(57)【要約】本発明は、食品に関連する病原性細菌を検出する方法、特に、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）とリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）種の細菌をｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって同時に特異的に検出する方法、ならびに黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の細菌をｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって特異的に検出する方法、ならびにカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）とカンピロバクター・コリ（Ｃ．ｃｏｌｉ）および／またはカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）の細菌をｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって同時に特異的に検出する方法に関する。本発明はまた対応するオリゴヌクレオチドプローブおよびキットに関するものでもあり、これらを用いて本発明の方法を実施することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のｉ）〜ｉｖ）からなる群より選択される核酸配列（配列は全て５’→３’方向）を有する、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）およびリステリア・モノサイトゲネス種（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）の細菌を同時に特異的に検出するためのオリゴヌクレオチド。
ｉ）
配列番号１：  ５’−  ｇｇｃ  ｔｔｇ  ｃａｃ  ｃｇｇ  ｃａｇ  ｔｃａ  ｃｔ
配列番号２：  ５’−  ｃｇｇ  ｃｔｔ  ａｃａ  ｃｃｇ  ｇｃａ  ｇｔｃ  ａｃｔ
配列番号３：  ５’−  ｃｃｃ  ｔｔｔ  ｇｔａ  ｃｔａ  ｔｃｃ  ａｔｔ  ｇｔａ
配列番号４：  ５’−  ｃｃｃ  ｔｔｔ  ｇｔａ  ｃｃａ  ｔｃｃ  ａｔｔ  ｇｔａ
配列番号５：  ５’−  ｃｃｃ  ｔｔｔ  ｇｔａ  ｔｔａ  ｔｃｃ  ａｔｔ  ｇｔａ  ｇ配列番号６：  ５’−  ｃｃｃ  ｔｔｔ  ｇｔａ  ｃｔｇ  ｔｃｃ  ａｔｔ  ｇｔａ
ｉｉ）塩基の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％がｉ）に記載のオリゴヌクレオチドと同一であり、リステリア属およびリステリア・モノサイトゲネス種の少なくともいずれかの細菌の核酸配列との特異的ハイブリダイゼーションが可能なオリゴヌクレオチド
ｉｉｉ）少なくとも１ヌクレオチド分だけ長いという点で、ｉ）およびｉｉ）に記載のオリゴヌクレオチドと異なるオリゴヌクレオチド
ｉｖ）ストリンジェントな条件下で、ｉ）、ｉｉ）、およびｉｉｉ）に記載のオリゴヌクレオチドに相補的な配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
【請求項２】
以下のｉ）〜ｉｖ）からなる群より選択される核酸配列（配列は全て５’→３’方向）を有する、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌を特異的に検出するためのオリゴヌクレオチド。
ｉ）
配列番号７：    ５’−  ＧＡＡ  ＧＣＡ  ＡＧＣ  ＴＴＣ  ＴＣＧ  ＴＣＣ  Ｇ
配列番号８：    ５’−  ＧＧＡ  ＧＣＡ  ＡＧＣ  ＴＣＣ  ＴＣＧ  ＴＣＣ  Ｇ
配列番号９：    ５’−  ＧＡＡ  ＧＣＡ  ＡＧＣ  ＴＴＣ  ＴＣＧ  ＴＣＡ  ＴＴ
配列番号１０：  ５’−  ＣＴＡ  ＡＴＧ  ＣＡＧ  ＣＧＣ  ＧＧＡ  ＴＣＣ
配列番号１１：  ５’−  ＣＴＡ  ＡＴＧ  ＣＡＣ  ＣＧＣ  ＧＧＡ  ＴＣＣ
配列番号１２：  ５’−  ＣＴＡ  ＡＴＧ  ＣＧＧ  ＣＧＣ  ＧＧＡ  ＴＣＣ
配列番号１３：  ５’−  ＣＴＡ  ＡＴＧ  ＣＡＧ  ＣＧＣ  ＧＧＧ  ＴＣＣ
ｉｉ）塩基の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％がｉ）に記載のオリゴヌクレオチドと同一であり、黄色ブドウ球菌の核酸配列との特異的ハイブリダイゼーションが可能なオリゴヌクレオチド
ｉｉｉ）少なくとも１ヌクレオチド分だけ長いという点で、ｉ）およびｉｉ）に記載のオリゴヌクレオチドと異なるオリゴヌクレオチド
ｉｖ）ストリンジェントな条件下で、ｉ）、ｉｉ）、およびｉｉｉ）に記載のオリゴヌクレオチドに相補的な配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
以下のｉ）〜ｉｖ）からなる群より選択される核酸配列（配列は全て５’→３’方向）を有する、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）ならびにカンピロバクター・コリ（Ｃ．ｃｏｌｉ）および／またはカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）の細菌を同時に特異的に検出するためのオリゴヌクレオチド。
ｉ）
配列番号１６    ５’ＣＴＧ  ＣＣＴ  ＣＴＣ  ＣＣＴ  ＣＡＣ  ＴＣＴ  ＡＧ
配列番号１７    ５’ＣＴＧ  ＣＣＴ  ＣＴＣ  ＣＣＴ  ＴＡＣ  ＴＣＴ  ＡＧ
配列番号１８    ５’ＣＴＧ  ＣＣＴ  ＣＴＣ  ＣＣＣ  ＴＡＣ  ＴＣＴ  ＡＧ
配列番号１９    ５’ＣＴＧ  ＣＣＴ  ＣＴＣ  ＣＣＣ  ＣＡＣ  ＴＣＴ  ＡＧ
配列番号２０    ５’ＣＣＴ  ＡＣＣ  ＴＣＴ  ＣＣＣ  ＡＴＡ  ＣＴＣ  ＴＡＧ  Ａ
配列番号２１    ５’ＣＣＡ  ＴＣＣ  ＴＣＴ  ＣＣＣ  ＡＴＡ  ＣＴＣ  ＴＡＧ  Ｃ
配列番号２２    ５’ＣＣＴ  ＡＣＣ  ＴＣＴ  ＣＣＡ  ＧＴＡ  ＣＴＣ  ＴＡＧ  Ｔ
配列番号２３    ５’ＣＣＴ  ＧＣＣ  ＴＣＴ  ＣＣＣ  ＡＣＡ  ＣＴＣ  ＴＡＧ  Ａ
配列番号２４    ５’ＣＧＣ  ＴＣＣ  ＧＡＡ  ＡＡＧ  ＴＧＴ  ＣＡＴ  ＣＣＴ  Ｃ
配列番号２５    ５’ＣＴＡ  ＡＡＴ  ＡＣＧ  ＴＧＧ  ＧＴＴ  ＧＣＧ
配列番号２６    ５’ＣＴＡ  ＡＡＣ  ＡＣＧ  ＴＧＧ  ＧＴＴ  ＧＣＧ
配列番号２７    ５’ＡＧＣ  ＡＧＡ  ＴＣＧ  ＣＣＴ  ＴＣＧ  ＣＡＡ  Ｔ
配列番号２８    ５’ＡＧＣ  ＡＧＡ  ＴＣＧ  ＣＴＴ  ＴＣＧ  ＣＡＡ  Ｔ
配列番号２９    ５’ＡＧＴ  ＡＧＡ  ＴＣＧ  ＣＣＴ  ＴＣＧ  ＣＡＡ  Ｔ
配列番号３０    ５’ＴＣＧ  ＡＧＴ  ＧＡＡ  ＡＴＣ  ＡＡＣ  ＴＣＣ  Ｃ
配列番号３１    ５’ＴＣＧ  ＧＧＴ  ＧＡＡ  ＡＴＣ  ＡＡＣ  ＴＣＣ  Ｃ
配列番号３２    ５’ＣＧＴ  ＡＧＣ  ＡＴＧ  ＧＣＴ  ＧＡＴ  ＣＴＡ  Ｃ
配列番号３３    ５’ＣＧＴ  ＡＧＣ  ＡＴＡ  ＧＣＴ  ＧＡＴ  ＣＴＡ  Ｃ
配列番号３４    ５’ＣＧＴ  ＡＧＣ  ＡＴＴ  ＧＣＴ  ＧＡＴ  ＣＴＡ  Ｃ
配列番号３５    ５’ＧＣＣ  ＣＴＧ  ＡＣＴ  ＡＧＣ  ＡＧＡ  ＧＣＡ  Ａ
配列番号３６    ５’ＴＴＣ  ＴＴＧ  ＧＴＧ  ＡＴＣ  ＴＣＴ  ＡＣＧ  Ｇ
配列番号３７    ５’ＴＴＣ  ＣＴＧ  ＧＴＧ  ＡＴＣ  ＴＣＴ  ＡＣＧ  Ｇ
配列番号３８    ５’ＴＴＣ  ＴＴＧ  ＧＴＧ  ＡＴＡ  ＴＣＴ  ＡＣＧ  Ｇ
配列番号３９    ５’ＴＴＧ  ＡＧＴ  ＴＣＴ  ＡＧＣ  ＡＧＡ  ＴＣＧ  Ｃ
配列番号４０    ５’ＴＴＧ  ＡＧＴ  ＴＣＣ  ＡＧＣ  ＡＧＡ  ＴＣＧ  Ｃ
配列番号４１    ５’ＴＴＧ  ＡＧＴ  ＴＣＴ  ＡＧＣ  ＡＧＡ  ＴＡＧ  Ｃ
配列番号４２    ５’ＴＴＧ  ＡＧＴ  ＴＣＣ  ＡＧＣ  ＡＧＡ  ＴＡＧ  Ｃ
配列番号４３    ５’ＣＧＣ  ＧＣＣ  ＴＴＡ  ＧＣＧ  ＴＣＡ  ＧＴＴ  ＧＡＧ  
配列番号４４    ５’ＣＡＣ  ＧＣＣ  ＴＴＡ  ＧＣＧ  ＴＣＡ  ＧＴＴ  ＧＡＧ  
配列番号４５    ５’ＣＧＣ  ＧＣＣ  ＴＴＡ  ＧＣＧ  ＴＣＡ  ＧＴＴ  ＡＡＧ  
配列番号４６    ５’ＣＡＣ  ＧＣＡ  ＴＴＡ  ＧＣＧ  ＴＣＡ  ＧＴＴ  ＧＡＧ  
配列番号４７    ５’ＣＧＡ  ＧＣＡ  ＴＴＡ  ＧＣＧ  ＴＣＡ  ＧＴＴ  ＧＡＧ  
配列番号４８    ５’ＴＡＣ  ＡＣＴ  ＡＧＴ  ＴＧＴ  ＴＧＧ  ＧＧＴ  ＧＧ
