(57)【要約】本発明は、単子葉植物の形質転換用ＯｓＣｃ１プロモーターおよび所望の外来遺伝子を含有する組換えプラスミドにより単子葉植物を形質転換するステップ、および前記外来遺伝子を発現させるステップを含んでなる、単子葉植物の形質改変方法を提供する。本発明によれば、シトクロムｃ遺伝子（ＯｓＣｃ１）用プロモーターおよび形質転換された緑色蛍光タンパク質をコードするｓｇｆｐ遺伝子を含有する組換えプラスミドによりイネが形質転換され、形質転換されたイネにおいて発現された蛍光タンパク質がモニターされ、ＯｓＣｃ１プロモーターがイネの全ての組織において所望の遺伝子の発現を強力、安定的そして遍在的な態様で誘導することを示す。従って、ＯｓＣｃ１プロモーターが単子葉植物の形質転換用に実際に適用できることが分かった。
2005507260.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単子葉植物の形質転換用ＯｓＣｃ１プロモーター（配列ＩＤ番号：１）。
【請求項２】
ＯｓＣｃ１プロモーターおよび所望の外来遺伝子を含有する組換えプラスミドにより単子葉植物を形質転換するステップ、および前記外来遺伝子を発現させるステップを含んでなる、単子葉植物の形質改変方法。
【請求項３】
前記外来遺伝子がヒグロマイシン耐性遺伝子ＨｙｇR および除草剤耐性遺伝子ｂａｒまたは生物学的もしくは非生物学的ストレスに耐性な遺伝子を含む選択マーカーである、請求項２に記載の単子葉植物の形質改変方法。
【請求項４】
単子葉植物がイネ、オオムギ、コムギまたはトウモロコシである、請求項２に記載の単子葉植物の形質改変方法。
【請求項５】
形質転換が微粒子銃法またはアグロバクテリウム媒介法により行われる、請求項２に記載の単子葉植物の形質改変方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単子葉植物の形質転換用プロモーターに関し、より詳しくは、単子葉植物の形質転換用ＯｓＣｃ１プロモーターおよび所望の外来遺伝子を含有する組換えプラスミドにより単子葉植物を形質転換するステップ、および前記外来遺伝子を発現させるステップを含んでなる、単子葉植物の形質改変方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
農業分野を発展させることができる新規な特徴を有する農業植物の生産において、植物体に導入される外来遺伝子（すなわち導入遺伝子）の発現は、転写要素、転写後要素、翻訳要素および翻訳後要素によって大きく影響を受ける。前記要素の中でも、特に転写要素に属するプロモーターは、導入遺伝子の転写に影響を与えて直接的かつ究極的に発現レベルを変化させるだけでなく、導入遺伝子の組織特異性または細胞特異性あるいは発現段階をも変化させることができるにという意味で最も重要である。今日まで、様々な植物から導入遺伝子の発現のための多数のプロモーターが単離されているが、それらの中で少数のプロモーターだけが植物体の形質転換のために現在特に使用されている。この分野で現在最も広く使用されているＣａＭＶ（カリフラワーモザイクウイルス）３５Ｓプロモーターおよびその誘導物は、植物体の全組織における、より詳しくは管組織および根と葉の殆どの細胞における遺伝子の広範囲の発現を誘導する。しかしながら、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターは、イネ等のような単子葉植物において双子葉植物における活性よりも低い活性を示し、花粉等のようなある種の細胞において活性を示さないことさえある。双子葉植物に由来する、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター以外の多数のプロモーターが、単子葉植物の形質転換のために使用されているが、単子葉植物に由来するプロモーターよりも低い活性を示す。さらに、イネのｒｂｃＳ（リブロースビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ小サブユニット）プロモーター、イネのＡｃｔ１（アクチン１）プロモーターおよびトウモロコシ植物のＵｂｉ１プロモーターが、単子葉植物の形質転換に有用なプロモーターとして研究されている。