(57)【要約】本発明は、個体をイオン・チャネル疾患に罹り易くする遺伝的異常を同定する方法および材料を提供している。本発明は、関連するカリウムイオン・チャネル電流の伝導度の低下を引き起こすKCNQ1遺伝子おける4個の多型部位、および当該チャネルを通過する伝導度の低下を引き起こすKCNE1遺伝子の変異型を提供している。KCNE1の変異型は、KCNQ1の変異型と共に、どちらかの変異型だけの場合に比べて、伝導度をより減少させるように相乗的に作用しもする。本発明は、イオン・チャネル疾患を罹っている集団において、あるいは対照群中において、より高い頻度を呈しているイオン・チャネル遺伝子における遺伝子多型をさらに提供している。患者における異型接合あるいは同型接合の形でカリウムイオン・チャネル・タンパク質変異型を生成するこれらの多型部位を検出した場合、上記患者が先天的あるいは後天的心筋不整脈、QT延長症候群、SIDS、てんかん、あるいは聴力喪失のようなイオン・チャネル疾患を有しているかあるいはそのような疾患に罹り易いことを示唆している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体のイオン・チャネル疾患遺伝子型の決定方法であって、以下の：
a.KCNQ1タンパク質の第393位アミノ酸におけるリジン残基からアスパラギン残基へのアミノ酸変更、
b.KCNQ1タンパク質の第408位アミノ酸におけるプロリン残基からアラニン残基へのアミノ酸変更、
c.KCNQ1タンパク質の第448位アミノ酸におけるプロリン残基からアルギニン残基へのアミノ酸変更、および
d.KCNQ1タンパク質の第643位アミノ酸におけるグルタミン酸残基からセリン残基へのアミノ酸変更、
から成る群から選択されるアミノ酸の変更をもたらす、イオン・チャネル伝導性の低下を示す少なくとも1つの突然変異の存在について、前記個体由来の核酸サンプルを分析することを含む前記方法。
【請求項２】
前記イオン・チャネル伝導性の低下を示す少なくとも１つの突然変異が以下の：
a.KCNQ1コード配列の第1179位におけるチアミンのグアニンでの置換、
b.KCNQ1コード配列の第1222位におけるグアニンのシトシンでの置換、
c.KCNQ1コード配列の第1343位におけるグアニンのシトシンでの置換、および
d.KCNQ1コード配列の第1927位におけるアデニンのグアニンでの置換、
から成る群から選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
以下のさらなるステップ：
KCNE1タンパク質の第85位アミノ酸におけるアスパラギン酸残基からアスパラギン残基へのアミノ酸変更をもたらす突然変異の存在について前記核酸サンプルを分析する、
を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
KCNE1タンパク質の第85位アミノ酸におけるアスパラギン残基をコードする突然変異が、KCNE1コード配列の第671位におけるアデニンのグアニンでの置換である、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
前記分析ステップが、ディファレンシャル・プライマー・エクステンション、対立遺伝子特異的プローブ・ハイブリダイゼーション、対立遺伝子特異的増幅法、直接シーケンス法、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法及び一本鎖構造遺伝子多型解析から成る群から選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記個体が、QT延長症候群、心不整脈、てんかん、聴力喪失、SIDS、SUDEP、心筋梗塞合併症後のSUDS、および後天性突然死症候群から成る群から選択されたイオン・チャネル疾患を有しているかあるいは有していることが疑われる、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前記個体が、QT延長症候群、心不整脈、てんかん、聴力喪失、SIDS、SUDEP、心筋梗塞合併症後のSUDS、および後天性突然死症候群から成る群から選択されたイオン・チャネル疾患を有しているかあるいは有していることが疑われる個体の直系子孫である、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
前記分析ステップが、前記個体由来の核酸サンプルを1組のプライマーの存在下で増幅条件に共することを含む、請求項3に記載の方法であって、ここで当該プライマーの一方が少なくとも12個のヌクレオチドを含み、かつ、以下の：
a.配列番号2の第1179位に直に隣接し、かつ、配列番号2の第1179位のチアミン又はグアニンのどちらかを当該プライマーの3'末端塩基として含む配列；
b.配列番号2の相補配列の第1179位に直に隣接し、かつ、配列番号2の相補配列の第1179位のアデニン又はシトシンのどちらかを当該プライマーの3'末端塩基として含む配列；
c.配列番号2の第1222位に直に隣接し、かつ、配列番号2の第1222位のグアニン又はシトシンのどちらかを当該プライマーの3'末端塩基として含む配列；
d.配列番号2の相補配列の第1222位に直に隣接し、かつ、配列番号2の相補配列の第1222位のシトシン又はグアニンのどちらかを当該プライマーの3'末端塩基として含む配列；
e.配列番号2の第1343位に直に隣接し、かつ、配列番号2の第1343位のグアニン又はシトシンのどちらかを当該プライマーの3'末端塩基として含む配列；
f.配列番号2の相補配列の第1343位に直に隣接し、かつ、配列番号2の相補配列の第1343位のシトシン又はグアニンのどちらかを当該プライマーの3'末端塩基として含む配列；
g.配列番号2の第1927位に直に隣接し、かつ、配列番号2の第1927位のアデニン又はグアニンのどちらかを当該プライマーの3'末端塩基として含む配列；
h.配列番号2の相補配列の第1927位に直に隣接し、かつ、配列番号2の相補配列の第1927位のアデニン又はグアニンのどちらかを当該プライマーの3'末端塩基として含む配列；
i.配列番号5の第671位に直に隣接し、かつ、配列番号5の第671位のアデニン又はグアニンのどちらかを当該プライマーの3'末端塩基として含む配列；および
j.配列番号5の相補配列の第671位に直に隣接し、かつ、配列番号5の相補配列の第671位のアデニン又はグアニンのどちらかを当該プライマーの3'末端塩基として含む配列；
から成る群から選択される配列を含む配列を有する上記方法。
【請求項９】
以下の：(a) 配列番号6、(b) 配列番号7、(c) 配列番号8、(d) 配列番号9 および(e) (a)〜(d)に記載の核酸配列に完全に相補的である核酸配列から成る群から選択される核酸配列を含む単離されたKCNQ1核酸分子であり、長さが約5キロベース未満である上記単離されたKCNQ1核酸分子。
【請求項１０】
前記核酸分子が、約70ヌクレオチド未満の長さである、請求項9に記載の単離されたKCNQ1核酸分子。
【請求項１１】
前記単離された核酸分子が、100ヌクレオチド以下のプローブである、請求項10に記載の単離された核酸分子。
【請求項１２】
前記プローブが、50以下のヌクレオチドを含む、請求項10に記載の単離された核酸分子。
【請求項１３】
前記プローブが、検出マーカーに結合する、請求項10に記載の単離された核酸分子。
【請求項１４】
請求項10に記載のプローブの少なくとも1つを含むオリゴヌクレオチドのアレイ。
【請求項１５】
表4に特定された多型ヌクレオチドを含むイオン・チャネル関連遺伝子配列の塩基変異のうち少なくとも1つの塩基変異、および上記多型ヌクレオチドと一緒に表4に特定されたイオン・チャネル関連遺伝子の少なくとも20個の他の塩基を含む単離された核酸分子であって、長さが約5キロベース未満である上記単離された核酸分子。
【請求項１６】
表5に特定された多型ヌクレオチドを含むイオン・チャネル関連遺伝子配列の塩基変異のうち少なくとも1つの塩基変異、および上記多型ヌクレオチドと一緒に表5に特定されたイオン・チャネル関連遺伝子の少なくとも20個の他の塩基を含む単離された核酸分子であって、長さが約5キロベース未満である上記単離された核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、イオン・チャネル疾患に関する遺伝的変化、およびイオン・チャネル疾患を有するあるいは有すると疑われる個体においてそのような変化を同定し検出する方法の分野にわたっている。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
複雑な生体における電気的機能は、「イオン・チャネル」と呼ばれるある特殊なクラスの分子に依存している。イオン・チャネルとは、細胞膜を貫通する帯電原子（イオン）の流れを制御するタンパク質の分子である。複雑な生体は、イオンの流れのタイミング、方向、および大きさを正確に調節できる複数のイオン・チャネルタンパク質を有している(Hille, B. (1984). Ionic Channels of Excitable Membranes, pp. 99-116, Sinauer)。イオンの流れとイオン・チャネル構造の両方または一方の変化は、総称して「イオン・チャネル疾患」と呼ばれている数種類の疾病状態に関連している (Schulze-Bahr, Z Kardiol 89 Suppl 4:IV12-22 (2000); Noebels News Physiol Sci. Oct;13:255-256 (1998); Bockenhauer , Curr Opin Pediatr. 2001 Apr;13(2):142-9.; Schofield, Clin Exp Pharmacol Physiol.28(1-2):84-8. (2001))。
【０００３】
イオン・チャネル疾患の例には、特定の心不整脈、てんかんと一部の他の神経性伝導異常、ある種の聴力喪失、および筋肉機能障害などが挙げられる。ごく最近に発見されたイオン・チャネル疾患の一例は、QT延長症候群として知られる突然死の臨床症候群である (LQTS; Ward, J. Ir. Med. Assoc. 54:103-106 (1964); Romano, Lancet, I:658-659 (1965), Jervell, Am. Heart J. 54:59-78 (1957)。この病名は、この症候群によく見られるQT間隔が延長された心電図上の特徴に由来している。ヒトの心電図は通常、各心拍で電気的活性の決まったパターンを示す。電気的インパルスの心電図記録は、図１に示すように、P、Q、R、S、およびTといった1文字の名が付けられている。
【０００４】
QT間隔とは、QRS複合波の起始部からT波の終わりまでの時間の長さである。QT間隔は、様々な条件下における正常範囲の上限が定められている。QT間隔が正常範囲の上限を超える場合、QT延長症候群（LQTS）が、冠動脈性心不全あるいはうっ血性心不全 (Tomaselli, Circulation 90: 2534-2539 (1994)) などの考えられる原因の1つである (Roden, Circulation 94: 1996-2012 (1996))。
【０００５】
QT延長症候群は、先天的障害である可能性も、また受胎後の後天性である可能性もある。「後天性QT延長症候」という語は、先天性と後天性の形態を区別するためによく使われる (Karaguezian, J Cardiovasc Electrophysiol. Nov;11(11):1298 (2000))。ある種の薬剤（特に抗不整脈剤）、ある種の食事療法、またある種の電解質異常により、後天的QT延長症候群が突然起こることがある (Zipes, Am. J. Cardiol. 59:26E-31E (1987)), Jackman, Prog Cardiovasc Dis 31: 115-172 (1988))。
【０００６】
ブルガダ症候群 (Brugada,Curr Cardiol Rep. Nov; 2(6):507-14 (2000))、乳幼児の突然死症候群 (SIDS; Schwartz N. Engl. J. Med. 343(4):262-7 (2000))、てんかんによる突然死 (SUDEP; Noebels, News Physiol. Sci.:255-256 (1998))、睡眠中の突然死 (SUDS)、不整脈惹起性右室心筋症 (ARVD; Towbin, J. Electrocardiol. （2000））など（これらに限定されない）、その他の臨床症候群もまた、イオン・チャネルの機能あるいは数の異常に起因する可能性がある。残念ながら、後天性あるいは先天性の延長QT不整脈に関連するこれらの症候群の多くが、説明不可能な個体の突然死まで、発見されない場合が多い。したがって、有害な心臓イベントが発生する前にQT延長症候群を発見する必要性がある。
