(57)【要約】  本発明は、ウイルスHIV-1の変異外被糖タンパク質をコードする変異env遺伝子に関する。参照または一次感染初代単離株のenv遺伝子に関連して、前記遺伝子はグリコシル化部位に、1種の初代単離株と別の初代単離株との間で保存されている、少なくとも2つの変異を提示している。各変異は、アスパラギンをコードするAACまたはAATコドンをグルタミンをコードするCAGまたはCAAコドンで置換することからなり、2つの変異が、(a)少なくとも2つの変異がenvタンパク質の領域C3をコードするenv遺伝子の部分にあること、(b)少なくとも1つの変異が領域C3をコードする部分にあり、少なくとも1つの変異が領域V3をコードする部分にあること、(c)少なくとも1つの変異が領域C2をコードする部分にあり、少なくとも1つの変異が領域V3をコードする部分にありコドン862-864および970-972のグリコシル化部位から選択されること、(d)少なくとも1つの変異が領域C2をコードする部分にありコドン667-669、679-681、700-702、763-765、844-846のグリコシル化部位から選択され、少なくとも1つの変異が領域V3をコードする部分にあること、から少なくとも選択される。あるいは、変異env遺伝子は、配列番号8、配列番号9もしくは配列番号10、またはそれらの相補配列の配列のいずれか1つからなる。本発明はまた、変異Env糖タンパク質、ならびに抗体を産生させ、治療薬を評価するための薬剤組成物におけるこの遺伝子および糖タンパク質の使用にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
HIV-1ウイルスの変異外被糖タンパク質をコードしている変異env遺伝子であって、前記遺伝子が、「参照」一次感染初代単離株のenv遺伝子と比較して1種の初代単離株と別の初代単離株との間で保存されているグリコシル化部位で少なくとも2つの変異を示し、各変異が、アスパラギンをコードするAACまたはAATコドンをグルタミンをコードするCAGまたはCAAコドンで置換することからなる、2つの変異が、
(a)少なくとも2つの変異がenvタンパク質のC3領域をコードしているenv遺伝子の部分にあること、
(b)少なくとも1つの変異がC3領域をコードしている部分にあり、少なくとも1つの変異がV3領域をコードしている部分にあること、
(c)少なくとも1つの変異がC2領域をコードしている部分にあり、少なくとも1つの変異がV3領域をコードしている部分にありコドン862-864および970-972のグリコシル化部位から選択されること、
(d)少なくとも1つの変異がC2領域をコードしている部分にありコドン667-669、679-681、700-702、763-765および844-846のグリコシル化部位から選択され、少なくとも1つの変異がV3領域をコードしている部分にあること
から少なくとも選択され、
前記コドンの少なくともいずれか1つの位置が3から24ヌクレオチド変動することが可能であり、
あるいは、変異env遺伝子が配列番号8、配列番号9または配列番号10の配列のいずれか1つまたはそれら相補的な配列からなる
ことを特徴とする遺伝子。
【請求項２】
変異(a)に従って、C3領域をコードしている部分のコドン976-978、991-993で少なくとも1つの変異がもたらされ、C3領域をコードしている部分のコドン1039-1041または1060-1062で少なくとも1つの変異がもたらされ、前記コドンの少なくともいずれか1つの位置が3から24ヌクレオチド変動することが可能であることを特徴とする、請求項1に記載の遺伝子。
【請求項３】
配列が配列番号21、配列番号22および配列番号23に特定した配列またはそれらに相補的な配列から選択される配列からなることを特徴とする、請求項2に記載の遺伝子。
【請求項４】
変異(b)に従って、C3領域をコードしている部分のコドン976-978、991-993、1039-1041または1060-1062で少なくとも1つの変異がもたらされ、V3領域をコードしている部分のコドン880-882で少なくとも1つの変異がもたらされ、前記コドンの少なくともいずれか1つの位置が3から24ヌクレオチド変動することが可能であることを特徴とする、請求項1に記載の遺伝子。
【請求項５】
変異がコドン976-978、991-993および880-882でもたらされ、前記コドンの少なくともいずれか1つの位置が3から24ヌクレオチド変動することが可能であることを特徴とする、請求項4に記載の遺伝子。
【請求項６】
配列が配列番号2、配列番号3および配列番号4に特定した配列またはそれらに相補的な配列からなることを特徴とする、請求項5に記載の遺伝子。
【請求項７】
少なくとも1つの変異がコドン976-978または991-993でもたらされ、少なくとも1つの変異がコドン880-882でもたらされ、少なくとも1つの変異がコドン1039-1041または1060-1062でもたらされ、前記コドンの少なくともいずれか1つの位置が3から24ヌクレオチド変動することが可能であることを特徴とする、請求項4に記載の遺伝子。
【請求項８】
変異がコドン976-978、991-993、880-882、1039-1041および1060-1062でもたらされることを特徴とする、請求項7に記載の遺伝子。
【請求項９】
配列が配列番号5、配列番号6および配列番号7に特定した配列から選択された配列またはそれらに相補的な配列からなることを特徴とする、請求項8に記載の遺伝子。
【請求項１０】
変異(c)に従って、C2領域をコードしている部分のコドン805-807で少なくとも1つの変異がもたらされ、前記コドンの少なくともいずれか1つが3から24ヌクレオチド変動することが可能であることを特徴とする、請求項1に記載の遺伝子。
【請求項１１】
変異(d)に従って、V3領域をコードしている部分のコドン880-882で少なくとも1つの変異がもたらされ、前記コドンの少なくともいずれか1つの位置が3から24ヌクレオチド変動することが可能であることを特徴とする、請求項1に記載の遺伝子。
【請求項１２】
HIV-1ウイルスの変異Env糖タンパク質であって、糖タンパク質が、「参照」一次感染初代単離株のネイティブEnvタンパク質と比較して1種の初代単離株と別の初代単離株との間で保存されている前記参照タンパク質のグリコシル化部位で少なくとも2つの変異を示し、各変異が、アスパラギンをグルタミンで置換することからなり、2つの変異が、
(a')少なくとも2つの変異がEnvタンパク質のC3領域にあること、
(b')少なくとも1つの変異がC3領域にあり、少なくとも1つの変異がV3領域にあること、
(c')少なくとも1つの変異がC2領域にあり、少なくとも1つの変異がV3領域にありアミノ酸288または324のグリコシル化部位から選択されること、
(d')少なくとも1つの変異がC2領域にありアミノ酸223、227、234、255および282のいずれか1つのグリコシル化部位から選択され、少なくとも1つの変異がV3領域にあること
から少なくとも選択され、
1種の一次感染初代単離株と別の一次感染初代単離株との間で保存されている前記グリコシル化部位の位置が1から8アミノ酸変動することが可能であり、
あるいは、変異Env糖タンパク質がいずれか1つの配列からなるか、または変異env遺伝子が配列番号18、配列番号19または配列番号20のいずれか1つの配列からなる
ことを特徴とする糖タンパク質。
【請求項１３】
変異(a')に従って、少なくとも1つの変異がアミノ酸326または331のグリコシル化部位でもたらされ、少なくとも1つの変異がアミノ酸347または354のグリコシル化部位でもたらされ、
1種の一次感染初代単離株と別の一次感染初代単離株との間で保存されている前記グリコシル化部位の位置が1から8アミノ酸変動することが可能である
ことを特徴とする請求項12に記載の糖タンパク質。
【請求項１４】
配列が配列番号21、配列番号22および配列番号23に特定した配列から選択される配列からなることを特徴とする、請求項13に記載の糖タンパク質。
【請求項１５】
変異(b')に従って、少なくとも1つの変異がアミノ酸326または331でもたらされ、少なくとも1つの変異がアミノ酸294でもたらされ、
1種の一次感染初代単離株と別の一次感染初代単離株との間で保存されている前記グリコシル化部位の少なくともいずれか1つの位置が1から8アミノ酸変動することが可能である
ことを特徴とする請求項12に記載の糖タンパク質。
【請求項１６】
変異がアミノ酸326、331および294でもたらされ、
1種の一次感染初代単離株と別の一次感染初代単離株との間で保存されている前記グリコシル化部位の位置が1から8アミノ酸変動することが可能である
ことを特徴とする請求項15に記載の糖タンパク質。
【請求項１７】
配列が配列番号12、配列番号13および配列番号14に特定した配列から選択される配列からなることを特徴とする、請求項16に記載の糖タンパク質。
【請求項１８】
変異(b')に従って、少なくとも1つの変異がアミノ酸326または331でもたらされ、少なくとも1つの変異がアミノ酸347または354でもたらされ、少なくとも1つの変異がアミノ酸294でもたらされ、
1種の一次感染初代単離株と別の一次感染初代単離株との間で保存されている前記グリコシル化部位の少なくともいずれか1つの位置が1から8アミノ酸変動することが可能である
ことを特徴とする請求項12に記載の糖タンパク質。
【請求項１９】
変異がアミノ酸326、331、294、347および354でもたらされ、
1種の一次感染初代単離株と別の一次感染初代単離株との間で保存されている前記グリコシル化部位の少なくともいずれか1つの位置が1から8アミノ酸変動することが可能である
ことを特徴とする請求項18に記載の糖タンパク質。
【請求項２０】
配列が配列番号15、配列番号16および配列番号17で特定された配列から選択される配列からなることを特徴とする、請求項19に記載の糖タンパク質。
【請求項２１】
変異(c')に従って、少なくとも1つの変異がC2領域のアミノ酸269でもたらされ、1種の一次感染初代単離株と別の一次感染初代単離株との間で保存されている前記グリコシル化部位の位置が1から8アミノ酸変動することが可能であることを特徴とする、請求項12に記載の糖タンパク質。
【請求項２２】
変異(d')に従って、少なくとも1つの変異がV3領域のアミノ酸294でもたらされ、1種の一次感染初代単離株と別の一次感染初代単離株との間で保存されている前記グリコシル化部位の位置が1から8アミノ酸変動することが可能であることを特徴とする、請求項12に記載の糖タンパク質。
【請求項２３】
(i)HIV-1ウイルスの変異外被糖タンパク質をコードしている少なくとも1つの変異遺伝子であって、前記変異遺伝子が請求項1から11までのいずれか一項に記載の遺伝子のいずれか1種から選択され、宿主細胞中におけるその発現を可能にする調節配列の制御下にある遺伝子と、
製薬上許容されるベヒクルと、
