(57)【要約】  この発明は、骨の病気の治療、診断及び予防方法に関係し、並びに交感神経活動状態及びレプチン活性の測定及び調節を含む方法を包含する。骨の病気における交感神経活動状態の変化は、レプチン合成、レプチンレセプター合成、レプチンレセプターへのレプチンの結合、及びレプチンレセプター活性を減少又は増大させることによって達成することができる。骨の病気における交感神経活動状態の変化は、前記の方法において、骨粗鬆症の治療又は予防のための伝統的な交感神経系アゴニスト及び／又はアンタゴニスト例えば制限はしないがドーパミンβヒドロキシラーゼアンタゴニスト又はβアドレナリン作動性アンタゴニストと組み合わせても達成することができる。
2005516001.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨粗鬆症を治療する方法であって、該治療を必要とする哺乳動物に治療上有効な量のβアドレナリン作動性アンタゴニストを投与することを含む当該方法。
【請求項２】
治療上有効な量のレプチンアンタゴニストの投与を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
βアドレナリン作動性アンタゴニストを、β1、β2及びβ3アンタゴニストよりなる群から選択する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
レプチンアンタゴニストを、アセチルフェノール、レプチンに結合する抗体、及びレプチンレセプターに結合する抗体よりなる群から選択する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
骨粗鬆症の症状を予防する方法であって、該症状を予防するのに有効な量のβアドレナリン作動性アンタゴニストを投与することを含む当該方法。
【請求項６】
レプチンの投与を更に含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
βアドレナリン作動性アンタゴニストを、β1、β2及びβ3アンタゴニストよりなる群から選択する、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
レプチンアンタゴニストを、アセチルフェノール、レプチンに結合する抗体、及びレプチンレセプターに結合する抗体よりなる群から選択する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
大理石骨病又は骨硬化症の症状を治療する方法であって、該治療を必要とする哺乳動物に、治療上有効な量のβアドレナリン作動性アゴニストを投与することを含む当該方法。
【請求項１０】
治療上有効な量のレプチンアゴニストを更に投与する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
βアドレナリン作動性アゴニストを、β1、β2及びβ3アゴニストよりなる群から選択する、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
大理石骨病又は骨硬化症を予防する方法であって、βアドレナリン作動性アゴニストを投与することを含む当該方法。
【請求項１３】
レプチンアゴニストを投与することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
βアドレナリン作動性アゴニストを、β1、β2及びβ3アゴニストよりなる群から選択する、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
レプチンの骨に対する効果を調節する方法であって、該調節を必要とする哺乳動物に、治療上有効な量の該哺乳動物の交感神経活動状態を変える医薬組成物を投与することを含む当該方法。
【請求項１６】
骨量を調節する方法であって、該調節を必要とする哺乳動物に、治療上有効な量の該哺乳動物の交感神経活動状態を変える医薬組成物を投与することを含み、それで該哺乳動物の骨量が調節される当該方法。
【請求項１７】
骨の病気の症状を治療する方法であって、該治療を必要とする哺乳動物に、治療上有効な量の該哺乳動物の交感神経活動状態を変える医薬組成物を投与することを含む当該方法。
【請求項１８】
骨の病気の症状を予防する方法であって、該予防を必要とする哺乳動物に、有効量の該哺乳動物の交感神経活動状態を変える医薬組成物を投与することを含む当該方法。
【請求項１９】
医薬組成物がレプチンアゴニストを含む、請求項１５、１６、１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
医薬組成物がレプチンアンタゴニストを含む、請求項１５、１６、１７又は１８に記載の方法。
【請求項２１】
レプチンアンタゴニストを、アセチルフェノール、レプチンに結合する抗体、及びレプチンレセプターに結合する抗体よりなる群から選択する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
医薬組成物が、交感神経系アゴニストを含む、請求項１５、１６、１７又は１８に記載の方法。
【請求項２３】
交感神経系アゴニストが、βアドレナリン作動性アゴニストである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
交感神経系アゴニストを、エピネフリン、イソプロテレノール、ドーパミン及びドブタミンよりなる群から選択する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
医薬組成物が、交感神経系アンタゴニストを含む、請求項１５、１６、１７又は１８に記載の方法。
【請求項２６】
交感神経系アンタゴニストが、βアドレナリン作動性アンタゴニストである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
交感神経系アンタゴニストを、プロプラノロール、エスモロール、メトプロロール、アテノロール、アセブトロール、フェントラミン、トラゾリン、プラゾシン、テルゾシン、ドキサゾシン、トリマゾシン、インドラミン、フェノキシベンザミン、ジベンザミン、グアネチジン、グアナドレル、レセルピン及びメチロシンよりなる群から選択する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
医薬組成物が、レプチンアゴニスト及び交感神経系アゴニストを含む、請求項１５、１６、１７又は１８に記載の方法。
【請求項２９】
医薬組成物が、レプチンアンタゴニストと交感神経系アンタゴニストの組合せを含む、請求項１５、１６、１７又は１８に記載の方法。
【請求項３０】
骨量が増大する、請求項１６に記載の方法。
【請求項３１】
骨量が減少する、請求項１６に記載の方法。
【請求項３２】
骨の病気が、病気でない対応する骨と比較して減少した骨量を特徴とする、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項３３】
骨の病気を、骨粗鬆症、オステオペニア、及びパジェット病よりなる群から選択する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
骨の病気が、病気でない対応する骨と比較して増大した骨量を特徴とする、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項３５】
骨の病気を、大理石骨病、骨硬化症、骨端症及びピンコディソストーシスよりなる群から選択する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
哺乳動物の骨の病気を診断又は予測する方法であって、下記を含む当該方法：
(ａ)骨の病気を有することが疑われる哺乳動物の交感神経活動状態及びレプチン活性を測定し；そして
(ｂ)(ａ)で測定された値を対応する対照用の値と比較する。
【請求項３７】
哺乳動物において利用するための医薬組成物であって、治療上有効な量のβアドレナリン作動性アンタゴニスト及びレプチンアンタゴニストを含む当該医薬組成物。
【請求項３８】
哺乳動物において利用するための医薬組成物であって、治療上有効な量のβアドレナリン作動性アゴニスト及びレプチンアゴニストを含む当該医薬組成物。
【請求項３９】
哺乳動物において利用するための医薬組成物であって、治療上有効な量のドーパミンβヒドロキシラーゼ及びレプチンアンタゴニストを含む当該医薬組成物。
【請求項４０】
製薬上許容しうるキャリアーを更に含む、請求項３７、３８又は３９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
１．導入
本発明は、骨粗鬆症を含む(これに限定はしない)骨の状態、不調又は病気の治療、診断及び予防のための組成物及び方法に関係する。この発明は、ポリペプチドホルモンのレプチンのレセプターシグナリング経路の調節に関係する。一層特に、本発明は、レプチン合成、レプチンレセプター合成、レプチンのそのレセプターへの結合、及び骨細胞へのレプチンシグナリングの調節に関係する。この発明は又、骨のホメオスタシスの交感神経系経路による調節にも関係する。
【０００２】
本発明は又、骨の状態、不調又は病気の治療、予測及び診断における化合物の同定及び予防又は治療用途のための方法をも提供する。加えて、骨の状態又は不調の治療のための臨床評価を受けている患者を診断のためにモニターし、化合物の効力を臨床的試みにおいてモニターし、そしてかかる骨の状態、不調又は病気にかかりやすい患者を同定するための方法をも提供する。
【０００３】
２．発明の背景
骨リモデリングの生理的過程は、骨の恒常的再生を、２つのよく定義された順次的細胞過程によって可能にする(Karsenty, 1999, Genes and Development, 13:3037-3051)。初期事象は、以前から存在している骨の破骨細胞による再吸収であり、その後、骨芽細胞による新しい骨の形成が行なわれる。骨リモデリングにおけるこれらの２つの過程は、骨の量の平衡を思春期の終わりから性腺機能の停止までの間狭い限界内に維持しなければならない。一定の骨量の維持を引き受けている分子機構は未知であり、未だ、幾つかの証拠の線は、これが、少なくとも部分的に、複雑なエンドクリン調節により達成されうることを示唆している。例えば、性腺の減退及び付随する性ステロイドの欠乏は、骨リモデリングの骨の再吸収過程を刺激して、最終的には、オステオペニア(低い骨量)又は骨粗鬆症(低い骨量及び高い骨折率)へと導く。同様に、最近の血清中のオステオプロテゲリンの同定及びその全身経路による機能的特徴付けは、分泌された分子が破骨的骨再吸収に影響を及ぼすという別の指示である(Simonet等、1997, Cell, 89:309-319)。この骨再吸収の全身的制御は、未だ同定されていない他の循環分子が、骨芽細胞による骨形成を制御することができることを示唆している。これらのホルモン又は成長因子の同定は、もしそれらが存在するならば、最も重要である(発病率及び病気の罹患率が骨リモデリングに影響するとして)。
【０００４】
かかる病気の一つは、骨粗鬆症である(Riggs等、1998, J.Bone Miner.Res.,13:763-773)。骨粗鬆症は、骨リモデリングに影響を及ぼす最も一般的な病気であり且つ東半球で最も流行している病気である。生理病理学レベルにおいて、この病気の顕著な特徴は、骨が低下した量を示すこと即ち骨が一層低密度となり、そうして骨折することである。加えて、骨粗鬆症の開始は、両性において、性腺機能の停止と密接にリンクしており、肥満した個体においてはめったに認められない。細胞レベルでは、骨粗鬆症は、骨形成よりも骨再吸収を好む骨リモデリングの平衡における損失によって特徴付けられ、これは、低下した骨量及び増大した骨折へと導く。分子レベルでは、骨粗鬆症の病因論は、殆ど未知のままである。
【０００５】
βアドレナリン作動性レセプターの活性化及び阻害の骨に対する複雑な同化及び異化効果が記載されてきた。βアドレナリン作動性レセプターの活性化から生じる骨に対する同化及び異化効果が報告されている。潜在的に相反する結果が記載されてきたが、コンテキスト依存性の結果であり副甲状腺ホルモンから生じうるものである(Kellenberger等、1998, Bone 22(5):471-478)。更に、同化効果は、βアゴニストについて報告されただけでなく、βアンタゴニストについても報告されている。βアゴニストのホルモテロール及びサルブタモールの同化効果が、卵巣摘出されたラットの骨において認められている(Pataki等、1996, Bone 19(3), 補遺129S-169S)。その上更に、β3アンタゴニストのＢＲＬ３５１３５は、腰椎棘条中の骨髄の含脂肪細胞のサイズを低下させるが脛骨ではそういうことはないことが記載されている(Kurabayashi等、2001, Calcif Tissue Int 68:248-254)。軽減された作業条件下でのクレンブテロール(β2アゴニスト)の筋肉と骨の量に対する効果の間の直接的関係が示され、クレンブテロールにより引き起こされた筋肉量の変化から生じると仮定された(これは、不活発のための骨の鉱質化の減少を生じる)(Zeman等、1991, Am J.Physiol Endocrin Metab 261:E285-E289)。増大した大腿骨幹端鉱質付加率が、プロプラノロール(非特異的βブロッカー)で処理したラットにおいて認められ、これは、プロプラノロールが、βアドレナリン作動性又は膜安定化機構によって、骨の代謝を刺激し又は骨芽細胞に影響を与えることができることを示唆している(Minkowitz等、1991, J.Orthop Res 9:869-875)。従って、骨の種類に対してβアゴニスト及び／又はアンタゴニストのどのような効果があるのか及びβアゴニスト及び／又はアンタゴニストの効果が直接的なものなのか間接的なものなのかは明らかでない。
【０００６】
視床下部におけるレプチンシグナリングは、幾つかの組織特に褐色脂肪組織、腎臓、後脚、副腎に対する交感神経の活動を刺激することができる(Haynes等、1997, J.Clin.Investigation 100(2):270-278)。褐色脂肪組織に対する増大した交感神経活動の機能的結果は、増大した産熱活動であり、並びにＵＣＰ１(非カップリングタンパク質１)及びレプチン自体の増大した遺伝子発現である(Commins等、1999, Endocrinology 140(10):4772-4778)。レプチンが、膵臓のエンドクリン機能を交感神経刺激を介して調節することができるという幾つかの証拠もある(Mizuno等、1998, Endocrinology 139(9):3863-3870)。他の論文は、レプチンの発現の不十分な哺乳動物が減少した交感神経活動及びエンドクリン欠損を有すること及び、幾つかの場合には、アドレナリン作動性アゴニストがこれらの動物の体重増加を抑制することができることを示している(Commins等、2000, J.Biol.Chem. 275(42):33059-33067及びOzata等、1999, J Clin Endocrinol Metab 84(10):3686-95)。
【０００７】
３．発明の概要
本発明の目的は、骨の病気の、交感神経系経路の操作による治療、診断及び／又は予防である。本発明の一つの面により、骨粗鬆症の少なくとも一つの症状を治療し又は予防するための一つの方法であって、βアドレナリン作動性アンタゴニストの投与を含む当該方法がある。この面の特定の具体例は、レプチンアンタゴニストのβアドレナリン作動性アンタゴニストと組み合わせての更なる投与を含むが、これに限られない。他の具体例においては、骨粗鬆症又は骨硬化症の少なくとも一つの症状を治療し又は予防するための方法であって、βアドレナリン作動性アゴニストの投与を含む当該方法がある。更なる具体例は、レプチンアゴニストのβアドレナリン作動性アゴニストと組み合わせての更なる投与を含むが、これに限られない。
【０００８】
本発明の他の目的は、レプチンの骨に対する効果を調節する方法であって、治療上有効な量の交感神経活動状態を変える医薬組成物の投与を含む当該方法に関係する。本発明の他の具体例は、骨量を調節する方法であって、治療上有効な量の交感神経活動状態を変えて骨量を調節する医薬組成物の投与を含む当該方法と関係する。この医薬組成物の特別の具体例には、レプチンアンタゴニスト、レプチンアゴニスト、交感神経系アンタゴニスト、交感神経系アゴニスト、及びこれらの組合せが含まれるが、これらに限られない。
【０００９】
本発明の他の目的は、骨の病気の少なくとも一つの症状を治療し又は予防する方法であって、治療上有効な量の、骨におけるレプチンの効果を交感神経活動状態を変えることにより調節する医薬組成物の投与を含む当該方法と関係する。この医薬組成物の特別の例には、レプチンアンタゴニスト、レプチンアゴニスト、交感神経系アンタゴニスト、交感神経系アゴニスト、及びこれらの組合せが含まれるが、これらに限られない。
【００１０】
本発明の他の目的は、下記を含む哺乳動物における骨組織の診断又は予測である：
(ａ)交感神経活動状態及びレプチン活性を、骨の病気を有することが疑われる哺乳動物において測定し、そして
(ｂ)ステップ(ａ)で測定された値を対応する対照用の値と比較する。
【００１１】
本発明の他の目的は、レプチンアンタゴニスト、レプチンアゴニスト、交感神経系アンタゴニスト、交感神経系アゴニストの任意の組合せを含む医薬組成物を含む。組合せの例には、レプチンアンタゴニストと交感神経系アンタゴニスト、レプチンアゴニストと交感神経系アゴニスト、レプチンアンタゴニストと交感神経系アゴニスト、及びレプチンアゴニストと交感神経系アンタゴニストが含まれるが、これらに限られない。他の具体例においては、この組成物は、更に、製薬上許容しうるキャリアーを含む。
【００１２】
本発明の他の目的は、骨の病気の、レプチンシグナリング経路の操作による治療、診断及び／又は予防である。本発明によって治療及び／又は防止することのできる骨の病気には、病気でない対応する骨と比較して減少した骨量により特徴付けられる病気が含まれるが、骨粗鬆症、オステオペニア及びパジェット病に限られない。本発明によって治療及び／又は防止することのできる骨の病気には、病気でない対応する骨と比較して増大した骨量により特徴付けられる骨の病気も含まれるが、大理石骨病、骨軟骨症及びピンコディソストーシスに限られない。
【００１３】
従って、本発明の一つの面によれば、骨の病気を治療する一つの方法であって、該治療を必要とする哺乳動物に治療上有効な量の、血清中のレプチンレベルを低下させる化合物を投与することを含み、骨の病気が対応する病気でない骨と比較して減少した骨量を特徴とする当該方法がある。これらの化合物及び方法の幾つかの特定の具体例には、レプチン合成を阻害し若しくは低下させ又はレプチン分解を増大させるものが含まれるが、これらに限られない。かかる化合物の内には、アンチセンス、リボザイム又はレプチンをコードするポリペプチドの三重らせん配列がある。
【００１４】
本発明の他の面によれば、骨の病気を治療する方法であって、該治療を必要とする哺乳動物に治療上有効な量の、脳脊髄液中のレプチンレベルを低下させる化合物を投与することを含み、骨の病気が、病気でない対応する骨と比較して減少した骨量を特徴とする当該方法がある。これらの化合物及び方法の幾つかの特定の例には、レプチン合成を阻害し若しくは低下させ又はレプチン分解を増大させるものが含まれるが、これらに限られない。
【００１５】
この発明の方法の特定の具体例には、例えば、骨の病気を治療する方法であって、該治療を必要とする哺乳動物に治療上有効な量の、化合物を投与することを含み、骨の病気が、病気でない対応する骨と比較して減少した骨量を特徴とし、該化合物を、血中のレプチンに結合する化合物よりなる群から選択する(但し、特異的にレプチンに結合する抗体、可溶性レプチンレセプターポリペプチド、インターアルファ−トリプシンインヒビター重鎖関連タンパク質及びアルファ２−マクログロブリンタンパク質などの化合物に限られない)当該方法が含まれる。
【００１６】
本発明の他の面によれば、骨の病気を治療する方法であって、該治療を必要とする哺乳動物に治療上有効な量の、リン酸化Ｓｔａｔ３ポリペプチドのレベルを低下させる化合物を投与することを含み、骨の病気が、病気でない対応する骨と比較して減少した骨量を特徴とする当該方法がある。これらの化合物及び方法の幾つかの特定の具体例には、レプチン合成を阻害し若しくは低下させ又はレプチン分解を増大させるもの、血中のレプチンに結合する化合物、及びレプチンレセプターアンタゴニスト化合物例えばアセチルフェノール化合物、レプチンに特異的に結合する抗体、レプチンレセプターに特異的に結合する抗体、及び可溶性レプチンレセプターポリペプチド配列を含む化合物が含まれるが、これらに限られない。
【００１７】
本発明の他の面によれば、骨の病気を治療し又は予防する方法であって、該治療又は予防を必要とする哺乳動物に治療上有効な量の、ドーパミンβヒドロキシラーゼ(「ＤＢＨ」)(ドーパミンのノルエピネフリンへの変換に必要な酵素)の活性を阻害する化合物を投与することを含む当該方法がある。これらの化合物及び方法の幾つかの特別の具体例には、ＤＢＨ酵素活性、ＤＢＨ遺伝子発現を阻害するもの、ＤＢＨに特異的に結合する抗体、及びノルエピネフリン合成経路に含まれる化合物が含まれるが、これらに限られない。他の具体例においては、ＤＢＨインヒビターを、他のアンタゴニスト又はアゴニスト(例えば、βアドレナリン作動性アンタゴニスト及び／又はレプチンアンタゴニスト)と一緒に投与することができる。
【００１８】
本発明の別の面によれば、骨の病気を治療する方法であって、該治療を必要とする哺乳動物に治療上有効な量の、視床下部のレプチンレセプターレベルを低下させる化合物を投与することを含み、骨の病気が、病気でない対応する骨と比較して減少した骨量を特徴とする当該方法がある。これらの化合物及び方法の幾つかの特別の具体例には、レプチンレセプター合成を阻害し若しくは低下させ又はレプチンレセプター分解を増大させるものが含まれるが、これらに限られない。かかる化合物の内には、アンチセンス、リボザイム又はレプチンレセプターをコードするポリペプチドの三重らせん配列がある。
【００１９】
本発明の更に別の面によれば、骨の病気を治療する方法であって、該治療を必要とする哺乳動物に治療上有効な量の、血清中及び／又は脳脊髄液中のレプチンレベルを増大させる化合物を投与することを含み、骨の病気が、病気でない対応する骨と比較して増大した骨量を特徴とする当該方法がある。これらの化合物及び方法の幾つかの特定の具体例には、レプチン合成を増大させ若しくは誘導し又はレプチン分解を増大させるものが含まれるが、これらに限られない。
【００２０】
本発明の他の面によれば、骨の病気を治療する方法であって、該治療を必要とする哺乳動物に治療上有効な量の、リン酸化Ｓｔａｔ３ポリペプチドのレベルを増大させる化合物を投与することを含み、骨の病気が、病気でない対応する骨と比較して増大した骨量を特徴とする当該方法がある。これらの化合物及び方法の幾つかの特別の具体例には、レプチン合成を増大若しくは誘導し又はレプチン分解を減少させるもの、及びレプチンレセプターアゴニスト化合物が含まれるが、これらに限られない。
【００２１】
本発明の他の面によれば、骨の病気を治療する方法であって、該治療を必要とする哺乳動物に治療上有効な量の、視床下部のレプチンレセプターレベルを増大させる化合物を投与することを含み、骨の病気が、病気でない対応する骨と比較して増大した骨量を特徴とする当該方法がある。これらの化合物及び方法の幾つかの特別の具体例には、レプチンレセプター合成を増大させ若しくは誘導し又はレプチンレセプター分解を減少させるものが含まれるが、これらに限られない。
【００２２】
本発明の更に別の面によれば、骨の病気を防止する方法であって、該病気の危険にある哺乳動物に、血清中のレプチンレベルを低下させる化合物を、該骨の病気を防止するのに十分な濃度で投与することを含み、該骨の病気が、病気でない対応する骨と比較して減少した骨量を特徴とする当該方法がある。これらの化合物及び方法の幾つかの特別の具体例には、レプチン合成を阻害し若しくは低下させ又はレプチン分解を増大させるものが含まれるが、これらに限られない。かかる化合物の内には、アンチセンス、リボザイム又はレプチンをコードするポリペプチドの三重らせん配列がある。
【００２３】
本発明の他の面によれば、骨の病気を防止する方法であって、該骨の病気の危険にある哺乳動物に、脳脊髄液中のレプチンレベルを低下させる化合物を、該骨の病気を防止するのに十分な濃度で投与することを含み、該骨の病気が、病気でない対応する骨と比較して減少した骨量を特徴とする当該方法がある。これらの化合物及び方法の幾つかの特別の具体例には、レプチン合成を阻害し若しくは低下させ又はレプチン分解を増大させるもの、及び血中のレプチンに結合する化合物が含まれるが、これらに限られない。
【００２４】
この発明の方法の特定の具体例は、例えば、骨の病気を防止する方法であって、該骨の病気の危険にある哺乳動物に、化合物を、該骨の病気を防止するのに十分な濃度で投与することを含み、該骨の病気が、病気でない対応する骨と比較して減少した骨量を特徴とし、該化合物を、血中のレプチンに結合する化合物より2なる群から選択する(レプチンに特異的に結合する抗体、可溶性レプチンレセプターポリペプチド、インターアルファ−トリプシンインヒビター重鎖関連タンパク質及びアルファ２−マクログロブリンタンパク質などの化合物を含むが、これらに限られない)当該方法を包含する。
【００２５】
本発明の他の面によれば、骨の病気を防止する方法であって、該骨の病気の危険にある哺乳動物に、リン酸化Ｓｔａｔ３ポリペプチドのレベルを低下させる化合物を、該骨の病気を防止するのに十分な濃度で投与することを含み、該骨の病気が、病気でない対応する骨と比較して減少した骨量を特徴とする当該方法がある。これらの化合物及び方法の幾つかの特別の具体例は、レプチン合成を阻害し若しくは低下させ又はレプチン分解を増大させるもの、血中のレプチンに結合する化合物、及びレプチンレセプターアンタゴニスト化合物例えばアセチルフェノール化合物、レプチンに特異的に結合する抗体、レプチンレセプターに特異的に結合する抗体、及び可溶性レプチンレセプターポリペプチド配列を含む化合物を包含するが、これらに限られない。
【００２６】
本発明の他の面によれば、骨の病気を防止する方法であって、該骨の病気の危険にある哺乳動物に、視床下部のレプチンレセプターレベルを低下させる化合物を投与することを含み、該骨の病気が、病気でない対応する骨と比較して減少した骨量を特徴とする当該方法がある。これらの化合物及び方法の幾つかの特別の具体例は、レプチンレセプター合成を阻害し若しくは低下させ又はレプチンレセプター分解を増大させるものを包含するが、これらに限られない。かかる化合物の内に、アンチセンス、リボザイム又はレプチンレセプターをコードするポリペプチドの三重らせん配列がある。
【００２７】
本発明の更に別の面によれば、骨の病気を防止する方法であって、該骨の病気の危険にある哺乳動物に、血清及び／又は脳脊髄液中のレプチンを増大させる化合物を、該骨の病気を防止するのに十分な濃度で投与することを含み、該骨の病気が、病気でない対応する骨と比較して増大した骨量を特徴とする当該方法がある。これらの化合物及び方法の幾つかの特別の具体例は、レプチン合成を増大させ若しくは誘導し又はレプチン分解を減少させるものを包含するが、これらに限られない。
【００２８】
本発明の他の面によれば、骨の病気を防止する方法であって、該骨の病気の危険にある哺乳動物に、リン酸化されたＳｔａｔ３ポリペプチドのレベルを増大させる化合物を、該骨の病気を防止するのに十分な濃度で投与することを含み、該骨の病気が、病気でない対応する骨と比較して増大した骨量を特徴とする当該方法がある。これらの化合物及び方法の幾つかの特別の具体例は、レプチン合成を増大させ若しくは誘導し又はレプチン分解を減少させるもの、及びレプチンレセプターアゴニスト化合物を包含するが、これらに限られない。
【００２９】
本発明の他の面によれば、骨の病気を防止する方法であって、該病気の危険にある哺乳動物に、視床下部のレプチンレセプターレベルを増大させる化合物を、該骨の病気を防止するのに十分な濃度で投与することを含み、該骨の病気が、病気でない対応する骨と比較して増大した骨量を特徴とする当該方法がある。これらの化合物及び方法の幾つかの特別の具体例は、レプチンレセプター合成を増大させ若しくは誘導し又はレプチンレセプター分解を減少させるものを包含するが、これらに限られない。
【００３０】
本発明の更に別の面によれば、哺乳動物例えばヒトの骨の病気を診断し又は予測する方法であって、下記：
(ａ)哺乳動物例えば骨の病気を示し又は該病気の危険にあることが疑われる哺乳動物の血清中のレプチンレベルを測定し；そして
(ｂ)(ａ)で測定されたレベルを、対照用血清中のレプチンのレベルと比較し、それで、(ａ)で得られたレベルが対照よりも高いならば、この哺乳動物は、骨の病気を示し又は該病気の危険にあると診断し又は予測する
ことを含み、該骨の病気が、病気でない対応する骨と比較して減少した骨量を特徴とする当該方法がある。
【００３１】
本発明の他の面によれば、哺乳動物例えばヒトの骨の病気を診断し又は予測する方法であって、下記：
(ａ)哺乳動物例えば骨の病気を示し又は該病気の危険にあることが疑われる哺乳動物の脳脊髄液中のレプチンレベルを測定し；そして
(ｂ)(ａ)において測定されたレベルを、対照用脳脊髄液中のレプチンレベルと比較する
ことを含み、それで、(ａ)で得られたレベルが対照よりも高いならば、この哺乳動物は、骨の病気を示し又は該病気の危険にあると診断し、該骨の病気は、病気でない対応する骨と比較して減少した骨量を特徴とする当該方法がある。
【００３２】
本発明の更に別の面によれば、哺乳動物例えばヒトの骨の病気を診断し又は予測する方法であって、下記：
(ａ)哺乳動物例えば該骨の病気を示し又は該病気の危険にあることが疑われる哺乳動物の血清中のレプチンレベルを測定し；そして
(ｂ)(ａ)で測定されたレベルを、対照用血清中のレプチンレベルと比較する
ことを含み、それで、(ａ)で得られたレベルが対照よりも低いならば、この哺乳動物は、該骨の病気を示し又は該病気の危険にあると診断し、該骨の病気が、病気でない対応する骨と比較して増大した骨量を特徴とする当該方法がある。
【００３３】
本発明の他の面によれば、哺乳動物例えばヒトの骨の病気を診断し又は予測する方法であって、下記：
(ａ)哺乳動物例えば該骨の病気を示し又は該病気の危険にあることが疑われる哺乳動物の脳脊髄液中のレプチンレベルを測定し；そして
(ｂ)(ａ)で測定されたレベルを、対照用脳脊髄液中のレプチンレベルと比較する
ことを含み、それで、(ａ)で得られたレベルが対照より低いならば、この哺乳動物は、該骨の病気を示し又は該病気の危険にあると診断し、該骨の病気が、病気でない対応する骨と比較して増大した骨量を特徴とする当該方法がある。
【００３４】
本発明の更に別の面によれば、哺乳動物例えばヒトの骨の病気を治療するための化合物の効力をモニターする方法であって、下記：
(ａ)その化合物を哺乳動物に投与し；
(ｂ)その哺乳動物の血清中のレプチンレベルを測定し；そして
(ｃ)(ｂ)で測定されたレベルを、その化合物を投与する前のその哺乳動物の血清中のレプチンレベルと比較し、
それにより、その化合物の効力をモニターすることを含み、該骨の病気が、病気でない対応する骨と比較して減少した骨量を特徴とする当該方法がある。
【００３５】
本発明の他の面によれば、哺乳動物例えばヒトの骨の病気を治療するための化合物の効力をモニターする方法であって、下記：
(ａ)その化合物を哺乳動物に投与し；
(ｂ)その哺乳動物の脳脊髄液中のレプチンレベルを測定し；そして
(ｃ)(ｂ)で測定されたレベルを、その化合物を投与する前のその哺乳動物の脳脊髄液中のレプチンレベルと比較し、
それにより、その化合物の効力をモニターすることを含み、該骨の病気が、病気でない対応する骨と比較して減少した骨量を特徴とする当該方法がある。
【００３６】
本発明の更に他の面によれば、哺乳動物例えばヒトの骨の病気を治療する化合物の効力をモニターする方法であって、下記：
(ａ)その化合物を哺乳動物に投与し；
(ｂ)その哺乳動物の血清中のレプチンレベルを測定し；そして
(ｃ)(ｂ)で測定されたレベルを、その化合物を投与する前のその哺乳動物の血清中のレプチンレベルと比較し、
それにより、その化合物の効力をモニターすることを含み、該骨の病気が、病気でない対応する骨と比較して増大した骨量を特徴とする当該方法がある。
【００３７】
本発明の他の面によれば、哺乳動物例えばヒトの骨の病気を治療するための化合物の効力をモニターする方法であって、下記：
(ａ)その化合物を哺乳動物に投与し；
(ｂ)その哺乳動物の脳脊髄液中のレプチンレベルを測定し；そして
(ｃ)(ｂ)で測定されたレベルを、その化合物を投与する前のその哺乳動物の脳脊髄液中のレプチンレベルと比較し、
それにより、その化合物の効力をモニターすることを含み、該骨の病気が、病気でない対応する骨と比較して増大した骨量を特徴とする当該方法がある。
【００３８】
本発明の他の面によれば、哺乳動物の骨量を調節する(増大又は減少させる)能力について試験すべき化合物を同定する方法であって、該方法は、下記：
(ａ)試験化合物をポリペプチドと接触させ；そして
(ｂ)その試験化合物がそのポリペプチドに結合するかどうか測定し、それで、その試験化合物がそのポリペプチドに結合するならば、骨量を調節する能力について試験すべき化合物を同定することを含み、該ポリペプチドを、レプチンポリペプチド、レプチンレセプターポリペプチド、及びアドレナリン作動性レセプターポリペプチドよりなる群から選択する当該方法がある。
【００３９】
本発明の他の面によれば、哺乳動物の骨量を調節する(増大させ又は減少させる)化合物を同定する方法であって、該方法は、下記：
(ａ)試験化合物をポリペプチドと接触させ；
(ｂ)そのポリペプチドと結合する試験化合物を同定し；そして
(ｃ)(ｂ)の試験化合物を非ヒト哺乳動物に投与して、その試験化合物がその哺乳動物の骨量を、未処理の非ヒト対照用哺乳動物の対応する骨と比較して調節するかどうか測定する
ことを含み、該ポリペプチドを、レプチンポリペプチド、レプチンレセプターポリペプチド、及びアドレナリン作動性レセプターポリペプチドよりなる群から選択し、それで、試験化合物が骨量を調節するならば、哺乳動物の骨量を調節する化合物が同定される当該方法がある。
【００４０】
本発明の更に別の面によれば、哺乳動物の骨量を調節する(増大させ又は減少させる)能力について試験すべき化合物を同定する方法であって、該方法は、下記：
(ａ)試験化合物を、レプチンポリペプチド及びレプチンレセプターポリペプチドに、レプチン／レプチンレセプター複合体又はカテコールアミン／アドレナリン作動性レセプター複合体を形成するのに十分な時間接触させ；そして
(ｂ)レプチン／レプチンレセプター又はカテコールアミン／アドレナリン作動性レセプター複合体レベルを測定することを含み、それで、測定されたレベルが、試験化合物の非存在下で測定されたものと異なるならば、骨量を調節する能力について試験されるべき化合物が同定される当該方法がある。
【００４１】
本発明の他の面によれば、哺乳動物の骨量を減少させる能力について試験すべき化合物を同定する方法であって、該方法は、下記：
(ａ)試験化合物を、機能的レプチンレセプター又は機能的アドレナリン作動性レセプターを発現する細胞と接触させ；そして
(ｂ)試験化合物が、レプチンレセプター又はアドレナリン作動性レセプターを活性化するかどうかを測定する
ことを含み、該化合物が、該レプチンレセプター又はアドレナリン作動性レセプターを活性化するならば、哺乳動物の骨量を減少させる能力について試験すべき化合物が同定される当該方法がある。
【００４２】
本発明の他の面によれば、哺乳動物の骨量を減少させる化合物を同定する方法であって、該方法は、下記：
(ａ)試験化合物を、機能的レプチンレセプター又はアドレナリン作動性レセプターを発現する細胞と接触させて、該試験化合物が、レプチンレセプター又はアドレナリン作動性レセプターを活性化するかどうかを測定し；
(ｂ)(ａ)でレプチンレセプター又はアドレナリン作動性レセプターを活性化するとして同定された試験化合物を非ヒト動物に投与して、該試験化合物が該動物の骨量を、対照用非ヒト動物の対応する骨と比較して減少させるかどうかを測定する
ことを含み、それで、該試験化合物が骨量を減少させるならば、哺乳動物の骨量を減少させる化合物が同定される。
【００４３】
本発明の他の面によれば、哺乳動物の骨量を増大させる能力について試験すべき化合物を同定する方法であって、該方法は、下記：
(ａ)レプチンポリペプチドと試験化合物を、機能的レプチンレセプターを発現する細胞と接触させ；そして
(ｂ)該試験化合物がレプチンレセプターの活性化を、該試験化合物の非存在下で認められる活性化と比較して低下させるかどうかを測定する
ことを含み、該レプチンレセプターの活性化を低下させる化合物を、哺乳動物の骨量を増大させる能力について試験すべき化合物として同定する当該方法がある。
【００４４】
本発明の他の面によれば、哺乳動物の骨量を増大させる能力について試験すべき化合物を同定する方法であって、該方法は、下記：
(ａ)カテコールアミンと試験化合物を、機能的アドレナリン作動性レセプターを発現する細胞と接触させ；そして
(ｂ)該試験化合物が、該アドレナリン作動性レセプターの活性化を、該試験化合物の非存在下で認められる活性化と比較して低下させるかどうかを測定することを含み、該アドレナリン作動性レセプターの活性化を低下させる試験化合物を、哺乳動物の骨量を増大させる能力について試験すべき化合物として同定する当該方法がある。
【００４５】
本発明の更に別の面によれば、哺乳動物の骨量を増大させる化合物を同定する方法であって、該方法は、下記：
(ａ)レプチンポリペプチドと試験化合物を、機能的レプチンレセプターを発現する細胞と接触させて、該試験化合物が該レプチンレセプターの活性化を減少させるかどうかを測定し；
(ｂ)(ａ)でレプチンレセプターを減少させるとして同定された試験化合物を非ヒト動物に投与して、該試験化合物が該動物の骨量を、対照用非ヒト動物の対応する骨と比較して増大させるかどうかを測定することを含み、それで、該試験化合物が骨量を増大させるならば、哺乳動物の骨量を増大させる化合物が同定される当該方法がある。
【００４６】
本発明の更に別の面によれば、哺乳動物の骨量を増大させる化合物を同定する方法であって、該方法は、下記：
(ａ)カテコールアミンと試験化合物を、機能的アドレナリン作動性レセプターを発現する細胞と接触させて；該試験化合物が該アドレナリン作動性レセプターの活性化を減少させるかどうかを測定し；
(ｂ)(ａ)でアドレナリン作動性レセプターを減少させるとして同定された試験化合物を非ヒト動物に投与して、該試験化合物が該動物の骨量を、対照用非ヒト動物の対応する骨と比較して増大させるかどうかを測定することを含み、それで、該試験化合物が骨量を増大させるならば、哺乳動物の骨量を増大させる化合物が同定される当該方法がある。
【００４７】
本発明は又、骨の病気を治療及び／又は防止するために利用することのできる医薬組成物をも提供する。
【００４８】
他の及び更なる目的、特徴及び利点は、下記の明細書を読み、その一部を形成する付随する図面を参照することによって明らかとなるであろうし、結局一層容易に理解され、又はこの発明の好適具体例の何れの実施例も開示の目的のために与えてある。
【００４９】
３．１．専門用語
ここで用いる下記の用語は、示した意味を有する：
レプチン(「Ｏｂ」)は、ここで用いる場合、ｏｂ遺伝子好ましくはヒトのｏｂ遺伝子の内因性ポリペプチド産物により規定され、その公知の活性は、視床下部により媒介される。
【００５０】
レプチンレセプター(「ＯｂＲ」)は、ここで用いる場合、レプチンホルモンが結合してそのシグナルを生成するレセプターにより規定され、好ましくは、この用語は、ヒトのレプチンレセプターを指す。
【００５１】
カテコールアミンは、ここで用いる場合、カテコール、１，２−ジヒドロキシベンゼン好ましくはノルエピネフリン及びエピネフリンの内因性のアミン含有誘導体として定義される。
【００５２】
アドレナリン作動性レセプター(「ＡＲ」)は、ここで用いる場合、カテコールアミンが結合してそのシグナルを生成するレセプターにより規定され、好ましくは、この用語は、ヒトのアドレナリン作動性レセプターを指す。
【００５３】
ＮＰＹは、ここで用いる場合、ニューロペプチドＹ、好ましくはヒトのニューロペプチドＹとして定義される。ニューロペプチドＹ(ＮＰＹ)は、膵臓ポリペプチドファミリーのメンバーである。用語ＮＰＹは、ここで用いる場合、ニューロペプチドＹを包含するだけでなく、その膵臓ポリペプチドファミリー内のペプチド関連物(例えば、ペプチドＹＹ(ＰＹＹ)及び膵臓ポリペプチド(ＰＰ))をも含むということは理解されるべきである。
【００５４】
ニューロペプチドＹレセプター(「ＮＰＹレセプター」又は「ＮＰＹ−Ｒ」)は、ここで用いる場合、内因性ＮＰＹと生理的条件下で結合するレセプター好ましくはヒトのレセプターとして規定される。ＮＰＹレセプターは、Ｇタンパク質結合性レセプターであり、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、Ｙ４又はＹ５(又はＰＰ)として知られるサブタイプを含むが、これらに限られない。
【００５５】
繊毛神経栄養因子(「ＣＮＴＦ」)は、ここで用いる場合、ＣＮＴＦ遺伝子好ましくはヒトのＣＮＴＦ遺伝子の内因性ポリペプチド産物により規定され、その公知の活性は、中枢神経系及び抹消神経系(自律神経系を含む)により媒介される。
【００５６】
ＣＮＴＦレセプターは、ここで用いる場合、ＣＮＴＦが結合してそのシグナルを生成するレセプターにより規定され、好ましくは、この用語は、ヒトのＣＮＴＦレセプターを指す。特別の具体例において、このＣＮＴＦレセプターは、ｇｐ１３０、ＬＩＦＲ、ＣＮＴＦＲα及び任意の他のＣＮＴＦシグナルの変換に必要な分子の多重結合の複合体を含む。別の具体例において、ＣＮＴＦレセプターは、ｇｐ１３０、ＬＩＦＲ及びＣＮＴＦＲαの類似体の多重結合の複合体を含む。かかる類似体は、ＣＮＴＦレセプター機能に寄与することが当業者に知られている。一つのかかる具体例において、ＣＮＴＦレセプターは、特異的にｇｐ１３０、ＬＩＦＲ及びｓＣＮＴＦＲαの多重結合複合体を含む。
【００５７】
ＣＮＴＦレセプターポリペプチドは、ここで用いる場合、ＣＮＴＦレセプターのポリペプチド成分として規定される。この発明の特別の具体例において、ＣＮＴＦレセプターポリペプチドは、ｇｐ１３０、ＬＩＦＲ、ＣＮＴＦＲα及び任意の他のＣＮＴＦシグナルの変換に必要なポリペプチド及びその機能的類似体を包含する。かかる類似体(ｓＣＮＴＦＲαを含む)は、ＣＮＴＦシグナル変換に関与することが当業者に知られている。
【００５８】
ＣＮＴＦレセプターポリヌクレオチドは、ここで用いる場合、ＣＮＴＦレセプターのポリペプチド成分をコードするポリヌクレオチドとして規定される。特別の具体例において、ＣＮＴＦレセプターポリヌクレオチドは、ｇｐ１３０をコードするポリヌクレオチド、ＬＩＦＲをコードするポリヌクレオチド、ＣＮＴＦＲαをコードするポリヌクレオチド及び任意の他のＣＮＴＦレセプターの成分をコードするポリヌクレオチドである。
【００５９】
ＣＮＴＦレセプター遺伝子は、ここで用いる場合、ＣＮＴＦレポーターのポリペプチド成分をコードする遺伝子として規定され、例えば、ｇｐ１３０、ＬＩＦＲ、ＣＮＴＦＲα又は任意の他のＣＮＴＦレセプターの成分をコードする遺伝子がある。
【００６０】
可溶性ＣＮＴＦＲα(「ｓＣＮＴＦＲα」)は、ここで用いる場合、細胞外環境で可溶性のＣＮＴＦＲαのポリペプチド成分を含む分子である。可溶性ＣＮＴＦＲαは、典型的には、ＣＮＴＦＲαのＧＰＩ膜アンカーを欠く。
【００６１】
骨の病気は、ここで用いる場合、任意の骨の病気及び健康又は骨への完全性の喪失を生じ又は該喪失により特徴付けられる状態をいい、骨粗鬆症、オステオペニア、骨形成不全又は再吸収不全、パジェット病、骨折、骨転移、大理石骨病、硬骨化症及び骨端症が含まれるが、これらに限られない。一層詳細には、本発明によって治療及び／又は防止しうる骨の病気には、病気でない対応する骨と比較して減少した骨量により特徴付けられる骨の病気(例えば、骨粗鬆症、オステオペニア及びパジェット病)及び病気でない対応する骨と比較して増大した骨量により特徴付けられる骨の病気(例えば、大理石骨病、硬骨化症及び骨端症)が含まれる。骨の病気の防止は、ここに記載したように病気が始まる前にそれを防止するために積極的に介入することを含む。骨の病気の治療は、病気の開始後に病気又は状態の悪化を遅らせ、症状を改善させ又は逆行させるために積極的に介入することを含む。一層詳細には、治療は、ここで用いる場合、骨量を調節して病気でない対応する骨(即ち、同じ方の対応する骨、例えば、長骨、脊椎骨など)の骨量と一層似たものにする方法をいう。
【００６２】
レプチンレセプターアンタゴニストは、ここで用いる場合、レプチンレセプターの作用又は効果を中和し又は妨げ或は減少させる因子をいう。かかるアンタゴニストは、レプチンに結合する化合物又はレプチンレセプターに結合する化合物を含むことができる。かかるアンタゴニストは又、レプチンレセプターの出力即ちレプチンのレプチンレセプターへの結合後のレプチンシグナリング経路の細胞内ステップ(即ち、レセプター／リガンド相互作用レベルでは起きないレプチン／レプチンレセプターシグナリングに影響する下流事象)を中和し、妨げ或は減少させる化合物を含むこともできる。レプチンレセプターアンタゴニストは、タンパク質、抗体、小型有機分子又は炭水化物(例えば、アセチルフェノール化合物、レプチンに特異的に結合する抗体、レプチンレセプターに特異的に結合する抗体、及び可溶性レプチンレセプターポリペプチド配列を含む化合物)を含むことができるが、これらに限られない。
【００６３】
レプチンレセプターアゴニストは、ここで用いる場合、レプチンレセプターの作用又は効果を活性化し、誘導し或は増大させる因子をいう。かかるアゴニストは、レプチンに結合する化合物又はレプチンレセプターに結合する化合物を含むことができる。かかるアンタゴニストは又、レプチンレセプター出力即ちレプチンのレプチンレセプターへの結合後のレプチンシグナリング経路の細胞内ステップ(即ち、レセプター／リガンド相互作用レベルでは起きないレプチン／レプチンレセプターシグナリングに影響する下流事象)を活性化し、誘導し或は増大させる化合物を含むこともできる。レプチンレセプターアゴニストには、タンパク質、抗体、小型有機分子又は炭水化物(例えば、レプチン、レプチン類似体、及びレプチンに特異的に結合して活性化する抗体)が含まれるが、これらに限られない。
