(57)【要約】ヒトＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２の結晶構造が記載され、これは高解像度Ｘ−線回折構造およびそれから得られた原子構造座標を含む。また、この結晶化方法に関与する結晶化添加剤の使用および具体的な経験的条件を含むＭＫ−２の結晶化の方法も、記載される。結晶化のこの方法によって、３オングストロームの解像度が達成される。３オングストロームの解像度までのＸ−線結晶学によって決定されるこの蛋白質の立体構造が示される。また、ＭＫ−２結晶から得られた原子構造情報による方法を、新規薬物をスクリーン、同定および／または設計するのに使用できることも記載する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
結晶性ＭＫ−２。
【請求項２】
該ＭＫ−２がヒトＭＫ−２である請求項１記載の結晶性ＭＫ−２。
【請求項３】
該ＭＫ−２が、塩化第一コバルト六水和物、塩化マグネシウム、塩化ストロンチウム六水和物、塩化イットリウム六水和物、エタノール、メタノール、塩酸トリメチルアミン、尿素、ＥＤＴＡナトリウム塩、ＮＡＤ＋、Ｄ（＋）フルコース、スペルミジン、スペルミジン−テトラ−ＨＣｌ、グリシン、グリシル−グリシル−グリシン、ジメチルスルホキシド、フッ化ナトリウム、ｔｅｒｔ−ブタノール、１，３−プロパンジオール、ｎ−プロパノール、アセトン、ジクロロメタン、１，４−ジチオ−ＤＬ−スレイトール、Ｃ１２Ｅ８、ｎ−ドデシル−−Ｄ−マルトシド、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００、デオキシ−ＢｉｇＣｈａｐ、Ａｎａｐｏｅ（登録商標）Ｘ−１１４、Ａｎａｐｏｅ（登録商標）Ｃ１３Ｅ８、Ｃ−ＨＥＧＡ−８（商標）、ｎ−ヘキサデシル−−Ｄ−マルトシド、ｎ−テトラデシル−−Ｄマルトシド、ｎ−トリデシル−−Ｄマルトシド、ＦＯＳ−Ｃｈｏｌｉｎｅ（登録商標）９、およびＣｙｍａｌ（登録商標）−１よりなる群から選択される結晶化添加剤で結晶化された請求項１記載の結晶性ＭＫ−２。
【請求項４】
該ＭＫ−２が、デオキシ−ＢｉｇＣｈａｐ、ｎ−ヘキサデシル−ベータ−Ｄ−マルトシド、塩化イットリウム六水和物、およびｎ−トリデシル−ベータ−Ｄ−マルトシドよりなる群から選択される結晶化添加剤で結晶化された結晶性ＭＫ−２。
【請求項５】
該ＭＫ−２が、デオキシ−ＢｉｇＣｈａｐで結晶化された請求項１記載の結晶性ＭＫ−２。
【請求項６】
該ＭＫ−２が、ｎ−ヘキサデシル−ベータ−Ｄ−マルトシドである請求項１記載の結晶性ＭＫ−２。
【請求項７】
該ＭＫ−２が、塩化イットリウム六水和物で結晶化された請求項１記載の結晶性ＭＫ−２。
【請求項８】
該ＭＫ−２が、ｎ−トリデシル−ベータ−Ｄ−マルトシドで結晶化された請求項１記載のＭＫ−２。
【請求項９】
配列番号１を含むヒトＭＫ−２構築体。
【請求項１０】
配列番号１およびその保存的置換を含むヒトＭＫ−２構築体。
【請求項１１】
共複合体におけるさらなる種と組み合わされたＭＫ−２を含む結晶性化合物。
【請求項１２】
さらなる種が、ＡＴＰアナログを含む請求項１１記載の結晶性化合物。
【請求項１３】
該ＡＴＰアナログがＡＭＰ−ＰＮＰである請求項１２記載の結晶性化合物。
【請求項１４】
ＭＫ−２ポリペプチドの原子座標の決定につき、約３．５オングストロームよりも良好な解像度まで、Ｘ−線を効果的に回折する、寸法ａ＝ｂ＝ｃ＝約２５２ないし約２５６オングストロームの単位格子を形成するように、空間群Ｆ４１３２にて、結晶の様式で配列されたＭＫ−２ポリペプチド分子を含む組成物。
【請求項１５】
ＭＫ−２ポリペプチドの原子座標の決定につき、約２．５ないし約３．３オングストロームの解像度まで、Ｘ−線を効果的に回折する、寸法ａ＝ｂ＝ｃ＝約２５４．８オングストロームの単位格子を形成するように、空間群Ｆ４１３２にて、結晶の様式で配列されたＭＫ−２ポリペプチド分子を含む組成物。
【請求項１６】
請求項１記載の結晶性ＭＫ−２の構造を具体化するデータセットを含むＭＫ−２の構造モデル。
【請求項１７】
該データセットが、ＭＫ−２の結晶解析によって決定された請求項１６記載のモデル。
【請求項１８】
該データセットが、ＭＫ−２の全構造を具体化する請求項１６記載のモデル。
【請求項１９】
該データセットが、ＭＫ−２の構造の部分を具体化する請求項１６記載のモデル。
【請求項２０】
該部分が、ＭＫ−２のＡＴＰ結合部位である請求項１９記載のモデル。
【請求項２１】
該ＭＫ−２が、ＡＴＰアナログとの共複合体において存在する請求項１６記載のモデル。
【請求項２２】
該ＡＴＰアナログが、ＡＭＰ−ＰＮＰである請求項２１記載のモデル。
【請求項２３】
請求項１６記載のモデル上に貯蔵されたコンピューターで読み取り可能な媒体。
【請求項２４】
（ａ）請求項１６記載のモデルを供し；
（ｂ）そのようなモデルで、候補種の相互作用を調べ；次いで
（ｃ）阻害剤として作用することが予測される種を選択する；
ことを含むＭＫ−２活性の阻害剤である種を同定する方法。
【請求項２５】
請求項２４の方法に従って同定された種。
【請求項２６】
（ａ）ＭＫ−２ポリペプチド分子の溶液を供し；
（ｂ）約１．６ないし約２．６Ｍの硫酸アンモニウム、約８０ないし１２０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび約２ないし５０ｍＭの結晶化添加剤を含む沈殿溶液を供し；次いで
（ｃ）ＭＫ−２ポリペプチド分子の溶液と、沈殿溶液を合わせ、蛋白質ＭＫ−２の結晶を形成させる；
ことを含む結晶を成長させる方法。
【請求項２７】
蛋白質ＭＫ−２の結晶が、Ｍｇ２＋、ＡＴＰアナログおよび阻害剤の存在下で形成される請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
該ＡＴＰアナログがＡＭＰ−ＰＮＰである請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
該阻害剤が、ＳＣ−８３５９８である請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
該結晶化添加剤が、塩化第一コバルト六水和物、塩化マグネシウム、塩化ストロンチウム六水和物、塩化イットリウム六水和物、エタノール、メタノール、塩酸トリメチルアミン、尿素、ＥＤＴＡナトリウム塩、ＮＡＤ＋、Ｄ（＋）フルコース、スペルミジン、スペルミジン−テトラ−ＨＣｌ、グリシン、グリシル−グリシル−グリシン、ジメチルスルホキシド、フッ化ナトリウム、ｔｅｒｔ−ブタノール、１，３−プロパンジオール、ｎ−プロパノール、アセトン、ジクロロメタン、１，４−ジチオ−ＤＬ−スレイトール、Ｃ１２Ｅ８、ｎ−ドデシル−−Ｄ−マルトシド、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００、デオキシ−ＢｉｇＣｈａｐ、Ａｎａｐｏｅ（登録商標）Ｘ−１１４、Ａｎａｐｏｅ（登録商標）Ｃ１３Ｅ８、Ｃ−ＨＥＧＡ−８（商標）、ｎ−ヘキサデシル−−Ｄ−マルトシド、ｎ−テトラデシル−−Ｄ−マルトシド、ｎ−トリデシル−−Ｄ−マルトシド、ＦＯＳ−Ｃｈｏｌｉｎｅ（登録商標）９、およびＣｙｍａｌ（登録商標）−１よりなる群から選択される請求項２６記載の方法。
【請求項３１】
該結晶化添加剤が、デオキシ−ＢｉｇＣｈａｐ、ｎ−ヘキサデシル−−Ｄ−マルトシド、塩化イットリウム六水和物、およびｎ−トリデシル−−Ｄ−マルトシドを含む請求項２６記載の方法。
【請求項３２】
該結晶化添加剤を、約１０ないし約２０ｍＭ間の濃度で存在させる請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
得られた結晶を撮影したＸ−線が、３．５オングストロームまたはそれ以上の解像度に回折されるＭＫ−２を結晶化する方法。
【請求項３４】
得られた結晶を撮影したＸ−線が、約２．５ないし約３．３オングストローム間の解像度に回折される請求項２６記載の方法。
【請求項３５】
請求項１記載の結晶の構造座標、またはその部分を用いて、ＭＫ−２の突然変異体、同族体、または共−複合体の結晶形態を解明することを含む結晶構造を解明する方法。
【請求項３６】
（ａ）結晶化添加剤を含有する溶液からＭＫ−２蛋白質を結晶化し；次いで
（ｂ）結晶を分析して、三次元構造を決定する
ことを含む空間群Ｆ４１３２、および約３．０オングストロームの解像度を有する請求項１６記載のデータセットを含む結晶化されたＭＫ−２蛋白質の三次元構造を決定する方法。
【請求項３７】
結晶化添加剤が、塩化第一コバルト六水和物、塩化マグネシウム、塩化ストロンチウム六水和物、塩化イットリウム六水和物、エタノール、メタノール、塩酸トリメチルアミン、尿素、ＥＤＴＡナトリウム塩、ＮＡＤ＋、Ｄ（＋）フルコース、スペルミジン、スペルミジン−テトラ−ＨＣｌ、グリシン、グリシル−グリシル−グリシン、ジメチルスルホキシド、フッ化ナトリウム、ｔｅｒｔ−ブタノール、１，３−プロパンジオール、ｎ−プロパノール、アセトン、ジクロロメタン、１，４−ジチオ−ＤＬ−スレイトール、Ｃ１２Ｅ８、ｎ−ドデシル−−Ｄ−マルトシド、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００、デオキシ−ＢｉｇＣｈａｐ、Ａｎａｐｏｅ（登録商標）Ｘ−１１４、Ａｎａｐｏｅ（登録商標）Ｃ１３Ｅ８、Ｃ−ＨＥＧＡ−８（商標）、ｎ−ヘキサデシル−−Ｄ−マルトシド、ｎ−テトラデシル−−Ｄ−マルトシド、ｎ−トリデシル−−Ｄ−マルトシド、ＦＯＳ−Ｃｈｏｌｉｎｅ（登録商標）９、およびＣｙｍａｌ−１よりなる群から選択される請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
該結晶化添加剤が、デオキシ−ＢｉｇＣｈａｐ、ｎ−ヘキサデシル−ベータ−Ｄ−マルトシド、塩化イットリウム六水和物、およびｎ−トリデシル―ベータ
―Ｄ−マルトシドよりなる群から選択される請求項２９記載の方法。
【請求項３９】
（ａ）請求項１記載のＭＫ−２の結晶の結晶構造座標に基づいてアミノ酸残基６９−８０、９０−９５、１０４、１０８、１１８−１１９、１３６−１４７、１８４−１９５、２０４−２１０、および２２４−２２６よりなる群から選択されるＡＴＰ結合配列における１つ以上のアミノ酸と結合する潜在的阻害剤を設計し、
（ｂ）阻害剤を合成し；次いで
（ｃ）潜在的阻害剤がＭＫ−２の活性を阻害するか否かを決定する；
ことを含む合理的な薬物設計（rational drug design）によって、阻害剤を同定する方法。
【請求項４０】
該阻害剤が、Gly 71、Leu 72、Gly 73、Ile 74、Asn 75、およびGly 76よりなる群から選択される配列における１つ以上のアミノ酸と相互作用するように設計されている請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
該阻害剤が、Glu 139およびLeu 141よりなる群から選択される１つ以上のアミノ酸と相互作用するように設計されている請求項３９記載の方法。
【請求項４２】
該阻害剤が、Ala 91、Met 138、Cys 140、Val 118、Leu 70、およびVal 78よりなる群から選択される配列における１つ以上のアミノ酸と相互作用するように設計されている請求項３９記載の方法。
【請求項４３】
該阻害剤 が、Gly 71、Leu 72、Glu 145、およびLeu 193よりなる群から選択される配列における１つ以上のアミノ酸と相互作用するように設計されている請求項３９記載の方法。
【請求項４４】
該阻害剤が、Leu 72、Gly 73、Ile 74、Asn 75、Val 78、Asp 207、Lys 93、Lys 188、Asn 191、Glu 190およびThr 206よりなる群から選択される配列における１つ以上のアミノ酸と相互作用するように設計されている請求項３９記載の方法。
【請求項４５】
（ａ）コンピューターモデリングアプリケーションに、ＭＫ−２またはＭＫ−２−様アミノ酸69-80、90-95、104、108、118-119、136-147、184-195、204-210、および224-226を含むＡＴＰ結合部位の少なくとも部分を含む分子または分子複合体の構造座標の組を供給し; 
（ｂ）コンピューターモデリングアプリケーションに、化学体の構造座標の組みを供給し；次いで
（ｃ）化学体が、分子または分子複合体に結合する、あるいはそれらに干渉すると予測される阻害剤であるか否かを決定する
ことを含むＭＫ−２活性の阻害剤を同定するコンピューター−援助方法。
【請求項４６】
（ａ）コンピューターモデリングアプリケーションに、ＭＫ−２またはＭＫ−２−様アミノ酸69-80、90-95、104、108、118-119、136-147、184-195、204-210、および224-226を含むＡＴＰ結合部位の少なくとも部分を含む分子または分子複合体の構造座標の組を供給し;
