(57)【要約】本発明は核内受容体タンパク質に対するリガンドの同定法であって、当該核内受容体タンパク質を少なくとも１種の候補リガンドの存在下に真核生物発現系にて最初に発現させることを含む方法を提供する。次いで、核内受容体タンパク質を精製、単離し、質量分析法を使用して結合したリガンドの存在を判定する。最後に、リガンドを単離し、測定したスペクトルを化合物ライブラリー中の既知のリガンドのスペクトルと比較し、リガンドを同定する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核内受容体タンパク質に対するリガンドの同定法であって、
（ｉ）核内受容体タンパク質を少なくとも１種の候補リガンドの存在下に真核生物発現系にて発現させる工程；
（ii）該核内受容体タンパク質を精製し、単離する工程；
（iii）該タンパク質とタンパク質−リガンド複合体のスペクトルと分子量を質量分析法により測定し、リガンドの存在を判定する工程；および
（iv）該リガンドを単離し、該リガンドの分子量を質量分析法により測定し、測定したリガンドのマススペクトルを既知化合物ライブラリー中の化合物のマススペクトルと比較し、リガンドを同定する工程；
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
当該核内受容体タンパク質がリガンド結合ドメインを含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
当該工程（ｉ）の発現が好ましくは昆虫細胞を用いるバキュロウイルス発現系を含む請求項１記載の方法。
【請求項４】
工程（ｉ）が、同時発現する少なくとも１種のコレギュレーターの存在下に起こる請求項１記載の方法。
【請求項５】
工程（ii）が、少なくとも１種のコレギュレーターの存在下に起こる請求項１記載の方法。
【請求項６】
工程（ｉ）および工程（ii）が、少なくとも１種のコレギュレーターの存在下に起こる請求項１記載の方法。
【請求項７】
リガンドの存在を判定する当該工程（iii）の質量分析法が、好ましくは、連続もしくはパルスエレクトロスプレーイオン化法またはマトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）を含む請求項１記載の方法。
【請求項８】
リガンドを同定する当該質量分析法が、好ましくは、連続もしくはパルスエレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）、大気圧化学イオン化法（ＡＰＣＩ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）、電子衝撃イオン化法（ＥＩ）または化学イオン化（ＣＩ）質量分析法である請求項１記載の方法。
【請求項９】
当該ライブラリーが小型分子有機化合物を含む請求項１記載の方法。
【請求項１０】
核内受容体タンパク質に対するリガンドを同定する高処理能力スクリーンに使用する請求項１ないし請求項９のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明はオーファン核内受容体などの核内受容体に対するリガンドの同定法に関する。
【０００２】
発明の背景
核内受容体は、ホルモンまたはビタミンなど、生理的に関連する小型分子リガンドの特異的な結合を可能とするタンパク質のスーパーファミリーを意味する。核内受容体はモノマー、ホモダイマーまたはヘテロダイマーとして、標的遺伝子のＤＮＡ応答エレメントと直接相互作用するか、また同様にシグナル伝達経路を介して相互作用するリガンド誘発性転写因子として作用する。核内受容体スーパーファミリーのメンバーは、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、ミネラルコルチコイド受容体（ＭＲ）、プロゲスチン受容体（ＰＲ）、エストロゲン受容体（ＥＲ）、甲状腺ホルモン受容体（ＴＲ）、ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）、レチノイド受容体（ＲＡＲおよびＲＸＲ）、ペルオキシソーム受容体（ＸＰＡＲおよびＰＰＡＲ）およびイコサノイド受容体（ＩＲ）などの受容体である。
【０００３】
内在性膜受容体および膜付着受容体とは違って、核内受容体は真核細胞の細胞質または核のいずれかに存在する。従って、核内受容体は真核細胞においてのみ見出される細胞内可溶性リガンド制御転写因子に分類されるものを含む。このファミリーのメンバーは以下の３つのモジュラードメインの全体構造モチーフを表示する：（ｉ）可変アミノ末端ドメイン；（ii）高度に保存されたＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）；および（iii）低度に保存されたカルボキシル末端リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）。このスーパーファミリーのモジュール方式は、各タンパク質の異なるドメインとサブドメインが異なる機能を個別に遂行することを可能とするが、ドメインは互いに影響し合うことができる。ドメインの個別の機能は、通常、特定のドメイン（例えば、リガンド結合ドメイン）がタンパク質の残りの部分から隔離されている場合に保存される。いわゆる“オーファン核内受容体”も、構造的に相同であるので核内受容体スーパーファミリーの一部であるが、特異性リガンドと関連するとはまだ同定されていない。
【０００４】
本発明は核内受容体タンパク質に対するリガンドの同定法であって、
（ｉ）核内受容体タンパク質を少なくとも１種の候補リガンドの存在下に真核生物発現系にて発現させる工程；
（ii）該核内受容体タンパク質を精製し、単離する工程；
（iii）該タンパク質とタンパク質−リガンド複合体のスペクトルと分子量を質量分析法により測定し、リガンドの存在を判定する工程；および
（iv）該リガンドを単離し、測定したリガンドのマススペクトルを既知化合物ライブラリー中の化合物のマススペクトルと比較し、リガンドを同定する工程；
を含むことを特徴とする方法を提供する。
【０００５】
本発明の一実施態様においては、当該核内受容体タンパク質が、核内受容体タンパク質のリガンド結合ドメインを含む方法が提供される。
本発明の好適な実施態様においては、該核内受容体タンパク質の発現が、昆虫細胞を用いるバキュロウイルス発現系において起こる。
本発明のもう一つの実施態様において、核内受容体の発現は少なくとも１種のコレギュレーター（coregulator）の存在下に起こる。本発明のさらなる実施態様において、核内受容体タンパク質の精製と単離は少なくとも１種のコレギュレーターの存在下にも起こり得る。
