(57)【要約】本発明は、新規皮内ワクチン、および皮内ワクチンの製造におけるアジュバントに関する新規用途、およびそれらを含む新規治療方法を提供する。本発明の皮内アジュバントおよび方法はサポニンおよびステロールを含み、該サポニンおよびステロールはリポソーム中に製剤化されている。該皮内アジュバントは、ヒトに対する皮内ワクチンの製造およびヒトの皮内治療において使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
疾患の治療用の皮内ワクチンの製造における、免疫学的に活性なサポニン、ステロールおよび抗原または抗原調製物を含むリポソームの使用。
【請求項２】
免疫学的に活性なサポニンがQS21である、請求項1記載の使用。
【請求項３】
ステロールがコレステロールである、請求項1または2記載の使用。
【請求項４】
QS21：コレステロールの比が1：1〜1：100 w/wである、請求項2または3記載の使用。
【請求項５】
該リポソームが単層リポソームである、請求項1記載の使用。
【請求項６】
リポソームの平均径が10〜220nmである、請求項1記載の使用。
【請求項７】
皮内ワクチンがLPS誘導体または免疫刺激性CpGオリゴヌクレオチドを更に含む、請求項1〜6のいずれか1項記載の使用。
【請求項８】
抗原または抗原調製物が、ヒト免疫不全ウイルス、水痘・帯状疱疹ウイルス、単純ヘルペスウイルス1型、単純ヘルペスウイルス2型、ヒトサイトメガロウイルス、デングウイルス、A型、B型、C型もしくはE型肝炎ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ヒトパピローマウイルス、インフルエンザウイルス、ヘモフィルス・インフルエンゼ（Haemophilus Inlfuenzae）、髄膜炎菌（Meningococcus）、サルモネラ（Salmonella）、ナイセリア（Neisseria）、ボレリア（Borrelia）、クラミジア（Chlamydia）、ボルデテラ（Bordetella）、ストレプトコッカス（Streptococcus）、マイコプラズマ（Mycoplasma）、マイコバクテリア（Mycobacteria）、プラスモジウム（Plasmodium）またはトキソプラズマ（Toxoplasma）よりなる病原体群の少なくとも1つに対する免疫応答を生成しうる抗原である、請求項1〜7のいずれか1項記載の使用。
【請求項９】
疾患または慢性障害に罹患した個体の治療方法であって、リポソーム組成物を含む組成物を該個体の真皮内に投与することを含んでなり、該リポソームがステロールおよび免疫学的に活性なサポニンを含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
サポニンおよびステロールを含んでなる、皮膚の真皮への投与用の医薬組成物であって、該サポニンおよびステロールがリポソーム中に製剤化されていることを特徴とする医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規皮内ワクチン、および皮内ワクチンの製造におけるアジュバントに関する新規用途、およびそれらを含む新規治療方法を提供する。本発明の皮内アジュバントおよび方法はサポニンおよびステロールを含み、該サポニンおよびステロールはリポソーム中に製剤化されている。該皮内アジュバントは、ヒトに対する皮内ワクチンの製造およびヒトの皮内治療において使用される。
【背景技術】
【０００２】
現在のワクチン接種の実施はワクチンの筋肉内投与に大きく偏っている。筋肉内経路は、何十年にもわたり精力的に研究されており、免疫応答の刺激に筋肉が効率的であるということ及び再現性を伴った筋肉へのワクチン運搬が容易かつ簡便であることを含む多くの理由により、長年にわたる成功実績を有する。
【０００３】
一方、他の経路によるワクチン接種では、再現性を伴った投与が困難であることが判明しており、筋肉内経路により達成されるものと同等の免疫応答の誘導においては限られた成功しか収められていない。これらの理由で、ワクチンの大多数、特に非生ワクチンは筋肉内投与される。
【０００４】
しかし、筋肉内ワクチンは、他の経路のワクチン接種の開発を望ましいものにする重大な欠点を伴う。例えば、筋肉内ワクチンは、長い皮下針を介した組織深部へのワクチンの投与を要し、これは、患者の「針に対する恐怖心」およびそれに伴うワクチン接種計画コンプライアンスの低下を招く。また、筋肉内に投与される幾つかのワクチンは、有意な局所性および全身性の反応生成（reactogenicity）、例えば局所性筋肉炎症もしくは壊死およびそれに伴う痛み、または頭痛、悪心もしくは「インフルエンザ様」症候群のような全身性作用を引き起こす。
したがって、筋肉内ワクチン接種より少なくとも効率的であり、好ましくはそれより優れた、筋肉内ワクチン接種プロトコールに代わる手段の開発が必要とされている。
【０００５】
サポニンは、Lacaille-Dubois, MおよびWagner H.（1996. A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol 2 pp 363-386）に教示されている。サポニンは、植物および海洋動物界に広く分布するステロイドまたはトリテルペン配糖体である。サポニンは、振とうされると発泡する水中コロイド懸濁液を形成する点およびコレステロールを沈殿させる点で注目されている。サポニンが細胞膜付近に存在する場合には、それは、該膜を破裂させる該膜中の孔様構造体を形成する。赤血球の溶血がこの現象の一例であり、これは、すべてという訳ではないが或る種のサポニンの特性の1つである。
【０００６】
サポニンは全身投与用のワクチン中のアジュバントとして公知である。個々のサポニンのアジュバントおよび溶血活性が、当技術分野において詳細に研究されている（Lacaille-DuboisおよびWagner, 前掲）。例えば、Quil A（クウィルA）（南米産樹木Quillaja Saponaria Molinaの樹皮に由来する）およびその画分が、米国特許第5,057,540号および「ワクチンアジュバントとしてのサポニン（Saponins as vaccine adjuvants）」, Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12(1-2);1-55およびEP 0 362 279 B1に記載されている。Quil Aの画分を含む免疫刺激性複合体（Immune Stimulating Complexes）（ISCOM）と称される微粒子構造体は溶血性であり、ワクチンの製造において使用されている（Morein, B., EP 0 109 942 B1; WO 96/11711; WO 96/33739）。溶血性サポニンQS21およびQS17（Quil AのHPLC精製画分）は強力な全身性アジュバントとして記載されており、それらの製造方法は米国特許第5,057,540号およびEP 0 362 279 B1に開示されている。全身ワクチン接種研究において使用されている他のサポニンには、ギプソフィラ（Gypsophila）およびサポナリア（Saponaria）のような他の植物種に由来するものが含まれる（Bomfordら, Vaccine, 10(9):572-577, 1992）。
【０００７】
マウスの皮膚に投与されるQS21はKensilら, 1991, J.Immunol., 146(2): 431-7に記載されている。しかし、この研究においては、マウス皮膚モデルの技術的な制約のため、QS21が真皮に投与されたのかどうか定かではない。
【０００８】
また、サポニンアジュバントは比較的高用量で筋肉に運搬される必要がある。前記のサポニンアジュバントは、筋肉内に運搬された場合、様々な程度の痛みを生じさせる。また、サポニンを含む筋肉内ワクチンにより生じる免疫応答の質および大きさを改善する必要がある。
【発明の開示】
【０００９】
