(57)【要約】細胞網を形成するデバイス（１４、２０、２２）が提示されている。このデバイスは基板（２）を備えている。細胞（３２）による占有を目的として、複数の親水性部位（１６）が基板（２）上に設けられている。親水性部位（１６）同士の間に細胞接続部を形成するのを促進することを目的として、複数の親水性トラック（１０）が基板（２）上に設けられている。複数の親水性領域（６Ａ）も設けられている。親水性部位（１６）と親水性トラック（１０）は親水性領域（６Ａ）同士の間で陥没している。細胞網の形成を誘導することを目的として、親水性部位（１６）および/または親水性トラック（１０）に誘導合図（２４）が設けられても良い。誘導合図（２４）は細胞外間充織（ＥＣＭ）蛋白のような化学誘導合図（２４）であるのが好ましい。ＥＣＭ蛋白の一例がラミニンである。デバイス（１４、１０、２２）を利用して、神経細胞の細胞網を形成することもできる。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板と、
細胞による占有のために前記基板上に設けられた複数の親水性部位と、
前記親水性部位同士の間に細胞接続部を形成することを誘導するために前記基板上に設けられた複数の親水性トラックと、
前記基板上に設けられた複数の疎水性領域とを備えており、
前記親水性部位と前記親水性トラックとは、前記疎水性領域同士の間で陥没していることを特徴とする細胞網形成装置。
【請求項２】
前記親水性部位および／または前記親水性トラックには、前記細胞網の形成を誘導する誘導合図が設けられていることを特徴とする請求項１に記載の細胞網形成装置。
【請求項３】
前記誘導合図は、化学的誘導合図であることを特徴とする請求項２に記載の細胞網形成装置。
【請求項４】
前記誘導合図は、細胞外基質蛋白であることを特徴とする請求項１に記載の細胞網形成装置。
【請求項５】
前記基板は親水性層を支え、前記親水性部位及び前記親水性トラックを定義するために、前記複数の疎水性領域が前記親水性層の上に設けられることを特徴とする請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の細胞網形成装置。
【請求項６】
前記親水性層は、前記基板上に設けられた親水性材料の層であることを特徴とする請求項５に記載の細胞網形成装置。
【請求項７】
前記基板は実質的に透明（トランスペアレント）であることを特徴とする請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の細胞網形成装置。
【請求項８】
前記親水性部位は、前記親水性トラック同士の間の交点に形成されていることを特徴とする請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の細胞網形成装置。
【請求項９】
前記親水性トラック及び前記親水性部位は、前記疎水性領域同士の間で陥没して１個の細胞が１つの部位を占有するには十分小さな深さであり、かつ、前記疎水性領域面上部に一部突出し、かつ、細胞接続部が前記疎水性領域を横断して形成されないようにするのに十分な深さであることを特徴とする請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の細胞網形成装置。
【請求項１０】
前記親水性トラック及び前記親水性部位は、前記疎水性領域同士の間で陥没して約５μｍから約１０μｍの範囲の深さであることを特徴とする請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載の細胞網形成装置。
【請求項１１】
前記親水性トラックは、約６μｍから約１０μｍの範囲の幅を有していることを特徴とする請求項１〜請求項１０のいずれか１項に記載の細胞網形成装置。
【請求項１２】
前記親水性部位は、約８μｍから約１４μｍの範囲の直径を有していることを特徴とする請求項１〜請求項１１のいずれか１項に記載の細胞網形成装置。
【請求項１３】
前記親水性部位は、隣接する親水性部位から約５０μｍから約１００μｍの範囲の距離を隔てていることを特徴とする請求項１〜請求項１２のいずれか１項に記載の細胞網形成装置。
【請求項１４】
請求項１〜請求項１３のいずれか１項に記載の装置及び電極配列を含むキット。
【請求項１５】
細胞による占有のために基板上に複数の親水性部位を設ける工程と、
前記親水性部位同士の間に細胞接続部を形成することを誘導するために前記基板上に複数の親水性トラックを設ける工程と、
疎水性領域同士の間で前記親水性部位及び親水性トラックを陥没させる工程とを含む細胞網を形成する装置の製造方法。
【請求項１６】
前記親水性部位および／または前記親水性トラックに誘導合図を適用する工程を更に含むことを特徴とする請求項１５に記載の製造方法。
【請求項１７】
前記誘導合図は、化学的誘導合図であることを特徴とする請求項１６に記載の製造方法。
【請求項１８】
（ａ）  前記基板上に親水性材料層を配置する工程と、
（ｂ）  前記親水性材料層の上に疎水性領域を配置し、前記基板上に前記複数の親水性部位及び前記複数の親水性トラックを定義するようにし、かつ、前記疎水性領域同士の間で前記親水性部位及び親水性トラックを陥没させるようにする工程とを含むことを特徴とする請求項１５〜請求項１７のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１９】
前記工程（ｂ）は、
（ｉ）  前記親水性材料層の上に疎水性材料の層を配置する工程と、
（ii）  前記疎水性材料の部分を除去して、これに対応する前記親水性材料の部分を露出させる工程とを含み、前記親水性材料の対応部分は前記親水性部位及び前記親水性トラックを形成し、かつ前記除去されなかった疎水性材料は前記疎水性領域を形成することを含むことを特徴とする請求項１８に記載の製造方法。
【請求項２０】
前記工程（ii）は、
前記疎水性材料層にマスクを付与する工程と、
前記マスクを介して前記疎水性材料に放射線を当てて、前記疎水性材料の部分を除去する工程を含むことを特徴とする請求項１９に記載の製造方法。
【請求項２１】
前記工程（ｂ）は、
（ｉ）  前記親水性材料層に鋳型（モールド）を適用する工程と、
（ii）  前記鋳型の中で疎水性材料を堆積させて、前記疎水性領域を形成する工程とを含むことを特徴とする請求項１８に記載の製造方法。
【請求項２２】
