(57)【要約】  質量分析計と共に使用するのに適したプレートであって、前記プレートの表面部分に多数の標的スポットが配列されており、流体が逃げることなしに、又は、同じプレートの別の標的面にデポジットされた流体と混ざり合うことなしに、前記標的スポットに少量の流体をデポジットすることを可能にする、プレート。前記プレートの基材がレセプタクルの壁を構成するように前記プレートの表面部分に配置された標的面において、前記レセプタクルの形状、サイズ、温度及び可能な作用物質が、試料分子が懸濁される溶液の蒸発を助成することを特徴とする。実施態様は、前記スポットに配置された種々異なるタイプのマトリックス及び酵素、並びにMALDI分析を効率的に増強する方法を含む。
2005513490.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
質量分析計と共に使用するのに適したプレートであって、前記プレートの表面部分に多数のバイアル及び/又は標的スポットが配列されており、流体が逃げることなしに、又は、同じプレートの別の標的面にデポジットされた流体と混ざり合うことなしに、前記標的スポットに少量の流体をデポジットすることを可能にすることを特徴とする、前記プレート。
【請求項２】
質量分析計と共に使用可能なプレートであって、該プレートが実質的に平らな表面を有しており、該平らな表面上の第1標的スポット上に第1の少量の流体をデポジットして、この際に表面張力が前記流体が逃げるのを防止するか、又は、前記流体が、該第1標的スポットから800μm未満の所定の間隔を置いた第2標的スポット上にデポジットされた第2の量の流体と混ざり合うのを防止するのが可能であることを特徴とする、前記プレート。
【請求項３】
前記標的面が前記プレートの表面部分に、前記プレートの基材がレセプタクルの壁を構成するように配置されており、前記レセプタクルの形状、サイズ及び温度が、試料分子が懸濁される溶液の蒸発を助成する、請求項1に記載のプレート。
【請求項４】
標的スポットの直径及び面積が、商業的に入手可能なMALDIレーザーのレーザー・ビームの有効横断面積と適合するように形成されている、請求項1に記載のプレート。
【請求項５】
該スポットの直径が約10〜400μmである、請求項1に記載のプレート。
【請求項６】
該スポットの直径が300〜400μmの近傍にあって、ほぼ3:1から4:1の範囲までの関係を成して該スポットの直径がMALDIレーザー・ビームの直径に適合している、請求項1に記載のプレート。
【請求項７】
前記形状及びサイズが下記制限：
-上から見た場合、前記レセプタクルが矩形の形状であること；
-該スポットが直方体の形状を含むこと
を確立している、請求項3に記載のプレート。
【請求項８】
レセプタクルの前記形状が丸みを付けられた横断面プロフィールを含む、請求項3に記載のプレート。
【請求項９】
前記それぞれの標的スポット上に1又は2種以上の作用物質をデポジットすることが可能であり、前記作用物質が、マトリックス、酵素、高度に選択的な生体マクロ分子親和性バインダー、又はこれらの混合物であり、同じ試料の異なる部分に異なる作用物質を施すことにより、その結果得られた僅かに異なるスペクトルから生じた情報を、MALDIを用いた後続の分析が利用することができる、請求項1又は3に記載のプレート。
【請求項１０】
前記作用物質が消化酵素を含み、タンパク質の寸法が小さく、温度が制御されており、そして濃度が高いため、酵素反応が平衡状態に達した後で、高濃度のペプチドが形成されるようになっている、請求項3に記載のプレート。
【請求項１１】
前記プレートが標的手段を含み、該標的手段が前記プレートを、ディスペンサーから分配された試料液滴を受容するのに特に好適にする、請求項1〜3のいずれか1項に記載のプレート。
【請求項１２】
前記ディスペンサーがディスペンサー・アレイ又はアレイ・ディスペンサーであることにより、アレイの同時のデポジションが、試料スポット間の試験変動の低減を可能にする、請求項11に記載のプレート。
【請求項１３】
前記プレートが標的手段を含み、該標的手段が前記プレートを、アレイ・ディスペンサーから分配された試料液滴を受容するのに特に好適にする、請求項1〜3のいずれか1項に記載のプレート。
【請求項１４】
前記プレートが、同じ試料の異なる部分を受容するように、スポット/レセプタクルに配置された種々異なるマトリックスを含むことにより、その結果得られた僅かに異なるスペクトログラムから生じた情報を、MALDIによる後続の分析が利用することができる、請求項3又は9に記載のプレート。
【請求項１５】
前記プレートが、同じ試料の異なる部分を受容するように、スポット/レセプタクルに配置された種々異なる酵素を含むことにより、その結果得られた異なるスペクトログラムから生じた情報を、検索されたタンパク質に対応するスペクトログラムの認識のために、MALDIによる後続の分析が利用することができる、請求項3又は10に記載のプレート。
【請求項１６】
前記プレートが使い捨てできるように構成されている、請求項3又は10に記載のプレート。
【請求項１７】
請求項1又は2に記載のプレートの調製方法であって、
-前記スポットの1つに、基質/溶液を含有する第1容積のタンパク質を塗布するステップと、
-前記溶液を蒸発させるステップと、
-酵素開裂ステップとを含み、前記塗布が第1濃度のタンパク質を生じさせ、そして、酵素の存在により所定の濃度のペプチドを生じさせ、溶液/流体の急速な蒸発により、該第1濃度のタンパク質よりも酵素開裂にとって好ましい第2濃度のタンパク質を生じさせることを特徴とする、プレートの製造方法。
