＦ(１ｍｌ)と共に共蒸発した。残渣を無水のＤＭＦ(０.５ｍｌ)中に取って、反応液を室温で攪拌した。一夜後に、７−ヒドロキシ−３−シアノクマリン(３３.３ｍｇ，２０当量)およびＴＥＡ(２５μｌ、２０当量)を加えて、混合液を室温で攪拌した。１日後に、主要生成物(２５４ｎｍにおいて５５％)が、１０分におけるもう一つの少ない生成物(約１０％)と共に、８.１分に観察された。もう１日後に顕著な変化は起きなかった。反応混合液をロータリーエバポレーター上で濃縮し、そして残渣を水３×２ｍｌで抽出してろ過した。水溶液を濃縮して、Ｃ１８上で、３０分間で０.１ＭＴＥＡＢ(ｐＨ６.７)中の０〜３０％アセトニトリルおよび１０分間で３０〜５０％アセトニトリル、流速１５ｍｌ／分を用いて精製した。主要ピークを３つのフラクションに採取した。主要ピークのＨＰＬＣ(フラクション２)は、２５４ｎｍにおいて９５.６％および３３５ｎｍにおいて９８.１％の純度を示した。それをロータリーエバポレーター上で濃縮して(室温で)、ＭｅＯＨ(２回)および水(１回)と共に共蒸発した。残渣を水０.５ｍｌ中に溶解した。試料５μｌをＵＶ分析のために１ｍｌに希釈した。Ａ３４６ｎｍ＝０.７８４。２０,０００の吸光係数(７−エトキキシ−３−シアノクマリン、Molecular Probesカタログ、について報告された)を仮定して、濃度＝７.８４ｍＭ。収量＝３.９２μｍｏｌ、４４％。試料をＣ−１８カラム上で上と同一の方法を用いて再精製した。試料ピークを３つのフラクションに採取した。２５４ｎｍにおいて＞９８％および３４０ｎｍにおいて＞９９.５％の純度を持つフラクション２および３を合併した。濃縮後に、残渣を、ＭｅＯＨ(２回)および水(１回)と共に共蒸発した。試料を水(１ｍｌ)中に溶解すると、２.７７ｍＭ溶液を与えた。ＭＳ：Ｍ−＝６４２.９８ａｕ(計算値６４３.００ａｕ)、ＵＶλＡ＝２６３および３４６ｎｍ。ｄｄＡＴＰのガンマホスフェ−トに付加したシアノクマリン色素は、約３４６ｎｍの励起極大および約４１１ｎｍの照射極大をもって蛍光性である。遊離のクマリン色素を放出するホスフェートエステルの加水分解で、スペクトルは約４０８ｎｍの励起極大および約４５０ｎｍの照射極大をもって変化する。この変化は、簡単な蛍光測定もしくは色の変化により容易に検出される。ガンマヌクレオチドの合成は、Arzumanov, A. et al. in J Biol Chem (1996) Oct 4; 271 (40): 24389-94、により一般的に記述されている。
【化２２】
2005501567.tif 000023
γ−(３−シアノクマリニル)ジデオキシアデノシン−５'−三ホスフェート  (γＣＮクマリン−ｄｄＡＴＰ)
【００６０】
実施例３
δ−９Ｈ(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル)−ジデオキシチミジン−５'−テトラホスフェ−ト(ｄｄＴ４Ｐ−ＤＤＡＯ)の作成
ｄｄＴＴＰ(８０ｍＭ溶液１００μｌ)を無水のジメチルホルムアミド(ＤＭＦ、２×１ｍｌ)と共に共蒸発した。これに、ジシクロヘキシルカルボジイミド(８.３ｍｇ、５当量)を加えて、混合液を再び無水のＤＭＦ(１ｍｌ)と共に共蒸発した。残渣を無水のＤＭＦ(１ｍｌ)中に取って、反応液を終夜室温で攪拌した。ＨＰＬＣはほとんど環化したトリホスフェ−ト(約８２％)を示した。反応混合液を濃縮して、残渣を無水のジエチルエーテルで３回洗浄した。それを無水のＤＭＦ中に再溶解して、ロータリーエバポレーター上で濃縮乾固した。残渣を無水のＤＭＦ２００μｌ中のＤＤＡＯ−一ホスフェート、アンモニウム塩(５ｍｇ、１.５当量)と共に取って、週末にかけて４０℃で攪拌した。ＨＰＬＣは、１１.９６分に望ましいＵＶ特色を持つ新しい生成物の形成を示した。(ＨＰＬＣ方法：１５分間で０.１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム(ｐＨ７)中の０〜３０％アセトニトリル、５分間で３０〜５０％アセトニトリル、Novapak  Ｃ−１８  ３.９×１５０ｍｍカラム、１ｍｌ／分)。