(57)【要約】本発明は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）ポリペプチド及びこれをコードする核酸分子を提供する。本発明はまた、ＧＰＣＲポリペプチドを生産するための選択的結合物質、ベクター、宿主細胞及び方法を提供する。本発明はさらに、ＧＰＣＲポリペプチドに関連する疾患、障害及び状態の診断、治療、改善、及び／又は予防のための医薬組成物及び方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１、配列番号３又は配列番号５のいずれかに示すヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）のいずれかのヌクレオチド配列の相補物に、少なくとも中ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列、又は
（ｄ）（ａ）又は（ｂ）のいずれかのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列
を含む単離核酸分子。
【請求項２】
（ａ）コードするポリペプチドが配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドの活性を有し、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドに少なくとも約７０％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号１、配列番号３又は配列番号５のいずれかに示すヌクレオチド配列、又は（ａ）のヌクレオチド配列の、対立遺伝子変異体又はスプライシング変異体をコードするヌクレオチド配列、
（ｃ）コードするポリペプチドが配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドの活性を有するか、あるいは抗原性である、少なくとも約２５個のアミノ酸残基のポリペプチドフラグメントをコードする、配列番号１、配列番号３又は配列番号５のいずれかに示すヌクレオチド配列の領域、あるいは（ａ）又は（ｂ）のいずれかのヌクレオチド配列の領域、
（ｄ）少なくとも約１６個のヌクレオチドのフラグメントを含む、配列番号１、配列番号３又は配列番号５のいずれかのヌクレオチド配列の領域、又は（ａ）から（ｃ）のいずれかのヌクレオチド配列の領域、
（ｅ）（ａ）から（ｄ）のいずれかのヌクレオチド配列の相補物に、少なくとも中ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列、又は
（ｆ）（ａ）から（ｄ）のいずれかのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列
を含む単離核酸分子。
【請求項３】
（ａ）コードするポリペプチドが配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドの活性を有し、少なくとも１個の保存的アミノ酸置換を含む、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（ｂ）コードするポリペプチドが配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドの活性を有し、少なくとも１個のアミノ酸挿入を含む、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（ｃ）コードするポリペプチドが配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドの活性を有し、少なくとも１個のアミノ酸欠失を含む、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（ｄ）コードするポリペプチドが配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドの活性を有し、Ｃ末端及び／又はＮ末端トランケーションを備える、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（ｅ）コードするポリペプチドが配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドの活性を有し、１個のアミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端トランケーション、又はＮ末端トランケーションである少なくとも１つの修飾を含む、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドをコードするヌクレオチド、
（ｆ）少なくとも約１６個のヌクレオチドのフラグメントを含む、（ａ）から（ｅ）のいずれかのヌクレオチド配列、
（ｇ）（ａ）から（ｆ）のいずれかのヌクレオチド配列の相補物に、少なくとも中ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列、又は
（ｈ）（ａ）から（ｅ）のいずれかのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列
を含む単離核酸分子。
【請求項４】
請求項１、２又は３のいずれかの核酸分子を含むベクター。
【請求項５】
請求項４のベクターを含む宿主細胞。
【請求項６】
真核細胞である、請求項５の宿主細胞。
【請求項７】
原核細胞である、請求項５の宿主細胞。
【請求項８】
ＧＰＣＲポリペプチドを発現するように適切な条件下で請求項５に記載の宿主細胞を培養すること、及び場合によっては前記培養から前記ポリペプチドを単離することを含む、ＧＰＣＲポリペプチドを生産する方法。
【請求項９】
請求項８の方法によって生産されるポリペプチド。
【請求項１０】
前記核酸分子が、前記ＧＰＣＲポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結された、天然ＧＰＣＲポリペプチドについてのプロモーターＤＮＡ以外のプロモーターＤＮＡを含む、請求項８の方法。
【請求項１１】
ＧＡＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＸ、ＢｅｓｔＦｉｔ、及びＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムから成る群より選択されるコンピュータプログラムを使用してパーセント同一性を決定する、請求項２に記載の単離核酸分子。
【請求項１２】
請求項５、６又は７のいずれかに記載の細胞を化合物に接触させること、及び前記細胞においてＧＰＣＲポリペプチド活性又はＧＰＣＲポリペプチド産生を測定することを含む、化合物がＧＰＣＲポリペプチド活性又はＧＰＣＲポリペプチド産生を阻害するかどうかを判定する方法。
【請求項１３】
配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
【請求項１４】
（ａ）配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかのオーソローグについてのアミノ酸配列、
（ｂ）ポリペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドの活性を有する、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかのアミノ酸配列に少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドの活性を有するか、あるいは抗原性であり、少なくとも約２５個のアミノ酸残基を含む、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すアミノ酸配列のフラグメント、又は
（ｄ）配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すアミノ酸配列、あるいは（ａ）又は（ｂ）のいずれかのアミノ酸配列の、対立遺伝子変異体又はスプライシング変異体についてのアミノ酸配列
を含む単離ポリペプチド。
【請求項１５】
（ａ）ポリペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドの活性を有する、少なくとも１個の保存的アミノ酸置換を含む、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すアミノ酸配列、
（ｂ）ポリペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドの活性を有する、少なくとも１個のアミノ酸挿入を含む、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すアミノ酸配列、
（ｃ）ポリペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドの活性を有する、少なくとも１個のアミノ酸欠失を含む、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すアミノ酸配列、
（ｄ）ポリペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドの活性を有する、Ｃ末端及び／又はＮ末端トランケーションを備える、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すアミノ酸配列、又は
（ｅ）ポリペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドの活性を有する、１個のアミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端トランケーション、又はＮ末端トランケーションである少なくとも１つの修飾を含む、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すアミノ酸配列
を含む単離ポリペプチド。
【請求項１６】
配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドの活性を有する、請求項１、２又は３のいずれかの核酸分子によってコードされている単離ポリペプチド。
【請求項１７】
ＧＡＰ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＸ、ＢｅｓｔＦｉｔ、及びＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムから成る群より選択されるコンピュータプログラムを使用してパーセント同一性を決定する、請求項１４に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１３、１４又は１５のいずれかのポリペプチドに特異的に結合する、選択的結合物質又はそのフラグメント。
【請求項１９】
配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すアミノ酸配列又はそのフラグメントを含むポリペプチドに特異的に結合する、請求項１８の選択的結合物質又はそのフラグメント。
【請求項２０】
抗体又はそのフラグメントである、請求項１８の選択的結合物質。
【請求項２１】
ヒト化抗体である、請求項１８の選択的結合物質。
【請求項２２】
ヒト抗体又はそのフラグメントである、請求項１８の選択的結合物質。
【請求項２３】
ポリクローナル抗体又はそのフラグメントである、請求項１８の選択的結合物質。
【請求項２４】
モノクローナル抗体又はそのフラグメントである、請求項１８の選択的結合物質。
【請求項２５】
キメラ抗体又はそのフラグメントである、請求項１８の選択的結合物質。
【請求項２６】
ＣＤＲ移植抗体又はそのフラグメントである、請求項１８の選択的結合物質。
【請求項２７】
抗イディオタイプ抗体又はそのフラグメントである、請求項１８の選択的結合物質。
【請求項２８】
可変領域フラグメントである、請求項１８の選択的結合物質。
【請求項２９】
Ｆａｂ又はＦａｂ’フラグメントである。請求項２８の可変領域フラグメント。
【請求項３０】
配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチドについての特異性を備える、少なくとも１つの相補性決定領域を含む選択的結合物質又はそのフラグメント。
【請求項３１】
検出可能標識に結合している、請求項１８の選択的結合物質。
【請求項３２】
ＧＰＣＲポリペプチドの生物活性に拮抗する、請求項１８の選択的結合物質。
【請求項３３】
請求項１８に記載の選択的結合物質の有効量を患者に投与することを含む、ＧＰＣＲポリペプチドに関連する疾患、状態、又は障害を治療するため、予防するため又は改善するための方法。
【請求項３４】
配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドで動物を免疫することによって産生される選択的結合物質。
【請求項３５】
請求項１３、１４又は１５のいずれかに記載のポリペプチドに結合することができる選択的結合物質を産生するハイブリドーマ。
【請求項３６】
抗ＧＰＣＲ抗体又は請求項１８のフラグメントを使用してＧＰＣＲポリペプチドを検出する又はＧＰＣＲポリペプチドの量を測定する方法。
【請求項３７】
請求項１８の選択的結合物質を含む、生物学的試料中のＧＰＣＲポリペプチドを検出する又はＧＰＣＲポリペプチドの量を測定するためのキット。
【請求項３８】
請求項１３、１４又は１５のいずれかのポリペプチド及び医薬適合性の製剤物質を含有する組成物。
【請求項３９】
医薬適合性の製薬物質が、担体、アジュバント、可溶化剤、安定剤、又は抗酸化剤である、請求項３８の組成物。
【請求項４０】
請求項１３、１４又は１５のいずれかのポリペプチドの誘導体を含むポリペプチド。
【請求項４１】
水溶性ポリマーで共有結合修飾されている、請求項４０のポリペプチド。
【請求項４２】
水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオル、又はポリビニルアルコールである、請求項４１のポリペプチド。
【請求項４３】
請求項１、２又は３のいずれかの核酸分子及び医薬適合性の製剤物質を含有する組成物。
【請求項４４】
前記核酸分子がウイルスベクター内に含まれる、請求項４３の組成物。
【請求項４５】
請求項１、２又は３のいずれかの核酸分子を含むウイルスベクター。
【請求項４６】
異種アミノ酸配列に融合した、請求項１３、１４又は１５のいずれかのポリペプチドを含む融合ポリペプチド。
【請求項４７】
異種アミノ酸配列がＩｇＧ定常ドメイン又はそのフラグメントである、請求項４６の融合ポリペプチド。
【請求項４８】
請求項１３、１４又は１５のいずれかのポリペプチド又は請求項１、２又は３のいずれかの核酸がコードするポリペプチドを患者に投与することを含む、医学的状態を治療するため、予防するため又は改善するための方法。
【請求項４９】
（ａ）試料中の、請求項１３、１４又は１５のいずれかのポリペプチド又は請求項１、２又は３のいずれかの核酸がコードするポリペプチドの存在又は発現量を判定すること、及び
（ｂ）前記ポリペプチドの発現又は発現量に基づいて病的状態又は病的状態への感受性を診断すること
を含む、被験者において病的状態又は病的状態への感受性を診断する方法。
【請求項５０】
（ａ）移植に適した膜、及び
（ｂ）請求項１３、１４又は１５のいずれかのタンパク質を分泌する、前記膜内に被包された細胞
を含み、前記膜が、前記タンパク質には透過性であり、前記細胞に有害な物質には不透過性である、デバイス。
【請求項５１】
（ａ）請求項１３、１４又は１５のいずれかのポリペプチドを化合物に接触させること、及び
（ｂ）前記化合物へのＧＰＣＲポリペプチドの結合の程度を測定すること
を含む、ＧＰＣＲポリペプチドに結合する化合物を特定する方法。
【請求項５２】
前記化合物に結合したときのポリペプチドの活性を測定することをさらに含む、請求項５１の方法。
【請求項５３】
請求項１、２又は３のいずれかの核酸分子を動物に投与することを含む、動物においてポリペプチドのレベルを調節する方法。
【請求項５４】
請求項１、２又は３のいずれかの核酸分子を含むトランスジェニック非ヒト哺乳類。
【請求項５５】
請求項５４に記載のトランスジェニック哺乳類を化合物に接触させること、及び前記哺乳類においてＧＰＣＲポリペプチド活性又はＧＰＣＲポリペプチド産生を測定することを含む、化合物がＧＰＣＲポリペプチド活性又はＧＰＣＲポリペプチド産生を阻害するかどうかを判定するための方法。
【請求項５６】
保持体に結合した、請求項１、２又は３のいずれかの核酸分子。
【請求項５７】
請求項１、２又は３のいずれかの少なくとも１個の核酸分子を含む、核酸分子のアレイ。
【請求項５８】
２位のアスパラギン酸、８位のロイシン、１２位のグルタミン酸、１３位のプロリン、１５位のトレオニン、２４位のロイシン、２５位のバリン、２７位のロイシン、３５位のイソロイシン又はロイシン、４９位のセリン、５２位のイソロイシン、８２位のイソロイシン、８３位のロイシン、８７位のアラニン、９０位のロイシン、９１位のバリン、９４位のリシン又はメチオニン、１１１位のバリン、１２３位のメチオニン、１２６位のアラニン、１２９位のＮ、１３１位のトレオニン、１３４位のアラニン、１３５位のトレオニン、１３６位のアラニン、１３８位のバリン、１４１位のトレオニン、１５２位のメチオニン、１５４位のセリン、１５９位のアルギニン、１６０位のグリシン、１６１位のメチオニン、１６２位のロイシン又はバリン、１６３位のセリン、１７９位のバリン、１８７位のロイシン、１９０位のトレオニン、１９７位のバリン、１９８位のアスパラギン、１９９位のバリン、２０５位のグルタミン、２１０位のトレオニン、２１６位のアルギニン、２１７位のアルギニン、２２７位のセリン、２３８位のロイシン、２４９位のトレオニン、２５８位のトレオニン又はイソロイシン、２６２位のバリン、２６６位のロイシン、２６９位のロイシン、２８５位のロイシン、２９０位のアラニン、２９３位のトレオニン、２９５位のアルギニン、３００位のアルギニン、３０１位のアルギニン、３０４位のアルギニン、３０５位のトレオニン、３０６位のグルタミン、３０７位のアラニン、３０８位のアルギニン、３１０位のセリン、３１９位のグリシン、３２０位のセリン、３２１位のリシン、３２２位のセリン、３２４位のトレオニン、３２５位のアスパラギン酸、３２６位のグリシン、３２７位のバリン、３２９位のアルギニン、３３０位のセリン、３３２位のアルギニン、３３４位のプロリン、３３９位のグリシン、３４０位のロイシン、３４１位のグルタミン、及び３４２位のバリンである、少なくとも１個の保存的アミノ酸置換を含み、配列番号２に示すポリペプチドの活性を有する、配列番号２に示すアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）ポリペプチド及びこれをコードする核酸分子に関する。本発明はまた、選択的結合物質、ベクター、宿主細胞及びＧＰＣＲポリペプチドを生産するための方法に関する。本発明はさらに、ＧＰＣＲポリペプチドに関連する疾患、障害及び状態の診断、治療、改善及び／又は予防のための医薬組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸分子の特定、クローニング、発現及び操作における技術的進歩とヒトゲノムの解読は、新規治療法の発見を大きく加速した。迅速な核酸配列決定手法は、今や未曾有の速度で配列情報を生み出すことができ、コンピュータ解析と組み合わせて、オーバーラップ配列の部分的ゲノム及び全体的ゲノムへの構築ならびにポリペプチドコード領域の特定を可能にする。予測アミノ酸配列を既知のアミノ酸配列のデータベース集積と比較することにより、これまでに特定された配列及び／又は構造指標との相同性の程度を決定することが可能となる。核酸分子のポリペプチドコード領域のクローニングと発現は、構造的及び機能的分析のためのポリペプチド産物を提供する。核酸分子及びコードされるポリペプチドの操作は、治療薬として使用するための生成物に有益な特性を付与しうる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
この１０年間にわたるゲノム研究の重要な技術的進歩にもかかわらず、ヒトゲノムに基づく新規治療薬の開発の潜在的可能性はまだほとんど理解されていない。潜在的に有益なポリペプチド治療薬をコードする多くの遺伝子、又は治療薬分子のための「標的」として働きうるポリペプチドをコードする遺伝子は、いまだ特定されていない。従って、診断上又は治療上の恩恵を有する新規ポリペプチド及びそれらをコードする核酸分子を特定することが本発明の１つの目的である。
【０００４】
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、哺乳類細胞におけるシグナル伝達カスケードの必須成分である内在性膜タンパク質の大きなスーパーファミリーを含む。このスーパーファミリーの成員によって行われるシグナル伝達の過程は、ホルモン又は神経伝達物質のような細胞外分子のＧタンパク質共役受容体への結合、ヘテロ三量体型Ｇタンパク質とＧタンパク質受容体の相互作用、及びその後のＧタンパク質によるエフェクター分子の活性化を含む（Ｆｒａｓｅｒら、１９９４、Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４９：１１３−５６参照）。ＧＰＣＲポリペプチドの特徴は、αヘリックス構造内の脂質二重層にまたがる２０個から２８個の疎水性残基の７つの膜貫通ドメイン、疎水性ドメインを結ぶ６つの細胞内と細胞外の交互の疎水性ループ、及び細胞外のアミノ末端領域と細胞内のカルボキシル末端領域を含む（Ｆｒａｓｅｒら、１９９４参照）。
【０００５】
過去１５年以上にわたり、Ｇタンパク質共役受容体を標的とする３５０近くの治療薬が市場に導入されて成功を収め、Ｇタンパク質共役受容体が、ヒト疾患の治療のための治療標的として、確立され、立証された経緯を有することが示された。明らかに、この分野において、疾患又は障害を診断する、治療する、改善する又は予防する上で役割を果たしうるこのスーパーファミリーの他の成員の特定と特性づけが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、新規ＧＰＣＲ核酸分子及びコードされるポリペプチドに関する。
【０００７】
本発明は、
（ａ）配列番号１、配列番号３又は配列番号５のいずれかに示すヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）のいずれかのヌクレオチド配列の相補物に、少なくとも中ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列、又は
（ｄ）（ａ）又は（ｂ）のいずれかのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列
を含む単離核酸分子を提供する。
【０００８】
本発明は、
（ａ）コードするポリペプチドが配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドの活性を有し、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドに少なくとも約７０％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号１、配列番号３又は配列番号５のいずれかに示すヌクレオチド配列あるいは（ａ）のヌクレオチド配列の、対立遺伝子変異体又はスプライシング変異体をコードするヌクレオチド配列、
（ｃ）コードするポリペプチドが配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドの活性を有するか、あるいは抗原性である、少なくとも約２５個のアミノ酸残基のポリペプチドフラグメントをコードする、配列番号１、配列番号３又は配列番号５のいずれかに示すヌクレオチド配列の領域、あるいは（ａ）又は（ｂ）のいずれかのヌクレオチド配列の領域、
（ｄ）少なくとも約１６個のヌクレオチドのフラグメントを含む、配列番号１、配列番号３又は配列番号５のいずれかのヌクレオチド配列の領域、又は（ａ）から（ｃ）のいずれかのヌクレオチド配列の領域、
（ｅ）（ａ）から（ｄ）のいずれかのヌクレオチド配列の相補物に、少なくとも中ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列、又は
（ｆ）（ａ）から（ｄ）のいずれかのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列
を含む単離核酸分子を提供する。
【０００９】
本発明はさらに、
（ａ）コードするポリペプチドが配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドの活性を有し、少なくとも１個の保存的アミノ酸置換を含む、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（ｂ）コードするポリペプチドが配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドの活性を有し、少なくとも１個のアミノ酸挿入を含む、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（ｃ）コードするポリペプチドが配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドの活性を有し、少なくとも１個のアミノ酸欠失を含む、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（ｄ）コードするポリペプチドが配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドの活性を有し、Ｃ末端及び／又はＮ末端トランケーションを備える、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（ｅ）コードするポリペプチドが配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドの活性を有し、１個のアミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端トランケーション、又はＮ末端トランケーションである少なくとも１つの修飾を含む、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドをコードするヌクレオチド、
（ｆ）少なくとも約１６個のヌクレオチドのフラグメントを含む、（ａ）から（ｅ）のいずれかのヌクレオチド配列、
（ｇ）（ａ）から（ｆ）のいずれかのヌクレオチド配列の相補物に、少なくとも中ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列、又は
（ｈ）（ａ）から（ｅ）のいずれかのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列
を含む単離核酸分子を提供する。
【００１０】
本発明は、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すアミノ酸を含む単離ポリペプチドを提供する。
【００１１】
本発明はまた、
（ａ）配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかのオーソローグについてのアミノ酸配列、
（ｂ）ポリペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドの活性を有する、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかのアミノ酸配列に少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドの活性を有するか、又は抗原性であり、少なくとも約２５個のアミノ酸残基を含む、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すアミノ酸配列のフラグメント、又は
（ｄ）配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すアミノ酸配列、あるいは（ａ）又は（ｂ）のいずれかのアミノ酸配列の、対立遺伝子変異体又はスプライシング変異体についてのアミノ酸配列
を含む単離ポリペプチドを提供する。
【００１２】
本発明は、
（ａ）ポリペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドの活性を有する、少なくとも１個の保存的アミノ酸置換を含む、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すアミノ酸配列、
（ｂ）ポリペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドの活性を有する、少なくとも１個のアミノ酸挿入を含む、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すアミノ酸配列、
（ｃ）ポリペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドの活性を有する、少なくとも１個のアミノ酸欠失を含む、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すアミノ酸配列、
（ｄ）ポリペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドの活性を有する、Ｃ末端及び／又はＮ末端トランケーションを備える、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すアミノ酸配列、又は
（ｅ）ポリペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドの活性を有する、１個のアミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端トランケーション、又はＮ末端トランケーションである少なくとも１つの修飾を含む、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すアミノ酸配列
を含む単離ポリペプチドを提供する。
【００１３】
本発明はさらにまた、２位のアスパラギン酸、８位のロイシン、１２位のグルタミン酸、１３位のプロリン、１５位のトレオニン、２４位のロイシン、２５位のバリン、２７位のロイシン、３５位のイソロイシン又はロイシン、４９位のセリン、５２位のイソロイシン、８２位のイソロイシン、８３位のロイシン、８７位のアラニン、９０位のロイシン、９１位のバリン、９４位のリシン又はメチオニン、１１１位のバリン、１２３位のメチオニン、１２６位のアラニン、１２９位のＮ、１３１位のトレオニン、１３４位のアラニン、１３５位のトレオニン、１３６位のアラニン、１３８位のバリン、１４１位のトレオニン、１５２位のメチオニン、１５４位のセリン、１５９位のアルギニン、１６０位のグリシン、１６１位のメチオニン、１６２位のロイシン又はバリン、１６３位のセリン、１７９位のバリン、１８７位のロイシン、１９０位のトレオニン、１９７位のバリン、１９８位のアスパラギン、１９９位のバリン、２０５位のグルタミン、２１０位のトレオニン、２１６位のアルギニン、２１７位のアルギニン、２２７位のセリン、２３８位のロイシン、２４９位のトレオニン、２５８位のトレオニン又はイソロイシン、２６２位のバリン、２６６位のロイシン、２６９位のロイシン、２８５位のロイシン、２９０位のアラニン、２９３位のトレオニン、２９５位のアルギニン、３００位のアルギニン、３０１位のアルギニン、３０４位のアルギニン、３０５位のトレオニン、３０６位のグルタミン、３０７位のアラニン、３０８位のアルギニン、３１０位のセリン、３１９位のグリシン、３２０位のセリン、３２１位のリシン、３２２位のセリン、３２４位のトレオニン、３２５位のアスパラギン酸、３２６位のグリシン、３２７位のバリン、３２９位のアルギニン、３３０位のセリン、３３２位のアルギニン、３３４位のプロリン、３３９位のグリシン、３４０位のロイシン、３４１位のグルタミン、及び３４２位のバリンである、少なくとも１個の保存的アミノ酸置換を含み、配列番号２に示すポリペプチドの活性を有する、配列番号２に示すアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを提供する。
【００１４】
また、ＧＰＣＲアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドも提供する。
【００１５】
本発明はまた、ここで示すような単離核酸分子を含む発現ベクター、ここで示すような組換え核酸分子を含む組換え宿主細胞、ならびに、前記宿主細胞を培養すること及び場合によってはそのようにして生産したポリペプチドを単離することを含む、ＧＰＣＲポリペプチドを生産する方法を提供する。ＧＰＣＲ活性のアゴニスト又はアンタゴニストの特定のためのスクリーニング法において使用するために細胞表面上又は細胞膜上で該ポリペプチドを発現することを所望する場合がありうるので、発現されたポリペプチドの単離を任意ケースとして記述している。
