(57)【要約】  局所的に一本鎖である中間状態を仮定する速度論的モデルにより、定常状態条件下における核酸ハイブリダイゼーションが記述される。核酸の二次構造をオリゴヌクレオチド-RNAハイブリダイゼーションの速度に関連づける式を誘導した。このモデルでは、ハイブリダイズされる領域がアンチセンスオリゴヌクレオチドへの結合前に一本鎖コンフォメーションをとる中間状態を経て、核酸のハイブリダイゼーションが起こると仮定する。誘導の際、定常状態条件を仮定する。このモデルは、生きている細胞の定常状態条件と、全長ハイブリッドが有意に蓄積されておらず核形成複合体の濃度がほぼ一定であるシングルチューブハイブリダイゼーションの初期段階と、に適用可能である。このモデルにより、相補的核酸間のハイブリダイゼーションの速度定数に比例する速度係数を計算することが可能である。RNAの二次構造を推定するための市販のアルゴリズムを用いて速度係数を計算したところ、発表されている101ヌクレオチドの人工RNAへのアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)のハイブリダイゼーションの速度およびHIV-1tatmRNAへの分子ビーコンのハイブリダイゼーションの速度との良い相関関係が得られた。RNA-RNAアニーリングでは、最大速度係数を有する11ヌクレオチド長の領域の位置が、実験的に決定された核形成部位と一致する。アンチセンスRNAの長さへの最大速度係数の依存度は、ハイブリダイゼーション速度とアンチセンス長さとの観測された関係と一致する。また、HIV-1インテグラーゼmRNA中の32の部位について計算した速度係数は、RNAのODN媒介リボヌクレアーゼH依存的開裂により測定したときのそれぞれの部位へのアンチセンスODNのハイブリダイゼーションとの相関関係を示した。RNAの三次構造に影響を及ぼすと予想されるマグネシウムイオン濃度の範囲にわたり容易にハイブリダイズする部位が当該モデルにより同定されたので、三次構造は不在であるかまたはハイブリダイゼーションには大きな障害にならないことが示唆される。計算された標的部位速度係数はまた、多剤耐性、アンギオテンシンタイプ1レセプター、c-myb、アセチルコリンエステラーゼをコードするヒト遺伝子のmRNAおよびC型肝炎ウイルスを用いたアンチセンスオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションに関する発表されたデータに対応した。これらの結果から、速度論的モデルが一般に適用可能であることおよびmRNAのアンチセンス攻撃のための部位の迅速同定に利用可能であることが裏づけられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
所与のアンチセンス核酸によるRNA分子へのハイブリダイゼーションのための、初速度に比例する速度係数を計算する方法であって、
該RNA分子の特定領域を一本鎖状態に変換するのに必要な融解エネルギー(ΔGm)を計算すること、
オリゴヌクレオチドへの該RNA分子の特定領域のハイブリダイゼーションの結果として生じるエネルギー利得(ΔGd)を計算すること、および
速度係数xを計算すること、ただし、
【数１】
2005514002.tif 000040
(細胞内ハイブリダイゼーションの場合)
または
【数２】
2005514002.tif 000041
(シングルチューブアッセイの場合)
であること、
を含む上記方法。
【請求項２】
内因的に発現される所与のアンチセンスリボ核酸による細胞内遺伝子発現の阻害を予測する方法であって、
【数３】
2005514002.tif 000042
を用いて、請求項１に記載の方法により、内因的に発現されるアンチセンスリボ核酸によるRNAへのハイブリダイゼーションの速度係数xを計算することを含む上記方法。
【請求項３】
RNA-RNAアニーリングのための少なくとも1つの有望な核形成部位を同定する方法であって、
【数４】
2005514002.tif 000043
を用いて、請求項１に記載の方法により、RNA分子中のそれぞれの短い対合領域(11〜20ヌクレオチドの長さ)について速度係数xを段階的に計算すること、および
速度係数xの最大値を有する1つまたは複数の領域を同定すること、ここで、該1つまたは複数の領域が、RNA-RNAアニーリングのための少なくとも1つの有望な核形成部位となること、
を含む上記方法。
【請求項４】
アンチセンスデオキシリボ核酸によるハイブリダイゼーションのためのRNA分子上の接近しやすい部位を同定する方法であって、
【数５】
2005514002.tif 000044
を用いて、請求項１に記載の方法により、該アンチセンスデオキシリボ核酸のそれぞれの短い領域(11〜20ヌクレオチドの長さ)について速度係数xを段階的に計算すること、および
最も大きい速度係数を有する領域を同定すること、ここで、該部位が最も接近しやすい部位となること、
を含む上記方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法により同定された部位へのハイブリダイゼーションに好適なアンチセンスリボ核酸。
【請求項６】
所与のアンチセンスリボヌクレオチドによるRNAの攻撃の初速度を推定するためのデバイスであって、該RNAの二次構造の自由エネルギーを推定して、請求項１に記載の方法により該アンチセンスリボヌクレオチドへの該RNAのハイブリダイゼーションの速度係数xを計算するプログラムを有するコンピュータを含み、該攻撃の初速度が速度係数xに比例する、上記デバイス。
【請求項７】
請求項３に記載の方法を実行するプログラムを有するコンピュータを含む、RNA-RNAアニーリングのための核形成部位を同定するためのデバイス。
【請求項８】
請求項４に記載の方法を実行するプログラムを有するコンピュータを含む、アンチセンスデオキシヌクレオチドによる攻撃のためのRNA分子上の接近しやすい部位を同定するためのデバイス。
【請求項９】
大きいRNA内の二次構造から一本鎖RNAの短い領域を解放するのに必要な融解エネルギーを推定する方法であって、RNAの該短い領域を強制的に一本鎖にするときのRNAの自由エネルギーをRNAフォールディングプログラムにより決定すること、および、その情報を用いて、二次構造からRNAの該短い領域を解放するのに必要な融解エネルギーを推定すること、を含み、該融解エネルギーがΔGm〔ただし、ΔGm = (G1anti + G1target) - (G0anti +G0target)〕に関連づけられる、上記方法。
【請求項１０】
遺伝子の機能を決定する方法であって、該遺伝子の配列を決定すること、該遺伝子によりコードされるRNA分子上の少なくとも1つの接近しやすい部位を請求項４に記載の方法により同定すること、該部位を攻撃するのに好適な少なくとも1つのアンチセンスヌクレオチドを合成すること、細胞を該ヌクレオチドに接触させること、および、該接触ステップの影響を同定して該遺伝子の機能を決定すること、を含む上記方法。
【請求項１１】
特定の遺伝子を標的とする薬物を開発する方法であって、1)該遺伝子の配列を決定すること、2)該遺伝子によりコードされるRNA分子上の少なくとも1つの接近しやすい部位を請求項４に記載の方法により同定すること、および、3)該部位を標的とするのに好適な薬物を合成すること、を含む上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、初速度の推定、核形成部位(nucleation site)の予測、およびRNAをアンチセンス攻撃するのに接近しやすい部位の選択を行うための方法およびデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
DNA-RNAおよびRNA-RNAハイブリダイゼーションは、DNA複製、転写、および翻訳をはじめとする核酸機能の多くの側面に重要である。ハイブリダイゼーションはまた、特定の核酸を検出したり、その発現を改変したりするさまざまな技術の中心をなす。アンチセンスヌクレオチドは、たとえば、標的RNAにハイブリダイズして、RNAスプライシング、転写、翻訳、および複製を阻害することにより、遺伝子発現を破壊する。アンチセンスDNAは、DNA-RNAハイブリッドがリボヌクレアーゼH（ほとんどの細胞型に存在する活性）による消化のための基質として機能するというさらなる特徴を有する。アンチセンス分子は、オリゴデオキシヌクレオチド(ODN)の場合のように細胞中に送達したり、またはRNA分子として内因性遺伝子から発現させたりすることができる。FDAは、最近、アンチセンス薬物であるVitravene(登録商標)(サイトメガロウイルス網膜炎を処置するための薬物)を承認した。このことから、アンチセンスが治療上の有用性をもつことがわかる。
【０００３】
