(57)【要約】本発明は、生存に十分な最小遺伝子セットをコードするナノマシンを含む、自律的原栄養性ナノマシンのための基礎的遺伝子操作システムを提供する。栄養素要求性生体分子の存在下での生存に十分なミニ遺伝子セットをコードするナノマシンゲノムを含む自律的栄養素要求性ナノマシンのための基礎的遺伝子操作システムもまた提供される。基礎的遺伝子操作システムによってコードされる最小遺伝子セットは、転写、翻訳、好気性代謝、解糖／ピルビン酸デヒドロゲナーゼ／ペントースリン酸経路、炭水化物代謝、中心的中間代謝、ヌクレオチド代謝、輸送および結合タンパク質、ならびにハウスキーピング機能の機能的カテゴリーを含み得る。機能的カテゴリーは、所定の物理的または時間的順序で配列され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生存に十分な最小遺伝子セットをコードするナノマシンゲノムを含む、自律的原栄養性ナノマシンのための基礎的遺伝子操作システム。
【請求項２】
請求項１に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、前記最小遺伝子セットが、転写、翻訳、好気性代謝、解糖／ピルビン酸デヒドロゲナーゼ／ペントースリン酸経路、炭水化物代謝、中心的中間代謝、ヌクレオチド代謝、輸送および結合タンパク質、ならびにハウスキーピング機能の機能的カテゴリーをさらに含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項３】
請求項２に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、前記ナノマシンゲノムが、転写、翻訳、好気性代謝、および解糖／ピルビン酸デヒドロゲナーゼ／ペントースリン酸経路を含む前記機能的カテゴリーの合成を、相対的順序で指向する、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項４】
請求項３に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、前記相対的順序が、相対的な時間的順序をさらに含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項５】
請求項３に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、前記相対的順序が、相対的な物理的な順序をさらに含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項６】
請求項１に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、ＭＧ００８、ＭＧ００９、ＭＧ０５６、ＭＧ２２１、ＭＧ３３２、ＭＧ４４８またはＭＧ４４９、これらのオルソログもしくは非オルソログ遺伝子置換体からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を欠いている最小遺伝子セットをさらに含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項７】
請求項１に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、前記ナノマシンゲノムが、約１４０キロベース（ｋｂ）未満の大きさをさらに含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項８】
請求項１に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、前記生存のために十分な最小遺伝子セットが、約１５２以下のファンダメンタル遺伝子をさらに含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項９】
請求項８に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、前記ファンダメンタル遺伝子が、転写遺伝子カテゴリーの約１４個の遺伝子、翻訳遺伝子カテゴリーの約９０個の遺伝子、好気性代謝遺伝子カテゴリーの約１３個の遺伝子、解糖／ピルビン酸デヒドロゲナーゼ／ペントースリン酸経路遺伝子カテゴリーの約１６個の遺伝子、炭水化物遺伝子カテゴリーの約３個の遺伝子、中心的中間代謝遺伝子カテゴリーの約３個の遺伝子、ヌクレオチド代謝遺伝子カテゴリーの約２個の遺伝子、輸送／結合タンパク質遺伝子カテゴリーの約１０個の遺伝子、およびハウスキーピング機能遺伝子カテゴリーの約１個の遺伝子をさらに含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項１０】
請求項８に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、前記約１５２個以下のファンダメンタル遺伝子が、図１に示される遺伝子、そのオルソログまたは非オルソログ遺伝子置換体に示される遺伝子と実質的に同じファンダメンタル遺伝子をさらに含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項１１】
請求項１に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、複製遺伝子カテゴリーから選択される１つ以上の遺伝子をさらに含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項１２】
請求項１に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、翻訳遺伝子カテゴリー、中心的中間代謝遺伝子カテゴリー、ヌクレオチド代謝遺伝子カテゴリー、ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）遺伝子カテゴリー、シグナル伝達調節遺伝子カテゴリー、輸送／結合タンパク質遺伝子カテゴリー、粒子分割遺伝子カテゴリー、シャペロン系遺伝子カテゴリー、脂肪酸／脂質代謝遺伝子カテゴリー、粒子エンベロープ遺伝子カテゴリーおよびハウスキーピング機能遺伝子カテゴリーからなる群より選択される１つ以上の遺伝子をさらに含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項１３】
請求項１に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、生体分子の産生のための発現制御領域をさらに含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項１４】
請求項１３に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、前記生体分子が、ＲＮＡをさらに含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項１５】
請求項１３に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、前記生体分子が、ポリペプチドをさらに含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項１６】
自律的原栄養性の生存および粒子エンベロープのための基礎的遺伝子操作システムを含む、自律的原栄養性ナノマシン。
【請求項１７】
請求項１６に記載の自律的原栄養性ナノマシンであって、前記粒子エンベロープが、膜をさらに含む、自律的原栄養性ナノマシン。
【請求項１８】
請求項１６に記載の自律的原栄養性ナノマシンであって、前記粒子エンベロープが、生体適合性材料をさらに含む、自律的原栄養性ナノマシン。
【請求項１９】
請求項１６に記載の自律的原栄養性ナノマシンであって、前記基礎的遺伝子操作システムが、生体分子の産生のための発現制御領域をさらに含む、自律的原栄養性ナノマシン。
【請求項２０】
請求項１９に記載の自律的原栄養性ナノマシンであって、前記生体分子が、さらにＲＮＡをさらに含む、自律的原栄養性ナノマシン。
【請求項２１】
請求項１９に記載の自律的原栄養性ナノマシンであって、前記生体分子が、さらにポリペプチドをさらに含む、自律的原栄養性ナノマシン。
【請求項２２】
栄養素要求性生体分子の存在下での生存に十分なミニ遺伝子セットをコードするナノマシンゲノムを含む自律的栄養素要求性ナノマシンのための基礎的遺伝子操作システム。
【請求項２３】
請求項２２に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、前記最小遺伝子セットが、転写、翻訳、好気性代謝、解糖／ピルビン酸デヒドロゲナーゼ／ペントースリン酸経路、炭水化物代謝、中心的中間代謝、ヌクレオチド代謝、輸送および結合タンパク質、ならびにハウスキーピング機能の機能的カテゴリーをさらに含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項２４】
請求項２３に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、前記ナノマシンゲノムが、転写、翻訳、好気性代謝、および解糖／ピルビン酸デヒドロゲナーゼ／ペントースリン酸経路を含む前記機能的カテゴリーの合成を、相対的順序で指向する、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項２５】
請求項２４に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、前記相対的順序が、相対的な時間的順序をさらに含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項２６】
請求項２４に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、前記相対的順序が、相対的な物理的な順序をさらに含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項２７】
請求項２２に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、ＭＧ００８、ＭＧ００９、ＭＧ０５６、ＭＧ２２１、ＭＧ３３２、ＭＧ４４８またはＭＧ４４９、これらのオルソログもしくは非オルソログ遺伝子置換体からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を欠いている最小遺伝子セットをさらに含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項２８】
請求項２２に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、前記ナノマシンゲノムが、約１４０キロベース（ｋｂ）未満の大きさをさらに含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項２９】
請求項２２に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、前記生存のために十分な最小遺伝子セットが、約１５１以下のファンダメンタル遺伝子をさらに含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項３０】
請求項２９に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、前記ファンダメンタル遺伝子が、転写遺伝子カテゴリーの約１４個の遺伝子、翻訳遺伝子カテゴリーの約９０個の遺伝子、好気性代謝遺伝子カテゴリーの約１３個の遺伝子、解糖／ピルビン酸デヒドロゲナーゼ／ペントースリン酸経路遺伝子カテゴリーの約１６個の遺伝子、炭水化物遺伝子カテゴリーの約３個の遺伝子、中心的中間代謝遺伝子カテゴリーの約３個の遺伝子、ヌクレオチド代謝遺伝子カテゴリーの約２個の遺伝子、輸送／結合タンパク質遺伝子カテゴリーの約１０個の遺伝子、およびハウスキーピング機能遺伝子カテゴリーの約１個の遺伝子からなるファンダメンタル遺伝子の最小遺伝子セットから選択される少なくとも１つの非機能性遺伝子をさらに含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項３１】
請求項２９に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、前記約１５１個以下のファンダメンタル遺伝子が、図１に示される遺伝子、そのオルソログまたは非オルソログ遺伝子置換体に示される遺伝子と実質的に同じファンダメンタル遺伝子をさらに含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項３２】
請求項２２に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、複製遺伝子カテゴリーから選択される１つ以上の遺伝子をさらに含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項３３】
請求項２２に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、翻訳遺伝子カテゴリー、中心的中間代謝遺伝子カテゴリー、ヌクレオチド代謝遺伝子カテゴリー、ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）遺伝子カテゴリー、シグナル伝達調節遺伝子カテゴリー、輸送／結合タンパク質遺伝子カテゴリー、粒子分割遺伝子カテゴリー、シャペロン系遺伝子カテゴリー、脂肪酸／脂質代謝遺伝子カテゴリー、粒子エンベロープ遺伝子カテゴリーおよびハウスキーピング機能遺伝子カテゴリーからなる群より選択される１つ以上の遺伝子をさらに含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項３４】
請求項２２に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、生体分子の産生のための発現制御領域をさらに含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項３５】
請求項３４に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、前記生体分子が、ＲＮＡをさらに含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項３６】
請求項３４に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、前記生体分子が、ポリペプチドをさらに含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項３７】
自律的栄養素要求性ナノマシンであって、自律的栄養素要求性生体分子および粒子エンベロープの存在下で自律的栄養素要求性生存のための基礎的遺伝子操作システムを備える、自律的栄養素要求性ナノマシン。
【請求項３８】
前記粒子エンベロープが、膜をさらに含む、請求項３７に記載の自律的栄養素要求性ナノマシン。
【請求項３９】
前記粒子エンベロープが、生体適合性材料をさらに含む、請求項３７に記載の自律的栄養素要求性ナノマシン。
【請求項４０】
前記基礎的遺伝子操作システムが、生体分子の産生のための発現制御領域をさらに含む、請求項３７に記載の自律的栄養素要求性ナノマシン。
【請求項４１】
前記生体分子が、ＲＮＡをさらに含む、請求項４０に記載の自律的栄養素要求性ナノマシン。
【請求項４２】
前記生体分子が、ポリペプチドをさらに含む、請求項４０に記載の自律的栄養素要求性ナノマシン。
【請求項４３】
自律的原栄養性ナノマシンのための基礎的遺伝子操作システムであって、該システムは、自律的原栄養性複製にとって十分である最小遺伝子セットをコードするナノマシンゲノムを含み、該ナノマシンゲノムは、複製、転写、翻訳、好気性代謝、および解糖／ピルビン酸デヒドロゲナーゼ／ペントースリン酸経路を含む機能的カテゴリの相対的順序で該最小遺伝子セットの合成を指向する、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項４４】
請求項４３に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、前記最小遺伝子セットの前記機能的カテゴリが、炭化水素代謝、中心的中間代謝、ヌクレオチド代謝、シグナル伝達調節、輸送タンパク質および結合タンパク質、粒子分割、シャペロンシステム、脂肪酸／脂質代謝、粒子エンベロープ、およびハウスキーピング機能をさらに含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項４５】
前記相対的順序が、相対的時間順序を含む、請求項４３に記載の基礎的遺伝子操作システム。
【請求項４６】
前記相対的順序が、相対的物理順序をさらに含む、請求項４３に記載の基礎的遺伝子操作システム。
【請求項４７】
前記相対的物理順序が、複製起点に対する相対的順序をさらに含む、請求項４６に記載の基礎的遺伝子操作システム。
【請求項４８】
双方向性順序をさらに含む、請求項４３に記載の基礎遺伝的操作システム。
【請求項４９】
生体分子の産生のための発現制御領域をさらに含む、請求項４３に記載の基礎的遺伝子操作システム。
【請求項５０】
自律的原栄養性ナノマシンのための基礎的遺伝子操作システムであって、該システムは、自律的原栄養性複製にとって十分である最小遺伝子セットをコードするナノマシンゲノムを含み、該最小遺伝子セットは、ＭＧ００８、ＭＧ００９、ＭＧ０５６、ＭＧ２２１、ＭＧ２６２、ＭＧ３３２、ＭＧ４４８もしくはＭＧ４４９、それらのオルソログもしくは非オルソログ遺伝子置換体からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を欠く、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項５１】
請求項５０に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、ここで、前記最小遺伝子セットが、複製、転写、翻訳、好気性代謝、解糖／ピルビン酸デヒドロゲナーゼ／ペントースリン酸経路、炭化水素代謝、中心的中間物代謝、ヌクレオチド代謝、シグナル伝達調節、輸送、および結合タンパク質、粒子分割、シャペロンシステム、脂肪酸／脂質代謝、粒子エンベロープ、およびハウスキーピング機能の機能的カテゴリを含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項５２】
請求項５０に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、該システムは、以下：
ＭＧ０２０、ＭＧ０２２、ＭＧ０３４、ＭＧ０３９、ＭＧ０４１、ＭＧ０４６、ＭＧ０５１、ＭＧ０６１、ＭＧ０６２、ＭＧ１０８、ＭＧ１２１、ＭＧ１２９、ＭＧ１８３、ＭＧ１８８、ＭＧ３６８、ＭＧ４２９およびそれらのオルソログまたは非オルソログ遺伝子置換体
からなる群より選択される１以上の遺伝子をさらに含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項５３】
生体分子の産生のための発現調節領域をさらに含む、請求項５０に記載の基礎的遺伝子操作システム。
【請求項５４】
自律的栄養原性ナノマシンのための基礎的遺伝子操作システムであって、該自律的栄養原性ナノマシンは、自律的栄養原性複製を指向するのに十分な最小遺伝子セットをコードするナノマシンゲノムを含み、該ナノマシンゲノムは、サイズにして約２５０キロベース（ｋｂ）未満である、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項５５】
請求項５４に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、ここで、前記最小遺伝子セットが、複製、転写、翻訳、好気性代謝、解糖／ピルビン酸デヒドロゲナーゼ／ペントースリン酸経路、炭化水素代謝、中心的中間物代謝、ヌレクオチド代謝機能、シグナル伝達調節機能、輸送機能、および結合タンパク質機能、粒子分割機能、シャペロンシステム機能、脂肪酸／脂質代謝機能、粒子エンベロープ機能、およびハウスキーピングからなる群より選択される機能的カテゴリをさらに含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項５６】
約２４７以下のファンダメンタル遺伝子をさらに含む、請求項５４に記載の基礎的遺伝子操作システム。
【請求項５７】
請求項５６に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、ここで、前記ファンダメンタル遺伝子が、複製遺伝子カテゴリ中の約２４個の遺伝子、転写遺伝子カテゴリ中の約１４個の遺伝子、翻訳遺伝子カテゴリ中の約９４個の遺伝子、好気性代謝遺伝子カテゴリ中の約１３個の遺伝子、解糖／ピルビン酸デヒドロゲナーゼ／ペントースリン酸経路遺伝子カテゴリ中の約１６個の遺伝子、炭化水素代謝遺伝子カテゴリ中の約３個の遺伝子、中心的中間物代謝遺伝子カテゴリ中の約１３個の遺伝子、ヌクレオチド代謝遺伝子カテゴリ中の約１８個の遺伝子、シグナル伝達調節遺伝子カテゴリ中の約４個の遺伝子、輸送／結合タンパク質遺伝子カテゴリ中の約２３個の遺伝子、粒子分割機能遺伝子カテゴリ中の約４個の遺伝子、シャペロンシステム遺伝子として約１１個の遺伝子、脂肪酸／脂質代謝遺伝子カテゴリ中の約３個の遺伝子、粒子エンベロープ遺伝子カテゴリ中の約３個の遺伝子、およびハウスキーピング遺伝子カテゴリ中の約４個の遺伝子をさらに含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項５８】
請求項５６に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、前記約２４７以下のファンダメンタル遺伝子が、図２に示されるのと実質的に同じ基礎遺伝子、それらのオルソログまたは非オルソログ置換体をさらに含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項５９】
請求項５７に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、翻訳遺伝子カテゴリ、転写遺伝子カテゴリ、ヌクレオチド代謝遺伝子カテゴリ、ホスホトランスフェラーゼシステム（ＰＴＳ）遺伝子カテゴリおよび脂肪酸／脂質代謝遺伝子カテゴリからなる群より選択される１個以上の遺伝子をさらに含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項６０】
請求項５９に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、該遺伝子操作システムは、以下：
ＭＧ０２０、ＭＧ０２２、ＭＧ０３４、ＭＧ０３９、ＭＧ０４１、ＭＧ０４６、ＭＧ０５１、ＭＧ０６１、ＭＧ０６２、ＭＧ１０８、ＭＧ１２１、ＭＧ１２９、ＭＧ１８３、ＭＧ１８８、ＭＧ３６８、ＭＧ４２９、およびそれらのオルソログまたは非オルソログ遺伝子置換体
からなる群より選択される１個以上の遺伝子をさらに含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項６１】
生体分子の産生のための発現制御領域をさらに含む、請求項５４に記載の基礎的遺伝子操作システム。
【請求項６２】
自律的栄養原性ナノマシンのための基礎的遺伝子操作システムであって、該システムは、約２４７以下の基礎遺伝子の自律的栄養原性複製のための十分な遺伝子セットをコードするナノマシンゲノムを含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項６３】
請求項６２に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、前記基礎遺伝子が、複製遺伝子カテゴリ中の約２４個の遺伝子、転写遺伝子カテゴリ中の約１４個の遺伝子、翻訳遺伝子カテゴリ中の約９４個の遺伝子、好気性代謝遺伝子カテゴリ中の約１３個の遺伝子、解糖／ピルビン酸デヒドロゲナーゼ／ペントースリン酸経路遺伝子カテゴリ中の約１６個の遺伝子、炭化水素代謝遺伝子カテゴリ中の約３個の遺伝子、中心的中間物代謝遺伝子カテゴリ中の約１３個の遺伝子、ヌクレオチド代謝遺伝子カテゴリ中の約１８個の遺伝子、シグナル伝達調節遺伝子カテゴリ中の約４個の遺伝子、輸送／結合タンパク質機能遺伝子カテゴリ中の約２３個の遺伝子、粒子分割機能遺伝子カテゴリ中の約４個の遺伝子、シャペロンシステム遺伝子として約１１個の遺伝子、脂肪酸／脂質代謝遺伝子カテゴリ中の約３個の遺伝子、粒子エンベロープ遺伝子カテゴリ中の約３個の遺伝子、およびハウスキーピング機能遺伝子カテゴリ中の約４個の遺伝子をさらに含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項６４】
請求項６２に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、前記約２４７以下の基礎遺伝子が、図２に示されるのと実質的に同じ基礎遺伝子、それらのオルソログまたは非オルソログ置換体をさらに含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項６５】
請求項６２に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、翻訳遺伝子カテゴリ、転写遺伝子カテゴリ、ヌクレオチド代謝遺伝子カテゴリ、ホスホトランスフェラーゼシステム（ＰＴＳ）遺伝子カテゴリおよび脂肪酸／脂質代謝遺伝子カテゴリからなる群より選択された１以上の遺伝子をさらに含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項６６】
請求項６３に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、該システムは、以下：
ＭＧ０２０、ＭＧ０２２、ＭＧ０３４、ＭＧ０３９、ＭＧ０４１、ＭＧ０４６、ＭＧ０５１、ＭＧ０６１、ＭＧ０６２、ＭＧ１０８、ＭＧ１２１、ＭＧ１２９、ＭＧ１８３、ＭＧ１８８、ＭＧ３６８、ＭＧ４２９、およびそれらのオルソログまたは非オルソログ遺伝子置換体
からなる群より選択される１以上の遺伝子をさらに含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項６７】
生体分子の産生のための発現制御領域をさらに含む、請求項６２に記載の基礎的遺伝子操作システム。
【請求項６８】
自律的栄養原性複製および粒子エンベロープのための基礎的遺伝子操作システムを含む、自律的栄養原性ナノマシン。
【請求項６９】
前記粒子エンベロープが、膜をさらに含む、請求項６８に記載の自律的栄養原性ナノマシン。
【請求項７０】
前記粒子エンベロープが、生体適合性物質をさらに含む、請求項６８に記載の自律的栄養原性ナノマシン。
【請求項７１】
前記遺伝子操作システムが、生体分子の産生のための発現制御領域をさらに含む、請求項６８に記載の自律的栄養原性ナノマシン。
【請求項７２】
前記生体分子はＲＮＡをさらに含む、請求項７１に記載の自律的栄養性ナノマシン。
【請求項７３】
前記生体分子はポリペプチドをさらに含む、請求項７１に記載の自律的原栄養性ナノマシン。
【請求項７４】
栄養素要求性生体分子の存在下での自律的複製のために十分な最小遺伝子セットをコードするナノマシンゲノムを含む、自律的栄養素要求性ナノマシンのための基礎的遺伝子操作システムであって、該ナノマシンゲノムは、複製、転写、翻訳、好気性代謝および解糖／ピルビン酸デヒドロゲナーゼ／ペントースリン酸経路を含む機能的カテゴリの相対的順序で該最小遺伝子セットの合成を指向する、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項７５】
請求項７４に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、前記最小遺伝子セットの他の機能的カテゴリは、炭水化物代謝、中心的中間体代謝、ヌクレオチド代謝、シグナル伝達調節、輸送タンパク質および結合タンパク質、粒子分割、シャペロンシステム、脂肪酸／脂質代謝、粒子エンベロープおよびハウスキーピング機能をさらに含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項７６】
前記相対的順序が、相対的時間順序をさらに含む、請求項７４に記載の基礎的遺伝子操作システム。
【請求項７７】
前記相対的順序が、相対的物理順序をさらに含む、請求項７４に記載の基礎的遺伝子操作システム。
【請求項７８】
前記相対的物理順序が、複製起点に対する相対的順序をさらに含む、請求項７７に記載の基礎的遺伝子操作システム。
【請求項７９】
双方向性順序をさらに含む、請求項７４に記載の基礎的遺伝子操作システム。
【請求項８０】
生体分子の産生のための発現制御領域をさらに含む、請求項７４に記載の基礎的遺伝子操作システム。
【請求項８１】
栄養素要求性生体分子の存在下での自律的複製を指向するために十分な最小遺伝子セットをコードするナノマシンゲノムを含む、自律的栄養素要求性ナノマシンのための基礎的遺伝子操作システムであって、該最小遺伝子セットは、ＭＧ００８、ＭＧ００９、ＭＧ０５６、ＭＧ２２１、ＭＧ２６２、ＭＧ３３２、ＭＧ４４８もしくはＭＧ４４９、それらのオルソログまたは非オルソログ遺伝子置換体からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を欠く、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項８２】