前記堆積工程（ａ）および／または前記堆積工程（ｂ）は、回転塗布により実施されることを特徴とする請求項１８〜請求項２１のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項２３】
前記基板は親水性の層を形成する親水性面を有し、前記製造方法は、
前記基板上に前記複数の親水性部位及び前記複数の親水性トラックを定義するため、かつ、前記疎水性領域同士の間で前記親水性部位及び親水性トラックを陥没させるようにするため、前記親水性層の上に疎水性領域を堆積する工程を含むことを特徴とする請求項１５〜請求項１７のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項２４】
前記基板は疎水性表面を有しており、前記製造方法は、
複数の部位及び複数のトラックを前記基板上で陥没させることにより、疎水性領域同士の間に前記部位及びトラックを設ける工程と、
前記部位及びトラックの上に親水性材料を堆積させることにより、前記複数の親水性部位及び前記複数の親水性トラックを堆積する工程とを含むことを特徴とする請求項１５〜請求項１７のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項２５】
請求項１〜請求項１３のいずれか１項に記載の装置に細胞源を接触させることと、
前記細胞を処理して、前記装置上で細胞網が形成し易くなるようにすることを含む細胞網の形成方法。
【請求項２６】
細胞を細胞供給媒体で前記細胞を処理して、前記細胞網が形成し易くなるようにした工程を含むことを特徴とする請求項２５に記載の形成方法。
【請求項２７】
前記細胞源は神経細胞（ニューロン）源であることを特徴とする請求項２５または請求項２６に記載の形成方法。
【請求項２８】
請求項１〜請求項１３のいずれか１項に記載の装置で形成された細胞網の前記細胞の特徴を調査するために、電極配列を用いることを含む細胞網の解析方法。
【請求項２９】
前記細胞網の細胞は神経細胞（ニューロン）であることを特徴とする請求項２８に記載の解析方法。
【請求項３０】
細胞網の活動に影響を与える物質を特定する分析方法であって、
請求項１〜請求項１３のいずれか１項に記載の装置の上に形成される細胞網に候補物質を供与し、
前記細胞網の活動に影響を与える候補物質かどうかを判断することを含むことを特徴とする分析方法。
【請求項３１】
前記細胞網が形成された後で、前記細胞網に前記候補物質を適用する工程を含むことを特徴とする請求項３０に記載の分析法。
【請求項３２】
前記細胞網の細胞の活動を制御細胞網の活動と比較して、前記候補物質が前記細胞網の活動に影響を与えているかどうかを判断する工程を含むことを特徴とする請求項３０または請求項３１に記載の分析法。
【請求項３３】
電極配列を用いて、前記候補物質が前記細胞網の活動に影響を与えているかどうかを判断する工程を含むことを特徴とする請求項３０〜請求項３２のいずれか１項に記載の分析法。
【請求項３４】
前記細胞網は神経細胞（ニューロン）網であることを特徴とする請求項３０〜請求項３３のいずれか１項に記載のアッセイ法。
【請求項３５】
請求項３０〜請求項３４のいずれか１項に記載の分析法により特定される候補物質。
【請求項３６】
添付の図面を参照しながら関連明細書に実質的に記載されているとおりに細胞網を形成する装置。
【請求項３７】
添付の図面を参照しながら関連明細書に実質的に記載されているとおりの装置を製造する方法。
【請求項３８】
添付の図面を参照しながら関連明細書に実質的に記載されているとおりに細胞網を形成する方法。
【請求項３９】
添付の図面を参照しながら関連明細書に実質的に記載されているとおりに細胞網を解析する方法。
【請求項４０】
添付の図面を参照しながら関連明細書に実質的に記載されているとおりに細胞網の活動に影響を与える物質を特定する分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞網を形成するための装置に関するものであり、特に、神経細胞の有機的細胞網のような有機的細胞網を形成するための装置に関連している。本発明はまた、かかる装置を製造および使用するための方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
有機的細胞網すなわち細胞の網状組織を形成する組織構造体は周知である。通例、組織構造体は多数の予め定められた部位を有しており、各部位において細胞が形成される。このような組織構造体を用いて、所定の部位に配置された細胞から構成させ結集させた人工的なネットワークを形成し、或いは、成長させることができる。
【０００３】
かかる構造体に形成される細胞網としては、解離セル網や全組織細胞からなる網状組織などが挙げられる。例えば、網状組織には皮膚細胞の網状組織、神経細胞の網状組織、および、心筋細胞の網状組織がある。
【０００４】
一旦形成されてしまうと、有機的細胞網は多様な研究で利用することができる。このような研究に、細胞対細胞の通信の研究、中継組織網の研究、及び互いに異なる化学条件下または生理学的条件下における細胞網の活動の変化に関する研究がある。
【０００５】
特に興味のある領域の１つは、神経細胞の有機的細胞網の形成および研究、或いは、限定されたパターンの神経細胞の形成および研究である。これは神経細胞パターン化と呼ばれ、組織網は「ニューラルネット」として公知である。ニューラルネットは電子生理学的記録処理、神経生理学ニューラルネットは電子生理学的記録、神経生理学、および、全体としての神経機能の生体化学的態様や分子的解釈の研究に利用することができる。
【０００６】
ユン（Yeung）らは、格子状および線状の細胞外間充織（ECM）蛋白構造で培養された脳幹薄片から神経細胞、神経突起、糸状仮足が伸び出ることを説明している。マイクロスタンプがラミニンすなわちECM蛋白のインクが塗られ、基板上に転写されて、基板の表面に印刷パターンを形成する。印刷パターンは神経細胞と神経細胞を局所化することができる部位との間の軸索接続部を成長させるためのトラックを規定する。ラミニンは神経細胞の成長と拡散の化学的誘導合図として作用する。ショール（Scholl）らは、マイクロ接点印刷処理を利用して酸化シリコン表面にパターン化された基板を製造する際に、化学的誘導合図、すなわち、粘着ペプチドを使用することを記載している。ティーゼイ（Tisay）らは、細胞外間充織成分を利用して神経突起外殖の成長と誘導を説明している。
【０００７】
【非特許文献１】
