(57)【要約】  本願発明は、PGC-1β核酸分子に指定された、新規PGC-1関連補助活性分子をコードする、単離された核酸分子を提供する。本願発明はまた、アンチセンス核酸分子、PGC-1β核酸分子を含有する組換え発現ベクター、前記発現ベクターを導入した宿主細胞、およびPGC-1β遺伝子を導入したまたは破壊した非ヒトトランスジェニック動物も提供する。本願発明はさらに、分離されたPGC-1βタンパク質、融合タンパク質、抗原性ペプチド、および抗PGC-1β抗体を提供する。本願発明の組成物を用いた診断および治療方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された核酸分子であって、
（a）  配列番号1もしくは4に記載のヌクレオチド配列またはその相補体を含む核酸分子と、
（b）  配列番号3もしくは6に記載のヌクレオチド配列またはその相補体を含む核酸分子と、
からなるグループから選択される、核酸分子。
【請求項２】
配列番号2または5に記載のアミノ酸配列またはその相補体を含むポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
【請求項３】
配列番号2または5に記載のアミノ酸配列またはその相補体を含むポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子変異体をコードする、単離された核酸分子。
【請求項４】
単離された核酸分子であって、
（a）  配列番号1、3、4、もしくは6のヌクレオチド配列またはその相補体と、少なくとも60%同一のヌクレオチド配列を含む核酸分子と、
（b）  配列番号1、3、4、もしくは6のヌクレオチド配列またはその相補体の少なくとも50個のヌクレオチドの断片を含む核酸分子と、
（c）  配列番号2もしくは5のアミノ酸配列またはその相補体と、少なくとも約60%同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子と、
（d）  配列番号2もしくは5のアミノ酸配列を含むポリペプチドの断片をコードする核酸分子であって、前記断片が配列番号２若しくは５のアミノ酸配列又はその相補体の連続した少なくとも10個のアミノ酸残基を含む核酸分子と、
からなるグループから選択される、単離された核酸分子。
【請求項５】
ストリンジェントな条件下において、請求項１、２、３、または４のいずれか1つに記載の核酸分子の相補体にハイブリダイズする、単離された核酸分子。
【請求項６】
請求項１、２、３、または４のいずれか1つに記載の核酸分子、および非相同ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項７】
請求項１、２、３、または５のいずれか1つに記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のベクターであって、発現ベクターであるベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の発現ベクターをトランスフェクトした宿主細胞。
【請求項１０】
請求項９に記載の宿主細胞を適切な培養培地で培養し、前記ポリペプチドを産生するステップを含む、ポリペプチドの産生の方法。
【請求項１１】
単離されたポリペプチドであって、
a）  配列番号2または5のアミノ酸配列を含むポリペプチドの断片であって、当該断片が配列番号2または5の少なくとも10個の連続するアミノ酸を含む、ポリペプチドの断片と、
b）  配列番号2または5のアミノ酸配列を含むポリペプチドの、天然に存在する対立遺伝子変異体であって、当該対立遺伝子変異体において、前記ポリペプチドが、ストリンジェントな条件下において配列番号1、3、4、または6からなる核酸分子の相補体とハイブリダイズする核酸分子によってコードされる、対立遺伝子変異体と、
c）  配列番号 1、3、4、または6のヌクレオチド配列を含む核酸に少なくとも60%同一である、ヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされるポリペプチドと、
d）  配列番号2または5のアミノ酸配列に少なくとも60%同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、
からなるグループから選択される、単離されたポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号2または5のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１１に記載のポリペプチドであって、非相同アミノ酸配列をさらに含む、ポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１１に記載のポリペプチドに選択的に結合する抗体。
【請求項１５】
サンプル中で請求項１１に記載のポリペプチドの存在を検出する方法であって、
a） 前記サンプルを前記ポリペプチドに選択的に結合する化合物に接触させるステップと、
b）  前記化合物が前記サンプル中のポリペプチドと結合するかどうかを測定し、前記サンプル中における、請求項１２に記載のポリペプチドの存在を検出するステップと、
を含む、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、当該方法において、前記ポリペプチドに結合する前記化合物が抗体である、方法。
【請求項１７】
請求項１１に記載のポリペプチドに選択的に結合する化合物と、使用説明書を含むキット。
【請求項１８】
サンプル中に請求項１、２、３、または４のいずれか1つに記載の核酸分子の存在を検出する方法であって、
a）  前記サンプルを、前記核酸分子に選択的にハイブリダイズする核酸プローブまたはプライマと接触させるステップと、
b）  前記核酸プローブまたはプライマがサンプル中の核酸分子と結合するかどうかを測定し、前記サンプル中における請求項１、２、３、または４のいずれか1つに記載の核酸分子の存在を検出するステップと、
を含む、方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、当該方法において、前記サンプルがmRNA分子を含み、前記サンプルを核酸プローブと接触させる、方法。
【請求項２０】
請求項１、２、３、または４のいずれか1つに記載の核酸分子に選択的にハイブリダイズする化合物と、使用説明書を含む、キット。
【請求項２１】
請求項１１に記載のポリペプチドに結合する化合物を同定する方法であって、
a）  前記ポリペプチド、または前記ポリペプチドを発現する細胞をテスト化合物と接触させるステップと、
b）  前記ポリペプチドが前記テスト化合物に結合するかどうかを測定するステップと、
を含む、方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、当該方法において、前記テスト化合物の前記ポリペプチドへの結合が、
a）  テスト化合物／ポリペプチド結合の直接的な検出による結合の検出と、
b）  競合結合アッセイを用いた結合の検出と、
c）  PGC-1β活性のアッセイを用いた結合の検出と、
からなるグループから選択される方法によって検出される、方法。
【請求項２３】
請求項１１に記載のポリペプチドの活性を調節する方法であって、前記ポリペプチドまたは前記ポリペプチドを発現する細胞を、前記ポリペプチドの活性を調節するのに十分な濃度の、前記ポリペプチドに結合する化合物に接触させるステップを含む、方法。
【請求項２４】
請求項１１に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物を同定する方法であって、
a）  請求項１１に記載のポリペプチドをテスト化合物と接触させるステップと、
b）  前記テスト化合物が前記ペプチドの活性に及ぼす作用を測定して前記ポリペプチドの活性を調節する化合物を同定するステップと、
を含む、方法。
【請求項２５】
代謝障害を有する、または代謝障害を発症するリスクのある対象を同定するための方法であって、
a）  前記対象から採取した核酸分子を含むサンプルを配列番号1または4の少なくとも25個の連続するヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブと接触させるステップと、
b）  前記サンプル中の、前記プローブにハイブリダイズする核酸分子の存在を検出して、代謝障害を有する対象を同定するステップと、
を含む、方法。
【請求項２６】
代謝障害を有する、または代謝障害を発症するリスクのある対象を同定する方法であって、
a）  前記対象から採取した核酸分子を含むサンプルを、第１および第２の増幅プライマと接触させるステップであって、前記第１のプライマは配列番号1または4の少なくとも25個の連続するヌクレオチドを含み、前記第２のプライマは配列番号1または4の相補体の少なくとも25個の連続するヌクレオチドを含む、ステップと、
b）  核酸増幅が可能な条件下で前記サンプルをインキュベートするステップと、
c）  前記サンプル中において、増幅された核酸分子の存在を検出し、代謝障害を有する、または代謝障害を発症するリスクのある対象を同定するステップと、
を含む、方法。
【請求項２７】
代謝障害を有する、または代謝障害を発症するリスクのある対象を同定する方法であって、
a）  前記対象から採取したポリペプチドを含むサンプルとPGC-1β結合物質を接触させるステップと、
b）  前記サンプル中で前記PGC-1β結合物質と結合するポリペプチドの存在を検出し、代謝障害を有する、または代謝障害を発症するリスクのある対象を同定するステップと、
を含む、方法。
【請求項２８】