【０００６】
本発明によると、リガンドの存在を判定する質量分析法は、好ましくは、連続もしくはパルスエレクトロスプレーイオン化法またはマトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）を含む。
本発明によると、該リガンドを同定する質量分析法は、好ましくは、連続もしくはパルスエレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）、大気圧化学イオン化法（ＡＰＣＩ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）、電子衝撃イオン化法（ＥＩ）または化学イオン化（ＣＩ）質量分析法である。
本発明によると、該リガンドは小型分子有機化合物を含むライブラリーから同定する。
さらに本発明によると、核内受容体タンパク質に対するリガンドを同定する方法は、自動化高処理能力スクリーンにて使用し得る。
【０００７】
本発明は、核内受容体スーパーファミリーのタンパク質が、特に以下の３つのモジュラードメイン、すなわち、（ｉ）可変アミノ末端ドメイン；（ii）高度に保存されたＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）；および（iii）低度に保存されたカルボキシル末端リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）において、全体構造として類似性を示すので、オーファン核内受容体などの核内受容体に関する。このスーパーファミリーのモジュール方式は、各タンパク質の異なるドメインが異なる機能を別個に遂行することを可能とするが、ドメインは互いに影響し合うことができる。ドメインの個別の機能は、通常、特定のドメインがタンパク質の残りの部分から隔離されている場合に保存される。タンパク質またはタンパク質からのドメインの単離は、従来のタンパク質化学の技法により達成できる。従来の分子生物学技法を用い、ドメインまたはサブドメインは、その元の機能を無傷のままとして個別に発現させることができる。２つ以上の異なる核内受容体のキメラも構築可能であり、その場合、キメラはキメラを生成させたそれぞれの核内受容体の個々の機能的ドメインの性質を保持する。従って、本発明は核内受容体タンパク質のみならず、核内受容体タンパク質の単離されたドメインにも関する。
【０００８】
本発明は、好ましくは、核内受容体のリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）に関する。ＬＢＤは核内受容体の保存ドメインである。数種の異なるＬＢＤサブドメインの統合性がリガンド結合にとって重要であるが、ＬＢＤのみを含む末端切除した分子は、正常なリガンド結合活性を保持する。このドメインはまた他の機能、例えば、二量化、核内移行および転写活性化などの機能にも関与する。重要なことは、このドメインがリガンドに結合し、リガンド誘発性立体構造変化を受けることである。
【０００９】
本発明によると、核内受容体タンパク質に対するリガンドの同定法には、真核生物細胞での核内受容体タンパク質または核内受容体リガンド結合ドメインの発現が含まれる。適切な宿主細胞はクローン化配列を発現し得る真核生物細胞である。好ましくは、真核生物細胞は高等真核生物の細胞である。適切な真核生物細胞は、非ヒト哺乳動物組織培養細胞およびヒト組織培養細胞である。好適な宿主細胞は、昆虫細胞、例えば、Ｓｆ２１、Ｓｆ２１のクローン誘導体であるＳｆ９、およびハイファイブ；チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）、ＥＢＮＡ１形質転換ＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ．ＥＢＮＡ細胞）、マウス３Ｔ３線維芽細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＣＯＳ細胞）、乳仔ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウス骨髄腫細胞（Ｓｐ２／０およびＮＳＯ）、およびヒト頚部癌腫細胞株（ＨｅＬａ）などである。
【００１０】
組換えタンパク質発現用の宿主細胞としては、真核生物が、生物機能にとって必要とされ、また潜在的に必須である二次的修飾を担持する正しく折り畳まれたタンパク質を生成するという利点を有する。本発明に関しては、真核生物宿主細胞はさらに天然起源のリガンドを提供でき、従って、発現すべき核内受容体を安定化することができる。
【００１１】
本発明によると、宿主細胞として最も好適なのは昆虫細胞である。本発明の好適な態様において、核内受容体タンパク質または核内受容体タンパク質ドメインは、昆虫細胞を使用して、バキュロウイルス発現系により発現する（バキュロウイルス発現の技法については、以下の文献参照：Luckow et al., Bio/Technology, 1988, 6, 47, Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual （バキュロウイルス発現ベクター：実験室マニュアル）, O'Rielly et al. (Eds.), W.H. Freeman and Company, New York, 1992, および米国特許第４,８７９,２３６号公報）。
【００１２】
昆虫細胞を用いるバキュロウイルス発現系は、技術上既知の他の発現系に比較しても利点を有する。遺伝子のクローニングからタンパク質の産生までの時間は、安定に形質転換した動物細胞株を確立するために必要な時間に比べ、取分け、遺伝子増幅法と関連する場合に、短い。さらに、昆虫細胞のウイルス感染は必然的に細胞死を伴う。このことは他の発現系よりも有利であり得る；その理由は核内受容体タンパク質の遺伝子などの細胞毒性、調節性または必須の細胞性遺伝子のより良好な発現を可能とし得るからである。
【００１３】
