(57)【要約】  本発明は、サイトヒン（ＳＴＨ）をコード化する単離された核酸配列、該配列へとハイブリダイゼーションする単離された核酸配列、該核酸配列によりコード化される精製されたタンパク質を提供する。本発明は、精製されたＳＴＨタンパク質、およびＳＴＨタンパク質を作る方法も提供する。本発明は更に、ＳＴＨに特異的な抗体、および該抗体を産生する方法を指向するものである。加えて、本発明は、ＳＴＨをコード化する核酸配列を含むベクター、該ベクターで形質転換された宿主細胞、および遺伝子導入非ヒト動物を開示する。本発明は更に、被験者が神経変性疾患を持っているか、もしくはこれを進展させるリスクが増大しているかどうかを決定する方法、および該被験者の予後を査定する方法を提供する。最後に、本発明は、被験者が、神経変性疾患を持っているか、もしくはこれを進展させるリスクが増大しているかどうかを決定するためのキットを開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイトヒン（ＳＴＨ）をコード化する、単離された核酸配列。
【請求項２】
ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡである、請求項１に記載の核酸配列。
【請求項３】
サイトヒン−Ｑ（ＳＴＨ−Ｑ）対立遺伝子である、請求項１に記載の核酸配列。
【請求項４】
図１において説明されるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の核酸配列。
【請求項５】
図３において説明されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコード化する、請求項１に記載の核酸配列。
【請求項６】
高ストリンジェント条件下に、図１において説明されるヌクレオチド配列またはこれの連続断片に相補的な第２の核酸配列へとハイブリダイゼーションする、単離された核酸配列。
【請求項７】
サイトヒン−Ｒ（ＳＴＨ−Ｒ）対立遺伝子である、請求項１に記載の核酸配列。
【請求項８】
図２において説明されるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の核酸配列。
【請求項９】
図３において説明されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコード化する、請求項１に記載の核酸配列。
【請求項１０】
高ストリンジェント条件下に、図２において説明されるヌクレオチド配列またはこれの連続断片に相補的な第２の核酸配列へとハイブリダイゼーションする、単離された核酸配列。
【請求項１１】
精製されたサイトヒンタンパク質。
【請求項１２】
サイトヒン−Ｑ（ＳＴＨ−Ｑ）アイソフォームである、請求項１１に記載のタンパク質。
【請求項１３】
図３において説明されるアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載のタンパク質。
【請求項１４】
図１において説明されるヌクレオチド配列によりコード化される、請求項１１に記載のタンパク質。
【請求項１５】
サイトヒン−Ｒ（ＳＴＨ−Ｒ）アイソフォームである、請求項１１に記載のタンパク質。
【請求項１６】
図４において説明されるアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載のタンパク質。
【請求項１７】
図２において説明されるヌクレオチド配列によりコード化される、請求項１１に記載のタンパク質。
【請求項１８】
高ストリンジェント条件下に、図１において説明されるヌクレオチド配列またはこれの連続断片に相補的な第２の核酸配列へとハイブリダイゼーションする核酸配列によりコード化される、精製されたタンパク質。
【請求項１９】
高ストリンジェント条件下に、図２において説明されるヌクレオチド配列またはこれの連続断片に相補的な第２の核酸配列へとハイブリダイゼーションする核酸配列によりコード化される、精製されたタンパク質。
【請求項２０】
サイトヒン（ＳＴＨ）タンパク質に特異的な抗体。
【請求項２１】
前記ＳＴＨタンパク質がＳＴＨ−Ｑアイソフォームである、請求項２０に記載の抗体。
【請求項２２】
前記ＳＴＨタンパク質がＳＴＨ−Ｒアイソフォームである、請求項２０に記載の抗体。
【請求項２３】
サイトヒン（ＳＴＨ）タンパク質に特異的な抗体を産生する方法であって、
（ａ）哺乳類をＳＴＨタンパク質で免疫し；および
（ｂ）該哺乳類の組織から、または該哺乳類の組織を使用して作られたハイブリドーマから抗体を精製する
段階を含む方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法により産生される抗体。
【請求項２５】
前記ＳＴＨタンパク質がＳＴＨ−Ｑアイソフォームである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＳＴＨタンパク質がＳＴＨ−Ｒアイソフォームである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
サイトヒン（ＳＴＨ）をコード化する核酸配列を含むベクター。
【請求項２８】
前記核酸配列がサイトヒン−Ｑ（ＳＴＨ−Ｑ）対立遺伝子である、請求項２７に記載のベクター。
【請求項２９】
前記核酸配列が図１において説明されるヌクレオチド配列またはこれの連続断片を含む、請求項２７に記載のベクター。
【請求項３０】
前記核酸配列が、高ストリンジェント条件下に、図１において説明されるヌクレオチド配列またはこれの連続断片に相補的な核酸配列へとハイブリダイゼーションする、請求項２７に記載のベクター。
【請求項３１】
前記核酸配列がサイトヒン−Ｒ（ＳＴＨ−Ｒ）対立遺伝子である、請求項２７に記載のベクター。
【請求項３２】
前記核酸配列が、図２において説明されるヌクレオチド配列またはこれの連続断片を含む、請求項２７に記載のベクター。
【請求項３３】
前記核酸配列が、高ストリンジェント条件下に、図２において説明されるヌクレオチド配列またはこれの連続断片に相補的な核酸配列へとハイブリダイゼーションする、請求項２７に記載のベクター。
【請求項３４】
請求項２７に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項３５】
請求項２８に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項３６】
請求項３１に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項３７】
サイトヒン（ＳＴＨ）タンパク質を作る方法であって、
（ａ）宿主細胞中へ、ＳＴＨをコード化する核酸配列を導入し；
（ｂ）該核酸配列が発現されてＳＴＨタンパク質を産生するような条件下に、該宿主細胞を維持し；および
（ｃ）該ＳＴＨタンパク質を回収する
段階を含む方法。
【請求項３８】
前記ＳＴＨタンパク質がＳＴＨ−Ｑアイソフォームである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＳＴＨタンパク質がＳＴＨ−Ｒアイソフォームである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
ゲノムがそれの内因性ＳＴＨ遺伝子中で分断を含む、遺伝子導入非ヒト動物。
【請求項４１】
前記分断が前記ＳＴＨ遺伝子中のノックアウト突然変異である、請求項４０に記載の遺伝子導入動物。
【請求項４２】
サイトヒン（ＳＴＨ）タンパク質を過剰に発現する遺伝子導入非ヒト動物。
【請求項４３】
前記ＳＴＨタンパク質がサイトヒン−Ｑアイソフォームである、請求項４２に記載の遺伝子導入動物。
【請求項４４】
前記ＳＴＨタンパク質がサイトヒン−Ｒアイソフォームである、請求項４２に記載の遺伝子導入動物。
【請求項４５】
被験者がアルツハイマー病（ＡＤ）を持っているか、またはＡＤを進展させるリスクが増大しているかどうかを決定する方法であって、サイトヒン（ＳＴＨ）の１つ以上の対立遺伝子の存在に関して、該被験者の診断サンプルをアッセイすることを含み、ここでＳＴＨ−Ｒ対立遺伝子の存在の検出が、該被験者がＡＤを持っているか、またはＡＤを進展させるリスクが増大していることを指し示す方法。
【請求項４６】
前記診断サンプルが、ＳＴＨをコード化する核酸へとハイブリダイゼーションする少なくとも１つの核酸プローブを使用してアッセイされる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記核酸プローブがＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記核酸プローブが検出可能なマーカーで標識された、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記診断サンプルが、ＳＴＨタンパク質の１つ以上のアイソフォームの発現に関してアッセイすることにより、ＳＴＨの１つ以上の対立遺伝子の存在に関してアッセイされる、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記診断サンプルが、ＳＴＨと反応性の物質を使用してアッセイされる、請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
前記物質が検出可能なマーカーで標識される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記物質が抗体である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記抗体が検出可能なマーカーで標識される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
アルツハイマー病（ＡＤ）を持っているか、またはこれを進展させるかも知れない被験者の予後を査定する方法であって、サイトヒン（ＳＴＨ）の１つ以上の対立遺伝子の存在に関して、該被験者の診断サンプルをアッセイすることを含み、ここで、該被験者の該診断サンプル中の２つのＳＴＨ−Ｒ対立遺伝子の存在が、該被験者に関してのより悲観的な予後を指し示す方法。
【請求項５５】
前記診断サンプルが、ＳＴＨをコード化する核酸へとハイブリダイゼーションする少なくとも１つの核酸プローブを使用してアッセイされる、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記診断サンプルが、ＳＴＨタンパク質の１つ以上のアイソフォームの発現に関してアッセイすることにより、ＳＴＨの１つ以上の対立遺伝子の存在に関してアッセイされる、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記診断サンプルが、ＳＴＨと反応性の物質を使用してアッセイされる、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
被験者がアルツハイマー病（ＡＤ）を持っているか、またはＡＤを進展させるリスクが増大しているかを決定するためのキットであって、サイトヒン（ＳＴＨ）の１つ以上の対立遺伝子の存在を検出する試薬、および該被験者がアルツハイマー病（ＡＤ）を持っているか、またはＡＤを進展させるリスクが増大しているかを決定するためのキットを使用することに関しての説明書を含むキット。
【請求項５９】
更に容器を含む、請求項５８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［政府の権利についての陳述］
本発明は、ＮＩＭＨ Grant No. 38623  の下に、政府の支援と共になされた。これ故に、米国政府は、本発明における所定の権利を持つ。
【背景技術】
【０００２】
［本発明の背景］
アルツハイマー病（ＡＤ）は、認知機能の進行性で容赦ない喪失により特徴付けられる神経変性疾患である（１）。ＡＤは、最もよく見られる後発性の痴呆であり、世界の先進国の何百万人の人々に影響を及ぼしている。約４，０００，０００人のアメリカ人がアルツハイマー病に苦しみ、その年間コストは約＄１００，０００，０００，０００であり、ＡＤを、３番目に最もコストのかかる加齢疾患にしている。この疾患は、男性における約２倍女性においてよく起こり、老齢者における痴呆の６５％よりも多くを数える。早期の同定がＡＤのような進行性の病状においては決定的であり、これはより早期の処置が、認知機能の保存において、より遅い処置よりもより有効であることがあるからである。更に、早期の検出は、処置および介護の選択肢に触れさせる時間を許容することがある。しかしながら現在までに、アルツハイマー病に関しての治癒は得られておらず、認知の衰えは不可避である。
【０００３】
ＡＤは、２つの主要な神経病理学的特徴を持っている：細胞外凝集、いわゆるアミロイド斑、神経炎斑、もしくは老人斑であり、これは、アミロイド核の周りの神経突起、星状細胞、およびグリア細胞から構成され、ならびにこれは、大脳皮質中に位置される；細胞内凝集、いわゆる神経繊維の絡み合いであり、これは組になった渦巻き状のフィラメントから構成される。老人斑および神経繊維の絡み合いが通常の老化に伴って起きる一方、それらはアルツハイマー病を患っている人たちにおいては、遙かにより罹患している。ＡＤの進展は、多くの環境による傷害が引き金となり得るが、遺伝子研究は、特定の遺伝子の突然変異および多型が、この変性過程へ罹患性を与え得る。
【０００４】
アルツハイマー病患者の遺伝子研究は、幾つかの早期発症（＜６５歳）の疾患リスク要因（例えば、アミロイド前駆体タンパク質、プレセニリン１およびプレセニリン２における突然変異）、および後発性（＞６５歳）の疾患リスク要因、アポリポタンパク質ＥのＥ４対立遺伝子（ＡｐｏＥ４）（例えば、米国特許第５，７１６，８２８号；米国特許第５，７６７，２４８号；および米国特許第６，１３６，５３０号参照）を同定した。この後発性ＡＤ（ＬＯＡＤ）集団中、５０％の被験者だけが、このＡｐｏＥ４対立遺伝子を持っていることが示されており、ＡＤに関連する更なる遺伝子リスク要因の存在を支持する証拠を突き付けている。実際、ＬＯＡＤの影響を受けた子孫の夫婦の最近の関連した研究は、リスク要因遺伝子を宿しているかも知れない染色体９および１０上の遺伝子座を同定している（２）。