アンチセンスODNの最近確認された用途は、未知の機能を有する遺伝子の発現の標的化破壊である。ヒトを含めて多くの種の全遺伝子のヌクレオチド配列が、研究団体に利用可能になっているが、ごく一部分の機能がわかっているにすぎない。遺伝子チップアレイが広く利用できるようになれば、遺伝子回路に関して仮説を立てることが可能になり、アンチセンスODNを用いれば、単独でまたは組合せで特定の遺伝子をダウンレギュレートすることにより、これらの仮説を試験することができるようになるであろう。より多くの生物のゲノムヌクレオチド配列が利用可能になっているので、またより多くの製薬会社がこの情報を用いて新しい薬物を探索しているので、アンチセンスODNの使用は増大することが予想される。
【０００４】
それにもかかわらず、アンチセンス核酸の広範な使用は、重大な障害に直面している。広範囲のRNA構造がアンチセンス-RNAハイブリダイゼーションを妨害するので、アンチセンス結合に有利な標的RNA部位を同定することは困難である。細胞内では平衡に達する可能性が少ないので、ハイブリダイゼーションを解明するには、ハイブリダイゼーションの速度を正確に記述することが必要であろう。たとえRNAがかなりの二次構造を含んでいると予想される場合であっても、ハイブリダイゼーション速度は非常に速い可能性があるので、この課題は難題である。たとえば、大腸菌(Escherichia coli)では、調節性アンチセンスRNAは、非構造化RNA会合の上限に近い二次会合速度でその標的RNAとの安定な複合体を形成する(106M-1秒-1; (Perssonら, 1988; PorscheおよびEigen, 1971; Tomizawa, 1984))。
【０００５】
オリゴヌクレオチドと標的RNAとのハイブリダイゼーションを記述しようとするこれまでの取組みは、2つのグループに大別される。一方のグループでは、RNAの二次構造の予測結果を用いることにより、一本鎖の可能性があってハイブリダイゼーションに利用しやすいと思われる領域が同定された(Christoffersonら, 1994; Patzelら, 1999)。オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションとの相関は、かなりのばらつきを示した。現在では、ヌクレアーゼにより同定される一本鎖領域は最も容易にハイブリダイズする領域に対応しないことがわかっている(Birikhら, 1997の図3を参照されたい)。第2の方法では、ハイブリッド形成に基づく全エネルギー利得が計算された(Stullら, 1992)。ハイブリッドの平衡収率に焦点をあてたこの方法では、エネルギー利得と、RNAへのアンチセンスオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションと、の相関は不十分であった(Stullら, 1992)。比較的最近になって、Mathewsらは、2つの実験の結果を分析した(Mathewsら. 1999a)。一方の実験から得られたデータは、ΔGd(図1)相当量との相関関係を示し、他方の実験のデータは、ΔGh(図1)相当量との相関関係を示した。したがって、汎用的な取扱いができないので、mRNAをアンチセンス攻撃するのに有利な部位を実験的に同定することが必要になる(Birikhら, 1997; Branch, 1998)。
【０００６】
そのような有利な部位を同定するのに用いられる現行の手順では、ランダム配列ODNライブラリーの構築、標的mRNAの発現および精製、標的RNAへのライブラリーODNのハイブリダイゼーション、RNase Hによるハイブリッドの開裂、開裂産物のゲル電気泳動によるそのサイズの決定、およびプライマー伸長による開裂部位の正確な決定を行うことが必要である。遺伝子の機能に関心をもつほとんどの研究室にとって、ハイブリダイゼーションに有利な部位を同定するためのこの手順は、それ自体がプロジェクトである。したがって、ハイブリダイゼーションに有利な部位を同定するための正確で時間と労力がそれほどかからない方法が必要とされている。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
本発明は、準定常状態条件下においてRNA中のすべての部位についてハイブリダイゼーション速度に比例する速度係数を計算することのできる選択方法を本発明者らが開発したことに依拠する。本発明の方法は、初速度の推定、核形成部位の予測、およびRNAをアンチセンス攻撃するのに接近しやすい部位の選択を行うのに使用することのできる、相補的核酸アニーリングの第一段階の数学的記述を提供する。本発明の方法の顕著な特徴は、2つの特定パラメーターを用いて有利な標的部位を同定するということである。我々の発明は、全定常状態速度定数を、ハイブリッドを形成するために克服しなければならない融解エネルギーと、ハイブリッド形成の結果として得られる自由エネルギーと、に関連づける。融解エネルギーおよびエネルギー利得を計算する市販のRNA構造アルゴリズムを用いることにより、長いRNA標的へのオリゴヌクレオチドの結合を妨害すると予想されるRNA二次構造を考慮に入れる(Campbellら, 1997; Limaら, 1992)。本発明の方法を用いる任意の標的部位へのハイブリダイゼーションの速度係数の計算は、比較的単純明快である。
【０００８】
一般的には、本発明は、所与のアンチセンス核酸によるRNA分子へのハイブリダイゼーションの速度係数(初速度に比例する)を計算する方法を特徴とする。この方法には、該RNA分子の特異的領域を一本鎖状態に変換するのに必要な融解エネルギー(ΔGm)を計算するステップと、オリゴヌクレオチドへの該RNA分子の該特異的領域のハイブリダイゼーションの結果として生じるエネルギー利得(ΔGd)を計算するステップと、速度係数xを計算するステップと、が含まれ、ただし、
【数１】
2005514002.tif 000002
(細胞内ハイブリダイゼーションの場合)
または
【数２】
2005514002.tif 000003
(シングルチューブアッセイの場合)
である。
【０００９】
一実施形態では、本発明は、内因的に発現される所与のアンチセンスリボ核酸による細胞内遺伝子発現の阻害を予測する方法を特徴とする。この方法には、
【数３】
2005514002.tif 000004
を用いて、上述した方法により、該内因的に発現されるアンチセンスリボ核酸によるRNAへのハイブリダイゼーションの速度係数xを計算することが含まれる。
【００１０】
他の実施形態では、本発明は、RNA-RNAアニーリングのための少なくとも1つの有望な核形成部位を同定する方法を特徴とする。この方法には、
【数４】
2005514002.tif 000005
を用いて、上述した方法により、RNA分子中のそれぞれの短い対合領域(11〜20ヌクレオチドの長さ)について速度係数xを段階的に計算するステップと、速度係数xの最大値を有する1つまたは複数の領域（該1つまたは複数の領域は、RNA-RNAアニーリングのための該少なくとも1つの有望な核形成部位である）を同定するステップと、が含まれる。
【００１１】
さらに他の実施形態では、本発明は、アンチセンスデオキシリボ核酸によるハイブリダイゼーションのためのRNA分子上の接近しやすい部位を同定する方法を特徴とする。この方法には、
【数５】
2005514002.tif 000006
を用いて、上述した方法により、該アンチセンスデオキシリボ核酸のそれぞれの短い領域(11〜20ヌクレオチドの長さ)について速度係数xを段階的に計算するステップと、最も大きい速度係数を有する領域（該部位は最も接近しやすい部位である）を同定するステップと、が含まれる。この方法により同定された部位へのハイブリダイゼーションに好適なアンチセンスリボ核酸もまた、本発明の態様であるとみなされる。
【００１２】
本発明にはまた、特定のデバイスが包含される。本発明のデバイスの1つは、所与のアンチセンスリボヌクレオチドによるRNAの攻撃の初速度を推定するためのデバイスである。このデバイスには、該RNAの二次構造の自由エネルギーを推定して、上述した方法により該アンチセンスリボヌクレオチドへの該RNAのハイブリダイゼーションの速度係数xを計算するプログラムを有するコンピュータが含まれ、攻撃の初速度が速度係数xに比例する。
【００１３】
本発明の他のデバイスは、RNA-RNAアニーリングのための核形成部位を同定するためのデバイスである。このデバイスには、RNA-RNAアニーリングのための少なくとも1つの有望な核形成部位を同定するための上述した方法を実行するプログラムを有するコンピュータが含まれる。
【００１４】
本発明のさらに他のデバイスは、アンチセンスデオキシヌクレオチドによる攻撃のためのRNA分子上の接近しやすい部位を同定するためのデバイスである。このデバイスには、アンチセンスデオキシリボ核酸によるハイブリダイゼーションのためのRNA分子上の接近しやすい部位を同定するための上述した方法を実行するプログラムを有するコンピュータが含まれる。
【００１５】