【００６４】
薬剤は、投与された量が、レシピエント哺乳動物の生理機能に所望の変化を生じたならば、例えば、骨量の増加又は減少を生じたならば、即ち、骨量を、病気でない対応する骨(即ち、同じ型の対応する骨、例えば、長骨、脊椎骨など)と一層似たものとなるように調節したならば、「製薬上有効な量」で投与されたといわれる。
【００６５】
ＥＣＤは、ここで用いる場合、細胞外ドメインをいう。
ＴＭは、ここで用いる場合、膜貫通ドメインをいう。
ＣＤは、ここで用いる場合、細胞質ドメインをいう。
【００６６】
４．図面の簡単な説明
図１Ａ〜Ｆ。ｏｂ／ｏｂ及びｄｂ／ｄｂマウスにおける高骨量表現型。図１Ａにおいては、６月齢の野生型(ｗｔ)及びｏｂ／ｏｂマウスの椎骨(vert.)及び長骨(大腿骨)のＸ線分析を示している。図１Ｂは、３月齢(３ｍ．)及び６月齢(ｍ．)のｗｔ及びｏｂ／ｏｂマウスの骨の組織学的分析を示している。２つの上側パネルは、脊椎骨の分析を示し、２つの下側パネルは、長骨を示している。鉱化した骨のマトリクスを、フォン−コッサ試薬により黒色に染色してある。図１Ｃは、ｏｂ／ｏｂマウスにおける骨容積の増大の定量化を示している。ＢＶ／ＴＶ、小柱容積当たりの骨容積。灰色の棒、ｗｔマウス；黒色棒、ｏｂ／ｏｂマウス。図１Ｄは、野生型(ｗｔ)、ｏｂ／ｏｂ及び野生型卵巣摘出(ｗｔ−ＯＶＸ)マウスの大腿骨の３点曲げ分析を示している。図１Ｅは、６月齢のｗｔ及びｄｂ／ｄｂマウスの脊椎骨の組織学的分析である。図１Ｆは、ｄｂ／ｄｂマウスにおける骨容積の増大の定量化である。アスタリスクは、マウスの２グループ間の統計的に有意の差異を示している(ｐ＜０．０５)。誤差棒は、平均の標準誤差(ＳＥＭ)を表している。
図２Ａ〜Ｄ。ｏｂ／ｏｂマウスの高骨量表現型は、レプチン欠損によるものであり、肥満によるものではない。図２Ａは、１月齢のｗｔ(ｗｔ １ ｍｏ)及び１月齢の低脂肪食餌を摂取したｏｂ／ｏｂマウス(ｏｂ／ｏｂ １ ｍｏ ＬＦ食餌)の組織学的分析を示している。図２Ｂは、３月齢のｗｔ及びｏｂ／＋マウスの脊椎骨の組織学的分析である。図２Ｃは、６月齢のｗｔ及びアグーチイェロー変異体マウス(Ａy/a)の脊椎骨の組織学的分析である。図２Ｄは、通常の食餌又は高脂肪(ＨＦ)食餌を摂取した６月齢のｗｔマウスの脊椎骨の組織学的分析である。下線を付けた番号は、マウスの実験及び対照用グループ間の統計的に有意の差異を示している(ｐ＜０．０５)。
図３Ａ〜Ｈ。レプチンシグナリングの非存在は、骨芽細胞機能の増大を引き起こす。図３Ａにおいて、３月齢の野生型(ｗｔ)及びｏｂ／ｏｂマウスにおけるカルセイン二重標識を示している。２つの標識(白い矢印)の間の距離は、骨形成速度を表している。図３Ｂ〜Ｆにおいて、骨形成速度は、ｏｂ／ｏｂマウス(Ｂ)及びｄｂ／ｄｂマウス(Ｄ)において、それぞれ４５及び７０％増加している。この増加は、正常数の骨芽細胞の存在下で(図３Ｃ及びＥ)及び性腺機能低下症のために増加した骨芽細胞数(図３Ｆ)にもかかわらず起きる。空の棒、ｗｔマウス；黒色棒、ｏｂ／ｏｂマウス；灰色棒、ｄｂ／ｄｂマウス；３ｍ．、３月齢動物；６ｍ．、６月齢動物。図３Ｇにおいて、脂肪制限した１月齢のｏｂ／ｏｂマウス及びヘテロ接合のｏｂ／＋マウス(肥満でない)(図２Ａ及びＢの体重参照)における増大した骨形成速度が示されている。図３Ｈにおいて、高脂肪食餌を摂取したｗｔマウス、又はＡy/aマウス{太りすぎ(図２Ｃ及びＤ参照)であるが、レプチン欠損でない}は、正常の骨形成速度を有する。アスタリスクは、対照用マウスと比較して統計的に有意の差異を示している(ｐ＜０．０５)。誤差棒は、ＳＥＭを表している。
図４Ａ〜Ｅ。レプチンシグナリングの非存在下での正常な破骨細胞機能。野生型(ｗｔ)及びｏｂ／ｏｂマウス(１７β−エストラジオール処理により性腺機能低下症を矯正されている(Ｅ２)か又はされていない(Ｐ，プラシーボ))の比較分析を示している。図４Ａは、１７β−エストラジオール処理によりｏｂ／ｏｂマウスの子宮萎縮症の矯正があることを示している。図４Ｂ〜Ｄでは、１７β−エストラジオール処理が、１７β−エストラジオール処理されたｗｔマウスにおいて及び１７β−エストラジオール処理されたｏｂ／ｏｂマウスにおいては一層の、骨小柱の有意の増大へと導くことを示す脊椎骨の組織学的分析がある。灰色棒、野生型マウス;黒色棒、ｏｂ／ｏｂマウス；縞模様棒、処理したマウス；中実棒、プラシーボ対照用マウス。アスタリスクは、処理マウスと未処理マウスとの間の統計的に有意の差異を示している(ｐ＜０．０５)。誤差棒は、ＳＥＭを表している。図４Ｅにおいて、ｏｂ／ｏｂ及びｄｂ／ｄｂ破骨細胞の正常な分化及び機能が示されている(エキソ・ビボ)。ｗｔ、ｏｂ／ｏｂ、及びｄｂ／ｄｂマウスに由来する骨髄前駆細胞は、ＴＲＡＰ陽性(ＴＲＡＰ＋)にて、同様によく破骨細胞に分化する(上側パネル及び基線)。それらの象牙質スライスマトリクス上に再吸収穴を形成する能力においても差異はない(下側パネル)。
図５Ａ〜Ｆ。レプチンは、骨芽細胞においてシグナル生成しない。組織及び一次細胞(非鉱化(ＮＭ)骨芽細胞、鉱化(Ｍ)骨芽細胞及び軟骨細胞)(上側パネル)におけるレプチン発現のノーザンブロット分析を、図５Ａに示してある。ＧＡＰＤＨ発現を、ローディングのための内部対照として利用した(下側パネル)。図５Ｂは、Ｏｂ−Ｒｂ(Ｏｂレセプター、ｂ型)転写物が、長骨、頭蓋冠及び一次骨芽細胞においてＲＴ−ＰＣＲによって検出され得ないが、このメッセージは視床下部において検出されることを示している。Ｈｐｒｔの増幅は、ｃＤＮＡの質の内部対照として利用された。図５Ｃは、ウエスタンブロット分析である。オンコスタチンＭ(ＯＳＭ)による誘導を、陽性対照として利用した。図５Ｄにおいて、一次骨芽細胞培養物のレプチン又はオンコスタチンＭでの処理の際の、最初期遺伝子発現(Ｔｉｓ１１及びｃ−ｆｏｓ遺伝子)のノーザンブロット分析がある。Ｇａｐｄｈ発現を、ローディングのための内部対照として利用した(下側パネル)。図５Ｅにおいて、レプチンの非存在下(ビヒクル)又は存在下に維持された野生型マウスに由来するエキソ・ビボ一次骨芽細胞培養物を示している。コラーゲン合成(上側パネル、van Gieson染色)又はマトリクス鉱化(下側パネル、フォン−コッサ染色)に対する効果は認められない。図５Fにおいて、エキソ・ビボ培養実験におけるｄｂ／ｄｂ骨芽細胞の正常機能を示してある。ｗｔマウス及びｄｂ／ｄｂマウスに由来する一次骨芽細胞培養物間のコラーゲン合成(上側パネル、van Gieson染色)及びマトリクス鉱化(下側パネル、フォン−コッサ染色)を示してある。
図６Ａ〜Ｃ。脂肪組織は、高骨量表現型の出現に必要とされない。図６Ａにおいて、６月齢のｗｔ及びＡ−ＺＩＰ／Ｆ−１トランスジェニックマウス(脂肪組織を有しない)の脊椎骨の組織学的分析が示されている。これらのトランスジェニックマウスにおける骨容積(Ｂ)及び骨形成速度(Ｃ)を説明している。アスタリスクは、ｗｔとトランスジェニックマウスとの間の統計的に有意な差異を示している(ｐ＜０．０５)。誤差棒は、ＳＥＭを表している。
図７Ａ〜Ｄ。骨形成に対するレプチンの作用は、視床下部のリレーにより媒介される。図７Ａにおいて、ＰＢＳ又はレプチンを中枢(第３脳室)に注入された４月齢のｏｂ／ｏｂマウス及びｗｔマウスの脊椎骨の組織学的比較がある。骨容積(Ｂ)、小柱容積(Ｃ)及び骨形成速度(Ｄ)を示してある。アスタリスクは、ＰＢＳ注入されたマウスとレプチン注入されたマウスとの間の統計的に有意の差異を示している(ｐ＜０．０５)。誤差棒は、ＳＥＭを表している。
図８。ＤＢＨノックアウトマウスは、高骨容積を有する。図８は、ｗｔ及びＤＢＨ−／−マウスの脊椎骨の組織学的分析を示している。アスタリスクは、マウスの実験及び対照用グループ間の統計的に有意の差異を示している(ｐ＜０．０５)。
図９Ａ〜Ｆ。視床下部におけるレプチンの食欲不振誘発作用及び抗骨形成作用の分離。(図９Ａ〜Ｃ)ＭＳＧ障害。(Ａ)視床下部構造に対する効果、クレシルバイオレット染色(上段パネル)、ＮＰＹの免疫組織化学(中段パネル)及びＳＦ１の免疫組織化学(下段)。弓状核(ＡＲＣ)及びＶＭＨは、それぞれ、黒色及び赤色の点線により囲まれている。ＭＳＧ処理は、ＡＲＣ構造及びＮＰＹ発現(矢印)に顕著に影響を与えたが、ＶＭＨ構造及びＳＦ１を発現するニューロンは保存された。(Ｂ)ＭＳＧ障害を有するマウスの脊椎骨の組織学的分析；骨容積(％骨容積／組織容積)は、影響を受けていない。(Ｃ)レプチンＩＣＶ注入は、ＭＳＧ障害ｏｂ／ｏｂマウス(ＭＳＧ＋レプチン)において、体重に影響しない(左)が、骨容積を減少させる(右)。(図９Ｄ〜Ｆ)ＧＴＧ障害。(Ｄ)視床下部構造の影響、クレシルバイオレット染色(上段)、ＳＦ１の免疫組織化学(中段)及びＮＰＹの免疫組織化学(下段)。ＧＴＧ処理は、ＶＭＨに影響を与えて、密な瘢痕を生じ、ＳＦ−１を発現するニューロンの分布を著しく変えたが、ＡＲＣ構造及びＮＰＹ発現は保存された。(Ｅ)ＧＴＧ障害を有するマウスの脊椎骨の組織学的分析；骨容積及び骨形成速度(ＢＦＲ／ＢＳ)は、増加する。(Ｆ)レプチン注入は、ＧＴＧ処理された動物(ＧＴＧ＋レプチン)において、体重を減少させる(左)が、骨容積には影響を与えない(右)。アスタリスクは、実験及び対照用グループ間の統計的に有意の差異を示している(Ｐ＜０．０１)。
図１０Ａ〜Ｄ。食欲不振誘発性ニューロペプチドは、骨形成を制御しない。(Ａ)４月齢のアグーチイェロー変異体マウス(Ａy/a)のＰＢＳ又はレプチンを注入されたＩＣＶの脊椎骨の組織学的分析。ＩＣＶレプチン注入は、骨容積(骨容積％)及び骨形成速度(ＢＦＲ／ＢＳ、白色矢印)の減少を引き起こす。(Ｂ)３月齢のＭｃ４−Ｒ−欠損マウス(ＭＣ４−Ｒ−／−)の脊椎骨の組織学的分析；骨容積は、正常である。(Ｃ〜Ｄ)ＰＢＳ又はＭＴＩＩをＩＣＶ注入されたｏｂ／ｏｂマウスの脊椎骨の組織学的分析；骨容積は影響されてない(Ｃ)が、体重は減少している(Ｄ)。アスタリスクは、実験及び対照用グループ間の統計的に有意な差異を示している(Ｐ＜０．０１)。誤差棒は、ＳＥＭを表している。
図１１Ａ〜Ｅ。レプチン抗骨形成性機能の末梢媒介。(Ａ)並体結合された後にＰＢＳ又はレプチンを注入されたｏｂ／ｏｂマウスの脊椎骨の組織学的分析を左に示してある。レプチンＩＣＶ注入は、同側マウス(レプチン)の骨容積を減少させる(骨容積％)が、対側性マウス(レプチンパートナー)の骨容積を減少させない。ＰＢＳでは、何らの効果も認められなかった(ＰＢＳ及びＰＢＳパートナー)。(Ｂ)骨芽細胞特異的レプチン(ａｌ(ｌ)−レプチン)トランスジェニックマウスの生成。上段パネル、構築物の図式表示。マウスのレプチンｃＤＮＡは、ａｌ(ｌ)コラーゲンプロモーターの２．３ｋｂの骨芽細胞特異的な断片の制御下にある。下段左側パネル、トランスジーンの骨における発現のノーザンブロット分析。下段右側パネル、レプチン免疫反応性は、ａｌ−レプチンマウスの骨において検出可能であるが、ｗｔマウスでは検出可能でない。(Ｃ)ａｌ−レプチントランスジーンとＳｔａｔ３依存性プロモーターｌｕｃ構築物を同時トランスフェクトされたＯｂＲｂを発現する２９３細胞で行なったａｌ−レプチントランスジーンの生物活性の分析。(Ｅ)１２月齢のａｌ(ｌ)−レプチントランスジェニックマウスの脊椎骨の組織学的分析。骨芽細胞におけるレプチン発現は、骨容積に影響を与えない。アスタリスクは、実験及び対照用グループ間の統計的に有意な差異を示している(Ｐ＜０．０１)。誤差棒は、ＳＥＭを表している。
図１２Ａ〜Ｇ。骨形成の交感神経制御。(Ａ)１２月齢のＤｂｈ欠損マウス(Ｄｂｈ−／−)の脊椎骨の組織学的分析。骨容積(骨容積％)は、Ｄｂｈ−／−マウスにおいて有意に増加している。(Ｂ)カルセイン二重標識、骨形成速度(ＢＦＲ／ＢＳ、白色矢印)及び骨芽細胞数(Ｎ．Ｏｂ／Ｂ．Ｐｍ)は、Ｄｂｈ−／−マウスにおいて増大している。(Ｃ、Ｄ)Ｄｂｈ欠損マウスにおける正常な骨芽細胞数(Ｎ．Ｏｃ／Ｂ．Ｐｍ)及びデオキシピリジノリン架橋排除。(Ｅ)副腎髄質摘出マウス(ＡＤＸ)の脊椎骨の組織学的分析；骨容積は、影響されない。(Ｆ、Ｇ)Ｄｂｈ−／−マウスにおけるレプチンｉｃｖ注入。脂肪パッド重量は減少する(Ｄ)が、骨容積は、この処理によって影響されない(Ｅ)。アスタリスクは、実験及び対照用グループ間の統計的に有意な差異を示している(Ｐ＜０．０１)。誤差棒は、ＳＥＭを表している。
図１３Ａ〜Ｆ。機能的アドレナリン作動性レセプターの骨芽細胞における存在。(Ａ)α及びβアドレナリン作動性レセプター発現のＲＴ−ＰＣＲ(上段パネル)及びノーザンブロット分析(下段パネル)。β２アドレナリン作動性レセプターの発現のみが、骨芽細胞では検出可能である。試料は、一次骨芽細胞(ｏｂ)、心臓(Ｃ１、Ｃ２、Ｃ４及びＣ６)、褐色脂肪組織(Ｃ３)及び肝臓(Ｃ５)に由来した。Ｈｐｒｔ増幅及びＧａｐｄｈ発現を、ローディング及びＲＮＡ完全性の対照として利用した。(Ｂ)ｗｔマウス及びＬａｃＺを骨芽細胞中で過剰発現するトランスジェニックマウスの骨におけるβ２アドレナリン作動性レセプターの免疫局在化(挿入写真)。単核化細胞は、β２アドレナリン作動性レセプターを発現し、それらの細胞は、Ｘ−ｇａｌ陽性(即ち、骨芽細胞)である。(Ｃ、Ｄ)神経繊維の免疫局在化(Ｃ)及びチロシンヒドロキシラーゼ(Ｄ、矢印)(骨芽細胞に隣接)。(Ｅ)２日齢マウスの骨切片の電子顕微鏡写真。神経(ｎ)は、骨芽細胞(ｏｂ)及び骨小柱(ｔ)に近接している。(Ｆ)マウス一次骨芽細胞(左)及びヒトＳａＯＳ−２骨芽細胞(右)において、ｃＡＭＰ産生は、βアドレナリン作動性レセプターアゴニスト(イソプロテレノール、ｉｓｏ；ノルエピネフリン、ＮＥ)により誘導され、βアドレナリン作動性アンタゴニスト(プロプラノロール、Ｐｒｏ)の添加により阻害される。ＰＴＨを陽性対照として利用した。
図１４Ａ〜Ｉ。βアドレナリン作動性アゴニストは、骨形成を阻害する。ｏｂ／ｏｂ(Ａ〜Ｃ、Ｇ)及びｗｔ(Ｄ〜Ｈ)マウスのイソプロテレノール(Ｉｓｏ)処理(Ａ、Ｄ)。脊椎骨及び脛骨の組織学的分析(Ａ)。骨容積(骨容積％)は、Ｉｓｏ処理により減少する。(Ｂ、Ｅ)カルセイン二重標識(上段パネル)、骨形成速度(ＢＦＲ／ＢＳ、白色矢印)及び骨芽細胞数(Ｎ．Ｏｃ／Ｂ．Ｐｍ)は、Ｉｓｏ処理により減少する。(Ｃ、Ｆ)体重分析。Ｉｓｏのこれらの投与量は、体重に影響を与えない。(Ｇ)ノーザンブロット分析。Ｉｓｏは、褐色脂肪組織においてＵＣＰ−１発現を増大させる(上段パネル)。(Ｈ)骨芽細胞増殖。Ｉｓｏ、デキサメタゾン(Ｄｅｘ)又はビヒクル(対照)で処理したマウスの頭蓋冠におけるＢｒｄＵ取込みの免疫局在化(赤色染色、矢印)。ＢｒｄＵ陽性細胞の対照に対するパーセンテージを右側に示してある。(Ｉ)Ｉｓｏ、Ｉｓｏ及びプロプラノロール(Ｉｓｏ＋Ｐｒｏ)又はビヒクル(対照)で処理した一次骨芽細胞におけるＣｂｆａｌ及びａｌ(ｌ)コラーゲン発現のノーザンブロット分析。Ｇａｐｄｈ発現を、すべてのノーザンブロットについて内部対照として利用した。アスタリスクは、実験及び対照用グループ間の統計的に有意な差異を示している(Ｐ＜０．０１)。
図１５Ａ〜Ｇ。βアドレナリン作動性アンタゴニストは、骨量を増大させる。ｗｔ(Ａ、Ｃ)、レプチンＩＣＶ注入を受けたｗｔ(Ｄ、Ｅ)卵巣摘出された(ＯＶＸ)及び疑似手術を受けた(Ｓｈａｍ ＯＶＸ)(Ｆ、Ｇ)マウスのプロプラノロール(Ｐｒｏ)処理。脊椎骨(Ａ、Ｂ、Ｅ〜Ｇ)及び脛骨(Ａ)の組織学的分析。骨容積(骨容積％)は、Ｐｒｏ処理により増大する(Ａ、Ｅ、Ｆ)。カルセイン二重標識(上段パネル)、骨形成速度(ＢＦＲ／ＢＳ、白色矢印)及び骨芽細胞数(Ｎ．Ｏｂ／Ｂ．Ｐｍ)は、プロプラノロール処理マウスにおいて増大する(Ｂ及びＧ)。体重(Ｃ)は、影響されない。レプチンＩＣＶ注入は、ｐｒｏ処理したｗｔマウスにおいて脂肪パッド重量を減少させるが、骨量を減少させない(Ｄ及びＥ)。Ｐｒｏ処理は、骨形成パラメーターをＯＶＸマウスにおいて増大させることにより骨損失を防止する(Ｆ及びＧ)。アスタリスクは、実験及び対照用グループ間の統計的に有意な差異を示している(Ｐ＜０．０１)。菱形は、ＯＶＸ及び疑似手術を受けたマウス間の統計的に有意な差異を示している(Ｐ＜０．０１)。
【００６７】
これらの図面は、必ずしも一定の割合で作成しておらず、言及された特徴は、縮尺において誇張されていることもありうるし、明確化及び簡明のために図式表示されていることもありうる。
【００６８】
５．発明の詳細な説明
本発明の様々な面をここで詳細に与える。
５．１．レプチン、レプチンレセプター及びアドレナリン作動性レセプター
タンパク質、ポリペプチド及び核酸
レプチン(「Ｏｂ」)、レプチンレセプター(「ＯｂＲ」)及びアドレナリン作動性レセプター(「ＡＲ」)タンパク質及び核酸(センス及びアンチセンス)を、本発明の治療方法、診断方法、予測方法及びスクリーニング方法の部分として利用することができる。例えば、Ｏｂ、ＯｂＲ、及び／又はＡＲタンパク質、ポリペプチド及びペプチド断片、Ｏｂ，ＯｂＲ及びＡＲの変異型、切り詰め型又は欠失型(例えば少なくとも一つのレプチンレセプターＥＣＤ；少なくとも一つのＥＣＤ又はＴＭを欠く、切り詰められたレプチンレセプターポリペプチド；少なくとも一つのＥＣＤ又はＴＭを欠く、切り詰められたアドレナリン作動性レセプターポリペプチドに対応するペプチド又はポリペプチドなどの可溶性誘導体を含むが、これらに限られない)並びにレプチン、レプチンレセプター及びアドレナリン作動性レセプターの融合タンパク質産物(かかるレプチンレセプター−Ｉｇ融合タンパク質即ち、レプチンレセプター又はレプチンレセプターのドメインのＩｇＦｃドメインとの融合物)を利用することができる。
【００６９】
ヒトのレプチン及びレプチンレセプターを含むレプチン及びレプチンレセプターの配列は、周知である。レプチンレセプタータンパク質の総説に関しては、例えば、Friedman及びHalaas, 1998, Nature, 395:763-770及び米国特許第５，９７２，６２１号を参照されたい。ヒトレプチンコード配列及びレプチン遺伝子調節配列を含むレプチン配列については、例えば、Zhang等、1994, Nature 372:425-432；de la Brousse等、1996, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:4096-4101；He等、1995, J.Biol.Chem. 270:28887-28891；Hwang等、1996, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:873-877；及びGong等、1996, J.Biol.Chem 271:3971-3974を参照されたい。
【００７０】
ヒトのアドレナリン作動性レセプターを含むアドレナリン作動性レセプターの配列は、周知である(例えば、米国特許第６,２７４，７０６号；５，９９４，５０６号；５，８１７，４７７号；及び５，５９６，８８０号を参照されたい)。
【００７１】
例えば、Ｏｂに又はＯｂＲ若しくはＡＲの少なくとも一つのドメイン(例えば、ＥＣＤ、ＴＭ又はＣＤ)、切り詰められ又は削除されたＯｂ、ＯｂＲ又はＡＲ(例えば、ＴＭ及び／又はＣＤが削除されたＯｂＲ)に対応するペプチド及びポリペプチド並びに完全長のＯｂ、ＯｂＲ若しくはＡＲ、Ｏｂ、ＯｂＲ若しくはＡＲペプチド又は切り詰められたＯｂ、ＯｂＲ若しくはＡＲ(例えば、ＯｂＲ ＥＣＤ、ＴＭ又はＣＤドメイン)が異種の無関係のタンパク質と融合された融合タンパク質も又、この発明の範囲内にあって、かかるＯｂ、ＯｂＲ及びＡＲヌクレオチド及びＡＲアミノ酸配列(当業者に周知)に基づいて利用しそしてデザインすることができる。好ましくは、レプチンポリペプチドは、標準的な生理的条件及び／又は細胞培養条件下でレプチンレセプターと結合することができる。同様に、好ましくは、レプチンレセプターポリペプチドは、レプチンに、標準的な生理的条件及び／又は細胞培養条件下でレプチンと結合することができる。同様に、好ましくは、アドレナリン作動性レセプターポリペプチドは、カテコールアミンと、標準的な生理的及び／又は細胞条件下で結合することができる。従って、最小でも、レプチンレセプターポリペプチドは、レプチン結合に十分な即ちレプチン／レプチンレセプター複合体形成に十分なレプチンレセプターアミノ酸配列を含み、同様に、最小でも、レプチンレセプターポリペプチドは、レプチン結合に十分なレプチンレセプターＥＣＤ配列を含む。同様に、最小でも、アドレナリン作動性レセプターポリペプチドは、カテコールアミン結合に十分な即ちカテコールアミン／アドレナリン作動性レセプター複合体形成に十分なアドレナリン作動性レセプターアミノ酸配列を含み、同様に、最小でも、アドレナリン作動性レセプターポリペプチドは、カテコールアミン結合に十分なアドレナリン作動性レセプターＥＣＤ配列を含む。
【００７２】
ＯｂＲ及びＡＲペプチド、ポリペプチド、ＯｂＲ又はＡＲ ＥＣＤの全部又は部分を含む融合ペプチド及び融合ポリペプチドに関して、かかるペプチドは、可溶性レプチンレセプター又はアドレナリン作動性レセプターポリペプチドを含む。好ましくは、かかる可溶性レプチンレセプター又はアドレナリン作動性レセプターポリペプチドは、標準的な生理的及び／又は細胞培養条件下で、それぞれ、レプチン又はカテコールアミンと結合する。従って、最小でも、かかる可溶性レプチンレセプター又はアドレナリン作動性レセプターポリペプチドは、それぞれ、レプチン結合又はカテコールアミン結合に十分なＯｂＲ又はＡＲ ＥＣＤ配列を含む。
【００７３】
融合タンパク質には、可溶性ＯｂＲ又はＡＲタンパク質又はペプチドを安定化させてイン・ビボでの半減期を延長させるＩｇＦｃ融合物；又は融合タンパク質を細胞膜に係留させてＥＣＤを細胞表面に露出させる任意のアミノ酸配列への融合物；又は酵素、蛍光タンパク質若しくは化学発光タンパク質への融合物(これらは、例えばこの発明のスクリーニング及び／又は診断方法において有用なマーカー又はレポーター機能を与える)が含まれるが、これらに限られない。
【００７４】
Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲポリペプチド及びペプチドは、化学合成することができる(例えば、Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman & Co., N.Y. 参照)が、Ｏｂ、ＯｂＲ及びＡＲに由来する大きいポリペプチド並びに完全長のＯｂ、ＯｂＲ及びＡＲは、有利には、組換えＤＮＡ技術により、Ｏｂ、ＯｂＲ及びＡＲ遺伝子配列をコードする核酸及び／又はコード配列の発現のための当分野で周知の技術を利用して生成することができる。Ｏｂ、ＯｂＲ及びＡＲをコードするポリヌクレオチドは、オープンリーディングフレームをコードする配列だけをいうのではなく、Ｏｂ、ＯｂＲ及びＡＲ遺伝子内の上流及び下流の配列をも指す。かかる方法は又、Ｏｂ、ＯｂＲ及びＡＲヌクレオチド配列を含む発現ベクターを構築するために利用することもできる。これらの方法は、例えば、イン・ビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びイン・ビボ遺伝子組換えを包含する(例えば、Sambrook等、1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第二版、Cold Spring Harbor Press, N.Y.及びAusabel等、1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.(これらの各々をそっくりそのまま、参考として本明細書中に援用する)を参照されたい)。或は、Ｏｂ、ＯｂＲ及びＡＲヌクレオチドをコードすることのできるＲＮＡを、例えば、シンセサイザーを利用して、化学合成することができる(例えば、「Oligonucleotide Synthesis」1984, Gait, M.J.編、IRL Press, Oxford(参考として、そっくりそのまま、本明細書中に援用する)に記載された技術を参照されたい)。
【００７５】
様々な宿主−発現ベクター系を、この発明のＯｂ、ＯｂＲ及びＡＲヌクレオチド配列を発現させるために利用することができる。Ｏｂ、ＯｂＲ及びＡＲペプチド又はポリペプチドが可溶性誘導体(例えば、ＥＣＤに対応するＯｂＲ又はＡＲペプチド；ＴＭ及び／又はＣＤが削除された、切り詰められた又は削除されたＯｂＲ)である場合には、そのペプチド又はポリペプチドを、培養物即ち宿主細胞から(ＯｂＲ又はＡＲペプチド又はポリペプチドが分泌されない場合)、及び培養培地から(ＯｂＲ又はＡＲペプチド又はポリペプチドが細胞により分泌される場合)回収することができる。しかしながら、これらの発現系は又、Ｏｂ、ＯｂＲ及びＡＲ又は機能的同等物をイン・シトゥーで即ち細胞膜に繋留して発現する加工された宿主細胞をも包含する。かかる発現系からのＯｂ、ＯｂＲ又はＡＲの精製又は富化を、適当な洗浄剤及び脂質ミセル並びに当業者に周知の方法を利用して達成することができる。しかしながら、かかる加工された宿主細胞自体は、Ｏｂ、ＯｂＲ及びＡＲの構造及び機能的特徴を保持することだけでなく、生物学的活性を評価することが重要である状況例えば薬物スクリーニングアッセイにおいて利用することができる。
【００７６】
この発明の目的のために利用することのできる発現系には、微生物例えば細菌(例えば、Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲヌクレオチド配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡ発現ベクターによりトランスフォームされた大腸菌、Ｂ．ズブチリス)；これらのヌクレオチド配列を含む組換え酵母発現ベクターによりトランスフォームされた酵母(例えば、サッカロミセス、ピチア)；これらの配列を含む組換えウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)を感染させた昆虫細胞系；これらの配列を含む組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ)を感染させ又は組換えプラスミド発現ベクター(例えば、Ｔｉプラスミド)によりトランスフォームされた植物細胞系；又は哺乳動物細胞系(例えば、哺乳動物細胞ゲノムに由来するプロモーター(例えば、メタロチオネインプロモーター)又は哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター(例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター)を含む組換え発現構築物を有するＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３)が含まれるが、これらに限られない。
【００７７】
細菌の系において、多くの発現ベクターを、発現させるＯｂ、ＯｂＲ又はＡＲ遺伝子産物について意図している用途に応じて有利に選択することができる。例えば、Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲタンパク質の医薬組成物の生成のために又はＯｂ、ＯｂＲ若しくはＡＲタンパク質に対する抗体を作成するために多量のかかるタンパク質を生成する場合には、例えば、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベルの発現を指示するベクターが望ましい。かかるベクターには、Ｏｂ又はＯｂＲコード配列を別個に、ｌａｃＺコード領域と融合タンパク質が産生されるようにイン・フレームで連結させた大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８(Ruther等、1983, EMBO J. 2:1791)；ｐＩＮベクター(Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109；Van Heeke & Schuster, 1989, J.Biol.Chem. 264:5503-5509)などが含まれるが、これらに限られない。ｐＧＥＸベクターも又、外来ポリペプチドを、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)との融合タンパク質として発現させるために利用することができる。一般に、かかる融合タンパク質は、可溶性であり、溶解させた細胞からグルタチオン−アガロースビーズへの吸着とその後の遊離グルタチオンの存在下での溶出によって容易に精製することができる。ＰＧＥＸベクターは、トロンビン又は因子Ｘａプロテアーゼ開裂部位を含むようにデザインされており、それで、クローン化された標的遺伝子産物をＧＳＴ部分から遊離させることができる。
【００７８】
昆虫の系においては、オートグラファ核多角体ウイルス(ＡｃＮＰＶ)が、外来遺伝子を発現させるベクターとして用いられる。このウイルスは、夜盗蛾(Spodoptera frugiperda)細胞中で増殖する。Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲ遺伝子のコード配列は、別個に、該ウイルスの非必須領域(例えば、ポリヘドリン遺伝子)内にクローン化して、ＡｃＮＰＶプロモーター(例えば、ポリヘドリンプロモーター)の制御下に置くことができる。Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲ遺伝子のコード配列の上首尾の挿入は、ポリヘドリン遺伝子の不活性化及び非閉塞組換えウイルス(即ち、ポリヘドリン遺伝子によりコードされるタンパク質様コートを欠くウイルス)の産生を生じる。これらの組換えウイルスを、その後、夜盗蛾(Spodoptera frugiperda)細胞に感染させるために利用し、該細胞において挿入遺伝子が発現される(例えば、Smith等、1983, J.Virol. 46:584及び米国特許第４，２１５，０５１号を参照されたい)。
【００７９】
哺乳動物宿主細胞においては、多くのウイルスベースの発現系が利用できる。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合には、関心あるＯｂ、ＯｂＲ又はＡＲヌクレオチド配列を、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体例えば後期プロモーター及び３つに別れたリーダー配列に連結することができる。このキメラ遺伝子を、次いで、アデノウイルスゲノム中に、イン・ビトロ又はイン・ビボ組換えによって挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域(例えば、Ｅ１又はＥ３領域)内への挿入は、組換えウイルスを生じ、これは、感染した宿主において生存可能であり且つＯｂ、ＯｂＲ又はＡＲ遺伝子産物を発現することができる(例えば、Logan & Shenk, 1984, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3655-3659を参照されたい)。挿入されたＯｂ、ＯｂＲ又はＡＲヌクレオチド配列の効率的翻訳には特異的開始シグナルも必要とされうる。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドン及び隣接する配列が含まれる。完全なＯｂ、ＯｂＲ又はＡＲ遺伝子又はｃＤＮＡ(開始コドン及び隣接配列を含む)を適当な発現ベクターに挿入する場合には、更なる翻訳制御用シグナルは必要とされない。しかしながら、コード配列の一部分だけが挿入された場合には、外因性の翻訳制御シグナル(おそらくＡＴＧ開始コドンを含む)が与えられなければならない。その上更に、開始コドンは、全挿入物の翻訳を保証するために、所望のコード配列の読み枠と位相が合っていなければならない。これらの外因性の翻訳制御シグナル及び開始コドンは、様々な起源のもの(天然及び合成の両方)であってよい。発現の効率は、適当な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含むことによって増大させることができる(Bittner等、1987, Methods in Enzymol. 153:516-544参照)。
【００８０】
加えて、挿入された配列の発現を調節し、又は遺伝子産物を所望の特異的様式で改変し若しくはプロセッシングを行なう宿主細胞株を選択することができる。かかるタンパク質産物の改変(例えば、グリコシル化)及びプロセッシング(例えば、開裂)は、そのタンパク質の機能に重要でありうる。種々の宿主細胞は、タンパク質及び遺伝子産物の翻訳後プロセッシング及び改変のための特徴的で特異的な機構を有している。適当な細胞株又は宿主系を選択して、発現された外来タンパク質の正しい改変及びプロセッシングを保証することができる。この目的のために、一次転写物の適当なプロセッシング、遺伝子産物のグリコシル化及びリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細胞を利用することができる。かかる哺乳動物宿主細胞には、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８及び特に脈絡膜叢細胞株が含まれるが、これらに限られない。
【００８１】
長期間にわたる組換えタンパク質の高収率生成のためには、安定な発現が好ましい。例えば、Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲ配列を安定に発現する細胞株を加工することができる。ウイルス性複製起点を含む発現ベクターを用いるよりも、宿主を、適当な発現制御エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など)により制御されるＤＮＡ及び選択マーカーを用いてトランスフォームすることができる。外来ＤＮＡの導入後に、加工した細胞を、富化培地で１〜２日間生育させることができ、その後、それらを選択培地に移す。組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択に対する耐性を与えて、細胞がそのプラスミドを染色体中に安定に組み込み、増殖してフォーカスを形成することを可能にし、それは、更にクローン化されて細胞株に拡大されうる。この方法を有利に用いて、Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲ遺伝子産物を発現する細胞株を加工することができる。かかる加工された細胞株は、Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲ遺伝子産物の内因性活性に影響を与える化合物のスクリーニング及び評価において特に有用でありうる。
【００８２】
単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wigler等、1977, Cell 11:223)、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalska & Szybalski, 1962, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48:2026)及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowy等、1980, Cell 22:817)遺伝子を含む(これらに限られない)多くの選択系を利用することができる(これらの遺伝子は、それぞれ、ｔｋ-、ｈｇｐｒｔ-又はａｐｒｔ-細胞で利用することができる)。代謝拮抗物質耐性も又、次の遺伝子の選択の基礎として利用することができる：メトトレキセート耐性を与えるｄｈｆｒ(Wigler等、1980, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:3567；O'Hare等、1981, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1527)；ミコフェノール酸耐性を与えるｇｐｔ(Mulligan及びBerg, 1981, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2072)；アミノグリコシドＧ−４１８耐性を与えるｎｅｏ(Colberre-Garapin等、1981, J.Mol.Biol. 150:1)；及びヒグロマイシン耐性を与えるｈｙｇｒｏ(Santerre等、1984, Gene 30:147)。
【００８３】
Ｏｂ、ＯｂＲ及びＡＲ遺伝子産物は又、トランスジェニック動物において発現させることもできる。マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、ブタ、マイクロブタ、ヤギ及び非ヒト霊長類(例えば、ヒヒ、サル及びチンパンジー)を含む(これらに限られない)任意の種の動物を用いてトランスジェニック動物を生成することができる。
【００８４】
当分野で公知の任意の技術を利用して、Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲトランスジーンを動物に導入し、又は内因性のＯｂ、ＯｂＲ又はＡＲを「ノックアウト」し若しくは不活性化してトランスジェニック動物の創出系列を生成することができる。かかる動物は、この発明のスクリーニング方法の部分として利用することができ、そしてかかる動物由来の細胞及び／又は組織を、この発明のスクリーニング方法の部分として利用することもできる更なる組成物(例えば、細胞株、組織培養系)の生成のために獲得することができる。
【００８５】
かかる動物の生成のための技術は、当業者に周知であり、前核マイクロインジェクション(Hoppe & Wagner, 1989, 米国特許第４，８７３，１９１号)；レトロウイルス媒介の生殖系列への遺伝子トランスファー(Van der Putten等、1985, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:6148-6152)；胚性幹細胞における遺伝子ターゲティング(Thompson等、1989, Cell 56:313-321)；胚のエレクトロポレーション(Lo, 1983, Mol Cell Biol 3:1803-1814)及び精子媒介の遺伝子トランスファー(Lavitrano等、1989, Cell 57:717-723)などが含まれるが、これらに限られない。かかる技術の総説に関しては、Gordon, 1989, Transgenic Animals, Intl.Rev.Cytol. 115:171-229(参考として、そっくりそのまま本明細書中に援用する)を参照されたい。
【００８６】
トランスジェニックＯｂ、ＯｂＲ及び／又はＡＲを含むトランスジェニック動物に関して、かかる動物は、Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲトランスジーンをすべての細胞に有しうる。或は、かかる動物は、トランスジーンをすべての細胞でなくて幾つかの細胞に有することができる(即ち、モザイク動物)。このトランスジーンは、単一のトランスジーンとして組み込まれうるし、又はコンカテマーとして(例えば、ヘッドトゥーヘッドの直列又はヘッドトゥーテイルの直列で)組み込むこともできる。このトランスジーンは又、例えば、Lasko等、1992, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6232-6136の教示に従って、特定の細胞型に選択的に導入して活性化することもできる。かかる細胞型特異的な活性化に必要な調節配列は、関心ある特定の細胞型に依存し、当業者には明らかであろう。トランスジーンが内因性遺伝子の染色体上の部位に組み込まれることが望ましい場合には、遺伝子ターゲティングが好適である。簡単にいえば、かかる技術を利用すべき場合には、内因性Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲ遺伝子に相同な幾つかのヌクレオチド配列を含むベクターを、染色体配列との相同組換えによる組込みの目的のために及び内因性Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲ遺伝子のヌクレオチド配列の機能を破壊する目的のためにそれぞれデザインする。このトランスジーンは又、例えばGu等、1994, Science 265:103-106に従って、特定の細胞型に選択的に導入し、そうしてその細胞型においてのみ内因性Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲ遺伝子を不活性化することもできる。かかる細胞型特異的な不活性化に必要な調節配列は、関心ある特定の細胞型に依存し、当業者にはあきらかであろう。
【００８７】
一度トランスジェニック動物が生成されたならば、組換え遺伝子の発現は、標準的技術を利用してアッセイすることができる。最初のスクリーニングは、動物組織を分析するためのサザーンブロット分析又はＰＣＲ技術により達成して、トランスジーンの組込みが起きたかどうかをアッセイすることができる。トランスジェニック動物の組織におけるトランスジーンのｍＲＮＡ発現のレベルも又、動物から得られた組織試料のノーザンブロット分析、イン・シトゥーハイブリダイゼーション分析、及びＲＴ−ＰＣＲを含む(これらに限らない)技術を利用して評価することができる。Ｏｂ、ＯｂＲ及びＡＲ遺伝子を発現する組織の試料を、トランスジーンの産物に特異的な抗体を利用して、免疫細胞化学的に評価することもできる。
【００８８】
５．１．１．Ｏｂ、ＯｂＲ及びＡＲタンパク質に対する抗体
Ｏｂ、ＯｂＲ若しくはＡＲの少なくとも一つ又はＯｂ、ＯｂＲ若しくはＡＲの保存的変異体のエピトープ、又はＯｂ、ＯｂＲ若しくはＡＲのペプチド断片を特異的に認識して結合する抗体を、本発明の方法の部分として利用することができる。かかる抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(ｍＡｂ)、ヒト、ヒト化又はキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆab断片、Ｆ(ab')2断片、Ｆab発現ライブラリーにより生成された断片、抗イディオタイプ(抗Ｉｄ)抗体及び上記の何れかのエピトープ結合性断片が含まれるが、これらに限られない。
【００８９】
かかる抗体は、例えば、哺乳動物の骨の病気を該哺乳動物におけるレプチンレベル例えば該哺乳動物の血清中又は脳脊髄液中のレプチンレベルを測定することにより診断するためのこの発明の診断又は予測方法の部分として利用することができる。かかる抗体は又、例えば、下記のような化合物スクリーニング計画に関連して利用することもでき、Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲ遺伝子産物の発現及び／又は活性に対する試験化合物の効果の評価のために利用することができる。加えて、かかる抗体は、この発明の治療及び予防方法において利用することができる。例えば、かかる抗体は、レプチン又はアドレナリン作動性レセプターアゴニスト又はアンタゴニストに対応することができる。更に、かかる抗体は、脳内の一層低いレプチンレベル(脳脊髄液内のレプチンレベルによりアッセイ)に投与することができる。加えて、かかる抗体は、レプチンが循環から除去される速度を増大させる(例えば、レプチン分解を速めることができる)ことによりレプチンレベルを低下させるために利用することができ、又はレプチンレセプターレベルを低下させる(レプチンレセプターの分解速度を増大させることによる)ために利用することができる(レプチンレセプターを発現する細胞を低下させることを含む)。
【００９０】
抗体産生のために、様々な宿主動物を、Ｏｂ、ＯｂＲ若しくはＡＲの、又はＯｂＲ若しくはＡＲペプチド(例えば、ＯｂＲについては、該レセプターの機能的ドメイン例えばＥＣＤ、ＴＭ又はＣＤに対応するもの)、切り詰めたＯｂ、ＯｂＲ若しくはＡＲポリペプチド(例えば、ＯｂＲ又はＡＲについて、少なくとも一つのドメイン例えばＴＭ又はＣＤが削除されている)、Ｏｂ、ＯｂＲ若しくはＡＲの機能的同等物、又はＯｂ、ＯｂＲ若しくはＡＲの変異体の注射によって免疫化することができる。かかる宿主動物には、少数例を挙げれば、ウサギ、マウス及びラットが含まれるが、これらに限られない。宿主の種によって、フロイント(完全及び不完全)、鉱物ゲル例えば水酸化アルミニウム、表面活性物質例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、カサガイヘモシアニン、ジニトロフェノール及び潜在的に有用なヒトのアジュバント例えばＢＣＧ(bacilli Calmette-Guerin)及びコリネバクテリウム・パルブムを含む(但し、これらに限られない)様々なアジュバントを利用して、免疫学的応答を増大させることができる。ポリクローナル抗体は、免疫化された動物の血清から得られた抗体分子の不均質な集団である。
【００９１】
特定の抗原に対する抗体の均質な集団であるモノクローナル抗体を、連続的培養細胞株により抗体分子の産生を与える任意の技術によって得ることができる。これらには、Kohler及びMilstein, 1975, Nature 256:495-497及び米国特許第４，３７６，１１０号、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kosbor等、1983, Immunology Today 4:72；Cole等、1983, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:2026-2030)及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術(Cole等、1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., p.77-96)が含まれるが、これらに限られない。かかる抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤを含む如何なる免疫グロブリンのクラスであってもよいし、それらの如何なるサブクラスであってもよい。この発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマは、イン・ビトロ又はイン・ビボで培養することができる。イン・ビボでの高力価のｍＡｂの産生は、これを、現在好適な産生方法にする。
【００９２】
