(57)【要約】炎症プロセスは、４０−４２個のアミノ酸からなる不溶性小タンパク質（アミロイドタンパク質）から主に構成される大脳皮質内の神経斑の存在を特徴とするアルツハイマー病（ＡＤ）、神経変性疾患の発病に関与していることが示唆される。それにもかかわらず、本プロセスの生物学的な相関は明らかではない。インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）は、ヒト及びマウスにおいてＴリンパ球及び細胞性免疫を抑制するサイトカインであり、強力な抗炎症特性を備えている。ＩＬ−１０の産生がＡＤ患者において損なわれているかどうかを確かめるために、本発明者らは、４７人の患者及び２５人の同年齢の健常対照者（ＨＣ）のＰＢＭＣをマイトジェン、リコール抗原又はアミロイドペプチドで誘発した。また、ＩＬ−２の産生も同じ培養条件下で測定した。その結果、アミロイド特異的なＩＬ−１０の生成がＡＤ患者において選択的且つ有意に（ｐ＝０．０２３）減少していることが示された。ＩＬ−１０遺伝子の対立遺伝子を分析したところ、ＩＬ−１０の高産生に関与する遺伝子型の出現頻度がＡＤ個体では著しく少ない（２％対２８％）ことが明らかになった。ＩＬ−１０低／中産生遺伝子型（ＧＣＣ／ＡＴＡ、ＡＴＡ／ＡＴＡ）の存在は早期の発病と関連があり、（ＡＣＣ／ＡＣＣ、ＡＣＣ／ＡＴＡ）は疾患の進行速度の加速と関連があった。低ＩＬ−１０対立遺伝子アイソフォームが存在するとＩＬ−１０産生がアミロイド特異的に損なわれ、ＡＤの臨床的重症度と関連していることを示すことにより、これらのデータは、ＡＤの発症に関与する炎症プロセスの生理を解明した。これらの結果は、本疾患の治療に抗炎症化合物を使用できることを裏付けるものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルツハイマー病、自己免疫疾患又はその他の神経変性疾患の存在又はこれらの疾患に対する素因を決定する方法であって、被験対象動物からＤＮＡ含有試料を採取する工程と、前記試料を分析してＩＬ−１０をコードする遺伝子の−１０８２、−８１９及び５９２位の１個又は複数のＳＮＰ座に存在する対立遺伝子変種を決定する工程と、を含む方法。
【請求項２】
−１０８２、−８１９及び５９２位の３カ所の遺伝子型をすべて決定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料を分析してＩＬ−６及びＡｐｏ−Ｅをコードする遺伝子に存在する対立遺伝子を決定することをさらに含む、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記試料を分析してＩＬ−１をコードする遺伝子に存在する対立遺伝子を決定することをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
表１に示したＩＬ−１０の対立遺伝子多型の１つを有する遺伝子の機能を高めることを含む、アルツハイマー病、自己免疫疾患又はその他の神経変性疾患の治療方法。
【請求項６】
表１に示したＩＬ−１０の対立遺伝子多型の１つを有する遺伝子の機能を低めることを含む、アルツハイマー病、自己免疫疾患又はその他の神経変性疾患を治療する方法。
【請求項７】
前記遺伝子の機能のモジュレーションが遺伝子治療によるものである、請求項５又は請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記遺伝子の機能のモジュレーションが薬理的介入によるものであり、請求項５又は請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記薬理的介入が、インターロイキン−１０の抗原特異的産生、及び必要に応じて１個又は複数の他のサイトカインの抗原特異的産生を促進又は阻害する１種又は複数の化合物を使用することである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記その他のサイトカインが、インターロイキン−１（α又はβ）、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−７、インターロイキン−８、インターロイキン−９、インターロイキン−１１、インターロイキン−１２、インターロイキン−１３、インターロイキン−１４、インターロイキン−１５、インターロイキン−１６、インターロイキン−１７、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＬＳＦ及びＴＧＦ−βから成る群から選択されることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項７の方法で使用するための表Ｉの対立遺伝子多型を含むＤＮＡ断片及びｃＤＮＡ断片。
【請求項１２】
表Ｉの対立遺伝子多型をモジュレートする能力について化合物をスクリーニングする方法における、請求項１１のＤＮＡ又はｃＤＮＡ断片の使用。
【請求項１３】
アルツハイマー病をモジュレート又は予防する能力について化合物をスクリーニングする方法における、請求項１１のＤＮＡ又はｃＤＮＡ断片の使用。
【請求項１４】
新生物形成ではない疾患を治療又は予防するための医薬の調製におけるサイトカインの使用。
【請求項１５】
前記疾患が神経変性疾患又は自己免疫疾患であることを特徴とする、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記使用がアルツハイマー病のためであることを特徴とする、請求項１４又は請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記サイトカインが、インターロイキン−１（α又はβ）、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−７、インターロイキン−８、インターロイキン−９、インターロイキン−１０、インターロイキン−１１、インターロイキン−１２、インターロイキン−１３、インターロイキン−１４、インターロイキン−１５、インターロイキン−１６、インターロイキン−１７、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＬＳＦ及びＴＧＦ−βから成る群から選択されることを特徴とする、請求項１４から１６のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本発明は、疾患の診断、治療又は予防におけるサイトカインの使用に関する。より具体的には、本発明は、自己免疫疾患又は神経変性疾患などの非新生物疾患又は非白血病疾患を診断又は治療するためのサイトカインの使用に関する。
【０００２】
以下の説明では、神経変性疾患、アルツハイマー病の診断、治療又は予防におけるサイトカイン、インターロイキン−１０の使用に関する本発明の最も好ましい実施形態を特に参照しながら本発明を説明する。本発明は、自己免疫疾患などその他の疾患、例えば、多発硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、糖尿病及び喘息、その他の神経変性疾患、例えば、パーキンソン病、運動ニューロン疾患及びアルツハイマー病、慢性炎症性疾患、例えば関節リウマチ、及びＴ細胞機能のモジュレーションが望まれるＨＩＶ感染やＡＩＤＳなどのその他の疾患、において同等に有用なことが発見されたので、本発明の範囲はこの一実施形態に限定されるものではない。
