(57)【要約】本発明は、α-フッ化マルトシル由来の式(I)の二糖に関する(式中、R1及びR2は、請求項1において定義したものである。)。該二糖は、オリゴ糖又は多糖の調製時の、グリコシドヒドロラーゼにより触媒されたグリコシル転換反応又はトランスグリコシラーゼにより触媒された転移反応におけるグリコシル供与体として有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
α-フッ化マルトシルに由来する以下の式（I）：
【化１】
2005501046.tif 000063
(式中、R1及びR2は、同じ又は異なっており、場合により保護された、グリコシド単位に窒素原子、酸素原子、イオウ原子もしくはハロゲン原子を介して結合された官能有機基を表わすか、さもなければR1及びR2は一緒になって、場合により保護された、グリコシド単位に酸素、イオウ及び窒素原子から選択された2個の原子を介して結合された官能有機基を形成する。但し、R1はヒドロキシル基を表わさない。）により表される二糖。
【請求項２】
R2はヒドロキシルを表わすことを特徴とする、請求項1に記載の二糖。
【請求項３】
ハロゲン原子、酸素原子、イオウ原子又は窒素原子を介してグリコシド単位に結合された、場合により保護された官能有機基が、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、アセタール基、ヘミアセタール基、エステル基、エーテル基、スルホン酸基、カルバミン酸基、炭酸基、アミン基、アミド基、アジド基、尿素基、チオ酢酸基、ジスルフィド基、チオ尿素基又は保護された形でのこれらの基のいずれかひとつから選択され、但し、R2はさらにフッ素原子を表わす、請求項1又は2に記載の二糖。
【請求項４】
R1及びR2は、共にジオール官能基のための保護された基、例えば、アリールで場合により置換されたアルキリデンジオキシ基を形成することを特徴とする、請求項1記載の二糖。
【請求項５】
R1及びR2は共に、O-イソプロピリデン又はO-ベンジリデン基を形成することを特徴とする、請求項4に記載の二糖。
【請求項６】
R1は2-テトラヒドロピラニルを表わし、そして好ましくは、R2はOHを表わすことを特徴とする、請求項2に記載の二糖。
【請求項７】
R1は2-テトラヒドロピラニルを表わし、そしてR2はハロゲン、例えば臭素を表わすことを特徴とする、請求項1に記載の二糖。
【請求項８】
R1及びR2は独立して、場合により置換されたアミノ又は-N3を表わすことを特徴とする、請求項1に記載の二糖。
【請求項９】
R1は、場合により置換されたアジド又はアミノを表わし、そしてR2はOHを表わすことを特徴とする、請求項1に記載の二糖。
【請求項１０】
−グリコシドヒドロラーゼにより触媒されたグリコシル転移反応；
−グリコシル転位酵素により触媒される転移反応
における、グリコシル供与体としての、請求項1〜9のいずれか1項に記載の二糖の使用。
【請求項１１】
前記グリコシドヒドロラーゼが、グリコシドヒドロラーゼ・ファミリー13に属することを特徴とする、請求項10に記載の使用。
【請求項１２】
前記グリコシドヒドロラーゼが、シクロデキストリン・グリコシルトランスフェラーゼである、請求項10又は11に記載の使用。
【請求項１３】
オリゴ糖又は多糖の調製のため、及び請求項1〜9のいずれか1項に記載の二糖のマルトシル型単位と、グリコシル受容体のピラノシル単位の間の1個又は複数の縮合反応を含む、請求項10〜12のいずれか1項に記載の使用。
【請求項１４】
前記グリコシル受容体がプルランであることを特徴とする、請求項13に記載の使用。
【請求項１５】
各縮合反応が、グリコシル受容体の非還元ピラノシル単位のヒドロキシルと、マルトシル型単位との、好ましくはフッ素原子を保持するマルトシル単位のアノマー炭素との反応から生じることを特徴とする、請求項13に記載の使用。
【請求項１６】
少なくとも1種の請求項1〜9のいずれか1項に記載の式（I）の二糖と、グリコシル受容体との、グリコシドヒドロラーゼ型又はトランスグリコシラーゼ型の酵素の存在下での反応を含む、オリゴ糖又は多糖の製造方法。
【請求項１７】
前記グリコシド・ヒドロラーゼが、グリコシド・ヒドロラーゼファミリー13に属することを特徴とする、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
前記グリコシド・ヒドロラーゼが、シクロデキストリン・グリコシルトランスフェラーゼであることを特徴とする、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
前記グリコシル受容体が、非還元末端に、前記式（I）の二糖と反応することができる少なくとも1個の官能基を示しているピラノシル単位を示す、請求項16〜18のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２０】
前記グリコシル受容体がプルランであることを特徴とする、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
前記ピラノシル単位の反応性官能基が、2、3、4又は6位、好ましくは4位のヒドロキシル官能基であることを特徴とする、請求項19に記載の方法。
【請求項２２】
請求項1〜9のいずれか1項に記載の式（I）の１個又は複数の二糖と、グリコピラノシル単位の線状又は分枝した配列で構成される多糖との縮合から生じる、遺伝子療法において使用することができるベクターであり、当該縮合が、当該多糖のグリコピラノシル単位の4位の1個又は複数のヒドロキシル官能基と、当該式（I）の二糖のフッ素原子を担持するアノマー炭素との反応を含む、前記ベクター。
【請求項２３】
前記多糖がプルランであることを特徴とする、請求項22に記載のベクター。
【請求項２４】
式（I）の二糖が、R1＝NH2又はアジド及びR2＝OHであるか、さもなければR1及びR2は独立してNH2又はアジドを表わすことを特徴とする、請求項22又は23に記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリコシドヒドロラーゼ及びトランスグリコシラーゼ型の酵素により触媒されたオリゴ糖及び多糖の化学酵素合成におけるグリコシル供与体として使用することができる、α-フッ化マルトシル由来の二糖ファミリーに関する。
本発明の方法は、特にグリコシドヒドロラーゼ又はトランスグリコシラーゼ型の酵素によりグリコシル受容体として認識されたオリゴ糖及び／又は多糖の連続(sequential)配列及び線状の延長を可能にする。
【背景技術】
【０００２】
フッ化グリコシルは、良好なグリコシル供与体であり、及び通常グリコシドヒドロラーゼ又はトランスグリコシラーゼにより触媒されるグリコシル転移反応において使用されることは、かなり以前から分かっている。
【０００３】
Hehreの研究(Arch. Biochem. Biophys.、135:75 (1969)；Arch. Biochem. Biophys.、142:382 (1971)；及び、Carbohydr. Res.、26:240 (1973)に発表された)は、特にアミラーゼは、縮合生成物を形成するために、フッ化グリコシルを用いることが可能であることを示している。1978年に、Hehreのチームは(Carbohydr. Res.、61:291-299 (1978))、β-アミラーゼのための基質としてα-フッ化マルトシルを用いる研究を発表した。引き続きHehreは、α-マルトシルからのマルトオリゴ糖の合成のために、Aspergillus oryzaeから生じるα-アミラーゼを含む、α-アミラーゼの様々な系統を使用し、そして非常に少ない加水分解産物であるマルトースが最終的に単離されるので、これらの酵素は、優先的非-加水分解的活性を示すことを観察した(Carbohydr. Res.、71:287-298 (1979)参照)。
【０００４】
同じ方法で、Okadaらは、6-O-マルトシル-シクロデキストリンの生成は、プルラナーゼ(α-アミラーゼファミリーに属するタンパク質)を使用するα-フッ化マルトシルのシクロデキストリンへの転移を用いることが可能であることを明らかにしている。
この方法の主な欠点のひとつは、シクロデキストリンの多置換から及び高分子鎖の制御されない延長から生じる6-O-マルトシルシクロデキストリンの複合混合物の単離である。
【０００５】
当該技術分野において、修飾されたα-フッ化マルトシルの使用も説明されている。Driguezらは、特に、シクロデキストリングルコシルトランスフェラーゼ(cGTase)による6'-O-メチル-α-フッ化マルトシルの縮合及び環化による、6A,6C,6E-トリ-O-メチル-シクロルトヘキサノースの合成を発表している。執筆者らは、cGTaseの存在下及び下記の6位で任意に修飾されたフッ化マルトシル(1)又は(2)のひとつの存在下で置換されたシクロデキストリン(α、β、γ)の混合物を調製する可能性を明らかにしている：J. Chem. Soc.、16:1088-1089 (1989)：
【化１】
2005501046.tif 000002
これらの修飾されたフッ化マルトシルは、cGTaseにより、グリコシル供与体及び受容体の両方として認識される。
【０００６】
Bornaghiらは、4-チオ-α-フッ化マルトシル(3)及びα-C-フッ化マルトシル(4)からの、cGTase存在下での、ヘミチオマルトデキストリン及びヘミ-C-マルトオリゴ糖の合成を説明している：Carbohydr. Res.、305: 561-568 (1997)。
