(57)【要約】化合物（Ｉ）は、α２及び／又はα３サブユニットに対して機能的に選択性を有するＧＡＢＡａ受容体リガンドであり、病的な精神状態、特に不安の治療に有用である。
2005507391.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
2005507391.tif 000011
で表される、７−ｔｅｒｔ−ブチル−３−（２−フルオロフェニル）−６−（２Ｈ−［１，２，４］トリアゾール−３−イルメトキシ）−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ｂ］ピリダジン化合物、又は薬学的に許容できるその塩。
【請求項２】
単離された形態である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
請求項１に記載の化合物と薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。
【請求項４】
医薬として用いるための、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
不安の治療又は予防のための医薬の製造における、請求項１に記載の化合物の使用。
【請求項６】
痙攣の治療又は予防のための医薬の製造における、請求項１に記載の化合物の使用。
【請求項７】
治療を必要とする患者に、有効量の請求項１に記載の化合物を投与すること含む、不安の治療又は予防のための方法。
【請求項８】
治療を必要とする患者に、有効量の請求項１に記載の化合物を投与すること含む、痙攣の治療又は予防のための方法。
【請求項９】
式ＩＩＩの化合物と式ＩＶの化合物：
【化２】
2005507391.tif 000012
（式中、Ｌ１は適切な離脱基を表し、及び、ＲＰはアミノ保護基を表す。）を反応させて、その後アミノ保護基ＲＰを除去することを含む、請求項１に記載の化合物の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、置換トリアゾロ−ピリダジン誘導体、及び治療におけるその使用に関する。より詳しくは、本発明は、ＧＡＢＡＡ受容体リガンドであり、それ故に病的な精神状態の治療において有用である、特定の置換［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ｂ］ピリダジン誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
主要な抑制性神経伝達物質に対する受容体である、ガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）は、２つの主なクラス：（１）リガンド依存性イオンチャンネルスーパーファミリーの一員であるＧＡＢＡＡ受容体、及び、（２）Ｇ−タンパク結合性受容体スーパーファミリーの一員であり得るＧＡＢＡＢ受容体に分けられる。個々のＧＡＢＡＡ受容体サブユニットをコードする最初のｃＤＮＡが複製されたことにより、哺乳類のファミリーの既知のメンバーの数は、少なくとも６つのαサブユニット、４つのβサブユニット、３つのγサブユニット、１つのδサブユニット、１つのεサブユニット、及び２つのρサブユニットにまで増えている。
【０００３】
ＧＡＢＡＡ受容体遺伝子ファミリーの多様性に関する知見は、前記リガンド依存性イオンチャンネルに対する理解において大きな前進を示すが、サブタイプの多様性の範囲に対する見識は、まだ初期段階である。αサブユニット、βサブユニット及びγサブユニットが、ｃＤＮＡを細胞内に一時的に核酸導入することにより発現される完全な機能性ＧＡＢＡＡ受容体の形成における必要最低条件を構成することが示されている。前に示したように、δ、ε、及びρサブユニットもまた存在するが、これらは、ＧＡＢＡＡ受容体群中の小規模の範囲にのみ存在している。
【０００４】
受容体の大きさの研究及び電子顕微鏡による視覚化によって、リガンド依存性イオンチャンネルファミリーの他のメンバーと同様に、天然のＧＡＢＡＡ受容体が５量体の形態で存在することが結論づけられる。１７のレパートリーからの、少なくとも１つのα、１つのβ、及び１つのγサブユニットの選択は、１０，０００より多くの５量体サブユニットの組み合わせが存在することを可能にする。さらにこの計算は、イオンチャンネルの周囲のサブユニットの配置が制限されない場合に可能な追加の置換を考慮していない（すなわち５つの異なるサブユニットから構成される受容体に対して１２０の可能な変化形が存在し得る。）。