異常なPGC-1β核酸発現またはPGC-1βポリペプチド活性によって特徴づけられる代謝疾患を処置する能力がある化合物を同定する方法であって、前記化合物がPGC-1β核酸発現またはPGC-1βポリペプチド活性を調節する能力をアッセイし、異常なPGC-1β核酸発現またはPGC-1βポリペプチド活性によって特徴づけられる代謝疾患を処置する能力がある化合物を同定するステップを含む、方法。
【請求項２９】
異常なPGC-1βポリペプチド活性または異常な核酸発現によって特徴づけれらる代謝障害を有する対象を処置する方法であって、前記対象にPGC-1βモジュレータを投与し、代謝障害を有する前記対象を処置するステップを含む、方法。
【請求項３０】
PGC-1αタンパク質とHCFタンパク質との相互作用を調節する化合物を同定する方法であって、前記化合物の存在下において、前記PGC-1αタンパク質とHCFタンパク質を、HCFタンパク質がPGC-1αタンパク質に結合して複合体を形成することができる条件下において接触させるステップと、PGC-1αタンパク質とHCFタンパク質の複合体形成を検出するステップであって、前記化合物がPGC-1タンパク質とHCFタンパク質の間の相互作用を調節する能力が、前記化合物の非存在下において形成される複合体の量と比較した複合体形成の変化によって表されるステップと、を含む、方法。
【請求項３１】
請求項２５乃至３０に記載の方法であって、当該方法において前記代謝障害が糖尿病である、方法。
【請求項３２】
神経障害を有する、または神経障害を発症するリスクのある対象を同定するための方法であって、
a）  前記対象から採取した核酸分子を含むサンプルを配列番号1または4の少なくとも25個の連続するヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブと接触させるステップと、
b）  前記サンプル中の前記プローブにハイブリダイズする核酸分子の存在を検出して、神経障害を有する対象を同定するステップと、
を含む、方法。
【請求項３３】
神経障害を有する、または神経障害を発症するリスクのある対象を同定する方法であって、
a）  前記対象から採取した核酸分子を含むサンプルを、第１および第２の増幅プライマと接触させるステップであって、前記第１のプライマは配列番号1または4の少なくとも25個の連続するヌクレオチドを含み、前記第２のプライマは配列番号1または4の相補体の少なくとも25個の連続するヌクレオチドを含む、ステップと、
b）  核酸増幅が可能な条件下で前記サンプルをインキュベートするステップと、
c）  前記サンプル中において増幅された核酸分子の存在を検出し、神経障害を有する、または神経障害を発症するリスクのある対象を同定するステップと、
を含む、方法。
【請求項３４】
神経障害を有する、または神経障害を発症するリスクのある対象を同定する方法であって、
a）  前記対象から採取したポリペプチドを含むサンプルとPGC-1β結合物質を接触させるステップと、
b）  前記サンプル中において前記PGC-1β結合物質と結合するポリペプチドの存在を検出し、神経障害を有する、または神経障害を発症するリスクのある対象を同定するステップと、
を含む、方法。
【請求項３５】
異常なPGC-1β核酸発現またはPGC-1βポリペプチド活性によって特徴づけられる代謝疾患を処置する能力がある化合物を同定する方法であって、前記化合物がPGC-1β核酸発現またはPGC-1βポリペプチド活性を調節する能力をアッセイし、異常なPGC-1β核酸発現またはPGC-1βポリペプチド活性によって特徴づけられる代謝疾患を処置する能力がある化合物を同定するステップを含む、方法。
【請求項３６】
異常なPGC-1βポリペプチド活性または異常な核酸発現によって特徴づけれらる神経障害を有する対象を処置する方法であって、前記対象にPGC-1βモジュレータを投与し、神経障害を有する前記対象を処置するステップを含む、方法。
【請求項３７】
請求項３２乃至３６のいずれかに記載の方法であって、当該方法において前記神経障害がパーキンソン病である、方法。
【請求項３８】
フリーラジカルによる損傷に関連する障害を有する、またはフリーラジカルによる損傷に関連する障害を発症するリスクのある対象を同定するための方法であって、
a）  前記対象から採取した核酸分子を含むサンプルを配列番号1または4の少なくとも25個の連続するヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブと接触させるステップと、
b）  前記サンプル中の前記プローブにハイブリダイズする核酸分子の存在を検出して、フリーラジカルによる損傷に関連する障害を有する対象を同定するステップと、
を含む、方法。
【請求項３９】
フリーラジカルによる損傷に関連する障害を有する、またはフリーラジカルによる損傷に関連する障害を発症するリスクのある対象を同定する方法であって、
a）  前記対象から採取した核酸分子を含むサンプルを、第１および第２の増幅プライマと接触させるステップであって、前記第１のプライマは配列番号1または4の少なくとも25個の連続するヌクレオチドを含み、前記第２のプライマは配列番号1または4の相補体の少なくとも25個の連続するヌクレオチドを含む、ステップと、
b）  核酸増幅が可能な条件下で前記サンプルをインキュベートするステップと、
c）  前記サンプル中において増幅された核酸分子の存在を検出し、フリーラジカルによる損傷に関連する障害を有する、またはフリーラジカルによる損傷に関連する障害を発症するリスクのある対象を同定するステップと、
を含む、方法。
【請求項４０】
フリーラジカルによる損傷に関連する障害を有する、またはフリーラジカルによる損傷に関連する障害を発症するリスクのある対象を同定する方法であって、
a）  前記対象から採取したポリペプチドを含むサンプルとPGC-1β結合物質を接触させるステップと、
b）  前記サンプル中において前記PGC-1β結合物質と結合するポリペプチドの存在を検出し、フリーラジカルによる損傷に関連する障害を有する、またはフリーラジカルによる損傷に関連する障害を発症するリスクのある対象を同定するステップと、
を含む、方法。
【請求項４１】
異常なPGC-1β核酸発現またはPGC-1βポリペプチド活性によって特徴づけられる代謝疾患を処置する能力がある化合物を同定する方法であって、前記化合物がPGC-1β核酸発現またはPGC-1βポリペプチド活性を調節する能力をアッセイし、異常なPGC-1β核酸発現またはPGC-1βポリペプチド活性によって特徴づけられる代謝疾患を処置する能力がある化合物を同定するステップを含む、方法。
【請求項４２】
異常なPGC-1βポリペプチド活性または異常な核酸発現によって特徴づけれらるフリーラジカルによる損傷に関連する障害を有する対象を処置する方法であって、前記対象にPGC-1βモジュレータを投与し、フリーラジカルによる損傷に関連する障害を有する前記対象を処置するステップを含む、方法。
【請求項４３】
請求項３８乃至４２のいずれかに記載の方法であって、当該方法において前記フリーラジカルによる損傷に関連する障害が、加齢、神経変性疾患、または心疾患から選択される、方法。
【請求項４４】
請求項４３に記載の方法であって、当該方法において前記障害が細胞死を引き起こす、方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
政府支援
本願明細書に記載の研究は、米国立衛生研究所から付与された補助金R37DK31405およびDK54477に基づく支援を受けた。米国政府は本願発明の一定の権利を有する可能性がある。
【０００２】
関連出願
本出願は、引用をもって内容全体を本出願に援用するものとする、2001年11月9日に出願された米国特許仮出願第60/338,126号の優先権を主張する。  
【０００３】
発明の背景
多くの核内受容体（NR）の転写機能は、活性化補助因子をカルボキシル末端リガンド結合ドメインに、リガンドに依存した補充をすることによって調節される(Aranda, A., and Pascual, A. (2001) Physiol. Rev. 81:1269-1304; Rosenfeld, M.G. and Glass, C.K. (2001) J. Biol. Chem. 276:36865-36868)。p160 ファミリであるp300/CBPおよびP/CAFを含む、数多くの活性化補助因子は、内因性のヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性を含み、ヒストンアセチル化を調節することによって転写を制御する(Aranda and Pascual (2001) 同上)。配列に相同性の少ない不均一なタンパク質からなるその他の活性化補助因子は、ヒストントランスフェラーゼ含有複合体を補充する、またはRNAポリメラーゼIIホロ酵素などの基礎転写因子と結合する、タンパク質結合面として作用することによって転写を調節する(Freedman, L.P. (1999) Cell 97:5-8)。NRと多くの活性化補助因子の間の相互作用には、受容体と疎水性の接触を形成すると考えられている、保存されたLXXLLモチーフ（Lはロイシンで、Xは任意のアミノ酸）を必要とする(Nolte, R.T. et al. (1998) Nature 395:137-143; Westin, S. et al. (1998) Nature 395:199-202)。
【０００４】
