(57)【要約】  本発明は癌細胞が本明細書にて決定される程度まで１７−１Ａ抗原を過剰発現するヒト癌患者であって、抗体などの治療用１７−１Ａ抗原結合物質を用いる治療に適すると考えることのできる患者を同定する方法を提供する。好ましくは、当該治療抗体はエドレコロマブである。かかる方法に用いるためのキットおよびそのように同定された患者を治療する方法も提供される。
2005509159.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
結腸直腸癌（例えば、結腸癌）に苦しむヒト患者または不顕性癌細胞に苦しんでいると考えられるヒト患者の、当該癌または癌細胞により発現される１７−１Ａ抗原を標的とする（例えば、特異的に結合する）治療薬での処置に対する適性の測定方法であって、
（ａ）当該患者から癌性結腸直腸細胞のエクスビボ試料（例えば、切除された原発腫瘍の一部あるいは原発／二次性または転移性腫瘍の生検および／または播種性癌細胞の検出が望まれる場合には血液または骨髄試料）を得る工程；
（ｂ）１７−１Ａの当該細胞による発現を（例えば、測定することにより）評価する工程；
（ｃ）工程（ｂ）の発現と、対照となる発現レベルとを比較する工程；
（ｄ）工程（ｃ）でなされた比較が該細胞の１７−１Ａ（例えば、１７−１Ａ抗原）の過剰発現を示すかどうかを測定し、例えば、当該細胞が対照発現レベルよりも高い１７−１Ａの発現を示すこと、ここで過剰発現が適性の決定要因である、を決定する工程；
（ｅ）工程（ｄ）にて適当であると同定されたヒト患者に１７−１Ａ抗原を標的とする薬物を投与してもよい工程；
を含む、方法。
【請求項２】
１７−１Ａ抗原の発現を１７−１Ａ抗原特異的抗体と当該細胞との結合に良好な条件下でかかる結合量を測定することにより評価するところの、請求項１記載の方法。
【請求項３】
１７−１Ａ抗原特異的抗体が検出可能な部分を連結させるところの、請求項２記載の方法。
【請求項４】
その検出可能な部分が、放射性標識、蛍光標識、リン光標識、比色酵素からなる群より選択されるところの、請求項３記載の方法。
【請求項５】
１７−１Ａ抗原特異的抗体が３６２２Ｗ９４であるところの、上記したいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
濃度が２．８ｎｇ／ｍｌまたはその周辺であるところの、請求項５記載の方法。
【請求項７】
１７−１Ａ抗原特異的抗体が３６２２Ｗ９４以外であるところの、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
抗体が一の濃度、すなわち、結合に良好な同じ条件下、２．８ｎｇ／ｍｌの濃度で３６２２Ｗ９４で達成される結合度と実質的に均等な結合度を提供する濃度で存在するところの、請求項８記載の方法。
【請求項９】
工程（ｄ）にて適当であると同定された患者に、１７−１Ａ抗原と特異的に結合する治療抗体を投与するところの、上記したいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
治療抗体がエドレコロマブであるところの、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
結腸直腸癌、播種性癌細胞に苦しむヒト患者または不顕性癌細胞に苦しんでいると考えられるヒト患者を治療する方法であって、
（ａ）請求項１の工程（ａ）ないし（ｄ）を行って、当該患者が１７−１Ａ抗原を特異的に標的とする薬物での治療に適しているかどうかを決定し、
（ｂ）適すると判断された患者に治療上有効量の当該薬物を投与することを含む、方法。
【請求項１２】
薬物が抗体であるところの、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
抗体がヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体またはＣＤＲグラフト化抗体であるところの、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
抗体がＩｇＧ抗体であるところの、請求項１２または１３記載の方法。
【請求項１５】
抗体がエドレコロマブであるところの、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法に用いるための部材のキットであって、検出可能な部分を結合させた１７−１Ａと特異的に結合する抗体と、１７−１Ａ抗原を過剰に発現する試料と発現しない試料との間で差異があるようにする抗体の濃度で癌細胞のエクスビボ試料による１７−１Ａ抗原の発現レベルを測定するための説明書とを含む、キット。
【請求項１７】
さらに、治療用１７−１Ａ抗原特異的結合剤を含む、請求項１６記載のキット。
【請求項１８】
結腸直腸癌、播種性癌細胞に苦しむヒト患者または不顕性癌細胞に苦しんでいると考えられるヒト患者であり、５−フルロウラシル投与の癌療法に応答しないかまたは一部応答する患者、あるいは当該癌療法に応答しないか一部応答すると考えられる患者を治療する方法であって、
（ａ）請求項１の工程（ａ）ないし（ｄ）を行って、当該患者が１７−１Ａ抗原を特異的に標的とする薬物での治療に適しているかどうかを測定する工程；
（ｂ）適すると判断された患者に治療上有効量の当該薬物を投与する工程
を含む、方法。
【請求項１９】
癌に苦しんでいるヒト患者であり、癌を治療するための１またはそれ以上の治療薬（例えば、化学治療薬）に応答しないかまたは一部応答する患者、あるいは当該治療薬に応答しないか一部応答すると考えられる患者を治療する方法であって、
（ａ）請求項１の工程（ａ）ないし（ｄ）を行って、当該患者が１７−１Ａ抗体を特異的に標的とする薬物での治療に適しているかどうかを決定する工程；
（ｂ）適すると判断された患者に治療上有効量の１７−１Ａ抗原を特異的に標的とする薬物を投与する工程
を含む、方法。
【請求項２０】
患者が、結腸癌、結腸直腸癌、乳癌、胃癌、食道癌、前立腺癌、肺癌、膵臓癌および卵巣腸からなる群より選択される癌に苦しんでいるところの、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
癌に苦しむヒト患者の、当該癌により発現される１７−１Ａ抗原を標的とする（例えば、特異的に結合する）治療薬での治療の適性の測定方法であって、
（ａ）患者から癌性結腸直腸細胞のエクスビボ試料（例えば、切除された原発腫瘍の一部あるいは原発／二次性または転移性腫瘍の生検および／または播種性癌細胞の検出が望まれる場合には血液または骨髄試料）を得る工程；
（ｂ）１７−１Ａの当該細胞による発現を（例えば、測定することにより）評価する工程；
（ｃ）工程（ｂ）の発現と、対照となる発現レベルとを比較する工程；
（ｄ）工程（ｃ）でなされた比較が該細胞の１７−１Ａ（例えば、１７−１Ａ抗原）の過剰発現を示すかどうかを測定し、例えば、当該細胞が対照発現レベルよりも高い１７−１Ａの発現を示すこと、ここで過剰発現が適性の決定要因である、を決定する工程；
（ｅ）工程（ｄ）にて適当であると判断されたヒト患者に１７−１Ａ抗原を標的とする薬物を投与してもよい工程；を含み、
当該癌が、結腸直腸癌、乳癌、胃癌、食道癌、前立腺癌、肺癌、膵臓癌および卵巣腸からなる群より選択されるところの、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全体として、広汎性結腸癌に罹患した患者の集団よりも、１７−１Ａ抗原を標的とする治療で有益となる可能性の高い、結腸癌に苦しんでいる個々のヒト患者を同定する方法に関する。特に、原発腫瘍の摘出術後に播種性／不顕性癌細胞に苦しんでいると考えられる患者の、医学療法、予測用キットおよび治療用キットも提供される。本発明の他の態様、目的および利点は以下の記載より明らかとなるであろう。
【背景技術】
【０００２】
大腸癌は、欧州およびアメリカ合衆国において、第２または第３位の癌の関連する一般的な死因である。結腸直腸癌の発症率は世界的に大きく変化し、アメリカ合衆国および英国（年間１０万人当たり１５−４５人）と比べて、インド（年間１０万人当たり１−２人）などの発展途上国ではずっと低い（Ｐａｒｋｉｎら、１９９２）。
結腸および直腸癌は、一般に、腸壁への浸潤の深さ、リンパ節の関与および遠隔転移を含む、デュークス段階（Ｄｕｋｅｓ  ｓｔａｇｅ）により定義される。デュークス段階Ａの細胞癌は腸壁に浸潤するが、固有筋層を越えて広がっているものではなく、デュークス段階Ｂの細胞癌は固有筋層を越えて浸潤するが、リンパ節は影響を受けておらず、デュークス段階Ｃの細胞癌はリンパ節に影響を及ぼしている。その後、段階Ｄが肝転移の患者を分類するのに導入された（Ｄｕｋｅｓ  １９３２；Ｔｕｒｎｂｕｌｌら、１９６７）。
【０００３】
デュークス段階Ｄの腫瘍は、可能であるならば、腫瘍の摘出または減量のための手術を行い、つづいて化学療法により再発または疾患の進行速度を減少させる。最近の化学療法は、典型的には、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）を用いる処理で構成される。初期段階の疾患は潜在的に治癒可能である手術で処理される。しかし、再発が手術の際に存在する不顕性転移、手術の際の細胞（微小転移巣）の分散または局所的残存病変により惹起されうる。転移性拡散は肝臓にて優先的に起こる。転移性拡散が原発腫瘍を切除した２年以内に起こる場合には、これらのケースの多くにおいて、術前評価にて不顕的であるが、転移巣が手術の時点で既に存在していると考えられる（Ｆｉｎｌａｙ＆ＭｃＡｒｄｌｅ、１９８３）。腫瘍細胞は手術の時点で門脈循環にて検出されうることが明らかにされており（Ｆｉｓｈｅｒ＆Ｔｕｒｎｂｕｌｌ、１９５５）、このことが治療的手術の後約２年またはそれ以上の期間肝転移巣の成長する原因かもしれない。静脈系に流入した腫瘍細胞の大部分は破壊されるが、いくつかは生き延びて転移巣を形成しうる。
【０００４】
外見的に治癒的切除された患者であっても再発に苦しむことが多いため、特に最も危険性が高いと考えられるデュークス段階Ｃの疾患では、アジュバント処置を施すことが多い。施される処理は、通常、５ＦＵを基礎とする化学療法である。その療法で生存率がある程度改善されるが、すべての患者で効果的というものではない。というのも、転移性腫瘍細胞においては休眠細胞が優勢だからである。このため、休眠腫瘍細胞を根絶させることのできる別のアジュバント処理も結腸直腸癌治療において重要な役割がある。
【０００５】
５ＦＵを基礎とする化学療法は、白血球減少、嘔気、嘔吐、下痢、口内炎を含む毒性と関係することが多く、稀に命取りとなる。化学療法は個々の患者でその効能が異なり、有意な副作用があるため、化学療法が最大の利益をもたらすであろう患者、その全体としての利益が毒性を上回る患者を同定することが理想的であろう。さらに、不必要な毒性を回避できるように、可能であるならば、別の治療法を用いることができるように、利益がほとんどまたは全くない患者を同定することも可能であろう。このことは患者の介護において有意な改善を示すである。