【０００５】
実在する受容体サブタイプアセンブリは、数ある中でもα１β２γ２、α２β２／３γ２、α３βγ２／３、α２βγ１、α５β３γ２／３、α６βγ２、α６βδ、及びα４βδである。α１サブユニットを含むサブタイプアセンブリは、脳の大部分の領域に存在し、ラットにおけるＧＡＢＡＡ受容体の４０％より多くを占めると考えられている。α２及びα３サブユニットを含むサブタイプアセンブリは、それぞれラットにおけるＧＡＢＡＡ受容体の約２５％及び１７％を占めると考えられている。５αサブユニットを含むサブタイプアセンブリは、主に海馬及び皮質において発現され、ラットにおけるＧＡＢＡＡ受容体の約４％に相当すると考えられている。
【０００６】
全ての既知のＧＡＢＡＡ受容体の特性は、多くの調節領域の存在であり、その一つがベンゾジアゼピン（ＢＺ）結合領域である。ＢＺ結合領域は、最も研究されているＧＡＢＡＡ受容体調節領域であり、これを通してジアゼパム及びテマゼパムのような抗不安薬が効力を発揮する領域である。ＧＡＢＡＡ受容体遺伝子ファミリーがクローニングされる以前に、ベンゾジアゼピン結合領域は、歴史的に、放射性リガンド結合の研究に基づいてＢＺ１及びＢＺ２の２つのサブタイプに細分化された。ＢＺ１サブタイプは、βサブユニット及びγ２と結合したα１サブユニットを含むＧＡＢＡＡ受容体と薬理学的に同等であることが示されている。これは最も豊富なＧＡＢＡＡ受容体サブタイプであり、脳内の全てのＧＡＢＡＡ受容体のほぼ半分に相当すると考えられている。
【０００７】
２つの他の主要群は、α２βγ２及びα３βγ２／３サブタイプである。これらは共に、全ＧＡＢＡＡ受容体レパートリーのさらなる約３５％を構成する。ＢＺ２サブタイプはまた、いくつかのα５−含有サブタイプアセンブリを含み得るが、前記の組み合わせは、放射性リガンド結合により前に定義されるＢＺ２サブタイプと薬理学的に同等であるように見える。これらのサブタイプの生理学的役割は、十分な選択的アゴニスト又はアンタゴニストが知られていなかったことからこれまで不明確であった。
【０００８】
現在、α１βγ２、α２βγ２、又はα３βγ２サブタイプにおいてＢＺアゴニストとして作用する薬剤は、所望の抗不安特性を有すると考えられている。ＢＺアゴニストとして作用することによってＧＡＢＡＡ受容体のベンゾジアゼピン結合領域の調節剤となる化合物は、以下で「ＧＡＢＡＡ受容体アゴニスト」と称される。α１選択的ＧＡＢＡＡ受容体アゴニストであるアルピデム及びゾルピデムは、臨床的に睡眠薬として処方されるが、このことは、ＢＺ１結合領域で作用する既知の抗不安薬に関連する少なくともいくらかの鎮静作用が、α１サブユニットを含むＧＡＢＡＡ受容体を通して媒介されることを示唆している。従って、α１よりもα２及び／又はα３サブユニットと有利に相互作用するＧＡＢＡＡ受容体アゴニストが、鎮静作用を引き起こす傾向を低減した不安の治療において効果的であると考えられている。また、α１においてアンタゴニスト又は逆アゴニストである薬剤は、α１アゴニストにより引き起こされる鎮静作用又は催眠作用を改善するために使用されてもよい。
【０００９】
本発明の化合物は、ＧＡＢＡＡ受容体に対する選択的リガンドであり、それ故に中枢神経系のさまざまな障害の治療及び／又は予防において使用される。該障害は、広場恐怖症を伴うか又は伴わないパニック障害、パニック障害の病歴がない広場恐怖症、社会恐怖症を含む動物及びその他の恐怖症、強迫性障害、外傷後及び急性ストレス障害を含むストレス障害、及び全般性又は物質誘発性不安障害といった不安の障害；ノイローゼ；痙攣；片頭痛；例えば一時性の発作又は再発性の大鬱病性障害、気分変調性障害、双極性Ｉ及び双極性ＩＩの躁病、及び気分循環性障害といった抑鬱又は躁鬱病；統合失調症を含む精神障害；脳虚血により起こる神経変性；注意欠陥多動性障害；吃音を含む言語障害；及び、例えば時差又は交代制の仕事の影響に苦しむ対象における日周期の障害を含む。
【００１０】