PGC-1はもともと、PPAR-γ相互作用タンパク質として褐色脂肪組織（BAT）ライブラリから同定されたもので、その後、NRおよび転写因子のアレイと会合することが明らかになった(Puigserver, P. et al. (1998) Cell 92:829-839; Wu, Z. et al. (1999) Cell 98:115-124; Vega, R.B. et al. (2000) Mol. Cell. Biol. 20:1868-1876; Michael, L.F. et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:3820-3825)。重要なことに、PGC-1は、BATのミトコンドリア生合成および適応性熱産生のプログラム、ならびに骨格筋を、主にPPARおよび核呼吸因子1（NRF1）を同時活性化させることによって、協調的に調節する(Puigserver et al. (1998)同上; Wu et al. (1999) 同上)。核呼吸因子1（NRF1）は、多くのミトコンドリア遺伝子を調節する核転写因子である。トランスジェニックマウスの場合、PGC-1は、心臓におけるミトコンドリア生合成と脂肪酸のβ-酸化を、おそらくPPARαおよびNRF1転写活性の増強によって増加させる(Lehman, J.J. et al. (2000) J. Clin. Invest. 106:847-856)。最近、絶食肝ならびに1型および2型糖尿病のいくつかのモデルにおいて、PGC-1発現が高まることが明らかになった。さらに、PGC-1が肝の糖新生の活性化を直接制御できることも明らかになった(Yoon, J.C. et al. (2001) Nature 413:131-138; Herzig, S. et al. (2001) Nature 413:179-183)。
【０００５】
発明の概要
本願発明は、本願発明書においてPCG-1β核酸およびタンパク質分子（たとえばヒトおよびマウスPCG-1β）とよぶPGC-1分子ファミリーの新規メンバーの発見に、少なくとも部分的に基づく。本願発明はさらに、PGC-1βは褐色脂肪の決定／分化中には上方調節されるが低温に曝露されている間はそうならないという発見に、少なくとも部分的に基づいている。本願発明はさらに、PGC-1β発現は絶食中に肝において上方調節されるという発見に、少なくとも部分的に基づく。本願発明はさらに、PGC-1βは肝および培養マウス筋管においてミトコンドリア生合成および脂肪酸酸化遺伝子の発現を誘導するという発見に、少なくとも部分的に基づく。本願発明はさらに、PGC-1βは褐色脂肪組織（BAT）および心（ミトコンドリアおよび基質の酸化を大量に含む組織）において大量に発現するという発見、およびPGC-1βは強力なNRF1活性化補助因子であるという発見に、少なくとも部分的に基づく。本願発明はさらに、単純ヘルペスウイルス（HSV）感染および細胞周期の調節に関与する細胞タンパク質である宿主細胞因子（HCF）(Wilson, A.C. et al. (1993) Cell 74:115-125; Wilson, A.C. et al. (1997) Mol. Cell. Biol. 17:6139-6146)は、本願明細書ではPGC-1αとよぶ最初に同定されたPGC-1およびPGC-1βの両方の転写活性を上方調節する結合パートナーであるという発見に、少なくとも部分的に基づく。本願発明はさらに、PGC-1αおよびPGC-1βの両方が神経芽腫細胞においてミトコンドリア遺伝子の発現を誘導するという発見であって、神経性疾患に重要な役割を果たしていることを示唆する発見に、少なくとも部分的に基づく。本願発明はさらに、PGC-1αおよびPGC-1βの両方がスーパーオキシドジスムターゼ（Mn-SOD）およびグルタチオンペルオキシダーゼ（GPx）などのフリーラジカル代謝物が関与する酵素の発現を誘導するという発見であって、フリーラジカルによる損傷に対する細胞防御に重要な役割を果たしていることを示唆する発見に、少なくとも部分的に基づく。
【０００６】
本願発明のPGC-1β核酸およびタンパク質分子は、たとえば細胞の決定および／または分化（たとえば褐色脂肪決定および／または分化）、細胞代謝、脂肪酸酸化、ミトコンドリアの機能および／または呼吸、細胞シグナル伝達、および／または細胞増殖など、さまざまな細胞プロセスの制御において調節物質として有用である。したがって、ある局面では、本願発明はPGC-1βタンパク質をコードする単離された核酸分子または生物学的に活性なその部分、およびPCG-1βコード核酸の検出用のプライマまたはハイブリダイゼーションプローブとして好適な核酸断片を提供する。
【０００７】
ある実施態様では、本願発明のPGC-1β核酸分子は、配列番号1、3、4、もしくは6に示されるヌクレオチド配列（たとえばヌクレオチド配列の全長）、またはそれらに相補的な配列に、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、99.99%又はそれ以上、同一である。
【０００８】
好ましい実施態様では、前記の単離された核酸分子には、配列番号1、3、4、もしくは6に示されるヌクレオチド配列、またはそれらに相補的な配列が含まれる。別の好ましい実施態様では、前記の単離された核酸分子は配列番号3の1乃至660番のヌクレオチドを含む。別の好ましい実施態様では、前記の単離された核酸分子は配列番号3の1乃至1140番のヌクレオチドを含む。別の好ましい実施態様では、前記核酸分子は配列番号1、3、4、または6に示されるヌクレオチド配列からなる。
【０００９】
別の実施態様では、PGC-1β核酸分子は配列番号2または5のアミノ酸配列に十分同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。好ましい実施態様では、PGC-1β核酸分子には、配列番号2または5のアミノ酸配列の全長と、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、99.99%又はそれ以上同一のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列が含まれる。
【００１０】
別の好ましい実施態様では、単離された核酸分子はヒトPGC-1βのアミノ酸配列をコードする。別の好ましい実施態様では、単離された核酸分子はマウスPGC-1βのアミノ酸配列をコードする。さらに別の好ましい実施態様では、前記核酸分子には配列番号2または5のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列が含まれる。さらに別の好ましい実施態様では、前記核酸分子の長さは、少なくとも50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、457、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000、2050、2100、2150、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2600、2650、2700、2750、2800、2850、2900、2950、3000、3050、3100、3150、3200、3250、3300、3350、3400、3450、3500、3550、3600又はそれ以上のヌクレオチド長である。さらに好ましい実施態様では、前記核酸分子の長さは少なくとも50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 457, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950, 2000, 2050, 2100, 2150, 2200, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2600, 2650, 2700, 2750, 2800, 2850, 2900, 2950, 3000, 3050, 3100, 3150, 3200, 3250, 3300, 3350, 3400, 3450, 3500, 3550, 3600又はそれ以上のヌクレオチド長であって、PGC-1β活性を有するタンパク質をコードする（本願明細書に記載の通り）。
【００１１】
本願発明の別の実施態様は、核酸分子、好ましくはPGC-1β核酸分子であって、非PGC-1βタンパク質をコードする核酸分子に対してPGC-1β核酸分子を特異的に検出する核酸分子を特徴とする。たとえば、ある実施態様では、そのような核酸分子は、長さが少なくとも20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、457、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000、2050、2100、2150、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2600、2650、2700、2750、2800、2850、2900、2950、3000、3050、3100、3150、3200、3250、3300、3350、3400、3450、3500、3550、3600又はそれ以上のヌクレオチド長であって、ストリンジェントな条件下において配列番号1または4に示されるヌクレオチド配列またはそれらに相補的な配列を含む核酸分子にハイブリダイズする。
【００１２】
好ましい実施態様では、前記核酸分子は長さが少なくとも15（たとえば連続する15）ヌクレオチドであって、ストリンジェントな条件下において配列番号1または4に記載の核酸分子にハイブリダイズする。
【００１３】
他の好ましい実施態様では、前記核酸分子は配列番号2または5のアミノ酸配列を含むポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子変異体であって、当該変異体において、ストリンジェントな条件下において、前記核酸分子が配列番号1、3、4、または6を含む核酸分子の相補体にそれぞれハイブリダイズする、対立遺伝子変異体をコードする。
