(57)【要約】本発明は、胃抑制性ポリペプチドの新規なＣ末端欠失した断片および新規なＮ末端修飾したアナログ並びにジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＩＶ）耐性の改善および半減期の延長を目的としてペプチド結合が還元されたまたはＤＰＩＶ特異的開裂部位に近接したアミノ酸の変化した種々のＧＩＰアナログに関する。さらに、本発明は、ＧＩＰの潜在的なレセプター結合部位間に種々のリンカーを有する新規なアナログに関する。本発明の化合物および薬理学的に許容しうるその塩は、インスリン非依存性糖尿病や肥満などのＧＩＰ−レセプターによって媒体される状態の治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然のＧＩＰ（１−１４）の配列を除く、アミノ酸配列：
Tyr-A-B-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met
（式中、ＡおよびＢは、Ｄ−アミノ酸残基、Ｎ−メチル化アミノ酸残基または他のタンパク質非構成性アミノ酸残基を含むアミノ酸残基である）を有する化合物または薬理学的に許容しうるその塩。
【請求項２】
１位のチロシン残基のＮ末端が、アルキル化、スルホニル化、グリケーション、ホモセリン形成、ピログルタミン酸形成、ジスルフィド結合形成、アスパラギンまたはグルタミン残基の脱アミド化、メチル化、ｔ−ブチル化、ｔ−ブチルオキシカルボニル化、４−メチルベンジル化、チオアニシル化、チオクレシル化、ベンジルオキシメチル化、４−ニトロフェニル化、ベンジルオキシカルボニル化、２−ニトロベンゾイル化、２−ニトロスルフェニル化、４−トルエンスルホン化、ペンタフルオロフェニル化、ジフェニルメチル化、２−クロロベンジルオキシカルボニル化、２,４,５−トリクロロフェニル化、２−ブロモベンジルオキシカルボニル化、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル化、トリフェニルメチル化、２,２,５,７,８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル化、ヒドロキシル化、メチオニンの酸化、ホルミル化、アセチル化、アニシル化、ベンジル化、ベンゾイル化、トリフルオロアセチル化、アスパラギン酸またはグルタミン酸のカルボキシル化、リン酸化、硫酸化、システイン化、ペントース、デオキシヘキソース、ヘキソサミン、ヘキソースまたはＮ−アセチルヘキソサミンとのグリコシル化、ファルネシル化、ミリストイル化、ビオチン化、パルミトイル化、ステアロイル化、ゲラニルゲラニル化、グルタチオン化、５’−アデノシル化、ＡＤＰ−リボシル化、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、Ｎ−アセチルノイラミン酸、ピリドキサールリン酸、リポ酸、４’−ホスホパンテテイン、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドでの修飾によって修飾することができる、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
該ペプチドが、いずれかのアミノ酸位置において少なくとも１のε−アミノ脂肪酸アシル化リシンの導入によって修飾されている、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
アミノ酸配列：
Tyr-(D-Ala)-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met
を有する、請求項１、２または３に記載の化合物。
【請求項５】
アミノ酸配列：
Tyr-Ala-Pro-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met
を有する、請求項１、２または３に記載の化合物。
【請求項６】
還元されたペプチド結合を含む下記アミノ酸配列：
Tyr-Ala-Ψ(CH2NH2)-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met；または
Tyr-Ala-Ψ(CH2NH)-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met-Asp-Lys-Ile-His-Gln-Gln-Asp-Phe-Val-Asn-Trp-Leu-Leu-Ala-Gln-Lys
を有する化合物または薬理学的に許容しうるその塩。
【請求項７】
アミノ酸配列：
Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Tyr-Met
を有する化合物または薬理学的に許容しうるその塩。
【請求項８】
アミノ酸配列：
Ala-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met；
Tyr-Ala-Ala-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met；
Tyr-Ala-Glu-Ala-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met；
Tyr-Ala-Glu-Gly-Ala-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met；
Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Ala-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met；
Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ala-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met；
Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ala-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met；
Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Ala-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met；
Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Ala-Ser-Ile-Ala-Met；
Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ala-Ile-Ala-Met；
Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ala-Ala-Met；または
Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Ala
を有する化合物または薬理学的に許容しうるその塩。
【請求項９】
１またはそれ以上のリンカーペプチドを含む下記アミノ酸配列：
Tyr-A-B-Gly-Thr-Phe-C-Gln-Gln-Asp-Phe-Val-Asn-Trp-Leu-Leu-Ala-Gln-Lys-Gly-Lys-Lys-Asn-Asp-Trp-Lys-His-Asn-Ile-Thr-Gln
（式中、Ｃは、
（ａ）使用されない、
（ｂ）アミノ酸残基、Ｄ−アミノ酸およびタンパク質非構成性アミノ酸よりなる群から選ばれた４のアミノ酸残基を含むリンカーペプチド、
（ｃ）Glu-Lys-Glu-Lys、
（ｄ）Ala-Ala-Ala-Ala、
（ｅ）アミノ酸残基、Ｄ−アミノ酸およびタンパク質非構成性アミノ酸よりなる群から選ばれた１２のアミノ酸残基を含むリンカーペプチド、
（ｆ）Glu-Lys-Glu-Glu-Lys-Glu-Lys-Glu-Glu-Lys-Glu-Lys、
（ｇ）6-Ahxn（６−アミノヘキサン酸）（ｎ＝１〜３）；または
（ｈ）６ないし３４個の炭素原子を有するオメガ−アミノ脂肪酸（飽和および／または不飽和）；および
ＡおよびＢは、アミノ酸残基、Ｄ−アミノ酸残基、Ｎ−メチル化アミノ酸残基または他のタンパク質非構成性アミノ酸残基である）を有する化合物または薬理学的に許容しうるその塩。
【請求項１０】
１位のチロシン残基のＮ末端が、アルキル化、スルホニル化、グリケーション、ホモセリン形成、ピログルタミン酸形成、ジスルフィド結合形成、アスパラギンまたはグルタミン残基の脱アミド化、メチル化、ｔ−ブチル化、ｔ−ブチルオキシカルボニル化、４−メチルベンジル化、チオアニシル化、チオクレシル化、ベンジルオキシメチル化、４−ニトロフェニル化、ベンジルオキシカルボニル化、２−ニトロベンゾイル化、２−ニトロスルフェニル化、４−トルエンスルホン化、ペンタフルオロフェニル化、ジフェニルメチル化、２−クロロベンジルオキシカルボニル化、２,４,５−トリクロロフェニル化、２−ブロモベンジルオキシカルボニル化、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル化、トリフェニルメチル化、２,２,５,７,８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル化、ヒドロキシル化、メチオニンの酸化、ホルミル化、アセチル化、アニシル化、ベンジル化、ベンゾイル化、トリフルオロアセチル化、アスパラギン酸またはグルタミン酸のカルボキシル化、リン酸化、硫酸化、システイン化、ペントース、デオキシヘキソース、ヘキソサミン、ヘキソースまたはＮ−アセチルヘキソサミンとのグリコシル化、ファルネシル化、ミリストイル化、ビオチン化、パルミトイル化、ステアロイル化、ゲラニルゲラニル化、グルタチオン化、５’−アデノシル化、ＡＤＰ−リボシル化、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、Ｎ−アセチルノイラミン酸、ピリドキサールリン酸、リポ酸、４’−ホスホパンテテイン、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドでの修飾によって修飾することができる、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
該ペプチドが、いずれかのアミノ酸位置において少なくとも１のε−アミノ脂肪酸アシル化リシンの導入によって修飾されている、請求項９または１０に記載の化合物。
【請求項１２】
該ペプチドが、ＡとＢとの間での還元されたペプチド結合またはペプチド結合の他の修飾の導入によって修飾されている、請求項９、１０または１１に記載の化合物。