ユン（Yeung）ほか著、「パターン化された細胞外間充織蛋白を利用したラットの脳幹神経細胞の成長と誘導の調節（Modulation of the Growth and Guidance of Rat Brain Stem Neurons Using Patterned Extracellular Matrix Proteins）」、ニューロサイエンスレター301巻（2001年刊）、147頁-150頁
【非特許文献２】
ショール（Sholl）ほか著、「酸化シリコン表面に付着されたラット河馬状隆起神経細胞の規則的組織網（Ordered Networks of Rat Hippocampal Neurons Attached to Silicon Oxide Surfaces）」、ジャーナルオブニューロサイエンスメソッズ104号（1）、2001年刊、65頁-75頁
【非特許文献３】
ティーゼイ（Tisay）ほか著、「細胞外間充織は鞘性細胞上の味覚神経突起の外殖を調節する（The Extracellular Matrix Modulates Olfactory Neurite outgrowth on Ensheathing Cells)」、ジャーナルオブニューロサイエンス19号（22）、1999年刊、9890頁-9899頁
【非特許文献４】
グロス（Gross)ほか著、「試験管外における神経網を利用した、臭い、薬物、毒物の分析:組織網反応の細胞外配列記録（Odor, Drug and Toxin Analysis with Neuronal Networks in Vitro: Extracellular Array Recording of Network Responses）」、バイオセンサーズ＆バイオエレクトロニクス12号（5）、1997年刊、373頁-393頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
細胞網の形成を誘導する印刷された化学誘導合図を利用したアプローチは幾つかの問題点や欠点を被っている。重要な技術的問題点は、細胞接続部が化学誘導合図で処理されていない構造体の領域を横断する傾向にあることである。印刷された誘導合図におけるわずかな損傷もしくはわずかな不完全さであるかもしないこと、或いは、該化学物質を含む領域の汚染がその原因であるかもしれないことが提示されてきた。更に、細胞および細胞接続部は、化学的未処理の領域にある組織構造体の僅かに損傷のある区域に優先的に癒着することが観察されている。それゆえ、トラックに沿って細胞接続部を形成し、所定の部位に細胞を殖産することは不確実である。このような信頼性の欠如は、所望の組織網が形成されないかもしれないことを意味している。更に、その結果は一貫しておらず、再現可能とはいえない。このような信頼性の欠如、一貫性の無さ、および、再現性の無効は重要な欠点を表すものである。特に、これらは神経生理学的研究では相当な欠点を意味する。
【０００９】
神経の組織化は一般に神経研究では望ましい。しかし、問題となるのは、完璧にパターン化され、有機的にされた神経培養は達成するのが困難である。切れ目無く神経細胞の組織網を生成することが望ましい。しかし、切れ目無く神経細胞の組織網を生成することは困難である。
【００１０】
本発明の実施形態は、細胞網を形成する周知のアプローチに付随する諸問題点や欠点を減じるべく模索している。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の特定の局面と好ましい局面が添付の独立項と従属項に明示されている。従属項に由来する特徴の組み合わせが独立項の特徴と組み合わされるが、そのやり方としては適切で、請求項に明確に明示された以上のものである。
【００１２】
本発明の一態様によれば、細胞網を形成する装置が提供されるが、該装置は、
基板と、
細胞による占有のために前記基板上に設けられた複数の親水性部位と、
前記親水性部位同士の間に細胞接続部を形成することを誘導するために前記基板上に設けられた複数の親水性トラックと、
前記基板上に設けられた複数の疎水性領域とを備えており、
前記親水性部位と前記親水性トラックとは、前記疎水性領域同士の間で陥没している。
【００１３】
トラックおよび親水性部位と、これら両者の間に位置して、親水性の差が加わった領域との間に物理的弁別（陥没）を設けることは、細胞網を形成するための組織構造体を供与する周知のアプローチからの過激な逸脱を意味しており、本発明のこの態様に従った装置は、トラックと親水性部位との間の領域を横断する細胞接続部の技術的問題を実質的に減じるものである。
【００１４】
本発明のこの態様に従った装置に細胞網を形成することは、信頼性、一貫性、および、再現性に関連した周知の組織構造体に組織網を形成することよりも優っている点で有利である。その結果、このような組織網を培養するのに費やされる時間とお金が付随して減じられることになる。
【００１５】
また別な利点は、装置は多目的であり、多様な細胞網を形成するために利用することができる。細胞網は解離細胞の組織網であってもよいし、或いは、組織細胞全体の組織網であってもよい。更に、本装置は、構成（形状またはパターン）或いは寸法が或る範囲の調査の要件に適うように達成されるという点で、柔軟に対応している。
【００１６】
更に、装置の上に形成された神経細胞の組織網は組織化と連続性に関して優れている。このため、装置に神経網を生成することで、神経学的調査に多目的手段を提供することができる。主たる興味の領域の１つとして、メモリ機能とシナプス形成の研究がある。組織網は、如何にすればメモリを達成し、向上させ、修正することができるのかという研究に構造化された環境を提供するという点で有利である。装置の卓越性は、この分野における新たな実験を工夫して生むことができることを意味している。更に、形成された卓越した細胞網でも、特に神経組織の細胞網は、脳機能と神経病の分野の研究者に有用となる。
【００１７】
一実施形態では、親水性部位および／または親水性トラックには細胞網の形成を誘導する誘導合図が設けられている。誘導合図は物理的誘導合図であればよいが、これは、例えば、親水性部位および/または親水性トラックに電荷を付加することにより達成される。しかし、誘導合図は、細胞外基質成分すなわち蛋白などの化学的誘導合図であるのが好ましい。特定の実施形態では、化学誘導合図はラミニンである。他の実施形態では、化学誘導合図はポリリシンである。
【００１８】