ＧＡＢＡＡ受容体に対する選択的リガンドが利益をもたらし得るさらなる疾患は、苦痛及び痛覚；特に、化学療法又は放射線療法及び乗り物酔いにより誘発される嘔吐、及び術後の嘔気及び嘔吐である、急性の、遅延型の、及び予期的な嘔吐を含む嘔吐；拒食症及び多食症を含む摂食障害；月経前症候群；例えば下半身不随の患者における筋肉の痙攣又は痙縮；耳鳴り及び加齢に伴う聴覚障害を含む聴覚障害；尿失禁；及び、アルコール離脱を含む薬物乱用及び依存の影響を含む。ＧＡＢＡＡ受容体に対する選択的リガンドは、また、麻酔又は胃部の内視鏡検査を含む内視鏡検査といった軽微な処置の前の前薬物療法としても有効である。
【００１１】
さらに、本発明の化合物は、ヒトＧＡＢＡＡ受容体に結合する能力を持つ化合物の検出のためのアッセイにおける放射性リガンドとして使用できる。
【００１２】
ＷＯ９８／０４５５９には、不安及び痙攣を含む神経疾患の治療及び／又は予防に有益なＧＡＢＡＡ受容体に対する選択的リガンドである置換及び７，８環縮合の［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ｂ］ピリダジン誘導体のクラスが記載されている。
【発明の開示】
【００１３】
本発明は、さまざまなＧＡＢＡＡ受容体サブタイプにおいて所望の結合特性を有する、特定のトリアゾロ−ピリダジン誘導体及び薬学的に許容できるその塩を提供するものである。本発明の化合物は、ヒトＧＡＢＡＡ受容体のα２及び／又はα３サブユニットに対するリガンドとして良好な親和性を持つ。本発明の化合物は、α１サブユニットよりもα２及び／又はα３サブユニットと良好に相互作用する。実際、本発明の化合物は、α１サブユニットと比較してα２及び／又はα３サブユニットに対して選択的な有効性を持つという点で機能的選択性を示すものである。
【００１４】
本発明の化合物は、１ｎＭより低い、以下に記載のアッセイで測定されるα２及び／又はα３サブユニットに対する結合親和性（Ｋｉ）を持つＧＡＢＡＡ受容体サブタイプリガンドである。
【００１５】
さらに、本発明の化合物は、α１サブユニットと比較してα２及び／又はα３サブユニットに対して選択的な有効性を持つという点で機能的選択性を示す。さらに、本発明の化合物は、改善された経口での生物学的利用能において顕著である興味深い薬物動態学的特性を有する。
【００１６】
本発明は、式Ｉ
【００１７】
【化１】
2005507391.tif 000003
の、７−ｔｅｒｔ−ブチル−３−（２−フルオロフェニル）−６−（２Ｈ−［１，２，４］トリアゾール−３−イルメトキシ）−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ｂ］ピリダジン又は薬学的に許容できるその塩を提供するものである。
【００１８】
本発明はまた、単離された形態である前記式Ｉの７−ｔｅｒｔ−ブチル−３−（２−フルオロフェニル）−６−（２Ｈ−［１，２，４］トリアゾール−３−イルメトキシ）−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ｂ］ピリダジン又は薬学的に許容できるその塩を提供するものである。
【００１９】
本発明の化合物は、ＷＯ９８／０４５５９の包括的な範囲内に含まれる。しかしながら、その中には、前記式Ｉの化合物又は薬学的に許容できるその塩についての具体的な開示はない。
【００２０】
医薬用途において、前記式Ｉの化合物の塩は、薬学的に許容できる塩である。しかしながら、その他の塩は、式Ｉの化合物又は薬学的に許容できるその塩の調製に使用できるものであってもよい。適切な薬学的に許容できる式Ｉの化合物の塩は、例えば、式Ｉの化合物の溶液と、塩酸、硫酸、メタンスルホン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酢酸、安息香酸、シュウ酸、クエン酸、酒石酸、炭酸、もしくはリン酸のような薬学的に許容できる酸の溶液を混合することにより形成され得る酸添加塩を含む。
【００２１】
本発明はまた、治療を必要とする患者に有効量の前記式Ｉの化合物又は薬学的に許容できるその塩を投与することを含む、不安の治療及び／又は予防の方法を提供するものである。
【００２２】