【０００７】
カリウムイオンの流れに関与する4個の遺伝子のある種の変異がQT延長症候群を引き起こすと知られている。その遺伝子とは、 KCNQ1 （KCNQ1、KVLQT1 あるいは LQT1とも呼ばれている）、KCNH2 （HERG （ヒト ether-a-go-go 関連遺伝子） あるいは LQT2とも呼ばれる）、KCNE1 （MinK あるいは LQT5とも呼ばれる）およびKCNE2 （MirP1とも呼ばれる）である。第5遺伝子SCN5A （hH1 あるいは  LQT3とも呼ばれる）における変異が、ナトリウムイオンの流れを調節し、突然死を起す(Splawski, Circulation. Sep 5; 102(10):1178-85 (2000)。これらの5個遺伝子は総称して、しばしば「QT延長遺伝子」あるいは「LQT遺伝子」として知られている (Vincent, Ann. Med. Feb; 30(1):58-65 (1998))。したがって、QT延長症候群を早期発見する一つの手段は、個体をイオン・チャネル疾患に罹患し易くさせる遺伝子異常の同定テストである。
【発明の開示】
【０００８】
発明の要約
本発明の一態様では、個体のイオン・チャネル疾患の遺伝子型を決定する方法を提供しており、その方法は、個体から採取した核酸サンプルから、イオン・チャネル伝導性の低下を示唆する突然変異物質の存在を解析することからなる。この突然変異によって、KCNQ1タンパク質のアミノ酸393位のリジン残基がアスパラギン残基へ、KCNQ1タンパク質のアミノ酸408位のプロリン残基がアラニン残基へ、KCNQ1タンパク質のアミノ酸408位のプロリン残基がアラニン残基ヘ、KCNQ1タンパク質のアミノ酸448位のプロリン残基がアルギニン残基ヘ、あるいはKCNQ1タンパク質のアミノ酸643位のグルタミン酸残基がセリン残基へ、といったアミノ酸の変化が起こると思われる。これらのアミノ酸変化の原因となる突然変異は、KCNQ1コード化配列の1179位のチアミンがグアニンと置換、KCNQ1コード化配列の1222位のグアニンがシトシンと置換、KCNQ1コード化配列の1343位のグアニンがシトシンと置換、あるいはKCNQ1コード化配列の1927位のアデニンがグアニンと置換することであると考えられる。本発明の別の実施例では、KCNE1タンパク質のアミノ酸85位のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に変化する原因となる突然変異の存在を確認するため、核酸サンプルの追加解析方法を含んでいる。タンパク質、このアミノ酸変化は、KCNE1コード化配列の671位のアデニンがグアニンと置換した結果起こる可能性がある。
【０００９】
この方法には、ディファレンシャル・プライマー・エクステンション、対立遺伝子特異的プローブハイブリダイゼーション、対立遺伝子特異的増幅法、直接シーケンス法、変性濃度勾配ゲル電気泳動法、一本鎖DNA高次構造多型解析等の既知の解析ステップが含まれる。
【００１０】
テストは、QT延長症候群、心不整脈、てんかん、聴力喪失、乳幼児の突然死（SIDS）、てんかんによる突然死（SUDEP）、睡眠中の突然死（SUDS）、心筋梗塞後の合併症、および後天的突然死症候群のようなイオン・チャネル疾患を有するあるいは有すると疑われる個体で行うのが好ましい。
【００１１】
本発明の他の態様では、個体の核酸サンプル解析方法として、一対のプライマー存在下で、個体から採取した核酸サンプルを増幅条件に置くことが含まれている。この実施例では、一方のプライマーに少なくとも12個のヌクレオチドが含まれており、以下の配列を一つ有している可能性がある。つまり配列番号2の1179位に直接隣接し、チアミンあるいはグアニンを配列番号2の1179位にそのプライマーの末端3'塩基として含む配列、配列番号2の相補体（complement）の1179位に直接隣接し、アデニンあるいはシトシンを配列番号2の相補体の1179位にそのプライマーの末端3'塩基として含む配列、配列番号2の1222位に直接隣接し、グアニンあるいはシトシンを配列番号2の1222位にそのプライマーの末端3'塩基として含む配列、配列番号2の相補体の1222 位に直接隣接し、シトシンあるいはグアニンを配列番号2の相補体の1222 位にそのプライマーの末端3'塩基として含む配列、配列番号2の1343位に直接隣接し、グアニンあるいはシトシンを配列番号2の1343位にそのプライマーの末端3'塩基として含む配列、配列番号2の相補体の1343位に直接隣接し、シトシンあるいはグアニンを配列番号2の相補体の1343位にそのプライマーの末端3'塩基として含む配列、配列番号2の1927位に直接隣接し、アデニンあるいはグアニンを配列番号2の1927位にそのプライマーの末端3'塩基として含む配列、配列番号2の相補体の1927位に直接隣接し、チアミンあるいはシトシンを配列番号2の相補体の1927位にそのプライマーの末端3'塩基として含む配列、配列番号5の671位に直接隣接し、アデニンあるいはグアニンを配列番号5の671位にそのプライマーの末端3'塩基として含む配列、あるいは配列番号5の相補体の671位に直接隣接し、チアミンあるいはシトシンを 配列番号5の相補体の671位にそのプライマーの末端3'塩基として含む配列などである。
【００１２】
本発明の他の態様では、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9 の核酸配列、および/またはこれら配列に対し完全に相補的である核酸配列を有する単離KCNQ1核酸分子で、その分子の長さは5キロベース未満であるものを提供している。本発明の他の実施例で、単離KCNQ1核酸分子は、その長さがヌクレオチド約70個未満または、100個あるいはそれ以下のヌクレオチドを持つプローブであると考えられる。これらのプローブはまた、検出可能なマーカーと結合させることができる。これらのプローブはまた、オリゴヌクレオチドのアレイとして提供することができる。
【００１３】
本発明はまた、表4に示すイオン・チャネル関連遺伝子配列の塩基に少なくとも1個の変異があり、さらにそのイオン・チャネル関連遺伝子のその他の塩基を少なくとも20個有する単離核酸分子を提供している。これらの単離核酸分子は、その長さが約5キロベース未満である。
【００１４】
本発明はまた、表5に示すイオン・チャネル関連遺伝子配列の塩基に少なくとも1個の変異があり、さらにそのイオン・チャネル関連遺伝子のその他の塩基を少なくとも20個有する単離核酸分子を提供している。これらの単離核酸分子は、その長さが約5キロベース未満である。
【００１５】
発明の詳細な説明
化学量論的には明白に定義されていないが、KCNQ1およびKNCE1遺伝子は、心臓のカリウムイオン・チャネル形成に関連するタンパク質生成物をコード化する。 KCNQ1タンパク質の4つのサブユニットがKCNE1の4つのサブユニットと結合して心臓の電流IKs（緩徐活性型遅延整流性カリウムイオン電流）に係わるカリウムチャネルを形成すると提案されている (Mitchson, Cell. Phys. Biol. 9:201-216 1999)。この関連性を裏付ける証拠は、同時トランスフェクト実験から得られている。この実験では、KCNE1のみをトランスフェクトした細胞で電流の流れに変化が認められず、KCNQ1のみをトランスフェクトした細胞でカリウム電流の流れが増加し、さらにKCNQ1およびKCNE1の双方をトランスフェクトした細胞はKCNQ1のみをトランスフェクトした細胞に比べて、著しく高い電流の流れが観察され、さらにこの電流は心筋細胞で観察される天然IKsの模倣である(Sanguinetti Nature 384:80-83, 1996)。
【００１６】
本発明者らは、関連カリウムイオン・チャネル電流の伝導度の減少を引き起こす4個のKCNQ1遺伝子多型部位を同定した。本発明者らはまた、KCNE1遺伝子の変異型（カリウムイオン・チャネルの修正サブユニットであるIKs をコード化する変異型）の1つが、チャネルを通して伝導度を減少させることを確認した。この変異型はまた、複数のKCNQ1変異型との相乗作用により、いずれの変異型単独の場合に比べて、さらに伝導度を減少させる。ある被験体内に、カリウムイオン・チャネルタンパク質変異形を異型接合あるいは同型接合の形で生成するこれらの遺伝子多型部位が発見されたことは、その被験体が先天性あるいは後天的心筋不整脈、QT延長症候群、乳幼児の突然死症候群（SIDS）、てんかん、あるいは聴力喪失のようなイオン・チャネル疾患を有しているかあるいはそのような疾患に罹患し易いことを意味する。そこで、その被験体は、KCNQ1の変異型に由来する欠損症を改善する薬物あるいは植え込み型心臓装置を用いて治療を受けるか、その欠損症を悪化させる可能性のある薬物あるいは生活状況を避ける指示を受けるか、および/または心臓が適切に機能しているか定期的にモニターすることができる。本発明記載の変異型の一つを有するKCNQ1遺伝子を含む細胞株あるいは薬物は、カリウムイオン・チャネル伝導度を復帰させる薬剤活性あるいはさらなる伝導性の低下をスクリーニングするのに有用である。臨床試験のために集めた被験者を、本発明記載の変異遺伝子多型を有しているかスクリーニングすることも可能である。ある種の薬物は、被験者集団が変異遺伝子多型を有しているか否かにより、異なった有効性/毒性プロフィールを示すことがある。当該遺伝子多型に相同性である被験者群を用いれば、薬物の統計学的に有意な薬物効果を検知し易く、さらに患者の遺伝的背景に応じて様々な薬物の選択をカスタマイズすることが可能である。
【００１７】
本発明は、イオン・チャネル疾患を患う患者に発生し、KCNQ1/KCNE1イオン・チャネルを通過する減衰電流と相関する変異型を持つことがわかっている、4個のKCNQ1遺伝子多型を提供している。これらの遺伝子多型はすべて、KCNQ1遺伝子のエキソン9および10にあるサブユニットの6個の推定膜貫通アルファへリックスおよび ポア・ループ・シグナチャ配列から3'の部位に位置している。
【００１８】
Neyroud, Circ. Res. 84(3): 290-297 (1999)により説明されているように、配列番号1はアミノ酸配列で、配列番号2はヒトKCNQ1遺伝子のコード化配列である(GenBank ACCESSION AJ006345, VERSION AJ006345.1 GI:5042384)。このタンパク質は、676個のアミノ酸を有している。変異タンパク質は、XnYの記号で表されており、式中、nは基準配列内のあるアミノ酸の部位、Xは基準配列内のその部位を占めるアミノ酸、さらにYは変異タンパク質内のその部位を占めるアミノ酸をそれぞれ表している。もし変異タンパク質のアミノ酸の数が基準配列と異なっていれば、変異型と基準のタンパク質を最大限に整列させる時、その変異タンパク質のコドンに基準配列の当該コドンと同じ数が割り当てられる。同様に、この遺伝子内の変異ヌクレオチドはWnZの記号で表され、式中、nは基準配列内のあるヌクレオチドの部位、Wは基準配列内のその部位を占めるヌクレオチド、さらにZはある変異遺伝子のその部位を占めるヌクレオチドをそれぞれ表している。特に別記されていない限り、本開示内の命名法で使用している番号は、コード化配列内のヌクレオチドの位置を表している（ATG開始コドンであるアデノシンヌクレオチドをヌクレオチド1番とする）。
【００１９】
この命名法を用いると、伝導性の低下との相関性が示された変異型を有するKCNQ1の4個の遺伝子多型は、K393N、P408A、P448R、およびG643Sである。これらの遺伝子多型のうち3個の同定は、アメリカ合衆国仮出願番号60/314,331に説明されている。P448Rは、同時出願中の同一特許文書中でまた、Splawski et al., Circulation 102:1178-1185 (2000)に説明されている。これらの遺伝子多型はすべて、イオン・チャネル疾患患者に発生する変異型を有している。本発明者等は、同定された4個の遺伝子多型とイオン・チャネル疾患との因果関係を示唆するKCNQ1およびKCNE1遺伝子生成物を発現する細胞を利用して、変異型が減衰伝導電流の減少と相関性を示すことを見出した。
【００２０】
