(57)【要約】鳥類の遺伝子組み換えまたは選択では、多くのトリで関係する配列を遺伝子的に分析する必要がある。典型的には、トリから得られるサンプルを個々のベースとしてＤＮＡを抽出する。現在のＤＮＡ抽出法は、長たらしく、時間のかかる方法を使用して血液または組織からＤＮＡを抽出する。本発明は、複数のサンプルで遺伝子配列を検出するハイスループットスクリーニング分析を提供する。該分析は、さらに、赤血球のような、複数の鳥類のサンプルからＤＮＡを迅速に抽出するＤＮＡ抽出法を提供する。該抽出法は極めて信頼性があり、抽出後に各サンプルを定量する必要がない。導入遺伝子の挿入を同定するためのハイスループットスクリーニング分析を含む、さまざまな遺伝子分析に、抽出したＤＮＡを使用できる。本発明は、有核ＲＢＣｓからＤＮＡを抽出するのに特に有用である。それゆえ、鳥類、魚類、爬虫類および両生類の遺伝子分析に該方法を適用できる。
2005524397.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有核赤血球から核酸を単離する方法であって、
ａ）有核赤血球を含有する生物学的サンプルを得て；
ｂ）この生物学的サンプルを第一溶解緩衝液に加えて原形質膜を溶解させ、ここで該第一溶解緩衝液は沈殿した核酸を結合させる容器に入れられており；
ｃ）該溶液を遠心分離に付して上清およびペレットを得；
ｄ）容器中のペレットから上清を除去し；
ｅ）容器中のペレットに第二溶解緩衝液を加え、その後、該ペレットを第二溶解緩衝液にて８時間未満の間インキュベートして核酸を放出させ；
ｆ）容器中の核酸を核酸沈殿溶液を用いて沈殿させ；
ｇ）容器中の核酸を洗浄し；
ｈ）容器中の核酸を乾燥させ；および
ｉ）容器中の核酸を溶媒に溶解させる；
という工程を含む方法。
【請求項２】
生物学的サンプルが哺乳類、鳥類、爬虫類、魚類、または両生類から得られる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
生物学的サンプルが鳥類、爬虫類、魚類、または両生類に由来する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
生物学的サンプルが鳥類に由来する、請求項１記載の方法。
【請求項５】
容器がポリスチレン製である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
生物学的サンプルが血液である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
第一溶解緩衝液が約０．０５Ｍ〜約１．０Ｍの間のスクロース、約５ｍＭ〜約５００ｍＭの間のＴｒｉｓ−ＨＣｌ、約１ｍＭ〜約５０ｍＭの間のＭｇＣｌ２、および約０．１％重量／容量〜約１０％重量／容量の間のトリトンＸ−１００を含み、ｐＨが約５．０〜約９．０の間である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
第一溶解緩衝液が約０．２Ｍ〜約０．５Ｍの間のスクロース、約５ｍＭ〜約５０ｍＭの間のＴｒｉｓ−ＨＣｌ、約１ｍＭ〜約１０ｍＭの間のＭｇＣｌ２、および約０．１％重量／容量〜約５％重量／容量の間のトリトンＸ−１００を含み、ｐＨが約６．０〜約８．０の間である、請求項１記載の方法。
【請求項９】
第一溶解緩衝液が約０．３２Ｍのスクロース、約１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、約５ｍＭのＭｇＣｌ２、および約１％重量／容量のトリトンＸ−１００を含み、ｐＨが約７．５である、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
第二溶解緩衝液が約５ｍＭ〜約１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、約１ｍＭ〜約１００ｍＭのＮａＣｌ、約１ｍＭ〜約１００ｍＭのＥＤＴＡ、およびプロテアーゼを含み、ｐＨが約５．０〜約９．０の間である、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
第二溶解緩衝液が、約５ｍＭ〜約５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、約１ｍＭ〜約５０ｍＭのＮａＣｌ、約１ｍＭ〜約５０ｍＭのＥＤＴＡ、およびプロテアーゼを含み、ｐＨが約７．０〜約９．０の間である、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
第二溶解緩衝液が約１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、約１０ｍＭのＮａＣｌ、約１０ｍＭのＥＤＴＡ、約１ｍｇ／ｍＬのプロテアーゼＫを含み、ｐＨが約８．０である、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
容器が区画化された容器を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
容器がマルチウェルプレートを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
核酸沈殿溶液が約０．０５ＭのＮａＣｌおよびエタノールを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
鳥類由来の核酸をハイスループット単離する方法であって、
ａ）鳥類由来の有核血球を含有する複数の血液サンプルを得て；
ｂ）工程ａ）の血液サンプルを第一溶解緩衝液に加え、ここで該第一溶解緩衝液は約０．３Ｍのスクロース、約１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、約５ｍＭのＭｇＣｌ２、および約１％重量／容量のトリトンＸ−１００を含み、ｐＨが約７．５であって、区画化されたポリスチレン容器に入れられており、複数の血液サンプルのうち一の血液サンプルが区画化されたポリスチレン容器の単一の区画にて単離され；
ｃ）区画化されたポリスチレン容器を遠心分離に付し、複数の上清および複数のペレットを得；
ｄ）区画化されたポリスチレン容器中のペレットから上清を除去し；
ｅ）第二溶解緩衝液を区画化されたポリスチレン容器中のペレットに加え、ここで第二溶解緩衝液が約１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、約１０ｍＭのＮａＣｌ、約１０ｍＭのＥＤＴＡ、約１ｍｇ／ｍＬのプロテアーゼＫを含み、ｐＨが約８．０であり、その後、ペレットを第二分解緩衝液中にて８時間未満の間インキュベートし、それによりペレットから核酸サンプルを放出させ；
ｆ）区画化されたポリスチレン容器中の核酸サンプルを、約０．０５ＭのＮａＣｌおよびエタノールを含む核酸沈殿溶液を用いて沈殿させ；
ｇ）区画化されたポリスチレン容器中の核酸サンプルを洗浄し；
ｈ）区画化されたポリスチレン容器中の核酸サンプルを乾燥させ；および
ｉ）区画化されたポリスチレン容器中の核酸サンプルを溶媒に溶解させる；
という工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は２００２年５月２日付け提出の一部継続出願番号１０／１３６９４２の優先権の利益を主張する。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、一般的に、サンプル中の外来ＤＮＡ配列の存在を検出するのに有用なスクリーニングアッセイ、より詳細には、ハイスループットスクリーニングアッセイに関する。本発明は、さらに、有核細胞、特に赤血球からＤＮＡを抽出するハイスループット抽出法を含む。
【０００３】
（背景技術）
本発明は、サンプル中の外因ＤＮＡの存在を検出するのに有用なハイスループットスクリーニングアッセイを提供する。本発明の方法は、さらに、例えば、受容者のゲノム中の外来ＤＮＡの挿入を検出するためのアッセイとしてのスクリーニングアッセイでその後使用するための、鳥類の血液からＤＮＡを抽出するのに有用なハイスループットＤＮＡ抽出法を含む。
