(57)【要約】細胞により発現されるアナライトの量に影響する薬物を同定する方法であって、該方法が、−少なくとも２つのアナライトを産生させるために細胞を刺激すること、−候補化合物の非存在下および存在下で、マトリックスのピン上でアナライトと認識分子間の少なくとも２つの認識複合体を形成させること、−マトリックスのピン上で検出複合体を得るために、該認識複合体を検出分子で処理すること、−候補化合物の非存在下および存在下で形成される検出複合体のそれぞれの量を比較すること、および−少なくとも１つの検出複合体の量に影響する候補化合物を選択すること、を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞により発現されるアナライトの量に影響する薬物を同定する方法であって、次の段階
（ａ）刺激により少なくとも２つのアナライトを発現できる細胞を含む媒体を用意すること、
（ｂ）該アナライトを発現させるための該細胞の刺激手段を用意すること、
（ｃ）候補化合物を用意すること、
（ｄ）（ａ）の媒体を（ｂ）の刺激手段と、刺激された細胞を含む媒体を得るのに十分な時間接触させること、および候補化合物を接触前、同時、または直後に添加するか；または候補化合物を添加しないこと、
（ｅ）必要に応じて細胞を破壊すること、
（ｆ）少なくとも２つの異なる認識分子（それぞれが、特異的結合部位で、アナライトの１つと結合すると知られている）を含む被覆用混合物で被覆されているピンを含むマトリックスを用意すること、
（ｇ）（ｆ）のマトリックスのピンを（ｄ）で得られた媒体と、該マトリックスのピン上での認識複合体の形成を可能とする十分な時間、接触させること（ここで、それぞれの認識複合体が、１個のアナライトのその特異的認識分子との結合により形成される複合体である）、
（ｈ）少なくとも２つの異なる検出分子（検出分子のそれぞれが、（ｇ）で形成された認識複合体の１つの特異的結合部位と、該アナライトのその認識分子との結合に干渉することなく、結合すると知られている）を用意すること、
（ｉ）（ｈ）の検出分子を（ｇ）で得られたマトリックスのピンと、該マトリックスのピン上での検出複合体の形成を可能とするのに十分な時間、接触させること（ここで、それぞれの検出複合体が、１個の認識複合体のその特異的検出分子との結合により形成される複合体である）、
（ｊ）（ｉ）において該ピン上で形成された、それぞれの検出複合体のそれぞれの量を決定すること、
（ｋ）候補化合物の非存在下および存在下で形成された、検出複合体のそれぞれの量を比較すること、
（ｌ）（ｊ）および（ｋ）で決定された、形成された検出複合体の少なくとも１つの量に影響する薬物を選択すること、
を含む、方法。
【請求項２】
該アナライトが、ヒトＩＬ−４、ＩＬ−１０、およびＩＦＮ−γからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該認識分子が、ヒトＩＬ−４、ＩＬ−１０、およびＩＦＮ−γに対する抗体からなる群から選択される、請求項１または２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
認識分子により認識されるものとは異なる該アナライトのエピトープを認識する該検出分子が、ヒトＩＬ−４、ＩＬ−１０、およびＩＦＮ−γに対する標識抗体からなる群から選択される、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
細胞により発現されるアナライトの量に影響する薬物を同定するキットであって、
（ａ）刺激により少なくとも２つのアナライトを発現できる細胞を含む媒体、
（ｂ）該アナライトを発現させるための該細胞の刺激手段、
（ｃ）必要に応じて、細胞の破壊手段、
（ｄ）少なくとも２つの異なる認識分子（それぞれが、特異的結合部位でアナライトの１つと結合し、従って（ａ）のアナライトの１つと接触して、ピン上で認識複合体を形成すると知られている）を含む被覆用混合物で被覆されているピンを含むマトリックス、
（ｅ）少なくとも２つの検出分子（検出分子それぞれが、（ｄ）により形成された認識複合体の１つの特異的結合部位と、該アナライトのその認識分子との結合に干渉することなく結合し、従って（ｄ）により形成された認識複合体と接触して、ピン上で検出複合体を形成すると知られている）、
（ｆ）該ピン上で形成された検出複合体の量を決定する手段、
（ｇ）ウェルシステム（ここで、その数および形態が、（ｄ）のマトリックスに含まれるピンに対応する）、
（ｈ）必要に応じて、（ａ）の細胞により発現されたアナライトに対する校正スタンダード、
（ｉ）必要に応じて、既知の量／濃度の（ａ）の細胞により発現されるアナライトを含有する対照試料、および
（ｊ）必要に応じて、試料中の（ａ）の細胞により発現されるアナライトを定量または検出するための、該キットの構成要素を用いるための指示書、
を含むキット。
【請求項６】
請求項１から４のいずれか１項に記載の方法により同定される薬物。
【請求項７】
製剤として用いるための、請求項６に記載の薬物。
【請求項８】
自己免疫関連疾患またはアレルギー疾患の処置のための医薬の製造のための、請求項２から４のいずれか１項に記載の方法により同定される薬物。
【請求項９】
請求項１から４のいずれか１項に記載の方法により同定される薬物を、少なくとも１つの医薬添加剤と共に含む、医薬組成物。
【請求項１０】
自己免疫関連疾患またはアレルギー疾患を処置する方法であって、該処置が必要な対象に、請求項２から４のいずれか１項により同定される薬物を有効量投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、被覆ピンアッセイ、および媒体中の細胞により発現される複数のアナライトを検出する方法、例えば、細胞によるアナライトの発現に影響する薬物（agent）を同定する方法に関する。
【０００２】
一般に、媒体中のこの種のアナライトを検出するアッセイは、該アナライトを含有する媒体を認識分子と接触させること、および必要に応じて、形成された認識複合体を検出分子とさらに接触させること、および形成された検出複合体の量を決定することにより、行われる。該接触は、該アナライトを含有するマイクロタイタープレートのウェル中で行われる。例えば、いくつかのアナライトが測定されることが望まれる場合、複雑な方法が必要となる。
我々はここで、このような複雑な方法を容易にすることを見出した。
【０００３】
１つの態様において、本発明は、細胞により発現されるアナライトの量に影響する薬物を同定する方法を提供する。該方法は、次の段階：
（ａ）刺激により少なくとも２つのアナライトを発現できる細胞を含む媒体を用意すること、
