(57)【要約】本発明は、植物または植物細胞において興味あるタンパク質またはポリペプチドを製造する方法において、（i）興味あるタンパク質またはポリペプチド、上記融合タンパク質をアポプラストに標的化する機能を有するシグナルペプチド、およびその融合タンパク質を細胞壁成分に結合させることができるポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする領域を有するヌクレオチド配列により、植物または植物細胞を形質転換またはトランスフェクトし、（ii）発現し、結合した融合タンパク質を有する細胞壁成分を濃縮し、（iii）興味あるタンパク質もしくはポリペプチドまたは興味あるタンパク質もしくはポリペプチドからなるタンパク質を分離することを含む、方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物または植物細胞において興味あるタンパク質またはポリペプチドを製造する方法において、
（i）興味あるタンパク質またはポリペプチド、融合タンパク質をアポプラストに標的化する機能を有するシグナルペプチド、および融合タンパク質を細胞壁成分に結合させることができるポリペプチドを含む融合タンパク質をコードするコード領域を有するヌクレオチド配列により、植物または植物細胞を形質転換またはトランスフェクトし、
（ii）発現され、結合した融合タンパク質を有する細胞壁成分を濃縮し、
（iii）興味あるタンパク質もしくはポリペプチドまたは興味あるタンパク質もしくはポリペプチドを含むタンパク質を分離すること、
を含む方法。
【請求項２】
上記植物は上記融合タンパク質の一過性発現のためにトランスフェクトされる「請求項1」記載の方法。
【請求項３】
上記植物はウイルスベクターを用いてトランスフェクトされる「請求項1または2」に記載の方法。
【請求項４】
工程（i）を実施する前に植物を所望の生育状態まで生育させる「請求項1〜3」のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
上記工程（ii）の細胞壁成分の濃縮は細胞内容の機械的、物理学的または化学的分離を含む「請求項1〜4」のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
融合タンパク質を細胞壁成分に結合させることができるポリペプチドは植物の細胞壁ポリサッカライドに結合する「請求項1〜5」のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
融合タンパク質を細胞壁成分に結合させることができるポリペプチドはβ- 1,4 -グリカンに結合する「請求項6」記載の方法。
【請求項８】
融合タンパク質を細胞壁成分に結合させることができるポリペプチドはセルロースに結合する「請求項6」記載の方法。
【請求項９】
融合タンパク質を細胞壁成分に結合させることができるポリペプチドはヘミセルロースに結合する「請求項6」記載の方法。
【請求項１０】
融合タンパク質を細胞壁成分に結合させることができるポリペプチドはペクチンに結合する「請求項6」記載の方法。
【請求項１１】
上記融合タンパク質は、上記シグナルペプチドとしておよび上記融合タンパク質を細胞壁成分に結合させることができるポリペプチドとして機能するペクチンメチルエステラーゼまたはその機能性断片を含む「請求項1〜10」のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
上記融合タンパク質は、上記融合タンパク質を細胞壁成分に架橋させることができるタバコNtTLPRタンパク質のシステインに富んだドメインまたはその機能性断片を含む「請求項1〜11」のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
上記シグナルペプチドおよび／または細胞壁に上記融合タンパク質を結合させることができる上記ポリペプチドを含まない興味ある上記タンパク質またはポリペプチドを得るために、上記融合タンパク質を切断することを含む「請求項1〜12」のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
上記融合タンパク質は、融合タンパク質の切断を可能にする切断配列を含む「請求項13」記載の方法。
【請求項１５】
切断配列は部位特異的プロテアーゼによって認識される「請求項14」記載の方法。
【請求項１６】
切断配列はユビキチンのC-末端部分を含む「請求項15」記載の方法。
【請求項１７】
上記融合タンパク質はそのN-末端に上記シグナルペプチド、ついで上記融合タンパク質を細胞壁成分に結合させることができる上記ポリペプチド、ついで興味ある上記タンパク質またはポリペプチドを含有する「請求項1〜16」のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
上記融合タンパク質はそのN-末端に上記シグナルペプチド、ついで興味ある上記タンパク質またはポリペプチド、ついで融合タンパク質を細胞壁成分に結合させることができる上記ポリペプチドを含有する「請求項1〜16」のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
上記融合タンパク質はそのN-末端に上記シグナルペプチドを含有し、興味ある上記タンパク質またはポリペプチドは、融合タンパク質を細胞壁成分に結合させることができるポリペプチドがその両側に隣接して含有される「請求項1〜16」のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
植物または植物細胞を形質転換またはトランスフェクトするための上記ヌクレオチド配列はDNAである「請求項1〜19」のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
植物または植物細胞を形質転換またはトランスフェクトするための上記ヌクレオチド配列はRNAである「請求項1〜19」のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
上記興味あるタンパク質またはポリペプチドは1または2以上の親和性ペプチドタグを含有する「請求項1〜21」のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
親和性ペプチドタグは、オレオシンタンパク質またはその部分、インテインまたはその部分、付加的な細胞壁結合ドメイン、デンプン結合ドメイン、ストレプトアビジンエピトープ-タグ配列、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）親和性タグ、6×His親和性タグ、カルモジュリン結合ペプチド（CBP）親和性タグからなる群より選択される「請求項22」記載の方法。
【請求項２４】
上記ヌクレオチド配列が、植物またはその細胞を上記植物の細胞中でプロセッシングを受けるように設計された少なくとも1種の前駆体ベクターとともに提供すること、ここで上記プロセッシングにより、上記植物細胞は上記増幅および／または発現を提供する少なくとも1種のレプリコンを与えられる、を含む方法により上記植物中で増幅および／または発現される、「請求項1〜23」のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
植物またはその細胞は少なくとも2種の前駆体ベクターを提供される「請求項24」記載の方法。
【請求項２６】
上記プロセッシングにより、上記植物細胞は、少なくとも2種のレプリコンであって、
a）上記プロセッシングにより互いに構造的に関連し、
b）機能的には互いに異なり、
c）上記増幅および／または発現を提供する、
ものが与えられる、「請求項24」記載の方法。
【請求項２７】
「請求項1〜26」のいずれかに定義された上記融合タンパク質をコードする上記ヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項２８】
「請求項1〜26」のいずれかに定義された上記融合タンパク質をコードする上記ヌクレオチド配列によって形質転換またはトランスフェクトされた植物細胞または植物。
【請求項２９】
「請求項1〜26」のいずれかの方法によって得られたまたは得られ得る興味あるタンパク質または融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は興味あるタンパク質の植物又は植物細胞における製造のための方法及びベクター、ならびにそれにより得られるタンパク質及びポリペプチドに関する。さらに、本発明はこの方法のためのベクター及びそれにより形質転換された植物又は植物細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物系における組換えタンパク質は工業的用途のあるタンパク質、食品及び飼料添加物、動物の健康用製品及びヒト医薬たとえば抗原及び免疫応答タンパク質を包含する多くの様々な製品の製造にきわめて有効である。
【０００３】
この分野につき包括的に記載した多くの総説がある（Daniellら, 2001, Trends Plant Sci 2001, 6: 219-226; Larrick & Thomas, 2001, Curr Opin Biotech 12: 411-418; Doran, 2000, Curr Opin Biotech 11: 199-204；Hood & Jilka, 1999, Curr Opin Biotech 10: 382-386）。植物は細菌、酵母、昆虫及び哺乳動物細胞ベースの製造システムに比べて、有意に安価なコストの低いタンパク質製造システムとして考えられてきた。しかしながら植物材料からの下流タンパク質の精製に伴う技術的チャレンジについてはほとんど考慮されなかった。バイオマスからのタンパク質の回収ならびに精製は、経費のかかる技術的に複雑な過程であり、とくにそれは「高価ではない」製造システムたとえば酵母又は微生物細胞による製造における総製造コストの90％以上を占めている。植物バイオマスからの精製はきわめて困難であるが、それ以前に植物ベースの製造舞台における工業化への道における最も重大な障壁である。この点に関するデータは、上述の事実を確認するものである。たとえば、トランスジェニックトウモロコシの種子からβ-グルクロニダーゼを抽出する工程における生産コストは総経費の94％を占める（Evangelistaら, 1998, Biotechnol Prog 14: 607-614）。
【０００４】
この問題を処理するために、多くの方法が特別に設計されてきた。植物細胞による組み換えタンパク質の分泌の前の植物細胞内でのその組換えタンパク質の区分化は、生成物を容易に精製できるようにするための一つの前提要件であるといえる。組換えタンパク質の根からの分泌は遺伝子操作に付されたタバコ植物で証明されていた（Borisjukら, 1999, Nat Biotechnol 17: 466-469; US 6096546）。シグナルペプチドとの融合を用い、タンパク質を小胞体に標的化すると、既に部分的に精製された分泌タンパク質が得られる（分泌液中、通常植物により分泌される12種だけ又はその程度のタンパク質とともに）、何千ものタンパク質及び他の分子とのきわめて複雑な混合物としてホモジナイズされた植物組織からの単離と異なり有意に大量に得られることが示されている。類似のアプローチが植物性ウイルス発現ベクターとともに使用され、この場合タンパク質はアポプラストに標的化されているので、精製は、高度に濃縮された生成物から開始される（たとえばYusibovら, 1999, Curr Top Microbial. Immunol 240, 81-94）。M. Moloneyによって開発された他の技術（US 5650554）では、興味あるタンパク質を、オレオシン融合体の部分として、油体へすなわち、容易に除去できる細胞分画として標的化することによってこの問題を解決した。
【０００５】
さらに他の重要な戦略は組換えタンパク質に親和性タグを装着し、親和性クロマトグラフィーによってタンパク質の精製を容易にする方法である。この方法は様々な親和性タグ、たとえばポリヒスチジン、フラッグ、プロテインA, グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、セルロース結合ドメイン（CBD）等を用いるインビトロにおけるタンパク質の精製方法として広く記載されている（Sassenfeld, 1990, TIBTECH 8: 88-93）。CBD融合タンパク質の場合には、興味あるタンパク質がポリサッカライド（セルラーゼ、キチナーゼ及びアミラーゼ、ならびにキシラナーゼ及びβ1,4-グリカナーゼ）の基質結合領域に融合される。基質たとえばセルロースを含む親和性マトリックスを、ポリペプチドを固定化するために採用することができる。ポリペプチド又は融合タンパク質はプロテアーゼ切断部位を用いてマトリックスから除去される。植物及び細菌起源のCBDを使用するこのアプローチの様々な変法がいくつかの刊行物及び特許に記載されている（Ongら, 1991, Enzyme Microb Technol 13: 59-65; Linderら, 1998, Bio- technol Bioeng 60: 642-647; US 5137819; US 5202247; US 5670623; US 5719044; US 5962289; US 6060274）。この精製の変法は、興味ある材料がセルロースを含む植物の細胞壁に結合して、精製は不可能であろうと考えられたことから植物では試験されたことがない。さらに植物細胞壁へのタンパク質の標的化は植物細胞の生育を妨害すると考えられていた（WO 00/77174）。
【０００６】
上述のアプローチは、インビトロ精製方法のために、組換えタンパク質の分泌経路への標的化又は親和性タグたとえばセルロース結合ドメインの使用のいずれかに焦点を置くものである。大規模なセルラーゼの産生及びセルロース分解のためのセルロース分解酵素の亜細胞での標的化（WO9811235）又は構造的もしくは形態学的に変化したトランスジェニック植物の発生（US 6184440）を記述している発明も存在する。これらの特許はいずれもタンパク質の精製操作の改良に焦点を当てたものではない。それらはむしろ大規模な製造及び／又は細胞壁の形態を修飾するためのそれらの使用におけるセルロース分解酵素の毒性の問題を処理するものである。実際に、これらの技術は細胞壁分解又は修飾酵素の発現に限定される。もちろん、植物におけるこのような酵素の産生のためには、亜細胞の局在が好ましい。しかしながらセルラーゼ及び細胞壁修飾酵素は商業的な価値があるタンパク質のほんの小分画でしかない。一般に組換えタンパク質の安価な大規模な製造及び精製のための技術、とくに植物における細胞毒性タンパク質における技術はない。
【０００７】
US 5,474,925には興味あるタンパク質を綿植物における綿繊維に標的化する方法が開示されている。興味あるタンパク質は上記綿繊維上に固定化され、この固定化状態で工業的方法に用いられる。
【０００８】
Ziv & Shoseyov（US 6331416, WO 00/77174）は、興味ある組換えタンパク質をセルロース結合ドメイン（CBD）と融合させたタンパク質として発現させ、この細胞壁セルロースへの上記CBDの結合をタンパク融合体の親和性精製の構築の間にも使用する方法を記載している。細胞壁セルロースへのタンパク質の結合は植物の生育を妨害して生育の静止を招来するので、著者らは細胞壁から融合タンパク質を隔離するために、融合タンパク質を細胞内に区分化した。タンパク融合体を植物材料のホモジナイズによって細胞壁セルロースと接触させる。この方法には大規模な又は分子ファームのような商業的適用を事実上無益にする重大な欠点がある。
【０００９】
すなわち、
（i）融合タンパク質は植物の生育時に発現され、細胞性コンパートメント内に蓄積されるので、植物は生育時に実質的な負荷を蒙ることになる。したがって、植物の生育及び植物の最大の大きさは野生型植物の場合に比して低下し、産生されるバイオマスの喪失、及び組換えタンパク質の量における制限を招来する。野生型植物の場合と同量のバイオマスを得るためには、さらに大量の植物を生育せねばならず、これはさらに高価な温室空間ならびに下流処理時及びタンパク質精製時におけるコストの消費を意味する。
（ii）植物に対して毒性のあるタンパク質は発現させることができない。
（iii）特定の融合タンパク質を発現する植物は興味ある特定タンパク質の産生のためには本質的に１シーズン全てを必要とするトランスジェニックな種子又は苗から出発する必要がある。分子ファーマーは特定のタンパク質の短期の注文に対応することができない。したがって、この方法はきわめて柔軟性に乏しい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、興味あるタンパク質の植物における製造方法を提供するものであり、この場合、異種タンパク質の発現の植物の生育への干渉は問題とならない。
【００１１】
本発明の更なる目的は、植物に対して毒性を示すタンパク質の製造を可能にする、植物における興味あるタンパク質の製造方法を提供することにある。
【００１２】
本発明の更なる目的は現存の技術に比較して有意に簡単であり、植物中でタンパク質を製造する経済的な方法を提供する、興味あるタンパク質の植物又は植物細胞における製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
これらの目的は、以下の興味あるタンパク質又はポリペプチドを植物又は植物細胞中で製造する方法により解決される。当該方法は、
（i）興味あるタンパク質又はポリペプチド、融合タンパク質をアポプラストに標的化する機能を有するシグナルペプチド、及びその融合タンパク質を細胞壁成分に結合させることができるポリペプチドを含む融合タンパク質をコードするコード領域を有するヌクレオチド配列により、植物又は植物細胞を形質転換又はトランスフェクトし、
（ii）発現され、結合した融合タンパク質を有する細胞壁成分を濃縮し、
（iii）興味あるタンパク質もしくはポリペプチド又は興味あるタンパク質もしくはポリペプチドを含むタンパク質を分離すること、
を含む。
【００１４】
本発明者らは、興味あるタンパク質を発現するために用いられる植物の寿命を概念的に異なる2つの相、すなわち、（i）形質転換又はトランスフェクション前の植物生命及び生育、ならびに（ii）形質転換又はトランスフェクション後の植物生命及び生育に分割できることを認識することにより、従来技術の欠点を乗り超えることができた。
【００１５】
本発明の方法においては、上述の融合タンパク質を発現するために使用される植物は、まず形質転換又はトランスフェクション前に所望の生育状態に生育させるのが好ましい。上述の所望の生育状態は特定の融合タンパク質の発現に好ましい生育状態である。上述の生育状態は、好ましくはその植物が達成できる最大の生育、すなわち最大又は最大に近いバイオマスが蓄積した場合に近い。相当なバイオマスが蓄積した植物の形質転換、又はトランスフェクションには以下の利点がある。すなわち、（a）植物あたり多くの細胞及び／又は大量のバイオマスが融合タンパク質の発現のために利用可能である；（b）融合タンパク質のアポプラスト中の細胞壁への結合は細胞の生育に干渉しないし、このような干渉が、本発明方法を妨害することもない；（c）形質転換に使用されるヌクレオチド配列は、後期段階において選択することが可能であり、分子ファーマーに高度の柔軟性を提供する。
【００１６】
本発明のアプローチは、融合タンパク質の発現によって植物の生育が本質的に混乱しないという利点がある。植物とくに野生型植物は、上記融合タンパク質の発現による負荷がなく、所望の生育状態まで生育することができる。産生できる興味あるタンパク質の最大量は植物のバイオマスに依存するので、植物の成長が異種タンパク質の発現及び／又は細胞コンパートメントもしくは細胞壁内の異種タンパク質の蓄積により妨害される従来技術よりも、植物あたりに興味あるタンパク質をより大量に製造することができる。したがって本発明の方法は従来技術に比較して、より高い効率、生産性を示し、より安価である。
【００１７】
上記融合タンパク質を発現した植物は工程（ii）を実施するために任意の適当な時期に収穫できる。上述のように本発明による生育植物の形質転換又はトランスフェクションは、形質転換又はトランスフェクションと上記植物の収穫の間に必要とされる時間を著しく減少させることができるので好ましい。したがって、植物は上記形質転換又はトランスフェクション後速やかに収穫するのが好ましい。さらに好ましくは、植物は上記形質転換又はトランスフェクション後1〜7日、最も好ましくは2〜4日で収穫される。したがって、従来技術に反し、融合タンパク質の結合による細胞壁機能の障害は問題ではない。
【００１８】