【００１６】
ＧＰＣＲポリペプチドをコードする核酸分子を含むトランスジェニック非ヒト動物も、本発明に包含される。ＧＰＣＲポリペプチドの発現及びレベル上昇（循環レベルの上昇を含みうる）を可能にするように、ＧＰＣＲ核酸分子を動物に導入する。選択的に、内因性ＧＰＣＲポリペプチドの発現を妨げる（すなわち、ＧＰＣＲポリペプチド遺伝子ノックアウトを有するトランスジェニック動物を作製する）ように、ＧＰＣＲ核酸分子を動物に導入する。前記トランスジェニック非ヒト動物は、好ましくは哺乳類、より好ましくはラット又はマウスのようなげっ歯類である。
【００１７】
本発明のＧＰＣＲポリペプチドの誘導体も提供する。
【００１８】
さらに、本発明のＧＰＣＲポリペプチドに特異的に結合することができる抗体及びペプチドのような選択的結合物質を提供する。そのような抗体及びペプチドはアゴニスト又はアンタゴニストでありうる。
【００１９】
本発明のヌクレオチド、ポリペプチド又は選択的結合物質と、１つ又はそれ以上の医薬適合性の製剤物質を含有する医薬組成物も、本発明に包含される。医薬組成物は、本発明のヌクレオチド又はポリペプチドの治療上有効な量を提供するために使用される。本発明はまた、前記ポリペプチド、核酸分子及び選択的結合物質を使用する方法を対象とする。
【００２０】
本発明のＧＰＣＲポリペプチド及び核酸分子は、ここで列挙するものを含めて、疾患及び障害を治療する、予防する、改善する及び／又は検出するために使用しうる。
【００２１】
本発明はまた、ＧＰＣＲポリペプチドに結合する試験分子を特定するために試験分子を検定する方法を提供する。この方法は、ＧＰＣＲポリペプチドを試験分子に接触させて、試験分子がポリペプチドに結合する度合を測定することを含む。この方法はさらに、そのような試験分子がＧＰＣＲポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストであるかどうかを判定することを含む。本発明はさらに、分子がＧＰＣＲポリペプチドの発現又はＧＰＣＲポリペプチドの活性に及ぼす影響を調べる方法を提供する。
【００２２】
ＧＰＣＲポリペプチドの発現を調節し、レベルを変化させる（すなわち上昇させるか又は低下させる）方法も、本発明に包含される。１つの方法は、ＧＰＣＲポリペプチドをコードする核酸分子を動物に投与することを含む。もう１つの方法では、ＧＰＣＲポリペプチドの発現を調節する又は変化させるエレメントを含む核酸分子を投与してもよい。これらの方法の例は、ここでさらに記述するような遺伝子治療、細胞治療及びアンチセンス治療を含む。
【００２３】
ＧＰＣＲポリペプチドは、そのリガンドを特定するために使用できる。様々な形態の「発現クローニング」が、受容体についてのリガンドをクローニングするために使用されてきた（例えばＤａｖｉｓら、１９９６、Ｃｅｌｌ，８７：１１６１−６９参照）。これらやその他のＧＰＣＲリガンドクローニング実験をここで詳細に説明する。ＧＰＣＲリガンドの単離は、ＧＰＣＲシグナル伝達経路の新規アゴニスト及び／又はアンタゴニストの特定又は開発を可能にする。そのようなアゴニスト及びアンタゴニストは、ＧＰＣＲリガンド、抗ＧＰＣＲリガンド抗体及びそれらの誘導体、低分子、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、それらのいずれもが、ここで列挙するものを含めて、潜在的に１つ又はそれ以上の疾患又は障害を治療するために使用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
ここで使用する章の見出しは、構成目的のためだけのものであり、記述される主題を限定すると解釈されるべきではない。この明細書において引用する参考文献は、明白に参照してここに組み込まれる。
【００２５】
（定義）
「ＧＰＣＲ遺伝子」又は「ＧＰＣＲ核酸分子」又は「ＧＰＣＲポリヌクレオチド」の語は、配列番号１、配列番号３又は配列番号５のいずれかに示すヌクレオチド配列を含む又は前記ヌクレオチド配列から成る核酸分子、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、及びここで定義するような核酸分子を表わす。
【００２６】
「ＧＰＣＲポリペプチド対立遺伝子変異体」の語は、一生物又は生物個体群の染色体上の所与の遺伝子座を占める遺伝子の、いくつかの可能な天然に生じる交替形態の１つを表わす。
【００２７】
「ＧＰＣＲポリペプチドスプライシング変異体」の語は、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すＧＰＣＲポリペプチドアミノ酸配列のＲＮＡ転写におけるイントロン配列の選択的プロセシングによって生じる核酸分子、通常はＲＮＡを表わす。
【００２８】
「単離核酸分子」の語は、（１）全核酸をソース細胞から単離するとき天然に認められるタンパク質、脂質、炭水化物又は他の物質の少なくとも約５０％から分離されたか、（２）「単離核酸分子」が自然の状態で結合しているポリペプチドの全部又は一部に結合していないか、（３）自然の状態では結合していないポリペプチドに作動可能に結合しているか、又は（４）自然の状態ではより大きなポリヌクレオチド配列の一部としては生じない、本発明の核酸分子を表わす。好ましくは、本発明の単離核酸分子は、その天然環境では認められない、ポリペプチド生産におけるその使用あるいはその治療、診断、予防又は研究用途に干渉するであろう何らかの他の汚染核酸分子又は夾雑物を実質的に含まない。
【００２９】
「核酸配列」又は「核酸分子」の語は、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列を表わす。この語は、４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニル−シトシン、プソイドイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシ−メチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソ−ペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチル−グアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボニル−メチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、及び２，６−ジアミノプリンのような、但しこれらに限定されない、ＤＮＡ及びＲＮＡの既知の塩基類似体のいずれかから形成される分子を包含する。
【００３０】
「ベクター」の語は、コード情報を宿主細胞に転移するために使用される何らかの分子（例えば核酸、プラスミド又はウイルス）を表わすために用いられる。
【００３１】
「発現ベクター」は、宿主細胞の形質転換に適し、挿入される異種核酸配列の発現を指令する及び／又は制御する核酸配列を含むベクターを表わす。発現は、転写、翻訳、及びイントロンが存在する場合にはＲＮＡスプライシングなどのプロセスを含むが、これらに限定されない。
【００３２】
「作動可能に連結された」の語は、ここでは、そのように記述されるフランキング配列が、それらの通常の機能を果たすように立体配置されている又は構築されている、フランキング配列の配置を表わすために用いられる。従って、コード配列に作動可能に連結されたフランキング配列は、コード配列の複製、転写及び／又は翻訳を生じさせうる。例えば、コード配列は、プロモーターがそのコード配列の転写を指令することができるとき、そのプロモーターに作動可能に連結されている。フランキング配列は、それが正しく機能する限り、コード配列と隣接している必要はない。従って、例えば、介在非翻訳転写配列がプロモーター配列とコード配列の間に存在することができ、そのプロモーター配列は、それでもやはりコード配列に「作動可能に連結されている」とみなすことができる。
【００３３】
「宿主細胞」の語は、形質転換された細胞、又は核酸配列で形質転換され、その後目的とする選択遺伝子を発現することができる細胞を表わすために用いられる。この語は、その子孫が形態又は遺伝的特性において元の親と同一であるか否かに関わらず、選択遺伝子が存在する限り、該親細胞の子孫を包含する。
【００３４】
「ＧＰＣＲポリペプチド」の語は、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド及び関連ポリペプチドを表わす。関連ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、ＧＰＣＲポリペプチドフラグメント、ＧＰＣＲポリペプチドオーソローグ、ＧＰＣＲポリペプチド変異体及びＧＰＣＲポリペプチド誘導体を包含する。ＧＰＣＲポリペプチドは、ここで定義するような成熟ポリペプチドであってもよく、またそれらを調製する方法に依存して、アミノ末端のメチオニン残基を有していてもよく又は有していなくてもよい。
【００３５】
「ＧＰＣＲポリペプチドフラグメント」の語は、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれか示すポリペプチドのアミノ末端（リーダー配列を伴う又は伴わない）のトランケーション及び／又はカルボキシル末端のトランケーションを含むポリペプチドを表わす。「ＧＰＣＲポリペプチドフラグメント」の語はまた、ＧＰＣＲポリペプチドオーソローグ、ＧＰＣＲポリペプチド誘導体又はＧＰＣＲポリペプチド変異体のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端トランケーション、あるいはＧＰＣＲポリペプチド対立遺伝子変異体又はＧＰＣＲポリペプチドスプライシング変異体がコードするポリペプチドのアミノ末端及び／又はカルボキシル末端トランケーションを表わす。ＧＰＣＲポリペプチドフラグメントは、選択的ＲＮＡスプライシングから又はインビボプロテアーゼ活性から生じうる。ＧＰＣＲポリペプチドの膜結合形態も本発明によって意図される。好ましい実施態様では、トランケーション及び／又は欠失は、約１０個のアミノ酸、又は約２０個のアミノ酸、又は約５０個のアミノ酸、又は約７５個のアミノ酸、又は約１００個のアミノ酸、又は約１００個を超えるアミノ酸を含む。このようにして生産されるポリペプチドフラグメントは、約２５個の隣接アミノ酸、又は約５０個のアミノ酸、又は約７５個のアミノ酸、又は約１００個のアミノ酸、又は約１５０個のアミノ酸、又は約２００個のアミノ酸、又は約２００個を超えるアミノ酸を含む。そのようなＧＰＣＲポリペプチドフラグメントは、場合によってはアミノ末端のメチオニン残基を含みうる。そのようなフラグメントは、例えばＧＰＣＲポリペプチドに対する抗体を作製するために使用できることが認識される。
【００３６】
「ＧＰＣＲポリペプチドオーソローグ」の語は、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すＧＰＣＲポリペプチドアミノ酸配列に対応する、もう１つ別の種からのポリペプチドを表わす。例えば、マウスとヒトのＧＰＣＲポリペプチドは相互のオーソローグとみなされる。
【００３７】
「ＧＰＣＲポリペプチド変異体」の語は、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すＧＰＣＲポリペプチドアミノ酸配列（リーダー配列を伴う又は伴わない）と比較して、１個又はそれ以上のアミノ酸配列の置換、欠失（内部欠失及び／又はＧＰＣＲフラグメントなど）、及び／又は付加（内部付加及び／又はＧＰＣＲ融合ポリペプチドなど）を有するアミノ酸配列を含むＧＰＣＲポリペプチドを表わす。変異体は、天然に生じうる（例えばＧＰＣＲポリペプチド対立遺伝子変異体、ＧＰＣＲポリペプチドオーソローグ及びＧＰＣＲポリペプチドスプライシング変異体）か又は人工的に構築しうる。そのようなＧＰＣＲポリペプチド変異体は、配列番号１、配列番号３又は配列番号５のいずれかに示すＤＮＡ配列に対応して異なるＤＮＡ配列を有する対応核酸分子から調製しうる。好ましい実施態様では、変異体は、１〜３、又は１〜５、又は１〜１０、又は１〜１５、又は１〜２０、又は１〜２５、又は１〜５０、又は１〜７５、又は１〜１００、又は１００個を超えるアミノ酸の置換、挿入、付加及び／又は欠失、又はそれらの組合せを含み、この場合、置換は保存的であってもよく又は非保存的であってもよい。
【００３８】
「ＧＰＣＲポリペプチド誘導体」の語は、化学修飾された、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチド、ここで定義するようなＧＰＣＲポリペプチドフラグメント、ＧＰＣＲポリペプチドオーソローグ又はＧＰＣＲポリペプチド変異体を表わす。「ＧＰＣＲポリペプチド誘導体」の語はまた、化学修飾された、ここで定義するようなＧＰＣＲポリペプチド対立遺伝子変異体又はＧＰＣＲポリペプチドスプライシング変異体がコードするポリペプチドを表わす。
【００３９】
「成熟ＧＰＣＲポリペプチド」の語は、リーダー配列を欠くＧＰＣＲポリペプチドを表わす。成熟ＧＰＣＲポリペプチドはまた、アミノ末端（リーダー配列を伴う又は伴わない）及び／又はカルボキシル末端のタンパク質分解性プロセシング、大きな前駆体からより小さなポリペプチドへの開裂、Ｎ結合及び／又はＯ結合グリコシル化などのような他の修飾も含みうる。
【００４０】
「ＧＰＣＲ融合ポリペプチド」の語は、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチド、ここで定義するようなＧＰＣＲポリペプチドフラグメント、ＧＰＣＲポリペプチドオーソローグ、ＧＰＣＲポリペプチド変異体又はＧＰＣＲ誘導体の、アミノ末端又はカルボキシル末端における１個又はそれ以上のアミノ酸（異種タンパク質又はペプチドなど）の融合を表わす。「ＧＰＣＲ融合ポリペプチド」の語はまた、ここで定義するようなＧＰＣＲポリペプチド対立遺伝子変異体又はＧＰＣＲポリペプチドスプライシング変異体がコードするポリペプチドのアミノ末端又はカルボキシル末端における１個又はそれ以上のアミノ酸の融合を表わす。
【００４１】
「生物活性ＧＰＣＲポリペプチド」の語は、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドの、特徴的な少なくとも１つの活性を有するＧＰＣＲポリペプチドを表わす。さらに、ＧＰＣＲポリペプチドは免疫原として活性でありうる。すなわち、ＧＰＣＲポリペプチドは、それに対する抗体が惹起されうる少なくとも１個のエピトープを含む。
【００４２】
「単離ポリペプチド」の語は、（１）源細胞から単離されて天然に認められるポリヌクレオチド、脂質、炭水化物又は他の物質の少なくとも約５０％が分離されたか、（２）「単離ポリペプチド」が自然の状態で結合しているポリペプチドの全部又は一部が（共有結合によって又は非共有結合相互作用によって）結合していないか、（３）自然の状態ＤＮＡは結合していないポリペプチドに（共有結合によって又は非共有結合相互作用によって）作動可能に結合しているか、又は（４）自然の状態では生じない、本発明のポリペプチドを表わす。好ましくは、前記単離ポリペプチドは、その天然環境では認められない、その治療、診断、予防又は研究用途を妨害するであろう何らかの他の汚染ポリペプチド又は夾雑物を実質的に含まない。
【００４３】
「同一性」の語は、この分野において既知であるように、配列を比較することによって決定される、２個又はそれ以上のポリペプチド分子の配列あるいは２個又はそれ以上の核酸分子の配列の間の関係を表わす。この分野では、「同一性」はまた、ケースによっては、２個又はそれ以上のヌクレオチド配列あるいは２個又はそれ以上のアミノ酸配列の鎖の間の対合によって決定される、核酸分子又はポリペプチドの間の配列関連性の程度を意味する。「同一性」は、特定の数学的モデル又はコンピュータプログラム（すなわち「アルゴリズム」）によって処理される、ギャップ整列（もし存在する場合は）を含む２個又はそれ以上の配列のより小さいものの間の同一対合のパーセントを測定する。
【００４４】
「類似性」の語は、関連するが、「同一性」と異なる概念であり、「類似性」は、同一対合と保存的置換対合の両方を含めた関連性の尺度を表わす。２個のポリペプチド配列が、例えば、１０／２０個の同一アミノ酸を有し、残りの部分がすべて非保存的置換である場合、パーセント同一性及び類似性はいずれも５０％となる。同じ例で、さらに５個の部分に保存的置換が存在する場合には、パーセント同一性は５０％のままであるが、パーセント類似性は７５％（１５／２０）になる。それ故、保存的置換が存在する場合には、２つのポリペプチドの間のパーセント類似性は、それら２つのポリペプチド間のパーセント同一性よりも高くなる。
【００４５】
核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞などのような生物学的物質に関して使用するとき、「天然に生じる」又は「天然の」の語は、自然の状態で認められ、ヒトによって操作されていない物質を表わす。同様に、ここで使用するとき「非天然に生じる」又は「非天然の」の語は、自然の状態では認められないか、あるいはヒトによって構造的に修飾された又は合成された物質を表わす。
【００４６】
「有効量」及び「治療上有効な量」の語は各々、ここで示すＧＰＣＲポリペプチドの１つ又はそれ以上の生物活性の観察可能なレベルを保持するために使用されるＧＰＣＲポリペプチド又はＧＰＣＲ核酸分子の量を表わす。
【００４７】
ここで使用するとき「医薬適合性の担体」又は「生理的に許容される担体」の語は、医薬組成物としてのＧＰＣＲポリペプチド、ＧＰＣＲ核酸分子又はＧＰＣＲ選択的結合物質の供給送達を達成する又は促進するのに適した１又はそれ以上の製剤材料を表わす。
【００４８】
「抗原」の語は、抗体のような選択的結合物質が結合することができ、それに加えて、その抗原のエピトープに結合することができる抗体を作製するために動物において使用することができる分子又は前記分子の一部を表わす。
【００４９】
「選択的結合物質」の語は、ＧＰＣＲポリペプチドに対して特異性を有する１分子又は複数の分子を表わす。ここで使用するとき、「特異的」及び「特異性」の語は、ヒトＧＰＣＲポリペプチドに結合し、ヒト非ＧＰＣＲポリペプチドには結合しない、選択的結合物質の能力を表わす。しかし、選択的結合物質はまた、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドのオーソローグ、すなわちマウス及びラットＧＰＣＲポリペプチドのような、その種間変異型にも結合しうることが認識される。
【００５０】
「形質導入」の語は、通常はファージによる、１つの細菌からもう１つ別の細菌への遺伝子の移入を表わすために使用される。「形質導入」はまた、レトロウイルスによる真核細胞配列の獲得及び移入を表わす。
【００５１】
「トランスフェクション」の語は、細胞による異種又は外来性ＤＮＡの取込みを表わすために用いられ、外来性ＤＮＡが細胞膜の内側に導入されたとき、その細胞は「トランスフェクション」されたことになる。多くのトランスフェクション手法がこの分野において周知であり、ここでも開示する。例えば、Ｇｒａｈａｍら、１９７３、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，１９８９）；Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８６）；及びＣｈｕら、１９８１、Ｇｅｎｅ  １３：１９７参照。そのような手法は、１又はそれ以上の外来性ＤＮＡ部分を適切な宿主細胞に導入するために使用することができる。
【００５２】
ここで使用するとき「形質転換」の語は、細胞の遺伝的特徴における変化を表わし、細胞が新しいＤＮＡを含むように修飾されたとき、その細胞は形質転換されたことになる。例えば、細胞がその天然の状態から遺伝的に修飾されている場合、その細胞は形質転換されている。トランスフェクション又は形質導入後、形質転換ＤＮＡは、細胞の染色体に物理的に組み込むことによってその細胞のＤＮＡと組み換えてもよく、複製されないエピソームエレメントとして一過性に保持してもよく、あるいはプラスミドとして独立して複製させてもよい。ＤＮＡが細胞の分裂を伴って複製されるとき、その細胞は安定に形質転換されたとみなされる。
【００５３】
（核酸分子及び／又はポリペプチドの関連性）
関連核酸分子が、配列番号１、配列番号３又は配列番号５のいずれかの核酸分子の対立遺伝子変異体又はスプライシング変異体を包含すること、及び上記ヌクレオチド配列のいずれかに相補的である配列を包含することは明白である。関連核酸分子はまた、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドと比較して、１個又はそれ以上のアミノ酸残基の置換、修飾、付加及び／又は欠失を含む、又は基本的にそれらから成るポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。そのような関連ＧＰＣＲポリペプチドは、例えば、１又はそれ以上のＮ結合又はＯ結合グリコシル化部位の付加及び／又は欠失、あるいは１個又はそれ以上のシステイン残基の付加及び／又は欠失を含みうる。
【００５４】
関連核酸分子はまた、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかのＧＰＣＲポリペプチドの少なくとも約２５個の隣接アミノ酸、又は約５０個のアミノ酸、又は約７５個のアミノ酸、又は約１００個のアミノ酸、又は約１５０個のアミノ酸、又は約２００個のアミノ酸、又は約２００個を超えるアミノ酸残基のポリペプチドをコードする、ＧＰＣＲ核酸分子のフラグメントを包含する。
【００５５】
さらに、関連ＧＰＣＲ核酸分子はまた、ここで定義するような中ストリンジェンシー又は高ストリンジェンシー条件下で、配列番号１、配列番号３又は配列番号５のいずれかのＧＰＣＲ核酸分子、又は配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すようなアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする分子、又はここで定義するような核酸フラグメント、又はここで定義するようなポリペプチドをコードする核酸フラグメントの、完全に相補的な配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む分子を包含する。関連配列に関してｃＤＮＡ、ゲノム又は合成ＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために、ここで提供するＧＰＣＲ配列を使用してハイブリダイゼーションプローブを作製しうる。ここで述べるような配列整列化アルゴリズムを使用して、既知の配列に有意の同一性を示すＧＰＣＲポリペプチドのＤＮＡ及び／又はアミノ酸配列の領域が容易に決定され、それらの領域は、スクリーニング用のプローブを設計するために使用しうる。
【００５６】
「高ストリンジェンシー条件」の語は、配列が高度に相補的であるＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを許容し、有意の不対合ＤＮＡのハイブリダイゼーションを排除するように設計される条件を表わす。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、主として温度、イオン強度、及びホルムアミドのような変性剤の濃度によって決定される。ハイブリダイゼーション及び洗浄についての「高ストリンジェンシー条件」の例は、６５℃から６８℃で０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム又は４２℃で０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム及び５０％ホルムアミドである。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  第４章（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）参照。
【００５７】
よりストリンジェントな条件（より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド又は他の変性剤）も使用しうる。しかし、ハイブリダイゼーションの速度が影響を受ける。非特異的及び／又はバックグラウンドハイブリダイゼーションの低下のために、他の作用物質をハイブリダイゼーション及び洗浄緩衝液に含めてもよい。その例は、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、ＮａＤｏｄＳＯ４、（ＳＤＳ）、フィコール、デンハルト溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（又はもう１つ別の非相補的ＤＮＡ）、及び硫酸デキストランであるが、他の適切な作用物質も使用できる。これらの添加剤の濃度及び種類は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的な影響を及ぼすことなく変化させることができる。ハイブリダイゼーション実験は通常ｐＨ６．８−７．４で実施する；しかし、典型的なイオン強度条件では、ハイブリダイゼーションの速度はほとんどｐＨに無関係である。Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  第４章（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）参照。
【００５８】
ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を及ぼす因子は、塩基の組成、長さ、塩基対不対合の度合を含む。当業者は、これらの変数を適応させ、種々の配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを生成することを可能にするように、ハイブリダイゼーション条件を調整することができる。完全に対合するＤＮＡ二重鎖の融点は、次の等式によって推定することができる：
Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｎ−０．７２（％ホルムアミド）
［式中、Ｎは、生成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション又は洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基のパーセンテージである。不完全対合ハイブリッドに関しては、融点は、各々１％の不適正対合について約１℃ずつ低下する。
【００５９】
「中ストリンジェンシー条件」の語は、「高ストリンジェンシー条件」下で起こりうるよりも大きな度合の塩基対不適正対合を有するＤＮＡ二重鎖が生成しうる条件を表わす。典型的な「中ストリンジェンシー条件」の例は、５０℃から６５℃で０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム又は３７℃から５０℃で０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム及び２０％ホルムアミドである。例として、０．０１５Ｍナトリウムイオン中５０℃の「中ストリンジェンシー条件」は、約２１％の不適正対合を生じる。
【００６０】
「高ストリンジェンシー条件」と「中ストリンジェンシー条件」の間に絶対的な区別が存在しないことは、当業者には認識される。例えば、０．０１５Ｍナトリウムイオン（ホルムアミドなし）で、完全に対合する長いＤＮＡの融点は約７１℃である。６５℃で洗浄すると（同じイオン強度で）、これによって約６％の不適正対合が生じる。より関連性の遠い配列を捕獲するためには、当業者は単に温度を下げるか又はイオン強度を上げるだけでよい。
【００６１】
約２０ｎｔまでのオリゴヌクレオチドプローブについての１Ｍ  ＮａＣｌ＊中の融点の良好な推定が、次の式によって与えられる：
Ｔｍ＝２℃／Ａ−Ｔ塩基対＋４℃／Ｇ−Ｃ塩基対
＊６Ｘクエン酸ナトリウム塩溶液（ＳＳＣ）中のナトリウムイオン濃度は１Ｍである。Ｓｕｇｇｓら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｇｅｎｅｓ  ６８３（Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｆｏｘ編集、１９８１）参照。
【００６２】
オリゴヌクレオチドについての高ストリンジェンシー洗浄条件は、通常、６Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、オリゴヌクレオチドのＴｍより低い０℃から５℃の温度である。
【００６３】
もう１つの実施態様では、関連核酸分子は、配列番号１、配列番号３又は配列番号５のいずれかに示すヌクレオチド配列と少なくとも約７０％同一であるヌクレオチド配列を含む又は前記ヌクレオチド配列から成る。好ましい実施態様では、前記ヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号３又は配列番号５のいずれかに示すヌクレオチド配列と約７５％、又は約８０％、又は約８５％、又は約９０％、又は約９５、９６、９７、９８又は９９％同一である。関連核酸分子は、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチドをコードする。
【００６４】
核酸配列における相違は、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかのアミノ酸配列に関する、アミノ酸配列の保存的及び／又は非保存的修飾を生じうる。
【００６５】
配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかのアミノ酸配列への保存的修飾（及びそのコードするヌクレオチドへの対応する修飾）は、ＧＰＣＲポリペプチドに類似した機能的及び化学的特徴を有するポリペプチドを生成する。これに対し、ＧＰＣＲポリペプチドの機能的及び／又は化学的特徴の実質的な修飾は、（ａ）例えばシート又はらせんコンフォメーションのような、置換領域における分子骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷又は疎水性、あるいは（ｃ）側鎖のかさ（バルク）、を維持することへの影響が有意に異なる、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかのアミノ酸配列における置換を選択することによって達成しうる。
【００６６】
例えば、「保存的アミノ酸置換」は、その部位のアミノ酸残基の極性又は電荷にほとんど又は全く影響がないように、天然アミノ酸残基を非天然残基で置換することを含みうる。さらにまた、「アラニンスキャニング突然変異誘発」に関してこれまでに記述されているように、ポリペプチド内の何らかの天然残基をアラニンで置換してもよい。
【００６７】
保存的アミノ酸置換はまた、典型的には生物系における合成によってではなく化学的ペプチド合成によって組み込まれる、非天然に生じるアミノ酸残基を包含する。これらは、ペプチドミメティック、及びアミノ酸部分の他の逆（ｒｅｖｅｒｓｅｄ又はｉｎｖｅｒｔｅｄ）形態を含む。
【００６８】
天然に生じる残基は、共通の側鎖特性に基づいて次のクラスに分類しうる：
１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）鎖の方向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び
６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【００６９】
例えば、非保存置換は、これらのクラスの１つの成員をもう１つ別のクラスからの成員と交換することを含みうる。そのような置換残基は、非ヒトＧＰＣＲポリペプチドと相同なヒトＧＰＣＲポリペプチドの領域に導入するか、又は前記分子の非相同領域に導入しうる。
【００７０】
そのような交換を行う場合、アミノ酸の疎水親水指数が考慮しうる。各々のアミノ酸には、その疎水性と電荷特性に基づいて疎水親水指数が割り当てられている。疎水親水指数は：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸塩（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸塩（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；及びアルギニン（−４．５）である。
【００７１】
タンパク質に相互作用性生物機能を付与する上でのアミノ酸疎水親水指数の重要性はこの分野で一般的に理解されている（Ｋｙｔｅら、１９８２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−３１）。一部のアミノ酸が同様の疎水親水指数又はスコアを持つ他のアミノ酸を置換して、それでもなお同様の生物活性を保持しうることが知られている。疎水親水指数に基づく変更を行う場合、疎水親水指数が±２以内のアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるものが特に好ましく、±０．５以内であることがより一層好ましい。
【００７２】