（ｂ）該アナライトを発現させるための該細胞の刺激手段を用意すること、
（ｃ）候補化合物を用意すること、
（ｄ）（ａ）の媒体を（ｂ）の刺激手段と、刺激された細胞を含む媒体を得るのに十分な時間接触させること、および候補化合物を接触前、同時、または直後に添加するか；または候補化合物を添加しないこと、
（ｅ）必要に応じて細胞を破壊すること、
（ｆ）少なくとも２つの異なる認識分子（それぞれが、特異的結合部位で該アナライトの１つと結合すると知られている）を含む被覆用混合物で被覆されているピンを含むマトリックスを用意すること、
（ｇ）（ｆ）のマトリックスのピンを（ｄ）で得られた媒体と、該マトリックスのピン上での認識複合体の形成を可能とする十分な時間、接触させること（ここで、それぞれの認識複合体が、１個のアナライトのその特異的認識分子との結合により形成される複合体である）、
（ｈ）少なくとも２つの異なる検出分子（検出分子のそれぞれが、（ｇ）で形成された認識複合体の１つの特異的結合部位と、該アナライトのその認識分子との結合に干渉することなく、結合すると知られている）を用意すること、
（ｉ）（ｈ）の検出分子を（ｇ）で得られたマトリックスのピンと、該マトリックスのピン上での検出複合体の形成を可能とするのに十分な時間、接触させること（ここで、それぞれの検出複合体が、１個の認識複合体のその特異的検出分子との結合により形成される複合体である）、
（ｊ）（ｉ）において該ピン上で形成された、それぞれの検出複合体のそれぞれの量を決定すること、
（ｋ）候補化合物の非存在下および存在下で形成された、検出複合体のそれぞれの量を比較すること、
（ｌ）（ｊ）および（ｋ）で決定された、形成された検出複合体の少なくとも１つの量に影響する薬物を選択すること、
を含む。
【０００４】
本発明によれば、
−「細胞」は、媒体中で刺激により少なくとも２つのアナライトを発現できる、１以上の細胞または細胞株、好ましくは１つの細胞株を含み、
−「アナライト」は、アッセイされるべき物質であり、
−媒体中に溶解可能な少なくとも２つのアナライトが、単一のピンシステムを用いて同時に検出され、
−アナライトは、刺激により細胞（細胞株）によって細胞外または細胞内で発現され、
−少なくとも２つ、例えば、２から１０、好ましくは２から６、例えば、３から４つのアナライトがアッセイされる。
【０００５】
本発明によるアナライトは、サイトカイン、ケモカイン、（認識）受容体、抗体、およびオリゴヌクレオチドの様な、生体内現象を仲介可能なポリペプチド／オリゴペプチド／オリゴヌクレオチドを含む。
【０００６】
サイトカインは、ＢおよびＴリンパ球細胞（「Ｂ細胞」および「Ｔ細胞」）、ナチュラルキラー（「ＮＫ」）細胞、抗原提示（「ＡＰＣ」）細胞の様な、免疫系細胞の応答を制御する一群の化合物である。該「サイトカイン」は、誘導物質（刺激物）との接触に際して、ある種の細胞集団により放出される溶解性物質であり、細胞内メディエーターとして働く。用語「サイトカイン」および「リンホカイン」は互換使用できる。該化合物の命名を単純にする試みで、１９７９年に開催された第２回国際リンホカインワークショップの参加者グループが、白血球の異なる集団間のコミニケーションシグナルとして働くタンパク質の能力に基いて、命名の統一システムを展開するために用語「インターロイキン」（ＩＬ）を提唱した。サイトカインは、好ましくは、インターロイキン（好ましくは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３）、インターフェロン（好ましくは、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ分子）（例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β）、トランスフォーミング成長因子ＴＧＦ（ＴＧＦ−βファミリー、インヒビンファミリー、ＤＰＰ／ＶＧ１ファミリー、およびミュラー管阻害物質ファミリーからなるサイトカインの群から選択されるＴＧＦ−βスーパーファミリーを含む）、および顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子ＧＭ−ＣＳＦを含む。サイトカインは、サイトカイン受容体を含む。「サイトカイン（スーパーファミリー）受容体」は、密接に関係する糖タンパク質細胞表面および可溶性受容体であって、ＷＳＸＷＳドメインを多くの場合含む、かなりの相同性を有し、かつ一般にサイトカイン受容体スーパーファミリーのメンバーとして分類される。スーパーファミリーのメンバーは、ＩＬ−２（α、β、およびγ鎖）、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５；ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）；オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）の受容体、およびプロラクチン、成長ホルモン（ＧＨ）、絨毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）の受容体も含むが、これらに限定されない。該受容体は一般に、膜貫通型タンパク質として発現されるが、それらは媒体試料の溶液中にも見出され得る。
【０００７】
ケモカインは、「インタークリン」および「ＳＩＳサイトカイン」としても知られており、白血球を誘引し、そして活性化し、これにより免疫系の刺激および制御で役立つ、小分泌タンパク質（例えば、７０〜１００アミノ酸、そして約８〜１０ｋＤａ）のファミリーを含む。名称「ケモカイン」は、走化性サイトカインに由来し、該タンパク質の白血球の走化性を刺激する能力を意味している。実際、ケモカインは、病理組織への炎症細胞の主な誘引物質を含む（概論として、Baggiolini et al., Advances in Immunology, 55:97-179 (1994)を参照）。既に同定されたケモカインは一般に、互いに２０〜７０％のアミノ酸同一性を示し、かつ４つの高保存システイン残基を含有する。該システイン残基の最初の２つの相対位置に基づき、ケモカインはさらにサブファミリーに分類されている。ヒト染色体４に位置する遺伝子によりコード化されている、「Ｃ−Ｘ−Ｃ」または「α」サブファミリーでは、該最初の２つのシステインの間に１アミノ酸が存在する。ヒト染色体１７上の遺伝子によりコード化されてる、「Ｃ−Ｃ」または「β」サブファミリーでは、最初の２つのシステインは隣接する。いくつかのケモカインのＸ線結晶構造解析およびＮＭＲ研究は、それぞれのファミリーで、１番目と３番目のシステインがジスルフィド結合を形成し、そして２番目と４番目のシステインが第２のジスルフィド結合を形成し、このことが該タンパク質の天然立体構造に強く影響することを示した。ケモカインタンパク質のファミリーは、Zlotnik et al., 12 Immunity 121-27 (2000)およびSaunders et al., 4 DDT 80-92 (1999)において、より詳細に記載されている。