（ｂ）コンピューターモデリングアプリケーションに、化学体の構造座標を供給し；次いで 
（ｃ）化学体および分子または分子複合体のＡＴＰ結合部位間の潜在的結合相互作用を評価し; 
（ｄ）化学体を構造的に修飾して、修飾された化学体に対する構造座標の組を得；次いで 
（ｅ）修飾された化学体が阻害剤であるか否かを決定する；
ことを含むＭＫ−２活性の阻害剤を設計するコンピューター−援助方法。
【請求項４７】
（ａ）コンピューターモデリングアプリケーションに、アミノ酸69-80、90-95、104、108、118-119、136-147、184-195、204-210、および224-226を含むＡＴＰ結合部位の少なくとも部分を含む分子または分子複合体の構造座標の組を供給し;
（ｂ）構造座標の組によって表される化学体をコンピューター上に形成し;
（ｃ）化学体が、分子または分子複合体と結合するか、あるいはそれらと相互作用すると予測される阻害剤であるか否かを決定し、ここに分子または分子複合体に結合するか、あるいはそれらと相互作用することが、ＭＫ−２活性の潜在的阻害の指標である；
ことを含むＭＫ−２活性のデ・ノボ阻害剤を設計するコンピューター−援助方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２００２年４月４日に出願された米国非仮出願シリアル番号１０／１１６，６４９に基づくものであり、これは２００２年３月７日に出願された仮出願シリアル番号６０／３６２，３８０に基づく完全な出願である。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ヒトＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２（ＭＫ−２）の結晶化に関する。より具体的には、本発明は、ＭＫ−２を結晶化する方法およびこれらの結晶化の方法に関与する独特の経験的状態に関する。さらに、本発明は、ヒトＭＫ−２自体の結晶構造に関するものであり、これは、高−解像度Ｘ−線回折構造およびその入手されるデータを含む。本発明のＭＫ−２結晶およびそれから入手される原子構造的情報は、新規薬物を同定および／または設計する際のスクリーニングに有用である。
【０００３】
発明の背景
細胞外刺激に対する細胞の応答は、部分的に、多くの細胞内キナーゼおよびホスファターゼ酵素によって、媒介される。マイトジェン−活性化蛋白質（ＭＡＰ）キナーゼは、別々のシグナリングカスケード、または細胞外刺激を細胞内プロセスへと変換する機能を持つ経路に関係している。１つのそのようなマイトジェン−活性化蛋白質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路は、ｐ３８シグナリング同時導入経路である。ｐ３８シグナリング同時導入経路は、炎症、細胞分化、細胞増殖、および細胞死滅を含む多くの細胞のプロセスを制御することにおいて、重要な役割を演じる。
【０００４】
ｐ３８ＭＡＰＫ経路は、広範囲のストレスおよび細胞損傷によって活性化される可能性がある。これらのストレスおよび細胞損傷は、熱刺激、ＵＶ照射、炎症性サイトカイン（例えばＴＮＦおよびＩＬ−１）、ツニカマイシン、化学療法薬物（つまり、シスプラチナム）、アニソマイシン、ソルビトール／高浸透圧、ガンマ照射、亜ヒ酸ナトリウム、および虚血を含む（K. Ono, J. Han, Cellular Signalling 12 (2000) 1-13,2.)。ｐ３８経路の活性化は、（１）ＴＮＦ−αといった炎症誘発性のサイトカインの生成；（２）病理学的状態における結合組織修復を管理する例えばＣＯＸ−２といった酵素の誘導；（３）酸化の制御において重要な役割を演じる例えばｉＮＯＳといった細胞内酵素の発現；（４）例えばＶＣＡＭ−１といった接着性細胞および多くの他の炎症関連分子の誘導に関する。さらに、ｐ３８経路は、免疫系の細胞の増殖および分化において調節装置として機能する。７の前述に同じ。
【０００５】
ｐ３８は、マイトジェン−活性化蛋白質キナーゼ−活性化蛋白質キナーゼ−２の上流キナーゼである（ＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２またはＭＫ−２）(Freshney NW et al. J. Cell 1994 ; 78: 1039-49.)。ＭＫ−２は蛋白質であり、これは細胞において、ｐ３８に主に制御されているようである。実際、ＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２は、ｐ３８αの最初に同定された基質である。例えば、ｐ３８αによるＭＫ−２のインビトロリン酸化は、ＭＫ−２を活性化する。その結果、ＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２が作用する基質は、熱刺激蛋白質２７、リンパ球−特異蛋白質１（ＬＳＰ１）、ｃＡＭＰ応答エレメント結合蛋白質（ＣＲＥＢ）、ＡＴＦ１、ＳＲＦおよびチロシン水酸化酵素を含む。最もよく特徴がわかっているＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２の基質は、小熱刺激蛋白質２７（ｈｓｐ２７）である。６に上記。
【０００６】
炎症関連疾患におけるｐ３８経路の役割は、いくつかの動物モデルにおいて研究されてきた。ＳＢ２０３５８０は、ｐ３８インビボの具体的な阻害剤であり、それはまた、ＭＫ−２の活性化を阻害することがわかった（Freshney NW ら J. Cell 1994; 78: 1039-49; Rouse J, Cohen P, Trigon S, Morange M, Alonso-Llamazares A, Zamanillo D, Hunt T, Nebreda AR. Cell 1994 ; 78: 1027-37; Cuenda A, Dorow DS. Biochem J 1998 ; 333: 11-5.)。ＳＢ２０３５８０によるｐ３８の阻害は、内毒素−誘発性刺激のマウスのモデルにおいて、生存率を減少させ、マウスコラーゲン−誘発性関節炎およびラットアジュバント関節炎の発達を阻害することができる(Badger AM, Bradbeer JN, Votta B, Lee JC,Adams JL, Griswold DE. J Pharmacol Exp Ther 1996; 279: 1453-61.)。動物モデルにおいて利用されてきたｐ３８に対する阻害効果において、ＳＢ２０３５８０より強力であると思われるもう１つのｐ３８は、ＳＢ２２００２５である。最近の動物研究は、ＳＢ２２００２５は実験ラットにおける肉芽腫の血管密度の有意な用量−依存性の減少を引き起こすことを示した(Jackson JR, Bolognese B,Hillegrass L, Kassis S, Adams J, Griswold DE, Winkler JD. J Pharmacol Exp Ther 1998; 284: 687-92.)。これらの動物研究の結果は、ｐ３８またはｐ３８の成分が、炎症性疾患に対する有用な治療標的になり得ることを示す。
【０００７】
ｐ３８シグナリング経路において不可欠な役割を持っているため、ＭＫ−２は、経路における活性化のレベルに対するモニターとして使用されてきた。ＭＫ−２は、ｐ３８活性化を評価する、たとえ間接的でもより便利な方法として測定されてきた。しかしながら、これまでは、研究努力は、主に、治療戦略としてｐ３８を阻害することに集中してきた。これらの努力は、２つのｐ３８阻害剤、ピリジニルイミダゾール阻害剤ＳＫＦ８６００２および２，４，５トリアリールイミダゾール阻害剤ＳＢ２０３５８０に基づいてきた(John C. Leeら, "Inhibition of p38 MAP kinase as a therapeutic strategy", Immunopharmacology 47 (2000), 185-201,192.)。同様の構造を有する化合物は、また、潜在的ｐ３８阻害剤として研究されてきた。実際、様々な疾患状態におけるｐ３８キナーゼの役割は、阻害剤の使用を介して解明されてきた。Ｘ−線結晶学および突然変異誘発を含む技術による阻害剤／キナーゼ相互作用の構造的側面に関する情報の発見によって、改良された効力、選択性および減少した望ましくない副作用を有する第二世代阻害剤を設計することが可能であった。１９５の前述に同じ。
【０００８】
また、ＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２は、炎症性応答を制御する焦点として提案されてきた。「MAPKAP kinase 2 is essential for LPS-induced TNF-a biosynthesis」のAlexeyKotlyarovらは、標的化突然変異を、マウスＭＫ−２遺伝子に導入して、インビボＭＫ−２の機能を調べた。ＭＫ−２を欠乏しているマウスは、強化されたストレス耐性を示し、ＬＰＳ−誘発内毒素刺激の後、生き残ることができた。この現象は、ＴＮＦ受容体自体からのシグナリングにおける変化によるというよりも、ＴＮＦ−αの生成における約９０％の減少の結果であることがわかった。筆者達は、ＭＫ−２はＴＮＦ−αの生合成を、転写後レベルにて制御し、そのようなものは、炎症性応答において重要な構成要素であると結論づけた。また、ＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２は、ｐ３８シグナリング同時導入経路において、ｐ３８から下流にあるという潜在的利点を有し、焦点として、ｐ３８ＭＡＰキナーゼのようなシグナリングカスケードにおいてさらに上流にある酵素ほどは多くの基質に影響を及ぼさずに、炎症性応答を制御するのに有効であるかもしれない。ｐ３８シグナリング同時導入経路におけるその下流位置の価値によって、ＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼが有するものと同様の利点、つまり、改善された効力、選択性および減少された望ましくない副作用を有する阻害剤を得る可能性がある。
【０００９】
すなわち、ＭＫ−２の構造を決定することは、炎症、炎症性疾患および関連障害の治療に対する薬物の同定および発展を、促進するために、非常に望ましいだろう。ＭＫ−２の三次元構造は、ＭＫ−２の発展の可能性および選択的阻害剤の薬物発見プロセスを促進すると期待されている。
【００１０】
発明の概要
本発明は、ＭＫ−２の結晶を得るためのヒトＭＫ−２のアミノ酸残基を含むＭＫ−２試薬を提供する。さらに、本発明は、ヒトＭＫ−２の結晶構造を提供する。ＭＫ−２の結晶構造は、非加水分解性ＡＴＰアナログ（ＡＭＰ−ＰＮＰ）、１３−残基阻害ペプチド（ＳＣ−８３５９８）およびＭｇＣｌ２の存在下で、ＭＫ−２成長から形成されたＭＫ−２の複合体の結晶を利用して解明された。Ｘ−線結晶学データは、これらの結晶から得られ、次いで、分子置換の方法を使用して、プログラムＥＰＭＲを使用して、ＭＫ−２結晶構造を決定した。すなわち、本発明は、ＭＫ−２ポリペプチド分子の溶液を、結晶化添加剤を含有する沈殿溶液と合わせ、蒸気拡散の方法を使用して、ＭＫ−２の結晶を形成させることによって、結晶を成長させる方法を提供する。特定の結晶化添加剤の使用によって形成された結晶は、Ｘ−線回折データの測定を、３．０オングストロームの解像度まで可能にする。
【００１１】
また、本発明は、ＡＴＰ結合部位の詳細のマッピングを含むＭＫ−２の結晶構造を提供する。本発明のさらなる具体例において、結晶構造およびその入手されたデータを用いて、新規薬物をスクリーニング、同定および／または設計する方法が提供される。
【００１２】
発明の詳細な記載
結晶および構造決定
本発明の原子構造座標が由来する結晶は、蛋白質結晶学の分野においてよく知られるバッチ、液体ブリッジ、透析、および蒸気拡散方法を含む従来の方法によって得ることができる(例えば、McPherson, 1982, Preparation and Analysis of Protein Crystals, John Wiley, New York; McPherson, 1990, Eur. J. Biochem. 189 : 1-23.; Weber, 1991, Adv. Protein Chem. 41: 1-36.参照)。特定の蛋白質の結晶を入手するためのプロセスは、各蛋白質につき個別的であることはよく知られている。好ましい具体例においては、共−結晶を、ハンギング（hanging）／シッティング(sitting)ドロップ（drop)を含む蒸気拡散の方法によって成長させる(McPherson, 1982, Preparation and Analysis of Protein Crystals, John Wiley, New York; McPherson, 1990, Eur. J. Biochem. 189: 1-23.)。この方法において、蛋白質溶液を、結晶を生成するのに最適な沈殿濃度を有する水性滞めと、閉鎖容器内にて平衡化する。一般に、実質的に純粋なポリペプチド溶液の約２ないし５μＬを、同等量の滞め溶液と混合し、結晶化に必要な沈殿濃度の約半分を得る。この溶液を、カバーグラス上の液滴として懸濁し、次いで、これを滞めの頂部で密閉する。密閉容器を、共結晶が成長するまで、通常約２ないし６週間静置させる。