【請求項１８】
標的プレート・スポット上への作用物質と検体との混合物の塗布が、該検体を先ず塗布することを含む、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
標的プレート・スポット上への作用物質と検体との混合物の塗布が、該作用物質を先ず塗布することを含む、請求項17に記載の方法。
【請求項２０】
標的プレート・スポット上への作用物質と検体との混合物の塗布が、該作用物質と検体を同時に塗布することを含む、請求項17に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は化学分析のための方法及び装置に関する。より具体的には本発明は、例えばマトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析(MALDI TOF MS)を用いた後続の分析を容易にする、少量の試料分子を調製する方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
生体分析分野において、高速で正確な装置/方法、及び、試験片容積が小さくでも正確且つ精密な分析を確立することができる装置/方法への必要性が高まっている。
【０００３】
マトリックス支援レーザー脱離(MALDI)によるイオン化を伴う質量分析は、大型分子を有する生体物質の分析のための標準的な手順として確立されている。これを目的として、飛行時間型質量分析型(TOF-MS)が通常採用されるが、フーリエ変換イオン・サイクロトロン共鳴質量分析計(FT-ICR)又は4重極イオントラップ質量分析計(略してイオントラップ)も利用されている。
【０００４】
以下、被験生体物質の分子を単に「検体分子」又は「生体分子」と呼ぶ。全ての場合において、検体分子は、水溶液中の極めて希薄な形、純粋形、又は有機溶剤との混合形で存在する。これらの分析溶液は例えば体液の場合、分析手順の要件に関して極めて複雑であり、汚染されている。
【０００５】
生体物質は、全ての生体高分子並びに前記生体高分子とその他の分子との相互作用の結果を含む。「生体高分子」はオリゴヌクレオチド(すなわちDNA又はRNAのような種々の形の遺伝物質のフラグメント)、多糖及びタンパク質(生物界の主要ビルディング・ブロック)、並びに、これらの特別な類似体及び複合体、例えばグリコタンパク質又はリポタンパク質、及び、消化酵素の作用から生じるペプチドを含む。
【０００６】
MALDIのためのマトリックス物質の選択は、検体分子のタイプに依存する。100種を上回る様々なマトリクス物質が知られており、今日知られている。マトリックス物質の仕事の1つは、検体分子を可能な限り互いに隔離し、これらを試料キャリヤ・プレートに結合し、レーザー照射中に蒸気雲を形成することにより分子を気相に転移し、そして最終的に、プロトン付加又は脱プロトンにより生体分子をイオン化し、すなわち1又は2つ以上のプロトンを付加又は除去することである。このような仕事にとって、検体分子をこれらの結晶化中にマトリックス物質の結晶内に個別に組み入れること、又は、少なくとも、結晶間の境界領域内にこれらを細かく分配することが有用であるのが判っている。この場合、検体分子を互いに分離することが重要であると考えられる。すなわち、調製されたマトリックス結晶試料中には検体分子群が放置されないことが望ましい。
【０００７】
検体及びマトリックスを付着させるための種々の手順が知られている。これらのうち最もシンプルな手順は、検体及びマトリックスの両方を含有する溶液を、清浄化された金属試料支持体上にピペットにより載置することを必要とする。溶液の液滴は、金属面(又はその酸化物層)の特定領域を湿潤する。親水性面上のこの領域のサイズは、液滴の直径よりも数倍大きい。このサイズは、金属面の親水性及びミクロ構造、並びに、液滴の特性、具体的には溶剤の特性に依存する。溶液の乾燥後、小さなマトリックス結晶から成る試料スポットが形成される。この試料スポットは、最初に湿潤された表面領域と同じサイズである。マトリックス結晶は通常、予め湿潤された領域全体にわたって均一には分配されていない。普通、マトリックスの結晶は、金属プレート上の湿潤面の内縁で成長し始める。次いでこれらの結晶は湿潤面の内部に向かって成長する。これらの結晶は、しばしば使用されるマトリックス、5-ジヒドロキシ安息香酸(DHB)又は3-ヒドロキシピコリン酸(HPA)の場合のように、細い針状の結晶を形成する。これらの結晶はしばしば、スポット内部でキャリヤ・プレートから突出する。スポットの中心は空であるか、又は微結晶で覆われていることが多いが、これらの微結晶は、MALDIイオン化には使用されない。なぜならば、これらはアルカリ塩濃度が高いからである。結晶への生体分子のローディングはまた、極めて不均一である。従って、このようなタイプのローディングは、ビデオ顕微鏡によってMALDIイオン化中に試料キャリヤ表面を観察することを必要とする。ビデオ顕微鏡は、このタイプの分析に使用される商業的に入手可能な任意の質量分析計において見出すことができる。イオン収量及び質量分解能は、試料スポットにおいて場所間で変動する。申し分のない検体イオン収量及び質量分解能を有する、試料スポット上の好適な位置を見出すことは、しばしば骨の折れるプロセスであり、経験及び試行錯誤のみに頼らざるを得ず、このことは改善の余地を残す。
【０００８】