【０００５】
現在までに、ＡＤに関する既知のリスク要因は、アミロイド産生または沈着を調節することが示されている；が、ＡＤの診断に関してはどれも必要または充分ではなく、どれもが神経繊維の絡み合い（ＮＦＴ）の形成における役割を論証していない。ＮＦＴに関する更なる研究が、通常は可溶性のタンパク質であるタウ（τ）の、ＮＦＴにおいて検出される過剰にリン酸化された不溶性のタンパク質への変換に関する研究と共に行われた。微小管会合タンパク質であるタウは、神経の形状を樹立し維持するのに重要である。通常細胞におけるそれの役割に加えて、タウタンパク質は、神経内凝集物の主要な成分として、ＡＤを包含する多くの神経変性疾患に含まれる。タウの病理を伴うより多く見られる疾患の内の幾つかは、前頭葉側頭葉痴呆（ＦＴＤ）、ピック病、および進行性核上麻痺（ＰＳＰ）を包含する（３）。これらの疾病においてタウが含まれることは、これらの疾病の進行におけるそれの機能および役割へと多くの調査を促進させた。
【０００６】
最近、タウをコードしている幾つかの突然変異がＦＴＤとは乖離することが示され、タウの凝集を進展させるＦＴＤ−タウ突然変異Ｐ３０１Ｌを発現する遺伝子導入マウスを用いた幾つかの興味を惹かれる結果があった（３、４）。しかしながら、ＡＤにおいては、このタウ遺伝子においては全く突然変異は見出されず、このことは、他の要因がタウ凝集物の形成に含まれているようであることを示唆している。これらの要因は、タウの病理を伴う他の神経変性疾患を暗示している可能性がある（５〜９）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＦＴＤおよびＰＳＰの被験者において、このタウ遺伝子座に関する最近の遺伝子研究は、幾つかの突然変異および多型がそれぞれ、これらの疾病とは乖離することを示した（３）。該タウ遺伝子座中の隣接する遺伝子の同定および調査は、ＰＳＰにおける分子遺伝子的リスク要因の研究において価値を有し得るであろうが、これは、タウをコードするかまたはイントロンの報告された突然変異がないからである（１０）。この情報もまた、ＰＳＰに関してだけでなく、ＡＤのような他の神経変性疾患に関しても有用であり得よう。ＡＤおよび他の神経変性疾患に関連する新しいリスク要因の同定は、このような疾患の診断において、これらの疾病を指向した将来の予防および治療基準を簡単にするのを支援するかも知れない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
［本発明の要約］
本発明は、該タウ遺伝子座内の新規遺伝子サイトヒン（saitohin、ＳＴＨ）の同定、およびこのＳＴＨ遺伝子のサイトヒン−Ｒ（ＳＴＨ−Ｒ）対立遺伝子がアルツハイマー病（「ＡＤ」）を進展させる増大したリスクと関連しているという観測に基づいている。これらの知見を元に、本発明の目的は、ＳＴＨ−ＱおよびＳＴＨ−Ｒ両方の対立遺伝子を包含するサイトヒン（ＳＴＨ）をコード化する単離された核酸配列、および、ＳＴＨをコード化する核酸配列に相補的な第２の核酸配列へ、高ストリンジェント条件下にハイブリダイゼーションする単離された核酸配列を提供することである。
【０００９】
本発明は、ＳＴＨ−ＱおよびＳＴＨ−Ｒ両方のアイソフォームを包含する精製サイトヒン（ＳＴＨ）タンパク質、および、該ＳＴＨ−ＱおよびＳＴＨ−Ｒ対立遺伝子の両方を包含するＳＴＨをコード化する核酸配列に相補的な第２の核酸配列へ、高ストリンジェント条件下にハイブリダイゼーションする核酸配列によりコード化される精製タンパク質をも開示する。該ＳＴＨ−ＱおよびＳＴＨ−Ｒアイソフォーム両方を包含するＳＴＨタンパク質を作る方法も、提供される。
【００１０】
本発明は、該ＳＴＨ−ＱおよびＳＴＨ−Ｒアイソフォーム両方を包含するサイトヒン（ＳＴＨ）タンパク質に特異的な抗体、および、該ＳＴＨ−ＱおよびＳＴＨ−Ｒアイソフォーム両方を包含するＳＴＨタンパク質に特異的な抗体を産生する方法を、更に指向するものである。
【００１１】
加えて、本発明は、該ＳＴＨ−ＱおよびＳＴＨ−Ｒ対立遺伝子両方を包含するサイトヒン（ＳＴＨ）をコード化する核酸配列を含むベクター、および、該ＳＴＨ−ＱおよびＳＴＨ−Ｒ対立遺伝子両方を包含するＳＴＨをコード化する核酸配列を含むベクターを用いて形質転換された宿主細胞を開示する。
【００１２】
本発明は、ゲノムがそれの内因性ＳＴＨ遺伝子において分断（disruption）を含む遺伝子導入非ヒト動物、および、該ＳＴＨ−ＱおよびＳＴＨ−Ｒアイソフォーム両方を包含するサイトヒン（ＳＴＨ）タンパク質を過剰に発現する遺伝子導入非ヒト動物をも指向するものである。
【００１３】
本発明は、サイトヒン（ＳＴＨ）の１つ以上の対立遺伝子の存在に関して、被験者の診断サンプルをアッセイすることを含む、該被験者が神経変性疾患を持っているか、または神経変性疾患を進展させるリスクが増大しているかを決定する方法を更に提供し、ここでＳＴＨ−Ｒ対立遺伝子の存在の検出は、該被験者が、神経変性疾患を持っているか、またはこれを進展させるリスクが増大していることを指し示すものである。
【００１４】
本発明は、サイトヒン（ＳＴＨ）の１つ以上の対立遺伝子の存在に関して、被験者の診断サンプルをアッセイすることを含む、神経変性疾患を持っているか、またはこれを進展させるかも知れない該被験者の予後を査定する方法をも提供し、ここで該被験者の診断サンプル中における２つのＳＴＨ−Ｒ対立遺伝子の存在は、該被験者に関してのより悲観的な予後を指し示す。
【００１５】
最後に、本発明は、被験者が神経変性疾患を持っているか、または神経変性疾患を進展させるリスクが増大しているかを決定するキットを開示する。
【００１６】
本発明の更なる目的は、以下に伴う記載の観点から明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
［本発明の詳細な説明］
本発明は、染色体１７上に位置され、微小管関連タンパク質であるタウをコード化する遺伝子のイントロン内にある新規遺伝子サイトヒン（ＳＴＨ）を指向するものである。本明細書中で開示されるように、このサイトヒン遺伝子は、ヒトの集団においては、少なくとも２つの形態または対立遺伝子中に存在する。１つの形態においては、本明細書中で「サイトヒン−Ｑ（ＳＴＨ−Ｑ）」として言及され、この１２６番目のヌクレオチドはＡであり、これは結果的に、ＳＴＨタンパク質のこのＳＴＨ−Ｑアイソフォーム（isoform）の７番目の位置にてＱ（グルタミン）になっている。ＳＴＨの第２の形態においては、本明細書中で「サイトヒン−Ｒ（ＳＴＨ−Ｒ）」として言及され、この１２６番目のヌクレオチドはＧであり、これは結果的に、ＳＴＨタンパク質のこのＳＴＨ−Ｒアイソフォームの７番目の位置にてＲ（アルギニン）になっている。
【００１８】
従って、本発明は、サイトヒン（ＳＴＨ）遺伝子、およびＳＴＨタンパク質をコード化する単離された核酸配列を提供する。該ＳＴＨ遺伝子、およびＳＴＨタンパク質をコード化する該核酸配列は、ＳＴＨ−ＱおよびＳＴＨ−Ｒ両方の対立遺伝子を包含する。該ＳＴＨ遺伝子は「内因性」ＳＴＨ遺伝子であってもよく、これは微生物内から天然に起源を発し、または生じるものである。この遺伝子コードの変性により、本発明の該ＳＴＨ遺伝子は、該ＳＴＨ−ＱおよびＳＴＨ−Ｒ両方のアイソフォームを包含するＳＴＨタンパク質をもコード化するであろう複数の核酸置換物を包含する。本明細書中で使用されるように、「ＳＴＨタンパク質」は、適切な場合、ＳＴＨタンパク質（ＳＴＨ−ＱおよびＳＴＨ−Ｒ両方のアイソフォームを包含する）および「ＳＴＨ類似体」両方を包含する。他に指し示されなければ、「タンパク質」は、タンパク質、タンパク質ドメイン、ポリペプチド、またはペプチドを意味するようにされる。「ＳＴＨ類似体」は、該ＳＴＨタンパク質とのアミノ酸配列の相同性において６０％以上（好ましくは７０％以上）である該ＳＴＨタンパク質に対する機能的類似性を持つ如何なるタンパク質であってもよい。
【００１９】
本発明の核酸配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、またはアンチセンスＲＮＡであってもよく、如何なる種由来であってもよい。本発明の核酸配列は、好ましくは哺乳類の種由来であり、より好ましくはヒト由来である。
【００２０】
本発明の核酸配列は、本明細書中で「サイトヒン−Ｑ（ＳＴＨ−Ｑ）」として言及されるＳＴＨのＱ対立遺伝子であってもよく、ここで１２６番目のヌクレオチドはＡであり、これは結果的に、該ＳＴＨ−Ｑタンパク質の７番目の位置にてＱ（グルタミン）になる。該核酸配列が該ＳＴＨ−Ｑ対立遺伝子である場合、該核酸配列は、好ましくは図１のヌクレオチド配列（これらの保存置換を包含する）を含む。「保存置換」は、本明細書中で使用されるように、この置換されたアミノ酸残基に機能的に等価であるアミノ酸置換であり、これは、それらが似た極性もしくは立体配置を持つからであるか、またはそれらがこの置換された残基と同じクラス（例えば、疎水的、酸性、または塩基性）に属するからである。本発明の核酸は、該ＳＴＨタンパク質のＳＴＨ−Ｑアイソフォームをコード化してもよく、これは図３において説明されるアミノ酸配列を含む。
【００２１】
本発明は更に、好ましくは高ストリンジェント条件下に（例えば、０．５−ＭのＮａＨＰＯ４中６５℃にて、フィルターと結合したＤＮＡへのハイブリダイゼーション、および６８℃にて０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中での洗浄）、または中庸なストリンジェント条件下に（例えば、４２℃にて０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中での洗浄）（１３）、図１において説明されるヌクレオチド配列もしくはこれの連続断片に相補的な第２の核酸へとハイブリダイゼーションする単離された核酸配列を提供する。加えて、本発明は、１つ以上の突然変異を持つ該ＳＴＨタンパク質の該ＳＴＨ−Ｑアイソフォームをコード化する核酸配列を提供し、ここで該突然変異は結果的に、非機能的（本来の正常な機能を果たさない）もしくは突然変異タンパク質の発現、または全くの発現の欠落になる。該突然変異は、点突然変異、挿入突然変異、再配列、または欠損突然変異、あるいはこれらの組み合わせからなる群から選択される方法の少なくとも１つにより、生成されてもよい。
【００２２】
本発明の核酸配列は、本明細書中で「サイトヒン−Ｒ（ＳＴＨ−Ｒ）」として言及される、ＳＴＨのＲ対立遺伝子であってもよく、ここで１２６番目のヌクレオチドはＧであり、これは結果的に、該ＳＴＨタンパク質の該ＳＴＨ−Ｒアイソフォームの７番目の位置にて、Ｒ（アルギニン）になる。該核酸配列が該ＳＴＨ−Ｒ対立遺伝子である場合、該核酸配列は、好ましくは図２のヌクレオチド配列（これらの保存置換を包含する）を含む。本発明の核酸は、該ＳＴＨタンパク質の該ＳＴＨ−Ｒアイソフォームをコード化してもよく、これは図４において説明されるアミノ酸配列を含む。
【００２３】
本発明は更に、好ましくは高ストリンジェント条件下に（例えば、０．５−ＭのＮａＨＰＯ４中６５℃にて、フィルターと結合したＤＮＡへのハイブリダイゼーション、および６８℃にて０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中での洗浄）、または中庸なストリンジェント条件下に（例えば、４２℃にて０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中での洗浄）（２）、図２において説明されるヌクレオチド配列もしくはこれの連続断片に相補的な第２の核酸へとハイブリダイゼーションする単離された核酸配列を開示する。加えて、本発明は、１つ以上の突然変異を持つ該ＳＴＨタンパク質の該ＳＴＨ−Ｒアイソフォームをコード化する核酸配列を提供し、ここで該突然変異は結果的に、非機能的もしくは突然変異タンパク質の発現、または全くの発現の欠落になる。該突然変異は、点突然変異、挿入突然変異、再配列、または欠損突然変異、あるいはこれらの組み合わせからなる群から選択される方法の少なくとも１つにより、生成されてもよい。
【００２４】
本発明はまた、単離され精製されたＳＴＨタンパク質を提供する。該ＳＴＨタンパク質は、被験者から得られた組織（例えば、脳組織）から単離されてもよく、または以下に記載されるように組み換え的に産生されてもよい。該ＳＴＨタンパク質は、本明細書中で開示されるＳＴＨ−ＱおよびＳＴＨ−Ｒ両方のアイソフォームを包含する。
【００２５】
本発明のタンパク質は、ＳＴＨタンパク質のＱアイソフォーム、すなわちサイトヒン−Ｑ（ＳＴＨ−Ｑ）であってもよく、ここで７番目の位置にＱ（グルタミン）がある。該タンパク質が該ＳＴＨ−Ｑアイソフォームである場合、該タンパク質は、好ましくは図３において説明されるアミノ酸配列を含む。あるいは、該ＳＴＨタンパク質の該ＳＴＨ−Ｑアイソフォームは、図１において説明されるヌクレオチド配列によりコード化されてもよい。本発明は更に、高ストリンジェントまたは中庸なストリンジェント条件下に、図１において説明されるヌクレオチド配列もしくはこれの連続断片に相補的な第２の核酸配列へとハイブリダイゼーションする核酸配列によりコード化される精製されたタンパク質を指向するものである。
【００２６】
本発明のタンパク質はまた、該ＳＴＨタンパク質の該Ｒアイソフォーム、すなわちサイトヒン−Ｒ（ＳＴＨ−Ｒ）であってもよく、ここで７番目の位置にＲ（アルギニン）がある。該タンパク質が該ＳＴＨ−Ｒアイソフォームである場合、該タンパク質は、好ましくは図４において説明されるアミノ酸配列を含む。あるいは、該ＳＴＨタンパク質の該ＳＴＨ−Ｑアイソフォームは、図２において説明されるヌクレオチド配列によりコード化されてもよい。本発明は更に、高ストリンジェントまたは中庸なストリンジェント条件下に、図２において説明されるヌクレオチド配列もしくはこれの連続断片に相補的な第２の核酸配列へとハイブリダイゼーションする核酸配列によりコード化される精製されたタンパク質を指向するものである。
