(57)【要約】本発明は、サバイビン発現の阻害およびダウンレギュレーションに関する。本発明は、細胞におけるサバイビン発現を阻害またはダウンレギュレーションするため、ならびにアポトーシスおよび細胞壊死を促進するための方法およびアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または11を有する合成オリゴヌクレオチドであり、サバイビンタンパク質をコードする核酸に相補的な合成オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を有する、請求項1記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号：6、7または9を有する、請求項1記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を有する、請求項3記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
請求項1記載のオリゴヌクレオチドを細胞に接触させる段階を含む、サバイビンを発現する細胞においてサバイビンの合成を阻害する方法。
【請求項６】
請求項1記載のオリゴヌクレオチドを細胞に接触させる段階を含む、サバイビンタンパク質を発現する癌細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項７】
癌細胞が神経系の癌細胞である、請求項6記載の方法。
【請求項８】
癌細胞が神経芽細胞腫細胞または乏突起神経膠腫細胞である、請求項7記載の方法。
【請求項９】
請求項1記載のオリゴヌクレオチドを細胞に接触させる段階を含む、サバイビンを発現する細胞でのアポトーシスを増強する方法。
【請求項１０】
細胞が癌細胞である、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
癌細胞が神経系の癌細胞である、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
神経系の癌細胞が神経芽細胞腫細胞または乏突起神経膠腫細胞である、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
請求項1記載の合成オリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項１４】
請求項13記載の薬学的組成物の治療的有効量を哺乳類に投与する段階を含む、哺乳類の神経系腫瘍を治療する方法。
【請求項１５】
配列番号：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または11の核酸配列に少なくとも85%同一である核酸配列を有する合成オリゴヌクレオチドであり、サバイビンタンパク質をコードする核酸に相補的な合成オリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を有する、請求項15記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
配列番号：6、7または9の核酸配列に少なくとも85%同一である核酸配列を有する、請求項15記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を有する、請求項17記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項15記載のオリゴヌクレオチドを細胞に接触させる段階を含む、サバイビンを発現する細胞においてサバイビン合成を阻害する方法。
【請求項２０】
請求項15記載のオリゴヌクレオチドを細胞に接触させる段階を含む、サバイビンタンパク質を発現する癌細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項２１】
癌細胞が神経系の癌細胞である、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
癌細胞が神経芽細胞腫細胞または乏突起神経膠腫細胞である、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
請求項15記載のオリゴヌクレオチドを細胞に接触させる段階を含む、サバイビンを発現する細胞のアポトーシスを増強する方法。
【請求項２４】
細胞が癌細胞である、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
癌細胞が神経系の癌細胞である、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
神経系の癌細胞が神経芽細胞腫細胞または乏突起神経膠腫細胞である、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
請求項15記載の合成オリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項２８】
請求項27記載の薬学的組成物の治療的有効量を哺乳類に投与する段階を含む、哺乳類の神経系の腫瘍を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府の支援による研究
本発明の研究は、米国立衛生研究所の連邦助成金(Grant R01NS38102)により支援されたものであり、従って米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明は、細胞生物学、医学および腫瘍疾患の分野に関する。さらに具体的には、本発明は、アンチセンス技術による細胞増殖の制御に関する。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の概要
サバイビンは、胎児発生中のアポトーシス性細胞死の阻害の原因となるアポトーシス阻害(IAP)ファミリーのタンパク質のメンバーである(Adidaら、(1998) Am. J. Pathol. 152: 41-49)。サバイビンは最終的な分化細胞では発現されないが、ヒト腫瘍ではかなり増大される。サバイビンは、脳腫瘍、乳癌、肺癌、結腸癌、膵臓癌、肝臓癌および胃癌では検出されているが、低級（low-grade）非ホジキンリンパ腫では検出されていない(Ambrosiniら、(1997) Nature Med. 3: 917-921)。原発性神経芽細胞腫および神経芽細胞腫の細胞系はサバイビンを発現し、発現レベルは直腸結腸癌、乳癌および肺癌の細胞系より高いことも示されている(Islamら、(2000) Oncogene 19: 617-623)。
【０００４】
免疫組織化学的検討は、サバイビン発現が、神経芽細胞腫および直腸結腸癌では腫瘍の攻撃性および患者の予後不良に関連することを示している(Adidaら、(1998) Lancet 351: 882-883；Kawasakiら、(1998) Cancer Res. 58: 5071-5074)。また、サバイビンタンパク質の上昇はこれらの腫瘍の細胞死の減少と関連している。
【０００５】
以前の検討は、非神経系腫瘍系統におけるサバイビンのアンチセンスダウンレギュレーションにより細胞死が増強されることを示しているが、サバイビンは、神経系の腫瘍の治療的介入の標的として使用されていない。例えば、最近の2つの検討は、肺癌および結腸癌細胞系並びにHeLa細胞ではサバイビン発現の阻害がサバイビン発現を低下し、細胞死を生じたことを証明している(Olieら、(2000) Cancer Res. 60: 2805-2809；Chenら、(2000) Neoplasia 2: 235-241)。しかし、サバイビンのダウンレギュレーションを標的とした細胞死(アポトーシス)の誘導は報告されていない。従って、非常に困難な挑戦となりうる脳腫瘍細胞の細胞死を誘導する治療が、長い間切実に必要とされていた。
【０００６】
攻撃的な脳腫瘍は、細胞周期チェックポイントの克服、胎児発生早期に発現される遺伝子の再発現、細胞死シグナルの阻害による細胞生存の延長および放射線および化学療法による細胞毒性に対する耐性の促進を含む数多くの細胞機序によって細胞死を回避する。bcl-2ファミリーおよびアポトーシス阻害(IAP)ファミリーのタンパク質などの抗アポトーシス遺伝子ファミリーは脳腫瘍においてアップレギュレーションされていることが多く、脳腫瘍では、アポトーシスを遮断する際のそれらの作用が腫瘍の病原性の原因となっている(Leaverら、(1998) J. Neurosurg. 12: 539-546；Deiningerら、(1999) Cancer 86: 1832-1839；LaCasseら(1998) Oncogene 17: 3247-3259)。
【０００７】
サバイビンは哺乳類のIAPファミリーの抗タンパク質の一メンバーである。IAPファミリーメンバーはバキュロウィルスにおいて最初に同定されたが、これはカスパーゼに結合して、カスパーゼ活性を阻害するバキュロウィルスIAPリピート(BIR)ドメインとして既知の70アミノ酸モチーフのコピーを1つまたは複数含有する(Birmbaumら(1994) J. Virol. 68: 2521-2528)。ヒトでは、6つのIAPファミリーメンバー：XIAP、IAP-1、IAP-2、NAIP、アポロン(apollon)(BRUCE)およびサバイビンがある(Deverauxら(1999) Genes Dev. 13: 239-252；Chenら(1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 264: 847-854；Adidaら(1998) Am. J. Pathol. 152: 41-49；Ambrosiniら(1997) Nature Med. 3: 917-921)。XIAP、NAIP、c-IAP-1およびc-IAP-2は3つのBIRドメインを含有するが、アポロン(apollon)およびサバイビンは1つのBIRドメインを含有する(Deverauxら(1999) Genes Dev. 13: 239-252、Miller(1999) Trends. Cell. Biol. 9: 323-328、Readら(2000) Cell 102: 545-548)。
【０００８】
IAPファミリーメンバーは、サバイビンを除いて、COOH末端RINGフィンガーモチーフも有する。胸腺細胞では、RINGドメインは、ユビキチン化並びにc-IAP-1およびXIAPのプロテアソームを介した分解に必要であることが示されている(Yangら(2000) Science 288: 874-877)。
【０００９】
サバイビンは、IAPファミリーメンバーとしての分類以外に、細胞周期調節因子として機能すると考えられている。線虫(C. elegans)では、サバイビンは有糸分裂紡錘体に関連して、BIR-1欠損によって誘導される細胞質分裂の欠損を部分的に補足することが示されており、細胞周期における役割を示唆している(Fraserら(1999) Curr. Biol. 9: 292-301)。
【００１０】
サバイビン発現は細胞周期のG2/M期に増加し、G2/M細胞周期チェックポイントおよび正常な有糸分裂を通過する細胞周期の移行に必須であると考えられる(Liら(1998) Nature 396: 580-584)。有糸分裂のとき、サバイビンは有糸分裂紡錘体に関連し、微小管結合アッセイは、サバイビンはチューブリンに結合することを証明している(Liら(1998) Nature 396: 580-584)。サバイビンはまた、cdk4に結合して、G1/S細胞周期移行の助けとなることが示されている(Suzukiら(2000) Oncogene 19: 3225-3234)。さらに別の検討は、サバイビンの別のスプライスバリアントは核に輸送され、細胞周期移行中の遺伝子発現を調節することを示唆している(Rodriguezら(2002) Exp. Cell. Res. 275: 44-53)。
【００１１】
比較ゲノムハイブリダイゼーション検討により、神経芽細胞腫は17qの遠位領域にゲイン(gain)を有することが多いことが明らかにされた。FISHデータにより、17q25にマッピングされるサバイビン遺伝子は17q ゲイン（gain）領域内にあると証明された(Islamら(2000) Oncogene 19: 617-623)。実際、サバイビンタンパク質は神経芽細胞腫では大量に増加されており、予後の不良を予告している(Adidaら、(1998) Lancet 351: 882-883)。肺癌および結腸癌並びにHeLa細胞におけるサバイビンのダウンレギュレーションによって誘導されるアポトーシス(Olieら(2000) Cancer Res. 60: 2805-2809；Chenら(2000) Neoplasia 2: 235-241)が証明されているが、このような影響は、神経系の腫瘍では検討されていない。脳腫瘍の既存の治療では致死率はほぼ100%であるので、神経系の癌の新規で、比較的無毒性の治療法の大きな必要性が存在している。従って、神経系の細胞、特に神経系の癌細胞においてサバイビンタンパク質レベルをダウンレギュレーションする効果的な治療法を開発する必要性がある。
【発明の開示】
【００１２】
発明の概要
本発明は、神経系の癌細胞においてサバイビンの活性を遮断する新規合成オリゴヌクレオチドおよび方法を提供する。
【００１３】
サバイビンmRNAを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドはサバイビンタンパク質をダウンレギュレーションし、ヒトの神経系腫瘍の細胞死を誘導する。具体的には、これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドはサバイビンmRNA配列を特異的に標的とし、ヒト神経芽細胞腫細胞および乏突起神経膠腫細胞におけるサバイビンタンパク質の発現を有意に阻害することが明らかにされている。アンチセンスオリゴヌクレオチドによる治療は、サバイビンを発現する細胞のアポトーシス性細胞死を生じた。これらの決定結果等は、サバイビン核酸に相補的な合成オリゴヌクレオチドおよびそれらを使用する方法を含む本発明を提供するために活用されている。
【００１４】
さらに具体的には、一局面において、本発明は、サバイビン遺伝子の種々の領域に相補的な合成オリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの態様において、これらの領域は、ヌクレオチド位置1839〜1858、2867〜2886、3180〜3199、3239〜3258、3248〜3267、4385〜4404、5248〜5267、11432〜11451、11897〜11916、11951〜11970および12241〜12260を含む。
【００１５】
いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは約12〜30ヌクレオチドを有する。少なくともいくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは約15〜25ヌクレオチドを有する。一態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは鎖長約20ヌクレオチドである。
【００１６】
いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは少なくとも1つの修飾ヌクレオシド間結合を含む。ある種の態様において、そのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートヌクレオシド間結合である。
【００１７】
いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは少なくとも1つの2'-置換リボヌクレオシドを含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは少なくとも1つの修飾ヌクレオシド間結合および少なくとも1つの2'-置換リボヌクレオシドを含む。ある種の態様において、オリゴヌクレオチドは少なくとも3つの2'-置換リボヌクレオシドまたは少なくとも4つの2'-置換リボヌクレオシドを含む。ある種の態様において、2'-置換リボヌクレオシドは2'-アルキルまたは2'-O-アルキルリボヌクレオシドである。ある種の態様において、オリゴヌクレオチドは少なくとも3つの隣接デオキシリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオシドホスホロチオエートを含む。ある種の態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも4つの隣接デオキシリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオシドホスホロチオエートを含む。
【００１８】
特定の態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号：1〜11からなる群から選択される核酸配列を含む。具体的な態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号：6、7および9からなる群から選択される核酸配列を含む。
【００１９】
本発明の一局面は、配列番号：1〜11からなる群から選択される核酸配列と少なくとも85%同一である核酸配列を有するオリゴヌクレオチドである。特定の態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号：6、7および9からなる群から選択される核酸配列に少なくとも85%同一である核酸配列を有する。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を有する。
【００２０】
本発明の別の局面は、配列番号：1〜11からなる群から選択される核酸配列を有するオリゴヌクレオチドである。ある種の態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号：6、7および9からなる群から選択される核酸配列を有する。ある種の態様において、オリゴヌクレオチドはホスホロチオエートヌクレオシド間結合を有する。
【００２１】
別の局面において、本発明は、上記の本発明のオリゴヌクレオチドを細胞に接触させる段階を含む、サバイビンを発現する細胞のアポトーシスを増強する方法を提供する。ある種の態様において、サバイビンを発現する細胞は癌細胞である。特定の態様において、癌細胞は神経系の癌細胞である。具体的な態様において、神経系の癌細胞は神経芽細胞腫細胞または乏突起神経膠腫細胞である。
【００２２】
さらに別の局面において、本発明は、上記の本発明のオリゴヌクレオチドを細胞に接触させる段階を含む、サバイビンを発現する細胞においてサバイビンの合成を阻害する方法を提供する。
【００２３】
よりさらに別の局面において、本発明は、上記の本発明のオリゴヌクレオチドを細胞に接触させる段階を含む、サバイビンを発現する癌細胞の増殖を阻害する方法を提供する。いくつかの態様において、癌細胞は、神経芽細胞腫細胞または乏突起神経膠腫細胞などの神経系の癌細胞である。
【００２４】
さらに別の局面において、本発明は、サバイビンmRNAまたは遺伝子に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。本発明はまた、哺乳類の神経系の腫瘍を治療する方法を提供する。本発明の方法では、本発明によるサバイビン特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは薬学的製剤の治療的有効量を哺乳類に投与する。いくつかの態様において、哺乳類はヒトである。いくつかの態様において、神経系の腫瘍は神経芽細胞腫または乏突起神経膠腫である。
【００２５】
本発明の上記および他の目的、本発明の種々の特徴並びに本発明自体は、添付の図面と共に、以下の説明からさらに十分に理解することができる。
【００２６】
詳細な説明
本明細書において言及している公開特許および科学文献は、当業者が利用可能な知識を確立したものである。本明細書に引用されている、公布された米国特許、公開出願、公開外国特許出願およびGenBankデータベース配列を含む文献は、各々が参照として組み入れられることが具体的に個々に示されているものと同じ程度に、参照として本明細書に組み入れられている。これらの公開公報と本発明の開示内容との間のいかなる矛盾も本発明の開示内容を指示して解決される。
【００２７】
本発明は、核酸レベルで発現を阻害することによって、ヒト腫瘍細胞に存在するサバイビンをダウンレギュレーションする組成物および方法を提供する。本発明は、腫瘍細胞のアポトーシス性細胞死を阻害する原因となっていることが明らかであるサバイビンタンパク質の合成の特異的な阻害を提供し、従って癌の治療的治療を提供する。
【００２８】
本発明者らは、サバイビンmRNAを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドはサバイビンタンパク質をダウンレギュレーションし、ヒト神経系の腫瘍細胞の細胞死を誘導するという発見をした。具体的には、これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドはサバイビンmRNAを特異的に標的化し、ヒト神経芽細胞腫および乏突起神経膠腫細胞におけるサバイビンタンパク質の発現を有意に阻害することが明らかにされている。アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処理は、サバイビンを発現する細胞の細胞死を生ずる。
【００２９】
これらの決定等は、サバイビン核酸に相補的な合成オリゴヌクレオチドおよびそれらの用途を含む本発明を提供するために使用されている。
【００３０】
本明細書において使用する「オリゴヌクレオチド」という用語は、2つ以上のデオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシドまたは任意の組み合わせのポリマーを含む。いくつかの態様では、このようなオリゴヌクレオチドは、約6個〜約50個のヌクレオシド残基を有し、いくつかの態様では、約12個〜約30個のヌクレオシド残基を有し、他の態様では、約15個〜約25個のヌクレオシドを有する。ヌクレオシド残基は、数多くの既知のヌクレオシド間結合のいずれかによって互いに結合されうる。このようなヌクレオシド間結合には、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、シロキサン、カルボネート、カルボキシメチルエステル、アセタミデート、カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホロアミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロチオエートおよびスルホンヌクレオシドが挙げられるが、これらに限定されない。少なくともいくつかの態様において、これらのヌクレオシド間結合はホスホトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたはホスホロアミデート結合またはそれらの組み合わせである。少なくともいくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つのホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートヌクレオシド間結合を含む。特定の態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは少なくとも1つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。
【００３１】
本発明のオリゴヌクレオチドは、天然型ヌクレオシド、改変ヌクレオシドまたはそれらの混合物を含んでもよい。「改変ヌクレオシド」という用語は、改変複素環塩基、改変糖部分またはそれらの組み合わせを含むヌクレオシドをいう。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドは2'-置換リボヌクレオシドを含んでもよい。本発明の目的のためには、「2'-置換リボヌクレオシド」という用語は、ペントース部分の2'位置のヒドロキシル基が置換されて、2'-O-置換リボヌクレオシドを生じるリボヌクレオシドを含む。例えば、このような置換は、炭素原子数1〜6の飽和もしくは不飽和低級アルキル基または炭素原子数2〜6もしくは炭素原子数6〜10のアリールもしくはアリル基(ここで、このようなアルキル、アリールまたはアリル基は未置換であっても、または例えば、ハロ、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、アルコキシ、カルボキシル、カルボアルコキシルまたはアミノ基で置換されていてもよい)による。「2'-置換リボヌクレオシド」という用語は、2'ヒドロキシル基が炭素原子数1〜6の飽和もしくは不飽和低級アルキル基またはアミノもしくはハロ基で置換されているリボヌクレオシドも含む。
【００３２】
本明細書において使用する「アルキル」という用語は、必要に応じて1、2または3つの置換基で置換されていてもよい、炭素原子数1〜12、いくつかの態様では炭素原子数1〜8、他の態様では炭素原子数1〜6の直鎖および分岐鎖脂肪族基をいう。文脈上特に明らかでない限り、「アルキル」という用語は、飽和、不飽和および部分的不飽和脂肪族基を含むことが意味される。不飽和基が特に意図される場合には、「アルケニル」または「アルキニル」という用語が使用される。飽和基だけが意図される場合には、「飽和アルキル」という用語が使用される。いくつかの態様において、飽和アルキル基には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチルおよびヘキシルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
「オリゴヌクレオチド」という用語はまた、ペプチド核酸(PNA)を有するポリマー、リン酸基を有するペプチド核酸(PHONA)、ロックド核酸(locked nucleic acid)(LNA)またはモルホリノ骨格およびアリルリンカーまたはアミノリンカーを有する骨格部分を有するオリゴヌクレオチドを含むが、これらに限定されない任意の他の有機塩基を含むポリマーも含む。
【００３４】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、化学的に修飾された塩基または糖および／または親油性基、挿入剤、ジアミンおよびアダマンタンを含むが、これらに限定されない追加の置換基を有するポリマーも含む。
【００３５】
本発明のオリゴヌクレオチドは、サバイビンをコードする核酸に相補的である。本発明の目的のためには、「相補的」という用語は、ゲノム領域、遺伝子またはRNA転写物に生理学的条件下においてハイブリダイゼーションする能力を有することを意味する。このようなハイブリダイゼーションは、通常、相補鎖間の塩基特異的水素結合の結果で、典型的にはワトソンクリックまたはHoogsteen塩基対を形成するが、他の様式の水素結合および塩基のスタッキングもハイブリダイゼーションを生じることができる。実際、このようなハイブリダイゼーションは、転写もしくは翻訳(または両者)レベルであってもよい特異的な遺伝子の発現阻害の観察から推測することができる。有用なオリゴヌクレオチドには、キメラオリゴヌクレオチドおよびハイブリッドオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００３６】
本明細書において使用する「キメラオリゴヌクレオチド」は、2つ以上の種類のヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドをいう。このようなキメラオリゴヌクレオチドの一態様は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートおよびホスホジエステル結合などの異なるヌクレオシド間結合領域を含むオリゴヌクレオチドであり、いくつかの態様ではこの領域は約2個〜約12個のヌクレオシドを含む。いくつかの態様では、有用なキメラオリゴヌクレオチドは少なくとも1つを有し、またはいくつかの態様ではホスホジエステルもしくはホスホロチオエート結合またはそれらの組み合わせである少なくとも3つもしくは4つの連続ヌクレオシド間結合を有する。本発明のいくつかの有用なオリゴヌクレオチドは、アルキルホスホネート結合領域またはアルキルホスホノチオエート結合領域を有する(例えば、米国特許第5,635,377号および同第5,366,878号を参照されたい)。米国特許第5,652,356号、同第5,973,136号および同第5,773,601号に記載されているように、逆向きキメラオリゴヌクレオチドも考慮される。
【００３７】
本発明の目的のためには、「ハイブリッドオリゴヌクレオチド」は、2つ以上の種類のヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドをいう。このようなハイブリッドオリゴヌクレオチドの一態様は、リボヌクレオシドまたは2'-O-置換リボヌクレオシド領域を含み、少なくともいくつかの態様では、約2個〜約12個の2'-O-置換ヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシド領域を含む。いくつかの態様において、このようなハイブリッドオリゴヌクレオチドは少なくとも3つの連続デオキシリボヌクレオシドを有し、リボヌクレオシド、2'-O-置換リボヌクレオシドまたはそれらの組み合わせを含有する(例えば、MetelevおよびAgrawal、米国特許第5,652,355号および同第5,652,356号を参照されたい)。米国特許第5,652,356号に記載されているように、逆向きのハイブリッドオリゴヌクレオチドも考慮される。
【００３８】
いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホジエステルおよび修飾オリゴデオキシ-またはオリゴリボ-ヌクレオチドのセグメントなどの修飾ヌクレオシド間結合の適当に配置されたセグメントで中央部または末端が修飾されたヌクレオシドを有するキメラ骨格(mixed backbone)オリゴヌクレオチド(MBO)である(Agrawal(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 94: 2620-2625；Agrawal(1999) Biochem. Biophys. Acta 1489: 53-67)。
