(57)【要約】ポリポディウム抽出物の新規な治療用途。Ｐｏｌｙｐｏｄａｃｅａ属抽出物の新しい用途を、線維性の病状、例えば、強皮症、肺線維症、アテローム性動脈硬化症、骨髄線維症、肝臓線維症、膵臓線維症、腎臓線維症、心臓線維症、デュピュイトラン病および詳細には、ペイロニー病の処置について記載する；この線維性の病状は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）過剰発現によって、およびトランスフォーミング成長因子（TFG-β）の過剰発現によって生じる。インビトロにおける細胞外マトリックス阻害；ならびにポリポディウム抽出物投与後の、ペイロニー病に罹患している患者における陰茎白膜の減少およびプラークの減少が開示されている。好ましい形態では、ポリポディウム抽出物は、Ｐｏｌｙｐｏｄｉｕｍ  ｌｅｕｃｏｔｏｍｏｓの地下茎および抽出物から極性溶媒を用いて得られる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
強皮症、肺線維症、アテローム性動脈硬化症、骨髄線維症、腎臓線維症、心臓線維症、デュピュイトラン病、ペイロニー病のような線維性疾患の処置のための薬学的組成物の製造のためのポリポディウム抽出物の使用。
【請求項２】
前記抽出物がトランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）発現を低下させるという点で特徴付けられる、請求項１に記載のポリポディウム抽出物の使用。
【請求項３】
前記抽出物が少なくとも、ペイロニー病に罹患している患者において、陰茎の湾曲を軽減するか、陰茎のプラークを軽減するか、性交時疼痛を軽減するかまたは心理学的な改善をもたらすという点で特徴付けられる、請求項１〜２のいずれかに記載のポリポディウム抽出物の使用。
【請求項４】
前記薬学的組成物が、２０より大きい誘電定数を有する溶媒を用いる抽出によって獲得可能であるポリポディウム抽出物を含む、請求項１〜３のいずれかに記載のポリポディウム抽出物の使用。
【請求項５】
前記薬学的組成物が、水溶性化合物を溶解する方法を用いる抽出によって獲得可能である抽出物を含む、請求項４に記載のポリポディウム抽出物の使用。
【請求項６】
前記抽出物が地下茎から得られる、請求項１〜５のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
前記抽出物がＰｏｌｙｐｏｄｉｕｍ  ｌｅｕｃｏｔｏｍｏｓ（Ｐｏｉｒｅｔ）から得られる、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記抽出物が、少なくとも乳酸、フマル酸、キナ酸、クエン酸またはリンゴ酸を含むという点で特徴付けられる、請求項１〜７のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
前記薬学的組成物が経口投与されるという点で特徴付けられる、請求項１〜８のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、詳細には、線維化した状態の処置のための、ポリポディウム（Ｐｏｌｙｐｏｄｉｕｍ）抽出物の新規な治療剤を記載する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
組織の線維症は慢性の病変であり、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）、主にコラーゲンおよびフィブロネクチンの過剰な発現、ならびに線維芽細胞の増殖によって特徴付けられる。
【０００３】
近年、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）は、全ての線維性の状態に関与しており、そして（ＴＧＦ−β）は、疾患と独立して、ＥＣＭタンパク質発現を誘導することが発見されている。例えば、強皮症、肝臓線維症、骨髄線維症、心臓線維症、肺線維症、アテローム性動脈硬化症、膵臓線維症、腎臓線維症、デュピュイトラン病またはペイロニー病を、線維性障害として挙げることができる。