MALDIイオン化のための最良のスポットを自動的に探索するためのアルゴリズムを備えた質量分析計用の制御プログラムがあるものの、このような手順は多くの試行及び評価を伴い、必然的に極めて時間がかかる。
【０００９】
他のローディング手順では、マトリックス物質は、溶剤液滴付着前にキャリヤ・プレート上に既に存在する。溶剤液滴はこの場合、検体分子しか含有しない。
試料キャリヤ・プレートの表面が親水性ではなく疎水性である場合、より小さな結晶集塊が形成されるが、しかし、液滴は乾燥中、制御不能な状態で移動する傾向がある。従って、結晶集塊の局在化は予測することができず、MALDIプロセス中に探さなければならない。さらに、液滴が集塊化し、ひいては試料の個々の分析を不可能にしてしまうというかなり大きなリスクがある。
【００１０】
今や数千もの生体試料分析が行われ、自動高処理量手順を必要とする状況となっている。視覚的な処理又は探索、又は自動探索でさえも、このような高処理量手順を妨げるおそれがある。
【００１１】
最近の先行技術に含まれる1手順は、その他の部分では疎水性の表面内の直径範囲100〜800μmの小さな親水性アンカー上に、局所的なサイズ規定された結晶化フィールドをもたらす(独国特許第197 54 978号明細書)。水性液滴は親水性アンカーによって固定され、これらの液滴が初めは周囲の疎溶媒性領域に載置される場合でも移動を防止される。乾燥中、液滴はアンカー上に回収され、比較的濃密な、均質に分配された結晶集塊がこれらのアンカーの正確な位置上に生じる(マトリックス物質のタイプ及び濃度如何では、単一のコンパクトな結晶性ブロックとして構成されることさえある)。検体分子のための検出限界は、湿潤面の表面積を低減することにより改善される。このように、試料調製中には、より少量の検体と共に、より希釈された溶液をもたらすことができる。このような利点は、生化学調製手順の実施を改善し、化学材料コストを低減する上で期待される。好適に調製された場合には、試料表面全体にわたる分析感度は極めて均一である。従って、イオン化プロセスに際して、好都合な部位に対する視覚的又は自動的な探索を実施する必要はなく、その代わりに、脱離レーザー光による結晶集塊への「ブラインド」照射を用いることができる。等しい感度を有する前配置スポットのこのような調製方法は、分析プロセスを加速する。
【００１２】
親水性アンカー表面上に形成される結晶集塊は、MALDI法に適したミクロ結晶性構造を示す。乾燥プロセスの速度が上昇するのに伴って、結晶構造はより微細になる。
「疎水性」面は、撥水面、すなわち水溶液による湿潤に対して抵抗性の表面と理解される。これに相応して、「親水性」面は、水によって簡単に湿潤することができる表面と理解される。「疎油性」及び「親油性」とは、それぞれ油を弾く表面、又は油によって湿潤することができる表面を意味する。水と混和できない有機溶剤は通常、このような湿潤性という意味において油性の性質を有する。すなわち、これらの有機溶剤は親油性面を湿潤することができる。これらの有機溶剤は原則として油と混和可能である。水、例えばメタノール、アセトン又はアセトニトリルと混和可能な有機溶剤は、親油性面及び親水性面の両方を純粋な状態で湿潤することができる。しかし、含水量が増加するのに伴って、親油性面の湿潤性は低減する。
【００１３】
長い間、疎水性面は常に親油性であり、そして疎油性面は常に親水性であると考えられていた。しかし、ここ数年、疎水性且つ疎油性である表面が存在することが判った。これらの表面は、ペルフルオロ化炭化水素、例えばポリテトラフルオロエチレン(PTFE)から成る平滑面を含む。このような表面は本明細書中で「疎溶媒性」と呼ばれる。これは、コロイド科学から採用された用語である。
【００１４】
最近、表面の湿潤特性又は撥液特性は、そのミクロ構造に依存することも判ってきた。この一例は、いわゆる「ロータス効果」(植物の蓮にちなんで命名)である。
【００１５】
液滴が乾燥中又はピペットによる吸引中に表面上で収縮し、湿潤された表面を低減し、サイズを低減して乾燥面を残す場合、表面は特に「疎水性」と呼ばれる(いわゆる動的疎水性)。
【００１６】
原則として、生体分子は水中に最良に溶解される。この場合、水溶性有機溶剤、例えばアルコール、アセトン又はアセトニトリルが添加されることがある。生体分子の分析溶液は、これらの調製に応じて、その他の物質、例えばグリコール、グルー状の緩衝剤、塩、酸又は塩基を含有することもある。MALDI法は、或る時にはプロトン化の妨害により、また或る時には付加物の形成により、これらの不純物の存在によって著しく混乱させられる。具体的には、アルカリイオンは、種々のサイズの検体分子と付加物を形成し、正確な質量決定を妨げる。試料調製物中のアルカリイオンの濃度、並びに、その他の不純物物質の濃度は、注意深い精製手順によって極度に低く保たれなければならない。
【００１７】
生体分子の精製及び同時富化に際しては、アフィニティ・クロマトグラフィに使用されるのと同様の、いわゆるアフィニティ吸着媒質を使用することができる。アフィニティ・クロマトグラフィの場合には、高度に生体選択的なアフィニティ吸着剤が使用されるのに対して、特定タイプの生体分子を損失することなしに、最初は未知の生体高分子混合物を精製するのに際しては、非特異的吸着剤が必要となる。これらの非特異的吸着剤は、混合物の全ての生体分子成分にできる限り同程度に結合することができる。
【００１８】