また、同様のアミノ酸の置換は、特に、本発明の場合のように、それによって創造される生物機能的に等価のタンパク質又はペプチドが免疫学的実施態様における使用を意図されている場合には、親水性に基づいて有効に実施することができる。タンパク質の最大局所平均親水性は、その隣接アミノ酸の親水性に支配されるので、その免疫原性及び抗原性、すなわち該タンパク質の生物学的性質と相関する。
【００７３】
これらのアミノ酸残基には次のような親水値が割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパラギン酸塩（＋３．０±１）；グルタミン酸塩（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン酸（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；及びトリプトファン（−３．４）。類似する親水値に基づいて変更を行う場合、親水値が±２以内のアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるものが特に好ましく、±０．５以内であることがより一層好ましい。また、親水性に基づいて一次アミノ酸配列からエピトープも特定しうる。これらの領域は「エピトープコア領域」とも称される。
【００７４】
所望アミノ酸置換（保存的又は非保存的）は、そのような置換を所望する時点で当業者が決定することができる。例えば、アミノ酸置換は、ＧＰＣＲポリペプチドの重要な残基を特定するため、又はここで述べるＧＰＣＲポリペプチドのアフィニティーを高める又は低下させるために使用できる。アミノ酸置換の例を表Ｉに示す。
【００７５】
【表１】
2005503124.tif 000002
【００７６】
当業者は、周知の手法を用いて配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドの適切な変異体を決定することができる。生物活性を破壊することなく変化させうる該分子の適切な領域を特定するには、当業者は、活性にとって重要ではないと考えられる領域を標的としうる。例えば、同じ種から又は他の種からの類似活性を有する類似ポリペプチドが既知であるとき、当業者はＧＰＣＲポリペプチドのアミノ酸配列をそのような類似ポリペプチドと比較しうる。そのような比較により、類似ポリペプチドの間で保存されている該分子の残基及び部分を特定することができる。そのような類似ポリペプチドに関して保存されていないＧＰＣＲ分子の領域における変化は、ＧＰＣＲポリペプチドの生物活性及び／又は構造に有害な影響を及ぼす可能性が低いであろうことは認識される。当業者はまた、比較的保存された領域であっても、活性を保持しながら、天然に生じる残基を化学的に類似するアミノ酸で置換しうることを理解する。それ故、生物活性にとって又は構造にとって重要であると考えられる領域でも、生物活性を破壊せずに、あるいはポリペプチド構造に有害な影響を及ぼさずに、保存的アミノ酸に置換に供することが可能である。
【００７７】
さらに、当業者は、活性又は構造にとって重要な類似ポリペプチド内の残基を特定する構造−機能試験を検討することができる。そのような比較に鑑みて、類似ポリペプチド内の活性又は構造にとって重要なアミノ酸残基に対応する、ＧＰＣＲポリペプチド内のアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者は、ＧＰＣＲポリペプチドのそのような予測上の重要アミノ酸残基を化学的に類似するアミノ酸で置換することを選択しうる。
【００７８】
当業者はまた、類似ポリペプチドの構造に関して三次元構造及びアミノ酸配列を分析することができる。そのような情報を考慮して、ＧＰＣＲポリペプチドのアミノ酸残基の整列をその三次元構造に関して予測しうる。タンパク質の表面に存在すると予測されるアミノ酸残基は他の分子との重要な相互作用に関与すると考えられるので、当業者は、そのような残基に根本的な変化を与えないように選択することができる。さらに、当業者は、各々のアミノ酸残基に１個のアミノ酸置換基を含む試験変異体を作製することができる。前記変異体は、当業者に既知の活性検定を用いてスクリーニングすることができる。そのような変異体は、適切な変異体についての情報を収集するために使用できる。例えば、特定アミノ酸残基への変化が、活性の破壊、活性の望ましくない低下、又は不適切な活性をもたらすことが発見されれば、そのような変化を有する変異体は回避される。言い換えれば、そのような常用実験から収集される情報に基づいて、当業者は、単独で又は他の突然変異と組み合わせて、さらなる置換を回避すべきであるアミノ酸を容易に決定することができる。
【００７９】
いくつかの学術公表文献が二次構造の予測を取り上げている。Ｍｏｕｌｔ，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７：４２２−２７；Ｃｈｏｕら、１９７４、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：２２２−４５；Ｃｈｏｕら、１９７４、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １１３：２１１−２２；Ｃｈｏｕら、１９７８、Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４７：４５−４８；Ｃｈｏｕら、１９７８、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：２５１−２７６；及びＣｈｏｕら、１９７９、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．２６：３６７−８４参照。さらに、二次構造の予測を助けるためにコンピュータプログラムが現在使用可能である。二次構造を予測する１つの方法はホモロジーモデリングに基づく。例えば、３０％以上の配列類似性又は４０％以上の配列類似性を有する２個のポリペプチド又はタンパク質は、しばしば類似した構造トポロジーを持つ。近年のタンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の拡大は、ポリペプチド又はタンパク質構造内の潜在的な折りたたみ数を含めて、二次構造の高い予測性を提供してきた。Ｈｏｌｍら、１９９９、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７：２４４−４７参照。所与のポリペプチド又はタンパク質内には限られた数の折りたたみが存在すること、及びひとたび決定的に重要な数の構造が解明されれば、構造予測が劇的により正確になるであろうことが示唆されてきた（Ｂｒｅｎｎｅｒら、１９９７、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３６９−７６）。
【００８０】
二次構造を予測するさらなる方法は、「スレッディング法（Ｊｏｎｅｓ，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３７７−８７；Ｓｉｐｐｌら、１９９６、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４：１５−１９）、「プロファイル分析」（Ｂｏｗｉｅら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３：１６４−７０；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、１９９０、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：１４６−５９；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：４３５５−５８）、及び「進化的連鎖」（Ｈｏｌｍら（前出）及びＢｒｅｎｎｅｒら、前出参照）を含む。
【００８１】
好ましいＧＰＣＲポリペプチド変異体は、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すアミノ酸配列に比べてグリコシル化部位の数及び／又は様式が変化したグリコシル化変異体を含む。１つの実施態様では、ＧＰＣＲポリペプチド変異体は、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すアミノ酸配列よりも多い又は少ない数のＮ結合グリコシル化部位を含む。Ｎ結合グリコシル化部位は、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒの配列によって特徴付けられ、前記の式中、Ｘで表わすアミノ酸残基はプロリン以外のいずれのアミノ酸残基であってもよい。この配列を創造するためのアミノ酸残基の置換は、Ｎ結合型糖鎖を付加する潜在的な新しい部位を提供する。選択的に、この配列を取り除く置換は、既存のＮ結合糖鎖を取り除く。また、１又はそれ以上のＮ結合グリコシル化部位（典型的には天然に生じるもの）を取り除き、１又はそれ以上の新しいＮ結合部位を創造する、Ｎ結合型糖鎖の再構成も提供される。さらなる好ましいＧＰＣＲ変異体は、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すアミノ酸配列に比べて１個又はそれ以上のシステイン残基が欠失している又はもう１つ別のアミノ酸（例えばセリン）で置換されているシステイン変異体を含む。システイン変異体は、不溶性封入体の単離後のように、ＧＰＣＲポリペプチドを生物活性立体構造に折りたたまれなければなければならないときに有用である。システイン変異体は、通常天然タンパク質よりも少ないシステイン残基を持ち、通常非対合システインの相互作用を最小限にするよう、等しい数のシステイン残基を有する。
【００８２】
他の実施態様では、ＧＰＣＲポリペプチド変異体は、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドの活性を有し、少なくとも１個のアミノ酸挿入を含む配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すアミノ酸配列、または配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドの活性を有し、少なくとも１個のアミノ酸欠失を含む配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すアミノ酸配列、を含む。ＧＰＣＲポリペプチド変異体はまた、カルボキシル末端及び／又はアミノ末端トランケーションを有し、さらに配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドの活性を有する、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すようなアミノ酸配列を含む。ＧＰＣＲポリペプチドさらに、１個のアミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、カルボキシル末端トランケーション、又はアミノ末端トランケーションである少なくとも１つの修飾を含み、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドの活性を有する、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すようなアミノ酸配列を含む。
【００８３】
さらなる実施態様では、ＧＰＣＲポリペプチド変異体は、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すようなアミノ酸配列に少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含む。好ましい実施態様では、ＧＰＣＲポリペプチド変異体は、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すようなアミノ酸配列に少なくとも約７５％、又は約８０％、又は約８５％、又は約９０％、又は約９５、９６、９７、９８又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。ＧＰＣＲポリペプチド変異体は、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する。
【００８４】
さらに、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は他のＧＰＣＲポリペプチドは、ホモダイマーを形成するために相同ポリペプチドに、又はヘテロダイマーを形成するために異種ポリペプチドに、融合しうる。異種ペプチド及びポリペプチドは、ＧＰＣＲ融合ポリペプチドの検出及び／又は単離を可能にするエピトープ；細胞外ドメイン又は膜貫通及び細胞内ドメインのような、膜貫通受容体タンパク質又はその部分；膜貫通受容体タンパク質に結合するリガンド又はその部分；触媒として活性である酵素；ロイシンジッパードメインのような、オリゴマー化を促進するポリペプチド又はペプチド；免疫グロブリン定常領域のような、安定性を高めるポリペプチド又はペプチド；及び配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すアミノ酸配列を含むポリペプチドとは異なる治療上の活性を有するポリペプチド、又は他のＧＰＣＲポリペプチドを含むが、これらに限定されない。
【００８５】
融合は、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかに示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は他のＧＰＣＲポリペプチドのアミノ末端又はカルボキシル末端のいずれかで実施することができる。融合は、リンカー又はアダプター分子なしに直接であってもよく、あるいはリンカー又はアダプター分子を通してであってもよい。リンカー又はアダプター分子は、１個又はそれ以上のアミノ酸残基、典型的には約２０個から約５０個のアミノ酸残基でありうる。リンカー又はアダプター分子はまた、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼについての開裂部位又は融合分子の分離を可能にするプロテアーゼについての開裂部位を含むように設計しうる。ひとたび構築されれば、ここで述べる方法によって融合ポリペプチドを誘導体化できることは認識される。
【００８６】
本発明のさらなる実施態様では、配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は他のＧＰＣＲポリペプチドを、ヒトＩｇＧのＦｃ領域の１又はそれ以上のドメインに融合する。抗体は、２つの機能的に独立した部分、すなわち、抗原に結合する、「Ｆａｂ」として知られる可変ドメイン、及び補体の活性化及び食細胞による攻撃などの効果器機能に関与する、「Ｆｃ」として知られる定常ドメインを含む。Ｆｃは長い血清半減期を持ち、一方Ｆａｂは短命である。Ｃａｐｏｎら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：５２５−３１。治療タンパク質と共に構築するとき、Ｆｃドメインは、より長い半減期を提供するか、又はＦｃ受容体結合、プロテインＡ結合、補体固定などの機能、そしておそらく胎盤移行の機能も組み込むことができる。表ＩＩは、この分野において既知である一部のＦｃ融合の使用を要約している。
【００８７】
【表２】
2005503124.tif 000003
【００８８】
１つの例では、ヒトＩｇＧヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域を、当業者に既知の方法を用いてＧＰＣＲポリペプチドのアミノ末端又はカルボキシル末端のいずれかで融合しうる。もう１つの例では、ヒトＩｇＧヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域を、ＧＰＣＲポリペプチドフラグメント（例えばＧＰＣＲポリペプチドの推定細胞外部分）のアミノ末端又はカルボキシル末端のいずれかで融合しうる。
【００８９】
生じるＧＰＣＲ融合ポリペプチドは、プロテインＡアフィニティーカラムを使用して精製しうる。Ｆｃ領域に融合したペプチド及びタンパク質は、融合していない対応物よりも実質的に長いインビボ半減期を示すことが認められた。また、Ｆｃ領域への融合は融合ポリペプチドの二量体化／多量体化を可能にする。前記Ｆｃ領域は、天然に生じるＦｃ領域であるか、又は治療品質、循環時間又は凝集低下のような、ある種の品質を改善するように変化していてもよい。
【００９０】
関連核酸分子及びポリペプチドの同一性及び類似性は既知の方法によって容易に算定される。そのような方法は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａ．Ｍ．Ｌｅｓｋ編集、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｄ．Ｗ．Ｓｍｉｔｈ編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ（第１部、Ａ．Ｍ．ＧｒｉｆｆｉｎとＨ．Ｇ．Ｇｒｉｆｆｉｎ編集、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  １９９４）；Ｇ．ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｌｅ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８７）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｍ．ＧｒｉｂｓｋｏｖとＪ．Ｄｅｖｅｒｅｕｘ編集、Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ  １９９１）；及びＣａｒｉｌｌｏら、１９８８、ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８：１０７３に述べられているものを含むが、これらに限定されない。
【００９１】
同一性及び／又は類似性を決定する好ましい方法は、検討する配列の間で最大の対合を与えるように設計される。同一性及び類似性を決定する方法は、公的に使用可能なコンピュータプログラムの中に述べられている。２つの配列の間の同一性及び類似性を決定する好ましいコンピュータプログラム法は、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ウィスコンシン州（ＷＩ））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０）を含めて、ＧＣＧプログラムパッケージを含むが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）及び他のソース（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ（ＮＣＢ  ＮＬＭ  ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，メリーランド州（ＭＤ））；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、前出）から公的に入手可能である。周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも同一性を決定するために使用しうる。
【００９２】
２個のアミノ酸配列を整列するための一部の整列化スキームは、この２個の配列の短い領域だけの対合をもたらすと考えられ、この小さな整列領域は、２個の完全長配列の間に有意の関係が存在しない場合でも、非常に高い配列同一性を有しうる。従って、好ましい実施態様では、選択整列化法（ＧＡＰプログラム）は、特許請求するポリペプチドの少なくとも５０個の隣接アミノ酸にわたる整列をもたらす。
【００９３】
例えば、コンピュータアルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ウィスコンシン州（ＷＩ））を使用して、パーセント配列同一性を決定しようとする２個のポリペプチドを、それらのそれぞれのアミノ酸が至適対合するように整列する（アルゴリズムによって決定される「対合スパン（ｍａｔｃｈｅｄ  ｓｐａｎ）」）。ギャップ開放ペナルティー（３Ｘ平均対角として算定される；「平均対角（ａｖｅｒａｇｅ  ｄｉａｇｏｎａｌ）」は、使用する比較マトリックスの対角の平均である；「対角」は特定の比較マトリックスによって各々の完全なアミノ酸対合に割り当てられるスコア又は数である）及びギャップ伸長ペナルティー（通常０．１Ｘギャップ開放ペナルティー）、ならびにＰＡＭ  ２５０又はＢＬＯＳＵＭ  ６２のような比較マトリックスをアルゴリズムと共に使用する。標準比較マトリックスもアルゴリズムによって使用される（Ｄａｙｈｏｆｆら、５  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（補遺３、１９７８）（ＰＡＭ  ２５０比較マトリックス）；Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１９（ＢＬＯＳＵＭ  ６２比較マトリックス）参照）。
【００９４】
ポリペプチド配列比較のための好ましいパラメータは次のものを含む：
アルゴリズム：ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ，１９７０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−５３；
比較マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ  ６２（Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、前出）；
ギャップペナルティー：１２
ギャップ長ペナルティー：４
類似性の閾値：０
ＧＡＰプログラムは上記のパラメータに関して有用である。上述したパラメータは、ＧＡＰアルゴリズムを使用したポリペプチド比較のためのデフォールトパラメータである（末端ギャップについてのペナルティーを伴わない）。
【００９５】
核酸分子の配列比較のための好ましいパラメータは次のものを含む：
アルゴリズム：ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ、前出；
比較マトリックス：対合＝＋１０、不適正対合＝０；
ギャップペナルティー：５０
ギャップ長ペナルティー：３
ＧＡＰプログラムは上記のパラメータに関しても有用である。上述したパラメータは、核酸分子比較のためのデフォールトパラメータである。
【００９６】
他の例示アルゴリズム、ギャップ開放ペナルティー、ギャップ伸長ペナルティー、比較マトリックス、及び類似性の閾値も、Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９，１９９７年９月に示されているものを含めて、使用しうる。行うべき個々の選択は当業者には明白であり、ＤＮＡ対ＤＮＡ、タンパク質対タンパク質、タンパク質対ＤＮＡのように、実施する特定の比較、及びそれに加えて、その比較が所与の配列の対の間であるか（この場合はＧＡＰ又はＢｅｓｔＦｉｔが一般に好ましい）又は１個の配列と配列の大きなデータベースとの間であるか（この場合はＦＡＳＴＡ又はＢＬＡＳＴＡが好ましい）に依存する。
【００９７】
（核酸分子）
ＧＰＣＲポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子は、化学合成、ｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーのスクリーニング、発現ライブラリーのスクリーニング、及び／又はｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を含むがこれらに限定されない、様々な方法で容易に入手することができる。
【００９８】
ここで使用する組換えＤＮＡ法は、一般にＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）及び／又はＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、編集、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．及びＷｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  １９９４）に示されているものである。本発明は、ここで述べるような核酸分子及びそのような分子を得るための方法を提供する。
【００９９】
ＧＰＣＲポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子が他の種から特定された場合、その遺伝子の全部又は一部を、オーソローグ又は同じ種からの関連遺伝子を特定するためのプローブとして使用しうる。前記プローブ又はプライマーは、ＧＰＣＲポリペプチドを発現すると考えられる様々な組織ソースからのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用しうる。さらに、配列番号１、配列番号３又は配列番号５のいずれかに示すような配列を有する核酸分子の部分又は全体を使用して、ＧＰＣＲポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子を特定し、単離するためにゲノムライブラリーをスクリーニングすることができる。典型的には、スクリーニングから得られる偽陽性の数を最小限に抑えるために、スクリーニングには中又は高ストリンジェンシー条件が用いられる。
【０１００】
ＧＰＣＲポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子はまた、発現されたタンパク質の性質に基づいた陽性クローンの検出を使用する、発現クローニングによっても特定されうる。典型的には、宿主細胞の表面で発現され、提示されるクローン化タンパク質への抗体又は他の結合パートナー（例えば受容体又はリガンド）の結合によって核酸ライブラリーをスクリーニングする。前記抗体又は結合パートナーは、所望クローンを発現する細胞を特定するために検出可能な標識で修飾する。
【０１０１】
下記で述べる説明によって実施される組換え発現手法により、これらのポリヌクレオチドを生産し、コードされたポリペプチドを発現することができる。例えば、ＧＰＣＲポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列を適切なベクターに挿入することにより、当業者は、容易に所望ヌクレオチド配列を大量に生産することができる。その後前記配列を使用して検出プローブ又は増幅プライマーを作製することができる。選択的に、ＧＰＣＲポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入することができる。前記発現ベクターを適切な宿主に挿入することにより、コードされたＧＰＣＲポリペプチドが大量に生産されうる。
【０１０２】
適切な核酸配列を得るためのもう１つの方法はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。この方法では、逆転写酵素を使用してポリ（Ａ）＋ＲＮＡ又は全ＲＮＡからｃＤＮＡを調製する。次に、典型的にはＧＰＣＲポリペプチドのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの２つの別々の領域に相補的な、２個のプライマーをＴａｑポリメラーゼのようなポリメラーゼと共にｃＤＮＡに加えると、前記ポリメラーゼが２個のプライマーの間のｃＤＮＡ領域を増幅する。
【０１０３】
ＧＰＣＲポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子を調製するもう１つの手段は、Ｅｎｇｅｌｓら、１９８９、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．２８：７１６−３４が述べられているような、当業者に周知の方法を用いる化学合成である。これらの方法は、とりわけ、核酸合成のための、ホスホトリエステル法、ホスホルアミダイト法及びＨ−ホスホネート法を包含する。そのような化学合成のための好ましい方法は、標準ホスホルアミダイト化学を使用するポリマー支援合成である。典型的には、ＧＰＣＲポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡは数百ヌクレオチドの長さである。これらの方法を使用すると、約１００ヌクレオチドより大きい核酸は、いくつかのフラグメントとして合成できる。その後、それらのフラグメントを一緒に連結して、ＧＰＣＲ遺伝子の完全長ヌクレオチド配列を形成することができる。通常、前記ポリペプチドのアミノ末端をコードするＤＮＡフラグメントは、メチオニン残基をコードするＡＴＧを有する。このメチオニンは、宿主細胞において産生されるポリペプチドがその細胞から分泌されるように設計されているか否かに依存して、ＧＰＣＲポリペプチドの成熟形態に存在してもよく、又は存在しなくてもよい。当業者に既知の他の方法も同様に使用しうる。
【０１０４】
一部の実施態様では、核酸変異体は、所与の宿主細胞におけるＧＰＣＲポリペプチドの至適発現のために変化したコドンを含む。個々のコドンの変化は、発現のために選択するＧＰＣＲポリペプチドと宿主細胞に依存する。そのような「コドンの至適化」は、様々な方法によって、例えば所与の宿主細胞において高度発現される遺伝子での使用のために好ましいコドンを選択することによって、実施できる。高度発現細菌遺伝子のコドン選択のための、「Ｅｃｏ＿ｈｉｇｈ．Ｃｏｄ」のようなコドン出現頻度表を組み込んだコンピュータアルゴリズムが使用でき、ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ウィスコンシン州（ＷＩ））によって提供されている。他の有用なコドン出現頻度表は、「Ｃｅｌｅｇａｎｓ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｃｅｌｅｇａｎｓ＿ｌｏｗ．ｃｏｄ」、「Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｈｕｍａｎ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｍａｉｚｅ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」及び「Ｙｅａｓｔ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」を包含する。
【０１０５】
一部の場合には、ＧＰＣＲポリペプチド変異体をコードする核酸分子を調製することが望ましいと考えられる。変異体をコードする核酸分子は、プライマーが所望点突然変異を有する、部位指定突然変異誘発、ＰＣＲ増幅、又は他の適切な方法を使用して生産しうる（突然変異誘発手法の説明については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）及びＡｕｓｕｂｅｌら、前出参照）。Ｅｎｇｅｌｓら（前出）が述べた方法を用いる化学合成も、そのような変異体を生産するために使用しうる。当業者に既知の他の方法も同様に使用しうる。
【０１０６】
（ベクター及び宿主細胞）
ＧＰＣＲポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子は、標準連結手法を用いて適切な発現ベクターに挿入される。ベクターは、典型的には使用する特定宿主細胞において機能的であるように選択される（すなわち遺伝子の増幅及び／又は遺伝子の発現が起こりうるように、ベクターは宿主細胞機構と適合性である）。ＧＰＣＲポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子は、原核生物、酵母、昆虫（バキュロウイルス系）及び／又は真核生物宿主細胞において増幅／発現されうる。宿主細胞の選択は、一部には、ＧＰＣＲポリペプチドが翻訳後修飾（例えばグリコシル化及び／又はリン酸化）されるかどうかに依存する。翻訳後修飾される場合には、酵母、昆虫又は哺乳類宿主細胞が好ましい。発現ベクターの総説については、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，第１８５巻（Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９０）参照。
【０１０７】
典型的には、前記宿主細胞のいずれかで使用する発現ベクターは、プラスミドの維持のため及び外来ヌクレオチド配列のクローニングと発現のための配列を含む。一部の実施態様では集合的に「フランキング配列」と称される、そのような配列は、典型的には次のヌクレオチド配列の１個又はそれ以上を含む：プロモーター、１個又はそれ以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、スプライス供与部位及びスプライス受容部位を含む完全イントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現すべきポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、及び選択マーカーエレメント。これらの配列の各々を下記で論じる。
