(57)【要約】本発明は、一般的には、軸索の修復を行う方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の中枢神経系傷害部位において軸索の修復又は再生を刺激する方法であって、成体神経細胞中で喪失又は欠失している成長円錐タンパク質ファミリーの２以上の要素を前記傷害部位に存在する神経細胞の細胞体中に導入することを備え、前記刺激が達成される条件下で、前記導入が実施される、方法。
【請求項２】
前記要素が、関連するが相補的な機能を軸索成長円錐中で有する、請求項１の方法。
【請求項３】
前記要素がＧＡＰ−４３とＣＡＰ−２３、又はそれらの類縁体若しくは機能的部分を備える、請求項１の方法。
【請求項４】
前記要素のうち少なくとも１つが、ＭＡＲＣＫＳ、ＭａｃＭＡＲＣＫＳ、パラレミン、ＧＡＰ−４３、ＣＡＰ−２３、並びにそれらの類縁体及び機能的部分からなるタンパク質の群から選択される、請求項１の方法。
【請求項５】
前記要素をコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列が、前記ＤＮＡ配列が発現され且つ前記要素がそれによって生成される条件下で、前記神経細胞の細胞体中に導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つのＤＮＡ配列がプロモーターに作用可能に連結されたベクター中に存在する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ベクターがウイルス又はプラスミドベクターである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ウイルスが神経向性ウイルスである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ウイルスがヘルペス、シンドビス、ポリオ、仮性狂犬病、又はアデノウイルスである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１つのＤＮＡ配列がリポフェクションによって導入される、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
前記リポフェクションに用いるリポソームが標的誘導分子に化学的に連結された陽イオン性脂質を備える、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的誘導分子が、ホルモン、神経伝達物質、又は抗体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つのＤＮＡ配列が裸のＤＮＡプラスミドとして導入される、請求項５に記載の方法。
【請求項１５】
前記要素が前記傷害部位に存在する神経細胞の細胞体中に直接導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
患者の中枢神経系傷害部位において軸索の修復又は再生を刺激する方法であって、前記傷害部位に存在する神経細胞を、成体神経細胞中で喪失又は欠失している成長円錐タンパク質ファミリーの２以上の要素の発現を活性化させる物質と、前記刺激が達成される条件下で接触させることを備えた方法。
【請求項１７】
前記要素がＧＡＰ−４３とＣＡＰ−２３をその中に備える、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
軸索の修復又は再生を刺激することができる被検化合物をスクリーニングする方法であって、成体神経細胞を前記被検化合物と接触させることと、前記被検化合物の不存在下で、前記成体神経細胞中で喪失又は欠失している成長円錐タンパク質ファミリーの２以上の要素の発現の活性化についてアッセイすることとを備え、前記発現を活性化する被検化合物が軸索の修復又は再生を刺激するために使用する候補物質である、方法。
【請求項１９】
前記要素がＧＡＰ−４３とＣＡＰ−２３を備える、請求項１８の方法。
【請求項２０】
神経系の病変又は疾患又は機能不全に伴う神経損傷を治療する方法であって、このような治療を必要としている患者に、前記治療を達成させるように軸索の修復又は再生を刺激する能力を有している請求項１８に記載の方法によって同定可能な一定量の化合物を投与することを備えた、方法。
【請求項２１】
前記神経損傷が脊髄傷害、頭部外傷、又は卒中に起因する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記神経損傷が神経変性疾患に起因する、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００１年１０月１１日に出願された米国仮出願第６０／３２８，１０２号の優先権を主張し、その内容は参考文献として本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所によって与えられたＥＹ１１４７５の下で、政府の支援を受けてなされたものである。合衆国政府は、本発明に対して一定の権利を有している。
【０００３】
本発明は、一般的には、軸索の修復を実施する方法に関する。
【背景】
【０００４】
