(57)【要約】  本発明は生存可能な固定化された生物材料を使用するバイオリアクターの製造方法および該バイオリアクターそのものに関する。より詳しくは、本発明はバイオマス固定化と、選択される閾値よりも高い分子量を有するマクロ分子の選択的カットオフとを行い得るケイ質層の製造方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオマス固定化と、選択される閾値よりも高い分子量を有するマクロ分子の選択的カットオフとを行い得るケイ質層の製造方法であって、
ａ）(1) Ｓｉ（ＯＲ）4 ，(2) ＳｉＨ（ＯＲ）3 ，(3) Ｒ’Ｓｉ（ＯＲ）3 および(4) Ｒ’ＳｉＨ（ＯＲ）2 ［式中、互いに等しいか又は異なるＲおよびＲ’は、アルキルおよび／またはアリール基である］を含んでなる群より選択されるシリコンアルコキシドの混合物により飽和されたガスキャリアのガス流を供給するステップにおいて、前記ガス流は前記ガスキャリアを２０〜１８０℃、好ましくは２０〜１００℃の温度の(1) ４０〜８５／（2） ０〜６０／(3) ０〜６０／(4) ０〜６０（％ｖ／ｖ）の比にある前記アルコキシドの混合液中にバブリングすることによって調製されるステップと、
ｂ）バイオマスを含んでなる支持体をステップａ）のガス流に曝露するステップとを含んでなり、
前記選択される閾値の分子量が１００００ダルトン〜１５００００ダルトンの範囲で選択され、ステップａ）における前記(1)，（2），(3)および(4)のＳｉ誘導体間の比がカットオフされるべきマクロ分子の分子量の関数として選択される方法。
【請求項２】
Ｒがエチルまたはメチルであり、Ｒ’がメチルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップａ）における前記(1)，（2），(3)および(4)のＳｉ誘導体間の比が、１０，０００ダルトンよりも高い分子量を有するマクロ分子をカットオフするために選択される、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップａ）における前記(1)，（2），(3)および(4)のＳｉ誘導体間の比が、７０，０００ダルトンよりも高い分子量を有するマクロ分子をカットオフするために選択される、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ステップａ）における前記(1)，（2），(3)および(4)のＳｉ誘導体間の比が、９０，０００ダルトンよりも高い分子量を有するマクロ分子をカットオフするために選択される、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項６】
ステップａ）における前記(1)，（2），(3)および(4)のＳｉ誘導体間の比が、１５０，０００ダルトンよりも高い分子量を有するマクロ分子をカットオフするために選択される、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項７】
ステップａ）におけるＲ’Ｓｉ（ＯＲ）3 誘導体の含有量が約１０％ｖ／ｖまでであり、これが同量のＳｉ（ＯＲ）4 と置き換えて添加される、請求項１、２および６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ステップａ）における前記Ｓｉ誘導体が、６５〜７９％／２０〜２５％／１〜１０％ｖ／ｖの比にあるＳｉ（ＯＲ）4 ／Ｒ’ＳｉＨ（ＯＲ）2 ／Ｒ’Ｓｉ（ＯＲ）3 である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ステップａ）におけるＲ’Ｓｉ（ＯＲ）3 誘導体の含有量が約１０％ｖ／ｖ〜約２０％ｖ／ｖであり、これが同量のＳｉ（ＯＲ）4 と置き換えて添加される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップａ）における前記Ｓｉ誘導体が、５３〜７０％／１５〜２５％／１０〜２２％ｖ／ｖの比にあるＳｉ（ＯＲ）4 ／Ｒ’ＳｉＨ（ＯＲ）2 ／Ｒ’Ｓｉ（ＯＲ）3 である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
Ｒ’Ｓｉ（ＯＲ）3 誘導体の含有量が０％である、請求項１、２および５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ステップａ）の全ガス流量が、曝露表面の平方センチメートル当たり１〜１００ｍＬの全ガスに相当する時間曝露するために０．０５〜１０Ｌ／分である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ステップｂ）の支持体が、足場材料に付着するマトリックスである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ステップｂ）の支持体が、好ましくは０．０５〜１．０ｍｍの直径を有するミクロスフェアの形態のマトリックスである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ミクロスフェアの形態のマトリックスが足場材料を伴わないものである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ステップｂ）の支持体がマトリックスを伴わない足場材料であり、バイオマスが前記足場材料上に直接に支持される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ケイ質層が０．０１〜１０μｍ、好ましくは０．０５〜０．３μｍの厚さを有する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ケイ質層が１０Ｐａよりも高い、好ましくは１２〜２０Ｐａの臨界剪断減粘応力を有する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記キャリアガスが空気である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法により得られるケイ質層により固定化されたバイオマスを含んでなるバイオリアクター。
【請求項２１】
人工臓器または組織であるか、あるいは遺伝子改変されてもよい細胞凝集体である、請求項２０に記載のバイオリアクター。
【請求項２２】
支持体がミクロスフェアの形態のマトリックスである、請求項２０または請求項２１に記載のインプラント可能バイオリアクター。
【請求項２３】
生物学的タイプの機能を行うための注入可能な医薬組成物を調製するための請求項２２に記載のバイオリアクターの使用。
【請求項２４】
生理溶液中に懸濁された請求項２２に記載のバイオリアクターの有効量を含んでなる注入可能な医薬組成物。
【請求項２５】
ミクロスフェアが０．０５〜１．０ｍｍの直径を有する、請求項２４に記載の注入可能な医薬組成物。
【請求項２６】
ミクロスフェアの量が１００〜５０，０００ミクロスフェア／ｍｌ生理溶液である、請求項２４または請求項２５に記載の注入可能な医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイオリアクターに関する。
【０００２】