それらの中で、Ａｃｔ１プロモーターおよびＵｂｉ１プロモーターは、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターと比較して、単子葉植物において相対的に高い活性を示し、それ故に単子葉植物の形質転換のために一般に使用されている。しかしながら、Ｕｂｉ１プロモーターは、多数のタイプの細胞において活性を示すものの、植物体の全組織まではカバーしない。さらに、Ｕｂｉ１プロモーターは、特に若い根において強い活性を示すものの、その活性は根が成長するにつれて大きく減少する。また、Ａｃｔ１プロモーターは主に伸長中の組織と生殖組織において活性を示す。したがって、前記プロモーターは単子葉植物における遍在的遺伝子(ubiquitous gene）の発現にとって効率的でない。
【０００３】
かかる状況の下で、単子葉植物の形質転換において強力、安定的そして遍在的な活性を示すプロモーターを探索および開発することが強く求められている。
【発明の開示】
【０００４】
本発明者は、単子葉植物の形質転換のための効率的なプロモーターを開発するために努力を重ねたところ、イネのシトクロムｃ遺伝子（ＯｓＣｃ１）のためのプロモーターおよび形質転換された緑色蛍光タンパク質をコードするｓｇｆｐ遺伝子を含有する組換えプラスミドにより形質転換されたイネが、強力、安定的そして遍在的な態様で蛍光タンパク質を発現することを見出した。
【０００５】
したがって、本発明の第一の目的は単子葉植物の形質転換のためのＯｓＣｃ１プロモーターを提供することである。
【０００６】
本発明の他の目的は、ＯｓＣｃ１プロモーターを含有する組換えプラスミドにより単子葉植物を形質転換することによって単子葉植物の形質を改変するための方法を提供することである。
【０００７】
本発明の上記の及び他の目的および特徴は、添付図面とともに示される以下の説明から明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
単子葉植物の形質転換のための効率的なプロモーターを開発するために、本発明者は最初にシトクロムｃに注目した。シトクロムｃは真核生物のミトコンドリアに位置する小さなタンパク質であり、呼吸複合体ＩＩＩとＩＶの間の電子伝達において触媒的役割をする。現在まで、シトクロムｃは、そのアミノ酸配列と塩基配列が酵母、哺乳動物および植物のような遠縁の生物の間であっても高度に保存されていることから、分子発生学研究のために広く使用されている。さらに、シトクロムｃは、その特有の細胞内位置のために、オルガネラへのタンパク質ターゲッティングのために有用な分子としても使用されている。近年、シトクロムｃは、その細胞質ゾルへの放出がヒト細胞におけるアポトーシスの指標となることから、強く注目を集めている。しかしながら、シトクロムｃについて植物においては、シロイヌナズナ(Arabidopsis）およびイネのシトクロムｃ遺伝子（ＯｓＣｃ１）がクローン化および配列決定されたこと（参照：Kemmerer et al., Mol. Biol. Evol., 8:212-226, 1991）を除いては、殆ど分かっていない。
【０００９】
こうして、本発明者は、シトクロムｃが電子伝達に関与して細胞にエネルギーを供給する役割をすることから、シトクロムｃ遺伝子が細胞内で高レベルに発現され、そして発育段階の如何とは無関係に個体の全組織において継続的および安定的に発現されるものと期待している。従って、本発明者は、植物体の全組織における遺伝子の発現を高レベルに誘導できるプロモーターとしてＯｓＣｃ１プロモーターを開発することを意図した。特に、大抵の場合、植物の形質転換のために利用されるプロモーターは双子葉植物と単子葉植物の両方において共通に使用することができないことから、それらのプロモーターはそれらの各々で独立して開発されるべきである。しかしながら、現在、単子葉植物に使用することができるプロモーターは、Ｕｂｉ１プロモーターおよびＡｃｔ１プロモーター等、非常に限られており、それ故に、本発明は単子葉植物の形質転換のための効率的なプロモーターとしてＯｓＣｃ１プロモーターの開発に重点を置いている。