本明細書に記載の皮内アジュバントはサポニンおよびステロールを含み、該サポニンおよびステロールはリポソーム中に製剤化される。ヒトに対する皮内ワクチンの製造におけるこれらのアジュバント製剤の使用が、本発明により提供される。驚くべきことに、そのようなヒト用皮内ワクチンは、共投与された抗原に対する有意な免疫応答を刺激し、その大きさは、少なくとも、筋肉内投与により誘導されるものと同程度であるが、本発明の皮内ワクチンは、それを引き起こすのに、筋肉内投与の場合より有意に少量の抗原および／または有意に少量のサポニンアジュバントしか必要としない。
【００１０】
本発明の1つの好ましい実施形態においては、本発明の皮内ワクチンおよび用途は、ステロールとサポニンとを含むリポソームアジュバント製剤を含む。
好ましいステロールには、β-シトステロール、スチグマステロール、エルゴステロール、エルゴカルシフェロールおよびコレステロールが含まれる。これらのステロールは当技術分野でよく知られており、例えば、コレステロールは、動物脂肪中に見出される天然に存在するステロールとしてMerck Index, 第11版, 341ページに開示されている。最も好ましいステロールはコレステロールである。
【００１１】
好ましくは、リポソームは単層リポソームである。該アジュバント製剤は、好ましくは、さらに、2分子膜を形成しうる脂質を含む。したがって、好ましくは、リポソームは、室温で好ましくは非結晶性である中性または両性脂質（例えば、ホスファチジルコリン）、例えば、卵黄ホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリンまたはジラウリルホスファチジルコリンを含有し、これらの脂質のうち、ジオレオイルホスファチジルコリンが最も好ましい。該小胞は、飽和脂質から構成されるリポソームのリポソーム構造の安定性を増加させる荷電脂質をも含有しうる。これらの場合には、荷電脂質の量は、好ましくは、1〜20％ w/w、最も好ましくは、5〜10％である。
【００１２】
リン脂質に対するステロールの比率は1〜50％（mol/mol）、最も好ましくは20〜25％である。
典型的には、両者が存在する場合、ステロール（コレステロール）：ホスファチジルコリンの比は1：4（w/w）である。
【００１３】
本発明の小胞アジュバントは単層または多層でありうる。最も好ましくは、該小胞は単層リポソームである。動的光散乱技術（例えば、Malvern Zetasizer（商標）またはCoulter Counter（商標）を使用した測定）により測定した該小胞の直径は、典型的には、10〜1000nm、より好ましくは10〜220nm、より好ましくは10〜150nm、最も好ましくは70〜150nmの範囲、例えば約115nm（すべての範囲は「強度による」サイズとして表されている）である。好ましくは、該粒子の少なくとも90％が該特定サイズ範囲内であり、最も好ましくは、該粒子の少なくとも95％が該特定範囲内に存在する。
【００１４】
好ましいサポニンとしては、免疫刺激性（免疫促進性）であることが当技術分野で公知であるものが挙げられる。該サポニンは天然源から精製されることが可能であり、あるいは天然源由来のサポニンの誘導体でありうる。あるいは、該サポニンは半合成体または全合成体でありうる。半合成サポニンは他の非サポニン化学物質から構築されうる。
【００１５】
最も好ましいサポニンは、南米産樹木Quillaja Saponaria Molinaの樹皮に由来しうる免疫刺激性の精製、合成または半合成サポニンである。好ましくは、本発明の組成物は、Quillaja Saponaria Molinaの樹皮に由来する免疫学的に活性なサポニン画分を実質的に純粋な形態で含有する。「精製（された）サポニン」は、以下の基準の1つ以上にまで精製された実質的に純粋なサポニンを包含する意である：1）クロロホルム/メタノール/水（60/45/10 v/v/v）中の40mM 酢酸の溶媒系中のシリカゲルTLC（EM Science HPTLC Si60）において唯一の主要炭水化物染色バンドとして現れる、2）メタノール/水（70/30 v/v）の溶媒系中の逆相TLC（EM Science Silica Gel RP-8）において唯一の主要炭水化物染色バンドとして現れる、または3）メタノール/水（58/42 v/v）中の40mM 酢酸中のバイダック（vydac）C4（粒径5μm、孔径300オングストローム、4.6 ID×25cm L）を用いた逆相HPLCにおいて唯一の主要ピークとして現れる、または3）少なくとも90％純粋（該サポニンに天然で通常付随している他の成分を含有しないことにより定義される）である。サポニン画分の純度は、米国特許第5,057,540号に記載のHPLC技術を用いて測定することができる。
【００１６】
好ましくは、本発明の組成物はサポニン画分QS21を含有する。QS21は、好ましくは、実質的に純粋な形態（すなわち、Quillaja Saponaria Molinaの樹皮からサポニンを分離した後に単一のHPLCピークを集めることにより単離されたもの）であり、より詳しくは、QS21は少なくとも90％純粋であり、好ましくは少なくとも95％純粋であり、最も好ましくは少なくとも98％純粋である。
【００１７】
本発明の組成物において有用な他の免疫学的に活性なサポニン画分には、QA17/QS17が含まれる。β-エスキン（escin）は、本発明のアジュバント組成物において使用するもう1つの好ましい溶血性サポニンである。エスキンは、セイヨウトチノキ（Lat: Aesculus hippocastanum）の種子中に見出されるサポニンの混合物としてMerckインデックス（第12版：エントリー3737）に記載されている。その単離は、クロマトグラフィーおよび精製によるもの（Fiedler, Arzneimittel-Forsch. 4, 213 (1953)）ならびにイオン交換樹脂によるもの（Erbringら, 米国特許第3,238,190号）が記載されている。エスキンαおよびβの画分は精製されており、生物学的に活性であることが示されている（Yoshikawa Mら, (Chem Pharm Bull (Tokyo) 1996 Aug;44(8):1454-1464)）。β-エスキンはエスシン（aescin）としても公知である。
【００１８】
本発明での使用のためのもう1つの好ましいサポニンはジギトニンである。ジギトニンは、キツネノテブクロ（Digitalis purpurea）の種子に由来するサポニンとしてMerckインデックス（第12版、エントリー3204）に記載されており、Gisvoldら,J. Am. Pharm. Assoc., 1934, 23,664およびRuhenstroth-Bauer, Physiol. Chem., 1955, 301,621に記載の方法に従い精製される。その用途は、コレステロールの測定のための臨床用試薬として記載されている。
【００１９】
該サポニンと該ステロール（好ましくは、QS21およびコレステロール）とを含み、過剰のステロールが存在する70〜150nmの平均粒径を有する小さな単層小胞（SUV）が、本発明における使用のための特に好ましいアジュバントである。
【００２０】
リポソームアジュバント製剤中のサポニン：ステロールの比は、典型的には1：100〜1：1（重量：重量）のオーダーである。より好ましくは、過剰のステロールが存在し、より好ましくは、サポニン：ステロールの比は、少なくとも、1：2 w/wであり、最も好ましくは、該比は1：5（w/w）である。好ましい実施形態においては、サポニンがQS21である場合、該サポニン画分中に含有されるQS21：ステロールの比は、典型的には、1：100〜1：1（重量：重量）のオーダーである。好ましくは、QS21に対して過剰のステロールが存在し、より好ましくは、QS21：ステロールの比は、少なくとも、1：2 w/wであり、最も好ましくは、該比は1：5（w/w）である。開示しているこれらの比のすべてにおいては、コレステロールが好ましいステロールであり、それには同等に該比が適用される。