【００１４】
本願発明の別の実施態様では、たとえばPGC-1β核酸分子のコード鎖などのPGC-1β核酸分子にアンチセンスな、単離された核酸分子を提供する。
【００１５】
本願発明の別の局面は、PGC-1β核酸分子を含むベクターを提供する。ある実施態様では、前記ベクターは組換え発現ベクターである。別の実施態様では、本願発明は本願発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。さらに別の実施態様では、本願発明は本願発明の核酸分子を含む宿主細胞を提供する。本願発明はまた、タンパク質、好ましくはPGC-1βタンパク質を、それが産生されるように、組換え発現ベクターを含むたとえば非ヒト哺乳類細胞などの哺乳類宿主細胞などの本願発明の宿主細胞を適当な培地で培養することによって生産する方法を提供する。
【００１６】
本願発明の別の局面は、単離されたまたは組換えPGC-1βタンパク質およびポリペプチドを特徴とする。ある実施態様では、単離されたPGC-1βタンパク質には少なくとも1つのLXXLLモチーフ、RRM、AD、HBMおよび／またはグルタミン酸／アスパラギン酸リッチ酸性ドメインが含まれる。
【００１７】
好ましい実施態様では、PGC-1βタンパク質には少なくとも1つのLXXLLモチーフ、RRM、AD、HBMおよび／またはグルタミン酸／アスパラギン酸リッチ酸性ドメインが含まれ、配列番号2または5のアミノ酸配列と少なくとも約50%、55%、60%、65%、67%、68%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、99.99%又はそれ以上同一なアミノ酸配列を有する。
【００１８】
別の好ましい実施態様では、PGC-1βタンパク質には少なくとも1つのLXXLLモチーフ、RRM、AD、HBMおよび／またはグルタミン酸／アスパラギン酸リッチ酸性ドメインが含まれ、PGC-1β活性を有する（本願明細書に記載の通り）。
【００１９】
さらに別の好ましい実施態様では、PGC-1βタンパク質には少なくとも1つのLXXLLモチーフ、RRM、AD、HBMおよび／またはグルタミン酸／アスパラギン酸リッチ酸性ドメインが含まれ、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において配列番号1、3、4、または6のヌクレオチド配列を含む核酸分子の相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされている。
【００２０】
別の実施態様では、本願発明は配列番号2または5のアミノ酸配列を有するタンパク質の断片であって、当該断片は配列番号2または5のアミノ酸配列の、少なくとも10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、または1000アミノ酸（たとえば連続するアミノ酸）を含む、断片を特徴とする。別の実施態様では、PGC-1βタンパク質は配列番号2または5のアミノ酸配列を有する。
【００２１】
別の実施態様では、本願発明は配列番号1、3、4、もしくは6のヌクレオチド配列またはその相補体に、少なくとも約50%、55%、60%、65%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、または99.99%以上同一であるヌクレオチド配列からなる核酸分子によってコードされているPGC-1βタンパク質を特徴とする。本願発明はさらに、配列番号1、3、4、もしくは6のヌクレオチド配列またはその相補体を含む核酸分子の相補体に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ハイブリダイズするヌクレオチド配列からなる核酸分子によってコードされているPGC-1βタンパク質を特徴とする。
【００２２】
本願発明のタンパク質、またはたとえばその生物学的に活性な部分などの部分を、非PGC-1βポリペプチド（たとえば非相同アミノ酸配列）に作動可能に結合させて、融合タンパク質を形成することができる。本願発明はさらに、本願発明のタンパク質であって好ましくはPGC-1βタンパク質に特異的に結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体などの抗体を特徴とする。さらに、前記PGC-1βタンパク質またはその生物学的に活性な部分は、薬学的に許容される担体を任意に含む薬学的組成物に組み込むことができる。
【００２３】
別の局面では、本願発明は生物学的なサンプル中でPGC-1β核酸分子、タンパク質、またはポリペプチドの存在を検出する方法であって、前記生物学的なサンプルをPGC-1β核酸分子、タンパク質、またはポリペプチドを検出できる物質と接触させることによって、PGC-1β核酸分子、タンパク質、またはポリペプチドの存在を生物学的サンプル中で検出する、方法を提供する。
【００２４】
別の局面では、本願発明は生物学的なサンプル中でPGC-1β活性を検出する方法であって、前記生物学的なサンプルをPGC-1β活性を検出できる物質と接触させることによって、PGC-1β活性を生物学的サンプル中で検出する、方法を提供する。
【００２５】
別の局面では、本願発明は、細胞のPGC-1β活性が調節されるようにPGC-1β活性を調節する物質をPGC-1βを発現する能力のある細胞と接触させるステップを含む、PGC-1β活性を調節する方法を提供する。ある実施態様では、前記物質はPGC-1β活性を阻害する。別の実施態様では、前記物質はPGC-1β活性を刺激する。ある実施態様では、前記物質はPGC-1βタンパク質に特異的に結合する抗体である。別の実施態様では、前記物質は、PGC-1βの発現を、PGC-1β遺伝子の転写またはPGC-1β mRNAの翻訳を調節することによって調節する。さらに別の実施態様では、前記物質は、PGC-1β mRNAまたはPGC-1β遺伝子のコード鎖に対してアンチセンスのヌクレオチド配列を有する核酸分子である。
【００２６】
ある実施態様では、本願発明の方法は、異常なまたは望ましくないPGC-1βタンパク質または核酸の発現または活性によって特徴づけられる障害を有する対象を、前記対象にPGC-1β調節物質である物質を投与することによって治療するために用いられる。ある実施態様では、前記PGC-1β調節物質はPGC-1βタンパク質である。別の実施態様では、前記PGC-1β調節物質はPGC-1β核酸分子である。さらに別の実施態様では、前記PGC-1β調節物質はペプチド、ペプチド模倣体、またはその他の低分子である。好ましい実施態様では、異常なまたは望ましくないPGC-1βタンパク質または核酸発現によって特徴づけられる障害は、本願明細書に記載のように、たとえば代謝障害または神経障害などのPGC-1β関連疾患である。別の好ましい実施態様では、前記障害はフリーラジカルによる損傷によって特徴づけられる。
【００２７】
本願発明はまた、（i）PGC-1βタンパク質をコードする遺伝子の異常な修飾または突然変異、（ii）前記遺伝子の誤調節、および（iii）PGC-1βタンパク質の異常な翻訳後修飾、の少なくともいずれか1つによって特徴づけられる遺伝子の変化の有無を同定する診断的アッセイであって、当該アッセイにおいて前記遺伝子の野生型はPGC-1β活性を有するタンパク質をコードする、診断アッセイを提供する。
【００２８】
別の局面では、本願発明は、PGC-1β活性を有するPGC-1βタンパク質を含む指標組成物を提供し、指標組成物をテスト化合物と接触させて、PGC-1βタンパク質の活性を調節する化合物を同定するために指標組成物中でテスト化合物がPGC-1β活性に及ぼす作用を決定することによって、PGC-1βタンパク質の活性に結合するまたはそれを調節する化合物を同定する方法を提供する。
【００２９】
他の実施態様では、本願発明は代謝障害を有する、または代謝障害を発症するリスクのある対象を同定する方法と、異常なPGC-1β核酸発現またはPGC-1βポリペプチド活性によって特徴づけられる代謝障害を治療する能力がある化合物を同定する方法と、異常なPGC-1βポリペプチド活性または異常なPGC-1β核酸発現によって特徴づけられる代謝障害を有する対象を治療する方法と、を提供する。
【００３０】
さらに他の実施態様では、本願発明は神経障害を有する、または神経障害を発症するリスクのある対象を同定する方法と、異常なPGC-1β核酸発現またはPGC-1βポリペプチド活性によって特徴づけられる神経障害を治療する能力がある化合物を同定する方法と、異常なPGC-1βポリペプチド活性または異常なPGC-1β核酸発現によって特徴づけられる神経障害を有する対象を治療する方法と、を提供する。
【００３１】
さらに別の実施態様では、本願発明は細胞へのフリーラジカルによる損傷を特徴とする障害を有する、または細胞へのフリーラジカルによる損傷を特徴とする障害を発症するリスクのある対象を同定する方法と、異常なPGC-1β核酸発現またはPGC-1βポリペプチド活性によって特徴づけられる細胞へのフリーラジカルによる損傷を特徴とする障害を治療する能力がある化合物を同定する方法と、異常なPGC-1βポリペプチド活性または異常なPGC-1β核酸発現によって特徴づけられるそのような障害を有する対象を治療する方法と、を提供する。
【００３２】
別の実施態様では、本願発明は、PGC-1αタンパク質とHCFタンパク質の相互作用を調節する化合物を同定する方法であって、前記化合物の存在下において、HCFタンパク質がPGC-1αタンパク質と結合して複合体を形成するような条件下においてPGC-1αとHCFタンパク質を接触させるステップと、PGC-1αタンパク質とHCFタンパク質の相互作用を調節する前記化合物の能力が、前記化合物の非存在下において形成された複合体（たとえば構造および／または形成した複合体の量）と比較した複合体形成の変化によって表される、PGC-1αタンパク質とHCFタンパク質の複合体の形成を検出するステップと、を含む、方法を提供する。
