(57)【要約】タイプＩＩコラーゲンの酵素分解により生成されるペプチドの同定及び定量化を行うための方法であって、既知の質量電荷比を有するカルボキシ末端の特徴付けられたペプチド断片を質量分析することにより、カルボキシ末端を有するペプチドを同定する。生体サンプル内のペプチドの同定及び定量化は、例えば変形性関節症や関節リウマチなどの病気又は生理的状態における、タンパク質分解酵素の活性、及び酵素抑制剤の有効性を評価するのに使用される。
2005507877.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲンの酵素的タンパク質分解を検出するための方法であって、
生体サンプル又は生体抽出物内に存在するコラーゲンにおける特定ペプチドのタンパク質分解生成物の同定及び定量化を行うステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記コラーゲンはタイプＩＩコラーゲンであり、
前記特定ペプチドは、Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 1)によって表わされるＣ末端、及びその翻訳後修飾を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記コラーゲンはタイプＩコラーゲンであり、
前記特定ペプチドは、Gly-Thr-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 12)によって表わされるＣ末端、及びその翻訳後修飾を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記コラーゲンはタイプＩＩＩコラーゲンであり、
前記特定ペプチドは、Gly-Ala-Pro-Gly-Pro-Leu-Gly(SEQ ID NO: 13)によって表わされるＣ末端、及びその翻訳後修飾を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記コラーゲンの酵素的タンパク質分解は、コラゲナーゼ活性の成果であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記コラゲナーゼは、マトリックス・メタロプロテイナーゼ−１３であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
薬に起因するコラゲナーゼ活性の変化をモニタリングするステップを含むことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項８】
生体サンプル又は生体抽出物内に存在する、１つ以上の特定ペプチドの同定及び定量化を行うステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
生体サンプル又は生体抽出物内に存在するコラーゲンのタンパク質分解生成物は、滑液、全血、血漿及び尿から成る群より選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記特定ペプチドのタンパク質分解生成物は、SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 8、 SEQ ID NO: 9、 SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO: 11、 SEQ ID NO: 15、 SEQ ID NO: 16、 SEQ ID NO: 17、 SEQ ID NO: 18、 SEQ ID NO: 19、 SEQ ID NO: 20、 SEQ ID NO: 21、 SEQ ID NO: 22、 SEQ ID NO: 23、 SEQ ID NO: 24、 SEQ ID NO: 25、 SEQ ID NO: 26、 SEQ ID NO: 27、 SEQ ID NO: 28、 SEQ ID NO: 29、 SEQ ID NO: 30、 SEQ ID NO: 31、 SEQ ID NO: 32、 SEQ ID NO: 33、 SEQ ID NO: 34、 SEQ ID NO: 35、 SEQ ID NO: 36、 SEQ ID NO: 37、 SEQ ID NO: 38、 SEQ ID NO: 39、 SEQ ID NO: 40、 SEQ ID NO: 41、 SEQ ID NO: 42、 SEQ ID NO: 43、
及びSEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 8、 SEQ ID NO: 9、 SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO: 11、 SEQ ID NO: 15、 SEQ ID NO: 16、 SEQ ID NO: 17、 SEQ ID NO: 18、 SEQ ID NO: 19、 SEQ ID NO: 20、 SEQ ID NO: 21、 SEQ ID NO: 22、 SEQ ID NO: 23、 SEQ ID NO: 24、 SEQ ID NO: 25、 SEQ ID NO: 26、 SEQ ID NO: 27、 SEQ ID NO: 28、 SEQ ID NO: 29、 SEQ ID NO: 30、 SEQ ID NO: 31、 SEQ ID NO : 32、 SEQ ID NO: 33、 SEQ ID NO: 34、 SEQ ID NO: 35、 SEQ ID NO: 36、 SEQ ID NO: 37、 SEQ ID NO:38、 SEQ ID NO: 39、 SEQ ID NO: 40、 SEQ ID NO: 41、 SEQ ID NO: 42、 SEQ ID NO: 43の翻訳後修飾の類似物、から成る群より選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記生体サンプル又は生体抽出物はヒトの被検体からのものであり、
生体サンプル又は生体抽出物内の、ペプチドLeu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ala-Glu-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 2)、又はその翻訳後修飾の類似物の同定及び定量化を行うステップを含むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記生体サンプル又は生体抽出物はヒトの被検体からのものであり、
前記生体サンプル又は生体抽出物内の、ペプチドLeu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ala-Glu-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 15)、又はその翻訳後修飾の類似物の同定及び定量化を行うステップを含むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記生体サンプル又は生体抽出物はヒトの被検体からのものであり、
前記生体サンプル又は生体抽出物内の、ペプチドAla-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Glu-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ala-Glu-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 16)、又はその翻訳後修飾の類似物の同定及び定量化を行うステップを含むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記生体サンプル又は生体抽出物はヒトの被検体からのものであり、
前記生体サンプル又は生体抽出物内の、ペプチド配列Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ala-Glu-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 17)、又はその翻訳後修飾の類似物の同定及び定量化を行うステップを含むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記生体サンプル又は生体抽出物はウシの被検体からのものであり、
前記生体サンプル又は生体抽出物内のペプチドの同定及び定量化を行うステップを含み、
前記ペプチドは、
Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 3)とその翻訳後修飾の類似物、
Lys-Gly-Ala-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 34)とその翻訳後修飾の類似物、
Ala-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 35)とその翻訳後修飾の類似物、
Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 36)とその翻訳後修飾の類似物、
Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 37)とその翻訳後修飾の類似物、
及びGlu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 38)とその翻訳後修飾の類似物、から成る群より選択されることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記生体サンプル又は生体抽出物はイヌの被検体からのものであり、
前記生体サンプル又は生体抽出物内のペプチドの同定及び定量化を行うステップを含み、
前記ペプチドは、
Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 4)とその翻訳後修飾の類似物、
Lys-Gly-Ala-Arg-GlyAsp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 18)とその翻訳後修飾の類似物、
Ala-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-AspGly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 19)とその翻訳後修飾の類似物、
Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 20)とその翻訳後修飾の類似物、
Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 21)とその翻訳後修飾の類似物、
及びGlu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 22)とその翻訳後修飾の類似物、から成る群より選択されることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記生体サンプル又は生体抽出物はウマの被検体からのものであり、
前記生体サンプル又は生体抽出物内のペプチドの同定及び定量化を行うステップを含み、
前記ペプチドは、
Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-PrO-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 11)とその翻訳後修飾の類似物、
Lys-Gly-Ala-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 29)とその翻訳後修飾の類似物、
Ala-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 30)とその翻訳後修飾の類似物、
Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 31)とその翻訳後修飾の類似物、
Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 32)とその翻訳後修飾の類似物、
及びGlu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 33)とその翻訳後修飾の類似物、から成る群より選択されることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
前記生体サンプル又は生体抽出物はネズミの被検体からのものであり、
前記生体サンプル又は生体抽出物内のペプチドの同定及び定量化を行うステップを含み、
前記ペプチドは、
Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Ala-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 8)とその翻訳後修飾の類似物、
Ala-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 39)とその翻訳後修飾の類似物、
Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 40)とその翻訳後修飾の類似物、
Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 41)とその翻訳後修飾の類似物、
及びAsp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 42)とその翻訳後修飾の類似物、から成る群より選択されることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
前記生体サンプル又は生体抽出物はネコの被検体からのものであり、
前記生体サンプル又は生体抽出物内のペプチドの同定及び定量化を行うステップを含み、
前記ペプチドは、
Lys-Gly-Ala-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 23)とその翻訳後修飾の類似物、
Ala-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 24)とその翻訳後修飾の類似物、
Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 25)とその翻訳後修飾の類似物、
Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 26)とその翻訳後修飾の類似物、
Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 27)とその翻訳後修飾の類似物、
及びGlu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 28)とその翻訳後修飾の類似物、から成る群より選択されることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
前記生体サンプル又は生体抽出物はモルモットの被検体からのものであり、
生体サンプル又は生体抽出物内の、ペプチドVal-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Val-Ser-Gly-Ala-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 43)、又はその翻訳後修飾の類似物の同定及び定量化を行うステップを含むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項２１】
前記ペプチドの同定及び定量化を行うステップの前に、前記サンプル又は抽出物内に存在する前記特定ペプチドのタンパク質分解生成物の派生物又は修飾を作成するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ペプチドの同定及び定量化を行うステップの前に、前記サンプル又は抽出物内に存在する前記特定ペプチドのタンパク質分解生成物の派生物又は修飾を作成するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
生体サンプル内のコラーゲン分解ペプチドのアミノ酸配列を同定するための方法であって、
前記ペプチドの相対分子量を測定するステップ、
前記ペプチドのＣ末端の特性診断配列を生成するべく、前記ペプチドを衝突活性化により断片化するステップ、
前記ペプチドのＣ末端を、既知の質量電荷比を有する前記特性診断配列により同定するステップ、
及び前記ペプチドのＮ末端配列を、前記ペプチドの相対分子量を有する同定されたＣ末端配列と結合したときに、アミノ酸配列を測定することにより同定し、それによってコラーゲン分解ペプチドを同定するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項２４】
前記Ｃ末端は、Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 1)及びその翻訳後修飾であることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記Ｃ末端は、Gly-Thr-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 12)及びその翻訳後修飾であることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記Ｃ末端は、Gly-Ala-Pro-GlyPro-Leu-Gly(SEQ ID NO: 13)及びその翻訳後修飾であることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記ペプチドのＮ末端配列を、前記ペプチドの相対分子量を有する同定されたＣ末端配列と結合したときに、アミノ酸配列を測定することにより同定するステップは、
同定されたＣ末端配列と結合したときに、既知のペプチドを含むデータベースのペプチドの質量を有するアミノ酸配列を測定するステップをさらに含むことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
特有の診断用配列を同定することにより、ペプチドのＣ末端を同定するステップは、
配列Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 5)、Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ. ID NO: 6)、及びPro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 7)と、その配列の翻訳後修飾を有する３つの診断用配列を同定するステップをさらに含むことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記３つの診断用配列は、それぞれ、約３０１、約４７１、及び約５６８の質量電荷比を有することを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記３つの診断用配列は、それぞれ、約３０１、約４５５、及び約５５２の質量電荷比を有することを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
既知の配列のタンパク質のＮ末端部分及びカルボキシル末端（Ｃ末端）を有するコラーゲン分解ペプチドのアミノ酸配列を同定するための方法であって、
前記ペプチドの相対分子量を測定するステップ、
フラグメントイオンを作成するべく、前記ペプチドを断片化するステップ、
前記ペプチドの前記Ｃ末端の断片から、既知のフラグメントイオンを同定するステップ、
同定された前記ペプチドのＣ末端の前記フラグメントイオンから、前記Ｃ末端のアミノ酸配列を同定するステップ、
及び前記Ｃ末端のアミノ酸配列と前記ペプチドの質量電荷比とから、前記ペプチドのＮ末端のアミノ酸配列を同定するステップ、
及び前記Ｎ末端のアミノ酸配列と前記Ｃ末端のアミノ酸配列とから、前記ペプチドのアミノ酸配列を決定するステップを含むことを特徴とする方法。
するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項３２】
前記コラーゲン診断用ペプチドは、タンパク質分解酵素分解産物を含むことを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ペプチドの前記フラグメントイオンを同定することにより、前記ペプチドの翻訳後修飾における少なくとも１つの部位及び種類を決定するステップをさらに含むことを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記タンパク質分解酵素は、コラゲナーゼ又はマトリックス・メタロプロテイナーゼであることを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記コラーゲン分解ペプチドは、タイプＩコラーゲンの分解ペプチドであることを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記コラーゲン分解ペプチドは、タイプＩＩＩコラーゲンの分解ペプチドであることを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