任意選択で、変異遺伝子が前記細胞に侵入することを促進する、および/または前記細胞の標的化を可能にする追加の薬剤、あるいは、
(ii)組換えウイルスベクターにクローニングされた少なくとも(i)で同定された遺伝子
を含む薬剤組成物。
【請求項２４】
変異糖タンパク質が請求項12から22までのいずれか一項に記載の糖タンパク質のいずれか1種から選択される、HIV-1ウイルスの少なくとも1種の変異外被糖タンパク質と、
製薬上許容されるベヒクルおよび/または賦形剤および/またはアジュバントおよび/または希釈剤と
を含む薬剤組成物。
【請求項２５】
抗体を得る方法であって、マウス、ラットまたはサルなどの哺乳動物を、HIV-1ウイルスの変異外被糖タンパク質をコードしている少なくとも1種の変異遺伝子で免疫化する、前記変異遺伝子が請求項1から11までのいずれか一項に記載の遺伝子のいずれか1つから選択され、かつin vivoにおけるその発現を可能にする調節配列の制御下に置かれる方法。
【請求項２６】
抗体を得る方法であって、マウス、ラットまたはサルなどの哺乳動物を少なくとも1つのHIV-1ウイルスの変異外被糖タンパク質で免疫化する、前記変異糖タンパク質が請求項12から22までのいずれか一項に記載の糖タンパク質のいずれか1種から選択される方法。
【請求項２７】
請求項25または26に記載の方法によって得られる抗体。
【請求項２８】
請求項27に記載の抗体を少なくとも1種含む薬剤組成物。
【請求項２９】
治療薬を評価する方法であって、請求項1から11までのいずれか一項に記載のHIV-1ウイルスの変異外被糖タンパク質をコードしている少なくとも1種の変異遺伝子を動物に投与し、
変異糖タンパク質に特異的な抗体の力価の測定、および/または
変異糖タンパク質もしくはネイティブ糖タンパク質に特異的な中和抗体の力価の測定、および/または
たとえば変異糖タンパク質に特異的なT「ヘルパー」リンパ球細胞のin vitroでの活性化のアッセイを使用する、変異糖タンパク質に対して誘発される細胞性免疫応答の測定
を行う方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
後天性免疫不全症候群(AIDS)は、アメリカ、ヨーロッパ、アフリカおよびアジアで非常に重大なウイルス感染状態である。感染した個体は重篤な免疫抑制を示す。3剤療法(tritherapy)によって進歩が見られているが、この疾病は依然として致命的であり得る。この疾病は、最も一般的には性的接触および静脈内薬物使用を介して伝染する。この疾病は、母親から子供へ伝染可能である。この疾病の病因の1つはHIV-1レトロウイルスである。HIV-1のゲノムは、Wain-Hobson他、1985 (22); Ratner他、1985 (23); Muesing他、1985 (24); Sanchez-Pescador他、1985 (25)によって完全に特徴づけられている。HIV-1ゲノムの最も重要な3つの部分は、gag、polおよびenv遺伝子である。env遺伝子の配列は、細胞性エンドプロテアーゼによって切断されて2つのサブユニット、すなわちgp120表面タンパク質およびgp41膜貫通タンパク質になる、グリコシル化された前駆体であるgp160の形で合成されるEnvタンパク質をコードしている。これら2つのサブユニットは非共有結合が維持され、細胞質膜もしくはウイルス外被に固着したネイティブ糖タンパク質は三量体である可能性が非常に高く、またはgp120/gp41複合体の四量体である可能性があり、gp41サブユニットの細胞外ドメインでの相互作用によって安定化されている(McInerney T.L他、1998 (5))。その構造が複雑なことにより、Envタンパク質をそのネイティブコンホメーションの状態で精製するのは非常に困難である。
【背景技術】
【０００２】
HIV-1が1983年に発見されて以来、HIV-1に対するワクチンの開発が重要な国際的な試みの中心となってきた。現在、約20年間の積極的な研究ののち、信頼性のあるワクチンが存在しないだけでなく、多くのチームが未だ合理的に使用できるワクチン手法を特定しようと努めている。複製性レトロウイルスの使用に伴う危険性は、ヒトでの使用を想定するには大きすぎるので、従来の戦略、すなわち弱毒化した株または不活性化したウイルスの使用は除外されている。この感染症が自然に治癒したヒトの事例の文献は存在しないので、信頼性のある保護的免疫因子の同定も不可能であった。たとえば麻疹ウイルスやインフルエンザウイルスなどのいくつかのウイルス感染症では、保護の主要因子は中和する体液性応答、すなわちウイルス粒子に結合することによって標的細胞への侵入を遮断する抗体の誘発である。そのため、HIV-1に対するワクチンを開発する試みは、当初は中和抗体を誘発させることを目的としたこの手法に集中していた。ウイルス外被糖タンパク質(Env)は中和応答の主要な標的、または唯一の標的でさえあるので、このようなワクチン戦略では、これが好ましい免疫原を構成する。しかし、外被タンパク質を用いて実施した免疫化試験では、現在までに非常に期待外れの結果しかもたらされていない。このような免疫原を用いた場合、チンパンジーおよびマカク動物モデル、ならびに健康なボランティアにおける実験室株に関して、高い中和力価を誘発させるのは実際に可能である。しかし、形質転換したTリンパ球系(実験室株またはTCLA)での培養に順応した株に対して有効なこれら中和抗体は、HIV-1の伝染に関与する初代ウイルスの感染に対して保護しない(Moore J.P.およびD.D. Ho、1995 (1))。
【０００３】
実験室順応株と、初代T細胞での短期間の培養によって得た初代単離株との相違は1995年に浮上し、HIV-1の補助受容体の発見によってより明白になった。これらのうち主要な2つはCCR5およびCXCR4ケモカイン受容体である。初代ウイルスの圧倒的多数が、標的細胞に侵入する際にすべてのウイルスに共通するCD4受容体にだけでなくCCR5補助受容体を使用する。リンパ球T系への順応は、CCR5を使用する能力の損失、およびウイルスが既に所有していない場合はCXCR4を使用する能力の獲得をもたらす(Trkola A.他、1996 (2))。2種の型のウイルスの他の基本的な違いは免疫型である。初代単離株は一般に、抗体および可溶性CD4による中和に対して実験室株よりも耐性がある。具体的には、CD4受容体結合部位およびV3ループなどのエピトープは、培養順応ウイルスの表面では露出しているのに対して、初代単離株のEnvタンパク質上では比較的近づきにくい。その結果、これら抗原決定基に特異的な抗体は順応株を有効に中和するが、初代単離株は中和しない(1)。さらに、中和に対する初代単離株の耐性は、順応株と初代株との間の補助受容体の使用の差異に依存しない。CXCR4のみを補助受容体として使用する稀な初代単離株は、CCR5を使用する単離株と同様に中和が困難である。さらに、動物モデルにおいて、実験室順応株に対する保護を得るのは有効に可能であるが、この保護は自己株(autologous strain)およびそれに近い少数の変異株に依然として限られている。中和応答は、それが培養順応変異株であったとしても、異種株(heterologous strain)に対しては依然として無効である。この限定された保護は、恐らく、外被タンパク質の超可変領域であるV3ループに向けられた抗体の誘発が原因である。様々な単離株由来の免疫原の混合物を使用して、免疫応答の特異性を広げることが可能となったが、いくつかのサブタイプをカバーする広範な保護を誘発することは一度も可能となっていない(Girard, M.他、2000 (3))。
【０００４】
この状況に面して、いくつかのチームがHIV-1特異的な細胞性免疫の誘発に焦点をあてた。実際、ワクチン接種したヒトで、動物モデルと同様に、感染細胞を死滅させる能力または抑制因子の分泌によって感染細胞内でHIV-1の複製を遮断する能力を有する、細胞毒性CD8+Tリンパ球(CTL)に基づいた細胞性応答を得ることが可能である。しかし、免疫化した個体の30〜40%を超える個体でCTL応答の誘発が達成されず、得られた応答は多くの場合、依然として非常に限定された数のエピトープにしか向けられていない。
【０００５】
現在までに比較的調査されていない第3の手法は、粘膜免疫の誘発である。比較的少数の結果により、中和IgG免疫グロブリンの形質導入およびIgAの分泌が、上皮を介するウイルスの排除に役割を果たすかもしれないことが示されている。
【０００６】
HIV-1の特殊性、すなわち免疫系細胞内での複製および感染個体における抗ウイルス免疫応答の初期不全は、様々なサブタイプ間で保存されており、初代ウイルスの外被糖タンパク質上に存在する中和エピトープに結合する抗体を誘発させることを目的とすべき新規手法を開発する必要性を強調している。
【０００７】
このために、本発明者らは、有効な予防ワクチンを得るためのいくつかの要件を自身で設定した。TCLA実験室株ではなく初代単離株由来の外被糖タンパク質を使用することが不可欠である。このタンパク質を、必ずそのネイティブなオリゴマーコンホメーションで免疫系に提供することが必要である。抗体による中和に抵抗するための初代ウイルスの変異の並外れた適応能力のため、新規の広範な中和エピトープを同定することが必要である。実際、ヒト化SCIDマウスモデルでは、3種の抗体IgG1b12、2G12および2F5の混合物を投与することからなる治療の試みによって、1週間の間に、3種の抗体を用いた中和のそれぞれに耐性のあるウイルス分集団が選択された(Poignard P.他、1999 (5))。
【０００８】
HIV-1外被タンパク質は高度にグリコシル化されている(全質量の50%)。その表面に存在する糖は、とりわけ中和応答に対する保護をもたらす(Reitter J.N.他、1998 (6))。多くの研究により、感染性または保護においてこれらの残基が果たす役割が示されている。しかし、系統的であるには程遠いこれらの研究は、グリコシル化部位を互いに独立して、または可変ループV1、V2およびV3もしくはタンパク質のN末端およびC末端などの特定の構造要素上のグリコシル化部位について、常に考慮してきた(6-8)。
【０００９】
1998年に、その可変ループのほとんどが削除され、17b抗体のCD4およびFab(抗原結合断片)と複合体形成した分子を結晶化した後に、gp120の構造モデルがKwongによって提供された(Kwong P.D他、1998 (9))。興味深いことに、オリゴマー分子の表面における潜在的なグリコシル化部位の配置についていくつかの研究が行われている。gp120の完全にグリコシル化された形のモデルを提案しているX. Zhu他、2000 (10)による研究、および結晶化の研究に関するR. Whyatt他、1998 (11)による研究を挙げることができる。
【００１０】
したがって、国際公開公報WO-A-99/24464号によれば、その著者らは、V1/V2ループが削除されたHIV-1 Envタンパク質の結晶化構造から、同一中和エピトープで相互作用する能力を有する様々なグリコシル化部位を同定し、対応する変異体を得ている。しかし、これらの変異体は実験室株から得たものであり、これに関しては、有効なワクチンの探索にもはや不適切であることを既に言及した。