ペプチド、タンパク質又はDNA混合物に対しては、吸着剤材料のスポンジ状ミクロ球体(例えばPOROS、Applied Biosystems, Inc.の登録商標POROS)、スポンジ状吸着剤が充填されたピペット・チップ(例えばMillipore Corporationの登録商標ZIPTP)、又はC18でコーティングされた磁化球体(例えばBruker Daltonics, Inc.の製品GenoPure)が、今までのところ有用であることが判っている。これらの材料は全て強親油性であり、疎水性結合を介してペプチド又はオリゴヌクレオチドに結合する。原則として、生体分子は水性メタノール又はアセトニトリル溶液を使用して溶出することができ、溶出はpH値を変えることによりしばしば助成することができる。しかし、これらの材料による精製は手間がかかる。それというのも、この精製は付加的な材料と付加的な手順ステップとを必要とするからである。
【００１９】
親和性捕捉法は、質量分析との関連において特定の生体分子を生体特異的に選択することでも知られている。例えば米国特許第6,020,208号明細書、同第6,027,942号明細書、同第5,894,064号明細書(T.W. Hutchens及びT.-T. Yip)を参照されたい。このような生体特異的親和性吸着法は、精製にも同様に利用することができる。
米国特許出願公開第20020045270号明細書に開示された試料支持体プレートは、MALDI分析に適した強疎水性環境内に親水性アンカーを備えている。このプレートは、生体物質を精製するために、そして任意には、生体物質の親和性選択を実施するために、親水性アンカーに隣接して親和性吸着剤を有する領域を提供し、これにより、MALDI分析のために最終的に調製された、生体物質を有するマトリックス試料結晶は、親水性アンカー上に適切に局在化される。
【００２０】
Ekstroem他の論文(迅速且つ自動化されたタンパク質同定を可能にする一体化されたミクロ分析技術(Anal. Chem. 2000年1月))に示された一体化されたミクロ分析システムにおいては、所定量の試料が高密度ナノバイアルMALDI標的プレート上に駆出される。こうしてデポジットされた試料は、続いてMALDI-TOF MSによって分析され、その結果得られたペプチド・マップはデータベース検索のために使用される。
Miliotis他(Rapid Com. Mass Spect. 16, 2002,第117−126頁)による論文には、マトリックスがプリコーティングされたナノバイアルMALDI標的が記載されており、Ericsson(Ericsson D, Proteomics第1巻、2001年、第1072−1081頁)による論文には、タンパク質の標的上ナノバイアル消化が記載されている。
【発明の開示】
【００２１】
概要
本発明の目的は概ね、アレイ形式で使用するための、そして予め位置決めされた機能を備えるためのスポットを有する標的プレートを提供することである。前記プレートはまた、タンパク質配列決定及び/又はペプチド質量フィンガー・プリンティングによって2次元読み出しアルゴリズムが実施可能になるように構成されている。標的プレートは好ましくは試料のデポジションの前に既製されているのが好ましい。このことは、全ての必要な試薬及び化学物質、例えば内標準及び結晶化剤が、使用前にプレート上に標的として設けられることを意味する。標的プレート上の2次元アプローチは、同じ試料に対して例えば5つの異なる結晶化剤が使用されるように行われる。その結果、タンパク質の異なる配列が5つの種々の結晶化剤によって検出され、これにより試料中に存在するタンパク質の総配列カバレージが増大することになる。
【００２２】
これに相応する本発明の実施態様及び上記のものとは異なる本発明の実施態様は、付加的な次元を含むこともできる。この場合、例えば5つの酵素がデポジットされることになる。これらの種々の酵素は、様々な基質選択性を有することになる。その結果、最終的には、異なる開裂特異性が生じ、これによりその結果得られる酵素生成物、ペプチド組成物は異なるものになる。アレイ標的プレート性能に多様な第2次元を加えると、分析の酵素的な第1次元とは異なるこれらのペプチドは、次いで結晶化剤アレイによって分析されることになる。このことは最終的に、タンパク質配列の融通性及び分析されたタンパク質の配列カバレージを高める。本発明は、冒頭で述べた必要性を満たす。標的プレート及びその使用法、並びに、前記プレート上に所定量の試料をデポジットするための装置が提供される。この方法は、後続のMALDI-TOF分析及びデータベース検索と共に、高速で正確な分析結果を提供するように構成されている。
【００２３】
好ましい実施態様の場合、標的プレート面を有する標的プレートは、ミクロ分配装置から分配された不連続的な反復可能な少量の流体を受容するように構成されている。前記標的プレート面は、標的スポットの2次元アレイを備えている。各スポットはスポット作用物質を備えており、スポットに受容された所定量の流体が前記作用物質と相互作用できるようになっている。作用物質はマトリックス溶液を含んでよく、或いは、検体を酵素開裂するように提供された1又は2種以上の消化酵素と共にマトリックス溶液を含んでもよい。
【００２４】
ディスペンサーを制御して、制御されたペースで正しいスポットに発射し、適量の流体を各スポットに分配するように、分配制御ユニットが配置されている。温度制御ユニットが標的プレート・ヒーターに接続されている。前記ヒーターは、標的プレートに適温を提供するために設けられている。液滴が連続発射され、続いて標的スポットに衝突すると、熱は流体を蒸発させ、濃度が増大した検体分子を作用物質と一緒に残し、前記検体分子と作用物質との所期の相互作用を向上させる。