前記マトリックス・メタロプロテイナーゼは、マトリックス・メタロプロテイナーゼ−１３であることを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記ペプチドの相対分子量を測定するステップ、前記ペプチドを断片化するステップ、及び前記ペプチドのＣ末端から既知のペプチドのフラグメントイオンを同定するステップは、タンデム質量分析により行われることを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
分離ペプチドLeu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ala-Glu-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 2)とその翻訳後修飾の類似物、
分離ペプチドLys-Gly-Ala-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Glu-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ala-Glu-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 15)とその翻訳後修飾の類似物、
分離ペプチドAla-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Glu-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ala-Glu-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 16)とその翻訳後修飾の類似物、
分離ペプチドGly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ala-Glu-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 17)とその翻訳後修飾の類似物、
分離ペプチドLeu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 3)とその翻訳後修飾の類似物、
分離ペプチドLeu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 8)とその翻訳後修飾の類似物、
分離ペプチドLeu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 11)とその翻訳後修飾の類似物、
分離ペプチドLeu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 3)とその翻訳後修飾の類似物、
分離ペプチドLys-Gly-Ala-Arg- Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro- Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly- Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 34)とその翻訳後修飾の類似物、
分離ペプチドAla-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 35)とその翻訳後修飾の類似物、
分離ペプチドGly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 36)とその翻訳後修飾の類似物、
分離ペプチドPro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 37)とその翻訳後修飾の類似物、
分離ペプチドGlu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 38)とその翻訳後修飾の類似物、
分離ペプチドLys-Gly-Ala-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 18)とその翻訳後修飾の類似物、
分離ペプチドAla-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 19)とその翻訳後修飾の類似物、
分離ペプチドAla-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 20)とその翻訳後修飾の類似物、
分離ペプチドPro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 21)とその翻訳後修飾の類似物、
分離ペプチドGlu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 22)とその翻訳後修飾の類似物、
分離ペプチドLys-Gly-Ala-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 23)とその翻訳後修飾の類似物、
分離ペプチドAla-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 24)とその翻訳後修飾の類似物、
分離ペプチドLeu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 25)とその翻訳後修飾の類似物、
分離ペプチドAla-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 26)とその翻訳後修飾の類似物、
分離ペプチドPro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 27)とその翻訳後修飾の類似物、
分離ペプチドGlu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 28)とその翻訳後修飾の類似物、
分離ペプチドLys-Gly-Ala-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 29)とその翻訳後修飾の類似物、
分離ペプチドAla-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 30)とその翻訳後修飾の類似物、
分離ペプチドAla-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 31)とその翻訳後修飾の類似物、
分離ペプチドPro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 32)とその翻訳後修飾の類似物、
分離ペプチドGlu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 33)とその翻訳後修飾の類似物、
分離ペプチドAla-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 39)とその翻訳後修飾の類似物、
分離ペプチドGlu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 40)とその翻訳後修飾の類似物、
分離ペプチドGly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 41)とその翻訳後修飾の類似物、
分離ペプチドVal-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Val-Ser-Gly-Ala-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 43)とその翻訳後修飾の類似物、
分離ペプチドAsp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 42)とその翻訳後修飾の類似物、から成る群より選択されることを特徴とする分離ペプチド。
【請求項４０】
前記ペプチドは、Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 3)、又はその翻訳後修飾の類似物であることを特徴とする請求項３９に記載の分離ペプチド。
【請求項４１】
前記ペプチドは、Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 8)、又はその翻訳後修飾の類似物であることを特徴とする請求項３９に記載の分離ペプチド。
【請求項４２】
前記分離は、Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 11)、又はその翻訳後修飾の類似物であることを特徴とする請求項３９に記載の分離ペプチド。
【請求項４３】
合成ペプチドVal-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ala-Glu-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 14)、又はその翻訳後修飾の類似物。
【請求項４４】
前記ペプチドは、Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 3)、又はその翻訳後修飾の類似物であることを特徴とする請求項３９に記載の分離ペプチド。
【請求項４５】
前記ペプチドは、Lys-Gly-Ala-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 34)、又はその翻訳後修飾の類似物であることを特徴とする請求項３９に記載の分離ペプチド。
【請求項４６】
前記ペプチドは、Ala-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO35)、又はその翻訳後修飾の類似物であることを特徴とする請求項３９に記載の分離ペプチド。
【請求項４７】
前記ペプチドは、Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 36)、又はその翻訳後修飾の類似物であることを特徴とする請求項３９に記載の分離ペプチド。
【請求項４８】
前記ペプチドは、Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 37)、又はその翻訳後修飾の類似物であることを特徴とする請求項３９に記載の分離ペプチド。
【請求項４９】
前記ペプチドは、Glu-Lys-GIy-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 38)、又はその翻訳後修飾の類似物であることを特徴とする請求項３９に記載の分離ペプチド。
【請求項５０】
前記ペプチドは、Lys-Gly-Ala-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 18)、又はその翻訳後修飾の類似物であることを特徴とする請求項３９に記載の分離ペプチド。
【請求項５１】
前記ペプチドは、Ala-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 19)、又はその翻訳後修飾の類似物であることを特徴とする請求項３９に記載の分離ペプチド。
【請求項５２】
前記ペプチドは、Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 20)、又はその翻訳後修飾の類似物であることを特徴とする請求項３９に記載の分離ペプチド。
【請求項５３】
前記ペプチドは、Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 21)、又はその翻訳後修飾の類似物であることを特徴とする請求項３９に記載の分離ペプチド。
【請求項５４】
前記ペプチドは、Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 22)、又はその翻訳後修飾の類似物であることを特徴とする請求項３９に記載の分離ペプチド。
【請求項５５】
前記ペプチドは、Lys-Gly-Ala-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-GlyPro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 23)、又はその翻訳後修飾の類似物であることを特徴とする請求項３９に記載の分離ペプチド。
【請求項５６】
前記ペプチドは、Ala-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 24)、又はその翻訳後修飾の類似物であることを特徴とする請求項３９に記載の分離ペプチド。
【請求項５７】
前記ペプチドは、Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 25)、又はその翻訳後修飾の類似物であることを特徴とする請求項３９に記載の分離ペプチド。
【請求項５８】
前記ペプチドは、Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 26)、又はその翻訳後修飾の類似物であることを特徴とする請求項３９に記載の分離ペプチド。
【請求項５９】
前記ペプチドは、Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 27)、又はその翻訳後修飾の類似物であることを特徴とする請求項３９に記載の分離ペプチド。
【請求項６０】
前記ペプチドは、Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 28)、又はその翻訳後修飾の類似物であることを特徴とする請求項３９に記載の分離ペプチド。
【請求項６１】
前記ペプチドは、Lys-Gly-Ala-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 29)、又はその翻訳後修飾の類似物であることを特徴とする請求項３９に記載の分離ペプチド。
【請求項６２】
前記ペプチドは、Ala-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 30)、又はその翻訳後修飾の類似物であることを特徴とする請求項３９に記載の分離ペプチド。
【請求項６３】
前記ペプチドは、Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 31)、又はその翻訳後修飾の類似物であることを特徴とする請求項３９に記載の分離ペプチド。
【請求項６４】
前記ペプチドは、Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 32)、又はその翻訳後修飾の類似物であることを特徴とする請求項３９に記載の分離ペプチド。
【請求項６５】
前記ペプチドは、Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 33)、又はその翻訳後修飾の類似物であることを特徴とする請求項３９に記載の分離ペプチド。
【請求項６６】
前記ペプチドは、Ala-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 39)、又はその翻訳後修飾の類似物であることを特徴とする請求項３９に記載の分離ペプチド。
【請求項６７】
前記ペプチドは、Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 40)、又はその翻訳後修飾の類似物であることを特徴とする請求項３９に記載の分離ペプチド。
【請求項６８】
前記ペプチドは、Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 41)、又はその翻訳後修飾の類似物であることを特徴とする請求項３９に記載の分離ペプチド。
【請求項６９】
前記ペプチドは、Val-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Val-Ser-Gly-Ala-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 43)、又はその翻訳後修飾の類似物であることを特徴とする請求項３９に記載の分離ペプチド。
【請求項７０】
前記ペプチドは、Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 42)、又はその翻訳後修飾の類似物であることを特徴とする請求項３９に記載の分離ペプチド。
【請求項７１】
前記ペプチドは、Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ala-Glu-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 2)、又はその翻訳後修飾の類似物であることを特徴とする請求項３９に記載の分離ペプチド。
【請求項７２】
前記ペプチドは、Lys-Gly-Ala-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Glu-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ala-Glu-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 15)、又はその翻訳後修飾の類似物であることを特徴とする請求項３９に記載の分離ペプチド。
【請求項７３】
前記ペプチドは、Ala-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Glu-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ala-Glu-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 16)、又はその翻訳後修飾の類似物であることを特徴とする請求項３９に記載の分離ペプチド。
【請求項７４】
前記ペプチドは、Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ala-Glu-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 17)、又はその翻訳後修飾の類似物であることを特徴とする請求項３９に記載の分離ペプチド。
【請求項７５】
合成ペプチドVal-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ala-Glu-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 14)、又はその翻訳後修飾の類似物。
【請求項７６】
SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 8、 SEQ ID NO: 9、 SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO: 11、 SEQ ID NO: 15、 SEQ ID NO: 16、 SEQ ID NO: 17、 SEQ ID NO: 18、 SEQ ID NO: 19、 SEQ ID NO: 20、 SEQ ID NO: 21、 SEQ ID NO: 22、 SEQ ID NO: 23、 SEQ ID NO: 24、 SEQ ID NO: 25、 SEQ ID NO: 26、 SEQ ID NO: 27、 SEQ ID NO: 28、 SEQ ID NO: 29、 SEQ ID NO: 30、 SEQ ID NO: 31、 SEQ ID NO: 32、 SEQ ID NO: 33、 SEQ ID NO: 34、 SEQ ID NO: 35、 SEQ ID NO: 36、 SEQ ID NO: 37、 SEQ ID NO: 38、 SEQ ID NO: 39、 SEQ ID NO: 40、 SEQ ID NO: 41、 SEQ ID NO: 42、 SEQ ID NO: 43、
及びSEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 8、 SEQ ID NO: 9、 SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO: 11、 SEQ ID NO: 15、 SEQ ID NO: 16、 SEQ ID NO: 17、 SEQ ID NO: 18、 SEQ ID NO: 19、 SEQ ID NO: 20、 SEQ ID NO: 21、 SEQ ID NO: 22、 SEQ ID NO: 23、 SEQ ID NO: 24、 SEQ ID NO: 25、 SEQ ID NO: 26、 SEQ ID NO: 27、 SEQ ID NO: 28、 SEQ ID NO: 29、 SEQ ID NO: 30、 SEQ ID NO: 31、 SEQ ID NO: 32、 SEQ ID NO: 33、 SEQ ID NO: 34、 SEQ ID NO: 35、 SEQ ID NO: 36、 SEQ ID NO: 37、 SEQ ID NO: 38、 SEQ ID NO: 39、 SEQ ID NO: 40、 SEQ ID NO: 41、 SEQ ID NO: 42、 SEQ ID NO: 43の翻訳後修飾の類似物、から成る群より選択されるペプチドを含んでいる、コラゲナーゼ酵素活性の生体マーカー。
