(57)【要約】本発明は、目的の分析物に特異的な結合化合物に結合された複数の放出可能な分子タグを使用することによって、サンプル中の１つ以上の分析物を測定するための方法およびアルゴリズムを提供する。結合化合物が、それらのそれぞれの分析物に特異的に結合し、複合体を形成した後に、このような複合体を形成する結合化合物の分子タグは、切断され、そして放出される。しかし、このような複合体を形成していない結合化合物の分子タグは、放出されない。次いで、放出された分子タグは、１つ以上の電気泳動標準物質に沿って電気泳動的に分離され、電気泳動図データを生成し、そして、各分子タグの同一性は、１つ以上の電気泳動標準物質に対するこのようなデータにおけるその対応するピークの位置によって決定される。このように、機器の違い、アッセイ条件、試薬の変動性などの因子に起因する、電気泳動図データにおける歪みが説明され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
電気泳動図データにおける複数の分子タグのピークの位置を決定する方法であって、各分子タグは、異なる電気泳動移動度を有し、それにより、電気泳動分離の際に、異なる分子タグが、該電気泳動図データにおいて別個のピークを形成し、該方法は、以下の工程：
（ａ）該分子タグと１つ以上の電気泳動標準物質とを電気泳動的に分離して、電気泳動図データを生成する工程であって、各電気泳動標準物質は、異なる電気泳動移動度を有し、それにより、電気泳動分離の際に、各電気泳動標準物質が、該分子タグおよび他方の電気泳動標準物質のピークとは別個のピークを形成し、そして、このような１つ以上の電気泳動標準物質および分子タグの各ピークは、移動間隔を有し、そして、各移動間隔は、平均を有する、工程；
（ｂ）該電気泳動図データにおける移動間隔内の少なくとも１つの電気泳動標準物質のピーク位置を決定する工程；
（ｃ）電気泳動標準物質または認定されたピークセット中の認定されたピークに最も近い、該電気泳動図データにおいて移動間隔内のピークのピーク位置を決定する工程であって、該ピーク位置は、該最も近い電気泳動標準物質または認定されたピークの位置に相対的であり、かつ、該移動間隔の平均に最も近い移動間隔内のピークと分子タグまたは電気泳動標準物質とを相関する、工程；
（ｄ）該ピークのピークシグナル対ノイズ比を決定し、そして該ピークシグナル対ノイズ比が１．５以上である場合、該認定されたピークセットに該ピークを加える工程；
（ｅ）ピーク位置が該電気泳動図データにおいてピークを有する全ての分子タグに相関されるまで、工程（ｃ）および（ｄ）を繰り返す工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記各分子タグについて、ピークサイズを決定し、そして該ピークサイズを該分子タグの量に相関させる工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、前記電気泳動的に分離する工程が、少なくとも２つの前記電気泳動標準物質を提供する工程を包含し、第１の電気泳動標準物質は、前記分子タグのいずれの電気泳動移動度よりも高い電気泳動移動度を有し、そして第２の電気泳動標準物質は、該分子タグのいずれの電気泳動移動度よりも低い電気泳動移動度を有する、方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、前記分子タグと相関された前記ピークの位置の各々が、このようなピークの移動時間と前記最も近い電気泳動標準物質または認定されたピークの移動時間との間の差および前記第２の電気泳動標準物質の移動時間と該最も近い電気泳動標準物質または認定されたピークの移動時間との間の差の比として決定される、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、前記電気泳動的に分離する工程が、前記各々の分子タグに、切断可能な結合によって結合された１つ以上の該分子タグを有する少なくとも１つの結合化合物を提供し、それにより、異なる結合化合物が、該結合された異なる分子タグを有する工程、をさらに包含し、そして、電気泳動的に分離されている該分子タグの各々は、以下の式：
Ｂ−［Ｌ−（Ｄ，Ｍ）］ｋ
によって規定される群から選択される結合化合物から放出され、
ここで：
Ｂは、分析物の少なくとも１つに特異的な結合部分であり；
Ｌは、切断可能な結合であり；
ｋは、１以上の整数であり；
Ｄは、蛍光標識であり；そして
Ｍは、水素、炭素、酸素、硫黄、窒素、リン、およびホウ素からなる群より選択される３００個までの原子から構成される水溶性有機化合物であるか、または、Ｄと合わされる場合、５０〜１５００ダルトンの範囲の合わされた分子量を有する部分を形成するかのいずれかである、方法。
【請求項６】
請求項４に記載の方法であって、前記電気泳動的に分離する工程が、前記各分子タグに、切断可能な結合によって結合された１つ以上の該分子タグを有する少なくとも１つの結合化合物を提供し、それにより、異なる結合化合物が、該結合された異なる分子タグを有する工程、をさらに包含し、そして、電気泳動的に分離されている該分子タグの各々は、以下の式：
（Ｍ，Ｄ）−Ｎ−Ｔ
によって規定される群から選択される結合化合物から放出され、
ここで：
（Ｍ，Ｄ）−Ｎは、該分子タグであり；
Ｔは、前記分析物の少なくとも１つに相補的なオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドは、１２〜６０個のヌクレオチドを有し；
Ｎは、ヌクレオチドであり；
Ｄは、蛍光標識であり；そして
Ｍは、水素、酸素、硫黄、窒素、リン、およびホウ素からなる群より選択される３００個までの原子から構成される水溶性有機化合物であるか、または、該分子タグとしてＤおよびＮと合わされる場合、該分子タグは、５０〜１５００ダルトンの範囲の合わされた分子量を有する、方法。
【請求項７】
複数の分子タグを同定するためのコンピューターによる実行に対するプログラムを、このような分子タグと相関された電気泳動図データにおけるピークの位置を決定することによって実施するコンピューター読み取り可能製品であって、該プログラムは、以下：
（ａ）記憶媒体から電気泳動図データを読み取る工程であって、該電気泳動図データは、該複数の分子タグおよび１つ以上の電気泳動標準物質の電気泳動分離によって得られ、各電気泳動標準物質および分子タグは、異なる電気泳動移動度を有し、それにより、電気泳動分離の際に、各電気泳動標準物質および分子タグが、該電気泳動図データにおいて別個のピークを形成する、工程；
（ｂ）該電気泳動図データにおいて少なくとも１つの電気泳動標準物質のピーク位置を決定する工程；
（ｃ）該電気泳動図データにおいてピークのピーク位置を決定し、該ピーク位置は、電気泳動標準物質の位置に相対的であり、そして、該ピーク位置と分子タグまたは電気泳動標準物質とを相関させる、工程；
（ｄ）ピーク位置が該電気泳動図データにおいてピークを有する全ての分子タグに相関されるまで工程（ｃ）を繰り返す工程、
についての命令を含む、コンピューター読み取り可能製品。
【請求項８】
請求項７に記載のコンピューター読み取り可能製品であって、前記読み取る工程が、少なくとも２つの前記電気泳動標準物質を提供する工程を包含し、第１の電気泳動標準物質は、前記分子タグのいずれの電気泳動移動度よりも高い電気泳動移動度を有し、そして第２の電気泳動標準物質は、該分子タグのいずれの電気泳動移動度よりも低い電気泳動移動度を有する、コンピューター読み取り可能製品。
【請求項９】
請求項８に記載のコンピューター読み取り可能製品であって、前記分子タグと相関された前記ピークの位置の各々が、このようなピークの移動時間と前記第１の電気泳動標準物質の移動時間との間の差および前記第２の電気泳動標準物質の移動時間と該第１の電気泳動標準物質の移動時間との間の差の比として決定される、コンピューター読み取り可能製品。
【請求項１０】
前記各分子タグについてのピークサイズを決定し、そして該ピークサイズと該分子タグの量とを相関させる工程をさらに包含する、請求項９に記載のコンピューター読み取り可能製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、分子タグの生成およびその電気泳動的分離によって、アッセイにおいて１つ以上の分析物を検出および／または測定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ゲノム規模の発現測定およびプロテオーム規模の発現測定のためのいくつかの強力な技術の開発により、非常に種々の条件および刺激に応答する生物の遺伝子の大きな集合（全てではないが）の協調的な活動を研究し、理解する機会が作られた（例えば、ＤｅＲｉｓｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７８：６８０−６８６（１９９７）；Ｗｏｄｉｃｋａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１５、１３５９−１３６７（１９９７）；Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕら、Ｃｅｌｌ、２４３−２５１（１９９７）；Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１８：６３０−６３４（２０００）；ＭｃＤｏｎａｌｄら、Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｍａｒｋｅｒｓ、１８：９９−１０５（２００２）；Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、１８（補遺  ２）：Ｓ１８１（２００２））。これらの技術を使用した研究により、遺伝子の部分集合が、同時制御（ｃｏ−ｒｅｇｕｌａｔｅ）されて、特定の機能を実行しているようであること、ならびに、発現した遺伝子およびタンパク質の部分集合が、細胞を表現型によって分類するために使用され得ること（例えば、ＳｈｉｆｆｍａｎおよびＰｏｒｔｅｒ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１１：５９８−６０１（２０００）；Ａｆｓｈａｒｉら、Ｎａｔｕｒｅ、４０３：５０３−５１１（２０００）；Ｇｏｌｕｂら、Ｓｃｉｎｅｃｅ、２８６：５３１−５３７（１９９９）；ｖａｎ’ｔ  Ｖｅｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、４１５：５３０−５３６（２００２）など）が示されている。これにより、３〜４から数十以上の範囲の数の遺伝子からなる部分集合中のメッセンジャーＲＮＡの発現またはタンパク質の発現を測定することに興味が持たれるようになった。
【０００３】
例えば、薬物開発の目的の範囲は、生体異物化合物の代謝またはその毒性効果に関わる遺伝子およびタンパク質の発現プロフィールである。いくつかの研究により、数十の遺伝子の集合が、化合物の毒性の指標として役に立ち得ることが示された（例えば、Ｔｈｏｍａｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、６０：１１８９−１１９４（２００１）；Ｗａｒｉｎｇら、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１２０：３５９−３６８（２００１）；Ｌｏｎｇｕｅｖｉｌｌｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、６４：１３７−１４９（２００２）など）。同様に、癌の診断および癌の予後の領域において、遺伝子またはタンパク質の小さな集団の差次的な発現が、癌の進行および予後と強い相関を有していることが、頻繁に示されている（例えば、Ｂｕｎｎら、Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２９（５  補遺  １４）：３８−４４（２００２）；Ｂａｋｅｒ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１７：３２６１−３２７０（１９９８）；Ｙａｒｄｅｎ、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、６１：補遺  ２：１−１３（２００１）；Ｏｕｙａｎｇら、Ｌａｎｃｅｔ、３５３：１５９１−１５９２（１９９９）；Ｇｅｏｒｇｅら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、１：８０８−８２０（２００２）；Ｈｏｗａｒｄら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２２：１３２−１４０（２００１）；Ｓｅｙｍｏｕｒ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ、２：１１７−１３３（２００１））。
【０００４】
最近、Ｓｉｎｇｈおよびその共同研究者らが、上記の測定によく適した中規模の多重化アッセイのための技術を開発した。この技術は、分析物の多重化検出および多重化定量のために、結合物質に接着する放出可能な分子タグ（電気泳動移動度および光学的特徴性により区別される）のライブラリーを利用する（例えば、国際特許公開ＷＯ  ００／６６６０７；同ＷＯ  ０１／８３５０２；同ＷＯ  ０２／９５３５６；同ＷＯ  ０３／０６９４７；および米国特許第６，３２２，９８０号および同第６，５１４，７００号）。しかし、この技術を実施することは、難題を課す。なぜなら、たとえ分子タグの分離特性が、あらかじめ選択されたとしても、特定のアッセイおよび特定の装置ならびに分離プロセスそれ自体が、分子タグの分離プロフィールに、予測困難な歪みを導入するからである（ピークおよびトレースの伸長、ピークの移動、ベースラインの変化などを含む）。このようなデータの分析は、結合分析物が、アッセイされるサンプル中に存在しているかどうかに依存して、分子タグが、分離混合物中に存在し得るか、または存在し得ないので、さらに複雑である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記を考慮して、１度のアッセイ反応において、多数の分析物（例えば、発現産物のｍＲＮＡ遺伝子のタンパク質）の存在または不存在、あるいはその量を測定するための、簡便でかつ費用効率のいい技術の有用性によって、このような測定がだんだんと重要になりつつある、多くの分野（生命科学研究、医療的研究および医療的診断、薬物開発、遺伝的同定、動物科学および植物科学などを含む）が進歩し得る。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、複数の分子タグを生成することにより、サンプル中の１つ以上の分析物を分析するための方法に関し、これらのタグの電気泳動分離およびその測定によって、分析物の存在またはその量についての情報が提供される。