【００１０】
本発明を以下で更に詳細に説明する。
【００１１】
本発明は、単子葉植物の形質転換用ＯｓＣｃ１プロモーターおよび所望の外来遺伝子を含有する組換えプラスミドにより単子葉植物を形質転換するステップ、および前記外来遺伝子を発現させるステップを含んでなる、単子葉植物の形質改変方法を提供する。この方法において、外来遺伝子は、ヒグロマイシン耐性遺伝子ＨｙｇR および除草剤耐性遺伝子ｂａｒまたは生物学的もしくは非生物学的ストレスに耐性な遺伝子を含む選択マーカーを含め、植物体の全組織において高レベルに発現されることが意図される全ての遺伝子であってよい。単子葉植物としてはイネ、オオムギ、コムギまたはトウモロコシ植物が含まれ、形質転換は微粒子銃法またはアグロバクテリウム媒介法により行うことができる。
【００１２】
本発明者は、ＯｓＣｃ１プロモーターおよび形質転換された緑色蛍光タンパク質をコードするｓｇｆｐ遺伝子を含有する組換えプラスミドを構築し、イネをアグロバクテリウム媒介法により前記プラスミドで形質転換して、ＯｓＣｃ１遺伝子の発現パターンを解析するためにイネの各々の組織から抽出された全ＲＮＡを用いたノーザンブロット解析を最初に行い、該形質転換されたイネから抽出された遺伝子およびタンパク質を用いたサザンブロットおよびウェスタンブロット解析を次に行い、そして該イネの蛍光イメージを解析してＯｓＣｃ１プロモーターの活性を決定した。ＣＲＥ結合部位（ｃＡＭＰ応答配列結合部位）を含有する動物のＯｓＣｃ１プロモーターおよび葉緑体で特異的に高い活性を有するｒｂｃＳプロモーターが、それ自体の特有の性質に起因してそれぞれｃＡＭＰ濃度および光により大きく影響を受けること、そしてイネのＯｓＣｃ１プロモーターがＣＲＥ結合部位の塩基配列と類似する塩基配列を含有することが知られている。それ故に、ＯｓＣｃ１プロモーターの制御の下でＯｓＣｃ１遺伝子の発現がｃＡＭＰまたは光により影響を受けるか否かを決定するために上記ノーザンブロット解析を行った。ＯｓＣｃ１プロモーターの活性を、単子葉植物の形質転換のために現在特に使用されているＡｃｔ１プロモーター、ｒｂｃＳプロモーターおよびＵｂｉ１プロモーターの活性と比較した。
【００１３】
本発明を以下の実施例で更に例示するが、この実施例を本発明の範囲を限定するものと解釈すべきでない。
【実施例】
【００１４】
例１：ＯｓＣｃ１遺伝子の発現パターン
ＯｓＣｃ１遺伝子の発現パターンを調べるために、グアニジニウム／ＬｉＣｌ法によりイネの各組織および細胞から全ＲＮＡを抽出し、これを次にノーザンブロット解析の対象とした。成熟オリザ・サチバ（Oryza sativa）Ｌ．（cv Nakdong）の胚からイネの胚形成カルスを得て、これを次に１％（ｗ／ｖ）アガロース、３０ｇ／Ｌスクロースおよび２．５ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ を含有するＭＳ固体培地，ｐＨ５．８中で保持した。２６℃の暗室内で１２０ｒｐｍの振とうインキュベータを使用して、３０ｇ／Ｌスクロース、２．０ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ および０．２ｍｇ／Ｌキネチンを含有するＡＡ液体培地中で、前記胚形成カルスをインキュベートして、懸濁培養細胞を得た。１ｍＭジブチルｃＡＭＰ（Ｂｔ2ｃＡＭＰ ，Sigma，USA）または光による処理を行った又は行わない、懸濁培養細胞およびカルスを液体窒素中で凍結させた。４Ｍグアニジニウムイソチオシアネート、２５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、０．５％（ｗ／ｖ）サルコシルおよび０．１Ｍβ−メルカプトエタノールを含有する抽出バッファー溶液１ｍｌ中で、約０．１ｇの葉、根、カルスおよび稚苗をホモジナイズし、次に０．１ｍｌの２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）、１ｍｌの水飽和フェノール（ｐＨ４．５）および０．