(57)【要約】本発明は粒子フローサイトメトリー分析を利用して複数のＨＰＶ型に対する抗体の存在を同時に測定するイムノアッセイに関する。既知の型特異的蛍光標識中和モノクローナル抗体を特定ＨＰＶ−ＶＬＰ上のコンホメーション感受性中和エピトープとの結合に関して試験サンプル内の抗体と競合させる競合フォーマットで試験サンプル中の中和抗体の存在及び／又は力価を測定する。本発明はＨＰＶ  ＶＬＰと結合したミクロスフェアを含むミクロスフェアコンプレックスも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体からのサンプル中で少なくとも１種のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）型上の中和エピトープに対する抗体を検出する競合イムノアッセイであって、
（ａ）（ｉ）固有仕分化特性、および
（ｉｉ）固有ＨＰＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）型に結合したミクロスフェアと、ＶＬＰと結合する検出可能に標識したモノクローナル抗体とを含むミクロスフェアコンプレックスを各々含む少なくとも１個のミクロスフェアセットを提供する段階；
（ｂ）サンプル内の任意の抗体がＶＬＰと結合できるように少なくとも１個のミクロスフェアセットを該サンプルと接触させる段階；並びに
（ｃ）各ミクロスフェアセットについて、
（ｉ）ＶＬＰと結合する検出可能に標識したモノクローナル抗体の量；又は
（ｉｉ）ＶＬＰと結合しない検出可能に標識したモノクローナル抗体の量のいずれかを測定する段階、
を含む前記競合イムノアッセイ。
【請求項２】
段階（ａ）が複数のミクロスフェアセットを提供する請求項１に記載の競合イムノアッセイ。
【請求項３】
ミクロスフェアセットの固有仕分化特性が固有スペクトル特性である請求項２に記載の競合イムノアッセイ。
【請求項４】
ミクロスフェアセットの固有仕分化特性が固有寸法である請求項２に記載の競合イムノアッセイ。
【請求項５】
被験体からのサンプル中の複数のＨＰＶ型の各々に特異的な抗体力価を定量する段階を更に含む請求項３に記載の競合イムノアッセイ。
【請求項６】
型特異的ＨＰＶ  ＶＬＰを複数のミクロスフェアセットの各々と結合させる段階を更に含む請求項５に記載の競合イムノアッセイ。
【請求項７】
複数のＨＰＶ型がＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５５、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９、及びＨＰＶ６８から構成される群から選択される請求項２に記載の競合イムノアッセイ。
【請求項８】
複数のＨＰＶ型がＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８から構成される請求項７に記載の競合イムノアッセイ。
【請求項９】
サンプルが血清から構成される請求項３に記載の競合イムノアッセイ。
【請求項１０】
検出可能に標識したモノクローナル抗体の結合が阻害されるか否かを調べ、抗体力価を定量するためにＵＭＩＮＥＸ１００アナライザーを使用する請求項５に記載の競合イムノアッセイ。
【請求項１１】
検出可能に標識したモノクローナル抗体の結合が阻害されるか否かを調べ、抗体力価を定量するためにフローサイトメーターを使用する請求項５に記載の競合イムノアッセイ。
【請求項１２】
モノクローナル抗体をフィコエリトリンで標識する請求項３に記載の競合イムノアッセイ。
【請求項１３】
検出抗体がＨ６．Ｂ１０．５、Ｈ１１．Ｂ２、Ｈ１６．Ｖ５、及びＨ１８．Ｊ４から構成される請求項８に記載の競合イムノアッセイ。
【請求項１４】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）と結合したミクロスフェアを含むミクロスフェアコンプレックス。
【請求項１５】
ＶＬＰと結合した検出可能に標識したモノクローナル抗体を更に含む請求項１４に記載のミクロスフェアコンプレックス。
【請求項１６】
モノクローナル抗体がフィコエリトリンで検出可能に標識されている請求項１５に記載のミクロスフェアコンプレックス。
【請求項１７】
ＨＰＶ  ＶＬＰ型がＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８から構成される群から選択される請求項１５に記載のミクロスフェアコンプレックス。
【請求項１８】
被験体からの血清サンプル中でヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）６、１１、１６及び１８型上の中和エピトープに対する抗体を検出する競合イムノアッセイであって、
（ａ）（ｉ）固有スペクトル特性、および
（ｉｉ）固有ＨＰＶ  ＶＬＰ型に結合したミクロスフェアと、ＶＬＰと結合しフィコエリトリンレポーター分子で標識したモノクローナル抗体とを含むミクロスフェアコンプレックスを各々含む４個の蛍光ミクロスフェアセットを提供する段階、ここで第１のミクロスフェアセットをＨＰＶ６  ＶＬＰと結合し、第２のミクロスフェアセットをＨＰＶ１１  ＶＬＰと結合し、第３のミクロスフェアセットをＨＰＶ１６  ＶＬＰと結合し、第４のミクロスフェアセットをＨＰＶ１８  ＶＬＰと結合する；
（ｂ）サンプル内の任意の抗体がＶＬＰと結合できるように４個のミクロスフェアセットを該血清サンプルと接触させる段階；並びに
（ｃ）各ミクロスフェアセットについて、
（ｉ）ＶＬＰと結合するフィコエリトリン標識化モノクローナル抗体の量；又は
（ｉｉ）ＶＬＰと結合しないフィコエリトリン標識化モノクローナル抗体の量のいずれかを測定し、検出抗体の結合が阻害された場合には、ＨＰＶ６、１１、１６又は１８に特異的な抗体が該血清サンプル中に存在すると判定する段階、
を含む前記競合イムノアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般にはヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の分野、特に臨床試料中のＨＰＶ抗体の存在の検出方法に関する。より具体的には、本発明は複数のＨＰＶ型に特異的な抗体を同時に検出及び定量する多重競合イムノアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
８０種を上回るヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）型が記載されており、その多くは良性増殖性疣贅から悪性癌腫に至る多様な生物学的表現型に結び付けられる（ＭｃＭｕｒｒａｙら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．８２（１）：１５−３３（２００１）参照）。ＨＰＶ６とＨＰＶ１１は最も一般に良性疣贅に関連する型であり、ＨＰＶ１６とＨＰＶ１８は悪性病変に関連することが最も多いハイリスク型である。子宮頚癌の９０％以上がＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８又は低有病率の発癌性ＨＰＶ３１、３３、４５、５２及び５８型の感染に結び付けられている（Ｓｃｈｉｆｆｍａｎら，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８５（１２）：９５８−６４（１９９３））。ＨＰＶ  ＤＮＡが子宮頚癌の９０％以上で検出されるという知見はＨＰＶが子宮頚癌の原因であるという強力な疫学的証拠となる（Ｂｏｓｃｈら，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８７（１１）：７９６−８０２（１９９５）参照）。
【０００３】
ＨＰＶに対する有効なワクチンは子宮頸部異形成及び癌腫の発生とそれに関連する疾病率及び死亡率を抑制することが必要である。低リスクと高リスクの両方のＨＰＶ型に対するワクチンが現在臨床試験中である。臨床試料中で数種のＨＰＶ型に対するＨＰＶ型特異的抗体の存在を測定できることは見込みのあるワクチンの効力をモニターするためと自然誌感染研究の両方に有用であろう。
【０００４】
ＨＰＶに対する中和抗体の定量方法としては、ｉｎ  ｖｉｖｏ中和アッセイ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ擬似中和アッセイ、競合ラジオイムノアッセイ（ｃＲＩＡ）、及び酵素結合イムノソルベント法（ＥＬＩＳＡ）等の数種の方法が開発されている。しかし、これらの技術は各々大規模ワクチン臨床試験及び自然誌研究用として多数の患者血清の試験を阻む１種以上の制約がある。
【０００５】
最も一般的な中和ＨＰＶ抗体力価の測定技術は無胸腺マウス異種移植システムである（Ｂｒｙａｎら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．５３（３）：１８５−  ８８（１９９７）；Ｋｒｅｉｄｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  ３１７（６０３８）：６３９−４１（１９９８））。このアッセイでは、個体からの血清を感染性ＨＰＶと混合し、包皮組織に加えた後、無胸腺マウスの腎臓被膜下に移植する。移植片の組織学的変化とＨＰＶ  ＤＮＡをｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによりモニターする。このような組織学的変化が出現するには数カ月を要するので、この方法は高スループット分析には適していない。
【０００６】
