(57)【要約】土からキレート鉄の取り込みを媒介する膜タンパク質をコードするトウモロコシのイエローストライプ１遺伝子を提供する。本明細書において、該遺伝子は、鉄の低い生物学的利用能の条件下、アップレギュレートされ、タンパク質生産が増大することが示されている。また、該タンパク質は、銅等の他の金属も輸送することができると示されている。また、本発明は、アラビドプシス遺伝子ファミリーおよびYS1に関連するｙs１１−８と呼ばれる遺伝子産物を提供する。本発明は、遺伝子およびそれらの遺伝子産物、並びに、栄養作物内の鉄取り込みの増大とともに土のレメディエーションのためのトランスジェニック植物を作出し且つ使用する方法を提供する。
2005501502.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６または１８のアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６または１８の少なくとも６個のアミノ酸断片をコードする単離された核酸分子、（ｃ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５または１７を含む核酸分子の補体にハイブリダイズする単離された核酸分子、（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６または１８のアミノ酸配列をコードする核酸分子で且つYS1またはアラビドプシスYSLタンパク質をコードする核酸分子の補体にハイブリダイズする単離された核酸分子、および（e）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６または１８と少なくとも約７９％のアミノ酸配列一致率を示すタンパク質をコードする単離された核酸分子、より成る群から選択される単離された核酸分子。
【請求項２】
前記核酸分子が、一つ以上の発現制御因子に作動可能に連結されている、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
請求項１に記載の単離された核酸分子を含むベクター。
【請求項４】
請求項１に記載の核酸分子を含む形質転換された宿主細胞。
【請求項５】
請求項３に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項６】
前記宿主が、原核宿主細胞および真核宿主細胞から成る群より選択される、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項７】
請求項１に記載の核酸分子によってコードされたタンパク質が発現される条件下で、前記核酸分子で形質転換された宿主細胞を培養するステップを含む、ペプチドを製造する方法。
【請求項８】
前記宿主細胞が、原核宿主細胞および真核宿主細胞から成る群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項７に記載の方法によって製造される単離されたポリペプチド。
【請求項１０】
（a）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６または１８のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６または１８の少なくとも６個のアミノ酸断片を含む単離されたポリペプチド、（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６または１８の保存的アミノ酸置換体を含む単離されたポリペプチド、（ｄ）配列番号２の天然アミノ酸配列変異体、および（e）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６または１８と少なくとも約７９％のアミノ酸配列一致率を示す単離されたポリペプチドから成る群より選択される、単離されたポリペプチドまたはタンパク質。
【請求項１１】
少なくとも一つの請求項１に記載の核酸を含むトランスジェニック植物。
【請求項１２】
高蓄積体でもある、請求項１１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１３】
トランスジェニック植物が、高蓄積体表現型を発現するように設計されている、請求項１２に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１４】
金属の高蓄積が、特定の植物組織の中にコンパートメント化される、請求項１３に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１５】
前記特定の植物組織が食用である、請求項１４に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１６】
請求項１０に記載のタンパク質を発現するように設計されているトランスジェニック植物。
【請求項１７】
高蓄積体でもある、請求項１６に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１８】
トランスジェニック植物が、高蓄積体表現型を発現するように設計されている、請求項１７に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１９】
金属の高蓄積が、特定の植物組織の中にコンパートメント化される、請求項１８に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２０】
前記特定の植物組織が食用である、請求項１９に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２１】
土壌環境から金属を取り入れる方法であって、
アンチモン、ヒ素、バリウム、ベリリウム、カドミウム、クロム、コバルト、銅、金、鉄、鉛、マンガン、モリブデン、ニッケル、パラジウム、セレン、銀、ストロンチウム、スズ、ウラン、バナジウムおよび亜鉛から成る群より選択される金属を含む土壌環境を同定するステップと、
前記土壌環境に請求項１１乃至２０に記載の少なくとも一つの植物を植えるステップと、
前記植物が前記土壌環境から前記金属を取り入れるために充分な時間にわたって、条件の下で、前記土壌環境に前記植物を維持するステップと、
を含む、前記方法。
【請求項２２】
前記植物に蓄積された金属の濃度が、前記環境の前記金属の濃度よりも高い、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
金属が、鉄、クロム、マンガン、セレンおよび銅から成る群より選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
植物が、アマランサス（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ）、ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、ラファナス（Ｒａｐｈａｎｕｓ）およびシナピス（Ｓｉｎａｐｉｓ）から成る群より選択される種の植物である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
植物が、アマランサス・パニキュラータ（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ）、ダイコン（Ｒａｐｈａｎｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ）およびトラスピ・カエルレセンス（Ｔｈｌａｓｐｉ  ｃａｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ）より成る群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
植物が、カラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）、アビシニアガラシ（Ｂ．  ｃａｒｉｎａｔａ）、キャベツ（Ｂ．  ｏｌｅｒａｃｅａ）、クロガラシ（Ｂ．  ｎｉｇｒａ）、アブラナ（Ｂ．  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、セイヨウアブラナ（Ｂ．  ｎａｐｕｓ）およびブラシカ・トルニフォルティイ（Ｂ．  ｔｏｕｒｎｉｆｏｒｔｉｉ）から成る群より選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
植物が、シロガラシ（Ｓｉｎａｐｉｓ  ａｌｂａ）、ノハラガラシ（Ｓ．  ａｒｖｅｎｓｉｓ）、シナピス・フレクスオーサ（Ｓ．  ｆｌｅｘｕｏｓａ）およびシナピス・プベセンス（Ｓ．  ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ）から成る群より選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも一つの請求項２に記載の核酸を含む、トランスジェニック植物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の説明】
【０００１】
本願は、仮特許出願第６０／２４９，２２２号（２０００年１１月１６日出願）に基づく優先権を主張し、ここにその全文を援用する。
【０００２】
（連邦政府の資金提供を受けた研究でなされた発明に対する権利の陳述）
本発明の一部は、米国国立衛生研究所助成金第ＲＯ１  ＧＭ３８１４８号および米国農務省ＮＲＩＣＧＰ助成金第９９−３５１００−７６０１号として、米国政府の資金提供を受けてなされた。
【技術分野】
【０００３】
本発明は概して、土壌からの鉄および他の金属、例えば重金属の取り込みを担うトウモロコシタンパク質、前記タンパク質をコードする遺伝子、前記遺伝子を含むベクター、前記遺伝子を含む組換え原核および真核細胞、ならびに前記ベクターを使ったトランスジェニック植物細胞、植物組織および植物全体の作出に関する。より具体的に述べると、本発明は、トウモロコシ・イエローストライプ１（ｙｅｌｌｏｗ  ｓｔｒｉｐｅ  １（ｙｓ１））遺伝子およびアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のイエローストライプ１様（ｙｅｌｌｏｗ  ｓｔｒｉｐｅ  １−ｌｉｋｅ）（ｙｓｌ）遺伝子のクローニングおよび単離に関する。また本発明は、土壌からの鉄の取り込みの増進および金属または重金属汚染土壌のバイオレメディエーションにｙｓ１またはｙｓｌトランスジェニック植物を使用する方法も提供する。さらに本発明は、植物体内でのＦｅの分布を変化させること、例えば作物の可食部がより多くの鉄を含むように変化させることを目的とする、ｙｓ１またはｙｓｌトランスジェニック植物の操作を提供する。
【背景技術】
【０００４】
本明細書に記載する全ての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願について、ここに援用することを個別に明示した場合と同じように、いずれもここに援用される。この開示の一部はＣｕｒｉｅ，Ｃ．ら  Ｎａｔｕｒｅ  ２００１  ４９：３４６−３４９に報告されており、ここにその全文を援用する。
【０００５】
鉄欠乏は、現在世界中で最も一般的なヒトの栄養問題であり、全米国立科学財団および世界保健機関の統計によれば、工業国と発展途上国の両方で、推定３０億人がこの問題を抱えている。往々にして、作物は十分な量の鉄を土壌から取り込まず、退緑、低収量、および栄養の質の低下を引き起こす。世界中のほとんどの日常食で、植物は主要な鉄源として役立っている。残念なことにほとんどの作物は生物学的に利用可能な鉄を少量しか含んでいない。加えて、土壌中に利用可能な鉄が少ないことは、植物の生長を制限し、収穫量の低下を招く。世界中の土壌の約３分の１が鉄不足である。植物による鉄の取り込みを低下させる要因は、鉄不足だけではない。植物による鉄の取り込みは、例えば高い土壌ｐＨ（アルカリ度）、土壌中の高い石灰含量、石灰質土壌、土壌中の過剰なリン酸塩、高レベルの炭酸水素イオンを含む潅漑用水、過剰な水分と低い土壌温度、ならびに酸性土壌中の過剰量の銅およびマンガンなどの条件によって制限される場合もある。土壌中の鉄の生物学的利用能は高いｐＨによる影響を特に受け、酸化されてＦｅ2Ｏ3になる。また、土壌における鉄不足は、リン含量の高い肥料を多量に施用した場合、土壌中のＣｕ濃度が高い場合、およびマンガンのレベルが異常に高いまたは低い場合にも起こりうる（Ｈａｕｓｅｎｂｕｉｌｌｅｒ，ＲＬ．「Ｓｏｉｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」第２版（１９７８）Ｗｍ．Ｃ．Ｂｒｏｗｎ  Ｃｏ．（アイオワ州ダビューク）の３３９−３６２頁）。
【０００６】
植物中の鉄欠乏は、葉脈自体は緑色のまま葉脈間の組織が黄化することを視覚的特徴とする退緑を引き起こす。これが植物全体に広がるにつれて、葉の先端部および縁部は褐変し始め、乾燥して脆くなる。重症な場合は退緑が起こった葉の上に壊疽斑点を生じるか、またはその植物の死を引き起こす。鉄の、限られた生物学的利用能は、キレート化、すなわち鉄を結合する分子の特異的排出と再取り込み、および還元、すなわち鉄トランスポーターと共役した形質膜局在型三価鉄還元酵素、と広く定義することができる取り込み戦略の進化をもたらした（Ｂｒｉａｔ，Ｊ−Ｆら，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．１９９７，２：１８７−１９３；Ｍｏｒｉ，Ｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．１９９９，２：２５０−２５３；Ｙｉ，Ｙら，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１９９６  １０：８３５−８４４）。
【０００７】
ストラテジー（Ｓｔｒａｔｅｇｙ）I植物（Ｂｒｉａｔ，Ｊ−Ｆら，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．１９９７  ２：１８７−１９３）と総称される双子葉植物および非イネ科単子葉植物は、鉄が不十分な条件下で、還元戦略を採用する。これらの生物は、プロトンを排出してその環境を酸性化することによって三価鉄イオンを可溶化し、次いで根の周りにある土壌中の不溶性の鉄（Ｆｅ［III］）を膜結合型還元酵素によって酵素的に還元し、続いてＦｅ［II］トランスポーターが二価鉄を取り込むことができるようにする。鉄飢餓時にアップレギュレートされる根の三価鉄キレート還元酵素（ＦＲＯ２）と、根のＦｅ［II］トランスポーター（ＩＲＴ１）とが、最近、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）からクローニングされ、特徴づけられた（Ｙｉ，Ｙら，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１９９６  １０：８３５−８４４；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ＮＪら，Ｎａｔｕｒｅ  １９９９  ３９７：６９４−６９７）。
【０００８】
イネ科植物種は、ファイトシデロフォア（ｐｈｙｔｏｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅ）と呼ばれるムギネ酸（ＭＡ）ファミリーの低分子量２級アミノ酸による三価鉄キレート化を含む戦略（ストラテジーIIと呼ばれる）によって鉄を獲得する（Ｂｒｉａｔ，Ｊ−Ｆら，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．１９９７  ２：１８７−１９３）。これらの化合物は六座陽イオンキレート剤として機能する（Ｔａｇａｋｉ，Ｓら，Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｎｕｔｒ．１９８４  ７：４６９−４７７）。ファイトシデロフォアは、鉄欠乏ストレスに対する応答として、メチオニン前駆体からニコチンアミンを経由して合成される。植物の根から放出されると、ファイトシデロフォアは、水酸化Ｆｅまたはリン酸Ｆｅなどに由来するやや溶けにくい鉄をキレートすることができる。この戦略による鉄獲得は、プロトンの放出が鉄の可溶化に無効であって三価鉄還元酵素活性が阻害される高いｐＨおよび／または高レベルの炭酸水素イオンを持つ土壌では、おそらく非常に有利である。これは、土壌中の鉄が不足している条件下または他の理由で鉄の生物学的利用能が制限されている条件下で、イネ科植物が非イネ科植物種よりも生態学的に優勢であることの説明になっている。ファイトシデロフォアが媒介する鉄の取り込みについてはＳ．Ｍｏｒｉによる詳しい総説がある（ここにその全文を援用するＡｅ，Ｎ．，Ａｒｉｈａｒａ，Ｎ．，Ｏｋａｄａ，Ｋ，およびＡ．Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ編「Ｐｌａｎｔ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ」（２００１，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，東京）の「Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｍｕｇｉｎｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｎ  ｉｒｏｎ  ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ：  ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｒｉｃｅ」）。
【０００９】
研究により、三価鉄の還元はファイトシデロフォアが媒介する取り込みにとって必要条件ではないことが示されている。三価鉄還元酵素活性が妨害される生理学的条件（例えば高いｐＨ）ではＦｅ［III］・ＭＡの取り込みは妨害されず、ストラテジーI植物における鉄取り込みを妨害するのに極めて有効な強いＦｅ［II］キレート剤、４，７−ビフェニル−１，１０−フェナントロリン−ジスルホン酸（ＢＰＤＳ）は、Ｆｅ［III］・ＭＡの取り込みの妨害には無効である。細菌シデロフォアによる鉄の取り込みから類推して、ストラテジーII植物は、Ｆｅ・ファイトシデロフォア錯体全体を輸送すると考えられる。この考えを裏付ける証拠は59Ｆｅ［III］・［14Ｃ］デオキシムギネ酸（ＤＭＡ）を使った二重標識研究によって得られる（ｖｏｎ  Ｗｉｒｅｎ，Ｎら，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９５  １０６：７１−７７）。
【００１０】