【００２５】
別の好ましい実施態様の場合、試料は分割することにより多数の部分にされる。各部分は個別のスポットに分配/発射される。個別のスポットのそれぞれは異なる作用物質、例えば異なる消化酵素又は異なるタイプのマトリックスを備えている。異なるマトリックスを有する場合、スポットは、同じ試料の異なる部分を受容するように配置される。スポットは、異なるイオン化エネルギーを有する異なるマトリックス溶液を備えているので、同じ検体に対して、すなわち同じ試料の異なる部分に対して、(僅かに)異なるスペクトログラムが得られる。これにより、検体に対する特異性を増大させることができる。
【００２６】
別の実施態様の場合、スポット上の作用物質は異なる消化酵素であってよい。質量分析計から得られた出力とマッチングするためのコンピューターは、試料中の検体を分析するためのデータベースを備えている。前記データベースは、質量分析の前に種々異なる作用物質を施された多数の既知の物質/物質部分に対応するスペクトログラムを備えている。前記コンピューターは、検体の結果に関心のある人物に、(もし存在するならば)最も信憑性の高いマッチを提示するように構成されている。
【００２７】
使い捨て可能性
本発明の実施態様は、使い捨て標的プレートを容易に提供することができる。なぜならば、本発明の実施態様は、ポリマー材料による製造コストが低いことにより、低廉であることが期待されるからである。使い捨てプレートを使用することの別の利点は、いわゆるキャリーオーバー(以前の使用に起因する汚染、洗浄/クリーニング中に全てが除去されるわけではない)、及びいわゆるメモリー効果が排除される。
【００２８】
図面
本発明のこれらの及びその他の特徴、観点及び利点は、下記の説明、添付の特許請求の範囲、添付の図面を参照することにより、一層明らかになる。
【００２９】
説明
定義
本出願及び本発明の関連において、下記の定義が当てはまる：
「注釈付け」という用語は、MALDIスポットのスペクトルが或る生体高分子に対応することを判定する行為を意味する。
「生体高分子」という用語は、例えばタンパク質、核酸及び多糖を含む物質群を意味するように意図されている。
【００３０】
「試料結晶」という用語は、MALDIスポット上のマトリックス及び試料に関与する、化学的及び物理的な反応による乾燥の結果を意味する。
「MALDIスポット」という用語は、試料結晶を受容して保持するためのMALDI標的プレートにおける領域を意味するように意図されている。
【００３１】
「マトリックス」という用語は、試料塗布前、試料塗布と同時、又は試料塗布後にMALDIスポット上に塗布される物質を意味する。この物質は、試料分子の分析の様々な局面、例えばプレートへの付着、空間内の分配、レーザー・エネルギーの吸収を助成する。
【００３２】
「スペクトル・データ」という用語は、前記スポットのレーザー脱離/イオン化中にMALDI機器で測定されたイオンの相対強度、及び質量/電荷の商を含む、試料結晶のデータを意味する。タンパク質のスペクトル・データは、純粋形のそのタンパク質だけを含有するスポットの同一MALDI分析から生じた対応データを含む。本発明は、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析(MALDI-TOF MS)の検体試料を調製するための標的プレートに関する。代わりの用語：スペクトル、フィンガープリント。
【００３３】
「ナノバイアル」という用語は、本明細書の関連においては好ましくはMALDIプレート上に設けられた小型バイアルを意味するように意図されており、好ましくはMALDIスポットを含む。
【００３４】
標的プレート
本発明の好ましい実施態様を図1に示す。標的プレート100が、前記プレートに規則的に配列された多数のナノバイアル110,111,112などを備えている。各バイアル110, 110などは壁140と底面又はスポット150とを備えている。別の実施態様は、他の形状、例えば円形又は丸みを付けられたバイアル160を含み、これらのバイアルは、深さ100μm以下、好ましくは50μm以下の傾斜した又は楕円形の壁を含み、これにより、今日使用されるMALDIレーザー・ビームの特性に適合する。バイアルがこれよりも深いと、MALDI-TOF質量分解能に不都合な影響を与えるおそれがある。
【００３５】
スポットのサイズ及び配列
有利な実施態様の場合、前記壁は、幅300μmおよび高さ50μm以下となるように構成され、最大深さ50μmのバイアルを提供し、スポット150にほぼ300μm x 300μmの面積を与える。この面積は、商業的に入手可能なMALDIレーザーのレーザー・ビームの有効横断面積と適合するように形成され、これによりスポットの面積はレーザー・ビームの横断面積の25〜400%の範囲内にあることになる。
【００３６】
スポットは好ましくは2次元アレイとして配列され、スポット中心間の距離は、MALDI質量分析において使用される商業的に入手可能な高密度プレートの対応尺度と一致するように適合されている。これらのスポット間の中心間距離にはまた、好ましくは、アレイ・ディスペンサー又はディスペンサー・アレイのディスペンサー・ノズルの中心間距離が対応するようになっている。
【００３７】
バイアルを有さない平らな表面プレート