【００２１】
ヒトへの投与には、典型的には、サポニンおよびステロールは、約1μg〜約100μg、好ましくは約10μg〜約50μg／用量の範囲でワクチン中に存在する。
【００２２】
所望により、該アジュバント、およびそれを含む用途は、さらに、LPS誘導体を含む。ワクチンにおける腸内細菌リポ多糖（LPS）の使用はその毒性作用により制限されているが、腸内細菌LPSは免疫系の強力な刺激物質である。コア炭水化物基とホスファートとを還元末端グルコサミンから除去することにより産生されるLPSの無毒性誘導体であるモノホスホリルリピドA（MPL）が、Ribiら（1986, Immunology and Immunopharmacology of bacterial endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, p407-419）により記載されており、以下の構造を有する。
【化１】
2005507898.tif 000002
【００２３】
MPLの更なる弱毒型が、該二糖バックボーンの3位からアシル鎖を除去することにより得られ、3-O-脱アシル化モノホスホリルリピドA（3D-MPL）と称される。それは、GB 2122204Bに教示されている方法により精製し製造することが可能であり、その参考文献はまた、ジホスホリルリピドAおよびその3-O-脱アシル化形態の製造を開示している。3D-MPLの好ましい形態は、直径0.2μm未満の小さな粒径を有するエマルションの形態であり、その製造方法はWO 94/21292に開示されている。モノホスホリルリピドAと界面活性剤とを含む水性製剤がWO 98/43670A2に記載されている。
【００２４】
本発明のアジュバント中に製剤化されうる細菌リポ多糖由来アジュバントは、細菌源から精製し加工することが可能であり、あるいはそれは合成物でありうる。例えば、精製されたモノホスホリルリピドAがRibiら 1986（前掲）に記載されており、Salmonella sp.由来の3-O-脱アシル化モノホスホリルまたはジホスホリルリピドAがGB 2220211および米国特許第4912094号に記載されている。他の精製および合成リポ多糖が記載されている（米国特許第6,005,099号およびEP 0 729 473 B1; Hilgersら, 1986, Int. Arch. Allergy. Immunol., 79(4):392-6; Hilgersら, 1987, Immunology, 60(1):141-6; およびEP 0 549 074 B1）。特に好ましい細菌リポ多糖アジュバントは、3D-MPLおよびβ(1-6)グルコサミン二糖（米国特許第6,005,099号およびEP 0 729 473 B1に記載されている）である。
【００２５】
したがって、本発明で使用しうるLPS誘導体は、LPSまたはMPLまたは3D-MPLと構造において類似した免疫刺激物質である。本発明のもう1つの態様においては、該LPS誘導体は、MPLの前記構造の副次的部分であるアシル化単糖でありうる。
【００２６】
好ましい二糖LPS誘導体アジュバント、以下の式の精製または合成リピドAである。
【化２】
2005507898.tif 000003
［式中、R2はHまたはPO3H2でありうる；R3はアシル鎖またはβ-ヒドロキシミリストイル、または式：
【化３】
2005507898.tif 000004
XおよびYは0〜約20の値を有する）を有する3-アシルオキシアシル残基でありうる］。
【００２７】
該LPS誘導体は、該サポニンおよびステロール含有リポソームと共に製剤化することが可能であり、あるいは該サポニンおよびステロール含有リポソームと単に混合することが可能である。本発明の組成物およびその用途においては、まず、該ステロール／サポニン含有リポソームをLPS誘導体の非存在下で調製し、ついで該LPS誘導体を、好ましくは約100nmの平均径を有する粒子として加える。したがって、これらの実施形態においては、該LPS誘導体は小胞膜内に含有されていない（LPS誘導体-外（LPS derivative-out）として公知である）。LPS誘導体がリポソーム膜内に含有されている組成物（LPS誘導体-内（LPS derivative-in）として公知である）も、本発明の一態様を構成する。この点において、該アジュバント製剤は、好ましくは、ステロールおよびサポニン含有リポソームを含み、該LPS誘導体（好ましくは、3D-MPL）が該リポソーム膜内に含有されている。リポソーム製剤の膜内にステロール、サポニンおよび3D-MPLを含む皮内ワクチン製剤は、細胞性免疫応答の誘導において特に強力であり、本発明のもう1つの態様を構成する。
【００２８】
該抗原は小胞膜内または小胞膜外に含有されうる。好ましくは、親水性抗原は膜構造の外部に、疎水性または脂質化抗原は膜構造の内部または外部に含有される。あるいは、親水性抗原は膜構造の外部に含有されうるが、小胞の内腔内に捕捉されうる。
【００２９】
より好ましくは、これらのアジュバント製剤は、サポニンとしてQS21を、そしてLPS誘導体として3D-MPLを、そしてステロールとしてコレステロールを含み、この場合、QS21：コレステロールの比は1：1〜1：100（重量/重量）であり、最も好ましくは1：5（重量/重量）である。そのようなアジュバント製剤はEP 0 822 831 B（その開示を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。
【００３０】
本発明のもう1つの実施形態においては、疾患の治療のための皮内ワクチンの製造における、ステロールと、サポニン（前記のとおり）と、非メチル化CpGジヌクレオチド（CpG）を含有する免疫刺激性オリゴヌクレオチドとの使用を提供する。非メチル化CpGジヌクレオチド（CpG）を含有する免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、全身経路および粘膜経路の両方により投与される場合のアジュバントとして当技術分野において公知である（WO 96/02555, EP 468520, Davisら, J. Immunol, 1998, 160(2):870-876; McCluskieおよびDavis, J. Immunol., 1998, 161(9):4463-6）。CpGは、DNA中に存在するシトシン-グアノシンジヌクレオチドモチーフの略語である。その後、Kriegによる刊行物（Nature 374, p546 1995）において、免疫刺激における該CGモチーフの中心的役割が明らかにされた。
【００３１】
本発明のアジュバントまたはワクチンにおいて使用する好ましいオリゴヌクレオチドは、好ましくは、少なくとも3、より好ましくは少なくとも6またはそれ以上のヌクレオチドにより隔てられた2以上のジヌクレオチドCpGモチーフを含有する。本発明のオリゴヌクレオチドは、典型的にはデオキシヌクレオチドである。好ましい実施形態においては、該オリゴヌクレオチド中のヌクレオチド間は、ホスホロジチオアート、より好ましくはホスホロチオアート結合であるが、ホスホジエステルおよび他のヌクレオチド間結合も本発明の範囲内であり、混合ヌクレオチド間連結を有するオリゴヌクレオチドも含まれる。ホスホロチオアートオリゴヌクレオチドまたはホスホロジチオアートの製造方法は、米国特許第5,666,153号、米国特許第5,278,302号およびWO95/26204に記載されている。
【００３２】
好ましいオリゴヌクレオチドの具体例は以下の配列を有する。該配列は、好ましくは、ホスホロチオアート修飾ヌクレオチド間連結を含有する。
OLIGO 1(配列番号1): TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826)
OLIGO 2 (配列番号2): TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758)