この化学配列（すなわち、化学誘導合図の利用）は装置に形成された組織網の信頼性、一貫性、および、再現性を更に向上させるという点で有利である。
【００１９】
疎水性領域は、疎水性領域を横断する細胞接続部の形成を抑止するために回避合図で処理される。一般に、回避合図は疎水性領域の疎水性を向上させる。具体例としては、ミエリンに由来するNI-35のような蛋白がある。
【００２０】
基板上には親水性部位、親水性トラック、および、疎水性領域が設けられており、親水性部位と親水性トラックは疎水性領域同士の間で陥没している。これはどのような好適な方法で達成されてもよい。しかし、基板は親水性層を支えることが好ましく、親水性部位と親水性トラックを定義するために、複数の疎水性領域が親水性層の上に設けられる。基板は基板自体の一部として親水性層を支えるようにしてもよい。換言すると、基板自体は親水性材料から形成される。これに代わるものとして、或いは、追加として、基板上に設けられた親水性材料の層として親水性層が設けられてもよい。好適な親水性材料の一例が金である。別な例はアミノアルキルシランである。親水性材料の親水性は、例えば、化学誘導合図により向上されるのが好適である。
【００２１】
基板材料は透明（トランスペアレント）であるのが好ましい。例えば、電極配列のような分析装置に関連して装置を配向する際には、透明性が装置に形成された組織網を研究するのに役立つという点で有利である。好適な基板材料の具体例としては、ガラス、溶融シリカ、および、シリコンがある。
【００２２】
親水性材料の層は、その層が親水性トラック及び親水性部位を設けている限りにおいて、切れ目無く連続する層である必要がないことが分かる。例えば、層は疎水性領域の下に入る領域においては非連続的であってもよい。
【００２３】
一実施形態では、疎水性領域に利用される疎水性材料は紫外線硬化処理されたエポキシかフォトレジストである。テフロン（登録商標）およびアルキルシランはまた別な疎水性材料の例である。
【００２４】
親水性層を基板に結合させるために、また、疎水性領域を親水性層に適切になるように結合させるために、１種以上の粘着剤が供与されるのが好適である。粘着剤の一例はクロムであり、これは、例えば、ガラスに金を粘着させるために利用されてもよい。
【００２５】
通例、親水性トラックは親水性部位に接続しているトラックの組織網を形成している。親水性トラックは装置の一方側から別な側まで延びているが、これは必要ではない。一実施形態では、装置は一方向に延びている一連の互いに平行なトラックと、別な方向に延びている別な一連の互いに平行なトラックとを備えている。親水性部位は、ユンらの特許に記載されている線状パターンにおけるのと同様に、トラックに沿ったどの位置に形成されてもよいが、親水性部位は親水性トラック同士の間の交点に形成されるのが好ましい。この構成の利点は、組織網は一方向以上の方向に形成または拡散することができる。特定の実施形態では、複数列のトラックが実質的に互いに直交して形成されている。しかし、別な実施形態では、トラックは、親水性トラックと親水性部位の組織網を所望されるとおりに形成する向きで設けて良い。
【００２６】
一実施形態では、親水性トラック及び親水性部位は、疎水性領域同士の間で陥没して１個の細胞が１つの部位を占有するには十分小さな深さであり、かつ、前記疎水性領域面より上部に一部突出し、かつ、細胞接続部が前記疎水性領域を横断して形成されないようにするのに十分な深さである。別な実施形態では、親水性トラックおよび親水性部位は、細胞の一部が表面より上部に突出しないようになっている。
【００２７】
装置は神経細胞の組織網を形成するように構成されているのが好ましい。或る実施形態では、親水性トラック及び親水性部位は、疎水性領域同士の間で陥没して約５μｍから約１０μｍの範囲の深さである、親水性トラックは約６μｍから約１０μｍの範囲の幅を有しており、親水性部位は約８μｍから約１４μｍの範囲の直径を有している。このような値は神経細胞の組織網を、信頼性をもって形成するために有利であるのが分かっている。約６μｍのトラック幅が特に好ましいと分かっている。
【００２８】
親水性部位は隣接する親水性部位から約５０μｍから約１００μｍの範囲の距離を隔てているのが好ましい。このような値は神経細胞の組織網を信頼をもって形成するには特に有利であるのが分かっている。
【００２９】
本発明の別な態様によれば、電極配列と一緒に上述の装置を含んでいるキットが提供される。装置の上に形成され、或いは、成長する細胞網の電子物理学的特性を分析する際に、電極配列を使用するのが好適である。通例、電極配列は、装置上の設けられた多数の親水性部位に対応する電極の配列を含んで構成されているという点では、相補的電極配列である。一実施形態では、電極配列は神経細胞の細胞網を解析するためのマイクロ電極配列である。
【００３０】
本発明の別な態様によれば、細胞網を形成する装置の製造方法が提示されるが、該方法は、
細胞による占有のために基板上に複数の親水性部位を設ける工程と、
前記親水性部位同士の間に細胞接続部を形成することを誘導するために前記基板上に複数の親水性トラックを設ける工程と、
疎水性領域同士の間で前記親水性部位及び親水性トラックを陥没させる工程とを含んでいる。
【００３１】
一実施形態では、この方法は、親水性部位および／または親水性トラックに誘導合図を適用する工程を含んでおり、好ましくは、化学的誘導合図を付与する工程を含んでいる。
【００３２】
好ましい実施形態では、この方法は、
（ａ）  前記基板上に親水性材料層を配置する工程と、
（ｂ）  前記親水性材料層の上に疎水性領域を配置し、前記基板上に前記複数の親水性部位及び前記複数の親水性トラックを定義するようにし、かつ、前記疎水性領域同士の間で前記親水性部位及び親水性トラックを陥没させるようにする工程とを含んでいる。
【００３３】
親水性材料は真性層すなわち非連続層として形成することができる。真性層として親水性材料を形成する利点は、特に、或る実施形態に必要とされる規模で、材料の層を配置するのが簡単になることである。
【００３４】
これが本発明の実施形態に従った装置を製造する唯一の方法ではないことを認識されたい。例えば、上述の好ましい実施形態の修正例では、基板は親水性の層を形成する親水面を有していれば良く、この方法は、親水性の層の上に親水性の領域を配置することで、複数の親水性部位と複数の親水性トラックとを基板上に定義し、また、疎水性の領域同士の間で親水性部位と親水性トラックとを陥没させるようにする工程を含んでいてもよい。この修正例では、親水性の層は親水性の材料の層に置き換わる。
