(57)【要約】本発明は、タンパク質キナーゼおよび／またはタンパク質ホスファターゼの阻害剤を同定する方法を提供する。タンパク質キナーゼ活性および／またはタンパク質ホスファターゼ活性を阻害する方法もまた提供する。特異的非ペプチドタンパク質チロシンキナーゼおよび／またはタンパク質ホスファターゼ阻害剤を提供する。本発明のタンパク質キナーゼ阻害剤またはタンパク質ホスファターゼ阻害剤は、癌、乾癬、関節硬化症、免疫系活性、糖尿病、または肥満を含む患者の、多くの状態の治療に使用してもよい。さらに、本発明は、被験者における聴覚損失を防御または治療する方法も提供する。この方法は、有効量のタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤を被験者に投与して、聴覚損失防御または治療する段階を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式を有する非ペプチドタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤またはタンパク質ホスファターゼ阻害剤：
2005514339.tif 000229
（式中、
Xはハロゲンであり；
R1からR6は同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、ヘテロ環式化合物、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキルからなる群より選択され；
ここで、Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキルからなる群より選択される；または
R5およびR6は共にヘテロ環式化合物を形成し；かつ
R1からR6およびRaからRcのいずれかは置換されているかまたは置換されていない）
【請求項２】
R5またはR6の少なくとも一方が下記式である、請求項1記載の非ペプチド阻害剤：
2005514339.tif 000230
（式中、
R7*は付着点であり、かつ(CH2)x（Xは0〜10である）、CH2CHOH、CH(CH3)R、またはCH(CH3)Sであり、R8からR12はそれぞれ同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、ヘテロ環式化合物、および、分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキルからなる群より選択され、
ここで、Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキルからなる群より選択され；かつ
R8からR12およびRaからRcのいずれかは置換されているかまたは置換されていない）
【請求項３】
R5またはR6の少なくとも一方が下記式である、請求項1記載の非ペプチド阻害剤：
2005514339.tif 000231
（式中、アステリスクは窒素への付着点を示す）
【請求項４】
Xがフッ素である、請求項1記載の非ペプチド阻害剤。
【請求項５】
pp60c-srcチロシンキナーゼの活性を阻害する、請求項1記載の非ペプチド阻害剤。
【請求項６】
タンパク質チロシンホスファターゼ1Bの活性を阻害する、請求項1記載の非ペプチド阻害剤。
【請求項７】
上皮増殖因子受容体チロシンキナーゼの活性を阻害する、請求項1記載の非ペプチド阻害剤。
【請求項８】
p56 lckチロシンキナーゼの活性を阻害する、請求項1記載の非ペプチド阻害剤。
【請求項９】
p55 fynチロシンキナーゼの活性を阻害する、請求項1記載の非ペプチド阻害剤。
【請求項１０】
下記式を有する非ペプチドタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤またはタンパク質ホスファターゼ阻害剤：
2005514339.tif 000232
（式中、Xはハロゲンであり、R1はHであり、R2は、
2005514339.tif 000233
であり、R3はHであり、かつR4はHである）
【請求項１１】
Xがフッ素である、請求項10記載の非ペプチド阻害剤。
【請求項１２】
pp60c-srcチロシンキナーゼの活性を阻害する、請求項10記載の非ペプチド阻害剤。
【請求項１３】
タンパク質チロシンホスファターゼ1Bの活性を阻害する、請求項10記載の非ペプチド阻害剤。
【請求項１４】
上皮増殖因子受容体チロシンキナーゼの活性を阻害する、請求項10記載の非ペプチド阻害剤。
【請求項１５】
p56 lckチロシンキナーゼの活性を阻害する、請求項10記載の非ペプチド阻害剤。
【請求項１６】
p55 fynチロシンキナーゼの活性を阻害する、請求項10記載の非ペプチド阻害剤。
【請求項１７】
以下の段階を含む、タンパク質キナーゼ阻害剤を同定する方法：
タンパク質キナーゼの触媒残基にそれぞれ共有結合的にまたは非共有結合的に結合できる1つまたは複数の官能基を有する少なくとも1つの第一モジュールを提供する段階であって、1つまたは複数の官能基の少なくとも1つはハロゲンである段階；
少なくとも1つの第一モジュールと非ペプチド骨格を提供する少なくとも1つの第二モジュールとを組み合わせて、第一および第二モジュールの1つまたは複数の組合せを形成する段階；
タンパク質キナーゼ阻害について、第一および第二のモジュールの1つまたは複数の組合せをスクリーニングする段階；ならびに
タンパク質キナーゼ活性を阻害する第一および第二のモジュールの組合せを選択する段階。
【請求項１８】
少なくとも1つの第一モジュールを提供する段階が以下の段階を含む、請求項17記載の方法：
少なくとも1つの第一モジュールをペプチド骨格に付着させる段階；
タンパク質キナーゼの触媒残基に優先的に結合する第一モジュール上の1つまたは複数の官能基を同定する段階であって、少なくとも1つの第一モジュールを少なくとも1つの第二モジュールと組み合わせる段階が、ペプチド骨格を少なくとも1つの第二モジュールで置換する段階を含む方法。
【請求項１９】
ハロゲンがフッ素である、請求項17記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも1つの第一モジュールが2つ以上の官能基を含む、請求項17記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも1つの第一モジュールが、ボロン酸、ヒドロキシル基、ホスホン酸、スルファミン酸、グアジニノ基、カルボン酸、アルデヒド、アミド、およびヒドロキシメチルホスホン酸からなる群より選択される官能基を含む、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも1つの第一モジュールがボロン酸基を含む、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも1つの第一モジュールがヒドロキシル基を含む、請求項21記載の方法。
【請求項２４】
少なくとも1つの第一モジュールがアミド基を含む、請求項21記載の方法。
【請求項２５】
アミド基が隣接するトリカルボニルアミドである、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
少なくとも1つの第二モジュールが、インドール、ナフタレン、ビフェニル、イソキノリン、ベンゾフラン、およびベンゾチオフェンからなる群より選択される、請求項17記載の方法。
【請求項２７】
少なくとも1つの第二モジュールがインドールを含む、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも1つの第二モジュールがナフタレンを含む、請求項26記載の方法。
【請求項２９】
少なくとも1つの第一モジュールが、少なくとも1つの第一モジュールを少なくとも1つの第二モジュールに連結している1個から3個の炭素原子を含む直鎖をさらに含む、請求項17記載の方法。
【請求項３０】
直鎖中の炭素原子の1つが、窒素原子、酸素原子、または硫黄原子で置換されている、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
タンパク質キナーゼはタンパク質チロシンキナーゼである、請求項17記載の方法。
【請求項３２】
タンパク質チロシンキナーゼが、pp60c-src、p56lck、p55fyn、ZAPキナーゼ、血小板由来増殖因子受容体チロシンキナーゼ、Bcr-Abl、VEGF受容体チロシンキナーゼ、上皮増殖因子受容体チロシンキナーゼ、および上皮増殖因子受容体様チロシンキナーゼからなる群より選択される、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
タンパク質チロシンキナーゼがpp60c-srcである、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
タンパク質キナーゼがタンパク質セリンキナーゼである、請求項17記載の方法。
【請求項３５】
タンパク質セリンキナーゼが、MAPキナーゼ、プロテインキナーゼC、およびCDKキナーゼからなる群より選択される、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
1つまたは複数の特異性側鎖要素を、第一および第二のモジュールの1つまたは複数の組合せに付着させる段階をさらに含む、請求項17記載の方法。
【請求項３７】
以下の段階を含む、改善されたタンパク質キナーゼ阻害剤を同定する方法：
請求項17記載の方法に従って作製した第一阻害剤を提供する段階；
少なくとも1つの第一モジュール、特異性側鎖要素、または第一阻害剤のそれらの組合せを改変する段階；
改変されていない第一阻害剤と比べてタンパク質キナーゼ活性を阻害する能力の増加している改変された阻害剤を同定する段階。
【請求項３８】
タンパク質キナーゼ阻害剤はタンパク質キナーゼ活性を阻害するが、タンパク質キナーゼへのATPの結合は阻害しない、請求項17記載の方法。
【請求項３９】
以下の段階を含む、タンパク質キナーゼ活性を阻害する能力について化合物を試験する方法：
請求項17記載の方法に従ってタンパク質キナーゼ阻害剤を提供する段階；
タンパク質キナーゼを発現する細胞に見出されるのと同じ温度、pH、イオン強度、モル浸透圧濃度、および遊離マグネシウム濃度で、阻害剤の存在下で、タンパク質キナーゼの活性を測定する段階；ならびに
タンパク質キナーゼ活性を、阻害剤の非存在下のタンパク質キナーゼの活性と比較する段階。
【請求項４０】
下記の段階を含む、タンパク質キナーゼを阻害する方法：
タンパク質キナーゼの触媒残基にそれぞれ共有結合的にまたは非共有結合的に結合できる1つまたは複数の官能基を有する少なくとも1つの第一モジュール（1つまたは複数の官能基はハロゲンを含む）と非ペプチド骨格を提供する第二モジュールとを含む化合物に、タンパク質キナーゼを接触させる段階であって、少なくとも1つの第一モジュールと第二モジュールとの組合せがタンパク質キナーゼの活性を阻害する段階。
【請求項４１】
ハロゲンがフッ素である、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
第一モジュールが2つ以上の官能基を含む、請求項40記載の方法。
【請求項４３】
第一モジュールが、ボロン酸、ヒドロキシ、ホスホン酸、スルファミン酸、グアニジノ基、カルボン酸、アルデヒド、アミド、およびヒドロキシメチルホスホン酸からなる群より選択された官能基を含む、請求項42記載の方法。
【請求項４４】
第一モジュールがボロン酸基を含む、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
第一モジュールがヒドロキシル基を含む、請求項43記載の方法。
【請求項４６】
第二モジュールが、インドール、ナフタレン、ビフェニル、イソキノリン、ベンゾフラン、およびベンゾチオフェンからなる群より選択される、請求項40記載の方法。
【請求項４７】
第二モジュールがインドールを含む、請求項46記載の方法。
【請求項４８】
第二モジュールがナフタレンを含む、請求項46記載の方法。
【請求項４９】
1個から3個の炭素原子を含む直鎖が第一モジュールを第二モジュールに連結している、請求項40記載の方法。
【請求項５０】
直鎖中の炭素原子の1つが、窒素原子、酸素原子、または硫黄原子で置換されている、請求項49記載の方法。
【請求項５１】
タンパク質キナーゼがタンパク質チロシンキナーゼである、請求項40記載の方法。
【請求項５２】
タンパク質チロシンキナーゼが、pp60c-src、p56lck、p55fyn、ZAPキナーゼ、血小板由来増殖因子受容体チロシンキナーゼ、Bcr-Abl、VEGF受容体チロシンキナーゼ、上皮増殖因子受容体チロシンキナーゼ、および上皮増殖因子受容体様チロシンキナーゼからなる群より選択される、請求項51記載の方法。
【請求項５３】
タンパク質チロシンキナーゼがpp60c-srcである、請求項52記載の方法。
【請求項５４】
化合物が下記式を有する、請求項53記載の方法：
2005514339.tif 000234
（式中、
Xはハロゲンであり；
R1からR6は同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、ヘテロ環式化合物、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキルからなる群より選択され、
ここで、Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキルからなる群より選択されるか；または
R5およびR6は共にヘテロ環式化合物を形成し；かつ
R1からR6およびRaからRcのいずれかは置換されているかまたは置換されていない）
【請求項５５】
R5またはR6の少なくとも一方が下記式である、請求項54記載の方法：
2005514339.tif 000235
（式中、
R7*は付着点であり、かつ(CH2)x（Xは0〜10である）、CH2CHOH、CH(CH3)R、またはCH(CH3)Sであり、R8からR12はそれぞれ同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、ヘテロ環式化合物、および、分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキルからなる群より選択され、
ここで、Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキルからなる群より選択され；かつ
R8からR12およびRaからRcのいずれかは置換されているかまたは置換されていない）
【請求項５６】
R5またはR6の少なくとも一方が下記式である、請求項54記載の方法：
2005514339.tif 000236
（式中、アステリスクは窒素への付着点を示す）
【請求項５７】
Xがフッ素である、請求項54記載の方法。
【請求項５８】
化合物が下記式を有する、請求項53記載の方法：
2005514339.tif 000237
（式中、Xはハロゲンであり、R1はHであり、R2は、
2005514339.tif 000238
であり、R3はHであり、かつR4はHである）
【請求項５９】
Xがフッ素である、請求項58記載の方法。
【請求項６０】
タンパク質キナーゼがタンパク質セリンキナーゼである、請求項40記載の方法。
【請求項６１】
タンパク質セリンキナーゼが、MAPキナーゼ、プロテインキナーゼC、およびCDKキナーゼからなる群より選択される、請求項60記載の方法。
【請求項６２】
化合物が、少なくとも1つの第一モジュールと第二モジュールとの組合せに付着した1つまたは複数の特異性側鎖要素をさらに含む、請求項40記載の方法。
【請求項６３】
下記の段階を含む、被験者においてタンパク質キナーゼ阻害剤に応答性である状態を治療する方法：
有効量のタンパク質キナーゼ阻害剤を被験者に投与する段階であって、タンパク質キナーゼ阻害剤が、タンパク質キナーゼの触媒残基にそれぞれ共有結合的にまたは非共有結合的に結合できる1つまたは複数の官能基を有する少なくとも1つの第一モジュール（1つまたは複数の官能基はハロゲンを含む）と非ペプチド骨格を提供する第二モジュールとを含み、少なくとも1つの第一モジュールと第二モジュールとの組合せがタンパク質キナーゼ活性を阻害する段階。
【請求項６４】
状態は、癌、乾癬、関節硬化症、または免疫系活性からなる群より選択される、請求項63記載の方法。
【請求項６５】
ハロゲンがフッ素である、請求項63記載の方法。
【請求項６６】
第一モジュールが2つ以上の官能基を含む、請求項63記載の方法。
【請求項６７】
第一モジュールが、ボロン酸、ヒドロキシ、ホスホン酸、スルファミン酸、グアニジノ基、カルボン酸、アルデヒド、アミド、およびヒドロキシメチルホスホン酸からなる群より選択される官能基を含む、請求項66記載の方法。
【請求項６８】
第一モジュールがボロン酸基を含む、請求項67記載の方法。
【請求項６９】
第一モジュールがヒドロキシル基を含む、請求項67記載の方法。
【請求項７０】
第二モジュールが、インドール、ナフタレン、ビフェニル、イソキノリン、ベンゾフラン、およびベンゾチオフェンからなる群より選択される、請求項63記載の方法。
【請求項７１】
第二モジュールがインドールを含む、請求項70記載の方法。
【請求項７２】
第二モジュールがナフタレンを含む、請求項70記載の方法。
【請求項７３】
1個から3個の炭素原子を含む直鎖が、少なくとも1つの第一モジュールを第二モジュールに連結している、請求項63記載の方法。
【請求項７４】
直鎖中の炭素原子の1つが、窒素原子、酸素原子、または硫黄原子で置換されている、請求項73記載の方法。
【請求項７５】
タンパク質キナーゼがタンパク質チロシンキナーゼである、請求項63記載の方法。
【請求項７６】
タンパク質チロシンキナーゼが、pp60c-src、p56lck、p55fyn、ZAPキナーゼ、血小板由来増殖因子受容体チロシンキナーゼ、Bcr-Abl、VEGF受容体チロシンキナーゼ、上皮増殖因子受容体チロシンキナーゼ、および上皮増殖因子受容体様チロシンキナーゼからなる群より選択される、請求項75記載の方法。
【請求項７７】
タンパク質チロシンキナーゼがpp60c-srcである、請求項76記載の方法。
【請求項７８】
化合物が下記式を有する、請求項77記載の方法：
2005514339.tif 000239
（式中、
Xはハロゲンであり；
R1からR6は同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、ヘテロ環式化合物、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキルからなる群より選択され；
ここで、Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキルからなる群より選択されるか；または
R5およびR6は共にヘテロ環式化合物を形成し；かつ
R1からR6およびRaからRcのいずれかは置換されているかまたは置換されていない）
【請求項７９】
R5またはR6の少なくとも一方が下記式である、請求項78記載の方法：
2005514339.tif 000240
（式中、
R7*は付着点であり、かつ(CH2)x（Xは0〜10である）、CH2CHOH、CH(CH3)R、またはCH(CH3)Sであり、R8からR12はそれぞれ同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、ヘテロ環式化合物、および、分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキルからなる群より選択され、
ここで、Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキルからなる群より選択され；かつ
R8からR12およびRaからRcのいずれかは置換されているかまたは置換されていない）
【請求項８０】
R5またはR6の少なくとも一方が下記式である、請求項78記載の方法：
2005514339.tif 000241
（式中、アステリスクは窒素への付着点を示す）
【請求項８１】
Xがフッ素である、請求項78記載の方法。
【請求項８２】
化合物が下記式を有する、請求項77記載の方法。
2005514339.tif 000242
（式中、Xはハロゲンであり、R1はHであり、R2は
2005514339.tif 000243
であり、R3はHであり、かつR4はHである）
【請求項８３】
Xがフッ素である、請求項82記載の方法。
【請求項８４】
タンパク質キナーゼがタンパク質セリンキナーゼである、請求項63記載の方法。
【請求項８５】
タンパク質セリンキナーゼが、MAPキナーゼ、プロテインキナーゼC、およびCDKキナーゼからなる群より選択される、請求項84記載の方法。
【請求項８６】
化合物が、少なくとも1つの第一モジュールと第二モジュールとの組合せに付着した1つまたは複数の特異性側鎖要素をさらに含む、請求項63記載の方法。
【請求項８７】
下記の段階を含む、タンパク質ホスファターゼの阻害剤を同定する方法：
タンパク質ホスファターゼの触媒残基にそれぞれ共有結合的にまたは非共有結合的に結合できる1つまたは複数の官能基を有する少なくとも1つの第一モジュールを提供する段階；
少なくとも1つの第一モジュールと非ペプチド骨格を提供する少なくとも1つの第二モジュールとを組み合わせて、第一および第二のモジュールの1つまたは複数の組合せを形成する段階；
タンパク質ホスファターゼ阻害について、第一および第二のモジュールの1つまたは複数の組合せをスクリーニングする段階；および
タンパク質ホスファターゼ活性を阻害する第一および第二のモジュールの組合せを選択する段階。
【請求項８８】
少なくとも1つの第一モジュールの提供する段階が下記の段階を含む、請求項87記載の方法：
少なくとも1つの第一モジュールをペプチド骨格に付着させる段階；
タンパク質ホスファターゼの触媒残基に優先的に結合する第一モジュール上の1つまたは複数の官能基を同定する段階であって、
少なくとも1つの第一モジュールと少なくとも1つの第二モジュールを組み合わせる段階が、ペプチド骨格を少なくとも1つの第二モジュールで置換する段階を含む段階。
【請求項８９】
少なくとも1つの第一モジュールが2つ以上の官能基を含む、請求項87記載の方法。
【請求項９０】
少なくとも1つの第一モジュールが、ハロゲン、ボロン酸、ヒドロキシル基、ホスホン酸、スルファミン酸、グアニジノ基、カルボン酸、アルデヒド、アミド、およびヒドロキシメチルホスホン酸からなる群より選択された官能基を含む、請求項87記載の方法。
【請求項９１】
少なくとも1つの第一モジュールがハロゲンを含む、請求項90記載の方法。
【請求項９２】
少なくとも1つの第一モジュールがボロン酸基を含む、請求項90記載の方法。
【請求項９３】
少なくとも1つの第一モジュールがヒドロキシル基を含む、請求項90記載の方法。
【請求項９４】
少なくとも1つの第一モジュールがアミド基を含む、請求項90記載の方法。
【請求項９５】
アミド基が隣接するトリカルボニルアミドである、請求項94記載の方法。
【請求項９６】
少なくとも1つの第二モジュールが、インドール、ナフタレン、ビフェニル、イソキノリン、ベンゾフラン、およびベンゾチオフェンからなる群より選択される、請求項87記載の方法。
【請求項９７】
少なくとも1つの第二モジュールがインドールを含む、請求項96記載の方法。
【請求項９８】
少なくとも1つの第二モジュールがナフタレンを含む、請求項96記載の方法。
【請求項９９】
少なくとも1つの第一モジュールが、少なくとも1つの第一モジュールを少なくとも1つの第二モジュールに連結している1個から3個の炭素原子を含む直鎖をさらに含む、請求項87記載の方法。
【請求項１００】
直鎖中の炭素原子の1つが、窒素原子、酸素原子、または硫黄原子で置換されている、請求項99記載の方法。
【請求項１０１】
タンパク質ホスファターゼが、タンパク質チロシンホスファターゼ1Bである、請求項87記載の方法。
【請求項１０２】
1つまたは複数の特異性側鎖要素を、第一および第二のモジュールの1つまたは複数の組合せに付着させる段階をさらに含む、請求項87記載の方法。
【請求項１０３】
下記の段階を含む、改善されたタンパク質ホスファターゼの阻害剤を同定する方法：
請求項87記載の方法に従って作製した第一阻害剤を提供する段階；
少なくとも1つの第一モジュール、特異性側鎖要素、または第一阻害剤のそれらの組合せを改変する段階；および
改変されていない第一阻害剤と比べてタンパク質ホスファターゼ活性を阻害する能力の増大した改変阻害剤を同定する段階。
【請求項１０４】
下記の段階を含む、タンパク質ホスファターゼ活性を阻害する能力について化合物を試験する方法：
請求項87記載の方法に従ってタンパク質ホスファターゼ阻害剤を提供する段階；
タンパク質ホスファターゼを発現する細胞に見出されるのと同じ温度、pH、イオン強度、モル浸透圧濃度、および遊離マグネシウム濃度で、阻害剤の存在下でタンパク質ホスファターゼ活性を測定する段階；ならびびに
タンパク質ホスファターゼ活性を、阻害剤の非存在下のタンパク質ホスファターゼの活性と比較する段階。
【請求項１０５】
以下の段階を含む、を含む、タンパク質ホスファターゼを阻害する方法：    タンパク質ホスファターゼの触媒残基にそれぞれ共有結合的にまたは非共有結合的に結合できる1つまたは複数の官能基を有する少なくとも1つの第一モジュールと非ペプチド骨格を提供する第二モジュールとを含む化合物に、タンパク質ホスファターゼを接触させる段階であって、少なくとも1つの第一モジュールと第二モジュールとの組合せがタンパク質ホスファターゼの活性を阻害する段階。
【請求項１０６】
第一モジュールが2つ以上の官能基を含む、請求項105記載の方法。
【請求項１０７】
第一モジュールが、ハロゲン、ボロン酸、ヒドロキシ、ホスホン酸、スルファミン酸、グアニジノ基、カルボン酸、アルデヒド、アミド、およびヒドロキシメチルホスホン酸からなる群より選択される官能基を含む、請求項105記載の方法。
【請求項１０８】
第一モジュールがハロゲンを含む、請求項107記載の方法。
【請求項１０９】
第一モジュールがボロン酸基を含む、請求項107記載の方法。
【請求項１１０】
第一モジュールがヒドロキシル基を含む、請求項107記載の方法。
【請求項１１１】
第二モジュールが、インドール、ナフタレン、ビフェニル、イソキノリン、ベンゾフラン、およびベンゾチオフェンからなる群より選択される、請求項105記載の方法。
【請求項１１２】
第二モジュールがインドールを含む、請求項111記載の方法。
【請求項１１３】
第二モジュールがナフタレンを含む、請求項111記載の方法。
【請求項１１４】
1個から3個の炭素原子を含む直鎖が、少なくとも1つの第一モジュールを第二モジュールに連結している、請求項105記載の方法。
【請求項１１５】
直鎖中の炭素原子の1つが、窒素原子、酸素原子、または硫黄原子で置換されている、請求項114記載の方法。
【請求項１１６】
タンパク質ホスファターゼがタンパク質チロシンホスファターゼ1Bである、請求項105記載の方法。
【請求項１１７】
化合物が下記式を有する、請求項105記載の方法：
2005514339.tif 000244
（式中、
R1からR7は同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、ヘテロ環式化合物、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキルからなる群より選択され；
ここで、Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキルからなる群より選択されるか；または
R6およびR7は共にヘテロ環式化合物を形成し；かつ
R1からR7およびRaからRcのいずれかは置換されているかまたは置換されていない）
【請求項１１８】
R3がハロゲンである、請求項117記載の方法。
【請求項１１９】
R3がフッ素である、請求項118記載の方法。
【請求項１２０】
R6またはR7の少なくとも一方が下記式である、請求項117記載の方法：
2005514339.tif 000245
（式中、
R8*は付着点であり、かつ(CH2)x（Xは0〜10である）、CH2CHOH、CH(CH3)R、またはCH(CH3)Sであり、R9からR13はそれぞれ同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、ヘテロ環式化合物、および、分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキルからなる群より選択され、
ここで、Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキルからなる群より選択され；かつ
R9からR13およびRaからRcのいずれかは置換されているかまたは置換されていない）
【請求項１２１】
R6またはR7の少なくとも一方は、下記式である、請求項117記載の方法：
2005514339.tif 000246
（式中、アステリスクは窒素への付着点を示す）
【請求項１２２】
化合物が下記式を有する、請求項105記載の方法：
2005514339.tif 000247
（式中、
R1からR7はそれぞれ同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、ヘテロ環式化合物、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキルからなる群より選択され；
ここで、Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキルからなる群より選択され；
R1からR7およびRaからRcのいずれかは置換されているかまたは置換されておらず；
Xは0または1である）
【請求項１２３】
化合物が、少なくとも1つの第一モジュールと第二モジュールとの組合せに付着した1つまたは複数の特異性側鎖要素をさらに含む、請求項105記載の方法。
【請求項１２４】
下記の段階を含む、被験者においてタンパク質ホスファターゼ阻害剤応答性の状態を治療する方法：
有効量のタンパク質ホスファターゼ阻害剤を被験者に投与する段階であって、タンパク質ホスファターゼ阻害剤が、タンパク質ホスファターゼの触媒残基にそれぞれ共有結合的にまたは非共有結合的に結合できる1つまたは複数の官能基を有する少なくとも1つの第一モジュールと非ペプチド骨格を提供する第二モジュールとを含む段階であり、少なくとも1つの第一モジュールと第二モジュールとの組合せがタンパク質ホスファターゼ活性を阻害する段階。
【請求項１２５】
状態が、癌、II型糖尿病、および肥満からなる群より選択される、請求項124記載の方法。
【請求項１２６】
第一モジュールが2つ以上の官能基を含む、請求項124記載の方法。
【請求項１２７】
第一モジュールが、ボロン酸、ヒドロキシ、ホスホン酸、スルファミン酸、グアニジノ基、カルボン酸、アルデヒド、アミド、およびヒドロキシメチルホスホン酸からなる群より選択される官能基を含む、請求項124記載の方法。
【請求項１２８】
第一モジュールがハロゲンを含む、請求項127記載の方法。
【請求項１２９】
第一モジュールがボロン酸基を含む、請求項127記載の方法。
【請求項１３０】
第一モジュールがヒドロキシル基を含む、請求項127記載の方法。
【請求項１３１】
第二モジュールが、インドール、ナフタレン、ビフェニル、イソキノリン、ベンゾフラン、およびベンゾチオフェンからなる群より選択される、請求項124記載の方法。
【請求項１３２】
第二モジュールがインドールを含む、請求項131記載の方法。
【請求項１３３】
第二モジュールがナフタレンを含む、請求項131記載の方法。
【請求項１３４】
1個から3個の炭素原子を含む直鎖が、少なくとも1つの第一モジュールを第二モジュールに連結している、請求項124記載の方法。
【請求項１３５】
直鎖中の炭素原子の1つが、窒素原子、酸素原子、または硫黄原子で置換されている、請求項134記載の方法。
【請求項１３６】
タンパク質ホスファターゼが、タンパク質チロシンホスファターゼIBである、請求項124記載の方法。
【請求項１３７】
化合物が下記式を有する、請求項124記載の方法：
2005514339.tif 000248
（式中、
R1からR7は同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、ヘテロ環式化合物、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキルからなる群より選択され；
ここで、Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキルからなる群より選択され；または
R6およびR7は共にヘテロ環式化合物を形成し；かつ
R1からR7およびRaからRcのいずれかは置換されているかまたは置換されていない）
【請求項１３８】
R3がハロゲンである、請求項137記載の方法。
【請求項１３９】
R3がフッ素である、請求項138記載の方法。
【請求項１４０】
R6またはR7の少なくとも一方が下記式である、請求項137記載の方法：
2005514339.tif 000249
（式中、
R8*は付着点であり、かつ(CH2)x（Xは0〜10である）、CH2CHOH、CH(CH3)R、またはCH(CH3)Sであり、R9からR13はそれぞれ同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、ヘテロ環式化合物、および、分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキルからなる群より選択され、
ここで、Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキルからなる群より選択され；かつ
R9からR13およびRaからRcのいずれかは置換されているかまたは置換されていない）
【請求項１４１】
R6またはR7の少なくとも一方が下記式である、請求項137記載の方法：
2005514339.tif 000250
（式中、アステリスクは窒素への付着点を示す）
【請求項１４２】
化合物が下記式を有する、請求項124記載の方法：
2005514339.tif 000251
（式中、
R1からR7はそれぞれ同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、ヘテロ環式化合物、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキルからなる群より選択され；
ここで、Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキルからなる群より選択され；
R1からR7およびRaからRcのいずれかは置換されているかまたは置換されておらず；かつ
Xは0または1である）
【請求項１４３】
化合物が、少なくとも1つの第一モジュールと第二モジュールとの組合せに付着した1つまたは複数の特異性側鎖要素をさらに含む、請求項124記載の方法。
【請求項１４４】
化合物が下記式を有する、請求項40記載の方法：
2005514339.tif 000252
（式中、
R1からR8は同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され；
ここで、Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され；かつ
R1からR8およびRaからRcのいずれかは置換されているかまたは置換されておらず；ただし、R1からR8の少なくとも1つはハロゲンである）
【請求項１４５】
化合物が下記式を有する、請求項40記載の方法：
2005514339.tif 000253
（式中、
R1からR7は同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され；
ここで、Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され；かつ
R1からR7およびRaからRcのいずれかは置換されていてもまたは置換されていなくてもよい）
【請求項１４６】
化合物が下記式を有する、請求項40記載の方法：
2005514339.tif 000254
（式中、
R1からR7は同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され；
ここで、Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され；かつ
R1からR7およびRaからRcのいずれかは置換されていてもまたは置換されていなくてもよい）
【請求項１４７】
化合物が下記式を有する、請求項40記載の方法：
2005514339.tif 000255
（式中、
R1からR6は同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され；
ここで、Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され；かつ
R1からR6およびRaからRcのいずれかは置換されていてもまたは置換されていなくてもよい）
【請求項１４８】
化合物が下記式を有する、請求項40記載の方法：
2005514339.tif 000256
（式中、
R1からR6は同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され；
ここで、Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され；かつ
