(57)【要約】フィブリリンを産生するように線維芽細胞を刺激するのに有効な薬物の製造におけるペプチド、またはペプチドの誘導体の使用であって、そのペプチドが、α−Ｓ２カゼイン前駆物質中に存在するアミノ酸配列を含み、前記配列が３個以上のアミノ酸を含み、全長α−Ｓ２カゼイン前駆物質のＮ末端アミノ酸をそのＮ末端に含まないことを特徴とする使用が提供された。さらに、フィブリリンを産生するように線維芽細胞を刺激するのに有効な薬物の製造におけるペプチド、またはペプチドの誘導体の使用であって、そのペプチドがα−Ｓ２カゼイン断片活性を有することを特徴とする使用が提供された。【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィブリリンを産生するように線維芽細胞を刺激するのに有効な薬物の製造におけるペプチド、またはペプチドの誘導体の使用であって、そのペプチドが、α−Ｓ２カゼイン前駆物質中に存在するアミノ酸配列を含み、前記配列が３個以上のアミノ酸を含み、全長α−Ｓ２カゼイン前駆物質のＮ末端アミノ酸をそのＮ末端に含まないことを特徴とする使用。
【請求項２】
フィブリリンを産生するように線維芽細胞を刺激するのに有効な薬物の製造におけるペプチド、またはペプチドの誘導体の使用であって、そのペプチドがα−Ｓ２カゼイン断片活性を有することを特徴とする使用。
【請求項３】
前記薬物が、歯周病を緩和または予防するのに有効である請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記薬物が、皮膚における老化の影響を緩和または防止するのに有効である請求項１または２に記載の使用。
【請求項５】
前記ペプチドが、９個以上のアミノ酸を含む請求項１から４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
前記ペプチドが、９〜３１個のアミノ酸を含む請求項１から５のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
前記ペプチドが、全長α−Ｓ２カゼイン前駆物質のＣ末端を含む請求項１から６のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
前記ペプチドが、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサギまたはブタのα−Ｓ２カゼイン由来のペプチドであるか、または合成されたその等価物または相同体である請求項１から７のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
前記ペプチドが、以下の配列：
LysValIleProTyrValArgTyrLeu;
ThrLysValIleProTyrValArgTyrLeu;
LysThrLysValIleProTyrValArgTyrLeu;
ProLysThrLysValIleProTyrValArgTyrLeu
GlnProLysThrLysValIleProTyrValArgTyrLeu
AlaMetLysProTrpIleGlnProLysThrLysValIleProTyrValArgTyrLeu;
ThrValTyrGlnHisGlnLysAlaMetLysProTrpIleGlnProLysThrLysValIleProTyrValArgTyrLeu;および
ProGlnTyrLeuLysThrValTyrGlnHisGlnLysAlaMetLysProTrpIleGlnProLysThrLysValIleProTyrValArgTyrLeu
から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１から８のいずれかに記載の使用。
【請求項１０】
前記ペプチドが、以下の配列：
LysValIleProTyr;
ThrLysValIleProTyr;
LysThrLysValIleProTyr;
ProLysThrLysValIleProTyr;
GlnProLysThrLysValIleProTyr;
AlaMetLysProTrpIleGlnProLysThrLysValIleProTyr;
ThrValTyrGlnHisGlnLysAlaMetLysProTrpIleGlnProLysThrLysValIleProTyr;および
ProGlnTyrLeuLysThrValTyrGlnHisGlnLysAlaMetLysProTrpIleGlnProLysThrLysValIleProTyr
から選択されるアミノ酸配列を含む請求項１から９のいずれかに記載の使用。
【請求項１１】
前記ペプチドが：
（ａ）そのアミノ酸Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＶａｌのうちの１つまたは複数が互いに置換され；および／または
（ｂ）そのアミノ酸ＴｙｒおよびＰｈｅのうちの１つまたは複数が互いに置換され；および／または
（ｃ）そのアミノ酸ＡｒｇおよびＬｙｓのうちの１つまたは複数が互いに置換された；
ペプチド相同体を含む、請求項１から１０のいずれかに記載の使用。
【請求項１２】
老化の前記影響が、皮膚の皺ができることである請求項４から１１のいずれかに記載の使用。
【請求項１３】
前記ペプチドが、線維芽細胞の成長を刺激することができる請求項１から１２のいずれかに記載の使用。
【請求項１４】
前記ペプチドが、コラーゲンを産生するように線維芽細胞を刺激することができる請求項１から１３のいずれかに記載の使用。
【請求項１５】
前記ペプチドが、ケラチノサイトの成長を刺激することができる請求項１から１４のいずれかに記載の使用。
【請求項１６】
哺乳動物の皮膚の基底膜域を修復および／または維持するのに有効な薬物の製造におけるペプチド、またはペプチドの誘導体の使用であって、そのペプチドが、α−Ｓ２カゼイン前駆物質中に存在するアミノ酸配列を含み、前記配列が３個以上のアミノ酸を含み、全長α−Ｓ２カゼイン前駆物質のＮ末端アミノ酸をそのＮ末端に含まないことを特徴とする使用。
【請求項１７】
哺乳動物の皮膚の基底膜域を修復および／または維持するのに有効な薬物の製造におけるペプチド、またはペプチドの誘導体の使用であって、そのペプチドがα−Ｓ２カゼイン断片活性を有することを特徴とする使用。
【請求項１８】
前記薬物が、歯周病を緩和または予防するのに有効である請求項１６または１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記薬物が、皮膚における老化の影響を緩和または防止するのに有効である請求項１６または１７に記載の使用。
【請求項２０】
前記哺乳動物がヒトである請求項１６から１９のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、線維芽細胞におけるフィブリリンの産生を刺激することによって、老化の影響、特に皮膚の老化の影響を軽減または防止するために使用することができる、タンパク質、ペプチド（一般に、ポリペプチド）、ペプチド誘導体、またはペプチド断片に関する。これは、治療方法または美容的方法に用いることができる。本発明は、線維芽細胞におけるフィブリリンの産生を刺激することによって、歯周病（歯肉疾患）の予防または治療として使用することができる、同じペプチド、ポリペプチド、ペプチド誘導体またはペプチド断片にも関する。これは、所望の場合には、医学的治療法に用いることができる。特に、本発明は、α−Ｓ２カゼイン前駆物質からのアミノ酸配列を含むペプチドの使用に関する。
【０００２】
長年にわたり、乳は、その栄養内容の他に、細胞に対する成長促進活性を含有することが知られている。これに関して、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）が、ヒト（ＳｈｉｎｇおよびＫｌａｇｓｂｒｕｎ，１９８４；Ｐｅｔｎｄｅｓ，１９８５）、ラット（Ｒａａｂｅｒｇら，１９９０）、ブタ（Ｔａｎら，１９９０）およびヤギ（ＢｒｏｗｎおよびＢｌａｋｅｌｅｙ，１９８３）の乳において同定されている。
