(57)【要約】本発明は、微生物の組換酵素（recombinaseA、ｒｅｃＡ）が色素体で発現されるように製作した植物体を利用し、相同組換の効率と色素体形質転換の効率を高める方法に関する。具体的には、微生物の組換酵素遺伝子に色素体標的序列を含むベクターで植物体の核を形質転換して形質転換植物体を製作し、この植物体の色素体に目的遺伝子を含むベクターを導入したとき相同組換の効率が遥かに増加し、既存の微生物組換酵素を有しない植物体を用いたときより選抜回数が１／２〜１／３に減少し、２倍以上の形質転換成功率を示す新しい色素体形質転換植物体を製作する方法に関する。
2005514070.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物体の色素体を形質転換する方法において、
（Ａ）色素体で活性を示す組換酵素の遺伝子序列および色素体に対する標的序列を含む植物核形質転換用ベクターを製作する組換酵素発現ベクターの製作段階、
（Ｂ）前記の組換酵素発現ベクターを利用して核形質転換された植物体を製作する１次形質転換植物の獲得段階、
（Ｃ）色素体で発現できる少なくとも１つ以上の目的遺伝子序列および選抜マーカー遺伝子序列を含む植物色素体形質転換用ベクターを製作する色素体用ベクターの製作段階、
（Ｄ）前記の色素体用ベクターを利用して前記の１次形質転換植物の色素体を形質転換する２次形質転換植物の獲得段階、
を含むことを特徴とする植物体の色素体を形質転換する方法。
【請求項２】
前記の組換酵素遺伝子は原核生物由来のものであることを特徴とする請求項１に記載の植物体の色素体を形質転換する方法。
【請求項３】
前記の選抜マーカーは、スペクチノマイシン或いはストレプトマイシンに抵抗性のある１６Ｓリボゾームサブユニット、または
スペクチノマイシン、ストレプトマイシン或いはカナマイシン等のような抗生剤に抵抗性を示すたんぱく質、または
シトシンデアミナーゼ、ベタインアルデヒド酵素（ＢＡＤＨ）等のような酵素、および／または
ＧＦＰであることを特徴とする請求項１に記載の植物体の色素体を形質転換する方法。
【請求項４】
植物体の色素体を形質転換する方法において、
（Ａ）色素体で発現できる少なくとも１つ以上の目的遺伝子序列および選抜マーカーの遺伝子序列を含む植物色素体形質転換用ベクターを製作する色素体形質転換用ベクターの製作段階、
（Ｂ）色素体で活性を示す組換酵素の遺伝子により形質転換された植物体の色素体を、前記の色素体形質転換用ベクターを利用して色素体を形質転換する２次形質転換植物の獲得段階、
を含むことを特徴とする植物体の色素体を形質転換する方法。
【請求項５】
前記選抜マーカーは、スペクチノマイシン或いはストレプトマイシンに抵抗性のある１６Ｓリボゾームサブユニット、または
スペクチノマイシン、ストレプトマイシン或いはカナマイシン等のような抗生剤に抵抗性を示すたんぱく質、または
シトシンデアミナーゼ、ベタインアルデヒド酵素（ＢＡＤＨ）等のような酵素、および／または
ＧＦＰであることを特徴とする請求項４に記載の植物体の色素体を形質転換する方法。
【請求項６】
前記の組換酵素遺伝子は原核生物由来のものであることを特徴とする請求項５に記載の植物体の色素体を形質転換する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の組換酵素（recombinase）を利用して色素体の形質転換効率を高める方法に関する。より詳しくは、微生物（原核生物）の組換酵素遺伝子と色素体の標的序列を含むベクターで植物体の核を形質転換して色素体で組換酵素が過多な量で存在することになる植物体を製作し、目的遺伝子序列および選抜マーカー遺伝子序列を含む色素体の形質転換用ベクターで前記の形質転換植物体を再び形質転換させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
色素体は光合性を担当する葉緑体、澱粉の貯蔵を行う澱粉体、色素を含まない白色体、花および果物の色に関与する有色体等に分類されるが、植物細胞１つには２００個までの色素体が存在し、１つの色素体は１００個余りのゲノムを有しており、１０,０００〜５０,０００copyの遺伝子が存在する。その反面、植物の核は普通１〜２copyのゲノムを有している。
したがって、論理的には色素体の形質転換による外来遺伝子の導入は核を形質転換させたときと比べ、目的たんぱく質を約１０,０００倍以上効率的に生産することができるのである。