本発明のこのほかの実施形態は、大きいRNA内の二次構造から一本鎖RNAの短い領域を解放するのに必要な融解エネルギーを推定する方法を特徴とする。この方法には、RNAの該短い領域を強制的に一本鎖にするときのRNAの自由エネルギーをRNAフォールディングプログラム(たとえば、RNA二次構造の自由エネルギーを推定する、GCGパッケージ中のFOLDRNA)により決定するステップと、その情報を用いて、二次構造からRNAの該短い領域を解放するのに必要な融解エネルギーを推定するステップと、が含まれ、該融解エネルギーは、式：
ΔGm = (G1anti + G1target) - (G0anti +G0target)
に従うΔGmに関連づけられる。
【００１６】
本発明のさらに他の実施形態は、遺伝子の少なくとも1つの機能を決定する方法を特徴とする。この方法には、該遺伝子の配列を決定するステップと、アンチセンスデオキシリボ核酸によるハイブリダイゼーションのためのRNA分子上の接近しやすい部位を同定するための上述した方法を用いて、該遺伝子によりコードされるRNA分子上の少なくとも1つの接近しやすい部位を同定するステップと、同定された部位を攻撃するのに好適な少なくとも1つのアンチセンスヌクレオチドを合成するステップと、細胞を合成ヌクレオチドに接触させるステップと、該接触ステップの影響を同定して該遺伝子の機能を決定するステップと、が含まれる。
【００１７】
このほかのさらなる実施形態では、本発明は、特定の遺伝子を標的とする薬物を開発する方法を特徴とする。この方法には、次のステップ：(1)該遺伝子の配列を決定するステップ、2)アンチセンスデオキシリボ核酸によるハイブリダイゼーションのためのRNA分子上の接近しやすい部位を同定するための上述した方法を用いて、該遺伝子によりコードされるRNA分子上の少なくとも1つの接近しやすい部位を同定するステップ、および3)該部位を標的とするのに好適な薬物を合成するステップが含まれる。
【００１８】
アンチセンスでは、ヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチド(たとえば、ホスホロチオエートまたは2'-O-メチルリボヌクレオシド)が一般に好ましい。たとえば、細胞内ヌクレアーゼによりアンチセンス分子が急速に破壊されることがないように、ホスホチオエートを使用することができる。したがって、簡潔に例示するために本願全体にわたりオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)が言及されてはいるが、特許請求された方法のいずれにおいても、公知のものやまだ発見されていないものも含めて、ヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドをODNの代わりに用いることができる。
【００１９】
本発明には多くの利点がある。相対ハイブリダイゼーション速度の計算を可能にすることにより、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドに最も迅速にハイブリダイズするRNA標的中の部位の同定を可能にする。本発明を用いてハイブリダイゼーションを速度論的に記述することにより、有利な部位を同定することができるので、現在利用されているある種の費用と時間のかかる実験手順は回避される。本発明者らは、定常状態速度を仮定して、活発に増殖および代謝を行う細胞が効果的にモデル化されると考えている。平衡を仮定すれば、休止細胞をモデル化することができる。したがって、パラメーターを適切に調整すれば、増殖細胞および休止細胞の両方に本発明を適用できると考えられる。
【００２０】
アンチセンス技術の広範な適用は、有効なアンチセンス配列を見いだすのに必要な情報資源による制約を受けてきた。有利なことに、本発明を用いれば、既知のヌクレオチド配列をもつどのようなRNAにもアンチセンスオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるのに最も有利な部位を迅速に同定することができる。
【００２１】
本発明に係る実施形態は、有利な標的部位の同定に使用されるほかに、周囲の配列から生じるマイナス効果を最小限に抑える。ベクターまたは染色体遺伝子が内因的にアンチセンスRNAを発現する場合、このRNAは、ほぼ常に、該ベクターまたは該染色体を起源とする無関係な配列に取り囲まれるであろう。これらの無関係な配列は、アンチセンス配列と共に二次構造を形成して、標的RNAへのアンチセンスの結合を阻害する可能性がある。本発明の方法では、速度係数を計算する際、これらの余分な配列を容易に考慮に入れることができる。したがって、本発明はベクターの設計に有用である。
【００２２】
本発明はまた、ハイブリダイゼーションにより標的に結合するリボザイムのような触媒的アンチセンス作用剤に適用することもできる。リボザイムの内部構造により分析がさらに複雑になる可能性があるが、in vitroで測定されたリボザイムの動態挙動(Campbellら, 1997)は、本発明の方法を用いて厳密にモデル化することができる(図2)。
【００２３】
有利な標的部位を同定する能力が向上したので、アンチセンスに基づく抗ウイルス療法(たとえば、感染を減少させ、かつ患者の回復を促進する)の開発への取組みにさらに拍車がかかるはずである。
【００２４】
全ゲノムアンチセンスライブラリーを提供するために、この新しい方法を有利に使用することができる。そのようなライブラリーは、たとえば、特定の機能を阻止することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドをスクリーニングすることにより、発見されたが活性のわからない遺伝子の機能を決定するのに有用である。たとえば、化学療法剤に対する原発腫瘍細胞系の耐性を克服することができる配列を得るために、アンチセンスゲノムライブラリーを試験することができる。この実施形態は、小分子薬物探索のために利用できる可能性のある標的または標的のセットを確認するうえで、さらには、アンチセンス療法に至る直接的な手段を提供するうえで、役に立つ。
【００２５】
本発明を用いて選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、化学的取組みに莫大なお金を投資する前に、特定のタンパク質の作用を阻止する効果(この場合には、その発現を阻止することによる)を実証することにより可能性のある薬物標的を確認するために使用することができる。さらに、本発明を用いて選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定の適応症(たとえば、局所適応症、所定の全身感染症、および腫瘍)に対して標的を確認するためだけでなく、適切なベクターに導入してそれを処置するためにも使用することができる。
【００２６】
別段の規定がないかぎり、本明細書で使用されている科学技術用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されているものと同一の意味を有する。本発明の実施または試験にあたり、本明細書に記載のものと類似したまたは等価な方法および材料を使用することができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。刊行物、特許出願、特許、および本明細書に記載の他の引用文献はすべて、それらの全体が参照により組み入れられるものとする。矛盾を生じた場合には、定義を含む本明細書に従うことになろう。さらに、材料、方法、および実施例は、例示的なものにすぎず、それらに限定しようとするものではない。
【００２７】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から自明なものとなるであろう。
【００２８】
詳細な説明
RNA標的へのアンチセンスヌクレオチドの結合およびそれに続く標的の破壊またはコンフォメーション変化は、
【数６】
2005514002.tif 000007
により記述することができる。式中、Aはアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、Sは標的RNAであり、ASはアンチセンスヌクレオチド-標的RNAハイブリッドであり、Pは第二段階の産物を表し、k1およびk-1は、それぞれ、結合および解離の速度定数であり、そしてk2は不可逆的であると仮定される第二段階の速度定数である。第二段階は、たとえば、アンチセンスDNA媒介RNase H開裂反応のときのように酵素的開裂を伴うか、または長いアンチセンス標的RNAハイブリダイゼーションの全長アニーリングのときのように構造変化を伴う可能性がある。
【００２９】
我々の発明によれば、活性化状態は、ハイブリダイズする領域内の構造が融解される中間体であると考えられる(図1)。我々は、ハイブリダイゼーションの速度論に適合する3つのパラメーター: (1)融解エネルギーΔGm(標的部位中およびオリゴヌクレオチド中の構造を融解させるのに必要なエネルギー増加)、(2)ハイブリダイゼーションエネルギー、ΔGh(アンチセンスオリゴヌクレオチドと融解された標的部位とのハイブリッドが形成されるときのエネルギー減少)、および(3)最終状態と初期状態とのエネルギー差またはエネルギー増ΔGdを同定した。これらの点を考慮して、我々は、定常状態における標的消失の速度定数を融解エネルギーおよびエネルギー差に関連づける式を誘導した。