２ｍｌのクロロホルム：イソアミルアルコール（１：１，ｖ／ｖ）を添加し、次に３０秒間一緒によく混合し、そして室温において５，０００ｇで１０分間遠心分離した。遠心分離から得られた上清に等体積のイソプロパノールを添加し、次にその混合物を−２０℃で１時間置き、その後、７０％（ｖ／ｖ）エタノールで洗浄し乾燥した。得られたＲＮＡペレットを４０ｍｌのＤＥＰＣ（ジエチルピロカルボネート）処理蒸留水中に溶解させ、ＲＮＡの濃度をＡ260値から算出した。次に、Sambrookの方法（参照：Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）により、２０μｇの全ＲＮＡを用いてノーザンブロット解析を行った。膜に移し取られたそれらのＲＮＡを、ランダムプライマー標識キット(Takara, Japan）の［32Ｐ］−プローブとハイブリダイズさせ、洗浄し、次にホスホ・イメージ・アナライザー(FLA3000, Fuji, Japan）により解析した。
【００１５】
図１ａ、図１ｂおよび図１ｃは、それぞれ未処理のイネおよびＢｔ2ｃＡＭＰ で処理されたイネの様々な組織から並びに光で処理された稚苗の葉から抽出された全ＲＮＡについてのノーザンブロット解析の結果を示す写真である。図１ａおよび図１ｂにおいて記号ＳＣ、Ｌ、ＲおよびＣはそれぞれ懸濁培養細胞、葉、根およびカルスを示し；図１ｂおよび図１ｃにおける数値は Ｂｔ2ｃＡＭＰ処理または光処理に要した時間（時間）を示し；そして図１ｃにおいて記号Ｌは成熟した葉を示す。図１ａ、図１ｂおよび図１ｃで見られるように、ＯｓＣｃ１は懸濁培養細胞、根およびカルスで高レベルに発現されたが、葉では比較的に低レベルで発現し、さらにＯｓＣｃ１の発現はｃＡＭＰまたは光による影響を受けない。結果として、ＯｓＣｃ１はｃＡＭＰまたは光に非依存性であると考えることができ、その非光合成組織における発現は光合成組織における発現よりも高いと考えられた。この結果は、光合成組織において葉緑体が主なエネルギーを供給する役割をするのに対し、非光合成組織においてはミトコンドリアが主なエネルギーを供給する役割をするということと矛盾しない。
【００１６】
例２：プラスミドの構築
形質転換された緑色蛍光タンパク質をコードするｓｇｆｐ遺伝子およびＯｓＣｃ１、Ａｃｔ１またはＵｂｉ１のプロモーターを含有するプラスミドを構築した。ＸｈｏＩおよびＮｃｏＩ制限酵素切断部位（下線により示す）をそれぞれ含有する以下の２種のプライマーａおよびｂを使用して、ｐＯｓＣｃ１（参照：Kemmerer EC. et al., Mol. Biol. Evol., 8:212-226, 1991）から１．８ｋｂのＯｓＣｃ１プロモーター（配列ＩＤ番号：１）をＰＣＲ増幅した。
５’−ＡＡＣＴＣＧＡＧＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＴＴＣＧＡＡＧＧＴＡＧＧＣ−３’：プライマーａ（配列ＩＤ番号：２）、および
５’−ＡＡＣＣＡＴＧＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＧＡＧＡＡＣＧ−３’：プライマーｂ（配列ＩＤ番号：３）。
【００１７】
増幅されたＤＮＡをＸｈｏＩおよびＮｃｏＩにより切断（digest）し、次に、同一制限酵素により切断されたｓｇｆｐ遺伝子を含有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳＩＩ（参照：Chiu W-L, et al., Curr. Biol., 6:325-330, 1996）と結合（ligate）して、プラスミドｐＫＳＣＧを構築した。その後、ｐＫＳＣＧのＸｈｏＩおよびＮｏｔＩによる切断により、ＯｓＣｃ１−ｓｇｆｐを含有する２．５ｋｂのＤＮＡが得られ、これを同一制限酵素により切断されたｐＳＢ１０５（参照：Jang, I-C. et. al., Mol. Breeding, 5:453-461, 1999）と結合して、プラスミドｐＳＢ−ＣＧ（ＯｓＣｃ１−ｓｇｆｐ）を作製した。ｐＳＢ１０５は、ｐＳＢ１１の右側境界配列と左側境界配列の間にジャガイモプロテアーゼインヒビターＩＩ遺伝子、３５Ｓプロモーター、ｂａｒ遺伝子（ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）およびノパリンシンターゼ遺伝子のターミネーターを含有する。