【０００８】
化学誘引物質の認識受容体は、化学誘引分子と相互作用可能な受容体である。認識とは一般に、典型的に相互作用する生体分子（例えば、受容体とそのリガンド）を意味している。ケモカインは、ケモカイン受容体、そして好ましくは、ケモカイン受容体であるＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０、ＣＣＲ１１、ＸＣＲ１、ＣＸ３ＣＲ１、Ｃ５ａ受容体、アラキドン酸誘導体ロイコトリエンＢ４受容体、血小板活性化因子受容体、ホルミル−ｍｅｔ−ｌｅｕ−ｐｈｅ受容体、好中球活性化タンパク質１受容体、インターロイキン８受容体、血小板因子４受容体、血小板塩基性タンパク質受容体、黒色腫成長刺激因子／ＧＲＯ受容体を含むが、これらに限定されない。
【０００９】
本発明によるアナライトを発現させるための細胞の刺激手段は、既知のものであるか、または例えば、既知の方法に準じて見出されてもよいし、あるいは本明細書に記載されるものである。刺激物質は、例えば、抗体、抗原、スーパー抗原、および化学物質を含む。細胞を破壊する方法は、既知のものであるか、または例えば、既知の方法に準じて見出されてもよい。本発明による細胞破壊は、必要に応じて、例えば、アッセイされる（検出されることが望まれる）アナライトが細胞内で発現されている場合、段階（ｆ）を行う前に実行され得る。
【００１０】
本発明のピンを含むマトリックスは、ピンが設置されているマトリックスからなり、これは本明細書において「ピンシステム」とも呼ばれる。マトリックスは、好ましくはプラスチックマトリックスである。ピンは、好ましくは、プラスチックピンまたは（前処理された）ガラスピンであり、好ましくは、本発明の被覆用混合物をその表面に、例えば、直接またはリンカーを介して固定できるプラスチックピンである。認識分子を固定（安定的に）できるプラスチックまたは（前処理された）ガラス材は、既知であるか、または通常の方法に準じて用意されてもよい。ピンは便宜上、全てが同じ大きさであるべきである。ピンの長さは、全てのピンが都合よく、ウェル（例えば、マイクロタイタープレートのウェル）に、それぞれのピンが個々の区分されたウェルに、同時に浸漬される様なものでなければならない。好ましいピンの長さは、１０ｍｍ以上（例えば、１０ｍｍから４００ｍｍ）、好ましくは、２０ｍｍから３００ｍｍ（例えば、４０ｍｍから２００ｍｍ）を含む。これらのピンは、該ピンを都合良く被覆することを可能とし、かつ該ピンをウェルに、例えば、０．２から２．０ｍｍ（例えば、０．３から１．５ｍｍ）、都合良く浸漬することを可能とする、適当な太さであるべきである。該マトリックスの大きさは、手動または（ロボット）機械のいずれかにより都合よく取り扱われ得るようなものでなければならない。該マトリックスの大きさは、例えば、所望のピンの数、およびそれらが挿入されることが意図されているウェルシステムに依存する。好ましくは、９６本以上のピン（例えば、９６から１０００００本のピン）が用いられ、例えば、都合良いピンの数は、例えば、現行の標準的マイクロタイタープレートに合うフォーマットで配置された数、例えば、９６、３８４、または１５３６を含むが；標準的オリゴヌクレオチドアレイに適応させるためのピンの大きさおよびマトリックスフォーマットの小型化も選択肢である。該ピンは、それぞれのピンが、その隣接するピンから隔離されるように設置される。該ピンは、マトリックスに規則的に設置されるべきである。そのために、ウェルシステムは、ピンの数に対応するウェルの数で用意されるべきであり、ここで該ウェルは、ピンシステムのピンが該ウェルシステムに同時に、それぞれのピンが１つのウェルに個別に浸漬される態様で浸漬され得る様に、設置される。
【００１１】
本発明によると、ピンは、少なくとも２つの異なる認識分子（該認識分子のそれぞれが、特異的結合部位でアナライトの１つと結合し、その結果、認識分子と結合したアナライト（以下、「認識複合体」と呼ばれる）を形成すると知られている）を、例えば、適当な媒体中に含む、被覆用混合物で被覆されている。適当な認識分子は、例えば、抗体、（認識）受容体（例えば、（認識）受容体の抗体フラグメントを含む）；およびアナライトと結合する能力が知られている、低分子量の化合物の様な他の物質を含む。例としては、例えば、
−サイトカイン（サイトカイン受容体がアナライトとして用いられる場合）、または
−サイトカイン受容体（サイトカインがアナライトとして用いられる場合）、
−オリゴヌクレオチド配列（相補的配列を含有するオリゴヌクレオチドがアナライトとして用いられる場合）、
を含む。
【００１２】
ピンの被覆は、通常の方法に準じて実施され、そして好ましくは、ピンシステムのピンをウェルシステム（ここで、ウェルは、認識分子で被覆されているピンを含むマトリックスを得るために、適当な媒体中の少なくとも２つの認識分子の混合物で満たされている）に浸漬することにより、簡単に実施される。
【００１３】
アナライトを含有するウェル中に被覆ピンを浸すと、例えば、刺激された無傷の細胞を含有するウェルに該ピンを浸漬することにより、あるいは、刺激された細胞を含有するウェルへ、細胞を含有する媒体中への細胞内アナライトの放出を可能とするために、その膜を破壊した後、該ピンを浸漬することにより、アナライトはその特異的認識分子と結合し、そして認識複合体が該ピン上で形成される。候補化合物の非存在下で、特定量の該認識複合体がピン上で形成され、アナライトの発現に影響する候補化合物の存在下で、該認識複合体の少なくとも１つが、その非存在下で形成された特定量より多いかまたは少ない量で形成される。かかる影響が本発明により見出される候補化合物は、以下、アンタゴニストもしくはアゴニスト、または本発明の（による）薬物と呼ばれる。
【００１４】
刺激された細胞（故に、アナライト）を含む媒体は、好ましくは、本発明による被覆ピンの存在下で、認識複合体の形成に十分な時間、インキュベートされる。必要な時間は、予試験で決定される。段階（ｇ）による接触は、好ましくは、段階（ｆ）により用意されたピンシステムのピン、対応するウェルシステム（ここで、ウェルが本発明による被覆用混合物を含む媒体で満たされている）に浸漬することで、実行される。
【００１５】