【請求項７７】
前記生体マーカーを定量化するための前記ペプチドを特定可能な派生物又は修飾を作成するべく、前記ペプチドは派生化又は修飾されていることを特徴とする請求項７６に記載の生体マーカー。
【請求項７８】
SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 8、 SEQ ID NO: 9、 SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO: 11、 SEQ ID NO: 15、 SEQ ID NO: 16、 SEQ ID NO: 17、 SEQ ID NO: 18、 SEQ ID NO: 19、 SEQ ID NO: 20、 SEQ ID NO: 21、 SEQ ID NO: 22、 SEQ ID NO: 23、 SEQ ID NO: 24、 SEQ ID NO: 25、 SEQ ID NO: 26、 SEQ ID NO: 27、 SEQ ID NO: 28、 SEQ ID NO: 29、 SEQ ID NO: 30、 SEQ ID NO: 31、 SEQ ID NO: 32、 SEQ ID NO: 33、 SEQ ID NO: 34、 SEQ ID NO: 35、 SEQ ID NO: 36、 SEQ ID NO: 37、 SEQ ID NO: 38、 SEQ ID NO: 39、 SEQ ID NO: 40、 SEQ ID NO: 41、 SEQ ID NO: 42、 SEQ ID NO: 43、
及びSEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 8、 SEQ ID NO: 9、 SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO: 11、 SEQ ID NO: 15、 SEQ ID NO: 16、 SEQ ID NO: 17、 SEQ ID NO: 18、 SEQ ID NO: 19、 SEQ ID NO: 20、 SEQ ID NO: 21、 SEQ ID NO: 22、 SEQ ID NO: 23、 SEQ ID NO: 24、 SEQ ID NO: 25、 SEQ ID NO: 26、 SEQ ID NO: 27、 SEQ ID NO: 28、 SEQ ID NO: 29、 SEQ ID NO: 30、 SEQ ID NO: 31、 SEQ ID NO: 32、 SEQ ID NO: 33、 SEQ ID NO: 34、 SEQ ID NO: 35、 SEQ ID NO: 36、 SEQ ID NO: 37、 SEQ ID NO: 38、 SEQ ID NO: 39、 SEQ ID NO: 40、 SEQ ID NO: 41、 SEQ ID NO: 42、 SEQ ID NO: 43の翻訳後修飾の類似物、から成る群より選択されるペプチドの少なくとも７つのアミノ酸のＮ末端配列と直接的に接触する抗体。
【請求項７９】
SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 8、 SEQ ID NO: 9、 SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO: 11、 SEQ ID NO: 15、 SEQ ID NO: 16、 SEQ ID NO: 17、 SEQ ID NO: 18、 SEQ ID NO: 19、 SEQ ID NO: 20、 SEQ ID NO: 21、 SEQ ID NO: 22、 SEQ ID NO: 23、 SEQ ID NO: 24、 SEQ ID NO: 25、 SEQ ID NO: 26、 SEQ ID NO: 27、 SEQ ID NO: 28、 SEQ ID NO: 29、 SEQ ID NO: 30、 SEQ ID NO: 31、 SEQ ID NO: 32、 SEQ ID NO: 33、 SEQ ID NO: 34、 SEQ ID NO: 35、 SEQ ID NO: 36、 SEQ ID NO: 37、 SEQ ID NO: 38、 SEQ ID NO: 39、 SEQ ID NO: 40、 SEQ ID NO: 41、 SEQ ID NO: 42、 SEQ ID NO: 43
及びSEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 8、 SEQ ID NO: 9、 SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO: 11、 SEQ ID NO: 15、 SEQ ID NO: 16、 SEQ ID NO: 17、 SEQ ID NO: 18、 SEQ ID NO: 19、 SEQ ID NO: 20、 SEQ ID NO: 21、 SEQ ID NO: 22、 SEQ ID NO: 23、 SEQ ID NO: 24、 SEQ ID NO: 25、 SEQ ID NO: 26、 SEQ ID NO: 27、 SEQ ID NO: 28、 SEQ ID NO: 29、 SEQ ID NO: 30、 SEQ ID NO: 31、 SEQ ID NO: 32、 SEQ ID NO: 33、 SEQ ID NO: 34、 SEQ ID NO: 35、 SEQ ID NO: 36、 SEQ ID NO: 37、 SEQ ID NO: 38、 SEQ ID NO: 39、 SEQ ID NO: 40、 SEQ ID NO: 41、 SEQ ID NO: 42、 SEQ ID NO: 43の翻訳後修飾の類似物、から成る群より選択されるペプチドを含んでいるコラゲナーゼ酵素抑制の生体マーカー。
【請求項８０】
前記生体マーカーを定量化するための前記ペプチドを特定可能な派生物又は修飾を作成するべく、前記ペプチドは派生化又は修飾されていることを特徴とする請求項７９に記載の生体マーカー。
【請求項８１】
コラゲナーゼ酵素のタンパク質分解活性を減少させるのに使用される薬又は物質の有効性を測定するための方法であって、
生体流動体サンプル内のタイプＩＩコラーゲン分解断片の同定及び定量化を行うステップを含み、
前記サンプルは、
SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 8、 SEQ ID NO: 9、 SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO: 11、 SEQ ID NO: 15、 SEQ ID NO: 16、 SEQ ID NO: 17、 SEQ ID NO: 18、 SEQ ID NO : 19、 SEQ ID NO: 20、 SEQ ID NO: 21、 SEQ ID NO: 22、 SEQ ID NO: 23、 SEQ ID NO: 24、 SEQ ID NO: 25、 SEQ ID NO: 26、 SEQ ID NO: 27、 SEQ ID NO: 28、 SEQ ID NO: 29、 SEQ ID NO: 30、 SEQ ID NO: 31、 SEQ ID NO: 32、 SEQ ID NO: 33、 SEQ ID NO: 34、 SEQ ID NO: 35、 SEQ ID NO: 36、 SEQ ID NO: 37、 SEQ ID NO: 38、 SEQ ID NO: 39、 SEQ ID NO: 40、 SEQ ID NO: 41、 SEQ ID NO: 42、 SEQ ID NO: 43、
及びSEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 8、 SEQ ID NO: 9、 SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO : 11、 SEQ ID NO: 15、 SEQ ID NO : 16、 SEQ ID NO: 17、 SEQ ID NO: 18、 SEQ ID NO: 19、 SEQ ID NO: 20、 SEQ ID NO: 21、 SEQ ID NO: 22、 SEQ ID NO: 23、 SEQ ID NO: 24、 SEQ ID NO: 25、 SEQ ID NO: 26、 SEQ ID NO: 27、 SEQ ID NO: 28、 SEQ ID NO: 29、 SEQ ID NO: 30、 SEQ ID NO: 31、 SEQ ID NO : 32、 SEQ ID NO: 33、 SEQ ID NO: 34、 SEQ ID NO: 35、 SEQ ID NO: 36、 SEQ ID NO: 37、 SEQ ID NO: 38、 SEQ ID NO: 39、 SEQ ID NO: 40、 SEQ ID NO: 41、 SEQ ID NO: 42、 SEQ ID NO: 43の翻訳後修飾の類似物、から成る群より選択される配列を有することを特徴とする方法。
【請求項８２】
前記分解断片の同定及び定量化を行うステップの前に、前記サンプル又は抽出物内のタイプＩＩコラーゲン分解断片の派生物又は修飾を作成するステップをさらに含むことを特徴とする請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
タイプＩＩコラーゲン分解により特徴付けられた被検体の病気又は状態を診断するための方法であって、
生体サンプル内のペプチドの同定及び定量化を行うステップを含み、
前記ペプチドは、
SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 8、 SEQ ID NO: 9、 SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO: 11、 SEQ ID NO: 15、 SEQ ID NO: 16、 SEQ ID NO: 17、 SEQ ID NO: 18、 SEQ ID NO: 19、 SEQ ID NO: 20、 SEQ ID NO: 21、 SEQ ID NO: 22、 SEQ ID NO: 23、 SEQ ID NO: 24、 SEQ ID NO: 25、 SEQ ID NO: 26、 SEQ ID NO: 27、 SEQ ID NO: 28、 SEQ ID NO: 29、 SEQ IID NO: 30、 SEQ ID NO: 31、 SEQ ID NO: 32、 SEQ ID NO: 33、 SEQ ID NO: 34、 SEQ ID NO: 35、 SEQ ID NO: 36、 SEQ ID NO: 37、 SEQ ID NO: 38、 SEQ ID NO: 39、 SEQ ID NO: 40、 SEQ ID NO: 41、 SEQ ID NO: 42、 SEQ ID NO: 43、
及びSEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 8、 SEQ ID NO: 9、 SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO: 11、 SEQ ID NO: 15、 SEQ ID NO: 16、 SEQ ID NO: 17、 SEQ ID NO: 18、 SEQ ID NO: 19、 SEQ ID NO: 20、 SEQ ID NO: 21、 SEQ ID NO: 22、 SEQ ID NO: 23、 SEQ ID NO: 24、 SEQ ID NO: 25、 SEQ ID NO: 26、 SEQ ID NO: 27、 SEQ ID NO: 28、 SEQ ID NO: 29、 SEQ ID NO: 30、 SEQ ID NO: 31、 SEQ ID NO: 32、 SEQ ID NO: 33、 SEQ ID NO: 34、 SEQ ID NO: 35、 SEQ ID NO: 36、 SEQ ID NO: 37、 SEQ ID NO: 38、 SEQ ID NO: 39、 SEQ ID NO: 40、 SEQ ID NO: 41、 SEQ ID NO: 42、 SEQ ID NO: 43の翻訳後修飾の類似物、から成る群より選択されることを特徴とする方法。
【請求項８４】
前記ペプチドの同定及び定量化を行うステップの前に、前記サンプル又は抽出物内の前記ペプチドの派生物又は修飾を作成するステップをさらに含むことを特徴とする請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
タイプＩＩコラーゲン分解により特徴付けられた被検体の病気又は状態は、変形性関節症及び関節リウマチから成る群より選択されることを特徴とする請求項８３に記載の方法。
【請求項８６】
前記生体サンプルは、尿、血、血漿及び滑液から成る群より選択されることを特徴とする請求項８３に記載の方法。
【請求項８７】
タイプＩＩコラーゲン分解により特徴付けられた被検体の病気又は状態でのコラゲナーゼ酵素のタンパク質分解活性を、ヒト又は動物の被験体内で、減少させる又は無くするのに使用される薬又は物質の有効性を測定するための方法であって、
前記被験体からの生体サンプル内のタイプＩＩコラーゲン分解ペプチドの同定及び定量化を行うステップを含み、
前記タイプＩＩコラーゲン分解ペプチドは、
SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 15、 SEQ ID NO: 16、 SEQ ID NO: 17、 SEQ ID NO: 18、 SEQ ID NO: 19、 SEQ ID NO: 20、 SEQ ID NO: 21、 SEQ ID NO: 22、 SEQ ID NO: 23、 SEQ ID NO: 24、 SEQ IID NO: 25、 SEQ D NO: 26、 SEQ ID NO: 27、 SEQ ID NO: 28、 SEQ ID NO: 29、 SEQ ID NO: 30、 SEQ ID NO: 31、 SEQ ID NO: 32、 SEQ ID NO: 33、 SEQ ID NO: 34、 SEQ ID NO: 35、 SEQ ID NO: 36、 SEQ ID NO: 37、 SEQ ID NO: 38、 SEQ ID NO: 39、 SEQ ID NO: 40、 SEQ ID NO: 41、 SEQ ID NO: 42、 SEQ ID NO: 43、
及びSEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 15、 SEQ ID NO: 16、 SEQ ID NO: 17、 SEQ ID NO: 18、 SEQ ID NO: 19、 SEQ ID NO: 20、 SEQ ID NO: 21、 SEQ ID NO: 22、 SEQ ID NO: 23、 SEQ ID NO: 24、 SEQ ID NO: 25、 SEQ ID NO: 26、 SEQ ID NO: 27、 SEQ ID NO: 28、 SEQ ID NO: 29、 SEQ ID NO: 30、 SEQ ID NO: 31、 SEQ ID NO: 32、 SEQ ID NO: 33、 SEQ ID NO: 34、 SEQ ID NO: 35、 SEQ ID NO : 36、 SEQ ID NO: 37、 SEQ ID NO: 38、 SEQ ID NO: 39、 SEQ ID NO: 40、 SEQ ID NO: 41、 SEQ ID NO: 42、 SEQ ID NO: 43の翻訳後修飾の類似物から成る群より選択されることを特徴とする方法。
【請求項８８】
前記コラゲナーゼ酵素は、マトリックス・メタロプロテイナーゼであることを特徴とする請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記マトリックス・メタロプロテイナーゼは、マトリックス・メタロプロテイナーゼ−１、マトリックス・メタロプロテイナーゼ−８、及びマトリックス・メタロプロテイナーゼ−１３から成る群より選択されることを特徴とする請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記コラゲナーゼ酵素のタンパク質分解活性を減少させるのに使用される薬又は物質は、マトリックス・メタロプロテイナーゼ抑制剤であることを特徴とする請求項８８に記載の方法。
【請求項９１】
軟骨組織の損傷により部分的に特徴付けられた哺乳類における軟骨組織の損傷の生理的状態を測定するための方法であって、
マーカーペプチドの量を測定するべく、哺乳類の生体サンプルを分析するステップを含み、
前記マーカーペプチドは、
SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 15、 SEQ ID NO: 16、 SEQ ID NO: 17、 SEQ ID NO: 18、 SEQ ID NO: 19、 SEQ ID NO: 20、 SEQ ID NO: 21、 SEQ ID NO: 22、 SEQ ID NO: 23、 SEQ ID NO: 24、 SEQ ID NO: 25、 SEQ ID NO: 26、 SEQ ID NO: 27、 SEQ ID NO: 28、 SEQ ID NO: 29、 SEQ ID NO: 30、 SEQ ID NO: 31、 SEQ ID NO: 32、 SEQ ID NO: 33、 SEQ ID NO: 34、 SEQ ID NO: 35、 SEQ ID NO: 36、 SEQ ID NO: 37、 SEQ ID NO: 38、 SEQ ID NO: 39、 SEQ ID NO: 40、 SEQ ID NO: 41、 SEQ ID NO: 42、 SEQ ID NO: 43、
及びSEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO:15、 SEQ ID NO: 16、 SEQ ID NO: 17、 SEQ ID NO: 18、 SEQ ID NO: 19、 SEQ ID NO: 20、 SEQ ID NO: 21、 SEQ ID NO: 22、 SEQ ID NO: 23、 SEQ ID NO: 24、 SEQ ID NO: 25、 SEQ ID NO: 26、 SEQ ID NO: 27、 SEQ ID NO: 28、 SEQ ID NO: 29、 SEQ ID NO: 30、 SEQ ID NO: 31、 SEQ ID NO: 32、 SEQ ID NO: 33、 SEQ ID NO: 34、 SEQ ID NO: 35、 SEQ ID NO: 36、 SEQ ID NO: 37、 SEQ ID NO: 38、 SEQ ID NO: 39、 SEQ ID NO: 40、 SEQ ID NO: 41、 SEQ ID NO: 42、 SEQ ID NO: 43の翻訳後修飾の類似物、から成る群より選択される配列を有することを特徴とする方法。
【請求項９２】
前記マーカーペプチドを同定及び定量化するステップは、
前記マーカーペプチドの質量を測定するステップ、
衝突活性化により前記マーカーペプチドを断片化するステップ、
前記マーカーペプチドの断片を既知の質量電荷比に基づき同定することにより、Ｃ末端配列Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID. NO: 1)及びその翻訳後修飾の類似物を同定するステップ、
マーカーペプチドの質量が測定されているＣ末端配列Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID. NO: 1)及びその翻訳後修飾の類似物と結合したときに、ペプチドのＮ末端配列を同定し、それによってマーカーペプチドを同定するステップ、
及び体液内のマーカーペプチドの相対分子量を測定するステップ
をさらに含むことを特徴とする請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記生体サンプルは、尿、血、血漿及び滑液から成る生体流動体の群より選択されることを特徴とする請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記既知の質量電荷比を有する断片は、
約３０１の質量電荷比を有する断片SEQ ID NO: 5、約４５５の質量電荷比を有する断片SEQ ID NO: 6、及び約５５２の質量電荷比を有する断片SEQ ID NO: 7、であることを特徴とする請求項９２に記載の方法。
【請求項９５】
前記既知の質量電荷比を有する断片は、
約３０１の質量電荷比を有する断片SEQ ID NO: 5、約４７１の質量電荷比を有する断片SEQ ID NO: 6、及び約５６８の質量電荷比を有する断片SEQ ID NO: 7、であることを特徴とする請求項９１に記載の方法。
【請求項９６】
前記軟骨組織の損傷により部分的に特徴付けられた、哺乳類の軟骨組織の生理的状態は、変形性関節症であることを特徴とする請求項９１に記載の方法。
【請求項９７】
前記軟骨組織の損傷により部分的に特徴付けられた、哺乳類の軟骨組織の生理的状態は、関節リウマチであることを特徴とする請求項９１に記載の方法。
【請求項９８】
前記生体サンプル内の前記マーカーペプチドの相対分子量を測定するステップは、
前記生体サンプル内に、既知の量の標準ペプチドを添加するステップ、
前記標準ペプチドの存在量／応答のグラフ曲線を得るべく、前記生体サンプル内の前記標準ペプチドの存在量を、分析応答に対してプロットするステップ、
前記マーカーペプチドの存在量のグラフ曲線を得るべく、前記生体サンプル内のマーカーペプチドの存在量をプロットするステップ、
前記マーカーペプチドの存在量のグラフ曲線における下側の領域を測定するステップ、
及び前記生体サンプル内における前記マーカーペプチドの相対存在量を得るべく、前記マーカーペプチドの存在量のグラフ曲線における下側の領域と、前記標準ペプチドの存在量のグラフ曲線における下側の領域とを比較するステップをさらに含むことを特徴とする請求項９２に記載の方法。