詳しくは、本発明は生存可能な固定化された生物材料を使用するバイオリアクターに関する。
【０００３】
さらに詳しくは、本発明は、足場材料とマトリックスの存在する又は存在しない条件下で上記生存可能な生物材料を固定化し得るケイ質層を含んでなるバイオリアクターに関する。
【背景技術】
【０００４】
例えば酵素、細菌、酵母、植物または動物細胞等（以下「バイオマス」と称する）の前記生物材料の分散体を保持するマトリックスの表面上に付着されたケイ質層によって生物材料の固定化または閉じ込めを実現し得ることが知られている。
【０００５】
このようなケイ質層は以下の特徴を有する。
ａ）バイオマスを固定化し、バイオリアクターのマトリックスから液体媒体中へのバイオマスの放出を防止すること、
ｂ）バイオマスの生存度を維持し、固定化相と培地との間の輸送を制御および明確化できるようにすること、および
ｃ）生体適合性であるため、生きた動物の体臓器または体液が固定化バイオマスとの接触に耐えること。
【０００６】
液相中の金属またはシリコンのアルコキシドから出発する溶液中で行われるゾル・ゲル法によるバイオマスの固定化プロセスが知られている。
【０００７】
しかしながら、上記プロセスは、例えば以下のような幾つかの欠点を有する。
ａ）該プロセスは多数の生物系に毒性であるアルコールを生成すること、
ｂ）ｐＨ要求が生きた細胞に不適切であるか又は一部の生物活性酵素の変性を促進する場合があること、
ｃ）要求される攪拌操作が流体力学的ストレスに感受性のある細胞株に有害となる場合があること、
ｄ）一部の実験手順が、要求される無菌環境と両立しないこと、および
ｅ）機能の喪失を避けるために明確な構造機構を要求するバイオマスには適用できないこと。
【０００８】
上記の問題点を克服するために、シリコンアルコキシドを搬送するガス媒体の使用を含むプロセスによりマトリックス内に閉じ込められたバイオマスを固定化することが提案されている。
【０００９】
特に、米国特許第５９９８１６２号には、ガス状シリコンアルコキシドとの反応により細胞表面上に得られるケイ質層に固定化された植物細胞が記載されている。この固定化された細胞は６ヶ月の期間にわたり溶液中に放出されず、その生存度を維持しながら、二次代謝産物を生成する。固定化細胞は製薬用途に使用される。
【００１０】
国際公開ＷＯ９７／４５５３７号には、ガス状シリコンアルコキシドとの反応により細胞表面上に直接に付着されたケイ質層により閉じ込められた動物細胞が記載されている。このプロセスは毒性がなく、生存可能細胞は媒体により浸出されず、そして媒体侵入により増殖しない。閉じ込められた細胞は、バイオ人工臓器のため、及び所望生成物のために使用される。
【００１１】
しかしながら、場合によっては、細胞表面上にケイ質層が直接付着すると、有効性と機能が低下し、生きた動物の体臓器および／または体液が汚染され、生存可能バイオマスの生存度が消失することが観察されている。
【発明の開示】
【００１２】
それ故に、本発明の発明者は、上記現象を検討したところ、有効性と機能には、場合により、ゲルマトリックス中のバイオマス成分間での自由接触（free contact）が必要であること、そして汚染はバイオマスに由来する病原物質に起因し、一方、バイオマスの機能の喪失は宿主である生きた生物の体液の抗体に起因することを見いだした。
【００１３】
実際に、生きた生物の抗体はバイオマスの外来動物細胞の表面上のエピトープを認識し、それ故に外来動物細胞を破壊する傾向にある。
【００１４】
それ故に、本発明の基礎となる課題は、上述の不都合を防止することを可能にするバイオマス用の固定化系を提供するものである。
【００１５】
このような課題は、添付の特許請求の範囲に記載のバイオリアクターおよび該バイオリアクターの入手方法により、本発明に従って解決される。
【００１６】
さらに、本発明の発明者により行われた研究は、一方で、抗体および病原物質が１５０，０００よりも大きな分子量を有し、他方で、従来技術のケイ質層が上記分子を排除すること又は相補的に保つことが不可能な多孔度を有することを示す。
【００１７】
それ故に、本発明の第一の対象は、バイオマス固定化と、選択される閾値よりも高い分子量を有するマクロ分子の選択的カットオフとを行い得るケイ質層の製造方法であって、
ａ）(1) Ｓｉ（ＯＲ）4 ，(2) ＳｉＨ（ＯＲ）3 ，(3) Ｒ’Ｓｉ（ＯＲ）3 および(4) Ｒ’ＳｉＨ（ＯＲ）2 ［式中、互いに等しいか又は異なるＲおよびＲ’は、アルキルおよび／またはアリール基である］を含んでなる群より選択されるシリコンアルコキシドの混合物により飽和されたガスキャリアのガス流を供給するステップにおいて、前記ガス流は前記ガスキャリアを２０〜１８０℃の温度の(1) ４０〜８５／（2） ０〜６０／(3) ０〜６０／(4) ０〜６０（％ｖ／ｖ）の比、好ましくは(1) ４０〜８５／（2） ０〜５０／(3) ０〜５０／(4) ０〜５０（％ｖ／ｖ）の比、より好ましくは(1) ５０〜８０／（2） ０〜２０／(3) ５〜３０／(4) ５〜３０（％ｖ／ｖ）の比にある前記アルコキシドの混合液中にバブリングすることによって調製されるステップと、
ｂ）バイオマスを含んでなる支持体をステップａ）のガス流に所定時間曝露するステップとを含んでなり、
前記閾値の分子量が１００００ダルトン〜１５００００ダルトンの範囲内で選択され、ステップａ）における前記(1)，（2），(3)および(4)のＳｉ誘導体間の比がカットオフされるべきマクロ分子の分子量の関数として選択される方法を提供することである。
【００１８】
カットオフされるべきマクロ分子の分子量は、バイオリアクターに予定される特定の用途に鑑みて、ケース・バイ・ケースで選択されることになる。
【００１９】
例えば１５０，０００ダルトンよりも高い分子量を有するマクロ分子のカットオフは、宿主である生きた生物の体液に由来する抗体およびバイオマスに由来する病原体がケイ質メッシュを通じて移動するのを排除することを可能とし、従って体液およびバイオマスの往復による損傷を防止する。７０，０００ダルトンのカットオフ閾値も、補体系の成分、例えばＣ１ｓ（９０ｋＤ）、Ｃ１ｑＩＮＨ（８０ｋＤ）、Ｃ３ｂＩＮＡ（８０ｋＤ）、Ｃ９（８０ｋＤ）およびＣ３ＰＡ（８０ｋＤ）等がケイ質膜を通過するのを阻止する。これは補体の非抗体により誘発される活性化が起こるのを防止する。他方、７０ｋＤカットオフは、高分子量の物質がバイオマスから体液に拡散できるようにするために十分に大きい。このような物質としては、例えば、細胞外マトリックスの分子、例えばコラーゲン、グリコサミノグリカンまたはフィブロネクチンがあり、これらはインプラント用途における生体適合性に不可欠である。逆に、９０ｋＤのカットオフ閾値は、補体系の成分の阻止においては選択性が低いが、多量の物質が交換されることを可能にする。
【００２０】
一般に、１３０ｋＤ〜１５０ｋＤのカットオフ閾値をもったケイ質膜は、工業的規模のバイオリアクターの場合に適用することができ、ここでバイオマスにより生成された高分子量分子の培地への分泌と拡散が最大限に向上されるはずである。反対に、低分子量分子がバイオマスにより生成され、そして培地から単離されるべき場合には、１０ｋＤのカットオフ閾値を、同様に工業的タイプのバイオリアクターに適用し得る。
【００２１】