無胸腺マウス異種移植システムで多数の血清を試験するのは技術的に困難であるので、中和抗体力価と非中和抗体力価を測定するための数種の相補的アッセイが開発されている。これらのアッセイとしては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ擬似中和アッセイ（Ｂｒｙａｎら，前出；Ｒｏｄｅｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０（９）：５８７５−  ８３（１９９６））、競合ＲＩＡ（Ｐａｌｋｅｒら，Ｖａｃｃｉｎｅ  １９（２７）：３７３３−４３（２００１））及びウイルス様粒子（ＶＬＰ）に基づくＥＬＩＳＡ（Ｗｉｄｅｒｏｆｆら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７２（６）：１４２５−  ３０（１９９５））が挙げられる。擬似中和アッセイはＨＰＶ−ＶＬＰ  ＥＬＩＳＡの２０〜３０倍弱い感度であり（Ｎａｒｄｅｌｌｉ−Ｈａｅｆｌｉｇｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３（１１）：９６０９−１３（１９９９））、競合ＲＩＡ（Ｐａｌｋｅｒら，前出）と比較すると１００倍まで弱いことが報告されている。他方、ＥＬＩＳＡに基づくアッセイは一度に１種類の分析物しか検出できないので、数種のＨＰＶ型に対する抗体力価の検出と定量が望ましい多数の臨床試料の分析には非実用的である。
【０００７】
最近、粒子フローサイトメトリーアッセイを使用して複数の分析物を同時に測定する方法が開発されている。このアプローチは種々の抗原に特異的な抗体を含む多数の型の可溶性分析物を測定し、種々の受容体の細胞表面発現を定量するために使用されている（Ｖｉｇｎａｌｉ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４３：２４３−２５５（２０００）参照）。Ｓｃｈｌｏｔｔｍａｎらは肺炎コンジュゲートワクチンに対する抗体応答を測定するために肺炎球菌ワクチン試験でこの方法を使用した（Ｍａｒｔｉｎｓ，Ｃｌｉｎ  Ｄｉａｇｎ  Ｌａｂ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ：９（１）：４１−４５（２００２））。Ｂｅｌｌｉｓａｒｉｏらは新生児乾燥血斑検体でＨＩＶ−１抗原ｐ２４、ｇｐ１６０及びｇｐ１２０に対する抗体を同時に測定するための粒子フローサイトメトリーアッセイを開発した（Ｅａｒｌｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｅｖｅｌ．６４：２１−２５（２００１））。これらの研究はいずれも所望分析物を試料中で直接検出する単純捕獲型アッセイを利用していた。
【０００８】
上記イムノアッセイが開発されているが、中和エピトープに対するＨＰＶ型特異的抗体を測定するためのアッセイとして、感度と再現性が高く、当分野で開示されている方法よりも必要な人的投入時間数の少ないアッセイが開発されるならば有利であろう。連続実験を必要とする単一血清学的アッセイよりも数種のＨＰＶ型に対するＨＰＶ型特異的抗体を同時に測定するイムノアッセイが好ましい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は粒子フローサイトメトリー分析を利用して複数のＨＰＶ型に対する抗体の存在を検出するイムノアッセイに関する。既知の型特異的な検出可能に標識した中和モノクローナル抗体を、ＨＰＶ  ＶＬＰ上のコンホメーション感受性中和エピトープとの結合に関して試験サンプル内の抗体と競合させる競合フォーマットで、中和抗体の存在及び／又は力価を測定する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
より具体的には、本発明は被験体からのサンプル中で少なくとも１種のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）型上の中和エピトープに対する抗体を検出する競合イムノアッセイであって、（ａ）（ｉ）固有仕分化特性、および（ｉｉ）固有ＨＰＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）型に結合したミクロスフェアと、ＶＬＰと結合する検出可能に標識したモノクローナル抗体とを含むミクロスフェアコンプレックスを各々含む少なくとも１個のミクロスフェアセットを提供する段階；（ｂ）サンプル内の任意の抗体がＶＬＰと結合できるように少なくとも１個のミクロスフェアセットを該サンプルと接触させる段階；並びに（ｃ）各ミクロスフェアセットについて、（ｉ）ＶＬＰと結合する検出可能に標識したモノクローナル抗体の量；又は（ｉｉ）ＶＬＰと結合しない検出可能に標識したモノクローナル抗体の量のいずれかを測定する段階、を含む競合イムノアッセイに関する。
【００１１】
本発明は更に被験体からのサンプル中の複数のＨＰＶ型に対する中和抗体を検出する競合イムノアッセイであって、Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ＭｕｌｔｉＡｎａｌｙｔｅ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＬａｂＭＡＰ（登録商標），Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）をＬＵＭＩＮＥＸ１００（登録商標）デスクトップアラナイザーと併用して、単一血清サンプルからの複数のＨＰＶ型に対する抗体を同時に測定する競合イムノアッセイに関する。本発明の１好適態様では、複数の別個の蛍光Ｌｕｍｉｎｅｘミクロスフェアに結合した酵母由来ＶＬＰを使用する。型特異的ＨＰＶ−ＶＬＰ抗体（Ａｂ）応答はＬＵＭＩＮＥＸ１００（登録商標）で夫々の別個の赤及び赤外蛍光色素スペクトル特性により識別される特定Ｌｕｍｉｎｅｘミクロスフェアと関連付けられる（Ｆｕｌｔｏｎら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４３（９）：１７４９−５６（１９９７））。既知のＨＰＶ型特異的フィコエリトリン（ＰＥ）で標識した中和検出抗体を、ＶＬＰ上のコンホメーション感受性中和エピトープとの結合に関して患者血清抗体と競合させる、競合フォーマットで中和抗体力価を測定する。本発明の方法はヒト血清中でＨＰＶ型特異的抗体を高い確度と精度で同時に測定する。
【００１２】
本発明は更に被験体からの血清サンプル中でヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）６、１１、１６及び１８型上の中和エピトープに対する抗体を検出する競合イムノアッセイであって、（ａ）（ｉ）固有スペクトル特性、および（ｉｉ）固有ＨＰＶ  ＶＬＰ型に結合したミクロスフェアと、ＶＬＰと結合しフィコエリトリンレポーター分子で標識したモノクローナル抗体とを含むミクロスフェアコンプレックスを各々含む４個の蛍光ミクロスフェアセットを提供する段階、ここで第１のミクロスフェアセットをＨＰＶ６  ＶＬＰと結合し、第２のミクロスフェアセットをＨＰＶ１１  ＶＬＰと結合し、第３のミクロスフェアセットをＨＰＶ１６  ＶＬＰと結合し、第４のミクロスフェアセットをＨＰＶ１８  ＶＬＰと結合する；（ｂ）サンプル内の任意の抗体がＶＬＰと結合できるように４個のミクロスフェアセットを該血清サンプルと接触させる段階；並びに（ｃ）各ミクロスフェアセットについて、（ｉ）ＶＬＰと結合するフィコエリトリン標識化モノクローナル抗体の量；又は（ｉｉ）ＶＬＰと結合しないフィコエリトリン標識化モノクローナル抗体の量のいずれかを測定し、検出抗体の結合が阻害された場合には、ＨＰＶ６、１１、１６又は１８に特異的な抗体が該血清サンプル中に存在すると判定する段階、を含む競合イムノアッセイに関する。
【００１３】
本発明は更にＨＰＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）と結合したミクロスフェアを含むミクロスフェアコンプレックスに関する。本発明の１好適態様において、ミクロスフェアコンプレックスは更にＶＬＰと結合した検出可能に標識したモノクローナル抗体を含む。
【００１４】
本明細書及び特許請求の範囲において使用する単数形は、そうでないことが文脈から明白に読み取れる場合を除いて複数形も含む。
【００１５】
本明細書及び特許請求の範囲では以下の定義と略語を適用する。
【００１６】
「複数」とは２以上を意味する。
【００１７】
「ＨＰＶ」とはヒトパピローマウイルスを意味する。「ＨＰＶ」は現在公知であるか今後記載されるかを問わずにＨＰＶの任意サブタイプを表すために使用する一般用語である。
【００１８】
「ミクロスフェア」とは本発明の方法で使用する特定ＨＰＶ−ＶＬＰと共有結合又は他の方法で結合することが可能な小粒子を意味する。ミクロスフェア、粒子、微粒子、ビーズ又はマイクロビーズなる用語は同義に使用し、等価の意味を有する。
【００１９】
「ミクロスフェアセット」とはセットの一部として同定させ、別のミクロスフェアセットを含むミクロスフェアからの区別を規定する「固有仕分化特性」を共有する複数のミクロスフェアを意味する。「固有仕分化特性」は例えばフローサイトメーターにより検出することができ、ミクロスフェアセットを相互に区別する基礎として寄与する。典型的な「固有仕分化特性」はビーズの寸法である。ビーズ寸法を固有仕分化特性として選択する場合には、特定ミクロスフェアセット内の全ビーズは比較的同一寸法でなければならず、この特定ミクロスフェアセット以外の全ビーズは別の寸法でなければならない。
【００２０】
あるいは、ミクロスフェアセットを異なる割合の２種以上の蛍光色素で標識し、発光波長と蛍光強度を固有仕分化特性として機能させてもよい。例えば、実施例３では、ＨＰＶ  ＶＬＰ６、１１、１６及び１８をＬｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）製品である固有ミクロスフェアセットと各々結合した。識別可能な固有ミクロスフェアセットを開発するに当たり、Ｌｕｍｉｎｅｘは２種の蛍光色素の割合を変化させることによりビーズ集団を内部的に色コード化した。固有ミクロスフェアセットを使用してサンプル中の種々の分析物、即ち抗体を検出すると、固有仕分化特性を検出することが可能な計器により分析物を分離することができる。例えば、蛍光標識ミクロスフェアセットの場合には、あるミクロスフェアセットからのビーズを別のセットに属するビーズから仕分け又は分離し、フローサイトメーターにより定量することができる。
【００２１】
本発明の方法では、各ミクロスフェアセットは「固有ＨＰＶ  ＶＬＰ型」に結合した複数のミクロスフェアを含み、即ち、各ミクロスフェアセットは別のミクロスフェアセットに連結するＨＰＶ  ＶＬＰ型とは異なる特定ＨＰＶ  ＶＬＰ型に連結する複数のミクロスフェアを含む。しかしながら、単一ミクロスフェアセットは単一ＨＰＶ  ＶＬＰ型を含む。
【００２２】