本発明の背景を明らかにするために本明細書に引用した出版物、および、特に、本発明の実施に関してさらなる詳細を提供するために引用した材料は、その出典を明示することにより本明細書の一部とし、便宜上下記の文中に引用する。
【０００４】
トランスジェネシスとは、宿主、例えばヒツジ、ウシ、またはさらにはニワトリのゲノムに異種または外因ＤＮＡを導入できることである。動物のゲノムを改変できることは、直ちに、容易に採取される形態で外因蛋白を発現できる動物を産生することを含む、多くの商用的適用例を示唆する。
鳥類のトランスジェネシスでの主な障害は、ニワトリのゲノムへの外来ＤＮＡの導入の効率の悪さである。他の動物でうまくいく方法を使用してニワトリのゲノムに外来ＤＮＡを挿入することは難しい課題であり、そのような試みは、一部分にはニワトリの独自の生理機能のために、ほとんど成功していない（Loveら、Transgenic birds by DNA microinjection, Biotechnology 12: 60-63, 1994; Naitoら、Introduction of exogenous DNA into somatic and germ cells of chickens by microinjection into the germinal disc of fertilized ova, Mol Reprod Dev 37: 167-171, 1994）。
【０００５】
レトロウイルスの使用を介して、多くの研究グループが、許容できるが効率の悪い、ニワトリのゲノムへの外来ＤＮＡの導入に成功している（Bosselmanら、GerｍＬine transmission of exogenous genes in the chicken, Science 243: 533-5, 1989; Petropoulosら、Appropriate in vivo expression of a muscle-specific promoter by using avian retroviral vectors for gene transfer [corrected] [published erratum appears in J Virol 66: 5175, 1992] J Virol 66: 3391-7, 1992; Thoravalら、GerｍＬine transmission of exogenous genes in chickens using helper-free ecotropic avian leukosis virus-based vectors, Transgenic Res 4: 369-377, 1995）。使用したレトロウイルスベクターは、それらが新しいレトロウイルスの複製および蔓延をもたらさないように、遺伝子操作された。これにより、いずれのレトロウイルスも有しないトランスジェニックニワトリを生成できる。しかし、レトロウイルスベクターはニワトリの中で増殖できないので、導入遺伝子は細胞から細胞へと伝達されない。レトロウイルスベクターは、典型的には、卵の殻の小さい穴を介して、新しく産まれた卵の胚に注入される。胚細胞のおよそ１％が形質導入され、導入遺伝子の一つのコピーが細胞ＤＮＡに挿入される。性的成熟および減数分裂後、精子または卵母細胞の０．５％が導入遺伝子を保有する。１羽のトランスジェニックトリを得るために、少なくとも２００匹のヒヨコをスクリーニングしなければならない。異なる染色体挿入により導入遺伝子が異なるレベルで発現しうるので、数種のトランスジェニックヒヨコを得ることが望ましい場合も多い。かくして、無数のヒヨコを繁殖させ、スクリーニングする必要があり、所望の遺伝子配列を検出するためのハイスループット遺伝子スクリーニング法を必要とする。
【０００６】
非レトロウイルス法による導入遺伝子の無作為染色体挿入は、ブタ、ヒツジ、ヤギ、およびウシを含むいくつかの家畜動物でのトランスジェニックの中心となっている。導入遺伝子を導入する第一方法は、接合子の前核に、所望の導入遺伝子を含有する線状ＤＮＡを注入することである。Ｇ０期の子孫の２０％までが導入遺伝子を含有する。トランスジェネシスが比較的高効率であることにより、その操作の間にかかる高い技術費用が相殺される。例えば、乳腺で医薬の発現を指示し、その後ミルク中に分泌させる、導入遺伝子がヤギに挿入された（Ebertら、Transgenic production of a variant of human tissue-type plasminogen activator in goat milk: generation of transgenic goats and analysis of expression, Biotechnology 9: 835-8, 1991）。
【０００７】
ニワトリでは、一部分にはニワトリの生理機能および胚形成の独自の態様に関連するさらなる複雑さのために、接合子胚盤の注入は達成されるが、成功は限定される(Loveら、1994; Naitoら、1994)。ある研究室は、いくつかのトランスジェニックニワトリの生成に成功し、それらは、それらの染色体に、注入されたＤＮＡを組み込み、導入遺伝子を子孫へと受け継いでいった。別の研究室は、その技術を再現しようとしたが、失敗した。核がかなり小さく、卵黄膜の下が約５０ミクロンであるので、ニワトリでの接合子注入は難しい。かくして、ＤＮＡは細胞質に注入されなければならない。マウスでのように、ＤＮＡの細胞質注入は、染色体への導入遺伝子の組み込みの効率が悪い。接合子を除去するためにニワトリを犠牲にしなければならず、各ニワトリは一つの接合子しか生成しない。
重要な技術的進展は、例えば、産卵での胚ステージＸの胚、例えば卵が産まれた時から集めた胚盤葉細胞（ＢＤＣ）を使用することで、ゲルフ大学のGibbin、Etchesおよび彼らの同僚により切り開かれた。（Brazolotら、、Efficient transfection of chicken cells by lipofection, and introduction of transfected blastodermal cells into the embryo, Mol Reprod Dev 30: 304-12. 1991; Fraserら、Efficient incorporation of transfected blastodermal cells into chimeric chicken embryos,  Int J Dev Biol 37: 381-5, 1993）。生殖細胞系を再構築できる、ＢＤＣ培養の最近の進歩とともに、該方法は、理論上、相同組み換えによる標的遺伝子工学と同様に、非相同組み換えによる無作為の導入遺伝子付加も可能にする。
【０００８】
ステージＸでは、胚体胚盤葉は、不透明部分により囲まれたシート（透明部分）として組織された４０，０００ないし６０，０００の細胞からなり；まだ移動ＰＧＣに分化していない予定原始生殖細胞（ＰＧＣ）を含む。分散ＢＤＣに適当な導入遺伝子をトランスフェクションし、ｙ−照射した受容者のステージＸの胚の胚芽下腔に導入できる。照射により、選択的に予定ＰＧＣを破壊し、受容者の胚の成長を遅らせて、注入した細胞に、受容者の胚盤葉に定着するためのさらなる時間を与えてもよい。羽の色に対する遺伝子マーカー（バレッドロックの黒およびホワイトレグホンの白）を使用して、Etches、Gibbinsおよび彼らの同僚は、卵が孵るまで生存していた、注入した胚のうち、５０％またはそれ以上が、ほぼ半分が生殖細胞系モザイクでもあった体細胞キメラであった、ということを示すことができた（Petitteら、Production of somatic and gerｍＬine chimeras in the chicken by transfer of early blastodermal cells, Development 108: 185-9, 1990）。