【００１３】
この一般的手順に従い、共−結晶を、シッティングドロップ（sitting drop)蒸気拡散によって成長させた。具体的には、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ中の約８ないし９のｐＨのＭＫ−２（４５−３７１）よりなり、かつ約１５ないし５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＴおよび５％グリセロールを含有する蛋白質溶液を調製した。この蛋白質溶液を、約１．６ないし２．６Ｍ硫酸アンモニウムおよび１００ｍＭ酢酸ナトリウムを含有する約４．５ないし５．４のｐＨの滞め溶液と、１：１の割合で混合した。小さな双ピラミッド型またはプリズム−型の結晶が、１ないし２日で、滴中に現れ、約１ないし３週間で、０．４ｍｍｘ０．４ｍｍほどの大きさにまで成長した。
【００１４】
結晶化のプロセスは、特定の添加剤の使用で促進させた。これらの添加剤は、一般に結晶化を改善する添加剤から選択された。そのような添加剤は、二価の陽イオン、非−揮発性有機化合物、両親媒性物質、イオン、還元剤、キレート剤、補因子、炭水化物、ポリアミン、リンカー、ポリマー、可溶化剤、解離剤、カオトロープ、洗浄剤および塩であってもよい。結晶化添加剤の多くは塩である。適した結晶化添加剤の例は、下の表１に載せる。
【００１５】
【表１】
2005521392.tif 000003
【００１６】
表１の添加剤は、結晶化添加剤スクリーン（Additive Screen)キットＩ、ＩＩ、およびＩＩＩならびに洗浄剤スクリーン(Detergent Screens)Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩとして、Hampton Research Company, San Diego, Californiaから商業的に入手可能である。他の添加剤、他の添加剤スクリーンキットおよび洗浄剤スクリーンキットを使用して、前に言及した結晶化状態に添加ｒした時に、結晶化を促進することができる添加剤を同定することもできる。これらの添加剤は、約０ｍＭないし約１５０ｍＭ間の濃度にて添加できる。好ましくは、添加剤の濃度は、約３ｍＭないし約５０ｍＭ間である。より好ましくは、濃度は、約５ｍＭないし約３０ｍＭである。さらにより好ましくは、濃度は、約１０ｍＭないし約２０ｍＭの間である。溶液からの分子の結晶化は、可逆性平衡プロセスであり、動力学的および熱力学的パラメーターは、関心のある溶媒システムおよび溶質の化学的および物理的性質の機能である（McPherson, A., In : Preparation and Analysis of Protein Crystals, Wiley Interscience (1982); Weber, P. C., Adv. Protein Chem. 41: 1-36 (1991))1991)。過飽和状態下で、システムは、溶質が折り畳まれていないおよび未変性の状態の代わりに、可溶および固体相間で分配される平衡へと向かう。結晶相における分子は秩序立っており、かつ周期的な三次元アレイに充填され、これは、蛋白質折り畳みに対して重要な凝集力の多くの同じ型、つまりファンデルワールス（van der Waals）相互作用、静電気的相互作用、水素結合、および共有結合によって、エネルギー的に支配されている(Moore, W. J., In: Physical Chemistry, 第四版, Prentice Hall, (1972), pp. 865-898)。
【００１７】
すなわち、多くの点で、蛋白質結晶化は、全分子が充填され個々のアミノ酸残基の代わりに、凝集力を最大化する、蛋白質折り畳みのより高レベルの変異として見ることができる。さらに、蛋白質結晶化および蛋白質折り畳みの両方につき、溶媒の成分は、可溶性（折り畳まれていない）および結晶（未変性）形態の間で分配される程度に対して、非常に重要な貢献をする。蛋白質マクロ分子に存在する凝集性相互作用および蛋白質折り畳みおよび蛋白質結晶化の両方に対するこれらの相互作用を変調する際に溶媒によって演じられる役割は、複雑であり、現時点では完全には理解されていない。いずれの理論に拘束されるつもりもないが、結晶化添加剤は、結晶状態における安定性に有利な形で、これらの凝集性相互作用を変調するのに参加すると考えられている。
【００１８】
結晶構造は、非−加水分解性ＡＴＰアナログ（ＡＭＰ−ＰＮＰ）、１３−残基阻害剤ペプチド（ＳＣ−８３５９８）（ＫＫＫＡＬＬＲＱＬＧＶＡＡ）およびＭｇＣｌ２の存在下で成長したＭＫ−２の結晶を用いて、解明された。ペプチドＳＣ−８３５９８の構造は、構造１に示される。
【００１９】
【化１】
2005521392.tif 000004
【００２０】
ＡＭＰ−ＰＮＰの構造は、構造２に示される。
【００２１】
【化２】
2005521392.tif 000005
【００２２】
得られたＭＫ−２結晶構造は、図１に示される。非−加水分解性ＡＴＰアナログ（ＡＭＰ−ＰＮＰ）は、図１のリボン状図におけるＭＫ−２のＡＴＰ部位にて結合しているのが分かる。残留電子密度は、プロテインキナーゼにおいてペプチド基質に結合することが知られている部位にて見えるが、阻害剤ペプチド（ＳＣ８３５９８）は、現在の構造においてはモデル化されていない。
【００２３】
ＭＫ−２複合体のＣｏｘレンダリングの立体表現は、図２に示される。また、ＭＫ−２のＡＴＰ部位に結合したＡＭＰ−ＰＮＰは、ＭＫ−２複合体のこのＣａｌｐｈａ画において、やはり見える。
【００２４】
ＭＫ−２のこの複合体は、Crystal Structure of the Catalytic Subunit of cAMP-Dependent Proteiya Kinase Complexed with MgATP and Peptide Inhibitor, Biochemistry, 1993, Vol. 32, No. 9, ページ2154-2161においてZhengらによって記載されるように、ｃ−ＡＭＰ−依存性プロテインキナーゼの三元複合体を結晶化するのに使用されるものと同様の方法で、酵素／ペプチド／Ｍｇ２＋／ＡＭＰ−ＰＮＰモル比１：３：５：２０を使用して形成された。ｃ−ＡＭＰ−依存性プロテインキナーゼの三元複合体を形成するのに用いられた手順は、ページ２１５５の最初の欄の２番目の段落に具体的に記載されている。
【００２５】
結晶の単位格子の寸法は、６つの数字、３つのユニークな辺、ａ、ｂ、およびｃ、ならびに３つのユニークな角度α、β、およびγで定義される。結晶を含む単位格子のタイプは、単位格子内に存在するこれらの変数の値および様々な対称要素によって決まる。ＭＫ−２結晶は、Ｆ４１３２の空間群を有する面心立方格子を有し、非対称性単位において三元複合体の単独コピーを含有する。単位格子寸法は、３辺に沿って、約２５４．８（＋／−２）オングストロームである。単位格子は、９６のＭＫ−２分子を含有する。
【００２６】
勿論、特定の蛋白質の結晶を入手するプロセスは、各蛋白質に対して個別的である。また、リガンドの存在は、所与の蛋白質の結晶化に深い影響を及ぼし得る。すなわち、ＭＫ−２蛋白質を結晶化するプロセスは、どの蛋白質でもそうであるように、ＭＫ−２蛋白質自体における随伴性の変化によって変化するだろう。例えば、突然変異蛋白質は、突然変異の性質、および蛋白質におけるその位置によって、野生型蛋白質と比較してわずかに異なる結晶化条件下、あるいは全く新しい結晶化条件下で、結晶化し得る。例えば、非−保存的突然変異は、結果として突然変異体の親水性の変化を招くことがあり、これは今度は、突然変異体蛋白質を、野生型蛋白質よりも可溶性あるいは不溶性にすることがある。典型的には、もし蛋白質が突然変異の結果としてより親水性になれば、それは水性溶液において、野生型蛋白質よりも可溶性であり、それを結晶化させるには、より高い沈殿濃度が必要になるだろう。逆に、もし蛋白質が、突然変異の結果として疎水性になると、それは水性溶液において不溶性になり、それを結晶化させるにはより低い沈殿濃度を必要とするだろう。もし突然変異が、結晶格子接触に関与する蛋白質の領域で起これば、結晶化条件はより予測不可能な形で影響を受けるだろう。
【００２７】
Ｘ線回折
一般に、Ｘ線結晶学からの回折データは、次のごとく入手される。結晶がＸ線ビームに置かれる時、Ｘ線が結晶を構成する分子の電子雲と相互作用すると、結果としてＸ線散乱を引き起こす。Ｘ線散乱と結晶の格子の組合せは、散乱の非均一性を上昇させ、高強度の領域は、回折Ｘ線と呼ばれる。回折ビームが結晶から出現する角度は、回折を結晶における原子の何組もの同等の平行な面からの反射であるとみなすことによって計算できる（ブラッグの法則）。結晶格子における最も明らかな組の面は、単位格子面に平行なものである。これらおよび他の組の面は、格子点を通って引くことができる。面の各組は、３つの指数、ｈｋｌによって同定される。ｈ指数は、単位格子のａ辺が切断される部分の数であり、ｋ指数は単位格子のｂ辺が切断される部分の数を示し、ｌ指数は、単位格子のｃ辺がｈｋｌ面の組によって切断される部分の数を示す。すなわち、例えば、２３５面は、各単位格子のａ辺を半分に切断し、各単位格子のｂ辺を１／３に切断し、各単位格子のｃ辺を１／５に切断する。単位格子のｂｃ面に平行な面は１００面であり；単位格子のａｃ面に平行な面は０１０面であり；単位格子のａｂ面に平行な面は００１面である。
【００２８】
検知器が回折Ｘ線の経路に置かれる時、事実上、回折の球体への切り込み、一連のスポット、または反射は記録されて、「静止」回折パターンを生む。各反射は、１組の平行面を反射するＸ線の結果であり、強度によって特徴付けられ、これは、単位格子における分子の分布、およびｈｋｌ指数に関連し、これは該スポットを生み出しているビームが反射されるところからの平行面に対応する。もし結晶がＸ線ビームに対して垂直な軸の周りに回転されると、多くの反射が検知器に記録され、結果的に回折パターンになる。
【００２９】
結晶の単位格子寸法および空間群は、その回折パターンから決定され得る。まず、反射の間隔は、単位格子の辺の長さに対して、反比例している、すなわち、もしＸ線ビームが単位格子の面に対して垂直である時に、回折パターンが記録されると、単位格子寸法のうちの２つは、検知器のｘおよびｙ方向における反射の間隔、結晶から検知器までの距離、およびＸ線の波長から推定することができる。当業者は、全ての３つの単位格子寸法を得るために、結晶は、Ｘ線ビームが単位格子のもう１つの面に対して垂直であるように回転されなければならないことを理解するだろう。第二に、単位格子の角度は、回折パターン上のスポットの線の間の角度によって決定され得る。第三に、視覚検査によって明らかであるかもしれない特定の反射の不在および回折パターンの反復性質は、結晶の内部対称性、または空間群を示す。すなわち、結晶は、単位格子および空間群、ならびにその回折パターンによって特徴付けられることができる。
【００３０】
一旦、単位格子の寸法が決定されると、非対称性単位におけるポリペプチドの大体の数は、ポリペプチドの大きさ、平均的蛋白質の密度、および通常単位格子容量の３０ないし７０％範囲内である蛋白質結晶の典型的溶媒含有量から推定できる。
【００３１】
回折パターンは、フーリエ変換による分子の三次元形状に関連する。解を決定するプロセスは、本質的には、回折Ｘ線に再度焦点を合わせて、結晶における分子の三次元イメージを生成することである。Ｘ線の再焦点合せは、このときにレンズで行うことができないため、数学的操作を介して行われる。
【００３２】
回折の球体は、結晶の内部対称性による対称性を有し、これは、結晶の特定の向きが同じ組の反射を生むであろうことを意味する。すなわち、高対称性を持つ結晶は、より反復性の回折パターンを有し、そこには、回折の完全な描写のために記録されなければならない独特の反射は少ない。データ収集、データセットの目標は、できる限り多くの反射につき、一貫して測定され、示された強度の組である。完全なデータセットは、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のユニークな反射が記録されると収集される。１つの具体例において、完全なデータセットは、１つの結晶を用いて収集される。もう１つの具体例において、完全なデータセットは、同タイプの１つ以上の結晶を用いて収集される。