さらに本発明の方法では、どのタンパク質を発現させるか（どの核酸を形質転換するか）の決定を植物発生の後期まで遅らせることができるため、分子ファーマーに柔軟さを提供できる。分子ファーマーが成長した植物及びそれぞれ商業用のタンパク質をコードする多数のベクターを有していれば、突然の市場の要求に速やかに反応し、短期間に、たとえば1週間以内に、興味あるタンパク質を大量に提供することができる。したがって本発明の方法は、近代的な市場の要求、たとえば即座の生産に適合する。これに反し、従来技術の方法では生産するタンパク質について長期間の計画が必要になる。
【００１９】
興味あるタンパク質又はポリペプチドの本発明による製造方法は、シグナルペプチドによって融合タンパク質を発現する細胞から分泌される融合タンパク質としての上述の興味あるタンパク質又はポリペプチドの発現を包含する。アポプラストにおいては、融合タンパク質は、融合タンパク質を細胞壁成分に結合させることができる上記ポリペプチドにより細胞壁成分に結合される。したがって植物細胞壁又はその成分は、興味あるタンパク質もしくはポリペプチド又は興味あるタンパク質もしくはポリペプチドからなるタンパク質を精製するための親和性マトリックスとして活用される。
【００２０】
本発明の方法における最初の工程では、植物又は植物細胞を上記融合タンパク質をコードするコード領域を有するヌクレオチド配列により形質転換又はトランスフェクトする。形質転換では安定に形質転換された植物又は植物細胞たとえばトランスジェニック植物が産生される。別法として、上記植物又は植物細胞は上記融合タンパク質の一時的な発現のためにトランスフェクトすることもできる。成長した植物の一時的トランスフェクションが好ましい。
【００２１】
植物又は植物細胞のいくつかの形質転換又はトランスフェクション方法が本技術分野では知られていて、たとえば、Agrobacterium-仲介形質転換、粒子射撃法(ボンバードメント、bombardment)、PEG-仲介プロトプラスト形質転換、ウイルス感染などが包含される。一時的発現のためのトランスフェクションによる一時的発現の好ましい実施態様では、ウイルス感染又はAgrobacterium-仲介形質転換が有利に使用される。
【００２２】
上記ヌクレオチド配列は形質転換又はトランスフェクションの方法に依存してDNA又はRNAである。多くの場合、それはDNAである。しかしながら、重要な実施態様においては、形質転換又はトランスフェクションはRNAウイルスベースのベクターを使用して実施される。この場合、上記ヌクレオチド配列はRNAである。
【００２３】
非常に便利な方法の一つはウイルスに基づくDNAベクターの使用である。好ましくは、DNAベクターはRNAウイルスに基づいている。すなわち、DNAベクターは上記ヌクレオチド配列に加えてRNAウイルス配列のcDNAを含有する。本発明によりウイルスベクターとして使用できる植物DNA又はRNAウイルスの例はWO02/29068及びPCT/EP/02/03476に記載されている。このようなDNAベクターはさらにRNAウイルス転写体を産生するための転写プロモーターを含有する。これらの実施態様においては、形質転換又はトランスフェクションは好ましくはウイルストランスフェクション、さらに好ましくはAgrobacterium-仲介形質転換によって実施される。
【００２４】
上記ヌクレオチド配列は、融合タンパク質をコードするコード領域を含む。上記融合タンパク質は興味あるタンパク質又はポリペプチドを含む（以下の「興味あるタンパク質」参照）。上述の興味あるタンパク質は本発明の方法により調製され、単離できる任意のタンパク質もしくはポリペプチドである。それは、フォールディングされていない、ミスフォールディングされた、あるいは天然の機能的にフォールデフィングされた状態で調製されていてもよい。後者のが好ましい。医薬用のタンパク質がとくに好ましい。
【００２５】
上記融合タンパク質は、さらに、上記融合タンパク質をアポプラストに標的化する機能を有するシグナルペプチドを含む。これは、融合タンパク質を小胞体（ER）及び分泌経路に標的化するシグナルペプチドによって達成することができる。アポプラストに分泌又は標的化されることが知られているタンパク質、すべてのシグナルペプチドが、本発明の目的に使用できる。好ましい例はタバコのカルレティキュリン又は米のアミラーゼである。更なる例にはペクチンメチルエステラーゼ、又はN. tabaccoチロシン及びリジンに富んだタンパク質（NtTLPR）のシグナルペプチドがある。更なる例には、ズッキーニからのアポプラスチックイソペルオキシダーゼのシグナルペプチド（APRX）（Carpinら, 2001, The Plant Cell 13: 511- 520）がある。シグナルペプチドは上記融合タンパク質中で上記標的化に機能するように構成される。この条件は融合タンパク質中の任意の位置で達成される。しかしながら一般に、シグナルペプチドは融合タンパク質を機能的にアポプラストに標的化するため、融合タンパク質のN-末端に配置される。
【００２６】
上記融合タンパク質はさらに、融合タンパク質を細胞壁成分に結合させることができるポリペプチドを含む。上記ポリペプチドにより、アポプラストに分泌される融合タンパク質の有意な分画が細胞壁上に結合又は固定化される。細胞壁への結合は任意の細胞壁成分に行われる。本発明の目的における細胞壁成分には、セルロース、ヘミセルロース、β-1,4-グリカン、ペクチン等のようなポリサッカライド、及びタンパク質又はリグニンのような非ポリサッカライドが包含される。細胞壁のポリサッカライド成分への結合が好ましい。最も好ましいのはセルロースへの結合である。
【００２７】
ペクチンは、陸上の植物すべてに見出される他の主要な細胞壁ポリマーである（Willatsら, 2001, Plant Mol Biol 47, 9-27）。ペクチンはホモガラクツロナン及びラムノガラクツロナンのようなポリサッカライドの複雑なポリマー性のネットワークである。このネットワークの主要なモノマー成分はガラクツロン酸であり、セルロースの場合のようにグルコースではない。ペルオキシダーゼは細胞壁の構築及び細胞壁の可塑性のコントロールに、電子アクセプターとして過酸化水素を使用して芳香族分子の架橋を触媒することにより関与する。ペルオキシダーゼにより触媒されることが知られた反応には、ヒドロキシシンナメートエステル残基、又はペクチンもしくはヘミセルロースを伴うフラボノイド間の共有結合の確立がある。いくつかのペルオキシダーゼには、細胞壁ポリマーホモガラクツロナンの間の特異的相互作用が見出され、それがそれらの活性に必須であるように思われる。本発明の一例では、本発明者らは、ズッキーニからのアポプラスチックイソペルオキシダーゼ（APRX）（Carpinら, 2001, The Plant Cell 13: 511-520）のCa2+-ペクテート結合部位を使用した。上記部位はインビボ及びインビトロにおいて、Ca2+-イオンによって形成される架橋によりペクチン鎖に結合する（例6及び7参照）。
融合タンパク質を細胞壁成分に結合させることができるポリペプチドの例には、このような細胞壁成分を基質として使用するセルラーゼ又はヘミセルラーゼのようなタンパク質がある。このような酵素の基質結合ドメインは、好ましくは、結合可能な上記ポリペプチドとして使用される。更なる例には微生物起源のポリサッカライド結合ドメイン（PBD）がある（下記参照）。この場合とくに例示されるものはペクチンメチルエステラーゼである（例1〜3）。これらの例においては、細胞壁成分への結合は一般に非共有結合である。代替的に、結合には細胞壁成分への共有結合（架橋）が関与していてもよい。この例には、蛋白性の細胞壁成分にジスルフィド結合を形成できるNtTLPRがある。
【００２８】
本発明の方法における第二工程では、発現して融合タンパク質に結合した細胞壁成分が濃縮される。この工程には、植物中に含有される多くの化合物の除去が包含され、生産される興味あるタンパク質の実質的精製を与える。発現細胞（プロトプラスト）からの融合タンパク質の分泌は、大部分のプロトプラスト化合物から興味あるタンパク質を含む融合タンパク質を空間的に分離し、これらのプロトプラスト化合物はこの工程で除去してもよい。工程（ii）では技術分野で公知の細胞壁調製方法を用いることができる。工程（ii）は、植物又は植物細胞を収穫し、次いで発現した本発明の融合タンパク質を含有する植物組織をホモジナイズすることによって行われる。ついで、ホモジナイズの固相及び液相をたとえば遠心分離又はろ過を用いて分離する。細胞壁成分は、たとえばロールの間で圧縮又は潰すことにより濃縮してもよい。それに融合タンパク質が結合又は固定化された固体の残留物をついで可溶性の夾雑物を除去するために、好ましくは適当な緩衝液で洗浄し、ついで不溶性の細胞壁材料を再び回収する。工程（ii）で用いられる条件は融合タンパク質中の興味あるタンパク質-ドメインのフォールディング状態を維持できるように選択するのが好ましい。洗浄緩衝液は好ましくは水性である。しかしながら、産生されるタンパク質により、有機溶媒の使用も有利である。本発明の利益を完全に利用するためには、融合タンパク質を有する細胞壁成分を、工程（ii）の少なくとも初期段階においては、好ましくは不溶性の状態に維持すべきである。しかしながら濃縮／精製は様々な方法に設計され、細胞壁成分の分離を包含することができる。
【００２９】
本発明の最終工程（iii）では、興味あるタンパク質又は興味あるタンパク質を含む融合タンパク質を、工程（i）でそれが結合された細胞壁成分から分離する。この分離は多くの様々な方法で実施できる。一実施態様においては、融合タンパク質は細胞壁もしくは各細胞壁成分から分離される（大部分の場合、融合タンパク質はその分泌時における自然の切断により、もうシグナルペプチドを含まないことを留意すべきである）。これが行われる方法は、その状況とくに融合タンパク質を細胞壁成分に結合させるために用いられるポリペプチドに依存する。細胞壁成分に結合する多くのポリペプチドについて、強固な又は弛い結合が起こることが知られている。又は、これらの条件は実験的に決定することができる。結合が非共有結合の場合には、結合は、たとえばイオン強度、pH, 温度又は緩衝液の成分（たとえばカオトロピック剤）を調整することにより、緩和又は脆弱化される（Greenwoodら, 1988, FEBS Lett 224: 127-131; Shoseyovら, 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89: 3483-3487）。共有結合の場合には、共有結合のタイプを考慮しなければならない。細胞壁成分に結合できるポリペプチドとしてNtTLPRを用いる場合には、ジスルフィド結合を切断するためメルカプトエタノール又はジチオスレイトールのような遊離の-SH基を含有する還元剤の添加が使用される。
【００３０】
工程（iii）の分離は、他の融合タンパク質成分を含まないか実質的に含まない興味あるタンパク質が得られるように、融合タンパク質の切断を包含する。この実施態様には、少なくとも一つのペプチド結合の切断を包含する。この目的には、融合タンパク質はさらにその切断を可能にする切断配列を含む。切断配列は部位特異的プロテアーゼによって認識されるペプチドである。ついで、適当なプロテアーゼを添加して、まだ細胞壁成分に結合している融合タンパク質から興味あるタンパク質を切断する。ついで、残った細胞壁成分の除去により、大部分の植物材料が除かれた興味あるタンパク質が産生する。親和性により精製されたタンパク質から親和性タグを除去するために一般に使用される切断配列／プロテアーゼシステムが本発明において使用されてもよい。このようなシステムは、たとえばAmersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Swedenからの市販品を入手することができる。His-タグの除去に頻繁に用いられる特定の例はXa因子システムである。他の実施態様においては、融合タンパク質中にユビキチンが包含され、切断はユビキチン特異的ヒドロラーゼによって達成される。切断配列はまた、自己触媒性でもよく、この場合、切断は切断のために適当な条件を与えることにより、たとえばインテニン仲介切断を用いて達成される。このようにして得られた興味あるタンパク質は濃縮されている。状況により、興味あるタンパク質はさらに精製に付される。
【００３１】
本発明のヌクレオチド配列の構築は、分子生物学の標準操作によって行われる。上記ヌクレオチド配列は、好ましくは、そのコード配列に作動可能なように連結した植物特異的なプロモーターを含有し、上記コード領域の後に転写ターミネーターを有する。上記融合タンパク質の組織特異的発現は所望により適当なプロモーターを選択して達成される。好ましい実施態様においては、ウイルスベースのベクターが本発明の実施に使用される。このようなベクターの構築は引用例に記載する。
【００３２】
本発明の工程（ii）及び（iii）における実務的態様の更なる情報については、本明細書に引用されるWO 00/77174に見出される。
【００３３】
ヌクレオチド配列は、上記融合タンパク質をコードするコード領域を含む。上記融合タンパク質の成分は様々な順序に配置される。しかしながら、シグナルペプチドは好ましくは、標的化に機能するように、融合タンパク質のN-末端に配置される。興味あるタンパク質は好ましくは融合タンパク質のC-末端に配置され、これは1回のペプチド結合切断により融合タンパク質の残部からの分離を可能にする。ついで結合可能なポリペプチドはシグナルペプチドと興味あるタンパク質の間に配置される。しかしながら、本発明によれば様々な順序に構成されてもよく、たとえば細胞壁成分に結合できるポリペプチドは融合タンパク質のC-末端に配置することもできる。興味あるタンパク質はさらに、細胞壁成分に結合可能なポリペプチドの両側に隣接され、この場合、これらのポリペプチドは同種でも異種でもよい。興味あるタンパク質はついで2回の蛋白分解事象により切断される。好ましくは、これらの2回の蛋白分解事象では同一の切断配列が使用される。興味あるタンパク質はさらに、単離の便宜上、インテインに包含される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
好ましい実施態様においては、本発明は、植物中で興味あるタンパク質又はポリペプチドを製造する方法であって
（ia）植物を所望の生育状態に生育させ、
（ib）工程（ia）の植物又はその細胞をウイルス性ベクターで一時的に形質転換又はトランスフェクトし、ここで上記ベクターは興味あるタンパク質又はポリペプチド、融合ペプチドをアポプラストに標的化する機能を有するシグナルペプチド、及び細胞壁成分に融合タンパク質を結合させることができるポリペプチドを含む融合タンパク質をコードするコード領域を有するヌクレオチド配列を含有し、
（ii）発現し、結合した融合タンパク質を有する細胞壁成分を濃縮し、
（iii）興味あるタンパク質もしくはポリペプチド又は興味あるタンパク質もしくはポリペプチドを含むタンパク質を分離すること、
を含む方法を提供する。
この場合、融合タンパク質を細胞壁成分に結合させることができるポリペプチドはセルロース又はペクチンに結合し、ペクチンへの結合が最も好ましい。
【００３５】
他の好ましい実施態様においては、本発明は、植物中で興味あるタンパク質又はペプチドを製造する方法であって、
（i）植物又はその植物細胞を、興味あるタンパク質又はポリペプチド、融合タンパク質をアポプラストに標的化する機能を有するシグナルペプチド、及び細胞壁成分に融合タンパク質を結合させることができるポリペプチドを含む融合タンパク質をコードするコード領域を有するヌクレオチド配列で形質転換又はトランスフェクトし、
（ii）発現し、結合した融合タンパク質を有する細胞壁成分を濃縮し、
（iii）興味あるタンパク質もしくはポリペプチド又は興味あるタンパク質もしくはポリペプチドを含むタンパク質を分離すること、
を含む方法を提供する。
この場合、上記ヌクレオチド配列は上記植物中で、植物又はその細胞に、上記植物の細胞中でプロセッシングを受けるように設計された少なくとも1種の前駆体ベクターを提供することを含む方法によって増幅又は発現され、この場合、上記プロセッシングにより上記植物細胞は上記増幅及び／又は発現を提供する少なくとも1個のレプリコンが与えられる。
さらに好ましくは、植物又は植物細胞は少なくとも2種の前駆体ベクターを提供される。又は、上記プロセッシングにより上記植物細胞には、
（a）上記プロセッシングにより互いに構造的に関連し、
（b）機能的には互いに異なり、かつ
（c）上記増幅及び／又は発現を提供する
少なくとも2個のレプリコンが与えられる。前駆体ベクターを包含する実施態様は、さらに以下に記載し、例6及び7に例示する。
【００３６】
（図面の簡単な説明）
図1は本発明による、植物細胞における組換えタンパク質製造の一般的スキームである。
A−様々な方法による植物細胞への導入遺伝子の送達（ウイルスベクター−RNA, DNAウイルス；安定な核又はプラスチド形質転換；一時的なAgrobacterium-仲介発現−アグロインフィルトレーション）；
B−組換えタンパク質合成及び細胞壁への結合；
C−サイトゾルの押しつぶしによる組換えタンパク質用植物組織の濃縮；
D−植物組織からの組換えタンパク質の分離
【００３７】
図2は、完全なタバコペクチンメチルエステラーゼ（PME）遺伝子のcDNA配列を示す。翻訳開始及び停止コドンは太字で示す。
【００３８】
図3は、タバコ（受入番号AJ401158）、トマト（受入番号U49330）及びオレンジ（受入番号U82976）からのPME遺伝子の、推定アミノ酸配列のアラインメントを示す。推定アミノ酸配列のアラインメントはGenebeeプログラムパッケージを用いて行われた。矢印はプロセッシングされたPMEタンパク質のN-末端を指示する。膜貫通ヘリックス（黒四角）及びPEMシグネチャー1及び2は四角で囲む。
【００３９】
図4は、PME-GFP融合の様々なバージョンについてのクローニングスキームである。
（A）ベクターpIC2452（完全長PME-GFP）及びpIC2462（成熟PME）のクローニングスキーム；
（B）ベクターpIC2472（GFP-完全長PME）及びpIC2482（GFP-成熟PME）のクローニングスキーム。
【００４０】
図5は、4種のGFP融合とPME遺伝子のインビトロRRL（ウサギ網状赤血球分解物）の翻訳を示す。レーン1：pIC2482, レーン2：pIC2452, レーン3：pIC 2472, レーン4：pIC2462。
【００４１】
図6は、一時的発現実験のための植物発現カセットにおける様々なGFP-PME融合のクローニングスキームを示す。
【００４２】
図7は35Sプロモーターの制御下に完全長PME-GFPによる射撃後、細胞壁に標的化されたGFP（明るい領域）を発現するN. benthamiana細胞を示す。
【００４３】
図8は、flPME-GFP融合体を運搬する二元性ベクターのT-DNA領域を示す。
【００４４】
図9は、NtTLPR-GFP融合体を運搬する二元性ベクターのT-DNA領域を示す。
【００４５】
図10は、NtTLPRubq-GFP融合体を運搬する二元性ベクターのT-DNA領域を示す。
【００４６】
図11は、NtTLPR-GFP融合体を運搬するcrTMVベクターを示す。
【００４７】
図12は、ベクターT7/crTMV及びSP6/crTMVを示す。
【００４８】
図13は、ベクターT7/crTMV/IRESMP,75CR-GUS, T7/crTMV/IRESMR,75UI-GUS, T7/crTMV/IRESMP,228CR-GUS, T7/crTMV/IRESCP,148CR-GUS, Y7/crTMV/SPA-CERCP,148UI-GUS及びT7/crTMV/PL-GUSを示す。
【００４９】
図14は、ベクターpICH8600-C及びpICH9666-Cを示す。IRESmp75CRは、crucifer感染tobamoウイルスの移動タンパク質におけるリボゾーム挿入部位要素を表す：詳細はWO 02/29068参照。
【００５０】
図15はウイルスプロベクターシステムの5'-末端を提供するT-DNAベースのベクターpICH4851、ならびにattP（pICH4851）及びattB（pICH9666-C, 図14）部位の間の組換えを仲介する部位特異的インテグラーゼPhiC31を提供するpICP 1010を示す。これらのベクターのクローニングについてはPCT/EP02/03476及び図17に記載されている。
【００５１】
図16は、制限エンドヌクレアーゼEcoRIを発現させるために設計されたベクターpICH9666-RIA及びpICH9666RIを示す。
【００５２】
図17はPVXベースの前駆体ベクターの構造、完全形式の転写体を与えるその転写（pIC3242から）による発生及びそのスプライシング生成物を示す。発現は転写体（前駆体ベクター及びレプリコン）ならびにスプライスされた転写体（レプリコン）から生じ得る。
【００５３】
図18は、PVXベースの前駆体ベクターの塩基構造及びcDNAクローニングを用いるクローニング戦略を示す。
【００５４】
図19は、2つの遺伝子（CP及びGFP）の、CrTMVベースのスプライシング可能な前駆体ベクター（プロベクター）を用いる発現の一般的スキームを示す。
【００５５】