【０００６】
エドレコロマブ（Ｅｄｒｅｃｏｌｏｍａｂ）（ＰａｎｏｒｅｘＴＭ、またＡｄｊｕｑｕａｌＴＭ）は、１７−１Ａ抗原として知られているヒト上皮細胞分子を対象とするＩｇＧ２ａネズミモノクローナル抗体である。当該分子はまた、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＰ４０、ＧＡ７３３−２、ＫＳＡ、４０ｋＤ抗原およびＥＳＡなどの別名でも知られている。当該分子は数種の腫瘍の上皮細胞ならびに正常な上皮組織上で発現され、細胞接着工程に関与していると考えられる（Ｌｉｔｖｉｎｏｖら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１９９４、１２５、４３７−４４６；Ｌｉｔｖｉｎｏｖら、Ｃｅｌｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ、１９９４、２，４１７−４２８；その全内容を出典明示により本明細書の一部とし、その内容に具体的に言及するものとする）。
【０００７】
エドレコロマブはまた、文献中、Ｍａｂ  ＣＯ１７−１Ａ、Ｍａｂ  １７−１ＡおよびＰａｎｏｒｅｘＴＭ／ＡｄｊｕｑｕａｌＴＭとしても知られている。エドレコロマブ治療により１８９人のデュークス段階Ｃの結腸直腸癌患者の試験にて有意な効能のあったことが報告されている。この試験において、患者に原発腫瘍の摘出術を施し、つづいて無作為に観察試験またはエドレコロマブ治療（最初に５００ｍｇを注入し、つづいて一月に１００ｍｇの用量を４ヶ月注入する処置）を施した。７年間の追跡データから、治療によって全体の死亡率が３２％（ｐ＜０．０１）まで減少し、再発が２３％（ｐ＜０．０４）まで減少することが証明された。全生存率（ｐ＜０．０１）および無病生存率（ｐ＝０．０２）において有意な改善があった。治療は局所的再発に至るまでの時間に影響を及ぼさないため、エドレコロマブの生存効果が遠隔転移の進行を防止したことによることは明らかである（Ｒｉｅｔｈｍｕｌｌｅｒら、１９９８）。この死亡率の減少は５ＦＵを基礎とする化学療法による治療に応答して以前に見られた減少に等しいものであった（Ｍｏｅｒｔｅｌら、１９９５）。
【０００８】
エドレコロマブは、主として、抗体依存的細胞障害性（ＡＤＣＣ）を介する腫瘍細胞の撲滅を媒介すると考えられる。抗体の他のエフェクター機能がその作用機序に関係している可能性もある。これらはオプソニン化、補体の活性化または抗イディオタイプカスケードの誘発を包含する。抗体およびエフェクター細胞の腫瘍細胞とのアクセス性のため、エドレコロマブは単細胞および小細胞会合に対して最も効果的であると考えられる。このことは、レイスミュラー（Ｒｉｅｔｈｍｕｌｌｅｒ）試験にて局所的再発ではなく、遠隔転移までの時間を減少させるエドレコロマブの能力を説明するものである。免疫学的エフェクター機構は細胞循環に入る腫瘍細胞に依存していないため、エドレコロマブはまた、休眠腫瘍細胞に対して活性であると考えられる。
【０００９】
１７−１Ａ抗原を標的とする療法に対する応答を予想するのではなく、１７−１Ａ抗原の発現を予後的に評価する研究がなされた。肺および前立腺癌における試験により、たとえ前立腺癌の場合、その発現レベルが正常細胞から腫瘍細胞までの形質転換において増加すること（Ｐｏｃｚａｔｅｋ、１９９９）、そして肺癌の場合、その発現レベルが疾患の進行とともに増加すること（Ｐｉｙａｔｈｉｌａｋｅ、２０００）が認められたとしても、１７−１Ａ抗原に予後価値のないことが判明した。乳癌の患者の実験で、１７−１Ａの過剰発現が無病生存率および全生存率の減少と相関関係にあることが判明した（Ｇａｓｔｌ、２０００）。最新の文献から、１７−１Ａ抗原の発現のレベルの予後的有意性が結腸癌では測定されなかったのは明らかである。
しかし、１７−１Ａ抗原の発現の一般的予後的有意性とは異なり、１７−１Ａ抗原を標的とする療法に対する応答について１７−１Ａ抗原の発現の予測的意義を考慮した場合、異なる結果が得られる可能性がある。
【００１０】
腫瘍細胞に１７−１Ａ抗原が全く存在しないことで１７−１Ａ抗原標的療法による有用性は排除されると考えられる。しかしながら、現在においても、１７−１Ａ抗原を標的とする療法による効果を十分に受けるのにいかなるレベルの発現が必要とされるかについて何の考えもない。腫瘍における１７−１Ａ抗原の発現が１７−１Ａ抗原の発現レベルと関係しないと考えられる場合、抗−１７−１Ａ抗原を標的とする療法の治療それ自体が１７−１Ａを標的とする療法の治療からの利益を得るのに十分である（Ｐｕｎｔ  ＣＪＡら、Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ、３６０、６７１−６７７、２００２、Ｒｉｅｔｈｍｕｌｌｅｒら、１９９４）。特に当該療法の利益を享受する患者を同定する方法のないことは本発明により是正され、合理的な患者の選択方法を可能とする。
本明細書において用いられる「予後価値」等なる語は、治療を施すかどうか、またはいかなる治療が必要であるかとは別に、疾患の進行あるいは死亡の危険性のあることを意味する。反対に、本明細書で用いる「予測因子」等なる語は、個々の療法がどの程度の利益をもたらすかを意味する（Ｈａｙｅｓ  ＤＦ、１９９８、Ｂｒｅｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ、５２、３０５−３１９）。
【００１１】
１７−１Ａ抗原を標的とする療法から最も利益を受けると考えられる個々のヒト患者を同定する方法を提供することが本発明の目的である。典型的には、これらは、アポトーシスおよび／または壊死に至る癌細胞にて発現される１７−１Ａ抗原に特異的に結合するか、あるいは癌細胞を患者の免疫系に付して除菌をもたらす、薬物であろう。１７−１Ａ抗原と結合する薬物の例が、エドレコロマブおよびＭＴ２０１である（Ｎａｕｎｄｏｒｆ  Ｓら、２００２、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎ．  １００、１０１−１１０）。
本発明者らは、結腸癌細胞上での１７−１Ａ抗原の発現のレベルが、応答、すなわち、結腸癌に苦しんでいるヒト患者が１７−１Ａ抗原を標的とする治療を必要とするであろう応答の前兆であることを見いだした。したがって、本発明は１７−１Ａを標的とする療法、例えば、抗−１７−１Ａイムノグロブリンの処置の臨床的利益を享受するレベルで１７−１Ａ抗原を発現する患者を同定する手段を提供する。
【００１２】
その上、本発明は、患者が抗体などの治療用１７−１Ａ抗原結合薬での治療に適すると考えられる本明細書中で定められる程度まで癌細胞が１７−１Ａ抗原を過剰発現する癌患者を同定する方法を提供する。好ましくは、治療抗体はエドレコロマブまたはＭＴ２０１である。このような方法に用いるキットおよびそのように同定された患者の治療方法も提供される。
本明細書中に言及される先行文献はすべて出典明示により本明細書の一部とする。
【発明の詳細な説明】
【００１３】
（発明の要約）
本発明によれば、結腸癌に苦しむヒト患者または播種性および／または不顕性癌細胞に苦しんでいると考えられるヒト患者の、当該癌または癌細胞により発現される１７−１Ａ抗原を標的とする（例えば、特異的に結合する）治療薬での治療に対する適性の測定方法であって、
（ａ）当該患者から癌性結腸直腸細胞のエクスビボ試料（例えば、切除された原発腫瘍の一部あるいは原発／二次性または転移性腫瘍の生検および／または（播種性癌細胞の検出が望まれる場合の）血液または骨髄試料）を得る工程；
（ｂ）１７−１Ａの当該細胞による発現を（例えば、測定することにより）評価する工程；
（ｃ）工程（ｂ）の発現と、対照の発現レベルとを比較する工程；
（ｄ）工程（ｃ）でなされた比較により当該癌細胞が１７−１Ａ（例えば、１７−１Ａ抗原）を過剰発現するかどうかを測定し、例えば、当該細胞が対照細胞レベルよりも高い１７−１Ａの発現を示すことを測定する工程（過剰発現が適性の決定要因である）；
（ｅ）工程（ｄ）にて適切であると同定されたヒト患者に１７−１Ａ抗原を標的とする薬物を投与してもよい工程；
を含む、方法が提供される。
【００１４】
特に腫瘍摘出後の、結腸癌に苦しんでいるヒト患者または不顕性癌細胞に苦しんでいると考えられるヒト患者、前掲の方法で適当であると同定された患者を治療する方法であって、当該患者を１７−１Ａ抗原を標的とする治療剤で治療する工程を含む、方法も提供される。
不顕性癌細胞、特に結腸癌腫瘍から誘導される細胞あるいは１７−１Ａ抗原を標的とする治療に応答しうる細胞に苦しんでいると考えられるヒト患者を治療する方法であって、当該患者が本発明にかかる１７−１Ａ抗原を標的とする治療剤での処置に適当であるかどうかを同定する工程を含む、方法も提供される。
【００１５】
１７−１Ａに結合した場合に検出することのできる検出可能な部分を含む１７−１Ａ（好ましくは１７−１Ａ抗原）との結合能を有する作用剤を含むキットであって、上記したヒト患者を同定する方法を実施するための説明書を一緒に含み、所望によりそのように同定されたヒト患者を治療するための説明書を一緒に含んでもよい、キットも提供される。
本発明の別の態様によれば、本発明の方法およびキットは、１７−１Ａ抗原で指示されない他の療法からの利益を予測するために他の方法と組み合わせて用いることができる。好ましい具体例において、これらの他の療法は１７−１Ａ抗原を標的とする療法と組み合わせて用いられる。
【００１６】
（発明の詳細な記載）
「１７−１Ａ」なる語は１７−１Ａ発現のすべての態様に言及するものである。したがって、当該語はゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡおよび１７−１Ａ蛋白（以下、「１７−１Ａ」抗原という）を包含する。
「治療に適する」なる語およびその文法上の修飾語は患者が１７−１Ａ抗原を標的とする処置から利益を得るさらなる可能性があるかどうかに言及しているにすぎないことが分かるであろう。もちろん、患者が実際にかかる治療を受けるかどうかを決定するという別の考え方もあり、これらの考えは主治医の権限の範囲内である。
【００１７】
本発明にかかる治療に適する患者を同定することが、すべてのケースにてその治療が成功するであろうこと（それにより少なくともある種の臨床的利益を意味する）を示すものではないことも理解されるであろう。本発明は、結腸癌、播種性癌細胞に苦しんでいる個々のヒト患者または１７−１Ａ抗原を過剰発現する不顕性癌細胞に苦しんでいると考えられるヒト患者であって、全体としてヒト広汎性結腸直腸癌に苦しんでいる患者の集団よりも１７−１Ａ抗原を標的とする（好ましくは特異的に標的とする）治療の利益を得る可能性のある患者の同定を容易にする。もちろん、患者の年齢および一般的健康状態などの他の因子も最終結果などの臨床上の有益性に影響を及ぼす可能性がある。
【００１８】
「過剰発現」なる語は、癌細胞がヒト患者が上記した治療に適すると考えられる十分に高い程度まで１７−１Ａ抗原を発現することを意味する。