請求項８１に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、前記最小遺伝子セットが、複製、転写、翻訳、好気性代謝および解糖／ピルビン酸デヒドロゲナーゼ／ペントースリン酸経路、炭水化物代謝、中心的中間体代謝、ヌクレオチド代謝、シグナル伝達調節、輸送タンパク質および結合タンパク質、粒子分割、シャペロンシステム、脂肪酸／脂質代謝、粒子エンベロープおよびハウスキーピング機能といった機能的カテゴリをさらに含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項８３】
請求項８１に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、ＭＧ０２０、ＭＧ０２２、ＭＧ０３４、ＭＧ０３９、ＭＧ０４１、ＭＧ０４６、ＭＧ０５１、ＭＧ０６１、ＭＧ０６２、ＭＧ１０８、ＭＧ１２１、ＭＧ１２９、ＭＧ１８３、ＭＧ１８８、ＭＧ３６８、ＭＧ４２９、それらのオルソログまたは非オルソログ遺伝子置換体からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子をさらに含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項８４】
請求項８１に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、生体分子の産生のための発現制御領域をさらに含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項８５】
栄養素要求性生体分子の存在下での自律的栄養素要求性複製を指向するために十分な最小遺伝子セットをコードするナノマシンゲノムを含む、自律的栄養素要求性ナノマシンのための基礎的遺伝子操作システムであって、該ナノマシンゲノムは、サイズが約２５０キロベース（ｋｂ）未満である、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項８６】
請求項８５に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、前記最小遺伝子セットが、複製、転写、翻訳、好気性代謝、解糖／ピルビン酸デヒドロゲナーゼ／ペントースリン酸経路、炭水化物代謝、中心的中間体代謝、ヌクレオチド代謝、シグナル伝達調節、輸送タンパク質および結合タンパク質、粒子分割、シャペロンシステム、脂肪酸／脂質代謝、粒子エンベロープおよびハウスキーピング機能からなる群より選択される機能的カテゴリをさらに含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項８７】
請求項８５に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、約２４６個以下のファンダメンタル遺伝子をさらに含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項８８】
請求項８７に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、前記ファンダメンタル遺伝子は、複製遺伝子カテゴリ中の約２４個の遺伝子、転写遺伝子カテゴリ中の約１４個の遺伝子、翻訳遺伝子カテゴリ中の約９４個の遺伝子、好気性代謝遺伝子カテゴリ中の約１３個の遺伝子、解糖／ピルビン酸デヒドロゲナーゼ／ペントースリン酸経路遺伝子カテゴリ中の約１６個の遺伝子、炭水化物代謝遺伝子カテゴリ中の約３個の遺伝子、中心的中間代謝遺伝子カテゴリ中の約１３個の遺伝子、ヌクレオチド代謝遺伝子カテゴリ中の約１８個の遺伝子、シグナル伝達調節遺伝子カテゴリ中の約４個の遺伝子、輸送／結合タンパク質遺伝子カテゴリ中の約２３個の遺伝子、粒子分割遺伝子カテゴリ中の約４個の遺伝子、シャペロンシステム遺伝子カテゴリ中の約１１個の遺伝子、脂肪酸／脂質代謝遺伝子カテゴリ中の約３個の遺伝子、粒子エンベロープ遺伝子カテゴリ中の約３個の遺伝子、およびハウスキーピング機能遺伝子カテゴリ中の約４個の遺伝子からなるファンダメンタル遺伝子の最小遺伝子セットから選択される、少なくとも１つの非機能的遺伝子をさらに含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項８９】
請求項８７に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、前記約２４６個以下のファンダメンタル遺伝子は、図２に示される実質的に同じファンダメンタル遺伝子、そのオルソログまたは非オルソログ置換体をさらに含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項９０】
請求項８８に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、翻訳遺伝子カテゴリ、転写遺伝子カテゴリ、ヌクレオチド代謝遺伝子カテゴリ、ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）遺伝子カテゴリ、および脂肪酸／脂質代謝遺伝子カテゴリからなる群より選択される１つ以上の遺伝子をさらに含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項９１】
請求項９０に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、ＭＧ０２０、ＭＧ０２２、ＭＧ０３４、ＭＧ０３９、ＭＧ０４１、ＭＧ０４６、ＭＧ０５１、ＭＧ０６１、ＭＧ０６２、ＭＧ１０８、ＭＧ１２１、ＭＧ１２９、ＭＧ１８３、ＭＧ１８８、ＭＧ３６８、ＭＧ４２９、それらのオルソログまたは非オルソログ遺伝子置換体からなる群より選択される１つ以上の遺伝子をさらに含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項９２】
請求項８５に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、生体分子の産生のための発現制御領域をさらに含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項９３】
栄養素要求性生体分子の存在下での約２４６個以下のファンダメンタル遺伝子の自律的複製のために十分な最小遺伝子セットをコードするナノマシンゲノムを含む、自律的栄養素要求性ナノマシンのための基礎的遺伝子操作システム。
【請求項９４】
請求項９３に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、前記ファンダメンタル遺伝子は、複製遺伝子カテゴリ中の約２４個の遺伝子、転写遺伝子カテゴリ中の約１４個の遺伝子、翻訳遺伝子カテゴリ中の約９４個の遺伝子、好気性代謝遺伝子カテゴリ中の約１３個の遺伝子、解糖／ピルビン酸デヒドロゲナーゼ／ペントースリン酸経路遺伝子カテゴリ中の約１６個の遺伝子、炭水化物代謝遺伝子カテゴリ中の約３個の遺伝子、中心的中間代謝遺伝子カテゴリ中の約１３個の遺伝子、ヌクレオチド代謝遺伝子カテゴリ中の約１８個の遺伝子、シグナル伝達調節遺伝子カテゴリ中の約４個の遺伝子、輸送／結合タンパク質遺伝子カテゴリ中の約２３個の遺伝子、粒子分割遺伝子カテゴリ中の約４個の遺伝子、シャペロンシステム遺伝子カテゴリ中の約１１個の遺伝子、脂肪酸／脂質代謝遺伝子カテゴリ中の約３個の遺伝子、粒子エンベロープ遺伝子カテゴリ中の約３個の遺伝子、およびハウスキーピング機能遺伝子カテゴリ中の約４個の遺伝子をさらに含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項９５】
請求項９３に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、前記約２４６個以下のファンダメンタル遺伝子は、図２に示される実質的に同じファンダメンタル遺伝子、そのオルソログまたは非オルソログ置換体をさらに含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項９６】
請求項９３に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、翻訳遺伝子カテゴリ、転写遺伝子カテゴリ、ヌクレオチド代謝遺伝子カテゴリ、ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）遺伝子カテゴリおよび脂肪酸／脂質代謝遺伝子カテゴリからなる群より選択される１つ以上の遺伝子をさらに含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項９７】
請求項９４に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、ＭＧ０２０、ＭＧ０２２、ＭＧ０３４、ＭＧ０３９、ＭＧ０４１、ＭＧ０４６、ＭＧ０５１、ＭＧ０６１、ＭＧ０６２、ＭＧ１０８、ＭＧ１２１、ＭＧ１２９、ＭＧ１８３、ＭＧ１８８、ＭＧ３６８、ＭＧ４２９、それらのオルソログまたは非オルソログ遺伝子置換体からなる群より選択される１つ以上の遺伝子をさらに含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項９８】
請求項９３に記載の基礎的遺伝子操作システムであって、生体分子の産生のための発現制御領域をさらに含む、基礎的遺伝子操作システム。
【請求項９９】
栄養素要求性生体分子および粒子エンベロープの存在下での自律的複製のための基礎的遺伝子操作システムを含む、自律的栄養素要求性ナノマシン。
【請求項１００】
前記粒子エンベロープが膜をさらに含む、請求項９９に記載の自律的栄養素要求性ナノマシン。
【請求項１０１】
前記粒子エンベロープが生体適合性材料をさらに含む、請求項９９に記載の自律的栄養素要求性ナノマシン。
【請求項１０２】
請求項９９に記載の自律的栄養素要求性ナノマシンであって、前記基礎的遺伝子操作システムは、生体分子の産生のための発現制御領域をさらに含む、自律的栄養素要求性ナノマシン。
【請求項１０３】
請求項１０２に記載の自律的栄養素要求性ナノマシンであって、前記生体分子は、ＲＮＡをさらに含む、自律的栄養素要求性ナノマシン。
【請求項１０４】
請求項１０２に記載の自律的栄養素要求性ナノマシンであって、前記生体分子は、ポリペプチドをさらに含む、自律的栄養素要求性ナノマシン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に有機生物に関与し、そしてより具体的に、ＤＮＡに基づくナノマシンの構築および操作に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト疾患の診断および処置は、主要な社会の関心であり続けている。健康管理を改善することの重要性は明白であり、個人に影響を及ぼす疾患が存在し続ける限り、このような疾患の診断および処置の試みに加えて、このような疾患原因の理解の試みが存在する。生命の保護は、莫大な量の時間および出費を科学的発見および発達過程に、連続的に投資させ先天的な力である。医学分野の科学的な過程に由来するこれらの結果の適用は、診断および処置において今世紀、そして特に今四半世紀にわたり驚くべき前進を導いている。このような前進は、個人の生涯の質および寿命の両方を改善している。
【０００３】
科学的および医学的の両方におけるそれぞれの分野の貢献がどんなに大きくとも、前進の過程は、緩慢および骨の折れるものであり、一般に階段的な試みおよび誤った仮定に駆り立てられた研究に起因する。さらに、各々の前進より、問題の全体的な科学的な理解は累積的に進行し得るが、発見を実際の医学的適用に移行するのに必要とされる閾が達成される保証はない。加えて、全てを達成しても、過度に多い前進は、特定の生理学的または生化学的な過程の完全な理解と、認知された最終的な解答が、代わって、なおも分析および理解が必要とされる、より複雑な過程の始まりであるという事実を現実化している。
【０００４】
科学的な前進およびこれらの実際的な適用過程のさらなる複雑さは、利用可能な方法論または材料における技術的な限界に起因し得る。各々の発見または前進は、新しい境地に科学の開拓者を推し進め得る。何度も、連続した過程は、新しい境地で研究を続けるために必要な技術的な知識が利用不可能または不十分なことに起因して阻止され得る。それゆえ、科学的な発見および医学的な分野におけるさらなる前進は、より能力の高い技術および材料の登場および開発について、他の分野における進展を待つ必要がある。結果として、実際的な診断的および治療的な適用を有する科学的な前進の過程は、多くのより小さな発見の蓄積、技術の寄与および前進に由来するため、比較的緩慢に生じ得る。
【０００５】
ナノテクノロジーは、発見過程および発達過程への新しい道を開拓し開放、そして医学的診断的分野および治療的分野における新しい次元を達成することを意図する、このような科学的前進の１つである。ナノテクノロジ−は、１〜１００ｎｍ規模のシステムの構築または原子レベルでの物体操作として記載される。医療的な適用のためのナノテクノロジーの未来の推測は、化学結合した生体力学的集合および生物電気学的集合を介して生物化学的な過程を事実上、模倣または調節する小デバイスおよび小機械の生産に直結している。同様に、ナノ構成の構築はまた、これらの正確な物理的特徴およびこれらの分子標的に匹敵するサイズのために、診断的な適用を根本的に変える前進として意図される。
【０００６】
分子操作を介する原子レベルの物質の構築は、５０年前に考えられた技術である。同様に、生物学的材料および非生物学的材料の融合の考えもまた新しいものではない。様々な材料の利用性の拡大により、およびナノスケールレベルでの物体の操作のための物理的方法および化学的方法における前進により、高度に調節され￥単一の特性を有する物体の構築が達成され得る。ナノ構成のこれらの特性を利用することを試みている駆け出しの企業が、現在出現している。ところが、物体操作に対する物理的および化学的試みを除いて、生物学に対するナノテクノロジーの適用は、未だ概念の段階にある。
【０００７】
それゆえ、その潜在的な結果は壮観であるが、当初に想像されていたようなナノテクノロジーは、まだ実現に至っていない。身体を検査および調査する小デバイスおよび小機械についての多数の記載にも関わらず、ナノテクノロジーから生じた唯一の商業的適用は、汚れ防止用表面塗装および着色添加剤であった。ナノテクノロジーの生物学への適用および発達をさえぎる一つの欠点は、単一原子または単一分子からの、正確な小型化のためのボトムアップ合成アプローチが原因である。このようなアプローチは、多大な努力の組み合わせに由来する、精巧かつ発達した技術を必要とする。ところが、多くの結合段階に関して、複雑化したナノデバイスおよび生物化学的な機械の正確な合成のために必要とされる想像された技術は、まだ利用可能でないまたは完全に発達していない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、技術の発達における限界によって妨害されることが無く、物理学的過程および生物化学的な過程を調査し、そして模倣し得る規定された特性を有するナノスケールの構成に対する必要性がある。本発明は、この必要性を満たし、そして加えて関連する利益を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、生存のために十分な最小遺伝子セットをコードするナノマシンゲノムを有する、自律的な原栄養性のナノマシンのための、基礎的遺伝子操作システムを提供する。さらに、栄養素要求性の生物分子の存在中で、生存に十分な最小遺伝子セットをコードするナノマシンゲノムを有する、自律的な栄養素要求性のナノマシンのための、基礎的遺伝子操作システムを提供する。基礎的遺伝子操作システムによってコードされる最小遺伝子セットは、転写、翻訳、好気性代謝、解糖系／ピルビン酸デヒドロゲナーゼ経路／ペントースリン酸経路、炭水化物代謝、中心的中間代謝、ヌクレオチド代謝、輸送タンパク質および結合タンパク質、ならびにハウスキーピング機能の機能的カテゴリーを含み得る。機能的なカテゴリーは、予め決定された物理的順序または時間的順序で配置され得る。原栄養性の自律的生存に十分な基礎的遺伝子操作システムは、約１５２かそれ以下の基本遺伝子の最小遺伝子セット、それらのオーソログまたは非オーソロガス置換体を含み得る。栄養素要求性の生物分子の存在中で、自律的な生存に十分な栄養素要求性の基礎的遺伝子操作システムは、約１５１かそれ以下の基本遺伝子、そのオーソログまたは非オーソロガス置換を含み得る。さらに、生物分子の生産のために発現調節領域を有し得る、自律的原栄養性の生存能または自律的栄養素要求性の生存のために十分な、基礎的遺伝子操作システムを提供する。生存可能な自律的原栄養性のナノマシンおよび自律的栄養素要求性のナノマシンをさらに提供する。
【００１０】
さらに、自律的原栄養性の複製のために十分な最小限の遺伝子をコードするナノマシンゲノムを有する自律的原栄養性のナノマシンのための、基礎的遺伝子操作システムを提供する。また、栄養素要求性の生物分子の存在中で、自律的な複製に十分な最小遺伝子セットをコードする、ナノマシンゲノムを有する、自律的栄養素要求性のナノマシンのための基礎的遺伝子操作システムを提供する。基礎的遺伝子操作システムによってコードされる最小遺伝子セットは、複製、転写、翻訳、好気性代謝、解糖系／ピルビン酸デヒドロゲナーゼ経路／ペントースリン酸経路に相当する機能的カテゴリーの相対的な順序で、最小遺伝子セットを直接的に合成し得る。さらなる機能的カテゴリーは、炭水化物代謝、中心的中間代謝、ヌクレオチド代謝、シグナル伝達調節、輸送タンパク質および結合タンパク質、粒子分割、シャペロンシステム、脂肪酸／脂質代謝、粒子被膜およびハウスキーピング的な機能であり得る。機能的なカテゴリーは、予め決定された物理的順序および時間的順序で配置され得る。自律的な複製に十分な、原栄養性の基本的な遺伝的操作システムは、約２４７かそれ以下の基本遺伝子、そのオーソログまたは非オーソロガス置換を含み得る。栄養素要求性の生物分子の存在中で、自律的複製に十分な栄養素要求性の基礎的遺伝子操作システムは、約２４６かそれ以下の基本遺伝子、そのオーソログまたは非オーソロガス置換を含み得る。また、生物分子の生産のための発現調節領域を有し得る自律的原栄養性の複製または自律的栄養素要求性の複製のために十分な、基礎的遺伝子操作システムを提供する。また、複製能力を有する自律的な原栄養性のナノマシンおよび自律的な栄養素要求性のナノマシンを提供する。
（発明の詳細な説明）
本発明は、核酸ベースの情報によってプログラム化されるかまたは自己産生される生物学的ナノマシンに関する。自律的な存在および操作についての全ての本質的な情報をコードするナノマシンゲノムが、作製され得る。さらに、ナノマシンは、細胞生存によって示される本質的に任意の活性を達成するようにプログラム化され得る。ナノマシンプログラミングは、核酸ベースの情報を介して実行される。本発明の生物学的ナノマシンが、必要とされる成分を自己産生しかつ細胞生存機能を達成するのに十分な全ての機能をコードする遺伝子命令（例えば、遺伝子操作システム）が、作製され得る。本発明の生物学的ナノマシンは、所定の機能を組み込むかまたは改変するためにそれらのゲノムを改変することによって、広範な種々の活性を達成するようにさらにプログラム化され得る。従って、自己産生しかつ補助細胞機能および細胞活性を維持するのに十分なさらなる命令をコードするさらなる遺伝子が、この遺伝子操作システムに加えられえる。変動性は、本発明のナノマシンの１つの利点である。なぜなら、本発明のナノマシンは、最小機能、基礎的な細胞生存機能についてプログラム化され得るか、または広範な種々の複雑な活性をさらに含むようにプログラム化され得るからである。
【００１１】
遺伝子命令、または核酸物質は、通常の細胞機構を使用して読み出され、そして他の核酸、ポリペプチド、高分子または他の有機化合物（これらは、コードされた細胞機能の操作を行う）に変換される。従って、本発明のナノマシンは、構成成分の生合成を介して生産され、そして機能的な生物学的構築物に自己アセンブリする。操作物質の、核酸ベースの情報、生化学的法則および複雑な機構の使用は、複雑なナノ技術の必要性も高度なナノ技術の必要性もなしに、確実に利用され得る。従って、本発明の生物学的ナノマシンの別の利点は、それらが、進化的に選択されそして十分に理解されている、本来の法則および自己アセンブリプロセスを使用するボトムアップ合成によって、産生および維持され得るということである。さらに、核酸によってコードされる情報の使用は、本発明のさらなる利点である。なぜなら、この情報は、生物学的複製プロセスを介して維持され得、そして確実な生合成プロセスを介して構成的ナノマシン成分の産生を指向するように連続的に用いられ得るからである。
【００１２】
１つの実施形態において、本発明は、自律性ナノマシンについての生存力を維持するのに十分である基礎的遺伝子操作システムに関する。基礎的遺伝子操作システムは、自律性ナノマシンの合成および操作を指向するために必要とされる遺伝子プログラミングを含むナノマシンゲノムである。このようなゲノムプログラミングは、自律性ナノマシンのファンダメンタル機能のために必要とされる成分合成を行うのに十分な最小限の遺伝子セットからなる。生存力を支持するのに十分な情報を有する遺伝子の最小限の編集は、例えば、基礎的な細胞プロセスおよび生化学プロセス（例えば、転写、翻訳およびエネルギー生成）、ならびに他の基礎的な細胞恒常性プロセス（例えば、ヌクレオチド代謝、炭水化物代謝、中心的中間代謝およびハウスキーピング機能）を実施するために必要とされる遺伝子を含む。特定の実施形態において、ナノマシン生存力を特定化するこのような基礎的遺伝子操作システムは、約１５２の遺伝子を含む。例えば、治療用ポリペプチドまたは診断用指示薬の生成のための、さらなる遺伝子または遺伝子セットは、この基礎的遺伝子操作システムに組み込まれて、この基礎的遺伝子操作システムによって特定化される活性および操作に加えて、活性および操作を遂行しおよび実行するようにさらにプログラム化されたゲノムを生じ得る。本発明の基礎的遺伝子操作システムはまた、液体ビヒクルまたは他の生物学的に適合性の材料に提供され、本発明の自律性ナノマシンを産生し得る。
【００１３】
別の実施形態において、本発明は、複製能力を有する自律性ナノマシンのための基礎的遺伝子操作システムに関する。複製能力を有するナノマシンのファンダメンタル機能のための成分合成を行うのに十分な最小遺伝子セットは、生存のために必要とされる遺伝子に加えて、例えば、複製、粒子分割、脂肪酸／脂質代謝および粒子エンベロープ成分のために必要とされる遺伝子を含み得る。特定の実施形態において、複製能力を有するナノマシンを特定化するこのような基礎的遺伝子操作システムは、約２４７の遺伝子を含む。さらなる遺伝子プログラミングは、広範な種々の活性および操作のための命令をこのナノマシンゲノムに組み込むことによって自律的複製を指向する、基礎的遺伝子操作システム上にオーバーレイされ得る。従って、複製能力を有するナノマシンは、有用な活性の持続的な実行（例えば、治療用ポリペプチドまたは診断用指示薬の生成）のために、有益に使用され得る。複製能力を特定化する基礎的遺伝子操作システムは、ナノマシンの基礎的遺伝子操作システムから指向および合成される液体二層膜、ならびに液体膀胱または他の生物学的に適合性の材料に与えられ、本発明の複製能力を有する自律性ナノマシンを生成し得る。
【００１４】
別の実施形態において、本発明の自律性ナノマシンは、原栄養菌または栄養素要求性の基礎的遺伝子操作システムでプログラム化され得る。原栄養菌の基礎的遺伝子操作システムを与えるナノマシンは、ナノマシン自律性について全ての必須遺伝子産物をコードするように、遺伝子型の完全なゲノムである。例えば、複製能力を与える基礎的遺伝子操作システムでプログラム化される原栄養菌ナノマシンは、細胞生存形態に類似の複製を維持するのに十分な必須遺伝子産物をコードする。自律性の基礎的遺伝子操作システムを与えるナノマシンは、ナノマシン自律性のために必要とされる少なくとも１つの遺伝子産物に対する不完全なゲノムである。自律性は、その遺伝子産物または生合成中間体をこのナノマシンに外因的に供給することによって、基礎的遺伝子操作システムでプログラム化されたこのような自律性ナノマシンに与えられ得る。
【００１５】
本明細書中で使用される場合、用語「基礎的な（ｂａｓｉｃ）」は、遺伝子操作システムに言及して使用される場合、ナノマシンの自律機能を指向し得る遺伝子の命令（ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）の基本的（ｅｌｅｍｅｎｔａｒｙ）またはファンダメンタルなセットを意味することを意図される。遺伝子の命令の基本的またはファンダメンタルなセットは、例えば、ナノマシンの１つ以上の自律した機能を行うのに必要とされる最小限の数の遺伝子産物をコードする遺伝子の実質的に重複していないセットを含む。実質的に重複していない遺伝子命令は、構造または機能において同程度ではない（ｎｏｎ−ｃｏｅｘｔｅｎｓｉｖｅ）遺伝子または遺伝子セットであり、そして類似であるが機能的に区別可能な遺伝子または遺伝子セットおよびそれらの各遺伝子産物を含む。従って、用語基礎的なとは、ナノマシンのファンダメンタルな活性に必要とされる産物をコードする根底にある遺伝子セットをいう。従って、基礎的な遺伝子システムは、ナノマシンの自律性を指向する本質的な遺伝プログラムを提供する。基礎的なシステムはまた、実行された場合に、種々の他の活性を行い得る、さらなる遺伝プログラムの組み込みを可能にし、これは、例えば、有用な作業を予備形成することまたは有用な分子の産生および生物学的プロセスを指向することを含む。
【００１６】
本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子操作システム」は、核酸にコードされる遺伝プログラムまたは命令セットを意味することを意図され、これは、ナノマシンの１つ以上の自律的機能の操作を制御する。従って、遺伝子操作システムは、ファンダメンタルな活性を提供し、そして機能的自律性を達成するようにこのような活性の調節を指向するナノマシン遺伝子産物を特定する。遺伝子操作システムはまた、ナノマシンの一般的または特化された多数の機能を果たし得るさらなる遺伝プログラムの、組み込みを制御し、そして調節および実行を指向する。このような積み重ね型（ｏｖｅｒｌｙｉｎｇ）または操作システム依存性の遺伝プログラムは、例えば、ナノマシンの非自律性機能を特定する。なぜなら、この遺伝プログラムは、コードされたタスクの開始、実行または完了に不可欠な構成要素または活性を供給する、根底にある基礎的な遺伝子操作システムに依存しているからである。遺伝子操作システムは、単一の自律性ナノマシン機能の制御および操作、ならびに複数の自律性機能（例えば、ナノマシンの生存力（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）、複製および増殖を含む）の制御組み込みおよび操作に十分な遺伝子をコードし得る。
【００１７】
遺伝子操作システムの構造は、ナノマシンの１つ以上の自律的機能の制御および操作に関する十分な遺伝情報をコードする限り、種々の異なる形式で配置され得る。例えば、遺伝子操作システムは、基礎的操作システムの機能性を特定する遺伝子の完全に組み込まれたセットを含有する単一の核酸ゲノムから構成され得る。あるいは、基礎的操作システムの機能性を一緒に特定する２つ以上の核酸ゲノムから構成され得る。同様に、遺伝子操作システムを構成する遺伝子は、コードされる自律性機能の制御および操作を指向する限り、任意の配置でナノマシンゲノムに組み込まれ得る。例えば、成分遺伝子は、線状に、機能的に、または無作為に、遺伝子操作システム内で組織化され得る。同様に、構成性遺伝子は、例えば、当業者に公知の種々の構造的基準または機能的基準により規定されるサブセットから構成され得、そしてこのようなサブセットまたはモジュールは、線状に、機能的にまたは無作為に遺伝子操作システム内で組織化され得る。従って、遺伝子操作システムが自律性ナノマシン機能の制御および操作を実行する遺伝子産物を十分にコードしかつ産生する限り、遺伝子操作システムの構造は、例えば、個々にもしくはモジュール式に組み込まれるか、または線状、機能的もしくは無作為な構成のファンダメンタル遺伝子と共に、単一または複数の成分ゲノムとして配置され得る。
【００１８】
本明細書中で使用される場合、用語「自律（性の）」は、独立した操作を意味することを意図される。独立は、言及されるナノマシンの操作された活性またはそのプロセスに関連して自律性の操作を特徴付けるために使用される。従って、自律性の操作または活性は、この操作された活性または機能と一致する特定の環境を考慮して、それ自体の供給源に対して機能し得る。同様に、自律性の操作または活性は、例えば、言及されるナノマシンの操作または活性に関して、産生、活性、調節またはホメオスタシスのために核酸コード可能な分子の外部供給源の必要なく行われ得る。ナノマシンの自律性操作または活性としては、例えば、生存力、複製、増幅またはタンパク質合成が挙げられる。用語「自律性」は、例えば、生存のための必須栄養素必要条件の外部供給源に対する依存を含むことを意図される。このような必須栄養素必要条件としては、例えば、炭素源、好気性条件のための酸素源、窒素源、および無機化合物が挙げられる。自律性操作はまた、例えば、硫黄源に対する依存を含み得る。
【００１９】