ｂａｒ遺伝子によりコードされるホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼは、ホスフィノスリシン系除草剤を解毒する役割をし、それ故に選択マーマートして作用することができる。次に、ｓｇｆｐ遺伝子に連結されたｒｂｃＳプロモーターを含有するｐＳＫ−ＲＧ（参照：Chiu W-L, et al., Curr. Biol., 6:325-330, 1996）のＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩによる切断により、ＤＮＡ断片が得られ、これを同一制限酵素により切断されたｐＳＢ１０５と結合して、プラスミドｐＳＢ−ＲＧ（ｒｂｃＳ−ｓｇｆｐ）を作製した。その後、得られたプラスミドｐＳＢ−ＲＧ中のｒｂｃＳプロモーターをイネのＡｃｔ１プロモーター（参照：McElroy D. et al., Mol. Gen. Genet., 231:150-160, 1991）により置換して、プラスミドｐＳＢＧ７００（Ａｃｔ１−ｓｇｆｐ）を作製した。
【００１８】
図２は、プラスミドｐＳＢ−ＣＧ、ｐＳＢ−ＲＧおよびｐＳＢＧ７００の遺伝地図を示す。図２において、ＢＲおよびＢＬはそれぞれ右側境界および左側境界を示し；３’ＰｉｎＩＩおよび３’ＮｏｓはそれぞれジャガイモプロテアーゼインヒビターＩＩ遺伝子のターミネーターおよびノパリンシンターゼ遺伝子のターミネーターを示す。上述のように構築されたプラスミドｐＳＢ−ＣＧ、ｐＳＢ−ＲＧおよびｐＳＢＧ７００をそれぞれ、トリペアレンタルメイティング（triparental mating）法によりアグロバクテリウム・チュメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens）ＬＢＡ４４０４に導入した。
【００１９】
例３：アグロバクテリウム媒介形質転換により生産されたイネにおける導入遺伝子の安定性
破砕されていない約２００粒（Oryza sativa L. cv Nakdong）を滅菌のために７０％（ｖ／ｖ）エタノールで処理して１分間弱く混合した。次に、エタノールを廃棄し、残留する粒を更なる滅菌のために１００ｍｌの２０％（ｖ／ｖ）クロラックス（Clorax）と１時間混合し、滅菌水で数回洗浄した。イネを形質転換するために、カルス誘導、上の例で作製されたプラスミドを含有するアグロバクテリウムとのカルスの同時培養、および形質転換されたカルスの選択を、ヤン（Jang）等により記載されている方法（参照：Jang, I-C. et al., Mol. Breeding, 5:453-461, 1999） により行った。除草剤に対する耐性をもったイネを選択するために、アグロバクテリウム媒介法により形質転換されたイネを温室内で生育した。上述のように選択されたトランスジェニックイネのゲノムのサザンブロット解析により、導入された導入遺伝子がイネの染色体に組み込まれていること及び１〜３コピーを有することが同定された。イネがゲノムＤＮＡハイブリダイゼーションによりそのゲノム中に単一コピーのＯｓＣｃ１を有することが知られていることに鑑みると、当該導入遺伝子が植物体内に安定的に位置し、そして高レベルに発現されることが容易に期待できる。
【００２０】
例４：形質転換されたイネの組織におけるプロモーターの活性
上述のように構築されたプラスミドｐＳＢ−ＣＧ、ｐＳＢ−ＲＧおよびｐＳＢＧ７００により形質転換されたイネの各組織において発現された蛍光タンパク質の解析により、各プロモーターの活性を解析し、相互に比較した。
【００２１】
例４−１：蛍光タンパク質のウェスタンブロット解析