【００１１】
さらに、Kwong(Kwong P.D他、2000 (12))を除いては、すべての結果は本質的にTCLA株で得ている。ここで、培養順応ウイルスは、初代ウイルスに比べて非常に著しいエピトープの相違を有しており、ZhuおよびWhyattによる研究は、ネイティブHIV-1 gp120の抗原構造の正確な実態を反映していない。
【００１２】
発明者らはまず、感染細胞の表面またはウイルスに存在するヘテロ二量体の三量体のレベルでは、ウイルスにとって重要なコンホメーション要素を保護するため、最も保存されている潜在的なグリコシル化部位が一緒になってグループ形成しているという仮説を提示して検証した。
【００１３】
この仮説を試験するために、彼らはかなりの研究を行った。彼らは、13 HIV-1一次感染初代単離株の外被配列上に存在するすべての潜在的なグリコシル化部位を位置決定し(133、146、153、159、160、374、384、Qz、120、309、355、373、426)、比較によって、5 TCLA株上でも位置決定した(MN、HXB2、OYI、RF、SF2)。12種の一次感染一次配列(QZを除く)を単離し、リヨン所在のCroix-rousse病院に入院中の一次感染期の患者由来のPBMC(末梢血単核細胞)から特徴づけた(Ataman-Onal Y.他、1999 (13))。一次感染の選択は、疾病のこの段階で存在するウイルスが感染を開始させたウイルスに近いことによって正当化される。その後、13種の参照配列中で保存されていた潜在的なグリコシル化部位の位置を決定し、対応する配列を選択した。これらの部位は、Nがアスパラギンを示し、Xがプロリン以外の任意のアミノ酸を表し、Tがスレオニンを示し、Sがセリンを示す、タンパク質モチーフN.X.T/Sに対応している。この研究の結果を表1に示す。
【００１４】
【表１】
2005508624.tif 000002
【００１５】
その後、発明者らは最も保存されているグリコシル化部位を選択し、PDB-Viewソフトウェア(Glaxo-Welcome)を用いてこれらの保存されている部位をgp120 (#PDBデータベース: 1G9M)の3D構造上で位置決定した。分子内に埋まっている部位、またはgp120の、gp41と相互作用し、したがってオリゴマーの表面でほとんど露出していないもしくはまったく露出していない内部ドメイン中に存在する部位は、この研究から排除した。各配列をそれぞれ独立に分析した。この分析により、保存されている部位は、初代単離株の配列がどのようなものであれ、分子の表面との比較に値する配置を有していたことが示された。
【００１６】
その後、発明者らは、1種の初代単離株と別の初代単離株との間でgp120の表面で保存されている部位が一緒になってグループ形成することに対応する、「グループ」または「グリコシル化クラスター」を定義した。これらのグループが定義されているので、これらの結果を考慮している脱グリコシル化変異体のリストが確立された。
【００１７】
グリコシル化グループの1つは、V3ループのGPGSモチーフの近傍に位置する領域に対応する(グループg14)。
【００１８】
別のグループ(g112/g122)は、中和エピトープ2G12を定義するグリコシル化部位を部分的に回復する(Trkolla A.他、1996 (14))。
【００１９】
第3のグループは、補助受容体への結合に関与するアミノ酸が位置する空隙に対して並列である(グループ1112)。
【００２０】
第4のグループは、gp120の2つの主要なドメインの接合部に位置する4つの逆平行βシート内に位置する(架橋シート)。
【００２１】
第5のグループは、gp120の「サイレント」面上に存在する(グループ113)。
【００２２】
対照は、VI (6)における完全に脱グリコシル化された外被遺伝子またはV1V2ループの完全な削除のどちらかからなる。
【００２３】
並行して、かつグリコシル化「クラスター」の概念を検証するために、同一クラスター内ではなくそれぞれの異なる「クラスター」内の脱グリコシル化に対応する(「クラスター」1個あたり1つの変異)、2つの追加の変異体(g123およびg1123)を定義した。
【００２４】
患者133から得た選択配列で少なくとも1つの変異がもたらされた(PHI133、登録番号AF041126)。各変異は、部位特異的突然変異誘発キットを用いて製造者の指示に従って(Quickchange Site-directed Mutagenesis Kit、Stratagene)、潜在的なグリコシル化部位(NXS/T)のアスパラギンをグルタミンで置換することからなる。各変異体を発現ベクターpCI (Promega)内にクローニングし、突然変異後の配列の強度を検証するために完全に配列決定した。変異体プラスミドは、Nucleobond PC500キット(Macherey-Nagel)を用いて精製した。
【００２５】
図1は、クラスターの定義および結晶化したgp120分子上の各部位の近接度を表す図である。
【００２６】
表2は、所定の変異体における各変異の性質および位置を要約している。表2では、参照アミノ酸配列は、HIV-1単離株133の削除された非変異のEnvタンパク質の配列、およびHIV-1単離株133の完全な非変異のEnvタンパク質の配列である。アミノ酸が対応する位置を表2に示す。HIV-1単離株133の完全な非変異Envタンパク質のアミノ酸配列を配列番号11に特定し、HIV-1単離株133のenv遺伝子の、対応する(完全な)非変異ヌクレオチド配列を配列番号1に特定する。以下に記載する配列番号2から10および配列番号12から20の配列は、HIV-1単離株133の切断された変異env遺伝子および完全な変異env遺伝子の配列、ならびにHIV-1単離株133の切断された変異Envタンパク質および完全な変異Envタンパク質の配列にそれぞれ対応する。gp160の配列は、配列番号11を参照しながら示す。配列番号11を参照すると、gp120の配列はアミノ酸1で始まり、アミノ酸498で終わる。配列番号11を参照すると、gp140(gp120とgp41の細胞外ドメインとをたしたものに対応する)の配列はアミノ酸1で始まり、アミノ酸669で終わる。
【００２７】
【表２】
2005508624.tif 000003
【００２８】
初代単離株に応じて、保存されているグリコシル化部位の位置が1から8個のアミノ酸変動することが可能なことは明白に理解されよう。本発明はこれらの位置的な変形を包含する。
【００２９】
以下の表3は、グリコシル化部位の変動の一部の例ならびに初代単離株133、146、153、159、160、374および384のenv遺伝子中の潜在的なグリコシル化部位すべての要約を確立している。アミノ酸位置は、Kwong他、1998による削除された配列と同一である。表中の各列は潜在的な部位に対応し、様々な位置間の対応は、削除された配列のアラインメントによって決定した。すべての配列で保存されているグリコシル化部位に下線を引いた。
【００３０】
【表３】
2005508624.tif 000004
【００３１】
その後、発明者らは、これら変異体それぞれの抗原性特徴および機能的特徴を研究し、予防ワクチンの目的に最も良好な特徴を示す変異体を選択した。変異体g12、g112およびg14を選択した。結果を実施例および添付の図に示す。
【００３２】
配列番号2の配列は、g12変異体のヌクレオチド配列を表す(env遺伝子)。
【００３３】
配列番号3の配列は、gp120をコードしている、g12変異体の切断ヌクレオチド配列を表す。
【００３４】
配列番号4の配列は、gp140をコードしている、g12変異体の切断ヌクレオチド配列を表す。
【００３５】
配列番号5の配列は、g112変異体のヌクレオチド配列を表す(env遺伝子)。
【００３６】
配列番号6の配列は、gp120をコードしている、g112変異体の切断ヌクレオチド配列を表す。
【００３７】
配列番号7の配列は、gp140をコードしている、g112変異体の切断ヌクレオチド配列を表す。
【００３８】
配列番号8の配列は、g14変異体のヌクレオチド配列を表す(env遺伝子)。
【００３９】
配列番号9の配列は、gp120をコードしている、g14変異体の切断ヌクレオチド配列を表す。
【００４０】
配列番号10の配列は、gp140をコードしている、g14変異体の切断ヌクレオチド配列を表す。
【００４１】
配列番号12の配列は、g12変異体のアミノ酸配列を表す(Envタンパク質)。
【００４２】
配列番号13の配列は、g12変異体のgp120アミノ酸配列を表す。
【００４３】
配列番号14の配列は、g12変異体のgp140アミノ酸配列を表す。
【００４４】
配列番号15の配列は、g112変異体のアミノ酸配列を表す(Envタンパク質)。
【００４５】
配列番号16の配列は、g112変異体のgp120アミノ酸配列を表す。
【００４６】
配列番号17の配列は、g112変異体のgp140アミノ酸配列を表す。
【００４７】
配列番号18の配列は、g14変異体のアミノ酸配列を表す(Envタンパク質)。
【００４８】
配列番号19の配列は、g14変異体のgp120アミノ酸配列を表す。
【００４９】
配列番号20の配列は、g14変異体のgp140アミノ酸配列を表す。
【００５０】
gp120およびgp140の配列は、遺伝子の切断、または遺伝子を削除せずにストップコドンの挿入および/もしくは読み枠シフトによって得る。gp120およびgp140の形は可溶性であり、したがって完全なEnvタンパク質より容易に精製かつ投与できる。
【非特許文献１】Wain-Hobson他、1985 (22)
【非特許文献２】Ratner他、1985 (23)
【非特許文献３】Muesing他、1985 (24)
【非特許文献４】Sanchez-Pescador他、1985 (25)
【非特許文献５】McInerney T.L他、1998 (5)
【非特許文献６】Moore J.P.およびD.D. Ho、1995 (1)
【非特許文献７】Trkola A.他、1996 (2)
【非特許文献８】Girard, M.他、2000 (3)
【非特許文献９】Poignard P.他、1999 (5)
【非特許文献１０】Reitter J.N.他、1998 (6)
【非特許文献１１】Kwong P.D他、1998 (9)
【非特許文献１２】X. Zhu他、2000 (10)
【非特許文献１３】R. Whyatt他、1998 (11)
【特許文献１４】国際公開公報WO-A-99/24464号
【非特許文献１５】Kwong P.D他、2000 (12)
【非特許文献１６】Ataman-Onal Y.他、1999 (13)
【非特許文献１７】Trkolla A.他、1996 (14)
【非特許文献１８】Remington's Pharmaceutical Sciences第16版、Mack Publishing Co.