【００３３】
Ｘ線源は、Rigaku RU-200といった回転陽極Ｘ線発生器またはArgonn National LaboratoryのAdvanced Photo Sourceといったシンクロトン光源のビームラインを含むが、これらに限定されるわけではない。回折パターンを記録するのに適した検知器は、Ｘ線感光フィルム、マルチワイヤエリア検知器、リンで覆われたイメージプレート、およびＣＣＤカメラを含むが、これらに限定されるものではない。典型的には、回折の結晶の球体の異なる部分からの回折を記録するために、結晶自体はゴニオスタット（goniostat）と呼ばれる可動性サークルの自動のシステムを介して動かされるように、検知器およびＸ線ビームは静止したままである。
【００３４】
特に高溶媒含有量を有するマクロ分子結晶からのデータ収集における最も大きな問題の１つは、Ｘ線ビームにおける結晶の高速劣化である。劣化を遅らせるために、データは、しばしば、液体窒素温度にて、結晶から収集される。結晶が液体窒素への最初の暴露に耐えるためには、結晶内での氷の形成は凍結保護物質の使用によって防がれなければならない。適した凍結保護物質は、低分子量ポリエチレングリコール、エチレングリコール、スクロース、グリセロール、キシリトール、およびその混合物を含むが、これらに限定されるものではない。結晶は、液体窒素への暴露前に、１つ以上の凍結保護物質を含む溶液に浸漬されていてもよく、あるいは１つ以上の凍結保護物質が結晶化溶液に添加されてもよい。液体窒素温度でのデータ収集によって、１つの結晶からの全データセットを収集することが可能である。
【００３５】
ＭＫ−２複合体の初期の結晶は、典型的には、約４ないし５オングストロームまで回折された。この回折データは、Argonn National LaboratoryのAdvanced Photon Sourceにて得られた。しかしながら、様々な添加剤の存在下で成長した共−結晶によって、改善された解像度が達成された。これらの添加剤は、一般的に結晶化を改善する添加剤から選択する。これらの好ましい結晶化添加剤は、デオキシ−ＢｉｇＣｈａｐ、ｎ−ヘキサデシル−ベータ−Ｄ−マルトシド、ｎ−トリデシル−ベータ−Ｄ−マルトシド、および塩化イットリウム六水和物を含む、これらの好ましい添加剤は結晶の改善を促進し、かつＸ−線回折において改善された解像度を達成させる。これらの好ましい添加剤は、約０ｍＭないし約２０ｍＭの間の濃度にて添加される。好ましくは、添加剤の濃度は、約１０ｍＭないし約２０ｍＭの間である。
【００３６】
すなわち、結晶化および回折両方に好ましい条件は、約０ｍＭないし約２０ｍＭ間、より好ましくは約１０ｍＭないし約２０ｍＭ間のデオキシ−ＢｉｇＣｈａｐ、ｎ−ヘキサデシル−ベータ−Ｄ−マルトシド、塩化イットリウム六水和物またはｎ−トリデシル−ベータ−Ｄ−マルトシドの濃度を含む。これらの添加剤の存在下で成長したＭＫ−２、ＡＭＰ−ＰＮＰ、マグネシウム、およびＳＣ−８３５９８の共−結晶は、４ないし５オングストローム以上の解像度まで回折することができる。好ましくは、これらの添加剤の存在下で成長したＭＫ−２、ＡＭＰ−ＰＮＰ、マグネシウム、およびＳＣ−８３５９８の共−結晶は、３．５オングストローム以上の解像度まで回折できる。より好ましくは、これらの添加剤の存在下で成長したＭＫ−２、ＡＭＰ−ＰＮＰ、マグネシウム、およびＳＣ−８３５９８の共−結晶は、約２．５ないし約３．３オングストロームまで回折が可能である。この改善された回折から、表２において示す回折データを得た。
【００３７】
【表２】
2005521392.tif 000006
【００３８】
MK-2の三次元（ｘ，ｙ，ｚ）座標を、下記の表３に、通常の蛋白質データバンク（Protein Data Bank）（ＰＤＡ）フォーマットで示す（Bernstein F.C.,らJ. Mol. Biol. (1977) 122, 535）。
【００３９】
【表３−１】
2005521392.tif 000007
【００４０】
【表３−２】
2005521392.tif 000008
【００４１】
【表３−３】
2005521392.tif 000009
【００４２】
【表３−４】
2005521392.tif 000010
【００４３】
【表３−５】
2005521392.tif 000011
【００４４】
【表３−６】
2005521392.tif 000012
【００４５】
【表３−７】
2005521392.tif 000013
【００４６】
【表３−８】
2005521392.tif 000014
【００４７】
【表３−９】
2005521392.tif 000015
【００４８】
【表３−１０】
2005521392.tif 000016
【００４９】
【表３−１１】
2005521392.tif 000017
【００５０】
【表３−１２】
2005521392.tif 000018
【００５１】
【表３−１３】
2005521392.tif 000019
【００５２】
【表３−１４】
2005521392.tif 000020
【００５３】
【表３−１５】
2005521392.tif 000021
【００５４】
【表３−１６】
2005521392.tif 000022
【００５５】
【表３−１７】
2005521392.tif 000023
【００５６】
【表３−１８】
2005521392.tif 000024
【００５７】
【表３−１９】
2005521392.tif 000025
【００５８】
【表３−２０】
2005521392.tif 000026
【００５９】
【表３−２１】
2005521392.tif 000027
【００６０】
【表３−２２】
2005521392.tif 000028
【００６１】
【表３−２３】
2005521392.tif 000029
【００６２】
【表３−２４】
2005521392.tif 000030
【００６３】
【表３−２５】
2005521392.tif 000031
【００６４】
【表３−２６】
2005521392.tif 000032
【００６５】
【表３−２７】
2005521392.tif 000033
【００６６】
【表３−２８】
2005521392.tif 000034
【００６７】
【表３−２９】
2005521392.tif 000035
【００６８】
【表３−３０】
2005521392.tif 000036
【００６９】
【表３−３１】
2005521392.tif 000037
【００７０】
【表３−３２】
2005521392.tif 000038
【００７１】
【表３−３３】
2005521392.tif 000039
【００７２】
【表３−３４】
2005521392.tif 000040
【００７３】
【表３−３５】
2005521392.tif 000041
【００７４】
【表３−３６】
2005521392.tif 000042
【００７５】
【表３−３７】
2005521392.tif 000043
【００７６】
【表３−３８】
2005521392.tif 000044
【００７７】
【表３−３９】
2005521392.tif 000045
【００７８】
【表３−４０】
2005521392.tif 000046
【００７９】
【表３−４１】
2005521392.tif 000047
【００８０】
【表３−４２】
2005521392.tif 000048
【００８１】
【表３−４３】
2005521392.tif 000049
【００８２】
【表３−４４】
2005521392.tif 000050
【００８３】
【表３−４５】
2005521392.tif 000051
【００８４】
【表３−４６】
2005521392.tif 000052
【表３−４７】
2005521392.tif 000053
【００８５】
【表３−４８】
2005521392.tif 000054
【００８６】
【表３−４９】
2005521392.tif 000055
【００８７】
【表３−５０】
2005521392.tif 000056
【００８８】
【表３−５１】
2005521392.tif 000057
【００８９】
【表３−５２】
2005521392.tif 000058
【００９０】
【表３−５３】
2005521392.tif 000059
【００９１】
【表３−５４】
2005521392.tif 000060
【００９２】
【表３−５５】
2005521392.tif 000061
【００９３】
【表３−５６】
2005521392.tif 000062
【００９４】
【表３−５７】
2005521392.tif 000063
【００９５】
【表３−５８】
2005521392.tif 000064
【００９６】
【表３−５９】
2005521392.tif 000065
【表３−６０】
2005521392.tif 000066
【００９７】
【表３−６１】
2005521392.tif 000067
【００９８】
【表３−６２】
2005521392.tif 000068
【００９９】
【表３−６３】
2005521392.tif 000069
【０１００】
【表３−６４】
2005521392.tif 000070
【０１０１】
【表３−６５】
2005521392.tif 000071
【０１０２】
【表３−６６】
2005521392.tif 000072
【０１０３】
【表３−６７】
2005521392.tif 000073
【０１０４】
【表３−６８】
2005521392.tif 000074
【０１０５】
【表３−６９】
2005521392.tif 000075
【０１０６】
【表３−７０】
2005521392.tif 000076
【０１０７】
【表３−７１】
2005521392.tif 000077
【０１０８】
【表３−７２】
2005521392.tif 000078
【０１０９】
【表３−７３】
2005521392.tif 000079
【０１１０】
【表３−７４】
2005521392.tif 000080
【０１１１】
【表３−７５】
2005521392.tif 000081
【０１１２】
【表３−７６】
2005521392.tif 000082
【０１１３】
【表３−７７】
2005521392.tif 000083
【０１１４】
【表３−７８】
2005521392.tif 000084
【０１１５】
【表３−７９】
2005521392.tif 000085
【０１１６】
【表３−８０】
2005521392.tif 000086
【０１１７】
【表３−８１】
2005521392.tif 000087
【０１１８】
【表３−８２】
2005521392.tif 000088
【０１１９】
【表３−８３】
2005521392.tif 000089
【０１２０】
【表３−８４】
2005521392.tif 000090
【０１２１】
【表３−８５】
2005521392.tif 000091
【０１２２】
【表３−８６】
2005521392.tif 000092
【０１２３】
一旦、表２におけるもののようなデータセットが収集されると、該情報を用いて、結晶における分子の三次元構造を決定する。しかしながら、適した分子モデルが存在しない場合、位相情報として知られる特定の情報が、分子の三次元形状、およびそのフーリエ変換、回折パターンの間で失われているため、これは、反射強度単独の測定から行うことはできない。この位相情報は、回折パターンにフーリエ変換を行って、結晶内の分子の三次元構造を入手するために、下記の方法によって獲得されなければならない。実際にＸ線を再度焦点を合わせて、分子のイメージを生成するのは位相情報の決定である。
【０１２４】
位相情報を得る１つの方法は、同形置換によってであり、これには、重−原子誘導体結晶を使用する。この方法において、重−原子誘導結晶内で分子に結合している重原子が決定され、次いで、この情報を使用して、未変性の結晶の三次元構造を解明するのに必要な位相情報を得る(Blundelら, 1976, Protein Crystallography, Academic Press)。
【０１２５】
位相情報を得るもう１つの方法は、分子置換によってであり、これは、新しい結晶の観察された回折パターンに対する最善の説明のために、その構造座標が新しい結晶の単位格子内で知られている関連するポリペプチドを配向および配置させることによって、その構造座標が未知のポリペプチドまたはポリペプチド複合体の新しい結晶に対する初期位相を計算する方法である。これを可能にするために、関連する分子は、同様の三次元構造を持っていなければならない。簡潔に述べると、分子置換の方法の背後にある原理は次の通りである。未知の標的のものと同様の三次元構造を持つ適したサーチモデルが、まず同定される。次いで、サーチモデルは、回転され、未知のものの単位格子内で移動される。モデルの各位置につき、モデルの構造ファクターの組が計算される。次いで、これらの計算された構造ファクターは、未知のものの測定された強度と比較され、相関係数として表現される。最も高い相関係数を持つ解が、真の解として選択される。これらの概念は、Rossmannによって編集された本「The Molecular Replacement Method」に詳細に論じられている（(1972, Int. Sci. Rev. Ser. No 13, Gordon & Breach, New York)。