【００３５】
好ましい実施形態では、配置工程（ｂ）は、
（ｉ）  前記親水性材料層の上に疎水性材料の層を配置する工程と、
（ii）  前記疎水性材料の部分を除去して、これに対応する前記親水性材料の部分を露出させる工程とを含み、前記親水性材料の対応部分は前記親水性部位及び前記親水性トラックを形成し、かつ前記除去されなかった疎水性材料は前記疎水性領域を形成している。
【００３６】
親水性材料に関しては、疎水性材料を層として形成する利点は、特に、或る実施形態で必要となる規模で、材料の層を配置するのが簡単になることである。
【００３７】
一実施形態では、疎水性材料の部分を除去して、これに対応する親水性材料の部分を露出させる工程（ii）は、
前記疎水性材料層にマスクを付与する工程と、
前記マスクを介して前記疎水性材料に放射線を当てて、前記疎水性材料の部分を除去することを含んでいる。
【００３８】
マスクを利用すると、特に精度の高い結果が得られるという点で有利である。放射線は電磁放射線であるのが好ましい。一例では紫外線放射を利用している。
【００３９】
本発明の実施形態による方法を実現する方法は幾つもあることを、当業者なら認識するだろう。例えば、疎水性材料の層を配置してマスク及び放射線を用いて層をエッチングする代わりに、この方法は、
（ｉ）  前記親水性材料層に鋳型（モールド）を適用する工程と、
（ii）  前記鋳型の中で疎水性材料を堆積させて、前記疎水性領域を形成する工程とを含んでいる。
【００４０】
基板上に親水性材料を堆積させて、親水性層を形成すること、および／または、親水性の層の上に疎水性の領域を配置することとは回転塗布により実施されるのが好ましい。回転塗布は、材料の一貫した精度の高い層を供与するので特に有利である。任意選択的に、堆積処理は蒸着により実施されてもよい。
【００４１】
或る実施形態では、基板は疎水性面を有していることがあり、かかる実施形態では、製造方法は、
前記基板上に前記複数の親水性部位及び前記複数の親水性トラックを定義するため、かつ、前記疎水性領域同士の間で前記親水性部位及び親水性トラックを陥没させるようにするため、前記親水性層の上に疎水性領域を堆積する工程を含むように修正されてもよい。
【００４２】
本発明の実施形態による方法を利用して上述のような装置を製造することができることを認識されたい。
【００４３】
本発明の別な態様によれば、細胞網を形成する方法が提供されるが、該方法は、
上述のような装置に細胞源を接触させることと、
前記細胞を処理して、前記装置上で細胞網が形成し易くなるようにすることを含んでいる。
【００４４】
一実施形態では、細胞は細胞供給媒体で処理されて、細胞網の形成を促進している。或る実施形態では、細胞源は神経細胞（ニューロン）源である。
【００４５】
本発明の別な態様によれば、細胞網を解析する方法が提供されるが、該方法は、上述のような装置で形成された細胞網の前記細胞の特徴を調査するために、電極配列を用いることを含んでいる。細胞網の組織化及び連続性の点で卓越しているということの意味が、電極配列の電極に対応している部位を細胞が占有していることであるという点で有利である。このため、電極配列を利用した解析はより効率的となる。
【００４６】
電極配列はマイクロ電極配列であってもよいし、細胞網の細胞が神経細胞であってもよい。
【００４７】
本発明の別な態様によれば、細胞網の活動に影響を与える物質を特定する分析方法が提供されるが、該方法は、
細胞網に候補物質を供与し、細胞網は上述のような装置の上に形成されており、
前記細胞網の活動に影響を与える候補物質かどうかを判断することを含んでいる。
【００４８】
この分析方法を用いて、数百もの候補物質を篩にかけることができるという点で有利である。
【００４９】
分析方法は、細胞網が形成された後で細胞網に候補物質を適用する工程を含んでいてもよい。これに代わるものとして、或いは、追加として、分析方法は、細胞網の細胞の活動を制御細胞網の活動と比較して、候補物質が細胞網の活動に影響を与えているかどうかを判断する工程を含んでいる。
【００５０】
更に、分析方法は、マイクロ電極配列などの電極配列を用いて、候補物質が細胞網の活動に影響を与えているかどうかを判断することを含んでいる。一実施形態では、細胞網は神経細胞の組織網である。
【００５１】
本発明による方法は、大学研究機関や薬産業にとって益があり、特に、神経薬理学と薬剤適格審査では有益となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５２】
添付の図面を参照しながら、本発明の好ましい実施形態を単なる具体例として以下に記載するが、図面中、同一参照番号は同一要素に関連している。
【００５３】
添付の図面を参照しながら、本発明の好ましい実施形態をここに説明する。
図１Ａから図１Ｅは細胞網を形成するための装置を製造するためのプロセスの工程段を例示している。これらの図面は各層の装置の構造を側面から見たところを例示している。
【００５４】
図１Ａから図１Ｅを参照すると、基板２が図１Ａに例示されている。図１Ｂに例示されているように、親水性材料４の層が基板２の上に堆積されている。次いで、疎水性材料６の層が親水性材料４の層の上に積層され、図１Ｃに例示されている中間構造体を形成する。
【００５５】
図１Ｄに例示されているように、マスク８が疎水性の層６の上方に位置決めされる。マスク８は実質的に格子状の平面（図示せず）であるのが好ましく、一連のトラックと部位とを画定している。トラックと部位との輪郭を規定しているマスク８の空隙１１が図示されている。マスク８はトラックと部位の輪郭を規定している区域（空隙１１）では実質的に放射線に対して透明であるが、トラックと部位を画定していない区域では実質的に放射線不透過性である。矢印１２によって表される放射線はマスク８を通り抜ける方向に当てられて、疎水性の層６のトラックと部位をエッチング除去し、その下に位置している親水性の層４を露わにする。トラックおよび部位は空隙１１に一致する。好ましい実施形態では、放射線は電磁放射線である。
【００５６】
マスクは除去されて、図１Ｅに例示されたデバイス（半導体素子）１４を残存する。デバイス１４は基板２、親水性の層４、および、親水性トラック１０と親水性部位が陥没している部分を両側から挟む位置にある疎水性領域６Ａから構成される。