【０１０８】
場合によっては、前記ベクターは、「タグ」コード配列、すなわちＧＰＣＲポリペプチドコード配列の５’又は３’末端に位置するオリゴヌクレオチド分子を含みうる；このオリゴヌクレオチド配列は、ポリＨｉｓ（ヘキサＨｉｓなど）、又はＦＬＡＧ、ＨＡ（赤血球凝集素インフルエンザウイルス）のようなもう１つの「タグ」、又はそれに対する市販の抗体が存在するｍｙｃをコードする。このタグは、典型的にはポリペプチドの発現時にポリペプチドに融合され、宿主細胞からのＧＰＣＲポリペプチドのアフィニティー精製の手段として使用できる。アフィニティー精製は、例えば該タグに対する抗体をアフィニティー基質として使用するカラムクロマトグラフィーによって実施できる。場合によっては、その後、開裂のためにある種のペプチダーゼを使用することなどの様々な手段によって、精製ＧＰＣＲポリペプチドから前記タグを除去することができる。
【０１０９】
フランキング配列は、相同（すなわち宿主細胞と同じ種及び／又は系統から）、異種（宿主細胞の種又は系統以外の種から）、ハイブリッド（すなわち２つ以上のソースからのフランキング配列の組合せ）、又は合成であってもよく、あるいはフランキング配列は、ＧＰＣＲポリペプチド発現を調節するように正しく機能する天然配列であってもよい。フランキング配列のソースは、それ自体、フランキング配列がその中で機能性であること及び宿主細胞機構によって活性化されうることを条件として、いかなる原核又は真核生物、脊椎動物又は無脊椎動物、あるいは植物であってもよい。
【０１１０】
本発明のベクターにおいて有用なフランキング配列は、この分野で周知のいくつかの方法のいずれかによって入手しうる。典型的には、ここで有用な−ＧＰＣＲ遺伝子フランキング配列以外の−フランキング配列は、地図作製によって及び／又は制限エンドヌクレアーゼ消化によってあらかじめ特定され、それ故、適切な制限粘度ヌクレアーゼを使用して適切な組織ソースから単離することができる。一部の場合には、フランキング配列の完全ヌクレオチド配列が既知でありうる。この場合には、核酸合成又はクローニングに関してここで述べる方法を用いてフランキング配列を合成しうる。
【０１１１】
フランキング配列の全部又は一部だけが既知である場合、ＰＣＲを使用して、及び／又は適切なオリゴヌクレオチド及び／又は同じか又はもう１つの宿主細胞からのフランキング配列フラグメントでゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって、前記フランキング配列を入手しうる。フランキング配列が不明である場合は、フランキング配列を含むＤＮＡのフラグメントを、例えばコード配列又はさらに別の１個又はそれ以上の遺伝子を含みうるＤＮＡのより大きな断片から単離しうる。単離は、適切なＤＮＡフラグメントを生成する制限エンドヌクレアーゼ消化、及びそれに続いて、アガロースゲル精製、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィー（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，カリフォルニア州（ＣＡ））又は当業者に既知の他の方法を用いた単離によって実施しうる。この目的を達成するための適切な酵素の選択は当業者には容易に明らかである。
【０１１２】
複製起点は、典型的には市販のものが購入される原核生物発現ベクターの一部であり、この起点は宿主細胞におけるベクターの増幅を助ける。一定コピー数までのベクターの増幅は、一部の場合には、ＧＰＣＲポリペプチドの至適発現のための重要でありうる。選択ベクターが複製起点部位を含まない場合には、既知の配列に基づいて化学合成し、該ベクター内に連結してもよい。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，マサチューセッツ州（ＭＡ））からの複製起点は大部分のグラム陰性菌に適しており、様々な起点（例えばＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、あるいはＨＰＶ又はＢＰＶのようなパピローマウイルス）が哺乳類細胞におけるクローニングベクターのために有用である。一般に、複製起点成分は哺乳類発現ベクターには必要ない（例えばＳＶ４０起点は、初期プロモーターを含むというだけの理由でしばしば使用される）。
【０１１３】
転写終結配列は、典型的にはポリペプチドコード領域の末端の３’側に位置し、転写を終結させる働きをする。通常、原核細胞における転写終結配列は、ポリ−Ｔ配列がそれに続く、Ｇ−Ｃに富むフラグメントである。前記配列はライブラリーからクローンから容易にクローン化されるか、さらにはベクターの一部として市販のものが購入されるが、ここで述べるような核酸合成のための方法を用いて容易に合成することもできる。
【０１１４】
選択マーカー遺伝子エレメントは、選択培地で成長する宿主細胞の生存と増殖のために必要なタンパク質をコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）抗生物質又は他の毒素、例えば原核宿主細胞についてはアンピシリン、テトラサイクリン又はカナマイシン、に対する耐性を与える；（ｂ）細胞の栄養要求欠損を補う；又は（ｃ）複合培地からは得られない重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードする。好ましい選択マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、及びテトラサイクリン耐性遺伝子である。ネオマイシン耐性遺伝子も原核及び真核宿主細胞における選択のために使用しうる。
【０１１５】
他の選択遺伝子は、発現される遺伝子を増幅するために使用しうる。増幅は、成長に不可欠なタンパク質の生産のためにより需要の大きい遺伝子が、組換え細胞の連続する世代の染色体内で縦列反復される過程である。哺乳類細胞のための適切な選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）及びチミジンキナーゼを含む。哺乳類細胞形質転換体を、該形質転換体だけがベクター内に存在する選択遺伝子によって唯一生存に適応する、淘汰圧下に置く。培地中の選択剤の濃度を連続的に変化させ、それによって選択遺伝子とＧＰＣＲポリペプチドをコードするＤＮＡの両方の増幅を導く条件下で該形質転換細胞を培養することによって、淘汰圧を課す。結果として、増幅したＤＮＡからより高い量のＧＰＣＲポリペプチドが合成される。
【０１１６】
リボソーム結合部位は、通常、ｍＲＮＡの翻訳開始のために必要であり、シャイン−ダルガーノ配列（原核生物）又はコザック配列（真核生物）によって特徴付けられる。このエレメントは、典型的にはプロモーターの３’側及び発現されるＧＰＣＲポリペプチドのコード配列の５’側に位置する。シャイン−ダルガーノ配列は多様であるが、典型的にはポリプリンである（すなわち高いＡ−Ｇ含量を有する）。多くのシャイン−ダルガーノ配列が特定されており、それらの各々がここで述べる方法を用いて容易に合成でき、原核生物ベクターにおいて使用できる。
【０１１７】
リーダー又はシグナル配列は、ＧＰＣＲポリペプチドを宿主細胞から外部へと指令するために使用しうる。典型的には、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列をＧＰＣＲ核酸分子のコード領域内に置くか、又は直接ＧＰＣＲポリペプチドコード領域の５’末端に置く。多くのシグナル配列が特定されており、選択する宿主細胞において機能性であるものはいずれも、ＧＰＣＲ核酸分子に関連して使用しうる。それ故、シグナル配列はＧＰＣＲ核酸分子に相同であるか（天然に生じる）又は異種でありうる。さらに、シグナル配列はここで述べる方法を用いて化学合成することができる。ほとんどの場合、シグナルペプチドの存在を通しての宿主細胞からのＧＰＣＲポリペプチドの分泌は、分泌されたＧＰＣＲポリペプチドからシグナルペプチドの除去をもたらす。シグナル配列はベクターの成分であってもよく、又はベクター内に挿入するＧＰＣＲ核酸分子の一部であってもよい。
【０１１８】
ＧＰＣＲポリペプチドコード領域に連結された天然ＧＰＣＲポリペプチドシグナル配列をコードするヌクレオチド配列又はＧＰＣＲポリペプチドコード領域に連結された異種シグナル配列をコードするヌクレオチド配列の使用は、本発明の範囲内に含まれる。選択する異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識され、プロセシングされるもの、すなわちシグナルペプチダーゼによって開裂されるものでなければならない。天然ＧＰＣＲポリペプチドシグナル配列を認識せず、プロセシングしない原核宿主細胞については、前記シグナル配列を、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ又は熱安定エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列で置換する。酵母分泌については、天然ＧＰＣＲポリペプチドシグナル配列を酵母インベルターゼ、α因子又は酸性ホスファターゼリーダーで置換しうる。哺乳類細胞の発現においては天然シグナル配列で十分であるが、他の哺乳類シグナル配列も適する。
【０１１９】
真核宿主細胞発現系においてグリコシル化を所望する場合のように、一部の場合には、様々なプレ配列を、グリコシル化又は収率を改善するように操作しうる。例えば、特定シグナルペプチドのペプチダーゼ開裂部位を変化させてもよく、又は同様にグリコシル化に影響を及ぼしうるプロ配列を付加してもよい。最終タンパク質産物は、−１位に（成熟タンパク質の第一アミノ酸に対して）、完全には除去されなかったと考えられる、発現に付随する１個又はそれ以上の付加アミノ酸を有しうる。例えば、最終タンパク質産物は、アミノ末端に結合した、ペプチダーゼ開裂部位に認められる１個又は２個のアミノ酸残基を有しうる。選択的に、一部の酵素開裂部位の使用は、該酵素が成熟ポリペプチド内のそのような領域を切断する場合、わずかにトランケートされた形態の所望ＧＰＣＲポリペプチドを生じうる。
【０１２０】
多くの場合、核酸分子の転写はベクター内に１又はそれ以上のイントロンが存在することによって高められる。これは特に、ポリペプチドが真核宿主細胞、とりわけ哺乳類宿主細胞において生産される場合に当てはまる。使用するイントロンは、特に使用する遺伝子が完全長ゲノム配列又はそのフラグメントである場合に、ＧＰＣＲ遺伝子内で天然に生じうる。イントロンが遺伝子内で天然に生じない場合は（大部分のｃＤＮＡの場合）、イントロンをもう１つ別のソースから入手しうる。イントロンは有効に転写されねばならないので、フランキング配列及びＧＰＣＲ遺伝子に対するイントロンの位置は一般に重要である。そこで、ＧＰＣＲ  ｃＤＮＡ分子が転写されるとき、イントロンの好ましい位置は、転写開始部位の３’側及びポリ−Ａ転写終結配列の５’側である。好ましくは、この１個又はそれ以上のイントロンは、コード配列を中断しないようにｃＤＮＡの一方の側又は他方の側（すなわち５’又は３’）に位置する。ウイルス、原核及び真核（植物又は動物）生物を含めて、いかなるソースからのいかなるイントロンも、それを挿入する宿主細胞と適合性であることを条件として、本発明を実施するために使用しうる。場合によっては、２個以上のイントロンをベクターにおいて使用しうる。
【０１２１】
本発明の発現ベクター及びクローニングベクターは、典型的には、宿主生物によって認識され、ＧＰＣＲポリペプチドをコードする分子に作動可能に連結されたプロモーターを含む。プロモーターは、構造遺伝子（一般に約１００〜１０００塩基対）の転写を制御する、構造遺伝子の開始コドンの上流（すなわち５’側）に位置する非転写配列である。プロモーターは慣例的に２つのクラスのいずれかに分類される：誘導的プロモーター及び構成的プロモーター。誘導的プロモーターは、養分の存在又は不在あるいは温度変化のような、培養条件のある種の変化に応答して、それらの制御下にあるＤＮＡからの高いレベルの転写を開始させる。構成的プロモーターは、他方で、連続的な遺伝子産物の生産を開始させる；すなわち、遺伝子発現への制御はほとんどあるいは全く存在しない。様々な潜在的宿主細胞によって認識される数多くのプロモーターが広く知られている。適切なプロモーターを、そのソースＤＮＡから制限酵素消化によって取り出し、所望プロモーター配列をベクターに挿入することによって、ＧＰＣＲポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結する。天然ＧＰＣＲプロモーター配列が、ＧＰＣＲ核酸分子の増幅及び／又は発現を指令するために使用しうる。しかしながら、天然プロモーターに比べてより高い転写と発現タンパク質のより高い収率を得ようとする場合、及び使用のために選択した宿主細胞系と適合性である場合には、異種プロモーターが好ましい。
【０１２２】
原核生物宿主に関する使用に適したプロモーターは、β−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系；アルカリホスファターゼ；トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系；及びｔａｃプロモーターのようなハイブリッドプロモーターを包含する。他の既知の細菌プロモーターも適する。それらの配列は公開されており、当業者は、有用な制限部位を与えるために必要に応じてリンカー又はアダプターを使用して、それらを所望ＤＮＡ配列に連結することができる。
【０１２３】
酵母宿主に関する使用に適したプロモーターもこの分野において周知である。酵母エンハンサーは酵母プロモーターと共に好都合に使用される。哺乳類宿主細胞に関する使用に適したプロモーターは周知であり、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、及び最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムから得られるものを含むが、これらに限定されない。他の適切な哺乳類プロモーターは、異種哺乳類プロモーター、例えば熱ショックプロモーター及びアクチンプロモーターを包含する。
【０１２４】
ＧＰＣＲ遺伝子発現を制御する上で興味深いと考えられるさらなるプロモーターは、次のものを含むが、これらに限定されない：ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔとＣｈａｍｂｏｎ、１９８１、Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−１０）；ＣＭＶプロモーター；ラウス肉腫ウイルスの３’ロングターミナルリピートに含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９８０、Ｃｅｌｌ  ２２：７８７−９７）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４４−４５）；メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８２、Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２）；β−ラクタマーゼプロモーターのような原核生物発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら、１９７８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、７５：３７２７−３１）；又はｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８０：２１−２５）。組織特異性を示し、トランスジェニック動物において使用されてきた、次のような動物転写制御領域も興味深い：膵腺房細胞において活性なエラスターゼＩＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔら、１９８４、Ｃｅｌｌ  ３８：６３９−４６；Ｏｒｎｉｔｚら、１９８６；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９（１９８６）；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ７：４２５−５１５）；膵β細胞において活性なインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５、Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：１１５−２２）；リンパ系細胞において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら、１９８４、Ｃｅｌｌ  ３８：６４７−５８；Ａｄａｍｅｓら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：５３３−３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、１９８７、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：１４３６−４４）；精巣、乳房、リンパ系細胞及びマスト細胞において活性なマウス乳腺癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒら、１９８６、Ｃｅｌｌ  ４５：４８５−９５）；肝において活性なアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら、１９８７、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−７６）；肝において活性なαフェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら、１９８５、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：１６３９−４８；Ｈａｍｍｅｒら、１９８７、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：５３−５８）；肝において活性なα１アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙら、１９８７、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−７１）；骨髄性細胞において活性なβグロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：３３８−４０；Ｋｏｌｌｉａｓら、１９８６、Ｃｅｌｌ  ４６：８９−９４）；脳内の乏突起神経膠細胞において活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら、１９８７、Ｃｅｌｌ  ４８：７０３−１２）；骨格筋において活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，１９８５、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２８３−８６）；及び視床下部において活性な性腺刺��ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎら、１９８６、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：１３７２−７８）。
【０１２５】
高等真核生物による、本発明のＧＰＣＲポリペプチドをコードするＤＮＡの転写を高めるために、エンハンサー配列をベクターに挿入してもよい。エンハンサーは、転写を高めるようにプロモーターに作用する、通常約１０〜３００塩基対の長さの、ＤＮＡのシス作用性エレメントである。エンハンサーは比較的方向や位置に無関係である。それらは転写単位の５’側及び３’側で認められている。哺乳類遺伝子から入手可能ないくつかのエンハンサー配列が知られている（例えばグロビン、エラスターゼ、アルブミン、αフェトプロテイン及びインスリン）。典型的には、しかしながら、ウイルスからのエンハンサーが使用される。ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが、真核生物プロモーターの活性化のための例示的なエンハンサーエレメントである。エンハンサーはＧＰＣＲ核酸分子の５’側又は３’側でベクターにスプライシングされうるが、典型的にはプロモーターから５’側の部位に位置する。
【０１２６】
本発明の発現ベクターは、市販されているベクターのような出発ベクターから構築しうる。そのようなベクターは、所望フランキング配列の全部を含んでいてもよく、又は全部は含んでいなくてもよい。ここで述べるフランキング配列の１個又はそれ以上が既にベクター内に存在していない場合、それらをここに入手して、ベクターに連結しうる。各々のフランキング配列を得るために使用する方法は、当業者には周知である。
【０１２７】
本発明を実施するための好ましいベクターは、細菌、昆虫及び哺乳類宿主細胞と適合性であるベクターである。そのようなベクターは、とりわけ特に、ｐＣＲＩＩ、ｐＣＲ３及びｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，カリフォルニア州（ＣＡ））、ｐＢＳＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，カリフォルニア州（ＣＡ））、ｐＥＴ１５（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ウィスコンシン州（ＷＩ））、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ニュージャージー州（ＮＪ））、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，カリフォルニア州（ＣＡ））、ｐＥＴＬ（ＢｌｕｅＢａｃＩＩ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＤＳＲ−α（国際公開公報第ＷＯ９０／１４３６３号）及びｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ニューヨーク州（ＮＹ））を包含する。
【０１２８】
さらなる適切なベクターは、コスミド、プラスミド又は改変ウイルスを含むが、これらに限定されず、但し、ベクター系が選択宿主細胞と適合性でなければならないことは認識される。そのようなベクターは、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）プラスミド誘導体（高いコピー数のＣｏｌＥ１ベースのファージミド；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，カリフォルニア州（ＣＡ））、Ｔａｑ増幅したＰＣＲ産物をクローニングするために設計されたＰＣＲクローニングプラスミド（例えばＴＯＰＯ（商標）ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）キット及びＰＣＲ２．１（登録商標）プラスミド誘導体；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のようなプラスミド、及びバキュロウイルス発現系（ｐＢａｃＰＡＫプラスミド誘導体；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のような哺乳類、酵母又はウイルスベクターを含むが、これらに限定されない。
【０１２９】
ベクターを構築し、ＧＰＣＲポリペプチドをコードする核酸分子をベクターの適切な部位に挿入した後、完成したベクターを増幅及び／又はポリペプチド発現のために適切な宿主細胞に挿入しうる。ＧＰＣＲポリペプチドについての発現ベクターの選択宿主細胞への形質転換は、トランスフェクション、感染、塩化カルシウム法、電気穿孔法、微量注入法、リポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン法、又は他の既知の手法を含めて、周知の方法によって実施しうる。選択する方法は、一部には使用する宿主細胞の種類に依存する。これらの方法や他の適切な方法は当業者に周知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（前出）の中に示されている。
【０１３０】
宿主細胞は、原核宿主細胞（大腸菌など）又は真核宿主細胞（酵母、昆虫又は脊椎動物細胞など）のいずれでもよい。宿主細胞は、適切な条件下で培養したとき、ＧＰＣＲポリペプチドを合成し、その後それを培地から収集するか（宿主細胞がＧＰＣＲポリペプチドを培地中に分泌する場合）又はＧＰＣＲポリペプチドを産生する宿主細胞から直接採集する（ＧＰＣＲポリペプチドが分泌されない場合）ことができる。適切な宿主細胞の選択は、所望発現レベル、活性のために望ましい又は必要なポリペプチド修飾（グリコシル化又はリン酸化など）及び生物活性物質への折りたたみの容易さのような、様々な因子に依存する。
【０１３１】
いくつもの適切な宿主細胞がこの分野で知られており、多くはｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，，バージニア州（ＶＡ）から入手しうる。それらの例は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＣＨＯ  ＤＨＦＲ（−）細胞（Ｕｒｌａｕｂら、１９８０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７：４２１６−２０）、ヒト胚腎（ＨＥＫ）２９３又は２９３Ｔ細胞、あるいは３Ｔ３細胞を含むが、これらに限定されない。適切な哺乳類宿主細胞の選択、及び形質転換、培養、増幅、スクリーニング、産物生産及び精製のための方法はこの分野において既知である。他の適切な哺乳類細胞系は、サルＣＯＳ−１及びＣＯＳ−７細胞系、及びＣＶ−１細胞系である。さらなる例としての哺乳類宿主細胞は、形質転換細胞系を含めて、霊長類細胞系及びげっ歯類細胞系を含む。正常二倍体細胞、一次組織のインビトロ培養から誘導される細胞株ならびに一次外植片も適する。候補細胞は、選択遺伝子において遺伝子型的に欠損していてもよく、又は優性作用性選択遺伝子を含んでいてもよい。他の適切な哺乳類細胞系は、マウス神経芽細胞種Ｎ２Ａ細胞、ＨｅＬａ、マウスＬ−９２９細胞、Ｓｗｉｓｓ、Ｂａｌｂ−ｃ又はＮＩＨマウスから誘導される３Ｔ３系統、ＢＨＫ又はＨａＫハムスター細胞系統を含むが、これらに限定されない。これらの細胞系は各々、タンパク質発現の分野の当業者には既知であり、入手可能である。
【０１３２】
本発明に適した宿主細胞として同様に有用であるのは細菌細胞である。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の様々な菌株（例えばＨＢ１０１、ＤＨ５α、ＤＨ１０及びＭＣ１０６１）がバイオテクノロジーの分野における宿主細胞として周知である。枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、他のＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．などもこの方法において使用しうる。
【０１３３】
当業者に既知の多くの菌株の酵母細胞も、本発明のポリペプチドの発現のための宿主細胞として入手可能である。好ましい酵母細胞は、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓを包含する。
【０１３４】
さらに、所望する場合は、昆虫細胞系が本発明の方法において使用しうる。そのような系は、例えば、Ｋｉｔｔｓら、１９９３、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１４：８１０−１７；Ｌｕｃｋｌｏｗ，１９９３，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：５６４−７２；及びＬｕｃｋｌｏｗら、１９９３、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７：４５６６−７９に述べられている。好ましい昆虫細胞はＳｆ−９及びＨｉ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。
【０１３５】
グリコシル化ＧＰＣＲポリペプチドを発現するためにトランスジェニック動物も使用しうる。例えば、トランスジェニック乳生産動物（例えば雌牛又はヤギ）を使用して、動物の乳において本発明のグリコシル化ポリペプチドを得ることができる。また、ＧＰＣＲポリペプチドを生産するために植物も使用しうるが、一般に、植物で起こるグリコシル化は哺乳類細胞で生じるものとは異なっており、ヒト治療用途には適さないグリコシル化生成物を生じうる。
【０１３６】
（ポリペプチドの生産）
ＧＰＣＲポリペプチド発現ベクターを含む宿主細胞は、当業者に周知の標準培地を使用して培養しうる。前記培地は通常、細胞の発育と生存に必要なすべての栄養素を含む。大腸菌細胞を培養するための適切な培地は、例えばルリア肉汁（ＬＢ）及び／又はテリフィック肉汁（ＴＢ）を包含する。真核細胞を培養するための適切な培地は、Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ培地１６４０（ＲＰＭＩ  １６４０）、最小必須培地（ＭＥＭ）及び／又はダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を包含し、それらはすべて、培養する個々の細胞系の必要に応じて血清及び／又は成長因子を補足しうる。昆虫細胞についての適切な培地は、必要に応じてイーストレート、ラクトアルブミン加水分解産物及び／又はウシ胎仔血清を補足したグレース培地である。
【０１３７】
典型的には、トランスフェクトした細胞又は形質転換細胞の選択的増殖に有用な抗生物質又は他の化合物を補足物として培地に加える。使用すべき化合物は、それによって宿主細胞が形質転換されたプラスミド上に存在する選択マーカーエレメントによって決定される。例えば、選択マーカーエレメントがカナマイシン耐性である場合には、培地に加える化合物はカナマイシンである。選択的増殖のための他の化合物は、アンピシリン、テトラサイクリン及びネオマイシンを包含する。
【０１３８】
宿主細胞によって生産されるＧＰＣＲポリペプチドの量は、この分野において既知の標準的方法によって評価することができる。そのような方法は、限定を伴わずに、ウエスタンブロット分析、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、非変性ゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分離、免疫沈降法、及び／又はＤＮＡ結合ゲルシフト分析のような活性検定法を包含する。
【０１３９】
ＧＰＣＲポリペプチドが宿主細胞から分泌されるように設計されている場合、大部分のポリペプチドは細胞培地中に認められうる。しかし、ＧＰＣＲポリペプチドが宿主細胞から分泌されない場合には、該ポリペプチドは細胞質及び／又は核内（真核宿主細胞の場合）又はサイトゾル内（グラム陰性菌宿主細胞の場合）に存在する。
【０１４０】
宿主細胞の細胞質及び／又は核内（真核宿主細胞の場合）又はサイトゾル内（細菌宿主細胞の場合）に存在するＧＰＣＲポリペプチドについては、当業者に既知の何らかの標準手法を用いて細胞内物質（グラム陰性菌についての封入体を含む）を宿主細胞から抽出することができる。例えば、フレンチプレス、均質化、及び／又は音波処理とそれに続く遠心分離によって宿主細胞を溶解し、ペリプラズム及び／又は細胞質の内容物を放出させることができる。
【０１４１】
ＧＰＣＲポリペプチドがサイトゾル内で封入体を形成した場合、その封入体はしばしば細胞内膜及び／又は細胞外膜に結合することができ、それ故、主として遠心分離後のペレット物質中で認められる。このペレット物質を、その後、極値ｐＨで処理するか、あるいはアルカリ性ｐＨでのジチオトレイトール又は酸性ｐＨでのトリスカルボキシエチルホスフィンのような還元剤の存在下に、界面活性剤、グアニジン、グアニジン誘導体、尿素又は尿素誘導体のようなカオトロピック試薬で処理して、封入体を放出させ、破壊分離して、可溶化することができる。次にこの可溶化したＧＰＣＲポリペプチドを、ゲル電気泳動、免疫沈降法などを用いて分析することができる。ＧＰＣＲポリペプチドを単離することを所望する場合は、ここで述べる方法やＭａｒｓｔｏｎら、１９９０、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．、１８２：２６４−７５に述べられている方法のような標準的方法を用いて単離しうる。
【０１４２】