本発明はさらに、カリウムイオン・チャネルのサブユニットをコード化するKCNE1の一遺伝子多型を提供している。この 遺伝子多型は、KCNQ1の名称の類似名称を使用しているとされている。村井ら (Murai et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 161(1):176-81 (1989)) により説明されているように、配列番号3はアミノ酸配列、配列番号4はコード化配列、配列番号5はKCNE1遺伝子の遺伝子配列である (GenBank ACCESSION NM_000219, VERSION NM_000219.1 GI:4557686)。したがって、この遺伝子多型はD85Nと呼ばれている。この遺伝子多型はまた、アメリカ合衆国仮出願番号60/314,331に、George et al.によるWO 01/27323 に、さらにTessonによるMol. Cell. Cardiol. 28:2051-55(1996)に説明されている。本発明者らは、KCNE1遺伝子生成物のD85N変異型を、上記KCNQ1遺伝子生成物の4個の変異型の一つと組み合わせると、いずれの変異型を単独で用いた場合に比べて、電流の減衰が大きくなることを見出した。
【００２１】
表1は、イオン・チャネル疾患に関連する本発明記載の5個の遺伝子多型の位置、ヌクレオチド変化、およびフランキング（隣接）配列を示している。本発明は、本書で述べた塩基変化から成る表1記載の配列を含み、これらの配列には10, 15, 20, 25, 30, 35, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, あるいは1000個の 塩基を持つ付属配列、あるいは10から10,000 までの範囲に包含されるすべての数の塩基を持つ付属配列がある。
【００２２】
【表１】
2005503149.tif 000002
【００２３】
これらの遺伝子多型の出現頻度は、様々な試験被験者群で確認された。サンプリングした様々な被験集団の特徴を、表2に示す。すべての被験者は組織採取時にアメリカ合衆国に居住しており、また1名の被験者はてんかん群とQT延長症候群の両方に属していた。乳幼児の突然死症候群（SIDS）は、検死の結果、乳幼児の突然死症候群（SIDS）と診断された被験者である。これらの個体から採取した凍結胸腺、脳、あるいは肝臓の組織は、組織バンクから得た。
【００２４】
てんかん（EPIL）、QT延長症候群（ LQTS）、および心拍停止（CARD）群は、DNA Sciences社により管理されるGene Trustプロジェクトの患者である。これらの患者は、DNA Sciences社に、自分の受けた診断を報告し、血液サンプルを供給した。CON1群は、血液を供給した非選択ボランティアである。患者は、白人10名、アフリカ系米国人10名、中国系6名、および日系6名であった。CON2群は、研究のため血液を供給した数種の人種の非選択ボランティアから成る。それ以外の非選択ボランティアから成るいくつかのの人種特有群も使用された。
【００２５】
【表２】
2005503149.tif 000003
【００２６】
表3は、イオン・チャネル疾患に罹患した患者の様々な集団および対照群中の野生型および変異型対立遺伝子の頻度を示している。表3に示すように、K393N 変異型はSIDS患者に見られたが（0.004）、対照群には全く見られなかった。P408A変異型は、SIDS群に0.004の頻度で見られ、てんかん群に0.019の頻度で見られたが、対照群には全く見られなかった。P448R変異型は、SIDS群およびいくつかの対照群の双方に見られた。D85N変異型は、試験されたSIDS群に0.008の頻度で見られ、1つの対照群に同等レベルの頻度で見られた。T125M変異型は、SIDS群に0.12の頻度で見られ、ラテンアメリカ系対照群を除いて試験したすべての対照群で不在であった（ラテンアメリカ系対照群では、T125M変異型は、0.003の頻度で見られた）。
【００２７】
【表３】
2005503149.tif 000004
【００２８】
本発明はまた、乳幼児突然死症候群（SIDS）、てんかん、QT延長症候群（LQTS）、あるいは心停止の病歴のある患者に発見された新規の遺伝子多型、関連核酸分子（例えば、プライマー、プローブ等）、および同一多型を検出するヌクレオチドを提供している。表4は、遺伝子多型を大文字で表したヌクレオチド、その遺伝子上の位置、およびイオン・チャネル遺伝子内の相当するSEQ ID番号を一覧表にしたものである。この一覧表には、HERG (GenBank ACCESSION NM_000238, XM_004743, AB044806)、SCN5A (GenBank ACCESSION NM_000335) およびKCNE2 (GenBank ACCESSION NM_005136, XM_009744) 遺伝子のみならずKCNQ1およびKCNE1遺伝子の付加的遺伝子多型も含まれている。
【００２９】
表4は、遺伝子多型に隣接する配列、および変異型と参照対立遺伝子が対照群あるいはイオン・チャネル疾患群に現れる頻度も示している。本発明は、本書で述べた塩基変化から成る表4記載の配列を含み、これらの配列には10, 15, 20, 25, 30, 35, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, あるいは1000個の 塩基を持つ付属配列、あるいはまた10から10,000 までの範囲に包含されるすべての数の塩基を持つ付属配列がある。
【００３０】
【表４】
2005503149.tif 000005
【００３１】
【表５】
2005503149.tif 000006
【００３２】
【表６】
2005503149.tif 000007
【００３３】
【表７】
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【００３４】
【表８】
2005503149.tif 000009
【００３５】
【表９】
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【００３６】
【表１０】
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【００３７】
【表１１】
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【００３８】
【表１２】
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【００３９】
【表１３】
2005503149.tif 000014
【００４０】
【表１４】
2005503149.tif 000015
【００４１】
【表１５】
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【００４２】
【表１６】
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【００４３】
【表１７】
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【００４４】
【表１８】
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【００４５】
【表１９】
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【００４６】
【表２０】
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【００４７】
【表２１】
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【００４８】
【表２２】
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【００４９】
【表２３】
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【００５０】
【表２４】
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【００５１】
【表２５】
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【００５２】
【表２６】
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【００５３】
【表２７】
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【００５４】
【表２８】
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【００５５】
【表２９】
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【００５６】
【表３０】
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【００５７】
本発明はまた、疾患を全く持たない被験者におけるQT延長症候群に関連する遺伝子内に見出された新規の遺伝子多型、およびそれらの遺伝子多型を検出するための関連核酸分子（例えば、プライマー、プローブ等）およびヌクレオチドを提供している。下記に記したように、前記の遺伝子多型は、あらゆる応用において有用である。表5は、ヌクレオチドの頭文字で示された遺伝子多型、その遺伝子上の位置、および当該配列番号と遺伝子多型に隣接する配列を一覧表示したものである。表5はまた、変異形および参照対立遺伝子が対照群内に現れる頻度をも表している。本発明は、本書で述べた塩基変化から成る表5記載の配列を含み、これらの配列には10, 15, 20, 25, 30, 35, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, あるいは1000個の 塩基を持つ付属配列、あるいはまた10から10,000 までの範囲により包含されるすべての数の塩基を持つ付属配列がある。
【００５８】
【表３１】
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【００５９】
遺伝子多型の解析
遺伝子多型は、解析する個人から採取された標的核酸から検出される。ゲノムDNAのアッセイには、事実、いかなる生物学的サンプルも（純粋な赤血球細胞を除いて）適している。「組織」とは、いかなる被験体（好ましくはヒト）から採取されたいかなるサンプルをも意味する。例えば、便利な組織には、全血、精液、唾液、涙、尿、便、汗、頬部上皮、皮膚、および毛髪がある。cDNA あるいは mRNAのアッセイでは、組織サンプルは、標的核酸が発現されている臓器から採取されなければならない。
【００６０】
下記の方法の多くは、標的サンプルから採取されたDNAを増幅することが必要である。これは、例えばPCRにより、達成できる。一般的には、次のPCR技術を参照すること。：Principles and Applications for DNA Amplification (ed. H.A. Erlich, Freeman Press, NY, NY, 1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (eds. Innis, et al., Academic Press, San Diego, CA, 1990); Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19, 4967 (1991); Eckert et al., PCR Methods and Applications 1, 17 (1991); PCR (eds. McPherson et al., IRL Press, Oxford); およびアメリカ合衆国特許4,683,202 （上記文献の全体をあらゆる目的のために本明細書中に援用する。）など。
【００６１】
その他の適切な増幅法には、リガーゼ連鎖反応（LDR） （Wu and Wallace, Genomics 4, 560 (1989), Landegren et al., Science 241, 1077 (1988) を参照）、転写増幅（Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173 (1989)）、3SR（self-sustained sequence replication）（Guatelli et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87, 1874 (1990)）、核酸配列に基づく増幅（NASBA: Nucleic Acid Sequence-Based Amplification）がある。後者2つの増幅方法は、等温転写に基づく等温反応を含み、この反応によって、一本鎖RNA（ssRNA）と二本鎖DNA（dsDNA）の両方をそれぞれ1：30、1：100の増幅生成物として生成する。