さらに本発明は、治療を必要とする患者に有効量の前記式Ｉの化合物又は薬学的に許容できるその塩を投与することを含む、（例えばてんかん又は関連する疾患の患者における）痙攣の治療及び／又は予防の方法を提供するものである。
【００２３】
ヒトＧＡＢＡＡ受容体のα３サブユニットに対する本発明の化合物の結合親和性（Ｋｉ）は、以下に記載のアッセイにより有利に測定される。本発明の化合物のα３サブユニット結合親和性（Ｋｉ）は、１ｎＭより低い。
【００２４】
本発明の化合物は、ヒトＧＡＢＡＡ受容体のα１サブユニットを発現する安定に核酸導入された組み換え細胞系において導き出されるＧＡＢＡ  ＥＣ２０応答の増強作用と比較して、ヒトＧＡＢＡＡ受容体のα３サブユニットを発現する安定に核酸導入された組み換え細胞系におけるＧＡＢＡ  ＥＣ２０応答の増強作用を選択的に導き出す。
【００２５】
ヒトＧＡＢＡＡ受容体のα３及びα１サブユニットを発現する安定に核酸導入された細胞系におけるＧＡＢＡ  ＥＣ２０応答の増強作用は、Ｗａｆｆｏｒｄ等，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９６，５０，６７０−６７８に記載されたプロトコルに類似の手順によって有利に測定することができる。本手順は、安定に核酸導入された真核細胞、典型的には安定に核酸導入されたマウスＬｔｋ−繊維芽細胞の株を用いて適切に行われる。
【００２６】
本発明の化合物は、高付加迷路における正の応答及び飲水試験の条件付け抑制により示される抗不安作用を示す（Ｄａｗｓｏｎ等．，Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１９９５，１２１，１０９−１１７を参照）。さらに、応答感受性（鎖引き（ｃｈａｉｎ−ｐｕｌｌｉｎｇ））試験から得られる適切な結果によって確認されるように、本発明の化合物は、実質的に鎮静作用がない（Ｂａｙｌｅｙ等．，Ｊ．Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９６，１０，２０６−２１３を参照）。
【００２７】
本発明の化合物はまた、抗痙攣作用を示し得る。このことは、以下のＢｒｉｓｔｏｗ等．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７９，４９２−５０１に記載されたものと類似のプロトコルに従って、ラット及びマウスにおけるペンチレンテトラゾール誘導性の発作を阻害する能力により示され得る。
【００２８】
本発明の化合物は、有利に、経口経路での投与によって有益な治療効果を発揮する能力を持つ。
【００２９】
本発明はまた、１又は２以上の本発明の化合物と薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物を提供するものである。好ましくは、これらの組成物は、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末剤、顆粒剤、無菌の非経口の溶液もしくは懸濁液剤、定量エアゾールもしくは液体スプレー、点滴剤、アンプル剤、自動注入装置、又は坐剤といった単位投与形態であって、経口、非経口、経鼻、舌下もしくは直腸投与、又は、吸入もしくは吹き入れによる投与のためのものである。錠剤のような固形の組成物の調製において、活性主成分は、例えばトウモロコシデンプン、乳糖、ショ糖、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム、及びガムなどの従来の錠剤化成分のような薬学的担体、及び、例えば水などの他の薬学的希釈剤と混合されて、本発明の化合物又は薬学的に許容できるその塩の均質混合物を含む固形の予備処方組成物を形成する。
【００３０】