【０００３】
同様に、本発明には、インターロイキン−１０だけでなく、全てのサイトカインが有用なので、インターロイキン−１（α又はβ）、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−７、インターロイキン−８、インターロイキン−９、インターロイキン−１０、インターロイキン−１１、インターロイキン−１２、インターロイキン−１３、インターロイキン−１４、インターロイキン−１５、インターロイキン−１６、インターロイキン−１７、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＬＳＦ及びＴＧＦ−βなどのサイトカインも本発明の範囲に含まれるものとする。
【０００４】
高齢者の認識力減退の主な原因はアルツハイマー病（ＡＤ）である。世界的に寿命が長くなってきたため、ＡＤに罹る人口は今後５０年で３倍になるだろうと予測されている（１）。ＡＤの臨床徴候の特徴は、複雑かつ様々な要素から成る病理機序である。確認されている遺伝的要素には、アミロイド前駆体タンパク質（２）、プレセニリン１及び２（３、４）をコードする遺伝子の変異が含まれ、これは家族性で通常早発性のＡＤ症例の一部を占める。遺伝的要因は、散在性又は非家族性のＡＤ疾患にも関係しており、アポリポタンパク質Ｅ（Ａｐｏ  Ｅ）の対立遺伝子ｅ４によってＡＤの危険性は著しく増大するが、本疾患の進行に必要でもなければ、十分でもない（５−７）。したがって、その他の遺伝要因及び環境要因が関係していると考えられ、熱心に研究されている。
【０００５】
ＡＤ脳に特有の神経変性プロセスに炎症が関連していることが繰り返し示唆されているので（８）、炎症カスケードに関与する分子には多大な関心が寄せられている。例えば、反応性星状細胞の増加がこれらの患者の皮質と海馬の両方に認められ、グリア細胞は、老人斑内部又は周辺でも活性化している。サイトカイン及びその他の炎症分子の過剰発現はＡＤ脳病態に共通する特徴である（９）。さらに、疫学的研究によって、非ステロイド性抗炎症薬の長期使用は双子対照研究（１０）におけるＡＤ発症率の減少に関与することが示され、その他いくつかの臨床研究によって、ＣＯＸ２特異的阻害剤（１２）などの抗炎症薬（１１）で処理した患者ではＡＤとの相関が低減することが確かめられた。これらの発見によって、ＡＤに伴う神経変性に炎症が関与しているという仮説が裏付けられる（１３）。
【０００６】
ＡＤについての生物学的な理解を深めるために、最近いくつかのサイトカインやケモカインが果たし得る役割について調べられている。ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＬ−８、ＴＧＦ−β及びマクロファージ炎症性タンパク質−１ａ（ＭＩＰ−１ａ）など、これらの研究で分析されたほぼ全ての介在物質は、痴呆症ではない対照と比較してＡＤではアップレギュレートされていることが示唆された（１４−１８）。対照的に、ヒト及びマウスにおいてＴリンパ球及び細胞性免疫を抑制し、強力な抗炎症特性を有するＩＩ型サイトカインである免疫調節性サイトカインＩＬ−１０に関しては矛盾する結果が得られた（１９−２１）。
【０００７】
これらの研究では、それぞれのサイトカインを独立に遺伝子多型及び／又は遺伝子産物として検討したが、同一集団試料における炎症促進性要素と抗炎症性要素との間、例えば、ＩＬ−１０とＩＬ−６との間の関係については調べられなかった。
【０００８】
これら２つの遺伝子のプロモータ領域において一塩基多型（ＳＮＰ）の存在が知られていることは、再考する価値がある。１番染色体の１ｑ３１と１ｑ３２との間に位置するＩＬ−１０をコードする遺伝子は多型性が高い。ＩＬ−１０産生は、−１０８２位（グアニンからアデニンへの置換）、−８１９位（チミンからシトシンへの置換）及び５９２位（アデニンからシトシンへの置換）での二対立遺伝子多型と相関している。−１０８２位の多型は、Ｅｔｓ（Ｅ−２６特異的）様認識部位内にあり、この転写因子の結合に影響を及ぼし、それによって転写活性化を変更する可能性がある。−１０８２Ａ対立遺伝子は、インビトロにおいてＴ細胞刺激後のＩＬ−１０生成に関与するが（５７）、−８１９位及び５９２位の多型は関与していないようである。ヒトのＩＬ−６遺伝子は、５個のエキソン及び４個のイントロンから構成されており、７番染色体の短腕（７ｐ２１）に位置する（５０、７３）。ＩＬ−６は多くの生物学的機能に関係しているため、その対立遺伝子変種はいくつかの生理学的状態及び異常生理学的状態とも遺伝的に関与している。この多型部位のうちの２つ、すなわち、３’隣接領域に位置する多対立遺伝子的可変性タンデムリピート（ＶＮＴＲ）多型（ＡＴリピート）及び１７４位に位置するプロモータの二対立遺伝子的なＧからＣへの多型が、しばしば遺伝関連研究のために使用されてきた。Ｇ／Ｃ一塩基多型（ＳＮＰ）は、ＩＬ−６の様々な血中濃度及び転写速度に関係するようである（５４、５６、６８）。
【０００９】
これらの考察を考慮し、イタリアの散在的遅発性ＡＤ患者及び対応する健常者対照（ＨＣ）における症例−対照関連研究に基づいて、本発明者等は、ＩＬ−１０及びＩＬ−６のＳＮＰがＡＤの発症に関係があるか否かを検証した。この結果によって、ＡＤの炎症病原仮説の解明がさらに進み、遺伝的素因は代謝的素因と独立していることが示唆された。
【００１０】
これらの対立遺伝子の差異は、抗原及びマイトジェン誘発末梢血リンパ球によるＩＬ−１０及びＩＬ−６産生に測定可能な差をもたらす。実際に、これらの多型は該遺伝子の調節領域に生じており、ＩＬ−１０の高、中、又は低産生と関連している（２２）。
【００１１】
本発明者らは、ＡＤ患者と同年齢の健常者対照の末梢血リンパ球（ＰＢＭＣ）によるベータアミロイド誘発性ＩＬ−１０及びＩＬ−６産生について調べた。このサイトカインの生成は、ＡＤ患者では著しく抑制されていたので、ＩＬ−１０多型をこれら同一の患者で分析した。結果によって、ＡＤ患者ではＩＬ−１０高産生対立遺伝子は非常に少ないことが示された。
【００１２】
特に、ＡＤをＨＣと比較すると、ＩＬ−１０遺伝子型の配分が異なっている（χ2＝１６．００７、ｐ＝０．００７）。したがって、ＩＬ−１０産生抑制に対応する遺伝子型はＡＤ患者で有意に高い配分を示す（表Ｉ）。ＩＬ−１０低産生遺伝子型の存在は、以下のように、ＡＤの臨床結果の悪化、すなわち、１）より早い年齢での発病（表ＩＩ）及び２）疾患の速い進行（ＭＭＳＥスコア）（表ＩＩＩ）に関係する。
【表１】
2005528119.tif 000002
【００１３】
アルツハイマー病患者（ＡＤ）における様々な遺伝子型の頻度は、健常者対照（ＨＣ）とは統計学的に異なる。χ2＝１６．００７、ｄｆ＝５、ｐ＝０．００７。括弧内（ｃ）には、対応する遺伝子型、高（Ｈ）、中（Ｍ）、低（Ｌ）が示されている。
【表２】
2005528119.tif 000003
【００１４】
アルツハイマー病患者における様々な遺伝子型と発病年齢との相関。ＡＮＯＶＡ：ｐ＝０．０４２。
【表３】
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【００１５】
アルツハイマー病患者における様々な遺伝子型とＭＭＳＥとの相関。ＡＮＯＶＡ：ｐ＝０．０１０。
【００１６】