【請求項１３】
１またはそれ以上のリンカーペプチドを含む下記アミノ酸配列：
Tyr-A-B-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met-D-Gln-Gln-Asp-Phe-Val-Asn-Trp-Leu-Leu-Ala-Gln-Lys-Gly-Lys-Lys-Asn-Asp-Trp-Lys-His-Asn-Ile-Thr-Gln
（式中、Ｄは、
（ａ）使用されない、
（ｂ）アミノ酸残基、Ｄ−アミノ酸およびタンパク質非構成性アミノ酸よりなる群から選ばれた４のアミノ酸残基を含むリンカーペプチド、
（ｃ）Ala-Ala-Ala-Ala、
（ｄ）Glu-Lys-Glu-Lys、
（ｅ）6-Ahxn（６−アミノヘキサン酸）（ｎ＝１〜３）；または
（ｆ）６ないし３４個の炭素原子を有するオメガ−アミノ脂肪酸（飽和および／または不飽和）；および
ＡおよびＢは、アミノ酸残基、Ｄ−アミノ酸残基、Ｎ−メチル化アミノ酸残基または他のタンパク質非構成性アミノ酸残基である）を有する化合物および薬理学的に許容しうるその塩。
【請求項１４】
１位のチロシン残基のＮ末端が、アルキル化、アセチル化またはグリケーションによって修飾することができる、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
該ペプチドが、いずれかのアミノ酸位置において少なくとも１のε−アミノ脂肪酸アシル化リシンの導入によって修飾されている、請求項１３または１４に記載の化合物。
【請求項１６】
該ペプチドが、ＡとＢとの間での還元されたペプチド結合またはペプチド結合の他の修飾の導入によって修飾されている、請求項１３、１４または１５に記載の化合物。
【請求項１７】
リン酸化セリル残基を含む下記アミノ酸配列：
Tyr-[Ser(P)]-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met、
Tyr-[Ser(P)]-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met-Asp-Lys-Ile-His-Gln-Gln-Asp-Phe-Val-Asn-Trp-Leu-Leu-Ala-Gln-Lys、または
Tyr-[Ser(P)]-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met-Asp-Lys-Ile-His-Gln-Gln-Asp-Phe-Val-Asn-Trp-Leu-Leu-Ala-Gln-Lys-Gly-Lys-Lys-Asn-Asp-Trp-Lys-His-Asn-Ile-Thr-Gln
を有する化合物または薬理学的に許容しうるその塩。
【請求項１８】
アミノ酸配列：
Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met-
┌─────────┐
Asp-Lys-Ile-His-Gln-Gln-Asp-Phe-Val-Asn-Trp-Leu-Leu-Ala-Gln-Lys
を有する化合物または薬理学的に許容しうるその塩。
【請求項１９】
遊離のカルボン酸の形態または薬理学的に許容しうるその塩である、請求項１ないし１８のいずれかに記載の化合物。
【請求項２０】
アミドの形態または薬理学的に許容しうるその塩である、請求項１ないし１８のいずれかに記載の化合物。
【請求項２１】
ジペプチジルペプチダーゼＩＶまたはジペプチジルペプチダーゼＩＶ様の酵素活性による分解に対して耐性である、請求項１ないし２０のいずれかに記載の化合物。
【請求項２２】
ＧＩＰ−レセプターアゴニストである、請求項１ないし２１のいずれかに記載の化合物。
【請求項２３】
ＧＩＰ−レセプターアンタゴニストである、請求項１ないし２１のいずれかに記載の化合物。
【請求項２４】
サイクリックＡＭＰ産生を増大させる、請求項１ないし２３のいずれかに記載の化合物。
【請求項２５】
カスパーゼ−３の活性化を阻止する、請求項１ないし２４のいずれかに記載の化合物。
【請求項２６】
薬理学的に許容しうる担体または希釈液および請求項１ないし２５のいずれかに記載の化合物または薬理学的に許容しうるその酸付加塩を含む医薬組成物。
【請求項２７】
ＧＩＰ−レセプターアナログの損なわれた結合に関連する疾患または状態の予防または治療用医薬の製造のための、請求項１ないし２６のいずれかに記載の医薬組成物または化合物または薬理学的に許容しうるその酸付加塩の使用。
【請求項２８】
β細胞アポトーシスの予防または治療用医薬の製造のための請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
膵β細胞のグルコース依存性増殖の増大用医薬の製造のための請求項２７に記載の使用。
【請求項３０】
インスリン非依存性糖尿病および肥満の治療用医薬の製造のための請求項２７に記載の使用。
【請求項３１】
ＧＩＰ−レセプター結合によって媒体される状態の治療方法であって、そのような治療を必要とする哺乳動物に治療学的有効量の請求項１ないし２６のいずれかに記載の化合物または医薬組成物を投与することを含む方法。
【請求項３２】
食物摂取の結果、哺乳動物において上昇した血中グルコースレベルを低下させる方法であって、治療学的有効量の請求項１ないし２６のいずれかに記載の少なくとも１の化合物または医薬組成物を投与することを含む方法。
【請求項３３】
ペプチド配列の２つのアミノ酸残基間での側鎖ラクタム架橋の導入によって修飾されている、請求項１ないし２６のいずれかに記載の化合物または医薬組成物または薬理学的に許容しうるその塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド（ＧＩＰ）の新規アナログ、該化合物を含む医薬組成物、およびＧＩＰレセプターによって媒体された状態の治療のためのＧＩＰレセプターアゴニストまたはアンタゴニストとしての該化合物の使用の領域に関する。
【背景技術】
【０００２】
４２アミノ酸ペプチドであるインクレチン（incretin）ＧＩＰ（グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド）は、経口で栄養を摂取したのに応答して小腸のＫ細胞から血中に放出される。ＧＩＰは、胃酸の分泌を抑制し、膵臓島細胞からのインスリンの放出を促進する［１，２］。ＧＩＰとグルカゴン様ペプチド−１7-36（ｔＧＬＰ−１）との併合作用が、腸−ランゲルハンス島軸（entero-insular axis）の全インクレチン作用を説明するのに十分であることが示されている［３］。ＧＩＰおよび関連ホルモンであるｔＧＬＰ−１は、II型（インスリン非依存性）糖尿病の病因に関与していると考えられている。インクレチン、とりわけＧＬＰ−１の生理作用は、インスリン分泌の促進のみならず、胃の空隙化（gastric emptying）の抑制［４］およびグルカゴン放出の抑制［５,６,７,８］によっても示されており、改善されたグルコース耐性という結果となる。さらに、ＧＩＰは脂肪細胞機能の重要なレギュレーターであり、ＧＩＰ機能の変化はヒトの肥満の進行に貢献しうる［９］。
【０００３】
血清中ではＧＩＰおよびｔＧＬＰ−１の両インクレチンがジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＩＶ）により分解される。その結果として短い半減期（インビボでは〜２分）はＧＩＰおよびｔＧＬＰ−１の治療目的の使用を制限している［１０,１１,１２］。ｔＧＬＰ−１の場合、ＤＰＩＶ耐性の改善された生物学的に活性なｔＧＬＰ−１アナログを得ることに幾つかの研究が向けられている［１３,１４］。ＧＩＰについては、ＤＰＩＶ耐性の改善されたアナログを得るべく予備的研究がなされている［２０］。最近、完全長ＧＩＰ（１−３０）アナログであるＴｙｒ1−グルシトール−ＧＩＰ［１５］および（Ｐｒｏ3）ＧＩＰ［２０,２１］がＤＰＩＶ耐性および向上した生物活性を示すことが証明された。
【０００４】
Ｇタンパク質結合レセプターファミリー［１６,１７］の一員であるＧＩＰレセプターはＧＩＰに対して高い特異性を有し、グルカゴンファミリーの他のペプチドには結合しない。この理由からＧＬＰ−１／ＧＩＰキメラペプチドはＧＩＰレセプターに対する親和性を殆ど示さない［１８］。そのような研究に基づき、ＧＩＰ1-42分子のＧＩＰ1-30配列はレセプター認識のために必須であると結論付けられている。このことは、Gellingら［１９］によって確認された。Gellingらは、ＧＩＰ6-30アミド（ＧＩＰ6-30a）がＧＩＰ1-42の高親和性結合領域を含むが、他のＮ末端欠失形態がそうであるようにアンタゴニスト活性を示すことを示した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
種々の標的臓器の機能に対するＧＩＰアナログの作用および治療剤としてのＧＩＰアナログの潜在的使用に関連して以下の特許出願がなされている。
【０００６】
ＤＥ１９９２１５３７は、インスリン産生β細胞の増殖の刺激およびそのプログラムされた細胞死の回避により該細胞の生存を引き延ばす方法を開示している。その特別の目標は、内生のインスリン含量および上昇した血中グルコースレベルに対するインスリン応答を増大させることである。この発明の重要な要素は、ＧＬＰ−１、ＧＩＰ、エクセンディン−４（Exendin-4）やＧＬＰ−１レセプターアゴニストまたはＧＩＰレセプターアゴニストなどのエフェクターの投与に応答したインスリン産生β細胞中でのプロテインキナーゼＢ／Ａｋｔの活性化である。
【０００７】
ＥＰ０４７９２１０は、式：GIP(1-13)-X-GIP(15-30)-Y［式中、ＸはＭｅｔ以外のアミノ酸残基、Ｙはホモセリン（ホモセリン−ラクトンを含み、「Ｈｓｅ」と称する）、ホモセリンアミド（Ｈｓｅ−ＮＨ2）、H-Gly-Lys-Lys-Asn-Asp-Trp-Lys-His-Asn-Ile-Thr-Gln-HseまたはH-Gly-Lys-Lys-Asn-Asp-Trp-Lys-His-Asn-Ile-Thr-Gln-Hse-NH2から選ばれる］で示される新規ＧＩＰアナログを開示している。
【０００８】
ＷＯ９８／２４４６４は、ＧＩＰの配列の位置７〜３０に対応する２４アミノ酸ポリペプチドから本質的になるグルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド（ＧＩＰ）のアンタゴニスト、インスリン非依存性糖尿病の治療方法およびインスリン非依存性糖尿病患者においてグルコース耐性を改善する方法を開示している。
【０００９】
ＷＯ００／５８３６０は、インスリンの放出を刺激するペプチドを開示している。この発明は、とりわけ、ＧＩＰのＮ末端を修飾する方法および糖尿病の治療のための該ペプチドアナログの使用を提供している。この発明に開示された特別のペプチドアナログは、ＧＩＰ（１−４２）のＮ末端からの少なくとも１５アミノ酸残基を含む。他の態様において、Ｔｙｒ1グルシトールＧＩＰ（１−４２）が開示されている。