【０００３】
ラットの乳中に存在するＥＧＦは、ラットの子の正常な発達に重要であることが示されている（Ｏｋａら，１９８３）。しかしながら、ＥＧＦは、ウシの乳では発見されていない（Ｒｅａｄ  １９８５）。代わりに、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）ＩおよびＩＩ（Ｆｒａｎｃｉｓら，１９８６）、および血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）に構造的に関連するウシ初乳成長因子（ＢＣＧＦ）（ＳｈｉｎｇおよびＫｌａｇｓｂｒｕｎ，１９８４；ＢｒｏｗｎおよびＢｌａｋｅｌｅｙ，１９９４）がウシの乳において同定されている。
【０００４】
国際特許出願公開番号：ＷＯ９７／１６４６０には、ＩＧＦまたはＰＤＧＦによって有意に刺激されない、ラット乳腺線維芽細胞株（Ｒａｍａ２７）に対する成長促進活性を含有することが開示されている。本出願において、この成長促進活性を誘発するペプチド配列が同定される。これらの配列は、ウシα−Ｓ２カゼイン前駆物質のＣ末端と実質的に同一である配列として同定される。本出願は、成長を促進するための薬物または食品の製造に、これらのペプチドまたはその塩を使用することができることを示している。
【０００５】
欧州特許出願公開番号：ＥＰ  ０  ４５７  ５６５には、毛髪および皮膚の処置に使用される乳タンパク質加水分解産物および組成物が開示されている。加水分解産物におけるタンパク質は、明確には定義されておらず、１０００ダルトン未満の分子量を有する。したがって、これらは、乳中に存在する多種多様なタンパク質からの非常に小さな加水分解産物である。
【０００６】
国際特許出願公開番号：ＷＯ９２／００９９４、ＷＯ９５／２９９３３およびＷＯ９６／３４６１４には、成長促進剤および消化管障害を治療するための薬剤として使用することができる乳からの抽出物が開示されている。その乳製品抽出物は、ヒトまたは動物の乳からの抽出物であり、例えばホエイ抽出物および脱脂乳抽出物が挙げられる。その文書では、ＩＧＦ  ＩまたはＩＩは、製品にそれらの有用性を付与する活性成分であることを示しており、製品が特定のタンパク質を含むべきであることは示していない。
【０００７】
さらに、別の上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）（Ｅｓｔｅｅ  Ｌａｕｄｅｒ，ａｄｖｅｒｔｉｓｅｄ  ｉｎ  Ｅｌｌｅ，１９９９）および「ホエイタンパク質」（Ｅｓｔｅｅ  Ｌａｕｄｅｒ’ｓ’Ｄｉｍｉｎｉｓｈ’ｉｎ  Ｍａｒｔｈａ  Ｓｔｅｗａｒｔ’ｓ  Ｌｉｖｉｎｇ，Ｆｅｂ，２０００）の老化防止有効性が主張されるクリームなどの局所適用薬が販売されている。しかしながら、この有効性がとりわけ高いということは示されていない。
【０００８】
国際特許出願公開番号：ＷＯ０２／０２１３３において、歯周病および皮膚の老化の徴候を治療するための組成物が開示されている。この組成物には、線維芽細胞におけるコラーゲンの産生を刺激することができるα−Ｓ２カゼイン前駆物質が用いられている。
【０００９】
従来技術と関連する問題を解決することが本発明の目的である。特に、皮膚の老化の影響を緩和または防止することができる薬剤を提供することである。歯周病を治療または予防することができる薬剤を提供することもまた、本発明の目的である。驚くべきことに、本発明者らは、α−Ｓ２カゼイン前駆物質およびそれに関連する種、例えばＷＯ９７／１６４６０に記載の成長促進物質として開示されている物質などが、線維芽細胞におけるフィブリリンの産生を刺激することによって、皮膚の老化の影響を緩和および防止し、かつ歯周病を治療するのに非常に有用であることを見出した。本発明で使用されるα−Ｓ２カゼイン前駆物質および前駆物質断片および誘導体は、公知の老化防止製品および歯肉疾患の治療に使用される製品、特に上記の従来技術において開示されている薬剤よりも優れている。
【００１０】
したがって、本発明は、フィブリリンを産生するように線維芽細胞を刺激するのに有効な薬物の製造における、ペプチド、またはペプチドの誘導体の使用を提供し、そのペプチドは、α−Ｓ２カゼイン前駆物質中に存在するアミノ酸配列を含み、前記配列は、３個以上のアミノ酸を含み、全長α−Ｓ２カゼイン前駆物質のＮ末端アミノ酸をそのＮ末端に含まない。本発明は、フィブリリンを産生するように線維芽細胞を刺激するのに有効な薬物の製造における、α−Ｓ２カゼイン断片活性を有する、ペプチド、またはペプチドの誘導体の使用も提供する。その薬物は、歯周病の緩和または予防かつ／または皮膚の老化の影響、好ましくは光老化（紫外線または太陽光にさらされる、または過度にさらされることによって生じるダメージまたは老化）の影響の緩和または防止に有効である。
【００１１】
上記で定義される本発明の使用には、純粋な状態での、または天然源からペプチドを単離することによって得られる一部精製された状態での、ペプチド、またはその誘導体の使用が含まれる。このように、本発明は、ペプチドまたはその誘導体を含む天然物質の使用など、天然の未精製状態でのペプチドの使用に及ぶとともに、完全に（１００％）純粋を含む、いずれかの精製レベルでのペプチドまたはその誘導体の使用を含み得る。そのペプチドは、タンパク質分解消化物由来であるか、または合成ペプチドなどの非天然由来であってもよい。本発明の文脈において、ペプチドという用語は、タンパク質、ポリペプチドおよびペプチド断片を含むことを意図するものである。
【００１２】
本発明は、皮膚の老化の影響を緩和または防止するための美容的および／または医学的方法に用いることができ、その方法は、対象をポリペプチドまたはポリペプチドの誘導体で処置することを含み、そのポリペプチドは、α−Ｓ２カゼイン前駆物質中に存在するアミノ酸配列を含み、前記配列は３個以上のアミノ酸を含み、全長α−Ｓ２カゼイン前駆物質のＮ末端を含まない。
【００１３】
繰り返すが、驚くべきことに、本発明の発明者らは、α−Ｓ２カゼイン前駆物質からのアミノ酸配列を含むペプチド、および特にかかるペプチドの断片が、皮膚に対して非常に有益な効果を有し、その結果、老化の多くの影響が防止および緩和され、歯周病が治療および予防されることを見出した。これらの特定の薬剤の効果は、従来技術の薬剤の効果よりも優れている。本発明の文脈において、断片とは、全配列ではない、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドからの配列の一部を意味する。
【００１４】
一例として、以下の図面および具体的な実施形態を参照して、本発明をさらに説明する。
【００１５】
本発明の文脈において、老化の影響とは、老化のいずれの影響でもよい。したがって、その影響とは、皮膚のたるみ、皮膚の皺、または皮膚の損傷部位の再生の遅れなどがあげられる。しかしながら、その影響は最も好ましくは、皮膚の皺である。歯周病は、歯肉の疾患である。本発明の文脈においては、これは、何の原因に起因するものでもよいが、歯もしくは歯肉の感染症ならびに歯もしくは歯肉の清掃（ブラッシングまたはフロッシング）不足などを含む。
【００１６】
本発明において使用されるポリペプチドおよびポリペプチド断片は、緩和効果と予防効果のいずれか、あるいはまた両方を有する。このように、それらは、予防的効果を有し、かつ／または老化の影響または歯肉疾患の影響を低減し、または歯肉疾患の発症に対する保護を提供し、または皮膚の若々しい外観を向上させ得る。
【００１７】