【非特許文献１９】G. KohlerおよびC. Milstein (1975)、Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined specificity、Nature 256:495-497頁
【非特許文献２０】G. Galfre他、(1977)
【非特許文献２１】Nature、266: 522-550頁に、ポリクローナル抗体の産生にはA. Roda、G.F. Bolelli、Production of high-titer antibody to bile acids、Journal of Steroid Biochemistry、第13巻、449-454頁、(1980)G. Galfre他(1977) Nature、266: 522-550頁
【非特許文献２２】Jones他、Nature、321: 522-525頁、(1986)
【非特許文献２３】Reichmann他、Nature、332: 323-329頁、(1988)
【非特許文献２４】Presta他、Curr. Op. Struct. Biol.、2: 593-596頁、(1992)
【非特許文献２５】Blazar他、1997、Journal of Immunology、159: 5821-5833頁
【非特許文献２６】Bird他、1988、Science、242: 423-426頁
【非特許文献２７】Arakawa他、1996、J. Biochem 120: 657-662頁
【非特許文献２８】Chaudray他、1989、Nature 339: 394-397頁
【非特許文献２９】Moulard (15)
【非特許文献３０】Pollakis (16)
【非特許文献３１】Wyatt (11)
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００５１】
したがって、本発明の目的は、HIV-1ウイルスの変異外被糖タンパク質をコードしている変異env遺伝子であって、前記遺伝子が、「参照」一次感染初代単離株のenv遺伝子と比較して1種の初代単離株と別の初代単離株との間で保存されているグリコシル化部位で少なくとも2つの変異を示し、各変異が、アスパラギンをコードするAACまたはAATコドンをグルタミンをコードするCAGまたはCAAコドンで置換することからなる、2つの変異が、
(a)少なくとも2つの変異がenvタンパク質のC3領域をコードしているenv遺伝子の部分にあること、
(b)少なくとも1つの変異がC3領域をコードしている部分にあり、少なくとも1つの変異がV3領域をコードしている部分にあること、
(c)少なくとも1つの変異がC2領域をコードしている部分にあり、少なくとも1つの変異がV3領域をコードしている部分にありコドン862-864および970-972のグリコシル化部位から選択されること、
(d)少なくとも1つの変異がC2領域をコードしている部分にありコドン667-669、679-681、700-702、763-765および844-846のグリコシル化部位から選択され、少なくとも1つの変異がV3領域をコードしている部分にあること
から少なくとも選択され、
前記コドンの少なくともいずれか1つの位置が3から24ヌクレオチド変動することが可能であり、
あるいは、変異env遺伝子が配列番号8、配列番号9または配列番号10の配列のいずれか1つまたはそれら相補的な配列からなる、
遺伝子を提供することである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５２】
本発明による複数変異体(少なくとも2つの変異)の利点の1つは、代償的変異(compensatory mutation)を有する結果、野生型表現型が再度見つかる確率を低下させることにある。
【００５３】
本発明による好ましい変異は以下のとおりである。
【００５４】
変異(a)に従って、C3領域をコードしている部分のコドン976-978、991-993で少なくとも1つの変異がもたらされ、C3領域をコードしている部分のコドン1039-1041または1060-1062で少なくとも1つの変異がもたらされ、前記コドンの少なくともいずれか1つの位置が3から24ヌクレオチド変動することが可能である。好ましくは、この遺伝子は、配列番号21、配列番号22および配列番号23に特定した配列またはそれらに相補的な配列から選択される配列からなる。
【００５５】
変異(b)に従って、C3領域をコードしている部分のコドン976-978、991-993、1039-1041または1060-1062で少なくとも1つの変異がもたらされ、V3領域をコードしている部分のコドン880-882で少なくとも1つの変異がもたらされ、前記コドンの少なくともいずれか1つの位置が3から24ヌクレオチド変動することが可能であり;この変異株によれば、この遺伝子は少なくとも3つの変異、すなわち、C3領域をコードしている部分に少なくとも2つの変異、かつV3領域をコードしている部分に少なくとも1つの変異を含み、
好ましくは、これらの変異はコドン976-978、991-993および880-882でもたらされ、前記コドンの少なくともいずれか1つの位置が3から24ヌクレオチド変動することが可能であり;有利には、このように変異した遺伝子の配列は、配列番号2、配列番号3および配列番号4に特定した配列またはそれらに相補的な配列からなるか、あるいは、
少なくとも1つの変異がコドン976-978または991-993でもたらされ、少なくとも1つの変異がコドン880-882でもたらされ、少なくとも1つの変異がコドン1039-1041または1060-1062でもたらされ;好ましくは、この変異はコドン976-978、991-993、880-882、1039-1041および1060-1062でもたらされ;有利には、このように変異した遺伝子の配列は、配列番号5、配列番号6および配列番号7に特定した配列から選択された配列またはそれらに相補的な配列からなり、
前記上述のコドンの少なくともいずれか1つの位置が3から24ヌクレオチド変動することが可能であることが理解されよう。
【００５６】
変異(c)に従って、C2領域をコードしている部分のコドン805-807で少なくとも1つの変異がもたらされ、前記コドンの少なくともいずれか1つが3から24ヌクレオチド変動することが可能である。
【００５７】
変異(d)に従って、V3領域をコードしている部分のコドン880-882で少なくとも1つの変異がもたらされ、前記コドンの少なくともいずれか1つの位置が3から24ヌクレオチド変動することが可能である。
【００５８】
また、変異遺伝子の配列は、配列番号8、配列番号9および配列番号10に特定した配列から選択される配列、またはそれらに相補的な配列からなることもできる。
【００５９】
本発明はまた、HIV-1ウイルスの変異Env糖タンパク質であって、糖タンパク質が、「参照」一次感染初代単離株のネイティブEnvタンパク質と比較して1種の初代単離株と別の初代単離株との間で保存されている前記参照タンパク質のグリコシル化部位で少なくとも2つの変異を示し、各変異が、アスパラギンをグルタミンで置換することからなり、2つの変異が、
(a')少なくとも2つの変異がEnvタンパク質のC3領域にあること、
(b')少なくとも1つの変異がC3領域にあり、少なくとも1つの変異がV3領域にあること、
(c')少なくとも1つの変異がC2領域にあり、少なくとも1つの変異がV3領域にありアミノ酸288または324のグリコシル化部位から選択されること、
(d')少なくとも1つの変異がC2領域にありアミノ酸223、227、234、255および282のいずれか1つのグリコシル化部位から選択され、少なくとも1つの変異がV3領域にあること、
から少なくとも選択され、
1種の一次感染初代単離株と別の一次感染初代単離株との間で保存されている前記グリコシル化部位の位置が1から8アミノ酸変動することが可能であり、
あるいは、変異Env糖タンパク質がいずれか1つの配列からなるか、または変異env遺伝子が配列番号18、配列番号19または配列番号20のいずれか1つの配列からなる、
糖タンパク質に関する。
【００６０】
変異したグリコシル化部位のアミノ酸の位置は、ネイティブEnvタンパク質の配列を参照して示す。
【００６１】
本発明による好ましい変異は以下のとおりである。
【００６２】
変異(a')に従って、少なくとも1つの変異がアミノ酸326または331のグリコシル化部位でもたらされ、少なくとも1つの変異がアミノ酸347または354のグリコシル化部位でもたらされ、1種の一次感染初代単離株と別の一次感染初代単離株との間で保存されている前記グリコシル化部位の位置が1から8アミノ酸変動することが可能である。好ましくは、糖タンパク質は、配列番号21、配列番号22および配列番号23に特定した配列から選択される配列からなる。
【００６３】
変異(b')に従って、少なくとも1つの変異がアミノ酸326または331でもたらされ、少なくとも1つの変異がアミノ酸294でもたらされ、1種の一次感染初代単離株と別の一次感染初代単離株との間で保存されている前記グリコシル化部位の少なくともいずれか1つの位置が1から8アミノ酸変動することが可能であり;一変異株によれば、糖タンパク質は、C3領域に少なくとも3つの変異、好ましくは少なくとも2つの変異を含み、V3領域に少なくとも1つの変異を含み、
好ましくは、これらの変異はアミノ酸326、331および294でもたらされ;有利には、本発明の変異Env糖タンパク質は配列番号12、配列番号13および配列番号14に特定した配列から選択される配列からなるか、あるいは、
少なくとも1つの変異がアミノ酸326または331でもたらされ、少なくとも1つの変異がアミノ酸347または354でもたらされ、少なくとも1つの変異がアミノ酸294でもたらされ;有利には、変異がアミノ酸326、331、294、347および354でもたらされ、より好ましくは、本発明の変異Env糖タンパク質は配列番号15、配列番号16および配列番号17で特定された配列から選択される配列からなり、
1種の一次感染初代単離株と別の一次感染初代単離株との間で保存されている前記グリコシル化部位の位置が1から8アミノ酸変動することが可能なことが理解されよう。
【００６４】
変異(c')に従って、少なくとも1つの変異がC2領域のアミノ酸269でもたらされる。
【００６５】
変異(d')に従って、少なくとも1つの変異がV3領域のアミノ酸294でもたらされる。
【００６６】
本発明の変異Env糖タンパク質は、配列番号18、配列番号19および配列番号20に特定した配列から選択される配列からなることができる。
【００６７】
本発明の目的はまた、
(i)HIV-1ウイルスの変異gp120外被糖タンパク質をコードしている少なくとも1つの変異遺伝子であって、前記変異遺伝子が上述の遺伝子のいずれか1種から選択され、宿主細胞中におけるその発現を可能にする調節配列の制御下にある遺伝子と、
製薬上許容されるベヒクルと、
任意選択で、変異遺伝子が前記細胞に侵入することを促進する、および/または前記細胞の標的化を可能にする追加の薬剤、あるいは、
(ii)組換えウイルスベクターにクローニングされた少なくとも(i)で同定された変異遺伝子
を含む薬剤組成物でもある。
【００６８】
調節配列のうち、ヒトCMVの中間期/初期プロモーターおよびHIV-1 rev遺伝子を挙げることができる。
【００６９】