【００３９】
「腫瘍細胞」および「癌細胞」という用語は、異常な細胞増殖を示す細胞を示すために使用される。少なくともいくつかの態様において、腫瘍細胞の異常な細胞増殖は細胞増殖の亢進である。腫瘍細胞は、過形成細胞、インビトロにおいて増殖の接触阻止が欠如している細胞、インビボにおいて転移することができない良性の腫瘍細胞またはインビボにおいて転移することができ、除去の試みの後再発する可能性のある癌細胞であってもよい。「腫瘍形成」という用語は、腫瘍または癌増殖に発展する細胞増殖の誘導を示すために使用される。癌細胞成長または増殖のこのような評価は、例えば、Coulterセルカウンター(Coulter、フロリダ州マイアミ)または血球計を使用して接触細胞および非接触細胞を計数することによって行うことができる。細胞が固形増殖(例えば、固形腫瘍または臓器)段階である場合には、このような細胞増殖の評価は、カリパーで増殖を測定し、接触細胞の増殖サイズを非接触細胞と比較することによって行うことができる。
【００４０】
本明細書において使用する「壊死細胞」は、プログラムされた細胞死、すなわち、アポトーシスを受けた死細胞およびトリパンブルー染色で染色したとき陽性の試験結果である細胞を含む。
【００４１】
「細胞増殖の阻害」という用語は、非接触細胞と比較したときの、接触細胞の数の減少またはサイズの低下を含む。従って、接触細胞において細胞増殖を阻害する本発明のサバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチドは、接触細胞に、増殖遅延、増殖停止、プログラムされた細胞死(すなわち、アポトーシス)または壊死性細胞死を受けるように誘導することができる。
【００４２】
本発明によるオリゴヌクレオチドの合成は、通常任意の既知の方法によって実施することができる。例えば、分子生物学の方法(Methods in Molecular Biology)、20巻：オリゴヌクレオチドおよび類似体のプロトコール(Protocols for Oligonucleotodes and Analogs) 165〜189ページ(S. Agrawal編、Humana Press、1993)；オリゴヌクレオチドおよび類似体：実践的方法(Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach)、87〜108ページ(F. Eckstein編、1991)、AgrawalおよびIyer(1995) Curr. Op. in Biotech. 6: 12；およびアンチセンス研究と応用(Antisense Research and Applications)(CrookeおよびLebleu編、CRC Press、Boca Raton、1993)を参照されたい。いくつかの既知の合成方法にはホスホジエステルおよびホスホトリエステル化学が挙げられる(Khoranaら(1972) J. Molec. Biol. 72: 209はオリゴヌクレオチド合成のホスホジエステル化学を開示しており、Reese(1978) Tetrahedron Lett. 34: 3143-3179はオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド合成のホスホトリエステル化学を開示している)。
【００４３】
別の化学的方法には、ホスホロアミダイトおよびH-ホスホネート合成方法が挙げられる(BeaucageおよびCaruthers(1981) Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862はポリヌクレオチド合成におけるデオキシヌクレオシドホスホロアミダイトの用途を開示しており、AgrawalおよびZamecnik、米国特許第5,149,798号(1992)は、H-ホスホネート方法によるオリゴヌクレオチドの最適合成を開示している)。
【００４４】
多種多様の修飾ヌクレオシド間結合を有する修飾オリゴヌクレオチドの製造は当技術分野上既知である。例えば、AgrawalおよびGoodchild(1987) Tetrahedron Lett. 28: 3539-3542は、ホスホロアミダイト化学を使用したオリゴヌクレオチドメチルホスホネートの合成を開示している。Connollyら(1984) Biochemistry 23: 3443は、ホスホロアミダイト化学を使用したオリゴヌクレオチドホスホロチオエートの合成を開示している。Jagerら(1988) Biochemistry 27: 7237は、ホスホロアミダイト化学を使用したオリゴヌクレオチドホスホロアミデートの合成を開示している。Agrawalら(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7079-7083は、H-ホスホネート化学を使用したオリゴヌクレオチドホスホロアミデートおよびホスホロチオエートの合成を開示している。
【００４５】
ヒトサバイビンmRNAの異なる領域を標的とするホスホロチオエートまたは混合骨格(mixed backbone)修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドの合成は、Agrawal(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 94: 2620-2625に記載されているように実施することができる。オリゴヌクレオチドを合成したら、多孔質ガラスなどの、固相オリゴヌクレオチド合成に使用される任意の好適な固相支持体に配置することができる(例えば、Pon(1993) Meth. Molec. Biol. 20: 465-496)を参照されたい)。
【００４６】
ヒト神経系から誘導した腫瘍におけるサバイビン発現を証明するために、ノーザンブロット分析およびウェスタンブロット分析を実施した。検討した全ての脳腫瘍細胞系はサバイビンmRNAおよびタンパク質を発現した。乏突起神経膠腫細胞系ではサバイビンの高い発現が見出されたが、神経芽細胞腫、グリア芽細胞腫および神経膠星状細胞腫は同程度のサバイビン発現を示した。従って、神経系の腫瘍細胞におけるサバイビンの有無は、サバイビンの、神経系の腫瘍の生存および病因の調節因子としての役割を示している。
【００４７】
ヒト神経芽細胞腫(MSN)(Reynoldsら(1986) J. Natl. Cancer. Inst. 76: 375-387)、2種の乏突起神経膠腫(HOGおよびTC620)、神経膠星状細胞腫(ATCC第HTB14号、American Type Culture Collection、バージニア州マナサス)およびグリア芽細胞腫(ATCC第HTB17号、American Type Culture Collection、バージニア州マナサス)から誘導した細胞系からRNAおよびタンパク質を単離した。ノーザンブロット分析により、検討した5つのヒト神経系腫瘍細胞系における1.9 kbのサバイビン転写物の発現が明らかになった(図1A)。ブロットをスキャンするためにデンシトメトリーを使用した。20μgの総RNAを1%アガロース-ホルムアルデヒドゲルで分析し、ニトロセルロースに移した。最初に、cDNAプローブを用いてブロットをサバイビン遺伝子のコード領域全体にハイブリダイゼーションし、その後cDNAを用いて18Sにハイブリダイゼーションした。サバイビンRNA発現を、18S RNAの発現について正規化した。相対的な量はMSNで0.075、HTB-14で0.11、HTB-17で0.065、TC620で0.25、HOGで0.25であった。
【００４８】
18S RNAに正規化したとき、サバイビンの高発現は2種の乏突起神経膠腫細胞系において見られたが、神経芽細胞腫、グリア芽細胞腫および神経膠星状細胞腫は同程度のサバイビン発現を示した。イムノブロット法により、全ての脳腫瘍系統における16.5 kDサバイビンタンパク質の存在が確認された(図1B)。
【００４９】
MSN、HTB 14、HTB 17およびHOG細胞から総タンパク質を単離した。75μgの総タンパク質を各レーンにロードした。32.9 kDにおいてブロットを切り出し、先端のブロットをβ-チューブリンモノクローナル抗体(mAb) (1:1000)と共にインキュベーションして、ロード量が等しいことを確認した。32.9 kD未満のタンパク質を保持する下層のブロットはサバイビンポリクローナル抗体(1:500)または10μgのGST-サバイビン融合タンパク質で前処理したサバイビンポリクローナル抗体(1:500)と共にインキュベーションした。可視化は、化学発光の増強によった。ブロットは直線飛程でスキャンし、データは、各細胞種におけるチューブリンに対するサバイビンの比として表した。相対的な量はMSNで0.35、HTB-14で0.45、HTB-17で0.39、HOGで0.13であった。
【００５０】
β-チューブリンに正規化したとき、サバイビンタンパク質レベルは、HOG細胞ホモジネートに対して、HTB-14、MSNおよびHTB-17ホモジネートは3倍高かった。2つの別の神経芽細胞腫(IMR32、ATCC第CCL-127号、American Typte Culture Collection、バージニア州マナサス)およびSK-N-SH、ATCC第HTB-11号、American Type Culture Collection、バージニア州マナサス))並びに乏突起神経膠腫(TC620)においてもサバイビンの存在が確認された。サバイビン抗体の特異性を証明するために、同じタンパク質ブロットを、GST-サバイビン融合タンパク質と共に事前インキュベーションしたサバイビン抗体と共にインキュベーションした。図1Bに示すように、抗体の吸収によりサバイビンの免疫活性がなくなった。
【００５１】
次に、G2/M細胞周期チェックポイントにおけるサバイビン発現の調節を評価した。まず、G2/Mチェックポイント遮断剤、ビンブラスチン、ノカドゾールおよびタキソテールで処理することにより、サバイビンの発現を増加させた。ビンブラスチンおよびタキソテールで処理したMSN細胞のフローサイトメトリーにより、細胞はG2/M細胞周期において遮断されることが確認された。
【００５２】
未処理またはビンブラスチン(250 nM)、ノカドゾール(nocadozole)(10 μM）またはタキソテール(1μM）で処理したMSN細胞から総タンパク質を単離した。DMSOおよびエタノール(EtOH)を担体として添加した。各レーンは、総タンパク質が75μgであった。32.9 kDでブロットを切り出し、下層のブロットをサバイビンポリクローナル抗体(1:500)と共にインキュベーションしたが、先端のブロットをβ-チューブリンmAb(1:1000)と共にインキュベーションした。各処理において、DMSOまたはEtOHに対するサバイビンタンパク質の増加の倍率はビンブラスチンで1.9、ノカドゾール(nocadozole)で2.6、タキソテールで1.7であった。
【００５３】
図2Aに示すように、サバイビンタンパク質の1.7〜2.6倍の増加が、DMSO対照と比較して、3つの遮断剤で処理したMSN総細胞溶解液において観察された。サバイビンタンパク質の同様の1.6倍の増加が、ノカドゾール処理したTC620細胞において観察され(図2B)、神経系の腫瘍細胞系では、サバイビンの発現はG2/M細胞周期依存的に増加することを証明している。一方、典型的にG1/S期の細胞を遮断するフラボピリドール(Carlsonら、(1996) Cancer Res. 56: 2973-2978)などの薬剤で処理した細胞はサバイビンタンパク質の豊富な量を変更しなかった。図2Bに示すウェスタンブロットは、ノカドゾール処理(10μM、24時間)および未処理のTC620細胞、MSN細胞およびジャーカット細胞から総タンパク質を単離することによって調製した。各レーンは、タンパク質が75μgであった。
【００５４】
サバイビンの阻害が神経系腫瘍の細胞死を誘導するのに十分であるかどうかを判定するために、サバイビン遺伝子の11個のアンチセンスオリゴヌクレオチドをMSNおよびTC620細胞系において分析した。サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列を配列番号：1〜11として表1に示す。上記のように、本発明のオリゴヌクレオチドは、サバイビンの少なくとも一部をコードするmRNAの領域と相補的である。サバイビンmRNAの配列は既知である(GenBankアクセッション番号U75285)。本発明のオリゴヌクレオチドは、AgrawalおよびKandimalla(2000) Mol. Med. Today 6: 72-81に記載されている選択基準に基づいて設計した。
【００５５】
いくつかの例において、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10および11からなる群から選択される核酸配列を有する。他の例において、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10および11からなる群から選択される核酸配列と少なくとも85%同一である核酸配列を有する。本明細書において使用する、基準核酸配列と所定のパーセントの同一性を有する核酸配列は、ヌクレオシドの数が基準配列と同じであるが、1つまたは複数のヌクレオシド置換、最も頻繁には保存的改変が生じている核酸配列である。いくつかの例において、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10および11からなる群から選択される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列を有する。他の例において、同一率は少なくとも93%であり、例えば、配列番号：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10および11からなる群から選択される核酸配列と少なくとも95%同一である。さらに他の例において、同一率は少なくとも97%であり、配列番号：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10および11からなる群から選択される核酸配列と、例えば少なくとも98%、または少なくとも95%同一である。
【００５６】
【表１】
2005503807.tif 000002
【００５７】
表1に上記するように、異なる領域のサバイビンmRNAに対する11個のオリゴヌクレオチド（その全てが20-merホスホロチオエートサバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチドである）を設計し、配列番号：1〜11として配列リストに記載する。また、対照として使用するために、サバイビンmRNAに相補的でない2つのミスマッチオリゴヌクレオチドも設計し、配列番号：12および13として配列リストに記載している。
【００５８】
6つのサバイビン(900〜906)アンチセンスオリゴヌクレオチド400 nMをリポフェクチンの存在下においてMSN細胞に48時間投与した。各レーンのタンパク質は、100μgであった。32.9 kDでブロットを切り出し、下層部をサバイビンポリクローナル抗体(1:500)と共にインキュベーションし、一方で先端部をβ-チューブリンと共にインキュベーションした。サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド処理では、リポフェクチンと比較したときのβ-チューブリンによるサバイビンタンパク質の割合は900で77.7%、901で38.3%、903で24.3%、904で35.7%、905で55.6%、906で26.9%であった。