例えば、自律性複製し得る原栄養性（ｐｒｏｔｒｏｔｒｏｐｈｉｃ）ナノマシンは、複製のための必須プロセスを生成および実行するために必要な要求される分子を合成するために十分な核酸コード可能な情報を保有する。従って、複製能力を有する自律性原栄養性ナノマシンは、転写機能、翻訳機能および核酸複製機能を、高分子のようなコード可能な因子のための外部供給源に依存することなく実行し得る。自己自制（ｓｅｌｆ−ｃｏｎｔａｉｎｅｄ）複製は、このような複製能力を有する原栄養性ナノマシンの１つの表現型である。このような原栄養性ナノマシンの遺伝子型は、転写、翻訳、複製およびエネルギー生成の生物学的機能を開始しそして実行するのに必要な必須遺伝子からなる。
【００２０】
同様に、自律性複製し得る栄養素要求性ナノマシンは、１つ以上の栄養素要求性生物学的分子を封入すると共に、複製のための必須プロセスを生成しそして実行するために必要な要求される分子を合成するために十分な核酸コード可能な情報を保有する。従って、複製能力を有する自律性栄養素要求性ナノマシンは、栄養素要求性分子以外のコード可能な因子について外部供給源に依存することなく、転写機能、翻訳機能および核酸複製機能を実行し得る。栄養素要求性分子の存在下での自己自制複製は、このような複製能力を有する栄養素要求性ナノマシンの１つの表現型である。このような栄養素要求性ナノマシンの遺伝子型は、栄養素要求性分子に対応する少なくとも１つの欠損遺伝子、ならびに転写、翻訳、複製およびエネルギー生成の生物学的機能を開始しそして実行するのに必要な他の全ての必須遺伝子から構成される。
【００２１】
本明細書中で使用される場合、用語「原栄養体」または「原栄養性」は、遺伝子型的に完全なナノマシンの言及された表現型に対応する栄養素必要性を有する、ナノマシンまたはその操作を意味することを意図される。ナノマシン、またはその操作は、必要とされる生物学的成分を合成し、そして言及された表現型における操作された活性（単数または複数）を自律的に実行するために、必須遺伝子産物をコードする場合、遺伝型的に完全である。ナノマシンの言及された表現型またはその操作はまた、遺伝子型的に完全なナノマシンの操作または活性を記載するために使用される場合、野生型表現型として言及される。従って、原栄養性ナノマシンは、遺伝子型的に完全なナノマシンの操作された活性（単数または複数）に対応する設計された栄養要件を引用する。
【００２２】
例えば、操作された活性がサルベージ経路を介するアミノ酸合成である場合、遺伝子型的に完全なナノマシンのコードされた必須遺伝子産物は、アミノ酸合成に必要なサルベージ経路酵素からなる。同様に、デノボアミノ酸合成が、操作された活性である場合、遺伝子型的に完全なナノマシンは、全ての２０種の天然に存在するアミノ酸を生化学的に合成するために十分なコードされた遺伝子産物の必要なセットからなる。上記の具体例の両方において、参照表現型は、複製能力を有し得る。前者は、アミノ酸サルベージ合成の操作された活性を有するが、一方後者は、デノボアミノ酸合成の操作された活性を有する。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、用語「栄養素要求体」または「栄養素要求性」は、遺伝子型的に不完全なナノマシンの言及された表現型に対応する栄養素要件を有するナノマシンまたはその操作を意味することを意図される。言及された表現型の操作された活性（単数または複数）の自律性性能に十分な必要とされる生物学的成分の合成のための、少なくとも１つの必須遺伝子産物をコードすることを欠く場合、ナノマシンまたはその操作は、遺伝子型的に不完全である。従って、栄養素要求性ナノマシンは、他の遺伝子型的に完全なナノマシンの操作された活性に対応する、設計された栄養素要件を引用することに加えて、捜査された活性（単数または複数）の自律性性能を回復させ得る、欠損遺伝子産物または下流産物の要件を引用する。
【００２４】
例えば、操作された活性がサルベージ経路を介するヌクレオチド活性であり、そしてナノマシンがプリンに関して栄養素要求性である場合、栄養要件は、プリンまたはプリン前駆体の供給を含む。他の遺伝子型的に完全なナノマシンのコードされた必須遺伝子産物は、プリンサルベージ経路における１つ以上の遺伝子産物を除いて、完全なヌクレオチド合成のために必要とされるサルベージ経路酵素からなる。同様に、デノボヌクレオチド合成が操作された活性である場合、栄養要件は、この経路内の基質もしくは前駆体、または下流産物の供給を含む。他の遺伝子型的に完全なナノマシンは、全ての天然に存在するヌクレオチドを生化学的に合成するのに十分なコードされた遺伝子産物の必要なセットからなる。上記の具体例の両方において、参照表現型は、複製能力であり得る。前者は、ヌクレオチドのサルベージ合成の操作された活性を有するが、一方後者は、デノボヌクレオチド合成の操作された活性を有する。
【００２５】
「栄養素要求性生物学的分子」または「栄養素要求性生体分子」は、本明細書中で使用される場合、ナノマシンの増殖培地または生存環境に供給されたときに、栄養素要求性ナノマシン、またはその操作に対して自律性を回復する分子である。同様に、言及された生合成欠損の原因である遺伝子（単数または複数）は、本明細書中で「栄養素要求性遺伝子」（単数または複数）と呼ばれる。
【００２６】
本明細書中に使用される場合、用語「ナノマシン（ｎａｎｏｍａｃｈｉｎｅ）」は、生化学的機能または生理学的機能を果たすために遺伝学的にプログラムされ得る生化学的ベースの粒子を意味することが意図される。生化学的ベースの粒子は、自然界において見出される分子（例えば、生理学的システムにおける分子を含む）由来の自律的な機能に必要とされる成分を合成し得る集団である。従って、生化学的ベースの粒子はまた、核酸ベースの粒子（ここで、成分合成に必要とされる命令は、核酸にコードされる）も検討され得る。一般に、ナノマシンは、少なくとも基礎の遺伝的操作システムおよび粒子エンベロープを含む。粒子エンベロープは、例えば、物理的隔壁あるいは微環境を制御し得る他の物理的または化学的手段であり得る。これらの粒子エンベロープが、例えば、非ナノマシン成分からナノマシン成分を隔てるのに対して、このファンダメンタルな遺伝的操作システムは、例えば、自律的なナノマシン機能の制御および操作を命令する。ナノマシンはまた、例えば、ナノマシンの多数の一般的なまたは特化された生化学的活性を果たす付加的な遺伝的プログラムを含み得る。ナノマシンの生化学的または生理学的機能は、例えば、粒子バイアビリティ、増殖、複製、転写および翻訳を含み得る。さらに、ナノマシンは、操作の開始前または開始後のいずれかに、種々の付加的な成分を負荷され得、そして依然としてこの用語の意味内に含まれる。ナノマシンの実際の形またはサイズは、生化学的ベースの粒子である限りにおいて変動し得、そして、生化学的作用または生理学的作用を行うために、遺伝的にプログラムされるか、または遺伝的にプログラムされるように作製され得る。
【００２７】
本明細書中に使用される場合、用語「最小の」が遺伝子セットに関連して使用される場合、言及する活性を果たすのに十分であるかまたは適切である実質的に非重複（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ）の遺伝子の閾数（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｎｕｍｂｅｒ）を意味することが意図される。従って、遺伝子の最小のセットとは、言及するナノマシン活性を適切に果たすのに必要とされる遺伝子の最小のセットをいう。例えば、最小の遺伝子セットは、複製または好気的代謝のような言及する機能的カテゴリーに特異的であり得る。あるいは、最小の遺伝子セットは、言及する活性（例えば、複製能力または生存力）の複合機能に指向され得る。遺伝子の閾数は、例えば、少なくとも、言及する遺伝子セットによってコードされるナノマシンの操作または活性の性能に不可欠な遺伝子であり得る。遺伝子の閾数はまた、例えば、遺伝子産物機能において実質的な重複のないプロセスの能力を高め得る他の遺伝子も含み得る。従って、最小の遺伝子セットは、言及する操作または活性を果たすに足る最小限の数の遺伝子であり得るか、あるいは例えば含み得る。
【００２８】
最小遺伝子セットは、１つの種に由来する遺伝子またはさらに異なる少数の種に由来する遺伝子に制限されないと理解される。それどころか、最小遺伝子セットは、同種、異なる関連種、異なる分岐種またはこれらの多様な組み合わせに由来する全ての遺伝子で構成され得る。このような種としては、例えば、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのような原核生物、ならびに酵母、線虫、昆虫、他の無脊椎動物、脊椎動物、哺乳類（げっ歯類、霊長類、およびヒトを含む）のような真核生物が挙げられ得る。最小の遺伝子セットとしては、例えば、Ｆｒａｓｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７０：３９７−４０３（１９９５）；ＭｕｓｈｅｇｉａｎおよびＫｏｏｎｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９３：１０２６８−７３（１９９６）；Ｋｏｏｎｉｎら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．，１２，３３４−３３６（１９９６）；Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６：２１６５−６９（１９９９）、またはＮＣＢＩ、ＵＲＬ  ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／Ｃｏｍｐｌｅｔｅ＿Ｇｅｎｏｍｅｓ／ｍｇｌｉｓｔ（これらの全ては、参考として本明細書中で援用される）に記載されるＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、およびＥ．ｃｏｌｉが挙げられる。ファンダメンタルな遺伝子のセットは、最小遺伝子セットのさらに特殊な例である。
【００２９】
本明細書中に使用される場合、用語「ファンダメンタルな」が遺伝子に関連して使用される場合、言及する活性の性能に重要なまたは必須の遺伝子を意味することが意図される。従って、ファンダメンタルな遺伝子または遺伝子のセットとは、これが無ければ、共役（ｃｏｎｇｎａｔｅ）遺伝子セットまたは遺伝子操作システム全体として、参照されるナノマシン活性を不十分に果たすような遺伝子をいう。ファンダメンタルな遺伝子は、例えば、言及する遺伝子セットによってコードされるナノマシン操作または活性の性能に不可欠な遺伝子を含み得る。ファンダメンタルな遺伝子のセットは、例えば、言及するナノマシン活性を果たすのに重要なまたは十分である実質的に非重複の閾数の遺伝子を含む。従って、ファンダメンタルな遺伝子のセットは、言及する操作または活性を果たすに足る最小限の数の遺伝子から構成される。機能可能なナノマシンおよび複製能のあるナノマシンに関してファンダメンタルな遺伝子セットの具体的な例を、それぞれ図１および図２に示す。
【００３０】
最小の遺伝子セットと同様に、ナノマシンゲノムのファンダメンタルな遺伝子および本発明の遺伝子操作システムは、１つの種に由来する遺伝子またはさらに異なる少数の種に由来する遺伝子に制限されないと理解される。それどころか、ファンダメンタルな遺伝子は、同種、異なる関連種、異なる分岐種またはこれらの多様な組み合わせから得られ得る。同様に、このような種としては、例えば、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのような原核生物、ならびに酵母、線虫、昆虫、他の無脊椎動物、脊椎動物、哺乳類（げっ歯類、霊長類、およびヒトを含む）のような真核生物が挙げられ得る。
【００３１】
同種または異なる種に由来する最小の遺伝子セット中のファンダメンタルな遺伝子は、異なるコドンの使用または優先を示すように改変され得ることもまた理解される。例えば、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ遺伝子に関するコード領域は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型のコドン優先をコードするために変更され得る。このような改変は、基礎の遺伝的操作システムが、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉの生合成環境において機能する場合、有用であり得る。さらに、コドン優先の変更もまた、例えば、ファンダメンタルな遺伝子が異なる２以上の種に起源を持つ場合、有用であり得る。このような例において、１つの種に由来するオルソロガス遺伝子または非オルソロガス遺伝子の置換は、異種コドン優先由来の同一または実質的に同一のポリペプチドをコードするように設計され得る。従って、基礎の遺伝的操作システムまたはゲノム中の全てのファンダメンタルな遺伝子は、所定のコドン使用に標準化され得る。さらに、さらなる改変は、コドン使用において、ゆらぎに合わせておよびそれ故アミノ酸取り込みの頻度に合わせて調整するためになされ得る。遺伝子の機能またはその遺伝子産物の機能に実質的に影響を及ぼさない、当業者に周知のコード化核酸配列に対する他の改変もまた、導入され得る。ファンダメンタルな遺伝子に関連して本明細書中に記載される多様な改変もまた、ナノマシンゲノムに含まれる非ファンダメンタルな遺伝子にも適用されることもまた理解される。
【００３２】
本明細書中に使用される場合、用語「オルソログ」は、垂直降下（ｖｅｒｔｉｃａｌ  ｄｅｓｃｅｎｔ）の関係にあるかあるいは異なる生物において実質的に同一のまたは完全同一の性能を担う遺伝子を意味することが意図される。例えば、マウスエポキシド加水分解酵素およびヒトエポキシド加水分解酵素は、エポキシドの加水分解の生物学的機能についてオルソログであるとみなされ得る。遺伝子は、例えば、同種であることを示すのに十分な量の配列類似性を共有する場合、または共通の祖先からの進化の関係にある場合、垂直降下の関係にある。遺伝子はまた、三次元構造を共有するが、一次配列の類似性が同定不可能な程度まで、共通の祖先から進化したことを示すのに十分な量の配列類似性を必ずしも共有しない場合にも、オルソログであるとみなされ得る。オルソロガスである遺伝子は、約２５％〜１００％アミノ酸配列同一性の配列類似性を有するタンパク質をコードし得る。２５％より小さいアミノ酸類似性を共有するタンパク質をコードする遺伝子もまた、それらの三次元構造も類似性を示す場合は、垂直降下によって生じたとみなし得る。セリンプロテアーゼ酵素ファミリーのメンバー（組織プラスミノゲンアクチベータおよびエラスターゼを含む）は、共通の祖先からの垂直降下によって生じたとみなされ得る。
【００３３】
この用語は、例えば、進化により構造または全体的活性において分岐した遺伝子またはそれらがコードする遺伝子産物を含むことが意図されると理解される。例えば、１つの種が２つの機能を示す遺伝子産物をコードし、そしてこのような機能が第２の種において別個の遺伝子に分類される場合、それらの３つの遺伝子およびそれらに対応する産物は、オルソログであるとみなされる。分類可能な活性を示すオルソログの例は、別個の活性が、２以上の種の間でまたは単一種内で、別個の遺伝子産物に分類される場合である。具体的な例は、セリンプロテアーゼ活性の２つのタイプであるエラスターゼタンパク質分解およびプラスミノゲンタンパク質分解の分類であり、プラスミノゲンアクチベータおよびエラスターゼとして別個の分子に分類される。第２の例としては、マイコプラズマ５’−３’エキソヌクレアーゼ活性およびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ活性の分類である。この１番目の種に由来するＤＮＡポリメラーゼは、２番目の種に由来するエキソヌクレアーゼまたはポリメラーゼの一方または両方に対してオルソログであるとみなされ得、そして逆もまた同じである。
【００３４】
オルソログは、例えば、特有の機能または機能の組み合わせを有する全く新しいポリペプチドを生成するために、異なる種由来のポリペプチドの領域または部分を組み合わせることによっても人工的に生成され得ると理解される。このような領域は、個々に、またはユニークなポリペプチドに組み合わせる場合のいずれかの場合に、垂直降下の関係にあり且つ異なる生物において実質的に同一の機能を担う遺伝子または遺伝子領域に対して、オルソロガスであるとみなされ得る。同様に、領域または部分のユニークな組み合わせもまた、異なるがオルソロガスな領域から生成される第２のユニークな組み合わせに対してオルソログであるとみなされ得る。オルソログまたはオルソロガスな領域の機能としては、当業者に周知の他の活性に加えて、例えば、酵素的、触媒的、シグナル伝達、構造的および力学的な活性が挙げられる。
【００３５】
対照的に、パラログは、例えば、進化的分岐が続く重複により関連するホモログであり、類似または共通であるが同一ではない機能を有する。パラログは、例えば、同種もしくは異種に起源を有し得るかまたは由来し得る。例えば、ミクロソームのエポキシド加水分解酵素（エポキシド加水分解酵素Ｉ）および可溶性エポキシド加水分解酵素（エポキシド加水分解酵素ＩＩ）は、共通の先祖から共進化した２つの異なる（同種において異なる反応を触媒し、また異なる機能を有する）酵素に相当するので、パラログであるとみなし得る。パラログの他の例としては、ヘモグロビン（グロビン）ファミリーのメンバー、セリンプロテアーゼファミリーのメンバー、および免疫グロブリン重鎖遺伝子産物が挙げられる。パラログは、互いに有意な配列類似性を有する同種由来のタンパク質であり、このことは、これらが同種であるか、または共通の先祖からの共進化により関連付けられるタンパク質である。パラログのタンパク質ファミリーの群としては、ＨｉｐＡホモログ、ルシフェラーゼ遺伝子、ペプチダーゼなどが挙げられる。さらに、オルソログおよびオルソロガスな領域と同様に、パラログおよびパラロガスな領域は、例えば、進化上の分岐によって、または遺伝子操作もしくは組換え操作によって、異なる遺伝子および遺伝子産物に、同様に分類され得る。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、用語「非オルソログ遺伝子置換」は、異なる種における参照遺伝子機能を置換し得る、ある種由来の非オルソログ遺伝子を意味することを意図している。置換としては、例えば、異なる種における参照機能と比較して、起源の種において実質的に同一または類似の機能を発揮し得ることが挙げられる。一般的に、非オルソログ遺伝子置換は、参照機能をコードする既知の遺伝子に構造的に関連することで識別可能であるが、それにもかかわらず、構造的な関連性が低いが機能的に類似する遺伝子およびそれらの対応する遺伝子産物は、本明細書中で使用される用語の意味の中に含まれる。例えば、機能的類似性は、置換されることが求められる機能をコードする遺伝子と比較して、活性部位または非オルソログ遺伝子の結合領域において少なくともいくつかの構造的類似性を必要とする。従って、非オルソログ遺伝子は、例えば、パラログまたは非関連遺伝子を含む。
【００３７】
Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ遺伝子ＭＧ２６２は、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅおよび他の種におけるＲＮａｓｅＨによりコードされる機能に対する非オルソログ遺伝子置換の１つの特定の例である。なぜならば、ＭＧ２６２は、ＤＮＡポリメラーゼ５’−３’エキソヌクレアーゼに対する配列同一性を示し、そしてＲＮａｓｅＨに遠く関連するからである。非オルソログ遺伝子置換の他の特定の例としては、例えば、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅおよびＥ．ｃｏｌｉにおけるヌクレオシド二リン酸キナーゼ（Ｎｄｋ）によりコードされる機能について、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ遺伝子ＭＧ２６４およびＭＧ２６８が挙げられる。オルソログおよびパラログと共に、非オルソログ遺伝子置換の遺伝子産物は、本明細書中で使用される用語の意味の中に含まれることが意図される。
【００３８】
オルソログ、パラログ、および非オルソログ遺伝子置換は、当業者に周知の方法により決定され得る。例えば、２つのポリペプチドについての核酸またはアミノ酸配列の調査は、比較される配列間の配列同一性および類似性を明らかにする。このような類似性に基づいて、当業者は、タンパク質が共通祖先からの進化を通じて関連することを示すのに類似性が十分高いか否かを決定し得る。当業者に周知のアルゴリズム（例えば、Ａｌｉｇｎ、ＢＬＡＳＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖなど）は、生の配列類似性または同一性を比較および決定し、そしてまた、ウェイトまたはスコアを割り当てられ得る配列におけるギャップの存在または大きさを決定する。このようなアルゴリズムはまた、当該分野で公知であり、そしてヌクレオチド配列類似性または同一性を決定するのに同様に適用可能である。関連性を決定するのに十分類似するパラメータは、統計的な類似性を算出するための周知の方法、またはランダムポリペプチドにおいて類似の一致を見出す可能性、および決定された一致の有意性に基づいてコンピューター処理される。２つ以上の配列のコンピューター比較もまた、所望の場合、当業者により視覚的に最適化され得る。関連の遺伝子産物またはタンパク質は、高い類似性（例えば、２５％〜１００％の配列同一性）を有すると考えられ得る。関連しないタンパク質は、十分な大きさのデータベースがスキャンされる場合、偶然生じると考えられるのと本質的に同じ同一性を有し得る（約５％）。５％〜２４％の間の配列は、比較配列と関連すると結論付けるのに十分な相同性を示す場合も示さない場合もある。データセットの大きさを考慮してこのような一致の有意性を決定するためのさらなる統計学的分析が、これらの配列の関連性を決定するために実施され得る。
【００３９】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて２つ以上の配列の関連性を決定するための例示のパラメータは、例えば、以下に示され得る。簡単に言うと、アミノ酸配列のアラインメントは、ＢＬＡＳＴＰバージョン２．０．８（Ｊａｎ−０５−１９９９）よび以下のパラメータを用いて実施され得る：マトリックス：０  ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップオープン：１１；ギャップエクステンション：１；ｘ＿ドロップオフ：５０；期待値：１０．０；ワードサイズ：３；フィルタ：オン。核酸配列のアラインメントは、ＢＬＡＳＴＮバージョン２．０．６（Ｓｅｐｔ−１６−１９９９）および以下のパラメータを用いて実施され得る：マッチ：１；ミスマッチ：−２；ギャップオープン：５；ギャップエクステンション：２；ｘ＿ドロップオフ：５０；期待値：１０．０；ワードサイズ：１１；フィルタ：オフ。当業者は、比較のストリンジェンシーを増大または減少するために、および、例えば、２つ以上の配列の関連性を決定するために、上記パラメータをどのように変更し得るかを認識している。
【００４０】
本明細書中で使用する場合、用語「機能カテゴリー」は、細胞の生命活動におけるそれらの目的に基づいた遺伝子の操作上の分類を意味することが意図される。従って、この用語は、参照する生化学的プロセスまたは活性に対する機能的寄与に従って、遺伝子およびそれらのそれぞれの遺伝子産物をグループ分けすることが意図される。例えば、複製プロセスに関与する遺伝子は、複製機能カテゴリーの遺伝子として分類される。ＤＮＡポリメラーゼは、複製遺伝子の１つの特定の例である。同様に、ＲＮＡポリメラーゼは、転写機能カテゴリーに分類される遺伝子の特定の例である。各々のカテゴリーに含まれる機能カテゴリーおよびファンダメンタル遺伝子の例示的な列挙は、生存ナノマシンおよび複製能力を有するナノマシンについての基礎的な遺伝子操作システムについて、それぞれ、図１および図２に示される。いくつかの遺伝子が１つより多い機能カテゴリーに関与し得るが、単一カテゴリーへの分類は、各々の記載についての便宜上および単純鎖のための事項であり、１つのカテゴリーと別のカテゴリーにおける、重要性の上下関係を持った区別ではないことが理解される。
【００４１】
本明細書中で使用する場合、用語「生存」は、宿主ナノマシンが、その操作プログラミングに適合した環境設定において生存または存在し得ることを意味することが意図される。同様に、生存に十分な遺伝子産物をコードする最小の遺伝子セットを含む基礎的な遺伝子操作システムはまた、遺伝子プログラミングが、宿主ナノマシンが基礎的な遺伝子操作システムの操作された遺伝子型と適合する環境設定において生存または存在することを可能にする必須のファンダメンタル遺伝子をコードすることを意味することが意図される。環境設定としては、例えば、天然環境、生化学的環境、生理学的環境、または産業的環境、ならびにインビボ設定、インサイチュ設定、またはインビトロ設定が挙げられ得る。生存または存在は、例えば、受動的（例えば、生化学的プロセスまたはその選択的反応が、環境条件の好ましい変化が生じるまで休止される状態）であり得る。生存または存在はまた、例えば、能動的（例えば、生化学的プロセスまたはその選択的反応が少なくとも部分的に能動的である状態が継続される状態）であり得る。生存期間は、短期間から、長期間延長された期間であり得、例えば、秒および分から時間、日、週、月、および年の時間範囲であり得る。特定の宿主ナノマシンの実際の生存期間は、例えば、基礎的な遺伝子操作システムの操作プログラミングおよび標的宿主ナノマシンの応用に依存する。
【００４２】
本明細書中で使用する場合、用語「複製」または「複製能力を有する」は、宿主ナノマシンが、その操作プログラミングと適合する環境設定におけるそのゲノムの少なくとも１つの複製コピーを生じ得ることを意味することが意図される。同様に、複製に十分な遺伝子産物をコードする最小の遺伝子セットを含む基礎的な遺伝子操作システムはまた、遺伝子プログラミングが、宿主ナノマシンが基礎的な遺伝子操作システムの操作遺伝子型と適合する環境設定におけるそのゲノムの少なくとも１つのコピーを複製することを可能にする必須のファンダメンタル遺伝子をコードすることを意味することが意図される。従って、用語、複製は、宿主ナノマシンの基礎的な遺伝子操作システムおよび、例えば、そのゲノムにおいてコードされる他の遺伝子の生合成をいう。ゲノム複製としては、例えば、調節様式、条件付き様式、または構成的様式のゲノム生合成が挙げられ得る。対照的に、増殖、再生、または粒子分割は、２つ以上の子孫ナノマシンを生じるナノマシン粒子エンベロープの複製をいい得る。粒子分割の非存在下で、複製能力を有するナノマシンは、粒子エンベロープ内に、例えば、２、３、４、５、１０、２０、または５０以上のナノマシンゲノムコピーを蓄積し得る。複製能力を有する基礎的な遺伝子操作システム内における粒子分割機能的遺伝子の包含は、例えば、単一または複数コピーのナノマシンゲノムの、子孫ナノマシン粒子への両同時分離を可能にし得る。
【００４３】
本明細書中で使用する場合、用語「欠く」は、遺伝子を参照して使用する場合、機能遺伝子の欠損または欠如を意味することが意図される。本明細書中で参照する場合、機能遺伝子は、その遺伝子が、活性な遺伝子産物（例えば、核酸遺伝子産物およびポリペプチド遺伝子産物の両方を含む）をコードすることを意味する。機能遺伝子は、例えば、そのコード領域、１つ以上の調節領域、またはプロセシングシグナルの欠失または変異によって欠損または欠如され得る。同様に、コード領域、調節領域、またはプロセシングシグナルにおける変化の組み合わせにより、遺伝子セット、基礎的な遺伝子操作システム、またはナノマシンゲノムは遺伝子を欠く。従って、機能的遺伝子産物について欠損させる遺伝子における変化は、小さく（例えば、単一点変異によって）または大きく（例えば、大きな欠失によって（核酸の全てまたは実質的に全てのコード領域または調節領域を含む））あり得る。
【００４４】
本明細書中で使用する場合、用語「粒子エンベロープ」は、ナノマシン成分を非ナノマシン成分から分離または区画化するパーティションを意味することが意図される。この用語はさらに、ミクロ環境への区画化を制御し得る他の物理的手段または化学的手段を含む。このような物理的手段および化学的手段としては、例えば、静電力、疎水性、および完全なパーティション化を伴わないミクロカプセル化が挙げられる。ナノマシン成分としては、例えば、ナノマシンゲノム（基礎的な遺伝子操作システムを含む）、コードされる核酸、およびポリペプチド遺伝子産物およびそれらから生成される産物が挙げられる。コードされる遺伝子産物から生成される産物としては、例えば、細胞の生化学的経路によって合成され得る複数の代謝基質および触媒基質、中間体および産物が挙げられる。このような分子としては、例えば、アミノ酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、プリン塩基およびピリミジン塩基、脂肪酸、脂質、炭水化物、補因子、ならびに他の有機分子が挙げられる。細胞生化学的経路（核酸のコードする遺伝子産物によって合成される基質、中間体、および産物を含む）の例示的な記載は、例えば、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ＮｅｌｓｏｎおよびＣｏｘ、第３版、２０００、Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ならびにＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｓｔｒｙｅｒ、第４版、１９９５、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（両方の文献は、本明細書中に参考として援用される）に見出され得る。対照的に、非ナノマシン成分としては、例えば、環境成分が挙げられる。粒子エンベロープは、当業者に公知の種々の生化学的分子および生理学的に適合性の分子で構成され得る。