慢性炎症は、ＡＤに特徴的な神経変性プロセスに関与していることが示唆されている（２４、２５）。この示唆は、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｅｘ  ａｄｊｕｖａｎｔｉｂｕｓという両方の基準から得られたものである。したがって、炎症媒介物質と活性化グリア細胞は、インビボにおいて老人斑と密接に関連していることが認められた。さらに、最近のデータによって、抗炎症療法は疾患の進行の改変するために有用であり得ることが示された（１０−１２）。このように膨大な量の証拠があるにもかかわらず、ＡＤとの生物学的相関は未だに明らかではない。この問題を解明するために、ＩＬ−１０に注目した。このサイトカインは、免疫応答の多くの面に関与する極めて重要な調節サイトカインで、ヒトの自己免疫疾患（２６）、悪性腫瘍（２７−３１）及び感染性疾患（３２−３５）では調節が異常になっている。さらに最近になって、遺伝的に決定されたＩＬ−１０分泌レベルの上昇が全身性エリトマトーデス（３６）及び感染性疾患（３７）の発症における遺伝的背景の重要な要素であることが示された。ヒト末梢血白血球をＬＰＳでインビトロ誘発することによって生じるＩＬ−１０の分泌には、個体間に著しい相違があり、サイトカインのハプロタイプが分泌レベルの差と関連する（３８）ことも示された。さらに、患者及びその第１親等の細胞によるＩＬ−１０血清の産生には差があること（３７、３９）、並びにＩＬ−１０対立遺伝子の分布に差があることによって、感染性疾患（３７、４０）、自己免疫疾患（２６、３６、４１、４２）及び悪性腫瘍（４３）ではヒト疾患の重要な量的形質の遺伝子座としてＩＬ−１０遺伝子の様々なアイソフォームが関与していることが示唆された。
【００１７】
本発明者等はまず、ＡＤ患者及び同年齢のＨＣの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）によるＬＰＳ−、Ｆｌｕ−及びアミロイドペプチド特異的ＩＬ−２及びＩＬ−１０産生を分析した。結果から、１）ＡＤ患者及び対照のＰＢＭＣによるＩＬ−２産生は測定したいずれの条件でも同様であること、２）ＬＰＳ及びＦｌｕによって誘発されたＰＢＭＣによるＩＬ−１０の生成は２つの個体群で類似していることが示された。対照的に、ＡＤではＩＬ−１０生成の減少を特徴とするアミロイド特異的免疫障害が見られた。このようなサイトカイン不均衡がマイトジェン誘発ＰＢＭＣで見られなかったという所見によって、アミロイド特異的免疫応答はＡＤ患者で選択的に損なわれていることが示唆される。さらに、ｆｌｕによって誘発される増殖が患者と対照で同様であることを示す結果から、ＨＬＡクラスＩＩ分子に関連した抗原プロセシング及び抗原提示、並びに免疫系活性化のＣＤ４−ＨＬＡクラスＩＩ自己拘束性経路（４４）はこれらの患者では欠損していないことが示唆される。
【００１８】
次に、同じ患者群のＩＬ−１０遺伝子で多型を分析した。健康なイタリア人からなる標本中のＩＬ−１０対立遺伝子の分布解析から得られた結果は、その他の白人集団で報告された結果と非常に類似していることが示された（４５）。反対に、ＡＤ患者ではＩＬ−１０産生抑制に対応する遺伝子型（ＡＣＣ／ＡＣＣ、ＡＣＣ／ＡＴＡ及びＡＴＡ／ＡＴＡ）の出現頻度が有意に高いことが認められた。このため、ＡＤ集団では、ＩＬ−１０低産生アイソフォームの存在率が異常に増加していることが決定された。アミロイド特異的免疫応答を測定すると、これらのアイソフォームの表現型における相関が明らかになった。
【００１９】
その後の分析では、ＩＬ−１０低／中産生遺伝子型の存在が様々な疾患の発症と関係があるかどうかを確認することによって、ＩＬ−１０産生障害とＡＤの臨床症状との間に存在する可能性がある相関に注目した。これが事実であることが確認された。したがって、ＡＴＡ／ＡＴＡ及びＧＣＣ／ＡＴＡ遺伝子型の存在は、より低い年齢での発病と相関していた。さらに、ＡＣＣ／ＡＴＡ及びＡＣＣ／ＡＣＣ（いずれもＩＬ−１０低／中産生遺伝子型である）対立遺伝子は、ＭＭＳＥスコアの低下が示しているように、認知障害の悪化と関連があった。
【００２０】
年齢に関連した疾患に罹りにくい１００歳以上のイタリア人に関する最近の報告で、長寿はＩＬ−１０高産生遺伝子型の有意に高い出現頻度と関係があることが見いだされたこと（４６）は興味深い。
【００２１】
ＩＬ−１０は強力な抗炎症特性を有することが知られている（４７）。したがって、アミロイド特異的なＩＬ−１０産生が抑制されることによって、ＡＤが進行する際に見られる慢性の炎症プロセスの引き金が引かれやすくなるという生物学的仮説を立てることができるであろう。これらの結果によって、アミロイド特異的でＩＬ−１０媒介性の阻害的フィードバック回路は、ＡＤでない個体では活性化している可能性が示唆される。この回路の破壊がＡＤの発病に関連しているか、又はこれによってＡＤの発病を予測することができる。最近、ある確かな研究によって、自然免疫系細胞の周囲で生じるＩＬ−１０／炎症誘発回路が自己免疫疾患に対する感受性を制御していることが示された（４８）。ＡＤ患者ではこの回路に変化が生じていることが示されて、この結果はさらに拡張された。
【００２２】
本発明者等が多型領域を同定したところ、この多型はサイトカイン産生不全の指標であり、したがって自己免疫疾患、神経変性疾患又は慢性炎症性疾患への素因と関連している。
【００２３】
現在のところ、アルツハイマー病は、ＤＭＳ  ＩＶ又はＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡ（２３）などの確立された基準を使用し、多くの場合、脳の核磁気共鳴画像（ＭＲＩ）又はコンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンを併用して、脳の海馬領域の萎縮と共に特徴的なアミロイド斑及び神経原線維濃縮体を同定することによって診断している。
【００２４】
アルツハイマー病の完全な確定診断は、検死又は脳生検（効果的な治療法がないので推奨されていない）によって脳患部を目視検査することによってのみ可能である。
【００２５】
アルツハイマー病の治療及びモニター方法が切実に求められている。神経変性及び疾患の進行を阻止又は遅延させる努力が進むにつれて、アルツハイマー病を早期検出し、罹患しやすい患者を同定することは、これによってできる限り早く予防策をとることが可能になるので、重要になるだろう。したがって、認識能力を長期的かつ主観的に評価する必要なしに、アルツハイマー病の発症のし易さを調べることができる予測性があり且つ信頼性の高い試験を提供することが必要である。
【００２６】
したがって、本発明は、アルツハイマー病、自己免疫疾患又はその他の神経変性疾患の存在又は素因を測定する方法であって、対象動物からＤＮＡ含有試料を採取する工程と、該試料を分析してＩＬ−１０をコードする遺伝子の−１０８２位、−８１９位及び５９２位の１又は複数のＳＮＰ座に存在する対立遺伝子変種を決定する肯定、言い換えれば、図２の対立遺伝子の有無について該試料を分析する工程とを備えた方法を提供する。
【００２７】
好ましくは、−１０８２位、−８１９位及び５９２位の３カ所全ての遺伝子型を決定する。
【００２８】
図２の対立遺伝子を同定することはアルツハイマー病の同定に有用で、その予測に使えることが見出されたが、ＩＬ−１０及びＩＬ−６の対立遺伝子を組み合わせると、アルツハイマー病に対する素因をさらに確実に予測することができ、又はアルツハイマー病の存在を診断できることが見出された。
【００２９】
アポリポタンパク質（Ａｐｏ−Ｅ）は、散在性又は非家族性のＡＤに関連してきた。したがって、本発明の他の態様では、アルツハイマー病を診断する方法は、動物からＤＮＡ含有試料を取得する工程と、ＩＬ−１０、ＩＬ−６及びＡｐｏ−Ｅの多型対立遺伝子の存在を同定する工程とを、備える。