「ミクロスフェアコンプレックス」は本明細書では「ＶＬＰ−ミクロスフェア」及び「ＶＬＰ−ミクロスフェアコンプレックス」と同義に使用し、ＨＰＶ  ＶＬＰに結合したミクロスフェアを意味する。例えば、実施例３に示すように、ミクロスフェアコンプレックスはＬａｂＭＡＰ（登録商標）技術と併用するものとしてＬｕｍｉｎｅｘから市販されているＬｕｍｉｎｅｘビーズ１３８をＨＰＶ１６由来ＶＬＰと結合したものを利用できる。あるいは、当業者は当分野で公知であるか又は今後同定される任意ビーズ又はミクロ粒子を任意ＨＰＶ型に由来するＨＰＶ  ＶＬＰと結合したものも利用できる。ミクロスフェアコンプレックスは更にＶＬＰと結合する検出可能に標識したモノクローナル抗体も含むことができる。
【００２３】
１又は複数の「ＶＬＰ」は１又は複数のウイルス様粒子を意味する。ウイルス様粒子はヒト及び動物のパピローマウイルスの主要キャプシド蛋白質であるＬ１が酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞又は細菌で発現されるときに自己アセンブリすることができる（Ｓｃｈｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｄｅｎ，ｉｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  Ｒｅｖｉｅｗｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ；Ｌａｃｅｙ，ｅｄ．Ｌｅｅｄｓ，ＵＫ：Ｌｅｅｄｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｐｐ１０１−１２（１９９６）参照）。Ｌ１及びＬ２キャプシド蛋白質の組合せを発現させることにより、形態的に区別できないＨＰＶ  ＶＬＰを生産することもできる。ＶＬＰはＴ＝７で二十面体構造のＬ１の７２個の五量体から構成される（Ｂａｋｅｒら，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．６０（６）：１４４５−  ５６（１９９１））。
【００２４】
ＶＬＰは真正ビリオンと形態的に類似しており、動物に投与すると、高い中和抗体力価を誘導することができる。ウサギ（Ｂｒｅｉｔｂｕｒｄら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９（６）：３９５９−６３（１９９５））とイヌ（Ｓｕｚｉｃｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２（２５）：１１５５３−５７（１９９５））をＶＬＰで免疫すると、いずれも中和抗体を誘導し、実験パピローマウイルス感染から防御できることが示されている。他方、ＶＬＰは潜在発癌ウイルスゲノムを含まず、単一遺伝子から自己アセンブリすることができるので、ＨＰＶワクチン開発において生きたウイルスに代わる安全な代用品である（Ｓｃｈｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｈｉｄｅｓｈｅｉｍ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．１９：６７−７４（２０００）参照）。
【００２５】
「ＰＥ」とは蛍光ラベルであるフィコエリトリンを意味する。
【００２６】
「ＣＶ」又は「％ＣＶ」とは変動係数を意味する。
【００２７】
「ＭＦＩ」とは蛍光強度中央値を意味する。
【００２８】
「Ａｂ」と「ｍＡｂ」は夫々「抗体」と「モノクローナル抗体」を意味する。
【００２９】
「検出抗体」又は「検出Ａｂ」とは本発明の競合アッセイで使用されるミクロスフェアコンプレックスと結合した検出可能に標識したＨＰＶ型特異的抗体を意味する。検出抗体はミクロスフェアコンプレックスの一部を構成する型特異的ＶＬＰと結合する。本発明の競合イムノアッセイは、検出抗体と夫々のＶＬＰ上のコンホメーション感受性中和エピトープとの結合を置き換えることが可能な患者サンプル中のポリクローナルＡｂの力価を測定する。結合したＨＰＶ特異的検出Ａｂからの蛍光シグナルは患者の中和Ａｂ力価に反比例する。
【００３０】
「レポーター分子」は「蛍光タグ」、「蛍光レポーター分子」、「レポーター蛍光色素」、又は「検出可能なタグ」としても知られ、特定抗体と結合するか、その存在を証明するか、又はその定量を可能にする蛍光剤を意味する。レポーター分子は例えばフィコエリトリンとすることができる。
【００３１】
本明細書で使用する「ＣＬ１」及び「ＣＬ２」は夫々分類１及び分類２を意味する。本発明の１つの例示的態様では、ＣＬ１は６５８ｎｍでのＬｕｍｉｎｅｘミクロスフェアからの発光スペクトルを意味し、ＣＬ２は７１２ｎｍでの発光スペクトルを意味する。Ｌｕｍｉｎｅｘ計器は２種の分類の波長を測定し、どちらのミクロスフェアが分析されているかを判定する。
【００３２】
「ｃＲＩＡ」は競合ラジオイムノアッセイを意味する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
全ワクチンプログラムの共通の目的は臨床的に関連する防御相関を同定することである。具体的には、臨床的疾患からの防御に関連することが示されている実験パラメーターを同定する必要がある。多くの感染性疾患では、中和抗体（Ａｂ）アッセイを使用して予防ワクチンの免疫原性を評価する。
【００３４】
従って、本発明は被験体からのサンプル中で少なくとも１種のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）型上の中和エピトープに対する抗体を検出する競合イムノアッセイであって、（ａ）（ｉ）固有仕分化特性、および（ｉｉ）固有ＨＰＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）型に結合したミクロスフェアと、ＶＬＰと結合する検出可能に標識したモノクローナル抗体とを含むミクロスフェアコンプレックスを各々含む少なくとも１個のミクロスフェアセットを提供する段階；（ｂ）サンプル内の任意の抗体がＶＬＰと結合できるように少なくとも１個のミクロスフェアセットを該サンプルと接触させる段階；並びに（ｃ）各ミクロスフェアセットについて、（ｉ）ＶＬＰと結合する検出可能に標識したモノクローナル抗体の量；又は（ｉｉ）ＶＬＰと結合しない検出可能に標識したモノクローナル抗体の量のいずれかを測定する段階、を含む競合イムノアッセイに関する。
【００３５】
本発明の方法では、ＨＰＶ型特異的ＶＬＰに対する検出可能に標識したモノクローナル抗体の結合が阻害されるか又は結合量が低下した場合に、このＨＰＶ型に特異的なＨＰＶ型特異的中和エピトープに対する抗体が被験体のサンプル中に存在すると判定する。結合したＨＰＶ特異的検出ｍＡｂからの蛍光シグナルは被験体の中和抗体力価に反比例する。
【００３６】
本発明の方法は少なくとも１個のミクロスフェアセットを用いて実施することができる。当業者は患者又は被験体サンプル中のスクリーニングすべきＨＰＶ型特異的抗体の数に応じてミクロスフェアセットの数を変えることができる。サンプル内の複数のＨＰＶ型に対する抗体を同時に検出するためには複数のミクロスフェアセットを使用することが好ましい。
【００３７】
「同時に」又は「一度に」とは、サンプル中に存在する異なるＨＰＶ型を示す複数のＨＰＶ型特異的抗体の存在及び／又は力価を単一実験プロトコールで検出できることを意味する。換言するならば、当業者はアッセイプレートの単一ウェルで１組の試薬で、２種以上のＨＰＶ型に対するＨＰＶ抗体の存在及び／又は量を測定することができる。例えば、本発明の方法によると、当業者は９６ウェルプレートの単一ウェルで適当な試薬と試験サンプルと興味あるＨＰＶ型を検出するように設計されたミクロスフェアセットを混合することにより、試験サンプル中のＨＰＶ６、１１、１６及び１８型抗体の存在を同時に検出することができる。このような場合には、アッセイプレートで試験サンプルの４個の別個のアリコート又は４個の別個のウェルを使用する必要なしに、単一実験でＨＰＶ６、１１、１６及び１８型に関する結果を得ることができる。従って、本発明の方法によると、当業者は従来技術の方法で必要だった連続実験の必要なしに、サンプル中の２種以上のＨＰＶ型に対する抗体をスクリーニングできるという利点がある。
【００３８】
本発明の１好適態様では、上記競合イムノアッセイは被験体からのサンプル中の複数のＨＰＶ型の各々に特異的な抗体力価を定量する段階を更に含む。
【００３９】
本発明の別の態様では、競合イムノアッセイは型特異的ＨＰＶ  ＶＬＰを複数の蛍光ミクロスフェアセットの各々に結合する段階を更に含む。
【００４０】
本発明の方法は上述のように、単一サンプル中の複数の興味あるＨＰＶ型を同時に検出できるという利点がある。本明細書に開示するアッセイでＨＰＶ型の任意の組合せを検出できるという融通性に加え、本発明の方法はウイルス負荷測定やサイトカインアッセイ等の他のアッセイを同一試験に追加することもできる。本発明によると、更に当業者は所望により単一試験サンプルで複数のＨＰＶ型に対する抗体を同時に容易に定量することができる。
【００４１】
ＶＬＰの捕獲アッセイは中和エピトープ及び非中和エピトープの両者に対する抗体と潜在的に酵母由来蛋白質に対する他の抗体の組合せを測定するので、本発明の多重競合イムノアッセイは単一捕獲アッセイフォーマットを利用する従来技術の方法の改良である。本発明の方法のように競合イムノアッセイを使用すると、より高い特異性と再現性を確保することができる。競合フォーマットでは、高濃度のサンプルを試験して低力価ＨＰＶ型特異的抗体を試験することもできる。
【００４２】
更に、本発明の新規方法は従来技術の方法よりも小容量のサンプルでサンプルのＨＰＶ抗体状態を正確且つ迅速に試験することができる。本発明の方法の１典型的態様では、被験体からの僅か５０μｌの血清を使用して数種のＨＰＶ型に対する抗体の存在を測定した（実施例４参照）。単一サンプルで多数のＨＰＶアッセイを同時に実施することができるので、本発明の方法は労力、高価な試薬（例えば小児血清）及び消耗品を節約することができる。更に、本発明は特異性を確保するために各サンプルで内部対照を使用することができる。本発明は更に実験者に安全な非放射性物質で抗体を検出できるという利点もある。
【００４３】