【００２７】
加えて、本発明は、該ＳＴＨタンパク質の該ＳＴＨ−ＱおよびＳＴＨ−Ｒ両方のアイソフォームを包含するＳＴＨタンパク質に結合する物質を提供する。該物質は、限定することなく、抗体、化合物、薬剤、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、分子、核酸、タンパク質（成長因子を包含する）、ポリペプチド、ペプチド、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡを包含する）、およびこれらの如何なる組み合わせをも包含してよい。更に、該ＳＴＨ−ＱおよびＳＴＨ−Ｒ両方のアイソフォームを包含する該ＳＴＨタンパク質に結合する該物質は、天然物であっても、または合成物であってもよい。Ｆａｂ断片は、抗体の１価の抗原結合断片であり、これはパパイン消化により産生される。Ｆ（ａｂ’）２断片は、抗体の２価の抗原結合断片であり、これはペプシン消化により産生される。該ＳＴＨタンパク質に結合する物質は、該タンパク質を興味ある物質と接触させること、および該タンパク質に結合する該物質の能力を査定することにより、同定またはスクリーニングされてもよい。
【００２８】
本発明の該物質は、好ましくは、ＳＴＨタンパク質に特異的またはＳＴＨタンパク質と免疫反応性の抗体であり、該ＳＴＨ−Ｑおよび該ＳＴＨ−Ｒアイソフォームを包含する。本発明の該抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよく、当業者によく知られた技術により産生されてもよい。本発明の該抗体は、適切な標識系、バッファー、ならびに種々の検出および診断適用における使用のために必要な他の試薬を包含するキット中へ取り込まれてもよい。本発明の該抗体の標識化は、当業界において既知の種々の異なる化学蛍光剤および放射活性標識の内の１つを使用する、標準技術により達成されてもよい。
【００２９】
本発明は更に、該ＳＴＨ−ＱおよびＳＴＨ−Ｒ両方のアイソフォームを包含する該ＳＴＨタンパク質に特異的な抗体を産生する方法を提供し、これは：（ａ）哺乳類をＳＴＨタンパク質（例えば、ＳＴＨ−ＱまたはＳＴＨ−Ｒ）で免疫し；（ｂ）該哺乳類の組織から、または該哺乳類の組織を使用して作られたハイブリドーマから、抗体を精製する段階を含む。例えば、ポリクローナル抗体は、ウサギ、マウス、またはラットを精製されたＳＴＨ（例えば、ＳＴＨ−ＱまたはＳＴＨ−Ｒ）で免疫することにより産生されてもよい。この後、ウサギ、マウス、またはラットから脾臓を除去し、この脾臓の細胞を、骨髄腫細胞と融合し、ハイブリドーマを形成することにより産生されてもよく、このハイブリドーマは、培養されて成長される場合、モノクローナル抗体を産生するであろう。この方法により産生される抗体も提供される。
【００３０】
本発明は更に、該ＳＴＨ−ＱおよびＳＴＨ−Ｒ両方の対立遺伝子を包含する、ＳＴＨタンパク質をコード化する核酸に結合する物質を開示する。適切な物質は、限定されるものではないが、抗体、化合物、薬剤、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、分子、核酸、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡを包含する）、およびこれらの如何なる組み合わせをも包含する。ＳＴＨをコード化する該核酸に結合するこれらの物質は、該核酸の発現を阻害または促進することがある。このような物質は、ＳＴＨ（例えば、該ＳＴＨ−Ｑ対立遺伝子、または該ＳＴＨ−Ｒ対立遺伝子）をコード化する核酸に結合する物質に関してスクリーニングする方法により発見されることがあり、この方法は、該核酸を興味ある物質と接触させること、および該核酸に結合する該物質の能力を査定することを含む。ＳＴＨをコード化する核酸の該発現を阻害または促進する物質は、該核酸を含むベクターで形質転換された宿主細胞を接触させること、および該核酸の発現への該物質の効果を査定することにより、スクリーニングされてもよい。
【００３１】
本発明はまた、該ＳＴＨ−ＱおよびＳＴＨ−Ｒ両方の対立遺伝子を包含する、ＳＴＨタンパク質をコード化する核酸へとハイブリダイゼーションする核酸プローブおよびこれらの混合物を提供する。このようなプローブは、当業者には既知の種々の技術により調製されてよく、これらは限定なしに、ＰＣＲ、およびＳＴＨ（例えば、該ＳＴＨ−Ｑ対立遺伝子または該ＳＴＨ−Ｒ対立遺伝子）をコード化する核酸の制限酵素による消化；およびその配列が、Applied Biosystems Model ３９２  ＤＮＡ／ＲＮＡ  合成機のような、市販のオリゴヌクレオチド合成機を使用する、ＳＴＨをコード化する核酸のヌクレオチド配列の選択された位置に対応するオリゴヌクレオチドの、自動化された合成を包含する。本発明の核酸プローブはまた、それらが少なくとも１つの点、挿入、再配列、または欠損突然変異、あるいはこれらの組み合わせを含有し、このＳＴＨ遺伝子の突然変異に対応するように、調製されてもよい。
【００３２】
本発明の該核酸プローブは、ＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、ＳＴＨ（例えば、該ＳＴＨ−Ｑ対立遺伝子、または該ＳＴＨ−Ｒ対立遺伝子）をコード化する核酸の、約８ヌクレオチド〜全長の長さにおいて変動してもよい。好ましくは、これらのプローブは、長さにおいて８〜３０ヌクレオチドである。核酸プローブの標識化は、当業界において既知の数多くの方法の内の１つを使用して達成されてもよく、これらは限定なしに、ＰＣＲ、ニック（ｎｉｃｋ）翻訳、末端標識化、穴埋めの末端標識化、ポリヌクレオチド・キナーゼ交換反応、ランダム開始、またはＳＰ６ポリメラーゼ（リボプローブ調製用）を包含し、ならびに、限定なしに、３５Ｓ、３２Ｐ、または３Ｈのような放射活性標識、およびビオチン、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、アクリジン、コレステロール、またはカルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）のような非放射活性標識を包含する種々の標識の内の１つを包含する。ＳＴＨをコード化する核酸の異なる領域または重複する領域に対応する２つ以上の核プローブの組み合わせはまた、種々の検出および診断適用における使用のためのキット中に包含されてもよい。
【００３３】
本発明は更に、ＳＴＨタンパク質をコード化する核酸配列を含むベクターを指向するものである。ＳＴＨタンパク質をコード化する該核酸配列は、例えば、該ＳＴＨ−Ｑ対立遺伝子、または該ＳＴＨ−Ｒ対立遺伝子であってもよい。該ベクターの核酸配列が該ＳＴＨ−Ｑ対立遺伝子である場合、該核酸配列は、図１のヌクレオチド配列またはこれらの連続断片を含んでもよい。あるいは、該ベクターの核酸配列は、図１において説明されるヌクレオチド配列に、またはこれらの連続断片に相補的な核酸配列に、高ストリンジェントまたは中庸なストリンジェント条件下にハイブリダイゼーションする核酸配列を含んでもよい。該ベクターの該核酸配列が該ＳＴＨ−Ｒ対立遺伝子である場合、該核酸配列は、図２のヌクレオチド配列またはこれらの連続断片を含んでもよい。あるいは、該ベクターの核酸配列は、図２おいて説明されるヌクレオチド配列またはこれらの連続断片に相補的な核酸配列に、高ストリンジェントまたは中庸なストリンジェント条件下にハイブリダイゼーションする核酸配列を含んでもよい。
【００３４】
本発明の該ベクターは、以下に記載されるように、ＳＴＨをコード化する核酸（例えば、該ＳＴＨ−Ｑ、または該ＳＴＨ−Ｒ対立遺伝子）を、発現制御配列に操作されて結合された適切なベクター核酸中へ挿入することにより、構築されてもよい。この用語「挿入された」は、本明細書中で使用されるように、外来ＤＮＡ断片のベクターＤＮＡとの結合を意味し、これは、制限エンドヌクレアーゼによる消化により生成される、相容れる付着末端のアニール化のような技術により、または平滑末端結合技術の使用による。ＤＮＡ分子を結合させる他の方法は、当業者には明らかであろう。
【００３５】
本発明の該ベクターは、プラスミド、ウィルス由来核酸、ラムダファージ由来の溶菌バクテリオファージ、コスミド、またはＭ１３のようなフィラメント状一本鎖バクテリオファージを包含する、数多くの異なる源由来であってよい。該ベクターが導入される宿主細胞の型に依って、ベクターは、バクテリア性または真核性であってもよい。バクテリア性ベクターは、プラスミドおよびファージのゲノムを包含する多くの源由来である。真核性ベクターは、数多くの異なる源、例えばイースト菌のプラスミドおよびウィルスから構築される。幾つかのベクターはシャトル・ベクターとして言及され、バクテリアおよび真核細胞の両方において、複製可能である。該ベクターが由来する該核酸は、大きさにおいて通常大きく抑制され、それでそれの自家複製に必須なそれらの遺伝子のみが残る。大きさにおけるこの抑制は、これらのベクターが、外来ＤＮＡの大きなセグメントに順応することを可能にする。ＳＴＨをコード化する核酸（例えば、該ＳＴＨ−Ｑ、または該ＳＴＨ−Ｒ対立遺伝子）が挿入され得る適切なベクターの例は、これらに限定されないが、ｐＣＧＳ、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＨＳＶ−１０６、ｐＪＳ９７、ｐＪＳ９８、Ｍ１３ｍｐ１８、Ｍ１３ｍｐ１９、ｐＳＰＯＲＴ１、ｐＧｅｍ、ｐＳＰＯＲＴ２、ｐＳＶ・ＳＰＯＲＴ１、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、λＺａｐＩＩ、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λｇｔ２２Ａ、およびλＺＩＰＬＯＸを包含する。他の適切なベクターは、当業者には明らかであろう。
【００３６】
本発明の該ベクターは、宿主細胞中へ導入されてもよい。従って、本発明は更に、本発明の該ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。この用語「宿主細胞」は、本明細書中で使用されるように、該ベクターが導入されるバクテリア性または真核性の細胞を意味する。この用語「形質転換」は、ベクターの、バクテリア性または真核性の宿主細胞中への導入を記述する。加えて、本明細書中で使用されるように、この用語「導入」は、種々の手段の内の１つが、該核酸がその中で安定な形態で存在し、発現されることがあるような方法で、該ベクターが該宿主細胞の細胞内環境に入るようにするように使用されて来たことを指し示す、一般的な用語である。このように、それは、バクテリア細胞の形質転換同様、真核細胞におけるトランスフェクション、トランスダクション、および関連方法を取り込む。本発明の該ベクターは、該宿主細胞内に、統合された形態で、または統合されていない形態で存在してよい。統合されていない形態である場合は、該ベクターは自家複製可能である。
【００３７】
数多くの適切なバクテリア性または真核性宿主細胞のいずれの１つも、本発明の該ベクターで形質転換されてよい。適切な宿主細胞の例が当業者には既知であり、限定なしに、大腸菌株ｃ６００、ｃ６００ｈｆｌ、ＨＢ１０１、ＬＥ３９２、Ｙ１０９０、ＪＭ１０３、ＪＭ１０９、ＪＭ１０１、ＪＭ１０７、Ｙ１０８８、Ｙ１０８９、Ｙ１０９０、Ｙ１０９０（ＺＺ）、ＤＭ１、ＰＨ１０Ｂ、ＤＨ１１Ｓ、ＤＨ１２５、ＲＲ１、ＴＢ１、およびＳＵＲＥ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍのようなバクテリア細胞；Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ  ａｎｓｅｒｉｎａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｕｎｃｉｎｕｌａ  ｎｅｃａｔｏｒのような真核細胞、培養昆虫細胞、培養鶏線維芽細胞、培養ハムスター細胞、ＨＴ１０８０、ＭＣＦ７および１４３Ｂのような培養ヒト細胞、ならびにＥＬ４およびＮＩＨ３Ｔ３細胞のような培養マウス細胞を包含する。
【００３８】
幾つかのバクテリア性または真核性ベクターは、それらが該宿主細胞内での高レベルに至る挿入された核酸を発現させることが出来るように、操作されている。「発現カセット」または「発現制御配列」は、操作されて結合された、または転写および翻訳制御要素（例えば、プロモーター、リボゾーム結合部位、オペレーター、またはエンハンサー）の制御下のＳＴＨタンパク質（例えば、該ＳＴＨ−Ｑ、または該ＳＴＨ−Ｒ対立遺伝子）をコード化する核酸を含み、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ＳＴＨタンパク質（例えば、該ＳＴＨ−Ｑ、または該ＳＴＨ−Ｒアイソフォーム）の発現用に作られて使用され得る。本明細書中で使用されるように、「発現」は、該ベクターの、この挿入された核酸をｍＲＮＡへと転写する能力に関し、それでこの挿入された核酸によりコード化されるタンパク質の合成が起こり得る。用いられる制御要素の選択は、形質転換されるべき該宿主細胞および望まれるレベルの発現のような因子に依って、変動することがある。
【００３９】