イネ科ストラテジーII植物であるトウモロコシには、２つの鉄取り込み突然変異体、イエローストライプ１（ｙｅｌｌｏｗｓｔｒｉｐｅ１）（ｙｓ１）とイエローストライプ３（ｙｅｌｌｏｗｓｔｒｉｐｅ３）（ｙｓ３）が報告されている。両突然変異体はよく似た退緑黄縞斑入り葉の表現型を持ち、これは葉に鉄を直接施用することによって復帰させることができる。トウモロコシｙｓ１突然変異体はファイトシデロフォア取り込み機構を取り扱う多くの生理学的研究に使用されてきた。トウモロコシにおけるファイトシデロフォア媒介鉄取り込みにＹＳ１が関与することは、いくつかの研究によって示されている。野生型（ＷＴ）トウモロコシは同時栽培されたオオムギのファイトシデロフォアを利用することができるようであるが、ホモ接合性ｙｓ１突然変異体は、退緑を生じたその外観から判断して、オオムギのファイトシデロフォアを利用することができなかった（Ｊｏｌｌｅｙ，ＶＤら，Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｎｕｔｒ．１９９１  １４：４５−５８；Ｈｏｐｋｉｎｓ，ＢＧら，Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｎｕｔｒ．１９９２  １５：１５９９−１６１２）。ｙｓ１突然変異体植物は正常な量のトウモロコシ・ファイトシデロフォア、ＤＭＡを産生することが、後に確認された。59Ｆｅ−ＤＭＡからの59Ｆｅの取り込みと、苗条への転流はどちらも、ｙｓ１突然変異体植物ではＷＴ対照での２０分の１未満だった。これらの取り込み実験から、ＹＳ１は、１０μＭ域のＫmを持つ高親和性Ｆｅ［III］トランスポーターであることが示唆された（ｖｏｎ  Ｗｉｒｅｎ，Ｎら，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９５  １０６：７１７７）。
【００１１】
本発明者らはトウモロコシｙｓ１遺伝子を初めてクローン化し、ＹＳ１タンパク質を単離した。ＹＳ１は、内在性膜タンパク質の構造的特徴を持つ新規タンパク質であることをここに示す。これは、特にＦｅ−ＤＭＡ含有培地での鉄取り込みに欠陥を持つ酵母突然変異体の成長を回復させる。さらにｙｓ１遺伝子は、根でも苗条でも、鉄飢餓に応答してアップレギュレートされることを、ここに示す。
【００１２】
したがって本発明の目的は、鉄の生物学的利用能が土壌中の欠乏または植物による鉄取り込みを阻害する他の条件によって制限されている土壌から栄養学的に有意な量の鉄を取り込む食用植物の能力を改善するという、当技術分野における長年の要望を満たすことである。本発明は、鉄の生物学的利用能が低い条件下で本発明のｙｓ１遺伝子を発現させるトランスジェニック植物の作出を可能にする。
【００１３】
植物は正常な生長および発生に鉄を必要とし、栄養的価値の面でも植物物質中の鉄は十分なレベルであることが望ましいが、鉄は高レベルに集積すると植物にとって有毒にもなりうる。したがって鉄が過剰な土壌では、収穫量も低下する。本発明者らは、ｙｓ１の発現が、その天然プロモーターの制御下にあっては、鉄が過剰に利用可能な条件ではダウンレギュレートされることを、ここに示す。
【００１４】
したがって本発明のさらにもう一つの目的は、土壌中の高レベルの鉄に対して耐性を持ち、より高レベルの鉄を土壌から集積することができるトランスジェニック植物が得られるように、ｙｓ１の発現が高レベルの鉄によってダウンレギュレートされないベクターを作製することである。これらのトランスジェニック植物は、それら自体が持つ栄養的価値ゆえに有用であるか、または鉄が過剰に豊富な土壌に対して耐性を持たない植物−例えば鉄が過剰に豊富な土壌ではその生長能力が低下する植物−が生長できるように土壌を調節するのに有用である。例えば、耐性の低い植物の周りの局所的鉄濃度を一過性に低下させるために、ｙｓ１トランスジェニック植物を、鉄が過剰に豊富な土壌に対して耐性を持たない前記植物と同時に栽培することができる。したがって、この方法では、将来栽培される作物のために生物学的に利用可能な鉄を長期間にわたって低下させることなく、ある範囲の土壌で、鉄を一過性かつ局所的に枯渇させることができるだろう。
【００１５】
世界中で耕作されている土壌の１２％までが、植物の生長と発生を妨げ収穫量の低下をもたらす高濃度の金属（銅およびマグネシウムなどの重金属を含む）を含有している。また、工業廃棄物などによる土壌全般の金属汚染は、世界中で健康に対する重大な脅威となっている。土壌の金属汚染に関して特に関心が持たれるのは、その多くが植物および／または動物にとって有毒な、重金属による汚染である。植物を利用して行なわれる土壌からの金属の除去はファイトレメディエーション（ｐｈｙｔｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ）と呼ばれており、しばしばファイトエクストラクション（ｐｈｙｔｏｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）、バイオレメディエーション、植物バイオレメディエーション（ｂｏｔａｎｉｃａｌ−ｂｉｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ）およびグリーンレメディエーション（Ｇｒｅｅｎ  Ｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ）とも呼ばれる。ファイトエクストラクションについては、例えば「Ｐｌａｎｔｓ  ｔｈａｔ  Ｈｙｐｅｒａｃｃｕｍｕｌａｔｅ  Ｈｅａｖｙ  Ｍｅｔａｌｓ：  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｏｌｅ  ｉｎ  Ｐｈｙｔｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ａｒｃｈａｅｏｌｏｇｙ，  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｈｙｔｏｍｉｎｉｎｇ」（１９９８）ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（英国オックスフォード）の２６１〜２８７頁にＳ．Ｐ．ＭｃＧｒａｔｈによる詳しい総説がある。驚いたことに、本発明者らは、ｙｓ１が鉄以外の他の金属、例えば銅などを取り込む能力も持っていることを見いだし、これを本願に開示する。しかしトウモロコシは、高レベルの金属を取り込む能力は持つが、高レベルの金属を貯蔵または集積する能力は持たない、大きい高バイオマス植物である。したがって、バイオレメディエーションへのトウモロコシの使用は費用対効果に乏しく、新たな廃棄物処理問題を引き起こすかもしれない。汚染土壌から金属を除去するために植物を利用する場合は、金属超集積体表現型を持つ植物が、高い植物物質収穫能力を持つ植物よりもはるかに重要である。そのような金属超集積体の一つはトラスピ・カエルレセンス（Ｔｈｌａｓｐｉ  ｃａｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ）である。トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）の場合、植物バイオマス１Ｋｇにつき５００ｍｇのＺｎで収穫量の有意な低下が起こるのに対して、このトラスピ・カエルレセンスは、植物バイオマス１Ｋｇにつき約２５，０００ｍｇまでのＺｎに超耐性を持つことができる。超集積植物の他の典型例には、アマランサス・パニキュラータ（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ）、カラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）、アビシニアガラシ（Ｂ．  ｃａｒｉｎａｔａ）、キャベツ（Ｂ．  ｏｌｅｒａｃｅａ）、クロガラシ（Ｂ．  ｎｉｇｒａ）、アブラナ（Ｂ．  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、セイヨウアブラナ（Ｂ．  ｎａｐｕｓ）、ブラシカ・トルニフォルティイ（Ｂ．  ｔｏｕｒｎｉｆｏｒｔｉｉ）、ダイコン（Ｒａｐｈａｎｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ）、シロガラシ（Ｓｉｎａｐｉｓ  ａｌｂａ）、ノハラガラシ（Ｓ．  ａｒｖｅｎｓｉｓ）、シナピス・フレクスオーサ（Ｓ．  ｆｌｅｘｕｏｓａ）およびシナピス・プベセンス（Ｓ．  ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ）などがあるが、これらに限るわけで���ない。超集積の方法と超集積植物のさらなる典型例は、例えばＲ．Ｒ．Ｂｒｏｏｋｓによって「Ｐｌａｎｔｓ  ｔｈａｔ  Ｈｙｐｅｒａｃｃｕｍｕｌａｔｅ  Ｈｅａｖｙ  Ｍｅｔａｌｓ：  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｏｌｅ  ｉｎ  Ｐｈｙｔｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ａｒｃｈａｅｏｌｏｇｙ，  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｈｙｔｏｍｉｎｉｎｇ」（１９９８）ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（英国オックスフォード）の５５〜９４頁に、またＲｅｅｖｅｓ  ＲＤらによって「Ｐｈｙｔｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｏｘｉｃ  Ｍｅｔａｌｓ」（２０００）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（ニューヨーク）の１９３〜２２９頁に、またＳａｌｔ  ＤＥらによって「Ｐｈｙｔｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｏｘｉｃ  Ｍｅｔａｌｓ」（２０００）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（ニューヨーク）の２３１〜２４６頁に記載されている。
【００１６】
超集積体である植物は、根および苗条細胞中の高レベルの金属に対して耐性（超耐性）を持つことができなればならないが、金属の液胞コンパートメント化が多くの天然超集積植物の超耐性の原因になっているようである。植物は根から苗条に元素を高速に転流する能力を持たなければならない。通常、根の金属濃度は苗条の金属濃度より１０倍以上高いが、超集積体では苗条金属濃度が根でのレベルを越える場合もある（Ｃｈａｎｅｙ，ＲＬら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９７，８：２７９−２８４；Ｖｏｇｅｌｉ−Ｌａｎｇｅ  Ｒら，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １９９０，９２：１０８６−１０９３；Ｏｒｔｉｚ  ＤＦら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９５，２７０：４７２１−４７２８；Ｇｕｅｒｉｎｏｔ，ＭＬ「Ｐｈｙｔｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｏｘｉｃ  Ｍｅｔａｌｓ」（２０００）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（ニューヨーク）の１９３〜２２９頁）。超集積体は高濃度の金属に耐えることができるが、それらの生長は遅いことが多く、それらの金属が毒性を示すであろう植物よりも速くは土壌から金属を取り込まないかもしれない。例えば、トラスピ・カエルレセンス（Ｔ．  ｃａｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ）はトマトとほぼ同程度にしか栄養液からＺｎを集積しなかったが、トマトが３０μＭ  Ｚｎで激しい損傷を受けたのに対して、トラスピ・カエルレセンスは１０，０００μＭ  Ｚｎまで激しい損傷を受けなかった（Ｂｒｏｗｎ  ＳＬら，Ｓｏｉｌ  Ｓｃｉ  Ｓｏｃ  Ａｍ  Ｊ  １９９５，５９：１２５−１３３）。
【００１７】
ファイトレメディエーションにおける植物による金属の取り扱いで超集積に代わるもう一つの方法は、揮発法（ｖｏｌａｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ）と呼ばれている。揮発法は、例えばＲ．Ｒ．Ｂｒｏｏｋｓが「Ｐｌａｎｔｓ  ｔｈａｔ  Ｈｙｐｅｒａｃｃｕｍｕｌａｔｅ  Ｈｅａｖｙ  Ｍｅｔａｌｓ：  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｏｌｅ  ｉｎ  Ｐｈｙｔｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ａｒｃｈａｅｏｌｏｇｙ，  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｈｙｔｏｍｉｎｉｎｇ」（１９９８）ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（英国オックスフォード）の２８９〜３１２頁に記載している。
【００１８】
ファイトレメディエーションにとって重要な植物活性の分子的理解はほとんどなされてないが、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）および酵母突然変異体によるＦｅ、ＣｄおよびＺｎ取り込みの特徴づけに関する最近の進歩により、商業利用のためのトランスジェニック改良型ファイトレメディエーション栽培品種を開発するための戦略が示されている。また、本発明者らは、アラビドプシス中に存在し、やはり金属を取り込む能力を持つ、一群の関連イエローストライプ１様（ｙｅｌｌｏｗ  ｓｔｒｉｐｅ  １−ｌｉｋｅ）（ＹＳＬ）タンパク質も見いだした。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明はトウモロコシのイエローストライプ１（ｙｅｌｌｏｗ  ｓｔｒｉｐｅ  １）（ｙｓ１）遺伝子（配列番号１）およびその遺伝子のタンパク質産物（配列番号２）を対象とする。ｙｓ１  ｃＤＮＡの配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ１８６２３４として登録されている。さらに本発明は、アラビドプシスのイエローストライプ１様（ｙｅｌｌｏｗ  ｓｔｒｉｐｅ  １−ｌｉｋｅ）（ｙｓｌ）遺伝子（配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５および１７）ならびにこれらの遺伝子のタンパク質産物（それぞれ配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６および１８）を対象とする。本発明者らは、ｙｓ１遺伝子産物がトウモロコシにおけるファイトシデロフォア媒介性鉄取り込みを担っていることを発見した。本発明者らは、ＹＳ１を他の生物に導入できること、そしてＹＳ１はそれらの生物においてファイトシデロフォア媒介性鉄取り込みを媒介できることを見いだし、ここに開示する。さらに本発明者らは、驚いたことに、ＹＳ１が形質転換生物への他の金属の取り込みも媒介できることを発見した。ここに開示する本発明の核酸分子は金属イオントランスポーターとして作用するタンパク質をコードするので、本発明によれば、ここに開示する核酸分子の発現パターンおよび／または発現レベルを変化させることにより、任意の植物で、金属イオンホメオスタシスを変化させることが可能になる。したがって本発明の核酸を使って、高度に望ましく商業的に有益で、ユニークかつ農学的に有用な形質を、所望する任意の植物に付与することができる。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明の目的の一つはトウモロコシｙｓ１核酸およびそれが産生するＹＳ１タンパク質を提供することである。本発明はアラビドプシスのｙｓｌ核酸およびそれらが産生するＹＳＬタンパク質も提供する。本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６および１８からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６または１８の少なくとも６アミノ酸の断片をコードする単離された核酸分子、および配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５または１７を含む核酸分子にハイブリダイズする単離された核酸分子、からなる群より選択される単離された核酸分子を包含する。核酸分子には、本発明のタンパク質をコードする天然核酸分子の機能的等価物を含めることができる。天然核酸分子の機能的等価物には、例えば天然アレル変異体、ならびに本発明の分子をコードする当該核酸分子の能力を実質的に妨げることがないような形でヌクレオチドの挿入、欠失、置換および／または逆位が起こっている改変核酸分子などが含まれるが、これらに限るわけではない。前記アミノ酸置換は保存的であっても、非保存的であってもよい。好ましい機能的等価物は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）に記載の条件に従って、シグナル伝達タンパク質コード核酸分子の少なくとも一部に、ストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる配列（すなわち少なくとも約７０％の一致率を持つ配列）を含む。ストリンジェントな条件とは、０．１％ＳＤＳ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、６ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、２ｍＭ  ＥＤＴＡからなるｐＨ＝６．８の緩衝液中でハイブリダイゼーションが行なわれることを意味する。より好ましい機能的等価物は、シグナル伝達タンパク質コード核酸分子の少なくとも一部に、ストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる配列（すなわち少なくとも約９０％の一致率を持つ配列）を含む。高度にストリンジェントな条件とは、０．１％ＳＤＳ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．３ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡからなるｐＨ＝６．８の緩衝液中でハイブリダイゼーションが行なわれることを意味する。本発明の核酸分子は、配列番号２に記載の配列に対して、少なくとも約５０または６０％のアミノ酸配列一致率を持つタンパク質、好ましくは配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６または１８に記載のタンパク質配列に対して、少なくとも約７０または７５％、より好ましくは少なくとも約８０％、さらに好ましくは少なくとも約８５％、さらに好ましくは少なくとも約９０％、さらに好ましくは少なくとも約９５％、最も好ましくは少なくとも約９８％の配列一致率を持つタンパク質をコードしうる。