加えて、標準的組換えＤＮＡ技術を利用して作成することのできる組換え抗体例えばキメラの及びヒト化モノクローナル抗体(ヒト及び非ヒト部分の両方を含む)は、この発明の範囲内にある。キメラ抗体は、種々の部分が異なる動物種に由来する分子であって、例えば、マウスｍＡｂに由来する可変領域とヒト免疫グロブリンの定常領域を有するものである(例えば、米国特許第４，８１６，５６７号及び４，８１６３９７号(これらをそっくりそのまま参考として本明細書中に援用する)を参照されたい)。ヒト化抗体は、少なくとも一つの非ヒト種に由来する相補性決定領域(ＣＤＲ)とヒトの免疫グロブリン分子に由来するフレームワーク領域を有する非ヒト種由来の抗体分子である(例えば、米国特許第５，５８５，０８９号(参考としてそっくりそのまま本明細書中に援用する)を参照されたい)。かかるキメラの及びヒト化モノクローナル抗体は、当分野で公知の組換えＤＮＡ技術によって例えばＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ８７／０２６７１；欧州特許出願第１８４，１８７号；欧州特許出願第１７１，４９６号；欧州特許出願第１７３，４９４号；ＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ８６／０１５３３；米国特許第４，８１６，５６７号；欧州特許出願第１２５，０２３号；Better等、1988, Science 240:1041-1043；Liu等、1987, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:3439-3443；Liu等、1987, J.Immunol.139:3521-3526；Sun等、1987, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:214-218；Nishimura等、1987, Canc.Res.47:999-1005；Wood等、1985, Nature, 314:446-449；及びShaw等、1988, J.Natl.Cancer Inst.80:1553-1559；Morrison, 1985, Science 229:1202-1207；Oi等、1986, Bio/Techniques 4:214；米国特許第５，２２５，５３９号；Jones等、1986, Nature 321:552-525；Verhoeyan等、1988, Science 239:1534；及びBeilder等、1988, J.Immunol.141:4053-4060に記載された技術を利用して生成することができる。
【００９３】
完全にヒトの抗体は、ヒト患者の治療のために特に望ましい。かかる抗体は、例えば、内因性免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子を発現することはできないがヒトの重鎖及び軽鎖遺伝子を発現することのできるトランスジェニックマウスを利用して生成することができる。これらのトランスジェニックマウスを、選択した抗原例えばこの発明のポリペプチドの全部又は一部分を用いて、通常の様式で免疫化する。この抗原に対するモノクローナル抗体を、慣用のハイブリドーマ技術を利用して得ることができる。これらのトランスジェニックマウスに担われたヒト免疫グロブリンのトランスジーンは、Ｂ細胞分化に際して再配置され、その後、クラススイッチング及び体細胞変異を受ける。こうして、かかる技術を利用して、治療上有用なＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥ抗体を生成することができる。ヒト抗体を生成するためのこの技術の概観に関しては、Lonberg及びHuszar, 1995, Int.Rev.Immunol.13:65-93を参照されたい。ヒト抗体及びヒトモノクローナル抗体を生成するためのこの技術の詳細な検討及びかかる抗体を生成するためのプロトコールについては、例えば、米国特許第５，６２５，１２６号；５，６３３，４２５号；５，５６９，８２５号；５，６６１，０１６号；及び５，５４５，８０６号を参照されたい。加えて、Abgenix, Inc.(カリフォルニア、Fremont在)などの会社は、選択した抗原に対するヒト抗体を上記と類似の技術を利用して提供するために参戦しうる。
【００９４】
選択したエピトープを認識する完全にヒトの抗体を、「ガイドされた選択」と呼ばれる技術を利用して生成することができる。このアプローチにおいては、選択した非ヒトモノクローナル抗体(例えば、マウス抗体)を利用して、同じエピトープを認識する完全にヒトの抗体の選択をガイドする(Jespers等、1994, Bio/technology 12:899-903)。
【００９５】
或は、一本鎖抗体の産生のために記載された技術(米国特許第４，９４６，７７８号；Bird, 1988, Science 242:423-426；Huston等、1988, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；及びWard等、1989, Nature 334:544-546)を、Ｏｂ及びＯｂＲ遺伝子産物に対する一本鎖抗体を生成するために適合させることができる。一本鎖抗体は、Ｆｖ領域の重鎖断片と軽鎖断片をアミノ酸ブリッジによって結合して一本鎖ポリペプチドを生成させることによって形成される。
【００９６】
特異的エピトープを認識する抗体断片を、公知技術によって生成することができる。例えば、かかる断片には、抗体分子のペプシン消化により生成することのできるＦ(ab')2断片及びＦ(ab')2断片のジスルフィドブリッジを還元することにより生成することのできるＦab断片が含まれるが、これらに限られない。或は、所望の特異性を有するモノクローナルＦab断片の迅速で容易な同定を可能にするＦab発現ライブラリーを構築することができる(Huse等、1989, Science, 246:1275-1281)。
【００９７】
Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲに対する抗体を、更に利用して、Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲを「真似る」抗イディオタイプ抗体を当業者に周知の技術を利用して生成することができる(例えば、Greenspan及びBona, 1993, FASEB J 7(5):437-444；及びNisshinoff, 1991, J.Immunol.147(8):2429-2438を参照されたい)。例えば、ＯｂＲ ＥＣＤに結合してＯｂのＯｂＲへの結合を競争的に阻害する抗体を利用して、ＥＣＤを「真似」し、それ故、Ｏｂに結合して中和する抗イディオタイプを生成することができる。かかる中和する抗イディオタイプ又はかかる抗イディオタイプのＦab断片を治療養生法で用いて、Ｏｂを中和し、病気でない対応する骨と比較して減少した骨量を特徴とする骨の病気を治療することができる。
【００９８】
５．２．骨の病気の診断及び予測並びに化合物/患者のモニター
骨粗鬆症、オステオペニア、骨形成不全又は再吸収不全、パジェット病、骨折、骨転移、大理石骨病、硬骨化症及び骨端症を含む(これらに限られない)骨の病気又は状態の診断及び予測評価のために並びにかかる病気又は状態に対する疾病素質を有する患者の同定のために様々な方法を利用することができる。
【００９９】
特に、本発明によって診断し又は予測することのできる骨の病気には、病気でない対応する骨と比較して減少した骨量を特徴とする骨の病気が含まれ、これには、骨粗鬆症、オステオペニア及びパジェット病が含まれるが、これらに限られない。
【０１００】
本発明の目的は、哺乳動物の骨の病気の診断又は予測であって、下記：
(ａ)骨の病気を有することが疑われる哺乳動物の交感神経活動状態及びレプチン活性を測定し、そして
(ｂ)ステップ(ａ)で測定された値を対応する対照用の値と比較する
ことを含む当該診断又は予測である。
【０１０１】
従って、本発明のこの面によれば、哺乳動物の骨の病気を診断し又は予測する方法であって、該方法は、下記：
(ａ)哺乳動物例えば骨の病気を示し又は該病気の危険にあると疑われる哺乳動物の血清中のレプチンレベルを測定し；そして
(ｂ)(ａ)で測定されたレベルを、対照用血清中のレプチンレベルと比較し、それで、(ａ)で得られたレベルが対照よりも高いならば、その哺乳動物を、骨の病気を示し又は該病気の危険にあると診断することを含み、該骨の病気が、病気でない対応する骨と比較して減少した骨量を特徴とする当該方法がある。
【０１０２】
或は、哺乳動物例えばヒトの骨の病気を診断し又は予測する方法であって、該方法は、下記：
(ａ)哺乳動物例えば骨の病気を示し又は該病気の危険にあることが疑われる哺乳動物の脳脊髄液中のレプチンレベルを測定し；そして
(ｂ)(ａ)で測定されたレベルを対照用の脳脊髄液中のレプチンレベルと比較し、
それで、(ａ)で得られたレベルが対照より高いならば、その哺乳動物を、骨の病気を示し又は該病気の危険にあると診断することを含み、該骨の病気が、病気でない対応する骨と比較して減少した骨量を特徴とする当該方法がある。
【０１０３】
更に、本発明によって診断し又は予測することのできる骨の病気には、病気でない対応する骨と比較して増大した骨量を特徴とする骨の病気も含まれ、これには硬骨化病及び骨端症が含まれるが、これらに限られない。
【０１０４】
従って、本発明のこの面によれば、哺乳動物例えばヒトの骨の病気を診断し又は予測する方法であって、該方法は、下記：
(ａ)哺乳動物例えば骨の病気を示し又は該病気の危険にあることが疑われる哺乳動物の血清中のレプチンレベルを測定し；そして
(ｂ)(ａ)で測定されたレベルを、対照用血清中のレプチンレベルと比較し、それで、(ａ)で得られたレベルが対照より低いならば、その哺乳動物が骨の病気を示し又は該病気の危険にあると診断することを含み、該骨の病気が、病気でない対応する骨と比較して増大した骨量を特徴とする当該方法がある。
【０１０５】
或は、哺乳動物例えばヒトの骨の病気を診断し又は予測する方法であって、該方法は、下記：
(ａ)哺乳動物例えば骨の病気を示し又は該病気の危険にあることが疑われる哺乳動物の脳脊髄液中のレプチンレベルを測定し；そして
(ｂ)(ａ)で測定されたレベルを、対照用脳脊髄液中のレプチンレベルと比較し、
それで、(ａ)で得られたレベルが対照より低いならば、その哺乳動物を、骨の病気を示し又は該病気の危険にあると診断することを含み、該骨の病気が、病気でない対応する骨と比較して増大した骨量を特徴とする当該方法がある。
【０１０６】
加えて、骨の病気の治療について臨床評価を受ける患者を診断的にモニターするための及び臨床的試みにおける化合物の効力をモニターするための方法を提供する。
【０１０７】
それ故、本発明の更に別の面では、哺乳動物例えばヒトの骨の病気を治療するための化合物の効力をモニターする方法であって、該方法は、下記：
(ａ)該化合物を哺乳動物に投与し；
(ｂ)該哺乳動物の血清中のレプチンレベルを測定し；そして
(ｃ)(ｂ)で測定されたレベルを、該化合物の投与前の該哺乳動物の血清中のレプチンレベルと比較し、それにより、該化合物の効力をモニターすることを含み、該骨の病気が、病気でない対応する骨と比較して減少した骨量を特徴とする当該方法がある。
【０１０８】
本発明の他の面によれば、哺乳動物例えばヒトの骨の病気を治療するための化合物の効力をモニターする方法であって、該方法は、下記：
(ａ)該化合物を哺乳動物に投与し；
(ｂ)該哺乳動物の脳脊髄液中のレプチンレベルを測定し；そして
(ｃ)(ｂ)で測定されたレベルを、該化合物を投与する前の該哺乳動物の脳脊髄液中のレプチンレベルと比較し、
それにより、該化合物の効力をモニターすることを含み、該骨の病気が、病気でない対応する骨と比較して減少した骨量を特徴とする当該方法がある。好適な化合物は、レプチンレベルを、投与前に認められたレベルまで増大させるものである。
【０１０９】
本発明の更に別の面によれば、哺乳動物例えばヒトの骨の病気を治療するための化合物の効力をモニターする方法であって、該方法は、下記：
(ａ)該化合物を哺乳動物に投与し；
(ｂ)該哺乳動物の血清中のレプチンレベルを測定し；そして
(ｃ)(ｂ)で測定されたレベルを、該化合物の投与前の該哺乳動物の血清中のレプチンレベルと比較し、
それにより、該化合物の効力をモニターすることを含み、該骨の病気が、病気でない対応する骨と比較して増大した骨量を特徴とする当該方法がある。好適な化合物は、レプチンレベルを、投与前に認められたレベルと比較して減少させるものである。
【０１１０】
本発明の他の面によれば、哺乳動物例えばヒトの骨の病気を治療するための化合物の効力をモニターする方法であって、該方法は、下記：
(ａ)該化合物を哺乳動物に投与し；
(ｂ)該哺乳動物の脳脊髄液中のレプチンレベルを測定し；そして
(ｃ)(ｂ)で測定されたレベルを、該化合物の投与前の該哺乳動物の脳脊髄液中のレプチンレベルと比較し、
それにより、該化合物の効力をモニターすることを含み、該骨の病気が、病気でない骨と比較して増大した骨量を特徴とする当該方法がある。好適な化合物は、レプチンレベルを、投与前に認められたレベルと比較して減少させるものである。
【０１１１】
これらの方法は又、骨の病気の治療に関して臨床評価を受けている患者をモニターするためにも利用することができる。一般に、かかる方法は、更に、病気でない対応する骨と比較して骨量をモニターすることを含む。
【０１１２】
ここに記載の方法は、例えば、上記の及び等業者に公知のＯｂ及びＯｂＲヌクレオチド配列(例えば、米国特許第５，９７２，６２１号参照)並びに第５．１．１．節に記載したようなＯｂ及びＯｂＲ抗体のような試薬を利用することができる。Ｏｂは、典型的には、脂肪細胞内で発現され、一層低レベルが胃及びリンパ球においても見出される。ＯｂＲは、典型的には、脳内の視床下部において発現される(Friedman & Halaas, 1998, Nature, 395:763-770)。そうして、かかる試薬は、例えば：(１)Ｏｂ及びＯｂＲ遺伝子変異の存在の検出、又は例えば哺乳動物の血清又は脳脊髄液中のＯｂ又はＯｂＲ ｍＲＮＡの、骨の病気でない状態と比較しての過剰発現又は過少発現の検出；(２)例えば哺乳動物の血清又は脳脊髄液中の、骨の病気でない状態と比較しての十分な又は十分でないＯｂ又はＯｂＲ遺伝子産物の検出；及び(３)Ｏｂ又はＯｂＲに媒介されるシグナル変換経路における摂動又は異常の検出のために利用することができる。或は、Ｓｔａｔ３タンパク質のリン酸化のレベルを、対応する対照用試料又は哺乳動物において認められたレベルと比較して測定することができる。Ｓｔａｔ３リン酸化は、生化学的事象であり、これは、レプチンのレプチンレセプターへの結合後に起きる(Devos等、1997, J.Biol.Chem. 727:18404-18310)。他の具体例において、ここに含まれる方法は、ドーパミンβヒドロキシラーゼ(「ＤＢＨ」)(ドーパミンのノルエピネフリンへの変換に必要な酵素)の活性の測定をも包含する。
【０１１３】
ここに記載の方法は、哺乳動物の交感神経活動状態の測定を包含することができる。交感神経活動状態は、交感神経系の活性化又は「緊張」の相対的状態に関係する。交感神経の活性は、様々な機能を調節し、神経発射率(例えば、Esler & Kay, 2000, J.Cardiovasc.Pharmaco.35(7補遺4):S1-7参照)、血漿カテコールアミンのレベル(例えば、Urban等、1995, European Journal of Pharmacology, 282:29-37参照)、熱消費率(例えば、Boutouyrie等、1994, Am.J.Physiol.267(4Pt2):H1368-76参照)又は副腎交感神経活性(例えば、Feng等、1992, Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 261:1129-1135参照)の直接測定を含む(これらに限られない)多くの方法で測定される。ここに記載の方法は、骨量を測定する技術と共に、該技術の前に又は後に行なうことができる。例えば、対応する対照用試料と比較して一層高レベル又は低レベルのレプチンを(例えば、血清又は脳脊髄液中で)発現する哺乳動物(例えば、ヒト)の同定に際して、各個体の骨量を測定して、その哺乳動物が病気でない対応する骨と比較して増大した又は減少した骨量を示すかどうかを更に明確にすることができる。もし異常な骨量が認められないならば、その哺乳動物は病気の発症の危険にあると考えられ、異常な骨量が認められればその哺乳動物は骨の病気を示している。
【０１１４】
骨量を測定するための当業者に周知の技術には、骨の光るレベルを示す骨格Ｘ線(光るレベルが低いほど、骨量は多い)；古典的な骨組織学(例えば、骨容積、小柱／梁状突起の数及び面、骨芽細胞の対照と及び／又は破骨細胞と比較しての数)；及び骨粗鬆症において骨量を測定して一般に用いられる二重エネルギーＸ線吸光光度法(ＤＥＸＡ)(Levis & Altman, 1998, Arthritis and Rheumatism, 41:577-587)を包含するものが含まれる(これらに限られない)。
【０１１５】
ここに記載の方法は、更に、骨の病気の危険にある個体を診断するために利用することができる。かかる個体は、閉経期の頃の女性(ここで用いる場合、この用語は、閉経期の開始前約６ヶ月から閉経期後約１８ヶ月までの時間枠を包含することを意味する)及びコルチコステロイドでの治療(特に、長期の治療)を受けている患者を包含する(これらに限られない)。
【０１１６】
ここに記載の方法は、例えば、少なくとも一つの特異的Ｏｂ、ＯｂＲ若しくはＡＲヌクレオチド配列又はＯｂ、ＯｂＲ若しくはＡＲ抗体試薬を含む予めパッケージにした診断用キット(例えば、臨床環境で骨の病気を示す患者の診断に便利に利用することができる)を利用することによって実施することができる。
【０１１７】
Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲ変異の検出のために、任意の有核細胞を、ゲノム核酸の出発起源として利用することができる。Ｏｂ、ＯｂＲ若しくはＡＲ遺伝子発現又は遺伝子産物の検出のために、Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲ遺伝子が発現される任意の種類の細胞又は組織(例えば、ＯｂＲ又はＡＲについては、脈絡膜叢)を利用することができる。
【０１１８】
核酸ベースの検出技術を、以下の、第５．２．１節に、ペプチド検出技術を５．２．２節に記載する。
【０１１９】
５．２．１．Ｏｂ、ＯｂＲ及びＡＲ遺伝子及び転写物の検出
Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲ遺伝子中の突然変異を、多くの技術を利用することにより検出することができる。任意の有核細胞からの核酸を、かかるアッセイ技術のための出発点として利用することができ、当業者に周知の標準的核酸調製手順によって単離することができる。
【０１２０】
ＤＮＡは、点突然変異、挿入、欠失及び染色体再配置を含む異常を含むＯｂ、ＯｂＲ又はＡＲ遺伝子構造を検出するための生物学的試料のハイブリダイゼーション又は増幅アッセイにおいて利用することができる。かかるアッセイは、サザーン分析、一本鎖コンホメーション多型分析(ＳＳＣＰ)及びＰＣＲ分析を含むが、これらに限られない。
【０１２１】
Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲ遺伝子特異的突然変異の検出のためのかかる診断方法は、例えば、組換えＤＮＡ分子、クローン化遺伝子又はそれらの縮重した変異体(試料例えば患者の試料又は他の適当な細胞起源から得られたもの)を含む核酸を、少なくとも一種の組換えＤＮＡ分子、クローン化遺伝子又はそれらの縮重した変異体を含む核酸試薬と、これらの試薬のそれぞれＯｂ、ＯｂＲ又はＡＲ遺伝子内の相補的配列への特異的アニーリングに好適な条件下で接触させてインキュベートすることを含むことができる。好ましくは、これらの核酸試薬の長さは、少なくとも１５〜３０ヌクレオチドである。インキュベーション後に、すべてのアニールしてない核酸を核酸：Ｏｂ／ＯｂＲ／ＡＲ分子ハイブリッドから除去する。ハイブリダイズした核酸の存在を(もしかかる分子が存在するならば)、その後検出する。かかる検出計画を利用して、関心ある細胞型又は組織からの核酸を例えば固体支持体例えば膜又はプラスチック表面例えばミクロ滴定プレート若しくはポリスチレンビーズに固定することができる。この場合において、インキュベーション後に、アニールしていない標識核酸試薬は、容易に除去される。残りのアニールした標識されたＯｂ、ＯｂＲ又はＡＲ核酸試薬の検出は、当業者に周知の標準的技術を利用して達成される。核酸試薬がアニールしたＯｂ、ＯｂＲ又はＡＲ遺伝子配列を、Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲ遺伝子変異が存在するかどうかを測定するために、正常Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲ遺伝子配列から発現されたアニーリングパターンと比較することができる。
【０１２２】
患者試料又は他の適当な細胞起源におけるＯｂ、ＯｂＲ又はＡＲ遺伝子特異的核酸分子の検出のための別の診断方法は、それらの例えばＰＣＲによる増幅(米国特許第４，６８３，２０２号に示された実験具体例)及びその後の増幅された分子の当業者に周知の技術を利用する検出を含むことができる。その結果生成した増幅された配列を、Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲ遺伝子変異が存在するかどうかを測定するために、増幅された核酸がＯｂ、ＯｂＲ又はＡＲ遺伝子の正常なコピーのみを含む場合に予想されるものと比較することができる。
【０１２３】
加えて、周知の遺伝子型分類技術を実施して、Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲ遺伝子変異を有する個体を同定することができる。かかる技術は、例えば、制限断片長多型(ＲＦＬＰ)の利用を含み、これは、用いる特異的制限酵素の認識部位の一つにおける配列変異を含む。
【０１２４】
加えて、Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲ遺伝子変異の同定に利用することのできるＤＮＡ多型を分析する改良された方法が記載されており、それは、制限酵素部位間の短い直列に繰り返すＤＮＡ配列の変化する数を利用する。例えば、米国特許第５，０７５，２１７号(参考としてそっくりそのまま本明細書中に援用する)は、(ｄＣ−ｄＡ)ｎ−(ｄＧ−ｄＴ)ｎの短い直列の繰り返しのブロック内の長さの多型に基づくＤＮＡマーカーを記載している。(ｄＣ−ｄＡ)ｎ−(ｄＧ−ｄＴ)ｎブロックの平均分離は、３０，０００〜６０，０００ｂｐに見積もられる。非常に近接しているマーカーは、高頻度共通遺伝を示しており、遺伝子変異例えばＯｂ又はＯｂＲ遺伝子内の変異の同定並びにＯｂ又はＯｂＲ変異に関係する病気及び障害の診断において極めて有用である。
【０１２５】
米国特許第５，３６４，７５９号(参考としてそっくりそのまま本明細書中に援用する)も又、短い３及び４ヌクレオチドの反復配列の検出のためのＤＮＡプロファイリングアッセイを記載している。この方法は、関心あるＤＮＡ例えばＯｂ、ＯｂＲ又はＡＲ遺伝子の抽出、抽出したＤＮＡの増幅及び個々のＤＮＡの遺伝子型マップを形成するための反復配列の標識を含む。
【０１２６】
Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲ遺伝子発現のレベルは又、それぞれ、Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲ転写を検出し又は測定することによってアッセイすることもできる。例えば、Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲ遺伝子を発現することが知られ又は疑われる細胞型又は組織例えば脳特にＯｂ及びＯｂＲについては脈絡膜叢細胞に由来するＲＮＡを、上記のようなハイブリダイゼーション又はＰＣＲ技術を利用して単離して試験することができる。培養から取った細胞の分析は、細胞ベースの遺伝子治療技術の部分として利用すべき細胞、或は化合物のＯｂ、ＯｂＲ又はＡＲ遺伝子の発現に対する効果を試験する細胞の評価において必要なステップでありうる。かかる分析は、Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲ遺伝子の発現パターンの定量的及び定性的面の両方を明らかにすることができる(Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲ遺伝子発現の活性化又は不活性化を含む)。
【０１２７】
かかる検出計画の一具体例において、ｃＤＮＡを、関心あるＲＮＡから合成することができる(例えば、ＲＮＡ分子のｃＤＮＡへの逆転写により)。次いで、そのｃＤＮＡ内の配列を核酸増幅反応例えばＰＣＲ増幅反応などのためのテンプレートとして利用することができる。この方法の逆転写及び核酸増幅ステップにおける合成開始試薬として利用される核酸試薬(例えば、プライマー)は、当業者に周知のＯｂ、ＯｂＲ及びＡＲ核酸試薬の内から選択する。かかる核酸試薬の好適な長さは、少なくとも９〜３０ヌクレオチドである。増幅生成物の検出のために、核酸増幅を、放射性又は非放射性標識したヌクレオチドを利用して行なうことができる。或は、十分増幅した生成物を、該生成物が標準的なエチジウムブロミド染色により又は他の任意の適当な核酸染色法を利用することによって可視化されうるようにすることができる。
【０１２８】
加えて、かかるＯｂ、ＯｂＲ及びＡＲ遺伝子発現アッセイを「イン・シトゥー」で即ち生検又は切除術から得られた患者組織の組織切片(固定及び／又は凍結切片)上で直接行ない、それで、核酸精製を必要でなくすることができる。当業者に周知の核酸試薬をかかるイン・シトゥー手順のために、プローブ及び／又はプライマーとして利用することができる(例えば、Nuove, 1992, 「PCR In situ Hybridization: Protocols And Applications」、Raven Press, NY参照)。
【０１２９】
或は、もし十分な量の適当な細胞を得ることができるならば、標準的なノーザン分析を行なって、Ｏｂ、ＯｂＲ及びＡＲ遺伝子のｍＲＮＡ発現のレベルを測定することができる。
【０１３０】
５．２．２．Ｏｂ、ＯｂＲ及びＡＲ遺伝子産物の検出
野生型又は変異型Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲ遺伝子産物又はそれらの保存的変異体若しくはぺプチド断片に対する抗体(上記の第５．１．１節で検討した)も又、ここに記載のように骨の病気の診断薬又は予測薬として利用することができる。かかる診断方法は、Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲ遺伝子発現のレベルの異常、又はＯｂ、ＯｂＲ又はＡＲの構造及び／又は時間的な、組織、細胞又は細胞下配置の異常を検出するために利用することができ、イン・ビボ又はイン・ビトロで例えば生検組織などについて実施することができる。
【０１３１】
例えば、ＡＲ ＥＣＤ、ＯｂＲ ＥＣＤ又はＯｂのエピトープに対する抗体をイン・ビボで利用して、ＡＲ、ＯｂＲ又はＯｂの身体における発現のパターン及びレベルを検出することができる。かかる抗体を、例えば、放射線不透過性の又はその他の適当な化合物を利用して標識して、身体内で発現されたＡＲ、ＯｂＲ又はＯｂへの結合を、Ｘ線、ＣＡＴスキャンまたはＭＲＩなどの方法を利用して可視化するために患者に注射することができる。標識抗体断片例えばＦab又は一本鎖抗体(抗原結合性領域の最小部分を含む)は、この目的のために好適であり、血液−脳関門を横切って、脳内で発現されたＯｂＲの標識を可能にする。
【０１３２】
加えて、任意のＯｂ、ＯｂＲ若しくはＡＲ融合タンパク質又はＯｂ、ＯｂＲ若しくはＡＲ結合体化タンパク質(その存在を検出することができる)を投与することができる。例えば、放射線不透過性又はその他の適当な化合物で標識したＯｂ、ＯｂＲ又はＡＲ融合又は結合体化タンパク質を投与して、標識した抗体につき上で検討したようにイン・ビボで可視化することができる。更に、かかる融合タンパク質をイン・ビトロ診断手順のために利用することができる。
【０１３３】
或は、上記のようなイムノアッセイ又は融合タンパク質検出アッセイを、イン・ビトロ生検及び検屍試料について利用して、Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲの発現パターンの評価を可能にすることができる。かかるアッセイは、Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲの何れかの特定のエピトープを規定する抗体の利用に限られない。これらの標識した抗体の利用は、Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲの翻訳及び細胞表面への細胞内輸送に関する有用な情報を生成するであろうし、プロセッシングにおける欠陥を同定することができる。
【０１３４】
分析すべき組織又は細胞型には、一般に、Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲ遺伝子を発現することが知られ又は疑われるもの例えば視床下部及び脈絡膜叢細胞(ＯｂＲ)；及び脂肪細胞(Ｏｂ)が含まれる。ここで用いるタンパク質分離方法は、例えば、Harlow & Lane, 1988, 「Antibodies: A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(参考として、そっくりそのまま本明細書中に援用する)に記載されたものなどであってよい。単離された細胞を、細胞培養物から又は患者から得ることができる。培養物から取った細胞の分析は、細胞ベースの遺伝子治療技術の部分として、或は化合物のＯｂ、ＯｂＲ又はＡＲ遺伝子の発現に対する効果を試験するために利用できる細胞の評価において必要なステップでありうる。
【０１３５】
例えば、本発明で有用な抗体又は抗体断片(第５．１．１節に記載したようなもの)を利用して、Ｏｂ、ＯｂＲ若しくはＡＲ遺伝子産物又はそれらの保存された変異体若しくは断片の存在を定量的又は定性的に検出することができる。これは、例えば、光学顕微鏡、フローサイトメトリー又はフルオロメーターによる検出と組み合わせた蛍光標識抗体(この節の以下を参照)を利用する免疫蛍光技術によって達成することができる。かかる技術は、かかるＯｂ又はＯｂＲ遺伝子産物が細胞表面で発現されるならば、特に好適である。
【０１３６】
本発明で有用なこれらの抗体(又はそれらの断片)又はＯｂ、ＯｂＲ若しくはＡＲ融合若しくは結合体化タンパク質は、更に、免疫蛍光、免疫電子顕微鏡法又は非免疫学的アッセイにおけるように、Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲ遺伝子産物又はそれらの保存された変異体若しくはペプチド断片のイン・シトゥー検出のために、又はＯｂ結合(標識されたＯｂ融合タンパク質の場合)のために、組織学的に利用することができる。
【０１３７】
イン・シトゥー検出は、組織学的試料を患者から取り出して、それに本発明の標識抗体又は融合タンパク質を適用することによって達成することができる。この抗体(又は断片)又は融合タンパク質は、好ましくは、標識抗体(又は断片)を生物学的試料上に重層することにより適用する。かかる手順の利用によって、Ｏｂ、ＯｂＲ若しくはＡＲ遺伝子産物又はそれらの保存された変異体若しくはペプチド断片、又はＯｂの結合若しくはカテコールアミンの結合の存在だけでなく、調べた組織中の分布をも測定することができる。本発明を利用して、当業者は、容易に、様々な組織学的方法(染色手順など)の何れでも、かかるイン・シトゥー検出を達成するために改変することができることを認めるであろう。
【０１３８】
Ｏｂ、ＯｂＲ及びＡＲ遺伝子産物又はそれらの保存された変異体若しくはペプチド断片のイムノアッセイ及び非イムノアッセイは、典型的には、試料例えば生物学的液体(例えば、血清又は脳脊髄液)、組織抽出物、新鮮な採取した細胞、又は細胞培養でインキュベートした細胞の溶解物を、Ｏｂ、ＯｂＲ及びＡＲ遺伝子産物又はそれらの保存された変異体若しくはペプチド断片を同定することのできる検出可能に標識した抗体の存在下でインキュベートして、結合した抗体を当分野で周知の多くの技術の何れかによって検出すること含む。
【０１３９】
生物学的試料を、固相支持体又はキャリアー例えばニトロセルロース又は他の細胞、細胞顆粒若しくは可溶性タンパク質を固定化することのできる固体支持体と接触させて、その上に固定することができる。その支持体をその後適当な緩衝液で洗ってから検出可能に標識したＯｂ、ＯｂＲ若しくはＡＲ抗体で又はＯｂ、ＯｂＲ若しくはＡＲ融合タンパク質で処理する。固相支持体をその後緩衝液で洗って(２回目)未結合の抗体又は融合タンパク質を除去することができる。固体支持体上に結合した標識の量をその後慣用の手段によって検出することができる。
【０１４０】
「固相支持体又はキャリアー」とは、抗原又は抗体を結合することのできる任意の支持体を意図している。周知の支持体又はキャリアーは、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然の及び改変されたセルロース、ポリアクリルアミド、斑糲岩及び磁鉄鉱を包含する。キャリアーの性質は、本発明の目的のために、ある程度可溶性であっても不溶性であってもよい。支持体材料は、事実上、結合した分子が抗原又は抗体と結合できるのであれば、任意の可能な構造形状を有してよい。従って、支持体の形状は、ビーズのように球形であっても、試験管の内面又は棒の外表面のような円筒状であってもよい。或は、該表面は、シート、試験片などのように平らであってよい。好適な支持体は、ポリスチレンビーズを含む。当業者は、抗体若しくは抗原を結合するための多くの他の適当なキャリアーを知り、又はそれを日常的実験を利用して確かめることができるであろう。
【０１４１】
所定ロットのＯｂ、ＯｂＲ若しくはＡＲ抗体又はＯｂ、ＯｂＲ若しくはＡＲ融合タンパク質の結合活性を、周知の方法によって測定することができる。当業者は、機能的で最適なアッセイ条件を、各測定について、日常的実験を利用して決定することができる。
【０１４２】
抗体に関して、Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲ抗体を検出可能に標識する方法の一つは、該抗体を酵素に結合することによるものであり、酵素イムノアッセイ(ＥＩＡ)における利用である(Voller, 「The Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)」、1978, Diagnostic Horizons 2:1-7, Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, Md.)；Voller等、1978, J.Clin.Pathol.31:507-520；Butler, 1981, Meth.Enzymol.73:482-523；Maggio(編)、1980, Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Fla.,；Ishikawa等(編)、1981, Enzume Immunoassay, Kgaku Shoin, Tokyo)。抗体に結合された酵素は、適当な基質好ましくは色原体基質と、例えば分光測光法、蛍光測定法により又は可視的手段によって検出することのできる化学部分を生成するような様式で反応する。抗体を検出可能に標識するのに利用できる酵素には、マレートデヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファグリセロホスフェート、デヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼが含まれるが、これらに限られない。この検出は、酵素のための色原体基質を利用する熱量測定法によって達成することができる。検出は又、基質の酵素反応の程度を同様に調製した標準と視覚的に比較することによっても達成することができる。
【０１４３】
検出は又、様々な他のイムノアッセイの何れかを利用して達成することもできる。例えば、抗体又は抗体断片を放射性標識することにより、ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)の利用によって、Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲを検出することができる(例えば、Weintraub, Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, 1986年３月(参考として本明細書中に援用する)を参照されたい)。放射性同位体を、ガンマーカウンター又はシンチレーションカウンター又はオートラジオグラフィーの利用などの手段によって検出することができる。
【０１４４】
抗体を蛍光化合物で標識することも可能である。蛍光標識した抗体を適当な波長の光に曝すと、その後その存在が蛍光のために検出されうる。最も一般に用いられる蛍光標識化合物の内には、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒド及びフルオレスカミンがある。
【０１４５】
抗体は、蛍光放出金属例えば152Ｅｕその他のランタン系列を利用して、検出可能に標識することもできる。これらの金属を、ジエチレントリアミン五酢酸(ＤＴＰＡ)又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの金属キレート基を用いて、抗体に結合させることができる。
【０１４６】
抗体は又、それを化学発光化合物に結合させることによって検出可能に標識することもできる。化学発光標識された抗体の存在を、その後、化学反応過程で生じた発光の存在を検出することによって測定する。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、テロマチックアクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩及びオキサレートエステルである。
【０１４７】
同様に、生物発光化合物を利用して、本発明の抗体を標識することができる。生物発光は、生物学的系で見出される化学発光の一種であり、該発光においては、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を増大させる。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することにより測定される。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することにより測定される。標識目的のための重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及びエクオリンである。
【０１４８】
５．３．骨の病気の治療、診断及び予防において有用な化合物のスクリーニングアッセイ
本発明は又、骨の病気に影響を与える化合物の同定のためのスクリーニング方法(例えば、アッセイ)をも提供する。この発明は、更に、レプチンとレプチンレセプター、及びカテコールアミンとアドレナリン作動性レセプターのアゴニスト及びアンタゴニスト(小さい分子、大きい分子、及び抗体を含む)、並びにレプチン、レプチンレセプター、及びアドレナリン作動性レセプターの遺伝子の発現を阻害するために利用することのできるヌクレオチド配列(例えば、アンチセンス及びリボザイム分子)、及びレプチン、レプチンレセプター又はアドレナリン作動性遺伝子の発現を増進させるためにデザインされた遺伝子又は調節配列置換構築物(例えば、レプチン、レプチンレセプター、又はアドレナリン作動性レセプター遺伝子を強力なプロモーターシステムの制御下に置いた発現用構築物)を包含する。かかる化合物は、骨の病気を治療するために利用することができる。
【０１４９】
特に、レプチン、レプチンレセプター又はアドレナリン作動性レセプターと相互作用する(例えば、レプチン及びレプチンレセプター又はカテコールアミン及びアドレナリン作動性レセプターの活性を調節し及び／又はレプチンレセプター又はアドレナリン作動性レセプターに結合する)化合物を同定するために利用することのできる細胞アッセイ及び非細胞アッセイを記載する。これらの細胞ベースのアッセイを利用して、レプチンとレプチンレセプター及び／又はカテコールアミンとアドレナリン作動性レセプターのシグナル変換活性に影響を与える化合物又は組成物(レプチンレセプター若しくはカテコールアミンレセプターに結合するか、又はレプチンシグナル変換経路若しくはアドレナリン作動性シグナル変換経路に関与する細胞内因子に作用する)を同定することができる。この発明のかかる細胞ベースのアッセイは、レプチン、レプチンレセプター又はアドレナリン作動性レセプターを発現する細胞、細胞株又は加工した細胞若しくは細胞株を利用する。これらの細胞を更に加工して、活性化されたレプチンレセプター又はアドレナリン作動性レセプターにより変換されたシグナルにリンクして、レプチン及びレプチンレセプターシグナリング活性及び／又はアドレナリン作動性シグナリング活性を調節する化合物の同定を助成するレポーター分子を組み込むことができる。
【０１５０】
この発明は又、レプチン、レプチンレセプター、及びアドレナリン作動性レセプター遺伝子の発現を調節する化合物又は組成物をスクリーニングするための細胞ベースのアッセイ又は細胞溶解物アッセイ(例えば、イン・ビトロ転写又は翻訳アッセイ)の利用をも包含する。この目的のために、レプチン又はレプチンレセプター遺伝子の調節エレメントにリンクされたレポーター配列を含む構築物を、加工された細胞において又は細胞溶解抽出物において利用して、レポーター遺伝子産物の発現を転写のレベルで調節する化合物をスクリーニングすることができる。例えば、かかるアッセイを利用して、レプチン、レプチンレセプター、及びアドレナリン作動性レセプター遺伝子の発現に関与する転写因子の発現又は活性を調節する化合物を同定し、又は三重らせんポリヌクレオチドの活性を試験することができる。或は、加工された細胞又は翻訳抽出物を利用して、レプチン、レプチンレセプター及びアドレナリン作動性レセプターのｍＲＮＡ転写物からの翻訳を調節し、それ故、レプチンレセプター及び／又はアドレナリン作動性レセプターの発現に影響を与える化合物(アンチセンス及びリボザイム構築物を含む)をスクリーニングすることができる。
【０１５１】
次のアッセイは、Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲと相互作用(例えば、結合)する化合物(ＯｂＲ又はＡＲのＥＣＤ又はＣＤを含むが、これらに限られない)、Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲと相互作用する細胞内タンパク質と相互作用(例えば、結合)する化合物(ＯｂＲ又はＡＲのＴＭ及びＣＤを含むが、これらに限られない)、Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲの、ＯｂＲ媒介のシグナル変換又はアドレナリン作動性シグナル変換に関与する膜貫通又は細胞内タンパク質との相互作用に干渉する化合物、及びＯｂ、ＯｂＲ若しくはＡＲ遺伝子の発現の活性を調節し又はＯｂ、ＯｂＲ若しくはＡＲのレベルを調節する化合物を同定するためにデザインされている。Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲ遺伝子調節配列(例えば、プロモーター配列)に結合してＯｂ、ＯｂＲ又はＡＲ遺伝子発現を調節することのできる化合物を同定するアッセイを更に利用することができる(例えば、Platt, 1994, J.Biol.Chem.269:28558-28562参照)。同定に際して、化合物は、更に、イン・ビトロ又はイン・ビボでレプチンシグナリングを調節する能力について試験され、更に、骨量を調節する(即ち、骨量を増し又は減少させる)能力及び病気でない対応する骨と比較して減少若しくは増大した骨量を特徴とする骨の病気を治療する能力について試験されうる。
【０１５２】
従って、本発明のこの面によれば、哺乳動物の骨量を調節する(増大又は減少させる)能力について試験すべき化合物を同定する方法であって、該方法は、下記：
(ａ)試験化合物をポリペプチドと接触させ;そして
(ｂ)該試験化合物が該ポリペプチドに結合するかどうかを検出することを含み、それで該試験化合物が該ポリペプチドに結合するならば、骨量を調節する能力について試験すべき化合物が同定され、該ポリペプチドをレプチンポリペプチド、レプチンレセプターポリペプチド及びアドレナリン作動性ポリペプチドよりなる群から選択する当該方法がある。
【０１５３】
或は、哺乳動物の骨量を調節する(増大又は減少させる)化合物を同定する方法であって、該方法は、下記：
(ａ)試験化合物をポリペプチドと接触させ；
(ｂ)該ポリペプチドに結合する試験化合物を同定し；そして
(ｃ)(ｂ)の試験化合物を非ヒト哺乳動物に投与し、そして該試験化合物が該哺乳動物の骨量を未処理の対照用非ヒト哺乳動物の対応する骨と比較して調節するかどうかを測定することを含み、該ポリペプチドをレプチンポリペプチド、レプチンレセプターポリペプチド及びアドレナリン作動性ポリペプチドよりなる群から選択し、それで該試験化合物が骨量を調節するならば、哺乳動物の骨量を調節する化合物が同定される当該方法がある。
【０１５４】
本発明のこの面及び他の面によれば、対照用非ヒト哺乳動物は、ここで用いる場合、試験化合物を投与されていない対応する哺乳動物を意味することを意図している。
【０１５５】
本発明の更に別の面によれば、哺乳動物の骨量を調節する(増大又は減少させる)能力について試験すべき化合物を同定する方法であって、該方法は、下記：
(ａ)試験化合物をレプチンポリペプチド及びレプチンレセプターポリペプチドと、レプチン／レプチンレセプター複合体を形成するのに十分な時間接触させ；そして
(ｂ)レプチン／レプチンレセプター複合体レベルを測定することを含み、それで、測定されたレベルが該試験化合物の非存在下で測定されたレベルと異なるならば、骨量を調節する能力について試験すべき化合物が同定される当該方法がある。
【０１５６】
本発明の更に別の面によれば、哺乳動物の骨量を調節する(増大又は減少させる)能力について試験すべき化合物を同定する方法であって、該方法は、下記：
(ａ)試験化合物をカテコールアミン及びアドレナリン作動性レセプターポリペプチドとカテコールアミン／アドレナリン作動性レセプター複合体を形成するのに十分な時間接触させ；そして
