(57)【要約】本発明は、抗ヒト肝臓癌ＭｃＡｂ  ＨＡｂ１８の重鎖および軽鎖可変領域遺伝子、それらによりコードされているポリペプチド、ならびに、腫瘍および炎症疾患を診断および処置するための医薬の製造におけるそれらの使用に関する。重鎖および軽鎖可変領域遺伝子に基づいて、単鎖抗体、キメラ抗体、Ｆａｂ抗体などを含む、多様な新規小分子遺伝子工学抗体が、肝臓癌の診断および処置のために構築および発現できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の配列、または厳密な条件下で配列番号１とハイブリダイズ可能な配列を有する抗ヒト肝臓癌モノクローナル抗体ＨＡｂ１８重鎖可変領域遺伝子。
【請求項２】
配列番号３の配列を含んでいる、請求項１に記載の遺伝子によりコードされたポリペプチド。
【請求項３】
配列番号２の配列、または厳密な条件下で配列番号１とハイブリダイズされた配列を有する抗ヒト肝臓癌モノクローナル抗体ＨＡｂ１８軽鎖可変領域遺伝子。
【請求項４】
配列番号４の配列を含んでいる、請求項３に記載の遺伝子によりコードされたポリペプチド。
【請求項５】
請求項１または請求項３に記載の遺伝子を含んでいる発現ベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の発現ベクターにより形質転換された、またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項７】
請求項１に記載の重鎖可変領域遺伝子、および請求項３に記載の軽鎖可変領域遺伝子を含んでいる組換えＦａｂ遺伝子。
【請求項８】
ベクターがｐＣｏｍｂ３／Ｆｄ−Ｌである請求項７に記載の組換えＦａｂ遺伝子を含んでいる発現ベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の発現ベクターの発現により産生される、組換えＦａｂ抗体。
【請求項１０】
請求項１に記載の重鎖可変領域遺伝子、および請求項３に記載の軽鎖可変領域遺伝子を含んでいるキメラヒト／マウスＦａｂ遺伝子。
【請求項１１】
ベクターがｐＣｏｍｂ３Ｃ／ｃＦａｂである請求項１０に記載のキメラヒト／マウスＦａｂ遺伝子を含んでいる発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載の発現ベクターの発現により産生される、キメラヒト／マウスＦａｂ抗体。
【請求項１３】
肝臓癌の診断または処置のための医薬製造における、請求項１または３に記載の遺伝子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗ヒト肝臓癌モノクローナル抗体（ＭｃＡｂ）ＨＡｂ１８重／軽鎖可変領域遺伝子およびそれらをコードするポリペプチド、および腫瘍または炎症性疾患を診断および処置するための医薬製造における該遺伝子およびポリペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓癌は、中国および東南アジアで高い罹患率を有する普通の疾患である。特に中国においては、毎年約１１０，０００人の患者が肝臓癌で死亡しており、それは世界における死亡肝臓癌患者の４３％を占めている。それ故、肝臓癌診断および治療についての総合的および深い研究がいまだ必要とされている。１９７５年に、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎによりハイブリドーマ技術が確立されて以来、多様なＭｃＡｂが同定されてきた。彼らは前臨床および臨床研究に新しい光をあて、抗肝臓癌ＭｃＡｂも例外ではなかった。過去２０年において、抗肝臓癌抗体の伝統的製造は、ほとんど、フェトプロテインおよびフェリチンのごとき標的分子に集中されてきた。これらの過程において、伝統的免疫化法が採用されており、即ち、免疫源として、肝臓癌の可溶性抽出物質または培養肝臓癌細胞を用いている。しかしながら、腫瘍抗原性エピトープの変異、不安定性または部分的喪失にため、これらの方法では高い親和性および特異性を有する抗肝臓癌抗体の発生は困難である。
【０００３】
動物を免疫化するために、新鮮な腫瘍組織から誘導された細胞懸濁液を使用する、抗体発生のためのいくつかの成功報告がある。複雑なスクリーニングにもかかわらず、この方法では抗原性はより良好に保持できる。発明者は、この方法により、特異的抗肝臓癌抗体のいくつかのクローンを首尾よく得た。マウス抗肝臓癌抗体を分泌する、これらハイブリドーマ細胞株確立のための詳細な方法は、Ｚｈｉｎａｎ  Ｃｈｅｎ，Ｙａｎｆａｎｇ  Ｌｉｕ，Ｊｉｚｈｅｎｇ  Ｙａｎｇら、ＭｃＡｂ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１９８９；２：３３−３６、に示されている。これらの抗体の中でも、抗肝臓癌抗体ＭｃＡｂ  ＨＡｂ１８はより高い特異性を有することが観察され、７５％に至る免疫組織化学陽性率を有している。遺伝子工学および抗体研究の発展により、発明者は抗肝臓癌抗体ＭｃＡｂ  ＨＡｂ１８の重および軽鎖可変領域遺伝子を首尾よくクローン化した。このことは、ＭｃＡｂ  ＨＡｂ１８に基づいた遺伝子工学による新規小分子抗体を開発するための、強固な基礎を築いている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
一つの態様において、本発明は、肝臓癌付随抗原ＨＡｂ１８Ｇに対するモノクローナル抗体ＨＡｂ１８の可変領域遺伝子に関する。これらのＭｃＡｂ  ＨＡｂ１８可変領域遺伝子は、高活性を有するマウス抗ＨＡｂ１８Ｇモノクローナル抗体を分泌できるハイブリドーマ細胞株ＨＡｂ１８からクローン化した。重鎖可変領域遺伝子の完全長は４４５ｂｐであり、配列番号１に示したヌクレオチド配列を有する。この遺伝子によりコードされているアミノ酸配列は配列番号３に示されている。軽鎖可変領域遺伝子の完全長は４２１ｂｐであり、配列番号２に示したヌクレオチド配列を有する。この遺伝子によりコードされているアミノ酸配列は配列番号４に示されている。組換え後、これら２つの遺伝子は、肝臓癌付随抗原ＨＡｂ１８Ｇを特異的に同定および結合できる、活性抗体断片を発現するために使用することができる。本発明はまた、厳密な（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）ハイブリダイゼーション条件下、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に述べてある条件下、配列番号１または配列番号２の配列とハイブリダイズできる配列を含んでいることも意図されている。