全長α−Ｓ２カゼイン前駆物質が老化または歯肉疾患の影響に対して有意な有効性を示さないのに対して、α−Ｓ２カゼインのＣ末端由来のポリペプチドなど、かかるタンパク質の断片は、これらの効果を有する。例えば、歯肉疾患および老化の影響に対する有効性は、α−Ｓ２カゼイン前駆物質のＣ末端に由来し、かつ３個以上のアミノ酸を有するが、全長α−Ｓ２カゼイン分子のＮ末端アミノ酸を含有しないペプチドに存在する。このように、本発明で使用されるカゼイン由来ペプチドおよび断片は一般に、３個以上のアミノ酸を含むが、全カゼインタンパク質のＮ末端を含まない。本発明の文脈において、そのＮ末端アミノ酸を含まないペプチドは、タンパク質のＮ末端（Ｎ終端）自体を含まないことを意味する。一部の実施形態では、これは、ペプチドが、Ｎ末端を含み、かつＮ末端までの多数のアミノ酸を含有しないことを意味し得る。好ましくは、そのペプチドは、全タンパク質のＣ末端を含有する。
【００１８】
このように、本発明で使用されるペプチドまたは断片におけるアミノ酸の数は、それが３個以上のアミノ酸を有し、全長カゼインのＮ末端を含有しないという条件で、特に限定されない。しかしながら、そのペプチドにおけるアミノ酸の数は、３〜５０、４〜５０、５〜５０、６〜５０、または７〜５０であることが好ましい。有利には、アミノ酸の数は、８〜５０、さらに好ましくは９〜５０または１０〜５０である。これらすべての場合でアミノ酸の上限は３５であることが特に好ましく、最も好ましくは３１である。アミノ酸の最も好ましい数は９〜３１である。
【００１９】
このように、そのペプチドは好ましくは、α−Ｓ２カゼイン前駆物質のＣ末端（Ｃ末端を含む）の最後の３〜５０、３〜３５または３〜３１アミノ酸を含み、さらに、α−Ｓ２カゼインのＣ末端の最後の３〜１０、３〜９、３〜８または３〜７個またはα−Ｓ２カゼインのＣ末端の最後のちょうど３個のアミノ酸と短くてもよい。
【００２０】
本発明で使用されるウシα−Ｓ２カゼイン前駆物質は以下のアミノ酸配列は下記の通りである：
［ＣＡＳ２＿ＢＯＶＩＮ］  α−Ｓ２カゼイン前駆物質
配列：
MKFFIFTCLL  AVALAKNTME  HVSSSEESII  SQETYKQEKN  MAINPSKENL  CSTFCKEVVR
NANEEEYSIG  SSSEESAEVA  TEEVKITVDD  KHYQKALNEI  NQFYQKFPQY  LQYLYQGPIV
LNPWDQVKRN  AVPITPTLNR  EQLSTSEENS  KKTVDMESTE  VFTKKTKLTE  EEKNRLNFLK
KISQRYQKFA  LPQYLKTVYQ  HQKAMKPWIQ  PKTKVIPYVR  YL  
【００２１】
３文字表記では、これは：
Met  Lys  Phe  Phe  Ile  Phe  Thr  Cys  Leu  Leu
Ala  Val  Ala  Leu  Ala  Lys  Asn  Thr  Met  Glu
His  Val  Ser  Ser  Ser  Glu  Glu  Ser  Ile  Ile
Ser  Gln  Glu  Thr  Tyr  Lys  Gln  Glu  Lys  Asn
Met  Ala  Ile  Asn  Pro  Ser  Lys  Glu  Asn  Leu
Cys  Ser  Thr  Phe  Cys  Lys  Glu  Val  Val  Arg
Asn  Ala  Asn  Glu  Glu  Glu  Tyr  Ser  Ile  Gly
Ser  Ser  Ser  Glu  Glu  Ser  Ala  Glu  Val  Ala
Thr  Glu  Glu  Val  Lys  Ile  Thr  Val  Asp  Asp
Lys  His  Tyr  Gln  Lys  Ala  Leu  Asn  Glu  Ile
Asn  Gln  Phe  Tyr  Gln  Lys  Phe  Pro  Gln  Tyr
Leu  Gln  Tyr  Leu  Tyr  Gln  Gly  Pro  Ile  Val
Leu  Asn  Pro  Trp  Asp  Gln  Val  Lys  Arg  Asn
Ala  Val  Pro  Ile  Thr  Pro  Thr  Leu  Asn  Arg
Glu  Gln  Leu  Ser  Thr  Ser  Glu  Glu  Asn  Ser
Lys  Lys  Thr  Val  Asp  Met  Glu  Ser  Thr  Glu
Val  Phe  Thr  Lys  Lys  Thr  Lys  Leu  Thr  Glu
Glu  Glu  Lys  Asn  Arg  Leu  Asn  Phe  Leu  Lys
Lys  Ile  Ser  Gln  Arg  Tyr  Gln  Lys  Phe  Ala
Leu  Pro  Gln  Tyr  Leu  Lys  Thr  Val  Tyr  Gln
His  Gln  Lys  Ala  Met  Lys  Pro  Trp  Ile  Gln
Pro  Lys  Thr  Lys  Val  Ile  Pro  Tyr  Val  Arg
Tyr  Leu                
となる。
【００２２】
本発明において、そのペプチドは、以下の配列：
LysValIleProTyrValArgTyrLeu;
ThrLysValIleProTyrValArgTyrLeu;
LysThrLysValIleProTyrValArgTyrLeu;
ProLysThrLysValIleProTyrValArgTyrLeu;
GlnProLysThrLysValIleProTyrValArgTyrLeu;
AlaMetLysProTrpIleGlnProLysThrLysValIleProTyrValArgTyrLeu;
ThrValTyrGlnHisGlnLysAlaMetLysProTrpIleGlnProLysThrLysValIleProTyrValArgTyrLeu;および
ProGlnTyrLeuLysThrValTyrGlnHisGlnLysAlaMetLysProTrpIleGlnProLysThrLysValIleProTyrValArgTyrLeu
から選択されるアミノ酸配列を含むことが好ましい。
【００２３】
これらの配列はすべて、ウシα−Ｓ２カゼイン前駆物質のＣ末端の最後の９アミノ酸を含む。本発明の発明者らは、このＣ末端配列、ＬｙｓＶａｌＩｌｅＰｒｏＴｙｒＶａｌＡｒｇＴｙｒＬｅｕを組み込んだペプチド配列が、特に顕著な老化防止活性を示すことを見出した。このように、本発明の特に好ましい態様では、ポリペプチドは、配列ＬｙｓＶａｌＩｌｅＰｒｏＴｙｒＶａｌＡｒｇＴｙｒＬｅｕを含むウシα−Ｓ２カゼイン断片を含む。上記で言及された他の特に好ましい配列は、ウシα−Ｓ２カゼイン前駆物質のＣ末端の最後の１０、１１、１２および１３アミノ酸を含む。これらのアミノ酸は、ヤギおよびヒツジα−Ｓ２カゼイン前駆物質の最後の７アミノ酸とも同じであり、特にそれらのＣ末端において、これらのタンパク質間での類似度が確認される。
【００２４】
また、ウシα−Ｓ２カゼイン前駆物質のＣ末端からの酸配列を含むが、最後の４つのＣ末端アミノ酸は含まない（つまり、ＶａｌＡｒｇＴｙｒＬｅｕを含まない）ペプチドもまた本発明においては好ましい。したがって、以下の配列：
LysValIleProTyr;
ThrLysValIleProTyr;
LysThrLysValIleProTyr;
ProLysThrLysValIleProTyr;
GlnProLysThrLysValIleProTyr;
AlaMetLysProTrpIleGlnProLysThrLysValIleProTyr;
ThrValTyrGlnHisGlnLysAlaMetLysProTrpIleGlnProLysThrLysValIleProTyr;
ProGlnTyrLeuLysThrValTyrGlnHisGlnLysAlaMetLysProTrpIleGlnProLysThrLysValIleProTyr.