本発明によると、数種の昆虫細胞株が組換えバキュロウイルスでの感染に適している。例えば、アメリカシロナガヤ（スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda））の卵巣組織由来の細胞株Ｓｆ−２１、Ｓｆ−２１のクローン誘導体であるＳｆ−９（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手可能；ＣＲＬ１７１１）、ハイファイブ細胞株、およびタマナキンウワバガ（トリコプルシア・ニ（Trichoplusia ni））から得られるＴｎ−３６８およびＴｎ−３６８Ａ細胞株である。昆虫細胞増殖に最も広く使用されている培地にはＴＮＭ−ＦＨおよびＩＰＬ−４１が含まれる。これらの培地には、通常、多少とも明らかになっている成分、例えば、哺乳動物血清、取分けウシ胎仔血清などを補う。血清置換物も昆虫細胞培養に適用されている；また無血清培地、例えば、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ４０１、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ４０５およびＳＦ９００ＩＩなどが市販品として入手可能であり、現在、タンパク質精製を容易にするために広く適用されている。
【００１４】
本発明によると、核内受容体タンパク質は少なくとも１種のコレギュレーターの存在下に同時発現させることもできる。さらに、本発明によると、核内受容体タンパク質は少なくとも１種のコレギュレーターの存在下に精製するか、または単離することができる。コレギュレーターは小型分子リガンドが核内受容体に結合するのを仲立ちする分子である。小型分子リガンドが核内受容体に特異的に結合する結果として、核内受容体は細胞がＤＮＡを転写する能力を変化させる。コレギュレーターは特定の核内受容体タンパク質に依存してコアクチベーターとコリプレッサーの分類に典型的に分けられる。コアクチベーターは転写因子の活性化を促進する分子であり、一方、コリプレッサーは転写に活性な複合体の形成を阻害する。核内受容体のサブセットはコリプレッサー因子に結合し、リガンドの不存在下に標的遺伝子の発現を積極的に抑制する（Aranda et al., Physiological Reviews, Vol.81, No.3, July 2001）。
【００１５】
本発明によると、文献（Shibata, H., et al. Recent Progress in Hormone Res. 52: 141-164, 1997））に紹介されているようなコアクチベーター、例えば、ステロイドレセプターコアクチベーター−ワン（ＳＲＣ−１）、ＳＲＣ−１関連タンパク質、ＴＩＦ−２とＧＲＩＰ−１、およびＡＲＡ−７０、Ｔｒｉｐ１、ＲＩＰ−１４０、およびＴＩＦ−１などのその他のコアクチベーターが使用し得る。相互作用し、かつ相乗的に転写活性化を高めるＣＢＰおよびＳＲＣ−１などのコアクチベーター、またはＣＢＰ、ＳＲＣ−１およびリガンド化受容体の三者複合体などの組合せも使用し得る。
【００１６】
さらに、ＳＭＲＴおよびＮ−ＣｏＲなどのコリプレッサーが使用し得る。アゴニストの結合により、受容体はリガンド結合ドメインにおけるその立体構造を変化させ、コアクチベーターの採用を可能とする。このことは、受容体が基本となる転写機構とより効率的に相互作用し、転写が活性化することを可能とする。対照的に、アンタゴニストの結合は別の受容体立体構造変化を誘発する。一部のアンタゴニスト結合受容体は二量化し、その関連ＤＮＡエレメントに結合するが、会合したコリプレッサーを除去し損ない、結果として基本となる転写機構との非生産的な相互作用が起こる。
【００１７】
混合アゴニスト／アンタゴニストの場合、遺伝子転写の活性化は、様々な化合物の相対的アゴニストまたはアンタゴニストの潜在能力を決定する細胞または細胞特異因子におけるコアクチベーターおよびコリプレッサーの相対比に依存し得る。これらのコアクチベーターおよびコリプレッサーは、ホルモン応答性標的遺伝子発現の転写制御を変調するアクセルおよび／またはブレーキとして作用すると思われる。
【００１８】
本発明によると、核内受容体タンパク質の単離は液体クロマトグラフィーシステムにより実施可能であり、この操作には場合により細胞溶解工程（細胞内で発現したタンパク質のために）が先行する。好適な液体クロマトグラフィー分画工程は、親和性に基づくクロマトグラフィー（タグ付タンパク質用）または免疫親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーなどを含み、これらの技法はすべて当業者にとって既知である。
【００１９】
本発明によると、核内受容体リガンドの単離は液体またはガスクロマトグラフィー分離により実施し得るが、この操作には場合により高分子量バックグラウンドを除去する抽出工程が先行する。好適な液体クロマトグラフィー分離工程は、ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、キャピラリーエレクトロクロマトグラフィー（ＣＥＣ）、等電点フォーカシング（ＩＥＦ）またはミセル界面動電クロマトグラフィー（ＭＥＫＣ）などである。好適なガスクロマトグラフィー分離工程は充填カラムガスクロマトグラフィー、キャピラリーガスクロマトグラフィーまたは高温キャピラリーガスクロマトグラフィーなどである。好適な抽出工程は、固相抽出（ＳＰＥ）および液相抽出（ＬＰＥ）などの相分配技法であり、これらの技法はすべて当業者にとって既知である。
【００２０】
本発明によると、タンパク質、リガンド−タンパク質複合体およびリガンドの分子量およびスペクトルの測定に使用する質量分析法の形式は、イオン化技法、例えば、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）、連続もしくはパルスエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）および関連の方法、例えば、イオンスプレーまたは熱スプレー、大量クラスター衝撃（ＭＣＩ）、電子衝撃（ＥＩ）および化学イオン化法（ＣＩ）などである。かかるイオン源は線形または非線形反射飛行時間型（ＴＯＦ）、単一もしくは多重四重極、単一または多重扇形磁場、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴＩＣＲ）、イオントラップ、およびその組合せ、例えば、イオントラップ／飛行時間型などが適している。イオン化のためには、多くのマトリックス／波長の組合せ（ＭＡＬＤＩ）または溶媒の組合せ（ＥＳＩ）が採用される（Valaskovic, et al., Science 273: 1199-1202 (1996); Li et al., J. Am. Chem. Soc., 118: 1662-1663 (1996)）。
【００２１】