R1からR6およびRaからRcのいずれかは置換されていてもまたは置換されていなくてもよい）
【請求項１４９】
化合物が下記式を有する、請求項40記載の方法：
2005514339.tif 000257
（式中、
R1からR5は同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され；
ここで、Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され；かつ
R1からR5およびRaからRcのいずれかは置換されていてもまたは置換されていなくてもよい）
【請求項１５０】
化合物が下記式を有する、請求項40記載の方法：
2005514339.tif 000258
（式中、
R1からR8は同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され；
ここで、Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され；かつ
R1からR8およびRaからRcのいずれかは置換されていてもまたは置換されていなくてもよい）
【請求項１５１】
化合物が下記式を有する、請求項40記載の方法：
2005514339.tif 000259
（式中、
R1からR6は同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され；
ここで、Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され；かつ
R1からR6およびRaからRcのいずれかは置換されていてもまたは置換されていなくてもよい）
【請求項１５２】
化合物が下記式を有する、請求項40記載の方法：
2005514339.tif 000260
（式中、
R1からR10は同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され；
ここで、Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され；かつ
R1からR10およびRaからRcのいずれかは置換されていてもまたは置換されていなくてもよい）
【請求項１５３】
化合物が下記式を有する、請求項63記載の方法：
2005514339.tif 000261
（式中、
R1からR8は同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され、
ここで、Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され；かつ
R1からR8およびRaからRcのいずれかは置換されていてもまたは置換されていなくてもよく；ただし、R1からR8の少なくとも1つはハロゲンである）
【請求項１５４】
化合物が下記式を有する、請求項63記載の方法：
2005514339.tif 000262
（式中、
R1からR7は同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され、
ここで、Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され；かつ
R1からR7およびRaからRcのいずれかは置換されていてもまたは置換されていなくてもよい）
【請求項１５５】
化合物が下記式を有する、請求項63記載の方法：
2005514339.tif 000263
（式中、
R1からR7は同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され、
ここで、Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され；かつ
R1からR7およびRaからRcのいずれかは置換されていてもまたは置換されていなくてもよい）
【請求項１５６】
化合物が下記式を有する、請求項63記載の方法：
2005514339.tif 000264
（式中、
R1からR6は同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され、
ここで、Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され；かつ
R1からR6およびRaからRcのいずれかは置換されていてもまたは置換されていなくてもよい）
【請求項１５７】
化合物が下記式を有する、請求項63記載の方法：
2005514339.tif 000265
（式中、
R1からR6は同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され、
ここで、Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され；かつ
R1からR6およびRaからRcのいずれかは置換されていてもまたは置換されていなくてもよい）
【請求項１５８】
化合物が下記式を有する、請求項63記載の方法：
2005514339.tif 000266
（式中、
R1からR5は同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され、
ここで、Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され；かつ
R1からR5およびRaからRcのいずれかは置換されていてもまたは置換されていなくてもよい）
【請求項１５９】
化合物が下記式を有する、請求項63記載の方法：
2005514339.tif 000267
（式中、
R1からR8は同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され、
ここで、Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され；かつ
R1からR8およびRaからRcのいずれかは置換されていてもまたは置換されていなくてもよい）
【請求項１６０】
化合物が下記式を有する、請求項63記載の方法：
2005514339.tif 000268
（式中、
R1からR6は同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され、
ここで、Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され；かつ
R1からR6およびRaからRcのいずれかは置換されていてもまたは置換されていなくてもよい）
【請求項１６１】
化合物が下記式を有する、請求項63記載の方法：
2005514339.tif 000269
（式中、
R1からR10は同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され、
ここで、Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され；かつ
R1からR10およびRaからRcのいずれかは置換されていてもまたは置換されていなくてもよい）
【請求項１６２】
化合物が下記式を有する、請求項105記載の方法：
2005514339.tif 000270
（式中、
R1からR8は同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され、
ここで、Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され；かつ
R1からR8およびRaからRcのいずれかは置換されていてもまたは置換されていなくてもよく；ただしR1からR8の少なくとも1つはハロゲンである）
【請求項１６３】
化合物が下記式を有する、請求項105記載の方法：
2005514339.tif 000271
（式中、
R1からR7は同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され、
ここで、Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され；かつ
R1からR7およびRaからRcのいずれかは置換されていてもまたは置換されていなくてもよい）
【請求項１６４】
化合物が下記式を有する、請求項105記載の方法：
2005514339.tif 000272
（式中、
R1からR7は同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され、
ここで、Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され；かつ
R1からR7およびRaからRcのいずれかは置換されていてもまたは置換されていなくてもよい）
【請求項１６５】
化合物が下記式を有する、請求項105記載の方法：
2005514339.tif 000273
（式中、
R1からR6は同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され、
ここで、Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され；かつ
R1からR6およびRaからRcのいずれかは置換されていてもまたは置換されていなくてもよい）
【請求項１６６】
化合物が下記式を有する、請求項105記載の方法：
2005514339.tif 000274
（式中、
R1からR6は同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され、
ここで、Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され；かつ
R1からR6およびRaからRcのいずれかは置換されていてもまたは置換されていなくてもよい）
【請求項１６７】
化合物が下記式を有する、請求項105記載の方法：
2005514339.tif 000275
（式中、
R1からR5は同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され、
ここで、Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され；かつ
R1からR5およびRaからRcのいずれかは置換されていてもまたは置換されていなくてもよい）
【請求項１６８】
化合物が下記式を有する、請求項105記載の方法：
2005514339.tif 000276
（式中、
R1からR8は同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され、
ここで、Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され；かつ
R1からR8およびRaからRcのいずれかは置換されていてもまたは置換されていなくてもよい）
【請求項１６９】
化合物が下記式を有する、請求項105記載の方法：
2005514339.tif 000277
（式中、
R1からR6は同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され、
ここで、Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され；かつ
R1からR6およびRaからRcのいずれかは置換されていてもまたは置換されていなくてもよい）
【請求項１７０】
化合物が下記式を有する、請求項105記載の方法：
2005514339.tif 000278
（式中、
R1からR10は同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され、
ここで、Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され；かつ
R1からR10およびRaからRcのいずれかは置換されていてもまたは置換されていなくてもよい）
【請求項１７１】
化合物が下記式を有する、請求項124記載の方法：
2005514339.tif 000279
（式中、
R1からR8は同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され、
ここで、Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され；かつ
R1からR8およびRaからRcのいずれかは置換されていてもまたは置換されていなくてもよく；ただし、R1からR8の少なくとも1つはハロゲンである）
【請求項１７２】
化合物が下記式を有する、請求項124記載の方法：
2005514339.tif 000280
（式中、
R1からR7は同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され、
ここで、Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され；かつ
R1からR7およびRaからRcのいずれかは置換されていてもまたは置換されていなくてもよい）
【請求項１７３】
化合物が下記式を有する、請求項124記載の方法：
2005514339.tif 000281
（式中、
R1からR7は同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され、
ここで、Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され；かつ
R1からR7およびRaからRcのいずれかは置換されていてもまたは置換されていなくてもよい）
【請求項１７４】
化合物が下記式を有する、請求項124記載の方法：
2005514339.tif 000282
（式中、
R1からR６は同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され、
ここで、Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され；かつ
R1からR6およびRaからRcのいずれかは置換されていてもまたは置換されていなくてもよい）
【請求項１７５】
化合物が下記式を有する、請求項124記載の方法：
2005514339.tif 000283
（式中、
R1からR６は同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され、
ここで、Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され；かつ
R1からR6およびRaからRcのいずれかは置換されていてもまたは置換されていなくてもよい）
【請求項１７６】
化合物が下記式を有する、請求項124記載の方法：
2005514339.tif 000284
（式中、
R1からR５は同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され、
ここで、Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され；かつ
R1からR5およびRaからRcのいずれかは置換されていてもまたは置換されていなくてもよい）
【請求項１７７】
化合物が下記式を有する、請求項124記載の方法：
2005514339.tif 000285
（式中、
R1からR８は同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され、
ここで、Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され；かつ
R1からR8およびRaからRcのいずれかは置換されていてもまたは置換されていなくてもよい）
【請求項１７８】
化合物が下記式を有する、請求項124記載の方法：
2005514339.tif 000286
（式中、
R1からR６は同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され、
ここで、Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され；かつ
R1からR6およびRaからRcのいずれかは置換されていてもまたは置換されていなくてもよい）
【請求項１７９】
化合物が下記式を有する、請求項124記載の方法：
2005514339.tif 000287
（式中、
R1からR10は同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され、
ここで、Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキル基からなる群より選択され；かつ
R1からR10およびRaからRcのいずれかは置換されていてもまたは置換されていなくてもよい）
【請求項１８０】
聴覚損失を防御または治療するために有効量のタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤を被験者に投与する段階を含む、被験者の聴覚損失を防御または治療する方法。
【請求項１８１】
タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤が、非ペプチドタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤である、請求項180記載の方法。
【請求項１８２】
非ペプチドタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤が、タンパク質キナーゼの触媒残基にそれぞれ共有結合的にまたは非共有結合的に結合できる1つまたは複数の官能基を有する少なくとも1つの第一モジュールと非ペプチド骨格を提供する第二モジュールとを含む方法であって、少なくとも1つの第一モジュールと第二モジュールとの組合せは、タンパク質キナーゼ活性を阻害する、請求項181記載の方法。
【請求項１８３】
少なくとも1つの第一モジュールが2つ以上の官能基を含む、請求項182記載の方法。
【請求項１８４】
少なくとも1つの第一モジュールが、ハロゲン、ボロン酸、ヒドロキシル基、ホスホン酸、スルファミン酸、グアニジノ基、カルボン酸、アルデヒド、アミド、およびヒドロキシメチルホスホン酸からなる群より選択された官能基を含む、請求項182記載の方法。
【請求項１８５】
少なくとも1つの第一モジュールがハロゲンを含む、請求項184記載の方法。
【請求項１８６】
少なくとも1つの第一モジュールがボロン酸基を含む、請求項184記載の方法。
【請求項１８７】
少なくとも1つの第一モジュールがヒドロキシル基を含む、請求項184記載の方法。
【請求項１８８】
少なくとも1つの第一モジュールがアミド基を含む、請求項184記載の方法。
【請求項１８９】
アミド基が隣接するトリカルボニルアミドである、請求項188記載の方法。
【請求項１９０】
第二モジュールが、インドール、ナフタレン、ビフェニル、イソキノリン、ベンゾフラン、およびベンゾチオフェンからなる群より選択された基を含む、請求項182記載の方法。
【請求項１９１】
第二モジュールがインドールを含む、請求項190記載の方法。
【請求項１９２】
第二モジュールがナフタレンを含む、請求項190記載の方法。
【請求項１９３】
少なくとも1つの第一モジュールが、少なくとも1つの第一モジュールを第二モジュールに連結している1個から3個の炭素原子を含む直鎖をさらに含む、請求項182記載の方法。
【請求項１９４】
直鎖中の炭素原子の1つが、窒素原子、酸素原子、または硫黄原子で置換されている、請求項193記載の方法。
【請求項１９５】
非ペプチドタンパク質キナーゼ阻害剤が、少なくとも1つの第一モジュールと第二モジュールとの組合せに付着した1つまたは複数の特異性側鎖要素を含む、請求項182記載の方法。
【請求項１９６】
非ペプチドタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤が下記式を有する、請求項182記載の方法：
2005514339.tif 000288
（式中、
R1からR7は同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、ヘテロ環式化合物、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキルからなる群より選択され；
ここで、Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、および、分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキルからなる群より選択されるか；または
R5およびR6は共にヘテロ環式化合物を形成し；かつ
R1からR7およびRaからRcのいずれかは置換されているかまたは置換されていない）
【請求項１９７】
R3がハロゲンである、請求項196記載の方法。
【請求項１９８】
R3がフッ素である、請求項197記載の方法。
【請求項１９９】
R6またはR7の少なくとも一方はが下記式である、請求項196記載の方法：
2005514339.tif 000289
（式中、
R8*は付着点であり、かつ(CH2)x（Xは0〜10である）、CH2CHOH、CH(CH3)R、またはCH(CH3)Sであり、R9からR13はそれぞれ同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、ヘテロ環式化合物、および、分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキルからなる群より選択され、
ここで、Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキルからなる群より選択され；かつ
R9からR13およびRaからRcのいずれかは置換されているかまたは置換されていない）
【請求項２００】
R6またはR7の少なくとも一方が下記式である、請求項196記載の方法：
2005514339.tif 000290
（式中、アステリスクは窒素への付着点を示す）
【請求項２０１】
非ペプチドチロシンキナーゼ阻害剤が下記式を有する、請求項182記載の方法：
2005514339.tif 000291
（式中、Xはハロゲンであり、R1はHであり、R2は
2005514339.tif 000292
であり、R3はHであり、かつR4はHである）
【請求項２０２】
Xがフッ素である、請求項201記載の方法。
【請求項２０３】
非ペプチドチロシンキナーゼ阻害剤が下記式を有する、請求項182記載の方法：
2005514339.tif 000293
（式中、
R1からR7は同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、ヘテロ環式化合物、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキルからなる群より選択され、
ここで、Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、および分岐、環式、もしくは非分岐型のアルキルからなる群より選択され；
R1からR7およびRaからRcのいずれかは置換されているかまたは置換されておらず；かつ
Xは0または1である）
【請求項２０４】
タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤が、ペプチドタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤である、請求項180記載の方法。
【請求項２０５】
タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤はタンパク質チロシンキナーゼ活性を阻害するが、タンパク質チロシンキナーゼへのATPの結合は阻害しない、請求項180記載の方法。
【請求項２０６】
タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤がペプチド基質に指向された阻害剤である、請求項205記載の方法。
【請求項２０７】
タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤がSH2阻害剤である、請求項180記載の方法。
【請求項２０８】
タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤がSH3阻害剤である、請求項180記載の方法。
【請求項２０９】
タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤がアロステリック阻害剤である、請求項180記載の方法。
【請求項２１０】
タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤が、タンパク質チロシンキナーゼへのATPの結合を阻害する、請求項180記載の方法。
【請求項２１１】
タンパク質チロシンキナーゼがSrcファミリータンパク質チロシンキナーゼである、請求項180記載の方法。
【請求項２１２】
Srcファミリータンパク質チロシンキナーゼがpp60c-srcチロシンキナーゼである、請求項211記載の方法。
【請求項２１３】
タンパク質チロシンキナーゼが焦点接着キナーゼである、請求項180記載の方法。
【請求項２１４】
投与が、経口、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内滴下、腔内または膀胱内滴下、耳内、動脈内、病巣内、定量ポンプにより、または、粘膜への適用により実施される、請求項180記載の方法。
【請求項２１５】
タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤が薬学的に許容される担体と共に投与される、請求項180記載の方法。
【請求項２１６】
タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤が聴覚損失が始まる前に投与される、請求項180記載の方法。
【請求項２１７】
タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤が聴覚損失が始まった後に投与される、請求項180記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2001年10月22日に提出された米国仮特許出願第60/336,191号、および2002年9月13日に提出された米国仮特許出願第60/410,726号の恩典を主張し、これらは参照としてその全体が本明細書に組み入れられる。本出願の主題は、NIH/NIDCD（助成金番号P01-DC03600および1R21DC04984-01）の支援の下でなされた。米国政府は本発明に一部の権利を有しうる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
タンパク質キナーゼは、ATPからタンパク質およびペプチドにおけるSer/ThrまたはTyrの側鎖ヒドロキシル基へのγリン酸基転移を触媒し、様々な重要な細胞機能、おそらく最も顕著にはシグナルトランスダクション、分化および増殖の制御に密接に関与している大きな酵素群である。ヒトの体には約2000の異なるタンパク質キナーゼがあると推定されており（Hunter、1987、1994、Hanks & Hunter、1995）、これらはそれぞれ特定のタンパク質／ペプチド基質をリン酸化するが、いずれも高度に保存されたポケット内の同じ第２の基質ATPに結合する。タンパク質ホスファターゼは、逆方向へのリン酸の移行を触媒する。
【０００３】
様々な公知のタンパク質キナーゼまたはタンパク質ホスファターゼの阻害剤は、十分な選択性と許容できるインビボでの薬理学的性質がこのような阻害剤に組み込まれうるとするならば、様々な治療への適用例を有すると考えられる（Levitzki、1996a）。おそらく、タンパク質キナーゼまたはタンパク質ホスファターゼの阻害剤の最も有望な治療的使用の可能性は、抗癌剤としての使用である。タンパク質チロシンキナーゼ（「PTK」）阻害剤のこのような適用の可能性が、最近多くの総説で強調されている（例えば、Lawrence & Hiu、1998、Kolibaba & Druker、1997、Showalter & Kraker、1997、Patrick & Heimbrook、1996、Groundwaterら、1996、Levitzki、1995）。この適用の基礎は部分的には、公知の癌遺伝子産物の約50％はPTKであり、そのキナーゼ活性は細胞形質転換を引き起こすことが判明している（Yamamoto、1993）という事実に基づいている。
【０００４】
PTKは、膜受容体PTK（例えば、成長因子受容体PTK）および非受容体PTK（例えば、プロト癌遺伝子産物のSrcファミリー）の２つの範疇に分類することができる。非受容体PTKのSrcファミリーには少なくとも９つのメンバーがあり、pp60c-src（以下、単に「Src」と呼ぶ）が約300アミノ酸の触媒ドメインが高度に保存されているファミリーの原型PTKである（Ruddら、1993、Courtneidge、1994）。Srcの過剰活性化が、大腸癌（Maoら、1997、Talamontiら、1993）、乳癌（Luttrellら、1994）、肺癌（Mazurenkoら、1992）、膀胱癌（Fanningら、1992）および皮膚癌（Barnekovら、1987）ならびに胃癌（Takeshimaら、1991）、有毛細胞白血病（Lynchら、1993）および神経芽細胞腫（Bjelfmanら、1990）を含む、いくつかのヒト癌で報告されている。膜貫通型受容体（例えばEGFRおよびp185HER2/Neu）から細胞内部への過刺激細胞増殖シグナルも、Srcを通過するようである（Maoら、1997、Parsons & Parsons、1997、Bjorgeら、1996）、Taylor & Shalloway、1996）。したがって、Srcの過剰活性化（突然変異なし）がヒト腫瘍の多くの重要なタイプの腫瘍イニシエーション、進行、および転移に関与しているため、最近、Srcは癌治療の普遍的な標的であると提唱されている（Levitzki、1996）。
【０００５】
様々なタンパク質キナーゼおよびタンパク質ホスファターゼの阻害剤に対する大きな、また成長しつつある可能性を考慮して、有用な阻害剤を得るための様々なアプローチが必要とされている。PTK阻害剤の発見の状態（Lawrence & Niu、1988、Showalter & Kraker、1997、Patrick & Heimbrook、1996、Groundwaterら、1996、Buddeら、1995、Levitzki & Gazit、1995; Frame,2002; Sawyerら、2001;Haskellら、2001、Martin、2001; Bridges、2001; Blume-Jensenら、2001; Biscardiら、2000; SusaおよびTeti、2000; Susaら、2000; Irbyら、2000; Schlessinger、2000; Abramら、2000; Garcia-Echeverriaら、2000; Sedlacek、2000; Sridharら、2000; Biscardiら、1999）が広く再調査されている。非ペプチドタンパク質キナーゼ阻害剤の特定においては無作為スクリーニングによる努力が功を奏したが、これらの大半は高度に保存されたATP結合部位に結合する。そのような非ペプチドATP競合的阻害剤のうち、注目に値する最近の一例は4-アニリノキナゾリンおよびその類縁体で、これらは上皮成長因子受容体PTK（EGFRPTK）に対して有効であることが明らかにされている（例えば、Rewcastleら、1996）。このクラスの阻害剤は他の６つのPTK（Srcを含む）と比べてEGFRPTKに選択的であると報告された（Fryら、1994）が、すべてATPに結合する残りの2000のタンパク質キナーゼのほとんど、ならびにATP、ADP、GTP、GDP等を利用する体内の多くの他のタンパク質に対する影響がどのようなものであるかは不明である。したがって、費用のかかる動物毒性試験やヒト臨床試験後にのみ見いだされる、ATPを模したPTK阻害剤からの副作用の可能性は、いまだに重大な問題である。また、このクラスの化合物は素晴らしい発見であり、さらに探究が行われているが、これらはいかなる所望のPTK、例えば、この場合にはSrcの非ペプチド阻害剤を得るための合理的かつ一般的解決にはならない。ATP競合的PTK阻害剤が、単離酵素アッセイ法で用いられるμMレベルではなく、細胞内ATPのmMレベルと競合する場合に示す、固有の３桁の効力低下に加え、これらの阻害剤に伴うインビボでの不十分な特異性のリスクが、他の研究者らによって認められている（例えば、Lawrence & Niu、1998、Hankeら、1996、Kelloffら、1996参照）。
【０００６】
より古く、より広範に研究された非ペプチドPTK阻害剤の１つのクラスはエルブスタチンおよび関連するチロホスチンである（総説参照）。このクラスの阻害剤は受容体PTKに対して活性で、その阻害の様式は複雑であるが、活性部位のペプチド基質特異部位領域における結合には関与しないようである（Hsuら、1992、Posnerら、1994）。さらに、これらは非天然アッセイ金属Mn2+を天然Mg2+に置き換えると、単離PTKに対して不活性で（Hsuら、1992）、化学的に不安定であり（Buddeら、1995、Ramdasら、1995および1994）、またタンパク質を架橋することにより正常および腫瘍細胞に対して細胞毒性を示すること（Stanwellら、1995および1996）、ならびにPTKの阻害ではなく、ミトコンドリアを破壊することにより細胞増殖を阻害すること（Burgerら、1995）が知られている。
【０００７】
タンパク質キナーゼ分野への重要な貢献は、熱安定阻害剤タンパク質由来の20残基ペプチドであるPKI（5〜24）に結合したセリンキナーゼcAMP依存性タンパク質キナーゼ（「PKA」）、およびMg2ATPによるX線構造研究である（Taylorら、1993）。この構造研究は、タンパク質キナーゼは単一の祖先タンパク質キナーゼから進化したため、PKAがタンパク質キナーゼの全ファミリーの原型であると考えられることから、特に価値がある。PKAと他のセリンおよびチロシンキナーゼの配列アライメントにより、保存された約260残基の触媒コアと、このコア内の高度に保存された11残基が特定された（Taylorら、1993）。本明細書において提唱される研究のために特に重要な２つの高度に保存された残基は、基質のOHと相互作用するとされている一般塩基Asp-166と、セリンキナーゼではLys-168、チロシンキナーゼではArg（Knightonら、1993）で、これはATPのγリン酸基と相互作用してこのリン酸基転移の触媒作用を助けるとされている。さらに別の２つの重要なPKA結晶構造が報告されており（Madhusudanら、1994）、１つはPKI Ala 21がSerで置換されている（それにより基質となっている）三元のPKA：ADP：PKI（5〜24）複合体、もう１つはPKI Ala 21がホスホセリン（最終産物阻害剤）で置換されている二元のPKA：PKI（5〜24）複合体についてである。三元複合体では、Asp-166にH-結合を供与し、Lys168の側鎖からH-結合を受容するセリンのOHが認められる。二元複合体では、Lys-168の側鎖との塩橋であって、Asp-166のカルボキシル基のH-結合距離内の塩橋を形成するホスホセリンのリン酸基が認められる。これらの構造は、先に提唱されたAsp-166およびLys-168の触媒メカニズムにおける役割を支持している。
【０００８】
PKAのX線構造は、酵素が２つのローブからなり、小さいローブはATPに結合し、大きいローブはペプチド基質に結合することを示している。触媒作用はローブの間の裂け目で起きる。PKAを用いた結晶学および溶液構造試験により、酵素が基質と結合すると、「開いた」形状から「閉じた」触媒として活性な形状への大きなコンフォメーションの変化を受けることが示された（Coxら、1994）。これらコンフォメーションの変化は、基質の結合に伴い２つのローブ間の裂け目を閉じ、リン酸基を直接転移させるためにATPのγリン酸基およびSerのOHをより接近させると推定される。
【０００９】
しかし、タンパク質キナーゼおよびタンパク質ホスファターゼの阻害剤はなお、治療に用いる際に望まれる特異性および効力が不足している。癌、乾癬、関節硬化症、II型糖尿病、肥満を含むいくつかの異なる疾患においてタンパク質キナーゼおよびタンパク質ホスファターゼが重要な役割を果たし、免疫系の活性調節に役割を果たすことから、特定のタンパク質キナーゼおよびタンパク質ホスファターゼの阻害剤が必要である。本発明は、標的とする経路により特異的と考えられる、タンパク質キナーゼ阻害剤および/またはタンパク質ホスファターゼ阻害剤の設計、ならびに結果として得られるタンパク質キナーゼ阻害剤および/またはタンパク質ホスファターゼ阻害剤のための新規なアプローチを提供する。本発明はまた、聴覚損失を防御または治療する新規なアプローチも提供する。
【発明の開示】
【００１０】
発明の概要
本発明は、下記式を有する非ペプチドタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤および/またはタンパク質ホスファターゼ阻害剤を提供する：
2005514339.tif 000002
（式中、