【００１０】
ＷＯ００／２０５９２は、骨密度または骨形成を維持または増大させるためのＧＩＰアナログとしてのＧＩＰまたはＧＩＰもしくはその断片の抗イディオタイプ抗体を開示している。
【００１１】
参照文献
【表１】
2005529862.tif 000002
【００１２】
【表２】
2005529862.tif 000003
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、胃抑制性ポリペプチドの新規なＣ末端欠失した断片および新規なＮ末端修飾したアナログ並びにジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＩＶ）耐性の改善および半減期の延長を目的としてペプチド結合が還元されたまたはＤＰＩＶ特異的開裂部位に近接したアミノ酸の変化した種々のＧＩＰアナログに関する。さらに、本発明は、ＧＩＰの潜在的なレセプター結合部位間に種々のリンカーを有する新規なアナログに関する。
【００１４】
本発明の化合物およびその薬理学的に許容しうる塩は、インスリン非依存性糖尿病を含む、ＧＩＰレセプター機能が変化した状態を治療するのに有用である。２つの特別の応用が提唱される：
１．本発明の化合物は、膵β細胞のグルコース依存性増殖を増大させることができる。
２．本発明の化合物は、膵β細胞に対して抗アポトーシス作用を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチドの新規なＣ末端欠失した断片および新規なＮ末端修飾したアナログ並びにジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＩＶ）耐性の改善および半減期の延長を目的としてペプチド結合が還元されたまたはＤＰＩＶ特異的開裂部位に近接したアミノ酸の変化した種々のＧＩＰアナログに関する。本発明によるアミノ酸の変化は、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、タンパク質構成性（proteinogenic）アミノ酸およびタンパク質非構成性（non-proteinogenic）アミノ酸の残基を包含する。タンパク質構成性アミノ酸は、天然のタンパク質由来のα−アミノ酸として定義される。タンパク質非構成性アミノ酸は、通常の天然タンパク質の構築ブロックを構成しない他のすべてのアミノ酸として定義される。
【００１６】
さらに、本発明は、ＧＩＰの潜在的なレセプター結合部位間に種々のリンカーを有する新規なアナログに関する。
【００１７】
さらに詳細には、本発明は、式（１）：
Tyr-A-B-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met              (1)
（式中、ＡおよびＢは、Ｄ−アミノ酸残基、Ｎ−メチル化アミノ酸残基または他のタンパク質非構成性アミノ酸残基を含むアミノ酸残基である）により示される一般的なアミノ酸配列を有する新規なＧＩＰアナログに関する。さらに、１位のチロシン残基のＮ末端は、アルキル化、スルホニル化、グリケーション、ホモセリン形成、ピログルタミン酸形成、ジスルフィド結合形成、アスパラギンまたはグルタミン残基の脱アミド化、メチル化、ｔ−ブチル化、ｔ−ブチルオキシカルボニル化、４−メチルベンジル化、チオアニシル化（thioanysilation）、チオクレシル化（thiocresylation）、ベンジルオキシメチル化、４−ニトロフェニル化、ベンジルオキシカルボニル化、２−ニトロベンゾイル化、２−ニトロスルフェニル化、４−トルエンスルホン化、ペンタフルオロフェニル化、ジフェニルメチル化、２−クロロベンジルオキシカルボニル化、２,４,５−トリクロロフェニル化、２−ブロモベンジルオキシカルボニル化、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル化、トリフェニルメチル化、２,２,５,７,８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル化、ヒドロキシル化、メチオニンの酸化、ホルミル化、アセチル化、アニシル化、ベンジル化、ベンゾイル化、トリフルオロアセチル化、アスパラギン酸またはグルタミン酸のカルボキシル化、リン酸化、硫酸化、システイン化、ペントース、デオキシヘキソース、ヘキソサミン、ヘキソースまたはＮ−アセチルヘキソサミンとのグリコシル化、ファルネシル化、ミリストイル化、ビオチン化、パルミトイル化、ステアロイル化、ゲラニルゲラニル化、グルタチオン化、５’−アデノシル化、ＡＤＰ−リボシル化、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、Ｎ−アセチルノイラミン酸、ピリドキサールリン酸、リポ酸、４’−ホスホパンテテイン、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドでの修飾によって修飾することができる。式１のペプチドは、いずれのアミノ酸位置においても少なくとも１のε−アミノ脂肪酸アシル化リシンの導入により修飾することができる。
【００１８】
天然のＧＩＰ（１−１４）の配列は本発明から除外される。
【００１９】
式（１）で示される最も好ましい化合物は、Ｄ−Ａｌａ2−ＧＩＰ（１−１４）、Ｐｒｏ3−ＧＩＰ（１−１４）およびＳｅｒ2−ＧＩＰ（１−１４）である。
【００２０】
他の好ましい態様において、本発明は、式（２）：
Tyr-Ala-Ψ(CH2NH2)-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met    (2a)
Tyr-Ala-Ψ(CH2NH)-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met-Asp-Lys-Ile-His-Gln-Gln-Asp-Phe-Val-Asn-Trp-Leu-Leu-Ala-Gln-Lys                    (2b)
により示される、還元されたペプチド結合を有するＧＩＰアナログに関する。
【００２１】
さらなる態様において、本発明は、式（３）：
Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Tyr-Met          (3)
により示される一般的なアミノ酸配列を有する新規なＧＩＰアナログに関する。
【００２２】
別の態様において、本発明は、アラニンスキャニングの結果として得られる式４ａ〜４ｌで示される新規なＧＩＰアナログを提供する。詳細には、これらは式：
Ala-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met      (4a)
Tyr-Ala-Ala-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met      (4b)
Tyr-Ala-Glu-Ala-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met      (4c)
Tyr-Ala-Glu-Gly-Ala-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met      (4d)
Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Ala-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met      (4e)
Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ala-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met      (4f)
Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ala-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met      (4g)
Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Ala-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met      (4h)
Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Ala-Ser-Ile-Ala-Met      (4i)
Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ala-Ile-Ala-Met      (4j)
Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ala-Ala-Met      (4k)
Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Ala      (4l)
で示されるものである。
【００２３】
新規なＧＩＰアナログはリンカーペプチドの合成により得ることができる。それゆえ、本発明は、式（５）：
Tyr-A-B-Gly-Thr-Phe-C-Gln-Gln-Asp-Phe-Val-Asn-Trp-Leu-Leu-Ala-Gln-Lys-Gly-Lys-Lys-Asn-Asp-Trp-Lys-His-Asn-Ile-Thr-Gln                          (5)
（式中、Ｃは、
（ａ）使用されない、
（ｂ）４アミノ酸残基からなるリンカーペプチド；Ｄ−アミノ酸およびタンパク質非構成性アミノ酸の残基を含む、アミノ酸残基のあらゆる組み合わせが可能であり、本発明の範囲に包含される、
（ｃ）Glu-Lys-Glu-Lys、
（ｄ）Ala-Ala-Ala-Ala、
（ｅ）１２アミノ酸残基からなるリンカーペプチド；Ｄ−アミノ酸およびタンパク質非構成性アミノ酸の残基を含む、アミノ酸残基のあらゆる組み合わせが可能であり、本発明の範囲に包含される、
（ｆ）Glu-Lys-Glu-Glu-Lys-Glu-Lys-Glu-Glu-Lys-Glu-Lys、
（ｅ）6-Ahxn（６−アミノヘキサン酸）（ｎ＝１〜３）；または
（ｆ）６ないし３４個の炭素原子、好ましくは６ないし２１個の炭素原子を有するオメガ−アミノ脂肪酸（飽和および／または不飽和）；
ＡおよびＢは、Ｄ−アミノ酸残基、Ｎ−メチル化アミノ酸残基または他のタンパク質非構成性アミノ酸残基を含むアミノ酸残基である）により示されるリンカーペプチドを提供する。
【００２４】