【００５９】
図3Aに示すように、アンチセンスオリゴヌクレオチド903、904および906(400 nM)は、デンシトメトリーによるβ-チューブリンへの正規化により、リポフェクチン処理した対照と比較して、MSN細胞におけるサバイビンタンパク質レベルを低下させる際に、それぞれ76%、64%および73%と最も効果的であった。
【００６０】
サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド903はサバイビンタンパク質レベルを76%低下したので、サバイビンタンパク質レベルに対する903の用量依存性をさらに検討した。予測されるように、ミスマッチオリゴヌクレオチドは、サバイビンの相対的な量に影響を与えなかった。図3Bに示すように、サバイビンタンパク質の濃度依存的な減少はアンチセンスオリゴヌクレオチド903で48時間処理後のMSN細胞において観察された。サバイビンの51%低下は200 nMにおいて観察された。リポフェクチンの存在下において、50 nM〜200 nMのサバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド903をMSN細胞に48時間投与した。レーンあたり総タンパク質(100μg)をロードした。サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド903処理では、リポフェクチンと比較したときのβ-チューブリンによるサバイビンタンパク質の割合は、50 nMで83.9%、75 nMで62.6%、100 nMで95.6%、200 nMで48.5%であった。
【００６１】
アンチセンスオリゴヌクレオチド904も、濃度依存的にサバイビンタンパク質レベルを低下する際に有効であったが、ミスマッチオリゴヌクレオチド1132は影響を示さなかった。100 nMアンチセンスオリゴヌクレオチド濃度を使用した他の実験では、図3Bに示すサバイビンタンパク質レベルの大きな低下が観察された。
【００６２】
サバイビンのダウンレギュレーションがMSN細胞において細胞死を誘導するのに十分であるかどうかを検討することによって、アポトーシスの阻害剤としておよび腫瘍のサバイビンタンパク質としての役割を検討した。リポフェクチンによるトランスフェクション後、異なる濃度のサバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド904(200 nM、400 nM、600 nM)またはミスマッチオリゴヌクレオチド1132(400 nMおよび600 nM)、トリパンブルー陽性細胞の数(死細胞だけがトリパンブルーによって染色される)を処理の48時間後に計数した。死細胞の数を、リポフェクチン処理した対照細胞と比較して評価した。200 nM、400 nMおよび600 nM濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチド904の存在下において、トリパンブルー陽性である細胞の割合は、それぞれ、52%、59%および62%であった(図4A)。ミスマッチオリゴヌクレオチド1132(400 nMおよび600 nM)はリポフェクチン対照処理とほぼ同じで、細胞の23%(400 nM)および22%(600 nM)がトリパンブルー陽性であった。未処理対照細胞の約6%がトリパンブルー陽性であった。
【００６３】
別の実験において、リポフェクチンによるトランスフェクション後、ミスマッチオリゴヌクレオチド1132(600 nM)またはサバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド904もしくは906(600 nM)、トリパンブルー陽性細胞の数(死細胞)を処理の48時間後に計数した。600 nMのサバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド904および906の存在下において、トリパンブルー陽性である細胞の割合は、それぞれ、73%および81%であった(図4B)。リポフェクチンまたはミスマッチオリゴヌクレオチド1132による処理の結果、わずか7%〜11%の細胞がトリパンブルー陽性であった。
【００６４】
上記データは、アンチセンスオリゴヌクレオチド処理後のサバイビンの阻害は、MSN細胞において細胞死を誘導するのに十分であることを証明している。
【００６５】
図4Cは、400 nMおよび600 nMのサバイビンアンチセンス処理はサバイビンタンパク質レベルを低下したが、ミスマッチオリゴヌクレオチド1132はサバイビンタンパク質レベルを変更しなかったことを証明している。サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド904はサバイビンタンパク質レベルを46%および60%低下したが、ミスマッチオリゴヌクレオチド1132と共にインキュベーションした細胞ではサバイビンレベルは変化しなかった。MSN細胞をリポフェクチン、400 nMおよび600 nMのサバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド904もしくは908または400 nM濃度のミスマッチオリゴヌクレオチドで処理した。総タンパク質(100 μg)をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離して、ニトロセルロース支持体に移した。32.9 kDでブロットを切り出し、下層をサバイビンポリクローナル抗体(1:500)と共にインキュベーションしたが、先端のブロットをチューブリンと共にインキュベーションした。
【００６６】
ヒト乏突起神経膠腫(TC620)細胞におけるアポトーシス性細胞死を誘導する能力について、配列番号：1〜11を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを評価した。アンチセンスオリゴヌクレオチド904でTC620細胞をトランスフェクションすると、サバイビンタンパク質レベルの顕著な濃度依存的減少を誘導することが観察された。図5Aに示すように、400 nMの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチド904では、リポフェクチン処理した細胞と比較してサバイビンタンパク質量は54%低下した。
【００６７】
低密度TC620乏突起神経膠腫細胞を、リポフェクチンまたは濃度を増加させたサバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド904(25 nM〜400 nM)でトランスフェクトした。レーンあたり75μgの総タンパク質をロードした。32.9 kDでブロットを切り出し、下層をサバイビンポリクローナル抗体(1:500)と共にインキュベーションし、一方で先端部をβ-チューブリンモノクローナル抗体(1:1000)と共にインキュベーションした。サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド904により処理では、リポフェクチンと比較したときのβ-チューブリンによるサバイビンタンパク質の割合は、25 nMで109.1%、50 nMで97.4%、100 nMで67.6%、200 nMで45.2%、400 nMで45.7%であった。
【００６８】
TC620細胞におけるサバイビンタンパク質レベルの低下がカスパーゼ依存的アポトーシス性細胞死に関連するかどうかを判定するために、種々の濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチド904でトランスフェクション後にイムノブロットすることによって、PARP(ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ)(Pharmingen、カリフォルニア州サンディエゴ)切断を検討した。当業者によって評価されているように、PARPはカスパーゼ-3の基質であり、リボシル化タンパク質のウェスタンブロット分析の陽性対照として有用な酵素である。レーンあたり75μgの総タンパク質をロードした。ゲル電気泳動し、ニトロセルロースに移した後、ブロットをPARPモノクローナル抗体(1:500)と共にインキュベーションし、化学発光の増加によって可視化した。
【００６９】
図5Bに示すように、アンチセンス処理はPARP切断を誘導し、アポトーシスの特徴である85 kDの断片を形成した。また、100 nM〜400 nMの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチド904では、116 kD PARPタンパク質の劇的な減少が検出され、リポフェクチン処理した細胞および未処理の細胞において見られる切断断片と比較して85 kDの切断断片の存在が増加した。リポフェクチン処理した細胞および未処理の細胞におけるPARP切断は、サバイビンアンチセンス処理以前のTC620細胞における基底レベルの自発的アポトーシス(Yangら、(2000) Science 288: 874-877)を反映した。これらの実験は、アンチセンスオリゴヌクレオチド処理によるサバイビン発現の阻害はアポトーシス性細胞死を誘導するのに十分であることを証明している。
【００７０】
トリパンブルー保持アッセイの結果により、サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド904が、48時間の処理後トリパンブルー陽性(死)細胞における濃度依存的な増加を誘導することが確認された(図6A)。100 nM、200 nMおよび400 nMでは、細胞死の割合は、それぞれ、28%、36%および62%であった。200 nM(8%)および400 nM(7.5%)ミスマッチオリゴヌクレオチド1132で処理したトリパンブルー陽性細胞の割合は、リポフェクチン対照(6%)とほぼ同じであった。細胞をリポフェクチン、100 nM、200 nMもしくは400 nMのサバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド904または200 nMもしくは400 nMのミスマッチオリゴヌクレオチド1132で処理した。処理の48時間後に細胞を回収し、図4について記載するように、0.04%トリパンブルーで染色した。
【００７１】
サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチドによるTC620細胞の処理によって誘導される細胞死がカスパーゼ依存的機序によって生じるかどうかをさらに検討するために、別の実験を実施して、カスパーゼ阻害剤が細胞死に対して与える影響を検討した。図6Bに示すように、600 nMのサバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド904または906で処理したトリパンブルー陽性細胞の割合は、それぞれ、70%および67%であった。カスパーゼ阻害剤z-Val-Ala-Asp(Ome)-フルオロメチルケトン(zVAD-fmk)は、サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド処理によって誘導されたトリパンブルー陽性細胞の数を11%および15%まで効果的に減少し、サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド処理したTC620細胞におけるアポトーシス性細胞死のカスパーゼ依存的機序をさらに裏付けている。TC620細胞を、リポフェクチンまたは600 nMのサバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド904、906またはミスマッチオリゴヌクレオチド1132で単独処理または20μM  zVAD-fmkと同時処理した。
【００７２】
サバイビンのダウンレギュレーションがアポトーシスを誘導したというPARPデータ結果を確認するために、TUNELアッセイを実施した。TUNEL反応は、鎖の切断部にフルオレセインdUTPを付加することによって、アポトーシス中に形成される切断されたゲノムDNAを優先的に標識する。リポフェクチン、ミスマッチオリゴヌクレオチド1132およびサバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド処理したTC620細胞にTUNELアッセイを実施した。400 nM濃度のサバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド904または906で処理したTUNEL陽性細胞の割合は、それぞれ、52%および54%であった。600 nMでは、サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド904処理したTC620細胞および906処理したTC620細胞の63%がTUNEL陽性であった。リポフェクチンまたはミスマッチオリゴヌクレオチド1132の存在下では4%の細胞だけがTUNEL陽性であった。
【００７３】
サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチドによるTC620細胞の処理によって生じる核形態の変化を調査するために、ヨウ化プロピジウム(PI)染色を実施した。PI染色は、サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド処理後のTC620細胞の異常な核形態を証明している。TC620細胞をリポフェクチン(図7A)または600 nMのミスマッチオリゴヌクレオチド1132(図7B)、サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド904(図7Cおよび図7E)もしくは906(図7D)で処理し、PI染色した。600 nMのサバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド904、906またはミスマッチオリゴヌクレオチド1132を単独またはzVAD-fmkの存在下において処理したTC620細胞の定量結果を図8A〜図8Bに示す。分裂中期の細胞は、分裂中期プレートに割り付けられた染色体を有するものとして同定された。
【００７４】
リポフェクチン処理したまたはミスマッチオリゴヌクレオチド1132処理したTC620細胞のPI染色は、正常な核形態を示し(図7Aおよび図7B)、アポトーシス細胞(2%)または異常核を有する細胞(1%、図8A)はごく少数であった。一方、サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド処理したTC620細胞の40%〜43%は、アポトーシス性細胞死の特徴であるクロマチンの断片化およびアポトーシス体を有する核を明らかにした(図7C、矢印；図8A)。また、サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド処理した細胞の9%は、多数の多葉性の（multilobed）核を示した(図7Dおよび図7E、矢印；図8A)。このように、サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド処理したTC620細胞の49%〜52%は異常な核を有した。サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびzVAD-fmkによる同時処理は、アポトーシスおよび異常な核形態を劇的に阻害し(図8A)、サバイビンのダウンレギュレーションがカスパーゼ活性化およびアポトーシスを生じることを示している。