【０１２６】
位相決定の第三の方法は、マルチ−波長異常分散またはＭＡＤである。この方法において、Ｘ線回折データは、入射のＸ線放射線エネルギーに近い、吸収端を持つ少なくとも１つの重原子を含有する１つの結晶からいくつかの異なる波長にて収集される。Ｘ線および電子軌道の間の共鳴は、重原子の位置を同定させるＸ線散乱における差異を導き、これは代わりに、ポリペプチドの結晶についての位相情報を提供する。ＭＡ分析の詳細な論議は、Hendrickson, 1985, Trans. Am. Crystallogr. Assoc.,21 : 11; Hendricksonら, 1990, EMBO J. 9: 1665; および Hendrickson,1991, Science 4:91で見つけることができる。
【０１２７】
位相情報を決定する第四の方法は、単独波長異常分散またはＳＡＤである。この技術において、Ｘ線回折データは、単一の未変性または重−原子誘導体結晶からの単一波長にて収集され、位相情報は、未変性の結晶における硫黄または塩素といった原子あるいは重−原子誘導結晶における重原子からの異常散乱情報を用いて抽出される。ＳＡＤ分析の詳細な論議は、Brodersenら, 2000, Acta Cryst.,D56 : 431-441で見つけることができる。
【０１２８】
位相情報を決定する第五の方法は、異常散乱またはＳＩＲＡＳによる単一同形置換である。この技術は、同形置換および異常散乱技術を組合わせて、ポリペプチドの結晶に対する位相情報を提供する。Ｘ線回折データは、通常単一の重−原子誘導体結晶からの単一波長にて収集される。単一の重−原子誘導体結晶における重原子の位置からのみ得られた位相情報は、位相角度における曖昧さを導き、これは、重原子からの異常散乱を用いて解決する。従って、位相情報は、重原子の位置および重原子の異常散乱の両方から抽出される。ＳＩＲＡＳ分析の詳細な論議は、North, 1965, Acta Cryst. 18 :212-216 ; Matthews, 1966, Acta Cryst. 20: 82-86で見つけることができる。
【０１２９】
ＭＫ−２構造は、分子置換の方法を用いて決定された。最初に、ＭＫ−２の相同性モデルは、カルシウムカルモジュリン依存性プロテインキナーゼ（アミノ酸配列のレベルにて３６％同一、１Ａ０６）、ホスホリラーゼキナーゼ（３０％、２ＰＨＫ）および環状ＡＭＰ−依存性プロテインキナーゼ（２９％、１ＡＴＰ）の結晶構造を用いて構築された。これは、結果的に、ＭＫ−２の最小キナーゼ領域に対する残基６４−３２７よりなるモデルとなった。残基６４−１４２は、ＭＫ−２のＮ−末端葉の部分に割り当てられ、残基１４３−３２７はＣ−末端領域として命名された。
【０１３０】
次いで、相同性モデルは、Ｘ−ＰＬＯＲ、ＡＭＯＲＥおよびＥＰＭＲを含むいくつかのプログラムソフトを用いて、分子置換に対するサーチモデルとして使用された。一致した解答にたどりつくために、分子置換計算を：データの分析、パターソンベクトル長、モデルのＢ−ファクター、分子／非対称単位および空間群の数（Ｆ４３２またはＦ４１３２）を含むいくつかのパラメーターを変化させることによって反復させた。結晶格子（面心立方格子）の高対称および結晶の比較的高い溶媒含有量（７２％）は、分子置換計算に有意な技術的試練を提示した。使用した３つのプログラムソフトの中で、プログラムＥＰＭＲ(Kissinger CR, Gehlhaar DR and Fogel DB Acta Crystallogr (1999) D55,484-491)のみが、３つの回転および３つの移動変数に対して一定かつ適切な解に辿り着くのに成功した。よりよい結果は、相同性モデルのポリ−アラニンテンプレートで得られ、ここに、全ての非−グリシンアミノ酸はアラニンに切断された。
【０１３１】
ＥＰＭＲを使用する成功した分子置換計算につき、１５−４オングストロームの解像範囲における解析データを使用した。最高解は、０．５２２の相関係数および５４．２％のＲ−ファクターを有した。最高解のピークの高さは、１４．２シグマであり、ここにシグマは、ＦｏｂｓおよびＦｃａｌｃ間の相関関数において、二乗平均平方根（root mean square)である。最高解に対する回転および移動パラメーターは、ＭＫ−２の２領域につき下記にリストする。
【０１３２】
【表４】
2005521392.tif 000093
【０１３３】
ＭＫ−２相同性のＮ−およびＣ−末端ドメインは、相同性モデルにおけるそれに対して、約１１度回転された。
【０１３４】
一旦、位相情報が得られると、それは回折データと組合わされて、電子密度マップ、単位格子内の分子を取り巻く電子雲のイメージを生成する。データの解明度が高いほど、共により近くにある原子は分解可能なため、電子密度マップ、例えば、アミノ酸側鎖およびペプチド骨格におけるカルボニル酸素原子の位置の特徴はより区別される。次いで、マクロ分子のモデルは、ポリペプチド配列および分子構造および立体化学の確立されたルールといった全ての入手可能な情報をガイドとして用いて、コンピューターの援助によって、電子密度マップへと組み立てられる。電子密度マップを解釈することは、マップに正確に合致する化学的に現実的な配座を見つけるプロセスである。
【０１３５】
モデルが生成された後、構造が精緻化される。精緻化は、関数Φを最小化するプロセスであり、関数Φは観察された強度値および計算された強度値（Ｒ−ファクターによって測定される）間の差異であり、これは、位置、温度ファクター、およびモデルにおける各非−水素原子の占有の関数である。通常、これは現実空間精緻化の代替サイクル、つまり電子密度マップおよびモデル組立の計算、ならびに逆空間精緻化、つまり、オリジナルの強度データおよび各順次モデルから生じた強度データ間の一致を改善しようという計算的な試みに関与する。関数Φが最小に収束する時、精緻化は終了し、ここにモデルは電子密度マップに合致し、立体化学的かつ立体配置的に合理的である。精緻化の間、秩序立った溶媒分子は、構造に加えられる。ＭＫ−２相同性モデルの変換された座標は、結晶学的精製に対する初期モデルとして使用された。多くの異なる結晶学的精緻化プロトコルが、評価された。最も良い結果は、モデルが、２５００Ｋｅｌｖｉｎの初期温度を割り当てた力学的ねじれ角精緻化手順で得られた。精緻化の終わりのＲ−ファクターおよびＲｆｒｅｅは、それぞれ、２４．７％および３０．７％であった。
【０１３６】
分子置換計算からの最も良い解で、ＭＫ−２の初期モデルを、相同性モデルを用いて構築した。次いで、このモデルを、数回の結晶学的精緻化に付した。次いで、電子密度マップを計算した。図３に示されるように、はっきりした電子密度は、ＭＫ−２のＡＴＰ部位にて、ＡＭＰ−ＰＮＰにつき目に見えた。
【０１３７】
また、強く連結した電子密度は、恐らくＡＭＰ−ＰＮＰとの強い相互作用のため、グリシンフラップ領域（残基７１−７６）につき、観察された。加えて、電子密度は、相同性モデルから除外されたいくつかのループにおけるいくつかの欠損したアミノ酸残基につき存在した。
【０１３８】
先に記載したような双方向的な形で、ＭＫ−２モデルは、構造中により多くの原子を含ませることによって、徐々に改善された。Ｎ−末端は、残基４５、結晶化に使用されたＭＫ−２構築体の一番目のアミノ酸残基まで延長された。同様に、Ｃ−末端は、残基３５１まで延長された。これは、ＭＫ−２の自動−阻害領域の部分を含む。最終精緻化のＲ−ファクターおよびＲｆｒｅｅは、それぞれ、２４．７％および３０．７％（８．０−３．０Ａ解像度）であった。次のアミノ酸は、電子密度中に明確に位置できなかったため、現在のモデルからは除外されている：156-157、216-226、268-274および352-371。加えて、次の残基は、それらの側鎖が曖昧さなしに同定することができなかったため、アラニンとしてモデル化された：Arg 153、Asp 155、Lys 197、Met 275、Lys 276、Ile 277、Arg 278、Glu 309、Pro 310、Thr 311、Gln 312、Ser 328、Thr 329、Lys 330、Val 331、Pro 332、Gly 333、Thr 334、Pro 335、Leu 336、His 337、Thr 338、Ser 339、Arg 340、Val 341、Leu 342、Lys 343、Glu 344、Asp 345、Lys 346、Glu 347、Arg 348、Trp 349、Glu 350およびAsp 351。
【０１３９】
ＡＴＰ−アナログ、ＡＭＰ−ＰＮＰは、ＭＫ−２のＡＴＰ部位にて狭いポケット中で結合する。ＡＴＰ結合部位は、アミノ酸残基によって定義される（ＡＭＰ−ＰＮＰの周り半径８．０Ａ内）：69-80、90-95、104、108、118-119、136-147、184-195、204-210、および224-226。具体的に、アミノ酸残基69-80は：Val 69、Leu 70、Gly 71、Leu 72、Gly 73、Ile 74、Asn 75、Gly 76、Lys 77、Val 78、Leu 79、およびGln 80である。アミノ酸残基90-95は: Phe 90、Ala 91、Leu 92、Lys 93、Met 94、およびLeu 95である。アミノ酸残基104および108は、Glu 104およびHis 108であり、アミノ酸残基118-119は、Val 118およびArg 119である。セグメント136-147は、次のアミノ酸を含有する:Ile 136、Val 137、Met 138、Glu 138、Cys 140、Leu 141、Asp 142、Gly 143;Gly 144、Glu 145、Leu 146、およびPhe 147。ペプチドセグメント184-195は、アミノ酸：His 184、Arg 185、Asp 186、Val 187、Lys 188、Pro 189、Glu 190、Asn 191、Leu 192、Leu 193、Tyr 194、およびThr 195よりなる。アミノ酸残基204-210は: Lys 204、Leu 205、Thr 206、Asp 207、Phe 208、Gly 209、およびPhe 210である。
【０１４０】
ＡＭＰ−ＰＮＰのアデニン環は、残基Glu 139およびLeu 141のペプチド骨格とで水素結合相互作用を形成する。加えて、アデニンの二環式環は、残基Ala 91、Met 138、Cys 140、Val 118、Leu 70、およびVal 78とで近接した接触を形成する。ＡＭＰ−ＰＮＰのリボース糖は、残基Gly 71、Leu 72、Glu 145、およびLeu 193と相互作用する。三リン酸部分は、アミノ酸残基、Leu 72、Gly 73、Ile 74、Asn 75、Val 78、Asp 207、Lys 93、Lys 188、Asn 191、Glu 190、およびThr 206によって囲まれている。ＭＫ−２の自動−阻害ドメインは、蛋白質上で折り畳まれ、ＡＴＰおよびペプチド基質の結合部位に近づく。結果として、ＡＴＰ結合部位は、さらに拘束される。
【０１４１】
本発明の原子構造座標および機械読み取り可能媒体は、様々な用途を持つ。本発明は、下記のソフトウェアプログラムおよび他のソフトウェアプログラムで使用するためのポリペプチドの三次元構造を発生させるのに使用される構造座標および他の情報、例えば、アミノ酸配列、結合性テーブル、ベクトルベースの表示、温度ファクター等を網羅する。例えば、表３にリストされる座標は、三次元結晶または他の蛋白質の液体構造を高解像度まで解明するのに有用である。ＭＫ−２は、他の相同性蛋白質の回折格子において結晶化され得る。
【０１４２】
加えて、本発明は、本明細書中に記載するモデルの三次元構造、またはその蛋白質に埋め込まれた機械読み取り可能媒体を網羅する。本明細書中で使用されるごとく、「機械読み取り可能媒体」は、コンピューターまたはスキャナーによって、直接読み取られたり、アクセスされたりすることが可能な媒体を指す。そのような媒体は：例えばフロッピーディスクのような磁気記憶装置媒体、ハードディスク記憶装置媒体および磁性テープ；光学ディスクまたはＣＤ−ＲＯＭのような光学記憶装置媒体；ＲＡＭまたはＲＯＭのような電気記憶装置体；および磁気／光学記憶装置媒体といったこれらのカテゴリーのハイブリッドを含むが、これらに限定されるものではない。そのような媒体は、さらに、スキャニングデバイスによって読み取られることが可能であり、Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ（ＯＣＲ）で三次元構造へ変換されることが可能な、例えばＣａｒｔｅｓｉａｎ座標のような原子構造座標の表現が記録される紙を含む。