例えば、大腸菌のようなバクテリア性宿主細胞での遺伝子の発現用に使用されるベクターにおいては、ｌａｃオペレーター−プロモーターまたはｔａｃプロモーターがしばしば使用される。真核性ベクターは、ウィルス性遺伝子のプロモーター−エンハンサー配列、特に腫瘍ウィルスのそれらを使用する。哺乳類細胞における使用のための幾つかのプロモーターは、当業界において既知である。これらのプロモーターの例は、限定なしに、ホスホグリセレート（ＰＧＫ）プロモーター、サル・ウィルス４０（ＳＶ４０）早期プロモーター、鶏（Ｒｏｕｓ）サルコーマ・ウィルス（ＲＳＶ）プロモーター、アデノウィルス主要後期プロモーター（ＭＬＰ）、およびヒト・サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）直早期１プロモーターを包含する。しかしながら、適切な発現レベルを容易にする如何なるプロモーターも、本発明において使用され得る。誘導可能なプロモーター（例えば、限定なしに、大腸菌中の該ｌａｃオペレーター−プロモーター、および真核細胞中のメタロチオニンまたはマウス哺乳類腫瘍ウィルスプロモーターを包含する熱ショック遺伝子、メタロチオニン遺伝子、ベーター−インターフェロン遺伝子、またはステロイド・ホルモン応答遺伝子から得られるもの）は、外因性の刺激に基づいて、転写を制御するのに有用であることがある。
【００４０】
ＳＴＨをコード化する核酸（例えば、該ＳＴＨ−Ｑ、または該ＳＴＨ−Ｒ対立遺伝子）の、宿主細胞における発現に適したベクターは、当業者にはよく知られており、ｐＥＴ−３ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ｐＰｒｏＥｘ−１（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｐＦａｓｔＢａｃ１（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｐＳＦＶ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｐｃＤＮＡＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＳＬ３０１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＳＥ３８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＴｒｃＨｉｓＡ，Ｂ，Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＳＥＴ  Ａ，Ｂ，Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＡＣ３６０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＶＬ１３９２およびｐＶｌ１３９２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＤＭ８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡＩ（ａｍｐ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＺｅｏＳＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲｃ／ＲＳＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＥＰ７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＥＰ８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＥＰ９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＥＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＥＢＶＨｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびλＰｏｐ６を包含する。他のベクターは、当業者には明らかであろう。
【００４１】
本発明の該ベクターは、当業界において既知の従来手順を使用して、宿主細胞中へ導入されてもよく、これは限定なしに、電気穿孔法、ＤＥＡＥデキストラン・トランスフェクション、リン酸カルシウム・トランスフェクション、モノカチオン性リポソーム融合、ポリカチオン性リポソーム融合、原形質融合、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける電場の創出、ＤＮＡ被覆マイクロ噴出性衝撃、組み換え複製−欠損ウィルスを用いた注入、相同的組み換え、ｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子治療、ｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子治療、ウィルス性ベクター、およびむき出しのＤＮＡの移入、あるいはこれらの如何なる組み合わせをも包含する。宿主細胞、組織、または被験者中への遺伝子移入の目的では、ＳＴＨ（例えば、該ＳＴＨ−Ｑ、または該ＳＴＨ−Ｒ対立遺伝子）をコード化する核酸を含有する組み換えベクターは、好ましくはこの受容者の血液と等張である無菌水溶液と組み合わされてもよい。このような製剤は、この組み換えベクターを、塩化ナトリウム、グリシン、および同様のもののような生理学的に相容れる物質を含有する水中に懸濁させ、生理学的条件と相容れる緩衝化されたｐＨを持たせて水溶液を生産し、その後この溶液を無菌にすることにより、調製されてもよい。本発明の好ましい実施形態において、該組み換えベクターは、哺乳類中への導入のための調製において、生理食塩水溶液中２０〜２５％のスクロースと組み合わされる。
【００４２】
本発明は更に、組み換えＳＴＨタンパク質を作る方法を提供し、これは：（ａ）適切なバクテリア性または真核性宿主細胞中へ、ＳＴＨをコード化する核酸配列（例えば、該ＳＴＨ−Ｑ、または該ＳＴＨ−Ｒ対立遺伝子）、あるいは図１において説明されるヌクレオチド配列またはこれらの連続断片に相補的な第２の核酸に、高ストリンジェント条件または中庸なストリンジェント条件下にハイブリダイゼーションする核酸、あるいは図２において説明されるヌクレオチド配列またはこれらの連続断片に相補的な第２の核酸に、高ストリンジェント条件または中庸なストリンジェント条件下にハイブリダイゼーションする核酸を導入し；（ｂ）該核酸配列が発現されて、ＳＴＨタンパク質（例えば、該ＳＴＨ−Ｑアイソフォーム、または該ＳＴＨ−Ｒアイソフォーム）を産生するような条件下に該宿主細胞を維持し；および（ｃ）この組み換えＳＴＨタンパク質を、この培養培地から、該宿主細胞から、または細胞溶解物から回収する段階を含む。本明細書中で使用されるように、この用語「組み換え」は、それの発現を高レベルへと向けることが出来るベクターで形質転換された宿主細胞からの精製により産生されるＳＴＨタンパク質（例えば、該ＳＴＨ−Ｑアイソフォーム、または該ＳＴＨ−Ｒアイソフォーム）に関する。本発明の方法においては、ＳＴＨをコード化する核酸配列（例えば、該ＳＴＨ−Ｑ対立遺伝子、または該ＳＴＨ−Ｒ対立遺伝子）が、前記方法のいずれかにより、適切な宿主細胞中へと導入されてもよい。
【００４３】
ベクターで形質転換された宿主細胞を成長させる種々の方法が、当業者に知られている。宿主細胞の型（例えば、バクテリア性、または真核性）は、利用されるべき方法、ならびに、温度、痕跡量の栄養分、湿度、および成長時間のような要因に関する特異的なパラメーターの最適化両方の、まず最初の決定因子である。使用されるベクターに依って、これらの宿主細胞は、該ベクター中に含有される核酸の発現を開始させるために、その成長サイクル中のある点における特異的な化合物の添加により誘導されなくてはならないことがある。該ベクター中に含有される該核酸の発現を誘導するに使用される化合物の例は、当業者には既知であり、限定なしに、ＩＰＴＧ、亜鉛、およびデキサメタゾンを包含する。硫酸アンモニウムによる沈殿および引き続いての塩を除去するための透析のような、タンパク質の単離および精製の標準方法を使用し、その後大きさ、特定のｐＨ値における該タンパク質の電荷、親和性による方法等に従って分画して、組み換えＳＴＨ（例えば、該ＳＴＨ−Ｑアイソフォーム、または該ＳＴＨ−Ｒアイソフォーム）は、ＳＴＨをコード化する核酸（例えば、該ＳＴＨ−Ｑ対立遺伝子、または該ＳＴＨ−Ｒ対立遺伝子）を発現できるベクターで形質転換された適切な宿主細胞から抽出されてもよい。
【００４４】
ゲノムが該ＳＴＨ遺伝子における分断を含む遺伝子導入非ヒト動物、またはＳＴＨタンパク質（例えば、該ＳＴＨ−ＱまたはＳＴＨ−Ｒアイソフォーム）を過剰に発現する遺伝子導入非ヒト動物を提供することも、本発明の範囲内である。該ＳＴＨ遺伝子は、非ヒト動物、特にマウスに存在することが知られている。該非ヒト動物は、如何なる適切な動物（例えば、ネコ、ウシ、イヌ、ウマ、ヤギ、齧歯類、およびヒツジ）であってもよいが、好ましくは齧歯類である。より好ましくは、該非ヒト動物は、ラットまたはマウスである。本発明の遺伝子導入非ヒト動物は、当業界において知られているものを包含する種々の、遺伝子導入動物を遺伝子工学的に操作する技術により産生されてもよい。
【００４５】
本明細書中で使用されるように、この用語「遺伝子導入非ヒト動物」は、遺伝子工学的に操作された非ヒト動物に関し、これは実験操作により生産され、このゲノムは、導入遺伝子の導入により代えられている。本明細書中で更に使用されるように、この用語「導入遺伝子」は、実験操作により動物の該ゲノム中へ導入された核酸（例えば、ＤＮＡ、すなわち遺伝子）に関し、ここでこの導入された遺伝子は、該動物にとって内因性ではなく、または、該動物にとって内因性である遺伝子の修飾もしくは突然変異された形態である。内因性遺伝子のこの修飾もしくは突然変異された形態は、ヒトの介入を通じて（例えば、点突然変異の導入、フレームシフト突然変異の導入、この内因性遺伝子の一部分または断片の欠損、選択可能なマーカー遺伝子の挿入、終結コドンの挿入等により）産生されてもよい。遺伝子導入非ヒト動物は、限定なしに、導入遺伝子の、胚幹細胞、新たに受精された卵、または非ヒト動物の早期胚への導入を含むヒトの介入；導入遺伝子の、非ヒト動物の体細胞および／または生殖細胞の染色体への統合；および本明細書中で記載される方法のいずれかを含む幾つかの方法により産生されてもよい。
【００４６】
１つの実施形態では、本発明の該遺伝子導入動物は、該ＳＴＨ遺伝子が選択的に不活性化されていて、結果的にそれの内因性ＳＴＨ遺伝子中での分断になるゲノムを持っている。本明細書中で使用されるように、「分断（disruption）」は、該ＳＴＨ遺伝子における突然変異（すなわち、遺伝子材料における永久的、伝播可能な変化）に関し、これは、機能的なＳＴＨタンパク質の正常な発現を妨げる（例えば、それは結果的に、突然変異ＳＴＨタンパク質の発現になる；それは正常量のＳＴＨタンパク質の発現を妨げる；または、それはＳＴＨタンパク質の発現を妨げる）。分断の例は、限定なしに、点突然変異、フレームシフト突然変異の導入、該内因性遺伝子の一部分もしくは断片の欠損、選択可能なマーカー遺伝子の挿入、および終結コドンの挿入を包含する。本明細書中で使用されるように、この用語「突然変異」は本明細書中で使用されて、その野生型遺伝子（またはそれの遺伝子産物）と比較して、それの配列（またはそれの機能特性）における少なくとも１つの修飾を呈する遺伝子（またはそれの遺伝子産物）に関する。対照的に、この用語「野生型」は、それの天然源において（例えば、天然の集団において）最も頻繁に見出されるような、特定の遺伝子（またはそれの遺伝子産物）に関する特徴的な遺伝子型（または表現型）に関する。野生型動物は例えば、機能的なＳＴＨを発現する。
【００４７】
本発明の該遺伝子導入非ヒト動物における選択的不活性化は、種々の方法により達成されてもよく、結果的に、異種接合分断（ここで、結果的に得られる遺伝子導入動物がこの突然変異に関して異種接合であるように、１つのＳＴＨ遺伝子の対立遺伝子（例えば、該ＳＴＨ−Ｑ対立遺伝子、または該ＳＴＨ−Ｒ対立遺伝子）が分断される）または同種接合分断（ここで、結果的に得られる遺伝子導入動物がこの突然変異に関して同種接合であるように、両方のＳＴＨ対立遺伝子−ＳＴＨ−ＱおよびＳＴＨ−Ｒ−が分断される）となってもよい。
【００４８】
本発明の１つの実施形態では、該遺伝子導入動物の該内因性ＳＴＨ遺伝子は、ＳＴＨ遺伝子産物に共通な領域をコード化する核酸配列との相同的な組み換えを通じて分断される。例としては、相同的な組み換えを通じての該分断は、該ＳＴＨ遺伝子におけるノックアウト突然変異、特に、少なくとも１つの欠損が、該ＳＴＨ遺伝子の少なくとも１つのエクソンにて導入されているノックアウト突然変異を発生することがある。加えて、該ＳＴＨ遺伝子における分断は、異種の選択可能なマーカー遺伝子の、該内因性ＳＴＨ遺伝子中への挿入から結果的に得られることがある。
【００４９】
それのＳＴＨ遺伝子中にノックアウト突然変異を持つ遺伝子導入非ヒト動物を創出するこの方法は、以下の段階：
（ａ）ＳＴＨを標的とするベクターを生成し；
（ｂ）このＳＴＨを標的とするベクターを、非ヒト動物の受容細胞中へ導入して、処理された受容細胞を産生し；
（ｃ）この処理された受容細胞を、非ヒト動物の芽細胞中へ導入して、処理された芽細胞を産生し；
（ｄ）この処理された芽細胞を、偽妊娠非ヒト動物中へ導入し；
（ｅ）この移植された芽細胞を、発達が終結するようにさせ；
（ｆ）ゲノムがそれの内因性ＳＴＨ遺伝子中にノックアウト分断を含む遺伝子導入非ヒト動物を同定し；および
（ｇ）該遺伝子導入非ヒト動物を育てて、野生型に比べて抑制されたＳＴＨタンパク質発現を呈する遺伝子導入非ヒト動物を得る
段階を含んでもよい。
【００５０】
ＳＴＨ（例えば、該ＳＴＨ−Ｑアイソフォーム、または該ＳＴＨ−Ｒアイソフォーム）を過剰に発現する遺伝子導入非ヒト動物を提供することも、本発明の範囲内である。該非ヒト動物は、適切な如何なる動物（例えば、ネコ、ウシ、イヌ、ウマ、ヤギ、齧歯類、およびヒツジ）であってもよいが、好ましくは齧歯類である。より好ましくは、該非ヒト動物は、ラットまたはマウスである。本発明の該遺伝子導入非ヒト動物は、当業界において既知のものを包含する、遺伝子導入動物を遺伝子工学的に操作する種々の技術により、生産されてもよい。例えば、該遺伝子導入動物は、限定なしに、導入遺伝子の胚幹細胞、新たに受精された卵、または非ヒト動物の早期胚への導入を包含するヒトの介在；導入遺伝子の、非ヒト動物の体細胞および／または生殖細胞の染色体中への統合；および本明細書中で記載される方法のいずれかを含む幾つかの方法により生産されてもよい。