本発明のケイ質層がある選択された閾値の分子量をもったマクロ分子をカットオフする能力は、本明細書で後述するように、ステップａ）におけるＳｉ誘導体の混合物の組成に依存する。
【００２２】
一般的指針として、Ｓｉ誘導体中のアルコキシ基の存在は、架橋結合形成を促進し、従って形成されるケイ質膜の孔径を小さくする。シリコン原子当たり少ない数のアルコキシ基をもったＳｉ誘導体（例えばＲ’Ｓｉ（ＯＲ）3 およびＲ’ＳｉＨ（ＯＲ）2 ）を比較的少量で混合物中に導入することは、膜のメッシュを拡大する効果を有する。
【００２３】
特に、７５：２５〜８０：２０の比にあるＳｉ（ＯＲ）4 およびＲ’ＳｉＨ（ＯＲ）2 の２成分系混合物（Ａ）は、約９０ｋＤのカットオフを有するケイ質膜の形成を可能にする。同量のＳｉ（ＯＲ）4 と置き換えて約１０％ｖ／ｖまでの量のＲ’Ｓｉ（ＯＲ）3 を該混合物に添加すること、従って、６５〜７８％／２０〜２５％／１〜１０％の比にあるＳｉ（ＯＲ）4 ／Ｒ’ＳｉＨ（ＯＲ）2 ／Ｒ’Ｓｉ（ＯＲ）3 の混合物（Ｂ）を提供することによって、１５０ｋＤまで増大するカットオフを有するケイ質膜が得られる。
【００２４】
常に同量のＳｉ（ＯＲ）4 と置き換えて、Ｒ’Ｓｉ（ＯＲ）3 が更に約２０％ｖ／ｖの含有量までＳｉ誘導体混合物に加えられると、膜のカットオフ閾値は徐々に１０ｋＤまで減少する。この構成は、５３〜７０％／２０〜２５％／１０〜２２％の比にあるＳｉ（ＯＲ）4 ／Ｒ’ＳｉＨ（ＯＲ）2 ／Ｒ’Ｓｉ（ＯＲ）3 の混合物（Ｃ）に相当する。いかなる理論にも束縛されないが、上述の効果は多分、疎水性の増大に起因し、また孔を塞ぐ傾向にある比較的多量のアルキル基（Ｒ’基）により生じる障害に起因するものであろう。
【００２５】
上記の議論から、例えば、適当な組成の２成分系混合物（Ｂ）または３成分系混合物（Ｃ）（但し、Ｒ’Ｓｉ（ＯＲ）3 の量は１０％以下）のいずれかの反応により、９０〜１５０ｋＤの範囲にある同カットオフ閾値を得ることができることが明らかであると思われる。さらにまた、２成分系混合物（Ａ）により約９０ｋＤのカットオフ値を得ることができ、一方、例えば、約１０％ｖ／ｖを超える量のＲ’Ｓｉ（ＯＲ）3 成分を有する混合物（Ｃ）の反応により、約１０ｋＤ〜９０ｋＤのカットオフ閾値を得ることができる。
【００２６】
好ましくは、Ｒはエチルまたはメチルであり、Ｒ’はメチルである。
【００２７】
一般的には、ステップａ）のガスキャリアは空気である。
【００２８】
好ましくは、ステップａ）の全ガス流量は、曝露表面の平方センチメートル当たり１〜１００ｍＬの全ガスに相当する時間曝露するために０．０５〜１０Ｌ／分である。
【００２９】
好ましくは、ステップａ）における飽和温度は２０〜１００℃である。
【００３０】
一般的には、ステップｂ）の支持体は、足場材料に付着するマトリックスである。
【００３１】
本発明の他の実施態様において、ステップｂ）の支持体は、足場材料に付着するミクロスフェアの形態のマトリックスである。好ましくは、このようなミクロスフェアは０．１〜１．０ｍｍの直径を有する。
【００３２】
本発明の別の実施態様において、ステップｂ）の支持体は、足場材料を伴わない、好ましくは直径が０．１〜１ｍｍの、ミクロスフェアの形態のマトリックスである。
【００３３】
本発明の別の実施態様において、ステップａ）は、マトリックスを伴わない足場材料上に支持されたバイオマスで行われる。
【００３４】
マトリックスの典型例は、コラーゲンのゲル、寒天、デキストラン、ペプトン、アルギネート、カラギーナンおよびコロイドである。このようなマトリックスは、さらに放射線不透過性材料、例えばバリウム塩等、および／またはＮＭＲイメージング検出用促進剤、例えば磁性粒子およびＮＭＲシフト試薬等を含有してよい。
【００３５】
足場材料の典型例は、多孔質紙シート、ガラス繊維、布、紡織繊維、多孔質セラミック、ガラス体、天然スポンジおよび発泡有機ポリマーである。特に好ましい足場材料は、天然スポンジである。
【００３６】
好ましくは、本発明のケイ質層は、０．０１〜１０μｍ、より一層好ましくは０．０５〜０．３μｍの厚さを有する。
【００３７】
好ましくは、本発明のケイ質層は、１０Ｐａよりも高い、より一層好ましくは１２〜２０Ｐａの臨界剪断減粘応力（critical shear thinning stress）を有する。
【００３８】
それ故に、本発明の対象は、バイオマス固定化と、選択される閾値よりも高い分子量を有するマクロ分子の選択的カットオフとを行い得るケイ質層を含んでなるバイオリアクターであって、
前記ケイ質層が、(1) ４０〜８５／（2） ０〜６０／(3) ０〜６０／(4) ０〜６０（％ｖ／ｖ）の比、好ましくは(1) ４０〜８５／（2） ０〜５０／(3) ０〜５０／(4) ０〜５０（％ｖ／ｖ）の比、より好ましくは(1) ５０〜８０／（2） ０〜２０／(3) ５〜３０／(4) ５〜３０（％ｖ／ｖ）の比にある、(1) Ｓｉ（ＯＲ）4 ，(2) ＳｉＨ（ＯＲ）3 ，(3) Ｒ’Ｓｉ（ＯＲ）3 および(4) Ｒ’ＳｉＨ（ＯＲ）2 ［式中、互いに等しいか又は異なるＲおよびＲ’は、アルキルおよび／またはアリール基である］を含んでなる群より選択されるシリコンアルコキシドの混合物により得られる、バイオリアクターを提供することである。
【００３９】
本発明の特定の態様によれば、バイオリアクターは固定化酵素を使用する。この場合に前記ケイ質層は、液体媒体への前記酵素の放出を防止する必要がある。一般に、多数の生物学的に関連のある酵素が１０，０００Ｄａを有する。
【００４０】
それ故に、本発明は、バイオマス固定化と、１０，０００Ｄａ〜１５００００Ｄａの間で選択される閾値よりも高い分子量を有するマクロ分子の選択的カットオフとを行い得るケイ質層の製造方法であって、
ａ）(1) Ｓｉ（ＯＲ）4 ，(2) ＳｉＨ（ＯＲ）3 ，(3) Ｒ’Ｓｉ（ＯＲ）3 および(4) Ｒ’ＳｉＨ（ＯＲ）2 ［式中、互いに等しいか又は異なるＲおよびＲ’は、アルキルおよび／またはアリール基である］を含んでなる群より選択されるシリコンアルコキシドの混合物により飽和されたガスキャリアのガス流を供給するステップにおいて、前記ガス流は前記ガスキャリアを２０〜１８０℃の温度の(1) ４０〜８５／（2） ０〜６０／(3) ０〜６０／(4) ０〜６０（％ｖ／ｖ）の比、好ましくは(1) ４０〜８５／（2） ０〜５０／(3) ０〜５０／(4) ０〜５０（％ｖ／ｖ）の比、より好ましくは(1) ５０〜８０／（2） ０〜２０／(3) ５〜３０／(4) ５〜３０（％ｖ／ｖ）の比にある前記アルコキシドの混合液中にバブリングすることによって調製されるステップと、
ｂ）バイオマスを含んでなる支持体をステップａ）のガス流に曝露するステップとを含んでなる方法を提供する。
【００４１】
「バイオマス」という用語は、生物学的タイプの機能を行い得る動物または植物由来の生物材料をいうことが意図される。
【００４２】
「生物学的タイプの機能」の典型例は、疾患の治療に適した産物の生成、二次代謝産物およびタンパク質、例えば酵素、増殖因子、サイトカイン、ホルモン等の生成である。
【００４３】
このようなバイオマスの例は、一次細胞系統、幹細胞系統、変異細胞系統、それらの凝集体、酵素および微生物であり、この生物材料の全てがそれ自体で又は遺伝子組換えにより使用される。
【００４４】