Xはハロゲンであり、R1からR6は同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、ヘテロ環式化合物、および、好ましくは1〜20個の炭素原子を有し、選択的に二重結合または三重結合を含み、かつ選択的にヘテロ原子または他の官能基（例えば、カルボン酸、カルボン酸エステル、アルコール、エーテル、チオエーテル、アミド、チオアミド、尿素、ウレタン、スルホキシド、スルホン、ホスホン酸、ホスホン酸エステル、ホスフィン酸、ホスフィン酸エステル、ボロン酸、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、およびヘテロビアリール）で置換されている、アルキル（分岐、環式、もしくは非分岐型）からなる群より選択されるか；または、R5およびR6は共にヘテロ環式化合物を形成している。Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、および、選択的にヘテロ原子または他の官能基（例えば、カルボン酸、カルボン酸エステル、アルコール、エーテル、チオエーテル、アミド、チオアミド、尿素、ウレタン、スルホキシド、スルホン、ホスホン酸、ホスホン酸エステル、ホスフィン酸、ホスフィン酸エステル、ボロン酸、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、およびヘテロビアリール）で置換されているアルキル（分岐、環式、もしくは非分岐型）からなる群より選択される。上記側鎖中の全ての開いている置換位置はさらなる置換を含むことができると理解される）
【００１１】
1つの態様において、R5またはR6の少なくとも一方は下記式である：
2005514339.tif 000003
（式中、
R7*は付着点であり、かつ(CH2)x（Xは0〜10である）、CH2CHOH、CH(CH3)R、またはCH(CH3)Sであり、R8からR12はそれぞれ同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、ヘテロ環式化合物、および、好ましくは1〜20個の炭素原子を有し、選択的に二重結合または三重結合を含み、かつ選択的にヘテロ原子または他の官能基（例えば、カルボン酸、カルボン酸エステル、アルコール、エーテル、チオエーテル、アミド、チオアミド、尿素、ウレタン、スルホキシド、スルホン、ホスホン酸、ホスホン酸エステル、ホスフィン酸、ホスフィン酸エステル、ボロン酸、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、およびヘテロビアリール）で置換されているアルキル（分岐、環式、もしくは非分岐型）からなる群より選択される。Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、および、選択的にヘテロ原子または他の官能基（例えば、カルボン酸、カルボン酸エステル、アルコール、エーテル、チオエーテル、アミド、チオアミド、尿素、ウレタン、スルホキシド、スルホン、ホスホン酸、ホスホン酸エステル、ホスフィン酸、ホスフィン酸エステル、ボロン酸、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、およびヘテロビアリール）で置換されているアルキル（分岐、環式、もしくは非分岐型）からなる群より選択される。R8からR12のいずれかは置換されていてもまたは置換されていなくてもよいと理解される）
【００１２】
別の態様において、R5またはR6の少なくとも一方は下記式である：
2005514339.tif 000004
（式中、アステリスクは窒素への付着点を示す）
【００１３】
本発明はまた、下記式を有する非ペプチドタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤および/またはタンパク質ホスファターゼ阻害剤を提供する：
2005514339.tif 000005
（式中、Xはハロゲン、好ましくはフッ素であり、かつR1からR4は、特異性側鎖要素である）
1つの態様において、R1はHであり、R2は
2005514339.tif 000006
（または）
であり、R3はHであり、かつR4はHである。上記化合物はまた、インドール環上の任意の他の位置においても置換されていてもよい。
【００１４】
本発明は、タンパク質キナーゼ阻害剤を同定する方法を提供する。この方法は、タンパク質キナーゼの触媒残基にそれぞれ共有結合的にまたは非共有結合的に結合できる1つまたは複数の官能基を有する少なくとも1つの第一モジュールを提供する段階（1つまたは複数の官能基の少なくとも1つはハロゲンである）、少なくとも1つの第一モジュールを、ペプチド骨格を提供する少なくとも1つの第二モジュールと組み合わせて、第一および第二のモジュールの1つまたは複数の組合せを形成する段階、タンパク質キナーゼ阻害について第一および第二のモジュールの1つまたは複数の組合せをスクリーニングする段階、ならびにタンパク質キナーゼ活性を阻害する第一および第二のモジュールの組合せを選択する段階を含む。本明細書において使用される場合、モジュールは単一の分子実体または官能基の集合である。本明細書において使用される場合、非ペプチド骨格は分子の一部がペプチドではない限りペプチド結合を含みうる分子である。
【００１５】
本発明はまた、タンパク質キナーゼを阻害する方法も提供する。タンパク質キナーゼの触媒残基にそれぞれ共有結合的にまたは非共有結合的に結合できる1つまたは複数の官能基を有する少なくとも1つの第一モジュール（1つまたは複数の官能基はハロゲンを含む）と非ペプチド骨格を提供する第二モジュールとを含む化合物に、タンパク質キナーゼを接触させる。少なくとも1つの第一モジュールと第二モジュールとの組合せがタンパク質キナーゼ活性を阻害する。
【００１６】
さらに別の態様において、本発明は被験者におけるタンパク質キナーゼ阻害剤に応答性の状態を治療する方法を提供する。タンパク質キナーゼ阻害剤を被験者に投与する。タンパク質キナーゼ阻害剤は、タンパク質キナーゼの触媒残基にそれぞれ共有結合的にまたは非共有結合的に結合できる1つまたは複数の官能基を有する少なくとも1つの第一モジュールと（1つまたは複数の官能基はハロゲンを含む）非ペプチド骨格を提供する第二モジュールとを有する。少なくとも1つの第一モジュールと第二モジュールとの組合せが被験者におけるタンパク質キナーゼ活性を阻害する。
【００１７】
さらなる態様において、本発明はタンパク質ホスファターゼの阻害剤を同定する方法を提供する。この方法は、タンパク質ホスファターゼの触媒残基にそれぞれ共有結合的にまたは非共有結合的に結合できる1つまたは複数の官能基を有する少なくとも1つの第一モジュールを提供する段階、少なくとも1つの第一モジュールと非ペプチド骨格を提供する少なくとも1つの第二モジュールとを組み合わせて、第一および第二のモジュールの1つまたは複数の組合せを形成する段階、ホスファターゼ阻害について第一および第二のモジュールの1つまたは複数の組合せをスクリーニングする段階、ならびにタンパク質ホスファターゼ活性を阻害する第一および第二のモジュールの組合せを選択する段階を含む。
【００１８】
本発明の別の側面は、タンパク質ホスファターゼを阻害する方法である。タンパク質ホスファターゼの触媒残基にそれぞれ共有結合的にまたは非共有結合的に結合できる1つまたは複数の官能基を有する少なくとも1つの第一モジュールと非ペプチド骨格を提供する第二モジュールとを含む化合物に、タンパク質ホスファターゼを接触させる。少なくとも1つの第一モジュールと第二モジュールとの組合せがタンパク質ホスファターゼ活性を阻害する。
【００１９】
さらに別の態様において、本発明は被験者におけるタンパク質ホスファターゼ阻害剤に応答性の状態を治療する方法を提供する。タンパク質ホスファターゼ阻害剤を被験者に投与する。タンパク質ホスファターゼ阻害剤は、タンパク質ホスファターゼの触媒残基にそれぞれ共有結合的にまたは非共有結合的に結合できる1つまたは複数の官能基を有する少なくとも1つの第一モジュールと非ペプチド骨格を提供する第二モジュールとを有する。少なくとも1つの第一モジュールと第二モジュールとの組合せが、被験者におけるタンパク質ホスファターゼ活性を阻害する。
【００２０】
本発明はまた、被験者における聴覚損失を防御または治療する方法に関する。この方法は、聴覚損失を防御または治療するために、有効量のタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤を被験者に投与する段階を含む。
【００２１】
本発明の聴覚損失を防御または治療する方法によると、低濃度のタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤を被験者に投与して、所望の効果を達成することができる。さらに、本明細書に開示したタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤は低い毒性を示し、それ故、聴覚損失の治療に適している。さらに、タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤の有効量を投与し、聴覚損失を防御または治療するだけでなく、癌、乾癬、関節硬化症、または免疫系活性などのタンパク質キナーゼ阻害剤に応答性の他の疾患も治療することができる。特に、タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤は、一部の抗癌薬物と共に相乗効果を提供しうる。例えば、有望な阻害剤を、特に、他の既知の抗癌薬物との相乗性を調べるために、初期ヒト腫瘍組織アッセイ法でスクリーニングできる。さらに、タンパク質キナーゼ阻害剤は、一部の抗癌薬物（例えば蝸牛および腎臓に毒性である白金をベースとした薬物）の毒性を減少させる可能性があり、これにより用量を増加できる。
【００２２】
発明の詳細な説明
本発明は、タンパク質キナーゼおよび/またはタンパク質ホスファターゼの阻害剤を提供する。1つの態様において、タンパク質キナーゼおよび/またはタンパク質ホスファターゼ阻害剤は、下記式を有する非ペプチド阻害剤である：
2005514339.tif 000007
（式中、
Xはハロゲンであり、R1からR6は同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、ヘテロ環式化合物、および、好ましくは1〜20個の炭素原子を有し、選択的に二重結合または三重結合を含み、かつ選択的にヘテロ原子または他の官能基（例えば、カルボン酸、カルボン酸エステル、アルコール、エーテル、チオエーテル、アミド、チオアミド、尿素、ウレタン、スルホキシド、スルホン、ホスホン酸、ホスホン酸エステル、ホスフィン酸、ホスフィン酸エステル、ボロン酸、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、およびヘテロビアリール）で置換されているアルキル（分岐、環式、もしくは非分岐型）からなる群より選択されるか、または、R5およびR6は共にヘテロ環式化合物を形成している。Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、および、選択的にヘテロ原子または他の官能基（例えば、カルボン酸、カルボン酸エステル、アルコール、エーテル、チオエーテル、アミド、チオアミド、尿素、ウレタン、スルホキシド、スルホン、ホスホン酸、ホスホン酸エステル、ホスフィン酸、ホスフィン酸エステル、ボロン酸、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、およびヘテロビアリール）で置換されているアルキル（分岐、環式、もしくは非分岐型）からなる群より選択される。上記側鎖中の全ての開いている置換位置はさらなる置換を含むことができると理解される。適切なR基の例は、以下の表6に示す）
【００２３】
1つの態様において、R5またはR6の少なくとも一方は下記式である：
2005514339.tif 000008
（式中、
R7*は付着点であり、かつ(CH2)x（Xは0〜10である）、CH2CHOH、CH(CH3)R、またはCH(CH3)Sであり、R8からR12はそれぞれ同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、ヘテロ環式化合物、および、好ましくは1〜20個の炭素原子を有し、選択的に二重結合または三重結合を含み、かつ選択的にヘテロ原子または他の官能基（例えば、カルボン酸、カルボン酸エステル、アルコール、エーテル、チオエーテル、アミド、チオアミド、尿素、ウレタン、スルホキシド、スルホン、ホスホン酸、ホスホン酸エステル、ホスフィン酸、ホスフィン酸エステル、ボロン酸、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、およびヘテロビアリール）で置換されているアルキル（分岐、環式、もしくは非分岐型）からなる群より選択される。Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、および選択的にヘテロ原子または他の官能基（例えば、カルボン酸、カルボン酸エステル、アルコール、エーテル、チオエーテル、アミド、チオアミド、尿素、ウレタン、スルホキシド、スルホン、ホスホン酸、ホスホン酸エステル、ホスフィン酸、ホスフィン酸エステル、ボロン酸、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、およびヘテロビアリール）で置換されているアルキル（分岐、環式、もしくは非分岐型）からなる群より選択される。上記側鎖中の全ての開いている置換位置はさらなる置換を含むことができると理解される。好ましい態様において、R8からR12はそれぞれ、OCH3、OCH2CH3、H、CH3、OH、CH2OH、CF3、OCF3、CFO、C6H5、OC6H5、OCH2C6H5、OCH2CH2CH3、CHO、CO2H、CO2CH3、CH2CO2H、CH2CO2CH3、NO2、およびハロゲンからなる群より選択される。
【００２４】
別の態様において、R5またはR6の少なくとも一方は下記式である：
2005514339.tif 000009
（式中、アステリスクは窒素への付着点を示す）
【００２５】
好ましい態様において、非ペプチド阻害剤は、pp60c-srcチロシンキナーゼ、pp56lckチロシンキナーゼ、またはpp55fynチロシンキナーゼの活性を阻害する。
【００２６】
別の好ましい態様において、非ペプチド阻害剤はタンパク質チロシンホスファターゼ1B（PTP-1B）の活性を阻害する。
【００２７】
本発明の別の非ペプチドタンパク質チロシンキナーゼおよび/またはタンパク質ホスファターゼ阻害剤は、下記式を有する：
2005514339.tif 000010
（式中、
Xはハロゲン、好ましくはフッ素であり、かつR1からR4は特異性要素である）
本明細書に使用したような特異性要素または特異性側鎖は、個々のタンパク質キナーゼの独特な結合ポケットに結合する側鎖である。従って、使用される側鎖は、阻害する特定のタンパク質キナーゼまたはタンパク質ホスファターゼに依存する。適切な側鎖を同定するために、既知のペプチド結合側鎖を使用して類似体を同定してもよく、これをその後、コンビナトリアル化学技術に使用して可能性ある側鎖ライブラリーを拡大する。
【００２８】
1つの態様において、R1はHであり、R2は
2005514339.tif 000011
であり、R3はHであり、かつR4はHである。上記化合物はまた、インドール環上の任意の他の位置においても置換されていてもよい。
【００２９】
本発明の化合物は、pp60c-srcのようなチロシンキナーゼに対する活性を提供し、1つの容易に代謝されるOH基が除去されているので、これらは化合物のインビボでのチロシンキナーゼを阻害する能力を向上させる考えられる。特に、インドール環上の5位のOH基がハロゲンで置換されている。ハロゲンは、触媒残基（これは水素結合供与体である）に有用である水素結合受容体である。さらに、ハロゲンは第II相代謝で代謝されず、電気陰性であり、これによりインビボにおいて利点がもたらされる（例えばParkら、2001参照）。このクラスのいくつかのメンバーはまた、逆の酵素（すなわちホスホチロシンホスファターゼ）の阻害剤でもある。これらの化合物は、pp60c-srcの阻害剤であり、高度に転移性の前立腺癌細胞増殖の阻害剤であり、かつ以下の実施例1に記載のように、高用量の急性腹腔内投与時でもマウスにおいて無毒性である。これらの化合物のいくつかは、より広範囲に試験すると他の生物活性も有することが判明しうる（例えば、II型糖尿病におけるグリコーゲンホスホリラーゼ、HIV逆転写酵素、またはトロンボキサンシンターゼを阻害）。従って、これらの化合物は、癌などの治療用途におけるチロシンキナーゼ阻害剤として使用してもよい。チロシンキナーゼ阻害剤は同様に他の可能性ある治療用途も有し（例えばp56 lckの場合には免疫抑制剤）、チロシンホスファターゼPTP-1B阻害剤は、II型糖尿病または肥満の治療用薬物を提供しうる。
【００３０】
本発明はまた、タンパク質キナーゼ阻害剤を同定する方法も提供する。非ペプチドPTK阻害剤の開発のための一般的なモジュラー戦略の概略を図１に示す。基本的には、タンパク質キナーゼの触媒残基に結合するための1つまたは複数の官能基を有する（好ましい態様において、官能基の少なくとも1つはハロゲンでである）少なくとも1つの第一モジュールと非ペプチド骨格を提供する少なくとも1つの第二モジュールとを組み合わせる。少なくとも1つの第一モジュールの官能基は、それぞれタンパク質キナーゼの触媒残基に共有結合的にまたは非共有結合的に結合できる。従って、各第一モジュールのそれぞれの官能基は、タンパク質キナーゼと第一モジュールがこのような結合に有効な条件下で組み合わされた場合に、タンパク質キナーゼの触媒残基に共有結合的にまたは非共有結合的に、可逆的または非可逆的に結合を形成できる。タンパク質キナーゼ活性を阻害する第一と第二のモジュールの組み合わせを選択する。段階1は、すでに得られていたタンパク質キナーゼ阻害剤の情報から始める、すなわち、PKAまたはSrcの基質特異性部位に結合するペンタペプチド骨格は、保存された触媒残基MgATPまたはMgADPと相互作用するための様々な合理的に設計された官能基（すなわち、モジュール「M1」または「第一モジュール」）を配置するためにすでに用いられていた。このようにして好ましい官能基の選択が行われ、段階1の最初のM1モジュールとして用いられた。これらのM1官能基は段階1においてSrc阻害のための有望な非ペプチド骨格を同定するために用いられている。M1付属物のみを有するこれら裸の非ペプチド骨格は、結合親和性が低く、タンパク質チロシンキナーゼ（PTK）の間で相対的に非選択的であると予想された。段階1のレベルで選択性に欠けることは、別のPTKに適用することができる一般的方法の開発のためには有益と見なされる。したがって、段階1で特定される一連の非ペプチド骨格は、これらをすべて新しいPTK標的を用いて再度スクリーニングし、よりよいものを段階2および3に進めることによって、別のPTKに用いるために再循環させることができる。段階1からのこれら裸の骨格の効力は、１つまたは２つの最初の特異的因子（Sn）を連結させることによって十分高められ、骨格の非ATP競合性の妥当性確認ができ、合理的に導かれるコンビナトリアルケミストリーを用いたさらなる効力増強に適したものとなる。段階1で特定された有望なSrc非ペプチドM2（第二モジュール）骨格は段階2に進み、Srcに対する効力ならびにATPと比較しての非競合的結合において1桁から2桁の上昇を示した。
【００３１】
資源集中的コンビナトリアルライブラリー合成に着手し、段階3の試験を行う前に、段階2のレベルで骨格の妥当性確認を行うことが、次の3つの理由から重要である：1）特異的因子（Sn）側鎖を付加するための化学反応を開発するため；2）これらの阻害剤はATP競合的ではないことを調べるため；3）Src：阻害剤複合体の研究モデル（これにより、一連の個々の選択的因子Snを段階3の集中ライブラリーに含めるために、合理的に導かれた選択ができるとの確信が得られる）に基づいて予期されるとおり、効力は側鎖Snの性質および連結点に反応することを調べるため。
【００３２】
選択的因子（Sn）を有する多くのM1官能基（および非常に近い類縁体M1'）をコンビナトリアルケミストリーおよびハイスループットスクリーニングを通じて実験的に評価するため、段階3では特定のPTKに対する高い効力と特異性が予期される。効力および選択性は、別の特異的因子（図1の任意のSn参照）を付加することにより、必要があればさらに高めることができる。
【００３３】
段階1〜3のそれぞれで、IRTK：ペプチド：AMP-PNP結晶構造、Src：ペプチド複合体のモデル、および特定の骨格を基本とする個々の阻害剤ファミリーとのSrc複合体のモデルを用いた分子モデリング試験を定性的指標として用いる。これらのモデリング試験は、以下に詳述するとおり、阻害剤を設計する指標として、ここまでは非常に有用であった。このようにして構造に基づく設計とコンビナトリアルケミストリー法とを組み合わせることによって協力効果が得られ、分離して用いられる場合のこれらの方法の主な個々の欠点はもう一方の長所によって対処される。構造に基づく設計の主な欠点は、リガンド結合親和性を定量的に予測するのが困難な点であり、これは溶媒和とエントロピーとの複雑な影響によって特にむずかしいものとなっている（Ajay & Murcko、1995）。構造に基づく設計の主な長所は、どのようなタイプの分子が良いリガンドとなる可能性を有しているかを予測できることである。構造に基づく設計は分子のサイズや形のおおまかな境界（タンパク質は柔軟性を有することがあり、このことを考慮に入れる必要がある）を決定することができ、ならびに疎水性のH-結合およびイオン性相互作用が起こりやすい位置を示すことができる。他方、コンビナトリアルケミストリーの主な欠点は、薬物サイズの分子（すなわち、分子量が約500以下）のための「分子空間」が大きすぎて、この分子空間すべてを妥当なサイズのコンビナトリアルライブラリーにおいて高密度でカバーして調べられるとは考えられない。最近推定された、炭素、窒素、酸素、およびイオウ（Hの他に）だけから選ばれた30個までの原子を含む、可能な化合物の数は1060個である（Bohacekら、1996）。この数は典型的な薬物分子の分子量の範囲で、これでも他の原子、例えばハロゲンにより提供される分散性は含まれていない。したがって、特定の薬物候補が位置する可能性のある分子空間の領域を特定するためには、さらに制約を用いる必要がある。構造に基づく設計は、良いリガンドである確率の高い分子のタイプを特定することにより、調べるべき分子空間の大きさを劇的に縮小することができる。これらの「集中的」コンビナトリアルライブラリーのどのメンバーが実際に最も密接に結合するリガンドであるかを定量的に予測できない問題（すなわち、定量の問題）は、効率の良いコンビナトリアル合成とライブラリーのハイスループット試験を用いることによって解決される。
【００３４】
これまでペプチドを基本とするセリンおよびチロシンキナーゼ阻害剤を設計しようとする際に、保存された触媒残基との相互作用のためのタンパク質キナーゼ阻害剤モジュールM1を設計するための簡便な定性的モデルとしてPKAが用いられた。PKAについては、いかなる他のタンパク質キナーゼよりも多くの構造および動態に関する情報が得られている。
【００３５】
Mg2ATPおよび偽基質（すなわち、OHがHに置換されている）ペプチド阻害剤（PKI 5〜24アミド）と複合したPKAの結晶構造が解析されており（Zhengら、1993）、この阻害剤のP 0 Alaに近接する活性部位相互作用を図2に示している。
【００３６】
この結晶構造から、Mg2ATPはPKAの小さい方のローブに結合し、20残基の偽基質ペプチド阻害剤は大きい方のローブに結合し、酵素の全体のコンフォメーションは閉じて（すなわち、２つのローブが接触している）活性化された状態であることが明らかである。複合体におけるP 0 Ala側鎖の炭素と近くの重原子との距離は図2にÅで示している。これらの距離は、Ala側鎖は周囲の原子とファンデルワールス接触距離内であることを示し、また、付加されているバルキーなM1官能基にはAla側鎖までほとんどスペースがないことを示している。しかし、PKAは開いたり、閉じたり、および中間のコンフォメーションを取れる柔軟性の酵素であり（Coxら、1994）、これらのより開いたコンフォメーションによってATPのγリン酸基が阻害剤のAlaから後退し、それにより付加されたM1官能基のための結合空隙を作ることになると考えられる。さらに、PKAはMgATPと同等の親和性でMgADPと結合し（Whitehouseら、1983）、細胞内のATP/ADP比は通常10/1である（Albertsら、1994）。したがって、平衡状態では、細胞タンパク質キナーゼは約10％がMgADPと結合した状態であり、酵素のこの形状も阻害剤の標的となって、すべての酵素が触媒サイクルからPKA：MgADP：阻害剤の不活性複合体へと排出されうる。
【００３７】
PKA触媒残基Asp-166およびLys-168はすべてのセリンキナーゼで完全に保存されており、チロシンキナーゼはLys-168がArgで置換されている点だけが異なっている（Taylorら、1993）ため、M1として役立ち、全タンパク質キナーゼファミリーに対する阻害剤を開発するために広く有用となる阻害剤官能基の選択範囲を標的とするために、この活性部位の領域を近接するMgATPまたはMgADPと共に選択した。ヌクレオチドに隣接する活性部位の領域にM1を向けることにより、非ペプチド阻害剤の配向点が提供されて、阻害剤はATP/ADP結合と必ずしも競合せずにペプチド結合特異性部位へと伸びることができる。
【００３８】
M1として利用しうる官能基の選択は、この活性部位領域は非常に高度に保存されているが、それぞれの特定のタンパク質キナーゼは活性部位のコンフォメーションや近接する残基にわずかな差があるため、この選択範囲の中で幾分異なる嗜好性を示すと考えられる。さらに、M1のこの選択範囲の中の優先順位は、M1モジュールが異なる非ペプチド骨格に付加しているため、幾分変動することもある。この予測は、各非ペプチド骨格が各個々のタンパク質キナーゼおよび各特定の選択的因子（Sn）側鎖群と幾分異なる配向で結合する可能性に基づいている。ペンタペプチド骨格は、このような大きいペプチド骨格の結合配向が系列を通じて非常に一貫性があって予測しやすく（すなわち、X線で観察したものと非常に類似している）、且つ試験される各M1官能基を意図されたとおり保存触媒残基に隣接して置くと確実に予測できるため、M1官能基の最初のスクリーニングのために選ばれた。したがって、この以前のペプチドを基本とする研究の目標は、非ペプチド骨格の最初のスクリーニングのため（段階1）だけでなく、最終の非ペプチドコンビナトリアルライブラリーにおいて非常に近い類縁体を通してさらに拡大し、それによって他の側鎖と同時に最適化することができる最初のM1側鎖群として（段階3）も用いることができるM1官能基の集合を特定することであった。
【００３９】
PKA活性部位のこの保存触媒領域における候補M1官能基のモデリングを行うため、図3に示すとおり、シリコングラフィクス（Silicone Graphics）ワークステーションでSYBYL分子モデリングパッケージ（Tripos）を用いてPKA三元構造におけるP 0 Ala位上にこれらの基を構築した。
【００４０】
MgATPおよび阻害剤が結合したPKAのより「開いた」コンフォメーションの結晶構造は得られなかったため、最初のモデリング試験は単にATPのγリン酸基を除去することにより、図2に示した三元複合体由来のPKAのMgADP結合型に対して実施した。最初のモデリング試験は、合成および試験前にタンパク質キナーゼファミリーのために興味深いと思われるM1官能基を同定するための定性的指標を提供するために用いた。自由エネルギー摂動法（Free Energy Perturbation）法などの、結合自由エネルギーを定量的に予測するための最も進んだコンピューターアルゴリズムは、コンピューターによる集中的方法で、この時点では専門家以外の者がルーチンに用いるには実用的でない。最先端の方法であっても、サンプリングが難しく、分子力場／パラメーターが不十分で、水中の静電学の理解が不完全であるために、不正確になることもある（Ajay & Mureko、1995）。厳密性が低い（より使いやすい）コンピューター法は、結合親和性の定量的予測を行う際に、特にM1結合に関与しているような複数の極性でイオン性の相互作用を扱う場合には、信頼性が低い傾向にある。
【００４１】
シリコングラフィクスワークステーションを用い、妥当な時間で分子力学の計算を行うために、ペプチド阻害剤とMg2ADPと共にPKAの活性部位を取り囲んでいる2層の残基をPKA三元構造から切り取った。次いで、M1官能基をP 0 Ala側鎖に付加し、PKA活性部位：Mg2ADP：改変ペプチド阻害剤複合体全体を、SYBYLを用いて適当な形式電荷を割当て、ガスティガーマーシリー（Gasteiger Marsili）点電荷を計算した後、距離に依存する誘電率でTripos力場を用いて300回の分子力学最小化にかけた。最大反復回数300の設定は複合体にいかなる重大なひずみがあってもこれを除去するのに十分で、収束に達しない場合にも全体の構造を開始X線構造から著しく「ずれ」させることはなかった。次いで、これらの最小化した複合体を画像で評価し、付加した個々のM1官能基が保存触媒残基および／またはMg2ADPと好ましい相互作用をするかどうかを調べた。この画像評価では、他の標準的相互作用評価の中でも特に、原子−原子の距離を測定して、水素結合およびイオン性相互作用が好ましく形成されているかどうかを調べた。
【００４２】
個々のM1官能基と保存触媒残基またはMg2ADPとの間の好ましい分子間相互作用は、必ずしも新規の阻害剤について増強された結合親和性が認められるということを意味しているのではない。極性M1官能基と極性PKA活性部位残基の両方の好ましくない脱溶媒作用（ならびに複合体エントロピー作用）はこの分析には含まれず、付加されたM1官能基が意図されたとおり保存触媒残基および／またはMg2ADP（またはMgATP）と相互作用するとしても、改変された阻害剤は対応するP 0 Ala阻害剤よりも効力が低い可能性があると言ってもよい点まで正味の結合親和性を低下させる可能性がある。この脱溶媒作用に伴う不都合によって結合親和性に正味の増大が見られない場合でも、これらのM1官能基は非ペプチド阻害剤類縁体をタンパク質キナーゼ活性部位における正しい位置に置くための配向基として有用である。これらの極性官能基は保存触媒残基およびMgADP/MgATPに隣接して受容されることが示された能力（ペンタペプチド骨格に適切につながれて）に基づいて特別に設計され、選択されたため、これらを活性部位内の別の位置に置くと（骨格が活性部位に有利に結合している一方で、これらの官能基が大量の溶媒へと伸びることができないようにつながれていると仮定して）、結合親和性が低下する結果となりやすい。段階1で特定のM1官能基が非ペプチド骨格を正しく配置しないと、段階2における合理的に連結している最初の特異的因子によって効力を改善しようとする試みは失敗に終わりやすいと考えられる。
【００４３】
文献中にはタンパク質キナーゼアッセイ法でADPを追加しているものは存在しない。文献における典型的なPKAアッセイ法（Glassら、1989）を、細胞における自然な1/10の比を反映させるため、ATP濃度の10％のADPを加えることによって改変した。このタンパク質キナーゼアッセイ法を以下「文献模倣」アッセイ法と呼ぶ。これはPKAならびにSrcに対して用いられてきた。文献および市販のタンパク質キナーゼアッセイ法の試験から、研究所ごと、会社ごとに一貫性に乏しく、これらのアッセイ法はすべて公知の細胞内の条件とはかなり異なる物理化学的条件を用いていることが明らかとなった。細胞内タンパク質キナーゼの阻害が薬物発見の最終目標であるため、細胞内で知られている全体の細胞質ゾルの物理化学的条件をより厳密に模擬する新しいタンパク質キナーゼアッセイ法を開発した。これらの「細胞模倣」タンパク質キナーゼアッセイ法の開発を、どの形のタンパク質キナーゼが所与の阻害剤に最も良く結合するかを調べるための新規な方法（STAIRe法）と共に、本明細書に記載する。データは、細胞模倣アッセイ法における新規の非ペプチドSrc阻害剤の活性を、LA25 Src形質転換細胞株で得られたものと相関させて収集した（下記参照）。
【００４４】
これら2つのアッセイ条件を、図3に示すとおりに設計したペンタペプチドを基本とするPKA阻害剤のいくつかに適用し、表1に示す結果を得た。同じアッセイ条件を同様に設計したペンタペプチドを基本とするSrc阻害剤にも適用し、表2に示す結果を得た。
【００４５】
（表１）PKAペンタペプチド骨格に付加している初期M1スクリーニング結果
2005514339.tif 000012
M1-Ile-NH2に結合する
2005514339.tif 000013
として表1中に識別される構造は、配列番号：2である。
【００４６】
（表２）SRCペンタペプチド骨格に付加している初期M1スクリーニング結果
2005514339.tif 000014
M1-Gly-Glu-Phe-NH2に結合するAc-Ile-Tyrとして表2中に識別される構造は、配列番号：3である。
【００４７】
表1のPKA阻害剤の大多数に対して選択した標準的ペンタペプチド配列は、図1に示す結晶構造が解明された時の、PKAに結合していたペプチド阻害剤の偽基質配列からのものであった。表2のSrcに用いた標準的ペンタペプチド配列
2005514339.tif 000015
（配列番号：3）は、Nair、Kimら、1995に記載されていた。PKA阻害剤を調製するために用いた化学反応のいくつかは、Nair、LeeおよびHangauer、1995に記載されている。いくつかのSrc阻害剤を開発するために用いた合成法はLaiら、1998に記載されている。
【００４８】
表1および表2の一連の結果から、セリンキナーゼPKAおよびPTK Srcはいずれも、様々な大きい極性M1官能基をP 0リン酸化部位に適応させうることが明らかである。さらに、STAIRe法（Choiら、1996参照）を用いて、スルファミン酸阻害剤8、および関連する阻害剤は、MgATP（MgADPやヌクレオチドではなく）も結合している場合に実際に最も良く結合することが示された。このことは、タンパク質キナーゼについて一般的に認められている反応機構において、これらの阻害剤はリン酸基転移後、MgADPと同時に結合しなければならない「最終産物阻害剤」1および12の類縁体であるため、幾分驚く結果であった。
【００４９】
これらの結果は、PKAとSrcはいずれも構造的に非常に類似の阻害剤に対し、大きく異なる結合親和性を示しうることも明らかにしている。例えば、スルファミン酸PKA阻害剤8（表1）のKiは、文献模倣アッセイ条件（L）下で0.16μMであるのに対し、等配電子のスルホンアミド7では1,875分の1の効力（Ki＝300μM）である。スルファミン酸阻害剤8は最終産物リン酸基阻害剤1とも等配電子であるが、文献模倣アッセイ条件（31倍）および細胞模倣（C）アッセイ条件（108倍）のいずれでもはるかに密接に結合する。基質Serと同様の位置にある酸素原子の有益な効果を、ホスホン酸塩2とリン酸塩1との比較、およびエーテル6とリン酸塩1との比較により示している。この酸素原子はセリン様OH側鎖としても配置して、結合を増強する（2を3Aおよび4Aと比較されたい）ことができ、よりセリンに類似の4Aの方が活性が高い。ジアステレオマー阻害剤3AまたはBおよび4AまたはBの活性の差から、M1設計において企図されたとおり活性部位である触媒残基Asp-166との特異的相互作用が実際に起こっていることが示唆される（図3）。
【００５０】
Src阻害の結果（表2）より、最終産物阻害剤12は、PKA最終産物阻害剤1と同様、文献模倣アッセイ条件からイオン強度がより高い細胞模倣アッセイ条件へと変えることで、活性が低下することが明らかである。しかし、極性M1官能基を有するPKA阻害剤はすべて、細胞模倣アッセイ条件下では活性が低かったが、３つのSrc阻害剤14、15、および17は、これらのイオン強度がより高いアッセイ条件下でもその活性を維持していた。また、ヒドロキシホスホン酸塩Src阻害剤13（RおよびSジアステレオマーの混合物）はPKA阻害剤3Aの類縁体で、いずれもおおざっぱに言えば、文献模倣アッセイ条件下ではそれぞれ対応する最終産物阻害剤12および1と同じ活性範囲である。ホスホン酸塩Src阻害剤13の側鎖長を炭素原子１個分短縮する（同時に連結されたOHを必ず除去する）ことにより、活性が改善された14（PKA阻害剤3と4の比較と同様）となり、より重要なことに、細胞模倣アッセイ条件下で活性が同等となる。16〜19のSrc結果（特に17、下記の非ペプチドSrc阻害剤に付加した類似のα-トリカルボン酸M1類縁体参照）からも、類似のアミドが非ペプチドSrc阻害剤と共に調査するための有用なM1官能基であることが示唆される。
【００５１】
非ペプチドSrc阻害剤の中にはSrcに対して二重の効果を持つものもあることが部分的原因となって、ペプチド骨格を基本とする化合物よりも非ペプチド阻害剤の方が好まれる。例えば、ホスホン酸塩阻害剤14は活性部位に競合的に結合してSrcを阻害するだけでなく、SH2に結合し、それにより分子内自己阻害メカニズムを開放することによって、Srcを活性化する（Xuら、1997）。この相反する効果により14のIC50曲線は普通とは異なり、低阻害剤濃度ではSrcは滑らかな用量−反応様式で（最初のより強いSH2結合により）刺激され（最大70％まで）、続いてより高濃度では典型的なIC50阻害曲線を示す（活性部位の低い親和性遮断による）。このペンタペプチド阻害剤の相反する活性化作用により、実際よりも活性部位阻害剤として効力が低いように見え、このペンタペプチド骨格に付加しているM1基を正確に評価するのが困難になる。しかし、Srcペンタペプチド骨格によって特定されたより良いM1基でも、活性部位の触媒領域に適応するはずで、したがって意図されたとおり、現在行っている非ペプチドSrc阻害剤試験のための有用な配向基である。PKAはSH2ドメインを有していないため、この複雑な問題はPKAペンタペプチド阻害剤のM1試験データを解釈する際の因子にはならない。