エレクトロスプレー質量分析法については、Fenn ら（Fenn et al., J. Phys. Chem. 88: 4451-59 (1989); ＰＣＴ出願番号ＷＯ９０／１４１４８）が記載しており、現行の応用例についてはレビュー誌（Smith et al., Anal. Chem., 62: 882-89 (1990); Ardrey, Electrospray Mass Spectrometry, Spectroscopy Europe 4: 10-18 (1992)）に要約されている。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法については、Hillenkamp ら（Hillenkamp et al., 溺atrix Assisted UV-Laser Desorption/Ionization: A New Approach to Mass Spectrometry of Large Biomolecules, Biological Mass Spectrometry煤iマトリックス介助レーザーデソープション／イオン化法：大型生物分子の質量分析法の新しいアプローチ、生物学的質量分析法）；Burlingame and McCloskey, eds., Elsevier Science Publ., 1990, pp. 49-60）が記載している。ＥＳＩについては、タンパク質−リガンド複合体の定量が可能であると示されている（Veenstra et al., Biophys. Chem. 79: 63-79 (1999)）。ＥＳＩについては、多価イオンピークが存在し、そのすべてが質量計算に使用され得るため、フェムトモル量のサンプルにおいても分子量の測定が非常に正確である。
【００２２】
本発明によると、リガンドの同定および／または構造決定は、クロマトグラフィーの保持時間またはマススペクトル（ＭＳまたはタンデム質量分析法、例えば、ＭＳ／ＭＳ）またはその両方を既知化合物と比較することにより、またはＮＩＳＴ ＭＳデータベースなどのマススペクトルライブラリーに対してマススペクトルを検索することによりなし得る。リガンドの構造同定は、分光学的技法、例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）および関連技法、例えば、赤外線吸収スペクトル法（ＩＲ）ならびにＸ線結晶解析などによっても実施し得る。
本発明の方法は、核内受容体タンパク質に対するリガンドの高処理能力スクリーニング自動化システムにて使用可能である。
【００２３】
本発明による定義
本発明による“リガンド”という用語は、核内受容体の１個以上の特異部位に結合する分子または一群の分子をいう。代表的なリガンドについて例示説明すると、炭水化物、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡとＤＮＡフラグメント、ＲＮＡとＲＮＡフラグメントなど、脂質、レチノイド、ステロイド、糖ペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカンなど、およびその合成類似体または誘導体、例えば、ペプチド擬似体、小型分子有機化合物など、およびその混合物が含まれる。
【００２４】
本発明による用語“候補リガンド”は、その標的核内受容体に対する親和性または特異性がまだ決定されていないリガンドである。標的の核内受容体に結合し得る如何なるタイプの分子も候補リガンドであると考え得る。
【００２５】
本発明による“タンパク質”という用語は、“ポリペプチド”または“ペプチド”をいう場合、本明細書においては相互に入れ替えて使用することができる。本明細書にて使用する場合の用語“タンパク質”は、ペプチド結合によりつながる少なくとも２個のアミノ酸またはアミノ酸誘導体を意味し、これには大量修飾アミノ酸も含み、またペプチド結合は修飾ペプチド結合でもよい。ポリペプチドはコーディング配列の少なくとも一部であるヌクレオチド配列から、または、例えば、コーディングフレーム以外のリーディングフレームに位置するため、あるいはイントロン配列であったり、３'または５'非翻訳配列またはプロモーターなどの調節配列であったりするために、自然には翻訳されないヌクレオチド配列から翻訳され得る。ポリペプチドはまた化学的に合成可能であり、また翻訳または化学合成後に化学的または酵素的方法により修飾し得る。用語“タンパク質”、“ポリペプチド”および“ペプチド”は、核酸の翻訳産物、例えば、遺伝子産物をいう場合、本明細書では相互に入れ替えて使用し得る。
【００２６】
ＤＮＡおよびＲＮＡなど、核酸に関して本明細書にて使用する場合、“単離した”とは天然状態にある核酸と正常に会合した他の高分子から実質的に分離している核酸分子をいう。本発明による単離した核内受容体タンパク質またはタンパク質のドメインとは、細胞内で正常に会合している細胞性物質から実質的に分離しているタンパク質またはドメインをいう。核内受容体タンパク質の単離した部分とは、天然には存在しないそのフラグメントであり得る。“単離した”という用語は本明細書においてタンパク質−リガンド複合体から単離したリガンドをいうのにも使用される。
【００２７】
本発明による“小型分子有機化合物”という用語は、一般に、分子量が約１０００未満、好ましくは約５００未満の有機化合物をいう。
本発明による“化合物ライブラリー”は、典型的には、複数のメンバーまたはリガンドを含んでいる。さらに、本発明によると、化合物ライブラリーは小型分子有機化合物のマススペクトルのライブラリーであってもよく、それに対してリガンドのスペクトルを比較し、リガンドを同定してもよい。
【００２８】
本発明によると、化合物ライブラリーは、例えば、異性体１個だけ（例えば、エナンチオマーまたはジアステレオマー）が標的受容体に結合しているか、または異性体が標的受容体に対し異なる親和性をもっているかを判定するためのラセミ体混合物を含んでいてもよい。これに関して、異性体が標的受容体に対し異なる親和性をもっている場合には、異なる漏出時間が各異性体に観察される。
【００２９】
実施例
実施例１：バキュロウイルス系にて発現される核内受容体リガンド結合ドメイン（Ｈｉｓ）６ＲＯＲａ−ＬＢＤ２６９−５５６のクローニング、発現、精製および結合アッセイ