【００４５】
例えば、粒子エンベロープは、天然に存在する脂質膜と実質的に同じ分子から構成され得る。あるいは、粒子エンベロープは、非ナノマシン成分からナノマシン成分を分けるその能力を維持する限り、完全にまたは部分的に合成物であり得る。粒子エンベロープはまた、例えば、表面張力によって形成され得、ここで、ナノマシン成分は、表面張力によって形成される小滴中に一緒に保持されるか、またはここで水性媒体は、有機溶液中で別々に分配される。粒子エンベロープを達成する分離はまた、有機溶液と非有機溶液との間、または水溶液と空気との間のように、空間的に行われ得る。同様に、微小多孔質構造をまた用いて、粒子エンベロープを形成し得る。特定の例としては、多孔質樹脂および微細加工マトリクスが挙げられ得る。さらに、上記の種々の型の粒子エンベロープの全て、ならびに当業者に周知の他の型もまた、静電力による非ナノマシン成分からのナノマシン成分の分離を可能にするかまたは補助するかのいずれかのために、荷電した部分を用いて改変され得る。同様に、圧力および減圧力をまた用いて、粒子エンベロープの機能を作製または増強し得る。
【００４６】
本発明は、核酸に基づく情報からプログラムされて合成される、生物学的ナノマシンに関する。核酸に基づく情報の使用は、正確な機能的構造およびオペレーショナル粒子群への、原子レベルおよび分子レベルでの物質の正確なアセンブリを可能にする。核酸に基づく情報は、ナノスケールの機械および構造のボトムアップアセンブリを可能にする。なぜなら、物質の操作についての法則およびプロセスが、このコードする核酸に固有に含まれており、そして遺伝子産物へも付与されるからである。それゆえ、遺伝子操作システムを用いてプログラムされた、核酸に基づくナノマシンは、トップダウンの小型化アプローチおよび学際的なナノテクノロジーについての必要性を回避する。その代わり、核酸に基づく情報によってプログラムされたナノマシンは、生化学の法則およびプロセスを利用して、機能的生物学的でかつ生物学的に適合した構造体へと自己アセンブリする、構成要素であるナノマシン成分を作製する。この構造体は、有用な作業を行い得、そして広範な生理学的活性および生化学的活性を実施し得る。
【００４７】
本発明は、自律的原栄養性ナノマシンについての基礎的遺伝子操作システムを提供する。この基礎的遺伝子操作システムは、生存に充分な最小遺伝子セットをコードするナノマシンゲノムからなる。最小遺伝子セット内での遺伝子の機能的分類は、以下であり得る：転写、翻訳、好気性代謝、解糖経路／ピルビン酸デヒドロゲナーゼ経路／ペントースリン酸経路、炭水化物代謝、中心的中間代謝、ヌクレオチド代謝、輸送タンパク質および結合タンパク質、ならびにハウスキーピング機能。
【００４８】
本発明の基礎的遺伝子操作システムは、生合成細胞またはナノマシンについてのゲノムとして役立ち得る、核酸であるかまたは核酸の機能的等価物である。核酸の機能的等価物としては、以下が挙げられる：例えば、１以上の天然のヌクレオチドまたは天然に存在しないヌクレオチドを含む核酸（これは、改変された塩基、あるいはアデノシン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）またはチミン（Ｔ）もしくはウラシル（Ｕ）以外の塩基を含み、かつテンプレート特異的核酸重合についての基質である）。改変としては、例えば、化学的な基を用いた、誘導体化および共有結合が挙げられる。他の塩基としては、例えば、ピリミジンアナログもしくはアナログ、塩基対を形成し得る前駆体（例えば、イノシン）、および互変異性体が挙げられ得る。同様に、核酸の機能的等価物はまた、改変された形態または誘導体形態の、リボース糖部分またはデオキシリボース糖部分（例えば、それらの機能的アナログが挙げられる）を含み得る。当業者は、どの天然の、または天然に存在しない、ヌクレオチド、ヌクレオシドまたは塩基形態（それらの誘導体およびアナログを含む）が本発明の基礎的遺伝子操作システムにおいて用いられ得るか、およびテンプレート特異的核酸重合を補助し得るかがわかる。
【００４９】
基礎的遺伝子操作システムは、例えば、細胞生命の未発達な（ｒｕｄｉｍｅｎｔａｒｙ）または基礎的な機能を維持するために必須である、必要とされる遺伝子産物をコードする。基礎的遺伝子操作システムは、完全なゲノムとは異なる。例えば、これは、基本的な細胞の生命機能に必須である、遺伝子の遺伝コピーまたはその機能的フラグメントを複製するかまたはより密接に近似するからである。それゆえ、基礎的遺伝子操作システムは、生存力または他の細胞の生命機能を維持するために必要とされる、全ての必要な遺伝的情報を含む、合理化されたゲノムである。合理化されたバージョンのゲノムとして、基礎的遺伝子操作システムはまた、より単純でありかつより効率的なゲノムである。なぜなら、これは、望ましくないかまたは不必要な、遺伝情報または核酸構造を欠くからである。
【００５０】
細胞生命の未発達なまたは基礎的な機能を維持するために必須の合理化された遺伝子のコピーとして、基礎的遺伝子操作システムは、生合成および細胞の生命機能の維持のために必要とされる、遺伝子の最小編集物を構成する。細胞の生命機能としては、例えば、以下が挙げられる：生存力、複製、転写、翻訳、細胞分裂、エネルギー発生、細胞のホメオスタシス、接着、運動性移動、環境適応、走化性ならびに免疫細胞応答およびエフェクター細胞応答。それゆえ、基礎的遺伝子操作システムは、単独で、細胞ゲノムもしくはナノマシンゲノムの代わりをし得るかまたは細胞ゲノムもしくはナノマシンゲノムとして機能し得る。しかし、そして以下にさらに記載されるように、基礎的遺伝子操作システムはまた、この基本的な操作システムの遺伝的指示を増強するために他の遺伝子および遺伝子セットと組み合わせされ得る。他の遺伝子および遺伝子セットを含むことは、例えば、さらに、宿主ナノマシンが、基礎的な細胞の生命機能を構成するものに関連して、広範な種々の生化学的活性およびオペレーションを実行して維持することを可能にし得る。
【００５１】
１つの基礎的な細胞の生命機能は、生存力である。生存力に充分な最小遺伝子セットとしては、例えば、多数の機能的分類内に入る遺伝子が挙げられる。各機能的分類内の遺伝子は、例えば、別の分類と比較した機能的独立性に基づいて、ならびに説明の簡便さに基づいて、分類され得る。しかし、当業者は、本明細書中に記載される機能的分類もまた、ナノマシン細胞の生命機能の性能または維持について相互関係があっても、または相互依存的であってもよいことを理解する。例えば、転写の機能的分類に対応する最小遺伝子セット内の遺伝子は、好気性代謝の機能的分類内の遺伝子に関して独立し得る。なぜなら、ナノマシンは、好気性経路に由来するエネルギー源を用いて核酸遺伝子産物を産生し得るからである。例えば、解糖経路、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ経路およびペントースリン酸経路は、例えば、ＡＴＰを、好気性呼吸の不存在下でエネルギー源として発生させ得る、好気性機能的群内の経路である。同様に、転写は、エネルギー源を生成するために嫌気性経路についてのファンダメンタル遺伝子が存在する場合、好気性代謝に関して独立し得る。相互に関連した機能的群は、例えば、転写および翻訳を含み得る。これらの両方の機能的分類は独立して作動し得るが、両方とも、機能およびホメオスタシスを永続的に維持するために、他の分類の遺伝子産物を必要とする。構成要素の遺伝子および遺伝子産物ならびにそれらの相互関係または他の機能的分類および細胞の生命機能に関する独立性は、以下にさらに記載される。
【００５２】
細胞の生命機能としての生存力を支持するに充分な遺伝的プログラミングを構成する最小遺伝子セット内の遺伝子の機能的分類としては、例えば、約９個以下の基礎的な生化学的プロセスが挙げられる。相互関係しているが、これらのプロセスは、生合成プロセス、代謝プロセスおよびホメオスタシスのプロセスの一般的グループ分けに入る。この生合成グループ分けとしては、例えば、転写および翻訳の機能的分類が挙げられる。
【００５３】
代謝プロセスとしては、例えば、エネルギー代謝、炭水化物代謝、中心的中間代謝およびヌクレオチド代謝が挙げられる。エネルギー代謝は、さらに、好気性代謝および嫌気性代謝の機能的分類を含み得る。解糖経路、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ経路およびペントースリン酸経路は、好気性条件下で、高自由エネルギー分子（例えば、ＡＴＰ、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨ）を供給する、特異的な生化学的経路である。これらの経路（例えば、解糖）のいくつかはまた、例えば、嫌気性条件下で高い自由エネルギー分子を合成する。還元的クエン酸回路は、嫌気性条件下で高い自由エネルギー分子を供給する、特異的な生化学的経路である。
【００５４】
ホメオスタシスプロセス内の機能分類としては、例えば、輸送タンパク質および結合タンパク質、ならびにハウスキーピング機能が挙げられる。
【００５５】
当業者は、どのファンダメンタル遺伝子が、（例えば、原核生物供給源および真核生物供給源に由来する分類を含め）各分類に含まれるか、または各分類に含まれ得るかがわかる。自律的ナノマシン生存を指向する基礎的遺伝子操作システムに充分な機能的分類および構成要素の最小遺伝子セットの例示的な列挙を、図１および表４に示す。それゆえ、細胞の生命機能（例えば、生存力）に充分な、最小遺伝子セットを構成する機能的分類は、単一種または複数種に由来し得る。同様に、機能的分類に入ることを決定するファンダメンタル遺伝子としては、例えば、機能的等価物（例えば、オルソログ置換物および非オルソログ置換物）ならびにそれらの機能的フラグメントも挙げられる。
【００５６】
機能的分類の種々の組み合わせおよび置換（例えば、細胞の生命機能として自律的ナノマシン生存を指向するようにプログラムされた基礎的遺伝子操作システムについて図１および表４に示されるもの）は、宿主ナノマシンの必要性および所望のオペレーションに依存して産生され得る。例えば、ナノマシンは、完全に嫌気性の条件下で機能するようにプログラムされ得る。この特定の例では、嫌気性代謝についてのファンダメンタル遺伝子と実質的に重複しない、好気性代謝に必要とされる遺伝子を指定する機能的分類は、この基礎的遺伝子操作システムから削除され得る。あるいは、嫌気性代謝に必要とされる重複しない遺伝子を指定するこの機能的分類は、好気性条件下で機能するようにプログラムされるナノマシンについて削除され得る。同様に、ナノマシンは、デノボ生合成によって高分子（例えば、ヌクレオチド）を生成するようにプログラムされ得る。デノボヌクレオチド生合成の特定の例について、図１に示されるサルベージ経路の遺伝子は、例えば、デノボヌクレオチド生合成を指定する遺伝子の部分的または完全なセットの代わりをし得る。さらに、例えば、本発明のナノマシンが走化性を所望され、標的とされた適用を果たす場合、この機能的分類およびその構成要素のファンダメンタル遺伝子は、本発明の基礎的遺伝子操作システム内に含まれ得る。
【００５７】
機能的分類の、多くの他の組み合わせ、置換および変更は、特定の適用に対して自律的ナノマシンの性能を調整するための本発明の基礎的遺伝子操作システム内で成され得る。機能的分類のそのような他の改変としては、例えば、嫌気性代謝経路、醗酵、ストレス関連遺伝子、（例えば熱ショック、ＤＮＡ修復、ＲＮＡプロセシング、分泌、グリコシル化、グリコシド合成およびイソプレノイド合成）が挙げられる。当業者は、所定の活性、細胞の生命機能または適用を達成するために、どの機能的分類が組み合わされ得、改変され得、または置換され得るかを分かる。加えて、他の機能的分類と同様に、特定の生合成経路内の遺伝子が当業者に周知である。同様に、本明細中に提供される教示および指針を用い、当業者は、生化学的経路または生理学的プロセス内のどの遺伝子が、ファンダメンタル遺伝子であって、最小の遺伝子セットとともに含まれるかを、そしてどの遺伝子が、遺伝的にプログラムされた細胞の生命機能の効率的な機能および操作に不必要であるかが分かるか、または決定し得る。
【００５８】
最小の遺伝子セットは、例えば、生化学的プロセスに基礎的である機能的分類内の遺伝子を含む。ファンダメンタル遺伝子は、プロセスに必須であり、それがないと活性が生じ得ない遺伝子を含む。ファンダメンタル遺伝子はまた、例えば、生化学的プロセスの性能を細胞の生命形態と匹敵するレベルまでまたは標的とされた適用に必要とされる参照標準と匹敵するレベルまで増強する基本遺伝子を含む。例えば、タンパク質合成に必要とされるファンダメンタル遺伝子は、ナノマシンタンパク質合成が、原核生物細胞のシステムまたは真核生物細胞のシステムと匹敵した速度で生じるために必要な必須遺伝子および基本遺伝子の全てを含み得る。あるいは、標的とされた適用が、匹敵する細胞レベルに満たないナノマシンタンパク質合成速度で達成され得る場合、依然として必要とされるファンダメンタル遺伝子は、いくつかのまたは全ての基本遺伝子を除外し得、最小の遺伝子セットと、従って本発明の基礎的遺伝子操作システムと見なされ得る。
【００５９】
当業者は、細胞の生命形態の類似のプロセスと匹敵するかまたは標的とされた適用に必要とされる参照標準と匹敵する活性レベルを構成する生化学的プロセスの性能が分かる、または決定し得る。匹敵する細胞の活性レベルの特定の例としては、指定された環境条件下、生理学的条件下または培養条件下におけるタンパク質合成速度が挙げられる。匹敵する参照標準の特定の例としては、所定の標的の終点を達成するために十分な、指定された環境条件下、生理学的条件下または培養条件下での、指定された遺伝子産物の累積タンパク質合成が挙げられる。このような終点標準は、例えば、所定の量の遺伝子産物の蓄積または指定された活性（例えば、結合阻害または標的分子の調節）の達成を含み得る。最小の遺伝子セットによりコードされる本質的に任意のナノマシン活性、プロセス、細胞生命機能、オペレーションまたは属性は、対応する細胞生命または参照比較を有する。本明細書中に提供される教示および指針を使用し、当業者は、本発明の基礎的遺伝子操作システムによって、プログラムされたナノマシンと原核生物細胞生命形態または真核生物細胞生命形態のいずれかとの間のこのような同属比較が分かるか、または慣用的に決定し得る。
【００６０】
同様に、当業者は、必須機能または基本機能のいずれかをコードする、最小の遺伝子セット内のファンダメンタル遺伝子が分かるか、または決定し得る。例えば、必須遺伝子は、ナノマシンの細胞生命機能に不可欠であり、従って、参照の生命機能をプログラムした基礎的遺伝子操作システムによりコードされるために必要とされる。必須遺伝子の特定の例としては、ＲＮＡポリメラーゼサブユニットをコードする遺伝子が挙げられる。必須遺伝子に関連あるものは、必須遺伝子またはその遺伝子産物の活性を増強し得る基本機能または基礎的な機能を果たす遺伝子である。それゆえ、基本的なナノマシン操作の実質的な経費の面以外では基本遺伝子は必要ない。基本機能をコードするファンダメンタル遺伝子の特定の例としては、例えば転写ターミネーターのような転写因子をコードする遺伝子が挙げられる。転写ターミネーターを含むことは、少なくとも資源活用を増強するが、基礎的遺伝子操作システムからの転写ターミネーターの除去は、宿主ナノマシンの生存力に実質的に影響しない。
【００６１】
当業者は、基本プロセスの増強が、最適化と異なることを理解する。前者は、基礎的遺伝子操作システムによりコードされている基礎的なプロセスの補充をいうが、後者は、基礎的なプロセスのまたは最小の遺伝子セット活性に対して過度の活性および機能の実質的な増強に関係する。実質的な増強は、例えば、広い活性範囲内の、各々が補助機能を果たす、特化されているが関連する複数のポリペプチドの種類またはアイソタイプ（例えば、ファミリー内で関連するもの）を含むことを含み得る。一般的に、基礎的なプロセスの実質的な増強は、基礎的遺伝子操作システムによりコードされた成分分子または機能的分類の遺伝子重複または機能重複と分類され得る。
【００６２】
本発明のナノマシンは、例えば、その基礎的遺伝子操作システム内に含まれる核酸プログラミングにより確立される細胞生命機能を独立して性能可能な場合、自律的である。同様に、ナノマシンの活性または操作もまた、例えば、その活性または操作がナノマシンの基礎的遺伝子操作システムにより確立される指示により独立して実行され得る場合、自律的と見なされ得る。例えば、本発明のナノマシンは、そのプログラムされた機能を操作されたとおりに実行し得る場合、自律的である。従って、自律性とは、ナノマシンが例えば、宿主ナノマシンの基礎的遺伝子操作システムの中へと核酸コード配列および核酸調節配列を通じて操作された全ての分子、活性、およびプロセスを合成、性能、および維持する能力をいう。
【００６３】
例えば、基礎的遺伝子操作システムが、解糖の遺伝的指示の完全なセットであるように設計された場合、自律的なナノマシンは、グルコースをその最終産物へと代謝し得る。対照的に、例えば、ナノマシンの基礎的遺伝子操作システムが、解糖の遺伝子セットにおいて設計された欠損を有し、そして設計された欠損よりも下流の解糖中間体が外から供給され得る場合、ナノマシンは依然として自律的であると見なされ得る。下流中間体の添加は、ナノマシンが、不完全な遺伝子セットを有するにも拘わらず、そのコードされた活性および操作の自己生産を継続をすることを可能にする。従って、本発明の基礎的遺伝子操作システム内にコードされ得る、必要とされる外部供給源または外因性供給源への依存は、基礎的遺伝子操作システムがそのような所定の依存について設計されている限り、ナノマシンの自律性を妨げない。
【００６４】
同様に、本発明のナノマシンは、例えば、その基礎的遺伝子操作システムが、操作された細胞生命機能、活性または操作についての完全な最小遺伝子セットを含む場合、原栄養性であると見なされる。ファンダメンタル遺伝子の完全な最小遺伝子セットまたは機能的分類としては、例えば、宿主ナノマシンが、自足自給で様式で、操作された細胞生命機能、活性または操作を性能および維持するために十分な遺伝子が挙げられる。従って、原栄養機能および活性のために操作された基礎的遺伝子操作システムは、最小遺伝子セットまたは参照機能的分類中の欠損した遺伝子産物の外因性補充の必要のない参照した機能にとって自律的である。
【００６５】
対照的に、本発明のナノマシンは、例えば、その基礎的遺伝子操作システム、他の点では完全な最小遺伝子セットにおいて設計された遺伝子欠損を含む場合、栄養素要求性と見なされる。例えば、栄養素要求性の基礎的遺伝子操作システムは、操作された細胞生命機能、活性または操作についての不完全な最小遺伝子セットを含む。しかしながら、栄養素要求性であるためには、ファンダメンタル遺伝子の不完全な最小遺伝子セットまたは機能的分類は、例えば、設計された遺伝子欠損の遺伝子産物の外因性補充をを用いて、その操作された機能を性能および維持され得る。同様に、栄養素要求性の基礎的遺伝子操作システムはまた、設計された欠損の下流成分または設計された欠損と機能的に等しい成分の外因性補充を用いて、その操作された機能を性能および維持し得る。従って、本発明の栄養素要求性システムの自律性は、栄養素要求性生体分子の添加を通じた設計によってレスキューされ得る。従って、栄養素要求性機能および活性について設計された基礎的遺伝子操作システムは、操作された欠損遺伝子産物または設計された欠損をレスキューし得る成分の外因性補充を用いて、参照機能に対し自律的である。
【００６６】
本発明の基礎的遺伝子操作システムを構成する機能的分類は、最小遺伝子セットの全ての遺伝子が存在または作動する限り、本質的に任意の望ましい物理的または機能的順序で並べられ得る。しかしながら、重要性の相対的順序で機能的分類を並べることは、宿主ナノマシン操作の効率を増強し得る。同様に、重要性の相対的順序で機能的分類を並べることはまた、特定のナノマシン産物または活性の質を高め得る。本発明のナノマシンの所望の使用に依存して、機能的遺伝子分類は、例えば、基礎的遺伝子操作システムの遺伝的プログラミング、ナノマシン操作効率またはゲノムサイズを最適化するために、選択的に並べられ得る。
【００６７】
宿主ナノマシン上に生存力を与える基礎的遺伝子操作システム内の機能的分類の１つの配置は、例えば、プログラムされた細胞生命機能を達成するための遺伝子産物の相対的使用順序であり得る。細胞生命を維持するため、ナノマシンは構成要素高分子を生合成し得るべきである。従って、一つの相対的使用順序は、例えば、ゲノムの転写からｍＲＮＡのポリペプチド産物への翻訳である、細胞の生成物の流れに対する正常の情報の後に続き得る。この順序は、作動しているナノマシン産物に対する、前駆体および中間体をコードする遺伝子が最初に産生され、それにより、中心ナノマシン成分の産生および活性における律速工程を妨げるという点で利点を有する。従って、効率的なナノマシン操作の機能的分類の相対的順序は、各々、ナノマシンエネルギー源を特定する機能的分類が後に続く、転写分類および翻訳分類を構成している遺伝子であり得る。このようなエネルギー源は、好気性代謝および嫌気性代謝のいずれかまたは両方に十分なファンダメンタル遺伝子セットであり得る。加えて、エネルギー源を特定する経路はまた、細胞内代謝におけるそれらの使用に関連して順序付けられ得る。例えば、解糖経路をコードするファンダメンタル遺伝子は、基礎的遺伝子操作システム内に相対的順序で、ピルビン酸経路もしくはペントースリン酸経路を特定する遺伝子より前に、または非基礎的遺伝子（例えば、クエン酸（ＴＣＡ）回路もしくは還元的クエン酸回路を特定する遺伝子）より前に、配置され得る。
【００６８】
例えば、宿主ナノマシンの生存力を支持するのに十分な遺伝子の機能的カテゴリーのリマインダーは、本質的に任意の、ナノマシンの標的化適用に依存する所望の順序および所望の効率に存在し得る。残存するカテゴリーの１つの例示的な順序は、例えば、炭水化物代謝、中心的中間代謝、ヌクレオチド代謝、輸送タンパク質および結合タンパク質、ならびにハウスキーピング遺伝子、それぞれであり得る。機能的カテゴリー順序の順列および組み合わせの数は多い。当業者は、機能的カテゴリーの順序および組み合わせが、所望の結果を達成するための基礎的な遺伝子操作システムにおいて作製され得ることを知っている。
【００６９】
機能的カテゴリーの順序付けは、いくつかの異なる基準に基づき得る。例えば、順序付けは、物理的な順序または時間的な順序を参照して達成され得る。任意の特定の物理的な順序は、基礎的な遺伝子操作システム内に設置した最小遺伝子セットの、構築上の設計および配列によって達成され得る。さらに。物理的な順序は、多くのゲノムマーカーのうちの任意に関連し得る。このようなマーカーとしては、例えば、複製起点、特定の遺伝子または特定の遺伝子セットが挙げられる。遺伝子または遺伝子セットに関して基礎的な遺伝子操作システム内の機能的カテゴリーを順序付ける特定の例としては、生体分子の生成のための発現カセット、または不可欠な遺伝子セットの次ぎに、最初に観察される（好気性代謝についてのような）機能的カテゴリーを配列することが挙げられる。同様に、機能的カテゴリーの順序付けは、例えば、ゲノムの一本鎖に対して単方向、双方向、ゲノムの両鎖に対して単方向、双方向、およびそれらの全ての組み合わせであり得る。ゲノムの両鎖を利用することは、ゲノム空間の使用の効率的な利点を有する。
【００７０】
特定の任意の時間的な順序は、例えば、選択された順序において、標的された遺伝子および遺伝子セットの活性化および抑制によって達成され得る。選択的な活性化および抑制は、例えば、シス作用因子およびトランス作用因子によってか、あるいは転写または翻訳の条件付き調節によって達成され得る。従って、機能的カテゴリーまたはその構成的基礎遺伝子の発現の、任意の所望される時間的な順序は、それぞれのプロモーターの選択的活性化によって達成され得る。選択的活性化は、例えば、正の調節またはインヒビターの抑制によって達成され得る。このような選択的活性化のために使用されるシス作用因子およびトランス作用因子は、例えば、その因子が調節する遺伝子と比べて、相同または異種（ｈｅｔｅｒｌｏｇｏｕｓ）のエレメントまたは因子のいずれかであり得る。さらに、発現の時間的な順序はまた、遺伝子および遺伝子セットの選択された活性化および抑制、ならびに特定の標的遺伝子またはそのトランス作用調節因子の物理的な順序の組み合わせによって達成され得る。機能的カテゴリーまたは構成的基礎遺伝子の発現の相対順序を制御することについての当業者に周知である他の方法には、例えば、ＲＮＡプロセシング、翻訳後修飾（例えば、リン酸化、グリコシル化、タンパク質分解性切断、シグナル伝達カスケードおよび凝固カスケード）が挙げられる。
【００７１】
従って、本発明は、生存に十分な最小遺伝子セット（これは、転写、翻訳、好気的代謝および解糖／ピルビン酸デヒドロゲナーゼ／ペントースリン酸経路からなる相対順序における機能的カテゴリーの合成に関する）をコードする自律的原栄養性ナノマシン用の基礎的な遺伝子操作システムを提供する。相対順序は、例えば、機能的カテゴリーの物理的なアレンジメントまたは時間的なアレンジメントに関連し得る。
【００７２】
また、ＭＧ００８、ＭＧ００９、ＭＧ０５６、ＭＧ２２１、ＭＧ３３２、ＭＧ４４８またはＭＧ４４９、それらのオルソログまたは非オルソログ遺伝子置換からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を欠く最小遺伝子セットを有する基礎的な遺伝子操作を提供する。
【００７３】
例えば、遺伝子はＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍとＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａとの間に保存されるけれども、上記の遺伝子は、これらの種のゲノムおよび他の種のゲノムにおいて見出される他の遺伝子と比べて構造および機能において重複性である。例えば、ＭＧ００８は、フランおよびチオプレンオキシダーゼ（ｔｈｉｏｐｒｅｎｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）をコードする。ＭＧ２６２は、エキソヌクレアーゼをコードする。ＭＧ００９、ＭＧ０５６、ＭＧ２２１およびＧ３３２は、ヌクレオチド結合ドメイン（例えば、ＡＴＰ結合ドメイン、ＧＴＰ結合ドメイン、ＮＡＤ、ＦＡＤおよびＳＡＭ結合ドメイン、パーミアーゼまたは他の保存されたドメイン）を有するポリペプチドをコードする。ＭＧ４４８およびＭＧ４４９は、シェペロン結合ドメインを有するポリペプチドをコードする。さらに、これらの遺伝子のいくつかは、原始的な機能を必要とせず、それゆえ、本発明の基礎的な遺伝子操作システムから操作される付加遺伝子プログラムに配列するのにより適切である。例えば、シェペロン機能およびパーミアーゼ機能をコードするこれらの遺伝子は、自律的ナノマシン操作に必ずしも必要ではない。
【００７４】
本発明はさらに、約１４０キロベース（ｋｂ）未満のサイズを有する、生存力に十分なナノマシンについての基礎的な遺伝子操作システムを提供する。この基礎的な遺伝子操作システムは、約１５２未満のファンダメンタル遺伝子、機能的遺伝子、それらのオルソログまたは非オルソログ的置換であり得る。
【００７５】
生存力に十分な最小遺伝子セットを含む基礎的な遺伝子操作システムは、粒子エンベロープまたは他の分配構造内にパッケージングされ得る限り任意の大きさで構築され得る。基礎的な遺伝子操作システムを操作する１つの利点は、ナノマシンゲノムの構築についてのボトムアップアプローチである。原子レベルおよび分子レベルでの事象の生物学的自己アセンブリによるボトムアップナノマシン構築に類似して、所定の機能を指定する最小遺伝子セットの設計は、例えば、正確な構造を設計および合成し得る。例えば、遺伝子は、介在ゲノム配列を最小限含んで、ファンダメンタル遺伝子の並列によって空間を保存するようにアレンジされ得る。エンハンサーのような調節領域は、例えば、遺伝子間領域からイントロンにまで移動され得る。同様に、有用でない核酸セグメントは、例えば、短縮そうでなければ削除された構造遺伝子配列（例えば、イントロン、５’遺伝子および３’遺伝子の隣接領域）であり得、そして非翻訳配列は、縮小または排除され得、遺伝子は、ポリシストロニックｍＲＮＡとして転写および翻訳される遺伝子に重複または組み込まれ得、そして第１配列は、転写されるｍＲＮＡの翻訳における効率を増加させるための最適なヌクレオチド用法を組み込むように改変され得る。さらに、最小遺伝子セットを構築するファンダメンタル遺伝子は、例えば、適切な機能ドメインのみを含むように調整され得る。従って、最小遺伝子セットは、１つ以上の機能カテゴリーを構築するファンダメンタル遺伝子のいくつかまたはその全ての機能的フラグメントからなり得る。
【００７６】
当業者は、所定の教示および本明細書中で提供される指導、細胞の寿命機能（例えば、生存力）を支持するのに十分な基礎的な遺伝子操作システムのための広範な大きさを理解するか、または容易に設計し得る。例えば、図１または表４に記載される対応するオルソログ遺伝子において示されるような最小遺伝子セット（これは、ナノマシン生存力を指定するのに十分である）は、約１４０キロベース（ｋｂ）ペア未満の基礎的な遺伝子操作システム内に編成され得る。例えば、これらの遺伝子のイントロンを含まないバージョンの並列は、約１３７，５８９塩基対（ｂｐ）の核酸において生じ得る。このような最小遺伝子セットは、合計約４５，８６３個のアミノ酸について約１５２個のファンダメンタル遺伝子をコードする。並列アレンジメントにおいて、天然に存在する発現エレメントおよび調節エレメント、異種エレメントまたはそれらの組み合わせを含むということは、これらのエレメントが、最小遺伝子セットのファンダメンタル遺伝子と比べて、基礎的な遺伝子操作システムの全体の大きさを最小に導くので、核酸の大きさの増加を最小にして達成され得る。
【００７７】