１位のチロシン残基のＮ末端は、アルキル化、スルホニル化、グリケーション、ホモセリン形成、ピログルタミン酸形成、ジスルフィド結合形成、アスパラギンまたはグルタミン残基の脱アミド化、メチル化、ｔ−ブチル化、ｔ−ブチルオキシカルボニル化、４−メチルベンジル化、チオアニシル化、チオクレシル化、ベンジルオキシメチル化、４−ニトロフェニル化、ベンジルオキシカルボニル化、２−ニトロベンゾイル化、２−ニトロスルフェニル化、４−トルエンスルホン化、ペンタフルオロフェニル化、ジフェニルメチル化、２−クロロベンジルオキシカルボニル化、２,４,５−トリクロロフェニル化、２−ブロモベンジルオキシカルボニル化、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル化、トリフェニルメチル化、２,２,５,７,８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル化、ヒドロキシル化、メチオニンの酸化、ホルミル化、アセチル化、アニシル化、ベンジル化、ベンゾイル化、トリフルオロアセチル化、アスパラギン酸またはグルタミン酸のカルボキシル化、リン酸化、硫酸化、システイン化、ペントース、デオキシヘキソース、ヘキソサミン、ヘキソースまたはＮ−アセチルヘキソサミンとのグリコシル化、ファルネシル化、ミリストイル化、ビオチン化、パルミトイル化、ステアロイル化、ゲラニルゲラニル化、グルタチオン化、５’−アデノシル化、ＡＤＰ−リボシル化、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、Ｎ−アセチルノイラミン酸、ピリドキサールリン酸、リポ酸、４’−ホスホパンテテイン、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドでの修飾によって修飾することができる。さらに、２位と３位との間での還元されたペプチド結合またはペプチド結合の他の修飾の導入が提供される。式５のペプチドは、いずれのアミノ酸位置においても少なくとも１のε−アミノ脂肪酸アシル化リシンの導入により修飾することができる。
【００２５】
さらに、本発明は、式（６）：
Tyr-A-B-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met-D-Gln-Gln-Asp-Phe-Val-Asn-Trp-Leu-Leu-Ala-Gln-Lys-Gly-Lys-Lys-Asn-Asp-Trp-Lys-His-Asn-Ile-Thr-Gln        (6)
（式中、Ｄは、
（ｇ）使用されない、
（ｈ）４アミノ酸残基からなるリンカーペプチド；Ｄ−アミノ酸およびタンパク質非構成性アミノ酸の残基を含む、アミノ酸残基のあらゆる組み合わせが可能であり、本発明の範囲に包含される、
（ｉ）Ala-Ala-Ala-Ala、
（ｊ）Glu-Lys-Glu-Lys、
（ｋ）6-Ahxn（６−アミノヘキサン酸）（ｎ＝１〜３）；または
（ｌ）６ないし３４個の炭素原子、好ましくは６ないし２１個の炭素原子を有するオメガ−アミノ脂肪酸（飽和および／または不飽和）；
ＡおよびＢは、Ｄ−アミノ酸残基、Ｎ−メチル化アミノ酸残基または他のタンパク質非構成性アミノ酸残基を含むアミノ酸残基である）により示されるリンカーペプチドを提供する。
【００２６】
１位のチロシン残基のＮ末端は、アルキル化、アセチル化およびグリケーションにより修飾することができる。さらに、２位と３位との間での還元されたペプチド結合またはペプチド結合の他の修飾の導入が提供される。式６のペプチドは、いずれのアミノ酸位置においても少なくとも１のε−アミノ脂肪酸アシル化リシンの導入により修飾することができる。
【００２７】
他の新規なＧＩＰアナログは、Ｓｅｒ2のリン酸化により得ることができる。本発明の好ましい化合物は式７ａ〜７ｃに示す化合物である。
リン酸化セリル残基を含む式７ａ〜７ｃで示される新規なＧＩＰアナログ：
Tyr-[Ser(P)]-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met            (7a)
Tyr-[Ser(P)]-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met-Asp-Lys-Ile-His-Gln-Gln-Asp-Phe-Val-Asn-Trp-Leu-Leu-Ala-Gln-Lys                            (7b)
Tyr-[Ser(P)]-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met-Asp-Lys-Ile-His-Gln-Gln-Asp-Phe-Val-Asn-Trp-Leu-Leu-Ala-Gln-Lys-Gly-Lys-Lys-Asn-Asp-Trp-Lys-His-Asn-Ile-Thr-Gln                                                            (7c)
【００２８】
さらに、新規なＧＩＰアナログは、ペプチド配列のＡｓｐ／Ｇｌｕ残基とＬｙｓ残基との間での側鎖ラクタム架橋の導入による拘束された（constrained）ＧＩＰアナログである。本発明の一つの好ましい化合物は、式８：
Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met-
┌─────────┐
Asp-Lys-Ile-His-Gln-Gln-Asp-Phe-Val-Asn-Trp-Leu-Leu-Ala-Gln-Lys
により示される［シクロ（Ｌｙｓ16，Ａｓｐ21）］ＧＩＰ（１−３０）である。
【００２９】
本発明はさらに、その範囲に本発明の化合物のアミド形態および遊離のカルボン酸形態の両者を包含する。遊離の化合物とそのアミドの形態である化合物とが密接に関連していることに鑑み、化合物をこの文脈で言及する場合はいつでも、アミド並びに遊離のカルボン酸の形態を意図している（事情に応じ、そのようにすることが可能であり適切であることを前提として）。
【００３０】
本発明の化合物は、酸付加塩、とりわけ薬理学的に許容しうる酸付加塩に変換することができる。薬理学的に許容しうる塩は、一般に、アミノ酸の塩基性側鎖が無機または有機の酸でプロトン化された形態をとる。代表的な有機または無機酸としては、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硫酸、硝酸、リン酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、コハク酸、マレイン酸、フマール酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、シュウ酸、パモール酸（pamoic）、２−ナフタレンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、シクロヘキサンスルファミン酸、サリチル酸、サッカリン酸またはトリフルオロ酢酸が挙げられる。本発明の化合物のすべての薬理学的に許容しうる酸付加塩の形態が本発明の範囲に包含される。
【００３１】
遊離の化合物とその塩の形態である化合物とが密接に関連していることに鑑み、化合物をこの文脈で言及する場合はいつでも、対応の塩をも意図している（事情に応じ、そのようにすることが可能であり適切であることを前提として）。
【００３２】
本発明はさらに、その範囲に本発明の化合物のプロドラッグを包含する。一般に、そのような化合物は、化合物の機能的な誘導体であり、インビボで所望の治療学的に活性な化合物に容易に変換されうるものである。それゆえ、これら場合において、本発明の治療方法では「投与」なる語には、記載の種々の疾患を本願の特許請求した１またはそれ以上の化合物のプロドラッグ形態（該プロドラッグ形態は、患者に投与後にインビボで上記で特定した化合物に変換される）で治療することも包含される。適当なプロドラッグ誘導体の選択および調製のための常法は、たとえば、“Design of Prodrugs”、H. Bundgaard編、Elsevier、１９８５および特許出願ＤＥ１９８２８１１３号およびＤＥ１９８２８１１４号（参照のためその全内容を引用する）に記載されている。
【００３３】
本発明による化合物が少なくとも１つのキラル中心を有する場合は、それら化合物はエナンシオマーとして存在してよい。これら化合物が２またはそれ以上のキラル中心を有する場合には、それら化合物はさらにジアステレオマーとして存在してよい。そのような異性体およびその混合物は、すべて本発明の範囲に包含されることが理解されなければならない。さらに、これら化合物の結晶形のあるものは多形として存在してよく、そのようなものも本発明の範囲に包含されることが意図される。さらに、これら化合物のあるものは水（すなわち、水和物）または一般の有機溶媒との溶媒和物を形成してよく、そのような溶媒和物もまた本発明の範囲に包含されることが意図される。
【００３４】
これら化合物（その塩を含む）はまた、その水和物の形態で得ることができ、あるいはその結晶化に使用した他の溶媒を含んでいてよい。
【００３５】
本発明の幾つかの化合物は、その態様の薬理学的に許容しうる塩も含めて、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＩＶ）またはＤＰＩＶ様酵素の酵素活性による分解に対して改善された耐性を有する。ＤＰＩＶは、広範囲の様々な器官および組織、たとえば、腸の刷子縁（Gutschmidt S.ら、"In situ"-measurements of protein contents in the brush border region along rat jejunal villi and their correlations with four enzyme activities. Histochemistry 1981, 72(3), 467-79）、外分泌上皮、肝細胞、腎細管、内皮、筋線維芽細胞（Feller A. C.ら、A monoclonal antibody detecting dipeptidyl peptidase IV in human tissue. Virchows Arch. A. Pathol. Anat. Histopathol. 1986; 409(2): 263-73）、神経細胞、ある種の表面上皮、たとえばファローピウス管、子宮および小胞腺（vesicular gland）の外（lateral）膜、たとえば小胞腺上皮の管腔細胞質内、およびブルンナー腺の粘液細胞内（Hartel S.ら、Dipeptidyl peptidase (DPP) IV in rat organs. Comparison of immunohistochemistry and activity histochemistry. Histochemistry 1988: 89(2): 151-61）、生殖器官、たとえば精巣上体の尾および膨大部、精嚢およびその分泌物（Agrawal & Vanha-Perttula, Dipeptidyl peptidases in bovine reproductive organs and secretions. Int. J. Androl. 1986, 9(6): 435-52）に存在している。ヒト血清中では２つの分子形のジペプチジルペプチダーゼが存在している（Krepela E.ら、Demonstration of two molecular forms of dipeptidyl peptidase IV in normal human serum. Physiol. Bohemoslov. 1983, 32(6): 486-96）。ＤＰＩＶの血清高分子量形は活性化Ｔ細胞の表面に発現される（Duke-Cohan J.S.ら、Serum high molecular weight dipeptidyl peptidase IV (CD26) is similar to a novel antigen DPPT-L released from activated T cells. J. Immunol. 1996, 156(5): 1714-21）。本発明の一つの態様において、未だ発見されていないものも含めて、すべての哺乳動物の組織および器官からのＤＰＩＶのすべての分子形、ホモログおよびエピトープが本発明の範囲に包含されることが意図される。