【００２１】
さらに本発明は、１つまたは複数の発現制御因子に作動可能に連結された核酸分子、例えば上記単離された核酸分子を含むベクターなども包含する。また本発明は、本発明の核酸分子を含むように形質転換された宿主細胞を包含し、さらには、タンパク質の製造方法であって、本発明の核酸分子で形質転換された宿主細胞を前記タンパク質が発現される条件下で培養するステップを含む方法も包含する。
【００２２】
さらに本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６または１８のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６または１８の少なくとも６アミノ酸の断片を含む単離されたポリペプチド、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６または１８の保存的アミノ酸置換を含む単離されたポリペプチド、および配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６または１８の天然アミノ酸配列変異体を含む単離されたポリペプチド、からなる群より選択される単離されたポリペプチドも提供する。本発明のポリペプチドは、配列番号２に記載の配列に対して少なくとも約５０または６０％のアミノ酸配列一致率を持つアミノ酸配列を有するポリペプチド、好ましくは配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６または１８に記載のタンパク質配列に対して少なくとも約７０または７５％、より好ましくは少なくとも約８０％、さらに好ましくは少なくとも約８５％、さらに好ましくは少なくとも約９０％、さらに好ましくは少なくとも約９５％、最も好ましくは少なくとも約９８％の配列一致率を持つアミノ酸配列を有するポリペプチドも包含する。
【００２３】
本発明は、本発明の核酸コンストラクトを含むベクター、ならびに本発明のベクターを含む宿主細胞、組換え植物細胞およびトランスジェニック植物を提供する。より具体的には、本発明は、上記核酸コンストラクトに関してヘミ接合性、ヘテロ接合性またはホモ接合性であるような細胞およびトランスジェニック植物を提供するものであり、ここに前記植物は一倍体、二倍体または倍数体であることができる。本発明の目的の一つは、一コピーまたは多コピーの本発明ＹＳ１またはＹＳＬタンパク質産物の１つまたは複数を発現させるような細胞およびトランスジェニック植物を提供することである。多コピーのＹＳ１またはＹＳＬタンパク質の１つを発現させるか、２以上のＹＳ１またはＹＳＬタンパク質を発現させる細胞またはトランスジェニック植物は、例えば細胞もしくはトランスジェニック植物への金属の取り込みを増進するために、または細胞もしくはトランスジェニック植物によって取り込まれる金属の範囲もしくは種類を広げるために、望ましいだろう。
【００２４】
さらに本発明は、ＹＳ１および／またはＹＳＬ、またはそのホモログもしくはオルソログの少なくとも１つを発現するように遺伝子改変されている植物、またはＹＳ１、ＹＳＬタンパク質またはそのホモログもしくはオルソログを天然に発現させるかもしれない植物におけるＹＳ１および／またはＹＳＬまたはそのホモログもしくはオルソログの発現を検出するための核酸プローブも提供する。さらに本発明は、生物学的試料または組織切片をＹＳ１、ＹＳＬタンパク質またはそのホモログもしくはオルソログの発現について精査するための、ＹＳ１、ＹＳＬタンパク質に対する抗体またはそのホモログもしくはオルソログに対する抗体の使用も提供する。前記生物学的試料または組織切片は、前記タンパク質を発現させるように遺伝子改変されている植物またはＹＳ１、ＹＳＬタンパク質またはそのホモログもしくはオルソログを天然に発現させるかもしれない植物から得られるものであってよい。
【００２５】
本発明のさらにもう一つの目的は、栄養学的に有意な量の金属、例えば鉄を、土壌から取り込む植物の能力を改善するという当技術分野における長年の要望を満たすこと、および植物可食部または他の使用可能な植物部分中の金属微量栄養素含量が増加するように植物における金属の沈着を変化させることである。したがって本発明では、特定の栽培条件下で植物における金属イオンの沈着パターンが変化するように本発明のｙｓ１またはｙｓｌ遺伝子産物の少なくとも１つを発現させるトランスジェニック植物を作出することができる。本発明のトランスジェニック植物は、例えば土壌、砂、パーライト、バーミキュライト、水耕法など（ただしこれらに限らない）、任意の適切な培地で栽培することができる。また、本発明のトランスジェニック植物は、標的金属が低濃度、平均濃度または高濃度である条件下で、特定の植物部分に特定の金属を集積するために、使用することもできる。
【００２６】
本発明のさらにもう一つの目的は、鉄の生物学的利用能が土壌中の欠乏または植物による鉄取り込みを阻害する他の条件によって制限されている土壌から栄養学的に有意な量の鉄を取り込む食用植物の能力を改善するという、当技術分野における長年の要望を満たすことである。したがって本発明では、鉄の生物学的利用能が低い条件下で本発明のｙｓ１またはｙｓｌ遺伝子産物の少なくとも１つを発現させるトランスジェニック植物を作出することができる。
【００２７】
本発明のさらにもう一つの目的は、土壌中の高レベルの鉄に対して耐性を持ち、より高レベルの鉄を土壌から集積することができるトランスジェニック植物が得られるように、ｙｓ１またはｙｓｌ遺伝子の発現が正常な鉄レベルまたは高い鉄レベルによってダウンレギュレートされないベクターを作製することである。例えば、そのようなベクターでは、通常ｙｓ１に付随している鉄調節性プロモーターの代わりに、ｙｓ１の持続的発現を可能にするプロモーターが使用されるだろう。これらのトランスジェニック植物は、それら自体が持つ栄養的価値ゆえに有用であるか、または鉄が過剰に豊富な土壌に対して耐性を持たない植物−もしくは鉄が過剰に豊富な土壌ではその生長能力が低下する植物−が生長できるように土壌を調節するのに有用である。したがって本発明は、鉄濃度または他の重金属濃度が高い条件下でダウンレギュレートされないプライマーの制御を受けるｙｓ１またはｙｓｌコード配列を含むベクターを提供する。前記プロモーターは、同じベクター上に位置してもよいし、別個のベクター上に位置してもよい。
【００２８】
本発明のもう一つの目的は、土壌からの重金属の取り込みを促進、加速、増進および／または増加させるために、ＹＳ１またはＹＳＬタンパク質の少なくとも１つを発現させるトランスジェニック植物を提供することである。トランスジェニック植物は、天然の重金属超集積体であってもよいし、超集積体表現型が発現するように付加的に操作されてもよい。ここに開示する核酸は、金属イオンの沈着パターンを変化させて、高レベルの金属イオンを封鎖することができる組織に金属を効率よく輸送できるようにするためにも、使用することができる。
【００２９】
さらに本発明は、バイオレメディエーションに上記トランスジェニック植物を使用する方法も提供する。
【００３０】
本発明の他の目的、利点および特徴は、本願明細書および図面を精査すれば、当業者には明白になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
別段の定義をしない限り、本明細書で使用する全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者が一般に理解している通りの意味を持つ。本発明の実施または試験には、本明細書に記載する方法および材料と類似するまたは等価な方法を使用することができるが、好ましい方法および材料を説明する。
【００３２】
本発明のツールおよび方法が、配偶子を産生する全ての植物に当てはまることは、上記の説明から理解されるだろう。そのような植物には、例えばイネ科飼料作物、芝草、観賞用イネ科植物、マメ科飼料作物、地表植被、野菜、畑作物（例えばダイズ、トウモロコシ、コメ、綿、タバコ、モロコシ、フィールドピーなど）、木および装飾花などが含まれるが、これらに限るわけではない。
【００３３】
（定義）
本明細書で使用する用語「アレル」は、ある遺伝子の、いくつかある代替型のいずれかを指す。
【００３４】
本明細書で使用する用語「キレート剤」は、金属イオンが少なくとも２つの非金属化学化合物に結合して複素環を形成するような形で金属イオンに結合する任意の化学化合物を指す。多くのキレート剤は金属イオンとの間に可溶性またはある程度可溶性の錯体を形成し、それが植物に対する金属の利用能を高め、植物が特定の金属を集積することを可能にするだろう。他のキレート剤は金属との間に不溶性錯体を形成して、（i）金属を濃縮して、それらが植物の根に物理的または化学的に集積（すなわち吸収）する働き、および／または（ii）根域の近傍からの金属の浸出またはその他の除去を防止する働きをしうる。キレート剤の例には以下に挙げるものがあるが、これらに限るわけではない：プルプル酸アンモニウム（ムレキシド）、２，３−ブタンジオンジオキシム（ジメチルグリオキシム）、３，６−ジスルホ−１，８−ジヒドロキシナフタレン（クロモトロプ酸）、ならびにチオ尿素、α−ベンゾインオキシム（クプロン（ｃｕｐｒｏｎ））、トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸（ＣＤＴＡ）、ジエチレン−トリアミノ五酢酸（ＤＴＰＡ）、２，３−ジメルカプト−１−プロパノール、ジフェニルチオカルバゾン、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、置換１，１０−フェナントロリン（例えば５−ニトロ−１，１０−フェナントロリン）、ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム（ジエチルジチオカルバメート（クプラール（ｃｕｐｒａｌ））、２−テノイル−２−フロイルメタン、テノイル−トリフルオロアセトン、トリエチレンテトラミン、ならびにエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）およびクエン酸。例えば、ここにその全文を援用する参考文献「Ｄａｔａ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」（Ｃｌａｒｅｄｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，英国オックスフォード，１９８６）の３９９〜４１５頁、Ｄａｗｓｏｎら編「Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  Ｃｏｎｓｔａｎｔｓ  ｏｆ  Ｍｅｔａｌ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ」などを参照されたい。
【００３５】
本明細書で使用する用語「作物」は、任意の商業的目的で栽培される任意の植物を指し、それらの商業的目的には、例えば以下の目的が含まれるが、これらに限るわけではない：種子生産、乾草生産、観賞用途、果実生産、液果生産、野菜生産、油生産、タンパク質生産、植物飼料生産、動物放牧、ゴルフコース、芝生、花生産、造園、砂防、緑肥、土壌の易耕性／健康状態の改善、医薬品／薬物の製造、食品または食品添加物の製造、喫煙製品、パルプ製造、および木材製造。
【００３６】
本明細書で使用する用語「他家受粉」または「交雑育種」は、ある植物上のある花の花粉を別の植物のある花の胚珠（柱頭）に（人工的にまたは自然に）適用するプロセスを指す。
【００３７】
本明細書で使用する用語「栽培品種」は、園芸技術または作物栽培技術によって作出された植物の変種、株または品種であって、野生の集団には通常見いだされないものを指す。
【００３８】
本明細書で使用する用語「雌性」は、胚珠を産生する植物を指す。雌性植物は一般に受精後に種子を産生する。「雌性植物」と呼ばれる植物は、雄性生殖器と雌性生殖器の両方を持つ場合がある。あるいは、「雌性植物」は、天然に（例えば雌雄異株種の場合）、または（例えば雄穂除去による）除雄のせいで、雌性生殖器だけを含む場合もある。
【００３９】
本明細書で使用する用語「雑種世代」は、特定の親世代に続く細胞、組織または生物の世代のいずれかを指す。親の交配によって生じる世代は雑種第一代（「Ｆ１」または「Ｆ1」と表記）であり、Ｆ１個体の交配によって生じる世代は雑種第２代（「Ｆ２」または「Ｆ2」と表記）である。
【００４０】
本明細書で使用する用語「配偶子」は、同様の起源を持つが性が反対であるもう一つの配偶子と融合して、新しい個体に発達する潜在能力を持つ接合子を形成する核（およびしばしば細胞質）を有する生殖細胞を指す。配偶子は半数体であり、雌雄に分化している。
【００４１】
本明細書で使用する用語「遺伝子」は、生物学的機能に関係するＤＮＡのセグメントを指す。したがって遺伝子は、コード配列および／またはそれらの発現に必要な調節配列を含むが、これらに限るわけではない。遺伝子は、例えば他のタンパク質のための認識配列などを形成する非発現ＤＮＡセグメントを含むこともできる。遺伝子は、例えば興味ある供給源からのクローニングまたは既知配列情報もしくは予想配列情報からの合成など、様々な供給源から得ることができ、所望のパラメータを持つように設計された配列を含みうる。
【００４２】
本明細書で使用する用語「遺伝子型」は、個々の細胞、細胞培養、組織、植物または植物群の遺伝子構成を指す。
【００４３】
本明細書で使用する用語「異種ポリヌクレオチド」または「異種核酸」または「外因性ＤＮＡセグメント」は、その宿主細胞にとって異物である供給源に由来するか、同じ供給源に由来するとすれば、元の形から改変されている、ポリヌクレオチド、核酸またはＤＮＡセグメントを指す。したがって、ある宿主細胞中の異種遺伝子には、その宿主細胞にとって内因性であるが改変されている遺伝子が包含される。したがってこの用語は、その細胞にとって異物もしくは異種であるＤＮＡセグメント、またはその細胞にとって相同であるがその因子が通常見いだされない宿主細胞核酸内の位置に存在するＤＮＡセグメントを指す。外因性ＤＮＡセグメントが発現すると、外因性ポリペプチドが生じる。
【００４４】
本明細書で使用する用語「異種形質」は、外因性ＤＮＡセグメント、異種ポリヌクレオチドまたは異種核酸によって形質転換宿主細胞またはトランスジェニック生物に付与された表現型を指す。
【００４５】
本明細書で使用する用語「ヘテロ接合体」は、少なくとも１つの遺伝子座に異なるアレル（与えられた遺伝子の型）が存在している個々の二倍体または倍数体細胞または植物を指す。
【００４６】
本明細書で使用する用語「ヘテロ接合性」は、特定の遺伝子座に異なるアレル（与えられた遺伝子の型）が存在することを指す。
【００４７】
本明細書で使用する用語「ホモログ」は、別の種に由来する核酸またはペプチド配列と共通する起源および類似する機能を持つ核酸またはペプチド配列を指す。
【００４８】
本明細書で使用する用語「ホモ接合体」は、１つまたは複数の遺伝子座に同じアレルを持つ個々の細胞または植物を指す。
【００４９】
本明細書で使用する用語「ホモ接合性」は、相同な染色体セグメントの１つまたは複数の遺伝子座に同一のアレルが存在することを指す。
【００５０】
本明細書で使用する用語「雑種」は、１つまたは複数の遺伝子が異なる親同士の交配によって得られる任意の個々の細胞、組織または植物を指す。
【００５１】
本明細書で使用する用語「超集積体」は、対応する野生型と比較して乾燥バイオマスに占めるパーセンテージが高くなるような量の重金属を取り込んでその組織に貯蔵することができる任意の植物を指す。より具体的には、超集積体は、当該植物の乾燥バイオマスの約０．５％に少なくとも等しいかまたはそれを越える量の重金属を貯蔵することができる植物である。好ましくは、超集積体は、当該植物の乾燥バイオマスの約１．０％に少なくとも等しいかまたはそれを越える量の重金属を貯蔵することができる植物である。より好ましくは、超集積体は、当該植物の乾燥バイオマスの約１．５％に少なくとも等しいかまたはそれを越える量の重金属を貯蔵することができる植物である。さらに好ましくは、超集積体は、当該植物の乾燥バイオマスの約２．０％に少なくとも等しいかまたはそれを越える量の重金属を貯蔵することができる植物である。最も好ましくは、超集積体は、当該植物の乾燥バイオマスの約２．５％に少なくとも等しいかまたはそれを越える量の重金属を貯蔵することができる植物である。最適には、超集積体は、当該植物の乾燥バイオマスの約５．０％に少なくとも等しいかまたはそれを越える量の重金属を貯蔵することができる植物である。あるいは、超集積体は、金属含有土壌中に存在する金属の量より乾燥重量ベースで少なくとも約１０倍多い金属を苗条に取り込んで集積することができる任意の植物、または金属含有土壌中に存在する金属の量より乾燥重量ベースで少なくとも約２０倍多い金属を根に集積することができる任意の植物であると定義することもできる。
【００５２】