図20は、中間構築体pIC3342のクローニング戦略を示す。
【００５６】
図21は、中間構築体pIC3378及びpIC3382のクローニング戦略を示す。
【００５７】
図22は、プラスミドpIC3393のクローニングの最終戦略を示す。
【００５８】
図23は、CrTMVベースの前駆体ベクター（a〜c及び上部に示すベクター）を介する数種の遺伝子の発現の一般的スキーム及び酵素Creリコンビナーゼにより触媒されるLoxP-部位における部位特異的組換えによるレプリコンの発生（A〜C）を示す。
【００５９】
図24は、pIC3461構築体−組換えシステムにおける一次成分、のクローニングスキームを示す。
【００６０】
図25は、pIC3441構築体−組換えシステムにおける二次成分の一つの、クローニングスキームを示す。
【００６１】
図26は、pIC3491構築体−組換えシステムにおける二次成分の一つの、クローニングスキームを示す。
【００６２】
図27は、pIC3521構築体−組換えシステムにおける二次成分の一つの、クローニングスキームを示す。
【００６３】
図28は、非伝染性ウイルスベクターによる導入遺伝子発現の主要なスキームを示す。
【００６４】
図29は、Creリコンビナーゼ遺伝子をN. benthamianaのゲノムに導入するために使用したプラスミドpIC1593の構造を示す。
【００６５】
図30は、CrTMVベースの前駆体ベクター（a〜c及び上部に示すベクター）を介する数種の遺伝子の発現の一般的スキーム及び部位特異的組換えのために、インテグラーゼ／att-システムを用いるレプリコンの発生（A〜C）を記載する。前駆体ベクターは、T-DNA-ボーダーを有する二元性ベクター中にクローン化する（LB及びRB）。
【００６６】
図31はpICH4851構築体−組換えシステムにおける二次成分の一つの、クローニングスキームを示す。
【００６７】
図32はpICH5151構築体−組換えシステムにおける二次成分の一つの、クローニングスキームを示す。
【００６８】
図33はpICH5161構築体−組換えシステムにおける二次成分の一つの、クローニングスキームを示す。
【００６９】
図34はpICH5951構築体−組換えシステムにおける二次成分の一つの、クローニングスキームを示す。
【００７０】
図35はpICH6871及びpICH6891構築体−組換えシステムにおける二次成分の二つの、クローニングスキームを示す。
【００７１】
図36はpICH4371構築体−組換えシステムにおける二次成分の一つの、クローニングスキームを示す。
【００７２】
図37はpICH4461構築体−組換えシステムにおける二次成分の一つの、クローニングスキームを示す。
【００７３】
（発明の詳細な説明）
本発明の一般的原理を図1に示す。分泌シグナルペプチド及び細胞壁結合ドメインを有するタンパク質融合体をコードする遺伝子を、好ましくはDNA又はRNAベクターを使用して植物細胞内に送達する。組換えタンパク質は発現され、分泌シグナルペプチドの存在によって細胞内空間（アポプラスト）に標的化され、細胞壁結合ドメインを介して細胞壁に結合される。上記融合タンパク質を有する植物をついで細胞内容物から細胞壁マトリックスを分離するためプロセッシング（押しつぶし又はホモジナイゼーション）に付した。細胞壁マトリックスはついで組換えタンパク質の上記マトリックスからの分離を可能にするように処理することができる。
【００７４】
DNA又はRNAベクターを植物細胞中に送達するためには様々な方法を使用することができる。たとえば、マイクロプロジェクタイル射撃、エレクトロポレーション又はプロトプラストのPEG-仲介処置による、細胞中への上記ベクターの直接導入が包含される（総説については、Gelvin SB, 1998, Curr Opin Bio- technol, 9: 227-232; Hansen & Wright, 1999, Trends Plant Sci 4: 226-231）。植物のRNA及びDNAウイルスも効率的な送達システムを提供する（Hayesら, 1988, Nature, 334: 179-182; Palmerら, 1999, Arch Virol 144: 1345-1360; Lindboら, 2001, Curr Opin Plant Biol 4: 181-185）。上記ベクターは導入遺伝子を植物のゲノム／プラストームへの安定な組み込み（直接又はAgrobacterium-仲介DNAの組み込み）又は導入遺伝子の一時的発現（「アグロフィルトレーション」）のいずれかにより送達させることができる。
【００７５】
分泌シグナルペプチド及び細胞壁結合ドメインを有する興味あるタンパク質をコードするコード領域を有する核酸は様々な方法で設計することができる。通常シグナルペプチドは融合タンパク質のN-末端に配置される。細胞壁ドメインは興味あるタンパク質とシグナルペプチドを連結させることができるか、又は融合タンパク質のC-末端に配置させることが可能であり、あるいは2個の細胞壁結合ドメインは興味あるタンパク質を囲んでいてもよい。本発明の一実施態様においては、全tabaccoペクチンメチルエステラーゼ（PME cDNA, 図2参照；PMEタンパク質前駆体, 図3参照）遺伝子を、興味あるタンパク質としての緑色蛍光タンパク質（GFP）と融合させた。ペクチンメチルエステラーゼ（PME）（Gaffeら, 1997, Plant Physiol 114: 1547-1556; Dorokhovら, 1999, FEBS Lett 461: 223-228）は分泌タンパク質であり、小胞体（ER）及び細胞壁で検出できる。翻訳後プロセッシングを受けるPME多重遺伝子ファミリーのメンバー（Gaffeら, 1997, Plant Physiol 114: 1547-1556）は、細胞壁ターンオーバーに関与し、植物の成長及び発生に役割を有するように思われる（Wenら, 1999, Plant Cell 11: 1129- 1140）。PMEは植物界では普遍的に存在する酵素であることが知られ、ペクチンの脱メトキシ化を触媒することにより細胞壁の分解を制御する。成熟した33 kDa PMEは細胞壁に存在するが、一方、PME前駆体は70 kDaのポリタンパク質として合成される。PMEのプロセッシング及び細胞壁への輸送がN-末端リーダー配列の除去によって行われることは自明であり、一方、細胞壁におけるPMEの繋留には特異的なペクチン結合ドメインが要求される。
【００７６】
本発明の他の実施態様においては（例4及び5参照）、興味あるタンパク質の融合は、タバコからの小（106アミノ酸残基）細胞壁タンパク質NtTLPR、シグナルペプチド配列のプロセッシング及びシステインドメイン（CD）により実施される。CDはタンパク質の細胞壁への架橋連結に関与する（Domingoら, 1999, Plant J 20: 563-570）。
【００７７】
本発明の融合タンパク質又は興味ある上記タンパク質もしくはポリペプチドはさらに、親和性ペプチドタグを含有する。上記親和性ペプチドタグは以下の群の一つとすることができる。すなわち、オレオシン又はその部分、インテイン又はその部分、さらなる細胞壁結合ドメイン、デンプン結合ドメイン、ストレプトアビジンエピトープタグ配列、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）親和性タグ、6×His親和性タグ、カルモジュリン結合ペプチド（CBP）親和性タグである。上記親和性ペプチドタグがそのさらなる細胞壁結合ドメインである場合には、それは結合親和性及び／又は多分、細胞壁成分に対する融合タンパク質の結合を増大させるために使用することができる。細胞壁成分に結合可能なポリペプチド2種以上が用いられる場合には、それらは同種又は異種の細胞壁成分に結合できる。他の親和性ペプチドタグを、融合タンパク質又は興味あるタンパク質に、有益な性質たとえば（親和性）精製のために、又は興味あるタンパク質の使用のために使用することができる。
【００７８】
興味あるタンパク質は、異なる遺伝子から、また異なる動物種からのシグナル配列及び細胞壁結合ドメイン、たとえば植物起源のERシグナルペプチド（たとえば、タバコカルレティキュリンのシグナルペプチド）及び細菌起源のポリサッカライド結合ドメイン（PBD）を該融合タンパク質において用いることができる。ある種の植物病原体（細菌及びかび）はポリサッカライドたとえばセルロース、ペクチン、キシラン及び他の数種の炭素源をそれらの生育及びPBDを含有する酵素の合成に利用することができる。上記酵素のセルロース結合ドメインはその性質が十分明らかにされ、セルロースマトリックス上でのタンパク質の精製に広範に使用されている。特定のセルロース又はポリサッカライド結合ドメインの各細胞壁成分に対する親和性は特定のドメインに依存する。特定のCBD又はPBDを有する特定の融合タンパク質の溶出条件は好ましくは実験的に確立される。本発明に使用可能なCBDはたとえばUS 6,174,700に掲げられている。
【００７９】
本発明おける組換えタンパク質の製造には、上述の興味あるタンパク質のシグナルペプチド及び細胞壁結合ドメインとの融合が包含されることを考慮すれば、融合タンパク質からの興味あるタンパク質の正確な分離は重要事項である。興味あるコード配列に隣接する蛋白分解部位を包含するベクターは、タンパク質の切断を可能にするような条件を設定すれば、融合タンパク質を切断し、興味あるタンパク質を純粋な形で放出させることができる。このような切断は、融合タンパク質中の細胞壁結合ドメインが強い結合を示し、細胞壁マトリックスからの融合タンパク質の回収を低く抑えれば、とくに有利である。NtTLPRタンパク質が細胞壁結合ドメインである場合にそれは観察される。そのような切断は、融合タンパク質中の細胞壁結合ドメインが強い結合示す場合、細胞壁マトリックスからの融合タンパク質の低い回収を生じ、特に有利である。これは、たとえばNtTLPRタンパク質の細胞壁結合ドメインで観察される。
【００８０】
翻訳融合タンパク質の切断は、ウイルス性の部位特異的プロテアーゼによって認識される又は触媒的ペプチドを介して達成することができる（Dolja ら, 1992, Pro Natl Acad Sci USA 89: 10208-10212; Gopinathら, 2000, Virology 267: 159-173; US 5162601；US 5766885；US 5491076）。本発明に適用可能な他の部位特異的プロテアーゼの例には、哺乳動物エンテロキナーゼたとえば配列DDDIK-Iを認識し、Lys-Ile結合を特異的に切断するヒトエンテロキナーゼ軽鎖（Kitamotoら, 1994, Proc Natl Acad Sci 91: 7588-7592）；Gly-Glyジペプチドの間の蛋白分解を触媒するが、切断部位の認識には4アミノ酸を要求するHc-Pro等のウイルス性プロテアーゼ（Carrington JC & Herndon KL, 1992, Virology 187: 308-315）；Semliki Forest ウイルスの部位特異的なロテアーゼ（Vasiljevaら, 2001, J Biol Chem 276: 30786-30793）；及びポリユビキチンプロセッシングに関与するプロテアーゼ、ユビキチン-カルボキシ-末端ヒドロラーゼ（Osavaら, 2001, Biochem Biophys Res Commun 283: 627-633）がある。
【００８１】
ユビキチン特異的プロテアーゼは他の可能性を開くものである。ユビキチンに対する融合タンパク質及びポリペプチドとしての発現は、多くの場合、発現レベルの劇的な増大による利点と、ユビキチンの切断時において任意所望のアミノ末端残基の産生能を提供する。クローン化したユビキチン切断酵素における最近の利用は、細菌及び真核宿主システムの両者で、この技術の活用を増大させている（たとえば、Baker RT, 1996, Curr Opin Biotech 7: 541-546の総説参照）。ユビキチン融合発現システムは既に、植物（US 5773705）、酵母（US 6068994）及び細菌（US 545905）について記載されている。本発明の一実施態様によれば、ユビキチンポリペプチドはN-末端NtTLPRタンパク質及びGFP遺伝子の間に挿入される（図10, 例4）。これは、ユビキチン特異的プロテアーゼでユビキチン分子の切断後、天然に存在するN-末端を、任意の興味あるタンパク質にもたせることを可能にする。このような切断の正確さは、興味あるタンパク質のN-末端のアミノ酸配列に依存しない。
【００８２】
興味ある遺伝子は、ウイルス性ベクターを用いて植物又は植物細胞中に送達させることができる。このようなアプローチは、有意に高い発現レベルにより安定に形質転換された導入遺伝子の構造的発現、及び高レベルのトランスジェニック産物によって生じることがある毒性作用に依存しないことから、明らかに有利である。本発明によるウイルス送達システムは例5（図11）及び6（例14〜16）に記載する。NtTLPR-GFP融合はcrTMV発現ベクターに挿入する。アポプラスト標的化EcoRIエンドヌクレアーゼ-Ca2+-ペクテート結合部位融合は、TMVベースのプロベクターの3'末端に挿入する（例6）。植物におけるこれらのシステムの使用は参考例1〜3及びWO 02/29068に記載されている。
【００８３】
本発明の方法を用いて発現及び単離できる興味ある遺伝子にはそれらに限定されるものではないが、デンプン修飾酵素（デンプンシンターゼ、デンプン分岐酵素、デンプン分岐酵素II、顆粒結合デンプンシンターゼ）、リン酸スクロースシンターゼ、スクロースホスホリラーゼ、ポリガラクチュロナーゼ、ポリフルクタンスクラーゼ, ADPグルコースホスフォリラーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、フルクトシルトランスフェラーゼ、グリカゴンシンターゼ、ペクチンエステラーゼ、アプロチニン、アビジン、細菌性レバンスクラーゼ、大腸菌glgAタンパク質、MAPK4及びオルトローグス、窒素同化／代謝酵素、グルタミンシンターゼ、植物オスモチン、2Sアルブミン、タウマチン、部位特異的リコンンビナーゼ／インテグラーゼ（FLP, Cre, Rリコンビナーゼ, Int, SSVIインテグラーゼR, インテグラーゼphiC31, 又はその活性な断片又は変異体）、イソペンテニルトランスフェラーゼ、Sca M5（大豆カルモジュリン）、コレオプテラン型トキシン又は殺虫剤として活性な断片、ユビキチン抱合酵素（E2）融合タンパク質、リピド、アミノ酸、糖、核酸及びポリサッカライドを代謝する酵素、スーパーオキシドジスムターゼ、プロテアーゼの不活性型プロ酵素、植物タンパク質トキシン、繊維の性質が変化した繊維産生植物、コレオプテラン活性トキシン型Bacillus thuringiensis（Bt2トキシン、殺虫性結晶タンパク質 (ICP), CrylCトキシン、デルタエンドトキシン、ポリオペプチドトキシン、プロトキシン等）、昆虫特異的トキシンAaIT、セルロース分解酵素、Acidothermus celluloticusからのE1セルラーゼ、リグニン修飾酵素、シンナモイルアルコールデヒドロゲナーゼ、トレハロース-6-リン酸シンターゼ、サイトキニン代謝経路の酵素、HMG-CoAリダクターゼ、大腸菌無機ピロホスファターゼ、種子保存タンパク質、Erwinia herbicola lycopenシンターゼ、ACCオキシダーゼ、pTOM36コードタンパク質、フィターゼ、ケトヒドロラーゼ、アセトアセチルCoAリダクターゼ、PHB（ポリヒドロキシブタノエート）シンターゼ、アシル輸送タンパク質、ナピン、EA9, 非高等植物フィトエンシンターゼ、pTOM5コードタンパク質、ETR（エチレン受容体）、プラスティディックピルビン酸ホスフェートジキナーゼ、ネマトーダ誘導膜貫通ポアタンパク質、植物細胞の光合成又はプラスチド機能向上体、スチルベンシンターゼ、フェノールをヒドロキシル化できる酵素、カテコールジオキシゲナーゼ、カテコール2,3-ジオキシゲナーゼ、クロロムコネートシクロイソメラーゼ、アントラニレートシンターゼ、Brassica AGL15タンパク質、フルクトース-1,6-ビホスファターゼ（FBPアーゼ）、AMV RNA3, PVYレプリカーゼ、PLRVレプリカーゼ、ポチウイルスコートタンパク質、CMVコートタンパク質、TMVコートタンパク質、ルテオウイルスレプリカーゼ、MDMVメッセンジャーRNA, 突然変異ジャーミウイルスレプリカーゼ、Umbellularia californica C12:0好ましくはアシル-ACPチオエステラーゼ、植物C10又はC12:0好ましくはアシル-ACPチオエステラーゼ、C14:0好ましくはアシル-ACPチオエステラーゼ（IuxD）、植物シンターゼ因子A、植物シンターゼ因子B、Δ6-デサチュラーゼ、植物細胞における脂肪酸のペルオキシゾームβ-酸化酵素活性を有するタンパク質、アシル-CoAオキシダーゼ、3-ケトアシル-CoAチオラーゼ、リパーゼ、トーモロコシアセチルCoA-カルボキシラーゼ、5-エノールピルビルスキミメート-3-ホスフェートシンターゼ（EPSP）、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェアーゼ（BAR, PAT）、CP4タンパク質、ACCデアミナーゼ、翻訳後切断部位を有するタンパク質、スルホンアミド抵抗性を付与するDHPS遺伝子、細菌性ニトリラーゼ、2,4-Dモノオキシゲナーゼ、アセトラクテートシンターゼ又はアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ALS, AHAS）、ポリガラクチュロナーゼ、Taqポリメラーゼ、細菌性ニトリラーゼ、細菌又はファージの他の多くの酵素たとえば制限エンドヌクレアーゼ、メチラーゼ、DNA及びRNAリガーゼ、DNA及びRNAポリメラーゼ、逆トランスクリプターゼ、ヌクレアーゼ（DNアーゼ及びRNアーゼ）、ホスファターゼ、トランスフェラーゼ等が包含される。
【００８４】
本発明はまた、分子ファーミングならびに商業的及び医薬的に重要なタンパク質たとえば工業的な酵素（セルラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、フィターゼ等）の精製の目的で使用することができる。任意のヒト及び動物タンパク質が本発明のアプローチの記載を用いて発現及び精製させることができる。このような興味あるタンパク質の例には、とくに免疫応答タンパク質（モノクローナル抗体、単一鎖抗体、T細胞受容体等）、抗原、コロニー刺激因子、リラキシン、ポリペプチド誘導ソマトトロピン（HGH）及びプロインスリン、サイトカイン及びそれらの受容体、インターフェロン、生育因子及び凝固因子、酵素的に活性なリポソーム酵素、血液凝固因子、トリプシノーゲン、α1-アンチトリプシン（AAT）、ヒト血清アルブミン、ネイティブなコレラトキシンB、ならびに上述のタンパク質の融合、突然変異体及び合成誘導体のような機能保存タンパク質がある。
【００８５】
本発明を実施するための宿主植物は、単子葉又は双子葉植物とすることができる。最も好ましい植物には、N. tabacumを含むNicotiana種, canola, 馬鈴薯、トーモロコシ、小麦、燕麦、コメ、砂糖大根、大豆、Pennisetum, 綿、alfa-alfa, ヒマワリ、麻、エンドウ、人参、キューリ、トマト等を含むBrassicacea種が包含される。事実上、形質転換及び／又はトランスフェクションのプロトコールが確立されている任意の植物種が本発明に使用できる。
【００８６】
前駆体ベクター（プロベクターシステムを用いる）興味あるタンパク質又はポリペプチドの製造
本発明は他の植物操作技術と容易に併用することができる。このような技術の好ましい例には「プロ-ベクターシステム」である（PCT/EP02/03476）がある。例6及び7は、本発明と前駆体ベクター（プロベクター）の組み合わせを証明する。植物中で前駆体ベクターを用い、本発明と組み合わせて使用できる、1又は2以上の興味ある核酸配列の増幅及び／又は発現を起こさせるプロセスを以下に述べる。
【００８７】
植物、植物組織、植物細胞又は植物培養液中で、1又は2以上の興味ある核酸配列の増幅及び／又は発現を起こさせるプロセスは以下の特徴を有する。すなわち、上記植物細胞中でプロセシングを受けるように設計された少なくとも1種の前駆体ベクターを提供し、この場合、上記プロセシングにより、植物細胞は上記増幅及び／又は発現のために提供される少なくとも1種のレプリコンを与えられ、上記少なくとも1種のレプリコンは、上記プロセシングにより上記の少なくとも1種の前駆体ベクターそれぞれに構造的に類似することが好ましい。
【００８８】
植物、植物組織、植物細胞又は植物培養液中で、1又は2以上の興味ある核酸配列の増幅及び／又は発現を起こさせるプロセスは以下の特徴を有する。すなわち、上記植物細胞中でプロセシングを受けるように設計された少なくとも1種の前駆体ベクターを提供し、この場合、上記プロセシングにより、植物細胞は上記増幅及び／又は発現のために提供される少なくとも2種のレプリコン、すなわち、