基礎的な遺伝子操作システムの大きさはさらに、例えば、上記の建築的な設計の任意のものまたは種々の組み合わせを使用することによって減少され得る。例えば、コード領域、非コード領域、発現配列および調節配列は、１つ以上の機能的カテゴリー内で、細胞寿命機能もしくは遺伝子を指定する最小遺伝子セットを構築する、いくつかまたはその全ての遺伝子間で、部分的または実質的に重複され得る。さらに、構成的なファンダメンタル遺伝子は、本発明の基礎的な遺伝子操作システムをさらに縮小するために、二本鎖核酸の両方の鎖上に配置され得る。従って、ナノマシンの非複製的な細胞寿命機能をプログラミングする、本発明の基礎的な遺伝子操作システムは、約１４０ｋｂよりも実質的により小さくてもよい。例えば、生存力に十分な基礎的な遺伝子操作システムは、約１３０ｋｂ以下、１２０ｋｂ以下、１１０ｋｂ以下、そして１００ｋｂ以下であってもよい。このような基礎的な遺伝子操作システムの大きさを半分まで（例えば、最小遺伝子セットを構築するファンダメンタル遺伝子の、実質的な重複および短縮化によって約７０ｋｂまで）減少させることも可能である。当業者に周知の他の建築的な設計が、本発明の基礎的な遺伝子操作システムの構造を短縮または最適化するために同様に使用され得る。
【００７８】
本発明の基礎的な遺伝子操作システムはまた、例えば、コードされたポリペプチドへの情報の移行およびナノマシンの細胞寿命機能の操作を促進する、種々の構造的特徴を含み得る。このような構造的特徴としては、例えば、核膜結合部位または細胞膜結合部位、染色体足場のための結合領域、染色体凝縮のためのヒストン結合部位領域、および例えば、非コード遺伝子間核酸が挙げられ得る。このような遺伝子間空間セグメントの存在は、例えば、立体障害、結合部位競合および位相制限を減少させることによって、効率的な核酸結合因子の移行（ｅｎｔｒｙ）および排除（ｅｘｉｔ）を可能にする。さらに、本発明の基礎的な遺伝子操作システムは、二本鎖ゲノム構造または一本鎖ゲノム構造として設計され得る。当業者は、種々の構造領域が、基礎的な遺伝子操作システムに組み込まれて、標的とした用途を達成し得、そしてナノマシンゲノムとしてのその性能を増大または最適化し得ることを理解する。例えば、ナノマシンが原核生物の細胞寿命形式に似ている場合、染色体の凝縮は必ずしも必要ではない。しかし、染色体凝縮、アンカレッジ（ａｎｃｈｏｒａｇｅ）および足場は、基本的な遺伝子操作システムにおいて有利に利用され得、このシステムは、より高等な真核生物の細胞寿命形式のファンダメンタル遺伝子ためのプログラミングを指定する。
【００７９】
上記のように、基礎的な細胞寿命機能（例えば、生存力）を指定する基礎的な遺伝子操作システムは、例えば、約１５２個以下のファンダメンタル遺伝子で達成され得る。これらの遺伝子は、例えば、約９個の機能的カテゴリーに分類され得る。各機能的カテゴリー内の構成遺伝子の数は、例えば、宿主ナノマシンの標的化された用途に依存して変動し得る。例えば、構成遺伝子の数は、このプログラミングが、デノボまたは分子もしくは分子の種類の再利用経路生合成であるか否かに依存して変動し得る。構成的なファンダメンタル遺伝子の数はまた、例えば、プログラミングが、細胞内もしくは細胞外の生理学的環境または細胞外の非生理的環境での生存力を指定するか否かに依存して変動し得る。構成的なファンダメンタル遺伝子はまた、このプログラミングが、エネルギー源の産生のために、好気性遺伝子産物または嫌気性遺伝子産物を指定するか否かに依存して変動し得る。膜ソーティング、ペプチド分泌および細胞内輸送ならびに小胞遺伝子機能を含めることはまた、構成的ファンダメンタル遺伝子の数を、機能的カテゴリーの範囲内で変動させ得る。同様に、そしてさらに以下に記載されるように、各機能カテゴリー内の構成的な遺伝子の数は、例えば、基礎的な遺伝子操作システムが、原栄養性ナノマシンまたは栄養素要求性ナノマシンの自立性を特定化するか否かに依存して変動し得る。表４に記載するように、構成遺伝子の数はまた、基礎的な遺伝子操作システムが、原核生物遺伝子または真核生物遺伝子あるいはそれらのオルソログまたは非オルソログ置換物から操作されるか否かに依存して変動し得る。
【００８０】
しかし、一般に、生存力を支持するのに十分な成分遺伝子は、例えば、以下へと分類され得る：転写遺伝子カテゴリー中の約１４の遺伝子、翻訳遺伝子カテゴリー中の約９０の遺伝子、好気的代謝遺伝子カテゴリー中の約１３の遺伝子、解糖経路、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ経路およびペントースリン酸経路を構成する遺伝子カテゴリー中の約１６の遺伝子、炭水化物代謝遺伝子カテゴリー中の約３の遺伝子、中心的中間代謝遺伝子カテゴリー中の約３の遺伝子、ヌクレオチド代謝遺伝子カテゴリー中の約２の遺伝子、輸送／結合タンパク質遺伝子カテゴリー中の約１０の遺伝子、ならびにハウスキーピング機能遺伝子カテゴリー中の約１の遺伝子。翻訳プロセスにおいて機能する遺伝子を含むカテゴリーはまた、２つのさらなる下位群へとさらに分割され得る。これらの翻訳下位群は、その遺伝子産物がポリペプチドの修飾因子および翻訳因子において機能する約１３の遺伝子、ならびにその遺伝子産物がリボソームの生合成、アセンブリおよび修飾において機能する約５２の遺伝子からなり得る。同様に、解糖機能をコードする約１０のファンダメンタル遺伝子、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ経路遺伝子産物をコードする約２のファンダメンタル遺伝子、およびペントースリン酸経路において機能する遺伝子産物をコードする約４のファンダメンタル遺伝子が存在する。
【００８１】
例示的なファンダメンタル遺伝子およびその遺伝子産物は、図１に示される上記の機能的カテゴリーおよび下位群の各々内で機能する。図１に示されるものを同様に置き換え得るオーソロガス遺伝子は、以下の表４に示される。本明細書中に提供される教示および指針を考慮して、当業者は、例えば、比較ゲノム学および遺伝子産物機能によって、図１または表４に示されるファンダメンタル遺伝子のうち１つ以上を同様に置き換え得る他のオーソログ置換または非オーソログ置換を、知るかまたは決定し得る。従って、本発明は、図１、表４に示される、実質的に同じファンダメンタル遺伝子（そのオーソログ置換または非オーソログ置換を含む）からなる約１５２以下のファンダメンタル遺伝子を有する宿主ナノマシンの、自律的な原栄養性生存力を導くのに十分な基礎的な遺伝子操作システムを提供する。
【００８２】
生存に十分な最小限の遺伝子セットをコードする基礎的な遺伝子操作システムを参照して本発明を記載してきたが、当業者は、他の細胞生命機能をプログラミングする種々の他の基礎的な遺伝子操作システムが、本明細書中に提供される教示および指針を考慮して操作および合成され得ることを知る。例えば、宿主ナノマシンの細胞生命機能としての複製能を付与する、複製機能カテゴリーをコードする基礎的な遺伝子操作システムが、以下にさらに記載される。さらに、基礎的な遺伝子操作システムは、細胞内環境（例えば、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの場合）または細胞外環境（例えば、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｅ．ｃｏｌｉ、他の原核生物細胞および真核生物細胞の場合）における自立的なナノマシン作動のために操作され得る。さらなる非複製的な、基礎的な遺伝子操作システムは、さらに、以下のようなほかの細胞生命機能を含み得るか、またはプログラミングされて以下のようなほかの細胞生命機能をコードするように変化され得る：ポリペプチド合成、膜完全性、ポリペプチド折り畳み、ポリペプチド輸送（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）、細胞外合成および細胞外輸送（ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）、運動性、発酵ならびに胞子形成。
【００８３】
例えば、タンパク質合成機構は、特定のｍＲＮＡ種についての転写機能の非存在下でコードされ得る。宿主ナノマシンは、１つ以上のコードされたポリペプチドの合成のために、外因性ｍＲＮＡを補充され得る。また、基礎的な遺伝子操作システムは、膜構造遺伝子、脂質膜粒子エンベロープの構造的完全性を増強する膜内在性タンパク質ポリペプチドまたは膜貫通ポリペプチドを含み得る。同じ様式で、ポリペプチド折り畳み機能および輸送機能がコードされ得る。例えば、原核生物におけるｓｅｃ依存的ポリペプチド分泌、および真核生物におけるシグナル認識粒子（ＳＲＰ）依存的トランスロケーションは、折り畳み機能および輸送機能の２つの特定の例である。細胞外合成および細胞外輸送の特定の例は、特定の環境におけるナノマシンの生存のために有用であり得、そして例えば、ＡＢＣトランスポーターを使用する分子トランスロケーション、グリコーゲン合成、糖ポリマー（例えば、デキストランおよびキサンタンガム）の合成および分泌が挙げられる。
【００８４】
さらに、好気的エネルギー産生または嫌気的エネルギー機能（例えば、還元的クエン酸回路をコードする遺伝子）のための選択された経路が、プログラミングされ得る。簡潔には、好気的エネルギー産生のための炭水化物経路としては、例えば、解糖、ペントースリン酸経路およびエントナー−ドイドロフ経路が挙げられ得る。解糖すなわちＥＭＰ経路は、原核生物および真核生物の両方に存在し、そして炭水化物をピルビン酸に酸化して、ＡＤＰをリン酸化するように機能する。この経路はまた、他の経路のための前駆代謝物を提供し、これには、グルコース−６−ホスフェートを介したペントースリン酸経路への供給が挙げられる。ペントースリン酸経路は、原核生物および真核生物の両方に同様に存在し、そしてＮＡＤＰＨ、ペントースリン酸（これは、リボースおよびデオキシリボースの前駆体である）、およびエリスロースリン酸（これは、芳香族アミノ酸であるフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンの前駆体である）、ならびにホスホグリセロアルデヒドを産生する。エントナー−ドイドロフ経路は、原核生物で一般的に見出され、そして特定の炭素源（例えば、グルコン酸）の存在下で種々のエネルギー分子を産生する。
【００８５】
他の好気的エネルギー機能としては、例えば、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体およびクエン酸回路が挙げられる。ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体は、原核生物の細胞質ゾル中、および真核生物のミトコンドリア中に位置する酵素である。この複合体は、ピルビン酸をアセチル−ＣｏＡ、ＣＯ２およびＮＡＤＨに脱炭酸するように機能する。アセチル−ＣｏＡは、クエン酸回路（ここで、アセチル−ＣｏＡは、ＣＯ２へと酸化される）に入り得る。クエン酸回路は、呼吸（ｒｅｐｉｒａｔｉｏｎ）と共に作用して、ＮＡＤＰＨおよびＦＡＤＨ２を酸化し、そして一般に、好気的増殖の間に機能する。嫌気的条件下で、原核生物は、還元的クエン酸経路と称される改変経路を有し、ここで、ＮＡＤＨは、異化の間に生成される有機アクセプターによって酸化される。
【００８６】
嫌気的エネルギー産生は、例えば、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸−フェレドキシンオキシドレダクターゼまたはピルビン酸−蟻酸リアーゼ（これは、嫌気的条件下で、ピルビン酸をアセチル−ＣｏＡに分解するように機能する）をコードするファンダメンタル遺伝子を含むか、またはこれらを置き換えることを含む。還元的クエン酸経路の活用により、例えば、発酵が可能となる。Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ中には存在しないが、これらの機能は、他の生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）中の遺伝子から得られ得る。簡潔には、嫌気的呼吸を得るために、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性がダウンレギュレートされ得るかまたは遺伝子が非機能的にされ、そしてフマル酸レダクターゼが、コハク酸デヒドロゲナーゼを置き換え得るか、またはこれにさらに含まれ得る。
【００８７】
さらに、発酵回路（例えば、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｉｕｕｍ由来の酪酸発酵またはブタノール−アセトン発酵）もまた、プログラミングされ得る。基本的な運動性機能は、例えば、宿主ナノマシン環境に適合するように、異なる鞭毛モーターをコードすることによって、変化され得る。このような異なる鞭毛はまた、リポポリサッカリド鞘を含み得るか、または例えばスピロヘータ鞭毛であり得る。胞子形成機能は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのような生物によって含まれ得、そしてＳｐｏＯＡ、ＳｐｏＯＦ、ＫｉｎＡＢＣなどの遺伝子を含み得る。他の基本的な細胞生命機能もまた、当業者に周知であり、そして本発明の基礎的な遺伝子操作システム中に含まれ得る。
【００８８】
本発明の任意の基礎的な遺伝子操作システムは、例えば、基本的なナノマシンの活性もしくは作動を補充するためか、または例えば、宿主ナノマシンを、任意の所望の機能を本質的に行うようにカスタマイズするために、さらに遺伝的にプログラミングされて、補充され得る。さらなる遺伝的プログラミングによる補充には、例えば、原栄養性自律的機能、栄養素要求性自律的機能、非複製的細胞生命機能および複製コンピテント細胞生命機能を特定化するための、基本的プログラミングを含む、基礎的な遺伝子操作システムが例えば挙げられ得る。このようなさらなる遺伝的プログラミングは、概念的には、コンピュータ作動システム上にオーバーレイされるかまたはそこからコピー（ｒｕｎ  ｏｆｆ）される、コンピュータアプリケーションプログラムに類推され得、ここで、後者は、本発明の基礎的な遺伝子操作システムに概念的に類推され得る。類推によって、本発明の基礎的な遺伝子操作システムは、任意の所望の細胞生命機能、生化学的活性または作動のための指示を含む、遺伝的サブルーチンの進入および実行のための、制御機能、核酸配列および核酸構造を含むように操作され得る。このようなさらなる遺伝的プログラミングは、単純であり得るか（例えば、１つ以上の遺伝子産物が宿主ナノマシンによって生成されるための発現カセットを含むこと）、または複雑であり得る（例えば、洗練された生理学的応答を付与するために全生化学的経路またはネットワークの全体を含むこと）。従って、本発明の宿主生物学的ナノマシンは、１つ、２つ、いくつかまたは多数までものさらなる活性および作動を実行するように、天然に存在する細胞生命形態の実質的な機能的模倣にまで（およびこれを含む）、設計および調整され得る。
【００８９】
含まれ得るさらなる遺伝子は、最小の遺伝子セットを構成するカテゴリーならびに実質的に宿主ナノマシンの機能化および操作を高めるカテゴリーを包含する、任意の機能的なカテゴリーから得られ得る。このようなさらなるカテゴリーとしては、例えば、非複製基礎的遺伝子操作システムについて図１において示されるカテゴリー、複製能力を有する基礎的遺伝子操作システムについて図２において示されるカテゴリー、表４において例示されるような、または当該分野で当業者に公知であるようなこれらの機能的なカテゴリーの中の遺伝子についてのオルソログ、および非オルソロガス置換体が挙げられる。従って、例えば、生存度するのに十分な基礎的遺伝子操作システム、他の非複製細胞生命機能、複製能力、または他の複製能力を有する細胞生命機能は、例えば、図１または図２において示される、任意の機能カテゴリー表示において言及される細胞生命機能について非基礎遺伝子をコードする付加遺伝子適用（ｏｖｅｒｌｙｉｎｇ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）でさらに補充され得る。具体的には、付加遺伝子適用は、例えば、、転写、翻訳、複製についての機能的なカテゴリー、様々な代謝機能カテゴリー、ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）カテゴリー、シグナルの伝達および調節のカテゴリー、輸送および結合のタンパク質カテゴリー、粒子分割カテゴリー、シャベロン系カテゴリー、粒子エンベロープカテゴリー、ならびにハウスキーピング機能カテゴリーの中の非基礎遺伝子を包含し得る。当業者に周知である、他の非基礎遺伝子カテゴリーおよび機能的カテゴリーもまた、本発明の宿主ナノマシンに対して、１つ以上の所定の活性を付与するため、このような補充プログラミングにも包含され得る。
【００９０】
上記の機能的なカテゴリー内の非基礎遺伝子の具体例としては、例えば、ＭＧ０２０、ＭＧ０２２、ＭＧ０３４、ＭＧ０３９、ＭＧ０４１、ＭＧ０４６、ＭＧ０５１、ＭＧ０６１、ＭＧ０６２、ＭＧ１０８、ＭＧ１２１、ＭＧ１２９、ＭＧ１８３、ＭＧ１８８、ＭＧ３６８、ＭＧ４２９と名づけられるＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ遺伝子、これらのオルソログまたは非オルソロガス遺伝子置換体のように選択された遺伝子が挙げられる。ＭＧ０２０およびＭＧ１８３は、例えば、アミノ酸代謝に関与する遺伝子をコードする。ＭＧ０２２は、転写に関与する遺伝子をコードする。ＭＧ０３４およびＭＧ０５１は、ヌクレオチド代謝に関与する遺伝子をコードする。上記遺伝子のうちの９つは、ＰＴＳ系に必要とされる活性をコードする。これらの遺伝子は、例えば、ＭＧ０３９、ＭＧ０４１、ＭＧ０６１、ＭＧ０６２、ＭＧ１０８、ＭＧ１２１、ＭＧ１２９、ＭＧ１８８およびＭＧ４２９を包含する。ＭＧ０４６は、例えば、分泌に関与する。従って、ＭＧ０４６は、翻訳機能的カテゴリーの中に含まれると考えられ得る。最後に、ＭＧ３６８は、脂質代謝に関与する遺伝子をコードする。多数の他の遺伝子もまた、原核生物および真核生物の両方の細胞および生物からも存在する。本発明の基礎的遺伝子操作システムの機能的なカテゴリーの中の任意の他の遺伝子はまた、その基本的な遺伝子操作システムによってコードされる遺伝子に加えて、特定される活性または特定される操作をコードするナノマシンゲノムを生成するための基礎的遺伝子操作システムの中にも組み込まれ得る。
【００９１】
同様に、生存能力または複製能力について十分な基礎的遺伝子操作システムはまた、例えば、基礎となる操作システムにおいて特定される機能に対して依存しないかまたは実質的に依存しない機能をプログラミングする遺伝子適用計画によっても組み込まれ得る。例えば、様々な生理学的機能に対する完全な経路およびネットワークが取り込まれ得、そして例としては、可動性、走化性、ホーミング、アポトーシス、細胞性免疫、体液性／ｈｕｍｏｒａｌ免疫、生得免疫、サイトカイン、成長因子、細胞接着および細胞遊走が挙げられ得る。基礎的遺伝子操作システムとして組み込まれ得る他の活性としては、例えば、薬物耐性、薬物感受性、温度、ｐＨおよび塩分に対する耐性または感受性、ならびに酸化還元状態の調節が挙げられ得る。任意の基礎カテゴリー（例えば、転写または翻訳）の中のさらなる遺伝子は、翻訳後修飾、機能、またはポリペプチド折りたたみ構造をコードする遺伝子と同様に付加され得る。さらに、基礎的遺伝子操作システムはまた、ナノマシン粒子の構造の完全性を増加するため、構造ポリペプチド（例えば、細胞骨格のポリペプチドおよび膜骨格ポリペプチド）をコードする遺伝子とともに組み込まれ得る。多数の他のさらなるプログラミングは、宿主ナノマシンに対して、特性を与え、または活性を付与するために、本発明の基礎的遺伝子操作システムの中に組み込まれ得る。さらなる機能が標的化されたナノマシン適用と密接な関係があること、およびどの遺伝子が特定の結果を成し遂げるために必要かつ十分であるかは、当業者にとって公知である。
【００９２】
従って、本発明は、基礎的遺伝子操作システムと作動可能に連結される１つ以上の非基礎遺伝子を有する、原栄養性または自己栄養性の基礎的遺伝子操作システムを提供する。基礎的遺伝子操作システムは、生存のために十分な活性を有する非複製細胞生命機能および複製能力を有する細胞生命機能をコードし得る。このような非基礎的遺伝子は、例えば、基礎的遺伝子操作システムの機能カテゴリーもしくは任意の他の遺伝子、または本発明の宿主ナノマシンに対して所定の活性、操作または機能を与えるように操作される任意の他の遺伝子（単数または複数）の中に存在し得る。
【００９３】
上記されるように、それぞれ、基礎的遺伝子操作システムおよび宿主ナノマシンの、ボトムアップの設計および自己合成に有利に適合され得る１つの特定の適用は、生体分子発現および生物分子産生の設計された取り込みである。１つ以上の発現カセットは、例えば、任意の所望の生体分子をコードする遺伝子のモジール挿入のために、本発明の基礎的遺伝子操作システムの中に操作され得る。同様に、２つ以上の遺伝子、および生体分子の複数のサブユニット、複数の生体分子をコードする完全な経路または、例えば、目的の１つ以上の生体分子のナノマシン合成のための完全な生体合成経路または完全な生体合成ネットワークは、当該分野における当業者によって本発明の基礎的遺伝子操作システムの中に慣用的に操作され得る。このような生物分子の発現は、例えば、構成的であり得るかまたは調節され得る。調節される発現は、例えば、当該分野において公知である任意の遺伝子メカニズム、組換えメカニズム、酵素的メカニズムまたはシグナル伝達メカニズムによって成し遂げられ得、例えば、外因刺激または生理学的刺激による誘導性発現または条件的発現を包含し得る。従って、生体合成調節はまた、特定のナノマシン適用または特定のナノマシン操作に合わせられ得る。
【００９４】
例えば、インシュリンは、本発明のナノマシンによって産生される生体分子であり得る。インシュリンを、エキソビボで製薬レベルの量で作ることが望まれる場合、インシュリンは、構成的に産生され得る。あるいは、ナノマシンは、増大されたグルコース水準によって活性化される誘導性発現因子を用いて操作され得、または外因的に投与されるモジュレータを用いて活性化され得る。下記にさらに記載されるように、このようなナノマシンは、糖尿病の処置のために糖尿病である固体に有利に投与され得る。
【００９５】
生体分子は、例えば、ポリペプチド、ポリペプチド複合体、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、脂質、糖、グリコポリペプチド、グリコシドポリペプチド、ポリケチドおよび生体合成可能な有機化合物のような治療高分子を包含し得る。このような有機化合物は、例えば、アミノ酸、プリン塩基およびピリミジン塩基、ヌクレオシド、ヌクレオシドモノホスフェートのような高分子ビルディングブロックモノマー、およびヌクレオチド、アルデヒド、ケトン、脂肪酸、糖、ステロイド、炭化水素、ポリマー、アルカロイド、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、コファクター、神経伝達物質などを包含し得る。生体分子はまた、例えば、診断上の用途または産業上の用途に対し適合可能な高分子または生体合成可能な有機化合物であり得る。
【００９６】
例えば、非複製能力を有する形態または複製能力を有する形態を包含する本発明の基礎的遺伝子操作システムは、当業者に公知である核酸合成の任意の方法によって生産され得る。このような方法は、例えば、化学合成、組換え合成、酵素による重合およびその組み合わせを包含する。これらおよび他の合成法は、当業者に周知である。
【００９７】
例えば、オリゴヌクレオチドを合成するための方法は、例えば、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｇａｔｅ編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ（１９８４）；Ｗｅｉｌｅｒら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４３：２１８（１９９６）；Ｍａｓｋｏｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０（７）：１６７９（１９９２）；Ａｔｋｉｎｓｏｎら、Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｐｈｏｓｐｈｉｔｅｔｒｉｅｓｔｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄ，ｉｎ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ３５（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ  ａｎｄ  Ｇａｉｔ（ｅｄｓ．）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、ａｎｄ  ｉｎ  Ａｎｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ（１９９９）に記載されていることが理解され得る。
【００９８】
ポリメラーゼ連鎖反応および他の増幅方法論を包含する組換え合成および酵素合成は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｔｈｉｒｄ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）ａｎｄ  ｉｎ  Ａｎｓｕｂｅｌら、（１９９９）、前出、に記載されていることが理解され得る。
【００９９】
オリゴヌクレオチドおよび他のポリマー配列のアレイを生成するための固相合成法は、例えば、Ｐｉｒｒｕｎｇら、米国特許第５，１４３，８５４号（ＰＣＴ出願番号ＷＯ９０／１５０７０も参照のこと）、Ｆｏｄｏｒら、ＰＣＴ出願番号ＷＯ９２／１００９２；Ｆｏｄｏｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５１：７６７−７７７、およびＷｉｎｋｌｅｒら、米国特許第６，１３６，２６９号；Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、ＰＣＴ出願番号ＷＯ８９／１０９７７、およびＢｌａｎｃｈａｒｄ  ＰＣＴ出願番号ＷＯ９８／４１５３１に記載されていることが見出され得る。このような方法は、オリゴヌクレオチドアレイのマイクロピン、フォトリソグラフィーおよびインクジェット合成を使用するアレイの合成および印刷を包含する。
【０１００】
オリゴヌクレオチドの連続アニーリングによって大きな核酸ポリマーを合成するための方法は、例えば、ＰＣＴ出願番号ＷＯ９９／１４３１８（Ｅｖａｎｓ）に記載され、およびまた、実施例としてさらに下記にも記載されていることが見出され得る。上記参考文献の全ては、その全体が参考として本明細書により援用される。
【０１０１】
本発明はさらに、自律的な原栄養性生存のための基礎的遺伝子操作システムおよび粒子エンベロープを有する自律的な原栄養性ナノマシンを提供する。
【０１０２】
上記に記載されたような任意の基礎的遺伝子操作システム（例えば、基本細胞生存機能の合成および維持を指向させる操作系）は、本発明の自律的に生存可能な原栄養性ナノマシンを生産するために粒子エンベロープの中にパッケージングされ得る。粒子エンベロープの例としては、基礎的遺伝子操作システムまたはナノマシンゲノム、リボソームおよび転写装置のようなナノマシン高分子構造、高分子、および有機分子の外部の環境からの分離を維持する半透性分割（ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ）生物適合性物質を含み得る。粒子エンベロープは、例えば、拡散、受動輸送、能動輸送、飲作用、食作用、小胞融合、または当該分野において当業者に周知である他のプロセスにより、ナノマシンの適切な機能化および操作のために必要な栄養源、ミネラルおよび他の分子の流入を可能にし得る。同様に、粒子エンベロープは、例えば、当該分野において周知である上記のプロセスによって、代謝副産物および老廃産物の流出を可能にし得る。
【０１０３】
当業者に周知の種々の生体適合性物質が、粒子エンベロープとして使用され得る。例えば、粒子エンベロープは、天然に存在する細胞膜に類似の、脂質小胞または脂質二重層であり得る。粒子エンベロープとして有用な他の生体適合性物質としては、例えば、リン脂質、リポソーム、リポタンパク質ミセル、およびウイルスエンベロープまたはファージエンベロープが挙げられる。あるいは、粒子エンベロープは、合成または天然に存在する物質（例えば、フィルター膜、ＧｏｒｔｅｘＴＭ、ポリアミド、ポリフルオレンおよびフルオロカーボン）から構成され得る。上記の生体適合性物質の組み合わせはまた、本発明のナノマシン粒子エンベロープに使用され得る。また、本発明の基礎的遺伝子操作システムは、脂肪酸をコードする遺伝子の封入および脂質生合成によってさらにプログラムされ得、例えば、天然に存在する細胞に類似の二重層脂質膜を自律的に生成する。
【０１０４】
ナノマシンの初期の機能的操作は、例えば、開始分子、および少なくとも１周期の転写または翻訳を達成するのに十分な高分子の封入を必要とし得る。例えば、必須の細胞機構、ナノマシンゲノムをデノボで初期に転写または翻訳するための前駆体およびエネルギー源を有さない、基礎的遺伝子操作システムのみ、を含むナノマシン粒子は、作動し得ない。従って、上記の機構、前駆体またはエネルギー源からなる開始成分は、閾値量のナノマシン成分のゲノム指向型合成および生成を可能にするのに十分な量で、ナノマシン粒子エンベロープ内にパッケージングされ得る。閾値量は、基礎的遺伝子操作システムから生成される、自律的ナノマシン活性および操作に十分な量である。高分子および有機分子は、有限の半減期を有し得るので、初期にパッケージされた開始成分は、ナノマシン粒子の初期操作後に、排出または取り除かれる。それゆえに、自律的なプログラムされる機能は、引き継がれ、ファンダメンタル成分を補充し、そして本発明のナノマシンの原栄養性ホメオスタシスを維持する。