【０００４】
ペイロニー病に関して、その歴史、病因論および疫学は未知である。遺伝的要因、外傷的要因、動脈性高血圧および／または特発性の要因を、ペイロニー病における病因的な要因として考えることができる。
【０００５】
臨床的に、ペイロニー病患者は、この疾患の初期段階で、疼痛性の瘢痕を生じる、陰茎の白膜における線維の形成をみとめる。勃起の間のプラークが陰茎の湾曲を生じ、これが進行した段階では、性行為を困難にするかまたは妨げる。特別な場合には、臨床的症状として、勃起の硬さの消失を伴う。
【０００６】
他の線維性疾患と同様、（ＴＧＦ−β）は、ペイロニー病に関与しており、そしてこのタンパク質はペイロニー病患者において増大するということが報告されている。さらに、ペイロニー病は常に、他の線維症、主にはデュプュイトラン病またはパジェット病を伴う。
【０００７】
線維性疾患についての新しい処置の検索は、トランスフォーミング成長因子（ＴＦＧ−β）を阻害し得る産物に集中していたが、このタンパク質は、ＥＣＭタンパク質合成を低下させる。しかし、インビトロ研究におけるＴＦＧ−β減少と、動物モデルにおけるＴＦＧ−β減少（この結果は、臨床的改善またはプラークにおけるコラーゲンの減少に関してインビボで得られた）との間には明確な相関はない。
【０００８】
Ｅ１−Ｓａｋｋａら（Ｊ．Ｕｒｏ．１９９９  Ｊｕｎ；１６１（１６）：１９８０〜３）は、ラットの陰茎へのＴＧＦ−βの注射によってペイロニー病を発症したラットにおいて、コルヒチンがＴＦＧ−β発現を減少するということを教示している。
【０００９】
しかし、Ｒｅｉｎｈａｒｔら（Ｄｔｓｃｈ  Ｚ  Ｖｅｒｄａｕ  Ｓｔｏｆｆｗｅｃｈｓｅｌｋｒ  １９８６；４６（５）：２５７〜７５）は、肝臓線維症におけるコルヒチンを用いた処置では、線維症の程度の改善、悪化、または変化なしは等頻度で生じると記載している。
【００１０】
ペイロニー病に関して；（Ｋａｄｉｏｇｌｕら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｍｐｏｔ．Ｒｅｓ．２０００  Ｊｕｎ；１２（３）：１６９〜７５）は、ペイロニー病に罹患している６０例の患者をコルヒチンで１０ヶ月間処置したところ、陰茎の湾曲は３０％で改善され、悪化が２２％で、変化なしは４８％であったと報告されたということを教示している。
【００１１】
今日、タモキシフェンは、インビトロにおいてＴＧＦ−βを下方制御するためのタモキシフェン活性による、ペイロニー病の治療の１つである（Ｒａｌｐｈら、Ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｅｙｒｏｎｉｅ'ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｗｉｔｈ  Ｔａｍｏｘｉｆｅｎ．Ｂｒ  Ｊ  Ｕｒｏｌ．１９９２，７０：６８４〜６５１）。それにもかかわらず、タモキシフェンの臨床的な有効性は低い。従って、Ｔｅｌｋｏｎ  Ｃら（Ｔｈｅ  Ｔａｍｏｘｉｆｅｎ  ｖｅｒｓｕｓ  ｐｌａｃｅｂｏ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｅｙｒｏｎｉｅ'ｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｊ  Ｕｒｏｌ．１９９９  Ｄｅｃ；１６２（６）：２００３〜５）は、この結果は、タモキシフェン対プラセボの間の比較臨床研究において同様であったことを開示している。
【００１２】