【００３０】
好ましくは、該多型対立遺伝子は図２の対立遺伝子の１つである。
【００３１】
さらに、ＩＬ−１０及びＩＬ−６に加えて、その他のサイトカイン、例えば、ＩＬ−１０及びＩＬ−６プラスＩＬ−４及び／又はＩＬ−１の多型又はその他の対立遺伝子変異の有無について前記試料をアッセイしてもよい。
【００３２】
あるいは、ＩＬ−１０プラスＡｐｏ−Ｅ、又はＩＬ−６プラスＡｐｏ−Ｅの多型又はその他の対立遺伝子変異の有無について前記試料をアッセイしてもよい。
【００３３】
インターロイキン１アルファ（ＩＬ−１アルファ）多型は、アルツハイマー病に関与している（７７）。したがって、本発明のさらに他の態様では、アルツハイマー病を診断する方法は、動物からＤＮＡ含有試料を取得する工程と、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、Ａｐｏ−Ｅ及びＩＬ−１の多型対立遺伝子の存在を同定する工程と、を備える。
【００３４】
一般的には、試験中に可能な限り多数の予測因子を組み合わせることによって、最適な予測値を得ることができるだろう。Ａｐｏ−Ｅ及びＩＬ−１などのマーカーとともに本明細書中に記載されている方法を用いれば、ＡＤの発病の予測値であることが示された生物学的マーカー全てを含み得る強力な診断方法を開発することが可能である。
【００３５】
本発明は、表１に示したＩＬ−１０の対立遺伝子多型の１つを有する遺伝子、言い換えれば、図２の対立遺伝子多型の遺伝子の機能をモジュレートして、すなわち、増大又は減少させてアルツハイマー病、自己免疫疾患又は他の神経変性疾患を治療する方法も提供する。
【００３６】
例えば、ＩＬ−６産生はダウンレギュレートされていることが好ましいが、ＩＬ−１０産生はアップレギュレートされていることが好ましい。ＩＬ−６がダウンレギュレートされていると同時に、ＩＬ−１０がアップレギュレートされていることがさらに好ましい。
【００３７】
あるいは、適切なサイトカインを阻害又は供給する薬学的組成物を治療の必要な患者に投与してもよい。例えば、遺伝子レベルでＩＬ−６をダウンレギュレートする代わりに、ＩＬ−６の作用を阻害又は遮断する化合物を患者に与えてもよい。このような阻害又は遮断は、合成段階で、作用部位又はＩＬ−６代謝経路のいずれかで行うことができる。同様に、ＩＬ−１０の合成を最初から誘発するか、又はインターロイキン−１０と、必要に応じて、１種又は複数のその他のサイトカインとの抗原特異的産生を促進又は阻害する薬学的組成物、を投与することによって、ＩＬ−１０は中間体として、前駆体又は前前駆体として直接供給してもよい。
【００３８】
その他のサイトカインは、インターロイキン−１（α又はβ）、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−７、インターロイキン−８、インターロイキン−９、インターロイキン−１１、インターロイキン−１２、インターロイキン−１３、インターロイキン−１４、インターロイキン−１５、インターロイキン−１６、インターロイキン−１７、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＬＳＦ及びＴＧＦ−βから成る群から選択することが好ましい。
【００３９】
サイトカイン産生をモジュレートすることができる薬剤は本分野では公知で、例えば、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）及び／又はＣｐＧ−モチーフ含有免疫調節性オリゴヌクレオチドがある。６０ｋＤａ熱ショックタンパク質ヒトｈｓｐ６０（ｐｈｓｐ６０）をコードする構築物を用いたＤＮＡワクチン接種によって、ＩＬ−１０産生が増加する（７１）。ＣｐＧ−ＤＮＡはサイトカインシグナル伝達（ＳＯＣ）タンパク質の抑制因子の合成を誘導できることが示されている。ＧｐＧ−ＤＮＡによって誘導されるＳＯＣタンパク質はＩＬ−６産生を阻害する（７２）。さらに、細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）媒介経路によって、ＣｐＧ−ＤＮＡはＩＬ−１０産生を惹起することが示されている（７３）。ＣｐＧオリゴヌクレオチドを構造的に改変して、作用を受ける細胞のタイプと誘発されるサイトカインが所望のプロファイルで得られるように、Ｔｈ１（細胞性、インターフェロンガンマ生成）又はＴｈ２（抗体、ＩＬ−１０及びＩＬ−４生成）Ｔヘルパー細胞経路のいずれかに傾かせることができる（７４）。このような多様なモジュレーションの例としては、Ｃｏｌｅｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって作製されたＴｈ１プロファイルを与える化合物７９０９、Ｄｙｎａｖａｘによって作製されたＴｈ２プロファイルを与える化合物がある（７５）。さらに、ＣｐＧモチーフがＹｐＧ又はＣｐＲモチーフによって置換されているが、それらの化学構造のために免疫調節能力の変化が見込まれるＣｐＧ様免疫調節オリゴヌクレオチドを薬剤として使用し、所望するサイトカイン産生プロファイルに影響を及ぼすこともできる（７６）。
【００４０】
さらなる態様では、本発明は治療の必要な動物のアルツハイマー病を治療する方法であって、ＩＬ−６の合成を抑制すると同時にＩＬ−１０の合成を促進することを備えた方法を提供する。
【００４１】
本発明は、アルツハイマー病を治療又は予防するための医薬の製造におけるＩＬ−６阻害剤及びＩＬ−１０プロモータの使用も提供する。
【００４２】
本発明の他の態様では、前述の方法で使用するための表１の対立遺伝子多型をコードするＤＮＡ断片又はｃＤＮＡ断片、言い換えると図２の対立遺伝子多型。
【００４３】
これらのＤＮＡ断片は、これらの対立遺伝子に結合し、制御し、あるいはモジュレートする効果を有する化合物であって、したがって該遺伝子産物の合成を刺激するか、又は阻害する化合物のスクリーニング及び同定に有用である。
【００４４】
したがって、本発明はさらに、アルツハイマー病に関与するケモカインをモジュレートする化合物をスクリーニングする方法であって、スクリーニングすべき化合物を表１の対立遺伝子多型、言い換えると、図２の対立遺伝子多型をコードするＤＮＡ又はｃＤＮＡ断片に導入する工程と、前記化合物と前記断片とのハイブリダイゼーションを評価する工程と、を備えた方法を提供する。
【００４５】
したがって、本発明は、前記方法で同定されたアルツハイマー病をモジュレートする化合物も提供する。
【００４６】
前記動物は哺乳類であることが好ましく、ヒトであることがより好ましい。
【００４７】
本明細書で提示したデータは、ＡＤの発症において炎症プロセスが役割を担っていることを裏付けるものであり、ＡＤ患者における神経変性は、異常な抗原特異的免疫応答と深く関わっているという仮説を一層強化し、さらに本疾患の治療において抗炎症性化合物を使用することを支持している。
【００４８】
したがって、さらに他の態様では、本発明は新生物疾患、白血病及び急性炎症を除く疾患を治療又は予防するための医薬の調製において、サイトカインを含む薬学的組成物を提供する。前記疾患は、神経変性疾患又は自己免疫疾患であることが好ましい。前記疾患は、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、糖尿病、喘息、パーキンソン病、運動ニューロン疾患、アルツハイマー病、慢性炎症性関節リウマチ、ＨＩＶ感染及びＡＩＤＳを含む群から選択することが最も好ましい。