【００７５】
総合すると、85kDaのPARP切断産物、アポトーシス体のPI染色、細胞死のzVAD-fmk阻害およびアポトーシス細胞のTUNEL染色に関する結果により、サバイビンがダウンレギュレーションされたTC620細胞においてアポトーシス性細胞死が確立された。
【００７６】
サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチドとカスパーゼ阻害剤zVAD-fmkの同時投与により、40%を上回る数の異常核が2%まで減少した(図8A)。サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド＋zVAD-fmkで処理した細胞の顕微鏡評価は、サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド904または906単独で処理した細胞と比較して、分裂中期の細胞の数が約2倍増加することを証明した(図8B)。リポフェクチンおよびミスマッチ1132の存在下におけるzVAD-fmkは分裂中期の細胞数に影響を与えなかった。これは、サバイビンの非存在下では、サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド処理したTC620細胞は正常な有糸分裂周期を完了することができず、分裂中期で停止し、その後有糸分裂カタストロフィーの結果としてアポトーシスを受けることを示唆している。これらの結果は、有糸分裂の調整と、腫瘍の生存と細胞死の相互作用を裏付けている。
【００７７】
サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチドによるMSN細胞死がカスパーゼ-3活性化によって仲介されるかどうかを判定するために、サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド処理後にPARPが切断されるかどうかを検討するための検討を実施した。PARP特異抗体によるMSNタンパク質ホモジネートのイムノブロットでは、サバイビンアンチセンス処理後のPARP切断を検出できなかった。PARP切断が検出されなかったので、サバイビンアンチセンス処理した細胞は任意の活性なカスパーゼ-3を有するかどうかを判定するためのさらに別の試験を実施した。
【００７８】
MSN細胞がスタウロスポリン処理後にカスパーゼ-3を活性化することおよび、カスパーゼ-3が活性化されるとPARPが切断されることを、以前の検討は証明している。以下の表2に示すように、スタウロスポリンによるMSN細胞の処理の結果、カスパーゼ-3活性の7倍を超える増加が観察されたが、サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド903もしくは904(400 nM)またはミスマッチオリゴヌクレオチド1132を48時間トランスフェクトしたMSN細胞はカスパーゼ-3活性の有意な増加を示さなかった。
【００７９】
【表２】
2005503807.tif 000003
bSD=標準偏差。全ての値は3つ組でアッセイした。
【００８０】
サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド処理後のMSN細胞では、116 kDのPARPタンパク質のシングルバンドは切断されなかったことを示すイムノブロット試験の結果と、表2のデータは一致している。
【００８１】
さらに別の実験を実施して、サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチドによって誘導される細胞死は、広域スペクトルのカスパーゼ阻害剤zVAD-fmkによって遮断される可能性があるかどうかを調査した。MSN細胞を、リポフェクチンまたは600 nMのサバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド904、906またはミスマッチオリゴヌクレオチド1132で48時間単独処理するかまたは20μMのzVAD-fmkと共に48時間同時処理し、0.04%トリパンブルーで染色した。図4Bに示すように、サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド904または906による処理により、トリパンブルー陽性細胞は、それぞれ、73%および81%となった。サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド904または906をzVAD-fmkと共にインキュベーションすると、細胞の、それぞれ、73%および74%がトリパンブルー陽性を示し、阻害性のカスパーゼは細胞死に影響しなかったことを示している。
【００８２】
総合すると、サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド処理が、MSN細胞においてカスパーゼ非依存的に細胞死を誘導することが、カスパーゼ-3、PARPおよびzVAD-fmk実験データにより示唆される。
【００８３】
ヨウ化プロピジウム(PI)染色および位相顕微鏡を使用して、サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド処理したMSN細胞の核形態を評価した。MSN細胞をリポフェクチン(図9A)または600 nMのミスマッチオリゴヌクレオチド1132(図9B)またはサバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド904(図9Cおよび図9E)もしくは906(図9D)で処理し、PIで染色した。サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチドとカスパーゼ阻害剤zVAD-fmkの同時投与の核形態に対する影響を評価するために、MSN細胞を600 nMのサバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド904、906またはミスマッチオリゴヌクレオチド1132で単独または20μMのzVAD-fmkの存在下において処理し、PIで染色した(図9G)。
【００８４】
リポフェクチン処理またはミスマッチオリゴヌクレオチド1132処理した細胞は正常な核形態を示し(図9Aおよび図9B)、任意の所定の経過時間時にMSN細胞の約5%が異常な核を示した本発明者らの以前の観察と一致していた。一方、サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド処理した細胞のPI染色は、核膜が再会合する際に細胞分裂が遮断された細胞に一致する、多数の多葉性の核(図9Cおよび図9E、矢印)および異常に巨大な核(図9D)を含む異常な形態の核の劇的な増加を明らかにした。サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド904および906による処理後の定量により、異常な核形態を有する細胞の割合は、それぞれ、27%および31%であると測定されたが、この割合は、サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびzVAD-fmkで同時処理した細胞においても変更されなかった(図9G)。サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド処理した細胞ではアポトーシス体またはクロマチン断片化は観察されなかったが、サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド処理した細胞の22%は、部分的に凝縮したクロマチンを有する核を有し(図9E、矢印の先、図9G)、この割合はzVAD-fmk処理により変わらなかった。このように、サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド処理した細胞の約50%は異常な核および凝縮されたクロマチンを有した。部分的に凝縮されたクロマチンは壊死性細胞死に一致せず、アポトーシス性細胞死を受けたが、完了していない細胞を示している。サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド処理したMSN細胞における細胞死の割合はzVAD-fmkの存在下において変化しなかったという観察(図4Bおよび図9G)はカスパーゼ-3がサバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド処理の結果活性化されず、細胞死がカスパーゼ非依存的機序で生じたことをさらに裏付けている。
【００８５】
これらのデータにより、アポトーシス性細胞体および細胞の凝縮はカスパーゼの活性化を必要とすることが示されている。実験結果は、長期(?72時間)サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド曝露の際でも、既存の表現型はカスパーゼ非依存的であることを示している。カスパーゼ非依存的機序による細胞死を受ける細胞では、ミトコンドリアからチトクロームCが放出される前にアポトーシス誘導因子(AIF)がミトコンドリアから核に転位され、同時に部分的なクロマチン凝縮が観察される(Daugasら(2000) FASEB J. 14: 729-739)。
【００８６】
サバイビンのダウンレギュレーションがAIF核転位を誘導するかどうかを調査するために、リポフェクチン(図9H)または600 nMのサバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド904(図9I)、ミスマッチオリゴヌクレオチド1132(図9J)またはサバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド906(図9K)で処理したMSN細胞にAIFおよびDAPI二重標識を実施した。図9Hおよび図9Jに示すように、リポフェクチン処理細胞およびミスマッチオリゴヌクレオチド1132処理細胞は細胞質ゾルの顕著なAIF染色を示す。細胞の4〜8%だけがAIFの核局在化を有し、DAPI染色は、細胞の95%が正常に見える核を有することを示した。
【００８７】
一方、サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド904処理したおよび906処理した細胞の45〜51%はAIF核転位を示した(図9Iおよび図9K)。これらのサバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド処理した細胞の37%は部分的に凝縮したクロマチンを有し、25%は、図9GにおけるPI染色と同様の異常な核を有することが、DAPI染色により示された。高い程度に凝縮したアポトーシス体、AIFの核転位並びにPIおよびDAPIによる核の形態的な外観が見られないのは、カスパーゼ非依存的機序による細胞死を受ける細胞に一致している。このように、PI、DAPIおよびAIFデータを組み合わせたものは、有糸分裂カタストロフィーのような細胞周期の崩壊を生じ、細胞死を生じるサバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド処理に一致している。
【００８８】
MSN細胞の処理後のカスパーゼ-3の不活性化およびPARP切断の見られないことを評価するために、他の実験を実施した。サバイビンアンチセンス処理中にアポトーシス阻害剤(IAP)ファミリーの別のメンバーのタンパク質が活性化され、PARP切断を効果的に遮断すると仮定した。従って、MSNおよびTC620細胞においてサバイビンアンチセンス処理後イムノブロットすることによって、IAPファミリーの別のメンバーであるXIAPを調査した。
【００８９】
MSN細胞をリポフェクチンまたは400 nMのサバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド900、901、903、904、905および906で処理した。処理の48時間後に総タンパク質を単離し、レーンあたり100μgのタンパク質をロードした。ブロットを、XIAPに対するモノクローナル抗体(1:1000、IgG1)と共にインキュベーションした。可視化は、化学発光の増強(ECL)によった。ロード量が等しいことを確認するために、ブロットを帯状にし、ECLに再度曝露して、抗体が除去されたことを確認し、β-チューブリンモノクローナル抗体(1:1000)と共にインキュベーションした。実験は2回実施した。サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド処理の場合には、リポフェクチンと比較したときのβ-チューブリンによるXIAPタンパク質の変化の倍率は、900で2.3、901で3.9、903で5.2、904で8.0、905で7.6、906で8.3であった。
【００９０】
TC620乏突起神経膠腫細胞にリポフェクチンまたは濃度を増加させたサバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド904(25 nM〜400 nM)をトランスフェクトした。48時間の処理後総タンパク質を単離し、レーンあたり75μgの総タンパク質をロードした。実験は1回実施した。サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド904による処理の結果、リポフェクチンと比較してβ-チューブリンによるXIAPタンパク質の変化の倍率は、25 nMで1.3、50 nMで1.0、100 nMで0.71、200 nMで0.67、400 nMで0.66であった。
【００９１】
図10Aに示すように、サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド904による処理の48時間後のMSN細胞においてXIAPが8倍増加したのが観察されたが、リポフェクチン処理したMSN細胞のXIAPレベルは低かった。TC620細胞では、サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド904による処理は、リポフェクチン処理と比較してXIAPタンパク質レベルのいかなる増加も誘導しないが、アポトーシスは生じた(図10B)。
【００９２】
図10Bに示す結果により、MSN細胞において観察されたXIAPの増加はカスパーゼ-3活性の阻害の原因となることが示唆される。細胞死のカスパーゼ-3依存的機序がサバイビンアンチセンス処理したTC620細胞において生じるが、MSN細胞では、サバイビンの阻害によりカスパーゼ-3非依存的機序による細胞死が生じることをそれらはさらに示唆している。
【００９３】