所望する場合は、前記宿主細胞または前記宿主細胞の所定の細胞区画を標的にすることができ、これを行うためには、活性成分、すなわち本発明の変異DNAに少なくとも1つの標的化剤を結合させることが可能である。用語「標的化剤」とは、前記宿主細胞のin vivoでの標的化を可能にする化学的または生物学的分子を意味することを意図する。これは、とりわけ、特異的リガンド、または標的化する宿主細胞内もしくは細胞区画中に天然に存在する、具体的には前記宿主細胞の表面に存在する抗リガンドであり得、例として、リガンドとして抗体を、抗リガンドとして抗原を挙げることができる。したがって、抗体が活性成分に結合されており、かつ宿主細胞の表面抗原に特異的である場合、これは、抗体/抗原複合体の特異的形成によって宿主細胞を標的化するための試薬として作用する。
【００７０】
表現「前記変異遺伝子が前記細胞に侵入することを促進する試薬」とは、とりわけ、ブピバカインおよび心臓毒などの試薬を意味することを意図する。
【００７１】
用語「製薬上許容されるベヒクル」は、とりわけ、リポソーム、ビロソーム(virosomes)、ナノ粒子、ミクロ粒子(たとえば金ビーズ)、iscoms(免疫賦活複合体)を意味することを意図する。
【００７２】
組換えウイルスベクターは、例として、MVA(改変ワクシニアアンカラ(Modified Vaccinia Ankara))、αウイルス、SFV(セムリキ森林ウイルス(Semliki Forest Virus))、アデノウイルスおよびAAV(アデノ随伴ウイルス)が挙げられる。
【００７３】
上で定義した薬剤組成物は、具体的には組換えタンパク質に基づいた「従来の」ワクチン組成物と比較して特に有利なDNAワクチン組成物である。実際、ワクチン目的における組換えタンパク質の使用は困難で費用のかかるシステムであり、これは、具体的には組換え抗原を精製する非常に重要な工程を必要とするからである。さらに、直面する問題の1つは、良好な免疫記憶を維持するのに十分な期間のウイルス残留性を得ることである。逆に、DNAを用いて免疫化する方法の利点はDNAの本質的な特性に固有であり、単純かつ比較的安価であり、単純な筋肉内注射または皮内注射によって実施される。さらに、
DNAワクチンは非感染性/非複製性であり、
DNAを用いた免疫化はin vivo形質移入の一形態であるので、ウイルス抗体は哺乳動物細胞内でそのネイティブコンホメーションで発現され、
ウイルス感染の場合と同様、体液性および細胞性のいずれの免疫応答も広く誘発され、
さらに、DNAワクチンはその物理化学的な均一性により、容易に混合することができる
ことに注目されたい。
【００７４】
しかし、本発明は上に定義したDNAワクチン組成物に限定されておらず、
変異糖タンパク質が上述の糖タンパク質のいずれか1種から選択される、HIV-1ウイルスの少なくとも1種の変異gp120外被糖タンパク質と、
製薬上許容されるベヒクルおよび/または賦形剤および/またはアジュバントおよび/または希釈剤と
を含む薬剤組成物にも関する。
【００７５】
このような調製ワクチン組成物は注射用、すなわち液状溶液または懸濁液である。任意選択で、この調製物は乳化されていてもよい。抗原性分子、すなわち変異糖タンパク質を、製薬上許容され、かつ活性要素または成分と適合性のある賦形剤と混合することができる。好ましい賦形剤の例は、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールまたは等価物、およびそれらの組合せである。所望する場合は、ワクチンに、少量の湿潤剤または乳化剤などの補助物質、水酸化アルミニウム、ムラミルジペプチドもしくはそれらの変形などのpH緩衝剤またはアジュバント、陽イオンポリマー、陽イオンポリマーのナノ粒子もしくはそれらの変異形(ポリ乳酸、ポリ乳酸-コグリコシド)を含めることができる。
【００７６】
ワクチンは、習慣的に注射、たとえば筋肉内注射によって投与する。
【００７７】
用語「製薬上許容されるベヒクル」とは、たとえばRemington's Pharmaceutical Sciences第16版、Mack Publishing Co.に記載されているようにヒトまたは動物に投与することができる担体およびベヒクルを意味することを意図する。製薬上許容されるベヒクルは、好ましくは等張性もしくは低張性または僅かに高張性であり、比較的低いイオン強度を有する。製薬上許容される賦形剤およびアジュバントの定義も、上記のRemington's Pharmaceutical Sciencesに示されている。
【００７８】
本発明はまた、哺乳動物においてHIV-1ウイルスに対する改善された体液性および/または細胞性応答を誘発させる方法であって、
少なくとも上に定義した本発明の変異タンパク質をコードする変異遺伝子を含む、有効であるのに十分な一定量のDNAワクチン組成物を、筋肉内注射もしくは皮内注射によって哺乳動物に投与すること、または
少なくとも上に定義した本発明の変異タンパク質を含む、有効であるのに十分な一定量のワクチン組成物を、筋肉内注射もしくは皮内注射によって哺乳動物に投与すること
による方法に関する。
【００７９】
DNAワクチンの場合、in vivoの投与に使用する組成物中の核酸の濃度は約100μg/mlから10mg/ml、好ましくは1mg/mlである。
【００８０】
投与するタンパク質の量は、アジュバントを加えるかどうかに依存するが、一般に10から50μg/mlのタンパク質である。
【００８１】
ワクチンは、1回または複数回の筋肉内注射もしくは皮内注射で所定の用量を投与し、必要な場合は次いで1回または複数回の追加免疫を行う。ワクチンの免疫化効果は、免疫化した個体または動物において抗HIV-1抗体の力価を測定することによってモニターする。
【００８２】
目的の核酸もしくは複数の核酸またはタンパク質もしくは複数のタンパク質、あるいはそれらの断片もしくは複数の断片の、単体でまたは組み合わせた投与は、予防および/または治療に使用される。1種もしくは複数種の核酸またはそれらの断片、あるいは1種もしくは複数種のタンパク質またはそれらの断片を投与した場合、その特徴はHIV-1の毒性を示すものではなく、それらを投与した個体または動物において体液性および/または細胞性免疫応答を誘発させる特性を有するものである。タンパク質もしくは複数のタンパク質が関与する場合、前記1種もしくは複数種のタンパク質は、合成技術または遺伝的組換え技術、あるいは化学的または物理的処理による1種もしくは複数種の天然タンパク質の改変によって得ることができる。
【００８３】
ワクチンの形成の候補である1種もしくは複数種のタンパク質またはそれらの断片を同定し、その毒性が失われたことを確かにし、かつその免疫原性を検証するために、(i)投与した抗原に特異的なCD4+Tリンパ球の増殖のin vitroアッセイ(T細胞アッセイ)または投与した抗原に特異的なCD8+リンパ球の細胞毒性のin vitroアッセイを実施することによって、ならびに(ii)とりわけ天然タンパク質に対する循環中の抗体の力価および初代単離株を中和するその能力を測定することによって、機能的アッセイで分析した。これらの改変形は、適切なアジュバントを用いた標準化された手順によってヒトを免疫化するのに使用する。
【００８４】
本発明はまた、
抗体を得る方法であって、マウス、ラットまたはサルなどの哺乳動物をHIV-1ウイルスの変異外被糖タンパク質をコードしている少なくとも1種の変異遺伝子で免疫化する、前記変異遺伝子が上述の遺伝子のいずれか1つから選択され、かつin vivoにおけるその発現を可能にする調節配列の制御下に置かれる方法、およびこの方法によって得ることができる抗体、ならびに
抗体を得る方法であって、マウス、ラットまたはサルなどの哺乳動物を少なくとも1種のHIV-1ウイルスの変異外被糖タンパク質で免疫化する、前記変異糖タンパク質が上述の糖タンパク質のいずれか1つから選択される方法、およびこの方法によって得ることができる抗体
にも関する。
【００８５】
用語「抗体」とは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、膜貫通型抗体およびヒト化抗体、または前記抗体の断片を意味することを意図する。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の産生は、当分野の技術者の一般的な知識の一部である。参照として、モノクローナル抗体の産生にはG. KohlerおよびC. Milstein (1975)、Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined specificity、Nature 256:495-497頁ならびにG. Galfre他、(1977)、Nature、266: 522-550頁に、ポリクローナル抗体の産生にはA. Roda、G.F. Bolelli、Production of high-titer antibody to bile acids、Journal of Steroid Biochemistry、第13巻、449-454頁、(1980)を挙げることができる。モノクローナル抗体の産生には、免疫原を、免疫化用担体としてのキーホールリンペットヘモシアニン(KLHペプチド)に、または血清アルブミン(SAペプチド)に結合させることができる。フロイント完全アジュバントを用いて動物に免疫原を注射し、免疫化した動物由来の血清およびハイブリドーマ培養上清を、たとえばELISAまたはウエスタンブロットアッセイなどの従来の技術を使用して、その特異性および選択性について分析した。特異性および感受性の最も高い抗体を産生するハイブリドーマを選択した。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマをマウスに腹腔内注射した後、in vitroで生成したハイブリドーマの細胞培養によって、または腹水を回収することによって産生させることもできる。上清または腹水として、産生方法が何であれ、その後に抗体を精製する。使用する精製方法は、基本的にはイオン交換ゲル濾過および排除クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィー(タンパク質AまたはG)である。最も有効な抗体を同定するために、十分な数の抗体を機能的アッセイでスクリーニングした。抗体、抗体断片、または遺伝子操作によって産生させたキメラ抗体など抗体誘導体のin vitroでの産生は、当分野の技術者に周知である。
【００８６】
用語「膜貫通型抗体」とは、認識および結合を可能にするために、少なくとも、その特異的抗原を認識して結合する能力を有する機能的領域が、標的細胞の表面で発現される抗体を意味することを意図する。より詳細には、本発明の抗体は、前記機能的領域を定義するアミノ酸、および標的細胞の膜脂質二重層内への固着を可能にするまたはこの二重層の外部表面での固着を可能にするアミノ酸配列(膜貫通型ポリペプチド)を含む融合ポリペプチドからなる。多くの膜貫通型ポリペプチドをコードしている核酸配列が文献に記載されている。
【００８７】