第一の例において、癌性結腸細胞の試料を腫瘍そのものから直接得るか、またはより典型的には術後に切除された原発腫瘍から得る。本発明の方法を実施するのに必要な試料の大きさは、もちろん、最終的には患者から入手できる腫瘍の量により限定される。しかしながら、一般的に言えば、必要な試料の大きさは、標準的免疫組織化学技法および組織マイクロアレイ組織化学に使用される大きさであろう。
【００１９】
１７−１Ａの発現の測定は、定性的、定量的または半定量的に行うことができる。
好ましくは、１７−１Ａ抗原発現レベルは、抗原そのものの発現レベルを検出することで測定される。別法として、それほど好ましものではないが、１７−１Ａ遺伝子のコピー数、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡなどの１７−１Ａ発現の種々の態様を測定することで、間接的に測定を行うこともできる。このような間接的方法は、もちろん、その発現と１７−１Ａ抗原の発現の間の相関性を決定する必要がある。
【００２０】
１７−１Ａ  ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡなどの発現レベルは、当業者に既知の、または自明な方法により測定することができる。例えば、レベルは、その塩基配列が１７−１Ａに特異的な１７−１Ａ遺伝子（コピー数）／ｃＤＮＡ／ｍＲＮＡの領域に相補的であり、その結果、起こるハイブリダイゼーションを１７−１Ａ発現に起因させることのできる、オリゴヌクレオチドのストリンジェントな条件下、ハイブリダイゼーションの程度を測定することで決定できる。この方法の一例が蛍光インサイチュ・ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）である。これらの目的を達成するために必要な相補的オリゴヌクレオチドの正確な長さおよび組成は当業者であれば容易に測定することができるが、８個未満では一般的でなく、８個と約５０個の長さのヌクレオチドが典型的であろう。相補的オリゴヌクレオチドを、１７−１Ａ  ＤＮＡまたはＲＮＡを含有する細胞ライゼートまたは組織切片の試料と接触させ、ハイブリダイゼーションが生じるのに十分に長い時間そのままにしておく。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、（１）低イオン強度および高温を、洗浄のために、例えば、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを５０℃で用いること；（２）ハイブリダイゼーションの間、ホルムアミドなどの変性剤、例えば、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）を含む５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドを４２℃で用いること；または（３）５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハート溶液、超音波切断のサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳおよび１０％硫酸デキストラン、４２℃を用い、４２℃で０．２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）および５５℃で５０％ホルムアミドで洗浄し、つづいて５５℃でＥＤＴＡ含有の０．１ｘＳＳＣからなるハイストリンジェントな洗浄条件を用いる、ことで同定することができる。また、ｍＲＮＡレベルを、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、例えば、ＴａｑｍａｎＴＭなどの当業者に周知の、あるいは明らかな方法に従って増幅させてもよい。ＴＲ−ＰＣＲ法は定量的であってもよい。
【００２１】
１７−１遺伝子のエクソンおよび隣接領域の配列、ｍＲＮＡおよび抗原は、Ｌｉｎｎｅｎｂａｃｈ，ＡＪ．、Ｓｅｎｇ，ＢＡ．、Ｗｕ，Ｓ．、Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｓ．、Ｓｃｏｌｌｏｎ，Ｍ．、Ｐｙｒｃ，ＪＪ．、Ｄｒｕｃｋ，Ｔ．、Ｈｕｅｂｎｅｒ，Ｋ．の（１９９３）Ｒｅｔｒｏｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｇｅｎｅｓ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １３．１５０７に見いだすことができ、その内容を出典明示により本明細書の一部とする。１７−１Ａ全体のゲノム配列は、Ｇｅｎｅｂａｎｋなどのヒトゲノムデータベースをサーチすることで、受け入れ番号ＡＨ００３５７４で登録されている１７−１Ａ  ｍＲＮＡ配列であるとわかる。相補的オリゴヌクレオチドは、検出可能な部分、例えば、その検出が測定可能である、放射性標識と結合していることが好ましい。サザンおよびノーザンブロット法を、各々、ＤＮＡおよびＲＮＡの検出に用いることもできる。
【００２２】
しかしながら、１７−１Ａ抗原の発現のレベルを評価、例えば、測定することが好ましい。当業者に利用できる方法も多数ある。例えば、周知であって慣用的に用いられる方法によりウェスタンブロット法を利用することができる。免疫組織化学を用い、それにより１７−１Ａ抗原を検出し、１７−１Ａ特異的結合剤、例えば、放射性標識または蛍光標識あるいは比色反応に用いる酵素とカップリングする検出可能な部分を有する抗−１７−１Ａ抗体を用いて、その癌細胞上での発現を測定することが好ましい。この抗体は１７−１Ａ抗原と直接結合してもよく、あるいはまたそれ自体が１７−１Ａ抗原と結合する別の抗体と結合してもよい。抗−１７−１Ａ抗体は１７−１Ａ蛋白配列および／またはその糖鎖形成に対向するものである。このような技法は免疫組織化学の分野では標準的なものである。一般的に言えば、切除された原発腫瘍から癌細胞の試料を得、ホルマリンで固定し、パラフィンワックスに包埋するのが典型的である。ついで、１７−１Ａ抗体を細胞と一緒にインキュベートし、１７−１Ａ抗体と細胞の試料との結合度を当該分野にて標準的な方法で測定する。典型的には、ミクロトームを用いてホルマリン固定し、パラフィン包埋した試料から組織切片を切り取る。それらをガラススライド上に集め、乾燥させ、キシレンに入れてワックスを除去し、等級アルコールないし水に通すことで再水和させる。できれば、トリプシン溶液またはクエン酸バッファーを用い、超音波または高圧と組み合わせる、抗原修正法を適用してもよい。洗浄工程に付して、ペルオキシダーゼおよびビオチンなどの内因性分子を遮断することもできる。ついで、組織の切片を、検出される抗原に典型的には特異的である、一次抗体に暴露する。洗浄後、組織の切片を、一次抗体と特異的に結合し、種々の方法を用いて検出することのできる、二次抗体に暴露するのが一般的である。これらの方法は、ペルオキシダーゼをベースとする、および／またはアルカリ性ホスファターゼをベースとするものが多く、一次抗体が細胞に結合している部位にて比色変化を生じさせる。ついで、切片をヘモトキリンまたは他の核もしくは細胞質色素で染色し、その組織の試験を容易にすることができる。ついで、染色および染色の程度は光学顕微鏡を用いて、あるいはコンピューターを用いる画像解析により評価することができる。
【００２３】
しかしながら、単に１７−１Ａ抗原について免疫組織化学を行えるというだけで、治療に適する患者を選択することができるものではない。例えば、本明細書にて示される抗−１７−１Ａ抗体（３６２２Ｗ９４）を２．８μｇ／ｍｌの濃度で用いると、試験した腫瘍試料の９９％より多くが結合を示す。「結合を示す」なる語およびその文法的修飾語は、抗体の結合が、少なくとも４倍に拡大して、好ましくは少なくとも２０または４０倍に拡大して視覚的にヒトの眼で検出可能なことを意味する。
【００２４】
この一貫した記述とは反対に、本発明者らは、適当な免疫組織化学条件を用いると、１７−１Ａ抗原を標的とする治療薬がその臨床的効果にて特に有効である、特定の下位の一群のヒト患者を同定することができることを見いだした。例えば、本明細書に記載の一バッチの検出抗体３６２２Ｗ９４をおよそ２．８ｎｇの濃度で１７−１Ａ抗原についての免疫組織化学に利用すると、ヒト結腸癌の集団を、集団全体の４４％からなる一群を治療に適すると、そして集団の５６％からなるもう一つ別の群をかかる治療がさほど適切でないと、ランク付けることが可能である。免疫組織化学法の個々の態様および利用条件が１７−１Ａ検出抗体の有用な濃度の決定に寄与するのは明らかであろう。例えば、抗原修正条件の選択、検出／可視化方法の選択（例えば、画像解析を行う装置）、実験に用いられる試薬の特定のバッチの活性／アフィニティが挙げられる。したがって、本明細書にて具体的に示されている個々の方法を修飾することで、利用される検出抗体／試薬の有用な濃度を修飾することができる。一般的に言えば、有用な濃度は約１．４ｎｇ／ｍｌないし１４ｎｇ／ｍｌの範囲内にある。
【００２５】
１７−１Ａ抗原を検出するのに３６２２Ｗ９４抗体または他の抗体について正確に２．８ｎｇ／ｍｌの濃度を用いることが本発明を実施するのに絶対的に必要なわけではない。２．８ｎｇ／ｍｌの数値は３６２２Ｗ９４に、さらに言えば特定のバッチの３６２２Ｗ９４に言及するものである。数値はバッチ間で変動が生じることを考慮する必要があり、このことを前提として染色方法の適当な再検定を行うことが必要である。さらには、３６２２Ｗ９４以外の抗−１７１Ａ抗体についての必須の濃度を測定する方法は、３６２２Ｗ９４と同じ結果を得るために、同様に染色方法を必要とする。これらを行う方法は以下の実施例１０に記載されている。
【００２６】
このように、１７−１Ａ抗原結合剤での処理に適するとされる、結腸直腸癌に苦しんでいるおよび／または不顕性癌細胞に苦しんでいると考えられるヒト患者を同定する方法であって；
（ａ）不顕性癌細胞を含んでいる結腸腫瘍または含んでいると考えられる体組織または体液のエクスビボ試料を得る工程；
（ｂ）工程（ａ）の試料を、結合について好ましい条件下、２．８ｎｇ／ｍｌまたはその付近の抗体の濃度で、３６２２Ｗ９４抗体の溶液と接触させる工程；
（ｃ）工程（ｂ）の抗体の結合を検定する工程（ここで、抗体が結合することは当該患者が適していることを示す）、
（ｄ）工程（ｃ）にて同定された患者を１７１Ａ抗原に結合する治療薬を用いて治療してもよい工程
を含む方法が提供される。
【００２７】
上記した工程（ｂ）は、別に、３６２２Ｗ９４以外の抗１７−１Ａ抗体を、同じ条件下で３６２２Ｗ９４と実質的に同程度の結合を付与する濃度で用いてもよい。すなわち、３６２２Ｗ９４と同じ程度の結合を付与するのに必要な１７−１Ａ抗体の濃度は、３６２２Ｗ９４で観察されるのと同じまたは同じぐらいの結合の程度が得られるまで、１７−１Ａ抗体の濃度を滴定することで簡単に得ることができる。