【００６２】
「患者」とは、ヒトと動物の両被験体を指す。「被験体」あるいは「個体」とは、一般的にはヒトを指すが、また哺乳類およびその他の動物、植物などの多細胞生物、さらに単細胞生物あるいはウイルスをも指す。表4記載の遺伝子多型部位を占有する塩基の同定は、個体（例えば、解析対象患者）内で、以下に説明する数種の方法によって決定される。
【００６３】
1.  SBE（Single-Base Extension）法
SBE（Single-Base Extension）法は、例えばUS 5,846,710、US 6,004,744、US 5,888,819 およびUS 5,856,092に説明されている。簡単に言えば、これらの方法は、標的配列に相補的であるプライマーをハイブリダイズした結果、そのプライマーの3'末端が標的配列の潜在的変異型に隣接するが、部位をまたがないようにすることである。つまり、このプライマーは、その遺伝子多型部位に隣接しその多型部位から5'の部位に位置する塩基で終了する標的ポリヌクレオチドの相補体に由来するサブ配列から構成されている。「プライマー」とは、適切な条件下で（4つの異なったヌクレオシド三リン酸と、DNA またはRNAポリメラーゼ、あるいは逆転写酵素のような重合剤が共存する条件下）、適切なバッファを用い、適温下で、テンプレート特異的DNA合成の開始点として作用可能な一本鎖オリゴヌクレオチドを指す。プライマーの適切な長さは、そのプライマーの使用目的によるが、一般的に15個から40個のヌクレオチドである。短いプライマー分子は、テンプレートを用いて十分に安定した雑種複合体を形成する場合、一般的に低めの温度が必要である。プライマーは、テンプレートの配列をそのまま反映する必要はないが、テンプレートを用いてハイブリダイズするのに十分に相補的でなければならない。「プライマー部位」とは、プライマーがハイブリダイズする標的DNAの領域を指す。「プライマーペア」とは、増幅されるDNA配列の5'末端をハイブリダイズする5'上流プライマーと、増幅されるDNA配列の 3'末端の相補体をハイブリダイズする3'下流プライマーとを含む、プライマーの一セットを意味する。ハイブリダイゼーションプローブは、塩基特異的に核酸の相補鎖と結合できる。そのようなプローブには、Nielsen et al., Science 254, 1497-1500 (1991)で説明されているように、核酸およびペプチド核酸がある。必要であれば、プローブプライマーは、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的手段により検出可能な標識を組み込み、標識化できる。例えば、有用な標識には、32P、蛍光染料、高電子密度の試薬、酵素（ELISAでよく使われている）、ビオチン、あるいは抗血清またはモノクロナール抗体が入手可能なハプテンおよびタンパク質がある。「標識」は、プライマーあるいは増幅DNAのようなプライマー伸長生成物を堅固なサポート上に固定化する目的で、プライマーを「捕獲」するためにも使用できる。ハイブリダイゼーションは、潜在的変異型の部位を占有する塩基に対し相補的である一つ以上の標識化ヌクレオチドの存在下で実施される。例えば、二対立遺伝子多型には、標識化が異なる2個のヌクレオチドを使用することができる。四対立遺伝子多型には、標識化が異なる4個のヌクレオチドを使用することができる。一部の方法、特に異なって標識化された複数のヌクレオチドを使用する方法では、ヌクレオチドは、ジデオキシヌクレオチドである。ハイブリダイゼーションは、標的配列の変異部位を占有する塩基に相補的であるヌクレオチドが存在する場合、プライマー伸長が可能な条件下で行われる。伸長には、標識化ヌクレオチドが組み込まれるので、それによって標識化された伸長プライマーが生成する。標識化の異なる 複数のヌクレオチドが使用され、標的が異型接合である場合は、標識化の異なる複数の伸長プライマーが得られる。��長プライマーが検出され、標的ポリヌクレオチドの変異部位をどの塩基（一つまたはそれ以上）が占有しているかを示唆する。
【００６４】
2.  対立遺伝子特異的プローブ
遺伝子多型解析用の対立遺伝子特異的プローブのデザインおよび使用については、例えば、Saiki et al., Nature 324, 163-166 (1986)およびDattagupta, EP 235,726, Saiki, WO 89/11548に説明されている。対立遺伝子特異的プローブは、2個の個体から採取された標的 DNAの各セグメント中に異なる多型が存在することを理由に、片方の個体から採取した標的 DNAのセグメントをハイブリダイズし、もう一方の個体から採取した標的 DNAの該当部分をハイブリダイズしないようにデザインすることができる。ハイブリダイゼーション強度が対立遺伝子間に十分な差異がでるように、好ましくは本質的には二進法の反応が得られるように、ハイブリダイゼーションの条件は十分に厳格である必要があり、そうすることで、プローブは対立遺伝子の一つだけハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションは通常、1個のオリゴヌクレオチドと、表4に示す多型部位の1個を含む標的DNA間で、特異的な結合が可能となる厳密な条件下で行われる。厳密な条件とは、オリゴヌクレオチドを、表4に示す多型部位の少なくとも1個にまたがる高度に相同性な配列に、特異的にハイブリダイゼーションさせることができる適切なバッファ濃度および温度、さらにオリゴヌクレオチドの非特異的な結合を除去する洗浄状態のことである。例えば、5X SSPE 条件(750 mM NaCl, 50 mM リン酸ナトリウム, 5 mM EDTA, pH 7.4)および25〜30℃の温度は、対立遺伝子特異的プローブハイブリダイゼーションに適切である。洗浄条件は通常、室温から60℃の範囲である。プローブによっては、標的DNAのセグメントにハイブリダイズするようにデザインされ、その結果多型部位はそのプローブの中心に (例えば、7位の15 mer内に；8あるいは9位の16 mer内に) 整列する。このプローブデザインにより、異種の対立遺伝子形間のハイブリダイゼーションをうまく区別することができる。
【００６５】
対立遺伝子特異的プローブは、頻繁にペアで用いられる（ペアの一方は、標的配列の参照形に完全に一致し、他方は変異形に完全に一致している）。数種のプローブペアは、同一の標的配列内にある複数の遺伝子多型を同時解析するために、同一のサポートに固定することができる。多型はまた、核酸アレイへのハイブリダイゼーショにより同定することができ、その例はWO 95/11995に説明されている（本文献は包括的にすべて本特許申請に記載されている）。
【００６６】
3.  対立遺伝子特異的増幅法
対立遺伝子特異的プライマーは、遺伝子多型を重複している標的DNA上の1つの部位にハイブリダイズし、そのプライマーが完全な相補を示す対立遺伝子形の増幅のみを用意する。Gibbs, Nucleic Acid Res. 17, 2427-2448 (1989)を参照のこと。このプライマーは、遠位の部位でハイブリダイズする第二のプライマーと連携して使用される。2個のプライマーから、検出可能な生成物に増幅が進み、その特定の対立遺伝子形の存在が明示される。コントロールは通常、第二のプライマーペアを用いて行われ、ペアの一方は、多型部位に単一の不適正塩基があり、他方は遠位の部位に完全な相補を示している。この単一の不適正塩基は、増幅を妨げ、検出可能な生成物は形成されない。方法によっては、この不適正塩基は、遺伝子多型と整列されたオリゴヌクレオチドの3'寄りの部位に含まれている。その理由は、この部位は、プライマーからの延長に対し最も不安定であるからである。例えば、WO 93/22456を参照のこと。他の方法では二重不適正塩基を使用しており、そこでは、第一の不適正塩基が、多型と整列したオリゴヌクレオチドの3'寄りの部位に含まれており、第二の不適正塩基は直接隣接する塩基（末端3'から2番目の部位）に位置している。プライマーの3'部位と遺伝子多型が対応していない場合、この二重不適正塩基によってさらに増幅が妨げられる。
【００６７】
4.  直接シーケンス法
本発明の多型配列の直接解析法は、ジデオキシ法（dideoxy-chain termination method）あるいは Maxam-Gilbert 法 （Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd Ed., CSHP, New York 1989)およびZyskind et al., Recombinant DNA Laboratory Manual, (Acad. Press, 1988)を参照）を用いて達成することができる。
【００６８】
5.  変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（DGGE法）
ポリメラーゼ連鎖反応法により生成された増幅産物は、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法を用いて分析することができる。異種の対立遺伝子は、溶液DNAの配列依存性の溶解特性の差および電気泳動移動の差に基づいて、同定することができる（Erlich, ed., PCR Technology, Principles and Applications for DNA Amplification, (W.H. Freeman and Co, New York, 1992), Chapter 7.）。
【００６９】
6.  一本鎖高次構造遺伝子多型解析
標的配列の対立遺伝子は、一本鎖高次構造遺伝子多型解析法を用いて識別することができる。この解析方法は、Orita et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 86, 2766-2770 (1989)に説明されているように、一本鎖PCR産物の電気泳動移動の変化から塩基の違いを同定する。増幅PCR産物を上記に説明されているように生成し、加熱するかまたは変性させ、一本鎖のPCR産物を形成する。一本鎖核酸は、一部塩基配列に依存する二次的構造を再構成あるいは形成すると考えられる。一本鎖PCR産物による電気泳動移動性の違いは、標的配列の対立遺伝子間の塩基配列の差異に関連している。
【００７０】
本発明の利用法
個体に存在する遺伝子多型を1個以上の多型部位に同定した後、この情報は多くの方法に利用することができる。
【００７１】
本発明の遺伝子多型は、様々な方法で生物の表現型に貢献する可能性がある。いくつかの多型は、タンパク質コード化配列内に起こり、タンパク質構造に影響を与えることにより表現型に貢献する。その効果は、状況によって、有益であったり、有害であったり、どちらでもなかったりする可能性がある。例えて言えば、異型接合の鎌状血球突然変異はマラリアに対する抵抗力をもたらす一方、同型接合の鎌状血球突然変異は通常致死的である。他の遺伝子多型は、非コード化領域で起こるが、表現型効果を複製、転写、翻訳への影響を通して間接的に表す可能性がある。単一の遺伝子多型が、1個以上の表現型形質に影響を与えることもある。同様に、単一の表現型形質が、異なる遺伝子の複数の多型に影響を受けることもある。さらに、遺伝子多型によっては、特定の表現型と因果関係のある独特の突然変異を、個体に発生し易くさせる。
【００７２】
表4に示す遺伝子多型の、イオン・チャネル疾患との相関さらに、イオン・チャネル疾患治療薬への反応との相関について解析することができる。
【００７３】
相関は、イオン・チャネル疾患あるいは中間表現型の有無、および1個以上の多型マーカーについてテストした個体集団に対して解析される。そのような解析を行うには、1セットの個体に対し1セットの遺伝子多型の有無（すなわち、多型セット）を決定する。その個体中には、特定な形質を呈するものも、そのような形質を欠如しているものある。その後、セット中の各多型の対立遺伝子を調べ、特定の対立遺伝子の有無が着目する形質に関連しているかを判断する。カイ二乗検定、分散分析 、パラメトリック連鎖解析、ノンパラメトリック連鎖解析など（それに限定されない）標準統計学的方法を用いて、相関を解析することができ、統計学的に有意な遺伝子多型と表現型特徴との相関が特筆される。例えば、多型Aに対立遺伝子A1が存在する場合、イオン・チャネル疾患と相関性がある可能性が見出されるかもしれない。さらに別の例として、多型Aに対立遺伝子A1が、さらに多型 Bに対立遺伝子B1が同時に存在すると、イオン・チャネル疾患と相関性がある可能性が見出されるかもしれない。
