(57)【要約】  ＣＡ１２５遺伝子がクローニングされ、カルボキシル末端を含む複数のリピート配列が同定された。ＣＡ１２５分子は３つの主要ドメイン：細胞外アミノ末端ドメイン（ドメイン１）、大きなマルチリピートドメイン（ドメイン２）及び短い細胞質ドメインを有するトランスメンブレンアンカーを含むカルボキシル末端ドメイン（ドメイン３）を含んでいる。アミノ末端伸長部分が存在する。構造は、エピトープ結合部位を含む１５６アミノ酸リピートユニットにより占められている。６０よりも多いリピートユニットが同定された。リピートユニットはＯＣ１２５及びＭ１１結合の部位を含んでいる。前記リピートの発現が証明された。リピートドメインのいずれかは、ＣＡ１２５抗原の存在を検出及びモニターするための新規な金本位として使用する可能性を有する。リピートドメイン及びその他のドメインもワクチン開発に対する基礎を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含むＣＡ１２５分子：
（ａ）５つのゲノムエクソンを含む細胞外アミノ末端ドメイン、ここでエクソン１は配列番号：２９９のアミノ酸＃１−３３を含み、エクソン２は配列番号：２９９のアミノ酸＃３４−１５９３を含み、エクソン３は配列番号：２９９のアミノ酸＃１５９４−１６０５を含み、エクソン４は配列番号：２９９のアミノ酸＃１６０６−１６１７を含み、さらにエクソン５は配列番号：２９９のアミノ酸＃１６１８−１６３７を含む；
（ｂ）４つのゲノムエクソンを含むアミノ末端伸長部分、ここでエクソン１は配列番号：３１０のアミノ酸＃１−３１５７を含み、エクソン２は配列番号：３１０のアミノ酸＃３１５８−３１９３を含み、エクソン３は配列番号：３１０のアミノ酸＃３１９４−９２７７を含み、さらにエクソン４は配列番号：３１０のアミノ酸＃９２７８−１０４２７含む；
（ｃ）各リピートユニットが５つのゲノムエクソンを含むマルチリピートドメイン、ここでエクソン１は配列番号：１６４から１９４のいずれかのアミノ酸＃１−４２を含み、エクソン２は配列番号：１９５から２２１のいずれかのアミノ酸＃４３−６５を含み、エクソン３は配列番号：２２２から２４９のいずれかのアミノ酸＃６６−１２３を含み、エクソン４は配列番号：２５０から２７７のいずれかのアミノ酸＃１２４−１３５を含み、さらにエクソン５は配列番号：２７８から２９８のいずれかのアミノ酸＃１３６−１５６を含む；および
（ｄ）短い細胞質ドメインを有するトランスメンブレンアンカーを含み、さらに９つのゲノムエクソンを含むカルボキシ末端ドメイン、ここでエクソン１は配列番号：３００のアミノ酸＃１−１１を含み、エクソン２は配列番号：３００のアミノ酸＃１２−３３を含み、エクソン３は配列番号：３００のアミノ酸＃３４−８２を含み、エクソン４は配列番号：３００のアミノ酸＃８３−１３３を含み、エクソン５は配列番号：３００のアミノ酸＃１３４−１５６を含み、エクソン６は配列番号：３００のアミノ酸＃１５７−２１２を含み、エクソン７は配列番号：３００のアミノ酸＃２１３−２２５を含み、エクソン８は配列番号：３００のアミノ酸＃２２６−２５３を含み、さらにエクソン９は配列番号：３００のアミノ酸＃２５４−２８４を含む。
【請求項２】
図８Ｂで印（ｘ）を付したアミノ末端ドメインのＮ−糖化部位が、配列番号：２９９の＃８１、＃２７１、＃３２０、＃６２４、＃７９５、＃８３４、＃９３８および＃１１６５位にコードされる請求項１に記載のＣＡ１２５分子。
【請求項３】
前記アミノ末端ドメインのセリンおよびスレオニンのＯ−糖化パターンが図８Ｂの配列番号：２９９に印（ｏ）を付されてある請求項１に記載のＣＡ１２５分子。
【請求項４】
表２６で印（ｘ）を付されてあるアミノ末端伸長部分のＮ−糖化部位が、＃１３９、＃４３４、＃７８７、＃９３０、＃９５７、＃１２６６、＃１３７５、＃１６３３、＃１８４０、＃１８７７、＃１８９０、＃２３４５、＃２３７５、＃２７３７、＃３０８５、＃３１７８、＃３５０１、＃４２２１、＃４４９９、＃４６０７、＃４６１４、＃４６２５、＃５０４８、＃５１３３、＃５３２２、＃５３９６、＃５４２２、＃５６９１、＃５８６５、＃６０９０、＃６７３４、＃６８６１、＃６９６３、＃８０３１、＃８０５７、＃８３２６、＃８６２０、＃８６８６、＃８９１５、＃９２０４、＃９４９５、＃９７８７、＃１００７７および＃１０１７５位にコードされる請求項１に記載のＣＡ１２５。
【請求項５】
前記アミノ末端伸長部分のセリンおよびスレオニンのＯ−糖化パターンが表２６で印（ｏ）を付されてある請求項１に記載のＣＡ１２５分子。
【請求項６】
前記リピートドメインのエクソン２が少なくとも３１の異なるコピーを含み、エクソン２が少なくとも２７の異なるコピーを含み、エクソン３が少なくとも２８の異なるコピーを含み、エクソン４が少なくとも２８の異なるコピーを含み、さらにエクソン５が少なくとも２１の異なるコピーを含む請求項１に記載のＣＡ１２５分子。
【請求項７】
前記リピートドメインが、エピトープ結合部位を含む１５６アミノ酸リピートユニットを含む請求項１に記載のＣＡ１２５分子。
【請求項８】
前記エピトープ結合部位が、図５の配列番号：１５０のアミノ酸＃５９−７９のＣ−包囲部分（Ｃ−Ｃと印を付されてある）に位置している請求項７に記載のＣＡ１２５分子。
【請求項９】
前記１５６アミノ酸リピートユニットが、図５Ｃの配列番号：１５０の＃１２８、＃１２９、＃１３２、＃１３３、＃１３４、＃１３５、＃１３９、＃１４５、＃１４６、＃１４８、＃１５０、＃１５１および＃１５６位にＯ−糖化部位を含む請求項７に記載のＣＡ１２５分子。
【請求項１０】
前記１５６アミノ酸リピートユニットが、図５Ｃの配列番号：１５０の＃３３および＃４９位にＮ−糖化部位を含む請求項７に記載のＣＡ１２５分子。
【請求項１１】
前記１５６アミノ酸リピートユニットが、図５Ｃの配列番号：１５０の＃２４位に少なくとも１つの保存メチオニン（Ｍで表示）を含む請求項７に記載のＣＡ１２５分子。
【請求項１２】
前記カルボキシ末端ドメインのトランスメンブレンドメインが、図９Ｂの配列番号：３００の＃２３０−２５２位（下線部）に位置する請求項１に記載のＣＡ１２５。
【請求項１３】
前記カルボキシ末端ドメインの細胞質ドメインが高度に塩基性の配列を含み、前記塩基性配列が、図９Ｂの配列番号：３００の＃２５６−２６０位のトランスメンブレン、図９Ｂの配列番号：３００の＃２５４、＃２５５および＃２７６位のセリンおよびスレオニンリン酸化部位、並びに図９Ｂの配列番号：３００の＃２６４、＃２７３および＃２７４位のチロシンリン酸化部位の近傍にある請求項１に記載のＣＡ１２５分子。
【請求項１４】
少なくとも４５のリピートユニットがＣＡ１２５分子のリピートドメインに存在する請求項７に記載のＣＡ１２５分子。
【請求項１５】
配列番号：１６２のアミノ酸＃１−１６３８を含むアミノ末端ドメイン、配列番号：１６２のアミノ酸＃１６４３−１１４３８を含むリピートドメイン、および配列番号：１６２のアミノ酸＃１１４３９−１１７２２を含むカルボキシ末端ドメインを含むＣＡ１２５分子。
【請求項１６】
表１６の配列番号：１４６を含むＣＡ１２５分子のリピートドメイン。
【請求項１７】
さらに６３の個々のリピートユニットを含む請求項１６に記載のリピートドメイン。
【請求項１８】
各リピートユニットが少なくとも１５６のアミノ酸を含む請求項１７に記載のリピートドメイン。
【請求項１９】
各リピートユニットが、配列番号：１４６のアミノ酸＃５９−７９（下線部）のＣ−包囲部分に位置するエピトープ結合部位を含む請求項１８に記載のリピートドメイン。
【請求項２０】
各リピートユニットが、配列番号：１４６の＃１２８、＃１２９、＃１３２、＃１３３、＃１３４、＃１３５、＃１３９、＃１４５、＃１４６、＃１４８、＃１５０、＃１５１および＃１５６位のＯ−糖化部位を含む請求項１８に記載のリピートドメイン。
【請求項２１】
各リピートユニットが配列番号：１４６の＃３３および＃４９位のＮ−糖化部位を含む請求項１８に記載のリピートドメイン。
【請求項２２】
以下から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含むＣＡ１２５遺伝子の単離核酸：  （ａ）配列番号：４９、６７、８１、８３−１４５、１４７、１５０および１５２に示すヌクレオチド配列；
（ｂ）（ａ）のいずれかの配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；
（ｃ）（ａ）から（ｂ）のいずれかの配列の縮退変種；および
（ｄ）（ａ）から（ｃ）のいずれかの配列のフラグメント。
【請求項２３】
以下から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列を含むＣＡ１２５遺伝子の単離核酸：
（ａ）配列番号：１１−４７、５０−８０、８２、１４６、１４８、１４９、１５１および１５３−１５８に示すアミノ酸配列；
（ｂ）（ａ）の配列のいずれかと少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）から（ｂ）のいずれの配列の保存的変種；および
（ｄ）（ａ）から（ｃ）のいずれかの配列のフラグメント。
【請求項２４】
請求項２２の核酸を含むベクター。
【請求項２５】
前記ベクターがクローニングベクター、シャトルベクターまたは発現ベクターである請求項２４に記載のベクター。
【請求項２６】
請求項２４のベクターを含む培養細胞。
【請求項２７】
前記ポリペプチドを発現する請求項２４のベクターをトランスフェクトされた培養細胞または前記細胞の子孫細胞。
【請求項２８】
以下の工程を含む、細胞でＣＡ１２５抗原を発現させる方法：
（ａ）（ｉ）配列番号：４９、６７、８１、８３−１４５、１４７、１５０および１５２に示すヌクレオチド配列；（ｉｉ）（ｉ）のいずれかの配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；（ｉｉｉ）（ｉ）から（ｉｉ）のいずれかの配列の縮退変種；および（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかの配列のフラグメントから成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸を提供し；
（ｂ）ＣＡ１２５抗原をコードするｍＲＮＡを含む細胞を提供し；さらに
（ｃ）前記細胞に前記核酸を導入し、ここでＣＡ１２５抗原が前記細胞で発現される。
【請求項２９】
以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＣＡ１２５遺伝子の精製ポリペプチド：
（ａ）配列番号：１１−４８、５０、６８−８０、８２、１４６、１４８、１４９、１５０、１５１および１５３−１５８に示すアミノ酸配列；
（ｂ）（ａ）の配列のいずれかと少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）から（ｂ）のいずれの配列の保存的変種；および
（ｄ）（ａ）から（ｃ）のいずれかの配列のフラグメント。
【請求項３０】
ＣＡ１２５タンパク質のレセプター結合ドメイン内のエピトープと選択的に結合する精製抗体であって、前記エピトープが以下から成る群から選択されるアミノ酸配列内に存在する前記精製抗体：
（ａ）配列番号：１１−４８、５０、６８−８０、１４６、１５１および１５３−１５８に示すアミノ酸配列；
（ｂ）（ａ）の配列のいずれかと少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）から（ｂ）のいずれの配列の保存的変種；および
（ｄ）（ａ）から（ｃ）のいずれかの配列のフラグメント。
【請求項３１】
卵巣、結腸、肝臓および膵臓から成る群から選択される癌細胞と選択的に結合する請求項３０に記載の抗体。
【請求項３２】
配列番号：１１−４８、５０、６８−８０、８２、１４６、１５０、１５１、１５３−１６１および１６２（アミノ酸＃１６４３−１１４３８）に示すアミノ酸配列から成る群から選択されるエピトープ結合部位を含むＣＡ１２５リピートドメインの少なくとも１つのリピートユニットを含むリコンビナントＣＡ１２５を含む、ＣＡ１２５抗原の存在を検出およびモニターする診断薬。
【請求項３３】
前記エピトープ結合部位が配列番号：１５０のアミノ酸＃５９−７９のＣ−包囲部分に位置し、さらに配列番号：１４６および配列番号：１６２の下線部のアミノ酸を含む請求項３２に記載の診断薬。
【請求項３４】
エピトープ結合部位を含むリコンビナントＣＡ１２５リピートドメインを含む、ＣＡ１２５抗原レベルが上昇するか、またはＣＡ１２５抗原レベルの上昇に付随する症状または症状の再発を惹起させる危険性のある哺乳類を治療する治療用ワクチンであって、前記リピートドメインが、配列番号：１１−４８、５０、６８−８０、８２、１４６、１４８、１４９、１５０、１５１、１５３−１６１および１６２（アミノ酸＃１６４３−１１４３８）並びに配列番号：３００のアミノ酸＃１７５−２８４から成るアミノ酸配列群から選択される前記治療用ワクチン。
【請求項３５】
前記哺乳類が動物およびヒトを含む請求項３４の治療用ワクチン。
【請求項３６】
以下によってコードされるＣＡ１２５の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド：
（ａ）配列番号：４９、６７、８１、８３−１４５、１４７、１５０および１５２に示されたヌクレオチド配列；
（ｂ）（ａ）のいずれかの配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；
（ｃ）（ａ）から（ｂ）のいずれかの配列の縮退変種；および
（ｄ）（ａ）から（ｃ）のいずれかの配列のフラグメント。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
関連出願の相互引用
本出願は、米国仮特許出願６０／２８４１７５号（2001年4月17日出願）、米国仮特許出願６０／２９９３８０号（2001年6月19日出願）、米国非仮特許出願０９／９６５７３８号（2001年9月27日）、米国仮特許出願６０／３４５１８０（2001年12月21日）（前記は参照により本明細書に含まれる）の権利を請求する。
本発明は一般に、ＣＡ１２５遺伝子の糖化アミノ末端ドメイン、マルチリピートドメインおよびカルボキシ末端のin vitroでのクローニング、特定および発現に関し、より具体的にはエピトープ結合部位との遺伝子組換え体ＣＡ１２５の診断および治療を目的とする使用に関する。
【０００２】
背景技術
ＣＡ１２５は、卵巣癌細胞表面に存在する抗原性決定基で正常な成人卵巣組織では本来発現しない。ＣＡ１２５は卵巣腺癌をもつ患者の血清中で上昇し、そのために、ＣＡ１２５は、前記患者の治療への反応に対して患者を管理する場合に、さらに症状の再発のインジケーターとして１５年以上にわたって決定的な役割を担ってきた。
ＣＡ１２５は卵巣癌でのみ発現されるわけではなく、正常な分泌組織および他の癌（すなわち膵臓、肝臓、結腸(colon)）でも見出されることはよく認識されている（H. Hardardottir et al., Distribution of CA125 in embryonic tissue and adult derivatives of the fetal periderm, Am. J. Obstet. Gynecol. 163;6(1):1925-1931(1990); V.R. Zurawski et al., Tissue distribution and characteristics of the CA125 antigen, Cancer Rev. 11-12:102-108(1988); T.J. O'Brien et al., CA125 antigen in human amniotic fluid and fetal membranes, Am. J. Obstet Gynecol. 155:50-55(1986); M. Nap et al., Immunohistochemical characterization of 22 monoclonal antibodies against the CA125 antigen: 2nd report from the ISOBM TD-1 workshop, Tumor Biology 17:325-332(1996)）。
それにもかかわらず、ＣＡ１２５は、前記疾患をもつ患者の症状に正比例し（すなわち進行、退行および無変化）、卵巣癌患者をモニターする“ゴールドスタンダード”となった（R.C. Bast et al., A radioimmunoassay using a monoclonal antibody to monitor the course of epithelial ovarian cancer, N. Engl. J. Med. 309:883-887(1983); G.C. Bon et al., Serum tumor marker immunoassay s in gynecologic oncology: Establishment of reference values, Am. J. Obstet. Gynecol. 174:107-114(1996)）。ＣＡ１２５は、子宮内膜組織が萎縮し、結果として正常な循環ＣＡ１２５の主要な供給源ではなくなった閉経後の患者で特に有用である。
【０００３】