(ｂ)カテコールアミン／アドレナリン作動性レセプター複合体を測定し、それで測定されたレベルが該試験化合物の非存在下で測定されたものと異なるならば、骨量を調節する能力について試験すべき化合物が同定される
ことを含む当該方法がある。
【０１５７】
本発明のこの面及び他の面によれば、レプチン／レプチンレセプター及び／又はカテコールアミン／アドレナリン作動性レセプター複合体の形成を、例えば、該複合体を単離して、当業者に周知の様々なアッセイ例えばウエスタンブロットにより複合体形成量を測定するによって測定することができる。
【０１５８】
本発明の他の面によれば、哺乳動物の骨量を減少させる能力について試験すべき化合物を同定する方法であって、該方法は、下記：
(ａ)試験化合物を機能的レプチンレセプターを発現する細胞と接触させ；そして
(ｂ)該試験化合物が該レプチンレセプターを活性化するかどうかを測定する
ことを含み、該化合物が該レプチンレセプターを活性化するならば、哺乳動物の骨量を減少させる能力について試験すべき化合物が同定される当該方法がある。
【０１５９】
本発明のこの面及び他の面によれば、機能的レプチンレセプターは、レセプターの活性部位にリガンドが結合した後にシグナル変換が可能であるレプチンレセプターである。レプチンレセプターの活性化は、ここで用いる場合、レプチンレセプターの活性(即ち、シグナル変換)の任意の増加のことである。
【０１６０】
本発明の他の面によれば、哺乳動物の骨量を減少させる能力について試験すべき化合物を同定する方法であって、該方法は、下記：
(ａ)試験化合物を機能的アドレナリン作動性レセプターを発現する細胞と接触させ；そして
(ｂ)該試験化合物が該アドレナリン作動性レセプターを活性化するかどうかを測定する
ことを含み、該化合物が該アドレナリン作動性レセプターを活性化するならば、哺乳動物の骨量を減少させる能力について試験すべき化合物が同定される当該方法がある。
【０１６１】
本発明のこの面及び他の面によれば、機能的アドレナリン作動性レセプターは、レセプターの活性部位へのリガンド結合後にシグナル変換可能であるアドレナリン作動性レセプターである。アドレナリン作動性レセプターの活性化は、ここで用いる場合、該アドレナリン作動性レセプターの活性(即ち、シグナル変換)の任意の増加のことである。
【０１６２】
本発明の他の面によれば、哺乳動物の骨量を減少させる化合物を同定する方法であって、該方法は、下記：
(ａ)試験化合物を機能的レプチンレセプターを発現する細胞と接触させて、該試験化合物が該レプチンレセプターを活性化するかどうかを測定し；
(ｂ)(ａ)でレプチンレセプターを活性化するとして同定された試験化合物を非ヒト動物に投与して、該試験化合物が該動物の骨量を、対照用非ヒト動物の対応する骨と比較して減少させるかどうかを測定することを含み、該試験化合物が骨量を減少させるならば、哺乳動物の骨量を減少させる化合物が同定される当該方法がある。
【０１６３】
本発明の他の面によれば、哺乳動物の骨量を減少させる化合物を同定する方法であって、該方法は、下記：
(ａ)試験化合物を機能的アドレナリン作動性レセプターを発現する細胞と接触させて、該試験化合物が該アドレナリン作動性レセプターを活性化するかどうかを測定し；
(ｂ)(ａ)でアドレナリン作動性レセプターを活性化するとして同定された試験化合物を非ヒト動物に投与して、該試験化合物が該動物の骨量を対照用非ヒト動物の対応する骨と比較して減少させるかどうかを測定することを含み、それで、該試験化合物が骨量を減少させるならば、哺乳動物の骨量を減少させる化合物が同定される当該方法がある。
【０１６４】
本発明の他の面によれば、哺乳動物の骨量を増大させる能力について試験すべき化合物を同定する方法であって、該方法は、下記：
(ａ)レプチンポリペプチド及び試験化合物を、機能的レプチンレセプターを発現する細胞と接触させ；そして
(ｂ)該試験化合物がレプチンレセプターの活性化を、該試験化合物の非存在下で認められたものと比較して低下させたかどうかを測定することを含み；該レプチンレセプターの活性化を低下させた試験化合物が、哺乳動物の骨量を増大させる能力について試験されるべき化合物として同定される当該方法がある。
【０１６５】
本発明の他の面によれば、哺乳動物の骨量を増大させる能力について試験すべき化合物を同定する方法であって、該方法は、下記：
(ａ)カテコールアミン及び試験化合物を機能的アドレナリン作動性レセプターを発現する細胞と接触させ；そして
(ｂ)該試験化合物が、アドレナリン作動性レセプターの活性化を、該化合物の非存在下で認められたものと比較して低下させるかどうかを測定することを含み；該アドレナリン作動性レセプターの活性化を低下させる試験化合物が、哺乳動物の骨量を増大させる能力について試験されるべき化合物として同定される当該方法がある。
【０１６６】
本発明の更に別の面によれば、哺乳動物の骨量を増大させる化合物を同定する方法であって、該方法は、下記：
(ａ)レプチンポリペプチド及び試験化合物を機能的レプチンレセプターを発現する細胞と接触させて、該試験化合物がレプチンレセプターの活性化を減少させるかどうかを測定し；
(ｂ)(ａ)においてレプチンレセプターを減少させるとして同定された試験化合物を非ヒト動物に投与して、該試験化合物が該動物の骨量を、対照用非ヒト動物の対応する骨と比較して増大させるかどうかを測定することを含み、それで、該試験化合物が骨量を増大させるならば、哺乳動物の骨量を増大させる化合物が同定される当該方法がある。
【０１６７】
本発明の更に別の面によれば、哺乳動物の骨量を増大させる化合物を同定する方法であって、該方法は、下記：
(ａ)カテコールアミン及び試験化合物を機能的アドレナリン作動性レセプターを発現する細胞と接触させて、該試験化合物がアドレナリン作動性レセプターの活性化を減少させるかどうかを測定し；
(ｂ)(ａ)においてアドレナリン作動性レセプターを減少させるとして同定された試験化合物を非ヒト動物に投与して、該試験化合物が該動物の骨量を、対照用非ヒト動物の対応する骨と比較して増大させるかどうかを測定すること含み、該試験化合物が骨量を増大させるならば、哺乳動物の骨量を増大させる化合物が同定される当該方法がある。
【０１６８】
この発明の更に別の面によれば、レプチンレセプターの活性化を、リン酸化Ｓｔａｔ３ポリペプチドのレベルを測定することにより測定する方法がある。標的細胞におけるレプチンシグナリングの下流エフェクターであるＳｔａｔポリペプチド(Tartaglia等、1995, Cell 83, 1263-1271；Baumann等、1996, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93, 8374-8378；Ghilardi等、1996, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93, 6231-6235；Vaisse等、1996, Nat Genet 14:95-97)は、レプチンによるレプチンレセプターの活性化の後にリン酸化される。
【０１６９】
この発明によってスクリーニングされうる化合物は、Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲに結合して天然のリガンドにより引き金を引かれる活性を真似る(即ち、アゴニスト)か又は天然のリガンドにより引き金を引かれる活性を阻害する(即ち、アンタゴニスト)ペプチド、抗体及びその断片、並びに他の有機化合物(例えば、ペプチド模倣物)；並びにＯｂＲ又はＡＲのＥＣＤ(又は、その一部分)を真似し及び天然リガンドを「中和する」ペプチド、抗体又はその断片、及び他の有機化合物を包含するが、これらに限られない。この発明によってスクリーニングされるる更なる化合物には、Ｏｂと相互作用してＯｂの血液−脳関門を横切る輸送を妨げ、それによりＯｂがＯｂＲを活性化することを妨げる化合物が含まれるが、これらに限られない。
【０１７０】
かかる化合物は、ペプチド例えば可溶性ペプチド{ランダムペプチドライブラリー；(例えば、Lam, K.S.等、1991, Nature 354:82-84；Houghten, R.等、1991, Nature 354:84-86参照)及びコンビナトリアル化学に由来する分子のＤ及びＬ−コンフィギュレーションのアミノ酸から作られたライブラリーのメンバーを包含するが、これらに限られない}、ホスホペプチド(ランダム又は部分的に縮重した位置指定ホスホペプチドライブラリーのメンバーを含むが、これらに限られず、例えば、Songyang等、1993, Cell 72:767-778参照)、抗体(ポリクローナル、モノクローナル、ヒト、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラ又は一本鎖抗体及びＦAb、Ｆ(ab')2及びＦAb発現ライブラリー断片、及びこれらのエピトープ結合性断片を含むが、これらに限られない)、及び小型の有機又は無機の分子を包含するが、これらに限られない。
【０１７１】
この発明によってスクリーニングすることのできる他の化合物は、血液−脳関門を横切ることができ、適当な細胞(例えば、脈絡膜叢又は視床下部内)に入ることができ及びＯｂ、ＯｂＲ又はＡＲ遺伝子及び他の幾つかのＯｂＲシグナル変換経路又はアドレナリン作動性シグナル変換経路に関与する遺伝子の発現に影響を与える(例えば、遺伝子発現に関与する調節領域又は転写因子と相互作用することによって)小型有機分子；又はＯｂＲ若しくはＡＲの活性に影響を与え(例えば、ＣＤの酵素活性を阻害し又は増進させることにより)又は他の幾つかのＯｂＲシグナル変換経路に関与する細胞内因子(例えば、ｇｐ１３０)の活性に影響を与えるような化合物を包含するが、これらに限られない。
【０１７２】
コンピューターモデリング及び検索技術は、Ｏｂ、ＯｂＲ若しくはＡＲ発現若しくは活性を調節することのできる化合物の同定又は既に同定された化合物の改良を可能にする。かかる化合物又は組成物が同定されたならば、その活性部位又は領域を同定する。かかる活性部位は、典型的には、リガンド結合部位例えばＯｂとＯｂＲ自身との相互作用ドメインであってよい。当分野で公知の方法(例えば を含む)を利用して、ペプチドのアミノ酸配列から、核酸のヌクレオチド配列から、又は関連化合物若しくは組成物の天然リガンドとの複合体の研究から、活性化部位を同定することができる。後者の場合には、化学的方法又はＸ線結晶構造解析法を利用して、因子上の何処に複合体化リガンドが見出されるかを見出すことにより活性部位を見出すことができる。次に、活性部位の三次元幾何学的構造を決定する。これは、Ｘ線結晶構造解析を含む公知の方法により行なうことができ、これは、完全な分子構造を決定することができる。他方、液相又は固相ＮＭＲを利用して、ある種の分子内距離を測定することができる。任意の他の実験的構造決定法を利用して、部分的な又は完全な幾何学的構造を得ることができる。これらの幾何学的構造は、決定された活性部位構造の正確さを増大させることのできる複合体化リガンド(天然物又は人工物)を利用して測定することができる。
【０１７３】
完全でない又は不十分な精度の構造が測定されたならば、コンピューターベースの数値モデリング方法を利用して、その構造を完全にし又はその精度を改善することができる。特定の生体高分子例えばタンパク質又は核酸に特異的なパラメーター表示されたモデル、分子運動の計算に基づく分子動力学モデル、熱的集団に基づく統計メカニズムモデル又は組み合わせたモデルを含む任意の認められたモデリング法を利用することができる。殆どの種類のモデルについて、標準的分子力場(構成要素の原子及び原子団の間の力を表す)が必要であり、物理化学で知られた力場から選択することができる。不完全な又は低精度の実験的構造は、これらのモデリング法により計算される完全な又は一層正確な構造に対する拘束として役立ちうる。
【０１７４】
最後に、活性部位の構造を決定したならば、実験的に、モデリングにより又は組合せによって、候補の調節化合物を、化合物を含むデータベースをそれらの分子構造についての情報に沿って検索することにより同定することができる。かかる検索は、測定した活性部位構造と一致し且つ活性部位を規定する原子団と相互作用する構造を有する化合物を求める。かかる検索は、手作業であってもよいが、好ましくはコンピューター補助による。この検索から見出された化合物は、潜在的なＯｂ、ＯｂＲ又はＡＲ調節化合物である。
【０１７５】
或は、これらの方法を利用して、改良された調節化合物を既知の調節化合物又はリガンドから同定することができる。公知の化合物の組成物を改変することができ、改変の構造効果を実験的及び上記のコンピューターモデリング方法(新規組成物に適用)を利用して測定することができる。変化した構造をその後化合物の活性部位の構造と比較して、改良された適合又は相互作用を生じたかを測定する。この方法においては、組成物のシステム的変化(例えば、側鎖基を変えることによる変化)を、迅速に評価して、改善された特異性又は活性を有する改変された調節化合物又はリガンドを得ることができる。
【０１７６】
Ｏｂ、ＯｂＲ、ＡＲ及び関連する変換及び転写因子の活性部位の同定に基づいて調節化合物を同定するのに有用な更なる実験的及びコンピューターモデリング方法は、当業者には明らかとなろう。
【０１７７】
分子モデリングシステムの例は、ＣＨＡＲＭｍ及びＱＵＡＮＴＡプログラム(Polygen Corporation, マサチューセッツ、Waltham在)である。ＣＨＡＲＭｍは、エネルギー最小化及び分子動力学機能を行なう。ＱＵＡＮＴＡは、分子構造の構築、グラフィックモデリング及び分析を行なう。ＱＵＡＮＴＡは、分子の相互作用的構築、改変、可視化及びそれらの振る舞いの分析を可能にする。
【０１７８】
Rotivinen等、1988, Acta Pharmaceutical Fennica 97:159-166；Ripka, New Scientist 54-57(1988年６月16日)；McKinaly及びRossmann, 1989, Annu.Rev.Pharmacol.Toxiciol.29:111-122；Perry及びDavis, OSAR: Quantitative Structure-Activity Relationship in Drug Design p189-193(Alan R.Liss, Inc.1989)；Lewis及びDean, 1989 Proc.R.Soc.Lond.236:125-140及び141-162などの多くの論文が、特異的タンパク質と相互作用する薬物のコンピューターモデリングを総説しているし、核酸成分のレセプターも出るに関しては、Askew等、1989, J.Am.Chem.Soc.111:1082-1090に総説されている。化学物質をスクリーニングしてグラフィックに描く他のコンピュータープログラムは、BioDesign, Inc.(カリフォルニア、Pasadena在)、Allelix, Inc.(カナダ国、オンタリオ、Mississauga在)及びHypercube, Inc(オンタリオ、Cambridge在)などの会社から入手可能である。これらは、主に、特定のタンパク質に特異的な薬物に適用するためにデザインされているが、それらをＤＮＡ又はＲＮＡの領域に特異的な薬物のデザインに適合させることができる(該領域が一度同定されれば)。
【０１７９】
結合を変えることのできる化合物のデザイン及び生成に関して上記したが、公知の化合物(天然物又は合成化学物質)及び生物学的に活性な物質(タンパク質を含む)のライブラリーを、インヒビター又はアクチベーターである化合物につきスクリーニングすることもできる。
【０１８０】
ここに記載したようなアッセイによって同定された化合物は、例えば、Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲ遺伝子産物の生物学的機能を作る際に及び骨の病気を改善するために有用でありうる。例えば第５．３．１〜５．３．３節に記載したような技術により同定された化合物の効力を試験するためのアッセイを、以下の第５．３．４節で検討する。
【０１８１】
５．３．１．Ｏｂ、ＯｂＲ及びＡＲに結合する化合物のイン・ビトロスクリーニングアッセイ
イン・ビトロの系は、Ｏｂ、ＯｂＲ及びＡＲ(ＯｂＲ及びＡＲのＥＣＤ又はＣＤを含むが、これらに限られない)と相互作用(例えば、結合)できる化合物を同定するためにデザインすることができる。同定された化合物は、野生型及び／又は変異型Ｏｂ、ＯｂＲ及びＡＲ遺伝子産物の活性の調節において有用でありえ；Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲの生物学的機能を作る際に有用でありえ；正常なＯｂ、ＯｂＲ及びＡＲ相互作用を破壊する化合物を同定するためのスクリーニングにおいて利用することができ；又はかかる相互作用を破壊することができる。
【０１８２】
Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲに結合する化合物を同定するために利用されるアッセイの原理は、２種類の化合物が相互作用して結合するのに十分な条件下で十分な時間にわってＯｂ、ＯｂＲ又はＡＲの反応混合物及び試験化合物を調製し、そうして取り出し且つ／又は検出することのできる複合体を反応混合物中で形成することを含む。これらの利用するＯｂ、ＯｂＲ又はＡＲ種は、スクリーニングアッセイのゴールによって変化しうる。例えば、天然リガンドのアゴニストを求める場合には、完全長のＯｂＲ又は可溶性の切り詰めたＯｂＲ(例えば、ＴＭ及び／又はＣＤが分子から削除されているもの)、ＥＣＤに対応するペプチド又はＯｂＲ ＥＣＤをアッセイ系において利点(例えば、生成した複合体の標識、単離など)を与えるタンパク質又はポリペプチドに融合させて含む融合タンパク質を利用することができる。ＯｂＲの細胞質ドメインと相互作用する同定すべき化合物が求められる場合には、ＯｂＲ ＣＤに対応するペプチド及びＯｂＲ ＣＤを含む融合タンパク質を利用することができる。加えて、Ｏｂが血液−脳関門を横切って入ることを妨げる化合物を求める場合には、Ｏｂ又はその可溶性形態を利用することができる。完全長のＡＲ又は可溶性の切り詰めたＡＲを利用する同様のアプローチも又、利用することができる。
【０１８３】
これらのスクリーニングアッセイは、様々な方法で行なうことができる。例えば、かかるアッセイを行なう一つの方法は、Ｏｂ、ＯｂＲ若しくはＡＲタンパク質、ポリペプチド、ペプチド若しくは融合タンパク質又は試験物質を固相上に繋ぎ留めて、該固相上に繋ぎ留められたＯｂ、ＯｂＲ若しくはＡＲ／試験化合物複合体を反応の最後に検出することを含む。かかる方法の一具体例において、Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲ反応物を、固体表面に繋ぎ留めて、繋ぎ留められていない試験化合物を直接又は間接的に標識することができる。
【０１８４】
実際には、ミクロ滴定プレートを、固相として便利に利用することができる。繋ぎ留められた成分は、非共有結合又は共有結合によって固定化されうる。非共有結合は、単に固体表面をタンパク質溶液でコートして乾燥させることにより達成されうる。或は、固定化すべきタンパク質に対する固定化抗体(好ましくは、モノクローナル抗体)を利用して、該タンパク質を該固体表面に繋ぎ留めることができる。これらの表面は、予め調製して保存しておくことができる。
【０１８５】
このアッセイを行なうために、固定化されていない成分を、繋留された成分を含むコートされた表面に加える。反応が完結した後に、未反応の成分を、形成された如何なる複合体でも該固体表面上に固定化されたままでいるような条件下で除去する(例えば、洗浄によって)。固体表面上に繋留された複合体の検出は、多くの方法で達成することができる。前以って固定化していない成分を予備標識してある場合には、表面上に固定化された標識の検出は、複合体が形成されたことを示す。前以って固定化されていない成分を予備標識していない場合には、間接標識を利用して、例えば、前以って固定化していない成分に特異的な標識抗体を利用して、表面上に繋留された複合体を検出することができる(該抗体を、更に、直接標識することもできるし、標識した抗Ｉｇ抗体を用いて間接標識することもできる)。
【０１８６】
或は、反応を液相中で行ない、反応生成物を未反応成分から分離して、複合体を検出することができ；例えば、Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲタンパク質、ポリペプチド、ペプチド又は融合タンパク質又は試験化合物に特異的な固定化抗体を利用して、溶液中で形成された任意の複合体を繋留し、可能な複合体の他の成分に特異的な標識抗体を利用して、繋留された複合体を検出する。
【０１８７】
或は、細胞ベースのアッセイを利用して、Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲと相互作用する化合物を同定することができる。この目的のために、Ｏｂ、ＯｂＲ若しくはＡＲを発現する細胞株又はＯｂ、ＯｂＲ若しくはＡＲを発現するように遺伝子工学処理(例えば、Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲ ＤＮＡのトランスフェクション又は形質導入)した細胞株(例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、繊維芽細胞など)を利用することができる。この試験化合物の例えば宿主細胞により発現されたＯｂＲのＥＣＤとの相互作用を、天然のＯｂとの比較又は競争によって測定することができる。
【０１８８】
５．３．２．Ｏｂ、ＯｂＲ及びＡＲと相互作用するタンパク質のアッセイ
Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲと相互作用する膜貫通タンパク質又は細胞内タンパク質を同定するために、タンパク質−タンパク質相互作用の検出に適した任意の方法を利用することができる。利用することのできる伝統的方法の内には、同時免疫沈降法、勾配又はクロマトグラフィーカラムによる細胞溶解物又は細胞溶解物から得られたタンパク質の架橋及び同時精製並びにＯｂ、ＯｂＲ又はＡＲと相互作用する溶解物中のタンパク質を同定するためのＯｂ、ＯｂＲ又はＡＲがある。これらのアッセイのために、利用するＯｂ、ＯｂＲ又はＡＲ成分は、完全長であってよく、可溶性誘導体は、膜繋留領域を欠き(例えば、ＣＤに融合させたＥＣＤを含む、切り詰めた分子を生じるＴＭが削除された、切り詰めたＯｂＲ又はＡＲ)、一種のペプチドは、ＣＤに対応し又は融合タンパク質は、Ｏｂ又はＯｂＲ若しくはＡＲのＣＤを含む。一度単離されれば、かかる細胞内タンパク質は、同定されうるし、更に、標準的技術と共に用いて、それが相互作用するタンパク質を同定することができる。例えば、Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲと相互作用する細胞内タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも一部分を、当業者に周知の技術例えばエドマン分解技術を利用して確認することができる(例えば、Creighton, 1983,「Proteins: Structures and Molecular Principles」、W.H. Freeman & Co., N.Y., p34-49を参照されたい)。得られたアミノ酸配列は、かかる細胞内タンパク質をコードする遺伝子配列のスクリーニングに利用することのできるオリゴヌクレオチド混合物の生成のためのガイドとして利用することができる。スクリーニングは、例えば、標準的ハイブリダイゼーション又はＰＣＲ技術によって達成することができる。オリゴヌクレオチド混合物の生成及びスクリーニングのための技術は、周知である(例えば、Ausubel,前出、及びPCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, 1990, Innis, M.等編、Academic Press, Inc., New Yorkを参照されたい)。
【０１８９】
加えて、ＯｂＲ、Ｏｂ又はＡＲと相互作用する膜貫通タンパク質又は細胞内タンパク質をコードする遺伝子の同時同定を生じる方法を利用することができる。これらの方法は、例えば、λｇｔ１１ライブラリーの抗体プロービングの周知技術と同様の仕方で発現ライブラリーを、標識したＯｂ、ＯｂＲ若しくはＡＲタンパク質又はＯｂ、ＯｂＲ若しくはＡＲポリペプチド、ペプチド又は融合タンパク質例えばマーカー(例えば、酵素、蛍光、発光性タンパク質又は染料)と融合させたＯｂ、ＯｂＲ若しくはＡＲポリペプチド若しくはＯｂ、ＯｂＲ若しくはＡＲドメイン又はＩｇ−Ｆｃドメインを用いてプローブ検出することを含む。
【０１９０】
イン・ビボでタンパク質相互作用を検出する一つの方法であるツーハイブリッド系を、制限するのではなく説明のためのみに詳細に記載する。この系の一つのバージョンは、記載されており(Chien等、1991, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:9578-9582)、Clontech(カリフォルニア、Palo Alto在)から市販されている。
【０１９１】
簡単にいえば、かかる系を利用して、2種類のハイブリッドタンパク質をコードするプラスミドが構築される。一方のプラスミドは、Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲ、Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲポリペプチド、ペプチド又は融合タンパク質をコードするＯｂ、ＯｂＲ又はＡｒヌクレオチド配列に融合された転写アクチベータータンパク質のＤＮＡ結合ドメインをコードするヌクレオチドよりなり、他方のプラスミドは、ｃＤＮＡライブラリーの部分としてこのプラスミド中に組み換えられた未知のタンパク質をコードするｃＤＮＡに融合された転写アクチベータータンパク質の活性化ドメインをコードするヌクレオチドよりなる。このＤＮＡ結合ドメイン融合プラスミド及びｃＤＮＡライブラリーを、レポーター遺伝子(例えば、ＨＢＳ又はｌａｃＺ)を含む酵母サッカロミセス・セレビシエの一つの株にトランスフォームする(該レポーター遺伝子の調節領域は、転写アクチベーター結合部位を含んでいる)。何れのハイブリッドタンパク質も、単独では、レポーター遺伝子の転写を活性化できない。即ち、ＤＮＡ結合ドメインハイブリッドは、活性化機能を与えないので活性化できず、活性化ドメインハイブリッドは、アクチベーター結合部位へ局在化できないので活性化できない。これら２種類のハイブリッドタンパク質の相互作用は、機能的アクチベータータンパク質を再構成して、レポーター遺伝子の発現を生じ、それは、レポーター遺伝子産物のアッセイによって検出される。
【０１９２】
ツーハイブリッド系又は関連する方法論を利用して、活性化ドメインライブラリーを、「餌」遺伝子産物と相互作用するタンパク質についてスクリーニングすることができる。例としてであり制限するものではないが、Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲを、餌遺伝子産物として利用することができる。全ゲノム又はｃＤＮＡ配列を、活性化ドメインをコードするＤＮＡと融合させる。このライブラリーとＤＮＡ結合ドメインに融合させた餌のＯｂ、ＯｂＲ又はＡＲ遺伝子産物のハイブリッドをコードするプラスミドとを、酵母レポーター株に同時トランスフォームし、その結果生成したトランスフォーマントをレポーター遺伝子を発現するものにつきスクリーニングする。例であって制限ではないが、餌のＯｂ、ＯｂＲ又はＡＲ遺伝子配列例えばＯｂ、ＯｂＲ又はＡＲ(又は、ＯｂＲ又はＡＲのドメイン)のオープンリーディングフレームをベクター中にクローン化し、それで、ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡと翻訳により融合させることができる。これらのコロニーを精製して、レポーター遺伝子の発現の原因となるライブラリープラスミドを単離する。次いで、ＤＮＡ配列決定法を用いて、該ライブラリープラスミドによりコードされたタンパク質を同定する。
【０１９３】
餌のＯｂ、ＯｂＲ又はＡＲ遺伝子産物と相互作用するタンパク質が検出されるべき細胞株のｃＤＮＡライブラリーを、当分野で日常的に実施されている方法を利用して作成することができる。ここに記載した特定の例により、例えば、ｃＤＮＡ断片をベクター中に挿入し、それで、それらが翻訳によりＧＡＬ４の転写活性化ドメインと融合されるようにすることができる。このライブラリーを、餌のＯｂ、ＯｂＲ又はＡＲ遺伝子−ＧＡＬ４融合プラスミドと共に、ＧＡＬ４活性化配列を含むプロモーターにより駆動されるｌａｃＺ遺伝子を含む酵母株に同時トランスフォームすることができる。餌のＯｂ、ＯｂＲ又はＡＲ遺伝子産物と相互作用するＧＡＬ４転写活性化ドメインに融合されたｃＤＮＡにコードされるタンパク質は、活性なＧＡＬ４たんぱくしつを再構成し、それにより、ＨＩＳ３遺伝子の発現を駆動する。ＨＩＳ３を発現するコロニーは、ヒスチジンを欠く半固体寒天ベースの培地を含むペトリ皿での生育によって検出することができる。次いで、このｃＤＮＡをこれらの株から精製して、餌のＯｂ、ＯｂＲ又はＡＲ遺伝子相互作用性タンパク質を、当分野で日常的に実施されている技術を利用して製造及び単離するために利用することができる。
【０１９４】
５．３．３．ＯｂとＯｂＲとの又はカテコールアミンとＡＲとの巨大分子相互作用に干渉する化合物のアッセイ
Ｏｂ又はＯｂＲ又はカテコールアミン及びＡＲと相互作用する巨大分子は、この考察の目的に関して、「結合パートナー」と呼ばれる。これらの結合パートナーがＯｂＲシグナル変換経路又はアドレナリン作動性シグナル変換経路に関与し、それ故、骨の病気の調節におけるＯｂ又はＯｂＲ又はカテコールアミン又はＡＲの役割に関与することはありそうなことである。それ故、それぞれＯｂＲ又はＡＲの活性の調節において有用でありうるかかる結合パートナーとＯｂ又はカテコールアミンとの相互作用に干渉し又は該相互作用を破壊して、ＯｂＲ又はアドレナリン作動性活性と関連する骨の障害を制御する化合物を同定することは望ましい。
【０１９５】
Ｏｂ又はＯｂＲ、カテコールアミン又はＡＲとこれらのパートナーとの相互作用に干渉する化合物を同定するために用いられるアッセイ系の基礎原理は、反応混合物を調製することを含み、該反応混合物は、上記のようなＯｂ、ＯｂＲ、カテコールアミン又はＡＲタンパク質、ポリペプチド、ペプチド又は融合タンパク質、及び結合パートナーを、これら２者が相互作用して結合し、そうして複合体を形成する条件下で十分な時間含む。化合物を阻害活性について試験するために、反応混合物を試験化合物の存在下及び非存在下で調製する。試験化合物は、最初から反応混合物に含まれていてもよいし、Ｏｂ又はＯｂＲ部分、カテコールアミン又はＡＲ部分及びその各々の結合パートナーの添加の後に加えてもよい。対照用反応混合物は、試験化合物を含まずに又はプラシーボを加えてインキュベートする。次いで、Ｏｂ又はＯｂＲ部分、カテコールアミン及びＡＲ部分と各々の結合パートナーとの間の如何なる複合体の形成をも検出する。対照反応においては複合体が形成されたが、試験化合物を含む反応混合物では形成されなかったならば、これは、その化合物がＯｂ又はＯｂＲ、カテコールアミン又はＡＲと各々の相互作用性結合パートナーとの相互作用に干渉することを示している。或は、試験化合物及び正常なＯｂ又はＯｂＲタンパク質(又は、正常なカテコールアミン又はＡＲタンパク質)を含む反応混合物中での複合体形成は又、試験化合物及び変異型Ｏｂ又はＯｂＲ(又は、変異型カテコールアミン又はＡＲ)を含む反応混合物における複合体形成と比較することもできる。この比較は、変異体の相互作用を破壊するが正常なＯｂ又はＯｂＲ(又は、カテコールアミン又はＡＲ)の相互作用を破壊しない化合物を同定するのが望ましい場合には、重要でありうる。
【０１９６】
Ｏｂ又はＯｂＲ、カテコールアミン又はＡＲ及び結合パートナーの相互作用に干渉する化合物のアッセイを不均質又は均質形式で行うことができる。不均質アッセイは、Ｏｂ又はＯｂＲ部分、カテコールアミン又はＡＲ部分、生成物又は結合パートナーを固相上に繋留し、該固相上に繋留された複合体を反応の最後に検出することを含む。均質アッセイにおいては、全反応を液相中で行う。何れのアプローチにおいても、反応物の添加順序を変更して、試験される化合物についての異なる情報を得ることができる。例えば、相互作用に競争によって干渉する試験化合物を、該試験物質の存在下で反応を行うことにより；即ち、試験物質をＯｂ又はＯｂＲ部分、カテコールアミン又はＡＲ部分及び相互作用性結合パートナーより前に又は同時に反応混合物に加えることにより同定することができる。或は、予備形成された複合体を破壊する試験化合物例えば複合体の成分の一つと置き換わる一層大きい結合定数を有する化合物を、試験化合物を反応混合物に複合体が形成された後に加えることにより試験することができる。様々な形式を以下に記載してある。
【０１９７】
不均質アッセイ系においては、Ｏｂ又はＯｂＲ部分、カテコールアミン又はＡＲ部分又は相互作用性結合パートナーの何れかを、固体表面に繋留する一方、非繋留種を直接又は間接的に標識する。実際には、ミクロ滴定プレートを便利に利用する。繋留される種は、非共有結合又は共有結合によって固定化することができる。非共有結合は、単に固体表面をＯｂ、ＯｂＲ又はＡＲ遺伝子産物又は結合パートナーの溶液でコートして乾燥させることにより達成することができる。或は、繋留すべき種に特異的な固定化抗体を利用して、それらの種を固体表面に繋留することができる。これらの表面を予め調製して貯蔵しておくことができる。
【０１９８】
このアッセイを実施するために、固定化種のパートナーを、試験化合物と共に又は該化合物なしでコートされた表面にさらす。反応が完結した後に、未反応成分を除去し(例えば、洗浄により)、形成された任意の複合体は、固体表面上に固定化されたままとなる。固体表面に繋留された複合体の検出は、多くの方法で達成することができる。非固定化種が予備標識される場合には、表面に固定化された標識の検出は、複合体が形成されたことを示す。非固定化種が予備標識されない場合には、間接標識を利用して、例えば最初固定化されてない種に特異的な標識された抗体を利用して、表面に繋留された複合体を検出することができる(該抗体を、更に、直接標識するか又は標識された抗Ｉｇ抗体を利用して間接的に標識することができる)。反応化合物の添加の順序によって、複合体形成を阻害し又は予備形成された複合体を破壊する試験化合物を検出することができる。
【０１９９】
或は、反応を液相中で、試験化合物の存在下又は非存在下で行って、反応生成物を未反応化合物から分離して、複合体を例えば溶液中で形成された任意の複合体を繋留する結合成分の一つに特異的な固定化抗体、及び繋留された複合体を検出するための他のパートナーに特異的な標識された抗体を利用して検出することができる。再び、液相への反応物の添加の順序によって、複合体を阻害し又は予備形成された複合体を破壊する試験化合物を同定することができる。
【０２００】
この発明の別の具体例において、均質アッセイを利用することができる。このアプローチにおいて、Ｏｂ又はＯｂＲ部分、カテコールアミン又はＡＲ部分及び相互作用性結合パートナーの予備形成された複合体を調製し、該複合体において、Ｏｂ又はＯｂＲ又はその結合パートナーの何れかが標識されるが、該標識により生成されたシグナルは、複合体の形成のために消滅する(例えば、イムノアッセイのためにこのアプローチを利用している米国特許第４，１０９，４９６号を参照されたい)。予備形成された複合体の種の一つと競争して置き換わる試験物質の添加は、バックグラウンドを超えるシグナルの生成を生じる。この方法において、Ｏｂ又はＯｂＲ／細胞内結合パートナー相互作用及び又はカテコールアミン又はＡＲ／細胞内結合パートナー相互作用を破壊する試験物質を同定することができる。
【０２０１】
特定の具体例において、Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲ融合物を、固定化のために調製することができる。例えば、Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲ又はペプチド断片(例えば、ＯｂＲ ＣＤに対応するもの)を、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)遺伝子に、融合ベクター例えばｐＧＥＸ−５Ｘ−１を利用して、その結合活性が生成した融合タンパク質において保持されるような仕方で融合させることができる。この相互作用性結合パートナーを精製して、モノクローナル抗体を当分野で日常的に実施される方法を利用して産するために利用することができる。この抗体を、放射性同位体125Ｉを利用して、例えば当分野で日常的に実施されている方法によって標識することができる。不均質アッセイにおいて、例えば、ＧＳＴ−ＯｂＲ融合タンパク質(又は、ＧＳＴ−ＡＲ融合タンパク質)を、グルタチオン−アガロースビーズに繋留させることができる。この相互作用性結合パートナーを、次いで、試験化合物の存在下又は非存在下で、相互作用及び結合が起こるような仕方で加えることができる。反応期間の最後に、未結合の物質を洗い去り、標識されたモノクローナル抗体をこの系に加えて、複合体化した成分に結合させることができる。Ｏｂ又はＯｂＲ遺伝子産物(又は、カテコールアミン又はＡＲ遺伝子産物)と相互作用性結合パートナーとの間の相互作用を、グルタチオン−アガロースビーズと結合して残っている放射能の量を測定することによって検出することができる。この相互作用の試験化合物による上首尾の阻害は、測定される放射能の減少を生じる。
【０２０２】
或は、ＧＳＴ−Ｏｂ／ＯｂＲ融合タンパク質と相互作用性結合パートナーを液体中で、固体のグルタチオン−アガロースビーズの非存在下で一緒に混合することができる。これらの種を相互作用させる際に又はその後に、試験化合物を加えることができる。この混合物を、その後、グルタチオン−アガロースビーズに加えることができ、未結合物質を洗い去る。再び、Ｏｂ又はＯｂＲ／結合パートナー相互作用の阻害の程度を、標識抗体を加えてビーズと結合した放射能を測定することによって検出することができる。
【０２０３】
この発明の他の具体例において、これらの同じ技術を、Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲ及び／又は相互作用性又は結合性パートナーの結合ドメインに対応するペプチド断片を、完全長タンパク質の一方又は両方の代わりに利用して(結合パートナーがタンパク質の場合)用いることができる。当分野で日常的に実施されている任意の数の方法を利用して、結合部位を同定して単離することができる。これらの方法は、これらのタンパク質の一つをコードする遺伝子の突然変異誘発及び同時免疫沈降アッセイにおける結合の破壊のスクリーニングを含むが、これらに限られない。次いで、複合体中の第２の種をコードする遺伝子の補償変異を選択することができる。それぞれのタンパク質をコードする遺伝子の配列分析は、相互作用性結合に関与するタンパク質の領域に対応する突然変異を明らかにする。或は、一つのタンパク質は、固体表面に、上記の方法を利用して繋留されていてよく、その標識された結合パートナーと相互作用してそれに結合できる(該結合パートナーは、タンパク質分解酵素例えばトリプシンで処理されている)。洗浄後、結合ドメインを含む短い標識されたペプチドは、固体物質と結合したままでいてよく、該ペプチドを単離してアミノ酸配列決定により同定することができる。又、一度細胞内結合パートナーをコードする遺伝子が得られれば、短い遺伝子セグメントを加工して、該タンパク質のペプチド断片を発現させることができ、次いで、それを結合活性について試験し、精製又は合成することができる。
【０２０４】
例であって、制限ではないが、Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲ遺伝子産物を上記のような固体物質に、ＧＳＴ−Ｏｂ、−ＯｂＲ又は、−ＡＲ融合タンパク質を作成してそれをグルタチオンアガロースビーズに結合させることにより繋留することができる。この相互作用性結合パートナーを、放射性同位元素例えば35Ｓで標識して、タンパク質分解酵素例えばトリプシンで開裂させることができる。開裂生成物を、次いで、繋留されたＧＳＴ−Ｏｂ、−ＯｂＲ、又は−ＡＲ融合タンパク質に加えて結合させることができる。未結合ペプチドを洗い去った後に、細胞内結合パートナーの結合ドメインを表す標識された結合した物質を溶出させ、周知の方法によってアミノ酸配列について分析することができる。そのように同定されたペプチドを合成により生成し又は適当な促進性タンパク質に組換えＤＮＡ技術を利用して融合させることができる。
【０２０５】
５．３．４．骨の病気を改善させる化合物の同定のためのアッセイ
上記の第５．３．１〜５．３．３に記載したようなアッセイ技術によって同定された化合物を含む化合物(これらに限らない)を、能力について試験することができる。上記のアッセイは、Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲ活性に影響を与える化合物(例えば、レプチンレセプター又はアドレナリン作動性アゴニスト又はアンタゴニスト)及びＯｂＲ又はＡＲの天然リガンドに結合する化合物；又はＯｂ、ＯｂＲ若しくはＡＲ遺伝子活性に影響を与える(Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲ遺伝子発現に影響を与えること、スプライシング事象に影響を及ぼし又は干渉し、それで、完全長の又は切り詰められた形態のＯｂ、ＯｂＲ又はＡＲの発現を調節する分子例えばタンパク質又は小型有機分子を含むことによって)化合物を同定することができる。しかしながら、これらの記載したアッセイは、Ｏｂ、ＯｂＲ又はアドレナリン作動性シグナル変換を調節する化合物(例えば、下流のシグナリング事象に影響する化合物例えばＯｂのＯｂＲへの結合により活性化されたシグナルの変換に関与するチロシンキナーゼ又はホスファターゼ活性のインヒビター又はエンハンサー)をも同定することができるということに注意すべきである。或は、これらの記載したアッセイは又、Ｏｂが血液−脳関門を通過して入ることを調節する化合物をも同定することができる。Ｏｂ又はＯｂＲ遺伝子及び／又は遺伝子産物が関与し、これに影響を与えることにより同経路は骨の障害の発生に対するＯｂ又はＯｂＲの効果を調節することができるＯｂ又はＯｂＲシグナル変換経路における他のステップに影響するような化合物の同定及び利用は、この発明の範囲内にある。同様に、ＡＲ遺伝子及び／又は遺伝子産物が関与し、これに影響を与えることにより同経路は骨の障害の発生に対するカテコールアミン又はＡＲの効果を調節することができるアドレナリン作動性シグナル変換経路内の他のステップに影響を及ぼす、かかる化合物の同定及び利用は、この発明の範囲内にある。かかる化合物は、骨の病気の治療方法の部分として利用することができる。
【０２０６】
細胞ベースの系を利用して、骨の病気を改善させるように作用しうる化合物を同定することができる。かかる細胞系は、例えば、Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲ遺伝子を発現する組換えの細胞又は非組換えの細胞例えば細胞株例えばＮＩＨ３Ｔ３Ｌ１細胞株を含むことができる。更に、例えば、ＯｂＲについて、脈絡膜叢細胞、視床下部細胞、又は脈絡膜叢細胞若しくは視床下部に由来する細胞株を利用することができる。加えて、機能的Ｏｂ又はＯｂＲを発現して、天然のＯｂリガンドによる活性化に応答するように{例えば、化学的変化若しくは表現型変化、他の宿主細胞遺伝子の誘導、イオンフラックス(例えば、Ｃａ++)の変化、宿主細胞タンパク質のチロシンリン酸化などにより測定して}遺伝子工学処理された発現宿主細胞(例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、繊維芽細胞)をこのアッセイにおいて終点として利用することができる。
【０２０７】
かかる細胞系の利用において、細胞を、骨の障害を改善する能力を示すことが疑われる化合物に、かかる骨の障害の改善を誘出するのに十分な濃度及び時間でさらすことができる。さらした後に、これらの細胞をアッセイして、Ｏｂ又はＯｂＲ遺伝子の発現の変化を例えば細胞溶解物をＯｂ、ＯｂＲ又はＡＲｍＲＮＡ転写物について(例えば、ノーザン分析により)又は該細胞において発現されたＯｂ、ＯｂＲ若しくはＡＲタンパク質についてアッセイすることにより測定することができ；Ｏｂ、ＯｂＲ又はＡＲ遺伝子の発現を調節し又は変調する化合物は、治療剤の優れた候補である。或は、これらの細胞は、少なくとも一種の骨障害様細胞表現型が、一層正常な又は一層野生型の骨障害でない表現型、又は一層低い発病率若しくは一層軽い障害の症状を生じることが一層ありそうな表現型を真似るように変化したかどうかを測定するために試験される。尚更に、ＯｂＲ又はＡＲがその一部であるシグナル変換経路の成分の発現及び／又は活性、又はＯｂＲシグナル変換経路及び／又はアドレナリン作動性シグナル変換経路自身の活性をアッセイすることができる。
【０２０８】
例えば、さらした後に、細胞溶解物を、宿主細胞タンパク質のチロシンリン酸化の存在について、さらしてない対照用細胞由来の溶解物と比較してアッセイすることができる。試験化合物の、これらのアッセイ系において宿主細胞タンパク質のチロシンリン酸化を阻害する能力は、該試験化合物がＯｂＲ活性化により示されるシグナル変換を阻害することを示す。これらの細胞溶解物は、ウエスタンブロット形式を利用して容易にアッセイすることができる；即ち、宿主細胞タンパク質をゲル電気泳動により分離し、トランスファーして、抗ホスホチロシン検出用抗体(例えば、シグナルを生成する化合物例えば放射性標識、蛍光、酵素などで標識した抗ホスホチロシン抗体)を利用してプローブ検出する(例えば、Glenney等、1988, J.Immunol.Methods 109:277-285；Frackelton等、1983, Mol.Cell.Biol.3:1343-1352を参照されたい)。或は、ＯｂＲシグナル変換経路に関与する特定の宿主細胞タンパク質を、標的宿主細胞タンパク質に特異的な繋留させる抗体を利用して固定化して、該固定化細胞タンパク質におけるリン酸化チロシンの存否を標識した抗ホスホチロシン抗体を利用して検出するＥＬＩＳＡ形式を利用することができる(例えば、King等、1993, Life Science 53:1465-1472を参照されたい)。更に別のアプローチにおいて、イオンフラックス例えばカルシウムイオンフラックスを、ＯｂＲ刺激されたシグナル変換の終点として測定することができる。