疾患の治療に適した産物を生成し得るバイオマスの例は、慢性の痛みの治療のための（Saitoh, Y. et al. Cell Transplant. 1995, 4 Suppl 1:S13-7に記載されるような）β−エンドルフィンを生成し得るプロオピオメラノコルチン遺伝子で形質移入(transfect）されたニューロ２Ａ細胞、パーキンソン病の治療のためのドーパミンを生成し得る副腎褐色細胞腫ＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７２０）、アルツハイマー病の治療のための神経成長因子（ＮＧＦ）を生成し得る顎下腺ＳＣＡ−９クローン１５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７３４）、腫瘍を治療するためのＩＬ−２を生成し得るヒトリンパ腫Ｈ３３ＨＪ−ＪＡ１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−８１６３）、下垂体性小人症の治療のための成長ホルモンを生成し得る下垂体ＧＨ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８２．１）、血友病の治療のための第ＶＩＩＩ因子を生成し得る一次ブタ肝細胞、ハーゲマン徴候を治療するための第ＸＩＩ因子を生成し得る一次ブタ肝細胞、貧血を治療するためのエリスロポイエチンを生成し得る（Mark A. Goldberg Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 84:7972-7976, 1988に記載されるような）一次ブタ腎細胞またはＨｅｐ−Ｇ２細胞、インスリン依存性糖尿病真性Ｉ型を治療するためのインスリンを生成し得るブタ膵島、体外バイオ人工肝臓において使用するための一次ブタ肝細胞である。
【００４５】
「バイオリアクター」という用語は、本発明の図１に記載されるタイプの装置および本発明に従うケイ質層により固定化されたバイオマスを含有するマトリックスにより形成された生物学的ユニットの両方をいうことが意図される。
【００４６】
それ故に、本発明のバイオリアクターが生物学的ユニットである場合に、それは細胞次元のものであってもよい。
【００４７】
本発明の発明者はさらに、本発明に従うバイオリアクターの支持体が、足場材料を伴わない、バイオマスを含有するミクロスフェアの形態のマトリックスである場合に、該バイオリアクターを必要とする患者の臓器内に前記バイオリアクターを直接に注入し得ることを見いだした。
【００４８】
本発明に従うバイオリアクターを直接に注入し得る臓器の典型例は、延髄の背根、脳、基部のガングリオン、マイネルトの基底核、腫瘍が手術により摘出される部位、門脈、腹膜および肝臓である。
【００４９】
それ故に、本発明の別の目的は、生物学的タイプの機能を行うための注入可能な医薬組成物を調製するための、上述の方法により得られるバイオリアクターの使用である。
【００５０】
一般的には、本発明のバイオリアクターは、人工臓器として損傷を受けた臓器の置換または組込みのために使用し得る。
【００５１】
損傷を受けたヒト臓器の置換または組込みのためのバイオマスの例は、膵臓細胞、例えば損傷を受けた膵臓のランゲルハンス島、損傷を受けた肝臓のためのブタ肝細胞、そして損傷を受けた甲状腺、副甲状腺および副腎のための甲状腺、副甲状腺、副腎皮質および髄質に由来する細胞である。
【００５２】
本発明に従う注入可能な医薬組成物は、従来の生理溶液中に懸濁されたミクロスフェア形態のバイオリアクターの有効量を含んでなる。
【００５３】
本発明に従う注入可能な医薬組成物中のミクロスフェア形態のバイオリアクターの量は、既知の因子、例えば治療すべき疾患のタイプ、疾患の重症度、患者の体重、毎日投与される剤形の数および選択されるバイオマスの効力に依存して、かなり広い範囲で変動し得る。
【００５４】
しかしながら、最適な量については当業者が常法により容易に決定し得る。
【００５５】
一般的には、本発明に従う注入可能な医薬組成物は、１００〜５０，０００ミクロスフェア／ｍｌ生理溶液の量のミクロスフェア形態のバイオリアクターを含有し得る。
【００５６】
例えば、本発明に従うミクロスフェア形態のバイオリアクターがバイオマスとしてランゲルハンス島を含んでなる場合に、注入可能な医薬組成物中のミクロスフェア（その各々が１以上の島を含んでなる）の量は２０００〜２５０００、好ましくは１００００／ｋｇ体重である。
【００５７】
本発明に従う注入可能な医薬組成物は、混合、可溶化および滅菌を含む当業者に知られている技術に従って調製することができる。
【００５８】
更なる本発明の特徴および利点は、添付された図面を参照して、非限定的な例により示される、好ましい実施態様についての以下の説明から明確になるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５９】
図１は本発明に従うバイオリアクター１０を示し、容器１１、入口ポート１３および出口ポート１４を備えた恒温ジャケット１２、ｐＨセンサー１５および温度センサー１６、溶存酸素プローブ１７、サービスポート１８、可動式上部１９、可動式底部１９''およびガス供給装置１９''' を含んでなる。
【００６０】
本発明の好ましい実施態様において、図１のバイオリアクターは、Pyrex（登録商標） またはステンレス鋼といったような非毒性の生体適合性材料でできた円筒容器１１を含む。容器１１は、入口ポート１３および出口ポート１４を通じて加熱流体の循環により温度制御を行うためのジャケット１２により包囲されている。これに代えて、加熱／冷却流体内部コイルを使用してもよい。ｐＨプローブ１５、温度センサー１６、溶存酸素プローブ１７および経路が閉じている間の供給およびサンプル収集のためのポート１８が、容器１１に連結されている。容器１１は、Ｏリング（図示せず）および／またはラッチもしくはボルト（図示せず）により容器に密閉されている可動式上部１９および可動式底部１９''を有する。バイオリアクター１０は、好ましくは鋼製のフレームハウジングを含んでなり、このハウジングが容器１１を水平または垂直状態に保つ。バイオリアクター１０、容器１１、上部１９および底部１９''は、操作者がメンテナンスおよび手動作業のために内部にアクセスし得るように開口可能である。
【００６１】
円筒容器１１は、４０℃よりも低い温度で固形マトリックスを生成し得るような濃度の例えばコラーゲン、寒天、デキストラン、ペプトン、アルギネート、カラギーナンまたは類似の有機マクロ分子などのマトリックス化合物およびバイオマスの懸濁液により、底部１９''内の適した開口を通じて充填されている。このようなマトリックスは、バリウム塩といったような放射線不透過性材料、および／または磁性粒子、ＮＭＲシフト試薬といったようなＮＭＲイメージング検出のための促進剤をさらに含有してよい。
【００６２】
一般的には、コラーゲン濃度は０．０１〜３％（ｗ／ｖ）であり、寒天濃度は０．５〜３％（ｗ／ｖ）である。
【００６３】
代替的に、容器１１は、例えばガラス繊維および布、普通の繊維または布、多孔質セラミック体、紙シート、有機合成または天然ポリマーの発泡体およびセルロース固体といったような多孔質足場材料で充填され、これらの材料は全て上述のマトリックス化合物中に含まれるバイオマスを支持する。あるいは、これらの足場材料が容器１１を充填し、そこでバイオマスおよびマトリックス化合物の懸濁液を染み込ませてもよい。