【００３３】
本願発明のその他の特徴および利点は、以下の発明の詳細な説明および添付の特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【００３４】
発明の詳細な説明
本願発明は、本願明細書ではPGC-1β核酸およびタンパク質と呼ばれるPGC-1分子ファミリの新規メンバの発見に、少なくとも部分的に基づく。本願発明はさらに、PGC-1βは褐色脂肪決定／分化中に上方調節されるが、低温に曝露されている動物およびフォルスコリンで処理した褐色脂肪細胞中では調節されないという発見に、少なくとも部分的に基づく。本願発明はさらに、PGC-1β発現は絶食中の肝において上方調節されるという発見に、少なくとも部分的に基づく。本願発明はさらに、PGC-1βは肝および骨格筋において脂肪酸酸化遺伝子の発現を誘発するという発見に、少なくとも部分的に基づく。本願発明はさらに、PGC-1βは褐色脂肪組織（BAT）および心（大量のミトコンドリアおよび基質酸化を含む組織）に大量に発現するという発見と、PGC-1βはNRF1の強力な活性化補助因子であるという発見に、少なくとも部分的に基づく。本願発明はさらに、単純ヘルペスウイルス（HSV）感染症および細胞周期調節に関与する細胞タンパク質である宿主細胞因子（HCF）(Wilson, A.C. et al. (1993) Cell 74:115-125; Wilson, A.C. et al. (1997) Mol. Cell. Biol. 17:6139-6146)は、最初に同定されたPGC-1（本願明細書ではPGC-1αとよぶ）およびPGC-1βの両方の転写活性を上方調節する結合パートナーであるという発見に、少なくとも部分的に基づく。本願発明はさらに、PGC-1αおよびPGC-1βの両方とも、神経芽腫細胞でミトコンドリア遺伝子発現を誘発するという発見に、少なくとも部分的に基づく。本願発明はさらに、PGC-1αおよびPGC-1βの両方とも、スーパーペルオキシドジスムターゼ（Mn-SOD）およびグルタチオンペルオキシダーゼ（GPx）などのフリーラジカル代謝に関与する酵素の発現を誘発するという発見であって、フリーラジカルによる損傷から細胞を防御する重要な役割を示唆する発見に、少なくとも部分的に基づく。
【００３５】
本願発明のPGC-1β核酸およびタンパク質分子は、たとえば細胞決定および／または分化（たとえば褐色脂肪決定および／分化）、細胞代謝、脂肪酸酸化、ミトコンドリア機能および／または呼吸、細胞のシグナル伝達、細胞防御、および／または細胞増殖などの、多様な細胞プロセスの制御に、調節物質として有用である。
【００３６】
したがって、本願発明のPGC-1β分子は、代謝障害、神経障害、およびフリーラジカルによる損傷に関連する障害を制御する新規の診断標的および治療物質を提供する。本願明細書に用いられる「代謝障害」には、たとえばPGC-1β発現または活性の異常な調節によって生じる代謝の異常な調節など、代謝の異常な調節によって生じる、または影響される症状、障害および／または疾患が、これらに限定されずに含まれる。
【００３７】
たとえば、ある実施態様では、代謝障害には「褐色脂肪細胞障害」が含まれる。本願明細書に用いられる「褐色脂肪細胞障害」には、褐色脂肪細胞または組織に影響する疾患、障害、または症状が含まれる。褐色脂肪細胞障害には、異常な熱産生、または異常な褐色脂肪細胞内容物または機能を伴う疾患、障害、または症状が含まれる。褐色脂肪細胞疾患は、PGC-1β発現または活性の誤調節（たとえば下方調節または上方調節）によって特徴づけることができる。褐色脂肪細胞障害の例には、肥満、過体重、拒食症、悪液質、および糖尿病（たとえば1型糖尿病、2型糖尿病、および若年者の成人発症型糖尿病（MODY）など）などの障害が含まれる。肥満は、肥満度指数（BMI）が30kg/2m以上と定義する(National Institute of Health, Clinical Guidelines on the Identification, Evaluation, and Treatment of Overweight and Obesity in Adults (1998))。しかし、本願発明はまた、25kg/2m以上、26 kg/2m以上、27 kg/2m 以上、 28 kg/2m 以上、 29 kg/2m 以上、 29.5 kg/2m 以上、または29.9 kg/2m 以上の肥満度指数（BMI）であって、典型的に過体重と呼ばれるすべての肥満度数 (National Institute of Health, Clinical Guidelines on the Identification, Evaluation, and Treatment of Overweight and Obesity in Adults (1998))によって特徴づけられる疾患、障害、または症状も含むことを意図する。
【００３８】
代謝障害にはまた、たとえば糖尿病（たとえば1型糖尿病、2型糖尿病、および若年者の成人発症型糖尿病（MODY）など）などの異常な糖の恒常性に関連する障害、およびたとえば低血糖症を生じる肝酵素異常などの糖の産生不足を特徴とする障害、ならびにたとえば他の疾患、障害、または症状が引き起こす二次性低血糖などの低血糖も含まれる。代謝障害にはまた、たとえば肥満などの体重障害、悪液質、拒食症、および不十分なインスリン活性に関連する障害など、糖の恒常性の異常が影響する、任意のその他の障害または症状も含んでよい。体重に関連する障害は、異常な体重または体重の異常なコントロールに伴う障害である。本願明細書に用いられる「不十分なインスリン活性に関連するまたはそれを特徴とする疾患」という文言には、異常なインスリン機能のために糖の使われ方に異常がある障害または疾患が含まれる。異常なインスリン機能には、たとえばIDDM（1型糖尿病）などに見られるβ細胞の損失などによって生じるインスリン欠乏などの細胞小器官を介した発現および／または輸送などのインスリンの産生の異常または機能異常、NIDDM（2型糖尿病）などに見られるインスリン分泌応答の機能障害などの分泌の異常または機能異常、たとえば1次、2次、または3次構造などのインスリン分子そのものの形状の異常または機能異常、たとえば末梢組織などの体組織におけるインスリン抵抗性などの標的細胞にインスリンが及ぼす作用の異常または機能異常、およびインスリンへの標的細胞の応答の異常または機能異常のいずれかが含まれる。IDDMおよびNIDDMおよびその他の形態の糖尿病における異常なインスリン活性についてのさらなる説明は、Braunwald, E. et al. eds. Harrison’s Principles of Internal Medicine, Eleventh Edition (McGraw-Hill Book Company, New York, 1987) pp. 1778-1797、Robbins, S.L. et al. Pathologic Basis of Disease, 3rd Edition (W.B. Saunders Company, Philadelphia, 1984) p. 972を参照のこと。
【００３９】
本願明細書に用いられる「神経障害」という用語は、たとえばPGC-1β発現または活性の異常な調節によって生じる脳のエネルギー代謝の異常な調節など、脳のエネルギー代謝の異常な調節によって生じる、または影響される症状、障害、および／または疾患が、これらに限定されずに含まれる。たとえば、ある実施態様では、「神経性疾患」には、脳、脳神経系および末梢神経系、および筋肉と神経の接合面に関連する障害を含む、神経系の障害が、それらに限定されずに含まれる。神経関連障害のいくつかの例には、アルツハイマー病、アルツハイマー病に関連する痴ほう（ピック病）、パーキンソン病などのびまん性レビ小体疾患、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、進行性核上性麻痺、てんかん、およびヤコブクロイツフェルト病が、それらに限定されずに含まれる。「神経性疾患」はまた、たとえば脳梗塞、脳の外傷、脊髄の外傷、脊髄坐滅、脳および末梢神経系の外傷（CNS障害）などの、炎症を伴う神経障害も含まれる。
【００４０】
認識および神経変性疾患などのCNS障害の例には、アルツハイマー病、アルツハイマー病に関連する痴ほう（ピック病）、パーキンソン病などのびまん性レビ小体疾患、老年性痴ほう、ハンチントン病、ジルドラトゥレット症候群、多発性硬化症、筋萎縮性側策硬化症、進行性核上性麻痺、てんかん、およびヤコブクロイツフェルト病、たとえば高血圧および睡眠障害などの自律神経系機能障害ならびにたとえばうつ病、統合失調症、統合失調性感情障害、コルサコフ精神疾患、そう病、不安障害、または恐怖症性障害などの神経精神障害、たとえば記憶喪失または年齢性記憶喪失、注意欠損障害、気分変調性障害、大うつ病性障害、そう病、強迫神経障害、向精神薬使用障害、不安症、恐怖症、パニック障害などの学習または記憶障害、ならびにたとえば重度の双極性気分障害（BP-1）、およびたとえば偏頭痛および肥満などの双極性気分神経障害などの双極性気分障害が、それらに限定されずに含まれる。さらなるCNS関連障害には、たとえば、その内容全体を引用により援用する米国精神医学会の精神障害診断・統計マニュアル（DSM）の最新版に掲載されている障害が含まれる。「神経性疾患」にはまた、フリーラジカルによる損傷に関連する障害も含まれる。
【００４１】