超集積植物の例には、以下に挙げるものがあるが、これらに限るわけではない：アリッサム・ピニフォリウム（Ａｌｙｓｓｕｍ  ｐｉｎｉｆｏｌｉｕｍ）、アマランサス・パニキュラータ（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ）、ボルンムエレラ・バルダッキイ亜種マルグラフィイ（Ｂｏｒｎｍｕｅｌｌｅｒａ  ｂａｌｄａｃｃｉｉ  ｓｓｐ．  ｍａｒｋｇｒａｆｉｉ）、カラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）、アビシニアガラシ（Ｂ．  ｃａｒｉｎａｔａ）、キャベツ（Ｂ．  ｏｌｅｒａｃｅａ）、クロガラシ（Ｂ．  ｎｉｇｒａ）、アブラナ（Ｂ．  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、セイヨウアブラナ（Ｂ．  ｎａｐｕｓ）、クロガラシ（Ｂ．  ｎｉｇｒａ）、ブラシカ・トルニフォルティイ（Ｂ．  ｔｏｕｒｎｉｆｏｒｔｉｉ）、ダイコン（Ｒａｐｈａｎｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ（Ｌ．））、カロドフォラ（Ｃａｌｏｄｏｐｈｏｒａ）属の種、ジカペタルム・ゲロニオイデス（Ｄｉｃｈａｐｅｔａｌｕｍ  ｇｅｌｏｎｉｏｉｄｅｓ）、フレンチソレル（Ｒｕｍｅｘ  ｓｃｕｔａｔｕｓ）、シロガラシ（Ｓｉｎａｐｉｓ  ａｌｂａ（Ｌ．））、ノハラガラシ（Ｓ．  ａｒｖｅｎｓｉｓ（Ｌ.））、シナピス・フレクスオーサ（Ｓ．  ｆｌｅｘｕｏｓａ）およびシナピス・プベセンス（Ｓ．  ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ（Ｌ．））、トラスピ・アルペストレ変種カラミナレ（Ｔｈｌａｓｐｉ  ａｌｐｅｓｔｒｅ  ｖａｒ．  ｃａｌａｍｉｎａｒｅ）、シャグマハギ（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ  ａｒｖｅｎｓｅ）、トラスピ・ロツンジフォリウム（Ｔｈｌａｓｐｉ  ｒｏｔｕｎｄｉｆｏｌｉｕｍ）、トラスピ・カエルレセンス（Ｔｈｌａｓｐｉ  ｃａｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ）、トラスピ・ゴエシンゲンセ（Ｔｈｌａｓｐｉ  ｇｏｅｓｉｎｇｅｎｓｅ）、ビオラ・カラミナリア（Ｖｉｏｌａ  ｃａｌａｍｉｎａｒｉａ）、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、アグロスチス・カピラリエス（Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ）、およびラレア・トリデンテート（Ｌａｒｒｅａ  ｔｒｉｄｅｎｔａｔｅ）（米国特許第５，９２７，００５号；同第６，１５９，２７０号；Ｈｕａｎｇ，ＪＷら，Ｎｅｗ  Ｐｈｙｔｏｌ．１９９６  １３４：７５−８４；Ｃｏｔｔｅｒ−Ｈｏｗｅｌｌｓ，ＪＤら，Ａｐｐｌ．Ｇｅｏｃｈｅｍ．１９９６  １１：３３５−３４２；Ｖａｚｑｕｅｚ，ＭＤら，Ｊ＆Ｃ  Ｐｒｅｓｌ．Ｂｏｔ．Ａｃｔａ  １９９４  １０７：２４３−２５０；Ｒｅｅｖｅｓ，Ｒ．Ｄ．ら「Ｐｈｙｔｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｏｘｉｃ  Ｍｅｔａｌｓ，Ｉ」（ＲａｓｋｉｎおよびＢ．Ｄ．Ｅｎｓｌｅｙ編，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２０００）の１２章、１９３〜２２９頁）。
【００５３】
本明細書で使用する「超集積体遺伝子」は、野生型植物または遺伝子改変もしくは遺伝子操作植物に超集積体表現型を付与する遺伝子産物をコードする任意の核酸配列を指す。
【００５４】
本明細書で使用する「同系交配」または「近交系」は比較的純粋な育種株を指す。
【００５５】
本明細書で使用する用語「ノックイン」は、ある遺伝子がゲノム中に導入されている細胞、組織または生物を指し、前記遺伝子の起源は外因性でも内因性でもよい。一般に、導入遺伝子の起源が内因性である場合、その遺伝子は改変遺伝子であるだろう。起源が外因性である導入遺伝子は、野生型であってもよいし、改変型であってもよい。
【００５６】
本明細書で使用する用語「ノックアウト」は、内因性遺伝子の発現の部分的または完全な抑制が（例えばその遺伝子の少なくとも一部の欠失、その遺伝子の少なくとも一部の第２の配列による置換、停止コドンの導入、重要なアミノ酸をコードする塩基の突然変異、またはイントロン接合部の除去などに基づいて）起こっている細胞、組織または生物を指す。標的遺伝子は破壊、不活化または欠失により、部分的にまたは完全に抑制することができる。前記部分的抑制を本明細書では「ノックダウン」という場合もある。ノックアウトはインビトロ組換え技術およびインビボ組換え技術を使って行なうことができる。遺伝子機能を研究するために、通常は細胞、組織または生物を遺伝子改変して、所定の野生型アレルを突然変異型アレルで置き換える。ノックアウトは、標的遺伝子とクローン化ＤＮＡの断片との間の相同組換えを使って、破壊しようとする遺伝子中に「ジャンク（ｊｕｎｋ）」ＤＮＡの断片を挿入することにより、行なうことができる。生物が半数体である場合は、この技術により、その生物が持つ当該遺伝子のただ一つのコピーがノックアウトされることになるだろう。生物が二倍体である場合は、２つのアレルのうちの一方だけがノックアウトされるので、遺伝子のコピーが２つともノックアウトされた二倍体生物を作出するには、従来の育種を行なう必要があるだろう。
【００５７】
本明細書で使用する用語「系統」は広義に用いられ、組織培養技術によって単一の親植物から栄養繁殖した植物群、または共通する親に由来するため遺伝的に極めて類似している同系交配植物群を包含する（ただしこれらに限るわけではない）。ある植物が（ａ）ある特定の系統の材料から再生された一次形質転換体（Ｔ０）植物である場合、（ｂ）その系統のＴ０植物から構成される家系を持つ場合、または（ｃ）（例えば同系交配または自家受粉などにより）共通する祖先を持つために遺伝的に極めて類似している場合に、その植物はその特定の系統に「属する」という。これに関連して「家系」という用語は、例えばヘテロ接合（ヘミ接合）状態またはホモ接合状態にある遺伝子または遺伝子の組合わせがその植物に望ましい形質を付与するように達成される有性交配の観点から見た、植物の系譜を意味する。
【００５８】
本明細書で使用する用語「遺伝子座」は、遺伝学的に定義された任意の部位を指す。遺伝子座は、遺伝子、または遺伝子の一部、または何らかの調節的役割を持つＤＮＡ配列であってよく、異なる配列によって占められていてもよい。
【００５９】
本明細書で使用する用語「雄性」は、花粉粒を産生する植物を指す。「雄性植物」は一般に卵子を受精させるための配偶子を産生する性を指す。「雄性植物」と呼ばれる植物は、雄性生殖器と雌性生殖器の両方を持つ場合がある。あるいは、「雄性植物」は、天然に（例えば雌雄異株種の場合）、または（例えば子房の除去による）除雄のせいで、雄性生殖器だけを含む場合もある。
【００６０】
本明細書で使用する用語「集団選抜」は、個々の植物を選抜し、それらの種子の集合体から次世代を増殖させる選抜方式を指す。
【００６１】
本明細書で使用する用語「金属」は、好ましくは、金属含有環境に見いだされる金属イオンを指す。この用語がイオン型でない元素状金属も包含することは理解されるだろう。本発明の方法によって集積させることができる金属には、鉛、クロム、水銀、カドミウム、コバルト、バリウム、ニッケル、モリブデン、銅、ヒ素、セレン、亜鉛、アンチモン、ベリリウム、金、マンガン、銀、タリウム、スズ、ルビジウム、バナジウム、ストロンチウム、イットリウム、テクネチウム、ルテニウム、パラジウム、インジウム、セシウム、ウラン、プルトニウム、およびセリウムなどの安定金属および放射性金属が含まれる。植物は数種類の金属を濃縮することがあり、このことから金属取り込み機序は必ずしも金属特異的でないことが暗示されるので、「金属」という用語は２つ以上の金属も包含するものとする。「金属」という用語は、金属と一般的有機汚染物質との混合物、例えば鉛またはクロムとニトロフェノール、ベンゼン、アルキルベンジルスルホネート（洗剤）、ポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）および／またはハロゲン化炭化水素（例えばトリクロロエチレン）との組合わせなども包含する。「金属」という用語は、少なくとも約５．０の比重を持つ任意の金属が含まれる「重金属」をも包含し、そのような「重金属」であることが好ましい場合もある。さらに「金属」という用語は、当該植物を消費する者にとって栄養的価値を持ちうる任意の金属を包含する。「金属」という用語は、それを消費するかまたはそれと接触する生物にとって有毒な任意の金属も包含する。
【００６２】
本明細書で使用する用語「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、およびその一本鎖型または二本鎖型のポリマーを指す。特に限定しない限り、これらの用語は、基準核酸と類似する結合特性を持ち天然オリゴヌクレオチドと同様の方法で代謝される既知の天然ヌクレオチド類似体を含む核酸を包含する。別段の表示がない限り、ある特定の核酸配列は、明示した配列に加えて、保存的に改変されたその変異体（例えば縮重コドン置換）および相補配列も、暗黙のうちに包含する。具体的に述べると、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択した（または全ての）コドンの３番目の位置を混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換した配列を作製することによって達成することができる（Ｂａｔｚｅｒら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１；Ｏｈｔｓｕｋａら（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８；Ｃａｓｓｏｌら（１９９２）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８）。核酸という用語は遺伝子、ｃＤＮＡ、および遺伝子がコードするｍＲＮＡと同義に用いられる。「核酸」という用語は、当業者に周知の方法を使って実験室で合成されたポリヌクレオチドも包含する。
【００６３】
本明細書では、あるＤＮＡセグメントがもう一つのＤＮＡセグメントと機能的な関係に置かれている場合、そのＤＮＡセグメントは「作動可能に連結」されているという。例えば、シグナル配列のためのＤＮＡは、それがあるポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されるのであれば、そのポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結されており、プロモーターまたはエンハンサーは、それがあるコード配列の転写を刺激するのであれば、そのコード配列に作動可能に連結されている。一般的には、作動可能に連結されたＤＮＡ配列は隣接しており、シグナル配列の場合は、隣接していると共に、読み枠が一致している。しかしエンハンサーは、それらが転写を制御するコード配列と隣接している必要はない。連結は、都合のよい制限部位またはその代わりに挿入されたアダプターもしくはリンカーでのライゲーションによって達成される。
【００６４】
本明細書で使用する用語「自然受粉」は、遺伝子流動に対して効果的な障壁が設けられている閉鎖受粉とは対照的に、遺伝子流動を自由に受ける植物集団を指す。
【００６５】
本明細書で使用する用語「自然受粉集団」または「自然受粉品種」は、標準に選抜された、通常は少なくとも多少の他家受粉を行なうことができる植物であって、多様性を示すかもしれないが、その集団または品種を他の集団または品種と区別する手段となりうる１つまたは複数の遺伝子型または表現型上の特徴も持っているものを指す。他家受粉に対する障壁のない雑種は、自然受粉集団または自然受粉品種である。
【００６６】
本明細書で使用する用語「オルソログ」は、別の種に由来する核酸またはペプチド配列と類似する機能を持つ核酸またはペプチド配列を指す。
【００６７】
本明細書で使用する用語「胚珠」は雌性配偶体を指し、一方、「花粉」という用語は雄性配偶体を意味する。
【００６８】
本明細書で使用する用語「表現型」は、個々の細胞、細胞培養、植物または植物群の遺伝子構成（すなわち遺伝子型）と環境との相互作用によって生じる、それぞれの観察可能な特徴を指す。
【００６９】
本明細書で使用する用語「植物」は、植物全体、植物器官（例えば葉、茎、根など）、種子ならびに植物細胞およびその子孫を指す。本発明の方法で使用することができる植物の種類は、一般に、形質転換技術を適用することができる高等植物の種類と同じ程度に広く、単子葉植物と双子葉植物の両方を含む。
【００７０】
本明細書で使用する用語「プロモーター」は、転写を開始するためのＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するＤＮＡの一領域を指す。
【００７１】
本明細書で使用する用語「タンパク質」「ペプチド」または「ポリペプチド」は、アミノ酸残基およびそのポリマーを指す。特に限定しない限り、これらの用語は、基準アミノ酸と類似する結合特性を持ち天然アミノ酸残基と同様の方法で代謝される既知の天然アミノ酸残基類似体を含むアミノ酸を包含する。別段の表示がない限り、ある特定のアミノ酸配列は、明示した配列に加えて、保存的に改変されたその変異体（例えば保存的置換）も、暗黙のうちに包含する。「ポリペプチド」という用語は、当業者に周知の方法を使って実験室で合成されたポリペプチドも包含する。
【００７２】
本明細書で使用する用語「組換え体」は、組換えＤＮＡによる形質転換を受けた細胞、組織または生物を指す。最初の組換え体を「Ｒ０」または「Ｒ0」と呼ぶ。Ｒ０を自家受粉させると、「Ｒ１」または「Ｒ1」と呼ばれる第１形質転換世代が得られる。
【００７３】
本明細書で使用する用語「自家受粉した〜」または「自家受粉」は、ある植物上のある花の花粉を同じ植物上の同じまたは異なる花の胚珠（柱頭）に（人工的にまたは自然に）適用することを意味する。
【００７４】
本明細書で使用する用語「合成品種」は、特定の一組のクローンまたは種子繁殖系統を異種交配することによって得られる一組の子孫を指す。合成品種は、他家受精、自家受精、きょうだい受精（ｓｉｂ−ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ）によって得られる種子の混合物を含みうる。
【００７５】
本明細書で使用する用語「形質転換」は、細胞への核酸（すなわちヌクレオチドポリマー）の導入を指す。本明細書で使用する用語「遺伝的形質転換」は、細胞へのＤＮＡ、特に組換えＤＮＡの導入と取り込みを指す。
【００７６】
本明細書で使用する用語「形質転換体」は、形質転換を受けた細胞、組織または生物を指す。最初の形質転換体を「Ｔ０」または「Ｔ0」と呼ぶ。Ｔ０を自家受粉させると、「Ｔ１」または「Ｔ1」と呼ばれる第１形質転換世代が得られる。
【００７７】
本明細書で使用する用語「導入遺伝子」は、その機能が保証されるような形で生物、宿主細胞またはベクターに挿入される核酸を指す。
【００７８】
本明細書で使用する用語「トランスジェニック」は、様々な形質転換方法の一つによって外来または改変遺伝子を受容した細胞、細胞培養、生物、植物および植物の子孫を指し、前記外来または改変遺伝子は、その外来または改変遺伝子を受容する植物または生物の種と同じ種または異なる種から得られる。
【００７９】
本明細書で使用する用語「転位事象」は、供与部位から標的部位へのトランスポゾンの移動を指す。
【００８０】
本明細書で使用する用語「トランスポゾン」は遺伝因子を指し、ある染色体部位から別の染色体部位に移動することができるＤＮＡまたはＲＮＡのセグメントを含むが、これらに限らない。
【００８１】
本明細書で使用する用語「品種」は、ある種のなかで形態または機能が他の類似する多くの個体とは異なっている一群の個体からなる、種の下位分類単位を指す。
【００８２】
本明細書で使用する用語「ベクター」は、広く、外因性核酸をコードする任意のプラスミドまたはウイルスを指す。この用語は、ウイルス粒子または細胞への核酸の導入を容易にする非プラスミドおよび非ウイルス化合物、例えばポリリジン化合物なども包含すると解釈すべきである。ベクターは、細胞への核酸またはその突然変異体の送達に送達媒体として適しているウイルスベクターであってもよいし、同じ目的に適している非ウイルスベクターであってもよい。細胞および組織にＤＮＡを送達するためのウイルスベクターおよび非ウイルスベクターは当技術分野ではよく知られており、例えばＭａらの論文（１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１２７４４−１２７４６）などに記載されている。ウイルスベクターの例には、組換えワクシニアウイルス、組換えアデノウイルス、組換えレトロウイルス、組換えアデノ関連ウイルス、組換え鶏痘ウイルスなどがあるが、これらに限るわけではない（Ｃｒａｎａｇｅら，１９８６，ＥＭＢＯ  Ｊ．５：３０５７−３０６３；１９９４年８月１８日に公開された国際特許出願ＷＯ９４／１７８１０；１９９４年１０月２７日公開された国際特許出願Ｗ０９４／２３７４４）。非ウイルスベクターの例には、リポソーム、ＤＮＡのポリアミン誘導体などがあるが、これらに限るわけではない。
【００８３】
I．核酸
Ａ．プロモーター
植物中で遺伝子を発現させるのに適したプロモーターの好例は数多くある。プロモーターは、例えばトウモロコシ、コメ、トマト、タバコ、アラビドプシス、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）など、多くの植物種で同定されている（Ｏｄｅｌｌ，Ｔ．Ｏ．ら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：８１０−８１２；Ｍａｒｒｓ，Ｋ．Ａ．ら（１９９３）Ｄｅｖ  Ｇｅｎｅｔ，Ｖｏｌ．１４／１：２７−４１；Ｋｉｍ（１９９２）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ，Ｖｏｌ．１／４：１８８−９４；Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，Ｊ．Ｌ．ら（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｏｌ．４／５：５５７−７１；Ａｌｂａｎｉ，Ｄ．ら（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２／３：３３１−４２；Ｒｏｍｍｅｎｓ，Ｃ．Ｍ．ら（１９９２）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，Ｖｏｌ．２３１／３：４３３−４１；Ｋｌｏｅｃｋｅｎｅｒ−Ｇｒｕｉｓｓｅｍら（１９９２）Ｅｍｂｏ  Ｊ，Ｖｏｌ．１１／１：１５７−６６；Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｄ．Ａ．ら（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，Ｖｏｌ．１８／２：２１１−１８；Ｋｙｏｚｕｋａ，Ｊ．ら（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，Ｖｏｌ．２２８／１２：４０−８；Ａｌｂａｎｉ，Ｄ．ら（１９９１）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｖｏｌ．１６／４：５０１−１３；Ｔｗｅｌｌ，Ｄ．ら（１９９１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．５／３：４９６−５０７；Ｔｈｏｒｓｎｅｓｓ，Ｍ．Ｋ．ら（１９９１）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ  Ｖｏｌ．１４３／１：１７３−８４；ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，Ｓ．ら（１９９１）Ｓｙｍｐ  Ｓｏｃ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｖｏｌ．４５：２２９−４４；Ｇｕｅｒｒｅｒｏ，Ｆ．Ｄ．ら（１９９０）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｖｏｌ．２２４／２：１６１−８；Ｔｗｅｌｌ，Ｄ．ら（１９９０）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｖｏｌ．１０９／３：７０５−１３；Ｂｉｃｈｌｅｒ，Ｊ．ら（１９９０）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｖｏｌ．１９０／２：４１５−２６；ｖａｎ  Ｔｕｎｅｎら（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｏｌ．２／５：３９３−４０１；Ｓｉｅｂｅｒｔｚ，Ｂ．ら（１９８９）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｏｌ．１／１０：９６１−８；Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｔ．Ｄ．ら（１９８９）Ｄｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  Ｖｏｌ．１０／６：４１２−２４；Ｃｈｅｎ，Ｊ．ら（１９８７）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｖｏｌ  １１６／３：４６９−７７）。他のプロモーターをＧｅｎＢａｎｋに見いだすこともできる。ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターは米国特許第５，０３４，３２２号；第５，０８６，１６９号；第５，７５６，３２４号；第５，６３３，４３８号；第５，４１２，０８５号；第５，５４５，５４６号；第６，１７２，２７９号および第６，１７４，７２４号に記載されている。