【００３０】
我々の誘導は、反応1により記述される反応のハイブリッド濃度変化の速度から開始される。流入フローk1[A][S]および流出フローk-1[AS]およびk2[AS]を考慮すると、
【数７】
2005514002.tif 000008
が得られる。
【００３１】
細胞内(定常状態)条件に関係する標的消失の速度を表す明確な式を得るために、我々は準定常状態条件を記述するためのBriggsおよびHaldaneの速度論的方法を利用する(Stryer, 1990)。これによれば、ハイブリッド濃度[AS]は一定、すなわち、d[AS]/dt=0である。したがって、
【数８】
2005514002.tif 000009
が得られる。
【００３２】
産物生成の速度（これは、標的消失の速度でもある）は、
【数９】
2005514002.tif 000010
で記述される。式中、Kmは、
【数１０】
2005514002.tif 000011
である。
【００３３】
したがって、定常状態反応では、二次会合定数は、
【数１１】
2005514002.tif 000012
である。
【００３４】
シングルチューブアッセイでは、全アンチセンスは保存され、[A0] = [A] + [AS]が得られる。反応速度は、
【数１２】
2005514002.tif 000013
と書き換えることができる。
【００３５】
二次会合定数は、
【数１３】
2005514002.tif 000014
である。
【００３６】
RNA中の異なる部位の相対反応速度を比較するために、k2がほぼ一定であると仮定する。k-1/k1はハイブリッド解離の平衡定数であるので、したがって、
【数１４】
2005514002.tif 000015
である。
【００３７】
長い標的では、k1は、ハイブリダイゼーションを妨害する融解エネルギー障壁により決定される。ボルツマン分布から、活性化状態の占有率は、e-ΔGm/RTに比例する。Pauling (Pauling, 1988)によれば、
【数１５】
2005514002.tif 000016
である。式中、k1*は、活性化(融解)標的部位への活性化(融解)アンチセンスオリゴヌクレオチドの結合の順方向速度定数である。k1*は、RNA構造に依存しない(構造の影響は、式10中のe-ΔGm/RTにより記述される)が、カチオン濃度や温度などのアッセイ条件に関連づけられる。式5、9、および10を組み合わせると、Kmを表す式:
【数１６】
2005514002.tif 000017
が得られる。式中、Cは、
【数１７】
2005514002.tif 000018
で表される比例定数である。
【００３８】
アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド攻撃のためのRNA中のさまざまな部位を比較するために、式6および8を使用する。このために、速度係数x=k/k2が定義される。すなわち、定常状態反応の場合は、
【数１８】
2005514002.tif 000019
であり、シングルチューブアッセイの場合は、
【数１９】
2005514002.tif 000020
である。xは、特定された部位がアンチセンスヌクレオチドにハイブリダイズするときの相対速度を表す。式13は、細胞内相対ハイブリダイゼーション速度を比較するのに有用であり、式14は、シングルチューブアッセイで初期ハイブリダイゼーション速度を推定するのに有用である。
【００３９】
項ΔGmおよびΔGdは、以下に記載されているように、RNA二次構造の形成に伴うエネルギー変化を解析する市販のRNAフォールディングプログラム(たとえば、University of Wisconsinから入手可能なGCGパッケージ)から容易に決定することができる。融解エネルギーΔGmは、最低自由エネルギーを用いて、制限なしでフォールディングさせた標的RNA(図1中のプレハイブリダイゼーション状態G0)と、ハイブリダイズするヌクレオチドの領域を一本鎖状態に制限してフォールディングさせた標的RNA(図1中の活性化状態G1)と、の差を決定することにより、推定することができる。同一の条件下で同一の方法によりアッセイする場合、k2およびCの値は、RNA中の異なる部位で類似していると仮定される。Cは、以下で説明されるように、実験データから決定することができる。
【００４０】
エネルギーパラメーターの計算で考慮されていないマグネシウムイオン濃度([Mg2+])は、RNAの三次構造に大きな影響を及ぼす可能性があるので(PanおよびSosnick, 1997) (Cateら, 1997)、0.2および10mMのMg2+で実験を行った。0.2〜10mMの範囲で反応混合物中の[Mg2+]を変化させても、相対開裂はほとんど影響を受けなかった(データは示されていない)。もしも標的RNAで三次相互作用が生じるのであれば、10mM Mg2+で三次相互作用が存在していたであろう(PanおよびSosnick, 1997)。したがって、HIV-1インテグラーゼRNA中の有利な部位は、オリゴヌクレオチド-RNase H試験により決定した場合、RNA三次構造が仮に存在していたとしても、それによる顕著な影響を受けない。
【００４１】
我々は、ハイブリダイゼーション速度を予測するために、ΔGmおよびΔGdの一方だけでなくこれらのパラメーターの両方を使用したので、本発明の方法は、これまでの研究(Christoffersonら, 1994; Mathewsら, 1999a ; Patzelら, 1999; Stullら, 1992)と概念的に相違する。我々のデータから、両方のパラメーターを使用する論理(図1)が裏づけられる。図7Aに示されるHIV-1インテグラーゼmRNAの17の有利な部位のうち、9つの部位で、ΔGmおよびΔGdの両方について中程度の値が計算され、5つの部位で、非常に低いΔGm値が計算され、3つの部位で、非常に高いΔGd値が計算された。したがって、これらのエネルギーパラメーターはいずれも、ハイブリダイゼーション速度を決定するうえで重要な役割を果たす。比較として、開裂パーセントと、Mathewsらの平衡法により計算した全エネルギー変化と、の不十分な相関を、図7Bに示す。
【００４２】
オリゴヌクレオチドを用いて遺伝子発現を阻害する場合は、動的過程が平衡過程よりも関係している可能性が高いので、定常状態モデルは標的部位の選択により好適である。提示したデータからわかるように、高い速度係数を有する部位のほとんどは、迅速なハイブリダイゼーションをも呈する。すなわち、速度係数が104を超える場合、c-myb mRNA(データは示されていない)およびHIV-1インテグラーゼ(int)mRNA(図7)で同定された部位はすべて、最大レベルの少なくとも半分の開裂レベルを示す。したがって、我々の計算モデルでは、偽陽性(ハイブリダイゼーションが迅速であると予測されたが実験的には遅い)がほとんど生じない。
【００４３】
式13は、生きている細胞内におけるハイブリダイゼーションの速度を予測するために使用することができる。他の研究ではin vitroハイブリダイゼーションがしばしばin vivo阻害効果に対応することが示されているので(Jarvisら, 1996; LieberおよびStrauss, 1995; Limaら, 1997; Matveevaら, 1998)、速度係数は、おそらく、オリゴデオキシヌクレオチドによる攻撃のための細胞内標的部位を同定するのに有用であろう。
【００４４】
三次構造はODN-mRNAハイブリダイゼーションの重要な因子ではないようにみえるので(部位がハイブリダイズする相対能力は[Mg2+]に敏感でなかった)、有利な部位の推測的同定に残された主要な問題は、標的RNAに結合したタンパク質による細胞内部位の占有であろう。いくつかのリボザイムおよびアンチセンスヌクレオチドは細胞内および全生物内で効果を示すので、タンパク質結合は克服できない障害にはならないにちがいない。ヒト細胞系で発現されるHIV-1 tat mRNAを用いた実験から、アンチセンス攻撃に対する16の部位の細胞内ハイブリダイゼーション能は、計算された速度係数との良い相関関係(r=0.82)を示すことがわかる。我々は、速度係数を用いてアンチセンスオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションのための標的部位を同定することにより、実験的に試験しなければならない部位の数をごく小数に限定することができると結論する。
【００４５】