最近、このような論理の下で色素体の形質転換方法によって外来遺伝子を植物に導入することにより、新しい形質を植物に与える方法が開発されている（Svab et al.，1990；Staub et al.，2000）。このような色素体の形質転換方法は大きく （１）色素体の形質転換段階と、（２）形質転換された植物体の選抜段階で構成される。
たとえば、色素体の形質転換は相同組換（homologous recombination）により可能であるが、既存の色素体の塩基序列を相同組換のためのボーダーとして用い、ここに外来遺伝子を連結したあと粒子射撃（particle bombardment）法で導入することである。
次に、色素体に形質転換以後細胞内の全ての色素体がホモプラスミーとなるようにするため、２〜７回の選抜過程を経たあと再分化植物体を誘導する。このような選抜過程が欠如すると細胞内の一部の色素体のみ形質転換されるので、植物体が成体に発達する過程で形質転換された色素体が漸次消滅することになる。
色素体の形質転換に関する大部分の研究がタバコにおいて行われており、その他アラビドプシス、じゃが芋、トマト等で成功した事例がある。しかし、タバコ以外の植物体では形質転換の効率が非常に低いものと知られている。このような低い効率は色素体の形質転換が非常に不充分に発生し、結果的に形質転換された植物体を選別する過程に長い時間と複雑な作業が求められるためであると判断される。ただ、タバコの場合、数多くの研究を介しその特性が広く知られているため、比較的に高い効率の達成が可能なものである。
このような問題点を克服するためには、色素体内で相同組換の効率を高めるのが重要な解決方法になることができる。
相同組換には組換酵素たんぱく質が関与するものと知られている。大腸菌の組換酵素を微生物、高等植物のタバコまたは動物の核で発現されるようにすることにより、核内に相同組換の効率が１０倍以上増加したことが報告された（Stohl and Seifert, 2001; Bakhlanova et al., 2001; Reiss et al., 1996; 1997; Shcherbakova et al., 2000; Vispe et al., 1998）。
したがって、植物体の色素体の形質転換効率の増加と、形質転換された植物体の選抜過程の短期化のための新しい方法の模索が求められているのが現実である。
ここに、本発明者等は色素体の形質転換でホモプラスミーを製作する長期間の選抜過程と低い形質転換効率の問題点を克服し、簡単で効率的な形質転換の方法を開発するため努力した結果、核に導入された組換酵素が色素体に移動するようにした植物体を利用し、目的遺伝子序列とマーカー遺伝子序列を含む色素体形質転換用ベクターを作製して色素体の形質転換を行ったあと、色素体におけるマーカー遺伝子の発現程度に従って選別することにより、相同組換の効率と形質転換の効率の高い色素体形質転換方法を完成することになったのである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、色素体で組換酵素を発現する植物体を利用して簡単な操作と高い成功率で相同組換と色素体の形質転換を可能にする新しい植物体形質転換方法を提供することに目的がある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、（Ａ）色素体で活性を示す原核細胞組換酵素の遺伝子序列、および高等植物の色素体に対する標的序列を含む植物核形質転換用ベクターを製作する組換酵素発現ベクターの製作段階と、（Ｂ）前記の組換酵素発現ベクターを利用して核形質転換された植物体を製作する１次形質転換植物の獲得段階と、（Ｃ）色素体で発現できる少なくとも１つ以上の目的遺伝子序列および選抜マーカー遺伝子序列を含む植物色素体形質転換用ベクターを製作する色素体用ベクターの製作段階、および（Ｄ）前記の色素体用ベクターを利用して前記の１次形質転換植物の色素体を形質転換する２次形質転換植物の獲得段階を含む、植物体の色素体を形質転換する方法に関する。
さらに、本発明は予め色素体で活性を示す組換酵素の遺伝子により形質転換されている植物体を利用し、類似する方法で色素体の形質転換の効率を高める方法を提供する。
すなわち、本発明は（Ａ）色素体で発現できる少なくとも１つ以上の目的遺伝子序列および選抜マーカーの遺伝子序列を含む植物色素体形質転換用ベクターを製作する色素体形質転換用ベクターの製作段階と、（Ｂ）色素体で活性を示す組換酵素の遺伝子により形質転換された植物体の色素体を、前記の色素体形質転換用ベクターを利用して色素体の形質転換を行う２次形質転換植物の獲得段階を含む、植物体の色素体を形質転換する方法に関する。