【００８４】
Ｂ．導入遺伝子および異種核酸
組換えＤＮＡ法を使って植物に上手く導入された遺伝子の例は数多くあり、例えば以下の形質をコードするものが挙げられる：種子貯蔵タンパク質、例えば改変７Ｓマメ科種子貯蔵タンパク質（米国特許第５，５０８，４６８号、第５，５５９，２２３号および第５，５７６，２０３号）；除草剤耐性または抵抗性（米国特許第５，４９８，５４４号および第５，５５４，７９８号；Ｐｏｗｅｌｌら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：７３８−７４３（１９８６）；Ｋａｎｉｅｗｓｋｉら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ．８：７５０−７５４（１９９０）；Ｄａｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：６７２１−６７２５（１９９１））；フィターゼ（米国特許第５，５９３，９６３号）；細菌、真菌、線虫および害虫に対する抵抗性、例えばＢｔ遺伝子が付与する鱗翅目昆虫に対する抵抗性（米国特許第５，５９７，９４５号および第５，５９７，９４６号；Ｈｉｌｄｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３０：１６０−１６３；Ｊｏｈｎｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：９８７１−９８７５（１９８９）；Ｐｅｒｌａｋら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ．８：９３９−９４３（１９９０））；レクチン（米国特許第５，２７６，２６９号）；および花色（Ｍｅｙｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３０：６７７−６７８（１９８７）；Ｎａｐｏｌｉら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：２７９−２８９（１９９０）；ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：２９１−２９９（１９９０））。
【００８５】
Ｃ．部位特異的組換え系
特定のＤＮＡ遺伝子座に挿入するためにＤＮＡ配列のターゲティングを行なうと同時に、形質転換操作の副産物として生じるランダムに挿入されたＤＮＡ配列の除去を可能にするための方法およびコンストラクトは、米国特許第５，５２７，６９５号および第６，１１４，６００号に記載されている。これらのランダム挿入を除去する方法の一つは、部位特異的リコンビナーゼ系を利用することである。一般に、部位特異的リコンビナーゼ系は３つの要素、すなわち２対のＤＮＡ配列（部位特異的組換え配列）と特殊な酵素（部位特異的リコンビナーゼ）とからなる。部位特異的リコンビナーゼは２つの部位特異的組換え配列の間で起こる組換え反応だけを触媒するだろう。
【００８６】
例えばバクテリオファージＰ１のＣｒｅ／ｌｏｘ系、酵母のＦＬＰ／ＦＲＴ系、ファージＭｕのＧｉｎリコンビナーゼ、大腸菌のＰｉｎリコンビナーゼ、およびｐＳＲ１プラスミドのＲ／ＲＳ系など（ただしこれらに限らない）、多くの異なる部位特異的リコンビナーゼ系を使用することができる。好ましい部位特異的リコンビナーゼ系はバクテリオファージＰ１  Ｃｒｅ／ｌｏｘ系と、酵母ＦＬＰ／ＦＲＴ系の２つである。これらの系では、リコンビナーゼ（ＣｒｅまたはＦＬＰ）が、それぞれの部位特異的組換え配列（それぞれｌｏｘまたはＦＲＴ）と特異的に相互作用して、介在配列の逆位または切り出しを引き起こす。これら２つの系のそれぞれの配列は比較的短い（ｌｏｘの場合は３４ｂｐ、ＦＲＴの場合は４７ｂｐ）。酵母のＦＬＰ／ＦＲＴ系は、真核生物（酵母）中で正常に機能し、よく特徴付けられているので、現在のところ、好ましい部位特異的リコンビナーゼ系である。ＦＬＰ／ＦＲＴ系は真核生物由来であることから、ＦＬＰ／ＦＲＴ系は、真核細胞では、原核部位特異的組換えリコンビナーゼ系よりも効率よく機能することができる。
【００８７】
ＦＬＰ／ＦＲＴリコンビナーゼ系は、植物細胞中で効率よく機能することが証明されている。トウモロコシプロトプラストおよびコメプロトプラストにおけるＦＬＰ／ＦＲＴ系の性能に関する実験はどちらも、ＦＲＴ部位の構造および存在するＦＬＰタンパク質の量が切り出し活性を左右することを示している。一般に、短い不完全なＦＲＴ部位の方が、完全な全長ＦＲＴ部位よりも、削除産物の蓄積量が高くなる。部位特異的組換え系はトウモロコシプロトプラストにおける分子内反応と分子間反応をどちらも触媒することができることから、この系は組込み反応だけでなくＤＮＡの切り出しにも使用できることがわかる。組換え反応は可逆的であり、各方向の反応の効率はこの可逆性によって損なわれる可能性がある。部位特異的組換え配列の構造を改変することは、この状況を改善するためのアプローチの一つである。部位特異的組換え配列は、組換え反応の産物がもはや逆反応の基質として認識されず、よって組込みまたは切り出し事象が安定化されるように、突然変異させることができる。
【００８８】
Ｄ．ベクター
植物中で外因性ＤＮＡを発現させるための発現単位
上述のように本発明のいくつかの態様では、外部から供給した核酸配列を植物中で発現させるために、発現単位（または発現ベクターもしくは発現系）を利用する。植物で使用するための発現単位／系／ベクターを作製する方法は当技術分野では周知であり、本発明での使用に容易に適合させることができる。当業者は、以下に概説する本方法に、任意の適当な植物／ベクター／発現系を容易に使用することができる。
【００８９】
タンパク質の発現を調節するために使用される発現制御因子は、そのコード配列に通常付随して見いだされる発現制御因子（相同発現因子）であってもよいし、異種発現制御因子であってもよい。当技術分野では様々な相同および異種発現制御因子が知られており、それらを使って、本発明用の発現単位を容易に作製することができる。例えば転写開始領域は、アグロバクテリウム・ツマファシアンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍａｆａｃｉａｎｓ）のＴｉプラスミドに見いだされる様々なオピン開始領域、例えばオクトピン、マンノピン、ノパリンなどのいずれかを含むことができる。あるいは、カリフラワーモザイクウイルス１９Ｓおよび３５Ｓプロモーター（それぞれＣａＭＶ１９ＳおよびＣａＭＶ３５Ｓプロモーター）などの植物ウイルスプロモーターを使って、植物における遺伝子発現を制御することもできる（例えば米国特許第５，３５２，６０５号；第５，５３０，１９６号および第５，８５８，７４２号）。ＣａＭＶ由来のエンハンサー配列も利用することができる（例えば米国特許第５，１６４，３１６号；第５，１９６，５２５号；第５，３２２，９３８号；第５，５３０，１９６号；第５，３５２，６０５号；第５，３５９，１４２号；および第５，８５８，７４２号）。最後に、例えばプロリフェラ（ｐｒｏｌｉｆｅｒａ）プロモーター、果実特異的プロモーター、Ａｐ３プロモーター、熱ショックプロモーター、種子特異的プロモーターなどの植物プロモーターも使用することができる。
【００９０】
配偶子特異的プロモーター、構成的プロモーター（ＣａＭＶまたはＮｏｓプロモーターなど）、器官特異的プロモーター（トマト由来のＥ８プロモーターなど）、または誘導性プロモーターは、通例、タンパク質またはアンチセンスコード領域に、当技術分野で知られている標準的技術を使って、ライゲートされる。発現単位は、転写ターミネーターおよび／またはエンハンサー因子などの追加因子を使ってさらに最適化してもよい。
【００９１】
したがって、植物での発現のために、発現単位は、通例、タンパク質配列の他に、植物プロモーター領域、転写開始部位および転写終結配列を含むだろう。通例、発現単位の５’および３’末端には、既存のベクターに容易に挿入することができるように、ユニークな制限酵素部位発現単位を含める。
【００９２】
異種プロモーター／構造遺伝子またはアンチセンスの組合わせを構築する場合、プロモーターは、好ましくは、そのプロモーターがそれ本来の環境にある時の転写開始部位からの距離とほぼ同じ距離だけ、異種転写開始部位から離れた位置に置く。しかし当技術分野では知られているように、この距離は多少変化させてもプロモーター機能の損失は起こらない。
【００９３】
発現カセットは、プロモーター配列の他に、終結が効率よく起こるように、構造遺伝子の下流に転写終結領域を含むこともできる。終結領域はプロモーター配列と同じ遺伝子から取得してもよいし、異なる遺伝子から取得してもよい。構造遺伝子によってコードされるｍＲＮＡが効率よくプロセシングされるべき場合は、ＲＮＡのポリアデニル化を指示するＤＮＡ配列も、一般に、ベクターコンストラクトに加えられる。ポリアデニル化配列には、アグロバクテリウム・オクトピンシンターゼシグナル（Ｇｉｅｌｅｎら，ＥＭＢＯ  Ｊ３：８３５−８４６（１９８４））またはノパリンシンターゼシグナル（Ｄｅｐｉｃｋｅｒら，Ｍｏｌ．ａｎｄ  Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：５６１−５７３（１９８２））などがあるが、これらに限るわけではない。
【００９４】
得られた発現単位は、高等植物形質転換に適したベクター中にライゲートするか、または他の方法でそのようなベクターに含まれるように構築する。ベクターは、通例、形質転換植物細胞を培養中に同定するために利用することができる選択可能マーカー遺伝子も含むだろう。通常、マーカー遺伝子は抗生物質耐性をコードするだろう。これらのマーカーには、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、およびゲンタマイシンに対する耐性が含まれる。植物細胞の形質転換後に、ベクターを持つ細胞は、特定の抗生物質を含む培地で生育するというそれらの能力によって同定されるだろう。ベクターを細菌またはファージ宿主中にクローニングすることができるように細菌またはウイルス由来の複製配列も一般に含まれ、好ましくは広宿主域原核生物複製起点を含める。所望のコンストラクトを保持する細菌細胞を選択することができるように、細菌用の選択可能マーカーも含めるべきである。適切な原核生物選択可能マーカーにも、例えばアンピシリン、カナマイシンまたはテトラサイクリンなどの抗生物質に対する耐性が含まれる。
【００９５】
当技術分野では知られているように、ベクターには、さらなる機能をコードする他のＤＮＡ配列も存在しうる。例えば、アグロバクテリウム形質転換の場合は、続いて起こる植物染色体への導入に備えて、Ｔ−ＤＮＡ配列も含められるだろう。
【００９６】
本発明の配列は、他の様々な核酸分子、例えば発現配列タグ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔａｇ：ＥＳＴ）、エピトープまたは蛍光タンパク質マーカーに融合することもできる。
【００９７】
ＥＳＴは、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）クローンの３’末端または５’末端から配列決定された、通例３００〜４００ヌクレオチド長の遺伝子断片である。３０，０００近いシロイヌナズナＥＳＴがフランスとアメリカのコンソーシアムによって作製されている（Ｄｅｌｓｅｎｙら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４０５（２）：１２９−１３２（１９９７）；シロイヌナズナデータベース（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  Ｄａｔａｂａｓｅ），ｈｔｔｐ  ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｗｗｗ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）。大きなＥＳＴデータベースから導出される遺伝子発現パターンの解析に関する解説については、例えばＭ．Ｒ．Ｆａｎｎｏｎ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １４：２９４−２９８（１９９６）を参照されたい。
【００９８】
生体適合性の蛍光タンパク質プローブ、特にオワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）由来の自己集合性緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、細胞生物学、分子生物学および発生生物学における研究を一変させた。これらを利用すると、生細胞中の生物学的事象を可視化することができるからである（Ｍｕｒｐｈｙら，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．７（１１）：８７０−８７６（１９９７）；Ｇｒｅｂｅｎｏｋら，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１１（３）：５７３−５８６（１９９７）；Ｐａｎｇら，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １１２（３）（１９９６）；Ｃｈｉｕら，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６（３）：３２５−３３０（１９９６）；Ｐｌａｕｔｚら，Ｇｅｎｅ  １７３（１）：８３−８７（１９９６）；Ｓｈｅｅｎら，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．８（５）：７７７−７８４（１９９５））。
【００９９】
部位特異的突然変異誘発法を使って、可溶性改変ＧＦＰ（ｓｏｌｕｂｌｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＧＦＰ（ｓｍＧＦＰ））と呼ばれる、可溶性が増加したタイプのコドン改変ＧＦＰが開発されている。アラビドプシスに導入すると、コドン改変ＧＦＰよりも強い蛍光が観察されたことから、ｓｍＧＦＰの方が可溶型かつ機能型として存在する割合が多いので「明るい」と考えられる（Ｄａｖｉｓら，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６（４）：５２１−５２８（１９９８））。ＧＦＰおよびβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする遺伝子を融合することにより、研究者らはアラビドプシスを含む植物における一過性発現系および安定発現系での使用に最適な一組の二機能性レポーターコンストラクトを作製することができた（Ｑｕａｅｄｖｌｉｅｇら，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７（４）：７１５−７２７（１９９８））。
【０１００】
Ｂｅｒｇｅｒら（Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９４（２）：２２６−２３４（１９９８））は、アラビドプシス胚軸表皮細胞について、ＧＦＰマーカー系統の単離を報告している。ＧＦＰ融合タンパク質を使って、ゲラニルゲラニルピロホスフェート（ＧＧＰＰ）を含む多くのアラビドプシス遺伝子がその位置を特定され、特徴付けられている（Ｚｈｕら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ.３５（３）：３３１−３４１（１９９７））。
【０１０１】
II．形質転換
Ａ．植物形質転換
従来の方法で所望の遺伝子または一組の遺伝子を導入するには、２つの系統間で有性交配を行なった後、雑種子孫とその両親の一方との間で戻し交雑を、所望の特徴を持つ植物が得られるまで繰り返す必要がある。しかしこの方法は有性交雑が可能な植物に限定され、所望の遺伝子以外の遺伝子も導入されることになる。
【０１０２】
組換えＤＮＡ技術により、植物遺伝学者は、害虫に対する抵抗性などの望ましい形質を担う特殊な遺伝子を同定しクローニングすること、およびそれらの遺伝子を既に役立っている植物品種に導入することが可能になり、よって植物研究者は、上記の制約を回避できるようになった。いったん、外来遺伝子が植物に導入されたら、その植物を従来の植物育種手法（例えば系統育種、単粒系統育種法、相反循環選抜）に使用して、目的の遺伝子も含んでいる子孫を作出することができる。
【０１０３】
遺伝子は相同組換えを使って部位特異的に導入することができる。相同組換えによって内因性遺伝子の部位特異的な改変が可能になるので、先天的または後天的突然変異を矯正し、および／または新しい改変をゲノム中に作り出すことができる。
【０１０４】
植物における相同組換えおよび部位特異的組込みについては上述した他、例えば米国特許第５，４５１，５１３号、第５，５０１，９６７号および第５，５２７，６９５号で論じられている。
【０１０５】