（a）上記プロセシングにより互いに構造的に類似し、
（b）機能的には互いに異なり、
（c）上記生育及び／又は発現を提供する
レプリコンを与えられる。
【００８９】
植物、植物組織、植物細胞又は植物培養液中で、1又は2以上の興味ある核酸配列の増幅及び／又は発現を起こさせるプロセスは以下の特徴を有する。すなわち、上記植物細胞中でプロセシングを、好ましくは部位-特異的組換えを受けるように設計された少なくとも2種の前駆体ベクターを提供され、この場合、上記プロセッシングにより上記細胞は少なくとも1種のレプリコンを与えられ、これが上記増幅及び／又は発現を提供する。好ましくは上記少なくとも1種のレプリコンは、上記プロセッシングにより、上記少なくとも2種の前駆体ベクターのそれぞれと構造的に関連する。
【００９０】
さらに、生化学的生成物の産生方法が記載され、遺伝子機能の決定方法及び人工的な又は管理された発生の方法が記載される。これらの各方法は増幅及び／又は発現を生じる上記方法の一つからなる。
【００９１】
さらに、この方法のためのベクター又はベクター前駆体及びウイルス材料が提供され、又はこの方法を実施することにより得られる。ウイルス材料は、植物内で複製できる核酸からなり、感染性DNA又はRNAである。ウイルス材料は裸であるか、被覆タンパク質によりコーティングされている。
【００９２】
さらに（i）植物細胞、種子又は植物（ii）及び上述のベクター、ベクター前駆体、ウイルス材料又はレプリコンからなるキットオブパートが提供される。他のキットの一式には、（i）植物細胞、種子又は植物（ii）及び上述のベクター、ベクター前駆体、ウイルス材料又はレプリコンを含有するアグロバクテリウム細胞がある。
【００９３】
プロ-ベクター法では、1又は2種以上の興味ある核酸配列の植物細胞中における増幅及び／又は発現を生じる。増幅はDNA又はRNAの産生を意味する（たとえば、アンチセンス技術による）。発現はポリペプチド又はタンパク質の形成を意味する。いずれの場合も、最終的なゴールは生化学的生成物であり、その産生には上記DNA又はRNAの増幅及び／又はポリペプチド又はタンパク質の発現が要求される。
【００９４】
プロ-ベクター法は、植物、植物組織、植物細胞又は植物培養液中で実施できる。上記方法は植物細胞中で行うのが好ましい。最も好ましくは、上記方法は植物中で行われる。
【００９５】
前駆体ベクターを有する植物細胞の提供は、ウイルストランスフェクション、アグロバクテリウム仲介送達、非生物学的送達、又は植物の核DNAに予めインテグレートして前駆体ベクターを形成させたプレ-前駆体であってもよい。しかしながら、前駆体ベクターを有する植物細胞の上記提供はさらにトランスフェクション又は形質転換に加えて細胞の活性、たとえばRNAウイルスベースの前駆体ベクターの場合は、一次形質転換又はトランスフェクトDNAは、細胞中でRNAベクターを産生させるために転写を要求する。アグロバクテリウム仲介送達の場合には、前駆体ベクターはアグロバクテリウムによって送達されるT-DNAから切り出すか転写しなければならない。
【００９６】
レプリコンは上記植物の細胞内で自律的に複製できるDNA又はRNA分子である。例としては、細菌及び酵母プラスミド、プラスチド及びミトコンドリアDNA, DNA及びRNAウイルス、ビロイド、ファージが包含される。レプリコンは複製の起源をもたなければならない。複製の起源は、レプリコンがDNA又はRNAレプリコンのいずれであるかに依存して宿主植物細胞のDNA又はRNAポリメラーゼにより、又は異種たとえばウイルス起源のポリメラーゼによって認識される。この場合、植物細胞はたとえば上記レプリコンの一つによって上記異種ポリメラーゼを提供されねばならない。植物細胞中におけるレプリコンの自律的複製は多分それらの濃度を上昇させる効果を有するものと思われ、これが興味ある配列の発現レベルを上昇させ、その細胞から細胞へ及び細胞を通じての拡散を支持する。レプリコンは前駆体ベクターに比較して感染性及び拡散能力が上昇していることが好ましい。
【００９７】
上述の少なくとも1種又は上述の少なくとも2種のレプリコンは、付加的なウイルスの能力、たとえばウイルス粒子アセンブリー、感染性、遺伝子サイレンシングの抑制、逆転写、宿主染色体へのインテグレーション、細胞間の移動、又は長い距離の移動能力を維持する。上記レプリコンの一つは本質的に野生型レトロウイルス又はレトロトランスポゾンであり、複製、逆転写、他のレプリコン（単数又は複数）の宿主染色体へのインテグレーションに必要なトランス機能を提供する。
【００９８】
上述の少なくとも1種又は上述の少なくとも2種のレプリコンは、好ましくは両者で、興味ある上記核酸配列の増幅及び／又は発現を提供する。興味ある配列の一つが上記レプリコンの一つから増幅又は発現される場合には、他のレプリコンにはたとえば上記レプリコンの複製に必要な機能が要求されるか、又は上記方法が細胞培養液もしくは植物中で実施される場合には少なくとも1種のレプリコンの隣接細胞への拡散機能が要求される。この場合レプリコンは互いに機能的に協調することが要求される。
【００９９】
2種以上の興味ある配列が増幅又は発現される場合には、各配列は好ましくは一つのレプリコンから発現され、この場合レプリコンは（両者とも）上記生育又は発現を提供する。またこの場合、レプリコンは互いに機能的に協調する。例としては、複製又は上記レプリコンの拡散機能は一つ又は一部の上記レプリコンから発現され、これが興味ある上記配列を増幅又は発現され、又は付加的なレプリコンから発現される。機能的な協調がないと、増幅又は発現レベルは著しく低下するか又は限局されるので、植物細胞もしくは植物中での増幅又は発現が所望の場合には、細胞に上述の前駆体ベクターを与える。
【０１００】
上述の少なくとも1種又は上述の少なくとも2種のレプリコンは、興味ある上述の配列（単数又は複数）の増幅及び／又は発現に異なる機能を提供する点で互いに機能的に異なっている。このような機能の例には、興味ある上記配列（単数又は複数）の上記核酸のコーディングに加えて、レプリコンの複製に必要な生成物の発現、前駆体ベクター（単数又は複数）のプロセッシングを容易にして上記レプリコンを与える発現因子又は生成物（好ましくは酵素）、レプリコンの細胞から細胞へ又は長距離もしくは植物から植物への移動（たとえば、移動タンパク質又はコートタンパク質）等が包含される。これらの生成物は、トランス又はシスに機能することができる。機能的な区別には、植物内においてプロセッシングの過程で起こるレプリコンのランダムな突然変異は含まれない。
【０１０１】
上記プロセッシングにより、上記の少なくとも1種のレプリコンは互いにそれらが分け合う配列部分で構造的に類似する。類似のタイプは、プロセッシングのタイプ（修飾プロセッシング）に依存する。1種のレプリコンが上記方法で産生された場合には、上記プロセッシングにより、上記の少なくとも1種又は上記少なくとも2種の前駆体ベクターのそれぞれに構造的に類似する。
【０１０２】
前駆体ベクターは植物細胞中で、以下のDNA又はRNA修飾プロセスの一つにより植物細胞中でプロセッシングを受け、これが、植物細胞に上記レプリコン（単数又は複数）を付与する。植物細胞中でのプロセッシングは、DNAの修飾たとえばDNAの組換え、挿入又は切り出し等を包含する。また、それにはRNA修飾たとえばRNAスプライシング、リゲーション又は組換え等が包含される。上記プロセッシングには転写は含まれない。前駆体ベクターはそれ自体上記植物細胞中で自律的複製が可能なDNA又はRNA分子である。
【０１０３】
前駆体ベクター（単数又は複数）は、好ましくは植物ウイルス起源であり、さらに好ましくはRNAウイルス又はDNAウイルス起源である。特異的なウイルスの例には以下に掲げる。前駆体ベクターは、レプリコンと同様に植物細胞中で自律的な複製が可能である。
【０１０４】
植物細胞は1又は2種以上の前駆体ベクターを与えられる。細胞がただ1種の前駆体ベクターを付与される場合には、この前駆体は植物細胞に少なくとも2種以上の前駆体ベクターを提供し、上記前駆体ベクターの間の相互作用たとえば組換えを包含するプロセッシングにより、細胞は好ましくは上記少なくとも1種又は上記少なくとも2種のレプリコンを与えられる。植物細胞に2種以上の前駆体ベクターの付与は上記レプリコン（単数又は複数）の発生の可能性を著しく増大させる。数種の異なるDNA又はRNAの修飾が前駆体ベクターの設計に依存して植物細胞中で起こる。
【０１０５】
このプロセスは野生型植物細胞（単数又は複数）又は上記プロセッシングに必要な機能を提供するように遺伝子操作された植物細胞（単数又は複数）、又は感染性、レプリコンの複製、ウイルス粒子組み立て、宿主による遺伝子サイレンシングの抑制、宿主染色体へのインテグレーション、逆転写、生成した上記レプリコンの細胞から細胞へ又は長距離の移動に必要な1もしくは2種以上の機能をトランスに提供するように操作された植物細胞（単数又は複数）の使用に基づくものである。上記植物細胞の上記遺伝子操作は、一過性発現、ウイルスもしくはアグロバクテリウム仲介トランスフェクション、核のゲノム又はオルガネラへの安定なインテグレーション又は上記植物細胞のプラスミドの自律的複製により行われる。ここに記載のプロセスのための植物細胞及び植物は好ましくは高級植物又はそれらの細胞である。穀物の植物がとくに好ましい。
【０１０６】
生育又は発現を生じるプロセスは従来技術に勝る数種の重要な特徴を示す。増幅又は発現される興味ある核酸配列（単数又は複数）のサイズは、増幅又は発現に必要な機能が少なくとも2種のレプリコンに分与され、レプリコンは従来技術におけるベクターより小さいので、従来技術より限定がはるかに少ない。結果として、増幅又は発現はさらに効率的である。
【０１０７】
さらにこのプロセスでは興味ある核酸配列2種以上の増幅及び／又は発現が可能である。たとえば、2種の興味ある遺伝子の発現が提供される。しかしながら、3, 4又はそれ以上の興味ある核酸配列の発現も実行可能である。これは、全生化学的経路もしくはカスケード又は多重サブユニットタンパク質の発現を可能にする。興味ある配列それぞれは、好ましくは1種のレプリコンから発現される。以下に掲げるようなプロセスの効率的な実施のため、付加的なレプリコン上に付加的な機能（単数又は複数）を配置することもできる。またレプリコンはこれらの2種以上の機能をコードしてもよい。
【０１０８】
第三の重要な利点は従来技術のプロセスに比し、生物学的安全性が改良されるいくつかの可能性があることである。2種以上の前駆体ベクターを使用する実施態様においては、すべての前駆体が植物細胞内に取得される場合にのみプロセスは機能する。また、細胞内で上述の少なくとも1種又は上述の少なくとも2種のレプリコンを発生するプロセッシングが付加的な成分たとえば上記プロセッシングを触媒する酵素に依存させる。この場合付加的な成分が細胞内に送達されたときにのみ、又は上記成分を発現するトランスジェニック細胞を使用したときにのみ、そのシステムは機能する。一実施態様においては、興味ある配列を発現するレプリコンは一次感染細胞から植物全体に拡散するが、他の植物への拡散は不可能である。
【０１０９】
興味ある核酸配列の例には、コード配列もしくはその部分、又は任意の遺伝子要素が包含される。ここで遺伝子要素とは、遺伝子の構造的部分をコードする以外の異なる遺伝子機能を有する任意のDNA又はRNA要素である。それらの例には、転写エンハンサー、プロモーター、翻訳エンハンサー、組換え部位、転写終結配列、内部リボソーム挿入部位（IRES）、制限部位が包含される。好ましい遺伝子要素は興味あるタンパク質をコードする異種核酸に作動可能なように連結して翻訳エンハンサーとして使用されるtobamoウイルスIRESmp75がある。
【０１１０】
好ましい実施態様においては、上記植物細胞は少なくとも1種（タイプ）のレプリコンを付与される。上記1種のレプリコンは、好ましくは、少なくとも2種の前駆体ベクター間の部位特異的組換えによって形成される。上述の部位特異的組換えはDNAレベルで起こさせるのが好ましい。上記レプリコンはしたがって、DNAである。また、上述の1種のレプリコンは上記部位特異的な組換えに続く転写により形成されるRNAであってもよい。この実施態様においては、上記前駆体ベクターは、上記植物細胞中での自律的複製はできない。この実施態様は、生物学的安全性の点からとくに好ましい。
【０１１１】
他の好ましい実施態様においては、植物細胞に前駆体ベクターのDNAが提供される（図17及び19）。前駆体ベクターを産生する転写後、細胞のスプライシングによるプロセッシングはRNAウイルスベースのレプリコンを有する細胞を与え、これから興味ある配列が増幅又は発現できる。スプライシングは遅く、植物細胞中のすべての前駆体分子にスプライシングが起こるわけではないので、スプライシングされていない前駆体分子が細胞中に残存する。これらの残ったスプライシングされていない前駆体ベクターは自律的複製できる同じレプリコンである。それらは、興味ある上記配列の増幅又は発現に必要な機能（単数又は複数）たとえば隣接細胞へのレプリコン（単数又は複数）の拡散機能の発現に使用される。
【０１１２】
他の好ましい実施態様においては、タイプAB1, AB2,．．．,ABn又はタイプB1A, B2A,．．．,BnAのレプリコンのセットが細胞内に一次前駆体ベクターの部位特異的組換えにより（A）、少なくとも2種の二次前駆体ベクターのセット（B1, B2,．．．,Bn）とともに発生される（nは≧2の整数である）。図23に示す実施態様においては、発現又は増幅される配列を含む前駆体ベクター（二次ベクター）他の前駆体ベクター（一次前駆体ベクター）により組換えられ、タイプAB1, AB2及びAB3のレプリコンを形成し、これから、これらの配列は増幅又は発現させることができる。少なくとも3種の前駆体ベクターが、細胞に少なくとも2種のレプリコンを与えるために必要である。レプリコンを拡散させるための機能は上記1又は2種以上のレプリコンから発現させる。
【０１１３】
上述のプロセスを実施するためには、植物又は植物細胞を形質転換又はトランスフェクトするために直接、前駆体ベクターを使用できる。これはとくにDNAウイルスベースのレプリコンについては真実である。RNAウイルスベースのレプリコンについては、形質転換又はトランスフェクションに使用されるDNAベクターは、細胞内で前駆体ベクターを産生させる転写を要求する。
【０１１４】
ここに記載したプロセスは、植物、植物組織、植物細胞又は細胞培養液中において、環境に安全な方法で、1又は2種以上の核酸配列を大量に発生させるために使用することができる。とくに、上記プロセスは、上述の少なくとも1種又は上述の少なくとも2種のレプリコンを大量に発生させるために使用できる。上記レプリコン（単数又は複数）は植物材料から精製又は濃縮することができる。上記レプリコンはベクター又は、所望により植物、植物組織、植物細胞又は植物培養液をさらに形質転換又はトランスフェクトするための濃縮又は精製後に使用されるウイルス材料である。この実施態様においては、主題のプロセスは、農業又はファーミングと同様に大規模に、植物を形質転換又はトランスフェクトするための感染性ウイルス材料又はベクターを産生させる生物学的に安全なプロセスである。上記感染性ウイルス材料又は上記ベクターは、ウイルス材料でパッケージされ、又はコートされたウイルス材料である。上記ウイルス材料のパッケージに必要なタンパク質材料は上記レプリコン（単数又は複数）から発現することができる。
【０１１５】
プロ-ベクターシステムの詳細な説明
様々な分類学上のグループに属するウイルスが、プロ-ベクターシステムの原理により、ウイルスベースベクターの構築に使用することができる。これはRNA及びDNA含有ウイルスの両者において真実であり、その例はPCT/EP02/03476に記載されている。
【０１１６】
大部分の植物ウイルス起源のベクターは、植物中で自律的に複製できるプラスミド（レプリコン）として使用される。しかしながら、非ウイルス要素を用いてプラスミドを操作するのに必要な原理は分かっている。たとえば、植物細胞からの多くの複製の起源候補が記載されている（Berlaniら, 1988, Plant Mol Biol, 11: 161-162; Hernandesら, 1988, Plant Mol Biol 10: 413-422; Berlaniら, 1988, Plant Mol Biol, 11: 173-182; Eckdahlら, 1989, Plant Mol Biol, 12: 507-516）。高級植物のゲノムから自律的に複製する配列（ARS要素）が、酵母高級動物からのARS要素（Eckdahlら, 1989, Plant Mol Biol, 12: 507-516）と共通の構造及び配列の特徴を示すことが知られている。植物のARS要素はSacchromyces cerevisiaeでプラスミドに自律的複製能力を付与できる。トウモロコシの核DNA配列が酵母のプラスミド中で自律的複製を促進できることを示す研究は、それらがトーモロコシゲノム内における高度な反復配列の2つのファミリーであることを示している。それらの配列は特徴的なゲノムハイブリダイゼーションパターンを有する。通常は、それぞれ12〜15 kbのゲノム断片上にARS同種配列の1コピーのみがあった（Berlaniら, 1988, Plant Mol Biol, 11: 161-162）。植物起源レプリコンの他のソースには、植物中の異種遺伝子の増幅ならびに発現を刺激できる植物リボソームDNAスペーサー要素がある（Borisjukら, 2000, Nature Biotech 18: 1303-1306）。
【０１１７】
したがって、ここで意図されるレプリコン又は前駆体ベクターは必ずしも植物ウイルスから誘導されるものではない。植物DNAウイルスは、標的化DNAの形質転換にとくに有用なレプリコン（ベクター）の操作に簡単な方法を提供するが、植物RNAウイルスから全体をもしくは部分的に作成されるベクター又は非植物ウイルスでも使用が可能である。植物ウイルスベースのレプリコンは明らかに有利である。このようなレプリコンは、複製に加えてその他の有用な機能たとえば細胞から細胞へ及び長距離移動のための機能を有する。さらに、それらはしばしば、既知の感染植物からのウイルスの根絶方法を用い、植物細胞から事後的に容易に除去できる。
【０１１８】
最も単純な場合には、一つのタイプの前駆体ベクター（プロ-ベクター）（A）を植物細胞に送達させ、ここで上記細胞中におけるプロセッシングに際し、それは少なくとも1種又は少なくとも2種の構造的に類似し、機能的に異なるレプリコン（F及びG）を生成させる。これは興味ある配列の増幅及び／又は発現を提供することができる。2種以上の前駆体ベクターを植物細胞に導入することができる [A (+C, D, E・・)]。所望により上記植物細胞はトランスジェニック細胞であり、前駆体ベクターのプロセッシング及び／又は発現、複製、細胞から細胞もしくは全体的な移動に必要な他の付加的成分を含有する。
【０１１９】
一実施態様においては、本発明者らは植物の核内におけるプロ-ベクターRNAのスプライシングに基づくプロ-ベクター（前駆体ベクター）システムについて述べる。このシステムは、植物細胞ウイルスゲノムcDNAの部分、興味ある遺伝子及び植物細胞において機能性なスプライシング部位を含有するプロ-ベクターのDNA分子からなる（たとえば図17及び19参照）。トランスフェクトされた植物細胞中で転写後、一次RNA産物（プロ-ベクター又は前駆体ベクター）をスプライシングによってプロセスする。プロ-ベクター（前駆体ベクター）の設計により、興味ある遺伝子（たとえばGFP）はこのスプライスされた型でウイルス遺伝子の一つ（たとえばCP）を置換する。これは興味ある遺伝子（GFP）が、置換されたウイルスタンパク質ではなく、正常なウイルス経路を介して発現することを可能にする。しかしながら、スプライシングは100％の効率では進行できないので、一次転写体の分画がスプライシングされないまま残り、スプライシングされた型と同様に核外に輸送される。結果として、自己複製ウイルスベクターRNA（レプリコン）の2つのタイプがトランスフェクトされた植物細胞の細胞質中に現れる。これが、1種の前駆体ベクターを用いて発生したレプリコンからGFP及びCPの両者の発現を招来することになる。例示した場合には、GFPの発現レベルはCPのレベルよりはるかに高くみえることに留意すべきである。感染の間に産生されるウイルスタンパク質の量は、そのタンパク質をコードする遺伝子とウイルスの3'-末端の距離に依存することがtobamoウイルスについて示されている。GFPはRNAのスプライシング型から発現されるので相当するサブゲノムはCPが発現されるRNAよりも有意に短い（図19, GFPは合成又は操作されたGFPである）。
【０１２０】