神経細胞は、長い線維（エクソン（ｅｘｏｎ）と呼ばれる）を伸ばして、他の細胞とシナプス接触を行うことにより、神経系内で機能的な接続を形成する。哺乳動物の脳と脊髄中の損傷を受けた軸索は、再生しないのが通常である。その結果、中枢神経系の外傷、卒中、又は変性疾患によって、永久的な失明、麻痺、その他の機能喪失がもたらされる。ここ２０年にわたる研究によって、中枢神経系の再生に対する２つの主な障害が明らかとなってきた。１つは、軸索の伸長を直接阻害することができるタンパク質とプロテオグリカンが中枢神経系の膠細胞上に存在しているということである(Fidler et al, J. Neurosci. 19: 8778-8788 (1999), Goldberg et al, Nature 403:369-370 (2000), Chen et al, Nature 403:434-439 (2000), Davies et al, J. Neurosci. 19:5810-5822 (1999))。効果的な再生を開始する軸索でさえ、これらの阻害的なシグナルに遭遇すると停止してしまうことがある。中枢神経系の修復に対する別の大きな障害は、軸索が切断された神経細胞は再生を補助するのに十分な遺伝子発現のプログラムを活性化できないことが多いということである。特に、軸索の成長円錐（伸長する軸索の運動性先端）のタンパク質成分をコードする遺伝子は、一般に、成熟した神経細胞中では抑制されているが、末梢神経の傷害によって容易に再活性化される(Skene et al, J. Cell Biol. 89: 96-103 (1981), Skene, Ann. Rev. Neurosci. 12:127-156 (1989), Caroni, Bioessays 19:767-775 (1997))。しかし、中枢神経系が傷害を受けると、これらの成長関連タンパク質（ＧＡＰｓ）の少なくとも一部は、傷害を受けた神経細胞の大部分で抑制されたままとなる(Skene et al, J. Cell Biol. 89: 96-103 (1981), Kalil et al, J. Neurosci. 6:2563-2570 (1986), Doster et al, Neuron 6: 1-13 (1991), Schreyer et al, J. Neurobiol. 24: 959-970 (1993), Fernandes et al, J. Comp. Neurol. 414:495-510 (1999))。
【０００５】
このような遺伝子制御の差異が重要であることは、末梢神経の切片を脳又は脊髄中に移植し、中枢神経系の軸索に軸索の成長を補助する環境を与えることによって調べられた(David et al, Science 214: 931-933 (1981), Richardson et al, J. Neurocytol. 13: 165-182 (1984), So et al, Brain Res. 328: 349-354 (1985), Friedman et al, J. Neurosci. 5: 1616-1625 (1985))。中枢神経系の軸索中には、長い距離を再増殖してこれらの神経移植片に到達するものも存在するが、細胞体が損傷部位の数ミリ以内に位置する神経細胞からしか再生は起こらない。このような近接した損傷は、受傷神経細胞の小集団中でのＧＡＰ発現を活性化することが可能であり、再生する軸索は専らこれらのＧＡＰ発現細胞から生じる(Campbell et al, Exp. Brain Res. 87:67-74 (1991), Schaden et al, J. Neurobiol. 25:1570-1578 (1994))。
【０００６】
軸索切断によって誘導される遺伝子が再生において果たす中心的な役割は、後根神経節（ＤＲＧ）神経細胞に対して最も見事な実証がなされており、後根神経節神経細胞は、脊髄を上行する長い中枢神経系軸索と、末梢神経を通じて投射する第二の軸索分枝をともに有している点が特徴的である。ＤＲＧ脊髄軸索の遮断によって、ＧＡＰ遺伝子は誘導されず(Schreyer et al, J. Neurobiol. 24: 959-970 (1993), Chong et al, J. Neurosci. 14:4375-4384 (1994))、受傷軸索は再生することができない(Richardson et al, Nature 309:791-793 (1984))。しかし、脊髄損傷を末梢神経傷害と組み合わせると、神経細胞はその脊髄軸索を神経移植片中に再生させる能力を有するようになる(Richardson et al, Nature 309: 791-793 (1984))。実際、最近の研究によって、これらのＤＲＧ軸索は、かなりの距離にわたって、脊髄の本来的環境内で再生可能であることが示されている(Davies et al, J. Neurosci. 19: 5810-5822 (1999), Neumann et al, Neuron 23: 83-91 (1999))。
【０００７】
これらの観察結果は、中枢神経系の軸索再生の成否を決する上で、末梢神経の傷害によって活性化される遺伝子が重大な役割を担っている可能性があることを示している。基礎的な問題は、これらの遺伝子のうちの何れが、再生の引き金を引くのに必要であるかということである。最も広く研究が行われてきた例は、軸索再生の成功と相関が高いＧＡＰ−４３（軸索成長円錐の豊富な成分）の遺伝子である(Skene, Ann. Rev. Neurosci. 12: 127-156 (1989), Caroni, Bioessays 19: 767-775 (1997))。ＧＡＰ−４３の喪失により、細胞接着分子に反応して軸索の伸長が損なわれ(Meiri et al, J. Neurosci. 18:10429-10437(1998))、中枢神経系のミエリンによる成長円錐の崩壊が起こりやすくなり(Aigner et al, J. Cell Biol. 128:647-660 (1995))、成長時における軸索誘導とシナプスの編成が破壊される(Strittmatter et al, Cell 80: 445-452 (1995), Maier et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:9397-9402 (1999), Zhu et al, Exp. Neurol. 155:228-242 (1999))。成体神経細胞では、ＧＡＰ−４３の過剰発現によって、軸索末端での発芽が増大する(Caroni, Bioessays 19:767-775 (1997), Caroni et al, J. Cell Biol. 136:679-692 (1997), Buffo et al J. Neurosci. 17:8778-8791 (1997))。しかし、ＧＡＰ−４３のみを補給しても、再生を誘導するのには十分でない(Neumann et al, Neuron 23:83-91(1999), Buffo et al J. Neurosci.17:8778-8791(1997))。