【０１０５】
開始成分は、例えば、細胞溶解物、細胞画分、組換え産物、生化学的精製物、細胞−ナノマシン融合体および他の供給源ならびに当業者に周知の方法であり得るか、またはそれらから得られ得る。一般的に、開始分子は、対応する基礎的遺伝子操作システム内の遺伝子、経路もしくはネットワークによって合成される、閾値量の各遺伝子または最終生成成分を含み得る。しかし、本発明のナノマシン粒子は、たった数個の基本的な活性および構造（例えば、ＲＮＡポリメラーゼ、リボソームおよび翻訳因子）ならびにエネルギー源を用いる操作に供され得る。開始成分の例示的な量としては、例えば、フェムトモル量、ナノモル量またはマイクロモル量の必須ファンダメンタル遺伝子産物が挙げられる。当業者は、開始成分の実際の量および組成が必要に応じて調節され得ることが分かる。例えば、エネルギー成分（例えば、ＡＴＰ）の初期濃度の増加によって、開始組成物内の異なる型の分子の数の対応する減少を可能にし得る。なぜなら、ナノマシンは、それ自体のエネルギー供給の生成を開始する前に、より大きな初期貯蔵量を有するためである。
【０１０６】
本発明はさらに、栄養素要求性生体分子の存在下における生存力について十分な最少遺伝子セットをコードするナノマシンゲノムを有する、自律的栄養素要求性ナノマシンのための基礎的遺伝子操作システムを提供する。
【０１０７】
先に記載されたように、生体分子の外因性供給の存在下において、自律的ナノマシン細胞生命機能を指示し得る基礎的遺伝子操作システムは、それぞれ、栄養素要求性基礎遺伝システムおよび宿主ナノマシンである。自律的原栄養性基礎操作システムおよび自律的原栄養性宿主ナノマシンに関して上記に示される教示および案内は、栄養素要求性システムおよび栄養素要求性ナノマシンに同様に適用可能である。しかし、１つの相違点は、操作された欠損が、設計欠陥を救援し得る生体分子の外因性供給によって、機能的に提供されるということである。
【０１０８】
それゆえに、栄養素要求性の基礎的遺伝子操作システムは、同様に、例えば、以下の機能的カテゴリーをコードする最小遺伝子セットを含み得る：転写機能、翻訳機能、好気性代謝機能、炭水化物代謝機能、中心性中間体代謝機能、ヌクレオチド代謝機能、輸送タンパク質機能および結合タンパク質機能、ならびにハウスキーピング機能。このようなカテゴリーは、さらに、任意の所望の物理的順序または時間的順序（例えば、それぞれ転写、翻訳、好気性代謝および解糖作用経路、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ経路、ペントースリン酸経路の相対的な物理的順序または一時性の順序が挙げられる）において合成され得る。同様に、生存のために十分な基礎的遺伝子操作システムへの参照に記載されるように、栄養素要求性基礎的遺伝子操作システムは、ＭＧ００８、ＭＧ００９、ＭＧ０５６、ＭＧ２２１、ＭＧ３３２、ＭＧ４４８またはＭＧ４４９、オルソログまたはそれらの非オルソロガス遺伝子置換体から選択される少なくとも１つの遺伝子を欠き得る。同様に、栄養素要求性の基礎的遺伝子操作システムは、空間的に圧縮された約１４０ｋｂ以下のサイズの核酸としてとして同様に設計され得る。先に記載された設計代替案および考察はまた、栄養素要求性基礎的遺伝子操作システムに直接適用可能である。同様に、原栄養性基礎的遺伝子操作システムに重ねられ、実行されるさらなる遺伝プログラムの設計および組み込みは、栄養素要求性基礎的遺伝子操作システムにさらに直接適用可能である。それゆえに、栄養素要求性基礎的遺伝子操作システムを操作して、１つ以上の生体分子、生化学的経路およびネットワークの生成のための発現カセットを含み得る。
【０１０９】
本発明はさらに、約１５１個以下のファンダメンタル遺伝子を有する自律的栄養素要求性ナノマシンのための基礎的遺伝子操作システムを提供する。
【０１１０】
先に記載されたように、基礎的な細胞生命機能（例えば、生存力）を特定する基礎的遺伝子操作システムは、例えば、約１５２個以下のファンダメンタル遺伝子を用いて達成され得る。しかし、栄養素要求性基礎的遺伝子操作システムについて、これらの１つ以上の任意の遺伝子は、欠損が、化合物、分子または高分子の補充によって補完または救援され得る限り、不足して提供され得る。当業者は、どの遺伝子機能が、ナノマシン外部環境の補充によって供給され得るかを知る。例えば、解糖は、グルコースを、グルコースホスフェートを経由してグルコキナーゼにまで代謝する。グルコキナーゼ遺伝子の排除は、外部環境におけるグルコースではなく、グルコースホスフェートを供給することによって救援され、グルコキナーゼについてのこのようなシステム栄養素要求性の自律性を維持する。同様に、全体の機能的システムは、これらの成分が、外部の媒体に加えられるか、あるいは、ナノマシン自体に導入される場合に、削除され得る。例えば、リボソーム合成およびタンパク質合成マシンの排除はまた、栄養素要求性基礎的遺伝子操作システムに設計され得、そして３つの機能は、無細胞抽出物または人工抽出物によって供給され、タンパク質合成機能を提供する。このような栄養素要求性ナノマシンは、内部の合成された翻訳マシンではなく、外部から供給された機能を用いる栄養素要求性基礎的遺伝子操作システムによって指示されるポリペプチド合成について、自律的に機能し得る。
【０１１１】
それゆえに、以前に記載された約９個の機能的カテゴリーは、同様に、本発明の栄養素要求性基礎的遺伝子操作システムを構築し得る。しかし、ファンダメンタル遺伝子および選択されたカテゴリーに依存して、遺伝子の数は、例えば、１５１個以下であり得る。このように、栄養素要求性最小遺伝子セットは、例えば、生存を支持するのに十分な、以前に記載された構成要素遺伝子内に、少なくとも１つの非機能的遺伝子を含む。
【０１１２】
機能的カテゴリーおよびサブグループの各々内の例示的なファンダメンタル遺伝子およびそれらの遺伝子産物を、図１に示す。図１に示される遺伝子と同様に置換し得るオルソロガス遺伝子は、表４以降に示される。本明細書に提供される所定の教示および案内により、当業者は、図１または表４に示される１つ以上のファンダメンタル遺伝子について同様に置換し得る他のオルソログまたは非オルソロガス置換体を知るか、または決定し得る。それゆえに、本発明は、約１５１以下のファンダメンタル遺伝子を有する宿主ナノマシンの自律的栄養素要求性生存力を指示するのに十分な、基礎的遺伝子操作システムを提供し、このファンダメンタル遺伝子は、図１、表４に示される実質的に同じファンダメンタル遺伝子、オルソログまたはその非オルソロガス置換体からなる。
【０１１３】
上記の任意の栄養素要求性基礎的遺伝子操作システム（例えば、基礎細胞生存力機能の合成および維持を指示するシステム）は、粒子エンベロープにパッケージされ、対応する栄養素要求性生体分子の存在下において、本発明の自律的に生存可能な栄養素要求性ナノマシンを生成し得る。粒子エンベロープは、例えば、基礎的遺伝子操作システムまたはナノマシンゲノム、ナノマシン高分子構造体、高分子および有機分子の外部環境からの分離を維持する任意の半透過性分配生体適合性物質を含み得る。粒子エンベロープはまた、ナノマシンを非ナノマシン構成要素から分離するための微小環境を生成し得る他の物理力、化学力または電気力を含み得る。原栄養性細胞生命機能についてプログラムされた基礎的遺伝子操作システムについて、栄養素要求性基礎的遺伝子操作システムは、同様にプログラムされ、細胞生命機能の生合成および維持を支持し得る。このような細胞生命機能としては、例えば、生存力、複製、転写、翻訳、細胞分裂、エネルギー生成、細胞ホメオスタシス、接着、運動性、移動、環境適合、化学走性および免疫ならびにエフェクター細胞応答が挙げられる。当業者に周知の他の生命細胞機能、生化学的活動または生理学的活動はまた、上記の細胞生命機能を用いて、別々にか、または一緒にプログラムされ得る。
【０１１４】
本発明は、自律的原栄養性複製に十分な最小遺伝子セットをコードするナノマシンゲノムを有する自律的原栄養性ナノマシンのための、基礎的遺伝子操作システムを提供する。このナノマシンゲノムは、機能的カテゴリーの相対的順序における最小遺伝子セットの合成を支持し得、この機能的カテゴリーは、それぞれ、複製、転写、翻訳、好気性代謝および解糖、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ経路およびペントースホスフェート経路を有する。原栄養性ナノマシンのための基礎的遺伝子操作システムもまた、提供され、この原栄養性ナノマシンは、炭化水素代謝機能、中心的中間代謝機能、ヌクレオチド代謝機能、シグナル伝達調節機能、輸送タンパク質機能または結合タンパク質機能、粒子分割機能、シャペロン系機能、脂肪酸／脂質代謝機能、粒子エンベロープ機能およびハウスキーピング機能を有する。
【０１１５】
本発明は、栄養素要求性生物学的分子の存在を自律的に複製するために十分な最小遺伝子セットをコードするナノマシンゲノムを有する、自律的栄養素要求性ナノマシンのための基礎的遺伝子操作システムもまた提供する。このナノマシンゲノムは、複製、転写、翻訳、好気性代謝および解糖、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、およびペントースリン酸経路の機能をそれぞれ有する機能的分類の相対的順番において、最小遺伝子セットの合成を指向し得る。炭水化物代謝、中心的中間代謝、ヌクレオチド代謝、シグナル伝達調節、輸送および結合タンパク質、粒子分割、シャペロン系、脂肪酸／脂質代謝、粒子エンベロープおよびハウスキーピング機能のための最小遺伝子セットの機能的分類をさらに有する栄養素要求性ナノマシンのための基礎的遺伝子操作システムをさらに提供する。
【０１１６】
複製能力を有するナノマシンのための遺伝プログラミングを特定する本発明の基礎的遺伝子操作システムは、核酸であるか、または核酸の機能的等価物であり、これらは、生合成細胞またはナノマシンのゲノムとして働き得る。複製能力のために十分な基礎的遺伝子操作システム内にコードされるのは、例えば、細胞生命機能の構成要素的成分およびプロセスの基本的機能を合成および維持するために必須の必要な遺伝子産物である。基礎的遺伝子操作システムが、任意の種々の非複製ナノマシンまたは種々の任意の複製能力を有するナノマシンの遺伝情報を提供するか否かに拘わらず、基礎的遺伝子操作システムは、例えば、完全ゲノムとは異なる。なぜなら、この基礎的遺伝子操作システムは、遺伝子の遺伝的コピーまたはその機能的フラグメント（これらは、操作された複製細胞生命機能または非複製細胞生命機能に必須である）を複製するかまたはこれにより近似するからである。従って、基礎的遺伝子操作システムは、天然に存在するゲノムと比較して、より単純かつより効率的なゲノムである。なぜなら、このシステムは、不要または重複する遺伝情報または構造を欠くからである。
【０１１７】
例えば、複製能力を維持するために必須の遺伝子の合理化されたコピーとして、基礎的遺伝子操作システムは、この細胞生命機能を合成および維持するために必要な遺伝子の最小編集を構成する。原栄養性基礎的遺伝子操作システムは、完全な最小遺伝子セットをコードするのに対し、栄養素要求性基礎的遺伝子操作システムは、例えば、最小遺伝子セット内に少なくとも１つの非機能的遺伝子（その機能は、外因性の補充によって供給され得る）をコードする。従って、自律的複製を特定する基礎的遺伝子操作システムは、それ自体、少なくとも１サイクルの複製のために自律的複製を支持するに十分な細胞ゲノムまたはナノマシンゲノムと置き換わり得るか、またはそのような細胞ゲノムまたはナノマシンゲノムとして機能し得る。さらに、および以下にさらに記載されるように、基礎的遺伝子操作システムはまた、他の遺伝子および遺伝子セットと組み合わされて、基本的操作システムの遺伝的指示（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）を増大し得る。他の遺伝子の包含は、例えば、宿主ナノマシンが、基本的細胞生命機能（例えば、複製）を構成する活性および操作と関連して、種々の生化学的活性および操作を行って維持することを可能にし得る。
【０１１８】
原栄養性複製能力または栄養素要求性複製能力のいずれかを支持するに十分な最小遺伝子セットは、例えば、多くの機能分類の中に入る遺伝子を含む。単純な形態では、複製能力を有する最小遺伝子セットは、例えば、生存するに十分な最小遺伝子セットおよびゲノムの複製に十分なファンダメンタル遺伝子を含む。ゲノムが、ＤＮＡである場合、このような遺伝子は、例えば、ＤＮＡポリメラーゼおよび関連する基本的複製因子（ｅｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）を含み得る。比較すると、ゲノムがＲＮＡである場合、このような遺伝子は、操作された複製機構に必要な必須の逆転写酵素またはＲＮＡポリメラーゼを含み得る。
【０１１９】
より複雑な複製能力を有する最小遺伝子セットは、例えば、ナノマシン粒子分割および膜生物発生に必要なファンダメンタル遺伝子をさらに含み得る。粒子分割についての基本的な機能がない場合、複製能力を有する宿主ナノマシンは、そのゲノムを複製することはできるが、娘粒子へと分裂することが実質的にできない。粒子分割機能がない場合に、複製についての基本的機能を特定する基礎的遺伝子操作システムは、例えば、その粒子内空間に２以上のゲノムを有する粒子の生成を生じ得る。このような複製能力を有する基礎的遺伝子操作システムにおいて膜生物発生機能（例えば、脂肪酸およびリン脂質代謝）を包含することは、宿主ナノマシンが、さらなる核酸質量を収容するためのサイズおよび容積に拡げることを可能にし得る。粒子分割または膜生物発生に十分なファンダメンタル遺伝子の包含は、これらの言及された活性についての原栄養性（ｐｒｏｔｒｏｔｒｏｐｈｉｃ）基礎的遺伝子操作システムを生じる。
【０１２０】
あるいは、このような宿主ナノマシンは、膜生物発生、粒子分割またはその両方の上記の基本的機能についての栄養素要求株として操作および維持され得る。例えば、基礎的遺伝子操作システムとは別個のこれらの機能をコードする遺伝子産物またはさらに核酸が、そのナノマシンに導入されて、粒子拡大を可能にし得るかまたは粒子分割を誘導し得る。
【０１２１】
複製能力を有するナノマシンと関連して、膜生物発生および粒子分割に言及して記載されるが、操作のこのようなストラテジーおよび様式は、非複製能力を有するナノマシン種および複製能力を有するナノマシン種の両方、ならびに単一の栄養素要求性ファンダメンタル遺伝子、２以上の栄養素要求性ファンダメンタル遺伝子、経路およびネットワークが栄養素要求性であるように操作された基礎的遺伝子操作システムについて等しく適用可能である。教示およびガイダンスが本明細書中で提供されれば、当業者は、原栄養性および栄養素要求性の基礎的遺伝子操作システム、それらそれぞれの操作の要件、および栄養素要求性表現型をレスキューする様式についての、種々の異なる組み合わせおよび順列を知り、これらを慣用的に決定することができる。
【０１２２】
さらに、増大性根本的機能（ａｕｇｍｅｎｔｏｒｙ  ｒｕｄｉｍｅｎｔａｒｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）をコードするファンダメンタル遺伝子はまた、複製能力に十分な最小遺伝子セットを含む基礎的遺伝子操作システムに含められ得る。このような増大性根本的機能としては、例えば、ポリペプチドターンオーバーおよび折りたたみ；プリン、ピリミジン、ヌクレオシドおよびヌクレオチド生合成；シャペロン、ならびに調節性機能をコードするファンダメンタル遺伝子が挙げられ得る。例えば、図１と比較して図２に示される、さらなるＭ．ｇｅｎｎｉｔａｌｉｕｍ遺伝子、および表４に示される例示的オルソログは、生存に十分な遺伝子産物をコードするものと比較して、複製に十分な最小遺伝子セット中に含まれ得るファンダメンタル遺伝子の例である。自律的宿主複製を支持する最小遺伝子セットの他の例は、例えば、ＭｕｓｈｅｇｉａｎおよびＫｏｏｎｉｎ，前出；Ｋｏｏｎｉｎら，前出；Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎら，前出、ならびにＮＣＢＩ  ＵＲＬ  ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／Ｃｏｍｐｌｅｔｅ＿Ｇｅｎｏｍｅｓ／ｍｇｌｉｓｔ，前出において記載される。構成性遺伝子および遺伝子産物、ならびにそれらの他の機能分類および細胞生命機能に関する相互関係または独立性は、以下にさらに記載される。
【０１２３】
細胞生命機能としての複製を支持するに十分な遺伝プログラミングを構成する最小遺伝子セット内の遺伝子の機能的分類は、例えば、約１５以下の基本的生化学プロセスを含む。これらの機能的分類のうちの９つは、生存に十分な最小遺伝子セットについて上で記載されたものを含む。同様に、１５以下の機能的分類はまた、生合成プロセス、代謝プロセスおよびホメオスタシスプロセスの一般的分類分けに入る。生合成分類分けは、例えば、複製、転写、翻訳および粒子エンベロープ生成の機能的分類を含む。
【０１２４】
代謝プロセスは、例えば、エネルギー代謝、炭水化物代謝、中心的中間代謝、ヌクレオチド代謝、ならびに脂肪酸およびリン脂質代謝を含む。エネルギー代謝は、好気性代謝および嫌気性代謝の機能的分類をさらに含み得る。解糖、ピルビン酸デヒドロゲナーゼおよびペントースリン酸経路は、好気性条件下で高い自由エネルギーの分子（例えば、ＡＴＰ、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨ）を供給する特異的生合成経路である。ファンダメンタル遺伝子のこれらのエネルギー代謝サブグループのいずれも、複製能力を有するまたは非複製能力を有する基礎的遺伝子操作システムによってプログラムされる自律的ナノマシンについての適切なエネルギー供給を与えるために十分である。炭水化物代謝は、例えば、糖転換において活性なファンダメンタル遺伝子を含む。ヌクレオチド代謝は、例えば、ヌクレオシドおよびヌクレオチドのプリン塩基およびピリミジン塩基の新規経路またはサルベージ経路の合成を含む。
【０１２５】
ホメオスタシスプロセス内の機能分類は、例えば、調節性機能、輸送および結合機能、粒子分割、シャペロン機能およびハウスキーピング機能を含む。
【０１２６】
当業者は、どのような機能的遺伝子が、例えば、原核生物および真核生物の供給源に由来するものを含めて、各々の分類内に含まれるかまたは含まれ得るかを知る。基礎的遺伝子操作システムが複製能力を有する自律的ナノマシンを指向するために十分な機能的分類および構成性最小遺伝子セットの例示的な列挙は、図２および表４に示される。従って、複製能力のような細胞生命機能に十分な最小遺伝子セットを構成する機能的分類は、単一の種または複数の種に由来し得る。同様に、機能的分類内に入ることが決定されるファンダメンタル遺伝子はまた、例えば、オルソログおよび非オルソログの置換物、ならびにこれらの機能的フラグメントのような機能的等価物を含む。
【０１２７】
非複製系と同様に、例えば、複製能力を有する自律性ナノマシン（例えば、図２および表４に示されるもの）を指向するようにプログラムされた基礎的遺伝子操作システムについての機能的分類の種々の組み合わせおよび順列は、宿主ナノマシンの必要性および所望の操作に依存して作られ得る。特定のナノマシン適用のために合わせて作られた非複製能力を有する基礎的遺伝子操作システムの設計の考慮事項および設計工学はまた、複製能力を有する基礎的遺伝子操作システムに直接適用可能である。例えば、複製能力を有するナノマシンは、完全に好気性の条件下で、または代わりに以前に記載の嫌気性の条件下で機能するようにプログラムされ得る。同様に、複製能力を有するナノマシンはまた、新規生合成またはサルベージ生合成により高分子を生成するようにプログラムされ得る。さらに、例えば、本発明のナノマシンが、粒子−粒子接着または粒子−マトリクス接着、移動、運動性、サイトカイン調節、増殖因子調節、免疫およびエフェクター機構または標的化された適用を行うためのケモタキシスを示すことが所望される場合、これらの機能分類およびそれらの構成性ファンダメンタル遺伝子は、本発明の複製能力を有する基礎的遺伝子操作システム内に含まれ得る。
【０１２８】
多くの他の組み合わせ、置換および機能的分類の順列は、自立性原栄養性または栄養素要求性ナノマシンのいずれかを特定の適用に対する性能に合わせて作るために本発明の基礎的遺伝子操作システムにおいて、作製され得る。そのような機能的分類の他の改変として、例えば、前述の原栄養性および栄養素要求性の非複製システムを伴う系が挙げられる。当業者は、どの機能的分類が、所定の活性、細胞生存機能または適性を達成するために組み合わされ得、改変され得、または置換され得るかを知る。さらに、他の機能的分類と同様に、特定の生合成経路内の遺伝子は、当業者において周知である。同様に、当業者は、本明細書で提供される教示および手引きを使用することで、生合成経路または生理学的プロセス内のどの遺伝子が、ファンダメンタル遺伝子であり、また最小遺伝子セット内に含まれ得るのか、そして、どの遺伝子が効果的な機能および複製能力を与える基礎的遺伝子操作システムと共にプログラムされたナノマシンの操作に必要ではないのかを理解するか、または決定し得る。
【０１２９】
最小遺伝子セットは、例えば、生化学的プロセスの基本となる機能的分類内の遺伝子を含む。複製能力についてのファンダメンタル遺伝子としては、例えば、そのプロセスに必須の遺伝子、ならびに細胞の標準的レベルまたは参照の標準的レベルに匹敵する生物化学プロセスの性能を増大する基本の遺伝子などが挙げられる。例えば、複製能力を有するプログラムを詳細に述べた基礎的遺伝子操作システムはさらに、例えば、非複製基本システムと比較して、新規ヌクレオチド生合成をコードするファンダメンタル遺伝子を含み得る。さらなるヌクレオチド代謝機能を含めることにより、ナノマーシーンゲノムを複製するために必要な追加の必要条件が補われ得る。当業者は、最小遺伝子セットの中の必須の機能または基本機能のどちらかをコードするファンダメンタル遺伝子を理解するか、または決定し得る。同様に、当業者はまた、複製能力のある基礎的遺伝子操作システムの状況においてであろうと非複製基礎的遺伝子操作系の状況においてであろうと、基本プロセスの増加またその結果、ファンダメンタル遺伝子として含まれ得るが、最適化とは異なることを理解する。
【０１３０】
本発明の複製能力を有する基礎的遺伝子操作システムを構成する機能的分類は、最小遺伝子セットの全ての遺伝子が存在し、または作動可能である限り、本質的に任意の所望の物理的順序または機能的順序において、配置され得る。しかし、比較的重要な順序において、機能的分類を配置することにより、宿主の複製能力を有するナノマシン操作の効率が増加され得る。同様に、重要性の相対的順序において、機能的分類を配置することにより、特定のナノマシンの産物または活性化の質が増加され得る。本発明の自立性原栄養性ナノマシンまたは栄養素要求性ナノマシンの所望の使用に依存して、機能的遺伝子分類は、選択的に、例えば、基礎的遺伝子操作システムの遺伝的プログラム、ナノマシン効率の操作、またはゲノムの大きさを最適化または調節するために配列され得る。
【０１３１】
複製能力のある基礎的遺伝子操作システム内の機能的分類の１つの配置は、コードされた複製および補助機能を達成するために、例えば、遺伝子産物使用の相対的順序にあり得る。細胞生存機能を維持することおよびゲノム複製を可能にするために、宿主のナノマシンは、例えば、複製、転写、翻訳および少なくとも１つのエネルギー産生経路に十分な構成要素をなす高分子の生合成を可能にすべきである。ナノマシン使用の１つの相対的順序は、例えば、複製分類、転写分類および翻訳分類のそれぞれの機能的分類を構成するファンダメンタル遺伝子続いて、ナノマシンのエネルギー源を特定する機能的分類の相対的順序であり得る。あるいは、１つ以上のエネルギー源を構成するファンダメンタル遺伝子は、例えば、生合成の機能的分類の前か、または間に配置され得る。そのようなエネルギー源は、例えば、好気的代謝および嫌気的代謝のどちらかまたは両方、あるいはその経路に十分なファンダメンタル遺伝子のセットであり得る。
【０１３２】
宿主のナノマシンの複製能力に十分な遺伝子の機能的分類の残りは、本質的に、ナノマシンの目標とされる適用および所望の効率に依存して任意に所望される順序であり得る。残りの分類のひとつの例示的順序は、例えば、それぞれ炭化水素代謝、中心的中間代謝、ヌクレオチド代謝、シグナル伝達などの調節機能、輸送および結合タンパク質、粒子分割、シャペロン機能、脂肪酸および脂質代謝、粒子エンベロープ生成およびハウスキーピング機能であり得る。機能的分類の順序の順列および順序の数は、多い。当業者は、基礎的遺伝子操作システム内で、所望の結果を達成するために機能的分類のどのような順序および組み合わせが作製され得るかを理解する。このため、本発明は、上記ならびに図２および全ての可能性のある順序を整理した表４に記載の機能的分類を有する基礎的遺伝子操作システムを提供する。加えて、１つ以上の機能的分類内の任意の基本遺伝子が、分離され得、互いから別個または独立した基礎的遺伝子操作システム内で順序づけられた結果部分であり得る。
【０１３３】
前に述べられた原栄養性および栄養素要求性の基礎的遺伝子操作システムのように、複製能力のある基礎的遺伝子操作システムを特定する機能的分類の順序付けは、いくつかの異なる判断基準に基づき得る。例えば、順序付けは、物理的順序または時間的順序を参考に達成され得る。任意の特定の物理的順序は、例えば、基本遺伝子または１つ以上の遺伝子マーカーに関連した全機能的分類の配置によっておよび前記の１つ以上の順序付けにおいて達成され得る。また、前述のように、基本遺伝子または機能的分類の種々の時間的順序付けは、例えば、標的遺伝子の活性化および抑制、ならびに選択された順序にある遺伝子セットによって、または選択された活性化および抑制の組み合わせならびに生理的配置によって達成され得る。
【０１３４】
本発明はまた、自立性の原栄養性複製を指示するに十分な最小遺伝子セットをコードするナノマシンゲノムを有する自立性原栄養性ナノマシンのための基礎的遺伝子操作システムを提供し、その最小遺伝子セットは、ＭＧ００８、ＭＧ００９、ＭＧ０５６、ＭＧ２２１、ＭＧ２６２、ＭＧ３３２、ＭＧ４４８またはＭＧ４４９あるいはそのオルソログまたは非オルソログ遺伝子置換物からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を欠いている。
【０１３５】
栄養素要求性の生物学的分子の存在下での、自立性複製の指示に十分な最小遺伝子セットをコードするナノマシン遺伝子を有する自立性栄養素要求菌性ナノマシンのための基礎的遺伝子操作システムが、さらに提供され、その最小遺伝子セットは、ＭＧ００８、ＭＧ００９、ＭＧ０５６、ＭＧ２２１、ＭＧ２６２、ＭＧ３３２、ＭＧ４４８またはＭＧ４４９あるいはそのオルソログまたは非オルソログ遺伝子置換物からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を欠いている。
【０１３６】
生存力または他の非複製細胞生命機能に十分な基礎的遺伝子操作システムに関して前記のように、上記の遺伝子は、例えば、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍとＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａの間に保存された領域を含むが、それらはまた、それらの個々のゲノム内に認められる他の遺伝子と比較して余分な構造または余分な機能を含むと考えられ得る。同様に、ＭＧ００８、ＭＧ００９、ＭＧ０５６、ＭＧ２２１、ＭＧ２６２、ＭＧ３３２、ＭＧ４４８またはＭＧ４４９あるいはそのオルソログまたは非オルソログ遺伝子置換物は、例えば、他の種のゲノムにおいても同様に認められる遺伝子の相補体（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）と比較して余分な構造または余分な機能を含むと考えられ得る。加えて、これらの遺伝子のいくつかは、基本的な機能に必要ではなくまた、本発明の複製能力のある基礎的遺伝子操作システム内に含まれることが所望される場合、基礎となる基本システムから操作される上位にある遺伝子プログラム中に配置されるためにさらに適切である。
【０１３７】
ＭＧ００８、ＭＧ００９、ＭＧ０５６、ＭＧ２２１、ＭＧ２６２、ＭＧ３３２、ＭＧ４４８またはＭＧ４４９あるいはそのオルソログまたは非オルソログ遺伝子置換物を欠く複製能力のある基礎的遺伝子操作システムは、例えば、十分な機能分類ならびにその宿主ナノマシンの成分を合成および維持を指示するための構成性基本遺伝子を含むべきである。このため、１つ以上の上記の遺伝子を欠く複製能力のある基礎的遺伝子操作システムは、例えば、前述の複製能力のある基礎的遺伝子操作システムの単純、中間または複雑なバージョンとして構築され得る。同様に、任意の構造的設計または機能的分類もしくは構成性基本遺伝子の配置はまた、上記の８遺伝子を欠く原栄養性または栄養素要求性の基礎的遺伝子操作システムについて操作され得、または構築され得る。当業者は、そのような複製能力のある宿主ナノマシンの特定の目標とされる適用のために適切な遺伝子構成を理解し、または決定し得る。
【０１３８】
自立性原栄養性複製を指示するのに十分な最小遺伝子セットをコードするナノマシンゲノムを有する自立性原栄養株性ナノマシンについての基礎的遺伝子操作システムがまた、本発明により提供され、ナノマシンのゲノムは、約２５０キロベース未満の大きさを有する。さらに、栄養素要求性の生物学的分子の存在下で、自立性栄養素要求性複製を指示するのに十分な最小遺伝子セットをコードするナノマシンゲノムを有する自立性栄養素要求性ナノマシンについての基礎的遺伝子操作システムが、さらに提供され、ナノマシンのゲノムは、約２５０キロベース（ｂｐ）未満の大きさを有する。