【００６４】
あるいは、植物および酵母細胞の場合には、マトリックス化合物を用いないで、バイオマスの懸濁液が使用される。
【００６５】
こうして充填された容器１１は、次に本発明に従って、ガス状シリコンアルコキシドの混合物により飽和されたガス流に曝露される。前記ガス流は、底部１９''に可動式に接続されたガス供給装置１９''' により供給される。
【００６６】
本発明のガス状シリコンアルコキシドの混合物は、マトリックスゲルの表面上またはバイオマスの表面上に一様な連続したケイ質層を生成する。シリコンアルコキシドのガス状流束の曝露時間はケイ質層の厚さに依存する（V.M. Sglavo et al. J. Mat. Science 34, 3587 1999）。
【００６７】
ケイ質層の厚さは、処理表面ｃｍ2 当たりに付着されるシリコン５００μｇまで曝露時間の一次関数である。こうして得られたケイ質層は、マトリックスの化学組成、幾何、形状または足場材料の有無と無関係に、マトリックス表面に付着された無機付着層を提供する。
【００６８】
本発明のプロセスに従って生成されるケイ質層が形成されると、バイオリアクターの移動相は可動式底部１９''を通じて循環し得る。この可動式底部１９''は、バイオマス酸素添加を供給するガススプレッダー２０を備えることになる。移動相は、バイオマスの供給のため及び生成化合物の回収のために使用し得る。移動相の循環は、供給ポンプ（図示せず）により行われ、可動式上部１９を通じて閉回路内を移動する。
【００６９】
可動式上部１９は、シリコンアルコキシドにより飽和されたガス状流束とケイ質層形成の揮発性副生成物を排出するための出口ポート２１を含んでよい。
【００７０】
あるいは、上部１９は、移動相の循環のための出口ポートを備えてよい。この実施態様において上部は、移動相から所望生成物の液／液および／または気／液の連続分離を行う抽出器（図示せず）のラインに接続されてよい。あるいは、消耗した移動相の交換のために、および該バイオリアクターの不連続作業のための移動相の保存のために、カバー１９に接続されたリザーバ（溜め）を使用してもよい。
【００７１】
さらに、上部１９は、マトリックス溶液の液滴を生成するためのスプレーノズル２２を備えてよい。スプレーノズル２２は、ケイ質層により液滴を被覆するために使用されるシリコンアルコキシドガス状混合物の流束を供給してもよい。この実施態様において、可動式底部１９''は、落下する液滴を覆うシリコンアルコキシドにより非毒性ガス状流束を飽和させるために使用されるバブリング装置１９''' を含んでよい。
【００７２】
非限定的な例示によって示されるにすぎない実施例に関連して本発明を更に説明する。
【実施例】
【００７３】
例１
ケイ質層により固定化された、１％寒天中のウレアーゼの活性。
６４０Ｕのウレアーゼ（Sigma より購入、純度９９％）を、水中１％（ｗ／ｗ）寒天（FMC より購入、純度９９％）２０ｍＬと混合した。その溶液を、滅菌条件下、直径３０ｍｍ、高さ３００ｍｍのガラスPyrex （登録商標）シリンダーに注いだ。シリンダーの口とカバーを閉じ、該容器を３７℃の恒温槽内に水平状態に維持するフレームハウジング内に該シリンダーを置いた。該シリンダーの内壁に厚さ０．７ｍｍのゲルが生じるまで外部電気モーターにより５ｒｐｍの速度で該シリンダーに軸回転を付与した。口を、ＣＨ3ＳｉＨ（ＯＥｔ）2 およびＳｉ（ＯＥｔ）4 の混合物により飽和されたガス状流束であって８０℃のこれらシリコンアルコキシドの２５／７５体積比の溶液中に該ガス状流束をバブリングすることにより得られたものに接続した。キャリアガスは空気であり、流束は０．４Ｌ／分であった。流束を１２分間延長した。この操作の完了後に、シリンダーをｐＨ＝８．０のリン酸緩衝溶液で充填し、５ｒｐｍで回転しながら３７℃で１５時間保存した。この時間後に、該緩衝溶液のサンプルを収集した。ケイ質層により被覆されていない厚さ０．７ｍｍの寒天ゲル中に充填された同じウレアーゼを含有する別の容器からもｐＨ＝８．０で１５時間保存後にサンプルを収集した。サンプル中のタンパク質含有量を修正 Lowry法（Peterson G.L.,  Anal. Biochem. 83:346 (1977)）に従って測定した。ケイ質層により固定化されていないバイオリアクターからのサンプルは、寒天ゲルからの１００％ウレアーゼ浸出に相当するタンパク質含有量を有する。ケイ質固定化層を有するバイオリアクターからのサンプルは、０．７％のタンパク質含有量を含む（１００％＝非固定化サンプルの場合に測定されるタンパク質含有量）。ウレアーゼの酵素活性を、遊離の又は固定化されたウレアーゼ１Ｕ当たり尿素５μｇの初期条件から開始して、溶液中の尿素濃度の時間内の減少をモニタリングすることにより、測定した。尿素濃度を、ジアセチルモノオキシム法（Ceriotti G. and Spadaro L., Clin. Chim. Acta 11:519 1965）により測定した。以下の溶液：１．遊離ウレアーゼを保持、２．ケイ質層により被覆されていない寒天中のウレアーゼを保持、および３．ケイ質層により被覆された寒天中のウレアーゼを保持、について、同時に実験を行った。ケース１およびケース２の酵素の活性は同一（同じ最大速度と同じミカエリス−メンテン定数）であった。ケース３では、活性の明確な改善が観察された（同じミカエリス−メンテン定数をもちながら最大速度の８０％増大）。
【００７４】
例２
ケイ質層により固定化されたルタ・グラベオレンス（Ruta graveolens)細胞からのリグナン類薬物の生成
厚さ１ｃｍの発泡ポリウレタンのスポンジ状層（密度＝０．１ｇ／ｍＬ）を直径３．０ｃｍのディスクに切断した。ディスクを１２０℃のスチームで滅菌して、０．１ｇ湿潤細胞質量／ｍＬを保持するルタ・グラベオレンス（Ruta graveolens)（1995年に芽から発生）の細胞懸濁培養物で処理した。培地は、３％（ｗ／ｖ）スクロース、２．６ｍｇ／Ｌの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、０．３０ｍｇ／Ｌのキネチンおよび０．３０ｍｇ／Ｌのナフタレン酢酸を補充したガンボーグ基部成長（Gamborg's basal growth）Ｂ５溶液であった。リン酸でｐＨを５．７に調整した。該ディスクを、１０日間、１２時間周期、１００ｒｐｍで作動する旋回シェーカー上で、２５℃の無菌条件下、懸濁液中に保持した。ディスクを引き出し、吊るして２日間、３０℃の無菌フード内で乾燥させた。平均細胞荷重は、ディスク体積当たり０．３ｇ湿潤質量であった。金属糸により連結された１０００枚のディスクを、体積１０Ｌ（直径１５ｃｍ、高さ５７ｃｍ）の Pyrex（登録商標）円筒ガラス製バイオリアクター内に導入した。リアクターを垂直状態に維持し、底部口から３０℃の乾燥空気で１時間処理し、次に、ＣＨ3ＳｉＨ（ＯＥｔ）2 およびＳｉ（ＯＥｔ）4 の混合物により飽和された５Ｌ／分の空気流束であって７５℃のこれらシリコンアルコキシドの３０／７０体積比の混合物中に該ガス状流束をバブリングすることにより得られたもので処理した。ガス進入は、上部および底部側面をガス流束の入力および排出に接続する４方向タップに作用して、２分の間隔で底部口から上部カバーまで変化した。リアクターを直ちに上述の培地で充填し、３０分後に変えた。細胞生存度の保持を、ＭＴＴ（Mossman T. J. Immunol. Methods 65:55(1983)）により測定したところ、固定化前に測定された生存度に対して９２％であった。