【００５１】
本発明の該遺伝子導入動物（例えば、ゲノムが該ＳＴＨ遺伝子における分断を含む遺伝子導入非ヒト動物、およびＳＴＨ−ＱまたはＳＴＨ−Ｒを過剰に発現する遺伝子導入非ヒト動物）が生産された後、各々が解析されて、この導入遺伝子が結果的に病理（例えば、神経炎斑の蓄積、または神経繊維の絡み合い）をもたらすかどうか決定してもよい。病理が該動物において進展しなければ、該遺伝子導入動物は、病理（例えば、神経炎斑の蓄積、または神経繊維の絡み合い）を進展させる他の遺伝子導入動物と交配され、該導入遺伝子の存在が、問題となっている該病理を加速させるかどうかを決定してもよい。例えば、本発明者らは、ＳＴＨタンパク質の該ＳＴＨ−Ｒアイソフォームが、神経炎斑および神経繊維の絡み合いのような病理を加速することに対して応答性であると信じている。
【００５２】
本発明はまた、被験者が神経変性疾患を持っているかもしくは持っていた（剖検の場合）か、または神経変性疾患を進展させるリスクが上昇しているかどうかを決定する方法も提供する。本明細書中で使用されるように、この「被験者」は。限定なしに、ウシ、イヌ、ヒト、サル、マウス、ブタ、またはラットを包含する哺乳類（生存しているか、または死亡した）であるが、好ましくはヒトである。神経変性疾患の例は、限定なしに、アルツハイマー病、筋萎縮側硬化症（Ｌｏｕ  Ｇｅｈｒｉｇ病）、Ｂｉｎｓｗａｎｇｅｒ病、皮質基底変性（ＣＢＤ）、区別可能な組織病理を欠く痴呆（ＤＬＤＨ）、前頭葉痴呆（ＦＴＤ）、ハンチントン舞踏病、多発性硬化症、重症筋無力症、パーキンソン病、ピック（Ｐｉｃｋ）病、および進行性核上麻痺（ＰＳＰ）を包含する。本発明の方法において、該神経変性疾患は、好ましくはアルツハイマー病（ＡＤ）である。
【００５３】
本明細書中で開示されるように、このＳＴＨ−Ｒの遺伝子型は、アルツハイマー病を進展させる増大したリスクと関連している。この同種接合ＳＴＨ−Ｒ遺伝子型は、ＡＤを進展させる最も高い可能性と関連している。これ故に、被験者の診断サンプル中での該ＳＴＨ−Ｒ対立遺伝子の存在の検出は、該被験者が神経変性疾患（例えばＡＤ）を持っているか、もしくは神経変性疾患（例えばＡＤ）を持っていたか（剖検の場合）、または神経変性疾患（例えばＡＤ）を進展させるリスクが上昇していることを指し示すものである。
【００５４】
従って、本発明の方法は、該サイトヒン（ＳＴＨ）遺伝子の１つ以上の対立遺伝子の存在に関して、該被験者の診断サンプルをアッセイすることを含み、ここで該ＳＴＨ−Ｒ対立遺伝子の存在の検出は、該被験者が神経変性疾患（例えばＡＤ）を持っているか、もしくは神経変性疾患（例えばＡＤ）を持っていたか（剖検の場合）、または神経変性疾患（例えばＡＤ）を進展させるリスクが上昇していることを指し示すものである。本明細書中で使用されるように、この文言「神経変性疾患を進展させるリスクが増大している」は、神経変性疾患への素地を与えられる／与えられた被験者、神経変性疾患に対しての遺伝子的なかかりやすさを持っている／持っていた被験者、または該ＳＴＨ遺伝子の該ＳＴＨ−Ｒ対立遺伝子が存在していない被験者（すなわち、ＳＴＨ−Ｑに関して同種接合の被験者）よりも、神経変性疾患をより進展させやすい／させやすかった被験者に関する。本発明の好ましい実施形態では、本明細書中で記載される方法は、被験者がＡＤを持っているかもしくはＡＤを持っていたか（剖検の場合）、またはＡＤを進展させるリスクが上昇しているかを決定するために使用され、該ＳＴＨ−Ｒ対立遺伝子の存在の検出は、該被験者がＡＤを持っている（もしくはＡＤを持っていた）か、またはＡＤを進展させるリスクが増大していることを指し示すものである。１つの実施形態では、該ＡＤは後発性ＡＤ（ＬＯＡＤ）である。
【００５５】
被験者の診断サンプル中のＳＴＨ−Ｒの存在に関するスクリーニングは、被験者がＡＤを持っているかもしくはＡＤを持っていた（剖検の場合）か、またはＡＤを進展させるリスクが増大しているかを決定する、非侵襲性の方法を与える。本発明の方法は単独で、またはＡＤのリスク要因（例えば、ＡｐｏＥ４）に関する他のスクリーニング（例えば、米国特許第５，７１６，８２８号、米国特許第５，７６７，２４８号、および米国特許第６，１３６，５３０号参照）に加えて使用されてもよいことが、考えられる。
【００５６】
本発明の方法によれば、被験者の診断サンプルは、in vitro または  in vivo でアッセイされてよい。本発明によれば、該アッセイが  in vitro で行われる場合、該被験者からの診断サンプルは、標準的な手順を使用して除去されてもよい。該診断サンプルは、組織、特に如何なる脳組織、腎組織、筋組織、神経組織、網膜組織、または軟組織であってもよく、これらは標準的な生検により除去されてもよい。加えて、該診断サンプルは、血液、髄液、心膜液、腹膜液、唾液、血清、および尿を包含する体液であってもよい。好ましい実施形態では、該診断サンプルは血液である。該診断サンプルは、例えば神経変性疾患（例えばＡＤ）を持っていることを疑われる被験者もしくは患者、神経変性疾患（例えばＡＤ）を持っていることが分からない被験者もしくは患者、家族が神経変性疾患（例えばＡＤ）の経歴を持っている被験者もしくは患者、認知の衰えを呈する被験者もしくは患者、および年老いた被験者もしくは患者から採取されてもよい。
【００５７】
本発明の方法では、被験者の診断サンプルは、限定なしに、免疫学的技術、該被験者から採取された該診断サンプルから抽出された核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）のハイブリダイゼーション解析、蛍光画像化技術、放射能検出、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）、リガーゼ・チェーン・リアクション（ＬＣＲ）、ＲＩＡアッセイ、およびＥＬＩＳＡアッセイを包含する既知の技術から容易に決定されるアッセイおよび検出方法を使用して、該ＳＴＨ遺伝子の１つ以上の対立遺伝子（例えば、該ＳＴＨ−Ｑ対立遺伝子、または該ＳＴＨ−Ｒ対立遺伝子）の存在に関してアッセイされてもよい。
【００５８】
核酸は、当業者に既知の標準的な技術を使用して、被験者の診断サンプルから単離されてもよい。単離された核酸は、限定なしに、リガーゼ・チェーン・リアクション（ＬＣＲ）（２１）およびポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号；米国特許第４，６８３，２０２号；米国特許第４，８００，１５９号；および米国特許第４，９６５，１８８号参照）を包含する当業界において既知の手順により増幅されてもよい。例えば、本発明の方法において、該ＳＴＨ遺伝子の一部または全部をコード化するゲノムＤＮＡは、被験者の診断サンプルから単離され、本明細書中で開示されているもののような、ＳＴＨに特異的もしくはＳＴＨ領域特異的オリゴヌクレオチド・プライマーの少なくとも１対を使用して、増幅されてもよい。これにより生成されるこの増幅されたＤＮＡはその後、本明細書中で開示されている如何なるものをも包含する、該ＳＴＨ領域に特異的な部位にてＤＮＡを開裂させて消化物を形成出来る制限酵素と共にインキュベートされてもよい。この後、該消化物中のＤＮＡ断片の大きさが決定されてもよい。該ＳＴＨ−Ｒ対立遺伝子を欠くコントロールのサンプル中のＤＮＡ断片の大きさとは異なる大きさを持つＤＮＡ断片の存在は、該被験者の該診断サンプルにおける該ＳＴＨ−Ｒ対立遺伝子の存在を指し示す。
【００５９】
本発明のこの方法によれば、前記ハイブリダイゼーション解析は、ｍＲＮＡのノーザン・ブロット解析を使用して遂行されてもよい。加えて、本発明のこの方法は、ＳＴＨをコード化する核酸（例えば、該ＳＴＨ−Ｑ対立遺伝子、または該ＳＴＨ−Ｒ対立遺伝子）へとハイブリダイゼーションする１つ以上の核酸プローブを使用して、ＤＮＡのサザン・ブロット解析を行うことにより遂行されてもよい。該核酸プローブは、当業者には既知の種々の技術により調製されてもよく、これらは、限定なしに、以下を包含する：ＳＴＨタンパク質をコード化する核酸の制限酵素による消化；Applied Biosystems Model 392 DNA/RNA 合成機のような、市販のオリゴヌクレオチド合成機を使用する、該ＳＴＨ遺伝子のヌクレオチド配列の選択された部分に対応する配列を持つオリゴヌクレオチドの、自動化された合成；および本明細書中で開示される全ての方法。
【００６０】
該プローブにおいて使用されるＳＴＨ核酸は、哺乳類、好ましくはヒトのＳＴＨ由来であってもよい。本発明の方法において使用される核酸プローブは、ＤＮＡもしくはＲＮＡであってもよく、該ＳＴＨ核酸の約８ヌクレオチド〜全長の長さで変動してもよい。加えて、該プローブは、前記のプローブ調製方法に従って調製されてもよい。更に、本発明の該核酸プローブは、１つ以上の検出可能なマーカーで標識されてもよい。該核酸プローブの標識化は、前記のものを包含する種々の標識の内の１つを用いて、前記のものを包含する、当業界において既知の数多くの方法の内の１つを使用して達成されてもよい。該ＳＴＨ核酸の異なるかもしくは重複する領域に対応する２つ以上の核酸プローブ（もしくはプライマー）の組み合わせも、例えばＰＣＲもしくはＲＴ−ＰＣＲを使用して、ＳＴＨの発現に関して診断サンプルをアッセイするのに使用されてもよい。
【００６１】
本明細書中で開示されるように、該ＳＴＨの該ＳＴＨ−Ｒアイソフォームの存在は、ＡＤを進展させるリスクを上昇させるように思われる。これ故に、遺伝子型を分類することは、被験者の組織または体液中に存在する該ＳＴＨタンパク質の直接の試験によっても可能である。従って、本発明の方法では、被験者の診断サンプルもまた、該ＳＴＨタンパク質の１つ以上のアイソフォーム（例えば、該ＳＴＨ−Ｑアイソフォーム、および該ＳＴＨ−Ｒアイソフォーム）の発現に関してアッセイすることにより、該ＳＴＨ遺伝子の１つ以上の対立遺伝子の存在に関してアッセイされてもよい。本明細書中で使用されるように、「発現」は、前記で定義されたような、該ＳＴＨ遺伝子の少なくとも１つのｍＲＮＡ転写物への転写、または少なくとも１つのｍＲＮＡのＳＴＨタンパク質への翻訳を意味する。従って、診断サンプルは、ＳＴＨタンパク質（前記で定義されたような）、ＳＴＨのｃＤＮＡ、またはＳＴＨのｍＲＮＡに関してアッセイすることにより、ＳＴＨの発現に関してアッセイされてもよい。ＳＴＨの適切な形態は、本明細書中で議論される特定の技術に基づき、明らかであろう。
【００６２】
タンパク質は、限定なしに、組織からの抽出（例えば、該タンパク質を可溶化する洗剤を用いて）（必要な場合には、カラムでの親和性による精製を伴って）、クロマトグラフィー（例えば、ＦＴＬＣおよびＨＰＬＣ）、免疫沈降（ＳＴＨに特異的な抗体を用いて）、および沈降（例えば、イソプロパノール、およびトリゾール（Trizol）のような試薬を用いて）を包含する、当業界において既知の標準的な方法を使用して、本発明の診断サンプルから単離および精製されてもよい。該タンパク質の単離および精製は、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上の）に伴われてもよい。
【００６３】
本発明の方法によれば、被験者の診断サンプルは、ＳＴＨの発現に関してアッセイされてもよく、ＳＴＨの発現は、限定なしに、免疫学的技術、ハイブリダイゼーション解析、蛍光画像化技術、放射能検出、ＰＣＲ、ＬＣＲ、ＲＩＡアッセイ、およびＥＬＩＳＡアッセイを包含する、既知の技術から容易に決定されるアッセイおよび検出方法を使用して、診断サンプル中で検出されてもよい。例えば、本発明の方法により、該被験者の診断サンプルは、ＳＴＨと反応性の物質を使用して、ＳＴＨの発現に関してアッセイされてもよい。本明細書中で使用されるように、「反応性」とは、該物質がＳＴＨに関しての親和性を持つか、ＳＴＨに結合するか、またはＳＴＨに対して向けられたものであることを意味する。本明細書中で更に使用されるように、「物質」は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡを包含する）、抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、分子、化合物、抗生物質、薬剤、前記で開示された物質のいずれか、およびこれらの如何なる組み合わせをも包含するようにされる。好ましくは、本発明の該物質は、検出可能なマーカーで標識される。
【００６４】
本発明の１つの実施形態においては、ＳＴＨと反応性の該物質は、対立遺伝子に特異的な（例えば、該ＳＴＨ−Ｑ対立遺伝子に特異的な、または該ＳＴＨ−Ｒ対立遺伝子に特異的な）抗体である。本明細書中で使用されるように、本発明の該抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであってもよい。加えて、本発明の該抗体は、前記のもののいずれをも包含する、当業者にはよく知られた技術により産生されてもよい。本明細書中で使用されるこれらの抗体は、検出可能なマーカーで標識されてもよい。抗体の標識化は、当業界では既知のもの、および前記のものを包含する、種々の標識化技術の内の１つを使用して達成されてもよい。本発明のこの検出可能なマーカーは、如何なる前記の検出可能なマーカーと同様、当業界において既知のもののいずれであってもよい。好ましくは、本発明の該物質は、検出可能なマーカーで標識された高親和性抗体である。
【００６５】