別の好ましい実施態様は、バイアル又はいかなる種類の凹部をも有さない、実質的に平らなプレートを含む。その代わりに、このプレートは基準点を備えている。これらの基準点はコーナー及び/又はエッジを含み、これにより適正な塗布を容易にし、プレートの正しい領域で分子を処理して測定する。検体及び/又はその他の物質/流体は、表面張力及び/又は改質された表面によって正しいスポットに保持されるので、例えば中心間の距離が800μmであっても、隣り合う2つのスポット上の隣り合う2つの流体量が混ざり合うことはない。
【００３８】
プレート・スポットに作用物質を提供する方法
プレート・スポットに作用物質を提供する方法は、商業的に入手可能なものを用いることができる。別の実施態様の場合、標的プレートの作用物質の小さな液滴を分配、すなわち発射するためにミクロ・ディスペンサーを使用し、これにより標的プレートに所望の作用物質又は複数の作用物質のパターンを提供する。
【００３９】
プレートの使用
図2に示すように、試料の分析のために標的プレート100を使用する方法の1実施態様は下記ステップを含む：
-標的プレート・スポット150に、1つのMALDI-マトリックス溶液又は種々異なるMALDI-マトリックス溶液のパターンをローディングし、すなわち各スポット上にマトリックス薄層をデポジットするステップ(210)。MALDI-マトリックス溶液は、i)エネルギーを吸収し、そしてレーザー照射中に過剰のエネルギーから検体を保護するように、すなわち検体の分解を防止するように配置される。MALDI-マトリックス溶液はまた、ii)マトリックス分子の光励起又は光イオン化によって、続いて検体分子にプロトンを転移することによって、検体のイオン形成を増強するように配置され、そして、iii)前記マトリックスはまた、マトリックス内に試料を希釈し、これにより検体分子の会合を防止するように配置される。
【００４０】
-(任意のステップ)標的プレート・スポットに何もローディングしないか、1つの消化酵素をローディングするか、又は好ましくは種々異なる消化酵素のパターンをローディングするステップ(215)。
-前記ローディングされた標的プレート・スポット上に検体溶液を分配するステップ(220)。
【００４１】
-各スポット内で検体とマトリックス又はマトリックス/酵素溶液との混合を助成するステップ(230)。(このステップは液滴の分配を用いたときに、室温で自然発生し、配列されたミクロ・フォーマットで混合速度が高められる)。
【００４２】
-前記混合物を乾燥させ、溶液を蒸発させておき、標的プレートの各スポット上で結晶性コーティングを形成するステップ(240)。
【００４３】
標的プレートにMALDI-TOF MS分析を施し、続いて、プレート上の各スポットに関して、m/zに対する強度のグラフ、すなわち質量スペクトログラムを得るステップ(250)(検体のイオンに関するm=質量、z=電荷)。
【００４４】
-既知のスペクトルのデータベースに対して各スペクトルをマッチングするステップ(260)。
-信憑性の高いマッチを提示するステップ(270)。
【００４５】
好ましくは、分配ステップ220、助成ステップ230及び乾燥/溶液蒸発ステップ240は、第1濃度のタンパク質を生じさせ、また酵素の存在によって所定の濃度のペプチドを生じさせる基質/溶液を含有する第1容積のタンパク質が、溶液/流体の蒸発により、第1濃度のタンパク質よりも酵素開裂にとって好ましい第2の濃度のタンパク質を生じさせるように構成されている。酵素反応速度論のミカエリス-メンテン等式を参照されたい。
【００４６】
分配220は、1つの又は好ましくは多数のディスペンサー・ノズルを有するミクロ・ディスペンサーを使用して実施されるのが好ましい。多数のノズルを有することにより、所定量の同じ又は異なる試料を同時に、すなわち並列に分配することが可能になる。
ディスペンサーの作用は、この作用を検体流と同期する制御ユニットによって制御される。次のスポット列がディスペンサー・ノズルの前面(下側)に配置されるような標的プレートのステップ状の動作も、ディスペンサー・アレイの作用と同期される。
【００４７】
液滴の分配は、溶離液の蒸発と調和するように行われるので、スポット上にデポジットされる検体、例えばタンパク質の量は、同じスポット上により多くの液滴を分配することにより、時間とともに増大させることができる。蒸発は、所定の温度で小さな容積で行われて、蒸発が急速に実施されるように、すなわちデポジットされた溶液のほとんどが数秒で蒸発するようになっている。
【００４８】
好ましい実施態様において、スポットは酵素を備えている。タンパク質の寸法が小さく、温度が制御されており、そして濃度が高いため、酵素は前記タンパク質を消化して、高濃度のペプチドを形成する。例えば質量分析によって更なる化学分析を実施する場合には、高濃度のペプチドが好ましい。
これに関連して、この装置を使用して、全体的な発現研究及び集束された発現研究の双方を実施することが可能である。
【００４９】
活性化された生体機能面
活性化された生体機能面の場合、MALDI分析の前に付加的な洗浄ステップ235が実施される。
【００５０】
標的プレート・バイアルの表面改質
プレートの好ましい実施態様の場合、親水性化学改質、疎水性化学改質、金属親和性塗被化学改質、抗体生化学改質、抗原生化学改質、ペプチド生化学改質、捕捉生体マクロ分子改質を含む群に由来する1又は2つ以上の方法を利用して、バイアル/スポットが改質される。
【００５１】
材料
装置はケイ素、ガラス又はポリマー材料で製造されるのが好ましい。室温又は室温近くでタンパク質混合物を取扱う場合には、ケイ素は事実上不活性である。この材料は、マイクロマシン技術、例えば確立されているエッチング技術による材料部分のエッチング除去にも極めて適している。
【００５２】