この予備処方組成物が均質であるという場合、活性成分が組成物中に均一に分散しており、それにより組成物を、同等な効果を持つ錠剤、丸剤及びカプセル剤といった単位投与形態に容易に分割できることを意味する。この固形の予備処方組成物は、その後、０．１から約５００ｍｇの本発明の活性成分を含む前記の種類の単一投与形態に分割される。典型的な単位投与形態は、１から１００ｍｇ、例えば１、２、５、１０、２５、５０、又は１００ｍｇの活性成分を含む。本新規組成物の錠剤又は丸剤は、持続性の作用という利点を持つ投与形態を提供するために、被覆されるかさもなければ調合されてもよい。例えば、錠剤又は丸剤は、後者が前者を覆うエンベロープの形態である、内部の製剤成分及び外部の製剤成分を含んでいてもよい。２つの成分は、胃での崩壊を抑制する役割を果たす及び、内部の成分を損なわずに十二指腸内を通過させるかもしくは放出を遅延させることを可能にする腸溶層により分離されていてもよい。さまざまな原料が前記の腸溶層又はコーティングとして使用することができ、該原料は、例えばシェラック、セチルアルコール、及びセルロースアセテートといった原料と共にいくつかの高分子酸及び高分子酸の混合物を含むものである。
【００３１】
本発明の新規組成物が経口もしくは注入の投与用として組み込まれてもよい液体形態は、水溶液、適切に風味付けされたシロップ、水性又は油性の懸濁液、及び例えば綿実油、ゴマ油、ココナッツ油又はピーナッツ油といった食用油を含む風味付けされた乳剤、及びエリキシル剤、及び同様の医薬ビヒクルを含む。水性の懸濁液剤における適切な分散化剤又は懸濁化剤は、トラガカントガム、アラビアガム、アルギン酸塩、デキストラン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、又はゼラチンといった合成又は天然のガムを含む。
【００３２】
不安の治療において、適切な投与量レベルは、１日あたり約０．０１から２５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１日あたり約０．０５から１００ｍｇ／ｋｇ、及び、特に１日あたり約０．０５から５ｍｇ／ｋｇである。本化合物は、１日あたり１から４回の投与計画で投与されてもよい。
【００３３】
前記式Ｉの化合物は、式ＩＩＩの化合物と式ＩＶの化合物：
【００３４】
【化２】
2005507391.tif 000004
（式中、Ｌ１は適切な離脱基を表し、及び、ＲＰはアミノ保護基を表す。）を反応させて、その後アミノ保護基ＲＰを除去することを含む方法によって調製されてもよい。
【００３５】
離脱基Ｌ１は、典型的にはハロゲン原子であり、特に塩素である。
【００３６】
アミノ保護基ＲＰは、適切には２−（トリメチルシラニル）エトキシメチルを含み、この場合、アミノ保護基ＲＰの除去は、エタノールのような低級アルコール中で塩酸のような無機酸を用いて処理することにより有利に行われ得る。
【００３７】
化合物ＩＩＩとＩＶの反応は、塩基の存在下で、適切な溶媒中で反応物質を攪拌することにより有利に行われる。典型的には、溶媒は、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドであり、塩基は、リチウムヘキサメチルジシラジドのような強塩基である。
【００３８】
他の手順において、前記式Ｉの化合物は、式Ｖの化合物（又はその［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ｂ］ピリダジン−６−オン互変異性体）と式ＶＩＩの化合物：
【００３９】
【化３】
2005507391.tif 000005
（式中、ＲＰは前に定義するものであり、及びＬ２は適切な離脱基を表すものである。）を反応させて、その後アミノ保護基ＲＰを除去することを含む方法によって調製されてもよい。
【００４０】
離脱基Ｌ２は、適切にはハロゲン原子であり、典型的には塩素又は臭素である。
【００４１】
化合物ＶとＶＩの反応は、水素化ナトリウムのような強塩基の存在下で、典型的にはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドである適切な溶媒中で、反応物質を攪拌することにより有利に行われる。
【００４２】
前記式Ｖの中間体は、前記式ＩＩＩの化合物と例えば水酸化ナトリウムのようなアルカリ金属水酸化物を反応させることにより、有利に調製されてもよい。反応は、１，４−ジオキサンの水溶液のような不活性溶媒中で、理想的には溶媒の還流温度で有利に行われる。
【００４３】
さらなる手順において、前記式Ｉの化合物は、硝酸銀及び過硫酸アンモニウムの存在下で、トリメチル酢酸と式ＶＩＩの化合物：
【００４４】
【化４】
2005507391.tif 000006