本発明で使用するＨＰＶ型は任意複数の興味あるＨＰＶ型とすることができ、文献に記載されているか又は今後同定される任意ＨＰＶ型を含む。例えば、ＨＰＶ型としては限定されないが、ＨＰＶ６、ＨＰＶｌｌ、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５５、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９、及びＨＰＶ６８が挙げられる。
【００４４】
本発明の方法は開発中のワクチン候補に含まれるＨＰＶ型と興味あるＨＰＶ型を相関させて見込のあるＨＰＶワクチンの効力をモニターするように適合させることができる。このような場合には、興味あるＨＰＶ型は発癌又は他の望ましくない表現型に関連する型とすることができる。従って、本発明の１典型的態様はＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８を含む複数のＨＰＶ型を提供する。
【００４５】
この点で、本発明は更に被験体からの血清サンプル中でヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）６、１１、１６及び１８型上の中和エピトープに対する抗体を検出する競合イムノアッセイであって、（ａ）（ｉ）固有スペクトル特性、および（ｉｉ）固有ＨＰＶ  ＶＬＰ型に結合したミクロスフェアと、ＶＬＰと結合しフィコエリトリンレポーター分子で標識したモノクローナル抗体とを含むミクロスフェアコンプレックスを各々含む４個の蛍光ミクロスフェアセットを提供する段階、ここで第１のミクロスフェアセットをＨＰＶ６  ＶＬＰと結合し、第２のミクロスフェアセットをＨＰＶ１１  ＶＬＰと結合し、第３のミクロスフェアセットをＨＰＶ１６  ＶＬＰと結合し、第４のミクロスフェアセットをＨＰＶ１８  ＶＬＰと結合する；（ｂ）サンプル内の任意の抗体がＶＬＰと結合できるように４個のミクロスフェアセットを該血清サンプルと接触させる段階；並びに（ｃ）各ミクロスフェアセットについて、（ｉ）ＶＬＰと結合するフィコエリトリン標識化モノクローナル抗体の量；又は（ｉｉ）ＶＬＰと結合しないフィコエリトリン標識化モノクローナル抗体の量のいずれかを測定し、検出抗体の結合が阻害された場合には、ＨＰＶ６、１１、１６又は１８に特異的な抗体が該血清サンプル中に存在すると判定する段階、を含む競合イムノアッセイに関する。
【００４６】
本発明で使用するＨＰＶ  ＶＬＰは適当な宿主細胞（例えば哺乳動物及び昆虫宿主細胞）でｉｎ  ｖｉｖｏ産生させてもよいし、組換えＬ１蛋白質の精製により自然に形成されるものでもよい。本発明の１典型的態様では、ＶＬＰは酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのライゼートから精製される。
【００４７】
本発明は被験体からのサンプル中のＨＰＶ型特異的抗体の存在の測定方法に関する。当業者に自明の通り、ＨＰＶ型に対する中和抗体を含み得る興味ある被験体からの任意体液を本発明の目的でサンプル源として使用することができた。例えば、本発明の方法で使用されるサンプルとしては限定されないが、血清、血漿、全血、脳脊髄液、骨髄吸引物、リンパ節懸濁液又は尿が挙げられる。本発明の１好適態様では、サンプルは被験体からの血清から構成される。
【００４８】
本発明で使用されるミクロスフェアは粒子フローサイトメトリー分析で使用するためにＨＰＶ  ＶＬＰを結合させることが可能な任意の粒子又はビーズとすることができ、Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）、及びＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）等の数社から市販されている。ミクロスフェアは粒径範囲０．０１〜１００μｍが好ましく、約１μｍ〜約２０μｍがより好ましい。
【００４９】
単一ミクロスフェアセット内のミクロスフェアはほぼ同一寸法であることが好ましい。異なるミクロスフェアセットからのビーズは同一寸法でもよいし、寸法を変えてその寸法を識別パラメーター又は固有仕分化特性として本発明の方法で使用してもよい。ほぼ同一寸法のミクロスフェアを含むミクロスフェアセットはフローサイトメーターにより検出可能な別のパラメーター（例えば固有スペクトル特性）に基づき区別することができる。
【００５０】
前記ミクロスフェアは検出計器による検出のためにＶＬＰを結合することができる任意材料から構成することができる。例えば、ミクロスフェアを構成するのに許容可能な材料としては限定されないが、ポリスチレン、ポリアクリル酸、ポリアクリロニトリル、ポリアクリルアミド、ポリアクロレイン、ポリブタジエン、ポリジメチルシロキサン、ポリイソプレン、ポリウレタン、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリビニルピリジン、ポリビニルベンジルクロリド、ポリビニルトルエン、ポリ塩化ビニリデン、ポリジビニルベンゼン、ポリメタクリル酸メチル、又はその組合せが挙げられる。本発明の１好適態様では、ミクロスフェアはポリスチレンから構成される。
【００５１】
ミクロスフェアは本発明のＶＬＰ等の分析用反応体を結合するのに有用な追加的な官能基を場合により含むことができる。前記官能基としては限定されないが、カルボキシレート、エステル、アルコール、カルバミド、アルデヒド、アミン、酸化硫黄、酸化窒素、又はハロゲン化物が挙げられる。前記官能基を含むミクロスフェアは市販されている。例えば、Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎは同社のＬａｂＭＡＰ（登録商標）技術で使用するためのカルボキシル化ミクロスフェアを市販している。ミクロスフェアをカルボキシル化すると、簡単な化学技術を使用してＶＬＰと共有結合できる。
【００５２】
フローサイトメーター又は他の検出計器により検出及び／又は定量することが可能な任意特徴又はパラメーターを、検出計器による粒子仕分け又は選別する基礎とすることができる。前記パラメーターはＶＬＰ−ミクロスフェアセットを相互に区別するための手段となり、従って、同一サンプル内のＨＰＶ  ＶＬＰ集団を別々に検出及び定量することができる。本発明の１好適態様では、ミクロスフェアセットを規定する「固有仕分化特性」は固有スペクトル特性である。
【００５３】
本発明の方法では任意の興味あるＨＰＶ  ＶＬＰ上のコンホメーション感受性中和エピトープと結合することが可能な任意モノクローナル抗体を検出抗体として使用することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏ中和アッセイ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ擬似中和アッセイにより示されるようにＨＰＶウイルスを中和する数種のモノクローナル抗体が既に文献に記載されている（例えばＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２２４（２）：４７７−８６（１９９６）参照）。
【００５４】
更に、当業者に自明の通り、本発明で使用されるモノクローナル抗体はＨＰＶ  ＶＬＰ、ポリペプチド、蛋白質又はその部分を抗原として使用する当分野で公知の方法により生産することができる。例えば、モノクローナル抗体は本明細書中に参考として援用されているＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８））に記載されているように生産することができる。抗原として使用されるＨＰＶポリペプチドは天然源から単離することもできるし、（市販合成器を使用して）合成することもできる。ＨＰＶ  ＶＬＰを抗原として使用して本発明で使用されるモノクローナル抗体を生産することが好ましい。
【００５５】
本発明の１好適態様では、夫々ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８に特異的なＨ６．Ｂ  １０．５、Ｈ１１．Ｂ２、Ｈ１６．Ｖ５、及びＨ１８．Ｊ４モノクローナル抗体を検出抗体として使用する（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２２４（２）：４７７−８６（１９９６）；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４（１１）：５６７８−８１（１９９０）；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２２３（１）：１７４−８４（１９９６）；及びＹｅａｇｅｒら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２７８（２）：５７０−７７（２０００）参照）。
【００５６】
本発明の方法で使用されるモノクローナル検出抗体はフローサイトメーター又は他の検出計器により検出することが可能な任意分子（以下、「レポーター分子」と言う）で標識することができる。従って、前記計器により検出可能な範囲内で発光するレポーター分子を選択する必要がある。本発明で使用される計器はレポーター分子の必要な発光波長を指令する既知励起波長を有する励起手段（例えばレーザー）を含む。例えば、ＬＵＭＩＮＥＸ  １００（登録商標）（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）検出計器は５３２ｎｍの励起波長を有するアルゴンレーザーを含む。この励起波長に基づき、本発明で使用するためにＬＵＭＩＮＥＸ  １００（登録商標）を使用することを選択した当業者は５７５ｎｍ又はその付近で発光するレポーター分子を選択する必要がある。従って、励起手段を変えることにより、より多様なレポーター分子を使用できる。
【００５７】