この実施態様の例示として、本発明者らは2つのよく知られた植物ウイルス：potatoウイルスX（PVX）及びアブラナ科感染tobamoウイルス（CrTMV）に基づく2つのプロ-ベクターを構築した。いずれの場合も、ウイルスのCP遺伝子はドナー（上流）及びアクセプター（下流）スプライシング部位（それぞれSA及びSD）に隣接した。GFPは、スプライスされた転写体にのみ発現するように、アクセプター部位の下流にクローン化した。PVX及びCrTMVにおけるCPの生理学的役割は異なっている。PVXの場合は、CRはそのウイルスの細胞から細胞への移動を要求する。CrTMVにおいては、CPは主にウイルスの長い縦方向の拡散に参画し（全体的感染）、近隣細胞への感染は重要ではない。これらの例は、2つの異なるレポーター遺伝子（GFP）の発現パターンを提供する。PVX-ベースのシステムの場合には、ウイルスの拡散は、スプライスされていないRNAから形成された効率の低いレプリコンからCPの要求量が発現している間は一次トランスフェクト細胞に留まっている。これは同じ細胞内ではるかに急速に合成されるGFPの過剰産生を招来する。最後に、必要量のCPが蓄積し、両レプリコンが近隣細胞に浸透し、ここでそのプロセスが反復される。これに反してCrTMVベースのプロ-ベクターの場合は、ウイルスの拡散は細胞から細胞への移動に限定されない。両形態のベクターが独立に作用して、これが感染領域の急速な成長を招来する。
【０１２１】
レプリコンの発生の機構としてRNAの修飾を記載する特定の例はRNAスプライシングに基づいているが、他のRNA修飾機構も同様に使用される。これらにはとくに、RNAリゲーション及びRNA組換えの修飾が包含される。酵素たとえばRNAリガーゼによる異なるRNA分子のリゲーションは、植物細胞の内部酵素活性に基づき、又はよく知られたリガーゼたとえばT4RNAリガーゼ（Nishigakiら, 1998, Mol Divers 4: 187-190）又はLeishmaniaからのミトコンドリアRNAリガーゼ（Blancら, 1999, J Biol Chem 274: 24289- 24296）に基づき、細胞内に複数個の異なるレプリコンの産生を可能にする。RNA-RNA組換えは、よく研究された現象であり、それは植物宿主中、ある程度のホモロジーを有するウイルス性RNA分子間において容易に起こる（Allisonら, 1990, Proc Natl Acad Sci 87: 1820-1824; Raoら, 1990, J Gen Virol 71: 1403-1407; US 5,877,401）。
【０１２２】
他の実施態様においては、前駆体ベクターは部位特異的DNA組換えによって処理し、レプリコンもしくは部分的に異なるレプリコンを産生させ、1個のウイルスレプリコンにインビボで組み立てられる。この場合には、分子の再配置がDNAレベルで進行する。数種の分子が組換えによってシャフルされ、1又は数種のベクター分子を産生する。システムの最初のDNA成分はCrTMVゲノムの主要部分−ポリメラーゼ遺伝子MP遺伝子が特異的組換え部位に融合した植物プロモ−ター（Arabidopsis Actin 2）を含有する。第二の成分は同じ組換え部位に続いて興味ある遺伝子（任意のレポーター遺伝子）又はウイルス性CP遺伝子からなるプラスミドDNAである。3'-UTR又はCrTMVが興味ある遺伝子の下流にクローン化されなければならない。このシステムの最後の成分はCre-組換え又はインテグラーゼ発現DNAである。これらの酵素はプロ-ベクター成分の、活性ベクター分子（レプリコン）への認識を促進する。プロ-ベクター成分はいずれも単独では感染せず、これはシステムの生物学的安全性の点において重要であることが強調されねばならない。
【０１２３】
記載された多重成分システムの全成分を有する植物細胞が与えられたのちに、組換えが起こり、1又は数種のレプリコンが形成される（図23 A, B, C参照）。これらの再配置されたDNA分子は（Arabidopsis Actin 2プロモーターを有するので）核内での転写が可能であり、細胞質に輸送される。最後に、RNAスプライシングが関与する場合のように、トランスフェクトされた細胞の細胞質中に数種の複製ベクターRNAが現れる。この実施態様においては、本発明者らはこれらのすべてのベクターが機能性MP遺伝子を含有し、遺伝子は下流に位置されるシステムを記載する。これは、各ベクターRNAが機能性MP遺伝子及び下流に位置された遺伝子両者の発現、ならびに近隣細胞への浸透を可能にする。他の組み合わせも可能であることに留意すべきである。
【０１２４】
リコンビナーゼの送達に関しては、2つの異なるアプローチが例示される。リコンビナーゼは、同時射撃又はアグロバクテリウム仲介一過性発現とシステムの他のDNA成分により細胞内に送達される。他のアプローチとして、cre-リコンビナーゼを発現するトランスジェニック植物も得られている。これは、細胞が与えられなければならない成分の数を減少させ、その結果、システムの総合的な効率を上昇させる。さらにこれはプロセスを支持するように操作した植物の外部では起こすことができないので、プロセスの安全性を改良する。
【０１２５】
プロ-ベクター成分のクローニングの間に、興味ある遺伝子の上流にLoxP組換え部位がクローン化された。LoxP部位は、数個のヌクレオチドの間隔を置いて小さな2つの反転リピートを含有し、それはRNA中にステム-アンド-ループ構造を形成する。ステムはわずか4個のGCペアを含むのみであり、したがってあまり安定ではない。しかしながら、このステムは下流遺伝子の翻訳効率を低下させる。この問題を解決するために、LoxPと興味ある遺伝子の間に任意の翻訳エンハンサーをクローン化することができる。Creリコンビナーゼとの例において、本発明者らはTMV U1のΩリーダーを使用した。しかしながら、他の任意の翻訳増強配列（たとえば、CrTMV又はTMV U1からのIRESmp75）ならびに植物IRESも使用できる。ファージPhiC31のインテグラーゼの例ではIRESmp75要素の使用が翻訳エンハンサーとして好ましい。この場合、プロベクターのセット中でLoxP組換え部位がStreptomycesファージPhiC31 からのatt-部位（結合部位）で置換され（Thorpe & Smith, 1998, Proc Natl Acad Sci 95: 5505-5510; Grothら, 2000, Proc Natl Acad Sci 97: 5995-6000）、これが組換え酵素、インテグラーゼの標的配列である。2つの異なるatt-部位をプロベクターにクローン化した。一方、attPはポリメラーゼ型-MP-LoxPのベクターに挿入し、attB-組換え部位は、興味ある遺伝子についで3'NTR配列及びnos-ターミネーターを有するプロベクターにクローン化した。Creシステムと同様に、att-組換え部位は、下流に位置する遺伝子の翻訳効率を制限する。したがって、このシステムでも、翻訳エンハンサー配列をattB部位と興味ある遺伝子の間にクローン化した。IRESmp75配列は、TMV U1のΩリーダー配列に比べて翻訳エンハンサーとして匹敵する又はより良好でさえあることが示された。
【０１２６】
適当なリコンビナーゼ／組換え部位システムには、とくにバクテリオファージP1からのCre-Loxシステム（Austinら, 1981, Cell 25: 729-736）、Saccharomyces cerevisiaeからのFlp-Frtシステム（Broachら, 1982, Cell 29: 227-234）、Zygo- saccharomyces rouxiiからのR-Rsシステム（Arakiら, 1985, J Mol Biol 182: 191-203）、StreptomycesファージPhiC31 からのインテグラーゼ（Thorpe & Smith, 1998, Proc Natl Acad Sci 95: 5505-5510; Grothら, 2000, Proc Natl Acad Sci 97: 5995-6000）、及びレゾルバーゼが包含される。さらに、他のDNA再配置方法も意図される。他の修飾酵素システムも、すべて、関連するが機能的に異なるレプリコンの発生に、野生型又は遺伝子操作植物細胞の内部で、制限エンドヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、一般的もしくは特異的なリコンビナーゼ等により使用することができる。
【０１２７】
前駆体ベクターを有する植物細胞を提供するためには、様々な方法が使用される。DNAはアグロバクテリウム（US 5,591,616; US 4,940,838; US 5,464,763）もしくは粒子又はミクロプロジェクタイル射撃（US 05100792; EP 00444882B1; EP 00434616B1）により実施されるTi-プラスミドで植物細胞に形質転換することができる。他の植物形質転換法にはまた、ミクロインジェクション類似法（WO 09209696; WO 09400583A1; EP 175966B1）、エレクトロポレーション（EP 00564595B1; EP 00290395B1; WO 08706614A1）又はプロトプラストのPEG-仲介形質転換等が使用できる。形質転換法の選択は形質転換される植物種に依存する。たとえば、ミクロプロジェクタイル射撃は一般に、単子葉植物の形質転換に好ましく、一方双子葉植物の場合には、アグロバクテリウム仲介形質転換が一般に、より良好な結果を与える。前駆体ベクターのアグロバクテリウム仲介送達が好ましい。
【０１２８】
植物中における非ウイルス遺伝子発現のための植物ウイルスベクターの構築は数報の文献に記載されていて（Dawsonら, 1989, Virology 172, 285-293; Brissonら, 1986, Methods in Enzymology 118: 659; MacFarlande & Popovich, 2000, Virology 267: 29-35; Gopinathら, 2000, Virology 267: 159-173; Voinnetら, 1999, Proc Natl Acad Sci USA 96: 14147-14152）、本技術分野の熟練者には容易に実施できる。
【０１２９】
本発明のプロセスは植物中で外来遺伝子を発現させるウイルスベクターに基づく現存の戦略に比べて多くの利点がある。
【０１３０】
プロセスは、興味ある核酸配列2種以上の発現に使用できること、したがって、生化学経路もしくはカスケードの多重遺伝子の発現に効果的に使用できることが重要である。この点に関しては、ここに記載のプロセスは、遺伝子機能の決定の目的で、又は生化学的製造の目的で遺伝子の発現に効果的に使用できる、現在利用できる唯一の方法である。
【０１３１】
本発明はまた、任意の種類の生物学的カスケードについて、その構築に広範囲の機会を開くものである。一例を図28に示す。このシステムは、2つのレプリコンに3つの前駆体ベクター成分の組換えを利用する。第一にレプリコンAはMP及び興味ある遺伝子（この例ではGFP）を発現する。移動タンパク質（MP）の発現により、このベクターは接種された葉で細胞から細胞を移動することができる。しかしながら、それは感染植物内で全体的に拡散することはできず、コートタンパク質（CP）の不存在により他の植物に伝染することはできない。換言すれば、このレプリコンは、植物細胞内に人工的に送達された場合にのみ感染性である。第二のレプリコンBはCPのみを発現する。そのRNAはウイルス組み立ての起源を欠いているので（MP遺伝子の内部に位置する）、ウイルス粒子を形成できないことに留意すべきである。しかしながら、それは有意な量のCPを発現する。
【０１３２】
提案されたプロセスはすべての前駆体ベクターの存在下にのみ操作できるので、本来、安全性が高い。上述の両レプリコンが同じ細胞内に存在すると、それらは互いに補充し合って、両成分は近隣細胞中に除去することができる。しかしながら、ベクターAのみはCPでコートされ、ウイルス粒子を形成することが可能であり、したがってこの成分のみが感染した葉から全植物に輸送される。このようなウイルス粒子が感染していない葉に浸透すれば、感染性成分Aのみが送達され、Bは送達されない。これは全植物における感染の全体的拡散は招来するが、ウイルス粒子は一次的に接種された葉にのみで形成が可能であり、これらの粒子はただ1個のレプリコン成分を含有し、これは他の植物の全体的感染には十分ではない。このシステムは、隣接しないウイルス性ベクターを介しての全細胞における導入遺伝子の高度に効率的な発現のユニークな例を表す。
【０１３３】
さらに、少なくとも2種のレプリコン前駆体から、部位特異的DNA組換えによる1種のウイルス性レプリコンの組み立てプロセスは、感染植物細胞に使用される慣用のウイルス性ベクターに比較して高レベルの安全性が保証される。少なくとも2種の成分からの、ウイルス性レプリコン組み立てである上記プロセスは、上記2種の成分の存在と部位特異的リコンビナーゼの同じ植物細胞における存在を要求する。上記リコンビナーゼは上記成分の一つとともに、シスに送達することができる。好ましくは、リコンビナーゼは別個に送達させてもよい。さらに好ましくは、宿主植物を上記リコンビナーゼを発現するように操作することができる。後者の場合、プロベクター要素からの機能性ベクターの組み立ては操作された宿主植物に対して空間的な制限を与える。プロ-ベクターシステムは参考例4〜17に例示する。
【実施例】
【０１３４】
例1
植物の一過性発現及び安定な核形質転換のための、たばこペクチンメチルエステラーゼ（PME）遺伝子を有する異なるタイプのGFP融合体を有するベクターの構築
GFPのredシフト突然変異体（GFPst65T）をPMEとの融合のために選択し、インビボにおけるGFPの位置を決定した。以下の4種の構築体、すなわち1）完全長PME-GFP；2）GFP-成熟PME；3）GFP-完全長PME及び4）成熟PME-GFPである。第一の構築体は興味あるタンパク質（GFP）を細胞壁に標的化するように設計した。構築体2〜4は陰性対照として使用した。
【０１３５】
プロセッシングを受けていない非翻訳5'及び3'-領域を有するPME遺伝子の完全配列を含有するプラスミドpUC8、以下のプライマーと共にPCR増幅に用いた。
a）5'-TGACCCATGGTGGATTCCGGCAAGAACGTT-3'−PMEコード配列のN-末端部分に相当し、NcoI部位を含有する。
b）5'-TTTTGGATCCACGGAGACCAAGAGAAAAAG-3'− PMEコード配列のC-末端部分に相当し、BamHI部位を含有する。
このプライマーペアは翻訳停止シグナルを有しないPEM発生のために設計された。
c）5'-TGACGGATCCTTGGATTCCGGCAAGAACGTTAAT-3'−完全長のPMEコード配列のN-末端部分に相当し、BamHI部位を含有する。
d）5'-CCCCTCTAGATCAGAGACCAAGAGAAAAAGGGAA-3'−完全長PMEのC-末端部分に相当し、XbaI部位を含有する。
このプライマーペアは最初のメチオニン残基を有しないが、翻訳停止シグナルを有するPME創製のために設計された。
e）5'-TTTTCCATGGTGAGGCCCGACGTGGTTGTGGC-3'−NcoI部位に翻訳開始コドンを含有する成熟PME遺伝子のN-末端部分に相当する。
このプライマーは翻訳開始シグナルを有するが、翻訳停止シグナルはもたない成熟PME遺伝子を創製するために設計された。
f）5'-ATAAGGATCCGTGAGGCCCGACGTGGTTGTGGC-3'−BamHI部位内に翻訳停止シグナルをもたない成熟PME遺伝子のN-末端部分に相当する。このプライマーは開始コドンを有しないが、翻訳停止シグナルを有する成熟ＰＭＥ遺伝子を創製するために設計された。
【０１３６】
異なるタイプのPCR産物をT7プロモーターの制御下にpGEM-Tベクター（Promega）中にクローン化し、プラスミドpIC2406 {プライマーa）及びb）}、pIC2396 {プライマー b）及び c)}、pIC2425 {プライマーa）及びf)} ならびにpIC2415 {プライマー b） 及びプライマーf)} を得た。ついで、GFP遺伝子をPEMとのN- 又はC-末端翻訳融合で修飾した。GFP遺伝子の2つの修飾をT7プロモーターの制御下にpGEM-Tベクター中にクローン化した。翻訳開始コドンを有し、翻訳停止シグナルをもたないGFPはプライマーg）及びh）（pIC2441）を用いて得られた。翻訳開始コドンはもたないが、翻訳停止シグナルを有するGFPはプライマーi）及びプライマーj）（pIC2431）を用いて得られた。
【０１３７】
使用したGFPプライマー：
g）5'-TTTTCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3'− GFP遺伝子のN-末端部分に相当し、NcoI部位内に翻訳開始コドンを含有する。
h）5'-TTTTGGATCCTATTCTTGCGGGCCCTCGCTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3' −GFP遺伝子のC-末端に相当し、BamHI制限部位を含有する。
i）5'-TTTTGGATCCATAAGAACGGGGCCCAGAGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT-3'− GFP遺伝子のN-末端部分に相当し、BamHI部位を含有する。
j）5'-TTTTTCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCA-3'− GFP遺伝子のC-末端部分に相当し、XbaI部位内に翻訳停止シグナルを含有する。
【０１３８】
PME-GFPの融合のために、GFPを含有するが翻訳開始コドンのないpIC2431のNcoI/BamHI断片を、pIC2406及びpIC2425のNcoI/BamHI大断片とリゲートし、それぞれ構築体pIC2452及び2462を生成させた。クローニング操作の一般的スキームは図4Aに示す。
【０１３９】
GFP-PMEの融合のためには、pIC2441のNcoI/BamHI小断片を、pIC2396のNcoI/BamHI大断片又はpIC2411のNcoI/BamHI大断片とリゲートし、それぞれプラスミドpIC2472及び2482を生成させた。クローニング操作の一般的スキームは図4Bに示す。
【０１４０】
PME-GFP融合の正確さをチエックするため、構築体pIC2452, 2462, 2472及び2482を用いてウサギ網状赤血球溶解物（RRL）のインビトロ翻訳を調べた。結果は図5に様々なPME-GFP融合産物の完全性として表す。
【０１４１】
一過性発現実験では、pIC2452, 2462, 2472及び2482の大NcoI-クレノウ/ SalI断片をpIC056発現カセットのSmaI/SalI大断片と、35Sプロモーター及びnosターミネーター配列の間にリゲートし、p35S：完全長（fl）PME-GFP, 35S成熟（m）PME-GFP, p35S：GFP-flPME及びp35S：GFP-mPMEを持つ構築体が得られた。クローニングスキームは図6に示す。
【０１４２】
例2
Nicotiana benthamiana の葉におけるPME-GFPの一過性発現
プラスミドDNAの調製
p35S：flPME-GFP, p35S；mPME-GFP, p35S：GFP-flPME及びp35S：GFP-mPME融合体をもつプラスミドを大腸菌株DH10B中に形質転換し、LBメジウム中でmaxi prepを成長させ、Qiagenキットを用いてDNAを精製した。
【０１４３】
ミクロプロジェクタイル射撃
ミクロプロジェクタイル射撃はBiolistic PDS-1000/He Particle Delivery System（Bio-Rad）を用いて実施した。細胞は900〜1100 psi, マクロキャリヤー発射点から停止スクリーンまで15 mmの距離、停止スクリーンから標的組織までの距離60 mmで射撃した。破裂ディスクとマクロキャリヤーの発射点間距離は12 mmであった。浸透圧前処置の4時間後に射撃を実施した。
【０１４４】
Bio-Radの原プロトコールによるDNA-金コーティングを次のように実施した（Sanfordら, 1993, In Methods in Enzymology, ed R Wu 217: 483-509）。25μLの金粉（0.6, 1.0mm）を50%グリセロール中（60 mg/mL）、0.2μg/μLのプラスミドDNA 5μL, 25μLのCaCl2（2.5 M）及び0.1 Mスペルミジン10μLと混合した。混合物を2分間ボルテックス攪拌し、ついで室温で30分間インキュベートし、遠心分離し（2000 rpm, 1分間）、70及び99.5％のエタノールで洗浄した。最後にペレットを30μLの99.5％エタノールに再懸濁した（6μL/ショット）。新たなDNA-金コーティング操作（PEG/Mg）は次のように実施した。25μLの金懸濁液（60 mg/mLグリセロール50％中）を、5μLのプラスミドDNA とエッペンドルフチューブ中で混合し、ついで 30μLのMgCl2（1.0 M）中40％PEGを補充した。混合物を2分間ボルテックス攪拌したのち、ついで室温で30分間、攪拌せずにインキュベートした。遠心分離し（2000 rpm, 1分間）したのち、ペレットを1 mLの70％エタノールで2回及び1 mLの99.5％エタノールで１回洗浄した。最後にペレットを30μLの99.5％エタノールに分散させた。DNA-金懸濁液のアリコート（6μL）をマクロキャリヤーディスクに負荷し、5〜10分間乾燥させた。