【００５２】
表1および表2の結果は、阻害剤の効力と活性の順位の両方に対し、アッセイ条件がどれだけの影響を持つかも示している。例えば、表1に示すとおり、文献模倣（L）アッセイ条件から細胞模倣（C）アッセイ条件に切り換えることで、効力が最小で3倍（阻害剤10）から最大で108倍（阻害剤1）変化することがある。また、阻害剤10は文献模倣条件下では1よりも効力が弱いが、細胞模倣条件下では効力が強い。表2のSrc阻害剤のデータは、阻害剤の多くが文献模倣条件から細胞模倣条件に変更することで効力を失うことを示している。Srcに対する効力の順位もアッセイ条件に影響されやすい。文献模倣条件下では阻害剤18は阻害剤17よりも効力が強いが、細胞模倣条件下では反対になる。細胞内での活性が目標であるため、非ペプチドSrc阻害剤の可能性を試験するための標準的アッセイ法として細胞模倣Srcアッセイ法を選んだ。細胞模倣アッセイ法における活性は、細胞内活性にとって必要ではあるが十分ではない。後述するとおり、細胞模倣Srcアッセイ法に続き、細胞浸透、代謝および他の細胞構成要素への結合も測定効力の因子となる細胞培養アッセイ法を行う。
【００５３】
調査した次のクラスのM1官能基はボロン酸基であった。この官能基は次のいくつかの理由によりM1として興味をそそられる候補である：1）非イオン状態で存在しうるため、細胞膜を通過しての非ペプチド阻害剤の受動的吸収を阻止しない。2）平面で三角形のボロン酸は、空の2p軌道を通じ、触媒Aspカルボキシル基またはATP/ADP末端リン酸基酸素などのタンパク質キナーゼ活性部位にアニオンが存在する、可逆的な四面体の共有結合ボロン酸塩複合体を形成すると考えられる（ボロン酸のよく知られた性質、LoomisおよびDurst、1992参照）。この活性部位求核体とボロン酸塩複合体を形成する能力は、セリンプロテアーゼの遅結合阻害剤を開発するために広く利用されており（例えば、KettnerおよびShenvi、1984参照）、求核性のセリンOHはボロン酸の空の2p軌道と共有結合を形成して四面体のボロン酸塩複合体となる（例えば、Skordalakesら、1997参照）。また、ボロン酸と尿素NH2との分子内複合体が、ジヒドロオロターゼの遷移状態類縁阻害剤を調製するために用いられた（Kinderら、1990）。3）ボロン酸はルイス酸としてはたらき、水中で水または水酸化物イオンとボロン酸塩複合体を形成することにより四面体水和物に変換される。したがって、これらのボロン酸水和物が図2で提唱された模擬リン酸基およびM1モジュールとして機能する可能性もある。この水和性はBaggioら（1997）が利用し、水和ボロン酸はアルギナーゼに対する遷移状態類縁阻害剤の官能基として機能した。これらの研究者は、阻害された複合体をX線により評価し、水和ボロン酸官能基が活性部位の触媒Glu-277カルボキシル側鎖と2つの水素結合を形成し、他の水和ボロン酸のOHの１つが活性部位の２つの触媒Mn2+と相互作用することを明らかにした。これらの結合相互作用は、タンパク質キナーゼ活性部位で提唱されているもの、すなわち、触媒Asp側鎖カルボキシル基とのH-結合および活性部位Mg2+との相互作用（図2および4を参照）と非常に類似である。タンパク質キナーゼ阻害剤のためのボロン酸の使用は過去に調査されたことはない。
【００５４】
ペンタペプチドを基本としたPKA阻害剤の分野において、ボロン酸官能基がM1モジュールの候補として表3に示す4つの阻害剤21〜24を用いて調製され、試験されている（これらの化合物を調製するために用いたいくつかの化学反応については、HsiaoおよびHangauer、1998参照）。
【００５５】
（表３）ボロン酸含有ペプチド阻害剤によるPKA阻害結果
2005514339.tif 000016
*非常に歪んだIC50曲線：阻害剤もまた基質であることが示唆される。
L=文献模倣アッセイ条件
C=細胞模倣アッセイ条件
Inh=阻害
Sti=刺激
表3中にAc-RRGXI-NH2として識別される構造は、配列番号：4である。
【００５６】
これらのボロン酸含有PKA阻害剤を試験する際に、表3に示す時間依存性阻害の調査中に、対応するペンタペプチド偽基質阻害剤20を内部対照として含めた。文献模倣アッセイ条件下、予備インキュベーションせずに得られた最初の結果より、鎖長が最短のL-アミノ酸21は偽基質阻害剤20と同じ親和性（すなわち、Ki約9μM）で結合していることが示唆された。この側鎖の鎖長が伸びるにしたがい（23、次いで24）、結合親和性は低下するようであった。非天然アミノ酸の立体化学を21のLから22のDに反転させると、結合親和性は3倍に上がるようであった。この結合における改善は、21のボロン酸のOHはL-ホモセリンと同じ鎖長であるが、天然の基質L-セリンは鎖長が炭素1個分短いことから起こると考えられる。PKA三元構造によるモデリングの結果より、α-炭素の立体化学を21のLから22のDに反転させ、次いで触媒残基（Asp-166およびArg-168）に隣接する天然基質L-セリンのOHの位置をより厳密に模して側鎖を配置することにより、ボロン酸のOHが幾分後退させられることが示された。モデリングの結果は、続いて、PKAをこれらの阻害剤と共に競合するペプチド基質（ケンプタミド：LRRASLG-NH2（配列番号：5））を加えずに4時間までインキュベートすることにより、21と22の両方が基質として機能し、D-ジアステレオマーである22がより速やかにリン酸化されるという知見によって裏付けられた。
【００５７】
これらのボロン酸阻害剤も基質になるという事実は、細胞模倣条件下、予備インキュベーションを行った場合と行わない場合の両方で得られた、大きく変形したIC50曲線によってより明らかになった（PKAとSrcはいずれも、文献模倣条件下よりも細胞模倣条件下でより活性が高い酵素である）。これらの結果を得るために用いたアッセイ法において、P32リン酸化ケンプタミド生成物（γ-P32 ATPから生成した25）を基質インキュベーション期間の終わりに３つのカチオン基（２つのArgとN末端）を介してホスホセルロースフィルターペーパーに結合させることによって単離し、次いでペーパー上に単離されたリン酸化生成物のレベルを液体シンチレーション計数によって測定した（cpm）。ボロン酸阻害剤21〜24もその配列中に２つのArgを有するため、ケンプタミド以外にこれらもホスホセルロースペーパーに結合することになる（正電荷が１つ少ないため、一貫して、または完全に結合はしないが）。したがって、阻害剤として分析した場合、生成したリン酸化ケンプタミドの量だけではなく、同時に生成したリン酸化阻害剤（例えば、下記の26参照）の量も計数された。正味の結果は、場合によってはより高い阻害剤濃度では正味の「刺激」を示す変形したIC50曲線が得られるということである。Dジアステレオマー22が細胞模倣条件下、PKAと共に4時間予備インキュベートすると、最も大きい見かけの「刺激」を示し（71％）、次いでLジアステレオマー21（19％）、その次が１炭素同族体の23（5％）で、これら3つはすべてPKAの基質であることを示している（表3）。これら「阻害剤」の潜在的な基質としての挙動によって、現在のアッセイ法ではその阻害抗力の正確な測定は不可能となる。しかし、データから、ボロン酸官能基をCH2基だけで同族体化することにより（ボロン酸非ペプチドSrc阻害剤による同族体化も実施してもよい）、結合親和性および基質として機能する能力が低下するようである。
2005514339.tif 000017
【００５８】
リン酸化されたケンプタミドは配列番号：6である。リン酸化された22は配列番号：4である。ボロン酸阻害剤21および22は図4に示すとおり、同じであるがケンプタミドを加えないアッセイ法を行い、反応を様々な時点で停止させることによってPKAの基質であることが明らかにされた。グラフはそれぞれのリン酸化の速度およびレベルを示しており、ケンプタミドなどの標準的L-Ser基質と同様に、時間の経過に伴い最初の速度動態の典型的消失が認められる（基質の枯渇と最終産物の阻害による）。図示した21と22の比較を、cpmを直接比較できるよう、等しいボロン酸基質濃度で、等しい細胞模倣アッセイ溶液を用いて、同じアッセイで実施した。グラフより、D異性体22では1時間以内に最初の速度動態が消失したが、L異性体21では直線性が失われるのが幾分遅いようで、出発物質の消費が遅いことが示唆された。ボロン酸部分がPKAによってリン酸化されるのは驚くべき知見であったが、生成したホスホン酸−ボロン酸混合無水物（例えば26）が非常に安定で、pH7.2/37℃のアッセイインキュベーションに耐え、10％TCAを用いた酸による反応停止後、ホスホセルロースペーパーに結合させ、このホスホセルロースペーパーを25mMリン酸で洗浄（X3）することにより単離されたことは、さらに驚くべきことである。ホスホン酸およびボロン酸の混合無水物に対してSTN基礎構造検索を行い、823°Kでエタンからアセトアルデヒドへ部分酸化するための固体表面含浸触媒としてのホウ酸およびリン酸から生成された類似の推定（証明されてはいない）無水物に関する実験および理論的計算についての文献を３つだけ見いだした（ZhanpeisovおよびOtsuka、1992、Otsukaら、1992、Murakamiら、1990）。しかし、この非常に変わった無水物について、固体表面から遊離して合成、単離、または特徴付けがなされたことはない。したがって、これはタンパク質キナーゼ阻害剤設計のための新規な酵素反応および化学的実体である。
【００５９】
探索した次のクラスのM1官能基はハロゲン基であった。この官能基は、いくつかの理由からM1の興味深い候補である：１）それは良好な水素結合アクセプターである；および２）それは代謝速度を減少させ、よってインビボにおける利点がある。
【００６０】
ハロゲン官能基を調製し、以下に示した阻害剤を使用して可能性あるM1モジュールとして試験した（この化合物の調製に使用した化学的性質については実施例１を参照されたい）。
2005514339.tif 000018
【００６１】
この阻害剤は、実施例1に示したアッセイ法手順を使用して、Src阻害について試験した。得られた結果を表7に示し、これは上記阻害剤における  40μMのIC50を示す（表7の1a）。この阻害剤は、下記のスクリーニング法に基づいて選択した非ペプチド骨格（インドール）を含む。
【００６２】
前述のM1をつないだSrcおよびPKAペンタペプチド骨格の評価より、段階1（図1）に示した可能な非ペプチド骨格のスクリーニングに用いることができる様々な配向M1基が特定された。Src非ペプチド骨格スクリーニングのために利用できる可能性があるM1のメニューから、ボロン酸（22から）、ホスホン酸塩（14から）、およびスルファミン酸（8から）が選択された。これらの中で、ボロン酸M1基が段階1の非ペプチド骨格スクリーニングに有効であることが証明された。
【００６３】
ATPと競合しない非ペプチドSrc阻害剤の設計に利用できる、最も有用な結晶構造は、天然のSrc構造およびIRTK：ペプチド：AMP-PNP三元構造である。以下で論じるすべてのモデリング研究では、SYBYL分子モデリングソフトウェアパッケージをシリコングラフィクスワークステーション上で用いる。
【００６４】
SrcおよびIRTK構造は非ペプチド骨格の設計およびコンビナトリアルライブラリーにおける定性的指標としてのみ用いられるため、過去のPKAモデリング研究と同様に天然のSrcおよびIRTK三元構造から周囲の残基の2層に加えて活性部位を切り取った。比較相同モデリング法を用いてSrc構造上にSrc残基配列424〜418を構築する指標とするために、IRTK：ペプチド：AMP-PNP三元構造活性部位領域を鋳型構造として用いた（HutchinsおよびGreer、1991参照）。これらの残基は天然Src結晶構造では乱雑で、そのためX線では見ることができなかった。これらは、いくつかのモデリング研究で重要なペプチド基質のためのP+1からP+3結合部位の形成を助けるため、再導入した。IRTK三元構造における類似の残基はX線で見られ、結合したペプチド基質と直接相互作用する。事実、この配列の位置に秩序を与え、X線で見られるようにするのは、おそらく結合したペプチド基質と考えられる。次いで、IRTK三元構造を鋳型に用いて、Srcペンタペプチド基質Ac-Ile-Tyr-Gly-Glu-Phe-NH2（配列番号：1）（Nairら、1995）をSrc活性部位に再度結合させた。次いで、この複合体を部分的にきれいにするため、手動でわずかな調整を行い、すべての水素原子を加え、適当な形式および部分電荷（ガスティガーマーシリー（Gasteiger Marsili）法により計算）を加え、次いで過去のPKAモデリング法と同様、複合体全体をTripos力場を用いて300回の分子力学最小化にかけた。このモデリングした複合体を図5に図示している。このSrc：ペプチドおよびSrc：阻害剤モデルにおけるいかなる不正確性も、数と多様性をコンビナトリアルケミストリーの様式でSrcモデル活性部位における特定の結合領域の構造に対する不確定性のレベルに合わせておおよそ調整している、一連の側鎖を実験的に評価することによって適合させる（下記参照）。
【００６５】
図5に示すとおり、Srcに組み込まれた残基424〜418は、基質主鎖（IRTKペプチド基質と同様）とのベータシート型水素結合相互作用を通じて、P+1からP+3基質残基Gly-Glu-Phe-NH2とそれぞれ相互作用する。Lys 423は２つの重要な相互作用に関わっている：1）βおよびγCH2は疎水性結合相互作用に関わっているTyrフェニル環のP 0の上に折り重なっている、2）この側鎖の残りのCH2-CH2-NH3+は示されたとおりP+2 Glu側鎖と塩橋を形成するよう伸びている。P 0 Tyr疎水性結合ポケットの残りはフェニル環の下のPro 425およびフェニル環の上のCys 277側鎖の一部によって形成される。ペプチドSrc基質の大きなコンビナトリアルライブラリーを用いて、Songyangら（1995）は、P+1位に対して最も一般的に選ばれる側鎖はGlyと、続いてGluであることを見いだした。本発明のモデルにより、P+1 Glu側鎖は図5に示すとおり、近接するArg 469と塩橋を形成する可能性がある。過去に、研究者らはP+2位にGluだけが選ばれることを見いだし、本発明のモデルはこの側鎖がLys 423側鎖と塩橋を形成することを示している。P+3位において、Pheが非常に強く好まれ、モデルはこの側鎖がPhe 424側鎖とスタッキング相互作用を形成することを示している。P-1位において、SongyangらはIleが最も好ましい残基であり、続いてValおよびLeuの順であることを見いだした。モデルはP-1側鎖を結合するための疎水性ポケットが主にTrp 428、Ala 390およびLeu 347によって形成されることを示している。酵素は反応が起こる部位に近いこの領域でより重大な相互作用を形成することが多いため、P 0 Tyr主側鎖は触媒として能力のある複合体の活性部位と強く相互作用（水素結合であるが）すると予想される。IRTK三元複合体は、P 0 Tyr NHまたはカルボニルのいずれとも良好な水素結合を示さない。IRTK構造におけるこの相互作用に最も近い候補残基は、側鎖のNH2がTyrのカルボニル酸素から3.71Åの距離にあるAsn 1215である。背景および重要性の項で述べた４つの残基を用いてIRTK三元構造をSrcの天然構造に重ねると、Src構造のAsn 468は類似のIRTKのAsn 1215と非常に近い位置にあることが判明した。このことは、この保存された残基が重要な役割を果たしており、触媒として活性な複合体においては基質のP 0 NHおよびカルボニルにやや近く（すなわち、約1Å）移動して図5に示す水素結合相互作用を形成する可能性があることを示唆している。最後に、触媒性のArg 388およびAsp 386はSrcモデルにおいて、γリン酸基のATPからTyr OHへの転移を触媒するために正しく配置されている。
【００６６】
このように、Src：ペプチド基質複合体は、実験的に評価する新しい骨格を選ぶ前に、すべて適当に連結されたM1官能基を有する、可能な非ペプチド骨格のモデルとして、また特異的因子の好ましい置換位置を決めるために用いることができる。IRTK：ペプチド：AMP-PNP三元構造も、これら可能な骨格および好ましい置換位置のモデルとして用いることができる。これらの骨格は、図1に示す方法に従い、適当な特異的因子を用いてさらに開発することにより、選択的PTK阻害剤の開発のための広範な有用性を有する。
【００６７】
このSrc：ペプチド基質モデルで評価した第一の非ペプチド骨格はナフタレン骨格であった。これは、ATPと競合しない非ペプチドPTK阻害剤のために二環式芳香族骨格を初めて用いた例である。この目的のためのナフタレン骨格の有用性は、IRTKおよびEGF受容体PTKの非ペプチド阻害剤を開発することによって示された（Sapersteinら、1989）。IRTK三元複合体は続いて、この骨格をSrc阻害に適合させるために用いられた（Marsiljeら、2000参照）。まず、図6に示すとおり、原子a〜dのペプチド基質への最小自乗フィッティングを行うことによって、ナフタレン骨格をSrc活性部位に合体させた。このようにして、ナフタレン骨格は図6の矢印によって示される環化および基質Tyr NHの置換基として付加されたOHによって、ペプチド基質に関連づけられる。これは、マーシルジェ（Marsilje）2000に記載のこの骨格をIRTK構造に合体させるために用いられた工程と、本質的に同じ工程である。次いで、ペプチド基質を活性部位から除去し、様々なM1官能基や特異的因子S2およびS3を示されたとおりに骨格に付加し、次いで複合体を個々に300回の最小化にかけた。結合様式を図7に示すイソキノリンおよびインドール骨格を設計するためにも、この同じ工程を用いた。
【００６８】
これらのモデリングした複合体すべてにおいて、選択的因子S2は基質P-1 Ile側鎖と同じポケット内で結合しうる様々な疎水性側鎖からなり、選択的因子S3はペプチド基質結合部位のP+1からP+3領域で結合しうる様々な分子断片からなる（図5）。M1が結合する活性部位領域はすべてのタンパク質キナーゼで高度に保存されているため、過去にペプチド骨格を用いて特定されたM1官能基の小さいメニューを骨格の示された位置に連結するための最初のM1基とした。２つの選択的因子結合部位のうち、S2のための疎水性結合腔の構造は、S3のためのP+1からP+3結合領域よりも、高い信頼性をもって知られている。これは、S3結合部位は部分的には比較相同モデリングによって構築されたのに対し、S2部位は天然SrcについてX線で求められた構造からほとんど変わっていないからである。これらのM1、S2およびS3についてモデリングされた結合部位における信頼性のレベルにばらつきがあることを考慮して、コンビナトリアルライブラリーにおける側鎖の多様性と数が最も多いのはS3部位で、続いてS2部位およびM1の順になるようにコンビナトリアルライブラリーの多様性を調整する。
【００６９】
有望な非ペプチド骨格を実験的に同定するためのM1官能基を用いたSrc結果を表4に示している。
【００７０】
（表４）初期の段階1の結果：細胞模倣アッセイ法におけるSRC阻害(%)
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【００７１】
表4のデータから、いくつかの結論が導き出せる：1）骨格に連結された適当なM1官能基によって、低いが測定可能な阻害効力を得ることができる（例えば27および38）。2）このタイプのスクリーニングにとって1mMの阻害剤濃度は望まれるよりも高いが、100μMは低すぎる。M1基を有する骨格のスクリーニングは500μMで最適に実施される。3）PKAペンタペプチド骨格（22、表3および8、表1）またはSrcペンタペプチド骨格（14、表2）を用いてそれぞれ特定されたボロン酸、スルファミン酸、およびホスホン酸M1官能基は、モデルとなるナフタレン阻害剤：Src複合体で特定されたM1の好ましい位置である、ナフタレン環の2位に置いた場合（それぞれ27、28および30）に測定可能な活性を示す（図6）。ボロン酸またはホスホン酸M1基を1位に動かす（32または33）と、活性が低下した。4）PKAペンタペプチド骨格上で活性が低かった、関連するM1スルホンアミド官能基（7および9、表1）は、ナフタレン骨格の2位（31）または1位(34）に付加した場合にも活性が低い。ナフタレン2位のスルホン酸類縁体（29）は、たとえ1mMでも完全に不活性である。5）ボロン酸M1基をナフタレンの2位と類似の位置に配置した場合は、ナフタレン骨格は著しい活性低下なしにベンゾフラン（35）またはベンゾチオフェン（36）骨格に置き換えることができる。6）ボロン酸M1基がイソキノリン（37）またはインドール（38）骨格のモデリング結果によって示された位置に付加した場合も、活性化合物を提供する（図7）。しかし、インドール骨格はイソキノリン骨格よりも明らかに好ましく、Asn 468の水素結合を与える能力（図7参照）がより高い活性のために重要であることが示唆される（これはイソキノリンのプロトン化を必要とするが、隣接する電子吸引性のエステル基にとっては好ましくない）。この結論は、ペプチド基質が水素結合供与ペプチド結合NHを類似の位置に配置しうる（図6）と考えることによって、また同等に配置されたフェノールのOH（図6）が効力を改善する（フェノールのOHは受容体よりもはるかに良好なH結合供与体である）という知見によっても支持される。8）他のM1基と直接比較すると、ボロン酸基は優れている（例えば、27対28〜31、38対39）。9）ビフェニル骨格をSrcおよびIRTK活性部位内にモデリングし、この骨格の有望な結合様式が認められた。コンビナトリアルライブラリーがビフェニル骨格で作製され（Paviaら、1996参照）、モデリング結果は有望なものであった。したがって、ボロン酸M1基を有するパラ（40）およびメタ（41）異性体を評価した。両ビフェニル化合物は最良のナフタレンボロン酸（27）と同等の効力を示し、したがって、さらに評価し、開発するためのもう一つの骨格構造（２つのフェニル環は平面ではない）を提供する。
【００７２】
M1基だけが付加している裸の骨格は結合親和性が低いことが多いため、2-ナフタレンボロン酸およびスルファミン酸阻害剤のIC50およびKiを求めて、典型的な用量／反応IC50曲線を確実に得られるようにした。この分析から、より強力な阻害剤で見られる典型的な形状の用量／反応曲線が得られた。これらの単純な阻害剤のIC50およびKiから、ボロン酸阻害剤27がスルファミン酸類縁体28よりも効力が高く、Kiは約554μMであることも確認された。
【００７３】
これらの単純な阻害剤についてさらに開発を進める前に、これらに向けられた次の問題はその阻害の様式、特にATP競合的阻害剤であるかどうかということであった。ナフタレン阻害剤27および28の場合、ATP濃度が３段階で1mMまで上昇する間のIC50を測定した。比較として、ペンタペプチドホスホン酸Src阻害剤14（表2）のIC50も測定した。これらの阻害剤のいずれかがATPと競合していたならば、そのIC50はATP濃度に比例して上昇するはずである（すなわち、破線）。示されるように、3つの阻害剤のIC50はすべて、ATP濃度が上昇しても本質的に一定値を保ち、これらがATP競合的阻害剤ではないことが証明された。非常に類似しているが、費用がはるかに低く抑えられる（市販のSrcは高価である）分析を、インドールボロン酸阻害剤38で実施した。この場合、38の阻害％を、阻害剤濃度は一定の500μMであるが、ATP濃度は200、500および1,000μMに漸増させて測定した。ここでも、阻害剤の効力はATP濃度が上昇しても低下することはなく、38も非ATP競合的であることが示された。
【００７４】
段階1で得られた最初の結果から、この方法でさらに開発を進めるための有望な骨格を特定できることが示唆される。段階1の最大の不確定性は、このようにして特定された骨格の中に、先のモデリング評価によって示唆された様式で結合していないものがあることである。これは本質的には「偽陽性」の問題である。これら「偽陽性」は段階2で、モデリングされた複合体を指標に用いて結合改善について評価されれば、落とされると考えられる。偽陽性結果の中には、M1基だけが付加した基本骨格が容易に得られるため、段階1で許容されるものもある。さらなる阻害剤開発のために、新しい骨格を段階2および段階3に進める必要があるたびに、段階1に戻ることもできる。段階1を繰り返すたびに、得られた最良のM1を用いることができる。現在のところ、ボロン酸M1基は裸の骨格に付加して測定可能な活性を示す能力が証明されているため、この基が使用されている。ボロン酸M1基はまた、次の理由により保存触媒残基との共有および非共有結合のための複数の興味深い可能性を提供する：ボロン酸M1基は、1）水和できる、2）電子に富む活性部位原子とホウ酸塩複合体を形成しうる、および／または3）リン酸化され、次いで活性部位の求核物質と反応するか、もしくは別の非共有相互作用に関与することができる。表4のデータから、段階2の最初の試みとして、ナフタレンおよびインドール骨格をM2として選択した（ビフェニル骨格も好ましい骨格である）。また、Srcペプチド基質においてP 0 チロシンをナフチルアラニンおよび類縁体で都合よく置換することができ（例えば、Alfaro-Lopezら、1998）、ナフタレンおよび関連する骨格がP 0部位に結合しうるという知見をさらに支持していることは言及に値する。
【００７５】
ボロン酸M1基を有するナフタレンおよびインドール骨格（すなわち、表4の27と38）の結果を比較して、インドールの水素結合供与NHおよび／または隣接するエステル基が抗力増強の原因と考えられる。したがって、段階2における最初の試みの１つは、モデリング結果（図6）により示唆されたナフタレン骨格の隣接する位置にヒドロキシル基およびアミド（S2も共に）を付加することであった。インドール骨格については、１つの優先事項は、S2特異的因子によって効力が増大しうるかどうかを見るために、いくつかのアミド類縁体を調製することであった（図7）。これら最初の類縁体の合成を容易にするために、ボロン酸M1基をOHで一時的に置換した。OH基は触媒残基との相互作用によってリン酸化速度が加速される天然の基質M1であるため、OH基もM1基に要求される触媒残基との相互作用をすることが知られている。いくつかの最初の類縁体で得られた結果を表5に示しており、非ATP競合的であると報告されている文献に記載の2つのSrc阻害剤50および51と、細胞模倣Srcアッセイ法で突き合わせて比較した結果も併せて示している。これらの結果のいくつかと、別の類縁体が、マーシルジェ（Marsilje）2000に記載されている。
【００７６】
（表５）初期の段階2の結果：細胞模倣アッセイ法におけるSRC阻害(%)
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【００７７】
イミノクロメン骨格はナフタレン骨格と密接に関連しており、その結合様式はモデル（図6）に基づき非常に類似していると予想されるため、阻害剤50および類縁体（Huangら、1995）は特に興味が持たれる。一部にはこの密接な類似性により、表5に示すとおりヒドロキシアニリンのナフタレンおよびインドール骨格とのアミドを試験した。また、これらのヒドロキシアニリンアミド類縁体によるSrc活性部位でのモデリング試験から、このヒドロキシル基はペプチド基質と同様にSrcのPhe 424〜Ala 422骨格のペプチド結合との水素結合相互作用に関与しうることが示された（図5参照）。これらのモデリング試験から、同族のヒドロキシベンジルアミドも活性で、より重要なことに、付加している側鎖がP-1側鎖ポケットで結合する（例えば、図5のArg 469に）ための置換位置（すなわち、ベンジル炭素）を提供することも示された。
【００７８】
表5のデータより、次の結論を導き出すことができる：1）ナフタレンおよびインドール骨格の両方でアミドによる伸長部分を付け加えると、これらの骨格がSrc活性部位で結合したモデルによって予想されるとおり、効力を高めることができる（42対43-メタおよび47対48の場合に約5倍）。2）ナフタレン骨格のアミドの隣にヒドロキシル基を付加すると、Srcモデルによって予想されるとおり効力を高めることができ（43-メタ対44の場合に約5倍）、また、Asn 468がこのOHと水素結合することも示唆される。3）M1のOH基をSrcモデルにおいて最良と予想される位置から隣の位置に移動させると、効力が1桁低下する（43-メタから45）。4）ヒドロキシアニリン伸長部分のレジオ化学に対し、インドール骨格はナフタレン骨格よりも反応性が低い（48対43）。5）ナフタレンおよびインドール骨格では、ヒドロキシベンジルアミドを用いることによって生じる１炭素同族体化は許容される（46対43および49対48）。6）ナフタレン骨格の２つのM1ヒドロキシレジオ異性体はいずれも非ATP競合的である（Marsilje 2000参照）。7）メチルヒドロキシアニリンおよびヒドロキシベンジルアミド阻害剤はすべて活性が低いことが判明し、アミド伸長部分のヒドロキシル基は水素結合供与体として機能していることが示唆された。この点に関しては、もう一つのSrcペプチド基質コンビナトリアルライブラリー試験において、SerおよびThrがP+2位の最も好ましい残基の2つであると特定され（Alfaro-Lopezら、1998）、アミド伸長部分のOHにとってモデリング試験で示唆されたPhe424〜Ala 422ペプチド結合以外に他の結合の可能性があることが示唆されることは言及に値する。8）過去に文献に開示された最も強力な非ATP競合的非ペプチドSrc阻害剤（50）は、細胞模倣アッセイ条件下で試験した場合、報告されたほどの効力を示さず（Huangら、1995によって報告されたIC50＝118nMに対し、100μMでわずか30％の阻害）、最も類似の阻害剤（50対45）を含むいくつかの今回の阻害剤（特に43-メタ）よりも効力が低い。彼らのアッセイ（Huangら、1995）で50のヒドロキシレジオ異性体について報告された構造活性相関（SAR）も、関連するナフタレン阻害剤で得られたSARに対応していない。例えば、彼らのアッセイ法では、最も強力なナフタレン阻害剤43-メタのイミノクロメン類縁体は50の効力の230分の1である。イミノクロメン骨格に比べてナフタレン骨格の重要な利点は、ナフタレン骨格ではP-1疎水性部位に接近するための非常に望ましいS2特異的因子を付加することができる（図6参照）が、イミノクロメン骨格では同様の位置は環の酸素原子によって占有されているため、置換することができない点である。
【００７９】
Src細胞模倣アッセイ法における阻害剤の効力を、他の文献上の非ATP非ペプチドSrc阻害剤に対してさらに較正することができる。別の2つの例は、エルブスタチン類縁体の「チロホスチン」ファミリー（LawrenceおよびNiu、1998参照）の一員である51（ST 638、Shiraishiら、1989）および天然生成物のPTK阻害剤ピセアタノール52（Thakkarら、1993）である。細胞模倣アッセイ法では、これら公知の阻害剤はすべて報告されているよりも効力が低く、このアッセイ法は高い効力を得ることに関して特に要求がきびしいことが示唆される。すべての阻害剤について完全なIC50曲線を作るには市販のSrcは高価すぎるため、Src阻害剤の最初の試験は単一の濃度を用いて（三回繰り返して）実施する。しかし、IC50用量反応曲線は直線ではなく、100μMでの約50％の阻害と100μMでの約90％の阻害との間の差は実際には2倍ではなく10倍である（例えば、45対43-メタ）ことは述べておくべきであろう。したがって、文献のSrc阻害剤50〜52は、現在の最も強力な阻害剤43-メタに比べて1桁以上活性が低いのである。
【００８０】
これらの阻害剤の効力を報告している文献で見られる矛盾、PKA阻害剤を用いて以前に述べられたアッセイ条件の感受性、および多くの研究所および市販のタンパク質キナーゼアッセイキット間に一貫性がないことが、この分野で見逃されていたが、非常に重大な問題である。本発明によって製造される阻害剤は他のアッセイ条件下でも効力が高いかもしれないが、全細胞または組織アッセイ法に進むための化合物を選ぶ前に阻害剤を評価するための最初の効力および順位指標として、細胞内の物理化学的条件をできる限り模した細胞模倣アッセイ法を用いるべきである。以下にさらに詳細に述べるとおり、ここまでに細胞模倣アッセイ法から得られた最も強力なナフタレンを基本とする阻害剤（すなわち、43-メタ、IC50＝18μM、およびKi＝10μM）は、pp60v-src刺激細胞増殖の特異的阻止においても有効で、IC50は同程度の約25μMである。これは、細胞模倣Srcアッセイ法が予測的であるというだけでなく、このクラスのナフタレンを基本とする阻害剤は容易に細胞膜を通過して細胞内Srcを阻害することも示唆している。
【００８１】
前述のいくつかのナフタレンおよびインドール阻害剤の類縁体は、図6および図7に示すとおり、M1 OHの代わりのボロン酸またはハロゲンのM1基および／またはSrc P-1部位で結合するために連結されたS2疎水性特異的因子を用いて調製することができる。次いで、ナフタレンおよびインドール骨格を、以下に述べるとおりに段階3に進めることができる。段階1からの新しい骨格で段階2を繰り返すごとに、以前の骨格で見いだされた最良の選択的因子S2および／またはS3を段階3のコンビナトリアルライブラリーで用いることになる。M1、S2、およびS3の最適な組み合わせは各骨格で異なると考えられるとはいえ、先の関連した骨格（例えばナフタレンからインドール骨格に移る場合）で最適であると判明したものは、新しい骨格による段階2のよりよい初期特異的因子として用いるのに適していると考えられる。Src阻害剤のため、または後の別の治療的に重要なPTK阻害剤のために、十分な効力、選択性および適当な薬学的性質が得られるまで他の骨格を試す必要があるごとに、同じ工程を繰り返すことになる。
【００８２】
ナフタレン阻害剤を調製するために用いるいくつかの化学反応がマーシルジェ（Marsilje）2000に記載されている。表5のSrc阻害剤において、M1ヒドロキシル基の代わりにボロン酸官能基を連結するために、アリールトリフラート（Ishiyamaら、1997）またはハロゲン化アリール（Ishiyama、1995）のいずれかを市販のジボロンのピナコールエステルと結合させることができる、Pd(0)触媒によるクロスカップリング法を用いた。最近完了した実例を図8に示す。
【００８３】
図8に示す例は、M1位の立体障害が小さい方のOHを選択的にトリフラート化することができ、これはトリフラートを除去して56とし、続いて置換パターンを1H NMRで検証することにより証明されたことを示している。次いで、モノトリフラート53を示されたとおり所望のボロン酸55に変換した。同じ反応順序が、表5の阻害剤45に対応する42のレジオ異性体にも都合よく作用する。図9に示す合成模式図に従って、疎水性S2選択的因子をナフタレン骨格に連結することができる。
【００８４】
96ウェルプレート様式でナフタレン骨格のコンビナトリアルライブラリーを合成するために、ナフタレン化学反応を固相に変換することができる。44で表されるナフタレンレジオ異性体は、マーシルジェ（Marsilje）2000に記載のとおり、市販の3,5-ジヒドロキシ-2-ナフトイン酸から容易に得られるため、ここまではこの活性が低い化合物でモデル反応を行ってきた。これまでに成功したモデル反応を図10に示している。
【００８５】
これらのモデル反応は、ナフタレン骨格をワン（Wang）樹脂に結合し（63）、次いでトリフラートへの化学反応（この場合、ボロン酸エステル64へのPd(0)触媒によるクロスカップリング）後、温和な条件下での切断（65）を実施することが可能であることを示している。63のエステルは、鹸化した後カップリング反応を行い、S3選択的因子を含むアミドを形成することもできる。
【００８６】
ナフタレン骨格は現在のところ、コンビナトリアルライブラリーで調査すべき3つの多様性を示す部位、M1、S2およびS3を提供する。以前の研究（Paviaら、1996）で用いられた可能性のあるものと類似の96ウェルプレート反応器による固相コンビナトリアルケミストリー。前述した理由により、S3について最も数が多く、多様な側鎖が用いられ、次にS2、そしてM1の順となる。前述の合成モデルに基づき、これらのライブラリーを調製するための1つの可能な全合成方法を図11に示している。
【００８７】
もちろん、このルートで問題が生じた場合は、多くの他の可能性がある。例えば、67を得るための光延反応の収率が低すぎる（付加された隣接アリル基の立体的過密状態の増大によるが、おそらく図10で得られた92％の充填を考慮すれば問題ではない）場合、アシルスルホンアミド「セーフティキャッチ」リンカー（Backesら、1996）を用いて、骨格をOHではなくカルボキシル基によって樹脂につなぎ、最後にアミドを形成する（過剰のアミンは切断後に酸性樹脂を通して濾過することにより除去することができる）こともできる。同様に、ベンジルエーテル存在下でアルケンの還元（67から68）が望まれるが、問題がある場合には、他のリンカーおよび／または樹脂を用いることもできる。図11で提唱されている化学反応の第一の用途は、ボロン酸M1基を含み、適所にアリル側鎖を持たない96個のアミドのライブラリーを単純に調製することで、これら2つの複雑化要因は最初は問題とならず、最も有望なS3因子を速やかに同定することができる。