【０００５】
別の態様において、本発明は、重鎖および軽鎖可変領域遺伝子を含んでいるＦａｂ遺伝子、マウス−ヒトキメラＦａｂ遺伝子、並びにそれらの遺伝子産物、即ち、Ｆａｂ抗体およびキメラＦａｂ抗体に関する。
【０００６】
さらに別の態様において、本発明は、腫瘍または炎症性疾患を診断および処置するための医薬製造における、本発明の遺伝子およびポリペプチドの使用に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
発明の詳細な説明
設計されたプライマーの組を使用し、肝臓癌に対して特異的なモノクローナル抗体を分泌できるハイブリドーマ細胞株ＨＡｂ１８から、ＭｃＡｂ  ＨＡｂ１８重鎖および軽鎖可変領域遺伝子をクローン化した。重鎖可変遺伝子（ＶＨ遺伝子）は、Ｋａｓｔｕｒｉ，Ｋ．Ｎらにより記載されている胸腺細胞および赤血球に対する自己抗体の可変遺伝子と最も高い相同性を有することを、配列分析は示している。軽鎖可変遺伝子（ＶＬ遺伝子）は、マウス免疫グロブリンの再配列κ鎖のＶ−Ｊ領域遺伝子に属しており、それはＯ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｋ．Ｃらにより記載されている、抗ＤＮＡ抗体６Ｅ６軽鎖可変領域遺伝子と最も高い相同性を有する。本発明のＶＨおよびＶＬ遺伝子は、マウス抗体の正確な可変領域をコードしている。これらの遺伝子により、単鎖抗体、キメラ抗体、Ｆａｂ抗体などを含む、多様な新規小分子抗体を、肝臓癌の診断および治療のために、遺伝子工学により構築および発現することができる。
【０００８】
これまで、肝臓癌に対するモノクローナル抗体は、肝臓癌に付随する抗原の研究に主として使用されている。モノクローナル抗体の開発は、新規腫瘍付随抗原または新規標的部位を発見するための有効な方法を提供する。これらの抗原は、臨床血清試験に使用でき、そして診断および治療の効き目を評価する助けとなる。モノクローナル抗体はまた、肝臓癌モノクローナル−抗体−標的指向化薬剤の研究においても使用される。担体としてＭｃＡｂを用いる放射免疫診断、化学療法および放射線療法は、近年かなりの進歩を遂げた。この点については、化学化合物−ＭｃＡｂ複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）、細胞毒−ＭｃＡｂ複合体および放射性核種−ＭｃＡｂ複合体のような薬剤が開発されている。
【０００９】
本発明の軽鎖および重鎖可変領域遺伝子は、ある種のタンパク質医薬を構築するために使用することができ、それは関連する疾患、特に腫瘍および炎症性疾患の診断および処置に直接使用することができる。本発明の遺伝子によりコードされているポリペプチドは、ある種の疾患、特に腫瘍の診断および治療における標的指向化薬剤として使用されるように、細胞毒、毒素、放射性核種、酵素または生物学的応答修飾剤と結合させてもよい。
【００１０】
本発明の遺伝子によりコードされているポリペプチドから、キメラ抗体、ヒト化抗体、小分子抗体、多価ミニ抗体、二特異性抗体、組換え抗体融合タンパク質、組換え免疫毒素およびファージ抗体のごとき新規の型の抗体を構築することができる。
【００１１】
キメラ抗体については、マウスＭｃＡｂの可変領域をヒトＩｇの定常領域と連結することができる。これらの抗体は、ＨＡＭＡ応答のごとき副作用が軽減されている一方、マウスＭｃＡｂの特異性および親和性を維持しているので、そのようなキメラ抗体を使用することにより、腫瘍治療における望ましい効能が達成された。
【００１２】
ヒト化抗体を得るには、可変領域遺伝子の構造をＣＤＲ移植、表面アミノベニア（ｓｕｒｆａｃｅ  ａｍｉｎｏ  ｖｅｎｅｅｒ）、フレームワーク交換、位置づけ予約（ｌｏｃａｔｅｄ  ｒｅｓｅｖａｔｉｏｎ）およびエピトープ−指向性選択によりヒト化する。
【００１３】
小分子抗体は、ＶＨ−ＣＨ１およびＶＬ−Ｃ１から成るＦａｂ抗体、ＶＨおよびＶＬ遺伝子とポリペプチドリンカー（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）3との連結により形成された単鎖抗体、ＶＨおよびＶＬの非共有結合連結により形成されたＦｖ断片抗体、ＶＨまたはＶＬのただ一つのドメインのみから成る単一ドメイン抗体、および単一ＣＤＲにより構築された最小認識単位などを含んでいる。
【００１４】
多価ミニ抗体は主として二重鎖抗体、（ＳｃＦｖ）2、屈曲（Ｆｌｅｘ）ミニ抗体、ＬＤミニ抗体、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆ（ａｂ’）3、（ＳｃＦｖ）4などを含んでいる。多価ミニ抗体は多抗原結合部位、高親和性、中程度の分子量、腫瘍組織へ進入する高い能力、および腎臓での遅いクリアランス速度を有しているため、臨床応用に良好な潜在価値を有している。
【００１５】
二機能性抗体とも称される二特異性抗体は、二重の特異性および機能を有している。
【００１６】
組換え抗体融合タンパク質は、標的部位へ特異的生物学的活性を標的化できる組換えタンパク質であり、ＦａｂまたはＦｖ遺伝子と、毒素または酵素のごとき非抗体タンパク質をコードする遺伝子を連結することにより調製する。
【００１７】
組換え免疫毒素は、毒素の遺伝子および抗体の遺伝子を連結し、生じた遺伝子を発現することにより製造する。それらは低い非特異性を有し、ｉｎ  ｖｉｖｏで安定および安全であり、そして腫瘍内へ容易に浸透可能である。
【００１８】
ファージ抗体は、Ｉｇ  Ｖ遺伝子とファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子□を連結し、次に、ファージ膜表面上にＦａｂまたはＳｃＦｖの融合タンパク質を発現する、宿主細菌に遺伝子をトランスフェクトすることにより得られる。いくつかのアフィニティーパニングを経て、特異的抗体を得ることができる。
【００１９】
担体として、本発明の重鎖および軽鎖可変領域遺伝子によりコードされているポリペプチドを使用し、免疫複合体または標的指向薬剤を形成するように、多様な抗癌または抗炎症剤を前記ポリペプチドと結合することができる。例えば、免疫複合体または標的指向化薬剤は、抗体および核種の複合体の形でもよい。そのような複合体は、核種を局所的な腫瘍組織へ向けることができ、放射線療法間の照射により受ける、正常組織への損傷を軽減する。複合体はまた、放射免疫イメージングおよび放射免疫療法と名付けられている、腫瘍の標的指向化診断および処置を可能にする。モノクローナル抗体と結び合わせるために標準的に使用される核種には、125Ｉ、131Ｉ、111Ｉｎ、90Ｙ、99mＴｃ、188Ｒｅおよび186Ｒｅなどが含まれる。