別の利点は、前記エッチング技術を用いれば、寸法が極めて正確になることであり、マイクロメーターよりも遥かに良好な精度で表面をエッチングすることが可能である。
装置には任意には、金又はその他の高導電性材料をコーティングして、これにより電荷を導出することができる。或いは、1又は2種以上の導電性ポリマーを使用することができる。
【００５３】
プレート、MALDI装置、及び対応スペクトル・データベース及び検索アルゴリズムを使用した、改善された分析の方法
標的プレート上にアレイ形式で配列された、富化された検体分子を有するスポットは、単次元実行(シンプルなアレイ形式)を用いて、MALDI質量分析計で分析される。この分析は、化学物質(マトリックス、酵素)のアレイがスクリーニングされることを意味する。
【００５４】
図3に示すように、MALDI装置内の試料の位置決めはA01、A02などから実行される。進行中の分析と同時に、リアルタイム・データベース検索が実施される。この検索において、タンパク質の同一性が、結果として生じたスペクトルと比較することにより問い合わされる。前記スペクトルは、組み入れられたペプチドに関する相対強度及び質量/電荷を含む。ペプチド配列の自動検索は、マップとも呼ばれるデータベースを検索することにより達成される。このデータベースは事前にコンパイルされている。
【００５５】
また、位置A01から、リアルタイム同定が実施される。スポットは、MALDIスポット内に存在し得る複数のタンパク質に関して分析される。このようなリアルタイム同定は、有意なヒットとして同定されたタンパク質に属するペプチド質量/スペクトル・データを差し引くことにより行われ、そして第2のパス検索を実施する。この第2のパス検索において、リアルタイムで進行するイオン化が、位置A01上にレーザーパルス照射することによって行われる。この場合付加的なペプチドが試料結晶スポットからイオン化される。第2のタンパク質の同一性が確認されると、全く同じスポット位置A01上で装置により第3パス検索が行われ、第1タンパク質及び第2タンパク質に対応するペプチド質量/スペクトルを差し引く。リアルタイムで第3パスを問い合わせた後には、このようないわゆるリアルタイムMALDI標的タンパク質スクリーニング・カスケードにおいては、所与の標的プレート上に対して、機器によって自動実行により付加的なデータベース検索が実施されることはない。
【００５６】
-標的プレート上の試料1から試料2への移動
注釈付けが統計的に有意な高いスコアとして確認することができたら、そのタンパク質試料の注釈付けはリアルタイムで確認され、機器はMALDI試料プレート上の分析位置(スポット)A02に切り換わる。
【００５７】
最初に全ての試料は第1次元(「左から右へ」、A01, A02, A03など)スクリーニングにおいて、種々異なる化学物質(マトリックス)によって処理され、これにより、多数のタンパク質結晶化プロセスを発生させ、これにより、結晶は様々な物理・化学特性を有するようになり、これらの特性は結晶に種々異なるイオン化特性を与える。これにより試料中に存在する特定のペプチドはこれらの最適なイオン化特性及び飛行時間特性を見出す。
【００５８】
存在するタンパク質試料のレベルが低い場合には、アレイの第2次元(延長アレイ形式)が開始される。この場合、指定されたタンパク質試料を消化するのに、種々異なる酵素が使用されている。このことは、試料位置B01に続いてB02などが分析されることを意味する。これらの試料位置は第1の化学物質(B01)、第2の化学物質(B02)などを保持することになる。予め位置決めされたタンパク質試料スポットを有する標的プレートを通して同じ自動実行スクリーニングを行い、続いて、統計的に有意なタンパク質が同定されるまで、MALDI機器によって発生させられたペプチド質量全てに対してリアルタイム・データベース検索を実施する。
【００５９】
所与のタンパク質配列が実現されたら、処理中の自動フィードバック・ループ機能がアレイ内のスクリーニングを停止する。タンパク質配列に対する要件は、研究のオペレーターによって決定される。
【００６０】
アレイ・ディスペンサーは、標的プレートと一緒に多数の機能で操作される；
○静モード試料アレイ・マッピング
○アレイ・マッピングの分離モード
【００６１】
静モードの場合、アレイの全てのノズル内に単一の試料を供給し、これにより、同じ試料のサブセットを標的プレート・アレイの第1次元(化学物質マトリックス)、及び、第2次元の種々の酵素の双方に分配する。
【００６２】
分離モードの場合、標的プレート上に2次元で経時的に新しいタンパク質をデポジットする。
【００６３】
ディスペンサー・アレイ又は複数のディスペンサーのアレイによって、試料液滴を分配することができるので、アレイのデポジションを同時に行うことにより、試料スポット間の試験変動が低減される。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】図1a, b, c及びdは、標的プレートを、ナノバイアルの詳細と共に、断面図を含めて示す図である。
【図２】図2は、標的プレートを使用した分析方法のフローチャートを示す図である。
【図３】図3は、マトリックス及び酵素が特定のパターンでデポジットされたMALDI標的プレートの一部を示す概略図である。
【図１】
2005513490.tif 000003
【図２】
2005513490.tif 000004
【図３】