【００４９】
前記サイトカインは、インターロイキン−１（α又はβ）、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−７、インターロイキン−８、インターロイキン−９、インターロイキン−１０、インターロイキン−１１、インターロイキン−１２、インターロイキン−１３、インターロイキン−１４、インターロイキン−１５、インターロイキン−１６、インターロイキン−１７、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＬＳＦ及びＴＧＦ−β、又はそれらの組み合わせ又は混合物から成る群から選択することが好ましい。２種類以上のサイトカインを使用することが好ましい。
【００５０】
前記又は各サイトカインは、インターロイキン、特にインターロイキン−１０又はインターロイキン−６であることが最も好ましい。
【００５１】
ここで、添付の図面を参照しながら、本発明の実施形態を単なる一例として説明することにする。
【実施例１】
【００５２】
患者及び対照者
４７人のＡＤ患者及び２５人の痴呆ではない被験対象者（ＨＣ）がアルツハイマー病の研究に参加した。これらの患者は、イタリア、Ｍａｌｉａｎ大学、Ｇｅｒｉａｔｒｉｃ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｏｓｐｅｄａｌｅ  Ｍａｇｇｉｏｒｅ  ＩＲＣＣＳで追跡していたさらに大きな集団標本から選択した。ＤＭＳ  ＩＶ及びＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡ（２３）基準を採用して、ＡＤの臨床診断を行った。認識能力及び認識変化は、ミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）によって評価した。ＡＤ患者及びＨＣは自宅で生活しており、血液採取日に注意深く身体検査を行い、臨床記録を検討した。
【００５３】
臨床的又は準臨床的な炎症プロセスが発生するリスクを最小限に抑えるために、患者は全て以下のように選択した。炎症の臨床徴候のない（例えば、正常体温であるか、随伴する炎症性疾患がない）ＡＤ及びＨＣのみが研究に参加した。血液化学変数も調べ、赤血球沈降速度が異常であるか、アルブミン及びトランスフェリン血漿レベルの血液特性が変化している患者を除外した。Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）血漿レベルによってＡＤ患者をさらに選別して、ＣＲＰが５ｍｇ／ｌを上回る（平均値±対照値の標準偏差の２倍）患者は本研究に含めなかった。
【００５４】
この研究を実施するためのインフォームドコンセントは、対照及び各ＡＤ患者の親族から得た。
【００５５】
血液試料の収集
ＥＤＴＡを含有するバキュテーナー管（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｃｏ、Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ、ＮＪ）に静脈穿刺して、全血を収集した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、リンパ球分離培地（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ  Ｃｏｒｐ．、Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）上で遠心して分離し、ＰＢＳで２回洗浄した。生リンパ球数は、トリパンブルー排除法及び血球計数器によって測定した。
【００５６】
インビトロでのサイトカイン産生
ＲＰＭＩ  １６４０にＰＢＭＣを３ｘ１０6／ｍｌで再懸濁して、誘発しないか、あるいはＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＩ）（１０  ｇ／ｍｌ）、以下のｂ−アミロイドタンパク質に由来する３種の異なるペプチドプール、ｂ−Ａ：断片２５−３５（２５ｍｇ／ｍｌ）、ｂ−Ｂ：断片１−４０（１５０ｎｇ／ｍｌ）、ｂ−Ｃ：断片１−１６（１５０ｎｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＩ）、又はインフルエンザウイルスワクチン（Ａ／Ｔａｉｗａｎ＋Ａ／Ｓｈａｎｇｈａｉ＋Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ）（２４ｇ／ｌ、最終希釈度１：１０００）（Ｆｌｕ）（対照抗原）によって３７℃で、湿潤させた７％ＣＯ2雰囲気において誘発した。ＬＰＳ誘発の場合には４８時間後、ｂ−アミロイドタンパク質ペプチドとＦｌｕの場合には５日間の培養後に上清を収集した。ＰＢＭＣによるＩＬ−２及びＩＬ−１０の産生を市販のＥＬＩＳＡキット（ＡＣＣＵＣＹＴＥ、Ｃｙｔｉｍｍｕｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｐａｒｋ、ＭＤ）で調べた。全ての検査キットは、製造者が推奨する操作にしたがって使用した。
【００５７】
ＩＬ−１０遺伝子型解析
標準的なプロテイナーゼＫ及びフェノール／クロロホルム法を使用して、ゲノムＤＮＡをＥＤＴＡ処理末梢血（１０ｍｌ）から抽出した。ＤＮＡ濃度及び純度を分光光度分析によって決定した。ポリメラーゼ連鎖反応−配列特異的プライマー（ＰＣＲ−ＳＳＰ）法を使用してＩＬ−１０遺伝子型を解析した。ＩＬ−１０（多型位置−１０８２、−８１９、−５９２）遺伝子のプロモータ領域における配列の増幅は、サイトカイン遺伝子型解析トレイ法（Ｏｎｅ  Ｌａｍｂｄａ、Ｃａｎｏｇａ  Ｐａｒｋ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して実施した。ヒトβ−グロビン遺伝子は、ゲノムＤＮＡ調製物の内部対照として増幅した。ＰＣＲ条件は、Ｏｎｅ  Ｌａｍｂｄａ  ＰＣＲプログラム（ＯＬＩ−１）によって示した。次に、ＰＣＲ産物を２．５％アガロースゲルの電気泳動によって視覚化した。
【００５８】
統計解析
統計解析は、ＳＰＳＳ統計ソフト（ＳＰＳＳ、シカゴ、ＩＬ）を使用して実施した。ノンパラメトリック解析を基礎とする解析手法（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ）によってＩＬ−１０産生の差が得られた。異なる患者群の比較は、フィッシャーの正確確率両側検定を使用して行った。研究群間の遺伝子型の出現頻度はｃ２検定によって比較し、本検定の有意水準である０．０５を下回る結果が観察された。６種の異なるＡＤ群の発病年齢の平均値とＭＭＳＥとの比較は、一元配置分散分析によって実施した。
【００５９】
ＡＤ患者及びＨＣにおける年齢、性別及びＭＭＳＥスコア
４７人のＡＤ患者及び２５人の同年齢の健康な対照が本研究に参加した。ミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）によって、ＡＤ患者には中程度から重度の認識衰退が存在することが示された。これらのデータを表Ｉに示す。
【００６０】
ＭＢＰ誘発ＩＬ−１０産生はＡＤ患者では減少する。