形成された該認識複合体の形態および量は、該認識複合体を検出分子、好ましくは、少なくとも２つの検出分子（それぞれが、単一の認識複合体中のアナライトの特異的結合部位と、該アナライトの認識分子との結合に干渉することなく結合すると知られている）の混合物で処理すること、従って、本発明のマトリックスのピン上で「検出複合体」を形成し、そして形成されたそれぞれの検出複合体のそれぞれの量を決定することにより、決定される。該検出複合体の形成のため、認識分子に対するアナライト中の結合部位は、検出分子の該アナライトとの結合部位と異なっていなければならず、そして検出分子の認識複合体中の該アナライトとの結合は、該アナライトの認識分子との結合に干渉してはならない（すなわち、それぞれの検出複合体は、対応する認識複合体の量で形成され、言い換えれば、該検出分子は、認識分子により認識されるものとは異なる、アナライトの１つのエピトープを認識する）。適当なシステムは、見出されてもよいし、または既知のもの、例えば、「サンドイッチＥＬＩＳＡ」システム、例えば、「（抗体）−（アナライト）−（標識抗体）−サンドイッチ」ででもよい。
【００１６】
本発明の段階（ｉ）による被覆ピンを検出分子と接触させることは、段階（ｇ）のピンシステムを少なくとも２つのウェルシステム（ここで、ウェルは、それぞれの場合において、１つの適当な検出分子で満たされている）に浸漬することにより、または少なくとも２つの異なる適当な検出分子の混合物に浸漬することにより、行われる。検出複合体は、マトリックスのピン上で形成される。
【００１７】
検出分子は、例えば、酵素または標識が例えば定量的に測定される標識分子、例えば、蛍光または発光標識分子を含む。適当な標識は、既知であるか、または例えば、通常の方法に準じて見出されてもよい。本発明による検出分子は、好ましくは、西洋わさびペルオキシダーゼ基質、アルカリホスファターゼ基質、発光基質、ポリメラーゼ連鎖反応溶液、ランタニドの様な時間分解蛍光基質、および必要に応じてエンハンサー液を含む。標識には、好ましくは、ランタニド、例えば、ユウロピウム、テルビウム、サマリウム、およびジスプロシウムが用いられる。適当な検出分子または検出分子の混合物についての好ましい例は、ユウロピウムで標識された、ヒトＩＬ−４に対する抗体、サマリウムで標識された、ヒトＩＦＮ−γに対する抗体、テルビウムで標識された、ヒトＩＬ−１０に対する抗体、または該標識抗体の個々の混合物を含む。
【００１８】
段階（ｊ）により形成されたアナライトの量の決定は、該検出複合体を単離すること、すなわち、ウェルシステムからマトリックスシステムを単に取り出すこと、および該マトリックスシステムのピン上で形成された検出分子の結果を測定することにより、行われる。該測定は、一般的なアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＤＥＬＦＩＡ、およびオリゴヌクレオチド標的アッセイにおいて、本発明により形成された検出複合体の量を決定する手段を用いてなされる。好ましくは、ピン上のそれぞれのアナライトの量は、該ピンをウェルシステム（ここで、ウェルは、例えば、適当な媒体中の適当な検出成分で満たされている）に浸漬することにより検出される。適当な検出媒体は、例えば、ピン上の被覆と接触して検出複合体を形成することにより、光学または蛍光特性を変えることができる検出分子を含有している基質媒体を含む。適当な検出分子は、既知であるか、または通常の方法に準じて見出されてもよく、例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ基質、アルカリホスファターゼ基質、ルシフェラーゼ基質、時間分解蛍光基質（例えば、ランタニド標識を用いる）、およびエンハンサー液、およびポリメラーゼ連鎖反応溶液を含む（例えば、検出分子が酵素の場合、酵素活性を測定し、あるいは蛍光標識の場合、適当な波長での適当な発光／蛍光測定方法（例えば、通常の方法を含む）により、標識特異的結果を測定する）。
【００１９】
本発明による候補化合物は、例えば、化学ライブラリー、および天然産物ライブラリー中の低分子量化合物、および例えば、天然または合成物質ライブラリー（すなわち、化学的実体の系統的収集物）に存在するアンチセンスオリゴヌクレオチド（これらは、段階（ｂ）による細胞でのアナライト発現の産生に対する影響が未知であり、アッセイされることが望まれている）を含む。
【００２０】
本発明の方法により同定されるアゴニストまたはアンタゴニスト（本明細書において、「本発明の（による）薬物」とも呼ばれる）は、本発明により、細胞により発現されるアナライトの量への影響が決定された、選択された候補化合物の１つである。薬物は、アゴニストまたはアンタゴニストであってよく、例えば、（オリゴまたはポリ）ペプチド、モノクローナル抗体、低分子量化合物の様な化学物質、天然に存在する化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。本発明により同定されるアゴニストまたはアンタゴニストは、生体内でのアナライトの産生に干渉できるため、医薬的に活性な化合物および／または診断ツールとして有用である。
【００２１】
少なくとも２つのアナライトが、
−刺激により少なくとも２つのアナライトを発現する細胞を含む媒体、
−検出分子の混合物を含む媒体、
を、候補化合物の非存在下および存在下で含むウェルに単に浸漬される、単一のピンシステムで決定されるため、本発明による方法は先行技術工程と比較して有利である。
【００２２】
従って、少なくとも２つ、またはそれ以上の異なるアナライトを同時に決定するために、単一のピンマトリックスが使用される。該決定工程は、例えば、第１の実施でのピンシステムとは異なる認識分子の混合物でピンが被覆されているピンシステムを用いて、該アナライトを含む同一ウェルにおいて繰り返されてもよい。これにより、決定されるアナライトの数が２倍となる。認識分子との接触と検出成分との接触との間の様な、異なる決定段階間の洗浄操作（例えば、ＥＬＩＳＡ検出方法において必要である）は、省略してもよいし、または単純化（例えば、洗浄が所望される場合、洗浄用媒体を含むウェルにピンマトリックスシステムを単に浸漬することを含む）されてもよい。
【００２３】
別の態様において、本発明は、細胞により発現されるアナライトの量に影響する薬物を同定するためのキットを提供し、該キットは、
（ａ）刺激により少なくとも２つのアナライトを発現できる細胞を含む媒体、
（ｂ）該アナライトを発現させるための該細胞の刺激手段、
（ｃ）必要に応じて細胞の破壊手段、
（ｄ）少なくとも２つの異なる認識分子（それぞれが、特異的結合部位でアナライトの１つと結合し、従って、（ａ）のアナライトの１つと接触して、ピン上で認識複合体を形成すると知られている）を含む被覆用混合物で被覆されているピンを含むマトリックス、