１９８０年代の中ごろに、本発明の発明者および共同研究者はＭ１１（ＣＡ１２５のモノクローナル抗体）を開発した。Ｍ１１はＣＡ１２５分子のリピート構造上の優性エピトープと結合する（T.J. O'Brien et al., New monoclonal antibodies identify the glycoprotein carrying the CA125 epitope, Am. J. Obstet Gynecol. 165:1857-64(1991)）。最近になって、本発明者および共同研究者はＣＡ１２５の精製および安定化の方式を開発した。前記方式は高度に精製された高分子量のＣＡ１２５の蓄積を可能にする（T.J. O'Brien et al., More than 15 years of CA125: What is known about the antigen, its structure and function, Int. J. Biological Markers 13(4):188-195(1998)）。
顕著な進歩が何年かにわたって為され、ＣＡ１２５分子、その構造および機能の特徴がさらに明らかにされた。ＣＡ１２５分子は、もっぱらＯ−結合糖側鎖を有する高分子量糖タンパク質である。天然の分子は非常に大きな複合体（約２−５百万ダルトン）として存在する。前記複合体、ＣＡ１２５分子を含むエピトープおよびＣＡ１２５エピトープを含まない結合タンパク質で構成されているようである。ＣＡ１２５分子はサイズおよび荷電の両者において不均一であり、これはおそらくは、体液中でのＣＡ１２５の消長時における側鎖の連続的な糖除去反応によるものであろう。コアのＣＡ１２５サブユニットは２０００００ダルトンを越え、さらにＯＣ１２５およびＭ１１クラスの抗体の両者と結合する能力を保持する。前記糖タンパク質の生化学および代謝は本発明者によって報告されてきたが、ＣＡ１２５遺伝子をクローニングした者はまだいない。ＣＡ１２５遺伝子は、その構造並びに正常および悪性の両組織におけるその生理学的役割を理解する基礎を提供するであろう。
ＣＡ１２５のような血清腫瘍マーカーの検出および定量における進歩にもかかわらず、なお卵巣癌患者の大半は、その疾患の進行期（病期ＩＩＩまたはＩＶ）に診断が下される。さらにまた、治療に対する患者の反応の管理および症状再発の検出には大きな問題が残っている。したがって現行のＣＡ１２５アッセイ系を大きく改善しさらに標準化する必要がある。さらにまた、卵巣癌のリスクを示す初期インジケーターの開発は初期診断および予後診断の改善に有用なツールを提供するであろう。
【０００４】
発明の開示
発明が解決しようとする課題
ＣＡ１２５遺伝子をクローニングし、マルチリピート配列をその糖化アミノ末端およびカルボキシ末端と同様に特定した。ＣＡ１２５は３５０００塩基を越える転写物を必要とし、染色体１９ｑ１３．２のほぼ１５００００ｂｐを占有する。ＣＡ１２５分子は以下の３つの主要部分から構成される：細胞外アミノ末端ドメイン（ドメイン１）；大きなマルチリピートドメイン（ドメイン２）；および短い細胞質ドメインをもつトランスメンブレンアンカーを含むカルボキシ末端ドメイン（ドメイン３）。前記アミノ末端ドメインは５つのゲノムエクソン、４つの非常に短いアミノ末端配列および１つのきわめて大きなエクソンを結合させることによって組み立てられる。前記ドメインは、Ｏ−糖化の能力およびその結果としてのセリンとスレオニン残基の豊富さを特徴とする。さらに、アミノ末端伸長部分が存在し、前記は４つのゲノムエクソンを含む。前記アミノ末端伸長部分の分析によって、そのアミノ酸構成は前記のアミノ末端ドメインのアミノ酸構成と一致することが判明した。
ＣＡ１２５の特徴である細胞外リピートドメインはまた、ＣＡ１２５分子の構造の主要部分である。前記はアミノ末端ドメインの下流に存在し、その近傍の細胞外マトリックスに対してそれ自身を極めて特異な態様で提示する。前記リピートの特徴は、エクソン構造における高度に保存された性質および均一性を含む多くの特性である。しかしながら特に一貫していることは、配列に含まれるシステインがシステインループを形成することができるということである。ドメイン２はＣＡ１２５分子の１５６アミノ酸リピートユニットを含む。前記リピートドメインはＣＡ１２５分子の最大部分を構成する。前記リピートユニットはまた、ＯＣ１２５群およびＭ１１群を含む両主要クラスに対するエピトープ（今や詳細に報告され分類されている）を含む。６０を越えるリピートユニットが特定され、配列を決定され、ＣＡ１２５ドメイン構造内に切れ目なく配置された。前記リピート配列は互いに７０−８５％の相同性を示す。リピート配列の存在は大腸菌（E. coli）での発現によって確認された（前記大腸菌では、ＯＣ１２５／Ｍ１１両クラスの抗体はＣＡ１２５リピート上の部位と結合することが見出された）。
【０００５】
ＣＡ１２５は、トランスメンブレンドメインおよび短い細胞質テールによってそのカルボキシ末端で固定される。前記カルボキシ末端はまた、前記トランスメンブレンドメインから約５０アミノ酸上流にタンパク質切断部位を含み、前記部位はタンパク質分解による切断を可能にしＣＡ１２５分子を遊離させる。
ＣＡ１２５抗原のマルチリピートドメインの特定および配列決定によって、卵巣癌およびＣＡ１２５が発現される他の癌をもつ患者の検出、モニターおよび治療を目的とする新規な臨床的および治療的応用が提供されよう。例えば、適切なエピトープを有するＣＡ１２５のリピートドメインを発現させる能力は、研究および臨床で用いることができる必要性の高い標準試薬を提供するであろう。現行のＣＡ１２５のためのアッセイは、標準物として培養細胞株または患者の腹水から製造されたＣＡ１２５を利用する。いずれの供給源でもＣＡ１２５分子の品質または純度は明確ではない。本発明は、エピトープ結合部位を含むＣＡ１２５のマルチリピートドメインを提供することによって、現行アッセイの前記欠点を克服する。表１６に示した６０を越えるリピートのうち任意の少なくとも１つまたは２つ以上を、ＣＡ１２５の有無を調べるために“ゴールドスタンダード”として用いることができる。さらにまた、リコンビナント生成物を利用して抗体生成のために新規でより特異的なアッセイを開発することができる。
おそらくより重要なことであるが、ＣＡ１２５のマルチリピートドメインまたは他のドメインはまた、卵巣癌患者のための潜在的ワクチンの開発に用いることができた。ヒトでＣＡ１２５に対して細胞性および液性免疫を誘発するために、患者の抗イディオタイプ抗体産生を期待してＣＡ１２５に特異的なネズミの抗体を用い、したがって間接的にＣＡ１２５分子に対して免疫反応を誘発させることができた。リコンビナントＣＡ１２５（特に公知のネズミ抗体に対するエピトープ結合部位を包含するドメイン）の利用性に関しては、ＣＡ１２５に対する患者の免疫系をさらに直接的に刺激し、結果として卵巣癌患者を延命させるということは実現可能性が高いであろう。
【０００６】
本発明のリコンビナントＣＡ１２５はまた治療用標的の開発に用いることができる。腫瘍細胞表面で発現されるＣＡ１２５のような分子は、免疫刺激、ドラッグデリバリー、生物学的改変物質のデリバリーまたは特異的デリバリーによって最終的に腫瘍細胞を死滅させることができる任意の薬剤のための潜在的標的を提供できる。ＣＡ１２５エピトープに対するヒト化またはヒト抗体を用いて、全ての薬剤または毒性薬剤（放射性薬剤を含む）を輸送して腫瘍細胞の直接破壊を仲介することができる。ＣＡ１２５分子上のドメインに対して天然の結合親和性を有する天然のリガンドを用いて、腫瘍細胞を治療する薬剤を輸送することもまた可能である。
ＣＡ１２５の発現はさらに、卵巣腫瘍細胞にとって生存または転移に関して利益を提供する。ＣＡ１２５リピート配列に由来するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてＣＡ１２５の発現をダウンレギュレートすることができる。さらにまた、アンチセンス療法を上記に述べたタイプの腫瘍細胞デリバリー系と一緒に用いることもできる。ＣＡ１２５分子のリコンビナントドメインはまた、ＣＡ１２５分子の個々のドメインと結合する小分子を特定する潜在能力を有する。このような小分子はまたデリバリー薬剤として、または生物学的改変物質として用いることができる。
【０００７】
本発明のある特徴では、以下を含むＣＡ１２５分子が開示される：（ａ）細胞外アミノ末端ドメイン、前記は５つのゲノムエクソンを含み、ここでエクソン１は配列番号：２９９のアミノ酸＃１−３３を含み、エクソン２は配列番号：２９９のアミノ酸＃３４−１５９３を含み、エクソン３は配列番号：２９９のアミノ酸＃１５９４−１６０５を含み、エクソン４は配列番号：２９９のアミノ酸＃１６０６−１６１７を含み、エクソン５は配列番号：２９９のアミノ酸＃１６１８−１６３７を含む；（ｂ）アミノ末端伸長部分、前記は４つのゲノムエクソンを含み、ここでエクソン１は配列番号：３１０のアミノ酸＃１−３１５７を含み、エクソン２は配列番号：３１０のアミノ酸＃３１５８−３１９３を含み、エクソン３は配列番号：３１０のアミノ酸＃３１９４−９２７７を含み、エクソン４は配列番号：３１０のアミノ酸＃９２７８−１０４２７含む；（ｃ）マルチリピートドメイン、前記の各リピートユニットは５つのゲノムエクソンを含み、ここでエクソン１は配列番号：１６４から１９４のいずれかのアミノ酸＃１−４２を含み、エクソン２は配列番号：１９５から２２１のいずれかのアミノ酸＃４３−６５を含み、エクソン３は配列番号：２２２から２４９のいずれかのアミノ酸＃６６−１２３を含み、エクソン４は配列番号：２５０から２７７のいずれかのアミノ酸＃１２４−１３５を含み、エクソン５は配列番号：２７８から２９８のいずれかのアミノ酸＃１３６−１５６を含む；および（ｄ）カルボキシ末端ドメイン、前記は短い細胞質ドメインを有するトランスメンブレンアンカーを含み、さらに９つのゲノムエクソンを含み、ここでエクソン１は配列番号：３００のアミノ酸＃１−１１を含み、エクソン２は配列番号：３００のアミノ酸＃１２−３３を含み、エクソン３は配列番号：３００のアミノ酸＃３４−８２を含み、エクソン４は配列番号：３００のアミノ酸＃８３−１３３を含み、エクソン５は配列番号：３００のアミノ酸＃１３４−１５６を含み、エクソン６は配列番号：３００のアミノ酸＃１５７−２１２を含み、エクソン７は配列番号：３００のアミノ酸＃２１３−２２５を含み、エクソン８は配列番号：３００のアミノ酸＃２２６−２５３を含み、エクソン９は配列番号：３００のアミノ酸＃２５４−２８４を含む。
【０００８】
本発明の別の特徴では、図８Ｂで印（ｘ）を付したアミノ末端ドメインのＮ−糖化部位は、配列番号：２９９の＃８１、＃２７１、＃３２０、＃６２４、＃７９５、＃８３４、＃９３８および＃１１６５位にコードされる。
本発明の別の特徴では、アミノ末端ドメインのセリンおよびスレオニンＯ−糖化パターンは図８Ｂの配列番号：２９９に印（ｏ）を付して示されている。
本発明の別の特徴では、表２６に印（ｘ）を付したアミノ末端伸長部分のＮ−糖化部位は、＃１３９、＃４３４、＃７８７、＃９３０、＃９５７、＃１２６６、＃１３７５、＃１６３３、＃１８４０、＃１８７７、＃１８９０、＃２３４５、＃２３７５、＃２７３７、＃３０８５、＃３１７８、＃３５０１、＃４２２１、＃４４９９、＃４６０７、＃４６１４、＃４６２５、＃５０４８、＃５１３３、＃５３２２、＃５３９６、＃５４２２、＃５６９１、＃５８６５、＃６０９０、＃６７３４、＃６８６１、＃６９６３、＃８０３１、＃８０５７、＃８３２６、＃８６２０、＃８６８６、＃８９１５、＃９２０４、＃９４９５、＃９７８７、＃１００７７および＃１０１７５位にコードされる。
別の特徴では、アミノ末端伸長部分のセリンおよびスレオニンＯ−糖化パターンは表２６に印（ｏ）を付して示されている。
【０００９】
本発明の別の特徴では、リピートドメインのエクソン２は少なくとも３１の異なるコピーを含み、エクソン２は少なくとも２７の異なるコピーを含み、エクソン３は少なくとも２８の異なるコピーを含み、エクソン４は少なくとも２８の異なるコピーを含み、エクソン５は少なくとも２１の異なるコピーを含む。
本発明の別の特徴では、リピートドメインは、エピトープ結合部位を含む１５６アミノ酸リピートユニットを含む。前記エピトープ結合部位は、図５の配列番号：１５０のアミノ酸＃５９−７９（Ｃ−Ｃと印を付されている）のＣ−包囲部分に位置している。
別の特徴では、１５６アミノ酸リピートユニットは、図５Ｃの配列番号：１５０の＃１２８、＃１２９、＃１３２、＃１３３、＃１３４、＃１３５、＃１３９、＃１４５、＃１４６、＃１４８、＃１５０、＃１５１および＃１５６位にＯ−糖化部位を含む。前記１５６アミノ酸リピートユニットはさらに、図５Ｃの配列番号：１５０の＃３３および＃４９位にＮ−糖化部位を含む。前記リピートユニットはまた、図５Ｃの配列番号：１５０の＃２４位に少なくとも１つの保存メチオニン（Ｍで表示）を含む。
さらに別の特徴では、カルボキシ末端ドメインのトランスメンブレンドメインは、図９Ｂの配列番号：３００の＃２３０−２５２位（下線部）に位置する。前記カルボキシ末端ドメインの細胞質ドメインは高度に塩基性の配列を含み、前記塩基性配列は、図９Ｂの配列番号：３００の＃２５６−２６０位のトランスメンブレン、図９Ｂの配列番号：３００の＃２５４、＃２５５および＃２７６位のセリンおよびスレオニンリン酸化部位、並びに図９Ｂの配列番号：３００の＃２６４、＃２７３および＃２７４位のチロシンリン酸化部位に隣接する。
【００１０】
本発明のまた別の特徴では、ＣＡ１２５遺伝子の単離核酸が開示される。前記単離核酸は、以下から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む：（ａ）配列番号：４９、６７、８１、８３−１４５、１４７、１５０および１５２に示されたヌクレオチド配列；（ｂ）（ａ）のいずれかの配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；（ｃ）（ａ）から（ｂ）のいずれかの配列の縮退変種；および（ｄ）（ａ）から（ｃ）のいずれかの配列のフラグメント。
本発明の別の特徴では、ＣＡ１２５遺伝子の単離核酸は、以下から成る群から選択されるアミノ酸配列をもつポリペプチドをコードする配列を含む：（ａ）配列番号：１１−４７、５０−８０、８２、１４６、１４８、１４９、１５１および１５３−１５８に示すアミノ酸配列；（ｂ）（ａ）の配列のいずれかと少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；（ｃ）（ａ）から（ｂ）のいずれの配列の保存的変種；および（ｄ）（ａ）から（ｃ）のいずれかの配列のフラグメント。
さらに別の特徴では、ＣＡ１２５遺伝子の核酸を含むベクターが開示される。前記ベクターはクローニングベクター、シャトルベクターまたは発現ベクターであろう。前記ベクターを含む培養細胞もまた開示される。
さらに別の特徴では、細胞でＣＡ１２５抗原を発現させる方法が開示される。前記方法は以下の工程を含む：（ａ）（ｉ）配列番号：４９、６７、８１、８３−１４５、１４７、１５０および１５２に示されたヌクレオチド配列；（ｉｉ）（ｉ）のいずれかの配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；（ｉｉｉ）（ｉ）から（ｉｉ）のいずれかの配列の縮退変種；および（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかの配列のフラグメントから成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸を提供し；（ｂ）ＣＡ１２５抗原をコードするｍＲＮＡを含む細胞を提供し；さらに（ｃ）前記細胞に前記核酸を導入し、ＣＡ１２５抗原を前記細胞で発現させる。
【００１１】
さらに別の特徴では、ＣＡ１２５遺伝子の精製ポリペプチドは、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む：（ａ）配列番号：１１−４８、５０、６８−８０、８２、１４６、１４８、１４９、１５０、１５１および１５３−１５８に示すアミノ酸配列；（ｂ）（ａ）の配列のいずれかと少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；（ｃ）（ａ）から（ｂ）のいずれの配列の保存的変種；および（ｄ）（ａ）から（ｃ）のいずれかの配列のフラグメント。
別の特徴では、ＣＡ１２５タンパク質のレセプター結合ドメイン内のエピトープと選択的に結合する精製抗体が開示される。ここで前記エピトープは以下から成る群から選択されるアミノ酸配列内に存在する：（ａ）配列番号：１１−４８、５０、６８−８０、１４６、１５１および１５３−１５８に示すアミノ酸配列；（ｂ）（ａ）の配列のいずれかと少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；（ｃ）（ａ）から（ｂ）のいずれの配列の保存的変種；および（ｄ）（ａ）から（ｃ）のいずれかの配列のフラグメント。
Ｃａ１２５抗原の存在を検出およびモニターする診断薬もまた開示される。前記診断薬は、配列番号：１１−４８、５０、６８−８０、８２、１４６、１５０、１５１、１５３−１６１および１６２（アミノ酸＃１６４３−１１４３８）に示すアミノ酸配列から成る群から選択されるエピトープ結合部位を含むＣＡ１２５リピートドメインの少なくとも１つのリピートユニットを含むリコンビナントＣＡ１２５を含む。