治療剤は、好ましくは、１７−１Ａ抗体などの抗−１７−１Ａイムノグロブリンであり、動物血漿から誘導することができ、ポリクローナルであってもよいが、好ましくはモノクローナルおよび／または組換え抗体である。「抗体」なる語は、ヒト化／ＣＤＲ−移植／キメラまたは他の操作した抗体を包含し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖抗体分子などのフラグメント、および二特異的およびジアボディなどの多特異的抗体を包含する。最も好ましくは、抗体はエドレコロマブまたはＭＴ２０１である。
【００２８】
重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、イムノグロブリンは異なるクラスに分類することができる。５つのクラスの主たるイムノグロブリン：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、これらのうちいくつかはさらに下位のクラス（イソ型）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２に分割できる。種々のクラスのイムノグロブリン、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭに相当する重鎖定常領域は、各々、α、δ、ε、γおよびμと称される。種々のクラスのイムノグロブリンのサブユニット構造および三次元配置は周知である。本発明の抗体はいずれか適当なクラス／サブクラスのものでよいが、好ましくはエフェクター細胞／物質を補充する能力を有する、例えば、抗体依存性細胞障害性（ＡＤＣＣ）または補体介在溶解（ＣＭＬ）を介在することのできるものである。それらはまた、抗原提示細胞により認識され、治療的効果の抗イディオ型応答を誘発する能力を有する。さらに、本発明の抗体は細胞トキシンとコンジュゲートし、そのため治療的効果のエフェクター機能は必要とされない。
【００２９】
１７−１Ａイムノグロブリン、例えば、そこに検出可能な部分のカップリングした抗体と、１７−１Ａ抗原を過剰に発現する癌細胞とそうでない細胞を区別することのできる希釈／濃度の１７−１Ａ抗原レベルを測定するための説明書とを含む、本明細書に記載の方法に用いることのできるキットも提供される。当該キットはまた１７−１Ａ発現の対照となる標体を含んでいてもよい。当該標体は該キットの使用者が患者の試料で得られた結合と１７−１Ａ抗原の正常な発現および／または過剰な発現のいずれかを示す標準となる結合を視覚的に比較することのできる視覚対照カードの形態であってもよい。また、当該標体は、該キットに設けられており、患者の試料と一緒に処理される、１７−１Ａを所定のレベルで発現する細胞の対照となる試料の形態とすることができる。ついで、対照と患者の試料の間でその結合を比較し、１７−１Ａ抗原の過剰発現を測定する。好ましい具体例において、細胞の対照となる試料を患者自身の癌細胞でない細胞より得、内部対照とする。それらは癌細胞と同じ型の組織、例えば結腸組織から得ることが好ましい。当業者に明らかなように、具体的に示された当該キットは、（例えば、視覚的に、あるいは機械による解析で）１７−１Ａ抗原結合を評価するのに用いられる方法に適合するであろう。
【００３０】
上記した予測用キットと、投与すると、１７−１Ａ抗原を過剰に発現する細胞、特に結腸癌細胞を標的とする（例えば、特異的に結合する）治療的に有効量の治療剤とを含む治療用キットも考慮に値する。適当な治療剤の一例が抗−１７−１Ａイムノグロブリンである。
本明細書にて同定された患者の１７−１Ａを標的とする治療は、癌に苦しんでいる患者を治療する方法にて他の治療剤と組み合わせてもよい。他の治療剤は、１７−１Ａを標的とする治療と同時に、連続的に、あるいは別々に投与してもよく、そのような他の治療剤として、例えば、５ＦＵなどの確立された化学療法薬が挙げられる。
【００３１】
本発明はまた他の型の腫瘍の治療に適用されうる。所望により他の治療剤と組み合わせて１７−１Ａ抗体などの１７−１Ａを標的とする処理で治療することのできる型の腫瘍は、１７−１Ａ抗原を発現するいずれかの器官の腫瘍である。例えば、結腸直腸癌、乳癌、胃癌、食道癌、前立腺癌、肺癌、膵臓癌および卵巣癌である。上記したキットおよび治療用キットを用いてこれらの癌における１７−１Ａ、特に１７−１Ａ抗原を測定することができる。
【００３２】
本発明によれば、不顕性癌細胞に苦しんでいると考えられるヒト患者を治療する方法であって、
（ａ）ヒト患者から腫瘍またはその部分を摘出する工程；
（ｂ）工程（ａ）の腫瘍またはその部分の１７−１Ａ発現のレベルを測定する工程；
（ｃ）工程（ｂ）の１７−１Ａ発現のレベルと、１７−１Ａ発現の対照となるレベルを比較する工程；
（ｄ）工程（ｃ）の比較により１７−１Ａの過剰発現が示されるかどうかを測定する工程（この場合、過剰発現は１７−１Ａ抗原を標的とする治療に対する適性を示す）：
（ｅ）工程（ｄ）にて適当であると判断された場合に、所望により他の治療薬と組み合わせて１７−１Ａ抗原を標的とする治療薬を投与する工程
を含む方法が提供される。
【００３３】
（図面の説明）
次に本発明を図面を用いて説明する。図面は単なる例示であって、以下のとおりである。
図１  これは１７−１Ａ陽性および陰性患者の経時的な生存を比較するカプラン−メイアー（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ）全生存率プロットである。危険率（ＨＲ）は１７−１Ａ陽性または１７−１Ａ陰性であることに付随する死亡の危険性を示す。危険率＝１は２つのグループの間に死亡の危険性について何ら違いがないことをいい、ＨＲ＜１は１７−１Ａに対して陽性である患者で事象の危険性がより低いことを意味する。この場合に、ｐ値が＜０．０５であるとは、そのＨＲが有意であること、すなわち、１７−１Ａ陽性患者と１７−１Ａ陰性患者の間で死亡の危険性の違いが有意であることを意味する。これらの患者はエドレコロマブでの単独療法ですべて治療された。ＦＩＴＣ−３６２２Ｗ９４を２．８ｎｇ／ｍｌの濃度で用いて１７−１Ａ抗原の発現を検出した。「ｓ．ｅ．」はＨＲの標準偏差であり、「９５％Ｃｌ」は９５％の信頼区間である。「Ｃｕｍ．Ｎｏ．Ｃｅｎｓｏｒｅｄ」とは打ち切られた患者の累積数であり、ここで「ｃｅｎｓｏｒｅｄ」とは曲線から外れたことを意味する。患者はその後の関連する臨床情報が収集されたその最終時点から打ち切られる。「Ｃｕｍ．Ｎｏ．ｏｆ  ｅｖｅｎｔｓ」は事象の累積数であり、ここで事象とは死亡を意味する。「Ｎｏ．ａｔ  ｒｉｓｋ  ａｔ  ｓｔａｒｔ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｖａｌ」とは各時点でグラフ上に示される患者の数であり、患者は死亡し、あるいは打ち切られるため、その数は減少する。
【００３４】
図２  ５ＦＵ／ＬＶ単独で処理された患者の全生存率；１７−１Ａ陽性および陰性の患者の比較（２．８ｎｇ／ｍｌ  ３６２２Ｗ９４抗体希釈濃度）。ＨＲ＜１は１７−１Ａに対して陽性の患者で事象の危険性がより低いことを意味する。
図３  ５ＦＵ／ＬＶとエドレコロマブで処理した患者の全生存率；１７−１Ａ陽性および陰性の患者の比較（２．８ｎｇ／ｍｌ  ３６２２Ｗ９４抗体希釈濃度）。ＨＲ＞１は１７−１Ａに対して陽性の患者で事象の危険性がより高いことを示す。
【００３５】
図４  これは１７−１Ａ陽性および陰性の患者の経時的な無病生存率を比較するカプラン−メイアー無病生存率プロットである。患者をエドレコロマブ単独で処理する。１７−１Ａ抗原を２．８ｎｇ／ｍｌの濃度のＦＩＴＣ−３６２２Ｗ９４を用いて検出した。ＨＲ＜１は１７−１Ａに陽性の患者で事象の危険性がより低いことを意味する。無病生存率プロットの場合、「事象」は再発または死亡を意味する。
図５  ５ＦＵ／ＬＶ単独で処理された患者の無病生存率；１７−１Ａ陽性および陰性の患者の比較（２．８ｎｇ／ｍｌ  ３６２２Ｗ９４抗体希釈濃度）。ＨＲ＜１は１７−１Ａに対して陽性の患者で事象の危険性がより低いことを意味する。
図６  ５ＦＵ／ＬＶとエドレコロマブで処理した患者の無病生存率；１７−１Ａ陽性および陰性の患者の比較（２．８ｎｇ／ｍｌ  ３６２２Ｗ９４抗体希釈濃度）。ＨＲ＞１は１７−１Ａに対して陽性の患者で事象の危険性がより高いことを示す。
【００３６】
図７  エドレコロマブ単独で処理された患者の転移性再発に至るまでの時間；１７−１Ａ陽性および陰性の患者の比較（２．８ｎｇ／ｍｌ  ＦＩＴＣ−３６２２Ｗ９４）。ＨＲ＜１は１７−１Ａに対して陽性の患者で事象の危険性がより低いことを意味する。「事象」は転移性再発、すなわち、局所性再発ではなく、あるいは死亡を意味する。
図８  １７−１Ａ陽性患者の全生存率（２．８ｎｇ／ｍｌ  ３６２２Ｗ９４抗体希釈濃度）；治療アームの比較。
図９  １７−１Ａ陰性患者の全生存率（２．８ｎｇ／ｍｌ  ３６２２Ｗ９４抗体希釈濃度）；治療アームの比較。
【００３７】
図１０  ５ＦＵ／ＬＶ単独で処理した患者の全生存率；ＴＳの発現の高いおよび低い患者の比較（１０μｇ／ｍｌのＴＳ１０６抗体）。ＨＲ＞１はＴＳの高い腫瘍の患者で事象の危険性がより高いことを示す。
図１１  ５ＦＵ／ＬＶ単独で処理した患者の無病生存率；ＴＳの発現の高いおよび低い患者の比較（１０μｇ／ｍｌのＴＳ１０６抗体）。ＨＲ＞１はＴＳの高い腫瘍の患者で事象の危険性がより高いことを示す。
図１２  ＴＳの高い（１０μｇ／ｍｌのＴＳ１０６）および１７−１Ａの高い（２．８ｎｇ／ｍｌの３６２２Ｗ９４）の患者の全生存率。まず、５ＦＵ／ＬＶに対するエドレコロマブ＋５ＦＵ／ＬＶの結果を示し、つづいて５ＦＵ／ＬＶに対するエドレコロマブの結果を示す。ＨＲ＜１は５ＦＵ／ＬＶと比較した場合にエドレコロマブ＋５ＦＵ／ＬＶまたはエドレコロマブ治療で事象の危険性が低いことを意味する。
【００３８】
実施例１  ＦＩＴＣ−標識化された抗体  ３６２２Ｗ９４の調製
３６２２Ｗ９４抗体（ヒト化３２３／Ａ３抗体、Ｅｄｗａｒｄｓ  ＤＰ、Ｃａｎ．Ｒｅｓ．４６、１３０６−１３１７頁、１９８６を参照のこと）は、１７−１Ａ抗原に特異的な高親和性ヒト化モノクローナル抗体である。免疫組織化学での利用に適する誘導体を、検出可能なラベル（フルオレセインイソチオシアナート、ＦＩＴＣ）を抗体に付着させることで製造した。この試薬を本明細書でＦＩＴＣ−３６２２Ｗ９４という。抗体溶液を重炭酸塩緩衝剤の存在下で３時間、室温でＦＩＴＣと混合する。ゲル濾過カラムを用い、反応したＦＩＴＣを遊離ＦＩＴＣと分離する。ついでウシアルブミンを加え、安定性の手助けをする。
【００３９】
この試薬の特異性を確認するために、凍結させたヒト組織の試料をＦＩＴＣ−３６２２Ｗ９４または無関係な特異性の他のＦＩＴＣ標識したヒト化抗体を用いて染色した。この抗体は、極めて純度が高く、特異的であるように開発されて、フェーズＩおよびＩＩ臨床試験に用いられた。この検出抗体の特異性はウェルカムによりなされた従来の免疫組織化学を基礎とする研究にて明らかにされた。この研究において、フルオレセイン標識の３６２２Ｗ９４を用い、一連の凍結されたヒト組織試料にて染色を検出した。その結果を抗原特異性が無関係なイソ型対合フルオレセインで標識された全抗体を用いて観察される染色と比較した。当該研究は３６２２Ｗ９４抗体が（Ｆａｂ機構を介して）特異的に上皮細胞（大腸および小腸の上皮細胞を含む）に結合することを明らかにした。１７−１Ａ抗原染色は細胞質性／膜性であることが観察された。