遺伝子操作法を使って、１つまたは複数の本発明のｙｓ１および／またはｙｓｌ核酸を発現／過剰発現させる形質転換された細胞、組織および植物全体を作出することができる。バイオレメディエーションの取り組みとして、形質転換植物を、高い金属含量または重金属含量を持つ土壌で栽培した後、収穫することにより、収穫した植物部分に集積された金属または重金属を除去することができる。バイオレメディエーションを目的として形質転換される好ましい植物には、生長が速いという特徴を持ち、バイオマス産生量が高く、広範囲に及ぶ高度に分岐した根系を持つ植物が含まれる。特に好ましいこのタイプの植物には、イネ科飼料植物、特にウシノケグサ属（Ｆｅｓｔｕｃａ）；草本（ｈｅｒｂｓ）；低木；ならびにユリノキ（Ｌｉｒｉｏｄｅｎｄｒｏｎ  ｔｕｌｉｐｉｆｅｒａ）、セルベルチア（Ｓｅｒｂｅｒｔｉａ）属、サラノキ（Ｓｈｏｒｅａ）属およびニクズク（Ｍｙｒｉｓｔｉｃａ）属などの木本があるが、これらに限らない。本発明のｙｓ１およびｙｓｌ核酸を使って形質転換される他の好ましい植物は、超集積植物、特にアブラナ属の植物である。
【０１０６】
栄養目的の場合、栽培される形質転換植物には、ヒトまたは動物が直接的にまたは加工食品として消費するものを含めることができる。例えば、植物全体に、または１つもしくは複数の特定の植物部分、例えば穀粒、塊茎、果実または種子などに、金属または重金属を集積する形質転換植物を作出することができる。本発明の核酸を使って形質転換される好ましい植物には、人間の食用に広く栽培されている植物、例えばコメ、ダイズ、コムギ、エンバク、ライムギ、キャッサバ、バレイショ、サヤインゲン、ドライピー（ｄｒｙ  ｐｅａ）、レンズマメ、イチゴ、オレンジなどが含まれる。形質転換植物または植物部分の消費により、その生物が消費する当該食品の価値を、特定の重金属に関して向上させることができる。形質転換植物は、１つまたは複数の金属または重金属の含量および／または濃度が低い、または平均的な、または高い、任意の培地で栽培することができる。バイオレメディエーション目的と栄養目的の両方に有用な植物種も使用することができる。例えば、形質転換された飼料作物種はファイトレメディエーションに有効であり、家畜飼料としても役立つだろう。形質転換された飼料作物は放牧動物に消費させることができ、または切断および乾燥して、動物飼料用の干し草を製造することができる。動物飼料として有用な形質転換植物の例には、アルファルファ、クローバー、および飼料として使用される様々なイネ科植物種があるが、これらに限るわけではない。
【０１０７】
Ｂ．形質転換方法
トランスジェニック植物を作出する方法は当業者にはよく知られている。トランスジェニック植物は、現在では、例えばエレクトロポレーション、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクタイル・ボンバードメント（粒子加速法またはバイオリスティック・ボンバードメントとも呼ばれる）、ウイルスによる形質転換、およびアグロバクテリウムによる形質転換など（ただしこれらに限らない）、様々な形質転換方法によって作出することできる（例えば米国特許第５，４０５，７６５号；第５，４７２，８６９号；第５，５３８，８７７号；第５，５３８，８８０号；第５，５５０，３１８号；第５，６４１，６６４号；第５，７３６，３６９号および第５，７３６，３６９号；Ｗａｔｓｏｎら「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ」（１９９２）；Ｈｉｎｃｈｅｅら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ．６：９１５−９２２（１９８８）；ＭｃＣａｂｅら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ．６：９２３−９２６（１９８８）；Ｔｏｒｉｙａｍａら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ．６：１０７２−１０７４（１９８８）；Ｆｒｏｍｍら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ．８：８３３−８３９（１９９０）；Ｍｕｌｌｉｎｓら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ．８：８３３−８３９（１９９０）；ならびにＲａｉｎｅｒｉら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ．８：３３−３８（１９９０）を参照されたい）。
【０１０８】
トランスジェニックアルファルファ植物は、これらの方法の多くによって、例えばアグロバクテリウムによる形質転換（Ｗａｎｇら，Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２３（３）：２６５−２７０（１９９６）；Ｈｏｆｆｍａｎら，Ｍｏｌｅｕｃｌａｒ  Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  １０（３）：３０７−３１５（１９９７）；Ｔｒｉｅｕら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １６：６−１１（１９９６））および粒子加速法（米国特許第５，３２４，６４６号）によって（ただしこれらに限らない）作出されている。
【０１０９】
形質転換はクローバーでも、アグロバクテリウムによる形質転換を使って、うまく達成されている（Ｖｏｉｓｅｙら，Ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４（４）：４７５−４８１（１９９４）；Ｑｕｅｓｂｅｎｂｅｒｒｙら，Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３６（４）：１０４５−１０４８（１９９６）；Ｋｈａｎら，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １０５（１）：８１−８８（１９９４）；Ｖｏｉｓｅｙら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １３（６）：３０９−３１４（１９９４））。
【０１１０】
数多くの飼料作物および芝草種で遺伝的形質転換も報告されている（Ｅ．Ｃ．Ｂｒｕｍｍｅｒら編「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｆｏｒａｇｅ  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ」（ＣＳＳＡ  Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．２６，  Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．，１９９８）４９〜５８頁のＣｏｎｇｅｒ  Ｂ．Ｖ．著「イネ科飼料作物の遺伝的形質転換（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｏｒａｇｅ  Ｇｒａｓｓｅｓ）」）。それらには、オーチャードグラス（Ｄａｃｔｙｌｉｓ  ｇｌｏｍｅｒａｔａ  Ｌ．）、トールフェスク（Ｆｅｓｔｕｃａ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ  Ｓｃｈｒｅｂ．）、レッドフェスク（Ｆｅｓｔｕｃａ  ｒｕｂｒａ  Ｌ．）、メドーフェスク（Ｆｅｓｔｕｃａ  ｐｒａｔｅｎｓｉｓ  Ｈｕｄｓ．）、ペレニアルライグラス（Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅ  Ｌ．）、クリーピングベントグラス（Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ  Ｈｕｄｓ．）およびレッドトップ（Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ａｌｂａ  Ｌ．）が含まれる。
【０１１１】
このような飼料作物および芝草での遺伝子導入の成功は、プロトプラストによるＤＮＡの直接取り込み、およびＤＮＡ被覆マイクロプロジェクタイルによる細胞または組織の射撃によって達成されている。どちらの場合も、遺伝子導入後に植物全体の再生が行なわれる。多くの研究が、形質転換のプロトコールを開発し改良することに重点を置き、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードするレポーター遺伝子ｕｉｄＡ、およびホスフィノスリシン系除草剤に対する抵抗性を付与する選択マーカーｂａｒが利用されている。形質転換は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術、転写されたＲＮＡのノーザンハイブリダイゼーション解析、可溶性タンパク質（遺伝子産物）のウェスタンブロット解析、および全ゲノムＤＮＡのサザンブロットハイブリダイゼーションによって証明されている。
【０１１２】
III．ヘミ接合性
アグロバクテリウム形質転換法を使って形成させたトランスジェニック植物は、複数コピーの遺伝子を含むことも考えられるものの、典型的には、一方の染色体上にただ一つの遺伝子を含んでいる。そのようなトランスジェニック植物は追加された遺伝子に関してヘミ接合性であるということができる。各形質転換植物はユニークなＴ−ＤＮＡ組込み事象を表すので、そのような植物のより正確な名前は独立分離個体（ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｅｇｒｅｇａｎｔ）である（米国特許第６，１５６，９５３号）。導入遺伝子座は一般に導入遺伝子の存在および／または不在によって特徴づけられる。一方のアレルが導入遺伝子の不在に相当するヘテロ接合性遺伝子型もヘミ接合性と呼ばれる（米国特許第６，００８，４３７号）。
【０１１３】
仮に通常のヘミ接合であるとすると、自家受粉は、Ｒ１またはＲ1世代とも呼ばれる第１自家受粉組換え世代に、最大の遺伝子型分離をもたらすだろう。Ｒ１世代は、Ｒ０またはＲ0世代とも呼ばれる元の組換え系統を自家受粉させることによって作出される。各インサートは優性アレルとして働くので、連鎖がなく、抵抗性の発現にはヘミ接合性インサートを一つだけ必要であると仮定すると、１つのインサートは３：１に、２つのインサートは１５：１に、３つのインサートは６３：１に、というように分離するだろう。したがって、比較的少ないＲ１植物を栽培するだけで、少なくとも１つの抵抗性表現型を見いだすことができる（米国特許第５，４３６，１７５号および第５，７７６，７６０号）。
【０１１４】
上述のように、ヘミ接合性トランスジェニック再生植物の自家受粉はＦ２に相当する子孫が生成するはずであり、そのうちの約２５％はホモ接合性トランスジェニック植物となるはずである。Ｆ２子孫の自家受粉および非形質転換対照植物への検定交雑を使って、ホモ接合性トランスジェニック植物を同定し、その系統を維持することができる。再生植物のために最初に得た子孫が他家受粉によるものであった場合は、ホモ接合性トランスジェニック植物の同定には、もう一世代の自家受粉が必要だろう（米国特許第５，５４５，５４５号）。
【０１１５】
IV．育種法
自然受粉集団．ライムギ、数多くのトウモロコシおよびテンサイ、イネ科牧草、アルファルファおよびクローバーなどのマメ科植物、カカオ、ココヤシ、アブラヤシおよび一部のゴムなどの熱帯樹木などの作物の自然受粉集団の改良は、本質的に、高度の（しかし決して最大ではない）ヘテロ接合性を保ちつつ、好ましいアレルの固定に向けて遺伝子頻度を変化させることによる。このような集団では均一性が得られることはなく、自然受粉品種における典型性（ｔｒｕｅｎｅｓｓ−ｔｏ−ｔｙｐｅ）は、個々の植物の特徴ではなくその集団全体としての統計学的特徴である。したがって、自然受粉集団の不均質性は、同系交配系統、クローンおよび雑種の均質性（または事実上の均質性）とは対照的である。
【０１１６】
集団改良法は自ずから２つのグループ、すなわち集団選抜と通常呼ばれる純粋に表現型選抜に基づく方法と、後代検定による選抜に基づく方法とに分類される。集団間改良では自然育種集団（ｏｐｅｎ  ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ）の概念を利用し、ある集団から別の集団に遺伝子を流動させる。ある集団（栽培品種、株、生態型、または任意の生殖質源）中の植物を、自然に（例えば風によって）、または手で、もしくはハチ（一般的にはミツバチ（Ａｐｉｓ  ｍｅｌｌｉｆｅｒａ  Ｌ．）またはアルファルファハキリバチ（Ｍｅｇａｃｈｉｌｅ  ｒｏｔｕｎｄａｔａ  Ｆ．））によって、他の集団に由来する植物と交配する。両方の供給源に由来する望ましい形質を持つ植物を分離することによって一方の（または時として両方の）集団を改良するために選抜を行なう。
【０１１７】
自然受粉集団改良には主な方法が基本的に２つある。第１に、採用した選抜方法が集団をひとまとめにして変化させる場合がある。その結果は、孤立したその集団内での無作為交配によって無限に繁殖することができる改良された集団である。第２に、合成品種は、集団改良と同じ最終結果を達成するが、それ自体はそのままでは繁殖できず、親系統または親クローンから再構築する必要がある。自然受粉集団を改良するためのこれらの植物育種法は当業者には周知であり、他家受粉植物を改良するために日常的に使用される育種法の包括的説明は、数多くの教科書および論文、例えばＡｌｌａｒｄ「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９６０）；Ｓｉｍｍｏｎｄｓ「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｃｒｏｐ  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ」Ｌｏｎｇｍａｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｉｍｉｔｅｄ  （１９７９）；ＨａｌｌａｕｅｒおよびＭｉｒａｎｄａ「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｉｎ  Ｍａｉｚｅ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ」Ｉｏｗａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８１）；ならびにＪｅｎｓｅｎ「Ｐｌａｎｔ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９８８）などに記載されている。
【０１１８】
集団選抜．集団選抜では、望ましい個々の植物を選抜し、収穫し、後代検定を行なわずに種子を混合して、次の世代を生成する。選抜は雌性親だけに基づいて行い、受粉は制御されないので、集団選抜は選抜を伴う無作為交配の一形態に相当する。上述のように、集団選抜の目的は、その集団における優れた遺伝子型の割合を増加させることである。
【０１１９】
合成品種．合成品種は、考え得る全ての交雑組合せにおける組合せ能力が優れているという理由で選抜されるいくつかの遺伝子型を相互間で交配することによって作出され、自然受粉による品種の維持を行なう。一部のテンサイおよびマメ類（ソラマメ属（Ｖｉｃｉａ））がそうであるように親が（多かれ少なかれ同系交配の）種子繁殖系統であるか、それともイネ科牧草、クローバーおよびアルファルファがそうであるように親がクローンであるかは、基本的に重要でない。親は、一般組合せ能力に基づいて、時に検定交雑またはトップ交雑によって、より一般的には多交雑によって選抜される。親種子系統は（例えば自配またはきょうだい交配によって）故意に同系交配させることができる。しかし、たとえ親を故意には同系交配させないとしても、系統維持中の系統内での選抜により、多少の同系交配が起こることは保証されるだろう。クローン親は、もちろん、無変化のまま、高いヘテロ接合性を保つだろう。
【０１２０】
合成品種が親種子生産区から農業経営者に直行することができるか、それともまず１サイクルまたは２サイクルの増殖を経なければならないかは、種子生産量および種子の需要規模に依存する。実際には、イネ科植物とクローバーは一般に１回か２回増殖されるので、元の合成品種からはかなり隔たっている。
【０１２１】
時には集団選抜が使用されるが、多交雑には一般に後代検定が好ましい。それらは操作が簡単で、目的に対して明白な関連がある、すなわち合成品種における一般組合せ能力を利用するからである。
【０１２２】
合成品種に入る親系統または親クローンの数は様々である。実際問題として、親系統の数は１０〜数百の範囲にあり、１００〜２００が平均である。１００以上のクローンから形成される多系統（ｂｒｏａｄ  ｂａｓｅｄ）合成品種は、少系統（ｎａｒｒｏｗ  ｂａｓｅｄ）合成品種よりも種子増殖中に安定であると予想される。
【０１２３】
雑種．雑種は遺伝子型が異なる親同士の交配によって得られる個々の植物である。商業的雑種は現在、トウモロコシ、モロコシ、テンサイ、ヒマワリおよびブロッコリを含む多くの作物に広範に使用されている。雑種は、例えば両親を直接交配する方法（単交雑雑種）、単交雑雑種をもう一つの親と交配する方法（三元または三系交雑雑種）、または２種類の雑種を交配する方法（四元または複交雑雑種）を含む、様々な方法で形成させることができる。
【０１２４】
厳密に言えば、異系交配（すなわち自然受粉）集団中のほとんどの個体は雑種であるが、この用語は通常は、両親が互いに異なる種または亜種であると認められるほど十分に異なるゲノムを持つ個体である場合に限って用いられる。雑種は、両親のゲノムの定性的および／または定量的相違に依存して稔性である場合も、不稔性である場合もある。ヘテロシスまたは雑種強勢は、通常、雑種の生長力、生存力および稔性をその雑種の形成に用いた親系統と比較して増加させるヘテロ接合性の増加と関係する。最大のヘテロシスは通常、２つの遺伝的に異なる高度な近交系を交配することによって達成される。
【０１２５】
雑種の生産はよく発達した産業であり、親系統およびそれらの系統を交配することによって得られる雑種の隔離生産が含まれる。雑種生産方法の詳細な説明については、例えば「Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｒｏｐ  Ｐｌａｎｔｓ」第８章１６１〜１７６頁のＷｒｉｇｈｔ著「Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｅｅｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ」  などを参照されたい。
【０１２６】
V．発現アッセイ