もまた好ましい。
【００２５】
上記で強調されるように、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサギおよびブタ由来α−Ｓ２カゼイン前駆物質のＣ末端配列の間に、高度の相同性が存在する。そのＣ末端配列は種ごとに異なるが、重要な類似性が存在することが、これらのカゼインの配列から明らかである。したがって、ウシα−Ｓ２カゼイン前駆物質断片が本発明において使用するのに好ましいが、所望の場合には、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサギおよびブタα−Ｓ２カゼイン断片または他の種由来の同様な断片を用いてもよい。
【００２６】
ヤギ、ヒツジ、ウサギおよびブタ由来のα−Ｓ２カゼイン前駆物質の配列を以下に示す。
［ＣＡＳ２  ＣＡＰＨ１］  α−Ｓ２カゼイン前駆物質（α−Ｓ２−ＣＮ）
配列：
MKFFIFTCLL  AVALAKHKME  HVSSSEEPIN  IFQEIYKQEK  NMAIHPRKEK  LCTTSCEEVV
RNANEEEYSI  RSSSEESAEV  APEEIKITVD  DKHYQKALNE  INQFYQKFPQ  YLQYPYQGPI
VLNPWDQVKR  NAGPFTPTVN  REQLSTSEEN  SKKTIDMEST  EVFTKKTKLT  EEEKNRLNFL
KKISQYYQKF  AWPQYLKTVD  QHQKAMKPWT  QPKTNAIPYV  RYL  223
＞ｐｉｒ｜Ｓ３３８８１｜Ｓ３３８８１  α−Ｓ２カゼインＥ−ヤギ
配列：
MKFFIFTCLL  AVALAKHKME  HVSSSEEPIN  IFQEIYKQEK  NMAIHPRKEK  LCTTSCEEVV
RNANEEEYSI  RSSSEESAKV  APEEIKITVD  DKHYQKALNE  INQFYQKFPQ  YLQYPYQGPI
VLNPWDQVKR  NAGPFTPTVN  REQLSTSEEN  SKKTIDMEST  EVFTKKTKLT  EEEKNRLNFL
KKISQYYQKF  AWPQYLKTVD  QHQKAMKPWT  QPKTNAIPYV  RYL  223
＞ｇｐ｜Ｓ７４１７１｜Ｓ７４１７１＿１  α−Ｓ２カゼインＣ−ヤギ属腋毛
配列：
MKFFIFTCLL  AVALAKHKME  HVSSSEEPIN  IFQEIYKQEK  NMAIHPRKEK  LCTTSCEEVV
RNANEEEYSI  RSSSEESAEV  APEEIKITVD  DKHYQKALNE  INQFYQKFPQ  YLQYPYQGPI
VLNPWDQVKR  NAGPFTPTVN  REQLSTSEEN  SKKTIDMEST  EVFTKKTKLT  EEEKNRLNFL
KIISQYYQKF  AWPQYLKTVD  QHQKAMKPWT  QPKTNAIPYV  RYL  223
＞ｐｉｒ｜Ｓ３９７７６｜Ｓ３９７７６  α−Ｓ２カゼインｂ型前駆物質−ウサギ
＞ｇｐ｜Ｘ７６９０９｜ＯＣＰＡＳ２ＢＣＳ＿１  プレ−α−Ｓ２ｂカゼイン（ＡＡ−１５〜１６７）アナウサギ属疥癬トンネル
配列：
MKFFIFTCLL  AVALAKPKIE  QSSEETIAV  SQEVSPNLEN  ICSTACEEPI  KNINEVEYVE
VPTEIKDQEF  YQKVNLLQYL  QALYQYPTVM  DPWTRAETKA  IPFIRTMQYK  QEKDATKHTS
QKTELTEEEK  AFLKYLDEMK  QYYQKFVFPQ  YLKNAHHFQK  TMNPWNHVKT  IIYQVPTSL  179
［ＣＡＳ２＿ＳＨＥＥＰ］  α−Ｓ２カゼイン前駆物質−ヒツジ
配列：
MKFFIFTCLL  AVALAKHKME  HVSSSEEPIN  ISQEIYKQEK  NMAIHPRKEK  LCTTSCEEVV
RNADEEEYSI  RSSSEESAEV  APEEVKITVD  DKHYQKALNE  INQFYQKFPQ  YLQYLYQGPI
VLNPWDQVKR  NAGPFTPTVN  REQLSTSEEN  SKKTIDMEST  EVFTKKTKLT  EEEKNRLNFL
KKISQYYQKF  AWPQYLKTVD  QHQKAMKPWT  QPKTNAIPYV  RYL  223
［ＣＡＳ２＿ＰＩＧ］  α−Ｓ２カゼイン前駆物質−ブタ
配列：
MKFFIFTCLL  AVAFAKHEME  HVSSSEESIN  ISQEKYKQEK  NVINHPSKED  ICATSCEEAV
RNIKEVGYAS  SSSSEESVDI  PAENVKVTVE  DKHYLKQLEK  ISQFYQKFPQ  YLQALYQAQI
VMNPWDQTKT  SAYPFIPTVI  QSGEELSTSE  EPVSSSQEEN  TKTVDESME  EFTKKTELTE
EEKNRIKFLN  KIKQYYQKFT  WPQYIKTVHQ  KQKAMKPWNH  IKTNSYQIIP  NLRYF  235
【００２７】
３文字表記では、これらの配列は、以下のようになる。
［ＣＡＳ２  ＣＡＰＨ１］  α−Ｓ２カゼイン前駆物質（α−Ｓ２−ＣＮ）
配列：
Met  Lys  Phe  Ile  Phe  Phe  Thr  Cys  Leu  Leu
Ala  Val  Ala  Leu  Ala  Lys  His  Lys  Met  Glu
His  Val  Ser  Ser  Ser  Gly  Gly  Pro  Ile  Asn
Ile  Phe  Gln  Glu  Ile  Tyr  Lys  Gln  Glu  Lys
Asn  Met  Ala  Ile  His  Pro  Arg  Lys  Glu  Lys
Leu  Cys  Thr  Thr  Ser  Cys  Glu  Glu  Val  Val
Arg  Asn  Ala  Asn  Glu  Glu  Glu  Tyr  Ser  Ile
Arg  Ser  Ser  Ser  Glu  Glu  Ser  Ala  Glu  Val
Ala  Pro  Glu  Glu  Ile  Lys  Ile  Thr  Val  Asp
Asp  Lys  His  Tyr  Gln  Lys  Ala  Leu  Asn  Glu
Ile  Asn  Gln  Phe  Tyr  Gln  Lys  Phe  Pro  Gln
Tyr  Leu  Gln  Tyr  Pro  Tyr  Gln  Gly  Pro  Ile
Val  Leu  Asn  Pro  Trp  Asp  Gln  Val  Lys  Arg
Asn  Ala  Gly  Pro  Phe  Thr  Pro  Thr  Val  Asn
Arg  Glu  Gln  Leu  Ser  Thr  Ser  Glu  Glu  Asn
Ser  Lys  Lys  Thr  Ile  Asp  Met  Glu  Ser  Thr
Glu  Val  Phe  Thr  Lys  Lys  Thr  Lys  Leu  Thr
Glu  Glu  Glu  Lys  Asn  Arg  Leu  Asn  Phe  Leu
Lys  Lys  Ile  Ser  Gln  Tyr  Tyr  Gln  Lys  Phe
Ala  Trp  Pro  Gln  Tyr  Leu  Lys  Thr  Val  Asp
Gln  His  Gln  Lys  Ala  Met  Lys  Pro  Trp  Thr
Gln  Pro  Lys  Thr  Asn  Ala  Ile  Pro  Tyr  Val
Arg  Tyr  Leu              
＞ｐｉｒ｜Ｓ３３８８１｜Ｓ３３８８１  α−Ｓ２カゼインＥ−ヤギ
配列：
Met  Lys  Phe  Phe  Ile  Phe  Thr  Cys  Leu  Leu
Ala  Val  Ala  Leu  Ala  Lys  His  Lys  Met  Glu
His  Val  Ser  Ser  Ser  Glu  Glu  Pro  Ile  Asn
Ile  Phe  Gln  Glu  Ile  Tyr  Lys  Gln  Glu  Lys
Asn  Met  Ala  Ile  His  Pro  Arg  Lys  Glu  Lys
Leu  Cys  Thr  Thr  Ser  Cys  Glu  Glu  Val  Val
Arg  Asn  Ala  Asn  Glu  Glu  Glu  Tyr  Ser  Ile
Arg  Ser  Ser  Ser  Glu  Glu  Ser  Ala  Lys  Val
Ala  Pro  Glu  Glu  Ile  Lys  Ile  Thr  Val  Asp
Asp  Lys  His  Tyr  Gln  Lys  Ala  Leu  Asn  Glu