配列番号４９    ５’ＴＴＣ  ＧＣＧ  ＣＣＴ  ＣＡＧ  ＣＧＴ  ＣＡＧ  ＴＴＡ  ＣＡＧ
ｉｉ）塩基の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％がｉ）に記載のオリゴヌクレオチドの１つと同一であり、カンピロバクター属および／またはＣ．コリおよび／またはＣ．ジェジュニの細菌の核酸配列との特異的ハイブリダイゼーションが可能なオリゴヌクレオチド
ｉｉｉ）少なくとも１ヌクレオチド分だけ長いという点で、ｉ）およびｉｉ）に記載のオリゴヌクレオチドと異なるオリゴヌクレオチド
ｉｖ）ストリンジェントな条件下で、ｉ）、ｉｉ）、およびｉｉｉ）に記載のオリゴヌクレオチドに相補的な配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
【請求項４】
試料中のリステリア属およびリステリア・モノサイトゲネス種の細菌を同時に特異的に検出する方法であって、
ａ）試料に含まれる食品に関連する病原性細菌を培養する工程と、
ｂ）試料中に存在する食品に関連する病原性細菌を固定する工程と、
ｃ）ハイブリダイゼーションのために、固定された細菌を請求項１に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする工程と、
ｄ）ハイブリダイズしなかったオリゴヌクレオチドを除去する工程と、
ｅ）ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを用いて、食品に関連する病原性細菌の細胞を検出および視覚化ならびに任意選択で定量する工程と、
を含む方法。
【請求項５】
試料中の黄色ブドウ球菌の細菌を特異的に検出する方法であって、
ａ）試料に含まれる食品に関連する病原性細菌を培養する工程と、
ｂ）試料中に存在する食品に関連する病原性細菌を固定する工程と、
ｃ）ハイブリダイゼーションのために、固定された細菌を請求項２に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする工程と、
ｄ）ハイブリダイズしなかったオリゴヌクレオチドを除去する工程と、
ｅ）ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを用いて、食品に関連する病原性細菌細胞を検出および視覚化ならびに任意選択で定量する工程と、
を含む方法。
【請求項６】
試料中のカンピロバクター属ならびにＣ．コリおよびＣ．ジェジュニの少なくともいずれかの細菌を同時に特異的に検出する方法であって、
ａ）試料に含まれる食品に関連する病原性細菌を培養する工程と、
ｂ）試料中に存在する食品に関連する病原性細菌を固定する工程と、
ｃ）ハイブリダイゼーションのために、固定された細菌を請求項３に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする工程と、
ｄ）ハイブリダイズしなかったオリゴヌクレオチドを除去する工程と、
ｅ）ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを用いて、食品に関連する病原性細菌細胞を検出および視覚化ならびに任意選択で定量する工程と、
を含む方法。
【請求項７】
試料が食料品試料である、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
検出が、光学顕微鏡、エピフルオレッセンス顕微鏡、ケモルミノメータ、蛍光光度計、またはフローサイトメータにより行われる、請求項４〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、請求項４に記載の方法を行うためのキット。
【請求項１０】
請求項２に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、請求項５に記載の方法を行うためのキット。
【請求項１１】
請求項３に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、請求項６に記載の方法を行うためのキット。
【請求項１２】
ハイブリダイゼーション溶液に溶解した少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、請求項９〜１１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１３】
洗浄液、および任意選択で１種類以上の固定液をさらに含む、請求項９〜１２のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品に関連する病原性細菌を検出する方法、特に、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）およびリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）種の細菌をｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって同時に特異的に検出する方法、ならびに黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の細菌をｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって特異的に検出する方法、ならびにカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）ならびにカンピロバクター・コリ（Ｃ．ｃｏｌｉ）およびカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）の細菌をｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって特異的に検出する方法、ならびに本発明の方法を実施することができる対応するオリゴヌクレオチドプローブおよびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
リステリア属は短い運動性のグラム陽性杆菌である。リステリア属（Ｌ．）には６つの種：リステリア・グレイ（Ｌ．ｇｒａｙｉ）、リステリア・イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）、リステリア・イバノビ（Ｌ．ｉｖａｎｏｖｉｉ）、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・ゼーリゲリ（Ｌ．ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ）、およびリステリア・ウェルシメリ（Ｌ．ｗｅｉｓｈｉｍｅｒｉ）が属する。これらの遍在性の細菌の世界的な分布は水界ならびに土壌および植物に及んでいる。
【０００３】
リステリア属は、ヒトならびに家畜および野生動物において引き起こされるリステリア症として知られる感染症のために特に医薬上重要である。ヒトではリステリア症は潜伏期が数日から２ヶ月と非常に幅広く、リステリア・モノサイトゲネスによって引き起こされるが、リステリア症の中にはリステリア・イバノビ、リステリア・ゼーリゲリ、およびリステリア・ウェルシメリが検出されたものもある。リステリア感染は、敗血症、髄膜炎、または脳炎などの重篤な疾患の形となって表れる。特に、胎盤を通じて、または分娩中に感染することがある新生児ならびに高齢者では、リステリア症は健康上の高いリスクを有する。新生児リステリア症の場合、致死率は５０％まで達する。出産する前に感染すると胎児が流産することがある。高齢者または他の免疫機能が低下した人においてリステリア症が発症すると、感染者の３０％まで死に至ることがある。
【０００４】
伝染は、通常、汚染された食料品を摂取することによって起こる。特に、乳製品は、よくみられる感染源である。他のほぼ全ての食料品も潜在的なリステリア感染源である。乳ならびにチーズ、バター、またはアイスクリームなどの様々な乳製品に加えて、他の食料品も過去にリステリア症感染源として特定された。これらの食料品として、コールスロー、イガイ、豚肉、鶏肉、魚、コーンミール、またはライスサラダのような様々な製品が挙げられる。多くの場合、前記の食料品の摂取により引き起こされるリステリア症の大流行は致命的であることが分かっている。
【０００５】
これに関して特に重要なのは、リステリアが４℃でも増殖できることである（乳の中では−０．３℃でも増殖できる）。これは、食料品の冷蔵保存にもかかわらず、リステリアが食料品中で増殖および蓄積することができることを意味している。調理、ロースト、または燻製の後でさえ、リステリアは、不十分な処理または二次汚染の結果としてその食料品中で蓄積している可能性がある。
【０００６】
従って、リステリアが発生しているかどうか食料品を連続して監視することが、製造会社における品質保証ならびに衛生機関における日常業務の重要な部分である。