【００８８】
SrcモデルのP-1部位への候補側鎖のモデリング（図6）に基づき、また対応するウィッティヒ試薬を調製するために必要なハロゲン化物が市販されているかどうかに基づき、少なくとも14のS2疎水性側鎖（直鎖、分枝、および環状を含む）がさらなる試験のために特定される（対応するアルケンも調査する場合には28）。下記のS3選択的因子として可能性がある基を提供する、少なくとも96の市販のアミンが利用できる：1）炭化水素（4）、2）水素結合受容体を含むアルキル基（4）、3）水素結合受容体および供与体の両方を含むアルキル基（19）、4）水素結合受容体および供与体を含むアルキル／アリール基（25）、5）アリール水素結合受容体および供与体（10）、6）複素環水素結合受容体および供与体（20）、7）カチオン基を含む側鎖（4）、8）アニオン基を含む側鎖（9）、およびSrc活性の内部対照としての阻害剤43-メタからの3-アミノフェノール側鎖。Srcモデルにおけるこの結合部位の不確定性レベルが高いことにより、ここではライブラリーの過剰な偏りが生じないよう、S3のために広範囲のアミンが含まれた。
【００８９】
ほとんど同じ様式で、インドール骨格をコンビナトリアルライブラリーに作製することができる。この場合、類似のMinsunobu反応が知られている（BhagwatおよびGude、1994）ため、ワン（Wang）（または他の）樹脂につなぐための連結点としてインドールのNHを用いる。置換インドールの合成のために多くの合成法が開発され、S2疎水性側鎖を含めるためのルートが設計されている（図7）（Ezquerraら、1996）。
【００９０】
中間体69からの反応2で形成されるトリフラート官能基（図11）は、アミンに変換し（Wolfeら、1997）、次いで図12に示す反応順序に従って一連のアミドまたは他のアミン誘導体に変換することができる。事実、トリフラートは用途の広い合成ハンドルで、他の官能基に変換することもできる。
【００９１】
アミン72が得られれば、既知のM1（例えば、表5のSrc阻害剤28からのスルファミン酸および表3の17のアミド−酸）を、このより発展した骨格と共に評価することができ、いくつかの新しいアミン誘導体可能なM1として評価する。例えば、構造73に示す水和トリカルボニルアミドM1基（およびその非水和前駆体）を、この合成法を通じて得ることができ（Laiら、1996参照）、保存触媒残基との様々な興味深い相互作用を形成することができる。
【００９２】
前述のモデリング法に従い、図13に示すボロン酸M1基の一連のヒドロキシル基含有類縁体を、SrcおよびIRTK活性部位でモデリングし、興味深い可能性の一部として図示した相互作用／結合様式を見いだした。ボロン酸をリン酸化することにより、別の興味深い可能性が得られる（例えば、得られた混合無水物と活性部位求核体との反応を通じての自殺型阻害）。Tyr様フェニル環上に別のヒドロキシル基があることが必要不可欠で、多くのPTK阻害剤（例えば、表5のピセアタノール52）では一般的で、PKAホスホン酸阻害剤では側鎖上で有益であることが示された（例えば、表1の2対3および4）。したがって、図13に示すとおり、ボロン酸阻害剤のM1の設計に1つまたは複数のOHを付加することは、効力を著しく増強することがある。これらのOH基はまた、触媒AspおよびArgを超えてボロン酸側鎖を伸長し、PKAボロン酸同族体の場合におそらく生じている、炭化水素でそれらを覆うことに伴う不都合はない（表3の23および24）。ヒドロキシボロン酸76および77への可能な1つのルートは、Mattesonのキラルなボロン酸エステルによる同族体化法を用いることである（Mattesonら、1987、1988および1990参照）。
【００９３】
本発明の好ましい態様において、第一モジュールは第一モジュールをペプチド骨格に連結することによって製造される。1つまたは複数の官能基のうち少なくとも1つがハロゲンであるタンパク質キナーゼの触媒残基に優先的に結合する1つまたは複数の官能基を同定する。さらに、第一モジュールを第二モジュールに組み合わせて、ペプチド骨格を第二モジュールで置換する。
【００９４】
好ましい第一モジュールは、ハロゲン、ならびにボロン酸、ヒドロキシル基、ホスホン酸、スルファミン酸、グアニジノ基、カルボン酸、アルデヒド、アミド、およびヒドロキシメチルホスホン酸などの1つまたは複数の付加的な官能基を含む、2つ以上の官能基を有する。より好ましい付加的な官能基はボロン酸基、ヒドロキシル基、またはアミド基である。さらにより好ましいアミド基は隣接するトリカルボニルアミドである。
【００９５】
好ましい第二モジュールは、インドール、ナフタレン、ビフェニル、イソキノリン、ベンゾフラン、およびベンゾチオフェンを含む。より好ましい第二モジュールは、インドールまたはナフタレンである。本発明のいくつかの態様において、複数の第一モジュールが第二モジュールに結合していてもよい。加えて、第一モジュールは、第一モジュールを第二モジュールに連結する1個から3個の炭素原子を含む直鎖を有していてもよい。もう一つの態様において、直鎖中の炭素原子の1個が窒素、酸素、または硫黄原子で置換されていてもよい。
【００９６】
本発明の方法および化合物は、いかなるタンパク質キナーゼにも広く適用可能である。好ましいタンパク質キナーゼはタンパク質チロシンキナーゼおよびタンパク質セリンキナーゼ（セリン-トレオニンキナーゼとしても知られる）である。好ましいタンパク質チロシンキナーゼは、pp60c-src、p56lck、p55fyn、ZAPキナーゼ、血小板由来成長因子受容体チロシンキナーゼ、Bcr-Abl、VEGF（血管内皮成長因子）受容体チロシンキナーゼ、ならびに表皮成長因子受容体チロシンキナーゼ、および表皮成長因子受容体様チロシンキナーゼである。より好ましいタンパク質チロシンキナーゼはpp60c-srcである。好ましいセリンタンパク質キナーゼには、MAP（マイトジェン活性化タンパク質）キナーゼ、タンパク質キナーゼC、およびCDK（サイクリン依存性タンパク質キナーゼ）が含まれる。
【００９７】
本発明の方法は、上記のように第一および第二のモジュールの組み合わせに1つまたは複数の特異性側鎖因子を付加することをさらに含みうる。特異性側鎖は阻害剤の効力および特異性を高めることができる。適切な特異性側鎖は上部（上記の構造のためのR基）および以下の実施例に記載される。
【００９８】
有望な第二モジュールが特定されれば、方法のすべての段階を繰り返す必要はない。むしろ、第一モジュール、特異性側鎖、または2つの組み合わせを改変し、元の阻害剤を改善しうる、すなわち、改変されていない第一の阻害剤と比べたときに、タンパク質キナーゼ活性を阻害する能力が増大された阻害剤しうる。
【００９９】
本発明の方法は、タンパク質キナーゼへのATPの結合の阻害によって作用しないタンパク質キナーゼ阻害剤を優先的に提供するよう設計されている。ATPの結合を阻害することによって作用するタンパク質キナーゼの阻害剤は強力であってよいが、特異性に欠けることが多く、したがって、良い薬剤候補物とならないことが多い。したがって、タンパク質キナーゼ活性を阻害するが、タンパク質キナーゼへのATP結合を阻害しないか、または弱く阻害するだけのタンパク質キナーゼ阻害剤が好ましい。
【０１００】
別の態様において、本発明はタンパク質キナーゼを阻害する方法を提供する。タンパク質キナーゼの触媒残基に共有結合的にまたは非共有結合的に結合できる1つまたは複数の官能基（官能基はハロゲンを含む）を有する少なくとも1つの第一モジュールと非ペプチド骨格を提供する第二モジュールとを有する化合物に、タンパク質キナーゼを接触させる。少なくとも1つの第一モジュールと第二モジュールとの組合せがタンパク質キナーゼ活性を阻害する。
【０１０１】
本発明は、被験者における、タンパク質キナーゼ阻害剤に応答性の状態を治療する方法をさらに提供する。有効量のタンパク質キナーゼ阻害剤を被験者に投与する。タンパク質キナーゼ阻害剤は、タンパク質キナーゼの触媒残基にそれぞれ共有結合的にまたは非共有結合的に結合できる1つまたは複数の官能基を有する少なくとも1つの第一モジュールと（1つまたは複数の官能基はハロゲンを含む）、非ペプチド骨格を提供する第二モジュールを有し、少なくとも1つの第一モジュールと第二モジュールとの組合せがタンパク質キナーゼ活性を阻害する。
【０１０２】
本発明の別の側面は、タンパク質ホスファターゼ阻害剤の同定法である。上記方法は、タンパク質ホスファターゼの触媒残基にそれぞれ共有結合的にまたは非共有結合的に結合できる1つまたは複数の官能基を有する少なくとも1つの第一モジュールを提供する段階、少なくとも1つの第一モジュールと非ペプチド骨格を提供する少なくとも1つの第二モジュールとを組み合わせて、第一および第二モジュールの1つまたは複数の組合せを形成する段階、タンパク質ホスファターゼ阻害について第一および第二のモジュールの1つまたは複数の組合せをスクリーニングする段階、ならびにタンパク質ホスファターゼ活性を阻害する第一および第二のモジュールの組合せを選択する段階を含む。
【０１０３】
適切な第一および第二のモジュールおよび官能基は上記している。好ましい態様において、少なくとも1つの第一モジュールはハロゲン、最も好ましくはフッ素を含む。適切な非ペプチドタンパク質ホスファターゼ阻害剤の例は、以下の表8に示す。
【０１０４】
適切なタンパク質ホスファターゼはPTP-1Bを含むがこれに限定されない。他の適切なタンパク質ホスファターゼは、例えば、Zhang、2002；McCluskeyら、2002a；Zhang2001；McCluskeyら、2001；Pestellら、2000；Mollerら、2000；Ripka、2000；Kennedy、1999；Johnsonら、2002；McCluskey2002bに記載されている。
【０１０５】
上記したように、この方法は基質ペプチド結合部位に結合するホスファターゼ阻害剤を優先的に提供するように設計されている。
【０１０６】
本発明はまた、タンパク質ホスファターゼを阻害する方法にも関する。タンパク質ホスファターゼの触媒残基にそれぞれ共有結合的にまたは非共有結合的に結合できる1つまたは複数の官能基を有する少なくとも1つの第一モジュールと非ペプチド骨格を提供する第二モジュールとを含む化合物に、タンパク質ホスファターゼを接触させる。少なくとも1つの第一モジュールと第二モジュールとの組合せがタンパク質ホスファターゼ活性を阻害する。
【０１０７】
1つの態様において、化合物は下記式を有する：
2005514339.tif 000021
（式中、
R1からR7は同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、ヘテロ環式化合物、および、好ましくは1〜20個の炭素原子を有し、選択的に二重結合または三重結合を含み、かつ選択的にヘテロ原子または他の官能基（例えば、カルボン酸、カルボン酸エステル、アルコール、エーテル、チオエーテル、アミド、チオアミド、尿素、ウレタン、スルホキシド、スルホン、ホスホン酸、ホスホン酸エステル、ホスフィン酸、ホスフィン酸エステル、ボロン酸、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、およびヘテロビアリール）で置換されているアルキル（分岐、環式、もしくは非分岐型）からなる群より選択されるか、または、R5およびR6は共にヘテロ環式化合物を形成している。Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、および、選択的にヘテロ原子または他の官能基（例えば、カルボン酸、カルボン酸エステル、アルコール、エーテル、チオエーテル、アミド、チオアミド、尿素、ウレタン、スルホキシド、スルホン、ホスホン酸、ホスホン酸エステル、ホスフィン酸、ホスフィン酸エステル、ボロン酸、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、およびヘテロビアリール）で置換されているアルキル（分岐、環式、もしくは非分岐型）からなる群より選択される。R1からR7およびRaからRcのいずれかは置換されていてもまたは置換されていなくてもよいと理解される。好ましい態様において、R3はハロゲン、最も好ましくはフッ素である）
【０１０８】
別の態様において、R6またはR7の少なくとも一方は下記式である：
2005514339.tif 000022
（式中、
R8*は付着点であり、かつ(CH2)x（Xは0〜10である）、CH2CHOH、CH(CH3)R、またはCH(CH3)Sであり、R9からR13はそれぞれ同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、ヘテロ環式化合物、および、好ましくは1〜20個の炭素原子を有し、選択的に二重結合または三重結合を含み、かつ選択的にヘテロ原子または他の官能基（例えば、カルボン酸、カルボン酸エステル、アルコール、エーテル、チオエーテル、アミド、チオアミド、尿素、ウレタン、スルホキシド、スルホン、ホスホン酸、ホスホン酸エステル、ホスフィン酸、ホスフィン酸エステル、ボロン酸、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、およびヘテロビアリール）で置換されているアルキル（分岐、環式、もしくは非分岐型）からなる群より選択される。Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、および、選択的にヘテロ原子または他の官能基（例えば、カルボン酸、カルボン酸エステル、アルコール、エーテル、チオエーテル、アミド、チオアミド、尿素、ウレタン、スルホキシド、スルホン、ホスホン酸、ホスホン酸エステル、ホスフィン酸、ホスフィン酸エステル、ボロン酸、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、およびヘテロビアリール）で置換されているアルキル（分岐、環式、もしくは非分岐型）からなる群より選択される。R9からR13およびRaからRcのいずれかは置換されていてもまたは置換されていなくてもよいと理解される。好ましい態様において、R9からR13はそれぞれ、OCH3、OCH2CH3、H、CH3、OH、CH2OH、CF3、OCF3、CFO、C6H5、OC6H5、OCH2C6H5、OCH2CH2CH3、CHO、CO2H、CO2CH3、CH2CO2H、CH2CO2CH3、NO2、およびハロゲンからなる群より選択してもよい）
【０１０９】
さらなる態様において、R6またはR7の少なくとも一方は下記式である：
2005514339.tif 000023
（式中、
アステリスクは窒素への付着点を示す）
【０１１０】
またさらなる態様において、化合物は下記式を有する：
2005514339.tif 000024
（式中、
R1からR7は同じかまたは異なり、H、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、ヘテロ環式化合物、および、好ましくは1〜20個の炭素原子を有し、選択的に二重結合または三重結合を含み、かつ選択的にヘテロ原子または他の官能基（例えば、カルボン酸、カルボン酸エステル、アルコール、エーテル、チオエーテル、アミド、チオアミド、尿素、ウレタン、スルホキシド、スルホン、ホスホン酸、ホスホン酸エステル、ホスフィン酸、ホスフィン酸エステル、ボロン酸、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、およびヘテロビアリール）で置換されているアルキル（分岐、環式、もしくは非分岐型）からなる群より選択される。Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、および、選択的にヘテロ原子または他の官能基（例えば、カルボン酸、カルボン酸エステル、アルコール、エーテル、チオエーテル、アミド、チオアミド、尿素、ウレタン、スルホキシド、スルホン、ホスホン酸、ホスホン酸エステル、ホスフィン酸、ホスフィン酸エステル、ボロン酸、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、およびヘテロビアリール）で置換されているアルキル（分岐、環式、もしくは非分岐型）からなる群より選択される。上記側鎖中の全ての開いている置換位置はさらなる置換を含むことができると理解される）
【０１１１】
本発明の別の側面は、被験者における、タンパク質ホスファターゼ阻害剤に応答性の状態を治療する方法に関する。タンパク質ホスファターゼ阻害剤を被験者に投与する。タンパク質ホスファターゼ阻害剤は、タンパク質ホスファターゼの触媒残基にそれぞれ共有結合的にまたは非共有結合的に結合できる1つまたは複数の官能基を有する少なくとも1つの第一モジュールと非ペプチド骨格を提供する第二モジュールとを有する。少なくとも1つの第一モジュールと第二モジュールとの組合せが、被験者におけるタンパク質ホスファターゼ活性を阻害する。
【０１１２】
タンパク質ホスファターゼ阻害剤は、II型糖尿病、肥満、および癌の治療を含むがこれに限定されない種々の治療技術に使用してもよい（Zhang、2002；McCluskeyら、2002a；Zhang 2001；McCluskeyら、2001；Pestellら、2000；Mollerら、2000；Ripka、2000；Kennedy、1999；Johnsonら、2002；McCluskey 2002b）。
【０１１３】
本発明の上記および以下の方法において適切な他の化合物の例は、以下を含む：
2005514339.tif 000025
（式中、
個々のRのいずれかが、ハロゲンを含有するM1であってもよく、残りのR基は、H、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、および、選択的に二重結合または三重結合および/またはヘテロ原子または他の官能基（例えば、カルボン酸、カルボン酸エステル、アルコール、エーテル、チオエーテル、アミド、チオアミド、尿素、ウレタン、スルホキシド、スルホン、ホスホン酸、ホスホン酸エステル、ホスフィン酸、ホスフィン酸エステル、ボロン酸、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、およびヘテロビアリール）を含むアルキル基（分岐、環式、もしくは非分岐型）であってもよい。Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、および、選択的にヘテロ原子または他の官能基（例えば、カルボン酸、カルボン酸エステル、アルコール、エーテル、チオエーテル、アミド、チオアミド、尿素、ウレタン、スルホキシド、スルホン、ホスホン酸、ホスホン酸エステル、ホスフィン酸、ホスフィン酸エステル、ボロン酸、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、およびヘテロビアリール）で置換されているアルキル（分岐、環式、もしくは非分岐型）からなる群より選択される。上記側鎖中の全ての開いている置換位置はさらなる置換を含むことができると理解される）；
2005514339.tif 000026
（式中、
個々のRのいずれかがM1であってもよく、残りのR基は、H、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、および、選択的に二重結合または三重結合および/またはヘテロ原子または他の官能基（例えば、カルボン酸、カルボン酸エステル、アルコール、エーテル、チオエーテル、アミド、チオアミド、尿素、ウレタン、スルホキシド、スルホン、ホスホン酸、ホスホン酸エステル、ホスフィン酸、ホスフィン酸エステル、ボロン酸、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、およびヘテロビアリール）を含むアルキル基（分岐、環式、もしくは非分岐型）であってもよい。Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、および、選択的にヘテロ原子または他の官能基（例えば、カルボン酸、カルボン酸エステル、アルコール、エーテル、チオエーテル、アミド、チオアミド、尿素、ウレタン、スルホキシド、スルホン、ホスホン酸、ホスホン酸エステル、ホスフィン酸、ホスフィン酸エステル、ボロン酸、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、およびヘテロビアリール）で置換されているアルキル（分岐、環式、もしくは非分岐型）からなる群より選択される。上記側鎖中の全ての開いている置換位置はさらなる置換を含むことができると理解される）；
2005514339.tif 000027
（式中、
個々のRのいずれかがM1であってもよく、残りのR基は、H、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、および、選択的に二重結合または三重結合および/またはヘテロ原子または他の官能基（例えば、カルボン酸、カルボン酸エステル、アルコール、エーテル、チオエーテル、アミド、チオアミド、尿素、ウレタン、スルホキシド、スルホン、ホスホン酸、ホスホン酸エステル、ホスフィン酸、ホスフィン酸エステル、ボロン酸、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、およびヘテロビアリール）を含むアルキル基（分岐、環式、もしくは非分岐型）であってもよい。Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、および、選択的にヘテロ原子または他の官能基（例えば、カルボン酸、カルボン酸エステル、アルコール、エーテル、チオエーテル、アミド、チオアミド、尿素、ウレタン、スルホキシド、スルホン、ホスホン酸、ホスホン酸エステル、ホスフィン酸、ホスフィン酸エステル、ボロン酸、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、およびヘテロビアリール）で置換されているアルキル（分岐、環式、もしくは非分岐型）からなる群より選択される。上記側鎖中の全ての開いている置換位置はさらなる置換を含むことができると理解される）；
2005514339.tif 000028
（式中、
個々のRのいずれかがM1であってもよく、残りのR基は、H、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、および、選択的に二重結合または三重結合および/またはヘテロ原子または他の官能基（例えば、カルボン酸、カルボン酸エステル、アルコール、エーテル、チオエーテル、アミド、チオアミド、尿素、ウレタン、スルホキシド、スルホン、ホスホン酸、ホスホン酸エステル、ホスフィン酸、ホスフィン酸エステル、ボロン酸、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、およびヘテロビアリール）を含むアルキル基（分岐、環式、もしくは非分岐型）であってもよい。Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、および、選択的にヘテロ原子または他の官能基（例えば、カルボン酸、カルボン酸エステル、アルコール、エーテル、チオエーテル、アミド、チオアミド、尿素、ウレタン、スルホキシド、スルホン、ホスホン酸、ホスホン酸エステル、ホスフィン酸、ホスフィン酸エステル、ボロン酸、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、およびヘテロビアリール）で置換されているアルキル（分岐、環式、もしくは非分岐型）からなる群より選択される。上記側鎖中の全ての開いている置換位置はさらなる置換を含むことができると理解される）；
2005514339.tif 000029
（式中、
個々のRのいずれかがM1であってもよく、残りのR基は、H、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、および、選択的に二重結合または三重結合および/またはヘテロ原子または他の官能基（例えば、カルボン酸、カルボン酸エステル、アルコール、エーテル、チオエーテル、アミド、チオアミド、尿素、ウレタン、スルホキシド、スルホン、ホスホン酸、ホスホン酸エステル、ホスフィン酸、ホスフィン酸エステル、ボロン酸、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、およびヘテロビアリール）を含むアルキル基（分岐、環式、もしくは非分岐型）であってもよい。Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、および、選択的にヘテロ原子または他の官能基（例えば、カルボン酸、カルボン酸エステル、アルコール、エーテル、チオエーテル、アミド、チオアミド、尿素、ウレタン、スルホキシド、スルホン、ホスホン酸、ホスホン酸エステル、ホスフィン酸、ホスフィン酸エステル、ボロン酸、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、およびヘテロビアリール）で置換されているアルキル（分岐、環式、もしくは非分岐型）からなる群より選択される。上記側鎖中の全ての開いている置換位置はさらなる置換を含むことができると理解される）；
2005514339.tif 000030
（式中、
個々のRのいずれかがM1であってもよく、残りのR基は、H、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、および、選択的に二重結合または三重結合および/またはヘテロ原子または他の官能基（例えば、カルボン酸、カルボン酸エステル、アルコール、エーテル、チオエーテル、アミド、チオアミド、尿素、ウレタン、スルホキシド、スルホン、ホスホン酸、ホスホン酸エステル、ホスフィン酸、ホスフィン酸エステル、ボロン酸、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、およびヘテロビアリール）を含むアルキル基（分岐、環式、もしくは非分岐型）であってもよい。Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、および、選択的にヘテロ原子または他の官能基（例えば、カルボン酸、カルボン酸エステル、アルコール、エーテル、チオエーテル、アミド、チオアミド、尿素、ウレタン、スルホキシド、スルホン、ホスホン酸、ホスホン酸エステル、ホスフィン酸、ホスフィン酸エステル、ボロン酸、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、およびヘテロビアリール）で置換されているアルキル（分岐、環式、もしくは非分岐型）からなる群より選択される。上記側鎖中の全ての開いている置換位置はさらなる置換を含むことができると理解される）；
2005514339.tif 000031
（式中、
個々のRのいずれかがM1であってもよく、残りのR基は、H、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、および、選択的に二重結合または三重結合および/またはヘテロ原子または他の官能基（例えば、カルボン酸、カルボン酸エステル、アルコール、エーテル、チオエーテル、アミド、チオアミド、尿素、ウレタン、スルホキシド、スルホン、ホスホン酸、ホスホン酸エステル、ホスフィン酸、ホスフィン酸エステル、ボロン酸、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、およびヘテロビアリール）を含むアルキル基（分岐、環式、もしくは非分岐型）であってもよい。Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、および、選択的にヘテロ原子または他の官能基（例えば、カルボン酸、カルボン酸エステル、アルコール、エーテル、チオエーテル、アミド、チオアミド、尿素、ウレタン、スルホキシド、スルホン、ホスホン酸、ホスホン酸エステル、ホスフィン酸、ホスフィン酸エステル、ボロン酸、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、およびヘテロビアリール）で置換されているアルキル（分岐、環式、もしくは非分岐型）からなる群より選択される。上記側鎖中の全ての開いている置換位置はさらなる置換を含むことができると理解される）；
2005514339.tif 000032
（式中、
個々のRのいずれかがM1であってもよく、残りのR基は、H、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、および、選択的に二重結合または三重結合および/またはヘテロ原子または他の官能基（例えば、カルボン酸、カルボン酸エステル、アルコール、エーテル、チオエーテル、アミド、チオアミド、尿素、ウレタン、スルホキシド、スルホン、ホスホン酸、ホスホン酸エステル、ホスフィン酸、ホスフィン酸エステル、ボロン酸、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、およびヘテロビアリール）を含むアルキル基（分岐、環式、もしくは非分岐型）であってもよい。Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、および、選択的にヘテロ原子または他の官能基（例えば、カルボン酸、カルボン酸エステル、アルコール、エーテル、チオエーテル、アミド、チオアミド、尿素、ウレタン、スルホキシド、スルホン、ホスホン酸、ホスホン酸エステル、ホスフィン酸、ホスフィン酸エステル、ボロン酸、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、およびヘテロビアリール）で置換されているアルキル（分岐、環式、もしくは非分岐型）からなる群より選択される。上記側鎖中の全ての開いている置換位置はさらなる置換を含むことができると理解される）；
2005514339.tif 000033
（式中、
個々のRのいずれかがM1であってもよく、残りのR基は、H、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、および、選択的に二重結合または三重結合および/またはヘテロ原子または他の官能基（例えば、カルボン酸、カルボン酸エステル、アルコール、エーテル、チオエーテル、アミド、チオアミド、尿素、ウレタン、スルホキシド、スルホン、ホスホン酸、ホスホン酸エステル、ホスフィン酸、ホスフィン酸エステル、ボロン酸、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、およびヘテロビアリール）を含むアルキル基（分岐、環式、もしくは非分岐型）であってもよい。Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、および、選択的にヘテロ原子または他の官能基（例えば、カルボン酸、カルボン酸エステル、アルコール、エーテル、チオエーテル、アミド、チオアミド、尿素、ウレタン、スルホキシド、スルホン、ホスホン酸、ホスホン酸エステル、ホスフィン酸、ホスフィン酸エステル、ボロン酸、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、およびヘテロビアリール）で置換されているアルキル（分岐、環式、もしくは非分岐型）からなる群より選択される。上記側鎖中の全ての開いている置換位置はさらなる置換を含むことができると理解される）
【０１１４】
本発明はまた、タンパク質キナーゼまたはタンパク質ホスファターゼ活性の阻害能について、化合物を試験する方法を提供する。化合物は上記したように産生される。タンパク質キナーゼまたはタンパク質ホスファターゼの活性は、タンパク質キナーゼまたはタンパク質ホスファターゼを発現している細胞に見出されるのと同じ温度、pH、イオン強度、モル浸透圧濃度、および遊離マグネシウム濃度において、阻害剤の存在下で測定する。タンパク質キナーゼまたはタンパク質ホスファターゼの活性レベルを、阻害剤の非存在下におけるタンパク質キナーゼまたはタンパク質ホスファターゼの活性レベルと比較する。生理的条件を模倣したこのようなアッセイシステムは、最も関連した阻害データを提供する。アッセイ法は自動アッセイシステムで実施してもよい。さらに、アッセイ法はコンビナトリアルケミストリー法と組み合わせると数多くの候補を迅速に選別しうる。
【０１１５】
96ウェルプレートコンビナトリアルライブラリーの初期Srcスクリーニングのための細胞模倣アッセイ法条件に、ピアス96ウェルプレート非放射性ELISA PTKアッセイ法を適用してもよい。このハイスループットアッセイ法には、市販の96ウェルプレート中でNeutrAvidinコーティングされたウェルに連結できるようにビオチン化されていること以外は同じであるRR-SRCペプチド基質が用いられる。このハイスループット阻害アッセイ法は、ウェルに予め結合したRR-SRC基質と共にSrcをインキュベートした後、その抗ホスホチロシン抗体（PY20）-セイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）複合体およびそのHRP基質を加えることにより、96ウェルプレートUV測定器によるHRP生成物のレベル測定を通じて、生成されたホスホ-RR-SRCのレベルを定量することによって行うことができる。標準的なロースループットP32-ATP放射能アッセイ法が用いられてきたが、96ウェルプレート様式が好ましく、可能ならば特に非放射能アッセイ法が好ましい。非常に強力なSrc阻害剤が開発されるに伴い、タンパク質キナーゼアッセイ法のパネルを、細胞模倣タンパク質キナーゼアッセイ条件を使用して、市販されているタンパク質キナーゼを用いて設定でき、特異性の初期評価のために、パネル全体でこれらの阻害剤を試験することができる。全部の約2,000個のタンパク質キナーゼに関する、より完全な特異性評価を、細胞培養液またはインビボにおいて実施する必要があると考えられる。
【０１１６】
正常ラット腎（NRK）細胞およびこの細胞系統の温度感受性pp60v-src形質転換体（LA25）を用いた1組の並列細胞ベースアッセイ法において、活性Src阻害剤を調査することができる。LA25形質転換体は、pp60v-srcの活性化により「許容」温度33℃で足場非依存的成長および血清非依存的成長をするが、pp60v-srcが活性化されない「非許容」温度40℃では成長しない（Liら、1996）。許容温度と非許容温度の両方においてSrc阻害剤を試験するためにこの一対の密接に関連した細胞系統を用いることにより、異なる機序または一般的毒性作用によって、所与のSrc阻害剤がSrcシグナル伝達経路の特異的遮断に起因する細胞の成長を阻止しているかどうかを決定することができる。この一対の細胞系統における非ペプチドSrc阻害剤43-メタ（表5）の初期試験の結果を図14に示す。
【０１１７】
このグラフに示されるとおり、許容温度33℃におけるLA25細胞の成長は、対照としての非許容温度40℃でのLA25細胞の成長に比べて、43-メタの濃度25μMで約50％阻害される。濃度が400μMまで上昇するに従い、NRK非形質転換細胞、非許容温度40℃でのLA25細胞、および許容温度33℃（しかし、pp60v-srcは43-メタによって完全に阻害された）でのLA25細胞の基本的成長が低下しないだけでなく、実際には幾分上昇する（おそらく、この化合物のSrc関連でない活性による）ことから、43-メタに細胞毒性がないことが証明される。可溶化のために低濃度のDMSOで43-メタの溶液を調製したため、DMSO対照もまた同じ濃度で試験した。
【０１１８】
さらに、有望なSrc阻害剤は、特に他の既知の抗癌薬物との相乗効果を調べるために、初期ヒト腫瘍組織アッセイ法でスクリーニングできる。
【０１１９】
本発明の別の側面は、被験者における聴覚損失を防御または治療する方法に関する。この方法は、聴覚損失を防御または治療するために、有効量のタンパク質チロシンキナーゼ（PTK）阻害剤を被験者に投与する段階を含む。
【０１２０】
本発明の上記方法におけるPTK阻害剤は、受容体チロシンキナーゼ阻害剤または非受容体チロシンキナーゼ阻害剤でありうる（Hubbardら、2000を参照）。本発明の好ましい態様において、PTK阻害剤はSrcファミリーPTK阻害剤である。この態様において、PTK阻害剤は、pp60c-srcチロシンキナーゼを含む、Srcファミリーのいずれかのメンバーの活性を阻害しうる。別の好ましい態様において、PTK阻害剤は、焦点接着キナーゼ阻害剤である。
【０１２１】
1つの態様において、PTK阻害剤は非ペプチドPTK阻害剤である。好ましい態様において、非ペプチドPTK阻害剤は、タンパク質キナーゼの触媒残基にそれぞれ共有結合的にまたは非共有結合的に結合できる1つまたは複数の官能基を有する少なくとも1つの第一モジュールと非ペプチド骨格を提供する第二モジュールとを有する。第一および第二のモジュールの組合せが、被験者におけるタンパク質キナーゼ活性を阻害する。
【０１２２】
例えば、適切な非ペプチドPTK阻害剤は下記式を有する：
2005514339.tif 000034
（式中、