【０００７】
１つの局面において、本発明は、ピーク位置とピークサイズを正確に同定するためのさらなる電気泳動標準物質として電気泳動図（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ）データ中の分子タグを用いることで、同定されるピークを使用する方法を提供する。分子タグの特性は、あらかじめ決められているので、それらが十分な量で存在する、すなわち「適切な」ピークを形成する場合、それらは、電気泳動標準物質として使用され、その後のピークの同定の正確性を増大させ得る。このような方法の１つの実施形態は、以下の工程で実施される：（ａ）分子タグおよび１つ以上の電気泳動標準物質を電気泳動的に分離し、電気泳動図データを生成する工程。各電気泳動標準物質は、異なる電気泳動移動度を有し、その結果、電気泳動的分離の際、各電気泳動標準物質は、分子タグおよび他の電気泳動標準物質のピークとは異なるピークを形成する。そして、このような１つ以上の電気泳動標準物質および分子タグの各ピークは、移動間隔を有し、この各移動間隔は、平均を有する；（ｂ）電気泳動図データ中の移動間隔内にある、少なくとも１つの電気泳動標準物質のピークの位置を決定する工程；（ｃ）電気泳動的標準物質または適切なピークセット中の適切なピークに最も近い、電気泳動図データ中の移動間隔内にあるピークのピーク位置を決定する工程。ピークの位置とは、最も近い電気泳動標準物質または適切なピークの位置に対して相対的であり、その位置が移動間隔の中間に最も近い移動間隔内のピークを、分子タグまたは電気泳動標準物質と相関付ける；（ｄ）このピークのピークシグナル／ノイズ比を決定し、ピークシグナル／ノイズ比が１．５以上である場合に、ピークを、適切なピークセットに加算する工程；（ｅ）ピークの位置が、電気泳動図データ中にピークを有する全ての分子タグと相関付けられるまで、工程（ｃ）および工程（ｄ）を繰り返す工程。
【０００８】
別の局面において、本発明は、２つ以上のチャネルが、電気泳動図データを取得するために利用可能である場合、検出器飽和領域中のシグナル値を推定する方法を提供する。
【０００９】
別の実施形態において、本発明は、上記の方法の工程を実行するためのコンピューターで読み取り可能な製品を提供する。
【００１０】
本発明は、複数の分析物を検出または測定するための方法を提供する。この方法は、現在の技術を上回るいくつかの利点を有する。利点としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない。（１）アッセイ混合物から分離される分子タグの検出および／または測定により、バックグラウンドの大きな減少および感度の有意な増加が提供される；（２）分離および検出を容易にするために特に設計された分子タグの使用によって、簡便な多重化能力が提供される；および（３）分子タグを標準物質として使用することによる、分子タグと相関付けられる電気泳動図データ中のピークの正確な検出および定量。
【００１１】
（定義）
「分析物」とは、サンプル中の物質、化合物、または成分であって、その存在または非存在が検出されるか、あるいはその量が測定されるものを意味する。分析物としては、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、有機分子、ハプテン、エピトープ、生物学的細胞の一部、タンパク質の翻訳後修飾、レセプター、複雑な糖類、ビタミン、およびホルモンなどが挙げられるが、これらに限定はされない。単一の分子的実体（例えば、同一のタンパク質上の異なるリン酸化部位）に結合する分析物は、１つよりも多く存在し得る。
【００１２】
「抗体」とは、別の分子の特定の空間的組織および極性組織に対して特異的に結合し、それによって、その組織に相補的であると定義される免疫グロブリンを意味する。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得るし、当該分野で周知の技術（例えば、宿主の免疫および血清の回集（ポリクローナル））によって、または連続的ハイブリッド細胞株を調製し、分泌タンパク質を回集すること（モノクローナル）によって、あるいは少なくとも天然の抗体の特異的な結合に必要なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列またはその変異バージョンをクローニングし、発現させることによって、調製され得る。抗体には、完全な免疫グロブリンまたはそのフラグメントが含まれ得、ここで、この免疫グロブリンには、種々のクラスおよびアイソタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３、ＩｇＭなど）が含まれる。それらのフラグメントとしては、Ｆａｂ、ＦｖおよびＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’などが挙げられ得る。さらに、免疫グロブリンの凝集体、ポリマー、および結合体、またはそれらのフラグメントが、特定のポリペプチドに対する結合親和性が維持される限り、適切な場合において使用され得る。
【００１３】
「抗体結合組成物」とは、１つ以上の抗体を含み、抗体由来の結合特異性を誘導する、分子または分子の複合体を意味する。抗体結合組成物としては、第１抗体が標的分子に特異的に結合し、第２抗体が第１抗体の定常領域に特異的に結合する、抗体対；標的分子および部分（例えば、分子タグまたは光感作剤）を用いて誘導体化されたストレプトアビジンと特異的に結合する、ビオチン化抗体；標的分子に特異的であり、部分（例えば、分子タグまたは光感作剤）を用いて誘導体化されたポリマー（例えば、デキストラン）に結合体化された抗体；標的分子に特異的であり、部分（例えば、分子タグまたは光感作剤、あるいは後者の光感作剤を含むポリマー）を用いて誘導体化されたビーズまたは微小ビーズ、あるいは他の固体支持体に結合体化された抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１４】
「結合化合物」とは、分子タグが、直接的または間接的に結合し得る任意の分子であって、膜に結合した分析物に特異的に結合し得る分子を意味する。結合化合物としては、抗体、抗体結合組成物、ペプチド、タンパク質（特に、分泌タンパク質および孤児性分泌タンパク質）、核酸、ならびに有機分子であって、１０００ダルトンまでの分子量を有し、水素、炭素、酸素、窒素、イオウ、およびリンからなる群から選択される原子からなる有機分子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１５】
分離カラムについていう場合の「キャピラリーサイズの」とは、プレートまたは微小流体デバイス中のキャピラリー菅またはキャピラリーチャネルを意味し、ここで、その分離カラムの直径または最大寸法は、約２５〜約５００ミクロンの間であり、そのために分離媒体を通じた効果的な熱損失が可能であり、その結果として、媒体中の熱対流は小さい。
【００１６】
「コンピューター読み取り可能製品」とは、コンピューターによって読取られ得るか、またはコンピューター中に送信され得る、情報を記憶するための任意の有形の媒体を意味する。コンピューター読み取り可能製品としては、磁気ディスク、磁気テープ、光学ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、パンチテープまたはパンチカード、読出し専用メモリーデバイス、直接アクセス記憶装置、ゲートアレイ、静電メモリ、および任意の他の同様の媒体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１７】
分子タグの分離についていう場合の「電気泳動図」とは、アッセイ中で生成される各型の分子タグの数の読み出し、すなわち測定を提供する分子タグに関するパラメーター（例えば、移動時間）に対する、シグナル強度データのチャート、グラフ、曲線、棒グラフ、または他の表示を意味する。電気泳動図についていう場合の「ピーク」、「バンド」または「ゾーン」とは、シグナル強度の値が（例えば、バックグラウンドに対して）高く、分離された化合物の局所的濃度に対応する領域を意味する。単一のアッセイについて、多数の分離プロフィールが存在し得る。例えば、分子タグが、蛍光色素によって標識されており、データが、多数の波長で収集され、記録される場合である。従って、ほぼ同じ電気泳動移動度を有する分子タグまたは電気泳動標準物質は、電気泳動図データにおいて、異なるピークを有し得る。なぜなら、これは、それらが、異なる色素で標識されるためである。１つの局面において、放出された分子タグは、電気泳動移動度の違いによって、分離され、異なる分子タグが、電気泳動図上の異なるピークに対応する電気泳動図を形成する。電気泳動図上の隣接するピークの違いまたは重複の欠如の測定値が、「電気泳動分離能」である。これは、ピークの２つの標準偏差のうちの大きい方の４倍の値で割られた隣接するピーク間の距離の最大値として与えられ得る。好ましくは、隣接するピークは、少なくとも１．０の分離能、より好ましくは少なくとも１．５の分離能、そして最も好ましくは少なくとも２．０の分離能を有する。所定の分離検出システムにおいて、所望される分離能は、複数の分子タグを選択することにより、得られ得る。ここで、複数の分子タグのメンバーは、少なくともピーク分離能量が異なっている、電気泳動移動度を有する。このピーク分離能量は、当業者に周知であるいくつかの因子（シグナル検出システム、蛍光部分の性質、タグの拡散係数、ふるい分けマトリクスの存在または非存在、電気泳動装置の性質（例えば、チャネルの存在または非存在、分離チャネルの長さ）などを含む）に依存する。本明細書中で使用される場合、「電気泳動図データ」とは、分子タグの電気泳動による分離において収集された、各移動時間Ｘｉに対するシグナル強度の値の、表または離散的関数Ｆ（Ｘｉ）を意味する。好ましくは、電気泳動図データは、キャピラリー電気泳動装置中の従来の検出システムで収集された蛍光強度の値を含む。
【００１８】
本明細書中で使用される場合、用語「キット」とは、材料を送達するための任意の送達システムをいう。反応アッセイの状況において、このような送達システムは、反応試薬（例えば、適切な容器中のプローブ、酵素など）および／または支持材料（例えば、緩衝液、アッセイを実施するための文書など）の貯蔵、移送またはある位置から別の位置への送達を可能にするシステムを含む。例えば、キットは、関連の反応試薬および／または支持材料を含む１つ以上のエンクロージャ（例えば、箱）を備える。このような内容物は、意図されるレシピエントに、一緒にかまたは別々に送達され得る。例えば、第１の容器は、アッセイに使用するための酵素を含み得、一方、第２の容器は、プローブを含む。
【００１９】
「ポリペプチド」とは、１つのアミノ酸のカルボキシ基と別のアミノ酸のアミノ基との間の水の脱離を伴うアミド結合によって化学的に一緒に結合されたアミノ酸残基から構成される化合物のクラスをいう。ポリペプチドは、アミノ酸残基のポリマーであり、これは多数のこのような残基を含み得る。ペプチドは、これらが一般により少ない数のアミノ酸から構成されるという点以外、ポリペプチドと類似している。ポリペプチドは、時折、オリゴペプチドと称される。ポリペプチドとペプチドとの間にはっきりとした区別はない。簡便さのために、本開示および特許請求の範囲において、用語「ポリペプチド」は、一般に、ペプチドおよびポリペプチドをいうために使用される。アミノ酸残基は、天然または合成であり得る。
【００２０】
「タンパク質」とは、通常は生物学的細胞によって合成され、規定された三次元構造に折り畳まれたポリペプチドをいう。タンパク質は、一般に、約５，０００〜約５，０００，０００またはそれ以上の分子量、より通常は、約５，０００〜約１，０００，０００の分子量であり、そして翻訳後修飾（例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質もしくは脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の供給結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、供給結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアルコール形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレン化、硫酸化およびユビキチン化など）を含み得る。例えば、Ｗｏｌｄ，Ｆ．，Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ，ｐｇｓ．１−１２、Ｐｏｓｔ−  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８３。タンパク質としては、例として、サイトカインまたはインターロイキン、酵素（例えば、キナーゼ、プロテアーゼ、ガラクトシダーゼなど）、プロタミン、ヒストン、アルブミン、免疫グロブリン、硬タンパク質、リンタンパク質、ムコタンパク質、色素タンパク質、リポタンパク質、核タンパク質、糖タンパク質、Ｔ細胞レセプター、プロテオグリカン、非分類タンパク質（例えば、ソマトトロピン）、プロラクチン、インシュリン、ペプシン、ヒト血漿で見出されるタンパク質、血液凝固因子、血液型決定因子、タンパク質ホルモン、癌抗原、組織特異的抗原、ペプチドホルモン、栄養マーカー、組織特異的抗原および合成ペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
本明細書および特許請求の範囲における用語「サンプル」は、広い意味で使用される。一方、これは、試料または培養物（例えば、微生物学的培養物）を含むことが意味される。一方、これは、生物学的サンプルと環境サンプルの両方を含むことが意味される。サンプルは、合成起源の試料を含み得る。生物学的サンプルは、動物（ヒトを含む）、流体、固体（例えば、糞便）または組織、ならびに液体および固体の食品および飼料および成分（例えば、乳製品、野菜、肉および肉複製品および廃棄物）であり得る。生物学的サンプルとしては、患者から採取される物質があげられ得、これには、培養物、血液、唾液、脳髄液、胸水、乳汁、リンパ液、痰、精液、針吸引液などが挙げられるが、これらに限定されない。生物学的サンプルは、種々のファミリーの家畜、ならびに野生（ｆｅｒａｌまたはｗｉｌｄ）動物（有蹄動物、クマ、魚類、げっ歯類などの動物が挙げられるが、これらに限定されない）の全てから得られ得る。環境サンプルとしては、環境材料（例えば、表面物質、土壌、水および工業サンプル）、ならびに食品およびに乳加工機器、装置、機械、用具、使い捨て物品および非使い捨て物品から得られるサンプルが挙げられる。これらの例は、本発明に適用可能なサンプルのタイプを限定すると解釈されるべきではない。