2005513490.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】平成16年2月26日(2004.2.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
質量分析計と共に使用するのに適したプレートであって、前記プレートの表面部分に多数のバイアル及び/又は標的スポットが配列されており、流体が逃げることなしに、又は、同じプレートの別の標的面にデポジットされた流体と混ざり合うことなしに、前記標的スポットに少量の流体をデポジットすることを可能にする形式のものにおいて、前記それぞれの標的スポット上に、1つ又は2つ以上の作用物質が配置されており、前記作用物質がマトリックス、酵素又は高度に選択的な生体マクロ分子親和性バインダー又はこれらの混合物であり、前記配置が、異なる標的スポットが異なる作用物質混合物を含むように形成されており、前記混合物が様々な基質選択性を有する異なるマトリックス及び/又は異なる酵素を含むことにより、異なる開裂特異性が生じるので、結果として得られた僅かに異なるスペクトルから生じた情報を、酵素生成物に対するMALDIを用いた後続の分析が利用することができることを特徴とする、質量分析計と共に使用するのに適したプレート。
【請求項２】
前記作用物質が消化酵素を含み、塗布されたタンパク質試料の寸法が小さく、温度が制御されており、そして濃度が十分に高いため、酵素反応が平衡状態に達した後で、結果として生じた試料が高濃度のペプチドを含有することになる、請求項1に記載のプレート。
【請求項３】
前記標的面が前記プレートの表面部分に、前記プレートの基材がレセプタクルの壁を構成するように配置されており、前記レセプタクルの形状、サイズ及び温度が、試料分子が懸濁される溶液の蒸発を助成する、請求項2に記載のプレート。
【請求項４】
該スポットの直径が300〜400μmの近傍にあって、ほぼ3:1から4:1の範囲までの関係を成して該スポットの直径がMALDIレーザー・ビームの直径に適合している、請求項3に記載のプレート。
【請求項５】
前記形状及びサイズが下記制限：
-上から見た場合、前記レセプタクルが矩形の形状であること；
-該スポットが直方体の形状を含むこと
を確立している、請求項4に記載のプレート。
【請求項６】
レセプタクルの前記形状が丸みを付けられた横断面プロフィールを含む、請求項5に記載のプレート。
【請求項７】
前記プレートが標的手段を含み、該標的手段が前記プレートを、ディスペンサーから分配された試料液滴を受容するのに特に好適にする、請求項6に記載のプレート。
【請求項８】
前記ディスペンサーがディスペンサー・アレイ又はアレイ・ディスペンサーであることにより、アレイの同時のデポジションが、試料スポット間の試験変動の低減を可能にする、請求項7に記載のプレート。
【請求項９】
前記プレートが、行及び列に配列された標的スポットを含み、1行内の該標的スポットがそれぞれ同じマトリックスを備えており、異なる行内の該標的スポットが異なるマトリックスを備えている、請求項8に記載のプレート。
【請求項１０】
前記プレートが、行及び列に配列された標的スポットを含み、1列内の該標的スポットがそれぞれ同じ酵素を備えており、異なる列内の該標的スポットが異なる酵素を備えているので、一般に、同じマトリックス-酵素混合物を備えた標的スポットはない、請求項9に記載のプレート。
【請求項１１】
前記プレートが使い捨てできるように構成されている、請求項10に記載のプレート。
【請求項１２】
後続のMALDI分析のためのプレートの調製方法であって、
-マトリックスを標的スポットに分配して、1行内の該標的スポットが同じマトリックスを備えるように、また、異なる行内の該標的スポットが異なるマトリックスを備えるように配列するステップと、
-前記スポットの1つに、基質/溶液を含有する第1容積のタンパク質を塗布するステップと、
-前記溶液を蒸発させるステップと、
-酵素開裂ステップとを含み、前記塗布が第1濃度のタンパク質を生じさせ、そして、酵素の存在により所定の濃度のペプチドを生じさせ、溶液/流体の急速な蒸発により、該第1濃度のタンパク質よりも酵素開裂にとって好ましい第2濃度のタンパク質を生じさせることを特徴とする、プレートの製造方法。
【請求項１３】
さらに、
-酵素を標的スポットに分配して、1列内の該標的スポットがそれぞれ同じ酵素を備えており、異なる列内の該標的スポットが異なる酵素を備えているので、一般に、同じマトリックス-酵素混合物を備えた標的スポットはないように配列するステップを含む、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
標的プレート・スポット上への作用物質と検体との混合物の塗布が、該検体を先ず塗布することを含む、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
標的プレート・スポット上への作用物質と検体との混合物の塗布が、該作用物質を先ず塗布することを含む、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
標的プレート・スポット上への作用物質と検体との混合物の塗布が、該作用物質と検体を同時に塗布することを含む、請求項15に記載の方法。
【国際調査報告】
2005513490.tif 000006
2005513490.tif 000007
2005513490.tif 000008
2005513490.tif 000009
2005513490.tif 000010
2005513490.tif 000011