（ｅ）少なくとも２つの検出分子（検出分子それぞれが、（ｄ）により形成された認識複合体の１つの特異的結合部位と、該アナライトのその認識分子との結合に干渉することなく結合し、従って（ｄ）により形成された認識複合体と接触して、ピン上で検出複合体を形成すると知られている）、
（ｆ）該ピン上で形成された検出複合体の量を決定する手段、
（ｇ）ウェルシステム（ここで、その数および形態が、（ｄ）のマトリックスに含まれるピンに対応する）、
（ｈ）必要に応じて、（ａ）の細胞により発現されるアナライトに対する校正スタンダード（例えば、校正試料）、
（ｉ）必要に応じて、既知の量／濃度の（ａ）の細胞により発現されるアナライトを含有する対照試料、および
（ｊ）必要に応じて、試料中の（ａ）の細胞により発現されるアナライトを定量または検出するための、該キットの構成要素を用いるための指示書、
を含む。
【００２４】
本発明のキットにおいて、任意の構成要素（ａ）から（ｉ）は、物質的構成要素（例えば、試験されるべき試料の適当な環境を含む）を含む。
本発明によるキットは、診断キットとしても有用である。
【００２５】
別の態様において、本発明は、例えば、自己免疫関連疾患またはアレルギー疾患での診断キットとして用いるために、本発明によるキットを提供する。
【００２６】
ピンシステムのピン上で形成される検出複合体の量を決定する手段は、上記の手段を含む。（ａ）の細胞により発現されるアナライトに対する校正スタンダード、および対照試料は、例えば、通常の方法により、または同様にして、必要に応じて用意されてもよい。
【００２７】
ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ細胞）は、適応免疫系が種々の病原体を制御するために展開する、エフェクター機序の調節に主な役割を果たす。Ｔｈ細胞は、主要組織適合性クラスＩＩ（ＭＨＣ−ＩＩ）分子に関連して、専門の抗原提示細胞（ＡＰＣ）により提示される、特定の抗原ペプチドを認識する。活性化により、Ｔｈ細胞は増殖し、そしてそのサイトカイン分泌パターンに基づき定義された、異なるＴｈ細胞サブセットに分化する。Ｔｈ細胞分化は、遺伝的背景、抗原量、同時刺激分子の濃度、および上記のサイトカイン環境（cytokine milieu）（ここで、免疫応答が生じる）の様な因子により決定される、多因子決定である（例えば、Coffman RL and Reiner SL, Science (1999), 284: 1283を参照）。従って、ＩＬ−１２は、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−βの産生を特徴とする、Ｔｈ１フェノタイプへのＴｈ細胞の誘導（driving）に関与する。Ｔｈ１細胞は、例えば、細胞介在性免疫の特徴である前炎症性応答で関与し、そしてこのためそれらは多くの感染性生物の除去のために重要である。Ｔｈ２細胞は、例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３を産生し、そしてその発生は、ＩＬ−４により誘導される。Ｔｈ２細胞は、抗体介在性Ｂ細胞応答の有力なヘルパーであり、抗炎症機能を発揮する。一般に、未感作ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔｈ細胞は、Ｔｈ１およびＴｈ２サイトカイン共に産生可能なサブセットであるＴｈ０フェノタイプにまず移行する。続いて、特定の抗原での刺激が繰り返され、Ｔｈ０細胞が、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞にさらに分化する。生じたＴｈ１またはＴｈ２細胞サブセットは、部分的には、相互サブセットにより分泌されるサイトカインの対向阻害効果のため、特定の免疫反応過程を通じて優勢なままである（例えば、O’Garra A. Immunity (1998), 8: 275を参照）。しかしながら、激化したＴｈ１またはＴｈ２応答は宿主に有害なものである。故に、Ｔｈ１細胞は自己免疫疾患と関連する病因的免疫で関与し、Ｔｈ２細胞はアレルギー疾患を仲介する。幸運なことに、たいていのヒトＴｈ細胞は、様々な組合せのＴｈ１およびＴｈ２サイトカインを共発現する。該Ｔｈ０細胞は、病原体の除去に機能的に関与する、釣り合いのとれたＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインを産生する一方で、最小の病因的免疫を誘導する安定的サブセットも表す。さらに、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＩＬ−１０の存在下で、Ｔ制御（Ｔｒ１）細胞へも分化する。Ｔｒ１細胞は、高濃度のＩＬ−１０およびＴＧＦ−β１を産生し、Ｔｈ１およびＴｈ２応答の両方にダウンレギュレート作用を発揮する（例えば、Groux H, O'Garra A, Bigler M, Rouleau M, Antonenko S, De Vries JE and Roncarolo MG, Nature (1997), 389: 737を参照）。
【００２８】
免疫系は、特定の刺激それぞれに最も適当な免疫応答の種類を生むために展開し、そしてさらに、危険信号がなくなると、該応答をスイッチオフするための制御機序を展開させることは、明らかである。しかしながら、該制御機序にも関わらず、病因的免疫を生じる極度のＴｈ偏りの状況がしばしば起こり、その場合、偏ったサイトカインのエフェクター機能と拮抗し、そして／または進行中の免疫応答を非病因的免疫に戻すことができる、適切な活性物質を有することが、極めて有益である。本発明により、我々は、ヒトＩＬ−４、ＩＦＮ−γ、およびＩＬ−１０産生のモジュレーターを同定するための高処理スクリーニング（ＨＴＳ）アッセイの基礎を見出した。これらのサイトカインは、病因的免疫状況を含む、Ｔｈ細胞の分化過程および／またはエフェクター機能で重要な働きをする。ＩＬ−４産生のアンタゴニスト、例えば、特異的アンタゴニストは、アレルギー疾患を標的とするための候補であり、ＩＦＮ−γを抑制するアンタゴニスト、例えば、特異的アンタゴニストは、自己免疫疾患の処置に有益であり、そしてＩＬ−１０産生のアゴニスト、例えば、特異的アゴニストは、免疫応答の可能性のあるダウンレギュレーターであり、かつ対応する疾病の処置および予防に有用である。
【００２９】
別の態様において、本発明は、本発明（ここで、
−アナライトは、ヒトＩＬ−４および／またはＩＬ−１０および／またはＩＦＮ−γからなる群から選択され、
−認識分子は、ヒトＩＬ−４、ＩＬ−１０、およびＩＦＮ−γに対する抗体からなる群から選択され、