本願明細書に用いられる「フリーラジカルによる損傷に関連する障害」という文言には、たとえばPGC-1β発現または活性の異常な調節によって生じるフリーラジカル代謝の異常な調節など、フリーラジカル代謝の異常な調節によって生じるまたは影響される症状、障害および／または疾患が、それらに限定されずに含まれる。たとえば、ある実施態様では、「フリーラジカルによる損傷に関連する障害」には、ハンチントン病（HD）、パーキンソン病（PD）、およびアルツハイマー病、およびルー・ゲーリック病として一般に知られる筋萎縮性側策硬化症（ASL）などの神経変性疾患および神経変性障害が含まれる。「フリーラジカルによる損傷に関連する障害」にはまた、フリーラジカル反応によって生じる細胞の有害な変化によって生じる脂肪リスクの上昇として定義される生物学的老化または加齢も含まれる。このような細胞損傷プロセスは、主にミトコンドリアの呼吸過程において始まり、その一方で寿命はミトコンドリアへの損傷の速度によって決定される。「フリーラジカルによる損傷に関連する障害」にはさらに、癌および心疾患のすべての形態とともに、障害されたフリーラジカル代謝に関連する既知の全疾患が含まれる。
【００４２】
本願発明のPGC-1β分子は宿主細胞因子（HCF）と相互作用するため、ウイルス性障害および／または細胞増殖、成長、および／または分化障害を制御する新規の診断用標的および治療用物質も提供することができる。ウイルス性障害には、たとえば単純ヘルペスウイルス（HSV）などのウイルスによる細胞または対象の感染によって生じるまたは影響される障害、疾患、および／または症状が含まれる。細胞増殖、成長、分化、障害には、細胞増殖、成長、および／または分化のプロセスに影響する障害が含まれる。本願明細書に用いられる「細胞増殖、成長および／または分化プロセス」には、細胞の数、大きさ、または容量が大きくなるためのプロセスか、または細胞が他の細胞と違う特化された特徴のセットを発達させるプロセスか、または細胞が特定の位置または刺激物に近づいたりまたは遠ざかったりと移動するプロセスである。したがって、PGC-1β分子は、細胞成長および／または分化を調節する可能性もあり、および異常に調節された成長および／または分化によって特徴づけられる障害においてある役割を果たす可能性もある。そのような障害には、たとえば癌腫、肉腫、白血病、およびリンパ腫などの癌、ならびに特にたとえば単純ヘルペスウイルス（HSV）などのウイルスによる感染症によって生じる癌、腫瘍血管新生および転移、骨格異形成、肝障害、ならびに造血および／または骨髄増殖性障害が含まれる。
【００４３】
PGC-1β関連障害にはまた、たとえば褐色脂肪組織、白色脂肪組織、肝および／または心など、PGC-1βが発現する組織に生じる障害も含まれる。
【００４４】
本願明細書に記載の「褐色脂肪細胞活性」には、褐色脂肪細胞が発揮する活性、または褐色脂肪細胞で生じる活性が含まれる。たとえば、そのような活性には、褐色脂肪細胞の分化およびミトコンドリア活性などの褐色脂肪細胞の生理学的役割に寄与する細胞プロセスが含まれ、細胞増殖、分化、成長、遊走、プログラムされた細胞死、分離したミトコンドリア呼吸、および熱産生が、それらに限定されずに含まれる。
【００４５】
「ファミリ」という用語は、本願発明のタンパク質および核酸分子を意味する場合、一般的な構造ドメインまたはモチーフを有し、本願明細書に定義されたとおりの十分なアミノ酸またはヌクレオチド配列の相同性を有する、2つ以上のタンパク質または核酸分子を意味することを意図する。このようなファミリメンバは、天然に存在するか、または天然に存在しなくてよく、同一または異なる種のいずれに由来していてもよい。たとえば、あるファミリはヒト由来の第1のタンパク質と他の異なるヒト由来のタンパク質を含んでいることもあり、または代替的には、たとえばサルタンパク質などの非ヒト由来の相同体を含んでいることもある。ファミリのメンバは一般的な機能的特徴を有していることもある。
【００４６】
たとえば、本願発明のPGC-1β分子のファミリのメンバは、少なくともそのタンパク質または対応する核酸分子の中に「LXXLLモチーフ」を少なくとも1つ含んでいる。本願明細書に用いられる「LXXLLモチーフ」は、Xが任意のアミノ酸であってよいモチーフであって、核受容体と活性化補助因子の間の相互作用を媒介するモチーフを意味する(Heery et al. (1997) Nature 397:733-736; Torchia et al. (1997) Nature 387:677-684)。好ましい実施態様では、PGC-1βタンパク質は少なくとも2つまたは3つのLXXLLモチーフを有する。3つのLXXLLモチーフが、マウスPGC-1βのアミノ酸配列中の、配列番号2のほぼ140乃至144残基、156乃至160残基、および343乃至347残基あたり（図２）に同定された。2つのLXXLLモチーフが、マウスPGC-1βのアミノ酸配列中の、配列番号5のほぼ144乃至148残基および331乃至335残基あたり（図４）に同定された。
【００４７】
本願発明の別の実施態様では、本願発明のPGC-1β分子は、タンパク質または対応する核酸分子中に少なくとも1つの「RNA認識モチーフ」または「RRM」を含んでいる。本願明細書では交換可能に用いられる「RNA認識モチーフ」または「RRM」は、RNA分子または一本鎖DNA分子に結合することができるアミノ酸配列である。好ましい実施態様では、RRMはPGC-1βタンパク質のC末端近くに認められ、約50乃至160、60乃至150、70乃至140、80乃至130、90乃至120、または好ましくは約108アミノ酸残基を含む。RRMについては、Lodish, H., Darnell, J., and Baltimore, D. Molecular Cell Biology, 3rd ed. (W.H. Freeman and Company, New York, New York, 1995) に記載されている。RRMは、マウスPGC-1βのアミノ酸配列中の、配列番号2の894乃至958残基あたりに同定された（図２）。RRMは、ヒトPGC-1βのアミノ酸配列中の、配列番号5の889乃至953残基あたりに同定された（図５）。
【００４８】
別の実施態様では、本願発明のPGC-1β分子は、タンパク質または対応する核酸分子中に少なくとも1つの「活性化ドメイン」または「AD」を含む。本願明細書では交換可能に用いられる「活性化ドメイン」または「AD」は、非相同DNA結合ドメインに融合された場合に自律的な転写活性を有する、タンパク質ドメインである。ある好ましい実施態様では、ADはPGC-1βタンパク質のN末端220アミノ酸残基に位置し、約50乃至375、75乃至350、100乃至325、125乃至300、150乃至275、175乃至250、200乃至225、または約 220アミノ酸残基を含む。ADは、マウスPGC-1βのアミノ酸配列中の、配列番号2の1乃至220アミノ酸残基あたりに同定された。
【００４９】
さらに別の実施態様では、本願発明のPGC-1β分子はタンパク質または対応する核酸分子中に少なくとも1つの「宿主細胞因子結合モチーフ」を含む。本願明細書では交換可能に用いられる「宿主細胞因子結合モチーフ」、「宿主細胞因子結合部位」、または「HBM」には、PGC-1β分子と、細胞周期の進行の調節および単純ヘルペスウイルス（HSV）感染中の多タンパク質転写複合体の構築に関与するタンパク質である宿主細胞因子（HCF）との相互作用を媒介する能力があるアミノ酸モチーフが含まれる (Freiman, R.N. and Herr, W. (1997) Genes Dev. 11:3122-3127; Andersson, U. and Scarpulla, R.C. (2001) Mol. Cell. Biol. 21:3738-3749)。ある好ましい実施態様では、HBMはコンセンサス配列[D/E]-H-X-Yであって、当該配列において[D/E]は指定の位置にあるDまたはEのいずれかを表し、Xは指定の位置にある任意のアミノ酸を表す、配列を有する。HBMは、マウスPGC-1βのアミノ酸配列中の、配列番号2の683乃至686アミノ酸残基あたり（図２）に同定された。HBMはまた、ヒトPGC-1βのアミノ酸配列中の、配列番号5の677乃至680アミノ酸残基あたり（図５）に同定された。HBMはまた、マウスPGC-1αのアミノ酸配列中の、配列番号9の382乃至385アミノ酸残基あたり、およびヒトPGC-1αのアミノ酸配列中の、配列番号11の383乃至386アミノ酸残基あたりに同定された。
【００５０】
別の実施態様では、本願発明のPGC-1β分子は、タンパク質または対応する核酸分子中に少なくとも1つの「グルタミン酸／アスパラギン酸リッチ酸性ドメイン」を含む。本願明細書で用いられる「グルタミン酸／アスパラギン酸リッチ酸性ドメイン」には、約10乃至40、12乃至35、14乃至30、16乃至25、または好ましくは約18、21、または23アミノ酸残基のタンパク質ドメインが含まれる。グルタミン酸／アスパラギン酸リッチ酸性ドメインは、転写、RNA-タンパク質複合体の構築、およびタンパク質構造の修飾を含むさまざまな生物学的プロセスを調節するタンパク質の中に認められる。好ましい実施態様では、グルタミン酸／アスパラギン酸リッチ酸性ドメインにあるアミノ酸残基はすべて酸性残基（たとえばグルタミン酸またはアスパラギン酸）である。他の実施態様では、グルタミン酸／アスパラギン酸リッチ酸性ドメインは、酸性ではないアミノ酸残基を少なくとも1、2、3、4、5、6、7、または8つ有していてもよい。好ましくは、PGC-1β分子は少なくとも2つのグルタミン酸／アスパラギン酸リッチ酸性ドメインを含む。2つのグルタミン酸／アスパラギン酸リッチ酸性ドメインが、マウスPGC-1βのアミノ酸配列中の、配列番号2の429乃至451および798乃至815アミノ酸残基あたり（図２）に同定された。2つのグルタミン酸／アスパラギン酸リッチ酸性ドメインが、ヒトPGC-1βのアミノ酸配列中の、配列番号5の418乃至438および793乃至810アミノ酸残基あたり（図５）に同定された。