（式中、ＲＰは前に定義するものである。）を反応させて、その後アミノ保護基ＲＰを除去することを含む方法によって調製されてもよい。
【００４５】
反応は、例えば水又はアセトニトリルの水溶液のような適切な溶媒中で、場合によって例えばトリフルオロ酢酸又は硫酸を用いた酸性条件下で、典型的には高温で有利に行われる。
【００４６】
またさらなる手順において、前記式Ｉの化合物は、遷移金属触媒の存在下で、式ＶＩＩＩの化合物と式ＩＸの化合物：
【００４７】
【化５】
2005507391.tif 000007
［式中、ＲＰは前に定義するものであり、Ｍは、−Ｂ（ＯＨ）２又は−Ｓｎ（Ａｌｋ）３
（ＡｌｋはＣ１−６アルキル基、典型的にはｎ−ブチルを表す。）を表すものであり、及び、Ｌ３は適切な離脱基を表すものである。］を反応させて、その後アミノ保護基ＲＰを除去することを含む方法により調製されてもよい。
【００４８】
離脱基Ｌ３は、適切には例えば臭素のようなハロゲン原子である。
【００４９】
化合物ＶＩＩＩとＩＸの反応に使用される適切な遷移金属触媒は、ジクロロビス（トリフェニルホスフィン）−パラジウム（ＩＩ）又はテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）を含む。
【００５０】
化合物ＶＩＩＩとＩＸの反応は、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドのような不活性溶媒中で、典型的には高温で有利に行われる。
【００５１】
式ＶＩＩＩの中間体は、前に定義される式ＩＶの化合物と式Ｘの化合物：
【００５２】
【化６】
2005507391.tif 000008
（式中、Ｌ１及びＬ３は前に定義されるものである）を、化合物ＩＩＩとＩＶの反応について前に記載したものと類似の条件下で反応させることにより調製されてもよい。
【００５３】
前記式ＩＩＩの中間体は、ＷＯ９８／０４５５９及びＷＯ００／４７５８２に記載の手順、又はこれに類似の方法によって調製されてもよい。
【００５４】
前記式ＩＶ、ＶＩ、ＶＩＩ及びＸの典型的な中間体は、ＷＯ９８／０４５５９に記載の手順、又はこれに類似の方法によって調製されてもよい。
【００５５】
商業的に入手できない場合、式ＩＸの出発原料は、当該技術分野において周知の標準的な方法を用いて調製されてもよい。
【００５６】
以下の実施例は、本発明の化合物の調製を説明するものである。
【００５７】
本発明の化合物は、Ｌｔｋ細胞において安定に発現されたα２又はα３サブユニットを含むヒトＧＡＢＡＡ受容体のベンゾジアゼピン結合領域への［３Ｈ］−フルマゼニルの結合を強力に阻害する。
【００５８】
試薬
・リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）
・アッセイ緩衝剤：１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１００ｍＭ  ＫＣｌ、室温でｐＨ７．４
・アッセイ緩衝剤中の［３Ｈ］−フルマゼニル（α１β３γ２細胞に対して１８ｎＭ；α２β３γ２細胞に対して１８ｎＭ；α３β３γ２細胞に対して１０ｎＭ）
・アッセイ緩衝剤中のフルニトラゼパム  １００μＭ
・アッセイ緩衝剤中に再懸濁させた細胞（１トレー１０ｍｌ）
【００５９】
細胞収穫
細胞から上清を除去する。ＰＢＳ（約２０ｍｌ）を添加する。細胞をばらばらにして、５０ｍｌの遠心分離管内に置く。さらに１０ｍｌのＰＢＳを用いて前記手順を繰り返し、ほとんどの細胞を確実に除去する。細胞を、ベンチトップ遠心分離機を用いて３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離することによってペレット化して、その後、所望であれば凍結する。ペレットを、細胞のトレー（２５ｃｍ×２５ｃｍ）あたり１０ｍｌの緩衝剤中に再懸濁させる。
【００６０】
アッセイ
深型の９６穴プレート又は試験管内で行うことができる。各々の試験管は、
・３００μｌのアッセイ緩衝剤
・５０μｌの［３Ｈ］−フルマゼニル（α１β３γ２に対して１．８ｎＭ；α２β３γ２に対して１．８ｎＭ；α３β３γ２に対して１．０ｎＭの最終濃度）