【０００８】
本発明の少なくとも一部は、ＤＲＧ神経細胞による軸索伸長を刺激する末梢神経傷害の効果を模倣することができる遺伝子をさらに探索するためのインビトロアッセイの使用から生まれたものである。この探索によって明らかとなった遺伝子は、インビボで脊髄軸索の再生を満足に誘導する。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、一般的には、軸索の修復を行う方法に関する。より具体的には、本発明は、軸索の修復を行う方法であって、他の増殖関連遺伝子とともにＧＡＰ−４３を使用して、中枢神経系の軸索の再生を促進させることを備えた方法に関する。
【００１０】
本発明の目的と利点は、以下の記載から明らかとなるであろう。
【００１１】
本発明は、軸索の修復又は再生を刺激する方法であって、成体神経細胞中で喪失又は欠失しているのが通例である成長円錐タンパク質ファミリーの２以上の要素をコードするＤＮＡ配列を神経細胞の細胞体中に導入することを備えた方法に関する。本発明の要点の１つは、関連する機能であるが相補的な機能を軸索成長円錐中で有する２以上のタンパク質をコードする配列を組み合わせて使用することである。本方法の第２の重要な特徴は、軸索の成長を刺激すべき神経細胞の細胞体中で、目的の配列を直接発現させることである。従来のデザインでは、膠細胞又は他の非神経細胞中で、サイトカイン、神経栄養性因子、又は他の細胞外シグナル伝達分子の遺伝子を発現させることを目指してきた。これらのデザインは、神経細胞に副次的に作用して成長を刺激させ得る分泌因子を発現させるという原理に基づいている。
【００１２】
好ましい実施形態では、前記ＤＮＡ配列は、タンパク質ＧＡＰ−４３（ニューロモジュリン又はＢ５０としても知られる）とＣＡＰ−２３（ＮＡＰ２２又はＢＡＳＰ１としても知られる）をコードする。これらのタンパク質は、軸索の成長円錐中で、ホスホイノシチド脂質シグナル伝達分子、カルモジュリン、及びアクチンの分布と活性を各タンパク質がモジュレートするという点で関連する機能を有している。膜への誘導に要するタンパク質ドメインと、脂質及びタンパク質シグナル伝達分子との相互作用に要するタンパク質ドメインとは、ＧＡＰ−４３とＣＡＰ−２３で異なるので、これらは相補的である。これらの特性を共有する他のタンパク質には、ＭＡＲＣＫＳ、ＭａｃＭＡＲＣＫＳ、及びパラレミン（ｐａｒａｌｅｍｍｉｎ）が含まれる。このような配列は、ＧＡＰ−４３及びＣＡＰ−２３に代えて、あるいはＧＡＰ−４３及びＣＡＰ−２３とともに使用することができる。
【００１３】
ある遺伝子の発現を誘導する外来性ＤＮＡ構築物は、神経細胞中で遺伝子発現を誘導することができる任意のウイルス、プラスミド、又は他のベクターを利用することができる。ある実施形態では、ＧＡＰ−４３（又はその類縁体、例えば、米国特許第６，１０６，８２４号を参照）及びＣＡＰ−２３（又はその類縁体）をコードするＤＮＡ配列は、傷害を受けた軸索によって取り込まれ、その神経細胞の細胞体に逆行性に輸送される組換えウイルス中に挿入される。このようなウイルスには、ヘルペス、シンドビス、ポリオ、仮性狂犬病、及びアデノウイルスなどの公知の神経向性ウイルス群が含まれるが、これらに限定されるものではない。コード配列を標的神経細胞中に輸送するのに用いることができる他の任意の輸送体（ｖｅｈｉｃｌｅ）を用いても、同様の結果を得ることができる。
【００１４】
成長関連タンパク質の組合せを用いた軸索修復は、例えば、直接的遺伝子治療を用いて実施することができる。適切な組合せの遺伝子（又はタンパク質自体）を傷害又は損傷神経細胞中に導入するためには、実質的に任意のウイルス又は非ウイルスベクターを用いることができる。上述のように、コード配列は、インビボで、ウイルスベクター中に導入することができる。このようなベクターには、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、乳頭腫ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などの弱毒又は欠陥ＤＮＡウイルスが含まれるが、これらに限定されるものではない。ウイルス遺伝子を完全に又はほぼ完全に欠如した欠陥ウイルス（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｖｉｒｕｓ）が好ましい。欠陥ウイルスベクターの使用によって、ベクターが他の細胞に感染する可能性を懸念せずに、特異的な局所領域中に存在する細胞への投与が可能となる。
あるいは、ベクターは、インビボでリポフェクションによって導入することもできる。リポソームによるトランスフェクションにおいて遭遇する困難や危険を抑えるようにデザインされた合成陽イオン脂質を、本配列のインビボでのトランスフェクション用のリポソームを調製するために使用することができる（Felgner, et. al. ,1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:7413-7417; Mackey, et al. , 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 8027-8031)参照）。陽イオン性脂質を用いることによって、負に帯電した核酸の封入を促進させることができるとともに、負に帯電した細胞膜との融合も促進させることができる(Felgner and Ringold, 1989, Science 337:387-388)。インビボでの神経系へのリポフェクションも行われている(Holt, Neuron 4: 203-214 (1990))。インビボで神経系の中に外来遺伝子を導入するためにリポフェクションを用いることには、実践的な利点がある。特定の細胞にリポソームを分子誘導することは、利点の１つである。限られた種類の神経細胞に直接トランスフェクトすれば、脳のように、このような細胞の不均質性が見られる組織において特に有利である。脂質は、誘導を行う目的で、他の分子に化学的に連結させることができる。標的に誘導されるペプチド（例えば、ホルモン又は神経伝達物質）や、抗体などのタンパク質、又は非ペプチド分子を、リポソームに化学的に連結させることができる。