【００２２】
「ふるい分けマトリクス」または「ふるい分け媒体」とは、架橋ポリマーまたは非架橋ポリマーを含む電気泳動媒体を意味し、これらは、マトリクスを通る荷電種の電気泳動的な移動を遅らせるのに有効である。
【００２３】
「特異的」または「特異性」は、ある分子の別の分子（例えば、標的分析物について、結合化合物またはプローブ）への結合に関して、認識、接触およびプローブと標的との間の安定な複合体の形成、ならびに実質的により少ない認識、接触または他の分子とプローブとの複合体形成を意味する。１つの局面において、「特異的」は、第１の分子の第２の分子への結合に関して、第１の分子が反応物またはサンプル中の別の分子を認識し、そしてこのような分子と複合体を形成する程度まで、この第１の分子が第２の分子と多量の複合体を形成することを意味する。１つの局面において、多量とは、第１の分子により形成されるこのような複合体の全体の少なくとも５０％である。一般に、特異的結合事象に関連する分子は、その表面上またはキャビティ中に面積を有し、互いに結合している分子の間の特異的認識を生じる。特異的結合の例としては、抗体−抗原相互作用、酵素−基質相互作用、ポリヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチド間の二重鎖または三重鎖の形成、レセプター−リガンド相互作用などが挙げられる。本明細書中で使用される場合、「接触」は、特異性または特異的結合に関して、２つの分子が、弱い非供給結合的な化学的相互作用（例えば、ファンデルワールス力、水素結合、イオン相互作用および疎水性相互作用など）がこれらの分子の相互作用を支配するのに十分接近していることを意味する。本明細書中で使用される場合、「安定な複合体」は、２つ以上の分子に関して、このような分子が、例えば、特異的結合によって非共有結合的凝集体を形成することを意味し、この凝集体は、アッセイ条件下で、非凝集状態よりも熱力学的により有利である。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、用語「スペクトル分解可能な」とは、複数の蛍光標識に関して、標識の発光バンドが十分に異なり（すなわち、十分に重なりがなく）、それぞれの標識が結合する分子タグが、それぞれの標識により生成される蛍光シグナルに基づいて、標準的な光検出システム（例えば、米国特許第４，２３０，５５８号；同第４，８１１，２１８号など、またはＷｈｅｅｌｅｓｓら、ｐｇｓ．２１−７６、Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８５）により例示されるような、バンドパスフィルターおよび光電子増幅管のシステムを用いることなど）に記載されるシステムによって識別され得ることを意味する。
【００２５】
（発明の詳細な説明）
本発明は、目的の分析物に特異的な結合化合物に結合した複数の放出可能な分子タグを使用することによって、サンプル中の１種以上の分析物を測定するための方法およびアルゴリズムを提供する。結合化合物がそれらのそれぞれの分析物に特異的に結合して複合体を形成した後、このような複合体を形成している結合化合物の分子タグは切断され、そして放出され、一方、このような複合体を形成していないこれらの結合化合物の分子タグは放出されない。次いで、この放出された分子タグは、１つ以上の電気泳動基準物質と共に電気泳動分離されて、電気泳動図データが作成され、そして各分子タグの同一性が、この電気泳動基準物質の１つ以上についてのこのようなデータ中の対応するピークの位置によって決定される。このように、計装の違い、アッセイ条件、試薬の可変性などの因子に起因する電気泳動図データのひずみが考慮され得、そして異なる電気泳動システム、異なるアッセイなどからの実験結果が比較され得る。
【００２６】
１つの局面において、本発明は、電気泳動図データで検出されるピークとアッセイで使用される分子タグとを相関付けるためのコンピューター実行法を提供する。１つの局面において、初めに電気泳動基準物質を同定し、次いで、分子タグおよび／またはさらなる基準物質に関連するピークを連続的に同定することによる方法が企図される。別の局面において、アッセイで用いられる全ての分子タグがまた、分離混合物中のその固有の基準物質として用いられる。すなわち、既知量の各分子タグが、分離の前に添加され、その結果、全てのタグについて、アッセイに関連していてもいなくても、電気泳動図データおいて既知の位置のピークが存在する。この実施形態において、分析物の存在または量は、観察されたシグナルから「自己標準」の寄与を減算することによって決定される。
【００２７】
電気泳動図データを示す代表的な電気泳動図（２００）は、図２Ａに示される。いくつかのピークが示され、これらは、第１の電気泳動標準物質（２０２）（「ｓｔｄ１」）、分子タグｍＴ１〜ｍＴ６に対応するピーク、および第２の電気泳動標準物質９２０４（「ｓｔｄ２」）を含む。ピークの同定、またはピークと分子タグとの関連性を複雑にする要因としては、時間依存性であり得るノイズ（２０５）、隣接するピーク間の可変性、または伸長もしくは圧縮（２０８）、「ベースライン」シグナルの上昇または可変性（２０６）などが挙げられる。以下に十分に説明されるように、本発明の目的は、上記のデータにおけるひずみを考慮して、電気泳動図データ中のピークを分子タグと正確に相関付けるための方法を提供することである。図２Ｂに示されるように、１つの局面において、本発明は、１つ以上の電気泳動標準物質の位置に関するピークの位置の測定値を提供する。特に、分子タグ「ｍＴ３」の移動時間Ｔ３（２５２）は、以下の比として提供される：
Ｔ３＝（ｔ３−Ｔｓ１）／（Ｔｓ２／Ｔｓ１）
ここで、ｔ３は、観察された移動時間であり、Ｔｓ１およびＴｓ２は、それぞれ、電気泳動標準物質（２０２）および（２０４）の移動時間である。
【００２８】
電気泳動図データ中のピークを分子タグと相関付ける方法は、図２Ｃの一般的な工程に従う。電気泳動図データが処理ユニットによって読みとられた後（２９０）、ピークの位置が同定され（２９２）、そしてピークのサイズが決定される（２９４）。最後に、同定されたピークの全てまたはサブセットが、アッセイで使用された分子タグと相関付けられる（２９６）。好ましくは、ピークサイズは、サンプル中の分析物の量と関連する。種々の測定値がピークサイズについて使用され得、これには、ピーク高さ、ピーク面積などが挙げられる。好ましくは、ピーク面積は、ピークサイズの測定値として使用される。ピーク面積は、種々の方法で見積もられ得、この方法には、ピーク高さとピークの半値幅との積、曲線フィッティング、シグナル高さの時間平均値の積分などを用いることが挙げられる。
【００２９】
本発明の１つの局面において、２つの電気泳動標準物質が用いられ、第１の電気泳動標準物質は、例えば、図２Ａの（２０２）であり、そして第２の電気泳動標準物質は、例えば、図２Ａの（２０４）である。アッセイで使用される全ての他の分子タグは、これらの電気泳動図データ中のピークが、第１の電気泳動標準物質と第２の電気泳動標準物質（例えば、図２Ａで示される、分子タグ「ｍＴ１」、「ｍＴ２」、「ｍＴ３」、「ｍＴ４」、「ｍＴ５」および「ｍＴ６」により表されるような）との間に入るように選択される。他の実施形態において、２つより多い電気泳動標準物質が使用され得、そしてこれらの標準物質の位置は、分子タグに対応するピークの間であり得、必ずしもこのようなピークの位置の前および後ろである必要はない。
【００３０】
本発明の別の局面において、分子タグが予め決定された電気泳動移動度および光学特性のいずれかを有するように設計されているという事実を使用する。十分な数の特定のタグがアッセイ中に放出される場合、この分子タグ自体が、後のピークの同定のための電気泳動標準物質として働き得る。このことは有利である。なぜなら、参照ピークまたは標準物質が、位置が決定されたピークに近づくほど、ピーク位置の値が正確になるからである。本明細書中で使用される場合、「認定されたピーク（ｑｕａｌｉｆｉｅｄ  ｐｅａｋ）」とは、特定の分子タグに関連し、かつ電気泳動標準物質として使用するための予め決定された基準を満たす、電気泳動図データ中のピークをいう。このような基準としては、ピークシグナル  対  ノイズ比の測定値、絶対ピーク高さ、ピーク幅などが挙げられ得る。好ましくは、ピークシグナル  対  ノイズ比が１．５以上、より好ましくは２．０以上、さらにより好ましくは２．５以上である場合、ピークは認定されたピークである。この実施形態において、ピークの同定の精度は、サンプル中の分析物の存在または非存在に従って変化し得る。なぜなら、分子タグの全て、またはいくつかが検出可能な量で放出され得るか、または分子タグが検出可能な量で放出され得ず、それにより、より多くのまたはより少ない数の利用可能な標準物質を生じるからである。
【００３１】
図２Ｋに示される本発明の別の局面において、各分子タグは、ピークの位置を同定するためのその固有の標準物質として働く。この図は、１０個のピーク（ｍＴ１〜ｍＴ１０）を有する電気泳動図を示す。これらのピークの各々は、アッセイ中に放出された分子タグおよび分子タグ標準物質（２８０）からのシグナル寄与を含む。分子タグｍＴ２（２８２）およびｍＴ５（２８４）で示されるように、分子タグがアッセイ中に放出されない場合、観察されるピークは全体的に、既知の検出可能な量で存在する標準物質に起因する。
【００３２】
本発明に従って分析される分子タグ（例えば、図１Ａ〜１Ｃに例示される分子タグ）を生成するためのいくつかのタイプのアッセイが用いられ得る。図１Ａにおいて、サンプル中の複数のｎ個の分析物中のＫ番目の分析物（１０００）は、結合された切断誘導部分（１００６）（この場合、増感剤）を有する第１の結合剤（１００２）（この場合、抗体）によって結合される。増感剤（１００６）は、有効近接範囲（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ）（１００８）を有し、この中で、光活性化された際に増感剤により生成される一重項酸素は、分子タグ（「Ｔｋ」）（１０１０）を第２の結合剤（１００４）に保持している切断可能な結合を切断し得る。光活性化（１００９）の後、有効近接範囲（１００８）内の分子タグは、分子タグと共に他の結合複合体から放出され、混合物（１０１２）を形成し、この混合物は、電気泳動分離装置に導入され（１０１４）そして異なるバンド（１０１６）に分離される。分離されたタグは、従来の検出法を使用して検出される。例えば、分子タグが蛍光標識を有する場合、検出は、光源（１０２０）による照射および検出器（１０１８）による蛍光の収集の後に行われる。検出可能な生成物（１０２６）は、次いで、図１Ａについて記載されるような検出ステーションにおいて検出される。
【００３３】
図１Ｂにおいて、分子タグを生成する方法が示され、これは、「ｔａｑｍａｎ」ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく。標的ポリヌクレオチド（１０３０）はプライマー（１０３２）および（１０３４）を使用するＰＣＲによって増幅されるが、結合化合物（１０３６）は、プライマー伸長の間に、標的ポリヌクレオチドの一方の鎖に特異的にハイブリダイズし（１０４０）、そしてＤＮＡポリメラーゼ（１０３８）の５’→３’方向の得エキソヌクレアーゼ活性によって分解され、分子タグ（１０４４）（「Ｄ−Ｍ−Ｎ」として示される）の放出を生じる（１０４２）。数回のサイクル（１０４６）の後、十分な分子タグが放出されて、電気泳動分離後に検出可能なシグナルを生成する。図１Ｃにおいて、分子タグを生成する方法が示され、これは、「インベーダー（Ｉｎｖａｄｅｒ）」反応に基づく。インベーダープローブ（１０５２）および検出プローブ（１０５４）は、標的ポリヌクレオチド（１０５０）に特異的にハイブリダイズし、そしてクレアバーゼ（ｃｌｅａｖａｓｅ）（１０５６）によって認識される構造を形成し、その後、このクレアバーゼのヌクレアーゼ活性は、分子タグ（１０５８）を放出して、切断された検出プローブ（１０６０）を標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズしたままにする。検出プローブ（１０５４）の長さおよび配列は、切断された検出プローブ（１０６０）が切断されていない検出プローブ（１０６４）（これは過剰に存在する）で迅速に置換（１０６２）されるように選択される。上記のように、反応サイクルは、十分な分子タグが放出されて、電気泳動分離の後に検出可能なシグナルを生成するまで、続けられる（１０６６）。
【００３４】
分析物を含むサンプルは、広範な種々の供給源（細胞培養物、動物組織または植物組織、微生物などを含む）由来であり得る。サンプルは、このサンプルが採取される供給源に依存し得る従来の技術を使用して、本発明のアッセイのために調製される。サンプル調製技術のためのガイダンスが、以下のような標準的な論文中に見出され得る：Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９）；Ｉｎｎｉｓら編、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９０）；ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、第１５２巻、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）；Ｏｈｌｅｎｄｉｅｃｋ，Ｋ．（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ．第５９巻：５９：２９３−３０４；Ｍｅｔｈｏｄ  Ｂｏｏｋｌｅｔ  ５，「Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ」（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ，２００２）など。哺乳動物組織培養細胞、または同様の供給源について、分析物を含むサンプルが、従来の細胞溶解技術（例えば、０．１４Ｍ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．６）、１．５％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０ならびに必要に応じて、プロテアーゼおよび／またはプロテアーゼインヒビター）によって調製され得る。
【００３５】