【００７５】
図２の顕微鏡写真はポリウレタン足場材料上のケイ質層で固定化された細胞の詳細を示す。
【００７６】
リアクターを包囲するジャケットを通じた恒温水の循環により、温度を２３℃に維持した。媒体の循環は５Ｌ／時間の送出容量で作動する外部蠕動ポンプによって行った。４個の液／液抽出器に液体を通過させた。好ましい抽出液はクロロ溶媒である。底部口領域は、１０Ｌ／時間の空気流束を与えるガススプレッダーを備えた。この流束が上部カバーに運ばれ、ｐＨ７．２のリン酸緩衝液中にバブリングすることにより洗浄された。リグナン類薬物の生成が、液体抽出のために使用されるクロロ溶媒中で、及び排ガスの洗浄のために使用される水中で観察された。リグナン系生成物は、ブタノール−酢酸エチルでの抽出により回収し、Sephadex上でのクロマトグラフィにより、そして溶媒として９／１の体積比のクロロホルム／メタノールを使用するＨＰＬＣ（Jasco モデルPU1580）により分離した。全生成物質量は１６０ｍｇ／日であった。リグナン系生成物の同定はＦＡＢマススペクトロスコピーにより行った。同定された生成物は、主成分としてポドフィロトキシン、ジフィリン(Diphyllin）およびジャスティシジン−Ａであり、全質量の８０％であった。リアクターの生産性は、スクロースの濃度を３％（ｗ／ｖ）に戻すための５日間隔でのスクロースの添加により２０週間維持された。１６週後に細胞の死が現われ、ケイ質層固定化から２０週後に全体の死滅が観察された。
【００７７】
例３
異なる混合物のシリコンアルコキサイドから得られたケイ質層の分子量カットオフ
ａ）  Ｈｅｐ−Ｇ２細胞を直径６ｃｍのペトリ皿に堆積されたコラーゲン層上で培養した。０．１％（ｗ／ｖ）コラーゲン溶液を３７℃で加熱することにより、コラーゲンマトリックスを得た。媒体は１０％の致死性ウシ血清を補充したダルベッコー修正イーグル培地であった。単層形態への細胞集蜜後に、細胞を０．１％（ｗ／ｖ）のコラーゲン溶液の５０μｍ層で被覆した。固化(consolidation）後、トリパンブルー排除により決定される細胞生存度は９６％であった。サンプルを培地で処理し、９５％空気および５％ＣＯ2 の加湿雰囲気中、３７℃で２４時間保存した。培地を除去し、８枚のペトリ皿を 直径７０ｍｍ、高さ２５ｃｍの Pyrex（登録商標）ガラスシリンダー内に置いた。金属フレームによって皿の間に高さ１．５ｃｍの空間が残った。例１（シリンダー内温度＝３０℃、曝露時間＝８分、８ペトリ皿）に従ってケイ質層の付着を行った。反応後、サンプルを直ちに特定培地で覆い、その培地を３時間後に取り換えた。細胞生存度のためのチアゾリルブルーＭＴＴアッセイは９５％の細胞生存度を示した。ケイ質層コーティングから１８時間後、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ５０ｍＭ（Sigmaより購入），ｐＨ＝８．０、ＮａＮ3 ０．０２％（ｗ／ｖ）およびアプロチニン１μｇ／ｍＬの溶液（Sigma より購入）の溶液と反応させることによりバイオマスを溶解させた。２４時間後、溶液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル分離手順（Sambrook J. et al. "Molecular Cloning: a laboratory manual" Cold Spring Harbour Laboratory Press 1989 ）により分析した。サンプルを、１×ＳＤＳゲル・ローディング緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ＝６．８，１００ｍＭジチオトレイトール、２％ｗ／ｖ ＳＤＳ，０．１％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー，１０％（ｗ／ｖ）グリセロール）中で３分間、１００℃で変性させた。クロマトグラフィの実行を、BioradのミニPROTEAN II装置（移動相として２５ｍＭ Ｔｒｉｓ， ２５０ｍＭグリセリン，０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ，ｐＨ＝８．３）で、１８０Ｖで４５分間作動することによって行った。次に、ゲルを５０％（ｖ／ｖ）メタノールおよび１２％（ｖ／ｖ）酢酸溶液とともに３０分間インキュベートし、５分間、１０％（ｖ／ｖ）エタノール＋５％ｖ／ｖ酢酸溶液で３回洗浄し、３．４ｍＭ Ｋ2Ｃｒ2Ｏ7 および３．２ｍＭ ＨＮＯ3溶液とともにインキュベートし、次に二重蒸留水で３回、再び洗浄した。サンプルを１２ｍＭ ＡｇＮＯ3溶液とともに３０分間インキュベートした。タンパク質バンドの顕色は、０．２８Ｍ Ｎａ2ＣＯ3 および０．０２％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒド溶液を用いて処理し、１％（ｖ／ｖ）酢酸溶液中で固定することにより生じた。図３を参照すると、ケイ質層で被覆された溶解を受けた５つのサンプルと、ケイ質層により被覆されていないが同様に溶解を受けた２つの対照サンプル（Ｃ１，Ｃ２）について分子量の関数としてタンパク質分布が図示されている。被覆されたサンプルより得られた、Ｔ１〜Ｔ５と番号付けられたタンパク質分布は９０，０００Ｄａよりも高い分子量をもったタンパク質の痕跡を示さない。
【００７８】
ｂ）  ケイ質層付着について、ＣＨ3ＳｉＨ（ＯＥｔ）2 、ＣＨ3Ｓｉ（ＯＥｔ）3 およびＳｉ（ＯＥｔ）4 の混合物により飽和された０．４Ｌ／分の空気流束であって８０℃のこれらシリコンアルコキシドの１０／２０／７０体積比の混合物中に該ガス状流束をバブリングすることにより得られたものを使用する場合に、例３ａと同じ手順を繰り返した。溶解を受けた被覆されたサンプルから得られたタンパク質分布は１５０，０００Ｄａよりも高い分子量をもったタンパク質の痕跡を示さない。
【００７９】
ｃ）  ７５℃の体積比２０／２０／６０のＣＨ3ＳｉＨ（ＯＥｔ）2 、ＣＨ3Ｓｉ（ＯＥｔ）3 およびＳｉ（ＯＥｔ）4 の混合物によるガス状流速で飽和する場合に、例３ａと同じ手順を繰り返した。被覆された溶解を受けたサンプルから得られたタンパク質分布は１０，０００Ｄａよりも高い分子量をもったタンパク質の痕跡を示さない。
【００８０】
例４
ケイ質層により固定化された１％寒天中のバシラス・ポリミキサ（Bacillus polymyxa）とバシラス・サブティラス（Bacillus subtilis）の活性。