【００７４】
イオン・チャネル疾患と相関性がある遺伝子多型はまた、イオン・チャネル疾患の診断あるいは罹病性の診断に有用である。そのような多型をいくつか組み合わせて検出すると、正確な診断の確率が高くなる。例えば、イオン・チャネル疾患と相関性があると知られる遺伝子多型が一つ存在することは、個体がイオン・チャネル疾患を有するか、あるいは罹病の確率が20%であることを示唆する。一方多型が5つ検出され、それぞれが20%未満の確率で相関するとすれば、80%の確率でイオン・チャネル疾患を有するかあるいはこの疾患に罹りやすいことになる。本発明の遺伝子多型の解析は、他の多型の解析、あるいは家族の病歴などの他のイオン・チャネル疾患リスク因子と組み合わせることもできる。遺伝子多型は、発症前段階のイオン・チャネル疾患の診断に、また発症後診断の方法、診断の確定方法、あるいは検死方法として利用できる。
【００７５】
イオン・チャネル疾患と診断された患者は、従来の治療法を受け、および/または体調を悪化させたエピソードの原因となる環境的要因や薬物を避けるように指導される。イオン・チャネル疾患の従来の治療法には、植え込み型装置、βアドレナリン作動拮抗薬、電解質異常および特定薬物の忌避、水泳のような身体的活動の忌避が含まれるがこれらに限定されない。イオン・チャネル疾患と診断された患者は、本疾患を子孫に遺伝させる危険性について指導をうけるか、あるいは家族がイオン・チャネル疾患に関連する遺伝的変異体を共有している危険性について指導を受ける。
【００７６】
本発明の遺伝子多型は、イオン・チャネル疾患を有する患者に有益なあるいは有害な作用をもたらす薬剤のスクリーニングに有用である。一般的に、有益な作用とは、KCNQ1カリウム・チャネルの伝導度を増強させ、その結果、伝導度変異型による伝導度の減少効果が打ち消される。そのような作用を有する薬剤は、イオン・チャネル疾患あるいはその疑いのある患者の予防あるいは治療に有用である。一般的に、有害な作用とは、KCNQ1カリウム・チャネルの伝導度を減少させ、その結果変異型の伝導度減少効果を悪化させるものである。そのような薬剤には伝導度減少以外に有用な治療効果を持つものもあるが、そのような薬剤の使用は、本発明の遺伝子多型の1個以上を有する患者には一般的に回避すべきである。
【００７７】
薬剤スクリーニング・アッセイは、 KCNQ1および/またはKCNE1サブユニットをコード化する核酸をトランスフェクトした細胞で実施することができる。好ましくは、トランスフェクトされた核酸と内因的に同等物が細胞内に全く存在しないのがよい。細胞に、KCNQ1 および/または KCNE1のケース発現が一過性であるRNAをトランスフェクトしてもよい。あるいは、KCNQ1および/または KCNE1を、細胞株に安定して導入することもできる。KCNQ1および/または KCNE1を発現する細胞の内外間の伝導度および/またはイオンの流れが、対照に関連する試験薬の共存下でモニターされる。対照は、薬物を不含の賦形剤でもよく、またはKCNQ1/KCNE1イオン・チャネルの影響を与えないことが既知である薬剤であってもよい。さらに、対照は、既知のIksの作動剤および/または拮抗剤でもよく、それにより確実に、正しい電流がモニターされる。薬剤の投与に反応して伝導度あるいはイオンの流れが増加する場合は、取り消し作用を示唆し、伝導度が減少する場合は、悪化作用を示唆する。トランスフェクト細胞は、野生型に比べてKCNQ1/KCNE1の変異型の存在下で発現パターンが変化する遺伝子を同定するのにも有用である。そのような遺伝子自身、将来、心臓の病状の治療薬あるいは診断薬の標的になる可能性がある。
【００７８】
薬剤スクリーニング・アッセイはまた、トランスジェニック動物でも実施することができる。トランスジェニック動物には、本発明のKCNQ1 および/または KCNE1の変異型を含む外因性のヒト導入遺伝子を有するものがある。そのような動物では、トランスフェクトされた導入遺伝子に内因的に同等物は、ノックアウトされている。他のトランスジェニック動物では、本発明の変異型の一つを含むように内因性のKCNQ1 あるいはKCNE1遺伝子に変異を起している。可能な薬剤がトランスジェニック動物に投与され、心機能（例えば、心拍数、EGK、QT間隔など）がモニターされる。任意的に、モニターした心機能は、対照物質を投与されたトランスジェニック動物と比較したり、また同薬剤あるいは対照物質を投与された非トランスジェニック動物の心機能と比較することもできる。対照と比較して、心機能に（どちらの方向でも）影響を与える薬剤は、潜在的に有用な薬物活性を有する。また、対照と比較して、心機能に（どちらの方向でも）影響を与える薬剤で、無関係な適応症の治療薬として意図されたものは、心臓に潜在的副作用があることが示唆され、そのような薬剤は特定の患者（心臓病態のある患者）には回避されるかモニターされる必要がある。
【００７９】
スクリーニング用の薬剤は、大規模な組み合わせライブラリを作成し、スクリーニングすることにより得られる。大規模な組み合わせライブラリは、段階的に合成することができる多種の化合物について作成することができる。そのような化合物には、ポリペプチド、βターン模倣物、 多糖、リン脂質、ホルモン、プロスタグランジン、ステロイド、 芳香性化合物、ヘテロ環式化合物、ベンゾジアゼピン、オリゴマーＮ置換グリシン およびオリゴカーバメートがある。化合物の大規模な組み合わせライブラリは、Affymax, WO 95/12608、 Affymax、WO 93/06121、Columbia University、WO 94/08051、Pharmacopeia、WO 95/35503 およびScripps、WO 95/30642に説明されているコード化合成ライブラリ(ESL)法により構築することができる（上記文献の全体をあらゆる目的のために本明細書中に援用する。）。ペプチド・ライブラリもまた、ファージ・ディスプレイ法により作成することができる。例えば、Devlin, W0 91/18980を参照のこと。最初に、KCNQ1あるいは KCNE1タンパク質への特異的結合について、化合物のライブラリをスクリーニングする。好ましい薬剤がKd < μMと結合する。例えば、受容体・リガンドの組み合わせについては、マイクロタイターウェルのようなサポートに固定したクローン化受容体を使ってアッセイを行う。そして化合物の結合性は、リガンドの受容体に対する競合度から測定することができる。作動薬あるいは拮抗薬作用は、その後、細胞レポータ・システムあるいはトランスジェニック動物モデルを用いて、アッセイすることができる。
【００８０】
本発明の遺伝子多型はまた、イオン・チャネル疾患の治療薬候補の臨床試験を行うのに有用である。そのような治験は、本発明の変異多型の1個以上を有する投与集団あるいはそれを欠く対照集団に対し実施される。例えば、集団の選択は、被験者が変異多型K393N、P408A、P448R、G643S およびD85Nのうち少なくとも1個に異型あるいは同型接合であるかによって行われる。あるいはまた、上記の多型の5個すべての野生型について同型接合である集団を選択してもよい。遺伝的に一致している集団を用いると、遺伝的要因に由来する治療結果のばらつきを除去あるいは減じることができ、有力な薬剤の効果の評価、およびその薬剤が効果的な遺伝的集団の評価をより正確に行うことができる。
【００８１】
さらに、本発明の遺伝子多型は、臨床試験の完了後に、投与した治療薬の反応の差を解明する目的で利用することができる。例えば、1個以上の変異多型を用いて、登録患者を疾患のサブタイプあるいはクラスに階層化することができる。本発明の遺伝子多型はまた、治療に対し異常な反応を示すかあるいは全く反応しない（非反応者）、類似多型プロファイルを持った患者のサブセットを同定するのに利用することができる。このように、治療に対する反応に影響を与える、潜在的遺伝子要因に関する情報は、治療薬開発の多くの局面で利用することができる（これらの局面は、新規標的の同定から、新規治験のデザイン、生成物の標識化、および標的患者の決定に及ぶ）。加えて、本遺伝子多型は、治療に対する有害反応（有害事象）に関連する遺伝的要因を同定するのにも利用できる。例えば、副作用を呈する患者群は、偶然によるのではなく、類似多型プロファイルを有している可能性がある。これにより、そのような患者を早期に同定し、治療から除外することが可能になる。本発明はまた、有害事象の生物学的原因を理解し、当該治療を修正しそのような臨床結果を避けるために利用できる情報を提供している。
【００８２】
特定な遺伝子内でイオン・チャネル疾患と最強の相関性を示す遺伝子多型は、表現型の発現原因となる役割を果たしているか、あるいは原因である変異と連鎖不均衡である可能性が高い。そのような役割は、変異遺伝子の生体外遺伝子発現により、またはそのような多型を持つヒト遺伝子を発現するトランスジェニック動物を作製しその動物がイオン・チャネル疾患を発病するか否かを調べることにより、確認することができる。アミノ酸変化を起こすコード化領域における遺伝子多型は、通常、その多型が起こる遺伝子によりコード化されたタンパク質活性を減少、増強、あるいは変化することにより、イオン・チャネル疾患を引き起こす。終止コドンを導入するコード化領域における遺伝子多型は、通常、遺伝子により生成される機能性タンパク質を減少（異型接合）あるいは除去(同型接合)することにより、イオン・チャネル疾患を引き起こす。たまに、終止コドンは結果として、通常の長さのタンパク質に比べて異常な活動をする切形（truncate）ペプチドを生成することがある。調節領域の遺伝子多型は、その多型が起こる遺伝子によりコード化されるタンパク質の発現を増強あるいは抑制することにより、一般的にイオン・チャネル疾患を引き起こす。イントロンあるいは非翻訳配列における多型は、調節領域の多型と同じメカニズムによって、あるいはタンパク質スプライシングパターン変化させた結果タンパク質構造が変化することにより、イオン・チャネル疾患を引き起こす。
【００８３】
表4に示す遺伝子内の多型の正確な役割は、数種の手段により解明することができる。タンパク質の発現レベルの変化は、イオン・チャネル疾患（あるいは中間表現型）の有無で特徴分けしたサンプル集団群についてタンパク質のレベルを測定することにより、判断することができる。イオン・チャネル活性の変化は、同上のサンプル群におけるイオン・チャネル活性をアッセイすることにより、同様に検出することができる。
【００８４】
ある遺伝子多型をイオン・チャネル疾患の原因として同定し、そのような多型が関連タンパク質の活性あるいは発現レベルを増強あるいは減衰させているか否かを（少なくとも一般的な意味において）解明すると、その後、代謝疾患の異なった遺伝的サブタイプを有する患者のクラスに対し、カスタマイズした治療法を考案することができる。例えば、所与のタンパク質における遺伝子多型がそのタンパク質の発現レベルあるいは活性を増強させることによりイオン・チャネル疾患を引き起こしている場合は、その多型に関連した疾患は、そのタンパク質の拮抗物質を投与することにより治療することができる。所与のタンパク質における多型がそのタンパク質の発現レベルあるいは活性を減衰させることによりイオン・チャネル疾患を引き起こしている場合がある。その場合、タンパク質自身、患者の体内で発現するタンパク質をコード化する核酸、あるいはタンパク質のアナログまたは作動薬を投与することにより、多型に関連したイオン・チャネル疾患の型を治療することができる。これは、イオン・チャネルを強制的にオープン構造状態にさせる薬剤の投与を通して（すなわち、機能の減衰したカリウムチャネルの場合）、あるいはまたイオン・チャネル封鎖剤の投与を通して（すなわち、 SCN5A変異のいくつかの例の場合）、達成される可能性が高い。
【００８５】