ＬＣＭＳ(ＥＳ−)はまた、Ｍ−１として主要質量ピーク８３４を示した。反応混合液を濃縮して、Deltapak  Ｃ１８  １９×１５０ｍｍカラム上で０.１Ｍ  ＴＥＡＢ(ｐＨ６.７)およびアセトニトリルを用いて精製した。生成物を持つフラクションを上で説明した同一の方法を用いるＨＰＬＣにより再精製した。純粋な生成物を持つフラクションを濃縮して、ＭｅＯＨ(２回)および水(１回)と共に共蒸発した。残渣を水(１.２ｍｌ)中に溶解すると、１.２３ｍＭの溶液を与えた。ＨＰＬＣ純度２５４ｎｍにおいて＞９７.５％、４５５ｎｍにおいて＞９６％；ＵＶλＡ＝２６７および４５５ｎｍ；ＭＳ：Ｍ−１＝８３４.０４(計算値８３３.９５)。
【００６１】
δ−９Ｈ(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル)−ジデオキシシチジン−５'−テトラホスフェ−ト(ｄｄＣ４Ｐ−ＤＤＡＯ)、δ−９Ｈ(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル)−ジデオキシアデノシン−５'−テトラホスフェ−ト(ｄｄＡ４Ｐ−ＤＤＡＯ)およびδ−９Ｈ(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル)−ジデオキシグアノシン−５'−テトラホスフェ−ト(ｄｄＧ４Ｐ−ＤＤＡＯ)を、同一の様式で合成して精製した。これらの精製した化合物は以下のデータを与えた：ｄｄＣ４Ｐ−ＤＤＡＯ：ＵＶλＡ＝２６８ｎｍおよび４５４ｎｍ；ＭＳ：Ｍ−１＝８１９.３２(計算値８１８.９６)；ｄｄＡ４Ｐ−ＤＤＡＯ：ＵＶλＡ＝２６３ｎｍおよび４５７ｎｍ；ＭＳ：Ｍ−１＝８４３.３０(計算値８４２.９７)；ｄｄＧ４Ｐ−ＤＤＡＯ：ＵＶλＡ＝２５７ｎｍおよび４５７ｎｍ；ＭＳ：Ｍ−１＝８５９.４０(計算値８５８.９７)。
【化２３】
2005501567.tif 000024
【化２４】
2005501567.tif 000025
【化２５】
2005501567.tif 000026
【化２６】
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【００６２】
実施例４
ε−９Ｈ(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル)−ジデオキシチミジン−５'−ペンタホスフェ−トＤＤＡＯ−ｄｄＴ−ペンタホスフェ−ト(ｄｄＴ５Ｐ−ＤＤＡＯ)の作成
Ａ．ＤＤＡＯ−ピロホスフェートの作成
ＤＤＡＯ−ホスフェ−ト二アンモニウム塩(１１.８μｍｏｌ)を無水のＤＭＦ(３×０.２５ｍｌ)と共に共蒸発して、ＤＭＦ(０.５ｍｌ)中に溶解した。これに、カルボニルジイミダゾール(ＣＤＩ、９.６ｍｇ、５当量)を加えて、混合液を終夜室温で攪拌した。過剰のＣＤＩをＭｅＯＨ(５μｌ)の添加により分解して、３０分間攪拌した。混合液に、ホスフェート二水素トリブチルアンモニウム(１０当量、ＤＭＦ中の０.５Ｍ溶液２３６ｍｌ)を加えて、混合液を室温で４日間攪拌した。反応混合液をロータリーエバポレーター上で濃縮した。残渣をHiPrep  １６.１０  ＱＸＬカラム上で、０.１Ｍ  ＴＥＡＢ／アセトニトリル(３：１)を緩衝液Ａとしてそして１Ｍ  ＴＥＡＢ／アセトニトリル(３：１)を緩衝液Ｂとして用いる０〜１００％Ｂを使用して、精製した。主要ピーク(９８％ＨＰＬＣ純度)を採取して、濃縮して、メタノール(２回)と共に共蒸発した。残渣を水１ｍｌ中に溶解すると、５.９ｍＭの溶液を与えた。ＵＶ／ＶＩＳ  λｍａｘ＝４５６ｎｍ。
【００６３】
Ｂ．ｄｄＴ５Ｐ−ＤＤＡＯの作成