ＣＡ１２５抗原レベルが上昇するか、またはＣＡ１２５抗原レベルの上昇に付随する症状または症状の再発を惹起させる危険性のある哺乳類を治療する治療用ワクチンもまた開示される。前記ワクチンはエピトープ結合部位を含むリコンビナントＣＡ１２５リピートドメインを含み、前記リピートは、配列番号：１１−４８、５０、６８−８０、８２、１４６、１４８、１４９、１５０、１５１、１５３−１６１および１６２（アミノ酸＃１６４３−１１４３８）並びに配列番号：３００のアミノ酸＃１７５−２８４から成るアミノ酸配列群から選択される。
本発明の別の特徴では、以下によってコードされるＣＡ１２５の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドが開示される：（ａ）配列番号：４９、６７、８１、８３−１４５、１４７、１５０および１５２に示されたヌクレオチド配列；（ｂ）（ａ）のいずれかの配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；（ｃ）（ａ）から（ｂ）のいずれかの配列の縮退変種；および（ｄ）（ａ）から（ｃ）のいずれかの配列のフラグメント。
本発明の前述の特徴およびさらに別の特徴は、本発明の単なる例示として下記に述べる、現時点で好ましい本発明の実施態様の記載から当業者には明白となろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明にしたがって、当業者には明白な通常の分子生物学、微生物学およびリコンビナントＤＮＡ技術を用いることができる。そのような技術は文献に完全に説明されている（例えば以下を参照されたい：Maniatis, Fritsch & Sambrook, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (1982); “DNA Cloning: A Practical Approach”, Vol I and II (D.N. Glover ed., 1985); “Oligonucleotide Synthesis” (M.J. Gait ed., 1984); “Nucleic Acid Hybridization” (B.D. Hames & S.J. Higgins eds., 1985); “Transcription and Translation” (B.D. Hames & S.J. Higgins eds., 1984); “Animal Cell Culture” (R.I. Freshney ed., 1986); “Immobilized Cells and Enzymes” (IRL Press, 1986); B.Perbal, “A Practical Guide To Molecular Cloning”, 1984）。
したがって、本明細書で用いられる場合は、下記の用語は以下に設定される定義を有するであろう。
“ベクター”はレプリコン、例えばプラスミド、ファージまたはコスミドであり、それに対して別のＤＮＡセグメントが結合され、その結果、前記結合されたセグメントの複製を生じる。
“ＤＮＡ分子は”、一本鎖形または二本鎖らせんを示すデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミンまたはシトシン）の重合形を指す。本用語は前記分子の一次または二次構造のみを指し、具体的な三次元形はいずれも指定されない。したがって、本用語には、とりわけ直鎖状ＤＮＡ分子（例えば制限フラグメント）、ウイルス、プラスミドおよび染色体で見出される二本鎖ＤＮＡが含まれる。
【００１３】
本明細書で用いられるように、“遺伝子”という用語はポリペプチド鎖をコードするＤＮＡの領域を意味するであろう。
“メッセンジャーＲＮＡ”または“ｍＲＮＡ”は、１つまたは２つ以上のポリペプチドをコードするＲＮＡ分子を意味するであろう。
“ＤＮＡポリメラーゼ”は、ＤＮＡ鋳型を用いてデオキシリボヌクレオチド三リン酸の重合を触媒してＤＮＡ鎖を生成する酵素を指すであろう。
“逆転写酵素”は、ＲＮＡまたはＤＮＡ鋳型を用いて、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド三リン酸の重合を触媒してＤＮＡまたはＲＮＡを生成する酵素を意味するであろう。
“相補性ＤＮＡ”または“ｃＤＮＡ”は、逆転写酵素活性を有する酵素によるデオキシリボヌクレオチドの重合によって合成されたＤＮＡ分子を意味するであろう。
“単離核酸”は、その構造が天然に存在する核酸のいずれの構造とも同一でない、または３つを越えるそれぞれ別個の遺伝子を含む天然に存在するゲノム核酸のいずれのフラグメントの構造とも同一でない核酸である。したがって前記用語は以下を含む：例えば、（ａ）天然に存在するゲノムＤＮＡ分子の一部分の配列を有するＤＮＡであるが、前記ＤＮＡが天然に存在する生物のゲノム内の前記分子の前記部分と接するコード配列の両方と接していない前記ＤＮＡ；（ｂ）ベクター、原核細胞もしくは真核細胞のゲノムＤＮＡ内に取り込まれた核酸であって、その結果生じる分子が天然に存在するいずれのベクターまたはゲノムＤＮＡとも同一でない態様で取り込まれてある前記核酸；（ｃ）切り離された分子、例えばｃＤＮＡ、ゲノムフラグメント、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成されたフラグメント、または制限フラグメント；および（ｄ）ハイブリッド遺伝子（すなわち融合タンパク質をコードする遺伝子）の一部分であるリコンビナントヌクレオチド配列。
【００１４】
本発明のプローブまたはプライマーを指す場合に本明細書で用いられる“オリゴヌクレオチド”は、２つまたは３つ以上、好ましくは１０を越えるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドで構成される分子と定義される。その正確なサイズは、前記オリゴヌクレオチドの最終的な機能および用途によってそれぞれ左右される多くの因子によって異なる。
“ＤＮＡフラグメント”にはポリヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドが含まれ、天然に存在する塩基およびシクロフラノシル基が天然のホスホジエステル結合によって結合して生成された複数の結合ヌクレオチドユニットを指す。事実上、本用語は、天然に存在する種または天然に存在するサブユニットから生成された合成種を指す。“ＤＮＡフラグメント”はまた、プリンおよびピリミジン基、並びに同様に機能するが天然に存在しない部分を有する成分を指す。したがって、ＤＮＡフラグメントは改変糖成分または糖間結合を含むことができる。前記の例は、特にホスホロチオエートおよび他の硫黄含有種である。前記はまた、改変塩基ユニットまたは他の改変部分を含むことができるが、ただし生物学的活性が保持されていることを条件とする。ＤＮＡフラグメントはまた、少なくともいくつかの改変塩基系を有する種も含むことができる。したがって、通常は天然に見出されないプリンおよびピリミジンも前記に含むことができる。同様に、ヌクレオチドサブユニットのシクロフラノース部分の改変もまた、生物学的機能がそのような改変によって排除されないかぎり包含することができる。
【００１５】
“プライマー”とは、天然に存在するか合成によって生成されるかにかかわらず、合成の開始点として機能することができるオリゴヌクレオチドを指す。前記プライマーは、ある核酸鎖に相補的なプライマー伸長生成物の合成が誘発される条件下、すなわちヌクレオチドおよび誘発薬剤（例えばＤＮＡポリメラーゼ）の存在下並びに適切な温度およびｐＨに置かれたときに前述のように機能する。プライマーは一本鎖でも二本鎖でもよいが、誘発薬剤の存在下で所望の伸長生成物の合成を開始させるために十分な長さを有する必要がある。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの由来および使用される方法を含む多くの因子に左右されるであろう。例えば、診断薬として用いる場合には、標的配列の複雑度に応じて、オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には１０−２５またはそれより多くのヌクレオチドを含む。
本明細書のプライマーは、個々の標的ＤＮＡ配列の別の鎖と“実質的に”相補的であるように選択される。このことは、プライマーは、その対応する鎖とハイブリダイズするために実質的に相補的でなければならないことを意味する。したがって、プライマー配列は鋳型の正確な配列を反映する必要はない。例えば、非相補的なヌクレオチドフラグメントをプライマーの５’末端に結合させ、前記プライマー配列の残りの部分を前記鎖に相補的であるようにすることができる。また別に、非相補的な塩基、または長い配列をプライマー中に点在させてもよい（ただしプライマー配列が前記配列と十分な相補性を有するか、または前記とハイブリダイズし、それによって伸長生成物の合成のための鋳型を形成することを条件とする）。
【００１６】
本明細書で用いられるように、“ハイブリダイゼーション”という用語は一般的に、変性ＲＮＡまたはＤＮＡを、溶液中に遊離しているかまたは固相に結合している相補的な核酸配列と結合させる技術を指す。当業者には理解されるところであるが、２つの核酸間の完全な相補性はハイブリダイゼーションの発生に必須ではない。前記技術は分子遺伝学では普遍的であり、もっぱら複雑な核酸混合物で特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列を特定するために用いられる。
本明細書で用いられるように、“制限エンドヌクレアーゼ”および“制限酵素”とは、二本鎖ＤＮＡを固有のヌクレオチド配列で、またはその近くで切断する細菌由来の酵素を指す。
“精製ポリペプチド”は、タンパク分解切断または化学的切断によってＣＡ１２５から生成された任意のペピチドを指す。
“縮退変種”とはリピート配列における任意のアミノ酸変種を指し、前記変種はエクソン構造の相同性および配列の保存性を満たし、Ｍ１１、ＯＣ１２５およびＩＳＯＢＭ抗体シリーズによって認識される。
“フラグメント”とは、ある精製方式で特定されたＣＡ１２５分子の任意の部分を指す。
“保存的変種抗体”は、Ｍ１１、ＯＣ１２５またはＩＳＯＢＭ抗体シリーズのいずれかの抗体の基準を満たす任意の抗体を指す。
【００１７】
材料と方法
Ａ．組織の収集、ＲＮＡの単離およびｃＤＮＡの合成
正常および卵巣腫瘍組織の両方をｃＤＮＡ調製に用いた。組織収集プロトコルにしたがって組織を日常的に収集し、−８０℃で保存した。
全ＲＮＡの単離は、GibcoBRL（カタログ番号#15596-018）から購入したトリゾール試薬（TriZol Reagent）を用い製造元の指示にしたがって実施した。いくつかの事例では、ｍＲＮＡはオリゴｄＴアフィニティークロマトグラフィーを用いて単離した。回収したＲＮＡの量はＵＶ分光法によって定量した。第一鎖相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、クロンテック（Clontech）から入手した 第一鎖合成キット（カタログ番号K1402-1）を用い製造元のプロトコルにしたがい、５．０μｇのＲＮＡおよびランダムな六量体プライマーを用いて合成した。ｃＤＮＡの純度は、β−チューブリン遺伝子に特異的なプライマーを用いてＰＣＲによって検定した。これらのプライマーは、純粋なｃＤＮＡから生成されたＰＣＲ生成物をゲノムＤＮＡ夾雑ｃＤＮＡから区別することができるようにイントロンの全長に広がる。
【００１８】
Ｂ．ＣＡ１２５リピートユニットの特定および順序決定
臭化シアンを用いて、２−５百万ダルトンのＣＡ１２５糖タンパク質（リピートドメインを含む）を糖ペプチドフラグメントに化学的に分断することができる。図１に示すように、これらのフラグメントのいくつか（特に４０ｋＤａおよび６０ｋＤａフラグメント）は、ＯＣ１２５およびＭ１１で定義される２つの古典的抗体群となお結合する。
ＣＡ１２５を一定の糖ペプチドに変換するために、ＣＡ１２５親分子を臭化シアン消化で処理した。前記切断処理によって２つの主要な分画がポリアクリルアミドゲル電気泳動後のクーマシーブルー染色で得られた。約６０ｋＤａバンドおよび前記より優勢な４０ｋＤａバンドが図１に示すように特定された。これらのバンドのウェスタンブロットをＯＣ１２５またはＭ１１抗体（それらは両方ともＣＡ１２５分子を特定する）を用いて調べたとき、これらのバンドは両抗体と結合した。４０ｋＤａバンドは６０ｋＤａバンドよりもきわめて顕著であった。したがって、これらのデータは、前記バンド（特に４０ｋＤａバンド）はＣＡ１２５分子の純正の切断ペプチドであろうということを示した（前記ペプチドはＯＣ１２５およびＭ１１の結合という識別特性を保持していた）。
４０ｋＤａおよび６０ｋＤａバンドをＰＶＤＦブロットから切り出し、ハーバードシークェンシング（Harvard Sequencing, Harvard Microchemistry Facility and The Biological Laboratories, 16 Divinity Avenue, Cambridge, Massachusetts 02138）が報告し実施したように、アミノ末端ペプチドおよび内部ペプチドアミノ酸配列決定を実施した。配列決定は４０ｋＤａバンドについてのみ成功し、両アミノ末端配列およびいくつかの内部配列が表１の配列番号：１−４で示したように得られた。ＣＡ１２５タンパク質の４０ｋＤａフラグメントは、２つの翻訳されたＥＳＴ配列（GenBank Accession No. BE005912およびAA640762）と相同性を有することが判明した。これら翻訳された配列の目視検査によって類似のアミノ酸領域が判明し、反復ドメインの可能性が示唆された。ＥＳＴGenBank Accession番号ＢＥ００５９１２の核酸およびアミノ酸配列（配列番号：５および６にそれぞれ対応する）は表１に示されている。共通配列は枠で囲むか、または下線を施されている。
前記の提唱リピートファミリーの他の個々のメンバーを特定するために、２つのオリゴヌクレオチドプライマーを前記ＥＳＴ配列に相同な領域を基準にして合成した。表２Ａに示したように、前記プライマー配列は、配列番号：７および８（センスプライマー）並びに配列番号：９および１０（アンチセンスプライマー）に一致する。リピート配列は以下の参考文献に開示された方法にしたがって増幅した：K. Shigemasa et al., p.21: A monitor of p53 dysfunction in ovarian neoplasia, Int. J. Gynecol. Cancer 7:296-303 (1997); K. Shigemasa et al., p16 Overexpression: A potential early indicator of transformation in ovarian Carcinoma, J. Soc. Gynecol. Invest. 4:95-102(1997)。腫瘍ｃＤＮＡバンクから入手した卵巣腫瘍ｃＤＮＡを用いた。
【００１９】
増幅はサーマルサイクラー（Perkin-Elmaer Cetus）で実施した。反応混合物は以下から成る：保存用緩衝液Ａ中の１ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Promega）、１Ｘ好熱性ＤＮＡポリメラーゼ、１０ＸのＭｇ非含有緩衝液（Promega）、３００ｍＭのｄＮＴＰ、２．５ｍＭのＭｇＣｌ2、並びに標的遺伝子のための各々０．２５ｍＭのセンスおよびアンチセンスプライマー。２０μＬの反応物には、しょう液性腫瘍ｍＲＮＡから得られた５０ｎｇのｍＲＮＡから合成した１μＬのｃＤＮＡが鋳型として含まれていた。ＰＣＲ反応は以下の工程を必要とした：最初の変性工程は９４℃／１．５分、続いて９４℃／０．５分、４８℃／０．５分、７２℃／０．５分の３５サイクル、最終伸長工程７２℃／７分。３つのバンドが先ず特定され（>>４００ｂｐ、>>８００ｂｐおよび>>１２００ｂｐ）、これらを単離した。アガロースゲル電気泳動によるサイズ分析の後、これらのバンドを他の一切の問題の生成物とともにＴベクタープラスミド（Promega）に連結し、大腸菌細胞のコンピテントＤＨ５α株を形質転換した。選択培地で増殖させた後、個々のコロニーを３７℃で一晩培養し、プラスミドＤＮＡをＱＩＡプレップスピンミニプレップ（QIAprep Spin Miniprep）キット（Qiagen）を用いて抽出した。ＡｐａＩおよびＳａｃＩを用いて陽性クローンを制限消化によって特定した。ＡＢＩ自動配列決定装置（モデル３７７）、Ｔ７プライマーおよびビッグダイターミネーターサイクル配列決定キット（Applied Biosystems）を用いて挿入物の配列を決定した。
ＧＣＧ（Wisconsin Genetic's Computer Group）のパイルアップ（Pileup）プログラムを用いて得られた配列を分析した。これら特定したリピートユニットのヌクレオチド配列内の高度に保存された２つの領域に対してデザインしたプライマーを用いてリピートユニットの順序を決定した。表２Ｂに示したように、センスおよびアンチセンスプライマー（５’−ＧＴＣＴＣＴＡＴＧＴＣＡＡＴＧＧＴＴＴＣＡＣＣＣ−３’／５’−ＴＡＧＣＴＧＣＴＣＴＣＴＧＴＣＣＡＧＴＣＣ−３’、それぞれ配列番号：３０１および３０２）は任意の１つのリピート内で互いに反対向きにオーバーラップ配列をつくり、したがって２つのリピートユニットのいずれの結合部も横断増幅させることができる。ＰＣＲ反応、クローニング、配列決定および分析は上記に述べたように実施した。