すなわち、本発明は原核細胞由来の組換酵素が色素体に移動し、色素体内で組換酵素が活性を有する植物体（１次形質転換植物）に外来の目的遺伝子およびマーカー遺伝子を有する色素体形質転換用ベクターを形質転換して色素体形質転換の効率を高める方法を提供することである。
本発明において、組換酵素には高等植物の色素体内で活性を示すものであれば何れも使用可能であるが、具体的にはディノコッカス・ラジオデュランス ｒｅｃＡ、大腸菌のｒｅｃＡおよびこれらの相同体等を用いることができる。
本発明において、組換酵素たんぱく質が色素体に移動するようにする標的序列は、色素体に移動する如何なるたんぱく質の標的序列でも使用可能である。たとえば、ルビスコスモールサブユニット、ＡＧＰａｓｅ、Ｃａｂたんぱく質等の標的序列を利用することができる。
本発明に係る色素体形質転換用ベクターに含まれる外来遺伝子には、その種類に制限がなく植物細胞に導入しようとする外来形質を発現する遺伝子は全て可能である。たとえば、Ｂｔ遺伝子、除草剤（bar、glyphosate）抵抗性遺伝子、ソマトトロピン等のような人体由来たんぱく質の遺伝子等を単独に、または必要によって複数個が適用可能である。
本発明に係る色素体形質転換用ベクターに含まれる選抜マーカー遺伝子には、２次形質転換された植物個体を２次形質転換されない個体と差別化させることができる生理化学的特性を示すたんぱく質遺伝子を用いることができる。たとえば、（１）スペクチノマイシン（spectinomycine）或いはストレプトマイシン（streptomycine）に抵抗性のある１６Ｓリボゾームサブユニット遺伝子、または（２）スペクチノマイシン、ストレプトマイシン或いはカナマイシン（kanamycine）等のような抗生剤抵抗性たんぱく質遺伝子、または（３）シトシンデアミナーゼ（cytosine deaminase）、ベタインアルデヒド酵素（ＢＡＤＨ）等のような酵素遺伝子、または（４）ＧＦＰ（green fluorescence protein）遺伝子を単独に用いるか、複合的に用いることができる。特に、２次形質転換の可否を物理的に確認することができるよう（４）と他のもの等を共に用いるのが好ましい。このとき、他の選抜マーカー遺伝子とＧＦＰ遺伝子をオペロンで連結して色素体の形質転換植物体（すなわち、２次形質転換植物体）だけが選別培地で育つことができるようにすると共に、視覚的にも相同組換の程度を区分しながら選抜が可能であるようにするのが好ましい。
参考に、植物体の色素体にＧＦＰが存在すれば長波ＵＶの下で色素体が緑色の蛍光を帯びることになる。
【発明の効果】
【０００５】
本発明に係る、植物の色素体が微生物の組換酵素を有するよう核形質転換された植物体を用いて色素体形質転換の効率および相同組換の効率を高める方法によれば、既存のホモプラスミーを製作するため必要な長期間の選抜過程を短縮させることができ、タバコ以外の植物で色素体形質転換の効率が低いか、色素体形質転換が行われなかった植物に色素体形質転換の技術を適用することができる。このような方法で形質転換された植物細胞は、多様な作物を利用して有用な外来たんぱく質を発現して収得するのに有効に利用することができる。
本発明によれば、従来に比べ相同組換の効率が遥かに増加して選抜過程の回数を１／２〜１／３以下に減少させることができ、２倍以上の形質転換成功率で色素体形質転換植物体を製作することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下、実施例に基づき本発明を詳しく説明する。下記の実施例は本発明を例示するもので、本発明の内容がこれに限定または変更されるのではない。さらに、下記の実施例では選抜マーカー遺伝子にスペクチノマイシン抵抗性遺伝子とＧＦＰ遺伝子を同時に利用したが、他の選抜マーカー遺伝子だけを利用するか、他の選抜マーカー遺伝子とＧＦＰ遺伝子を同時に利用することができるのは当然のことである。さらに、形質転換の対象植物をタバコに設定したが、これもまた別の植物体に拡張することができるのは当然のことである。さらに、実施例では色素体に微生物組換酵素を有する植物体（１次形質転換植物体）を直接製作したが、その他の目的で既に製作されたこのような植物体を活用することができるのも当然のことである。