本発明の１つの局面において、結合化合物から放出された後に電気泳動によって異なるバンドまたはピークに分離され得る分子タグのセットが提供される。セット中の分子タグは、化学的に多種多様であり得る；しかし、便宜上、分子タグのセットは、通常化学的に関連している。例えば、これらの分子タグの全てがペプチドであるか、またはこれらが同じ基本構築ブロックまたはモノマーの異なる組合せから構成され得るか、またはこれらが以下により十分に記載されるように、異なる分離特性を与えるために異なる置換基を有する同じ基本骨格を使用して合成され得る。複数の分子タグの数は、用いられる分離様式、検出のための分子タグに使用される標識、結合部分の感度、切断可能な結合が切断される効率などを含むいくつかの要因に依存して変化し得る。１つの局面において、複数の分子タグの数は、２〜数十個（例えば、５０個）の範囲である。他の局面において複数のサイズは、２〜４０、２〜２０、２〜１０、３〜５０、３〜２０、３〜１０、４〜５０、４〜１０、５〜２０または５〜１０の範囲であり得る。
【００３６】
（結合化合物および分子タグ）
本発明の局面は、複数の異なる結合化合物の混合物を提供することを包含し、ここで各異なる結合化合物は、切断可能な結合を介して連結された１つ以上の分子タグを有する。結合化合物、切断可能な結合および分子タグの性質は、広く変動し得る。結合化合物は、結合部分（例えば、抗体結合組成物、抗体、ペプチド、細胞表面レセプターに対するペプチドリガンドまたは非ペプチドリガンド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドアナログ（例えば、ペプチド核酸）、レクチンまたは目的の分析物と特異的に結合し得るかまたはそれと複合体を形成し得る任意の他の分子実体）を含み得る。１つの局面において、以下の式で表され得る結合化合物は、分析物特異的結合部分に結合された１つ以上の分子タグを含む。
【００３７】
Ｂ−（Ｌ−Ｅ）ｋ
ここで、Ｂは、結合部分であり；Ｌは、切断可能な結合であり；そしてＥは、分子タグである。好ましくは、非ポリヌクレオチド分析物に対する均一アッセイにおいて、切断可能な結合（Ｌ）は、酸化不安定性結合であり、そしてより好ましくは、１重項酸素によって切断され得る結合である。部分「−（Ｌ−Ｅ）ｋ」は、単結合化合物が、切断可能な結合を介して結合される複数のタグを有し得ることを示す。１つの局面において、ｋは、１以上の整数であるが、他の実施形態において、ｋは、数百より大きく（例えば、１００〜５００）あり得るか、またはｋは、数百より大きく、数千程度の大きさ（例えば、５００〜５０００）である。本発明の組成物において、通常、複数の異なる型の結合化合物の各々は、異なる分子タグ（Ｅ）を有する。切断可能な結合（例えば、酸化不安定性結合）および分子タグ（Ｅ）は、従来の化学物質によってＢに結合される。
【００３８】
一旦、各々の結合化合物が、異なる分子タグと別々に結合体化されると、他の結合化合物と共にプールされ、複数の結合化合物または結合組成物を形成する。通常、異なる種類の結合化合物の各々は、このような組成物中に同じ割合で存在するが；割合は、設計の選択と共に変化され得、その結果、１つの特定の結合化合物または特定の結合化合物の部分集団は、特定の実施形態またはアッセイに対する望ましさまたは必要要件に依存して、より高い割合またはより低い割合で存在する。このような設計選択に影響し得る因子としては、特定の標的に対する抗体親和性および親和力、標的の相対的行き渡り（ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ）、分子タグの検出部分の蛍光特性などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００３９】
１つの局面において、Ｂは、以下の式によって規定されるオリゴヌクレオチドである：
Ｅ−Ｎ−Ｔ
ここで、Ｅは、上記の通りであり、Ｎは、ヌクレオチドであり、そしてＴは、ポリヌクレオチド分析物に対して特異的なオリゴヌクレオチドである。好ましくは、Ｎは、天然のリン酸ジエステル結合によってＴの５’ヌクレオチドに結合される。Ｅは、Ｎの塩基部分またはそのリボース部分もしくはデオキシリボース部分のいずれかにおける、いくつかの異なる結合部位を介してＮに結合され得る。好ましくは、Ｅは、リン酸ジエステル結合によってＮの５’炭素に結合される。このような化合物の合成は、米国特許第６，３２２，９８０号および同第６，５１４，７００号（これらは、参考として援用される）；ならびに国際特許出願ＷＯ０１／８３５０２において教示される。このクラスの結合化合物において、切断可能な結合は、好ましくは、ＮとＴとの間のリン酸ジエステル結合であり、結合化合物、標的ポリヌクレオチド、および可能な他の分子要素によって形成される特定の構造を認識するヌクレアーゼによる酵素反応によって切断される。酵素反応の結果として、形態「Ｅ−Ｎ」の分子タグが、放出される。好ましくは、酵素反応は、増幅反応と組み合わせられ、その結果、単一のアッセイにおいて、各標的ポリヌクレオチドが、数百または数千の放出分子タグを生じる。１つの局面において、分子タグは、ヌクレアーゼ活性によるプローブの分解を使用するいくつかの核酸ベースのシグナル増幅技術のいずれか１つによって生成され得、これらの技術としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：「ｔａｑｍａｎ」アッセイ（例えば、Ｇｅｌｆａｎｄ，米国特許第５，２１０，０１５号）；プローブサイクリングアッセイ（例えば、Ｂｒｏｗら、米国特許第５，８４６，７１７号）；Ｗａｌｄｅｒら、米国特許第５，４０３，７１１号；Ｈｏｇａｎら、米国特許第５，４５１，５０３号；Ｗｅｓｔｅｒｎら、米国特許第６，１２１，００１；Ｆｒｉｔｃｈら、米国特許第４，７２５，５３７号；Ｖａｒｙら、米国特許第４，７６７，６９９号；ならびに他の分解アッセイ（例えば、ＯｋａｎｏおよびＫａｍｂａｒａ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２８：１０１−１０８（１９９５））。この実施形態の例示的な放出分子タグが、図４〜６に示される。この実施形態において、放出された分子タグは、好ましくは、形態「（Ｍ，Ｄ）−Ｎ」を有し、ここで、部分「（Ｍ，Ｄ）」は、以下に示されるように規定される。
【００４０】
別の局面において、Ｂは、抗体結合組成物である。このような組成物は、広く種々の分析物に対して特異的な、広く種々の市販の抗体（モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両方）から容易に形成される。広範囲な指針は、分子タグを結合化合物（例えば、抗体）に共有結合することに関する文献（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６）など）に見出され得る。本発明の１つの局面において、１つ以上の分子タグは、結合化合物上の一般的な反応基に対して直接的または間接的に結合される。一般的な反応基としては、アミン、チオール、カルボキシレート、ヒドロキシル、アルデヒド、ケトンなどが挙げられ、そして市販の架橋剤によって分子タグに結合され得る（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（上に引用される）；Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，第９版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，２００２））。１つの実施形態において、分子タグのＮＨＳ−エステルは、結合化合物上の遊離アミンと反応される。結合化合物の遊離アミンに対する結合に適切な分子タグの例示的なＮＨＳ−エステルは、図７Ａ〜７Ｊに示される。
【００４１】
Ｌが、酸化不安定性である場合、Ｌは、好ましくは、チオエーテルまたはそのセレン類似物であるか、あるいは、炭素−炭素二重結合を含むオレフィンであり、ここでオキソ基への二重結合の切断は、分子タグ（Ｅ）を放出する。例示的なチオエーテル結合は、Ｗｉｌｌｎｅｒら、米国特許第５，６２２，９２９号（これは、参考として援用される）に開示される。例示的なオレフィンとしては、ビニルスルフィド、ビニルエーテル、エナミン、炭素原子においてα−メチンで置換されたイミン（ＣＨ、少なくとも１つの水素原子を有する炭素原子）が挙げられ、ここで、ビニル基は、環中にあり得、ヘテロ原子は、環中にあり得、または環状オレフィン性炭素原子上で置換され得、そしてオレフィン性炭素原子に結合される少なくとも１つおよび４つまでのヘテロ原子が存在する。得られたジオキセタンは、周囲温度を超えて（通常約７５℃未満）加熱することによって、酸もしくは塩基と反応することによって、または光感作剤の非存在下もしくは存在下における光活性化によって、自発的に分解され得る。このような反応は、以下の例示的な参考文献において記載される：ＡｄａｍおよびＬｉｕ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９４，１２０６−１２０９，１９７２，Ａｎｄｏら、Ｊ．Ｃ．Ｓ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．１９７２，４７７−８，Ａｎｄｏら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ２９，１５０７−１３，１９７３，Ａｎｄｏら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９６，６７６６−８，１９７４，ＡｎｄｏおよびＭｉｇｉｔａ，同書、９７，５０２８−９，１９７５，ＷａｓｓｅｒｍａｎおよびＴｅｒａｏ，Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．２１，１７３５−３８，１９７５，ＡｎｄｏおよびＷａｔａｎａｂｅ，同書、４７，４１２７−３０，１９７５，Ｚａｋｌｉｋａら、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３０，３５−４４，１９７９，ならびにＡｄａｍら、Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．３６，７８５３−４，１９９５。米国特許第５，７５６，７２６号もまた参照のこと。
【００４２】
ジオキセタンの形成は、１つの炭素原子において分子タグで置換された活性化オレフィンおよびオレフィンの他の炭素原子で結合部分で置換された活性化オレフィンと１重項酸素の反応によって得られる。例えば、米国特許第５，８０７，６７５号および国際特許出願ＷＯ０１／８３５０２（これらは、参考として援用される）を参照のこと。
【００４３】
いくつかの切断可能な結合およびこれらの切断可能な生成物は、図８Ａ〜Ｆに示される。図８Ａに示されるチアゾール切断結合チアゾール切断可能な結合（「−ＣＨ２−チアゾール−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−タンパク質」）は、部分「−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨＯ」を有する分子タグを生じる。好ましくは、ｎは、１〜１２の範囲に存在し、より好ましくは、１〜６の範囲に存在する。図８Ｂに示されるオキサゾール切断可能な結合（「−ＣＨ２−オキサゾール−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−タンパク質」）は、部分「−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−ＣＨＯ」を有する分子タグを生じる。オレフィン切断可能な結合（図８Ｃ）は、上記される結合化合物実施形態「Ｂ−Ｌ−Ｍ−Ｄ」（Ｄは、フルオレセイン色素である）と共に示される。オレフィン切断可能な結合はまた、他の実施形態において、使用され得る。示されるオレフィン結合の切断は、以下の形態の分子タグを生じ：
「Ｒ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｍ−Ｄ」
ここで、「Ｒ」は、上に提供される分子タグ（Ｅ）の一般的な記載の中の任意の置換基であり得る。好ましくは、Ｒは、電子供与基である（例えば、Ｕｌｌｍａｎら、米国特許第６，２５１，５８１号；ＳｍｉｔｈおよびＭａｒｃｈ，Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，第５版（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１）；など）。より好ましくは、Ｒは、１〜８の炭素原子およびＯ、Ｓ、およびＮからなる群から選択される０〜４のヘテロ原子を有する電子供与基である。さらに好ましくは、Ｒは、−Ｎ（Ｑ）２、−ＯＱ、ｐ−［Ｃ６Ｈ４Ｎ（Ｑ）２］、フラニル、ｎ−アルキルピロリル、２−インドリルなどであり、ここで、Ｑは、アルキルまたはアリールである。図８Ｃのオレフィン切断可能な結合に対するさらなる参考において、置換基「Ｘ」および「Ｒ」は、切断可能な結合（Ｌ）を記載する上式の置換基「Ｘ」および「Ｙ」と等価である。特に、図８ＣにおけるＸは、好ましくは、モルホリノ、−ＯＲ’、または−ＳＲ”であり、ここで、Ｒ’およびＲ”は、１〜８の炭素原子およびＯ、Ｓ、およびＮからなる群から選択される０〜４のヘテロ原子を有する、脂肪族、芳香族、脂環式または複素環式である。好ましいチオエーテル切断可能な結合は、形態「−（ＣＨ２）２−Ｓ−ＣＨ（Ｃ６Ｈ５）Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−」を有して図６Ｄに示され、ここで、ｎは、２〜１２の範囲にあり、そしてより好ましくは、２〜６の範囲にある。図８Ｄに示される型のチオエーテル切断可能な結合は、図８Ｅおよび８Ｆに示される前駆体化合物によって、結合部分（Ｔ）および分子タグ（Ｅ）に結合され得る。結合部分（Ｔ）のアミノ基に結合するために、末端ヒドロキシルは、従来の化学によってＮＨＳエステルに転換される。アミノ基との反応および結合の後、Ｆｍｏｃ保護基は、遊離アミンを生じるために除去され、次いで、分子タグのＮＨＳエステル（例えば、図１、２、および４のスキームによって生じる化合物）と反応される。但し、最後の反応工程は、ホスホルアミダイト基の代わりに、ＮＨＳエステルの付加となる。
【００４４】
分子タグ（Ｅ）は、好ましくは、活性種（特に、１重項酸素）に対して安定な水溶性有機化合物であり、検出基またはレポーター基を含む。そうでなければ、Ｅは、サイズおよび構造において広く変化する。１つの局面において、Ｅは、約５０〜約２５００ダルトンの範囲の分子量を有し、より好ましくは、約５０〜約１５００ダルトンの範囲の分子量を有する。Ｅの好ましい構造は、以下により十分に記載される。Ｅは、電気化学的シグナル、蛍光シグナル、または色素形成シグナルを生成するための検出基を含み得る。好ましくは、検出基は、蛍光シグナルを生成する。本発明の電気泳動標準物質は、分子タグのように、同じセットの化合物から選択され得る。１つの局面において、１つの複数状態にある１つ以上の分子タグが、本発明の方法において電気泳動標準として指定され得、そして使用され得る。電気泳動標準として使用される場合、既知量の分子タグが、分離されるべき混合物に添加される。すなわち、電気泳動標準として使用される分子タグは、結合化合物から放出されず、その放出形態で調製され、分離される混合物に直接添加される。