さらに本発明は、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）ｙｓ１およびアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ｙｓｌ１〜８のＤＮＡ配列中の変異を認識する方法、ならびに他の植物の属、種、株、変種または栽培品種中に前記遺伝子またはそのホモログもしくはオルソログを検出する方法を提供する。ある方法では、本発明のｙｓ１（配列番号１）またはｙｓｌ１〜８配列（配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５または１７）の少なくとも１つの少なくとも一部に一致するかまたは相補的である配列を持つ核酸分子（プローブまたは核酸プローブともいう）を、当業者にはわかるであろう十分なハイブリッド形成条件、例えば本明細書の他の項に記載する中等度にストリンジェントまたは高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件で導入する。前記プローブは、少なくとも約１０個の連続する核酸残基にわたって、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５または１７のＤＮＡ配列と一致するだろう。好ましくは、前記の一致は、少なくとも約２５または３０個の連続する核酸残基にわたるだろう。さらに好ましくは、前記の一致は、少なくとも約４０または５０個の連続する核酸残基にわたるだろう。よりいっそう好ましくは、前記の一致は、少なくとも約６０または７５個の連続する核酸残基にわたるだろう。さらにいっそう好ましくは、前記の一致は、少なくとも約１００または１５０個の連続する核酸残基にわたるだろう。さらに好ましくは、前記の一致は、少なくとも約２００または２５０個の連続する核酸残基にわたるだろう。最も好ましくは、前記の一致は、少なくとも約３００個の連続する核酸残基にわたるか、または配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５もしくは１７のオープンリーディングフレーム全体またはその相補鎖全体にわたるだろう。ＤＮＡ配列変異を認識するもう一つの方法は、当技術分野で周知の複数の方法による直接ＤＮＡ配列解析である。もう一つの態様では、異なる植物の属、種、株、変種または栽培品種が表すＹＳ１またはＹＳＬタンパク質中のＤＮＡ配列変異を検出する。もう一つの態様では、前記核酸プローブを使用して、試料または組織切片中のｙｓ１および／またはｙｓｌ配列を、当業者に知られている任意の方法によるインサイチューハイブリダイゼーションを使って検出する。プローブに使用されるｙｓ１またはｙｓｌ配列は、ｙｓ１またはｙｓｌの存在が決定された任意の植物から得ることができる。特によい双子葉植物用プローブは、アラビドプシスのＹＳＬ１〜８の一つをコードするものであり、特によい単子葉植物用プローブは、トウモロコシのＹＳ１をコードするものであるだろう。ある態様では、上記配列はＹＳ１もしくはＹＳＬコード遺伝子またはその断片の一つのアレルに特異的に結合し、もう一つの態様では、複数のアレルに結合するだろう。そのような検出方法には、ポリメラーゼ連鎖反応、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）解析、および一本鎖コンフォメーション解析が含まれる。
【０１２７】
そのような本発明のアッセイに役立つ診断プローブとしては、ＹＳ１またはアラビドプシスＹＳＬタンパク質の一つに対する抗体が挙げられる。ＹＳ１またはＹＳＬ１〜８の少なくとも一つに対する抗体は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよく、当技術分野で周知の標準的技術を使って製造される（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅの「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８を参照されたい）。これらの抗体は、ＹＳ１もしくはＹＳＬまたはそのホモログもしくはオルソログタンパク質を、それらのタンパク質に抗体を結合させた後、その抗体−タンパク質複合体をＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットなどで検出することによって検出するために使用することができる。これらの抗体を産生させるために使用するＹＳ１またはＹＳＬ配列は、上述のＹＳ１またはＹＳＬ変異体のいずれであってもよい。抗体は、当技術分野の標準的技術を使って、ＹＳ１またはＹＳＬ１〜８の少なくとも１つのペプチド配列から製造することもできる（「Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９４）を参照されたい）。免疫学的に重要な部分を含んでいるモノクローナル抗体またはポリクローナル抗血清の断片を製造することもできる。
【０１２８】
生物学的試料中のＹＳ１またはＹＳＬポリペプチドを抗体プローブで検出または測定するためのアッセイは、どの利用可能な形式に基づいてもよい。例えば、ＹＳ１またはＹＳＬポリペプチドが分析物であるイムノアッセイでは、試験試料、典型的には生物学的試料を、抗原−抗体複合体の形成が可能な条件で、抗ＹＳ１または抗ＹＳＬ抗体と共にインキュベートする。様々な形式を使用することができる。例えば「サンドイッチ」アッセイでは、固形支持体に結合した抗体を試験試料と共にインキュベートし、洗浄し、分析物に対する二次標識抗体と共にインキュベートし、支持体を再び洗浄する。分析物は、二次抗体が支持体に結合しているかどうかを決定することによって検出される。不均一系にすることも均一系にすることもできる競合形式では、試験試料を通常は抗体および標識競合抗原と共に、逐次的に、または同時に、インキュベートする。これらの形式および他の形式は、当技術分野ではよく知られている。もう一つの選択肢とて、植物の組織切片を試験試料とし、その組織切片を、組織切片中のタンパク質を抗体で検出するための当業者に周知の方法を使って、ＹＳ１および／またはＹＳＬタンパク質の１つまたは複数に対する抗体でプローブしてもよい。前記組織切片は、ＹＳ１および／またはＹＳＬタンパク質の１つもしくは複数、またはそのホモログもしくはオルソログの、天然の発現に関して調べようとする植物から得ることができる。または、そのような組織切片は、本発明の手段によって、または他の何らかの手段によって、ＹＳ１、ＹＳＬ１〜８およびそのホモログまたはオルソログからなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質を発現させるように遺伝子改変された植物から得ることもできる。
【実施例１】
【０１２９】
ｙｓ１のトランスポゾンタギングおよびクローニング
１番染色体上のＰ１遺伝子座（Ｐ−ＶＶアレル）にある内因性トウモロコシトランスポゾンＡｃを、記載されているようにランダム突然変異誘発に使用した（Ｄｅｌｌａｐｏｒｔａ，ＳＬら，「Ｔｈｅ  Ｍａｉｚｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」（ＦｒｅｅｌｉｎｇおよびＷａｌｂｏｔ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，ニューヨーク，１９９３）の２１９〜２３３頁）。転位事象についてスクリーニングした後、実生を突然変異体表現型についてスクリーニングしたところ、約２５％の頻度で黄縞斑突然変異を分離するファミリーが、目視観察によって同定された。ＷＴおよび突然変異型個体に関して表現型的に分離するファミリーの個体に対して、Ａｃをプローブとして使って、ゲノムブロッティングを行なった。親株から得たＤＮＡ、Ｐ−ＶＶ（Ａｃ供与遺伝子座）およびｒ−ｍ３もブロッティングテストに含めた。全ての試料を制限酵素ＳａｌIで消化した。プローブはＡｃの内部ＨｉｎｄIII断片とした。このブロットにより、９．５ｋｂのＡｃ含有ＳａｌI制限ｍ酵素断片と、黄縞斑突然変異表現型との同時分離が確認された。
【０１３０】
突然変異体植物のＤＮＡからゲノムライブラリーを作製し、図１Ａに示す９．５ｋｂのＳａｌIインサートを含むクローンλＹＳ３１が同定された。
【０１３１】
Ａｃ因子に隣接する配列を含むＡｃフランキングプローブ（ＹＳ１−Ｆ；図１Ａおよび１Ｂ参照）をλＹＳ３１から作製し、黄縞斑突然変異に関して分離するファミリーのゲノムブロットに対して、プローブとして使用した。ゲノムブロットは、ＷＴおよび突然変異型個体に関して表現型的に分離するファミリーの個体のＤＮＡ、ならびに親株、Ｐ−ＶＶ（Ａｃ供与遺伝子座）およびｒ−ｍ３に対して行なった。全ての試料を制限酵素ＳａｌIで消化した。各突然変異型個体は、９．５ｋｂのＳａｌI断片を示し、ヘテロ接合性野生型植物も同じであった。ある突然変異型植物は、上記９．５ｋｂ断片からのＡｃの転位後に予想されるサイズである５．２ｋｂのＳａｌI断片を示した。注目すべきことに、ヘテロ接合性ＷＴ植物もホモ接合性ＷＴ植物も、予想される５．２ｋｂのＳａｌI断片を示さなかった。５．２ｋｂ断片を欠くのは、おそらく、ＷＴ  Ｙｓ１アレル中のＳａｌI部位でシトシンメチル化が起こっているためだろう。Ａｃ挿入が起こると、その遺伝子座は脱メチル型になり、その遺伝子座からのＡｃ切り出し後しばらくは脱メチル化状態が持続するようである。
【０１３２】
同時分離解析結果を裏付けるために、黄縞斑突然変異を分離するもう一つのファミリーからＤＮＡを調製して、新しい一組の個体で同時分離を試験することができるようにした。そのＤＮＡをメチル化の影響を受けない酵素ＥｃｏＲＶで消化した。ブロットをまずＹＳ１−Ｆでプローブし、次にストリッピングし、Ａｃプローブで再プローブした。これらのブロットでは、予想通り、（Ａｃを欠く）短い断片が野生型表現型と同時分離した。
【実施例２】
【０１３３】
ｙｓ１の連鎖解析
ヘテロ接合性Ｙｓ１  ｐｒ１／ｙｓ１−ｍ１：：Ａｃ  Ｐｒ１植物を自家受粉させた。赤（ｐｒ１／ｐｒ１）および紫（Ｐｒ１／−）の子孫を選抜し、それらの黄縞斑表現型を観察した。赤色子孫は黄縞斑に関して主として野生型であったことから、予想通りｙｓ１−ｍ１：：Ａｃとｐｒ１の間には明らかな連鎖があることがわかった。紫色子孫の間では、ほぼ３分の１の個体が黄縞斑を持ったことから、ここでもｙｓ１  ｍ１：：Ａｃとｐｒ１の間の明らかな連鎖が示された。
【０１３４】
新しい黄縞斑突然変異体で連鎖および相補性アッセイを行なった。突然変異体植物を、ｙｓ１（ｙｓ１−ｒｅｆ）およびｙｓ３（ｙｓ３−ｒｅｆ）の基準突然変異体アレルに関してホモ接合性である植物に交配して相補性を調べた。新しい黄縞斑突然変異体はｙｓ１を補完できなかったが、ｙｓ３を補完したことから、新しい突然変異体はｙｓ１−ｍ１：：Ａｃと呼ばれるｙｓ１アレルである。ｙｓ１遺伝子座はトウモロコシの５番染色体上にマッピングされ、ｐｒ１遺伝子座より８地図単位末端側にある。ｙｓ１−ｍ１：：Ａｃとｐｒ１の連鎖を調べたところ、新しい突然変異体はｐｒ１に連鎖していることが確認された。
【実施例３】
【０１３５】
ｙｓ１  ｃＤＮＡのクローニングおよび特徴づけ
ＹＳ１−Ｆプローブを使って、鉄欠乏トウモロコシ植物由来の根ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした（Ｌｏｕｌｅｒｇｕｅ，Ｃら，Ｇｅｎｅ．１９９８  ２２５：４７−５７）。３つの完全長またはほぼ完全長ｙｓ１  ｃＤＮＡが回収された。これら３つのｃＤＮＡの正確なサイズは選択的ポリアデニル化部位および５’非翻訳領域（ＵＴＲ）のサイズのせいで異なるが、これらは全て同一のタンパク質をコードしていた。
【０１３６】
これらのｃＤＮＡの配列から、ＹＳ１タンパク質は６８２アミノ酸長で、１２個の推定膜貫通ドメインを含むので、ＹＳ１がＦｅ・ファイトシデロフォア錯体のトランスポーターであるとすれば予想されるように、ＹＳ１はおそらく膜に局在することがわかる。
【０１３７】
ＹＳ１の予想アミノ酸配列は次のとおりである（ＳＯＳＵＩプログラムを使って予測された１２個の推定膜貫通ドメインを下線で示す）：
ＭＤＬＡＲＲＧＧＡＡＧＡＤＤＥＧＥＩＥＲＨＥＰＡＰＥＤＭＥＳＤＰＡＡＡＲＥＫＥＬＥＬＥＲＶＱＳＷＲＥＱＶＴＬＲＧ
ＶＶＡＡＬＬＩＧＦＭＹＳＶＩＶＭＫＩＡＬＴＴＧＬＶＰＴＬＮＶＳＡＡＬＭＡＦＬＡＬＲＧＷＴＲＶＬＥＲＬＧＶＡＨＲＰＦ
ＴＲＱＥＮＣＶＩＥＴＣＡＶＡＣＹＴＩＡＦＧＧＧＦＧＳＴＬＬＧＬＤＫＫＴＹＥＬＡＧＡＳＰＡＮＶＰＧＳＹＫＤＰＧＦＧＷ
ＭＡＧＦＶＡＡＩＳＦＡＧＬＬＳＬＩＰＬＲＫＶＬＶＩＤＹＫＬＴＹＰＳＧＴＡＴＡＶＬＩＮＧＦＨＴＫＱＧＤＫＮＡＲＭＱＶＲ
ＧＦＬＫＹＦＧＬＳＦＶＷＳＦＦＱＷＦＹＴＧＧＥＶＣＧＦＶＱＦＰＴＦＧＬＫＡＷＫＱＴＦＦＦＤＦＳＬＴＹＶＧＡＧＭＩＣ
ＳＨＬＶＮＩＳＴＬＬＧＡＩＬＳＷＧＩＬＷＰＬＩＳＫＱＫＧＥＷＹＰＡＮＩＰＥＳＳＭＫＳＬＹＧＹＫＡＦＬＣＩＡＬＩＭＧＤＧ
ＴＹＨＦＦＫＶＦＧＶＴＶＫＳＬＨＱＲＬＳＲＫＲＡＴＮＲＶＡＮＧＧＤＥＭＡＡＬＤＤＬＱＲＤＥＩＦＳＤＧＳＦＰＡＷＡ
ＡＹＡＧＹＡＡＬＴＶＶＳＡＶＩＩＰＨＭＦＲＱＶＫＷＹＹＶＩＶＡＹＶＬＡＰＬＬＧＦＡＮＳＹＧＴＧＬＴＤＩＮＭＡＹＮＹ
ＧＫＩＡＬＦＩＦＡＡＷＡＧＲＤＮＧＶＩＡＧＬＡＧＧＴＬＶＫＱＬＶＭＡＳＡＤＬＭＨＤＦＫＴＧＨＬＴＭＴＳＰＲＳＬＬＶ
ＡＱＦＩＧＴＡＭＧＣＶＶＡＰＬＴＦＬＬＦＹＮＡＦＤＩＧＮＰＴＧＹＷＫＡＰＹＧＬＩＹＲＮＭＡＩＬＧＶＥＧＦＳＶＬＰＲＨ
ＣＬＡＬＳＡＧＦＦＡＦＡＦＶＦＳＶＡＲＤＶＬＰＲＫＹＡＲＦＶＰＬＰＭＡＭＡＶＰＦＬＶＧＧＳＦＡＩＤＭＣＶＧＳＬＡＶ
ＦＶＷＥＫＶＮＲＫＥＡＶＦＭＶＰＡＶＡＳＧＬＩＣＧＤＧＩＷＴＦＰＳＳＩＬＡＬＡＫＩＫＰＰＩＣＭＫＦＴＰＧＳ（配列番号２）。
【０１３８】
注目すべきことに、ＹＳ１の５０個のアミノ末端アミノ酸は、このタンパク質のグルタミン酸残基の４８％（２３個中１１個）を含んでいる。これらのうちの一部は、Ｆｅ［III］輸送に関与するＲＥＧＬＥ（配列番号２０）配列を連想させるＲＥＫＥＬＥＬＥＬＥＲ（配列番号１９）という配列の中にある（Ｓｔｅａｒｍａｎ，Ｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９６  ２７１：１５５２−１５５７）。
【０１３９】
ｙｓ１  ｃＤＮＡから得られるアミノ酸配列は、様々な配列データベース中の機能がわかっているどのタンパク質にも強い配列類似性を示さないが、単子葉植物と双子葉植物の両方、裸子植物およびコケを含む多様な植物種中の発現配列タグ（ＥＳＴ）クローンには類似性を示す。ＹＳ１は、化学浸透圧イオン勾配に反応して通例小さい溶質を輸送する単ポリペプチド二次運搬体を含むメジャー・ファシリテーター・スーパーファミリー（ｍａｊｏｒ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）（ＭＦＳ；Ｐａｏ，ＳＳら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１９９８  ６２：１−３４）に属する仮想酵母タンパク質ＹＧＬ１１４（３６％ポジティブ；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ５３１３４）、およびミクソコッカス・キサンタス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ  ｘａｎｔｈｕｓ）のＥｓｐＢ遺伝子（３９％ポジティブ；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＤ４７８１３．１）にも類似性を示す。ＹＳ１は、３つの類縁トウモロコシＥＳＴがＧｅｎＢａｎｋに存在するので、トウモロコシの遺伝子ファミリーにも属する。
【０１４０】
ＹＳ１のアミノ酸配列は、本発明者らがイエローストライプ１様（ＹＥＬＬＯＷ  ＳＴＲＩＰＥ１−ＬＩＫＥ）（ＹＳＬ）１〜８と名付けた８つの予想アラビドプシスタンパク質（それぞれ配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６および１８）にも強い完全長類似性を示した。注目すべきことに、ＹＳ１のアミノ末端の多数のグルタミン酸残基は、８つのアラビドプシスＹＳ１様ホモログにも保存されている。ＹＳ１はＹＳＬ１（配列番号４）に対して６６５アミノ酸残基にわたって７３％同一、ＹＳＬ２（配列番号６）に対して６５８アミノ酸残基にわたって７７％同一、ＹＳＬ３（配列番号８）に対して６６８アミノ酸残基にわたって７６％同一、ＹＳＬ４（配列番号１０）に対して６４４アミノ酸残基にわたって６９％同一、ＹＳＬ５（配列番号１２）に対して６８０アミノ酸残基にわたって６７％同一、ＹＳＬ６（配列番号１４）に対して６０４アミノ酸残基にわたって７０％同一、ＹＳＬ７（配列番号１６）に対して６７４アミノ酸残基にわたって６９％同一、およびＹＳＬ８（配列番号１８）に対して４５４アミノ酸残基にわたって６７％同一である。アラビドプシスｙｓｌ  ｃＤＮＡクローンおよびそれらのタンパク質産物を表１に記載する。
【０１４１】
【表１】
2005501502.tif 000003
ｙｓｌ１のｃＤＮＡクローンは、停止コドンを除いて残基１０から残基２０２６（２０２９に停止コドン）まで伸びるオープンリーディングフレームを持つ２１９６核酸残基長（配列番号３）であり、６７３アミノ酸残基長（配列番号４）のタンパク質をコードしている。ｙｓｌ２のｃＤＮＡクローンは、残基１５６から残基２１４５（２１４８）まで伸びるオープンリーディングフレームを持つ２３１６核酸残基長（配列番号５）であり、６６４アミノ酸残基長（配列番号６）のタンパク質をコードしている。ｙｓｌ３のｃＤＮＡクローンにはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号（配列番号７）が割り当てられ、６７５アミノ酸残基長（配列番号８）のタンパク質をコードすると予想される。ｙｓｌ４のｃＤＮＡクローンにはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号（配列番号９）が割り当てられ、６７０アミノ酸残基長（配列番号１０）のタンパク質をコードすると予想される。ｙｓｌ５のｃＤＮＡクローンは、残基８０から残基２２２１（２２２４）まで伸びるオープンリーディングフレームを持つ２３３７核酸残基長（配列番号１１）であり、７１４アミノ酸残基長（配列番号１２）のタンパク質をコードしている。ｙｓｌ６のｃＤＮＡクローンは、残基４２から残基２０７２（２０７５）まで伸びるオープンリーディングフレームを持つ２３２７核酸残基長（配列番号１３）であり、６７７アミノ酸残基長（配列番号１４）のタンパク質をコードしている。ｙｓｌ７のｃＤＮＡクローンは、残基１１２から残基２１７５（２１７８）まで伸びるオープンリーディングフレームを持つ２３４４核酸残基長（配列番号１５）であり、６８８アミノ酸残基長（配列番号１６）のタンパク質をコードしている。ｙｓｌ８のｃＤＮＡクローンは、残基４９から残基２２２０（２２２３）まで伸びるオープンリーディングフレームを持つ２３１１核酸残基長（配列番号１７）であり、７２４アミノ酸残基長（配列番号１８）のタンパク質をコードしている。
【実施例４】
【０１４２】
元のＹｓ１突然変異体中の突然変異の分子的特徴づけ