Ile  Asn  Gln  Phe  Tyr  Gln  Lys  Phe  Pro  Gln
Tyr  Leu  Gln  Tyr  Pro  Tyr  Gln  Gly  Pro  Ile
Val  Leu  Asn  Pro  Trp  Asp  Gln  Val  Lys  Arg
Asn  Ala  Gly  Pro  Phe  Thr  Pro  Thr  Val  Asn
Arg  Glu  Gln  Leu  Ser  Thr  Ser  Glu  Glu  Asn
Ser  Lys  Lys  Thr  Ile  Asp  Met  Glu  Ser  Thr
Glu  Val  Phe  Thr  Lys  Lys  Thr  Lys  Leu  Thr
Glu  Glu  Glu  Lys  Asn  Arg  Leu  Asn  Phe  Leu
Lys  Lys  Ile  Ser  Gln  Tyr  Tyr  Gln  Lys  Phe
Ala  Trp  Pro  Gln  Tyr  Leu  Lys  Thr  Val  Asp
Gln  His  Gln  Lys  Ala  Met  Lys  Pro  Trp  Thr
Gln  Pro  Lys  Thr  Asn  Ala  Ile  Pro  Tyr  Val
Arg  Tyr  Leu              
＞ｇｐ｜Ｓ７４１７１｜Ｓ７４１７１＿１  α−Ｓ２カゼインＣ−ヤギ属腋毛
配列：
Met  Lys  Phe  Phe  Ile  Phe  Thr  Cys  Leu  Leu
Ala  Val  Ala  Leu  Ala  Lys  His  Lys  Met  Glu
His  Val  Ser  Ser  Ser  Glu  Glu  Pro  Ile  Asn
Ile  Phe  Gln  Glu  Ile  Tyr  Lys  Gln  Glu  Lys
Asn  Met  Ala  Ile  His  Pro  Arg  Lys  Glu  Lys
Leu  Cys  Thr  Thr  Ser  Cys  Glu  Glu  Val  Val
Arg  Asn  Ala  Asn  Glu  Glu  Glu  Tyr  Ser  Ile
Arg  Ser  Ser  Ser  Glu  Glu  Ser  Ala  Glu  Val
Ala  Pro  Glu  Glu  Ile  Lys  Ile  Thr  Val  Asp
Asp  Lys  His  Tyr  Gln  Lys  Ala  Leu  Asn  Glu
Ile  Asn  Gln  Phe  Tyr  Gln  Lys  Phe  Pro  Gln
Tyr  Leu  Gln  Tyr  Pro  Tyr  Gln  Gly  Pro  Ile
Val  Leu  Asn  Pro  Trp  Asp  Gln  Val  Lys  Arg
Asn  Ala  Gly  Pro  Phe  Thr  Pro  Thr  Val  Asn
Arg  Glu  Gln  Leu  Ser  Thr  Ser  Glu  Glu  Asn
Ser  Lys  Lys  Thr  Ile  Asp  Met  Glu  Ser  Thr
Glu  Val  Phe  Thr  Lys  Lys  Thr  Lys  Leu  Thr
Glu  Glu  Glu  Lys  Asn  Arg  Leu  Asn  Phe  Leu
Lys  Ile  Ile  Ser  Gln  Tyr  Tyr  Gln  Lys  Phe
Ala  Trp  Pro  Gln  Tyr  Leu  Lys  Thr  Val  Asp
Gln  His  Gln  Lys  Ala  Met  Lys  Pro  Trp  Thr
Gln  Pro  Lys  Thr  Asn  Ala  Ile  Pro  Tyr  Val
Arg  Tyr  Leu              
＞ｐｉｒ｜Ｓ３９７７６｜Ｓ３９７７６  α−Ｓ２カゼインｂ型前駆物質−ウサギ
＞ｇｐ｜Ｘ７６９０９｜ＯＣＰＡＳ２ＢＣＳ＿１  プレ−α−Ｓ２ｂカゼイン（ＡＡ−１５〜１６７）アナウサギ属疥癬トンネル
配列：
Met  Lys  Phe  Phe  Ile  Phe  Thr  Cys  Leu  Leu
Ala  Val  Ala  Leu  Ala  Lys  Pro  Lys  Ile  Glu
Gln  Ser  Ser  Ser  Glu  Glu  Thr  Ile  Ala  Val
Ser  Gln  Glu  Val  Ser  Pro  Asn  Leu  Glu  Asn
Ile  Cys  Ser  Thr  Ala  Cys  Glu  Glu  Pro  Ile
Lys  Asn  Ile  Asn  Glu  Val  Glu  Tyr  Val  Glu
Val  Pro  Thr  Glu  Ile  Lys  Asp  Gln  Glu  Phe
Tyr  Gln  Lys  Val  Asn  Leu  Leu  Gln  Tyr  Leu
Gln  Ala  Leu  Tyr  Gln  Tyr  Pro  Thr  Val  Met
Asp  Pro  Trp  Thr  Arg  Ala  Glu  Thr  Lys  Ala
Ile  Pro  Phe  Ile  Arg  Thr  Met  Gln  Tyr  Lys
Gln  Glu  Lys  Asp  Ala  Thr  Lys  His  Thr  Ser
Gln  Lys  Thr  Glu  Leu  Thr  Glu  Glu  Glu  Lys
Ala  Phe  Leu  Lys  Tyr  Leu  Asp  Glu  Met  Lys
Gln  Tyr  Tyr  Gln  Lys  Phe  Val  Phe  Pro  Gln
Tyr  Leu  Lys  Asn  Ala  His  His  Phe  Gln  Lys
Thr  Met  Asn  Pro  Trp  Asn  His  Val  Lys  Thr
Ile  Ile  Tyr  Gln  Ser  Val  Pro  Thr  Leu  
［ＣＡＳ２＿ＳＨＥＥＰ］  α−Ｓ２カゼイン前駆物質−ヒツジ
配列：
Met  Lys  Phe  Phe  Ile  Phe  Thr  Cys  Leu  Leu
Ala  Val  Ala  Leu  Ala  Lys  His  Lys  Met  Glu
His  Val  Ser  Ser  Ser  Glu  Glu  Pro  Ile  Asn
Ile  Ser  Gln  Glu  Ile  Tyr  Lys  Gln  Glu  Lys
Asn  Met  Ala  Ile  His  Pro  Arg  Lys  Glu  Lys
Leu  Cys  Thr  Thr  Ser  Cys  Glu  Glu  Val  Val
Arg  Asn  Ala  Asp  Glu  Glu  Glu  Tyr  Ser  Ile
Arg  Ser  Ser  Ser  Glu  Glu  Ser  Ala  Glu  Val
Ala  Pro  Glu  Glu  Val  Lys  Ile  Thr  Val  Asp
Asp  Lys  His  Tyr  Gln  Lys  Ala  Leu  Asn  Glu
Ile  Asn  Gln  Phe  Tyr  Gln  Lys  Phe  Pro  Gln
Tyr  Leu  Gln  Tyr  Leu  Tyr  Gln  Gly  Pro  Ile
Val  Leu  Asn  Pro  Trp  Asp  Gln  Val  Lys  Arg
Asn  Ala  Gly  Pro  Phe  Thr  Pro  Thr  Val  Asn
Arg  Glu  Gln  Leu  Ser  Thr  Ser  Glu  Glu  Asn
Ser  Lys  Lys  Thr  Ile  Asp  Met  Glu  Ser  Thr
Glu  Val  Phe  Thr  Lys  Lys  Thr  Lys  Leu  Thr
Glu  Glu  Glu  Lys  Asn  Arg  Leu  Asn  Phe  Leu
Lys  Lys  Ile  Ser  Gln  Tyr  Tyr  Gln  Lys  Phe
Ala  Trp  Pro  Gln  Tyr  Leu  Lys  Thr  Val  Asp
Gln  His  Gln  Lys  Ala  Met  Lys  Pro  Trp  Thr
Gln  Pro  Lys  Thr  Asn  Ala  Ile  Pro  Tyr  Val
Arg  Tyr  Leu              
［ＣＡＳ２＿ＰＩＧ］  α−Ｓ２カゼイン前駆物質−ブタ
配列：