【００２０】
Ｃ．ＣＡ１２５アミノ末端ドメインの特定とアッセンブリー
ＣＡ１２５リピートユニットの他に開放読み枠含有配列の検索では、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information; www.ncbi.nlm.nih.gov/）で利用できるＢＬＡＳＴプログラムを用いてデータベース検索を実施した。検索用配列（query sequence）としてリピートユニットを用いて、コスミドＡＣ００８７３４は、順不同の（３５）連続ＤＮＡ断片（ｃｏｎｔｉｇとしても知られている）全体にマルチリピート配列を有することが明らかにされた。これらｃｏｎｔｉｇの１つ、＃３２はその３’末端にリピート領域のエクソン１および２を有することが見出された。ｃｏｎｔｉｇ＃３２はまた、前記リピート配列の上流に大きな開放読み枠（ＯＲＦ）を含むことが判明した。ＰＣＲを再度用いて前記ＯＲＦの存在を実証し、それがリピートユニットに連結されていることを確認した。特異的プライマーはこのＯＲＦの３’末端（５’−ＣＡＧＣＡＧＡＧＡＧＡＣＣＡＧＣＡＣＧＡＧＴＡＣＴＣ−３’；配列番号：５１）、およびリピート内の配列（５’−ＴＣＣＡＣＴＧＣＣＡＴＧＧＣＴＧＡＧＣＴ−３’；配列番号：５２）を認識する。アミノ末端ドメインの残りの部分はこのｃｏｎｔｉｇから同様な態様で組み立てた。それぞれＰＣＲで確認しながら新規なプライマー（表１０Ａ参照）を前記の組み立てた配列に対してデザインし、これを、別の上流の潜在的ＯＲＦに対してデザインしたプライマーと一緒に用いた（セット１：５’−ＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＡＧＣＴＣＴＴＣＣＣＡＧＧＡＣ−３’／５’−ＧＧＡＡＴＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＡＣＧＴＣＴＧ−３’（配列番号：５３および配列番号：５４）；セット２：５’−ＣＴＴＣＣＣＡＧＧＡＣＡＡＣＣＴＣＡＡＧＧ−３’／５’−ＧＣＡＧＧＡＴＧＡＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＴＧ−３’（配列番号：５５および配列番号：５６）；セット３：５’−ＧＴＣＡＧＡＴＣＴＧＧＴＧＡＣＣＴＣＡＣＴＧ−３’／５’−ＧＡＧＧＣＡＣＴＧＧＡＡＡＧＣＣＣＡＧＡＧ−３’）（配列番号：５７および配列番号：５８）。データベース検索で検索用配列としてｃｏｎｔｉｇ＃３２配列を用いて、潜在的な隣接配列（ＥＳＴＡＵ１３３６７３を含むｃｏｎｔｉｇ＃７）もまた特定された。確認用プライマーをデザインし、これを典型的な態様で用いた（５’−ＣＴＧＡＴＧＧＣＡＴＴＡＴＧＧＡＡＣＡＣＡＴＣＡＣ−３’／５’−ＣＣＣＡＧＡＡＣＧＡＧＡＧＡＣＣＡＧＴＧＡＧ−３’）（配列番号：５９および配列番号：６０）。
【００２１】
ＣＡ１２５配列の５’末端を特定するために、腫瘍ｃＤＮＡを用いてｃＤＮＡ末端５’ラピッド増幅（5' Rapid Amplification of cDNA Ends, First Choice（登録商標）RLM-RACE Kit, Ambion）を実施した。第一回目のＰＣＲ反応ではアンビオン社（Ambion）が供給したセンスプライマー（５’−ＧＣＴＧＡＴＧＧＣＧＡＴＧＡＡＴＧＡＡＣＡＣＴＧ−３’）（配列番号：６１）、および既に確認済みのｃｏｎｔｉｇ＃３２配列に特異的なアンチセンスプライマー（５’−ＣＣＣＡＧＡＡＣＧＡＧＡＧＡＣＣＡＧＴＧＡＧ−３’）（配列番号：６２）を用いた。続いて第二回目のＰＣＲはネストプライマーを用いて実施し、センス鎖（Ambion）は５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＡＡＣＡＣＴＧＣＧＴＴＴＧＣＴＧＧＣＴＴＴＧＡＴＧ−３’（配列番号：６３）で、アンチセンスは確認済みｃｏｎｔｉｇ＃７配列に特異的であった（５’−ＣＣＴＣＴＧＴＧＴＧＣＴＧＣＴＴＣＡＴＴＧＧＧ−３’）（配列番号：６４）。ＲＡＣＥＰＣＲの生成物（約３００ｂｐのバンド）を先に述べたようにクローニングし配列を決定した。
Ｄ．ＣＡ１２５カルボキシ末端ドメインの特定およびアッセンブリー
検索用配列として確認済みリピートユニットを用いてデータベース検索を実施し、他のリピートユニットだけでなく潜在的カルボキシ末端配列を含むｃＤＮＡ配列（GenBank AK024365）もまた特定した。組み立てられたＣＡ１２５を含むこの配列の連続性特性は、ｃｏｎｔｉｇおよびＥＳＴ分析と同様に、ＰＣＲを用いて確認した（５’−ＧＧＡＣＡＡＧＧＴＣＡＣＣＡＣＡＣＴＣＴＡＣ−３’／５’−ＧＣＡＧＡＴＣＣＴＣＣＡＧＧＴＣＴＡＧＧＴＧＴＧ−３’）（それぞれ配列番号：３０３および配列番号：３０４）。
【００２２】
Ｅ．６ｘＨｉｓタグ付加−ＣＡ１２５リピートの大腸菌での発現
表１１に示すＣＡ１２５リピートの開放読み枠を、センスプライマー（５’−ＡＣＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＧＣＣＡＣＡＣＡＧＡＧＣＣＴＧＧＣＣＣ−３’）（配列番号：６５）およびアンチセンスプライマー（５’−ＴＧＴＡＡＧＣＴＴＡＧＧＣＡＧＧＧＡＧＧＡＴＧＧＡＧＴＣＣ−３’）（配列番号：６６）を用いてＰＣＲで増幅した。ＰＣＲは以下から成る反応混合物を用いて実施した：５０ｎｇのｍＲＮＡに由来する卵巣腫瘍ｃＤＮＡ、ＣＡ１２５リピートに対する各々５ｐｍｏｌのセンスおよびアンチセンスプライマー、０．２ｍｍｏｌのｄＮＴＰおよび１ｘの緩衝液中の０．６２５ＵのＴａｑポリメラーゼ（最終容積２５ｍＬ）。前記混合物を１分の変性（９５℃）とそれに続く３０サイクルの以下から成るＰＣＲに付した：９５℃３０秒の変性、６２℃３０秒のアニーリングおよび７２℃１分の伸長、並びに最後のサイクルではさらに７分の伸長。生成物を２％アガロースゲルで電気泳動して分離した。ＰＣＲ生成物を精製し、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。前記消化ＰＣＲ生成物を続いて発現ベクターｐＱＥ−３０（ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで予め消化）に連結した。このクローンは、６ｘＨｉｓタグ付加−ＣＡ１２５リピートリコンビナントの発現を可能にするであろう。形質転換大腸菌（ＪＭ１０９）をＯＤ600＝１．５−２．０に３７℃で増殖させ、続いてＩＰＴＧ（０．１ｍＭ）で２５℃４−６時間誘発してリコンビナントタンパク質を生成した。全大腸菌溶解物を１２％のＳＤＳポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、クーマシ−染色して強く発現されたタンパク質を検出した。
【００２３】
Ｆ．ウェスタンブロット分析
タンパク質を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、１００Ｖ４０分４℃でニトロセルロース膜に電気的にブロッティングした。前記ブロットを５％脱脂乳含有リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．３）で一晩ブロックした。ＣＡ１２５抗体Ｍ１１、ＯＣ１２５またはＩＳＯＢＭ９．２を５％のミルク／ＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ＋０．１％ＴＸ−１００）中の５μｇ／ｍＬの希釈で前記の膜とインキュベートし、さらに室温で２時間インキュベートした。数回ＰＢＳを交換してブロットを３０分間洗浄し、１：１００００稀釈のセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Bio-Rad）で室温で１時間インキュベートした。数回ＰＢＳを交換してブロットを３０分洗浄し、さらに化学発光基質（ＥＣＬ（Amersham PharmaciaBiotech））とともにインキュベートし、その後可視化のためにＸ線フィルムに１０秒暴露した。
図４は、リコンビナントタンパク質を含まない大腸菌溶解物（レーン１、陰性コントロール）およびＣＡ１２５と無関係のリコンビナントタンパク質ＴＡＧＤ−１４（レーン３）と比較した大腸菌溶解物から精製したリコンビナントＣＡ１２５リピート（レーン２）のウェスタンイムノブロットの３つのパターンを示す。図に示したように、Ｍ１１抗体、ＯＣ１２５抗体および抗体ＩＳＯＢＭ９．２（ＯＣ１２５類似抗体）は全てＣＡ１２５リコンビナントリピート（レーン２）を認識したが、大腸菌溶解物（レーン１）または無関係のＴＡＤＧ−１４リコンビナント（レーン３）はいずれも認識しなかった。これらのデータによって、前記リコンビナントリピートが、ＣＡ１２５のそれぞれ別個のエピトープ、ＯＣ１２５エピトープおよびＭ１１エピトープをコードすることが確認された。
Ｇ．ノザンブロット分析
全ＲＮＡサンプル（約１０μｇ）を６．３％ホルムアミド、１．２％アガロースゲル（０．０２ＭのＭＯＰＳ、０．０５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ７．０）および０．００１ＭのＥＤＴＡ）で電気泳動により分離した。続いてＲＮＡを毛細管作用によって２０ＸのＳＳＰＥ中でハイボンド−Ｎ（Amersham）にブロッティングし、８０℃で２時間、乾熱処理して膜に固定した。ＣＡ１２５分子の４００ｂｐリピートであるＰＣＲ生成物をプロメガ（Promega）から入手可能なPrime-a-Gene標識系（カタログ番号Ｕ１１００）を用いて放射能標識した。ブロットをクロンテック（Clontech）から入手可能なExpressHyb Hybridization Solutionプロトコルにしたがってプローブして切り出した。
【００２４】
結果
１９９７年に、ＣＡ１２５（患者の腹水に由来する）の精製のための系が本発明の共同発明者および他の研究者らによって報告された。前記ＣＡ１２５は続いて臭化シアン消化を実施したとき、６０ｋＤａおよび４０ｋＤａのＣＡ１２５のペプチドフラグメントを生じた（T.J. O' Brien et al., More than 15 years of Ca125: What is known about the antigen, its structure and its function, Int. J. Biological Markers 13(4):188-195(1998)）。両フラグメントはポリアクリルアミドゲルでクマシーブルー染色によって、さらにウェスタンブロットによって特定された。両フラグメントはＯＣ１２５およびＭ１１抗体の両方に結合することが判明し、主要なエピトープクラスの両方が遊離されたペプチドに保存されていることが示唆された（図１）。
４０ｋＤａバンドのタンパク質配列決定によって、プロテアーゼ消化で生成されたアミノ末端配列といくつかの内部配列の両方が判明した（表１：配列番号：１−４）。６０ｋＤａバンドの収量は不十分で信頼できる配列情報は得られなかった。残念ながら、これらの配列に対してデザインしたリダンダントプライマーを用いてＰＣＲ生成物を増幅させる試みは成功しなかった。２０００年の半ばに、ＥＳＴ（＃ＢＥ００５９１２）がＧＣＧデータベースに登録された。ＥＳＴは表１（配列番号：５および６）に示すように、４０ｋＤａバンドの配列との相同性を含んでいた。このＥＳＴの翻訳は４０ｋＤａリピートのアミノ末端と良好な相同性を示し（例えばＰＧＳＲＫＦＫＴＴＥ）、ただ１つのアミノ酸のみが異なっていた（すなわちアスパラギンがフェニルアラニンの代わりにＥＳＴ配列に存在する）。さらにまた、内部配列のいくつかは部分的に保存されている（例えば配列番号：２、続いてその程度は低くなるが配列番号：３および４）。より重要なことには、全ての内部配列で塩基性アミノ酸が先行し（表１、矢印で表示）、前記は４０ｋＤａ臭化シアンリピートから内部ペプチドを得るために用いられるトリプシンによるタンパク質分解に適している。合体させた配列（アミノ酸配列決定によって得られた配列、並びにＥＳＴ（＃ＢＥ００５９１２）およびデータベースで特定した第二のＥＳＴ（＃ＡＡ６４０７６２）で特定された配列）を用いて、センスプライマー、５’−ＧＧＡＧＡＧＧＧＴＴＣＴＧＣＡＧＧＧＴＣ−３’（配列番号：７）（アミノ酸ＥＲＶＬＱＧを表す）およびアンチセンスプライマー、５’−ＧＴＧＡＡＴＧＧＴＡＴＣＡＧＧＡＧＡＧＧ−３’（配列番号：９）（ＰＬＬＩＰＦを表す）を作製した。ＰＣＲを用いて、卵巣腫瘍内にこれらの配列を示す転写物が存在すること、正常卵巣にはそれらが存在しないこと、およびムチン性腫瘍内では非常に低レベルで存在するかまたは全く検出できないレベルであることを確認した（図２Ａ）。転写物の存在はさらに多数の原発性卵巣癌細胞株に由来するｃＤＮＡで確認され、同じ患者の対応するリンパ球培養では転写物は存在しないことが確認された（図２Ｂ）。
【００２５】
増幅させた４００塩基対ＰＣＲ生成物のクローニングおよび配列決定後に、互いに高度な相同性を有するが、明らかに別個のリピート成分である一連の配列が特定された（図３）（配列番号：１５８から１６１）。
各カテゴリーのリピートの例を配列決定し、その結果は表３、４および５に示されている。前記の配列はＥＳＴ（GenBank Accession No. ＢＥ００５９１２）に由来するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて得たＰＣＲ生成物の増幅および配列データを示す。表３は、ＣＡ１２５分子の４００ｂｐリピートのアミノ酸配列を示す。前記は配列番号：１１から配列番号：２１として特定される。表４は、ＣＡ１２５分子の８００ｂｐリピートのアミノ酸配列を示す。前記は配列番号：２２から配列番号：３５に一致する。表５、ＣＡ１２５分子の１２００ｂｐリピートのアミノ酸配列を示す。前記は配列番号：３６から配列番号：４６として特定される。オーバーラップ配列のＰＣＲ増幅および配列決定を利用するこれらリピート配列（ＰＩＬＥＵＰアプリケーションを用いＧＣＧ（＝Genetics Computer Group）ソフトで決定したとき互いに７５−８０％の相同性を有する）のアッセンブリーによって、９リピート構造を構築することができた。９リピートのアミノ酸配列は配列番号４７として表６に示されている。個々のＣ−包囲部分は表で強調されている。
【００２６】
表６の集合リピート配列を用い遺伝子バンクのデータベースを検索して、ＡＫ０２４３６５（GenBank Accession No., 2000年9月29日登録）と称されるｃＤＮＡが見出された。表７はＡＫ０２４３６５のアミノ酸配列を示す。前記は配列番号：４８に対応する。ＡＫ０２４３６５は表６に示す集合リピート配列の２つのリピートでオーバーラップすることが判明した。個々のＣ−包囲部分は表７で強調されている。
ＡＫ０２４３６５のｃＤＮＡによって、ＣＡ１２５遺伝子の下流のカルボキシ末端配列だけでなくさらに４つのリピートのアラインメントが可能になった。表８は、ＣＡ１２５分子のカルボキシ末端に連続する１３のリピートの完全なＤＮＡ配列を示している。前記は配列番号：４９に対応する。表９は、ＣＡ１２５分子の１３リピートおよびカルボキシ末端の完全なアミノ酸配列を示している。前記は配列番号：５０に対応する。カルボキシ末端はさらに遺伝子バンクのデータベースの２つのＥＳＴ（GenBank Accession No., ＡＷ１５０６０２およびＡＩ９２３２２４）の存在によって確認された。前記の両者は（ＴＧＡ）と表示した終止コドンおよびポリＡシグナル配列（ＡＡＴＡＡ）およびポリＡテールであることが確認された（表９参照）。これらのリピートの存在はしょう液性卵巣腫瘍で確認され、正常卵巣組織およびムチン性腫瘍では予想されたように存在しないことが確認された（図２Ａ参照）。さらにまた、これらリピートの転写物は、卵巣腫瘍由来の腫瘍細胞株に存在するが、正常なリンパ球細胞株には存在しないことが示された（図２Ｂ参照）。さらにまた、正常組織または卵巣癌由来のｍＲＮＡおよびＰ32標識ＣＡ１２５リピート配列を用いたノザンブロット分析（図６に提示）によって、卵巣腫瘍抽出物に２０ｋｂのＲＮＡ転写物が過剰に存在することが確認された（図２Ｂ参照）。
【００２７】
今日までに互いに高い相同性をもつ４５リピート配列が特定された。これらのリピート配列の整列順序を決定するために、上流のリピートに由来するセンスプライマー（５’−ＧＴＣＴＣＴＡＴＧＴＣＡＡＴＧＧＴＴＴＣＡＣＣＣ−３’）、下流のリピート配列に由来するアンチセンスプライマー（５’−ＴＡＧＣＴＧＣＴＣＴＣＴＧＴＣＣＡＧＴＣＣ−３’）を用い、オーバーラップ配列を増幅させた。前記の試みは、図３に示したように連続的態様でこれらのリピートを配置するために実施した。いくつかの可能なリダンダンシーが存在する。さらに、配列内の２つ以上の位置にいくつかのリピートが存在するという証拠がオーバーラップ配列から得られ、ＣＡ１２５分子では合計６０を越えるリピートが生じる（表２１の配列番号：１６２参照）。