古典的なリステリア・モノサイトゲネス検出法は非常に時間がかかる。この場合、最初に、液体選択培地（いわゆる、１／２フレイザー（Ｆｒａｓｅｒ）ブイヨン）中で増菌を３０℃で２４時間行う。この後、第２の増菌工程（ここではフレイザーブイヨン中で３７℃で４８時間）を行う。次いで、両方の増菌物を選択寒天培地（オックスフォード寒天（Ｏｘｆｏｒｄ‐Ａｇａｒ）およびＰＡＬＣＡＭ寒天（ＰＡＬＣＡＭ‐Ａｇａｒ））に撒き、これらを３０℃または３７℃で２４時間〜４８時間インキュベートする。この方法で増殖したコロニーがリステリア属またはリステリア・モノサイトゲネスであることを確認するために、さらに継代培養を、少なくとも２４時間、長くても５日間、（トリプトンダイズ酵母寒天またはヒツジ血液寒天上で）行う。従って、古典的な検出法の全期間は５日〜１０日である。
【０００７】
ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）中毒は、細菌により引き起こされ、食料品により伝染する世界で最も流行している疾患に属する。これらは、特に、黄色ブドウ球菌株より引き起こされる。黄色ブドウ球菌は、非運動性でコアグラーゼ陽性のグラム陽性細菌であり、皮膚、鼻咽頭粘膜、大便、排泄物、腫瘍、および膿疱に存在する。黄色ブドウ球菌はまた健常集団の中にも広く存在している。黄色ブドウ球菌は、全健常者の半分の鼻咽頭において検出することができる。
【０００８】
黄色ブドウ球菌が感染した結果としての食中毒は、これらの細菌が食料品中で産生したエンテロトキシンによって引き起こされ、嘔吐および下痢を特徴とする。エンテロトキシンＡは最も強力な作用を有し、嘔吐を引き起こす量は１μｇ未満である。０．１〜０．２μｇのエンテロトキシンでさえ食中毒を引き起こす。Ｆ型毒素も特筆に価し、ショック症候群を引き起こすので「毒素性ショック症候群毒素（ＴＳＳＴ‐１）」とも呼ばれる。Ｆ型毒素により引き起こされるショック症候群の特徴は、肺浮腫、内皮細胞の変性、腎不全、およびショックである。
【０００９】
黄色ブドウ球菌の伝染もまた、通常、汚染された食料品を摂取することによって起こり、潜在的な感染源の範囲はかなり広い。特に、以下の食料品：肉を含む調理済みインスタント食品、パイ、ハム、ガモン、乳および乳製品、卵を含む料理、サラダ、クリーム、ケーキフィリング、アイスクリーム、パスタが疾患の発生に関与した。
【００１０】
エンテロトキシンの検出は実施するのが極めて複雑であるので、日常的な検出は、現在では、主として、疑わしいコロニーを培養および確認することによって行われる。培養による検出の場合、最初に、試験しようとする試料を適切な選択培地（例えば、ベアード（Ｂａｉｒｄ））において３７℃で４８時間インキュベートする。この最初の培養工程を液体培地中で行った場合、次の培養は、固体培地（例えば、ベアード−パーカー（Ｂａｉｒｄ‐Ｐａｒｋｅｒ））において（再度、４８時間）行う。次の工程では、コアグラーゼが存在するかどうか疑わしいコロニーを試験する。このために、２種類の方法を使用することができる。通常、最初にいわゆる「凝固因子の存在についての試験管試験（Ｒｏｅｈｒｃｈｅｎ‐Ｔｅｓｔ  ａｕｆ  Ａｎｗｅｓｅｎｈｅｉｔ  ｄｅｓ  Ｋｌｕｍｐｕｎｇｓｆａｋｔｏｒｓ）」が行われる。この試験は約６〜８時間かかる。この試験で陰性であれば、いわゆる「ウサギ血漿を用いた試験管試験（Ｒｏｅｈｒｃｈｅｎ‐Ｔｅｓｔ  ｕｎｔｅｒ  Ｖｅｒｗｅｎｄｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｋａｎｉｎｃｈｅｎ‐Ｐｌａｓｍａ）」によって結果を確認しなければならない。この試験は最大２４時間かかる。従って、古典的な検出法の全期間は５４時間〜５日である。
【００１１】
以前では過小評価されていた微生物（すなわち、カンピロバクター属）が食中毒を引き起こすものとして大きな役割を果たしてきたのは、この２０有余年にすぎない。例えば、サルモネラ菌とは対照的に、カンピロバクター属は食品においてめったに増殖しないが、この病原体に感染するには数百個の細菌細胞で十分である。
【００１２】
カンピロバクター属（Ｃ．）には２０の種および亜種が含まれる。これらの細菌は、細長い、弯曲〜らせん状に弯曲したグラム陰性桿菌であり、増殖には微好気性条件を必要とし、これまで培養するのが難しかった。
【００１３】
Ｃ．ジェジュニ、Ｃ．コリ、およびＣ．ラリス（Ｃ．ｌａｒｉｓ）が医学的に関連している。これらは小腸および結腸に棲息し、以下の症状：下痢、腹痛、発熱、吐き気、嘔吐を伴う急性胃腸炎を引き起こす。これらの症状は胃潰瘍の症状と非常に区別しにくい。従って、注意深い鑑別診断が必要である。
【００１４】
現在、日常的な検出は、多段階培養（液体選択培地（プレストン（Ｐｒｅｓｔｏｎ）によるカンピロバクター選択培地）での１８時間の増菌から始めて、２種類の固形培地で４８時間の培養を２回（カルマリ（Ｋａｒｍａｌｉ）寒天、その後にコロンビア（Ｃｏｌｕｍｂｉａ）血液寒天））することによって行われる。これらの５日間の培養の後に、生化学的または血清学的な同定が行われる。
【００１５】
リステリア属、黄色ブドウ球菌、およびカンピロバクター属の前記の検出法によって生じる困難（特に、時間の長さ）の必然的な結果として、核酸に基づく検出法は明らかな解決法のように思われる。
【００１６】
ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）では、各細菌ゲノムの特徴的な断片が特異的プライマーを用いて増幅される。プライマーがその標的部位を発見すれば、遺伝物質の断片が１００万倍に増幅される。例えば、ＤＮＡ断片を分離するアガロースゲルによる後の分析によって、定性的な評価を行うことができる。最も単純な場合、これは、使用したプライマーの標的部位が試験試料中に存在したという結論につながる。それ以上の結論を下すことはできない。というのも、これらの標的部位は生きた細菌および死んだ細菌のいずれに由来してもよく、または裸のＤＮＡに由来してもよい。この方法を用いて識別することは不可能である。ＰＣＲ反応は死んだ細菌または裸のＤＮＡが存在しても陽性になるので、しばしば、偽陽性の結果につながる。この技法をさらに改良したものが定量的ＰＣＲである。定量的ＰＣＲでは、存在する細菌の量と増幅ＤＮＡの量との相関の証明が試みられる。ＰＣＲの利点は、特異性が高いこと、使用が容易なこと、および時間の消費が短いことである。ＰＣＲの主な欠点は、汚染に対する感受性が高く、従って偽陽性の結果が得られること、ならびに前述のように生細胞と死細胞または裸のＤＮＡをそれぞれ識別できないことである。
【００１７】
ＰＣＲなどの分子生物学的方法の特異性と細菌視覚化の可能性（これは抗体法によって容易に行われる）を組み合わせた独自のアプローチが、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ；非特許文献１を参照）である。この方法を用いて、細菌の種、属、または群を高い特異性で同定および視覚化することができる。
【００１８】
ＦＩＳＨ法は、細菌細胞には、細菌細胞に不可欠な機能のために進化の過程でわずかしか変異しなかった分子が存在する、ということに基づいている。このような分子が１６Ｓおよび２３Ｓリボソームリボ核酸（ｒＲＮＡ）である。両方ともタンパク質生合成の場であるリボソームの一部であり、その遍在的な分布、サイズおよび構造、ならびに機能不変性の故に特異的マーカーとして役立ちうる（非特許文献２を参照）。比較配列分析に基づき、これらのデータのみに基づいて系統発生的な関連性を証明することができる。このためには、配列データをアラインメントしなければならない。これらの高分子の二次構造および三次構造に関する知見に基づくアラインメントでは、リボソーム核酸の相同な部位が互いに並べられる。
【００１９】
これらのデータに基づいて系統発生的な計算を行うことができる。最新のコンピュータ技術を用いることで、大規模な計算さえ迅速かつ効果的に行い、ならびに１６Ｓ  ｒＲＮＡおよび２３Ｓ  ｒＲＮＡのアラインメント配列を含む大きなデータベースをつくることが可能になる。このデータ材料に迅速にアクセスできるので、新たに獲得した配列は短時間で系統発生的に分析することができる。これらのｒＲＮＡデータベースは、種特異的および属特異的な遺伝子プローブを構築するのに使用することができる。その場合、利用可能な全てのｒＲＮＡ配列を互いに比較し、特異的配列部位に対するプローブを設計する。このプローブは細菌の特定の種、属、または群を対象とする。
【００２０】
ＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）法では、リボソーム標的配列上のある特定の領域に相補的なこれらの遺伝子プローブと細胞を接触させる。遺伝子プローブは、一般的に短い１６〜２０塩基長の一本鎖デオシキリボ核酸断片であり、細菌種または細菌群に特有の標的領域を対象としてつくられる。蛍光標識遺伝子プローブが細菌細胞において標的配列を見つけると、同プローブは標的配列に結合し、その蛍光によって細胞を蛍光顕微鏡において検出することができる。