Met  Lys  Phe  Phe  Ile  Phe  Thr  Cys  Leu  Leu
Ala  Val  Ala  Phe  Ala  Lys  His  Glu  Met  Glu
His  Val  Ser  Ser  Ser  Glu  Glu  Ser  Ile  Asp
Ile  Ser  Gln  Glu  Lys  Tyr  Lys  Gln  Glu  Lys
Asn  Val  Ile  Asn  His  Pro  Ser  Lys  Glu  Asp
Ile  Cys  Ala  Thr  Ser  Cys  Glu  Glu  Ala  Val
Arg  Asn  Ile  Lys  Glu  Val  Glu  Tyr  Ala  Ser
Ser  Ser  Ser  Ser  Glu  Glu  Ser  Val  Asp  Ile
Pro  Ala  Glu  Asn  Val  Lys  Val  Thr  Val  Glu
Asp  Lys  His  Tyr  Leu  Lys  Gln  Leu  Glu  Lys
Ile  Ser  Gln  Phe  Tyr  Gln  Lys  Phe  Pro  Gln
Tyr  Leu  Gln  Ala  Leu  Tyr  Gln  Ala  Gln  Ile
Val  Met  Asn  Pro  Trp  Asp  Gln  Thr  Lys  Thr
Ser  Ala  Tyr  Pro  Phe  Ile  Pro  Thr  Val  Ile
Gln  Ser  Gly  Glu  Glu  Leu  Ser  Thr  Ser  Glu
Glu  Pro  Val  Ser  Ser  Ser  Gln  Glu  Glu  Asn
Thr  Lys  Thr  Val  Asp  Met  Glu  Ser  Met  Glu
Glu  Phe  Thr  Lys  Lys  Thr  Glu  Leu  Thr  Glu
Glu  Glu  Lys  Asn  Arg  Ile  Lys  Phe  Leu  Asn
Lys  Ile  Lys  Gln  Tyr  Tyr  Gln  Lys  Phe  Thr
Trp  Pro  Gln  Tyr  Ile  Lys  Thr  Val  His  Gln
Lys  Gln  Lys  Ala  Met  Lys  Pro  Trp  Asn  His
Ile  Lys  Thr  Asn  Ser  Tyr  Gln  Ile  Ile  Pro
Asn  Leu  Arg  Tyr  Phe          
【００２８】
さらに、いくつかのアミノ酸の性質が相互に類似しているために、配列の機能に影響を及ぼすことなくいくつかのアミノ酸を交換することが可能である。したがって、ロイシン、イソロイシンおよびバリンを交換することができる。さらに、チロシンおよびフェニルアラニンも交換することができ、アルギニンおよびリジンも同様に交換できる。
【００２９】
ここで本発明をさらに詳細に説明する。本発明は好ましくは、α−Ｓ２カゼイン前駆物質断片、さらに好ましくは、皺など皮膚の老化の影響を低減するための、例えば化粧品としての、好ましくはクリームまたはローションにおける、ＷＯ９７／１６４６０に記載のペプチドに関する。本発明は好ましくは、ヒトの皮膚に適用可能であるが、所望の場合には、一般に哺乳動物の皮膚など他の皮膚に適用してもよい。
【００３０】
本発明は、歯周病の予防薬または治療薬として使用される上記のα−Ｓ２カゼイン前駆物質断片にも関する。これは好ましくは、ヒトにおけるかかる病気に関するが、所望の場合には一般に哺乳動物の歯肉におけるかかる疾患に適用してもよい。その薬剤は、局所剤（例えば、歯および／または歯肉を清掃するための練り歯磨き）またはチューインガムなどの、適切な形状である。
【００３１】
このペプチドは、純粋な産物として使用してもよいし、または便利なことには、疎水性相互作用クロマトグラフィー段階に関しては（を含む）ＷＯ９７／１６４６０に記載の以下のプロトコルによって乳から濃縮天然製剤として提供される。代替方法としては、チーズホエイを酸性（ミルク）ホエイの代わりに使用してもよい。
【００３２】
このペプチドは、単独で、または局所組成物、練り歯磨き、もしくはチューインガムを配合するのに有用である許容可能な（場合によっては薬学的に許容される）誘導体および／または賦形剤と組み合わせて、使用することができる。局所剤の添加剤としては、例えば、保湿剤および／または皮膚に有益な他の物質、例えば、皮膚の老化を防ぐ／逆行させるのに有利な効果をもたらすために使用される、ビタミンＡ、Ｃ、ＤおよびＥのすべてまたはいずれかなど、が挙げられる。
【００３３】
理論にこだわらずにいえば、本発明の基本は、このペプチドが、線維芽細胞、特に皮膚線維芽細胞におけるフィブリリンの産生を刺激することであると考えられる。これは、老化した皮膚の真皮表皮接合部の近位に、フィブリリン豊富なミクロフィブリル網状構造を回復させると考えられる。このように、このペプチドは、老化した（特に光老化した）皮膚におけるフィブリリンの欠損を修復することができる。
【００３４】
本発明において使用されるペプチドはウシの乳において、他の種におけるEGFと、同等の役割を果たすと思われる。本発明の発明者らは驚くべきことに、これらのペプチドが抗歯周病剤および老化防止剤として有効であり、かつ公知の製品よりも有効であることを発見した。本発明で使用されるペプチドのその他の利点は、それらはＥＧＦと同様な有効性を有するか、またはＥＧＦより優れているのと同時に、「天然製品」（乳由来の）とみなされ、本質的に完全なタンパク質ではないために、アレルゲン性ではないことである。
【００３５】
本発明において、そのペプチド、またはそのペプチドの誘導体を、皮膚の老化の影響を緩和または防止するのに有効な薬物の製造に使用することができ、そのペプチドは、α−Ｓ２カゼイン断片活性を有する。したがって、このペプチドは、上記で詳細に説明されるようにα−Ｓ２カゼイン前駆物質断片であるか、または相同体などの同様な活性を有する関連分子であり得る。このペプチドは特に、光老化に対して有効である。本発明の文脈において、皮膚の光老化とは、紫外線および／または太陽光への累積的な暴露の影響、または一方、経時的な老化と、紫外線および／または太陽光への累積的な暴露との組み合わせの影響を意味する。通常、それは、大皺および小皺、色素沈着異常、血色の悪さ、および良性および悪性腫瘍の形成によって臨床的に現れる。皺形成のメカニズムは完全に理解されていないが、理論に束縛されずにいえば、糖タンパク質フィブリリンが重要であると考えられる。フィブリリンは、真皮乳頭におけるエラスチン網状構造の主要成分であり、基底膜域の完全性を維持するのに重要な役割を担う。本発明は、フィブリリンの産生を刺激することによって、基底膜域を修復する方法に関する。
【００３６】
本発明において、ペプチド、またはペプチドの誘導体は、歯周病の緩和または予防に有効な薬物の製造に使用することもでき、そのペプチドは、α−Ｓ２カゼイン断片活性を有する。従って、関連する態様においては、そのペプチドは、上記で詳細に記載されるようにα−Ｓ２カゼイン前駆物質断片であるか、または相同体などの同様な活性を有する関連分子であり得る。
【００３７】
本発明で使用されるペプチドは、線維芽細胞の成長を刺激することができることが好ましい。そのペプチドが、コラーゲンを産生するように線維芽細胞を刺激することができることもまた好ましい。そのペプチドが、ケラチノサイトにおける成長を刺激することができることがさらに好ましい。
【００３８】
更なる態様において、本発明は、線維芽細胞におけるフィブリリンの産生を刺激することによって、皮膚における老化の影響を緩和または防止するための美容的方法または医学的方法を提供し、その方法は、対象をペプチドで処置することを含み、そのペプチドは、α−Ｓ２カゼイン前駆物質中に存在するアミノ酸配列を含み、前記配列は３個以上のアミノ酸を含み、全長α−Ｓ２カゼイン前駆物質のＮ末端アミノ酸をそのＮ末端に含まない。そのペプチドは好ましくは、上記で詳細に説明される特定のペプチドであるが、その代わりとして、α−Ｓ２カゼイン前駆物質断片、または相同体などの同様な活性を有する関連分子であってもよい。
【００３９】
また更なる態様では、本発明は、ペプチドまたはペプチドの誘導体を含む、線維芽細胞によるフィブリリンの産生を刺激する局所組成物を提供し、そのペプチドは、α−Ｓ２カゼイン前駆物質中に存在するアミノ酸配列を含み、前記配列は３個以上のアミノ酸を含み、全長α−Ｓ２カゼイン前駆物質のＮ末端アミノ酸をそのＮ末端に含まない。そのペプチドは好ましくは、上記で詳細に説明される特定のペプチドであるが、その代わりとして、α−Ｓ２カゼイン前駆物質断片、または相同体などの同様な活性を有する関連分子であってもよい。
【００４０】