【請求項９９】
前記生体サンプル内のマーカーペプチドの規定量を測定するべく、
前記マーカーペプチドと内的標準ペプチドとの分析に基づく反応を比較するステップをさらに含むことを特徴とする請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記内的標準ペプチドは、前記マーカーペプチドの同位体的に標識化された同族体であることを特徴とする請求項９８に記載の方法。
【請求項１０１】
前記内的標準ペプチドは、前記マーカーペプチドと構造又は生物学的性質が類似しているペプチドであることを特徴とする請求項９２に記載の方法。
【請求項１０２】
コラーゲン分解により部分的に特徴付けられた哺乳類における生理的状態のコラーゲン分解を測定するための方法であって、
SEQ ID NO: 13断片及びその翻訳後修飾の類似物を含んでいるペプチドの量を同定するべく、哺乳類の生体サンプルを分析するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１０３】
コラーゲン分解により部分的に特徴付けられた哺乳類における生理的状態のコラーゲン分解を測定するための方法であって、
断片SEQ ID NO: 12及びSEQ ID NO: 12の翻訳後修飾の類似物を含んでいるペプチドの量を同定するべく、哺乳類の生体サンプルを分析するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１０４】
生体サンプル内の標的コラーゲン分解ペプチドの同定及び定量化を行うための方法であって、
生体サンプルを取得するステップ、
前記生体サンプルを内的標準と混合させるステップ、
未知のサンプルを内的標準と混合させるステップ、
各サンプルを遠心分離するステップ、
ギ酸を添加しつつ各サンプルの溶解溶液を保持するステップ、
規定の量の溶解溶液が残るまで遠心分離するステップ、
前記溶解溶液を反応容器に移すステップ、
窒素下で前記溶解溶液を乾燥させるステップ、
各乾燥させたサンプルを、ギ酸を含んでいる水中に溶解させるステップ、
各乾燥させたサンプルを、オートサンプラー容器に移すステップ、
オートサンプラー容器からのサンプルのアリコートを、ＭＳ／ＭＳインターフェース分光計に接続されたカラムに注入するステップ、
サンプルのアリコートを溶出させるステップ、
約２分間保持するステップ、
前記カラムを再平衡させるステップ、
標的ペプチド及び内的標準ペプチドのイオン対をモニタするステップ、
各標的ペプチドのイオン対のピーク領域を統合するステップ、
前記標的ペプチドの統合されたピーク領域を標準化するステップ、
各未知のサンプルにおいて、前記標準ペプチドの量を測定すべく、前記標的ペプチドの標準化された統合領域と標準検定曲線とを比較するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１０５】
前記標的コラーゲン分解ペプチドは、
SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO. 8、 SEQ ID NO: 11、 SEQ ID NO: 15、 SEQ ID NO: 16、 SEQ ID NO: 17、 SEQ ID NO: 18、 SEQ ID NO: 19、 SEQ ID NO: 20、 SEQ ID NO: 21、 SEQ ID NO: 22、 SEQ ID NO: 23、 SEQ ID NO: 24、 SEQ ID NO: 25、 SEQ ID NO: 26、 SEQ IID NO: 27、 SEQ ID NO: 28、 SEQ ID NO: 29、 SEQ ID NO: 30、 SEQ ID NO: 31、 SEQ ID NO: 32、 SEQ ID NO: 33、 SEQ ID NO: 34、 SEQ ID NO: 35、 SEQ ID NO: 36、 SEQ IID NO: 37、 SEQ ID NO: 38、 SEQ ID NO: 39、 SEQ ID NO: 40、 SEQ ID NO: 41、 SEQ ID NO: 42、 SEQ ID NO: 43、
及びSEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO. 8、 SEQ ID NO: 11、 SEQ ID NO: 15、 SEQ ID NO: 16、 SEQ ID NO: 17、 SEQ ID NO: 18、 SEQ ID NO: 19、 SEQ ID NO: 20、 SEQ ID NO: 21、 SEQ ID NO: 22、 SEQ ID NO: 23、 SEQ ID NO: 24、 SEQ ID NO: 25、 SEQ ID NO: 26、 SEQ ID NO: 27、 SEQ ID NO: 28、 SEQ ID NO: 29、 SEQ ID NO: 30、 SEQ ID NO: 31、 SEQ ID NO: 32、 SEQ ID NO: 33、 SEQ ID NO: 34、 SEQ ID NO: 35、 SEQ ID NO: 36、 SEQ ID NO: 37、 SEQ ID NO: 38、 SEQ ID NO: 39、 SEQ ID NO: 40、 SEQ ID NO: 41、 SEQ ID NO: 42、 SEQ ID NO: 43の翻訳後修飾の類似物、から成る群より選択されることを特徴とする請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記生体サンプルは尿であることを特徴とする請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０７】
ペプチドGly-Ala-Pro-Gly-Pro-Leu-Gly(SEQ ID NO: 13)、又はその翻訳後修飾の類似物。
【請求項１０８】
ペプチドGly-Ala-Pro-Gly-Pro-Leu-Gly (SEQ ID NO: 13)、又はその翻訳後修飾の類似物。
ペプチドVal-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ala-Glu-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 14)、又はその翻訳後修飾の類似物。
【請求項１０９】
被験体からタイプＩＩコラーゲンの酵素的分解を検出するための方法であって、
３つの診断的配列の同定及び定量化を行うステップを含み、
前記診断的配列は、配列Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 5)、Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 6)、及びPro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 7)と、その翻訳後修飾の類似物を有していることを特徴とする方法。
【請求項１１０】
前記３つの診断的配列は、それぞれ、約３０１、約４７１、及び約５６８の質量電荷比を有していることを特徴とする請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記３つの診断的配列は、それぞれ、約３０１、約４５５、及び約５５２の質量電荷比を有していることを特徴とする請求項１０９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概してペプチドの同定及び定量化の方法に関するものである。詳しくは、コラゲナーゼによるコラーゲンの酵素分解により生成される分解ペプチドの同定及び定量化の方法に関するものである。また、本発明は、人間及び動物のタイプＩＩコラーゲンのコラーゲンの酵素分解により生成される特定ペプチドに関する。また、それらのペプチドを、生体サンプル内でのコラーゲンの酵素分解により特徴付けられた変形性関節症や関節リウマチのような病気又は生理条件における、コラゲナーゼ活性のマーカーとして認識する方法に関するものである。また、病気又は生理条件を治療又は調整するために用いられる物質及び薬の、酵素を抑制する効果を評価するためのペプチドの同定及び定量化の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
概して、活性及び多数のコラーゲンのターンオーバーは、健康な成人では顕著な特性とは見なされていない。関節コラーゲンの成分であるタイプＩＩコラーゲンのターンオーバーは、概して、関節リウマチ、変形性関節症、又は分解コラーゲンが要因である他の病気又は生理条件などの病気で発生する。
【０００３】
タイプＩＩコラーゲンの破壊は、マトリックス・メタロプロテイナーゼ・ファミリーの特定の酵素であるコラゲナーゼにより行われると考えられていた。コラゲナーゼは、３つのペプチド・ストランドから成っている。例えば、タイプＩＩコラーゲンは、アルファ１：タイプＩＩコラーゲン(SEQ ID NO: 44)と呼ばれる３つの同一ペプチド・ストランドの三重螺旋から成っている。コラーゲンがコラゲナーゼにより分解又は分解させられたときは、前記分解は特定のヘリカル内で行われる。このとき、ペプチドは、さらなる分解又は分解を受けやすい状態に置かれたままである。いずれにせよ、コラーゲン断片における初めの分解結果は、最終的にはタンパク質分解により決定される。例えば、タイプＩＩコラーゲンのコラゲナーゼ分解は、結果として、末尾がＧＰＸＧＰＱＧ（Ｘはプロリン又はヒドロキシプロリン）であるＣ末端配列を有するペプチド断片を生じさせる。Billinghurstらは、この初めのコラゲナーゼ分解部分及び作成された抗体は、カルボキシル末端及びアミノ末端「ネオエピトープ（neoepitope：人間のタイプＩＩコラーゲンの分解により生じる）」の両方とよく反応すると述べている（J. Clin. Invest. 99: 1534-1545 (1997)）。
【０００４】
Otternessらによる米国特許第6,030, 792号では、コラーゲン断片を検出するための抗体は、結果として、タイプＩＩコラーゲンのコラゲナーゼ分解を生じさせると開示している。Pooleらによる米国特許第6,132,976号では、タイプＩＩコラーゲンの免疫学的検定測量により軟骨組織の分解を評価する方法について開示している。いずれにせよ、従来の、ペプチド断片の存在を検出することによりタイプＩＩコラーゲン酵素分解を検出する方法では、単に、標的Ｃ端末部分とすぐ隣のペプチド配列の存在を、それら配列部位に対して特異的な抗体を使用して測定するだけであった。
【発明の開示】
【発明の効果】
【０００５】
本発明のある実施形態は、コラーゲンの酵素によるタンパク質分解を検出するための方法であって、生体サンプル又は生体抽出物内に存在するコラーゲンの特定ペプチドタンパク質分解生成物の同定及び定量化を行うステップを含んでいる。ある実施形態では、前記コラーゲンはタイプＩＩコラーゲンであり、前記特定ペプチドは、Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 1)によって表わされるＣ末端、及びその翻訳後修飾を有している。他の実施形態では、前記コラーゲンはタイプＩコラーゲンであり、前記特定ペプチドは、Gly-Thr-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 12)によって表わされるＣ末端、及びその翻訳後修飾を有している。他の実施形態では、前記コラーゲンはタイプＩＩＩコラーゲンであり、前記特定ペプチドは、Gly-Ala-Pro-Gly-Pro-Leu-Gly(SEQ ID NO: 13)によって表わされるＣ末端、及びその翻訳後修飾を有している。
【０００６】
好ましい実施形態では、前記コラーゲンの酵素によるタンパク質分解は、コラゲナーゼ活性の成果である。前記コラゲナーゼは、具体的には、マトリックス・メタロプロテイナーゼ−１３である。
【０００７】
また、ある実施形態は、薬（特にコラゲナーゼに対する薬）、により引き起こされるコラゲナーゼ活性の変化を、素早くかつ精度高くモニターすることを可能にする方法である。ある実施形態では、前記方法は、生体サンプル又は生体抽出物内に存在する、１つ以上の特定ペプチドの同定及び定量化を行うステップを含んでいる。前記生体サンプルは、具体的には、滑液、全血、血漿、又は尿である。
【０００８】
本発明のある実施形態は、タンパク質分解酵素によるタンパク質分解により生じるペプチドのアミノ酸配列を同定する方法を提供している。
【０００９】
本発明の他の実施形態は、ペプチドの質量を測定すべく、断片化されたペプチドの特徴付けられた又は診断用のカルボキシル末端アミノ酸配列を同定するべく、及び添加されたペプチドのフラグメントイオン及び無傷のペプチドの測定された分子量とに基づいて、前記ペプチドのＮ末端配列を同定するべく、生体流動体サンプル又は生体抽出物内のペプチドをタンデム質量分析により同定する方法である。
【００１０】
本発明の他の実施形態は、生体流動体サンプル又は生体抽出物内の、特定Ｃ末端配列Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 1)及びその翻訳後修飾を有するペプチドを、既知の質量電荷比を有する前記Ｃ端末配列のフラグメントイオンを同定することにより、検出するための方法である。
【００１１】
本発明の他の実施形態は、コラゲナーゼ酵素により分解したタイプＩＩコラーゲンのペプチド断片の存在を確認すべく、生体流動体サンプル又は生体抽出物内の、特定Ｃ末端配列Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 1)及びその翻訳後修飾を有するペプチドを検出するための方法である。
【００１２】
本発明の他の実施形態は、生体サンプル又は生体抽出物内の、ペプチド配列Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ala-GluGly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 2)、又はその翻訳後修飾を有するペプチドを検出するための方法である。
【００１３】
本発明の他の実施形態は、生体サンプル又は生体抽出物内の、ペプチド配列Leu-Lys-Gly-Ala-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Glu-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ala-Glu-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 15)、又はその翻訳後修飾を有するペプチドを検出するための方法である。
【００１４】
本発明の他の実施形態は、生体サンプル又は生体抽出物内の、ペプチド配列Ala-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Glu-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ala-Glu-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 16)、又はその翻訳後修飾を有するペプチドを検出するための方法である。
【００１５】
本発明の他の実施形態は、生体サンプル又は生体抽出物内の、ペプチド配列Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ala-Glu-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 17)、又はその翻訳後修飾を有するペプチドを検出するための方法である。
【００１６】
本発明の他の実施形態は、生体サンプル又は生体抽出物内の、ペプチド配列Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 3)、又はその翻訳後修飾を有するペプチドを検出するための方法である。
【００１７】
本発明の他の実施形態は、生体サンプル又は生体抽出物内の、ペプチド配列Lys-Gly-Ala-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 34)、又はその翻訳後修飾を有するペプチドを検出するための方法である。
【００１８】
本発明の他の実施形態は、生体サンプル又は生体抽出物内の、ペプチド配列Ala-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 35)、又はその翻訳後修飾を有するペプチドを検出するための方法である。
【００１９】
本発明の他の実施形態は、生体サンプル又は生体抽出物内の、ペプチド配列Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 36)、又はその翻訳後修飾を有するペプチドを検出するための方法である。
【００２０】
本発明の他の実施形態は、生体サンプル又は生体抽出物内の、ペプチド配列Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 37)、又はその翻訳後修飾を有するペプチドを検出するための方法である。
【００２１】
本発明の他の実施形態は、生体サンプル又は生体抽出物内の、ペプチド配列Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 38)、又はその翻訳後修飾を有するペプチドを検出するための方法である。
【００２２】
本発明の他の実施形態は、生体サンプル又は生体抽出物内の、ペプチド配列Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 4)、又はその翻訳後修飾の同定及び定量化を行うための方法である。
【００２３】
本発明の他の実施形態は、生体サンプル又は生体抽出物内の、ペプチド配列Lys-Gly-Ala-Arg-GlyAsp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 18)、又はその翻訳後修飾の同定及び定量化を行うための方法である。
【００２４】
本発明の他の実施形態は、生体サンプル又は生体抽出物内の、ペプチド配列Ala-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-AspGly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 19)、又はその翻訳後修飾の同定及び定量化を行うための方法である。
【００２５】
本発明の他の実施形態は、生体サンプル又は生体抽出物内の、ペプチド配列Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 20)、又はその翻訳後修飾の同定及び定量化を行うための方法である。
【００２６】
本発明の他の実施形態は、生体サンプル又は生体抽出物内の、ペプチド配列Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 21)、又はその翻訳後修飾の同定及び定量化を行うための方法である。
【００２７】
本発明の他の実施形態は、生体サンプル又は生体抽出物内の、ペプチド配列Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 22)、又はその翻訳後修飾の同定及び定量化を行うための方法である。
【００２８】
本発明の他の実施形態は、生体サンプル又は生体抽出物内の、ペプチド配列Lys-Gly-Ala-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 23)、又はその翻訳後修飾の同定及び定量化を行うための方法である。
【００２９】
本発明の他の実施形態は、生体サンプル又は生体抽出物内の、ペプチド配列Ala-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 24)、又はその翻訳後修飾の同定及び定量化を行うための方法である。
【００３０】
本発明の他の実施形態は、生体サンプル又は生体抽出物内の、ペプチド配列Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 25)、又はその翻訳後修飾の同定及び定量化を行うための方法である。
【００３１】
本発明の他の実施形態は、生体サンプル又は生体抽出物内の、ペプチド配列Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 26)、又はその翻訳後修飾の同定及び定量化を行うための方法である。
【００３２】
本発明の他の実施形態は、生体サンプル又は生体抽出物内の、ペプチド配列Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 27)、又はその翻訳後修飾の同定及び定量化を行うための方法である。
【００３３】
本発明の他の実施形態は、生体サンプル又は生体抽出物内の、ペプチド配列Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 28)、又はその翻訳後修飾の同定及び定量化を行うための方法である。
【００３４】
本発明の他の実施形態は、生体サンプル又は生体抽出物内の、ペプチド配列Lys-Gly-Ala-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 29)、又はその翻訳後修飾の同定及び定量化を行うための方法である。
【００３５】