【化２】
2005501046.tif 000003
しかしながら、この反応生成物は、実際には各場合において混合物である。
【０００７】
この執筆者らは、cGTase存在下でのフッ化物3は、アセチル化の後、アセチル化された4-チオマルトース(42％)(加水分解生成物)、アセチル化されたヘミチオマルトヘキサノース(4％)、アセチル化されたシクロ-α-(1-4)-チオマルトテトラオシド(13％)、アセチル化されたシクロ-α-(1-4)-チオマルトペンタオシド(16％)及びアセチル化されたシクロ-α-(1-4)-4-チオマルトヘキサオシド(7％)を得た。執筆者らは、4-チオマルトース3当量をグリコシル受容体として使用することにより、ヘミチオマルトテトラオース(18％)及びヘミチオマルトヘキサオース(14％)を単離した。
【０００８】
この執筆者らは、緩衝液中及びcGTase存在下においてフッ化物4で、グリコシル転移生成物を得ることはできず、その加水分解生成物のみを得た。執筆者らは、水性／有機性媒質を使用することにより、基質の加水分解反応を制限することに成功した。こうして彼らは、アセチル化後に、アセチル化されたヘミ-C-マルトヘキサオース(18％)、アセチル化されたヘミ-C-マルトオクタオース(11％)及びアセチル化されたヘミ-C-マルトオクタオース(5％)を得た。加水分解された基質の量が多い(各々、42及び66％)点が注目される。
【０００９】
加えてWithersら(Carbohydr. Res.、268:93-106 (1995))による4'-デオキシフッ化マルトシル及び4"-デオキシフッ化マルトトリオシルを合成することができることが指摘されているが、しかしこれらの2種の化合物は、オリゴ糖又は多糖の調製の観点で合成目的に使用されることはない。
【発明の開示】
【００１０】
本発明の修飾されたフッ化マルトシルは、グリコシドヒドロラーゼ型又はトランスグリコシラーゼ型の酵素のためのグリコシル供与体として機能する。フッ化マルトシルの 4II位又は4II位及び6II位に生じたこの修飾は、これらのグリコシル供与体のグリコシル受容体への単純な転換を可能にし、その結果オリゴ糖及び多糖の段階的合成が、多糖鎖の非同調的(uncoordinated)成長のリスクを伴わずに可能になる。
従って本発明の方法は、オリゴ糖又は多糖の合成を理想的に制御することが可能である。
【００１１】
より詳細に述べると、本発明は、α-フッ化マルトシルに由来する式Iの二糖に関する：
【化３】
2005501046.tif 000004
(式中、R1及びR2は、同じ又は異なっており、場合により保護された、グリコシド単位に窒素原子、酸素原子、イオウ原子もしくはハロゲン原子を介して結合された官能有機基を表わすか、さもなければR1及びR2は一緒になって、場合により保護された、グリコシド単位に酸素、イオウ及び窒素原子から選択された2個の原子を介して結合された官能有機基を形成し、
R1はヒドロキシル基を表わさないことが理解される。)。
式Iの化合物の環内不斉炭素の立体配置は、α-マルトシルの対応する炭素のものである。
【００１２】
R1及び／又はR2で表わす官能有機基が、出発反応物としての対応する式Iの二糖が関連する引き続きの縮合反応を妨害しないならば、かつR1が、得られる二糖がグリコシル受容体であることができる基へ転換され得るならば、あらゆる性質の基である。グリコシル受容体は、ここでは、それ自身酵素の受容体サブサイトに位置する分子を意味すると理解される。
【００１３】
得られる二糖がグリコシル受容体である基の例は、OH、NH2及びSHラジカルである。従ってR1は一般に、OH、SH又はNH2基の前駆体である。
【００１４】
本発明において、R1は、ヒドロキシル基を表わさない。しかしながら、R1は、有機化学において使用されるいずれかの保護基により保護されたヒドロキシル基を表わすことができ、例えば「Protective Groups in Organic Synthesis」、Green T.W.及びWutz P.G.M、John Wiley & Sons社出版、1991年、又は「Protecting Groups」、Kocienski P.J.、1994年、Georg Thieme Verlag社に説明されたもののひとつである。
【００１５】
逆に言えば、R2は、遊離ヒドロキシル基さもなければ他の保護基により保護されたヒドロキシル基を表わすことができ、例えば、前述のふたつの著書において説明されているものなどである。
【００１６】
好ましい式Iの二糖の群は、R2が-OHを表わしているような二糖で構成される。
ヒドロキシル官能基のための保護基は、エーテル基、エステル基、スルホン酸基、カルバミン酸基、アセタール基、ヘミアセタール基及び炭酸基である。
【００１７】
R1及び／又はR2の意味する例として下記群のものを挙げることができる：任意に置換されたアルコキシ；任意に置換されたアルケニルオキシ；任意に置換されたアリールオキシ；任意に置換されたジアリールアルコキシ；又は、任意に置換されたトリアリールアルコキシ；任意に置換されたヘテロアリールオキシ；任意に置換されたアリールアルコキシ；任意に置換されたヘテロアリールアルコキシ；任意に置換されたアルキルカルボニルオキシ；任意に置換されたアリールカルボニルオキシ；任意に置換されたヘテロアリールカルボニルオキシ；任意に置換されたアリールアルキルカルボニルオキシ；任意に置換されたヘテロアリールアルキルカルボニルオキシ；任意に置換されたアルキルスルホニルオキシ；任意に置換されたアリールスルホニルオキシ；任意に置換されたヘテロアリールスルホニルオキシ；任意に置換されたアリールアルキルスルホニルオキシ；任意に置換されたヘテロアリールアルキルスルホニルオキシ；-O-SiRfRgRh(式中、Rf、Rg、及びRhは独立して、任意に置換されたアルキル及びアリールから選択される。)；-O-CO-RaRb(式中、Ra及びRbは独立して、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアリールアルキル、任意に置換されたヘテロアリールアルキル及び水素原子から選択される。)；並びに
【化４】
2005501046.tif 000005
(式中、Rc及びRdは、先にRa及びRbについて定義されたものであるか、さもなければ他にRc及びRdは一緒に、任意に置換されたアルキレン鎖を形成し、そしてReは、先にRaについて定義されたものであるか、さもなければRd及びReは一緒になって、場合により置換されたアルキレン鎖を形成し、Rcは、先にRaについて定義されたものであり；そして、Yは、O又はSを表わしている。）。
【００１８】
本発明において、R1及び／又はR2は、ハロゲン原子、例えばR1については、臭素、塩素又はヨウ素原子を、及びR2については、塩素、臭素、ヨウ素又はフッ素原子を表わすことができる。
【００１９】
別の形において、R1及び／又はR2は、場合により置換された、又は「Protective Groups in Organic Synthesis」、Green T.W.及びWutz P.G.M、John Wiley & Sons社出版、1991年、又は「Protecting Groups」、Kocienski P.J.、1994年、Georg Thieme Verlag社に説明されたもののような1もしくは2個の保護基により保護された、アミン又はチオール官能基を表わすことができる。
このような保護基は、特に、カルバミン酸基、アミド基、アジド基、尿素基、チオ酢酸基、ジスルフィド基、チオ尿素基、アリールチオ基、アルキルチオ基、アシルチオ基、アリールカルボニルチオ基、アセトアミド基又はベンズアミド基である。
【００２０】
R1及びR2の意味する例として下記の群のものを注記することができる：アミノ；アルキルアミノ；ジアルキルアミノ；-NH-CO-Ra(式中、Raは、先に定義されたものである。）；アジド；-NRa-CO-NRbRf(式中、Ra及びRbは、先に定義されたものであり、Rfは、先にRaについて与えられた意味のいずれかひとつである。)；-O-CO-NH-Ra(Raは、先に定義されたものである。）；-S-Ra(Raは、先に定義されたものである。）；そして、-NRa-CO-Re(Ra及びReは、先に定義されたものである。）。
【００２１】
別の形において、R1及びR2基は一緒になって、場合により保護された官能有機基を形成する。
このような官能基は、例えば、場合により置換された、及び例えばアリールにより置換されたアルキリデンジオキシ基のような、ジオール官能基のための保護基である。
従って、R1及びR2は一緒に、O-イソプロピリデン又はO-ベンジリデン基を形成することができる。
【００２２】
特に好ましい二糖は、式中、R1は2-テトラヒドロピラニル基を表わし、及び好ましくはR2はヒドロキシル基を表わす、式Iの二糖である。
同じく好ましい二糖は、式中、R1は2-テトラヒドロピラニル基を表わし、及びR2はハロゲン原子、例えば臭素を表わす、式Iの二糖である。
その他の好ましい糖質として、式中R1は、場合により置換されたアミノ又はアジドを表わし、及びR2は、場合により置換されたアミノ又はアジドを表わす、式Iの二糖を注記することができる。
【００２３】
別の好ましい二糖は、式中R1は、場合により置換されたアミノ又はアジドを表わし、及びR2は-OHを表わす、式Iの二糖である。
より詳細には、式Iにおいて、以下の二糖が好ましい：
−R1＝NH2又はアジド；R2＝OH；又は、
−R1＝NH2又はアジド；R2＝NH2又はアジド。