速度論的モデルを試験するために、我々は、6つのオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)への人工RNA断片のハイブリダイゼーションおよび分子ビーコンへのHIV-1 tat mRNAのハイブリダイゼーションの速度係数を計算した。次に、我々は、これらの値を、他の研究室(Schwilleら, 1996)および我々によりこれまでに測定された初期ハイブリダイゼーション速度と比較した。良好な相関が得られた。また、我々は、モデルを用いて、RNA-RNAアニーリングのための核形成部位をも同定したところ、発表された実験データに一致した。第3の試験として、我々は、HIV-1インテグラーゼmRNA(935nt)中の広範な部位へのODNのハイブリダイゼーションの速度係数を計算し、接近容易性の尺度として標的RNAのODN媒介RNase H開裂を決定した。本発明の方法を用いて行った予測は、わずかの例外を除けば、実験データに一致する。発表されたデータのさらなる遡及的調査を行ったところ、我々の定常状態モデルが一般に適用可能であることがわかった。in vitroハイブリダイゼーションにおいてより有利な標的部位は、in vivoで遺伝子発現のアンチセンス阻害にとってもより有効であることが多いので(Matveevaら, 1998)、本発明の方法は、生きている細胞中のmRNAに適用することができる。この予想は、ヒト細胞を用いてHIV-1 tat遺伝子のアンチセンス阻害を調べた実施例5〜6に記載されている実験の結果により裏づけられる。
【００４６】
図2に示されるように、HIV-1 vif-vpr RNAを標的とする15のハンマーヘッドリボザイムについて、速度係数
【数２０】
2005514002.tif 000021
(式13)を計算した。そのためのkcat/Kmは測定済みであった(Campbellら, 1997およびCampbellからの個人的情報)。kcat/Kmの値を、計算された速度係数に対してプロットした。
【００４７】
融解エネルギー(ΔGm)およびエネルギー差(ΔGd)の計算
ハイブリダイゼーションが起こる前に、標的およびアンチセンス核酸(エネルギー=GO)は、相互作用の領域で一本鎖にならなければならない(エネルギー=G1; 図1参照)。ハイブリダイゼーション領域の構造を融解させるのに必要な自由エネルギーは、融解エネルギー(ΔGm = Gl - GO)と呼ばれる。ハイブリダイゼーションの結果として、より低いエネルギー状態(エネルギー=G2)になる。ハイブリダイズされた状態と活性化された状態との自由エネルギー差(G2 - Gl)は、ΔGhにより表される。ハイブリダイゼーション後の状態とハイブリダイゼーション前の状態との自由エネルギー差(G2 - G0)は、ΔGdにより表される。典型的な例では、ΔGmは正であり、ΔGhおよびはΔGdは負である。
【００４８】
所与の標的部位の速度係数(x)を決定するために、初期状態、活性化状態、および最終状態(ハイブリダイズされた状態)の自由エネルギーから、ハイブリッドを形成するのに必要な融解エネルギーおよびハイブリッドの形成時に得られるエネルギーを計算した(図1参照)。アンチセンスおよび標的RNAの初期自由エネルギー(G0antiおよびG0target)は、GCG RNAフォールディングプログラムFoldRNA(GCG Package Version 9.1-Unix, Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison)の出力ファイルから取得した。活性化アンチセンスオリゴヌクレオチド(G1anti)および活性化標的RNA(G1target)の自由エネルギーは、オンラインコマンドPREVENTを用いて、同じようにして取得したが、ハイブリダイゼーション領域を一本鎖コンフォメーションに拘束した。大きいRNA標的では、部位が埋め込まれている500ヌクレオチドだけがフォールディング中に含まれていた。これらのフォールディングプログラムでは一度に1分子しか解析することができないので、我々がCプログラミング言語で書いたプログラムを用いて、ハイブリダイゼーションの自由エネルギー(ΔGh)を計算した。他者により測定された熱力学パラメーター(Mathewsら, 1999b ; SantaLucia, 1998)を使用するこのプログラムは、申請すれば、Jian-Ying Wang, Public Health Research Institute, New Yorkから入手可能である。
【００４９】
最終状態のエネルギー(G2)、融解エネルギーΔGm、およびエネルギー差ΔGdは、次のように計算した。
【数２１】
2005514002.tif 000022
【００５０】
次に、ΔGmおよびΔGdの値を式7〜15に代入した。HIV-1インテグラーゼmRNAのデータを用いて、我々は、in vitroハイブリダイゼーションの場合にはC=10-8のとき、細胞内活性の場合にはC=10-11のとき、ばらつきが最も少なくなることを見出した。したがって、我々は、アンチセンスDNAオリゴヌクレオチドが関与するすべての計算に対して、経験的に決定されたこれらの数値を使用した。多くの部位を考慮するために、我々は、UNIXで書かれたスクリプトプログラム(下記参照)を利用して、反復計算を行った。曲線のあてはめは、プログラムDeltaGraph(DeltaPoint, Inc.)を用いて行った。
【００５１】
UNIXスクリプト
好適なコンピュータプログラムの例を以下に示す。プログラムはUNIX対応システム向けのスクリプトで書かれているが、他のプラットフォーム向けのプログラムおよび/または他のプログラミング言語で書かれたプログラムで以下のプログラムを置き換えることができることは自明であろう。
【００５２】
RNAのアンチセンスODN攻撃のための接近しやすい部位を探索するためのUNIX向けスクリプト
2005514002.tif 000023
2005514002.tif 000024
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【００５３】
RNA-RNAアニーリングの核形成部位を探索するためのUNIX向けスクリプト
2005514002.tif 000029
2005514002.tif 000030
2005514002.tif 000031
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2005514002.tif 000034
【００５４】
ハイブリダイゼーションの測定
バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼおよび発現プラスミドpLJS10 (SioudおよびDrlica, 1991)を用いてHIV-1 int遺伝子からin vitro転写させることにより、放射能標識された標的mRNAを得た。int RNA中の所定の部位へのアンチセンスDNAオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションにより、標的部位ハイブリダイゼーション能を測定した。20mM Tris-HCl(pH7.8)、100mM KCl、およびさまざまな濃度のMgCl2を含有する5μlの溶液中、0.1単位のRNase H(GIBCO)の存在下、37℃で、等モル量のオリゴヌクレオチドおよびmRNA(約0.2 pmol)をインキュベートした。等体積の10mM Tris-HCl(pH8.3)、10mM EDTA、0.1%ブロモフェノールブルー、0.1%キシレンシアノール、および96%ホルムアミドを添加することにより、反応を停止させた。各アンチセンスオリゴヌクレオチドについて、6%尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびPhosphorImagerスキャニングにより、インタクトな標的の消失をアッセイした。
【００５５】
培養ヒト細胞中におけるアンチセンス活性
本発明の方法を用いて、HIV-1のtat遺伝子由来のmRNAの16の領域についてハイブリダイゼーション速度係数を計算し、各部位に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを構築し、ヒト細胞系293においてTat発現を阻害する能力を試験した。計算された速度係数および細胞内アンチセンス活性は、in vitroにおけるmRNAのハイブリダイゼーションおよび細胞内遺伝子発現の阻害の場合と同様に、よい相関関係(r=0.8; p<0.001)を示した。したがって、我々は、RNAの三次構造およびin vitroでは存在しない細胞内RNA結合性タンパク質がこの系においてmRNAへのアンチセンスODNのハイブリダイゼーションにほとんど影響を及ぼさないことを見いだした。我々は、コンピュータ使用の計算モデルを用いて、ハイブリダイゼーションに最も好適であるmRNA標的部位を選択し、試行錯誤を伴う時間のかかる実験を回避することができると結論する。
【００５６】