本発明の他の実施形態は、生体サンプル又は生体抽出物内の、ペプチド配列Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 11)、又はその翻訳後修飾の同定及び定量化を行うための方法である。
【００３６】
本発明の他の実施形態は、生体サンプル又は生体抽出物内の、ペプチド配列Ala-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 30)、又はその翻訳後修飾の同定及び定量化を行うための方法である。
【００３７】
本発明の他の実施形態は、生体サンプル又は生体抽出物内の、ペプチド配列Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 31)、又はその翻訳後修飾の同定及び定量化を行うための方法である。
【００３８】
本発明の他の実施形態は、生体サンプル又は生体抽出物内の、ペプチド配列Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 32)、又はその翻訳後修飾の同定及び定量化を行うための方法である。
【００３９】
本発明の他の実施形態は、生体サンプル又は生体抽出物内の、ペプチド配列Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 33)、又はその翻訳後修飾の同定及び定量化を行うための方法である。
【００４０】
本発明の他の実施形態は、生体サンプル又は生体抽出物内の、ペプチド配列Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Ala-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 8)、又はその翻訳後修飾の同定及び定量化を行うための方法である。
【００４１】
本発明の他の実施形態は、生体サンプル又は生体抽出物内の、ペプチド配列Ala-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 39)、又はその翻訳後修飾の同定及び定量化を行うための方法である。
【００４２】
本発明の他の実施形態は、生体サンプル又は生体抽出物内の、ペプチド配列Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 40)、又はその翻訳後修飾の同定及び定量化を行うための方法である。
【００４３】
本発明の他の実施形態は、生体サンプル又は生体抽出物内の、ペプチド配列Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 41)、又はその翻訳後修飾の同定及び定量化を行うための方法である。
【００４４】
本発明の他の実施形態は、生体サンプル又は生体抽出物内の、ペプチド配列Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 42)、又はその翻訳後修飾の同定及び定量化を行うための方法である。
【００４５】
本発明の他の実施形態は、生体サンプル又は生体抽出物内の、ペプチド配列Val-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Val-Ser-Gly-Ala-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 43)、又はその翻訳後修飾の同定及び定量化を行うための方法である。
【００４６】
本発明の他の実施形態は、生体サンプル内の、ペプチドSEQ ID NO: 2、ペプチド SEQ ID NO: 3、又はペプチド SEQ ID NO: 4を、タンパク質分解酵素活性のマーカーとして、同定及び定量化を行うための方法である。
【００４７】
本発明の他の実施形態は、生体サンプル内の、ペプチド SEQ ID NO: 8、ペプチド SEQ ID NO: 11、ペプチド SEQ ID NO: 15、ペプチド SEQ ID NO: 16、ペプチド SEQ ID NO: 17、ペプチド SEQ ID NO: 18、ペプチド SEQ ID NO: 19、ペプチド SEQ ID NO: 20、ペプチド SEQ ID NO: 21、ペプチド SEQ ID NO: 22、ペプチド SEQ ID NO: 23、ペプチド SEQ ID NO: 24、ペプチド SEQ ID NO: 25、ペプチド SEQ ID NO: 26、ペプチド SEQ ID NO: 27、ペプチド SEQ ID NO: 28、ペプチド SEQ ID NO: 29、ペプチド SEQ ID NO: 30、ペプチド SEQ ID NO: 31、ペプチド SEQ ID NO: 32、ペプチド SEQ ID NO: 33、ペプチド SEQ ID NO: 34、ペプチド SEQ ID NO: 35、ペプチド SEQ ID NO: 36、ペプチド SEQ ID NO: 37、ペプチド SEQ ID NO: 38、ペプチド SEQ ID NO: 39、ペプチド SEQ ID NO: 40、ペプチド SEQ ID NO: 41、ペプチド SEQ ID NO: 42、及びペプチドSEQ ID NO: 43を、タンパク質分解酵素活性のマーカーとして、同定及び定量化を行うための方法である。
【００４８】
本発明の他の実施形態は、生体サンプル内の、ペプチドSEQ ID NO: 2、ペプチド SEQ ID NO: 3、又はペプチドSEQ ID NO: 4を、タイプＩＩコラーゲンの分解により特徴付けられた被験体の損傷の存在又は生理的状態のマーカーとして、同定及び定量化を行うための方法である。なお、前記損傷又は生理的状態としては、変形性関節症や関節リウマチが挙げられる（ただし、これに限定されるものではない）。
【００４９】
本発明の他の実施形態は、生体サンプル内の、ペプチド SEQ ID NO: 8、ペプチド SEQ ID NO: 11、ペプチド SEQ ID NO: 15、ペプチド SEQ ID NO: 16、ペプチド SEQ ID NO: 17、ペプチド SEQ ID NO: 18、ペプチド SEQ ID NO: 19、ペプチド SEQ ID NO: 20、ペプチド SEQ ID NO: 21、ペプチド SEQ ID NO: 22、ペプチド SEQ ID NO: 23、ペプチド SEQ ID NO: 24、ペプチド SEQ ID NO: 25、ペプチド SEQ ID NO: 26、ペプチド SEQ ID NO: 27、ペプチド SEQ ID NO: 28、ペプチド SEQ ID NO: 29、ペプチド SEQ ID NO: 30、ペプチド SEQ ID NO: 31、ペプチド SEQ ID NO: 32、ペプチド SEQ ID NO: 33、ペプチド SEQ ID NO: 34、ペプチド SEQ ID NO: 35、ペプチド SEQ ID NO: 36、ペプチド SEQ ID NO: 37、ペプチド SEQ ID NO: 38、ペプチド SEQ ID NO: 39、ペプチド SEQ ID NO: 40、ペプチド SEQ ID NO: 41、ペプチド SEQ ID NO: 42、及びペプチド SEQ ID NO: 43を、タイプＩＩコラーゲンの分解により特徴付けられた被験体の損傷の存在又は生理的状態のマーカーとして、同定及び定量化を行うための方法である。なお、前記損傷又は生理的状態としては、変形性関節症や関節リウマチが挙げられる（ただし、これに限定されるものではない）。
【００５０】
本発明の他の実施形態は、生体サンプル内の、ペプチドSEQ ID NO: 2、ペプチド SEQ ID NO: 3、又はペプチドSEQ ID NO: 4を、コラーゲンのタンパク質分解により特徴付けられた病気又は生理的状態の治療又はコントロールに使用される薬又は物質の有効性を評価又はモニターするべく、同定及び定量化を行うための方法である。
【００５１】
本発明の他の実施形態は、生体サンプル内の、ペプチド SEQ ID NO: 8、ペプチド SEQ ID NO: 11、ペプチド SEQ ID NO: 15、ペプチド SEQ ID NO: 1 6、ペプチド SEQ ID NO: 17、ペプチド SEQ ID NO: 18、ペプチド SEQ ID NO: 19、ペプチド SEQ ID NO: 20、ペプチド SEQ ID NO: 21、ペプチド SEQ ID NO: 22、ペプチド SEQ ID NO: 23、ペプチド SEQ ID NO: 24、ペプチド SEQ ID NO: 25、ペプチド SEQ ID NO: 26、ペプチド SEQ 1D NO: 27、ペプチド SEQ ID NO: 28、ペプチド SEQ ID NO: 29、ペプチド SEQ ID NO: 30、ペプチド SEQ ID NO: 31、ペプチド SEQ ID NO: 32、ペプチド SEQ ID NO: 33、ペプチド SEQ ID NO: 34、ペプチド SEQ ID NO: 35、ペプチド SEQ ID NO: 36、ペプチド SEQ ID NO: 37、ペプチド SEQ ID NO: 38、ペプチド SEQ ID NO: 39、ペプチド SEQ ID NO: 40、ペプチド SEQ ID NO: 41、ペプチド SEQ ID NO: 42、及びペプチド SEQ ID NO: 43を、コラーゲンのタンパク質分解により特徴付けられた病気又は生理的状態の治療又はコントロールに使用される薬又は物質の有効性を評価又はモニターするべく、同定及び定量化を行うための方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５２】
本発明のある実施形態は、人間又は動物の生体サンプル内に存在するコラーゲンのペプチドの同定及び定量化を行う方法である。「生体サンプル」は、体液又は生体抽出物から得られたサンプルを示す。また、本発明は、特定コラゲナーゼ酵素活性生成物の存在の測定、及び構造の同定を行う方法を含んでいる。
【００５３】
本発明は、タンパク質分解酵素（例えば、マトリックス・メタロプロテイナーゼ−１、８、１３）による分解の検出に使用することができる。前記分解は、特徴付けられたフラグメントイオンを有するアミノ酸配列のＣ末端を衝突活性化により断片化することによる生じる。本発明によれば、軟骨組織の損傷により特徴付けられた生理的な状態の診断及び予測を、コラーゲン分解ペプチドの同定及び定量化により行うことができる。このことにより、被験体の生体サンプルの軟骨組織の分解により特徴付けられた病気（例えば、変形性関節症や関節リウマチ）の症状及び徴候が明らかになる。本発明は、特に、ペプチドの翻訳後修飾の類似物の同定及び定量化を行うのに有効である。なお、本発明は、新しく発見されたペプチド及びその翻訳後修飾の類似物を含む。
【００５４】
本発明のある実施形態は、タンパク質分解生成物（特にタンパク質分解酵素により分解されたタンパク質）の検出及び測定をするべく、生体流動体サンプル又は生体抽出物内のペプチド断片を質量分析する方法に関する。タンパク質分解酵素によるタンパク質の分解により、特徴付けられたＣ末端アミノ配列を有する分解ペプチドが生じる。本発明のある実施形態では、生体サンプル内の質量が既知であるコラーゲン分解ペプチドを、クロマトグラフ法により分離させる。そして、その後、従来の手法を用いて、質量分析計内で、衝突活性化により断片化する。衝突活性化のときに、ペプチドは特徴のある質量電荷比を有する断片を生成する。例えばＣ末端に特徴のあるペプチド断片の存在を検出することにより、Ｃ末端の配列を確認することができる。Ｃ末端の配列と分解ペプチドの質量を確認することにより、ペプチドのＮ末端を推定することができる。
【００５５】
ペプチドのタンデム質量分析により決定されたペプチドとフラグメントイオン分子の重量と、既知のタンパク質配列（及びその仮定される翻訳後修飾）から予期されるそれらと比較して、全体のアミノ酸配列（ペプチドの翻訳後修飾を含んでいる）を決定する。また、本発明の同定方法によれば、Ｃ末端及びＮ末端配列を同定することができ、その結果、分解ペプチド全体のアミノ酸配列（ペプチド内に存在するプロリンアミノ酸の可能性のある水酸化を含む）が分かる。ペプチドの同定は、ペプチドの合成及び合成ペプチドが同様の分析データを示すことにより、さらに有効になる。ペプチドが一度同定されると、同じ又は類似した配列の標準ペプチドを、生体サンプル内の酵素的に分解されたペプチドの相対分子量を決定するのに使用することができる。この定量化は、タンパク質分解酵素の活性を評価するのに使用することができる。また、病気の診断又は予測、及びタンパク質分解酵素の活性を変更する薬又は物質の評価に使用することができる。
【００５６】
本発明のある実施形態は、コラーゲン分解生成物の同定及び定量化の方法を提供する。例えば、本発明のある実施形態は、タイプＩ、ＩＩ、及びＩＩＩコラーゲンの分解生成物の同定及び定量化の方法を提供する。また、本発明の好ましい実施形態は、生体サンプル内のタイプＩＩコラーゲンの、特定の、新しく発見されたペプチド分解生成物の検出及び定量化の方法を提供する。本発明は、酵素によるタイプＩＩコラーゲンの分解により生じた、例えばマトリックス・メタロプロテイナーゼ（特にマトリックス・メタロプロテイナーゼ１、８、及び１３）のような、タンパク質分解酵素分解生成物の存在を検出するのに使用することができる。
【００５７】
人間の尿サンプル内に存在するタイプＩＩコラーゲンのペプチド断片の同定及び定量化は、最初に、ペプチドLeu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ala-Glu-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 2)の翻訳後修飾の類似物（最も多い形成位置１４，２６は、４−ヒドロキシプロリンである）が、関節炎の症状及び徴候を示すと医学的に診断された人間の被験体に発見可能な量で存在することを示す。また、次のペプチドLys-Gly-Ala-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Glu-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ala-Glu-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 15)（最も多い形成位置１０、１６、２５、３１及び４２は、４−ヒドロキシプロリンである）、ペプチドAla-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Glu-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ala-Glu-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 16)（最も多い形成位置８、１４、２３、２９及び４１は、４−ヒドロキシプロリンである）、及びペプチドGly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-AlaGlu-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 17)（最も多い形成位置１２及び２４は、４−ヒドロキシプロリンである）も、関節炎の症状及び徴候を示すと医学的に診断された人間の被験体に発見可能な量で存在する。
【００５８】
ペプチドSEQ ID NO: 16は、人間の尿から最も多く検出された、タイプＩＩコラーゲン・ネオエピトープ（neoepitope）ペプチドである。
【００５９】
ウシの尿サンプル内に存在するタイプＩＩコラーゲンのペプチド断片の同定は、最初は、Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 3)の翻訳後修飾の類似物（最も多い形成位置１４及び２６は、４−ヒドロキシプロリンである）が、関節炎の症状及び徴候を示すウシの被験体に発見可能な量で存在することを示す。次のペプチドも同様である。ペプチドLys-Gly-Ala-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 34)（最も多い形成位置１０、１６、２５、２８及び４３は４−ヒドロキシプロリンであり、位置４３はヒドロキシリジンである）、ペプチドAla-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln- Gly (SEQ ID NO: 35)（最も多い形成位置８、１４、２３、２９及び４１は４−ヒドロキシプロリンであり、位置２６はヒドロキシリジンである）、ペプチドGly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 36)（最も多い形成位置４、１０及び２２は４−ヒドロキシプロリンであり、位置７はヒドロキシリジンである）、ペプチドPro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 37) （最も多い形成位置４、１０及び２０は４−ヒドロキシプロリンであり、位置５はヒドロキシリジンである）、及びペプチドGlu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 38)（最も多い形成位置２はヒドロキシリジンであり、位置５及び１７は４−ヒドロキシプロリンである）。
【００６０】
ペプチドSEQ ID NO: 35は、ウシの尿から最も多く検出された、タイプＩＩコラーゲン・ネオエピトープ（neoepitope）ペプチドである。
【００６１】
同様に、イヌの尿サンプル内に存在するタイプＩＩコラーゲンのペプチド断片の同定及び定量化により、Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 4)（最も多い形成位置１４及び２６は、４−ヒドロキシプロリンである）が、関節炎の症状及び徴候を示すイヌの被験体に発見可能な量で存在することを示す。次のペプチドも同様である。ペプチドLys-Gly-Ala-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys- Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 18)（最も多い形成位置１０、１６、２５、３１及び４３は４−ヒドロキシプロリンであり、位置２８はヒドロキシリジンである）、ペプチドAla-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 19)（最も多い形成位置８、１４、２３、２９及び４１は４−ヒドロキシプロリンであり、位置２６はヒドロキシリジンである）、ペプチドAla-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 20)（最も多い形成位置４、１０及び２２は４−ヒドロキシプロリンであり、位置１０はヒドロキシリジンである）、ペプチドPro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 21)（最も多い形成位置２、８及び２０は２，３又は４−ヒドロキシプロリンであり、位置５は４−ヒドロキシリジンである）、及びペプチドGlu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-GIy-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 22)（最も多い形成位置２はヒドロキシリジンであり、位置５及び１７は４−ヒドロキシプロリンである）。
【００６２】
ペプチドSEQ ID NO: 19は、イヌの尿から最も多く検出された、タイプＩＩコラーゲン・ネオエピトープ（neoepitope）ペプチドである。
【００６３】
次のペプチドは、関節炎の症状及び徴候を示すネコの尿から最も多く検出された、ペプチドである。ペプチドLys-Gly-Ala-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 23)（最も多い形成位置１０、１６、２５、３１及び４３は４−ヒドロキシプロリンであり、位置２８はヒドロキシリジンである）、ペプチドAla-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 24)（最も多い形成位置８、１４、２３、２９及び４１は４−ヒドロキシプロリンであり、位置２６はヒドロキシリジンである）、ペプチドLeu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-GlyPro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 25)（最も多い形成位置８、１４及び２６は、４−ヒドロキシプロリンであり、位置１１はヒドロキシリジンである）、ペプチドAla-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(SEQ ID NO: 26)（最も多い形成位置４、１０及び２２は、４−ヒドロキシプロリンであり、位置７はヒドロキシリジンである）、ペプチドPro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 27)（最も多い形成位置２、８及び２０は４−ヒドロキシプロリンであり、位置５はヒドロキシリジンである）、及びペプチドGlu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 28)（最も多い形成位置２はヒドロキシリジンであり、位置５及び１７は４−ヒドロキシプロリンである）。
【００６４】