【００５７】
図１Ｆはデバイス１４の平面図を例示しており、一連のトラック１０（図中、４本のトラックが左から右に走り、４本のトラックが上から下へ延びている）と複数の部位１６とがこれらトラック１０の交点に位置している。トラック１０及び部位１６を分離している疎水性領域６Ａも図示されている。明瞭にするために、トラック１０、部位１６、および、疎水性領域６Ａはほんの少数だけが、図中、参照番号が付して描画されている。
【００５８】
マスク８は、平面図には例示されていないが、図１Ｆに例示されている格子状構造にトラックと部位を定義する構成を有しているのが分かる。
【００５９】
親水性材料は基板上に回転塗布か蒸着され、疎水性材料は親水性材料の上に回転塗布されるか、或いは、蒸着される。特定の実施形態では、基板は透明である。特定の実施例では、基板はガラスであり、親水性材料は金であり、疎水性材料は紫外線硬化処理されたエポキシまたはフォトレジストである。金は蒸着により堆積される。マスクは金属パターンを有しているＵＶに対して透過性のある材料から作成されればよく、使用される放射線は紫外光である。クロムが粘着剤として使用されてもよく（金をガラスに接着するために）、また、必要ならば、疎水性を増大させるために、紫外線硬化エポキシまたはフォトレジストが事後処理されてもよい。
【００６０】
図１Ａから図１Ｅは概略図であり、等尺と見なすべきではない。具体例では、疎水性の層は厚さが５μｍから１０μｍであり、親水性の層は厚さが１μｍから２μｍであるが、親水性の層の厚さは重要な因子ではなく、好適ならどのような厚さを採用してもよい。親水性の層は光学特性が劣等になるほど厚くなく、細胞と接触しただけで層が破損してしまうほど薄くもないのが好ましい。トラックは６μｍから１０μｍの幅（図４Ｂの幅ｗを参照のこと）であるのが好ましいが、疎水性領域の幅（図４ＢのＬ）と長さ（図４ＢのＬ’）は５０μｍから１００μｍであるのが好ましい。
【００６１】
このような実施例のデバイスは、通例、およそ長さが約１ｃｍで幅が約１ｃｍであり、約７５本から約１５０本のトラックがデバイスの一方側から他方側に延びている。別な実施例は幅と長さの両方ともが大きく、トラック数の数も多い。また別な実施例は異なる形状とパターンを有している。
【００６２】
図１Ｆは、部位１６が先の尖った角を設けた正方形の疎水性領域により輪郭を規定されているように例示している。しかし、これは概略表示であって、疎水性領域は角が丸くされ、或いは、鈍にされて、細胞網の細胞によって占有されるような部位を設けるのが好ましい。特定の実施例では、各部位の直径、すなわち、斜めに互いに対向する疎水性領域間の部位の横断測定値は、８μｍと１４μｍの間である。
【００６３】
図２Ａから図２Ｅは、細胞網を形成するためのデバイスを製造する修正されたプロセスの工程段を例示している。図１Ａから図１Ｅと同様に、各図はデバイスの多層状の構造を側面から見たところを例示している。
【００６４】
図２Ａを参照すると、図２Ａおよび図２Ｂは、図１Ａおよび図１Ｂに対応しており、親水性材料４の層は基板２の上に配置される。次いで、図２Ｃに例示されているように、鋳型１８が親水性の層４の上に位置決めされている。
【００６５】
鋳型１８は平面（図示せず）が実質的に格子状であり、一連のトラックと部位の間に領域を定義している。鋳型１８の両端が例示されている。疎水性材料は領域内に堆積されて、図２Ｄに例示されているように疎水性領域６Ａを形成する。疎水性材料はトラックと部位の間の領域に堆積されるだけで、トラックと部位自体には堆積しない。鋳型１８が除去されて、図２Ｅに例示されているようなデバイス２０が出来上がる。
【００６６】
明らかに、デバイス２０の構造は図１Ｅに例示されたデバイス１４の構造と同じである。デバイス２０は基板２、親水性の層４、および、疎水性領域６Ａから構成されているが、疎水性領域同士の間には親水性トラック１０と親水性部位が陥没している。デバイス２０の平面構造は図１Ｅに例示されているデバイス１４の平面構造と同じである。
【００６７】
鋳型１８は、平面図には例示されていないが、図１Ｇに例示されている格子構造でトラックと部位との間に領域を定義する構成を有している。好ましい実施形態では、疎水性材料が鋳型１８の中に注入され、硬化するようにされる。図２Ａおよび図２Ｅの修正されたプロセスを利用して製造されたデバイスの実施例は、図１Ａから図１Ｅのプロセスを利用して形成されたデバイスについて先に提示された寸法と同一寸法を有している。
【００６８】
図３は、細胞網を形成するためのデバイス２２の概略平面図である。デバイス２２は上述のデバイス１４およびデバイス２０に平面図が類似しているが、デバイス２２は異なる数のトラックと部位とを備えているのが例示されている。デバイス２２は複数の親水性トラック１０と複数の親水性部位１６とを備えている。トラック１０および部位１６は、複数の疎水性領域６Ａ同士の間で陥没している。デバイス１４およびデバイス２０に関して、上述した寸法と材料が同様にデバイス２２にあてはまる。しかしながら、デバイス２２の親水性トラック１０および親水性部位１６は化学誘導合図２４で被膜される。
【００６９】
特定の実施例では、化学誘導合図は、ラミニンのような細胞外基質（ＥＣＭ）蛋白である。他の実施例では、ポリリシンである。化学物質をデバイスに注入し、化学物質が疎水性領域から親水性領域へ流入することができるようにすることにより、化学誘導合図がトラック１０及び部位１６に付与される。次いで、化学物質が送風により乾燥されるのが好ましい。
【００７０】
デバイス１４およびデバイス２０のトラック及び部位は、同様に、化学誘導合図で被膜することができる。
【００７１】
図４Ａから図４Ｃ、図５、および図６は本発明の実施形態によるデバイスの用途に関するものである。デバイスを使用して、デバイス上の各部位に細胞が配置され、細胞同士の間の細胞接続部が、トラックに沿って存在する細胞の組織網を成長させることができる。これらのデバイスの上で成長させられる組織網の特定の実施例は、神経細胞の組織網である。
【００７２】
ここで図４Ａを参照すると、デバイス２２は、細胞源２６がデバイスの上の細胞接種区域に設けられているのが例示されている。図示した実施例では、細胞接種区域はデバイスの中心の指定区域にすぎず、細胞源はこの区域のトラックと部位の上に置かれる。別な実施形態では、細胞接種区域は、親水性トラックと親水性部位とが設けられた指定区域である。このような実施形態では、指定区域に隣接する区域には親水性トラックと親水性部位が設けられて、細胞網を形成し続ける。指定区域は親水性であるのが好ましい。指定区域は、親水性トラック及び親水性部位と同じ深さまで陥没していてもよい。任意で、指定区域は疎水性領域と同じレベルに配置されていてもよい。