上述した実験からわかるように、ハイブリダイゼーション速度を求める本発明の方法は、細胞内条件下に当てはまる。すなわち、ODN-mRNAハイブリダイゼーションの計算された速度係数は、ODNアンチセンス活性との相関関係を示した(図12)。RNase H作用によるtat mRNAの開裂産物を6%尿素PAGEにより分離し、PhosphorImagerを用いて定量した。各ODNにより媒介されたた開裂のパーセントを、式13を用いて計算された速度係数に対してプロットした。RNase H媒介RNA開裂によりアッセイした場合、ほとんどの部位は、in vitroにおいて細胞内活性とハイブリダイゼーションとの高い相関関係を呈する(図13)。これらの結果は、細胞内mRNA中の部位のほとんどがタンパク質や他の因子によって占有されないことを示している。計算モデルは三次構造を無視するので、そのような構造は、mRNAにハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力に重要な因子ではない。本研究の実用上重要な点は、オリゴヌクレオチドライブラリースクリーニングの労力と時間のかかる方法を用いずに、計算によりアンチセンス攻撃に有利な部位を決定することができる点である。本研究で試験した16のODNのうちいくつかは、HIV-1複製の阻害を調べるために使用されている(Hendryら, 1997; Jacksonら, 1998; Sunら, 1995; Zhouら, 1994)。きわめて有利な部位に対応するものとして、最も良好な#8161を我々のモデルにより同定した。
【００５７】
以下の実施例により本発明についてさらに説明するが、これらの実施例は、特許請求の範囲に記載されている本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００５８】
実施例1： オリゴデオキシヌクレオチド-RNAハイブリダイゼーションの初速度定数の相関関係
我々は、最初に、101ヌクレオチドのRNA標的を用いて、初期ハイブリダイゼーション速度を予測する式14の能力を試験した。このRNA標的に対して、5つのアンチセンスDNAオリゴヌクレオチドの初期ハイブリダイゼーション速度が測定されている(Schwilleら, 1996)。図3A(左側)は、GCG FOLDRNAプログラムにより予測されたRNA標的およびアンチセンスDNAの二次構造を示している。
【００５９】
19〜37ヌクレオチドの範囲の長さを有するアンチセンスDNAは、さまざまな部位を標的とする。我々は、該分子のすべての亜領域の中で最大ハイブリダイゼーション速度定数を有する塩基対合の亜領域における核形成でハイブリダイゼーションが開始されると仮定する。
【００６０】
我々は、各アンチセンスオリゴヌクレオチドの15ntを有するすべての亜領域について、
【数２２】
2005514002.tif 000035
の値を計算した。式中、[S0]は標的RNAの初期濃度である。表1および図3B(右側)において、k/k2として得られた最大値を、測定された初期結合定数と比較した。これにより、15ntのサイズを有する亜領域について、
【数２３】
2005514002.tif 000036
の計算された極大値と、標的RNAのさまざまな領域に相補的なアンチセンスDNAオリゴヌクレオチドの測定された初期結合速度と、の相関関係が示される。
【表１】
2005514002.tif 000037
【００６１】
我々はまた、HIV-1 tat mRNAへの4つの分子ビーコンのハイブリダイゼーションの速度係数を計算し、ハイブリダイゼーションの初速度を測定した。分子ビーコンは、ステム-ループ構造（アンチセンス配列がループ領域中にある）を有するアンチセンス分子である。分子ビーコンの一方の末端に、UV照射時に蛍光を放出する発蛍光団を結合させる。他方の末端は、ステム領域が塩基対合したときに発蛍光団により放出された蛍光を吸収する消光剤を結合させる。ループ領域のアンチセンス配列が相補的標的にハイブリダイズした場合、発蛍光団と消光剤とが分離し、UV照射後に蛍光が観測される。表2は、速度係数と測定された初期ハイブリダイゼーション速度との相関関係を示している。
【表２】
2005514002.tif 000038
【００６２】
実施例2： RNA-RNAの核形成部位の同定
RNA-RNAアニーリングは安定な複合体の形成をもたらす短い領域の接触(キッシング: kissing)を介して開始することが提案されている。次に、安定な核形成複合体は伸長して、全長ハイブリッドを形成する。長いRNA-RNAハイブリダイゼーションの場合、核形成が律速であると予想される。したがって、核形成に必要な要素を理解しようとかなりの努力がなされてきた。ループ-ループ接触モデルによれば、アンチセンスと標的RNAの両方に存在するループ同士の接触から迅速なハイブリダイゼーションが開始される。いくつかの例についてはこのモデルにより説明がつくが、初期接触領域がループ中に存在しない例もある。配列情報から核形成領域を予測するのは困難であった。なぜなら、ループ領域は一本鎖マッピングにより決定されねばならず、また、複数のループが存在する可能性があるからである。式14を用いれば、短い塩基対合領域について段階的に計算したときに最大のハイブリダイゼーション速度係数を有する領域として核形成部位を同定することができる。
【００６３】
式14の1つの試験として、我々は、Sczakielグループ(Rittnerら, 1993)により提示されたハイブリダイゼーションデータを調べた。その研究では、一連の抗HIV-l RNAが調製された。そのセットの全てのメンバーは、共通の5'末端を有していたが、3'末端は異なっていたので、長さが異なっていた。HIV-1 RNAにハイブリダイズさせたとき、これらの分子は、長さに依存する顕著な差異を示した(図4A, 下側)。我々は、式14を用いて、Sczalcielグループ(Rittnerら, 1993)により試験された各アンチセンスの全ての可能性のある位置で11ヌクレオチド長の領域について速度係数(x)を計算した。各アンチセンスオリゴヌクレオチドについてxの最大値をプロットしたとき(図4A, 上側)、データはSczakiel(Rittnerら, 1993)のデータと一致した。その後、Sczakielら(Homannら, 1993)は、図4A(下側)に示されるパターンが核形成部位に起因するものであると説明した。彼らは、突然変異誘発によりそのような部位の1つを同定した((Homannら, 1993); 矢印(図4B)。その部位の位置は、各アンチセンスについて計算した速度係数の最大値の位置に対応した(図4B)。したがって、我々は、核形成部位を同定するために式14を用いることができる。
【００６４】
第2の例では、ファージP22 ant遺伝子の発現を、ant RNAへのアンチセンスRNA(sar)のハイブリダイゼーションにより制御する。初期の中間体dsRNAハイブリッドを単離することにより、Schafferら(SchaeferおよびMcClure, 1997)は、ant RNAの短いステム中のヌクレオチドと対合するsar RNAのループ領域中の核形成部位を同定した。我々は、長さが11ntのすべての領域について式14を用いて速度係数を計算し、観測された核形成部位(SchaeferおよびMcClure, 1997)に一致するヌクレオチド12〜22の領域に最大値が位置することを見いだした。sar RNAの5'部分の1〜27をトランケートすると、急速アニーリングが阻害された(SchaeferおよびMcClure, 1997)。nt 43までさらに欠失させると、アニーリング速度が部分的に回復した。計算された最大速度係数は、観測されたハイブリダイゼーション速度変化との相関関係を示した(図5)。
【００６５】
実施例3： HIV-1インテグラーゼmRNAへのアンチセンスODNハイブリダイゼーションのための接近しやすい部位の同定
標的部位ハイブリダイゼーションの予測指標として使用される速度係数(式14のx)の能力の試験として、我々は、10-2〜108の範囲のx値を有するHIV-1インテグラーゼmRNA内の32の部位を調べた。我々は、各部位に相補的なアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)を調製し、0.45mM MgCl2の存在下で放射能標識インテグラーゼmRNAおよびRNase Hと共に各オリゴヌクレオチドをインキュベートした。すべての反応物を同時に添加し、インキュベーション時間を制限することにより、準定常状態近似を適用した。in vitroで転写された放射性mRNAを、0.45mM MgCl2中で個々のオリゴヌクレオチドおよびRNase Hと共に13分間インキュベートした。ゲル電気泳動により標的RNA(935nt)および開裂産物を分離し、PhosphoImagerで検出した(図の下側部分)。各部位について計算した速度係数を、図6の対応するレーンの上端に示す。オリゴヌクレオチドは、任意に番号づけされている。文字「a」は、オリゴヌクレオチドを添加しなかったことを示し、文字「b」は、無関係のオリゴヌクレオチドを添加したことを示す。速度係数が大きい値をとると計算された標的部位は、明確に区別される産物断片を生じた。小さい速度係数を有する部位は、区別される産物をほとんど生じなかった。開裂されたRNAの量をハイブリダイゼーションの尺度として使用した場合、本発明の方法(式14)は、最も有利な部位を同定するうえで信頼性があった(図7a)。大きい速度係数(x>104)を有する17の部位はすべて、実験的に有利な部位であった(25%未満の標的RNAが開裂されずに残存した)。小さい係数(x<102)を有する4つの部位はすべて、実質的なハイブリダイゼーションを示さなかった(60%を超える標的RNAが開裂されずに残存した)。中間の速度係数(102<x<104)を有する部位は、ばらつきのある結果を示し、有利な部位と有利でない部位との間で急激な変化があるようである。我々は、速度係数(x)によりどの部位が最も有利であるかが予測されると結論する。