【００４５】
複数にある分子タグから、各々が、同じ１つの複数の他のメンバーに対して、特有の電気泳動分離特性および／または特有の光学的特性を有するように選択される。１つの局面において、電気泳動分離特性は、当該分野において従来的な標準分離条件のセット（例えば、電圧、キャピラリー型、電気泳動分離媒体など）下での移動時間である。別の局面において、光学的特性は、蛍光特性（例えば、発光スペクトル、蛍光寿命、所定の波長での蛍光強度または波長のバンドなど）である。好ましくは、蛍光特性は、蛍光強度である。例えば、複数あるうちの各分子タグの状態は、同じ蛍光放出特性を有し得るが、各々は、特有の移動時間によって互いに異なる。他方、複数あるうちの２つ以上の複数のタグの状態は、同じ移動時間を有するが、これらは、特有の蛍光特性（例えば、スペクトル的に分解可能な放出スペクトル）を有し、その結果、複数あるうちの全てのメンバーの状態は、分子の分離と蛍光測定との組み合わせによって区別され得る。
【００４６】
好ましくは、放出された分子タグは、検出基の電気泳動分離および蛍光によって検出される。このような実施形態において、実質的に同一の蛍光特性を有する分子タグは、異なる電気泳動移動度を有し、その結果、電気泳動図中の異なるピークは、分離条件下で形成される。好ましくは、本発明の複数の分子タグは、従来のふるい分けマトリクスの存在下または非存在下のいずれかで、従来のキャピラリー電気泳動装置によって分離される。例示的なキャピラリー電気泳動装置としては、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）モデル３１０、モデル３１００およびモデル３７００；Ｂｅｃｋｍａｎ（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）モデルＰ／ＡＣＥ  ＭＤＱ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）ＭｅｇａＢＡＣＥ  １０００または４０００；ＳｐｅｃｔｒｕＭｅｄｉｘ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ；などが挙げられる。電気泳動移動度は、ｑ／Ｍ２／３に比例し、ここで、ｑは、分子上の電荷であり、Ｍは、分子の質量である。望ましくは、最も近い電気泳動レベルの間の測定の条件下での移動度の差は、少なくとも約０．００１であり、通常０．００２であり、より通常は少なくとも約０．０１であり、そして０．０２以上であり得る。好ましくは、このような従来の装置において、複数あるうちの分子タグの状態の電気泳動移動度は、少なくとも１％、そしてより好ましくは、１〜１０％の範囲で少なくとも１％異なる。
【００４７】
１つの局面において、分子タグ（Ｅ）は、（Ｍ，Ｄ）であり、ここで、Ｍは、移動度改変部分であり、Ｄは、検出部分である。表記「（Ｍ，Ｄ）」は、Ｍ部分およびＤ部分の順番付けが、いずれかの部分が切断可能な結合（Ｌ）に隣接し得るようであり得ることを示すために使用される。すなわち、「Ｂ−Ｌ−（Ｍ，Ｄ）」は、２つの形態（「Ｂ−Ｌ−Ｍ−Ｄ」または「Ｂ−Ｌ−Ｄ−Ｍ」）のいずれかの結合化合物を示す。
【００４８】
検出部分（Ｄ）は、蛍光標識または色素、色素形成標識または色素、電気化学的標識などであり得る。好ましくは、Ｄは、蛍光色素である。本発明との使用のための例示的な蛍光色素としては、水溶性ローダミン色素、フルオレセイン、４，７−ジクロロフルオレセイン、ベンゾキサンテン色素、およびエネルギー移動色素が挙げられ、以下の参考文献に開示される：Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ，第８版、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，２００２）；Ｌｅｅら、米国特許第６，１９１，２７８号；Ｌｅｅら、米国特許第６，３７２，９０７号；Ｍｅｎｃｈｅｎら、米国特許第６，０９６，７２３号；およびＬｅｅら、米国特許第５，９４５，５２６号。より好ましくは、Ｄは、フルオレセインまたはフルオレセイン誘導体である。
【００４９】
移動度改変部分（Ｍ）のサイズおよび組成物は、鎖中の１つの結合から約１００原子、通常約６０原子以下、より通常約３０原子以下と変化し得、ここで、原子は、炭素、酸素、窒素、リン、ホウ素および硫黄である。一般的に、結合以外の場合、移動度改変部分は、約０〜約４０のヘテロ原子、より通常は、約０〜約３０のヘテロ原子を有し、これらヘテロ原子は、上記されるヘテロ原子に加えて、ハロゲンまたは他のヘテロ原子を含み得る。水素以外の原子の総数は、一般的に、約２００原子より少なく、通常約１００原子より少ない。酸の基が存在する場合、移動度改変部分が存在する媒体のｐＨに依存して、種々のカチオンは、酸の基と結合され得る。酸は、有機または無機であり得、これらとしては、カルボキシル、チオノカルボキシル、チオカルボキシル、ヒドロキサム、リン酸、亜リン酸、ホスホン酸、ホスフィン酸、スルホン酸、スルフィン酸、ホウ酸、硝酸、亜硝酸などが挙げられる。正電荷について、置換基としては、アミノ（アンモニウムを含む）、ホスホニウム、スルホニウム、オキソニウムなどが挙げられ、ここで置換基は、一般的に、約１〜６の炭素原子の脂肪族、１つのヘテロ原子当たりの炭素の総数は、通常約１２未満、通常約９未満である。側鎖としては、アミン、アンモニウム塩、ヒドロキシル基（フェノール基を含む）、カルボキシル基、エステル、アミド、ホスフェート、複素環式が挙げられる。Ｍは、ホモオリゴマーまたはヘテロオリゴマーであり得、同じまたは異なる化学的特性の異なるモノマー（例えば、ヌクレオチドおよびアミノ酸）を有する。
【００５０】
別の局面において、（Ｍ，Ｄ）部分は、コンビナトリアルライブラリーの生成において使用される化学的骨格から構築される。例えば、以下の参考文献は、種々の移動度改変部分を生成するのに有用な骨格化合物を記載する：ペプトイド（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１９７３５，１９９１年１２月２６日）、コードされるペプトイド（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／２０２４２，１９９３年１０月１４日）、ランダムバイオ−オリゴマー（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０００９１，１９９２年１月９日）、ベンゾジアゼピン（米国特許第５，２８８，５１４号）、ダイバーソマー（ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒｅ）（例えば、ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチド（Ｈｏｂｂｓ  ＤｅＷｉｔｔ，Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９−６９１３（１９９３））、ビニル性ポリペプチド（Ｈａｇｉｈａｒａら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：６５６８（１９９２））、β−Ｄ−グルコース骨格を有する非ペプチド性ペプチド模倣物（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎ，Ｒ．ら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：９２１７−９２１８（１９９２））、低分子化合物ライブラリーの類似の有機合成（Ｃｈｅｎ，Ｃ．ら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：２６６１（１９９４））オリゴカーバメート（Ｃｈｏ，Ｃ．Ｙ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３（１９９３））、ペプチジルホスホネート（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｄ．Ａ．ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５９：６５８（１９９４））；Ｃｈｅｎｇら、米国特許第６，２４５，９３７号；Ｈｅｉｚｍａｎｎら、「Ｘａｎｔｈｉｎｅｓ  ａｓ  ａ  ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ」、Ｍｏｌ．Ｄｉｖｅｒｓ．２：１７１−１７４（１９９７）；Ｐａｖｉａら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４：６５９−６６６（１９９６）；Ｏｓｔｒｅｓｈら、米国特許第５，８５６，１０７号；Ｇｏｒｄｏｎ，Ｅ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１３８５（１９９４）；など。好ましくは、この局面において、Ｄは、骨格上の置換基であり、Ｍは、骨格の残りである。
【００５１】
Ｍはまた、公知のポリマーサブユニット合成方法によって調製されるポリマー鎖を含み得る。選択された長さのポリエチレンオキシド含有鎖を形成する方法は、周知である（例えば、Ｇｒｏｓｓｍａｎら、米国特許第５，７７７，０９６号）。これらの方法（規定されたサイズの複数サブユニットのポリマー単位を、互いに直接または連結基を介して結合させる工程を包含する）は、広く種々のポリマー（例えば、ポリエーテル（例えば、ポリエチレンオキシドおよびポリプロピレンオキシド）、ポリエステル（例えば、ポリグリコール酸、ポリ乳酸）、ポリペプチド、オリゴサッカリド、ポリウレタン、ポリアミド、ポリスルホンアミド、ポリスルホキシド、ポリホスホナート、およびこれらのブロックコポリマー）に適用可能であり、これらのポリマーは、荷電性結合基または非荷電性結合基によって連結される複数のサブユニットの単位から構成されるポリマーを含む。ホモポリマーに加えて、本発明に従って使用されるポリマー鎖としては、選択された長さのコポリマー（例えば、ポリプロピレン単位と交互のポリエチレンオキシド単位のコポリマー）が挙げられる。別の例としては、ホモポリマーまたは混合ポリマーの場合、選択された長さのポリペプチドおよびアミノ酸組成物（すなわち、天然のアミノ酸残基または人工のアミノ酸残基を含む）である。
【００５２】
別の局面において、放出後、分子タグ（Ｅ）は、式：
Ａ−Ｍ−Ｄ
によって規定され、ここで、Ａは、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒであり、ここで、Ｒは、１〜８の炭素原子およびＯ、ＳおよびＮからなる群から選択される０〜４のヘテロ原子を有する脂肪族、芳香族、脂環式または複素環式であり（−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨＯ；−ＳＯ２Ｈ；−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−ＣＨＯ；−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ６Ｈ５））；ここで、ｎは、２〜１２の範囲であり；
Ｄは、検出基であり、好ましくは蛍光色素であり；そして、
Ｍは、上記される通りであり、但し、Ａ−Ｍ−Ｄの総分子量は、約１００〜約２５００ダルトンの範囲内にある。
【００５３】
別の局面において、Ｄは、フルオレセインであり、Ａ−Ｍ−Ｄの総分子量は、約１００〜約１５００ダルトンの範囲である。
【００５４】
１つの局面において、本発明のアッセイは、活性種（例えば、１重項酸素）を生成する感作剤化合物を使用し、分子タグを結合化合物へ結合させている切断可能な結合を切断する。感作剤結合および切断可能な結合に対する重要な考察は、これらが互いにそれほど離れておらず、結合化合物が膜結合分析物に結合される場合、感作剤によって生成される活性種は、切断可能な結合と相互作用し得る前に、拡散し、そしてその活性を失うということである。従って、切断工程の間、感作剤は、好ましくは、結合される切断−誘導部分の１０００ｎｍ内、好ましくは、２０〜１００ｎｍ内にある。この切断−誘導部分の有効な範囲は、その「有効近接」として、本明細書中でいわれる。
【００５５】
本発明とともに使用するための好ましい感作物質は、光励起に応答して分子酸素から一重項酸素を生成する光感作剤である。本明細書中で使用される場合、「光感作剤」とは、光によって活性化された場合、分子酸素を一重項酸素に変換する光吸収分子をいう。親油性部分を有する適切な光感作剤は、以下の参考文献に開示される：Ｙｏｕｎｇら、米国特許第６，３７５，９３０号；およびＹｏｕｎｇら、米国出願２００２／０００６３７８（これらは、参考として援用される）。親油性基または捕捉部分（例えば、ビオチン）で誘導体化され得、本発明とともに使用され得るさらなる光感作剤は、以下の参考文献に記載される：Ｓｅｓｓｌｅｒら、米国特許第５，２９２，４１４号；Ｍａｓｕｙａら、米国特許第５，３４４，９２８号；ＭｃＣａｐｒａ、米国特許第５，７０５，６２２号；Ｌｅｖｙら、同第４，８８３，７９０号；Ｍｅｕｎｉｅｒら、米国特許第５，１４１，９１１号；など（これらは、本明細書中において参考文献として援用される）。以下の参考文献は、アビジンまたはストレプトアビジンを介してビオチン化分子を膜に係留するための、ビオチンと親油性部分との間の結合体の使用を開示する：Ｐｌａｎｔら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７６：４２０−４２６（１９８９）；Ｂａｙｅｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，５５０：４６４−４７３（１９７９）；Ｒａｍｉｒｅｚら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ，９７１：１１７−１２７（２００２）；など（これらは、参考として援用される）。
【００５６】