【００２０】
免疫複合体または標的指向化薬剤はまた、抗体と化学療法薬との複合体の形であることもできる。そのような複合体は薬剤を特異的に腫瘍へ方向付け、正常組織への損傷および化学療法薬により起こされる副作用を軽減する。抗体と結び合わせるためによく使用される化学療法薬には、ホスホラミドのごときアルキル化剤、メトトレキセートおよび５−フルオロウラシルのごとき代謝拮抗剤、アドリブラスチン、エピルビシン、セルビジン、ロイロクリスチンおよびマイトマイシンのごとき抗生物質が含まれる。
【００２１】
免疫複合体または標的指向化薬剤はまた、抗体と毒素との複合体の形であることもでき、それは免疫毒素とも称されている。免疫毒素は強力な細胞毒性を有しており、生物学的補助機構とは独立している。免疫毒素は、腫瘍を殺すための伝統的化学療法および放射療法とは異なった機構を有しているため、化学療法および放射療法が効果をほとんど示さない腫瘍を処置するために使用することができる。抗体と結び合わせるために使用することができる毒素には、リシン、ジフテリア毒素、オルモシア毒素、シャボンソウ毒素、シュードモナス菌外毒素、ストレプトリシン、ペルフリンなどが含まれる。
【００２２】
免疫複合体または標的指向化薬剤はまた、抗体と生物学的応答修飾剤（ＢＲＭ）との複合体の形であることもできる。ＢＲＭ単独でヒト身体の免疫機能を調節し、および腫瘍細胞を良好な効率で殺すことができるけれども、注射されたＢＲＭのほんの一部しか標的部位に到達できないので、その機能を完全には発揮できない。ＢＲＭはまたいくらかの副作用を有している。もし、ＢＲＭがＭｃＡｂと結合されていれば、ＭｃＡｂはＢＲＭを標的部位へ導き、そして腫瘍細胞を殺すことができる。ＢＲＭにはＩＮＦおよびＩＬ−２が含まれる。
【００２３】
免疫複合体または標的指向化薬剤はまた、抗体−標的指向化プロドラッグの形であることもできる。抗体は、特異的にプロドラッグを活性化できる酵素と結び合わされる。複合体を最初に体内に注射し、いくらかの時間後、プロドラッグを注射すると、それは腫瘍部位で活性薬剤へ変換でき、腫瘍細胞を殺す。現在、安息香酸ハイドロジェンマスタードのグルタミン誘導体、リン酸ポドフィルムエチリデン、リン酸マイトシン−Ｃ、グリコシドセルビジン、アドリブラスチン、５−フルオロシトシンおよびセファロチンクロレタジンを含む、いくつかの化合物がプロドラッグとして使用できる。活性化酵素には、カルボキシペプチダーゼＧ2、アルカリホスファターゼ、ペニシリンアミダーゼ、β−ラクタマーゼ、シトシンデアミナーゼ、β−グリコシダーゼおよびアミノペプチダーゼが含まれる。
【００２４】
免疫複合体または標的指向化薬剤はまた、免疫リポソームの形であることもでき、その中では、ＭｃＡｂがリポソームの表面に結び付けられている。リポソームは大量の薬剤を被包でき、そして抗体は抗原を特異的に結合できるので、被包された薬剤を含む免疫リポソームは改良された特異性および効能を有している。
【００２５】
本発明は以下の図および実施例を参照してさらに説明される。
【実施例１】
【００２６】
抗ヒト肝臓癌ＭｃＡｂ  ＨＡｂ１８重／軽鎖の可変領域をコードしている遺伝子のクローニング：
使用した細胞株は、Ｆｏｕｒｔｈ  Ｍｉｌｉｔａｒｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＦＭＭＵ）のＣｅｌｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒでの通常の細胞融合技術（Ｚｈｉｎａｎ  Ｃｈｅｎ，Ｙａｎｆａｎｇ  Ｌｉｕ，Ｊｉｚｈｅｎｇ  Ｙａｎｇら、ＭｃＡｂ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１９８９；２：３３−３６）を使用することにより得られたマウスハイブリドーマ細胞株であった。前記細胞株により産生された抗体はマウス抗ヒト肝臓癌ＭｃＡｂ  ＨＡｂ１８であり、それはその標的分子ＨＡｂ１８Ｇに対して高い親和性および特異性を有するＩｇＧ1であった。
【００２７】
対数増殖期の細胞（５ｘ１０6）を、全ＲＮＡを調製するために使用した。典型的には、全ＲＮＡ抽出は、ＳＶ全ＲＮＡ単離システムを使用し、製造業者（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）により提供されているプロトコールに従って実施した。試料の質および量は、紫外分光光度計および１％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により決定した。抗体の可変領域に相当する第一鎖ｃＤＮＡは、ランダムプライマーＯｌｉｇｏ（ｄＴ）15（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）を使用する逆転写により得た。マウス抗ヒト肝臓癌ＭｃＡｂ  ＨＡｂ１８の重鎖および軽鎖の可変領域をコードしている遺伝子（ＶＨおよびＶＬ）は、一組の汎用性プライマーを使用するＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ生成物ＶＨ（約４５０ｂｐ）およびＶＬ（約４２１ｂｐ）は、１．５％アガロースゲルで分離し、ゲルを切断することにより単離し、回収し、そしてゲル精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）を使用することにより精製し、そして次にアガロースゲル電気泳動により同定した（図１）。問題とする断片は、各々ベクターｐＭＤ−１８−Ｔ内へクローン化し、そして次に配列分析にかけた。
【００２８】
逆転写には、ランダムプライマーとしてＯｌｉｇｏ（ｄＴ）15（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）を使用した。反応系の容量は２０μＬであり、１μｇの全ＲＮＡ（２μＬ）、０．５μｇのランダムプライマーＯｌｉｇｏ（ｄＴ）15（１μＬ）、４μＬのＭｇＣｌ2（２５ｍＭ）、２μＬの５ｘｄＮＴＰ、２μＬの１０ｘ緩衝液、０．５μＬのＲＮａｓｅ阻害剤を含んでいた。逆転写は、０．７５μＬのＡＭＶ逆転写酵素（１５Ｕ）の存在下で実施した。全容量が２０μＬに達するようにＲＮａｓｅを含まない水を加えた。混合物は４２℃で６０分インキュベートし、次に３分煮沸した。得られた生成物は続いて、使用するまで−２０℃に保った。
【００２９】