OLIGO 3(配列番号3): ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG
OLIGO 4 (配列番号4): TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006)
OLIGO 5 (配列番号5): TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668)。
【００３３】
別のCpGオリゴヌクレオチドは前記の好ましい配列を含みうるが、この場合、それらは、それらに対する有意でない（inconsequential）欠失または付加を有する。本発明で使用するCpGオリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知の任意の方法（例えば、EP 468520）により合成することができる。簡便には、そのようなオリゴヌクレオチドは、自動シンセサイザーを使用して合成することが可能である。
【００３４】
本発明で使用するオリゴヌクレオチドは、典型的には、デオキシヌクレオチドである。好ましい実施形態においては、該オリゴヌクレオチド中のヌクレオチド間結合はホスホロジチオアート、より好ましくはホスホロチオアート結合であるが、ホスホジエステルも本発明の範囲内である。種々のヌクレオチド間連結（例えば、混合ホスホロチオアートホホジエステル）を含むオリゴヌクレオチドも意図される。該オリゴヌクレオチドを安定化する他のヌクレオチド間結合を使用することが可能である。
【００３５】
本明細書中で用いる「皮内運搬」なる語は、皮膚の真皮へのワクチンの運搬を意味する。しかし、必ずしも真皮のみにワクチンを配置しなければならないわけではない。真皮は、ヒトの皮膚の表面から約1.0〜約2.0mmに位置する皮膚の層であるが、個体間および身体の部位によって多少の違いがある。一般に、皮膚表面から内部へ1.5mm入ると真皮に達すると予想されうる。真皮は表面の角質層および表皮と内部の皮下層との間に位置する。運搬方法に応じて、ワクチンは最終的には専ら又は主に真皮内に存在させることが可能であり、あるいは最終的には表皮および真皮内に分布させることが可能である。
【００３６】
皮内注射の通常の技術である「マントゥー法」は、皮膚を消毒し、ついで一方の手を伸ばし、細いゲージの針（26〜31ゲージ）の斜端を上向きにして10〜15°の角度で針を挿入する工程を含む。針の斜端を挿入したら、針の胴部を下げ、更に進め、その間、それが皮膚下に上がるよう若干の圧力を加える。ついで液体を非常にゆっくりと注射し、それにより皮膚表面上にプレブまたはバンプ（bump）を形成させ、ついで針をゆっくりと引き抜く。
【００３７】
最近、液体物質を皮膚内に又は皮膚を介して投与するために特別に設計された装置が記載され、例えばWO 99/34850およびEP 1092444に記載の装置、ならびに例えばWO 01/13977、米国特許第5,480,381号、米国特許第5,599,302号、米国特許第5,334,144号、米国特許第5,993,412号、米国特許第5,649,912号、米国特許第5,569,189号、米国特許第5,704,911号、米国特許第5,383,851号、米国特許第5,893,397号、米国特許第5,466,220号、米国特許第5,339,163号、米国特許第5,312,335号、米国特許第5,503,627号、米国特許第5,064,413号、米国特許第5,520,639号、米国特許第4,596,556号、米国特許第4,790,824号、米国特許第4,941,880号、米国特許第4,940,460、WO 97/37705およびWO 97/13537に記載の噴射式注射装置が挙げられる。該ワクチン製剤の皮内投与に代わる方法は、通常のシリンジおよび針、あるいは固体ワクチンの射入（ballistic）運搬用に設計された装置（WO 99/27961）、あるいは経皮パッチ（WO 97/48440; WO 98/28037）を含みうる。あるいは、それは皮膚の表面に適用されうる（経皮（transdermal、transcutaneous）運搬WO 98/20734 ; WO 98/28037）。
【００３８】
また、本発明は、疾患または慢性障害に罹患した個体の治療方法であって、リポソーム組成物を含む組成物を該個体の真皮内に投与することを含んでなり、該リポソームがステロールおよび免疫学的に活性なサポニン（本明細書に記載のとおり）を含むことを特徴とする方法も提供する。好ましくは、該サポニンは、Quillaja Saponariaの樹皮に由来する精製または合成サポニンであり、コレステロールアジュバントを単層リポソーム中に製剤化する。好ましい治療方法は、以下の病原体により引き起こされる疾患の治療方法である：ヒトパピローマウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、B型肝炎および／またはA型肝炎ウイルス、髄膜炎B、髄膜炎菌、および／またはHaemophilus influenzae bおよび／または他の抗原、Streptococcus pneumoniae、水痘・帯状疱疹ウイルス。
好ましくは、該治療方法は、該アジュバント製剤へのLPS誘導体またはCpGの添加も含む。
【００３９】
好ましくは、本発明の使用、方法およびワクチン製剤は、ヒト病原体に対して免疫応答を惹起しうる抗原または抗原組成物を含有し、該抗原または抗原組成物は以下のものに由来する：HIV-1（例えばtat、nef、gp120またはgp160）、ヒトヘルペスウイルス（HSV）、例えばgDもしくはその誘導体または前初期タンパク質、例えばICP27、HSV1またはHSV2、サイトメガロウイルス（CMV（特にヒト）（例えばgBまたはその誘導体）、ロタウイルス（生-弱毒化ウイルスを含む）、エプスタインバーウイルス（例えばgp350またはその誘導体）、水痘・帯状疱疹ウイルス（VZV、例えばgpI、IIおよびIE63）、または肝炎ウイルス、例えばB型肝炎ウイルス（例えばB型肝炎表面抗原またはその誘導体）、A型肝炎ウイルス（HAV）、C型肝炎ウイルスおよびE型肝炎ウイルス、または他のウイルス病原体、例えばパラミクソウイルス：呼吸器合胞体ウイルス（RSV、例えばFおよびGタンパク質またはそれらの誘導体）、パラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ヒトパピローマウイルス（HPV、例えばHPV6、11、16、18）、フラビウイルス（例えば黄熱ウイルス、デングウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス）またはインフルエンザウイルス［全生または不活化ウイルス、スプリットインフルエンザウイルス（卵またはMDCK細胞内で培養されたもの）、または全インフルエンザウイロソーム（R. Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920に記載のとおり）またはそれらの精製もしくは組換えタンパク質、例えばHA、NP、NAもしくはMタンパク質またはそれらの組合せ］、または細菌病原体、例えばNeisseria spp、例えばN. gonorrheaおよびN. meningitidis（例えば莢膜多糖およびそのコンジュゲート、トランスフェリン結合タンパク質、ラクトフェリン結合タンパク質、PilC、アドヘジン）；S. pyogenes（例えばM proteinsまたはその断片、C5Aプロテアーゼ、リポテイコ酸）、S. agalactiae、S. mutans；H. ducreyi；Moraxella spp、例えばBranhamella catarrhalisとしても知られているM catarrhalis（例えば高および低分子量アドヘジンおよびインベーシン）；Bordetella（ボルデテラ）spp、例えばB. pertussis（例えばペルタクチン（pertactin）、百日咳毒素またはその誘導体、繊維状赤血球凝集素、アデニル酸シクラーゼ、線毛）、B. parapertussisおよびB. bronchiseptica；Mycobacterium（マイコバクテリウム）spp.