一部の場合には、単離した時にＧＰＣＲポリペプチドが生物活性でないことがある。ポリペプチドをその三次構造へと「リフォールディング」する又は転換するため、及びジスルフィド結合を生成するための様々な方法が、生物活性を回復するために使用できる。そのような方法は、前記可溶化ポリペプチドを、一定濃度のカオトロピック試薬の存在下で通常は７を超えるｐＨに接触させることを含む。このカオトロピック試薬の選択は、封入体可溶化のために使用する選択試薬と非常に類似するが、通常このカオトロピック試薬はより低い濃度で使用され、可溶化に使用するカオトロピック試薬と必ずしも同じではない。ほとんどの場合、リフォールディング／酸化溶液はまた、還元剤、あるいはタンパク質のシステイン架橋の形成において起こるジスルフィド交換を可能にする特定のレドックス潜在能を生じさせるような特定比率で還元剤プラスその酸化形態を含む。一般的に使用されるレドックス対の一部は、システイン／シスタミン、グルタチオン（ＧＳＨ）／ジチオビスＧＳＨ、塩化第二銅、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）／ジチアンＤＴＴ、及び２−２−メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ジチオ−ｂ（ＭＥ）を含む。多くの場合、共溶媒を使用しうるか、又はリフォールディングの効率を高めるために必要であると考えられ、このために使用されるより一般的な試薬は、グリセロール、様々な分子量のポリエチレングリコール、アルギニンなどを包含する。
【０１４３】
ＧＰＣＲポリペプチドの発現時に封入体が有意の度合で形成されない場合には、このポリペプチドは、細胞ホモジネートの遠心分離後主として上清中に認められる。ここで述べるような方法を用いて前記ポリペプチドを上清からさらに単離しうる。
【０１４４】
溶液からのＧＰＣＲポリペプチドの精製は様々な手法を用いて実施することができる。前記ポリペプチドが、そのカルボキシル末端又はアミノ末端のいずれかにヘキサヒスチジン（ＧＰＣＲポリペプチド／ヘキサＨｉｓ）又はＦＬＡＧ（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，コネチカット（ＣＴ））のような他の低分子量ペプチド又はｍｙｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などのタグを含むように合成されている場合は、該溶液を、カラムマトリックスが前記タグに高いアフィニティーを持つアフィニティーカラムを通すことによる１段階工程で精製しうる。
【０１４５】
例えば、ポリヒスチジンは高いアフィニティーと特異性でニッケルに結合する。それ故、ＧＰＣＲポリペプチド／ポリＨｉｓの精製にはニッケルのアフィニティーカラム（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）ニッケルカラムなど）が使用できる。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  §１０．１１．８（Ａｕｓｕｂｅｌら、編集、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．及びＷｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  １９９３）参照。
【０１４６】
さらに、ＧＰＣＲポリペプチドは、ＧＰＣＲポリペプチドを特異的に認識し、結合することができるモノクローナル抗体の使用を通して精製することができる。
【０１４７】
精製のための他の適切な方法は、限定を伴わずに、アフィニティークロマトグラフィー、免疫アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、電気泳動（天然ゲル電気泳動を含む）とそれに続くゲル溶出、及び分取等電点電気泳動（「Ｉｓｏｐｒｉｍｅ」機器／手法、Ｈｏｅｆｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，カリフォルニア州（ＣＡ））を包含する。一部の場合には、２又はそれ以上の精製手法を組み合わせて高い純度を達成してもよい。
【０１４８】
ＧＰＣＲポリペプチドはまた、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら、１９６３、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、１９８５、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：５１３２；及びＳｔｅｗａｒｔとＹｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，１９８４）に示されているようなこの分野で既知の手法を用いた化学合成法（固相ペプチド合成など）によっても調製しうる。そのようなポリペプチドは、アミノ末端上のメチオニンと共に又はメチオニンなしで合成しうる。化学合成したＧＰＣＲポリペプチドは、ジスルフィド架橋を形成するためにこれらの参考文献で述べられている方法を用いて酸化しうる。化学合成ＧＰＣＲポリペプチドは、組換えによって生産された又は天然ソースから精製された対応するＧＰＣＲポリペプチドと同等の生物活性を有すると期待され、それ故組換え又は天然ＧＰＣＲポリペプチドと交換可能に使用しうる。
【０１４９】
ＧＰＣＲポリペプチドを得るもう１つの手段は、ＧＰＣＲポリペプチドが天然に認められるソース組織及び／又は流体のような生物学的試料からの精製によるものである。そのような精製は、ここで述べるようなタンパク質精製のための方法を用いて実施できる。精製の間のＧＰＣＲポリペプチドの存在は、例えば、組換え生産したＧＰＣＲポリペプチド又はそのペプチドフラグメントに対して作製した抗体を用いて監視しうる。
【０１５０】
核酸及びポリペプチドを生産するための多くの付加的な方法がこの分野において既知であり、これらの方法を使用してＧＰＣＲポリペプチドに特異性を有するポリペプチドを生産することができる。例えば、ｍＲＮＡとそのコードするペプチドの間の融合タンパク質の生産を述べた、Ｒｏｂｅｒｔｓら、１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１２２９７−３０３参照。また、Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９９，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．３：２６８−７３も参照のこと。加えて、米国特許第５，８２４，４６９号は、特定生物機能を実施することができるオリゴヌクレオチドを得るための方法を述べている。この方法は、各々が５’ランダム配列、中央の事前選択配列及び３’ランダム配列を有する、オリゴヌクレオチドの不均一なプールを生成することを含む。生じた不均一プールを、所望生物機能を示さない細胞個体群に導入する。次に細胞のサブ個体群を、あらかじめ定められた生物機能を示すものに関してスクリーニングする。そのサブ個体群から、所望生物機能を果たすことができるオリゴヌクレオチドを単離する。
【０１５１】
米国特許第５，７６３，１９２号；同第５，８１４，４７６号；同第５，７２３，３２３号；及び同第５，８１７，４８３号は、ペプチド又はポリペプチドを生産するための方法を述べている。これは、確率的遺伝子又はそのフラグメントを生産すること、そしてこれらの遺伝子を、確率的遺伝子によってコードされる１又はそれ以上のタンパク質を産生する宿主細胞に導入することによって実施される。次に前記宿主細胞をスクリーニングして、所望活性を有するペプチド又はポリペプチドを生産するクローンを特定する。
【０１５２】
ペプチド又はポリペプチドを生産するもう１つの方法は、Ａｔｈｅｒｓｙｓ，Ｉｎｃ．によって出願された国際公開公報第ＷＯ９９／１５６５０号に述べられている。「遺伝子発見のための遺伝子発現のランダム活性化（Ｒａｎｄｏｍ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）」（ＲＡＧＥ−ＧＤ）として知られるこの方法は、インサイチュー組換え法による内在性遺伝子発現の活性化又は遺伝子の過剰発現を含む。例えば、非相同的又は非正統的組換えにより、遺伝子の発現を活性化することができる調節配列を標的細胞に組み込むことによって内在性遺伝子の発現を活性化する又は上昇させる。標的ＤＮＡをまず放射線に供して、遺伝子プロモーターを挿入する。このプロモーターは最終的には遺伝子の前方の切断点に位置し、害遺伝子の転写を開始させる。これは所望ペプチド又はポリペプチドの発現をもたらす。
【０１５３】
これらの方法はまた、包括的ＧＰＣＲポリペプチド発現ライブラリーを創造するためにも使用でき、このライブラリーはその後、生化学的アッセイ、細胞アッセイ、及び全生物アッセイ（例えば植物、マウスなど）のような様々なアッセイにおいて高流量表現型スクリーニングのために使用できることは認識される。
【０１５４】
（合成）
ここで述べる核酸及びポリペプチド分子が組換え法及び他の手段によって生産しうることは、当業者に認識される。
【０１５５】
（選択的結合物質）
「選択的結合物質」の語は、１個又はそれ以上のＧＰＣＲポリペプチドに特異性を有する分子を表わす。適切な選択的結合物質は、抗体及びその誘導体、ポリペプチド、及び小分子を含むが、これらに限定されない。適切な選択的結合物質はこの分野で既知の方法を用いて調製しうる。本発明の例示的ＧＰＣＲポリペプチド選択的結合物質は、ＧＰＣＲポリペプチドの一定の部分に結合し、それによって該ポリヌクレオチドがＧＰＣＲポリペプチド受容体に結合するのを阻害することができる。
【０１５６】
ＧＰＣＲポリペプチドに結合する抗体及び抗体フラグメントのような選択的結合物質は、本発明の範囲内に包含される。該抗体は、単一特異性ポリクローナル、モノクローナル（ＭＡＢｓ）、組換え、キメラ、相補性決定領域（ＣＤＲ）移植のようなヒト化、ヒト、単鎖、及び／又は二重特異性、を含むポリクローナル、ならびにそのフラグメント、変異体又は誘導体でありうる。抗体フラグメントは、ＧＰＣＲポリペプチド上のエピトープに結合する該抗体の部分を含む。そのようなフラグメントの例は、完全長抗体の酵素的開裂によって生成されるＦａｂ及びＦ（ａｂ）’フラグメントを包含する。他の結合フラグメントは、抗体可変領域をコードする核酸配列を含む組換えプラスミドの発現のような、組換えＤＮＡ手法によって生成されるものを含む。
【０１５７】
ＧＰＣＲポリペプチドに対するポリクローナルは抗体、一般に、ＧＰＣＲポリペプチドとアジュバントの多回皮下注射又は腹腔内注射により動物（例えばウサギ又はマウス）において作製される。キーホールリンペットヘモシアニン、血清、アルブミン、ウシチログロブリン又はダイズトリプシン阻害因子のような、免疫される宿主細胞において免疫原性である輸送タンパク質にＧＰＣＲポリペプチドを複合することは有用である。また、ミョウバンのような凝集物質も、免疫応答を増強するために使用される。免疫後、前記動物から採血し、その血清を抗ＧＰＣＲ抗体力価に関して検定する。
【０１５８】
ＧＰＣＲポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、培養中の連続細胞系統による抗体分子の産生を提供する何らかの方法を用いて作製される。モノクローナル抗体を作製するための適切な方法の例は、Ｋｏｈｌｅｒら、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−９７のハイブリドーマ法及びヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ，１９８４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９８７）を包含する。また、ＧＰＣＲポリペプチドと反応性であるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系統も本発明によって提供される。
【０１５９】
本発明のモノクローナル抗体は、治療薬としての使用のために改変しうる。１つの実施態様は、重（Ｈ）及び／又は軽（Ｌ）鎖の一部が、特定種から誘導される又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体における対応配列と同一又は相同であり、前記鎖の残りの部分は、もう１つ別の種から誘導される又はもう１つ別の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体内の対応配列と同一又は相同である、「キメラ」抗体である。また、そのような抗体のフラグメントも、それらが所望生物活性を示す限り、包含される。米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１−５５参照。
【０１６０】
もう１つの実施態様では、本発明のモノクローナル抗体は「ヒト化」抗体である。非ヒト抗体をヒト化するための方法はこの分野において周知である。米国特許第５，５８５，０８９号及び同第５，６９３，７６２号参照。一般に、ヒト化抗体は、ヒト以外のソースからその中に導入された１個又はそれ以上のアミノ酸残基を有する。ヒト化は、例えば、ヒト抗体の対応領域をげっ歯類の相補性決定領域の少なくとも一部で置き換えることにより、この分野で記述されている方法を用いて（Ｊｏｎｅｓら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−２７；Ｖｅｙｈｏｅｙｅｎら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−３６）実施することができる。
【０１６１】
ＧＰＣＲポリペプチドに結合するヒト抗体も本発明に包含される。内在性免疫グロブリンの不在下でヒト抗体の集成を生産することができるトランスジェニック動物（例えばマウス）を使用して、場合によっては担体に複合した、ＧＰＣＲポリペプチド抗原（すなわち少なくとも６個の隣接アミノ酸を有する）で免疫することによってそのような抗体を作製する。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：２５５１−５５；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−５８；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、１９９３、Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．７：３３参照。１つの方法では、そのようなトランスジェニック動物は、その内部の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖をコードする内在性遺伝子座を無効にし、ヒト重鎖及び軽鎖タンパク質をコードする遺伝子座をそのゲノムに挿入することによって作製する。次に、部分的に改変された動物（すなわち完全な改変未満を有するもの）を交雑して、すべての所望免疫系改変を有する動物を得る。免疫原を投与したとき、これらのトランスジェニック動物は、これらの抗原に免疫特異的な可変領域を含む、ヒト（例えばマウスではなく）アミノ酸配列を有する抗体を産生する。国際特許願第ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５９２８号及び同第ＰＣＴ／ＵＳ９３／０６９２６号参照。さらなる方法は、米国特許第５，５４５，８０７号、国際特許願第ＰＣＴ／ＵＳ９１／２４５号及び同第ＰＣＴ／ＧＢ８９／０１２０７号、及び欧州特許第５４６０７３Ｂ１号及び同第５４６０７３Ａ１号に述べられている。ヒト抗体はまた、宿主細胞における組換えＤＮＡの発現によって又はここで述べるようなハイブリドーマ細胞における発現によって作製することができる。
【０１６２】
選択的実施態様では、ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーから生産することもできる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１；Ｍａｒｋｓら、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１）。これらの方法は、糸状バクテリオファージの表面に抗体リストを提示し、その後選択抗原へのそれらの結合によってファージを選択することを通して、免疫選択を模倣する。そのような手法の１つは国際特許願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／１７３６４号に述べられており、これは、そのようなアプローチを使用したＭＰＬ受容体及びｍｓｋ受容体についての高親和性及び機能性アゴニスト抗体の単離を説明している。
【０１６３】
キメラ、ＣＤＲ移植及びヒト化抗体は、典型的には組換え法によって作製される。ここで述べる材料及び方法を使用して、前記抗体をコードする核酸を宿主細胞に導入し、発現させる。好ましい実施態様では、ＣＨＯ細胞のような哺乳類宿主細胞において前記抗体を作製する。モノクローナル（例えばヒト）抗体は、宿主細胞における組換えＤＮＡ発現によって又はここで述べるようなハイブリドーマ細胞における発現によって生成されうる。
【０１６４】
本発明の抗ＧＰＣＲ抗体は、ＧＰＣＲポリペプチドの検出と定量のための競合結合測定法、直接及び間接サンドイッチ測定法、及び免疫沈降測定法（Ｓｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４７−１５８（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）のような既知の検定法において使用しうる。前記抗体は、用いる検定法にとって適切な親和性でＧＰＣＲポリペプチドに結合する。
【０１６５】
診断適用のために、一部の実施態様では、抗ＧＰＣＲ抗体を検出可能な成分で標識しうる。検出可能成分は、直接又は間接に、検出可能なシグナルを生じることができるものでありうる。例えば、検出可能成分は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ又は６７Ｇａのような放射性同位体；フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン又はルシフェリンのような蛍光又は化学発光化合物；アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ又はホースラディッシュペルオキシダーゼのような酵素（Ｂａｙｅｒら、１９９０、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１８４：１３８−６３）でありうる。
【０１６６】
競合結合測定法は、限られた量の抗ＧＰＣＲ抗体との結合に関して被験試料分析物（ＧＰＣＲポリペプチド）と競合する標識標準品（例えばＧＰＣＲポリペプチド又はその免疫反応性部分）の能力に基づく。被験試料中のＧＰＣＲポリペプチドの量は、前記抗体に結合する標準品の量に逆比例する。結合する標準品の量の測定を容易にするために、前記抗体は典型的には競合の前又は後に不溶化されるので、該抗体に結合している標準品と分析物は、結合しないままの標準品及び分析物とは好都合に分離されうる。
【０１６７】
サンドイッチ測定法は、典型的には２個の抗体の使用を含み、それらの抗体の各々は、検出する及び／又は定量するタンパク質の異なる免疫原性部分又はエピトープに結合することができる。サンドイッチ測定法では、被験試料分析物は、典型的には保持体に固定された第一抗体によって結合され、その後第二抗体が分析物に結合して、不溶性の３つの部分から成る複合体を形成する。例えば、米国特許第４，３７６，１１０号参照。前記第二抗体は、それ自体が検出可能成分で標識されていてもよく（直接サンドイッチ測定法）又は検出可能成分で標識した抗免疫グロブリン抗体を使用して測定してもよい（間接サンドイッチ測定法）。例えば、サンドイッチ測定法の１つのタイプは酵素結合イムノソルベント測定法（ＥＬＩＳＡ）であり、この場合検出可能成分は酵素である。
【０１６８】
抗ＧＰＣＲ抗体を含む選択的結合物質はまた、インビボ画像化においても有用である。検出可能成分で標識した抗体を動物に、好ましくは血流中に投与し、検定する宿主において前記標識抗体の存在と位置を測定する。この抗体は、核磁気共鳴、放射線学、又はこの分野で既知の他の検出手段により、動物において検出可能ないかなる成分で標識されていてもよい。
【０１６９】
抗体を含む、本発明の選択的結合物質は、治療薬として使用しうる。これらの治療薬は一般に、それぞれＧＰＣＲポリペプチドの生物活性の少なくとも１つを増強する又は低減するので、アゴニスト又はアンタゴニストである。１つの実施態様では、本発明のアンタゴニスト抗体は、インビボ又はインビトロで、ＧＰＣＲポリペプチドに特異的に結合することができ、ＧＰＣＲポリペプチドの機能的活性を阻害する又は排除することができる抗体又はその結合フラグメントである。好ましい実施態様では、選択的結合物質、例えばアンタゴニスト抗体は、ＧＰＣＲポリペプチドの機能的活性を少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約８０％阻害する。もう１つの実施態様では、選択的結合物質は、インビトロ又はインビボで、ＧＰＣＲポリペプチド結合パートナー（リガンド又は受容体）と相互作用し、それによってＧＰＣＲポリペプチドの活性を阻害する又は排除することができる、抗ＧＰＣＲポリペプチド抗体でありうる。アゴニスト及びアンタゴニスト抗ＧＰＣＲポリペプチド抗体を含めて、選択的結合物質は、この分野において周知のスクリーニングアッセイによって特定される。
【０１７０】
本発明はまた、ＧＰＣＲ選択的結合物質（抗体など）及び生物学的試料においてＧＰＣＲポリペプチドレベルを検出するために有用な他の試薬を含むキットに関する。そのような試薬は、検出可能標識、遮断血清、陽性及び陰性対照試料、及び検出試薬を含みうる。
【０１７１】
（マイクロアレイ）
ＤＮＡマイクロアレイテクノロジーが本発明によって利用できることは認識される。ＤＮＡマイクロアレイは、ガラスのような保持体上に配置された核酸の微小で高密度のアレイである。アレイ内の各々の細胞又はエレメントは、相補的核酸配列（例えばｍＲＮＡ）とのハイブリダイゼーションの標的として働く、単一核酸種の数多くのコピーを含む。ＤＮＡマイクロアレイテクノロジーを用いた発現プロファイルの作成では、まずｍＲＮＡを細胞又は組織標本から抽出し、次に酵素的に蛍光標識ｃＤＮＡに転換する。この物質をマイクロアレイにハイブリダイズさせ、非結合ｃＤＮＡを洗浄して除去する。その後、アレイ上に示された個々の遺伝子の発現を、各々の標的核酸分子に特異結合している標識ｃＤＮＡの量を測定することによって視覚化する。このようにして、数千個の遺伝子の発現を、生物学的物質の単一試料から平行して、高スループットで定量することができる。
【０１７２】
この高スループット発現プロファイル作成は、次のものを含むがこれらに限定されない、本発明のＧＰＣＲ分子に関する幅広い適用を有する：治療薬のための標的としてのＧＰＣＲ疾患関連遺伝子の特定と確認；関連ＧＰＣＲ分子及びその阻害因子の分子毒性；臨床試験のための個体群の層別と代理マーカーの生成；及び高スループットスクリーニングにおいて選択化合物の特定を助けることによる、関連ＧＰＣＲポリペプチド小分子薬剤開発の促進。
【０１７３】
（化学的誘導体）
ＧＰＣＲポリペプチドの化学修飾誘導体は、ここで述べる開示に従い、当業者によって調製されうる。ＧＰＣＲポリペプチド誘導体は、該ポリペプチドに天然結合している分子の種類又は位置のいずれかに関して、異なるように修飾される。誘導体は、１個又はそれ以上の天然結合化学基の欠失によって形成される分子を包含しうる。配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は他のＧＰＣＲポリペプチドは、１個又はそれ以上のポリマーの共有結合によって修飾しうる。例えば、選択するポリマーは典型的には水溶性であるので、それが結合するタンパク質は、生理的環境のような水性環境では沈降しない。ポリマーの混合物は適切なポリマーの範囲内に包含される。好ましくは、最終産物製剤の治療用途のために、前記ポリマーは治療上許容される。
【０１７４】
各々のポリマーはいかなる分子量であってもよく、分枝又は非分枝のいずれでもよい。各々のポリマーは、典型的には約２ｋＤａから約１００ｋＤａまで（「約」の語は、水溶性ポリマーの製剤中、いくつかの分子が言明される分子量より大きい又は小さいことを示す）の平均分子量を有する。各ポリマーの平均分子量は、好ましくは約５ｋＤａから約５０ｋＤａまで、より好ましくは約１２ｋＤａから約４０ｋＤａまで、最も好ましくは約２０ｋＤａから約３５ｋＤａまでである。
【０１７５】
適切なポリマー又はその混合物は、Ｎ結合又はＯ結合糖質、糖類、リン酸塩、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（モノ−（Ｃ１〜Ｃ１０）、アルコキシ又はアリールオキシポリエチレングリコールを含めて、タンパク質を誘導体化するために使用されてきたＰＥＧの形態を含む）、モノメトキシポリエチレングリコール、デキストラン（例えば約６ｋＤａの低分子量デキストランなど）、セルロース、又は他の糖質ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオル（例えばグリセロール）、及びポリビニルアルコールを含むが、これらに限定されない。また、共有結合ＧＰＣＲポリペプチド多量体を調製するために使用しうる二官能性架橋分子も本発明に包含される。
【０１７６】
一般に、化学的誘導体化は、タンパク質を活性化ポリマー分子と反応させるために使用する適切な条件下で実施しうる。ポリペプチドの化学的誘導体を調製するための方法は、一般に次の段階を含む：（ａ）配列番号２、配列番号４又は配列番号６のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド又は他のＧＰＣＲポリペプチドが、１個又はそれ以上のポリマー分子に結合する条件下で、該ポリペプチドを該活性化ポリマー分子（該ポリマー分子の反応性エステル又はアルデヒド誘導体など）と反応させること、及び（ｂ）反応産物を得ること。至適反応条件は、既知のパラメータと所望する結果に基づいて決定できる。例えば、タンパク質に対するポリマー分子の比率が大きいほど、結合するポリマー分子のパーセンテージは高くなる。１つの実施態様では、ＧＰＣＲポリペプチド誘導体はアミノ末端に単一ポリマー分子部分を有しうる。例えば米国特許第５，２３４，７８４号参照。
【０１７７】
ポリペプチドのＰＥＧ化は、この分野において既知のＰＥＧ化反応のいずれかを用いて特異的に実施しうる。そのような反応は、例えば、次の参考文献中に述べられている：Ｆｒａｎｃｉｓら、１９９２、Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ３：４−１０；欧州特許第０１５４３１６号及び同第０４０１３８４号、；及び米国特許第４，１７９，３３７号。例えば、ＰＥＧ化は、ここで述べるような反応性ポリエチレングリコール分子（又は類似反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応又はアルキル化反応を通して実施しうる。アシル化反応については、選択するポリマーは単一反応エステル基を有していなければならない。還元的アルキル化については、選択ポリマーは単一反応性アルデヒド基を有していなければならない。反応性アルデヒドは、例えば、水安定なポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド又はそのモノＣ１〜Ｃ１０アルコキシ又はアリールオキシ誘導体である（米国特許第５，２５２，７１４号参照）。
【０１７８】
もう１つの実施態様では、ＧＰＣＲポリペプチドはビオチンに化学結合しうる。次にこのビオチン／ＧＰＣＲポリペプチド分子をアビジンと結合させて、四価のアビジン／ビオチン／ＧＰＣＲポリペプチド分子を生じさせる。また、ＧＰＣＲポリペプチドをジニトロフェノール（ＤＮＰ）又はトリニトロフェノール（ＴＮＰ）と共有結合させ、生じた複合体を抗ＤＮＰ又は抗ＴＮＰ−ＩｇＭで沈殿させて、１０の原子価を有するデカマー複合体を生成しうる。
【０１７９】
一般に、本発明のＧＰＣＲポリペプチド誘導体の投与によって軽減されうる又は調節されうる条件は、ＧＰＣＲポリペプチドに関してここで述べたものを包含する。しかし、ここで開示するＧＰＣＲポリペプチド誘導体は、非誘導体化分子と比較して、付加的な活性、高い又は低い生物活性、あるいは長い又は短い半減期のような他の特徴を有しうる。
【０１８０】
（遺伝子操作非ヒト動物）
さらに、ＧＰＣＲポリペプチドの発現レベルが有意に低下する又は発現が完全に排除されるように、天然ＧＰＣＲポリペプチドをコードする遺伝子が破壊された（すなわち「ノックアウトされた」）、マウス、ラット又は他のげっ歯類；ウサギ、ヤギ、ヒツジ又は他の家畜のような非ヒト動物は、本発明の範囲内に包含される。そのような動物は、米国特許第５，５５７，０３２号に述べられているような手法及び方法を用いて作製しうる。
【０１８１】
本発明はさらに、その動物についてのＧＰＣＲ遺伝子又は異種ＧＰＣＲ遺伝子がその動物によって過剰発現され、それによって「トランスジェニック」動物が創造される、マウス、ラット又は他のげっ歯類；ウサギ、ヤギ、ヒツジ又は他の家畜のような非ヒト動物を包含する。そのようなトランスジェニック動物は、米国特許第５，４８９，７４３号及び国際公開公報第ＷＯ９４／２８１２２号に述べられているような周知の方法を用いて作製しうる。
【０１８２】
本発明はさらに、本発明のＧＰＣＲポリペプチドの１個又はそれ以上についてのプロモーターが、天然ＧＰＣＲポリペプチドの１個又はそれ以上の発現レベルを変化させるように活性化されている又は不活性化されている（例えば相同的組換え法によって）、非ヒト動物を包含する。
【０１８３】
これらの非ヒト動物は薬剤候補物スクリーニングのために使用しうる。そのようなスクリーニングでは、前記動物への薬剤候補物の影響を測定しうる。例えば、薬剤候補物はＧＰＣＲ遺伝子の発現を低下又は上昇させうる。一部の実施態様では、前記動物を薬剤候補物に接触させた後、生産されるＧＰＣＲポリペプチドの量を測定しうる。さらに、一部の実施態様では、薬剤候補物の前記動物への実際の影響を検出しうる。例えば、特定遺伝子の過剰発現は、疾患又は病的状態を生じさせる若しくは疾患又は病的状態に結びつくことがある。そのような場合、薬剤候補物が前記遺伝子の発現を低下させる能力、又は薬剤候補物が病的状態を予防する又は抑制する能力を試験することができる。他の例では、ポリペプチドのフラグメントのような特定代謝産物の生成が、疾患又は病的状態を生じさせる若しくは疾患又は病的状態に結びつくことがある。そのような場合、薬剤候補物がそのような代謝産物の生成を低下させる能力、又は薬剤候補物が病的状態を予防する又は抑制する能力を試験することができる。
【０１８４】
（ＧＰＣＲポリペプチド活性の他の調節因子に関する検定）
一部の状況下では、ＧＰＣＲポリペプチドの活性の調節因子、すなわちアゴニスト又はアンタゴニストである分子を特定することが望ましいと考えられる。ＧＰＣＲポリペプチドを調節する天然又は合成分子は、ここで述べるような、１又はそれ以上のスクリーニングアッセイを使用して特定しうる。そのような分子は、半ビボ又はインビボで、注射によって、経口送達、移植装置などによって投与しうる。
【０１８５】
「試験分子」は、ＧＰＣＲポリペプチドの活性を調節する（すなわち上昇させる又は低下させる）能力に関して評価中である分子を表わす。最も一般的には、試験分子はＧＰＣＲポリペプチドと直接相互作用する。しかし、試験分子が、ＧＰＣＲ遺伝子発現に影響を及ぼすことによって、又はＧＰＣＲポリペプチドの結合パートナー（例えば受容体又はリガンド）に結合することなどによって、ＧＰＣＲポリペプチド活性を間接的に調節しうることも想定される。１つの実施態様では、試験分子は、少なくとも約１０−6Ｍ、好ましくは約１０−８Ｍ、より好ましくは約１０−９Ｍ、さらに一層好ましくは約１０−１０Ｍの親和性定数でＧＰＣＲポリペプチドに結合する。
【０１８６】
ＧＰＣＲポリペプチドと相互作用する化合物を特定するための方法は本発明に包含される。一部の実施態様では、試験分子とＧＰＣＲポリペプチドの相互作用を可能にする条件下で、ＧＰＣＲポリペプチドを試験分子と共にインキュベートし、相互作用の程度を測定する。試験分子は、実質的に精製された形態で又は粗混合物としてスクリーニングすることができる。
【０１８７】
一部の実施態様では、ＧＰＣＲポリペプチドアゴニスト又はアンタゴニストは、ＧＰＣＲポリペプチドと相互作用してその活性を調節する、タンパク質、ペプチド、糖質、脂質、又は低分子量分子でありうる。ＧＰＣＲポリペプチドの発現を調節する分子は、ＧＰＣＲポリペプチドをコードする核酸に相補的であるか又はＧＰＣＲポリペプチドの発現を指令又は制御する核酸配列に相補的であって、発現のアンチセンス調節因子として働く核酸を包含する。
【０１８８】
ひとたび試験分子がＧＰＣＲポリペプチドと相互作用することが特定されれば、この分子を、ＧＰＣＲポリペプチド活性を上昇させる又は低下させる能力に関してさらに評価しうる。ＧＰＣＲポリペプチドと試験分子の相互作用の測定は、細胞ベースの結合測定法、膜結合測定法、溶液相アッセイ及び免疫測定法を含む、いくつかの様式で実施しうる。一般に、試験分子をＧＰＣＲポリペプチドと共に規定された期間インキュベートし、生物活性を測定する１又はそれ以上のアッセイによってＧＰＣＲポリペプチド活性を決定する。