Gibbinsおよび彼女の同僚は、インビトロで培養したＢＤＣでは、３００個のトランスフェクションした細胞のうち１個に無作為の遺伝子付加が起こる、ということを決定した(GibbinsおよびLeu, personal communication)。彼らは、生殖細胞系のＧ０キメラを生成するために、無作為に遺伝子付加したＢＤＣｓをステージＸの胚に再導入できるかどうかは決定しなかった。それゆえ、形質転換の実質的効率はまだ決定されていない。
【０００９】
遺伝子標的、つまり特異的遺伝子を特異的に組み換えられることは、そのような組み換えにより導入遺伝子の発現および機能をかなり予想できるので、ニワトリを含むさまざまな種でかなり需要の多い技術である。マウスの胚性幹（ＥＳ）細胞は、インビトロで長期間培養でき、なお生殖細胞系に寄与できるので、マウスでの遺伝子標的の達成に成功している（Mountfordら、Dicistronic targeting constructs: reporters and modifiers of mammalian gene expression, Proc Natl Acad Sci U S A 91: 4303-7, 1994）。マウスのＥＳ細胞の長期間培養により、研究者は、適当な部位に挿入された導入遺伝子を有する標的ベクターをトランスフェクトした細胞のコロニーを選択し、増やすことができる。キメラトリでの羽の色の対立遺伝子の使用と同様に、異なる品種のマウスの毛の色が、子孫でのドナー細胞を追跡するために使用される。マウスのＥＳ細胞技術を他の種に適用する上で困難な点は、他の種のＥＳ細胞を単離できていないことである。ＥＳ細胞に似た細胞をヤギおよびブタから単離し、インビトロで培養してきたが、これらの細胞は、長期間の培養後、宿主の胚に寄与できない。核転移技術は、ＥＳ細胞の使用の別法を提供し、将来、動物での遺伝子標的が核転移により実施されるだろう。しかし、現在では、核転移はかなり非効率的で高価であり、その実施を遅らせている。
【００１０】
ニワトリの胚盤葉細胞のインビトロでの短期間培養における最近の進歩は、鳥類の再生という独自の生理機能とともに、ニワトリで遺伝子標的が可能であることを示唆する。ステージＸのＢＤＣの分裂速度は、Ivarie研究室（ジョージア大学、アテネ、ＧＡ）およびAviGenics, Inc.（アテネ、ＧＡ）（Speksnijder およびBaugh、未発表データ）により開発された培養条件を使用して、８〜１０時間ごとに１回の分裂で、４〜８日間、インビトロで維持できる。全能性を維持しながら、インビトロでこの速度にてＢＤＣを増殖させられることにより、所望の遺伝子組み換えを含有する細胞コロニーを迅速に増やすことができる。新しく産まれたニワトリの卵から多くのＢＤＣ（４００００〜６００００の細胞／卵）を容易に単離できるという事実とともに、このことにより、関係する所望の遺伝子を有するもので、トランスフェクションした多くのＢＤＣコロニーをスクリーニングできるようになる。
現在、ＢＤＣは、宿主の胚の生殖組織に寄与できなくなる前に、４〜８日間培養できるだけである（SpeksnijderおよびBaugh、未発表データ）。それゆえ、所望の遺伝子組み換えを保有するＢＤＣは、おそらくドナー細胞の総量の０．１〜１０％まで増やすことができるだけであろう。遺伝子標的を可能にするのには十分だが、キメラ元祖動物（宿主の胚へのドナーＢＤＣの注入に直接由来したもの）からその子孫への、所望の遺伝子組み換えの伝達速度は、遅いだろう。無数の子孫をスクリーニングしなければならず、再び、所望の配列を検出するためのハイスループット遺伝子スクリーニング法を必要とする。
【００１１】
ＢＤＣの所望の遺伝的修飾のための強化、ならびに特異的遺伝子の修飾のための強化は、鳥類のゲノムに遺伝子を無作為に挿入することを含むトランスジェネシス計画に適用できる。それゆえ、ハイスループット遺伝子スクリーニング法は、鳥類の形質転換という急速に成長している分野において幅広い応用例を有するだろう。
有機体が新規な、または新しい遺伝子を含有するかどうかを決定するために、ＤＮＡを組織サンプル（血液、皮膚、精液）から抽出し、その遺伝子を検出するであろうアッセイに供する。選択できる方法は、極めて感度がよく信頼性のある、サザン分析であった（Southern, E. M、Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis, J Mol Biol 98, 503-17, 1975）。しかし、サザン分析は、かなり労働集約的で、時間がかかる。
サザン分析を、より感度がよく、迅速に分析できる、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法と置換した（Mullisら、Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction.  Cold Spring Harbor Symp Quant Biol 51 (Pt 1): 263-73, 1986）。
【００１２】
ＴＡＱＭＡＮ配列検出システム（Applied Biosystems, Foster City, CA）のような、最近開発された技術により、時間のかかるゲル電気泳動工程を必要とせずに、数百のサンプルを数時間で分析できる（Heidら、Real time quantitative PCR, Genome Res 6: 986-94, 1996）。ＰＣＲ反応と同様にセットアップした、ＴＡＱＭＡＮ反応操作の間に、記録および消光蛍光色素の両方を付着させたオリゴヌクレオチドからなる蛍光遺伝子プローブは、順行性および逆行性プライマーの間に特異的にアニールする。プローブおよびプライマーは、所望の導入遺伝子の配列に相補的である。プローブがＴａｑＤＮＡポリメラーゼの５'ヌクレアーゼ活性により開裂する場合、記録色素は消光色素から分離し、配列特異的シグナルが生成する。各サイクルで、さらなる記録色素分子がそれぞれのプローブから開裂し、ＰＣＲの間、蛍光強度が測定される。サンプルは９６ウェルプレートで分析され、ランの終点で、サンプルが所望の配列を含有するかが明らかになる。
【００１３】
配列検出のためのハイスループット法は利用できるものの、配列検出のためのハイスループット分析で有用なＤＮＡの抽出のための、類似の方法は存在しない。むしろ、既存のＤＮＡ抽出法は、いまだに労働集約的で、時間がかかる。抽出法の大部分は、ＤＮＡサンプルを個々のチューブで処理する必要がある。サンプルは、プロテイナーゼ分解、有機溶媒での抽出、および沈殿を含む、多くの工程に供される。抽出工程は、溶液相の操作の不便さのために、特に問題がある。塩析は、望ましくない蛋白の抽出の別法として使用されているが、この方法は、複数の遠心分離および管の移動を必要とする。ＤＮＡ結合樹脂を使用することにより抽出工程を避け、９６サンプルを同時に処理できるキットを利用できる。しかし、この樹脂は再利用できず、それらを使用しても、收率が低く、一定したＤＮＡの特性を得られない。さらに、これらのキットは経済的でなく、抽出処理されるサンプルにつき、３．００ドルまでかかる。
【００１４】