Ｂ．ポリミキサの株をＡＴＣＣより購入した。この培養物のフラクションを、酵母エキス／カゼイン／グルコース／スクロース／ＮａＣｌ／ＭｇＳＯ4 ＝２．５／２．５／８／２／１／０．５ｇ／Ｌの溶液からなる５０ｍＬ培地に接種し；懸濁液をｐＨ７．３で緩衝し、ＣａＣｌ2 ２Ｈ2Ｏ／ＦｅＳＯ4 ７Ｈ2Ｏ／ＺｎＳＯ4 ７Ｈ2Ｏ／ＣｕＳＯ4 ５Ｈ2Ｏ／ＭｎＳＯ4 ４Ｈ2Ｏ＝１／１／１／０．５／４ｇ／Ｌの１ｍＬを補充した。懸濁液を２７℃で３日間保存した。５ｍＬの懸濁液を、トリプトン（２ｇ／Ｌ）および硫酸アンモニウム（１ｇ／Ｌ）で補充されｐＨ７．３で緩衝された濃度＝２．５／２．５／１８／２／１／０．５ｇ／Ｌの前記化合物からなる培地１Ｌで希釈した。得られた懸濁液を攪拌しながら２７℃で５日間保存した。この懸濁液に寒天を１％（ｗ／ｖ）の濃度まで添加した。密度＝０．２ｇ／ｍＬをもった生地(texture）から得られた、直径３５ｍｍおよび高さ１０ｍｍのガラスウール５０００ディスクで充填された、直径２０ｃｍおよび高さ１００ｃｍのステンレス鋼シリンダーに、３０Ｌの懸濁液を注いだ。これらのディスクをシリンダー内にランダムに配置した。懸濁液を３０分間置き、次にシリンダーから噴出させた。シリンダーを、該容器の水平状態を維持して５ｒｐｍで回転しながら、フレームハウジング内に配置した。ここでディスクを例２に記載のようにシリコンアルコキサイドのガス状流束により処理した。処理を６時間続けた。垂直状態にある容器を、上述の培地で充填した。８週間の期間にわたりグルコース消費量をモニタリングすることによって、バイオマスの生存度をチェックした。１日当たり１．３ｇ／Ｌのグルコースの消費量が一定であり，２日毎にグルコースを添加することによって当初の１８ｇ／Ｌのグルコース濃度が回復した。
【００８１】
Ｂ．サブティラスの固定化のために同一の手順を用いた。両方の場合に、顕微鏡観察により、溶液中に放出された微生物が完全に存在しないことが明らかになった。ポリミキシンおよびバシトラシンの濃度をそれぞれ検出するために、培地のサンプルを収集した。抗生物質活性を、ポリミキサシン感受性株として大腸菌エシャリキア・コリ(Esherichia coli）で、そしてバシトラシン感受性生物として黄色ブドウ球菌スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus）での耐性記録により試験した。生理食塩水での当初サンプルの希釈により、８週間の観察の間のポリミキサシンおよびバシトラシンの生成の動向を決定した。
【００８２】
例５
コラーゲン上の厚さ０．１μｍケイ質層の臨界剪断応力の決定
コラーゲン上のケイ質層の臨界剪断応力を流体力学実験により決定した。長さ１２０ｃｍ、幅８ｃｍおよび高さ２ｃｍのガラス管を供給ポンプに接続した。水平に保たれた管に５Ｌ／分の最小流量から開始して水を入れた。０．１％（ｗ／ｖ）溶液から固化した０．１ｍｍの厚さのコラーゲン層を、管の基部に付着させ、その層の除去まで流量を増大させた。対応する臨界流量は０．５Ｐａの臨界剪断応力値を示した。３分の処理を用いた例２に記載の手順に従って付着されたケイ質層により被覆されたコラーゲンの場合に、同じ実験を行った。臨界剪断応力の結果は１５Ｐａであった。
【００８３】
例６
Jurkat細胞含有アルギネートミクロスフェアのケイ質層コーティング
（１×１０7 細胞／ｍＬ；〜２，４００細胞／ミクロスフェア）を含有するアルギネートミクロスフェアを従来のエアジェット押出（Lim F. and Sun A.M.  Science, 210:908 (1980)）により製造した。ヒトリンパ球細胞であるJurkat細胞を含有するアルギネート溶液（０．９％ＮａＣｌ溶液中の１．５％ｗ／ｖアルギン酸Ｎａ）を、無菌シリンジバレルに充填し、ピストンを均一駆動押圧装置により誘導した。無菌針（内径０．３ｍｍ、外径０．５ｍｍ）をシリンジに接続し、同軸エアジェット押出ノズル（直径０．６５ｍｍ）内に配置した。０．４Ｌ／分〜０．８Ｌ／分の範囲の空気流束を、８０℃のＣＨ3ＳｉＨ（ＯＥｔ）2 とＳｉ（ＯＥｔ）4 の溶液（２５／７５体積比の混合物）中にバブリングした。
【００８４】
該オルガノシランで飽和された空気流束は、ケイ質コーティングと針先端からのアルギネート滴の滴下とを行うエアジェット押出ノズルに入った。ミクロスフェア直径は、ガス状流束に依存して０．２ｍｍ〜０．８ｍｍの範囲であった。１００ｍＭ塩化カルシウム溶液中に滴下したミクロスフェアを、この溶液中で５分間保持し、細胞培地（RPMI1640）に移した。細胞生存度をＭＴＴアッセイにより試験したところ、８０％よりも高い生存度を示した。被包したJurkat細胞をホルボールエステルで刺激して、１５，０００Ｄａのリンホカインであるインターロイキン２（ＩＬ−２）を分泌させた。刺激から２４時間後に、ＩＬ−２レベルをヒトＩＬ−２ＥＬＩＳＡ検出キット（Sigma Chemical Company, Saint Louis, Missouri, USA, I-8273）により周囲の培地中で測定した（２２６ｐｇ／ｍｌ）。脱イオン水中でのミクロスフェアの浸透圧による溶解により、ケイ質層の存在を実証した。
【００８５】
カルシウムイオンの希釈の結果、アルギネートミクロスフェアの破壊がもたらされ、そのため遊離細胞が溶液中に開放された（図４Ｂ）。ケイ質層により被覆されたミクロスフェアの場合である図４Ｄを参照すると、層の残部が遊離細胞と一緒に観察された。
【００８６】
例７
ケイ質層によるランゲルハンス島コーティング。
標準手順に従って手術により Lewisラット膵臓から膵島を入手した。２００／３００島を、２２０メッシュネット上に付着させ、１．５ｍＬの Swiningフィルタホルダ内で懸濁させ、８０℃でＣＨ3ＳｉＨ（ＯＥｔ）2 およびＳｉ（ＯＥｔ）4 （２５／７５体積比の混合物）により飽和された０．１Ｌ／分の空気流束を１５秒間流した。
【００８７】
島を細胞培地（ＤＭＥＭ）に移し、５％ＣＯ2 雰囲気中、３７℃で２４時間インキュベートした。島をハンク平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ，０．５ｍｌ／分）を用いた潅流室内でin vitroで試験し、インシュリン分泌の検出のためのグルコース投与（フラクション４からフラクション１０までのＨＢＳＳ中２０ｍＭ，図５中の黒棒）を行った。２分毎にフラクションを収集した。ＥＬＩＳＡ装置におけるラット特異的インスリン抗体キットにより、各フラクションにおけるインスリン含有量を決定した。被覆された島は、対照の島について得られたものに匹敵し得るインスリン放出動向を示した（図５参照）。実験は文献の方法（Wang T. et al.  Nature Biotechnology 15:358 (1997)）に従って行った。
【００８８】
本例で前述したケイ質層により被覆された及び対照の両方のLewis ラット（体重２４０ｇ）に由来する膵臓ランゲルハンス島を利用して、ストレプトゾトシン（６ｍｇ／１００ｇ）の腹膜内投与により定常的に糖尿病（３００ｍｇ／１００ｍｌを上回る糖血症）にされた雄ＳＤ（Sprague-Dawley）ラット（体重２８０ｇ）への同種異系外科移植を行った。ドナーとレシピエントのラットの両方とも、無菌手術室内でハロタンによる麻酔の下で手術した。ラット当たり約６００の島を、１つの腎臓とその副腎との間にインプラントした。術後の処置として、手術のストレスからラットおよび移植した島が回復するのを支援するための１回のインスリン注射を含んだ。血糖値の測定のために、術前８日に１回、および術後最初の２週間は３〜４日毎に、その後は毎週１回、対照ラットおよび移植を受けたラットの両方の尾から血液サンプル（１００μｌ）を収集した。図６に示すように、被覆されていない島を移植された対照動物群（ｎ＝６）は術後１５日で糖尿病の血糖値（３００ｍｇ／１００ｍｌ）に戻ったのに対し、ケイ質層により被覆された島を移植された動物（ｎ＝６）は移植後４３日まで正常血糖であった。