【０１４５】
Nicotiana benthamianaの葉を、様々なプラスミドDNAでコーティングしたこれらの金粒子によって射撃した。実験の結果は図7に示すとおりであり、flPME-GFP融合産物は細胞壁に標的化される。
【０１４６】
例3
Arabidopsis thalianaのAgrobacterium仲介形質転換
構築体の設計
例1に記載のプラスミドp35S：flPME-GFP, p35S：mPME-GFP, p35S：GFP-flPME及びp35S：GFP-mPMEの大Nhe1-EcoR1断片をpICBV1二元ベクターの大Xba1- EcoR1断片にリゲートした。得られたプラスミドpICBV flPME-GFP, pICBV1 mPME-GFP, pICBV GFP-flPME及びpICBV GFP-mPMEは、T-DNA領域中にp35S：flPME-GFP, p35S：mPME-GFP, p35S：GFP-flPME及びp35S：GFP-mPME発現カセットを、選択可能なマーカーとしてのBAR遺伝子とともに含有していた。1つの構築体のT-DNA領域、pICBV flPME-GFPを図8に示す。
【０１４７】
Arabidopsis thalianaの植物中（イン プランタ）形質転換
プラスミド（カルベシリン抵抗性）をエレクトロポレーションによってAgrobacterium tumefaciens（株GV 2260）中に固定化した。この細菌細胞は、300 mLの2YTメジウム中、抗生物質と生育させ、遠心分離で収集して5％スクロースOD600＝0.8に再懸濁した。
【０１４８】
開花するまでA. thaliaha植物を生育させた。Arabidopsis植物の開花した一片をAgrobacterium溶液に浸漬し、数秒間真空を適用した。形質転換した植物を24時間、高湿の暗所に保持し、ついで温室に移した。3〜4週後に種子を収集し、土壌に播き、100 mg/Lのホスフィノスリシン、0.01％のSilvetをスプレーした。処置は選択効率及び後の発芽事象の頻度に依存して2〜3回反復した。トランスジェニックArabidopsis植物は、植物組織内のGFPの局在を検討するために使用した。
【０１４９】
形質転換個体の選択
射撃の2〜4日後、細胞の付着したろ紙を、適当な選択剤（10〜15μg/mL PPT）を補充したCIMを有するプレートに移した。7日毎に材料を新鮮な選択メジウムに移した。プレートを暗所に保持し、約6週後に植物材料を、適当な選択物質（10〜15μg/mL PPT）を補充したペトリ皿の、形態発生誘導メジウム（MIM）（付録参照）に移した。プレートを高い光強度で1日、明期16時間としてインキュベートした。
【０１５０】
例4
NtTLRP遺伝子との翻訳融合を用いるGFPの細胞壁標的化
GFP及びタバコ細胞壁タンパク質TLPRの二元ベクターに基づく翻訳融合（Domingoら, 1999, Plant J 20: 563-570；受入番号Y19032）は、プライマーが異なる以外は、PME-GFP融合について記載した方法と同様に実施した。
a）5'-TGACCCATGGGTTCTAAGGCATTTCTGTTTCTTG-3'−NtTLPR コード配列のN-末端部分に相当し、NcoI部位を含有する。
b）5'-TTTTGGATCCTTGTGAAGGCTGAACTTCAGTAAG-3'− NtTLPRコード配列のC-末端部分に相当し、BamHI部位を含有する。クローニング戦略は例1と3に記載したflPME- GFP融合の場合に類似する。P35S：NtTLPR-GFP発現カセットをT-DNAボーダーの内部に含有する最終構築体は図9に示す。
【０１５１】
任意のアミノ酸残基の前に既定位置で正確に切断することができるタンパク質切断部位を導入するためArabidopsisユビキチン遺伝子（UBQ11, US 5773705）をNtTLPRとGFP遺伝子の間に導入した。
UBQ11の増幅のために使用したプライマーは次の通りであった。
c）5'-TTTTGGATCCAGATCTTCGTAAAGACTTTGACCG-3'−UBQ11のコード配列のN-末端部分に相当し、BamHI部位を含有する。
d）5'-TTTTGGATCCTTGTGAAGGCTGAACTTCAGTAAG-3'−NtTLPRのコード配列のC-末端部分に相当し、BamHI部位を含有する。
【０１５２】
IBQ11遺伝子のBamHI処置及びゲル-精製PCR断片を、BamHI消化及びアルカリホスファターゼ処置ベクターpICBV1 NtTLPR-GFPとリゲートした。クローン化断片の方向性を、UBQ1及びGFPプライマーの様々な組換えを用いるPCRによりチエックした。得られたプラスミドのT-DNA領域を図8に示す。一過性発現実験及び植物の安定な形質転換は例2及び3に記載のように実施した。
【０１５３】
例5
crTMVベクターからのNtTLPR-GFP融合の発現
NtTLPR-GFP融合のNco1-Sal1断片をcrTMVベクターにクローニングし（図11）Nicotiana benthamiana, Nicotiana tabacum及びBrassica植物のトランスフェクションに使用した。crTMVベースのベクターの構築、及びIRES要素を介するレポーター遺伝子の発現については、参考例1〜3及びWO 02/ 29068に詳細が提供されている。
【０１５４】
例6
細胞壁成分に結合可能なポリペプチドとして、Ca2+-ペクテート結合部位の使用
この例では、zucchini（APRX, Carpinら, 2001, The Plant Cell 13: 511- 520）からのアポプラスチックイソペルオキシダーゼのCa2+-ペクテート結合部位を使用する。この部位はインビボならびにインビトロで、Ca2+-イオンにより形成される架橋を介してペクチン鎖に結合することが知られていた。この部位はその陽性の電荷をペルオキシダーゼの表面に露出している4つのクラスター化アルギニンのモチーフを有する。EGTA又はEDTAのようなCa2+-キレート剤はそれらの強力なCa2+-イオンに対する親和性により、ペクチン鎖に対するイオン的相互作用を抑制することができる。α-ヘリックス構造を有する27アミノ酸残基のペプチドは、カルレティキュリン標的化シグナル-GFP遺伝子のC-末端に融合して発現ベクターpICH8600-C（図14）及びウイルス「プロ-ベクターシステム」（PCT/EP02/03476）の3'成分（pICH9666-C, 図14）を創製した。このペプチドはAPRX-タンパク質のペクチンへの結合を主として担うCa2+-ペクテート結合部位の3つのアルギニンを含有する。
【０１５５】
GFPタンパク質は、アグロ接種N. benthamiana植物から3つの異なる方法で単離した。すなわち、a）粗抽出液から、b）細胞間液体（IF）から、及びc）押しつぶし、Ca2+-含有緩衝液の存在下に洗浄した植物組織から、である。
【０１５６】
a）の場合は、GFP-タンパク質をCa2+の存在下に粗製抽出液の細胞壁分画に結合させた。遠心分離後、上清を除去すると、結合したGFP-タンパク質はEGTA緩衝液に溶解させることができた。b）の場合は、GFPを、EGTA-含有緩衝液を用いてアポプラストから溶出させた。押しつぶされた植物組織からのGFPの抽出も同じ緩衝液を使用した。さらに、SDS-PAGE及びウエスタン分析により、すべての3種の異なる精製操作における収率及び精製効率が比肩することが確認された。
【０１５７】
a）タンパク質発現精製ベクターpICH8600-C及びpICH9666-Cのクローニング
GFP-配列を構築体pICH5290（35Sprom-sGFP-NOSterm）からPCRによって増幅し、GFP-遺伝子のC-末端にインフレームに、Ca2+-ペクテート結合部位を融合させた。順行プライマー（5'-TTTTCC ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG CTGT-3'）はGFP-配列の5'末端にNcoI-部位を導入したが、逆行プライマー（5'-TTTT GGA TCC TAT TCT TGC GGG CCC TCG CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC-3'）はGFP-配列の最終コドンの後に付加的な24 bpのスペーサーを包含させ、ついでBamHI-部位を続けた。このPCR産物は、構築体pICH5290にサブクローニングし構築体pICH8155のNcoI/BamHI断片を発生させた（8アミノ酸残基の35Sprom-sGFPスペーサーを有するが、停止コドン-NOS転写終結シグナルはない）。Ca2+-ペクテート結合部位は構築体pICH 8155に以下のオリゴ：5'-cgggatccat tgttaaccgt cttggttctc gtgaaggaa ctttctttag acaatttcgt g-3'及び5'-tgctctagat tacctaatgt ttcccatctt aatcatagaa acacgaaatt gtctaaagaa agttccttc-3'を用いるアダプターにより導入した。このアダプターの突出末端はBamHI- 及びXbaI-消化部位に相当し、構築体pICH8155へのCa2+-ペクテート結合ドメインのサブクローニングに使用された。最終構築体pICH- 8600は、Cla1-Nco1断片（Borisjukら, 1999, Nat Biotechnol 17: 466- 468）として、Cla1-Nco1消化され、カルレティキュリンシグナルペプチド（CSP）のクローニングに使用された。NcoI/XbaI断片は3'-プロベクターpICH9666を生成するので、GFP-融合カセットも3'-プロベクターpICH9422にサブクローニングされた（図には示していない）。PICH9666はCla1-Nco1で消化され、ゲル精製されて、カルレティキュリンシグナルペプチドのCla1-Nco1断片にリゲートされた。最終構築体、pICH9666-Cは図14に示す。
【０１５８】
b）構築体pICH8600-C及びpICH9666-Cのアグロインフィルトレーション後、N. benthamianaにおけるGFP-融合タンパク質の発現
タバコ植物のアグロインフィルトレーションを、Yang及び共同研究者ら（Yangら, 2000, Plant J 22: 543-551）によって記載された改良プロトコールに従って実施した。Agrobacterium tumefaciens GV3101株を、50 mg/LのRipampicin、50 mg/Lのカルベンシリン及び100μMのアセトシリンゴンを補充したLBメジウム中28℃において、適当な構築体で形質転換した。一夜Agrobacterium細胞を培養して（5 mL）、遠心分離（10分, 4500 g）して集め、10 mMのMgSO4及び100μMのアセトシリンゴンを補充した10 mM MES（pH 5.5）緩衝液に再懸濁した。細菌懸濁液の最終OD600を0.8に調整した。数種の構築体を送達する場合は、様々な構築体のAgrobacterium懸濁液をインフィルトレーションの前に混合した。まだ無傷の植物に付着している葉をほぼ完全に広げたアグロインフィルトレーションを実施した。細菌懸濁液は5 mLのシリンジでインフィルトレートした。100μLの細菌懸濁液を各スポット（通常インフィルトレート領域は3〜4 cm2）にインフィルトレートした。単一のtabaccoの葉に管によって分離された8〜16のスポットを配列することができた。植物は、さらに22℃の温室条件下に16時間の明期で生育させた。
【０１５９】
構築体pICH9666-Cを相当する5'プロ-ベクターpICH4851ならびにインテグラーゼ構築体pICP1010とともに同時インフィルトレートした（図15参照）。attP及びattB部位間のインテグラーゼ仲介組換えの結果として、高レベルでGFPを発現するウイルス性ベクターが組み立てられた。PICP1010の代わりに、PhiC31リコンビナーゼを発現できる任意の他のベクターも使用できる。
【０１６０】
インフィルトレートされた植物材料からのGFP融合の精製は、3つの異なるアプローチを用いて実施した。
1）細胞壁マトリックスへの結合による精製
GFP-融合構築体を発現する葉材料を2 mM CaCl2, 20 mM HEPES pH 7.0, 0.1％ Triton-X 100及び5 mMのβ-メルカプトエタノールを含有する抽出緩衝液と共に磨砕した。サンプルを氷上で60分間インキュベートしたのち、4℃, 9500 gで5分間遠心分離した。上清を注意深く除去し、ペレットを2 mM EGTA及び0.1％Tween 20を含有する20 mMのHEPES pH 7.0に再懸濁し、GFP-融合タンパク質を溶解させた。GFP-含量を洗浄及び溶出緩衝液の上清中、ウエスタンブロット解析で解析した。
【０１６１】
2）アポプラストからの溶出による精製
葉材料を、50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 2 mM CaCl2, 2 mM EDTAでインフィルトレートした。分泌タンパク質は含有するが、GFPは含まない細胞間液体（IF）を低速遠心分離した（2000〜3000 g）。第二の緩衝液（50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 2 mM EDTA）で上記操作を反復した。第二の抽出緩衝液によって溶出したGFPウエスタンブロット解析に用いた。アポプラスト標的化タンパク質の抽出の様々なバージョンがいくつかの刊行物に見出される（Firekら, 1993, Plant Mol Biol 23: 861-870; Vossら, 1995, Molecular Breeding 1: 39-50; De Wildeら, 1996, Plant Science 114: 233-24; Kinaiら, 1995, Plant Cell 7: 677-688; Liuら, 1996, Plant Science 121: 123-131）。ここに記載された操作はCa2+-ペクテート結合部位との融合タンパク質の単離に好都合である。
【０１６２】
3）押しつぶした植物組織からの抽出による精製
2 mM CaCl2, 20 mM HEPES pH 7.0, 0.1％ Triton-X 100及び 5 mMのβ-メルカプトエタノールの存在下に、アグロインフィルトレーションの3日又は7日後（ウイルスプロベクターシステムの場合）、植物組織をローラーとサップ抽出機（Erich Pollahne, Hannover, Germany）の間で押しつぶした。残った植物組織を同じ緩衝液で1回濯ぎ、2 mM EGTA及び0.1％Tween 20を含有する20 mMのHEPES pH 7.0を使用して融合タンパク質を溶出した。GFP-含量を洗浄及び溶出緩衝液の上清において、ウエスタンブロット解析で解析した。
【０１６３】
例7
細胞毒性タンパク質を産生するためのCa2+-ペクテート結合部位の使用
NcoI（5'末端）及びBamHI（3'末端）制限部位により隣接されたEcoRIエンドヌクレアーゼをコードし、EcoRI cDNAの721 bp後方に挿入された植物スプライスサム-認識イントロンを含む合成遺伝子（ゲノム配列受入番号J 01675）を用いる。以下のイントロン配列（太字で示す）及びそれに隣接するEcoRIエンドヌクレアーゼ配列（イタリック）が使用された。すなわち、
2005501558.tif 000002
合成配列の940 bp NcoI-BamHI断片をpICH9666-Cの大NcoI-XbaI断片及びCa2+-ペクテート結合部位を含有する小BamHI-XbaI断片とリゲートし（図14）、プラスミドpICH9666-RIA（図16）を生じた。pICH9666-RIAの大ClaI-NcoIクレノウ- 処置断片との再レゲートは、pICH 9666-RIを生じ、この場合、EcoRIエンドヌクレアーゼはアポプラスト標的化シグナルペプチドを欠く（図16）。
【０１６４】
pICH9666-RIA又はpICH9666-RIを、5'プロ-ベクターpICH4851及びインテグラーゼ構築体pICH1010と一緒にアグロ送達する方法は例6に記載のように実施した。インテグラーゼ仲介部位特異的な組換えの結果、増幅ベクターが組み立てられ、アポプラストに標的化されたか（pICH9666-RIAについて）又はサイトソルに位置するか（pICH9666-RI）、のいずれかのEcoRI酵素を産生する。
【０１６５】
EcoRI（構築体pICH9666-RI）のサイトソル局在の場合におけるEcoRIの細胞毒性は3日後には明瞭になり、アグロインフィルトレーション後5日に、葉の組織はひどく傷害された。これに対して、酵素のアポプラスト標的化は、アグロインフィルトレートされた植物の葉をはるかに長時間（2週まで）の保存を可能にした。植物組織からの酵素の単離は例6（1.「細胞壁マトリックスに対する結合による精製」）に記載のようにして、アグロインフィルトレーションの3及び5日後に植物材料から実施した。活性単位での酵素濃度を、1.2 kb EcoRI DNA断片とともにpBS (KS+) を含有するEcoRI反応緩衝液20μLに様々な×10〜×104の希釈液1μLを加えることにより測定した。市販されているEcoRI酵素を濃度測定のために使用した。比較収率としては、酵素のアポプラスト標的化の場合に約50倍高かった。
【０１６６】
参考例
以下の参考例1〜3は、ウイルスベクターの構築及びGUSレポーター遺伝子のIRES要素を経由する発現を示す。さらなる詳細はWO 02/29068に見出される。
参考例1
tobamoウイルスベクター感染アブラナ科植物の構築
アブラナ科植物を全体的に感染できる、crucifer tobamoウイルス（crTMV）と呼ばれる既知のtobamoウイルスのビリオンを、モザイク症状を呈するOlearacia officinalis L. から単離した。CrTMVの宿主範囲試験の結果は表1に示す、
【０１６７】
プラスミド構築体
CrTMV cDNAはジデオキシヌクレオチド配列決定により特性が明らかにされた（Dorokhovら, 1994, FEBS Letters 350: 5-8）。完全長T7 RNAポリメラーゼプロモーターに基づく感染性crTMV cDNAクローンは、オリゴヌクレオチドcrTMV1-Kpn
2005501558.tif 000003
（上流）（式中、イタリックの太字はKpnI部位の配列であり、下線を施した小文字はT7 RNAポリメラーゼプロモーターのヌクレオチド配列であり、大文字はcrTMV cDNAの5'-末端由来である）、及びcrTMV2は
2005501558.tif 000004
（下流）（式中、イタリックの太字はNotI部位の配列であり、大文字はcrMTV cDNAの3’末端由来である）を用いるcrTMV RNAからのRT- PCR、及びpUC19とKpnI及びBamHI制限部位の間にクローニングすることにより得た（図12）。
【０１６８】
完全長SP6 RNAポリメラーゼプロモーターに基づく感染性crTMV cDNAクローンは、オリゴヌクレオチドcrTMV1-SP6
2005501558.tif 000005
（上流）（式中、イタリックの太字はKpnI部位の配列であり、下線を施した小文字はT7 RNAポリメラーゼプロモーターのヌクレオチド配列であり、大文字はcrMTV cDNAの5'-末端由来の配列である）；及び crtMV2-
2005501558.tif 000006
（下流）（式中、イタリックの太字はNotI部位の配列であり、大文字はcrTMV cDNAの3'-末端由来である）を用いるcrTMV RNAからのRT-PCR、及びKpnI及びBamHI制限部位の間、pUC19中へのクローニングにより得られた（図12）。
【０１６９】
完全長crTMV cDNAクローンはジデオキシヌクレオチド配列決定により特性が明らかにされた。CrTMV感染性転写体Nicotiana及びアブラナ（crucifer)種に感染する能力はNicotiana tabacum var. Samsun及びArabidopsis thalianaそれぞれにおける感染試験により確認された。
【０１７０】
参考例2
Nicotiana及びcrucifer植物におけるウイルスIRESを介するGUS遺伝子の発現のためのtobamoウイルスベクターの構築