Ｓｆ９およびＳｆ２１細胞をスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）から取り出す。マウスコアクチベーターＧＲＩＰ１の残基６７６−６９９に相当するビオチン化２４−マーペプチド（ビオチニル−ＧＳＴＨＧＴＳＬＫＥＫＨＫＩＬＨＲＬＬＱＤＳＳＳ−ＮＨ２）はミモトープス社（Mimotopes(Pty) Ltd）が合成している（＃８１４２０１）。これより短い２０−マーペプチド、ＧＴＳＬＫＥＫＨＫＩＬＨＲＬＬＱＤＳＳＳ、はネオシステムズ（Neosystems）が合成している（＃ＳＰ０００２６７）。両ペプチドの純度は＞９５％である。ビオチニル−ＤＥＶＤ−１−ＡＬはシグマ（Sigma）からのものである（＃Ｂ７７９５）。ストレプトアビジン被覆ＳＡ−チップ、およびＨＢＳバッファー（バイアコア；Biacore）。Ｎｉ−ＮＴＡスーパーフロー樹脂はキアゲン（Qiagen）からのものである。他のクロマトグラフ材料はアマーシャム／ファルマシア・バイオテク（Amersham/Pharmacia Biotech）から入手する。
【００３０】
クローニング
核内受容体ＲＯＲａリガンド結合ドメインはバキュロウイルスベクターｐＢａｃＰＡＫ８−Ｈｉｓ１にてクローン化する。ｐＢａｃＰＡＫ８発現ベクターはクロンテック（Clontech）（パロアルト、カリフォルニア、ＵＳＡ）から入手する。ｐＣＭＸ ＲＯＲａ１はセロノ・ファールマシューティカルズ（Serono Pharmaceuticals）（ジュネーブ、スイス）から入手した。ＲＯＲａリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）はＲＯＲａ配列２６９−５５６に相当するＥｃｏＲＶ／ＢａｍＨ１フラグメントを切り出すことにより入手した。このフラグメントは迅速ＤＮＡライゲーションキット（ベーリンガー・マンハイム（Boehringer Mannheim）、マンハイム、ドイツ）を用い、ベクターｐＢａｃＰＡＫ８−Ｈｉｓ１のＨｉｎｃｌ／ＢａｍＨ１部位に挿入し、ｐＢａｃＰＡＫ８−ＲＯＲａ２６９−５５６を含む組換えコロニーを同定する。コンストラクトを配列決定により確認する。
【００３１】
昆虫細胞におけるバキュロウイルス発現
トランスファーベクターを担持する組換えＲＯＲａ−ＬＢＤを線状化ＡｃＮＰＶウイルスＤＮＡ（ＢａｃＰＡＫ６、クロンテック）と共に、Ｓｆ２１昆虫細胞に形質導入する。６日間インキュベーションした後、組換えウイルスを含む上清を採り、プラーク検定精製に付す。８つの解明の行き届いたプラークを分離する；次いで、ウイルスを小規模で増幅し、感染細胞を取得して６ｘＨｉｓ−タグのウエスタン・ブロット検出法により、ＲＯＲａ−ＬＢＤの発現について分析する。８つすべてのプラーク分離株がタンパク質の発現について陽性であると採点されるが、それから１つを選択してさらに増幅し、力価検定マスターウイルス保存株とし、さらに実験用ウイルス保存株を調製する。最初の小規模生産はローラー上Ｓｆ２１細胞にて実施した後、１０Ｌのバイオウエーブ（Biowave）反応容器にて、Ｓｆ９細胞生産にとって最適の条件を用い、高細胞密度で実施する（３.３×１０６細胞／ｍｌ、多重感染０.１、追加の酵母分離株摂食）。６０時間の感染の後、細胞を遠心分離により採取し、分割したペレットを−８０℃に保存する。
【００３２】
精製
凍結したＳｆ９細胞ペレットを８倍容量の氷冷溶解バッファー（５０ｍＭ−トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.０、５００ｍＭ−ＮａＣｌ、１０ｍＭ ｂ−メルカプトエタノール、０.６ｍＭ−ＰＭＳＦおよびＥＤＴＡ不含有プロテアーゼ阻害剤カクテル・コンプリートａ（ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルス（Roche Molecular Biochemicals）に再懸濁する。この懸濁液をダウンス（Dounce）ホモジナイザーにより１０ストロークで均一化し、次いで、１分ずつの超音波処理を３サイクル行う。細胞溶解液を１５０００Ｇにて６０分間遠心し、３ｍｍのミリポアフィルターで濾過し、バッファーＡ（５０ｍＭ−トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.０、５００ｍＭ−ＮａＣｌ、１０ｍＭ ｂ−メルカプトエタノール、および５ｍＭイミダゾール）にて予め平衡化した２０ｍｌのＮｉ−ＮＴＡスーパーフロー樹脂（キアゲン）に加える。４℃で２時間インキュベーションした後に、スラリーを遠沈し、バッファーＡで洗い、ＸＫ１６／１０カラムに詰める。ベースラインが平衡となった後、バッファーＢ（５００ｍＭイミダゾール／バッファーＡ）により、７０分ステップ勾配として、１ｍｌ／分で溶出する。４−２０％トリス−グリシン・ノベックス（Novex）ゲルを用い、このフラクションを還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。ＲＯＲ含有フラクションをプールし、濃縮し、サイズ排除スーパーデックスＳＰＸ７５ １６／６０カラム（ファルマシア）に負荷する。タンパク質は５０ｍＭ−トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.５、１００ｍＭ−ＮａＣｌ、５ｍＭ−ＤＴＴにて、１ｍｌ／分で分離する。フラクションはＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。アミノ末端配列決定および質量分析法により、３４ｋＤａのバンドがＲＯＲであると同定する。精製したＲＯＲ−ＬＢＤの濃度は、バイダック（Vydac）Ｃ４カラム＃２１４ＴＰ５４１５（３００Å、５μｍ、４.６ｍｍ内径×１５０ｍｍ）による逆相ＨＰＬＣにより測定する。分離は１０〜１００％溶媒Ｂ／溶媒Ａの直線勾配により、４０℃で２５分間実施する。溶媒Ａは０.１％無水トリフルオロ酢酸／アセトニトリル：水（１：９容量比）であり、溶媒Ｂは０.１％無水トリフルオロ酢酸／アセトニトリル：水（９：１容量比）である。流速は１ｍｌ／分であり、タンパク質は２２０ｎｍでの吸光度により検出する。
対照のタンパク質（Ｈｉｓ）６ＥＲα−ＬＢＤ３０１−５５３および（Ｈｉｓ）６シトヘシン−１は大腸菌でクローン化し、発現させる。精製は上記のＮｉ−ＮＴＡおよびサイズ排除クロマトグラフィーにより実施する。
【００３３】
タンパク質キャラクタリゼーション
アミノ酸配列はヒューレット・パッカードＧ１０００Ａ Ｎ−末端タンパク質配列決定システムにて決定する。このシステムは微小吸着型二相性カラム上に保持したタンパク質サンプルについて、自動的にエドマン化学反応を遂行する。最適化化学方法（二重カップル３.０）を用い、化学効率を高め、遅滞を最少化する。ＰＴＨ−アミノ酸の分析は、三元ポンプシステムと狭い穴をあけた（２.１ｍｍ×２５ｃｍ）ＰＴＨカラムを備えたオンライン・ヒューレット・パッカードＨＰ１０９０ＨＰＬＣシステムにて実施した。質量分析法は、マイクロマスＺ型エレクトロスプレーイオン化ソース（ＥＳＩ）を備えたＱ−Ｔｏｆ（マイクロマス（Micromass）、マンチェスター、英国）四重極飛行時間型ハイブリッド・タンデム質量分析計を用い、実施する。取得質量範囲は、典型的にｍ／ｚ５００〜２５００である。データを記録し、マスリンクス（Masslynx）・ソフトウエアを用い処理加工する。５００〜２５００ｍ／ｚ規模のカリブレーションは、ウマ心臓ミオグロビン（ＭＷ１６９５１.５）とウシトリプシノーゲン（ＭＷ２３９８１.０）の混合物からの多価イオンピークを用いることにより実施する。