【００１５】
コード配列は、裸のＤＮＡプラスミドとして導入することもできる。軸索が切断されているために、軸索の細胞質が露出している場合は、特に当てはまる。切断された軸索に近接した任意のＤＮＡが取り込まれ、軸索輸送機構を介して、細胞体に輸送され得る（プラスミドは、細胞体で核内に入ることができる）。
【００１６】
本発明のコード配列は、ＤＮＡベクター輸送体を介して導入することもできる（例えば、Wu et al, J. Biol. Chem. 267:963-967(1992) ; Wu and Wu, J. Biol. Chem. 263:14621-14624 (1988); Hartmut et al. ,1990年3月15日に出願されたカナダ特許出願第2,012,311号を参照）。
【００１７】
本発明によれば、前記コード配列は、ベクター中で任意のプロモーターの制御下に置くことができる。前記プロモーターは、限られた期間の間、前記コード配列を高レベル発現することが好ましい。このため、好ましいプロモーターとは、初期遺伝子のウイルスプロモーターなどの、短時間活性を示すプロモーターである。ある実施形態では、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の前初期プロモーターは、一過性発現を達成するために用いることができる。
【００１８】
あるいは、誘導性プロモーターを用いてもよい。
使用可能なプロモーターには、ＳＶ４０初期プロモーター領域(Benoist and Chambon, Nature 290:304-310(1981))、ラウス肉腫ウイルスの３’ＬＴＲ中に含有されるプロモーター(Yamamoto et al, Cell 22:787-797(1980))、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagner et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 1441-1445 (1981))、メタロチオネイン遺伝子の制御配列(Brinster et al, Nature 296:39-42 (1992))、及び、組織特異性を示し、トランスジェニック動物中で用いられる転写制御領域が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００１９】
本発明の軸索修復は、内在性遺伝子（例えば、ＧＡＰ−４３とＣＡＰ−２３）を活性化する薬剤を用いて、例えば、ＧＡＰ−４３とＣＡＰ−２３の発現の刺激を誘導することによって行うこともできる。
【００２０】
軸索修復は、模倣体（例えば、ＧＡＰ−４３とＣＡＰ−２３模倣体）を用いて行うこともできる。適切な模倣体には、ＧＡＰ−４３とＣＡＰ−２３、又は他のＭＡＲＣＫＳ関連タンパク質の生化学的作用を模倣するようにデザインされたペプチド又は融合タンパク質が含まれる。
【００２１】
さらなる実施形態では、本発明は、ＧＡＰ−４３、ＣＡＰ−２３、又は関連遺伝子を活性化させることができる薬物又はその他の処置をスクリーニングする方法に関する。軸索再生をもたらすのは遺伝子の組合せであることを実証することによって、軸索再生の促進に使用するための物質を検出するアッセイに対する基礎が与えられる。インビトロ又はインビボで成体神経細胞に付与し、例えば、ＧＡＰ−４３とＣＡＰ−２３の同時発現を引き起こす能力をモニタリングすることによって、薬物又は他の処理を調べることができる。発現の測定には、遺伝子発現を測定するための任意の標準的手法（ノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲ、インシチュハイブリダイゼーション、ＤＮＡアレイなど）を用いることができる。
【００２２】
さらに別の実施形態では、本発明は、再生を補助する神経細胞の能力を迅速に評価するインビトロアッセイに関する。本明細書に記載されているのは、成体神経細胞が効果的な軸索再生をインビボで補助する能力を正確に予測するインビトロアッセイである。本アッセイによれば、細胞体の直径の２倍を超えて突起を伸長させるパーセンテージ又は細胞が測定され、最も長い軸索突起の長さが測定され、最長突起から形成された分枝点の数も測定される（Smith and Skene, J. Neuro. 17: 646 (1997)も参照）。
【００２３】
本方法は、軸索の再成長が機能的な回復を促進させ得る多くの状況、すなわち、脊髄傷害、頭部外傷、卒中、変性疾患、とりわけ、中枢神経系の軸索を破壊する傷害（ｉｎｓｕｌｔ）に適用可能である。さらに、これは、後根内のＤＲＧ神経細胞の中枢に投射した軸索に作用する病変（例えば、後根剥離、「縮んだ（ｐｉｎｃｈｅｄ）」根など）に適用することができる。ＧＡＰ−４３とＣＡＰ−２３、又は他の成長関連タンパク質の少数の組合せを発現させると、後根の病変の効果的な修復が刺激される。
【００２４】
本発明は、神経系の病変又は疾病又は機能不全に伴う神経損傷を治療する方法を提供する。好ましくは、治療を受ける患者はヒトであるが、本発明の方法は、ヒト以外の哺乳動物にも用いることができる。
【実施例】
【００２５】
＜実験の詳細＞