【０２０９】
加えて、例えばｏｂ、ｄｂ及びｏｂ／ｄｂマウスを含みうる動物ベースの骨障害系は、骨障害様症状を改善することのできる化合物を同定するために利用することができる。かかる動物モデルは、かかる障害の治療において有効でありうる薬物、医薬、治療及び介入の同定のために試験基質として利用することができる。例えば、動物モデルは、骨障害の症状を改善する能力を示すことが疑われる化合物に、さらされた動物のかかる骨障害症状の改善を誘出するのに十分な濃度及び十分な時間でさらすことができる。これらの動物の曝露に対する応答は、骨障害と関連する障害例えば骨粗鬆症の逆転を評価することによってモニターすることができる。介入に関しては、骨障害様症状の任意の面を逆転させる任意の治療は、ヒトの骨障害の治療的介入の候補と考えるべきである。試験薬剤の投薬量は、下記のように、投与量応答曲線を得ることによって決定することができる。
【０２１０】
５．４．Ｏｂ又はＯｂＲ発現又は活性を調節する化合物
Ｏｂ又はＯｂＲと相互作用する(例えば、結合する)化合物(ＯｂＲのＥＣＤ又はＣＤを含むが、これらに限られない)、Ｏｂ又はＯｂＲと相互作用する細胞内タンパク質と相互作用する(例えば、結合する)化合物(ＯｂＲのＴＭ及びＣＤを含むが、これらに限られない)、Ｏｂ又はＯｂＲの、ＯｂＲ媒介によるシグナル変換に関与する膜貫通又は細胞内タンパク質との相互作用に干渉する化合物、及びＯｂ若しくはＯｂＲ遺伝子発現の活性を調節し又はＯｂ若しくはＯｂＲのレベルを調節する化合物は、骨量のレベルを調節することができる。一層特に、Ｏｂ又はＯｂＲのレベルを減少させ、Ｏｂの血液−脳関門を横切る輸送を阻害し又はＯｂのＯｂＲへの結合を阻害する化合物は、骨量の増大を引き起こす。
【０２１１】
かかる化合物の例は、レプチン及びレプチンレセプターアゴニスト及びアンタゴニストである。レプチンレセプターアンタゴニストは、ここで用いる場合、レプチンレセプターの作用又は効果を中和し又は妨げ或は減少させる因子をいう。かかるアンタゴニストは、レプチンに結合し又はレプチンレセプターに結合する化合物を含むことができる。かかるアンタゴニストは又、レプチンレセプターの出力(即ち、レプチンのレプチンレセプターへの結合後のレプチンシグナリング経路における細胞内ステップ、即ち、レセプター／リガンド相互作用レベルでは起きないレプチン／レプチンレセプターシグナリングに影響を与える下流事象)を中和し、妨げ或は減少させる化合物をも含むことができる。レプチンレセプターアンタゴニストは、タンパク質、抗体、小型有機分子又は炭水化物例えばアセチルフェノール化合物、レプチンに特異的に結合する抗体、レプチンレセプターに特異的に結合する抗体、及び可溶性レプチンレセプターポリペプチド配列を含む化合物を含むことができるが、これらに限られない。
【０２１２】
例えば、レプチンアンタゴニストは又、レプチンのレセプター又はその細胞外ドメインへの結合を減少させ、阻害し、ブロックし、排除し又は該結合に干渉する薬剤又は薬物；レプチンの産生又は活性化を減少させ、阻害し、ブロックし、排除し又は該産生又は活性化に干渉する薬剤;レプチン産生又は合成を引き出すシグナルのアンタゴニストである薬剤及びレプチンがレセプターに達するのを妨げる(例えば、レプチンが血液−脳関門を横切るのを妨げる)薬剤をも包含する。かかる薬剤は、レプチンのそのレセプターとの相互作用又はレプチン産生を阻害し又は妨げる任意の有機分子であってよい(例えば、米国特許第５，８６６，５４７号参照)。レプチンアンタゴニストには、抗レプチン抗体、レプチンと特異的に結合して、レプチンが同起源のレセプターと結合するのを妨げるレセプター分子及び誘導体が含まれるが、これらに限られない。
【０２１３】
レプチンレセプターアゴニストは、ここで用いる場合、レプチンレセプターの作用又は効果を活性化し、誘導し或は増大させる因子をいう。かかるアゴニストは、レプチンに結合し又はレプチンレセプターに結合する化合物を包含することができる。かかるアゴニストは又、レプチンレセプターの出力(即ち、レプチンのレプチンレセプターへの結合後のレプチンシグナリング経路における細胞内ステップ、即ち、レセプター／リガンド相互作用レベルでは起きないレプチン／レプチンレセプターシグナリングに影響する下流事象)を活性化し、誘導し或は増大させる化合物をも包含することができる。レプチンレセプターアゴニストは、タンパク質、抗体、小型有機分子又は炭水化物例えばレプチン、レプチン類似体、及びレプチンに特異的に結合して活性化する抗体を包含することができるが、これらに限られない。
【０２１４】
更なるＯｂ結合タンパク質は、インター−アルファ−トリプシンインヒビター重鎖関連タンパク質(ＩＨＲＰ)；アルファ２−マクログロブリン；及びＯＢ−ＢＰ１{Ｏｂに特異的に結合し、そうして、ＯｂのＯｂＲへの結合を妨げることができる}を包含するが、これらに限られない。この特異的なＯｂ結合性タンパク質は、更に、遊離のＯｂのレベルの調節、結合した／遊離のレプチンの固定化及びアッセイを可能にする(例えば、米国特許第５，９１９，９０２号；Birkenmeier等、1998, Eur.J.Endocrin., 139:224-230；Patel等、1999, J.Biol.Chem., 32:22729-22738参照)。更なるＯｂ結合性タンパク質例えばアポリポタンパク質は、米国特許第５，８３０，４５０号に記載されている。
【０２１５】
ＯｂＲアンタゴニストの例は、アセチルフェノールであり、これは、抗肥満及び抗糖尿病化合物として有用であることが知られている。アセチルフェノールは、ＯｂＲのアンタゴニストであるので、それらは、ＯｂのＯｂＲへの結合を妨げる。そうして、本発明の教示の故に、これらの化合物は、有効に骨量の増大を引き起こす。ＯｂＲアンタゴニストとして利用することのできるアセチルフェノールの特異的構造に関しては、米国特許第５，８５９，０５１号を参照されたい。
【０２１６】
骨障害の診断、薬物スクリーニング、モニター及び／又は治療のための臨床的試みのために利用することのできるＯｂＲの更なるアンタゴニスト及びアゴニスト、及びＯｂＲ遺伝子発現又はＯｂＲ活性を調節する他の化合物は、米国特許第５，９７２，６２１号；５８７４，５３５号；及び５，９１２，１２３号に見出すことができる。
【０２１７】
５．５．カテコールアミン又はアドレナリン作動性レセプターの発現又は活性を調節する化合物
カテコールアミン又はアドレナリン作動性レセプターと相互作用する(例えば、結合する)化合物(アドレナリン作動性レセプターのＥＣＤ又はＣＤを含むが、これらに限られない)、カテコールアミン又はアドレナリン作動性レセプターと相互作用する細胞内タンパク質と相互作用する(例えば、結合する)化合物(アドレナリン作動性レセプターのＴＭ及びＣＤを含むが、これらに限られない)、カテコールアミン又はＡＲの、アドレナリン作動性レセプター媒介によるシグナル変換に関与する膜貫通又は細胞内タンパク質との相互作用に干渉する化合物、及び カテコールアミン又はアドレナリン作動性レセプター遺伝子の発現の活性を調節し又はカテコールアミン若しくはアドレナリン作動性レセプターのレベルを調節する化合物は、骨量のレベルを調節することができる。一層特に、カテコールアミン若しくはアドレナリン作動性レセプターのレベルを減少させ又はカテコールアミンのアドレナリン作動性レセプターへの結合を阻害する化合物は、骨量の増大を引き起こす。
【０２１８】
かかる化合物の例は、カテコールアミン及びアドレナリン作動性レセプターアゴニスト及びアンタゴニストである。アドレナリン作動性アンタゴニストは、ここで用いる場合、アドレナリン作動性レセプターの作用又は効果を中和し又は妨げ或は減少させる因子をいう。かかるアンタゴニストには、カテコールアミンと結合し又はアドレナリン作動性レセプターと結合する化合物が含まれうる。かかるアンタゴニストは又、カテコールアミンレセプターの出力(即ち、カテコールアミンのアドレナリン作動性レセプターへの結合後のアドレナリン作動性シグナリング経路内の細胞内ステップ、即ち、レセプター／リガンド相互作用レベルでは起こらない、アドレナリン作動性シグナリングに影響する下流事象)を中和し、妨げ或は減少させる化合物をも包含しうる。アドレナリン作動性アンタゴニストは、タンパク質、抗体、小型有機分子又は炭水化物例えば、アドレナリン作動性レセプターに特異的に結合する抗体及び可溶性アドレナリン作動性レセプターポリペプチド配列を含む化合物を包含しうるが、これらに限られない。
【０２１９】
カテコールアミンは、カテコール、１，２−ジヒドロキシベンゼンのアミン含有誘導体であり、例えば、ノルエピネフリン及びそのメチル誘導体のエピネフリンがあるが、これらに限られない。ノルエピネフリンは、アドレナリン作動性神経の終末により産生されるが、エピネフリンは副腎髄質によって生成される。
【０２２０】
米国特許第６，３１３，１７２号の背景節(参考として、そっくりそのまま本明細書中に援用する)に記載されたように、ヒトのアドレナリン作動性レセプターは、完全な膜タンパク質であり、２つの広いクラス、アルファ及びベータアドレナリン作動性レセプターに分類されている。両型は、カテコールアミノ結合に際して、末梢交感神経系の作用を媒介する。アドレナリン作動性レセプターの、これらの化合物に対する結合親和性は、分類の一つの基礎を形成し：アルファレセプターは、エピネフリンより一層強くノルエピネフリンに結合する傾向があり、合成化合物のイソプロテレノールよりずっと強く結合する傾向がある。これらのホルモンの好適な結合親和性は、ベータレセプターについては逆になる。多くの組織において、レセプターの活性化により誘導される機能的応答例えば平滑筋収縮は、ベータレセプター結合により誘導される応答と逆である。
【０２２１】
その後、アルファ及びベータレセプター間の機能的差異は、様々な動物及び組織起源に由来するこれらのレセプターの薬理学的特性決定により、更に強調され、詳細なものとなった。結果として、アルファ及びベータアドレナリン作動性レセプターは、更に、α1及びα2並びにβ1、β2及びβ3サブタイプに細分された。
【０２２２】
例えば、βアドレナリン作動性アンタゴニストは、エスモロール、メトプロロール、アテノロール又はアセブトロールを含むが、これらに限られない(例えば、米国特許第６，３０３，５７３号を参照されたい。該特許を参考としてそっくりそのまま、本明細書中に援用する)。アドレナリン作動性アンタゴニストとして有用な他の薬剤には、(ｉ)アルファアドレナリン作動性レセプターに結合する交感神経ブロッキング剤及び(ii)伝達物質を涸渇させる薬剤が含まれるが、これらに限られない。ブロッキング剤は、可逆的アルファレセプターアンタゴニスト例えばフェントラミン、トラゾリン、プラゾシン、テルゾシン、ドキサゾシン、トリマゾシン及びインドラミン又は不可逆的アルファレセプターアンタゴニスト例えばフェノキシベンザミン又はジベンザミンであってよい。伝達物質の涸渇剤である薬剤には、グアネチジン、グアナドレル、レセルピン又はメチロシンが含まれる(例えば、米国特許第６，００９，８７５号を参照されたい。該特許を参考としてそっくりそのまま、本明細書中に援用する)。
【０２２３】
アドレナリン作動性アゴニストは、ここで用いる場合、アドレナリン作動性レセプターの作用又は効果を活性化し、誘導し或は増大させる因子をいう。かかるアゴニストは、カテコールアミンに結合するか又はアドレナリン作動性レセプターに結合する化合物を含むことができる。かかるアゴニストは、アドレナリン作動性レセプターの出力(即ち、カテコールアミンのアドレナリン作動性レセプターへの結合後のアドレナリン作動性シグナリング経路内の細胞内ステップ、即ち、レセプター／リガンド相互作用のレベルでは起きない、アドレナリン作動性シグナリングに影響する下流事象)を活性化し、誘導し或は増大させる化合物をも含むことができる。アドレナリン作動性アゴニストは、タンパク質、抗体、小型有機分子又は炭水化物例えばカテコールアミン及びカテコールアミン類似体を含むことができるが、これらに限られない。βアドレナリン作動性アゴニストの例には、イソプロテレノール、ドーパミン、及びドブタミンが含まれるが、これらに限られない(例えば、米国特許第５，７１３，３６７号を参照されたい。該特許を参考として、そっくりそのまま本明細書中に援用する)。
【０２２４】
５．６．ＮＰＹ又はＮＰＹ−Ｒの発現又は活性を調節する化合物
本発明は又、ＮＰＹ及びＮＰＹレセプターアゴニスト及びアンタゴニストの、骨に対するレプチンの効果及び／又は交感神経活動状態を調節するための、単独での又はここに記載の他のモジュレーターと組み合わせての利用をも提供する。
【０２２５】
ＮＰＹ又はＮＰＹ−Ｒと相互作用する(例えば、結合する)化合物(ＮＰＹ−ＲのＥＣＤ又はＣＤを含むが、これらに限られない)、ＮＰＹ又はＮＰＹ−Ｒと相互作用する細胞内タンパク質と相互作用する(例えば、結合する)化合物(ＮＰＹ−ＲのＴＭ及びＣＤを含むが、これらに限られない)、ＮＰＹ又はＮＰＹ−Ｒの、ＮＰＹ−Ｒ媒介によるシグナル変換に関与する膜貫通又は細胞内タンパク質との相互作用に干渉する化合物、及びＮＰＹ又はＮＰＹ−Ｒ遺伝子発現の活性を調節し又はＮＰＹ若しくはＮＰＹ−Ｒのレベルを調節する化合物は、骨量のレベルを調節することができる。一層特に、ＮＰＹ又はＮＰＹ−Ｒのレベルを減少させ、ＮＰＹの血液−脳関門を横切る輸送を阻害し又はＮＰＹのＮＰＹ−Ｒへの結合を阻害する化合物は、骨量の増大を引き起こす。
【０２２６】
かかる化合物の例は、ＮＰＹ及びＮＰＹ−Ｒアゴニスト及びアンタゴニストである。ＮＰＹレセプターアンタゴニストは、ここで用いる場合、ＮＰＹレセプターの作用又は効果を中和し、妨げ、或は減少させる因子をいう。かかるアンタゴニストは、ＮＰＹに結合し又はＮＰＹレセプターに結合する化合物を含む。かかるアンタゴニストは又、ＮＰＹレセプター出力(ＮＰＹのＮＰＹレセプターへの結合後のＮＰＹシグナリング経路における細胞内ステップ、即ち、レセプター／リガンド相互作用レベルでは起きないＮＰＹ／ＮＰＹレセプターシグナリング影響する下流事象)を中和し、妨げ、或は減少させる化合物をも含む。ＮＰＹレセプターアンタゴニストは、タンパク質、抗体、小型有機分子又は炭水化物例えばアセチルフェノール化合物、ＮＰＹに特異的に結合する抗体、ＮＰＹレセプターに特異的に結合する抗体、及び可溶性ＮＰＹレセプターポリペプチド配列を含む化合物を含みうるが、これらに限られない。
【０２２７】
例えば、ＮＰＹアンタゴニストは又、ＮＰＹのレセプター又はその細胞外ドメインへの結合を減少させ、阻害し、ブロックし、排除し又は該結合に干渉する薬剤又は薬物；ＮＰＹの産生又は活性化を減少させ、阻害し、ブロックし、排除し又は該産生又は活性化に干渉する薬剤；ＮＰＹの産生又は合成を駆動するシグナルのアンタゴニストである薬剤及びＮＰＹがそのレセプターに到達するのを妨げる(例えば、ＮＰＹが血液−脳関門を横切るのを妨げる)薬剤をも包含する。かかる薬剤は、ＮＰＹとそのレセプターとの相互作用又はＮＰＹ産生を阻害し又は妨げる任意の有機分子であってよい。
【０２２８】
ＮＰＹレセプターアゴニストは、ここで用いる場合、ＮＰＹレセプターの作用又は効果を活性化し、誘導し、或は増大させる因子をいう。かかるアゴニストは、ＮＰＹに結合し又はＮＰＹレセプターに結合する化合物を含むことができる。更なるＮＰＹアゴニスト及び類似体は、米国特許第５，３２８，８９９号に記載されたものを含む。かかるアゴニストは又、ＮＰＹレセプターの出力(即ち、ＮＰＹのＮＰＹレセプターへの結合後のＮＰＹシグナリング経路における細胞内ステップ、即ち、レセプター／リガンド相互作用レベルでは起きないＮＰＹ／ＮＰＹレセプターシグナリングに影響する下流事象)を活性化し、誘導し或は増大させる化合物をも包含することができる。ＮＰＹレセプターアゴニストは、タンパク質、抗体、小型有機分子又は炭水化物例えばＮＰＹ、ＮＰＹ類似体、及びＮＰＹに特異的に結合して活性化する抗体を包含しうるが、これらに限られない。
【０２２９】
多くのＮＰＹアンタゴニストが記載されている。例えば、米国特許第５，９７２，８８８号は、ＮＰＹアンタゴニストとして作用する様々な化合物を記載しており、ナフタレン、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン及びインドールの誘導体；ラロキシフェン；３−(４−メトキシフェニル)−４−[４−(２−ピロリディン−１−イルエトキシ)ベンゾイル−１，２−ジヒドロナフタレン、シトレート塩；３−フェニル−４−[４−(２−ピロリディン−１−イルエトキシ)ベンゾイル]−７−メトキシ−１，２−ジヒドロナフタレン；３−フェニル−４−[４−(２−ピロリディン−１−イルエトキシ)ベンゾイル]−１，２−ジヒドロナフタレン；１−[４−(２−ピロリディン−１−イルエトキシ)ベンゾイル]−２−フェニルナフタレン、シトレート塩；３−(４−メトキシフェニル)−４−[４−[２−(ピペリジン−１−イル)エトキシ]ベンゾイル]−１，２−ジヒドロナフタレン、シトレート塩；３−(４−メトキシフェニル)−４−[４−(２−ジメチルアミノエトキシ)ベンゾイル]−１，２−ジヒドロナフタレン、シトレート塩；３−(４−ヒドロキシフェニル)−４−[４−[２−(ピロリディン−１−イル)エトキシ]ベンゾイル]−１，２−ジヒドロナフタレン、メシレート、塩；３−(４−メトキシフェニル)−４−[４−[２−(ヘキサメチレンイミン−１−イル)ベンゾイル]−１，２−ジヒドロナフタレン、メシレート塩；３−(４−メトキシフェニル)−４−[４−[２−(ピペリジン−１−イル)エトキシ]ベンゾイル]−１，２−ジヒドロナフタレン、メシレート塩；３−(４−メトキシフェニル)−４−(４−ジエチルアミノエトキシベンゾイル)−１，２−ジヒドロナフタレン、メシレート塩；３−(４−メトキシフェニル)−４−(４−ジイソプロピルアミノエトキシベンゾイル)−１，２−ジヒドロナフタレン、メシレート塩；３−ヒドロキシ−４−[４−[２−(ピロリディン−１−イル)エトキシ]ベンゾイル]−１，２−ジヒドロナフタレン、ナトリウム塩；２−(４−メトキシフェニル)−１−[４−[２−(ピロリディン−１−イル)エトキシ]ベンゾイル]ナフタレン、メシレート塩；３−(４−メトキシフェニル)−４−[４−[２−(ピペリジン−１−イル)エトキシ]ベンゾイル]−７−メトキシ−１，２−ジヒドロナフタレン、メシレート塩；３−(４−メトキシフェニル)−４−[４−(２−ジメチルアミノエトキシ)ベンゾイル]−１，２−ジヒドロナフタレン、２−ヒドロキシ−１，２，３−プロパントリカルボン酸塩；３−(４−メトキシフェニル)−４−[４−[２−(Ｎ−メチル−１−ピロリディニウム)エトキシ]ベンゾイル]−１，２−ジヒドロナフタレン、ヨウ化物塩；及び３−(４−メトキシフェニル)−４−[４−[２−(ピロリディン−１−イル)エトキシ]ベンゾイル]−１，２−ジヒドロナフタレン、メシレート塩を含むが、これらに限られない。
【０２３０】
同様に、多くのＮＰＹ−Ｒアンタゴニストが同定されている。かかるアンタゴニストの例には、α−アルコキシ及びα−チオアルコキシアミド組成物(例えば、米国特許第５，９３９，４６２号参照)；ジヒドロピリジンベースの化合物(例えば、米国特許第５，５５４，６２１号、６，００１，８３６号、５，６６８，１５１号及び５，６３５，５０３号参照)；置換されたベンジルアミン誘導体(例えば、米国特許第５，９８５，８７３号、５，９６２，４５５号及び５，９００，４１５号参照)；ジヒドロピリミドン誘導体(例えば、米国特許第５，８８９，０１６号)；ナフトイミダゾリル誘導体(例えば、米国特許第５，７７６，９３１号)；ジメシレート塩(例えば、米国特許第５，９１４，３２９号参照)；及び置換されたベンゾフラン、ベンゾチオフェン又はインドール(例えば、米国特許第５，６６３，１９２号参照)が含まれるが、これらに限られない。更なるＮＰＹ−Ｒアンタゴニストは、米国特許第５，５６７，７１４号、５，５０４，０９４号、５，６７０，４８２号、５，９８９，９２０号、及び５，８２７，８５３号、５，９８５，６１６号に開示されている。
【０２３１】
５．７．ＣＮＴＦ又はＣＮＴＦレセプターの発現又は活性を調節する化合物
本発明は又、ＣＮＴＦ及びＣＮＴＦレセプターのアゴニスト及びアンタゴニストの、骨に対するレプチンの効果及び／又は交感神経活動状態を調節するための、単独での又はここに記載の他のモジュレーターと組み合わせての利用をも提供する。
【０２３２】
ＣＮＴＦ又はＣＮＴＦレセプターと相互作用する(例えば、結合する)化合物(ＣＮＴＦレセプターポリペプチドのＥＣＤ又はＣＤを含むが、これらに限られない)、ＣＮＴＦ又はＣＮＴＦレセプターと相互作用する細胞内タンパク質と相互作用する(例えば、結合する)化合物(ＣＮＴＦレセプターポリペプチドのＴＭ及びＣＤを含むが、これらに限られない)、ＣＮＴＦ又はＣＮＴＦレセプターの、ＣＮＴＦレセプター媒介によるシグナル変換に関与する膜貫通又は細胞内タンパク質との相互作用に干渉する化合物、及びＣＮＴＦ若しくはＣＮＴＦレセプター遺伝子発現の活性を調節し又はＣＮＴＦ若しくはＣＮＴＦレセプターのレベルを調節する化合物は、骨量のレベルを調節することができる。一層特に、ＣＮＴＦ若しくはＣＮＴＦレセプターのレベルを減少させ又はＣＮＴＦのＣＮＴＦレセプターへの結合を阻害する化合物は、骨量の増大を引き起こす。
【０２３３】
かかる化合物の例は、ＣＮＴＦ及びＣＮＴＦレセプターのアゴニスト及びアンタゴニストである。ＣＮＦＴレセプターアンタゴニストは、ここで用いる場合は、ＣＮＴＦレセプターの作用又は効果を中和し又は妨げ或は減少させる因子をいう。かかるアンタゴニストは、ＣＮＴＦに結合し又はＣＮＴＦレセプターに結合する化合物を含むことができる。かかるアンタゴニストは又、ＣＮＴＦレセプターの出力(即ち、ＣＮＴＦのＣＮＴＦレセプターへの結合後のＣＮＴＦシグナリング経路内の細胞内ステップ、即ち、レセプター／リガンド相互作用レベルでは起きないＣＮＴＦ／ＣＮＴＦレセプターシグナリングに影響する下流事象)を中和し、妨げ、或は減少させる化合物をも含むことができる。ＣＮＴＦレセプターアンタゴニストは、タンパク質、抗体、小型有機分子又は炭水化物例えば変異型ＣＮＴＦ分子(Ｆ１５２Ｓ変異型ＣＮＴＦ又はＫ１５５Ａ変異型ＣＮＴＦを含む)、ＣＮＴＦに特異的に結合する抗体、ＣＮＴＦレセプターに特異的に結合する抗体及び可溶性ＣＮＴＦレセプターポリペプチド配列を含む化合物を含むことができるが、これらに限られない。
【０２３４】
例えば、ＣＮＴＦレセプターアンタゴニストは又、ＣＮＴＦのレセプター又はその細胞外ドメインへの結合を減少させ、阻害し、ブロックし、排除し又は該結合に干渉する薬剤又は薬物；ＣＮＴＦの産生若しくは活性化を減少させ、阻害し、ブロックし、排除し又は該産生若しくは活性化に干渉する薬剤；ＣＮＴＦの産生若しくは合成を駆動するシグナルのアンタゴニストである薬剤、及びＣＮＴＦがそのレセプターに到達するのを妨げる薬剤を含むこともできる。かかる薬剤は、ＣＮＴＦとそのレセプターとの相互作用又はＣＮＴＦの産生を阻害し又は妨げる任意の有機分子であってよい。
【０２３５】
ＣＮＴＦレセプターのアンタゴニストは又、ＣＮＴＦレセプター機能に干渉する変異型ＣＮＴＦ分子をも包含する(例えば、米国特許第５，８４６，９３５号参照)。例えば、ＣＮＴＦの一次配列の１５５位のリジン残基の変異は、一種のＣＮＴＦアンタゴニストを産生した(例えば、Inoue等、1997, J.Neurochem.69:95-101；DiMarco等、1996, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:9247-52参照)。米国特許第５，７２３，１２０号は、アミノ酸１５４〜１６３の領域に変異を有するＣＮＴＦ分子を請求している。ＣＮＴＦレセプターアンタゴニストは又、抗ＣＮＴＦ抗体、レセプター分子及びＣＮＴＦに特異的に結合してＣＮＴＦが同起源のレセプターに結合するのを妨げる誘導体をも包含する。
【０２３６】
ＣＮＴＦレセプターのアンタゴニストは、ＣＮＴＦレセプター機能をも阻害するＩＬ−６レセプター機能のアンタゴニスト例えばＧＭ−ＣＳＦの構造に基づくｇｐ１３０インヒビター及び／又はＩＬ−６の構造に基づくｇｐ１３０インヒビターを包含する(例えば、米国特許第５，９１４，１０６号;５，８９１，９９８号；５，８４９，２８３号；５，７８９，５５２号；５，５９１，８２７号；及び５，７２３，１２０号参照)。ＣＮＴＦレセプターのアンタゴニストは、ＣＮＴＦレセプターポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む(例えば、米国特許第５，７４７，４７０号；５，６７４，９９５号；及び５，７４７，４７０号参照)。他のアンタゴニストは、ＣＮＴＦレセプターポリペプチドの可溶性ドメイン又は細胞外ドメインに由来するものを包含する(米国特許第５，８４４，０９９号、米国特許第５，４７０，９５２号参照)。最後に、これらのアンタゴニストは、ＣＮＴＦレセプターポリペプチドに対する抗体を含む(例えば、米国特許第５，８９２，００３号；第５，８６６，６８９号；及び第５，７１７，０７３号参照)。
【０２３７】
ＣＮＴＦレセプターアンタゴニストは又、ＣＮＴＦ活性化の下流のシグナリングカスケードを阻害する化合物をも包含する(ＣＮＴＦの活性に影響を与える)。例えば、ラパマイシン(セリンキナーゼｍＴＯＲのインヒビター)も又、ＣＮＴＦ誘導されたＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害する(Yokogami等、2000, Current Biology 10:47-50参照)。ＳＯＣＳ−３は、ＣＮＴＦシグナル変換の負のレギュレーターである。セリン／スレオニンキナーゼインヒビターＨ７は、ＣＮＴＦにより誘導されるＣｙＲＥ媒介の転写を阻害する(Symes等、1997, J.Biol.Chem.272:9648-9654参照)。プロテアソームインヒビターＭＧ１３２及びホルボールエステルは、リン酸化ＳＴＡＴ３のレベルを調節する(例えば、Malek等、1999, Cytokine 11:192-199参照)。
【０２３８】
ＣＮＴＦレセプターアンタゴニストは又、ＣＮＴＦ／ＣＮＴＦレセプター複合体の形成に干渉し及び／又は該形成を妨げる分子をも包含する。例えば、ＣＮＴＦに結合する分子又はＣＮＴＦレセプターの成分に結合する分子も又、ＣＮＴＦ／ＣＮＴＦレセプター複合体の形成を妨げることができる。かかる分子の例は、少なくとも一つのＣＮＴＦレセプターサブユニットを認識する抗体及び米国特許第５，７１７，０７３号及び５，８６６，６８９号に記載されたような分子、及びＣＮＴＦ／ＣＮＴＦレセプター複合体形成を妨げる他の分子(当業者に公知)を含むが、これらに限られない。
【０２３９】
ＣＮＴＦレセプターアゴニストは、ここで用いる場合、ＣＮＴＦレセプターの作用及び効果を活性化し、誘導し或は増大させる因子をいう。かかるアゴニストは、ＣＮＴＦに結合し又はＣＮＴＦレセプターに結合する化合物を包含することができる。かかるアゴニストは、ＣＮＴＦレセプターの出力(即ち、ＣＮＴＦのＣＮＴＦレセプターへの結合後のＣＮＴＦシグナリング経路内の細胞内ステップ、即ち、レセプター／リガンド相互作用のレベルでは起きないＣＮＴＦ／ＣＮＴＦレセプターシグナリングに影響する下流事象)を活性化し、誘導し或は増大させる化合物を含むこともできる。ＣＮＴＦレセプターアゴニストは、タンパク質、抗体、小型有機分子又は炭水化物例えばＣＮＴＦ、ＣＮＴＦ類似体、及びＣＮＴＦに特異的に結合して活性化する抗体を含むことができるが、これらに限られない。加えて、ＣＮＴＦアゴニストは、増大したＣＮＴＦ活性を有する変異型ＣＮＴＦ分子例えばＤＨ−ＣＮＴＦ、Ｓｅｒ１６６のＡｓｐへの変異及びＧｌｎ１６７のＨｉｓへの変異を有するＣＮＴＦのスーパーアゴニスト変異体(Saggio等、1995, EMBO J.14:3045-3054)を含む。ＣＮＴＦレセプターアゴニストは又、ＣＮＴＦ機能の下流シグナリング事象に影響する化合物をも含む。例えば、ＳＯＣＳ−３のインヒビターは、ＣＮＴＦシグナル変換を増進させることができる(Bjorbaek, 1999, Endocrinology 140:2035-2043参照)。
【０２４０】
更なるＣＮＴＦ結合タンパク質は、ＣＮＴＦに特異的に結合する抗体、可溶性ＣＮＴＦＲα(グリコシル−ホスファチジル−イノシトールアンカーを欠くＣＮＴＦＲα)、及びＣＮＴＦに結合する他の分子(例えば、米国特許第５，４７０，９５２号に記載されたもの)などの化合物並びに当業者に公知の他のものであって、ＣＮＴＦに特異的に結合し、そうしてＣＮＴＦがＣＮＴＦレセプターに結合するのを妨げることのできるものを含むが、これらに限られない。特定のＣＮＴＦ結合タンパク質は、更に、遊離のＣＮＴＦレベルの調節、固定化及び結合された／遊離のＣＮＴＦのアッセイを可能にする。
【０２４１】
更なるＣＮＴＦレセプターのアンタゴニスト及びアゴニスト及び他のＣＮＴＦレセプター遺伝子発現又はＣＮＴＦレセプター活性を調節する化合物であって、診断、薬物スクリーニング、臨床的試みのモニター及び／又は骨障害の治療に利用することのできる化合物は、米国特許第５，８４６，９３５号；Inoue等、1997, J.Neurochem.69:95-101；DiMarco等、1996, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:9247-52；米国特許第５，７２３，１２０号；及びSaggio, 1995, EMBO J 14:3045-54に見出すことができる。
【０２４２】
５．８．骨の病気の治療及び予防方法
本発明によって治療し及び／又は予防することのできる骨の病気には、病気でない対応する骨と比較して減少した骨量を特徴とする骨の病気が含まれ、これには、骨粗鬆症、オステオペニア、パジェット病、骨軟化症及び腎性骨ジストロフィーが含まれるが、これらに限られない。本発明により治療し及び／又は予防することのできる骨の病気は又、病気でない対応する骨と比較して増大した骨量を特徴とする骨の病気をも包含し、これには、大理石骨病、骨硬化症及び骨端症が含まれるが、これらに限られない。
【０２４３】
低い骨量の病気における臨界的パラメーターは、骨折しやすさである。骨折しやすさは、直接測定できないので、骨量又は骨鉱質密度の測定が、骨がどれほど骨折しやすいかの指示を与える。低骨密度と増大した骨折しやすさとの間には相関関係があるが、ときには骨の幾何学及び小柱構造の変異に帰することのできる不一致がある。一般に、骨量(又は骨密度又は骨容積)及び骨幾何学は、骨が似ているものの静的な画像を得て、それから、当業者が、骨の機械的特性(例えば、強度、剛性及び曲げ剛性)を推論して、骨折の危険についての予測を決定するために利用される。動物モデルにおいて、組織形態計測は、骨の量、幾何学及び形成速度の分析のために好まれる。再吸収速度は、破骨細胞数又は表面積の計数が破骨細胞活性を表さないので、特性決定するのが一層困難である。骨の機械的特性例えば引張り強度、圧縮強度及び曲げ強度、曲げ剛性及び最大負荷は、直接測定することができる(これらに限られない)。骨量及び骨幾何学は、単一又は二光子吸光光度法(ＳＰＡ及びＤＰＡ)、単一及び二重Ｘ線吸光光度法(ＳＸＡ及びＤＸＡ)、定量的コンピュータートモグラフィー(ＱＣＴ)、超音波(ＵＳ)及び磁気共鳴イメージング(ＭＲＩ)などの方法(これらに限られない)によって測定することができる(例えば、Guglielmi等、1995, Eur Radiol.5(2):129-39参照)。
【０２４４】
この発明は又、骨量に関係しない骨の病気をも包含する。例えば、本発明は、変化した鉱質含量、異常なマトリクス化合物(例えば、コラーゲン)又は異常な局所的外殖の病気を含むが、これらに限られない。
【０２４５】
本発明の目的は、骨の病気の、交感神経系経路の操作による治療、診断及び／又は予防である。本発明の一つの面によれば、骨粗鬆症の少なくとも一つの症状を治療して予防する方法であって、βアドレナリン作動性アンタゴニストの投与を含む当該方法がある。この面の特別の具体例は、レプチンアンタゴニストのβアドレナリン作動性アンタゴニストと組み合わせての更なる投与を含むが、これに限られない。他の具体例において、大理石骨病又は硬骨化症の少なくとも一つの症状を治療して予防する方法であって、βアドレナリン作動性アゴニストの投与を含む当該方法がある。更なる具体例は、レプチンアゴニストのβアドレナリン作動性アゴニストと組み合わせての更なる投与を含むが、これに限られない。
【０２４６】
本発明の他の目的は、骨に対するレプチンの効果を調節する方法であって、交感神経活動状態を変化させる医薬組成物の治療上有効な量の投与を含む当該方法である。本発明の他の具体例は、骨量を調節する方法であって、交感神経活動状態を変えて骨量を調節する医薬組成物の治療上有効な量の投与を含む当該方法に関係する。この医薬組成物の特定の具体例は、レプチンアンタゴニスト、レプチンアゴニスト、交感神経系アンタゴニスト、交感神経系アゴニスト、及びこれらの組合せを含むが、これらに限られない。
【０２４７】
本発明の他の目的は、骨の病気の少なくとも一つの症状を治療し又は予防する方法であって、交感神経活動状態を変えることにより骨に対するレプチンの効果を調節する医薬組成物の治療上有効な量の投与を含む当該方法に関係する。この医薬組成物の特定の具体例は、レプチンアンタゴニスト、レプチンアゴニスト、交感神経系アンタゴニスト、交感神経系アゴニスト、及びこれらの組合せを含むが、これらに限られない。
【０２４８】
この発明の一つの面において、骨の病気を治療する方法であって、該治療を必要とする哺乳動物に、血清中のレプチンレベルを低下させる化合物の治療上有効な量を投与することを含み、該骨の病気が、病気でない対応する骨と比較して減少した骨量を特徴とする当該方法がある。これらの化合物及び方法の幾つかの特定の具体例は、レプチン合成を阻害し若しくは低下させ又はレプチン分解を増大させるものを含むが、これらに限られない。かかる化合物の内には、アンチセンス、リボザイム又はレプチンをコードするポリペプチドの三重らせん配列がある。
【０２４９】
本発明の他の面によれば、骨の病気を治療する方法であって、該治療を必要とする哺乳動物に、脳脊髄液中のレプチンレベルを低下させる化合物の治療上有効な量を投与することを含み、該骨の病気が、病気でない対応する骨と比較して減少した骨量を特徴とする当該方法がある。これらの化合物及び方法の幾つかの特定の具体例は、レプチン合成を阻害し若しくは低下させ又はレプチン分解を増大させるもの及び血中のレプチンに結合する化合物を含むが、これらに限られない。
【０２５０】
この発明の方法の特定の具体例は、例えば、骨の病気を治療する方法であって、該治療を必要とする哺乳動物に、治療上有効な量の化合物を投与することを含み、骨の病気が、病気でない対応する骨と比較して減少した骨量を特徴とし、該化合物を血中のレプチンに結合する化合物よりなる群から選択し、該化合物が特異的にレプチンに結合する抗体、可溶性レプチンレセプターポリペプチド、インター−アルファ−トリプシンインヒビター重鎖関連タンパク質及びアルファ２−マクログロブリンタンパク質を包含するがこれらに限られない当該方法がある。
【０２５１】
本発明の他の面によれば、骨の病気を治療する方法であって、該治療を必要とする哺乳動物に、リン酸化Ｓｔａｔ３ポリペプチドのレベルを低下させる化合物の治療上有効な量を投与することを含み、骨の病気が、病気でない対応する骨と比較して減少した骨量を特徴とする当該方法がある。これらの化合物及び方法の幾つかの特定の具体例は、レプチン合成を阻害し若しくは低下させ又はレプチン分解を増大させるもの、血中のレプチンに結合する化合物、及びレプチンレセプターアンタゴニスト化合物例えばアセチルフェノール化合物、レプチンに特異的に結合する抗体、レプチンレセプターに特異的に結合する抗体、及び可溶性レプチンレセプターポリペプチド配列を含む化合物を含むが、これらに限られない。
【０２５２】
本発明の他の面によれば、骨の病気を治療し又は予防する方法であって、該治療又は予防を必要とする哺乳動物に、ドーパミンβヒドロキシラーゼ(「ＤＢＨ」)(ドーパミンのノルエピネフリンへの変換に必要な酵素)の活性を阻害する化合物の治療上必要な量を投与することを含む当該方法がある。これらの化合物及び方法の幾つかの特定の具体例は、ＤＢＨ酵素活性、ＤＢＨ遺伝子発現を阻害するもの、ＤＢＨに特異的に結合する抗体、及びノルエピネフリン合成経路に含まれる化合物を含むが、これらに限られない。
【０２５３】
本発明の他の面によれば、骨の病気を治療する方法であって、該治療を必要とする哺乳動物に、視床下部のレプチンレセプターレベルを低下させる化合物の治療上有効な量を投与することを含み、該骨の病気が、病気でない対応する骨と比較して減少した骨量を特徴とする当該方法がある。これらの化合物及び方法の幾つかの特定の具体例は、レプチンレセプター合成を阻害し若しくは低下させ又はレプチンレセプター分解を増大させるものを含むが、これらに限られない。かかる化合物の内には、アンチセンス、リボザイム又はレプチンレセプターをコードするポリペプチドの三重らせん配列がある。
【０２５４】
血清中又は脳脊髄液中のレプチンレベルを低下させる化合物は、次のアッセイにおいてレプチンレベルを低下させるものである：該化合物をレプチン発現細胞株に由来する細胞(好ましくは、ＮＩＨ３Ｔ３Ｌ１細胞株)と接触させて、レプチン発現及び／又は合成が、該化合物の非存在下で該細胞株が示すレベルと比較して低下されるかどうかを測定する。標準的アッセイ例えばノーザンブロットを利用して、レプチン発現のレベルを測定し、ウエスタンブロットを利用して、レプチン合成のレベルを測定することができる。別のアッセイは、骨の病気につき治療された哺乳動物におけるレプチンのレベルを、該化合物の投与の前後で比較することを含み、それで、レプチンのレベルが減少すれば、該化合物は、レプチンレベルを低下させるものである。同様にして、血清中又は脳脊髄液中のレプチンレベルを増大させる化合物は、かかるアッセイによりレプチンレベルを増大させるものである。
【０２５５】
リン酸化Ｓｔａｔ３ポリペプチド(標的細胞におけるレプチンシグナリングの下流エフェクター)(Tartaglia等、1995, Cell 83, 1263-1271；Baumann等、1996, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93, 8374-8378；Ghilardi等、1996, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93, 6231-6235；Vaisse等、Nat Genet 14, 95-97)のレベルを低下させる化合物は、次のアッセイでリン酸化Ｓｔａｔ３のレベルを低下させるものである：レプチンポリペプチド及び該化合物を、機能的レプチンレセプターを発現する細胞と接触させて、該細胞におけるリン酸化Ｓｔａｔ３ポリペプチドのレベルを測定する。Ｓｔａｔ３ポリペプチドのリン酸化レベルを測定するためには、例えば、それらの細胞を溶解させて、適当な分析(例えば、ウエスタンブロット)を行なうことができる。リン酸化Ｓｔａｔ３のレベルが、該化合物の非存在下で該細胞株が示すレベルと比較して減少すれば、該化合物は、リン酸化Ｓｔａｔ３のレベルを低下させるものである。同様に、リン酸化Ｓｔａｔ３ポリペプチドの血清中又は脳脊髄液中でのレベルを増大させる化合物は、かかるアッセイによりレプチンレベルを増大させるものである。
【０２５６】
ドーパミンβヒドロキシラーゼ(「ＤＢＨ」)(ドーパミンのノルエピネフリンへの変換に必要な酵素)の活性を阻害する化合物も又、本発明に関して提供される。試験化合物のドーパミンβ−ヒドロキシラーゼインヒビター特性は又、技術的に認められたイン・ビボアッセイによっても測定することができ、該アッセイは、ドーパミン及びノルエピネフリン組織濃度及び試験化合物のそれらに対する効果に依存する(例えば、B.A. Berkowitz等、1988 J.Pharm.Exp Ther.245:850-857参照)。これらの化合物及び方法の幾つかの特定の具体例は、ＤＢＨ酵素活性、ＤＢＨ遺伝子発現を阻害するもの、ＤＢＨに特異的に結合する抗体、及びノルエピネフリン合成経路に含まれる化合物を含むが、これらに限られない。米国特許第５，７４１，５０３号(参考として、そっくりそのまま本明細書中に援用する)に記載されたような公知のＤＢＨインヒビターの例は、フザリン酸、ジスルフィラム、３−フェニルプロパルギルアミン及び５−(４’−クロロブチル)−ピコリン酸、ジエチイジチオカーバメート、ベータ−クロロフェネチルアミン、４−ヒドロキシベンジルシアニド、２−ハロ−３−(ｐ−ヒドロキシフェニル)−１−プロペン、１−フェニル−１−プロピン、２−フェニルアリルアミン、２−(２−チエニル)アリルアミンを及びこれらの誘導体例えば２−チオフェン−２−(２−チエニル)アリルアミン、３−フェニルプロパルギルアミン、１−フェニル−１(アミノエチル)エタン及びこれらの誘導体例えばＮ−(トリフルオロアセチル)フェニル−１(アミノエチル)エテン及び５−ピコリン酸誘導体例えば５−(４’−クロロブチル)−ピコリン酸及び同様にアルキル又はハロアルキル置換された例えば適宜少なくとも一つのハロゲン原子で置換されたＣ1〜Ｃ6アルキル基で置換された他の５−ピコリン酸を包含するが、これらに限られない。
【０２５７】
化合物は、投与された量が、レシピエント哺乳動物の生理において所望の変化を生じるならば、例えば、骨量の、病気の状態の対応する骨と比較しての増大又は減少を生じるならば、即ち、治療を生じるならば、即ち、骨量を、病気でない対応する骨(即ち、同じ種類の対応する骨例えば長骨、脊椎骨など)のそれを一層真似るように調節するならば、「治療上有効な量」で投与されるという。これらの方法に関して、病気でない対応する骨は、治療される骨と同じ種類の骨(例えば、対応する脊椎骨又は長骨)をいい、骨量は、当業者に周知の及び上記の標準的技術を利用して測定され、該技術は、例えば、骨量の、Ｘ線、ＤＥＸＡ及び古典的な組織学的評価及び測定を包含する。
【０２５８】
ここに提供した方法の部分として利用することのできる化合物の内には、ここに与えた節及び教示に記載したもの並びに、ここに与えた節及び教示に記載した技術により同定された化合物がある。
この発明の治療及び予防方法の部分として利用することのできる特定の技術及び方法を、下記において詳細に示す。
【０２５９】
５．８．１．骨の病気を骨量を増大させることにより治療するためのＯｂ又はＯｂＲ発現、レベル又は活性の阻害
Ｏｂ又はＯｂＲ発現(転写又は翻訳)のレベル又は活性を中和し、遅延させ又は阻害する任意の方法を利用して、病気でない対応する骨と比較して減少した骨量を特徴とする骨の病気を、骨量の増大を実現することにより治療し又は予防することができる。かかるアプローチを利用して、骨粗鬆症、オステオペニア、骨形成不全症または骨再吸収不全症、パジェット病、骨転移、骨軟化症及び腎性骨ジストロフィーなどの骨の病気を治療し又は予防することができる。かかる方法を利用して、骨折及び折れた骨を含む状態を治療することができる。
【０２６０】
例えば、可溶性ペプチド、タンパク質、融合タンパク質又は循環Ｏｂ、ＯｂＲの天然のリガンドに結合して「中和する」抗体(抗イディオタイプ抗体を含む)などの化合物の投与を利用して、骨量の増大を実現することができる。同様に、可溶性ペプチド、タンパク質、融合タンパク質、又は抗体(抗イディオタイプ抗体を含む)などの化合物を利用して、骨量の増大を実現することができる。この目的のために、ＯｂＲのＥＣＤに対応するペプチド、ＯｂＲの可溶性欠失変異体、又は他のポリペプチド(例えば、ＩｇＦｃポリペプチド)に融合されたこれらのＯｂＲドメイン若しくは変異体の何れかを利用することができる。或は、抗イディオタイプ抗体又は抗イディオタイプ抗体のＦab断片(ＯｂＲ ＥＣＤを真似て、Ｏｂを中和する)を利用することができる。或は、ＯｂＲホモ二量体形成を阻害してレプチンレセプターに対するレプチンの親和性を減少させる化合物も又、利用することができる(例えば、Devos等、1997, J.Biol.Chem.,272:18304-18310)。治療のために、かかるＯｂＲペプチド、タンパク質、融合タンパク質、抗イディオタイプ抗体又はＦabを、治療を必要とする患者に、治療上有効なレベルで投与する。予防のためには、かかるＯｂＲペプチド、タンパク質、融合タンパク質、抗イディオタイプ抗体又はＦabを、骨の病気の危険にある患者に、該骨の病気の予防に十分な時間及び濃度で投与する。
【０２６１】
循環Ｏｂを中和するための別の具体例において、かかる可溶性又は分泌型のＯｂＲを発現するように遺伝子工学処理した細胞を患者に投与することができ、そこで、それらは、「バイオリアクター」としてイン・ビボで働いて、Ｏｂ中和タンパク質の連続的供給を与える。かかる細胞は、患者又はＭＨＣ適合性のドナーから得ることができ、繊維芽細胞、血液細胞(例えば、リンパ球)、含脂肪細胞、筋細胞、内皮細胞などが含まれるが、これらに限られない。これらの細胞は、イン・ビトロで、ＯｂＲ ＥＣＤの、又はＯｂＲ−Ｉｇ融合タンパク質のコード配列を細胞内に導入するための組換えＤＮＡ技術を利用して、例えば形質導入(ウイルスベクター好ましくはトランスジーンを細胞のゲノムに組み込むベクターを使用)又はプラスミド、コスミド、ＹＡＣ、エレクトロポレーション、リポソームなどの利用を含む(これらに限られない)トランスフェクション手順により、遺伝子工学処理されている。このＯｂＲコード配列を、強力な構成的プロモーター又は誘導性プロモーター又はプロモーター／エンハンサーの制御下に置いて、ＯｂＲペプチド又は融合タンパク質の発現及び分泌を達成することができる。所望のＯｂＲ産物を発現して分泌する遺伝子工学処理された細胞を、患者の全身に導入することができ、例えば、循環中、腹腔内に、脈絡膜叢又は視床下部に導入することができる。或は、これらの細胞を、マトリクスに組み込んで身体に移植することができ、例えば、遺伝子工学処理した繊維芽細胞を、皮膚移植の部分として移植することができ；遺伝子工学処理した内皮細胞を、血管移植片の部分として移植することができる(例えば、米国特許第５，３９９，３４９号及び５，４６０，９５９号参照。これらの各々を参考として、そっくりそのまま本明細書中に援用する)。
【０２６２】
投与される細胞が非自己細胞である場合には、それらを、宿主の導入された細胞に対する免疫応答の発生を防止する周知の技術を利用して投与することができる。例えば、これらの細胞を、カプセル封入形態で導入することができ、該形態は、隣接した細胞外環境との成分の交換は許すが、導入された細胞を宿主の免疫系に認識させない。
【０２６３】