【００２４】
アミノ基の好ましい置換基は、アルキル基、アリール基及びアリールが、場合により置換されたアリールアルキル基である。
【００２５】
本発明に関連して用語「アルキル」は、1〜14個の炭素原子、好ましくは1〜10個、更により良くは1〜6個の炭素原子、例えば1〜4個の炭素原子で構成される、線状又は分枝した炭化水素鎖を意味すると理解される。
【００２６】
アルキルラジカルの例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、t-ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、2-メチルブチル、1-エチルプロピル、ヘキシル、イソヘキシル、ネオヘキシル、1-メチルペンチル、3-メチルペンチル、1,1-ジメチルブチル、1,3-ジメチルブチル、2-エチルブチル、1-メチル-1-エチルプロピル、ヘプチル、1-メチルヘキシル、1-プロピルブチル、4,4-ジメチルペンチル、オクチル、1-メチルヘプチル、2-メチルヘキシル、5,5-ジメチルヘキシル、ノニル、デシル、1-メチルノニル、3,7-ジメチルオクチル及び7,7-ジメチルオクチルである。
【００２７】
用語「アリール」は、本発明に従い、好ましくはC6-C18芳香族の単-又は多環式(例えば、単-又は二環式)炭化水素基、例えばフェニル、ナフチル、アントリル又はフェナントリルなどを意味すると理解される。
【００２８】
ヘテロアリール基は、一般にO、S及びNから選択され、場合により酸化された状態(S及びNの場合)であるヘテロ原子を含む、単環式又は多環式芳香族複素環式基である。
好ましくは、ヘテロアリールは、単-、二-又は三環式である。
好ましくは、複素環を構成する少なくとも1個の単環は、1〜4個の環内ヘテロ原子、更により良くは1〜3個のヘテロ原子を含む。
好ましくは、複素環は、各々5〜7個の環構成員を有する1個又は複数の単環で構成される。
【００２９】
5〜7個の環構成員を含む単環式ヘテロアリールの例は、特にピリジン、フラン、チオフェン、ピロール、ピラゾール、イミダゾール、チアゾール、イソオキサゾール、フラザン、ピリダジン、ピリミジンン、ピラジン、チアジン、オキサゾール、ピラゾール、オキサジアゾール、トリアゾール及びチアジアゾールである。
【００３０】
各々の単環が5〜7個の環構成員を含む二環式ヘテロアリールの例は、インドリジン、インドール、イソインドール、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、インダゾール、ベンズイミダゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾフラザン、ベンゾチオフラザン、プリン、キノリン、イソキノリン、シンノリン、フタラジン、キナゾリン、キノキサリン、ナフチリジン、ピラゾロトリアジン(ピラゾロ[1,3,4]トリアジンなど)、ピラゾロピリミジン及びプテリジンより選択される。
各々の単環が5〜7個の環構成員を含む三環式ヘテロアリールは、例えば、アクリジン、フェナジン又はカルバゾールから選択される。
【００３１】
アルキレンは、水素原子の除去によるアルキル基に由来する、場合により置換された、線状又は分枝した、好ましくはC1-C14の二価の炭化水素基を定義する。アルキレンは、有利には、C1-C10基、更に好ましくはC1-C6基、例えばC1-C4基を意味する。
【００３２】
アルキリデンジオキシは、一般式：-O-A-O-(式中、Aは、先に定義されたような場合により置換されたアルキレンを意味する。）の二価の有機基を表わしている。
特に好ましいアリールアルキル基の例は、ベンジルである。
トリアリールアルキル基の例は、トリチルである。
【００３３】
アリール及びヘテロアリール基の置換基は、一般にハロゲン原子及び下記基から選択される：場合によりハロゲン化された(C1-C14)アルコキシ(及び、好ましくはトリフルオロメトキシ)；場合によりハロゲン化された(C1-C14)チオアルコキシ、好ましくは(C1-C10)チオアルコキシ；場合によりハロゲン化された、好ましくは過ハロゲン化された、(C1-C14)アルキル(及び、特にメチル又はトリフルオロメチル)；アルキル部分が場合によりハロゲン化された、(C1-C14)アルキルカルボニル；アリール部分が場合により1倍又は複数倍のハロゲン、場合によりハロゲン化された(C1-C14)アルキル及び／又は場合によりハロゲン化された(C1-C14)アルコキシにより置換された、(C6-C18)アリールカルボニル；アルキル部分が、場合によりハロゲン化された、(C1-C14)アルキルカルボニルアミノ；アリールが場合により1倍又は複数倍のハロゲン、場合によりハロゲン化された(C1-C14)アルキル及び／又は場合によりハロゲン化された(C1-C14)アルコキシにより置換された、(C6-C18)アリールカルボニルアミノ；並びに、場合により1倍又は複数倍のハロゲン、場合によりハロゲン化された(C1-C14)アルキル、例えばトリフルオロメチル、及び場合によりハロゲン化された(C1-C14)アルコキシ、例えばトリフルオロメトキシにより置換された、(C6-C18)アリール。
用語「ハロゲン原子」は、塩素、臭素、ヨウ素又はフッ素原子を意味すると理解される。
【００３４】
アリール及びヘテロアリール基は、先に列記した1個又は複数の置換基により、好ましくは1〜3倍、例えば1〜2倍で、置換することができる。
アルキル基及び前述のラジカルのアルキル部分並びにアルキレンラジカル又は前述のラジカルのアルキレン部分は、臭素のようなハロゲン、(C1-C14)アルコキシ又は(C1-C14)チオアルコキシ、好ましくはこの種のラジカルの1〜3個により、独立して選択される、1個又は複数のラジカルにより1倍又は複数倍で置換することができる。
【００３５】
R1及び／又はR2の一方が、置換されたアミノを表わす場合、これらの置換基は、場合により置換されたアルキル基、場合により置換されたアリール基、場合により置換されたヘテロアリール基、場合により置換されたアリールアルキル基又は場合により置換されたヘテロアリールアルキル基であることができる。
式Iの二糖において、R1及び／又はR2が保護されたヒドロキシル基を表わす場合、後者は、任意に置換されたベンジルオキシ；アリルオキシ；トリチロキシ；テトラヒドロピラニルオキシ；3-ブロモテトラヒドロピラニルオキシ；テトラヒドロチオピラニルオキシ；1-メトキシシクロヘキシルオキシ；4-メトキシテトラヒドロピラニルオキシ；4-メトキシテトラヒドロチオピラニルオキシ；アセトキシ；2-ハロアセトキシ；-O-Si-RfRgRh基(式中、Rf、Rg及びRhは、3種全て同じ又は異なるアルキルであるか、もしくは3種全て同じ又は異なるアリールである。)；トシルオキシ；及び、メシルオキシから選択されることが好ましい。
【００３６】
式Iの化合物は、いくつかの工程で調製することができる。合成法は、まず最初に、フッ化水素の、式IIの化合物との反応を含む：
【化５】
2005501046.tif 000006
(式中、P2、P3、P4、P5及びP6は、ヒドロキシル官能基の保護基であり；
R'1及びR'2は、各々、R1及びR2を意味するか、さもなければR1及びR2の置換基の前駆基であり；及び
Gは、フッ化物イオンと交換することができる基、例えばアルキルカルボニル基(ここで、アルキルは先に定義されている。)；アリル基；1,2-エポキシド基又は-C(=NH)-CCl3基を表わすか；又はさもなければ、G及びP2は一緒に、先に定義されたようなアルキリデンジオキシ基を形成する。)。
好ましくは、Gはアセチル基を表わし、これはP2、P3、P4、P5及びP6基と同じであることが可能である。
【００３７】
別の形において、フッ化水素を、式II'の化合物と反応することを描くことが可能である：
【化６】
2005501046.tif 000007
(式中、R'1、R'2、P2、P3、P4、P5及びP6は、式IIについて先に定義されたものであり、並びにWは、SG、SeG又はTeGを表わし、Gは先に定義されたものであり、これはG及びP2は一緒に、アルキレン鎖を形成することができ、ここでアルキレンは先に定義されたものであることが理解される。)。
【００３８】
この反応は、溶媒不存在下及び非常に過剰なフッ化水素の存在下で実行することができ、後者は溶媒として作用する。
しかしこの反応は、有利なことに、ピリジンのような溶媒中で実行される。より好ましくは、この反応は、追加的に非常に過剰なフッ化水素の存在下で実行される。
【００３９】
従って本発明の好ましい態様に従い、前記式IIの化合物は、10/1〜1/1のフッ化水素／ピリジン混合物中に溶解される。この反応は、通常周囲温度で、より一般的には温度-10〜50℃、例えば15〜30℃で実行される。
【００４０】
本発明の好ましい態様に従い、P2、P3、P4、P5及びP6は、アルキルカルボニル基、例えばアセチル基を表わし、R'1はヒドロキシル基を表わし、及びR'2は、ハロゲン原子(臭素原子など)又はアルキルカルボニル基、例えばアセチル基から選択される。
【００４１】
この第一工程の結果得られた化合物は、下記式を有する：
【化７】
2005501046.tif 000008
(式中、P2、P3、P4、P5、P6、R'1及びR'2は、式IIIについて先に定義されたものである。)。
式Iの化合物の単離を生じる次の工程は、式Iの目的の化合物のR1及びR2基の性質に従い、当業者は容易に調節することができるであろう。
【００４２】