以前の記載どおりに(Caroni et al, J. Cell Biol. 136:679-692 (1997), Aigner et al, Cell 83:269-278 (1995))、神経細胞特異的なＴｈｙ−１プロモーターの制御下にあるニワトリのＧＡＰ−４３又はＣＡＰ−２３を発現しているトランスジェニックマウス系統を、系統ｗｔ３（ＧＡＰ−４３）及び系統ｃ１１（ＣＡＰ−２３）から得た。従来の研究によって、鳥類のタンパク質はホスホイノシチドの分布とアクチンの動態をモジュレートするのに有効であり、哺乳類の神経細胞中で軸索の発芽を刺激できることが示された(Frey et al, J. Cell Biol. 149:1443-1453 (2000), Laux et al, J. Cell Biol. 149:1455-1471 (2000))。成体中での導入遺伝子発現のレベルが発育中の神経細胞中での内在性ＧＡＰ−４３及びＣＡＰ−２３の発現と同様になるように、前記トランスジェニック系統を選択した。導入遺伝子の発現は出生から約６日後に始まり、成体期間を通じて継続する。標準的なＰＣＲ法を用いて、マウスの遺伝子型を決定した。プライマー（５’−ＣＣＡＡＣＡＧＣＧＧＡＧＡＡＡＡＡＡＧＧＧ−３’）と（５’−ＴＣＴＴＣＴＴＴＣＡＣＣＴＣＴＴＣＣＴＧＣ−３’）は、ニワトリＧＡＰ−４３導入遺伝子から３８０ｂｐのＤＮＡ断片を増幅し、ＣＡＰ−２３導入遺伝子については、プライマー（５’−ＡＡＧＧＡＴＧＣＴＣＡＧＧＴＣＴＣＴＧＣ−３’）および（５’−ＧＴＣＴＴＴＴＴＧＧＣＴＴＣＣＣＣＴＴＣＣ−３’）が３１７ｂｐ断片を増幅する。何れのプライマー対も、マウス由来の対応する内在遺伝子は増幅しない。各導入遺伝子が陽性のマウスを交配して、実験動物のヘテロ接合性を確保し、二重トランスジェニック動物を作製した。対照動物は、同じ血統の同腹仔として得た。
【００２６】
インビトロ分析の場合、概ね既述のごとく(Smith et al, J. Neurosci. 17:646-658(1997))、成体マウス（８週齢超）の後根神経節（ＤＲＧ）神経細胞を解離させ、有髄軸索、細胞の破砕物、非神経細胞を除去するために、Ｆ１４培地中の１０％フィコールのクッションを通して、２００×ｇで１０分間遠心した。Ｎ１補充物を含有する無血清Ｆ１４培地中に神経細胞を再懸濁し、既述のように(Smith et al, J. Neurosci. 17:646-658(1997))、ポリリシン／ラミニンでコートされたガラス製カバーグラス上に置いた。標準的な２４ウェルプレートの１２ウェル中に、１２乃至１４個の神経節から得た細胞を置いた。１８−２４時間後に、室温で３０分間、培養物を４％のパラホルムアルデヒド中に固定し、洗浄し、ニワトリＣＡＰ−２３（モノクローナル抗体１５Ｃ１）とニワトリＧＡＰ−４３（ウサギポリクローナル抗体）を発現している神経細胞を検出するために、抗体で染色した(Caroni et al, J. Cell Biol. 136:679-692(1997), Aigner et al, Cell 83:269-278(1995))。全ての神経細胞突起を可視化するために、β  ＩＩＩチュブリンに対する抗体(MAB 1637; Chemicon, Temecula, California)を用いて培養物を染色した。ＣＣＤカメラで細胞を観察し、マッキントッシュ用のＩＰＬａｂ  ３．２(Scanalytics, Inc. , Fairfax, VA)で解析した。適切な導入遺伝子が強く染色された神経細胞のみを解析した。対照培養では、神経細胞特異的なβ  ＩＩＩチュブリンが強く染色された細胞を解析した。細胞体の直径の２倍を超える突起を有する細胞を記録した。次いで、各細胞の最も長い突起の長さと、該突起に沿って形成された分枝の数とを計測した。
【００２７】
インビボで脊髄軸索の再生を解析するためには、頚胸接合部の高さで、成体マウス（４週齢超）の脊髄両側の脊髄後索において、ＤＲＧの軸索を横切開した。一方の側の坐骨神経の断片を切除し、脊髄損傷部位中に移植した(Richardson et al, Nature 309:791 (1984), Richardson et al, J. Neurocytol. 15;585 (1986))。１乃至４ヶ月後に、脊髄から５ｍｍの神経移植片中に蛍光トレーサーｄｉＩを導入した。さらに５日後に、経心臓的に、４％のパラホルムアルデヒドを動物に灌流し、後根神経節を取り出し、３０％スクロース中に後固定した。蛍光顕微鏡下で、３０ミクロンのクリオスタット切片を調査した。蛍光標識された細胞を計数し、遺伝子型と末梢神経傷害による差を、両側ＡＮＯＶＡと、その後のフィッシャーのＰＬＳＤポストホック検定によって解析した(StatView; SAS Inc., Cary, NC)。導入遺伝子を発現している細胞を同定するために、ニワトリＣＡＰ−２３とＧＡＰ−４３に対する抗体、次いで、Alex Fluor 488とAlex Fluor 350で標識された二次抗体(Molecular Probes, Eugene, OR)によってクリオスタット切片を染色した。各標識用の狭帯域フィルターを用いて、切片を観察した。一次抗体で染色されていないか、又は１つの一次抗体のみで染色された対照切片によって、シグナルに検出可能な交差は存在しないことが確認された。
【００２８】
＜結果＞
軸索再生の開始に必要な遺伝子を同定するために、軸索傷害によってＤＲＧ神経細胞中に誘導された軸索伸長の転写依存的スイッチをモニターする短期インビトロアッセイを用いた(Smith et al, J. Neurosci. 17: 646-658 (1997))。成体の動物から神経細胞を切除し、１８−２４時間培養した(Smith et al, J. Neurosci. 17:646-658 (1997))。この切除中に神経細胞は軸索切断されるので、全ての増殖関連遺伝子を誘導することによって最終的に応答するであろう(Smith et al, J. Neurosci. 17: 646-658 (1997))。しかし、培養当初２４時間には、軸索の伸出は、動物から神経細胞を除去した時点で神経細胞中に既に発現されていた遺伝子のみに依存する(Smith et al, J. Neurosci. 17: 646-658 (1997))。予め何らの処理も施さずに成体マウスから単離した神経細胞（ナイーブ神経細胞）は、限られた数の伸出を示すにすぎず（Smith et al, J. Neurosci. 17:646-658 (1997)と図１）、比較的短く多数の分枝を有する軸索の発生を特徴とした（図２と３）。これに対して、切除の数日前に末梢神経損傷に応答した神経細胞は、軸索を伸長する確率がずっと高く（図１）、軸索は長く、分枝が少なかった（図２と３）。この「細長い」成長は、インビボでの神経再生に必要とされる伸長に類似しており、末梢神経傷害によって誘導された遺伝子の発現を反映している(Smith et al, J. Neurosci. 17:646-658 (1997))。