G2/M期遮断剤によるMSN神経芽細胞種細胞またはTC620乏突起神経膠腫細胞の処理は、G2/Mチェックポイントを通過して有糸分裂に至る腫瘍細胞の移行を促進するサバイビンの作用を示すサバイビンタンパク質レベルのアップレギュレーションを示したことを、上記の結果は示している。静止期ではサバイビンは紡錘形の中心小体周辺のγ-チューブリンに結合するが、分裂中期および後期では、サバイビンは有糸分裂紡錘体の微小管に結合する(Liら(1998) Nature 396: 580-584)。サバイビンが細胞周期の移行および有糸分裂の進行を調節する正確な機序は現時点では不明であるが、サバイビンの発現は、おそらく、細胞周期を介して腫瘍細胞の進行を増強する機能を果たす。
【００９４】
サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド処理により、MSN神経芽細胞種およびTC620乏突起神経膠腫細胞系の細胞死を生ずるが、細胞死の経路は顕著に異なることが示された。以前には、48〜64時間のサバイビン阻害はHeLa細胞(Liら(1999) Nat. Cell. Biol. 1: 461-466)および肺腺癌細胞(Olieら(2000) Cancer. Res. 60: 2805-2809)における活性カスパーゼ-3を増加することが示されている。しかし、MSN細胞では、アンチセンスオリゴヌクレオチド903および904は、カスパーゼ-3を活性化またはカスパーゼ-3基質であるPARPを切断せず、これらの細胞は、カスパーゼ-3活性化に依存しない経路による細胞死を受けることを示唆している。この理論に縛られるわけではないが、MSN細胞は、他のカスパーゼ-3結合タンパク質の活性化によりカスパーゼ-3活性化を抑制したと考えられる。この所見は、タンパク質IAPファミリーの他のメンバー(XIAP、c-IAP-1およびc-IAP-2)はカスパーゼと直接相互作用して、基質を切断する作用を阻害する作用を有することを証明している最近の検討により、裏付けられる(Deverauxら(1997) Nature 388: 300-304；Royら(1997) EMBO J. 16:6914-6925)。
【００９５】
この理論を試験するために、別のIAPファミリーのタンパク質であるXIAPを検討し、サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチドによるMSN細胞の処理にはXIAPの劇的な増加を伴うことが明らかにされた。MSN細胞は、他のIAPファミリーメンバーをアップレギュレーションして、サバイビンのような主要な抗アポトーシスタンパク質の減少または欠損を補償する能力を有することがこれにより示唆される。MSN細胞が依然として細胞死を受けたという事実は、サバイビンは細胞において2つ以上の機能を有し、考えられるカスパーゼ-3の阻害はMSN細胞ではサバイビンの機能的な役割を抑えることができないことを示している。
【００９６】
神経芽細胞腫細胞系とは異なり、乏突起神経膠腫細胞系TC620は、PARP切断によって評価したとき、カスパーゼ-3依存的アポトーシス細胞死を受けた。濃度を増加させたサバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド904によるTC620細胞の処理は、116 kDのカスパーゼ-3基質PARPを切断し、85 kDの切断断片を生じた。サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチドによるTC620細胞の処理はXIAPを変更せず、TC620細胞はカスパーゼ-3依存的に細胞死を受けつづけた。このように、これらの結果は、サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチドによるサバイビン発現の阻害は、神経芽細胞腫および乏突起神経膠腫細胞系において細胞死を明らかに誘導したことを示した。
【００９７】
しかし、サバイビン発現阻害の結果として生じるカスパーゼ活性化の誘導または阻害は、他のIAPファミリーメンバー、特にXIAPのレベルを調節および変更する各細胞種の能力が条件となると思われる。これは、サバイビンはインビトロにおいてIAP阻害タンパク質Smac/DIABLOに定量的に結合する(Duら(2000) Cell 102: 33-42)という観察を一部支持しており、他のIAPファミリーのタンパク質をタンパク質の拘束から遊離することによって間接的にカスパーゼを抑制する可能性を生じている。
【００９８】
任意の特定の理論に縛られる訳ではないが、本明細書に記載されている検討は、サバイビンは細胞分割において主に機能することを示唆している。細胞周期の進行は普遍的であるので、サバイビンの発現は検討した全ての神経腫瘍細胞において観察されたことはこの理論に一致する。サバイビンヌルマウスは胚形成期に死亡し、倍数体であり、細胞分裂の役割に一致する微小管が破壊されている(Urenら(2000) Curr. Biol. 10: 1319-1328)。染色体数または倍数性の制御に関与するタンパク質は、プログラムされた細胞死の調節に関係しており、サバイビンは、正常な細胞分裂および生存の助力となるBIRドメインを介するIAP機能を形成した可能性がある。腫瘍細胞では、細胞死のプログラムはランダム突然変異および選択の過程によって損傷および異常に調節されることが多く、生存し、増殖する能力を改善する突然変異を蓄積するとき、ますます悪性になる。このように、細胞分裂におけるサバイビンの役割は腫瘍細胞によって選出されて生存の助力となると思われる。
【００９９】
本発明のサバイビン特異的合成オリゴヌクレオチドは、本発明が提供する種々の方法に有用である。本発明は、サバイビンを発現する癌細胞においてアポトーシスを増強する方法を提供する。本発明はまた、上記のように、本発明のオリゴヌクレオチドを細胞に接触させる段階を含む、機能的なサバイビンを発現する細胞においてサバイビンの合成を阻害する方法も提供する。さらに、本発明はまた、上記のように、本発明のオリゴヌクレオチドを細胞に接触させる段階を含む、サバイビンを発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する方法も提供する。いくつかの態様において、腫瘍細胞は、脳腫瘍細胞などの神経系の癌細胞である。
【０１００】
これらの方法において、本発明の合成オリゴヌクレオチドを癌細胞に接触させる。これらの合成オリゴヌクレオチドは、サバイビンタンパク質をコードする核酸に相補的である。いくつかの態様において、合成オリゴヌクレオチドは、配列番号：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10および11からなる群から選択される核酸配列を有する。他の例において、合成オリゴヌクレオチドは、配列番号：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10および11からなる群から選択される核酸配列と少なくとも85%同一である核酸配列を有する。さらに他の例において、同一性の割合は少なくとも90%であり、例えば、配列番号：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10および11からなる群から選択される核酸配列と少なくとも93%または少なくとも95%同一である。さらに他の例において、同一性の割合は少なくとも97%であり、例えば、配列番号：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10および11からなる群から選択される核酸配列と少なくとも98%または少なくとも99%同一である。
【０１０１】
このような方法において、本発明の合成オリゴヌクレオチドは、単離され、例えば、転写および／または翻訳を阻害することによって、コードされたサバイビンタンパク質の発現を阻害するために、細胞条件において細胞のサバイビンmRNAと特異的にハイブリダイゼーションする「アンチセンス」オリゴヌクレオチドである。一般に、結合は、従来の塩基対相補性によるものであってもまたは例えば、DNA２本鎖との結合の場合には、2本鎖の主要な溝における特異的な相互作用を介してもよい。一般に、アンチセンスオリゴヌクレオチドの用途は、当技術分野において一般に使用される技法の範囲をいい、オリゴヌクレオチド配列との特異的な結合を使用する任意の方法を含む。
【０１０２】
上記のように、アンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用する例示的な核酸分子はホスホロアミデート、ホスホロチオエートおよびDNAのメチルホスホネート類似体である。また、アンチセンス治療に有用なオリゴマーを構築する一般的な方法が、例えば、Van der  Krolら(1988) Biotechniques 6: 958-976およびSteinら(1988) Cancer Res. 48: 2659-2668によって概説されている。従って、本発明の修飾型オリゴマーは、治療、診断および研究に関連して有用である。
【０１０３】
また、本発明のオリゴヌクレオチドは、標的DNAまたはそれらが特異的に結合するRNA配列の有無を検出するための診断試薬として使用することができる。サバイビンタンパク質の発現をダウンレギュレーションすることによる本発明のアンチセンス構築物は、インビボおよびエクスビボ組織培養において組織を操作する際に使用することができる。
【０１０４】
本発明のアンチセンス構築物は、例えば、発現プラスミドとして送達され、細胞内で転写され、サバイビンタンパク質をコードする細胞mRNAの少なくとも独自の部分と相補的であるRNAを作製する。または、アンチセンス構築物は、エクスビボにおいて作製され、細胞に導入されると、サバイビンmRNAとハイブリダイゼーションすることによって発現の阻害を生ずるオリゴヌクレオチドプローブである。このようなオリゴヌクレオチドプローブは、いくつかの態様において、内因性ヌクレアーゼ、例えば、エキソヌクレアーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼに抵抗性であり、従ってインビボにおいて安定である修飾型オリゴヌクレオチドである。
【０１０５】
本発明のオリゴヌクレオチドは、治療用製剤の形態であるとき、疾患、障害および癌に関連する状態を治療する際にも有用である。このような方法では、サバイビンの発現を阻害する際に効果的な本発明の合成オリゴヌクレオチドの治療量を、いくつかの例では別の抗腫瘍剤と共に細胞に投与する。この細胞は細胞培養物もしくは組織培養物の一部であってもまたはヒトもしくは他の哺乳類などの動物の生体全体であってもよい。
【０１０６】
本発明の方法によって治療する対象の細胞が動物の生体内にある場合には、本発明のオリゴヌクレオチド(および、治療方法の一部である場合には、任意の追加の抗癌剤)を、治療組成物を薬学的に許容される担体に入れたものとして従来の手法によって投与する。例えば、ハリソンの内科学原理(Harrison's Principles of Internal Medicine)、第14版、McGraw-Hill、ニューヨーク(1998)86章にSlapakらによって記載されているように、シスプラチンおよびその類似体並びに他の白金化合物、タキソール、タキソテール、アドリアマイシン、カンプトサール(例えば、CPT-11)、C225、トポテカン、5-フルオロウラシルおよびそれぞれの類似体、および細胞毒を癌患者に投与することができる。
【０１０７】
担体の特徴は、以下に記載するように、投与経路に依存する。このような組成物は、合成オリゴヌクレオチドおよび担体以外に、稀釈剤、フィラー、塩、緩衝液、安定剤、溶解剤および当技術分野において既知の他の材料を含有してもよい。本発明の薬学的組成物はまた、サバイビン遺伝子もしくはmRNA発現の阻害を増強するまたは癌細胞の増殖を低下する他の作用因子または作用剤を含有してもよい。例えば、各々がサバイビン核酸の異なる領域に対する合成オリゴヌクレオチドの組み合わせを本発明の薬学的組成物に使用することができる。
【０１０８】
本発明の薬学的組成物は、さらに、アジドチミジン、ジデオキシシチジン、ジデオキシイノシン等などのヌクレオシド類似体を含有してもよい。本発明の合成オリゴヌクレオチドとの相乗作用を生じるためまたは本発明の合成オリゴヌクレオチドによって生じる副作用を最小にするために、このような追加の因子および／または薬剤を薬学的組成物に含ませてもよい。逆に、抗サバイビン遺伝子因子および／または薬剤の副作用を最小にするために特定の抗サバイビン遺伝子または遺伝子産物因子に本発明の合成オリゴヌクレオチドを含ませてもよい。
【０１０９】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される他の担体以外に、水性溶液で存在するミセル、不溶性単層、液晶またはラメラ層として凝集した形態で存在する脂質などの両親媒性薬剤と本発明の合成オリゴヌクレオチドを組み合わせたリポソームの形態であってもよい。リポソーム製剤に好適な脂質には、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸等が挙げられるが、これらに限定されない。特に有用な脂質担体はリポフェクチンである。このようなリポソーム製剤の調製は、例えば、米国特許第4,235,871号、同第4,501,728号、同第4,837,028号および同第4,737,323号に開示されているように当技術分野において既知である。本発明の製剤組成物は、さらに、ZhaoらAntisense Research & Development 5: 185-192(1995)に記載されている、オリゴヌクレオチドの細胞内への送達を増強するシクロデキストリン等または徐放性ポリマーなどの化合物を含んでもよい。
【０１１０】
本明細書において使用する「治療的に有効な量」とは、意味のある患者の利益を示す、すなわち、腫瘍サイズを低下するまたは腫瘍の増殖を阻害するまたは癌細胞の増殖速度を阻害するのに十分である、薬学的組成物または方法の各作用化合物の総量を意味する。個々の作用成分に適用すると、単独で投与するという用語はその成分単独をいう。併用投与に適用すると、この用語は、併用投与を連続または同時に行うかどうかにかかわらず、治療効果を生ずる作用成分の合わせた量をいう。「治療的に有効な量」および「治療的に有効な期間」という用語は、腫瘍の細胞増殖を減少するのに有効な用量および期間の既知の治療を示すために使用される。
【０１１１】
本発明の治療方法または使用方法を実施する際には、本発明の合成オリゴヌクレオチドの1つ、2つまたはそれ以上の治療的有効量を、癌に関連する疾患または障害に罹患している被験者に投与する。本発明の合成オリゴヌクレオチドは、単独で、または酸化剤または細胞毒および／または癌の他の既知の治療などであるが、これらに限定されない種々の抗癌剤と併用して、本発明の方法により投与することができる。1つまたは複数の他の治療と同時投与する場合には、本発明の合成オリゴヌクレオチドは、他の治療と同時または連続的に投与することができる。連続的に投与する場合には、他の治療と併用する際に本発明の合成オリゴヌクレオチドを投与する適当な順番を担当医が決定する。
【０１１２】