本発明の該物質がＳＴＨと反応性の抗体である場合、該被験者から採取された診断サンプルは、ビーズ、ゲル、またはプレートの形態の不溶性有機ポリマーのような固体の支持体に付着されたリガンドとしてＳＴＨ抗体を含有する親和性カラム（アフィニティー・カラム）を通過させることにより精製されてもよい。この固体の支持体に付着された該抗体は、カラムの形態で使用されてもよい。適切な固体の支持体の例は、限定なしに、アガロース、セルロース、デキストラン、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、セファロース、または他の不溶性有機ポリマーを包含する。該ＳＴＨ抗体は、もし望まれる場合には、スペーサー分子を介してこの固体の支持体に更に付着されてもよい。適切な結合条件（例えば、温度、ｐＨ、および塩濃度）は、当業者によって容易に決定されてよい。１つの実施形態では、該ＳＴＨ抗体は、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（セファロース）４Ｂのようなセファロースカラムに付着される。
【００６６】
該物質が抗体である場合は、該被験者の診断サンプルは、標準的な免疫学的検出技術を用いて、ＳＴＨと免疫反応性の１つ以上の抗体を利用する結合研究（バインディング・スタディ）を使用して、ＳＴＨ発現に関してアッセイされてもよい。例えば、該親和性カラムから溶出される該ＳＴＨタンパク質は、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＲＩＡアッセイ、ウェスタン・ブロット解析、フロー・サイトメトリー、または抗原−抗体相互作用を用いる他の如何なる免疫染色方法に付されてもよい。本発明の好ましい実施形態では、該診断サンプルは、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、ＳＴＨ発現に関してアッセイされる。
【００６７】
本発明の方法に従って、被験者の診断サンプル中のＳＴＨの１つ以上の対立遺伝子の存在の検出は、該被験者の該診断サンプル中に存在するＳＴＨ−ＱおよびＳＴＨ−Ｒの相対量および合計量を測定もしくは定量するためのアッセイを伴ってもよい。このようなアッセイは当業者にはよく知られており、免疫組織化学／免疫細胞化学、フロー・サイトメトリー、質量分析、ウェスタン・ブロット解析、またはＳＴＨタンパク質の量を測定するためのＥＬＩＳＡを包含してもよい。例えば、免疫組織化学アッセイを使用するために、組織の組織学的（パラフィンに包埋された）切片がスライド上に置かれてもよく、その後ＳＴＨに対する抗体と共にインキュベートされてもよい。該スライドはその後（１次抗体に対して）２次抗体と共にインキュベートされてもよく、これは、染料または他の染色系（例えば、蛍光色素、放射性物質、または高電子走査容量を持つ物質）に対して、該切片中に存在するＳＴＨの視覚化を可能にするために取り付けられる。
【００６８】
本発明中の該診断サンプルはしばしば、該被験者もしくは患者によってではなく、またその担当医師によってでもないが、実験室の技術者もしくは他の臨床家によって、ＳＴＨ発現に関してアッセイされるであろうと考えられる。従って、本発明の方法は更に、被験者もしくは患者の担当医師に、ＳＴＨの１つ以上の対立遺伝子の存在に関する該被験者もしくは患者の診断サンプルのアッセイ時に得られる結果の報告を提供することを含む。
【００６９】
本明細書中で開示されるように、該ＳＴＨ遺伝子の２つの既知の対立遺伝子（ＳＴＨ−ＱおよびＳＴＨ−Ｒ）が、ヒト集団には存在する。これ故に、３つの可能な遺伝子型がある：（１）ＳＴＨ−Ｑに関して同種接合のもの、つまりＱＱ；（２）ＳＴＨ−Ｒに関して同種接合のもの、つまりＲＲ；および（３）ＱＲと略される、ＳＴＨ−Ｑの１つのコピーおよびＳＴＨ−Ｒの１つのコピーを持つ異種接合のもの。本発明者らは、被験者中の該ＳＴＨ−Ｒ遺伝子型の存在およびアルツハイマー病を進展させる該被験者のリスクの間に相関が存在することを見出している。特に、単一のＳＴＨ−Ｒ対立遺伝子の存在は（すなわち、該被験者はＳＴＨ−Ｒに関して異種接合、つまりＱＲである）、ＡＤを進展させるリスクの増大と関連している一方、２つのＳＴＨ−Ｒ対立遺伝子の存在は（すなわち、該被験者はＳＴＨ−Ｒに関して同種接合、つまりＲＲである）、ＡＤを進展させる最も高いリスクと関連している。
【００７０】
前記の観点から、本発明では、ＳＴＨの１つ以上の対立遺伝子の存在に関して、被験者の診断サンプルをアッセイすることは、神経変性疾患（例えばＡＤ）を持っているかもしくは進展させるかも知れない被験者もしくは患者の予後に関する情報を提供する有用な方法であることがあるとも考えられる。従って、本発明は更に、神経変性疾患を持っている被験者、または神経変性疾患を進展させるかも知れない被験者の予後を査定する方法を提供し、該方法は、ＳＴＨの１つ以上の対立遺伝子の存在に関して該被験者の診断サンプルをアッセイすることを含み、ここで該被験者の該診断サンプル中の２つのＳＴＨ−Ｒ対立遺伝子の存在は、該被験者に関して、よりな予後を指し示す。
【００７１】
本発明の方法によれば、該神経変性疾患は、アルツハイマー病（ＡＤ）を包含する、前記のものの内のいずれであってもよい。好ましい実施形態では、該神経変性疾患はＡＤである。１つのこのような好ましい実施形態では、該ＡＤは後発性ＡＤ（ＬＯＡＤ）である。該被験者の該診断サンプルは、前記のような組織または体液であってもよく、前で議論されたものを包含する既知の手順によって、該被験者から除去されてもよい。１つの実施形態では、該診断サンプルは血液サンプルである。加えて、該診断サンプルは、前記の種々のアッセイ、検出方法、および定量方法の全てを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでアッセイされてもよい。更に、被験者もしくは患者の該診断サンプルがアッセイされ、ＳＴＨの１つ以上の対立遺伝子の存在が決定されてもよく、これは、該被験者もしくは患者が神経変性疾患（例えばＡＤ）を持っているか、または神経変性疾患（例えばＡＤ）を進展させるリスクが増大しているというこの決定の前、間、または後の如何なる時であってもよい。
【００７２】
本発明の該診断サンプルは、該被験者もしくは患者によってではなく、その担当医師によってでもないが、実験室技術者もしくは他の臨床家によって、ＳＴＨの１つ以上の対立遺伝子の存在に関してしばしばアッセイされるであろうと考えられる。従って、本発明の方法は更に、被験者もしくは患者の担当医師に、ＳＴＨの１つ以上の対立遺伝子の存在に関して、該被験者もしくは患者の診断サンプルをアッセイする際に得られた結果の報告を提供することを含む。
【００７３】
本発明者らの生化学的成果は、該ＳＴＨタンパク質の該ＳＴＨ−Ｒアイソフォームが、該ＳＴＨ−Ｑアイソフォームが蓄積するよりも、脳中に更に蓄積することを示した。これ故に、上昇したレベルのＳＴＨの検出は、該ＳＴＨ−Ｒ遺伝子型の存在を指し示しているように思われる。該ＳＴＨタンパク質の該ＳＴＨ−Ｒアイソフォームは脳および恐らく他の組織中に蓄積するので、この蓄積が髄液および血液中での上昇したレベルにより反映されるであろうと予期することは合理的である。従って、ＡＤの進展の上昇したリスクの検出は、被験者の診断サンプルにおけるＳＴＨタンパク質のレベルの測定のみを単に要求してもよい。ＳＴＨタンパク質の上昇したレベルはその後、該被験者における該ＳＴＨ−Ｒ対立遺伝子配列の少なくとも１つのコピーの存在を指し示すものとなるであろう。
【００７４】
前記の観点から、被験者がアルツハイマー病（ＡＤ）を持っているかもしくはＡＤを持っていたか（剖検の場合）、またはＡＤを進展させるリスクが上昇しているかどうかを決定する方法を提供することも、本発明の範囲内であり、該方法は、ＳＴＨタンパク質の発現に関して該被験者の診断サンプルをアッセイすることを含み、ここでは、正常よりも上昇したＳＴＨ発現の検出が、該被験者がＡＤを持っている（もしくはＡＤを持っていた、剖検の場合）か、またはＡＤを進展させるリスクが上昇していることを指し示すものである。
【００７５】
本明細書で使用されるように、「正常よりも上昇したＳＴＨ発現」は、同性および同様の年齢の非罹患被験者もしくは患者（すなわち、神経変性疾患（例えばＡＤ）を持っていないか、または神経変性疾患（ＡＤ）を進展させる検出可能な上昇したリスクを持っていないもの）から採取された同じタイプの診断サンプルに関して予期されるレベルよりも有意により高いレベルでの、ＳＴＨの発現を意味する。本明細書中で更に使用されるように、「有意により高い」は、正常よりも上昇したＳＴＨ発現レベルおよびＳＴＨの予期される（正常な）レベルの間の差違が、統計的に有意であることを意味する。好ましくは、正常よりも上昇したＳＴＨ発現は、その他の場合に予期されるレベルのＳＴＨ発現よりも少なくとも１０％高いレベルでのＳＴＨ発現である。ＳＴＨ発現が特定の被験者もしくは患者から採取された特定の診断サンプルには存在しないと予期される場合は、その被験者もしくは患者に関する正常なレベルのＳＴＨ発現はゼロである。特定の被験者もしくは患者から採取された特定の診断サンプルが低レベルの本来のＳＴＨ発現を持っていると予期される場合は、その低いレベルは、その被験者もしくは患者に関しての正常レベルのＳＴＨ発現である。
【００７６】
被験者もしくは患者から採取された特定の診断サンプルに関して予期される、もしくは正常レベルのＳＴＨ発現は、同様の年齢の、および同性の非罹患被験者をアッセイすることにより容易に決定されるかも知れない。一旦これらの適切なサンプルが得られれば、男性および女性における正常量のＳＴＨ発現は、以下に記載されるような、フロー・サイトメトリー、ウェスタン・ブロット解析、またはタンパク質の量を測定するためのＥＬＩＳＡのような、定量用の標準的なアッセイを使用して決定されてもよい。例えば、ＥＬＩＳＡは各サンプルに関して２回実行されてもよく、該ＳＴＨタンパク質の量の平均および標準偏差が決定されてもよい。必要な場合は、ＳＴＨ発現の正常量が定量される前に、追加の被験者が動員されてもよい。
【００７７】
本発明の方法によれば、該神経変性疾患は、アルツハイマー病（ＡＤ）を包含する前記のもののいずれであってもよい。好ましい実施形態では、該神経変性疾患はＡＤである。１つのこのような好ましい実施形態では、該ＡＤは後発性ＡＤ（ＬＯＡＤ）である。該被験者の該診断サンプルは、前記のように組織または体液であってもよく、前で議論されたものを包含する既知の手順により該被験者から除去されてよい。１つの実施形態では、該診断サンプルは血液サンプルである。加えて、該診断サンプルは、前記の種々のタンパク質アッセイ、タンパク質検出方法、およびタンパク質定量方法の全てを使用して（例えば、ＥＬＩＳＡおよびＲＩＡによって）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいてアッセイされてもよい。１つの実施形態では、該診断サンプルは前で定義されたように、ＳＴＨと反応性の物質を使用してアッセイされる。該物質は前記のように、検出可能なマーカーで標識されてもよい。好ましい実施形態では、該診断サンプルは、ＳＴＨに選択的に結合する抗体を使用してアッセイされる。好ましくは、該抗体は、検出可能なマーカーで標識される。
【００７８】
上昇したレベルのＳＴＨタンパク質は、アルツハイマー病の上昇したリスクと関連していると思われるので、培養中または齧歯類中（遺伝子導入手法による）の細胞中でのこのタンパク質の過剰発現は、ＳＴＨタンパク質の過剰発現がアルツハイマー病に関するリスクを上昇させるメカニズム中へ、価値ある洞察を提供するであろう。ＳＴＨの該ＳＴＨ−Ｒアイソフォームを発現するマウスまたは細胞培養物（前記遺伝子導入非ヒト動物および形質転換された宿主細胞を包含する）は、この点において特に価値を有するであろう。ヒト集団における該ＳＴＨ−Ｒ同種接合は、ＡｐｏＥ４対立遺伝子のような、アルツハイマー病に関する他のリスク要因がない場合にさえ、前記ＲＲ遺伝子型がアルツハイマー病を引き起こすに充分であることを論証している。これ故に、ＳＴＨの該ＳＴＨ−Ｒアイソフォームを過剰に発現するマウスが、アルツハイマー病様の病状を進展させると予期され得る。このようなマウスは、この疾患に関する治療の開発および試験において、非常に価値を有するであろう。
【００７９】
被験者における該ＳＴＨ−Ｒ遺伝子型の存在、およびアルツハイマー病を進展させる該被験者のリスク間の相関があるという発見は、ＡＤもしくはもう１つ別の神経変性疾患を持つ患者、またはＡＤもしくはもう１つ別の神経変性疾患を進展させるリスクが上昇している患者を同定する手段を提供し、ＡＤのような神経変性疾患の進展し易さに関してスクリーニングする試験の形態での、商業適用に関する潜在力を表す。このような試験の開発は、ＡＤのような神経変性疾患の早期の検出および診断において支援するかも知れない一般的なスクリーニング手順を提供し、および／または神経変性疾患（例えばＡＤ）と診断されたか、もしくは神経変性疾患（例えばＡＤ）を進展させるリスクが上昇しているものとして同定された患者のフォロー・アップの方法を提供し得るであろう。
【００８０】
従って、本発明は更に、神経変性疾患（例えばＡＤ）を持っているか、または神経変性疾患（例えばＡＤ）を進展させるリスクが上昇している被験者を同定するスクリーニング・アッセイとしての使用のためのキットを提供する。本発明の該キットは、ＳＴＨの１つ以上の対立遺伝子をコード化する核酸配列の存在を直接検出するアッセイにおける使用のための少なくとも１つの試薬、またはＳＴＨタンパク質の１つ以上のアイソフォームの存在を検出するアッセイにおける使用のための少なくとも１つの試薬を含む。該キットはまた、該被験者がアルツハイマー病（ＡＤ）を持っているかもしくはＡＤを持っていたか（剖検の場合）、またはＡＤを進展させるリスクが上昇しているどうかを決定するための該キットの使用に関しての説明書を含む。
【００８１】