鳥類の組織の複数のサンプルからＤＮＡを抽出する既存の方法は、労働集約的で、長たらしい。全ての非哺乳類脊椎動物と同様に、鳥類の血液は、赤血球が有核であるという点で特別な性質を有する（Rowley and Ratcliffe, Vertebrate blood cells, Cambridge University Press, Cambridge, NY, 1988）。有核細胞の存在により、かなり少量の血液から大量のＤＮＡを抽出できる。しかし、既存のＤＮＡ抽出技術は、鳥類の血液のこの態様を利用していない。Grimbergらは、赤血球（ＲＢＣ）の核膜ではなく、原形質膜を分解する方法を開発した（Grimbergら、A simple and efficient non-organic procedure for the isolation of genomic DNA from blood, Nucleic Acids Res 17: 8390, 1989）。続いて、Petitteらは、初期の分解を最適化し、エタノール沈殿ＤＮＡをガラス棒に巻きつけることによりGrimbergの方法を補足し、その結果、より純粋なＤＮＡを調製できたが、より労働集約的なプロトコルを必要とした（Petitteら、Isolation of genomic DNA from avian whole blood, Biotechniques 17: 664-6, 1994）。Thoravalらは、同様の方法を使用したが、各サンプルを個々に処理する必要があった（Thoravalら、GerｍＬine transmission of exogenous genes in chickens using helper-free ecotropic  avian leukosis virus-based vectors, Transgenic Res 4: 369-377, 1995）。
【００１５】
前述した方法は全て、各サンプルを個々に処理しなければならず、抽出したＤＮＡを複数の管の間で移さなければならない、という点で同様の不都合を有する。労働集約的であるのに加えて、これらのＤＮＡ抽出法は、分解を生じさせるために一晩中インキュベートすることも含む。
マウスで遺伝子を標的するために、所望の遺伝子組み換えが存在するかを、数百のマウスの胚性幹（ＥＳ）細胞コロニーで個々に分析しなければならない。かなり多くのコロニーからＤＮＡを抽出するのを容易にするために、Ramirez-Solisらは、ＥＳ細胞が９６ウェルプレートで溶解される独創的な方法を考案した（Ramirez-Solisら、Genomic DNA microextraction: a method to screen numerous samples.  Anal Biochem 201: 331-5, 1992）。Ramirez-Solisらの方法を使用して、遠心分離せずに微小滴定ウェルの底に留まるように、ＤＮＡを沈殿させる。これは、一部には、ＤＮＡの９６ウェル組織培養プレートの主成分であるポリスチレンについての親和性によるものである。ＤＮＡはプレートに留まるが、ウェルを７０％エタノールで数回洗浄することで、全ての望ましくない蛋白および塩を除去できる。かくして、９６サンプルを同時に処理できる。ＤＮＡは管の間を移動しないので、サンプルの損失および汚染の両方の可能性を最小限にする。
【００１６】
方法の効率の悪さにより、効率的な抽出に十分な細胞を得るために大量の血液を処理する必要があったが、Ramirez-Solisらは、上記の方法を使用して、ヒトの血液サンプルからＤＮＡを単離しようと試みた。各微小滴定ウェルの最大許容量は約０．２５ｍＬにすぎなかったが、効率的な抽出に十分なＤＮＡを得るために、各ウェルにつき、少なくとも０．３ｍＬ、および最も好ましくは約１．０ｍＬのヒトの血液が必要であった。かくして、Ramirez-Solisらの方法は、ゲノム血液からＤＮＡをハイスループット抽出するのに有用でない。
UdyおよびEvansは、Ramirez-Solisらの方法と同様に、胚性幹（ＥＳ）細胞からＤＮＡを抽出する９６ウェルプレート法を開発したが、その方法を血液からのＤＮＡ抽出には決して適用しなかった（Udy and Evans, Microplate DNA preparation, PCR screening and cell freezing for gene targeting in embryonic stem cells, Biotechniques 17: 887-94, 1994）。
【００１７】
前述した従来技術の欠陥という見地からすると、サンプルを多量に必要とせず、ＤＮＡを複数の管を移動させる必要が無く、または一晩中のインキュベーション工程を必要としない、多くの血液サンプルからＤＮＡを迅速に、および容易に提供する方法が必要である。さらに、所望のＤＮＡ配列または導入遺伝子を検出するために多くのサンプルを迅速にスクリーニングするためのハイスループットアッセイで使用できるＤＮＡ抽出法が必要である。最後に、コピー数が少ない、つまり約５〜５０コピーの間である場合、多くのサンプルで所望の遺伝子配列の存在を検出するのに有用なハイスループットアッセイが必要である。
【００１８】
（本発明の要約）
本発明は、上記の従来技術の欠陥および欠点を認識し、取り扱う。本発明は、その後のハイスループットスクリーニングアッセイでの使用のために、ＤＮＡを迅速に抽出し、調製する方法を提供する。本発明の方法は、例えば、宿主のゲノム中の外来ＤＮＡの挿入を検出するためのアッセイとして、ハイスループットスクリーニングアッセイで使用するために、鳥類の血液からＤＮＡを抽出するのに特に有用である。
本発明は、所望のゲノム配列を検出するために、多くの有核血液サンプルを迅速にスクリーニングするのに有用なアッセイをも対象とする。本発明の一の具体例では、有核血液サンプルは、例えばニワトリまたはシチメンチョウのような、鳥類の血液であってよい。遺伝子配列は、内因ＤＮＡ遺伝子、または例えば導入遺伝子のような、外来配列であってよく、または別法として、遺伝子配列はプラスミドであってよい。
【００１９】
本発明の一の具体例では、サンプルを微小滴定ウェルに置き、原形質膜を溶解させるために細胞を溶かし、サンプルを遠心分離に付してペレットを回収し、そのペレットを８時間未満の間溶解させてＤＮＡを放出させ、核酸がウェルに付着するように微小滴定プレートのウェル中に核酸を沈殿させ、洗浄してウェルから異物を除去し、単離された核酸をスクリーニングアッセイに付して所望の遺伝子配列を検出することにより、核酸が有核血液サンプル、特に鳥類の血液サンプルから単離される。
本発明の別の具体例では、核酸を放出させるために、約１〜６時間の間で細胞ペレットの溶解を実施する。
本発明は、所望の配列を検出するためのハイスループットアッセイも提供し；該アッセイは、さらに、干渉性ゲノムＤＮＡの存在下でさえ、所望の遺伝子配列を少ないコピー数で検出できる、配列タグを含む。一の具体例では、ハイスループットアッセイは、約５〜５０コピーのレベルのニワトリのゲノムＤＮＡの存在下で、標的プラスミドを検出できる、配列タグを提供する。
【００２０】
（図面の簡単な記載）
当業者にとってのその最良の形態を含む、本発明の十分かつ実施可能な開示を、特に、添付した図面への言及を含む、本明細書の残りの部分で示す。
図１は、本発明の方法を図示する概略図である；
図２は、アガロースゲルの写真である。慣用的なフェノールをベースとする方法または本発明の方法のどちらかを使用して、ホワイトレグホンニワトリから得られた血液からＤＮＡを抽出した。抽出後、２６０ナノメートルでの吸光度によりＤＮＡサンプルを定量し、０．８％アガロースゲル上に各サンプルを１、２および５μｇずつ分けた。フェノールをベースとする方法を使用して抽出したサンプルは、Ｌと印をつけたレーンに示され、Ｈと印をつけたレーンは、本発明の方法により抽出したＤＮＡサンプルを含有する。レーンＭは、キロ塩基対として示される分子量で標準的なＤＮＡを含有する；
【００２１】
図３は、ニワトリのグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子の挿入を検出するためのアッセイで、本発明のハイスループットＤＮＡ抽出法を使用して、実施例３に記載されるように実施した実験の結果を図示するグラフである。ハイスループットＤＮＡ抽出法の信頼度を確認するために、ニワトリのＧＡＰＤＨ遺伝子に相補的なプライマーおよびＦＡＭ／ＴＡＭＲＡ−組み換えオリゴヌクレオチドプローブをＴＡＱＭＡＮ反応で使用した；