ＶＨおよびＶＬ遺伝子のＰＣＲ増幅のためには、反応を５０μＬの最終反応容量で実施し、それは５μｌの第一鎖ｃＤＮＡ、３０ピコモル（５μｌ）の逆および正プライマー（プライマーは以下に説明される）、０．４ｍＭの各々のｄＮＴＰ、５μＬの１０ｘ緩衝液および１．２５Ｕ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含んでいる。５０μｌの最終容量に達するまで水を加え、混合し、そして次に一滴のパラフィン油を混合物へ加えた。９４℃で３分加熱後、９４℃で１分、５４℃で１分および７２℃で１分の各々のサイクルで３５サイクル増幅を実施し、そして最後に７２℃で１０分、反応が延長された。
【００３０】
Ｔベクター内への所望の断片のクローニングは以下のように実行した。ＰＣＲ生成物をアガロースゲルで回収し、ｐＭＤ１８−Ｔ内へクローン化した。ライゲーション反応液は、１μｌのベクターｐＭＤ１８−Ｔ、３μｌの精製ＰＣＲ生成物（ＶＨまたはＶＬ遺伝子）、１μｌの脱イオンＨ2Ｏおよび５μｌのライゲーション緩衝液を含んでいた。反応系は４℃で一夜インキュベートした。生成物で大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。組換えクローンを選択し、そして次に汎用性プライマーを使用して配列決定した。
【００３１】
ＭｃＡｂ  ＨＡｂ１８の重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の増幅に使用された設計プライマーは以下のようである（下線部分は制限部位を示している）：
【００３２】
マウス抗体の重鎖可変領域のための５’プライマー：
（１）５’−ＧＧＧＡＴＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧ（ＡＧ）ＡＴＧ（ＣＧ）ＡＧＣＴＧ（ＴＧ）ＧＴ（ＣＡ）ＡＴ（ＣＧ）ＣＴＣＴＴ−３’
（２）５’−ＧＧＧＧＡＴＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧ（ＡＧ）ＡＣＴＴＣＧＧＧ（ＴＣ）ＴＧＡＧＣＴ（ＴＧ）ＧＧＴＴＴＴ−３’
（３）５’−ＧＧＧＧＡＴＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＧＴＣＴＴＧＧＧＧＣＴＧＣＴＣＴＴＣＴ−３’
【００３３】
マウス抗体の重鎖可変領域のための３’プライマー：
５’−ＧＡＣ（ＡＣＴ）ＣＡＴＧＧＧＧ（ＣＧ）ＴＧＴ（ＴＣ）ＧＴＧＣＴＡＧＣＴＧ（ＡＣ）（ＡＧ）ＧＡＧＡＣ（ＡＧＴ）ＧＴＧＡ−３’
【００３４】
マウス抗体の軽鎖可変領域のための５’プライマー：
（１）５’−ＧＧＧＧＡＴＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＡＣＴＣＣＴＧＣＴＡＴ−３’
（２）５’−ＧＧＧＧＡＴＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＴＴＴＣＡＡＧＴＧＣＡＧＡＴＴＴＴＣＡＧ−３’
（３）５’−ＧＧＧＧＡＴＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧ（ＡＴ）ＣＡＣＡ（ＧＴ）（ＡＴ）ＣＴＣＧＧＧＴＣＴＴＴ（ＧＡ）ＴＡ−３’
（４）５’−ＧＧＡＴＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧ（ＧＴ）ＣＣＣＣ（ＡＴ）（ＡＧ）ＣＴＣＡＧ（ＣＴ）ＴＣ（ＣＴ）ＣＴ（ＴＧ）ＧＴ−３’
（５）５’−ＧＧＧＧＡＴＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＴＴＧＣＣＴＧＴＴＡＧＧＣＴＧＴＴＧ−３’
【００３５】
マウス抗体の軽鎖可変領域のための３’プライマー：
５’−ＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＧＴＴＴ（ＧＴ）ＧＴＴＴＣＡ（ＡＧ）ＣＴＴ−３’
【００３６】
重／軽鎖の可変領域をコードしている遺伝子（ＶＨおよびＶＬ）の配列は配列番号１および配列番号２と呼ばれ、それらのアミノ酸配列は各々、配列番号３および配列番号４と呼ばれている。
【実施例２】
【００３７】
抗ヒト肝臓癌ＭｃＡｂ  ＨＡｂ１８のＦａｂをコードしている遺伝子のクローニングおよび発現：
Ｆａｂの相対分子量は約５０，０００である。Ｆａｂ断片は良好な侵入および薬物動力学特性を有し、そして多くの疾患の診断および治療に広く使用されてきた。本実施例において、ＭｃＡｂ  ＨＡｂ１８のＦａｂ断片をコードしている遺伝子は、大腸菌中でクローン化および発現させた。
【００３８】
１．材料および方法
１．１材料
マウス抗ヒト肝臓癌ＭｃＡｂ  ＨＡｂ１８（ＩｇＧ1）を産生しているマウスハイブリドーマ細胞株は、通常の細胞融合技術（Ｚｈｉｎａｎ  Ｃｈｅｎ，Ｙａｎｆａｎｇ  Ｌｉｕ，Ｊｉｚｈｅｎｇ  Ｙａｎｇら、ＭｃＡｂ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１９８９；２：３３−３６）を使用することにより得た。Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）および逆転写キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）を使用した。発現ベクターｐＣｏｍｂ３および大腸菌形質転換受容性細胞ＪＭ１０９およびＸＬ１−ｂｌｕｅは市販品を購入した。Ｔベクター、ＰＣＲ試薬、制限エンドヌクレアーゼおよびリガーゼはＴａｋａｒａ（大連、中国）から購入した。ＭｃＡｂ  ＨＡｂ１８およびＨＲＰ−ＨＡｂ１８は発明者が作製した（Ｚｈｉｎａｎ  Ｃｈｅｎ，Ｙａｎｆａｎｇ  Ｌｉｕ，Ｊｉｚｈｅｎｇ  Ｙａｎｇら、ＭｃＡｂ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１９８９；２：３３−３６）。ＩＰＴＧ−、ＦＩＴＣ−およびＨＲＰ−標識ヤギ抗マウスＩｇＧはＳＡＢＣ  Ｃｏ．から購入した。肝臓癌細胞株ＨＨＣＣはＦＭＭＵのＣｅｌｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒで維持および培養された。ＰＣＲのためのプライマーはＳＢＣ（北京、中国）により合成され、以下の配列を有している：
【００３９】
Ｆｄ  ５’プライマー：５’−ＡＡＧ  ＴＧＡ  ＡＧＣ  ＴＴＣ  ＴＣＧ  ＡＧＴ  ＣＴＧＧ−３’、Ｆｄ  ３’プライマー：５’−ＡＧＧ  ＣＴＴ  ＡＣＴ  ＡＧＴ  ＡＣＡ  ＡＴＣ  ＣＣＴ  ＧＧＧ  ＣＡＣ  ＡＡＴ−３’。軽鎖５’プライマー：５’−ＧＡＴ  ＧＴＧ  ＡＧＣ  ＴＣＧ  ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＣＣＣ  ＡＧＡ  ＣＴＣ  Ｃ−３’、軽鎖３’プライマー：５’−ＧＣＧ  ＣＣＧ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＡＴＴ  ＡＡＣ  ＡＣＴ  ＣＡＴ  ＴＣＣ  ＴＧＴ  ＴＧＡ  Ａ−３’。下線配列は各々、ＸｈｏＩ、ＳｐｅＩ、ＳａｃＩおよびＸｂａＩの制限部位を示している。