一連のIRES-仲介発現ベクターT7/crTMV/GUSは次のように構築された。最初に、HindIII及びXbaI部位を、T7/crTMVベクター（図12）のSacII/NotI断片のCP遺伝子末端に、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により、2つの特異的プライマーを用いて挿入した。次に、Skulachevら（1999, Virology 263: 139-154）記載のIRESMP,75CR-GUS, IRESMP,75UI-GUS, IRESMP,228CR-GUS, IRESCP,148CR-GUS, IRESCP,148UI-GUS, PL-GUS cDNAを、T7/crTMVベクターのSacII/Not断片を含むHindIII及びXbaIに挿入して、SacI-IRES MP,75CR-GUS-NotI, SacII-IRESMP,75UI-GUS-NotI, SacII-IRESMP,228CR-GUS-NotI, SacII-IRESCP,148CR-GUS-NotI, SacII-IRESCP,148UI-GUS-NotI, SacII-PL-GUS-NotIのcDNAをそれぞれ得た。第三に、C7/crTMVベクターの SacII-NotI cDNA断片を SacI-IRESMP,75CR-GUS-NotI又は SacII-IRESMP,75UI-GUS-NotI又はSacII-IRESMP,228CR-GUS-NotI又はSacII-IRESCP,148CR-GUS-NotI又はSacII-IRESCP,148UI-GUS-NotI又は SacII-PL-GUS-NotI cDNAにより置換し、それぞれベクターT7crTMV/IRES MP,75CR-GUS（図13）、ベクターT7/crTMV/IRES MP,75UI-GUS（図13）、ベクターT7/crTMV/IRES MP,228CR-GUS（図13）、ベクターT7/crTMV/IRES CP,148CR-GUS（図13）、ベクターT7/crTMV/IRES CP,148UI-GUS（図13）及びベクターT7/crTMV/PL- GUS（図13）が得られた。
参考例3
【０１７１】
感染Nicotiana及びcrucifer植物のウイルスIRESを介するGUS遺伝子の発現
この例は、crTMVベースのベクター：T7/crTMV/IRES MP,75CR-GUS（図13）、 ベクターT7/crTMV/IRES MP,75UI-GUS（図13）、ベクター：T7/crTMV/IRES MP,228CR-GUS（図13）、ベクターT7/crTMV/IRES CP,148CR-GUS（図13）、ベクターT7/crTMV/IRES CP,148UI-GUS（図13）及びベクターT7/crTMV/PL-GUS（図13）に感染させた植物 Nicotiana benthamiana及びArabidopsis thalianaにおけるGUS遺伝子の、tobamoウイルスIRES仲介発現を証明するものである。
【０１７２】
インビトロ転写
プラスミドT7/crTMV/IRESMP,75CR-GUS（図13）、 ベクターT7/crTMV/IRES MP,75UI-GUS（図13）、ベクターT7/crTMV/IRES MP,228CR-GUS（図13）、ベクターT7/crTMV/IRES CP,148CR-GUS（図13）、ベクターT7/crTMV/IRES CP,148UI-GUS（図13）及びベクターT7/crTMV/PL-GUS（図13）は、NotIにより線状化した。組換えプラスミドはインビトロで、Dawsonら（1986, Proc Natl Acad Sci USA 83: 1832-1836）の記載のように転写した。RNAのアガロースゲル電気泳動では、それらは無傷であることが確認された。RNAの濃度はアガロースゲル電気泳動及びスペクトロフォトメトリーによって定量された。
【０１７３】
GUS検出
接種された葉をキャップされた完全長転写体によるトランスフェクション後、10〜14日で収集した。IRES活性を、以前に記載されたように（Jefferson, 1987, Plant Molecular Biology Research 5: 387-405）GUS発現の組織化学的検出によってモニターした。サンプルは比色分析GUS基質を用いてインフィルトレートしたが、その方法（De Block & Debrouwer, 1992, Plant J 2: 261-266）は反応の中間生成物の拡散を制限するように改良された。すなわち、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-グルクロニド（X-Gluc）600μg/mL；3 mMフェリシアン化カリウム；10 mM EDTAを含有する0.115 Mリン酸緩衝液, pH 7.0を加えた。37℃で一夜インキュベートしたのち、葉を70％エタノール中で脱色し、光顕微鏡により検査した。
【０１７４】
参考例4
スプライス可能なPVX-ベースのプロベクターの構築
2つの35S-PVXベースのプロベクターが構築された。プラスミドPVX-201をクローニングのための基本的構築体として使用した（Chapman Sら, 1992, Plant J 1992 Jul; 2 (4): 549-57）。このプラスミドは35Sプロモーター及びnosターミネーターに融合したpotatoウイルスX（PVX）ゲノム（Gene Bank受入番号NC 001455; AF172259）の完全長cDNAを含有している。CPサブゲノミックプロモーター領域は複製され、PVX-201における複製された領域の間に数個の新しいクローニング部位が挿入される。
【０１７５】
最初の工程では中間構築体pIC2518が得られた。このプラスミドはしたがって、XhoI部位から停止コドン後に導入されたHindIII部位を有するターミネーターまでCPのC-末端（62 bp）、エンハンスされたGFP（sGFP）遺伝子（開始コドンはNcoI部位に含まれる）及びCPのC-末端（62 nt）を含むPVXウイルスの3' 末端、3'-UTR及びSacI部位に続くポリ（A）配列を含有する（図18）。
【０１７６】
2005501558.tif 000007
【０１７７】
互いにアニーリングしたのち、相当するオリゴヌクレオチドが以下の二本鎖DNA断片として形成される。
2005501558.tif 000008
D1及びD2の場合、断片の5'-突出末端はClaI/SalI制限DNAに対し粘着性である。断片A1及びA2はHindIII-NcoI部位にリゲートさせることができる。
【０１７８】
上述のプラスミドPVX-201（図18）をClaI及びSalIで消化した。ついで、D1又はD2断片を消化したベクターにリゲートすると、構築体pIC 3033（D1の場合）又はpIC3053（D2の場合）が得られる。
【０１７９】
プラスミドpIC2518（図18）をHindIII及びNcoIで消化した。断片A1又はA2のリゲーションは、それぞれ構築体pIC3041（A1）又はpIC3068（A2）を産生した。
スプライシング可能なPXVプロベクターの2種の変異体が、pIC3041からのXhoI-SacI断片をpIC3033へ、pIC3068からのXhoI-SacI断片をpIC3053へクローニングすることにより得られた。得られたプラスミドはpIC3242（スプライシング部位D1+A1）及びpIC3258（スプライシング部位D2+A2）と命名された（図18）。
【０１８０】
参考例5
ミクロプロジェクタイル射撃
ミクロプロジェクタイル射撃はBiolistic PDS-1000/He Particle Delivery System（Bio-Rad）を用いて実施した。分離したN. benthamianaの葉を900〜1100 psi, マクロキャリヤー発射点から停止スクリーンまで15 mmの距離、停止スクリーンから標的組織までの距離60 mmで射撃に付した。破裂ディスクとマクロキャリヤーの発射点間距離は12 mmであった。浸透圧前処置の4時間後に細胞に射撃した。
【０１８１】
DNA-金コーティング操作（PEG/Mg）を次のように実施した。25μLの金の懸濁液（50%グリセロール中60 mg/mL）を10μLのプラスミドDNA （1μg/μLまで）とエッペンドルフチューブ中で混合し、ついで1.0 M MgCl2中40％PEG10μLを補充した。混合物を2分間ボルテックス攪拌し、ついで室温で30分間、攪拌しないでインキュベートした。遠心分離し（2000 rpm, 1分間）、ペレットを1 mLの70％エタノールで2回、及び99.5％のエタノール１mLで１回洗浄し、最後にペレットを30μLの99.5％エタノール中に分散した。エタノール中DNA-金懸濁液の中アリコート（6μL）をマクロキャリヤーディスクに負荷し、5〜10分間乾燥させた。
【０１８２】
プラスミドDNAの調製
プラスミドE. coli株DH10B及びJM109に形質転換し、maxi prepをLBメジウム中で生育させ、DNAをQiagenキットにより精製した。
【０１８３】
参考例6
プロベクタープラスミドDNAによる植物の機械的接種
完全に生育した葉、5〜7週齢のNicotiana benthamiana植物を機械的創傷により接種した。この目的では、10〜50μgのDNAを3×GKP緩衝液（50 mMグリシン, 30 mM K2HPO4, 3％セライト, 3％ベントナイト）と混合し、葉の上面で穏やかに傷つけた。
【０１８４】
参考例7
変換された（スプライスされた）PVX-ベースのプロベクターによる植物の葉におけるリポーター遺伝子の発現
完全に発育したNicotiana benthamianaの葉をプラスミドpIC3242及びpIC 3258により射撃した。これらそれぞれのプラスミド−完全型及びスプライス型から、植物細胞中で2種の異なるRNA転写体が合成できることが期待された（図17）。
【０１８５】
第二の転写体の存在は、プロベクターでトランスフェクトされた細胞中におけるGFP蛍光によって検出することができる。
【０１８６】
pIC3242により射撃した多数の葉細胞で強力なGFP蛍光が観察された（射撃の48時間後）。PIC5328の場合、GFPの発現は検出されなかった。したがって、この構築体は、この実験の陰性対照として有効である。この差は、構築体に用いた異なるドナー／アクセプター部位によるものである（参考例4参照）。PIC3258の場合は、Arabidopsis thalianaのプライス部位の一致を示す9-nt配列を使用した。PIC3242の場合には、ドナー及びアクセプター部位は、植物中で活性であることが試験され、証明されているNussaumeら, Mol gen genet 1955, 249: 91-101の記載のように設計された。
【０１８７】
いくつかの研究により（Fedorkinら, J Gen Virol 2001, 82 (Pt2): 499-58; Cruzら, Plant Cell 1998, 10 (4): 495-510）、PVXのCPはウイルスの細胞から細胞への移動を要求する。構築体pIC3242の場合には、CP遺伝子はRNAからスプライシングされなければならない。これは、転写体のスプライシングされた型（図18）CPを発現することができず、ウイルスに細胞から細胞への移動を提供することを意味する。しかしながら、pIC3242での数回の実験では、GFPを発現する単一の細胞のみならず、多重細胞遺伝子座（10〜1000細胞）が検出された。これはプロベクターの転写体のスプライシングが100％の効率で起こらないことを指示している。完全長RNAの分画はスプライシングされないで残り、したがって、転写体のこの型からCPが発現可能であり、一方、このRNA中ではGFP遺伝子はサイレントのままである（pIC3258の場合には、GFPの発現は検出されなかったため）。
【０１８８】
参考例8
Creリコンビナーゼを発現する遺伝子導入N. benthamiana植物の発生
pIC1321からのアクチン2プロモーター-LoxP-Cre Orf-Nosターミネーター断片を、Not1-ブラント-SacI断片として、二元ベクターpBIN19のSmaI及びSacI部位にサブクローニングし、構築体pIC1593（図29）を得た。
【０１８９】
プラスミドpIC1593をエレクトロポレーションによりAgrobacterium株AgI1に導入し、形質転換したAgrobacteriumをN.benthamianaの形質転換に用いた。１０の形質転換体からのDNAをPCRによる導入遺伝子の存在についての試験に使用した。PCRをカナマイシン形質転換マーカー又はCre遺伝子のためのプライマーを用いて実施した場合、すべての植物が陽性であることが見出された。
【０１９０】
参考例9
部位特異的組換えを用いるプロベクターからの機能性ベクターの発生
a）システムの一般的記述
記載されたシステムは2つのコア型crTMVベースのベクターから構成され、これはLoxP-組換え部位を有する（図23）。
【０１９１】
i）ベクター型：ポリメラーゼ-MP-LoxP：このベクターはCrTMVのRdRP及び移動タンパク質（MP）をコードし、これはウイルスが細胞から細胞へと移動することを可能にするが、さらに全体的な移動を可能にするものではない。ウイルスの転写はArabidopsis-アクチン2プロモーターにより制御された。
【０１９２】
ii）ベクター型：LoxP-興味ある遺伝子-3'NTR-nos-ターミネーター（図23 a〜c参照）：このクラスのベクターはレポーター遺伝子（sGFP又はGUS）及び制御要素（nos：ノパリンシンターゼターミネーター；3'NTR：非翻訳領域、CrTMVのpseudoknots及びtRNA様構造）をコードする。コートタンパク質（CP；図23 b参照）の発現は、ベクターの宿主細胞内における全体的な拡散を可能にする。
【０１９３】
iii）ベクター型：ポリメラーゼ-MP-attP：attP-組換え部位についてはi）参照。
iv）ベクター型：attB-興味ある遺伝子-3'NTR-nos-ターミネーター（図30a〜c参照）：attB-組換え部位についてはii）参照。
【０１９４】
Cre-リコンビナーゼ又はインテグラーゼによって触媒される組換え後（Cre又はインテグラーゼコードウイルス構築体を介して）、レポーター遺伝子を効率的に発現可能で、細胞から細胞へ（図23A〜C, 30A〜C）又は全体的に（図23B）移動できる機能性単位（レプリコン）を形成する。
【０１９５】
b）プラスミドの構築
A．ベクター型ポリメラーゼ-MP-LoxP（図24）のクローニング
MPのEcoRI-XhoI断片をプラスミドpIC3342（図20）から採取し、プラスミドpIC1212にクローン化した。これは2つのLoxP-部位を逆方向に有する。プラスミドpIC3342のMP遺伝子はターミネーターコドンを含有し、これは天然の停止コドンの前25AAに導入された。得られた生成物pIC3431中には、LoxP-部位の次にMP遺伝子の部分を含有する断片が位置する。両要素はEcoRI-SacI制限部位を介して単離される。SacI制限部位をブラント末端化したのち、断片を、NP遺伝子中に単一のEcoRI制限部位を含有するプラスミドpIC3301のベクター含有部分にクローン化した。NotI（ブラント化）を第二の制限部位として選択した。得られたリゲーション産物（pIC3461）では、CP-遺伝子、IRES-配列, sGFP及びpIC3301の3'非翻訳領域のための遺伝子がLoxPによって置換される（図24）。
【０１９６】
B．LoxP-レポーター遺伝子-3’NTR-nos-ターミネーターベクターのクローニング
a）構築体LoxP-sGFP-3'NTR-nos（図23a）
Ω-リーダー配列の次にLoxP-部位をもつXhoI-NcoI-断片をベクターpIC2744から採取した。配列をレポーター遺伝子の隣に配置するためsGFP及び3'NTR配列遺伝子の隣の次の適当な制限部位を含有するプラスミドpIC1721に、その断片をクローン化した。その断片によりIRES-配列を置換させてプラスミドpIC3421を得た。nos-ターミネーター配列を付加するためには、プラスミドpIC3421をKpnI及びNotIで切断した。その断片を、プラスミドpIC3232のベクター含有部分に導入すると、最終構築体pIC3441が得られた（図25及び23a参照）。
【０１９７】
b）構築体LoxP-CS-sGFP-3'NTR-nos（図23b）
出発ベクターとして上述のプラスミドpIC3342及びpIC1212を使用した。CP及びsGFPの遺伝子を含有するpIC3342のPstI-SacI断片をpIC 1212中にクローン化した。その結果、産物pIC3451中では、LoxP-部位はCP及びsGFPの隣に配置される。nos-ターミネーター配列を付加するために、a）の場合と類似のアプローチを使用した。すなわち、pIC3451のEcoRI-NotI-断片をpIC3232のベクター含有部分に導入してプラスミドPIC3491を得た（図26参照）。
【０１９８】
c）構築体LoxP-CP-GUS-3'NTR-nos（図23c）
プラスミドpIC751はpIC1721に類似し、sGFPの代わりにGUSレポーター遺伝子を有する。NcoI及びNotIで切断すると、GUS遺伝子及び3'-非翻訳領域が、pIC3441に直接クローン化可能で、最終構築体pIC3521が得られる（図27）。
【０１９９】
参考例10
変換した（組換え）CrTMVベースのプロベクターによる、植物の葉における単一レポーター遺伝子の発現
分離したN. benthamianaの葉を、3種のプラスミド：pIC3441（LoxP-GFP, 図25）、pIC3461（Actin2プロモーターCrTMV RdRp-MP-LoxP, 図24）及びpIC 2721（hbtプロモーターの制御下にCre-リコンビナーゼ）の混合物によって、粒子射撃に付した。GFP蛍光が7つの多重細胞遺伝子座で、射撃の38時間後に検出された。それ以後の日には、蛍光及び感染領域のサイズに強度な上昇が観察された（射撃を受けた葉は、湿ったろ紙上25℃でインキュベ−トした）。pIC3461を用いないで、pIC3441及びpIC2721で射撃を行った対照の葉ではGFP蛍光は観察されなかった。
【０２００】
参考例11
変換した（組換え）CrTMVベースのプロベクターによる、植物の葉における数種の遺伝子の発現
分離したN. benthamianaの葉を数種のプラスミドの混合物で射撃に付した：
a）pIC3441（LoxP-GFP, 図25）、pIC3461（Actin2プロモーターCrTMV RdRp-MP-LoxP, 図24）及びpIC 2721（hbtプロモーターの制御下にCre-リコンビナーゼ）、pIC3521（LoxP-GUS, 図27）、
b）pIC3441（LoxP-GFP, 図25）、pIC3461（Actin2プロモーターCrTMV RdRp-MP-LoxP, 図24）及びpIC 2721（hbtプロモーターの制御下にCre-リコンビナーゼ）、pIC3491（LoxP-CP, 図26）。
両レポーター遺伝子、GFP及びGUSはa）の射撃に付した葉の場合いずれも強力に発現した。b）の場合には、ウイルス粒子の形成及びウイルスの全体的移動が起こる。
【０２０１】
参考例12
スプライシング可能なCrTMV-ベースのプロベクターの構築
CrTMVウイルスに基づくスプライシング可能なプロベクターは、PVX-ベースのプロベクターに比較してある種の利点がある。図19に記載のシステムはウイルスによるレポーター遺伝子発現システムの創製を可能にするものであるが感染した葉で完全に機能を発揮する。PVXに反して、CrTMVのコートタンパク質はウイルスの細胞から細胞への移動を要求せず、したがってスプライシングは感染した葉におけるウイルスの拡散に影響しない。
【０２０２】
A．中間構築体pIC3312のクローニング
PCR断片は、クローン化されたCrTMVのcDNA及び以下のプライマーを用いて得られた：
MPERI+（EcoRI部位を含むMPの中間領域−CrTMVゲノムにおける位置5455に相当する）：GTGGTTGACGAATTCGTC．
【０２０３】
MP−（天然の停止コドンの上流17 aa 下流ClaIとXhoI部位を有する人工的ターミネーターを導入するMPのC末端に相補性。このプライマーはまた、MPにおけるアミノ酸に変化なく、CP遺伝子の天然開始コドンを除去するCP ATGのACGへの点突然変異を含有する）：GGTCTCGAGTTATCGATTATTCGGG- TTTGTAATGTTGTAAGACGTTTTCTTCTTTC．
【０２０４】
他のPCR断片は、同じ鋳型及び以下のプライマーを用いても得られた：CP+（CP遺伝子の始めに相当し、XhoI及びPstI部位がATGの上流に導入されている）：TAACTCGAGACCTGCAGCATGTCTTACAACATTACAAACC- CGAATCAG．
CP−（CP遺伝子におけるNcoI部位を除去するために、単一ヌクレオチド置換をCPのC末端に相補性。このプライマーはまた、CP遺伝子の下流にHindIII及びNcoI制限部位を導入する）：CTACTCCATGGTCAAGCTTAAGTAGC-AGCAGCAGTAGTCCACGGCACC．
【０２０５】
最初にPCR断片をEcoRI及びXhoI酵素で消化した。第二に、XhoI及びNcoIで消化した断片を一緒にベクターpIC1721（図20）にEcoRI及びNcoI部位にリゲートしてプラスミドpIC3151を得た（図20）。ついで、pIC3151をKpnI-EcoRVで消化し、KpnI部位をT4 DNAポリメラーゼでブラント末端化し、切断されたプラスミドは自己リゲートしてKpnI及びEcoRVの間の部位が除去された。得られたプラスミドはpIC3312と命名された（図20）。