【００８９】
例８
ケイ質層の生体適合性
ａ）in vitroでの生体適合性
(i) 補体活性化。ＨｅｐＧ２細胞を例３ａに記載の手順に従ってペトリ皿で培養し、補体の不存在下で又はザイモサン活性化と共に０．５ｍＬのヒト血漿をコラーゲン層上に付着させた。サンプルを３７℃で３０分間保存した（Fushimi F., Nakayama M., Nishimura K., Hiyoshi T.  Artificial Organs 22(10):821-826 (1998)）。溶液のＥＬＩＳＡ分析によりＣ５ａレベルを決定した。ザイモサンにより処理されたサンプルについて測定されたレベルを１００％レベルと考えた。同じ実験を、例３ａ（曝露時間６分、６ペトリ皿）に従って調製された、ケイ質層により被覆されたコラーゲン中のＨｅｐＧ２細胞を用いて行った。Ｃ５ａ補体濃度はザイモサン処理サンプルの５％であった。
【００９０】
(ii)カリクレイン活性。ＨｅｐＧ２細胞を例３ａに記載の手順に従ってペトリ皿で培養し、０．５ｍＬのウシ血漿溶液（クエン酸を含有し、６０ｍＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌで３〜５体積に希釈されたもの）をコラーゲン層上に付着させた。サンプルを４℃で６０分間保存した。上清液を、第ＸＩＩ因子により処理されたプレカリクレインまたはカリクレインを検出するｚ−Ｆｅ−Ａｒｇ−７−アミノ−４−メチル−クマリンで処理した（Fushimi F., Nakayama M., Nishimura K., Hiyoshi T.  Artificial Organs 22(10):821-826 (1998)）。この分析から生じたカリクレインレベルを１００％と考えた。同じ実験を、例８ａ(i) に従って調製された、ケイ質層により被覆されたコラーゲン中のＨｅｐＧ２細胞を用いて行った。カリクレインレベルは被覆されていないサンプルの３％であった。
【００９１】
(iii) 血小板粘着。コラーゲンマトリックス上に付着されたケイ質層への血小板粘着の実験を例８ａ(i) （Fushimi F., Nakayama M., Nishimura K., Hiyoshi T.  Artificial Organs 22(10):821-826 (1998)）に従って行った。結果は、ケイ質層による血小板活性化が完全に存在しないことを示した。
【００９２】
(iv)赤血球溶血。ケイ質層との接触により又はケイ質層からの毒性物質の放出により誘発される可能性がある赤血球溶血を、例８ａ(i) に従ってコラーゲンマトリックス上に付着されたケイ質層と接触して保存された血液サンプル中のヘモグロビンの分光測定による濃度（λ＝５４０ｎｍ）を測定することにより、報告されている手順（Drabkin, D.L., Austin J.H.  J. Biol. Chem. 98:719 (1932)）に従って評価した。３７℃で３時間後に溶血が全く観察されなかった。
【００９３】
ｂ）in vivo での生体適合性。
シリカ処理した及び通常のコラーゲン被覆デキストランミクロスフェア（Cytodex, Pharmacia, 直径約１００μｍ）の両方をマウスの後脚に注入することにより、in vivo での生体適合性を評価した。
【００９４】
ネットの両側に入口ポートと出口ポートを備えた３０ｍＬの円筒形テフロン製反応室内の２２０メッシュのステンレス鋼ネット上にミクロスフェア群を置いた。該ミクロスフェアを例２に記載されたように飽和された空気流束で３０分間処理した。次に、処理したミクロスフェアを３ｍＬの無菌細胞培地中に集め、遠心分離（２００×ｇで５分間）により濃縮した。次に、処理したミクロスフェアおよび対照ミクロスフェアの両方を６百万ミクロスフェア／ミリリットル緩衝液の濃度となるまで無菌リン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）中に再懸濁した。５匹のマウスからなる３群に無菌シリンジにより５０μＬのシリカ処理ミクロスフェア懸濁液を注入し、５匹の対照マウスからなる３群に未処理ミクロスフェア懸濁液を同時に注入した：全動物はこの処理の間麻酔をかけられている。次に、注入後２週間、４週間および１２週間で、解剖観察と組織収集のためにマウスを屠殺した。全群で、ミクロスフェア注入と屠殺の期間の間、炎症、痛みまたは機能喪失の徴候が存在するようには見えなかった。各試験期間の終了時に、マウスを過剰麻酔で屠殺し、顕微鏡検査と組織学的分析のために後脚筋肉を集めた。全動物群で、注入部位における感染、炎症過程、出血または線維症の徴候は巨視的に明らかでなかった。ギムザ染色の後の厚さ５μｍの組織学的スライスについての筋組織形態の後続の顕微鏡観察の結果、処理した動物群の注入部位における浮腫、タンパク質溢出、白血球細胞浸潤および線維性瘢痕組織形成のいずれの徴候も存在しなかったのに対し、対照動物では対照の被覆されていないミクロスフェアの周囲の組織に線維性反応の証拠が存在した。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】本発明に従うバイオリアクター（１０）の模式的断面図である。
【図１ａ】図１のバイオリアクター１０の口領域１９''に接続されたガス供給可動式装置１９''' の模式的断面図である。
【図２】例２に従うケイ質コーティングにより被覆され、発泡ポリウレタン上に支持されたルタ・グラベオレンス(Ruta graveolens）細胞の顕微鏡写真である。
【図３】ケイ質層により固定化されたＨｅｐ−Ｇ２細胞から得られたタンパク質の分子量分布（Ｔ１〜Ｔ５）を、例３ａに従う非固定化細胞から得られたものと比較して示す図である。
【図４】図４Ａ〜４Ｄは、直径５００μｍのアルギン酸Ｃａ2+ミクロスフェア中のJurkat細胞の顕微鏡写真である。４Ｃは、ケイ質層により被覆された同ミクロスフェアを示す。４Ｂは、Ｃａ2+ 除去を受けた、ケイ質層の不存在下での同サンプルを示す。４Ｄは、Ｃａ2+ 除去を受けた、ケイ質層により被覆された同サンプルを示す（例６）。
【図５】対照（四角の点）とシリカ被覆（三角の点）のランゲルハンス島で行われた潅流試験を示す。
【図６】膵島を移植されたＳＤ（Spraque-Dawley）雄ラットの血糖値を示す。ラット（群当たり６匹）は、対照（丸）またはケイ質層（四角）により被覆された約６００の島を受入した。各点は６回の独立した測定の平均であり、標準偏差は各点について平均の１５％を下回る。
【図１】
2005514064.tif 000002
【図１ａ】
2005514064.tif 000003
【図２】
2005514064.tif 000004
【図３】
2005514064.tif 000005
【図４】
2005514064.tif 000006
2005514064.tif 000007
2005514064.tif 000008
2005514064.tif 000009
【図５】
2005514064.tif 000010
【図６】
2005514064.tif 000011
【国際調査報告】
2005514064.tif 000012
2005514064.tif 000013