−該検出分子（該検出分子は、認識分子により認識されるものとは異なる、該アナライトのエピトープを認識する）は、ヒトＩＬ−４、ＩＬ−１０、およびＩＦＮ−γに対する標識抗体（例えば、該抗体は、ユウロピウム、テルビウム、サマリウム、およびジスプロシウムの様なランタニドにより標識される）からなる群から選択される）
により細胞によって発現される、アナライトの量に影響する薬物を同定する方法を提供する。
【００３０】
本発明の薬物の特定の医薬活性、例えば、アゴニストまたはアンタゴニストは、検出されるアナライトの生物学的活性に依存し、生体内での特定のアナライトの放出により仲介される疾病での医薬活性を含む。例えば、アナライトは、サイトカイン、ケモカイン、（認識）受容体、抗体、およびオリゴヌクレオチドの様な生体内現象を仲介できるタンパク質から選択される。
【００３１】
本発明の薬物は、自己免疫関連疾患および／またはアレルギー疾患に対する治療活性を示す。
別の態様において、本発明は、
−医薬として用いるための、本発明の薬物、
−自己免疫関連疾患またはアレルギー疾患の処置のための医薬の製造のための、本発明の薬物、
を提供する。
【００３２】
処置のための本発明の薬物は、１以上（例えば、２以上の組合せ）、好ましくは、１つの本発明の薬物を含む。
【００３３】
別の態様において、本発明は、本発明の薬物を、少なくとも１つの医薬上の添加剤、例えば、適当な担体および／または希釈剤（例えば、充填剤、結合剤、崩壊剤、流動性調節剤、滑沢剤、糖および甘味剤、芳香剤、保存剤、安定剤、湿潤剤および／または乳化剤、軟化剤、保湿剤、浸透圧を調節するための塩、および／またはバッファーを含む）と共に含む、医薬組成物を提供する。
【００３４】
該組成物は、通常の方法に従い（例えば、準じて）、例えば、混合、造粒、被覆、溶解、または凍結乾燥工程により製造される。単位用量製剤は、例えば、約０．５ｍｇから約１０００ｍｇ、例えば、１ｍｇから約５００ｍｇを含有する。
【００３５】
さらなる態様において、本発明は、自己免疫関連疾患またはアレルギー疾患の処置方法を提供し、該処置は、該処置の必要な対象に、有効用量の本発明の薬物、例えば、あるいは本発明の医薬組成物を投与することを含む。
【００３６】
処置は、処置および予防を含む。
該処置のために、適当な用量はもちろん、例えば、化学的性質および利用される本発明の薬物の薬物動力学データ、個々の宿主、投与経路、および処置される状態の性質および重症度に非常に依存するであろう。しかしながら、一般に、大型哺乳類、例えば、ヒトでの満足な結果のための、所定の１日用量は、本発明の薬物約０．０１ｇから０．１ｇの範囲にあり；通常、例えば、１日最大４回に分けた用量で投与される。
【００３７】
本発明の薬物は、任意の通常の経路、例えば、経腸（例えば、経鼻、経頬、経直腸、経口投与を含む）；非経腸（例えば、静脈内、筋内、皮内投与を含む）；または局所（例えば、経皮、鼻腔内、気管内投与を含む）；例えば、被覆または非被覆錠剤、カプセル剤、注射用溶剤または懸濁剤（例えば、アンプル、バイアルの形）、クリーム剤、ゲル剤、軟膏、吸入用粉剤、発泡剤、チンキ剤、口紅、ドロップ剤、スプレー剤、または座剤の形で投与される。
【００３８】
本発明の薬物は、医薬的に許容される塩、例えば、酸付加塩または金属塩の形；または遊離形；必要に応じて、溶媒和物の形で投与される。塩の形の本発明の薬物は、遊離形；必要に応じて、溶媒和物の形の薬物と同じ順序の活性を表す。
【００３９】
本発明の薬物は、本発明のみ、または１以上の他の医薬的に活性な薬物との組合せによる医薬的処置に用いられる。組合せは、固定の組合せ（ここで、２以上の医薬的に活性な薬物が、同一製剤中にある）；キット（ここで、別々の製剤中の２以上の医薬的に活性な薬物が、例えば、同時投与の指示のある、同一パッケージで売られている）；および遊離の組合せ（ここで、医薬的に活性な薬物は、別々にパッケージされているが、同時または連続投与の指示が与えられている）を含む。
別の態様において、本発明は、本発明の薬物の診断／代替分子としての使用を提供する。
【００４０】
図面の説明
図１は、♯９８０１６Ｔ０細胞のサイトカイン産生を示す。Ｔ細胞刺激は、下記のアナライト含有媒体を産生する細胞株の調製に記載の様に、再刺激の１２日後に行われる。細胞質内染色が活性化の４時間後に行われ、単細胞レベルでのサイトカイン産生特性が測定される。活性化の２４時間後にＥＬＩＳＡにより測定されたサイトカイン産生の総量は、ＩＬ−２  ５．２ｎｇ／ｍｌ、ＩＦＮ−γ  １３．７ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−４  ７．９ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−５  ０．１ｎｇ／ｍｌ、およびＩＬ−１０  ２４．６ｎｇ／ｍｌであり、これは細胞質内染色により測定されたフェノタイプと相関する。
【００４１】
図２は、下記のＤＥＬＦＩＡ法による、組換えヒトサイトカインスタンダードの検出を示す。組換えヒトＩＬ−４（R&D Systems, Minneapolis, Minnesota）、ＩＬ−１０（PharMingen）、およびＩＦＮ−γ（R&D Systems）がスタンダードとして用いられる。洗浄およびブロッキング溶液は、上記のＥＬＩＳＡ法用と同じである。全試料はトリプリケートでアッセイされる。それぞれの点は、結果平均±標準偏差を表す。３つのサイトカイン全てが、希釈剤として組織培養上清を用いる混合溶液中で検出される。これらの結果は、トリプルＤＥＬＦＩＡが５０ｐｇ／ｍｌ未満のそれぞれのサイトカインを検出することを示す。
【００４２】
図３は、刺激された♯９８０１６Ｔ０細胞のＴ細胞の連続希釈液を用いて得られた結果を示す。これらの結果は、抗ＣＤ３免疫ビーズおよび抗ＣＤ２８ｍＡｂを刺激シグナルとして用いて、得られる（黒丸）。刺激されていない細胞の上清に存在するサイトカイン濃度（白丸）は、媒体のみを含有する（細胞を含まない）ウェルで観察される濃度と、有意な差はない。Ｔ細胞刺激およびＤＥＬＦＩＡアッセイ共に、上記の３８４ウェルプレートを用いて行われる。全試料はトリプリケートでアッセイされる。それぞれの点は、結果平均±標準偏差を表す。
【００４３】
図４は、本発明によるアッセイでの免疫抑制剤シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）量の増加のもと、刺激された♯９８０１６Ｔ０細胞のＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、およびＩＬ−１０産生の特徴的用量依存性阻害を説明する。Ｔ細胞は、抗ＣＤ３免疫ビーズおよび抗ＣＤ２８で２４時間活性化される。全試料はトリプリケートでアッセイされる。それぞれの点は結果平均±標準偏差を表す。