【０１３９】
その基礎的遺伝子操作システムが、粒子エンベロープまたは他の仕切れら構造物の中に包まれている限り、生存に十分な最小遺伝子セットを含む基礎的遺伝子操作システムは、任意の大きさで構築され得る。厳密な構造物は、例えば、空間を保存または減少させるため、直鎖状または凝縮した大きさのゲノムを部分的または最大限小型化するため、構造的または機能的効率増加させるため、発現または調節要素の使用を最適化するために設計および合成され得るか、あるいは関連する機能ドメインのみを含むように合わせてつくられ得る。
【０１４０】
当業者は、本明細書に提供される教示および手引きが、複製能力を与えるのに十分な基礎的遺伝子操作システムのための広い範囲の大きさを理解し、またはこれらを容易に設計し得る。例えば、図２に示されるような最小遺伝子セット、または複製能力を特定するのに十分な図４に示される対応するオルソログ遺伝子が、約２５０キロベース（ｂｐ）対以下の基礎的遺伝子操作システムに編成され得る。例えば、全ての示された基本遺伝子のイントロンのない型の並置は、約２４８、１２４ｂｐの核酸になり得る。そのような最小遺伝子セットは、全体で約８２，７０８のアミノ酸のために約２４７の基本遺伝子をコードする。
【０１４１】
天然に存在する発現エレメントおよび調節エレメントを含めることにより、イントロンのない遺伝子に作動可能に連結された異種エレメントまたはこれらの組み合わせは、核酸の大きさの最小の増加で達成され得る。複製不可能なバージョンに関して先に記載された、これらの問題および可能な代替の操作設計の全てもまた、複製能力をプログラムする基礎的遺伝子操作システムに対して直接適用可能である。しかし、１つのさらなる問題は、複製能力のある基礎的遺伝子操作システムが、少なくとも不可欠なファンダメンタル遺伝子を、複製機能カテゴリー内に含むことである。
【０１４２】
従って、複製能力であるナノマシン細胞生命機能をプログラムする、本発明の基礎的遺伝子操作システムは、約２５０ｋｂよりかなり小さくあり得る。例えば、複製能力のために十分な基礎的遺伝子操作システムは、約２４０ｋｂ以下、約２３０ｋｂ以下、約２２０ｋｂ以下、約２１０ｋｂ以下、および約２００ｋｂ以下でさえあり得る。このような基礎的遺伝子操作システムの大きさを、例えば、最小の遺伝子セットを構築するファンダメンタル遺伝子のかなりの重複および短縮によって、約１２５ｋｂまで半減させることもまた可能である。当業者に周知の他の建築的設計を同様に使用して、本発明の基礎的遺伝子操作システムの構造を濃縮または最適化し得る。
【０１４３】
先に記載された、複製不可能な基礎的遺伝子操作システムの場合と同様に、本発明の複製能力のある基礎的遺伝子操作システムはまた、例えば、コードされるポリペプチドへの情報の移入およびナノマシンの細胞生命機能の作動を容易にする、種々の構造的特徴を含み得る。さらに、本発明の基礎的遺伝子操作システムは、二本鎖または一本鎖のゲノム構造として設計され得る。機能的カテゴリー内の構成性遺伝子の数は、例えば、宿主ナノマシンの標的化された適用に依存して変動し得る。どの成分のファンダメンタル遺伝子を含めるかについての問題は、以前に記載されており、そして例えば、プログラミングが新規合成活性またはサルベージ生合成活性、細胞内もしくは細胞外の生理学的環境での複製、または細胞外の非生理学的環境での複製について操作されるか、または基礎的遺伝子操作システムが原栄養性ナノマシン自律性であるか栄養素要求性ナノマシン自律性を特定するかが挙げられる。
【０１４４】
一般に、自律性の原栄養性複製を指示するために十分なファンダメンタル遺伝子は、例えば、複製遺伝子カテゴリーに約２４遺伝子、転写遺伝子カテゴリーに約１４遺伝子、翻訳遺伝子カテゴリーに約９４遺伝子、好気性代謝遺伝子カテゴリーに約１３遺伝子、遺伝子カテゴリー（解糖、ピルビン酸デヒドロゲナーゼおよびペントースリン酸経路を構成する）に約１６遺伝子、炭水化物代謝遺伝子カテゴリーに約３遺伝子、中心的中間代謝遺伝子カテゴリーに約１３遺伝子、ヌクレオチド代謝遺伝子カテゴリーに約１８遺伝子、シグナル伝達調節遺伝子カテゴリーに約４遺伝子、移送／結合タンパク質遺伝子カテゴリーに約２３遺伝子、粒子分割遺伝子カテゴリーに約４遺伝子、シャペロンシステム遺伝子カテゴリーに約１１遺伝子、脂肪酸／脂質代謝遺伝子カテゴリーに約３遺伝子、粒子エンベロープ遺伝子カテゴリーに約３遺伝子、およびハウスキーピング機能遺伝子カテゴリーに約４遺伝子に群分けされ得る。自律性の栄養素要求性の複製を支持するために十分な、ファンダメンタル遺伝子は、例えば、少なくとも１つの非機能的なファンダメンタル遺伝子を、これらのカテゴリーのうちの１つ以上のうちに含み得る。従って、自律性の栄養素要求性のナノマシンについての基礎的遺伝子操作システムは、例えば、約２４６以下のファンダメンタル遺伝子を含む、栄養素要求性の生物学的分子の存在下で、自律性の複製のために十分な最少の遺伝子セットをコードする。
【０１４５】
複製プロセスにおいて機能するファンダメンタル遺伝子を含む、機能的カテゴリーとしては、例えば、ＤＮＡポリメラーゼコード遺伝子、ヘリカーゼ、トポイソメラーゼ、ならびに組換え酵素および修復酵素が挙げられる。複製のための例示的なファンダメンタル遺伝子は、図２に示される。転写機能的カテゴリーは、例えば、ＲＮＡポリメラーゼ、基本的な転写因子、ヌクレアーゼおよび修飾酵素を含む。翻訳プロセスにおいて機能するファンダメンタル遺伝子を含むカテゴリーは、例えば、４つのさらなるサブグループに、さらに分けられ得る。これらの翻訳サブグループは、例えば、ｔＲＮＡの合成活性および修飾活性ならびにアミノ酸代謝をコードする、約２５遺伝子；分解活性およびポリペプチド折り畳み活性をコードする、約４遺伝子；遺伝子産物がポリペプチドの修飾因子および翻訳因子において機能する、約１３遺伝子、ならびに遺伝子産物がリボソームの生合成、アセンブリおよび修飾において機能する、約５２遺伝子からなり得る。解糖機能をコードする約１０のファンダメンタル遺伝子、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ経路遺伝子産物をコードする約２のファンダメンタル遺伝子、およびペントースリン酸経路において機能する遺伝子産物をコードする約４のファンダメンタル遺伝子が存在する。複製能力のために十分な、種々の機能的カテゴリーにおける構成的なファンダメンタル遺伝子の特定の例は、図２および表４に示される。
【０１４６】
例示的なファンダメンタル遺伝子およびそれらの遺伝子産物は、上記機能的カテゴリーの各々において機能し、そして自律性の原栄養性および栄養素要求性の複製のために十分な最少の遺伝子セット内のサブグループは、図２に示される。図２に示されるものと同様に置換され得るオルソログ遺伝子は、以下の表４に示される。本明細書中に適用される教示および指針を考慮して、当業者は、例えば、匹敵するゲノム学および遺伝子産物機能、図２または表４に示されるファンダメンタル遺伝子の１つ以上を同様に置換し得る他のオルソログまたは非オルソログ置換がわかるか、またはこれらを決定し得る。
【０１４７】
従って、本発明は、約２４７以下のファンダメンタル遺伝子を有する宿主ナノマシンの自律性の原栄養性の複製を指向するために十分な、基礎的遺伝子操作システムを提供し、この宿主ナノマシンは、図２または表４に示される、実質的に同じファンダメンタル遺伝子（そのオルソログまたは非オルソログの置換を含む）からなる。栄養素要求性の生体分子の存在下で、自律性の栄養素要求性の複製を指向するために十分な基本的な、約２４６以下のファンダメンタル遺伝子を有する遺伝子操作システムがまた提供され、このシステムは、図２または表４に示される、実質的に同じファンダメンタル遺伝子（そのオルソログまたは非オルソログの置換を含む）からなる。
【０１４８】
以前に記載されるように、本発明の任意の基礎的遺伝子操作システムは、さらに操作的に本発明の宿主ナノマシンに所定の活性を与えるための重複遺伝子プログラミングをうまく組み込み得る。本発明のナノマシンは、基礎的遺伝子操作システムに加えて、生化学的な活性または操作を実行し得る一つ以上の活性を有する遺伝子産物をコードする所定の遺伝子を含む、ナノマシンのゲノムを構成することによって、広い範囲に渡る生化学的な活性または操作を遂行および実行するように、遺伝的にプログラム化され得る。
【０１４９】
非複製の基礎的遺伝子操作システムに関して以前に記載したように、原栄養性または栄養素要求性の複製能力を有する基礎的遺伝子操作システムの一つの特定の適用は、生体分子の発現および産生の、設計された組み込みである。例えば、一つ以上の発現カセットは、本発明の基礎的遺伝子操作システムの中で、任意の所望される生体分子、生化学的経路またはネットワークをコードする、一つ以上の遺伝子の分子挿入のために操作され得る。このような生体分子の発現は、例えば、構成的な方法または調節された方法を含む、当業者に周知のいずれかの方法によって成し遂げられ得る。それゆえ、生合成調節はまた、特定の複製能力を有するナノマシンの適用または操作に調整され得る。
【０１５０】
例えば、生体分子は、ポリペプチド、ポリペプチド複合体、リボ核酸（ＲＮＡ）もしくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のような治療的な高分子、脂質または糖質、および生合成可能な有機化合物を含む。生体分子は、また、診断上目的または産業上の目的のために産生され得る。他の例示的な生体分子は以前に記載されている。
【０１５１】
本発明は、自律的な原栄養性の複製および粒子エンベロープのための基礎的遺伝子操作システムを有する、自律的な原栄養性のナノマシンをさらに提供する。栄養素要求性の生物学的分子および粒子エンベロープの存在下で、自律的複製のための基礎的遺伝子操作システムを有する、自律的な栄養素要求性のナノマシンがさらに提供される。
【０１５２】
非複製形態と同様に、上記の複製能力を有する任意の基礎的遺伝子操作システムは、自律的な複製能力を有する本発明の原栄養性ナノマシンまたは栄養素要求性のナノマシンを産生するために粒子エンベロープの中に詰め込まれ得る。栄養素要求性のナノマシンは、非機能的遺伝子を与える自律的な生体分子が存在する状態で、自律的に機能する。以前に記載されるように、例えば、粒子エンベロープは、例えば、基礎遺伝操作システム、ナノマシン巨大分子構造、外界の環境由来の巨大分子および有機分子の分離を維持する任意の半透性分配生体適合性材料も含み得る。例えば、粒子エンベロープはまた、当業者に周知のプロセスによって、ナノマシンの適切な機能および操作のために必要とされる栄養素、無機質および他の分子の流入、ならび代謝の副生成物、および廃棄生成物の流出を可能にし得る。
【０１５３】
当業者に周知の様々な生体適合性材料が、粒子エンベロープとして使用され得る。例えば、粒子エンベロープは脂質小胞、脂質二重膜であり得るか、または当業者に周知の、以前に記載された、合成材料もしくは天然に存在する材料から構成され得る。さらに、天然の生体適合性材料および合成の生体適合性材料の組み合わせは、また、本発明のナノマシン粒子エンベロープのために使用され得る。粒子エンベロープはまた、さらに基礎的遺伝子操作システムによってコードされる遺伝子から合成され得、それによって自己産生され得る。脂質にベースの膜の使用は、ナノマシンを分配する機能、ならびに例えば、脂肪酸および脂質代謝のためのファンダメンタル遺伝子の含有によって恒常的に調節され得る粒子エンベロープとして働く機能の両方を実行し得る。膜成分機能をコードするさらなるファンダメンタル遺伝子はまた、エンベロープの生産または恒常的な調節を増強させるために基礎的遺伝子操作システムに含まれ得る。
【０１５４】
従って、本発明の複製「能力を有する」基礎的遺伝子操作システムは、例えば、天然に存在する細胞に類似する脂質二重層膜を自律的に生成するために脂肪酸および脂質をコードする遺伝子の生合成の包含によりプログラムされ得る。あるいは、粒子エンベロープは、部分的にかまたは完全に、生合成可能でない成分から構成され得る。生合成により生成され得る粒子エンベロープ成分は、ナノマシン（ｎａｎｏｍａｃｈｉｎｅ）の基礎的遺伝子操作システムへとプログラムされ得る。生合成により生成されない粒子成分は、例えば、粒子エンベロープの形態で添加され得、そしてこのエンベロープ組成物に添加するためにかまたはこのエンベロープ組成物における所望の変化を生じさせるために添加され得る。
【０１５５】
当業者は、複製能力および粒子分割が、原栄養性ナノマシンおよび栄養素要求性ナノマシンの両方に選別可能であることを知る。例えば、そのゲノムを自律的に二本鎖形成（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）し得る本発明のナノマシンは、複製能力ナノマシンである。粒子分割の非存在下において、複製能力ナノマシンは、複数コピーのそのゲノムを蓄積し得る。従って、複製能力は、粒子分割を必要としない。複製能力、非分裂ナノマシンの１つの利点は、これらが、ゲノムのコピー数を増加させることにより、コードされる遺伝子の発現レベルを増加させることである。複製能力、非分裂ナノマシンの有用な適用は、例えば、生体分子の発現のためのものであり得る。なぜなら、各々の回の自律的複製は、生体分子がコードされた遺伝子のコピー数ならびにその対応する合成または蓄積の速度を増加し得るからである。粒子分割をプログラムするために十分な基礎的遺伝子操作システムにおけるファンダメンタル遺伝子の封入は、さらに、宿主ナノマシンに、粒子数を複数にする（ｍｕｌｔｉｐｌｅ）能力を与える。粒子分割をまた受け得る複製能力ナノマシンの１つの利点は、これらが、自己再生し、従って、長期間にわたりプログラムされた機能を維持し得ることである。この再生表現型は、例えば、生体分子の安定した永続的な合成、またはプログラムされた活性の実施を可能にし得る。
【０１５６】
前に記載されるように、ナノマシンの最初の機能的操作は、例えば、スターター分子および少なくとも１回の複製、転写または翻訳を達成するのに十分な高分子の包含により達成され得る。例えば、複製、転写、もしくは翻訳の機構、前駆体またはエネルギー供給源から構成されるスターター成分が、閾値の量のナノマシン成分のゲノムに指向される合成および生成を可能にするのに十分な量で、ナノマシン粒子エンベロープ内にパッケージングされ得る。自律的プログラムされた機能は、ファンダメンタル成分を充填し、そして本発明のナノマシンの原栄養性または栄養素要求性のホメオスタシスを維持するように操作する。スターター成分は、例えば、細胞溶解物、細胞性画分、組換え産物、生化学的精製物、細胞性ナノマシン融合物、および他の供給源であり得るか、またはこれらから得ることができ、そして当業者に周知の方法および上記の方法から得ることができる。
【０１５７】
本発明のナノマシンは、広範な種々の治療適用、診断適用、および産業上の適用において用いられ得る。そのような適用の、例示的であり、網羅するものでない列挙としては、例えば、以下が挙げられるが、これらに限定されない：バイオリアクターとしてのナノマシンの使用；生物的環境浄化のため；治療的生体分子の生成のため、または治療試薬として；診断指示薬の生成のため、または診断試薬として；送達系として；人工組織または器官系として；エネルギー変換系として；加工システムとして；同化系または異化系として；環境に応答し得る生物学的フィルムまたはコーティングの生成のため、および化粧品を含む、化粧用適用のため。本発明のナノマシンは、種々の設定（例えば、インビボ、インサイチュ、またはインビトロでの設定が挙げられる）において、そのような適用において使用され得る。標的とされる適用に依存して、そのようなナノマシン適用が、上記のナノマシンのいずれかを用いて実施され得る。従って、自律性の原栄養性もしくは栄養素要求性非複製ナノマシンまたは自律性の原栄養性もしくは栄養素要求性の複製能力ナノマシンが、例えば、上記の適用において使用され、プログラムされた結果を生じ得る。同様に、そのような自律的で生存可能であるかまたは複製能力ナノマシンのいずれかもまた、本明細書中で提供される教示および誘導を考慮して、当業者に周知の広範な種々の他の適用において使用され得る。
【０１５８】
簡単には、ナノマシンが、化合物の生成のためおよび溶液または物質の処理のために有用である広範な種々の生化学反応を実施するためのバイオリアクターとして使用され得る。例えば、本発明のナノマシンは、例えば、エタノールの生成のために、発酵においてプログラムおよび使用され得る。発酵のための方法および基質は、当該分野において周知である。エステル化、メチル化、および多数の他の化学修飾および処理もまた、バイオリアクターとして本発明のナノマシンを用いて実施され得る。本明細書中に提供される教示および誘導を考慮して、当該分野において周知のこれらおよび他のバイオリアクター法が、本発明のナノマシンを、そのような方法において用いられる原核生物および真核生物の代替物として用いて使用され得る。
【０１５９】
さらに、任意の本発明のナノマシンはまた、目的の生体分子の生成のためのバイオリアクタープロセスにおいて使用され得る。例えば、前に記載されるように、ナノマシンが、１から多数までの異なるポリペプチド、経路またはネットワークを発現するようにプログラムされ得る。過剰発現および調節された発現もまた、例えば、標的のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの所望の生成を達成するために、前に記載されるように完了され得る。従って、ナノマシンからのコードされた生体分子、発現、またはプログラムされた合成のレベルが、必要性および標的とする適用に依存して調節され得る。目的の生体分子は、例えば、治療的ポリペプチド、診断ポリペプチドもしくは他の生合成可能な指示薬；または有機化合物であり得る。例えば、生化学的経路の全部または一部が、本発明のナノマシンにより発現され得る。このナノマシンから合成された遺伝子産物は、上記のような種々の異なる分子の生合成を達成し得る。他の例としては、ポリケチド、イソプレノイド、グリコシドの合成、窒素固定、硫酸固定、炭素固定、農薬（例えば、ピロルニトリン）、および高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）において用いられ得る種々の生理学的応答（例えば、抗原提示系）のための経路の組み込みが挙げられる。
【０１６０】
生物的環境浄化は、本発明のナノマシンの別の有用な適用である。例えば、このナノマシンは、広範な種々の環境浄化活性および産業的浄化活性を実施するようにプログラムされ得る。環境的生物的環境浄化活性としては、例えば、汚染物質内の所望されない物質を分解するようにプログラムされたナノマシンの使用による汚染物または廃棄物（例えば、石油流出または汚染された地下水）の処理が挙げられ得る。同様に、産業的プロセス（食品加工が挙げられる）において産生されるか、またはそのプロセスに含まれる、所望されない物質は、本発明のナノマシンに対する例示的な産業的生物的環境浄化活性である。当業者に周知の広範な種々の他の生物的環境浄化活性が、本発明のナノマシンとの使用に同様に適用可能である。簡単には、生物的環境浄化プロセスにおいて微生物の代わりにナノマシンを用いるために、当業者は、環境浄化プロセスを実施する活性遺伝子成分を、ナノマシンの基礎的遺伝子操作システムへと組み込み得る。一旦、ゲノムが特定の生物的環境浄化活性に対して調整（ｔａｉｌｏｒ）されると、このナノマシンは、元の微生物と実質的に同じ割合で、この活性において使用され得る。
【０１６１】
前に記載される任意のナノマシンはまた、治療適用のために直接的または間接的に用いられ得る。そのような治療適用としては、例えば、個体内の規定された位置での治療的分子の発現、および個体内の規定された位置への高分子または有機化合物の送達が挙げられ得る。本発明のナノマシンはまた、例えば、ナノマシンが、正常な細胞型を機能的に置換するか、または不完全な産物の一過性もしくは長期の供給を生じる場合、細胞治療様適用において用いられ得る。ナノマシンは、さらに、新規の細胞の活性もしくは分子の活性、または病理学的状態の重篤度を軽減する、個体に対する操作を供給するために用いられ得る。そのような治療的方法および当業者に周知の他の方法の全ては、本発明のナノマシンに適用可能な使用である。
【０１６２】
治療分子、診断指示薬、有機化合物、および種々の生理学的機能または産業的機能の送達系として使用される場合、ナノマシンは、例えば、標的の生体分子の生成、活性または操作を構成的に生成または調節するようにプログラムされ得る。そのような発現の方法は、以前に記載されており、そして治療分野、診断分野、または産業分野を含む分野の当業者に周知である。
【０１６３】
人工の組織または器官が、本発明のナノマシンにより合成され得、そして多くの治療適用において使用され得る。そのような構造のナノマシン生合成が、例えば、インビボ、インサイチュ、またはインビトロで実施され得る。例えば、ナノマシンが、細胞外マトリクスポリペプチドおよび組織内または生体基質上に沈着され得る他の成分を合成、分泌、および自己アセンブルするようにプログラムされ得る。そのような構造が、人工組織の機能を補うために、直接的にか、または他の成分（例えば、増殖因子）と組み合わせて用いられ得る。ナノマシンにより生成された組織は、例えば、標的化部位での生成により直接的にか、または生成および標的化部位への移植によって間接的に用いられ得る。同様に、器官（例えば、血管細胞、骨髄細胞、および肝臓細胞）の機能が、これらおよび他の組織の基礎的な細胞構築ブロックとしてナノマシンを用いて複製され得る。そのような組織は、例えば、組織の置換、修復もしくは補充の所望の部位で生成され得るか、またはエキソビボで生成され、次いでレシピエントの個体中に移植され得る。
【０１６４】
ナノマシンはまた、例えば、エネルギーまたは物質を作製、貯蔵、または変換するためのデバイスとして、用いられ得る。例えば、種々の形態のエネルギーが、公知の生化学または生理化学（ｐｈｙｓｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）または経路および機構を介して捕捉または利用され得る。基礎的遺伝子操作システムは、例えば、化学エネルギーまたは機械的エネルギーを補足し得る１つ以上の経路を含むようにプログラムされ得る。ナノマシンの経路および成分は、これらのエネルギーの供給源を、例えば、貯蔵、使用、または引き続く別のエネルギー型への変化のための高エネルギー分子へと変換し得る。高エネルギー分子としては、例えば、ＡＴＰ、ＮＡＤ、ＮＡＤＰＨ、ＦＡＤ、および他の高エネルギー結合含有分子が挙げられ得る。そのような分子は、例えば、他の型の物質へと変換され得るか、仕事を生じるように用いられ得るか、または化学エネルギー、放射エネルギー（例えば、光また熱）へと変換され得るか、または機械的エネルギーへと変換され得る。従って、ナノマシンは、細胞として多義的に機能するようにプログラムされ得る。
【０１６５】
有用な生合成可能なフィルムおよびコーティングを、本明細書中に記載される本発明の任意のナノマシンにより、さらに作製し得る。このようなフィルムまたはコーティングは、例えば、環境の変化に反応性である。
【０１６６】
ナノマシンは、種々様々な美容および再建の用途において、さらに利用され得る。このような美容的用途は、美容または再建の外科的な使用から、外部の美化の使用までの範囲にわたり得る。例えば、本発明のナノマシンを、再建の手術において支持生体適合構造として、利用し得る。これらは、例えば、新たに、または天然のまたは生体適合性の支持構造体と共にのいずれかで、種々の異なる構造に、実を結び、成長し得る。次いで、このような再建人工器官は、当業者に周知の種々の方法を用いて個体において移植され得る。美容外科的用途としては、例えば、唇、頬、胸および他の解剖学的な身体領域の増大のための任意の種々の移植が挙げられる。美容化粧品または薬用化粧品として、本発明のナノマシンを、種々の環境の刺激に反応して、物理的な特性を変えるように設計し得る。このような刺激としては、例えば、ｐＨ、重量オスモル濃度、温度および湿度が挙げられ得る。このような刺激に応じて改変され得る特性としては、例えば、色、大きさ、および匂いが挙げられ得る。従って、薬用化粧品は、構成され得、一時的なまたは永続する美容の付属品として用いられ得る。
【０１６７】
本明細書中に記載される任意の用途について、本発明のナノマシンの使用は、当該者に周知の方法と実質的に類似であり、この方法は、同じまたは類似の用途のための細胞または細胞系を利用する。このような細胞または細胞系としては、例えば、原核生物細胞、単純な真核生物細胞および複雑な真核生物細胞が挙げられ得る。細胞または細胞の系を代替するために、本発明のナノマシンは、類似の非複製細胞の生命機能または複製細胞の生命機能を維持するのに十分な基礎的遺伝子操作システム、および、必要な場合、本方法で用いられた同種の原核生物細胞または真核生物細胞により示される類似の活性または操作を行なうためのさらなる遺伝指示を含む。このようなプログラムされたナノマシンは、細胞または細胞系において代替され、実質的に同じ様式において、類似の量において、および例えば置き換えられた細胞についての処置であるような類似の時間に対して、処置される。従って、ナノマシンは、実質的に同じ条件下で、細胞または細胞の組織において起こるようなナノマシンからの類似のプログラムされた活性を維持するのに十分な有効量における方法に加え得、または方法において使用され得る。
【０１６８】
本発明の種々の実施形態の活性に実質的に影響しない改変はまた、本明細書中で提供された発明の定義内に含まれることが理解される。従って、以下の実施例は、本発明を例示することを意図するが、限定することを意図しない。
【実施例】
【０１６９】
（実施例１）
（複製能力を有するナノマシンのための基礎的遺伝子操作システムの設計および合成）
本実施例は、複製能力を有する自律性ナノマシンのための基礎的遺伝子操作システムの設計および合成を示す。
【０１７０】
複製能力を有するナノマシンを、ファンダメンタル遺伝子の遺伝子源としてＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍゲノムを用いて設計した。手短には、複製能力を与える最小の遺伝子セットをコードする自律性原栄養菌の基礎的遺伝子操作システムを、公開のデータベースにおいて入手可能な配列データ情報から電子的に作製した。最小の遺伝子セットを、図２および表４に示す１５の機能的カテゴリーを含むように、設計した。具体的には、機能的カテゴリーは、複製、転写、翻訳、好気性代謝、解糖／ピルビン酸塩脱水素酵素／五炭糖燐酸塩経路、炭水化物代謝、中心的中間代謝、ヌクレオチド代謝、シグナル変換調節、輸送および結合タンパク質、粒子分割、シャペロンシステム、脂肪酸／脂質代謝、粒子膜およびハウスキーピング機能であった。加えて、複製起点のような機能的遺伝子配列および構造的遺伝子配列がまた、電子的設計、操作および合成に含まれた。これらの遺伝子配列は、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ遺伝子から同様に由来した。
【０１７１】
複製能力を有する基礎的遺伝子操作システムの設計およびコンピューター合成を、各々のファンダメンタル遺伝子について、ヌクレオチド配列のｍＲＮＡ領域および所望された相同的発現エレメントに対応したヌクレオチド配列を組み合わせることにより、実施した。次いで、機能的なカテゴリー内のファンダメンタル遺伝子、または機能的なカテゴリー内のサブグループを、電子的に配置して、各々のそれぞれの機能的カテゴリーに対応した遺伝子カセット、または複製能力を有する基礎的遺伝子操作システム内のサブグループを生成した。次いで、最後に、これらの遺伝子カセットを、他の所望される遺伝子配列に沿って、電子的に組み合わせ、複製能力を有する自律的原栄養菌の基礎的遺伝子操作システムの最終コンピューター化バージョンを生成した。
【０１７２】
コンピューターの合成に続いて、基礎的遺伝子操作システムを化学的に合成する。合成は、最初に遺伝子配列を、電子的に解析し、より効率良く合成し得る、より小さなオリゴヌクレオチド配列にすることにより、成し遂げた。電子的解剖を、基礎的遺伝子操作システムの、センス鎖および相補的アンチセンス鎖の両方について実施する。解析をまた、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかの５’末端とその対応する相補的配列の３’末端との間の部分的相補を保つことによって実施し、その結果アジュバントオリゴヌクレオチドを、相補的なオリゴヌクレオチドとアニ−ルして、この遺伝子にわたる両方の鎖について、オーバーラップするオリゴヌクレオチド集合体を形成し得る。各々の解剖されたオリゴヌクレオチドの大きさは、変わり得るが、一般的には、相補センス鎖とアンチセンス鎖との間の約５０％のオーバーラップを有する５０〜１００ヌクレオチド長（ｎｔ）の間である。
【０１７３】
電子的解析に続いて、ホスホロアミダイトオリゴヌクレオチド合成化学を用いる個々のオリゴヌクレオチドの自動合成を、次いで実施した。基礎的遺伝子操作システムへのオリゴヌクレオチドの自動化構築を、逐次のアニ−リングおよび部分的な相補ヌクレオチドの連結により成し遂げ、約２６６，４３３塩基対（ｂｐ）長の複製能遺伝子操作システムの完全な物理的合成を達成する。上記の工程の全てを、以下にさらに詳細に記載する。
【０１７４】