【００４０】
１．２  方法
１．２．１  ＨＡｂ１８  ＭｃＡｂのＦａｂ遺伝子のクローニング
全ＲＮＡは、Ｔｒｉｚｏｌ試薬を使用し、ＭｃＡｂ  ＨＡｂ１８を分泌しているハイブリドーマ細胞から抽出し、ｃＤＮＡへ逆転写した。ｃＤＮＡは、Ｆｄおよび軽鎖遺伝子を増幅するための鋳型として使用した。ＰＣＲ生成物はアガロースゲルで精製し、別々にｐＭＤ１８−Ｔ内へクローン化して、ｐＭＤ１８−Ｔ／ＦｄおよびｐＭＤ１８−Ｔ／Ｌベクターを構築した。ベクターで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した後、陽性クローンをスクリーニングし、次ぎに配列決定した。
【００４１】
１．２．２  ＨＡｂ１８  Ｆａｂ発現ベクターの構築
発現ベクターｐＣｏｍｂ３およびクローニングベクターｐＭＤ１８−Ｔ／Ｌを制限エンドヌクレアーゼＳａｃＩおよびＸｂａＩで消化した。陽性クローンは、ゲル精製消化断片の連結および形質転換後に選択し、制限分析により確認した。得られた軽鎖発現ベクターｐＣｏｍｂ３／ＬおよびクローニングベクターｐＭＤ１８−Ｔ／Ｆｄは制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩおよびＳｐｅＩで各々消化した。Ｆａｂ展示（ｄｉｓｐｌａｙ）発現ベクターｐＣｏｍｂ３／Ｆｄ−ｇＩＩＩ−Ｌは、ゲル精製消化断片の連結、形質転換、選択および確認後に得られた。最後に、ベクターｐＣｏｍｂ３／Ｆｄ−ｇＩＩＩ−Ｌを、制限エンドヌクレアーゼ酵素ＳｐｅＩおよびＮｈｅＩで切断してｇＩＩＩ遺伝子断片を除去し、次に、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで環化し、新規分泌性発現ベクターｐＣｏｍｂ３／Ｆｄ−Ｌを発現させた。所望のクローンを、形質転換、スクリーニングおよび制限分析後に得た。
【００４２】
１．２．３  Ｆａｂ遺伝子の発現
正しい組換えクローンの単一コロニーを、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含んでいる２ｍＬのＳＢ−Ａ培地に別々に接種し、３７℃で一夜増殖させた。２日目、培養液を１：１００の比でＳＢ−Ａ培地へ移した後、Ａ600が０．４−０．６の間になるまで３７℃で維持した。ＩＰＴＧを、１ミリモル／Ｌの最終濃度になるように加えた。培養液は次に、３７℃で一夜維持した。細胞を遠心分離し、上清を、凍結および融解を繰り返した後に回収した。
【００４３】
１．２．４  Ｆａｂ発現のサンドイッチＥＬＩＳＡ検出
ＥＬＩＳＡプレートをヤギ抗マウスＩｇＧ（１０ｍｇ／Ｌ）で被覆し、次に４℃で一夜インキュベートし、すべてのウェルをブロックするために脱脂乳（５０ｇ／Ｌ）を使用して非特異的結合を防止した。１時間のブロッキングの後、非形質転換細菌、非誘導ｐＣｏｍｂ３／Ｆｄ−Ｌ形質転換体、および誘導ｐＣｏｍｂ３／Ｆｄ−Ｌ形質転換体の上清を加えた。ＭｃＡｂ  ＨＡｂ１８を陽性対照として、およびＰＢＳを空対照として使用した。最後に、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰを、基質としてのＴＭＢとともに加え、発色させた。
【００４４】
１．２．５  発現生成物の抗原結合活性の検出
１）間接ＥＬＩＳＡ
マイクロタイタープレートのウェルを精製ＧＳＴおよび原核生物発現生成物ＧＳＴ−ＨＡｂ１８ＧＥ（肝臓癌付随抗原ＨＡｂ１８Ｇの細胞外ドメインとＧＳＴの融合物）で被覆した。非形質転換細菌、非誘導形質転換体、および誘導形質転換体の上清を検出した。ＭｃＡｂ  ＨＡｂ１８を陽性対照として、およびＰＢＳを空対照として使用した。
【００４５】
２）競合ＥＬＩＳＡ
マイクロタイタープレートのウェルを、精製ＧＳＴ−ＨＡｂ１８ＧＥを用い、４℃で一夜被覆し、ウェルを５０ｇ／Ｌの脱脂乳でブロックした。次に、等量のＨＲＰ−ＨＡｂ１８（０．１ｍｇ／Ｌ）および異なった希釈の誘導形質転換体上清の混合物を加えた。インキュベーションおよび洗浄後、発色させるためにＴＭＢを使用した。Ａ450を測定し、そして阻害比率を計算した。％阻害＝［（対照群のＡ450−阻害群のＡ450）／対照群のＡ450］ｘ１００％。
【００４６】
３）免疫蛍光染色
抗原ＨＡｂ１８Ｇを高度に発現するＨＨＣＣの細胞懸濁液を調製した。ＨＨＣＣ懸濁液の濃度は５ｘ１０9−１ｘ１０10細胞／ｍＬに調節した。ＨＡｂ１８  Ｆａｂをウマ血清で希釈し、そして次にＨＨＣＣ懸濁液へ加え、４℃で３０分インキュベートした。細胞を２回洗浄し、ＦＩＴＣ結合化ウサギ抗マウスＩｇＧを次に加え、そして４℃で３０分インキュベートした。２回洗浄後、細胞を固定およびマウントし、その後蛍光顕微鏡下で観察した。この実験において、陽性対照としてＭｃＡｂ  ＨＡｂ１８、空対照としてＰＢＳ、および陰性対照として抗脳炎ウイルスＭｃＡｂを使用した。
【００４７】
２  結果
２．１  Ｆａｂ遺伝子の増幅および発現ベクターの構築
ＭｃＡｂ  ＨＡｂ１８のＦｄおよび軽鎖をコードしている遺伝子は、各々、ＦｄのためのＦｄ５’および３’プライマー、および軽鎖のための５’および３’プライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲにより増幅した。増幅生成物は１０ｇ／Ｌアガロースゲルにより分離した。期待されるように、両方の生成物が６６０ｂｐの長さであった（図２）。次に、ＭｃＡｂ  ＨＡｂ１８のＦｄおよび軽鎖をコードしている遺伝子をｐＭＤ−１８−Ｔ内にクローン化し、そして配列決定した。配列分析は、重鎖および軽鎖の可変領域をコードしている遺伝子（ＶＨおよびＶＬ）の配列は、実施例１でクローン化したＨＡｂ１８はＢ１８の可変領域の配列と同一であったことを示した。ＣＨ１はＩｇＧ1に属しており、およびＣＬはκに属している。組換えベクターｐＣｏｍｂ３／Ｆｄ−Ｌの構築は図３に示されている。制限分析は、問題とする遺伝子断片（約６６０ｂｐ）はベクターｐＣｏｍｂ３中に１コピーで挿入されていることを示した（図４）。
【００４８】
２．２  Ｆａｂの発現および同定