４７人のＡＤ患者及び２５人の同年齢同性のＨＣのＰＢＭＣをマイトジェン（ＬＰＳ）、３種のアミロイドペプチドプール（Ａ：２５−３５断片、Ｂ：１−４０断片、Ｃ：１−１６断片）（アミロイド）、又はＦｌｕ（対照抗原として使用）で誘発して、ＩＬ−２及びＩＬ−１０の産生をＥＬＩＳＡ法で測定した。ＡＤ患者及びＨＣでＬＰＳ又はＦｌｕ誘発性のＩＬ−２及びＩＬ−１０産生を比較すると、差は見られなかった。アミロイド誘発性のＩＬ−２産生も、研究した２つの個体群で同じであった。これらの結果とは対照的に、アミロイド誘発性のＩＬ−１０産生は、対照と比較してＡＤ患者では有意に減少していた（ｐ＝０．０２３）。これらのデータを図１に示す。
【００６１】
ＩＬ−１０高、中、及び低産生遺伝子型の分布はＡＤ患者では偏っている。
ＰＣＲ−ＳＳＰによって評価した６種の異なるＩＬ−１０遺伝子型の範例を図２に示し、一般的な白人集団標本における相対分布を表ＩＩに示す。ＨＣで観察された分布とは対照的に、ＡＤ患者における様々なＩＬ−１０遺伝子型の出現頻度は有意に偏っていた（ｃ２＝１６．００７、ｐ＝０．００７）（表ＩＩ）。したがって、ＩＬ−１０産生減少に対応する遺伝子型（ＡＣＣ／ＡＣＣ、ＡＣＣ／ＡＴＡ及びＡＴＡ／ＡＴＡ遺伝子型）はＡＤ患者で有意に高い分布を示した（それぞれ、１７％、２６％及び１１％に対し、ＨＣでは４％、１６％及び４％）。さらに、ＧＣＣ／ＡＣＣ対ＧＣＣ／ＡＴＡの比（中程度の表現型）はＡＤでは１：１で、ＨＣでは３：１であった。
【００６２】
ＩＬ−１０低産生はＡＤの臨床結果の悪化と相関する。
低ＩＬ−１０遺伝子型の存在が臨床的に関与している可能性を分析するために、本発明者らは、続いて、ＡＤの発病年齢（表ＩＩＩ）及び認識力衰退の進行（表ＩＶ）に関して前記６種の遺伝子型を調べた。この結果から低ＩＬ−１０産生遺伝子型の存在は実際にＡＤの臨床結果の悪化と関係があることが確かめられた。このように、ＡＴＡ／ＡＴＡ及びＧＣＣ／ＡＴＡ遺伝子型の存在は、早期発病と関係していた（ＡＮＯＶＡ：ｐ＝０．０４２）（表ＩＩＩ）、さらに、ＡＣＣ／ＡＣＣ及びＡＣＣ／ＡＣＣ、すなわちＩＬ−１０低産生遺伝子型とＭＭＳＥスコアとの間では逆相関が検出された（ＡＮＯＶＡ：ｐ＝０．０１０）（表ＩＶ）。
【表４】
2005528119.tif 000005
【００６３】
2005528119.tif 000006
【００６４】
2005528119.tif 000007
【００６５】
2005528119.tif 000008
【実施例２】
【００６６】
患者及び対照者
６５人のＡＤ患者（女性４４人／男性２１人、平均年齢８０±２）及び６５人の痴呆ではない同性同年齢の健康な対照（ＨＣ）が参加した。患者は、イタリア、Ｍｉｌａｎ大学、Ｇｅｒｉａｔｒｉｃ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｏｓｐｅｄａｌｅ  Ｍａｇｇｉｏｒｅ  ＩＲＣＣＳで追跡していたさらに大きな集団標本から選択した。ＤＭＳ  ＩＶ及びＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡ（２３）基準を採用して、ＡＤの臨床診断を行った。患者は全て、最近、脳の核磁気共鳴画像（ＭＲＩ）／コンピュータ断層撮影（ＣＴ）を受けていた。認識能力及び認識変化は、ミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）によって評価した。ＡＤ患者及びＨＣは自宅で生活しており、血液採取日に注意深く身体検査を行い、臨床記録を評価した。
【００６７】
臨床的又は準臨床的な炎症プロセスが発生するリスクを最小限に抑えるために、患者は以下のように選択した。炎症の臨床徴候のない（例えば、正常体温であるか、随伴する炎症性疾患がないなど）ＡＤ及びＨＣのみを適格とした。血液化学検査を行い、赤血球沈降速度が異常であるか、アルブミン及びトランスフェリン血漿レベルが変化している患者を除外した。Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）血漿レベルによってＡＤ患者をさらに選別して、ＣＲＰが５ｍｇ／ｌ（平均値＋対照値の標準偏差の２倍）を上回る場合には不適格とした。
【００６８】
インフォームドコンセントは、対照及び各ＡＤ患者の親族から得た。この研究計画は、大学病院の倫理委員会の承認を得た。
【００６９】
血液試料の収集
ＥＤＴＡを含有するバキュテーナー管（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｃｏ、Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ、ＮＪ）に静脈穿刺して、全血を収集した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、リンパ球分離培地（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ  Ｃｏｒｐ．、Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）上で遠心して分離し、ＰＢＳで２回洗浄した。生リンパ球数は、トリパンブルー排除法及び血球計数器によって測定した。
【００７０】
遺伝子型解析
標準的なプロテイナーゼＫ及びフェノール／クロロホルム法を使用して、ゲノムＤＮＡを抽出した。ＤＮＡ濃度及び純度は分光光度分析によって決定した。ポリメラーゼ連鎖反応−配列特異的プライマー（ＰＣＲ−ＳＳＰ）法を使用してＩＬ−１０及びＩＬ−６遺伝子型を評価した。ＩＬ−１０（多型位置−１０８２、−８１９、−５９２）遺伝子及びＩＬ−６（多型位置−１７４）遺伝子のプロモータ領域の配列は、サイトカイン遺伝子型解析トレイ法（Ｏｎｅ  Ｌａｍｂｄａ、Ｃａｎｏｇａ  Ｐａｒｋ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して増幅した。ヒトβ−グロビン遺伝子は、ゲノムＤＮＡ調製物の内部対照として増幅した。ＰＣＲ条件は、Ｏｎｅ  Ｌａｍｂｄａ  ＰＣＲプログラム（ＯＬＩ−１）に示されており、ＰＣＲ産物を２．５％アガロースゲルの電気泳動によって視覚化した。
【００７１】
ＡｐｏＥ遺伝子型は、ＡｐｏＥ遺伝子のエキソン４の２３４塩基対断片をＰＣＲ増幅し、その後Ｃｆｏ１で消化することによって決定した。この制限パターンは、ゲル電気泳動によって得られた。
【００７２】
インビトロにおけるサイトカイン産生
ＰＢＭＣをＲＰＭＩ１６４０に３ｘ１０6／ｍｌで再懸濁して、誘発しないか、あるいはＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＩ）（１０μｇ／ｍＬ）、以下のβ−アミロイドタンパク質に由来する３種のペプチドプール、β−Ａ：断片２５−３５（２５  ｇ／ｍＬ）、β−Ｂ：断片１−４０（１５０ｎｇ／ｍＬ）、β−Ｃ：断片１−１６（１５０ｎｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ）、又はインフルエンザウイルスワクチン（Ａ／Ｔａｉｗａｎ＋Ａ／Ｓｈａｎｇｈａｉ＋Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ）（２４μｇ／Ｌ、最終希釈度１：１０００）（Ｆｌｕ）（対照抗原）によって３７℃で、湿潤させた７％ＣＯ2雰囲気において誘発した。ＬＰＳ誘発の場合には４８時間後、β−アミロイドタンパク質ペプチドの場合には５日間の培養後に上清を収集した。ＰＢＭＣによるＩＬ−１０及びＩＬ−６の産生を市販のＥＬＩＳＡキット（ＡＣＣＵＣＹＴＥ、Ｃｙｔｉｍｍｕｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｐａｒｋ、ＭＤ）で調べた。全ての検査キットは、製造者が推奨する操作にしたがって使用した。