本発明の１好適態様では、モノクローナル抗体を蛍光レポーター分子で標識する。当業者に自明の通り、本発明の方法で使用するＨＰＶ型特異的ｍＡｂを標識するためのレポーター分子としては、検出計器により検出及び／又は定量することが可能な任意の蛍光分子を使用することができる。上述のように、検出計器の励起手段と検出手段に応じて利用可能なレポーター分子の選択を指令する。レポーター分子としては限定されないが、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、サイトフルオロタンジェリン、Ａｌｅｘａ（登録商標）５３２及びＡｌｅｘａ（登録商標）５４６（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、シアニン３（Ｃｙ３）、シアニン５（Ｃｙ５）、シアニン５．５（Ｃｙ５．５；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、リサミン・ローダミンＢ、イソチオシアン酸テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）、スルホローダミンＢ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ−Ｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、ＰＢＸＬ−１（Ｍａｒｔｅｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）、テキサスレッド−アビジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、ストレプトアビジン、Ｃ−フィコシアニン、Ｒ−フィコシアニンＩＩ、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）（例えばＡＰＣ−Ｂ）、ペリジニンクロロフィル蛋白質（ＰｅｒＣＰ）、カスケードブルー、クマリンが挙げられる。本発明の方法に関連して利用可能な他の蛍光レポーターは当分野で周知である（例えば、参考として本明細書中に援用されているＳｈａｐｉｒｏ，Ｈ．Ｍ．，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，１９９５参照）。
【００５８】
本明細書に開示する新規方法の１好適態様では、ＨＰＶ型特異的検出ｍＡｂを蛍光レポーター分子フィコエリトリン（ＰＥ）で標識する。
【００５９】
本発明は更に複数の天然ＨＰＶ  ＶＬＰ型に対するＨＰＶ型特異的抗体力価を評価するためにＬｕｍｉｎｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｎａｌｙｔｅ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ＬａｂＭＡＰ（登録商標）技術（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．，Ａｕｓｔｉｎ  ＴＸ）を使用する定量的競合イムノアッセイに関する。この競合イムノアッセイは、患者血清中のＨＰＶ型特異的抗体が、蛍光標識化ＨＰＶ型特異的中和検出ｍＡｂの結合を阻害するプロセスに基づく。結合したＨＰＶ特異的検出ｍＡｂからの蛍光シグナルは、患者の中和抗体力価に反比例する。結果は、夫々のＶＬＰ上のコンホメーション感受性型特異的中和エピトープとｍＡｂの結合を阻止することが可能なＡｂの力価を反映する。
【００６０】
ＬａｂＭＡＰ（登録商標）（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．；Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）システムはポリスチレン、ジビニルベンゼン及びメタクリル酸から構成される粒径５．６μｍのミクロスフェアを使用する。ＬａｂＭＡＰ（登録商標）ミクロスフェアは蛋白質、多糖又は核酸と共有結合できるようにカルボキシル化されている。本発明で使用する場合には、ＬａｂＭＡＰミクロスフェアをＨＰＶ  ＶＬＰと共有結合する。ＬａｂＭＡＰミクロスフェアは１００個のスペクトル指向性ミクロスフェアセットが得られるように、Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）から市販されている異なる割合の赤及び赤外発光蛍光色素を内部に含む。
【００６１】
当業者に自明の通り、本発明の方法ではＬａｂＭＡＰ（登録商標）システム以外にスペクトル指向性ミクロスフェアセットを含む他のシステムも使用することができる。このようなシステムはミクロスフェアセットを規定するために固有の割合の２種以上の蛍光色素を使用して開発することができる。スペクトル指向性ビーズセットの開発方法は当分野で公知である。例えばＷＯ９９／１９５１５、及び米国特許第５，７２３，２１８号参照。更に、蛍光ビーズは多数の業者から市販されており、限定されないが、Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｉｓｈｅｒｓ，ＩＮ）、Ｄｙｎａｌ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ＡＳ（Ｏｓｌｏ，ノルウェー）、及びＰｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｍｈｅｒｓｔ，ＭＡ）から購入できる。
【００６２】
本発明の１態様では、別個のスペクトル特性を有する異なるミクロスフェアに関連する蛍光シグナルを分析することにより、複数のＨＰＶ型に対するＨＰＶ型特異的抗体応答を同時に検出する。ミクロスフェアセットの固有スペクトル指向により、異なるミクロスフェアセットを相互に区別することができる。
【００６３】
特異的蛍光レポーターに結合したｍＡｂにより発光される蛍光はフローサイトメーター、又は複数のミクロスフェアセットを規定する固有特性を区別すると共に蛍光検出抗体の蛍光を検出することが可能な他の検出計器により検出することができる。ビーズ表面のＨＰＶ  ＶＬＰを定量するために本発明の方法と組合して蛍光レポーター分子を使用する場合には、検出計器は検出抗体に結合したレポーター分子を励起する手段を含む必要がある。当業者が固有スペクトル特性により区別されるミクロスフェアセットを使用するように選択する場合には、検出計器はスペクトル特性を区別する手段を含む必要がある。例えば、固有スペクトル特性に基づき区別されるミクロスフェアセットは異なる割合の２種以上の蛍光色素から構成する必要がある。このような場合には、検出計器はミクロスフェア内に蛍光色素を励起するための手段を含む必要がある。蛍光色素を励起するための手段としては限定されないが、アルゴン及びクリプトンイオンレーザー、ヘリウム−ネオンレーザー、ヘリウムカドミウムレーザー、ダイオードレーザー及びソリッドステートレーザー（例えばネオジム−ＹＡＧレーザー）が挙げられる。
【００６４】
本発明の典型的検出計器はフローサイトメーターである。フローサイトメトリーは生物学的粒子の特徴を測定するために使用されるレーザーに基づく技術である。フローサイトメトリーの基本原理は励起源からの光が移動中の粒子にぶつかるにつれて光が散乱され、蛍光が発生されるというものである。この技術を本発明の方法と組合せて使用すると、ビーズのスペクトル特性に基づいてミクロスフェアセットを区別することができる。更に、被験体サンプル内の複数の興味あるＨＰＶ型に特異的なＨＰＶ特異的抗体の存在を検出及び定量することができる。
【００６５】
ビーズセットを区別し、検出抗体に結合した検出可能なタグとして使用される蛍光レポーター分子により発光される蛍光を測定するための自動フローサイトメーターは当分野で公知であり、この特定アッセイで使用するように応用することができる。本発明の方法で使用されるフローサイトメーターは数社から市販されており、Ｔｈｅ  Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ；例えばＬＵＭＩＮＥＸ１００（登録商標））、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ＳａｎＪｏｓｅ，ＣＡ；例えばＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ及びＦＡＣＳｃａｎサイトメーター）、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）及びＰａｒｔｅｃ  ＧｍｂＨ（Ｍｕｎｓｔｅｒ，ドイツ）が挙げられる。
【００６６】
本発明の方法の１好適態様では、ＬＵＭＩＮＥＸ１００（登録商標）ベンチトップ型アナライザーを使用してデータを獲得する（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．；Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）。この計器は分析ソフトウェアを従来のフローサイトメトリーと組合せたものであり、Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐにより提供されるＬａｂＭＡＰ（登録商標）技術で使用するように特別に設計されている。Ｌｕｍｉｎｅｘ計器流体工学はフローセルを通して単一ファイルにミクロスフェアを送り、ミクロスフェアを赤レーザーと緑レーザーにより励起する。赤レーザーはミクロスフェアの内側の蛍光色素を励起し、緑レーザーはレポーター蛍光色素を励起し、ビーズ表面のアッセイを定量する。
【００６７】
光ダイオードと光電子増倍管はミクロスフェアから蛍光シグナルを受取る。Ｌｕｍｉｎｅｘアナライザーは波形をディジタル化し、シグナルをディジタルシグナルプロセッサーに送ると、ディジタルシグナルプロセッサーは蛍光シグナルを蛍光強度単位に変換する。ＬａｂＭＡＰ（登録商標）技術をＬｕｍｉｎｅｘアナライザーと併用すると、同一ウェル内で１００個までの異なるアッセイを同時に検出することができる。
【００６８】
本発明のアッセイは洗浄段階を加えても加えなくても実施することができる。洗浄段階はＶＬＰ−ミクロスフェア、患者サンプル及び標識化検出抗体を２〜１８時間インキュベーションした後に実施され、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ２５０μｌで３回洗浄するのが一般的である。洗浄段階を含むアッセイよりも無洗浄型粒子フローサイトメトリーアッセイのほうが迅速に実施できるという利点があるが、感度と精度は下がる。他方、無洗浄アッセイで血清濃度が高いと、ＬＵＭＩＮＥＸ１００（登録商標）等の検出計器が詰まり、ＶＬＰ−ミクロスフェアの多くがその指定校正ゲートの外側になり、読出時間が１時間を超える可能性がある。従って、本発明の１好適態様では、多重競合イムノアッセイは洗浄段階を含む。