関連する態様において、本発明は、線維芽細胞によるフィブリリンの産生を刺激することによって、歯周病を緩和または予防する医薬組成物であって、ペプチドまたはペプチドの誘導体を含有する医薬組成物を提供し、そのペプチドは、α−Ｓ２カゼイン前駆物質中に存在するアミノ酸配列を含み、前記配列は３個以上のアミノ酸を含み、全長α−Ｓ２カゼイン前駆物質のＮ末端アミノ酸をそのＮ末端に含まない。さらにまた、そのペプチドは好ましくは、上記で詳細に説明される特定のペプチドであるが、その代わりとして、α−Ｓ２カゼイン前駆物質断片、または相同体などの同様な活性を有する関連分子であってもよい。
【００４１】
一例として、以下の詳細な実施形態を参照して、本発明をさらに説明する。
【実施例】
【００４２】
実施例１−チーズホエイからの標準化天然製品の製造
この手順は、チーズホエイから標準化天然製品（Ｓｔａｎｄａｒｄｉｓｅｄ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔ）（ＳＮＰ）の回収、製造および保存の方法に関するものである。通常、この手順は、ＳＮＰの小規模製造に、例えば研究および開発の目的に用いられる。しかしながら、その手順は、公知の技術に従って商業生産に望ましいようにスケールアップすることができる。
チーズホエイの回収および保存
約４０リットルの新鮮な清澄化チーズホエイをＤｅｗＬａｙチーズ製造工場（ガースタング、ランカシャー）から入手した。そのホエイは、清潔な容器内に回収され、直ちにＰｅｐｓｙｎ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（リバプール）に輸送された。
【００４３】
ホエイは、翌日に加工するために冷蔵されるか、または必要となるまで２リットルの浅い容器内で−２０℃にて凍結された。
【００４４】
チーズホエイの解凍
プラスチック製バッグに２リットルブロックのホエイを入れ、流れる熱水中にそれを浸漬することによって、凍結したホエイを解凍した。解凍は１０分未満で終了し、融解したホエイの温度を１０℃未満に維持した。
【００４５】
塩析
濃ＨＣｌを用いて、ホエイのｐＨを３．０に調整した。ホエイ１リットルにつき、攪拌しながら、（ＮＨ４）２Ｓ０４（ＢＤＨ，ＡｎａｌａＲグレード）２２０ｇを攪拌しながら３０分間かけてゆっくりと添加した。攪拌せず、さらに１時間３０分平衡化し、次いで、操作温度４〜１０℃に予め平衡化させておいた、ＳｏｒｖａｌｌＲＣ−ＳＢ遠心機およびそれに付随するＧＳ−３ローター（ＤｕＰｏｎｔ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を使用して、９０００ｒｐｍで４０分間遠心した。回収した上清１リットルごとに、（ＮＨ４）２Ｓ０４１３０ｇを添加し、平衡化させ、上述のように遠心した。上清を廃棄し、ペレットを蒸留水に再溶解した（最初のホエイ１リットルごとに４００ｍｌ）。流れる水道水に対して、分画分子量（ＭＷＣＯ）１２，０００〜１４，０００ダルトンの透析チューブ（Ｍｅｄｉｃｅｌｌ  Ｉｎｔ．Ｌｔｄ，英国）を用いて、これを一晩透析し、次いで、緩衝液を１回装入して、ｐＨ６．０の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で７時間透析した。透析されたソルトカット（salt-cut）を回収し、翌日に加工するために冷蔵するか、または必要となるまで凍結した（−２０℃）。
【００４６】
陽イオン交換クロマトグラフィー
透析されたチーズホエイ・ソルトカット（cheese  whey  salt  cut）を、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）の移動相を有する陽イオン交換クロマトグラフィーに４℃でかけた。グラディエントミキサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｍｉｘｅｒ  ＧＭ−１）によって提供される１００〜７００ｍＭ  ＮａＣｌの直線塩勾配を用いて、タンパク質を溶出した。ＵＶモニター（Ｕｖｉｃｏｒｄ  Ｓ  ＩＩ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を使用して２８０ｎｍで作業の進行状況をモニターした。
【００４７】
ＣＭ５２カルボキシメチル（Ｗｈａｔｍａｎ社）を用いて、陽イオン交換カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＸＫ５０シリーズ、内径５０ｍｍ）を充填層高さ１５ｃｍに作製した。これを緩衝液５００ｍｌで平衡化した。透析されたチーズホエイ・ソルトカット（４００ｍｌ）をカラムに流量２．５ｍｌ／分で充填し、次いで、流量約０．５ｍｌ／分にて５０ｍＭ  ＮａＣｌの緩衝液５００ｍｌで一晩洗浄した。直線勾配１００〜７００ｍＭのＮａＣｌの緩衝液５００ｍｌを２．０ｍｌ／分で適用し、画分を２５ｍｌ毎に回収し、経時的に番号を付けた。次いで、そのカラムを２Ｍ  ＮａＣｌの緩衝液３００ｍｌで洗浄した。回収された画分を成長促進活性について試験した。これは通常、ラクトフェリンを含有する画分番号１１および１２で観察され、これらの直前および直後の画分においても観察された（図１参照）。ラクトフェリンは画分に茶色の外観を与えるため、次いでこれは、活性の可視的マーカーとして使用された。回収された画分それぞれにおけるＮａＣｌの平均推定濃度を表１に示す。次のクロマトグラフィー段階に必要となるまで、すべての画分を凍結した。
【００４８】
【表１】
2005531539.tif 000002
注：カラム入口と出口の間には、約１００ｍｌの排除体積があった。したがって、画分１〜４は、洗浄緩衝液からの５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有した。
【００４９】
疎水性相互作用クロマトグラフィー
陽イオン交換クロマトグラフィーからの活性画分を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）にかけた。２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）の移動相を用いて、これを室温で行った。グラディエントミキサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｍｉｘｅｒ  ＧＭ−１）によって提供される４〜０Ｍ  ＮａＣｌの直線塩勾配を用いて、タンパク質を溶出した。ＵＶモニター（Ｕｖｉｃｏｒｄ  Ｓ  ＩＩ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を使用して２８０ｎｍで作業の進行状況をモニターした。
【００５０】
ブチルセファロース４ファーストフロー（Ｂｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いて、充填層高さ１５ｃｍとなるように、ＨＩＣカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｃシリーズ、内径２６ｍｍ）を作製した。４Ｍ  ＮａＣｌの緩衝液２５０ｍｌで流量０．２５ｍｌ／分にて、カラムを一晩平衡化した。
【００５１】
数回の陽イオン交換クロマトグラフィーの操作から得られる活性画分を合わせてプールし、試料１００〜２００ｍｌを得た。この試料中のＮａＣｌ平均濃度を、構成画分におけるＮａＣｌの推定濃度から算出した。次いで、固体ＮａＣｌを試料にゆっくりと加え、３．７Ｍとし、ｐＨを６．５に調整した。カラムに２．０ｍｌ／分で試料を充填した。溶出勾配４Ｍ〜０ＭのＮａＣｌ  ５００ｍｌを適用し、画分を２５ｍｌ毎に回収し、経時的に番号を付けた。次いで、そのカラムを緩衝液２５０ｍｌで洗浄し、続いて水２５０ｍｌで洗浄した。
【００５２】
回収した画分を成長促進活性について試験した。これは通常、茶色のラクトフェリン画分の直前に溶出される画分である、画分番号１０〜１３において観察された（図２参照）。活性画分をプールし、蒸留水に対して広範に透析し、凍結乾燥させた。
【００５３】
実施例２−ＳＮＰがヒトにおいてｉｎ  ｖｉｖｏにてフィブリリン合成を増加することについての実証
この実施例によって、本発明で用いられるペプチドが、ｉｎ  ｖｉｖｏでフィブリリンの交換を刺激し、光老化した皮膚の修復を助けることが示されている。したがって、このペプチドは臨床的有効性を有する。
【００５４】
この実験は、光老化した皮膚におけるフィブリリンおよびＩ型プロコラーゲンの発現の変化を測定するために、カゼインペプチド（ＳＮＰ３６μｇ／水１ｍｌ；ＳＮＰは、実施例１に従って製造された）の局所適用を含む。閉塞のみ（Occlusion-only）の対照についてもまた実験した。
【００５５】
パッチ試験対照