これらの工程は、いずれかの順番で、(i)適当であるならば、各々、P2、P3、P4、P5及びP6で保護されたヒドロキシル官能基の脱保護、(ii)R'1及びR'2基のR1及びR2基への転換を含む。
【００４３】
式IIの化合物において、R'1がヒドロキシル基を表わし、及びR'2がP2、P3、P4、P5及びP6基(互いに同一)と同じであるならば、化合物IIIの式Iの化合物への転換は、例えば以下を含む：
−4II位のヒドロキシル基のR1基への転換の第一工程；
−2I、3I、6I、2II、3II及び6II位のヒドロキシル基の引き続きの同時脱保護；
−及び、適当であるならば、6II位のヒドロキシル基のR2基への転換。
【００４４】
その別の局面に従い、本発明は、先に定義されたような二糖の、グリコシドヒドロラーゼにより触媒されたグリコシル転移反応における、又はトランスグリコシラーゼにより触媒された転移反応における使用に関する。これらの反応において、本発明の二糖は、グリコシドヒドロラーゼ及び／又はトランスグリコシラーゼ型の酵素の基質であり、グリコシル供与体として機能する。
【００４５】
特に好ましい本発明の態様に従い、本発明の二糖は、グリコシドヒドロラーゼファミリー13に属する酵素の基質として使用される。これらの酵素は、特に、α-アミラーゼ、プルラナーゼ、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ、シクロマルトデキストリナーゼ、オリゴ-α-グルコシダーゼ、マルトース生成アミラーゼ、ネオプルラナーゼ、α-グルコシダーゼ、マルトテトラノース-生成α-アミラーゼ、イソアミラーゼ、グルコデキストラナーゼ、マルトヘキサノース-生成α-アミラーゼ、分枝酵素、4-α-グルカノトランスフェラーゼ、マルトペンタノース-生成α-アミラーゼ及びアミロスクラーゼがある。
【００４６】
本発明に関連して、該酵素は、グリコシルの逐次縮合によるオリゴ糖又は多糖の調製に使用される。
特に好ましい本発明の態様において、分枝したオリゴ糖、すなわち、単糖単位が分枝を伴う配列を形成するオリゴ糖の調製を目的として、R2が、ハロゲン原子、より詳細には臭素を表わす式Iの二糖が、酵素基質として使用される。
逆に用語「線状オリゴ糖」は、本発明において、単糖単位が線状配列を形成するオリゴ糖を意味すると理解される。
【００４７】
より特に好ましい方法で、オリゴ糖及び多糖の調製は、グリコシドヒドロラーゼ型の酵素のシクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ(cGTase)に関連している。
その別の局面において、本発明は、グリコシドヒドロラーゼ型又はトランスグリコシラーゼ型の酵素の存在下で、本発明の式Iの二糖の少なくとも1種を、グリコシル受容体と反応することを含む、オリゴ糖又は多糖を調製する方法に関連している。
【００４８】
本発明の好ましい態様において、本発明の二糖からのオリゴ糖又は多糖の合成は、式Iの二糖のマルトシル型単位とグリコシル受容体のピラノシル単位の間の、1種又は複数の縮合反応に関連している。
【００４９】
実際、特に有利な方法において、本発明の方法は、本発明の二糖と、その非還元末端に、該式Iの二糖と反応することが可能な官能基を少なくとも1個保持するピラノシル単位が存在するグリコシル受容体の間の、1種又は複数のカップリング反応を含み、このピラノシル単位と、本発明の二糖のフッ素原子を保持するアノマー炭素の間にグリコシド結合が生じ、ここで二糖はグリコシル供与体として機能する。
好ましいピラノシル単位の例は、アロース、アルトロース、グルコース、グロース、マンノース、イドース、ガラクトース又はタロース単位である。
【００５０】
好ましくは、オリゴ糖又は多糖の合成は、本発明の二糖のマルトシル型単位と、グリコシル受容体のピラノシル単位の間の縮合工程を含み、この縮合は、グリコシル受容体のピラノシル単位の単独のヒドロキシル基の、該マルトシル型単位のアノマー炭素との反応により進行する。
【００５１】
本発明の利点のひとつは、最終の多糖の各々について、工程毎に、オリゴ糖合成を制御する可能性にある。
本発明の二糖との各縮合工程の終了時に、更なる縮合反応のためのグリコシル受容体となる、得られたオリゴ糖のヒドロキシル官能基の可能な脱保護の後、更なる縮合反応を行うことが十分である。
本発明の二糖のフッ素を保持するアノマー炭素は、好ましくはグリコシル受容体のピラノシル単位の4位に位置した、ヒドロキシル、チオール又はアミン官能基(及びより詳細には、ヒドロキシル官能基)と反応することが好ましい。より一般的には、このピラノシル単位の官能基は、2、3、4又は6位に位置する。
【００５２】
グリコシル受容体は、無差別に、単糖、例えばメチルα-D-グルコピラノシド、オリゴ糖又は多糖、例えばプルランであることができる。
グリコシル受容体について、プルランであることが、並びに本発明の二糖について、R1＝NH2又はアジド及びR2＝OH、あるいは、R1及びR2は独立してNH2又はアジドを表わしているような式Iの二糖であることが、特に非常に好ましい。
【００５３】
得られるポリマーは、遺伝子療法の新規ベクターとしてことのほか特に利点がある。
従ってその別の局面において、本発明は、グリコピラノシル単位の線状又は分枝した配列で構成された多糖の、先に定義されたような式Iの二糖の1種又は複数との縮合から生じる、遺伝子治療に使用することができるベクターに関し、該縮合は、該多糖のグリコピラノシル単位の4位の1種又は複数のヒドロキシル官能基の、該式Iの二糖のフッ素原子を保持するアノマー炭素との反応に関係している。
【００５４】
好ましくは、該多糖はプルランである。
好ましくは、式Iの二糖は、R1及びR2は独立してNH2又はアジドを表わしている；あるいは、R1＝NH2又はアジド及びR2＝OHであるような式Iの二糖である。
【００５５】
より一般的には、本発明の方法は、管理された方法での、プルランの単糖単位の4位の分枝に適している。
グリコシル受容体である多糖の、本発明に関連して使用することができる別の例は、特に線状又は分枝することができるデキストラン、アルテルナン(alternan)、アミロース、グリコーゲン、アミロペクチン、及びより一般的には、本発明において定義されたI型の化合物が使用される場合にグリコシル受容体であることが可能ないずれかの多糖である。
【００５６】
本発明において、本発明の二糖のグリコシル受容体とのカップリングは、pHが中性範囲、例えばpHが6〜8、好ましくはpH7で、水性媒質において実行される。
このカップリングは、一般に緩衝した水溶液中で行われる。
別の形において、カップリングは、水酸化ナトリウムのような無機塩基の添加により行うこともでき、この添加は、pHメーターにより制御された自動ビューレットを用いて行われる。
この目的に使用することができる緩衝液は、リン酸、硫酸、酢酸、クエン酸、コハク酸及びマレイン酸緩衝液であり、リン酸緩衝液が好ましい。
【００５７】
この縮合は、通常、1当量のグリコシル受容体を、1〜5モル当量、好ましくは1.2〜3.5当量の式Iのフッ化マルトシル誘導体と一緒にすることにより実行される。
【００５８】
触媒として機能する酵素は、触媒量で反応媒質中に存在している。従って、1モル当量のグリコシル受容体につき酵素1当量未満が使用される(一般に、10-3M未満の量、更に良くは10-4M未満、及び例えば、10-4〜10-6M(例えば、10-5Mの桁の量)で通常十分である。)。
この反応は一般に、100℃未満の温度で実行される。
【００５９】
グリコシドヒドロラーゼ又はトランスグリコシラーゼ型の酵素を使用する、この型のオリゴ糖及び多糖の合成には、多くの利点がある：
−製造コストが削減される；
−合成が水性媒質において実行されるので、得られた生成物は、有機溶媒の残留がなく、このことはこれらが完全に無害であることを保証する。
【００６０】
本発明は下記の合成実施例1から6により例証される。
これらの実施例において、PEは石油エーテルを、MPは実験で得た融点を、及びMPlittは文献に報告された融点を意味する。
【実施例】
【００６１】
実施例1
a) 2,3-ジ-O-アセチル-α-D-グルコピラノシル-(1-＞4)-1,2,3,6-テトラ-O-アセチル-β-D-グルコピラノースの調製
【化８】
2005501046.tif 000009
テトラフルオロホウ酸溶液(HBF4/H2O, 35容量％, 6.1ml)を、アセトニトリル(420ml)溶液中の過アセチル化された4',6'-O-ベンジリデンマルトース(15g, 22mmol)の溶液に添加した。この混合物を、周囲温度で10分間攪拌し、トリエチルアミン(6.8ml)で中和し、その後蒸発させた。
高速クロマトグラフィー(EtOAc 3/PE 1)で精製した後、予想された化合物を、ジクロロメタン/エーテル混合液で晶出した(12g, 92％)。
MP＝204〜205℃
MPlitt＝205〜206℃：K. Takeo及びK. Shinmitsu、Carbohydr. Res.、133: 135-145 (1984)。
【化９】
2005501046.tif 000010
I及びIIは、各々、前記式A1において表わされたグリコシド単位を意味する。
【００６２】
b) 2,3,6-トリ-O-アセチル-α-D-グルコピラノシル-(1-＞4)-1,2,3,6-テトラ-O-アセチル-β-D-グルコピラノースの調製
【化１０】
2005501046.tif 000011