図４は、本発明によりトランスジェニック子孫のハイスループットスクリーニングを行った実験の結果を図示するグラフである。本発明のＤＮＡ抽出法を使用して、部分的にトランスジェニックしたオスから産まれた８２匹のヒヨコからＤＮＡを抽出した。導入遺伝子の存在を検出するために、プライマーおよび、細菌のネオマイシン耐性遺伝子に相補的なＴＥＴ／ＴＡＭＲＡ−組換えプローブでの、ＴＡＱＭＡＮ反応を使用した。３３サイクル後までΔＲｎでの増加を示さない曲線から、それぞれのヒヨコがトランスジェニックしていなかったことが示唆される。トランスジェニックヒヨコから抽出したＤＮＡは、１８サイクルで増幅した。異なる９６ウェルプレートで同じヒヨコから抽出したＤＮＡにより、１８サイクルで増幅し始めた第二曲線が生じた；
【００２２】
図５は、配列タグを示す標的遺伝子の概略図である。配列タグ（Ｔａｇ）がポリアデニル化シグナル配列（ｐＡ）の３'末端に挿入されるように、標的ベクターを組み換える。ベクターを所望の細胞に導入すると、ベクターは標的遺伝子に再結合する。ＤＮＡを細胞から抽出し、プライマーＮｅｏＲｅｖ−１およびプライマー２でのＰＣＲ分析を使用して、標的遺伝子のそれでスクリーニングする。リアルタイムＰＣＲ反応をランする場合、反応物にＴＡＱＭＡＮプローブ（Ｎｅｏｐｒｏｂｅ）を加えることができる；
図６は、配列タグのヌクレオチド配列を示す；
【００２３】
図７は、ハイスループットアッセイ、および本発明のタグを使用する実験の結果を示すアガロースゲルである。結果は、１５０ｎｇのニワトリのゲノムＤＮＡの存在下でさえ、コピー数での標的遺伝子の検出を示した。１０μＬのＴＡＱＭＡＮ反応物を含む各サンプルを１％アガロースゲルでランし、エチジウムブロマイドで染色した。レーン１は、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬからの１μｇの１キロベースＤＮＡラダーである。プラスミドＤＮＡはＴＴＶ−ＴＴｒｅｖである。各反応でのプラスミドのコピー数を各レーンの上に示す。所望の９４１塩基対生成物を示す。
図８は、本発明のハイスループットアッセイを使用しての、標的遺伝子のリアルタイムＰＣＲ検出を描いたグラフである。上記の図７に明記したように、反応を実施した。
【００２４】
（好ましい具体例の詳細な記載）
本発明の好ましい具体例について詳細に言及し、それらの一つまたはそれ以上の実施例を、添付する図面にて説明する。実施例は、各々、本発明の例示として提供されるものであって、本発明を限定するものではない。実際、本発明において、本発明の範囲または意図から逸脱することなく、さまざまな修飾および変形がなされうる、ということは、当業者に明らかであろう。例えば、一の具体例の一部として説明または記載される特徴を、さらなる具体例を生み出すために、別の具体例で使用できる。本発明は、添付した特許請求の範囲およびそれらと同等のものの範囲内に収まるような、修飾および変形を含む、ということが意図される。
【００２５】
本発明は、例えば、導入遺伝子またはプラスミドのような、所望の遺伝子配列を検出するために、多くのサンプルを迅速にスクリーニングするのに有用なハイスループットアッセイを対象とする。
本発明の一の態様では、ハイスループットスクリーニングアッセイでの使用のために、ＤＮＡを迅速に抽出および調製する方法を提供する。本発明の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、または受容者のゲノム中の遺伝子マーカーまたは外来ＤＮＡの検出のための他の慣用的ＤＮＡ検出アッセイを含むが、これらに限定されない、ハイスループットスクリーニングアッセイでの使用のために、有核血球からＤＮＡを抽出するのに特に有用である。
本発明の一の具体例では、例えば、ホワイトレグホンおよびバレッドロックのヒヨコおよび十分成熟したトリからのような、ニワトリの血液の複数のサンプルからＤＮＡを抽出するハイスループット法を開示する。しかし、鳥類、魚類、爬虫類、および両生類の有核血球を含むが、これらに限定されない、いずれかの有核血球からＤＮＡをハイスループット抽出するために、本発明の方法を使用できる。
【００２６】
本発明は、抽出工程の間にＤＮＡを別々の管または容器に移す必要なく、有核血球を含有する複数の血液サンプルからＤＮＡを抽出するハイスループット法を提供する。一の具体例では、サンプルを微小滴定ウェルに置き、ＤＮＡを放出させるために細胞を溶解させ、核酸がウェルに付着するように微小滴定プレートのウェル中に核酸を沈殿させ、ウェルからいずれかの異物を洗浄して除去し、単離した核酸を分析することにより、有核血液サンプル、特に鳥類の血液サンプルからＤＮＡのような核酸を抽出する。
本発明は、さらに、少ないコピー数で所望の遺伝子配列を検出できるハイスループットアッセイでの使用のための配列タグを提供する。例えば、一の具体例では、ニワトリのゲノムＤＮＡの存在下で、プラスミドを約５〜５０コピーのレベルで検出できるように、本発明のハイスループット分析で配列タグを使用する。
【００２７】
鳥類以外の種からの血液を使用するハイスループットＤＮＡ抽出法も、本発明の範囲内に企図される。例えば、本発明の別の具体例は、本発明のハイスループットアッセイで哺乳類の赤血球を使用するＤＮＡ抽出法を提供する。本発明の一の態様では、十分な量の有核細胞を、２５０μＬまたはそれ以下の量で微小滴定プレートの各ウェルに移動できるように、細胞分類、遠心分離、または造血剤の投与により、哺乳類の血液に有核ＲＢＣを増やす。
本発明のさらに別の具体例では、赤血球以外の有核細胞からＤＮＡまたは他の核酸を抽出する。例えば、顆粒球、好中球、およびマスト細胞を含む、白血球を本発明のハイスループットアッセイで使用できる。
実施例を用いると本発明をより理解できるかもしれない。かかる実施例は例示のために提供されるのであって、本発明の範囲を限定するものと解すべきでなく、その範囲は本明細書に添付した特許請求の範囲により特定される。
【００２８】
実施例１：ＤＮＡ抽出法
簡単には、本発明に記載の、鳥類の血液からＤＮＡを抽出するプロトコルは、以下の通りである：
Ａ．あらかじめ冷やした９６ウェルの平底ポリスチレン組織培養プレートに、０．２ｍＬ（０．２５ｍＬ程度でもよい）の（０．３２Ｍのスクロース、１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、および１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有し、ｐＨが７．５である）溶解緩衝液ＬＢ１を各ウェルに加えた。重複プレートを９６匹のヒヨコの各セットに用意した。以下の工程Ｃまで、９６ウェルプレートを氷の上に置いた。
【００２９】
Ｂ．出血しやすくするように、１〜１０日齢のホワイトレグホンのヒヨコを熱ランプで温め、足の静脈を刺して、ヘパリンを入れた０．０５ｍＬの毛細管を半分満たした。満たしすぎた毛細管は、血液の量が多すぎるので、最初の９６ウェルプレートに入れることはできない。毛細管を満たした後、それぞれＬＢ１を含有する、一つのウェルおよびそれと同一のものに、血液を一滴（約８μＬまたは毛細管の４分の１）移した。移した後、毛細管を使用して各ウェルで血液およびＬＢ１を混合した。血液ドナーとして１０日齢を過ぎたヒヨコを使用する場合、血液を集めるために、２５グレイの針および０．０５ｍＬのヘパリンを入れた１ｃｃのシリンジを使用できる。各ウェルに一滴（約８μＬ）移す。
溶解溶液はあまり多くの血液に適用できないことに注意する。そうでなければＤＮＡの質が有意に減少するだろう。分解溶液が中くらいの赤色に染まるように、十分な血液を加える。有意な凝固が起こる場合、細胞ペレットがその後の工程で失われる場合、またはＤＮＡが再懸濁後、黄色あるいは茶色に見える場合、ＬＢ１に血液を加えすぎたと思われる。
【００３０】
Ｃ．各微小滴定プレートを約９６０グラムで（卓上遠心分離機で約２０００ｒｐｍで）７分間遠心分離し、核酸をペレットにした。
Ｄ．各微小滴定ウェルの底に残っている核酸層を残しながら、各ウェルから上清を注意深く吸引した。赤色の大部分は消えた。