【００６９】
本発明は複数の異なるＨＰＶサブタイプに特異的な中和エピトープに対する抗体を同時に検出する方法を提供し、単一ＨＰＶ型の抗体を検出するように設計された個々のアッセイを連続実施するよりも臨床又は試験サンプルを分析するのに必要な時間の長さを実質的に短縮するものである。従って、本発明の方法は複数のＨＰＶサブタイプに特異的な抗体を臨床試料から高スループットでスクリーニングするように応用可能である。前記方法は例えば９６ウェルプレートＬｕｍｉｎｅｘアッセイフォーマットを使用することにより、高い特異性と確度を維持しながら多数のサンプルを同時にスクリーニングすることができる。有利な態様では、９６ウェルフォーマットで自動化を使用すると、ＨＰＶ抗体の存在について臨床サンプルを分析するために必要な人的投入時間数を更に減らすことができる。本発明の方法は例えばＴｅｃａｎ  Ｇｅｎｅｓｉｓ液体ハンドラー（ＴＥＣＡＮ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ．，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）を使用することにより自動化することができる。このシステムは時間の節約と共に、実験者が潜在的に感染性の血清に誤って接触しないようにするという二重の利点がある。
【００７０】
本発明は更に、ＨＰＶウイルス様粒子に結合したミクロスフェアを含むＶＬＰ−ミクロスフェアコンプレックスに関する。本発明の１好適態様では、ＶＬＰ−ミクロスフェアコンプレックスは更に蛍光レポーター分子で検出可能に標識されたＶＬＰに結合したモノクローナル抗体を含む。
【００７１】
本発明の１好適態様では、ミクロスフェアコンプレックスのＨＰＶ  ＶＬＰ型はＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８から構成される群から選択される。
【００７２】
本明細書に引用する全刊行物は、本発明に関連して使用可能な本明細書に開示する方法と材料を記載及び開示する目的で参考として援用されている。本明細書の如何なる記載も本発明が先発明により前記開示以前の日付を享受する資格がないと認めるものとして解釈すべきではない。
【００７３】
以上、添付図面を参考に本発明の好適態様を説明したが、当然のことながら本発明は上記の厳密な態様に限定されず、当業者は特許請求の範囲に記載する発明の範囲又は精神から逸脱しない範囲で種々の変更及び応用が可能である。
【００７４】
以下、実施例により本発明を説明するが、これらの実施例により発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００７５】
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）
参考として本明細書に援用されているＨｏｆｍａｎｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０９（２）：５０６−１８（１９９５）；Ｈｏｆｍａｎｎら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７７（ｐｔ  ３）（１）：４６５−６８；Ｎｅｅｐｅｒら，Ｇｅｎｅ  １８０（１−２）：１−６（１９９６）；及びＲｏｓｓｉら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１１（８）：１１６５−７６（２０００）に従来記載されている技術とＣｏｏｋら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１７（３）：４７７−４８４（１９９９）の変法に従い、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでＬ１遺伝子の発現により形成したＨＰＶ６、１１、１６及び１８型のＶＬＰを、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのライゼートから精製した。
【実施例２】
【００７６】
抗体
以下の抗体を、アッセイ用に入手した：ＨＰＶ−６に特異的なＨ６．Ｂ１０．５；ＨＰＶ−１１に特異的なｍＡｂ８７４０又はＨ１１．Ｂ２（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）；ＨＰＶ−１６に特異的なＨ１６．Ｖ５；及びＨＰＶ−１８に特異的なＨ１８．Ｊ４（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２２４（２）：４７７−８６（１９９６）；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４（１１）：５６７８−８１（１９９０）；及びＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２２３（１）：１７４−８４（１９９６）参照）。これらの抗体は各々、ＨＰＶ型特異的であって中和エピトープと結合することが従来示されている（Ｙｅａｇｅｒら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２７８（２）：５７０−７７（２０００））。Ｈ６．Ｂ１０．５、Ｈ１１．Ｂ２、Ｈ１６．Ｖ５、及びＨ１８．Ｊ４抗体をフィコエリトリン（ＰＥ）（Ｃｈｒｏｍａｐｒｏｂｅ，Ｉｎｃ．，Ａｐｔｏｓ，ＣＡ）で標識した。アッセイで使用するために、これらの４種のＰＥ標識ｍＡｂを各ｍＡｂの終濃度がＨ６．Ｂ１０．５は２．５μｇ／ｍｌ、Ｈ１１．Ｂ２は１．０μｇ／ｍｌ、Ｈ１６．Ｖ５は１．０μｇ／ｍｌ、Ｈ１８．Ｊ４は１．２５μｇ／ｍｌとなるように組合せた。
【実施例３】
【００７７】
ＨＰＶ  ＶＬＰのＬｕｍｉｎｅｘミクロスフェアへの共有結合
ＨＰＶ  ＶＬＰワクチンは、ヒトと動物の両者で型特異的中和抗体を誘導することが示されている。しかし、変性ＶＬＰは中和抗体を誘導することができず、有効な免疫応答を誘導するにはＶＬＰ上のコンホメーション感受性エピトープが重要であることが示された。更に、ＶＬＰのコンホメーション保全性は還元条件、ｐＨ及びイオン条件に鋭敏である（ＭｃＣａｒｔｈｙら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（１）：３２−４１（１９９８）参照）。
【００７８】
本発明者らはカルボジイミド仲介型の結合反応手順を使用した（Ｓｔａｒｏｓら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５６（１）：２２０−２２（１９８６）参照）。カルボジイミド反応によるＨＰＶ  ＶＬＰのＬｕｍｉｎｅｘミクロスフェアへの共有結合がＶＬＰのコンホメーション保全性を変化させるか否かを調べるために、１％ＢＳＡの存在下又は不在下で種々の緩衝液に４℃で保存したＶＬＰ−ミクロスフェアの安定性をモニターした。各種ＶＬＰに対する結合検出ｍＡｂの、蛍光強度中央値（ＭＦＩ）の３２回反復測定値の変動係数（％ＣＶ）を各種保存条件で６か月間測定した。
【００７９】
Ｌｕｍｉｎｅｘミクロスフェアは、蛋白質と共有結合するためにカルボキシル官能基を有する粒径約５０００ｎｍの蛍光ポリスチレンビーズである。ＶＬＰを夫々のミクロスフェアと結合する前にまずカルボキシル化Ｌｕｍｉｎｅｘミクロスフェアの活性化を行った。ミクロスフェアを４℃で暗所にてミクロスフェア１．２５×１０７個／ｍｌの濃度で保存した。ミクロスフェアを室温まで上げ、２分間音波処理してミクロスフェアを均等に分配し、１．５ｍｌバイアル（ＶＷＲ，Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）にミクロスフェア２．５×１０６個／バイアルを分注した。ミクロスフェアをペレット化し、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．２）４００μｌに再懸濁した。ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド）の５０ｍｇ／ｍｌ溶液５０μｌとＥＤＣ（塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）の５０ｍｇ／ｍｌ溶液５０μｌを加えることにより、ミクロスフェアの表面のカルボキシル化部位を活性化した。試験管を２分間音波処理し、ホイルを巻き、２０分間室温でインキュベーションした。活性化段階後、ミクロスフェアをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）５００μｌで１回洗浄した後、ＶＬＰを加えた。
【００８０】
ミクロスフェアのカルボキシル部位を活性化した後、ＨＰＶ−ＶＬＰと夫々のミクロスフェアの結合を実施した。６、１１、１６及び１８型のＨＰＶ−ＶＬＰをＰＢＳで濃度１２μｇ／ｍｌまで希釈した。ＶＬＰ（１２μｇ／ｍＬ）５００μｌを活性化ミクロスフェアに加え、低速設定で１０〜２０秒間ボルテックスし、ミクロスフェアを再懸濁させた。ＶＬＰは以下のミクロスフェアに結合した：ＶＬＰ−６はミクロスフェア＃１３２、ＶＬＰ−１１はミクロスフェア＃１５３、ＶＬＰ−１６はミクロスフェア＃１３８、ＶＬＰ−１８はミクロスフェア＃１１８に結合した。各種ミクロスフェアは、各種ミクロスフェアセット間のスペクトル分解が良好であるという理由から選択した。
【００８１】
ＶＬＰの添加後、バイアルにホイルを巻き、室温で２時間ローテーターにて振盪した。この段階は、ミクロスフェア上の空いているカルボン酸部位とアミド結合を形成することにより、ＶＬＰをミクロスフェアと共有結合させる。ミクロスフェアと結合したＶＬＰを０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０含有ＰＢＳ１ｍＬで１回洗浄し、ヒスチジン緩衝液（２０ｍＭヒスチジン，０．５ＭＮａＣｌ，ｐＨ６．２）、カラムＡ緩衝液（５０ｍＭ  ＭＯＰＳ，０．５Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．０）又は１％ＢＳＡ含有もしくは非含有ＰＢＳに再懸濁し、ミクロスフェア上にまだ空いているカルボキシル部位がある場合にはブロックした。ＶＬＰ−ミクロスフェア（ミクロスフェア１．０×１０６個／ｍＬ）を１ｍＬずつ遮光バイアルに４℃で保存した。