先行する工程において得た化合物(6.075g, M=594g/mol, 10.2mmol)及びN-ヒドロキシベンゾトリアゾール酢酸塩(2.004g, 1.2当量)を、ジクロロメタン(60ml)中に溶解した。トリエチルアミン(2.112ml)を添加した。この反応混合液を、周囲温度で20時間攪拌した。その溶媒を蒸発させた。予想された化合物を、エチルエーテルによる晶出により得た(5.164g, 80％)。
【化１１】
2005501046.tif 000012
I及びIIは、各々、式B1において表わされたグリコシド単位を意味する。
C26H36O18の元素分析：計算値：C＝49.06％；H＝5.7％
実測値：C＝48.97％；H＝5.85％
【００６３】
c) フッ化2,3,6-トリ-O-アセチル-α-D-グルコピラノシル-(1-＞4)-2,3,6-トリ-O-アセチル-α-D-グルコピラノシル
【化１２】
2005501046.tif 000013
この反応は、プラスチック容器内で0℃で実行した。
先行する工程において得られた七酢酸塩(5g, 7.86mmol)を、ピリジンを溶媒とするフッ化水素(7:3, 容量、30ml)の溶液中に溶解した。30分間攪拌した後、この反応混合液を、ジクロロメタンで希釈し、その後氷冷した3Mアンモニア水溶液に注いだ。
静置して分離した後、有機相を、氷冷した飽和炭酸水素ナトリウム溶液で2回洗浄した。引き続き有機相を、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、その後回転蒸発器を用いて蒸発させた。
トリエチルアミンで前もって中和したシリカゲルを使用する高速クロマトグラフィー(EtOAc 2/PE 1)で、予想されたフッ化物(4.45g, 95％)を得ることが可能であった。
【化１３】
2005501046.tif 000014
M.S. (FAB) :m/z＝659Da [M+Na]+
2005501046.tif 000015
I及びIIは、各々、前記式C1において表わされたグリコシド単位を意味する。
【００６４】
d) フッ化2,3,6-トリ-O-アセチル-4-O-テトラヒドロピラニル-α-D-グルコピラノシル-(1-＞4)-2,3,6-トリ-O-アセチル-α-D-グルコピラノシルの調製
【化１４】
2005501046.tif 000016
先行する工程で得た化合物(3g, 5mmol)を、蒸留したジクロロメタン(120ml)に溶解した。ジヒドロピラン(2.3ml)を、樟脳スルホン酸(86mg)と共に添加した。周囲温度で3時間攪拌した後、この反応混合液を、飽和した炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した。有機相を、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、その後蒸発させた。トリエチルアミンで前もって中和したシリカゲルを使用する高速クロマトグラフィー(EtOAc 1/PE 1)で精製した後、予想された化合物をジアステレオ異性体の混合物の形で得た(3.420g；98％)。
1H NMR (300 MHz, CDCl3)：解釈なし、ジアステレオ異性体の混合物
【化１５】
2005501046.tif 000017
2005501046.tif 000018
M.S. (DCI)：m/z＝698Da [M+NH4]+
I及びIIは、各々、前記式D1において表わされたグリコシド単位を意味する。
【００６５】
e) フッ化4-O-テトラヒドロピラニル-α-D-グルコピラノシル-(1-＞4)-α-D-グルコピラノシルの調製
【化１６】
2005501046.tif 000019
先行する工程で得た過アセチル化した化合物(1.55g, 2.28mmol)を、メタノール(50ml)に溶解した。メタノール中のナトリウムメトキシド(1M, 2.5ml)の溶液を添加した。周囲温度で30分間攪拌した後、この反応混合液を、0℃に冷却し、次にAmberlite IRN 120 H+樹脂で中和した。ろ過後、この化合物を濃縮し、残渣を水に溶かし、及び凍結乾燥した(956mg, 2.23mmol)。この化合物は、更に精製せずに使用した。
このフッ化物は、凍結乾燥した形で、-18℃で安定している。
注意：最初の分解化合物は、α-フッ化マルトシルである。
M.S. (FAB)：m/z＝429Da [M+H]+
【００６６】
実施例2
2,3,4,6-テトラ-O-アセチル-α-D-グルコピラノシル-(1-＞4)-2,3,6-トリ-O-アセチル-α-D-グルコピラノシル-(1-＞4)-[2,3,4,6-テトラ-O-アセチル-α-D-グルコピラノシル-(1-＞4)-2,3,6-トリ-O-アセチル-α-D-グルコピラノシル-(1-＞4)-2,3,6-トリ-O-アセチル-α-D-グルコピラノシル-(1-＞6)]-2,3-ジ-O-アセチル-α-D-グルコピラノシル-(1-＞4)-1,2,3,6-テトラ-O-アセチル-D-グルコピラノースの調製
【化１７】
2005501046.tif 000020
パノース(α-D-グルコピラノシル-(1-＞6)-α-D-グルコピラノシル-(1-＞4)-D-グルコピラノース)(80mg, 0.158mmol)及び実施例1e)で得られた修飾されたフッ化マルトシル(171mg, 0.4mmol, 2.5当量)を、リン酸緩衝液(8ml, 0.1M, pH=7)に溶解した。cGTase(触媒量)を添加した。この混合液を、周囲温度で2時間攪拌した。薄層クロマトグラフィー(溶離液H2O 1/CH3CN 2)は、フッ素が完全に転換されたことを示した。この反応混合物を、100℃で5分間維持した。このタンパク質を、綿フィルターでろ過した。ろ液を凍結乾燥し、その後ピリジン／無水酢酸混合物(1.5:1, 容量, 25ml)中で一晩70℃でアセチル化した。メタノール(10ml)を0℃で添加し、過剰な無水酢酸を中和した。この反応混合液を、回転蒸発器で濃縮し、残渣をCH2Cl2中に溶かし、及びこの溶液を水で洗浄し、その後飽和NaHCO3溶液で洗浄した。水相を、CH2Cl2 (3回)で抽出した。有機相を一緒にし、Na2SO4上で乾燥し、蒸発乾固した。残渣を、CH2Cl2 (10ml)に溶かし、トリフルオロ酢酸(10ml)を添加した。この反応混合液を、周囲温度で30分間攪拌し、蒸発乾固し、その後残渣をピリジン／無水酢酸混合物(1.5:1, 容量, 3.5ml)中で周囲温度で14時間アセチル化した。次にこの混合液を0℃に冷却し、メタノール(1ml)を添加した。回転蒸発器上で蒸発させた後、残渣を高速クロマトグラフィーにより精製した(CH2Cl2 100/MeOH 1)、w＝230mg (0.125mmol, 80％)。
M.S. (エレクトロスプレー) m/z＝2141 (M+Na)+
【００６７】
実施例3
α-D-グルコピラノシル-(1-＞4)-α-D-グルコピラノシル-(1-＞4)-[α-D-グルコピラノシル-(1-＞4)-α-D-グルコピラノシル-(1-＞4)-α-D-グルコピラノシル-(1-＞6)]-α-D-グルコピラノシル-(1-＞4)-D-グルコピラノースの調製
【化１８】
2005501046.tif 000021
実施例2の化合物(100mg, 0.546mmol)を、MeOH(30ml)に溶解し、メタノール中のナトリウムメトキシド溶液を添加した(1M, 300μl)。この反応混合液を、周囲温度で一晩攪拌した。薄層クロマトグラフィー(H2O 1/CH3CN 1.5)は、反応が完了したことを明らかにした。引き続きこの溶液を、Amberlite IRN 120 (H+)樹脂で中和し、蒸発させ、水と共沸させ、その後凍結乾燥し、予想された化合物61mg(96％)を得た。
高解像度M.S.：
m/z＝1191.3441 Da [M+K]+ C42H72O36Kに相当
m/z＝1175.3701 Da [M+Na]+ C42H72O36Naに相当
使用した略号DP：重合度(グリコシル単位の数)
結合(coupled)質量分析／質量分析：
【化１９】
2005501046.tif 000022
1H NMR：(400MHz, D2O (4.65ppm), 298K)
−H1α14 (3個の非分離ピーク)
5.23ppm, 5.19ppm, 5.149ppm, d, J12＝4Hz,
−H1α：5.073ppm, J12＝3.6Hz及び
5.028ppm, J12＝4Hz,
−H1α16：4.808ppm, d, J12＝3.2 Hz,
−H1β：4.491ppm, d, J12＝8Hz,
3.9-3.4ppm、非分離ピーク、プロトンは言及されず
−非還元単位のH4：3.249ppm, t, J32＝9.6Hz
−H2β：3.114ppm, t, J32〜J12
13C NMR：(400MHz, D2O, 298K)
−100.38, 100.09ppm：α14結合のC1；
−98.92ppm：α16結合のC1；
−96.09ppm：C1β；
−92.21ppm：C1α；
−79.139, 78.25, 78.06, 77.85, 77.73, 77.14, 77.00, 76.42, 74.98, 74.25, 73.70, 73.48, 73.30, 73.19, 73.05, 72.07, 71.98, 71.76, 71.62, 71.52, 70.65, 70.51, 70.38, 69.64：炭素は言及せず(すなわち、28炭素)；
−67.83-67.67：α16グリコシド結合に属するC6；
分離原因：−α型へ及びβ型へ
−又は、立体的平衡へ；
−61.14, 60.90, 60.80, 60.67ppm：グリコシド結合に参加していないC6 (6炭素).