仮定的Ｃ１２５リピートドメインと公知のＣＡ１２５分子との関係についての最終的確認は、リコンビナントリピートドメインを大腸菌で発現させることによって達成された。図４では、リコンビナントＣＡ１２５リピートドメインの発現は、ベクター単独（レーン１、パネルＤ）に対してレーン２に示されている。以下の大腸菌抽出物を表す一連のウェスタンブロットをＣＡ１２５抗体、Ｍ１１（パネルＡ）；ＯＣ１２５（パネルＢ）およびＩＳＯＢＭ９．２（パネルＣ）を用いて調べた：ベクター単独（レーン１）、ＣＡ１２５リコンビナントタンパク質（レーン２）、およびリコンビナントＴＡＧＤ−１４（無関係のリコンビナントプロテアーゼ）（レーン３）。全ての事例で、ＣＡ１２５抗体はリコンビナントＣＡ１２５抗原のみを認識した（各パネルのレーン２）。
【００２８】
ＣＡ１２５抗体のエピトープ上の配置をさらに調べるために、リコンビナントＣＡ１２５リピートをエンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃで消化し、さらに別々にプロテアーゼＡｓｐ−Ｎで消化した。両事例で、エピトープ認識は破壊された。図５に示したように、Ａｓｐ−Ｎのための最初の切断部位はアミノ酸＃７６である（図５Ｃに矢印で表示）。この配列（アミノ酸＃１−７６）（１７ｋＤａバンド）は抗ヒスチジン抗体で検出され（図５Ａ、レーン３）、ＣＡ１２５抗体と結合する能力がないことが判明した（図５Ｂ、レーン３）。図５Ａおよび５Ｂの上部のバンドは、ＣＡ１２５リコンビナントリピートの未消化の残留部分を示す。これらのデータから、エピトープは切断部位に位置しＡｓｐ−Ｎによって破壊されたか、またはエピトープはこの部位から下流にあり、切断によって破壊されたと合理的に結論づけることができる。同様に、Ｌｙｓ−Ｃによる切断は、アミノ酸＃６８−１５４を含むペプチドを生じ（図５Ｃ）、同様に抗体結合は検出されなかった。前述の記載から、エピトープ結合部は、潜在的ジスルフィド架橋（アミノ酸＃５９−７９）を含むシステインループ領域に存在するということがもっともありそうである。エピトープ部位の最終的な確認は、個々のアミノ酸を変異させることによって確認されつつある。
【００２９】
ＣＡ１２５分子の転写物のサイズを確認するために、ノザンブロット分析が正常組織および腫瘍組織の両者に由来するｍＲＮＡ抽出物を用いて実施された。腫瘍血清、腹水および腹腔液中のＣＡ１２５の公知のサイズがメガダルトンであるために（K. Nustad et al., CA125-epitopes and molecular size, Int. J. of Biolog. Markers, 13(4):196-199(1998)）、ＣＡ１２５は異常に大きな転写物であるかもしれないと考えられたとおり、転写物は保持ウェルからゲル内にほとんど進入することができないことが判明した（図６）。ＣＡ１２５ｍＲＮＡは腫瘍ＲＮＡサンプル中にのみ存在し、その真のサイズの正確な決定は適切な標準物が存在しないために困難であるが、その異常に大きなサイズは１１０００アミノ酸を越えるタンパク質コア構造を収納することができるであろう。
ＣＡ１２５分子のリピートドメインは、最低限４５個の種々の１５６アミノ酸リピートユニットを包含し、個々のリピートは配列内で２回以上発生するのでおそらく６０を超えるリピートが包含されるという証拠が示された。この発見は前記観察された異常なサイズをよく説明することができる。リピートユニットのアミノ酸組成（図７Ａ、７Ｃ、表２１）は、この配列がムチン遺伝子の高ＳＴＰリピート領域に典型的なセリン、スレオニンおよびプロリンに富んでいることを示している（J.R. Gum, Jr., Mucin genes and the proteins they encode: Structure, diversity and regulation, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 7:557-564(1992)）。結果からリピートの下流末端は重度に糖化されていることが示唆される。
【００３０】
さらに記載しなければならないことは、リピートの２４位に完全に保存されたメチオニンである（図７Ａ、７Ｃ）。ＣＡ１２５分子の臭化シアン消化を可能にし、ＣＮＢｒ消化ペプチドのウェスタンブロットでＯＣ１２５およびＭ１１抗体で特定される４０ｋＤａ糖タンパク質を生じたのはこのメチオニンである。これらのデータによって、ＣＡ１２５抗体のためのエピトープがリピート配列に位置することが予想される。リピート配列を示すリコンビナント生成物を生成することによって、前記の結果が正しいことが確認された。潜在的ジスルフィド結合が観察されたが、前記は＃５９位と＃７９位の２つのシステインによって囲まれる１９のアミノ酸を含むＣ−包囲部分を包含する。前記システインは完全に保存され、このことは、各リピートの結果として生じる仮定的Ｃ−包囲部分の生物学的役割を示唆する。上記で述べたように、ＯＣ１２５およびＭ１１エピトープはおそらくＣ−包囲部分に位置し、Ｃ−包囲部分の免疫検出のための適切な利用可能性が示唆される。これは、おそらくＣ−包囲部分の構造およびすぐ周辺の領域の糖化が少ないためであろう。ドメインの検索によって、ムチン遺伝子に一般的に見出される、各リピートのアミノ酸＃１で始まり＃１３で終わるＳＥＡドメインに対するいくらかの相同性がリピートドメインで示唆される（S.J. Williams et al., MUC13, a novel human cell surface mucin expressed by epithelial and hemopoietic cells, J. of  Biol. Chem. 276(21):18327-18336(2001)）。このドメインについては生物学的機能は報告されていない。
【００３１】
ゲノム増幅によって確認された、染色体１９ｑ１３．２（コスミド＃ＡＣ００８７３４）に対するリピート配列の相同性を基にして、各リピートは以下の５つのエクソン（約１９００塩基のゲノムＤＮＡをカバーする）で構成されることが確定した：エクソン１は４２アミノ酸（＃１−４２）を含み、エクソン２は２３アミノ酸（＃４３−６５）を含み、エクソン３は５８アミノ酸（＃６６−１２３）を含み、エクソン４は１２アミノ酸（＃１２４−１３５）を含み、さらにエクソン５は２１アミノ酸（＃１３６−１５６）を含む（図７Ｂ）。個々のエクソンの相同性パイルアップも完了し（図７Ｃ参照）、以下のとおり示された：エクソン１は最小限３１の異なるエクソンコピーを有し、エクソン２は２７のコピーを有し、エクソン３は２８コピーを有し、エクソン４は２８コピーを有し、さらにエクソン５は２１コピーを有する。全てのエクソンが互いにただ１つの構造でのみ見出されるとしたら、３１個の最少数のリピートがＣＡ１２５分子に存在すると決定できよう。一例としてエクソン２のパイルアップデータを用いて、個々のエクソン２配列が２７個存在することが上記に述べたとおり確認された。エクソン２（リピートユニットおよびオーバーラップの両方で完全に配列が決定された）を用い、エクソン２を他の固有のエクソンとの組み合わせで結合させたとき、最低限４５のリピートユニットが存在するという結果が確認された。しかしながら、オーバーラップ配列情報を基にすれば、おそらく６０＋のリピートユニットがＣＡ１２５分子に存在する（表２１）。このより大きなリピートユニット数は、２つ以上の位置に発生する同じリピートユニットの存在によって説明できるであろう。
【００３２】
現在のところ、ＣＡ１２５分子のリピートドメインの反復ユニットはその細胞外分子構造の大半を構成する。これらの配列は、オーバーラップ配列決定データに基づいて縦並びの態様で提示された。いくつかの配列は不正確に配置され、いくつかのリピートユニットはまだ特定されていない可能性がある（表２１）。最近になって、表２２および２３に示したようにさらに別のリピートがＣＡ１２５で特定された（配列番号：３０７および３０８）。正確な位置は未だ特定されていない。さらにまた、表に挙げたリピート変種のいくつかについてはまた別のスプライシングおよび／または変異が説明となるであろう。正常組織由来のＣＡ１２５リピートを個々の腫瘍由来ＣＡ１２５リピートと比較してそのような変種が存在するか否かを決定する実験が実施されつつある。現在のところ、公知のエクソンの構造は、提案されたように６０を越えるリピートユニットを容易に収容するであろう。したがって、また別のスプライシングがＣＡ１２５の反復配列の主要な寄与要件であるということはありそうなことではない。さらにまた、染色体１９ｑ１３．２のゲノムデータベースは約１０個のリピートユニットを含むだけであり、したがって本発明のデータ（６０リピートを超える）とゲノムデータとの間の矛盾が示唆されることは特記されるべきであろう。ゲノム配列の選別およびアッセンブリーに用いられる方法についての最近の評価（E. Marshall, DNA sequencing: Genome teams adjust to shotgum marriage, Science 292:1982-1983(2001)）は以下のように報告している：“ヒトゲノムでより一般的なほぼ同一のＤＮＡ配列のリピートブロックに関してはさらに多くの研究が必要とされる。現存のアッセンブリープログラムはそれらブロックを良好に操作することができず、しばしばそれらの欠失を招く”。染色体１９に位置するＣＡ１２５リピートユニットは、ゲノムデータベースでは欠失の犠牲になり易く、したがって現今のデータベースに存在しないほとんどのＣＡ１２５リピートユニットの説明がつく。
【００３３】
Ａ．ＣＡ１２５分子のアミノ末端ドメイン（ドメイン１）の配列の確認およびアッセンブリー
以前に述べたように、リピート配列に対する相同性がＧＣＧデータベースの染色体１９コスミドＡＣ００８７３４で見出された。前記コスミドはこの時点で３５の順不同ｃｏｎｔｉｇから成っていた。リピート配列について前記コスミドを検索した後、ｃｏｎｔｉｇ＃３２は、リピートユニットのエクソン１および２をその３’末端に有することが判明した。ｃｏｎｔｉｇ＃３２はまた、前記２つのリピートユニットの上流に大きな開放読み枠を有していた。このことは、前記ｃｏｎｔｉｇはＣＡ１２５のアミノ末端と一致する配列を含むことを示唆している。センスプライマーをｃｏｎｔｉｇ＃３２の上流の非リピート部分に対して合成しリピート領域内に由来する固有のプライマーと結合させた（方法の項参照）。卵巣腫瘍ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅によって、これら２つのドメインの連続的な位置決定が確認された。ＰＣＲ反応で約９８０ｂｐのバンドが得られた。前記バンドを配列決定して、上流の開放読み枠をＣＡ１２５のリピート領域に連結することが判明した。これらのデータから、さらに多くのプライマーセット（方法の項参照）を合成してＰＣＲ反応で用い、断片をつなぎ合わせｃｏｎｔｉｇ＃３２に含まれる完全な開放読み枠を完成させた。配列の５’最末端を見つけるために、ＥＳＴ（ＡＵ１３３６７３）を見つけた（前記ＥＳＴはｃｏｎｔｉｇ＃３２を同じコスミドのｃｏｎｔｉｇ＃７に連結させていた）。ＥＳＴおよびｃｏｎｔｉｇ＃３２に対する固有のプライマーを合成した（５’−ＣＴＧＡＴＧＧＣＡＴＴＡＴＧＧＡＡＣＡＣＡＴＣＡＣ−３’（配列番号：５９）および５’−ＣＣＣＡＧＡＡＣＧＡＧＡＧＡＣＣＡＧＴＧＡＧ−３’（配列番号：６０））。ＰＣＲ反応を実施し、ＥＳＴ配列部分はｃｏｎｔｉｇ＃３２と実際に連続していることを確認した。オーバーラップ配列を用いるこの連続５’プライマー配列決定法で確認することによって５’領域（ドメイン１）のアッセンブリーが可能になった（図８Ａ）。５’ＲＡＣＥＰＣＲを腫瘍ｃＤＮＡで実施し、ＣＡ１２５のアミノ末端配列を確認した。前記検査によってＣＡ１２５のアミノ末端にｃｏｎｔｉｇ＃７配列が存在することが確認された。
【００３４】
アミノ末端ドメインは、約１３２５０ｂｐをカバーする５つのゲノムエクソンを含む。エクソン１（小さなエクソン、アミノ酸＃１−３３）はｃｏｎｔｉｇ＃に由来する（図８Ａ）。残りのエクソンは全てｃｏｎｔｉｇ＃３２に由来する（エクソン２、アミノ酸＃３４−１５９３、きわめて大きなエクソン；エクソン３、アミノ酸＃１５９４−１６０５；エクソン４、アミノ酸＃１６０６−１６１７；およびエクソン５、アミノ酸＃１６１８−１６３７）（図８Ａ参照）。
印（ｘ）を付した潜在的Ｎ−糖化部位は＃８１、＃２７１、＃３２０、＃６２４、＃７９５、＃８３４、＃９３８および＃１１６５位にコードされる（図８Ｂ参照）。Ｏ−糖化部位はきわめて豊富で、本質的にアミノ末端ドメインをカバーする（図８Ｂ）。Ｏ−糖化パターンによって示されるように、ドメイン１にはスレオニンおよびセリンの両者が非常に豊富である（図８Ｂ）。
更なる研究により、糖化されるアミノ末端配列の伸長部分が特定されクローニングされた。表２４（配列番号：３０９）は、ＣＡ１２５のアミノ末端伸長部分のＤＮＡ配列を示している。表２５（配列番号：３１０）は、ＣＡ１２５遺伝子のアミノ末端伸長部分のタンパク質配列を示している。配列番号：３１０の最後の４つのアミノ酸、ＴＤＧＩはアミノ末端ドメインのエクソン１に属していることは留意されるべきである。表２６は、ＣＡ１２５アミノ末端伸長部分のセリン／スレオニンｏ−糖化パターンを示している。
【００３５】
Ｂ．ＣＡ１２５カルボキシ末端（ドメイン３）の配列の確認およびアッセンブリー
上記に記載したリピート配列を用いてＧｅｎＢａｎｋを検索することによって、ＡＫ０２４３６５（GenBank Accession No.）と称されるｃＤＮＡ配列が明らかになった。前記配列は２つのリピート配列を有することが判明した。前記リピート配列は６リピートシリーズのうちの２つの既知リピート配列とオーバーラップした。結果として、前記ｃＤＮＡは、固有のカルボキシ末端配列に沿って６つの全てのカルボキシ末端リピートのアラインメントを可能にした。前記カルボキシ末端はさらに、２つの他のＥＳＴ（GenBank Accession No. ＡＷ１５０６０２およびＡ１９２３２２４）の存在によって確認された。前記２つのＥＳＴのいずれもポリＡシグナル配列およびポリＡテールの他に終止コドンが確認された（ＧＣＧデータベース＃ＡＦ４１４４４２参照）。カルボキシ末端ドメインの配列は、リピートドメインのすぐ下流の配列に対してデザインされたセンスプライマー（５’−ＧＧＡＣＡＡＧＧＴＣＡＣＣＡＣＡＣＴＣＴＡＣ−３’、配列番号：３０３）、およびカルボキシ末端に対してデザインされたアンチセンスプライマー（５’−ＧＣＡＧＡＴＣＣＴＣＣＡＧＧＴＣＴＡＧＧＴＧＴＧ−３’、配列番号：３０４）を用いて確認された。
カルボキシ末端ドメインは１４０００を越えるゲノム塩基対をカバーする。連結によって前記ドメインは図９Ａに示すように９つのエクソンを含む。カルボキシ末端は、リピートドメインから下流の２８４アミノ酸配列と規定される（図９Ｂ参照）。印（ｘ）を付したＮ−糖化部位（＃３１、＃６４、＃１０３、＃１４０、＃１９４、＃２００）および印（ｏ）を付した少数のＯ−糖化部位が本分子のカルボキシ末端で予想される（図９Ａ、９Ｂ）。特に留意すべきは、仮定的トランスメンブレンドメインは＃２３０−＃２５２位に位置し、その後に細胞質ドメインが続くことであり、前記細胞質ドメインは、いくつかの潜在的Ｓ／Ｔリン酸化部位（＃２５４、＃２５５、＃２７６）およびチロシンリン酸化部位（＃２６４、＃２７３、＃２７４）とともに、膜近傍の高度に塩基性の配列（＃２５６−＃２６０）を特徴とする（図９Ａ、９Ｂ）。
オーバーラップ配列のＰＣＲ増幅によって実証されたＣＡ１２５分子のアッセンブリーは、前記分子の全体像を提供する（図１０および表２１参照）。完全なヌクレオチド配列は、GenBank Accession ＃ＡＦ４１４４４２で入手できる。現時点でアラインメントが完了したアミノ酸配列は表２1に示されている。
【００３６】
考察
ＣＡ１２５分子は以下の３つの主要なドメインを含む：細胞外アミノ末端ドメイン（ドメイン１）、大きなマルチリピートドメイン（ドメイン２）およびカルボキシ末端ドメイン（ドメイン３）。前記カルボキシ末端ドメインは短い細胞質ドメインを有するトランスメンブレンアンカーを含んでいる（図１０）。前記アミノ末端ドメインは、５つのゲノムエクソン、４つの非常に短いアミノ末端配列および１つのきわめて大きなエクソン（これはしばしばムチンの細胞外糖化ドメインの特徴である）を結合させることによって組み立てられる（J.L. Desseyn et al., Human mucin gene MUC5B, the 10.7-kb large central exon encoudes various alternate subdomains resulting in a super-repeat. Structual evidence for a 11p15.5 gene family, J. Biol. Chem. 272(6):3168-3178(1997)）。このドメインは、Ｏ−糖化の能力およびその結果としてセリンとスレオニン残基の豊富さを特徴とする。全体的に、Ｏ−糖化の潜在的能力は本質的にこのドメインの全体をカバーし、したがってＣＡ１２５分子のこの末端部分で炭水化物の上層構造がＥＣＭ相互作用に影響を与えることを可能にする（図８）。糖化がほとんどまたは全く予想できない短い１つの領域があり、この領域は細胞外マトリックスでタンパク質−タンパク質相互作用を可能にするであろう。