健康ではあるが、光老化したボランティア１０名を募集した（男性：７名；女性：３名；年齢範囲３７〜７７歳）。直径６ｍｍの標準フィンチャンバーの下で、前腕の伸筋側に、試験物質を別々に適用した：これらはカゼインペプチド（ＳＮＰ３６μｇ／水１ｍｌ）および閉塞（occluded）基準対照であった。４日間処置した後、フィンチャンバーを除去し、リグノカイン麻酔１体積％下にて、各試験部位から、３ｍｍパンチバイオプシーを採取した。各バイオプシーを液体窒素中で急速凍結させ、組織学的評価のために処理した。バイオプシー部位を１×４／ｏエチロンで縫合し、縫合を除去するために、７日後に戻ってくるように対象に指示した。
【００５６】
免疫組織化学によるフィブリリンの検討
凍結切片を厚さ１０μｍに作製した（ＯＴＦクリオスタット、Ｂｒｉｇｈｔ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ．）。患者１名当たり、１部分につき３つの切片を以下のように処理し、光学顕微鏡によってフィブリリン豊富なミクロフィブリル網状構造を同定した。
【００５７】
パラホルムアルデヒド４体積％のリン酸緩衝液で切片を固定した（１０分間）。トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ；１００ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中で水和した後、５体積％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００（登録商標）を添加することによって、切片を可溶化した（１０分間）。洗浄した後、メタノール中で過剰な過酸化水素と共にインキュベートすることによって（３０分間）、内因性ペルオキシダーゼ活性を消失させた。次いで、すべての切片を、希釈度１：１００で、一次抗体（マウス抗ヒトフィブリリン−１、クローン１１Ｃ１．３；ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ社、米国カリフォルニア州）を適用する前に、１体積％正常ウマ血清＋１体積％ウシ血清アルブミンでブロックした。ネガティブコントロールとして、１体積％正常ウマ血清＋１体積％ウシ血清アルブミンでのブロックだけか、または希釈度１：１００で対照マウス血清と共に同時にインキュベートした。インキュベート後、ウマ抗マウスＩｇＧビオチン化二次抗体の適用前に、切片をＴＢＳでストリンジェントに洗浄した。これをさらに市販のキット（ＡＢＣ  Ｅｌｉｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｖｅｃｔｒｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、英国、ピーターバラ）を使用して、以下のような製造元の説明書にしたがって、酵素ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合させた。色素原として３’，３’−ジアミノベンズアジンを用いて（１０分のインキュベーション）、抗体を局在化した。ＴＢＳで洗浄することによって、この反応をクエンチした。ヌクレアーファーストレッド（nuclear  fast  red）を用いて切片を対比染色し、最後に一連のアルコールによって脱水し、明瞭にし、永久的に標本にした。
【００５８】
切片を無作為化し、ブラインドし、ニコンＯＰＴＩＰＨＯＴ顕微鏡（日本、東京）で調べた。免疫染色の程度を５ポイントの半定量的スケールで評価した（０＝染色なし、４＝最高染色）。対象１名につき１部位で４つの切片（対照を含む）を調べた。１部位あたり３つの高倍率視野について、免疫染色の程度をスコアリングし、平均スコアを各部位／試験領域に対して算出した。
【００５９】
試験部位間での、および様々な期間の試験物質の適用後の、フィブリリンタンパク質の分布の差を、分散分析試験（ＡＮＯＶＡ；ＳＰＳＳ＋ｖｌＯ．０、ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．、米国イリノイ州）を用いて有意性について評価した。
【００６０】
ボランティアの大多数が、カゼインパッチ試験プロトコルに十分に耐え；１０名のうち個人１名のみが、カゼイン適用部位に圧痛を訴えた。カゼインペプチドパッチによって、７／１０の個体において、真皮／表皮接合部（基底膜）の近位にフィブリリン−１の沈着が生じた（圧痛を訴えたボランティアは、この試験において３名の「非応答者」の中に含まれた）。
【００６１】
フィブリリンの産生を刺激する公知の物質は、オールトランス型レチノイン酸（ＲＡ）である。しかしながら、この物質の欠点は、適用部位に著しい紅斑が生じることである。上記の対象のいずれも、カゼインの適用後に紅斑を生じず、それによって、オールトランス型レチノイン酸を超えるこの物質の利点が示されている。
【００６２】
個別の性能データを図３に示す。次いで、平均データ／ボランティアをプールし、図４に図示する；すべてのデータは平均＋ＳＥＭで表される。簡潔に言えば、カゼインは、真皮乳頭のフィブリリン豊富なミクロフィブリル網状構造に対して、ベースラインを超える非常にポジティブな効果を有することが見出された（閉塞のみ（occluded）：０．９３＝０．２１；カゼイン適用：１．８６＝０．３９；ｐ＝０．０２３）。
【００６３】
この実施例から、カゼインペプチドの局所適用（閉塞環境（occlusion）下での）は、光老化した真皮−表皮接合部の近位にあるフィブリリン豊富なミクロフィブリル網状構造を回復させることが分かる。これらの結果から、本発明で使用されるカゼインペプチドは、光老化した皮膚におけるフィブリリン欠乏および／または老化した皮膚を修復することができ、かつ明らかな臨床的有用性を有する。
【００６４】
実施例３−ＳＮＰが線維芽細胞においてコラーゲン合成を増加させることについての実証
Ｒａｍａ２７ラット乳細胞をコンフルエンスに成長させ、それらのコラーゲン合成の速度をＭ．Ｊ．Ｗａｒｂｕｒｔｏｎ，Ｓ．Ａ．Ｆｅｒｎｓ，およびＰ．Ｓ．Ｒｕｄｌａｎｄ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３７，３７３−３８０（１９８２）の方法を用いて測定した。ヒドロキシプロリンへの［３Ｈ］プロリンの取り込みによって推定されるコラーゲン合成速度は、以下の表２に示す。
【００６５】
【表２】
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ＳＮＰ０．６ｍｇ／ｍｌまでを添加することによって、コラーゲンの分泌が５４ｃｐｍから６６３ｐｐｍへと約１２倍増加する。また、これによって、分泌される合成コラーゲンと、細胞中に保持されるコラーゲンとの比が、約２倍−５４：５３（１：１）から６６３：３２１（２：１）となる。
【００６６】
実施例４−ケラチノサイトの成長に対するＳＮＰの効果の実証
ケラチノサイト成長培地（ＴＣＳ  Ｃｅｌｌｗｏｒｋｓ  Ｌｔｄ．）において、ヒトケラチノサイト（ＨａｔＫａｔ）を２０％コンフルエンスになるまで成長させた。次いで、同じ培地中で、ケラチノサイトを０．５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）と共に３日間成長させた。その時点で、細胞をコールター（登録商標）カウンターで計数した。得られた細胞数を以下の表３に示す。
【００６７】
【表３】
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【００６８】
このことから、ＳＮＰの存在によって、ケラチノサイトの成長が２３，７７７から６８，７１９へと、約３倍増加することが示されている。これは、１０ｎｇ／ｍｌＥＧＦを使用した場合の比較的少なめな増加と比較される。これらの結果から、本発明において使用されるペプチドのコラーゲン産生活性および成長促進活性がはっきりと実証されている。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】透析されたチーズホエイ・ソルトカット（cheese  whey  salt  cut）で行われた陽イオン交換カラムクロマトグラフィーによる実験の結果を示す図である。
【図２】陽イオン交換クロマトグラフィーからの活性画分で行われた疎水性相互作用カラムクロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図３】排除（occluded）対照と比較した、本発明のペプチドで処置されたヒトボランティア１０名におけるフィブリリンの産生を示す図である。
【図３Ａ】排除（occluded）対照と比較した、本発明のペプチドで処置されたヒトボランティア１０名におけるフィブリリンの産生を示す図である。
【図３Ｂ】排除（occluded）対照と比較した、本発明のペプチドで処置されたヒトボランティア１０名におけるフィブリリンの産生を示す図である。
【図４】この研究の相当するプール解析を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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