Ｅ．０．０５ｍＬの溶解緩衝液２（１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、１０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、および１ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫを含有し、ｐＨが８．０である、ＬＢ２）を各ウェルに加え、プレートを１〜８時間の間で、５６〜６５℃にてインキュベートした。インキュベーションの時間は変化してよいが、最適な結果から、第二溶解緩衝液でのインキュベーションは約２〜６時間であるべきである。およそ８時間のインキュベーションで、ＤＮＡ変性のためにサンプルは使用できなくなる。
【００３１】
Ｆ．各ウェルに、（あらかじめ混合した）１．５μＭのＮａＣｌおよび０．０１ｍＬの冷えたエタノールを加え、混合せずに、プレートを４℃で一晩中放置した。
Ｇ．その後、プレートを注意深く逆さにし、大きいビーカーに上清を注いで、上清を除去した。
Ｈ．７０％エタノールで、各ウェルにつき約０．２ｍＬ使用して、３〜４回ペレットを洗浄した。プレートを注意深く逆さにし、最後の洗浄後、プレートを紙タオルの上で吸い取って、上清を除去した。
Ｉ．黒いバックグラウンドにプレートを立てかけ、ウェルの底に密集した白いマットがないウェルに印をつけることで、ＤＮＡがなくなったウェルに印をつけた。
【００３２】
Ｊ．プレートを６５℃で１時間インキュベートすることで、（ＤＮＡの完全な透過度により示されるように）ＤＮＡサンプルを完全に風乾させた。
Ｋ．各ウェルに０．２ｍＬのＰＣＲまたはＤＮＡ等級純水を加え、１枚のパラフィルムをウェルの上に置き、パラフィルムの上からフタをきつく閉めた。ＤＮＡサンプルは４℃にて一晩で再懸濁した。次の日、微小プレートホルダー付のボルテックスで、最小速度、室温にて６〜８時間または一晩中、静かに振盪した。生じたＤＮＡ溶液は完全に透き通っているようであった。
【００３３】
図１について言及すると、本発明に記載のＤＮＡ抽出法の工程を図示するために、概略図を提供する。概略図に図示されるように、９６ウェルプレートの各ウェル中の溶解緩衝液１（ＬＢ１）に、８〜１２μＬの鳥類の血液を加える。赤血球の原形質膜の溶解が生じた後、核酸をスピンダウンさせ、細胞質蛋白を含有する上清を除去する。核酸層をかき乱さないように、プロテイナーゼＫ溶液を加える。核酸の溶解後、エタノールおよびＮａＣｌの溶液を静かに加える。染色体ＤＮＡは沈殿し、ウェルの底にしっかりと付着する密集した白いマットを形成する。遠心分離することなく、ＤＮＡマットを７０％エタノールで数回容易に洗浄できる。各洗浄の間に、溶液を手で注ぐだけである。最後の洗浄の後、プレートを紙タオルの上で逆さにし、乾燥させ、ＤＮＡを再懸濁させるために、各ウェルに水を加える。
本発明により抽出されるＤＮＡを定性分析で使用する場合、各ウェルに存在するＤＮＡ量を定量する必要はない。むしろ、最後の７０％エタノールの洗浄後、乾燥させる前に、プレートを観察すると、ウェルが適当な量のＤＮＡを有さないことが示唆されるだろう。適当な量のＤＮＡを含有するウェルなら、底にＤＮＡの密集した白いマットを有し、プレートを黒いバックグラウンドに立てかけたら、容易に観察できる。
【００３４】
実施例２：ハイスループットＤＮＡ抽出法を使用する平均ＤＮＡ収量
上記の実施例１に記載のように、ホワイトレグホンニワトリから得られた血液サンプルを使用して、三つの異なるＤＮＡ抽出実験を実施した。ハイスループット抽出後の生成物を定量するために、（０．１ＭのＴｒｉｓ−ｂａｓｅおよび０．００５ＭのＥＤＴＡを含有し、ｐＨが７．５である）１．０ｍＬのＴＥ緩衝液中の５μＬのピコグリーン（Molecular Probes, Eugen, OR）に、２μＬのＤＮＡを加えた。標体として、Ａ２６０での吸収度により定量したＣｓＣｌ結合プラスミドＤＮＡを使用して、Turner Designs TD-700蛍光測定器でサンプルを読み取った。
これらの実験の結果は、本発明のハイスループット法により抽出および再懸濁した１μＬのＤＮＡが、典型的には、１００〜６００ｎｇのゲノムＤＮＡを含有することを明らかにした。平均的ＤＮＡ収量は、以下の表に要約されているように、およそ３４０ｎｇ／μＬ＋／−１２０ｎｇ／μＬであった；
【００３５】
【表１】
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【００３６】
図２について言及すると、本発明の方法により抽出したＤＮＡと、慣用的なフェノールをベースとする方法を使用して得られたものとを比較するアガロースゲルの写真を表わす（例えば、溺olecular Cloning: A Laboratory Manual,  2nd ed., J. Sambrookら、eds., Cold Spring Harbor Press, 1989 およびMethods in Plant Molecular Bioloqy: A Laboratory Course Manual, P. Maligaら、eds., Cold Spring Harbor Press, 1994にて提供される標準的フェノール抽出プロトコルを参照のこと)。
【００３７】
実施例１に記載のような本発明のハイスループット法、または慣用的なフェノールをベースとする方法のどちらかにより、ホワイトレグホンニワトリから得られた血液を抽出した。抽出後、２６０ナノメートルの吸収度によりＤＮＡサンプルを定量し、（１、２、および５μｇの濃度のＤＮＡで）０．８％のアガロースゲルに載せ、慣用的プロトコルを使用して電気泳動した。本発明により抽出したＤＮＡの質（Ｈと印したレーン）と、慣用的なフェノールをベースとした技術を使用して抽出したもの（Ｌと印したレーン）とを比較するために、エチジウムブロマイド染色を使用してゲルを可視化した。レーンＭは、示唆される分子量に標準的なＤＮＡを含有する。図２に示されるように、本発明のハイスループット法を使用して抽出したＤＮＡの質は、慣用的な技術で抽出したものに匹敵する。
【００３８】
実施例３：ハイスループットアッセイを使用しての、ニワトリのゲノム中のＧＰＤＨ導入遺伝子の同定
本発明により抽出したＤＮＡの適合性を証明するために、二つの異なるＴＡＱＭＡＮアッセイを実施した。第一に、ニワトリのグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）に相補的なプライマー／プローブのセットを設計し、市販用に作成した。プライマーはGibco BRL (Gaithersburg, MD)で作成し、プローブはOperon Technologies (Alameda, CA)により合成した。使用したプライマーは以下のように設計した；
ｃｈＧＡＰＤＨ−１：５'−ＴＣＣＣＡＧＡＴＴＴＧＧＣＣＧＴＡＴＴＧ−３'（配列番号：１）および
ｃｈＧＡＰＤＨ−２： ５'−ＣＣＡＣＴＴＧＧＡＣＴＴＴＧＣＣＡＧＡＧＡ−３' （配列番号：１）。ｃｈＧＡＰＤＨプローブの配列は、５'−ＣＣＧＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＡＧＧＧＣＴＧ−３'であった。ｃｈＧＡＰＤＨプローブを５'末端にてＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）で、３'末端にてＴＡＭＲＡ（Ｎ'，Ｎ'，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチル−６−カルボキシローダミン）で標識した。ＴＡＱＭＡＮアッセイは、ＰＣＲ生成物へのｃｈＧＡＰＤＨプローブのハイブリダイゼーション、その結果として生じるプローブのエンドヌクレアーゼ開裂による、相対的蛍光の増加を測定する。蛍光がＴＡＭＲＡによりもはや消光されないように、開裂によりプローブからＦＡＭ分子を放出させる。
【００３９】