何年もの間試みられたＣＡ１２５の精製は、このアミノ末端ドメインの存在のために明らかに複雑であった（前記ドメインが、ＯＣ１２５またはＭ１１クラスの抗体によって認識されるエピトープをもつことはありそうもないことである）。ＣＡ１２５分子はin vivoで分解するので、この高度に糖化されたアミノ末端はおそらく種々の数のリピートユニットと結合しているであろうと考えられる。このことは、血清および腹水でしばしば特定されるＣａ１２５分子の荷電およびサイズの不均一性をともに非常によく説明することができる。さらにまた留意されるべきことは、アミノ酸＃４５−５８の２つのＴ−ＴＡＬＫ配列（図８Ｂの下線部）であり、前記はＣＡ１２５分子に固有である。
【００３７】
ＣＡ１２５分子の特徴である細胞外リピートドメインはまた、この分子の構造の主要部分を占める。前記はアミノ末端ドメインの下流に存在し、きわめて多様な態様でその近傍の細胞外マトリックスにそれ自身を提示する。これらリピートは、高度に保存された性質（図３）およびエクソン構造の均一性を含む多くの特性を特徴とする。しかしもっとも共通していることは、システイン包囲配列がシステインループを形成できるということである（表２１）。前記構造は、近傍のマトリックス分子と相互作用するためにきわめて大きな潜在能力を提供することができる。ドメイン２は、ＣＡ１２５分子の１５６アミノ酸リピートユニットを包含する。前記リピートドメインはＣＡ１２５分子の最大部分を構成する（表２１および図１０）。抗体はＣＡ１２５と多価様式で結合することが１５年以上前から知られていたので、ＣＡ１２５分子は、この分子を特定するセンチネル抗体のＯＣ１２５およびＭ１１クラスと結合することができる多数のリピートドメインを含むであろうということは予想されていた（O'Brien et al., New monoclonal antibodies identify the glycoprotein carrying the CA125 epitope, Am. J. Obstet Gynecol. 165:1857-64(1991); K. Nustad et al., Specificity and affinity of 26 monoclonal antibodies against the CA125 antigen: First report from the ISOBM TD-1 workshop, Tumor Biology 17:196-219(1996); R.C. Bast et al., A radioimmunoassay using a monoclonal antibody to minitor the course of epithelial ovarian cancer; N. Engl. J. Med. 309:883-887(1983)）。本発明では、６０を越えるリピートユニットが特定され、それらはＣＡ１２５分子の細胞外部分に縦並びに並んでいる。個々のリピートユニットは配列決定によって確認され、さらにオーバーラップリピート配列のＰＣＲ増幅によって特定された。得られた結果からほとんどのリピートはその近傍に対して連続的に配置されていることが確認された（表２１）。
【００３８】
最初の証拠によって、この領域は抗体結合およびリガンド結合の潜在的部位であることが提唱される。リピートドメイン内の高度に保存されたメチオニンおよびいくつかの高度に保存された配列もまた、これらリピートユニットの機能的能力を示唆している。リピートユニットのエクソン４および５の重度の糖化並びにエクソン１およびエクソン２の５’末端のＮ−糖化の潜在性はさらに、エクソン２の後者の部分およびエクソン３（Ｃ−包囲部分を含む）の機能的能力の証拠となるであろう（図７参照）。Ｃ−包囲部分はプロテアーゼ活性の第一の標的であろうということは明白で、そのような切断は、多くの研究者が未消化のＣＡ１２５を得ようとしたときに経験した困難をよく説明することができる。前記のような活性は、抗体結合の分散パターンおよび２０００００ｋＤａ未満の分子で抗体結合が低下することを説明できるかもしれない。タンパク分解はエピトープを破壊し、したがってマルチリピートのみがＣＡ１２５抗体によるブロッティングで特定することができるであろう。リピートユニット構造はまた細胞外成分との多価反応の潜在的能力を示唆している。
ＣＡ１２５分子のカルボキシ末端ドメインは、他の公知のドメインとは相同性をまったくもたない細胞外ドメインを含む。前記ドメインは典型的なトランスメンブレンドメインおよび短い細胞質テールをコードする。前記ドメインはまた、トランスメンブレンドメインから約５０アミノ酸上流にタンパク分解切断部位を含む。前記部位は、ＣＡ１２５分子のタンパク分解切断および遊離を可能にするであろう（図９）。Fendrickら（CA125 phosphorylation is associated with its secretion from the WISH human amnion cell line, Tumor Biology 18:278-289(1997)）が示したように、リン酸化がＣＡ１２５分子の遊離に先行し、ホスファターゼの抑制物質によって、特にホスファターゼ２Ｂの抑制によってＣＡ１２５の遊離は持続する。前記トランスメンブレンドメインの隣にＳ／Ｔリン酸化部位を、さらにそこから下流にチロシンリン酸化部位を含む細胞質テールはそのようなリン酸化に適応するであろう。非常に明瞭な陽性に荷電した配列が前記チロシンの上流に存在し、陰性荷電リン酸基並びに陽性荷電リジンおよびアルギニン基を含むシグナルトランスダクション系が示唆される。
【００３９】
ＣＡ１２５分子のこれらの特徴は、ＣＡ１２５の生物学的機能におけるシグナルトランスダクション経路の必要性を示唆している（J.L. Fendrick et al., CA125 phosphorylation is associated with its secretion from the WISH human amnion cell line, Tumor Biology 18:278-289(1997); I. Konish et al., Epidermal growth factor enhances secretion of the ovarian tumor-associated cancer antigen CA125 from human amnion WISH cell line, J. Soc. Gynecol. Invest. 1:89-96(1994)）。前記はまた。先に提唱されたように、膜表面からＣＡ１２５が遊離される前にリン酸化されねばならないことの補強となる（J.L. Fendrick et al., CA125 phosphorylation is associated with its secretion from the WISH human amnion cell line, Tumor Biology 18:278-289(1997); I. Konish et al., Epidermal growth factor enhances secretion of the ovarian tumor-associated cancer antigen CA125 from human amnion WISH cell line, J. Soc. Gynecol. Invest. 1:89-96(1994)）。さらにまた、トランスメンブレンドメインの細胞外側にある仮定的タンパク分解部位は＃１７６−１８１位に存在する。
【００４０】
本発明で述べたＣＡ１２５の構造は先に報告されたＣＡ１２５の構造とどのように類似するのであろうか。O'Brienらは、以下のように注意を向けねばならない多くの問題を報告した：１）分子の多価的性質；２）ＣＡ１２５の不均一性；３）炭水化物の組成；４）ＣＡ１２５の分泌性または膜結合性の性質；５）ＣＡ１２５分子の機能；６）特定が困難なＣＡ１２５遺伝子（More than 15 years of CA125: What is known about the antigen, its structure and function, Int. J. Biological Markers 13(4):188-195(1998)）。遺伝子およびそのタンパク質コア生成物を含むこれらの問題のいくつかは本発明で強調された。おそらくきわめて興味深いことは、個々の大きな転写物が完全なＣＡ１２５分子を作るのか、または特異的に結合する多数のサブユニットの小さな転写物がＣＡ１２５分子を作るのかという問題である。本発明の方法によって得られた結果から、ＣＡ１２５の転写物は大きく、ムチン遺伝子の転写物のいくつか（例えばＭＵＣ５Ｂ）と類似するということは今や明白である（以下の文献を参照されたい：M. Verma et al., Mucin genes: Structure, expression and regulation, Glycoconjugate J. 11:172-179(1994); S.J. Gendler et al., Epithelial mucin genes, Annu. Rev. Physiol. 57:607-634(1995)）。タンパク質コアの細胞外ドメインは全てＯ−糖化の高い能力を有し、したがって、ＣＡ１２５の単離に際して認められる荷電およびサイズの不均一性を説明する。前記のデータはまたＯ−糖化抑制のデータを確認し、ＣＡ１２５はＯ−糖化に富むことを示唆した（K.O. Lloyd et al., Synthesis and secretion of the ovarian cancer antigen CA125 by the human cancer cell line NIH:OVCAR-3, Tumor Biology 22:77-82(2001); K.O. Lloyd et al., Isolation and characterization of ovarian cancer antigen CA125 using a new monoclonal antibody (VK-8):Identification as a mucin-type molecule, Int. J. Cancer, 71:842-850(1997); J.L. Fredrick et al., Characterization of CA125 synthesized by the human epithelial amnion WISH cell line, Tumor Biology 14:310-318(1993)）。
【００４１】
６０を越えるリピートユニットを含むリピートドメインは前記エピトープの多価的性質の原因である。なぜならば、各リピートユニットは、おそらくＯＣ１２５類似抗体およびＭ１１類似抗体の両方に対するエピトープ結合部位を含むからである。トランスメンブレンドメインおよび切断部位の存在はＣＡ１２５の膜結合を確認し、ＣＡ１２５の遊離がタンパク分解に左右されることを示唆するデータを補強する。さらにまた、細胞表面のＣＡ１２５の遊離は細胞質リン酸化に大いに依存し、ＥＧＦシグナリングの結果であろう（K. Nustad et al., Specificity and affinity of 26 monoclonal antibodies against the CA125 antigen: First report from the ISOBM TD-1 workshop, Tumor Biology 17:196-219(1996)）。ＣＡ１２５のタンパク分解活性に対する固有の能力に関する問題については、前記は該当しないように思われる。しかしながら、ＣＡ１２５とともに単離される付随タンパク質（例えば抗体結合能をもたない５０ｋＤａタンパク質）はタンパク分解活性を有するかもしれない。いずれの場合でも、細胞外切断部位のタンパク分解がＣＡ１２５遊離のもっとも可能性の高いメカニズムである。そのような切断は細胞質シグナリングに必須で、付随する細胞外プロテアーゼ活性によって仲介されよう。
要約すれば、ＣＡ１２５の多数の縦並びのリピート（前記はＣＡ１２５分子構造の特徴であり、ＣＡ１２５分子のエピトープ結合部位をおそらく含んでいる）は予想されなかった。さらにまた、何年もの間この分子の単離および性状決定を困難にしてきたタンパク分解活性については誰も未だに説明することができない。プロテアーゼドメインそれ自体はＣＡ１２５分子の構成的部分ではないが、細胞外ドメインによるＣＡ１２５分子のリガンド結合ドメインとの直接的結合の可能性はきわめて高い。最後に、この細胞外構造で優勢なリピートドメインの役割は何であろうか。上皮細胞表面および腺管内のＣＡ１２５分子の発現データによれば、システインループをもつこれらリピートユニットの固有の構造が、腺の抗侵入分子としての役割（細菌の捕捉）および／または上皮表面間および管腔内層の抗粘着（開存維持）における役割の両方を果たすと結論することは合理的といえよう。
【００４２】
最近になって、本発明に記載した方法と完全に異なるアプローチを用いてＣＡ１２５抗原の部分的クローニングが報告された（Yin and Lloyd, Molecular cloning of the CA125 ovarian cancer antigen. Identification as a new mucin(MUC16), J. Biol. Chem. 276:27371-27375(2001)）。卵巣腫瘍細胞株ＯＶＣＡＲ−３の発現ライブラリーをスクリーニングするためにＣＡ１２５に対するポリクローナル抗体を用い、前記の報告者らは、終止コドンおよびポリＡテールを含む５９６５ｂｐのクローンを特定した。前記クローンは、部分的に保存された９つの縦並びリピートおよびそれに続く細胞質テールを有する潜在的トランスメンブレン領域を含んでいた。前記５９６５ｂｐの配列は、表２１に示したカルボキシ末端領域とほぼ完全に相同である。いくつかの塩基は異なっているが、これら配列は相同である。上記で述べたように、細胞質テールはリン酸化のための潜在能力を有し、トランスメンブレンドメインはＣＡ１２５分子のこの部分を上皮細胞または腫瘍細胞表面に固定するであろう。細胞外マトリックスでは、比較的短い変遷ドメインがトランスメンブレンアンカーを一続きの縦並びリピート（上記Yin & Lloydの場合には９つのリピート）に連結する。
【００４３】
対照的に、提示した本発明の分子の主要な細胞外部分は、Yinが記載した配列の上流にあり、一連の大きな縦並びリピートを含む。これらの結果は、もちろんＣＡ１２５の異なる像を提供し、ＣＡ１２５は連続した細胞外リピートを特色とすると提唱される。さらにまた、ＣＡ１２５分子の主要なアミノ末端ドメイン（約１６３８アミノ酸）も含まれ、前記は、ＣＡ１２５の重要な構造成分であることが知られている大量のＯ−糖化を説明すると考えられる。
結論すれば、ＣＡ１２５分子は、３５０００塩基を越える転写物を必要とし、染色体１９ｑ１３．２上で約１５００００ｂｐを占有することが開示される。ＣＡ１２５は、大きな一連の細胞外リピートユニット（１５６アミノ酸）を特徴とし、前記ユニットは、特に高度に保存された固有のシステインループによる分子の相互作用の潜在能力を提供する。前記リピートユニットはまた、今や詳しく記載され、主要な両クラスのＣＡ１２５抗体（すなわちＯＣ１２５およびＭ１１群）に対して分類されているエピトープを含んでいる。ＣＡ１２５分子は、トランスメンブレンドメインおよび短い細胞質テールを介してそのカルボキシ末端で固定される。ＣＡ１２５はまた、高度に糖化されたアミノ末端ドメインを含み、前記ドメインは、いくつかのムチンに典型的な大きな細胞外エクソンを含む。上皮表面および卵巣腫瘍細胞表面の両者に大量のリピートドメインが存在するとなると、ＣＡ１２５は、上皮細胞および腫瘍細胞周辺の細胞外環境の決定に主要な役割を果たすことができると考えられよう。
【００４４】
ＣＡ１２５リコンビナント生成物の利点および使用
１）従来のＣＡ１２５のアッセイは、培養細胞株または患者腹水から生成されたＣＡ１２５を標準物として使用する。いずれの供給源もＣＡ１２５分子の質または純度に関して特定されていない。したがって、患者のＣＡ１２５レベルの記載に任意の単位が用いられる。ＣＡ１２５が上昇している患者の治療ではカットオフ値は重用であり、さらにＣＡ１２５の測定に多くの異なるアッセイ系が臨床で用いられているので、全てのＣＡ１２５アッセイのための標準物を規定することは重要で、実際必要なことである。エピトープ結合部位を含むリコンビナントＣＡ１２５は、この標準化のための要件を満たすことができるであろう。さらにまた、リコンビナント生成物を抗体産生に用いて、新規でより特異的なアッセイを開発することができる。
２）ワクチン：ＣＡ１２５を治療用ワクチンとして用い、卵巣癌の患者を治療することができるという考えを支持する、適切なデータが今や存在する（以下を参照されたい：U. Wagner et al., Immunological consolidation of ovarian carcinoma recurrences with monoclonal anti-idiotype antibody ACA125:Immune responses and survival in palliative treatment, Clin. Cancer Res. 7:1112-1115(2001)）。これまで、ＣＡ１２５に対する細胞性および液性免疫をヒトで誘発するために、ＣＡ１２５に特異的なネズミ抗体を用いて患者で抗イディオタイプ抗体を産生させ、したがって間接的にＣＡ１２５分子に対する免疫を誘発した。リコンビナントＣＡ１２５（特に公知のネズミ抗体のためのエピトープ結合部位を含むドメインおよび腫瘍細胞上でＣＡ１２５を直接固定するドメイン）の利用可能性により、ＣＡ１２５に対する患者の免疫系をより直接的に刺激し、結果として前掲書（Wagner et al.）によって示されたように卵巣癌患者を延命させることが容易になるであろう。