R1からR7は同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、ヘテロ環式化合物、および、好ましくは1〜20個の炭素原子を有し、選択的に二重結合または三重結合を含み、かつ選択的にヘテロ原子または他の官能基（例えば、カルボン酸、カルボン酸エステル、アルコール、エーテル、チオエーテル、アミド、チオアミド、尿素、ウレタン、スルホキシド、スルホン、ホスホン酸、ホスホン酸エステル、ホスフィン酸、ホスフィン酸エステル、ボロン酸、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、およびヘテロビアリール）で置換されているアルキル（分岐、環式、もしくは非分岐型）からなる群より選択されるか、または、R5およびR6は共にヘテロ環式化合物を形成している。Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、および、選択的にヘテロ原子または他の官能基（例えば、カルボン酸、カルボン酸エステル、アルコール、エーテル、チオエーテル、アミド、チオアミド、尿素、ウレタン、スルホキシド、スルホン、ホスホン酸、ホスホン酸エステル、ホスフィン酸、ホスフィン酸エステル、ボロン酸、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、およびヘテロビアリール）で置換されているアルキル（分岐、環式、もしくは非分岐型）からなる群より選択される。上記側鎖中の全ての開いている置換位置はさらなる置換を含むことができると理解される。適切なR6基およびR7基の例は、以下の表6に示す。好ましい態様において、R3はハロゲン、最も好ましくはフッ素である）
【０１２３】
1つの態様において、R6またはR7の少なくとも一方は下記式である：
2005514339.tif 000035
（式中、
R8*は付着点であり、かつ(CH2)x（Xは0〜10である）、CH2CHOH、CH(CH3)R、またはCH(CH3)Sであり、R9からR13はそれぞれ同じかまたは異ってもよく、かつH、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、ヘテロ環式化合物、および、好ましくは1〜20個の炭素原子を有し、選択的に二重結合または三重結合を含み、かつ選択的にヘテロ原子または他の官能基（例えば、カルボン酸、カルボン酸エステル、アルコール、エーテル、チオエーテル、アミド、チオアミド、尿素、ウレタン、スルホキシド、スルホン、ホスホン酸、ホスホン酸エステル、ホスフィン酸、ホスフィン酸エステル、ボロン酸、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、およびヘテロビアリール）で置換されているアルキル（分岐、環式、もしくは非分岐型）からなる群より選択される。Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、および、選択的にヘテロ原子または他の官能基（例えば、カルボン酸、カルボン酸エステル、アルコール、エーテル、チオエーテル、アミド、チオアミド、尿素、ウレタン、スルホキシド、スルホン、ホスホン酸、ホスホン酸エステル、ホスフィン酸、ホスフィン酸エステル、ボロン酸、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、およびヘテロビアリール）で置換されているアルキル（分岐、環式、もしくは非分岐型）からなる群より選択される。R9からR13およびRaからRcのいずれかは置換されていてもまたは置換されていなくてもよいと理解される。好ましい態様において、R9からR13はそれぞれ、OCH3、OCH2CH3、H、CH3、OH、CH2OH、CF3、OCF3、CFO、C6H5、OC6H5、OCH2C6H5、OCH2CH2CH3、CHO、CO2H、CO2CH3、CH2CO2H、CH2CO2CH3、NO2、およびハロゲンからなる群より選択してもよい）
【０１２４】
別の態様において、R6またはR7の少なくとも一方は下記式である：
2005514339.tif 000036
（式中、アステリスクは窒素への付着点を示す）
【０１２５】
本発明の方法で有用な別の非ペプチドPTK阻害剤は、下記式を有する：
2005514339.tif 000037
（式中、Xはハロゲン、好ましくはフッ素であり、かつR1からR4は特異性要素である）
【０１２６】
1つの態様において、R1はHであり、R2は
2005514339.tif 000038
であり、R3はHであり、かつR4はHである。化合物はまた、インドール環上の任意の他の位置において置換されていてもよい。
【０１２７】
さらなる非ペプチドPTK阻害剤は下記式を有する：
2005514339.tif 000039
（式中、
R1からR7はそれぞれ同じまたは異なり、H、C(O)Ra、C(O)NRaRb、C(O)ORa、C(O)SRa、OH、ORa、OC(O)Ra、OC(O)ORa、NH2、NRaRb、NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRbRc、NRaC(O)ORb、NRaC(O)SRb、NRaS(O)Rb、NRaS(O)2Rb、NRaS(O)ORb、NRaS(O)2ORb、NRaP(O)ORbORc、NRaP(O)ORbRc、NRaP(O)ORbORc、SRa、S(O)Ra、S(O)2Ra、S(O)ORa、S(O)2ORa、S(O)NRaRb、S(O)2NRaRb、P(O)ORaORb、B(OH)2、ハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、ヘテロ環式化合物、および、好ましくは1〜20個の炭素原子を有し、選択的に二重結合または三重結合を含み、かつ選択的にヘテロ原子または他の官能基（例えば、カルボン酸、カルボン酸エステル、アルコール、エーテル、チオエーテル、アミド、チオアミド、尿素、ウレタン、スルホキシド、スルホン、ホスホン酸、ホスホン酸エステル、ホスフィン酸、ホスフィン酸エステル、ボロン酸、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、およびヘテロビアリール）で置換されている、アルキル（分岐、環式、もしくは非分岐型）からなる群より選択される。Ra、Rb、およびRcは同じかまたは異ってもよく、かつH、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、ヘテロビアリール、および、選択的にヘテロ原子または他の官能基（例えば、カルボン酸、カルボン酸エステル、アルコール、エーテル、チオエーテル、アミド、チオアミド、尿素、ウレタン、スルホキシド、スルホン、ホスホン酸、ホスホン酸エステル、ホスフィン酸、ホスフィン酸エステル、ボロン酸、アリール、ヘテロアリール、ビアリール、およびヘテロビアリール）で置換されているアルキル（分岐、環式、もしくは非分岐型）からなる群より選択される。上記側鎖中の全ての開いている置換位置はさらなる置換を含むことができると理解される。Xは好ましくは0または1である）
【０１２８】
またさらなる態様において、PTK阻害剤は、ペプチドタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤である。適切なペプチドPTK阻害剤は、例えば、Laiら、1998に記載されている。
【０１２９】
1つの態様において、本発明の方法におけるPTK阻害剤は、ペプチド基質に指向された阻害剤である。本明細書において使用される場合、ペプチド基質に指向された阻害剤は、チロシンキナーゼの活性部位のペプチド基質特異性部位に結合し、ATPには結合しない阻害剤である。上記した非ペプチドPTK阻害剤は、ペプチド基質に指向された阻害剤の例である。
【０１３０】
別の態様において、PTK阻害剤はATP部位に指向された阻害剤である。本明細書において使用される場合、ATP部位に指向された阻害剤は、ATPに結合してPTKを競合的に阻害する阻害剤である。ATP部位阻害剤の例は、フラバノイド、ゲニステイン、およびラベンダスチンAを含むがこれに限定されない。ATP部位阻害剤（アンタゴニスト）の例は、例えば、LevitzkiおよびGazit、1995に開示されている。
【０１３１】
さらに別の態様において、PTK阻害剤はSrc相同性2（SH2）部位阻害剤である。SH2部位阻害剤は、SH2部位に結合してPTKの活性を阻害する。適切なSH2阻害剤の例は、例えば、Garcia-Echeverria、2001、Muller、2001、Fretzら、2000、およびVu、2000に記載されている。
【０１３２】
さらなる態様において、PTK阻害剤はSrc相同性3（SH3）部位阻害剤である。SH3部位阻害剤は、SH3部位に結合してPTKの活性を阻害する。適切なSH3阻害剤の例は、例えばStein、1998およびSparksら、1994に記載されている。
【０１３３】
別の態様において、PTK阻害剤はアロステリック阻害剤である。本明細書において使用する場合、アロステリック阻害剤はPTKの活性部位以外のアロステリック部位に結合し、それによりPTKのコンフォメーションを変化させてPTKの活性を阻害する。
【０１３４】
上記PTK阻害剤は、そのそれぞれの部位に共有結合的にまたは非共有結合的に（可逆的にまたは非可逆的に）結合しうる。
【０１３５】
PTK阻害剤は、経口（例えば食物中で）、非経口的、経皮、静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内滴下、腔内または膀胱内滴下、耳内、動脈内、病巣内、定量ポンプにより、または、粘膜への適用により投与できる。それらは単独で、または薬学的または生理的に許容される担体、賦形剤、または安定剤と共に投与してもよく、かつ固体形態または液体形態、例えば錠剤、カプセル剤、粉末、溶液、懸濁液、またはエマルションであってもよい。
【０１３６】
固体単位投与形態は慣用的なタイプであってもよい。固体形態は、PTK阻害剤および担体、例えば潤滑剤および不活性増量剤(例えばラクトース、スクロース、またはコーンスターチ)を含む通常のゼラチンタイプなどのカプセルであってもよい。別の態様において、これらのPTK阻害剤は、ラクトース、スクロース、またはコーンスターチのような慣用的な錠剤基剤を用いて、結合剤（例えばアカシア、コーンスターチ、またはゼラチン）、崩壊剤（例えばコーンスターチ、馬鈴薯デンプン、またはアルギン酸）、および潤滑剤（例えばステアリン酸またはステアリン酸マグネシウム）と組み合わせて錠剤化できる。
【０１３７】
PTK阻害剤は、薬学的担体を含む生理的に許容される希釈剤中のこれらの材料の溶液または懸濁液により、注射可能な用量で投与してもよい。このような担体は、界面活性剤、補助剤、賦形剤、または安定剤を追加するかまたは追加しない、無菌液体（例えば水および油）を含む。油の例は、石油、動物油、植物油、または合成起源油、例えばピーナッツ油、大豆油、または鉱油である。一般に、水、生理食塩水、水性デキストロースおよび関連した糖溶液、ならびにプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールのようなグリコールが、特に注射溶液に好ましい液体担体である。
【０１３８】
エアゾールとして使用するために、PTK阻害剤の溶液または懸濁液は、適切な噴射剤（例えばプロパン、ブタン、またはイソブタンのような炭化水素噴射剤）および慣用的な補助剤と共に、加圧エアゾール容器に梱包してもよい。PTK阻害剤はまた、ネブライザーまたはアトマイザーのような非加圧形態で投与することもできる。
【０１３９】
適切な用量は、種々の因子に基づいて決定するが、約50mg/kgから約1000mg/kgのPTK阻害剤、好ましくは約50mg/kgから約400mg/kgのPTK阻害剤を含みうる（例えば、Bakhtiarら、2002；Druker、2002を参照）。
【０１４０】
本明細書に記載したPTK阻害剤は、チンパンジーおよび他の類人猿ならびにサル種のようなヒトおよび非ヒト霊長類；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、およびウマを含む家畜動物；ネコおよびイヌを含む家庭内動物；マウス、ラット、およびモルモットなどのようなげっ歯類を含む実験動物を含むがこれに限定されない哺乳類のクラスの任意のメンバーなどの任意の被験者に投与してもよい。この用語は特定の年齢または性別を表わさない。
【０１４１】
本明細書において記載される場合、PTK阻害剤は被験者における聴覚損失を防御または予防するために使用してもよい。聴覚損失を防御するために、PTK阻害剤は、音に暴露する前または聴覚損失を誘導する薬物に暴露する前に投与してもよい。このような薬物は、化学療法薬（例えば有毛細胞を標的とする白金をベースとした薬物）およびアミノグリコシド抗生物質を含みうる。
【０１４２】
または、PTK阻害剤は、被験者における聴覚損失を治療するために使用してもよい。この態様において、PTK阻害剤は、聴覚損失の開始後に被験者に投与され、聴覚損失のレベルを低減させる。
【０１４３】
理論で固めたくはないが、PTK阻害剤の投与は蝸牛有毛細胞のアポトーシスを防ぎ、これにより聴覚損失を防ぐと考えられる。特に、音への暴露後に、蝸牛有毛細胞間の堅い細胞接合部および細胞-細胞外マトリックス相互作用が引き裂かれ応力がかかる。これらの堅い細胞接合部の応力により、複雑なシグナル伝達経路(PTKのSrcファミリーは分子スイッチとして作用する)により細胞においてアポトーシスが開始され、焦点接着キナーゼと相互作用して細胞-マトリックス崩壊のシグナルを核に伝達する。PTK阻害剤の投与はこのカスケードにおいてアポトーシスの開始を予防すると考えられる。
【０１４４】
上記したように、本明細書に記載した阻害剤はpp60c-Srcの阻害剤であり、高度に転移性の前立腺癌細胞増殖の阻害剤であり、高用量の急性腹腔内投与時でもマウスにおいて無毒性である。これらの化合物のいくつかは、より広範囲に試験すると、他の生物活性も有することが判明しうる（例えば、II型糖尿病におけるグリコーゲンホスホリラーゼ、HIV逆転写酵素、またはトロンボキサンシンターゼを阻害）。従って、これらの化合物は、併用治療用途におけるチロシンキナーゼ阻害剤として使用してもよい。例えば、PTK阻害剤は、聴覚損失を治療または予防および癌を治療するのに有効な量および条件下で被験者に投与してもよい（ここでは相乗活性が見出される）。チロシンキナーゼ阻害剤は同様に他の可能性ある治療用途も有し（例えばp56 lckの場合における免疫抑制剤）、チロシンホスファターゼPTP-1B阻害剤は、II型糖尿病の治療の薬物を提供しうる。それ故、本明細書に開示したPTK阻害剤は、多種多様な併用療法に使用してもよい。
【０１４５】
実施例
実施例1  インドール派生的タンパク質キナーゼおよび/またはタンパク質ホスファターゼ阻害剤の合成および活性
以下の結果は、5-フルオロインドール-2-カルボキサミドライブラリーの液相合成、およびインドール由来タンパク質キナーゼおよび/またはタンパク質ホスファターゼ阻害剤の試験を示す。これらの最終生成物は、インドールをベースとした阻害剤の例であり、ここでは5-フルオロ基を用いた合成を示す。
【０１４６】
A．中間体および試料試薬の合成：
5-フルオロ-3-フェニルインドール-2-カルボン酸
2005514339.tif 000040
【０１４７】
（a）メチルエステルの調製
2005514339.tif 000041
5-フルオロインドール-2-カルボン酸（6g、33.5mmol）および新しく調製したメタノール性HCl（100mL）の混合物を一晩室温で攪拌した。沈降したエステルをろ過により回収し、NaHCO3飽和溶液、水、およびMeOHで洗浄した。ろ液を飽和NaHCO3で処理し、EtOAcで抽出した。有機層を塩性溶液で洗浄し、乾燥（MgSO4）し、真空で蒸発した。生成物エステル（6g）はオフホワイトの固体であり、さらに精製することなく次のステップに使用した。融点200〜201℃；
2005514339.tif 000042
【０１４８】
（b）3-ヨード誘導体の調製
2005514339.tif 000043
4.22g（21.8mmol）のメチルエステルをDMF（25mL）に溶かした。別のフラスコに、ヨウ素（6.09g、24mmol）およびKOH（4.65g、82.9mmol）のDMF（25mL）溶液を30分間攪拌し、5分間かけてエステル溶液に滴下して加えた。10分間室温で攪拌した後、反応物を、NaHSO3（2.2g）、NH4OH（H2Oに溶かした25％溶液）の300mLの水溶液に注ぐことによりクエンチした。混合物を30分間攪拌し、その後、沈降した固体生成物をろ過により回収し、H2Oで洗浄した：
2005514339.tif 000044
【０１４９】
（c）スズキカップリング
2005514339.tif 000045
ヨード誘導体を、ベンゼンボロン酸（2.76g、22mmol）、PdCl2(PPh3)2（0.7g、1mmol）、および50mLの2M Na2CO3のジオキサン（200mL）溶液と混合した。混合物を90℃で一晩攪拌した。溶媒を真空下で蒸発させた。生成物をEtOAc（3×200mL）で抽出した。合わせた抽出物を塩性溶液で洗浄し、MgSO4で乾燥し、結晶化（CH2Cl2-ヘキサン）およびシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン-EtOAc 4:1）により精製した。融点189℃；
2005514339.tif 000046
【０１５０】
（d）メチルエステルのけん化
上記のエステル（2.5g、9.28mmol）をTHF（30mL）に溶かした。LiOH（2.4g、100mmol）の水（20mL）溶液を加え、混合物を1時間加熱還流した。混合物を室温まで冷却し、THFを真空蒸発により除去した。混合物を2MのHClで酸性となるまで処理した。生成物をEtOAcで抽出した。有機層を洗浄し、乾燥（塩性溶液、Na2SO4）させ、真空下で濃縮した。粗固体生成物をNaHCO3（飽和溶液）に再度溶かし、CH2Cl2で数回洗浄した。水層を氷および2M HClで酸性とし、EtOAcで抽出した。洗浄し乾燥し回転蒸発（rotavaping）させた後、生成物を白色固体として回収した（収量2.3g、97％）：融点195〜196℃；
2005514339.tif 000047
【０１５１】
3-ベンジルオキシ-5-ヒドロキシベンゾニトリル
2005514339.tif 000048
3,5-ジヒドロキシベンゾニトリル（1.08g、8mmol）およびK2CO3（1.104g、8mmol）の混合物のCH3CN（50mL）溶液に、臭化ベンジル（1.438g、8mmol）を加えた。混合物を2時間加熱還流した。溶媒を真空下で蒸発させた。残渣をEtOAc（200mL）および1M HCl（200mL）で処理した。有機層を洗浄し、乾燥させ、真空で蒸発させた。残渣をクロマトグラフィーにかけると（勾配、ヘキサン-CH2Cl2-MeOH）、3-ベンジルオキシ-5-ヒドロキシベンゾニトリル（529mg、29％）、3,5-ジベンジルオキシベンゾニトリル（784mg、31％）および256mg（23.7mg、24％）の出発材料が得られた。生成物の3-ベンジルオキシ-5-ヒドロキシベンゾニトリルは以下を有した：融点144〜145℃；
2005514339.tif 000049
【０１５２】
3,5-ジベンジルオキシベンゾニトリル
2005514339.tif 000050
この化合物は以下を有した：融点106℃；
2005514339.tif 000051
【０１５３】
4-ベンジルオキシ-3-ヒドロキシベンゾニトリル
2005514339.tif 000052
3,4-ジヒドロキシベンゾニトリル（540mg、4mmol）、K2CO3（552mg、4mmol）、および臭化ベンジル（476mg、4mmol）の混合物のアセトン（20mL）溶液を、室温で3日間攪拌した。混合物を真空下で蒸発させ、フラッシュカラムクロマトグラフィー（トルエン-ヘキサン2：1に溶かした2％MeOH）に供すると、所望の生成物（224mg、25％）が得られた：融点101℃；
2005514339.tif 000053
【０１５４】
3-ヒドロキシ-4-プロピルオキシベンゾニトリル
2005514339.tif 000054
この化合物は、4-ベンジルオキシ-3-ヒドロキシベンゾニトリルの調製に使用したのと類似した手順に従って27％の収率で調製した：融点99℃；
2005514339.tif 000055
【０１５５】
3-ベンジルオキシ-5-ヒドロキシベンジルアミン
2005514339.tif 000056
3-ベンジルオキシ-5-ヒドロキシベンゾニトリル（225mg、1mmol）を、2mLのTHFに溶解した。2mLのBH3-THF（THFおよびエーテル中1.5M）を滴下して加え、その後、混合物を還流温度で3時間加熱した。冷却後、混合物を3M HCl（氷で冷却）に注意深く注ぎ、20時間室温で攪拌した。混合物を固体NaHCO3で中和し、従って生成物は白色固体として沈降させた。生成物をろ過により回収し、水で洗浄し、乾燥させた（140mg、61％）：融点164〜166℃（dec）；
2005514339.tif 000057
【０１５６】
3,5-ジベンジルオキシベンジルアミン
2005514339.tif 000058
この化合物は、3-ベンジルオキシ-5-ヒドロキシベンジルアミンの調製に使用した手順に従って調製した。反応液は、MeOHの添加によりクエンチし、混合物を一晩攪拌しておいた。溶媒を除去し、生成物がフラッシュカラムクロマトグラフィー（5％MeOHを含むCH2Cl2-ヘキサン）により透明な厚い油状物として得られた（90％）：
2005514339.tif 000059
【０１５７】
4-ベンジルオキシ-3-ヒドロキシベンジルアミン
2005514339.tif 000060
この化合物は、4-ベンジルオキシ-3-ヒドロキシベンゾニトリルから出発する、3,5-ジベンジルオキシベンジルアミンの調製に使用した手順に従って調製した。収率は33％であった。融点122〜125℃；
2005514339.tif 000061
【０１５８】
3-ヒドロキシ-4-プロピルオキシベンジルアミン
2005514339.tif 000062
この化合物は、3,5-ジベンジルオキシベンジルアミンの調製に記載した手順に従って、3-ヒドロキシ-4-プロピルオキシベンゾニトリルの還元により調製した。収率は48％であった：融点110〜113℃（dec）；
2005514339.tif 000063
【０１５９】
4-ヒドロキシメチルベンジルアミン
2005514339.tif 000064
この化合物は、3,5-ジベンジルオキシベンジルアミンの調製に記載した手順に従って、4-シアノベンズアルデヒドの還元により調製した。収率は46％であった：融点102〜123℃；
2005514339.tif 000065
【０１６０】
3-ヒドロキシメチルベンジルアミン
2005514339.tif 000066
この化合物は、3,5-ジベンジルオキシベンジルアミンの調製に記載した手順に従って、3-シアノベンズアルデヒドの還元により調製した。収率は66％であった；
2005514339.tif 000067
【０１６１】
2-メトキシ-5-ニトロベンズアルデヒドメチルヘミアセタール
2005514339.tif 000068
2-ヒドロキシ-5-ニトロベンズアルデヒド（3.34g、20mmol）を、アセトン（70mL）に溶かし；K2CO3（5.53g、40mmol）およびヨードメタン（14.19g、100mmol）を加え、溶液を一晩加熱還流した。溶媒を真空で除去し、残渣をEtOAcに溶かした。得られた生成物を2M NaOH、水、および塩性溶液で洗浄し、乾燥させた。溶媒を除去すると、2-メトキシ-5-ニトロベンズアルデヒドメチルヘミアセタールの固体生成物（2.5g、69％）が得られた：融点147〜148℃（アルデヒドでは89℃と報告された）；
2005514339.tif 000069
注記：このNMRは約10ヵ月後に行われ、ヘミアセタールは以前として存在し純粋であった。
【０１６２】
5-ニトロ-2-プロピルオキシベンズアルデヒド
2005514339.tif 000070
この化合物は、2-メトキシ-5-ニトロベンズアルデヒドメチルヘミアセタールの調製に記載したものと類似した手順を使用して、2-ヒドロキシ-5-ニトロベンズアルデヒドおよび1-ヨードプロパンの反応により調製した。収率は72％であった：融点（51〜52℃）；
2005514339.tif 000071
【０１６３】
2-ヒドロキシメチル-4-ニトロフェノール
2005514339.tif 000072
60mLの1M NaOHおよび30mLのMeOHの混合物に溶かした2-ヒドロキシ-5-ニトロベンズアルデヒド（5.01g、30mmol）の溶液を0℃まで冷却した。15mLの1M NaOHおよび5mLのMeOHに溶かしたNaBH4（1.13g、30mmol）溶液をゆっくりと加えた。反応混合物を24時間室温で攪拌した。混合物を氷冷した2M HClに注ぎ、EtOAcで抽出した。有機層を洗浄し、乾燥させ、真空で蒸発させると、アルコールが黄色の固体として得られた（5.1g、100％）：融点（112〜114℃）；
2005514339.tif 000073
【０１６４】
2-メトキシ-5-ニトロベンジルアルコール
2005514339.tif 000074
この化合物は、2-ヒドロキシメチル-4-ニトロフェノールの調製で記載したものと類似した方法を使用して、2-メトキシ-5-ニトロベンズアルデヒドメチルヘミアセタールの還元により76％収率で調製した：融点121〜122℃；
2005514339.tif 000075
【０１６５】
5-ニトロ-2-プロピルオキシ-ベンジルアルコール
2005514339.tif 000076
この化合物は、2-ヒドロキシメチル-4-ニトロフェノールの調製で記載したものと類似した方法を使用して、5-ニトロ-2-プロピルオキシベンズアルデヒドの還元により93％収率で調製した：融点（融点用の試料は残されていない）；
2005514339.tif 000077
【０１６６】
2-ベンジルオキシ-5-ニトロベンジルアルコール
2005514339.tif 000078
この中間体は、2-メトキシ-5-ニトロベンズアルデヒドメチルヘミアセタールの調製で記載した方法に従って、2-ヒドロキシメチル-4-ニトロフェノールの臭化ベンジルによるアルキル化により84％の収率で調製した：融点81〜83℃；
2005514339.tif 000079
【０１６７】
3-ヒドロキシメチル-4-メトキシアニリン
2005514339.tif 000080
2-メトキシ-5-ニトロベンジルアルコール（1.02g、6.03mmol）およびSnCl2.H2O（6.8g、30.15mmol）の混合物のEtOH（20mL）溶液を、70℃で1時間加熱した。冷却後、混合物を2M NaOHで処理し、エーテルで抽出した。有機層を水で洗浄し、乾燥させ、真空下で蒸発させると、2.18g（84％）のアニリン 3-ヒドロキシメチル-4-メトキシアニリンが得られた：
2005514339.tif 000081
【０１６８】
3-ヒドロキシメチル-4-プロピルオキシアニリン
2005514339.tif 000082
この化合物は、3-ヒドロキシメチル-4-メトキシアニリンの調製で記載した方法を使用して、5-ニトロ-2-プロピルオキシ-ベンジルアルコールの還元により37％収率で調製した：
2005514339.tif 000083
【０１６９】
4-ベンジルオキシ-3-ヒドロキシメチルアニリン
2005514339.tif 000084
この化合物は、3-ヒドロキシメチル-4-メトキシアニリンの調製で記載した方法を使用して、2-ベンジルオキシ-5-ニトロベンジルアルコールの還元により86％収率で調製した：
2005514339.tif 000085
【０１７０】
B．ライブラリーの形成
一般的構造
2005514339.tif 000086
【０１７１】
１．アミドカップリングの一般的手順
ａ．方法A
アミン（アミンについては以下の表6を参照）（CH2Cl2に溶かした0.15mLの1M溶液、0.15mmol）の冷混合物（0℃）に、酸（5-フルオロインドール-2-カルボン酸または5-フルオロ-3-フェニルインドール-2-カルボン酸）（THFに溶かした0.15mLの1M溶液として0.15mmol）のCH2Cl2溶液（0.5mL）を加え、0℃まで冷却した。その後、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド（EDCI）（0.15mmol）およびEt3N（0.06mmol）の混合物のCH2Cl2溶液（0.5mL）を加え、反応物をBohdan orbital振とう機（Mettler-Toledo Bohdan、Vernon Hills、IL）中0℃で30分間振とうさせ、その後、室温で18時間振とうさせた。0.5mLのCH2Cl2および0.5mLのMeOHを添加した後、混合物を陽イオン交換樹脂を充填したカートリッジに通した（Dowex 50wX4-200、Aldrich Chemical社、ウィスコンシン州ミルウォーキー、1M HCl、H2O、H2O-MeOH、MeOH、MeOH-CH2Cl2で予め洗浄）。溶出剤を、10％NaCO3と混合したシリカゲルを含むクロマトグラフィーカートリッジに直接通した。生成物を、2mLのCH2Cl2-MeOH（2mL）、CH2Cl2（2mL）、およびCH2Cl2-MeOH（2mL）で溶出させた。純粋な生成物を含む画分を、TLC（EtOAc-ヘキサン、1：1）により同定した。化合物を特徴づけ、その相対純度を1H NMRを使用して推定した。
【０１７２】
ｂ．方法B
アミン（アミンについては以下の表6を参照）（0.1mmol）、酸（5-フルオロインドール-2-カルボン酸または5-フルオロ-3-フェニルインドール-2-カルボン酸）（DMFに溶かした0.1mLの1M溶液として0.1mmol）、およびジイソプロピルエチルアミン（DIEA）（0.05mL、0.3mmol）の混合物を0℃まで冷却した。（ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ）トリピロリジノ-ホスホニウム-ヘキサフルオロホスフェート（PyBOP）（DMFに溶かした0.1mLの1M溶液として0.01mmol）を加えた。反応混合物をorbital振とう機を使用して0℃で30分間振とうさせ、その後室温で18時間振とうさせた。EtOAcを混合物に加え、有機溶液を1M HCl（2×1mL）、塩性溶液（1mL）、NaHCO3（2×1mL）、および塩性溶液（1mL）で洗浄した。有機層を、無水MgSO4の上層を含むシリカゲルカートリッジに通し、ヘキサンで湿潤化した。生成物のアミドをヘキサン（1×1mL）、ヘキサン-EtOAc 2:1（3×1mL）、ヘキサン-EtOAc 1：1（2×2mL）、およびヘキサン-EtOAc 1：2（1×2mL）で溶出させた。純粋な生成物を含む画分をTLC（5-フルオロ-3-フェニルインドール-2-カルボン酸アミド誘導体の場合、EtOAc-ヘキサン1：1およびEtOAc-ヘキサン1：2）により同定した。化合物を特徴づけ、その相対純度を1H NMRを使用して推定した。
【０１７３】
ｃ．方法C
アミン（アミンについては以下の表6を参照）（0.1mmol）、酸（5-フルオロインドール-2-カルボン酸または5-フルオロ-3-フェニルインドール-2-カルボン酸）（THFに溶かした0.1mLの1M溶液として0.1mmol）、およびDIEA（0.05mL、0.3mmol）の混合物の、0.4mLのCH2Cl2-THF（3：1）溶液を0℃まで冷却した。PyBrOP（0.1mmol）を加えた。反応混合物をorbital振とう機を使用して0℃で30分間振とうさせ、その後、室温で48時間振とうさせた（0.1mLのTHFおよび0.2mLのCH2Cl2を24時間後に加えた）。EtOAcを混合物に加え、有機溶液を1MのHCl（2×1mL）、塩性溶液（1mL）、NaHCO3（2×1mL）、および塩性溶液（1mL）で洗浄した。有機層を、無水MgSO4の上層を含むシリカゲルカートリッジに通し、ヘキサンで湿潤化した。生成物のアミドを、ヘキサン（1×1mL）、ヘキサン-EtOAc 2：1（3×1mL）、ヘキサン-EtOAc 1：1（2×2mL）、およびヘキサン-EtOAc 1：2（1×2mL）で溶出させた。純粋な生成物を含む画分をTLC（5-フルオロ-3-フェニルインドール-2-カルボン酸アミド誘導体の場合、EtOAc-ヘキサン1：1およびEtOAc-ヘキサン1：2）により同定した。化合物は1H NMRにより特徴づけた。
【０１７４】
ｄ．方法D
5-フルオロインドール-2-カルボン酸クロリドの調製
5-フルオロインドール-2-カルボン酸（537mg、3mmol）を、DME（8mL）に溶解した。0.6mLのトリエチルアミンを加え、混合物を0℃まで冷却した。4mLのDMEと混合したチオニルクロリド（0.44mL、6mmol）を、攪拌しながら10分間かけて付加漏斗を使用して注意深く加えた。混合物を30分間攪拌して放置した。形成された沈降物をろ別し、溶媒を減圧下で蒸発させると、酸クロリドの黄色の固体が得られた。
【０１７５】
アミンと5-フルオロインドール-2-カルボン酸クロリドとの反応
アミン（アミンについては表6を参照）（1mmol）およびピリジン（0.18mL）の混合物の1mL DCM溶液を、0℃まで冷却した。5-フルオロインドール-2-カルボン酸クロリド（19.8mg、1mmol）を加え、その後、反応液を1時間室温で攪拌した。得られたアミド（DCM中）を1M HClで洗浄し、その後、塩性溶液で洗浄した。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。
【０１７６】
ｅ．アミドカップリング法の代表例
化合物1zの合成
2005514339.tif 000087
3-フルオロベンジルアミン（2.03g、20mmol）および5-フルオロインドール-2-カルボン酸（3.58g、20mmol）の混合物のDMF溶液（50mL）に、DIEA（6.98mL、40mmol）の15mL CH2Cl2溶液を加えた。混合物を0℃まで冷却し、PyBOP（10.41g、20mmol）を少しずつ加えた。反応混合物を0℃で30分間攪拌し、その後、室温で4時間攪拌した。EtOAc（400mL）を混合物に加え、有機溶液を2M HCl（4×200mL）、塩性溶液（200mL）、NaHCO3（4×200mL）、および塩性溶液（2×200mL）で洗浄した。有機層を乾燥（MgSO4）させ、真空で濃縮すると、オフホワイトの固体として粗生成物が得られた。MeOHおよびCH2Cl2から再結晶すると5.36g（93％）の1zが白色結晶として得られた：融点239〜241℃；
2005514339.tif 000088
【０１７７】
化合物1aの合成
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【０１７８】
（a）メトキシ中間体の調製
2005514339.tif 000090
1zの合成について上記したのと同じ手順に従って、この化合物を、20mmolのアミンおよび酸から出発して調製した。フラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製すると5.43g（91％）のメトキシ中間体がオフホワイトの結晶固体として得られた：融点192℃。
【０１７９】
（b）脱メチル化
メトキシ中間体（5g、16.7mmol）およびCH2Cl2（80mL）の混合物を、滴下漏斗および温度計を具備したマルチネックフラスコに入れた。フラスコを、氷/塩浴中で0℃まで冷却した。BBr3のCH2Cl2溶液（80mL）を、温度を5℃未満に維持しながら滴下して加えた。混合物を室温で3時間攪拌した。氷および3M HCl（200mL）の添加後、混合物を一晩攪拌して放置した。沈降した固体生成物はろ過により回収し、水で洗浄し、乾燥させた。CH2Cl2およびMeOHからの結晶化により、4.2g（88％）の化合物1aが得られた：融点213℃；
2005514339.tif 000091
【０１８０】
f．得られた他の代表的な化合物および相対純度データ
以下は、上記方法を使用して得られた化合物の例およびその相対純度データである。以下の表6は、得られた全ての化合物を列挙する。
【０１８１】
化合物1bb
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2005514339.tif 000093
【０１８２】
化合物1cc
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【０１８３】
化合物1dd
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【０１８４】
化合物1bbb
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【０１８５】
化合物1yyy
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【０１８６】
化合物1ccc
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【０１８７】
化合物1oooo
2005514339.tif 000104
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【０１８８】
化合物2f
2005514339.tif 000106
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【０１８９】
化合物2g
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【０１９０】
化合物2s
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【０１９１】
化合物3q
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【０１９２】
2．ベンジルアルコールアミド誘導体からベンズアルデヒドへの酸化の一般的手順：化合物3b、3d、3e、3f、3g、および3hの調製