ペプチドSEQ ID NO: 24は、ネコの尿から最も多く検出された、タイプＩＩコラーゲン・ネオエピトープ（neoepitope）ペプチドである。
【００６５】
次のペプチドは、関節炎の症状及び徴候を示すウマの尿から最も多く検出された、ペプチドである。ペプチドLeu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 11)（最も多い形成位置８、１４及び２６は、４−ヒドロキシプロリンであり、位置１１はヒドロキシリジンである）、ペプチドLys-Gly-Ala-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 29)（最も多い形成位置１０、１６、２５及び３１は、４−ヒドロキシプロリンであり、位置２８はヒドロキシリジンである）、ペプチドAla-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 30)（最も多い形成位置８、１４、２３、２９及び４１は、４−ヒドロキシプロリンであり、位置２６はヒドロキシリジンである）、ペプチドAla-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 31)（最も多い形成位置４、１０及び２２は４−ヒドロキシプロリンであり、位置７はヒドロキシリジンである）、ペプチドPro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 32)（最も多い形成位置２、８及び２０は４−ヒドロキシプロリンであり、位置２６はヒドロキシリジンである）、及びペプチドGlu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 33)（最も多い形成位置２はヒドロキシリジンであり、位置５及び１７は４−ヒドロキシプロリンである）。
【００６６】
ペプチドSEQ ID NO: 30は、ウマの尿から最も多く検出された、タイプＩＩコラーゲン・ネオエピトープ（neoepitope）ペプチドである。
【００６７】
次のペプチドは、アジュバント関節炎の症状及び徴候を示すネズミの尿から最も多く検出されたペプチドである。ペプチドLeu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Ala-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 8)（最も多い形成位置８、１４及び２６は４−ヒドロキシプロリンであり、位置１１はヒドロキシリジンである）、ペプチドAla-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 39)（最も多い形成位置２、８及び２０は、４−ヒドロキシプロリンであり、位置５はヒドロキシリジンである）、ペプチドGlu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 40)（最も多い形成位置２はヒドロキシリジンであり、位置５、１７及び４は４−ヒドロキシプロリンである）、ペプチドGly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 41)（最も多い形成位置３及び１５は４−ヒドロキシプロリンである）、及びペプチドAsp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 42)（位置１０は４−ヒドロキシプロリンである）。
【００６８】
次のペプチドは、関節炎の症状及び徴候を示すモルモット（guinea pig：モルモット）から最も多く検出された、タイプＩＩコラーゲンのペプチドである。Val-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Val-Ser-Gly-Ala-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 43)（最も多い形成位置８、１４、２３、２０及び４１は４−ヒドロキシプロリンであり、位置２６はヒドロキシリジンである）。
【００６９】
翻訳後修飾、４−ヒドロキシプロリン、及びリジンの水酸化は、異なった種類で様々なレベルで現われる、ということが知られている。当初の翻訳されたペプチドは、翻訳後修飾の置換と同様に、被験体の尿から発見されるであろう。また、それらは、本発明の実施形態に含まれるであろう。
【００７０】
これらの分解ペプチドは、タイプＩＩコラーゲンのコラゲナーゼ（特にマトリックス・メタロプロテイナーゼ、さらにはマトリックス・メタロプロテイナーゼ−１３（ＮＭＰ１３））による分解の結果であると考えられる。したがって、ペプチドSEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 43、及び特にそれらの翻訳後修飾は、酵素活性及び／又はタイプＩＩコラーゲン破壊により特徴付けられる病気又は状態のマーカーとして、生体サンプルから検出される。ペプチドの特定可能な派生物又は修飾も同様に、マーカーとして機能する。また、本発明の範囲に含まれる。
【００７１】
ペプチドSEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、 SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、SEQ SD NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ED NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ED NO: 42、SEQ ID NO: 43、及びそれらの翻訳後修飾は、一般に、下記の分析的な検出方法により検出される。
【００７２】
生体サンプル（尿、血漿、全血、滑液）は、被験体から集められる。
【００７３】
サンプル内のペプチドの相対分子量は第１段階の質量分析により測定され、その後、ペプチドは断片化され、フラグメントイオンは第２段階のタンデム質量分析により測定される。詳細については後記する。例としては、関節炎の症状及び徴候を示す被験体の生体サンプル内でピコモルからナノモル量で検出されるペプチドSEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3及びSEQ ID NO: 4の翻訳後修飾の類似物は、約９００から約１０００の範囲の質量電荷比を有する。また、この範囲のプロリン（他の例ではリジン）の翻訳後修飾に応じた質量電荷比の既知のバリエーションを含む。これらのペプチドの電荷は＋３である。下記の実施例でさらに詳しく説明するが、ペプチドSEQ ID NO: 2から最も多く検出された翻訳後修飾の類似物の相対質量／電荷は、９１４．４であり、電荷は＋３である。ペプチドSEQ ID NO: 3から最も多く検出された翻訳後修飾の類似物の相対質量／電荷は、９１８．７であり、ペプチドSEQ ID NO: 4から最も多く検出された翻訳後修飾の類似物の相対質量／電荷は、９１３．４である。
【００７４】
ペプチドは、サンプルの生体基質成分から従来の手法により分離することができる。例えば、クロマトグラフ又は電気泳動の分離を使用することができる。他の従来の分離又はクリーンアップ方法は、本発明により提供される。液体クロマトグラフ分離では、標的集団のペプチドを含んでいる溶離剤は、従来の液体クロマトグラフィ質量分析インターフェースを介して、質量分析計に導入される。
【００７５】
ペプチドは、従来の手法を用いて、衝突細胞内の中性ガスによる衝突活性化により断片化される。結果として、対応するフラグメントイオンを作成するための、ペプチドの衝突誘起解離が生じる。フラグメントイオンのスペクトラルを分析する。ペプチドは、Ｃ末端配列Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 1)（第３の位置にあるプロリンは翻訳後修飾されており、ヒドロキシプロリンは質量電荷比により特徴付けられたイオンを生成するために断片化されている）を有する。例としては、SEQ ID NO: 1の第３の位置にあるプロリンは４−ヒドロキシプロリンであり、特徴付けられた断片の各質量は、約ｍ／ｚ３０１、４７１及び５６８である。こられのＣ末端配列の特徴付けられた断片は、プロリンのＮ末端側のペプチド結合の顕著な分解の結果である。Ｃ末端配列Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 1)を有するペプチド、即ち、非修飾形態は、下記の配列のフラグメントイオンを作成するために、断片化される。配列Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 5)（約３０１の質量を有する）、配列Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 6)（約４５５の質量を有する）、及び配列Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 7)（約５５２の質量を有する）。
【００７６】
特徴付けられた生成イオンの同定は、Ｃ末端配列Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 1)又はその翻訳後修飾の存在を強く示すものである。したがって、同様に、ペプチドSEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、及びSEQ ID NO: 7は、それら自体が、タイプＩＩコラーゲン分解のマーカーである。
【００７７】
後記するように、生体サンプル内の断片化されたペプチドのさらなる同定により、関節症の症状及び徴候があると医学的に診断されたヒト被験体では、主な分解ペプチドは、Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ala-Glu-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 2)（位置１４及び２６のプロリンは４−ヒドロキシプロリンである）、及びAla-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Glu-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly- Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ala-Glu-Gly-Pro-ProGly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 16)（位置８、１４、２３及び４１は４−ヒドロキシプロリンである）である。ペプチドSEQ ID NO: 16は、その２つの中で最も多く検出される。
【００７８】
翻訳後修飾されたペプチドSEQ ID NO: 3及びSEQ ID NO: 19は、イヌから最も多く検出されるペプチドである（ペプチドSEQ ID NO: 19の方がより多く検出される）。翻訳後修飾されたペプチドSEQ ID NO: 4及びSEQ ID NO: 35は、ウシから検出される主な分解ペプチドである（ペプチドSEQ ID NO: 35の方がより多く検出される）。翻訳後修飾されたペプチドSEQ ID NO: 24は、ネコから最も多く検出されるペプチドであり、翻訳後修飾されたペプチドSEQ ID NO: 30は、ウマから最も多く検出されるペプチドであり、翻訳後修飾されたペプチドSEQ ID NO: 42は、ネズミから最も多く検出されるペプチドであり、翻訳後修飾されたペプチドSEQ ID NO: 42は、モルモット（guinea pig）から検出される主なペプチドである。なお、これらの被験体は、全て、軟骨組織の悪化又は関節症の症状及び徴候を示している。
【００７９】
また、これらの列挙したペプチドは、前記した各動物のサンプルから検出された主なものであり、より好ましい生体マーカーとしての役割を果たす。ここで列挙された全ての発見されたペプチド配列は、後記するような有用性を有する。
【００８０】
任意のタンパク質分解酵素がタンパク質やペプチドを分解させると、結果として、特徴付けられたＣ末端、Ｎ末端及びそれらの起こり得る翻訳後修飾が発生する。これは、アミノ酸配列内では、特定の酵素がタンパク質を特定の位置で分解させるという事実のためである。特定のＣ末端を有するペプチドの断片化は、特定の質量電荷比を有する特徴付けられた断片の衝突活性化を引き起こす。つまり、断片化により、各Ｃ末端はそれぞれ自身の指紋を持つことができる。したがって、前記した方法は、タンパク質分解の結果生じた、特徴付けられた生成イオンに断片化される既知のＣ末端を残している、任意のペプチドのアミノ酸配列を測定するために使用することができる。
【００８１】
本発明に係る方法は、タイプＩＩコラーゲンから生じるペプチド、又は明細書中で配列識別番号により記載されている他の特定ペプチドの同定及び定量化に限定されるものではない。本発明に係る分析方法は、タイプＩＩコラーゲン以外のタンパク質の分解、又はコラゲナーゼ（特にメタロプロテイナーゼ−１３：ＭＭＰ−１３）以外の酵素により生成される、タンパク質分解酵素分解生成物の存在を検出するために使用することができる。一例としては、本発明に係る方法は、マトリックス・メタロプロテイナーゼ−１：（ＭＭＰ−１）やマトリックス・メタロプロテイナーゼ−８：（ＭＭＰ−８）のような他のマトリックス・メタロプロテイナーゼによる分解により生成されるタンパク質分解生成物の同定に使用することができる。
【００８２】
本発明に係る方法によりペプチドを発見するいくつかの実施例を以下に示す。
【実施例】
【００８３】
《実施例１》
（ウシ亜科のタイプＩＩコラーゲンのペプチド断片の同定）
変形性関節症の症状及び徴候を示すウシの尿の中に存在するペプチドSEQ ID NO: 3の翻訳後修飾を、次の手順により測定する。
１．変形性関節症の症状及び徴候を示すと認められた被験体から、尿を収集する。
２．酢酸アンモニウムにより、尿のｐＨを７．１に調整する。
３．予備の混合モードのイオン交換逆相カラムクロマトグラフィ・カラムを使用して、サンプルを断片化する。
４．カラムからサンプルを溶出させる。
５．サンプルを乾燥させる。
６．適したカラムクロマトグラフィ・バッファ内で、水を加えてサンプルを元に戻す。
７．下記のような液体クロマトグラフィタンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ−ＭＳ）により、サンプルを分析する。
（ａ）サンプルペプチドを衝突活性化により断片化する。
（ｂ）ｍ／ｚ３０１、４７１及び５６８の特徴付けられたペプチド断片を、主な断片として特定する。
（ｃ）ｍ／ｚ３０１、４７１及び５６８の断片化されたペプチドを、Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 3)（位置１４及び２６のプロリンは４−ヒドロキシプロリンである）の翻訳後修飾として同定する。
【００８４】
Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 1)Ｃ末端（位置３のプロリンは水酸化されている）を有する、タイプＩＩコラーゲンのペプチドの断片（SEQ ID NO: 3）を図１に示す。垂直線（Ｙ軸）は、特定の質量電荷比が検出されたフラグメントイオンの量（強度）を示し、検出された全てのイオン全体のパーセントとして表されている。水平線（Ｘ軸）は、検出されたフラグメントイオンの質量電荷比を示す。尿サンプル内の主な断片生成物は、ｍ／ｚ３０１、４７１及び５６８であると同定される。
【００８５】
タンパク質データベース内の全てのタンパク質を、全てのペプチド結合について分解させることにより（酵素の特異性は無い）、ペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトラル内のフラグメントイオンを、シリコン内で生成された理論的配列イオンと一致させるために、ソフトウエアが使用される。ソフトウエアは、各アミノ酸間で、期待されるペプチドの分解に基づく、無傷なペプチド及びそのフラグメントイオンの観測された理論的な分子量を一致させる。ソフトウエアは、観測されたデータを、既知の哺乳類のタンパク質の広範囲なタンパク質データベースにおける全てのタンパク質に由来する全ての可能性のあるペプチドと一致させる。
【００８６】
プログラムは、質量ｍ／ｚ９１８．７、電荷３＋を有するペプチド（その断片は、ｍ／ｚ３０１、４７１及び５６８においてイオンを生成する）は、Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 3)（位置１４及び２６のプロリンは４−ヒドロキシプロリンである）の翻訳後修飾であることを決定する。
【００８７】
ソフトウエアが正しいペプチドを決定することを証明するために、標準となるペプチドを合成し、そのＬＣ残留時間とＭＳ／ＭＳスペクトルを、尿内で検出されたペプチドのそれと一致させる。こうして、分析データは一致する。
【００８８】
《実施例２》
（ヒトのタイプＩＩコラーゲンのペプチド断片の同定及び定量化）
変形性関節症の症状及び徴候を示すと診断されたヒト被験体の尿サンプル内におけるペプチドSEQ ID NO: 2の存在を確認するために、実施例１で用いられた手法が使用される。
【００８９】
図２はヒト被験体に由来するサンプル内のペプチドの断片を示す。図２に示すように、ペプチドは、ペプチドLeu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ala-Glu-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 2)（位置１４及び２６のプロリンは４−ヒドロキシプロリンである）の翻訳後修飾である。ペプチドSEQ ID NO: 2は、質量／電荷が、９１４．４／３＋である。断片は、ｍ／ｚ３０１、４７１及び５６８において、それぞれSEQ. ID NO: 5、SEQ ID NO: 6及びSEQ ID NO: 7に対応する、特徴付けられた生成イオンを生成する。
【００９０】
《実施例３》
（イヌの尿サンプルのタイプＩＩコラーゲンの同定及び定量化）
変形性関節症の症状及び徴候を示すと診断されたイヌ被験体から得られた尿サンプル内におけるペプチドLeu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 4)（位置２６のプロリンは４−ヒドロキシプロリンである）の存在を確認するために、実施例１で用いられた手法が使用される。
【００９１】
図３はサンプル内のペプチドの断片を示す。図３に示すように、ペプチドは、ペプチドLeu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 4)（位置１４及び２６のプロリンは４−ヒドロキシプロリンである）の翻訳後修飾である。ペプチドSEQ ID NO: 4は、質量／電荷が、９１３．４／３＋である。断片は、ｍ／ｚ３０１、４７１又は４５５、及び５６８又は５５２において、それぞれSEQ. ID NO: 5、SEQ ID NO: 6及びSEQ ID NO: 7に対応する、特徴付けられた生成イオンを生成する。イヌの尿内の少なくとも２つの翻訳後修飾形態に、同一のペプチド配列が存在する。第１の形態では、上側の質量分析スペクトルに示すように、プロリン−１４が水酸化されている。そして、第２の形態では、下側の質量分析スペクトルに示すように、プロリン−２６が水酸化されている。
【００９２】
実施例１は、ウシに関して、タンパク質分解酵素によって分解することにより、ウシの尿内におけるタイプＩＩコラーゲン由来の特定の及び主なペプチド断片の検出について説明している。ウシは、アミノ配列Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 3)及び特にそれらの翻訳後修飾を有している。実施例２は、ヒトに関して、タンパク質分解酵素によって分解することにより、ヒトの尿内におけるタイプＩＩコラーゲン由来の特定の及び主なペプチド配列Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ala-Glu-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 2)の検出について説明している。実施例３は、イヌに関して、タンパク質分解酵素によって分解することにより、イヌの尿内におけるタイプＩＩコラーゲン由来の特定の及び主なペプチド断片の検出について説明している。イヌは、アミノ配列Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 4)又はそれらの翻訳後修飾を有している。全ての３つのペプチドは、位置８、１４及び２６でプロリンが４−ヒドロキシプロリンである、及び位置１１でリジンが４−ヒドロキシリジンである修飾を含むことができる。動物の種ごとに独立して、主なペプチドの断片化により、約３０１、４７１及び５６８の質量電荷比を有するフラグメントイオンが生じるということが知られている。もともとの転写ペプチドの断片化により、約３０１、４５５及び５５２の質量電荷比を有する特徴付けられたフラグメントイオンが生じる。このことは、本発明の範囲に含まれる。
【００９３】