【００３６】
プロリン特異的プロテアーゼの稀な一群の中で、ＤＰＩＶは最初、ポリペプチド鎖のアミノ末端から２番目の残基としてのプロリンに特異的な唯一の膜結合酵素であると考えられていた。しかしながら、最近、ＤＰＩＶとは構造的には非相同（non-homologous）であるが対応する酵素活性を示す他の分子が同定された。これまでに同定されたＤＰＩＶ様酵素としては、繊維芽細胞活性化タンパク質α、ジペプチジルペプチダーゼＩＶβ、ジペプチジルアミノペプチダーゼ様タンパク質、Ｎ−アセチル化α結合酸性ジペプチダーゼ、静止（quiescent）細胞プロリンジペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼＩＩ、アトラクチン（attractin）およびジペプチジルペプチダーゼＩＶ関連タンパク質（ＤＰＰ８）があり、これらはSedo & Malikによる論説に記載されている（Sedo & Malik, Dipeptidyl peptidase IV-like molecules: homologous proteins or homologous activities? Biochimica et Biophysica Acta 2001, 36506: 1-10）。本発明の他の好ましい態様において、未だ発見されていないものも含めて、すべての哺乳動物の組織および器官からのＤＰＩＶ様酵素活性を含むタンパク質のすべての分子形、ホモログおよびエピトープが本発明の範囲に包含されることが意図される。
【００３７】
対応する薬理学的に許容しうる塩を含む本発明の化合物に共通する特性は、ＤＰＩＶまたはＤＰＩＶ様酵素による分解に対する改善された耐性であり、これはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーにより測定することができる。本発明による選択したＧＩＰアナログについての結果を表１から実施例３に示す。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより、開裂部位でのアミノ酸のＤ−Ａｌａ2、ＮＭｅＧｌｕ3、Ｐｒｏ3による置換または還元されたペプチド結合の導入が、ＧＩＰ1-30アナログ並びに対応ＧＩＰ1-14アナログにおいてＤＰＩＶ分解に対して２４時間までの耐性に導くことが示された。Ａｌａ2をＶａｌ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ置換したアナログまたはＧｌｕ3をＤ−Ｇｌｕ置換したアナログは、ＤＰＩＶによる低減した加水分解速度を示した。これら結果については表１をも参照のこと。
【００３８】
表１：合成ＧＩＰアナログのＮ末端配列、質量およびＤＰＩＶ耐性
【表３】
2005529862.tif 000004
【００３９】
他の好ましい態様において、本発明の化合物は、対応する薬理学的に許容しうる塩を含めて、ＤＰＩ−レセプターに結合する能力によって特徴付けられる。対応する薬理学的に許容しうる塩を含む本発明の化合物がＧＩＰ−レセプターに結合する能力は、実施例４に記載する方法などに従って125Ｉ標識したｓｐＧＩＰ1-42を用いた結合試験を採用して測定することができる。
【００４０】
置換試験は、レセプターに対する本発明の化合物の非特異的な結合を示していない。これは、過剰の（≧１μＭ）ＧＩＰ1-42（またはＧＩＰ1-30）の存在下で残留する結合を記載するのに用いる術語である。
【００４１】
ＧＩＰ−レセプターに結合しＧＩＰ−レセプターから125Ｉ−ＧＩＰ1-42を置換する本発明の化合物の例を図８、１０および１１および表２および３に示す。
【００４２】
驚くべきことに、本発明の化合物は機能的に活性である。本発明の化合物の生物学的活性は、対応の薬理学的に許容しうる塩も含めて、レセプター結合後のサイクリックＡＭＰの産生を決定することによって測定することができる。ｃＡＭＰ産生アッセイは実施例４に記載してある。Ｇｌｕ3へのＤ−Ｇｌｕの置換およびＡｌａ2へのＤ−Ａｌａの置換はアデニルシクラーゼを刺激する能力がわずかに低減したペプチドという結果となったが、一方、Ｖａｌ2およびＧｌｙ2アナログは効力において有意の低減を示した。興味深いことに、還元したペプチド結合の導入はｃＡＭＰ産生の劇的な低減という結果となった。このことはＧＩＰのＮ末端の完全性の重要さを確認するものである。さらなる結果を表２および３および図１〜７に示す。
【００４３】
表２：様々な長さのＧＩＰアナログに対するサイクリックＡＭＰ産生および競合結合置換試験
【表４】
2005529862.tif 000005
【００４４】
表３：ラットＧＩＰ−レセプターでトランスフェクションしたＣＨＯ−Ｋ１細胞を用いた合成ＧＩＰ断片に対するサイクリックＡＭＰ産生および競合結合置換試験についての統計のまとめ
【表５】
2005529862.tif 000006
【００４５】
インビトロでの機能的活性に基づき、本発明の化合物が哺乳動物においてインビボでグルコース耐性を改善しグルコースＡＵＣを低減させる能力、それゆえインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）の治療に有用であることを試験した。本発明の化合物が哺乳動物においてインビボでグルコース耐性を改善しグルコースＡＵＣを低減させる能力は、対応の薬理学的に許容しうる塩も含めて、ウイスターラットモデルを用いて測定することができる。その方法は実施例５に記載してある。結果を図１２、１３および１４に示す。
【００４６】
本発明の化合物は、レセプター結合能およびｃＡＭＰ放出に対する刺激作用に基づき、膵β細胞のグルコースに依存した増殖を増大しうることがわかった。驚くべきことに、また特に好ましい態様として、本発明の化合物はグルコースの存在とは独立にβ細胞の生存に対して濃度依存性の作用を示す。対応の薬理学的に許容しうる塩も含めて本発明の化合物がグルコース依存性のβ細胞増殖並びにグルコース非依存性のβ細胞生存を増大させる能力は、実施例６に記載するようなＩＮＳ−１細胞を用いたアッセイを用いて測定することができる。
【００４７】
最も驚くべき知見の一つは、本発明の化合物が膵β細胞に対して抗アポトーシス作用を有することである。対応の薬理学的に許容しうる塩も含めて本発明の化合物の抗アポトーシス作用は、実施例７に記載するようなカスパーゼ−３活性化アッセイを用いて測定することができる。その結果を図１８Ａに示す。カスパーゼ−３の活性化は、細胞のアポトーシス誘発のマーカーである。本発明の化合物は、レセプター結合能およびｃＡＭＰ放出に対する刺激作用に基づき、グルコース引き上げ（withdrawal）に応答したカスパーゼ−３の活性化を選択的に阻止できることがわかった。
【００４８】
他のインビトロアッセイとして、ＩＮＳ−１細胞のストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘発β細胞死において、本発明の化合物は対応の薬理学的に許容しうる塩も含めてＳＴＺの前アポトーシス（カスパーゼ−３活性化）作用に対して完全に防御できることがわかった。その方法は実施例７に記載してある。その結果を図１８Ｂに示す。
【００４９】
さらなる態様において、本発明は、薬理学的に許容しうる担体または希釈液および治療学的有効量の式１〜８に示す本発明の化合物または薬理学的に許容しうるその塩を含む、たとえばＧＩＰ−レセプター結合に有用な医薬組成物を提供する。
【００５０】
さらに他の態様において、本発明は、ＧＩＰ−レセプターを結合または阻止する方法であって、そのような処置を必要とする哺乳動物に治療学的有効量の式１〜８に示す本発明の化合物または薬理学的に許容しうるその塩を投与することを含む方法を提供する。
【００５１】
さらなる態様において、本発明は、ＧＩＰ−レセプター結合によって媒体される状態の治療方法であって、そのような治療を必要とする哺乳動物に治療学的有効量の式１〜８に示す本発明の化合物または薬理学的に許容しうるその塩を投与することを含む方法を提供する。
【００５２】
本発明はまた、たとえばＧＩＰ−レセプターシグナル伝達に関連する疾患または状態の予防または治療用医薬の製造のための、本発明による化合物または薬理学的に許容しうるその塩の使用にも関する。
【００５３】
好ましい態様において、本発明は、たとえば糖尿病および肥満の予防または治療用医薬の製造のための、本発明による化合物または薬理学的に許容しうるその塩の使用にも関する。
【００５４】
本発明の実施例
実施例１：ペプチドの固相合成
改変Ｆｍｏｃ−プロトコールを用い、ＧＩＰアナログを自動合成機SYMPHONY（RAININ）で合成した。５倍過剰量のＦｍｏｃ−アミノ酸およびカップリング試薬とのペプチドのＣ末端から１５番目のアミノ酸からの二重カップリングを用いることにより、サイクルを改変した。ペプチドのカップリングを、０.２３ミリモルの置換NovaSyn ＴＧＲ−樹脂または２５μモルスケールでの対応のプレローディング（preloaded）Ｗａｎｇ−樹脂を用いたＴＢＴＵ／ＮＭＭ活性化により行った。樹脂からの開裂は、９４.５％ＴＦＡ、２.５％水、２.５％ＥＤＴおよび１％ＴＩＳからなる開裂カクテルにより行った。
【００５５】