その他、本発明の技術的思想の範囲内で下記の実施例の具体的な方式または利用物質等が合理的な範囲で他の方式または利用物質等に代置できるのは、本発明の属する技術分野の通常の知識人において当然のことである。
下記の実施例で表示されるベクター等の製作は、本発明の属する技術分野の通常の知識人において容易なことであるため、その寄託を省略した。
【実施例１】
【０００７】
組換酵素を有する植物核形質転換用ベクターの製作
色素体で組換酵素を発現する植物体を生産するため、先ず色素体に移動される微生物由来の組換酵素を有する植物核形質転換用ベクターを製作した。
ＰＣＲ法でアラビドプシス（Arabidopsis）組換酵素の標的序列とディノコッカス・ラジオデュランスの組換酵素（ｒｅｃＡ）遺伝子をそれぞれクローニングして連結し、３５Ｓプロモーターとｎｏｓターミネーターとの間にBamHI/SacI制限酵素部位に導入して植物核形質転換用ベクターｐＤｒｅｃＡＡＴを製作した。
より詳しく説明すると、ディノコッカス・ラジオデュランス菌株（ATCC13939）からＤＮＡを分離してＰＣＲ法（序列１と２を添加してＰＷＯポリメラーゼ(BM co.)を用いて変性：９４℃ １分、結合：５５℃ １分、重合反応：７２℃ ６０秒、３０サイクル反応）で１.１ｋｂのｒｅｃＡ遺伝子をクローニングし、３５Ｓプロモーターとｎｏｓターミネーターとの間にBamHI/SacI制限酵素部位に導入した。これとは別に、アラビドプシスの遺伝ＤＮＡからＰＣＲ法（序列３と４を添加してＰＷＯポリメラーゼ(BM co.)を用いて変性：９４℃ １分、結合：５５℃ １分、重合反応：７２℃ １０秒、３０サイクル反応）で０.２ｋｂの色素体標的序列をクローニングした。クローニングされた標的序列を前述の３５Ｓプロモーターと組換酵素との間のBamHI制限酵素部位に導入し、ディノコッカス・ラジオデュランスの組換酵素たんぱく質が色素体に移動されるようにした植物核形質転換用ベクターを製作した（図１）。
【実施例２】
【０００８】
色素体に微生物組換酵素を有する植物体の獲得
実施例１により製作された植物核形質転換用ベクターで植物体を１次形質転換させた。形質転換方法は現在まで知られているか、今後開発される植物形質転換方法が適用できるはずである。具体的に、本実施例ではアグロバクテリウム（Agrobacterium）共同培養法を用いた。
実施例１により製作された植物核形質転換用ベクターをFreeze-thaw法でアグロバクテリウム（GV3101 strain）に導入して５０ｍｇ／Ｌのカナマイシン、５０ｍｇ／Ｌのリファンピシンが添加されたＹＥＰ培地で２日間培養したあとタバコの形質転換に用いた。器内で培養したタバコ（Nicotiana tabacum cv. Samsun）の葉の切片体を浮かべたＭＳ（Murashige and Skoog, 1962）基本液体培地１０ｍＬに、２日間育てたアグロバクテリウム２００μＬを入れて２日間共同培養した。滅菌蒸留水でアグロバクテリウムを洗浄したあと１００ｍｇ／Ｌのカナマイシン、３００ｍｇ／Ｌのクラフォラン、２ｍｇ／ＬのＢＡＰ、０.１ｍｇ／ＬのＮＡＡが添加されたＭＳ培地で２５℃、２,０００ｌｕｘの光条件で培養して再分化個体を選抜した。培養３〜４週後選抜培地で発生したシュート（急速大量増殖物）を３００ｍｇ／Ｌのクラフォラン、１００ｍｇ／Ｌのカナマイシンが添加されたＭＳ基本培地に移して根を誘導し、土壌に移して温室で生育させて後代を育成した。
植物核形質転換体においてディノコッカス・ラジオデュランスの組換酵素の導入および発現は、形質転換体の葉から全てのＲＮＡを分離してノーザン・ブロット（northern blot）を介し確認した（図２）。図２において、Ｃｏｎは形質転換されない植物体を、１、２は形質転換されて組換酵素を発現する植物体を表わし、Ａはノーザン・ブロットを、Ｂはローディングした全てのＲＮＡを表わす。
１次形質転換された植物体をそのまま利用することもでき、種子を得て後代を利用することもできる。
【実施例３】
【０００９】
ＧＦＰを有する色素体形質転換用ベクターの製作
形質転換植物体をＵＶの下で視覚的に形質転換の可否を区別することができる色素体形質転換用ベクターを作製するため、ＰＣＲ法で前部にリボゾーム結合領域を有するようＧＦＰ遺伝子（選抜マーカー遺伝子）をクローニングし、既存の色素体形質転換用ベクターであるＣｔＶ２のａａｄＡ遺伝子の後のＸｂａｌ制限酵素部位に導入して色素体形質転換用ベクターＣｔＶＧを製作した。