ｙｓ１−ｍ１：：ＡｃゲノムクローンλＹＳ３１の配列をＡｃ挿入部に隣接する領域で決定した。Ａｃは予想通り挿入時に８ｂｐの標的部位重複をもたらした。Ａｃはコード領域内で、翻訳開始部位から６４９番目のアミノ酸に挿入される。
【０１４３】
ｃＤＮＡ配列に基づいて選択したプライマーを使って、Ｙｓ１野生型およびｙｓ１−ｒｅｆアレルを、ゲノムＤＮＡから増幅した。ゲノムブロット解析を、対応するゲノム領域のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と組み合わせると、ｙｓ１−ｒｅｆアレルは翻訳開始部位から４７２番目のアミノ酸に大きい挿入を持つことがわかる（上記の配列を参照されたい）。挿入された配列の両端を解析すると、これが長末端反復レトロトランスポゾンであることがわかる（非掲載データ）。
【０１４４】
さらに２つのｙｓ１突然変異体アレルｙｓ１：７４−１９２４−１およびｙｓ１：５３４４を増幅し、配列決定した。ｙｓ１：７４−１９２４−１突然変異は、フレームシフトを起こしてタンパク質配列のカルボキシ末端側の３分の１を改変してしまう一ヌクレオチド挿入に相当する。ｙｓ１：５３４４アレルは、１６塩基対（ｂｐ）の欠失に２ｂｐの挿入が伴っている少しだけ複雑な突然変異を持っていて、この突然変異により、タンパク質の最後の膜貫通ドメインでフレームシフトが始まる。ｙｓ１−ｒｅｆアレルは野生型Ｙｓ１と比較すると２ｋｂの挿入部分を持っている。この産物の配列解析によると、この挿入部分はＬＴＲレトロトランスポゾンであるらしいことがわかる。というのも、これは逆転写物コード領域と推定される領域を含むと共に、このタイプの因子に特有な長末端反復配列および標的部位重複を含むからである（非掲載データ）。ｙｓ１−ｒｅｆアレル内のこの挿入位置は、翻訳開始部位から４７４番目のアミノ酸にあたるコード領域内でもある。これら追加のｙｓ１突然変異体アレルおよびｙｓ１：ｒｅｆアレルにおける配列破壊は、本発明者らがｙｓ１遺伝子をクローニングしたことの最終的な裏付けになる。
【実施例５】
【０１４５】
酵母機能的相補性：ｙｓ１  ｃＤＮＡの発現は酵母ｆｅｔ３ｆｅｔ４株における鉄輸送欠損を補完する
サッカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）二重突然変異体ｆｅｔ３ｆｅｔ４（ＤＥＹ１４５３株）は、低親和性および高親和性鉄（II）取込み系の両方に欠損を持ち、鉄制限培地では生育することができず（Ｂｉｄｅ，Ｄら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９６  ９３：５６２４−５６２８）、トウモロコシファイトシデロフォアデオキシムギネ酸と錯化した鉄（Ｆｅ−ＤＭＡ）を利用して生育することができない（Ｌｏｕｌｅｒｇｕｅ，Ｃ．  Ｇｅｎｅ  １９９８  ２２５：４７−５７）。鉄輸送におけるＹＳ１の機能を調べるために、本発明者らは、ｙｓ１  ｃＤＮＡの発現が、唯一の鉄源としてＦｅ−ＤＭＡを含む培地でのｆｅｔ３ｆｅｔ４突然変異体の成長を復活させることができるかどうか調べた。
【０１４６】
ＤＥＹ１４５３（ｆｅｔ３ｆｅｔ４）株に３つのプラスミド、すなわち（１）発現ベクターｐＹＰＧＥ１５にクローニングしたｙｓ１  ｃＤＮＡ、（２）ｐＦＬ６１ベクターにクローニングしたアラビドプシスＩＲＴ１  ｃＤＮＡ（Ｍｉｎｅｔ，Ｍら，１９９２，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２：４１７−４２２）、および対照として（３）空のｐＹＰＧＥ１５ベクターを個別に導入した。ＩＲＴ１  ｃＤＮＡは、クエン酸鉄でのＤＥＹ１４５３株の成長を支持することができるシロイヌナズナ鉄トランスポータータンパク質をコードしている。ｙｓ１およびＩＲＴ１  ｃＤＮＡはどちらも強力なＰＧＫプロモーターの制御下に置いた（Ｌｏｕｌｅｒｇｕｅ，Ｃら，１９９８，Ｇｅｎｅ  ２２５：４７−５７）。次に、本発明者らは、ＹＳ１に基質特異性があるとすれば、その基質特異性を決定するために、２つの異なる鉄源、すなわちＦｅ−クエン酸またはＦｅ−ＤＭＡを培地中にどちらも低濃度で使用して、示差的成長試験を行なった。酵母は、５μＭ  Ｆｅ−クエン酸、５μＭ  Ｆｅ−ＤＭＡ、または５μＭ  Ｆｅ−ＤＭＡおよび５μＭ  ＢＰＤＳを添加した最少培地／Ｕｒａで成長させた。Ｆｅ−ＤＭＡ錯体は、ｖｏｎ  Ｗｉｒｅｎ，Ｎら，１９９８  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １３７２：１４３−１５５に従って調製した。培養は３０℃で４日間行なった。３つの酵母培養物希釈液（６００ｎｍでの光学密度が０．２、０．０２および０．００２であるもの）をプレート上にスポットした。
【０１４７】
Ｆｅ−クエン酸を唯一の鉄源として供給した場合、ＩＲＴ１の発現は、予想通り、ｆｅｔ３ｆｅｔ４の成長を復活させたが、ＹＳ１の発現はｆｅｔ３ｆｅｔ４の成長を復活させなかった。５μＭ  Ｆｅ−ＤＭＡが存在する場合、ＹＳ１発現とＩＲＴ１発現はどちらもｆｅｔ３ｆｅｔ４突然変異体を成長させた。これは培地中に存在する少量の残留非キレートＦｅ（II）のせいかもしれない。鉄をＦｅ−ＤＭＡキレートとして供給した場合、ｙｓ１はｆｅｔ３ｆｅｔ４成長欠損を補完するが、鉄をＦｅ−クエン酸として供給した場合は、そのような補完が起こらないことから、ｙｓ１はＦｅ−ＤＭＡに特異的な鉄トランスポーターをコードすることが示唆される。この点を明らかにするために、Ｆｅ−ＤＭＡ培地から残留Ｆｅ（II）が全て除去されるように、強力なＦｅ（II）キレート剤である５μＭ  ＢＰＤＳを、Ｆｅ−ＤＭＡ培地に添加した。ＢＰＤＳを添加すると、ＩＲＴ１による相補性は無くなったが、ＹＳ１による相補性には影響しなかった。ＢＰＤＳの存在下にＦｅ−ＤＭＡでの成長を可能にするというＹＳ１の能力は、ＹＳ１がファイトシデオフォア結合型Ｆｅ（III）のトランスポーターであることを強く示唆している。
【実施例６】
【０１４８】
若いトウモロコシ小植物体における鉄利用能によるｙｓ１  ｍＲＮＡレベルの調節
トウモロコシにおけるｙｓ１遺伝子発現に対するＦｅ飢餓の効果を、ノーザンブロットハイブリダイゼーションを使って解析した。植物を、鉄の存在下（＋）または不在下（−）で、発芽後１、５、７または１０日間、水耕栽培した（Ｔｈｏｉｒｏｎ，Ｓ．ら，１９９７  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｖ．２０：１０５１−１０６０）。１、５および７日齢の小植物体の根ならびに１０日齢の小植物体の根および苗条から調製した１０μｇの全ＲＮＡを含むノーザンブロットに、ＰＣＲによって得た３’ＵＴＲ  ｙｓ１プローブをハイブリダイズさせた。ＲＮＡ抽出とＲＮＡブロット解析は、Ｌｏｕｌｅｒｇｕｅ，Ｃ．ら，１９９８  Ｇｅｎｅ  ２２５：４７−５７に記載されているように行なった。ブロットをストリッピングし、コメシトクロムｂ5レダクターゼをコードするＮＡＤＰＨ−第二鉄（ＮＲＦ）ｃＤＮＡにハイブリダイズさせた（Ｂａｇｎａｒｅｓｉ，Ｐら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９９９  ３３８：４９９−５０５）。臭化エチジウム染色ｒＲＮＡも得た。ハイブリダイゼーションシグナルは、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ｓｔｏｒｍ４８０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を使って、３日間の露出後に明らかにした。
【０１４９】
ｙｓ１の発現は、若いトウモロコシ小植物体の根に、発芽の１日後には早くも検出された。ｙｓ１  ｍＲＮＡの存在量は、植物を鉄の不在下で生長させると、数倍に増加した。発芽の５、７、１０日後に同じ誘導が観察されたことから、ｙｓ１  ｍＲＮＡの定常状態レベルはトウモロコシ根での鉄飢餓によって増加することが明らかになった。この結果は、鉄十分な条件で栽培したトウモロコシ植物体が低い基礎鉄取込みレベルを示し、鉄欠乏状態では鉄取込み速度の２．８倍の増加を示すという生理学的研究とよく一致する（ｖｏｎ  Ｗｉｒｅｎ，Ｎ．ら，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  １９９５  ９５：６１１−６１６）。
【０１５０】
葉におけるｙｓ１の発現を、鉄の存在下（＋）または不在下（−）で栽培した１０日齢の植物体で調べた。１０日齢の鉄飢餓植物体の根は、鉄十分な植物体の根よりも高レベルのｙｓ１を発現させた。ｙｓ１  ｍＲＮＡは鉄十分な植物体の葉には検出されなかったが、鉄欠乏植物体の葉には高レベルの集積が検出された。ＤＭＡは植物の内部で細胞から細胞に鉄を輸送する鉄運搬体として働くことが考えられる。実際、ＤＭＡはコメ植物体の葉に検出されている（Ｍｏｒｉ，Ｓら，１９９１  Ｐｌａｎｔ  Ｓｏｉｌ  １３０：１４３−１５６）。あるいは、構造上ＤＭＡに関係するＦｅ（II）およびＦｅ（III）キレート剤ニコチアナミン（ｖｏｎ  Ｗｉｒｅｎ，Ｎら，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９９  １１９：１１０７−１１１４）が、根以外の組織ではＹＳ１による輸送の基質であるのかもしれない。ニコチアナミンはイネ科植物だけでなく全ての植物種に見いだされ、師管液での長距離Ｆｅ（II）輸送に関与すると主張されている（ｖｏｎ  Ｗｉｒｅｎ，Ｎら，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９９  １１９：１１０７−１１１４；Ｓｔｅｐｈａｎ，ＵＷら，Ｐｌａｎｔ  Ｓｏｉｌ．１９９４  １６５：１８１−１８８；Ｓｔｅｐｈａｎ，ＵＷら，Ｂｉｏｍｅｔａｌｓ  １９９６  ９：８４−９０）。この点で、ニコチアナミンを産生するがムギネ酸は産生しない種であるアラビドプシスのＹＳＬ遺伝子が、ＹＳ１と同様の輸送役割を持っているかもしれないことを指摘しておく。
【実施例７】
【０１５１】
トウモロコシにおけるＹＳ１によるＣｕの取込み
ＹＳ１のＣｕ輸送能力も調べた。トウモロコシ小植物体をＣｕ欠乏土壌で１０日間栽培した。次に、土壌にＣｕ−ニコチアナミンまたはＣｕ−ファイトシデロフォアの形で銅を施用した。それら小植物体の根および葉からＲＮＡを抽出し、実施例６に記載したように、ＲＮＡブロット解析にかけた。
【０１５２】
ｙｓ１  ｍＲＮＡ発現はＣｕ不足に応答して根でも葉でも増加することがわかった。さらに、サザンブロット解析により、根ではＹＳ１タンパク質発現の増加も起こることが確認された。
【実施例８】
【０１５３】
ＹＳ１は欠陥酵母におけるＣｕ取込みを補完する
植物での知見を補完するために、本発明者らは、Ｃｕの取込みに欠陥を持つ酵母株を補完するＹＳ１の能力を解析した。
【０１５４】
実施例５での知見と合致して、ｙｓ１で形質転換されＣｕ添加培地で培養されたＣｕ取込み欠損酵母突然変異体は、増殖することができた。したがって、鉄の他にもいくつかのタイプの重金属を輸送するというＹＳ１の能力が確認された。
【０１５５】
これらの結果は、バイオレメディエーションとの関連で、ＹＳ１トランスジェニック植物が土壌の鉄含量を低下させるためだけでなく、土壌中の銅レベルを低下させるためにも役立つことを証明している。したがって、ＹＳ１トランスジェニック植物を使用することにより、鉄ならびに銅で汚染された土壌の再生が可能になる。
【実施例９】
【０１５６】
アラビドプシスＹＳＬ２タンパク質による鉄取込み
上記実施例４と同様に、サッカロミセス・セレビシェ二重突然変異体ｆｅｔ３ｆｅｔ４（ＤＥＹ１４５３株）を使って、鉄輸送におけるＹＳＬ２（配列番号５）の機能を調べた。本発明者らは、ｙｓｌ２  ｃＤＮＡの発現が、唯一の鉄源としてＦｅ−ニコチンアミドまたはＦｅ−クエン酸を含む培地でのｆｅｔ３ｆｅｔ４突然変異体の成長を復活させることができるかどうかを調べた。ＹＳＬ２は、Ｆｅ−ニコチンアミド培地でのｆｅｔ３ｆｅｔ４の成長を促進することができたが、Ｆｅ−クエン酸培地での成長を促進することはできなかった。これは、ＹＳＬ２が真のＦｅ−ニコチンアミドトランスポーターであることを裏付けている。
【実施例１０】
【０１５７】
栄養としての鉄の取込み量を増加させるためのトランスジェニック植物
鉄含量に乏しい土壌から鉄を取り込む能力が強化されるように、または高い土壌ｐＨ（アルカリ度）、土壌中の高い石灰含量、石灰質土壌、土壌中の過剰なリン酸塩、高レベルの炭酸水素イオンを含む潅漑用水、過剰な水分と低い土壌温度、または土壌から鉄を取り込む植物の能力を妨害しうる他の任意の条件によって鉄の取込みが阻害される状況で、鉄を取り込む能力が強化されるように、トランスジェニック植物を操作する。鉄を取込む能力が強化されるように植物を操作することにより、食用植物中の栄養素の生物学的利用能が増加し、植物の生長がよくなり、および／または収穫量が増加する。
【０１５８】
ｙｓ１および／またはｙｓｌ１〜８の少なくとも１つと、土壌から鉄を取り込むという植物の能力が妨害されうる条件下で前記遺伝子の発現をアップレギュレートするプロモーターとを含み、任意の食用作物のゲノムへのそれらの組込みを可能にする隣接配列を持つベクターを構築する。形質転換実生およびＷＴ実生を、鉄の生物学的利用能が低い様々な条件の典型例となる土壌培地で栽培する。組織に集積される鉄が乾燥バイオマスに占めるパーセンテージが野生型対照の場合よりも高い栽培品種を選抜する。
【０１５９】
例えば、形質転換されたダイズまたはキャッサバの実生を、鉄の生物学的利用能が低い条件（例えば低い土壌鉄濃度または高い石灰濃度）をまねるように処方された砂／パーライト混合物で、親野生型植物体と並べて栽培することができる。全ての植物体に灌水し、鉄を除いたホーグランド栄養液を定期的に与える。植物体を完熟状態まで生長させた後、乾燥する。総植物体鉄濃度およびその植物体の可食部の鉄濃度をアッセイする。親ＷＴ植物体より高レベルの鉄集積を示す形質転換植物体を選抜して、さらなる増殖と、そしておそらくは植物育種、植物選抜および植物生産の当業者には周知の方法による育種計画を実施する。
【実施例１１】
【０１６０】
土壌からの金属の抽出
超集積体である植物種、すなわち同じ条件で栽培されたＷＴ植物体より高レベルの金属を根および他の組織に集積する能力を持ち、その金属がその植物体にとって有毒となることもない植物種は、数多く同定されている。しかし、これらの植物の多くは、土壌にキレート剤を加えなければ、土壌から重金属を抽出することができない。したがって、トウモロコシＹＳ１および／またはアラビドプシスＹＳＬ１〜８遺伝子産物の少なくとも１つを発現させ、土壌に化学的キレート剤を常時施用しなくても、金属汚染土壌で栽培および収穫することができる超集積植物を得ることが望ましい。
【０１６１】
ｙｓ１および／またはｙｓｌ１〜８の少なくとも１つと、土壌中の金属濃度が高い条件下でその遺伝子の発現を可能にするプロモーターとを含み、任意の超集積植物のゲノムへのそれらの組込みを可能にする隣接配列を持つベクターを構築する。例えばカラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）およびアマランサス・パニキュラータ（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ）の形質転換実生およびＷＴ実生を、目的とする重金属汚染条件の典型例となる土壌培地で栽培する。組織に集積される所定の重金属が乾燥バイオマスに占めるパーセンテージが野生型対照の場合よりも高い栽培品種を選抜する。
【０１６２】
ＷＴの実生および形質転換されたカラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）およびアマランサス・パニキュラータ（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ）の実生を、砂／パーライト混合物に植え、２１日間生長させることができる。次に、様々な濃度の様々な金属を含む溶液（キレート剤（例えばＨＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ）入り／キレート剤なし）を土壌に加える。土壌１グラムにつき２〜５００マイクログラムの金属を適用することができる。次に、植物に灌水し、ホーグランド栄養液を定期的に与える。金属を加えた１４日後に、根および土壌中の金属濃度を測定することができる。金属集積能力は、根組織中の金属濃度（乾燥重量ベース）を土壌中の金属濃度（乾燥重量ベース）で割ることによって計算する。
【０１６３】
親ＷＴ植物体より高レベルの鉄集積を示す形質転換植物体を選抜して、さらなる増殖と、そしておそらくは当業者に周知の方法による育種計画および生産を実施する。
【０１６４】
本明細書および本願特許請求の範囲で使用する単数形「ａ」「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上別段の定義がない限り複数の指示対象を包含することに注意しなければならない。したがって、例えば「金属」（ａ  ｍｅｔａｌ）という記載は、そのような金属および重金属の混合物ならびに多数のそのような金属および重金属を包含し、「トランスジェニック植物」（ａ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｐｌａｎｔ）という記載は、多数のトランスジェニック植物およびその混合物を包含し、「方法」（ｔｈｅ  ｍｅｔｈｏｄ）という記載は、本明細書に記載するタイプの１つまたは複数の方法もしくはステップを包含する。
【０１６５】
本明細書に記載した刊行物は単に、その開示が本願出願日前に行なわれたという理由で記載されているにすぎない。本明細書のいかなる記載も、先行発明という理由で、本発明が、そのような公表に先だってなされたとする資格がないとの自白であると解釈してはならない。
【０１６６】
別段の定義がない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解している意味と同じ意味を持つ。本明細書に記載するものと類似するまたは等価な方法および材料はいずれも本発明の実施または試験に使用することができるが、本明細書には好ましい方法および材料を記載する。本明細書で引用した刊行物は全て、その刊行物を引用する理由となった本発明の特定の側面を開示し説明する目的で、ここに援用する。
【図面の簡単な説明】
【０１６７】
【図１Ａ】λＹＳ３１ゲノムクローンに含まれる９．５ｋｂ  ＳａｌI断片の地図である。Ａｃ因子およびプローブ断片ＹＳ１−Ｆの位置を示してある。
【図１Ｂ】ｙｓ１遺伝子の地図である。エクソンを黒い枠で示す。ｙｓ１−ｍ１：：Ａｃアレル中のＡｃ因子およびｙｓ１：ｒｅｆアレル中のレトロトランスポゾン因子の位置を上下に示す。プローブ断片ＹＳ１−Ｆも示す。
【図１Ｂ】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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