【０１４３】
様々なデータ記憶装置構造が、本発明の原子構造座標またはその部分および／またはＸ−線回折データを記録したコンピューター読み取り可能媒体を作る業者には入手可能である。データ記憶装置構造の選択は、一般に、記憶された情報にアクセスするために選択された方法に基づくだろう。加えて、様々なデータ処理プログラムおよびフォーマットを使用して、コンピューター読み取り可能媒体上に配列およびＸ−線データ情報を記憶させることが可能である。そのようなフォーマットは、蛋白質データバンク（Protein Data Bank）(「ＰＤＢ」)フォーマット(Research Collaboratory for Structural Bioinformatics ; http://www.rcsb.org/pdb/docs/format/pdbguide2.2/guide2.2frame.html) ;ケンブリッジ結晶学データセンター（Cambridge Crystallographic Data Centre）フォーマット(http://www. codc. cam. ac.uklsupport/csd doc/volume3/z323. html) ;構造−データ（Structure-data）(「ＳＤ」)ファイルフォーマット(MDL Information Systems, Inc.; Dalby etal., 1992, J. Chem.In Comp. Sci. 32: 244-255)、および例えばＳＭＩＬＥＳ(Weininger, 1988, J. Chem.Inf. Comp. Sci. 28: 31-36)で使用されるような線−記号を含む。異なるコンピューターソフトウェアによって読み取られる様々なフォーマット間の変換方法は、当業者にはすぐに明らかだろう、例えばＢＡＢＥＬ(v. 1.06, Walters & Stahl,01992, 1993,1994 ; http://www.brunel.ac.uktdepartmentstchem/babel.htm)。本明細書中で記載するポリペプチド座標の全てまたはその部分のフォーマット表示は、本発明によって熟考されている。本発明の原子座標を記憶したコンピューター読み取り可能媒体を提供することによって、当業者は、ルーチン的に、本発明の原子座標、またはその部分、および下記するモデリングおよびデザインプログラムで使用するための関連情報にアクセスできる。
【０１４４】
デカルト座標は重要かつポリペプチドの三次元構造の便利な表示であるが、当業者はすぐに構造の他の表示もまた有用であることを認識するだろう。すなわち、本明細書中で論議するように、ポリペプチドの三次元構造は、デカルト座標表示だけでなく、原子の三次元分布の全ての代替表示も含む。例えば、原子座標は、Ｚ−行列として表示されてもよく、ここに蛋白質の第１の原子が選択され、第２の原子は第１の原子から定義された距離に位置され、第３の原子は第１の原子と定義された角度を作るように第２の原子から定義された距離に位置されている。各連続する原子は、第３の原子に対して特定の角度で、第４の原子に対して特定のねじれ角度にて、先に置かれた原子から定義された距離に位置される。また、原子座標は、パターソン（Patterson）関数として表示され、ここに全ての原子間のベクトルが引かれ、次いで、原点にそれらの尾部を置く。この表示は、単位格子内に重原子を配置する際に特に有用である。加えて、原子座標は、大きさおよび方向を有する連続するベクトルとして表示され、ポリペプチド構造中の選択された原点から各原子まで引かれる。さらに、三次元構造中の原子の位置は、単位格子の分率（分率座標）、または球面の極座標として表示されてもよい。
【０１４５】
また、構造における各原子の動きを測定する熱パラメーター、多重−鎖蛋白質の特定の鎖を同定する鎖同定、または原子が置かれる蛋白質共−複合体、および特定の原子がどの原子に結合しているかを示す結合性情報といったさらなる情報は、三次元分子構造を表示するのに有用である。
【０１４６】
原子構造座標の使用：薬物設計
また、しばしば原子構造座標の形態での構造情報は、例えば改変された生物学特性を有する変異体を設計したり、あるいはコンピューターで設計したり、ＭＫ−２蛋白質またはＭＫ−２蛋白質の断片に結合する化合物を同定するためにスクリーニングしたりするための様々な分子モデリングおよびコンピューター−ベースのスクリーニングアプリケーションにおいて使用されることもある。そのような化合物は、医薬努力におけるリード化合物として使用されて、炎症性疾患または炎症の治療における薬物として有用かもしれない化合物を同定することもできる。
【０１４７】
すなわち、本発明のさらなる側面において、ＭＫ−２の結晶構造からのデータを使用して、薬物としてのそれらの有用性につき化合物を評価する。これらの方法は、そのような共−結晶の三次元構造の原子座標を用いて、候補化合物を設計したり、合成したり、様々な医薬アプリケーションにおける利用性についてスクリーニングしたりすることを含む。そのような医薬アプリケーションは、炎症、炎症疾患状態、および関連状態の治療を含む。
【０１４８】
１つの具体例において、それから得られた共−結晶および構造座標は、炎症および炎症疾患状態用の新しい治療剤を開発するアプローチとして、ＭＫ−２を阻害する化合物を同定および／または設計するのに有用である。例えば、高解像度Ｘ−線構造は、しばしば、蛋白質の周りの秩序立った溶媒分子の位置、および特に蛋白質の推定上の結合部位またはその近くを示す。次いで、この情報を使用して、これらの部位で結合する分子を設計することができ、次いで、これは合成され、生物学アッセイにおいて結合につきテストされ得る(Travis, 1993, Science 262: 1374)。
【０１４９】
もう１つの具体例において、構造は複数の分子で探索されて、様々な部位にてＭＫ−２蛋白質に結合する能力を決定する。そのような化合物は、例えば、炎症、炎症疾患状態または他の障害の治療において潜在的な治療的重要性を持つ阻害剤を同定しようという医薬品化学の試みにおける標的またはリードとして使用され得る。
【０１５０】
本明細書中の具体的な具体例において、ＭＫ−２共−構造の高解像度Ｘ線構造は、ＭＫ−２およびＡＭＰ−ＰＮＰ間の相互作用の詳細を見せる。この情報を使用して、相互作用の箇所に結合する分子を設計し、それにより共−複合体形成を阻害する。
【０１５１】
さらにもう１つの具体例において、構造は、ＭＫ−２に全体的あるいは部分的に結合することができる化学体または化合物に対する小分子データベースをコンピューター的にスクリーンするのに使用され得る。このスクリーニングにおいて、結合部位へのそのような化学体または化合物の合致の質は、形相補性または推定される相互作用エネルギーのいずれかによって判断される（Meng et al.,1992, 5J : Comp. Chem. 13: 505-524)。
【０１５２】
本発明によるＭＫ−２へ結合する化合物の設計は、一般に、２つの要因を含む。まず、化合物は、物理的かつ構造的に、ＭＫ−２と結合可能でなければならない。この結合は、共有結合または非−共有結合である。例えば、共有結合性相互作用は、蛋白質の自滅阻害剤または不可逆性阻害剤を設計するのに重要である。ＭＫ−２の結合において重要な非−共有結合性分子の相互作用は、水素結合、イオン性および他の極性相互作用、相互作用ならびにファンデルワールス相互作用を含む。第二に、化合物は、ＭＫ−２蛋白質と結合することを許容する配座を仮定することが可能でなければならない。化合物のある部分は、蛋白質とのこの結合に直接参加はしないが、それらの蛋白質は、それでも分子の全体的な配座に影響を及ぼすかもしれない。これは、代わりに、作用強度に有意な影響を持つかもしれない。そのような立体配座の必要は、結合部位の全てまたは一部分に関連する化学群または化合物の全体的な三次元構造および配向、または蛋白質と直接相互作用するいくつかの化学群を含む化合物の官能基の間の間隔を含む。
【０１５３】
ＭＫ−２に対する化学化合物の潜在的阻害性または結合効果は、コンピューターモデリング技術の使用によって、その実際の合成およびテストの前に分析することができる。もし所与の化合物の理論的構造が、それと蛋白質間の不十分な相互作用および結合を示唆するならば、化合物の合成およびテストは不必要である。しかしながら、もしコンピューターモデリングが、強い相互作用を示せば、分子を合成し、蛋白質に結合しその活性を阻害する能力につきテストしてもよい。このように、無効な化合物の合成は避けることができる。
【０１５４】
ＭＫ−２の阻害化合物または他の結合化合物は、コンピューター上で評価され、化学群または断片が、個々の結合ポケットと結合する能力または各々の蛋白質の表面に干渉する能力につきスクリーニングされ選択される連続した工程の方法によって、設計される。当業者は、いくつかの方法の中の１つを用いて、ＭＫ−２と結合する能力につき、化学群または断片をスクリーニングすることができる。この工程は、ＭＫ−２、ＡＭＰ−ＰＮＰ、マグネシウム、およびＳＣ８３５９８共−複合体座標に基づいた、例えば、蛋白質／蛋白質界面コンピュータースクリーン上のＭＫ−２の様々な結合部位の視覚視察によって始まる。次いで、選択された断片または化学群は、様々な向きに位置され、あるいは共−複合体またはＭＫ−２の他の結合部位における蛋白質／蛋白質界面に関与するＭＫ−２の個々の表面にドッキングされる。ドッキングは、ＱＵＡＮＴＡおよびＳＹＢＹＬといったソフトウェアを用い、引き続いて、ＣＨＡＲＭＭおよびＡＭＢＥＲといった通常の分子力学的力場によるエネルギー最小化および分子動力学を用いて達成される。
【０１５５】
また、専門のコンピュータープログラムは、断片または化学群を選択するプロセスにおいて援助するかもしれない。これは：
１．ＧＲＩＤ(Goodford, 1985,J. Med. Chem. 28 : 849-857)。ＧＲＩＤは、Oxford University, Oxford, UKから入手可能である; 
２．ＭＣＳＳ(Miranker &Karplus,1991, Proteins: Structure, Function and Genetics 11: 29-34)。ＭＣＳＳは、Molecular Simulations, Burlington, MAから入手可能である; 
３．ＡＵＴＯＤＯＣＫ(Goodsell & Olsen, 1990, Proteins: Structure, Function, and Genetics 8: 195-202)。ＡＵＴＯＤＯＣＫは、Scripps Research Institute, La Jolla, CAから入手可能である; 
４．ＤＯＣＫ(Kuntzら, 1982, J. Mol. Biol. 161: 269-288)。ＤＯＣＫは、University of California, San Francisco,CAから入手可能である; 
５．ＦｌｅｘＥ(Clausen H, Buning C, Rarey MおよびLengauer T) J. Mol. Biol. (2001) 308,377-395。ＦｌｅｘＥは、Tripos, St. Louis, Missouriから入手可能である; 
６．Ｇｌｉｄｅ、Ｇｌｉｄｅは、Schrodinger, Portland,Oreganから入手可能である;
７．Ｇｏｌｄ、Jonesら J. Mol. Biol. 245,43-53, 1995; 
８．ＱＸＰ、McMartin C, Bohacek RS. J Comput Aided Mol Des 1997 11: 333-44; 
９．ＩＣエム。(http ://www. molsoft. com)。Molsoft, San Diego, Californiaから入手可能;および
１０．ＦｌｅｘＸ。[Sybl, Tripos, St. Louis, Missouri]
を含む。
【０１５６】
一旦、適した化学群または断片が選択されると、それらは１つの化合物または阻害剤へと構築される。構築は、ＭＫ−２の構造座標と関連して、コンピュータースクリーン上にディスプレイされる三次元イメージにおけるお互いとの断片の関係の視覚視察によって進む。
【０１５７】
個々の化学群またはその断片を結合させる際に、当業者を援助する有用なプログラムは：