【００７３】
図４Ｂはデバイス２２の拡大部を例示しており、図４Ｃは細胞源２６の拡大図である。
【００７４】
細胞源はデバイス上に細胞網を形成するのを促進するように処理され、これは、典型例では、細胞供給媒体で処理される。好ましい実施形態では、細胞接種区域２６（図面では等尺で例示されているわけではない）はおよそ３ｍｍ幅である。通例、デバイスは約２８本から約５３本の間のトラックを、細胞接種区域２６とデバイスの各辺との間に有している。
【００７５】
好ましい実施形態では、細胞源２６は神経細胞源である。特定の実施例では、極薄の脳の薄片が細胞源として使用される。典型的な先行技術の構造における細胞の成長に関して、ユンら記載しているように、２５０μｍ厚さのラットの脳薄片の冠状切断面がＨＡＭＳ  Ｆ１０から作られる冷凍脳薄片培養媒体（ｐＨ  ７．４）に２０ないし２５％の牛胎児の血漿と４ｍＭグルタミン（全てＳＩＧＭＡから入手できる）を補足して無菌状態で採取される。準備された薄片は３７℃で５％の二酸化炭素添加空気の保温器内に最低４〜５時間置かれる。保温期間の後、脳の薄片は滅菌されたデバイスの上に置かれて、或る量の脳薄片培養媒体で処理される。培養されて２〜３日後に、薄片はかなりの拡散を経験し、より多くの媒体が追加される。２週間後、神経細胞軸索が成熟状態に達し、３週間後には、神経細胞とそれぞれの突起が１０００から２０００μｍの中途で途切れることのないパターンにわたって拡散する。
【００７６】
この種の用途のために、デバイスは７０％アルコール中にデバイスを沈降させるか、或いは、１２０℃までデバイスを最低２０分間は加熱することを含む滅菌に耐えることができるようにするべきであることが分かる。更に、このデバイスは４℃から４０℃の温度範囲と６．５から７．９の間のｐＨ範囲に晒されるのに耐えることができるようにするべきである。
【００７７】
部位１６における細胞の細胞網の拡散／形成が図５に概略的に描かれている。矢印２７は細胞が部位１６に向けて拡散しているのを表している。トラック１０は部位１６同士の間に細胞接続部の形成を誘導し、細胞は部位１６を占有する。細胞によって占有された部位同士の間で細胞接続部が形成されるのと同様に、１つの部位１６から別な部位１６へ細胞が拡散していくことも起こるが、このようなプロセスは図５の概略描写には示されていない。
【００７８】
細胞網がデバイス上に形成されてしまうと、細胞網は多様な研究で使用することができる。このような研究には、デバイスの部位間の空隙に対応するように、それゆえ、細胞網の細胞同士の間の空隙に対応するように、互いに間隔を設けた電極から構成された電極配列を利用した細胞網の研究がある。電極配列は組織網中の多数の細胞と接触状態に置かれて、１個以上の細胞を刺激し、かつ、１個以上の別な細胞の反応を検出するために使用される。
【００７９】
図６は複数の電極３０から構成された電極配列２８を概略的に例示している。電極３０はデバイス１４およびデバイス２０の上に形成された細胞３２と接触させられる。電極配列２８は、細胞を刺激してそこにおける活動を検出するために使用される制御デバイス３４に接続されている。従って、細胞網の電気的活動度が測定される。
【００８０】
図６から明らかなように、細胞３２はデバイス１４およびデバイス２０の表面に盛り上がった状態で載置されるため、電極配列２８はそれらと接触状態になることができるが、これは、表面が盛り上がった状態で載置されてはいない細胞に接触することのできる電極配列を利用しているので、必要とはいえない。透明な基板を用いた実施形態では、細胞網に関して電極配列を配向させる際に、透明であることが助けとなる。状況によっては、細胞網は、細胞分析が開始される前にデバイスから除去することができる。
【００８１】
細胞膜にかかる摂動する電気勾配を呈する細胞網はいずれも電極配列を利用して研究することができるが、そのような細胞網の例は心臓細胞すなわち神経細胞の組織網である。電極配列の一例はマイクロ電極配列である。マイクロ電極配列を利用して、神経細胞の組織網の特性を研究することができる。グロス（Gross）らは、生体条件外における神経網や組織網反応の細胞外配列記録を利用した、臭い、薬物、毒物の分析を説明している。
【００８２】
本発明の実施形態によるデバイスは、どのような所望の構成であれ、部位およびトラックで形成することができる。デバイスの部位同士の間の空隙に対応するように互いに間隔を設けられた電極からなる電極配列を提供することができる。１種類以上のデバイスと１種類以上の相補電極配列が一緒にキットに梱包されてもよい。
【００８３】
このデバイスを利用することができる特に有用な１つの研究が、細胞網の活動に影響を与える物質を特定するための分析に存在する。例えば、物質を形成された細胞網に付与することにより、細胞網に候補物質を供与することができる。細胞網の活動は、候補物質の付与前後に分析されて、組織網の活動に付随する変化があったかどうかを判定することができる。細胞網の電気的活動度が測定され、スパイク対バースト比の一時的変化や信号形状の変動はどのようなものであれ分析される。
【００８４】
形成された組織網に候補物質を付与するよりむしろ、その物質で細胞源を事前処理することにより物質を付与するようにしてもよい。
【００８５】
或る実施形態では、電極配列を利用して、細胞網の活動が候補物質による影響を受けるかどうかを判定している。一実施形態では、候補物質が付与される細胞網の細胞の活動を制御細胞網の活動と比較して、候補物質が細胞網の活動に影響を与えるかどうかを判定する。
【００８６】
特定の実施例では、分析を利用して神経細胞の細胞網を分析する。従って、神経疾患や神経障害を治療するための候補物質を特定することができる。かかる疾患や障害には、記憶喪失（パーキンソン病や鬱病で生じるような記憶喪失など）、脳虚血、毒素誘発型の神経軸索／神経損傷（空気中または水中の毒素によるものなど）がある。
【００８７】
本発明の実施形態によるデバイスに形成された細胞網を薬物スクリーニングの主たる篩として利用することができることが分かる。組織網の配列は数百種の候補物質で探測され、組織網の活動に付随する変化が存在するかどうかや、そのような変化が望ましいものであるかどうかを見ることができる。