ｄｄＴＴＰ(４７.５ｍＭ水溶液１００μｌ)を無水のＤＭＦ(２×１ｍｌ)と共に共蒸発した。これに、ＤＣＣ(５当量、４.９ｍｇ)を加えて、混合液を無水のＤＭＦ(１×１ｍｌ)と共に共蒸発した。残渣を無水のＤＭＦ(０.５ｍｌ)中に取って、室温で３時間攪拌した。これに、別に無水のＤＭＦ(２×１ｍｌ)と共に共蒸発したＤＤＡＯ−ピロホスフェート１.０３当量をＤＭＦ溶液として加えた。混合液を濃縮乾固して、次いで無水のＤＭＦ２００μｌ中に取った。混合液を３８℃で２日間加熱した。反応混合液を濃縮し、水で希釈し、ろ過して、HiTrap  ５ｍｌイオン交換カラム上で、二段階傾斜を用いる０〜１００％Ａ−Ｂを使用して精製した。溶媒Ａ＝０.１Ｍ  ＴＥＡＢ／アセトニトリル(３：１)および溶媒Ｂ＝１Ｍ  ＴＥＡＢ／アセトニトリル(３：１)。生成物の大部分を含有するフラクション１２×１３を合併し、濃縮して、メタノール(２回)と共に共蒸発した。残渣をXterra  ＲＰ  Ｃ−１８  ３０〜１００ｍｍカラム上で、０.１Ｍ  ＴＥＡＢ中の０〜３０％アセトニトリルを５倍のカラム容積でそして３０〜５０％アセトニトリルを２倍のカラム容積で、流速１０ｍｌ／分を使用して再精製した。純粋な生成物を含有するフラクションを濃縮して、ＭｅＯＨ(２回)および水(１回)と共に共蒸発した。４５５ｎｍにおけるＨＰＬＣ純度＞９９％。ＵＶ／ＶＩＳ＝２６８ｎｍおよび４５５ｎｍ。ＭＳ：Ｍ−１＝９１４.０３(計算値９１３.９３)。
【００６４】
これらのポリホスフェ−トのガンマホスフェ−トに付加したＤＤＡＯ色素は、４５５ｎｍの励起極大および約６０８ｎｍの照射極大をもって蛍光性である。遊離の色素を放出するホスフェートエステルの加水分解で、スペクトルは約６４５ｎｍの励起極大および約６５９ｎｍの照射極大をもって変化する。この変化は、簡単な蛍光測定もしくは色の変化により容易に検出される。
【化２７】
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【００６５】
末端−ホスフェ−トに付加した色素もしくは他の検出可能な部分を持つ同様なヌクレオチド化合物はまた、上の実施例１〜４に説明したものと同様の方法を用いて作られるかもしれないということが注目される。これらには、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ヌクレオシド−テトラホスフェ−ト、天然起源の塩基(アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ヒポキサンチンおよびウラシル)ならびに修飾塩基もしくは修飾糖のいずれかを持つヌクレオチドが含まれる。
【００６６】
下の実施例５および６は、末端−ホスフェ−トに付加した色素誘導体を有するジデオキシヌクレオチドが、核酸の検出のための鋳型−指向方法において核酸ポリメラーゼにより成長する核酸鎖の中に基質として効果的に組み込まれ得ることを実証する。
【００６７】
実施例５
ガンマホスフェート−標識ｄｄＧＴＰのポリメラーゼ組み込みを用いる核酸配列の検出
実施例(１)のジデオキシヌクレオチドを用いて、反応液を室温(２３℃)でアセンブルした。反応液は、それぞれ、配列番号２および配列番号３に相当する、プライマーの３'端子に隣接した次の鋳型ヌクレオチドとしてｄＣもしくはｄＴのどちらかで二つの異なるオリゴヌクレオチド鋳型の一つにアニールした単一のオリゴヌクレオチドプライマー(配列番号１により表される)を有するプライマ：鋳型の組合せを含有した。
【００６８】
今や図１を参照すると、本実施例における鋳型１(配列番号２)について、ＤＮＡポリメラーゼは標識ｄｄＧＴＰでプライマーを拡張すると期待されるであろう。同様に、図１における鋳型２(配列番号３)について、ＤＮＡポリメラーゼはｄｄＡＴＰであるが、標識ｄｄＧＴＰではなく、プライマーを拡張すると期待されるであろう。
【００６９】
反応条件：２５ｍＭトリス、ｐＨ８.０、５％グリセロール，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０.５ｍＭベータ−メルカプトエタノール、０.０１％tween−２０、エビアルカリ性ホスファターゼ０.２５単位、鋳型(次の鋳型は、示したように、ｄＣＭＰもしくはｄＴＭＰのいずれかである)にアニールした１００ｎＭプライマーおよび２μＭ  ｄｄＧＴＰ−ＣＦ３−クマリンを含有する反応液７０μｌを、時間ドライブモードで運転される、ＬＳ−５５ルミネセンス分光計(Perkin Elmer)の中で石英蛍光超微小キュベット中にアッセンブルした。励起および放射波長は、それぞれ、３９０ｎｍおよび５００ｎｍである。スリット幅は、励起スリットについて５ｎｍ、放射スリットについて１５ｎｍであった。遺伝子的に工学して、３'−５'エキソヌクレアーゼ活性、５'−３'エキソヌクレアーゼ活性およびジデオキシヌクレオチドに対する識別を除外した、クローン化ＤＮＡポリメラーゼＩの０.３５μｌ(１１単位)ならびに０.２５ｍＭ  ＭｎＣｌ２の添加により、反応を開始した。