多くの種々の光源が、光感作剤を活性化して一重項酸素を生成するために利用可能である。多色供給源および単色供給源は、それらの供給源が、実用的な時間で十分な一重項酸素を生成するのに十分な強度である限り、使用され得る。照射の長さは、光感作剤の性質、切断可能な連結の性質、照射供給源の出力、およびサンプルからのその距離などに依存する。一般的に、照射の期間は、１マイクロ秒未満〜１０分もの長さ、通常、約１ミリ秒〜約６０秒の範囲であり得る。照射の強度および長さは、光感作剤分子の少なくとも約０．１％、通常、光感作剤分子の少なくとも約３０％、そして好ましくは、光感作剤分子の実質的に全てを励起するのに十分であるべきである。例示的な光源としては、例示として限定ではなく、レーザー（例えば、ヘリウム−ネオンレーザー、アルゴンレーザー、ＹＡＧレーザー、Ｈｅ／Ｃｄレーザー、およびルビーレーザー）；光ダイオード；水銀、ナトリウムおよびキセノン蒸気ランプ；白熱ランプ（例えば、タングステンおよびタングステン／ハロゲン）；フラッシュランプ；などが挙げられる。
【００５７】
本発明において使用され得る光感作剤の例は、上記特性を有するものおよび以下の参考文献に列挙されるものがある：Ｔｕｒｒｏ，Ｍｏｄｅｒｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（上で引用される）；ＳｉｎｇｈおよびＵｌｌｍａｎ，米国特許第５，５３６，８３４号；Ｌｉら、米国特許第５，７６３，６０２号；Ｕｌｌｍａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１，５４２６−５４３０（１９９４）；Ｓｔｒｏｎｇら、Ａｎｎ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７４５：２９７−３２０（１９９４）；Ｍａｒｔｉｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８６：６３５−６４５（１９９０）；Ｙａｒｍｕｓｈら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．，１０：１９７−２５２（１９９３）；Ｐｅａｓｅら、米国特許第５，７０９，９９４号；Ｕｌｌｍａｎら、米国特許第５，３４０，７１６号；Ｕｌｌｍａｎら、米国特許第６，２５１，５８１号；ＭｃＣａｐｒａ，米国特許第５，５１６，６３６号；Ｗｏｈｒｌｅ，Ｃｈｉｍｉａ，４５：３０７−３１０（１９９１）；Ｔｈｅｔｆｏｒｄ，欧州特許公開０４８４０２７；Ｓｅｓｓｌｅｒら、ＳＰＩＥ，１４２６：３１８−３２９（１９９１）；Ｍａｄｉｓｏｎら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５２２：９０−９８（１９９０）；Ｐｏｌｏら、Ｉｎｏｒｇａｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，１９２：１−３（１９９２）；Ｄｅｍａｓら、Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．，Ａ２５：１１８９−１２１４（１９８８）；など。１つの実施形態において、本発明で使用される光感作剤は、ポルフィリンであり、これは、例えば、Ｒｏｅｌａｎｔ、米国特許第６，００１，５７３号（これは、参考として援用される）に記載される。本発明とともに使用するのに適切な多くのポルフィリンは、市販される（例えば、Ｆｒｏｎｔｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．（Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ）；など）。
【００５８】
（放出分子タグ分離）
分子タグを電気泳動的に分離して、電気泳動図を形成する。ここで、この分離された分子タグは、異なるピークによって表される。電気泳動のための方法は、周知であり、当業者が、特定の複数の分子タグを形成および分離するために設計を選択するための豊富な手引きが存在する。以下は、電気泳動についての例示的な参照である：Ｋｒｙｌｏｖら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７２：１１１Ｒ−１２８Ｒ（２０００）；Ｐ．Ｄ．Ｇｒｏｓｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｃ．  Ｃｏｌｂｕｒｎ，Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９９２）；米国特許第５，３７４，５２７号；同第５，６２４，８００号；同第５，５５２，０２８号；ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ，Ｒｅｖ．Ａ，Ｊａｎｕａｒｙ  １９９５，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）；など。１つの局面において、分子タグは、キャピラリー電気泳動によって分離される。当業者の範囲内の設計の選択としては、いくつかの市販のモデルからの機器の選択、操作条件（分離媒体の型および濃度、ｐＨ、所望の分離時間、温度、電圧、キャピラリー型および寸法、検出様式、分離される分子タグの数などを含む）の選択が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
本発明の１つの局面において、電気泳動分離の間または電気泳動分離の後に、分子タグは、分離される化合物の蛍光シグナルおよび移動時間（または移動距離）を記録することによって、または分子タグの相対的な蛍光および移動の順序のチャート（例えば、電気泳動図として）を作成することによって、検出または同定される。このような検出を行うために、分子タグは、標準的な手段（例えば、高い強度の水銀蒸気ランプ、レーザーなど）によって照射され得る。代表的に、分子タグは、Ｈｅ−Ｎｅガスレーザーまたは固体ダイオードレーザーによって生成されるレーザー光によって照射される。次いで、蛍光シグナルは、レーザー感受性検出器（例えば、光電子増倍管、電荷結合デバイスなど）によって検出され得る。例示的な電気泳動検出器システムは、他の場所、例えば、米国特許第５，５４３，０２６号；同第５，２７４，２４０号；同第４，８７９，０１２号；同第５，０９１，６５２号；同第６，１４２，１６２号；などに記載される。別の局面において、分子タグは、例えば、米国特許第６，０４５，６７６号に記載されるように、電気化学的に検出され得る。
【００６０】
電気泳動分離は、移動度の差に基づく、電場における分子の移動および分離を含む。電気泳動分離の種々の形態としては、例として限定ではなく、フリーゾーン電気泳動、ゲル電気泳動、等電集束法、等速回転電気泳動、キャピラリー電気クロマトグラフィー、およびミセル動電学クロマトグラフィーが挙げられる。キャピラリー電気泳動は、約１〜約２０マイクロメートル、通常約１０〜約１００マイクロメートルの断面寸法のチューブまたはチャネルで行われる、好ましくは、動電学流れ（電気泳動流れ、誘電泳動流れおよび／または電気浸透流れを含む）による、電気分離を含む。キャピラリーは、ケイ素、石英、ガラスまたはプラスチックから構成されるウェハまたはフィルムの長い独立したキャピラリーチューブまたはチャネルであり得る。
【００６１】
キャピラリー電気分離において、分子タグを含む反応混合物のアリコートは、このアリコートを、増幅および他の反応が行われるキャピラリーデバイスの一部であり得るかまたはそのようなキャピラリーデバイスに連結され得る電気分離チャネル内に導入することによって、電気分離に供される。次いで、電位を、このチャネルに含まれる導電性媒体に印加して、組み合わせ内の成分の移動を達成する。一般的に、印加される電位は、当該分野で周知の実施に従って、所望の成分の電気分離を達成するのに十分である。当業者は、本発明で使用される所定のセットの試薬および／または切断される標識の性質、反応媒体の性質などについて適切な電位を決定し得る。電気分離のためのパラメーター（媒体および電位についてのパラメーターを含む）は、通常、所望の成分の最大の分離を達成するために最適化される。これは、経験的に達成され、そして当業者の範囲内で十分である。
【００６２】
検出は、キャピラリー電気泳動カラムの分析と関連する公知の方法のいずれかにより得、これには、米国特許第５，５６０，８１１号（第１１欄、１９〜３０行目）、同第４，６７５，３００号、同第４，２７４，２４０号および同第５，３２４，４０１号（これらの関連の開示は、本明細書中において、参考として援用される）に示される方法が挙げられる。電気泳動の当業者は、幅広い範囲の電位または電場強度が使用され得る（例えば、１０〜１０００Ｖ／ｃｍの電場が使用され、約２００〜約６００Ｖ／ｃｍがより代表的である）。商業的システムについての電圧上限は、約３０ｋＶであり、約４０〜約６０ｃｍのキャピラリー長さで、約６００Ｖ／ｃｍの最大電場を与える。ＤＮＡについて、代表的に、キャピラリーは、電気浸透流れを減少するためにコーティングされ、そしてキャピラリーの注入端は、負の電位に維持される。
【００６３】
検出を容易にするために、装置全体は、光学的に透明である（一般的に、約１８０〜約１５００ｎｍ、通常、約２２０〜約８００ｎｍ、より通常では、約４５０〜約７００ｎｍの範囲の波長の光が低い透過損失を有する）プラスチック材料から作製される。適切な材料としては、溶融シリカ、プラスチック、石英、ガラスなどが挙げられる。
【００６４】
本発明の１つの局面において、分子タグは、図９Ａ〜９Ｃに図で示される、マイクロフルイディクス（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）デバイスでの電気泳動によって分離される。マイクロフルイディクスデバイスは、多くの国内および外国の特許および公開された特許出願に記載される。例えば、米国特許第５，７５０，０１５号；同第５，９００，１３０号；同第６，００７，６９０号；ならびにＷＯ  ９８／４５６９３；ＷＯ  ９９／１９７１７およびＷＯ  ９９／１５８７６を参照のこと。便利には、アリコート（一般的に、約５μｌ以下）を、電気泳動注入または空気注入のいずれかによって一体化されたシステムに直接的に、あるいはシリング、キャピラリーなどによって、のいずれかによって、微小流体デバイスのサンプルレザバに移される。分離が実施される条件は、慣例的であり、生成物の性質とともに変化する。
【００６５】
例示として、図９Ａ〜９Ｃは、上記アッセイにおいて作製されるプローブのサンプルのサンプル充填および電気泳動分離のために、上記出願において詳細に記載される型の微小流体デバイスのマイクロチャネルネットワーク１００を示す。簡単に述べると、ネットワークは、上流レザバ１０４および下流レザバ１０６でそれぞれ終結する主要分離チャネル１０２を備える。この主要チャネルは、側部チャネル１０８（レザバ１１０で終結する）および側部チャネル１１２（レザバ１１４で終結する）によって、オフセット軸位置で交差する。２つの側部チャネルの間のオフセットは、主要チャネル内にサンプル充填ゾーン１１６を形成する。
【００６６】
操作において、アッセイ混合物を、図９Ａに示されるように、サンプルレザバ１１０に配置した。示されるように、アッセイ混合物は、１つ以上の標的細胞を、表面結合切断剤、１つ以上のタンパク質プローブ、および必要に応じて分子タグ標準物質とともに含む。アッセイ反応（標的細胞への最初のプローブ結合、続くプローブ結合細胞でのプローブリンカーの切断を含む）は、サンプルレザバ１１０において実施され得るか、あるいは、このアッセイ反応は、別の反応容器で実施され得、この反応したサンプル成分がサンプルレザバ１１０に添加される。
【００６７】
放出分子タグをサンプル充填ゾーンに充填するために、図９Ｂに示される方向で、電場が、レザバ１１０、１１４を横切って印加され、ここで、負に荷電された放出分子タグは、レザバ１１０から充填ゾーン１１６内に引き出され、一方、非荷電または正に荷電されたサンプル成分は、サンプルレザバ内に留まる。充填ゾーンの放出タグは、ここで、図９Ｃに示される方向で、電場をレザバ１０４、１０６を横切って印加することによって、従来のキャピラリー電気泳動によって、分離され得る。
【００６８】
（ピーク同定および相関）
電気泳動図データがプロセッサによって読み取られた後に、データの各ピークが、同定されるか、または単一の移動時間によって位置付けられる。ピークを同定するプロセスにおいて、従来のスムージングアルゴリズムまたはフィルタリングアルゴリズムを適用して、例えば、移動平均フィルター、Ｓａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙフィルターなどを使用して、ノイズおよび物理的関連を有さない範囲外のデータ点を除去し得る。このようなフィルターのためのアルゴリズムは、以下の参考文献に開示される：Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｒｅｃｉｐｅｓ  ｉｎ  Ｃ：Ｔｈｅ  Ａｒｔ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，１９９２）；Ｈａｍｍｉｎｇ，Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｆｉｌｔｅｒｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ，Ｉｎｃ．，Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ  Ｃｌｉｆｆｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９８３）；など。従来のピーク同定アルゴリズムを使用して、電気泳動図データの全てのピークの位置およびサイズを決定し得る。好ましいピーク同定アルゴリズムは、以下にさらに十分に開示される。図２Ｄに示されるように、同定されるピークの数は、アッセイで使用される分子タグの数よりも多くあり得る。図２Ｄの例において、２２のピークが同定されるが、６つの分子タグのみがアッセイで使用されている。分子タグおよび標準物質が予め決められた分子であるので、正規化条件下のそれらの移動時間は、予め実験的に決定され得る。従って、各分子タグについて、電気泳動図の下の影付きの四角によって図２Ｄで示されるように、間隔が規定される（「移動間隔」と本明細書中で呼ばれる）。移動間隔の幅は、種々の方法で規定され得る。例えば、各間隔の中心は、「実験的移動時間（ｅｍｉｐｉｒｉｃａｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ）」と本明細書中で呼ばれる、実験的に決定した平均値（図の影付きの四角で垂直線として示される）に対応し得、そして間隔の幅は、標準偏差の二倍として取られ得、必要に応じて、ユーザが規定した値で乗算される。位置が移動間隔の外であるピークは、図２Ｅに示されるように、無視され得る。いくつかの間隔（例えば、（２１７）および（２１９））において、１つより多くのピーク位置が、同定され得る。本発明は、分子タグとの正確な相関を作り出すために、このようなピークから選択するための方法を提供する。