別の具体例において、骨の病気の治療は、内因性Ｏｂ又はＯｂＲ遺伝子発現のレベルを例えばＯｂ又はＯｂＲ ｍＲＮＡ転写物の翻訳を阻害し又は妨げるアンチセンス又はリボザイムアプローチ；Ｏｂ又はＯｂＲ遺伝子の転写を阻害する三重らせんアプローチ；又はＯｂ若しくはＯｂＲ遺伝子若しくはその内因性プロモーターを不活性化若しくは「ノックアウト」する標的を定めた相同組換えを利用して、低下させるようにデザインすることができる。ＯｂＲ遺伝子は、脈絡膜叢及び視床下部を含む脳で発現されるので、送達技術は、好ましくは、血液−脳関門を横切るようにデザインされるべきである(例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ８９／１０１３４参照、参考として、そっくりそのまま本明細書中に援用する)。或は、ここに記載のアンチセンス、リボザイム又はＤＮＡ構築物は、直接、標的細胞を含む部位例えば脈絡膜叢、視床下部、脂肪組織などに投与することができる。
【０２６４】
アンチセンスアプローチは、Ｏｂ又はＯｂＲｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチド(ＤＮＡ又はＲＮＡ)のデザインを含む。これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、相補的Ｏｂ又はＯｂＲｍＲＮＡ転写物に結合して、翻訳を妨げる。完全な相補性は、好ましいが、必要でない。ＲＮＡの一部に対する配列「相補性」は、ここでは、そのＲＮＡとハイブリダイズして安定な二本鎖を形成することができるだけ十分な相補性を有する配列を意味する(二本鎖アンチセンス核酸の場合、二本鎖ＤＮＡの一本鎖をこうして試験することが出来、又は三重鎖の形成をアッセイすることができる)。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度とアンチセンス核酸の長さの両方に依存する。一般に、ハイブリダイズする核酸が長いほど、それは、ＲＮＡとミスマッチな一層多くの塩基を含むことができ、それでもなお、安定な二本鎖(又は、場合によっては、三重鎖)を形成することができる。当業者は、ミスマッチの許容度を、ハイブリダイズした複合体の融点を測定する標準的手順を利用して確認することができる。
【０２６５】
当業者は、遺伝子発現の改変を、レプチン又はレプチンレセプター遺伝子の制御領域即ちプロモーター、エンハンサー及びイントロン並びにこれらの遺伝子のコード領域に対するアンチセンス分子をデザインすることにより得ることができることを認める。かかる配列は、ここでは、それぞれ、レプチンをコードするポリヌクレオチド又はレプチンレセプターをコードするポリヌクレオチドと称する。
【０２６６】
転写開始部位(例えば、リーダー配列の−１０〜＋１０領域)から得られたオリゴヌクレオチドは、好適である。メッセージの５’末端(例えば、ＡＵＧ開始コドンを含んで該コドンまでの５’未翻訳配列)に相補的なオリゴヌクレオチドは、一般に、翻訳の阻害において最も効率的に働く。しかしながら、ｍＲＮＡの３’未翻訳配列に相補的な配列は、最近、やはりｍＲＮＡの翻訳の阻害に有効であることが示された(一般に、Wagner, 1994, 372:333-335を参照されたい)。ｍＲＮＡの５’未翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドンの相補配列を含むはずである。ｍＲＮＡのコード領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、翻訳の一層高率の低いインヒビターであるが、この発明によって利用されうる。Ｏｂ又はＯｂＲｍＲＮＡの５’−、３’−又はコード領域の何れにハイブリダイズするようにデザインされても、アンチセンス核酸は、少なくとも６ヌクレオチド長であるべきであり、好ましくは、６〜５０ヌクレオチド長に及ぶオリゴヌクレオチドであるべきである。特定の面においては、このオリゴヌクレオチドは、少なくとも１７オリゴヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド又は少なくとも５０ヌクレオチドである。
【０２６７】
標的配列の選択にかかわらず、アンチセンスオリゴヌクレオチドの遺伝子発現を阻害する能力を定量するイン・ビトロ研究を先ず行うということは好ましいことである。これらの研究が、アンチセンス遺伝子阻害とオリゴヌクレオチドの非特異的な生物学的効果とを区別する対照を利用するということは好ましいことである。これらの研究が、標的ＲＮＡ又はタンパク質のレベルを内部対照用ＲＮＡ又はタンパク質のレベルと比較するということも又好ましいことである。加えて、アンチセンスオリゴヌクレオチドを利用して得られた結果を、対照用オリゴヌクレオチドを利用して得られたものと比較するということが構想される。対照用オリゴヌクレオチドが試験オリゴヌクレオチドとほぼ同じ長さであり、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列が、標的配列への特異的ハイブリダイゼーションを妨げるのに必要なだけアンチセンス配列と異なるということは好ましいことである。
【０２６８】
これらのオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ又はキメラの混合物又はこれらの誘導体若しくは改変バージョン(一本鎖又は二本鎖)であってよい。このオリゴヌクレオチドは、例えば分子の安定性、ハイブリダイゼーションなどを改善するために、塩基部分、糖部分又はリン酸主鎖において改変されていてよい。このオリゴヌクレオチドは、他の付帯的な原子団例えばペプチド(例えば、宿主細胞レセプターをイン・ビボで標的とするため)又は細胞膜を横切る輸送を容易にし(例えば、Letsinger等、1989, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:6553-6556及びLemaitre等、1987, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:648-652；ＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ８８／０９８１０を参照されたい)又は血液−脳関門を横切る輸送を容易にする薬剤(例えば、ＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ８９／１０１３４参照)、ハイブリダイゼーションが引き金を引く開裂剤(例えば、Krol等、1988, BioTechniques 6:958-976)又はインターカレーティング剤(例えば、Zon, 1988, Pharm.Res.5:539-549参照)を含むことができる。この目的のために、オリゴヌクレオチドを他の分子例えばペプチド、ハイブリダイゼーションが引き金となる架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーションが引き金となる開裂剤などと結合体化することができる。
【０２６９】
このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−インドウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸(ｖ)、ヴィブトキシン、シュードウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸(ｖ)、５−メチル−２−チオウラシル、３−(３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル)ウラシル、(ａｃｐ３)ｗ、及び２，６−ジアミノプリンを含む(これらに限られない)群から選択する少なくとも一つの改変塩基部分を含むことができる。
【０２７０】
このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース、及びヘキソースを含む(これらに限られない)群から選択する少なくとも一つの改変糖部分をも含むことができる。
【０２７１】
更に別の具体例において、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミドチオエート、ホスホルアミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル及びホルムアセタール又はこれらの類似体よりなる群から選択する少なくとも一つの改変リン酸主鎖を含む。
【０２７２】
更に別の具体例において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、α−アノマーオリゴヌクレオチドである。α−アノマーオリゴヌクレオチドは、相補的ＲＮＡと特異的二本鎖ハイブリッドを形成し、該ハイブリッドでは、通常のβユニットと逆に、鎖が互いに平行に走っている(Gautier等、1987, Nucl.Acids Res.15:6625-6641)。このオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド(Inoue等、1987, Nucl.Acids Res.15:6131-6148)であるか又はキメラのＲＮＡ−ＤＮＡ類似体(Inoue等、1987, FEBS Lett.215:327-330)である。
【０２７３】
この発明のオリゴヌクレオチドは、当分野で公知の標準的方法により、例えば自動化ＤＮＡシンセサイザー(例えば、Biosearch, Applied Biosystemsなどから市販されているもの)によって合成することができる。例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Stein等、1988, Nucl.Acids Res.16:3209の方法によって合成することができ、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、制御された細孔のガラスポリマー支持体の利用によって調製することができる(Sarin等、1988, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:7448-7451)。
【０２７４】
Ｏｂ又はＯｂＲコード領域の配列に相補的なアンチセンスヌクレオチドを利用することはできるが、転写されるが翻訳されない領域に相補的なものが最も好適である。例えば、下記の配列を有するＯｂＲコード領域に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドをこの発明に従って利用することができる：
【化１】
2005516001.tif 000003
【０２７５】
これらのアンチセンス分子は、Ｏｂ又はＯｂＲをイン・ビボで発現する細胞に送達されるべきである。アンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡを細胞に送達するための多くの方法が開発されており；例えば、アンチセンス分子を、直接、組織部位に注射することができ、或は所望の細胞を標的とするようにデザインされた改変アンチセンス分子(例えば、標的細胞表面で発現されたレセプター又は抗原に特異的に結合するペプチド又は抗体に結合されたアンチセンス)を全身投与することができる。
【０２７６】
内因性ｍＲＮＡの翻訳を抑制するのに十分なアンチセンスの細胞内濃度を達成するための好適アプローチは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、強力なｐｏｌＩＩＩ又はｐｏｌＩＩプロモーターの制御下に置かれた組換えＤＮＡ構築物を利用する。患者内の標的細胞をトランスフェクトするためのかかる構築物の利用は、内因性Ｏｂ又はＯｂＲ転写物と相補的塩基対を形成し、それにより、それぞれＯｂ又はＯｂＲｍＲＮＡの転写を防止する十分量の一本鎖ＲＮＡの転写を生じる。例えば、細胞に取り込まれてアンチセンスＲＮＡの転写を指示するようにベクターをイン・ビボで導入することができる。かかるベクターは、転写されて所望のアンチセンスＲＮＡを生成することができるならば、エピソームのままであっても、染色体中に組み込まれてもよい。かかるベクターは、当分野で標準的な組換えＤＮＡ技術によって構築することができる。ベクターは、プラスミド、ウイルス性ベクター又は哺乳動物細胞中での複製及び発現のために利用できることが当分野で知られている他のものであってよい。アンチセンスＲＮＡをコードする配列の発現は、哺乳動物(好ましくは、ヒト)細胞中で作用することが当分野で知られている任意のプロモーターによってよい。かかるプロモーターは、誘導性であっても構成的であってもよい。かかるプロモーターは、ＳＶ４０初期プロモーター領域(Bernoist & Chambon, 1981, Natuer 290:304-310)、ラウス肉腫ウイルスの３’ロングターミナルリピート中に含まれるプロモーター(Yamamoto等、1980, Cell 22:787-797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagner等、1981, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1441-1445)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinster等、1982, Nature 296:39-42)などを包含するが、これらに限られない。何れの種類のプラスミド、コスミド、ＹＡＣ又はウイルスベクターでも、組織部位例えば脈絡膜叢又は視床下部に直接導入することのできる組換えＤＮＡ構築物を調製するために利用することができる。或は、投与を他の経路(例えば、全身投与)によって達成することができる場合には、所望の組織に選択的に感染するウイルス性ベクターを利用することができる(例えば、脳には、ヘルペスウイルスベクターを利用することができる)。
【０２７７】
Ｏｂ又はＯｂＲｍＲＮＡ転写物を酵素的に開裂させるためにデザインされたリボザイム分子も又、Ｏｂ又はＯｂＲｍＲＮＡの転写及びＯｂ又はＯｂＲの発現を妨げるために利用することができる(例えば、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９０／１１３６４及びSarver等、1990, Science 247:1222-1225参照)。ｍＲＮＡを特異的認識配列部位で開裂するリボザイムを利用してＯｂ又はＯｂＲｍＲＮＡを破壊することはできるが、ハンマーヘッドリボザイムの利用が好適である。ハンマーヘッドリボザイムは、ｍＲＮＡを、標的ｍＲＮＡと相補的塩基対を形成する隣接領域に指示される位置で開裂させる。唯一必要なことは、標的ｍＲＮＡが、次の２塩基の配列を有することである：５’−ＵＧ−３’。ハンマーヘッドリボザイムの構築及び生成は、当分野で周知であり、Haseloff & Gerlach, 1988, Nature, 334:585-591に一層完全に記載されている。ヒトのＯｂ及びＯｂＲｃＤＮＡのヌクレオチド配列中には、数百の潜在的なハンマーヘッドリボザイム開裂部位がある(例えば、米国特許第５，９７２，６２１号参照)。好ましくは、このリボザイムを処理して、開裂認識部位を、Ｏｂ又はＯｂＲｍＲＮＡの５’末端近くに位置させる(即ち、効率を増大させて、非機能的ｍＲＮＡ転写物の細胞内蓄積を最少にする)。
【０２７８】
例えば、下記の配列を有するＯｂＲｍＲＮＡに向けられたハンマーヘッドリボザイムを、この発明に従って利用することができる：
【化２】
2005516001.tif 000004
【０２７９】
本発明のリボザイムは又、ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ(以後、「Ｃｅｃｈ型リボザイム」と呼ぶ)例えばテトラヒメナ・サーモフィラ中に自然に存在するもの(ＩＶＳ又はＬ−１９ＩＶＳ ＲＮＡとして知られる)及び広く記載されているもの(Zaug等、1984, Science, 224:574-578；Zaug及びCech, 1986, Science, 231:470-475；Zaug等、1986, Nature,324:429-433；ＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ８８／０４３００；Benn及びCech, 1986, Cell, 47:207-216)をも包含する。Ｃｅｃｈ型リボザイムは、８塩基対の活性部位を有し、これは、標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズし、その後、標的ＲＮＡの開裂が起きる。この発明は、Ｏｂ及びＯｂＲ中に存在する８塩基対の活性部位の配列を標的とするＣｅｃｈ型リボザイムを包含する。
【０２８０】
アンチセンスのアプローチにおけるのと同様に、これらのリボザイムは、改変されたオリゴヌクレオチド(例えば、改良された安定性、ターゲティング能力など)からなってよく、Ｏｂ及びＯｂＲをイン・ビボで発現する細胞に送達されるべきである。送達の好適な方法は、リボザイムを、強力な構成的ｐｏｌＩＩＩ又はｐｏｌＩＩプロモーターの制御下に「コードする」ＤＮＡ構築物であって、トランスフェクトされた細胞が、内因性Ｏｂ又はＯｂＲメッセージを破壊して翻訳を阻害するのに十分な量のリボザイムを生成する当該ＤＮＡ構築物の利用を含む。リボザイムは、アンチセンス分子と異なり、触媒性があるので、効率に関して、一層低い細胞内濃度が必要とされる。
【０２８１】
同様に、レプチン又はレプチンレセプターの阻害は、「三重らせん」塩基対形成方法論の利用によって達成することができる。三重らせん対形成は、二重らせんがポリメラーゼ、転写因子又は調節用分子の結合のために十分に開く能力を危うくする。三重らせん技術を利用する技術は、当業者に周知である(一般に、Helene, 1991, Anticancer Drug Des.6(6):569-84；Helene, 1992, Ann.N.Y.Acad.Sci.660:27-36；及びMaher, 1992, Bioassays14(12):807-15を参照されたい)。
【０２８２】
内因性Ｏｂ又はＯｂＲ遺伝子発現は又、Ｏｂ又はＯｂＲ遺伝子又はそのプロモーターを標的を定めた相同組換えを利用して不活性化し又は「ノックアウト」することによって減少させることもできる(例えば、Smithies等、1985, Nature 317:230-234；Thomas & Capecchi, 1987, Cell 51:503-512；及びThompson等、1989 Cell 5:313-321参照；これらの各々をそっくりそのまま、参考として本明細書中に援用する)。例えば、内因性Ｏｂ又はＯｂＲ遺伝子(コード領域又は調節領域)に相同なＤＮＡと隣接した変異型の非機能的Ｏｂ又はＯｂＲ(又は、完全に無関係のＤＮＡ配列)を選択マーカー及び／又は負の選択マーカーと共に又はこれらのマーカーを伴わずに利用して、Ｏｂ又はＯｂＲをイン・ビボで発現する細胞にトランスフェクトすることができる。このＤＮＡ構築物の標的を定めた相同組換えによる挿入は、Ｏｂ又はＯｂＲ遺伝子の不活性化を生じる。かかるアプローチは、特に農業分野で適しており、該分野では、ＥＳ(胚性幹)細胞に対する改変を利用して、不活性なＯｂＲを有する動物子孫を生成することができる(例えば、Thomas & Capecchi 1987及びThompson 1989, 前出)。しかしながら、このアプローチは、組換えＤＮＡ構築物が直接投与され又は適当なウイルス性ベクター(例えば、脳組織例えば視床下部、脈絡膜叢又は脂肪組織への送達のためのヘルペスウイルスベクター)を利用して必要な部位をイン・ビボで標的とするならば、ヒトにおける利用のために適合させることができる。
【０２８３】
或は、内因性Ｏｂ又はＯｂＲ遺伝子の発現を、Ｏｂ又はＯｂＲ遺伝子の調節領域(即ちプロモーター及び／又はエンハンサー)に相補的なデオキシリボヌクレオチド配列のターゲティングによって、身体内の標的細胞におけるＯｂ又はＯｂＲ遺伝子の転写を妨げる三重らせん構造を形成することによって減少させることができる(一般に、Helene, C. 1991, Anticancer Drug Des.,6(6):569-84；Helene, C.等、1992, Ann,N.Y.Accad.Sci.,660:27-36；及びMaher,L.J.,1992,Bioassays 14(12):807-15を参照されたい)。
【０２８４】
この発明の更に別の具体例において、Ｏｂ又はＯｂＲの活性を、骨量の増大を実現するための「優性ネガティブ」アプローチを利用して減少させることができる。この目的のために、欠陥のあるＯｂ又はＯｂＲをコードする構築物を、適当な標的細胞においてＯｂ又はＯｂＲの活性を減らすための遺伝子治療アプローチにおいて利用することができる。例えば、宿主細胞のＯｂＲの発現を指示するヌクレオチド配列(ＣＤ又はＣＤの一部分が欠失し又は変異している)を、脈絡膜叢又は視床下部の細胞に導入することができる(上記のイン・ビボ又はエキソ・ビボ遺伝子治療によって)。或は、標的を定めた相同組換えを利用して、かかる欠失又は変異を患者の視床下部又は脈絡膜叢内の内因性ＯｂＲ遺伝子に導入することができる。これらの処理された細胞は、非機能的レセプター(即ち、天然のリガンドに結合することはできるがシグナル変換をすることのできない繋留されたレセプター)を発現する。脈絡膜叢又は視床下部中に存在するかかる処理された細胞は、内因性Ｏｂリガンドに対する減少した応答を示し、骨量の増大を生じるはずである。
【０２８５】
本発明の更なる具体例は、レプチンタンパク質の分解を増大させることにより即ち、レプチンタンパク質が排除の標的となるような抗体の結合によってレプチンレベルを減少させる方法である。本発明の別の具体例は、レプチンレセプタータンパク質の分解を増大させることにより即ち抗体の、レプチンレセプタータンパク質が排除の標的となるような結合によってレプチンレセプターレベルを減少させる方法である。他の具体例は、遊離のレプチンに結合する可溶性形態のレプチンレセプターの合成を増大させることによりレプチンレベルを減少させることである。
【０２８６】
本発明の他の具体例は、レプチンレセプター構造、機能又はホモ二量体形成特性に影響を与える化合物を投与する方法である。かかる化合物は、結合時にレプチンレセプターの構造、機能又は二量体形成特性を変化させ、それにより該レセプターの活性を無効にするタンパク質、核酸、炭水化物又は他の分子を包含するが、これらに限られない。
【０２８７】
５．８．２．骨量を減少させるＯｂ又はＯｂＲの発現または活性の回復又は増大
正常Ｏｂ又はＯｂＲ遺伝子の発現及び／又は遺伝子産物活性のレベルの増大に関して、Ｏｂ又はＯｂＲ核酸配列を、骨の障害の治療のために利用することができる。この障害の原因が欠損したＯｂ又はＯｂＲである場合には、治療を、例えば、遺伝子置換療法の形態で施与することができる。特に、正常な機能を示すＯｂ若しくはＯｂＲ遺伝子産物の生成を指示する少なくとも１コピーの正常Ｏｂ若しくはＯｂＲ遺伝子又はＯｂ若しくはＯｂＲ遺伝子の一部分を、患者又は動物患者内の適当な細胞に、ベクターを利用して挿入することができ、該ベクターには、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス及びヘルペスウイルスベクターが、リポソームなどのＤＮＡを細胞に導入する他の粒子に加えて含まれるが、これらに限られない。
【０２８８】
ＯｂＲ遺伝子は、脈絡膜叢及び視床下部を含む脳で発現されるので、ＯｂＲを含むかかる遺伝子置換療法技術は、ＯｂＲ遺伝子配列を患者内のこれらの細胞型に送達することができる。従って、ＯｂＲ遺伝子配列の送達のための技術は、容易に血液−脳関門を横切るようにデザインされるべきであって、これは当業者に周知であり(例えば、ＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ８９／１０１３４参照。参考としてそっくりそのまま、本明細書中に援用する)或はかかるＯｂＲ遺伝子配列の、該ＯｂＲ遺伝子配列が発現される細胞の部位への直接的投与を含むべきである。或は、標的を定めた相同組換えを利用して、適当な組織における欠損した内因性Ｏｂ又はＯｂＲ遺伝子を修正することができる。動物においては、標的を定めた相同組換えを利用して、修正された形質を有する子孫を生成するためにＥＳ細胞の欠損を修正することができる。
【０２８９】
Ｏｂ又はＯｂＲ遺伝子の発現及び／又は活性の全体的レベルを増大させるのに利用することのできる更なる方法は、適当なＯｂ又はＯｂＲを発現する細胞好ましくは自家細胞を、増大した骨量と関係する骨の障害の症状を改善するのに十分な位置及び数で、患者へ導入することを含む。かかる細胞は、組換え体であっても非組換え体であってもよい。患者におけるＯｂ又はＯｂＲ遺伝子発現の全体的レベルを増大させるために投与することのでできる細胞の内には、ＯｂＲ遺伝子を発現する正常細胞好ましくは脈絡膜叢細胞若しくは視床下部細胞、又はＯｂ遺伝子を発現する含脂肪細胞がある。これらの細胞を、脳若しくは脂肪組織内の解剖学的部位に、又は身体内の異なる部位に位置する組織移植片の部分として投与することができる。かかる細胞ベースの遺伝子治療技術は、当業者に周知である(例えば、米国特許第５，３９９，３４９号及び５，４６０，９５９号参照)。
【０２９０】
最後に、上記のアッセイで同定された化合物であって、活性化されたＯｂＲによって変換された(例えば、ＯｂＲカスケード内の下流のシグナリングタンパク質を活性化し、それにより、欠損ＯｂＲをバイパスすることにより)シグナルを刺激し又は増進させる当該化合物を利用して、減少した骨量を達成することができる。投与の配合物及び様式は、該化合物の物理化学的特性に依存する。この投与は、血液−脳関門を横切ることを可能にする公知の技術を包含すべきである。
【０２９１】
５．８．３．Ｏｂ及びＯｂＲ活性の制御並びに骨の病気の治療及び予防への遺伝子治療アプローチ
Ｏｂ及びＯｂＲの発現を、Ｏｂ及びＯｂＲ活性を調節して骨の障害を治療するための遺伝子治療アプローチを利用して、イン・ビボで(例えば、転写又は翻訳レベルで)制御することができる。ある種のアプローチを以下で説明する。
【０２９２】
正常なＯｂ及びＯｂＲ遺伝子発現のレベル及び／又はＯｂ及びＯｂＲ遺伝子産物の活性の増大に関して、Ｏｂ及びＯｂＲ核酸配列を、骨の病気の治療のために利用することができる。骨の病気の原因が欠損Ｏｂ又はＯｂＲ遺伝子である場合には、治療を、例えば遺伝子置換療法の形態で施与することができる。特に、正常な機能を示す遺伝子産物の生成を指示する少なくとも１コピーの正常なＯｂ若しくはＯｂＲ遺伝子又は該遺伝子の一部分を患者又は動物患者内の適当な細胞に、ベクターを利用して挿入することができ、該ベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス及びヘルペスウイルスを、ＤＮＡを細胞に導入するリポソームなどの他の粒子に加えて包含するが、これらに限られない。
【０２９３】
ＯｂＲ遺伝子は、脈絡膜叢、視床、脳幹及び脊髄及び視床下部を含む脳において発現されるので、かかる遺伝子置換療法技術は、ＯｂＲ遺伝子配列を患者内のこれらの細胞型に送達することができるべきである。従って、これらのＯｂＲ遺伝子配列の送達のための技術は、容易に血液−脳関門を横切るようにデザインされるべきであって、それらの技術は、当業者に周知であり(例えば、ＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ８９／１０１３４。参考としてそっくりそのまま、本明細書中に援用する)、或はかかるＯｂＲ遺伝子配列を、ＯｂＲ遺伝子配列が発現される細胞の部位へ直接投与することを包含すべきである。
【０２９４】
或は、標的を定めた相同組換えを利用して、適当な組織例えば脂肪組織及び脳組織内の欠損した内因性Ｏｂ又はＯｂＲ遺伝子をそれぞれ修正することができる。動物において、標的を定めた相同組換えを利用して、修正された形質を有する子孫を生成するために、ＥＳ細胞における欠損を修正することができる。
【０２９５】
Ｏｂ又はＯｂＲ遺伝子の発現及び／又は活性の全体的レベルを増大させるために利用することのできる更なる方法は、適当なＯｂ又はＯｂＲ発現細胞好ましくは自家細胞の、骨の障害(大理石骨病、硬骨化症及び骨端症を含むが、これらに限られない)の症状を改善するのに十分な位置及び数での患者への導入を含む。かかる細胞は、組換え体であっても、非組換え体であってもよい。患者におけるＯｂ又はＯｂＲ遺伝子発現の全体的レベルを増大させるために投与することのできる細胞の内には、それぞれＯｂ又はＯｂＲ遺伝子を発現する正常細胞即ち含脂肪細胞又は視床下部細胞がある。これらの細胞は、脂肪組織又は脳内の解剖学的部位に投与することができ、或は、身体内の異なる部位に位置する組織移植片の部分として投与することができる。かかる細胞ベースの遺伝子治療技術は、当業者に周知である(例えば、米国特許第５，３９９，３４９号及び５，４６０，９５９号参照を参照されたい)。
【０２９６】
５．８．４．骨の調節のための組合せ療法
本発明の一つの面は、骨粗鬆症を治療及び予防する方法であって、βアドレナリン作動性アンタゴニスト例えばβ1、β2及びβ3アンタゴニスト(これらに限られない)の投与を含む当該方法である。この面の特別の具体例は、レプチンアンタゴニストのβアドレナリン作動性アンタゴニストと組み合わせての更なる投与を含むが、これに限られない。
【０２９７】
他の具体例において、大理石骨病又は硬骨化症を治療及び予防する方法であって、βアドレナリン作動性アゴニスト例えばβ1、β2及びβ3アゴニスト(これらに限られない)の投与を含む当該方法がある。更なる具体例は、レプチンアゴニストのβアドレナリン作動性アゴニストと組み合わせての更なる投与を含むが、これに限られない。
【０２９８】
本発明の他の目的は、レプチンの骨に対する効果を調節する方法であって、治療上有効な量の交感神経活動状態を変える医薬組成物の投与を含む当該方法に関係する。この医薬組成物の特別の具体例は、レプチンアンタゴニスト、レプチンアゴニスト、交感神経系アンタゴニスト、交感神経系アゴニスト、及びこれらの組合せを含むが、これらに限られない。
【０２９９】
本発明の他の目的は、骨の病気を治療又は予防する方法であって、治療上有効な量の、骨におけるレプチンの効果を交感神経活動状態を変えることによって調節する医薬組成物の投与を含む当該方法に関係する。この医薬組成物の特別の具体例は、レプチンアンタゴニスト、レプチンアゴニスト、交感神経系アンタゴニスト、交感神経系アゴニスト、及びこれらの組合せを含むが、これらに限られない。
【０３００】
この発明は、第５．４節、５．５節、５．６節及び５．７節に記載した化合物の組合せを包含する。好適具体例において、これらの化合物の組合せは、相乗効果を生じる。用語「相乗的」は、ここで用いる場合、任意の２種類以上の単一薬剤の相加効果より一層効果的である組合せをいう。交感神経活動状態を調節する化合物の間の相乗的相互作用の測定は、例えば、制限はしないが、βアンタゴニストであり、他の治療剤は、以下の第６．２節に記載したように、Ｘ線及び組織形態学的分析から得られた結果に基づいてよい。これらのアッセイの結果は、組合せインデックスを得るためのChou及びTalalayの組合せ方法及びマイクロコンピューターソフトウェアによる投与量−効果分析を含む当分野で公知の任意の方法によって分析することができる(Chou及びTalalay, 1984, Adv.Enzyme Regul.22:27-55及びChou及びChou, 1987, ソフトウェア及びマニュアル、Elsevier Biosoft, 英国、Cambridge, p.19-64)。組合せインデックス値＜１は、相乗作用を示し、値＞１は、拮抗作用を示し、１に等しい値は、相加効果を示す。
【０３０１】
他の具体例において、第５．４節、５．５節、５．６節及び５．７節に記載した任意の化合物の組合せを順次的に投与する。例えば、制限はしないが、レプチンアンタゴニストを、アドレナリン作動性アンタゴニストと組み合わせて投与することができ、レプチンアンタゴニストを先ず投与した後にアドレナリン作動性アンタゴニストを投与してもよいし、逆でもよい。同様に、例であって、制限ではないが、アドレナリンアゴニストを、レプチンアゴニストと組み合わせて投与することができ、アドレナリン作動性アゴニストを先ず投与した後にレプチンアゴニストを投与してもよいし、逆でもよい。他の非制限的例において、ＤＢＨアンタゴニストを、レプチンアンタゴニスト及び／又はアドレナリン作動性アンタゴニストと組み合わせて投与することができる。化合物の順次的添加は、２種類以上の化合物を含むことができる。当業者は、所望の効果を発揮するために必要な化合物の順序を決定することができる。
【０３０２】
５．９．骨の障害を治療するための医薬配合物及び方法
この発明の化合物を、配合して投与して、様々な骨の病気の状態を、活性成分を哺乳動物の身体内の薬剤の作用部位と接触させる任意の手段によって阻止することができる。それらを、医薬と共に利用可能な任意の慣用の手段によって、個々の治療用活性成分として又は治療用活性成分の組合せにおいて投与することができる。それらは、単独で投与することができるが、一般には、選択した投与経路及び標準的な製薬上の実際に基づいて選択される製薬上許容しうるキャリアーと共に投与される。
【０３０３】
投与される投薬量は、骨の病気の症状の改善を生じるのに十分な化合物の治療上有効な量であり、当然、特定の活性成分の薬力学的特性及びその投与の様式及び経路；レシピエントの年齢、性別、健康及び体重；症状の性質及び程度；同時に行なう治療の種類、治療の頻度及び所望の効果などの既知の因子によって変化する。
【０３０４】
５．９．１．投与量の決定
かかる化合物の毒性及び治療的効力を、例えばＬＤ50(集団の５０％に致死的である投与量)及びＥＤ50(集団の５０％に治療上有効である投与量)の測定のための細胞培養物又は実験動物において標準的製薬手順によって測定することができる。毒性と治療効果の間の投与量比は、治療インデックスであり、ＬＤ50／ＥＤ50と表すことができる。大きい治療インデックスを示す化合物が好適である。毒性副作用を示す化合物を利用することはできるが、感染してない細胞への潜在的ダメージを最少にし、それにより副作用を減らすために、かかる化合物を冒された組織部位へ標的を定めて送達する送達システムをデザインするように注意すべきである。
【０３０５】
細胞培養アッセイ及び動物での研究から得られたデータは、ヒトにおける利用のための投薬量の範囲を処方する際に利用することができる。かかる化合物の投薬量は、好ましくは、僅かに毒性又は無毒性のＥＤ50を含む循環濃度の範囲にある。この投薬量は、この範囲内で、用いる投薬形態及び用いる投与経路によって変化しうる。この発明の方法で用いる任意の化合物について、治療上有効な投与量を、最初に細胞培養アッセイから評価することができる。投与量は、動物モデルにおいて、ＩＣ50(即ち、症状の半最大阻止を達成する試験化合物の濃度)(細胞培養にて測定)を含む循環血漿濃度範囲を達成するように配合することができる。かかる情報を利用して、ヒトにおいて有用な投与量を一層正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高性能液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
【０３０６】
特別の投薬量を抗体について利用することもできる。典型的には、好適な投薬量は、体重１ｋｇ当たり０．１〜１００ｍｇ(一般に、１０〜２０ｍｇ／ｋｇ)であり、もし抗体が脳内で作用するものであるならば、５０〜１００ｍｇ／ｋｇの投薬量が、一般に適当である。もし抗体が部分的に又は完全にヒトであるならば、それは、他の抗体より、人体内で長い半減期を有するであろう。従って、部分的に又は完全にヒトの抗体の低投薬量は、しばしば可能である。更なる改変を利用して、更に抗体を安定化させることができる。例えば、脂質化を利用して、抗体を安定化させることができ、取り込み及び組織透過性(例えば、脳内への)を増進させることができる。抗体の脂質化のための方法は、Cruikshank等、1997, J.Acquired Immune Deficiency Syndromes and Human Retrovirology 14:193により記載されている。
【０３０７】
治療上有効な量のタンパク質又はポリペプチド(即ち、有効投薬量)は、体重１ｋｇ当たり約０．００１〜３０ｍｇ、好ましくは、体重１ｋｇ当たり約０．０１〜２５ｍｇ、一層好ましくは、体重１ｋｇ当たり約０．１〜２０ｍｇであり、尚一層好ましくは、体重１ｋｇ当たり約１〜１０ｍｇ、２〜９ｍｇ、３〜８ｍｇ、４〜７ｍｇ又は５〜６ｍｇである。
【０３０８】
その上、治療上有効な量のタンパク質、ポリペプチド又は抗体による患者の治療は、単一の治療を含むことができ、又は好ましくは、一連の治療を含むことができる。好適な例において、患者を、体重１ｋｇ当たり約０．１〜２０ｍｇの範囲の抗体、タンパク質又はポリペプチドで、週１回、約１〜１０週間、好ましくは２〜８週間、一層好ましくは約３〜７週間わたって、尚一層好ましくは約４、５又は６週間にわたって治療する
【０３０９】
本発明は、更に、発現又は活性を調節する薬剤を包含する。薬剤は、例えば、小分子であってよい。例えば、かかる小分子は、ペプチド、ペプチド模倣物、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、約１０，０００グラム／モル未満の分子量を有する有機又は無機化合物(即ち、ヘテロ有機化合物及び有機金属化合物を含む)、約５，０００グラム／モル未満の分子量を有する有機又は無機化合物、約１，０００グラム／モル未満の分子量を有する有機又は無機化合物、約５００グラム／モル未満の分子量を有する有機又は無機化合物、及びかかる化合物の塩、エステル及び他の製薬上許容しうる形態を含むが、これらに限られない。
【０３１０】
小分子の薬剤の適当な投与量は、当業者例えば医師に公知の因子の数によるということは理解される。この小分子の投与量は、例えば、治療される患者又は試料の正体、大きさ及び状態によって変化し、更に、該組成物を投与する経路(利用可能な場合)及び開業医が小分子に有することを望む効果によって変化する。典型的な投与量は、患者又は試料の重量１ｋｇ当たり数ミリグラム又はマイクログラムの小分子を含む(例えば、１キログラム当たり約１マイクログラム〜５００ミリグラム、１キログラム当たり約１００マイクログラム〜５ミリグラム、又は１キログラム当たり約１〜５０マイクログラム)。
【０３１１】
５．９．２．配合物及び利用
本発明による利用のための医薬組成物を、少なくとも一種の生理的に許容しうるキャリアー又は賦形剤を利用して、慣用の仕方で配合することができる。
【０３１２】
従って、これらの化合物及びそれらの生理的に許容しうる塩及び溶剤を、吸入(口又は鼻からの吸入)、経口投与、頬内投与、非経口投与又は直腸投与による投与のために配合することができる。
【０３１３】
経口投与のために、医薬組成物は、例えば、慣用の手段により、製薬上許容しうる賦形剤例えば結合剤(例えば、予めゲル化したトウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース)；充填剤(例えば、ラクトース、微結晶性セルロース又はリン酸水素カルシウム)；潤滑剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク又はシリカ)；錠剤分解物質(例えば、ジャガイモ澱粉又はナトリウム澱粉グリコレート)；又は湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム)を用いて調製される錠剤又はカプセルの形態をとることができる。これらの錠剤を、当分野で周知の方法によってコートすることができる。経口投与のための液体調製物は、例えば、溶液、シロップ若しくは懸濁液の形態をとることができ、又はそれらを使用前に水その他の適当なビヒクルで戻す乾燥品として与えることもできる。かかる液体調製物は、慣用の手段によって、製薬上許容しうる添加剤例えば懸濁化剤(例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体又は水素化した食べられる脂肪)；乳化剤(例えば、レシチン又はアカシア)；非水性ビヒクル(例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール又は分画された植物油)；及び防腐剤(例えば、メチル又はプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエート又はソルビン酸)を用いて調製することができる。これらの調製物は又、緩衝剤の塩、薬味、着色剤及び甘味料をも適宜含むことができる。
【０３１４】
経口投与のための調製物を、適当に配合して、活性化合物の制御された放出を与えることができる。
【０３１５】
頬内投与のために、これらの組成物は、慣用の方法で配合された錠剤又はトローチ剤の形態をとることができる。
【０３１６】
吸入による投与のために、本発明による利用のための化合物を、都合よく、加圧されたパック又は噴霧器からの、適当な噴射剤(例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の適当なガス)の利用によるエアゾルスプレー授与の形態で送達する。加圧されたエアゾルの場合には、投薬量単位は、計量した量を送達するためのバルブを備えることによって決定することができる。吸入器又は注入器における利用のために、例えば化合物の粉末混合物及び適当な粉末ベース例えばラクトース又は澱粉を含むゼラチンのカプセル又は薬包を配合することができる。
【０３１７】
これらの化合物は、注射例えばボーラス注射又は連続的点滴による非経口投与のために配合することができる。注射用配合物は、単位投薬形態で例えばアンプルで又は多数の投与容器で、防腐剤と共に与えることができる。これらの組成物は、懸濁液、溶液またはエマルジョン(油性又は水性ビヒクル中)などの形態をとることができ、配合剤例えば懸濁化剤、安定剤及び／又は分散剤を含むことができる。或は、活性成分は、使用前に適当なビヒクル例えば無菌の発熱物質を含まない水で戻す粉末形態であってよい。一般に、水、適当な油、塩溶液、水性デキストロース(グルコース)及び関連する糖溶液及びグリコール例えばプロピレングリコール又はポリエチレングリコールは、非経口投与のための適当なキャリアーである。非経口投与のための溶液は、好ましくは、活性成分の水溶性の塩、適当な安定剤、及び必要であれば緩衝用物質を含む。抗酸化剤例えば、重硫酸ナトリウム、硫酸ナトリウム又はアスコルビン酸は、単独でも組み合わせても、適当な安定剤である。やはり用いられるのは、クエン酸及びその塩並びにエチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)ナトリウムである。加えて、非経口投与のための溶液は、防腐剤例えば塩化ベンザルコニウム、メチル又はプロピルパラベン及びクロロブタノールを含むことができる。適当な製薬用キャリアーは、Remington's Pharmaceutical Sciences (この分野の標準的参考書)に記載されている。
【０３１８】
これらの化合物は又、例えば慣用の座薬基剤(例えば、ココアバター又は他のグリセリド)を含む直腸投与用組成物例えば座薬又は滞留式浣腸器中に配合することもできる。
【０３１９】
前記の配合物に加えて、これらの化合物をデポー剤調製物として配合することもできる。かかる長期間作用する配合物は、移植(例えば、皮下又は筋肉内)により又は筋肉注射によって投与することができる。従って、例えば、これらの化合物を、適当なポリマーの又は疎水性の材料(例えば、許容しうる油中のエマルジョンとして)又はイオン交換樹脂と、又は僅かに可溶性の誘導体例えば僅かに可溶性の塩として配合することができる。
【０３２０】
加えて、標準的製薬方法を利用して、作用の持続時間を制御することができる。これらは、当分野で周知であって、制御放出用調製物を含み、適当な巨大分子例えばポリマー、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニル、ピロリドン、エチレンビニルアセテート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース又はプロタミンサルフェートを含むことができる。巨大分子の濃度並びに組込み方法を、放出を制御するために調節することができる。加えて、この薬剤は、ポリマー材料例えばポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ(乳酸)又はエチレンビニルアセテートコポリマーの粒子に組み込むことができる。組み込まれることに加えて、これらの薬剤は、マイクロカプセル内に化合物を捕捉するために利用することもできる。
【０３２１】
これらの組成物は、所望であれば、活性成分を含む一単位以上の投薬形態を含むことのできるパック又は分配装置にて提供することができる。このパックは、例えば、金属又はプラスチック箔例えばブリスターパックを含むことができる。このパック又は分配装置には、投与のための指示書を付けることができる。
【０３２２】
この発明の組成物の投与のための有用な医薬投薬形態は、以下のように説明することができる：
【０３２３】
カプセル：カプセルは、標準的な２ピース硬質ゼラチンカプセルを所望量の粉末状活性成分、１７５ミリグラムのラクトース、２４ミリグラムのタルク及び６ミリグラムのステアリン酸マグネシウムで満たすことにより調製する。
【０３２４】
軟質ゼラチンカプセル：大豆油中の活性成分の混合物を調製して、ポジティブディスプレースメントポンプ手段によってゼラチン中に注入して、所望量の活性成分を含む軟質ゼラチンカプセルを形成する。その後、これらのカプセルを洗って乾燥させる。
【０３２５】
錠剤：錠剤を、慣用の手順によって、投薬単位が所望量の活性成分、０．２ミリグラムのコロイド状二酸化珪素、５ミリグラムのステアリン酸マグネシウム、２７５ミリグラムの微結晶性セルロース、１１ミリグラムのトウモロコシ澱粉及び９８．８ミリグラムのラクトースとなるように調製する。適当なコーティングを塗布して味を良くし又は吸収を遅延させることができる。
【０３２６】
注射可能物質：注射による投与に適した非経口用組成物を、１．５重量％の活性成分を１０容積％のプロピレングリコール及び水中で攪拌することにより調製する。この溶液を塩化ナトリウムにより等張にして滅菌する。
【０３２７】
懸濁液：経口投与のために水性懸濁液を、各５ミリメートルが１００ミリグラムの微粉末化活性成分、２００ミリグラムのナトリウムカルボキシメチルセルロース、５ミリグラムの安息香酸ナトリウム、１．０グラムのソルビトール溶液(米国薬局方)及び０．０２５ミリメートルのバニリンを含むように調製する
【０３２８】