【非特許文献１】Ｒ．Ｉ．アマン（Ａｍａｎｎ），Ｗ．ルドヴィッヒ（Ｌｕｄｗｉｇ）、およびＫ．−Ｈ．シュライファー（Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ），１９９５年、「培養を伴わない個々の細菌細胞の系統発生的同定およびｉｎ  ｓｉｔｕ検出（Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation.）」、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．第５９巻、１４３−１６９頁
【非特許文献２】ウォエス（Ｗｏｅｓｅ），Ｃ．Ｒ．，１９８７年、「細菌の進化（Bacterial evolution.）」、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．第５１巻、２２１−２７１頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
ＦＩＳＨ分析は、評価のために細胞が高エネルギー光による照射によって視覚化されるので常にスライド上で行われる。しかし、ここで、古典的なＦＩＳＨ分析の欠点の１つが重くのしかかる。すなわち、スライド上では当然、比較的わずかな量しか分析できないので、この方法の感度は信頼できる分析にとっては不満足で、十分でない可能性がある。従って、本発明は、古典的なＦＩＳＨ分析の利点と培養の利点を組み合わせている。比較的短い培養工程によって、特異的ＦＩＳＨを用いて細菌を検出する前に、検出しようとする細菌が十分な数で存在することを確実にする。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
従って、本願に記載のリステリア属ならびにリステリア・モノサイトゲネス種の細菌を同時にかつ特異的に検出する方法、または黄色ブドウ球菌の細菌を特異的に検出する方法、またはカンピロバクター属ならびにＣ．コリおよびＣ．ジェジュニの細菌を同時にかつ特異的に検出する方法の実現には、次の工程、すなわち
−試験しようとする試料中に存在する細菌を培養する工程、
−試料中に存在する細菌を固定する工程、
−ハイブリダイゼーションのために、固定された細菌を核酸プローブ分子とともにインキュベートする工程、
−ハイブリダイズしなかった核酸プローブ分子を除去または洗い流す工程、および
−核酸プローブ分子とハイブリダイズした細菌を検出する工程
が含まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明の範囲内において、「培養」は、試料中に存在する細菌の適切な培地における増殖を意味すると理解される。リステリア属の検出には、培養を、例えば１／２フレイザーブイヨン中で３０℃で２４時間行ってもよい。黄色ブドウ球菌の検出には、培養を、例え
ば、３５℃で８時間〜４８時間の血液培養（例えば、バクテック（ＢＡＣＴＥＣ）９２４０，ベクトンディキンソンインスツルメンツ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））として行ってもよい。カンピロバクター属の検出には、培養を、例えば、４２℃で２４時間、プレストンの選択培地中で行ってもよい。どのような場合でも、専門家であれば先行技術の適切な培養法を見つけ出すことができる。
【００２４】
本発明の範囲内において、細菌の「固定」は、核酸プローブが細菌の膜を透過できるようにする処理を意味すると理解される。固定には、通常、エタノールが用いられる。これらの技法を用いても核酸プローブが細胞壁を透過できない場合、専門家であれば、同じ結果が得られる他の技法を十分な数知っている。これらの技法として、例えば、メタノール、アルコール混合物、低濃度パラホルムアルデヒド溶液、または希ホルムアルデヒド溶液、酵素による処理などが挙げられる。
【００２５】
本発明の範囲内において、固定された細菌は「ハイブリダイゼーション」のために蛍光標識核酸プローブとともにインキュベートされる。次いで、オリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチドに連結したマーカーとで構成されるこれらの核酸プローブは細胞壁を透過し、細胞内の核酸プローブに対応する標的配列に結合することができる。結合は、相補的な核酸断片間での水素結合の形成と理解される。
【００２６】
ここで、核酸プローブは、検出しようとする微生物の染色体ＤＮＡまたはエピソームＤＮＡに相補的であるだけでなく、ｍＲＮＡまたはｒＲＮＡに相補的であってもよい。検出しようとする微生物において２つ以上のコピーで存在する領域に相補的な核酸プローブを選択するのが有利である。検出しようとする配列は、細胞１個につき５００〜１００，０００コピー存在することが好ましく、特に好ましくは１，０００〜５０，０００コピーである。このような理由により、ｒＲＮＡが標的部位として用いられることが好ましい。なぜならタンパク質生合成の場であるリボソームは活動している細胞１個につき何千倍という数で存在するからである。
【００２７】
本発明の意味の範囲内で、核酸プローブは、通常、１２〜１，０００ヌクレオチド、好ましくは１２〜５００ヌクレオチド、より好ましくは１２〜２００ヌクレオチド、特に好ましくは１２〜５０および１５〜４０ヌクレオチド、最も好ましくは１７〜２５ヌクレオチドを含む、ＤＮＡプローブでもＲＮＡプローブでもよい。核酸プローブの選択は、検出しようとする微生物中に相補配列が存在するかどうかという基準に従って行われる。特定の配列を選択することによって、細菌種、細菌属、または細菌群全体を検出することができる。１５ヌクレオチドのプローブでは、配列は１００％相補的でなければならない。１５ヌクレオチドを超えるオリゴヌクレオチドでは、１つまたは複数のミスマッチが許される。
【００２８】
リステリア属およびリステリア・モノサイトゲネス種の細菌を同時に特異的に検出する本発明の方法の範囲内で、本発明の核酸プローブ分子は以下の長さおよび配列を有する。配列番号１：  ５’−  ｇｇｃ  ｔｔｇ  ｃａｃ  ｃｇｇ  ｃａｇ  ｔｃａ  ｃｔ
配列番号２：  ５’−  ｃｇｇ  ｃｔｔ  ａｃａ  ｃｃｇ  ｇｃａ  ｇｔｃ  ａｃｔ
配列番号３：  ５’−  ｃｃｃ  ｔｔｔ  ｇｔａ  ｃｔａ  ｔｃｃ  ａｔｔ  ｇｔａ
配列番号４：  ５’−  ｃｃｃ  ｔｔｔ  ｇｔａ  ｃｃａ  ｔｃｃ  ａｔｔ  ｇｔａ
配列番号５：  ５’−  ｃｃｃ  ｔｔｔ  ｇｔａ  ｔｔａ  ｔｃｃ  ａｔｔ  ｇｔａ  ｇ配列番号６：  ５’−  ｃｃｃ  ｔｔｔ  ｇｔａ  ｃｔｇ  ｔｃｃ  ａｔｔ  ｇｔａ
例えば、リステリア属およびリステリア・モノサイトゲネスを検出する方法は以下のように行われる：オリゴヌクレオチド配列番号１は、例えば緑色蛍光色素で特異的に標識され、リステリア属の全ての細菌を特異的に検出するために使用される。オリゴヌクレオチド配列番号２は未標識のままで、標識されたオリゴヌクレオチド配列番号１とリステリア
属に属さない細菌との結合を競合物質として阻害する。配列番号３のオリゴヌクレオチドも特異的に標識されるが、オリゴヌクレオチド配列番号１とは異なる、例えば赤色蛍光色素で標識され、リステリア・モノサイトゲネス種の全ての細菌を特異的に検出するために使用される。オリゴヌクレオチド配列番号４、配列番号５、および配列番号６も未標識のままで、標識されたオリゴヌクレオチド配列番号３とリステリア・モノサイトゲネス種に属さない細菌の結合を競合物質として阻害する。このように、リステリア属に属する細菌またはリステリア・モノサイトゲネス種に属する細菌をそれぞれ同時に、かつ高度に特異的に検出することが可能である。異なるマーカー（例えば、一方では緑色蛍光色素、他方では赤色蛍光色素）は、例えば蛍光顕微鏡において異なるフィルターを用いることによって、互いに容易に識別できる。
【００２９】
黄色ブドウ球菌の細菌を特異的に検出する本発明の方法の範囲内において、本発明の核酸プローブ分子は以下の長さおよび配列を有する。
配列番号７：    ５’−  ＧＡＡ  ＧＣＡ  ＡＧＣ  ＴＴＣ  ＴＣＧ  ＴＣＣ  Ｇ
配列番号８：    ５’−  ＧＧＡ  ＧＣＡ  ＡＧＣ  ＴＣＣ  ＴＣＧ  ＴＣＣ  Ｇ
配列番号９：    ５’−  ＧＡＡ  ＧＣＡ  ＡＧＣ  ＴＴＣ  ＴＣＧ  ＴＣＡ  ＴＴ
配列番号１０：  ５’−  ＣＴＡ  ＡＴＧ  ＣＡＧ  ＣＧＣ  ＧＧＡ  ＴＣＣ
配列番号１１：  ５’−  ＣＴＡ  ＡＴＧ  ＣＡＣ  ＣＧＣ  ＧＧＡ  ＴＣＣ
配列番号１２：  ５’−  ＣＴＡ  ＡＴＧ  ＣＧＧ  ＣＧＣ  ＧＧＡ  ＴＣＣ
配列番号１３：  ５’−  ＣＴＡ  ＡＴＧ  ＣＡＧ  ＣＧＣ  ＧＧＧ  ＴＣＣ