プラークを軽減させるための他の方法は、多様な薬物、例えば、インターフェロン□−２ｂ、ベラパミルまたはコルチコイドの海綿体内への注射を包含する。この投与経路は、患者にとって疼痛性であり、この薬物の投与は、資格のある人によって行なわれなければならない。これらの因子の投与は、有害な効果を生じ得る：インターフェロンγは、発熱、倦怠感および筋肉痛を生じる；コルチコイドはプラーク内で壊疽を生じる；経口投与されたタモキシフェンは、性欲の減退および射精（ｅｙａｃｕｌａｔｅ）の減退を生じる。
【００１３】
ポリポディウム抽出物は、先行技術において記載されているが、これは異なる薬理学的活性を有する。欧州（ＥＰ）０５０３,２０８、スペイン（ＥＳ）−２,０８８,７７０、欧州（ＥＰ）１１７２１１１および欧州（ＥＰ）１１７２１１１の先行技術は、ポリポディウム抽出物の異なる薬理学的活性を記載する。この薬理学的活性は、以下のようにまとめることができる：免疫学的活性および異なるサイトカイン集団の調節；接着分子の調節；神経変性疾患活性；抗炎症活性およびコラーゲンポイエティック（ｃｏｌｌａｇｅｎｐｏｉｅｔｉｃ）活性。
【００１４】
そのため、ポリポディウム抽出物のコラーゲンポイエティック活性、およびコラーゲン欠損によって特徴付けられる病状におけるその用途が記載された先行技術は隠されている。
【００１５】
欧州（ＥＰ）−５０３．２０８は、線維芽細胞を刺激し、かつプレコラーゲンを合成するポリポディウムの活性を開示する。
【００１６】
また、フランス（ＦＲ）２．４７９．６９０は、コラーゲン欠損に注意を向けるオステオモータ（ｏｓｔｅｏｍｏｔｏｒ）システムの疾患の処置におけるＰｏｌｙｐｏｄａｃｅａｓ抽出物の使用を開示している。従って、この書類は、ポリポディウム抽出物がコラーゲン合成を増大することおよび形成されたコラーゲンがさらに耐性であることを示唆する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
（発明の要旨）
本発明において解決される問題は、強皮症、肺線維症、腎臓線維症、アテローム性動脈硬化症、膵臓線維症、心臓線維症、肝臓線維症、骨髄線維症、デュピュイトラン病および詳細には、ペイロニー病のような線維性疾患であって、その病状は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）過剰発現によって特徴付けられる繊維性疾患のための有効な薬理学的処置を達成することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らによって見出された溶液は、請求項１に記載されるとおりポリポディウム抽出物の使用である。
【００１９】
本発明者らは、ポリポディウム抽出物がインビトロで容量依存性の様式でコラーゲンをそしてヒトにおいてフィブロネクチン合成を阻害するということを見出した。この能力はまた、インビボでも示されている；ポリポディウム抽出物は、陰茎における線維症によって特徴付けられる線維性の疾患であるペイロニー病に罹患している患者において、コラーゲンのプラークを軽減している。
【００２０】
ポリポディウム抽出物によって解決される別の問題は、この抽出物がトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）発現を減少させることである。このタンパク質は、請求項２に言及されるとおり、全ての線維性の状態に関与する。さらに、インビボにおいてポリポディウム抽出物によって生じたＴＧＦ−β減少は、ＴＧＦ−βを調節するための参照薬物であるタモキシフェンによって生じたＴＧＦ−β減少よりも有意に大きい。
【００２１】
当業者によって公知のとおり、ポリポディウム抽出物の投与は、有害な効果を生じない。従って、抗サイトカイン治療によって生じる有害効果は回避される。
【００２２】
好ましい実施形態において、ポリポディウム投与によって解決される他の問題は、ペイロニー病に関する臨床的パラメーターを改善することであり、すなわち、ポリポディウム抽出物の経口投与後、請求項３のように、陰茎白膜における線維性プラーク、性行為の間の疼痛、陰茎湾曲が軽減され、そして患者の心理学的改善も示される。ポリポディウム抽出物で処置されたペイロニー病患者において得られた臨床的結果は、他の薬物で得られた結果よりも優れていた。