分析的および分取ＨＰＬＣを、Merck-HitachiのLiChrograph ＨＰＬＣシステム上での異なる勾配を用いて行った。勾配は、２つの溶媒：（Ａ）Ｈ2Ｏ中の０.１％ＴＦＡおよび（Ｂ）アセトニトリル中の０.１％ＴＦＡから構成された。分析的ＨＰＬＣは以下の条件で行った：溶媒を、ＵＶ検出（λ＝２２０ｎｍ）を用い、125-4 Nucleosil RP18-カラムに５％−５０％Ｂを１５分間、ついで９５％Ｂまで２０分までの勾配で流した（１ｍｌ／分）。ペプチドの精製は、ペプチド鎖の長さに応じた種々の条件下、250-20 Nucleosil 100 RP8-カラムかまたは250-10 LiChrospher 300 RP18-カラム（流速６ｍｌ／分、２２０ｎｍ）のいずれかでの分取ＨＰＬＣにより行った。
【００５６】
ペプチドアナログの同定には、Hewlett-PackardのHP G2025 MALDI-TOFシステムを用いたレーザー脱着（desorption）マススペクトロメトリーを用いた。
【００５７】
実施例２：還元されたペプチド結合を有するＧＩＰアナログの合成
２当量のＦｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）Ψ（ＣＨ2ＮＨ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−ＯＨをＴＢＴＵ／ＤＩＰＥＡ活性化および二重カップリングを４時間行うことによりカップリングして、Ｔｙｒ−ＡｌａΨ（ＣＨ2ＮＨ）−ＧＩＰ3-30aおよびＴｙｒ−ＡｌａΨ（ＣＨ2ＮＨ）−ＧＩＰ3-14aを合成した。対応のＧＩＰ5-30をおよびＧＩＰ5-14断片を上記と同様にして合成した。完全に保護したテトラペプチドＴｙｒ−ＡｌａΨ（ＣＨ2ＮＨ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−ＯＨの合成を、半合成ペプチド合成機Labortec（BACHEM）を用い、実施例１の記載と同様にして酸感受性Sasrin樹脂上で０.７ミリモルのスケールで行った。保護テトラペプチドを１％ＴＦＡにより樹脂から開裂した。還元されたペプチド結合は、Ｆｍｏｃ−アラニナールを用いたsasrin樹脂上でのＮ末端脱保護ペプチドの還元的アルキル化により導入された。
【００５８】
実施例３：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーによるＤＰＩＶ耐性の決定
精製腎ＤＰＩＶによるペプチドアナログの加水分解を以前に記載されたようにして調べた［１２］。簡単に説明すると、ペプチドを０.０４Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７.６）およびＤＰＩＶ中で２４時間までインキュベートした。試料をインキュベーション混合物から取り出し、Pauly, R. P., Rosche, F., Wermann, M., Mclntosch, C. H. S., Pederson, R. A.およびDemuth, H. U. Investigation of glucose-dependent insulinotropic polypeptide-(1-42) and glucagon-like peptide-1-(7-36) degradation in vitro by dipeptidyl peptidase IV using matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry - A novel kinetic approach. J Biol Chem 271(38), 23222-23229. 1996の記載に従ってＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリー用に調製した。
【００５９】
実施例４：インビトロ試験
ラット膵臓島（野生型）ＧＩＰ−レセプターを安定に発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ−Ｋ１）細胞（ｗｔＧＩＰ−Ｒ１細胞）を以前に記載されたようにして調製した［１９，２１］。細胞を、１０％新生仔ウシ血清、５０単位／ｍｌペニシリンＧ、および５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２中で培養した（培地および抗生物質はGibco BRL, Life Technologiesから）。細胞を７５ｃｍ2フラスコ中で増殖させ、８０〜９０％コンフルエントになったときに剥がし、２４ウエルプレートに５０,０００細胞／ウエルの密度で播種した。実験は４８時間後に行った。
【００６０】
結合試験
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製した125Ｉ−標識ｓｐＧＩＰ1-42を用いた結合試験を本質的に以前に記載されたようにして行った［２１］。ｗｔＧＩＰ−Ｒ１細胞（１−５×１０5／ウエル）を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（GIBCO）、１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０.１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１％Trasylol（アプロチニン；Bayer）からなる結合緩衝液（ＢＢ；ｐＨ７.４）中、４℃で２回洗浄した。これら細胞を非標識ＧＩＰ1-42またはアナログの存在下または不在下、125Ｉ−ｓｐＧＩＰ（５０,０００ｃｐｍ）とともに４℃で１２〜１６時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を氷冷緩衝液で２回洗浄し、０.１Ｍ ＮａＯＨ（１ｍｌ）で可溶化し、ついで細胞に結合した放射能をカウントするために培養チューブに移した。非特異的結合は１μＭのＧＩＰ1-42またはＧＩＰ1-30の存在下で測定した結合として定義され、特異的結合は競合体の不在下での結合の％（％Ｂ／Ｂ0）として表した。
【００６１】
ｃＡＭＰ産生
野生型ＧＩＰ−Ｒ１細胞を４８時間培養し、ＢＢ中で３７℃にて洗浄し、ついで０.５ｍＭ ＩＢＭＸ（Research Biochemicals Intl.、ナティック、マサチューセッツ）の存在下での被験剤との３０分間の刺激の前に１時間プレインキュベートした［１９，２１］。抑制実験を用い、１ｎＭ ｓｈＧＩＰ1-42での３０分間の刺激の前に細胞をＧＩＰアナログとともに１５分間インキュベートした。細胞を７０％エタノールで抽出し、ｃＡＭＰレベルをラジオイムノアッセイ（Biomedical Technologies、ストートン、マサチューセッツ）により測定した［１９，２１］。データはフェムトモル／１０００細胞またはＧＩＰ1-42刺激によるｃＡＭＰ産生の最大％として表してある（抑制実験）。
【００６２】
実施例５：ウイスターラットへの合成ＧＩＰアナログの皮下投与後のグルコース耐性の改善
雄ウイスターラット（２５０〜３５０ｇ）を自由に飲水させながら一夜（１６〜１８時間）飢餓させた。血中グルコースの決定のため（手動のグルコメーターを使用）、全血試料を覚醒した非拘束ラットの尾静脈から採取した；血漿インスリン濃度の測定のため、血漿を遠心分離（２０分間、１２,０００ｒｐｍ、４℃）により分離した。基礎試料を、経口グルコース耐性試験（１ｇグルコース／Ｋｇ体重）およびペプチドアナログ（８ナノモル／Ｋｇ体重）または食塩水対照（５００μｌ注射容量）の肩胛骨内皮下注射の直前に得た。血液試料をインスリン決定のためにｔ＝２、１０、２０、３０および６０にて採取し、血中グルコースを１０分間隔で測定した。台形計算法を用い、ベースラインを差し引いてグルコース応答面積（integrated glucose response）を計算した。
【００６３】
実施例６：ＧＩＰは細胞増殖を刺激しβ（ＩＮＳ−１）細胞の生存を促進する
細胞培養および試薬
ＩＮＳ−１細胞（クローン８３２／１３）を、２ｍＭグルタミン、５０μＭ β−メルカプトエタノール、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、および１０％ウシ胎仔血清（Cansera、レクスデール、オンタリオ、カナダ）を添加した１１ｍＭグルコースＲＰＭＩ（Sigma Laboratories、ナティック、マサチューセッツ、米国）中で培養した。実験に先立って細胞を６−ウエル（２×１０6細胞／ウエル；Becton Dickinson、リンカーンパーク、ニュージャージー、米国）、２４−ウエル（５×１０5細胞／ウエル）、または９６−ウエル（５×１０4細胞／ウエル）プレートに回収した。細胞継代４５−６０を用いた。
【００６４】
ＧＩＰ−レセプター特徴付け試験；競合結合、ｃＡＭＰ、およびインスリン放出
合成ブタＧＩＰ（５μｇ）をクロラミン−Ｔ法によりヨード化し、125Ｉ−ＧＩＰを比活性２５０〜３００μＣｉ／μｇまで逆相高速液体クロマトグラフィーによりさらに精製した。競合結合分析を実施例４の記載と同様にして行った。ｃＡＭＰ試験については、細胞を２回洗浄し、ついでホスホジエステラーゼインヒビターである３−イソブチル−１−メチルキサンチン（０.５ｍＭ ＩＢＭＸ；RBI/Sigma、ナティック、マサチューセッツ、米国）の存在下でＧＩＰで３０分間刺激した。刺激後、反応を停止させ、細胞を７０％氷冷エタノール中で溶解し、細胞破砕物を遠心分離により除去し、その後、ｃＡＭＰをラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ；Biomedical Technologies Inc.、ストートン、マサチューセッツ）により定量した。インスリン放出実験はすべてＩＢＭＸの不在下で６０分間行い、培地中に分泌されたインスリンをＲＩＡにより定量した。
【００６５】
ＩＮＳ−１クローン８３２／１３細胞株でのＧＩＰ−レセプターは以前に特徴付けられているので、結合、アデニルシクラーゼ刺激およびＧＩＰに対するインスリン分泌応答を最初に調べた。細胞は１５７１±２８９結合部位／細胞（ｎ＝３）の密度でレセプターを発現し、結合のＩＣ50は２１.１±２.４９ｎＭ（ｎ＝３）およびＫD＝１０６.２±４.３フェムトモル（ｎ＝３）であった；ｃＡＭＰ産生はＧＩＰによって刺激され、ＥＣ50は４.７０±１.８１ｎＭ（ｎ＝４）であった；５.５ｍＭグルコースにより刺激されたインスリン分泌は、１０ｎＭ ＧＩＰにより増大した（５.５ｍＭグルコースに対して１.６３±０.１８３％の全インスリン分泌ｖｓ２.４４±０.２９％の全インスリン分泌（ｐ＜０.０５、ｎ＝３））。
【００６６】
細胞の定量