例えば、黄色ブドウ球菌を検出する方法は以下のように行われる：オリゴヌクレオチド配列番号７および配列番号１０は、例えば赤色蛍光色素で特異的に標識され、黄色ブドウ球菌の全ての細菌を特異的に検出するために使用される。オリゴヌクレオチド配列番号８および９ならびに配列番号１１、１２、および１３は未標識のままで、標識オリゴヌクレオチドと黄色ブドウ球菌に属さない細菌の結合を競合物質として阻害する。このように、黄色ブドウ球菌に属する細菌を高度に特異的に検出することが可能である。
【００３０】
好ましい実施態様において、得られるシグナルの強度を、いわゆる「ヘルパープローブ」を用いることによって高めることができる。これらのヘルパープローブは以下の配列を有する非標識オリゴヌクレオチドである。
配列番号１４：  ＴＣＧ  ＣＴＣ  ＧＡＣ  ＴＴＧ  ＣＡＴ  ＧＴＡ  ＴＴＡ  ＧＧＣ  Ａ
配列番号１５：  ＡＣＣ  ＣＧＴ  ＣＣＧ  ＣＣＧ  ＣＴＡ  ＡＣＡ  ＴＣＡ  Ｇ
ヘルパープローブの使用は必須ではなく、任意である。ヘルパープローブは、標識プローブと標的部位の結合を容易にし、従って、シグナル強度を高める。しかしながら、これらのヘルパープローブがなくても、この検出方法は非常に良好に機能する。
【００３１】
カンピロバクター属ならびにＣ．コリおよびＣ．ジェジュニの細菌を同時に特異的に検出する本発明の方法の範囲内において、本発明の核酸プローブ分子は以下の長さおよび配列を有する。
配列番号１６    ５’ＣＴＧ  ＣＣＴ  ＣＴＣ  ＣＣＴ  ＣＡＣ  ＴＣＴ  ＡＧ
配列番号１７    ５’ＣＴＧ  ＣＣＴ  ＣＴＣ  ＣＣＴ  ＴＡＣ  ＴＣＴ  ＡＧ
配列番号１８    ５’ＣＴＧ  ＣＣＴ  ＣＴＣ  ＣＣＣ  ＴＡＣ  ＴＣＴ  ＡＧ
配列番号１９    ５’ＣＴＧ  ＣＣＴ  ＣＴＣ  ＣＣＣ  ＣＡＣ  ＴＣＴ  ＡＧ
配列番号２０    ５’ＣＣＴ  ＡＣＣ  ＴＣＴ  ＣＣＣ  ＡＴＡ  ＣＴＣ  ＴＡＧ  Ａ
配列番号２１    ５’ＣＣＡ  ＴＣＣ  ＴＣＴ  ＣＣＣ  ＡＴＡ  ＣＴＣ  ＴＡＧ  Ｃ
配列番号２２    ５’ＣＣＴ  ＡＣＣ  ＴＣＴ  ＣＣＡ  ＧＴＡ  ＣＴＣ  ＴＡＧ  Ｔ
配列番号２３    ５’ＣＣＴ  ＧＣＣ  ＴＣＴ  ＣＣＣ  ＡＣＡ  ＣＴＣ  ＴＡＧ  Ａ
配列番号２４    ５’ＣＧＣ  ＴＣＣ  ＧＡＡ  ＡＡＧ  ＴＧＴ  ＣＡＴ  ＣＣＴ  Ｃ
配列番号２５    ５’ＣＴＡ  ＡＡＴ  ＡＣＧ  ＴＧＧ  ＧＴＴ  ＧＣＧ
配列番号２６    ５’ＣＴＡ  ＡＡＣ  ＡＣＧ  ＴＧＧ  ＧＴＴ  ＧＣＧ
配列番号２７    ５’ＡＧＣ  ＡＧＡ  ＴＣＧ  ＣＣＴ  ＴＣＧ  ＣＡＡ  Ｔ
配列番号２８    ５’ＡＧＣ  ＡＧＡ  ＴＣＧ  ＣＴＴ  ＴＣＧ  ＣＡＡ  Ｔ
配列番号２９    ５’ＡＧＴ  ＡＧＡ  ＴＣＧ  ＣＣＴ  ＴＣＧ  ＣＡＡ  Ｔ
配列番号３０    ５’ＴＣＧ  ＡＧＴ  ＧＡＡ  ＡＴＣ  ＡＡＣ  ＴＣＣ  Ｃ
配列番号３１    ５’ＴＣＧ  ＧＧＴ  ＧＡＡ  ＡＴＣ  ＡＡＣ  ＴＣＣ  Ｃ
配列番号３２    ５’ＣＧＴ  ＡＧＣ  ＡＴＧ  ＧＣＴ  ＧＡＴ  ＣＴＡ  Ｃ
配列番号３３    ５’ＣＧＴ  ＡＧＣ  ＡＴＡ  ＧＣＴ  ＧＡＴ  ＣＴＡ  Ｃ
配列番号３４    ５’ＣＧＴ  ＡＧＣ  ＡＴＴ  ＧＣＴ  ＧＡＴ  ＣＴＡ  Ｃ
配列番号３５    ５’ＧＣＣ  ＣＴＧ  ＡＣＴ  ＡＧＣ  ＡＧＡ  ＧＣＡ  Ａ
配列番号３６    ５’ＴＴＣ  ＴＴＧ  ＧＴＧ  ＡＴＣ  ＴＣＴ  ＡＣＧ  Ｇ
配列番号３７    ５’ＴＴＣ  ＣＴＧ  ＧＴＧ  ＡＴＣ  ＴＣＴ  ＡＣＧ  Ｇ
配列番号３８    ５’ＴＴＣ  ＴＴＧ  ＧＴＧ  ＡＴＡ  ＴＣＴ  ＡＣＧ  Ｇ
配列番号３９    ５’ＴＴＧ  ＡＧＴ  ＴＣＴ  ＡＧＣ  ＡＧＡ  ＴＣＧ  Ｃ
配列番号４０    ５’ＴＴＧ  ＡＧＴ  ＴＣＣ  ＡＧＣ  ＡＧＡ  ＴＣＧ  Ｃ
配列番号４１    ５’ＴＴＧ  ＡＧＴ  ＴＣＴ  ＡＧＣ  ＡＧＡ  ＴＡＧ  Ｃ
配列番号４２    ５’ＴＴＧ  ＡＧＴ  ＴＣＣ  ＡＧＣ  ＡＧＡ  ＴＡＧ  Ｃ
配列番号４３    ５’ＣＧＣ  ＧＣＣ  ＴＴＡ  ＧＣＧ  ＴＣＡ  ＧＴＴ  ＧＡＧ  
配列番号４４    ５’ＣＡＣ  ＧＣＣ  ＴＴＡ  ＧＣＧ  ＴＣＡ  ＧＴＴ  ＧＡＧ  
配列番号４５    ５’ＣＧＣ  ＧＣＣ  ＴＴＡ  ＧＣＧ  ＴＣＡ  ＧＴＴ  ＡＡＧ  
配列番号４６    ５’ＣＡＣ  ＧＣＡ  ＴＴＡ  ＧＣＧ  ＴＣＡ  ＧＴＴ  ＧＡＧ  
配列番号４７    ５’ＣＧＡ  ＧＣＡ  ＴＴＡ  ＧＣＧ  ＴＣＡ  ＧＴＴ  ＧＡＧ  
配列番号４８    ５’ＴＡＣ  ＡＣＴ  ＡＧＴ  ＴＧＴ  ＴＧＧ  ＧＧＴ  ＧＧ
配列番号４９    ５’ＴＴＣ  ＧＣＧ  ＣＣＴ  ＣＡＧ  ＣＧＴ  ＣＡＧ  ＴＴＡ  ＣＡＧ
カンピロバクター属またはＣ．コリおよびＣ．ジェジュニをそれぞれ検出する方法は以下のように行われる：オリゴヌクレオチド配列番号１６〜配列番号１９ならびにオリゴヌクレオチド配列番号２４〜配列番号２８ならびにオリゴヌクレオチド配列番号３０ならびにオリゴヌクレオチド配列番号３２〜３４は、例えば緑色蛍光色素で特異的に標識され、カンピロバクター属の全ての細菌を特異的に検出するために使用される。オリゴヌクレオチド配列番号２０〜２３ならびにオリゴヌクレオチド配列番号２９ならびにオリゴヌクレオチド配列番号３１は未標識のままで、カンピロバクター属に特異的な前記の標識オリゴヌクレオチドとカンピロバクター属に属さない細菌の結合を競合物質として阻害する。
【００３２】
オリゴヌクレオチド配列番号３５および３６ならびにオリゴヌクレオチド配列番号３９も特異的に標識されるが、オリゴヌクレオチド配列番号１６〜１９、２４〜２８、３０、ならびに３２〜３４とは異なって、すなわち、これらのオリゴヌクレオチドとは識別可能なように例えば青色蛍光色素で標識され、カンピロバクター・コリの全ての細菌を特異的に検出するために使用される。オリゴヌクレオチド配列番号３７、３８、ならびに４０〜４２も未標識のままで、Ｃ．コリに特異的な標識オリゴヌクレオチドとＣ．コリに属さない細菌の結合を競合物質として阻害する。
【００３３】
オリゴヌクレオチド配列番号４３および４８も特異的に標識されるが、この場合も前記のオリゴヌクレオチドとは異なって、すなわち、同オリゴヌクレオチドとは識別可能なように例えば赤色蛍光色素で標識され、カンピロバクター・ジェジュニの全ての細菌を特異的に検出するために使用される。オリゴヌクレオチド配列番号４４〜４７および４９も未標識のままで、Ｃ．ジェジュニに特異的な標識オリゴヌクレオチドとＣ．ジェジュニに属さない細菌の結合を競合物質として阻害する。
【００３４】
このように、カンピロバクター属に属する細菌またはＣ．コリもしくはＣ．ジェジュニ
をそれぞれ同時にかつ高度に特異的に検出することが可能である。
得られるシグナルの強度を、いわゆる「ヘルパープローブ」を用いることによって任意に高めることができる。ヘルパープローブも標識されないが、標識オリゴヌクレオチドと標的部位の結合を容易にし、従って、シグナルの強度を高める。ヘルパープローブはシグナルの強度を高めるだけであり、もちろん、ヘルパープローブがなくても検出方法は機能する。
【００３５】
このように、オリゴヌクレオチド配列番号２４を用いて得られるシグナルの強度は、ヘルパープローブとして以下に述べる非標識オリゴヌクレオチドを用いることによって高めることができる。
配列番号５０：  ５’ＣＡＣ  ＧＣＧ  ＧＣＧ  ＴＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴＧ／Ｔ  Ｃ  
配列番号５１：  ５’ＴＣＴ  ＴＴＴ  ［Ｃ／Ｔ］ＣＣ  ［Ａ／Ｃ／Ｔ］［Ｇ／Ａ］Ａ  ［Ａ／Ｃ／Ｔ］ＡＡ  ＡＡＧ  ＧＡＧ  ＴＴＡ  ＣＧ  
本発明の範囲内において、競合物質とは、特に、検出しようとする属または種に特異的な標識オリゴヌクレオチドよりも、検出したくない属または種に対して高い特異性を備えたオリゴヌクレオチドを意味すると理解される。
【００３６】
本発明のさらなる目的は、配列および／または長さの変化にかかわらず各細菌の標的核酸配列との特異的ハイブリダイゼーションを示す、従って、本発明の方法での使用に適した、前記のオリゴヌクレオチド配列の改変形態である。これらの改変形態として、特に、以下が挙げられる：
ａ）（ｉ）塩基の少なくとも６０％、６５％、好ましくは少なくとも７０％、７５％、より好ましくは少なくとも８０％、８４％、８７％、特に好ましくは少なくとも９０％、９４％、９６％が前記オリゴヌクレオチド配列（配列番号１〜配列番号５１）の１つと同一の核酸分子［ここで、核酸分子の配列領域が前記オリゴヌクレオチド（配列番号１〜配列番号５１）の１つの配列領域に対応するものとみなされ、核酸分子の配列全体が対応するとみなされるものではなく、核酸分子の配列全体は、前記オリゴヌクレオチド（配列番号１〜配列番号５１）と比較して１つまたは複数の塩基分だけ長くてもよい］、あるいは