【００４４】
次の実施例では、温度は全て摂氏で与えられ、校正されていない。
実施例
実施例１
アナライト含有媒体を産生する細胞株の調製
ＩＬ−４、ＩＦＮ−γ、およびＩＬ−１０をアナライトとして選択する。
アトピー性皮膚炎（ＡＤ）の患者の皮膚生検由来のヒトＣＤ４＋Ｔｈ０細胞株、すなわち、細胞株♯９８０１６Ｔｏを、Carballido JM, Aversa G, Kaltoft K, Cocks BG, Punnonen J, Yssel H, Thestrup-Pedersen K and de Vries JE. J Immunol (1997), 159: 4316に記載の方法により単離する。概略、特定の皮膚プリックテストおよび血清ＩｇＥ濃度によりＤｅｒ  ｐ  １に対してアレルギー性であると判定したＡＤ患者を、Ｄｅｒ  ｐ  １でパッチチャレンジさせる。アレルゲンに曝露した２４時間後、陽性皮膚反応を生じた患者からパンチ生検検体（４ｍｍ）を採取し、４つのおよそ等しい大きさの断片にカットし、１％  ヒトＡＢ血清、および１μｇ／ｍｌ  精製Ｄｅｒ  ｐ  １（ALK Laboratories, Horsholm, Denmark）含有Yssel's培地（Gibco BRL）中１２ウェルプレート（Costar, Cambridge, MA）において、３７℃、８％  ＣＯ２、加湿雰囲気下で培養する。該培養物に１００Ｕ／ｍｌ  ｒｈＩＬ−２、および４００Ｕ／ｍｌ  ｒｈＩＬ−４を、０．３ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＩＬ−１２（R&D Systems, Minneapolis, MN）の存在下および非存在下で添加する。Ｔｈ細胞は皮膚生検検体から遊走し、異なる培養条件下で同等の倍増時間で増殖する。関連するサイトカイン含有培地を、２、３日毎に取り替える。増殖の１４日後、該細胞培養物を１μｇ／ｍｌ  精製Ｄｅｒ  ｐ  １で再刺激し、サイトカインカクテルを添加した培養物中で再び増殖させる。該第２の培養サイクルの終わりに、５×１０７より多い細胞を、それぞれの条件から回収する。続いて、ヒトＴｈ細胞を１０％  ＦＣＳ含有Yssel's培地で維持し、１μｇ／ｍｌ  ＰＨＡ、およびフィーダー細胞の供給源として異系（５０Ｇｙ照射）末梢血単核細胞を用いて刺激を繰り返し、ＩＬ−２、およびＩＬ−４±ＩＬ−１２で増殖させる。ＣＤ４＋細胞株♯９８０１６Ｔ０細胞を選択する。このことは、該細胞が刺激により、ＦＡＣＳにより単細胞レベルで検出した細胞質内サイトカイン染色により、あるいはＥＬＩＳＡにより決定した全集団レベルでのサイトカイン産生により判断した、Ｔｈ０フェノタイプを一貫して示すためである（例えば、図１も参照）。
【００４５】
ＦＡＣＳおよびＥＬＩＳＡ（選択した細胞株によるサイトカイン産生の立証）
ヒト♯９８０１６Ｔ０細胞を再刺激の１２から１６日後に回収し、ＰＢＳで３回洗浄し、２４ウェルプレート（Costar）において、１０％  ＦＣＳ、５μｇ／ｍｌ  抗ＣＤ３ｍＡｂ  ＳＰＶ−Ｔ３（５）、および１ｎｇ／ｍｌ  １２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−酢酸塩（ＴＰＡ）（SIGMA, St. Louis, MO）含有Yssel's培地を用いて刺激する。単細胞中のＩＬ−４およびＩＦＮ−γの細胞質内の量を、Carballido JM, Aversa G, Kaltoft K, Cocks BG, Punnonen J, Yssel H, Thestrup-Pedersen K and de Vries JE. J Immunol (1997), 159: 4316に記載の方法により決定する。概略、Ｔｈ細胞を、刺激の２時間後に１０μｇ／ｍｌ  ブレフェルジンＡ（Epicentre Technologies, Madison, WI）で処理し、さらに２時間培養する。次に、Ｔｈ細胞を回収し、２％  ホルムアルデヒドで固定し、サポニンで透過処理し、そしてＰＥおよびＦＩＴＣをそれぞれ結合した抗ＩＬ−４および抗ＩＦＮ−γｍＡｂ（PharMingen, San Diego, CA）で染色する。Ｔｈ細胞を、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエア（Becton Dickinson, San Jose, CA）を用いて解析する。総サイトカイン産生を決定するために、Ｔｈ細胞を回収し、１０％  ＦＣＳ、５μｇ／ｍｌ  抗ＣＤ３ｍＡｂ  ＳＰＶ−Ｔ３、および１ｎｇ／ｍｌ  ＴＰＡ含有Yssel's培地１ｍｌ中で、２４ウェルプレート（Costar）を用いて１０６細胞／ウェルで２４時間刺激する。サイトカイン産生を、次の特異的サンドイッチＥＬＩＳＡにより測定する：Maxisorp Ｃ９６ウェル免疫プレート（NUNC, Roskilde, Denmark）を、３μｇ／ｍｌ  炭酸塩バッファー（SIGMA C-3041）中の特異的捕獲ｍＡｂ溶液５０μｌ／ウェルで、室温にて一晩被覆する。被覆後、該プレートをＰＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、ＰＢＳ中のカゼイン加水分解物（OKOID L41）および５％  Ｔｗｅｅｎ２０  ２００μｌとの１時間のインキュベーションにより、室温でブロッキングする。その後、該プレートを、２５μｌ／ウェルの別のＴ細胞上清、または特定のスタンダードと２５μｌ／ウェルのビオチン化ｍＡｂと共にインキュベーションする。室温で一晩インキュベーションした後、該プレートを再び洗浄し、アルカリホスファターゼ結合エクストラアビジン（SIGMA E-2636）と共に２時間インキュベーションする。読み取りを、基質として１Ｍ  ジエタノールアミンバッファー中のｐ−ニトロフェニルリン酸塩（SIGMA N-2640）を用いて行い、ＳｏｆｔＭａｘソフトウエア（Molecular Devices）を備え付けたＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ３４０分光光度計（Molecular Devices, Sunnyvale, California）にて４０５〜４９２ｎｍで吸光度を測定する。捕獲および検出に用いるｍＡｂは、それぞれ、ＩＬ−４  ＥＬＩＳＡ用に８Ｆ１２および３Ｈ−４であり、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡ用に４３−１１および４５−１５である。あるサイトカインの産生量を図１に示す。
【００４６】
実施例２