【００２３】
経口投与は、請求項９のように、ペイロニー病のプラーク投与への注射に関連する問題を解決する：この注射は、熟練者によって実施されなければならず、そしてこの投与用量は疼痛性である。
【００２４】
特定の実施形態において、ポリポディウム抽出物は、２０より大きい誘電定数を有する極性溶媒を用いた抽出によって獲得可能である。具体的には、ポリポディウム抽出物は、水を用いた抽出によって獲得可能であり、そしてさらに具体的には、抽出物は、請求項４、５、６および７に記載のように、Ｐｏｌｙｐｏｄｉｕｍ  ｌｅｕｃｏｔｏｍｏｓの水抽出物から獲得可能である。
【００２５】
この抽出物をパラメトリックに記載するために、請求項８は、この抽出物に存在する化合物に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
（発明の詳細な説明）
ポリポディウム抽出物は、極性の溶媒を用いた抽出によって獲得可能である。ここで「極性の溶媒（ｐｏｌａｒ  ｓｏｌｖｅｎｔ）」とは、２０より大きい誘電定数（ε）を有する溶媒を意味する。以下の表は、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ（第５４版）（１９７３）によるいくつかの誘電定数を示す。
【００２７】
溶      媒          誘電定数（ε）
水                    ８０
メタノール            ３２
エタノール            ２４
エチレングリコール    ３７
【００２８】
好ましい実施形態において、ポリポディウム抽出物は、水抽出および溶媒エバポレーションによって得られる。
【００２９】
あるいは、ポリポディウム抽出物の精製について専門家のための、そしてその当該分野で記載された他の公知の操作を用いること、またはこの抽出の収率を改善することが可能である。従って、これらの操作は、この抽出物に対してなんらさらなる利点をもたらさない。これらの操作は、以下：植物の乾燥条件の最適化、溶媒の組み合わせ；植物材料の脱脂；保存剤の添加；抗菌剤の添加；保存を容易にし、かつ操作を改善するためのキャリアの添加；超臨界流体状態の溶媒を用いた抽出；植物材料の収穫の時期の最適化；クロマトグラフィーによる精製；活性化炭を用いた吸着による精製などであり得る。
【００３０】
本発明において記載された植物材料は、グアテマラのＭｏｎｔｅｓ  Ｍａｔａｑｕｅ地方で、この国の当局の間接的な承認によって収集された。
【００３１】
この植物材料の種の分類学的な類別は、著者によるものであり、従って、分類によって、異なる命名法を用いる。
【００３２】
用いた植物材料の分類学的な類別は、
学名：Ｐｈｌｅｂｏｄｉｕｍ  ａｕｒｅｕｍ（Ｌｉｎｎａｅｕｓ）
亜属：Ｐｈｌｅｂｏｄｉｕｍ
属：Ｐｏｌｙｐｏｄｉｕｍ
科：Ｐｏｌｙｐｏｄｉａｃｅａｅ
【００３３】
さらに、他の同義語も認められている。例えば、Ｐｏｌｙｐｏｄｉｕｍ  ａｕｒｅｕｍ（Ｌｉｎｎａｅｕｓ）またはＰｏｌｙｐｏｄｉｕｍ  ｌｅｕｃｏｔｏｍｏｓ（Ｐｏｉｒｅｔ）および他の変種：Ｐｏｌｙｐｏｄｉｕｍ  ａｅｒｏｌａｔｕｍ、Ｐｈｌｅｂｏｄｉｕｍ  ａｅｒｏｌａｔｕｍ、Ｐｏｌｙｐｏｄｉｕｍ  ａｕｒｅｕｍ変種、ＡｅｒｏｌａｔｕｍまたはＰｌｅｏｐｅｌｔｉｓ  ａｕｒｅａ。
【００３４】
従って、「ポリポディウム（Ｐｏｌｙｐｏｄｉｕｍ）」は、ポリポディウム（Ｐｏｌｙｐｏｄｉｕｍ）属に含まれるシダ類に関する。
【００３５】