【００８２】
これらの試験の結果、ＶＬＰのコンホメーションは結合反応により測定可能な影響を受けず、ＶＬＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘミクロスフェアは代表的ＶＬＰ−１６について示すように、１％ＢＳＡ含有緩衝液に４℃で保存した場合に少なくとも５か月間安定であることが判明した（図３）。これらの結果から、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから発現させたＬ１  ＶＬＰは、Ｌ１の型特異的中和エピトープに影響を与えることなしにＬｕｍｉｎｅｘミクロスフェアと安全に結合できることが実証された。
【実施例４】
【００８３】
競合ＬｕｍｉｎｅｘアッセイによるＨＰＶ型特異的抗体定量
競合イムノアッセイを実施するために、４種のＨＰＶ  ＶＬＰ型の各々のＶＬＰ−ミクロスフェアを等容量ずつプールし、終濃度がビーズ８．０×１０５個／ｍＬとなるまでヒスチジン緩衝液で希釈した。ＶＬＰ−ミクロスフェアを、９６ウェル黒色不透明マイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃｏｍｉｎｇ，ＮＹ）の各ウェルに容量２５μｌずつ加えた（ＶＬＰ−ミクロスフェア合計２０，０００個，各ＨＰＶ型のＶＬＰ−ミクロスフェア５，０００個）。ＨＰＶ  ＶＬＰ−６、−１１、又は−１８ＶＬＰのいずれかで免疫しておいた個々のアフリカミドリザルからの血清と、ＶＬＰ−１６で免疫しておいたチンパンジーからの血清をプールすることによりＨＰＶストック標準血清を作製した。４種の各種血清は、擬似中和アッセイで予め力価を測定しておいた（Ｙａｅｇｅｒら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２７８（２）：５７０−７７（２０００））。各種ＨＰＶ型のプール血清のストック濃度はＨＰＶ−６では２５０ｍＭＵ／ｍＬとし、ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−１６及びＨＰＶ−１８では１０００ｍＭＵ／ｍＬとした。力価２００ｍＭＵ／ｍＬは、ＨＰＶ感染のｉｎ  ｖｉｖｏ無胸腺ヌードマウス移植モデルでＨＰＶ１１を中和することが示されている（Ｂｒｏｗｎら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８４（９）：１１８３−８６（２００１））。
【００８４】
個々のＨＰＶイムノアッセイを多重化できるか否かを調べるために、本発明者らは単一フォーマットと多重フォーマットのイムノアッセイで、４種のＨＰＶ標準血清を単独又はプールとしてまとめて試験した。１２点標準曲線（単一（単独）フォーマットと多重フォーマットの両者で２回ずつ試験）を作成するために、ストック標準をＨＰＶ陰性正常ヒト血清で１１回２倍系列希釈した。標準曲線用として各ウェルに血清を５０μｌずつ加えた。陰性対照を４重で加え、高低対照を２重で加え、患者サンプル３２個を２重で加えた。プレートにホイルを被せ、血清とＶＬＰ−ミクロスフェアを室温で１５分間インキュベーションした。ＰＥ標識した型特異的ｍＡｂの組合せをプレートの各ウェルに容量２５μｌずつ加え、その後、マルチチャネルピペットを使用して血清、ＶＬＰ−ミクロスフェア、及びｍＡｂ−ＰＥを３回混合した。プレートをホイルカバーで再び密閉し、室温で一晩インキュベーションした。
【００８５】
インキュベーション後、予めＰＢＳで湿しておいたフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に全サンプルを移した。血清サンプルをＰＢＳ緩衝液２００μｌで３回洗浄し、Ｌｕｍｉｎｅｘ１００（登録商標）で分析するためにＶＬＰ−ミクロスフェアをＰＢＳ＋１％ＢＳＡ２００μｌに再懸濁した。ミクロスフェアマルチマーを排除するようにゲートを設定した多重捕捉モードで、ＸＹプレートハンドラープラットフォームを使用してＬｕｍｉｎｅｘ１００計器でサンプルを分析した。計器分析時間はサンプル当たり約３０秒とした。
【００８６】
上述のように、ＨＰＶ  Ａｂ応答を検出するために使用した４種のｍＡｂはＨＰＶ型特異的エピトープと結合し、他の型とは交差反応しない。４種の標準をまとめてプールする効果は、ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−１６及びＨＰＶ−１８標準曲線に最小の影響しかなかった（図４Ｂ、４Ｃ及び４Ｄ参照）。他方、アッセイの多重化はＨＰＶ−６標準曲線に僅かな影響があった（図４Ａ参照）。理論に拘束する意図はないが、ＨＰＶ−６曲線に見られるこの効果は、ＨＰＶ−１１血清のＨＰＶ−６  ＶＬＰへの交差反応による可能性が最も高いと思われた。ＶＬＰ−１１で免疫した動物又は個体からの高力価血清サンプルは、ＨＰＶ−６を中和することができる（Ｙｅａｇｅｒら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２７８（２）：５７０−７７（２０００））ので、この交差反応性は予想外であった。
【００８７】
多重アッセイにおける各種標準曲線に関する定量の分析限界をＨＰＶ−６（１．２〜５４．８ｍＭＵ／ｍＬ）、ＨＰＶ−１１（９．８〜３６５．６ｍＭＵ／ｍＬ）、ＨＰＶ−１６（４．５〜４７６．５ｍＭＵ／ｍＬ）及びＨＰＶ−１８（１１．３〜２０３．０ｍＭＵ／ｍＬ）について測定すると、ｃＲＩＡで測定した定量限界に比肩し得るものであった（実施例７及び図８参照）。
【００８８】
低、中及び高力価の血清サンプル８個ずつを使用してＨＰＶ−Ｌｕｍｉｎｅｘイムノアッセイの精度を測定した（データは示さず）。試験内精度はＣＶで表すとＨＰＶ−６が４．３〜４．５％、ＨＰＶ−１１が３．６〜７．４％、ＨＰＶ−１６が７．４〜２２．０％、ＨＰＶ−１８が２．１〜２３．９％であった。ＨＰＶ６標準曲線には多重化の影響が少なかったが、本発明のＨＰＶ  Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイは競合ＨＰＶ型特異的ＲＩＡと良好な相関を示した（ピアソン相関係数０．７５１〜０．８３７，実施例７参照）。分析するミクロスフェア数を変えてもＭＦＩ値に影響がなかったことも付記しておく（データは示さず）。
【実施例５】
【００８９】
アッセイ希釈剤と洗浄の効果
数種の異なるアッセイ希釈剤がイムノアッセイに及ぼす効果と濾過−洗浄段階を操作に加える効果も試験した。血清又はＰＢＳ１％ＢＳＡマトリックスのいずれかでアッセイを実施すると、同様の結果が得られ（図５）、高力価サンプルでは患者血清をＰＢＳ１％ＢＳＡサンプル希釈剤に希釈できることが示唆された。濾過−洗浄段階を加えても標準曲線に有意な影響はなかった（図５）が、読出時間は８０〜１００分／プレートから３０〜４０分／プレートまで有意に改善された。血清ＮＨＳマトリックスで最適化アッセイを実施し、サンプルをフィルタープレートに移し、ＰＢＳ１％ＢＳＡで３回洗浄後にＬｕｍｉｎｅｘ１００（登録商標）に配置した。
【実施例６】
【００９０】
データ分析
４パラメーターロジスティック曲線フィット（Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌら，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｐｈａｒｍ  Ｓｅｃｔｉｏｎ，ｐ．１８０−８５（１９９２））を使用して、ｍＡｂ−ＰＥ結合の相対阻害を標準曲線と比較した。標準曲線に使用した免疫参照血清は、ミリメルク単位（ｍＭＵ／ｍＬ）で表した任意値を割当てた。無胸腺マウス異種移植アッセイでＨＰＶ−１１に関する中和Ａｂ力価＞２００ｍＭＵ／ｍＬは、ビリオン〜１０８個を中和することが示されている（Ｂｒｙａｎら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．５３（３）：１８５−８８（１９９７））。蛍光強度中央値（ＭＦＩ）単位のデータをＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌスプレッドシート（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ）で処理した。誤差線は２重の測定の標準偏差を表す。Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ａｂ力価の結果をＨＰＶ−ｃＲＩＡで得られたＡｂ力価と比較する場合にはピアソン相関係数を使用した。
【実施例７】
【００９１】
ＨＰＶ競合ラジオイムノアッセイ（ｃＲＩＡ）
現在使用されている個々のｃＲＩＡアッセイに対するＬｕｍｉｎｅｘアッセイの確度を調べるために、両方のアッセイフォーマットでサンプル４５個のパネルを２回試験した。全４種のＨＰＶ型に対する陰性サンプル１５個、低力価サンプル１５個、中力価サンプル１０個及び高力価サンプル５個を両アッセイフォーマットで２重に試験し、２回のアッセイの相対合致率を測定した。
【００９２】
ＨＰＶ型特異的競合ＲＩＡを使用して、天然ＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−１６及びＨＰＶ−１８  ＶＬＰに対するＨＰＶ型特異的抗体力価を従来の記載に従って評価した（Ｐａｌｋｅｒら，Ｖａｃｃｉｎｅ  １９（２７）：３７３３−４３（２００１））。要約すると、ＨＰＶＬ１  ＶＬＰ抗原１００ｎｇ／ｍｌ（ＨＰＶ−６，ＨＰＶ−１１）、５０ｎｇ／ｍｌ（ＨＰＶ−１６）及び１７５ｎｇ／ｍｌ（ＨＰＶ−１８）を固相ポリスチレンビーズ（鏡面仕上げ１／４インチ，Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｂａｌｌ  Ｃｏ．，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）に１時間室温で温和な撹拌下にコーティングした（ビーズ５個／ｍｌ）。ビーズを５０ｍＭ  ＭＯＰＳ，０．５Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．０で洗浄し、後期使用時まで４℃でＭＯＰＳ緩衝液に浸漬保存した。等容量の免疫血清（１００μｌ）と、１％ＢＳＡ，０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０及び０．１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳで１２，５００倍（Ｈ６．Ｂ１０．５）、１６０，０００倍（Ｈ１１．Ｂ２）、８００，０００倍（Ｈ１６．Ｖ５）又は２００，０００倍（Ｈ１８．Ｊ４）に希釈したｍＡｂ血清を、２０ウェルＡｂｂｏｔｔアッセイプレートの１個のウェルで混合した。ＨＰＶ  ＶＬＰをコーティングしたビーズを各ウェルに１個ずつ加え、室温で一晩インキュベーションし、脱イオン水で洗浄し、１２５Ｉ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）と共に３７℃で２．５時間インキュベーションし、脱イオン水で洗浄し、ガンマカウンター（Ｗａｌｌａｃ，Ｔｕｒｋｕ，フィンランド）でカウントした。４パラメーターロジスティック曲線フィットを使用してｍＡｂ結合の相対阻害を標準参照血清と比較した。使用した参照血清は、ミリメルク単位（ｍＭＵ／ｍｌ）で表した任意値を割当てた。