形質転換されたイネの各組織からタンパク質を抽出し、これを次にｓＧＦＰ抗体を用いたウェスタンブロット解析の対象とした。イネの約０．１ｇのカルス、葉および根の組織を液体窒素中で粉砕し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、３０ｍＭ ＮａＣｌおよび２ｍＭ フェニルメタンスルホニルフルオリド を含有するバッファー溶液中、４℃で１時間ホモジナイズし、そして次に４℃で５分間遠心分離した。上清中のタンパク質濃度をブラッドフォード（Bradford）溶液（Bio-Rad, USA）を用いて決定した。粗タンパク質を１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、セミドライ(Semidry）装置（Bio-Rad, USA）によりポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）にエレクトロブロットし、そして次にｓＧＦＰポリクローナル抗体（Clonetech, USA）とアルカリ性ホスファターゼ結合二次抗体を用いたイムノブロット解析の対象とした。図３は、形質転換されたイネの各組織から抽出されたタンパク質についてのノーザンブロット解析の結果を示す写真である。ＯｓＣｃ１−ｓｇｆｐ、Ａｃｔ１−ｓｇｆｐまたはｒｂｃＳ−ｓｇｆｐによりそれぞれ形質転換されたイネから選択された２、３または３体の植物からタンパク質を抽出し、次に解析した。図３において、記号Ｌ、Ｒ、Ｃ、ＰＣおよびＮＣは、葉、根、カルス、精製ｓＧＦＰおよび形質転換されていないイネの葉からそれぞれ抽出されたタンパク質を示し、各々の数値は選択された個体数を示す。図３に示されるように、ｓＧＦＰはＯｓＣｃ１−ｓｇｆｐにより形質転換されたイネの全ての組織において高レベルで発現され、その発現レベルはＡｃｔ１−ｓｇｆｐまたはｒｂｃＳ−ｓｇｆｐにより形質転換されたイネにおける発現レベルと類似している。
【００２２】
例４−２：形質転換されたイネにおけるｓＧＦＰの蛍光分析
その全植物のレベルでのＯｓＣｃ１プロモーターの活性を調べるために、形質転換された種子および形質転換されていない種子を生育して、イネにおけるｓＧＦＰの蛍光を分析した。ディジタルビデオ撮像系を利用する高解像度ＣＣＤカラービデオカメラ（モデル CoolSNAP, Roper Scientific Inc. USA）を使用して、垂直位置においてＯｓＣｃ１−ｓｇｆｐ（ＯｓＣｃ１）、Ａｃｔ１−ｓｇｆｐ（Ａｃｔ１）またはｒｂｃＳ−ｓｇｆｐ（ｒｂｃＳ）により形質転換された稚苗のｓＧＦＰ蛍光イメージを集めた。得られた結果を図４ａに示す。さらに、各々の形質転換されたイネの葉、根端、根の伸長領域および毛状根におけるｓＧＦＰ蛍光イメージを、共焦点レーザー走査型顕微鏡（Carl Zeiss LSM510, Carl Zeiss, Germany）で観察した。観察結果を図４ｂに示す。図４ｂにおいて観察されるｓＧＦＰ蛍光の強度を、LSM510バージョン2.8 に備えられるソフトウェアにより算出し、その相対的蛍光強度（Ａｃｔ１活性により導かれたＭＣの蛍光強度の値を１であると固定される基準として算出されたもの）を図４ｃに示す。図４ａにおいて、記号ＮＴは形質転換されていない稚苗を示し；図４ｂにおいて、記号ＧＣ、ＲＡ、ＲＣ、ＲＨＰ、ＬＣ、ＳＣ、ＰＲおよびＨＲは、それぞれ孔辺細胞、根端、根冠、根の毛状隆起部、長細胞、短細胞、一次根および毛状根を示し（ここで白線により示される尺度棒は３０μｍの長さを有する）；そして、図４ｃにおいて、記号ＭＣ、ＲＡおよびＲＥは、それぞれ葉肉細胞、根端および根の伸長領域を示す。
【００２３】
図４ａに示されるように、形質転換されていない稚苗は蛍光を全く示さないのに対し、形質転換された稚苗（ＯｓＣｃ１、Ａｃｔ１およびｒｂｃＳ）は薄緑色の蛍光を示し、特にＯｓＣｃ１は該植物の全組織において蛍光を示した。さらに、図４ｂは、ＯｓＣｃ１−ｓｇｆｐで形質転換された植物の葉細胞がＡｃｔ１−ｓｇｆｐで形質転換された植物の葉細胞よりも高レベルでｓＧＦＰ蛍光を示すが、ｒｂｃＳ−ｓｇｆｐで形質転換された植物の葉細胞よりも低レベルであることを示す。根細胞においては、ＯｓＣｃ１−ｓｇｆｐまたはＡｃｔ１−ｓｇｆｐで形質転換された植物がｒｂｃＳ−ｓｇｆｐで形質転換された植物よりも高レベルでｓＧＦＰ蛍光を示し、特に、ＯｓＣｃ１−ｓｇｆｐで形質転換された植物は根端、根冠および根の毛状隆起部において明るい蛍光を示す。