サンドイッチＥＬＩＳＡ検出は、ＩＰＴＧ誘導後に、組換えベクターｐＣｏｍｂ３／Ｆｄ−ＬによりＦａｂが発現されたことを示した（表１）。間接ＥＬＩＳＡからの結果はまた、発現されたＦａｂは肝臓癌付随抗原ＨＡｂ１８Ｇの細胞外ドメインと特異的に結合できることを示した（表１）。競合ＥＬＩＳＡはさらに、発現されたＦａｂはＨＡｂ１８とその特異的抗原の結合を競合的に阻害できたことを示した。阻害比率は、発現された生成物濃度の減少とともに減少した（図５）。免疫蛍光染色は、発現されたＦａｂは肝臓癌細胞株ＨＨＣＣと特異的に結合できるが（図６Ａ）、しかし、蛍光強度は陽性対照よりも弱いことを明らかにした（図６Ｂ）。陰性対照では免疫蛍光染色は観察されなかった（示されてはいない）。
【００４９】
【表１】
2005538691.tif 000002
【００５０】
【実施例３】
【００５１】
キメラヒト／マウスＦａｂ抗体のための汎用性発現ベクターの構築およびヒト肝臓癌付随抗原ＨＡｂ１８Ｇに対するキメラＦａｂ抗体の発現：
ＨＡｂ１８  ＭｃＡｂは、ヒト肝臓癌付随抗原ＨＡｂ１８Ｇ／ＣＤ１４７に対して高い特異性および親和性を有するマウスモノクローナル抗体である。マウス抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて異なった程度でヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応を開始することができ、それは治療効力を弱めるであろうし、毒性を生み出し、そして抗体を排出する器官に損傷を与える。加えて、その乏しい侵入能力のため、血液および非腫瘍組織における大きな抗体分子のクリアランスは相対的により遅く、より低いＴ／ＮＴ比を導き、それが前記抗体のさらなる応用を制限している。これらの欠点を克服するため、低い免疫原性および高いＴ／ＮＴ比を有する新しい型の遺伝子工学抗体を開発する必要がある。キメラＦａｂの相対分子量（Ｍｒ）は約５０，０００であり、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるより良好な侵入および薬物動力学的特性を可能にしている。そして、それは多様な疾患の診断および処置に使用されてきた。この実施例においては、実施例２に従って構築されたＦａｂ抗体から出発し、ＨＡＭＡ応答を大いに減少させるため、マウスｍＣＨ１／ｍＣＬをｈｕＣＨ１／ｈｕＣＬで置き換えることにより、部分ヒト化Ｆａｂ抗体を構築した。
【００５２】
１．材料および方法
１．１  材料
ヒトＩｇＧ３ＣＨ１およびκ軽鎖定常領域遺伝子を含んでいるベクターｐＣｏｍｂ３／ＨｕＦａｂはＷｅｎ博士、生化学部、ＦＭＭＵ、中国、から親切にも提供された。各々、ＭｃＡｂ  ＨＡｂ１８（ＩｇＧ１）Ｆｄおよび全軽鎖を含んでいる、ＴベクターｐＭＤ１８Ｔ−ＦｄおよびｐＭＤ１８Ｔ−Ｌは発明者により構築された。発現ベクターｐＣｏｍｂ３および大腸菌形質転換受容性細胞ＪＭ１０９およびＸＬ１−ｂｌｕｅは購入した。Ｔベクター、ＰＣＲ試薬、制限エンドヌクレアーゼおよびリガーゼはＴａｋａｒａ（大連、中国）から購入した。ＭｃＡｂ  ＨＡｂ１８、キメラＨＡｂ１８ＩｇＧおよびＨＲＰ−ＨＡｂ１８は発明者が作製した（Ｚｈｉｎａｎ  Ｃｈｅｎ，Ｙａｎｆａｎｇ  Ｌｉｕ，Ｊｉｚｈｅｎｇ  Ｙａｎｇら、ＭｃＡｂ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１９８９；２：３３−３６）。ＩＰＴＧ−、ＦＩＴＣ−およびＨＲＰ−標識ヤギ抗マウスＩｇＧはＳＡＢＣ  Ｃｏ．から購入した。肝臓癌細胞株ＨＨＣＣはＦＭＭＵのＣｅｌｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒで維持および培養された。ＰＣＲのためのプライマーはＳＢＣ（北京、中国）により合成され、以下の配列を有している：
【００５３】
ＭＶＨｂａｃｋ  ５’−ＡＡＧ  ＴＧＡ  ＡＧＣ  ＴＴＣ  ＴＣＧ  ＡＧＴ  ＣＴＧ  Ｇ−３’
ＭＶＨｆｏｒ  ５’−ＧＧＧ  ＧＡＴ  ＡＴＣ  ＴＧＣ  ＡＧＡ  ＧＡＣ  ＡＧＴ  ＧＡＣ−３’
ＨｕＣＨ１ｂａｃｋ  ５’−ＧＧＧ  ＧＣＴ  ＣＧＡ  ＧＴＴ  ＧＡＴ  ＡＴＣ  ＴＣＣ  ＡＣＣ  ＡＡＧ  ＧＧＣ  ＣＣＡ  ＴＣＧ  ＧＴＣ−３’
ＨｕＣＨ１ｆｏｒ  ５’−ＧＣＡ  ＴＧＴ  ＡＣＴ  ＡＧＴ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  ＡＣＡ  ＡＧＡ  ＴＴＴ  ＧＧＧ−３’
ＭＶＬｂａｃｋ  ５’−ＣＡＧ  ＡＴＧ  ＴＧＡ  ＧＣＴ  ＣＡＧ  ＴＡＴ  ＴＧＴ  ＧＡＴ  ＧＡＣ  ＣＣＡ  ＧＡＣ  ＴＣＣ−３’
ＭＶＬｆｏｒ  ５’−ＧＧＧ  ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＧＴＴ  ＴＴＡ  ＴＴＴ  ＣＣＡ  ＡＣＴ  ＴＴＧ  Ｔ−３’
ＨｕＣＬｂａｃｋ  ５’−ＧＴＴ  ＣＣＧ  ＡＧＣ  ＴＣＡ  ＡＧＴ  ＣＧＡ  ＣＣＴ  ＧＴＧ  ＧＣＴ  ＧＣＡ  ＣＣＡ  ＴＣＴ  ＧＴＣ−３’
ＨｕＣＬｆｏｒ  ５’−ＧＣＧ  ＣＣＧ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＡＴＴ  ＡＡＣ  ＡＣＴ  ＣＴＣ  ＣＣＣ  ＴＧＴ  ＴＧＡ  ＡＧＣ  ＴＣＴ  ＴＴＧ  ＴＧＡ  ＣＧＧ  ＧＣＧ  ＡＡＣ  ＴＣＡ  ＧＧＣ  ＣＣ−３’
プライマー中の下線配列は各々、ＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＶ、ＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＶ、ＳｐｅＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、ＳａｃＩ、ＳａｃＩおよびＸｂａＩの制限部位である。
【００５４】
１．２  方法
１．２．１  キメラヒト／マウスＦａｂ抗体のための汎用性発現ベクターの構築
ベクターｐＣｏｍｂ３／ＨｕＦａｂは、ヒトＩｇＧ３ＣＨ１およびκ軽鎖定常領域遺伝子を増幅するための鋳型として使用した。プライマー対ＨｕＣＨ１ｂａｃｋおよびＨｕＣＨ１ｆｏｒ、およびＨｕＣＬｂａｃｋおよびＨｕＣＬｆｏｒを各々使用した。ＰＣＲ反応生成物を精製し、そしてゲル精製キットにより回収し、続いてベクターｐＭＤ１８−Ｔ内へライゲートしてクローニングベクターｐＭＤ１８−Ｔ／ＨｕＣＨ１およびｐＭＤ１８−Ｔ／ＨｕＣκを構築した。ベクターで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した後、制限分析によりスクリーニングされた陽性クローンを配列決定した。発現ベクターｐＣｏｍｂ３およびクローニングベクターｐＭＤ１８−Ｔ／ＨｕＣκを制限エンドヌクレアーゼＳａｃＩおよびＸｂａＩで切断した。所望の断片をアガロースゲル電気泳動で分離し、そしてライゲートした。ライゲーションおよび形質転換により発生させたｐＣｏｍｂ３／ＨｕＣκ陽性クローンを選択し、制限分析により同定した。次に、ベクターｐＣｏｍｂ３／ＨｕＣκおよびクローニングベクターｐＭＤ１８−Ｔ／ＨｕＣＨ１をＸｈｏＩ＋ＳｐｅＩにより切断し、所望の断片をライゲートした。ライゲーション、形質転換、選択および同定後、キメラＦａｂ展示汎用性ベクターｐＣｏｍ３Ｃが構築された。