【００６９】
本発明の１つの実施形態において、全てのピークが同定された後に、第１の電気泳動標準物質が、標準物質として使用される化合物の既知の特性（例えば、光学的特性（分子タグとは異なる色であり得る）、量、電気泳動分離のために使用されるシステムについての絶対的な移動時間の既知の範囲など）に基づいて、一組の必要な条件を満足する第１のピークを決定することによって、同定される。好ましくは、第１の電気泳動標準物質は、（ｉ）実験的に決定された範囲内のピークの位置、（ｉｉ）所定の最小値を超えるピーク高さ、および（ｉｉｉ）所定の最小値を超えるピーク面積に基づいて決定される。本発明の好ましい実施形態において、第２の電気泳動標準物質が使用され、これは、アッセイで使用される分子タグのいずれよりも長い移動時間を有し、その結果、分離において、電気泳動図が、図２Ａおよび２Ｂに示されるエレクロトフェログラムと同様に作成される。一旦、両方の標準物質の位置が決定されると、１つの実施形態において、分子タグの移動時間は、図２Ｂに示されるように、２つの標準物質によって規定される間隔の関数として決定される。
【００７０】
複数のピークが、図２Ｅに示されるように、同じ移動間隔内の位置を有する場合、いくつかの方法を使用して、移動間隔に関連する分子タグと相関するピークを選択し得る。１つの実施形態において、各候補ピークの位置は、最初に、第１の電気泳動標準物質および第２の電気泳動標準物質に対して決定される。例えば、図２Ｆに示されるように、２つのピークは、実験的に決定されたＴ２を中心とした移動間隔内で、ｔ２１およびｔ２２に位置する。以下の値を決定する：
Ｓ１＝（ｔ２１−Ｔｓ１）／（Ｔｓ２−Ｔｓ１）
Ｓ２＝（ｔ２２−Ｔｓ１）／（Ｔｓ２−Ｔｓ１）。
比Ｓ１またはＳ２（実験的に決定された移動時間Ｔ２の比に最も近い）および標準物質の移動時間の間の差（つまり、Ｔ２／（Ｔｓ２−Ｔｓ１））は、どの候補ピークが、移動間隔の分子タグと相関するかを決定する。
【００７１】
別の実施形態において、各候補ピークの位置は、最初に、第２の電気泳動標準物質および分子タグと相関する先に決定されたピーク位置に対して決定される。例えば、図２Ｆに示されるように、２つのピークは、実験的に決定されたＴ２を中心とした移動間隔内で、ｔ２１およびｔ２２に位置する。以下の値を決定する：
Ｓ’１＝（ｔ２１−Ｔ１）／（Ｔｓ２−Ｔ１）
Ｓ’２＝（ｔ２２−Ｔ１）／（Ｔｓ２−Ｔ１）。
比Ｓ’１またはＳ’２（実験的に決定された移動時間Ｔ２の比に最も近い）および第２の標準物質の移動時間とＴ１との間の差（つまり、Ｔ２／（Ｔｓ２−Ｔ１））は、どの候補ピークが、移動間隔の分子タグと相関するかを決定する。この実施形態において、ピーク位置が首尾良く分子タグと相関するので、最新のこのように同定された移動時間を使用して、複数のピーク位置が移動間隔に存在する場合、次の移動時間を選択する。アッセイにおいて分子タグが生成しないかまたは低いレベルで生成する場合、対応するピークは、低いシグナル対ノイズ比を有し得、その位置を、正確に同定することは困難であり得る。従って、標準物質として使用されるピーク位置について、好ましくは、このようなピークは、最小値より上のシグナル対ノイズ比を有する。１つの局面において、最小のシグナル対ノイズ比は、少なくとも１．５、好ましくは、少なくとも２．０、より好ましくは、２．５である。
【００７２】
上記のように、ピークは、種々の方法（例えば、カーブフィッテイングなど）で電気泳動図データにおいて同定され得る。ピーク位置および他のパラメーター（例えば、ピーク高さ、ピークサイズまたは面積、およびシグナル対ノイズ比）を決定するための好ましいアルゴリズムは、図２Ｇ〜２Ｊおよび図３のフローチャートに示される。図２Ｇに示されるように、幅（２１２）を有するピーク検索ウィンドウ（２１０）を確立する。ウィンドウ（２１０）は、最も早い（最も左の）時間点で開始することによって全データを走査（２１４）し、次いで、ピーク検出および分析工程を実施した後に、ウィンドウ（２１２）を、ピーク検出および分析工程を再び実施するために、重複したセットの時間まで、所定の量で、右に移動させる。このプロセスは、全てのデータが分析されるまで、続けられる。ウィンドウ（２１２）の幅、ピーク検出および分析の各サイクルで移動される量、は、当業者の範囲内の設計の選択である。ピーク検索ウィンドウ（２１２）の位置が確立された後に、局所的なノイズレベルについての値（すなわち、検索ウィンドウ内のノイズレベル）を、図２Ｈおよび２Ｉに示されるように決定する。最初に、平均（２２２）を、ウィンドウ（２２０）内の全てのデータ値、Ｆ（Ｘｉ）についてとり、その後、計算された平均より過剰のデータ値全てを図２Ｉにおいてグラフィカルに（２２３）示される平均値（２２２）まで減少させる。このプロセスを繰り返し、そして新たな平均値（２２６）を得る。再び、新たな平均（２２６）を超えるデータ値（２２４）を、新たな平均値まで減少させる。有効にノイズ値に変化が存在しなくなるまで、このプロセスを繰り返し、図２Ｊに示されるように、最終のノイズ値が、ピーク検索ウィンドウの局所ノイズ値（２３０）としてとられる。一旦、この値が得られると、ピーク位置は、縦座標または移動時間値Ｘｍａｘ（ピーク検索ウィンドウの最大データ値、Ｆ（Ｘｊ）に対応する）としてとられ；ピーク開始位置ｔｓｔａｒｔ（２３６）は、ノイズレベル（２３０）およびＦ（Ｘ）の交差（２３２）に対応する縦座標であり；ピーク終了位置ｔｅｎｄ（２４０）は、ノイズレベル（２３４）およびＦ（Ｘ）の交差（２３４）に対応する縦座標であり；ピーク幅は、ピーク終了とピーク開始との間の差であり；そしてピークのシグナル対ノイズ比は、ピーク高さ（Ｆｍａｘ）対ノイズ値（２３０）の比である。必要に応じて、ピーク位置が決定された後、ノイズ値は、Ｘｍａｘを再び中心にしたピーク検索ウィンドウで再計算され得る（３０８、図３）。ピーク位置が決定された後、局所的ノイズのベースライン値でのリファインがなされ得る。例えば、局所的なノイズ値が、ピーク開始点およびピーク終了点に隣接して計算されて、ピークのベースラインの傾きを決定し得る。次いで、このような値を、ピーク面積についてのより正確な値を計算する際に使用し得る。このようなピークパラメーターが計算された後に、ピーク面積が決定され、そして次のウィンドウ移動が実施される前に、特定の必要な状態（３１４）を満たさなければならない。必要な条件としては、ピーク幅が他のピーク幅と重ならないこと、ピーク幅が予め設定された最小値より広いこと（例えば、電気泳動図データから偽のスパイクおよび他の範囲外の値を除去するために、プロセスが実行されなかった）が挙げられる。好ましくは、ピーク面積は、時間正規化面積（すなわち、以下の値：
ＰＡ＝Ｅ［Ｆ（Ｘｉ）／Ｘｉ］（ｉ＝ｔｓｔａｒｔ，ｔｅｎｄについて）
）を計算することによって決定される。
【００７３】
（ダイナミックレンジの拡大）
図４Ａに示すように、特定の状況において、器機は、異なる波長範囲内の複数のチャネルにおける電気泳動図データ（例えば、蛍光強度）を、検出および記録し、そして、同時に、シグナル強度の値は、１つ以上のチャネルにおける検出器のダイナミックレンジ（４０３）の外側である。この現象が生じたら、シグナル強度についての情報が特定のチャネルからの電気泳動図データの領域（図４の４０４および４０６）において失われる。しかし、別のチャネルにおいて、シグナルが検出器のダイナミックレンジを超えない場合、他のチャネルの「不飽和の」シグナルが第１のチャネルの「飽和した」領域のシグナルの値を推測するのに使用され得る。このような方法は、図４Ａに図式的に、図４Ｂにフローチャートにより示される。まず、「飽和した」ピーク（４０４）に対応する不飽和のピークを決定し（図４Ａの４０８および４１０、図４Ｂの４３２）、この後に、飽和した領域（４１４）および（４１２）のすぐ隣のデータの値を、一次関数（４３４）により不飽和のピークの対応する領域にマッピング（４１６）する。検出器がシグナル強度を増すように非線型的に応答する場合、他の関数が使用され得る。一旦、このような関数相関が確立されると、「飽和した」領域の第１のチャネルのデータ値が外挿によって推定される。
【００７４】
（コンピュータシステムおよびプログラム）
好ましくは、コンピューターが、上記の電気泳動図データにおけるピークを同定する方法の工程を実施する。１つの実施形態において、コンピューターは、処理ユニット、メモリ、Ｉ／Ｏデバイス、および、情報をこれらの間で通信するための関連するアドレス／データバス構造を備える。処理ユニットは、適切なオペレーティングシステムによって駆動される従来のマイクロプロセッサ（ＲＩＳＣプロセッサおよびＣＩＳＣプロセッサを含む）、内蔵されたファームウェアを使用する専用のマイクロプロセッサ、またはカスタマイズされたデジタルシグナル処理回路（ＤＳＰ）（これは、この方法の特定の処理タスク専用である）であり得る。メモリは、マイクロプロセッサの内部（すなわち、レベル１のキャッシュ）、高速Ｓ−ＲＡＭ（すなわち、レベル２のキャッシュ）、Ｄ−ＲＡＭまたは光学もしくは磁気のいずれかのディスクであり得る。Ｉ／Ｏデバイスは、コンピューターとユーザとの間で情報を移動し得る任意のデバイス（例えば、キーボード、マウス、ネットワークカードなど）であり得る。アドレス／データバスは、ＰＣＩバス、ＮＵバス、ＩＳＡまたは任意の他のバス様の構造であり得る。コンピューターが本発明の方法を行う場合、上記の方法の工程がコンピューター読取り可能な製品の中または製品上に記憶されたプログラムにおいて実施される。このようなコンピューター読取り可能な製品はまた、グラフィカル・ユーザ・インターフェースのためのプログラムおよび電気泳動システムまたはデータ回収デバイスの設定を変更するためのプログラムを含み得る。
【実施例】
【００７５】
（実施例１）
（標準物質として以前に相関したピークを用いる分子タグに対してピークを相関させるためのアルゴリズム）
目的：新たに同定した分子タグを動的に標準物質として用いることによって、２つのマーカー戦略において分子タグを同定すること。
【００７６】
式：新しいアルゴリズムはＮＲＤ（ｅ１，ｐ１，ｅ２，ｐ２）と呼ばれる関数を使用することを必要とする。ｅ１およびｅ２は分子タグであり、ｐ１およびｐ２はトレースのピークである。この関数は、以下のようにしてｐ１に対するｐ２の比とｅ１に対するｅ２の比の正規化した差分を計算する：
ＮＲＤ（ｅ１，ｐ１，ｅ２，ｐ２）＝Ａｂｓ（（（ｔｐ２−ｔ１）／（ｔｐ１−ｔ１）−ｍｅ２／ｍｅ１）（ｍｅ２−ｍｅ１）），
ｔｐ１、ｔｐ２はそれぞれ、ピークｐ１およびｐ２の絶対移動時間であり、ｔ１は、マーカーＭ１の絶対移動時間であり、ｍｅ１、ｍｅ２はそれぞれ、データベースにおける分子タグｅ１およびｅ２の平均相対的移動時間である。さらに、（ｔｐ２−ｔ１）／（ｔｐ１−ｔ１）は、ｐ１に対するｐ２の相対的移動時間比に等しい（この正規化は、ＳＤがｍｅ２−ｍｅ１に対して線形であることを仮定する）。
【００７７】
（ステップバイステップ方式のアルゴリズム：）
１．ＰｒｅＴａｇ＝ｅｍｐｔｙ（空）、ＰｒｅＰｅａｋ＝ｅｍｐｔｙ、ＰｒｅＴａｇ２＝ｅｍｐｔｙ、ＰｒｅＰｅａｋ２＝ｅｍｐｔｙ、ＦａｓｔｅｓｔＰｅａｋ＝Ｍ１  ｐｅａｋとする。
【００７８】
２．標的リストにおける各分子タグｅｉについて（最も早いものから最も遅いものまで）：
２．１．ＳｌｏｗｅｓｔＰｅａｋ＝Ｍ２  ｐｅａｋ
２．２．分子タグｅｉがすでに手動でピークｐａに割り当てられている場合：
２．２．１．ＰｒｅＴａｇ＝ｅｉ、ＰｒｅＰｅａｋ＝ｐａ
２．２．２．ＰｒｅＴａｇ２＝ｅｍｐｔｙ、ＰｒｅＰｅａｋ２＝ｅｍｐｔｙ
２．２．３．ＦａｓｔｅｓｔＰｅａｋ＝ｐａ
２．２．４．工程２に進む
２．３．ｅｉよりも遅い分子タグが存在し、すでに手動でピークに割り当てられている場合：
２．３．１．ｅｉに最も近く、ｅｉよりも遅い、自動的に割り当てられた分子タグｅａを求め、ＳｌｏｗｅｓｔＰｅａｋ＝ｅａとする
２．４．移動間隔（すなわち、｜ｔｐｊ−ｍｅｉ｜／σｅｉ＜θ）にある全てのピークを求める。ｔｐｊはＦａｓｔｅｓｔＰｅａｋとＳｌｏｗｅｓｔＰｅａｋとの間にあり、このピークは手動的には分子タグｅｉに割り当てられず（これは、手動割当ての現在の定義に起因して適用可能でない）、そして候補のピークセット（分子タグｅｉのＣＰ＝｛ｃ１，ｃ２，．．．，Ｃｋ｝）を組み立てる
２．５．ＣＰがｅｍｐｔｙの場合、いずれのピークにもｅｉを割り当てずに、工程２に進む
２．６．ＰｒｅＴａｇ＝ｅｍｐｔｙ（分子タグがまだピークに割り当てられていない）である場合：
２．６．１．最小の｜ｔｃｊ−ｍｅｉ｜／σｅｉを有するＣＰのピークｃｊを求め、ｅｉをピークｃｊに割り当てる
２．６．２．ＰｒｅＴａｇ＝ｅｉ，ＰｒｅＰｅａｋ＝ｃｊ
２．７．ＰｒｅＴａｇがｅｍｐｔｙでない場合（ＰｒｅＴａｇをｅｉを同定するための標準物質として使用する）：
２．７．１．関数ＮＲＤ（ＰｒｅＴａｇ，ＰｒｅＰｅａｋ，ｅｉ，ｃｊ）によって、以前に同定された分子タグ、ＰｒｅＴａｇに対して、各ｃｊについてのｅｉの正規化した比差分を計算する
２．７．２．ＰｒｅＴａｇ２がｅｍｐｔｙでない場合（以前に割り当てられた分子タグが正しい割当てであることを二重チェックするためにＰｒｅＴａｇ２を使用する）：
２．７．２．１．ＣＰの各ｃｊについてＮＲＤ（ＰｒｅＴａｇ２，ＰｒｅＰｅａｋ２，ｅｉ，ｃｊ）を計算する
２．７．２．２．最小のＮＲＤ（ＰｒｅＴａｇ２，ＰｒｅＰｅａｋ２，ｃｋ）を有するｃｋを求める
２．７．２．３．ピークｃｋがＰｒｅＰｅａｋであり（これはピークｃｋがすでにＰｒｅＴａｇであると割り当てられていることを意味する）、かつＮＲＤ（ＰｒｅＴａｇ２，ＰｒｅＰｅａｋ２，ｅｉ，ｃｋ）＜ＮＲＤ（ＰｒｅＴａｇ２，ＰｒｅＰｅａｋ２，ＰｒｅＴａｇ，ｃｋ）である場合（予め割り当てられたピークは、分子タグｅｉによりフィットする）：
２．７．２．３．１．ピークｃｋに分子タグｅｉを割り当てる（従って、ｃｋはもはやＰｒｅＴａｇに割り当てられない）
２．７．２．３．２．ＰｒｅＴａｇ＝ｅｉ、ＰｒｅＰｅａｋ＝ｃｋ（ＰｒｅＴａｇ２およびＰｒｅＰｅａｋ２は変化しない）
２．７．２．３．３．工程２に進む
２．７．２．４．他に、ｃｋがＰｒｅＰｅａｋより早く移動し、かつＮＲＤ（ＰｒｅＴａｇ２，ＰｒｅＰｅａｋ２，ｅｉ，ｃｋ）＜ＮＲＤ（ＰｒｅＴａｇ２，ＰｒｅＰｅａｋ２，ＰｒｅＴａｇ，ＰｒｅＰｅａｋ）である場合（予め割り当てられたピークよりも早いピークが存在し、これは、より確証を持ってｅｊに割り当てられるべきである。従って、ＰｒｅＴａｇはｅｉよりも早く移動するので、予め割り当てられたピークは、割り当てられない）：
２．７．２．４．１．ｅｉをｃｋに割り当てる
２．７．２．４．２．ＰｒｅＴａｇをＰｒｅＰｅａｋに割り当てない
２．７．２．４．３．ＰｒｅＴａｇ＝ｅｉ、ＰｒｅＰｅａｋ＝ｃｋ
２．７．２．４．４．工程２に進む