非ヒト抗体、たとえばネズミ抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の配列を最小限含むキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、受容体の超可変領域の残基が、所望する特異性、親和性および能力を有する、マウス、ラット、ウサギもしくはヒトでない霊長類など、非ヒトのドナー種(ドナー抗体)の超可変領域の残基で置換されている、ヒト免疫グロブリン(レセプター抗体)である。一部の場合では、ヒト免疫グロブリンのFv領域の残基(FR)が対応する非ヒト残基で置換されている。さらに、ヒト抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体中では見つからない残基を含むことができる。これらの改変は、抗体の性能レベルを向上させるために行う。一般に、ヒト化抗体は少なくとも、好ましくは2つの、すべてまたは事実上すべての超可変ループが非ヒト免疫グロブリンに対応し、すべてまたは事実上すべてのFR領域がヒト免疫グロブリンのFR領域である可変ドメインを含む。また、ヒト化抗体は任意選択で、ヒト免疫グロブリンなど免疫グロブリンの定常(Fc)領域の少なくとも一部を含んでもよい(Jones他、Nature、321: 522-525頁、(1986); Reichmann他、Nature、332: 323-329頁、(1988);およびPresta他、Curr. Op. Struct. Biol.、2: 593-596頁、(1992))。
【００８８】
用語「抗体断片」とは、ネイティブ抗体のF(ab)2、Fab、Fab'およびsFv断片(Blazar他、1997、Journal of Immunology、159: 5821-5833頁およびBird他、1988、Science、242: 423-426頁)を意味することを意図し、用語「誘導体」とは、とりわけネイティブ抗体のキメラ誘導体を意味することを意図する(たとえば、Arakawa他、1996、J. Biochem 120: 657-662頁およびChaudray他、1989、Nature 339: 394-397頁参照)。
【００８９】
HIV-1のウイルス感染に応答するために、これらの抗体を、特にこれらが中和抗体である場合に薬剤組成物に組み込むことができる。本発明はこのような薬剤組成物を包含する。
【００９０】
最後に、本発明は、治療薬を評価する方法であって、上述のHIV-1ウイルスの変異外被糖タンパク質をコードしている少なくとも1つの変異遺伝子を動物に投与し、
変異gp120に特異的な抗体の力価の測定、および/または
ウイルスの感染性の低下を引き起こす変異糖タンパク質もしくはネイティブ糖タンパク質に特異的な中和抗体の力価の測定、および/または
たとえば変異糖タンパク質に特異的なT「ヘルパー」リンパ球細胞のin vitroでの活性化のアッセイを使用する、変異gp120に対して誘発される細胞性免疫応答の測定
を行う方法に関する。
【００９１】
以下の実験セクションをより良く理解するために、HIV-1感染の機構を手短に見直すことが賢明である。感染の間、gp120がCD4受容体に結合する。この相互作用に次いで、gp120は構造的に再編成され、補助受容体の結合を可能にする「CD4誘発性」エピトープを放出する。CD4の結合、およびそれに次ぐ補助受容体の結合は、細胞膜におけるgp41融合ペプチドの固着、したがって細胞の感染に必須の現象である。
【実施例１】
【００９２】
発現および切断
Lipofectamine-Plusキット(Gibco-BRL)を使用して、製造者の指示に従って、293T細胞(腎臓上皮細胞)を構築体PCI-envおよび発現プラスミドPCI-revのそれぞれで同時形質移入する。Revは、外被タンパク質の発現において重要な役割を果たすHIV-1の調節タンパク質である。形質移入の48時間後、培養上清および細胞を回収し、1/5000に希釈した抗gp120ヒツジポリクローナル抗体(Biogenesis)を使用したウエスタンブロットによってアッセイする。このために、試料を変性8%アクリルアミドゲル上に載せる。分離後、製造者の指示に従って試料をPVDF膜(ImmobilonP、Amersham)に移す。溶解液では、1/5000に希釈した抗アクチンモノクローナル抗体(A4700、Sigma)および1/5000に希釈した抗Revモノクローナル抗体2D4D10(bioMerieux)を用いて試料を標準化する。上清では、培地中の血清アルブミンの量に応じて標準化を行う。ECFキット(Amersham)を用いてブロットを表示させ、ImageQuantソフトウェアを使用して、Typhoon 8600で表示されたバンドを定量する。すべての構築体が、抗gp120ポリクローナル抗体と反応するタンパク質を発現する。変異体タンパク質の移動は、1つまたは複数のグリコシル化の損失によって影響される。細胞溶解液中で検出されたgp120の減少は、変異数の増加に関連している(図2)。一部の場合には、特異的なバンドがまったく存在しない(変異体g1112、g122、g13、g113、g14、g123、g1123およびDV1V2)。これに対応する培養上清中にも存在せず、これは、切断の度合いが影響を受けるからかもしれない。Moulard (15)がこの現象を記載しており、彼はこれを、ERにおける乏しい転移および/または切断部位への接近を妨げるフォールディングの欠損に関連づけている。逆に、g14変異体では上清中に大量のgp120が検出されたが(標準化したタンパク質の量でネイティブタンパク質より約8倍多い)、前記gp120は細胞溶解液中では検出されなかった。したがって、このクローンに存在する変異は、外被サブユニットを互いに連結する相互作用に影響を与え、gp160の切断度合いには影響を与えないと考えられる。単一の変異体の切断の度合いは一般に、ネイティブ外被で観察される度合いに匹敵する(g21変異体以外)。比較によって、V1ループの完全な脱グリコシル化に対応する変異体が3つのグリコシル化によって比較的影響を受けないように見受けられることは、興味深い。
【実施例２】
【００９３】
変異体がin vitroで合胞体を形成する能力
形質移入の48時間後、様々な変異体を発現する293T細胞を1/10に分割し、50%の密度のGHOST-CCR5またはGHOST-CxCR4と接触させる。
【００９４】
16時間同時培養した後、細胞を0.5%のグルタルアルデヒドで15分間固定し、その後、核および細胞質をMay-Grunwald/Giemsaで染色する。観察および形成された合胞体の計数は、倒立光学顕微鏡による観察によって評価する。
【００９５】
GHOST-CCR5細胞では、変異の数が増加すると合胞体を誘発させる能力が低下する。切断されていないクローン(g113、g1123および恐らくはg1112)ではゼロである。この結果により以前の結果が確認され、変異後の様々な外被の機能の維持に関する指標が与えられる。gp160 ADAのV3ループの部分的な脱グリコシル化後にPollakis (16)によって実証されるように、構築体はCXCR4 指示細胞で合胞体の形成を誘発させない。
【００９６】
結果を表4に示す。
【００９７】
【表４】
2005508624.tif 000005
【００９８】
HIV陽性血清のプールにおける抗原性(図3参照)
溶解液および上清を、リヨン所在のCroix-Rousse病院からのHIV+血清のプールを用いた捕捉ELISAによってアッセイした。この血清プールは、2種のサブタイプB試料および1種のサブタイプC試料からなる。すべてのELISAの結果は、二つ組で行った2回の実験の平均に対応する。アッセイ様式は以下の通りである。
捕捉抗体:1×PBS中の1μg/mlのD7324(C5領域内に位置する代替切断部位に向けられている; Aalto)または1×PBS中の5μg/mlの12G10B11(gp41に向けられている、bioMerieux);6℃で終夜インキュベート。
1×PBS-0.1% Tween-3%粉末スキムミルクを用いた飽和;22℃で1時間インキュベート。
PBS-1% NP40-20μg/ml BSAで1/10に希釈した溶解液、または純粋な上清;22℃で2時間インキュベート。
1×PBS-0.1% Tween-20μg/ml BSAで1/100に希釈したHIV+血清のプール;22℃で1時間インキュベート。
1×PBS-0.1% Tween-20μg/ml BSAで1/5000に希釈したペルオキシダーゼ結合の抗FcヒトIgGコンジュゲート(Jackson);22℃で30分間インキュベート。
20mg OPD(Pierce)および10mlのColor2(BioMerieux)の混合物を用いた表示;22℃で15分間インキュベートし、プレート読取り器(Biorad)で492nmで読み取る。
【００９９】
それぞれのインキュベーションの間に、Bioradプレート洗浄器を用いて1×PBS-0.1% Tweenで4回洗浄する。
【０１００】
上清をD7324抗体で捕捉する。溶解液をD7324または12G11B10のどちらかで捕捉する。D7324エピトープは切断されていないgp160分子上で比較的露出しておらず、したがって検出されたシグナルは様々な変異体の切断の度合いに依存するので、主に後者を使用した。
【０１０１】
結果は、抗原性の損失が変異の数と相関していることを示している。溶解液(12G11B10コーティング)および上清での結果は一致しており、g113およびg1123変異体において上清中にgp120が存在しないことを確かにしている。
【実施例３】
【０１０２】
認識
2G12エピトープの認識
2G12は、HIV+PBLおよびCB-F7細胞の電気融合によって得られたヒトモノクローナル抗体である(17)。これは、初代単離株および一部のTCLAウイルスに対して広範な中和能力を有する。この抗体によって認識されるエピトープは非連続的であり、主にV3およびV4領域、ならびにこれらの領域内に存在する一部の糖をカバーする。2G12の認識は、様々な変異体の細胞溶解液および上清におけるELISAでアッセイした。アッセイ様式は既に示したものと同様であるが、検出抗体には2G12(1μg/ml)を使用する。133-ネイティブタンパク質でも陽性シグナルはまったく検出されない。この結果により、D. Brand (Tours)のチームによって、133外被についてRIPAおよびELISAで得られた結果が確認される。1998年にParrenが、3種の中和抗体2G12、2F5およびB12に耐性のある初代単離株について記載している。彼の結果は、この耐性が恐らく外被のオリゴマー構造の全体的な変化によるものであることを示している。
【０１０３】
CD4結合部位の認識
外被糖タンパク質は、高い親和性でCD4を結合する能力を有する。この結合能力は、感染プロセスにおいて重要である。
可溶性CD4(複数のCD4)の結合。以下のELISA様式を使用した。
D7324(上清)または12G11B10(溶解液)のコーティング。
飽和。
1/10に希釈した溶解液または純粋な上清。
1×PBS-0.1% Tween-20μg/ml BSAで1μg/mlに希釈したCD4(NIAID);22℃で2時間インキュベート。
1×PBS-0.1% Tween-20μg/ml BSAで1μg/mlに希釈したビオチン標識抗CD4ポリクローナル抗体;22℃で1時間インキュベート。
1×PBS-0.1% Tween-20μg/ml BSAで1/10 000に希釈したストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ(Jackson);22℃で30分間インキュベート。
20mg OPD(Pierce)および10mlのColor2(BioMerieux)の混合物を用いた表示。
492nmでの読取り。
【０１０４】