【０２０６】
B．スプライシング可能なプロベクター及び対照構築物pIC3401のクローニング
ドナー及びアクセプタースプライシング部位を含有する参考例4に記載のdsDMA断片を、ドナーの場合はClaI及びXhoI部位を用い、アクセプタースプライシング部位の場合はHindIII及びNcoIを用いてpIC3312にクローニングした（図21）。得られたプラスミドはpIC3378（ドナー部位の場合）及びpIC3382（アクセプター部位の場合）と命名した（図22）。陰性の対照構築体pIC3401を得るために、pIC3382からの EcoRI-NotI断片をpIC3301にクローニングした（図22）。
【０２０７】
最終構築体pIC3393は、pIC3378からのEcoRI-PstI断片とpIC3382からのPstI-NotI断片、及びベクターとしてpIC3301消化EcoRI及びNotIを用いる2-断片クローニングにより得られた（図22）。
【０２０８】
参考例13
変換されたCrTMVに基づくスプライシング可能なプロベクターによる植物の葉におけるレポーター遺伝子の発現
分離したN. benthamianaの葉をpIC3393及びpIC3401での粒子射撃に付した。pIC3393の場合、射撃の48時間後に、数種の多重細胞遺伝子座でGFP蛍光が検出された。対照構築体pIC3401での射撃に付された葉にはGFPの蛍光は出現しなかった。
【０２０９】
参考例14
部位特異的att/インテグラーゼベースの組換えシステムにより、2つのCrTMVベースのプロベクターから組み立てられたウイルスベクターからの興味ある一つの遺伝子の発現
a）システムの一般的記述
記載のシステムは、attB又はattP組換え部位を有する2つのコア型CrTMVベースのベクターから構成される（図30）。
i）ベクター型：ポリメラーゼ-MP-attP：このベクターはCrTMVのRdRP及び移動タンパク質（MP）をコードし、これはウイルスが細胞から細胞へと移動することを可能にするが、さらに全体的な移動を可能にするものではない。ウイルスの転写はArabidopsis-アクチン2プロモーターにより制御される。
【０２１０】
ii）ベクター型：attB-興味ある遺伝子-3'NTR-nos-ターミネーター（図30 a〜b参照）：このクラスのベクターはレポーター遺伝子（sGFP又はGUS）及び制御要素（nos：ノパリンシンターゼターミネーター；3'NTR：非翻訳領域、CrTMVのpseudoknots及びtRNA様構造）をコードする。
【０２１１】
iii）ベクター型：attB-ユビキチン-興味ある遺伝子-3'NTR-nos-ターミネーター（図30c参照）。植物から単離することができる所定のタンパク質を得るために、ユビキチン切断シグナル配列をattB-組換え部位及び興味ある遺伝子（たとえば、GFP、インターフェロンa2B、インスリン又はソマトポイエチン）の間に導入した。このシステムを使用することにより、プロリンを除く任意のアミノ酸を合成されるタンパク質の最初のアミノ酸として選択することが可能である。
【０２１２】
インテグラーゼ酵素によって触媒される組換え（インテグラーゼをコードするウイルス構築体の共感染による）ののち、興味ある遺伝子を発現することができ、細胞から細胞への移動が可能な機能性単位（レプリコン）が形成される（図23A〜C）。
【０２１３】
b）プラスミドの構築
A）ベクター型：ポリメラーゼ-MP-attP（図31）のクローニング
KpnI-XhoI断片をプラスミドpIC3461から採取した（図31）。XhoI制限部位をブラント末端化したのち、その断片を、反対方向の2つのattB部位、左及び右-T-DNAボーダー（LB及びRB）ならびに植物形質転換マーカーとしてカナマイシン発現カセットを有する二元ベクターpIC3944にクローン化した。CreLox由来のシステム類似のクローンのように、得られたプラスミドpICH4851は、MP遺伝子とともに天然の停止コドンの25 AA前に導入されたのターミネーターコドンを有する。
【０２１４】
B．ベクター型：attB-興味ある遺伝子-3’NTR-nos-ターミネーターのクローニング（図27〜35）
a）構築体attB-sGFP-3'NTR-nos
プライマーの組み合わせA）
attB Xho（+）：ATCACTCGAGCTCGAAGCCGCGGTGCGGGT：attBの5'部分に相補性であり、5'-末端にXhoI-制限部位を有する。
attBΩ（−）：GGTAATTGTTGTAAAAATACGATGGGTGAAGGTGGAGTACG：
プライマーの3'-部分はattB-配列の3'-領域に相当し、5'-部分はΩ要素の5'-部分に相補性の20ヌクレオチドを含有する。
プライマーの組み合わせAは、完全attB-配列、20 NtのΩリーダー配列及び5'末端におけるXhoI-制限部位からなるPCR産物を創製するために、attB含有鋳型で使用した。
【０２１５】
プライマーの組み合わせB）
attBΩ（+）：CGTACTCCACCTCACCCATCGTATTTTTACAACAATTACC：プライマーの3'-部分はΩ配列の5'-領域に相当し、5'-部分はattB-要素の5'-部分に相補性の20ヌクレオチドを含有する。
ΩNotI（−）：CATGCCATGGGTAATTGTAAATAGTAATTGTAATGTT
Ω要素の3'-部分に相補性であり、5'-末端にNcoI-制限部位を有する。
【０２１６】
プライマーの組み合わせBは、Ωリーダーの完全配列、attB-組換え部位の20 Nt及び3'末端におけるNotI-制限部位からなるPCR産物を創製するために、Ω配列含有鋳型上で使用した。
【０２１７】
プライマーの組み合わせA）及びB）からPCR産物が得られたのち、単離されたオリゴヌクレオチドを、プライマーattB, XhoI（+）及びΩNotI（−）を用いるPCR反応のための鋳型として一緒に使用した。最終のPCR産物、attB-組換え及びΩリーダー配列の融合体が合成された。この断片は、その末端にXhoI及びNcoI部位を含む。PCR産物を単離し、消化してプラスミドpICH3441のXhoI- 及びNcoI部位にクローン化して、LoxP-Ω-融合体に置換した。その中間体プラスミドをKpnI及びHindIIIで処理した。この断片を二元ベクターBV10の相当する部位に挿入することによりattB-sGFP-3'NTR- nos ベクターを得ることができた。これはAgrobacteriumに形質転換することができる（pICH5151, 図32参照）。
【０２１８】
レポーター遺伝子GUSと類似のプロベクターをクローニングするために類似のアプローチが使用された。上述のPCR断片は、GUS含有プラスミドpICH3521のXhoI- 及びNcoI部位にクローン化し、プラスミドpICH4601が得られた。最後に、プラスミドpICH4061のKpnI-HindIII-断片を二元ベクターBV10にリゲートし、安定なAgrobacterium形質転換が可能な最終ベクターpICH5161が得られた（pICH5161は図33参照）。
【０２１９】
C）attB-ユビキチン-インターフェロン-含有3'-プロベクターの構築
ユビキチン-配列及びインターフェロンα2Bの融合体をattB-3'-プロベクターにクローン化するために、両配列を融合体として合成し、pUC19中にクローン化した（プラスミドpUC5760が得られた）。このベクターをNcoI及びPstIで消化し、得られた断片をプラスミドpICH5781の相当する制限部位にリゲートした。得られたプラスミドpICH5951は、attB組換え部位、ユビキチン-インターフェロン融合体、3'非翻訳領域、nosプロモーター及びカナマイシン発現カセットを含有する。上記のすべての配列はT-DNAボーダーにより隣接している（LB及びRB、図34参照）。
【０２２０】
D）Ω-配列を、翻訳エンハンサーとして有効な、異なるIRES-要素によって置換するため、ClaI/ApaI-断片をプラスミドpIC1701（IRESmp75(UI)を含む）又はpICH1731（IRESmp75(cr)を含む）からそれぞれ採取した。その断片をプラスミドpICH5939（プラスミドpICH5781に類似するが、転写開始コドンとしてのATG-配列とともにNotI制限部位をもたない）にクローン化した。最後の二元ベクター（pICH6871, pICH6891）では、attB-組換え部位は75 bpのIRES-配列（6781：U1-起源、6891：CrTMV-起源）、sGFPレポーター遺伝子ならびに制御要素3'NTR及びnosに隣接して配置される。
【０２２１】
E）ベクター型ポリメラーゼ-MP-LoxPの二元ベクターへのクローニング
LoxP-プロベクターを有するポリメラーゼ-MPを二元ベクターにクローニングするために、KpnI/XhoI及びXhoI/HindIII断片を一緒に、HindIII及びKpnIで消化したベクターpICBV10中にリゲートした。得られたプラスミドpICH4371はAgrobacterium中に安定に形質転換できる（図36）。
【０２２２】
F）ベクター型Lox-興味ある遺伝子-3'NTR-nos-ターミネーターの二元ベクターへのクローニング
LoxP-レポーター遺伝子プロベクターを二元ベクターにクローニングする際にもE）の場合と同様なクローニング戦略が用いられた。プラスミドpICH3441を酵素KpnI及びHindIIIで消化した。得られた断片をpICBV10の相当する部位に挿入すると、二元プラスミドpICH4461が得られた（図37参照）。
【０２２３】
参考例15
N. benthamiana及びN. tabacum植物の葉へのAgrobacterium tumefaciensの懸濁液のインフィルトレーションによるウイルスベクター構築体の送達
Cre/Lox及びインテグラーゼ/att-システムのすべてのプロベクターは、安定にAgrobacteria中に形質転換できる二元ベクターにクローン化した。したがって、記載された技術に代わるDNA-送達方法が利用できる。
【０２２４】
きわめて簡単な送達方法は、無傷な葉へのAgrobacterium懸濁液のインフィルトレーションである。このいわゆるアグロフィルトレーション法、異種遺伝子の発現及び植物における遺伝子スプライスングを解析するために開発されたものである（Kapliaら, 1997, Plant Science 122: 101-108; Schobら, 1997, Mol Gen Genet 256: 581-588）。トランスジェニックタバコ植物のアグロフィルトレーションはYangら, 2000, The Plant Journal 22 (6): 543-551の記載した改良プロトコールに従い実施された。Agrobacterium tumefaciens株GV3101は個々の構築体（pICH4851, pICH5151, pICH1010, 図15）で形質転換し、リファンピシン50 mg/L、カルベンシリン50 mg/L及び100μMのアセトシリンゴンを補充したLBメジウム中28℃で生育させた。一夜培養したAgrobacterium細胞を遠心分離（10分, 4500 g）により集め、10 mM MgSO4及び100μMのアセトシリンゴンを補充した10 mMのMES緩衝液（pH 5.5）中に再懸濁した。細菌の懸濁液を最終のOD6000.8に調整した。数種の構築体を送達する場合には、様々な構築体のAgrobacteriaの等量をインフィルトレーション前に混合した。
【０２２５】
アグロフィルトレーションは、無傷の植物に依然として付着しているほぼ完全に広がった葉に実施した。細菌の懸濁液を5 mLのシリンジを用いてインフィルトレートした。各スポット（通常、インフィルトレートされた領域に3〜4 cm2）に100μLの細菌懸濁液をインフィルトレートし、管によって分離された8〜16個のスポットが単一のtabaccoの葉に配置された。インフィルトレーション後、植物はさらに、22℃の温室条件下に16時間生育させた。
【０２２６】
構築体でインフィルトレートしたN. benthamiana及びN. tabacumは、インフィルトレーションの8〜12日後に強力なGFP-発現のセクターの膨張を示す。その発現は、インフィルトレートされた葉についてUV-光下に直接検出できた。対照（インテグラーゼ-クローンを含まないプロベクターの組み合わせ）の場合には、GFPは検出できなかった。
【０２２７】
参考例16
Creリコンビナーゼ（pICH1754）を発現するトランスジェニックタバコ植物の葉へのAgrobacterium tumefaciens懸濁液のインフィルトレーションによるウイルスプロベクターの送達
トランスジェニックタバコ植物の葉（形質転換された構築体：pICH  1754, 種Nicotina tobacum）を構築体pICH4371及びpICH4461は、インフィルトレーション後16日に強力なGFP-発現のセクターの生育を示しこれは顕微鏡なしでも、無傷の植物でUV光下に観察された。同じAgrobacteria懸濁液ミックスでインフィルトレートした野生型の葉ではGFPの発現は認められなかった。
【０２２８】
参考例17
ウイルス起源のIRES配列（CrTMV又はU1からのIRESmp75）の翻訳エンハンサー配列としての使用
プロモーターと下流に位置する遺伝子の間のatt-又はLoxPの存在は翻訳の効率を限定する。したがって、大部分の場合、プロベクターシステムにおけるレポーター遺伝子発現を適当なレベルに到達させるために翻訳の増強要素が使用される。ウイルスIRES配列、IRESmp75（UI）又はIRESmp75（cr）はそれぞれ、attB組換え部位とGFPの間にレポーター遺伝子の発現の明らかな増大が認められた。一方、翻訳エンハンサーをもたないGFP-含有プロベクターでインフィルトレートされた植物では10日後にもGFPの発現はほとんど検出されず、上記IRES-配列の使用はGFPを発現させ、それは5日後には顕微鏡なしでUV光下に検出できる。IRESmp75ベースの翻訳エンハンサー活性niよって提供される興味ある遺伝子の発現レベルは「Ω」の翻訳エンハンサーによって提供されるレベルに比較して同程度か、又は高くさえある。
【図面の簡単な説明】
【０２２９】
【図１】本発明による、植物細胞における組換えタンパク質製造の一般的スキーム。  A−様々な方法による植物細胞への導入遺伝子の送達（ウイルスベクター−RNA, DNAウイルス；安定な核又はプラスチド形質転換；一時的なAgrobacterium-仲介発現−アグロインフィルトレーション）；  B−組換えタンパク質合成及び細胞壁への結合；  C−サイトゾルの押しつぶしによる組換えタンパク質用植物組織の濃縮；  D−植物組織からの組換えタンパク質の分離
【図２】完全なタバコペクチンメチルエステラーゼ（PME）遺伝子のcDNA配列を示す。翻訳開始及び停止コドンは太字で示す。
【図３】タバコ（受入番号AJ401158）、トマト（受入番号U49330）及びオレンジ（受入番号U82976）からのPME遺伝子の、推定アミノ酸配列のアラインメント。推定アミノ酸配列のアラインメントはGenebeeプログラムパッケージを用いて行われた。矢印はプロセッシングされたPMEタンパク質のN-末端を指示。膜貫通ヘリックス（黒四角）及びPEMシグネチャー1及び2は四角で囲む。
【図４】PME-GFP融合の様々なバージョンについてのクローニングスキーム。  （A）ベクターpIC2452（完全長PME-GFP）及びpIC2462（成熟PME）のクローニングスキーム；  （B）ベクターpIC2472（GFP-完全長PME）及びpIC2482（GFP-成熟PME）のクローニングスキーム。
【図５】4種のGFP融合とPME遺伝子のインビトロRRL（ウサギ網状赤血球分解物）の翻訳を示す。レーン1：pIC2482, レーン2：pIC2452, レーン3：pIC 2472, レーン4：pIC2462。
【図６】一時的発現実験のための植物発現カセットにおける様々なGFP-PME融合のクローニングスキーム。
【図７】35Sプロモーターの制御下に完全長PME-GFPによる射撃後、細胞壁に標的化されたGFP（明るい領域）を発現するN. benthamiana細胞。
【図８】flPME-GFP融合体を運搬する二元性ベクターのT-DNA領域。
【図９】NtTLPR-GFP融合体を運搬する二元性ベクターのT-DNA領域。
【図１０】NtTLPRubq-GFP融合体を運搬する二元性ベクターのT-DNA領域。
【図１１】NtTLPR-GFP融合体を運搬するcrTMVベクター。
【図１２】ベクターT7/crTMV及びSP6/crTMV。
【図１３】ベクターT7/crTMV/IRESMP,75CR-GUS, T7/crTMV/IRESMP,75UI-GUS, T7/cr TMV/IRESMP,228CR-GUS, T7/crTMV/IRESCP,148CR-GUS, Y7/crTMV/SPA- CERCP,148 UI-GUS及びT7/crTMV/PL-GUS。
【図１４】ベクターpICH8600-C及びpICH9666-Cを示す。IRESmp75CRは、crucifer感染tobamoウイルスの移動タンパク質におけるリボゾーム挿入部位要素：詳細はWO 02/29068参照。
【図１５】ウイルスプロベクターシステムの5'-末端を提供するT-DNAベースのベクターpICH4851ならびにattP（pICH4851）及びattB（pICH9666-C, 図14）部位の間の組換えを仲介する部位特異的インテグラーゼPhiC31を提供するpICP 1010。これらのベクターのクローニングについてはPCT/EP02/ 03476及び図17に記載。
【図１６】制限エンドヌクレアーゼEcoRIを発現させるために設計されたベクターpICH9666-RIA及びpICH9666RI。
【図１７】はPVXベースの前駆体ベクターの構造、完全形式の転写体を与えるその転写（pIC3242から）による発生及びそのスプライシング生成物を示す。発現は転写体（前駆体ベクター及びレプリコン）ならびにスプライスされた転写体（レプリコン）から生じ得る。
【図１８】PVXベースの前駆体ベクターの塩基構造及びcDNAクローニングを用いるクローニング戦略。
【図１９】2つの遺伝子（CP及びGFP）の、CrTMVベースのスプライシング可能な前駆体ベクター（プロベクター）を用いる発現の一般的スキーム。
【図２０】中間構築体pIC3342のクローニング戦略。
【図２１】中間構築体pIC3378及びpIC3382のクローニング戦略。
【図２２】プラスミドpIC3393のクローニングの最終戦略。
【図２３】CrTMVベースの前駆体ベクター（a〜c及び上部に示すベクター）を介する数種の遺伝子の発現の一般的スキーム及び酵素Creリコンビナーゼにより触媒されるLoxP-部位における部位特異的組換えによるレプリコンの発生（A〜C）。
【図２４】pIC3461構築体−組換えシステムにおける一次成分、のクローニングスキーム。
【図２５】pIC3441構築体−組換えシステムにおける二次成分の一つ、のクローニングスキーム。
【図２６】pIC3491構築体−組換えシステムにおける二次成分の一つ、のクローニングスキーム。
【図２７】pIC3521構築体−組換えシステムにおける二次成分の一つ、のクローニングスキーム。
【図２８】非伝染性ウイルスベクターによる導入遺伝子発現の主要なスキームを示す。
【図２９】Creリコンビナーゼ遺伝子をN. benthamianaのゲノムに導入するために使用したプラスミドpIC1593の構造。
【図３０】CrTMVベースの前駆体ベクター（a〜c及び上部に示すベクター）を介する数種の遺伝子の発現の一般的スキーム及び部位特異的組換えのために、インテグラーゼ／att-システムを用いるレプリコンの発生（A〜C）を記載する。前駆体ベクターは、T-DNA-ボーダーを有する二元性ベクター中にクローン化する（LB及びRB）。
【図３１】pICH4851構築体−組換えシステムにおける二次成分の一つ、のクローニングスキーム。
【図３２】pICH5151構築体−組換えシステムにおける二次成分の一つ、のクローニングスキーム。
【図３３】pICH5161構築体−組換えシステムにおける二次成分の一つ、のクローニングスキーム。
【図３４】pICH5951構築体−組換えシステムにおける二次成分の一つ、のクローニングスキーム。
【図３５】pICH6871及びpICH6891構築体−組換えシステムにおける二次成分の二つ、のクローニングスキーム。
【図３６】pICH4371構築体−組換えシステムにおける二次成分の一つ、のクローニングスキーム。
【図３７】pICH4461構築体−組換えシステムにおける二次成分の一つ、のクローニングスキーム。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図６】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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