【００７３】
統計解析
統計解析は、ＳＰＳＳ統計ソフト（ＳＰＳＳ、シカゴ、ＩＬ）を使用して実施した。研究群の遺伝子型の出現頻度は、χ2検定によって有意水準０．０５未満で比較した。オッズ比（ＯＲ）及び９５％信頼区間（ＣＩ）も算出した。調整したＯＲは、ロジスティック回帰によって概算し、ＡｐｏＥ４保因状態を制御した。階層間のＯＲの均一性は、モデルに適切な交互作用項を含めることによって評価した。ＩＬ−１０とＩＬ−６産生の差は、ノンパラメトリック分析に基づく方法（マン・ホイットニー検定）によって求めた。異なる患者群は、フィッシャーの正確確率両側検定を使用して比較した。
【００７４】
ＩＬ−１０高、中及び低産生遺伝子型の分布は、ＡＤ患者では偏っている。
−１０８２位の二対立遺伝子多型の遺伝子型及び対立遺伝子出現率を表Ｖに示す。このＳＮＰは、遺伝子用量関連効果によって転写活性を変化させるため、ＧＧはインビトロでＴ細胞を誘発した後のＩＬ−１０高産生に相関しており、ＧＡは中産生、ＡＡは低産生に相関している（５７）。ＡＤ患者では、−１０８２Ａ低産生対立遺伝子出現率が有意に高く、ＡＤではＨＣと比較して遺伝子型の分布が偏っており、−１０８２ＧＧ高産生遺伝子型が有意に減少している（表Ｖ）。
【表５】
2005528119.tif 000009
【００７５】
ＳＮＰの中には、−８１９位及び５９２位のその他２個のＳＮＰと連鎖しているものがある。これらはミクロサテライト対立遺伝子と一緒になってハプロタイプを形成し、ＩＬ−１０産生の違いは主に−１０８２ＳＮＰによって説明できる（３８、４２）。−８１９Ｃ→Ｔ及び５９２Ｃ→Ａ  ＳＮＰの遺伝子型及び対立遺伝子出現率の分布は、ＡＤとＨＣ標本で同様であった（データは示さず）。
【００７６】
ＩＬ−６遺伝子中の−１７４Ｃ対立遺伝子はＡＤ患者では過剰に提示される
ＨＣ及びＡＤ中のＩＬ−６の遺伝子型と対立遺伝子の分布を表６に示す。この機能的多型は、血漿ＩＬ−６濃度に関係するようである。しかし、このＳＮＰがどのようにＩＬ−６血漿レベルに影響を及ぼすかは不明である（５４）。本発明者らのＡＤ及びＨＣ標本における遺伝子型分布では、ＡＤ患者でＧＧ遺伝子型の出現率が低いという結果が得られた。同様に対立遺伝子の分布は、２つの群では有意に異なっており、ＡＤではＣ対立遺伝子が有意に高かった（表ＶＩ）。
【表６】
2005528119.tif 000010
【００７７】
ＩＬ−１０及びＩＬ−６対立遺伝子の組み合わせ及びＡＤ発病の相対的危険性
本発明者らは、ＩＬ−１０  ＧＡ及びＩＬ−６  ＧＣ対立遺伝子の任意の組み合わせがＡＤの危険性に影響を及ぼすかどうかを調べた。ＩＬ−１０Ａ及びＩＬ−６Ｃ対立遺伝子が共存すると、ＡｐｏＥ４ステータスとは独立して、有意にこの危険性が上昇した（表ＶＩＩ）。ＩＬ−１０  Ａ／Ａ遺伝子型単独又はＩＬ−６  Ｃ／Ｃ遺伝子型単独ではいずれも、この疾患の危険性の増加はより少なかった（ＯＲ  ５．８、ＣＩ  １．７−２０、ｐ＝０．００５、ＯＲ  ３．０、ＣＩ  ０．９−１０．６、ｐ＝０．０８７）。
【表７】
2005528119.tif 000011
【００７８】
ＡＤ患者ではＬＰＳ、Ｆｌｕ及びアミロイドペプチド誘発性のＩＬ−１０及びＩＬ−６産生は減少する。
４７人のＡＤ患者と２５人の同年齢同性のＨＣのＰＢＭＣをマイトジェン（ＬＰＳ）、３種類のβアミロイドペプチドプール（βＡ、断片２５−３５、βＢ、断片１−４０、βＣ、断片１−１６）、又はＦｌｕで誘発し、ＩＬ−１０、ＩＬ−６の産生をＥＬＩＳＡ法で測定した。ＡＤ及びＨＣにおいて、ＬＰＳ又はｆｌｕ誘発によるＩＬ−６及びＩＬ−１０産生の差はなかった。対照的に、β−アミロイドで誘発したＩＬ−６及びＩＬ−１０の産生を分析すると、ＡＤ患者ではＨＣと比較してＩＬ−６産生はかろうじて増加しており、ＩＬ−１０生成は有意に減少（ｐ＝０．０２３）しており、これらのサイトカイン産生は抗原特異的に損なわれることが示唆された。これらのデータを図３に示す。
【００７９】
ＡＤの発病における慢性炎症の原因的役割は、なお推測の域を出ない（２４、２５）が、抗炎症性サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−１０及びＩＬ−１３）はβ−アミロイド誘導性小膠細胞／マクロファージ炎症応答を制御し（１９）、アミロイド老人斑周囲の小膠細胞活性を変化させるという「サイトカインサイクル」が提案されている（５２）。これらのサイトカインは、分化したヒト単球においてＩＬ−１、ＴＮＦ−α及びＭＣＰ−１の誘導を阻害することができ、特に、ＩＬ−１０は、これらの細胞及びマウス小膠細胞中で、β−アミロイドによって誘導されるＩＬ−６分泌を用量依存的に阻害する（１９）。
【００８０】
臨床上の観点から、ＩＬ−１０は自己免疫疾患（４１、４２、２６）及び悪性腫瘍（３１、２７、４３）に関与しており、ＩＬ−１０のレベルが高くなることは、遺伝的背景（５９）に左右されるだけでなく、感染の発症にも影響を及ぼす（３４、４０、３７）。
【００８１】
ＡＤの発病におけるＩＬ−６の役割を示す証拠は、さらに一貫している。ＩＬ−６免疫反応性の増大が、これらの患者の脳内アミロイド斑の近くに観察された（６７）。ＩＬ−６はβ−アミロイド前駆体タンパク質の合成を誘導し（６９）、トランスジェニックマウスモデルでは、ＩＬ−６のＣＮＳレベルが上昇すると神経病発生効果及び認識欠損が引き起こされる（５１）。
【００８２】
ＩＬ−６遺伝子に対するＶＮＴＲのＣ対立遺伝子は、サイトカイン活性を減少させることが報告された（６１）。ＩＬ−６  ＶＮＴＲ  Ｃ対立遺伝子は、ドイツ人集団において、疾病の遅発及びＡＤリスクの減少と相関していた（６３）。プロモータ領域の機能的多型−１７８も、サイトカインの血漿濃度に関連があるので、ＡＤ表現型の発生に関与している可能性がある（５４）。しかし、民族が異なる２つの臨床集団では、この結果には議論の余地があった（４９）。
【００８３】
本発明者らの標本では、ＳＮＰ分析のデータによって、ＨＣはイタリア人集団と同様のＩＬ−１０及びＩＬ−６対立遺伝子分布を有していることが示された（６５）。本発明がＡＤ症例の中でＩＬ−１０  −１０８２Ａ保因者の割合が有意に高いことを示したことはさらに重要である。１００歳以上のイタリア人に関する最近の報告では、年齢の低い人よりも年齢に関係した疾患に明らかに罹りにくく、著しい長寿はＩＬ−１０高産生遺伝子型と有意な関係があることが示された（５８）。
【００８４】
本発明者らが以前に報告したように、ＩＬ−６  ＳＮＰに関する結果はさらに矛盾している。ＩＬ−６  Ｇ対立遺伝子は、日本人のＡＤ（６６）及び南イタリア人（６４）でも有意なようであるが、本発明者らの標本で過剰に提示されているのはＣ対立遺伝子である。
【００８５】
これらの異なる結果をつなぎ合わせるには、いくつかの点を考慮しなければならない。民族は遺伝的危険因子の役割に強い影響を及ぼす可能性があり、欧州の異なる国々の集団や、さらには同じ国でも異なる地域の集団では遺伝子変種の分布に影響を及ぼす可能性がある（５３、５５、６０、６２、７０）。さらに、ＡＤとＩＬ−６  ＳＮＰとの間の関係は、特定の年齢に限定され、本発明者らの標本では、ＡＤ及びＨＣ対照者はいずれも後期高齢者であった。
【００８６】