【００６８】
実施例4
a)2,3-ジ-O-アセチル-6-ブロモ-6-デオキシ-α-D-グルコピラノシル-(1-＞4)-1,2,3,6-テトラ-O-アセチル-β-D-グルコピラノースの調製
【化２０】
2005501046.tif 000023
トリフェニルホスフィン(PPh3, 4g, 2当量)及び四臭化炭素(CBr4, 2.57g, 1.02当量)を、ピリジン(54ml)中の実施例1a)の化合物(5g, 7.86mmol)の溶液に、0℃で添加した。この反応混合液を、0℃で15分間、その後50℃で3時間攪拌した。薄層クロマトグラフィー(EtOAc 1/PE 1)は、出発材料が消失したことを示した。その後メタノール(5ml)を添加した。反応媒質を蒸発させ、その後トルエンで共沸した。予想された化合物が、高速クロマトグラフィーで得られた(4.2g, 84％)。
【化２１】
2005501046.tif 000024
M.S. (DCI) ：m/z＝674Da (M+NH4)+
I及びIIは、各々、前記式A4において表わされたグリコシド単位を意味する。
【００６９】
b) フッ化2,3-ジ-O-アセチル-6-ブロモ-6-デオキシ-α-D-グルコピラノシル-(1-＞4)-2,3,6-トリ-O-アセチル-α-D-グルコピラノシルの調製
【化２２】
2005501046.tif 000025
この反応は、プラスチック容器内で0℃で実行した。
先行する工程において得られた五酢酸塩(2.041g, 3.11mmol)を、ピリジンを溶媒とするフッ化水素(7:3, 容量、20ml)の溶液中に溶解した。30分間攪拌した後、この反応混合液を、ジクロロメタンで希釈し、その後氷冷した3Mアンモニア水溶液に注いだ。
静置して分離した後、有機相を、氷冷した飽和した炭酸水素ナトリウム溶液で2回洗浄した。引き続き有機相を、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、その後回転蒸発器を用いて蒸発させた。
トリエチルアミンで前もって中和したシリカゲルを使用する高速クロマトグラフィー(EtOAc 2/PE 1)で、予想されたフッ化物(1.71g, 90％)を得ることが可能であった。
【化２３】
2005501046.tif 000026
I及びIIは、各々、前記式B4において表わされたグリコシド単位を意味する。
【００７０】
c) フッ化2,3-ジ-O-アセチル-6-ブロモ-6-デオキシ-4-O-テトラヒドロピラニル-α-D-グルコピラノシル-(1-＞4)-2,3,6-トリ-O-アセチル-α-D-グルコピラノシルの調製
【化２４】
2005501046.tif 000027
先行する工程で得られた化合物(1.725g, 2.79mmol)を、蒸留したジクロロメタン(95ml)に溶解した。ジヒドロピラン(1.4ml)を、樟脳スルホン酸(50mg)と共に添加した。この反応混合液を、周囲温度で2時間攪拌した後、飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した。有機相を、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、その後蒸発させた。トリエチルアミンで前もって中和したシリカゲルを使用する高速クロマトグラフィー(EtOAc 1/PE 1)で精製した後、予想された化合物をジアステレオ異性体の混合物の形で得た(1.8g, 95％)。
NMR ：解釈なし、ジアステレオ異性体の混合物
M.S. (DCI) ：m/z＝718Da (M+NH4)+
【００７１】
d) フッ化6-ブロモ-6-デオキシ-4-O-テトラヒドロピラニル-α-D-グルコピラノシル-α-(1-＞4)-α-D-グルコピラノシルの調製
【化２５】
2005501046.tif 000028
先行する工程で得られた過アセチル化した化合物(1g, 1.42mmol)を、メタノール(20ml)に溶解した。メタノール中のナトリウムメトキシド(1M, 200μl)の溶液を添加した。周囲温度で30分間攪拌した後、この反応混合液を、0℃に冷却し、次にAmberlite IRN 120 H+樹脂で中和した。ろ過後、この化合物を濃縮し、残渣を水に溶かし、及び凍結乾燥した(683mg, 98％)。
この化合物は、更に精製せずに使用した。
このフッ化物は、凍結乾燥した形で、-18℃で安定している。
M.S. (FAB)：m/z＝513Da [M+Na]+
【００７２】
実施例5
メチル2,3,4-トリ-O-アセチル-6-ブロモ-6-デオキシ-α-D-グルコピラノシル-(1-＞4)-2,3,6-トリ-O-アセチル-α-D-グルコピラノシル-(1-＞4)-2,3,6-トリ-O-アセチル-α-D-グルコピラノシドの調製
【化２６】
2005501046.tif 000029
実施例4d)で得られたフッ化物(80mg, 0.163mmol)及びメチルα-D-グルコピラノシド(94.8mg, 3当量)を、リン酸緩衝液(7ml, 0.1M, pH=7)に溶解した。cGTaseを、触媒量添加した。この反応混合液を、40℃で14時間インキュベーションし、その後100℃で5分間加熱した。このタンパク質を、綿フィルターでろ過した。ろ液を、50％酢酸を、pHがおよそ4に達するまで添加することにより酸性とし、1時間攪拌した。その後この混合液を、10％アンモニア溶液の添加により中和し、次に蒸発させた。残渣を、水で3回共沸させ、凍結乾燥し、その後ピリジン／無水酢酸混合物(1.5:1, 容量, 16ml)中で一晩70℃でアセチル化した。メタノール(7ml)を0℃で添加し、過剰な無水酢酸を中和した。この反応混合液を、回転蒸発器で濃縮し、残渣をCH2Cl2中に溶かし、及びこの溶液を水で洗浄し、その後飽和NaHCO3溶液で洗浄した。水相を、CH2Cl2 (3回)で抽出した。有機相を一緒にし、Na2SO4上で乾燥した。
予想された化合物を、高速クロマトグラフィーにより得た(溶離液：エチルエーテル) (118mg, 75％)。
【化２７】
2005501046.tif 000030
【化２８】
2005501046.tif 000031
I、II及びIIIは、前記式A5において表わされたグリコシド単位を意味する。
M.S. (FAB)：m/z＝983(M+Na)+
【００７３】
実施例6
グリコシド単位の4位のマルトシル単位の縮合により修飾されたプルランの調製
工程a)
プルラン(50mg)及び実施例1e)で得られたフッ化物(63.4mg, 1.5当量)は、リン酸緩衝液(5ml, 0.1M, pH=7.0)に溶解した。cGTase(触媒量)を添加した。この反応混合液を、周囲温度で2時間インキュベーションした。薄層クロマトグラフィー(CH3CN 4/H2O 1)は、フッ化物が完全に転換されたことを明らかにした。この反応混合物を、200mlのエタノール(95％)で沈殿させた。沈殿を遠心により回収し、及び一晩真空乾燥した。こうして65mgが得られ、すなわち置換度はおよそ37％であった。
【００７４】
工程b)
先行する工程で得られたポリマー(21mg)を、10-2M塩酸溶液(2ml)に溶解した。反応混合液を、周囲温度で2時間攪拌した。引き続き混合液を、アンモニアを添加することにより中和し、その後エタノールで沈殿した。遠心後、このポリマーを真空乾燥した。こうして15mgを単離した。
置換度は、Hakomori法に従ったメチル化により決定した。
こうしてメチル化したポリマーを、酸性媒質中で加水分解した。得られた単糖を還元し、次にアセチル化した。得られた混合物を、ガスクロマトグラフィー／質量分析を組合せて分析した。
グリコシル化された単位：1-O-アセチル-2,3,4,6-テトラ-O-メチルヘキシトール領域(area)：17190
グリコシルされない領域：1,6-ジ-O-アセチル-2,3,6-トリ-O-メチルヘキシトール部分：29163。
置換度：37％。
【００７５】
実施例6a)及び6b)のポリマーの1H NMRスペクトルを、プルプランのそれと比較した。
プルプランスペクトル：−H1α14 (2ピーク)：5.27；5.23ppm；int*＝2；
−H1α16：4.83ppm；int*＝1；
−3.9-3.4ppm；非分離ピーク；プロトンに言及せず：
理論的積分：18
実測積分：18.5。
実施例5a)のポリマー：−H1α14 (2ピーク)：5.26；5.24ppm；int*＝2.56；
−H1α16 (非分離ピーク)；4.83ppm；int*＝1；
−3.9-3.4ppm；非分離ピーク；プロトンに言及せず；
−1.71, 1.42ppm；2ピーク, int*＝1.66, テトラヒドロピラニル基
実施例5b)のポリマー：−H1α14 (2ピーク)：5.26；5.24ppm；int*＝2.56；
−H1α16 (非分離ピーク)；4.83ppm；int*＝1；
−3.9-3.4ppm；非分離ピーク；プロトンに言及せず；
−1.71, 1.42ppm；2ピーク, int*＝1.66,
*積分の結果
【００７６】
実施例7
a)トリフェニルメチル(2,3,6-トリ-O-アセチル-4-O-テトラヒドロピラニル-α-D-グルコピラノシル)-(1-＞4)-S-(2,3,6-トリ-O-アセチル-α-D-グルコピラノシル)-(1-＞4)-2,3,6-トリ-O-アセチル-チオ-α-D-グルコピラノシドの調製
【化２９】
2005501046.tif 000032