より具体的には、ＧＦＰの変形であるｍＧＦＰ４遺伝子が色素体内で発現されるようにするため、開始コドンの前方にリボゾーム結合領域（ＡＧＧＡＧＧＴＡＴＡＡＣＡ）を有するようプライマーを製作し、ＰＣＲ法（序列５と６を添加してＰＷＯポリメラーゼ(BM co.)を用いて変性：９４℃ １分、結合：５５℃ １分、重合反応：７２℃ ４０秒、３０サイクル反応）でＧＦＰ遺伝子をクローニングし、既存の色素体形質転換用ベクターであるＣｔＶ２内のスペクチノマイシン抵抗性遺伝子であるａａｄＡ遺伝子の後のＸｂａＩ制限酵素部位に導入してＧＦＰ遺伝子がオペロンに発現されるようにした色素体形質転換用ベクターＣｔＶＧを製作した（図３）。
【実施例４】
【００１０】
粒子射撃法による色素体形質転換
実施例２で製作した核形質転換植物体の後代および核形質転換されない対照区植物体に対し、実施例３で製作したベクターで形質転換実験を行った。
核形質転換植物体および対照区植物体をそれぞれ器内で８週間発芽させたあと、幼植物体の葉を分離して１ｍｇ／ＬのＢＡＰ、０.１ｍｇ／ＬのＮＡＡが添加されたＭＳ培地で置床して色素体形質転換に用いた。
０.６μｍ直径の金粒子にＣｔＶＧ色素体形質転換用ベクターをコーティングしたあと、ＢｉｏＲａｄ社のＰＤＨ−１０００/Ｈｅジーンデリバリーシステム機器を利用して１,１００ｐｓｉのアクセラレーションパワー、９ｃｍのターゲットディスタンス、２８ｉｎ／Ｈｇの真空条件で色素体形質転換を行った。以後、２５℃、２,０００ｌｕｘの暗条件で２日間培養し、タバコの葉を２〜５ｍｍ大きさの切片に分けて１ｍｇ／ＬのＢＡＰ、０.１ｍｇ／ＬのＮＡＡ、５００ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシンが添加されたＭＳ培地で培養して色素体形質転換植物体を選抜した。
【実施例５】
【００１１】
タバコの色素体形質転換の効率調査
以上の過程で製作された、色素体で組換酵素を発現する植物体に色素体形質転換用ベクターＣｔＶＧが導入された２次形質転換植物体の色素体形質転換の効率を調査した。
色素体形質転換が行われていない植物体はＵＶ照射時に葉緑素の自体蛍光の赤色を示す反面、色素体が形質転換された場合ＧＦＰが発現されるので、ＧＦＰの発現程度に従い朱色から緑色の蛍光を示す。このような色素体形質転換の可否を対照区（微生物組換酵素が形質転換されない場合）と比べて形質転換の効率を調査し、微生物組換酵素を利用した場合色素体形質転換の効率が高くなったことを確認した。
具体的には、前記実施例４で形質転換したあと１回選抜（すなわち、４週培養）された全てのシャーレのうち長波ＵＶの下で緑色の蛍光を帯びる再分化シュートを有するシャーレを調査して形質転換の効率を調査した。その結果、微生物組換酵素を有する植物体が対照区に比べて２倍以上の形質転換の効率を示すことを確認した（表１）。
【００１２】
表１
色素体形質転換の効率
2005514070.tif 000003
【００１３】
2005514070.tif 000004
さらに、４週間選抜された形質転換シュートから原形質体を分離し、細胞内でＧＦＰを発現する色素体を蛍光顕微鏡の下で調査して相同組換の効率を調査した。この場合も、本発明による植物体（微生物組換酵素を有する植物体を２次形質転換した場合）は対照区（微生物組換酵素を有しない植物体を２次形質転換した場合）に比べ、遥かに多いＧＦＰ発現量を示した（図４）。図４において、Ａは葉緑体が全く形質転換されないタバコ植物体の細胞を、Ｂは対照区を、Ｃは本発明による方法により獲得されたタバコ植物体の細胞を表わす。
本発明による植物体の１回選抜の際、ＧＦＰの発現量は２〜３回以上選抜過程を経た対照区のＧＦＰの発現量と類似する。すなわち、微生物組換酵素を有する植物体を２次で形質転換させる本発明による色素体形質転換方法は、従来の形質転換方法（対照区）に比べて相同組換の効率が著しく増加したことを確認することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明に係る植物核形質転換用ベクターの製作過程のフローチャートである。
【図２】核形質転換植物のノーザン・ブロット結果写真である。
【図３】本発明に係る色素体形質転換用ベクターの製作過程のフローチャートである。
【図４】本発明による形質転換方法の効率を示す写真である。
【図１】
2005514070.tif 000005
【図２】
2005514070.tif 000006
【図３】
2005514070.tif 000007
【図４】
2005514070.tif 000008
【国際調査報告】
2005514070.tif 000009