薬学的組成物に使用するまたは本発明の方法を実施するために使用する本発明の合成オリゴヌクレオチドの投与は、眼内投与、経口摂取、吸入または経皮、皮下、筋肉内もしくは静脈内注射などの種々の従来の方法で実施することができる。投与は、当業者によって決定される状態および応答に応じて、大量一回、間欠的または持続的であってもよい。上記の本発明の方法のいくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは局所(例えば、眼内または病巣内(interlesionally)および／または全身投与される。「局所投与」という用語は、生体の規定された部位または領域への送達をいうが、「全身投与」という用語は、経口摂取または筋肉内、静脈内、皮下もしくは腹腔内注射による生物全体への送達を含むことを意味する。
【０１１３】
本発明の合成オリゴヌクレオチドの治療的有効量を経口投与する場合には、合成オリゴヌクレオチドは錠剤、カプセル、粉末、溶液またはエリキシルの形態である。錠剤の形態で投与する場合には、本発明の薬学的組成物は、さらに、ゼラチンまたはアジュバントなどの固形担体を含有してもよい。錠剤、カプセルおよび粉末は約5%〜95%の合成オリゴヌクレオチドを含有し、いくつかの態様では、約25%〜90%の合成オリゴヌクレオチドを含有する。液体の形態で投与する場合には、水、石油、落花生油、鉱物油、ダイズ油、ゴマ油または合成油などの動物または植物起源の油などの液体担体を添加してもよい。液体の形態の薬学的組成物は、さらに、生理学的食塩液、デキストロースもしくは他の糖溶液またはエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなどのグリコールを含有してもよい。液体の形態で投与する場合には、薬学的組成物は約0.5重量%〜約90重量%の合成オリゴヌクレオチドを含有し、いくつかの態様では、約1重量%〜約50重量%の合成オリゴヌクレオチドを含有する。
【０１１４】
本発明の合成オリゴヌクレオチドの治療的有効量を静脈内、皮下、筋肉内、眼内または腹腔内注射によって投与する場合には、合成オリゴヌクレオチドは発熱物質を含有しない、非経口投与的に許容される水性溶液の形態で投与される。pHに関して、等張性、安定性等を有する非経口的に許容されるこのような溶液の調製は当技術分野の範囲内である。少なくともいくつかの態様において、静脈、皮下、筋肉内、腹腔内または眼内注射の薬学的組成物は、合成オリゴヌクレオチド以外に、塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液、デキストロース注射液、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射液、乳酸加リンゲル液などの等張基剤または当技術分野において基地の他の基剤を含む。本発明の薬学的組成物はまた、安定剤、保存剤、緩衝剤、抗酸化剤または当業者に既知の他の添加剤を含有してもよい。
【０１１５】
本発明の薬学的組成物における合成オリゴヌクレオチドの量は、治療対象の状態の性質および重症度並びに患者が受けた以前の治療の性質に依存する。最終的には、担当医が、個々の患者各々を治療する合成オリゴヌクレオチドの量を決定する。最初に、担当医は低用量の合成オリゴヌクレオチドを投与し、患者の応答を観察する。最適の治療効果がその患者で得られるまで高用量の合成オリゴヌクレオチドを投与し、その時点において用量をさらに増加しない。本発明の方法を実施するために使用する種々の薬学的組成物は、体重または臓器重量1kgあたり約10μg〜約20 mgの合成オリゴヌクレオチドを含有すべきであることが考慮される。
【０１１６】
本発明の薬学的組成物を使用する静脈内治療の期間は、治療対象の細胞増殖障害の重症度並びに個々の患者各々の状態および特異体質と思われる応答に応じて変わる。最終的には、担当医が、本発明の薬学的組成物を使用する適当な静脈治療期間を決定する。
【０１１７】
本発明のオリゴヌクレオチドを、全身的とは異なり局所領域的(例えば、腹腔内)に投与する場合には、正常組織の取り込みを少なくしなければならない。また、オリゴヌクレオチドをリポソームに封入し、リポソーム表面にタンパク質を挿入することによってこれらのリポソームを選択した組織に標的化する方法は今や既知である。
【０１１８】
本明細書に記載されている遺伝子および分子生物学的技術の一般原理を記載している標準的な参照研究には、OttおよびHoh(2000) Am. J. Hum. Genet. 67: 289-294；Zubay G. (1987) Genetics (The Benjamin/Cummings Publishing Co.、Menlo Park、CA)；Ausubelら(1999) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons、ニューヨーク州ニューヨーク)；Sambrookら(1989) 分子クローニング：実験マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)、第2版(Cold Spring Harbor Laboratory Press、ニューヨーク州プレインビュー)；Kaufmanら編(1995) 生物学および医学における分子的および細胞的方法のハンドブック(Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine)(CRC Press、ロサンゼルス、ボカラトン)；およびMcPherson編(1991)定方向突然変異誘発：実践的方法(Directed Mutagenesis: A Practical Approach)(IRL Press、オックスフォード)が挙げられる。免疫学および炎症の一般原理を記載している標準的な参照研究には、Gallinら(1998) 炎症：基本原理および臨床関連(Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates)(Raven Press、ニューヨーク州ニューヨーク)；Kuby, J. (1997) 免疫学(Immunology)、第3版、(W. H. Freeman、ニューヨーク州ニューヨーク)；Coliganら編(1991) 免疫学の最新プロトコール(Current Protocols in Immunology)(John Wiley & Sons、ニューヨーク州ニューヨーク)；およびHurley(1983)急性炎症(Acute Inflammation)、第2版(Churchill Livingstone、ニューヨーク)が挙げられる。
【０１１９】
以下の実施例は本発明のある種の態様をさらに例示することを意図しており、本質を限定することを意図したものではない。当業者は、日常に使用する程度の実験を使用して、本明細書に記載されている特定の物質および手法との数多くの等価物を認識または確認することができる。このような等価物は、本発明の範囲内であると考えられ、以下の特許請求の範囲に含まれる。
【０１２０】
実施例
1. アンチセンスオリゴヌクレオチドの合成
以前に記載されている選択基準に基づいて、サバイビンmRNAを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド(GenBankアクセッション番号U75285)を設計した(AgrawalおよびKandimalla、Mol. Med. Today (2000) 6: 72-81)。ヒトサバイビンmRNAの異なる領域を標的とする20-merのホスホロチオエートまたは混合(mixed)骨格修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドの合成は、標準的な手法を使用して実施した(例えば、Agrawal (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 94: 2620-2625を参照されたい)。オリゴヌクレオチドの同一性および純度は、従来の31P核磁気共鳴、キャピラリーゲル電気泳動、ハイブリダイゼーション融点、A269およびMALDI/TOF質量スペクトル(mass ratio spectral)分析によって確認された(例えば、Agrawal(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 94: 2620-2625を参照されたい)。
【０１２１】
2. 細胞培養
ヒト神経芽細胞腫細胞系、MSN(Reynoldsら(1986) J. Natl. Cancer. Inst. 76: 375-387)を、23.8 mMの炭酸水素ナトリウム、10%ウシ胎仔血清、0.1 mM非必須アミノ酸(GIBCO、ニューヨーク州グランドアイランド)、0.47 mM L-セリンおよび0.38 mM L-アスパラギンを添加したRPMI 1640で増殖させた。米国カリフォルニアロサンゼルス大学のAnthony Campagnoni博士から入手した乏突起神経膠腫細胞系、HOGおよびTC620を、10%ウシ胎仔血清を添加したIscove培地(Fisher Scientific、ペンシルバニア州ピッツバーグ)で維持した。グリア芽細胞腫細胞系、ATCC番号HTB 14および神経膠星状細胞腫細胞系、ATCC番号HTB 17はAmerican Type Culture Collection、バージニア州マナサスから入手し、10%ウシ胎仔血清を添加したDMEMで維持した。サバイビンを発現することが以前に示されているジャーカット細胞(Marshall Horwitz博士、ニューヨーク州ブロンクス、アルバートアインシュタイン医科大学(Albert Einstein College of Medicine)から入手)はイムノブロットの陽性対照として使用した(Conwayら(2000) Blood 95: 1435-1442)。ジャーカット細胞は、10%ウシ胎仔血清を添加したRPMI 1640で増殖させた。細胞は、5%(HOG、TC620)または8%(MSN、ATCC第HTB 14号およびATCC第HTB 17号)CO2を含有する加湿雰囲気下で37℃において増殖させた。
【０１２２】
3. RNA単離およびノーザンブロット分析
TRI試薬を使用して、細胞系から総RNAを単離した(Molecular Research Center、オハイオ州シンシナティ)。ノーザンブロット分析は以前に記載されているように実施した(Shafit-Zagardoら(1988) J. Neurochem. 51: 1258-1266)。30μgの総RNAを含有するニトロセルロースブロットにヒトサバイビンcDNAまたは18 S RNAに対するcDNAをハイブリダイゼーションした。プローブは[α-32P]dCTPを使用して標識し、Multiprime DNA標識システム(Amersham、イリノイ州アーリントンハイツ)を使用した。
【０１２３】
4. ノカドゾール、タキソテールおよびビンブラスチン処理
G2/M期の細胞を遮断するために、MSN細胞またはTC620細胞を、10μMノカドゾール、1μMタキソテールまたは250 nMビンブラスチンで16時間処理して、総タンパク質ホモジネートを単離し、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)およびイムノブロット法によりタンパク質を調査した。
【０１２４】
5. オリゴヌクレオチドトランスフェクション
以前に記載されている選択基準に基づいて、サバイビン遺伝子の11の異なるアンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチド(GenBankアクセッション番号U75285)および2つのミスマッチホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを設計した(Agrawalら(2000) Mol. Med. Today 6: 72-81)。
【０１２５】
β-シアノエチルホスホロアミダイト化学を使用して自動DNA合成装置を用いてアンチセンスオリゴヌクレオチドを固相支持体で合成した。細胞ヌクレアーゼによるアンチセンスオリゴヌクレオチドの迅速な分解を防止するために、Becauge浸硫剤で酸化して、ホスホロチオエート骨格修飾オリゴヌクレオチドを得た。合成後、オリゴヌクレオチドを固相支持体から遊離させ、脱保護し、逆相HPLCで精製し、脱塩し、ろ過して凍結乾燥した。オリゴヌクレオチドの純度および配列の完全性が、キャピラリーゲル電気泳動およびMALDI-TOF質量スペクトル分析で確認され、濃度が260 nMであることが測定された。細胞を100 mmの培養皿で増殖させ、製造業者により、リポフェクチン(GIBCO)の存在下において低密度培養物にオリゴヌクレオチド処理を実施した。処理の48時間後に、総タンパク質ホモジネートを単離した。
【０１２６】
6. タンパク質調製およびイムノブロット法
以前に記載されている手法により、総タンパク質ホモジネートを調製した(Albalaら(1995) J. Neurochem. 64: 2480-2490)。Bio-Rad検出システム(Bio-Rad Laboratories、カリフォルニア州ハーキュリーズ)を使用して、タンパク質含量を測定した。10%ゲルのSDS-PAGEで等量のタンパク質を分析した(Laemmli(1970) Nature 227: 680-685)。電気泳動で分離したポリペプチドをニトロセルロースに移した(Towbinら(1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350-4354)。
【０１２７】
ヒトサバイビンはGST融合タンパク質として発現され、その後イムノブロット中の特異性を証明するためにサバイビンポリクローナル抗体を吸収するために使用された。10マイクログラムの融合タンパク質をサバイビン抗体(1:500)と共に4℃において2時間から一晩インキュベーションしてからイムノブロットした。イムノブロットは、通常、5%脱脂粉乳の1×TBS(0.14M NaCl、0.001 M Tris塩基、pH 7.4)溶液でブロックした。32.9 kDでブロットを切り出し、ブロットの下層部分をサバイビン抗体と共に4℃において一晩インキュベーションし、以前に記載されているように(Sharmaら、Cell. Motil. Cytoskeleton 27: 234-247)、化学発光の増強により可視化した(Enhanced Chemiluminescence、Amersham、イリノイ州アーリントンハイツ)。
【０１２８】
32.9 kDより大きいタンパク質を含有するブロットの先端部分は、チューブリン抗体と共に室温において2時間インキュベーションした。サバイビンポリクローナル抗体はR&D Systems, Inc.(ミネソタ州ミネアポリス)から購入した。第2抗体は同じ結果を生じた(Alpha Diagnostics International、テキサス州サンアントニオ)。一般的なβ-チューブリンモノクローナル抗体(TUB 2.1)はSIGMA(ミズーリ州セントルイス)から購入した。XIAP mAbはStressGen Biotechnologies Corp.(ビクトリア、カナダ)から購入した。ポリADPリボシルポリメラーゼ(PARP)mAbはPharMingen/Transductionから購入した。
【０１２９】
7. トリパンブルーアッセイ
サバイビンアンチセンス処理の48時間後に細胞を回収し、0.04%トリパンブルー(GIBCO)で染色し、血球計数器で計数した。各視野の総細胞数に対するトリパンブルー陽性細胞の数を入手し、データを、総細胞数に対する死細胞の割合として表した。個々の実験は3つ組で実施した。MSN細胞検討は3回実施したが、TC620細胞における検討は1回実施した。