【００３４】
バイオコア・アッセイ
ＲＯＲα−ＬＤＢと核内コアクチベーターＧＲＩＰ１との相互作用は、バイオコア２０００システムを用い、表面プラスモン共鳴により実時間で分析する。ビオチン化２４−マーＧＲＩＰ１ペプチドをストレプトアビジン被覆ＳＡチップに２５℃で、最終濃度５、２０および５０μＭに固定する。ペプチド（５０μｌ）を５μｌ／分の流速で注入する。１つのフローセルには、無関係のビオチン化ペプチドを陰性対照として注入する。被覆チップ上のＲＯＲ−ＬＢＤの結合は２０μｌ／分の流速で実施する。サンプル注入（５０μｌ）の後、チップを同容量のＨＢＳバッファー（１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ、０.１５Ｍ−ＮａＣｌ、３ｍＭ−ＥＤＴＡ、０.００５％界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７.４）で洗浄し、次いで、５０μｌの２.０Ｍ−ＮａＣｌを注入して再生させる。会合と解離の速度定数、および平衡定数（Ｋｄ）はＢＩＡ評価ソフトウエアバージョン３.０により決定する。
【００３５】
バキュロウイルス系における（Ｈｉｓ）６ＲＯＲα−ＬＢＤ２６９−５５６の発現と精製
組換えバキュロウイルスの生成に続き、ＲＯＲａ−ＬＢＤ（残基２６９−５５６）はウエスタンブロッティングで確認されるように、Ｓｆ２１昆虫細胞にて容易に発現される。引続くプラーク精製、すなわち、均一なウイルスのスケールアップ、および低および高細胞密度での動力学的実験による発現の最適化に基づき、２つの初期４.５Ｌバッチ（２×１０ｇ ｗｃｐ）をローラーで製造し、Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーとＳＰＸ７５カラムによるゲル濾過により精製し、総量５ｍｇのタンパク質を得る。該タンパク質はサイズ排除クロマトグラフィーによりモノマーとして移動する。Ｎ−末端配列分析は該タンパク質のＮ−末端の〜８５％がブロックされているが、残りの遊離Ｎ−末端は均一であり、予想した配列ＧＨＨＨＨＨＨＶＶＩＮＧで始まることを示している。質量分析は、分子質量（３４,４１２）を示し、これは予測した分子質量（３４,３６７）に比べて、＋４５の質量過剰に相当する。このことは、Ｎ−末端のアセチル化を確証している。２番目のピークはＨＰＬＣ（総ＲＯＲの〜２４％）により、３４,４２２の質量に相当することが観察される。該物質は４℃で数週間安定性を示すが、凍結融解により凝集する。次いで、大量の物質が１個のバイオウエーブ反応容器にて製造可能であり、アッセイ目的の組換えＲＯＲａ−ＬＢＤの生産を賄うに十分な細胞量を得る。３０ｇ ｗｃｐ分割部分（１.５Ｌの培養容量に相当する）から、約１９ｍｇの（Ｈｉｓ）６ＲＯＲα−ＬＢＤ２６９−５５６がＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーとＳＰＸ７５サイズ排除クロマトグラフィーにより精製される。ＭＳ分析はＳｆ９により産生された物質がＳｆ２１細胞により産生されたものに相当することを示す。
【００３６】
ＧＲＩＰ１ペプチドに対する（Ｈｉｓ）６ＲＯＲα−ＬＢＤ２６９−５５６のバイアコア結合アッセイ
ＲＯＲαがオーファン受容体であるため、機能的研究のために利用し得るリガンド結合アッセイ法はない。従って、精製した（Ｈｉｓ）６ＲＯＲα−ＬＢＤ２６９−５５６について、バイアコアアッセイにより、コアクチベーターＧＲＩＰ１に対する結合をテストする。ＧＲＩＰ１（ＮＲ−２）の第二ＮＲボックスのロイシン負荷ドメインＬｘｘＬＬを含むビオチン化２４−マーペプチドをストレプトアビジン被覆ＳＡチップに５〜５０μＭの濃度で固定する。後の方の濃度は、〜１００共鳴単位（ＲＵ）の固定化ペプチドで表面を飽和してしまう。無関係なペプチド・ビオチニル−ＤＥＶＤ−１ＡＬを含む対照表面を使用し、非特異的結合を測定する。（Ｈｉｓ）６ＲＯＲａ−ＬＢＤは、対照に比較して、ビオチン化ＧＲＩＰ１ペプチドに特異的な結合を示す。ＧＲＩＰ１ペプチドに対するＲＯＲａ−ＬＢＤの結合は用量依存性である。測定した見かけ上のＫｄは〜２４１ｎＭであった。結合は非ビオチン化２０−マーＧＲＩＰ１ペプチドの添加により完全に阻害される。ＩＣ５０の計算値は〜３μＭである。
【００３７】
ＧＲＩＰ１に対するバイアコア結合アッセイと（Ｈｉｓ）６ＥＲａ−ＬＢＤ３０１−５５３との比較
ＥＲ／コアクチベーター相互作用のリガンド誘発モジュレーションは、バイアコアアッセイの陽性対照として使用し得る。ＲＯＲα−ＬＢＤと同様に、（Ｈｉｓ）６ＥＲａ−ＬＢＤ３０１−５５３は固定化ＧＲＩＰ１ペプチドに対し特異的結合を示す。見かけ上のＫｄは〜４５０ｎＭである。ＥＲ−ＬＢＤとＥ２（１０μＭ）とを予めインキュベーションすると、基底レベルに比較して、結合親和性（Ｋｄ〜７０ｎＭ）が６.５倍上昇する。対照的に、ＥＲαアンタゴニストＢＡ３１２５７を添加すると、Ｅ２に比較して結合親和性の有意な増加はない。固定化ペプチドに対するＥＲ−ＬＢＤ／Ｅ２の結合は、遊離の非ビオチン化ＧＲＩＰ１ペプチドの添加により完全に阻害される。
【００３８】
Ｎ−末端６ｘＨｉｓ−タグ付ＲＯＲα−ＬＢＤはバキュロウイルス系においてクローン化し、発現させ得る。コンストラクトは他のＬＢＤとの相同性分析により解明した場合、ヒトＲＯＲαＣ−末端リガンド結合ドメイン、残基３０４−５５６からなる。このＮ−末端伸張は（Ｈｉｓ）６ＲＯＲα−ＬＢＤを、バイアコア研究用Ｎｉ−ＮＴＡチップ表面などのＮｉ−ＮＴＡ金属親和性表面に、またはリガンド釣り上げ実験用Ｎｉ−ＮＴＡ−セファロースに結合させる場合、立体障害を避けるためのスペーサーとして当初設計する。バイオウエーブ反応容器を使用して発現条件を最適化すると、高発現力価が得られる（＞１０ｍｇ／Ｌの細胞培養）。ＬＢＤはＮｉ−ＮＴＡとサイズ排除クロマトグラフィーの組合せにより均一に精製する。精製したモノマータンパク質（クマシー染色ＳＤＳ−ゲル上で評価して＞９５％）は、バイアコア上でのコアクチベーター結合アッセイに使用する。コアクチベーターＧＲＩＰ１のビオチン化２４−マーペプチドは、ＮＲ−２ボックスのＬｘｘＬＬモチーフを含み、ストレプトアビジン被覆ＳＡチップ上に固定化する。