出発ベンジルアルコールアミド誘導体を、CH2Cl2およびTHF（5mL/mmol）の1:1混合物に溶かし、ピリジニウムクロロクロメート（2モル当量）を加え、混合物を室温で3.5時間攪拌した。EtOAcおよび水を加えた。褐色固体をろ過により除去した。有機層を数回NaHCO3、塩性溶液で洗浄し、乾燥させ、濃縮した。生成物のアルデヒドを結晶化により精製し、1H NMRにより確認した（ベンジルアルコールのメチレンの消失およびアルデヒドピークの出現）。
【０１９３】
以下の表は、上記の方法により作成した構造を示す。
【０１９４】
（表６）5-フルオロインドール-2-カルボキシアミド化合物のライブラリーおよび調製法
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【０１９５】
C．ヒト癌細胞系H460および単離Srcの阻害
合成に続いて、上記のいくつかの化合物を、ヒト肺癌細胞系H460増殖の阻害および単離Srcの阻害について試験した。H460の阻害について試験するために、細胞を、96ウェルプレートの、5％FCS、5％NuSerumIV、2mMのL-グルタミン、および10mMのHEPESを含む完全培地RPMI-1640中に600細胞/ウェルで播種した。一晩インキュベートした後、DMSOに可溶化しRPMI-1640に希釈した化合物を細胞プレートに加えた。72時間後、細胞を固定し、染色し、全タンパク質/ウェルを決定した。増殖を50％阻害する化合物濃度（IC50）を決定し、以下に報告する。単離Srcの阻害について試験するために、化合物を、Laiら、1998に記載のアッセイ手順を使用して、以下のアッセイ成分、最終濃度、および条件を用いて試験した：50.0mMのMOPS、4.02mMのMgCl2、6.00mMのK3シトレート（遊離Mg2+を安定化させるためにMg2+緩衝液として0.5mMで使用）、99.0mMのKCl、10.0mMの2-メルカプトエタノール、198μMのADP、10Uの全長ヒト精製組換えpp66c-src（Upstate Biotechnology Inc.、レークプラシッド、ニューヨーク）、2.00mMのRR-SRC、4.0%のDMSO、pH7.2、37℃。これらの全体的なアッセイ条件は、細胞内のpH、温度、遊離Mg2+（0.5mM）、イオン強度、モル浸透圧濃度、ATP/ADP、および還元電位の条件を再現することが示された。結果を以下の表7に示す。
【０１９６】
（表７）ヒト肺癌細胞系H460増殖の阻害および単離Srcの阻害
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a  H460-NSCLC細胞
b  全ての化合物はDMSOに可溶化し、5%FCS、5%NuSerumIV、2mMのL-グルタミン、および20mMのHEPESを含むRPMI1640にさらに希釈した。
c  NT＝試験せず
【０１９７】
これらの結果は、インドール環の3位に付着したフェニル基の使用が、阻害剤の活性を有意に向上させることができることを示す。
【０１９８】
D．表皮増殖因子受容体チロシンキナーゼ（EGFRTK）、p56 lck、p55 fyn、およびPTP-1Bの阻害
以下の表8に列挙した化合物を、EGFRTK、膜貫通受容体チロシンキナーゼ、p56 lck、非受容体チロシンキナーゼのSrcファミリーのメンバー、p55 fyn、非受容体チロシンキナーゼのSrcファミリーの別のメンバー、および、キナーゼの逆でありII型糖尿病および/または肥満の標的であるホスホチロシンホスファターゼのPTP-1Bの阻害について試験した。表中のデータは、10μmolの濃度の化合物による、示した酵素の阻害の割合（％）である。特定の酵素における空欄は、阻害が見出されなかったことを示す。
【０１９９】
（表８）EGFRPTK、p56 lck、p55 fyn、およびPTP-1Bの阻害
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【０２００】
E．マウス毒性試験
図15は、2つのインドール阻害剤を用いた、最大耐容量（MTD）試験の結果を示す。
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【０２０１】
これらの化合物は、tween80：EtOHで腹腔内投与によりSCIDマウスに投与した。図15の結果は、化合物1aを投与した場合にマウスはより少ない体重減少を示したので、化合物1aが実施例4の化合物2kよりもマウスにおいてより毒性が低いことを示す。
【０２０２】
実施例2  7-置換インドール誘導体タンパク質キナーゼ阻害剤の合成および活性
7-置換インドール誘導体タンパク質キナーゼ阻害剤は、以下のスキーム1に示したように合成した。
スキーム1
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【０２０３】
(2-ブロモ-4-フルオロ-フェニル)-ヒドラジン（2）
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市販されている2-ブロモ-4-フルオロアニリン1（2.36ml、20.75mmol）を、-5℃まで冷却した濃塩酸（40ml）の攪拌溶液に加えた。この溶液を10分間攪拌しながら放置した。NaNO2水溶液を15分間かけて加えた。SnCl2/HCl（10.40g、46.1mmol、10mlのHCl）を15分間かけて加え、さらに30分間から1時間放置した。混合物をろ過し、ジクロロメタンで洗浄した。得られた固体を1.0MのHClに溶かし、ジクロロメタンで3回抽出した。有機層を一晩真空乾燥すると、3.53g（収率83％）が得られた。
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【０２０４】
2-[(2-ブロモ-4-フルオロ-フェニル)-ヒドラゾノ]-プロピオン酸エチルエステル（3）
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市販されているp-トルエンスルホン酸（38.37mg、0.217mmol）を、丸底フラスコおよび磁気攪拌棒中の60mlのトルエンに加えた。その後、フラスコにDean Starkトラップおよび還流冷却器を取り付けた。その後、溶液を2時間攪拌した。2時間後、溶液を冷却し、2-(ブロモ-4-フェニル)ヒドラジン（4.135g、20.17mmol）を加えた。その後、溶液を、同じ装置を使用してさらに1.5時間還流した。1.5時間後、溶液を回転蒸発器に入れ、トルエンを除去した。暗い褐色のタール様物質がフラスコに残った。適切な量のヘキサンをフラスコに加え、還流して純粋なヒドラジンを溶かした。ヘキサンは黄色を帯び、その後、別のフラスコにすばやくデカントすると、タール様の副生成物が残った。これを繰り返した。ヘキサン溶液を含むフラスコを還流して、沈降しているヒドラジンを溶かし、フリーザーに入れて3の結晶3.6g（11.9mmol、収率87％）を形成させた。
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【０２０５】
7-ブロモ-5-フルオロ-1H-インドール-2-カルボン酸エチルエステル（4）
2005514339.tif 000168
市販されているp-トルエンスルホン酸二水和物（2.26g、11.9mmol）を、120mlのトルエンに加え、還流下でDean Stark装置を使用して2時間乾燥させた。2-[(2-ブロモ-4-フルオロ-フェニル)-ヒドラゾノ]-プロピオン酸エチルエステル（3.6g、11.9mmol）を冷却した溶液に加え、さらに1.5時間還流した。1.5時間後に溶液を冷却した。トルエンを減圧下で除去した。その後、固体をヘキサンと共に還流し、インドールエステルを単離した。得られたヘキサン溶液を還流して沈降したインドールを溶かし、結晶化のためにフリーザーに入れた。上清を除去し結晶を乾燥した後、3.30gで11.543mmolの4（収率97％）が得られた。
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【０２０６】
7-ブロモ-5-フルオロ-1H-インドール-2-カルボン酸（5）
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テトラヒドロフラン（35.2ml）、水（23.5ml）、水酸化リチウム（2.61g、10.9mmol）、および7‐ブロモ-5-フルオロ-1H-インドール-2-カルボン酸エチルエステル（3.11g、10.9mmol）を丸底フラスコに加え、磁気攪拌機で混合した。この混合物を1時間還流した。THFを回転蒸発器により除去し、水溶液を1MのHClで酸性とし、酢酸エチルで抽出した。
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【０２０７】
7-ブロモ-5-フルオロ-1H-インドール-2-カルボン酸3-メトキシ-ベンジルアミド（6）
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火で乾燥させ、連続的にアルゴン気流を流し、攪拌棒を装備しておいた丸底フラスコに、DMF（4.8ml）を加えた。この攪拌溶液5（600mg、2.33mmol）に、メトキシベンジルアミン（328μL、2.56mmol）およびPyBOP（1.33g、2.56mmol）を合わせた。その後、この溶液を0℃まで冷却した。2分間後、ジイソプロピルアミン（1.7ml、9.67mmol）を加え、全溶液を室温で一晩攪拌した。その後、反応液を約60mlの酢酸エチルで希釈し、飽和重炭酸ナトリウムで3回抽出し、3回、適切な容量の1MのHClで抽出し、反応していない出発物質を除去した。酢酸エチル層を単離し、硫酸ナトリウムで乾燥した。酢酸エチルを回転蒸発器を使用して除去すると、フラスコの側面上に褐色がかった膜が生成した。ヘキサンをフラスコに加え、還流した。その後、固体がフラスコの側面上に形成され、ヘキサンを回転蒸発器により除去すると、709.0mgの6（収率81％）が得られた。
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【０２０８】
7-ブロモ-5-フルオロ-1H-インドール-2-カルボン酸3-ヒドロキシ-ベンジルアミド（7）
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塩化メチレン（1ml）の攪拌溶液を、ドライアイスアセトン浴中で-78℃まで冷却し、アルゴン気流を流した。この冷攪拌溶液に、6（50mg、0.133mmol）を加えた。7当量のBBr3を加え、-78℃で1時間攪拌し、その後、溶液を室温で一晩攪拌した。その後、反応液を過剰な水でクエンチし、その後、飽和重炭酸ナトリウムで中和し、塩化メチレンで抽出した。塩化メチレン層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で除去すると、35.0mgの2（収率70％）が得られた。
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3.7ppmにおける特徴的なメトキシピークの消失は、脱保護の成功を示す。
【０２０９】
実施例3  pp60c-Srcチロシンキナーゼの非ATP競合的ヒドロキシナフタレン誘導体阻害剤の設計、合成、および活性
自己阻害ヒトIRTK触媒ドメインの結晶構造（Hubbardら、1994）を用いて、ナフタレン環をIRTK Tyr 1,162に重ね合わせた定性的分子モデリング試験を実施した（SYBYL（商標）、6.4、Tripos Inc.、セントルイス）。Tyr 1,162を含むIRTK領域は活性部位に折り返され、Tyr 1,162はペプチド基質のリン酸化可能なTyrと同様に配置され、それによりチロシンキナーゼを自己阻害していた。この重ね合わせにより、アミドカルボニルはTyr 1,162のカルボニルを模倣させるためにナフタレン環の2位（スキーム1）に配置されるべきであり、ヒドロキシル基はTyr 1,162のヒドロキシル基を模倣させるために6位に配置されるべきであることが示された。これらのモデリング試験から、3位のヒドロキシル基がTyr 1,162のNHを模倣できることもまた示された。
スキーム1
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【０２１０】
これらの設計概念を実験的に試験するために、2位のカルボニル基をメチルエステルまたは一連のアミドのいずれかとして付加した（表9）。付加されたヒドロキシN-フェニルアミド側鎖を含むイミノクロメン類似体で観察されたpp60c-src阻害剤の効力の増大（Huangら、1995）に基づき、ヒドロキシN-フェニル（X＝O）およびN-ベンジル（X＝1）アミドを選択した。6-ヒドロキシル基が除去されたか、または移動した類似体も調製し、モデリング試験から予想されたような効力の低下が起こるかどうかを判定した。
【０２１１】
一連の2-カルボニル-3,5-ジヒドロキシナフタレン阻害剤（1a、2a〜2d、2i〜2l、2o〜2p）および2-カルボニル-3,7-ジヒドロキシナフタレン阻害剤（1c、2t-2u）を、それぞれ市販（Aldrich）の3,5-ジヒドロキシ-2-ナフトイン酸および3,7-ジヒドロキシ-2-ナフトイン酸から合成した。それぞれの酸出発材料を、HClガスであらかじめ飽和させたメタノール中で、48時間還流することにより、メチルエステル1aおよび1cを得た。それぞれのカルボン酸を市販（AldrichまたはLancaster）のアミンと、2つのうちの一方の方法を用いてカップリングさせることにより、アミド（2a〜2d、2i〜2l、2o〜2p、2t〜2u）を合成した。第一の方法には、Froyenによって記載された（Froyen、1997）NBS/PPh3法を用いた。第二の方法には、カップリング試薬としてIIDQ（Aldrich）を用いた。カルボン酸をまず1.0当量のIIDQと、無水DMF中室温で24時間反応させた。次いで、それぞれのアミン（2.0当量）をニートで加え、反応物を80℃に2〜6時間加熱した。液体ワークアップ（workup）後、シリカゲルクロマトグラフィーおよびCH2Cl2/ヘキサンからの沈殿に続き、必要があれば調製用C-18RP-HPLC（CH3CN/H2O）により精製を行なった。ベンジルアミンは、その対応するヒドロキシル保護メチルエーテルとしてのみ市販されていた。従って、アミド形成後、DCM中、6当量のBBr3で-78℃1分間の処理後、室温で1時間処理することによりヒドロキシル基を脱保護した。
【０２１２】
（表９）ヒドロキシナフタレン誘導体および選択された公知の阻害剤のpp60c-src阻害活性a,b,c
2005514339.tif 000177
表9の補足説明：
a以前に記載されたアッセイ法（Laiら、1998）を、次のアッセイ要素、最終濃度、および条件と共に用いた：50.0mMのMOPS、4.02mMのMgCl2、6.00mMのK3クエン酸塩（遊離Mg2+を0.5mMで安定化させるためのMg2+緩衝液として用いた）、99.0mMのKCl、10.0mMの2-メルカプトエタノール、198μMのATP、19.8μMのADP、10U全長ヒト精製組換えpp60c-src（Upstate Biotechnology Inc.）、2.00mM RR-SRC、4.0％DMSO、pH7.2、37℃。これら全体のアッセイ条件は、pH、温度、遊離Mg2+（0.5mM）、イオン強度、モル浸透圧濃度、ATP/ADP、および還元電位の細胞内条件を再生することが明らかにされている（Choi、1999）。
b新しい化合物はすべて、プロトンNMR、EIまたはFAB(+)MSで特徴付けし、かつこれらはTLCにより純粋である。
cN/A=適用されない。n.t.＝試験していない。
dATP競合的
【０２１３】
一連の2-カルボニル,3,6-ジヒドロキシナフタレン阻害剤（1b、2e〜2h、2m〜2n、2q〜2s）を3,6-ジヒドロキシ-2-ナフトイン酸6から前述の方法を使用して合成した。開発された中間体6の合成は、市販の2,7-ジヒドロキシナフタレン3（Aldrich）を出発物質としてスキーム2に示す。
2005514339.tif 000178
【０２１４】
化合物1dを3-アミノ-2-ナフトイン酸（Aldrich）からDCM中におけるTMS-ジアゾメタンとの室温での反応により合成した。化合物2vは6-ヒドロキシ-2-ナフトイン酸（Aldrich）からFroyen記載（Froyen、1997）のアミド化法を用いて合成した。
【０２１５】
キナーゼアッセイ条件が、測定した阻害活性に影響することが明らかにされている（Lawrenceら、1998）。したがって、新しく設計されたpp60c-src阻害剤類の相対的効力を正確に決定するために、以前に報告された4つの非ATP競合的PTK阻害剤の阻害活性も試験した。ピセアタンノール、ST-638、およびチルホスチンA47は、市販され（SigmaおよびCalbiochem）、公知の非ATP競合的PTK阻害剤の範囲の代表であることから選択した。チロシンキナーゼp56lckで分析したところ、エモジン（Calbiochem）はATP競合的である。以前は、報告されている中で最も強力な非ATP競合的pp60c-src阻害剤はイミノクロメン9TAであった（Huangら、1995）。イミノクロメン9TAは市販されていなかったため、3-アミノフェノールを対応するTBDMSエーテルに変換することによる新規なルートを用いて合成した（1.1当量TBDMS-Cl、1.1当量DIEA、5mol％DMAP、DMF、室温24時間、71％）。得られたアニリンを2.0当量のシアノ酢酸を用いてカップリングさせた（1.1当量EDCI、1.1当量TEA、DMF、75℃18時間、70％）。得られたアミドと1.2当量の2,3-ジヒドロキシベンズアルデヒドとの縮合（cat.ピペリジン、abs.EtOH、60℃2時間）の後、脱保護（1.1当量TBAF、THF、15分、全収率43％）し、フラッシュクロマトグラフィー（DCM：MeOH＝10：1）による精製後の、元素分析、FAB(+)MS分析、および1H NMR分析が良好であるようなイミノクロメン9TAを得た。
【０２１６】
化合物1a〜dおよび2a〜2vについて表9に示した阻害活性を、精製した全長ヒト組換えpp60c-srcを用いて測定した。試験する化合物の数、およびそれに伴う費用のため、それらの順位効力をまず一定の阻害剤濃度（100μM）で測定した。モデリング試験によって予想されたとおり、IRTK Tyr 1,162のヒドロキシル基との類似性に基づき、エステル系（1b 47％対1a 5％および1c 19％）およびアミド系（例えば2f 89％対2b 51％および2t 68％）の両方でナフタレンのヒドロキシル基配置の5または7位の炭素上に対して6位の炭素上の優先傾向が見られた。ヒドロキシル基をナフタレンの3位の炭素に連結すると（Tyr 1,162 NHの模倣）効力が改善されるだろうとの予測も確認された（2f 89％対2v 45％）。最後に、阻害剤を2位でアミドとして伸長する（ペプチド結合の模倣）ことにより、効力をさらに改善することができるとの予測も同じく確認された（例えば2f 89％対1b 47％）。
【０２１７】
表9のデータは、ヒドロキシル基を最適な6位から隣のナフタレン炭素5位に移動させると、アミド側鎖のヒドロキシル基の最適な同時的配置に関して、構造活性特性が異なってくることを示している（例えば2f/2g対2b/2c）。同じく注目すべきは、化合物2i〜2nにおける対応するメトキシ基によるアミド側鎖ヒドロキシル基の置換である。N-フェニルアミド（2i〜2j）の場合、対応するヒドロキシアミド（2b〜2c）と比較したそれらの活性は、N-ベンジルアミド（2k〜2n対2o〜2q、2s）の場合ほど有意に低下しなかった。このことから、ベンジル誘導体では、アミド側鎖ヒドロキシル基が水素結合供与体として酸素と相互作用するか、またはメトキシ基が大きすぎて結合部位に合わないかのいずれかであることが示唆される。
【０２１８】
5位の炭素に対する6位の炭素上へのヒドロキシル基配置の選択性に関するより定量的な分析を、それぞれ2f（16μM）対2b（150μM）のIC50を比較することによって行なう。これらの結果からも、予期されたとおり、約90％から約50％への阻害の割合(％)の低下は効力における桁違いの差を表していることが確認された。同様に、約50％から約10％への阻害の割合(％)の低下は、別の、効力における桁違いの差があることを示していると考えられる。
【０２１９】
この一連の、最も強力な阻害剤である化合物2fを、表9に示される過去に報告された5つのPTK阻害剤と直接比較することにより、これらのアッセイ条件下では2fの効力が1〜2桁高いことが示される。興味深いことに、イミノクロメン9TAは過去にpp60c-srcに対して118nMのIC50を有すると報告され（Huangら、1995）、最も強力な公知の非APT競合的pp60c-src阻害剤であったが、本アッセイ法条件下では100μMで30％の阻害しか認められなかった。これらの結果は、タンパク質キナーゼ阻害剤を等しいアッセイ条件下で比較することの重要性を再度強調するものである（Lawrenceら、1998）。
【０２２０】
これらの試験の目標は、ATPと競合しない非ペプチドpp60c-src阻害剤を得ることであった。したがって、2fおよび2bによる一定の阻害剤濃度でのpp60c-srcの阻害の割合(％)を、細胞を模した1mMレベルまでの[ATP]の上昇の関数としてモニターした。[ATP]は阻害の割合(％)にほとんど影響をおよぼさなかったため、2fおよび2bはいずれもATPに関して非競合的阻害剤である。阻害剤濃度を一定に保ちながら、200μM、500μMおよび1,000μMのATP濃度を用いて阻害の割合(％)を測定した。阻害剤がATPと直接競合する場合、阻害の割合(％)への影響に関して、全体で5倍というこの[ATP]上昇は、阻害剤濃度の5分の1への低下に等しい。したがって、ATPとの直接の競合が起こっている場合、この実験で用いた固定阻害剤濃度の1/5の濃度では、阻害の割合(％)はIC50用量反応曲線（200μM ATPで得た）で観察された値まで低下するはずである。阻害剤2f（25μMで固定）については、200μM、500μM、および1,000μM ATPでそれぞれ62％（+/-5）、54％（+/-3）、および50％（+/-1）の阻害が観察されたが、ATPとの直接の競合が起こっていたならば、1,000μM ATPでの阻害のレベルは約20％まで低下するはずであった。同様に、阻害剤2b（300μMで固定）について、200μM、500μM、および1,000μM ATPでそれぞれ84％（+/-1）、81％（+/-）、および77％（+/-2）の阻害が得られた。キナーゼの多くが高価であるために、他の研究者も同じ目的のために[ATP]上昇の関数として阻害効力をモニターしている（Sapersteinら、1989；Burkeら、1993；Davisら、1989；Davisら、1992；Faltynekら、1995；およびSawutzら、1996）。
【０２２１】
要約すると、構造に基づく設計により、ATPと競合しない一連のヒドロキシナフタレンpp60c-src非ペプチド阻害剤が製造された。細胞を基準とするアッセイ法、および様々なアッセイ条件下での詳細な動態試験における系列由来の化合物の結果はやがて報告されると考えられる。ナフタレン骨格からインドール骨格へのこれらの設計概念の拡張を、以下の実施例に報告する。
【０２２２】
実施例4  pp60c-srcチロシンキナーゼの非ATP競合ヒドロキシインドール誘導体阻害剤の設計、合成、および活性
前述の実施例において、ナフタレン骨格を用いた一連のpp60c-src阻害剤の構造に基づく設計が記載された。これらの化合物は、細胞環境における、ATP基質部位と比較してより高い選択性および有効性に関する素質によりペプチド基質部位の方に結合するように設計された。この実施例は、インドール骨格を基本とする一連のpp60c-src阻害剤へのこれらの設計概念の拡張を示す。インドール環をIRTK Tyr 1,162に重ね合わせた事を除き、ここでも自己阻害インスリン受容体PTK（IRTK）の結晶構造を用いて定性的分子モデリング試験を実施した。この重ね合わせにより、インドールのNHはTyr 1,162のNHを模倣することができ、それぞれTyr 1,162のカルボニルおよびOHを模倣するためにカルボニルは2位に配置されるべきであり、かつヒドロキシル基は5位に配置されるべきであることが示された（スキーム1）。
スキーム1
2005514339.tif 000179
ナフタレン骨格の場合の6員環と比較してより小さいスキーム1に示すようなインドール5員環へのTyr 1,162の概念的環化により（Karniら、1999）、OHの最適な位置はナフタレン骨格6位の炭素からインドール骨格の5位の炭素に移動する。
【０２２３】
前の実施例で報告した類似のナフタレンを基本とするヒドロキシフェニルアミドで観察されたpp60c-src阻害剤効力の上昇に基づいて、ヒドロキシフェニル／ベンジル側鎖（それぞれ2d〜f、2j〜l(表10)）を含むインドールアミド誘導体を選択した。対応するメチルエーテル2a〜c、g〜i、vは合成における前駆体である。表10に示す他の類似体は、側鎖の範囲をヒドロキシ／メトキシ基以外に拡張を開始するために調製され、インドールおよびナフタレン骨格の両方で広く探索された。
【０２２４】
ヒドロキシまたはメトキシ側鎖のみを含むインドールアミドを下記に図示したとおりに合成した：
スキーム2
2005514339.tif 000180
【０２２５】
2-インドールカルボン酸誘導体、メトキシフェニルアミン（1.1当量、Aldrich、LancasterまたはFluka）、およびカップリング試薬PyBOP（ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ）トリピロリジノ-ホスホニウム-ヘキサフルオロホスフェート）（1当量、Fluka）を無水DMFに溶解した。溶液をアルゴン下で0℃に冷却し、次いでジイソプロピルエチルアミン（DIEA、3当量）を加えた。反応物を0℃で1分間、続いて室温で1時間攪拌した。ワークアップ後、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製した。
【０２２６】
望ましい場合には、メチルエーテルを三臭化ホウ素（1M DCM溶液、Aldrich）で切断した。インドールアミドメチルエーテルを無水DCMに懸濁し、アルゴン下で-78℃に冷却した。1過剰等量を加えた出発物質の各へテロ原子1個に対し1当量のBBr3を加えた。得られた暗赤色の溶液を-78℃で30分、続いて室温で1時間〜2時間攪拌した。反応を水でクエンチ（10分）させた後、ワークアップを行なった。
【０２２７】
（表１０）ヒドロキシインドール誘導体のpp60c-src阻害活性a、b、c
2005514339.tif 000181
a化合物はすべて、先の実施例に記載のとおりに試験した。5
b化合物はすべて、プロトンNMR、FAB(+)MSで特徴付けし、かつこれらはTLCにより純粋である。
cN/A＝適用されない
【０２２８】
この合成経路を用い、一連の5-ヒドロキシインドールアミド阻害剤2a〜m、y、zを5-ヒドロキシ-2-インドールカルボン酸から調製した。4-および6-ヒドロキシインドールアミド（それぞれ2x、u）を、それぞれ4-メトキシ-2-インドールカルボン酸メチルおよび6-メトキシ-2-インドールカルボン酸メチルから合成した。5,6-ジヒドロキシインドールアミド2tを5,6-ジメトキシインドール-2-カルボン酸エチルから調製した。エステルを1N NaOH中で1時間超音波処理することにより、カップリングのための対応するカルボン酸を得た。デス-ヒドロキシインドールアミド2v、wをインドール-2-カルボン酸から合成した。インドール出発物質はすべて市販のものであった（AldrichまたはLancaster）。
【０２２９】
フルオロ阻害剤2r、sは対応するフルオロフェニルアミン（Aldrich）から同様に調製した。対応するアミノカルボン酸（Aldrich）からアミド側鎖にエステルまたはカルボン酸を含む阻害剤2n〜qを調製した。側鎖カルボン酸をまずメチルエステルとして保護し（HClであらかじめ飽和させておいたanh.MeOH、還流、1日）、その後PyBOPカップリング（前述）を行い、次いで望ましい場合にはけん化してカルボン酸に戻した。
【０２３０】
メチルエステル1aは、HClガスであらかじめ飽和させておいた無水メタノール中のカルボン酸溶液を一晩還流させることによって調製した。エチルエステル1bは、前述のように、5,6-ジメトキシインドール-2-カルボン酸エチルのBBr3脱保護により調製した。表10に記載の阻害剤はすべて、シリカゲルゲルクロマトグラフィーにより精製した。
【０２３１】
Marsilje 2000と同様、この一連のpp60c-src阻害剤の順位活性を、まず一定の阻害剤濃度で測定した（表10）。本インドール系阻害剤、前のナフタレン系阻害剤、および文献記載の5つの非ATP競合的PTK阻害剤（前の実施例を参照）で同じ阻害剤濃度（100μM）を用いた。これにより、等しいアッセイ条件下で合計59個の化合物の有効な順位比較を行うことができた。
【０２３２】
モデリング試験により、インドール骨格の5位の炭素のヒドロキシ基が最適であると予想された。5-ヒドロキシインドール阻害剤2k（74％）と類似の6-ヒドロキシインドール阻害剤2u（56％）および4-ヒドロキシインドール阻害剤2x（60％）の比較によりこの予想が確認されたが、選択性は強くない。5位の炭素のヒドロキシ基が活性を改善するだろう（ヒドロキシ基がないものに比べて）との予想は、5-ヒドロキシインドール阻害剤2l（54％）と対応するデス-ヒドロキシ阻害剤2w（36％）との比較によって確認される。
【０２３３】
前のナフタレン阻害剤に基づいて予想されたとおり、インドール阻害剤を2位の炭素でのアリールアミドとして伸長することにより、効力が改善された。例えば、メタ-ヒドロキシベンジルアミドインドール2kは100μMで74％の阻害を示したが、類似のメチルエステル1aは500μMで40％の阻害を示すにすぎなかった。興味深いことに、5,6-ジヒドロキシエチルエステル1b（28％）と対応するアリールアミド2t（26％）の比較により、6位の炭素に第2のヒドロキシが同時に存在すると、そうでなければ好ましいメタ-ヒドロキシベンジルアミド側鎖によって通常提供される効力増強が妨げられることが示された。このアミド側鎖は、5-ヒドロキシ基が単独で存在する場合には本系列中最も良好であり（2k、74％）、6-ヒドロキシ基が単独で存在する場合にもまだ良好な阻害を示す（2u、56％）。また、2個のヒドロキシ基が5位と6位の炭素に同時に存在すると、アミド側鎖がない場合に耐容性が高いと考えられる（1b対1aおよび2e）。このデータより、第2のヒドロキシ基の存在によってインドール骨格の結合配向性に変化が起こり、異なるアミド側鎖が優先されることが示唆される。炭素4〜7位の側鎖（ヒドロキシ基の官能基置換を含む（Laiら、1999））とアミド側鎖との最適な組合せを、現在調査中である。
【０２３４】
一般に、表10のデータによって判明したインドール骨格構造活性相関（「SAR」）は、ナフタレン骨格について先の実施例で報告したものと類似している。いずれの場合にも、モデリング試験で同定されたように、骨格上のヒドロキシ基をTyr 1,162のOHと同様に配置すると、最も高い効力が得られた。いずれも場合にも、このヒドロキシ基を隣接する炭素の1つに移動させると効力が低下したが、劇的な低下ではなかった。Tyr 1,162のペプチド結合を模倣するために、モデリング試験で同定された位置で両骨格をアリールアミドにより伸長すると、効力が改善された。いずれの骨格においても、アミド側鎖のヒドロキシ基をメトキシ基で置換すると、通常は効力が低下し、側鎖がより長いベンジルアミドの場合には低下の程度が大きかった（例えば、2e 30％対2b 21％に比べて、2k 74％対2h 7％）。これら2つの骨格のSARにおける主な相違は、5-ヒドロキシインドール骨格ではより長いm-ヒドロキシベンジルアミド側鎖が好ましい（2k 74％対2e 30％）のに対し、類似の3,6-ジヒドロキシナフタレン骨格ではより短いm-ヒドロキシアニリン由来のアミド側鎖が好ましいことである。5-ヒドロキシインドール骨格は本質的には、より短いアミド側鎖上のヒドロキシル基の位置について偏向性を示すことはなかったが（2d〜f）、より長いヒドロキシベンジルアミド側鎖では、メタ位に有意に偏向した（2j〜l）。3,6-ジヒドロキシナフタレン骨格の場合、反対の事象が認められた。
【０２３５】
インドール骨格でより長いアミド側鎖についての優先度をさらに探索するため、追加の分子モデリング試験を実施した。以前の報告から最も活性の高いナフタレン阻害剤3を鋳型として用い、その上に類似のインドール阻害剤2eと同調させたインドール阻害剤2kとを重ね合わせた。ナフタレン阻害剤3の3つの最も重要な側鎖官能基は、両方の阻害剤系列の合理的設計およびSARに基づき、6-ヒドロキシル基（H結合供与体および受容体）、3-ヒドロキシ基由来の水素（H-結合供与体）、および側鎖ヒドロキシ基（H-結合受容体）であると考えられる。スキーム3において、両方の阻害剤系列のこの3点ファルマコフォアモデルをアステリスクにより識別する。
スキーム3
2005514339.tif 000182
【０２３６】
2eおよび2kを3に重ね合わせるために、SYBYL（商標）（6.4、Tripos、セントルイス）内の「マルチフィット（multifit）」エネルギー最小化および「フィット原子（fit atoms）」機能を順に用いた。この全フィッティング段階は、骨格ファルマコフォアOおよびH（100）を最適に重ね合わせることに最も重点を置き、続いて側鎖のO（10）、その次に介在するアミド結合（1）を重ね合わせることに重点を置いて選択したバネ定数（マルチフィット）および重量（フィット原子）を用いて実施した。「マルチフィット」段階が最大のファルマコフォアフィットのためのコンフォメーションを調整し、続く最小化によって最も近い局部最小エネルギーのコンフォメーションが得られ、最後に「フィット原子」段階により、これら最小化されたコンフォメーションの最良のファルマコフォアの重ね合わせが得られた。予想されたとおり、2eと2k両方の骨格ファルマコフォアOおよびHは、対応する3の原子上に近くかつ類似の状態で重ね合わされた（すべて約0.50Å以内）。しかし、2eおよび2kの側鎖ファルマコフォアOは、対応する3のOへのそれらの重ね合わせにおいて著しく異なり、ずれはそれぞれ1.8Å対わずか0.08Åであった。この2kと3との間の3つの鍵となるファルマコフォア部位の密接な一致が、効力の差がわずか2.4倍しかない（IC50はそれぞれ38μM対16μM）ことの説明となる。
【０２３７】
別の炭素原子によりアミド側鎖を伸長すると活性が低下した（2m 21％対2l 54％）。メチル基を2kのベンジル炭素に、いずれかの立体配置で付加すると、活性が大きく低下した（2y 15％および2z 13％対2k 74％）。側鎖ヒドロキシ基（パラ位）をカルボン酸アニオンで置換（2n 0％対2l 54％および2p％対2f、45％）すると活性が低下したが、対応するメチルエステル（それぞれ2o 11％および2q 32％）の効力低下はそれよりも小さいものであった。重要なことに、側鎖ヒドロキシ基をフッ素で置換しても、効力はほぼ維持された（2s 57％対2k 74％および2r 21％対2e 30％）。したがって、フルオロ類似体2sでは、可能性のある第II相代謝（例えばグルクロニド生成）のためにヒドロキシ基は1つしか残っておらず、この残っているヒドロキシ基が置換のための本発明の標的となる（Laiら、1998）。
【０２３８】
前述の例（Marsilje、2000）と同じ方法を用いて、本インドール系阻害剤の中で最も強力な阻害剤（2k）を、ATP競合について、阻害剤濃度を一定に保ったまま[ATP]を増大させて阻害の割合(％)をモニターすることにより分析した。[ATP]は阻害の割合(％)にあまり影響をおよぼさなかったため（45μMの2kおよび200μMまたは1,000μMの[ATP]による阻害の割合(％)はそれぞれ46％および41％）、2kはこれらのアッセイ条件下ではATPに関して非競合的である。
【０２３９】
要約すると、非ATP競合的pp60c-src阻害剤の開発のために、インドール骨格が設計され、初期SARが実施された。本系列の中で、最良のインドールを基にした阻害剤の効力は、最良のナフタレンを基にした阻害剤の効力とほぼ同等であることが判明した。45μMの2kおよび200μMまたは1,000μMの[ATP]による阻害の割合(％)はそれぞれ46％および41％であった。
【０２４０】
実施例5  追加的なインドール誘導体タンパク質キナーゼ阻害剤の合成
下記の結果は、インドール由来のタンパク質キナーゼ阻害剤の合成および試験を示す。4つの反応スキームを示し、続いてこれらそれぞれの反応スキームの最終生成物を調製するための実験の詳細を別々に示す。これらの最終生成物はインドールに基づくチロシンキナーゼ阻害剤の例であり、好ましいR基による合成を示している（ボロン酸、スキーム1；OH、スキーム2；脂肪族アミド伸長、スキーム3；およびホスホン酸、スキーム4）。
スキーム1
2005514339.tif 000183
【０２４１】
5-ヒドロキシ-2-インドールカルボン酸メチル（1）
3.50gの5-ヒドロキシ-2-インドールカルボン酸を、HClガスであらかじめ飽和させた無水MeOHに溶解し、48時間還流させた。減圧濃縮し、AcCNで3回粉砕して残存する酸を除去した。EtOAcを用い、シリカプラグを通してろ過し、ベースライン混入物を除去した。4.32gを回収した（定量的収率）。TLCRf＝0.78（EtOAc）