、例えばM. tuberculosis（例えばESAT6、抗原85A、BまたはC)、M. bovis、M. leprae、M. avium、M. paratuberculosis、M. smegmatis；Legionella spp、例えばL. pneumophila；Escherichia spp、例えば腸管毒性E. coli（例えば定着因子、熱不安定性毒素またはその誘導体、熱安定性毒素またはその誘導体）、腸管出血性E. coli、腸管病原性E. coli（例えば志賀毒素様毒素またはその誘導体）；Vibrio spp、例えばV. cholera（例えばコレラ毒素またはその誘導体）；Shigella spp、例えばS. sonnei、S. dysenteriae、S. flexnerii；Yersinia spp、例えばY. enterocolitica（例えばYopタンパク質）、Y. pestis、Y. pseudotuberculosis；Campylobacter spp、例えばC. jejuni（例えば毒素、アドヘジンおよびインベーシン）およびC. coli；Salmonella（サルモネラ）spp、例えばS. typhi、S. paratyphi、S. choleraesuis、S. enteritidis；Listeria spp.、例えばL. monocytogenes；Helicobacter spp、例えばH. pylori（例えばウレアーゼ、カタラーゼ、空胞化毒素）；Pseudomonas spp、例えばP. aeruginosa；Staphylococcus spp.、例えばS. aureus、S. epidermidis；Enterococcus spp.、例えばE. faecalis、E. faecium；Clostridium spp.、例えばC. tetani（例えば破傷風毒素およびその誘導体）、C. botulinum（例えばボツリヌス毒素およびその誘導体）、C. difficile（例えばクロストリジウム毒素AまたはBおよびそれらの誘導体）；Bacillus spp.、例えばB. anthracis（例えばボツリヌス毒素およびその誘導体）；Corynebacterium spp.、例えばC. diphtheriae（例えばジフテリア毒素およびその誘導体）；Borrelia（ボレリア）spp.、例えばB. burgdorferi（例えばOspA、OspC、DbpA、DbpB）、B. garinii（例えばOspA、OspC、DbpA、DbpB）、B. afzelii（例えばOspA、OspC、DbpA、DbpB）、B. andersonii（例えばOspA、OspC、DbpA、DbpB）、B. hermsii；Ehrlichia spp.、例えばE. equiおよびHuman Granulocytic Ehrlichiosisの因子；Rickettsia spp、例えばR. rickettsii；Chlamydia（クラミジア）spp.、例えばC. trachomatis（例えばMOMP、ヘパリン結合タンパク質）、C. pneumoniae（例えばMOMP、ヘパリン結合タンパク質）、C. psittaci；Leptospira spp.、例えばL. interrogans；Treponema spp.、例えばT. pallidum（例えばレア（rare）外膜タンパク質）、T. denticola、T. hyodysenteriae；寄生生物、例えばPlasmodium（プラスモジウム）spp.、例えばP. falciparum；Toxoplasma（トキソプラズマ）spp.、例えばT. gondii（例えばSAG2、SAG3、Tg34）；Entamoeba spp.、例えばE. histolytica；Babesia spp.、例えばB. microti；Trypanosoma spp.、例えばT. cruzi；Giardia spp.、例えばG. lamblia；Leshmania spp.、例えばL. major；Pneumocystis spp.、例えばP. carinii；Trichomonas spp.、例えばT. vaginalis；Schisostoma spp.、例えばS. mansoni、あるいは酵母、例えばCandida spp.、例えばC. albicans；Cryptococcus spp.、例えばC. neoformans。
【００４０】
M. tuberculosisの他の好ましい特異的抗原としては、例えば、Tb Ra12、Tb H9、Tb Ra35、Tb38-1、Erd 14、DPV、MTI、MSL、mTTC2およびhTCC1（WO 99/51748）が挙げられる。M. tuberculosisのタンパク質にはまた、M. tuberculosisのポリペプチドの少なくとも2つ、好ましくは3つが、より大きなタンパク質に融合した融合タンパク質およびその変異体が含まれる。好ましい融合体には、Ra12-TbH9-Ra35、Erd14-DPV-MTI、DPV-MTI-MSL、Erd14-DPV-MTI-MSL-mTCC2、Erd14-DPV-MTI-MSL、DPV-MTI-MSL-mTCC2、TbH9-DPV-MTI（WO 99/51748）が含まれる。
【００４１】
Chlamydiaの最も好ましい抗原には、例えば、高分子量タンパク質（HWMP）（WO 99/17741）、ORF3（EP 366 412）および推定膜タンパク質（Pmps）が含まれる。該ワクチン製剤の他のChlamydia抗原は、WO 99/28475に記載の群から選ばれうる。
【００４２】
好ましい細菌ワクチンは、Streptococcus（ストレプトコッカス）spp、例えばS. pneumoniaeに由来する抗原（例えば莢膜多糖およびそのコンジュゲート、PsaA、PspA、ストレプトリシン、コリン結合タンパク質）およびタンパク質抗原ニューモリジン（Biochem Biophys Acta, 1989, 67, 1007; Rubins et al., Microbial Pathogenesis, 25, 337-342）ならびにそれらの突然変異弱毒化誘導体（WO 90/06951; WO 99/03884）を含む。特に好ましい肺炎球菌ワクチンは、WO 00/56539に記載されているものである。
【００４３】
Pht（Poly Histidine Triad）抗原は、本発明の使用、医薬製剤および方法のための好ましいStreptococcus（ストレプトコッカス）抗原である。Pht（Poly Histidine Triad）ファミリーは、タンパク質PhtA、PhtB、PhtDおよびPhtEを含む。該ファミリーは、脂質化配列、プロリンリッチ領域と幾つかのヒスチジン三つ組構造（triad）とにより隔てられた2つのドメイン（おそらく、これらは金属またはヌクレオシド結合または酵素活性に関与しているであろう）、(3-5)コイルドコイル領域、保存されたN末端および異種C末端により特徴づけられる。それは、試験した肺炎球菌のすべての株に存在する。相同タンパク質は、他のStreptococciおよびNeisseria（ナイセリア）においても見出されている。該ファミリーの好ましいメンバーはPhtA、PhtBおよびPhtDを含む。より好ましくは、それはPhtAまたはPhtDを含む。
最も好ましいPht抗原はPhtDである。
【００４４】
しかし、Pht A、B、DおよびEなる語は、後記の引用文献に開示されている配列を有するタンパク質、および該参照タンパク質と少なくとも90％同一である配列相同性を有する天然に存在する（および人工的な）その変異体を意味すると理解される。好ましくは、それは少なくとも95％同一であり、最も好ましくは、それは97％同一である。
【００４５】