【００８８】
本発明を先行技術の具体的な実施形態に関連づけて説明してきたが、本発明はそれらに限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲で限定されるような発明の範囲に入る多数の変更を行い得ることが分かる。
【００８９】
本発明の範囲に入る具体的な変更例として、化学的誘導合図の代わりに、或いは、それと同様に、物理的誘導合図を利用することが挙げられる。物理的誘導合図の一例は、トラックおよび部位に供与される電荷である。ＥＣＭ蛋白以外の、例えば、コラーゲン、ポリエチレンイミン、ポリ−Ｌ−リシン、および、ポリ−Ｄ−リシンなどの化学的誘導合図を利用してもよい。更に、親水性材料の層と同じ機能を果たすことのできる親水性表面を基板自体が備えていてもよい。親水性材料の層は、疎水性領域の下に配置される特定の区域内の或る区域では非連続的であってもよい。
【００９０】
更に別な変更例として、トラック間の交点に位置していないトラック上の各点に親水性部位を形成することが挙げられる。かかる構成の一例がユンらの特許に記載されているが、そこでは、各部位がトラックに沿って配置された、線状トラックが利用されている。所望の構成のトラックおよび部位を備えたデバイスを形成することができる。
【００９１】
基板材料、親水性材料、および、疎水性材料はどのような好適な材料であってもよい。好適な基板材料の具体例として、可塑材とシリコンがある。任意選択で、この材料は、好適な粘着剤であればどのようなものによって結着されてもよい。
【００９２】
疎水性領域には回避合図が供与され、例えば、ミエリンに由来するＮＩ−３５などの蛋白を供与して、上記領域を横断して細胞接続部が形成されるのを抑制することができる。
【００９３】
本発明の範囲に入る製造方法には、基板が親水性の層である場合として、親水性の層上に疎水性領域を配置する方法がある。基板が疎水性表面を有している場合は、この方法は表面で部位とトラックを陥没させ、同部位と同トラックの上に親水性材料を積層することを含む。
【００９４】
製造方法の工程の変更例として、他のプロセスを利用してデバイスに層及び陥没部を形成することが挙げられる。このようなプロセスとしては、エピタキシ、写真製版術、レーザーエッチング、電子ビームエッチングがある。
【００９５】
分析方法の範囲に入る変更例として、他の技術を利用して細胞網の活動を研究することが挙げられる。例えば、パッチクランプ（細胞内）記録処理を利用してもよい。特に神経の諸機能を研究するためには、多数パッチのクランプ記録を利用してもよい。また別な好適な技術は、Ｆｕｒｏ−３のようなカルシウム画像処理がある。
【００９６】
紛らわしくなるのを避けるために、詳細な説明と特許請求の範囲の全体で使用されているような語「備えている・設けている・有している（comprising)」は「〜のみから構成されている（consisting only of）」を意味するとしか解釈できないとするのは間違いとすべきである。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１Ａ】本発明の実施形態に従ってデバイスを形成するための製造プロセスの工程段を側面から例示した概略図である。
【図１Ｂ】本発明の実施形態に従ってデバイスを形成するための製造プロセスの工程段を側面から例示した概略図である。
【図１Ｃ】本発明の実施形態に従ってデバイスを形成するための製造プロセスの工程段を側面から例示した概略図である。
【図１Ｄ】本発明の実施形態に従ってデバイスを形成するための製造プロセスの工程段を側面から例示した概略図である。
【図１Ｅ】本発明の実施形態に従ってデバイスを形成するための製造プロセスの工程段を側面から例示した概略図である。
【図１Ｆ】図１Ｅのデバイスを例示した平面図である。
【図２Ａ】本発明の実施形態に従ってデバイスを形成するための修正製造プロセスの工程段を側面から例示した概略図である。
【図２Ｂ】本発明の実施形態に従ってデバイスを形成するための修正製造プロセスの工程段を側面から例示した概略図である。
【図２Ｃ】本発明の実施形態に従ってデバイスを形成するための修正製造プロセスの工程段を側面から例示した概略図である。
【図２Ｄ】本発明の実施形態に従ってデバイスを形成するための修正製造プロセスの工程段を側面から例示した概略図である。
【図２Ｅ】本発明の実施形態に従ってデバイスを形成するための修正製造プロセスの工程段を側面から例示した概略図である。
【図３】本発明の実施形態によるデバイスを例示した概略平面図である。
【図４Ａ】デバイス上の細胞減を概略的に表したものと一緒に図３のデバイスを例示した図である。
【図４Ｂ】図４Ａのデバイスの一部を例示した概略拡大図である。
【図４Ｃ】図４Ａの細胞源を例示した概略拡大図である。
【図５】図３および図４のデバイスの上に細胞網を形成したところを例示した概略図である。
【図６】本発明の実施形態によるデバイスを側面から例示し、細胞がデバイスの上に配置され、電極配列が細胞と接触しているのを示した概略図である。
【国際公開パンフレット】
2005507253.tif 000003
2005507253.tif 000004
2005507253.tif 000005
2005507253.tif 000006
2005507253.tif 000007
2005507253.tif 000008
2005507253.tif 000009
2005507253.tif 000010
2005507253.tif 000011
2005507253.tif 000012
2005507253.tif 000013
2005507253.tif 000014
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2005507253.tif 000017
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2005507253.tif 000019
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2005507253.tif 000038
【国際調査報告】
2005507253.tif 000039
2005507253.tif 000040
2005507253.tif 000041
2005507253.tif 000042