作動薬および拮抗薬は、大規模な組み合わせライブラリを作成しスクリーニングすることにより、得られる。組み合わせライブラリは、段階的に合成できる多種の化合物について作成することができる。そのような化合物には、ポリペプチド、βターン模倣物、多糖、リン脂質、ホルモン、プロスタグランジン、ステロイド、芳香性化合物、ヘテロ環式化合物、ベンゾジアゼピン、オリゴマーＮ置換グリシンおよびオリゴカーバメートがある。化合物の大規模な組み合わせライブラリは、Affymax, WO 95/12608、 Affymax、WO 93/06121、Columbia University、WO 94/08051、Pharmacopeia、WO 95/35503 およびScripps、WO 95/30642に説明されているコード化合成ライブラリ(ESL)法により構築することができる（上記文献の全体をあらゆる目的のために本明細書中に援用する。）。ペプチド・ライブラリもまた、ファージ・ディスプレイ法により作成することができる。例えば、Devlin, W0 91/18980を参照のこと。化合物のライブラリを、まず、KCNQ1あるいは KCNE1タンパク質への特定の結合を探して、スクリーニングする。好ましい薬剤はKd が 1μM未満の状態で結合する。例えば、受容体・リガンドの組み合わせについては、マイクロタイターウェルのようなサポートに固定されたクローン受容体を使ってアッセイを行い、化合物の結合はリガンドを受容体に対して比較して測定することができる。作動あるいは拮抗作用は、その後、細胞レポータ・システムあるいはトランスジェニック動物モデルを用いて、アッセイすることができる。
【００８６】
本発明の多型はまた、イオン・チャネル疾患の治療薬候補の臨床試験を行うのに有用である。そのような治験は、定義済みの多型部位団における類似したあるいは同一の多型プロファイルを有する投与群あるいは対照群に対し行われる。遺伝的に一致している集団を用いると、遺伝的要因に由来する治療結果のばらつきを除去あるいは減じることができ、有望な薬剤効果の評価をより正確に行うことができる。
【００８７】
さらに、本発明の遺伝子多型は、臨床試験の完了後に、投与した治療薬に対する差異を解明する目的で利用することができる。例えば、変異多型のセットを用いて、登録患者を疾患サブタイプあるいはクラスに階層化することができる。本発明の多型はまた、治療に対し異常な（強度のあるいは弱度の）反応を示すかあるいは全く反応しない（非反応者）類似多型プロファイルを持った患者のサブセットを同定するのに利用することもまた可能である。このように、治療に対する反応に影響を与える潜在的遺伝子要因に関する情報は、治療薬開発の多くの局面で利用することができる（これらの局面は、新規標的の同定から、新規治験のデザイン、生成物標識化、および標的患者の決定に及ぶ）。加えて、本遺伝子多型は、治療に対する副作用に関連する遺伝的要因を同定するのにも利用できる。例えば、副作用を呈する患者群は、偶然によるのではなく、類似多型プロファイルを有している可能性がある。これにより、そのような患者を早期に同定し治療から除外することが可能になる。本発明はまた、有害事象の生物学的原因を理解し、当該治療を修正しこのような臨床結果を避けるために利用できる情報を提供している。
【００８８】
表4に一覧表示されている多型DNA配列はまた、QT延長遺伝子の存在を検出する目的で、プローブ調製用に、あるいはまたプライマーとして、利用できる。このように、これらの遺伝子の存在は、着目する個体から採取された生物学的サンプルから検出することができる。これにより、これらの遺伝子の存在を選択した患者内でアッセイすることが可能となる。さらに、これらの遺伝子のコード化領域内にその存在が発見された（表1および4に一覧表示されている）配列を利用して、個体から採取した生物学的サンプルをアッセイし、当該mRNA転写の検出により遺伝子発現の存在を調べることができる。この分野の技術者には既知の検出方法を用いて、本発明のこれらの配列を、これらの遺伝子の量的発現を評価するのにも利用できる。それは、遺伝子の量的発現は、個体間で、また同一個体内の異なった組織内で、異なる可能性があるという理由からである。
【００８９】
報告されている遺伝子多型は、イオン・チャネル疾患と無関係の隣接遺伝子（30 kbあるいはそれ以上の距離以内）と連鎖不均衡にある場合もあるが、一方で、自己免疫疾患、炎症、癌、神経系の疾患、および病原体による感染症などの表現型の一因となっている可能性もある。癌の例には、膀胱、脳、乳房、結腸、食道、腎臓、白血病、肝臓、肺、口腔、卵巣、すい臓、前立腺、皮膚、胃および子宮の癌がある。表現型形質にはまた、長寿、外観（例えば、禿頭症、肥満など）、体力、俊敏性、耐久力、生殖力、および特定の薬物または治療法に対する感受性あるいは受容性のような特徴が含まれる。
【００９０】
このような相関は、数種の方法に活用することができる。1個以上の遺伝子多型セットと治療法が存在する疾患の間に強力な相関関係が認められる場合に、ヒトあるいは動物の患者にその多型セットを検出することは、直ちに治療薬を投与するか、あるいは少なくともその患者を定期的にモニターする慣行が正当化される。重症疾患と相関性のある多型が結婚を考慮している男女に検出された場合には、その情報はその男女にとって生殖に関連する決断を下す上で重要である。例えば、妻は、そのような多型が夫から自分の子孫に伝えられる可能性を回避するために、体外受精を受けることを選択することができる。多型セットとヒト疾患の間の相関性が弱いが依然として統計学的に有意である場合には、緊急の治療介入あるいはモニターの慣行を正当化することにはならないかもしれない。しかしながら、患者は、患者が殆ど犠牲を払わずして達成できるが、変異対立遺伝子の存在ゆえにその患者が非常に罹りやすくなっている病態のリスクを減じるために将来役に立つと考えられ、経費の安い簡単な生活習慣の改善（例えば、食事療法、運動など）を開始するように動機付けられることができる。ある疾患の数種の治療法群の一つに対する改善受容性と相関性のある多型セットがある患者に同定された場合には、その情報はこの治療法が選択されるべきであることを示している。
【００９１】
個体においてどの遺伝子多型が多型部位セットを占有しているかを決定することにより、その個体を他と区別する多型部位セットを同定することができる。一般的には、National Research Council, The Evaluation of Forensic DNA Evidence (Eds. Pollard et al., National Academy Press, DC, 1996) を参照のこと。解析部位の数が多ければ多いほど、1個体内の多型セットが無関係の個体内の多型と同じである確率は低くなる。好ましくは、複数の部位を解析する場合、それらの部位は連鎖状態にないほうがよい。このように、本発明の多型はよく、遠位遺伝子中の多型と連携して利用される。法医学上の利用に好ましい多型は、二重対立遺伝子である。その理由は、2個の多型の集団中の頻度が通常、複数対立遺伝子座にある複数の多型の頻度に比べてはるかに正確に判断されるからである。
【００９２】
ある個体において他と異なるあるいは独特な法医学的マーカーを同定する能力は、法医学的分析に有用である。例えば、対象多型部位を占める多型組が容疑者とサンプルにおいて同一であるか否かを調べることにより、容疑者から採取された血液サンプルが犯罪現場から採取された血液あるいは組織サンプルと一致するか否かを、サンプル判断することができる。多型マーカーセットが容疑者とサンプル間で一致しなかった場合は、容疑者はサンプルの採取源ではなかったと結論付けることができる（実験上の誤差を除く）。マーカーセットが一致した場合には、容疑者の DNAが犯罪現場で発見されたそれと一致していると結論付けることができる。検査された遺伝子座における多型の頻度が決定されれば（例えば、適切な被験群の解析などにより）、統計学的解析を行い、容疑者と犯罪現場サンプル間の一致が偶然に起こる確率を計算することができる。
【００９３】
p(ID)は、無作為に抽出された2個の個体が所与の多型部位に同一の多型あるいは対立遺伝子形を有する確率である。本書で用いられている「遺伝子型」という語は、広義に生物体の遺伝的組成を指し、それには例えば、着目する1個以上の対立遺伝子について複相生物が異型接合か同型接合かが含まれる。二重対立遺伝子座においては、AA、AB、BA、およびBBの4個の遺伝子型が可能である。対立遺伝子A およびBがその生物の一倍体ゲノムにx およびyの頻度で起こるとすると、複相生物における各々の遺伝子型の確率は、International Publication WO 95/12607 に説明されているように計算することができる（本文献は包括的にすべて本特許申請に記載されている）。これらの計算は、所与の遺伝子座に存在するいかなる数の多型にも拡張することができる。例えば、n個の対立遺伝子の遺伝子座では、適切な二項拡張を用いて、p(ID) および p(exc)を計算する。
【００９４】
いくつかの多型遺伝子座をテストする場合、無作為に抽出された個体の非同一性の累積確率は非常に高くなる（例えば、1対10億）。このような確率は、容疑者の有罪あるいは無罪を判断する際にその他の証拠と共に考慮される。
【００９５】
父子鑑別の目的は通常、ある男性がある子の父親が否かを判断することである。殆どの場合、子の母親はわかっているので、子の遺伝子型への母親側由来の要因はつきとめることができる。父子鑑別は、子の遺伝子型で母親に帰属しない部分が推定上の父親のそれと一致するか否かを調べる。父子鑑別は、推定上の父と子の多型セットを解析することにより行うことができる。
【００９６】
子の多型セットで父に帰属するはずの部分が推定上の父親と一致しなかった場合は、実験上の誤差を除いて、推定上の父親は真の父親ではないと結論づけることができる。子の多型セットで父に帰属するはずの部分が推定上の父親と一致した場合は、統計学的計算を行い、偶然の一致が起こる確率を決定することができる。
【００９７】
親子関係の排除確率（無作為に抽出された男性が、所与の多型部位に父親として矛盾する多型を有する確率）は、 International Publication WO 95/12607に説明されているように計算することができる（本文献は包括的にすべて本特許申請に記載されている）。
【００９８】
いくつかの多型遺伝子座をこの解析に含めた場合、無作為に抽出された男性の排除累積確率は非常に高い。この確率は、推定上の父親の多型マーカーセットが、その父親に帰属する子の多型マーカーセットと一致した場合に、推定上の父親の責任を査定する際に考慮される。
【００９９】
連鎖により、遺伝子、対立遺伝子、遺伝子座、あるいは遺伝マーカーが、同一染色体上に存在していた結果の同時遺伝傾向がわかり、また連鎖は、同一の染色体上に物理的に連鎖状態に繋がっている2個の遺伝子、対立遺伝子、遺伝子座、あるいは遺伝マーカー間の組み換え率（パーセント）により、測定することができる。相互の距離が50センチモルガン以内である遺伝子座は、連鎖している。連鎖マーカーの中には、同一遺伝子あるいは遺伝子集団内に起こるものもある。
【０１００】
連鎖不均衡(LD)あるいは対立遺伝子関連性とは、特定の対立遺伝子あるいは遺伝マーカーと、固有の対立遺伝子あるいは遺伝子マーカーとの間に起こる優先的関連性を意味し、これは近隣の染色体位置において、その集団におけるいかなる特定の対立遺伝子の偶然率よりも高い頻度で、起こる。例えば、遺伝子座Xに対立遺伝子a とbがあり、これらが同等の頻度で起こるとし、連鎖遺伝座Yに対立遺伝子c とdがあり、これらもまた同等の頻度で起こるとすると、ハロタイプacは被験群に0.25の頻度で起こると予測される。acがより頻繁に起こるならば、対立遺伝子a とcは、連鎖不均衡であると考えられる。連鎖不均衡は、対立遺伝子のある組み合わせの自然淘汰の結果起こるか、あるいはまたある対立遺伝子が集団にごく最近になって導入されたため連鎖対立遺伝子間の均衡（無作為の関連性）に達していないために起こる可能性がある。
【０１０１】
疾患罹病変異を有する連鎖不均衡状態にあるマーカーは、そのマーカーが疾患を引き起こさない場合であっても、疾患に対する罹病性（あるいは潜在的表現型との関連性）を検出する上で、特に有用である。例えば、マーカー (X)（それ自体は疾患を起こす要因ではないが、表現型を起こす要因であるところの遺伝子（制御配列を含む）(Y)と連鎖不均衡状態にある）を利用して、遺伝子Yが同定されていないか、あるいは容易に検出できない状況下でその疾患に対する罹病性を示唆することができる。より新しい対立遺伝子（すなわち、進化の過程で比較的後期に現れた突然変異に由来する対立遺伝子）は、連鎖不均衡状態にあるゲノム部分が大きいと考えられる。対立遺伝子の年齢は、その対立遺伝子が異種の人種間で共有されているか、および/またはヒトとその関連種間で共有されているかにより、判断することができる。
【０１０２】