好ましい実施形態において、Ｐｏｌｙｐｏｄｉｕｍ  ｌｅｕｃｏｔｏｍｏｓ（Ｐｏｉｒｅｔ）由来の地下茎を乾燥して水で抽出するが、この地下茎／水の比は１：１０である。微生物の含量を低下させるため、この抽出物を、膜を通して濾過する。この溶媒を低圧で除去して、約２５％の水分含量を有する抽出物を得る。微生物の混入を回避するため、そして操作を容易にするため、抽出物にキャリア（デンプン、ラクトース、硫酸マグネシウム）を添加する。この安定化された抽出物は、１２０ｍｇの乾燥された水抽出物を有する単位用量にカプセル化される。
【００３６】
抽出物のクロマトグラフィー解析（オクタデシルシラン、５マイクロメートルでコートされたカラム；移動相（３％リン酸：水：アセトニトリル／２５：７２：３）；検出、ＵＶ２１０ｎｍ）によって、リンゴ酸、クエン酸、フマル酸、キナ酸および乳酸の存在が示される。これらの酸は、抽出物のマーカーとして解析の目的で用いられる。
【００３７】
ヒト皮膚線維芽細胞の培養物は、線維性疾患、すなわち、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の過剰発現によって特徴付けられる病状における薬物の研究のために適切なモデルである。
【００３８】
３７℃で２４時間、トリチウム化プロリン（３Ｈ−プロリン）の存在下で、ポリポディウム抽出物は、１、１０、５０、１００、５００μｇ／ｍｌの濃度において用量依存性の様式で、コラーゲン合成を阻害する。ポリポディウム抽出物は５０μｇ／ｍｌの濃度で、コントロール値の４０％までコラーゲン合成を阻害した。
【００３９】
ポリポディウム抽出物はまた、インビトロでフィブロネクチン合成を阻害し、葉の抽出物および地下茎の抽出物の両方ともフィブロネクチン合成を阻害した。ポリポディウム抽出物の存在下での線維芽細胞のインキュベーションおよびイムノアッセイの後、ポリポディウム抽出物は、用量依存性の様式（２０〜１０００μｇ／ｍｌ）でコントロールのフィブロネクチン合成の４０％まで阻害した。
【００４０】
インビトロにおけるＥＣＭ合成の阻害活性に加えて、ポリポディウム抽出物はまたインビボでこのような活性を示している。インビボにおけるペイロニー病患者へのポリポディウム抽出物の投与後、陰茎プラークのコラーゲンは減少して、ＴＦＧ−βの発現も減少した。
【００４１】
６ヶ月間の３４例のペイロニー患者における臨床試験によって、臨床的な改善および心理学的な改善は、タモキシフェン群よりもポリポディウム群で優れていたことが示された。得られた結果は統計学的に有意であった。
【００４２】
結果は、以下であった：
【表１】
2005528452.tif 000002
【００４３】
ポリポディウム抽出物を用いた処置後の結果は、Ｋａｄｉｏｇｌｕらによって開示される結果（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｍｐｏｔ．Ｒｅｓ．２０００  Ｊｕｎ；１２（３）：１６９〜７５）よりも優れていた。この著者らは、６０例のペイロニー病患者を１０ヶ月間コルヒチンを用いて処置したところ、陰茎湾曲が３０％で改善され、４８％で未変化のままであり、２２％で悪化したということを教示している。
【００４４】
ポリポディウム群の患者は、７２０ｍｇのポリポディウム抽出物を用いて、経口的に、８時間間隔で処置した。
【００４５】
タモキシフェン群の患者は、２０ｍｇのタモキシフェンを用いて、経口的に、２４時間間隔で処置した。
【００４６】
年齢は両方の群で同様であった。
【００４７】
プラークを理学的診察および陰茎の超音波検査（ｅｃｏｇｒａｐｈｙ）によって評価した。
【００４８】
陰茎湾曲を写真によって評価した。
【００４９】
ＴＧＦ−β産生においては、初期値と比較した場合、タモキシフェン群での５％に対して、ポリポディウム群では２２％の処置後低下が見出された。
【００５０】
また、ＩＬ−１０産生においては、初期値と比較した場合、タモキシフェン群での７９％に対して、ポリポディウム群では１７％の処置後低下であった。
【００５１】
処置後、タモキシフェン群の４５％に対して、ポリポディウム群では６７％が満足であった。
【実施例１】
【００５２】
（実施例１）