１．ＣＡＶＥＡＴ(Bartlettら, 1989, 'CAVEAT: A Program to Facilitate the Structure-Derived Design of Biologically Active Molecules'. In Molecular Recognition in Chemical and Biological Problems', Special Pub. , Royal Chem. Soc. 78: 182-196)。ＣＡＶＥＡＴは、University of California, Berkeley, CAから入手可能である; 
２．ＭＡＣＣＳ−３Ｄ(MDL Information Systems, San Leandro, Calif. )のような3Dデータベースシステム。この分野は、Martin, 1992, J. Med. Chem. 35: 2145-2154)において論評されている;および
３．ＨＯＯＫ(Molecular Simulations, Burlington, Mass.から入手可能)
を含む。
【０１５８】
上記したように、１度に１つの断片または化学群で、少しずつＭＫ−２の阻害剤を組み立てていく代わりに、ＭＫ−２結合化合物または阻害剤は、空の結合部位または共−複合体において蛋白質／蛋白質相互作用に関与するまたは所望により既知の（複数の）阻害剤のいくつかの部分を含む蛋白質の表面のいずれかを用いて、全体として、あるいは「デ・ノボ」として構築されてもよい。これらの方法は：
１．ＬＵＤＩ(Bohm, 1992, J. Comp. Aid.Molec. Design 6: 61-78)。ＬＵＤＩは、Molecular Simulations,Inc., San Diego, CAから入手可能である; 
２．ＬＥＧＥＮＤ(Nishibata & Itai, 1991, Tetrahedron 47: 8985)。ＬＥＧＥＮＤは、Molecular Simulations, Burlington, Mass.から入手可能である; および
３．ＬｅａｐＦｒｏｇ(Tripos, Inc. , St. Louis, Mo.から入手可能)を含む。
【０１５９】
また、本発明に従い、他の分子モデリング技術が使用されてもよい。例えば、Cohenら, 1990, J. Med. Chem. 33: 883-894参照。また、Navia & Murcko, 1992, Current Opinions in Structural Biology 2: 202-210参照。
【０１６０】
一旦、化合物が上記の方法によって設計または選択されると、化合物がＭＫ−２に結合する効率は、コンピューター上の評価によってテストされ、最適化することができる。ＭＫ−２の効果的な阻害剤は、好ましくは、その結合状態および遊離状態の間のエネルギーの比較的小さな差異を明示しなければならない（つまり、それは結合の小さな変形エネルギーを有する）。すなわち、最も効果的な阻害剤は、好ましくは、約１０ｋｃａｌ／ｍｏｌを超えない程度の結合の変形エネルギー、好ましくは、７ｋｃａｌ／ｍｏｌを超えない結合の変形エネルギーで設計されるべきである。阻害剤は、全体的な結合エネルギーが似ている１つ以上の立体配座における蛋白質と相互作用する。そういった場合、結合の変形エネルギーは、遊離化合物および阻害剤が蛋白質に結合する時に観察される立体配座の平均的エネルギー間の差異と捉えられる。
【０１６１】
ＭＫ−２に結合あるいはＭＫ−２を阻害するために選択または設計された化合物は、さらに、コンピューターで最適化され、その結合状態において、それは好ましくは標的蛋白質と反発的静電気相互作用を欠損している。そのような非−相補静電気的相互作用は、反発的な電荷−電荷、双極子−双極子および電荷−双極子相互作用を含む。具体的には、阻害剤がそれに結合している時の阻害剤と蛋白質の間の全ての静電気的相互作用の合計は、好ましくは、結合のエンタルピーに対して中立的あるいは有利な寄与をする。
【０１６２】
具体的なコンピューターソフトウェアは、化合物変形エネルギーおよび静電気的相互作用を評価するために、当該分野で入手可能である。そのような使用のために設計されたプログラムの例は：Ｇａｕｓｓｉａｎ  ９２，  ｒｅｖｉｓｉｏｎ  Ｃ(Frisch, Gaussian,Inc., Pittsburgh, PA.1992（著作権）);ＡＭＢＥＲ，  ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．０(Kollman, University of California at SanFrancisco, 1994（著作権）); ＱＵＡＮＴＡ／ＣＨＡＲＭＭ(Molecular Simulations, Inc., Burlington, MA,1994（著作権）);およびＩｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ／Ｄｉｓｃｏｖｅｒ(Biosym TechnologiesInc., San Diego, CA, 1994（著作権）)を含む。これらのプログラムは、当該分野でよく知られるように、例えばコンピューターワークステーションを用いて、実行することができる。他のハードウェアシステムおよびソフトウェアパッケージは、当業者に知られるだろう。
【０１６３】
ＭＫ−２活性の阻害剤を設計するコンピューター−援助の方法は、デ・ノボあるいは候補化合物に基づいていてもよい。すなわち、ＭＫ−２活性の阻害剤をデ・ノボで設計するコンピューター−援助の方法の例は、次の工程を含むだろう：（１）コンピューターモデリングアプリケーションに、ＭＫ−２またはＭＫ−２−様ＡＴＰ結合部位の少なくとも部分を含む分子または分子複合体の構造座標の１組を供給し、該ＡＴＰ結合箇所は、69-80、90-95、104、108、118-119、136-147、184-195、204-210、および224-226アミノ酸配列を含む；（２）コンピューターモデリングアプリケーションに、化学体の構造座標を１組与え；次いで（３）化学体が分子または分子複合体と結合あるいは干渉すると予測される阻害剤であるか否かを決定する、ここに分子または分子複合体との結合あるいは干渉は、ＭＫ−２活性の潜在的阻害の指標である。
【０１６４】
候補化合物に基づいてＭＫ−２活性の阻害剤を設計するコンピューター−援助の方法の例は、次の工程を含む：（１）コンピューターモデリングアプリケーションに、ＭＫ−２またはＭＫ−２−様ＡＴＰ結合部位の少なくとも部分を含む分子または分子複合体の構造座標の１組を供給し、該ＡＴＰ結合部位は、69-80、90-95、104、108、118-119、136-147、184-195、204-210、および224-226アミノ酸配列を含む；（２）コンピューターモデリングアプリケーションに、化学体の構造座標を１組与え；（３）分子または分子複合体の化学体およびＡＴＰ結合部位の間の潜在的結合相互作用を評価し；（４）化学体を構造的に修飾して、修飾された化学体につき構造座標を１組得て；次いで（５）修飾された化学体が阻害剤であるか否かを決定する。
【０１６５】
一旦、阻害剤またはＭＫ−２結合化合物が、上記のごとく、最善な形で選択または設計されると、その結合性質を改善または修飾するために、置換がその原子または化学群のいくつかにおいて行われる。一般的には、最初の置換は保存的である、つまり、置換基は、オリジナルの基と大体同じ大きさ、形状、疎水性および電荷を有するだろう。当業者は、立体配座を変化させる当該分野で知られる置換は避けられるべきであることを理解するだろう。次いで、そのような変化した化学化合物は、上記に詳細に記載したものと同じコンピューターの方法によって、ＭＫ−２に結合する効率につき分析される。
【０１６６】
すなわち、ＭＫ−２活性の阻害剤を同定するそのようなコンピューター−援助の方法の例は、（１）コンピューターモデリングアプリケーションに、ＭＫ−２またはＭＫ−２−様化合物の少なくとも一部分を含む分子または分子複合体の構造座標を１組供給し、（２）コンピューターモデリングアプリケーションに、化学体の構造座標を１組供給し；次いで（３）化学体が分子または分子複合体と結合または干渉すると予測される阻害剤であるか否かを決定する、を含む。
【０１６７】
ＭＫ−２共−複合体、またはＭＫ−２のみ、またはその部分の構造座標は、もう１つの分子へとさらに複雑化したＭＫ−２共−複合体の突然変異体のＭＫ−２の他の共−複合体の構造、またはＭＫ−２の官能基領域に相同する有意なアミノ酸配列を持つ他の蛋白質または蛋白質共−複合体の結晶形態の構造を解明するのに特に有用である。
【０１６８】
この目的のために使用される１つの方法は、分子置換である。この方法において、未知の共−結晶構造、それがもう１つのＭＫ−２共−複合体、突然変異体、もう１つの分子へとさらに複合したＭＫ−２共−複合体、または共−複合体結晶における蛋白質のうちの１つの官能性ドメインに相同性の有意なアミノ酸配列を持つ他の蛋白質または蛋白質共−複合体の結晶であれ、それは、現在のＭＫ−２共−複合体構造座標からの位相情報を用いて決定することができる。この方法は、新しい結晶における未知の蛋白質または蛋白質共−複合体に、はじめからそのような情報を決定しようと試みるよりも、迅速かつ効率的に、正確な三次元構造を提供するだろう。
【０１６９】
もし未知の結晶形態が、既知の共−複合体結晶形態と同じ空間群および同様の格子寸法を有するならば、既知の結晶形態から由来する位相は、未知の結晶形態に直接適用することができ、代わりに、未知の結晶形態の電子密度マップを計算することができる。次いで、差異電子密度マップを使用して、未知の結晶形態および既知の結晶形態の間の差異を検査することができる。差異電子密度マップは、１つの電子密度マップの減算であり、例えば、もう１つの電子密度マップから、既知の結晶形態から引いたもの、例えば、未知の結晶形態から引いたものである。すなわち、２つの電子密度マップの同様の特徴は、減算の中で除外され、２つの構造間の差異のみが残る。しかしながら、もし２つの結晶形態の空間群および／または格子寸法が異なるなら、このアプローチはうまくいかず、未知の結晶形態に対する位相を由来するために、分子置換が使用されなければならない。
【０１７０】
Ｘ−線回折の技術は、ＭＫ−２の共−複合体の研究において使用できる。すなわち、この情報を使用して、ＭＫ−２の既知の阻害剤を最適化することができ、より重要なことには、ＭＫ−２の阻害剤の新規なクラスを設計および合成することができる。
【０１７１】
また、原子構造座標のサブセットは、上記方法のいずれにおいても使用可能である。座標の特に有用なサブセットは、単一ドメインの座標、活性部位に並んでいる残基の座標、界面にて重要な蛋白質−蛋白質接触に関与する残基の座標、およびＣアルファ座標を含むが、これらに限定されるものではない。例えば、蛋白質は原子座標の大きな組によって完全に描写されているが、活性部位を含有する蛋白質の１ドメインの座標を使用して、その部位に結合する阻害剤を設計することができる。すなわち、下記の具体的な具体例で詳細に記載するように、多くのアプリケーションにおいて有用ではあるが、１組の全ポリペプチド鎖を定義する原子座標は本明細書中に記載する方法については使用する必要はない。
【０１７２】
具体的な具体例における原子座標のサブセットの使用
本発明の構造座標、およびそのサブセットは、ＭＫ−２蛋白質に結合する化合物を設計またはスクリーニングするのに有用である。本発明の共−複合体の高解像度Ｘ−線構造は、ＭＫ−２およびＡＭＰ−ＰＮＰの間の相互作用を詳細に見せる。この情報を使用して、ＭＫ−２の阻害剤として作用する化合物を設計および／またはスクリーニングすることができ、それにより、転写後レベルにてＴＮＦ−αの生合成を阻害する。
【０１７３】
当業者は、ＭＫ−２共−複合体構造座標の完全な組が、本発明の方法において有用であることを認識するだろう。さらに、当業者は、ＭＫ−２共−複合体の座標が、ＭＫ−２蛋白質の座標と離した方が有用であることを認識するだろう。加えて、当業者は、単一ドメインまたは界面または結合ポケットの座標のようなＭＫ−２蛋白質の構造座標のサブセットが、下記にて詳細に論議するように、本発明の方法において有用であることを認識するだろう。
【０１７４】
上記のＭＫ−２の構造を解明する技術を用いて、ＡＴＰ−アナログはＭＫ−２のＡＴＰ部位にて狭いポケット内で結合すると決定された。ＡＴＰ結合部位は、アミノ酸残基によって定義される（ＡＭＰ−ＰＮＰ／Ｍｇ２＋の周り半径８．０Ａ内）：69-80、90-95、104、108、118-119、136-147、184-195、204-210、および224-226。すなわち、ＭＫ−２のＡＴＰ部位のＭＫ−２座標、またはＭＫ−２座標のサブセットは、ＭＫ−２のＡＴＰ部位の結合を破壊する化合物を設計および／またはスクリーニングするのに有用である。そのような化合物は、潜在的に、ＡＴＰ、ＡＴＰアナログ、または他のＭＫ−２と関係のないリガンドの結合を破壊するのに有用である。本発明のこの具体例に有用なＭＫ−２座標のサブセットは、アミノ酸残基69-80、90-95、104、108、118-119、136-147、184-195、204-210、および224-226のものを含む。