【００２９】
この再生的な成長を誘発する遺伝子を同定するために、成体神経細胞中で特異的な増殖関連タンパク質の発現が維持されているトランスジェニック動物から、神経細胞を単離した(Caroni et al, J. Cell Biol. 136: 679-692 (1997), Aigner et al, Cell 83: 269-278 (1995))。成体ＤＲＧ神経細胞中でのＧＡＰ−４３の持続的な発現によって、短期伸出アッセイにおいてナイーブな成体神経細胞が軸索を伸長させる傾向が増加したが（図１）、それらの軸索の多くは、比較的短く、１００−１５０μｍのモード長を有していた（図２）。ＧＡＰ−４３を発現している細胞のうち、末梢神経傷害によって誘導された種類の（３００μｍを超える）長い軸索を伸長させたのはごく一部であった（図２）。これが、導入遺伝子の発現が不十分であることによるものでないことを確かめるために、ニワトリＧＡＰ−４３に対する抗体で培養物を染色した。少なくとも８０％のＤＲＧ神経細胞が導入遺伝子発現の強い染色を示し、本明細書で報告した解析にはこのような細胞のみを含めた。長い軸索の伸長に対してＧＡＰ−４３がほとんど効果を及ぼさないことは、ＧＡＰ−４３単独ではインビボにおける中枢神経系の軸索再生を誘発するには十分でないという従来の報告のとおりである(Neumann et al, Neuron 23:83-91 (1999), Buffo et al J. Neurosci. 17:8778-8791 (1997))。このことは、局所の軸索分枝が伸長した成長に移行する上で、さらなる遺伝子が関与していることを示唆している。
【００３０】
ＧＡＰ−４３は、末梢神経傷害によって誘導される別の主要な成長円錐成分であるＣＡＰ−２３と数多くの特徴を共有している(Wiederkehr et al, Experimental Cell Research 236: 103-116 (1997))。ＧＡＰ−４３とＣＡＰ−２３は何れも、カルモジュリン、アクチンフィラメント、プロテインキナーゼＣ、及びホスホイノシチドと相互作用する、ＭＡＲＣＫＳ関連群に属するアシル化膜タンパク質である(Wiederkehr et al, Experimental Cell Research 236:103-116 (1997), Mosevitsky et al, Biochimie 79:373-384 (1997), Maekawa et al, J. Biol. Chem. 274: 21369-21374 (1999))。トランスジェニックマウスでは、ＧＡＰ−４３とＣＡＰ−２３はともに、インビボでの軸索末端における局所的な発芽を増強させる(Caroni, Bioessays 19:767-775(1997), Aigner et al, Cell 83:269-278(1995))。従って、末梢神経傷害の後に、ＣＡＰ−２３が単独であるいはＧＡＰ−４３と共同して、軸索伸長の誘導に寄与することができるかについて測定を行った。ＧＡＰ−４３と同様に、ＣＡＰ−２３の持続的な発現によって、短期培養物中で軸索を伸長させた成体ＤＲＧ神経細胞の数が増加したが（図１）、長い軸索の伸長は起こさなかった（図２）。しかしながら、ＧＡＰ−４３とＣＡＰ−２３を同時発現させると、ＤＲＧ神経細胞の大集団が長い（３００μｍ超）軸索を伸長するように誘導された（図２）。
【００３１】
ＧＡＰ−４３とＣＡＰ−２３の同時発現の効果は、何れかのタンパク質単独の効果と質的に異なっていた。各タンパク質単独の場合には、主として軸索分枝を減少させるように作用したが、これらの成長円錐成分を同時発現させると、軸索長の激増が誘発された（図３）。ＤＲＧ神経細胞の全集団にわたって平均すると、ＧＡＰ−４３／ＣＡＰ−２３の同時発現の効果は、末梢神経傷害の効果と似通っていたが（図３）、小さな差は存在した。トランスジェニックマウスの軸索は、末梢神経傷害後に比べて、僅かに短く、分枝の頻度も幾分多い傾向にあった。軸索の長さの差異は、短い（１００−１５０μｍ）軸索を有する神経細胞の小集団がトランスジェニック動物由来の神経節中に常に存在することが原因であった（図２）。この小集団は解析から除いたが、ＧＡＰ−４３／ＣＡＰ−２３を発現する動物（５３８±５４μｍ）由来の残りの神経細胞の平均軸索長は、末梢神経傷害を行った神経節のもの（５４６±４９μｍ）とほぼ同じであった。しかし、分枝頻度には、僅かな差が一貫して存在していた。このように、ＧＡＰ−４３とＣＡＰ−２３の同時発現は、末梢神経傷害により誘導された全ての遺伝子群によって誘発されるものと極めて類似する（但し、完全に同一というわけではない）軸索成長の移行を引き起こした。
【００３２】
インビボでは、末梢神経傷害によってもたらされる最も顕著な結果の１つは、ＤＲＧ神経細胞により脊髄中での軸索の再生を補助することが可能となるということである(Richardson et al, J. Neurocytol. 13:165-182 (1984), Neumann et al, Neuron 23:83-91 (1999))。これらの後索軸索は、ＤＲＧ中の大きな運動感覚神経細胞の特定集団から生じたものである。本発明者らが解離した培養物中で最も大きなＤＲＧ神経細胞（直径４０μｍ）が、他のＤＲＧ神経細胞と同じような頻度で、ＧＡＰ−４３とＣＡＰ−２３導入遺伝子を発現することが、免疫染色で確認された。この小集団における軸索伸長を再度解析することによって、さらに、軸索伸長の頻度及びこれらの神経細胞の平均軸索長と軸索分枝数が、ＤＲＧ神経細胞の総集団に対する９５％信頼区間の中にあることが示された。このことは、長い様式の軸索成長が、他のクラスのＤＲＧ神経細胞のみならず、巨大な運動感覚神経細胞中でのＧＡＰ−４３とＣＡＰ−２３の発現によっても誘導され得ることを示唆している。さらに、クリオスタット切片の免疫染色によって、前記巨大なＤＲＧ神経細胞がインビボでＧＡＰ−４３とＣＡＰ−２３導入遺伝子を発現しており、これらのタンパク質を後索の軸索中に輸送することが示された（図４）。インビトロアッセイの場合と同様に、これらのタンパク質の発現は、インビボで再生を刺激する末梢神経傷害の効果を模倣するのに十分であれば、トランスジェニック動物中のＤＲＧ神経細胞は、末梢神経傷害の不存在下で、脊髄軸索の顕著な再生を補助するはずである。