【００７０】
図１に示すように、ガンマ標識ｄｄＧＴＰを含有する反応液については、プライマー；鋳型１によってのみ色素放射を検出し、そこでは鋳型中の次のヌクレオチドはｄＣであった。エビアルカリ性ホスファターゼによるホスホリル転移のピロホスフェ−ト生成物の開裂は、核酸の検出を許容するＣＦ３−クマリン標識中の検出可能な変化に至る。プライマー；鋳型２によっては、検出可能な色素放射は何も得られなかった。
【００７１】
実施例６
ガンマホスフェート−標識ｄｄＡＴＰのポリメラーゼ組み込みを用いる核酸配列の検出
実施例(２)のジデオキシヌクレオチドを用いて、反応液を室温(２３℃)でアセンブルした。反応液は、それぞれ、配列番号２および配列番号３に相当する、プライマーの３'端子に隣接した鋳型ヌクレオチドとしてｄＣもしくはｄＴのどちらかで二つの異なるオリゴヌクレオチド鋳型の一つにアニールした単一のオリゴヌクレオチドプライマー(配列番号１)を有するプライマー：鋳型の組合せを含有した。
【００７２】
今や図２を参照すると、本実施例における鋳型２(配列番号３)について、ＤＮＡポリメラーゼは標識ｄｄＡＴＰでプライマーを拡張すると期待されるであろう。同様に、図２における鋳型１(配列番号３)について、ＤＮＡポリメラーゼはｄｄＧＴＰであるが、標識ｄｄＡＴＰではなく、プライマーを拡張すると期待されるであろう。
【００７３】
反応条件：２５ｍＭトリス、ｐＨ８.０、５％グリセロール，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０.５ｍＭベータ−メルカプトエタノール、０.０１％tween−２０、エビアルカリ性ホスファターゼ０.２５単位、鋳型にアニールした１００ｎＭプライマーおよび２μＭ  ｄｄＡＴＰ−ＣＮ−クマリンを含有する反応液７０μｌを、時間ドライブモードで運転される、ＬＳ−５５ルミネセンス分光計(Perkin Elmer)の中で石英蛍光超微小キュベット中にアッセンブルした。励起および放射波長は、それぞれ、４１０ｎｍおよび４５０ｎｍである。スリット幅は、励起スリットについて５ｎｍ、放射スリットについて１５ｎｍであった。遺伝子的に工学して、３'−５'エキソヌクレアーゼ活性、５'−３'エキソヌクレアーゼ活性およびジデオキシヌクレオチドに対する識別を除外した、クローン化ＤＮＡポリメラーゼＩの０.３５μｌ(１１単位)ならびに０.２５ｍＭ  ＭｎＣｌ２の添加により、反応を開始した。
【００７４】
図２に示すように、ガンマ標識ｄｄＡＴＰを含有する反応液については、プライマー；鋳型２によってのみ色素放射を検出し、そこでは鋳型中の次のヌクレオチドはｄＴであった。エビアルカリ性ホスファターゼによるホスホリル転移のピロホスフェ−ト生成物の開裂は、核酸の検出を許容するＣＮ−クマリン標識中の検出可能な変化を生成する。プライマー；鋳型１によっては、検出可能な色素放射は何も得られなかった。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】図１は、ホスファターゼの存在下で鋳型に指図された方法においてガンマ−ホスフェ−ト−標識ｄｄＧＴＰのポリメラーゼの利用により得られた蛍光を示すグラフである。
【図２】図２は、ホスファターゼの存在下で鋳型に指図された方法においてガンマ−ホスフェ−ト−標識ｄｄＡＴＰのポリメラーゼの利用により得られた蛍光を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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