PhtXタンパク質に関しては、PhtAはWO 98/18930に開示されており、Sp36とも称される。前記のとおり、それはポリヒスチジン三つ組構造ファミリー由来のタンパク質であり、LXXCのII型シグナルモチーフを有する。
【００４６】
PhtDはWO 00/37105に開示されており、Sp036Dとも称される。前記のとおり、それはポリヒスチジン三つ組構造ファミリー由来のタンパク質であり、II型LXXCシグナルモチーフを有する。
【００４７】
PhtBはWO 00/37105に開示されており、Sp036Bとも称される。PhtBファミリーのもう1つのメンバーは、WO 00/17370に開示されているC3-分解性ポリペプチド（C3-Degrading Polypeptide）である。このタンパク質もポリヒスチジン三つ組構造ファミリー由来であり、II型LXXCシグナルモチーフを有する。好ましい免疫学的に機能的な等価体は、WO 98/18930に開示されているタンパク質Sp42である。PhtBトランケート化体（約70kD）がWO99/15675に開示されており、これもPhtXファミリーのメンバーであるとみなされる。
【００４８】
PhtEはWO00/30299に開示されており、BVH-3と称される。他の好ましい細菌ワクチンは、Haemophilus spp.、例えばH. influenzae（ヘモフィルス・インフルエンゼ）B型に由来する抗原（「Hib」、例えばPRPおよびそのコンジュゲート）、型別不能H. influenzaeに由来する抗原、例えばOMP26、高分子量アドヘジン、P5、P6、タンパク質Dおよびリポタンパク質、ならびにフィンブリンおよびフィンブリン誘導ペプチド（US 5,843,464）またはそれらの多コピー変異体もしくは融合タンパク質を含む。
【００４９】
B型肝炎表面抗原の誘導体は当技術分野でよく知られており、とりわけ、EP-A-414 374、EP-A-0304 578およびEP 198-474に記載のPreS1、PreS2 S抗原を含む。1つの好ましい態様においては、本発明のワクチン製剤は、特にCHO細胞内で発現される場合には、HIV-1抗原gp120を含む。もう1つの実施形態においては、本発明のワクチン製剤は前記のgD2tを含む。
【００５０】
本発明の好ましい実施形態において、クレームされたアジュバントを含有するワクチンは、陰部疣贅の原因となると考えられるヒトパピローマウイルス（HPV）（HPV 6またはHPV 11など）および子宮頸癌の原因となるHPVウイルス（HPV 16, HPV 18など）に由来する抗原を含む。
【００５１】
陰部疣贅の予防または治療用の特に好ましい形態のワクチンは、L1粒子またはキャプソマーと、HPV 6およびHPV 11タンパク質E6、E7、L1およびL2から選ばれる1以上の抗原を含む融合タンパク質とを含む。
最も好ましい形態の融合タンパク質は、WO 96/26277に開示されているL2E7、およびGB 9717953.5（PCT/EP98/05285）に開示されているタンパク質D(1/3)-E7である。
【００５２】
HPV子宮頸感染および癌の予防または治療用の好ましいワクチン組成物はHPV 16または18抗原を含みうる。例えば、L1もしくはL2抗原単量体、またはL1もしくはL2抗原は、ウイルス様粒子（VLP）として一緒に存在するか、またはL1タンパク質のみがVLPまたはキャプソマー構造中に存在しうる。そのような抗原、ウイルス様粒子およびキャプソマーは自体公知である。例えば、WO94/00152、WO94/20137、WO94/05792およびWO93/02184を参照されたい。
【００５３】
追加的な初期タンパク質が単独で又は融合タンパク質（例えばE7、E2または好ましくはE5）として含まれていてもよい。この特に好ましい実施形態は、L1E7融合タンパク質を含むVLPを含む（WO 96/11272）。
【００５４】
特に好ましいHPV 16抗原は、HPV 16由来の、タンパク質D-E6またはE7融合体を形成するようタンパク質D担体と融合した初期タンパク質E6またはE7、あるいはそれらの組合せ、あるいはE6またはE7とL2との組合せを含む（WO 96/26277）。
【００５５】
あるいは、HPV 16または18初期タンパク質E6およびE7は、単一分子、好ましくはタンパク質D-E6/E7融合体として与えられうる。そのようなワクチンは、所望により、HPV 18由来のE6タンパク質およびE7タンパク質の一方または両方を、好ましくは、タンパク質D-E6またはタンパク質D-E7融合タンパク質またはタンパク質D E6/E7融合タンパク質の形態で含有しうる。
【００５６】
本発明のワクチンは更に、他のHPV株、好ましくは株HPV 31または33由来の抗原を含みうる。
本発明のワクチンは更に、マラリアを引き起こす寄生生物に由来する抗原を含む。例えば、Plasmodia falciparum由来の好ましい抗原には、RTS、SおよびTRAPが含まれる。RTSは、B型肝炎ウイルスの表面（S）抗原にB型肝炎表面抗原のpreS2部分の4アミノ酸を介して連結されたP.falciparumのサーカムスポロゾイト（circumsporozoite）（CS）タンパク質のC末端部分の実質的に全部を含むハイブリッドタンパク質である。その全構造が、英国特許出願第9124390.7号に基づく優先権を主張している番号WO 93/10152として公開された国際特許出願番号PCT/EP92/02591に開示されている。酵母内で発現された場合には、RTSはリポタンパク質粒子として産生され、それがHBV由来のS抗原と共に共発現された場合には、それはRTS,Sとして公知の混合粒子を産生する。TRAP抗原は、WO 90/01496として公開された国際特許出願番号PCT/GB89/00895に記載されている。本発明の好ましい実施形態はマラリアワクチンであり、ここで、該抗原調製物はRTS,S抗原とTRAP抗原との組合せを含む。多段階（multistage）マラリアワクチンの成分の候補となりうる他のプラスモジウム抗原としては、P. faciparum MSP1、AMA1、MSP3、EBA、GLURP、RAP1、RAP2、Sequestrin、PfEMP1、Pf332、LSA1、LSA3、STARP、SALSA、PfEXP1、Pfs25、Pfs28、PFS27/25、Pfs16、Pfs48/45、Pfs230およびPlasmodium sppにおけるそれらの類似体が挙げられる。
【００５７】
該製剤は抗腫瘍抗原も含有することが可能であり、癌の免疫療法に有用でありうる。該製剤は抗腫瘍抗原も含有することが可能であり、癌の免疫療法に有用でありうる。例えば、該アジュバント製剤は腫瘍拒絶抗原、例えば前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、腎臓癌または黒色腫の腫瘍拒絶抗原に有用である。典型的な抗原には、MAGE 1、3およびMAGE 4または他のMAGE抗原、例えばWO99/40188に開示されているもの、PRAME、BAGE、Lage（NY Eos 1としても公知である）SAGEおよびHAGE（WO 99/53061）またはGAGEが含まれる（RobbinsおよびKawakami, 1996, Current Opinions in Immunology 8, pps 628-636; Van den Eyndeら, International Journal of Clinical & Laboratory Research (1997年に提出); Correaleら (1997), Journal of the National Cancer Institute 89, p293）。実際、これらの抗原は、黒色腫、肺癌、肉腫および膀胱癌のような広範囲の腫瘍型において発現される。好ましい実施形態においては、前立腺抗原、例えば前立腺特異抗原（PSA）、PAP、PSCA（PNAS 95(4) 1735-1740 1998）、PSMA、あるいは好ましい実施形態においては、プロスターゼ（Prostase）として公知の抗原が使用される。本発明の場合に有用な他の腫瘍関連抗原には、Plu-1（J Biol. Chem 274 (22) 15633-15645, 1999）、HASH-1、HasH-2、Cripto（Salomonら Bioessays 199, 21 61-70, 米国特許第5654140号）、Criptin（米国特許第5 981 215号）が含まれる。また、癌の療法におけるワクチンに特に適した抗原はまた、チロシナーゼおよびスルビビン（survivin）、ムチン由来ペプチド（例えばMuc1；例えば米国特許第5744,144号、米国特許第5827,666号、WO 8805054、米国特許第4,963,484号を参照されたい）を含む。特に意図されるのは、Muc1ペプチドの反復単位の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つのそのような反復を含むが、それはSM3抗体により認識されるMuc1由来ペプチドである（米国特許第6 054 438号）。他のムチン由来ペプチドには、Muc5由来のペプチドが含まれる。