【００６６】
32の部位に対するxの値は多くの桁にわたっていたのに、開裂されずに残存していた標的RNAの部分が30倍程度の差しかなかったので、我々は、図7に示されるデータを得るのに使用した単一時間-点アッセイがハイブリダイゼーション速度の差にそれほど敏感でないのではないかと疑わしく思った。この考えを検討するために、最大および最小の速度係数を有する部位(図6の#11および#19)について、さまざまなインキュベーション時間の後でRNase Hアッセイによりハイブリダイゼーションを測定した。曲線の準線形領域において、開裂速度に200倍の差が認められた(図8)。最も接近しやすい部位(図6の#11、黒丸)または最も接近しにくい部位(図6の#19、白丸)に相補的なオリゴヌクレオチドを、int mRNAおよびRNase Hと共に、0.45mM MgCl2中、指定の時間にわたりインキュベートした。挿入図は、最も有利な部位について短いインキュベーション時間範囲にわたって得られた結果を示している。我々の測定は初速度をより密接に近似しているので、有利な部位と不利な部位との実験差は増大する。
【００６７】
実施例4： 速度係数と発表されたアンチセンス-mRNAハイブリダイゼーションとの相関関係
式14の汎用性に関する試験として、我々は、速度係数xと、アセチルコリンエステラーゼmRNA中の部位へのODNのハイブリダイゼーションと、の関係を調べた(Birikhら, 1997)。この実験では、mRNAを10ヌクレオチド長のランダム配列のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドのプールにハイブリダイズさせた。RNase Hの存在下でオリゴヌクレオチドをmRNAに結合させ、次に、最も容易にハイブリダイズされた領域(RNase Hにより分解された領域)をゲル電気泳動により明らかにした。発表されたデータを調べることにより、我々は有利な部位を同定した(図9, 矢印)。実験的に有利な部位(ヌクレオチド位置1,000〜1,700)は、アンチセンスオリゴヌクレオチド-mRNAハイブリダイゼーションに続くRNase H媒介開裂のゲル電気泳動から同定した(Birikhら, 1997中の図3)。10ヌクレオチド長のアンチセンスDNAについて計算した速度係数(x)(実線)を、アセチルコリンエステラーゼmRNA中のアンチセンス結合部位の5'位置に対してプロットする。「●」の記された矢印は、不利な部位であると予測された、実験的に有利な部位を示している。
【００６８】
我々はまた、アセチルコリンエステラーゼmRNAの同一領域のすべての部位について5ヌクレオチド間隔で速度係数(x)を計算した(トレース、図9)。矢印は、トレースのピークの位置と一致する(図9)。x>104を有すると計算された部位の約半分は、有利な部位であるとして実験的に同定された。同様に、実験的に同定された有利な部位の85%は、104を超える速度係数を有することが見いだされた。実験的に有利な部位のうち1つだけが、計算では抜けていた。多剤耐性遺伝子のmRNA (Hoら, 1996)、アンギオテンシンタイプ1レセプター遺伝子(Hoら, 1998)、マウスc-myb mRNA(Jarvisら, 1996)、およびC型肝炎ウイルスゲノムRNAの断片(Limaら, 1997)についても、同様の結果が得られた(図示せず)。こうして、7種のRNAについて、式13を用いた速度係数の計算は、実験的に有利な部位を同定した。
【００６９】
実施例5： アンチセンスODNの抗Tat活性を測定するための細胞内システム
Tat発現に及ぼすアンチセンスODNの阻害効果を測定するために、3つの核酸種をトランスフェクションにより培養ヒト細胞に送達した：ODN、HIV-1 LTRにより調節されたGFPを発現するベクターp731、およびHIV-1 Tatを発現するベクターpCVl。
【００７０】
2つのプラスミドと、対照(パネルA)またはアンチセンス(パネルB)のオリゴデオキシヌクレオチドのいずれかと、を用いてヒト細胞系に同時トランスフェクトした。プラスミドのうちの一方は、HIV-1 LTRの制御下で緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現し、他方は、HIV-1 Tatを発現する。Tatタンパク質は、GFP発現プラスミドの転写物中のtar部位と相互作用し、蛍光を誘導する(パネルA)。機能性ODNがtat mRNAに結合すると、tat発現が阻害されて、より少ない蛍光がバックグラウンドとして観測される(パネルB)。
【００７１】
このシステム(図10)では、Tatタンパク質により10倍に促進されるGFPの一過性発現を、tat mRNA濃度の指標とみなした。tat mRNAがODNによる攻撃を受けると、Tatの量が減少するので、蛍光が低減すると予想された。
【００７２】
システムを最適化し、蛍光応答がトランスフェクション時に存在するTatコード化プラスミドの量と直線関係になる範囲を同定した。我々は、蛍光応答が存在するTatの量に比例すると仮定した。トランスフェクション試薬FuGeneTM 6の能力は、3μlの試薬につき2μgのDNAであると判明し、これは製造業者により示されたよりもわずかに少なかった。蛍光は、0.35×106細胞/mlの細胞密度で最大を示し、トランスフェクションに続いて24〜30時間インキュベーションした後に最大に達した。蛍光は、0.5μl/ウェル(直径35mm)のp731と共に細胞に送達された最大0.3μg/ウェルまでのpCVlの濃度に直線的に応答した。
【００７３】
材料および方法： p731は、発現ベクターpcDNA3.1/Zeo(-)(Invitrogen Carlsbad, CA)の誘導体であり、緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子がマルチクローニング部位に挿入されている。プロモーターPcmvは、HIV-1 LTR(nt 313-536 GenBank登録番号03455)で置き換えた。したがって、GFP遺伝子発現は、HIV-1 Tatタンパク質の存在により大幅に増大される。
【００７４】
構成的にtat mRNAを転写するpCV1はすでに記載されている(Aryaら, 1985)。pCV1中のtat cDNAは、nt 606から1265まで延在する(GenBank登録番号K03455)。
【００７５】
オリゴヌクレオチドは、Integrated DNA Technology, Inc (Coralville, IA)により合成されたものである。ヒト細胞にトランスフェクトするために使用したのは、ホスホロチオエートで改変されたものであった。
【００７６】
ヒト細胞系293を用いて一過性にGFPおよびtat遺伝子を発現させた。この細胞系は、アデノウイルスの初期領域を含有して、それを発現するアデノウイルス形質転換されたヒト胚性腎細胞系である。それらは、E1欠損アデノウイルス突然変異体およびベクターの増殖を補完する。細胞は、10%熱不活性化ウシ胎仔血清(FBS)、50u/mlのペニシリン、50μg/mlのストレプトマイシン、および4mMグルタミンが添加されたRPMI 1640基本培地(BioWhittaker, Walkersville, MD)中で増殖させた。FBS、グルタミン、および抗生物質は、RPMI 1640培地に添加する前に0.2μｍ滅菌フィルターを通して濾過した。
【００７７】
あらかじめ加温されたRPMI培地(6ml)に106個のヒト細胞系293を接種し、100×20mmディッシュ(培養面積55cm2)中、37℃でインキュベートした。増殖がコンフルエントになったとき、増殖培地を除去し、細胞を6mlのPBSで洗浄した。次に、トリプシン処理を行ってディッシュの壁面から細胞を分離し、0.35×106細胞/mlの濃度で再懸濁させた。2mlの細胞を6ウェルプラスチック培養プレート(Fisher, Springfield, NJ)の各ウェル(直径60mm、面積21cm2)に移した。37℃で24時間インキュベートした後、細胞にプラスミドおよびオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした。