他の特徴付けられたフラグメントイオンは、与えられた種で診断される。一例として、図１は、３９６及び１２１９の質量電荷比を有する特徴付けられたフラグメントイオンは、ウシのサンプル内で検出されたペプチドSEQ ID NO: 3の断片化により生じることを示す。また、図２は、４０７及び１２２２の質量電荷比を有する特徴付けられたフラグメントイオンは、ヒトのサンプル内で検出されたペプチドSEQ ID NO: 2の断片化により生じることを示す。また、図３は、３０１、４７１及び５６８の質量電荷比を有するフラグメントイオンは、本発明の好ましい実施形態である。また、他の特定のフラグメントイオンは、その種からのサンプルを分析する際の有用性を有している。このことは、本発明の範囲に含まれる。
【００９４】
ペプチドSEQ ID NO: 11及びその翻訳後修飾が、ウマ由来の試料内で検出されることが予測される。このことは実施例１０において詳述する。また、ペプチドSEQ ID NO: 9が、ウサギ由来の試料内で検出されることが予測される。また、ペプチドSEQ ID NO: 10が、ネズミ由来の試料内で検出されることが予測される。それらのペプチドの翻訳後修飾も同様である。なお、これは、これらの種が、タンパク質分解の症状及び徴候を示す、及び関節症の病気の症状及び徴候を示す前の状態の場合である。
【００９５】
例えば、Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ala-Glu-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 2)のような特定ペプチドが、ヒトの生体流動体サンプル内で、タイプＩＩコラーゲン分解ペプチドとして同定されることが分かっているので、与えられたサンプルのペプチドの相対存在量は、被験体内に存在するタイプＩＩコラーゲン分解の範囲を示す。
【００９６】
ペプチドSEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 9、及びSEQ ID NO: 10は、下記の手法により同定及び定量化される。
【００９７】
生体サンプル、例えば尿を、被験体より収集する。ｍ／ｚが（Ｍ＋３Ｈ）に対して約９１８．７、３＋（SEQ ID NO: 3）の質量を有するペプチド（前記した標的ペプチド）を、従来の手法を用いてサンプルから抽出する。下記の実施例４を参照されたし。サンプルを量が分かっている合成ペプチド（内的標準として知られている）と混合させる。合成ペプチドは、標的ペプチドの配列と非常に良く似た配列を有している。例えば、ペプチドVal-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ala-Glu-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO. 14)を内的標準として用いることができる。代わりに、同一の配列の安定同位体標識ペプチド、又は非類似の構造の化合物を、従来技術を用いて、生体サンプルと混合させ、内的標準として使用する。分析のため、サンプルを準備し、ＬＣ−ＭＳ−ＭＳに導入する。標的ペプチドの存在は、３つの基準により確認される。１）適当な時間でＬＣカラムから溶出する。２）正しい分子量である。３）衝突活性化により、ｍ／ｚが約３０１、４７１及び５６８である特徴付けられた断片、又は他の既知であるペプチドのフラグメントイオンを生成する。図５は、代表的な、標的ペプチド及び内的標準の溶出像を表すクロマトグラムである。標的ペプチドの量と、標準ペプチドの量との比較は、サンプル内の標的ペプチドの相対存在量を示す内的標準の量により規格化される。さらに、サンプル内での標的ペプチドの相対存在量を得るために、標準ペプチドの量を意味する曲線の下側の領域と、標的ペプチドの量を意味する曲線の下側の領域とを比較する。標準及び標的ペプチドの領域は、サンプル間における抽出効率、検出、及び他の可能性のある変量のばらつきを調整するために、内的標準ペプチドの領域と比較して標準化される。もちろん、生体サンプル内の標的ペプチドを定量化するための許容範囲な方法は、本発明の範囲に含まれる。人の尿内に存在するタイプＩＩコラーゲンのペプチド生体マーカーの一般的な計量手法は、代表的な手法として下記の実施例４で詳述する。
【００９８】
《実施例４》
（人の尿内に存在するタイプＩＩコラーゲンのペプチド生体マーカーの一般的な計量手法）
１．まず、ポリプロピレン・チューブ内に、尿を収集する。サンプルは使用されるまで、摂氏−８０度に冷凍される。
２．従来技術の標準的な手法を用いて、クレアチニン計量のために、１００ｍＬの尿をアリコートする。
３．合成ペプチド標準を使用して３０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬの標準液を用意する。
４．内的標準（類似ペプチド）を各尿サンプル３０ｍＬに混合させて、最終濃度が１．０ｎＭとなるように標準化する。
５．尿溶液を、混合相（ＲＰ及びＡＥＸ）の予備クロマトグラフィにより抽出する。
（ａ）１０ｍＬのＭｅＯＨによりカートリッジを平衡させる
（ｂ）カートリッジを１０ｍＬの５０ｍＭ  ＮＨ４０Ａｃ  ｐＨ７により条件付ける。
（ｃ）サンプルを入れる（ｐＨ７）
（ｄ）１０ｍＬの５０ｍＭ  ＮＨ４０Ａｃ  ｐＨ７で洗浄する。
（ｅ）１０ｍＬの５％  ＭｅＯＨで洗浄する。
（ｆ）１ｍＬの５％  ギ酸、９５％  ＭｅＯＨで溶出させる
６．溶離液を乾燥させた後、１００ｍＬの２％ギ酸溶液により戻す。
７．溶液をＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより分析する。
８．サンプル内のコラーゲン・ペプチドを、それらの標準と対応して、関連ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより定量化し、内的標準の対応のために標準化する。
９．最終的なペプチド濃度をクレアチニン・レベルとなるように標準化する。
【００９９】
（標準曲線の作成）
１．コラーゲンＩＩペプチドの原液の作成：１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、及び１０μｇ／ｍＬ
２．内的標準の原液の作成：３μｇ／ｍＬ
３．３０ｍＬの尿に１００μＬの内的標準を添加する
４．１００ｐｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、及び１００ｎｇ／ｍＬ標準を得るために、それぞれ、３００μＬの１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、及び１０μｇ／ｍＬを、３０ｍＬの尿に添加する。３０ｐｇ／ｍＬの標準を得るために、９０μＬの１０ｎｇ／ｍＬの原液を、３０ｍＬの尿に添加する。
【０１００】
図６は、タイプＩＩコラーゲン・ペプチド（SEQ ID NO: 2）を測定するために使用される、９１４／５６８イオン対に対する抽出イオンクロマトグラムの比較を示す図である。下側のスキャンは、関節症の症状及び徴候を示さないヒト被験体の尿からは、５．７分で溶出するペプチドは検出されないことを示す。真ん中のスキャンはペプチドの検出レベルを示し、上側のスキャンはこのペプチドの合成類似化合物が同時に溶出することを示す。図７は、３０ｐｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬの範囲での様々な濃度の対照としてのヒトの尿に混合されたタイプＩＩコラーゲンの標準曲線を示す。正確な定量化のために、反応はこの濃度の範囲を超えて直線状に延びる。
【０１０１】
図８は、異なる４頭のウシの尿におけるペプチドSEQ. ID. NO: 3（位置１４及び２６は４−ヒドロキシプロリンを有する）の翻訳後修飾の相対存在量を示す棒グラフである。ペプチドの相対存在量は、図４に示したグラフと略類似となるように図示した。曲線の下側の測定された領域により決定される標的ペプチドの相対存在量は棒グラフと対比される。ウシ１は関節症の症状及び徴候を示す。ウシ２は関節症の初期症状及び徴候を示す。ウシ３及び４は関節症の症状及び徴候を示さない。標的ペプチドの相対存在量は、ウシ１はウシ２よりも約５倍大きい。ウシ２のペプチドSEQ. ID. NO: 3の翻訳後修飾は、ウシ３及び４のそれよりも相対存在量が大きい。
【０１０２】
図９は、ヒトの尿におけるペプチドSEQ. ID. NO: 2（位置１４及び２６は４−ヒドロキシプロリンを有する）の翻訳後修飾の相対存在量を示す棒グラフである。図９に示すように、通常のヒトの尿におけるペプチドの相対存在量は検出されない（０で示す）。また、変形性関節症の症状及び徴候を示すヒト被験体の尿におけるペプチドの相対存在量は８０００である。
【０１０３】
図１０は、変形性関節症の症状及び徴候を示すヒト被験体の尿におけるタイプＩＩコラーゲン・ペプチド（SEQ ID NO: 2）の経時的なレベルを示す棒グラフである。ペプチドのレベルは、１４日間で、６０〜２００ｐｍｏｌ／ｍＬで変化する。また、対照としてのヒトの尿サンプルよりも、数値が高い。グラフにプロットされた結果は、生体マーカーとしてのペプチドの有効性と有用性を示す。生体マーカーのレベルの経時的な測定は、病気の進行は又は回復を示すであろう。生体マーカーのレベルの変化は、治療の有効性の評価に使用することが可能である。例えば、図９を参照して、ＭＭＰ−１３抑制剤による被験体の成功した治療は、結果として、患者から採取した生体サンプルにおけるタイプＩＩコラーゲン・ペプチドの相対レベルを減少させるであろう。当然のことながら、これらの新規である生体マーカーの使用は、生体マーカーの有用性の実例となる。任意の生体マーカーの有用な用途と、ここに記載した同定及び定量化の方法は、本発明の範囲に含まれる。
【０１０４】
また、当然のことながら、当業者であれば、認められた技術を用いて、特徴付けられた及び特定可能な本発明の新規である生体マーカーの派生物及び修正物を生成することが可能であろう。例えば、SEQ ID NO: 2〜SEQ ID NO: 43で表される任意のペプチド又はそれらの翻訳後類似物は、容易に特定可能な１つ以上の派生物を生成させるために、酵素的に又は化学的に分解させることができる。そのような派生物は、結果として、生体マーカーとして機能することができる。同様に、例えば、SEQ ID NO: 2〜SEQ ID NO: 43で表される任意のペプチド又はそれらの翻訳後類似物は、例えば、置換、添加又は１つ以上のアミノ酸残基を除去して変化させることにより、修飾することができる。その結果として、特定可能な修飾されたペプチドは、生体マーカーとして機能することができる。
【０１０５】
また、ペプチドの物理的性質（例えば、疎水性や分子量など）を変更することにより、標的ペプチドの精製又は検出を助長することができることは、当業者にとっては容易に理解できることであろう。それらの変更は、標的ペプチドの特定アミノ酸を修飾するべく、生体流動体（尿や血を含む）又は生体流動体の抽出物の誘導体化により行うことができる。修飾される位置は、ヒドロキシプロリン又はセリン上の水酸基；リジン又は標的ペプチドのＮ末端上のアミノ基；アルギニン上のグアニジル（guanidyl）基；グルタミン上のカルボクサミジル（carboxamidyl）基；アスパラギン酸、グルタミン酸、及び標的ペプチドのＮ末端上のカルボキシル基を持つアミノ基；それらの修飾における任意の組み合わせ、である。ただし、これらに限定されるものではない。
【０１０６】
化学誘導体化によるアミノ酸側鎖の修飾の例は、参考文献「D. Knapp, Handbook of Analytical Derivatization Reactions, John Wiley and Sons, Inc. (1979)」に記載されており、当業者に知られている。なお、この参考文献は引用することをもって本発明の一部とする。アミノ酸側鎖の化学誘導体化に使用される試薬は、市販されている。試薬の製造者と知られている一例としては、「Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois」がある。
【０１０７】
本発明のペプチドを含むアミノ酸は、生体流動体又は抽出物内で、科学的不安定性に起因して、修飾される。修飾の例としては、アスパラギン酸をイソアスパラギン酸に変換することや、グルタミンの環化が挙げられる。これらの科学的な変換により修飾されたペプチドに対する、本発明の定量化は、本発明の範囲に含まれる。
【０１０８】
本発明のペプチドは、短鎖ペプチド（その後、精製又は検出される）を生成するべく、科学的又は酵素的な手法により加水分解される。一例としては、アミノ・ペプチダーゼ、カルボキシ・ペプチダーゼ、arg-Cプロテイナーゼ（例えば、クロストリパイン（Clostridiopeptidase B）、asp-Nエンドペプチターゼ、キモトリプシン、lys-Cプロテイナーゼ、パパイン・ペプシン、プロリン・エンドペプチターゼ、プロテイナーゼ・Ｋ、ブドウ球菌性のペプチダーゼＩ、サーモリシン、トロンビン、及びトリプシンを含んでいるプロテアーゼが、短い形態（その後検出され、インビボでコラゲナーゼ活性のマーカーとして定量化される）を生成するべく、標的ペプチドを加水分解するのに使用される。参考文献「B. Keil, Specificity of proteolysis. Springer-Verlag Berlin-Heidelberg-NewYork, pp. 335. (1992)」を参照されたい。なお、この参考文献は引用することをもって本発明の一部とする。また、一例としては、alys-Cプロテイナーゼが、その後定量化される２つの短鎖ペプチドを生成するべく、リジンのＣ末端側の標的ペプチドを加水分解するのに使用される。また、グルタミル・エンドペプチターゼ（Glu-C又はV8）が、その後定量化することができる２つの短鎖ペプチドを生成するべく、グルタミン酸又はアスパラギン酸のＣ末端側で標的ペプチドを分解させるのに使用される。参考文献「J. Birktoft and K. Breddan, Glutamyl endopeptidases, Methods of Enzymology, 244: 114-126 (1994)」、「J. Houmard and G. Drapeau, Stapylococcal protease: a proteolytc enzyme specific for glutamoyl bonds, Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America, 69: 3506-3509 (1972)」を参照されたい。なお、この参考文献は引用することをもって本発明の一部とする。本発明は、標的ペプチドの加水分解生成物の検出及び定量化（本明細書では上記のプロテアーゼの使用により具現化された）、を含むが、それに限定されるものではない。さらに、定量化するための短鎖ペプチドを生成すべく、アスパラギン酸の残基に隣接した標的ペプチドを分解させるのにギ酸を使用することができる。参考文献「Li, A. et al., CAeemical cleavage at aspartyl residuesforproteir identification, Anal. Chem, 73: 5395-402 (2001)」を参照されたい。なお、この参考文献は引用することをもって本発明の一部とする。
【０１０９】
以上、本発明に係るペプチドの修飾及び派生物について説明した。なお、ここでは、当業者にとっては自明な全ての可能性のある修飾及び派生物は挙げてはいないが、本発明は、これらの検出及び／又は定量化、及び本発明に係るペプチドの他の任意の修飾及び派生物を含む。また、本発明は、生体マーカーとしての定量化されるべく使用される、それらの派生又は修飾されたペプチドを含む。
【０１１０】
本発明での分析方法は、タイプＩＩコラーゲン以外のコラーゲンの破壊の生体マーカーとしての役割を果たすペプチドの、同定及び定量化に使用することができる。ペプチド配列Gly-Thr-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 12)は、ペプチド・データベースによる分析に基づく、タイプＩコラーゲンのメタロプロテイナーゼ分解の結果として得られる、予期される生体マーカー・ペプチドのＣ末端配列である。図１１は、合成されたSEQ ID NO: 12の衝突活性化により得られるフラグメントイオンの特性を示す。タイプＩコラーゲン破壊ペプチドは、生体サンプル内で、特徴付けられたフラグメントイオン（非水酸化形態ではｍ／ｚ３０１及び４５５、水酸化形態ではｍ／ｚ３０１及び４７１）に基づく、本発明に係る方法を用いて同定することができる。同様に、図１２は、タイプＩＩＩコラーゲンの酵素分解により得られるペプチドＣ末端配列Gly-Ala-Pro-Gly-Pro-Leu-Gly (SEQ ID NO: 13)により、本発明に係る方法により分析した際に、同定可能な特徴付けられたフラグメントイオンを生成することを示している。タイプＩＩＩコラーゲンのフィンガープリント・フラグメントイオンは、非水酸化形態ではｍ／ｚ２８６及び４４０であり、水酸化形態ではｍ／ｚ２８６及び４７１である。図１２では、特にタイプＩコラーゲン及びタイプＩＩＩコラーゲン由来の破壊ペプチドをそれぞれ同定するのに用いられる特徴付けられたフラグメントイオンだけを同定するのではなく、本発明に係る方法を任意のコラーゲンの特徴付けられた分解生成物の同定に広く用いることができるという事実を実証する。
【０１１１】
《実施例５》
（タイプＩＩコラーゲン・生体マーカー・ペプチドの同定及び定量化方法の他の実施例）
〈サンプル作成〉
１．標準検定曲線を作成するため、標準的なヒトの女性（３０歳）の尿２ｍＬを、５０ｎｇの内的標準に混合させる。内的標準は、５ｎｇ〜１００ｎｇのタイプＩＩコラーゲン・３０アミノ酸ペプチドSEQ ID NO: 2（２ヒドロキシプロリン）、及び４５アミノ酸ペプチドSEQ ID NO: 16（５ヒドロキシプロリン）ペプチド（Ｎ＝２）を含んでいる、重水素で置換された３０アミノ酸ペプチドSEQ ID NO: 2及び４５アミノ酸ペプチドSEQ ID NO: 16）である。
２．未知の尿サンプル（２ｍＬ）を内的標準５０ｎｇに混合させる。標準尿及び未知の尿を、Centricona細胞膜遠心分離フィルタ装置（YM-3,2mL capacity with 3000 MW cut off, Millipore Co. , Bedford, MA）にセットする。そして、Speedfugea （HSC, 10KA, Savant Instruments, Farmingdale, NY）を使用して、水冷しつつ、５０００ｒｐｍ（５０００ｇ）で遠心分離する。尿をろ過する前に、各Centriconaを、５０ｕＬの１％ギ酸溶液により、予め湿らす。
３．尿の９０％が遠心分離によりろ過された後、２００ｕＬの残留溶解溶液が保存容器内に残る。容器に、１％（ｖ／ｖ）のギ酸を含んでいる１ｍＬの水を添加した後、さらに、約２００ｕＬの溶解溶液が残るまで遠心分離する。
４．保存容器内の溶解溶液を反応容器に移し、窒素下で、乾燥させる。各乾燥したサンプルを、１％（ｖ／ｖ）のギ酸を含んでいる１００ｕＬの水に溶解させる。そして、ＨＰオートサンプラー容器に移す。ろ過されたものは廃棄される。
【０１１２】
（ＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）
１．オートサンプラー容器由来のアリコート・サンプル（２０ｕＬ）を、Betasil C-18カラム（ThermoHypersil-Keystone Co. , Bellefonte, PA, 5 micron particle size, 200 x 2 mm）に注入する。前記カラムは、Rheas 2000 HPLCシステム（Leap Technologies, Carrbore, NC）に接続されており、ABI Sciex 4000 MS/MSスペクトロメータとインターフェースで接続されている。
２．移動相（Ａ＝水／１％ギ酸；Ｂ＝アセトニトリル／１％ギ酸）のＢを、５％から３５％にランピングする（５分で行い、その後２分保つ）ことにより、溶出物が得られる。
３．次のサンプルを注入する前に、カラムを、ランピングによりＢの勾配を５％戻すことで、再び平衡にする（０．５分で行い、その後４．５分保つ）。
４．３つのイオン対（1039/301、1039/471、1039/568；1040/306、1040/476、1040/573；914/301、914/471、914/568；916/306、916/476、916/573）は、それぞれ、４つのペプチド（45mer (5OH) (SEQ ID NO: 16)、d5-45mer (5OH) (SEQ ID NO: 16)、30mer (20H) (SEQ ID NO: 2)、及び d5-30mer (2OH) (SEQ ID NO: 2)内的標準）を、２００ｍｓの滞留時間で、低解像モードでモニタする。
５．各ペプチドにおける３つのイオン対の合成ピーク領域は、Sciex Analyst 1.2ソフトウエアにより測定され、合計される。２つの分析ペプチドの合成ピーク領域は、重水素で置換された内的標準ペプチドの合計された合成ピーク領域により標準化される。そして、未知のサンプルにおける30mer (SEQ ID NO: 2)及び45mer (SEQ ID NO: 16)タイプＩＩコラーゲン・ペプチドの量を測定すべく、標準検定曲線と比較される
【０１１３】
ＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析による各サンプルの分析は重複して行う。
【０１１４】
実施例５において説明した方法は、ヒトの尿サンプルを用いて説明されたが、その結果は、実施例６で詳述される。この方法は、下記の実施例７〜１２で説明される他の種の尿におけるペプチド・生体マーカーの同定及び定量化に使用することができる。また、特定の種の標準ペプチドが、他の種のペプチド・生体マーカーの存在を試験する際に用いることができるのは、当業者にとって自明のことである。