ヒトサイトカインインヒビターについてのＨＴＳアッセイ
段階１．Ｔ細胞刺激
抗ＣＤ３ｍＡｂ  ＳＰＶ−Ｔ３を、製造元の指示に従い、活性化免疫ビーズマトリックス（Irvine Scientific, Santa Ana, California）１００ｍｇと結合させる。免疫ビーズ結合抗ＣＤ３をＴ細胞増殖アッセイでタイトレーションし、最終濃度７５μｇ／ｍｌ（抗ＣＤ３ｍＡｂ２μｇ／ｍｌに相当）で、一連の実験全てで用いる。抗ＣＤ２８ｍＡｂ（PharMingen, San Diego, Californiaより市販）を５μｇ／ｍｌで用いる。♯９８０１６Ｔ０細胞の連続希釈液を、候補化合物の存在下または非存在下で、Yssel's培地中の抗ＣＤ３免疫ビーズおよび抗ＣＤ２８ｍＡｂで２４時間刺激する。Ｔ細胞刺激を、３８４ウェル組織培養プレート（Nunc #164688）を用いて４０μｌの容量で行う。
【００４７】
段階２．認識分子でのピン被覆、および複合体形成
共通して用いる認識分子として、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、およびＩＦＮ−γに対するｍＡｂを用いる。ＩＬ−４、ＩＬ−１０、およびＩＦＮ−γＤＥＬＦＩＡ用の被覆ｍＡｂを、本明細書においてそれぞれ８Ｆ１２、ＪＥＳ３−１２Ｇ８、および４３−１１と呼ぶ。サイトカイン産生を、Wallac１４２０Victor２多標識カウンターにおいて時間分解蛍光により決定する。
【００４８】
ピンを被覆する目的のため、３８４ウェル組織培養プレート（Nunc #164688）に合う、マトリックス（ここで、３８４本のピンの位置が決まっている）のピンを、３０μｌ／ウェルの炭酸塩バッファー、ｐＨ９．６（SIGMA C3041）中の２μｇ／ｍｌ  ｍＡｂ  ８Ｆ１２、２．５μｇ／ｍｌ  ｍＡｂ  ＪＥＳ３−１２Ｇ８、および２．５μｇ／ｍｌ  ｍＡｂ  ４３−１１含有カクテルに、該ピンを２時間浸漬し、そして室温で１時間ブロッキングすることにより、被覆する。ブロッキングは、ｍＡｂ被覆ピンを、ＰＢＳ中のカゼイン加水分解物（OXOID L41）およびＴｗｅｅｎ２０溶液含有３８４ウェルプレートに浸漬することで、行う。
【００４９】
段階３．検出分子との接触、およびアナライトの量の決定
ピン上で形成された検出複合体の決定のため、増強ランタニド蛍光免疫アッセイ（ＤＥＬＦＩＡ）を用いる。
上記の段階２で記載の認識分子ｍＡｂと競合しない、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、およびＩＦＮ−γＤＥＬＦＩＡ用の検出分子ｍＡｂを用い、それぞれ３Ｈ４（ＩＬ−４用）、ＪＥＳ３−９Ｄ７（ＩＬ−１０用）、および４５−１５（ＩＦＮ−γ用）と呼ぶ。３Ｈ４  ｍＡｂをサマリウム（Ｓｍ）で標識し、ＪＥＳ３−９Ｄ７  ｍＡｂをテルビウム（Ｔｂ）で標識し、そして４５−１５  ｍＡｂをユウロピウム（Ｅｕ）で標識する。ランタニド標識ｍＡｂは、Advant-Wallac, Turku, Finlandで標識され市販されている。組換えヒトＩＬ−４（R&D Systems, Minneapolis, Minnesota）、ＩＬ−１０（PharMingen）、およびＩＦＮ−γ（R&D Systems）をスタンダードとして用いる。洗浄およびブロッキング溶液は、上記のＥＬＩＳＡ用と同じである。ＤＥＬＦＩＡアッセイバッファー＃１２４４−１１１、エンハンサー液＃１２４４−１０５、およびエンハンサー＃Ｃ５００−１００は、Wallacから入手する。
【００５０】
被覆ピンシステムによる特異的アナライトの捕獲（認識複合体の形成）を、段階２で得たピンの、段階１に記載の調製した３８４ウェル組織培養プレートでのインキュベーション（Ｔ細胞の刺激薬物および候補化合物での２４時間の刺激）により達成する。生じたピンシステムを、新たな３８４ウェルプレート（それぞれのウェルを、３０μｌ／ウェルのＤＥＬＦＩＡアッセイバッファー中の３つのランタニド標識ｍＡｂ（それぞれ最終濃度５０μｇ／ｍｌ）含有溶液で満たす）に浸漬し、続いて該ピンを、３８４ウェル組織培養プレート（Nunc #164688）（それぞれのウェルを、５０μｌ／ウェルのWallacエンハンサー液で満たす）に浸漬する。ピンマトリックスを浸す、この最後の３８４ウェル組織培養プレート（Nunc #164688）を、ユーロピウムおよびサマリウムウィンドウの時間分解蛍光測定リーダーに移し、そしてユーロピウム（ＩＦＮ−γ）およびサマリウム（ＩＬ−４）量を決定する。その後、該３８４プレートのそれぞれのウェルに、Wallacエンハンサー１５μｌをさらに添加し、ピンマトリックスを再び浸す。最後に、該プレートをテルビウムウィンドウで読み取り、テルビウム（ＩＬ−１０）量を決定する。
【００５１】
実施例３
ヒトサイトカインインヒビターについてのＨＴＳアッセイで決定された、既知のサイトカイン産生インヒビターによるサイトカイン産生の阻害
実施例２の段階１から３の方法と同様に、原理を立証するためのサイトカイン産生実験の原型インヒビターとしてシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）（候補化合物）を用いて行う。つまり、実施例２の段階１によるＴ細胞刺激を、異なる量のＣｓＡ下、またはＣｓＡ非存在下で行い、他の段階およびサイトカイン産生の決定を、実施例２の段階２および段階３により行う。結果を図４に示す。これは、ＣｓＡによる、♯９８０１６Ｔ０細胞のＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、およびＩＬ−１０産生の特徴的容量依存性阻害を説明する。これは、本発明の原理も立証する。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、♯９８０１６Ｔ０細胞のサイトカイン産生を示す。
【図２】図２は、下記のＤＥＬＦＩＡ法による、組換えヒトサイトカインスタンダードの検出を示す。
【図３】図３は、刺激された♯９８０１６Ｔ０細胞のＴ細胞の連続希釈液を用いて得られた結果を示す。
【図４】図４は、本発明によるアッセイでの免疫抑制剤シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）量の増加のもと、刺激された♯９８０１６Ｔ０細胞のＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、およびＩＬ−１０産生の特徴的用量依存性阻害を説明する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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