遺伝子治療投与：適宜、遺伝子治療用ベクターを、調製物中に、固体、半固体、液体又は気体形態(例えば、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、坐薬、注射、吸入剤及びエアゾル)にて、各投与経路のための通常の方法で配合することができる。当分野で公知の手段を利用して、組成物の放出及び吸収を標的器官に到着するまで防止し又は該組成物の徐放性を確実にすることができる。本発明の組成物を無効にしない製薬上許容しうる形態を利用すべきである。医薬投薬形態において、これらの組成物は、単独で利用しても他の製薬上活性な化合物との適当な結合並びに組合せにて用いてもよい。
【０３２９】
従って、本発明の医薬組成物は、様々な経路により、動物の身体の様々な部位に送達して特定の効果を達成することができる(例えば、Rosenfeld等、1991, 前出、Rosenfeld等、1991, Clin.Res.,39(2),311A；Jaffe等、前出及びBerkner, 前出参照)。当業者は、投与のために一つより多くの経路を利用することができても、特定の経路が他の経路よりも一層直接的で一層有効な反応を与えるということを認めるであろう。局所送達又は全身送達を、配合物の塗布又は体腔内への点滴、エアゾルの吸入又は注入を含む投与により、又は筋肉内投与、静脈内投与、腹腔投与、皮下投与、経皮的投与並びに局所投与を含む非経口的導入によって達成することができる。
【０３３０】
本発明の組成物は、単位投薬形態で与えることができ、各投薬単位例えば茶さじ一杯分、錠剤、溶液、又は坐薬は、予め決めた量の組成物を単独で又は他の活性な薬剤と共に含む。用語「単位投薬形態」は、ここで用いる場合、ヒト又は動物患者のための単一式投薬に適した物理的に別個の単位をいい、各単位は、予め決めた量の本発明の組成物を単独で又は他の活性な薬剤と共に含み、適宜、製薬上許容しうる希釈剤、キャリアー又はビヒクルと共同で所望の効果を生じるのに十分な量にて計算されたものである。本発明の単位投薬形態の規格は、特定の宿主において達成すべき特定の効果及び医薬組成物と関連する特定の薬力学に依存する。
【０３３１】
本発明の組成物は、持続的放出及び／又は徐放性配合物として配合することもできる。かかる持続的及び／又は徐放性配合物は、当業者に周知の持続的放出手段又は送達装置例えば米国特許第３，８４５，７７０号；３，９１６，８９９号；３，５３６，８０９号；３，５９８，１２３号；４，００８，７１９号；４，７１０，３８４号；５，６７４，５３３号；５，０５９，５９５号；５，５９１，７６７号；５，１２０，５４８号；５，０７３，５４３号；５，６３９，４７６号；５，３５４，５５６号；及び５，７３３，５６６号(これらの開示を参考として本明細書中に援用する)に記載されたものによって作成することができる。本発明の医薬組成物を利用して、少なくとも一種の活性成分のゆっくりした又は持続的な放出を、例えば、ヒドロプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリクス、ゲル、透過性膜、浸透圧系、多層コーティング、微粒子、リポソーム、ミクロスフェアなどを利用して与えて、所望の放出プロフィルを割合を変えて与えることができる。ここに記載のものを含む当業者に公知の適当な持続的放出用配合物は、この発明の医薬組成物を用いる用途に関して容易に選択することができる。従って、経口投与に適した単一の単位投薬形態例えば、限定はしないが、持続的放出のために適合される錠剤、カプセル、ゲルキャップ、キャプレッツ、粉末などは、本発明に包含される。
【０３３２】
従って、本発明は又、治療用遺伝子を宿主にトランスファーする方法であって、本発明のベクターを、好ましくは組成物の部分として、前記の何れかの投与経路又は当業者に公知で特定の適用に適した別の経路を利用して投与することを含む当該方法をも提供する。組成物の「有効な量」は、宿主において所望の効果を生じるようなものであって、当業者に公知の幾つかの終点を利用してモニターすることのできるものである。本発明によるベクターの宿主細胞への有効な遺伝子トランスファーは、治療効果(例えば、治療された特定の病気と関連するある種の症状の緩和)により、又は更に、トランスファーされた遺伝子若しくは該遺伝子の宿主における発現の証拠によってモニターすることができる(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を配列決定法、ノーザン若しくはサザーンハイブリダイゼーション、又は宿主細胞中の核酸を検出する転写アッセイと共に利用し、又はイムノブロット分析、抗体媒介による検出、ｍＲＮＡ若しくはタンパク質半減期研究、又はトランスファーされた核酸によりコードされ又はかかるトランスファーによりレベル若しくは機能が強く影響されたタンパク質若しくはポリペプチドを検出する特殊アッセイを利用する)。
【０３３３】
ここに記載したこれらの方法は、決してすべてを含んだものではなく、特定の適用に適した更なる方法が当業者には明らかとなろう。その上、これらの組成物の有効な量は、更に、所望の効果を発揮することが知られた化合物からの類推によって概算することができる。
【０３３４】
その上、実際の投与量及び投与スケジュールは、組成物を他の医薬組成物と組み合わせて投与するかどうかにより、又は薬物動力学、薬物処理及び代謝の個体間の差異によって変わりうる。同様に、量は、イン・ビトロ適用において、利用する特定の細胞株によって変わりうる(例えば、細胞表面に存在するアデノウイルスレセプターの数に基づき、又は遺伝子トランスファーのために利用する特定のベクターの細胞株内で複製する能力に基づいて)。更に、細胞当たり加えるべきベクターの数が、該ベクターに挿入される治療用遺伝子の長さ及び安定性並びにその配列の性質によって変化することはありそうなことであり、又、特に経験的に決定することが必要なパラメーターであって、本発明の方法に固有でない因子(例えば、合成に関係するコスト)によって変わりうる。当業者は、特定の状況の緊急性に応じて、容易に必要な調整を行なうことができる。
下記の実施例は、例として与えるものであり、何れにしても、この発明の範囲を制限することを意図するものではない。
【０３３５】
６．実施例：レプチンと骨量との間の関係
６．１．動物の生成、特性決定及び治療
種畜及び変異体マウス(Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ Ｌｅｐob、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ Ｌｅｐｒdb、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ Ａy／a)をJackson Laboratoryから購入した。Ａ−ＺＩＰ／Ｆ−Ｉトランスジェニックマウスの生成は、以前に報告された(Moitra等、1998, Genes Dev 12, 3168-3181)。遺伝子型分類を、確立されたプロトコールに従って行なった(Chua等、1997, Genomics 45, 264-270；Moitra等、1998, Genes Dev 12, 3168-3181；Namae等、1998, Lab Animal Sci 48, 103-104)。動物には通常の食餌(ピュリーナ＃５００１)を与え又は、示した場合には、高脂肪／高炭水化物食餌(Bio-serv＃Ｆ３２８２)を与えた。骨試料を記載されたように処理した(Ducy等、1999, Genes Dev 13, 1025-1036)。
【０３３６】
６．２．ｏｂ／ｏｂ及びｄｂ／ｄｂマウスにおける骨量表現型の指示
性機能低下症は、破骨細胞数及び骨再吸収活性の増大を誘導し、これは、低骨量表現型へと導く(Riggs & Melton, 1986, N Engl J Med 314, 1676-1678)。従って、視床下部起源の性機能低下症を有するｏｂ／ｏｂマウスは、野生型の同腹子よりも一層低い骨量を有するはずである(Ahima等、1996, Nature 382, 250-252；Chehab等、1996, Nat Genet 12, 318-320；Ahima等、1997, J Clin Invest 99, 391-395)。ｏｂ／ｏｂマウスの肥満が、それらの予想される低骨量表現型に影響を与えうるかどうかを決定するために、６月齢の野生型及びｏｂ／ｏｂマウスの脊椎骨及び長骨のＸ線分析をＦａｘｉｔｒｏｎ(Phillips)を利用して行なった。驚くべきことに、ｏｂ／ｏｂマウスの骨は、それらの同腹子のものよりずっと高密度であることが明らかとなり(図１Ａ)、これは、一層多量の鉱質化骨マトリクスの存在を示している。骨量の異常を定量するＸ線の弱い感度の故に、骨密度の増大は、骨構造の主要な変化(即ち、骨マトリクスの３０％より多くに影響する変化)の指示であった。
【０３３７】
組織学的分析を、フォン−コッサ試薬で染色してＫｅｒｎｅｃｈｔｒｏｔで対比染色した脱石灰してない切片について行なった。３及び６月齢マウスにおいて、野生型と比較してｏｂ／ｏｂマウスの骨において、多くの一層厚い小柱の存在が認められた(図１Ｂ)。皮質骨は、影響を受けなかった。標準的技術による組織形態学的定量(Parfitt等、1987, J Bone Min Res 2, 595-610)を、オステオメジャー・アナリシス・システム(Osteometrics,Atlanta在)を利用して行なった。グループ(ｎ＝４〜６)間の統計的差異をスチューデント検定によって評価した。これらの実験は、野生型の同腹子と比較してｏｂ／ｏｂマウスの長骨及び脊椎骨におけるほぼ２倍の小柱骨容積の増大を示した(図１Ｃ)。この表現型は、両性において認められた。この骨量の増大の機能的結果を、６月齢のｏｂ／ｏｂマウス、野生型マウス及び、卵巣摘出して４ヶ月間ｏｂ／ｏｂマウスの性機能低下症状態を真似た野生型マウス(野生型ｏｖｘ)の長骨の生体力学的特性を比較することにより分析した。大腿骨をサーボハイドリック試験機(Zwick GmbH & Co.)で、一定変位速度１０ｍｍ／分にて３点曲げにより破壊検査するアッセイを利用して、破壊荷重を測定した(これが、骨の強さの尺度である)。野生型及びｏｂ／ｏｂマウスの骨の破壊荷重は、区別できなかったが、野生型ｏｖｘマウスの骨において認められたものより有意に高かった(図１Ｄ)。この結果は、レプチンの欠損が骨の生体力学的特性に有益な効果を有することを示している。レプチンレセプターの不活性化変異を有するｄｂ／ｄｂマウスの骨の分析も又、行なわれた(Tartaglia等、1995, Cell 83, 1263-1271)。ｏｂ／ｏｂマウスと同様に、ｄｂ／ｄｂマウスは、肥満で且つ性機能低下症である。長骨及び脊椎骨の両方において、ｏｂ／ｏｂマウスで認められたのと同様な小柱数の増大があり(図１Ｅ)、骨容積の野生型マウスと比較しての３倍増を生じた(図１Ｆ)。この後者の結果は、遺伝的に、レプチンシグナルが、その公知のレセプターを介して骨量に影響を与えることを示している。
【０３３８】
６．３．ｏｂ／ｏｂ及びｄｂ／ｄｂマウスの高骨量表現型は、レプチンシグナリングの非存在に従い、肥満に従うものではない
ｏｂ／ｏｂ及びｏｂ／ｄｂマウスの高骨量表現型は、これらのマウスのレプチンシグナリングの欠如又は肥満に従って二次的に起きうるものであった。これらの２つの可能性を区別するために、変異体マウスの幾つかの追加のグループを、実施例６．２におけるように高骨量表現型について分析した。先ず、ｏｂ／ｏｂマウスにおける肥満の出現を遅らせる低脂肪食餌を、ｏｂ／ｏｂマウスに与えたところ、それらのマウスは、１月齢で正常な体重を有した。しかしながら、これらのマウスは、既に高骨量表現型をその月齢で有した(図２Ａ)。第二に、肥満でないヘテロ接合体のレプチン欠損マウス(ｏｂ／＋)を分析した。これらの動物は又、高骨量表現型をも有した(図２Ｂ)。第三に、レプチンシグナリングに第一義的に関連していない他の肥満のマウスモデルの骨を分析した。他の肥満の遺伝的モデルのアグーチイェロー(Ａy／a)マウス(Herberg及びColeman, 1977, Metabolism 26,59-99)は、高脂肪食餌を摂取した野生型マウスのように、正常な骨量を有した(図２Ｃ及び２Ｄ)。
【０３３９】
従って、高骨量表現型の、肥満の出現前のｏｂ／ｏｂマウス及び肥満でないｏｂ／＋マウスにおける存在、並びにレプチンと関連しない肥満のモデルにおける非存在は、この高骨量表現型を引き起こすのはレプチンシグナリングの非存在であって肥満ではないことを示している。
【０３４０】
６．４．ｏｂ／ｏｂ及びｄｂ／ｄｂマウスにおいて増大した骨芽細胞機能
骨量の増大は、骨芽細胞の骨形成の増大、破骨細胞による骨の再吸収の減少、又は両者の異常の組合せのためでありうる。骨芽細胞機能をイン・ビボで研究するために、骨形成速度を、記載されたように(Ducy等、1999, Genes Dev 13:1025-1036)、カルセイン、新たに形成された骨(図３Ａ)のマーカーで二重標識後に定量した。カルセインを８日間隔で２回注射し、２日後に動物を犠牲にした。３月齢及び６月齢のｏｂ／ｏｂマウスにおいて、野生型の同腹子と比較して、それぞれ、７０％及び６０％の、骨形成速度の増大があった(図３Ｂ)。この結果は、これらのｏｂ／ｏｂマウスの高骨量表現型が、少なくとも部分的に、骨形成活性の増大のためであることを示した。珍しいことに、骨形成速度の甚だしい増大を考慮すると、骨芽細胞の表面並びに骨芽細胞数は、ｏｂ／ｏｂマウスで増大しなかった(これは、レプチン欠損が骨芽細胞の機能に影響するが誕生後のそれらの分化に影響しないことを示している)(図３Ｃ)。同様に、ｄｂ／ｄｂマウスのカルセイン標識は、正常数の骨芽細胞にもかかわらず、長骨及び脊椎骨の両方における骨形成速度の増大を示した(図３Ｄ及び３Ｅ)。予想されるように、性機能低下症の存在により、破骨細胞数は、両変異体マウスで増大し(図３Ｆ)、これは、ｏｂ／ｏｂ及びｄｂ／ｄｂマウスの高骨量表現型が、骨再吸収の増大にもかかわらず、発生しえたことを示唆している。
【０３４１】
レプチンシグナリングの非存在の骨芽細胞機能に対する効果の特異性を、上記の対照用動物の同じグループを利用して測定した。１月齢のｏｂ／ｏｂ動物に低脂肪食餌を与え、ヘテロ接合体のレプチン欠損マウス(これらの両方とも痩せていた)も、骨形成速度が有意に増大した(図３Ｇ)。対照的に、ｒ／ａ変異体マウス並びに野生型マウスには、高脂肪食餌を与え、レプチンと無関係の２肥満モデルは、正常の骨形成パラメーターを有した(図３Ｈ)。
【０３４２】
６．５．ｏｂ／ｏｂマウスにおける破骨細胞機能の分析
高骨量表現型と性機能低下症の共存は、非常に異例なことなので、骨の再吸収がこれらのマウスにおいて欠損しうるという仮説が立てられた。骨の再吸収の生化学的マーカーのデオキシピリジノリン架橋(Ｄｐｄ)(Eyre等、1988, Biochem 252,494-500)のｏｂ／ｏｂマウスにおける増大した尿排出は、この仮説に対する反証となった(野生型：１０．５±２．５ｎＭ Ｄｐｄ／ｍＭ クレアチニン；ｏｂ／ｏｂ：２４．０ｂ４．０ｎＭ Ｄｐｄ／ｍＭ クレアチニン)。デオキシピリジノリン架橋を、朝の尿において、ピリリンクス−Ｄイムノアッセイキット(Metra Biosystem)を利用して測定した。クレアチニン値を、試料間での標準化のために利用した(クレアチニンキット、Meta Biosystem)。１７β−エストラジオール及びレプチンの濃度を、それぞれ、第三世代エストラジオールキット(Diagnostic system laboratories)及びマウスレプチンＲＩＡキット(Linco)を利用して、ラジオイムノアッセイにより定量した。エストラジオールは、エストロゲン類似体であり、選択的エストロゲンレセプターモジュレーター(ＳＥＲＭ)でもある。エストロゲン類似体とＯｂ又はＯｂＲインヒビターとの同時投与は、高骨量表現型を更に増大させる。
【０３４３】
それにもかかわらず、この問題点を更に徹底的に扱うために、ｏｂ／ｏｂマウスの性機能低下症を利用した。性機能低下症は、通常、破骨細胞数及び骨の再吸収活性の増大へと導く。従って、もしｏｂ／ｏｂマウスの破骨細胞が機能的であれば、これらのマウスの性機能低下症を矯正することは、それらの骨再吸収速度を、破骨細胞数を減少させることにより低下させ、それにより、骨量を更に増大させるはずである。他方、もしｏｂ／ｏｂマウスの破骨細胞が適当に機能性でないならば、それらの性機能低下症を矯正することは、それらの高骨量表現型の激しさに影響しないはずである。これらの２つの可能性の何れが正しいかを決定するために、１７β−エストラジオール又はプラシーボペレット(Innovative Research of America)を、２月齢の雌のｏｂ／ｏｂマウスの皮下に移植して、２５０ｐｇ／ｍＬの血清濃度を維持した。これらの動物を、３ヶ月の治療期間の後に分析した。
【０３４４】
予想されるように、エストラジオール処理は、子宮の状況及び血中エストラジオールのレベルにより判断して、性機能低下症を矯正し(図４Ａ)、更に、破骨細胞数の標準化を生じた(図４Ｃ)。それは又、プラシーボ処理されたｏｂ／ｏｂマウスと比較して、これらのマウスの高骨量表現型の更なる増大にも導き、従って、ｏｂ／ｏｂマウスにおける高骨量表現型の起源としての骨再吸収の欠損を排除した(図４Ｂ)。エストラジオール処理されたｏｂ／ｏｂマウスは、エストラジオール処理された野生型マウスと比較して、５０％の骨容積の増加を有し、未処理の野生型マウスと比較して、処理期間の最後において３倍増であった(図４Ｄ)。同様の結果が、テストステロンインプラントで処理した雄のｏｂ／ｏｂマウスにおいて得られた。最後に、ｏｂ／ｏｂ及びｄｂ／ｄｂマウスの破骨細胞の機能をイン・ビトロで、野生型、ｏｂ／ｏｂ、又はｄｂ／ｄｂマウスに由来する造血前駆細胞及びこれらの細胞の機能的な破骨細胞への分化を誘導することが知られた成長因子を利用するアッセイにおいて研究した。マウスの破骨細胞を、以前に報告されたプロトコールに従って、イン・ビトロで生成させた(Simonet等、1997, Cell 89,309-319；Quinn等、1998, Endocrinology 139,4424-4427)。ｗｔ、ｏｂ／ｏｂ及びｄｂ／ｄｂマウスの骨髄細胞を、１０６細胞／ウェルの初期密度で２４ウェル組織培養プレート上又は象牙質チップ上で、１０％ ＦＢＳ(Hiclone)、マウスＭ−ＣＳＦ ４０ｎｇ／ｍＬ(Sigma)、ＲＡＮＫＬ／ＯＤＦ ２５ｎｇ／ｍＬ(Peprotech)、１０-8Ｍ デキサメタゾン(Sigma)及び１０-8１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３を含むα−ＭＥＭ(Sigma)中で培養した。培地を一日おきに交換した。６日間の培養の後に、細胞を３．７％ホルマリン中で固定した。プラスチックプレート上に形成された破骨細胞を、タルトレート耐性酸性ホスファターゼに対して染色した。象牙質チップ上の細胞を、次亜塩素酸ナトリウム溶液による処理により除去した。次いで、象牙質チップを、トルイジンブルーで染色して、再吸収ピットを可視化した。
【０３４５】
図４Ｅに示したように、野生型、ｏｂ／ｏｂ、及びｄｂ／ｄｂの造血前駆細胞は、マトリクスを再吸収することのできる破骨細胞に同程度に良好に分化した。
【０３４６】
従って、これらの実験は、ｏｂ／ｏｂ及びｄｂ／ｄｂマウスにおいて、破骨細胞の検出可能な機能的欠損はないことを示しており、これらのマウス変異体系統の高骨量表現型が専らレプチンシグナリングの非存在に次ぐ二次的な骨形成の増大から生じることを確立している。
【０３４７】
６．６．骨芽細胞におけるレプチンシグナリングの非存在
以前の分析は、レプチンが骨芽細胞による骨形成のインヒビターであることを示している。その上、ｄｂ／ｄｂマウスにおける高骨量表現型の存在は、レプチンがこの機能を遂行するにはその公知のレセプターに結合しなければならないことを示している。理論において、レプチンは、骨芽細胞に直接作用することもできるし、間接的に脂肪に存在する第二の因子の放出を介して作用することもできるし、又は視床下部経路を利用することにより作用することもできる(体重の制御の場合)。これらの３つの可能な作用機構を試験した。
【０３４８】
骨芽細胞中のレプチンの発現を、野生型マウスに由来する骨芽細胞の準集密的一次培養であって、１０％ ＦＢＳ鉱質化培地に４日間維持してから０．５％培地に切り替え、そして毎日交換する当該一次培養において研究した。８０ｎｇ／ｍＬ レプチン(Sigma)又は４０ｎｇ／ｍＬ オンコステインＭ(R & D Diagnostics)又はビヒクルでの２０分間の処理の２時間前に培地を交換した。ＲＮＡ抽出を、Triazol(Gibco)を利用して行なった。ノーザンブロットを、１５μｇの全ＲＮＡを用いて、当分野で周知の方法により行なった。
【０３４９】
骨芽細胞中のレプチンの発現は、長期間フィルムに露出した後でさえ、検出されず、これは、オートクリン調節がありそうにないことを示している(図５Ａ)。レプチン発現は又、全骨試料においても検出されず、これは、レプチンによる骨芽細胞機能のパラクリン調節に反対する間接的証明を与えるものである(図５Ａ)。何れにせよ、レプチンによる骨芽細胞機能のパラクリン及び／又はエンドクリン調節は、機能的なレプチンレセプターが骨芽細胞に存在することを必要とする。幾つかのレプチンレセプターの転写物があるが、唯一つＯｂ−Ｒｂのみが、シグナル変換能を有すると考えられる(Tartaglia等、1995, Cell83,1263-1271；Chen等、1996, Cell 84,491-495；Lee等、1996, Nature 379,632-635)。レプチンレセプターのこの転写物の発現は、厳密に視床下部特異的ではないけれども、高い。ＲＴ−ＰＣＲ実験を行なって、Ｏｂ−Ｒｂ転写物を、一次骨芽細胞及び全骨試料において検索した。Ｏｂ−Ｒｂ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析(２７サイクル)を、下記のプライマーを利用して行ない、ランダムプライムドｃＤＮＡにて行なった：
【化３】
2005516001.tif 000005
(Friedman & Halaas, 1998, Nature 395,763-770)。Ｈｐｒｔの増幅を、下記のプライマーを利用して、ｃＤＮＡ品質の内部対照として利用した：
【化４】
2005516001.tif 000006
【０３５０】
視床下部においてＯｂ−Ｒｂ転写物を検出するために必要な多くの増幅サイクルを利用する幾つかの実験において、頭蓋冠、長骨及び骨芽細胞一次培養物では、Ｏｂ−Ｒｂ発現は検出されなかった(図５Ｂ)。
【０３５１】
レプチンがそのシグナルを骨芽細胞において変換することができるか否かを決定するために、野生型マウスから単離して血清飢餓状態にした一次骨芽細胞を、レプチンで処理した。新生野生型又はｄｂ／ｄｂマウスの頭蓋冠に由来する一次骨芽細胞培養物を、以前に記載されたように樹立して(Ducy等、1999, Genes Dev 13,1025-1036)、１０％ＰＢＳを補った鉱質化培地(αＭＥＭＩ０．１ｍｇ／ｍＬ アスコルビン酸；５ｍＭ α−グリセロホスフェート)中に維持した。変異体細胞の培養物をこの培地中に、分析前に、１５日間維持した。野生型マウスに由来する培養物を１０日間にわたって維持してから、血清のパーセンテージを０．５％まで減少させ、該培地に１．２μｇ／ｍＬのレプチン又はビヒクルを５日間補った。
【０３５２】
標的細胞のレプチンシグナリングの下流のエフェクターであるＳｔａｔ３(Tartaglia等、1995, Cell 83, 1263-1271；Baumann等、1996, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93,8374-8378；Ghilardi等、1996, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93, 6231-6235；Vaisse等、1996, Nat Genet 14,95-97)のリン酸化を、標的細胞のレプチン処理後に転写が増大する(Elmquist等、1997, Endocrinology 138,839-842)２つの最初期遺伝子の発現に加えてモニターした。骨芽細胞においてＳｔａｔ３のリン酸化を誘導して該２つの最初期遺伝子の発現を活性化するオンコスタチンＭ(Levy等、1996, Endocrinology 137,1159-1165)を、陽性対照として利用した。ウエスタンブロット分析を行なって、Ｓｔａｔ３のリン酸化を次のように測定した。細胞を溶解させ、タンパク質抽出物を、７．５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、当分野で公知の方法によりイムノブロッティングアッセイのためにニトロセルロース(Biorad)上にブロットした。Ｓｔａｔ３のリン酸化の分析を、ホスホプラスＳｔａｔ３(Ｔｙｒ７０５)抗体キット(New England Biolabs)を利用して、製造業者の指示に従って行なった。
【０３５３】
図５Ｃに示したように、骨芽細胞のオンコスタチンＭによる処理は、Ｓｔａｔ３のリン酸化を誘導したが、レプチン処理は誘導しなかった。生理的及び超生理的な幾通りかのレプチンの投与量をこの実験で利用した(それらのすべては、Ｓｔａｔ３リン酸化を誘導することができなかった)。同様に、Ｔｉｓ１１及びｃ−ｆｏｓの発現は、迅速且つ一時的にオンコスタチンＭによって活性化された(標準的ノーザン分析法により分析)が、レプチンによっては活性化されなかった(図５Ｄ)。最後に、野生型マウスに由来する一次骨芽細胞培養物の長期間のレプチン処理の、細胞外マトリクス合成及び骨マトリクス鉱質化における効果を測定した。コラーゲンリッチな細胞外マトリクス及び鉱質化小節の存在を、それぞれ、培養物のファン・ギーソン及びフォン・コッサ試薬による全載染色によって評価した。コラーゲン合成又は鉱質化小節形成を評価した際に、対照とレプチン処理した培養物との間で差異が認められなかった(図５Ｅ)。
【０３５４】
最後に、もし機能的レプチンレセプターが骨芽細胞にないならば、野生型及びｄｂ／ｄｂ骨芽細胞は、エキソ・ビボ培養において区別がつかない。ｄｂ／ｄｂ及び野生型マウスに由来する骨芽細胞の一次培養物を、真正の細胞外マトリクスを生成してそれを鉱質化する能力について分析した。分析したすべてのパラメーター(アルカリホスファターゼ染色、Ｉ型コラーゲン生成及び鉱質化小節形成)について、野生型とｄｂ／ｄｂ骨芽細胞一次培養物の間で差異はなかった(図５Ｆ)。まとめると、これらの結果は、完全な動物における骨形成に対するレプチンの作用が骨芽細胞に局在しているレセプターにレプチンが結合することを必要としないことを示している。
【０３５５】
６．７．脂肪組織の非存在下における高骨量
このレプチンの作用が脂肪の存在を必要としうる可能性を扱うために、専ら含脂肪細胞においてＡ−ＺＩＰと呼ばれる優性ネガティブタンパク質を発現するトランスジェニックマウスを利用した(Moitra等、1998, Genes Dev 12,3168-3181)。この優性ネガティブタンパク質は、殆どのＢ−ＺＩＰ転写因子(含脂肪細胞の分化に臨界的な転写因子のクラス)のＤＮＡ結合能を完全に破壊する。その結果、Ａ−ＺＩＰ／Ｆ−１トランスジェニックマウスは、レプチンシグナリングにより脂肪調節される型である白色脂肪組織を有さず、劇的に減少した量の不活性な褐色脂肪組織を有する。それらは又、レプチン合成においても、２０倍の減少を有する(Moitra等、1998, Genes Dev 12,3168-3181)。Ａ−ＺＩＰ／Ｆ−１トランスジェニックマウスにおいて、ｏｂ／ｏｂ及びｄｂ／ｄｂマウスで見られたのとと同じ、骨芽細胞機能の増大による、高骨量表現型が認められた(図６)。
【０３５６】
この実験は、２つの暗示を有している。第一に、それは、高脂肪インデックスではなくレプチン欠乏が、ｏｂ／ｏｂ及びｄｂ／ｄｂマウスの高骨量表現型の原因であるということを確実にする。第二に、それは、脂肪組織が骨形成に対するレプチンの作用のリレーに必要でないことを示している。
【０３５７】
６．８．レプチンの脳室内注入は、ｏｂ／ｏｂマウスの高骨量表現型を矯正する
最後に、レプチンがその視床下部のレセプターに結合する結合することが、肥満表現型を救済するように、ｏｂ／ｏｂマウスの高骨量表現型を矯正するかどうかの問題を扱った。その目的のために、ＰＢＳ又はレプチンをｏｂ／ｏｂマウスの第三脳室内に送達する(８ｎｇ／時間)ポンプを、次のように挿入した。動物をアベルチンで麻酔して、定位装置(Stoelting)上に位置させた。頭蓋冠を露出させて、前頂にドリルで０．７ｍｍの孔を開けた。２８ゲージのカニューレ(ブレイン・インフュージョン・キットＵ、Alza)を、次の座標に従って第三脳室内に移植した：正中線、−０．３ＡＰ、３ｍｍ腹側(０ポイント前頂)。このカニューレを頭蓋骨にシアノアクリレートを用いて固定し、この動物の背側皮下間隙に位置させた浸透ポンプ(Alza)に至るタイゴンチューブを取り付けた。送達速度は、毎時０．２５μｌ(８ｎｇ／時間のレプチン(Sigma))とし又はＰＢＳを２８日間にわたって送達した。この投薬量は、以前に全身投与した際に、何の効果も有しないことが示されている(Halaas等、1997, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:8878-8883)。ｏｂ／ｏｂマウスの生物学的状況に可能な限り近付けるために、これらのポンプを挿入された動物を卵巣摘出して、それらの性機能低下症の矯正による骨量の人為的増加を回避した。これらのポンプを同じ位置に２８日間置き、カルセインによる二重標識を行なって、骨形成のパラメーターを測定した。
【０３５８】
古典的な組織学は、レプチン処理したマウスの骨は正常の外観を回復するがＰＢＳ処理したマウスでは回復しないことを示した(図７Ａ)。それらは、一層少ない小柱を有し、これらの小柱は、ＰＢＳ処理したｏｂ／ｏｂマウスにおけるよりも一層規則的に見えた。骨容積、小柱の厚み及び骨形成速度は、すべて、レプチン処理されたマウスでは有意に減少した(図７Ａ)。これらの動物の血清において、レプチンは、特異的ラジオイムノアッセイを利用して検出されなかった。レプチンの脳室内注入及び測定可能な循環レプチンの非存在による骨表現型の救済は、骨形成の制御が神経内分泌レプチン依存性機能であることを示している。
【０３５９】
７．実施例：レプチン、骨量及び交感神経活動状態の間の関係
レプチンは、骨形成を阻害し、レプチン欠損(ｏｂ／ｏｂ)マウスにおけるレプチンの脳室内(ＩＣＶ)注入は、それらの高骨量(ＨＢＭ)表現型を矯正し、これは、この調節の主要な性質を示している。ｏｂ／ｏｂマウスの間での交差循環実験と、その後の各動物ペアの一方へのレプチンのＩＣＶ注入は、この調節ループにおける遠心性シグナルが液性でないことを示す。体重に対するレプチン作用のメディエーターであるメラノコルチンシグナリング欠損の変異体マウスの分析は、如何なる骨の異常も同定できず、これは、他の経路がレプチンの骨形成調節機能を媒介していることを示唆している。レプチン欠損は、交感神経系の活動を低下させ、カテコールアミン合成に必要な酵素が欠乏したマウスは、ＨＢＭ表現型を有する。その上、ｏｂ／ｏｂマウスの交感神経様作動薬による処理は、それらのＨＢＭ表現型を矯正する。この実施例は、交感神経系の、骨形成のレプチン調節のエフェクターとしての同定を記載し、交感神経系モジュレーターが骨の病気の治療に利用できることを示す。
【０３６０】
免疫細胞化学。３日齢のＣ５７ＢＬ６マウスの脛骨を切り出して、直接ＯＣＴコンパウンド中で凍結させた。ミクロンクリオスタットを利用して、１２ミクロンの切片を作成した。これらの切片を固定して、５％血清中でブロックし、そしてβ１、β２及びβ３アドレナリン作動性レセプターに対する一次抗体(Santa Cruz Biotechnology)と共にインキュベートした。洗浄後、抗原抗体複合体を、可視化のためのペルオキシダーゼに結合させた二次抗体とのインキュベーションによって検出した。
【０３６１】
交差循環実験(並体結合)手順。標準的手順により麻酔した後に、外科手術を、十分な麻酔と無菌技術の下で行なう。各マウスの一方の側に沿って縦に切り口をもうけて、皮膚を結合組織から離す。切り口の腹側の縁を縫糸により結合する。各マウスの腹腔を開いて、結合させて腹腔の交差連絡を行なう。最後に、皮膚の切り口の背側の縁を結合させる。並体結合したマウスを、その後、別々のケージに収容する。この手順で用いるマウスは、免疫反応を回避するために同系のものである。処理期間の最後に、骨組織学及び組織形態学を行なって、骨量を測定する。
【０３６２】
ベータアゴニストのイソプロテレノールを、４週齢のｏｂ／ｏｂマウスに、１日当たり３０ｍｇ／ｋｇの投与量で腹腔内注射した。６週間の処理の後に、これらのマウスを解剖して、骨を第６．２節に記載したように、Ｘ線及び組織形態学により分析した。
【０３６３】
イン・ビボで、レプチンは、骨芽細胞による骨形成を阻害し、その結果、ｏｂ／ｏｂ、ｄｂ／ｄｂ及びリポジストロフィーマウス並びにレプチンシグナリングの欠如又は欠乏を共有するヒトは、体重に無関係に、高骨量(ＨＢＭ)表現型を有する。ｏｂ／ｏｂ及びｄｂ／ｄｂマウスのＨＢＭ表現型は、性機能低下症と共存し、現在までのところ、レプチン欠損は、高骨量と性機能低下症との共存を生じる唯一の知られた状況である。この最後の特徴は、骨の生物学におけるこの調節の重要性の基礎となる。中枢へのレプチンの注入は、レプチン欠損マウスと野生型マウスの両者における骨量並びに骨形成パラメーターを減少させ、それにより、骨形成の調節における主要な構成要素の存在を示している。
【０３６４】
脳からのシグナル放射及び骨形成の制御が液性であるかどうかを決定するために、交差循環(並体結合)実験を、ｏｂ／ｏｂマウス間で行なった。交差循環を確立して確認してから４週間後に、各並体結合ペアの一方のマウスに、レプチンＩＣＶ(８ｎｇ／時)を送達するポンプを取り付けた。血液脳関門を通過する漏れのないことを、これらの動物の血漿中に測定可能なレプチンがないことにより確認した。もしレプチンが、体重及び骨量を制御するのに液性手段を利用するならば、各ペアの両方のマウスがレプチン注入に対して等しく応答するはずであると推論して、各ペアの同側性及び対側性マウスの体重及び骨組織学を４週間後に分析した。前に示したように、体重及び骨容積は、レプチンＩＣＶを受けたｏｂ／ｏｂマウスにおいてかなり低下した。対照的に、すべての並体結合したマウスの対側性マウスにおける体重又は骨容積の喪失は、認められなかった。これらの結果は、骨形成を制御するレプチン依存性ループにおける遠心性シグナルが液性でないことを示唆している。
【０３６５】
プロ−オピオメラノコルチン(ＰＯＭＣ)ニューロンのレプチン活性化は、欲望と体重の調節におけるその機能に寄与する。ＰＯＭＣニューロンがレプチンの骨形成調節機能にも寄与するかどうかを決定するために、我々は、脳内のＰＯＭＣシグナリングに欠陥を有して、遅発性の肥満及びレプチンの食欲不振誘発機能に対する耐性を生じる致死性アグーチ(Ａｙ)マウスを研究した。Ａｙマウスは、異常な骨量を有し、これらのマウスにおけるレプチンのＩＣＶ注入は、それらの体重に影響を与えずに骨量の有意の減少へと導く。この結果は、レプチンが、メラノコルチンシグナリングの非存在下で骨量に影響しうることを示している。次に、脳特異的なメラノコルチンレセプターであるメラノコルチン４レセプター(ＭＣ４−Ｒ)が欠損したマウスを研究した。肥満で且つインシュリン過剰のＭＣ４−Ｒ欠損マウスは、正常の骨量及び正常の骨形成パラメーターを１及び３月齢で有する。まとめると、これらの２つの変異体マウス系統の分析は、ＰＯＭＣニューロンがレプチンによる骨形成の調節における主要なリレーでないことを示しており、これは、他のメディエーターが骨量の制御に関与していることを示唆している。これらの変異体マウスの分析は、骨形成の主要な調節の他の面をも扱った。実際、レプチンシグナリングの非存在下でのＨＢＭ表現型の存在により高められた合理的関心は、それがこれらの動物で認められたインシュリン過剰により説明されうるというものであった。Ａｙ及びＭＣ−４Ｒ欠損マウスの研究は、これは、これらの２変異体マウスモデルが、重いインシュリン過剰の存在を特徴とし尚且つ正常の骨量を有するのでありそうにないということを示している。
【０３６６】
交感神経が骨形成の調節に関与するかどうかを決定するために、ドーパミンのノルエピネフリンへの変換に必要な酵素であるドーパミンβヒドロキシラーゼ(ＤＢＨ)が欠損したマウスを研究した。図８に示したように、ＤＢＨ欠損マウスは、ＨＢＭ表現型を有する。レプチンシグナリングの非存在下で認められるものと同様に、この表現型は、時間と共に一層ひどくなり、骨形成パラメーターの増加に次いで生じる二次的なものである。骨再吸収のバイオマーカーであるデオキシピリジノリンの尿中排出は、ＤＢＨ欠損マウスにおいて正常であり、これは、骨再吸収の欠損がＨＢＭ表現型の原因であることを示している。
【０３６７】
８．実施例：交感神経系による骨形成のニューロン性調節
この実施例では、レプチン依存性の抗骨形成性視床下部ネットワークが、レプチンの食欲不振誘発機能を媒介するニューロペプチドが骨形成に影響しないこと及びレプチンの抗骨形成機能の抹消メディエーターがニューロン性でありうることを示す。レプチン欠損は、低い交感神経活動状態を生じ、マウスにおけるアドレナリン作動性シグナリングの遺伝的及び薬理学的消耗は、レプチン耐性の高骨量及び骨芽細胞上のβ−アドレナリン作動性レセプター(該細胞の増殖及び機能を調節する)へと導く。従って、β−アドレナリン作動性アゴニストは、レプチン欠損及び野生型マウスにおいて骨量を減少させ、β−アドレナリン作動性アンタゴニストは、野生型及び卵巣摘出したマウスにおいて骨量を増大させる。これらの操作の何れも、体重に影響しない。ここに提示したこの研究は、骨形成のレプチン依存性のニューロン性調節を示し、骨粗鬆症についての治療上の暗示を有する。
【０３６８】
８．１．導入
脊椎動物において、骨量は、破骨細胞による骨の再吸収及び骨芽細胞による骨の形成という２つの機能の相互作用により一定に維持される。これらの２つの細胞型の協調した作用は、骨のリモデリングを規定する。最も頻発する骨のリモデリング疾患である骨粗鬆症は又、先進国で最も頻繁な退行性疾患でもある(例えば、Cooper & Melton, 1996, Osteoporosis (R.Marcus, D.Feldman及びJ.Kelsey編)、San Diego, Academic Press, p.419-434参照)何故骨のリモデリングの分子レギュレーターを同定することが骨の生物学の重要な問題であるかを説明している。
【０３６９】
成体マウスにおける誘導性骨芽細胞消耗後の回復の精度は、骨形成の全身性制御の存在の要請へと導いた(例えば、Corral等、1998, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:13835-13840参照)。性腺機能低下後の骨粗鬆症の高発生率(例えば、Riggs等、1998, J Bone Miner Res 13:763-773参照)及び肥満者における低発生率(例えば、Felson等、1993, J Bone Miner Res 8:567-573及びTremollieres等、1993, J Clin Endocrinol Metab 77:683-686参照)は、骨量、体重及び生殖が同じホルモンによって制御されるという仮説を示唆した。この仮説の試験は、体重及び性腺機能を調節するホルモンであるレプチンが、骨形成の強力なインヒビター即ち抗骨形成因子でもあることを明らかにした(例えば、Ducy等、2000, Cell 100:197-207)。レプチン欠損(ｏｂ／ｏｂ)、レプチンレセプター欠損及びリポジストロフィーマウス(一般に、減少したレプチンシグナリングを有する)は、同じ高骨量(ＨＢＭ)表現型を有する。これらの３つの変異体マウス系統は、大きな体重格差を特徴とし、同じ骨表現型を示すが、骨量を制御するのはレプチンシグナリングであって体重ではないことを示唆した。レプチンのｏｂ／ｏｂ又は野生型(ｗｔ)マウスの第三脳室(ＩＣＶ)への注入は、骨量及び骨形成パラメーターを減少させ、骨形成の制御における中心的成分の存在を確立した(例えば、Ducy等、2000, Cell 100:197-207参照)。これらの結果は、肥満者は骨粗鬆症から防護されており、レプチンの主要な作用に耐性であるので、最初の仮説と一致している(例えば、Ahima & Flier, 2000, Annu Rev Physiol 62:413-437参照)。レプチンの抗骨形成機能の重要性は、レプチン欠損がＨＢＭと性機能低下症(骨の喪失に有利な状況)の共存を生じる唯一の公知の条件であるという事実によって強調される。
【０３７０】
レプチンがその食欲不振誘発機能を発揮する機構の同定において、多大な進歩がなされた。化学的傷害、マウス変異体系統の分子的解明及びニューロペプチド欠損マウスの生成は、食欲促進又は食欲不振誘発分子を合成する視床下部ニューロンを同定したが、これらは、レプチンの食欲不振誘発作用の標的である(例えば、Elias等、1999, Neuron 23:775-786；Cowley等、2001, Nature 411:480-484；及びDeFalco等、2001, Science 291:2608-2613参照)。対照的に、レプチンの抗骨形成機能の細胞及び分子的基礎は、未知のままである。
【０３７１】
レプチンの抗骨形成機能の基礎を解読するために、化学的傷害、遺伝的、生理的及び分子的分析を利用した。この実施例で提示したこれらの研究は、レプチン作用の食欲不振誘発及び抗骨形成の方式が明白であることを示唆し、骨形成のニューロン性調節を同定し、そしてこの経路の操作の治療上有用な方法を志向している。
【０３７２】
８．２．実験手順
８．２．１．動物、処理及び外科的手順
野生型(Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ)及び変異型(Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ Ａy／ａ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊｏｂ／ｏｂ)マウスを、Jackson laboratoryから得て、副腎髄質摘出マウスをHarlan Tecklad laboratoryから得た。Ｄｂｈ−／−マウスを以前に記載された(Thomas等、1998, Neurochem 70:2468-2476)ようにして救済した。イソプロテレノール(Sigma)を、毎日、一回、３０ｍｇ／ｋｇ(ｗｔ)又は３ｍｇ／ｋｇ(ｏｂ／ｏｂ)ずつ、６週間にわたって腹腔内に(ｉｐ)注射した。プロプラノロール(Sigma)を、飲料水に０．５ｇ／ｌの濃度で加えた。ＩＣＶ注入のために、前に記載したように、２８ゲージのカニューレ(ブレイン・インフュージョン・キットＩＩ、Alza)を、第三脳室内に移植し、ヒトのレプチン(Sigma)を、８ｎｇ／時間で又はＭＴ−ＩＩを１２５ｎｇ／時間で(Phoenix Pharmaceuticals)、２８日間注入した(例えば、Ducy等、2000, Cell 100:197-207参照)。このカニューレを動物の背側皮下間隙に位置させた浸透ポンプ(Alza)に接続した。並体結合のために、各マウスの一方の側に沿って皮膚及び腹腔に縦の切り口を作った。切り口の縁を縫合糸で結合して、腹腔交差連絡を誘導した。交差循環を、並体結合ペアの一方のマウスの尾静脈に０．２５％エバンスブルーを１ｍｌ／ｋｇで注射することによって定量した。３０分後に、両マウスから眼窩後部採血により血液を集めて、血液交換速度を標準的技術によって計算した(例えば、Harris & Martin, 1984, Am J Physiol 247:R380-386参照)。すべての並体結合ペアは、毎時２％を超える交換速度を有した。並体結合の２週間後に、各ペアの一方の動物にレプチンＩＣＶ送達のためのポンプを移植した。ＧＴＧ傷害のために、４週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、ＰＢＳ又はＧＴＧ(０．５ｍｇ／ｇ)の単一のｉｐ注射を行なった。ＭＳＧ傷害のために、２日齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに毎日、ＰＢＳ又はＭＳＧ(２ｍｇ／ｇ)を１０日間にわたって皮下注射した。
【０３７３】
８．２．２．トランスジェニックマウスの生成及び分子的研究
ａｌ(Ｉ)レプチントランスジーンを、マウスレプチンｃＤＮＡをａｌ(Ｉ)コラーゲンプロモーターの２．３ｋｂの骨芽細胞特異的断片の下流にクローン化することによって生成した。トランスジェニック創出動物を、標準的技術(例えば、Ausubel, 1995, Current Protocols in Molecular Biology, New York参照)によって生成した。遺伝子型をＰＣＲによって決定した。このトランスジーンを発現する２系統の子孫を分析した。ノーザンブロット分析を、全ＲＮＡ又はポリＡ＋ＲＮＡを利用して、標準的プロトコールに従って行なった。アドレナリン作動性レセプター発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を、ランダムプライムドｃＤＮＡにて２７サイクル行なった。
【０３７４】
８．２．３．組織学的手順、免疫細胞化学及び増殖
試料をパラフィンに包埋して、６μｍ切片にした。脳を、０．１％クレシルバイオレットで標準的手順を利用して染色した。免疫組織化学を標準的プロトコールに従って行なった(例えば、Ausubel, 1995, Current Protocols in Molecular Biology, New York参照)。イン・ビボ骨芽細胞増殖アッセイを、４０μｇイソプロテレノール、４μｇデキサメタゾンで又はビヒクルで毎日、５日間にわたって処理した新生マウスで行なった。ＢｒｄＵ(０．４ｍｇ)を５日目にｉｐ注射して、２時間後に犠牲にした。ＢｒｄＵの取込みを、免疫組織化学によりＺｙｍｅｄ ＢｒｄＵ染色キット(Zymed Laboratories Inc.)を利用して検出した。処理ごとに４匹の新生マウスを分析し、動物ごとに１０の頭蓋冠切片を計数した。ＮｏｖａＲＥＤを色素産生性のペルオキダーゼ基質として利用した。切片をヘマトキシリンで対比染色した。
【０３７５】
組織学的分析を、フォン・コッサにより染色してフォン・ギーソンにより対比染色した(例えば、Ducy等、2000, Cell 100:197-207参照)脱石灰してない切片について行なった。静的及び動的な組織形態学的分析を、標準的プロトコール(例えば、Parfitt等、1987, J Bone Miner Res 6:595-610参照)に従って、オステオメジャー・アナリシス・システム(Osteometrics, Atlanta在)を利用して行なった。各グループについて、６〜１２匹の動物を分析した。統計的有意さを、スチューデント検定により評価した。