【０１８９】
ＧＰＣＲポリペプチドと試験分子の相互作用はまた、免疫測定法においてポリクローナル又はモノクローナル抗体を使用して直接測定することもできる。選択的に、ここで述べるようなエピトープタグを含むＧＰＣＲポリペプチドの修飾形態が、溶液中及び免疫測定法において使用しうる。
【０１９０】
ＧＰＣＲポリペプチドが結合パートナー（例えば受容体又はリガンド）との相互作用を通して生物活性を発揮する場合、様々なインビトロアッセイを使用して、対応する結合パートナー（選択的結合物質、受容体又はリガンド）へのＧＰＣＲポリペプチドの結合を測定しうる。これらのアッセイは、試験分子を、ＧＰＣＲポリペプチドの結合パートナーへの結合の速度及び／又は程度を上昇させる又は低下させる能力に関してスクリーニングするために使用しうる。１つのアッセイでは、ＧＰＣＲポリペプチドをマイクロタイタープレートの穴に固定する。放射能標識ＧＰＣＲポリペプチド結合パートナー（例えばヨウ素化ＧＰＣＲポリペプチド結合パートナー）と試験分子を、一度に１つずつ（いずれかの順番で）又は同時に、前記の穴に加えることができる。インキュベーション後、穴を洗浄し、シンチレーション計数器を使用して放射能を測定し、結合パートナーがＧＰＣＲポリペプチドに結合した程度を測定することができる。典型的には、分子を一定範囲の濃度にわたって試験し、結果の評価における正確さを期すために試験アッセイの１又はそれ以上のエレメントを欠く一連の対照穴を使用することができる。この方法の１つの選択肢は、タンパク質の「位置」を逆にすること、すなわちＧＰＣＲポリペプチド結合パートナーをマイクロタイタープレートの穴に固定し、試験分子と放射能標識ＧＰＣＲポリペプチドをインキュベートして、ＧＰＣＲポリペプチド結合の程度を測定することを含む。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１８章（Ａｕｓｕｂｅｌら、編集、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．及びＷｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  １９９５）参照。
【０１９１】
放射能標識に代わるものとして、ＧＰＣＲポリペプチド又はその結合パートナーをビオチンに複合してもよく、その後、比色定量法によって又はストレプトアビジンの蛍光標識によって検出しうる、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）又はアルカリホスファターゼ（ＡＰ）のような酵素に結合したストレプトアビジンを使用して、ビオチニル化タンパク質の存在を検出することができる。ビオチンに複合したＧＰＣＲポリペプチド又はＧＰＣＲポリペプチド結合パートナーに対する抗体も、ＡＰ又はＨＲＰに連結した酵素結合ストレプトアビジンとの複合体のインキュベーション後の検出のために使用しうる。
【０１９２】
ＧＰＣＲポリペプチド又はＧＰＣＲポリペプチド結合パートナーはまた、アガロースビーズ、アクリルビーズ、又は他の種類のそのような不活性固相基質への結合によって固定することもできる。基質−タンパク質複合体を、相補的タンパク質と被験化合物を含む溶液中に入れることができる。インキュベーション後、遠心分離によってビーズを沈殿させ、ここで述べる方法を用いてＧＰＣＲポリペプチドとその結合パートナーの間での結合の量を評価することができる。選択的に、基質−タンパク質複合体をカラムに固定して、試験分子と相補的タンパク質をそのカラムに通すこともできる。その後、ここで述べる手法のいずれか（例えば放射能標識又は抗体結合）を使用してＧＰＣＲポリペプチドとその結合パートナーの間での複合体の形成を評価することができる。
【０１９３】
ＧＰＣＲポリペプチド結合タンパク質とＧＰＣＲポリペプチド結合パートナーの間での複合体の形成を上昇させる又は低下させる試験分子を特定するために有用なもう１つのインビトロアッセイは、ＢＩＡコアアッセイシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ニュージャージー州（ＮＪ））のような表面プラズモン共鳴検出器システムである。ＢＩＡコアシステムは製造者によって規定されているように使用される。このアッセイは基本的に、検出機内に位置するデキストラン被覆センサーチップにＧＰＣＲポリペプチド又はＧＰＣＲポリペプチド結合パートナーを共有結合することを含む。次に被験化合物とその他の相補的タンパク質を同時に又は連続的に、センサーチップの入ったチェンバーに注入することができる。結合する相補的タンパク質の量は、センサーチップのデキストラン被覆面に物理的に結合する分子量の変化と、検出器システムによって測定される分子量の変化に基づいて評価することができる。
【０１９４】
一部の場合には、２個又はそれ以上の被験化合物を一緒に、ＧＰＣＲポリペプチドとＧＰＣＲポリペプチド結合パートナーの間での複合体の形成を上昇させる又は低下させるそれらの能力に関して評価することが望ましいと考えられる。これらの場合、ここで述べるアッセイは、そのような付加被験化合物を第一被験化合物と同時に又は第一被験化合物の後に加えることによって容易に変更することができる。アッセイの残りの段階はここで述べる通りである。
【０１９５】
ここで述べるようなインビトロアッセイは、ＧＰＣＲポリペプチドとＧＰＣＲポリペプチド結合パートナーの間での複合体の形成への作用に関して多数の化合物をスクリーニングするために好都合に使用しうる。前記アッセイは、ファージディスプレイにおいて生成される化合物、合成ペプチド及び化学合成ライブラリーをスクリーニングするために自動化しうる。
【０１９６】
ＧＰＣＲポリペプチドとＧＰＣＲポリペプチド結合パートナーの間での複合体の形成を上昇させる又は低下させる化合物はまた、ＧＰＣＲポリペプチド又はＧＰＣＲポリペプチド結合パートナーのいずれかを発現する細胞及び細胞系統を使用した細胞培養においてもスクリーニングしうる。細胞及び細胞系統はいかなる哺乳類からも入手しうるが、好ましくはヒト又は他の霊長類、イヌ、又はげっ歯類ソースからのものである。その表面にＧＰＣＲポリペプチド結合パートナーを発現する細胞へのＧＰＣＲポリペプチドの結合を試験分子の存在下又は不在下で評価し、例えばＧＰＣＲポリペプチド結合パートナーに対するビオチニル化抗体を使用したフローサイトメトリーによって、結合の程度を測定することができる。ここで述べるタンパク質結合測定法において陽性と判定された化合物をさらに評価するために、細胞培養アッセイが好都合に使用できる。
【０１９７】
細胞培養はまた、薬剤候補物の影響をスクリーニングするためにも使用できる。例えば、薬剤候補物はＧＰＣＲ遺伝子の発現を低下又は上昇させうる。一部の実施態様では、細胞培養を薬剤候補物に接触させた後、生産されるＧＰＣＲポリペプチド又はＧＰＣＲポリペプチドフラグメントの量を測定しうる。一部の実施態様では、細胞培養への薬剤候補物の実際の影響を検出しうる。例えば、特定遺伝子の過剰発現は細胞培養に特定の影響を及ぼしうる。そのような場合、薬剤候補物が前記遺伝子の発現を上昇又は低下させる能力、又は薬剤候補物が細胞培養への特定の影響を予防する又は抑制する能力を試験することができる。他の例では、ポリペプチドのフラグメントのような特定代謝産物の生成が、疾患又は病的状態を生じさせる若しくは疾患又は病的状態に結びつくことがある。そのような場合、薬剤候補物が細胞培養におけるそのような代謝産物の生成を低下させる能力を試験することができる。
【０１９８】
（タンパク質の取込み）
ｔａｔタンパク質配列（ＨＩＶからの）を使用してタンパク質を細胞に内在化させることができる。例えばＦａｌｗｅｌｌら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：６６４−６８参照。例えば、ＨＩＶ  ｔａｔタンパク質の１１アミノ酸配列（Ｙ−Ｇ−Ｒ−Ｋ−Ｋ−Ｒ−Ｒ−Ｑ−Ｒ−Ｒ−Ｒ；配列番号７）（「タンパク質形質導入ドメイン」又はＴＡＴ  ＰＤＴと称される）は、細胞の細胞質膜と核膜を横切る送達を仲介すると述べられてきた。Ｓｃｈｗａｒｚｅら、１９９９、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：１５６９−７２；及びＮａｇａｈａｒａら、１９９８、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：１４４９−５２参照。これらの方法では、腹腔内投与後組織に侵入するＦＩＴＣ−構築物（ＦＩＴＣ標識Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｒ−Ｋ−Ｋ−Ｒ−Ｒ−Ｑ−Ｒ−Ｒ−Ｒ；配列番号８）を調製し、そのような構築物の細胞への結合を蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析によって検出する。ｔａｔ−β−ｇａｌ融合タンパク質で処理した細胞はβ−ｇａｌ活性を示す。注入後、そのような構築物の発現が、肝臓、腎臓、肺、心臓及び脳組織を含む多くの組織において検出できる。そのような構築物は細胞に入り込むためにある程度の変性を受け、それ自体、細胞への侵入後にリフォールディングを必要とするであろうと考えられる。
【０１９９】
それ故、ｔａｔタンパク質配列が所望ポリペプチドを細胞に取込まれするために使用しうることは認識される。例えば、ｔａｔタンパク質配列を使用して、ＧＰＣＲ分子の活性を阻害するためにＧＰＣＲアンタゴニスト（抗ＧＰＣＲ選択的結合物質、小分子、可溶性受容体又はアンチセンスオリゴヌクレオチドなど）を細胞内投与することができる。ここで使用するとき、「ＧＰＣＲ分子」の語は、ここで定義するようなＧＰＣＲ核酸分子及びＧＰＣＲポリペプチドの両方を表わす。所望する場合には、これらの手順を使用してＧＰＣＲタンパク質そのものを細胞内に投与することもできる。Ｓｔｒａｕｓ、１９９９、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：１４６６−６７も参照のこと。
【０２００】
（ＧＰＣＲポリペプチドを使用した細胞ソースの特定）
本発明のある実施態様によれば、ＧＰＣＲポリペプチドに関連するある種の細胞型のソースを判定できることは有用であると考えられる。例えば、適切な治療を選択する上での助けとして、疾患又は病的状態の由来を決定することは有用である。一部の実施態様では、ＧＰＣＲポリペプチドをコードする核酸はプローブとして使用でき、該細胞の核酸をそのようなプローブでスクリーニングすることによってここで述べる細胞を特定することができる。他の実施態様では、細胞内のＧＰＣＲポリペプチドの存在を試験し、それによってそのような細胞がここで述べるタイプのものであるかどうかを決定するために、抗ＧＰＣＲポリペプチド抗体を使用しうる。
【０２０１】
（ＧＰＣＲポリペプチド組成物及び投与）
治療組成物は本発明の範囲内である。そのようなＧＰＣＲポリペプチド医薬組成物は、投与様式に適合するように選択した医薬的又は生理的に許容される製剤物質との混合物中に、治療上有効な量のＧＰＣＲポリペプチド又はＧＰＣＲ核酸分子を含有しうる。医薬組成物は、投与様式に適合するように選択した医薬的又は生理的に許容される製剤物質との混合物中に、治療上有効な量の１又はそれ以上のＧＰＣＲポリペプチド選択的結合物質を含有しうる。
【０２０２】
許容される製剤物質は、好ましくは使用される用量及び濃度で受容者に非毒性である。
【０２０３】
医薬組成物は、例えば組成物のｐＨ、浸透圧モル濃度、粘度、透明度、色など張性、におい、不稔性、安定性、溶解又は放出速度、吸着又は浸透を変化させる、維持する、又は保存するための製剤物質を含みうる。適切な製剤物質は、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシンなど）、抗菌剤、抗酸化剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム又は亜硫酸水素ナトリウムなど）、緩衝剤（ホウ酸塩、炭酸水素塩、トリス−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩又は他の有機酸など）、充填剤（マンニトール又はグリシンなど）、キレート化剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）、錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリン又はヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンなど）、増量剤、単糖類、ニ糖類及び他の糖質（グルコース、マンノース又はデキストリンなど）、タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなど）、着色剤、着香剤及び希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）、低分子量ポリペプチド、塩形成性対イオン（ナトリウムなど）、防腐剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸又は過酸化水素など）、溶媒（グリセリン、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールなど）、糖アルコール（マンニトール又はソルビトールなど）、沈殿防止剤、界面活性剤又は湿潤剤（プルロニック；ＰＥＧ；ソルビタンエステル；ポリソルベート２０又はポリソルベート８０のようなポリソルベート；トリトン；トロメタミン；レシチン；コレステロール又はチロキサパルなど）、安定性促進剤（スクロース又はソルビトールなど）、張度増強剤（アルカリ金属ハロゲン化物−好ましくは塩化ナトリウム又は塩化カリウム−又はマンニトール、ソルビトールなど）、供給送達媒質、希釈剤、賦形剤及び／又は製薬佐剤を含むが、これらに限定されない。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編集、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  １９９０）参照。
【０２０４】
至適医薬組成物は、例えば予定投与経路、送達様式及び所望用量に応じて、当業者によって決定される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（前出）参照。そのような組成物は、ＧＰＣＲポリペプチドの物理的状態、安定性、インビボでの放出速度、及びインビボでのクリアランス速度に影響を及ぼしうる。
【０２０５】
医薬組成物の主要媒質又は担体は、水性又は非水性のいずれでもよい。例えば、注射用の適切な媒質又は担体は、場合によって非経口投与用組成物に共通する他の物質を補足した、水、生理食塩水又は人工脳脊髄液でありうる。中性緩衝食塩水又は血清アルブミンと混合した食塩水はさらなる例示的媒質である。他の例示的医薬組成物は、ソルビトール又は適切な代用物をさらに含みうる、約ｐＨ７．０〜８．５のトリス緩衝液又は約ｐＨ４．０−５．５の酢酸緩衝液を包含する。本発明の１つの実施態様では、ＧＰＣＲポリペプチド組成物は、凍結乾燥ケーク又は水溶液の形態で、所望純度を有する選択組成物を至適製剤物質（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、前出）と混合することによって保存用に調製しうる。さらに、ＧＰＣＲポリペプチド生成物は、スクロースのような適切な賦形剤を使用して凍結乾燥物として製剤しうる。
【０２０６】
ＧＰＣＲポリペプチド医薬組成物は非経口送達用に選択することができる。選択的に、前記組成物は、吸入又は経口のように消化管を通しての送達用に選択しうる。そのような医薬適合性の組成物の調製はこの分野の技術範囲内である。
【０２０７】
製剤成分は、投与部位にとって許容される濃度で存在する。例えば、組成物を生理的ｐＨ又はわずかに低いｐＨ、典型的には約５から約８のｐＨ範囲内に保持するために緩衝液を使用する。
【０２０８】
非経口投与を想定するとき、本発明で使用するための治療組成物は、医薬適合性の媒質中に所望ＧＰＣＲ分子を含有する、発熱物質不含の非経口的に許容される水溶液の形態をとりうる。非経口注射のための特に適切な媒質は、ＧＰＣＲ分子が、適切に保存される無菌等張液として製剤されている無菌蒸留水である。さらにもう１つの製剤は、蓄積注射によって送達されうる、生成物の制御又は持続放出を提供する、注射用ミクロスフェア、生体受食性粒子、高分子化合物（ポリアクチン酸又はポリグリコール酸など）、ビーズ又はリポソームのような作用物質を含有する所望分子の製剤を含みうる。ヒアルロン酸も使用でき、これは循環中での存在期間持続を促進する作用を有すると考えられる。所望分子の導入のための他の適切な手段は、移植可能薬剤の送達装置を包含する。
【０２０９】
１つの実施態様では、医薬組成物は吸入用に製剤しうる。例えば、ＧＰＣＲポリペプチドは、吸入用乾燥粉末として製剤しうる。ＧＰＣＲポリペプチド又は核酸分子の吸入溶液も、エーロゾル送達用の推進薬と共に製剤しうる。さらにもう１つの実施態様では、溶液を噴霧することができる。肺投与は国際公開公報第ＷＯ９４／２００６９号の中でさらに説明されており、これは化学修飾したタンパク質の肺送達を述べている。
【０２１０】
また、一部の製剤は経口的に投与しうると想定される。本発明の１つの実施態様では、この様式で投与するＧＰＣＲポリペプチドは、錠剤及びカプセルのような固形投与形態の配合において慣例的に使用される担体と共に又は担体なしで製剤することができる。例えば、カプセルは、バイオアベイラビリティーが最大であり、前全身性分解が最小である、胃腸管の所定位置で製剤の活性部分を放出するように設計しうる。ＧＰＣＲポリペプチドの吸収を促進するために付加的な作用物質を含有することができる。希釈剤、着香剤、低融点ろう、植物油、潤滑剤、沈殿防止剤、錠剤崩壊剤及び結合剤も使用しうる。
【０２１１】
もう１つの医薬組成物は、錠剤の製造に適する非毒性賦形剤との混合物中に有効量のＧＰＣＲポリペプチドを含みうる。錠剤を無菌水又は他の適切な媒質に溶解することにより、溶液を単位投与形態で調製することができる。適切な賦形剤は、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム又は炭酸水素ナトリウム、ラクトース又はリン酸カルシウムのような不活性希釈剤；デンプン、ゼラチン又はアカシアのような結合剤；あるいはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又は滑石のような潤滑剤を含むが、これらに限定されない。
【０２１２】
さらなるＧＰＣＲポリペプチド医薬組成物は、持続又は制御送達製剤中にＧＰＣＲポリペプチドを含有する製剤を含めて、当業者には明白である。リポソーム担体、生体受食性微粒子又は多孔性ビーズのような様々な他の持続又は制御送達手段及び蓄積注射を製剤するための手法も当業者に既知である。例えば、医薬組成物の供給送達のための多孔性ポリマー微粒子の制御放出を述べた、国際特許願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９号参照。
【０２１３】
持続放出製剤のさらなる例は、成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態の半透性ポリマー基質を含む。持続放出基質は、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号及び欧州特許第０５８４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミン酸塩のコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、１９８３、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら、１９８１、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７及びＬａｎｇｅｒ、１９８２、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５）、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら、前出）又はポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３９８８号）を包含しうる。持続放出組成物はまた、この分野で既知のいくつかの方法のいずれかによって製造できる、リポソームを含みうる。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎら、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３６８８−９２；及び欧州特許第０３６６７６号、同第０８８０４６号及び同第１４３９４９号参照。
【０２１４】
インビボ投与に使用するＧＰＣＲ医薬組成物は、典型的には無菌でなければならない。これは無菌ろ過膜を通すろ過によって達成しうる。前記組成物を凍結乾燥する場合、凍結乾燥及び還元の前又は後のいずれかに、この方法を用いた滅菌を実施しうる。非経口投与用組成物は凍結乾燥形態又は溶液として保存しうる。さらに、非経口組成物は一般に、無菌アクセス口を備えた容器、例えば皮下注射針によって貫通しうる栓を備えた静脈内溶液バッグ又はバイアルに入れる。
【０２１５】
ひとたび医薬組成物が製剤されれば、溶液、懸濁液、ゲル、乳剤、固体、あるいは脱水粉末又は凍結乾燥粉末として無菌バイアル中で保存しうる。組成物のような製剤は、即時使用形態又は投与前に還元する必要のある形態（例えば凍結乾燥）のいずれかで保存しうる。
【０２１６】
特定実施態様では、本発明は、単回用量投与単位を生産するためのキットを対象とする。前記キットは各々、乾燥タンパク質が入った第一容器と水性製剤が入った第二容器の両方を含みうる。単区画又は多区画予備充填注射器（例えば液体シリンジ及びリオシリンジ）を含むキットも本発明の範囲内に包含される。
【０２１７】
治療的に使用されるＧＰＣＲ医薬組成物の有効量は、例えば、治療の背景と目的に依存する。当業者は、それ故、治療のための適切な用量レベルが、一部には、送達される分子、ＧＰＣＲ分子を使用する適応症、投与経路、及び患者のサイズ（体重、体表面積又は器官の大きさ）と状態（年齢及び全身状態）によって異なることを認識する。従って、臨床医は、至適治療効果を得るために用量を調節し、投与経路を変更しうる。典型的用量は、上述した因子に依存して、約０．１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまで又はそれ以上の範囲をとりうる。他の実施態様では、用量は約０．１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまで；又は１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまで；又は約５μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまでの範囲をとりうる。
【０２１８】
投与頻度は、使用する製剤中のＧＰＣＲ分子の薬物動態パラメータに依存する。典型的には、臨床医は、所望効果を達成する用量に達するまで組成物を投与する。組成物は、それ故、単回投与として、経時的な２回又はそれ以上の投与として（同じ量の所望分子を含んでいてもよく又は含んでいなくてもよい）、あるいは移植装置又はカテーテルによる持続注入として投与しうる。適切な用量のさらなる改善は、当業者によって常套的に行われ、当業者が常套的に実施する作業の範囲内である。適切な用量は、適切な用量−応答データの使用を通して確認しうる。
【０２１９】
医薬組成物の投与経路は、既知の方法によって、例えば経口的；静脈内、腹腔内、大脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、又は病巣内経路による注射を通して；持続放出システムによって；又は移植装置によって為される。所望する場合には、前記組成物は、ボーラス注射によって又は注入によって持続的に、又は移植装置によって投与しうる。
【０２２０】
選択的に又は付加的に、該組成物は、所望分子が吸収された又は被包された膜、スポンジ又は他の適切な物質の移植によって局所的に投与しうる。移植装置を使用する場合は、装置を適切な組織又は器官に移植することができ、拡散、時間指定放出ボーラス又は連続投与によって所望分子を送達しうる。
【０２２１】
一部の場合、ＧＰＣＲポリペプチド医薬組成物をエクスビボ的に使用することが望ましいと考えられる。そのような場合には、患者から取り出した細胞、組織又は器官をＧＰＣＲポリペプチド医薬組成物に接触させ、その後前記細胞、組織又は器官を患者の体内に移植してもどす。
【０２２２】
また一部の場合には、ここで述べるような方法を使用して、ＧＰＣＲポリペプチドを発現し、分泌するように遺伝子操作した一定の細胞を移植することによってＧＰＣＲポリペプチドを送達することができる。そのような細胞は、動物細胞又はヒト細胞のいずれでもよく、また自己由来、異種又は外因性のいずれでもよい。場合によっては、前記細胞を不朽化してもよい。免疫応答の可能性を低下させるために、前記細胞を被包して周辺組織への浸潤を避けることもできる。被包材料は、典型的には生体適合性であり、タンパク質産物の放出は許容するが、患者の免疫系又は周辺組織からの他の有害因子による細胞の破壊を防ぐ、半透性ポリマー囲い又は膜である。
【０２２３】
ここで述べるように、単離細胞個体群（幹細胞、リンパ球、赤血球、軟骨細胞、ニューロンなどのような）を１又はそれ以上のＧＰＣＲポリペプチドで処理することが望ましいと考えられる。これは、ＧＰＣＲポリペプチドが細胞膜透過性の形態である場合には、ポリペプチドを直接単離細胞に接触させることによって実施できる。
【０２２４】
本発明のさらなる実施態様は、治療用ポリペプチドのインビトロでの生産及び遺伝子治療又は細胞治療による治療用ポリペプチドの生産と送達のための細胞及び方法（例えば相同的組換え及び／又は他の組換え生産法）に関する。相同的組換え及び他の組換え法を使用して、通常は転写沈黙性であるＧＰＣＲ遺伝子又は過少発現遺伝子を含む細胞を改変し、それによって治療上有効な量のＧＰＣＲポリペプチドを発現する細胞を生産しうる。
【０２２５】
相同的組換えはもともと、転写活性遺伝子において突然変異を誘発する又は矯正する遺伝子を標的するために開発された手法である。Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ、１９８９、Ｐｒｏｇ．ｉｎ  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．＆  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６：３０１。基本的手法は、哺乳類ゲノムの特定領域内に特定突然変異を導入するため（Ｔｈｏｍａｓら、１９８６、Ｃｅｌｌ  ４４：４１９−２８；ＴｈｏｍａｓとＣａｐｅｃｃｈｉ，１９８７、Ｃｅｌｌ  ５１：５０３−１２；Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：８５８３−８７）又は欠陥遺伝子内の特定突然変異を矯正するため（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、１９８７、Ｎａｔｕｒｅ  ３３０：５７６−７８）の方法として開発された。例示的な相同的組換え手法は、米国特許第５，２７２，０７１号；欧州特許第９１９３０５１号及び同第５０５５００号；国際特許願第ＰＣＴ／ＵＳ９０／０７６４２号、及び国際公開公報第ＷＯ９１／０９９５５号に述べられている。
【０２２６】
相同的組換えを通して、ゲノム内に挿入されるＤＮＡ配列は、標的ＤＮＡに結合することによって目的とする遺伝子の特定領域に位置づけられる。標的ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡの領域に相補的な（相同な）ヌクレオチド配列である。ＤＮＡ複製過程の間に、ゲノムの特定領域に相補的な標的ＤＮＡの小片を親鎖と接触させる。ハイブリダイズすること、それ故、共有する相同領域を通して内在性ＤＮＡの他の小片と組み換わることは、細胞内に挿入されたＤＮＡの一般的特性である。この相補鎖が、突然変異又は異なる配列又は付加ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに結合する場合、組換えの結果としてこの鎖も新たに合成された鎖に組み込まれる。校正機能の結果として、ＤＮＡのこの新しい配列は鋳型として働くことができる。このようにして、移入されたＤＮＡはゲノム内に組み込まれる。
【０２２７】
標的ＤＮＡのこれらの小片に結合するのは、ＧＰＣＲポリペプチドの発現と相互作用しうる又は発現を制御しうるＤＮＡの領域、例えばフランキング配列である。例えば、プロモーター／エンハンサーエレメント、サプレッサー又は外来転写調節エレメントは、所望ＧＰＣＲポリペプチドをコードするＤＮＡの転写に影響を及ぼすのに十分な近傍性と方向で、意図する宿主細胞のゲノム内に挿入される。制御エレメントは宿主細胞ゲノム内に存在するＤＮＡの一部を制御する。それ故、所望ＧＰＣＲポリペプチドの発現は、ＧＰＣＲ遺伝子自体をコードするＤＮＡのトランスフェクションによってではなく、ＧＰＣＲ遺伝子の転写のための認識可能なシグナルを備えた内在性遺伝子配列を提供するＤＮＡ調節セグメントと結合した標的ＤＮＡ（目的とする内在性遺伝子と相同な領域を含む）の使用によって達成されうる。
【０２２８】
１つの例示的な方法では、細胞内の所望標的遺伝子（すなわち所望内在性細胞遺伝子）の発現を、少なくとも調節配列、エクソン及びスプライス供与部位を含むＤＮＡの導入によって、あらかじめ選択した部位での細胞ゲノム内への相同的組換えを通して変化させる。これらの成分を、これが実際に新しい転写単位（ＤＮＡ構築物中に存在する前記調節配列、エクソン及びスプライス供与部位は内在性遺伝子に作動可能に連結されている）の生産をもたらすように、染色体（ゲノム）ＤＮＡに導入する。これらの成分が染色体ＤＮＡに導入された結果として、所望内在性遺伝子の発現が変化する。
【０２２９】
ここで述べるような変化した遺伝子発現は、得られたままの細胞内で通常はサイレントである（発現されない）遺伝子を活性化すること（又は発現を生じさせること）、ならびに得られたままの細胞内で生理的に有意のレベルでは発現されない遺伝子の発現を上昇させることを包含する。これらの実施態様は、さらに、得られたままの細胞において起こる調節又は誘導のパターンとは異なるように調節又は誘導のパターンを変化させること、及び得られたままの細胞で発現される遺伝子の発現を低下させること（完全に排除することを含む）を包含する。
【０２３０】
相同的組換えを使用して、細胞の内在性ＧＰＣＲ遺伝子からＧＰＣＲポリペプチド産生を上昇させる又は生じさせることができる１つの方法は、まず、部位特異的組換えシステム（例えばＣｒｅ／ｌｏｘＰ、ＦＬＰ／ＦＲＴ）（Ｓａｕｅｒ，１９９４、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５：５２１−２７；Ｓａｕｅｒ，１９９３、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２２５：８９０−９００）からの組換え配列を、細胞の内在性ゲノムＧＰＣＲポリペプチドコード領域の上流（すなわち５’側）に置く、相同的組換えを使用することを含む。ゲノムＧＰＣＲポリペプチドコード領域のすぐ上流に置いた部位に相同な組換え部位を含むプラスミドを、適切な組換え酵素と共に改変細胞系統に導入する。この組換え酵素は、プラスミドの組換え部位を通して、細胞系統内のゲノムＧＰＣＲポリペプチドコード領域のすぐ上流に位置する組換え部位への前記プラスミドの組込みを生じさせる（ＢａｕｂｏｎｉｓとＳａｕｅｒ，１９９３、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：２０２５−２９；Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１３５１−５５）。転写を上昇させることが知られている何らかのフランキング配列（例えばエンハンサー／プロモーター、イントロン、翻訳エンハンサー）は、このプラスミド内に適切に位置づけられれば、細胞の内在性ＧＰＣＲ遺伝子からの新たな又は高いＧＰＣＲポリペプチド産生をもたらす、新しい又は改変された転写単位を創造するように組み込まれる。
【０２３１】
部位特異的組換え配列が、細胞の内在性ゲノムＧＰＣＲポリペプチドコード領域のすぐ上流に置かれた細胞系統を使用するさらなる方法は、相同的組換えを用いて前記細胞系統のゲノム内の別の第二組換え部位を導入することである。次に適切な組換え酵素をこの２つの組換え部位の細胞系統に導入して、細胞の内在性ＧＰＣＲ遺伝子からの新たな又は高いＧＰＣＲポリペプチド産生をもたらす、新しい又は改変された転写単位を創造する、組換え事象（欠失、逆位及び転位）を生じさせる（Ｓａｕｅｒ，１９９４，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５：５２１−２７；Ｓａｕｅｒ，１９９３，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２２５：８９０−９００）。