ＲＯＲａ−ＬＢＤは見かけ上の親和性〜２４０ｎＭで該ペプチドに特異的結合性を示し、ＲＯＲαとＧＲＩＰ１との間の相互作用を示すこれまでのプル−ダウン実験を確認する。ＲＯＲαのリガンドはインビトロのリガンド誘発同時活性化の研究にはまだ利用し得ないので、ＥＲα−ＬＢＤを陽性対照として使用し、現在のバイアコアアッセイにおける受容体／コアクチベーターのリガンド依存性モジュレーションの程度を測定する。ＧＲＩＰ１ペプチドに対するＥＲα−ＬＢＤの見かけ上の結合親和性は、エストラジオール様のアゴニストを加えた場合、約６.５倍に増大するが、ＢＡ３１２５７などのアンタゴニストを加えても、殆ど変化しないままである。リガンド結合に基づくＥＲα−ＬＢＤ／コアクチベーター相互作用の相当するモジュレーションはバイアコアと蛍光共鳴エネルギー伝達実験により示し得る（Suen et al., J. Biol. Chem., 1998, 273: 27645-27653; Zhou et al., Mol. Endocrinol 1998, 10: 1594-1604）。
【００３９】
しかし、我々の研究と対照的に、これらの実験は他のＥＲ−コアクチベーター、すなわち、ＳＲＣ−３およびＳＲＣ−１、それぞれにて実施される。さらに、Suen et al. では、３つのＮＲボックスを含むＳＲＣ−３の全ドメインをチップ上に固定化し、Ｅ２結合（＞１０倍増強）の結合親和性をさらに増強させた。最近のアポ−ＬＢＤのＸ線構造、ならびに幾つかの核内受容体のアゴニスト／ＬＢＤおよびアンタゴニスト／ＬＢＤ複合体の構造により、親和性のシフトを説明する新しい見方が得られている。実際、アゴニストの結合はＬＢＤの立体配座の変化と安定化を誘発し、コアクチベーターの相互作用にとって同質の表面を与えるが、一方、かさ高い側鎖をもつ純然たるアンタゴニストは、この変化と、結果としてコアクチベーターの相互作用を防止する（Bourguet et al Trends Pharmacol Sci, 2000 21: 381-388）。この溝は高度に保存されたサインモチーフ（signature motif）を取り囲むので、殆どの核内受容体はコアクチベーターＮＲボックスと相互作用するための潜在力をもち、リガンド依存性核内受容体／コアクチベーター相互作用に共通のメカニズムがあることを示唆している。
【００４０】
実施例２：レチノイン酸受容体関連オーファン受容体（ＲＯＲ）ａの天然型リガンドの同定
（Ｈｉｓ）６ＲＯＲａ−ＬＢＤ２６９−５５６および（Ｈｉｓ）６ＲＯＲａ−ＬＢＤ３０４−５５６を、実施例１記載の手法に従って、真核生物昆虫Ｓｆ９細胞中で産生させ、精製する。良好な品質の結晶は、伸張した（Ｈｉｓ）６ＲＯＲａ−ＬＢＤ３０４−５５６コンストラクトからのみ得られる。両コンストラクトは同じ生物活性を示す。コンストラクト（Ｈｉｓ）６ＲＯＲａ−ＬＢＤ２６９−５５６はＭＳ実験（ＥＳＩ−ＭＳおよびＧＣ−ＭＳ）用に選択する。該タンパク質は１３５ｍＭの濃度でトリス−ＨＣｌバッファー中に保存する。質量分析法に先立ち、バッファーをサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により、５０ｍＭ酢酸アンモニウム溶液（ｐＨ７.０）で交換する。ＳＥＣは使い捨てスピンカラムで実施する。セントリ−スピン２０カラム（プリンストン・セパレーションズ（Princeton Separations）、アデルフィア、ニュージャージー）を、製造業者の説明書に従って、５０ｍＭ酢酸アンモニウムバッファー（ｐＨ７.０）で水和し、６０＊ｌのタンパク質溶液（０.２７ｍｇ）をカラムに加える。カラムを７５０ｘｇで２分間スピンし、収集した物質を、同じ方法で第二のセントリ−スピンカラムでバッファー交換する。タンパク質の最終濃度はｒＨＰＬＣにより決定し、初期濃度の約５０％に相当した。
【００４１】
Ｘ線構造解明
結晶はコンストラクト（Ｈｉｓ）６ＲＯＲａ−ＬＢＤ３０４−５５６について得られ、回折データはシンクロトロン（ＳＮＢＬ、ＥＳＲＦグレノーブル（Grenoble））で１.８８Åに集める。構造はＨｇ−誘導体により最初に解明する。タンパク質と水分子のモデル構築後、他を上回る電子密度は、該リガンドが曖昧さなしにコレステロールあると同定することのできたＬＢＰにおいてもなお未解明である。
【００４２】
リガンド交換：コレステロール硫酸塩によるコレステロール
コレステロール硫酸塩（ＭＷ４６６.７；ＣｈｏｌｅｓｔＳＯ４Ｈ、シグマ）をＤＭＳＯ中に５０ｍＭに溶解し、２.５ｍＭの最終濃度で（Ｈｉｓ）６ＲＯＲａ−ＬＢＤ２６９−５５６溶液（１３５μＭ）に加える。得られる溶液を４℃で一夜インキュベートし、上記の手法に従い、さらにバッファーを交換する。同じ量のＲＯＲａ−ＬＢＤタンパク質を同じ条件下に５％ＤＭＳＯとインキュベートする対照実験を実施する。
【００４３】
エレクトロスプレーイオン化質量分析法
質量分析法はマイクロマスＺ型エレクトロスプレーイオン化源（ＥＳＩ）を備えたＱ−Ｔｏｆ（マイクロマス、マンチェスター、英国）四重極飛行時間型ハイブリッド・タンデム質量分析計を用い、実施する。取得質量範囲は、典型的に５秒間でｍ／ｚ１５００〜４５００である。カリブレーションは、ニワトリ卵リソザイム（シグマ；ＭＷ１４３０５.１Ｄａ）からの多価イオンピークを用いることにより達成する。質量分析計は非共有結合複合体の多価イオン種の検出が可能となるように調整する。イオン化源遮断温度と脱溶媒和温度は、それぞれ５０℃と８０℃に維持する。試料錐体電圧（Ｖｃ）は標準測定のために２３ボルトにセットする。イオン化源内誘発フラグメント化実験は、Ｖｃを１００ボルトまで上げて実施する。タンパク質溶液は１０ｍＬ／分の流速で注入する。データを記録し、マスリンクス・ソフトウエアを用い処理加工する。スペクトルはマックスエント（MaxEnt）解析ソフトウエア（マイクロマス、マンチェスター、英国）を用いてデコンボリューションする。
【００４４】
抽出法と誘導体化
抽出は（Ｈｉｓ）６ＲＯＲａ−ＬＢＤ２６９−５５６を４.６ｍｇ／ｍｌ含有する溶液２ｍｌとヘキサン２ｍｌとを混合し、１分間振盪することにより実施する。水相は同じ手法で２回目の抽出をする。有機相をプールし、窒素気流下に蒸発乾固する。抽出物をピリジン５０ｍｌに溶かす。１０ｍｌの分割部分を５ｍｌのＮ,Ｏ−ビストリメチルシリル−トリフルオロアセトアミド（ＢＳＴＦＡ）にて６０℃で３０分間誘導体化する。参照化合物であるコレステロールと７−デヒドロコレステロール（シグマ）は、同じ手法に従い誘導体化する。構造解明のために、未誘導体化および誘導体化サンプルおよび参照化合物をそれぞれＧＣ／ＭＳにて分析する。