検出されたCD4の量は、溶解液および上清で同じように変動している(図4)。二重変異に対応するg12およびg14変異体以外では、シグナル強度は脱グリコシル化された部位の数に依存している。抗原性または切断の度合いが低下している外被タンパク質に対応するクローンは、低いシグナルを有する(g122、g13、g113、g123およびg1123)。
【０１０５】
IgG1b12エピトープの認識
このヒトモノクローナル抗体は、初代単離株(クレードA-D)および実験室株のいずれにも相当な中和活性を有すると記載されている。エピトープは非連続的であり、CD4結合部位をカバーする。認識は、有効な中和応答を妨げる「デブリ」の代償として、感染細胞またはウイルスの表面上のオリゴマーで優先的に行われる。
【０１０６】
試験したどのクローンでも、陽性シグナルはまったく見られなかった。これは、133外被におけるD. Brandの予備結果と一致している。IgG1b12は、V1およびV2ループにおける置換に非常に感受性が高いと記載されている。C2およびC3領域内の一部のアミノ酸も、b12エピトープの認識において重要な役割を果たすと記載されている(18)。133外被の特異点の1つは、同じサブタイプの他の外被タンパク質と比べて、異型のタンパク質配列を有することである。
【０１０７】
F105エピトープの認識(図5参照)
ヒトモノクローナル抗体F105はCD4結合部位の近傍に結合する。CD4はその結合を阻害することができる。F105抗体はTCLA株を中和する。一部の著者らは一部の初代単離株の中和を記載しているが(19)、結果はかなり議論の余地がある。
【０１０８】
この抗体の結合は溶解液および上清で試験されている。アッセイ様式は2G12で使用したものと同じである。F105抗体(NIBSC)は、1μg/mlの濃度で使用する。g12クローンで相当なシグナルが見られた(同等のタンパク質量のネイティブタンパク質のシグナルの4.5倍まで)。g12に存在する変異番号294(g2には存在しない)はV3ループ内に位置している。F105の、V3が削除された糖タンパク質への結合が改善されていることが知られている。他の変異は、抗体によるタンパク質の認識において重要な役割を果たしていると考えられる。これは、g13およびg113クローンに存在する変異番号255の場合そうである。これは、F105による中和の回避に重要であると記載されているC2のペプチド内に位置している(20)。g1112変異体およびg22/g122シリーズの変異体にはシグナルがなかった。
【０１０９】
誘発されたCD4エピトープの認識
CD4の結合はコンホメーションの変化を誘発させ、エピトープの新規形成を可能にし、これにより、補助受容体の結合の状態を整える。
【０１１０】
CG10エピトープの認識(図6)。CG10は、特定のTCLA株を中和する能力を有するネズミモノクローナル抗体である。これは、17bと競合して「架橋シート」の近傍に結合する。その結合は完全にCD4依存性である(21)。
【０１１１】
使用したELISAは以下の様式である。
コーティング:D7324(上清)または12G11B10(溶解液)。
飽和。
1/10に希釈した溶解液または純粋な上清。
1×PBS-0.1% Tween-20μg/ml BSAで希釈した1μg/mlのCD4の添加(または添加しない);22℃で2時間インキュベート。
1×PBS-0.1% Tween-20μg/ml BSAで希釈した1μg/mlのCG10(Francisco Veas、UMR 5087、モンペリエ(Montpellier)から提供);22℃で1時間インキュベート。
1×PBS-0.1% Tween-20μg/ml BSAで1/5000に希釈したペルオキシダーゼ結合の抗マウスIgGコンジュゲート(Jackson)。
表示:20mg OPD(Pierce)および10mlのColor2(bioMerieux)。
492nmでの読取り。
【０１１２】
ELISAによる結果により、g122、g13、g113、g123およびg1123変異体を除いて、ほとんどの外被タンパク質で、CD4の存在下におけるCG10エピトープの正しい認識が示されている。シグナルは、CD4の結合量と良好に相関している(図5参照)。CG10を単体で使用することにより、シグナルの欠如がもたらされる。
【０１１３】
17bエピトープの認識(図7参照)。17bは、CD4に誘発されるエピトープに向けられたヒトモノクローナル抗体である。これは、初代単離株およびTCLA株のどちらについても制限された中和活性を有する。エピトープの露出は完全にはCD4に依存していないが、それでもやはり、その存在によって改善される。使用するELISA様式はCG10と同じである。17b抗体は、1μg/mlの濃度で使用する。検出は、1/5000に希釈したペルオキシダーゼ結合の抗ヒトIgG Fc抗体(Jackson)を用いて行う。この実験では、一部の変異体、具体的にはg12/g112、g3およびg4/g14変異体がこの抗体の正しい認識を示す。g12では、シグナルは、同等のタンパク質量のネイティブタンパク質で記録されたものより約3倍大きい。g12/g112中に存在する変異は、V3ループおよびC3領域の先頭に関する。Wyatt (11)によれば、V2およびV3が17bエピトープを部分的にカバーし、V2ループの引きこもり(withdrawal)を可能にするのはCD4の結合であると考えられる。V3ループ(NB:133配列のV3ループは単一の潜在的なグリコシル化部位を有する)およびそのベースに位置する部位の脱グリコシル化により、V3ループの部分的なデマスキングおよびその柔軟性の増大のいずれもが可能になり、これにより17bエピトープがより接近しやすくなり得ることを想定することが可能である。
【０１１４】
上に詳述した実験は、抗原性および機能性特徴について、g12、g112およびg14変異体の利点を示している。
【０１１５】
g12およびg112変異体の免疫原性(F105および17bに対して良好な親和性)は良好であろう。g4/g14シリーズの変異体は、試験した様々な抗体に対して良好な反応性を有するので、有利である。
【実施例４】
【０１１６】
変異体パネルの選択およびBalb/Cマウスの免疫化後に評価した抗体遺伝子の中和能力の評価
変異体パネルg12、g112、g14を、ELISAの結果に従って選択した。gp120の外部ドメインの「サイレント」面上の変異部位がクラスター形成した配置であるので、g13変異体も評価した。g123変異体(非クラスター変異体)、ならびに野生型外被の遺伝子を参照として使用した。
【０１１７】
pCi-Neo(Promega)からネオマイシン遺伝子をrev遺伝子で置き換えることによってSV40プロモーターの制御下に置かれる、ベクターpCi-Revに各外被遺伝子をサブクローニングした。各構築体は、内毒素を含まないプラスミド抽出キット(Macherey-Nagel PC2000 EF)を用いて調製した。
【０１１８】
以下のように免疫化を実施した。各構築体において、注射するプラスミド4μgで事前にコーティングした金粒子を使用して、5匹の雌Balb/Cマウスを微粒子銃(GeneGun、Biorad)によって免疫化した。D0、D14、D28、D54およびD68に5回の連続的な注射を行った。D40およびD80に、動物の眼から血液試料を採取した。これらの試料は、様々な免疫化後における外被に対する抗体の増加を試験するために使用した。これを行うためにELISAアッセイを行った。1μg/mlに希釈したgp160外被タンパク質(ABL)を96ウェルプレート(Nunc)に吸着させた。非特異的部位を飽和させた後、D0、D40およびD80の日の免疫化したマウス由来の血清を、1/100から1/800の範囲の希釈率で使用し、次いでマウス抗体に対する西洋ワサビペルオキシダーゼ結合の抗体(Jackson)を用いて表示させた。0.35より大きい値で読み取られたODが、有意とみなされた。以下の表5に、各構築体で得られた陽性マウスを要約する。
【０１１９】
【表５】
2005508624.tif 000006
【０１２０】
これらのマウス由来の血清を、以下の2つの中和アッセイで使用した。
【０１２１】
a-FRウイルス(X4初代ウイルス)を様々なマウス血清の段階希釈液(1/10、1/20および1/40)と、DMEM培地(Euromedex)中、37℃で1時間接触させ、その後、P4PCCR5 Hela細胞を事前に培養しておいた96ウェルプレートに添加した。これらの細胞は、CD4受容体ならびにCCR5およびCXCR4補助受容体を有する。これらは、レトロウイルスLTRの制御下にあるβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を有する。1時間同時培養した後、5%のウシ胎児血清を含む200μlのDMEM培地を添加した。その後、細胞を37℃で48時間培養した。この24時間の期間の最後に、0.2Mフェリシアン化カリウム/0.2Mフェロシアン化カリウム/2M MgCl2中の400μg/mlのX-gal溶液を用いて、β-ガラクトシダーゼの発現を表示させた。中和の割合は、β-ガラクトシダーゼの合成が誘発されなかった非感染細胞の割合に対応する。並行して、マウス血清を用いずに(感染対照)または免疫化していないマウスの血清を用いて(中和背景対照、Tneg)、ウイルスでアッセイを行った。結果を以下の表6および図8に要約する。
【０１２２】
【表６】
2005508624.tif 000007
【０１２３】
ほとんどの血清で、背景ノイズ(約30%の中和)と区別される中和応答はなかった。しかし、構築体pCI-rev-g12およびpCI-rev-g14では、ELISAで陽性のマウス(それぞれS3/S4およびS3/S4)が、1/10の希釈率で有意な中和応答を示した(70%の中和)。この割合は1/20の希釈率ではより低く、1/40の希釈率では背景ノイズの値に戻るが、pCI-rev-g12で免疫化したS3マウスは例外であり、値が僅かに高い(40%)。非変異構築体(pCI-rev-env野生型=wt)で免疫化した、ELISAで陽性のマウス由来の血清は、このアッセイ様式では中和血清でない。
【０１２４】
b-マウス血清の、野生型133外被(=非変異自己株)を保有する疑似粒子を用いた許容細胞の感染を中和する能力について、評価した。陽性マウス由来の血清ならびに免疫化していないマウス由来の2種の血清を、段階希釈で(1/8から1/128)、疑似粒子を含む培養上清と共に37℃で1時間インキュベートした。以下のようにして、野生型133外被を保有する疑似粒子が得られた。構築体pCI-env133およびプラスミドpNL4-3luc(NIH AIDS Research and Reference Reagent Program)を用いて、pNL4-3luc/pCI-env133の比1/3で、293T細胞に同時形質移入させた。この形質移入は、リン酸カルシウム形質移入システムキット(Gibco)を用いて行った。プラスミドpNL4-3lucは、vprおよびenv(フレームシフト)ならびにルシフェラーゼ遺伝子以外のすべてのウイルス遺伝子を発現させることを可能にする。組換え野生型133外被を保有するウイルス疑似粒子は、補完によって形成される。形質移入の48時間後、培養上清を回収し、細胞デブリを除去するために遠心分離する。その後、ウシ胎児血清を加えて量を約20%にし、上清を一定分量に分けて-80℃で保存する。VIDAS自動化装置(bioMerieux)で行ったp24のアッセイにより、これらの上清中に存在するウイルス粒子の量を評価することが可能になる。