表4に示す遺伝子多型はまた、着目する形質と関連する遺伝子座と、その形質に関連しないが、形質の原因であり同時分離している遺伝子座に物理的に近位に存在する多型マーカーと間の、物理的連鎖を確立するのに利用することができる。このような解析は、表現特性と関連している遺伝子座を染色体部位にマッピングするのに有用であり、それにより形質の原因となっている遺伝子（群）をクローンするのに有用である。Landau et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 83, 7353--7357 (1986); Landau et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84, 2363-2367 (1987); Donis-Keller et al., Cell 51, 319-337 (1987); Landau et al., Genetics 121, 185-199 (1989))を参照のこと。連鎖により局在化した遺伝子は、定方向クローン化（directional cloning）として知られる過程により、クローン化することができる。Wainwright, Med. J. Australia 159, 170-174 (1993); Collins, Nature Genetics 1, 3-6 (1992) を参照されたい（上記文献の全体をあらゆる目的のために本明細書中に援用する。）。
【０１０３】
連鎖研究は、一般的に家族構成員に対し行われている。研究対象となった家族構成員は、表現型形質の有無あるいは多型マーカーセットについて、特徴付けられる。その後、有益な減数分裂における多型マーカーが解析され、どの多型マーカーが表現型形質と同時分離しているかが判断される。See, e.g., Kerem et al., Science 245, 1073-1080 (1989); Monaco et al., Nature 316, 842 (1985); Yamoka et al., Neurology 40, 222-226 (1990); Rossiter et al., FASEB Journal 5, 21-27 (1991)を参照のこと。
【０１０４】
連鎖は、ロッド（log of the odds）値により解析される。ロッド値とは、マーカーおよび遺伝子座が組換え率θに位置している場合（これらが非連鎖状態で、独立して分離している場合に比較して）、それらについて観察分離データを得られる相対的尤度（見込み）である(Thompson & Thompson, Genetics in Medicine (5th ed, W.B. Saunders Company, Philadelphia, 1991); Strachan, "Mapping the human genome" in The Human Genome (BIOS Scientific Publishers Ltd, Oxford), Chapter 4)。一連の尤度比が様々な組換え率(θ)で計算され、その範囲はθ = 0.0 （一致座） から θ = 0.50 （非連鎖）に及ぶ。このように、所与のθ値での尤度は、座位がθで連鎖されている場合のデータの確率から、座位が連鎖されていない場合のデータの確率の範囲になる。計算された尤度は、通常、この割合のlog10（すなわちロッド値）で表される。例えば、ロッド値3は、明らかに観察された連鎖が偶然であるという1000:1の可能性を意味する。対数を使用することにより、様々な家族から収集されたデータを単純加算法により組み合わせることができる。様々なθ値に対するロッド値の計算ができるコンピュータプログラムが利用可能である（例えば、LIPED、MLINK (Lathrop, Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 81, 3443-3446 (1984))。特殊なロッド値については、組換え率を数表に基づいて決定する。Smith et al., Mathematical tables for research workers in human genetics (Churchill, London, 1961); Smith, Ann. Hum. Genet. 32, 127-150 (1968)を参照のこと。ロッド値が最大となるθ値が、組換え率の最良の推定値であると考えられている。正のロッド値は、2個の遺伝子座が連鎖されていることを表し、負の値は、連鎖の尤度がこれらの2個の遺伝子座が非連鎖である確率よりも（θ値で）低いことを表している。慣例的に、組み合わせのロッド値が+3あるいはそれ以上の場合（1000:1より大きい確率で連鎖があるということに等しい）、2個の遺伝子座が連鎖しているという明確な証拠を考えられている。同様に、慣例的に、-2あるいはそれ以下の負のロッド値は、比較対象になっている2個の遺伝子座の連鎖がないという明確な証拠と考えられている。負の連鎖データは、染色体あるいはその一部を、考慮対象から除外するのに有用である。研究は、残りの非除外染色体位置に、焦点を当てて行うことができる。
【０１０５】
修正ポリペプチドおよび遺伝子配列
本発明はさらに、核酸の変異型と対応するタンパク質を提供している。これらの核酸は、表4に示す配列の一つから成り、その配列では多型部位がその位置の代替塩基で占有されている。核酸の中には、タンパク質の完全な長さの変異型をコード化するものもある。同様に、変異タンパク質は、表4に示す多型の一つを含むコドンによりコード化されるアミノ酸を除いて、プロトタイプのアミノ酸配列を表4に示す核酸によってコード化させている（当該核酸配列が構成要素である完全な長さのコード化配列の内部に完全に含まれるように解読されている）。この部位は、表4に示す代替形において対応するコドンによりコード化されるアミノ酸により占有されている。
【０１０６】
変異遺伝子は、変異遺伝子が作為的に天然のあるいはその他のプロモーターと連鎖されている発現ベクター内で発現させることができる。通常、このプロモーターは、哺乳類の細胞における発現用の真核性プロモーターである。転写制御配列は、一般的に異種プロモーターであり、任意的にはホストに認識されるエンハンサーである。trp、lac、ファージプロモーター、解糖酵素プロモーター類および tRNAプロモーターなどからどの適切なプロモーターを選択するかは、選択されたホストによって異なる。市販されている発現ベクターを使用することができる。ベクターには、ホスト認識複製システム、増幅遺伝子、選択可能マーカー、ホストゲノムへの挿入に有用なホスト配列などがある。
【０１０７】
発現構築物をホスト細胞に導入する方法は、個々の構築法および標的ホストにより異なる。適切な方法には、上記のSambrookに説明されているように、融合、接合、トランスフェクト、形質導入、エレクトロポレーションあるいは注入がある。多様なホスト細胞（原核性および真核性の双方）を、変異遺伝子の発現に用いることができる。適切なホスト細胞には、大腸菌などのバクテリア、イースト、糸状菌類、昆虫細胞、哺乳類細胞、一般的に不死化された例えばネズミ、CHO 、ヒトおよびサルの細胞株またその誘導体が、含まれる。好ましいホスト細胞は、変異遺伝子産物を処理し、適切な成熟ポリペプチドを生成する能力がある。処理過程には、糖鎖形成、ユビキチン化、ジスルフィド結合の形成、翻訳後の一般修正などがある。
【０１０８】
タンパク質は従来のタンパク質生化学および精製方法により分離し実質的に純粋な産物（すなわち、80、95 あるいは99%細胞構成要素に汚染されていない産物）を得ることができ、この情報は、以下に説明されている：Jacoby, Methods in Enzymology Volume 104, Academic Press, New York (1984); Scopes, Protein Purification, Principles and Practice, 2nd Edition, Springer-Verlag, New York (1987); and Deutscher (ed), Guide to Protein Purification, Methods in Enzymology, Vol. 182 (1990)。このタンパク質はまた、分離することができる。このタンパク質が分泌される場合、ホスト細胞が成長している上澄み液から分離することもできる。分泌されなかった場合、ホスト細胞の溶解産物から分離することができる。
【０１０９】
本発明はまた、外因性の変異遺伝子を発現能力があり、および/または活性化された内因性の変異遺伝子の一つあるいは両方の対立遺伝子を持つ能力がある、トランスジェニック非ヒト動物を提供している。外因性の変異遺伝子の発現は通常、作為的にその遺伝子をプロモーターにおよび任意的にはエンハンサーに連鎖し、その構築物を接合子に微量注入することにより、達成される。Hogan et al., "Manipulating the Mouse Embryo,  A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratoryを参照されたい。内因性の変異遺伝子の活性化は、クローン化された変異遺伝子がポジティブな選択マーカーの挿入により活性化されるトランスジェニックを作製することにより達成することができる。Capecchi, Science 244, 1288-1292 (1989) を参照されたい。この導入遺伝子は次に胚幹細胞に導入され、胚幹細胞内で内因性の変異遺伝子との相同組み換えを受ける。ネズミおよびその他のげっ歯類が、好ましい動物である。そのような動物は、有用な薬剤スクリーニング・システムを提供する。
【０１１０】
変異遺伝子によって発現された実質的に完全な長さのポリペプチドに加えて、本発明は、ペプチドの相互作用を刺激する有機分子など、そのポリペプチドの生物学的に活性な断片あるいはそのアナログを含んでいる。生物学的に活性である断片には、変異遺伝子産物に生物学的機能を与える完全な長さのポリペプチドのいかなる部分をも含み、それにはリガンド結合および抗体結合が含まれる。リガンド結合には、核酸、タンパク質またはポリペプチド、小規模の生物学的に活性分子または大規模な細胞構造による結合が含まれる。
【０１１１】
特異的に変異遺伝子産物に結合するが、対応するプロトタイプ遺伝子産物には結合しないポリクローナルおよび/またはモノクローナル抗体も提供されている。抗体は、ネズミやその他の動物に変異遺伝子産物またはその合成ペプチド断片を注入することにより作製することができる。モノクローナル抗体は、例えば、Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York (1988); Goding, Monoclonal antibodies, Principles and Practice (2d ed.) Academic Press, New York (1986)に説明されているように、スクリーニングすることができる。モノクローナル抗体は、変異遺伝子産物の特異的免疫反応性について、および対応するプロトタイプ遺伝子産物に対する免疫反応性の欠如について、テストされる。これらの抗体は、変異型を検出するための診断テストに、また薬物組成の活性成分として有用である。
【０１１２】
キット
本発明はまた、上記の少なくとも一つの対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドから成るキットを提供している。頻繁に、このキットには、様々な多型にハイブリダイズする対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドが含まれている。キットには、基質に固定された対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドが提供されているものもある。例えば、同一の基質に、表4記載の多型うちの任意のものあるいは全部を検出する対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを含むことが可能である。このようなキットにオプションとして付属されているものには、例えば、制限酵素、逆転写酵素またはポリメラーゼ、基質ヌクレオシド三リン酸、標識化方法（例えば、標識がビオチンである場合は、アビジン酵素抱合体および酵素基質およびクロモーゲン）、および逆転写、PCR、またはハイブリダイゼーション反応に適切なバッファが含まれる。通常、このようなキットには、当該方法を実行するための取扱説明書が含まれている。
【０１１３】