（ｉｉ）１つまたは複数の欠失および／または付加によって前記オリゴヌクレオチド配列（配列番号１〜配列番号５１）とは異なり、リステリア属およびリステリア・モノサイトゲネス種の細菌の核酸配列、黄色ブドウ球菌の細菌の核酸配列、またはカンピロバクター属ならびにＣ．コリおよびＣ．ジェジュニの細菌の核酸配列との特異的ハイブリダイゼーションが可能な核酸分子（これに関して「特異的ハイブリダイゼーション」とは、本明細書に記載の、およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法に関連する当業者に周知のハイブリダイゼーション条件下で標的生物のリボソームＲＮＡだけがオリゴヌクレオチドに結合し、標的でない生物のｒＲＮＡは結合しないことを意味する。）、
ｂ）ストリンジェントな条件下でａ）に記載の核酸分子に相補的な配列またはプローブ配列番号１〜配列番号５１の１つに特異的にハイブリダイズする核酸分子、
ｃ）配列番号１〜配列番号５１のオリゴヌクレオチド配列またはａ）もしくはｂ）に記載の核酸分子の配列を含み、前記配列またはそのａ）もしくはｂ）に記載の改変形態に加えて少なくとも１つのさらなるヌクレオチドを有し、標的生物の核酸配列との特異的ハイブリダイゼーションが可能な核酸分子。
【００３７】
核酸分子のプローブ配列番号１〜配列番号５１に対する同一性については、通常のアルゴリズムを用いて求めることができる。これに関して、例えば、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST （例えば、このページのリンク「Standard nucleotide-nucleotide BLAST[blastn]」）から入手可能な配列同一性を求めるプログラムが適している。
【００３８】
リステリア属またはリステリア・モノサイトゲネス種の細菌の検出の場合、特異的オリゴヌクレオチドプローブは、オリゴヌクレオチド配列番号１または配列番号３に相当する
ことが好ましい。プローブと標的配列の間で特異的ハイブリダイゼーションが生じる限り、改変形態も可能である。使用するオリゴヌクレオチドプローブが、配列番号１または配列番号３と１５個、好ましくは１６および１７個、特に好ましくは１８および１９個の連続したヌクレオチドにおいて同一なことで十分な場合がある。同じことが、競合物質として働く配列番号２、４、５、および６に関するオリゴヌクレオチドに当てはまる。
【００３９】
同じことが黄色ブドウ球菌の検出に当てはまる。この場合、特異的オリゴヌクレオチドプローブは、配列番号７または配列番号１０の１つと１３および１４個、好ましくは１５、１６、または１７個の連続したヌクレオチドにおいて同一である配列を有することが好ましい。同じことが、競合物質として働く配列番号８、９、および１１〜１３に関するオリゴヌクレオチドに当てはまる。
【００４０】
同じことが、カンピロバクター属ならびにカンピロバクター・コリおよびカンピロバクター・ジェジュニの細菌の検出に当てはまる。この場合でも、特異的オリゴヌクレオチドプローブは、好ましくは、配列番号１６〜１９、２４〜２８、３０、３２〜３６、３９、４３、および４８と１３または１４個、好ましくは１５または１６個、特に好ましくは１７または１８個の連続したヌクレオチドにおいて同一の配列を有することが好ましい。同じことが、競合物質として働く配列番号２０〜２３、２９、３１、３７、３８、４０〜４２、４４〜４７、および４９に関するオリゴヌクレオチドに当てはまる。
【００４１】
本発明による核酸プローブ分子は、様々なハイブリダイゼーション溶液を用いた検出方法の範囲内で使用することができる。０〜８０％の濃度で様々な有機溶媒を使用することができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を保つことによって、核酸プローブ分子が標的配列に実際にハイブリダイズすることが保証される。本発明の意味での穏やかな条件は、例えば、以下に記載のような、ホルミアミドが０％のハイブリダイゼーション緩衝液である。本発明の意味でのストリンジェントな条件は、例えば、ホルムアミドが２０〜８０％のハイブリダイゼーション緩衝液である。
【００４２】
リステリア属およびリステリア・モノサイトゲネス種の細菌を同時に特異的に検出する本発明による方法の範囲内で、一般的なハイブリダイゼーション溶液は、０％〜８０％ホルムアミド、好ましくは２０％〜６０％ホルムアミド、特に好ましくは４０％ホルムアミドを含む。さらに、この溶液の塩濃度は、０．１ｍｏｌ／ｌ〜１．５ｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．５ｍｏｌ／ｌ〜１．０ｍｏｌ／ｌ、より好ましくは０．７ｍｏｌ／ｌ〜０．９ｍｏｌ／ｌ、特に好ましくは０．９ｍｏｌ／ｌであり、塩は、好ましくは、塩化ナトリウムである。さらに、ハイブリダイゼーション溶液は、通常、０．００１％〜０．２％の濃度、好ましくは０．００５〜０．０５％の濃度、より好ましくは０．０１〜０．０３％の濃度、特に好ましくは０．０１％の濃度の界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））を含む。ハイブリダイゼーション溶液を緩衝化するために、Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ、クエン酸ナトリウム、ＰＩＰＥＳ、またはＨＥＰＥＳなどの様々な化合物を使用することが可能であり、これらは、通常、０．０１〜０．１ｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．０１〜０．０５ｍｏｌ／ｌの濃度で、ｐＨ６．０〜９．０、好ましくはｐＨ７．０〜８．０のｐＨ域で用いられる。ハイブリダイゼーション溶液の特に好ましい本発明の実施態様は、０．０２ｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を含む。
【００４３】
黄色ブドウ球菌の細菌を特異的に検出する本発明による方法の範囲内で、一般的なハイブリダイゼーション溶液は、０％〜８０％ホルムアミド、好ましくは２０％〜６０％ホルムアミド、特に好ましくは２０％ホルムアミドを含む。さらに、この溶液の塩濃度は、０．１ｍｏｌ／ｌ〜１．５ｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．７ｍｏｌ／ｌ〜０．９ｍｏｌ／ｌ、特に好ましくは０．９ｍｏｌ／ｌであり、塩は、好ましくは、塩化ナトリウムである。さらに、ハイブリダイゼーション溶液は、通常、０．００１％〜０．２％の濃度、好ましく
は０．００５〜０．０５％の濃度、より好ましくは０．０１〜０．０３％の濃度、特に好ましくは０．０１％の濃度の界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））を含む。ハイブリダイゼーション溶液を緩衝化するために、Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ、クエン酸ナトリウム、ＰＩＰＥＳ、またはＨＥＰＥＳなどの様々な化合物を使用することが可能であり、これらは、通常、０．０１〜０．１ｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．０１〜０．０５ｍｏｌ／ｌの濃度で、ｐＨ６．０〜９．０、好ましくはｐＨ７．０〜８．０のｐＨ域で用いられる。ハイブリダイゼーション溶液の特に好ましい本発明の実施態様は、０．０２ｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を含む。
【００４４】
カンピロバクター属ならびにＣ．コリおよびＣ．ジェジュニの細菌を特異的に検出する本発明の方法の範囲内で、一般的なハイブリダイゼーション溶液は、０％〜８０％ホルムアミド、好ましくは２０％〜６０％ホルムアミド、特に好ましくは２０％ホルムアミドを含む。さらに、この溶液の塩濃度は、０．１ｍｏｌ／ｌ〜１．５ｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．７ｍｏｌ／ｌ〜０．９ｍｏｌ／ｌ、特に好ましくは０．９ｍｏｌ／ｌであり、塩は、好ましくは、塩化ナトリウムである。さらに、ハイブリダイゼーション溶液は、通常、０．００１％〜０．２％の濃度、好ましくは０．００５〜０．０５％の濃度、より好ましくは０．０１〜０．０３％の濃度、特に好ましくは０．０１％の濃度の界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））を含む。ハイブリダイゼーション溶液を緩衝化するために、Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ、クエン酸ナトリウム、ＰＩＰＥＳ、またはＨＥＰＥＳなどの様々な化合物を使用することが可能であり、これらは、通常、０．０１〜０．１ｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．０１〜０．０５ｍｏｌ／ｌの濃度で、ｐＨ６．０〜９．０、好ましくはｐＨ７．０〜８．０のｐＨ域で用いられる。ハイブリダイゼーション溶液の特に好ましい本発明の実施態様は、０．０２ｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を含む。