（細胞外マトリックスに対するポリポディウム抽出物の効果）
（ポリポディウム抽出物）ポリポディウム抽出物は、４８時間の水抽出、膜を通した濾過、低圧での溶媒除去、生理学的な血清への再溶解および凍結乾燥によって得た。この抽出物をＰＢＳに溶解して、それらを再構成後に用いた。
【００５３】
（細胞培養）線維芽細胞を外科的試料から得た。ＲＰＭＩ  １６４０培地および２％（二倍量）のペニシリン／ストレプトマイシン溶液中において４℃で２時間、皮膚の小片をプレインキュベートした。脂肪組織を除去して、皮膚を小片に切断して、マイクロウェルに固定して、これをウシ胎仔血清（ＦＣＳ）で湿らせた。１０％ＦＣＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液を補充したＲＰＭＩ  １９６４培地中において５％ＣＯ２雰囲気で皮膚細胞を培養した。この培地を週に２回、更新した。線維芽細胞をトリプシン処理して（トリプシン／ＥＤＴＡ：０．０５％／０．０２％）実験のために継代培養した。４代〜１４代位の継代で得た細胞だけを用いた。
【００５４】
（コラーゲン合成）ヒト皮膚線維芽細胞を、組織培養マイクロプレート中で回収した。各々のマイクロウェルに１０，０００細胞を含む１００μｌのＲＰＭＩ培地（１０％ＦＣＳおよび５０μｇ／ｍｌのＬアスコルビン酸を含む）を播種した。５％の二酸化炭素雰囲気において、２４時間インキュベーションした後、異なる濃度のポリポディウム抽出物（１〜１０００μｇ／ｍｌ）および１μＣｉ  ３Ｈ−プロリンを含む１００ｍｌの新鮮培地を用いてこの培地を更新した。２４時間のインキュベーション後、コラーゲンを１００μｌの冷酢酸（１％ペプシン含有）の添加によって抽出した；この培地を４℃で一晩培養した。以下の工程は４℃で行なった。マイクロウェルの内容物を３ｍｌのポリプロピレンチューブに移した。ラット皮膚のコラーゲン可溶性塩を含む、８００ｍｌの０．５Ｍ酢酸を希釈剤として添加した。このチューブを４０００ｇで２０分間遠心分離した。この上清を透明なチューブに移して、その沈殿物を廃棄した。０．５Ｍ酢酸を含有する２５０μｌの２５％塩化ナトリウム溶液を添加することによってコラーゲンを沈殿させた。チューブを４０００ｇで２時間遠心分離した。この沈殿物を０．１５モルの塩化ナトリウムを含有する０．０５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ７．５）に再溶解した。２ｍｌの４．５Ｍの添加によってコラーゲンを沈殿させた。２時間後、このチューブを４０００ｇで３０分間遠心分離した。この上清を廃棄して、沈殿したコラーゲンを２ｍｌの２％エタノールを用いて洗浄した。得られた溶液を４０００ｇで３０分間遠心分離した。最終的に、各々の沈殿物を２５０μｌの０．５Ｍ酢酸に溶解した。この溶液を、５〜１０ｍｌのシンチレーション溶液を含むシンチレーションバイアルに移した。ＷｅｂｓｔｅｒおよびＨａｒｖｅｙのＡｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ９６，２２０〜２２４，１９７９に記載される方法に従って、液体シンチレーションカウンター中で、外部標準を用いて、この放射能を測定した。
【００５５】
（フィブロネクチン合成）マイクロウェルプレート中で線維芽細胞を培養した。その初期密度は２０，０００細胞／ｍｌであって、その培地はＦＣＳを含まないＲＰＭＩであった。この細胞を、５％二酸化炭素雰囲気下において３７℃で２４時間培養した。この培地を更新した。培養物に異なる濃度のポリポディウム抽出物を添加した（１〜１０００μｇ／ｍｌ）。その後、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびｙポリソルベート（ｐｏｌｙｓｏｒｂａｒｔｅ）２０（Ｔｗｅｅｎ  ２０）を含有するＰＢＳを用いて、この細胞を３回洗浄した。細胞を水／アセトン（ｖ／ｖ：１：１）を用いて３０分間固定して、上記に記載したように３回洗浄した。マウスにおいて生じたモノクローナル抗フィブロネクチン抗体（Ｓｉｇｍａ  Ｆ−７３８４）とともにこの細胞をインキュベートした。洗浄後、この細胞を抗マウスＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）（ヤギにおいて生成したアルカリホスファターゼ抗体）とともに３７℃で１時間インキュベートした。この細胞を再度３回洗浄して、それらを１ｍｇ／ｍｌの濃度のｐ−ニトロフェニルホスフェートの溶液で１５分間、暗野でインキュベートした。