細胞を実験に先立って９６−ウエルプレートに播種した（５×１０4細胞／ウエル）。血清の不在下で２４時間、代謝の静止状態を確立した後、細胞をアゴニスト（グルコース、グルコース＋ＧＩＰ／ＧＬＰ−１／ＧＨ）とともに低グルコース培地（０.１％ＢＳＡを添加したＲＰＭＩ）中でさらに２４時間培養した。その後、細胞をＫＲＢＨ（１１５ｍＭ ＮａＣｌ、４.７ｍＭ ＫＣｌ、１.２ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、１０ｍＭ ＮａＨＣＯ3、１.２８ｍＭ ＣａＣｌ2、１.２ｍＭ ＭｇＳＯ4を含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび０.１％ウシ血清、ｐＨ７.４）で洗浄し、アッセイするときまで−７０℃で凍結した。ＣＹＱＵＡＮＴTMアッセイシステム（Molecular Probes、ユージーン、オレゴン、米国）を用い、製造業者のプロトコールに従って細胞を定量した。最終的な細胞数は、細胞増殖を評価するためにプレーティングした最初の細胞数よりも常に多かった。
【００６７】
細胞の生存を、長期化したグルコース枯渇の存在下で評価した。グルコース枯渇（０.１％ＢＳＡを含むＲＰＭＩ）の２４時間後、ＧＩＰまたはフォルスコリンをさらに２４時間加え、細胞数を定量した。最終的な細胞数は、細胞の生存を評価するためにプレーティングした最初の細胞数よりも常に少なかった。
【００６８】
ＧＩＰはグルコース依存性のβ細胞増殖を増大させる
ＩＮＳ−１細胞株は、β細胞増殖のための細胞モデルとして以前に充分に調べられている（Hugl SR, White MF, Rhodes CJ 1998: Insulin-like growth factor 1 (IGF-1)-stimulated pancreatic beta-cell growth is glucose-dependent. J. Biol. Chem. 273: 17771-17779; Dickson LM, Linghor MK, McCuaig J, Hugl SR, Snow L, Kahn BB, Myers Jr. MG, Rhodes CJ (2001), Differential activation of protein kinase B and p70S6K by glucose and insulin-like growth factor 1 in pancreatic beta cells (INS-1). J. Biol. Chem. 276: 21110-21120）。ＧＩＰはＧＨで得られるのに匹敵するレベルまで１１ｍＭグルコース媒体β細胞増殖を増大させることがわかった（５.５ｍＭグルコースの存在下、１００ｎＭ ＧＩＰでは増殖の１５８±１６％、１０ｎＭ ＧＨでは増殖の１５８±９％（ｎ＝３〜５）；図１５Ａ）。別の実験では（図１６Ｂ）、１００ｎＭ ＧＩＰは５.５ｍＭグルコースの存在下で測定される細胞増殖の１３１±７％まで細胞増殖を刺激し、これは１００ｎＭ ＧＬＰ−１に対する増殖応答（１２９±４％；ｎ＝４）と同様であった。
【００６９】
ＧＩＰは０ｍＭグルコースの不利な効果を逆転させる
これら増殖促進効果のグルコース依存性を決定する際に、ＧＩＰは細胞生存に対する０ｍＭグルコース培地の不利な効果を逆転させ得ることが観察された。０ｍＭグルコース培地の存在下での細胞の４８時間のインキュベーションは、約５０％の細胞死という結果となった（図１６Ａ）。驚くべきことに、培地に１００ｎＭ ＧＩＰを添加したときにはプレーティングした細胞の９１±１０％が２４時間後に生存していた。これらＧＩＰの細胞生存効果は濃度依存的であり、ＥＣ50値は１.２４±０.４８ｎＭ ＧＩＰであった（ｎ＝４；図１６Ｂ）。
ＧＩＰはウォルトマンニン誘発細胞死に対して保護作用を有する
どの細胞内シグナル伝達経路がＧＩＰにより誘発された細胞生存に関与しているかを確立するため、薬理学的インヒビターを候補プロテインキナーゼに対する選択性の示される濃度にて用いて研究を行った（図１７）。フォルスコリンによるアデニリルシクラーゼの刺激は細胞の生存に対するＧＩＰの効果を擬態したが、Ｈ８９の効果の欠如（図１８ＡおよびＢ）はＰＫＡに依存しない作用態様を示している。Ｍｅｋ１／２インヒビターであるＰＤ９８０５９（５０および１００μＭ）およびＵ０１２６（１０μＭ）は、いずれも細胞生存に対するＧＩＰの効果を阻害しなかった（ｎ＝３）。細胞生存を促進するＧＩＰの能力は、ＰＩ３キナーゼ−ＰＫＢ経路インヒビターであるウォルトマンニンの作用に関する研究によってさらに支持された（図１７Ｃ）。ウォルトマンニン単独で細胞の損失を促進したので、ＧＩＰがＰＩ３キナーゼ−ＰＫＢ経路を活性化するか否かを決定することはできなかった。しかしながら、ＧＩＰ処理によって細胞はウォルトマンニン誘発細胞損失に対して部分的に防護された（ｎ＝３、ｐ＜０.０５）。試験した化合物でＧＩＰ媒体細胞生存に影響を及ぼした唯一のものはインヒビターのＳＢ２０２１９０であり（図１７Ｄ）、ＧＩＰがｐ３８ＭＡＰＫとして作用し得ることを示していた。
【００７０】
実施例７：ＧＩＰは抗アポトーシス作用を有する
カスパーゼ−３活性
６−ウエルプレートに播種したＩＮＳ−１細胞（クローン８３２／１３）を１２〜２４時間、血清飢餓させ、グルコース枯渇（０.１％ＢＳＡを含むＲＰＭＩ）かまたは２ｍＭストレプトゾトシン（ＳＴＺ）処理に供した。ＧＩＰおよびＧＬＰ−１をＳＴＺ処理の１０分前およびＳＴＺ処理の間の３０分間加えた。処理後、カスパーゼ−３活性を製造業者のプロトコール（Molecular Probes、ユージーン、オレゴン、米国）に従って２、６、または２４時間後に決定した。カスパーゼ−３活性／ウエルをＢＣＡタンパク質アッセイ（Pierce、ロックスフォード、イリノイ、米国）を用いて全タンパク質含量に対して補正した。
【００７１】
カスパーゼ−３活性は細胞のアポトーシス誘発のマーカーである。ＧＩＰの細胞生存作用が該ポリペプチドの抗アポトーシス作用によるものかどうかを確立するため、グルコース枯渇によって誘発されたカスパーゼ−３の活性化を調べた。図１８Ａは、０ｍＭグルコースが６時間までに（２時間までには促進しなかった；データは示していない）アポトーシスを促進したこと、およびこの効果がＧＩＰまたはフォルスコリンの添加によって完全に逆転されたことを説明している。グルコースの引き上げに応答したカスパーゼ−３の活性化をＧＩＰが選択的に阻止するとの結論は、カスパーゼ−３の特異的なアルデヒドインヒビターであるＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯが低グルコース活性化を完全に阻止したことによって確認された（図１９Ａ）。
【００７２】
ＳＴＺ誘発細胞死
ＧＩＰがストレプトゾトシン（ＳＴＺ）によって誘発されたβ細胞死に対して防御する能力を調べた。ＳＴＺに暴露する１０分前および暴露の間の３０分間にＧＩＰを加えると、ＧＩＰはＳＴＺの前アポトーシス（カスパーゼ−３活性化）作用に対して完全に防御することができた（図１８Ｂ）。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】ラット膵臓ランゲルハンス島ＧＩＰ−レセプターで安定にトランスフェクションしたＣＨＯ−Ｋ１細胞（ｗｔＧＩＰＲ細胞）におけるＮ末端修飾したＧＩＰアナログによるサイクリックＡＭＰの産生。図示した濃度のペプチドの存在下または不在下、１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝（ｐＨ７.４）ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋０.１％ＢＳＡおよび０.５ｍＭ ＩＢＭＸ中、３７℃で３０分間、刺激を行った。細胞内容物を氷冷７０％エタノールで抽出し、真空乾燥させ、サイクリックＡＭＰをラジオイムノアッセイにより測定した。データは、少なくとも３回の独立した実験の平均±ＳＥＭを表す。データは、ＧＩＰ1-30NH2により刺激した最大ｃＡＭＰに対して正規化してある。
【００７４】
【図２】天然ホルモンと比較した、修飾ＧＩＰ1-14OHペプチドによるｗｔＧＩＰＲ細胞中でのサイクリックＡＭＰの産生。図示した濃度のペプチドの存在下または不在下、１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝（ｐＨ７.４）ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋０.１％ＢＳＡおよび０.５ｍＭ ＩＢＭＸ中、３７℃で３０分間、刺激を行った。細胞内容物を氷冷７０％エタノールで抽出し、真空乾燥させ、サイクリックＡＭＰをラジオイムノアッセイにより測定した。データは、少なくとも３回の独立した実験の平均±ＳＥＭを表す。データは、細胞数に対して正規化してある。
【００７５】
【図３】ｗｔＧＩＰＲ細胞中での修飾ＧＩＰ1-14OHペプチド（２０マイクロモル）によるサイクリックＡＭＰの産生。データは図２からのものであり、細胞中の基礎サイクリックＡＭＰ含量の因数として表してある。*＝ＧＩＰ1-42による１ｎＭ刺激したｃＡＭＰに対してｐ＜０.０５；＃＝基礎サイクリックＡＭＰに対してｐ＜０.０５（ｎ≧３）。
【００７６】
【図４】アラニンスキャニングにより修飾したＧＩＰ1-14OHペプチド（４０マイクロモル）によるサイクリックＡＭＰの産生。アラニンが天然の一次配列に存在する２位および１３位では、これら位置でのアミノ酸は関連ホルモンであるグルカゴンの一次配列において認められるもので置換した。図示した濃度のペプチドの存在下または不在下、１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝（ｐＨ７.４）ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋０.１％ＢＳＡおよび０.５ｍＭ ＩＢＭＸ中、３７℃で３０分間、刺激を行った。細胞内容物を氷冷７０％エタノールで抽出し、真空乾燥させ、サイクリックＡＭＰをラジオイムノアッセイにより測定した。データは、細胞中の基礎サイクリックＡＭＰ含量の因数として表してある。*＝ＧＩＰ1-42による１ｎＭ刺激したｃＡＭＰに対してｐ＜０.０５；＃＝基礎サイクリックＡＭＰに対してｐ＜０.０５（ｎ≧３）。
【００７７】
【図５】天然ホルモンと比較した、コア配列欠失またはアルファらせん挿入を有する修飾ＧＩＰペプチドによるｗｔＧＩＰＲ細胞中でのサイクリックＡＭＰの産生。図示した濃度のペプチドの存在下または不在下、１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝（ｐＨ７.４）ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋０.１％ＢＳＡおよび０.５ｍＭ ＩＢＭＸ中、３７℃で３０分間、刺激を行った。細胞内容物を氷冷７０％エタノールで抽出し、真空乾燥させ、サイクリックＡＭＰをラジオイムノアッセイにより測定した。データは、少なくとも３回の独立した実験の平均±ＳＥＭを表す。データは、細胞数に対して正規化してある。
【００７８】