【００４５】
当然ながら、専門家であれば、ハイブリダイゼーション反応の望ましいストリンジェンシーが得られるように、ハイブリダイゼーション緩衝液の構成要素の特定の濃度を選択することができる。特に好ましい実施態様は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件から特にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を反映している。専門家であれば、これらのストリンジェントな条件を用いて、ある特定の核酸分子により標的生物の核酸配列の特異的な検出が可能かどうか、従って、該核酸分子を本発明の範囲内で確実に使用できるかどうかを確かめることができる。専門家であれば、必要に応じて、またはプローブもしくは標的生物に応じて、ハイブリダイゼーション緩衝液のパラメータを変えることによってストリンジェンシーを上げる、または下げることができる。
【００４６】
ハイブリダイゼーション緩衝液中の核酸プローブの濃度は、標識の種類および標的構造体の数によって決まる。迅速かつ効率的なハイブリダイゼーションを可能にするために、核酸プローブ分子の数は標的構造体の数より数桁多くなければならない。しかしながら、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）では、蛍光標識核酸プローブ分子の濃度が高すぎるとバックグラウンドの蛍光が増大することに留意しなければならない。従って、核酸プローブ分子の濃度は、０．５〜５００ｎｇ／μｌ、好ましくは１．０〜１００ｎｇ／μｌ、特に好ましくは１．０〜５０ｎｇ／μｌの範囲とすべきである。
【００４７】
本発明の方法の範囲内で、使用される各核酸プローブ分子の好ましい濃度は、ハイブリダイゼーション溶液１μｌにつき１〜１０ｎｇである。使用されるハイブリダイゼーション溶液の体積は８μｌ〜１００ｍｌとすべきであり、本発明の方法の特に好ましい実施態様では３０μｌである。
【００４８】
ハイブリダイゼーションは、通常、１０分〜１２時間続き、好ましくは、約１．５時間続く。ハイブリダイゼーションの温度は好ましくは４４℃〜４８℃、特に好ましくは４６
℃であり、ハイブリダイゼーション温度ならびにハイブリダイゼーション溶液中の塩および界面活性剤の濃度のパラメータは、核酸プローブ（特に、核酸プローブの長さ、および検出しようとする細胞内の標的配列に対する相補性の程度）に応じて最適化することができる。専門家であれば適切な計算値を出すことに精通している。
【００４９】
ハイブリダイゼーションの後、ハイブリダイズしなかった核酸プローブ分子および過剰な核酸プローブ分子を除去するか、洗い流さなければならないが、これは、通常、従来の洗浄液によって行われる。この洗浄液は、所望であれば、０．００１〜０．１％、好ましくは０．００５〜０．０５％、特に好ましくは０．０１％の界面活性剤（例えば、ＳＤＳ）、ならびに０．００１〜０．１ｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．０１〜０．０５ｍｏｌ／ｌ、特に好ましくは０．０２ｍｏｌ／ｌの濃度のＴｒｉｓ‐ＨＣｌを含んでもよい。ここで、Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌのｐＨ値は６．０〜９．０の範囲内であり、好ましくは７．０〜８．０の範囲内であり、特に好ましくは８．０である。界面活性剤が含まれてもよいが、絶対に必要ということではない。さらに、通常、洗浄液は、必要とされるストリンジェンシーに応じて濃度が０．００３ｍｏｌ／ｌ〜０．９ｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．０１ｍｏｌ／ｌ〜０．９ｍｏｌ／ｌのＮａＣｌを含む。０．０７ｍｏｌ／ｌ（リステリア属およびリステリア・モノサイトゲネス種の細菌を同時に特異的に検出する方法）、または０．２１５ｍｏｌ／ｌ（黄色ブドウ球菌の細菌を特異的に検出する方法）、または０．２１５ｍｏｌ／ｌ（カンピロバクター属ならびにＣ．コリおよびＣ．ジェジュニの細菌を同時に特異的に検出する方法）のＮａＣｌ濃度が特に好ましい。さらに、洗浄液は、濃度が好ましくは０．００５ｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡを含んでもよい。洗浄液は、専門家に周知の適量の防腐剤をさらに含んでもよい。
【００５０】
一般的に、洗浄工程では緩衝溶液が用いられ、これは、洗浄工程が低い塩濃度または高温の緩衝液中で通常行われることを除けば、ハイブリダイゼーション緩衝液（緩衝塩化ナトリウム溶液）と原則的によく似ていてもよい。ハイブリダイゼーション条件の理論推定値については、以下の式を使用することができる：
Ｔｄ＝８１．５＋１６．６ｌｇ［Ｎａ＋］＋０．４×（％ＧＣ）−８２０／ｎ−０．５×（％ＦＡ）
Ｔｄ＝解離温度（℃）
［Ｎａ＋］＝ナトリウムイオンのモル濃度
％ＧＣ＝総塩基数に対するグアニンおよびシトシンヌクレオチドの比率（％）
ｎ＝ハイブリッドの長さ
％ＦＡ＝ホルムアミドの比率（％）
この式を用いて、洗浄緩衝液のホルムアミド含有量（ホルムアミドは毒性を有するのでできる限り少なくなければならない）を、例えば、それに相当して低くした塩化ナトリウム含有量に置き換えることができる。しかしながら、当業者であれば、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法に関する広範囲の文献から、記載の含有量を変更可能であること、および変更する方法を理解している。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに関して、ハイブリダイゼーション緩衝液について前記で概説したのと同じことが当てはまる。
【００５１】
結合しなかった核酸プローブ分子は、通常、４４℃〜５２℃、好ましくは４４℃〜５０℃、特に好ましくは４６℃の温度で、１０〜４０分間、好ましくは１５分間「洗い流される」。
【００５２】
本発明による方法の別の実施態様では、本発明の核酸分子は、記載の標的生物を特異的に検出する、いわゆるＦａｓｔ‐ＦＩＳＨ法において用いられる。Ｆａｓｔ‐ＦＩＳＨ法は専門家に周知であり、例えば、独国特許出願公開第１９９  ３６  ８７５号明細書および国際公開第９９／１８２３４号パンフレットに記載されている。本明細書に記載の検出
法の実施に関して、これらの文献に含まれる開示内容が本明細書で明確に参照される。
【００５３】
次いで、核酸プローブ分子が（例えば、共有結合による核酸プローブ分子とマーカーとの連結によって）検出可能であれば、特異的にハイブリダイズした核酸プローブ分子を各細胞において検出することができる。検出可能なマーカーとしては、例えば、ＣＹ２（米国アーリントンハイツ（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ）所在のアマシャムライフサイエンシーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）から入手可能）、ＣＹ３（これもアマシャムライフサイエンシーズから入手可能）、ＣＹ５（これもアマシャムライフサイエンシーズから入手可能）、ＦＩＴＣ（米国ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ）所在の（モレキュラプローブズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．））、ＦＬＵＯＳ（独国マンハイム（Ｍａｎｎｈｅｉｍ）所在のロシュダイアグノスティクス（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）から入手可能）、ＴＲＩＴＣ（モレキュラプローブズ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＵＳＡから入手可能）、６‐ＦＡＭ、またはＦＬＵＯＳ‐ＰＲＩＭＥなどの蛍光基が用いられ、これらは当業者に周知である。化学マーカー、放射性マーカー、または酵素マーカー（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、酸性ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ）も使用することができる。これらの酵素のそれぞれについて、天然の基質の代わりに変換されて着色生成物または蛍光生成物になる多数の色原体が知られている。このような色原体の例を以下の表に列挙する。