【０２３２】
細胞内在性ＧＰＣＲ遺伝子からのＧＰＣＲポリペプチドの発現を上昇させる又は生じさせるためのさらなるアプローチは、細胞内在性ＧＰＣＲ遺伝子からの新たな又は高いＧＰＣＲポリペプチド産生をもたらすように、１個又はそれ以上の遺伝子の発現を上昇させる又は生じさせること（例えば転写因子）及び／又は１個又はそれ以上の遺伝子の発現を低下させること（例えば転写リプレッサー）を含む。この方法は、非天然に生じるポリペプチド（例えば転写因子ドメインに融合した部位特異的ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチド）を、細胞の内在性ＧＰＣＲ遺伝子からの新たな又は高いＧＰＣＲポリペプチド産生が生じるように細胞内に導入することを含む。
【０２３３】
本発明はさらに、標的遺伝子の発現を変化させる方法において有用なＤＮＡ構築物に関する。ある実施態様では、例示的ＤＮＡ構築物は、（ａ）１個又はそれ以上の標的配列、（ｂ）調節配列、（ｃ）エクソン、及び（ｄ）不対スプライス供与部位を含む。前記ＤＮＡ構築物中の標的配列は、エレメント（ｂ）から（ｄ）が内在性標的遺伝子の配列に作動可能に連結されるように、細胞内の標的遺伝子へのエレメント（ａ）から（ｄ）の組込みに関する。もう１つの実施態様では、ＤＮＡ構築物は、（ａ）１個又はそれ以上の標的配列、（ｂ）調節配列、（ｃ）エクソン、（ｄ）スプライス供与部位、（ｅ）イントロン、及び（ｆ）スプライス受容部位を含み、前記標的配列は、エレメント（ｂ）から（ｆ）が内在性標的遺伝子の配列に作動可能に連結されるようにエレメント（ａ）から（ｆ）の組込みに関する。前記標的配列は、それとの相同的組換えが起こる細胞染色体ＤＮＡ内のあらかじめ選択された部位と相同である。前記構築物において、エクソンは一般に調節配列の３’側であり、スプライス供与部位はエクソンの３’側である。
【０２３４】
ここで示すＧＰＣＲポリペプチドの核酸配列のように、特定遺伝子の配列が既知である場合、前記遺伝子の選択領域に相補的なＤＮＡの断片を合成する、又は目的とする領域の境界となる特異的認識部位で天然ＤＮＡを適切に制限切断することなどによって入手することができる。このハイブリダイゼーションがＤＮＡ複製の間に起こる場合、このＤＮＡ断片及びそれに連結された付加配列は岡崎フラグメントとして働き、ＤＮＡの新たに合成された娘鎖に組み込まれる。本発明は、それ故、ＧＰＣＲポリペプチドをコードするヌクレオチドを包含し、かかるヌクレオチドは標的配列として使用しうる。
【０２３５】
ＧＰＣＲポリペプチド細胞治療、例えばＧＰＣＲポリペプチドを産生する細胞の移植も意図される。この実施態様は、ＧＰＣＲポリペプチドの生物活性形態を合成し、分泌することができる細胞を移植することを含む。そのようなＧＰＣＲポリペプチド産生細胞は、ＧＰＣＲポリペプチドの天然プロデューサーである細胞か、又は所望ＧＰＣＲポリペプチドをコードする遺伝子又はＧＰＣＲポリペプチドの発現を上昇させる遺伝子での形質転換によってＧＰＣＲポリペプチドを産生する能力が上昇した組換え細胞でありうる。そのような修飾は、遺伝子を送達することならびにその発現と分泌を促進することに適したベクターによって実現しうる。異種のポリペプチドの投与によって起こりうるような、ＧＰＣＲポリペプチドを投与する患者における潜在的免疫応答を最小限に抑えるために、ＧＰＣＲポリペプチドを産生する天然細胞は、ヒト由来であり、ヒトＧＰＣＲポリペプチドを産生することが好ましい。同様に、ＧＰＣＲポリペプチドを産生する組換え細胞は、ヒトＧＰＣＲポリペプチドをコードする遺伝子を含む発現ベクターで形質転換されることが好ましい。
【０２３６】
移植細胞は、周辺組織への浸潤を避けるために被包してもよい。ヒト又は非ヒト動物細胞は、ＧＰＣＲポリペプチドの放出を許容するが、患者の免疫系又は周辺組織からの他の有害因子による細胞の破壊を防ぐ、生体適合性の半透性ポリマーに包み又は膜内に入れて患者に移植しうる。選択的に、半ビボでＧＰＣＲポリペプチドを産生するように形質転換した患者自身の細胞を、そのような被包なしで患者に直接移植してもよい。
【０２３７】
生細胞の被包のための手法はこの分野において既知であり、被包細胞の調製及び患者へのそれらの移植は常套的に実施しうる。例えば、Ｂａｅｔｇｅら（国際公開公報第ＷＯ９５／０５４５２号及び国際特許願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／０９２９９号）は、生物活性分子の有効送達のために遺伝子操作した細胞を含有する膜カプセルを述べている。このカプセルは生体適合性であり、容易に回収できる。前記カプセルは、哺乳類宿主に移植したときインビボで下方調節を受けないプロモーターに作動可能に連結された生物活性分子をコードするＤＮＡ配列を含む、組換えＤＮＡ分子でトランスフェクトした細胞を被包している。このデバイスは、生細胞から受容者の体内の特定部位への分子の送達を提供する。加えて、米国特許第４，８９２，５３８号；同第５，０１１，４７２号；及び同第５，１０６，６２７号も参照のこと。生細胞を被包するためのシステムは、国際公開公報第ＷＯ９１／１０４２５号（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら）の中で述べられている。また、国際公開公報第ＷＯ９１／１０４７０号（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら）；Ｗｉｎｎら、１９９１、Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．１１３：３２２−２９；Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら、１９９１、Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．１１１：２６９−７５；及びＴｒｅｓｃｏら、１９９２、ＡＳＡＩＯ  ３８：１７−２３も参照のこと。
【０２３８】
ＧＰＣＲポリペプチドのインビボ及びインビトロ遺伝子治療の送達も考慮される。遺伝子治療手法の１つの例は、構成的又は誘導的プロモーターに作動可能に連結して、「遺伝子治療ＤＮＡ構築物」を形成しうる、ＧＰＣＲポリペプチドをコードするＧＰＣＲ遺伝子（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ及び／又は合成ＤＮＡ）を使用することである。前記プロモーターは、構築物を挿入する細胞又は組織型において活性であることを条件として、内在性ＧＰＣＲ遺伝子に相同であってもよく、又は異種であってもよい。遺伝子治療ＤＮＡ構築物の他の成分は、場合によっては、部位特異的組込み用に設計されたＤＮＡ分子（例えば相同的組換えに有用な内在性配列）、組織特異的プロモーター、エンハンサー又はサイレンサー、親細胞に比べて選択的利点を提供することができるＤＮＡ分子、形質転換細胞を特定するための標識として有用なＤＮＡ分子、陰性選択システム、細胞特異的結合物質（例えば細胞ターゲティングに関して）、細胞特異的インターナリゼーション因子、ベクターからの発現を促進する転写因子、及びベクターの生産を可能にする因子を含みうる。
【０２３９】
遺伝子治療ＤＮＡ構築物は、その後、ウイルス又は非ウイルスベクターを使用して細胞に導入することができる（半ビボ又はインビボで）。遺伝子治療ＤＮＡ構築物を導入する１つの手段は、ここで述べるようなウイルスベクターによるものである。レトロウイルスベクターのようなある種のベクターは、前記ＤＮＡ構築物を細胞の染色体ＤＮＡに送達し、遺伝子を染色体ＤＮＡに組み込むことができる。他のベクターはエピソームとして機能し、遺伝子治療ＤＮＡ構築物は細胞質内にとどまる。
【０２４０】
さらに他の実施態様では、標的細胞におけるＧＰＣＲ遺伝子の制御発現のために調節エレメントを含めることができる。そのようなエレメントは適切な効果器に応答して発動する。このようにして、所望するときに治療ポリペプチドを発現させることができる。１つの慣例的な制御手段は、小分子結合ドメイン及び、ＤＮＡ結合タンパク質又は転写活性化タンパク質のような、生物学的プロセスを開始させることができるドメインを含むキメラタンパク質を二量化するために小分子二量化剤又はラパログ（ｒａｐａｌｏｇ）の使用を含む（国際公開公報第ＷＯ９６／４１８６５号、同第ＷＯ９７／３１８９８号及び同第ＷＯ９７／３１８９９号参照）。前記タンパク質は、導入遺伝子の転写を開始するために使用できる。
【０２４１】
選択的な調節テクノロジーは、目的とする遺伝子から発現されるタンパク質を凝集物又はクラスターとして細胞の内部で貯蔵する方法を利用する。目的遺伝子を、小胞体内での凝集タンパク質の保持を生じさせる条件凝集ドメインを含む融合タンパク質として発現させる。貯蔵タンパク質は細胞の内部で安定であり、不活性である。前記タンパク質は、しかしながら、条件凝集ドメインを除去し、それによって該タンパク質が細胞から分泌されうるように凝集物又はクラスターを破壊して切り離す薬剤（例えば小分子リガンド）を投与することにより、放出することができる。Ａｒｉｄｏｒら、２０００、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：８１６−１７及びＲｉｖｅｒａら、２０００、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：８２６−３０参照。
【０２４２】
他の適切な制御手段又は遺伝子スイッチは、ここで述べるシステムを含むが、これらに限定されない。ミフェプリストン（ＲＵ４８６）はプロゲステロンアンタゴニストとして使用される。修飾プロゲステロン受容体リガンド結合ドメインのプロゲステロンアンタゴニストへの結合は、２つの転写因子の二量体を形成し、それを核内へと通過させてＤＮＡに結合することによって転写を活性化する。リガンド結合ドメインは、受容体が天然リガンドに結合する能力を排除するように修飾する。修飾ステロイドホルモン受容体システムは、米国特許第５，３６４，７９１号及び国際公開公報第ＷＯ９６／４０９１１号及び同第ＷＯ９７／１０３３７号において詳述されている。
【０２４３】
さらにもう１つの制御システムは、エクジソン受容体（細胞質受容体）に結合してそれを活性化する、エクジソン（ショウジョウバエステロイドホルモン）を使用する。この受容体はその後核内に転位して、特異的ＤＮＡ応答エレメント（エクジソン応答遺伝子からのプロモーター）に結合する。エクジソン受容体は、トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、及び転写を開始させるためのリガンド結合ドメインを含む。エクジソンシステムは、米国特許第５，５１４，５７８号及び国際公開公報第ＷＯ９７／３８１１７号、同第ＷＯ９６／３７６０９号及び同第ＷＯ９３／０３１６２号に詳述されている。
【０２４４】
もう１つの制御手段は、正のテトラサイクリン制御性トランス活性化因子を使用する。このシステムは、転写を活性化するポリペプチドに連結された突然変異ｔｅｔリプレッサータンパク質ＤＮＡ結合ドメイン（逆テトラサイクリン調節トランス活性化因子タンパク質を生じる突然変異ｔｅｔ  Ｒ−４アミノ酸変化、すなわちテトラサイクリンの存在下でｔｅｔオペレーターに結合する）を含む。そのようなシステムは、米国特許第５，４６４，７５８号、同第５，６５０，２９８号及び同第５，６５４，１６８号に述べられている。
【０２４５】
さらなる発現制御システム及び核酸構築物は、Ｉｎｎｏｖｉｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．への米国特許第５，７４１，６７９号及び同第５，８３４，１８６号に述べられている。
【０２４６】
インビボ遺伝子治療は、ＧＰＣＲ核酸分子の局所注入により又は他の適切なウイルス又は非ウイルス送達ベクターにより、ＧＰＣＲポリペプチドをコードする遺伝子を細胞に導入することによって実施しうる。Ｈｅｆｔｉ  １９９４、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２５：１４１８−３５。例えば、標的細胞への送達のために、ＧＰＣＲポリペプチドをコードする核酸分子をアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに組み込むことができる（例えばＪｏｈｎｓｏｎ，国際公開公報第ＷＯ９５／３４６７０号；国際特許願第ＰＣＴ／ＵＳ９５／０７１７８号参照）。組換えＡＡＶゲノムは、典型的には、機能性プロモーターに作動可能に連結されたＧＰＣＲポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に隣接するＡＡＶ逆方向末端反復配列及びポリアデニル化配列を含む。
【０２４７】
適切な選択的ウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、肝炎ウイルス、パルボウイルス、パポバウイルス、ポックスウイルス、αウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、及びパピローマウイルスベクターを含むが、これらに限定されない。米国特許第５，６７２，３４４号は、組換え神経栄養性ＨＳＶ−１ベクターを含むインビボでのウイルス仲介遺伝子導入システムを述べている。米国特許第５，３９９，３４６号は、治療タンパク質をコードするＤＮＡセグメントを挿入するようにインビトロで処理したヒト細胞の送達によって、治療タンパク質を患者に供給するためのプロセスの例を提供している。遺伝子治療手法の実施のためのさらなる方法と材料は、米国特許第５，６３１，２３６号（アデノウイルスベクターを含む）、同第５，６７２，５１０号（レトロウイルスベクターを含む）、同第５，６３５，３９９号（サイトカインを発現するレトロウイルスベクターを含む）に述べられている。
【０２４８】
非ウイルス送達法は、リポソームを介した遺伝子導入、裸のＤＮＡの送達（直接注入）、受容体を介した導入（リガンド−ＤＮＡ複合体）、電気穿孔法、リン酸カルシウム沈殿法、及び微粒子衝撃法（例えば遺伝子ガン）を含むが、これらに限定されない。遺伝子治療の材料及び方法はまた、誘導性プロモーター、組織特異的エンハンサー−プロモーター、部位特異的組み込み用に設計されたＤＮＡ配列、親細胞に比べて選択的利点を提供することができるＤＮＡ配列、形質転換細胞を特定するための標識、陰性選択システム及び発現制御システム（安全措置）、細胞特異的結合物質（細胞ターゲティング用）、細胞特異的インターナリゼーション因子、ベクターによる発現を促進する転写因子、ならびにベクターの製造の方法を含みうる。遺伝子治療手法の実施のためのそのような付加的な方法及び材料は、米国特許第４，９７０，１５４号（電気穿孔法を含む）、同第５，６７９，５５９号（遺伝子送達のためのリポタンパク質含有システムを述べる）、同第５，６７６，９５４号（リポソーム担体を含む）、同第５，５９３，８７５号（リン酸カルシウムトランスフェクションのための方法を述べる）及び同第４，９４５，０５０号（生物活性粒子が細胞の表面を貫通して細胞の内部に組み込まれる速度で、前記粒子を細胞に推進するプロセスを述べる）、及び国際公開公報第ＷＯ９６／４０９５８号（核リガンドを含む）に述べられている。
【０２４９】
ＧＰＣＲ遺伝子治療又は細胞治療が、同じか又は異なる細胞内への１個又はそれ以上の付加ポリペプチドの送達をさらに含みうることも想定される。そのような細胞は患者に別々に導入してもよく、又は前記細胞が上述した被包膜のような単一移植装置に含まれていてもよく、又は前記細胞がウイルスベクターによって別々に改変されてもよい。
【０２５０】
遺伝子治療によって細胞における内在性ＧＰＣＲポリペプチドの発現を上昇させる１つの手段は、ＧＰＣＲポリペプチドプロモーターに１個又はそれ以上のエンハンサーエレメントを挿入することであり、この場合エンハンサーエレメントはＧＰＣＲ遺伝子の転写活性を上昇させる働きをすることができる。使用するエンハンサーエレメントは、遺伝子を活性化しようとする組織に基づいて選択し、その組織においてプロモーターの活性化をもたらすことが知られているエンハンサーエレメントを選択する。例えば、ＧＰＣＲポリペプチドをコードする遺伝子がＴ細胞において「発動（ｔｕｒｎ  ｏｎ）」すべきであれば、ｌｃｋプロモーターエンハンサーエレメントが使用しうる。ここでは、付加する転写エレメントの機能性部分を、標準クローニング手法を用いてＧＰＣＲポリペプチドプロモーターを含むＤＮＡのフラグメントに挿入しうる（及び場合によっては、ベクター及び／又は５’及び／又は３’フランキング配列に挿入しうる）。「相同的組換え構築物」として知られるこの構築物は、その後半ビボ又はインビボで所望細胞に導入することができる。
【０２５１】
遺伝子治療はまた、内在性プロモーターのヌクレオチド配列を修飾することによってＧＰＣＲポリペプチド発現を低下させるために使用できる。そのような修飾は、典型的には相同的組換え法によって実施される。例えば、不活性化のために選択したＧＰＣＲ遺伝子のプロモーターの全部又は一部を含むＤＮＡ分子を、転写を調節するプロモーターの断片を除去する及び／又は置換するように操作することができる。例えば、標準分子生物学手法を用いて前記プロモーターの転写活性化因子のＴＡＴＡボックス及び／又は結合部位を欠失させうる；そのような欠失はプロモーター活性を阻害し、それによって対応するＧＰＣＲ遺伝子の転写を抑制する。プロモーター内のＴＡＴＡボックス又は転写活性化因子結合部位の欠失は、ＴＡＴＡボックス及び／又は転写活性化因子結合部位ヌクレオチドの１個又はそれ以上が、１個又はそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失及び／又は挿入によって突然変異している、ＧＰＣＲポリペプチドプロモーター（調節されるＧＰＣＲ遺伝子と同じか又は関連する種からの）の全部又は該当部分を含むＤＮＡ構築物を作製することによって実施しうる。結果として、ＴＡＴＡボックス及び／又は活性化因子結合部位は、低下した活性を有するか又は完全に不活性化される。典型的には修飾されたプロモーターセグメントに隣接する天然（内在性）５’及び３’ＤＮＡ配列に対応する少なくとも約５００塩基のＤＮＡを同時に含むこの構築物は、直接又はここで述べるようなウイルスベクターによって適切な細胞に導入しうる（エクスビボ又はインビボで）。典型的には、細胞のゲノムＤＮＡへの前記構築物の組込みは相同的組換えを通して行われ、この場合前記プロモーター構築物内の５’及び３’ＤＮＡ配列は、内在性染色体ＤＮＡへのハイブリダイゼーションによって修飾プロモーター領域を組み込むのを助ける働きをすることができる。
【産業上の利用可能性】
【０２５２】
（治療用途）
ＧＰＣＲ核酸分子、ポリペプチド、及びそれらのアゴニスト及びアンタゴニストはここで列挙するものを含めて、多くの疾患、障害又は状態を治療する、診断する、改善する、又は予防するために使用できる。
【０２５３】
ＧＰＣＲポリペプチドアゴニスト及びアンタゴニストは、ＧＰＣＲポリペプチド活性を調節し、成熟形態のＧＰＣＲポリペプチドの少なくとも１つの活性を上昇させる又は低下させる分子を包含する。アゴニスト又はアンタゴニストは、ＧＰＣＲポリペプチドと相互作用し、それによってその活性を調節する、タンパク質、ペプチド、糖質、脂質又は低分子量分子のような補因子でありうる。潜在的ポリペプチドアゴニスト又はアンタゴニストは、該タンパク質の細胞外ドメインの一部又は全部を含む、ＧＰＣＲポリペプチドの可溶性形態又は膜結合形態と反応する抗体を包含する。ＧＰＣＲポリペプチド発現を調節する分子は、典型的には、発現のアンチセンス調節因子として働くことができる、ＧＰＣＲポリペプチドをコードする核酸を含む。
【０２５４】
脂肪組織においてＧＰＣＲポリペプチドの発現が検出されているので、ＧＰＣＲ核酸分子、ポリペプチド、それらのアゴニスト及びアンタゴニスト（抗ＧＰＣＲ選択的結合物質を含むが、これらに限定されない）は脂肪代謝に関わる疾患の治療又は診断のために有用であると考えられる。そのような疾患の例は、肥満、糖尿病、及び脂質代謝異常（例えば異脂血症（ｄｉｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ））を含むが、これらに限定されない。本発明の分子はまた、ガンに関連する体重減少（すなわち悪液質）、及びＡＩＤＳ、神経性食欲不振に関連するもののような異常体重減少の他の状態の治療への適用も有すると考えられる。脂肪代謝に関連する他の疾患は、本発明の範囲内に包含される。
【０２５５】
ＧＰＣＲポリペプチドはまた、生物学的に炎症のメディエイターとして機能しうる。ＧＰＣＲの発現又は活性化を調節する分子は、それ故、肺疾患（例えば喘息、慢性気管支炎及び関連気道閉塞性疾患）、アレルギー及びアレルギー反応（例えばアレルギー性鼻炎、接触皮膚炎及びアレルギー性結膜炎）、アンギナ、脳痙縮、糸球体腎炎肝炎、内毒素血症、ブドウ膜炎、及び同種移植拒絶反応のような、ロイコトリエンを介した炎症性疾患を含むが、必ずしもこれらに限定されない、関連疾患又は異常状態の治療ための薬剤として有用であると考えられる。
【０２５６】
精巣においてＧＰＣＲポリペプチドの発現が検出されているので、ＧＰＣＲ核酸分子、ポリペプチド、それらのアゴニスト及びアンタゴニストは、精巣を冒す疾患及び状態を診断する又は治療する上で有用であると考えられる。そのような疾患及び状態の例は、雄性不妊症及び精巣癌を含むが、これらに限定されない。精巣の発育及び機能に関連する他の疾患及び状態は、本発明の範囲内に包含される。
【０２５７】
より広くは、本発明のＧＰＣＲ分子は、過剰量又は不十分な量のＧＰＣＲ（シグナル伝達）活性に関連する他の異常状態を治療する方法を提供しうる。一般に、ＧＰＣＲの活性が過剰である場合には、いくつかのアプローチが使用しうる。１つのアプローチは、ＧＰＣＲへのリガンドの結合を遮断することによるか、又は第二シグナルを阻害して、それによって異常状態を緩和することにより、活性化を阻害するのに有効な量で、医薬適合性の担体と共に阻害因子化合物（アンタゴニスト）を被験者に投与することを含む。もう１つのアプローチでは、内部で生成された又は別個に投与したアンチセンス配列などによる発現遮断手法を用いて、内在性ＧＰＣＲをコードする遺伝子の発現を阻害することができる。
【０２５８】
ＧＰＣＲポリペプチド機能のアゴニスト又はアンタゴニストは、治療する状態に適切であるように、１又はそれ以上のサイトカイン、成長因子、抗生物質、抗炎症薬、及び／又は化学療法剤と組み合わせて使用しうる（同時に又は連続的に）。
【０２５９】
有害なレベルのＧＰＣＲポリペプチドによって生じる又は仲介される他の疾患又は障害は、本発明の範囲内に包含される。有害なレベルは、ＧＰＣＲポリペプチドの過剰レベル及びＧＰＣＲポリペプチドの正常以下のレベルを含む。
【０２６０】
（ＧＰＣＲ核酸及びポリペプチドの使用）
本発明の核酸分子（それ自体は生物活性ポリペプチドをコードしないものを含む）は、ＧＰＣＲ遺伝子及び関連遺伝子の位置を染色体上に特定するために使用しうる。遺伝子地図の作製は、ＰＣＲ増幅やインサイチューハイブリダイゼーションのようなこの分野で既知の手法によって実施しうる。
【０２６１】
ＧＰＣＲ核酸分子（それ自体は生物活性ポリペプチドをコードしないものを含む）は、哺乳類組織又は体液標本中のＧＰＣＲ核酸分子の存在に関して、定性的又は定量的に試験するための診断アッセイにおけるハイブリダイゼーションプローブとして有用であると考えられる。
【０２６２】
１個又はそれ以上のＧＰＣＲポリペプチドの活性を阻害することが望ましい場合には、他の方法も使用しうる。そのような阻害は、発現制御配列（三重らせん形成）又はＧＰＣＲ  ｍＲＮＡに相補的であり、ハイブリダイズする核酸分子によって行われうる。例えば、ＧＰＣＲ遺伝子の少なくとも一部に相補的な配列を有するアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡ分子を細胞に導入することができる。アンチセンスプローブは、ここで開示するＧＰＣＲ遺伝子の配列を用いて使用可能な手法によって設計しうる。典型的には、そのような各々のアンチセンス分子は、各々の選択ＧＰＣＲ遺伝子の開始部位（５’末端）に相補的である。その後前記アンチセンス分子が対応するＧＰＣＲ  ｍＲＮＡにハイブリダイズするとき、このｍＲＮＡの翻訳が妨げられる又は低下する。アンチセンス阻害因子は、細胞又は生物におけるＧＰＣＲポリペプチドの低下又は不在に関する情報を提供する。
【０２６３】
あるいは、遺伝子治療は、１個又はそれ以上のＧＰＣＲポリペプチドのドミナントネガティブ阻害因子を創造するために使用しうる。この場合、各選択ＧＰＣＲポリペプチドの突然変異型ポリペプチドをコードするＤＮＡを調製し、ここで述べるようなウイルス又は非ウイルス法を用いて患者の細胞に導入することができる。そのような各々の突然変異体は、典型的にはその生物学的役割において内在性ポリペプチドと競合するように設計される。
【０２６４】
さらに、ＧＰＣＲポリペプチドは、生物活性であるか否かに関わらず、免疫原として使用しうる、すなわちこのポリペプチドは、それに対する抗体が惹起されうる少なくとも１つのエピトープを含む。ＧＰＣＲポリペプチドに結合する選択的結合物質（ここで述べるような）は、体液又は細胞試料においてＧＰＣＲポリペプチドの存在を検出するための標識携帯での使用を含むが、これに限定されない、インビボ及びインビトロでの診断目的に使用しうる。前記抗体はまた、ここで列挙するものを含めて、多くの疾患及び障害を予防する、治療する、又は診断するためにも使用しうる。該抗体は、ＧＰＣＲポリペプチドの特徴的な少なくとも１つの活性を低下させる又は遮断するようにＧＰＣＲポリペプチドに結合しうるか、又はＧＰＣＲポリペプチドの特徴的な少なくとも１つの活性を上昇させる（ＧＰＣＲポリペプチドの薬物動態を上昇させることによる場合を含む）ようにポリペプチドに結合しうる。
【０２６５】
ＧＰＣＲポリペプチドは、「発現クローニング」戦略を使用してＧＰＣＲリガンドをクローニングするために使用できる。放射能標識（１２５ヨウ素）ＧＰＣＲポリペプチド又は「親和性／活性標識」ＧＰＣＲポリペプチド（Ｆｃ融合又はアルカリホスファターゼ融合など）は、ＧＰＣＲリガンドを発現する細胞型、細胞系統又は組織を特定するための結合アッセイにおいて使用できる。そのような細胞又は組織から単離したＲＮＡは、その後ｃＤＮＡに転換して、哺乳類発現ベクターにクローニングし、哺乳類細胞（例えばＣＯＳ又は２９３）にトランスフェクトして、発現ライブラリーを作製することができる。放射能標識又は標識ＧＰＣＲポリペプチドは、その後、ＧＰＣＲリガンドを発現する、このライブラリー中の細胞のサブセットを特定し、単離するための親和性試薬として使用できる。次にこれらの細胞からＤＮＡを単離し、哺乳類細胞にトランスフェクトして、ＧＰＣＲリガンドを発現する細胞の分画が最初のライブラリーにおけるよりも何倍も高い第二の発現ライブラリーを創造する。ＧＰＣＲリガンドを含む単一組換えクローンが単離されるまで、この濃縮過程を何度も反復することができる。ＧＰＣＲリガンドの単離は、ＧＰＣＲシグナル伝達経路の新規アゴニスト及びアンタゴニストを特定する又は開発するために有用である。そのようなアゴニスト及びアンタゴニストは、ＧＰＣＲリガンド、抗ＧＰＣＲリガンド抗体、小分子又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを包含する。
【０２６６】
本発明のヒトＧＰＣＲ核酸はまた、対応する染色体ＧＰＣＲポリペプチド遺伝子を単離するための有用なツールである。ヒトＧＰＣＲゲノムＤＮＡは、遺伝性組織変性疾患を特定するために使用できる。
【０２６７】
下記の実施例は例示のみを意図しており、いかなる意味においても本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【実施例１】
【０２６８】
ラットＧＰＣＲポリペプチド遺伝子のクローニング
一般に、ラットＧＰＣＲポリペプチドをコードする遺伝子をクローニングし、分析するために、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に述べられているような材料及び方法を使用した。
【０２６９】
ラットＧＰＣＲポリペプチドをコードするｃＤＮＡ配列を単離するために、専有発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースの相同性に基づく検索を実施した。白色脂肪組織ｃＤＮＡライブラリーからの部分クローンが、潜在的Ｇ−タンパク質共役受容体をコードすることが認められた。ＧＰＣＲポリペプチドについての完全長ｃＤＮＡ配列を作製するために、ラット脂肪細胞Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ  ＲＡＣＥキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用し、製造者に指示されている条件を用いてＲＡＣＥを実施した。２回の連続的ＰＣＲ反応を行った。第１回目の反応（ＰＣＲ１）では、Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ  ＲＡＣＥキットからのＡＰ１プライマーを、プライマー：５’−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｔ−３’（配列番号９）と共に使用した。第２回目の反応（ＰＣＲ２）では、前記キットからのＡＰ２プライマーを、プライマー：５’−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｇ−３’（配列番号１０）と共に使用した。生じたＲＡＣＥ  ＤＮＡをＰＣＲＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結し、大腸菌に形質転換した。陽性クローンを配列決定し、コンセンサス配列を構築した。ＲＡＣＥによって決定される配列から誘導した信頼性の高いＰＣＲとプライマーを使用して完全長クローンを得た。増幅反応は、総容量４９μＬ中に、ラット脂肪細胞ｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ  ＲＡＣＥキットで調製した）、プライマー：５’−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｇ−３’（配列番号１１）及び５’−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｔ−３’（配列番号１２）、反応緩衝液１０μＬ（１００ｍＭトリシン、ｐＨ５．７、２５％グリセロール及び４２５ｍＭ  ＫＯＡｃ）、ｄＮＴＰ  ４μＬ（各々１ｍＭ）、ｒｔＴｈ  １μＬ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、２Ｕ／μＬ）、及びＶｅｎｔポリメラーゼ１μＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、０．０１Ｕ／μＬ）を含んだ。反応は、９４℃で１０秒間、６２℃で１分間、及び６８℃で５分間を３５サイクル実施した。熱循環器の温度が６５℃に達したとき、１０ｍＭ  ＭｇＯＡｃ  １μＬを加えた。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分析し、適切なフラグメントをゲルから切り出して、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮキット（Ｂｉｏ１０１；Ｖｉｓｔａ，カリフォルニア州（ＣＡ））を用いて精製した。精製ＤＮＡをＰＣＲｓｃｒｉｐｔキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，カリフォルニア州（ＣＡ））を用いてクローン化し、増幅ＤＮＡを含むクローンを大腸菌において回収した。その後、挿入物のＤＮＡ配列を決定した。
【０２７０】