このような説明書は、例えば、該キットがサイトヒン（ＳＴＨ）の１つ以上の対立遺伝子の存在に関して、被験者の診断サンプルをアッセイするのに使用されてもよいことを提供してもよく、ここで該ＳＴＨ−Ｒ対立遺伝子の存在の検出は、該被験者がＡＤを持っている（もしくはＡＤを持っていた、剖検の場合）か、またはＡＤを進展させるリスクが上昇していることを指し示すものである。加えて、このような説明書はまた、該キットがサイトヒン（ＳＴＨ）タンパク質の発現に関して被験者の診断サンプルをアッセイするのに使用されてもよいことを提供してもよく、ここで正常を上回って上昇したＳＴＨ発現の検出は、該被験者がＡＤを持っている（もしくはＡＤを持っていた）か、またはＡＤを進展させるリスクが上昇していることを指し示すものである。本発明の１つの実施形態では、該キットは更に、該試薬および該説明書が梱包される容器を含む。
【００８２】
ＳＴＨの１つ以上の対立遺伝子をコード化する核酸配列の存在を検出するように設計されたキットは、ＳＴＨと特に反応性の物質を含有してもよい。該物質は、該ＳＴＨ遺伝子の該ＳＴＨ−Ｑ対立遺伝子または該ＳＴＨ−Ｒ対立遺伝子をコード化する核酸配列に選択的に結合するオリゴヌクレオチド・プローブを包含する前記のもののいずれであってもよく、ＳＴＨの１つ以上の対立遺伝子の存在を検出もしくは定量するための前記のアッセイもしくは方法のいずれにおいて使用されてもよい。本発明の該キットはまた、該ＳＴＨ遺伝子の一部もしくは全てに対応する核酸配列の増幅された断片へとハイブリダイゼーション可能な、およびＳＴＨの１つ以上の対立遺伝子の存在を同定するのに使用され得る対立遺伝子特異的プローブを包含してもよい。更に、ＳＴＨの１つ以上の対立遺伝子をコード化する核酸配列の存在を検出するために設計されたキットは、該ＳＴＨ遺伝子の一部もしくは全てに対応する核酸配列へとハイブリダイゼーションし、該配列の増幅（例えば、ＬＣＲ、ＰＣＲ、および他の当業界において既知の増幅手順による）を可能にするプライマーを含有してもよい。
【００８３】
該ＳＴＨタンパク質の１つ以上のアイソフォームの存在を検出するために設計されたキットは、ＳＴＨと特に反応性の物質を含有してもよい。該物質は、該ＳＴＨタンパク質の該ＳＴＨ−Ｑもしくは該ＳＴＨ−Ｒアイソフォームに選択的に結合する対立遺伝子特異的抗体を包含する前記のものの内のいずれであってもよく、ＳＴＨの１つ以上の対立遺伝子の存在を検出もしくは定量する前記のアッセイもしくは方法の内のいずれにおいて使用されてもよい。本発明の該キットはまた、ＳＴＨタンパク質に結合可能な固体の支持体を用いて、好ましくは検出可能なマーカーで標識されて、ＳＴＨを指向した少なくとも１つの対立遺伝子特異的抗体を包含してもよい。
【００８４】
本発明は、以下の実験の部において記載され、これは、本発明の理解における助けとなるように説明され、この後伴う請求項において定義されるような本発明の範囲を、如何なるやり方であっても限定するように解釈されるべきではない。
【実施例】
【００８５】
［実験の詳細］
［１．はじめに］
２月に、ヒトゲノムプロジェクトが、染色体１７ｑ２１上のタウ遺伝子座を重複するゲノムクローンに関する配列決定を完結させ、発現された配列ｔａｇ（ＥＳＴ）（寄託＃ＡＡ３２５３０４）が、図６に示されるタウ遺伝子のエクソン９の下流約２．５ｋｂのタウ・イントロン中で同定された。この位置は本発明者らにとって特に興味あるものであったが、これは、ＦＴＤにおける突然変異の殆どが、このイントロンおよび隣接するタウのエクソンの中もしくは周辺にあるからである（３）。該ＥＳＴは、マラトン（Marathon）小脳ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中、およびヒトオリゴ樹状膠腫細胞株（これはタウを発現する）中に発現されているのが見出された。しかしながら、ＣＯＳ７細胞から単離されたｍＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲ産物を得るのには上手く行かず、これにより、該ｍＲＮＡがＣＯＳ７細胞中に発現されなかったことが示唆された（データーは示されていない）。
【００８６】
ヒトオリゴ樹状膠腫細胞株からのＲＮＡを使用して、本発明者らは、新しいヒトの遺伝子を発見し、これは、ヒト集団において少なくとも２つの形態で存在する。この遺伝子は、彼らはこれをサイトヒン（ＳＴＨ）と名付けたが、染色体１７上、微小管関連タンパク質タウをコード化する遺伝子のイントロン内にある。このサイトヒン遺伝子によりコード化される該タンパク質は、該微小管関連タンパク質タウには似ておらず、如何なる他の既知のタンパク質にも実質的に似ていない。更に、タンパク質データーベースの探索は、サイトヒンに対して有意な相同性を有するもう１つ別のタンパク質を解明していない。
【００８７】
［２．材料および方法］
［Ａ．サイトヒン（ＳＴＨ）遺伝子のクローニング］
ヒトオリゴ樹状膠腫細胞株からのＲＮＡを使用して、この推定の遺伝子の５’および３’末端が、Ｇｅｎｅ  Ｒａｃｅｒ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてクローンされた。この全長のクローンの配列は、新しい遺伝子サイトヒン（ＳＴＨ）［故サイトウ・ツナオ博士および彼の研究室に因んで名付けられた］を解明し、これは、イントロンがなく、タウに比べてセンス方向であった。
【００８８】
［Ｂ．ＳＴＨ遺伝子発現の解析］
ＳＴＨを更に特徴付けるために、本発明者らは、Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒａｐｉｄ−ＳｃａｎａＰａｎｅｌ（Ｏｒｉｇｅｎｅ）を使用して、２４のヒト組織における遺伝子発現を解析した（図８）。ＳＴＨおよびタウは共通の遺伝子座を分け合うので、本発明者らは、ＳＴＨおよびタウが協調して発現され得るであろうと仮定した。これ故に、タウの発現も試験された。代わりにスプライシングされたそのエクソン１０の上流のＳＴＨの位置がそれの発現に影響を及ぼすであろうかどうかを決定するために、エクソン１０を有する（図８、パネルＡ、上方のバンド）およびエクソン１０を有さない（図８、パネルＡ、下方のバンド）タウのアイソフォームも試験された。タウおよびＳＴＨは一般的な組織での発現において有意に重複しているので、更なる研究が、中枢神経系（ＣＮＳ）発現パターンを決定し、ＳＴＨおよびタウが脳中で協調して発現されるかどうかを突き止めるために、Ｈｕｍａｎ  Ｂｒａｉｎ  Ｒａｐｉｄ−ＳｃａｎａＰａｎｅｌ（Ｏｒｉｇｅｎｅ）を使用して実行された。
【００８９】
これらの研究では、ｃＤＮＡは「タッチダウン」ＰＣＲ法（１１）を使用して増幅された。使用されたプライマーは、Ｆ  ＣｅｌＩ（５’−ｃｃｃ  ｔｇｔ  ａａａ  ｃｔｃ  ｔｇａ  ｃｃａ  ｃａｃ−３’）およびＲ  ＣｅｌＩ（５’−ｃａｔ  ｇｇｇ  ａａｇ  ｔａｇ  ｃｔｔ  ｃｃｃ  ｔｇｔ−３’）であった。ＰＣＲは，２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２μＭの各プライマー、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ、２μＬのゲノムＤＮＡ、および１ＵのＴａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する５０μＬの反応混合物中で実行された。
【００９０】
サイトヒンに関しての該タッチダウンＰＣＲ法は、以下の段階からなる：最初のアニール化サイクルのために、９４℃にて３分間インキュベーション後、９４℃にて３０秒間の段階、６５℃にて３０秒間の段階（各々の連続したサイクルにおいて、このアニール化温度は０．２℃下げられる）、およびポリメリゼーションのために、７２℃にて３０秒間の段階を伴う。この配列はその後、２５サイクル繰り返される。最終的に、追加の１０サイクルのセットが行われ、これは９４℃３０秒間、６０℃３０秒間、および７２℃３０秒間からなる。最後のサイクルは、７２℃にて３０秒間のインキュベーションを伴う。タウ転写物の増幅に関しては、このＰＣＲ混合物およびタッチダウン・プログラムは、このタウ・センス・プライマーが２１−ｍｅｒ５’−ｇｃｃ  ａａｃ  ｇｃｃ  ａｃｃ  ａｇｇ  ａｔｔ  ｃｃａ  ｇｃａ  ａａａ−３’であり、このアンチセンスプライマーが２１−ｍｅｒ５’−ｔｔｔ  ａｃｔ  ｔｃｃ  ａｃｃ  ｔｇｇ  ｃｃａ  ｃｃｔ−３’であり、５５秒のより長いＰＣＲポリメリゼーション時間が使用される以外、前記と同じであった。サイトヒンおよびタウＰＣＲ産物両方が、臭化エチジウムを有する２．０％アガロース・ゲル上で行われた。
【００９１】
［Ｃ．ＳＴＨのＤＮＡのＰＣＲ増幅および制限酵素による消化］
対立遺伝子分類ゲル（図５）に関して、ＱＱ、ＱＲおよびＲＲ遺伝子型のＨｉｎＦＩ−消化ＰＣＲ産物が、既知のプロトコールに従って調製された。特に、該被験者のゲノムＤＮＡが、製造者プロトコール（Ｑｉａｇｅｎ）に従って、ゲノムＤＮＡ抽出キットを使用して、凍結脳組織から抽出された。このサイトヒンＤＮＡ配列はその後、プライマーＦ−ＣｅｌＩおよびＲ−ＣｅｌＩを使用する、サイトヒンに関する前記ＰＣＲプロトコールを使用して、ＡＤおよび正常なコントロールの被験者からのゲノムＤＮＡから増幅された。このＰＣＲ産物の配列決定は、ヌクレオチド多型Ａ→Ｇを同定し、これは７番目の位置のアミノ酸をグルタミン（Ｑ）からアルギニン（Ｒ）へと変え、これによって新しいＨｉｎＦＩ制限酵素部位を創出した。遺伝子型の分類に関しては、該ＰＣＲ産物は、３時間３７℃にて、５単位のＨｉｎＦＩ｛５’−ＧＡＮＴＣ−３’｝制限酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化され、その後臭化エチジウムを有する２．０％アガロース・ゲル上で行われた。
【００９２】
［Ｄ．ＳＴＨのモノクローナル抗体］
サイトヒン・モノクローナル抗体１１Ｆ１１（ＩｇＧ２Ｂ）、ＴＳ６（ＩｇＭ）、および１０Ｂ３（ＩｇＭ）が、前記のように（１２）マウスをＳＴＨの組み換えおよび合成両方のペプチドで免疫することにより、生成された。該ＱＱ、ＱＲおよびＲＲ遺伝子型を有する正常（ＮＣ）およびアルツハイマー病（ＡＤ）被験者の脳タンパク質サンプルが、１ＸＴＢＳ（２ｍＭのＰＭＳＦ）中で均一化され、タンパク質が、大きさによる分画により部分的に精製された。引き続いて、これらの調製されたサンプルは、３７℃にて３０分間尿素サンプル緩衝液中でインキュベートされ、その後１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で走らされた（図９）。ＥＣＬ−ウェスタン・ブロット解析が、以前に記載されたプロトコール（１２）を使用して行われた。
【００９３】
［３．結果および議論］
該ＳＴＨ遺伝子のヌクレオチドおよびアミノ酸配列解析（図７）は、ＳＴＨが、遺伝子、タンパク質、シグナル配列、またはモチーフに対して明確な相同性を持たないように思われる１２８アミノ酸のタンパク質をコード化する（１４）ことを解明した。しかしながら、該タウ遺伝子座内のＳＴＨの位置は、それの機能へと洞察を提供し得るであろう。ＳＴＨおよびタウの両方が同様の発現パターンを分かち合うので、タウおよびＳＴＨは、コリン・アセチルトランスフェラーゼ＼胞状アセチルコリン・トランスポーター遺伝子座の例（１５）においてと同様に、一緒に機能し得るであろう。マウスのゲノムは、サイトヒンのオープン・リーディング・フレームに１００％同じ配列を含有し、このことは、この遺伝子が、齧歯類およびヒトの間で保存されていることを強く示唆する。マウスのゲノムは、該ＳＴＨオープン・リーディング・フレームに１００％同じ配列を含有し、このことは、この遺伝子が、齧歯類およびヒトの間で保存されていることを強く示唆する。
【００９４】
ＳＴＨを更に特徴付けるために、本発明者らは、Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒａｐｉｄ−ＳｃａｎａＰａｎｅｌ（Ｏｒｉｇｅｎｅ）を使用して、ヒトの２４の組織中での遺伝子発現を解析した。ＳＴＨの発現は、胎盤、筋、胎児脳、および成人の脳において最も高く、心臓、腎臓、胃、精巣、および副腎においては低い発現だった（図８、パネルＡ）。ＳＴＨおよびタウは共通の遺伝子座を分け合うので、それらは協調して発現され得るであろう；これ故に、タウの発現も決定された。代わりにスプライシングされたエクソン１０の上流のＳＴＨの位置がそれの発現に影響を及ぼすであろうかどうかを決定するために、エクソン１０を有するタウのアイソフォーム、およびエクソン１０を有さないタウのアイソフォームも試験された。図８パネルＢに示されるように、タウの発現は心臓、腎臓、筋、精巣、唾液腺、副腎、成人および胎児の脳において最も高く、胎盤、甲状腺、前立腺、および皮膚において低い発現であることが見出された。このことは、タウ発現についての他の報告（１６）と一致している。
【００９５】
タウおよびＳＴＨが、一般的な組織での発現において有意に重複しているので、更なる研究が、Ｈｕｍａｎ  Ｂｒａｉｎ  Ｒａｐｉｄ−ＳｃａｎａＰａｎｅｌ（Ｏｒｉｇｅｎｅ）を使用して行われ、中枢神経系（ＣＮＳ）での発現パターンを決定し、ＳＴＨおよびタウが脳中で協調して発現されるかどうかを突き止めた。図８パネルＣは、ＳＴＨがＣＮＳにおいて発現され、側頭葉、視床下部、髄および脊髄においてより高発現であり、その他の脳領域ではより低発現であることを示す。図８パネルＤにおいて描かれるように、タウの発現は、該発現がより低い場合、橋中を除いて、ＣＮＳサンプルの殆どにおいて高い。
【００９６】
本発明者らによって解析された一般組織およびＣＮＳ組織での発現に基づけば、タウは、ＳＴＨと幾つかの組織での発現を分かち合うように思われるが、幾つかの相違がある。一緒に解釈されれば、これらの結果はＳＴＨがタウのプロモ−ターの制御下にないことを指し示すが、タウ遺伝子と幾つかの領域制御要素を分かち合い得るであろうし、該タウ遺伝子は、ＳＴＨの機能に関して暗示するであろう。該エクソン１０の上流のＳＴＨの位置および発現は、ＣＮＳまたはその他の組織においてはタウのエクソン１０のスプライシングと相関するようには思われない。
【００９７】