【０１７５】
ＡＭＰ−ＰＮＰのアデニン環は、残基Glu 139およびLeu 141のペプチド骨格と水素結合相互作用を形成する。加えて、アデニンの二環式環は、残基、Ala 91、Met 138、Cys 140、Val 118、Leu 70、およびVal 78と近接した接触を形成する。ＡＭＰ−ＰＮＰのリボース糖は、残基、Gly 71、Leu 72、Glu 145、およびLeu 193と相互作用する。三リン酸部分は、アミノ酸残基、Leu 72、Gly 73、Ile 74、Asn 75、Val 78、Asp 207、Lys 93、Lys 188、Asn 191、Glu 190、およびThr 206によって囲まれている。これらの物理的相互作用が、ＭＫ−２共−複合体の形成または安定を援助する限り、ＭＫ−２のこれらの部位のＭＫ−２座標、またはＭＫ−２座標のサブセットは、ＭＫ−２およびＡＴＰアナログの共−複合体の安定および結果的に恐らく形成を破壊する化合物につき、設計および／またはスクリーニングするのに有用である。本発明のこの具体例に有用なＭＫ−２座標のサブセットは、それがＡＭＰ−ＰＮＰのアデニン環との水素結合相互作用に関連するように、アミノ酸残基のGlu 139およびLeu 141を含む。本発明のこの具体例に有用なＭＫ−２座標のサブセットは、それがアデニンの二環式環によって形成される接触に関連するように、Ala 91、Met 138、Cys 140、Val 118、Leu 70、およびVal 78を含む。本発明のこの具体例に有用なＭＫ−２座標のサブセットは、それがＡＭＰ−ＰＮＰのリボース糖との相互作用に関連するように、アミノ酸残基Gly71、Leu 72、Glu 145、およびLeu 193を含む。本発明のこの具体例に有用なＭＫ−２座標のサブセットは、それが三リン酸部位との相互作用に関連するように、Leu 72、Gly 73、Ile 74、Asn 75、Val 78、Asp 207、Lys 93、Lys 188、Asn 191、Glu 190およびThr 206を含む。
【０１７６】
次の実施例は本発明を説明するが、示されるごとく本発明の様々な側面を限定するように受け取られるべきではない。
【実施例】
【０１７７】
実施例１  ＭＫ−２蛋白質の産生
具体的なＭＫ−２配列（図４にリストされる）を、Ｅ−ｃｏｌｉにおける発現のため、グルタチオンｓトランスフェラーゼとの融合蛋白質として使用した。
【０１７８】
実施例２  蛋白質精製
ヒトＭＫ−２を、Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（LysS）細胞内のＧＳＴ融合蛋白質として発現させた。５００ｇのＥ．ｃｏｌｉ細胞ペーストを２ＬのＰＢＳ中で懸濁し、１００００ｐｓｉ圧力下で、マイクロフルイダイザー（microfluidizer）を用いて、超音波処理した。溶解物を、１１３００ｘｇにて、二度、遠心し、上澄みをその度に収集した。上澄みを、４−８℃にて、４５分間、１００ｍｌの５０パーセントＰＢＳで洗浄したグルタチオン樹脂と、結合させた。樹脂を、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で、１０カラム容量のＰＢＳで洗浄し、次いで２０カラム容量のＰＢＳで洗浄した。ＧＳＴ−タグを開裂するために、次いで樹脂を室温にて４時間、２５００単位のトロンビンと混合した。次いで、ＰＭＳＦ、ＤＴＴおよびグリセロールを添加した。溶出物を、４０倍容量の透析緩衝液(５０ｍＭ Ｔｒｉｓ， ｐＨ８．８，２ｍＭ ＤＴＴ， ５％ グリセロール)に対して緩衝液を交換した。透析物質を、２０カラム容量(緩衝液Ａ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ， ｐＨ８．８， ２ｍＭ ＤＴＴ， ５％ グリセロール; 緩衝液Ｂ： １ＭＮａＣｌ以外は緩衝液Ａと同じ)を超える０−２５ｍＭのＮａＣｌグラジエントを用いて、ＭｏｎｏＱカラムに流した。最も純粋なＭＫ−２（＞９８％）は、−１５ｍＭのＮａＣｌの前面のピークにて溶離した。この物質を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ蛋白質濃縮器または（ＭＷＣＯ＝１０ｋＤ）内で、１ないし１５ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、結晶化実験において使用した。
【０１７９】
実施例３  ＭＫ−２の結晶化
ＭＫ−２（４５ないし３７１）の結晶を、室温にて、蒸気拡散のシッティングドロップ（sitting drop）方法によって成長させた。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ， ｐＨ ８．５−８．８，または５０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６−６．３，−１５ｍＭ  ＮａＣｌ, ２ｍＭ  ＤＴＴ中の１．５−１５  ｍｇ／ｍＬ  ＭＫ−２ (４５−３７１）、および５％  グリセロールよりなる蛋白質溶液を、１．６−２．６Ｍの硫酸アンモニウムおよび１００ｍＭのｐＨ  ４．２−５．４の酢酸ナトリウム、またはｐＨ  ３．８−６．２のクエン酸を含有する滞め溶液と、１：１比率で混合した。１ないし２日で、小さな双錐体またはプリズム形状の結晶が滴中に現れ、１ないし３週間にわたり、０．４ｍｍｘ０．４ｍｍほどの大きさまで成長した。結晶構造を、非-加水分解性ＡＴＰアナログ（ＡＭＰ−ＰＮＰ）、13-重体阻害剤ペプチド（ＳＣ−８３５９８）およびＭｇＣｌ２の存在下で成長したＭＫ−２の結晶を用いて解明した。この三元複合体を、Crystal Structure of the Catalytic Subunit of cAMP-Dependent Protein Kitzase Complexed with MgATP and Peptide Inhibitor, Biochemistry, 1993, Vol. 32, No. 9, pages 2154-2161,2155においてZhengらによって記載されるように、ＣＡＭＰ−依存性プロテインキナーゼの三元複合体を結晶化する際に使用する方法と同様の方法で、１：３：５：２０の酵素／ペプチド／Ｍｇ２＋／ＡＭＰ−ＰＮＰ分子比率を用いて、形成した。ＭＫ−２複合体の最初の結晶は、Argonne National Laboratoryの高度フォトン源（Advanced Photon Source）で、典型的に、４ないし５オングストロームまで回折した。Hampton Researchからの結晶化添加剤スクリーニングキットを使用して、先に言及した結晶条件に添加した時に、得られた結晶の回折を３．０オングストロームまで改善した添加剤を同定した。
【０１８０】
実施例４  ＭＫ−２構造決定
ＭＫ−２の四角ないし双錐体状結晶を、実施例２記載のごとく入手した。これらの結晶は、面心立体格子を持つ空間群Ｆ４１３２（空間群Ｎｏ．２１０）に属し、非対称単位において、三元複合体の単一コピーを含有する。単位細胞パラメーターは、三辺に沿って、約２５４．８オングストロームである。添加剤の存在は、回折解像度を３．０オングストロームまで改善した。完全な回折データは、Darian, Illinoisのthe Advanced Photon Source of the Argonne National Labにて、Beamline171DのシンクロトンＸ−線を用いて、推定上の三元複合体のいくつかの結晶から入手した。結晶を、液体窒素中で瞬間冷凍した。個々の結晶からのデータセットの概要は、下記に再表記する表２にある。
【０１８１】
【表５】
2005521392.tif 000094
【０１８２】
個々の結晶からの回折データを合わせると、結果として、完全なデータセット（５．６％の全体的なＲ混合で９９．８％完全）を得た。
【０１８３】
ＭＫ−２の相同性モデルを、環状−ＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（１ＡＴＰ）、カルモジュリン−依存性プロテインキナーゼ（１Ａｏ６）およびホスホリラーゼキナーゼ（２ＰＨＫ）の構造を用いて構築した。これにより、結果的に、最小キナーゼドメインにつき、６４ないし３２７の残基を含むＭＫ−２のモデルを得た。相同性モデルを、プログラムＥＰＭＲを用いて、分子置換に対するサーチモデルとして使用した。よりよい結果を、相同性モデルのポリアラニンテンプレートで得、ここに全ての非−グリシンアミノ酸を、アラニンへ切断した。残基６４ないし１４２を、ＭＫ−２のＮ−末端ローブの部分に割り当て、残基１４３ないし３２７をＣ−末端ドメインとして設計した。解像度範囲１５ないし４．０Ａにおける回折データを、分子置換計算につき使用した。最高解は、０．５２２の相関係数および５４．２％のＲ−ファクターを有した。最高解のピークの高度は、１４．２シグマであり、ここにシグマは、ＦｏｂｓおよびＦｃａｌｃの間の相関関数における二乗平均平方根（root mean square)変動である。最高解に対する回転および移動パラメーターは、ＭＫ−２の２つのドメインにつき、下記にリストした。
【０１８４】
【表６】
2005521392.tif 000095
【０１８５】
ＭＫ−２相同性のＮ−およびＣ−末端ドメインを、相同性モデルにおけるものに対して、約１１度回転した。ＭＫ−２相同性モデルの変換された座標を、結晶学精緻化に対する初期モデルとして使用した。多くの異なる結晶学精密化プロトコルを評価した。最も良い結果は、モデルが、２５００Ｋｅｌｖｉｎの初期温度を割り当てた力学的ねじれ角精緻化手順で得られた。精緻化の最後のＲ−ファクターおよびＲ−ｆｒｅｅは、それぞれ、２４．７％および３０．７％であった。ＭＫ−２の、リガンド、ＡＭＰ−ＰＮＰとの全体的な構造は、図１に示される。
【０１８６】
電子密度マップを、この段階で計算した。はっきりとした電子密度は、図３に示すように、ＭＫ−２のＡＴＰ部位にて、ＡＭＰ−ＰＮＰおよびＭｇ２＋につきはっきり見える。加えて、電子密度は、初期モデルから除外したループ領域のいくつかにおいて欠落しているアミノ酸についても見える。
【０１８７】
ＡＴＰ−アナログは、ＭＫ−２のＡＴＰ部位にて、狭いポケット内で結合する。ＡＴＰ結合部位は、アミノ酸残基によって定義される（ＡＭＰ−ＰＮＰ／Ｍｇ２＋の周り半径８．０Ａ内）：69-80、90-95、104、108、118-119、136-147、184-195、204-210,および224-226。はっきりとした電子密度は、恐らくＡＭＰ−ＰＮＰとの強い相互作用のため、グリシンフラップ領域８７１ないし７６）につき観察された。ＡＭＰ−ＰＮＰのアデニン環は、残基Glu 139およびLeu 141のペプチド骨格との水素結合相互作用を形成する。加えて、アデニンの二環式環は、残基、Ala 91、Met 138、Cys 140、Val 118、Leu 70、およびVal 78と緊切な接触を形成する。ＡＭＰ−ＰＮＰのリボース糖は、アミノ酸残基、Leu 72、Gly 73、Ile 74、Asn 75、Val 78、Asp 207、Lys 93、Lys 188、Asn 191、Glu 190およびThr 206によって囲まれている。ＭＫ−２の自動−阻害ドメインは、蛋白質上で折り畳まれ、ＡＴＰおよびペプチド基質の結合部位に近づく。結果として、ＡＴＰ結合部位は、さらに拘束される。
【図面の簡単な説明】
【０１８８】
【図１】図１は、ＭＫ−２結晶構造のリボン状図である。
【図２】図２は、ＭＫ−２複合体を与えるＣαの立体表現である。
【図３】図３は、ＭＫ−２結晶構造の電子密度マップである。
【図４】図４は、ヒトＭＫ−２蛋白質の配列（配列番号１）である。
【図５】図５は、ヒトＭＫ−２蛋白質、アミノ酸数４５ないし３７１、の部分の配列（配列番号２）であり、これは、本出願で議論されるように、ＭＫ−２の結晶を入手するのに使用された。
【配列表】
2005521392.tif 000096
2005521392.tif 000097
2005521392.tif 000098
2005521392.tif 000099
【図１】
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【図２】
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【図３】
2005521392.tif 000102
【図４】
2005521392.tif 000103
【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年2月1日(2005.2.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005521392000001.app