それ故に、ＯｓＣｃ１プロモーターが植物体の全組織において活性を示し、特に、急速に分裂し高い代謝活性を有する細胞において高い活性を示すと考えることができる。このような結果は図４ｃからも確認し得る。以下の表１はＯｓＣｃ１プロモーターおよびイネの形質転換に広く使用されている他のプロモーターの活性を示す。表１において、３５Ｓおよび３５Ｓｉはそれぞれイントロンの無いＣａＭＶ３５ＳおよびトウモロコシＡｄｈ１プロモーターのイントロンと結合されたＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを示し；Ａｄｈ１、Ｕｂｉ１およびＡｃｔ１はそれぞれその固有イントロンと結合されたプロモーターを示し；そしてＯｓＣｃ１およびｒｂｃＳはイントロンの無いイネのプロモーターを示す。この表に示される値は、ＣａＭＶ３５ＳまたはＡｃｔ１の活性の値を１とすることを基準として算出された相対値である。表１に示されるように、葉および根におけるＯｓＣｃ１プロモーターの活性はＡｃｔ１のプロモーターの活性よりもそれぞれ５倍および２倍高い。
【００２４】
【表１】
2005507260.tif 000003
【００２５】
上記で明確に説明および実証されたように、本発明は、単子葉植物の形質転換用ＯｓＣｃ１プロモーターおよび所望の外来遺伝子を含有する組換えプラスミドにより単子葉植物を形質転換するステップ、および前記外来遺伝子を発現させるステップを含んでなる、単子葉植物の形質改変方法を提供する。本発明によれば、シトクロムｃ遺伝子（ＯｓＣｃ１）用プロモーターおよび形質転換された緑色蛍光タンパク質をコードするｓｇｆｐ遺伝子を含有する組換えプラスミドによりイネが形質転換され、形質転換されたイネにおいて発現された蛍光タンパク質がモニターされ、ＯｓＣｃ１プロモーターがイネの全ての組織において所望の遺伝子の発現を強力、安定的そして遍在的な態様で誘導することを示す。従って、ＯｓＣｃ１プロモーターが単子葉植物の形質転換用に実際に適用できることが分かった。
【００２６】
本発明を特定の実施態様について説明してきたが、このような説明は単に本発明の最良の形態を提示するにすぎず、それにより本発明の範囲を限定するものでないことが当業者により理解されるであろう。従って、本発明の趣旨および範囲は添付の特許請求の範囲およびその均等な範囲で画定される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１ａ】未処理のイネの様々な組織から抽出された全ＲＮＡを用いたノーザンブロット解析の結果を示す写真である。
【図１ｂ】Ｂｔ2ｃＡＭＰ で処理されたイネの様々な組織から抽出された全ＲＮＡを用いたノーザンブロット解析の結果を示す写真である。
【図１ｃ】光で処理された稚苗の葉から抽出された全ＲＮＡを用いたノーザンブロット解析の結果を示す写真である。
【図２】プラスミドｐＳＢ−ＣＧ、ｐＳＢ−ＲＧおよびｐＳＢＧ７００の遺伝地図を示す図である。
【図３】形質転換されたイネの様々な組織から抽出されたタンパク質についてのウェスタンブロット解析の結果を示す写真である。
【図４ａ】ＯｓＣｃ１−ｓｇｆｐ（ＯｓＣｃ１）、Ａｃｔ１−ｓｇｆｐ（Ａｃｔ１）またはｒｂｃＳ−ｓｇｆｐ（ｒｂｃＳ）で形質転換された稚苗のｓＧＦＰ蛍光イメージを示す写真である。
【図４ｂ】ＯｓＣｃ１−ｓｇｆｐ（ＯｓＣｃ１）、Ａｃｔ１−ｓｇｆｐ（Ａｃｔ１）またはｒｂｃＳ−ｓｇｆｐ（ｒｂｃＳ）で形質転換されたイネの様々な組織のｓＧＦＰ蛍光イメージを示す写真である。
【図４ｃ】ＯｓＣｃ１−ｓｇｆｐ（ＯｓＣｃ１）、Ａｃｔ１−ｓｇｆｐ（Ａｃｔ１）またはｒｂｃＳ−ｓｇｆｐ（ｒｂｃＳ）で形質転換されたイネの様々な組織の相対的ｓＧＦＰ蛍光強度を示すグラフである。
【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２】
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【図４ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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