２．７．２．５．その他の場合（ピークｃｋはＰｒｅＴａｇおよびＰｒｅＰｅａｋと矛盾しない）：
２．７．２．５．１．最小のＮＲＤ（ＰｒｅＴａｇ，ＰｒｅＰｅａｋ，ｅｉ，ｃｌ）を有するピークｃｌを求め（ｃｋであってもなくてもよい）、ｃｌはＣＰのＰｒｅＰｅａｋよりも遅い
２．７．２．５．２．ｃｌが選択されない場合、分子タグｅｉをいずれのピークにも割り当てず、工程２に進む
２．７．２．５．３．分子タグｅｉをピークｃｌに割り当てる
２．７．２．５．４．ＰｒｅＴａｇ２＝ＰｒｅＴａｇ，ＰｒｅＰｅａｋ２＝ＰｒｅＰｅａｋ
２．７．２．５．５．ＰｒｅＴａｇ＝ｅｉ，ＰｒｅＰｅａｋ＝ｃｌ
２．７．２．５．６．ＦａｓｔｅｓｔＰｅａｋ＝ＰｒｅＰｅａｋ２
２．７．２．５．７．工程２に進む
２．７．３．その他の場合（ＰｒｅＴａｇ２がｅｍｐｔｙである）、
２．７．３．１．最小の｜ｔｃｊ−ｍｅｉ｜／σｅｉを有するＣＰのベストピークｃｊを求める（以前に割り当てられた分子タグが正しい割てであることを二重チェックするために）
２．７．３．２．ｃｊがＰｒｅＰｅａｋであるかＰｒｅＰｅａｋより早く移動し、かつ｜ｔｃｊ−ｍｅｉ｜／σｅｉ＜｜ｔＰｒｅＴａｇ−ｍＰｒｅＴａｇ｜／σＰｒｅＴａｇである場合（ｅｉによりフィットする矛盾するピークが存在し、以前に割り当てられた分子タグは取り消されるべきである）
２．７．３．２．１．分子タグｅｉをピークｃｊに割り当てる
２．７．３．２．２．ＰｒｅＴａｇをＰｒｅＰｅａｋに割り当てない
２．７．３．２．３．ＰｒｅＴａｇ＝ｅｉ、ＰｒｅＰｅａｋ＝ｃｊ
２．７．３．２．４．工程２に進む
２．７．３．３．そうでなければ、以前の割当てを変更しない
２．７．３．４．最小のＮＲＤ（ＰｒｅＴａｇ，ＰｒｅＰｅａｋ，ｅｉ，ｃｌ）を有するピークｃｌを求め、ｃｌはＣＰのＰｒｅＰｅａｋよりも遅い
２．７．３．５．ｃｌが選択されない場合、いずれのピークにも分子タグｅｉを割り当てず、工程２に進む
２．７．３．６．分子タグｅｉをピークｃｌに割り当てる
２．７．３．７．ＰｒｅＴａｇ２＝ＰｒｅＴａｇ，ＰｒｅＰｅａｋ２＝ＰｒｅＰｅａｋ
２．７．３．８．ＰｒｅＴａｇ＝ｅｉ，ＰｒｅＰｅａｋ＝ｃｌ
２．７．３．９．ＦａｓｔｅｓｔＰｅａｋ＝ＰｒｅＰｅａｋ２
２．７．３．１０．工程２に進む
１．全ての分子タグがＭ１とＭ２との間であると仮定する。そして、相対的移動時間が（ｔ−ｔ１）／（ｔ２−ｔ１）として計算され、ここで、ｔ、ｔ１、ｔ２はそれぞれピーク、Ｍ１およびＭ２の移動時間であり、Ｍ１がより早いマーカーである。
２．この方法は、以下の誤同定を防ぐのを補助する
ａ．両方のピークが分子タグの移動間隔にある場合、予想される分子タグが正しいピークの代わりに誤ったピークに割り当てられる
ｂ．ａに起因して、正しいピークが別の分子タグに誤って割り当てられるので、予想される分子タグは正しいピークには割り当てられない（このピークが分子タグの移動間隔にある場合）。
３．この方法は、予想されていない分子タグがジャンクピークに割り当てられることを防がない。
４．以下の条件が満たされる場合、分子タグｅｉは、ピークｐｊに割り当てられる：
ａ．ピークｐｊが分子タグｅｉの移動間隔にあり、すなわち｜ｔｐｊ−ｍｅｉ｜／σｅｉ＜θであり、かつ、以下の条件の１つが満たされている
ａ．ｅｉがｐｊに対するベストフィットであり、ｐｊがｅｉに対するベストフィットである
ｂ．ｅｉがｐｊに対するベストフィットであり、ｐｊはｅｉに対するベストフィットではないが、ｅｉに対するベストフィットは別の分子タグに対するベターフィットであり、他の分子タグに割り当てられる
ｃ．ｐｊがｅｉに対するベストフィットであり、ｅｉはｐｊに対するベストフィットではないが、ｐｊに対するベストフィットは別のピークに対するベターフィットであり、別のピークに割り当てられる
（実施例２）
（ダイナミックレンジ拡大のアルゴリズム）
目的：「飽和した」領域の電気泳動図データのシグナル値を外挿する。
【００７９】
インプット：（ｉ）飽和したピークのシグナル強度を含む一次元アレイＰ、ここでｐ０は開始ピークであり、ｐｎ−１は終了ピークであり、ｎは飽和したピークの幅であり、従って、Ｐのサイズである。（ｉｉ）ダイナミックチャネルにおける対応するピークのシグナル強度を含む一次元アレイＤ。（ｉｉｉ）Ｓ：飽和したピーク閾値
（ステップバイステップ方式のアルゴリズム）
１．アレイＰにおける飽和した範囲の境界を求める。
【００８０】
ａ．ｐｉ＜Ｓかつｐｉ＋１＞ＳとなるようにＰにおける第１のデータポイントｐｉを求め、このデータのインデックスをｋと表示する
ｂ．ｐｊ＜Ｓかつｐｊ−１＞ＳとなるようにＰにおける第１のデータポイントｐｊを求め、このデータのインデックスをｌと表示する
２．アレイＹ＝（ｐｋ−６，ｐｋ−５，．．．，ｐｋ−１，ｐｌ＋１，ｐｌ＋２，．．．，ｐｌ＋６）、およびアレイＸ＝（ｄｋ−６，ｄｋ−５，．．．ｄｋ−１，ｄｌ＋１，ｄｌ＋２，．．．，ｄｌ＋６）を組み立てる。ｋ−６＜０である場合、０から開始し；ｌ＋６＞ｎ−１である場合、ｎ−１で終了する。
【００８１】
３．以下のようにして、ＹおよびＸについてのベスト線形フィッティングｙ＝Ａ＊ｘ＋Ｂを求める：
ａ．Ｂ＝（Σ（ｘｉ＊ｙｉ）−ｍ＊ｘａｖｇ＊ｙａｖｇ）／（Σ（ｘｉ＊ｘｉ）−ｍ＊ｘａｖｇ＊ｘａｖｇ）、ここでｘａｖｇおよびｙａｖｇはそれぞれＸおよびＹの平均であり、ｍはＸのサイズである
ｂ．Ａ＝ｙａｖｇ−Ｂ＊ｘａｖｇ
４．修復したピークアレイＰを計算する。ｊ＝ｋ〜ｌ、ｐｊ＝Ａ＊ｄｊ＋Ｂ。
【００８２】
（実施例３）
（複数のサイトカインの同定）
本実施例において、７つのヒトサイトカイン（ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦαおよびＩＦＮγ）を、１つの分子タグのみを各抗体に結合体化させたことを除いて、図１Ａに示すようなシングル多重化サンドイッチアッセイ（ｓｉｎｇｌｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ｓａｎｄｗｉｃｈ  ａｓｓａｙ）にて検出した。３３３ｐＭの各サイトカインを含む１０μＬのサイトカインサンプルを、各サイトカインに特異的な抗体の混合物を含む２０μＬの結合組成物と合わせる。ここで、各抗体は、一重項の酸素切断可能な結合を介して異なる分子タグに結合体化させられる（図１１において同定される）。３０分間のインキュベーション後、１０μＬの切断試薬（インキュベーション後にアビジン化光感作ビーズ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ、また、国際特許公報ＷＯ  ０１／９０３９９にも開示される）と合わされる、ビオチン化抗サイトカイン二次抗体）を添加し、混合物をさらに３０分間インキュベートする。反応緩衝液を減圧下でフィルターを通して液体を吸引することによって１００μＬの低塩緩衝液で２回交換し、この後、２つの電気泳動標準物質を含む５０μＬの電気泳動分離媒体を添加し、この混合物を５分間照射する（例えば、型番ＯＤ−８８０Ｗのような高出力ＧａＡＩＡｓ  ＩＲエミッタ（ＯＰＴＯ  ＤＩＯＤＥ  Ｃｏｒｐ，Ｎｅｗｂｕｒｙ  Ｐａｒｋ，ＣＡ製）を用いて）。５分間の振盪の後、図１１に示す電気泳動図データを作成するために、放出分子タグを含む１０μＬの混合物をＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）モデル３  １  ００キャピラリー電気泳動システムに移す。
【００８３】
電気泳動図データにおけるピークを、Ｃ＃やＶＢ．ＮＥＴなどのような都合のよい言語で従来のＰｅｎｔｉｕｍ（登録商標）ベースのコンピューターをプログラミングすることによって、指示された分子タグを用いて同定および相関し、実施例１のアルゴリズムを実行する。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１Ａ】図１Ａは、結合化合物として抗体を使用する「サンドイッチ」型のアッセイにおいて、分子タグを生成することによって、標的分析物（例えば、タンパク質）を検出または測定するための例示的な多重化アッセイを示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において、「タックマン（ｔａｑｍａｎ）」型のアッセイにおいて、分子タグを生成することによって、標的ポリヌクレオチドを検出または測定するための例示的な多重化アッセイを示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、インベーダー（Ｉｎｖａｄｅｒ）型のアッセイにおいて、分子タグを生成することによって、標的ポリヌクレオチドを検出または測定するための例示的な多重化アッセイを示す。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明のアルゴリズムの特性を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本発明のアルゴリズムの特性を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、本発明のアルゴリズムの特性を示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、本発明のアルゴリズムの特性を示す。
【図２Ｅ】図２Ｅは、本発明のアルゴリズムの特性を示す。
【図２Ｆ】図２Ｆは、本発明のアルゴリズムの特性を示す。
【図２Ｇ】図２Ｇは、本発明のアルゴリズムの特性を示す。
【図２Ｈ】図２Ｈは、本発明のアルゴリズムの特性を示す。
【図２Ｉ】図２Ｉは、本発明のアルゴリズムの特性を示す。
【図２Ｊ】図２Ｊは、本発明のアルゴリズムの特性を示す。
【図２Ｋ】図２Ｋは、本発明のアルゴリズムの特性を示す。
【図３】図３は、電気泳動図データ中のピークを同定するための好ましいアルゴリズムの主要な工程を示すフローチャートである。
【図４Ａ】図４Ａは、検出システムのデータ収集チャネルの１つにおいて、ダイナミックレンジの外へと伸びるピークのピークパラメーターを決定するための方法を概略的に示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、検出システムのデータ収集チャネルの１つにおいて、ダイナミックレンジの外へと伸びるピークのピークパラメーターを決定するための主要な工程を示すフローチャートである。
【図５】図５は、ポリヌクレオチド分析物を検出するためのアッセイからの、いくつかの分子タグの、化学式、電気泳動移動時間、および分子量を示す。
【図６】図６は、ポリヌクレオチド分析物を検出するためのアッセイからの、いくつかの分子タグの、化学式、電気泳動移動時間、および電荷をさらに示す。「Ｃ３」「Ｃ６」および「Ｃ９」として示される化学式中の部分は、ホスホジエステルに結合される３炭素のポリエチレングリコールリンカー、６炭素のポリエチレングリコールリンカー、および９炭素のポリエチレングリコールリンカーである。例えば、Ｃ３は、−（（ＣＨ２）２Ｏ）３−ＯＰ（Ｏ−）（＝Ｏ）Ｏ−である。
【図７】図７は、１０個の分子タグの式を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、フリーのアミンまたはビオチンのいずれかを有する結合化合物に結合され得る、ＮＨＳエステル形態またはビオチン化形態の分子タグの式を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、フリーのアミンまたはビオチンのいずれかを有する結合化合物に結合され得る、ＮＨＳエステル形態またはビオチン化形態の分子タグの式を示す。
【図８Ｃ】図８Ｃは、フリーのアミンまたはビオチンのいずれかを有する結合化合物に結合され得る、ＮＨＳエステル形態またはビオチン化形態の分子タグの式を示す。
【図８Ｄ】図８Ｄは、フリーのアミンまたはビオチンのいずれかを有する結合化合物に結合され得る、ＮＨＳエステル形態またはビオチン化形態の分子タグの式を示す。
【図８Ｅ】図８Ｅは、フリーのアミンまたはビオチンのいずれかを有する結合化合物に結合され得る、ＮＨＳエステル形態またはビオチン化形態の分子タグの式を示す。
【図８Ｆ】図８Ｆは、フリーのアミンまたはビオチンのいずれかを有する結合化合物に結合され得る、ＮＨＳエステル形態またはビオチン化形態の分子タグの式を示す。
【図８Ｇ】図８Ｇは、フリーのアミンまたはビオチンのいずれかを有する結合化合物に結合され得る、ＮＨＳエステル形態またはビオチン化形態の分子タグの式を示す。
【図８Ｈ】図８Ｈは、フリーのアミンまたはビオチンのいずれかを有する結合化合物に結合され得る、ＮＨＳエステル形態またはビオチン化形態の分子タグの式を示す。
【図８Ｉ】図８Ｉは、フリーのアミンまたはビオチンのいずれかを有する結合化合物に結合され得る、ＮＨＳエステル形態またはビオチン化形態の分子タグの式を示す。
【図８Ｊ】図８Ｊは、フリーのアミンまたはビオチンのいずれかを有する結合化合物に結合され得る、ＮＨＳエステル形態またはビオチン化形態の分子タグの式を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、酸化不安定性の結合および、１重項の酸素によって媒介されるそれぞれの切断反応を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、酸化不安定性の結合および、１重項の酸素によって媒介されるそれぞれの切断反応を示す。
【図９Ｃ】図９Ｃは、酸化不安定性の結合および、１重項の酸素によって媒介されるそれぞれの切断反応を示す。
【図９Ｄ】図９Ｄは、酸化不安定性の結合および、１重項の酸素によって媒介されるそれぞれの切断反応を示す。
【図９Ｅ】図９Ｅは、酸化不安定性の結合および、１重項の酸素によって媒介されるそれぞれの切断反応を示す。
【図９Ｆ】図９Ｆは、酸化不安定性の結合および、１重項の酸素によって媒介されるそれぞれの切断反応を示す。
【図１０】図１０は、微小流体キャビラリー電気泳動（ＣＥ）デバイスを使用する、本発明の方法の実施における工程を示す。
【図１１】図１１は、分子タグおよび結合した分析物に従って、同定されたピークを示す電気泳動図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図２Ｊ】
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【図２Ｋ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図８Ｉ】
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【図８Ｊ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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