【００５６】
次いで、マイクロプレートを２００ｇで５分間遠心分離して、１００μｌの上清を新しいマイクロプレートに移した。ＥＬＩＳＡリーダーで４０５ｎｍの吸光度を測定した。
【００５７】
（結果）
（１．コラーゲン合成阻害に対するポリポディウム抽出物の効果）
得られた結果は以下であった：
濃度              取り込み（％）    阻害（％）
コントロール        １００％          ０％
１μｇ／ｍｌ        １１６％      −１６％
１０μｇ／ｍｌ        ８４％        １６％
５０μｇ／ｍｌ        ５８％        ４２％
１００μｇ／ｍｌ      ６０％        ４０％
５００μｇ／ｍｌ      ５３％        ４７％
１０３μｇ／ｍｌ     ６４％        ３６％
【００５８】
図１はこれらの結果を示す。
【００５９】
（２．フィブロネクチン合成阻害に対するポリポディウム抽出物の効果）
３つの平行した実験において得られた結果は以下であった：
濃度              取り込み（％）    阻害（％）
コントロール        １００％          ０％
１μｇ／ｍｌ          ９５％          ５％
１０μｇ／ｍｌ        ９８％          ２％
５０μｇ／ｍｌ        ９５％          ５％
１００μｇ／ｍｌ      ８７％        １３％
５００μｇ／ｍｌ      ７６％        ２４％
１０３μｇ／ｍｌ     ６０％        ４０％
【００６０】
（３．フィブロネクチン合成阻害に対する葉由来のポリポディウム抽出物の効果）
３つの平行した実験において得られた結果は以下であった：
濃度              取り込み（％）    阻害（％）
コントロール        １００％          ０％
１μｇ／ｍｌ        １０５％        −５％
１０μｇ／ｍｌ        ８６％        １４％
５０μｇ／ｍｌ        ８５％        １５％
１００μｇ／ｍｌ      ８２％        １８％
５００μｇ／ｍｌ      ５５％        ４５％
１０３μｇ／ｍｌ     ４０％        ６０％
【００６１】
図３はこれらの結果を示す。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】ポリポディウム抽出物によって生じたコラーゲン合成阻害。あらゆる値は、４つの平行した実験の平均である。標準偏差を示す。
【図２】ポリポディウム抽出物によって生じたフィブロネクチン合成阻害。あらゆる値は、３つの平行した実験の平均である。標準偏差を示す。
【図３】ポリポディウム抽出物によって生じたフィブロネクチン合成阻害。あらゆる値は、３つの平行した実験の平均である。標準偏差を示す。
【図１】
2005528452.tif 000003
【図２】
2005528452.tif 000004
【図３】
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【国際調査報告】
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