【図６】天然ホルモンと比較した、コア配列欠失またはアルファらせん挿入を有する修飾ＧＩＰペプチドによるｗｔＧＩＰＲ細胞中でのサイクリックＡＭＰの産生。図示した濃度のペプチドの存在下または不在下、１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝（ｐＨ７.４）ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋０.１％ＢＳＡおよび０.５ｍＭ ＩＢＭＸ中、３７℃で３０分間、刺激を行った。細胞内容物を氷冷７０％エタノールで抽出し、真空乾燥させ、サイクリックＡＭＰをラジオイムノアッセイにより測定した。データは、少なくとも３回の独立した実験の平均±ＳＥＭを表す。データは、細胞数に対して正規化してある。
【００７９】
【図７】天然ホルモンと比較した、Ｎ末端修飾したまたはアミノ酸１６と２１との間で環状化した修飾ＧＩＰペプチドによるｗｔＧＩＰＲ細胞中でのサイクリックＡＭＰの産生。図示した濃度のペプチドの存在下または不在下、１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝（ｐＨ７.４）ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋０.１％ＢＳＡおよび０.５ｍＭ ＩＢＭＸ中、３７℃で３０分間、刺激を行った。細胞内容物を氷冷７０％エタノールで抽出し、真空乾燥させ、サイクリックＡＭＰをラジオイムノアッセイにより測定した。データは、少なくとも３回の独立した実験の平均±ＳＥＭを表す。データは、ＧＩＰ1-42OHにより産生された最大ｃＡＭＰに対して正規化してある。
【００８０】
【図８】図示した濃度の125Ｉ−ＧＩＰおよび修飾ＧＩＰ1-14ペプチドを対比して用いた、完全ｗｔＧＩＰＲ細胞における競合結合抑制試験。平衡結合は、１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝（ｐＨ７.４）ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋０.１％ＢＳＡ＋１％トラシロール（アプロチニン）中、４℃で１２〜１６時間インキュベートした後に達成された。未結合の標識を洗浄工程の際に除去し、細胞を０.２Ｍ ＮａＯＨに可溶化し、細胞に付随した放射能をカウントするためにホウ珪酸チューブに移した。非特異的結合を、１マイクロモルのＧＩＰ1-42の存在下で検出した細胞付随放射能として定義した。データは、３回以上の実験の平均±ＳＥＭを表しており、競合物（Ｂ0）の不在下で測定した125Ｉ−ＧＩＰの特異的結合に対して正規化してある。
【００８１】
【図９】５０マイクロモルのペプチドアナログ（アラニン、セリン、チロシン、Ｄ−アラニン、Ｄ−プロリン、還元されたＰ２−Ｐ３ペプチド結合、またはＢＴＤ置換／修飾を有するＧＩＰ1-14ペプチド）によるｗｔＧＩＰＲ細胞からの125Ｉ−ＧＩＰのパーセント置換。平衡結合は、１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝（ｐＨ７.４）ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋０.１％ＢＳＡ＋１％トラシロール（アプロチニン）中、４℃で１２〜１６時間インキュベートした後に達成された。未結合の標識を洗浄工程の際に除去し、細胞を０.２Ｍ ＮａＯＨに可溶化し、細胞に付随した放射能をカウントするためにホウ珪酸チューブに移した。非特異的結合を、１マイクロモルのＧＩＰ1-42の存在下で検出した細胞付随放射能として定義した。データは、３回以上の実験の平均±ＳＥＭを表してある。*＝ＧＩＰ1-14による％置換に対してｐ＜０.０５；＃＝０置換に対してｐ＜０.０５（すなわち、Ａ３およびＡ５のみが測定可能な125Ｉ−ＧＩＰ結合を置換することができなかった）。
【００８２】
【図１０】天然ホルモンと比較した、図示した濃度の125Ｉ−ＧＩＰおよびコア配列欠失またはアルファらせん挿入を有するＧＩＰペプチドを対比して用いた完全ｗｔＧＩＰＲ細胞における競合結合抑制試験。平衡結合は、１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝（ｐＨ７.４）ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋０.１％ＢＳＡ＋１％トラシロール（アプロチニン）中、４℃で１２〜１６時間インキュベートした後に達成された。未結合の標識を洗浄工程の際に除去し、細胞を０.２Ｍ ＮａＯＨに可溶化し、細胞に付随した放射能をカウントするためにホウ珪酸チューブに移した。非特異的結合を、１マイクロモルのＧＩＰ1-42の存在下で検出した細胞付随放射能として定義した。データは、３回以上の実験の平均±ＳＥＭを表しており、競合物（Ｂ0）の不在下で測定した125Ｉ−ＧＩＰの特異的結合に対して正規化してある。
【００８３】
【図１１】天然ホルモンと比較した、図示した濃度の125Ｉ−ＧＩＰおよびコア配列欠失またはアルファらせん挿入を有するＧＩＰペプチドを対比して用いた完全ｗｔＧＩＰＲ細胞における競合結合抑制試験。平衡結合は、１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝（ｐＨ７.４）ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋０.１％ＢＳＡ＋１％トラシロール（アプロチニン）中、４℃で１２〜１６時間インキュベートした後に達成された。未結合の標識を洗浄工程の際に除去し、細胞を０.２Ｍ ＮａＯＨに可溶化し、細胞に付随した放射能をカウントするためにホウ珪酸チューブに移した。非特異的結合を、１マイクロモルのＧＩＰ1-42の存在下で検出した細胞付随放射能として定義した。データは、３回以上の実験の平均±ＳＥＭを表しており、競合物（Ｂ0）の不在下で測定した125Ｉ−ＧＩＰの特異的結合に対して正規化してある。
【００８４】
【図１２】合成ＧＩＰアナログを用いた麻酔（６５ｍｇ／ＫｇのペントバルビタールナトリウムＩＰ）雄ウイスターラットでの腹腔内グルコース耐性試験。食塩水またはペプチド（Ａ：１ピコモル／分／１００ｇ体重またはＢ：１００ピコモル／分／１００ｇ体重）の静脈内（頸静脈内）注入を、１ｇグルコース／Ｋｇ体重の腹腔内注射の５分前に開始した。注入の前（基礎試料）および１０分間隔で１時間、尾静脈から血液試料を採取した。血液グルコースの測定を手動のグルコメーター（glucometer）を用いて行った。*＝食塩水対象に対してｐ＜０.０５。データは、≧４匹の動物の平均±ＳＥＭを表す。
【００８５】
【図１３】皮下ペプチド注射（８ナノモル／Ｋｇ体重を５００μＬ容量にて；または１の例では８０ナノモル／Ｋｇ体重）したまたは注射していない覚醒非拘束雄ウイスターラットでの経口グルコース耐性試験（１ｇ／Ｋｇ体重）。基礎試料は、経口グルコースおよびペプチド注射の前に尾静脈から得た。ついで、試料を指定の時点で得、手動のグルコメーターを用いて全血液グルコースを測定した。データは、≧４匹の動物の平均±ＳＥＭを表す。
【００８６】
【図１４】経口グルコース耐性試験および皮下ペプチド注射を同時に行った覚醒非拘束雄ウイスターラットからの総和（integrated）グルコース応答（すなわち、図１３からの総和（integrated）データ）。曲線下面積の計算は、台形法を用い、ベースラインを差し引いて行った。データは、≧４匹の動物の平均±ＳＥＭを表す。
【００８７】
【図１５】ＧＩＰは、ＩＮＳ−１（８３２／１３）細胞においてＧＨ（Ａ）およびＧＬＰ−１（Ｂ）と同レベルに１１ｍＭグルコース誘導細胞の増殖を増大させる。実験の前および実験中に細胞を血清飢餓させた。最終的な細胞数は常に最初のプレーティング密度よりも大きく、有糸分裂生起を示しており、最終的な細胞数はＣＹＱＵＡＮＴTMにより蛍光測定で定量した。値は、３つずつの５（Ａ）または４（Ｂ）の個々の実験の平均であり、*はｐ＜０.０５を表す。
【００８８】
【図１６】ＧＩＰは、グルコース枯渇の際にＩＮＳ−１（８３２／１３）細胞の生存を濃度に依存した仕方で促進させる。細胞を４８時間、血清およびグルコース飢餓させ、培養の最後の２４時間の期間にＧＩＰを加えた。最終的な細胞数は常に最初のプレーティング密度よりも小さく、細胞死の生じたことを示しており、最終的な細胞数はＣＹＱＵＡＮＴTMにより蛍光測定で定量した。値は、３つずつの３（Ａ）または４（Ｂ）の個々の実験の平均であり、*はｐ＜０.０５を表す。
【００８９】
【図１７】グルコース枯渇の際のＩＮＳ−１（８３２／１３）細胞の生存のＧＩＰ促進にはｐ３８ ＭＡＰＫが関与する。１００ｎＭ ＧＩＰの不在下または存在下、プロテインキナーゼインヒビターを最後の２４時間培養の１５分前に培地に加えた。ＰＫＡインヒビターであるＨ８９は、ＧＩＰ（Ａ）またはフォルスコリン（Forskolin）（Ｂ）によって媒体された細胞の生存を逆転させることはできなかった。ウォルトマンニンは細胞の生存に対して有害な作用を有し（Ｃ）、これはＧＩＰによって部分的に逆転された。パネルＤは、ＳＢ２０２１９０との特異的な抑制によりｐ３８ ＭＡＰＫの関与を示す。最終的な細胞数はＣＹＱＵＡＮＴTMにより蛍光測定で定量してあり、データは３つずつで行った３〜８の実験の平均を表しており、*および#は各対照に対してｐ＜０.０５を表す。
【００９０】
【図１８】ＧＩＰは０ｍＭグルコースを排除し（ablates）（Ａ）、ＳＴＺ（Ｂ）はＩＮＳ−１（８３２／１３）細胞においてカスパーゼ−３活性を誘起した。実験の前および実験中に細胞を血清飢餓させ、グルコース（３ｍＭ）またはＳＴＺの存在下または不在下で１００ｎＭ ＧＩＰ、１０ Ｍフォルスコリン、または１００ｎＭ ＧＬＰ−１を６時間かけて加えてカスパーゼ−３活性に対する効果を評価した。カスパーゼ−３活性の定量は、アミノメチルクマリン（ＡＭＣ）から誘導した物質であるＺ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣを用い、全タンパク質濃度について補正して行い、*および#は各対照に対してｐ＜０.０５を表している（Ａ、ｎ＝３；Ｂ、ｎ＝５）。相対活性は特異的なものであることがカスパーゼ−３インヒビターであるＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯを用いることにより確認された（Ａ、挿入図）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年11月30日(2004.11.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2005529862000001.app
【国際調査報告】
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