免疫系における前記のような治療反応を達成するためにはいくつかのアプローチを利用することができる：１）ＣＡ１２５エピトープまたは他のドメインを含むリコンビナント抗原を用いて患者を直接免疫する；２）患者から樹状細胞を採集する；３）前記の細胞をin vitro培養で増殖させる；４）リコンビナントＣＡ１２５エピトープドメインもしくは他のドメインまたはこれらのドメインに由来するペプチドで前記樹状細胞を活性化させる（以下の文献を参照されたい：A.D. Santin et al., Induction of ovarian tumor-specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes by acid-eluted peptide-pulsed autologous dendritic cells, Obstetrics & Gynecology 96(3):422-430(2000)）；続いて５）前記免疫系細胞を前記患者に戻し、ＣＡ１２５に対する免疫反応を完成させる。前記の方法はまた、患者の組織適合抗原と適合する特定のペプチドを用いて実施することができる。集団内で一般的なＨＬＡ−Ａ２結合モチーフと適合するそのようなペプチドは図１２に示されている。
【００４５】
３）治療用標的：腫瘍細胞表面にＣＡ１２５として発現される分子は、しばしば免疫刺激、ドラッグデリバリー、生物学的改変物のデリバリー、または特異的に輸送され最終的に腫瘍細胞を死滅させる任意の薬剤のための潜在的標的となる。ＣＡ１２５は以下のような標的としてそのような潜在能力を提供する：１）ＣＡ１２５エピトープまたは今後報告される潜在的エピトープに対する抗体：特にＣＡ１２５に対するヒト化またはヒト抗体、前記は患者の免疫系を直接活性化して腫瘍細胞を攻撃し死滅させることができよう。腫瘍細胞の直接的破壊を仲介するために、放射性薬剤を含む一切の薬剤または毒性薬剤のデリバリーに抗体を用いることができよう。２）天然のリガンド：正常な環境下でＣＡ１２５分子に結合する分子。例えばＣＡ１２５エピトープを含まない５０ｋＤａタンパク質はＣＡ１２５とともに同時精製される。そのような分子（ＣＡ１２５分子上のドメインに対して天然の結合親和性を有する可能性がある）はまた、治療薬剤を腫瘍細胞に輸送するために利用することができよう。
４）アンチセンス療法：ＣＡ１２５発現は卵巣腫瘍細胞の生存または転移に利点を提供する可能性がある。したがってＣＡ１２５配列に由来するアンチセンスオリゴヌクレオチドはＣＡ１２５発現のダウンレギュレーションに用いることができよう。アンチセンス療法は、例えば上記で述べたような腫瘍細胞デリバリー系と併用して用いることができよう。
５）小分子：ＣＡ１２５のリコンビナントドメインはまた、前記分子の個々のドメインと結合する小分子を特定する潜在能力を提供する。組み合わせ化学物質ライブラリーまたは小ペプチドに由来する小分子はまた、デリバリー薬剤としてまたは生物学的改変物質として用いることができる。
本明細書に引用した全ての参考文献は参照によりその全体が本明細書に含まれる。
本明細書に記載した現時点で好ましい実施態様に対する種々の変更および改変は当業者には明白であることは理解されよう。前記のような変更および改変は、本発明の範囲内で本発明の利点を低下させることなく為されるものであろう。
【００４６】
【表１】
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【００４７】
【表２−Ａ】
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【００４８】
【表２−Ｂ】
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【００４９】
【表３．１】
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【００５０】
【表３．２】
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【００５１】
【表４．１】
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【００５２】
【表４．２】
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【００５３】
【表５．１】
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【００５４】
【表５．２】
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【００５５】
【表５．３】
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【００５６】
【表６】
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【００５７】
【表７】
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【００５８】
【表８．１】
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【００５９】
【表８．２】
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【００６０】
【表８．３】
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【００６１】
【表８．４】
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【００６２】
【表８．５】
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【００６３】
【表８．６】
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【００６４】
【表９．１】
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【００６５】
【表９．２】
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【００６６】
【表１０−Ａ】
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【００６７】
【表１０−Ｂ】
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【００６８】
【表１０−Ｃ】
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【００６９】
【表１１】
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【００７０】
【表１２．１】
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【００７１】
【表１２．２】
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【００７２】
【表１２．３】
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【００７３】
【表１２．４】
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【００７４】
【表１２．５】
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【００７５】
【表１２．６】
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【００７６】
【表１３．１】
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【００７７】
【表１３．２】
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【００７８】
【表１３．３】
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【００７９】
【表１３．４】
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【００８０】
【表１３．５】
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【００８１】
【表１３．６】
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【００８２】
【表１４．１】
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【００８３】
【表１４．２】
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【００８４】
【表１５．１】
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【００８５】
【表１５．２】
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【００８６】
【表１５．３】
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【００８７】
【表１５．４】
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【００８８】
【表１５．５】
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【００８９】
【表１５．６】
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【００９０】
【表１５．７】
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【００９１】
【表１５．８】
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【００９２】
【表１５．９】
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【００９３】
【表１５．１０】
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【００９４】
【表１５．１１】
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【００９５】
【表１５．１２】
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【００９６】
【表１５．１３】
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【００９７】
【表１５．１４】
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【００９８】
【表１５．１５】
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【００９９】
【表１５．１６】
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【０１００】
【表１５．１７】
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【０１０１】
【表１５．１８】
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【０１０２】
【表１５．１９】
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【０１０３】
【表１５．２０】
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【０１０４】
【表１５．２１】
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【０１０５】
【表１５．２２】
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【０１０６】
【表１５．２３】
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【０１０７】
【表１５．２４】
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【０１０８】
【表１５．２５】
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【０１０９】
【表１５．２６】
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【０１１０】
【表１５．２７】
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【０１１１】
【表１５．２８】
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【０１１２】
【表１５．２９】
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【０１１３】
【表１５．３０】
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【０１１４】
【表１５．３１】
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【０１１５】
【表１５．３２】
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【０１１６】
【表１５．３３】
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【０１１７】
【表１５．３４】
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【０１１８】
【表１６．１】
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【０１１９】
【表１６．２】
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【０１２０】
【表１７．１】
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【０１２１】
【表１７．２】
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【０１２２】
【表１８】
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【０１２３】
【表１９−Ａ】
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【０１２４】
【表１９−Ｂ．１】
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【０１２５】
【表１９−Ｂ．２】
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【０１２６】
【表２０．１】
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【０１２７】
【表２０．２】
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【０１２８】
【表２１．１】
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【０１２９】
【表２１．２】
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【０１３０】
【表２１．３】
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【０１３１】
【表２１．４】
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【０１３２】
【表２１．５】
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【０１３３】
【表２１．６】
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【０１３４】