【００４５】
ガスクロマトグラフィー−質量分析法（ＧＣ−ＭＳ）
ＧＣ／ＭＳシステムはカルロ・エルバ・メガ（Carlo Erba Mega）５１６０ガスクロマトグラフから構成されており、電子衝撃イオン源（ＥＩ）を備えたフィンニガン（Finnigan）ＴＳＱ−７００質量分析計に連結している。イオン源を温度１５０℃に加熱し、フィラメント電流を２０ｍＡとし、電子増幅管電圧１０００Ｖ、および転換ダイノードを１５ｋＶにセットする。走査範囲は走査時間２秒としてｍ／ｚ１００〜７００である。ガスクロマトグラフ分離は、ＳＤＰＥ−０８の０.１５ｍｍフィルムで被覆したデュラン（Duran）ガラスカラム（１０ｍ×０.２ｍｍ）にて、キャリアーガスとして水素を用い、一定流速２.５ｍｌ／分にて実施する。温度プログラムは１００〜３３０℃、６℃／分の速度にセットする。ＧＣ／ＭＳ界面温度は３５０℃にセットする。
【００４６】
高分解Ｘ線結晶解析
（Ｈｉｓ）６ＲＯＲａ−ＬＢＤ３０４−５５６の結晶からの高分解（１.８８Å）Ｘ線データは、ＬＢＰに予期せぬリガンドの存在を示す。電子密度が良好に適合したことで、コレステロールであるリガンドの同定が可能である。さらに、Ｘ線構造はＬＢＰにおける相互作用の立体構造をすべて詳細に示す。Ｘ線構造に基づき、コレステロール誘導体が提案されるが、取分けコレステロール硫酸塩は、ＬＢＰの親水性末端の２つのＡｒｇ側鎖との静電的相互作用を示すことから、コレステロールよりもＲＯＲａにより高い親和性を有するリガンドとして提案される。コレステロールの存在の確認およびコレステロールとコレステロール硫酸塩との結合に関する比較検討を、コンストラクト（Ｈｉｓ）６ＲＯＲａ−ＬＢＤ２６９−５５６の質量分析法によりさらに遂行する。
【００４７】
（Ｈｉｓ）６ＲＯＲａ−ＬＢＤ２６９−５５６のＥＳＩ−ＭＳ
非共有結合複合体のＭＳについて記載するこれまでの報告（総説：Pramanik et al 1998, J. Mass Spectrom. 33, 911-920, Veenstra et al 1999 Biophysical Chemistry, 79, 63-79）では、タンパク質の本来の立体配座の保存が非共有結合複合体の検出にとって重要であるとしている。生理学的条件に近似させねばならず、有機溶媒は避けなければならない。イオン強度、ｐＨおよび対イオンなどの溶媒条件が気相イオンの形成に強く影響する（Lemaire et al 2001, Anal Chem, 73, 1699-1706）。タンパク質濃度はイオン化の過程でタンパク質が凝集するのを回避するために、ミリモル濃度でなければならない。最後に、エレクトロスプレーイオン化条件、例えば、イオン源温度、流速および開口部電位などは、複合体が衝突により誘発される解離を避けるために制御しなければならない。（Ｈｉｓ）６ＲＯＲａ−ＬＢＤ２６９−５５６（５０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ７.０）中１５ｍＭ）のマックスエント・デコンボリューション・スペクトルはＶｃ＝２０ボルトで記録する。スペクトルは２つの主たる分子量、例えば、それぞれ３４４１１Ｄａおよび３４７９７Ｄａを与える。ＭＷ３４４１１Ｄａ（Ａ）は予測した（Ｈｉｓ）６ＲＯＲａ−ＬＢＤ２６９−５５６に相当する。ＭＷ３４７９７Ｄａ（Ｂ）は該タンパク質にさらに３８６Ｄａが加わった付加体に相当する。この付加体は、錐体電圧を該タンパク質とこの付加体間の弱い結合および大気と真空の界面で衝突が誘発する解離下に結合したタンパク質−リガンドの分断とを示す３５ボルトまで上げた場合に、消失する。平均分子量３８６.３±０.５Ｄａは化合物Ａ（ＭＷ３４４１１Ｄａ）および化合物Ｂ（３４７９７Ｄａ）それぞれからの多価イオン種のｍ／ｚ値の差から推定する。Chapman と Hall の天然物データベースにて実施したＭＷ検索において、３８５.８および３８６.８Ｄａの間の質量をもつ化合物は３７５種ある。すでにＸ線解析が示唆しているように、検索をステロイドに限定すると、１１種の化合物になる。これらの化合物には、コレステロールとコレステロール類似体が存在する。リガンドをより正確に同定し、ステロイドの存在を確認するために、ＧＣ−ＭＳによりさらなる解析を行う。
【００４８】
抽出物のＧＣ−ＭＳ
ＢＳＴＦＡによる誘導体化後に得られる抽出物をＧＣ−ＭＳ分析（ＳＩＣ）すると、２種の主要なステロイド（Ｒ.Ｔ．２４.９分および２５.７分）と１種のマイナーなステロイド（Ｒ.Ｔ．６分）を示す。非誘導体化および誘導体化主要化合物の＋ＥＩマススペクトルは、対照化合物であるコレステロールと７−デヒドロコレステロール（プロビタミンＤ３）に殆ど一致する。さらに、コレステロールおよび７−デヒドロコレステロールを抽出物と同時に注入すると、それぞれのピークで同時溶出を示す。
【００４９】
モノ−トリメチルシリル化マイナーステロイドの＋ＥＩマススペクトルはｍ／ｚ４７４.８に大量の分子イオンを示す。メチルラジカル（ｍ／ｚ４５９.９）とトリメチルシラノール（ｍ／ｚ３８４.４）の喪失が観察される。ｍ／ｚ３６８.６の基準ピークはメチルラジカルの喪失と引続くトリメチルシラノールの除去により形成される。さらに、エチルラジカルの喪失がｍ／ｚ４４５.７に観察される。非誘導体化マイナーステロイドの＋ＥＩマススペクトルは分子イオンを生じない。ｍ／ｚ３８４.３のイオンは水の喪失により形成される。さらに、より高い存在割合のフラグメントが、ｍ／ｚ３６９.７（＝ｍ／ｚ３８４.３−メチルラジカル）、ｍ／ｚ３６６.７（＝ｍ／ｚ３８４.３−Ｈ２Ｏ）およびｍ／ｚ３５５.７（＝ｍ／ｚ３８４.３−エチルラジカル）に観測される。これらの観察のため、この化合物の正確な同定は不可能であるが、高い可能性として、この化合物はヒドロキシル化コレステロールである。ヒドロキシル基の位置は特定できない。
【００５０】
全体として、コレステロールと７−デヒドロコレステロールは（Ｈｉｓ）６ＲＯＲａ−ＬＢＤ２６９−５５６の抽出物中にＧＣ／ＭＳにより同定される。さらに、マイナー化合物はヒドロキシコレステロールと特徴付けられる。それぞれの化合物につき提案された構造とＳＩＣ−％は以下のとおりである：
（ｉ）コレステロール：ＭＷ＝３８６.７、ＳＩＣ％＝７７.４
（ii）７−デヒドロコレステロール（プロビタミンＤ３）：ＭＷ３８４.７、ＳＩＣ％＝１８.３
（iii）ヒドロキシコレステロール：ＭＷ＝４０２.７、ＳＩＣ％＝４.２
【国際調査報告】
2005524086.tif 000002
2005524086.tif 000003
2005524086.tif 000004