【０１３０】
8. カスパーゼ-3活性のアッセイ
MSN細胞を、リポフェクチン、400 nMのサバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド903、904またはミスマッチオリゴヌクレオチド1132で48時間処理した。細胞ペレットを冷却したPBSで2回洗浄し、氷冷した低張細胞溶解緩衝液(25 mM HEPES、pH 7.5、5 mM MgCl2、5 mM EDTA、5 mM DTT、2 mM PMSF、10μg/mlペプスタチンA、10μg/ml ロイペプシン)に再懸濁させた。再懸濁させたペレットを氷上で20分間インキュベーションし、次に20秒間超音波処理した。溶解液を4℃において14,000 rpmで20分間遠心分離した。上清を保持し、上記のBio-Radタンパク質アッセイでタンパク質濃度を分析した。
【０１３１】
黒色不透明な96ウェルの平底プレート(Greiner Laboratories、USA Scientific Inc.、フロリダ州オーランド)を使用して、カスパーゼ-3阻害剤であるAc-DEVD-CHOの存在下および非存在下において、上清を3つ組でアッセイした。阻害剤の最終濃度が最終容量100μl中50μMとなるように、2μlのDMSOまたは2μlの2.5 mM Ac-DEVD-CHO(Pharmingen、カリフォルニア州サンディエゴ)のいずれかを添加したカスパーゼ-3アッセイ緩衝液(100 mM HEPES、pH 7.5、10%スクロース、0.1% CHAPSおよび10 mM DTT)中で50μg〜100μgの上清をインキュベーションした。次いで、これを30℃において30分間インキュベーションした。その後、2μlのカスパーゼ-3基質2.5mM Ac-DEVD-AMC(Pharmingen、カリフォルニア州サンディエゴ)(最終濃度50μM)を各ウェルに添加した。プレートを30℃において遮光下で60分間インキュベーションした。
【０１３２】
SOFTmax(登録商標)PROソフトウェアーを使用したSPECTRAmax GEMINIスペクトロフルオロメーター(Molecular Devices、カリフォルニア州サニーベイル)を使用して、励起波長355 nm、放射波長460 nm、カットオフフィルター455 nmにおいて、反応の蛍光を測定した。データは、平均相対蛍光単位/mgタンパク質±SDの比として表してある。全ての実験は、カスパーゼ-3活性を消失させたカスパーゼ-3阻害剤Ac-DEVD-CHOを含んだ。
【０１３３】
9. ヨウ化プロピジウム(PI)染色
サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド処理した細胞を4%パラホルムアルデヒドで室温において30分間固定し、1×TBSで洗浄し、0.1% Triton X-100で30分間透過処理し、10 μg/mlのDNaseを含有しないRNase A(Sigma)で60分間処理した。4℃において核を200μg/ml PIで30分間染色し、1×PBSで2回洗浄した。位相および落射蛍光光学を備えたOlympus 1×70倒立蛍光顕微鏡で核の形態を評価した。各処理について、2つ組で実施した15のランダムな40×対物視野上で約600の核を正常、凝縮(アポトーシス)または異常(多葉性の巨核)としてスコアリングした。定量結果は、2つ組で実施した2つの独立した実験で得られた平均±SEMである。
【０１３４】
10. TUNELアッセイ
インサイチュー細胞死検出キット、フルオレセイン(Roche Molecular Biochemicals、インディアナ州インディアナポリス)を使用して、サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド処理したTC620細胞においてアポトーシス性細胞死を評価するためにTUNELアッセイを実施した。TUNEL反応は、鎖の切断部位にフルオレセインdUTPを付加することによって、アポトーシス中に形成される切断ゲノムDNAを優先的に標識する。PI染色について記載したように、リポフェクチン、ミスマッチオリゴヌクレオチド1132またはサバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド処理したTC620細胞を固定し、透過処理した。細胞を洗浄し、製造業者の指示により調製したTUNEL反応混合物中で37℃において1時間インキュベーションした。標識溶液に末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを加えないものをTUNEL蛍光染色の陰性対照として使用した。細胞を2回洗浄し、DNA特異的色素DAPIで対比染色した(1mg/mlのストック液を1:1000で使用、室温において15分間)。細胞をOlympus 1×70倒立顕微鏡で調査した。各処理について、約1000個の細胞からなる15のランダムな40×対物視野を2つ組みのチャンバースライド上で調査した。TUNEL陽性核は、個々の視野あたりの総細胞数に対する割合として現した。
【０１３５】
11. アポトーシス誘導因子(AIF)の免疫染色および定量
PI染色について記載されているように、リポフェクチン、ミスマッチオリゴヌクレオチド1132またはサバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド処理したMSN細胞を固定し、透過処理して、5%脱脂粉乳の1×TBS溶液に10%正常ヤギ血清を添加したもので室温において1時間ブロックした。細胞をAIFポリクローナル抗体(1:100、Santa Cruz Biotechnology Inc.、カリフォルニア州サンタクルーズ)と共に4℃において一晩インキュベーションし、TRITCに結合したヤギ抗ウサギIgG(Southern Biotechnology Associates、アラバマ州バーミンガム)で示した。一次抗体がないことにより、免疫染色が特異的であることが確認された。細胞をDNA特異的色素DAPIで対比染色した(1mg/mlストック液を1:1000で使用、室温において15分)。細胞をOlympus 1×70倒立顕微鏡で調査した。12ビットPhotometrics冷却CCDカメラを使用して蛍光画像を採取した。各処理について、約600個の細胞からなる15のランダムな40×対物視野を調査した。TRITC(赤)およびDAPI(青)染色した細胞を、調査した総数に対してミトコンドリアまたは核にAIF染色を有するとスコアリングした。平行して、DAPI染色した核を、正常、凝縮または異常な核としてもスコアリングした。実験は2つ組で実施した。
【０１３６】
等価物
本発明が属する当技術分野の当業者に明らかであるように、本発明は、本発明の精神または本質的な特徴から逸脱することなく、上記に具体的に開示されているものとは異なる形態で具体化されてもよい。従って、上記の本発明の特定の態様は、例示的であるが、限定的でないと考慮されるべきである。本発明の範囲は、上記の説明に含まれる実施例に限定されるのではなく、添付の特許請求の範囲に記載されている
【図面の簡単な説明】
【０１３７】
【図１】図1Aは、5つの神経系の癌細胞系、MSN、HTB 14、HTB 17、TC 620およびHOGにおける1.9 kbサバイビン転写物の発現を示すノーザンブロットの図である。図1Bは、神経系の腫瘍細胞系MSN、HTB-14、HTB-17およびHOGにおける16.5kDサバイビンタンパク質の発現を示すウェスタンブロットの図である。
【図２】図2Aは、G2/M細胞周期チェックポイント遮断剤で処理したMSN細胞におけるサバイビン発現の増加を示すウェスタンブロットの図である。図2Bは、ノカドゾール(nocadozole)で処理したTC620乏突起神経膠腫細胞におけるサバイビン発現の増加を示すウェスタンブロットの図である。
【図３】図3Aは、6つの異なるサバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理したMSN癌細胞におけるサバイビンタンパク質レベルのダウンレギュレーションを示すウェスタンブロットの図である。図3Bは、サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド903で処理したMSN細胞におけるサバイビンタンパク質レベルの濃度依存的減少を示すウェスタンブロットの図である。
【図４】図4Aは、MSN細胞のサバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド904処理後の、トリパンブルー陽性細胞によって表した、細胞死の用量依存的増加を示すグラフ図である。図4Bは、サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド904または905を単独またはカスパーゼ阻害剤zVAD-fmkと併用してMSN細胞を処理した後の、トリパンブルー陽性細胞によって表した、細胞死の増加を示すグラフ図である。図4Cは、400 nMまたは600 nMサバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理したMSN細胞におけるサバイビン発現を示すウェスタンブロットの図である。
【図５】図5Aは、異なる濃度のサバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチドによる48時間の処理後のTC620癌細胞において発現されたサバイビンタンパク質の用量依存的減少を示すウェスタンブロットの図である。図5Bは、サバイビンアンチセンス処理後のTC620細胞におけるPARPの切断を示すウェスタンブロットの図である。
【図６】図6Aは、異なる濃度のサバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド904で処理したTC620細胞の細胞死の用量依存的増加を示すグラフ図である。図6Bは、サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド904または906単独によるTC620細胞の処理後の細胞死の増加、および、カスパーゼ阻害剤zVAD-fmkによる併用処理後のその後の細胞死の減少を示すグラフ図である。
【図７】図7Aは、リポフェクチンおよびPI染色による処理後のTC620細胞の核形態を示す顕微鏡写真の図である。図7Bは、600 nMのミスマッチオリゴヌクレオチド1132およびPI染色による処理後のTC620細胞の核形態を示す顕微鏡写真の図である。図7Cは、600 nMのアンチセンスオリゴヌクレオチド904およびPI染色による処理後のTC620細胞の核形態を示す顕微鏡写真の図である。矢印はアポトーシス核を指している。図7Dは、600 nMのアンチセンスオリゴヌクレオチド906およびPI染色による処理後のTC620細胞の核形態を示す顕微鏡写真の図である。矢印は、多葉性の（multilobed）異常な巨核を指している。図7Eは、600 nMのアンチセンスオリゴヌクレオチド904およびPI染色で処理後のTC620細胞の核形態を示す顕微鏡写真の図である。矢印は、多葉性の異常な巨核を指している。図7Fは、多葉性の異常核が個々の細胞内に存在することを示す、図7Eの位相顕微鏡写真の図である。矢印は、多葉性の異常な巨核を指している。
【図８】図8Aは、サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド904もしくは906単独によるまたはカスパーゼ阻害剤zVAD-fmkとの併用によるTC620細胞の処理後の核形態の変化を示すグラフの図である。図8Bは、サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド904または906単独によるおよびカスパーゼ阻害剤zVAD-fmkとの併用によるTC620細胞の処理後の中期の細胞数の増加を示すグラフの図である。
【図９】図9Aは、リポフェクチンおよびPI染色による処理後のMSN細胞の核形態を示す顕微鏡写真の図である。図9Bは、600 nMのミスマッチオリゴヌクレオチド1132およびPI染色による処理後のMSN細胞の核形態を示す顕微鏡写真の図である。図9Cは、600 nMのアンチセンスオリゴヌクレオチド904およびPI染色による処理後のMSN細胞の核形態を示す顕微鏡写真の図である。矢印は多葉性の多数の異常な核を指している。図9Dは、600 nMのアンチセンスオリゴヌクレオチド906およびPI染色による処理後のMSN細胞の核形態を示す顕微鏡写真の図である。矢印は、多葉性の多数の異常な核を指している。図9Eは、600 nMのアンチセンスオリゴヌクレオチド904およびPI染色による処理後のMSN細胞の核形態を示す顕微鏡写真の図である。矢印は、多葉性の多数の異常な核を指している。矢印の先端は、部分的に凝縮した核を指している。図9Fは、多葉性の異常な核が個々の細胞内に存在することを示す図7Eの位相顕微鏡写真の図である。矢印は、多葉性の多数の異常な核を指している。矢印の先端は、部分的に凝縮した核を差している。図9Gは、サバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド904もしくは906単独によるまたはカスパーゼ阻害剤zVAD-fmkとの併用によるMSN細胞の治療後の核形態の変化を示すグラフの図である。図9Hは、リポフェクチンで処理し、かつアポトーシス誘導因子(AIF)およびDAPIで二重標識したMSN細胞を示す顕微鏡写真の図である。図9Iは、600 nMのサバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド904で処理し、かつAIFおよびDAPIで二重標識したMSN細胞におけるAIFの核転座を示す顕微鏡写真の図である。図9Jは、600 nMのミスマッチオリゴヌクレオチド1132で処理し、かつAIFおよびDAPIで二重染色したMSN細胞を示す顕微鏡写真の図である。図9Kは、600 nMのサバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド906で処理し、かつAIFおよびDAPIで二重染色したMSN細胞のAIFにおける核転座を示す顕微鏡写真の図である。スケールバーは20μmを示す。
【図１０】図10Aは、異なるサバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処理後のMSN細胞におけるXIAPの発現増加を示すウェスタンブロットの図である。図10Bは、異なる濃度のサバイビンアンチセンスオリゴヌクレオチド904によるTC620乏突起神経膠腫細胞の処理後のXIAPの発現レベルの増加を示すウェスタンブロットの図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【図９Ｉ】
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【図９Ｊ】
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【図９Ｋ】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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