【表２２】
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【０１３５】
【表２３】
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【０１３６】
【表２４．１】
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【０１３７】
【表２４．２】
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【０１３８】
【表２４．３】
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【０１３９】
【表２４．４】
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【０１４０】
【表２４．５】
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【０１４１】
【表２４．６】
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【０１４２】
【表２４．７】
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【０１４３】
【表２４．８】
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【０１４４】
【表２４．９】
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【０１４５】
【表２４．１０】
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【０１４６】
【表２４．１１】
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【０１４７】
【表２４．１２】
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【０１４８】
【表２４．１３】
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【０１４９】
【表２４．１４】
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【０１５０】
【表２４．１５】
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【０１５１】
【表２４．１６】
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【０１５２】
【表２４．１７】
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【０１５３】
【表２４．１８】
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【０１５４】
【表２４．１９】
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【０１５５】
【表２４．２０】
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【０１５６】
【表２４．２１】
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【０１５７】
【表２４．２２】
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【０１５８】
【表２４．２３】
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【０１５９】
【表２４．２４】
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【０１６０】
【表２４．２５】
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【０１６１】
【表２４．２６】
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【０１６２】
【表２４．２７】
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【０１６３】
【表２４．２８】
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【０１６４】
【表２４．２９】
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【０１６５】
【表２４．３０】
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【０１６６】
【表２４．３１】
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【０１６７】
【表２４．３２】
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【０１６８】
【表２４．３３】
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【０１６９】
【表２４．３４】
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【０１７０】
【表２５．１】
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【０１７１】
【表２５．２】
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【０１７２】
【表２５．３】
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【０１７３】
【表２５．４】
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【０１７４】
【表２５．５】
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【０１７５】
【表２５．６】
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【０１７６】
【表２５．７】
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【０１７７】
【表２５．８】
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【０１７８】
【表２５．９】
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【０１７９】
【表２５．１０】
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【０１８０】
【表２５．１１】
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【０１８１】
【表２５．１２】
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【０１８２】
【表２６．１】
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【０１８３】
【表２６．２】
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【０１８４】
【表２６．３】
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【０１８５】
【表２６．４】
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【０１８６】
【表２６．５】
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【０１８７】
【表２６．６】
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【０１８８】
【表２６．７】
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【０１８９】
【表２６．８】
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【０１９０】
【表２６．９】
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【０１９１】
【表２６．１０】
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【０１９２】
【表２６．１１】
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【０１９３】
【表２６．１２】
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【図面の簡単な説明】
【０１９４】
【図１】Ｍ１１およびＯＣ１２５抗体をプローブとするＣＡ１２５の臭化シアン消化生成物のウェスタンブロット。表１は、４０ｋＤａ臭化シアンペプチドのアミノ末端に由来するアミノ酸配列を、４０ｋＤａフラグメントのプロテアーゼ消化後に得られた内部配列と併せて示す（配列番号：１−４）。配列番号：１は４０ｋＤａペプチドのアミノ末端配列で、配列番号：２、３および４は４０ｋＤａのプロテアーゼ消化後のペプチドに由来する内部アミノ酸配列を示す。表１はさらに、相同な配列（配列番号：５および６）（枠で囲まれているかまたは下線を付されている）を有するＥＳＴ（ＢＥ００５９１２）の翻訳を示す。プロテアーゼ切断部位は矢印で表示されている。
【図２Ａ】図１で述べたＥＳＴ配列、４０ｋＤａフラグメントから得られたアミノ酸配列およびＥＳＴ配列ＡＡ＃６４０７６２を用いたプライマーから得られた生成物のＰＣＲ増幅。レーン１−２：正常、レーン３：しょう液性卵巣癌、レーン４：しょう液性卵巣癌、レーン５：ムチン性卵巣癌、レーン６：ベータ−チューブリンコントロール。予期されるサイズバンド４００ｂはレーン３に存在し、レーン４ではレーン３より少ない。
【図２Ｂ】卵巣腫瘍の初代培養細胞でＣＡ１２５転写物の有無を調べるために実施したＲＴ−ＰＣＲ。前記発現は、内部コントロールのチューブリンの発現と比較した。レーン１、３、５、７および９は初代卵巣腫瘍細胞株を示す。レーン２、４、６および８は、レーン１、３、５、７および９の対応する患者から得た末梢血単核細胞株を示す。レーン１０はレーン９の患者の腫瘍から得た線維芽細胞を示す。レーン１１および１２は、それぞれＣａＯＶ３および原発性腫瘍標本である。
【図３】図２Ｂの４００ｂバンドから得たクローン化ｃＤＮＡの配列決定によって明らかにされたリピート配列。連続的態様におけるリピート配列の配置決定は、ＰＣＲ増幅および２つのリピート配列間のオーバーラップ領域の配列を決定することによって達成された。完全なリピート配列のサンプルは配列番号：１５８、１５９、１６０および１６１に示されている。前記サンプルはこのようにして得られ、オーバーラップ配列を基にして互いに隣り合うように配置された。得られたリピート配列の完全なリストは表２1に示されている（配列番号：１６２）。
【図４】３つのウェスタンイムノブロットパターン：パネルＡ＝プローブはＭ１１、パネルＢ＝プローブはＯＣ１２５、パネルＣ＝プローブは抗体ＩＳＯＢＭ９．２。各パネルは以下のとおりの大腸菌抽出物を表す：レーン１＝プラスミドＰＱＥ−３０のみを有する細菌由来の大腸菌抽出物、レーン２＝ＣＡ１２５リピートユニットを含むプラスミドＰＱＥ−３０を有する細菌由来の大腸菌抽出物、レーン３＝ＣＡ１２５とは無関係のＴＡＤＧ−１４プロテアーゼを含むプラスミドＰＱＥ−３０を有する細菌由来の大腸菌抽出物。パネルＤは、ＰＱＥ−３０単独またはＰＱＥ−３０−ＣＡ１２５リピート（リコンビナントＣＡ１２５）を感染させた細菌由来大腸菌抽出物のＰＡＧＥゲルのクーマシーブルー染色を示す。
【図５】リコンビナントＣＡ１２５リピート内のＭ１１エピトープの位置を決定するために作製したＣＡ１２５リピート配列のウェスタンブロット。発現タンパク質をＮｉ−ＮＴＡアガロースビーズに結合させた。前記タンパク質は未消化のままであるか、またはＡｓｐ−ＮまたはＬｙｓ−Ｃで消化された。ビーズに結合したままのタンパク質をレーン１、２または３（それぞれ未消化、Ａｓｐ−Ｎ消化およびＬｙｓ−Ｃ消化に対応する）にロードした。消化物の上清はレーン４、５および６にロードした（それぞれ未消化、Ａｓｐ−Ｎ消化およびＬｙｓ−Ｃ消化に対応する）。ブロットを抗Ｈｉｓタグ抗体（Ａ）またはＭ１１抗体（Ｂ）をプローブとして調べた。パネルＣは配列番号：１５０に対応する典型的なリピート配列を示す（各エクソンは矢印で表示）。全てのタンパク分解性アスパラギン酸部位およびリジン部位は上部矢印またはダッシュで印を付されている。下のパネルでは、エクソン４および５のＯ−糖化部位はＯで、Ｎ−糖化部位はＸおよびリピート内のアミノ酸番号（＃１２、＃３３および＃４９）で印を付されている。保存メチオニンはＭおよびアミノ酸番号（Ｍ＃２４）で示され、システイン包囲部分（全てのリピートに存在し、システイン間に１９アミノ酸を包含する）はＣ−Ｃ（アミノ酸＃５９−７９）で印を付されている。Ｍ１１およびＯＣ１２５に対するエピトープはＣ−包囲部分の後方部分またはＣ−包囲部分の下流に位置する。
【図６】ＣＡ１２５のＰ32ｃＤＮＡリピート配列をプローブとする正常卵巣（Ｎ）または卵巣癌（Ｔ）由来ＲＮＡのノザンブロット分析。全ＲＮＡサンプル（１０μｇ）のサイズ分離をホルムアルデヒド含有１．２％アガロースゲルで電気泳動によって実施した。ハイボンドＮにブロッティングした後、Ｐ32放射能標識４００ｂｐリピートをプローブとして用いてレーンを調べた（図２参照）。レーン１は正常卵巣組織のＲＮＡを示し、レーン２はしょう液性卵巣腫瘍組織由来のＲＮＡを示す。
【図７Ａ】アミノ末端のＮ−糖化部位および完全に保存されているメチオニン（Ｍ）を示す、ＣＡ１２５の典型的なリピートユニットの模式図である。さらにＯＣ１２５およびＭ１１のための抗体結合部位を有する、提唱システイン包囲ループもまた示されている。前記リピートのカルボキシ末端の高度にＯ−糖化された残基もまた示されている。
【図７Ｂ】ＣＡ１２５（配列番号：１６３）の１５６アミノ酸リピート配列のゲノム構造およびエクソンの構成を示す。前記は標準的なリピートユニットを含む。
【図７Ｃ】各エクソンの個々の既知配列を示す。前記は以下のように決定された：エクソン１−配列番号：１６４−１９４；エクソン２−配列番号：１９５−２２１；エクソン３−配列番号：２２２−２４９；エクソン４−配列番号：２５０−２７７；およびエクソン５−配列番号：２７８−２９８。
【図８Ａ】ＣＡ１２５遺伝子のアミノ末端のゲノム構造を示す。細胞外ドメインの各エクソンのアミノ酸組成もまた示されている。
【図８Ｂ】アミノ末端ドメイン（配列番号：２９９）のアミノ酸組成を示す。潜在的な各Ｏ−糖化部位は上付き文字（ｏ）で、Ｎ−糖化部位は上付き文字（ｘ）で印を付されている。Ｔ−ＴＡＬＫ配列は下線を付されている。
【図９Ａ】ＣＡ１２５遺伝子のカルボキシ末端ドメインのゲノムエクソン構造を示す。本図は、細胞外部分、潜在的切断部位、トランスメンブレンドメインおよび細胞質テールを示す模式図を含む。
【図９Ｂ】エクソンの境界、Ｏ−糖化部位（ｏ）およびＮ−糖化部位（ｘ）を含む、カルボキシ末端ドメインのアミノ酸組成を示す。提唱するトランスメンブレンドメインには下線が施されている。
【図１０】本明細書に記載した開放読み枠を基にして提唱されるＣＡ１２５分子の構造を示す。図に示すように、本分子の特色は、細胞外スペースの主要なリピートドメインおよび高度に糖化されたアミノ末端リピートである。ＣＡ１２５分子はトランスメンブレンドメインによって固定され、さらにまたリン酸化の潜在能力を有する細胞質テールを含む。
【図１１】ＣＡ１２５遺伝子の模式図。ゲノム配列およびアミノ酸配列の最初にクローン化されたドメイン、並びに糖化されたアミノ末端タンパク質配列の伸長部分を示す。
【図１２】オーバーラップした染色体１９コスミドから得たｃｏｎｔｉｇアラインメントの模式図である。
【図１３】ＣＡ１２５遺伝子のアミノ末端伸長部分のゲノムエクソン構造を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ．１】
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【図７Ｃ．２】
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【図７Ｃ．３】
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【図７Ｃ．４】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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