【００５５】
１．２．２  ＨＡｂ１８ｃＦａｂ発現ベクターの構築
ＭｃＡｂ  ＨＡｂ１８の重鎖および軽鎖可変領域遺伝子ＶＨおよびＶＬは、各々、ベクターｐＭＤ１８Ｔ−ＦｄおよびｐＭＤ１８Ｔ−Ｌを鋳型として使用し、対応するプライマー対ＭＶＨｂａｃｋおよびＭＶＨｆｏｒ、またはＭＶＬｂａｃｋおよびＭＶＬｆｏｒにより増幅した。対応する制限部位も同時に組み入れた。次に、発現ベクターｐＣｏｍｂ３Ｃ、およびゲル精製キットにより精製および回収した、ＭＡｂ  ＨＡｂ１８の重鎖可変領域遺伝子のＰＣＲ増幅生成物をＳａｃＩ＋ＳａｌＩで切断した。アガロースゲルによる所望の断片の精製、連結、形質転換のごとき遺伝子操作を通して、ｐＣｏｍｂ３Ｃ／ｃＬ陽性クローンを選択し、制限分析により同定した。次に、構築したｐＣｏｍｂ３Ｃ／ｃＬ、およびゲル精製キットにより精製および回収した、ＭＡｂ  ＨＡｂ１８の軽鎖可変領域遺伝子のＰＣＲ増幅生成物をＸｈｏＩ＋ＥｃｏＲＶで切断した。ライゲーション、形質転換、選択および同定過程後、キメラＦａｂ展示ベクターｐＣｏｍｂ３Ｃ／ｃＦａｂ−ｇＩＩＩが構築された。正しい組換えｐＣｏｍｂ３Ｃ／ｃＦａｂ−ｇＩＩＩ中のｇＩＩＩ断片をＳｐｅＩ＋ＮｈｅＩで切断し、次にＴ４  ＤＮＡリガーゼにより、分泌発現ベクターｐＣｏｍｂ３Ｃ／Ｆａｂへ環化した。上記形質転換、選択および制限分析による同定を繰り返すと、所望のクローンを得た。
【００５６】
１．２．３  ｃＦａｂ遺伝子の発現
同定された正しい組換え体クローンを含んでいる個々のクローンを１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを補給した２ｍＬのＳＢ−Ａ培地にまき、３７℃で一夜培養した。次の日、培養液を１：１００で新鮮なＳＢ−Ａ培地へまき、Ａ600が０．４−０．６の間になるまで３７℃で培養した。ＩＰＴＧを、１ミリモル／Ｌの最終濃度になるように加え、細胞を３７℃で一夜培養した。細胞を遠心分離し、上清を、凍結および融解を繰り返した後に回収した。
【００５７】
１．２．４  ｃＦａｂ発現のサンドイッチＥＬＩＳＡ検出
ＥＬＩＳＡプレートをヤギ抗マウスＩｇＧ（１０ｍｇ／Ｌ）で被覆し、次に４℃で一夜インキュベートし、すべてのウェルをブロックするために脱脂乳（５０ｇ／Ｌ）を使用して非特異的結合を防止した。１時間のブロッキングの後、非形質転換細菌、非誘導ｐＣｏｍｂ３／ｃＦｄ−Ｌ形質転換体、および誘導ｐＣｏｍｂ３／ｃＦａｂ形質転換体の上記上清を加えた。ＨＡｂ１８ＩｇＧを陽性対照として、およびＰＢＳを空対照として使用した。最後に、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰを、基質としてのＴＭＢとともに加え、発色させた。
【００５８】
１．２．５  発現生成物の抗原結合活性の検出
１）間接ＥＬＩＳＡ
マイクロタイタープレートのウェルを精製ＧＳＴおよび原核生物発現生成物ＧＳＴ−ＨＡｂ１８ＧＥ（肝臓癌付随抗原ＨＡｂ１８Ｇの細胞外ドメインとＧＳＴの融合物）で被覆した。非形質転換細菌、非誘導形質転換体、および誘導形質転換体の上清を検出した。ＨＡｂ１８ＩｇＧを陽性対照として、およびＰＢＳを空対照として使用した。
【００５９】
２）競合ＥＬＩＳＡ
マイクロタイタープレートのウェルを、精製ＧＳＴ−ＨＡｂ１８ＧＥを用い、４℃で一夜被覆し、ウェルを５０ｇ／Ｌの脱脂乳でブロックした。次に、等量のＨＲＰ−ＨＡｂ１８（０．１ｍｇ／Ｌ）および異なった希釈の誘導形質転換体上清の混合物を加えた。インキュベーションおよび洗浄後、発色させるためにＴＭＢを使用した。Ａ450を測定し、そして阻害比率を計算した。％阻害＝［（対照群のＡ450−阻害群のＡ450）／対照群のＡ450］ｘ１００％。
【００６０】
３）免疫蛍光染色
抗原ＨＡｂ１８Ｇを高度に発現するＨＨＣＣの細胞懸濁液を調製した。ＨＨＣＣ懸濁液の濃度は５ｘ１０9−１ｘ１０10細胞／ｍＬに調節した。ＨＡｂ１８  Ｆａｂをウマ血清で希釈し、そして次にＨＨＣＣ懸濁液へ加え、４℃で３０分インキュベートした。細胞を２回洗浄し、ＦＩＴＣ結合化ウサギ抗マウスＩｇＧを次に加え、そして４℃で３０分インキュベートした。２回洗浄後、細胞を固定およびマウントし、その後蛍光顕微鏡下で観察した。この実験において、陽性対照としてＨＡｂ１８ＩｇＧ、空対照としてＰＢＳ、および陰性対照としてヒトＩｇＧを使用した。
【００６１】
２．結果
２．１  キメラヒト／マウスＦａｂ抗体のための汎用性発現ベクターの構築
２つのプライマー対、各々、ＨｕＣＨ１ｂａｃｋおよびＨｕＣＨ１ｆｏｒ、およびＨｕＣＬｂａｃｋおよびＨｕＣＬｆｏｒを使用し、所望の遺伝子が首尾よく増幅され、それは期待されたサイズを有していた。それらをＴベクター内へクローン化した後、配列分析は、これらの遺伝子が既知のヒトＩｇＧ３ＣＨ１遺伝子およびヒトκ軽鎖定常領域遺伝子と完全に同一であったことを示した。これらの遺伝子は、各々、３２４ｂｐおよび３３３ｂｐの長さであった。また、正しい制限部位が組み入れられていた。組換え汎用性発現ベクターｐＣｏｍｂ３Ｃの制限分析は、ＩｇＧ３ＣＨ１遺伝子およびヒトκ軽鎖定常領域遺伝子は、ベクターｐＣｏｍｂ３の対応する制限部位へ正しく挿入されていたことを示した（図７）。
【００６２】
２．２  ＨＡｂ１８ｃＦａｂ遺伝子発現ベクターの構築
２つのプライマー対、各々、ＨｕＣＨ１ｂａｃｋおよびＨｕＣＨ１ｆｏｒ、およびＨｕＣＬｂａｃｋおよびＨｕＣＬｆｏｒを使用し、期待されたサイズを有する所望の遺伝子を増幅した。組換え発現ベクターｐＣｏｍｂ３Ｃ／ｃＦａｂは、ベクターおよび対応する遺伝子の切断およびライゲーションにより構築した（図８）。制限分析は、所望の遺伝子断片が、ベクターｐＣｏｍｂ３Ｃの対応する制限部位へ正しく挿入されていたことを示した（図９）。配列分析は、キメラＦｄ中の重鎖可変領域（ＶＨ）配列およびキメラ軽鎖中の軽鎖可変領域（ＶＬ）配列が、ＭｃＡｂ  ＨＡｂ１８の可変領域のクローン化配列と同一であったことを示した。対応する制限部位もまた、適切に組み込まれていた。その間に、マウスＶＨおよびＶＬは各々、ＥｃｏＲＶおよびＳａｌＩの制限部位を通して、ヒトＩｇＧ３ＣＨ１およびκ軽鎖定常領域と正しくライゲートされていた。読み取り枠は正確であった。