これらの知見はＦＩＴＣ−３６２２Ｗ９４がヒト組織試料中で１７−１Ａ抗原を検出するための特異的で感度の高い試薬であることを明らかにする。
【００４０】
実施例２  ＦＩＴＣ−３６２２Ｗ９４抗体との１７−１Ａ抗原の免疫組織化学
デューク段階Ｃの結腸癌を治療するために治癒的手術を受ける可能性のある患者から原発結腸腫瘍組織の試料を得た。これらを、当該患者を治療する病院の慣習に従って、ホルマリンに固定し、パラフィンに包埋した。
典型的な試料調製方法は以下のとおりである。約５倍の容量の適当な固定剤を該試料に加え、選択された固定剤の最適条件に応じて４−２４時間インキュベートする（典型的には、ホルマリン６−１２時間、ボウイン（Ｂｏｕｉｎ’ｓ）４時間；エタノール／酸、２４時間）。７０％エタノールを３回交換してリンスし、７０％エタノール中の包埋カセットに試料を入れる。試料およびカセットを組織プロセッサー中に置く。組織プロセッサーはアルコール１００％まで脱水し、ついで該組織にキシレンを浸透させる。ついで、加圧下、６０−７０℃でキシレンの飽和した組織に溶融パラフィンを浸透させる。その試料をカセットの正しい位置に置き、パラフィン中に埋め込み、固体ブロックに冷却する。
【００４１】
ついで、パラフィン包埋固定結腸腫瘍組織試料をＦＩＴＣ−３６２２Ｗ９４を用いる免疫組織化学により１７−１Ａ抗原発現について分析した。４μｍの組織切片をスーパーフロスト・プラス（Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓ）の顕微鏡用スライド上で切断し、３７℃で一夜インキュベートした。温キシレン中に１０分間、ついで無水アルコール（ｘ３）に浸すことにより切片からロウを除去した。メタノール（４００ｍｌ）中３０％過酸化水素（１０ｍｌ）を室温で２０分間用い、内在性ペルオキシダーゼを遮断した。切片を水で洗浄し、抗原を回収した。抗原を回収するために、切片をトリプシン溶液（２００ｍｇのトリプシン、４００ｍｌの蒸留水、８ｍｌの５％塩化カルシウム、３７℃、ｐＨ７．８に調整）に３７℃で３分間置いた。水中でリンスした後、切片をクエン酸緩衝液（０．８４ｇの無水クエン酸、４００ｍｌの蒸留水、ｐＨ６に調整）中、７分間全出力で超音波処理に付すことでさらに抗原を回収した。切片を水中、ついでトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）（６ｇのトリス−（ヒドロキシメチル）−メチルアミン、８．５ｇの塩化ナトリウム、１リットルの蒸留水、ｐＨ７．６に調整）中でリンスした。ついで、ついで、スライドをシャンドン・シークエンザ・イムノスタイニング・システム上に負荷した。切片をＴＢＳで洗浄し、非特異的蛋白を蒸留水で１：１０に希釈したカゼイン溶液（ベクター・ラボラトリー・カタログ番号ｓｐ５０２０）で１０分間遮断した。ＴＢＳで洗浄した後、切片を、適宜、種々の濃度に希釈した一次抗体（ＦＩＴＣ−３６２２Ｗ９４）と一緒に室温でインキュベートした。
【００４２】
切片をＴＢＳで洗浄し、ＴＢＳで１：５０に希釈した、フルオレセインに対するビオチニル化抗体（ベクター・ラボラトリー・カタログ番号ＢＡ０６０１）と一緒に室温で３０分間インキュベートした。ＴＢＳで洗浄した後、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のコンジュゲートしたストレプトアビジン／ビオチンの複合体（各々、ＴＢＳで１：１００に希釈されたダコ（Ｄａｋｏ）キットからの試薬ＡおよびＢ、カタログ番号Ｋ０４９２）を室温で３０分間適用した。ついで、切片をＴＢＳで洗浄し、シークエンザ・システムから取り外し、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を５分間加えた（ＨＲＰの存在下で褐色となる）。切片を水中で洗浄し、硫酸銅溶液（４ｇの硫酸銅、７．２ｇの塩化ナトリウムおよび１リットルの蒸留水）中に５分間浸した。再度、水中で洗浄した後、メイヤーズ・ヘマトキシリンに、つづいて酸アルコールおよびスコットタップ溶液に浸すことで核を染色させた。切片を無水アルコールで脱水し、キシレンに浸して、合成固定媒体で固定した。
【００４３】
実施例３  免疫組織化学方法の具現化
免疫組織化学検定を行うに際し、陰性対照としての切片を含めた。ＦＩＴＣ−３６２２Ｗ９４一次抗体を除いて、実施例２と全く同様に、切断して処理した；これは一次抗体以外の試薬による染色を制御するものであった。
免疫組織化学検定を行うに際し、陽性対照としての切片を含めた。これは１７−１Ａ抗原を発現することが知られている組織試料であり、実施例２と全く同様に、切断して処理した；これは免疫組織化学染色方法を行ったことを示すものであった。
一群１０個の試料で、３６２２Ｗ９４の代わりに、イソ型対合のフルオレセイン化ヒト化マウス抗ヒトＣＤ４抗体を用いた。特異的な染色は見られず、染色をもたらす抗原と特異的に結合する以外に３６２２Ｗ９４一次抗体の特徴はないことがわかった。
【００４４】
結腸直腸癌を切除した患者から正常な結腸試料（ｎ＝２０）を取得した。これらの試料は切除マージンからの組織であり、病理学者により組織学的に正常であり、腫瘍過程と無関係であると判断された。これらは腸の左側および右側から略均等であった。試料をホルマリンに固定し、パラフィン包埋に付した。これらの試料を用いて抗原回収条件を最適なものとし、ついで腫瘍見本における１７−１Ａ抗原を検出するために用いられるべきＦＩＴＣ−３６２２Ｗ９４一次抗体の希釈度を決定した。１：５０、１：１００、１：５００、１：７５０、１：１０００および１：５０００の希釈度で、肉眼で測定される染色は強烈であって、１：６５００、１：８５００および１：１００００の希釈度で強度がいくらか失われ、１：１０００００の希釈度で、染色は失われたところであり、１：５０００００および１：１００００００では肉眼できなかった。染色の強度レベルはこれら正常な試料全体を通して均一であった。
ＦＩＴＣ−３６２２Ｗ９４の３つの希釈度、１：１００、１：１００００および１０００００をさらなる分析のために選択した。これらの希釈度は、組織切片に加えられるＦＩＴＣ−３６２２Ｗ９４の、略２．８μｇ／ｍｌ、２８．０ｎｇ／ｍｌおよび２．８ｎｇ／ｍｌの量に相当する。
【００４５】
実施例４  デュークス段階Ｃの結腸癌に苦しんでいる患者の治療
無作為の実験に患者を補充して、段階ＩＩＩの結腸癌のアジュバント療法を評価した。２７カ国、２４７カ所のセンターから２７６１人の患者を登録した。多数の患者が関与し、地理的に広範囲に及ぶため、この患者のグループが全体としてその集団にある段階ＩＩＩの結腸癌の患者を代表する。
【００４６】
後記する３つのうちの１つの治療アームの術後７日と４２日の間に起こる無作為化
１．  エドレコロマブ＋５−フルオロウラシル（５ＦＵ）およびロイコボリン（ＬＶ）    エドレコロマブ（５００ｍｇ）の第１の投与を術後の７ないし４２日に行った。エドレコロマブ（１００ｍｇ）の第２の投与を５ＦＵ／ＬＶの第１の投与の前に行った。さらにエドレコロマブ（各々、１００ｍｇ）の３回の投与を４週間の間隔でデリバリーした。５ＦＵ／ＬＶの第１のサイクルをエドレコロマブの第１の投与の少なくとも１４日後、術後５６日までに開始した。それは２０ｍｇ／ｍ２のロイコボリンと、つづいて４２５ｍｇ／ｍ２の５ＦＵとからなっていた。５ＦＵおよびＬＶを５日間毎日投与した。５ＦＵ／ＬＶの第２および第３のサイクルを４週間の間隔で行い、第４、第５および第６のサイクルを５週間の間隔で行った。エドレコロマブの第２、第３および第４の投与および５−ＦＵ／ＬＶの最初の３回のサイクルは同日に行われた。エドレコロマブの第５の注入は５ＦＵ／ＬＶの第４のサイクルの１週間前に行った。
【００４７】
２．  ５ＦＵ／ＬＶ    ５ＦＵ／ＬＶの第１のサイクルを術後７ないし４２日に開始し、それは２０ｍｇ／ｍ２のロイコボリンと、つづいて４２５ｍｇ／ｍ２の５ＦＵとからなっていた。５ＦＵおよびＬＶを５日間毎日投与した。第２および第３のサイクルを４週間の間隔で行い、第４、第５および第６のサイクルを５週間の間隔で行った。
【００４８】
３．  エドレコロマブ    エドレコロマブ（５００ｍｇ）の第１の投与を術後の７ないし４２日に行った。エドレコロマブ（各１００ｍｇ）のさらなる４回の投与を４週間の間隔でデリバリーした。
【００４９】
上記した実験に登録した患者から解析するための腫瘍試料を選択した。この場合、患者はすべて段階ＩＩＩ／デュークスＣ結腸癌であり、原発腫瘍の治療的切除を潜在的に受けた。したがって、これらの患者は微小残存病変のある好適例の患者であり、したがって抗−１７−１Ａを標的とする療法の治療に適している可能性がある。他の段階の疾患、例えば、デュークス段階ＢまたはＤの患者は、微小残存病変の危険性のある、あるいは微小残存病変であり、本発明の利益を受ける可能性があると考えられる付加的なグループである。
【００５０】
実施例５  腫瘍試料の１７−１Ａ抗原発現についての免疫組織化学
試料のグループの大きさが大きく、地理的に広範囲に及ぶため、これらのケースは一般に段階ＩＩＩ／デュークスＣ結腸癌の集団を代表していると考える。このグループの中で平均年齢は６１．６歳であり、５０．１％が男性であった。
腫瘍試料を１７−１Ａ抗原の発現レベルを免疫組織化学分析に付す６０９人の患者より得た。各試料を１：１００、１：１００００および１：１０００００の希釈度でＦＩＴＣ−３６２２Ｗ９４を用いて別々に染色した。処理に付された組織の切片を以下のスキームにしたがって病理学者が１７−１Ａ抗原の発現の強度および分布について評点を付した。
【００５１】
強度について    ０−染色なし
１−染色（低度）
２−染色（中度）
３−染色（高度）
分布について    ０−染色なし
１−細胞染色の＜１０％
２−細胞染色の１０−６９％
３−細胞染色の＞７０％
さらに、強度および分布の評点を合し、０−６の範囲の総評点で表した。
【００５２】
各バッチのスライドで行った陽性対照により、染色工程はうまくいったことがわかった。各バッチのスライドで行った陰性対照により、第１抗体以外の試薬による染色は生じなかったことがわかった。イソ型対合のフルオレセイン化に付したヒト化マウス抗−ヒトＣＤ４抗体の対照は染色が１７−１Ａ抗原に特異的であることを示した。
当該実験に含まれるすべての試料を分析することが可能であった。正常組織と腫瘍組織の間で染色パターンにおいて違いのないことが観察された：すべての組織で均質な膜および細胞質染色が生じた。何らかの染色があれば（強度＞１）、分布については（３人を除く）すべてのケースで評点は３であった。１：１００の希釈度の抗体を用いた場合、＞９９％の腫瘍が１７−１Ａ発現（強度評点＞１）について陽性であり、したがって実質的にはすべての腫瘍はある程度の１７−１Ａ抗原を発現しているようである。１：１０００００の抗体希釈度での予備実験で、正常な結腸粘膜上での染色は丁度失われたところであることがわかった。したがって、この実験の腫瘍の４４％は正常な組織での発現よりも高いレベルで１７−１Ａ抗原を発現することを暗示するものである。１７−１Ａ抗原の検出の要約を表１に示す。