【０１２５】
96ウェル培養プレート中で、疑似粒子を含む一定量の上清を事前に血清(ウェルあたり10ngのp24等量)と接触させることによって、GHOST-CCR5またはGHOST-CXCR4細胞(NIH AIDS Research and Reference Reagent Program、これらの細胞はCD4を発現する)の感染を終夜行う。その後、培地を加える。さらに3日間インキュベートした後、上清を除去し、細胞を1×PBSで洗浄する。LucLite Plusキット(Perkin Elmer)を用いて溶解および酵素反応を行う。発光は、TopCountプレート読取り器(Packard Biosciences)で読み取る。
【０１２６】
結果は、g12-S3、g14-S3およびg14-S4血清では、発光が免疫化前のマウス由来の血清で記録されたものより約23%低いので(Vg19-S3=85 000対VT0=111 000)、これらの試料で、1/8の希釈率では僅かな中和が観察されることを示している。これらの結果は、先行の実験で記載したものと同じ傾向であると考えられる。例外は、中和活性が観察されなかったg12-S4血清である。
【実施例５】
【０１２７】
すべての脱グリコシル化変異体の機能の評価:擬似ウイルスを用いた感染およびHIV-1陽性ヒト血清を用いたこの感染の中和のアッセイ
様々な脱グリコシル化変異体を発現している擬似粒子の獲得は、外被タンパク質をその天然の状況(context)、すなわちウイルス粒子に組み込まれた状態で調査することを可能にするので、重要である。
【０１２８】
293T細胞を、それぞれの変異pCI-env構築体(脱グリコシル化変異体、表2のリストを参照)およびプラスミドpNL4-3luc (NIH AIDS Research and Reference Reagent Program)で、上記実施例1に記載したプロトコルに従って同時形質移入させた。
【０１２９】
形質移入の48時間後、培養上清を回収し、細胞デブリを除去するために遠心分離する。その後、ウシ胎児血清を加えて量を約20%にし、上清を一定分量に分けて-80℃で保存する。VIDAS自動化装置(bioMerieux)で行ったp24のアッセイにより、これらの上清中に存在するウイルス粒子の量を評価することが可能になる。
【０１３０】
24ウェル培養プレート中で、ウェルあたり50ngのp24に対応する一定量の上清をと接触させることによって、GHOST-CCR5またはGHOST-CXCR4細胞(NIH AIDS Research and Reference Reagent Program)の感染を終夜行った。その後、培地を新しくする。さらに3日間インキュベートした後、上清を除去し、細胞を1×PBSで洗浄し、300μlのCCLR(Promega製の細胞培養物溶解試薬)を用いて15分間溶解する。これらの溶解液の20μl体積を80μlの基質(Promega製のルシフェラーゼアッセイシステム)を接触させ、照度計(Turner Designs TD20/20)で発光を測定する。結果を図9に示す。
【０１３１】
この実験は、変異の数が多いほど、GHOST CCR5細胞の感染を誘発させる組換え外被の能力が低下することを示している。切断が少ないまたはまったくない構築体ではゼロである。GHOST-CXCR4細胞の感染を誘発させる変異体はなかった。これらの結果は、既に記載した合胞体形成アッセイと一致している(表4参照)。しかし、g112、g122、g13およびg123変異体で感染が検出されなかったが、細胞-細胞の融合活性が僅かに観察された。中和実験で使用したg14変異体では、僅かな量の感染が観察された。この調査を完全にするために、本発明者らはビリオン中に存在する外被タンパク質を制御した。このために、本発明者らは、20%ショ糖クッションで70 000g、3時間超遠心することによって疑似粒子を濃縮および精製した。ペレットをPBS-0.5% Tritonで溶解し、p24のアッセイによって試料の標準化が可能となった。その後、ポリクローナル抗gp120抗体(Biogenesis)を用いてウエスタンブロットを実施した。Envは、GHOST細胞に感染する疑似粒子中でのみ検出された。脱グリコシル化された部位の数が増加すると、原形質膜への外被タンパク質の輸出、および疑似粒子への外被の取込みにも影響が与えられると考えられる。
【０１３２】
最後に、中和血清に対するこれら擬似粒子の感度を評価した。GHOST-CCR5指示細胞の感染の前に、疑似粒子を含む培養上清を、ヒト血清の段階希釈液の存在下、37℃で1時間インキュベートした。これはGRI/LY血清(Dr C. Moog、INSERM U544、ストラスブール(Strasbourg)から提供)であり、その中和力価は様々なサブタイプの5種の初代単離株について決定された。並行して、参照中和HIV-1血清#1および#2(NIBSC)をネイティブ133外被を保有する疑似粒子における対照として使用した。感染プロトコルは上述のものと同様である。10ngのp24に等価の体積と接触させることによって、感染を96ウェルプレートで行う。溶解および酵素反応は、LucLite Plusキット(Perkin Elmer)を用いて行う。発光をTopCountプレート読取り器(Packard Biosciences)で読み取る。
【０１３３】
結果を図10に示す。
【０１３４】
「陰性血清」の曲線は、HIV-1陰性血清(CTS Lyon-Gerland)と接触させた、野生型外被を発現する擬似ビリオンで実施した実験に対応する。この曲線は、背景ノイズを決定する曲線である。1/640より高い血清希釈での中和が有効である。
【０１３５】
これらの結果は、疑似粒子が、その表面に発現される外被に応じて中和が異なることを示している。しかし、g30およびg22変異体でのみ、感染割合が野生型(非変異)外被と比べて有意に低下している。この実験と、このような変異体が中和抗体をin vivoで誘発させる能力との間に直接の相関はないが、g22変異体は、小動物のDNAの免疫化後に中和抗体を誘発させるその能力について試験する有利な候補であり得る。
【０１３６】
［参考文献］
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【図面の簡単な説明】
【０１３７】
【図１】クラスターの定義および結晶化したgp120分子上の各部位の近接度を表す図である。
【図２】生成した各変異体および対照のそれぞれの細胞溶解液における、gp160□およびgp120□の検出を表す図である。
【図３Ａ】HIV-陽性血清のプールに関して、細胞溶解液中でELISAを用いてアッセイした抗原性を表す図である。
【図３Ｂ】HIV-陽性血清のプールに関して、培養上清中でELISAを用いてアッセイした抗原性を表す図である。
【図４Ａ】細胞溶解液中に検出されたCD4の量を表す図である。
【図４Ｂ】培養上清中に検出されたCD4の量を表す図である。
【図５Ａ】培養上清中でELISAを用いてアッセイした、F105エピトープの認識を表す図である。
【図５Ｂ】細胞溶解液中でELISAを用いてアッセイした、F105エピトープの認識を表す図である。
【図６Ａ】細胞溶解液中でELISAを用いてアッセイした、CD4の存在下におけるCG10エピトープの認識を表す図である。
【図６Ｂ】培養上清中でELISAを用いてアッセイした、CD4の存在下における(□)、および単体(■)での、CG10エピトープの認識を表す図である。
【図７Ａ】細胞溶解液中でELISAを用いてアッセイした、CD4の存在下における(□)、および単体(□)での、17bエピトープの認識を表す図である。
【図７Ｂ】培養上清中でELISAを用いてアッセイした、CD4の存在下における(□)、および単体(□)での、17bエピトープの認識を表す図である。
【図８】P4PCCR5 Hela細胞上のFRウイルス(X4初代ウイルス)の、様々な構築体(実施例4で免疫化したマウス由来の血清を用いた中和を例示する図である。
【図９】表2で同定した変異糖タンパク質を保有する疑似粒子を用いた、GHOST-CCR5およびGHOST-CXCR4細胞の感染を例示する図である。
【図１０】中和CRI/LYヒト血清を用いた、変異糖タンパク質を保有する疑似粒子の中和を例示する図である。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年5月6日(2004.5.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１２】
HIV-1ウイルスの変異Env糖タンパク質であって、糖タンパク質が、「参照」一次感染初代単離株のネイティブEnvタンパク質と比較して1種の初代単離株と別の初代単離株との間で保存されている前記参照タンパク質のグリコシル化部位で少なくとも2つの変異を示し、各変異が、アスパラギンをグルタミンで置換することからなり、2つの変異が、
(a')少なくとも2つの変異がEnvタンパク質のC3領域にあること、
(b')少なくとも1つの変異がC3領域にあり、少なくとも1つの変異がV3領域にあること、
(c')少なくとも1つの変異がC2領域にあり、少なくとも1つの変異がV3領域にありアミノ酸288または324のグリコシル化部位から選択されること、
(d')少なくとも1つの変異がC2領域にありアミノ酸223、227、234、255および282のいずれか1つのグリコシル化部位から選択され、少なくとも1つの変異がV3領域にあること
から少なくとも選択され、
1種の一次感染初代単離株と別の一次感染初代単離株との間で保存されている前記グリコシル化部位の位置が1から8アミノ酸変動することが可能であり、
あるいは、変異Env糖タンパク質が、配列番号18、配列番号19または配列番号20のいずれか1つの配列からなる
ことを特徴とする糖タンパク質。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
本発明はまた、HIV-1ウイルスの変異Env糖タンパク質であって、糖タンパク質が、「参照」一次感染初代単離株のネイティブEnvタンパク質と比較して1種の初代単離株と別の初代単離株との間で保存されている前記参照タンパク質のグリコシル化部位で少なくとも2つの変異を示し、各変異が、アスパラギンをグルタミンで置換することからなり、2つの変異が、
(a')少なくとも2つの変異がEnvタンパク質のC3領域にあること、
(b')少なくとも1つの変異がC3領域にあり、少なくとも1つの変異がV3領域にあること、
(c')少なくとも1つの変異がC2領域にあり、少なくとも1つの変異がV3領域にありアミノ酸288または324のグリコシル化部位から選択されること、
(d')少なくとも1つの変異がC2領域にありアミノ酸223、227、234、255および282のいずれか1つのグリコシル化部位から選択され、少なくとも1つの変異がV3領域にあること、
から少なくとも選択され、
1種の一次感染初代単離株と別の一次感染初代単離株との間で保存されている前記グリコシル化部位の位置が1から8アミノ酸変動することが可能であり、
あるいは、変異Env糖タンパク質が、配列番号18、配列番号19または配列番号20のいずれか1つの配列からなる、
糖タンパク質に関する。
【国際調査報告】
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