【００５８】
本発明は、乳癌抗原、例えばher 2/ Neu、マンマグロビン（米国特許第5668267号）またはWO/00 52165、WO99/33869、WO99/19479、WO 98/45328に開示されているものと組合せても有用である。Her 2 neu抗原は、とりわけ、米国特許第5,801,005号に開示されている。好ましくは、Her 2 neuは、全細胞外ドメイン（アミノ酸約1-645）またはその断片と、C末端の約580アミノ酸の全細胞内ドメインまたは少なくともその免疫原性部分とを含む。特に、該細胞内部分は、リン酸化ドメインまたはその断片を含むべきである。そのような構築物はWO00/44899に開示されている。
【００５９】
本発明のワクチンは、アレルギーの予防または治療に使用することができる。そのようなワクチンは、アレルゲン特異的（例えばDer p1）およびアレルゲン非特異的抗原（例えばヒトIgE由来ペプチド、例えばスタンウァース（stanworth）デカペプチド（EP 0 477 231 B1）が挙げられるが、これに限定されるものではない）を含むであろう。
【００６０】
本発明のワクチンはまた、アレルギー、癌または感染症以外の慢性障害の予防または治療に使用することができる。そのような慢性障害としては、アテローム性動脈硬化症およびアルツハイマー病が挙げられる。
【００６１】
アルツハイマー神経変性疾患に感受性の又は罹患した患者の予防および治療に適した抗原としては、特に、N末端39-43アミノ酸断片（アミロイド前駆体タンパク質のAβおよびより小さな断片）が挙げられる。この抗原は国際特許出願番号WO 99/27944（Athena Neurosciences）に開示されている。
【００６２】
本発明での使用に好ましい抗原は、RSV、Streptococcus（および特に、参照により本明細書に組み入れるWO 00/56359に記載のワクチンの使用）、HSV、HAV、HBV、VZV、HPVおよびCMVよりなる群から選ばれる。また、この好ましい限られた列挙におけるワクチンの少なくとも2つを組合せて、好ましいワクチン組合せ体（例えば、StreptococcusワクチンとRSVワクチンとの組合せ、およびHPVワクチンとHSVワクチンとの組合せ、およびHBVワクチンとHAVワクチンとの組合せ）を得ることが可能である。本発明のこの第2の態様において使用しうるもう1つの具体的なワクチン組合せ体には、GlaxoSmithKline Biologicalsにより製造されたInfanrix（商標）組（range）が含まれる。そのようなワクチンは、ジフテリア毒素、破傷風毒素およびB. pertussis抗原の「コア」組合せに基づく。この組合せは、百日咳成分［不活化全細胞B. pertussis、または典型的には2つの抗原（PTおよびFHA）（しばしば69kDa）と場合によっては凝集原2または凝集原3の一方または両方とよりなる無菌体百日咳］を含む。そのようなワクチンは、しばしば、DTPｗ（全細胞）またはDTPa（無菌体）と称される。
【００６３】
本発明の範囲内の特定の組合せワクチン（混合ワクチン）には以下のものが含まれる：
ジフテリア-破傷風-百日咳-B型肝炎（DTP-HB）、
ジフテリア-破傷風-B型肝炎（DT-HB）、
Hib-B型肝炎、
DTP-Hib-B型肝炎、
IPV（不活性化ポリオワクチン）-DTP-Hib-B型肝炎［例えば、Infanrix-Hexa（商標）-SmithKline Beecham Biologicals s.a.］、
ジフテリア-破傷風-百日咳-B型肝炎-IPV（DTP-HB-IPV）［例えば、Infanrix-Penta TM-SmithKline Beecham Biologicals s.a.］。
【００６４】
該百日咳成分は、適切には、全細胞百日咳ワクチン、または部分的または高度に精製された抗原を含有する無菌体百日咳ワクチンである。前記の組合せは、所望により、A型肝炎に対して防御的な成分を含みうる。好ましくは、該A型肝炎成分はホルマリン不活化HM-175である。培養されたHM-175をトリプシンで処理し、浸透クロマトグラフィーにより小さなプロテアーゼ消化タンパク質から無傷ウイルスを分離し、ホルマリンで不活化することによりHM-175を精製するのが好都合である。B型肝炎含有組合せワクチンは小児科用ワクチンであることが好都合である。
【００６５】
最も好ましい抗原は以下の病原体から選ばれる：ヒトパピローマウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、B型肝炎および／またはA型肝炎ウイルス、髄膜炎B、髄膜炎菌、および／またはHaemophilus influenzae bおよび／または他の抗原、Streptococcus pneumoniae抗原の単独体または他の抗原との組合せ、水痘・帯状疱疹ウイルス。
好ましくは、該ワクチン成分はインフルエンザ抗原を含まない。
【００６６】
各ワクチン用量中の抗原の量は、典型的なワクチン被接種者において有意な有害な副作用を伴うことなく免疫防御応答を誘導する量から選ばれる。そのような量は、どのような特異的免疫原を使用するのか及びどのようにしてそれが与えられるのかに応じて様々となろう。通常、各ワクチン用量は、該または各抗原1〜1000μg、好ましくは1〜500μg、好ましくは1〜100μg、最も好ましくは1〜50μgを含む。好ましくは、抗原の合計用量は1〜500μg、好ましくは1〜100μg、最も好ましくは1〜50μgである。本発明の好ましい態様においては、得られたワクチンは、それが該または各抗原10〜100μg/用量、より好ましくは1〜20μg/用量、最も好ましくは約10μg/用量を含むという点で「低用量」である。より好ましくは、抗原の合計用量は1〜50μg、より好ましくは1〜20μg/用量、最も好ましくは約10μg/用量である。個々のワクチンに関する最適量は、対象における適当な免疫応答の観察を含む標準的な検討により確認することができる。初回ワクチン接種の後、対象は1回の又は適当な間隔で数回の追加免疫を受けることが可能である。
【００６７】
好ましくは、該ワクチンは、本明細書に記載のとおり、通常の筋肉内ワクチンより小さな液体容積（「小容積」）、特に約0.05ml〜0.2mlの容積である。好ましくは、本発明のワクチンの1用量の容積は0.025ml〜2.5ml、より好ましくは約0.1ml、または約0.2mlである。50μlの用量容積も考慮されうるであろう。0.1mlの用量は通常の筋肉内ヒトワクチン用量（通常は0.5〜1ml）の容積の約1/5〜1/10である。皮内投与しうる液体の容積は、1つには注射部位に左右される。例えば、三角筋部における注射には、0.1mlが好ましい最大容積であり、腰部においては、大容積、例えば約0.2mlを投与することが可能である。