【００７８】
トランスフェクションのために、6μlのFuGeneTM 6(Boehringer Mannheim)と100μlのFBS欠損RPMI培地との混合物を室温で5分間インキュベートし、次に、細胞に移入されるDNAを含有するエッペンドルフ管に滴下した。得られたコンジュゲートを室温で15分間インキュベートし、次に、6ウェルプレートのウェル中の293細胞に添加した。プレートを24〜30時間インキュベートしたところ、その間にHIV-1 tatの発現が起こった。
【００７９】
GFPの存在に基づく蛍光を定量するために、増殖培地を除去し、2mlのPBSで細胞を洗浄した。50mM Tris.HCl(pH8.0)、1% NP40、0.02% NaN3、100μg/ml PMSF、および1μg/mlアプロチニン(Sigma)を含有する溶解緩衝液を1ウェルあたり350μlの量で添加して細胞を破壊した。氷上で15分間インキュベートした後、溶解物を遠心管に移し、マイクロ遠心機を用いて最大速度で5分間遠心することにより細胞破片を除去した。上清液(150μl)をMicroFluorescenceプレート(Dynatech)のウェルに移し、励起波長485nmおよび発光波長535nmで蛍光リーダーを用いて蛍光を測定した。
【００８０】
tat mRNAの合成用の鋳型として、プラスミドpCV1由来のtat cDNAを、2種のプライマー: pCV1L (5'CTGCAGGAATTCTAATACGACTCACTATAGCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGC)およびpCV1R (5'CTGCAGGAATTCGCACTCAAGGCAAGCTTTATTGAGGCTT)を用いてPCRにより増幅させた後、プラスミドpUC19中にサブクローン化させた。PCRにより、該遺伝子の上流にT7プロモーターを、それぞれの末端にEcoRI部位を生成させた。得られたプラスミドpUCtatは、EcoRI消化による線状化の後、ラン・オフ転写用の鋳型として用いた。
【００８１】
実施例6： 抗tatオリゴデオキシヌクレオチドによるGFPの細胞内阻害と、計算されたハイブリダイゼーション速度係数との相関
計算された速度係数がどれくらい良好に細胞内アンチセンス活性に対応するかを調べるために、我々は、最初に、tat発現に及ぼす各種濃度の16のODNの影響を測定した(ヌクレオチド配列については表3を参照)。各アンチセンスODNについて、100nM(0.2nmole/ウェル)まで濃度を増大させたところ、蛍光が減少した(代表例を図11に示す)。これらの実験では、293細胞系のヒト細胞を6ウェルプレートのウェル中で増殖させ、記載のごとくさまざまな量のアンチセンスODNと共に、0.5μgのGFPプラスミドDNA、0.3μgのTatプラスミドDNA、および0.1μgのpBR322 DNAを用いてトランスフェクトした。全ODNを100nMまたは0.2nmole/ウェルで一定に保つように、スクランブルされたODNを添加した。
【００８２】
次に、16のODNのそれぞれについて、図11に示されるような直線の傾きを、式13のハイブリダイゼーション速度係数(x)の計算値に対してプロットした。図12に示される、速度係数とアンチセンス活性との関係は、0.8(p<0.001)の相関係数を有していた。これらの実験では、6ウェルプレートのウェル中のヒト293細胞に、図11に示された濃度の個々のODNを、0.5μg/ウェルのp731(GFP)、0.3μg/ウェルのpCV1、および0.1μg/ウェルのpBR322と共に、トランスフェクトした。トランスフェクタントを37℃で30時間インキュベートした。阻害性インジケーターとして、用量に依存した蛍光減少率(曲線の傾き)を、3つの実験の平均として求め、計算されたハイブリダイゼーション能に対してプロットした。これらのデータから、RNAの二次構造だけを考慮することにより、mRNAの多くの領域へのアンチセンスODNの細胞内ハイブリダイゼーションをモデル化できることが示唆される。
【表３】
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【００８３】
他の実施形態
本発明についてその詳細な説明に関連して記述してきたが、当然のことながら、以上の説明は、例示することを意図したものであって、添付の特許請求の範囲により規定される本発明の範囲を限定しようとするものではない。他の態様、利点、および変更も特許請求の範囲内である。たとえば、この新規方法を用いて、所与のゲノム中のすべての遺伝子について最良部位のライブラリーを作製することができると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】アンチセンスRNAと標的RNAとのハイブリダイゼーションに伴うエネルギー変化を示す。
【図２】計算されたハイブリダイゼーション速度係数(x)と、HIV-1 vif-vpr遺伝子に対するハンマーヘッドリボザイムにより媒介されたRNA産物開裂の効率と、の関係をプロットしたものである。
【図３】短いHIV-1標的RNAへのアンチセンスオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを記述する図である。標的RNAの二次構造を左側に示し、その周りに6つのアンチセンスオリゴヌクレオチドの構造およびハイブリダイゼーション位置を示す。右側にあるのは、式14を用いて小さい領域について計算した結合速度定数(x)と、アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドおよびHIV-1 RNAについて測定したハイブリダイゼーション開始速度(k)と、の比較を示すプロットである。
【図４Ａ】HIV-1 RNAにハイブリダイズした一連のアンチセンスオリゴヌクレオチドについて計算したハイブリダイゼーション速度係数(x) (上側)と、実験によるハイブリダイゼーション速度(下側)と、を示す1組のグラフである。パターンは、長さの変化に伴うアンチセンス構造の変化を反映している。計算された最小値は、観測された最小値との相関関係を示す。
【図４Ｂ】図４Ａに示されるHIV-1標的RNA中のさまざまな位置で計算したハイブリダイゼーション速度係数(x)を示すグラフである。矢印は、実験により決定された核形成部位の位置を示す。
【図５Ａ】ファージP22の3種のSar変異体の相対的ハイブリダイゼーション(左側パネル)と、sar領域の構造(右側パネル)と、を示す1組のグラフである。変異体3はインタクトなsarを有し、100%のハイブリダイゼーションを示す。変異体2は長さの27%を欠失しており、ごくわずかのハイブリダイゼーションを示す。変異体1は長さの43%を欠失しており、ハイブリダイゼーションの部分的回復を示す。
【図５Ｂ】図５Ａで述べた変異体3(左側パネル)、変異体2(中央パネル)、および変異体1(右側パネル)について本発明の方法により計算したハイブリダイゼーション速度係数(x)を示す。xの最高値を上端に示す。それらの値は、図５Ａの左側パネルに示される実験値との相関関係を示す。
【図６】アンチセンスオリゴヌクレオチドにより媒介されたHIV-1インテグラーゼmRNAのRNase H開裂を示す。
【図７】HIV-1インテグラーゼmRNAのハイブリダイゼーション能の予測値と実験値との関係を示す。パネルAは、本発明の方法を利用したものである。パネルBは、Mathewsら(1999a)の方法を利用したものである。
【図８】最も接近しやすい部位(黒丸)または最も接近しにくい部位(白丸)で形成されたHIV-1 int mRNA-アンチセンスオリゴヌクレオチドハイブリッドのRNase H開裂の時間的経過を示す。
【図９】アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドmRNAとヒトアセチルコリンエステラーゼmRNAとの相互作用について計算された速度係数と測定されたハイブリダイゼーションとの相関を示す。
【図１０】HIV-1 tat発現に及ぼすアンチセンスODNの阻害効果を調べるために使用したアッセイシステムを示す。
【図１１】培養ヒト細胞におけるtat発現の阻害に及ぼすアンチセンスODNの濃度の影響を示す。
【図１２】計算されたハイブリダイゼーション能と、蛍光減少により測定したときのODNの細胞内阻害効果と、の相関を示す。
【図１３】HIV-1 tat発現の細胞内阻害の効率と、アンチセンスODNにより媒介されたin vitroにおけるtat RNAのRNase H開裂と、の相関を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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