【００９３】
ＨＰＶ６、１１、１６及び１８型に対する抗体に陰性、低陽性及び陽性の代表的サンプル４個の１組はＨＰＶ−Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイで蛍光強度中央値（ＭＦＩ）（図６Ａ）と血清力価計算値（図６Ｂ）の間に逆関係を示す。ＨＰＶ−１６のｃＲＩＡとＬｕｍｉｎｅｘアッセイについてミリメルク単位／ｍＬ（ｍＭＵ／ｍＬ）で表した代表的平均力価を図７に示す。両アッセイフォーマットで測定した対数力価を比較すると、どちらのアッセイも良好な合致率を示すことが判明した。具体的に言うと、両アッセイフォーマットのピアソン相関係数（Ｒ２）は全て０．７５を上回り（ＨＰＶ−６，０．８３７；ＨＰＶ−１１，０．７５１；ＨＰＶ−１６，０．７６８；ＨＰＶ−１８，０．７７５）、両アッセイフォーマット間の良好な一致が示された。更に、ＨＰＶ  ＬｕｍｉｎｅｘアッセイはｃＲＩＡに比較した場合には疑陽性率０％及び疑陰性率０％であった。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１Ａ】典型的なＨＰＶ−Ｌｕｍｉｎｅｘ多重競合イムノアッセイを示す。パネルＡはＨＰＶ−Ｌｕｍｉｎｅｘイムノアッセイのアッセイデザインの模式図である。このイムノアッセイは、患者血清中のＨＰＶ型特異的抗体がフィコエリトリンで標識したＨＰＶ型特異的検出モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の結合を阻止する能力を定量的に測定する。結合したＨＰＶ特異的検出ｍＡｂからの蛍光シグナルは、夫々のＶＬＰ上のＨＰＶ型特異的中和エピトープに対する患者の抗体力価に反比例する。パネルＢはＰＥ標識ｍＡｂが患者血清中の型特異的ＨＰＶ  Ａｂにより結合阻害された場合のＨＰＶ  ＶＬＰミクロスフェアコンプレックスの模式図を示す。
【図１Ｂ】典型的なＨＰＶ−Ｌｕｍｉｎｅｘ多重競合イムノアッセイを示す。パネルＡはＨＰＶ−Ｌｕｍｉｎｅｘイムノアッセイのアッセイデザインの模式図である。このイムノアッセイは、患者血清中のＨＰＶ型特異的抗体がフィコエリトリンで標識したＨＰＶ型特異的検出モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の結合を阻止する能力を定量的に測定する。結合したＨＰＶ特異的検出ｍＡｂからの蛍光シグナルは、夫々のＶＬＰ上のＨＰＶ型特異的中和エピトープに対する患者の抗体力価に反比例する。パネルＢはＰＥ標識ｍＡｂが患者血清中の型特異的ＨＰＶ  Ａｂにより結合阻害された場合のＨＰＶ  ＶＬＰミクロスフェアコンプレックスの模式図を示す。
【図２】別個のＬｕｍｉｎｅｘミクロスフェアに対するＨＰＶ−ＶＬＰ型の指定を示す（実施例３参照）。分類１（ＣＬ１）６５８ｎｍ及び分類２（ＣＬ２）７１２ｎｍの離散スペクトル特性を有する特定Ｌｕｍｉｎｅｘミクロスフェア集団に各ＨＰＶ−ＶＬＰを結合させ、自動ゲーティングにより分離させた（楕円はゲートを示す）。ＶＬＰ−６はミクロスフェア１３２に結合し、ＶＬＰ−１１はミクロスフェア１５３、ＶＬＰ−１６はミクロスフェア１３８、ＶＬＰ−１８はミクロスフェア１１８に結合した。
【図３】Ｌｕｍｉｎｅｘミクロスフェアに結合したＨＰＶ−ＶＬＰ−１６の安定性を示す。Ｌｕｍｉｎｅｘミクロスフェアに結合したＨＰＶ６、１１、１６及び１８型ＶＬＰの安定性を６か月間試験した。ＶＬＰ−ミクロスフェアを４℃で暗所にて１％ＢＳＡの存在下又は不在下にＰＢＳ（菱形で示す）、カラムＡ緩衝液（三角で示す）又はヒスチジン緩衝液（正方形で示す）のいずれかに保存した。夫々白記号はＢＳＡの不在下の保存を示し、黒記号は１％ＢＳＡの存在下の保存を示す。ミクロスフェア１３８に結合したＶＬＰ−１６の代表的データを示す。３２個の反復サンプルのＭＦＩを平均し、％ＣＶを決定した。％ＣＶは１％ＢＳＡを含有する緩衝液に保存した全４種のＨＰＶ−ＶＬＰ型で１０％未満であった。
【図４Ａ】ＨＰＶ６、１１、１６及び１８型の単独及び多重標準曲線を示す。ＨＰＶ−ＶＬＰ−６（パネルＡ）、ＨＰＶ−ＶＬＰ−１１（パネルＢ）、及びＨＰＶ−ＶＬＰ−１８（パネルＤ）の各種アフリカミドリザル血清とＨＰＶ−ＶＬＰ−１６のチンパンジー血清（パネルＣ）について標準参照血清の１２点希釈系列の代表的標準曲線を示す。単独曲線は１種のみのＶＬＰ−ミクロスフェア型が存在するアッセイで試験した単一標準血清からの結果を示し（三角で示す）、多重曲線は単一ウェルに全４種のＶＬＰ−ミクロスフェアが存在する４価標準を示す（円で示す）。誤差線は２重サンプルの標準偏差を示す。
【図４Ｂ】ＨＰＶ６、１１、１６及び１８型の単独及び多重標準曲線を示す。ＨＰＶ−ＶＬＰ−６（パネルＡ）、ＨＰＶ−ＶＬＰ−１１（パネルＢ）、及びＨＰＶ−ＶＬＰ−１８（パネルＤ）の各種アフリカミドリザル血清とＨＰＶ−ＶＬＰ−１６のチンパンジー血清（パネルＣ）について標準参照血清の１２点希釈系列の代表的標準曲線を示す。単独曲線は１種のみのＶＬＰ−ミクロスフェア型が存在するアッセイで試験した単一標準血清からの結果を示し（三角で示す）、多重曲線は単一ウェルに全４種のＶＬＰ−ミクロスフェアが存在する４価標準を示す（円で示す）。誤差線は２重サンプルの標準偏差を示す。
【図４Ｃ】ＨＰＶ６、１１、１６及び１８型の単独及び多重標準曲線を示す。ＨＰＶ−ＶＬＰ−６（パネルＡ）、ＨＰＶ−ＶＬＰ−１１（パネルＢ）、及びＨＰＶ−ＶＬＰ−１８（パネルＤ）の各種アフリカミドリザル血清とＨＰＶ−ＶＬＰ−１６のチンパンジー血清（パネルＣ）について標準参照血清の１２点希釈系列の代表的標準曲線を示す。単独曲線は１種のみのＶＬＰ−ミクロスフェア型が存在するアッセイで試験した単一標準血清からの結果を示し（三角で示す）、多重曲線は単一ウェルに全４種のＶＬＰ−ミクロスフェアが存在する４価標準を示す（円で示す）。誤差線は２重サンプルの標準偏差を示す。
【図４Ｄ】ＨＰＶ６、１１、１６及び１８型の単独及び多重標準曲線を示す。ＨＰＶ−ＶＬＰ−６（パネルＡ）、ＨＰＶ−ＶＬＰ−１１（パネルＢ）、及びＨＰＶ−ＶＬＰ−１８（パネルＤ）の各種アフリカミドリザル血清とＨＰＶ−ＶＬＰ−１６のチンパンジー血清（パネルＣ）について標準参照血清の１２点希釈系列の代表的標準曲線を示す。単独曲線は１種のみのＶＬＰ−ミクロスフェア型が存在するアッセイで試験した単一標準血清からの結果を示し（三角で示す）、多重曲線は単一ウェルに全４種のＶＬＰ−ミクロスフェアが存在する４価標準を示す（円で示す）。誤差線は２重サンプルの標準偏差を示す。
【図５】ＨＰＶ−Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイに及ぼす血清と各種アッセイ緩衝液の効果を示す（実施例５参照）。ＶＬＰ−１１で免疫したアフリカミドリザルからの標準参照血清を種々のアッセイ希釈剤緩衝液中で分析した。ストック参照標準をＨＰＶ陰性正常ヒト血清（ＮＨＳ）で２倍系列希釈し、１２点標準曲線を作成した。フィルタープレート中でＰＢＳ／１％ＢＳＡにより３回リンスする洗浄段階を加える（三角で示す）か又は加えず（正方形で示す）に、標準参照血清をＰＢＳ／１％ＢＳＡ（円で示す）又はＨＰＶ陰性ＮＨＳ中で分析した。誤差線は２重サンプルの標準偏差を示す。
【図６Ａ】ＨＰＶ型特異的中和抗体力価の計算値を示す。パネルＡは４種の代表的ＨＰＶ陰性、低陽性及び血清陽性サンプルの中央蛍光値（ＭＦＩ）を示す。各代表的ＨＰＶ型で得られた結果を異なる色の棒グラフで示し、グレーの棒はＨＰＶ６を示し、縞の棒はＨＰＶ１１を示し、黒の棒はＨＰＶ１６を示し、白の棒はＨＰＶ１８を示す。パネルＢは（Ａ）に示したと同一の４種の代表的サンプルのミリメルク単位／ｍＬ（ｍＭＵ／ｍＬ）値で表した抗体力価を示す。誤差線は２重サンプルの標準偏差を示す。
【図６Ｂ】ＨＰＶ型特異的中和抗体力価の計算値を示す。パネルＡは４種の代表的ＨＰＶ陰性、低陽性及び血清陽性サンプルの中央蛍光値（ＭＦＩ）を示す。各代表的ＨＰＶ型で得られた結果を異なる色の棒グラフで示し、グレーの棒はＨＰＶ６を示し、縞の棒はＨＰＶ１１を示し、黒の棒はＨＰＶ１６を示し、白の棒はＨＰＶ１８を示す。パネルＢは（Ａ）に示したと同一の４種の代表的サンプルのミリメルク単位／ｍＬ（ｍＭＵ／ｍＬ）値で表した抗体力価を示す。誤差線は２重サンプルの標準偏差を示す。
【図７】ＨＰＶ−１６のｃＲＩＡアッセイで測定した力価と、多重競合Ｌｕｍｉｎｅｘイムノアッセイからの力価の比較を示す（実施例７参照）。４５個のサンプルのＨＰＶ型特異的抗体力価（ｍＭＵ／ｍＬ）をｃＲＩＡとＬｕｍｉｎｅｘイムノアッセイにより測定した。ＨＰＶ陰性血清サンプル１５個、低力価血清サンプル１５個、中力価血清サンプル１０個及び高力価血清サンプル５個の抗体力価を測定した。ｃＲＩＡとＬｕｍｉｎｅｘアッセイはいずれも２重に実施し、アッセイ内精度とアッセイ間確度について２重試験の平均を比較した。ＨＰＶ−１６のｃＲＩＡとＬｕｍｉｎｅｘアッセイの平均ｍＭＵ／ｍＬ値を示す。
【図８】ＨＰＶ−６、１１、１６及び１８型アッセイについて競合ＲＩＡとＬｕｍｉｎｅｘ多重イムノアッセイに関する検出及び定量の限界の比較をミリメルク単位／ｍＬで示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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