cGTase (207μl)を、リン酸緩衝液(3ml, 0.1M, pH=7.0)中の実施例1e)において調製したフッ化物E1(50mg, 0.12mmol)及びトリフェニルメチルチオ-α-D-グルコピラノシド(62mg, 1.2当量)の溶液に添加した。この反応混合液を、40℃で2時間インキュベーションし、凍結乾燥し、ピリジン／無水酢酸混合液(10ml, 1/1, 容量)に溶解し、触媒量のDMAPを添加した。この混合液を、70℃で12時間攪拌し、冷条件下で0℃のメタノール(5ml)を添加することにより中和し、蒸発させた。残渣を、ジクロロメタンに溶かし、水で洗浄し、その後飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した。有機相を回収し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、蒸発させ、トルエンと共沸した。ジアステレオ異性体の混合物を、高速クロマトグラフィーにより精製した(PE 1/EtOAc 1)(127mg, 86％)。
高解像度M.S. (ES+)：C60H72O25NaS [M+Na]+
計算値：m/z＝1247.3981
実測値：m/z＝1247.3989
【化３０】
2005501046.tif 000033
【００７７】
b) (2,3,4,6-テトラ-O-アセチル-α-D-グルコピラノシル)-(1-＞4)-(2,3,6-トリ-O-アセチル-α-D-グルコピラノシル-(1-＞4)-2,3,6-トリ-O-アセチル-1-S-アセチル-1-チオ-α-D-グルコピラノースの調製
【化３１】
2005501046.tif 000034
トリエチルシラン(Et3SiH, 35.8μl, 225μmmol)及びトリフルオロ酢酸(1.2ml)を、ジクロロメタン(1.9ml)に溶解した先行する工程において調製した化合物A7(81mg, 66.2μmol)に添加した。この混合物を、周囲温度で45分間攪拌し、次に蒸発させた。この残渣を無水ピリジン(2ml)に溶かし、無水酢酸(1.5ml)及び触媒量のDMAPを添加した。反応混合物を周囲温度で12時間攪拌し、その後メタノール(1.2ml)を0℃で添加し中和し、蒸発させた。予想された化合物を、高速クロマトグラフィーで精製した(PE/EtOAc：1/1.5) (45mg, 69％)。
[α]D：+ 183° (c=0.27, クロロホルム)
高解像度M.S. (ES+)：C40H54O26SNa [M+Na]+
計算値：m/z＝1005.2522
実測値：m/z＝1005.2519
1H NMR (400MHz, CDCl3):
【表１】
2005501046.tif 000035
【表２】
2005501046.tif 000036
実施例8
a) (2,3,4,6-テトラ-O-アセチル-α-D-グルコピラノシル)-(1-＞4)-(2,3,6-トリ-O-アセチル-α-D-グルコピラノシル)-(1-＞4)-(2,3-ジ-O-アセチル-6-ブロモ-6-デオキシ-α-D-グルコピラノシル)-(1-＞4)-1,2,3,6-テトラ-0-アセチル-D-グルコピラノースの調製
【化３２】
2005501046.tif 000037
実施例1e)において調製したフッ化物E1 (250mg, 0.58mmol)及び6-ブロモ-6-デオキシ-α-D-グルコピラノシル-D-グルコピラノース(235mg, 1当量)を、リン酸緩衝液(25ml, 0.1M, pH=7.0)に溶解した。cGTase (750μl)を添加し、反応混合物を40℃で1時間インキュベーションし、その後100℃で5分間加熱した。この酵素を、綿フィルターを通してろ過した。ろ液を、pHがおよそ2に達するまで塩酸を添加することにより酸性とし、室温で20分間攪拌した。その後溶液を、アンモニアを添加し中性とし、その後凍結乾燥した。凍結乾燥物を、無水ピリジン(30ml)に溶解し、無水酢酸(20ml)及びDMAP(＜1mg)を添加した。この反応混合物を、70℃で12時間攪拌し、その後過剰な無水物を、メタノール(20ml)を0℃で添加し中和した。この反応混合物を回転蒸発器で濃縮し、残渣をジクロロメタンに溶かし、この溶液を水、その後飽和NaHCO3溶液で洗浄した。水相を、ジクロロメタン(3回)で抽出した。有機相を一緒にし、無水硫酸カリウム上で乾燥し、蒸発させた。
予想されたアノマー混合物を、高速クロマトグラフィーにより精製した(PE/EtOAc: 3/4) (521mg, 70％)。
M.S. (FAB+)：m/z＝1299 [M+Na]+
C24H33BrO16の元素分析：
計算値：C 47.07；H 5.29；Br 6.26
実測値：C 47.25；H 5.52；Br 6.34
【化３３】
2005501046.tif 000038
【化３４】
2005501046.tif 000039
【００７８】
実施例9
a ) α-D-グルコピラノシル-(1-＞4)-α-D-グルコピラノシル-(1-＞4)-[α-D-グルコピラノシル-(1-＞4)-α-D-グルコピラノシル-(1-＞4)-S-α-D-グルコピラノシル-(1-＞6)]-6チオ-α-D-グルコピラノシル-(1-＞4)-D-グルコピラノースの調製
【化３５】
2005501046.tif 000040
S-α-D-グルコピラノシル-(1-＞6)-6-チオ-α-D-グルコピラノシル-(1-＞4)-D-グルコピラノース(34.2mg, 65.7μmol)及び実施例1e)で調製したフッ化物E1 (94mg, 4当量)を、リン酸緩衝液(4.6ml, 0.1M, pH=7.0)に溶解した。cGTase (141μl)を添加した。この反応混合物を、周囲温度で2時間インキュベーションし、その後100℃で5分間加熱した。この酵素を、綿フィルターを通してろ過した。ろ液を、pHがおよそ2に達するまで塩酸を添加することにより酸性とし、室温で20分間攪拌した。その後溶液を、飽和炭酸水素ナトリウム溶液を添加し中性とし、その後凍結乾燥した。この混合物を、HPLCカラムで精製した(NH2カラム；溶離液：CH3CN 55 H2O 45)。ふたつの画分を回収した：F1及びF2。画分F1を、水(10ml)に溶解し、酸性樹脂(Dowex 50W x 8)を添加した。混合物を、周囲温度で8時間攪拌し、その後ろ過した。水相を、酢酸エチル(3x)で洗浄し、画分F2と一緒にした。凍結乾燥は、予想された化合物(51mg, 66％)を得ることを可能にした。
高解像度M.S. (ES+) ：C42H72O35NaS[M+Na]+
計算値：m/z＝1191.3473
実測値：m/z＝1191.3473
【化３６】
2005501046.tif 000041
【００７９】
実施例10：
a)メチル(2,3,4,6-テトラ-O-アセチル-α-D-グルコピラノシル)-(1-＞4)-(2,3,6-トリ-O-アセチル-α-D-グルコピラノシル)-(1-＞4)-(2,3-ジ-O-アセチル-6-ブロモ-6-デオキシ-α-D-グルコピラノシル)-(1-＞4)-(2,3,6-トリ-O-アセチル-α-D-グルコピラノシル)-(1-＞4)-2,3,6-トリ-O-アセチル-α-D-グルコピラノシル
【化３７】
2005501046.tif 000042
実施例4d)において調製した化合物D4(100mg, 0.20mmol)及びメチルα-D-グルコピラノシド(43.5mg, 1.1当量)を、リン酸緩衝液(3.7ml, 0.1M, pH=7.0)に溶解した。cGTase(130μl)を添加した。反応混合物を、40℃で15時間インキュベーションし、その後100℃で5分間加熱した。この酵素を、綿フィルターを通してろ過した。ろ液を、pHがおよそ2に達するまで塩酸を添加することにより酸性とし、室温で20分間攪拌した。その後溶液を、アンモニアを添加し中性とし、及び前記緩衝液(1ml)中の実施例1e)において調製したフッ化物E1(112mg, 1.3当量)の溶液、及びcGTase (129μl)を添加した。この混合液を、周囲温度で2時間インキュベーションし、その後100℃で5分間加熱した。この酵素を、綿フィルターを通してろ過した。ろ液を、pHがおよそ2に達するまで塩酸を添加することにより酸性とし、室温で20分間攪拌した。その後溶液を、アンモニアを添加し中性とした。凍結乾燥物を、無水ピリジン(20ml)中に溶解し、無水酢酸(10ml)及びDMAP(＜1mg)を添加した。反応混合液を、70℃で12時間攪拌し、その後過剰な無水物を、0℃のメタノール(10ml)を添加することにより中和した。反応混合液を、回転蒸発器で濃縮し、残渣を、CH2Cl2に溶かし、この溶液を水で、その後飽和NaHCO3溶液で洗浄した。水相を、CH2Cl2 (3回)で抽出した。有機相を一緒にし、Na2SO4上で乾燥し、蒸発させた。高速クロマトグラフィーによる精製(Et2O及びその後Et2O 10 アセトン1)は、化合物A10 (161mg, 52％)を得ることを可能にした。
[α]D：+105° (c=0.25, クロロホルム)
高解像度M.S. (ES+) ：C61H83BrO40Na[M+Na]+
計算値：m/z＝1557.3542
実測値：m/z＝1557.3542
1H NMR (400MHz, CDCl3)：
【表３】
2005501046.tif 000043
【化３８】
2005501046.tif 000044
【００８０】
実施例11
a) 2,3,6-トリ-O-アセチル-α-D-ガラクトピラノシル-(1-＞4)-1,2,3,6-テトラ-β-D-グルコピラノースの調製
【化３９】
2005501046.tif 000045
実施例1b)において調製した化合物B1 (202g, 0.32mmol)を、無水ジクロロメタン(8.6ml)に溶解し、ピリジン(860μl)を添加した。この反応液を、0℃に冷却し、無水トリフリック酸(143μl)を添加した。反応混合液を、30分間攪拌し、冷条件下で、水、飽和炭酸水素ナトリウム溶液及び酸性硫酸水素カリウム溶液で洗浄した。有機相を、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、蒸発乾固した。残渣を、蒸留したジメチルホルムアミド(12ml)に溶かし、亜硝酸テトラブチルアンモニウム(922mg)を添加した。反応混合液を、周囲温度で12時間攪拌し、酢酸エチルで希釈し、その後連続して飽和塩化ナトリウム溶液及び水で洗浄した。有機相を、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、蒸発乾固させた。予想された化合物を、高速クロマトグラフィーにより精製した(1. EtOAc 1 PE 1；2. EtOAc 1.5 PE 1) (192mg, 95％)。