手短に、選択されたファンダメンタル遺伝子配列を、ゲノム配列からそれぞれのｍＲＮＡ配列に電子的に減少させた。代わりに、ファンダメンタル遺伝子配列が、いくつかの場合、ファンダメンタル遺伝子の５’側の翻訳されていない領域の配列または３’側の翻訳されていない領域の配列のいくらかまたは実質的に全てを除去し、例えば、必要な場合各々のファンダメンタル遺伝子またはシストロンについて、リボソーム結合部位を保持することによって、最小のコード配列に電子的に減少させる。Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍは原核生物であるために、イントロン配列の電子的減少除去に含まれる必要はない。得られる電子的ｃＤＮＡ配列を、続いてプロモーター、エンハンサー、サプレッサー、および他のシス活性転写配列またはシス活性翻訳配列のような機能的発現エレメントを含むよう、設計した。このような配列は、例えば、少なくとも上流のプロモーターおよび各々の遺伝子またはシストロンについてのリボソーム結合部位ならびに任意の必要な転写終止シグナルまたは翻訳終止シグナルを含んだ。
【０１７５】
全ての５’発現エレメントおよび３’発現エレメントならびにシス活性配列を、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍゲノム配列から得た。次いで、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ発現エレメントおよびシス活性配列を、コンピューター合成により、基礎的遺伝子操作システムの最小の遺伝子セット内の対応するこれらのファンダメンタル遺伝子に作動可能に結合した。効果的に、相同的発現および調節配列を含めることを、約１００ｎｔまたは５’方向における遺伝子の開始点と上流の遺伝子の末端との間の遺伝子内領域として規定されるセグメントを保持することにより電子的に実施した。同様に、約１００ｎｔまたは３’方向における遺伝子の末端と下流の遺伝子の開始点との間の遺伝子内領域として規定されるセグメントを、遺伝子の各々の電子的バージョンにおいて保持した。翻訳終止コドンの３’側のｎｔ領域配列をまた、遺伝子の各々の電子的バージョンにおいて保持した。
【０１７６】
上記の様な各々のファンダメンタル遺伝子のコンピューター合成に続き、各々の機能的カテゴリーまたはサブグループについての構成的なファンダメンタル遺伝子を、単一の連続配列または遺伝子カセットに電子的に構成した。各々の機能的カテゴリーまたはサブグループについての連続配列は、配列番号１〜１８に相当する。例えば、配列番号１は、複製の機能的カテゴリー内の２４のファンダメンタル遺伝子をコードする約３８，５９６ｎｔ配列を示す。遺伝子は、図２に列挙された通り、５’から３’への方向において順序づけられる。各々の機能的カテゴリーまたはそのサブグループの完全なリスト、そのカテゴリーまたはサブグループをコードする遺伝子カセットの大きさ、含まれるファンダメンタル遺伝子の数および対応する配列番号を、以下の表１に示す。他に記載される場合を除いて、機能的カテゴリーまたはサブグループ内の各々の遺伝子の整列は、図２に列挙される遺伝子の順番における５’から３’の方向に対応する。
【０１７７】
【表１】
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最後の遺伝子を生成するために、各々の機能的カテゴリーまたはサブグループをコードする上記の遺伝子カセットを、複製起点から始まる５’から３’への一方向性の順序において平行に配列し、複製能力を有するナノマシンについての基礎的遺伝子操作システムの完全な電子的表現を得た。複製起点を、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＥ００５１７４からの４，７８８，１６７位〜４，７８８，３９８位する２３２ｎｔ領域としてｐＢＲ３２２またはＥ．ｃｏｌｉから得た。この複製起点を、配列番号１９として示す。上記のナノマシン遺伝子を、以下にさらに記載されるように、電子的に解析し、合成し、構築し得る。
【０１７８】
配列番号１〜１８によって示される上記されるナノマシン（ｎａｎｏｍａｃｈｉｎｅ）のゲノムは、コンピューターアルゴリズムおよび２つのセットの重複するオリゴヌクレオチドを生成する対応する実行プログラムを使用して電子的に解釈され得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、核酸配列アセンブリを最適化する私的コンピュータープログラムであるＰａｒｓｅＯｌｉｇｏＴＭを使用して解釈され得る。配列アセンブリにおける任意の工程としては、ヘアピン、反復または他の困難な配列を生じ得る配列を同定する工程およびそれを削除する工程が挙げられる。さらに、アルゴリズムは、まず、所望されるコドン優先性に対応するように各ファンダメンタル遺伝子に対するコード領域の合成を指向する。例えば、ファンダメンタル遺伝子に対するコード領域は、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍコドンの代わりにＥ．ｃｏｌｉコドンの使用法を特定するファンダメンタル遺伝子のコード領域が、生成され得る。ファンダメンタル遺伝子配列の別のコドン優先性への転換について、アルゴリズムは、ポリペプチド配列を使用し、明記されたコドン表を使用してＤＮＡ配列を生成する。この工程のためのアルゴリズムは、以下のように記載され得る：
ＤＮＡ配列ＧＥＮＥ［］について、塩基のアレイは、明記されたコドン表を使用して、タンパク質配列ＡＡ［］（アミノ酸のアレイ）から生成される。
ａ．パラメーター
ｉ．      アミノ酸残基中のＮ長のタンパク質
ｉｉ．    Ｌ＝ＤＮＡ塩基中の３Ｎ長の遺伝子
ｉｉｉ．  Ｑ長の各成分オリゴヌクレオチド
ｉｖ．    Ｘ＝Ｑ／２長のオリゴヌクレオチド間の重複
【０１７９】
ｖ．      Ｗ＝Ｆセット中の３Ｎ／Ｑ数のオリゴヌクレオチド
ｖｉ．    Ｚ＝Ｒセット中の３Ｎ／Ｑ＋１のオリゴヌクレオチド
ｖｉｉ．  Ｆ［１：Ｗ］セットの（＋）鎖オリゴヌクレオチド
ｖｉｉｉ．Ｒ［Ｌ：Ｚ］セットの（−）鎖オリゴヌクレオチド
ｉｘ．    ＡＡ［１：Ｎ］アレイのアミノ酸残基
ｘ．      遺伝子を含むＧＥＮＥ［１：Ｌ］アレイの塩基。
ｂ．１つのアミノ酸残基のリストからなるタンパク質配列ＡＡ［］を得るかまたは設計する。
ｃ．タンパク質配列（ＡＡ［］）からＤＮＡ配列（ＧＥＮＥ［］）を生成する
ｉ．      Ｉに対して１〜Ｎ
ｉｉ．    ＧＥＮＥ［Ｉ：Ｉ＋２］を生成するコドン表からＡＡ［Ｊ］を転写する
ｉｉｉ．  Ｉ＝Ｉ＋３
ｉｖ．    Ｊ＝Ｊ＋１
ｖ．      ｉｉに戻る。
【０１８０】
ファンダメンタル遺伝子のコード領域に対するコドン優先性を明記してもしなくても、解釈アルゴリズムは、ナノマシンゲノムのセンス鎖およびアンチセンス鎖の全長に対応する解釈オリゴヌクレオチドのセットを生成し得る。解釈は、全ゲノム、機能的カテゴリーを構成する遺伝子カセット、またはこれらのより短いフラグメントに対して実施され得、ユーザの好みに依存する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が、アセンブリプロセスにおいて使用される場合、例えば、解釈は、ゲノムの約１０〜１５ｋｂフラグメントに対して実施される。なぜなら、この大きさは、この手順において使用されるポリメラーゼの伸長範囲内であるからである。従って、１０ｋｂセグメントの上記されるナノマシンゲノムを解釈することは、２７の異なるセットのセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクオレオチドを生じる。これらのセットは、下記されるＰＣＲ法を使用してアセンブルされ、次いで、一緒に連結され、完成した基礎的遺伝子操作システムを生じ得る。解釈アルゴリズムは、以下のように記載され得る：
重複する２つのセットのオリゴヌクレオチドは、ＧＥＮＥ［］から生成され；Ｆ［］は、センス鎖を含み、Ｒ［］は、アンチセンス鎖を含む相補的な部分的に重複するセットである。
ａ．Ｆ［］セットのオリゴを生成する
ｉ．      Ｉに対して１〜Ｗ
ｉｉ．    Ｆ［Ｉ］＝ＧＥＮＥ［Ｉ：Ｉ＋Ｑ−１］
ｉｉｉ．  Ｉ＝Ｉ＋Ｑ
ｉｖ．    ｉｉに戻る。
ｂ．Ｒセットのオリゴを生成する
ｉ．      Ｊ＝Ｗ
ｉｉ．    Ｆに対して、Ｉ＝１〜Ｗ
ｉｉｉ．  Ｒ［Ｉ］＝ＧＥＮＥ［Ｗ：Ｗ−Ｑ］
ｉｖ．    Ｊ＝Ｊ−Ｑ
ｖ．      ｉｉｉに戻る。
ｃ．結果は、２つのセットのＱ長のオリゴＦ［］およびＲ［］である。
ｄ．最終の２つの終了オリゴを生成する
ｉ．      Ｓ［１］＝ＧＥＮＥ［Ｑ／２：１］
ｉｉ．    Ｓ［２］＝ＧＥＮＥ［Ｌ−Ｑ／２：Ｌ］。
【０１８１】
ナノマシンの完成した基礎的遺伝子操作システムを示す、２つのセットの重複する部分的に相補的なオリゴヌクレオチドへと解釈した後、オリゴヌクレオチドを、合成する。この点において、ナノマシンゲノムのセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方に対するオリゴヌクレオチドの解釈されたセットのコンピューター出力は、オリゴヌクレオチド合成機ドライバーソフトウェアに移送され得る。約２５〜１５０ｎｔ長の配列の合成は、アレイ合成機システムを使用して製造およびアセンブルされ、そしてさらなる精製なしに使用され得る。例えば、１００ｎｔのオリゴヌクレオチドを含む２つの９６ウェルプレートは、遺伝子カセットの９６００ｂｐフラグメントを生じ得る。従って、上記複製能力を有するナノマシンに対する全ての基礎的遺伝子操作システムの合成は、約２８対の９６ウェルプレートを使用して実施され得る。一旦合成されると、個々のオリゴヌクレオチドは、元のプレートに維持され得るか、またはオリゴヌクレオチドアセンブリに対する新規のマルチウェル形式へと移され得る。
【０１８２】
アセンブリは、例えば、膨大な数のオリゴヌクレオチドサンプルを操作するための、当該分野で周知のロボット工学および微量流体工学を使用して達成された。ロボット工学および微量流体工学によって、合成およびアセンブリが、迅速かつ高度に制御された様式で、実施される。このような方法は、例えば、ＷＯ９９／１４３１８および米国特許出願番号６０／２６２，６９３および０９／９２２，２２１に記載される。
【０１８３】
例えば、コンピューター中で設計されるゲノム配列から解釈されるオリゴヌクレオチドは、合成のためにプログラムされ得、ここで、センス鎖およびアンチセンス鎖は、アレイのウェルに交互に配置される。この形式での合成後、遺伝子の１２列の配列は、三連の構造を形成する反応容器に３つのウェルを規則正しくプールするプールマニホールドに指向される。アニーリングおよび連結のための温度サイクルの後、４つのセットのアニールされた三連のオリゴヌクレオチドが、２セットの６オリゴヌクレオチド産物にプールされ、次いで、１セットの１２オリゴヌクレオチド産物にプールされる。合成アレイの各列が、同様のマニホールドを用いて合わせられ、各々１２オリゴヌクレオチドを表す、アセンブルされた８セットのオリゴヌクレオチドの第１段階のアセンブリを生じる。第２のマニホールドプール段階は、８列のアセンブリを単一の完全なアセンブリにプールする単一のマニホールドによって制御される。２つのマニホールドアセンブリ（第１の８のアセンブリおよび第２の単一アセンブリ）によるオリゴヌクレオチド成分の通過は、アレイからの全９６オリゴヌクレオチドの完全アセンブリを生じる。ＧｅｎｅｗｒｉｔｅｒＴＭのアセンブリモジュールは、単一のプラスチックブロックにおいて微小製造を使用して生成される７のプールマニホールドの完全なセットを備え得、このプラスチックブロックは、合成容器の下に置かれる。種々の構成のプールマニホールドは、解釈された成分オリゴヌクレオチドの９６，３８４ウェルまたは１５３６ウェルのアレイのアセンブリを可能にする。同様の戦略は、オリゴヌクレオチドの対が三連鎖の代わりにプールされる場合、実施され得る。
【０１８４】
上記されるようなオリゴヌクレオチドのアセンブリに対するコンピュータープログラムにおいて実行され得るアルゴリズムは、以下のように記載され得る：
２セットのオリゴヌクレオチド  Ｆ［１：Ｗ］  Ｒ［１：Ｚ］  Ｓ［１：２］
工程１
ａ．Ｉについて、１〜Ｗ。
【０１８５】
ｂ．Ｆ［Ｉ］、Ｆ［Ｉ＋１］、Ｒ［Ｉ］をアニールし、Ｔ［Ｉ］に配置する。
【０１８６】
ｃ．Ｆ［Ｉ＋２］、Ｒ［Ｉ＋１］、Ｒ［Ｉ＋２］  Ｔ［Ｉ＋１］をアニールする。
【０１８７】
ｄ．Ｉ＝Ｉ＋３。
【０１８８】
ｅ．ｂに戻る。
工程２
ａ．単一の反応物が残るまで、以下を実施する。
【０１８９】
ｉ．      Ｉについて、１〜Ｗ／３
ｉｉ．    Ｔ［Ｉ］、Ｔ［Ｉ＋１］を連結する。
【０１９０】
ｉｉｉ．  Ｉ＝Ｉ＋２
ｉｖ．    ｉｉに戻る。
【０１９１】
マルチウェル様式を使用するオリゴヌクレオチドセットのアレイ合成の後の、上記される基礎的遺伝子操作システムに対応する解釈されたオリゴヌクレオチドのアセンブリが、以下にさらに記載される。この方法は、２工程手順においてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）をさらに使用し、アセンブリを容易にする。
【０１９２】
解釈された重複オリゴヌクレオチドのアレイのセットは、ロボット工学的指示によって得られる。各オリゴヌクレオチドは、約２５塩基対（ｂｐ）の重複を有する５０ｎｔからなる。オリゴヌクレオチド濃度は、２５０ｎＭ（２５０μＭ／ｍｌ）からである。５０塩基オリゴは、７５〜８５℃のＴｍ、６〜１０のｏｄ２６０、１１〜１５ナノモル、１５０〜３００μｇを与える。５０〜１００μｌのＨ２Ｏに再懸濁し、２５０ｎＭ／ｍｌを作製する。等量の各オリゴヌクオレオチドは、各々１μｌを１９２μｌに添加することによって２５０μＭ（２５０ｎＭ／ｍｌ）の最終濃度に混合される。８μｌのｄＨ２Ｏの添加によって、２００μｌまでの容量および最終濃度２５０μＭの混合オリゴを生じる。混合物は、１０μｌの混合オリゴをとることによって２５０倍希釈され、１ｍｌの水に添加し（１／１００；２．５ｍＭ）に添加し、１μｌのこの混合物を２４μｌの１×ＰＣＲ混合物に移す。ＰＣＲ反応物は、以下を含む：１０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）；２．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２；５０ｍＭ  ＫＣｌ；０．２ｍＭ  各ｄＮＴＰ、および０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００。１ＵのＴａｑＩポリメラーゼが、この反応物に添加される。反応物は、アセンブリに対して以下の条件下で熱サイクルする：５５サイクルの（１）９４℃３０秒；（２）５２℃３０秒、および（３）７２℃３０秒。
【０１９３】
アセンブリの増幅の後、２．５μｌのアセンブリ混合物が、１００μｌのＰＣＲ混合物（４０倍希釈）に添加される。外側プライマーは、２５０μＭ（２５０ｎｍ／ｍｌ−０．２５０ｎｍｏｌ／μｌ）の１μｌのＦ１（順方向プライマー）および１μｌのＲ９６（逆方向プライマー）を取り、１００μｌのＰＣＲ反応液に添加されることによって調製される。この混合物は、２．５μＭの各オリゴの最終濃度を提供する。Ｔａｑ１ポリメラーゼが、添加され（１Ｕ）、反応は、以下の条件下での熱サイクルである：（１）９４℃３０秒；（２）５０℃３０秒；および（３）７２℃６０秒を３５サイクル（または元のプロトコルの２３サイクル）。産物は、フェノール／クロロホルムで抽出され、エタノールで沈殿され、ペレットは、１０μｌのｄＨ２Ｏに再懸濁され、アガロースゲル上で分析される。
【０１９４】
オリゴヌクレオチドセットのアレイ合成後の、上記される基礎的遺伝子操作システムに対応する解釈されたオリゴヌクレオチドのアセンブリに対する代替的な方法は、以下に提供される。この方法は、Ｔａｑ１連結手順を使用して、解釈されたオリゴヌクレオチドをアセンブルする。
【０１９５】
簡単には、それぞれ約２５〜１５０塩基長の、約１２〜７５塩基対（ｂｐ）の重複を有する、解析した重複オリゴヌクレオチドの整列セットを得る。オリゴヌクレオチド濃度は、２５０ｎＭ（２５０μＭ／ｍｌ）からである。例えば、５０塩基のオリゴは、７５〜８５℃のＴｍ、６〜１０のｏｄ２６０、１１〜１５ナノモル、１５０〜３００μｇを与える。このオリゴヌクレオチドを、５０〜１００ｍｌのＨ２Ｏに再懸濁して、２５０ｎＭ／ｍｌにする。
【０１９６】
ロボットワークステーション（例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｂｉｏｍｅｋ自動化ピペッティングロボットまたは別の自動化ラボワークステーション）を使用して、等量の順方向オリゴヌクレオチドおよび逆方向オリゴヌクレオチドを合わせて対にする。等量（１０μｌ）の順方向オリゴヌクレオチドおよび逆方向オリゴヌクレオチドを、新たな９６ウェルｖ底プレート中で混合して、２５０μＭの二重鎖オリゴヌクレオチドのセットを含む１つのアレイを、表２のプールスキーム工程１に従って提供する。構築プレートを、２μｌの各オリゴマー対を採取し、そして各ウェル中に１００μｌの連結混合物を含む新たなプレートに添加することによって、調製する。この手順は、２．５μＭまたは２．５ｎＭ／ｍｌの有効濃度を与える。これらのウェルの各々のウェルから、２０μｌを新たなマイクロウェルプレートに移し、続いて、１μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼおよび１μｌの１ｍＭ  ＡＴＰを、各ウェルに添加する。各反応物は、５０ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドおよび１ｎｍｏｌのＡＴＰを有する。これらの反応物を、３７℃で３０分間インキュベートする。
【０１９７】
構築の開始を、表２の工程２〜７に従って実施する。例えば、プール工程２を、各連続ウェルを次のウェルと混合することによって実施する。次いで、Ｔａｑ１リガーゼ（１μｌ）を、各混合ウェルに添加し、そしてこの混合物を、９４℃で３０秒間；５２℃で３０秒；次いで７２℃で１０分間、一回サイクリングする。
【０１９８】
さらなる構築を、プールスキームの表２の工程３、および上記の温度スキームに従うサイクルに従って、実施する。同様に、次いで、プールスキームの工程４および５を、さらなる構築のために実施し、そしてまた、上記の温度スキームに従って、サイクリングする。続くプールスキームの工程６の実施を、１０μｌの各混合物を、新たなマイクロウェルに移すことによって達成し、そしてプールスキームの工程７を、残りの３個のウェルをプールすることによって達成する。このプールスキームのこれらの工程の各々の反応容量は、以下である：
初期プレートは、２０μｌ／ウェルを有する。
【０１９９】
工程２  ２０μｌ＋２０μｌ＝４０μｌ
工程３            ８０μｌ
工程４            １６０μｌ
工程５            ２３０μｌ
工程６  １０μｌ＋１０μｌ＝２０μｌ
工程７  ２０＋２０＋２０＝６０μｌの最終反応容量。
【０２００】
次いで、２μｌの最終連結混合物をとり、そして２０μｌのＰＣＲ混合物（１０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、２．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰおよび０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む）に添加することによって、最終のＰＣＲ増幅を行う。
【０２０１】
１μｌのＦ１（順方向プライマー）および１μｌのＲ９６（逆方向プライマー）を２５０μＭ（２５０ｎｍ／ｍｌ−０．２５０ｎｍｏｌ／μｌ）をとり、１００μｌのＰＣＲ反応物に加えて、各オリゴの２．５μＭの最終濃度を与えることによって、外側プライマーを調製する。１ＵのＴａｑ１ポリメラーゼを添加し、そして以下の条件下で、３５サイクルをサイクリングする：９４℃で３０秒；５０℃で３０秒；および７２℃で６０秒。この混合物を、フェノール／クロロホルムで抽出し、そしてエタノールで沈殿させる。ペレットを、１０μｌのｄＨ２Ｏ中に再懸濁し、そしてアガロースゲルで分析する。
【０２０２】
表２．構築物を連結するためのプールスキーム
連結方法−ウェルプールスキーム
【０２０３】
【表２】
2005503799.tif 000003
オリゴヌクレオチドセットのアレイ合成に従う上記の基礎的遺伝子操作システムに対応する解析されたオリゴヌクレオチドの別の代替の方法が、さらに以下に記載される。この方法は、ＴａｑＩ合成および段階的構築を使用して、解析されオリゴヌクレオチドを構築する。
【０２０４】
簡単には、各々約２５〜１５０塩基長の解析された重複オリゴヌクレオチドの、約１２〜７５塩基対（ｂｐ）の重複を有する整列セットが、上記のようにして得られ、そして５０〜１００ｍｌのＨ２Ｏ中に再懸濁されて、２５０ｎＭ／ｍｌにされる。同様に、サンプルの操作が、上記のようなロボット工学を使用して行われる。
【０２０５】
ＰＣＲ混合物中に、２．５ｍＭで順方向オリゴヌクレオチドおよび逆方向オリゴヌクレオチドを含む２つの作動マルチウェルプレートを調製し、そして１μｌの各オリゴを、新たなマイクロウェル中の１００μｌのＰＣＲ混合物に添加して、アレイ中で順方向オリゴの１つのプレートおよび逆方向オリゴの１つのプレートを提供する。次いで、サイクリングアセンブリを、表３に概説されるプールスキームに従って、以下のようにして開始する。この例において、９６サイクルの構築が、このスキームに従って達成され得る。
【０２０６】
構築を開始するために、ウェル  Ｆ−Ｅ１中の２μｌのオリゴヌクレオチドを、新たなウェルに移す。同様に、ウェルＲ−Ｅ１中の２μｌのオリゴヌクレオチドを、新たなウェルに移し、そして１８μｌの１×ＰＣＲ混合物および１ＵのＴａｑ１ポリメラーゼを添加する。この混合物を、以下の条件下で一回サイクリングする：（１）９４℃で３０秒；（２）５２℃で３０秒、および（３）７２℃で３０秒。続いて、ウェルＦ−Ｅ２およびウェルＲ−Ｄ１２からの２μｌのオリゴヌクレオチドを、反応容器に移す。この混合物を、上記の温度条件に従って、一回サイクリングする。このプール工程およびサイクリング工程を、表３に記載のスキームに従って、約９６サイクル繰り返す。
【０２０７】
次いで、２μｌの最終反応混合物をとり、そしてこれを２０μｌのＰＣＲ混合物（１０ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）；２．２ｍＭのＭｇＣｌ２；５０ｍＭのＫＣｌ；各々０．２ｍＭのｄＮＴＰおよび０．１％のＴｒｉｔｏｎ  ｘ−１００を含む）に添加することによって、ＰＣＲ増幅を実施する。
【０２０８】
１μｌのＦ１および１ｍｌのＲ９６を２５０ｍＭ（２５０ｎｍ／ｍｌ−０．２５０ｎｍｏｌ／ｍｌ）でとり、そして上記の１００μｌのＰＣＲ反応物に添加することによって、外側プライマーを調製する。この手順により、各オリゴヌクレオチドの２．５μＭの最終濃度を得る。続いて、１ＵのＴａｑ１ポリメラーゼを、添加し、そしてこの反応物を、約２３〜約３５サイクル、以下の条件下でサイクリングする：（１）９４℃で３０秒；（２）５０℃で３０秒、および（３）７２℃で６０秒。続いて、この反応物を、フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させ、そしてアガロースゲルでの分析のために、１０ｍｌのｄＨ２Ｏ中に再懸濁する。
【０２０９】
オリゴヌクレオチドの最初のプール工程について、１０μｌの順方向オリゴヌクレオチドおよび１０μｌの逆方向オリゴヌクレオチドをとり、そして新たな９６ウェルのｖ底プレート中で混合することによって、等量の順方向オリゴヌクレオチド対および逆方向オリゴヌクレオチド対を添加する。この手順は、表３のプールスキーム工程１に従って、２５０ｍＭの二重鎖オリゴヌクレオチドのセットを含む１つのアレイを提供する。２μｌの各オリゴマー対をとり、そしてこれを、各ウェル中の１００μｌの連結混合物を含むプレートに添加することによって、構築プレートを調製する。これは、２．５μＭまたは２．５ｎＭ／ｍｌの有効濃度を与える。約２０μｌの各ウェルを、１μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼおよび１μｌの１ｍＭ  ＡＴＰに加えて、新たなμウェルプレートに移す。各反応物は、５０ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドおよび１ｎｍｏｌのＡＴＰを有する。この反応物を、３７℃で３０分間インキュベートする。
【０２１０】
核酸構築を、表３の工程２〜７に従って、開始する。工程２について、プール工程を、各ウェルを次のウェルと連続的に混合することによって行う。詳細には、１μｌのＴａｑ１リガーゼを各混合ウェルに添加し、そして以下のようにして１回サイクリングする：（１）９４℃で３０秒；（２）５２℃で３０秒、および（３）７２℃で１０分。
【０２１１】
続いて、プールスキームの工程３を実施し、そして上記の温度スキームに従ってサイクリングする。類似の様式で、次いで、プールスキームの工程４および工程５を、実施し、そして上記の温度スキームに従ってサイクリングする。プールスキームの工程６を、１０μｌの各混合物を新たなマイクロウェルにとることによって実施する。残りの３個のウェルをプールすることにより、プールスキームの工程７が完了する。反応容量は、以下である（初期のプレートは２０μｌ／ウェルを有する）：
工程２  ２０μｌ＋２０μｌ＝４０μｌ
工程３            ８０μｌ
工程４  １６０μｌ
工程５  ２３０μｌ
工程６  １０μｌ＋１０μｌ＝２０μｌ
工程７  ２０＋２０＋２０＝６０μｌの最終反応容量。
【０２１２】
上記の工程が完了した後、２μｌの最終連結混合物をとり、そしてこれを２０μｌのＰＣＲ混合物（１０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、２．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰおよび０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む）に添加することによって、最終のＰＣＲ増幅を実施する。
【０２１３】
１μｌのＦ１および１μｌのＲ９６を２５０ｍＭ（２５０ｎｍ／ｍｌ−０．２５０ｎｍｏｌ／ｍｌ）でとり、そしてこれらを上記のＰＣＲ反応物に添加して、各オリゴヌクレオチドについて２．５μＭの最終濃度を得ることによって、外側プライマーを調製する。続いて、１ＵのＴａｑ１ポリメラーゼを添加し、そして以下の条件下で、約２３〜約３５サイクルの間サイクリングする：（１）９４℃で３０秒；（２）５０℃で３０秒、および（３）７２℃で６０秒。この産物を、フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させ、１０μｌのｄＨ２Ｏに再懸濁し、そしてアガロースゲルで分析する。
【０２１４】
表３．Ｔａｑ１ポリメラーゼ（およびトポイソメラーゼＩＩ）を使用する構築のためのプールスキーム
【０２１５】
【表３−１】
2005503799.tif 000004
【０２１６】
【表３−２】
2005503799.tif 000005
【０２１７】
【表３−３】
2005503799.tif 000006
本発明は、開示される実施形態を参照して記載されてきたが、当業者は、詳述される特定の実施形態が本発明の例示に過ぎないことを容易に理解する。種々の改変が、本発明の精神から逸脱することなくなされ得ることが理解されるべきである。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲のみによって限定される。
【０２１８】
【表４】
2005503799.tif 000007
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【図面の簡単な説明】
【０２１９】
【図１−１】図１は、生存可能な原栄養性ナノマシンのための基礎的遺伝子操作システムのファンダメンタル遺伝子および機能的カテゴリーを示す。
【図１−２】図１は、生存可能な原栄養性ナノマシンのための基礎的遺伝子操作システムのファンダメンタル遺伝子および機能的カテゴリーを示す。
【図１−３】図１は、生存可能な原栄養性ナノマシンのための基礎的遺伝子操作システムのファンダメンタル遺伝子および機能的カテゴリーを示す。
【図１−４】図１は、生存可能な原栄養性ナノマシンのための基礎的遺伝子操作システムのファンダメンタル遺伝子および機能的カテゴリーを示す。
【図２−１】図２は、複製能力を有する原栄養性ナノマシンのための基礎的遺伝子操作システムのファンダメンタル遺伝子および機能的カテゴリーを示す。
【図２−２】図２は、複製能力を有する原栄養性ナノマシンのための基礎的遺伝子操作システムのファンダメンタル遺伝子および機能的カテゴリーを示す。
【図２−３】図２は、複製能力を有する原栄養性ナノマシンのための基礎的遺伝子操作システムのファンダメンタル遺伝子および機能的カテゴリーを示す。
【図２−４】図２は、複製能力を有する原栄養性ナノマシンのための基礎的遺伝子操作システムのファンダメンタル遺伝子および機能的カテゴリーを示す。
【図２−５】図２は、複製能力を有する原栄養性ナノマシンのための基礎的遺伝子操作システムのファンダメンタル遺伝子および機能的カテゴリーを示す。
【図２−６】図２は、複製能力を有する原栄養性ナノマシンのための基礎的遺伝子操作システムのファンダメンタル遺伝子および機能的カテゴリーを示す。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２−１】
2005503799.tif 000024
【図２−２】
2005503799.tif 000025
【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図２−６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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