2005514339.tif 000184
【０２４２】
5-[(トリフルオロメチル)スルホニルオキシ]インドール-2-カルボン酸メチル（2）
3.24g（17mmol）の5-ヒドロキシ-2-インドールカルボン酸メチル（1）および6.67g（18.7mmol）のn-フェニルトリフルオロメタンスルホンアミドに、150mlの無水DCMを0℃で加えた。2.6mlのトリエチルアミンを滴下し、この時点で澄明な黄色溶液が生成され。0℃で1時間攪拌後、室温まで暖め、2時間攪拌した。減圧濃縮し、シリカゲルカラム（1/1 EtOAc/ヘキサン）を通して精製した。4.69g（86％）を回収した。TLC Rf＝0.63（1/1 EtOAc/ヘキサン）。HPLC Rf＝20.879。
2005514339.tif 000185
【０２４３】
5-メチルインドール-2-カルボン酸メチル,4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボランメチル（3）
500mg 1.55mmolの5-[(トリフルオロメチル)スルホニルオキシ]インドール-2-カルボン酸メチル（2）、37.9mg（0.05mmol）のPdCl2（dppf）、432mg（1.7mmol）のビスピナコラートジボロン、454.8mg（4.65mmol）の酢酸カリウム、および25.7mg（0.05mmol）dppfをフラスコに加え、40℃で2時間減圧乾燥した。20mlの無水ジオキサンを加え、80℃に終夜加熱した。Pd黒が沈殿し、反応混合物は黒色に変わった。触媒をろ去し、シリカプラグを通過させて、ベースライン不純物を除去した。TLC Rf＝0.51（EtOAc/ヘキサン＝1/4）。粗生成物を次の反応に用いた。
【０２４４】
5-ボロニルインドール-2-カルボン酸メチル（4）
391.2mg（1.3mmol）の5-メチルインドール-2-カルボン酸メチル,4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロランメチル（3）をEtOAcに溶解した。0.25ml（2.6mmol）のジエタノールアミンを加え、反応混合物を室温で終夜攪拌した。生成した白色沈殿物をろ過し、1N HCl中で超音波処理した。得られた白色沈殿物をろ過し、MeOHに溶解し、減圧濃縮した。36.6mg（13％）を回収した。HPLC Rf＝13.912。
2005514339.tif 000186
スキーム2
2005514339.tif 000187
【０２４５】
(5-ヒドロキシインドール-2-イル)-N-[(3-メトキシフェニル)メチル]カルボキシアミド（5）
2.00g（11.3mmol）の5-ヒドロキシ-2-インドールカルボン酸、1.6ml（12.4mmol）の3-メトキシベンジルアミン、および5.87g（11.3mmol）のPyBOPを10mlの無水DMFに溶解した。0℃に冷却し、5.9ml（33.9mmol）のDIEAを加えた。0℃で5分間攪拌し、1時間かけて室温に暖めた。2.83g（収率85％）を回収した。TLC Rf＝0.34（1/1 EtOAc/ヘキサン）。
2005514339.tif 000188
【０２４６】
(5-ヒドロキシインドール-2-イル)-N-[(3-ヒドロキシフェニル)メチル]カルボキシアミド（6）
200mg（0.67mmol）の(5-ヒドロキシインドール-2-イル)-N-[(3-メトキシフェニル)メチル]カルボキシアミド（5）に、20mlの無水DCMを加え、アルゴン雰囲気下で-78℃に冷却した。4.0ml（4.0mmol、6当量）のBBr3を加えた。5分間-78℃に維持した後、室温まで暖めた。室温に90分間置いた後、H2Oでクエンチし、10分間攪拌した。反応物をEtOAcと混合して希釈し、NaHCO3および塩性溶液で洗浄した。有機層をMgSO4で乾燥し、減圧濃縮した。シリカプラグを通過させ、ベースライン混入物を除去した。Xmg（収率80％）を回収した。TLC Rf＝0.21（1/1 EtOAc/ヘキサン）。
2005514339.tif 000189
スキーム3
2005514339.tif 000190
【０２４７】
N-(1-カルバモイル-2-メチルブチル)(5-ヒドロキシインドール-2-イル)カルボキシアミド（7）
100mg（0.56mmol）の5-ヒドロキシ-2-インドールカルボン酸、103.4mg（0.62mmol、1.1当量）のL-イソロイシンアミド、および291mg（0.56mmol、1当量）のPyBOPをすべて1mlの無水DMFに溶解した。溶液を0℃に冷却し、0.3ml（1.68mmol、3当量）のDIEAを加えた。反応混合物を0℃で1分間攪拌し、次いで室温で1時間攪拌した。反応物を次いでEtOAcで希釈し、1N HClで3回および飽和NaHCO3で3回洗浄した。有機層をMgSO4で乾燥し、減圧濃縮して166.7mg（収率91％）を得た。TLC Rf＝0.08（1/1 EtOAc/ヘキサン）。
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スキーム4
2005514339.tif 000192
【０２４８】
5-ジベンジルホスホリルインドール-2-カルボン酸メチル（8）
200mg（0.62mmol）の5-[(トリフルオロメチル)スルホニルオキシ]インドール-2-カルボン酸メチル（2）、195.8mg（0.74mmol、1.2当量）のジベンジルホスファイト、0.14ml（0.81mmol、1.3当量）のDIEA、および35.7mg（0.03mmol、5mol％）のPd(PPh3)4をすべてアルゴン雰囲気下で無水AcCNに溶解した。反応混合物を80℃に終夜加熱した。溶媒を減圧下で除去し、標題化合物をシリカゲルクロマトグラフィーにより単離した。130mg（収率50％）。TLC Rf＝0.28（1/1 EtOAc/ヘキサン）。
2005514339.tif 000193
【０２４９】
5-ホスホノールインドール-2-カルボン酸メチル
5-ジベンジルホスホリルインドール-2-カルボン酸メチル（8）（125mg）を10mlのMeOHに溶解した。20mgのPd-Cを加え、混合物をParr装置内で終夜水素付加した。触媒をろ過して除き、溶媒を減圧下で除去した。72.5mg（収率73％）を得た。TLC Rf＝EtOAc中でベースライン。
2005514339.tif 000194
【０２５０】
この実施例におけるエステル化合物は、エステルをアミドに変換すること、および／または追加の特異性要素を加えることによって、効力を増強することができた。
【０２５１】
実施例6  さらなるインドール誘導体タンパク質キナーゼ阻害剤の合成
いくつかのさらなる産生インドール阻害剤の合成を以下に示す。これらの合成により、pp60c-srcおよび他のチロシンキナーゼに対する効力がより強い化合物が得られる。続いて、効力を高めるために、メチルエステル基を様々なアミド誘導体に変換することができる。
スキーム1
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スキーム2
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スキーム3
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【０２５２】
実施例7  Src阻害剤の毒性
多くの最近の文献が、重大な毒性をもたらさない、広範囲にわたって有用な癌治療へのアプローチとして、pp60c-src（Src）の標的化を支持している。例えば、EGF受容体PTKシグナル伝達の増大を示すか、または関連するHer-2/neu受容体を過剰発現する腫瘍は、構成的にSrcを活性化し、腫瘍の侵襲性を促進する。これらの細胞においてSrcを阻害すると、増殖の抑止が誘導され、アポトーシスが引き起こされ、形質転換された表現型が戻る（Karniら、1999）。異常に上昇したSrc活性は、形質転換細胞の足場非依存的な様式での増殖を可能にすることが知られている。これは明らかに、細胞外マトリックスシグナル伝達が分裂促進的なシグナル伝達と協調する様式でFAK/Src経路におけるSrc活性を上昇させ、それにより通常は活性化されているアポトーシスメカニズムを阻止するという事実によって引き起こされる。したがって、細胞外マトリックスから解放されることにより通常は活性化されているアポトーシスメカニズムが誘導されると考えられるため、腫瘍細胞におけるFAK/Src阻害はアポトーシスを誘導すると考えられる（Hisanoら、1997）。加えて、Src阻害によるVEGF mRNA発現の低下が認められ、これらのSrcが阻害された細胞系統由来の腫瘍は、脈管形成性発生の低下を示した（Ellisら、1998）。
【０２５３】
Src阻害の潜在的毒性の問題は、非常に有望な結果によって対処された。例えば、マウスにおけるSrc遺伝子のノックアウトは、たった1つの異常、すなわち波状縁を形成できず、したがって骨再吸収をしない破骨細胞をもたらした。しかし、これらのマウスにおける破骨細胞の骨再吸収機能は、キナーゼ欠損Src遺伝子を挿入することによって救済された（Schwartzbergら、1997）。Srcタンパク質の存在は破骨細胞必須シグナル伝達複合体における他のPTK（破骨細胞の機能を維持するのに必須である）を動因および活性化するのに十分であることが明らかな為、既知の毒性のみを誘発することなく、Srcキナーゼ活性がインビボで阻害されうることが示唆された。
【０２５４】
前述された腫瘍（Levitzki、1996）に加えて、Srcが過剰に活性化されることが判明したヒト腫瘍の数が増加しているため、Srcは癌治療のための「万能」標的であると提唱されている。引用された文献やその他の文献に基づき、癌治療のためのSrc阻害の潜在的恩典は、4倍になったように思われる。すなわち、1）オートクライン成長因子ループ効果などにより引き起こされる無制御の細胞増殖の阻害、2）細胞マトリックスからの開放によるアポトーシス誘発に起因する転移の阻害、3）VEGFレベル低下を介した腫瘍脈管形成の阻害、4）低毒性。
【０２５５】
初期非ペプチドSrc阻害剤は、4つの異なる一連の細胞培養アッセイ法においても非常に有望な結果を示している。1）NIHの60腫瘍細胞パネルアッセイ法では、前立腺の系統を含む腫瘍細胞株に対し、広い活性（Src阻害剤に対して期待されるとおり）が示された。例えば、阻害剤の3つはNIH前立腺癌細胞株に対して下記の増殖阻害IC50を示した：45（PC-3、15μM；DU-145、38μM）、43-メタ（PC-3、19μM）、49-メタ（PC-3、39μM；DU-145、＞100μM）。2）v-Src形質転換正常ラット腎細胞株（LA25）において、43-メタおよび45は非形質転換親細胞の正常な増殖は阻害せずに、v-Src誘導細胞増殖を特異的に阻害した。この結果より、阻害剤は正常な細胞には影響をおよぼさないが、Src誘導細胞形質転換の阻害において有効であることが示された。3）3名の異なる患者由来の卵巣腫瘍およびもう1名の患者由来の腹部癌における、抗癌剤エトポシド、タキソール、ドキソルビシン、およびシスプラチンに対して、Src阻害剤を比較した。すべての場合において、Src阻害剤は公知の抗癌剤と少なくとも同程度に有効、典型的にはより有効であり、試験した最低用量（3μM）で完全な有効性が認められた。代表的な例として、タキソールおよびドキソルビシン（この特定の腫瘍細胞培養物においては、これらはエトポシドおよびシスプラチンよりも有効であった）と前述の3つのSrc阻害剤（構造は図16Eに示す）との、腫瘍NO15由来の卵巣腫瘍細胞を用いた比較を図16Aに示す。4）正常なヒト線維芽細胞増殖の阻害についてもSrc阻害剤を試験したところ、正常な細胞増殖の阻害は全く見られなかった（サブコンフルエントとコンフルエント両方；代わりに若干の増殖促進が観察された）が、このことはこれらの阻害剤が10倍高い濃度であっても正常細胞には毒性でないことを示している。データの例を図16Bに示す。5）Src阻害剤の2つを、ts v-Src刺激LA25細胞増殖の阻害についても試験した。結果を図16Cに示す。これらの結果は、試験した化合物がSrc刺激細胞増殖を阻害することを示す。6）Src阻害剤の2つを、正常ラット腎細胞増殖の阻害についても試験した。結果を図16Dに示し、阻害剤が正常細胞に対して細胞保護的であることを示す。
【０２５６】
全体として、ここまでに得られた細胞データは、Src阻害剤への期待、すなわち、通常の細胞毒性がほとんどまたは全くない多くの癌細胞株に対する広い活性を示している。
【０２５７】
予備的Src阻害剤は、そこからより強力で選択性が高い阻害剤を設計することができる先導構造である。チロシンキナーゼ結晶構造の利用に加え、天然産物チロシンキナーゼ阻害剤ダムナカンサル（Faltynekら、1995）を用いた分子モデリング試験を実施してこの阻害剤のペプチド競合的結合形式を調べることができる。これらの追加的モデリング試験により、ダムナカンサルの鍵となるファルマコフォア成分が新しい阻害剤に組み込まれている、Src阻害剤のさらなる類似体を設計することが可能となる。これらの合成および単離Src試験は報告のように行われる（Marsilje 2000）。
【０２５８】
実施例8  悪性前立腺癌の治療のためのSrc PTK阻害剤の開発
前立腺癌細胞においては、パキシリンおよびp130casが過剰発現されているだけでなく過剰リン酸化されているとの両方の報告がなされており（Tremblayら、1996）、従って、Src阻害剤の主な標的となり得る。前立腺癌は最も頻繁に起こる悪性腫瘍であり、男性の癌死亡率の第二位の原因である。臨床的に局在している場合には、手術または放射線療法により最も効果的に治療される（Dorkinら、1997）。進行した疾患では、数十年前からアンドロゲン抑制が治療法の頼みの綱であり、アンドロゲン応答性前立腺癌細胞において細胞増殖停止およびアポトーシス刺激を引き起こすことが知られている（Dorkinら、1997）。しかし、前立腺癌は異種性細胞集団から構成されているので、疾患の進行および死亡は最終的にはアンドロゲン非依存的細胞の出現に起因する。なぜなら、進行した前立腺癌に対する治療法は存在しないからである（Abate-Shenら、2000）。高度に悪性の前立腺癌に対して有効な強力なPTK阻害剤の特定は、進行した疾患の治療における価値あるツールを提供するだろう。
【０２５９】
方法
アポトーシス
対照および薬物処理細胞由来の培地を30mlのチューブに移し、氷上に保った。接着細胞をPBSで穏やかに洗浄し、3分間37℃でトリプシン処理した。トリプシン処理した細胞を浮遊細胞と合わせ、計測した。細胞（5×105）を、15mlのコニカルチューブに移し、5mlの冷PBSで1回洗浄し、15分間暗くしてアネキシンV-FITCと共に結合緩衝液に再度懸濁した。その後、細胞を遠心分離し、結合緩衝液に再度懸濁し、10μlのヨウ化プロピジウムを加えた。FACSCANにより解析を実施した。アネキシンで標識された細胞はアポトーシス性であると判断した。死細胞をヨウ化プロピジウムで標識され、生存細胞は標識されなかった。結果を免疫組織化学法により確認した。
【０２６０】
ウェスタンブロット解析
全タンパク質を〜5×106個の細胞から単離し、1mlの溶解緩衝液［50mMのトリス-HCl、pH8.0、100mMのNaCl、0.5%のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、0.5%Nonidet P40、10mMのジチオトレイトール、1mMのPMSF、および0.4Uのアプロチニン］に溶かした。タンパク質濃度を、DCタンパク質アッセイキットを用いて決定した。チロシンリン酸化タンパク質の発現をイムノブロットにより調べた。細胞溶解液からのタンパク質（50μg）を10％SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、その後、ニトロセルロース膜を使用して4.5μmのTrans-Blot Transfer培地に転写した。ブロットを適切な二次抗体と共にインキュベートし、化学ルミネセンス試薬キットを使用して展開した。パキシリンで得られたウェスタンは、新しい二次抗体を用いての膜の標準的な剥ぎ取りおよび再プローブを使用して得られた。各ブロットは、複数回操作したものの典型である。
【０２６１】
毒性アッセイ法
96ウェルプレート形式で細胞生存度を測定するように、スルホローダミンアッセイ法を設計する。細胞を計測し、50,000細胞/ウェルの濃度で、RPCI 1640培地中10％のFBS 0.1mlに播種した。プレートを2日間増殖させて細胞を付着させ、その後、漸増濃度の薬物で72時間処理した。培地をウェルから取り出し、プレートを10％のトリクロロ酢酸で1時間固定した。ウェルをPBSで洗浄し、0.4%のスルホローダミンBで15分間染色した。その後、非結合色素を、プレートを1％酢酸溶液で洗浄することにより除去し、（タンパク質）結合ダイを10mMトリスを使用して抽出した。その後、吸光度を波長570nmでマルチウェルプレートリーダーで測定した。各点は12点の平均±S.D.であり、各グラフは複数回の解析の代表である。
【０２６２】
結果
高度に悪性の前立腺癌細胞におけるSrc阻害剤に関するかなりの量のデータが得られた。4つの各薬物および1つの不活性対照を連続的に72時間暴露した後の代表的な毒性データを示す（図17AおよびB）。時間経緯およびアポトーシス応答の判定は主に45（データは示していない）を使用して実施し、45は、高度に悪性のPC3-LN3前立腺癌細胞に対して最も活性の高い化合物として同定された（図17AおよびB）。悪性LNCaP-LN細胞を使用した第二の解析により、2つの化合物45および49-メタのほぼ等しい効力が示された（データは示していない）。KLM2-25は陰性対照であり、いずれの細胞系でも殆ど活性を示さない。この化合物に対するアポトーシス応答は、LD50濃度を用いる任意の所与の時間において僅かな比率の細胞（5％未満）のみにアポトーシスを起こるという点で異常であった。しかし、20％のアポトーシス率が、LD90濃度を92時間用いて観察された（データは示していない）。さらに、45は、任意の1つのキナーゼ標的に対する特異性には欠けているるが、チロシンキナーゼ活性の良好な阻害剤であることが示された（図18A）。ブロットした膜から抗体を剥ぎ取り、パキシリン（図18B）またはp130cas（示していない）の第二抗体を用いた再ブロッティングにより、ウェスタンブロットにおける2つの罹患タンパク質バンドが成功裏に同定される。第二抗体で再探索することにより、同じ分子サイズ標識を用いての厳密な同定に起因して個々のタンパク質バンドが明解に同定される。45はこれまでインビボでの半減期が短いと特徴づけられていたが、これらの化合物をインビトロで評価するための包括的な戦略を開発する上で最も有用である。
【０２６３】
続いて、焦点接着キナーゼの2つの別個のリン酸化基質（パキシリンおよびp130cas）および第三の未知の基質を定量した。ウェスタンブロットフィルムの濃度測定走査により定量を実施し、これは図19に示す。3つ全てのリン酸化基質が、用量依存的なリン酸化阻害を示した。
【０２６４】
実施例9  PTK阻害剤を使用した、雑音により誘発される聴覚損失の防御
チンチラ（N＝8）を、雑音により誘発される聴覚損失の試験に使用した。動物の聴覚感度を、実験操作前に標準的な電気生理的技術を使用して測定した。特に、聴覚閾値は、標準的な実験手順に従って、下丘に慢性的にインプラントした記録用電極の誘発電位により測定した。動物を麻酔し、耳のう（auditory bullae）を開け、左および右の蝸牛を可視化した。蝸牛の鼓室階に至る正円窓を、薬物適用のアクセス点として使用した。4匹の動物を、DMSO中で乳化した、1000mMの食塩水溶液に対して3mMの45 30μlで処理し（これは一方の耳の正丸窓に配置した）、かつ1000mMの食塩水溶液に対して3mMのDMSOの対照溶液で処理した（これは他方の耳の正円窓に配置した）。5匹の動物を、DMSO中で乳化した、1000mMの食塩水溶液に対して3mMの1a 30μl（実施例1の表6）で処理し（これは一方の耳の正円窓に配置した）、かつ1000mMの食塩水溶液に対して3mMのDMSOの対照溶液で処理した（これは他方の耳の正円窓に配置した）（1匹の動物を実験が終わる前に失った）。いずれの場合においても、溶液を正円窓に30分間設置し、その後、耳のうを閉じた。続いて、動物を4kHzバンドの雑音に105dB SPLで4時間暴露した。雑音暴露後、動物の聴覚を、1日目、3日目、7日目、および20日目に試験して、誘発電位閾値シフトを決定した。永久的な閾値シフトを20日目に評価した。蝸牛を20日目に収集して、蝸牛の形態学的調査が可能となった。45のデータを表11-13に示し、1a（実施例1）のデータを以下の表14に示す。
【０２６５】
（表１１）
2005514339.tif 000198
2005514339.tif 000199
2005514339.tif 000200
【０２６６】
（表１２）
2005514339.tif 000201
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【０２６７】
（表１３）
2005514339.tif 000203
【０２６８】
（表１４）
2005514339.tif 000204
2005514339.tif 000205
【０２６９】
図20〜26は、45で処理した動物の平均閾値シフトを示す。特に、図20は、実験操作（すなわち4kHzバンドの雑音に105dBで4時間暴露）前に試験した0.5kHz、1kHz、2kHz、4kHz、および8kHzバンドの雑音への暴露後の平均閾値シフトを示す。図21は、実験操作後の0日目、1日目、3日目、および20日目における0.5kHzバンドの雑音に暴露した後の平均閾値シフトを示す。図22は、実験操作後の0日目、1日目、3日目、および20日目において1kHzバンドの雑音に暴露した後の平均閾値シフトを示す。図23は、実験操作後の0日目、1日目、3日目、および20日目において2kHzバンドの雑音に暴露した後の平均閾値シフトを示す。図24は、実験操作後の0日目、1日目、3日目、および20日目において4kHzバンドの雑音に暴露後の平均閾値シフトを示す。図25は、実験操作後の0日目、1日目、3日目、および20日目における8kHzバンドの雑音に暴露した後の平均閾値シフトを示す。図26は、対照および治療した耳の20日目の平均dB閾値シフトを示す。図21〜26に示したように、治療した耳における平均dB閾値シフトは低く、聴覚損失の程度がより低いことを示す。
【０２７０】
図27〜32は、1aで処理した動物の平均閾値シフトを示す（実施例1の表6に由来）。特に、図27は、実験操作前に試験した0.5kHz、1kHz、2kHz、4kHz、および8kHzバンドの雑音に暴露した後の平均閾値シフトを示す。図28は、実験操作後の1日目の0.5kHz、1kHz、2kHz、4kHz、および8kHzバンドの雑音に暴露した後の平均閾値シフトを示す。図29は、実験操作後の3日目の0.5kHz、1kHz、2kHz、4kHz、および8kHzバンドの雑音に暴露した後の平均閾値シフトを示す。図30は、実験操作後の7日目の0.5kHz、1kHz、2kHz、4kHz、および8kHzバンドの雑音に暴露した後の平均閾値シフトを示す。図31は、実験操作後の20日目の0.5kHz、1kHz、2kHz、4kHz、および8kHzバンドの雑音に暴露した後の平均閾値シフトを示す。図32は、1日目、3日目、7日目、および20日目の8000Hzに暴露した後の平均閾値シフトを示す。図28〜32に示したように、処理した耳の平均dB閾値シフトは低く、これは聴覚損失の程度がより低いことを示す。
【０２７１】
図20〜32に示したように、45および1a（実施例1）の両方が雑音暴露に対して防御を提供した。しかし、1a（実施例1）は最大レベルの防御を提供した。特に、PTK阻害剤で処理した耳は、対照耳よりも平均で15〜25dB少ない聴覚損失を示し、動物は実験操作の副作用を示さなかった。
【０２７２】
実施例10  PTK阻害剤を使用した蝸牛有毛細胞における雑音により誘発されるアポトーシスの阻害
チンチラ（N＝3）を、75対の155dB pSPLのインパルス雑音に暴露した。動物を雑音暴露の5分後に屠殺した。蝸牛を、複合体の内的メンバーである焦点接着キナーゼに対する抗体を使用して、焦点接着複合体の活性化について調べた。
【０２７３】
図33A〜Fは、PTK阻害剤で処理しなかった場合のチンチラの蝸牛における高レベルインパルス雑音の効果を示す。特に、図33Aは、高レベルインパルス雑音（155dB）の後の蝸牛傷害を示す電子顕微鏡写真である。図33Aは、網状板（S）における裂け目を示す。裂け目は、外有毛細胞の第二列と第三列の間にあるようである。図33Bは、中程度に高いレベルのオクターブバンドの雑音（105dB）後の焦点接着キナーゼ（FAK）について免疫組織化学的に染色した蝸牛を示す。図33Bに観察される染色は、比較的低いレベルであり、雑音なしで観察されたものに近い。染色は、ダイテルス細胞の支持突起において主に局在し、有毛細胞には局在していないようである。雑音レベルを110dB OBNまで上昇すると、アポトーシス細胞が、図33Cに示したように出現した。これらのアポトーシス細胞は、図の左上象限の2つの領域に位置し、核は明るく高度に凝集しており、一方、正常核は大きく色がより拡散している。図33Dは、焦点接着キナーゼ（FAK）抗体で染色した同じ細胞の写真である（図33Bのように；しかし、支持突起は、細胞が欠失している場所の病変を囲むようである）。これらの病変は、細胞にアポトーシスが起こる図33Cの領域に対応する。図33Eは、同じ領域を示すがより低い垂直平面においてであり、病変が、クチクラ板の十分下方で細胞体の中に及んでいることを実証する。図33Fは、155dB SPLのインパルス雑音に暴露された蝸牛を示す。蝸牛は、クチクラ板においてその完全性を欠失し、全体に濃く染色されていた。多くの暗い領域が見られ、これは有毛細胞が死滅した領域を示す。
【０２７４】
図34Aは、1a（実施例1）で前処理した蝸牛を示し、図34Bは、高レベルの雑音（155dB）に暴露した後の非処理蝸牛を示す。処理した蝸牛では（図34A）、ダイテルス細胞の支持突起を越えて十分にクチクラ板内へと及ぶ高レベルのFAK染色が存在する。点状の染色は、FAKが内因的メンバーである焦点接着複合体の形成を示す。さらに、3列の有毛細胞核（標識OHCl-3）は順序よくかつ無傷であるようであり、アポトーシスが起こっている兆しはない。FAKは焦点接着複合体内で活性であることが知られているので、このデータはFAKが、高い雑音への暴露後に活性であることを強く示唆する。これに対して、1a（実施例1）での処理により妨げられるのはキナーゼ機能の阻害であり、結果として蝸牛有毛細胞の生存をもたらすとの仮説が立つ。
【０２７５】
図34Aとは対照的に、図34Bは幾分低いレベルのFAK染色を示すが、顕著に高いレベルの細胞死も示す。この図においては、濃縮核の数により示されるように、細胞のほぼ半分がアポトーシスにより死滅した。これは処理によりアポトーシス核が全く観察されなかった図34Aとは対照的であった。1a（実施例1）は、パキシリンおよびpp130casを含む（実施例8）、数個のFAK基質のリン酸化を阻害できるので、蝸牛におけるFAKキナーゼ機能は、高いレベルの雑音暴露に応答して防御的な役割を示していると考えられる。
【０２７６】
上記したように、PTK阻害剤により処理した耳は、対照よりも少ない外有毛細胞の減少を示した。これは、アノイキス（アポトーシスを生じる細胞マトリックスからの脱着）が、雑音により誘導される有毛細胞の減少に有意な役割を果たしうり、細胞マトリックスで生じたアポトーシスシグナルの遮断は有毛細胞の減少を防ぐことができることを示す。
【０２７７】
より具体的には、上記のチンチラ動物モデルを使用して、焦点接着複合体が、極めて高いレベルの雑音に応答して形成されることが実証された。FAKは、これらの複合体の形成時に活性化され、まず一連の自己リン酸化事象を経て、続いて下流ペプチド基質のリン酸化を経る、いくつかのシグナル伝達カスケードを開始することが知られている。アポトーシス細胞は、焦点接着複合体によって囲まれる病変内に見られることが実証された。さらに、pp60c-src阻害剤の添加は、焦点接着複合体の形成を妨げることなくアポトーシス応答を妨ぐことができる。これらのデータは、FAKによるチロシンリン酸化を通じての下流シグナル伝達が有毛細胞のアポトーシスシグナル伝達における初期段階でありうることを示唆する。FAKは他の生物系において剪断応力により活性化されるので、これらの観察は、機械的応力により活性化される耳で同定される第1のシグナル伝達経路を示しうる。
【０２７８】
本明細書において好ましい態様を示し、詳細に述べてきたが、本発明の精神から逸脱することなく様々な修正、追加、置換などが行われることが当業者には明らかであり、これらはしたがって、以下の特許請求の範囲に定義されるような本発明の範囲内であるとみなされる。
【０２７９】
引用文献
本明細書に引用されている以下の参考文献は、これによってその全体が参照として本明細書に組み入れられる。
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【図面の簡単な説明】
【０２８０】
【図１】非ペプチドタンパク質キナーゼ阻害剤を開発するためのモジュール方法を示す図である。段階1は有望な非ペプチド骨格を同定するための１つまたは複数の第一モジュール（「M1」）を利用する。段階2は特異的因子を加えることによって効力を増強する。この段階において骨格の妥当性を確認する。阻害剤が非ATP競合的であるかどうかも調べることができる。段階3では、コンビナトリアルライブラリーを用いて効力および選択性をさらに増強し、M1および特異的因子を最適化する。
【図２】（PKA）：Mg2ATP：偽基質阻害剤のX線構造を示す図を提供する。
【図３】保存されたタンパク質キナーゼ触媒領域に結合するための一般的モジュールM1の設計を提供する。
【図４】ボロン酸「阻害剤」21および22がPKAの基質となることを示す。
【図５】モデルSrc活性部位におけるSrc基質Ac-Ile-Tyr-Gly-Glu-Phe-NH2（配列番号：1）の結合相互作用を示す。
【図６】ナフタレンを基本とするSrc阻害剤の骨格の設計を示す図である。
【図７】イソキノリンおよびインドールを基本とするSrc阻害剤の骨格の設計を示す。
【図８】マーシルジェ（Marsilje）2000に記載のナフタレン阻害剤を調製するために用いる化学反応の一例を提供する。表5からのSrc阻害剤において、アリールトリフラート（Ishiyamaら、1997）またはハロゲン化アリール（Ishiyama、1995）のいずれかを市販のジボロンピナコールエステルと結合させることができるPd(0)触媒クロスカップリング法を用いて、M1ヒドロキシル基の代わりにボロン酸官能基を導入することができる。
【図９】ナフタレン骨格に疎水性のS2選択的因子を連結させるために従うことができる合成スキームを示す。
【図１０】ナフタレン化学による良好なモデル反応を示す図であり、96ウェルプレート様式でこの骨格のコンビナトリアルライブラリーを合成するための調製において固相に変換することができる。この化学反応は、44で表される活性が低いナフタレンレジオ異性体がマーシルジェ（Marsilje）2000に記載のとおり市販の3,5-ジヒドロキシ-2-ナフトエ酸から容易に得られるため、この化合物で実施している。
【図１１】コンビナトリアルライブラリーにおけるナフタレン骨格を改変するための可能な方法を提供する。
【図１２】中間体69からの反応2で生成したトリフラート官能基（図11）の、アミン（Wolfeら、1997）、次いで一連のアミドまたは他のアミン誘導体への変換を示す。
【図１３】SrcおよびIRTK（インスリン受容体タンパク質チロシンキナーゼ）活性部位で示されるボロン酸M1基の一連のヒドロキシ含有類似体のモデリングを示す。
【図１４】LA25およびNRK細胞系における、非ペプチドSrc阻害剤43-メタ（表5）の試験の結果を示す。
【図１５】SCIDマウスにおける、2つのSrc阻害剤（実施例1の1aおよび実施例4の2k）の最大耐容量（MTD）を示すグラフである。
【図１６】図16Aは、腫瘍N015の卵巣腫瘍細胞を使用した、タキソールおよびドキソルビシン（これらはこの腫瘍細胞培養物においてはエポトシドおよびシスプラチンよりも効果的であった）と、3つのSrc阻害剤（表5の45、43-メタ、および49-メタ）との比較を示す。図16Bは、正常ヒト線維芽細胞増殖の阻害についてのSrc阻害剤の試験の結果を示す。正常細胞増殖の阻害は全く見出されず（サブコンフルエントおよびコンフルエントの両方；代わりに若干の増殖促進が観察された）が、このことはこれらの阻害剤が10倍高い濃度であっても正常細胞には毒性でないことを示している。図16Cは、ts v-Src刺激LA25細胞増殖の阻害についての、2つのSrc阻害剤の試験結果を示す。図16Dは、正常ラット腎臓細胞増殖の阻害についての、2つのSrc阻害剤の試験結果を示す。図16Eは、Src阻害剤45、43-メタ、および49-メタの構造を提供する。
【図１７】図17A〜Bは、一組の各4つのSrcタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤および1つの不活性対照（KLM2-25）を用いた、悪性前立腺PC-3-LN細胞のインビトロでの細胞毒性を示すグラフである。
【図１８】図18A〜Bは、45で処理し、抗ホスホチロシン（図18A）抗体または抗パキシリン（図18B）抗体を使用して検出した、悪性PC-3-LN前立腺癌細胞におけるタンパク質のウェスタン解析を示す。
【図１９】焦点接着複合体のための2つの別個のリン酸化基質（パキシリンおよびp130cas）および第三の未知の基質の定量を示すグラフである。
【図２０】実験操作前に、0.5kHz、1kHz、2kHz、4kHz、および8kHzバンドの雑音に暴露した後のチンチラの蝸牛における平均閾値シフト（dB）を示すグラフである。
【図２１】実験操作後の0日目、1日目、3日目、および20日目に0.5kHzバンドの雑音に暴露した後のチンチラの蝸牛における平均閾値シフト（dB）を示すグラフである。
【図２２】実験操作後の0日目、1日目、3日目、および20日目に1kHzバンドの雑音に暴露した後のチンチラの蝸牛における平均閾値シフト（dB）を示すグラフである。
【図２３】実験操作後の0日目、1日目、3日目、および20日目に2kHzバンドの雑音に暴露した後のチンチラの蝸牛における平均閾値シフト（dB）を示すグラフである。
【図２４】実験操作後の0日目、1日目、3日目、および20日目の4kHzバンドの雑音に暴露した後のチンチラの蝸牛における平均閾値シフト（dB）を示すグラフである。
【図２５】実験操作後の0日目、1日目、3日目、および20日目の8kHzバンドの雑音に暴露した後のチンチラの蝸牛における平均閾値シフト（dB）を示すグラフである。
【図２６】対照および処理耳の20日目のチンチラの蝸牛における平均dB閾値シフト（dB）を示すグラフである。
【図２７】実験操作前に0.5kHz、1kHz、2kHz、4kHz、および8kHzバンドの雑音に暴露した後のチンチラの蝸牛における平均閾値シフト（dB）を示すグラフである。
【図２８】実験操作後の1日目の0.5kHz、1kHz、2kHz、4kHz、および8kHzバンドの雑音に暴露した後のチンチラの蝸牛における平均閾値シフト（dB）を示すグラフである。
【図２９】実験操作後の3日目の0.5kHz、1kHz、2kHz、4kHz、および8kHzバンドの雑音に暴露した後のチンチラの蝸牛における平均閾値シフト（dB）を示すグラフである。
【図３０】実験操作後の7日目の0.5kHz、1kHz、2kHz、4kHz、および8kHzバンドの雑音に暴露した後のチンチラの蝸牛における平均閾値シフト（dB）を示すグラフである。
【図３１】実験操作後の20日目の0.5kHz、1kHz、2kHz、4kHz、および8kHzバンドの雑音に暴露した後のチンチラの蝸牛における平均閾値シフト（dB）を示すグラフである。
【図３２】1日目、3日目、7日目、および20日目の8000Hzに暴露した後のチンチラの蝸牛における平均閾値シフト（dB）を示すグラフである。
【図３３】図33A〜Fは、チンチラの蝸牛のSEM画像である。図33Aは、インパルス雑音に暴露した後の網状体の裂け目（Sにより印をつける）を示す。図33Bは、105dB（SPL）で4kHzを中心としたオクターブバンドの雑音（OBN）に暴露した蝸牛おける焦点接着キナーゼ（FAK）染色を示す。図33Cは、110dBでOBNに暴露された蝸牛由来のいくつかのアポトーシス核（矢印で印をつける）を有する小さな病変を示す。図33Dは、図33Cに示した病変のFAK染色を示す。図33Eは、図33Dよりも数ミクロン低い共焦点走査レベルを示し、病変がクチクラ板より十分下に伸び、細胞体（矢印で印をつける）内まで伸びていることを示す。図33Fは、155dB（SPL）のインパルス雑音に暴露した蝸牛におけるFAK染色を示す。この図において、多くの外有毛細胞がそのクチクラ板完全性を失っている。残りの外有毛細胞は、クチクラ板に強力なFAK蛍光を示す。
【図３４】図34A〜Bは、高いレベル雑音に暴露されたチンチラの蝸牛の共焦点画像である。図34では、チンチラの蝸牛を1aで前処理した（表6、実施例1を参照）。図34Bでは、チンチラの蝸牛は未処理のままであった。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【国際調査報告】
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