[α]D：73.3° (c=1, クロロホルム)
高解像度M.S. (ES+) ：C26H36O18Na [M+Na]+
計算値：m/z＝659.1799
実測値：m/z＝659.1813
高解像度M.S. (ES+) ：C26H36O18K [M+K]+
計算値：m/z＝675.1539
実測値：m/z＝675.1542
【化４０】
2005501046.tif 000046
【００８１】
b) 4-アジド-4-デオキシ-2,3,6-トリ-O-アセチル-α-D-グルコピラノシル-(1-＞4)-1,2,3,6-テトラ-O-アセチル-β-D-グルコピラノースの調製
【化４１】
2005501046.tif 000047
実施例11a)において調製した化合物A11(110mg, 0.17mmol)を、無水ジクロロメタン(4ml)中に溶解し、ピリジン(400μl)を添加した。この反応混合液を、-15℃に冷却し、無水トリフリック酸(70μl)を添加した。反応混合液を、-15℃で30分間、その後周囲温度で2時間攪拌した。その後この混合物を、冷条件下で下記により洗浄した：水、飽和炭酸水素ナトリウム溶液及び酸性硫酸水素カリウム溶液。有機相を、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、蒸発乾固した。残渣を、蒸留したジメチルホルムアミド(0.9ml)に溶かし、アジ化ナトリウム(64mg)を添加した。この反応混合液を、周囲温度で12時間攪拌し、その後酢酸エチルで希釈し、水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、蒸発させた。予想された化合物を、高速クロマトグラフィーにより精製した(EtOAc/PE：4/1) (102mg, 91％)。
[α]D：+181° (c=1, クロロホルム)
高解像度M.S. (ES+) ：C26H35N3O17Na [M+Na]+
計算値：m/z＝684.1864
実測値：m/z＝684.1863
高解像度M.S. (ES+) ：C26H35N3O17K [M+K]+
計算値：m/z＝700.1604
実測値：m/z＝700.1591
【化４２】
2005501046.tif 000048
【化４３】
2005501046.tif 000049
【００８２】
c) フッ化4-アジド-4-デオキシ-2,3,6-トリ-O-アセチル-α-D-グルコピラノシル-(1-＞4)-2,3,6-トリ-O-α-D-グルコピラノシルの調製
【化４４】
2005501046.tif 000050
この反応は、プラスチック容器内で0℃で実行した。
実施例11b)において調製した化合物B11 (100mg, 0.15mmol)を、ピリジン中のフッ化水素溶液(7/3, 容量, 3ml)に溶解した。30分間攪拌した後、この反応混合液を、ジクロロメタンで希釈し、その後氷冷した3Mアンモニア水溶液に注いだ。
静置して分離した後、有機相を、氷冷した飽和炭酸水素ナトリウム溶液で2回洗浄した。引き続き有機相を、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、その後回転蒸発器を用いて蒸発させた。
トリエチルアミンで前もって中和したシリカゲルを使用する高速クロマトグラフィー(EtOAc/PE：1/1)で、予想されたフッ化物(71mg, 75％)を得ることが可能であった。
[α]D：+112°(c=0.3, クロロホルム)
高解像度M.S. (ES+) ：C24H32FN3O15Na [M+Na]+
計算値：m/z＝644.1715
実測値：m/z＝644.1720
高解像度M.S. (ES+) ：C24H32FN3O15K [M+K]+
計算値：m/z＝660.1455
実測値：m/z＝660.1470
【化４５】
2005501046.tif 000051
【００８３】
d) フッ化4-アジド-4-デオキシ-α-D-グルコピラノシル-(1-＞4)-α-D-グルコピラノシルの調製
【化４６】
2005501046.tif 000052
先行する工程において調製された化合物C11 (34mg, 51.5μmol)を、メタノール(10ml)に溶解した。メタノール中のナトリウムメトキシド溶液(1N, 100μl)を添加した。周囲温度で4時間攪拌した後、反応混合物を0℃に冷却し、その後Amberlite IRN 120 H+樹脂で中和した。ろ過後、化合物を濃縮し、残渣を水に溶かし、凍結乾燥した(19mg, 100％)。この化合物を更に精製せずに使用した。
[α]D：154° (c=0.87, 水)
高解像度M.S. (ES+) ：C12H20FN3O9Na [M+Na]+
計算値：m/z＝392.1081
実測値：m/z＝392.1081
1H NMR (400MHz, D2O):
【表４】
2005501046.tif 000053
【００８４】
実施例12
a) (2,3,6-トリ-O-アセチル-4-アジド-4-デオキシ-α-D-グルコピラノシル)-(1-＞4)-(2,3,6-トリ-0-アセチル-α-D-グルコピラノシル)-(1-＞4)-(ジ-O-アセチル-6-ブロモ-6-デオキシ-α-D-グルコピラノシル)-(1-＞4)-1,2,3,6-テトラ-O-アセチル-D-グルコピラノースの調製
【化４７】
2005501046.tif 000054
実施例11d)において調製したフッ化物D11 (90.9mg, 0.25mmol)及び6-ブロモ-6-デオキシ-α-D-グルコピラノシル-(1-＞4)-D-グルコピラノース(90.9mg, 0.22mmol)を、リン酸緩衝液(0.1M, pH=7, 9ml)中に溶解し、及びcGTase (270μl)を添加した。この反応混合液を、周囲温度で3時間インキュベーションし、その後凍結乾燥した。固形物を、蒸留したピリジン(10ml)に溶かし、無水酢酸(10ml)を、触媒量の4,4-ジメチルアミノピリジン(DMAP, 〜1mg)と一緒に添加した。この反応液を、70℃で12時間攪拌し、その後反応媒質を冷却し、過剰な無水物を、0℃のメタノール(5ml)をゆっくり添加することにより破壊した。
この混合物：
計算値：m/z＝1089.3234
実測値：m/z＝1089.3233
1H NMR (400MHz, CDCl3)
【表５】
2005501046.tif 000055
【化４８】
2005501046.tif 000056
【００８５】
【化４９】
2005501046.tif 000057
実施例11d)において調製したフッ化物D11 (10mg, 27.1μmol)を、リン酸緩衝液(50mM, pH=7, 95μl)に溶解し、並びにメタノール(156μl)及びこの緩衝液中のAspergillus oryzaeのα-アミラーゼ(54 U, 51μl)溶液を添加した。この混合液を室温で2時間インキュベーションし、その後100℃で5分間加熱し、ろ過した。この混合液を濃縮し、水で共沸した。予想された化合物を、Sep-pack C18(登録商標)で精製した(15mg, 65％)。
高解像度M.S. (ES+) ：C30H51N3O25Na [M+Na]+
計算値：m/z＝876.2709
実測値：m/z＝876.2713
【化５０】
2005501046.tif 000058
【００８６】
【化５１】
2005501046.tif 000059
硫化水素を、化合物A13 (15mg, 17.6μmol)を含有する、ピリジン／水混合液(1/1, 3ml)中に30分間泡立てた。その後丸底フラスコを密封し、反応媒質を周囲温度で12時間攪拌し、その後ろ過し、濃縮し、水で共沸した。予想された化合物を、Sep-pak C18上で精製し、凍結乾燥した(14mg, 96％)。
高解像度M.S. (ES+) ：C30H54NO25 [M+H]+
計算値：m/z＝828.2983
実測値：m/z＝828.2985
【化５２】
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【化５３】
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【００８７】
c) 4-デオキシ-4-(6-ニトロベラトリルオキシ-カルボニルアミノ)-α-D-グルコピラノシル-(1-＞4)-α-D-グルコピラノシル-(1-＞4)-α-D-グルコピラノシル-(1-＞4)-α-D-グルコピラノシル-(1-＞4)-D-グルコピラノースの調製
【化５４】
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ピリジン(5μl)を、無水DMF (300μl)に溶解した実施例13b)において調製した化合物B13 (10mg, 12.1μmol)に添加した。この混合物を0℃に冷却し、6-ニトロベラトリルクロロギ酸(3.2mg, 1当量)及び触媒量のDMAPを添加した。混合物を、周囲温度で4時間攪拌し、クロロギ酸(3.2mg)を添加した。反応混合物を、70℃で12時間加熱し、クロロギ酸(3.2mg)を添加した。その後この混合物を、100℃で4時間加熱し、これを0℃に冷却した。アセトン(3ml)を添加し、生成された沈殿をろ過し、水に溶解し、Sep-pack C18(登録商標)で精製し、凍結乾燥した(9mg, 70％)。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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