ＳＴＨの位置は、神経変性疾患におけるそれの可能な役割中へと研究を確かなものとし、これは、これらの疾患の内の多くにおいて該タウ遺伝子座を暗示する遺伝子的な証拠があるからである。ヒトの被験者からの該ＳＴＨ遺伝子の配列決定の間に、図７に示されるように、ＳＴＨのアミノ酸の位置７（Ｑ７Ｒ）において、グルタミン（Ｑ）からアルギニン（Ｒ）へと変わるヌクレオチド多型（Ａ→Ｇ）が同定された。この「Ｇ」多型（Ｒ対立遺伝子）は、この「Ａ」ヌクレオチド（Ｑ対立遺伝子）に比較して区別可能な断片パターンを生成する新規ＨｉｎｆＩ制限酵素部位を創出する。代表的なゲルが図５に示される。
【００９８】
異なるＳＴＨ対立遺伝子および頻度を有するＡＤおよび正常コントロール被験者の分布は、表１に表として纏められた。被験者らのこれらの２つの群は、年齢的に適合され、コーカソイド人種の被験者に限定された。該ＲＲ遺伝子型は、該正常コントロール被験者（０％）に比較して、該ＡＤ群において有意により高い頻度（１６％）にて見出された（ｐ＝０．０２３２；オッズ比１１．９２０、フィッシャーの精密試験による）。該Ｒ対立遺伝子は、正常な被験者においては１３％の頻度にて起こるが、該Ｒ対立遺伝子が３２％であるＡＤ被験者に比較して、有意により低いパーセンテージにて起こる（ｐ＝０．００８５；オッズ比３．１０９、フィッシャーの精密試験による）。該ＲＲ被験者に関する発症の平均年齢は、７７〜９３歳の範囲で８３．１歳であり、このことは、ＲＲ遺伝子型が後発性アルツハイマー病に関するリスク要因であるとの証拠を提供する。
【００９９】
【表１】
2005508653.tif 000002
【０１００】
該ＳＴＨ遺伝子型に加えて、これらの被験者の該ＡｐｏＥ遺伝子型も決定され、これは該ＡｐｏＥ遺伝子の対立遺伝子４がＡＤに関する重要なリスク要因だからであり、本発明者らが、該ＡｐｏＥ対立遺伝子４が該ＳＴＨ遺伝子型と共同して働き得るであろうか（１７）どうか調べたかったからである。該ＡｐｏＥ遺伝子型は、一般的な集団における頻度と密接に一致していて、このことにより、サンプリングにおけるバイアスに対しての証拠を提供した（データーは示されていない）（１８）。以前の報告と一致して、該ＡｐｏＥ４対立遺伝子は、表２に示される正常なコントロール被験者に比較して、本発明者らのＡＤ群において過剰に発現されていることが見出された；しかしながら、該ＡｐｏＥ対立遺伝子は、表３中のＡＤ群のＲＲ、ＱＲ、およびＱＱ被験者の間では等しく分布しており、このことは、該ＡｐｏＥおよびＳＴＨ遺伝子型の間に、何も関連がないことを示唆した（１８）。
【０１０１】
【表２】
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【０１０２】
【表３】
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【０１０３】
該ＡＤ群に加えて、他の神経変性疾患（これらの内の殆どがタウ病理を持つ）を有するより少数の被験者も、該多型について試験された。これらの結果は表４に説明されるが、幾つかの興味ある傾向を示し、このＳＴＨ−Ｑ／Ｒ多型がＡＤに特異的ではないかも知れないことを示唆する。例えば、区別可能な組織病理を欠く痴呆を有する１被験者は、該ＲＲ遺伝子型を持ち、このことによりこの遺伝子型がＡＤに特異的ではないことを示唆した。更に、正常コントロールと比較した場合、ＰＳＰ被験者は該ＱＱ遺伝子型を過剰に表す一方、ＦＴＤおよびピック病はより高いパーセンテージのＱＲ遺伝子型を持つと思われる。より大きな群の被験者を用いたこれらの傾向の更なる調査が、それらの重要性を決定するために要求される。
【０１０４】
【表４】
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【０１０５】
ＳＴＨ発現を論証する実験はこれ故に更にＰＣＲの使用に依るが、ＰＣＲは非常に敏感なので、バンドが正統なｍＲＮＡ転写物に由来するか、または痕跡量のＤＮＡの混入から来るものなのかを確かめるのは難しい。イントロンのない遺伝子と共に作動する場合は、該ｍＲＮＡの配列が該遺伝子をコード化するゲノムＤＮＡと精密に合致し、ＤＮＡ混入は問題となったままである。ＣＯＳ７細胞中およびＭｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｃＤＮＡパネルの幾つかの組織中にＳＴＨｍＲＮＡの証拠を見付けることの一貫した失敗は、混入に対して論議するものである。
【０１０６】
本発明者らは、ＳＴＨタンパク質産物の存在を論証するために、６−Ｈｉｓを取り付けられた組み換えタンパク質として、またはバクテリア中のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク質として産生された、予見されたタンパク質に対するモノクローナル抗体を生成させた。該ＳＴＨ配列からの合成ペプチドおよび欠損突然変異タンパク質の組み合わせを使用して、これらのモノクローナル抗体によって認識されたエピトープが、ＳＴＨの３つの異なる領域：Ｎ−末端、中央領域、およびＣ−末端へとマッピングされた。図９（上の３つのパネル）において、ＧＳＴ（ＤＴ１２）、６ＸＨｉｓ、およびＳＴＨ（ＴＳ６）に対しての抗体を用いた３つの代表的な免疫ブロットが、これらのモノクローナル抗体の特異性を論証する。
【０１０７】
図９（下の３つのパネル）に描かれるように、ＳＴＨタンパク質は、ＡＤ被験者および正常被験者からの脳ホモジェネートの免疫ブロットによって検出され、ＳＴＨタンパク質の該Ｎ−末端（１１Ｆ１１、ＩｇＧ２Ｂ）、該Ｃ−末端（１０Ｂ３、ＩｇＭ）、および介在配列（ＴＳ６、ＩｇＭ）に対する抗体を使用した。これらの免疫ブロットは、１３．６ｋＤの計算された大きさよりも約２０ｋＤ〜６ｋＤ多い明確な分子量を有するタンパク質を示す。同様のタンパク質が、ＳＴＨの３つの異なるエピトープと反応性の３つの全ての抗体により認識される。加えて、ＳＴＨに対する他のＮ−末端抗体が、同様のブロット結果（データーは示されていない）を示す。この大きさの違いは、アミノ酸組成、翻訳後修飾、および／またはそれ自身もしくは他のタンパク質との凝集によるものであり得るであろう。この凝集仮説は、これらのブロットの全てに共通のより大きな分子量のバンドの存在を説明するであろう。更なる調査が、どの仮説（単数または複数）が正しいかを決定するであろう。
【０１０８】
［４．結論］
本明細書中で開示される実験および結果に基づけば、幾つかのことがＳＴＨについて分かる。ＳＴＨは、該タウ遺伝子座中に巣くった（nested）遺伝子である。それはタウの発現パターンに非常に似た発現パターンを持ち、これらの２つのタンパク質が共同して発現され、経路中一緒に機能するかも知れないことを示唆する。このような状況のよく研究された例は、コリン・アセチルトランスフェラーゼ（ＣＨＡＴ）／胞状アセチルコリン・トランスポーター（ＶＣＨＡＴ）遺伝子座である。該ＶＣＨＡＴ遺伝子は、該ＣＨＡＴ遺伝子のエクソン１および２の間のイントロン内にある。該ＶＣＨＡＴおよびＣＨＡＴ遺伝子は、協調して発現され、それぞれ神経伝達物質アセチルコリン（ＡＣＨ）の小胞中への取り込み、およびＡＣＨ合成中に含まれる（１５）。魅力的な仮説が、ＳＴＨおよびタウが、正常状態で一緒に機能するだけではなく、疾患状態でも一緒に機能するかも知れないことを浮かび上がらせ始めている。
【０１０９】
該ＳＴＨ遺伝子におけるＱ７Ｒ多型がヒト被験者において同定され、ＬＯＡＤ集団において同種接合状態で過剰に表れることが見出された。該ＲＲ遺伝子型は、ＡＤ患者におけるそれの同種接合状態のために、「機能の欠損」突然変異を示唆している。ＳＴＨが正常な細胞機能を持つことが推定される。配列解析は手がかりを得ていないが、ＳＴＨの機能およびＡＤにおける可能性ある役割に対するヒントがあるかも知れない。ＳＴＨは共通認識標的化シグナル配列を欠いているので、それは推定の細胞質タンパク質である；これ故に、それはタウと同じコンパートメント中に置かれているかも知れない。ＳＴＨは、タウとは異なり、プロリンを指向したリン酸化部位を持たない。しかしながら、正常には中枢神経系において重要な役割を持ちタウのリン酸化およびＡＤにおいて暗示される（１９）ＰＫＣおよびＣＫＩＩキナーゼについては、ＳＴＨ上に推定のリン酸化部位がある。種々のタウもしくはアミロイド病理を有する神経変性疾患におけるＳＴＨの今後の遺伝子研究は、ＳＴＨが神経繊維の絡み合いおよび／またはアミロイド斑の形成において役割を演じるかどうかを決定するのを助け得るであろう。
【０１１０】
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【０１３１】
本明細書中前記の全ての刊行物は、それらの全体を援用される。以上の本発明は明確化および理解の目的で幾分詳細に記載されたが、一方当業者によって、この開示の読解から、形態および詳細における種々の変更が添付の請求項における本発明の真の範囲から逸脱することなくなされ得ることが、認められるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１】図１は、サイトヒン−Ｑ（ＳＴＨ−Ｑ）遺伝子（配列ＩＤ番号：１）のヌクレオチド配列を描いている。このタンパク質の開始（ａｔｇ）および停止（ｔａｇ）コドンが、下線を施されている。ＳＴＨ−Ｑのヌクレオチド配列は、ＳＴＨ−Ｑ中ではＡ（大文字化され、太字化されている）である１２６番目のヌクレオチドにおいて、サイトヒン−Ｒのそれと異なる。
【図２】図２は、サイトヒン−Ｒ（ＳＴＨ−Ｒ）遺伝子（配列ＩＤ番号：２）のヌクレオチド配列を描いている。このタンパク質の開始（ａｔｇ）および停止（ｔａｇ）コドンが、下線を施されている。ＳＴＨ−Ｒ中では、１２６番目のヌクレオチドがＧ（大文字化され、太字化されている）である。
【図３】図３は、ＳＴＨ−Ｑタンパク質の予見されるアミノ酸配列を説明する（配列ＩＤ番号：３）。該ＳＴＨ−Ｑ遺伝子の１２６番目のヌクレオチドは結果的に、該ＳＴＨ−Ｑタンパク質の７番目の位置にてＱ（グルタミン）となっている。
【図４】図４は、ＳＴＨ−Ｒタンパク質の予見されるアミノ酸配列を示す（配列ＩＤ番号：４）。該ＳＴＨ−ＱおよびＳＴＨ−Ｒ遺伝子の１２６番目のヌクレオチドにおける違いは、該ＳＴＨ−Ｑタンパク質中のＱ（グルタミン）を、該ＳＴＨ−Ｒタンパク質中のＲ（アルギニン）へと変えるものである。
【図５】図５は、以下に記載される方法による、ＱＱ、ＱＲ、およびＲＲ遺伝子型のＨｉｎＦＩ−消化ＰＣＲ産物の代表的な対立遺伝子分類ゲルを説明する。この多型は、新規ＨｉｎＦ１制限酵素部位を創出する。ＨｉｎＦ１−消化ＰＣＲ産物は、Ｑ対立遺伝子を有する被験者において２つのバンド（１７１塩基対および５５塩基対にて）を与え、Ｒ対立遺伝子を有する個体において３つのバンド（５５塩基対、７４塩基対、および９７塩基対にて）を与える。２つのＱＱ同種接合体、２つのＱＲ異種接合体、および２つのＲＲ同種接合体が示される。
【図６】図６は、タウ遺伝子のエクソン９の下流のイントロン内の、タウ遺伝子座およびサイトヒン遺伝子の物理的な位置（鉛直のバー、上）を例示する。
【図７】図７は、ＳＴＨタンパク質に関するオープン・リーディング・フレームを描く。このヌクレオチド配列に関して予見されるアミノ酸（３文字略号）が示される。７番目のアミノ酸における４角で囲まれたグルタミン（ｇｌｎ）コドン［ＣＡＡ］において、このヌクレオチドの多型（Ａ−＞Ｇ）が、このコドン［ＣＧＡ］を、該ＳＴＨタンパク質中でアルギニンへと変える。
【図８】図８は、複数の組織および中枢神経系における、サイトヒンおよびタウのヒトでの発現を示す。ＲＴ−ＰＣＲが、刊行されたプロトコール（１１）に従って、Human Tissue Rapid-Scan（商標）Panel（Origene）（パネルＡおよびＢ）および Human Brain Rapid-Scan（商標）Panel（Origene）（パネルＣおよびＤ）上で行われた。サイトヒン発現は、単一バンドとして、これらのパネル中に示される（パネルＡおよびＣ）。パネルＢおよびＤにおいては、タウのこれらのアイソフォームの発現は、２つのバンドにより表される。上のバンドはエクソン１０を有するアイソフォームからなり、下のバンドはエクソン１０を有さないアイソフォームを含有する。パネルＡおよびＢ中の複数の組織のレーンは、以下の通りである：１−脳；２−心臓；３−腎臓；４−脾臓；５−肝臓；６−結腸；７−肺；８−小腸；９−筋；１０−胃；１１−精巣；１２−胎盤；１３−唾液腺；１４−甲状腺；１５−副腎；１６−膵臓；１７−卵巣；１８−子宮；１９−前立腺；２０−皮膚；２１−ＰＢＬ；２２−骨髄；２３−胎児脳；２４−胎児肝。（パネルＣおよびＤ）についてのレーンは、以下の通りである：１−前頭葉；２−側頭葉；３−小脳；４−海馬；５−黒質；６−尾状核；７−扁桃；８−視床；９−視床下部；１０−橋；１１−随；および１２−脊髄。
【図９】図９は、正常な被験者（ＮＣ）、ならびにＱＱ、ＱＲおよびＲＲ遺伝子型を有するアルツハイマー病（ＡＤ）被験者の、ウェスタン・ブロット解析を説明する。上の３つのパネルは、組み換え６ＸＨｉｓを取り付けられたサイトヒン（６Ｈ−ＳＡ）、または６ＸＨｉｓを取り付けられたタウ（６Ｈ−ＴＡＵ）、またはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（転移酵素）（ＧＳＴ）、またはＧＳＴ−サイトヒン融合タンパク質（ＧＳＴ−ＳＡ）、ＧＳＴに対する抗体を有するもの（ＤＴ１２）、６ＸＨＩＳ（６ＨＩＳ）、およびサイトヒン（ＴＳ６）を発現する、ＩＰＴＧ誘導バクテリアの全溶解物の免疫ブロットを示す。下の３つのパネルは、刊行されたプロトコール（１２）に従った、ＳＴＨモノクローナル抗体の左、中央、および右のパネル（それぞれ１１Ｆ１１、ＴＳ６、および１０Ｂ３）を有する、ＡＤ被験者（ＱＱ−ＡＤ、ＡＤ−ＱＲおよびＡＤ−ＲＲ）および正常被験者（ＱＱ−ＮＣ、ＱＲ−ＮＣ）の、ＱＱ、ＱＲまたはＲＲ遺伝子型からの部分的に精製された脳のホモジェネートの免疫ブロットである。
【図１】
2005508653.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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