最後に、この変異との連鎖不均衡において１又は数個の遺伝子が果たす役割について検討しなければならない。−１７４ＳＮＰとＩＬ−６遺伝子の３’隣接領域のＶＮＴＲ多型との間に強い不均衡があることがドイツ人で報告された（４９）。
【００８７】
この研究の主な発見は、ＩＬ−１０の−１０８２ＡとＩＬ−６の−１７４Ｃ対立遺伝子が共存したことにより、遅発性ＡＤの危険性が高まった患者群を同定したことであった。本発明者らは、ＡｐｏＥとＩＬ−１０又はＩＬ−６遺伝子との間の相互作用についても調べたが、相乗作用効果を裏付ける証拠は発見されず、これらの炎症関連対立遺伝子は、加算的で独立したＡＤの危険因子であることが示唆された。
【００８８】
この遺伝学的な結果をさらに解明するために、本発明者等は、ＡＤ患者及び同年齢ＨＣの亜集団における末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）によるβ−アミロイドペプチド、ＬＰＳ、及びＦｌｕ特異的ＩＬ−１０及びＩＬ−６産生についても分析を行った。その結果、１）ＡＤ患者及び対照のＰＢＭＣによるＩＬ−６産生はいずれの状態でも有意な差はなく、２）ＬＰＳ及びＦｌｕ誘発を行ったＰＢＭＣによるＩＬ−１０生成は、２つの群で同等であったが、ＡＤではＩＬ−１０生成減少を特徴とするβアミロイド特異的な免疫障害が認められることが示された。マイトジェン誘発ＰＢＭＣではこのサイトカイン不均衡が認められないということは、βアミロイド特異的免疫応答はＡＤで選択的に損なわれていることを示している。さらに、ｆｌｕ誘発性の増殖が患者と対照とで同じであったということは、ＨＬＡクラスＩＩ分子に関連した抗原プロセシング及び抗原提示、並びにＣＤ４−ＨＬＡクラスＩＩ自己拘束性免疫系活性化経路（４４）がＡＤでも不完全ではないことを示している。したがって、アミロイド特異的ＩＬ−１０産生が減少すると、ＡＤ脳に見られた慢性炎症プロセスの引き金が引かれ易いという生物学的な仮説を立てることができる。非ＡＤ個体では、アミロイド特異的及びＩＬ−１０媒介性阻害的フィードバック回路が活動しており、この回路の破壊がＡＤの発症に関連するか、又は前兆となる可能性がある。最近の研究によって、自然免疫系細胞の周囲で機能するＩＬ−１０／炎症誘発回路が自己免疫疾患に対する感受性を制御することが明確となった（４８）。ＡＤ患者ではこの回路が変化していることを示すことによって、本発明者らの結果はこの概念を拡張した。本データは、全体として、ＡＤ発症の総合的なリスクは複数の高リスク対立遺伝子を受け継いだ複合的な影響を反映する「感受性プロフィール」によって支配されている可能性があるという理論を裏付けるものであり、このプロフィールにおけるＩＬ−１０とＩＬ−６ＳＮＰの中枢的役割が明らかとされた。
【００８９】
炎症はアルツハイマー病（ＡＤ）の発病に関与しており、抗炎症性サイトカインであるインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）が脳内のＩＬ−６活性を打ち消している可能性がある。これらの遺伝子のプロモータは多型であるので、本発明者らは、６５人のＡＤ患者と６５人の健康な対照（ＨＣ）について、ＩＬ−１０  −１０８２ＧＡ及びＩＬ−６  −１７４ＧＣ対立遺伝子を調べた。いくつかの場合には、ＰＢＭＣによるＩＬ−１０及びＩＬ−６産生も調べた。ＩＬ−１０については、ＨＤにおける−１０８２ＧＧ遺伝子型の濃度はＨＣよりも有意に高く（ｐ＝０．０１９）、ＩＬ−６については、Ｇ／Ｃ遺伝子型は低く、Ｃ対立遺伝子が高かった（ｐ＜０．００５）。ＩＬ−１０  ＡとＩＬ−６  Ｃ対立遺伝子が共存すると、ＡｐｏＥ４（調整されたＯＲ  １０．３、ＣＩ  １−１０８；ｐ＜０．０５）とは独立に、ＡＤのリスクが有意に上昇した（オッズ比：ＯＲ１１．２、信頼区間：ＣＩ  １．３−９７．３；ｐ＜０．０５）。アミロイド誘発性のＩＬ−１０産生のみがＡＤとＨＣでは異なっていた（ｐ＝０．０２３）。これらの結果は、ＡＤにおける炎症理論と矛盾しており、ＩＬ−１０及びＩＬ−６の多型が中枢的な役割を担い、このネットワークにおいて選択的に交代することを示している。
【実施例３】
【００９０】
インターフェロン−γ及びＴＮＦ−αの遺伝子型分析
前記の実施例で説明した方法を使用して、アルツハイマー病患者及び健常対照者におけるインターフェロン−γ及びＴＮＦ−αの遺伝子型分析を実施した。この結果を表ＶＩＩＩ及びＩＸにまとめて示す。
【表８】
2005528119.tif 000012
【表９】
2005528119.tif 000013
【００９１】
アルツハイマー病患者及び対照を比較すると統計学的に有意な差はなく、インターフェロン−γもＴＮＦ−αもアルツハイマー病発症の可能性とは関連がないことが示された。
【００９２】
これに対して、本発明は、ＩＬ−１０及びＩＬ−６によるアルツハイマー病発症の予測性は高く、疾患の進行も予測できる可能性があることを示している。複数の遺伝子多型（例えば、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、Ａｐｏ−Ｅ及びアルツハイマーとの関連が示されたその他の遺伝子型）の遺伝子型検査を組み合わせることによって、最も予測性の高い値が得られるであろう。
【参考文献】
【００９３】
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【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】図１Ａ−１Ｄは、４７人のＡＤ患者（Ｏ）および２５人の同年齢同性の健常者対照（Ｏ）のＰＢＭＣによるＬＰＳおよびβアミロイド（３種のβアミロイドペプチドのプール：βＡ：断片２５−３５、βＡ：断片１−４０およびβＣ：断片１−１６）で誘発したＩＬ−２（パネルＡおよびＣ）およびＩＬ−１０（パネルＢおよびＤ）の産生を示す棒グラフである。平均値±標準誤差を示す。ｐ≦０．０２３。
【図２】図２は、６つの異なる試料のＩＬ−１０遺伝子型解析の範例を示す。各ゲルの最も濃いバンドは、内部対照として使用したヒトβ−グロビン遺伝子のアンプリコンに対応する。その他の特異的に増幅されたＤＮＡ断片は、ＩＬ−１０遺伝子の多型：ＧＣＣ／ＧＣＣ（Ａ）、ＧＣＣ／ＡＣＣ（Ｂ）、ＧＣＣ／ＡＴＡ（Ｃ）、ＡＣＣ／ＡＣＣ（Ｄ）、ＡＣＣ／ＡＴＡ（Ｅ）、ＡＴＡ／ＡＴＡ（Ｆ）に対応する。
【図３】図３Ａ−３Ｄは、４７人のＡＤ患者（Ｏ）および２５人の同年齢同性の健常者対照（Ｏ）のＰＢＭＣによるＬＰＳおよびβアミロイド（３種のβアミロイドペプチドのプール：βＡ：断片２５−３５、βＡ：断片１−４０およびβＣ：断片１−１６）で誘発したＩＬ−６（パネルＡおよびＣ）およびＩＬ−１０（パネルＢおよびＤ）の産生を示す棒グラフである。平均値±標準誤差を示す。ｐ≦０．０２３。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年6月7日(2004.6.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
アルツハイマー病、自己免疫疾患又はその他の神経変性疾患の存在又はこれらの疾患に対する素因を決定する方法であって、被験対象動物から採取したＤＮＡ含有試料を分析してＩＬ−１０をコードする遺伝子の−１０８２、−８１９及び５９２位の１個又は複数のＳＮＰ座に存在する対立遺伝子変種を決定する工程を含む方法。
【国際調査報告】
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