【００５３】
【表１】
2005509159.tif 000003
【００５４】
実施例６  １７−１Ａ抗原の発現レベルの統計分析
１７−１Ａ抗原の免疫組織化学の結果を、エドレコロマブおよび／または５ＦＵ／ＬＶで処理した後の臨床結果と相関付けるように一連の統計的分析を計画した。
１７−１Ａ抗原の分布が均一であることが判明したため、統計分析をその強度評点だけを用いて行った。１７−１Ａ抗原について陽性である、すなわち、強度の評点が１、２または３である腫瘍の患者と、１７−１Ａ抗原について陰性である、すなわち、強度の評点が０である腫瘍の患者との間で比較を行った。分析の前に、目的とする比較としての当該比較を特定する。すなわち、データに示される統計試験の数を限定する。これは多様性の制御に役立ち、結論を誤る機会が減少する。
予備データは、試験した患者の９９．２％（６０４／６０９）は１７−１Ａ抗原について陽性であるため、１：１００の抗体の希釈度から得られるデータに基づいて統計試験を行うことに利点はないと示唆する。したがって、統計分析を１：１００００および１０００００の抗体の希釈度からもたらされるデータだけで行った。１：１００００の希釈度で１７−１Ａ抗原の発現に陰性の患者のグループは少数であった（ｎ＝６４／６０９）ことに留意すべきである。
【００５５】
「１７−１Ａ抗原陽性」なる語は、免疫組織化学用の特定の濃度のＦＩＴＣ−３６２２Ｗ９４を用いて１７−１Ａ抗原を染色して検出できる腫瘍を意味するのに用いられる。同様に、「１７−１Ａ抗原陰性」なる語は、免疫組織化学用の特定の濃度のＦＩＴＣ−３６２２Ｗ９４を用いて１７−１Ａ抗原の検出可能な染色を欠く腫瘍を言うのに用いられる。１：１００の希釈度の抗体を用いて得られた結果として、この実験の実質的にすべての（少なくとも９９．２％の）腫瘍は１７−１Ａ抗原を発現することがわかる。
統計分析の計画は１７−１Ａ抗原の最初の検出データの試験に従って決定された。これは潜在的に有用な分析を実施させるにすぎず、比較の回数を減少させることにより誤って有意な結果となる可能性は減少することとなる。
【００５６】
分析は全生存率の主要評価項目に焦点を合わせているが、それは無病生存の副次評価項目でも繰り返される。カプラン−メイアー生存率の評価および危険率（ＨＲ）のプロットを、対応する９５％信頼区間（ＣＩ）で用いてグループＡと比較した。層別化ログランク検定を用いて、原発腫瘍が１７−１Ａ抗原について陽性である患者と、原発腫瘍が１７−１Ａ抗原について陰性である患者とを比較した場合に生存において有意な違いがあるかどうかを測定した。主たる臨床試験解析と同様に、検定を地理的位置および結節状態に応じて層別化し、包括解析を行った。個々の無作為化治療アームを用いて比較し、１７−１Ａ抗原が個々の治療計画の生存を正方向に予測するかどうかを決定した。さらに１７−１Ａ抗原陽性と陰性の患者における各治療から由来の利益を比較した。複数を比較するのに何ら調整を行わなかった。
【００５７】
実施例７  １７−１Ａ抗原は結腸癌の一般的予後マーカーではない
１７−１Ａ抗原の発現レベルが結腸癌の一般的予後マーカーとして作用するかどうかを測定するために、１７−１Ａ抗原陽性および１７−１Ａ抗原陰性の患者の生存結果を、１７−１Ａ標的療法で治療されなかった患者の間で比較した。この分析をＦＩＴＣ−３６２２Ｗ９４の１：１００００および１：１０００００の両方の希釈度からのデータを用いて行った。１７−１Ａ抗原の状態と５ＦＵ／ＬＶ治療した全生存率または無病生存率の間に有意な関係は見られず、１７−１Ａ抗原の発現レベルは結腸癌の一般的予後マーカーとして作用しないことを示す。
【００５８】
実施例８  ＦＩＴＣ−３６２２Ｗ９４の１：１００００の希釈度を用いる分析
ＦＩＴＣ−３６２２Ｗ９４の１：１００００の希釈度を用いて得られる免疫組織化学データを２つの方法で試験した。最初に、１７−１Ａ抗原の発現について患者を陰性（強度評点０）または陽性（強度評点１、２または３）として特定した。この操作で集団を８９％の陽性と１１％の陰性の患者に分類した。いずれの治療アームにおいても、１７−１Ａ抗原についての陽性または陰性の患者の間で全生存率または無病生存率において有意な違いは見られなかった。
【００５９】
これらの結果から、この希釈度の検出抗体を用いて１７−１Ａ抗原で陽性および陰性に分類した患者はエドレコロマブからの利益の異なる患者と区別されないことがわかる。
加えて、当該データを分割し、１７−１Ａ抗原の低い発現者（強度評点０、１）と高い発現者（強度評点２、３）を比較した。この操作は、また、１：１００００希釈度の検出抗体を用いて、そのレベルの１７−１Ａの発現がエドレコロマブからの利益と関連している締め切り点が同定されるように、患者を分類することができるかどうかを見いだすことであった。この定義により集団を分類しても、エドレコロマブから利益を受ける集団と受けない集団に区別できなかった。
【００６０】
実施例９  ＦＩＴＣ−３６２２Ｗ９４の１：１０００００の希釈度を用いる分析
ＦＩＴＣ−３６２２Ｗ９４の１：１０００００の希釈度を用いて得られる免疫組織化学結果を用いて、１７−１Ａ抗原の発現が検出のレベルより下である場合に陰性（強度評点０）として、あるいは１７−１Ａ発現について陽性（強度評点１または２）として患者を定義した。この操作で集団を４４％の陽性と５６％の陰性の患者に分類し、２つのグループの結果を比較した。
【００６１】
これらの免疫組織化学の条件を用いて１７−１Ａ抗原の発現に陽性である腫瘍のある患者は、エドレコロマブ単独で治療した場合に１７−１Ａ発現に陰性である腫瘍のある患者に比べて全生存率を有意に改善した（危険率（ＨＲ）＝０．４２（９５％の信頼区間０．２１、０．８４）ｐ＝０．０１１）（図１）。この違いは５ＦＵ／ＬＶで治療した患者（ＨＲ＝０．７５（９５％ＣＩ０．３０、１．９０）ｐ＝０．５４７）（図２）あるいは５ＦＵ／ＬＶ＋エドレコロマブで治療した患者（ＨＲ＝１．１０（９５％ＣＩ０．６０、２．０１）ｐ＝０．７６８）（図３）では見られなかった。
【００６２】
１７−１Ａ抗原の状態の無病生存率に対する効果も考慮した。全生存率について見られる、１７−１Ａ発現について陽性であり、エドレコロマブ単独で治療される、結果の改善の傾向は、無病生存率では小さい（ＨＲ＝０．７８（９５％ＣＩ  ０．５０、１．２４）ｐ＝０．２９７）（図４）。全生存率について見られるように、５ＦＵ／ＬＶまたは５ＦＵ／ＬＶ＋エドレコロマブで治療した場合、１７−１Ａについて陽性である患者では無病生存率の改善はなかった。
【００６３】
リースミュラーら（１９９４）はデュークス段階Ｃの結腸癌患者をエドレコロマブ治療について研究し、エドレコロマブは、局所部位での再発ではなく、遠隔部位での再発に有意な保護を付与すると結論した。遠隔転移（第１事象として）に至るまでの時間を考えた場合、エドレコロマブで治療した患者はアジュバント治療を受けなかった患者と比べて有意な利点があった（ｐ＝０．００１）。これは局所部位での再発に至るまでの時間のケースではなく、エドレコロマブを受ける患者とアジュバント治療を受けていない患者の間で違いはない（ｐ＝０．７４０）。エドレコロマブでの治療は細胞の分散に対して最も効果的であり、腫瘍細胞の大きな塊に対してはそれほど効果的ではないため、当然の結果として、無病生存率の改善を予測するのに１７−１Ａ抗原の発現の数値は局所部位で再発した患者と比較して第１事象としての遠隔転移の患者で大きいと考えられる。
【００６４】
さらなる分析を行い、この効果を最近のデータにて試験し、それにより、エドレコロマブ単独で治療した患者（第１の再発が遠隔転移であった患者だけは含む）についての無病生存率をプロットした。１７−１Ａ抗原陽性の患者が無病生存率を改善する傾向の低さ（ｐ＝０．２９７）は、予想通り、第１事象として遠隔転移を再発する患者だけを当該分析にて用いた場合に大きくなった（ＨＲ＝０．６５（９５％ＣＩ０．３９、１．０８）ｐ＝０．０９３）（図７）。
【００６５】
１７−１Ａ抗原について陽性である患者だけを考慮した場合、エドレコロマブ単独で治療した患者の全生存率は５ＦＵ／ＬＶで治療した患者と有意に違わなかった（ｐ＝０．７３４）；しかしながら、ＨＲは５ＦＵ／ＬＶで弱く好ましいものであった（ＨＲ＝１．１８２（９５％ＣＩ０．４５、３．１０））（図８）。１７−１Ａ抗原の発現について陰性である腫瘍の患者のうち、５ＦＵ／ＬＶ単独で治療するよりも、エドレコロマブ単独で治療した方が、全生存率が有意に低い（ｐ＝０．０２３）（図９）。
【００６６】
１７−１Ａ抗原陽性および陰性のグループの間で患者の特徴を比較した（表２）。この操作は、エドレコロマブ単独で治療した１７−１Ａ抗原陽性および陰性の患者について有意な全生存率の違いが他の因子に起因するかどうかを見いだすことであった。結節状態および粘液状態の場合を除いて、１７−１Ａ抗原陽性および陰性のサブセットの間でエドレコロマブで治療したグループにて患者の特徴は均衡が取れているようであった。結節状態を、地理的配置に従って、最初の分析において調節するが、粘液状態は調節しなかった。したがって、ログランク試験を繰り返し、付加的に粘液状態について調節し、その結果が影響されないことを見いだした。
【００６７】
そのデータから、１７−１Ａ抗原の発現についての結腸腫瘍の免疫組織化学分析を用いてエドレコロマブを用いる治療から最高の利益を誘導することのできる一群の患者（１：１０００００のＦＩＴＣ−３６２２Ｗ９４を用いて同定された「１７−１Ａ抗原陽性」群）を同定できることがわかる。同様に、同じ試験を行い、エドレコロマブ治療の利益の受けることのほとんどない一群の患者（「１７−１Ａ抗原陰性」群）を求めることができる。その患者は５ＦＵ／ＬＶなどの別の療法で治療することが好ましい。
【００６８】
実施例１０  １７−１Ａ抗原の発現レベルを検出するためのさらなる方法
本発明は１７−１Ａ抗原のレベルを評価するための適当な試薬としてＦＩＴＣ−３６２２Ｗ９４を用いることが記載されているが、この抗原と方向付けられる他の抗体も容易に用いることができることが理解されよう。かかる抗体の例として、ＧＡ７３３（Ｈｅｒｌｙｎ  Ｄ．  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、７３、１５７−１６７，１９８４）および３２３／Ａ３（Ｅｄｗａｒｄｓ  Ｄら、Ｃａｎ．Ｒｅｓ  ４６、１３０６−１３１７、１９８６）。本発明の実施においてかかる試薬を用いるために、比較実験を行う。
かかる抗体は、１７−１Ａ抗原とのアフィニティなどの媒介変数において、ＦＩＴＣ−３６２２Ｗ９４とは異なるため、適当な免疫組織化学染色が得られ、かつ所望の患者集団が正しく同定されたことを保証するために校正操作を行う必要がある。別の抗体がＦＩＴＣで標識化されていないが、他の検出可能な部分を有する場合、適当な修飾がその検出を行う方法に施されるであろう。これらは当該分野にて周知である。
【００６９】