【０１１５】
《実施例６》
（ヒトの尿内に存在するタイプＩＩコラーゲン・ペプチドの同定及び定量化）
ヒトの尿内に存在するさらなるタイプＩＩコラーゲン・ペプチド断片の同定及び定量化は、実施例５で説明した手法により行われる。下記のペプチドは、関節症の症状及び徴候を示すと医学的に診断されたヒト被験体から、検出可能な量が検出される。
【０１１６】
Lys-Gly-Ala-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Glu-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ala-Glu-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 15)（最も多い形成位置１０、１６、２５、３１及び４２は４−ヒドロキシプロリンである）、
Ala-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Glu-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ala-Glu-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 16)（最も多い形成位置８、１４、２３、２９及び４１は４−ヒドロキシプロリンである）、
及びGly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ala-Glu-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 17)（最も多い形成位置１２及び２４は４−ヒドロキシプロリンである）。
【０１１７】
ペプチドSEQ ID NO: 16は、ヒトの尿から最も多く検出された、タイプＩＩコラーゲン・ネオエピトープ・ペプチドである。
【０１１８】
《実施例７》
（ウシの尿内に存在するタイプＩＩコラーゲン・ペプチドの同定及び定量化）
ウシの尿内に存在するさらなるタイプＩＩコラーゲン・ペプチド断片の同定及び定量化は、実施例５で説明した手法により行われる。下記のペプチドは、関節症の症状及び徴候を示すと医学的に診断されたウシ被験体から、検出可能な量が検出される。
【０１１９】
Lys-Gly-Ala-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 34)（最も多い形成位置１０、１６、２５、２８及び４３は４−ヒドロキシプロリンであり、位置４３はヒドロキシリジンである）、
及びAla-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 35)（最も多い形成位置８、１４、２３、２９及び４１は４−ヒドロキシプロリンであり、位置２６はヒドロキシリジンである）、
ペプチドSEQ ID NO: 35は、ウシの尿から最も多く検出された、タイプＩＩコラーゲン・ネオエピトープ・ペプチドである。
【０１２０】
《実施例８》
（イヌの尿内に存在するタイプＩＩコラーゲン・ペプチドの同定及び定量化）
イヌの尿内に存在するタイプＩＩコラーゲン・ペプチド断片の同定及び定量化は、実施例５で説明した手法により行われる。下記のペプチドは、関節症の症状及び徴候を示すと医学的に診断されたイヌ被験体から、検出可能な量が検出される。
【０１２１】
Lys-Gly-Ala-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 18)（最も多い形成位置１０、１６、２５、３１及び４３は４−ヒドロキシプロリンであり、位置２８はヒドロキシリジンである）、
Ala-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 19)（最も多い形成位置８、１４、２３、２９及び４１は４−ヒドロキシプロリンであり、位置２６はヒドロキシリジンである）、
Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 20)（最も多い形成位置４、１０及び２２は４−ヒドロキシプロリンであり、位置１０はヒドロキシリジンである）、
Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 21)（最も多い形成位置２、８及び２０は３又は４−ヒドロキシプロリンであり、位置５は４−ヒドロキシリジンである）、
及びGlu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 22)（最も多い形成位置２はヒドロキシリジンであり、位置５及び１７は４−ヒドロキシプロリンである）。
【０１２２】
ペプチドSEQ ID NO: 19は、イヌの尿から最も多く検出された、タイプＩＩコラーゲン・ネオエピトープ・ペプチドである。
【０１２３】
《実施例９》
（ネコの尿内に存在するタイプＩＩコラーゲン・ペプチドの同定及び定量化）
ネコの尿内に存在するタイプＩＩコラーゲン・ペプチド断片の同定及び定量化は、実施例５で説明した手法により行われる。下記のペプチドは、関節症の症状及び徴候を示すと医学的に診断されたネコ被験体から、検出可能な量が検出される。
【０１２４】
Lys-Gly-Ala-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 23)（最も多い形成位置１０、１６、２５、３１及び４３は４−ヒドロキシプロリンであり、位置２８はヒドロキシリジンである）、
Ala-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 24)（最も多い形成位置８、１４、２３、２９及び４１は４−ヒドロキシプロリンであり、位置２６はヒドロキシリジンである）、
Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 25)（最も多い形成位置８、１４及び２６は４−ヒドロキシプロリンであり、位置１１はヒドロキシリジンである）、
Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 26)（最も多い形成位置４、１０及び２２は４−ヒドロキシプロリンであり、位置７はヒドロキシリジンである）、
Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 27)（最も多い形成位置２、８及び２０は４−ヒドロキシプロリンであり、位置５はヒドロキシリジンである）、
及びGlu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 28)（最も多い形成位置２はヒドロキシリジンであり、位置５及び１７は４−ヒドロキシプロリンである）。
【０１２５】
ペプチドSEQ ID NO: 24は、ネコの尿から最も多く検出された、タイプＩＩコラーゲン・ネオエピトープ・ペプチドである。
【０１２６】
《実施例１０》
（ウマの尿内に存在するタイプＩＩコラーゲン・ペプチドの同定及び定量化）
ウマの尿内に存在するタイプＩＩコラーゲン・ペプチドSEQ ID NO: 11の存在の確認、及びさらなるタイプＩＩコラーゲン・ペプチド断片の同定及び定量化は、実施例５で説明した手法により行われる。下記のペプチドは、関節症の症状及び徴候を示すと医学的に診断されたウマ被験体から、検出可能な量が検出される。
【０１２７】
Lys-Gly-Ala-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 29)（最も多い形成位置１０、１６、２５、３１及び４３は４−ヒドロキシプロリンであり、位置２８はヒドロキシリジンである）、
Ala-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 30)（最も多い形成位置８、１４、２３、２９及び４１は４−ヒドロキシプロリンであり、位置２６はヒドロキシリジンである）、
Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 31)（最も多い形成位置４、１０及び２２は４−ヒドロキシプロリンであり、位置７はヒドロキシリジンである）、
Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 32)（最も多い形成位置２、８及び２０は４−ヒドロキシプロリンであり、位置２６はヒドロキシリジンである）、
及びGlu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 33)（最も多い形成位置２はヒドロキシリジンであり、位置５及び１７は４−ヒドロキシプロリンである）。
【０１２８】
ペプチドSEQ ID NO: 30は、ウマの尿から最も多く検出された、タイプＩＩコラーゲン・ネオエピトープ・ペプチドである。
【０１２９】
《実施例１１》
（ネズミの尿内に存在するタイプＩＩコラーゲン・ペプチドの同定及び定量化）
下記のペプチドは、関節症の症状及び徴候を示すと医学的に診断されたネズミ被験体から、検出可能な量が検出される。
【０１３０】
Ala-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 39)（最も多い形成位置２、８及び２０は４−ヒドロキシプロリンであり、位置５はヒドロキシリジンである）、
Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 40)（最も多い形成位置２はヒドロキシリジンであり、位置５及び１７は４−ヒドロキシプロリンである）、
Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 41)（位置３及び１５は４−ヒドロキシプロリンである）、
及びAsp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 42)（最も多い形成位置１０は４−ヒドロキシプロリンである）。
【０１３１】
ペプチドSEQ ID NO: 42は、ネズミの尿から最も多く検出された、タイプＩＩコラーゲン・ネオエピトープ・ペプチドである。
【０１３２】
《実施例１２》
（モルモットの尿内に存在するタイプＩＩコラーゲン・ペプチドの同定及び定量化）
モルモットの尿内に存在するタイプＩＩコラーゲン・ペプチド断片の同定及び定量化は、実施例５で説明した一般的な手法により行われる。下記のペプチドは、関節症の症状及び徴候を示すと医学的に診断されたモルモット被験体から、検出可能な量が検出される。
【０１３３】
Val-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Pro-Gly-Arg-Ala-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Val-Ser-Gly-Ala-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 43)（最も多い形成位置８、１４、２３、２０及び４１は４−ヒドロキシプロリンであり、位置２６はヒドロキシリジンである）。
【０１３４】
以上説明したように、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42、及びSEQ ID NO: 43で表される、特定のタンパク質分解ペプチド及びその翻訳後修飾のアミノ酸配列を分離及び測定した。
【０１３５】
ある動物のタイプＩＩコラーゲンのタンパク質分解により形成された特定の種の完全なアミノ酸配列は、本発明に係る方法により測定できるので、また、他のコラーゲンのタンパク質分解により形成された他の特定のペプチドを測定するのに一般的に適用される方法は開示されているので、なので、生体サンプル又は生体抽出物内における特定のペプチドを同定又は定量化するのには、多くの方法を使用することができる。
【０１３６】
ここで開示した特定ペプチドの検出に使用されるタンデム質量分析方法は、他の特定タンパク質分解ペプチドの同定又は定量化に用いることもできる。この方法は、既存の方法により検出される通常のＣ末端を共有しているペプチド・ファミリーだけではなく、タンパク質分解により形成されたペプチドの同定又は定量化をすることができるという点で、従来の免疫学よりも優れている。そして、この方法は、ペプチドの翻訳後修飾の同定又は定量化を確実に行うことができる。また、異なる哺乳類の分離された抗体を作成する必要は無い。分光分析方法は、サンプルを処理又は抽出することにより、上記した派生物及び修飾を使用して、ペプチドの派生物又は修飾を生成するべく（又は、それらを標準として使用するべく）、ペプチドの同定及び定量化を行うことができる。
【０１３７】
他のペプチドの同定及び定量化方法が、本発明の範囲に含まれる。例えば、クロマトグラフィを使用して又は使用しないで行われる、紫外分光法、電気化学分析、又は蛍光による方法が、本発明の範囲に含まれる。既知の順序付け法も、本発明の範囲に含まれる。また、特定ペプチドの配列又はそれらの翻訳後修飾を認識することができる、免疫特定抗体（ＥＬＩＳＡ）又は他の放射免疫測定技術を使用することもできる。例えば、捕獲抗体を使用して又は使用しないで行われる、ペプチドのＮ末端に対するネオエピトープ・抗体は、配列の一部に接触するＣ末端ネオエピトープ・抗体及び捕獲抗体を使用する現在のＥＬＩＳＡ方法よりも、優れた検出感度及び選択性を提供する。一例として、１つのペプチドのＮ末端に接触するネオエピトープ・抗体は、ペプチドの同定及び定量化を行うのに用意され使用される。抗体が、７つのヒトのペプチドのアミノ酸Ｎ末端配列に対して接触する場合、又はヒトのペプチド（SEQ ID NO: 2を有する）のアミノ酸Ｎ末端配列に対して接触する場合は、その配列を有するペプチドの一意的な同定を提供することができる。その理由は、ネコのペプチド（SEQ ID NO: 23及びSEQ ID NO: 25）、イヌのペプチド（SEQ ID NO: 18及びSEQ ID NO: 4）、ウマのペプチド（SEQ ID NO: 29及びSEQ ID NO: 11）、ウシのペプチド（SEQ ID NO: 34及びSEQ ID NO: 3）、に対応するそれらの末端部分は保存されているので、生体サンプル又は生体抽出物のソースが既知である限り、これらのペプチドを明確に同定することができる。抗体を短鎖Ｎ末端配列と直接接触させる場合、ペプチドの積極的な同定は、例えば第２の抗体をＣ末端に直接接触させる方法や、サンドイッチＥＬＩＳＡ方法などの他の技術を使用する必要がある。必要な抗体を作成する技術は、従来技術において良く知られている。例えば、らにより使用された、分解ペプチドのＣ末端に抗体（Ｎ末端に抗体を形成するのに利用される）を直接形成する方法がある（Otterness et al, supra）。
【０１３８】
ここで開示したタンデム質量分析を使用することにより、他のコラーゲン（他の動物のコラーゲンを含む。また、タイプＩ及びタイプＩＩＩを含む）のタンパク質分解により生成した特定のペプチドを容易に確定することができる。そして、これらの特定ペプチドは任意の従来の方法により同定することができる。
【０１３９】
また、前記した実施例は、尿サンプル内のペプチドの同定及び定量化を含む。ペプチドは、血、血漿又は滑液などの他の生体流動体サンプル又は抽出物において、検出することができる。また、組織のサンプル（例えば関節の周囲の組織）を生検などにより取得し、従来技術によりペプチドを分離させることもできる。本発明に係る方法による生体マーカーの同定及び定量化は、組織サンプルの同定及び定量化に適用することもできる。したがって、ここで使用されたように、生体サンプルは、生体マーカーの同定又は定量化をすることができる任意の体液や体内組織のサンプルを含むことができる。
【０１４０】
このペプチドの定量化は、変形性関節症や関節リウマチなどの病気の診断及び予測に使用することができる。また、コラゲナーゼ活性により特徴付けられた病気のコラゲナーゼ酵素活性又は生理的状態のモニタと、コラーゲン分解を抑制するための薬又は物質（例えばマトリックス・メタロプロテイナーゼ抑制剤。特に、コラーゲン分解を抑制するの薬又は物質）の評価に使用することができる。したがって、生体サンプル内の、ペプチドSEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 43及びその翻訳後修飾は、タイプＩＩコラーゲンのタンパク質分解が特徴付けられた病気又は状態の生体マーカーである。生体マーカー・ペプチドの同定及び定量化は、タイプＩＩコラーゲン分解により特徴付けられた病気又は状態の診断又は予測に用いることができる。
【０１４１】
さらに、生体サンプル内の、生体マーカー・ペプチドSEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 43及びその翻訳後修飾は、タンパク質分解酵素の活性及び／又は量を阻害する薬又は他の物質の有効性をモニタ又は評価をするのに使用することができる。前記タンパク質分解酵素は、分解生成物であるペプチドSEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 43及びその翻訳後修飾を生成する。
【０１４２】
本発明に係る生体マーカーの典型的な使用は、マトリックス・メタロプロテイナーゼ抑制剤（ＭＭＰｉ）の活性のモニタ又は評価をするのに使用することである。生体流動体サンプル内の、SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ED NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ED NO: 30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ED NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 43で表されるペプチド及びその翻訳後修飾の同定及び定量化は、タイプＩＩコラーゲン分解及びインビボでのコラゲナーゼ酵素（例えばＭＭＰ−１３）の相対的な活性を指し示すことができる。タイプＩＩコラーゲン分解物の病気又は生理的状態（病理学的性質、ＭＭＰ抑制剤（例えば、ＭＭＰ−１３抑制剤）の効果的な量の薬理学的な投与）は、例えばヒト被験体の生体流動体サンプル内で、ペプチドLeu-Gln-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ala-Glu-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly (SEQ ID NO: 2)の減少又は除去をもたらす。
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１】関節症の症状及び徴候を示すウシ被験体の尿のタンデム質量分析により生成された、Ｃ末端配列（SEQ ID NO: 1）を有するペプチドSEQ ID NO : 3のフラグメントイオンを示す。
【図２】変形性関節症の症状及び徴候を示すと医学的に診断されたヒト被験体の尿のタンデム質量分析により生成された、ペプチドSEQ ID NO: 2のフラグメントイオンを示す。
【図３】関節症の症状及び徴候を示すイヌ被験体の尿のタンデム質量分析により生成された、ペプチドSEQ ID NO: 4のフラグメントイオンを示す。
【図４】タンデム質量分析により生成された、ヒトのタイプＩＩコラーゲン合成標準ペプチドのフラグメントイオンを示す。
【図５】変形性関節症の症状及び徴候を示すと医学的に診断されたヒト被験体の尿のタンデム質量分析により測定された、内的標準ペプチドSEQ ID NO: 14と、タイプＩＩコラーゲンの標的ペプチドSEQ ID NO: 2との抽出イオンクロマトグラフィの比較を示す。
【図６】変形性関節症の症状及び徴候を示すと医学的に診断されたヒト被験体の尿のタンデム質量分析により測定された、変形性関節症（bottom）の症状及び徴候を示さないと医学的に診断されたヒト被験体の尿のタンデム質量分析により測定された、及びタイプＩＩコラーゲンの合成標準ペプチドに混合された変形性関節症（middle）の症状及び徴候を示さないと医学的に診断されたヒト被験体の尿のタンデム質量分析により測定された、タイプＩＩコラーゲンの標的ペプチドSEQ ID NO: 2の抽出イオンクロマトグラフィの比較を示す。
【図７】３０ｐｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度で標準的なヒトの尿に混合された、ヒトのタイプＩＩコラーゲン合成ペプチドの標準曲線を示す。
【図８】ウシの尿内のタイプＩＩコラーゲン標的ペプチドSEQ. ID. NO: 3の相対存在量を表した棒グラフである。
【図９】ヒトの尿内のタイプＩＩコラーゲン標的ペプチドSEQ. ID. NO: 2の相対存在量を表した棒グラフである。
【図１０】ヒトの尿内のタイプＩＩコラーゲン標的ペプチドSEQ. ID. NO: 2の相対存在量を表した棒グラフである。
【図１１】タンデム質量分析により生成された、タイプＩコラーゲン合成ペプチドSEQ ID NO: 12のフラグメントイオンを示す。
【図１２】タンデム質量分析により生成された、タイプＩＩＩコラーゲン合成ペプチドSEQ ID NO: 13のフラグメントイオンを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際公開パンフレット】
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