完全長ラットＧＰＣＲ  ｃＤＮＡクローンも、ラット白色脂肪組織から構築したオリゴ−ｄＴプライムｃＤＮＡライブラリーから単離した。全ＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，メリーランド州（ＭＤ））を用いて雌性Ｗｉｓｔａｒラット白色脂肪組織から単離した。Ｄｙｎａｌ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓを用いて全ＲＮＡからメッセンジャーＲＮＡを精製した。ｃＤＮＡを合成し、ｍＲＮＡ  ２．７μｇ及びｃＤＮＡ合成とプラスミドクローニングのためのｔｈｅ  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してベクター、ｐＳＰＯＲＴ１にクローニングした。前記ｃＤＮＡを電気穿孔法によってＤＨ１０Ｂ大腸菌（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に導入した。ＣｓＣｌ勾配で精製したプラスミドＤＮＡを、１００万個以上の非増幅ｃＤＮＡクローンを含む１００ｍｌテリフィック肉汁培養から採集した。Ｇｅｎｅｔｒａｐｐｅｒシステム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＣｓＣｌ勾配精製したプラスミドｃＤＮＡ  ５μｇをプライマー：５’−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−３’（配列番号１３）でスクリーニングした。救い出したプラスミドの５分の１をＤＨ１０Ｂ大腸菌細胞に電気穿孔で導入し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天平板に塗布した。Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋ナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ニュージャージー州（ＮＪ））及び末端標識プライマー（５’−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−３’；配列番号１４）を使用してコロニーハイブリダイゼーションを実施した。ハイブリダイズしたコロニーを、プライマー：５’−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−３’（配列番号１５）及び５’−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−３’（配列番号１６）を使用したＰＣＲによって再スクリーニングした。１つの陽性単離コロニーを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ中で一晩増殖させた。Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してプラスミドＤＮＡを単離し、配列決定した。マウスＧＰＣＲポリペプチドについての完全長ｃＤＮＡの配列分析は、マウスＧＰＣＲ遺伝子が３５１アミノ酸のタンパク質をコードする１０５３塩基対のオープンリーディングフレームを含むことを示唆した（図３Ａから３Ｃ）。
【実施例２】
【０２７１】
マウスＧＰＣＲポリペプチド遺伝子のクローニング
一般に、マウスＧＰＣＲポリペプチドをコードする遺伝子をクローニングし、分析するために、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に述べられているような材料及び方法を使用した。
【０２７２】
マウスＧＰＣＲポリペプチドをコードするｃＤＮＡ配列を単離するために、ラットＧＰＣＲ  ｃＤＮＡ配列を使用して専有ゲノムデータベースを検索した。マウス骨髄ｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡクローンが、ラットクローンの５’末端に対合すると特定された。このクローンを回収し、その完全な配列を決定した。ラットＧＰＣＲポリペプチドについての完全長ｃＤＮＡの配列分析は、ラットＧＰＣＲ遺伝子が３５１アミノ酸のタンパク質をコードする１０５３塩基対のオープンリーディングフレームを含むことを示唆した（図２Ａから２Ｄ）。
【実施例３】
【０２７３】
ヒトＧＰＣＲポリペプチド遺伝子のクローニング
一般に、ヒトＧＰＣＲポリペプチドをコードする遺伝子をクローニングし、分析するために、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に述べられているような材料及び方法を使用した。
【０２７４】
ヒトＧＰＣＲポリペプチドをコードするｃＤＮＡ配列を単離するために、３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識した７００塩基対のラットＧＰＣＲプローブ（プライマー：５’−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−３’；配列番号１５及び５’−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−３’；配列番号１６を使用してラットＧＰＣＲ  ｃＤＮＡ配列からＰＣＲによって調製した）を使用して、プラークハイブリダイゼーションによってヒト白色脂肪組織ｃＤＮＡファージライブラリー（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）をスクリーニングした。組換えファージを約５×１０４形質転換体／１５０ｍｍ  ＬＢ平板で大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ系統に接種した。正に荷電したナイロンフィルターを取り出し、５ｘＳＳＣ、５ｘデンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ及び２００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ中、４５℃で３時間プレハイブリダイズした。次にこのフィルターを、５ｎｇ／ｍｌの標識プローブを補足した同じ溶液中、４５℃で一晩ハイブリダイズした。前記フィルターをまず２ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中、室温で２０分間ずつ２回洗い、次に０．５ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中、４５℃で３０分間ずつ２回洗った。その後増感紙を使用して−８０℃の温度で５日間、前記フィルターをＸ線に暴露した。２枚のフィルターを整列して陽性ハイブリダイズプラークを決定した。３６個の陽性プラークを採取し、一次スクリーニングで用いたのと同じ方法を使用して二次スクリーニングのために再び接種した。二次スクリーニングによって１６個の陽性プラークが生じた。
【０２７５】
二次スクリーニングで特定した組換えファージを、ｃｒｅ−リコンビナーゼを発現する大腸菌ＢＭ２５．８系統に形質導入した。ｌｏｘＰ部位でのｃｒｅ−リコンビナーゼを介した部位特異的組換えの結果として、ｐＴｒｉｐｌＥｘファージミドを切り出した。感染したＢＭ２５．８細胞をＬＢ／アンピシリン平板に塗布し、一晩インキュベートした。正に荷電した８２ｍｍフィルター（ＮＥＮ；Ｂｏｓｔｏｎ，マサチューセッツ州（ＭＡ））を上述したように取り出し、先に述べた７００塩基対の標識ラットＧＰＣＲプローブを用いて三次スクリーニングを実施した。プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションは先に述べたように実施した。陽性平板につき２個のコロニーを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地中で増幅した。プラスミドＤＮＡを調製し、ｃＤＮＡ挿入物の２本の鎖を配列決定した。ヒトＧＰＣＲをコードするＤＮＡは２．５ｋｂの長さであることが認められた。ヒトＧＰＣＲポリペプチドについての完全長ｃＤＮＡの配列分析は、ヒトＧＰＣＲ遺伝子が３４６アミノ酸のタンパク質をコードする１０３８塩基対のオープンリーディングフレームを含むことを示唆した（図１Ａから１Ｂ）。
【０２７６】
図４は、ヒトＧＰＣＲポリペプチド（ｈｕ＿ＧＰＣＲ；配列番号２）、マウスＧＰＣＲポリペプチド（ｍｕ＿ＧＰＣＲ；配列番号４）及びラットＧＰＣＲポリペプチド（ｒａ＿ＧＰＣＲ；配列番号６）のアミノ酸配列の整列化を示す。ヒトＧＰＣＲポリペプチドは、マウス及びラットＧＰＣＲポリペプチドの両方と７８％の同一性を共有する。マウスＧＰＣＲポリペプチドとラットＧＰＣＲポリペプチドは９０％の同一性を共有する。ヒト、マウス及びラットＧＰＣＲポリペプチドの構造は、各々のポリペプチドが７つの膜貫通ドメインを有することから、Ｇタンパク質共役受容体ファミリーの他の成員の構造に匹敵する。
【実施例４】
【０２７７】
ＧＰＣＲ  ｍＲＮＡの発現
多数のヒトｃＤＮＡ試料におけるＧＰＣＲ  ｍＲＮＡ発現を評価するために、ＰＲＩＳＭ  Ｔａｑｍａｎシステムを用いた定量的ＰＣＲを実施した（ヒトポリＡ＋はＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓより入手した；ｃＤＮＡはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ；Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬを使用して作製した）。２個のプライマーと、我々がヒトＧＰＣＲ配列から誘導した発蛍光性プローブを使用してＰＲＩＳＭ  Ｔａｑｍａｎ反応を実施した。生じたデータをヒトハウスキーパー遺伝子シクロフィリンに基準化し、ヒトシクロフィリンコピー数に対するＧＰＣＲコピー数の比として報告した。ヒトＧＰＣＲ  ｍＲＮＡ発現の測定のための反応は、プライマー：５’−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ａ−３’（配列番号１７）及び５’−Ａ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−３’（配列番号１８）、ならびに発蛍光性プローブ：５’−（６−ＦＡＭ）−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−（ＴＡＭＲＡ）−３’（配列番号１９；式中、「６−ＦＡＭ」は５’レポーター染料、６−カルボキシフルオレセインであり、「ＴＡＭＲＡ」は３’消光剤、６−カルボキシテトラメチルローダミンである）を含んだ。ヒトシクロフィリンｍＲＮＡ発現の測定のための反応は、プライマー：５’−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−３’（配列番号２０）及び５’−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−３’（配列番号２１）、ならびに発蛍光性プローブ：５’−（６−ＦＡＭ）−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−（ＴＡＭＲＡ）−３’（配列番号２２）を含んだ。ＧＰＣＲ  ｍＲＮＡ発現の最高レベルは精巣と白色脂肪組織において検出された（図５）。
【０２７８】
ＧＰＣＲ  ｍＲＮＡの発現をノーザンブロット分析によって検討する。多数のヒト組織ノーザンブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、ヒトＧＰＣＲポリペプチドｃＤＮＡクローンから単離した適切な制限フラグメントでプローブする。このプローブを標準手法を用いて３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識する。
【０２７９】
ノーザンブロットを、ハイブリダイゼーション溶液（５ＸＳＳＣ、５０％脱イオン化ホルムアミド、５Ｘデンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ及び１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ）中、４２℃で２時間プレハイブリダイズし、その後５ｎｇ／ｍｌの標識プローブを含む新鮮ハイブリダイゼーション溶液中４２℃で一晩ハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション後、フィルターを２ＸＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中、室温で１０分間ずつ２回洗い、次に０．１ＸＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中、６５℃で３０分間ずつ２回洗う。その後、これらのブロットをオートラジオグラフィーに暴露する。
【０２８０】
ＧＰＣＲ  ｍＲＮＡの発現をインサイチューハイブリダイゼーションによって局在決定する。正常胚及び成体マウス組織のパネルを４％パラホルムアミドに固定し、パラフィンに包埋して、５μｍの切片にする。切片にした組織を０．２Ｍ  ＨＣｌ中で透過性を上げ、プロテイナーゼＫで消化して、トリエタノールアミン及び無水酢酸でアセチル化する。切片をハイブリダイゼーション溶液（３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１Ｘデンハルト溶液、０．２％ＳＤＳ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．２５ｍｇ／ｍｌ  ｔＲＮＡ、２５μｇ／ｍｌポリＡ、２５μｇ／ｍｌポリＣ及び５０％ホルムアミド）中、６０℃で１時間プレハイブリダイズし、その後１０％デキストラン及びヒトＧＰＣＲ遺伝子に相補的な２×１０４ｃｐｍ／μｌの３２Ｐ−標識アンチセンスリボプローブを含む同じ溶液中、６０℃で一晩ハイブリダイズする。このリボプローブは、標準手法を用いてヒトＧＰＣＲ  ｃＤＮＡを含むクローンのインビトロ転写によって得る。
【０２８１】
ハイブリダイゼーション後、切片をハイブリダイゼーション溶液中で洗浄し、ＲＮアーゼＡで処理してハイブリダイズしていないプローブを消化し、その後０．１ＸＳＳＣ中、５５℃で３０分間洗う。次に切片をＮＴＢ−２乳剤（Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ニューヨーク州（ＮＹ））中に液浸し、４℃で３週間暴露して、現像し、ヘマトキシリンとエオシンで対比染色する。脳（1矢状切断及び２冠状切断）、胃腸管（食道、胃、十二指腸、空腸、回腸、近位結腸及び遠位結腸）、下垂体、肝臓、肺、心臓、脾臓、胸腺、リンパ節、腎臓、副腎、膀胱、膵臓、唾液腺、雄性及び雌性生殖器（雌性では卵巣、卵管及び子宮；雄性では精巣、精巣上体、前立腺、精嚢及び輸精管）、ＢＡＴ及びＷＡＴ（皮下、腎周囲）、骨（大腿骨）、皮膚、胸、及び骨格筋に関して、暗視野及び標準照明により組織形態及びハイブリダイゼーションシグナルを同時に分析する。
【実施例５】
【０２８２】
ＧＰＣＲポリペプチドの生産
Ａ：細菌におけるＧＰＣＲポリペプチドの発現
ＰＣＲを用いて、該配列の５'末端と３'末端に対応するプライマーを使用してＧＰＣＲポリペプチドをコードする鋳型ＤＮＡ配列を増幅する。増幅したＤＮＡ産物は、発現ベクターへの挿入を可能にする制限酵素部位を含むように修飾してもよい。ＰＣＲ産物をゲル精製し、標準組換えＤＮＡ法を用いて発現ベクターに挿入する。ｌｕｘプロモーター及びカナマイシン耐性をコードする遺伝子を含むｐＡＭＧ２１（ＡＴＣＣ番号９８１１３）のような例示的ベクターを、挿入したＤＮＡの方向指示クローニングのためにＢａｍ  ＨＩとＮｄｅ  Ｉで消化する。連結した混合物を電気穿孔法によって大腸菌宿主株に形質転換し、形質転換体をカナマイシン耐性に関して選択する。選択したコロニーからのプラスミドＤＮＡを単離し、ＤＮＡ塩基配列決定に供して、挿入物の存在を確認する。
【０２８３】
形質転換した宿主細胞を、誘導の前に３０℃で、３０μｇ／ｍＬカナマイシンを含む２ｘＹＴ培地中でインキュベートする。３０ｎｇ／ｍＬの最終濃度までＮ−（３−オキソヘキサノイル）−ｄｌ−ホモセリンラクトンを加え、その後３０℃又は３７℃で６時間インキュベートして遺伝子発現を誘導する。培養の遠心分離、細菌ペレットの再懸濁と溶解、及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による宿主細胞タンパク質の分析によって、ＧＰＣＲポリペプチドの発現を評価する。
【０２８４】
ＧＰＣＲポリペプチドの封入体を次のように精製する。細菌細胞を遠心分離によってペレット化し、水に再懸濁する。この細胞懸濁液を音波処理によって溶解し、１９５，０００×ｇで５−１０分間遠心分離してペレット化する。上清を廃棄し、前記ペレットを洗って、ホモジナイザーに移す。ペレットをパーコル溶液（７５％液体パーコル及び０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）５ｍＬ中で均一に懸濁するまでホモジナイズし、その後希釈して、２１，６００×ｇで３０分間遠心分離する。前記封入体を含む勾配分画を回収し、プールする。この単離した封入体をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。
【０２８５】
大腸菌が産生したＧＰＣＲポリペプチドに対応するＳＤＳポリアクリルアミドゲル上の単一バンドをゲルから切り出し、そのＮ末端アミノ酸配列を、基本的にＭａｔｓｕｄａｉｒａら、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１０−３５が述べたようにして決定する。
【０２８６】
Ｂ．哺乳類細胞におけるＧＰＣＲポリペプチドの発現
ＰＣＲを用いて、該配列の５'末端と３'末端に対応するプライマーを使用してＧＰＣＲポリペプチドをコードする鋳型ＤＮＡ配列を増幅する。増幅したＤＮＡ産物は、発現ベクターへの挿入を可能にする制限酵素部位を含むように修飾してもよい。ＰＣＲ産物をゲル精製し、標準組換えＤＮＡ法を用いて発現ベクターに挿入する。エプスタイン−バーウイルス複製起点を含む例示的ベクター、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，カリフォルニア州（ＣＡ））が、２９３−ＥＢＮＡ−１細胞におけるＧＰＣＲポリペプチドの発現のために使用しうる。増幅してゲル精製したＰＣＲ産物をｐＣＥＰ４ベクターに連結し、リポフェクションによって２９３−ＥＢＮＡ細胞に導入する。トランスフェクトした細胞を１００μｇ／ｍＬヒグロマイシン中で選択し、生じた薬剤耐性培養を集密まで増殖させる。次に前記細胞を無血清培地で７２時間培養する。順化培地を取り出し、ＧＰＣＲポリペプチド発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。
ＧＰＣＲポリペプチドの発現は銀染色法によって検出しうる。選択的に、ＧＰＣＲポリペプチドを、ＩｇＧ定常ドメイン又はＦＬＡＧエピトープのようなエピトープタグを有する融合タンパク質として生産し、それを、前記ペプチドタグに対する抗体を使用したウエスタンブロット分析によって検出することができる。
【０２８７】
ＧＰＣＲポリペプチドをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから切り出すか、又はＧＰＣＲ融合タンパク質をエピトープタグに対するアフィニティークロマトグラフィーによって精製して、ここで述べるようなＮ末端アミノ酸配列分析に供する。
【０２８８】
Ｃ．哺乳類細胞におけるＧＰＣＲポリペプチドの発現と精製
ＧＰＣＲポリペプチド発現構築物を、リポフェクション又はリン酸カルシウムプロトコールのいずれかを使用して２９３  ＥＢＮＡ又はＣＨＯ細胞に導入する。
【０２８９】
産生されるＧＰＣＲポリペプチドについての機能性試験を実施するため、ヒグロマイシン選択２９３  ＥＢＮＡクローンのプールから多量の順化培地を生成する。前記細胞を５００ｃｍのＮｕｎｃトリプルフラスコ中で８０％の集密度に増殖させ、その後培地採集の１週間前に無血清培地に切り替える。順化培地を取り出し、精製まで−２０℃で凍結する。
【０２９０】
順化培地を下記で述べるようにアフィニティークロマトグラフィーによって精製する。前記培地を解凍し、０．２μｍフィルターに通す。プロテインＧカラムをｐＨ７．０のＰＢＳで平衡させ、その後ろ過した培地を充填する。Ａ２８０での吸光度が基線値に達するまでカラムをＰＢＳで洗う。ＧＰＣＲポリペプチドをｐＨ２．７の０．１Ｍグリシン−ＨＣｌでカラムから溶出し、直ちにｐＨ８．５の１Ｍトリス−ＨＣｌで中和する。ＧＰＣＲポリペプチドを含む分画をプールし、ＰＢＳ中で透析して、−７０℃で保存する。
【０２９１】
ヒトＧＰＣＲポリペプチド−Ｆｃ融合ポリペプチドの第Ｘａ因子開裂のために、アフィニティークロマトグラフィーで精製したタンパク質をｐＨ８．０の５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２中で透析する。制限プロテアーゼ第Ｘａ因子を透析したタンパク質に１／１００（ｗ／ｗ）で加え、試料を室温で一晩消化する。
【実施例６】
【０２９２】
抗ＧＰＣＲポリペプチド抗体の作製
ＧＰＣＲポリペプチドに対する抗体は、生物学的又は化学合成によって生産した精製タンパク質又はＧＰＣＲペプチドで免疫することによって入手しうる。抗体を作製するための適切な手順は、ＨｕｄｓｏｎとＢａｙ，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第２版、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）に述べられているものを含む。
【０２９３】
抗体生産のための１つの手順では、動物（典型的にはマウス又はウサギ）にＧＰＣＲ抗原（ＧＰＣＲポリペプチドなど）を注射し、ＥＬＩＳＡによって測定したとき十分な血清力価を有するものをハイブリドーマ生産のために選択する。免疫した動物の脾臓を採集し、単細胞懸濁液として調製して、そこから脾細胞を回収する。この脾細胞をマウス骨髄腫細胞（Ｓｐ２／０−Ａｇ１４細胞など）に融合し、まず２００Ｕ／ｍＬペニシリン、２００μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシン及び４ｍＭグルタミンを含むＤＭＥＭ中でインキュベートし、次にＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミンプテリン及びチミジン）中でインキュベートする。選択後、組織培養上清を各々の融合ウエルから取り出し、ＥＬＩＳＡによって抗ＧＰＣＲ抗体産生に関して試験する。
【０２９４】
ヒトＩｇ遺伝子座を担うトランスジェニックマウスの免疫、及び抗体可変ドメインの突然変異誘発によって作製されるような合成抗体ライブラリーのスクリーニングなどの、抗ＧＰＣＲ抗体を得るための選択的手順も使用しうる。
【実施例７】
【０２９５】
トランスジェニックマウスにおけるＧＰＣＲポリペプチドの発現
ＧＰＣＲポリペプチドの生物活性を評価するため、肝特異的ＡｐｏＥプロモーターの制御下のＧＰＣＲポリペプチド／Ｆｃ融合タンパク質をコードする構築物を作製する。この構築物の送達は、ＧＰＣＲポリペプチドの機能に関して有益な生理的変化を生じさせると期待される。同様に、β−アクチンプロモーターの制御下の完全長ＧＰＣＲポリペプチドを含む構築物を調製する。この構築物の送達は偏在的発現をもたらすと予想される。
【０２９６】
これらの構築物を作製するために、ＰＣＲを用いて、所望配列の５'末端と３'末端に対応し、増幅産物の発現ベクターへの挿入を可能にする制限酵素部位を組み込んだプライマーを使用してＧＰＣＲポリペプチドをコードする鋳型ＤＮＡ配列を増幅する。増幅後、ＰＣＲ産物をゲル精製し、適切な制限酵素で消化して、標準組換えＤＮＡ手法を用いて発現ベクターに連結する。例えば、増幅したＧＰＣＲポリペプチド配列を、Ｇｒａｈａｍら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１７：２７２−７４及びＲａｙら、１９９１、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．５：２２６５−７３が述べているように、ヒトβ−アクチンプロモーターの制御下の発現ベクターにクローニングすることができる。
【０２９７】
連結後、反応混合物を使用して電気穿孔法によって大腸菌宿主株に形質転換し、形質転換体を薬剤耐性に関して選択する。選択したコロニーからのプラスミドＤＮＡを単離し、ＤＮＡ塩基配列決定に供して、適切な挿入物の存在と突然変異の不在を確認する。２回のＣｓＣｌ密度勾配遠心分離を通してＧＰＣＲポリペプチド発現ベクターを精製し、適切な制限酵素で開裂して、ＧＰＣＲポリペプチド導入遺伝子を含む線状化したフラグメントをゲル電気泳動によって精製する。精製したフラグメントを５ｍＭトリス、ｐＨ７．４及び０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ中に２ｍｇ／ｍＬの濃度で再懸濁する。
【０２９８】
ＢＤＦ１×ＢＤＦ１交配マウスからの単細胞胚を記述されているように（国際公開公報第ＷＯ９７／２３６１４号）注入する。胚をＣＯ２培養器中で一晩培養し、１５−２０のニ細胞胚を偽妊娠ＣＤ１雌性マウスの卵管に移す。微量注入胚の移植から得られた子を、次のようにしてゲノムＤＮＡ試料中に組み込んだ導入遺伝子のＰＣＲ増幅によってスクリーニングする。耳片を耳緩衝液（２０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ及び５００ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ）２０ｍＬ中、５５℃で一晩消化する。次に試料をＴＥ２００ｍＬで希釈し、この耳試料２ｍＬを、適切なプライマーを用いたＰＣＲ反応において使用する。
【０２９９】
８週齢で、トランスジェニック創始者動物及び対照動物を犠牲剖検し、生理学的分析に供する。脾臓の部分を切除し、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全細胞ＲＮＡを脾臓から単離して、導入遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲによって測定する。次のようにＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）  Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を使用して脾臓から回収したＲＮＡをｃＤＮＡに変換する。発現ベクター配列内の、ＧＰＣＲポリペプチド導入遺伝子の３’側に位置する適切なプライマーを使用して、導入遺伝子転写産物からｃＤＮＡ合成を開始させる。トランスジェニック創始者動物及び対照動物からの全脾臓ＲＮＡ１０ｍｇをプライマー１ｍＭと共に７０℃で１０分間インキュベートし、氷上に置く。次にこの反応に１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、各ｄＮＴＰ  １０ｍＭ、０．１ｍＭ  ＤＴＴ及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素２００Ｕを補足する。４２℃で５０分間インキュベートした後、７２℃で１５分間加熱して反応を停止させ、ＲＮアーゼＨ  ２Ｕにより３７℃で２０分間消化する。その後ＧＰＣＲポリペプチドに特異的なプライマーを使用するＰＣＲによって試料を増幅する。
【実施例８】
【０３００】
トランスジェニックマウスにおけるＧＰＣＲポリペプチドの生物活性
安楽死の前に、トランスジェニック動物を計量し、イソフルランで麻酔して、心臓穿刺によって採血する。試料を血液学的検査と血清化学分析に供する。最終瀉血後、Ｘ線撮影を実施する。肉眼的解剖の際に、主要内臓器官を重量分析に供する。
【０３０１】
肉眼的解剖後、組織（すなわち、肝臓、脾臓、膵臓、胃、全胃腸管、腎臓、生殖器、皮膚及び乳腺、骨、脳、心臓、肺、胸腺、気管、食道、甲状腺、副腎、膀胱、リンパ節及び骨格筋）を切除し、組織学的検査のために１０％緩衝亜鉛−ホルマリンに固定する。固定後、前記組織をパラフィンブロックに加工し、３ｍｍの切片を得る。すべての切片をヘマトキシリンとエオシンで染色し、その後組織学的分析に供する。
【０３０２】
トランスジェニックマウス及び対照マウスの両方の脾臓、リンパ節及びパイアー斑を、次のようにＢ細胞及びＴ細胞特異的抗体による免疫組織学分析に供する。ホルマリン固定パラフィン包埋切片を脱パラフィン化し、脱イオン水中で水和する。前記切片を３％過酸化水素でクエンチングし、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｌｏｃｋ（Ｌｉｐｓｈａｗ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ペンシルバニア州（ＰＡ））で遮断して、ラットモノクローナル抗マウスＢ２２０及びＣＤ３（Ｈａｒｌａｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，インディアナ州（ＩＮ））中でインキュベートする。ＤＡＢを色素原（ＢｉｏＴｅｋ，Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，カリフォルニア州（ＣＡ））として、ビオチニル化ウサギ抗ラット免疫グロブリン及びペルオキシダーゼ複合ストレプトアビジン（ＢｉｏＧｅｎｅｘ，Ｓａｎ  Ｒａｍｏｎ，カリフォルニア州（ＣＡ））によって抗体結合を検出する。切片をヘマトキシリンで対比染色する。
【０３０３】
剖検後、トランスジェニック動物及び対照同腹子からのＭＬＮ及び脾臓と胸腺の切片を切除する。１００ｍｍナイロン細胞ストレーナー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ニュージャージー州（ＮＪ））の底に対してシリンジの平らな先端で組織を静かに摩砕して単細胞懸濁液を調製する。細胞を２回洗い、計数して、その後各組織からの約１×１０６細胞を、２０μＬ容量中０．５μｇ  ＣＤ１６／３２（ＦｃγＩＩＩ／ＩＩ）Ｆｃブロックと共に１０分間インキュベートする。次に試料を、１００μＬ容量のＰＢＳ（Ｃａ＋及びＭｇ＋を欠く）、０．１％ウシ血清アルブミン及び０．０１％アジ化ナトリウム中、ＣＤ９０．２（Ｔｈｙ−１．２）、ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）、ＣＤ１１ｂ（Ｍａｃ−１）、Ｇｒ−１、ＣＤ４又はＣＤ８（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，カリフォルニア州（ＣＡ））に対するＦＩＴＣ又はＰＥ複合モノクローナル抗体の０．５μｇ抗体により、２−８℃で３０分間染色する。抗体結合後、細胞を洗って、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でのフローサイトメトリーによって分析する。
【０３０４】
本発明を好ましい実施態様の見地から説明したが、当業者には変法及び修正が生じることは明白である。それ故、付属の特許請求の範囲は、特許請求するような本発明の範囲内に含まれるそのようなすべての等価変法をカバーすることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０３０５】
【図１Ａ】ヒトＧＰＣＲ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）及びヒトＧＰＣＲポリペプチドの推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図１Ｂ】ヒトＧＰＣＲ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）及びヒトＧＰＣＲポリペプチドの推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図２Ａ】マウスＧＰＣＲ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号３）及びマウスＧＰＣＲポリペプチドの推定アミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図２Ｂ】マウスＧＰＣＲ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号３）及びマウスＧＰＣＲポリペプチドの推定アミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図２Ｃ】マウスＧＰＣＲ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号３）及びマウスＧＰＣＲポリペプチドの推定アミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図２Ｄ】マウスＧＰＣＲ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号３）及びマウスＧＰＣＲポリペプチドの推定アミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図３Ａ】ラットＧＰＣＲ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号５）及びラットＧＰＣＲポリペプチドの推定アミノ酸配列（配列番号６）を示す。
【図３Ｂ】ラットＧＰＣＲ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号５）及びラットＧＰＣＲポリペプチドの推定アミノ酸配列（配列番号６）を示す。
【図３Ｃ】ラットＧＰＣＲ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号５）及びラットＧＰＣＲポリペプチドの推定アミノ酸配列（配列番号６）を示す。
【図４】ヒトＧＰＣＲポリペプチド（ｈｕ＿ＧＰＣＲ；配列番号２）、マウスＧＰＣＲポリペプチド（ｍｕ＿ＧＰＣＲ；配列番号４）及びラットＧＰＣＲポリペプチド（ｒａ＿ＧＰＣＲ；配列番号６）のアミノ酸配列の整列化を示す。推定上の膜貫通ドメインを指示している（下線部）。
【図５】定量的ＰＣＲにより、いくつかのヒト組織において測定したＧＰＣＲ  ｍＲＮＡ発現のレベルを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005503124.tif 000137
【国際調査報告】
2005503124.tif 000138
2005503124.tif 000139
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