【００５１】
好ましい実施態様では、本願発明のPGC-1β分子には、LXXLL モチーフ、 RRM、 AD、HBM、および／またはグルタミン酸／アスパラギン酸リッチ酸性ドメインのうち少なくとも1つ以上のドメインが含まれる。
【００５２】
本願発明の単離されたタンパク質、好ましくはPGC-1βは、配列番号2または5のアミノ酸配列に十分に同一なアミノ酸、または配列番号1、3、4または6に十分に同一な核酸によってコードされるアミノ酸配列に十分に同一なアミノ酸を有する。本願明細書で用いられる「十分に同一」という文言は、第2のアミノ酸またはヌクレオチド配列に同一なまたは同等の（たとえば類似の側鎖を有するアミノ酸残基など）十分なまたは最小の数のアミノ酸残基またはヌクレオチドを含み、第1と第2のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列が共通の構造ドメインもしくはモチーフ、および／または共通の機能的活性を共有する、第1のアミノ酸またはヌクレオチド配列を意味する。たとえば、共通の構造ドメインを共有するアミノ酸またはヌクレオチド配列が、そのドメインのアミノ酸配列全体において少なくとも30%、40%、または50%の相同性、好ましくは60%の相同性、より好ましくは70乃至80%、およびよりさらに好ましくは90乃至95%の相同性を有し、少なくとも1つおよび好ましくは2つの構造ドメインまたはモチーフを含んでいるアミノ酸またはヌクレオチド配列を、本願明細書では十分に同一であると定義する。さらに、少なくとも30%、40%、または50%の相同性、好ましくは60%、より好ましくは70乃至80%、または90 %の相同性を共有し、共通の機能的活性を共有するアミノ酸またはヌクレオチド配列を、本願明細書では十分に同一であると定義する。
【００５３】
本願明細書では交換可能に用いられる「PGC-1β活性」、「PGC-1βの生物学的活性」、または「PGC-1βの機能的活性」という文言は、標準技術に従ってin vivoまたはin vitroで決定された、PGC-1βタンパク質、ポリペプチド、または核酸分子が、PGC-1β反応性細胞もしくは組織、またはPGC-1βタンパク質基質に作用を与える活性を意味する。ある実施態様では、PGC-1β活性は、PGC-1β標的分子との結合などの直接的な活性である。本願明細書に記載の「標的分子」または「結合パートナー」は、PGC-1β媒介機能が実現するように、PGC-1βが事実上結合するまたは相互作用する分子である。例示的な実施態様では、PGC-1β標的分子は核内受容体（たとえばHNF4α、PPARα、レチノイン酸受容体α（RARα）、甲状腺ホルモン受容体β（TRβ）、および糖質コルチコイド受容体（GR））、宿主細胞因子（HCF）、核呼吸因子1（NRF1）、または基礎転写因子である。代替的には、PGC-1β活性はPGC-1βタンパク質とPGC-1β標的分子との相互作用によって媒介される細胞シグナル伝達活性などの間接的な活性である。PGC-1βの生物学的な活性は、本願明細書に記載される。たとえば、本願発明のPGC-1βタンパク質は以下の1つ以上の活性を有してよい。それは1）核内受容体（たとえばHNF4α、PPARα、レチノイン酸受容体α（RARα）、甲状腺ホルモン受容体β（TRβ）、および糖質コルチコイド受容体（GR））との相互作用、2）HCFとの相互作用、3）NRF1との相互作用、4）基礎転写因子との相互作用、5）核内受容体および／またはNRF1の、たとえば転写活性などの活性の調節、6）褐色脂肪細胞決定および／または分化の調節、7）細胞内または細胞間シグナル伝達の調節、8）ウイルス感染（たとえばHCFとの相互作用を介した）の調節、9）細胞増殖の調節、10）代謝の調節、11）ミトコンドリア活性および／または生合成の調節、および12）脂肪酸β酸化の調節、である。
【００５４】
したがって、本願発明の別の実施態様では、PGC-1β活性を有する分離されたPGC-1βタンパク質およびポリペプチドを特徴とする。他の好ましいタンパク質は、LXXLL モチーフ、 RRM、 AD、HBM、および／またはグルタミン酸／アスパラギン酸リッチ酸性ドメインのうち少なくとも1つ以上のドメイン、好ましくはPGC-1β活性を有するPGC-1βタンパク質である。
【００５５】
別の好ましいタンパク質は、LXXLL モチーフ、 RRM、 AD、HBM、および／またはグルタミン酸／アスパラギン酸リッチ酸性ドメインのうち少なくとも1つを有し、好ましくは配列番号1、3、4または6の配列を含む核酸分子の相補体とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされている。
【００５６】
単離されたマウスPGC-1βcDNAのヌクレオチド配列は図1A乃至1B、および配列番号1に示されており、予測されたマウスPGC-1βポリペプチドのアミノ酸配列は図2および配列番号2に示されている。単離されたヒトPGC-1βcDNAのヌクレオチド配列は図3A乃至3Bおよび配列番号4に示されており、予測されたヒトPGC-1βポリペプチドのアミノ酸配列は図4および配列番号5に示されている。これらの寄託はBudapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure（特許手続上微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約）の条項に従って維持されるであろう。これらの寄託は単に当業者の便宜上行われたもので、35 U.S.C. ss112によって要求される寄託であると自認するものではない。
【００５７】
マウスPGC-1β遺伝子は長さが約3664ヌクレオチドで、約111.5kDの分子量を有するタンパク質をコードし、アミノ酸残基の長さは約1014である。ヒトPGC-1β遺伝子は長さが約3030ヌクレオチドで、約111.0kDの分子量を有するタンパク質をコードし、アミノ酸残基の長さは約1009である。
【００５８】
本願発明のさまざまな局面を、以下のサブセクションに詳述する。
【００５９】
I.  単離された核酸分子
本願発明のある局面は、PGC-1βタンパク質または生物学的に活性なその部分をコードする単離された核酸分子、ならびにPGC-1βコード核酸分子（たとえばPGC-1βmRNA）を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして用いるのに十分な核酸断片、およびPGC-1β核酸分子を増幅または突然変異させるためのPCRプライマとしてもちいるための断片に関連する。本願明細書に用いられる「核酸分子」は、DNA分子（たとえばcDNAまたはゲノムDNA）、およびRNA（たとえばmRNA）ならびにヌクレオチド類似体を用いて生成したDNAまたはRNAの類似体を含むことを意図する。本願発明の核酸分子は1本鎖または2本鎖であってよいが、好ましくは2本鎖DNAである。
【００６０】
「単離された核酸分子」という用語には、核酸の天然供給源に存在するその他の核酸分子から単離された核酸分子が含まれる。たとえば、ゲノムDNAに関しては、「単離された」という用語には、もともとゲノムDNAを伴っている染色体から単離された核酸分子が含まれる。好ましくは「単離された」核酸分子は、核酸が由来する生物のゲノムDNAにおいて前記核酸に天然で隣接する配列（すなわち核酸の5’および3’末端に位置する配列）がない。たとえば、さまざまな実施態様において、前記の単離されたPGC-1β核酸分子は、前記核酸が由来する細胞のゲノムDNAの中にある、前記核酸分子に天然に隣接する、約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb、または0.1kb未満のヌクレオチドを含有してよい。さらに、cDNA分子などの「単離された」核酸分子は、組換え技術によって産生された場合にはその他の細胞性物質または培養培地を実質的に含まなくてよく、または化学的に合成された場合には化学前駆体またはその他の化学物質を実質的に含まなくてよい。
【００６１】
たとえば配列番号1、3、4、もしくは6のヌクレオチド配列またはその部分を有する核酸分子などの本願発明の核酸分子は、標準の分子生物学的技術および本願明細書において提供する配列情報を用いて単離することができる。配列番号1、3、4、もしくは6の核酸分子の全体または部分をハイブリダイゼーションプローブとして用いて、PGC-1β核酸分子を標準ハイブリダイゼーションおよびクローニング法を用いて単離することができる（たとえばSambrook, J., Fritsh, E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載の通り）。
【００６２】
さらに、配列番号1、3、4、もしくは6の核酸分子の全体または部分を包含する核酸分子は、配列番号1、3、4、もしくは6の配列をもとにデザインされた合成オリゴヌクレオチドプライマを用いて、ポリメラーゼ鎖反応（PCR）によって単離することができる。
【００６３】
本願発明の核酸は、cDNA、mRNA、またはそのかわりにゲノムDNAを、標準PCR増幅技術にしたがったテンプレートおよび適切なオリゴヌクレオチドプライマとして用いて、増幅することができる。そのように増幅された核酸を適切なベクターにクローニングし、DNA配列解析によって特徴付けを行うことができる。さらに、PGC-1βヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、たとえば自動化DNA合成装置など、標準の合成技術によって調製することができる。