【００３３】
この可能性を調べるために、野生型マウスおよびＧＰＡ−４３とＣＡＰ−２３の両方を発現しているトランスジェニック動物中で、ＤＲＧ神経細胞の中央軸索を分断する脊髄損傷を与えた。頚胸接合部の高さで、脊髄の両側において後索軸索を横切断した。傷害を受けた軸索に再成長に最適な環境を与えるために、末梢神経（坐骨）の切片の一方側を切除し、神経切片を脊髄損傷部位中に移植した(Richardson et al, J. Neurocytol. 13:165-182 (1984), Neumann et al, Neuron 23:83-91 (1999)), Richardson et al, J. Neurocytol. 15: 585-594 (1986))。前記切除によって、ＤＲＧ神経細胞の損傷と同じ側に末梢神経傷害が与えられたが、脊髄損傷自体を除き、反対側の神経節は傷害を受けなかった（図５）。
【００３４】
１乃至４ヶ月後に、前記移植片中に少なくとも５ｍｍ軸索を再生することが可能な全ての神経細胞を標識するために、神経移植片の遠位末端中に蛍光性軸索トレーサーｄｉＩを導入した。従前の研究から予想されたように(Richardson et al, J. Neurocytol. 13:165-182 (1984), Neumann et al, Neuron 23:83-91 (1999))、末梢神経を傷害させた後根神経節には、数多くの標識神経細胞が含有されていた（神経節当り６３±２２個の標識神経細胞、図５）。これらの神経節については、対照（野生型）とトランスジェニック動物の間に差はなかった。末梢神経の傷害によって、野生型とトランスジェニック動物の両方のＤＲＧ神経細胞中に、他の成長関連タンパク質に加えてＧＡＰ−４３とＣＡＰ−２３が誘導されるので、このことは驚くに値しない。
【００３５】
逆行性標識手法によっては、再生能を有している可能性があるが、脊髄と移植組織間の直接的組織架橋に遭遇しない軸索が、損傷部位の阻害的分子によって移植片中に入るのを遮断されるのか(Davies et al, Nature 390:680-683(1997))、あるいは、移植片中に入らずに、損傷部位の周囲を成長するのか(Neumann et al, Neuron 23:83-91 (1999))は明らかとならない。再生能を有する軸索の同定における前記移植手法の効率を推測するために、病変によって横切断された全ての軸索を標識するために、ｄｉＩを脊髄損傷部位に直接与えた。この直接的な脊髄投与によって、神経節当り３７２±６０の神経細胞が標識された。このように、ＤＲＧ神経細胞が、末梢神経傷害によって誘導された全ての遺伝子群を発現しているときには、約１７％（６３／３７２）の脊髄ＤＲＧの軸索が首尾よく移植片の中に入って、少なくとも５ｍｍ再生する。
【００３６】
しかし、末梢神経の損傷が存在しないと、対照（非トランスジェニック）マウスの成体ＤＲＧ神経細胞は、その脊髄の軸索を神経移植片中に伸長させることができなかった。末梢神経の損傷とは反対側の神経節は、神経節当り平均０．４の標識神経細胞を含有しており（ｎ＝５匹）、ラットにおける従来の観察結果と一致していた(Richardson et al, J. Neurocytol. 13:165-182 (1984)。ＧＡＰ−４３とＣＡＰ−２３の発現は、脊髄の軸索を再生した神経細胞の数を劇的に増加させた。両導入遺伝子を発現している動物では、末梢神経の損傷の不存在下で、神経節当り２５±８細胞が標識され、対照の６０倍を超えていた（ｎ＝６匹；ｐ＜０．０００１）。このことは、後索中の横切断された軸索のうち約７％が、神経移植片中に、および神経移植片を貫いて再生できることを意味している。
【００３７】
インビトロアッセイによって予測されたように、ＧＡＰ−４３単独あるいはＣＡＰ−２３単独では、何れも、前記２つの導入遺伝子が共同して誘発した再生を起こすことができなかった。何れかの遺伝子のみを発現しているトランスジェニックマウスの後索中に末梢神経移植片を導入しても（それぞれ、ｎ＝２匹）、末梢傷害の不存在下では、神経節当り僅か１乃至２細胞が逆行性標識されるにすぎなかった。
【００３８】
この標識は、末梢傷害のない非トランスジェニック動物とは統計的に区別できないが、両導入遺伝子を発現している動物よりはるかに少ない（ｐ＜０．０００５）。末梢神経傷害を加えた側の逆行性標識（神経節当り５５−８８細胞）によって、これらの動物で移植と標識操作が有効に行われたことが確認された。このように、ＧＡＰ−４３とＣＡＰ−２３の同時発現によって誘発された脊髄の軸索再生の劇的な増加は、何れか遺伝子のみの作用によってはもたらされなかった。
【００３９】
ＧＡＰ−４３とＣＡＰ−２３の両方を発現している動物では、免疫組織化学によって、ほとんど全ての逆行性標識された神経細胞が両導入遺伝子を発現することが示された（図４）。１つの神経節から得られた結果の定量によって、逆行性標識された神経細胞は全て、ニワトリＣＡＰ−２３タンパク質が強く染色されたのに対して、ｄｉＩを充填した２６個の細胞のうち２５個の細胞体がＧＡＰ−４３について明瞭な染色を示すことが明らかとなった（図４）。残りの細胞は、ＧＡＰ−４３の強い膜様染色で取り囲まれていたが、軸索の染色が強いために（図４）、ｄｉＩで標識された細胞中に導入遺伝子が発現しているのか、あるいは隣接する神経細胞中に発現しているのかを決定することが困難であった。このような曖昧さにもかかわらず、前記結果は、ＧＡＰ−４３とＣＡＰ−２３の両方を発現している動物中での脊髄の軸索再生の増加が同一細胞内に両導入遺伝子を発現している各神経細胞から生じたものであることを示している。先に引用した全ての文献は、参考文献として、その全体が本明細書に援用される。特に、Bomze et al, Nature Neuroscience 4(1):38-43(2001)を参考文献として援用する。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】ＧＡＰ−４３とＣＡＰ−２３は、成体神経細胞のインビトロにおける軸索成長性向を増加させる。対照（非トランスジェニック）成体マウス又は成体神経細胞中に高レベルのＧＡＰ−４３及び／又はＣＡＰ−２３を発現するトランスジェニックマウスから、ＤＲＧ神経細胞を単離した。比較のために、神経節を除去する４日前に、末梢神経の損傷を行った非トランスジェニック動物から神経細胞を単離した。グラフは、播種から２４時間後までに軸索突起を伸長した成体神経細胞のパーセントを示している。