【００５４】
【表１】
2005516627.tif 000002
最後に、ハイブリダイゼーションに適した別の核酸配列が核酸プローブ分子の５’または３’末端に存在するように、核酸プローブ分子を作成することが可能である。この核酸
配列もまた、約１５〜１，０００個、好ましくは１５〜５０個のヌクレオチドを含む。この第２の核酸領域もまた、前述の薬剤の１つによって検出可能な核酸プローブ分子によって検出することができる。
【００５５】
もう１つの可能性は、検出可能な核酸プローブ分子とハプテンの結合であり、結合の後、ハプテンとハプテンを認識する抗体とを接触させればよい。このようなハプテンの一例としてジゴキシゲニンを挙げることができる。前述の例に加えて他の例が専門家に周知である。
【００５６】
最終的な評価は、使用されるプローブ標識の種類によって決まり、光学顕微鏡、エピフルオレッセンス顕微鏡（Ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｚｅｎｚｍｉｋｒｏｓｋｏｐ）、ケモルミノメータ（Ｃｈｅｍｏｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）、蛍光光度計などを用いて可能である。
【００５７】
リステリア属およびリステリア・モノサイトゲネス種の細菌を同時に特異的に検出する方法、または黄色ブドウ球菌の細菌を特異的に検出する方法、またはカンピロバクター属ならびにＣ．コリおよびＣ．ジェジュニの細菌を特異的に検出するための本願に記載の方法の、前記の検出方法と比較して重要な利点は、非常に迅速であることである。１０日まで必要な従来の培養法と比較して、本発明による方法を使用した時には結果が２４〜４８時間以内に得られる。
【００５８】
別の利点は、リステリア属およびリステリア・モノサイトゲネス種の細菌が同時に検出されることである。現在よく用いられている方法では、おおよその信頼性で、リステリア・モノサイトゲネス種の細菌しか検出されない。しかしながら、疫学的調査から、リステリア・モノサイトゲネスの他にリステリア属の他の種も危険なリステリア症を引き起こすことが明らかになっている。従って、現在入手可能な情報によれば、リステリア・モノサイトゲネスだけの検出では十分でない。
【００５９】
別の利点は、リステリア属の細菌とリステリア・モノサイトゲネス種の細菌を識別できることである。これは、対応する属または種に特異的な核酸プローブ分子に異なる標識を使用することによって容易にかつ確実に行うことができる。
【００６０】
別の利点は、これらの方法が特異的なことある。使用される核酸プローブ分子によって、リステリア属の全種およびリステリア・モノサイトゲネス種のみのいずれについても特異的に検出および視覚化することができる。同じように確実に、黄色ブドウ球菌、およびカンピロバクター属の全種だけでなくＣ．コリまたはＣ．ジェジュニのみについても高い特異性で検出される。
【００６１】
別の利点は、カンピロバクター属の細菌とＣ．コリまたはＣ．ジェジュニの細菌を識別できることである。これは、対応する属または種に特異的な核酸プローブ分子に異なる標識を使用することによって容易にかつ確実に行うことができる。
【００６２】
細菌の視覚化によって視覚的な管理を同時に行うことができる。従って、偽陽性の結果（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応においてしばしば生じる偽陽性）が除外される。
本発明による方法のさらなる利点は使いやすいことである。例えば、この方法を用いると、記載の細菌が存在するかどうかについて多量の試料を容易に試験することができる。
【００６３】
本発明による方法は様々な方法で使用することができる。
例えば、食品試料（例えば、鳥肉、生肉、乳、チーズ、野菜、果物、魚など）について、検出しようとする細菌が存在するかどうか試験することができる。
【００６４】
例えば、環境試料についても、検出しようとする細菌が存在するかどうか試験することができる。これらのプローブは、例えば土壌から集められてもよいし、植物の一部であってもよい。
【００６５】
本発明による方法は、さらに、汚水試料またはサイレージ試料の試験に使用することができる。
本発明による方法は、さらに、医療試料（例えば、糞便試料、血液培養物、痰、組織試料（切除したものも含む）、創傷試料、尿、呼吸器管からの試料、移植片、およびカテーテル表面）の試験に使用することができる。
【００６６】
本発明による方法の別の応用分野は食料品の管理である。好ましい実施態様において、食品試料は、乳または乳製品（ヨーグルト、チーズ、スイートチーズ、バター、バターミルク）、飲料水、飲料（レモネード、ビール、ジュース）、ベーカリー製品または肉製品から得られる。
【００６７】
本発明による方法の別の応用分野は医薬製品および化粧品（例えば、軟膏、クリーム、チンキ剤、ジュース、液剤、ドロップなど）の分析である。
さらに、本発明によれば、それぞれの方法を行うためのキットが提供される。これらのキットに含まれるハイブリダイゼーション装置は、例えば、独国特許出願第１００  ６１
６５５．０号に記載されている。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション装置に関して、この文献に含まれる開示内容が本明細書で明確に参照される。
【００６８】
記載のハイブリダイゼーション装置（ＶＩＴリアクタと呼ぶ）に加えて、キットの最も重要な構成要素は、検出しようとする微生物に特異的な核酸プローブ分子を含む各ハイブリダイゼーション溶液（ＶＩＴ溶液と呼ぶ）であり、ハイブリダイゼーション溶液は前記に記載されている（ＶＩＴ溶液）。さらに、各ハイブリダイゼーション緩衝液（溶液Ｃ）および各洗浄液の濃縮液（溶液Ｄ）が含まれる。任意選択で固定液（溶液Ａ（５０％エタノール）および溶液Ｂ（無水エタノール））ならびに、任意選択で包埋溶液（フィニッシャ）も含まれる。フィニッシャは市販されており、特に、蛍光顕微鏡下で蛍光プローブが急速に退色するのを防ぐ。任意選択で、陽性対照ならびに陰性対照を同時に実施するための溶液が含まれる。
【００６９】
以下の実施例は本発明を例示することを目的とし、本発明を限定することを目的としない。使用される緩衝液および溶液は、前記で示された組成を有する。
【実施例】
【００７０】
（試料中の食品に関連する病原性細菌の特異的かつ迅速な検出）
試料を、適切な方法で２０〜４４時間培養する。リステリア属の検出には、培養は、例えば、１／２フレイザーブイヨン中で、３０℃で２４時間実施すればよい。黄色ブドウ球菌の検出には、培養は、例えば、３５℃で８時間〜４８時間の血液培養（例えば、バクテック９２４０，ベクトンディキンソンインスツルメンツ）として実施すればよい。カンピロバクター属の検出には、培養は、例えば、４２℃で２４時間、プレストンによる選択培地中で実施すればよい。
【００７１】
培養物のアリコートに、等容量の固定液（溶液Ｂ）を添加する。あるいは、培養物のアリコートを遠心分離し（４０００ｇ、５分、室温）、上清を捨てた後、ペレットを４滴の固定液に溶解してもよい。
【００７２】
ハイブリダイゼーションを行うために、固定された細胞の適切なアリコート（好ましくは４０μｌ）をスライド上に供し、乾燥させる（４６℃で３０分、または完全に乾燥する
まで）。あるいは、細胞を他の担体物質（例えば、マイクロタイタープレートまたはフィルター）に供してもよい。次いで、固定液（溶液Ｂ、好ましくは４０μｌ）を再添加することによって、乾燥した細胞を完全に脱水する。スライドを再度、乾燥させる（室温で３分、または完全に乾燥するまで）。
【００７３】
次いで、検出しようとする微生物に特異的な前記の核酸プローブ分子を含むハイブリダイゼーション溶液（ＶＩＴ溶液）を、固定して脱水した細胞に加える。好ましい体積は４０μｌである。次いで、スライドを、ハイブリダイゼーション緩衝液（溶液Ｃ、プローブ分子を含まないハイブリダイゼーション溶液に相当する）で加湿したチャンバ（好ましくは、ＶＩＴリアクタ）内でインキュベートする（４６℃、９０分）。
【００７４】
次いで、スライドをチャンバから取り出し、チャンバを洗浄液（蒸留水で１：１０に希釈した溶液Ｄ）で満たし、スライドをチャンバ内でインキュベートする（４６℃、１５分）。
【００７５】
次にチャンバを蒸留水で満たし、スライドを短時間浸けてから横向きにして風乾させる（４６℃で３０分、または完全に乾燥するまで）。
次いで、スライドを適切な媒体（フィニッシャ）に包埋する。
【００７６】
最後に、試料を蛍光顕微鏡によって分析する。
【配列表】
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【国際調査報告】
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2005516627.tif 000005
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