上記の実施例１に記載の本発明の方法により、無作為に選択したホワイトレグホンのヒヨコから得られた血液から抽出した、１００〜３００ｎｇのＤＮＡを加えて、５０μＬの容量でＴＡＱＭＡＮ反応を実施した。各反応管に、０．７５ＸＰＣＲ緩衝液（Perkin-Elmer, Foster City, CA）、０．２５ＸＴＡＱＭＡＮ緩衝液（Perkin-Elmer）、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５％のＤＭＳＯ、１２５μＭのｄＡＴＰ、１２５μＭのｄＣＴＰ、１２５μＭのｄＧＴＰ、２５０μＭのＵＴＰ、０．９μＭの順行性プライマー、０．９μＭの逆行性プライマー、４０ｎＭのｃｈＧＡＰＤＨプローブ、０．０５ユニット／μＬのＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄＤＮＡポリメラーゼ（Perkin-Elmer）、０．００４ユニット／μＬのＡｍｐＥｒａｓｅＵＮＧ（Perkin-Elmer）を、製造業者の指示に従って加えた。以下の条件：５０℃で２分間、９５℃で１０分間、その後９５℃で１５秒間を４０または５０サイクル、および６０℃で１分間、を使用して、Perkin-Elmer Applied Biosystems Sequence Detector Model 7700で反応を分析した
【００４０】
ＰＣＲ反応の各サイクル間の蛍光（∈Ｒｎ）の増加として、ＴＡＱＭＡＮ反応の結果を可視化した。より早期のサイクルでの∈Ｒｎの増加は、その特定の配列のより多くのコピーの存在を示唆し、より後期のサイクルでの∈Ｒｎの増加は、存在するその配列のコピーが少なくなることを示唆する。かくして、ＴＡＱＭＡＮデータにより、特定の配列の存在およびその配列の相対量を決定できる。
図３は、ＰＣＲ反応の各サイクルでの蛍光を測定するＴＡＱＭＡＮ増幅分析の結果を示す。サイクル数をｘ軸に示す（１８〜５０サイクルだけを示す）。ΔＲｎは、ＰＣＲ生成物へのｃｈＧＡＰＤＨプローブのハイブリダイゼーション、およびその結果生じるプローブのエンドヌクレアーゼ開裂のための、相対的蛍光の増加である。図３に示されるように、三つの対照サンプル（空白）は、ΔＲｎで増加を示さない重複曲線を形成するが、２１匹のホワイトレグホンヒヨコの全てから得られたＤＮＡサンプルは、ｃｈＧＡＰＤＨ遺伝子へのプローブのハイブリダイゼーションを示すかなり似た増幅プロットを形成する。これらの結果により、ＴＡＱＭＡＮ増幅分析で使用した本発明のハイスループットＤＮＡ抽出法は、ゲノムＤＮＡ中の特異的遺伝子配列の存在を検出するための、正確で一貫した方法を提供することが示唆される。
【００４１】
実施例４：ハイスループット遺伝子配列法での使用のための配列タグの構成
標的ベクターの設計における重要な障害は、標的遺伝子を模倣するプラスミドを、ＰＣＲを使用して検出できないことである。本発明者らは、さまざまな条件下で、試験プラスミドの検出制限は５０００コピーまたはそれ以上であった、ということを見出した。主要な障害は、ニワトリのＤＮＡが存在しない場合、本発明者らの分析の検出制限は１０ないし５０コピーであったが、ニワトリのゲノムＤＮＡのナノグラム量をＰＣＲ反応に加えた場合、反応が有意に抑制された、ということである。さまざまな異なる方法で調製され、異なる品種のニワトリに由来するニワトリのゲノムＤＮＡで試みたが、全てＰＣＲ分析での検出制限を満たさず、標的細胞を正しく同定できなかった。
【００４２】
この問題を克服するために、異なるプライマーを試みることもできたが、これは費用および時間のかかる方法である。標的ベクターの、その標的遺伝子への組み込みを検出するためのプライマーを設計するような場合では、プライマーを選択する配列は、標的ベクターおよび標的遺伝子の特異的領域に制限される。例えば、標的ベクターに特異的なプライマーは、選択カセットの３'非翻訳領域（ＵＴＲ）内に存在するべきである。しかし、大部分の３'ＵＴＲはかなり短く、可能性のあるプライマー結合部位を制限する。さらに、ＰＣＲ生成物の長さを出来る限り短く保つために、プライマー結合部位は３'ＵＴＲの３'末端の比較的近くに存在するべきである。ＰＣＲ生成物が長くなるほど、ＰＣＲ反応が非効率的になる。
ニワトリのゲノムＤＮＡの存在下での検出制限を改善する試みにおいて、以下でより詳細に記載されるように、配列タグであるＮｅｏＲｅｖ１（配列番号：６）を構成した。本発明のハイスループット分析で、鋳型を有する配列タグを使用した結果から、鋳型により、ゲノムＤＮＡの存在下でさえ、極めて少ないコピー数（５〜２０コピー）で検出できる、ということが示される。ＮｅｏＲｅｖ１の下流の部位にアニールし、反対方向でのＤＮＡ合成を開始させるほとんど全てのプライマーと組み合わせて、ＮｅｏＲｅｖ１配列タグを使用できる。
【００４３】
新しい配列がＵＴＲのすぐ下流に存在するように、ＧＴＧ  ＣＣＣ  ＡＧＴ  ＣＡＴ  ＡＧＣ  ＣＧＡ  ＡＴＡ  ＧＣＣ  ＴＣＴ  ＣＣＡ  ＣＣＣ  ＡＣＧ  ＣＧＧ  ＣＣＧ  ＧＡＧ  ＡＡＣ  ＣＴＧ  ＣＧＴ  ＧＣＡ  ＡＴＣ  ＣＡ（配列番号：５）という配列を有する、ネオマイシン耐性遺伝子由来の６２塩基対配列を複製して、ウシの成長ホルモンの３'非翻訳領域（ＵＴＲ）またはポリアデニル化配列とした（図６を参照のこと）。これは、ＰＣＲ反応を使用してＵＴＲから離れてＤＮＡ合成を開始するＮｅｏＲｅｖ１プライマー（配列番号：６）の結合部位に位置する。ＰＣＲ反応は、使用したポリメラーゼの種類またはマグネシウム濃度に比較的反応せず、反応のエラー強さを示唆する。
【００４４】
挿入された配列は、ＴＡＱＭＡＮ（Perkin-Elmer）を含む、遺伝子標的実験のハイスループット検出を可能にするさまざまなリアルタイムＰＣＲ反応で使用できる、ネオマイシンプローブ（Ｎｅｏｐｒｏｂｅ；配列番号：７）の結合部位を含有する。挿入された配列は、ＮｅｏＲｅｖ１のそれと反対の方向で合成を開始する第二プライマー結合部位（ＮｅｏＦｏｒｌ；配列番号：４）を含有する。これら二つのプライマーおよびプローブの組み合わせにより、配列の前後に関係なく、効率的でハイスループットな方法で配列を検出できる。増幅体は短い（６２塩基対）ので、増幅は非常に効率的である。導入遺伝子のコピー数を正確に決定するために、（リアルタイムまたはゲルベースの）定量的ＰＣＲ反応で該プライマーセットを使用できる。無作為挿入の多くの場合、導入遺伝子の複数のコピーが挿入するので、例えば、導入遺伝子が無作為に組み込まれている場合、これは有用である。かくして、導入遺伝子のコピー数を決定することが必要となる。動物が導入遺伝子のホモ接合体として生まれた場合、コピー数を決定しなければならない別の例が生じる。この場合、所望の動物は、両親またはヘミ接合体（単一コピー）同胞の二倍のコピー数の導入遺伝子を有する。
【００４５】
図５について言及すると、ポリアデニル化シグナルの３'末端の制限部位に、図６に示される６２塩基対の配列（配列番号：５）をサブクローニングすることにより、標的ベクターを構成した。この特定の場合では、鋳型としてネオマイシン耐性遺伝子および以下のプライマーを使用して、ＰＣＲにより、６２塩基対の生成物を作った：
ＮｅｏＦｏｒｌ：５'−ＴＧＧＡＴＴＧＣＡＣＧＣＡＧＧＴＴＣＴ−３'（配列番号４）、および
ＮｅｏＲｅｖ１：５'−ＧＴＧＣＣＣＡＧＴＣＡＴＡＧＣＣＧＡＡＴ−３'（配列番号：６）。
【００４６】
ＰＣＲの前に、プライマーをＴ４ＤＮＡキナーゼおよびＡＴＰでキナーゼ化した。鈍端を生成し、ＰＣＲ生成物に連結した制限部位で、ベクターを切断した。ＮｅｏＲｅｖ１プライマーが、図５に示されるように、ポリアデニル化シグナルから離れてＤＮＡ合成を開始するように、ＰＣＲ生成物が逆の配向で挿入したサブクローンを選択した。この増幅のために、該ベクターは、標的ベクター−導入遺伝子Ｔａｇ−ｒｅｖまたはＴＶ−ＴＴｒｅｖと呼ばれる。
【００４７】
標的遺伝子を模倣するために、ニワトリのオボアルブミン遺伝子領域に相同的である、標的ベクターの３'側面を、該遺伝子の同じ領域のより長い断片と置換した。該ベクターは、標的試験ベクター−導入遺伝子Ｔａｇ−ｒｅｖまたはＴＴＶ−ＴＴｒｅｖと呼ばれる。