【００６８】
本発明は更に、サポニンおよびステロールを含んでなる、皮膚の真皮への投与用の医薬組成物であって、該サポニンおよびステロールがリポソーム中に製剤化されていることを特徴とする医薬組成物を提供する。
好ましくは、本発明は、低用量および小容積皮内ワクチン製剤の製造における、リポソーム中に製剤化されたステロール、サポニンの使用を提供する。
【実施例１】
【００６９】
マウスにおけるスプリットワクチンの免疫原性
スプリットRSV製剤
一連の以下の実験は、スプリットRSVが、皮内（ID）経路により投与された場合に強力な免疫応答を誘導することを例示している。
【００７０】
方法
スプリットRSV
2％ デオキシコール酸ナトリウムを使用して、RSVのサンプルを分割した。分割するウイルスを、ゆっくりと撹拌しながら該界面活性剤と共に室温で一晩インキュベートした。
【００７１】
分割後、過剰の界面活性剤を除去するために該溶液を製剤化バッファー（PO4 10 mM/ NaCl 150 mM pH7.5）に対して透析した。
【００７２】
分析：超遠心分離
遠心チューブに30％ スクロース溶液（450μl）を半分充填した後、被検サンプル（450μl）をこのスクロースクッション上に穏やか且つ注意深く配置し、ついでBeckman TL100ローター中、50,000rpm、+4℃で1時間遠心分離した。遠心分離後、3分割して該チューブから排液した。上相（300μl）を「上清」と称することにする。中間相（300μl）はサンプルとスクロースクッションとの間の境界相であり、本明細書中では「中間相」と称することにする。下相（300μl）は、完全ウイルスに対して遠心分離を行う際の再懸濁ペレットを含有する下部溶液であり、「ペレット」と称することにする。
【００７３】
これらの3つの画分を特定のウイルス抗原に対してウエスタンブロットにより更に分析した。この分析は該ウイルスの完全性（ペレット画分の陽性）の確認および該スプリット（分割）の有効性の確認（適切には、すべて又はほとんどの構造タンパク質、例えばエンベロープタンパク質に関する、上清画分の陽性）を可能にする。
【００７４】
FG特異的ELISA
免疫応答を評価するために用いた最初の免疫測定は、ワクチン接種動物の血清中に存在する全RSV FG特異的免疫グロブリン（Ig）を測定するELISAアッセイであった。これらのアッセイにおいては、96ウェルディッシュを組換えRSV FG抗原でコートし、該動物血清を系列希釈し、該コート化ウェルに適用する。ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗モルモットIgの添加により、結合抗体を検出する。結合抗体は、OPDA基質を添加し、次いで2N H2SO4で処理し、490nmにおいて光学密度（OD）を測定することにより確認される。抗体力価は、SoftMax Proソフトウェア（4パラメーター方程式を用いるもの）を使用してレファレンスから算出し、EU/ml単位で表した。
【００７５】
中和アッセイ
ELISAアッセイに加えて、免疫化により誘導された免疫応答の質を更に特徴づけるために中和アッセイを行った。中和アッセイのために、動物血清の2倍希釈物をRSV/Aウイルス（3000 pfu）およびモルモット補体と共に、96ウェル組織培養ディッシュ中、37℃で1時間インキュベートした。Hep-2細胞（104細胞/ウェル）を各ウェルに直接加え、該プレートを37℃で4日間インキュベートした。該上清を吸引し、市販のWST-1溶液を各ウェルに加えた。該プレートを37℃で更に18〜24時間インキュベートした。ODを450nmでモニターし、力価を線形回帰分析により分析した。記載されている力価は、未感染細胞に関して認められた最大ODにおける50％の減少を引き起こした血清希釈度の逆数である。
【００７６】
ワクチンの製造
1.1  リポソームの製造方法：
有機溶媒中の脂質（例えばホスファチジルコリン）とコレステロールとの混合物を真空下（あるいは不活性ガス流下）で完全に蒸発させる。ついで水溶液（例えばリン酸緩衝食塩水）を加え、すべての脂質が懸濁するまで該溶液を振とうする。ついで、リポソームサイズが100nmにまで減少するまでこの懸濁液をマイクロフルイダイズ（microfluidise）し、ついで0.2μmフィルターで滅菌濾過する。
典型的には、コレステロール：ホスファチジルコリン比は1：4（w/w）であり、該水溶液を加えて最終コレステロール濃度を5〜50mg/mlにする。
【００７７】
該リポソームは100nmの一定のサイズを有し、SUV（小さな単層小胞）と称される。この溶液を反復的な凍結・融解に付すと、該小胞が融合して、500nm〜15μmの範囲のサイズを有する大きな多層構造体（MLV）を形成する。有機溶液中の3D-MPLを有機溶液中の脂質に加えると、該最終リポソームは該膜内に3D-MPLを含有する（3D-MPLイン（3D-MPL in）と称される）。
該リポソームは単独で、長期にわたり安定であり、融合誘導能を有していない。
【００７８】
1.2  製剤化方法：
水溶液中のQS21を該リポソームに加える。ついでこの混合物を該抗原溶液に加える。
【００７９】
ワクチン接種プロトコール
ID（皮内）経路により投与した場合のRSVスプリット抗原の免疫原性をモルモットにおいて評価した。この種における実際のID注射の実施可能性は、真皮内への墨の注射および該組織の組織学的検査（データは非表示）（ツベルクリン針を使用するマントゥー法を用いたもの）により証明されている。この場合にも、高齢集団において見出される免疫状態を刺激するために（すなわち、RSVに対する初回抗原刺激）、Hartleyモルモット（5匹/群）を生RSVウイルス（100μl〜50μl/外鼻孔でIN投与される5×105 pfu；群A〜E）または精製全RSV（100μlでIM投与される6μgのFタンパク質を含有；群F〜J）で初回免疫刺激した。同等の2用量のワクチンを初回免疫刺激後の第21日および第42日に投与した。群AおよびFには、ID経路により投与される4.2μgのFタンパク質を含有するスプリットRSV製剤を与えた。群BおよびGには、ID経路により投与される0.84μgのFタンパク質を含有するスプリットRSV製剤を与えた。群CおよびHには、ID経路により投与される、本発明のサポニン／ステロールリポソーム（該リポソーム中に5μgのQS21、25μgのコレステロール、ホスファチジルコリンおよび5μgの3D-MPLを含む）でアジュバント化された4.2μgのFタンパク質を含有するスプリットRSV製剤を与えた。群DおよびIには、ID経路により投与される、群Cと同じアジュバントでアジュバント化された0.84μgのFタンパク質を含有するスプリットRSV製剤を与えた。群EおよびJには、IM経路により投与される4.2μgのFタンパク質を含有するスプリットRSV製剤を与えた。ワクチンの第1用量の投与の3週間後およびワクチンの第2用量の投与の2週間後に動物の採血を行い、免疫応答を評価した。
【００８０】
この実験の結果を図1および2に要約する。図1は、該実験の経過中に該モルモット血清において検出されたFG特異的免疫応答を示す。図2は中和データを要約したものである。このように、初回抗原刺激（精製全ウイルスの生ウイルス感染または投与による初回抗原刺激）された集団においては、ID経路により投与されたスプリットRSVの1回量は強力な免疫原性を示し、この応答は第2用量のワクチンにより更に増強されうる。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】図１は、RSVスプリット抗原免疫モルモット各群におけるFG特異的免疫応答の評価結果を示すグラフである。
【図２】図２は、RSVスプリット抗原免疫モルモット各群における中和アッセイの結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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