【図２】ＧＡＰ−４３とＣＡＰ−２３の同時発現は、細長い様式の軸索伸長を誘発する。図１のように、非トランスジェニック野生型マウス（ｗｔ）又は表記の導入遺伝子を発現している動物から得たＤＲＧ神経細胞を単離し、播種した。神経節は、事前の処置を行わずに（図２Ａ−２Ｄ）、又は坐骨神経に挫滅外傷を加えてから４日後（末梢損傷、図２Ｅ）に単離した。左の写真は、各タイプの培養から得た代表的な神経細胞の位相差顕微鏡像を示している。ＧＡＰ−４３／ＣＡＰ−２３トランスジェニック動物からの軸索、及び末梢神経損傷に応答した神経細胞からの軸索は、これらの像の縁を越えて伸長している。描出された細胞は、チュブリンに対する抗体（野生型動物）又は当該導入遺伝子産物に対する抗体で染色した。二重トランスジェニック細胞については、ＧＡＰ−４３に対する染色である。各像のスケールバーは、１００μｍを表している。右側のヒストグラムは、各培養中の各神経細胞について、最も長い突起の長さを表している。非トランスジェニック対照動物から得たナイーブ神経節は、主に短い（１００−２００μｍ）の軸索を伸長しているのに対して、末梢神経傷害は極めて長い（３００μｍ超）軸索の伸長を誘導する。ＣＡＰ−２３単独の発現では、末梢神経傷害によって誘導されるものと同様な、長い軸索の伸長は誘発されない。ＧＡＰ−４３によって、極めて長い軸索（３００μｍ超）を有する小集団の神経細胞が出現するが、大部分の神経細胞は、ナイーブ成体神経細胞に特徴的なこれより短い軸索（１００−１５０μｍ）を伸長させ続ける。何れかのタンパク質単独の場合と比べて、ＧＡＰ−４３とＣＡＰ−２３を同時発現させると、ＤＲＧ神経細胞の多くに極めて長い軸索の伸長を誘発し、末梢神経傷害の効果を模倣する。
【図３】ＧＡＰ−４３とＣＡＰ−２３による段階的な軸索伸長の誘導。図２と同様に、インビトロでの軸索成長についてＤＲＧ神経細胞を分析した。各神経細胞で最も長い突起について、分岐点の数と軸索の全長を測定した。グラフは、各条件についての平均分枝数と長さ±９５％信頼区間を示している。非トランスジェニック動物の場合（白抜きの記号）、ナイーブ神経細胞（白丸）は比較的伸長が短く、軸索の分枝が高度であったのに対して、末梢神経傷害（白抜き四角）は、極めて長く、分枝の少ない軸索の伸長を誘導する。予め神経傷害を行わずにトランスジェニック動物から単離されたナイーブ神経細胞（黒塗りの記号）の場合、ＧＡＰ−４３（黒四角）又はＣＡＰ−２３（黒丸）の何れかを発現させると、軸索の分枝が減少するが、軸索の伸長は誘発しない。これに対して、これら２つの成長関連タンパク質を同時発現させると（黒菱形）、細長い様式の成長を引き起こすという末梢神経傷害の効果が模倣される。
【図４】ＧＡＰ−４３とＣＡＰ−２３の発現及びトランスジェニックマウスの巨大運動感覚ＤＲＧ神経細胞による脊髄軸索のインビボでの再生。図４Ａ。免疫蛍光染色によって、成体トランスジェニックマウスから得た脊髄の縦断切片の後索軸索中に、ニワトリＣＡＰ−２３（青）又はＧＡＰ−４３（緑）が存在することが示されている。左側のパネルは、後索（像の左側）と後角の灰白質の間の縁から得たものである。ＣＡＰ−２３が後索の軸索中に存在するとともに、後角の神経細胞中にも存在することに注目されたい。右側のパネルは、後索中に存在するＧＡＰ−４３陽性の軸索を示している。下側のパネルは、一次抗体を用いずに染色した対照切片である。図４Ｂ。ＧＡＰ−４３（緑）とＣＡＰ−２３（青）の両方を遺伝子導入した動物の後根神経節（ＤＲＧ）中に存在する神経細胞の細胞体。両タンパク質は、多くの巨大ＤＲＧ神経細胞中に発現されている。これらの細胞のうち３つは、逆行性軸索トレーサーであるｄｉＩ（赤）も含有しており、５週前に、後索中に配置された末梢神経切片を通じて脊髄軸索を再生したことを示している。３つの細胞の細胞体は全て、ＧＡＰ−４３とＣＡＰ−２３の両方が強く染色されていた。右側の拡大図は、これらの神経細胞のうち１つに対する、ＧＡＰ−４３とＣＡＰ−２３免疫蛍光の各像を表している。
【図５】ＣＡＰ−４３とＣＡＰ−２３の補給により、インビボで脊髄感覚性軸索の再生が可能となる。図５Ａ。実験の模式図。成体非トランスジェニック（野生型）マウス又はＧＡＰ−４３とＣＡＰ−２３導入遺伝子の両方を発現するマウス（トランスジェニック）中で、脊髄の後索を上行する軸索を遮断した。末梢神経の切片を、左坐骨神経から除去し、一方側のＤＲＧ神経細胞の末梢軸索を分断する。次いで、この神経切片を脊髄損傷部位の中に移植し、正中線の両側の後索をつなぐ。１乃至４ヵ月後に、蛍光トレーサー（ｄｉＩ、赤で図示）を移植片の遠位末端に与える。神経移植片の中に少なくとも５ｍｍ再生した軸索は、蛍光トレーサーを取り込んで、神経細胞の細胞体に逆行性に輸送することができる。図５Ｂは、腰部後根神経節中に検出された標識神経細胞の平均数をまとめたものである。後索損傷と同時に末梢神経傷害を加えたＤＲＧ神経細胞（末梢損傷、白バー）は、神経移植片中に脊髄軸索を再生することができる。非トランスジェニック（ｗｔ）マウスでは、末梢神経損傷に応答しなかった神経細胞（末梢損傷なし）は、脊髄軸索を再生できない。ＧＡＰ−４３とＣＡＰ−２３の発現は、後索損傷からそれらの脊髄軸索を再生することができるＤＲＧ神経細胞の数を６０倍増加させる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2005508353.tif 000046