ＰＣＲ生成物が順行性配向であったクローンも選択した。この場合、ＮｅｏＦｏｒｌ配列タグは、ポリアデニル化シグナルから離れてＤＮＡ合成を開始する。類似試験ベクターは、標的試験ベクター−導入遺伝子Ｔａｇ−ｆｏｒまたはＴＴＶ−ＴＴｆｏｒと呼ばれる。このベクターを使用する場合、ＤＮＡ合成を開始するために、ＮｅｏＦｏｒｌ配列タグを使用する。ＮｅｏＦｏｒｌ配列タグおよびＯＶ１８ｒｅｖプライマー（配列番号：８；５'−ＣＡＡ  ＴＡＧ  ＡＡＧ  ＡＴＴ  ＴＡＴ  ＡＣＴ  ＴＧＴ  ＴＣＴ  ＧＴＣ  ＴＧＴ  ＴＴ）を使用するＴＴＶ−ＴＴｆｏｒのハイスループット検出アッセイと、ＮｅｏＲｅｖ１およびＯＶ１８ｒｅｖでＴＴＶ−ＴＴｒｅｖを検出するアッセイとを比較した結果から、ＮｅｏＦｏｒ１配列タグおよびＯＶ１８ｒｅｖアッセイは、ＴＴＶ−ＴＴｒｅｖのアッセイ、およびプライマーＮｅｏＲｅｖ１およびＯＶ１８ｒｅｖのアッセイよりもかなり感度が低い（１０〜１００倍）ことがわかる。
【００４８】
ＮｅｏＲｅｖ１配列タグを使用する検出の感度を以下のように調べた：ＴＡＱＭＡＮ反応を２０μＬの量で実施し、全ての反応は、上記の実施例１に記載の本発明の方法により、無作為に選択したヒヨコから得られた血液から抽出した、１５０ｎｇのホワイトレグホンＤＮＡを有した。各反応管に、０．７５ＸＰＣＲ緩衝液（Perkin-Elmer, Foster City, CA）、０．２５ＸＴＡＱＭＡＮ緩衝液（Perkin-Elmer）、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５％のＤＭＳＯ、１２５μＭのｄＡＴＰ、１２５μＭのｄＣＴＰ、１２５μＭのｄＧＴＰ、２５０μＭのＵＴＰ（ｄＮＴＰＳおよびＵＴＰはPerkin-Elmerからであった）、０．９μＭのＮｅｏｆｏｒ１、０．９μＭのＯＶ１８ｒｅｖ、４０ｎＭのＮｅｏｐｒｏｂｅ、０．０５ユニット／μＬのＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄＤＮＡポリメラーゼ（Applied Biosystems, Foster City, CA）、０．００４ユニット／μＬのＡｍｐＥｒａｓｅＵＮＧ（Perkin-Elmer）を、製造業者の指示に従って加えた。いくつかの場合では、ＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄＤＮＡポリメラーゼをＰｒｏｍｅｇａＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Promega, Madison, WI）と置換した。さらに、Perkin-Elmer  ｄＮＴＰｓ／ＵＴＰ混合物をＲｏｃｈｅからのｄＮＴＰｓ（catalog number 1969064, Indianapolis, IN）と置換できる。以下の条件：５０℃で２分間、９５℃で１０分間、その後９５℃で２０秒間を４０または５０サイクル、および６２．８℃で２分間、３０秒間、を使用して、Perkin-Elmer Applied Biosystems Sequence Detector Model 7700でＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄＤＮＡポリメラーゼを分析した。反応混合物中にＰｒｏｇｍａＴａｑＤＮＡポリメラーゼが存在した場合、以下の条件：９４℃で２分間、その後９４℃で２０秒間を４０または５０サイクル、および６２．８℃で２分間、３０秒間、を使用した。
【００４９】
図７および８は、順行性プライマーとしてＮｅｏＲｅｖ１配列タグ（配列番号：６）および逆行性プライマーとしてＯＶ１８ｒｅｖ（配列番号：８）を使用するＰＣＲ実験の結果を示す。図７に示されるアガロースゲルからわかるように、予想された９４１塩基のバンドが、５コピーのプラスミドＤＮＡ程度で検出できる。図８は、１５０ｎｇのニワトリのＤＮＡの存在下で配列タグを使用するリアルタイムＰＣＲ検出実験の結果を示す。結果から、５コピーのレベルでの所望の遺伝子配列の検出が確認される。
【００５０】
実施例５：ハイスループットＤＮＡ抽出法を使用する、ニワトリのゲノムのネオマイシン耐性遺伝子の検出
細菌のネオマイシン耐性遺伝子（ＮｅｏＲ）を含有するレトロウイルスベクターをホワイトレグホンの胚に形質導入した。形質導入の非効率さのために、最良の場合でも、組織を発生させるものを含む、胚細胞の１％以下しか導入遺伝子のコピーを保有しない。形質導入から生じたオスは、非形質転換ホワイトレグホンのメスに育った。生じたヒヨコを孵化させ、上記の実施例１に記載のハイスループットＤＮＡ抽出法により、ＤＮＡを全く同じように抽出した。
プライマーの配列が以下のようであったことを除いて、上記の実施例３に記載のＴＡＱＭＡＮ分析を使用して、ネオマイシン耐性遺伝子の検出を実施した：
ＮｅｏＦｏｒｌ１：５'ＴＧＧＡＴＴＧＣＡＣＧＣＡＧＧＴＴＣＴ−３'（配列番号：４）および
ＮｅｏＲｅｖ１：５'−ＧＴＧＣＣＣＡＧＴＣＡＴＡＧＣＣＧＡＡＴ−３'（配列番号：６）。細菌のネオマイシン耐性遺伝子に相補的であるように設計した、ＴＡＱＭＡＮプローブ（Ｎｅｏｐｒｏｂｅ）の配列は、５'−ＣＣＴＣＴＣＣＡＣＣＣＡＡＧＣＧＧＣＣＧ−３'（配列番号：７）であった。ネオプローブを、５'末端でＴＥＴ（テトラクロロ−６−カルボキシ−フルオロセイン）またはＦＡＭ（６−カルボキシフルオロセイン）にて、および３'末端でＴＡＭＲＡ（Ｎ'，Ｎ'，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチル−６−カルボキシローダミン）にて標識した。上記の実施例３に記載されるように、反応を実施した。
【００５１】
図４はネオマイシン検出分析の結果を示す。図４に見られるように、十分形質転換したヒヨコ由来の二重ＤＮＡだけが、十分早期のサイクルでの∈Ｒｎの増加を示した。特異的配列の検出のためではなく、プローブの不安定化のために、３４サイクル後、他のサンプルが増幅し始めた。
これらの結果から、細菌のネオマイシン耐性遺伝子の存在を検出するために設計されたＴＡＱＭＡＮアッセイで、本発明のＤＮＡハイスループット抽出法を使用できる可能性が示される。この結果から、多くのヒヨコを所望の導入遺伝子でスクリーニングするＴＡＱＭＡＮ配列検出システムと関連して、ハイスループットＤＮＡ抽出法を使用できる可能性も示される。
【００５２】
本発明の方法は、トランスジェニックニワトリの生成に広く関係する。元祖トランスジェニックニワトリの単離を容易にするためにこのＤＮＡ抽出法を使用できるだけでなく、これらのヒヨコを生成群に繁殖させるのを容易にするためにも使用できる。所望の導入遺伝子に両方ホモ接合体であるトリがお互いにつがいとならない限り、トランスジェニック元祖からの一部の子孫（５０〜７０％）だけが導入遺伝子を保有し、数千のヒヨコを所望の導入遺伝子でスクリーニングする必要がある。
本発明の方法は、所望のまたは所望されない形質に関連する遺伝子マーカーのスクリーニングにも重要な影響与える。いったん同定すると、スクリーニング分析とともに本発明により抽出されたＤＮＡを使用して、遺伝的に優性な子孫を生成するようにこれらの形質を増やすか、または生成しないように選択することができる。
本発明の好ましい具体例を特異的な用語、装置および方法を使用して記載したが、そのような記述は単なる例示に過ぎない。使用した用語は、制限というよりも記載するためのものである。特許請求の範囲に示される本発明の範囲または意図を逸脱することなく、当業者であれば種々の修飾および変形を行うことができるということが理解される。さらに、さまざまな具体例の態様は、全部または一部、相互交換されてよいということが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
原文に記載なし
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年12月27日(2004.12.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005524397000001.app
【国際調査報告】
2005524397.tif 000014
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