・化合物（全量）を１０％ＤＭＳＯに溶解させる場合は、５０μｌの緩衝剤又は溶剤担体（例えば１０％ＤＭＳＯ）；１０μＭの最終濃度の試験化合物又はフルニトラゼパム（非特異的結合を測定するための）
・１００μｌの細胞
を含む。
【００６１】
アッセイを４０℃で１時間インキュベートして行い、その後、ＧＦ／Ｂフィルター上のトムテック又はブランデル細胞収穫機のいずれかを用いて濾過して、その後、氷冷したアッセイ緩衝剤を用いて３×３ｍｌで洗浄する。フィルターを乾燥して、液体シンチレーションカウンターを用いて数を数える。全結合に対する期待値は、液体シンチレーションカウンターを用いた場合は、全カウントとして３０００〜４０００ｄｐｍであり、非特異的結合として２００ｄｐｍより少ない、又は、メルチレックス固体シンチラントを用いて数を数えた場合は、全カウントとして１５００〜２０００ｄｐｍであり、非特異的結合として２００ｄｐｍより少ない。結合パラメーターは、それぞれの試験化合物について阻害定数Ｋｉを計算することが可能な非線形最小二乗回帰解析によって決定される。
【００６２】
実施例に付随する化合物は、前記のアッセイにおいて試験されて、１ｎＭより少ないヒトＧＡＢＡＡ受容体のα２及び／又はα３サブユニットからの［３Ｈ］−フルマゼニルの置換におけるＫｉ値を持つことが見出された。
【実施例１】
【００６３】
７−ｔｅｒｔ−ブチル−３−（２−フルオロフェニル）−６−（２Ｈ−［１，２，４］トリアゾール−３−イルメトキシ）−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ｂ］ピリダジン
ａ）７−ｔｅｒｔ−ブチル−３−（２−フルオロフェニル）−６−［２−（２−（トリメチルシラニル）エトキシメチル）−２Ｈ−［１，２，４］トリアゾール−３−イルメトキシ］−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ｂ］ピリダジン
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１５ｍｌ）中の、［２−（２−（トリメチルシラニル）エトキシメチル）−２Ｈ−［１，２，４］トリアゾール−３−イル］メタノール（１８０ｍｇ、０．７９ｍＭ、ＷＯ９８／０４５５９）及び７−ｔｅｒｔ−ブチル−６−クロロ−３−（２−フルオロフェニル）−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ｂ］ピリダジン（２００ｍｇ、０．６６ｍＭ、ＷＯ００／４７５８２）の溶液に、リチウムヘキサメチルジシラジドの溶液（０．７２ｍｌの１ｍＭテトラヒドロフラン溶液）を添加して、反応混合物を１時間攪拌した。溶液が濁るまで水を添加して、３０分後に、固体を濾過により回収した。固体を水洗し、ジクロロメタン中に溶解し、（ＭｇＳＯ４で）乾燥し、濾過及び蒸留して、所望の生成物（２５０ｍｇ）を得た。
【００６４】
【化７】
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【００６５】
ｂ）７−ｔｅｒｔ−ブチル−３−（２−フルオロフェニル）−６−（２Ｈ−［１，２，４］トリアゾール−３−イルメトキシ）−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ｂ］ピリダジン
エタノール（５ｍｌ）中の、７−ｔｅｒｔ−ブチル−３−（２−フルオロフェニル）−６−［２−（２−（トリメチルシラニル）エトキシメチル）−２Ｈ−［１，２，４］トリアゾール−３−イルメトキシ］−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ｂ］ピリダジン（２００ｍｇ、０．４０ｍＭ）の溶液に、塩酸（２ｍＭの１ｍｌ）を添加して、反応混合物を６０℃に５時間加熱した。冷却後、固体の炭酸カリウムを、溶液がｐＨ１０になるまでゆっくりと添加した。溶液を１８時間静置して、生成物を濾過により回収した。生成物を水洗し、ジクロロメタン及び酢酸エチルの混合物から再結晶化して、所望の生成物（８２ｍｇ）を得た。
【００６６】
【化８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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