同様に、免疫組織化学の分野における当業者にとって、同じ検出抗体（例えば、ＦＩＴＣ−３６２２Ｗ９４）であっても異なるバッチでは使用において異なる効能を有するかもしれず、所望の患者集団を正確に同定するためにバッチの各々が適宜校正されなければならないことは明らかであろう。
かかる校正操作は多数の方法で行うことができるが、その目的は、結腸癌の集団を実施例９にて概説された研究においてＦＩＴＣ−３６２２Ｗ９４で同定された類似群に分離するであろう別の抗体の検出および濃度の条件を同定するためでいつも同じである。校正操作の２つの例を以下に示す。
【００７０】
１の校正方法において、調査対象の結腸癌組織の試料を第２の抗−１７−１Ａ抗体で染色する。ついで種々のケースを染色強度に従ってランク付けし、その染色の最大強度を有する４４％が１７−１Ａ高発現体であると考えられ、染色強度の小さいもの（５６％）が低発現体である。ついで、これらの群を用いてエドレコロマブなどの１７−１Ａ抗原を標的とする薬剤を用いる治療に対する患者の適性を測定することができる。すなわち、上位４４％にいるケースがエドレコロマブなどの１７−１Ａ抗原を標的とする療法での治療に好ましい群のケースである。使用すべき検出抗体を正確に校正するのに上記した方法を用いた後、これらのケースで得られた染色の強度を対照発現レベルとして用いる。発現の高いおよび低い群の間で締め切り点に近い腫瘍（例えば、高発現群のうち染色の最も低い腫瘍と低発現群の染色の最も高い腫瘍）を対照発現レベルとして用いる。この対照は、１７−１Ａ抗原を標的とする療法での治療に対する個々の適性を測定するために、それと個々の腫瘍試料を比較するものである。
【００７１】
本発明を実施するのに、一連の試料を正確に４４％：５６％に分けることが必要なわけではない。類似するが同じではない、分離をもたらす染色操作を用いてもよい。これは以下の例から明らかである。
４１人の患者を選択した。１７人を手術およびエドレコロマブで治療し、術後２年までの間、その疾患を局所または遠隔再発することなく、臨床過程を無事に過ごした。同様に治療した２４人の患者は、局所再発はないが、切除から６ヶ月と１８ヶ月の間で原発病変から遠隔にある部位で疾患を再発するより悪い結果となった。これらの患者から切除した原発腫瘍をその１７−１Ａ発現レベルについて分析した。腫瘍が高１７−１Ａ発現を有した患者（１４／４１、３４％）は、最も低い１７−１Ａ発現（６３０日）の６６％（２７／４１）と比べて拡張された無病生存時間（７７８日）を有した。このことは集団を３４％：６６％に分けるように１７−１Ａ発現をランク分けすることが治療の望ましい集団を選択するのに十分であることを示す。同様に、５４％：４６％までの割合を用いることもできる。
【００７２】
第２の校正方法を用いることもできる。その目的もまた、結腸または結腸直腸癌の集団を実施例９で説明されている実験にてＦＩＴＣ−３６２２Ｗ９４により同定される同様の群に分類するであろう別の抗体の検出および濃度の正確な条件を同定することにある。一連の正常な結腸の粘膜試料（例えば、３０種の個体からの試料）を一群の濃度の別の抗体で染色する。約８０％の正常な組織（好ましくは腫瘍と同じ組織型であると評価されている）の試料および３４％以上の腫瘍試料が陽性である濃度を選択し、ついで高および低１７−１Ａ発現体を同定するのに用いた。
【００７３】
例えば、上記した例で用いられるバッチとは別の反応にて標識された３６２２Ｗ９４ＦＩＴＣのバッチが使用に要求された。それは上記した例で用いられる抗体のバッチとは別の反応にて標識されたことが明らかであるため、再度校正する必要があった。約１６．５ｎｇ／ｍｌの濃度（正常な試料の１０／１０および腫瘍試料の７／１０が陽性であった）で評価した。これは上記した基準を満たさず、選択されなかった。約２．８ｎｇ／ｍｌの濃度（正常な試料の約３／４０および腫瘍試料の約５／４０が陽性であった）で評価した。これは上記した基準を満たさず、選択されなかった。ついで、約１１．２ｎｇ／ｍｌの３番目の濃度を評価した。この場合、正常な試料の約１０／５０および腫瘍試料の２９／５０が陽性であった。かくして、上記した選択基準が満たされており、１７−１Ａ抗原を標的とする療法を用いる治療に特に適している患者を同定するために、免疫組織化学用にこの濃度を選択した。
【００７４】
この操作に続いて、別の新しいバッチの抗体の適当な濃度を測定した。ついで、この濃度を用いて抗−１７−１Ａを標的とする療法を用いる治療用の個々の患者の適性が評価されるであろう。この方法を用いた場合、決定される別の抗体の濃度は、１７−１Ａを標的とする療法を用いる治療に最適なケースを積極的に染色するであろう。この積極性を同定するために、標体、例えば、この濃度で消極的に染色することが分かっている腫瘍を用いてもよい。
【００７５】
この校正の精度を、約１１．２ｎｇ／ｍｌの濃度で再度校正されたＦＩＴＣ−標識化３６２２Ｗ９４の新しいバッチを用い、６０９人の最初のグループのうち５０人の染色操作を繰り返すことで測定した。この再度校正された抗体濃度を用いて、４４／５０（８８％）のケースが、上記した例にて用いられる約２．８ｎｇ／ｍｌでのＦＩＴＣ−３６２２Ｗ９４のバッチを用いた場合に得られる結果と比較して一致した染色結果を示し、この結果は十分に免疫組織化学で考えられる実験誤差の範囲内である。次に、新たな抗体のバッチのこの校正された濃度を用いて検査すべき結腸癌の組織の試料を染色する。１７−１Ａについて陽性の腫瘍試料は高発現体である。実施例９に記載されるように、高発現の患者は１７−１Ａを標的とする抗体エドレコロマブの療法からより大きな効果を得る。ついで、これらのグループ分類を用いてエドレコロマブまたはＭＴ２０１などの１７−１Ａ抗原を標的とする薬物を用いる治療に対する患者の適性を測定することもできる。
【００７６】
これらの校正方法の目的が１７−１Ａ抗原を標的とする療法に特に適する一般的な癌の集団の割合を同定するために免疫組織化学の条件を調節することにあることが理解されよう。明らかではあるが、かかる療法にさらに適する下位群のグループを捜し求めるために、そのように同定されたグループの全患者を治療することが望ましくない環境があるかもしれない。これらの方法を適用して１７−１Ａ検出方法を校正し、そのようなより小さなグループを特定することもできる。例えば、第１の校正方法（前掲）において、前記したようにその発現レベルでケースをランク付けし、治療のために最大の染色強度が４４％のものを選択する代わりに、おそらくは、最も厳しい２０％もしくは１０％または５％あるいはたった２％だけを治療するように、より制限的な締め切りを選択する。理論に拘束されるつもりはないが、この方法にて選択される治療選択ハードルが厳しければ厳しいほど、その患者はますます１７−１Ａ抗原を標的とする療法に適しているかもしれない。
【００７７】
実施例１１    １７−１Ａ発現分析と他の予後分析との組み合わせ
デュークス段階Ｃおよび結腸直腸癌の患者のエドレコロマブおよび５ＦＵ／ＬＶ治療は共に臨床的効果が知られており、最も効果的な方法としてこれらの治療を組み合わせることが最も望ましい。同様に、結腸直腸癌の治療のための他の化学療法もあり、それとエドレコロマブなどの１７−１Ａを標的とする療法を組み合わせることが有用であろう。例えば、ラルチトレキシド（ｒａｌｔｉｔｒｅｘｅｄ）、オキサリプラチン、イリノテカン／ＣＰＴ１１、エニルラシル（５ＦＵ＋／−ロイコボリンを含む）、ＵＦＴ、カペシタビン、ミトマイシン、ヘルセプチンが挙げられる。
このような療法を包含する組み合わせもまた、これらの治療から由来の利益の程度についての予後マーカーにより方向付けられるか、決定される。
【００７８】
５ＦＵの作用の細胞障害性機構は２つの主要な部分に分かれる：フッ化リボヌクレオチドのＲＮＡへの組み込みと、ＤＮＡ合成および修復に対してその後に効果を有するチミジレート・シンターゼ（ＴＳ）の阻害とである。
５ＦＵの代謝物により阻害されるＴＳ酵素はヌクレオチド代謝作用における重大な酵素である。というのも、デオキシチミジントリホスフェート（ｄＴＴＰ）合成におけるその役割は他の経路により補うことができないからである。通常、ＴＳはｄＵＭＰに、ついで葉酸コファクター、ＣＨ２ＦＨ４に結合する。ＴＳはｄＵＭＰの、ＤＮＡへの組み込みのためにさらにｄＴＴＰにリン酸化される、デオキシチミジンモノホスファート（ｄＴＭＰ）への変換を触媒する（Ｄａｎｅｎｂｅｒｇ＆Ｄａｎｅｎｂｅｒｇ、１９７８）。
【００７９】
５ＦＵがＦｄＵＭＰに代謝した後、それはＴＳ上の触媒部位についてｄＵＭＰと競合する。ＦｄＵＭＰがＴＳに結合すれば、葉酸コファクターの結合が生じ、酵素、葉酸およびＦｄＵＭＰは三成分の複合体にて共有結合するようになる（Ｓａｎｔｉら、１９７４）。ＴＳを阻害することにより、５ＦＵがｄＵＭＰのｄＴＭＰへの変換を阻害し、その結果がチミンの枯渇であり、細胞死に至りうる。５ＦＵの細胞障害作用がＣＨ２ＦＨ４に代謝され、より高いレベルの葉酸コファクターを提供するＬＶを一緒に投与することによりＲＮＡからＤＮＡを基礎とする効果にシフトさせることができる。このことは三成分複合体の安定性を、かくしてＴＳの阻害を増大させる。
【００８０】
ＴＳの予測マーカーとしての価値は研究するのに重要である。それは患者を５ＦＵを基礎とする療法から最も利益を受けるであろう患者と、別のまたは付加的な療法を考えるべき患者とを区別することができる。
９人の播種性結腸直腸腫瘍の予備実験から、５ＦＵ／ＬＶ療法に応答する患者は、応答しない患者よりも前処理生検において平均ＴＳ蛋白レベルおよびｍＲＮＡレベルが低いことが判明した（ｐ＜０．０１）。この実験からまた、ＴＳの免疫組織化学染色強度がウェスタンブロットにより測定された蛋白発現およびｒｔＰＣＲにより評価されたｍＲＮＡレベルと密接に関連することが判明した（Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、１９９５）。
【００８１】
進行癌の患者を２種の実験に付してこれらの知見を確認した。Ｌｅｉｃｈｍａｎら（１９９７）は内部対照としてβ−アクチンｍＲＮＡレベルを用いて４２人の患者からの予備処理した生検中のＴＳｍＲＮＡを測定した。患者は５ＦＵ／ＬＶから種々の利益を得、β−アクチンに対してＴＳの割合の高い患者と比べて、その割合の低い患者では生存期間の長さが有意に高かった（ｐ＝０．０２）。Ｌｅｎｚら（１９９８）は類似する方法を用いて５ＦＵ／ＬＶで処理した３６人の患者にてＴＳｍＲＮＡの発現を評価した。予備処理したＴＳレベルの低い患者は療法に対して著しく大きな応答を示し（ｐ＝０．００３）、その生存は著しく長かった（ｐ＝０．００２）。ＴＳレベルの低い患者のすべてがすべて応答したものでもなく、他の因子も関与している可能性がある。免疫組織化学を基礎とする実験も同定された類似する関係を有した（Ａｓｃｈｅｌｅら、１９９９；Ｐａｒａｄｉｓｏら、２０００）。
【００８２】