【００６３】
２．３  ｃＦａｂの誘導発現および同定
サンドイッチＥＬＩＳＡ検出は、ＩＰＴＧ誘導後に、組換えベクターｐＣｏｍｂ３Ｃ／ｃＦａｂによりｃＦａｂが発現されたことを示した（図１０）。間接ＥＬＩＳＡからの結果もまた、発現されたｃＦａｂがＨＡｂ１８Ｇの細胞外ドメインと特異的に結合できることを示した（図１１）。免疫蛍光染色は、発現されたｃＦａｂは肝臓癌細胞株ＨＨＣＣと特異的に結合できたが（図１２Ａ）、しかし蛍光強度は陽性対照よりも弱かったこと（図１２Ｂ）を示した。陰性対照においては、免疫蛍光染色は観察されなかった（示されてはいない）。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】ＲＴ−ＰＣＲにより増幅された、抗ヒト肝臓癌ＭｃＡｂ  ＨＡｂ１８の重／軽鎖可変領域遺伝子のアガロースゲル電気泳動。Ａ、ＤＬ−２０００マーカー；Ｂ、ＭｃＡｂ  ＨＡｂ１８の重鎖可変領域遺伝子；Ｃ、ＭｃＡｂ  ＨＡｂ１８の軽鎖可変領域遺伝子。
【図２】抗ヒト肝臓癌ＭｃＡｂ  ＨＡｂ１８  Ｆａｂ遺伝子のＰＣＲ−増幅生成物のアガロースゲル電気泳動分析。１、ＤＬ−２０００マーカー；２、Ｆｄ遺伝子、３、軽鎖遺伝子。
【図３】Ｆａｂ発現ベクターの構築ダイアグラム。
【図４】組換え発現ベクターｐＣｏｍｂ３／Ｆｄ−Ｌの制限分析。１、ｐＣｏｍｂ３／Ｆｄ−Ｌ／ＸｈｏＩ＋ＳｐｅＩ；２、ｐＣｏｍｂ３／Ｆｄ−Ｌ／ＳａｃＩ＋ＸｂａＩ；３、ｐＣｏｍｂ３／Ｆｄ−ｇＩＩＩ−Ｌ／ＳｐｅＩ＋ＮｈｅＩ；４、ｐＣｏｍｂ３／Ｆｄ−Ｌ／ＳｐｅＩ＋ＮｈｅＩ。
【図５】ＦａｂおよびＨＡｂ１８と対応する抗原との結合活性のための競合ＥＬＩＳＡアッセイ。
【図６】ＭｃＡｂ  ＨＡｂ１８およびそのＦａｂ断片と肝臓癌細胞株ＨＨＣＣとの反応性の免疫蛍光検出。Ａ、ＨＡｂ１８  Ｆａｂを使用した免疫蛍光染色；Ｂ、ＨＡｂ１８を使用した免疫蛍光染色。
【図７】組換え発現ベクターｐＣｏｍｂ３Ｃの制限分析。Ｍ、ＤＮＡマーカー；１、ヒトＩｇＧ３ＣＨ１；２、ヒトκ鎖定常領域；３、ｐＣｏｍｂ３Ｃ／Ｘｈｏ□＋ＳｐｅＩ；４、ｐＣｏｍｂ３Ｃ／ＳａｃＩ＋ＸｂａＩ；５、ｐＣｏｍｂ３Ｃ／ＥｃｏＲ□＋ＳａｌＩ。
【図８】キメラＦａｂ遺伝子（ｃＦａｂ）を含んでいる発現ベクターの構築。
【図９】組換えｃＦａｂ発現ベクターｐＣｏｍｂ３Ｃ／ｃＦａｂの制限分析。Ｍ、ＤＮＡマーカー；１、ＶＨ；２、ＶＬ；３、ｐＣｏｍｂ３Ｃ／ｃＦａｂ−ｇＩＩＩ／ＸｈｏＩ＋ＳｐｅＩ；４、ｐＣｏｍｂ３Ｃ／ｃＦａｂ−ｇＩＩＩ／ＥｃｏＲ□＋ＳｐｅＩ；５、ｐＣｏｍｂ３Ｃ／ｃＦａｂ−ｇＩＩＩ／ＳａｃＩ＋ＸｂａＩ；６、ｐＣｏｍｂ３Ｃ／ｃＦａｂ−ｇＩＩＩ／ＳａｌＩ＋ＸｂａＩ；７、ｐＣｏｍｂ３Ｃ／ｃＦａｂ−ｇＩＩＩ／ＳｐｅＩ＋ＮｈｅＩ。
【図１０】ｃＦａｂ結合アッセイのためのＥＬＩＳＡアッセイ。１、空ベクターで形質転換した細菌溶解物の上清；２、ｐＣｏｍｂ３で形質転換した細菌溶解物の上清、誘導前；３、ｐＣｏｍｂ３Ｃ／ｃＦａｂで形質転換した細菌、誘導後；４、キメラＨＡｂ１８ＩｇＧ；５、ＰＢＳ。
【図１１】ｃＦａｂおよびＨＡｂ１８と対応する抗原との結合活性の競合ＥＬＩＳＡ検出。
【図１２】キメラＨＡｂ１８ＩｇＧおよびそれから誘導されたｃＦａｂと肝臓癌細胞株ＨＨＣＣとの反応性の免疫蛍光検出。Ａ、ＨＡｂ１８  ｃＦａｂを使用した染色；Ｂ、キメラＨＡｂ１８ＩｇＧを使用した染色。
【配列表】
2005538691.tif 000003
2005538691.tif 000004
2005538691.tif 000005
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2005538691.tif 000012
【図８】
2005538691.tif 000013
【図９】
2005538691.tif 000014
【図１０】
2005538691.tif 000015
【図１１】
2005538691.tif 000016
【図１２】
2005538691.tif 000017
【手続補正書】
【提出日】平成15年7月28日(2003.7.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の配列、または厳密な条件下で配列番号１とハイブリダイズ可能な配列を有する抗ヒト肝臓癌モノクローナル抗体ＨＡｂ１８重鎖可変領域遺伝子。
【請求項２】
配列番号３の配列を含んでいる、請求項１に記載の遺伝子によりコードされたポリペプチド。
【請求項３】
配列番号２の配列、または厳密な条件下で配列番号１とハイブリダイズされた配列を有する抗ヒト肝臓癌モノクローナル抗体ＨＡｂ１８軽鎖可変領域遺伝子。
【請求項４】
配列番号４の配列を含んでいる、請求項３に記載の遺伝子によりコードされたポリペプチド。
【請求項５】
請求項１または請求項３に記載の遺伝子を含んでいる発現ベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の発現ベクターにより形質転換された、またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項７】
請求項１に記載の重鎖可変領域遺伝子、および請求項３に記載の軽鎖可変領域遺伝子を含んでいる組換えＦａｂ遺伝子。
【請求項８】
ベクターがｐＣｏｍｂ３／Ｆｄ−Ｌである請求項７に記載の組換えＦａｂ遺伝子を含んでいる発現ベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の発現ベクターの発現により産生される、組換えＦａｂ抗体。
【請求項１０】
請求項１に記載の重鎖可変領域遺伝子、および請求項３に記載の軽鎖可変領域遺伝子を含んでいるキメラヒト／マウスＦａｂ遺伝子。
【請求項１１】
ベクターがｐＣｏｍｂ３Ｃ／ｃＦａｂである請求項１０に記載のキメラヒト／マウスＦａｂ遺伝子を含んでいる発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載の発現ベクターの発現により産生される、キメラヒト／マウスＦａｂ抗体。
【請求項１３】
肝臓癌または肝臓においての炎症の診断または処置のための医薬製造における、請求項１または３に記載の遺伝子の使用。
【国際調査報告】
2005538691.tif 000018
2005538691.tif 000019
2005538691.tif 000020
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