【０３７６】
８．２．４．細胞培養及びバイオアッセイ
一次骨芽細胞培養物を、以前に記載された(例えば、Ducy等、2000, Cell 100:197-207参照)ようにして樹立して、１０％ＦＢＳを補ったαＭＥＭ／０．１ｍｇ／ｍｌアスコルビン酸中に維持した。ＳａＯＳ−２をＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中で生育させた。ｃＡＭＰアッセイのために、集密培養物を、１００μＭ ＩＢＭＸ(３−イソブチル−１−メチルキサンチン、Sigma)を含む無血清培地と共に８分間インキュベートしてから、ＰＢＳ、ＰＴＨ(１−３４)(Bachem)、イソプロテレノール、ノルエピネフリン、フェニレフリン(Sigma)又はプロプラノロールを加えて５分間インキュベートした。細胞内ｃＡＭＰ濃度を、イムノアッセイ(R&D System)によって測定した。遺伝子発現分析のために、一次骨芽細胞を、０．１％ＦＢＳ中の適当な薬物で７２時間処理した。ホルモンの血清レベルを、Peninsula Laboratories(インシュリン)又はAlpco Diagnostics(レプチン)のイムノアッセイキットを利用して定量した。デオキシピリジノリン架橋及びクレアチニンを、朝の尿において、Ｑｕｉｄｅｌキットを利用して測定した。α１(Ｉ)レプチン生物活性を、ＯｂＲｂをＳＴＡＴ３応答性ｌｕｃレポーター構築物と共に発現する２９３細胞の、ｐＳＶβｇａｌプラスミド及びα１(Ｉ)レプチン発現ベクター及び偽物による同時トランスフェクションにより確認した。２４時間後に、ルシフェラーゼ及びβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。データは、ルシフェラーゼ／β−ガラクトシダーゼ活性の比を表しており、値は、６つの独立したトランスフェクション実験の平均である。
【０３７７】
８．３．結果
８．３．１．視床下部抗骨形成領域の同定
２つの視床下部核、視床下部腹内側部核(ＶＭＨ)及び弓状核(ＡＲＣ)は、最高密度の、ＯｂＲｂ、シグナル変換型のレプチンレセプター(両核ともレプチンの食欲不振誘発機能の媒介において臨界的役割を演じる)を発現するニューロンを有する(例えば、Tartaglia等、1995, Cell 83:1263-1271及びFei等、1997, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:7001-7005)。これらの核のニューロンのレプチン抗骨形成機能への潜在的関与を、先ず、化学的傷害により評価し、その後、レプチンＩＣＶ注入により評価した(又は、後者は行なわなかった)。
【０３７８】
新生マウスを、先ず、グルタメートレセプターを発現する脳室周囲ニューロンを損傷するグルタミン酸一ナトリウム(ＭＳＧ)(例えば、Olney, 1969, Science 164:719-721参照)で処理した。ＭＳＧ処理は、ニューロペプチドＹ(ＮＰＹ)を合成するニューロンが殆ど存在しないことにより示されるように、ＡＲＣ構造に著しく影響した(図９Ａ)。対照的に、ＶＭＨニューロンのマーカー(例えば、Ikeda等、1995, Mol Endocrinol 9:478-486及びDellovade等、2000, J Comp Neurol 423:579-589参照)であるステロイド合成因子１(ＳＦ１)の保存された発現は、これらのニューロンの大多数がＭＳＧ処理によって影響されないことを示した。視床下部の外部では傷害は認められなかった。１２週齢のＭＳＧ処理したマウスは、それらの骨容積の測定により組織学的に測定して、正常の骨量を有した(図９Ｂ)。レプチン抗骨形成機能におけるＭＳＧ感受性ニューロンの役割を更に扱うために、レプチンＩＣＶ注入を、ＭＳＧで処理したｏｂ／ｏｂマウスで行なった。ＭＳＧ処理は、レプチンＩＣＶ注入の体重を減少させる能力をブロックしたが、骨量を減少させる能力はブロックしなかった(図９Ｃ)。ｏｂ／ｏｂマウスにおいてＭＳＧ誘導された傷害にもかかわらず、レプチンＩＣＶ注入の効力を伴うＭＳＧ処理したマウスの正常な骨量は、レプチンの抗骨形成作用にはＭＳＧ感受性ニューロンがなくても済むことを示している。
【０３７９】
次に、４週齢のｗｔマウスを、他のニューロンにも影響するが、ＶＭＨの及びＡＲＣの一層側背の部分のニューロンを破壊する化合物である金チオグルコース(ＧＴＧ)(例えば、Debons等、1962, Am J Physiol 4:743-750参照)で処理した。分析した各マウスにおいて、ＧＴＧ処理のＶＭＨに対する有害な効果が、腹側視床下部の解剖学的構造を歪める密な傷痕によって示された。ＧＴＧ処理したマウスにおける免疫組織化学的研究は、ＳＦ１を発現するＶＭＨニューロンの顕著な動揺を示したが、ＡＲＣに位置するＮＰＹを発現するニューロンは残された(図９Ｄ)。これらの観察は、ＧＴＧ及びＭＳＧがＡＲＣ及びＶＭＨのニューロンに差次的に影響したことを示唆している。骨の組織学的分析は、１２週齢のＧＴＧ処理したマウスが、ｏｂ／ｏｂマウスと殆ど同じ重さのＨＢＭを示すことを示した(図９Ｅ)。ｏｂ／ｏｂマウスの場合と同様に、このＨＢＭは、骨形成速度の増大により規定された骨形成の増大によるものであった(図９Ｅ)。コラーゲン分解産物であって破骨細胞活性の指標であるデオキシピリジノリン(ｄｐｄ)の尿中排出及び破骨細胞数は、正常であり、これは、骨再吸収がＧＴＧによって明白には影響されなかったことを示している(データは示さない)。これらの発見は、ＧＴＧに感受性のニューロンが骨量の制御に関与することを確立した。
【０３８０】
ＧＴＧ感受性ニューロンがレプチンの抗骨形成機能に関与するかどうかを決定するために、レプチンＩＣＶ注入をＧＴＧ処理したｏｂ／ｏｂマウスにおいて行った。レプチンＩＣＶ注入は、これらの動物の体重を減少させ、これは、それが有効であることを示している(図９Ｆ)。しかしながら、ｏｂ／ｏｂマウスのレプチンに対する極度の感受性にもかかわらず、この注入は、それらの骨量を減少させることができなかった(図９Ｆ)。まとめると、これらのデータは、ＧＴＧ感受性ニューロンネットワークがレプチンの抗骨形成機能に必要であることを示している。その上、ＧＴＧ又はＭＳＧ処理が差次的にレプチンの抗骨形成及び食欲不振誘発機能に影響したという観察は、これらの２つの機能が、少なくとも部分的に別個のニューロン性経路によって遂行されることを示唆している。
【０３８１】
８．３．２．レプチンの抗骨形成機能は、公知の食欲不振誘発性ニューロペプチドを必要としない
化学的傷害を超えるために、遺伝学的アプローチを利用した。ＡＲＣニューロンにより生成されるα−メラノサイト刺激ホルモン(αＭＳＨ)の、メラノコルチン４レセプター(ＭＣ４−Ｒ)及びメラノコルチン３レセプター(ＭＣ３−Ｒ)を発現するニューロンへの結合が、レプチンの食欲不振誘発機能に必要であるということが示されている(例えば、Huszar等、1997；Vaisse等、1998；Yeo等、1998；Cowley等、2001, Nature 411:480-484)。レプチンの抗骨形成機能におけるメラノコルチンシグナリングの役割を評価するために、変異体マウス系統を、中断されたメラノコルチンシグナリングを用いて分析し、ｏｂ／ｏｂマウスをメラノコルチンレセプターアゴニストにより処理した。
【０３８２】
Ａy／ａマウスは、ＭＣ４−Ｒに対する高い親和性を有するメラノコルチンレセプターシグナリングの競争的アンタゴニストであるアグーチタンパク質のメラノコルチンレセプターへの結合のためにメラノコルチンシグナリングを減少させた(例えば、Miller等、1993；Lu等、1994；Fan等、1997参照)。その結果、Ａy／ａマウスは、レプチンの食欲不振誘発機能に対する主要な耐性を伴って、遅発性肥満症を発症し(例えば、Halaas等、1997, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:8878-8883参照)、それは、Ｍｃ４−ｒ欠損マウスにおいて認められた表現型に似ている(例えば、Huszar等、1997, Cell 88:131-141参照)。対照的に、証拠の複数の系統は、レプチンの抗骨形成機能は、メラノコルチンシグナリングが中断された場合に生じるを示している。第一に、Ａy／ａマウスは、正常な骨量を有する(例えば、Ducy等、2000, Cell 100:197-207参照)。第二に、Ａy／ａマウスは、長期間のＩＣＶレプチン注入が骨容積をＡy／ａマウスと野生型マウスにおいて、骨形成速度の減少に次いで等しく減少させたので、レプチンの抗骨形成機能に耐性でない(図１０Ａ)。第三に、Ｍｃ４−ｒ欠損マウスは、正常な骨量を有する(図１０Ｂ)。第四に、ＭＣ４−Ｒ／ＭＣ３−Ｒアゴニストである(Fan等、1997)ＭＴＩＩのｏｂ／ｏｂマウスにおけるＩＣＶ注入は、それらの骨量に影響しなかったが、それらの体重を有意に減少させた(図１０Ｃ及び１０Ｄ)。
【０３８３】
他の食欲不振誘発性ペプチドであって、その発現がレプチンにより調節されるものは、コカインアンフェタミン関連転写物(ＣＡＲＴ)である(例えば、Kristense等、1998, Nature 393:72-76参照)。ＣＡＲＴは、マウスにおいて体重を調節する(例えば、Asnicar等、2001, Endocrinology 142:4394-4400参照)が、Ｃａｒｔ欠損マウスは、ＨＢＭを示さなかった(データは示さない)。まとめると、これらの実験は、メラノコルチン及びＣＡＲＴシグナリング経路(レプチンの食欲不振誘発作用に臨界的)は、抗骨形成機能に必要でないということを示している。これらの結果は、ＭＳＧ感受性ニューロン(αＭＳＨの視床下部での主要な起源)がレプチンの抗骨形成作用になくても済むという観察と一致する。
【０３８４】
Ｍｃ４−ｒ欠損マウスの分析は、レプチンシグナリング欠損マウスでは研究できなかった他の問題を扱った。レプチンシグナリングの非存在下で認められたＨＢＭは、それが、この条件により造られたインシュリン過剰症に次ぐ二次的なものでありうるという可能性を高めた。Ｍｃ４−ｒ欠損マウスにおける高い血漿インシュリンレベルにもかかわらず正常な骨量は、インシュリン過剰症はＨＢＭへと導かないということを示している(表１)。以下に与えた３つの他の証拠の系統は、血漿インシュリンレベルと骨量の調節とを更に分離させた。
【０３８５】
８．３．３．レプチンの抗骨形成機能の末梢での媒介
次の疑問は、視床下部の抗骨形成ネットワークから放射されるシグナルが液性のものかニューロン性のものかということであった。その目的のために、ｏｂ／ｏｂ動物(循環するレプチンを有しない)間での交差循環(並体結合)実験が頼みとされた。並体結合を実験手順に記載のように行ない、２時間後に、染料注射により、並体結合された動物間の有効な交差循環(＞９５％平衡)を確認した。並体結合の２週間後に、各並体結合ペアに、レプチンＩＣＶ注入用のポンプを移植した。分析したすべての動物の血清中に測定可能なレプチンの存在しないことは、レプチンの全身循環への漏れを除外した(データは示さない)。４週間後に、これらの動物を犠牲にして、分析した。予想されたように、骨量は、レプチンＩＣＶを受けたｏｂ／ｏｂマウスにおいて有意に低下し；対照的に、骨量の改変は、対側性マウスにおいて認められなかった(図１１Ａ)。それは、短寿命の液性メディエーターの存在を除外しないが、この実験は、レプチンの抗骨形成機能のニューロンによる媒介の可能性を高めた。
【０３８６】
上記の実験の何れも、レプチンが、局所的に作用することにより、骨芽細胞機能に影響を与えることもできるという可能性を排除しなかった。この仮説を試験するために、２つのトランスジェニックマウス系統を、骨芽細胞におけるレプチン発現を駆動するために、α１(Ｉ)コラーゲンプロモーター(例えば、Rossert等、1995, J Cell Biol 129:1421-1432参照)の骨芽細胞特異的断片[α１(I)−ｌｅｐｔｉｎ]を利用して生成させた(図１１Ｂ)。ノーザンブロット分析及び免疫細胞化学は、骨芽細胞による高レベルのレプチン合成を示し(図１１Ｂ、１１Ｃ)、これは、血漿レプチンレベルの僅かな増加を生じたが、それは、正常範囲内に留まった(ｗｔ：３．２ｎｇ／ｍｌ±０．４ｖｓα１(Ｉ)レプチン：５．６±０．８、ｎ＝遺伝子型当たり７)。このトランスジーンにより転写されたレプチンの生物活性は、後続のＤＮＡトランスフェクションによるレプチンが、Ｓｔａｔ３依存性ルシフェラーゼレポーター構築物の活性を、ＯｂＲｂを発現する２９３細胞において増大させたことを示すことにより確立された(図１１Ｄ)。この生物活性なレプチンの高い局所的レベルにもかかわらず、これらのトランスジェニックマウスの骨量は、１年齢を含む如何なる年齢のｗｔマウスとも区別できなかった(図１１Ｅ)。この結果は、レプチンの抗骨形成機能の主要な基礎が骨芽細胞に対する直接的作用でないことを示している。
【０３８７】
８．３．４．骨形成の交感神経による調節
レプチン欠損の十分に特性決定された結果は、交感神経系(ＳＮＳ)の減少した活性である(例えば、Bray及びYork, 1998, Recent Prog Horm Res 53, 95-117参照)。その上、ＶＭＨがカテコールアミン分泌のレプチン誘導された増大を媒介するということが提案されている(例えば、Ruffin及びNicolaidis, 1999, Brain Res 846:23-29及びSatoh等、1999, Diabetes 48:1787-1793参照)。これらの観察並びにここに提示した発見は、骨形成の制御におけるＳＮＳの役割の探究へと導いた
【０３８８】
ＳＮＳ機能は、アドレナリン作動性レセプターによって媒介されるので、ノルエピネフリン及びエピネフリン(アドレナリン作動性レセプターのカテコールアミンリガンド)の合成に必要な酵素であるドーパミンβ−ヒドロキシラーゼ(ＤＢＨ)を欠損する変異体マウスを研究した。組織学的試験は、ｏｂ／ｏｂマウスで認められるものより軽症ではあるが、Ｄｂｈ欠損マウスにおけるＨＢＭの存在を示した(図１２Ａ)。この発見は、Ｄｂｈ欠損マウスは、血清コルチコステロン及びドーパミンレベルの増大を有し(例えば、Alaniz等、1999, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:2274-2278参照)、２条件は、低骨量に有利である(例えば、Adachi等、1993, Semin Arthritis Rheum 22:375-384；Alaniz等、1999, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:2274-2278；及び等、2000, Bone 26:15-19参照)ので、重要である。このＨＢＭは、骨形成速度及び骨芽細胞数の増加に次ぐ二次的なものであり、骨再吸収のマーカーは正常であった(図１２Ａ〜１２Ｄ、データは示さない)。Ｄｂｈ欠損マウスで認められたＨＢＭは、高コルチコステロイドレベルを除いて、インシュリン過剰症又は他の液性動揺と関係しなかった(表１、データは示さない)。カテコールアミンは、２つの主要な源である交感神経及び副腎から放出される。副腎のカテコールアミン生成が骨量の調節に関係するのかどうかを決定するために、副腎髄質を４週間前に外科的に取り除いたｗｔマウスを分析したが、この副腎髄質は、循環エピネフリンの主要な源である(例えば、Young及びLandsberg, 1998, The Adrenal. Williams Textbook of Endocrinology, J.D.Wilson, D.W. Foster, H.Kronenberg及びP.R. Larsen編(Philadelphia, W.B. Saunders Co.),p665-682参照)。組織学的分析は、副腎髄質の除去が骨量に影響しなかったことを示した(図１２Ｅ)。これらの結果は、骨形成のニューロン性の調節の存在を確立する。
【０３８９】
レプチンの主要な抗骨形成機能と骨形成のＳＮＳ調節との間に直接的リンクがあるのかどうかが次に問われた。その目的のために、Ｄｂｈ欠損マウスにおけるレプチンＩＣＶ注入を行なった。この注入により、すべての処理されたＤｂｈ欠損マウスにおいて性腺の脂肪パッドが殆ど消失し、これは、中枢に送達されたレプチンが、ノルエピネフリン及びエピネフリンの非存在下で、体重の調節に影響しうることを示している(図１２Ｆ)。しかしながら、レプチンは、Ｄｂｈ欠損マウスの骨量を減少させることができず(図１２Ｇ)、これは、レプチンの抗骨形成機能が機能的ＳＮＳに依存していることを示している。
【０３９０】
【表１】
2005516001.tif 000007
【０３９１】
８．３．５．骨芽細胞上の機能的アドレナリン作動性レセプター
骨形成の交感神経性調節が存在するためには、幾つかの要件が満たされなければならない。第１の要件は、機能的アドレナリン作動性レセプターが骨芽細胞に存在することである。ＲＴ−ＰＣＲ及びノーザンブロットによる遺伝子発現分析は、マウス骨芽細胞一次培養物において、β2アドレナリン作動性レセプター転写物の存在を示したが、他のアドレナリン作動性レセプターの転写物の存在は示さなかった(図１３Ａ)。α１(Ｉ)コラーゲンプロモーターの骨芽細胞特異的断片の制御下でＬａｃＺを発現するトランスジェニックマウス由来の長骨の免疫組織化学は、骨芽細胞におけるβ２−アドレナリン作動性レセプターの存在を確認した(図１３Ｂ)。他のアドレナリン作動性レセプターサブタイプは、検出されえなかった。その上、抗ニューロフィラメント及び抗チロシンヒドロキシラーゼ抗体と免疫反応性の軸索が、骨芽細胞の近くで認められた(図１３Ｃ及びＤ)。電子顕微鏡写真は、骨小柱及び骨芽細胞に隣接する骨髄中を走る髄鞘のない末梢神経軸索の存在を確認した(図１３Ｅ)。β−アドレナリン作動性レセプターは、ｃＡＭＰ経路を通してシグナルを送るＧ結合性レセプターである(例えば、Benovic等、1988, Annu Rev Cell Biol 4:405-428参照)。従って、骨芽細胞上のβ2−アドレナリン作動性レセプターの存在の生物学的意味を評価するために、これらの細胞を、β−アドレナリン作動性アゴニストであるイソプロテレノールで(単独で、又はβ−アドレナリン作動性レセプターアンタゴニストであるプロプラノロールの存在下で)；β−アドレナリン作動性レセプターの天然リガンドであるノルエピネフリンで；α−アドレナリン作動性アゴニストであるフェニレフリンで又はビヒクルで処理して、ｃＡＭＰ生成を測定した。陽性対照として、骨芽細胞に存在する他のＧ結合性レセプターに結合する副甲状腺ホルモン(ＰＴＨ)を利用した(Gardella及びJuppner, 2001, Trends Endocrinol Metab 12:210-217)。イソプロテレノール又はノルエピネフリン処理は、ｃＡＭＰ生成をＰＴＨと同じ程度まで増大させたが、フェニレフリン処理は増大させなかった。これらの効果は、プロプラノロール処理により完全に破壊された。同じ結果が、マウスとヒトの骨芽細胞を利用して得られた(図１３Ｆ)。
【０３９２】
８．３．６．交感神経様作用薬処理したｏｂ／ｏｂマウスにおける持続性の肥満を伴わない減少した骨量
第２の要件は、ｏｂ／ｏｂマウスの交感神経様作用薬での処理がそれらの骨量を減少させることである。この問題点を扱うために、１月齢のｏｂ／ｏｂマウスを、６週間にわたって、β−アドレナリン作動性アゴニストであるイソプロテレノール又はビヒクルで処理した。図１４Ａに示したように、長期間のイソプロテレノール処理(３ｍｇ／ｋｇ／日)は、ｏｂ／ｏｂマウスの脊椎骨及び長骨において多大な骨喪失を生じた。これは、骨形成速度及び骨表面当たりの骨芽細胞数の顕著な減少(図１４Ｂ)に次ぐ二次的なものであり、骨再吸収パラメーターは影響されなかった(データは示さない)。同じ結果が、１０ｍｇ／ｋｇ／日のイソプロテレノールを利用した場合に得られた(データは示さない)。この実験の２つの面は、特に重要である。第１に、この低骨量は、ｏｂ／ｏｂマウスがインシュリン過剰を維持したまま発生し、これは、インシュリン過剰と骨量調節とを更に分離する(表１)。第２に、これらの２投与量のイソプロテレノールは、体重に影響を与えずに骨量を減少させ、これは、イソプロテレノールが選択的に骨量に影響を与える投与量範囲の存在を示している(図１４Ａ及び１４Ｃ)。レプチン欠損により引き起こされた代謝異常及び神経病学的異常のない動物におけるＳＮＳの役割を決定するために、この実験をｗｔマウスにおいて繰り返した。イソプロテレノールは再び、骨量、骨形成速度及び骨芽細胞数を、体重に影響を及ぼすことなく有意に減少させた(図１４Ｄ〜１４Ｆ)。アンカップリングタンパク質１(Ｕｃｐ１)の褐色脂肪組織における増大した発現は、イソプロテレノールが、ｏｂ／ｏｂ及びｗｔマウスにおける交感神経活動の増大を真似たことを示した(Scarpace及びMatheny, 1998, Am J Physiol 275:E259-264)(図１４Ｇ)。まとめると、これらのデータは、体重に対して有する効果とは独立に、β２アドレナリン作動性レセプターを介して、骨形成のレギュレーターとして作用するＳＮＳを同定する。
【０３９３】
イソプロテレノールのイン・ビボでの抗骨形成効果の基礎を解明するために、骨芽細胞増殖、遺伝子発現及びアポトーシスを研究した。イン・ビボでのブロモデオキシウリジン(ＢｒｄＵ)標識後に、イソプロテレノール処理したｗｔマウスの頭蓋冠は、対照用マウスの頭蓋冠と比較して陽性細胞数のほぼ２倍の減少を示し、これは、イソプロテレノールが骨芽細胞の増殖を減少させることを示している(図１４Ｈ)。対照として、骨芽細胞増殖をひどく減少させるデキサメタゾンを利用した。骨芽細胞遺伝子発現の研究は、イソプロテレノール処理が、骨芽細胞機能を制御する転写因子であるＣｂｆａ１(例えば、Ducy等、1999, Genes Dev 13:1025-1036参照)及び骨の細胞外マトリクスの主成分をコードする遺伝子であるα１(Ｉ)コラーゲンの発現を減少させることを示した(図１４Ｉ)。β−アドレナリン作動性アンタゴニストであるプロプラノロールでの処理は、イソプロテレノールの遺伝子発現に対する阻害効果を示した(図１４Ｉ)。アポトーシスを研究するために、カスパーゼ３発現及びアネキシンＶ染色のレベルを調べたところ、イソプロテレノール処理した骨芽細胞と対照とで如何なる変化も認めなかった(データは示さない)。これらの結果は、ＳＮＳの抗骨形成機能が、骨芽細胞の増殖及び機能の阻害に次ぐ二次的なものであることを示している。
【０３９４】
８．３．７．β−アドレナリン作動性アンタゴニストは、ｗｔ及び卵巣摘出マウスにおいて骨量を増大させる
ＳＮＳによる骨形成の調節に関する最も重要な生物医学的要求は、β−アドレナリン作動性アンタゴニスト(βブロッカー)が、骨形成を増大させることにより骨量を増大させることである。この問題点を扱うために、ｗｔマウスを、プロプラノロール(０．４ｍｇ／日)で５週間処理した。この処理は、脊椎骨及び長骨の骨量の有意の増大を生じた(図１５Ａ)。プロプラノロール処理したマウスの何匹かにおいては、骨容積が、ｏｂ／ｏｂマウスで認められたものと一致した。この骨量の増大は、骨形成速度と骨芽細胞数の両方の増大に次ぐ二次的なものであった(図１５Ｂ)。プロプラノロールにより誘導された骨量の変化は生じたが、動物の体重及び脂肪パッド重量は、正常なままであった(図１５Ｃ、データは示さない)。プロプラノロールは、インシュリン過剰又は他のホルモンの改変を引き起こさなかった(表１、データは示さない)。次に、レプチンの抗骨形成機能と骨量に対するβブロッカーの効果の間の可能なリンクを調べた。その目的のために、レプチンＩＣＶ注入を、プロプラノロール処理したマウスにおいて行なった。中枢に送達されたレプチンは、プロプラノロール処理したマウスの脂肪パッドの消失へと導いたが、骨量には影響しなかった(図１５Ｄ、１５Ｅ)。この実験は、レプチンの抗骨形成機能が交感神経活動を必要とするということを支持する第２の証明である。
【０３９５】
ｗｔマウスにおける骨形成に対するプロプラノロールのこの効果は、それがエストロゲン涸渇後に認められる骨粗鬆症を軽減することができることを示唆した。それが事実かどうか調べるために、６週齢のｗｔマウスの卵巣摘出を行い、それらのマウスを７週間にわたってプロプラノロール又はビヒクルで処理した。卵巣摘出によるエストロゲン涸渇は、ビヒクル処理されたマウスにおいて骨量を減少させた。対照的に、プロプラノロール処理した卵巣摘出マウスは、正常の骨量を有した(図１５Ｆ)。このプロプラノロール処理の防止効果は、共に対照用の卵巣摘出マウスより有意に高い骨形成速度及び骨芽細胞数の著しい増加によるものであった(図１５Ｇ)。この後者の結果は、骨形成の交感神経性調節の生理的及び治療的重要性を強調している。
【０３９６】
８．４．検討
レプチンの抗骨形成機能に必要なニューロン性経路は同定されており、ＳＮＳが骨形成の負のレギュレーターであるということが示されている。この骨形成におけるＳＮＳの阻害的役割は、体重に影響を及ぼすことなく調節することができた。レプチンの抗骨形成機能の分子的基礎を与えること以外に、これらの発見は、骨リモデリングのニューロン性の調節を確立する。β−アドレナリン作動性アンタゴニストが、体重に影響を及ぼすことなく骨に対する卵巣摘出の有害な効果を克服できるという発見は、骨粗鬆症の治療に関する主要な暗示を有する。
【０３９７】
８．４．１．レプチンの抗骨形成機能の特異性
これらの結果は、レプチンの抗骨形成機能における視床下部の重要性を示し、ＶＭＨを、すべての傷害の研究の固有の限界があっても、この経路におけるレプチン作用の部位として暗示する。しかしながら、これらの化学的傷害の研究は、レプチンの抗骨形成機能に必要な視床下部内のニューロンのサブグループを正確には同定しないし、脳内のどこかの別のニューロン集団がこの機能に関与しうることを除外しない。これらの問題を厳密に扱うためには、脳内のレプチンレセプターの領域特異的不活性化を利用する更なる研究が必要であろう(例えば、Cohen等、2001, J Clin Invest 108:1113-1121参照)。
【０３９８】
遺伝的に改変したマウス系統を利用して、レプチンの抗骨形成機能の特異性を扱った。レプチンの抗骨形成機能に関係する一つのニューロペプチドは、ＡＲＣニューロンにより産生されてメラノコルチンレセプターに結合するαＭＳＨである。このシグナリング経路は、Ａy／ａ及びＭｃ４−ｒ欠損マウス(これらは、骨量異常を示さない)において中断されている。その上、Ａy／ａマウスは、レプチンの抗骨形成機能に耐性でないが、ｏｂ／ｏｂマウスのメラノコルチンレセプターアゴニストでの処理は、それらの体重を骨量に影響することなく減少させた。これらの結果は、メラノコルチンアゴニストが骨形成の主要なレギュレーターでないことを示し、レプチンの抗骨形成機能に対するＭＳＧ誘導された傷害の明白な効果がないことと一致する。ＣＡＲＴは、他の食欲不振誘発性ニューロペプチドであり、その視床下部における発現は、レプチンにより調節される(例えば、Kristensen等、1998, Nature 393:72-76参照)。Ｃａｒｔ欠損マウスは、高脂肪食餌で、軽い肥満を生じる(例えば、Asnicar等、2001, Endocrinology 142:4394-4400参照)が、しかも尚、それらは、ＨＢＭを有しない。ＭＳＧ又はＧＴＧ処理したマウス及び変異体マウス系統において認められるような視床下部内のレプチンの食欲不振誘発効果及び抗骨形成効果を差次的に調節する能力は、これらの２つの機能が、少なくとも部分的に別個のニューロン集団によって遂行されることを示唆する。
【０３９９】
８．４．２．交感神経の活動及び骨形成の調節
並体結合実験、Ｄｂｈ欠損マウスの分析、及びｏｂ／ｏｂ、野生型又は卵巣摘出したマウスの交感神経アゴニスト又はアンタゴニストでの処理を含む幾つかの系統の証拠は、ＳＮＳが、骨形成の主要なレギュレーターであることを確立する。このβブロッカーの骨形成に対する同化効果は、それらのラットの骨折における有益な効果を説明することができる(例えば、Minkowitz等、1991, J Orthop Res 9:869-875参照)。これらの実験において、ＳＮＳの骨量に対する効果は、体重又は脂肪重量と無関係である。加えて、レプチンＩＣＶ注入が、Ｄｂｈ欠損マウス及びプロプラノロール処理したマウスの骨量を減少させることができないことは、レプチンの抗骨形成機能と交感神経活動の間の機能的リンクを明かしている。
【０４００】
他のマウスの遺伝的観察も、骨形成の交感神経性の調節の存在を支持している。ドーパミンのシナプス前終末への迅速な取込みが起きないドーパミントランスファー欠損マウスは、オステオペニアである(例えば、Bliziotes等、2000, Bone 26:15-19参照)。この後者の観察は、Ｄｂｈ欠損マウスで認められる循環ドーパミンの増大したレベル(例えば、Alaniz等、1999, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:2274-2278参照)が、造られ又は増幅されたそれらの骨表現型より制限されうることを示唆する。並体結合マウスにおける交差循環実験は、レプチンの抗骨形成機能の短寿命の液性メディエーターの可能性を排除しない。しかしながら、副腎摘出実験は、かかる機構に対する反証となる。同様に、汎下垂体機能低下症の患者の低骨量は、この考えを支持しない(例えば、Kaufman等、1992, J Clin Endocrinol Metab 74:118-123参照)。
【０４０１】
８．４．３．マスターホルモンとしてのレプチン
体重、生殖及び骨形成の制御を含むレプチンの多面発現性機能は、コルチゾール、エストロゲン、甲状腺ホルモン及びインシュリンなどのホルモンの多くの機能を思い出させる。発生中マスター遺伝子が細胞分化のプログラムを組織化するという考えからの類推により、レプチンが、これらの他のホルモンと共に、重要なホメオスタシス機能の協同的制御に関与するマスターホルモンのグループを規定するということが提案された。これらのマスターホルモンの多数の機能は、作用の異なるモードを利用することができる。実際、糖質コルチコイドレセプター変異体の分析は、このレセプターに結合するホルモンであるコルチゾールが異なる経路を利用して異なる機能を達成することを明らかにした(例えば、Reichardt等、1998, Cell 93:531-541及びKarst等、2000, Nat Neurosci 3:977-978参照)。ここに提示した作用の食欲不振誘発及び抗骨形成モードを区別する証拠は、同じことが、レプチンの場合にも正しいことを示唆する。マスターホルモンの異なる経路を利用して脊椎動物において多数の機能を実行する能力は、進化において、大きい動物におけるホメオスタシスの増大する複雑さをまとめる方法であり得た。
【０４０２】
８．４．３．生物医学的暗示
一つの証拠の系統は、骨量の交感神経性調節が、ヒトに存在して、重要な役割を演じていることを示している。反射性交感神経性萎縮症は、ヒトの病気であり、アドレナリン作動性亢進の症状発現を特徴とし、該症状発現には骨粗鬆症が含まれる。この病気に冒された患者のβブロッカーによる治療は、骨粗鬆症を含む殆どの症状発現を矯正する(例えば、Schwartzman, 2000, N Engl J Med 343:654-656参照)。過剰な交感神経活動を特徴とするヒトの疾患における骨粗鬆症の存在及びβブロッカー処理による骨粗鬆症の消失は、この実施例で提示した発見と完全に一致する。多くの薬物がこの病気における骨の破壊を効果的に止めることができるが、骨形成を増進させる薬物への要求がある。ここに提示した副作用が少なくて広く用いられている薬物であるプロプラノロールが骨形成及び骨量を体重に影響することなく有意に増大させることができるという観察は、βアドレナリン作動性アンタゴニスト又はその誘導体を利用して骨粗鬆症を治療することができるという証拠を提供する。
【０４０３】
この明細書中で言及したすべての特許及び他の刊行物は、この発明が属する分野の当業者のレベルの表示である。すべての特許及び他の刊行物を、参考として本明細書中に援用する。
【０４０４】
当業者は、この特許発明が目的を遂行して言及した結果及び利益を得るために良く適合されることを容易に認識する。ここに記載したレプチン、レプチンレセプター、レプチン抗体、レプチン類似体、レプチンアゴニスト及びアンタゴニスト、アゴニスト及びアンタゴニスト、医薬組成物、治療剤、方法、手順及び技術は、現在の代表的な好適具体例であり、例示を意図するものであって、この発明の範囲を制限することを意図するものではない。変形及び他の利用が、当業者に起きるであろうが、それらは、この発明の精神の内に包含され、又は現在の請求の範囲の範囲により規定される。
【図面の簡単な説明】
【０４０５】
【図１Ａ】６月齢の野生型(ｗｔ)及びｏｂ／ｏｂマウスの椎骨(vert.)及び長い骨(大腿骨)のＸ線分析を示している図である。
【図１Ｂ】３月齢(３ｍ．)及び６月齢(ｍ．)のｗｔ及びｏｂ／ｏｂマウスの骨の組織学的分析を示している図である。
【図１Ｃ】ｏｂ／ｏｂマウスにおける骨容積の増大の定量化を示している図である。
【図１Ｄ】野生型(ｗｔ)、ｏｂ／ｏｂ及び野生型卵巣摘出(ｗｔ−ＯＶＸ)マウスの大腿骨の３点曲げ分析を示している図である。
【図１Ｅ】６月齢のｗｔ及びｄｂ／ｄｂマウスの脊椎骨の組織学的分析を示す図である。
【図１Ｆ】ｄｂ／ｄｂマウスにおける骨容積の増大の定量化を示す図である。
【図２Ａ】１月齢のｗｔ(ｗｔ １ ｍｏ)及び１月齢の低脂肪食餌を摂取したｏｂ／ｏｂマウス(ｏｂ／ｏｂ １ ｍｏ ＬＦ食餌)の組織学的分析を示している図である。
【図２Ｂ】３月齢のｗｔ及びｏｂ／＋マウスの脊椎骨の組織学的分析を示す図である。
【図２Ｃ】６月齢のｗｔ及びアグーチイェロー変異体マウス(Ａy/a)の脊椎骨の組織学的分析を示す図である。
【図２Ｄ】通常の食餌又は高脂肪(ＨＦ)食餌を摂取した６月齢のｗｔマウスの脊椎骨の組織学的分析である。
【図３Ａ】３月齢の野生型(ｗｔ)及びｏｂ／ｏｂマウスにおけるカルセイン二重標識を示している図である。
【図３Ｂ】図３Ｂ〜Ｆにおいて、骨形成速度は、ｏｂ／ｏｂマウス(Ｂ)及びｄｂ／ｄｂマウス(Ｄ)において、それぞれ４５及び７０％増加している。この増加は、正常数の骨芽細胞の存在下で(図３Ｃ及びＥ)及び性腺機能低下症のために増加した骨芽細胞数(図３Ｆ)にもかかわらず起きる。
【図３Ｃ】図３Ｂ〜Ｆにおいて、骨形成速度は、ｏｂ／ｏｂマウス(Ｂ)及びｄｂ／ｄｂマウス(Ｄ)において、それぞれ４５及び７０％増加している。この増加は、正常数の骨芽細胞の存在下で(図３Ｃ及びＥ)及び性腺機能低下症のために増加した骨芽細胞数(図３Ｆ)にもかかわらず起きる。
【図３Ｄ】図３Ｂ〜Ｆにおいて、骨形成速度は、ｏｂ／ｏｂマウス(Ｂ)及びｄｂ／ｄｂマウス(Ｄ)において、それぞれ４５及び７０％増加している。この増加は、正常数の骨芽細胞の存在下で(図３Ｃ及びＥ)及び性腺機能低下症のために増加した骨芽細胞数(図３Ｆ)にもかかわらず起きる。
【図３Ｅ】図３Ｂ〜Ｆにおいて、骨形成速度は、ｏｂ／ｏｂマウス(Ｂ)及びｄｂ／ｄｂマウス(Ｄ)において、それぞれ４５及び７０％増加している。この増加は、正常数の骨芽細胞の存在下で(図３Ｃ及びＥ)及び性腺機能低下症のために増加した骨芽細胞数(図３Ｆ)にもかかわらず起きる。
【図３Ｆ】図３Ｂ〜Ｆにおいて、骨形成速度は、ｏｂ／ｏｂマウス(Ｂ)及びｄｂ／ｄｂマウス(Ｄ)において、それぞれ４５及び７０％増加している。この増加は、正常数の骨芽細胞の存在下で(図３Ｃ及びＥ)及び性腺機能低下症のために増加した骨芽細胞数(図３Ｆ)にもかかわらず起きる。
【図３Ｇ】脂肪制限した１月齢のｏｂ／ｏｂマウス及びヘテロ接合のｏｂ／＋マウス(肥満でない)(図２Ａ及びＢの体重参照)における増大した骨形成速度が示されている。
【図３Ｈ】高脂肪食餌を摂取したｗｔマウス、又はＡy/aマウス{太りすぎ(図２Ｃ及びＤ参照)であるが、レプチン欠損でない}は、正常の骨形成速度を有する。
【図４Ａ】１７β−エストラジオール処理によりｏｂ／ｏｂマウスの子宮萎縮症の矯正があることを示している。
【図４Ｂ】図４Ｂ〜Ｄでは、１７β−エストラジオール処理が、１７β−エストラジオール処理されたｗｔマウスにおいて及び１７β−エストラジオール処理されたｏｂ／ｏｂマウスにおいては一層の、骨小柱の有意の増大へと導くことを示す脊椎骨の組織学的分析がある。
【図４Ｃ】図４Ｂ〜Ｄでは、１７β−エストラジオール処理が、１７β−エストラジオール処理されたｗｔマウスにおいて及び１７β−エストラジオール処理されたｏｂ／ｏｂマウスにおいては一層の、骨小柱の有意の増大へと導くことを示す脊椎骨の組織学的分析がある。
【図４Ｄ】図４Ｂ〜Ｄでは、１７β−エストラジオール処理が、１７β−エストラジオール処理されたｗｔマウスにおいて及び１７β−エストラジオール処理されたｏｂ／ｏｂマウスにおいては一層の、骨小柱の有意の増大へと導くことを示す脊椎骨の組織学的分析がある。
【図４Ｅ】ｏｂ／ｏｂ及びｄｂ／ｄｂ破骨細胞の正常な分化及び機能が示されている(エキソ・ビボ)。
【図５Ａ】組織及び一次細胞(非鉱化(ＮＭ)骨芽細胞、鉱化(Ｍ)骨芽細胞及び軟骨細胞)(上側パネル)におけるレプチン発現のノーザンブロット分析。
【図５Ｂ】Ｏｂ−Ｒｂ(Ｏｂレセプター、ｂ型)転写物が、長い骨、頭蓋冠及び一次骨芽細胞においてＲＴ−ＰＣＲによって検出され得ないが、このメッセージは視床下部において検出されることを示している。
【図５Ｃ】ウエスタンブロット分析。
【図５Ｄ】一次骨芽細胞培養物のレプチン又はオンコスタチンＭでの処理の際の、最初期遺伝子発現(Ｔｉｓ１１及びｃ−ｆｏｓ遺伝子)のノーザンブロット分析。
【図５Ｅ】レプチンの非存在下(ビヒクル)又は存在下に維持された野生型マウスに由来するエキソ・ビボ一次骨芽細胞培養物。
【図５Ｆ】エキソ・ビボ培養実験におけるｄｂ／ｄｂ骨芽細胞の正常機能。
【図６Ａ】６月齢のｗｔ及びＡ−ＺＩＰ／Ｆ−１トランスジェニックマウス(脂肪組織を有しない)の脊椎骨の組織学的分析が示されている。
【図６Ｂ】これらのトランスジェニックマウスにおける骨容積を説明している図である。
【図６Ｃ】これらのトランスジェニックマウスにおける骨形成速度を説明している図である。
【図７Ａ】ＰＢＳ又はレプチンを中枢(第３脳室)に注入された４月齢のｏｂ／ｏｂマウス及びｗｔマウスの脊椎骨の組織学的比較がある。
【図７Ｂ】骨容積を示してある。
【図７Ｃ】小柱容積を示してある。
【図７Ｄ】骨形成速度を示してある。
【図８】ｗｔ及びＤＢＨ−／−マウスの脊椎骨の組織学的分析を示している。
【図９】視床下部におけるレプチンの食欲不振誘発作用及び抗骨形成作用の分離。(図９Ａ〜Ｃ)ＭＳＧ障害。(Ａ)視床下部構造に対する効果、クレシルバイオレット染色(上段パネル)、ＮＰＹの免疫組織化学(中段パネル)及びＳＦ１の免疫組織化学(下段)。弓状核(ＡＲＣ)及びＶＭＨは、それぞれ、黒色及び赤色の点線により囲まれている。ＭＳＧ処理は、ＡＲＣ構造及びＮＰＹ発現(矢印)に顕著に影響を与えたが、ＶＭＨ構造及びＳＦ１を発現するニューロンは保存された。(Ｂ)ＭＳＧ障害を有するマウスの脊椎骨の組織学的分析；骨容積(％骨容積／組織容積)は、影響を受けていない。(Ｃ)レプチンＩＣＶ注入は、ＭＳＧ障害ｏｂ／ｏｂマウス(ＭＳＧ＋レプチン)において、体重に影響しない(左)が、骨容積を減少させる(右)。(図９Ｄ〜Ｆ)ＧＴＧ障害。(Ｄ)視床下部構造の影響、クレシルバイオレット染色(上段)、ＳＦ１の免疫組織化学(中段)及びＮＰＹの免疫組織化学(下段)。ＧＴＧ処理は、ＶＭＨに影響を与えて、密な瘢痕を生じ、ＳＦ−１を発現するニューロンの分布を著しく変えたが、ＡＲＣ構造及びＮＰＹ発現は保存された。(Ｅ)ＧＴＧ障害を有するマウスの脊椎骨の組織学的分析；骨容積及び骨形成速度(ＢＦＲ／ＢＳ)は、増加する。(Ｆ)レプチン注入は、ＧＴＧ処理された動物(ＧＴＧ＋レプチン)において、体重を減少させる(左)が、骨容積には影響を与えない(右)。アスタリスクは、実験及び対照用グループ間の統計的に有意の差異を示している(Ｐ＜０．０１)。
【図１０】食欲不振誘発性ニューロペプチドは、骨形成を制御しない。(Ａ)４月齢のアグーチイェロー変異体マウス(Ａy/a)のＰＢＳ又はレプチンを注入されたＩＣＶの脊椎骨の組織学的分析。ＩＣＶレプチン注入は、骨容積(骨容積％)及び骨形成速度(ＢＦＲ／ＢＳ、白色矢印)の減少を引き起こす。(Ｂ)３月齢のＭｃ４−Ｒ−欠損マウス(ＭＣ４−Ｒ−／−)の脊椎骨の組織学的分析；骨容積は、正常である。(Ｃ〜Ｄ)ＰＢＳ又はＭＴＩＩをＩＣＶ注入されたｏｂ／ｏｂマウスの脊椎骨の組織学的分析；骨容積は影響されてない(Ｃ)が、体重は減少している(Ｄ)。アスタリスクは、実験及び対照用グループ間の統計的に有意な差異を示している(Ｐ＜０．０１)。誤差棒は、ＳＥＭを表している。
【図１１】レプチン抗骨形成性機能の末梢媒介。(Ａ)並体結合された後にＰＢＳ又はレプチンを注入されたｏｂ／ｏｂマウスの脊椎骨の組織学的分析を左に示してある。レプチンＩＣＶ注入は、同側マウス(レプチン)の骨容積を減少させる(骨容積％)が、対側性マウス(レプチンパートナー)の骨容積を減少させない。ＰＢＳでは、何らの効果も認められなかった(ＰＢＳ及びＰＢＳパートナー)。(Ｂ)骨芽細胞特異的レプチン(ａｌ(ｌ)−レプチン)トランスジェニックマウスの生成。上段パネル、構築物の図式表示。マウスのレプチンｃＤＮＡは、ａｌ(ｌ)コラーゲンプロモーターの２．３ｋｂの骨芽細胞特異的な断片の制御下にある。下段左側パネル、トランスジーンの骨における発現のノーザンブロット分析。下段右側パネル、レプチン免疫反応性は、ａｌ−レプチンマウスの骨において検出可能であるが、ｗｔマウスでは検出可能でない。(Ｃ)ａｌ−レプチントランスジーンとＳｔａｔ３依存性プロモーターｌｕｃ構築物を同時トランスフェクトされたＯｂＲｂを発現する２９３細胞で行なったａｌ−レプチントランスジーンの生物活性の分析。(Ｅ)１２月齢のａｌ(ｌ)−レプチントランスジェニックマウスの脊椎骨の組織学的分析。骨芽細胞におけるレプチン発現は、骨容積に影響を与えない。アスタリスクは、実験及び対照用グループ間の統計的に有意な差異を示している(Ｐ＜０．０１)。誤差棒は、ＳＥＭを表している。
【図１２】骨形成の交換神経制御。(Ａ)１２月齢のＤｂｈ欠損マウス(Ｄｂｈ−／−)の脊椎骨の組織学的分析。骨容積(骨容積％)は、Ｄｂｈ−／−マウスにおいて有意に増加している。(Ｂ)カルセイン二重標識、骨形成速度(ＢＦＲ／ＢＳ、白色矢印)及び骨芽細胞数(Ｎ．Ｏｂ／Ｂ．Ｐｍ)は、Ｄｂｈ−／−マウスにおいて増大している。(Ｃ、Ｄ)Ｄｂｈ欠損マウスにおける正常な骨芽細胞数(Ｎ．Ｏｃ／Ｂ．Ｐｍ)及びデオキシピリジノリン架橋排除。(Ｅ)副腎髄質摘出マウス(ＡＤＸ)の脊椎骨の組織学的分析；骨容積は、影響されない。(Ｆ、Ｇ)Ｄｂｈ−／−マウスにおけるレプチンｉｃｖ注入。脂肪パッド重量は減少する(Ｄ)が、骨容積は、この処理によって影響されない(Ｅ)。アスタリスクは、実験及び対照用グループ間の統計的に有意な差異を示している(Ｐ＜０．０１)。誤差棒は、ＳＥＭを表している。
【図１３】機能的アドレナリン作動性レセプターの骨芽細胞における存在。(Ａ)α及びβアドレナリン作動性レセプター発現のＲＴ−ＰＣＲ(上段パネル)及びノーザンブロット分析(下段パネル)。β２アドレナリン作動性レセプターの発現のみが、骨芽細胞では検出可能である。試料は、一次骨芽細胞(ｏｂ)、心臓(Ｃ１、Ｃ２、Ｃ４及びＣ６)、褐色脂肪組織(Ｃ３)及び肝臓(Ｃ５)に由来した。Ｈｐｒｔ増幅及びＧａｐｄｈ発現を、ローディング及びＲＮＡ完全性の対照として利用した。(Ｂ)ｗｔマウス及びＬａｃＺを骨芽細胞中で過剰発現するトランスジェニックマウスの骨におけるβ２アドレナリン作動性レセプターの免疫局在化(挿入写真)。単核化細胞は、β２アドレナリン作動性レセプターを発現し、それらの細胞は、Ｘ−ｇａｌ陽性(即ち、骨芽細胞)である。(Ｃ、Ｄ)神経繊維の免疫局在化(Ｃ)及びチロシンヒドロキシラーゼ(Ｄ、矢印)(骨芽細胞に隣接)。(Ｅ)２日齢マウスの骨切片の電子顕微鏡写真。神経(ｎ)は、骨芽細胞(ｏｂ)及び骨小柱(ｔ)に近接している。(Ｆ)マウス一次骨芽細胞(左)及びヒトＳａＯＳ−２骨芽細胞(右)において、ｃＡＭＰ産生は、βアドレナリン作動性レセプターアゴニスト(イソプロテレノール、ｉｓｏ；ノルエピネフリン、ＮＥ)により誘導され、βアドレナリン作動性アンタゴニスト(プロプラノロール、Ｐｒｏ)の添加により阻害される。ＰＴＨを陽性対照として利用した。
【図１４】βアドレナリン作動性アゴニストは、骨形成を阻害する。ｏｂ／ｏｂ(Ａ〜Ｃ、Ｇ)及びｗｔ(Ｄ〜Ｈ)マウスのイソプロテレノール(Ｉｓｏ)処理(Ａ、Ｄ)。脊椎骨及び脛骨の組織学的分析(Ａ)。骨容積(骨容積％)は、Ｉｓｏ処理により減少する。(Ｂ、Ｅ)カルセイン二重標識(上段パネル)、骨形成速度(ＢＦＲ／ＢＳ、白色矢印)及び骨芽細胞数(Ｎ．Ｏｃ／Ｂ．Ｐｍ)は、Ｉｓｏ処理により減少する。(Ｃ、Ｆ)体重分析。Ｉｓｏのこれらの投与量は、体重に影響を与えない。(Ｇ)ノーザンブロット分析。Ｉｓｏは、褐色脂肪組織においてＵＣＰ−１発現を増大させる(上段パネル)。(Ｈ)骨芽細胞増殖。Ｉｓｏ、デキサメタゾン(Ｄｅｘ)又はビヒクル(対照)で処理したマウスの頭蓋冠におけるＢｒｄＵ取込みの免疫局在化(赤色染色、矢印)。ＢｒｄＵ陽性細胞の対照に対するパーセンテージを右側に示してある。(Ｉ)Ｉｓｏ、Ｉｓｏ及びプロプラノロール(Ｉｓｏ＋Ｐｒｏ)又はビヒクル(対照)で処理した一次骨芽細胞におけるＣｂｆａｌ及びａｌ(ｌ)コラーゲン発現のノーザンブロット分析。Ｇａｐｄｈ発現を、すべてのノーザンブロットについて内部対照として利用した。アスタリスクは、実験及び対照用グループ間の統計的に有意な差異を示している(Ｐ＜０．０１)。
【図１５】βアドレナリン作動性アンタゴニストは、骨量を増大させる。ｗｔ(Ａ、Ｃ)、レプチンＩＣＶ注入を受けたｗｔ(Ｄ、Ｅ)卵巣摘出された(ＯＶＸ)及び疑似手術を受けた(Ｓｈａｍ ＯＶＸ)(Ｆ、Ｇ)マウスのプロプラノロール(Ｐｒｏ)処理。脊椎骨(Ａ、Ｂ、Ｅ〜Ｇ)及び脛骨(Ａ)の組織学的分析。骨容積(骨容積％)は、Ｐｒｏ処理により増大する(Ａ、Ｅ、Ｆ)。カルセイン二重標識(上段パネル)、骨形成速度(ＢＦＲ／ＢＳ、白色矢印)及び骨芽細胞数(Ｎ．Ｏｂ／Ｂ．Ｐｍ)は、プロプラノロール処理マウスにおいて増大する(Ｂ及びＧ)。体重(Ｃ)は、影響されない。レプチンＩＣＶ注入は、ｐｒｏ処理したｗｔマウスにおいて脂肪パッド重量を減少させるが、骨量を減少させない(Ｄ及びＥ)。Ｐｒｏ処理は、骨形成パラメーターをＯＶＸマウスにおいて増大させることにより骨損失を防止する(Ｆ及びＧ)。アスタリスクは、実験及び対照用グループ間の統計的に有意な差異を示している(Ｐ＜０．０１)。菱形は、ＯＶＸ及び疑似手術を受けたマウス間の統計的に有意な差異を示している(Ｐ＜０．０１)。
【配列表】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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