遺伝子多型データ保存用コンピュータシステム
図11A は、本発明を実施するために適切なコンピュータシステム（10）のブロック図を表している。コンピュータシステム（10）には、中央プロセッサ（14）のような主要なサブシステムに相互接続するバス（12）、システムメモリ（16）（一般的にRAM ）、入力/出力(I/O)コントローラー（18）、表示アダプタ（26）を媒介とする表示スクリーン（24）などの外部装置、シリアルポート（28）および（30）、キーボード（32）、記憶装置インターフェース（35）およびフロッピーディスク（38）を受けるように操作可能なフロッピーディスク・ドライブ（36）を媒介とする固定ディスク・ドライブ（34）、およびCD-ROM（42）を受けるように操作可能なCD-ROM （あるいはDVD-ROM）装置（40）が含まれる。その他多くの装置を接続することができる（例えば、マウス（44）のようなユーザーポインティング・デバイスをシリアルポート（28）を媒介として接続したり、またネットワーク・インターフェース（46）をシリアルポート（30）を媒介として接続したりすることができる）。その他多くの装置またはサブシステム（記載なし）を同様に接続することができる。また、下に記したように、本発明を実施するためには、図11記載の装置がすべて存在する必要はない。装置およびサブシステムは、図11記載の方法と異なった方法で相互接続してよい。図11記載のようなコンピュータシステムの操作は、既知である。本発明に従った多型情報を保管するデータベースは、例えば、システムメモリ（16）あるいは固定ディスク（34）、フロッピーディスク（38）、またはCD-ROM（42）のような記憶装置に、保管することができる。そのようなデータベースにアクセスするアプリケーションプログラムは、システムメモリ（16）あるいは固定ディスク（34）、フロッピーディスク（38）、またはCD-ROM（42）のような記憶装置に、作為的に配置することができる。
【０１１４】
図11は、コンピュータ・システム（10）の遠隔コンピュータ（48）、（50）、および（52）への相互接続を表している。図11は、遠隔サーバー（48）、（50）、および（52）を相互接続しているネットワーク（54）を表している。ネットワーク・インターフェース（46）は、クライアント・コンピュータシステム（10）とネットワーク（54）間の接続を提供している。ネットワーク（54）は、例えば、インターネットであってよい。インターネットおよびその他のネットワークを介してデータを交換するプロトコルは、既知である。本書に説明されている多型を同定する情報は、ネットワーク（54）に使われている物理的メディアを渡る能力を有する信号に埋め込まれているネットワーク（54）を介して転送することができる。
【０１１５】
上記の各表記載の遺伝子多型同定情報は、記録の形で表されており、これらの記録は任意的に分野別に分けることができる。各々の記録は、ある異なった多型に関する情報を保管している。集約的に、これらの記録は上記の各表記載のすべての多型、またそのいかなるサブセット（例えば、表2記載の5、10、50、あるいは100個の多型）に関する情報を保管することができる。データベースには、その情報が多型部位を占める塩基およびその多型部位の位置を同定しているものもある。塩基は、参照対立遺伝子の塩基ではなく、遺伝子多型に存在する塩基の単一文字コード（すなわち、A、C、G あるいはT/U）により表されてよい。あるいはまた、多型部位を占める塩基は、IUPAC多義性コードで表されてもよい。多型部位の位置は、各表記載の配列の一つの中におけるその部位として同定されてよい。例えば、表4記載の最初の配列では、多型部位群はG あるいはC塩基を占めている。部位はまた、例えば、染色体に、または染色体内の既知のマーカーからの距離に関連させることにより、同定することができる。その他のデータベースにおいては、遺伝子多型同定情報は、本発明の多型部位含む10から100個の塩基またはその補体を有する配列を含んでいる。好ましくは、そのような情報は、多型部位を含む配列の少なくとも10、15、20、あるいは30個の隣接塩基を記録していることが望ましい。
【０１１６】
上記のすべての出版物および特許申請は、各々の出版物および特許申請が援用されているかのように明確にまた個別に示されているのと同程度に、あらゆる目的のためにその全体を本明細書中に援用する。本発明は明確さおよび理解を目的として説明により詳細に記載されているが、ある変更および修正が添付の請求項の範囲内で実施され得るということは、明らかである。
【０１１７】
以下の実施例が本発明の態様を説明するために提供されているが、請求項に記載の本発明の範囲を制限しない。
【実施例】
【０１１８】
KCNQ1 およびKCNE1の野生型発現構築物が、ユタ大学のDr. Michael Sanguinetti から入手された。標準の部位特異的突然変異技術を用いて、発現構築物以下の変異型について作製された：KCNQ1-K393N、KCNQ1-P408A、KCNQ1-P448A、KCNQ1-G643S、KCNE1-D85N、およびKCNE1-T125M。それぞれの構築物についてRNAを合成し、全細胞電圧固定法による解析を行うため、6ng のKCNQ1 cRNA および0.6 ng のKCNE1 cRNA をツメガエルの卵母細胞に注入した。
【０１１９】
実施例 1
この実施例は、トランスフェクトされた卵母細胞に確立された電流電圧関係を示している。電流電圧(I-V)関係が決定され、（図2、3、6 および9）に示されている。これは、測定電圧における電流値（振幅）を測定するのである。電流は、5秒パルスを用いて、野生型チャネルについては-70 から +50 mVの範囲で、また変異型については-70 から +80 mVの範囲で、測定された（下記のゲートにおけるシフトを説明するため）。K393N KCNQ1は、卵母細胞の第二バッチで評価されているため、それ自体の制御セットを有している。KCNQ1突然変異は、I-V関係に右向きのシフトを起す。電流の大きさは、いかなる電位でも、50%を超えるだけ、減衰される（図10）。D85N KCNE1突然変異体は、電流活性の電流依存性に、類似してはいるがこれほど劇的ではないシフトを起こし、T125M KCNE1変異体はなんの影響も及ぼさない（図5）。G643S KCNQ1/D85 N KCNE1二重変異体は、電流を殆どゼロにまで減衰させた。これにより、これら二つの変異が付加的ではなく相乗的に作用していることがわかる(図9)。この結果は、これら双方の変異を有している患者は、どちらか一方の変異のみを有している患者に比べて、イオン・チャネル疾患のはるかに大きいリスクを背負っているということを示している。
【０１２０】
実施例 2
この例は、トランスフェクト卵母細胞について確立された活性化率の関係を示している。活性化率（図4および7）は、活性化対測定電位について、時定数（tau）をプロットすることにより、決定された。イオン・チャネルの動態特性を表す時定数は、IV定量から作成される曲線を適合させることにより、計算することができる（Hille,  Ionic Channels in Excitable Membranes. 2nd ed. Sinauer Associates, Sunderland, Mass., p. 607 (1992)。これは、閉鎖状態からチャネルがいかに速く開くかについての測定である。速度の遅い時定数は、活動電位時間内に、再分極電流を減衰させる。T125M KCNE1を除くすべての突然変異が、活性化率の速度を下げる。
【０１２１】
実施例 3
この例は、トランスフェクト卵母細胞について確立された不活性化率の関係を示している。不活性化率（図5および8）は、不活性化対測定電位について、時定数（tau）をプロットすることにより、決定された。これは、開放状態からチャネルがいかに速く閉じるかについての測定である。速度の速い時定数は、電流の減少を引き起こす。不活性化は、不活性化が抑制されたD85Nを除いて、検査されたすべての変異について、不変であった。従って、KCNQ1 およびKCNE1における突然変異が理由でカリウムイオン・チャネルを通して減少した電流は、活動電位時間内の速度の遅い活性化に起因する。
【０１２２】
これら3つの全例に説明されている方法により得られた結果により、本発明、のKCNQ1 およびKCNE1の変異が、これらの遺伝子によりコード化されるカリウムチャネルにおける全体の外向き再分極電流を減少させることにおいて、機能的効果を有しているということがわかる。従って、変異形イオン・チャネル疾患あるいはそういった疾患への罹病率の存在と相関関係にある。
【０１２３】
本申請の発明は、2001年8月20日に出願されたアメリカ合衆国仮出願番号60/314,331、および2002年5月6日に出願されたアメリカ合衆国仮出願番号60/378,521に説明されている多型に関し、上記文献の全体をあらゆる目的のために本明細書中に援用する。
【０１２４】
「一つの」という語は、そのものの一つまたはそれ以上を意味し、これにはそのものの二つまたはそれ以上の混合をも含むことを述べておく。しかして、「一つの」、「一つまたはそれ以上の」、および「少なくとも一つの」という語が、本書では、同義に使われている。さらに、「から成る」、「を含む」、および「を有する」という語もまた、同義に使われている。
【０１２５】
本発明の様々な態様が詳細に説明されているが、それらの態様の修正および改造は当業者には考えつくことであることは明白である。しかしながら、そのような修正および改造が、以下の請求項に記載の本発明の本質および範囲の中に存在することは、明白に理解される。
【０１２６】
【化１】
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【０１２７】
【化２】
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【０１２８】
【化３】
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【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】心電図のQT間隔を示す。
【図２】wt KCNQ1 あるいは K393N KCNQ1をトランスフェクトした細胞の電流電圧関係を示す。
【図３】wt KCNQ1 あるいは P408A、P448R あるいは G643S 変異型をトランスフェクトした細胞の電流電圧関係を示す。
【図４】tau（時定数）により測定されたKCNQ1の野生型と突然変異型の活性化率を示す。
【図５】tau（時定数）により測定されたKCNQ1の野生型と突然変異型の非活性化率を示す。
【図６】KCNE1 およびKCNQ1双方の野生型をトランスフェクトした細胞の電流電圧関係を、野生型KCNQ1 および 突然変異体 KCNE1をトランスフェクトした細胞と比較している。
【図７】KCNE1 およびKCNQ1双方をトランスフェクトした細胞の活動率をtau（時定数）により測定し、野生型KCNQ1 および 突然変異体 KCNE1をトランスフェクトした細胞と比較している。
【図８】KCNE1 およびKCNQ1双方をトランスフェクトした細胞のKCNE1非活性化率をtau（時定数）により測定し、野生型KCNQ1 および 突然変異体 KCNE1をトランスフェクトした細胞と比較している。
【図９】KCNE1 およびKCNQ1双方をトランスフェクトした細胞の電流電圧関係を、二重変異体G643S KCNQ1/D85N KCNE1をトランスフェクトした細胞と比較している。
【図１０】KCNQ1のK393N、P408A、P448RおよびG643Sと、KCNE1 のD85N とT125Mについて、20 mVにおける正常化された電流値を示す。
【図１１Ａ】本発明の遺伝子データを保管し操作するのに有用なコンピュータシステムを示す。
【図１１Ｂ】本発明の遺伝子データを保管し操作するのに有用なコンピュータシステムを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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2005503149.tif 000122
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005503149.tif 000123
【国際調査報告】
2005503149.tif 000124
2005503149.tif 000125
2005503149.tif 000126