初期段階の疾患も研究した。しかしながら、このケースにおいて、ＴＳレベルは５ＦＵで治療されている腫瘍（転移または再発疾患）となる腫瘍（原発）にて測定される。ＴＳレベルは肝臓転移におけるよりも原発腫瘍にて有意に高いことが分かっているため（Ｃｈａｚａｌら、１９９７）、このことが重要であると、信じさせる根拠がある。しかしながら、ＴＳレベルは、５ＦＵを基礎とする化学療法で治療した１００人のデュークス段階Ｃの結腸癌の患者の原発腫瘍における免疫組織化学により測定されており；再発を苦しんでいる大部分はＴＳ過剰発現性腫瘍を有し、無病を維持する大部分はＴＳ陰性腫瘍を有することが判明した（Ｃａｓｃｉｎｕら、２００１）。この実験は進行段階にある疾患の実験からの結果と適合するのは明らかであるが、１３４人の初期段階の結腸直腸疾患の第２研究から原発腫瘍にて免疫組織化学により測定したＴＳ発現と、５ＦＵまたはラルチトレキシドから由来の効果の間に関係のないことが判明した（Ｆｉｎｄｌａｙら、１９９７）。しかしながら、この実験において、ＴＳの分布だけが評価され、染色の強度は評価されなかった。
【００８３】
ＴＳと５ＦＵから由来の効果の間の関係は他の因子により複雑なものとされている。例えば、Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗｉｌｔらは、インビボ結腸腫瘍実験にて、ＴＳのレベルは５ＦＵでの治療の結果として増加することを明らかにした（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗｉｌｔら、１９９２）。Ｃｈｕら（１９９１）はＴＳ酵素がそれ自身のｍＲＮＡの翻訳を制御し、酵素の基質または阻害剤が存在する場合、翻訳の阻害が亢進されることを示すインビトロにおける証拠を見いだした。５ＦＵに対する耐性もまた、葉酸またはＦｄＵＭＰへの結合の干渉をもたらす、ＴＳの変異によるものとすることができる。
文献のこの調査から、進行疾患についてはＴＳレベルと５ＦＵを基礎とする療法の後の結果との間に関係があるのは明らかであるが、初期段階の疾患ではその関係は解決されていない。
【００８４】
実施例１２  チミジレートシンターゼ発現レベルの染色方法
上記されているホルマリン固定し、パラフィン包埋された同じ組織試料からの切片をチミジレートシンターゼのレベルについて免疫組織化学により分析した。４μｍの切片をスーパーフロスト・プラスの顕微鏡スライド上で切断し、３７℃で一夜インキュベートした。切片を温キシレンに１０分間、ついで無水アルコール（ｘ３）に浸すことで脱ロウに付した。メタノール（４００ｍｌ）中３０％過酸化水素（１０ｍｌ）を室温で２０分間用いて内因性ペルオキシダーゼを遮断した。抗原を回収する前に、切片を水で洗浄した。抗原を回収するために、切片をプレスチジ・プレッシャー・クッカー中のベクター抗原回収溶液（Ｖｅｃｔｏｒ、カタログ番号Ｈ３３０）に全圧で３分間入れた。切片を水中でリンスし、ついでトリス緩衝セイライン（ＴＢＳ）（トリス−（ヒドロキシメチル）−メチルアミン（６ｇ）、塩化ナトリウム（８．５ｇ）、蒸留水（１リットル）、ｐＨ７．６に調整）でリンスした。ついで、スライドをシャンドン・シーケンザ免疫染色システム上に負荷した。切片をＴＢＳで洗浄し、非特異的蛋白をカゼイン溶液（ベクター・ラボラトリース、カタログ番号Ｓｐ５０２０）と一緒に１０分間遮断した。ＴＢＳで洗浄した後、切片をアビジン溶液およびビオチン溶液（ベクター、カタログ番号ＳＰ２００１）と一緒に各々１５分間インキュベートし、内因性ビオチンを遮断した。ＴＢＳで再び洗浄した後、一次抗体（ＴＳ１０６、ケミコン）を加えて、カゼイン溶液で１：１００（１０μｇ／ｍｌ）または１：５０００（２００ｎｇ／ｍｌ）まで希釈し、４℃で一夜インキュベートした。切片をＴＢＳで洗浄し、ＴＢＳで適宜希釈した二次抗体（ビオチニル化抗マウス／ウサギ免疫グロブリン（ダコ（Ｄａｋｏ）、Ｋ０４９２））と一緒に室温で３０分間インキュベートした。ＴＢＳで洗浄した後、ストレプトアビジンおよびビオチニル化ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＰＲ）（ダコ、Ｋ０４９２）の複合体を室温で３０分間適用させた。ついで、切片をＴＢＳで洗浄し、シークエンザシステムから取り出し、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を２分間加えた（ＨＲＰの存在下で褐色になる）。ついで、切片を水中で洗浄し、硫酸銅溶液（硫酸銅（４ｇ）、塩化ナトリウム（７．２ｇ）および蒸留水（１リットル））に５分間浸した。再び水中で洗浄した後、マイヤーズ・ヘマトキシリンに浸すことで核を染色させた。切片を無水アルコールで脱水させ、キシレンに浸し、合成固定培地で固定した。
【００８５】
実施例１３  腫瘍試料のＴＳ発現についての免疫組織化学
腫瘍試料をＴＳ発現レベルの免疫組織化学分析のために６０９人の患者より取得した。各試料を１：１００または１：５０００の希釈度の抗体ＴＳ１０６と一緒に別々に染色した。処理された組織切片を以下のスキームに従ってＴＳ発現の強度および分布について病理学者が評点を付した。
【００８６】
強度について    ０−染色なし
１−染色（低度）
２−染色（中度）
３−染色（高度）
分布について    ０−染色なし
１−細胞染色の＜１０％
２−細胞染色の１０−６９％
３−細胞染色の＞７０％
さらに、強度および分布の評点を合し、０−６の範囲の総評点で表した。
【００８７】
実施例１４  ＴＳ発現レベルの統計的分析
臨床結果と、抗体ＴＳ１０６を１：１００の希釈度で用いる免疫組織化学によって測定された、ＴＳ発現レベルの関係の統計学的分析を行った。ＴＳ発現レベルの低い（総評点０−３、患者の３９．５％）腫瘍の患者の結果を発現レベルの高い（総評点４−６、患者の６０．５％）腫瘍の患者と比較した。これらのグループを以下の記載全体を通して各々「低ＴＳ」および「高ＴＳ」と称する。
ＴＳ発現レベルが結腸癌の一般的予後マーカーとして作用するかどうかを測定するために、低ＴＳと高ＴＳ患者の生存結果を、ＴＳを標的とする療法で治療されていない患者のそれと比較した。エドレコロマブ単独療法で治療した場合、ＴＳ発現レベルと全生存率（ＨＲ＝０．８３９、ｐ＝０．５６６）または無病生存率（ＨＲ＝０．７３０、ｐ＝０．１７３）の間に有意な関係は見られなかった。このことはＴＳ発現が結腸癌の一般的予後マーカーではないことを示すものである。
【００８８】
ＴＳ発現の高レベルは５ＦＵ／ＬＶ単独で治療した場合（ＨＲ＝３．８１３、ｐ＝０．０３３；この分析において、ＨＲ＞１は高ＴＳ発現体についての事象の危険性がより大きいことを示す）に全生存率が著しく低いことと関連付けられる。これらのデータを図１０に示す。これはエドレコロマブ単独で治療した患者（ＨＲ＝０．８３９、ｐ＝０．５６６）のケースではない。同様に、無病生存終点を考慮して、ＴＳ発現の高レベルは５ＦＵ／ＬＶ単独で治療した場合（ＨＲ＝２．９２２、ｐ＝０．０１１）に無病生存率が著しく低いことと関連付けられる。図１１に示す。これはエドレコロマブ単独で治療した患者のケースではない。
したがって、ＴＳ発現のレベルは、エドレコロマブを用いる治療についてではなく、５ＦＵ／ＬＶから由来の効果についての予測マーカーとすることができるようである。
【００８９】
１３％の低発現体と比較して２５％の高発現体が粘液腺癌であるというムチン状態を除いて、治療アームとＴＳ状態（すなわち、低ｖｓ高）の間の特徴を均衡させた。この違いは分析に十分に影響を及ぼすものであり、そこで高ｖｓ低の比較を繰り返し、粘液状態ならびに最初に調整された結節状態および地理的地域を調整した。したがって、得られた有意な結果は地理的位置、結節状態および粘液状態とは独立したものである。
【００９０】
実施例１５  １７−１Ａ抗原とＴＳ発現レベル試験の組み合わせ
ＴＳ発現の高レベルの患者だけを考慮した場合、すなわち、５ＦＵ／ＬＶから最低の効果を得る患者を考慮した場合、エドレコロマブ単独で治療患者と５ＦＵ／ＬＶで治療した患者と比較して、全生存率および無病生存率のいずれにおいても有意な違いはなかった。しかしながら、５ＦＵ／ＬＶ単独よりも、エドレコロマブ単独でより低い全生存率（ＨＲ＝１．５０７、ｐ＝０．１８１；この分析において、ＨＲ＞１は治療アーム（５ＦＵ／ＬＶ単独の場合と比較して（エドレコロマブ単独またはエドレコロマブ＋５ＦＵ／ＬＶ）にて治療した患者について事象の危険性がより大きいことを示す）および無病生存率（ＨＲ＝１．３７６、ｐ＝０．１６４）を付与する弱い傾向にあった。エドレコロマブ治療後の生存は、この高ＴＳグループにて、５ＦＵ／ＬＶ後の生存と有意に違うものではない。したがって、１７−１Ａ抗原陽性発現体（エドレコロマブ単独療法から最大の利益を得ることが判明したもの）がこのグループの中から同定されれば、その発現体は５ＦＵ／ＬＶからの利益よりも大きくないとしても少なくとも同等の、エドレコロマブ単独から由来の治療利益を有すると考えられる。これは、高ＴＳおよび高１７−１Ａ状態の患者を考慮した場合に、エドレコロマブが５ＦＵ／ＬＶに比べて全生存率（ＨＲ＝０．５３０、ｐ＝０．４１６）および無病生存率（ＨＲ＝０．７０７、ｐ＝０．５２１）の点でわずかながら優れていると思われる。図１２を参照のこと。
【００９１】
同様に、１７−１ＡおよびＴＳ発現レベルの試験を用いて、５ＦＵ／ＬＶ単独の場合と比較して、組み合わせ療法（５ＦＵ／ＬＶ＋エドレコロマブ）から最大の利益を得る患者の集団を同定することが可能である。
同様に、１７−１ＡおよびＴＳ発現レベルの試験を用いて、エドレコロマブ、５ＦＵ／ＬＶまたはエドレコロマブと５ＦＵ／ＬＶの組み合わせのいずれかでの治療から最低の利益を得る患者の集団を同定することが可能である。かかる集団は別の療法を評価するための優れた候補体であろう。
同様に、他の治療剤からある程度の利益があるとの予測的な価値が示されている他のマーカー（例えば、ハーセプチンからの利益についてのＨｅｒ２／ｎｅｕなど）と１７−１Ａおよび／またはＴＳとを組み合わせて用い、エドレコロマブを単独でまたは５ＦＵ／ＬＶと組み合わせてこれらの他の治療剤と合し、このようにして利益を最大限受ける可能性のある患者のグループを同定することができる。図１を参照のこと。
【００９２】
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【００９３】
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【図面の簡単な説明】
【００９９】
（原文に記載なし）
【図１】
2005509159.tif 000004
【図２】
2005509159.tif 000005
【図３】
2005509159.tif 000006
【図４】
2005509159.tif 000007
【図５】
2005509159.tif 000008
【図６】
2005509159.tif 000009
【図７】
2005509159.tif 000010
【図８】
2005509159.tif 000011
【図９】
2005509159.tif 000012
【図１０】
2005509159.tif 000013
【図１１】
2005509159.tif 000014
【図１２】
2005509159.tif 000015
【国際調査報告】
2005509159.tif 000016
2005509159.tif 000017
2005509159.tif 000018