【００６４】
好ましい実施態様では、本願発明の単離された核酸分子は配列番号1、3、4、もしくは6に示されたヌクレオチド配列を含む。このcDNAはマウスPGC-1βタンパク質をコードする配列とともに、配列番号1の5’未翻訳配列（ヌクレオチド1乃至64）および3’未翻訳配列（ヌクレオチド3170乃至3664）をコードする配列を含んでよい。代替的には、核酸分子は配列番号1のコード領域（たとえば配列番号3に対応するヌクレオチド65乃至3106）のみを含むことができる。したがって、別の実施態様では、本願発明の単離された核酸分子は配列番号3および配列番号1のヌクレオチド1乃至65を含む。さらに別の実施態様では、単離された核酸分子は配列番号3および配列番号1のヌクレオチド3107乃至3664を含む。さらに別の実施態様では、前記核酸分子は配列番号1または配列番号3に記載のヌクレオチド配列からなる。さらに別の実施態様では、前記核酸分子は配列番号1のコード領域（たとえば配列番号3に相当するヌクレオチド65乃至3106）とともに終止コドン（配列番号1のヌクレオチド3107乃至3109）を含んでもよい。
【００６５】
このcDNAは、ヒトPGC-1βタンパク質（すなわちヌクレオチド1乃至3027の「コーディング領域」）、および配列番号4の終止コドン（ヌクレオチド3028乃至3030）を含んでよい。代替的には、前記核酸分子は配列番号4のコード領域（たとえば配列番号6に対応するヌクレオチド1乃至3027）のみを含むことができる。さらに別の実施態様では、前記核酸分子は配列番号4または配列番号6に記載のヌクレオチド配列からなる。
【００６６】
別の好ましい実施態様では、本願発明の単離された核酸分子は配列番号1、3、4、もしくは6またはこれらのヌクレオチド配列のいずれかの部分に示されるヌクレオチド配列の相補体である核酸分子を含む。配列番号1、3、4、もしくは6に示すヌクレオチド配列に相補的な核酸分子は、配列番号1、3、4、もしくは6に示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズして安定な2本鎖を形成することができるように配列番号1、3、4、もしくは6に示されるヌクレオチド配列に十分相補的なものである。
【００６７】
さらに別の好ましい実施態様では、本願発明の単離された核酸分子は、配列番号1、3、4、もしくは6に示す核酸配列の全長またはこれらのヌクレオチド配列のいずれかの部分に、少なくとも約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、99.99%またはそれ以上同一なヌクレオチド配列を含む。
【００６８】
さらに、本願発明の核酸分子は、たとえばプローブもしくはプライマとして用いられる断片、またはたとえばPGC-1βタンパク質の生物学的に活性な部分などのPGC-1βタンパク質の一部分をコードする断片など、配列番号1、3、4、または6の核酸配列の一部分だけを含むことができる。PGC-1β遺伝子のクローニングから決定されたヌクレオチド配列は、その他のPGC-1βファミリメンバならびに他の種のPGC-1β相同体の同定および／またはクローニングに用いるためにデザインされたプローブまたはプライマの生成を可能にする。プローブ／プライマは典型的には実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。前記オリゴヌクレオチドは典型的に、ストリンジェントな条件下において、配列番号1、3、4、または6のセンス配列、配列番号1、3、4、または6のアンチセンス配列、または配列番号1、3、4、または6の天然に存在する対立遺伝子変異体または突然変異体の、少なくとも約12または15、好ましくは約20または25、さらに好ましくは約30、35、40、45、50、55、60、65、または75個の連続するヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。ある実施態様では、本願発明の核酸分子は、長さが50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、457、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000、2050、2100、2150、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2600、2650、2700、2750、2800、2850、2900、2950、3000、3050、3100、3150、3200、3250、3300、3350、3400、3450、3500、3550、3600ヌクレオチドまたはそれ以上であって、ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件下において配列番号1、3、4、または6の核酸分子にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。
【００６９】
PGC-1βヌクレオチド配列に基づくプローブは、同一のまたは相同性のタンパク質をコードする転写物またはゲノム配列を検出するために用いることができる。好ましい実施態様では、前記プローブはさらにそれに結合させた標識基を含み、たとえば前記標識基は放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補助因子であってよい。そのようなプローブは、たとえばPGC-1βmRNAレベルを検出するかまたはゲノムPGC-1β遺伝子が突然変異しているかまたは削除されているかどうかを決定するなど、対象から採取した細胞のサンプル中のPGC-1βコード核酸のレベルを測定するなどによって、PGC-1βタンパク質を誤発現する細胞または組織を同定する診断用テストキットの一部として用いることができる。
【００７０】
「PGC-1βタンパク質の生物学的に活性な部分」をコードする核酸断片は、PGC-1βの生物学的活性（PGC-1βタンパク質の生物学的活性は本願明細書に記載）を有するポリペプチドをコードする配列番号1、3、4、または6のヌクレオチド配列の一部分を単離するステップと、PGC-1βタンパク質のコードされた部分を発現させるステップと（たとえばin vitroにおける組換え発現によって）、およびPGC-1βタンパク質のコードされた部分の活性を評価するステップによって調製することができる。
【００７１】
本願発明はさらに、遺伝子コードの縮重のために配列番号1、3、4、または6に示されるヌクレオチド配列とは異なり、そのため配列番号1、3、4、または6に示されるヌクレオチド配列によってコードされたものと同一のPGC-1βタンパク質をコードする核酸分子を包含し、本願発明のある単離された核酸分子は、配列番号2または5に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【００７２】
配列番号1、3、4、または6に示されるPGC-1βヌクレオチド配列に加えて、当業者は、個体群（たとえばヒト群）の中に、PGC-1βタンパク質のアミノ酸配列に変化を生じるDNA配列多型が存在することを理解するであろう。PGC-1β遺伝子におけるこのような遺伝子多型は、天然の対立遺伝子変異があるために、個体群の個体間に存在してよい。本願明細書に記載のとおり、「遺伝子」および「組換え遺伝子」という用語は、PGC-1βタンパク質、好ましくは哺乳類PGC-1βタンパク質をコードする翻訳領域を含む核酸分子を意味し、さらに非翻訳調節領域およびイントロンを含んでもよい。
【００７３】
ヒトPGC-1βの対立遺伝子変異体には、機能性タンパク質および非機能性PGC-1βタンパク質の両方が含まれる。機能性対立遺伝子変異体は、PGC-1β標的分子に結合する能力を有し、およびまたは転写および／または細胞分化および／または増殖機序を調節する、ヒトPGC-1βタンパク質の天然に存在するアミノ酸配列変異体である。機能性対立遺伝子変異体は、典型的には、配列番号2または5の1つ以上のアミノ酸の保存的置換のみか、またはタンパク質の重要ではない領域の重要ではない残基の置換、削除、もしくは挿入を含むであろう。
【００７４】
非機能性対立遺伝子変異体は、PGC-1β標的分子に結合する能力か、および／または本願明細書に記載のPGC-1β活性のいずれかを調節する能力のいずれかを有さない、マウスまたはヒトPGC-1βタンパク質の天然に存在するアミノ酸配列変異体である。非機能性対立遺伝子変異体は、典型的には非保存的置換、配列番号2または5のアミノ酸配列の削除もしくは挿入もしくは未成熟な切断か、または前記タンパク質の重要な残基または重要な領域の置換、挿入、もしくは削除を含む。
【００７５】
本願発明はさらに、マウスまたはヒトPGC-1βタンパク質の非ヒト相同分子種を提供する。マウスまたはヒトPGC-1βの相同分子種は、非ヒト生物から分離されたタンパク質で、本願明細書に記載の通り、マウスまたはヒトPGC-1βと同一のPGC-1β活性を有する。マウスまたはヒトPGC-1βの相同分子種は、配列番号2または5と実質的に同一のアミノ酸配列を含むと容易に同定することができる。
【００７６】
さらに、他のPGC-1βファミリメンバをコードする核酸分子であって、その結果配列番号1、3、4または6のPGC-1β配列とは異なるヌクレオチド配列を有する当該核酸分子は、本願発明の範囲内であることを意図する。たとえば、別のPGC-1βcDNAはマウスまたはヒトPGC-1βのヌクレオチド配列に基づいて同定することができる。さらに、異なる種に由来するPGC-1βタンパク質をコードする核酸分子であって、その結果配列番号1、3、4または6のPGC-1β配列とは異なるヌクレオチド配列を有する当該核酸分子は、本願発明の範囲内であることを意図する。たとえば、マウスPGC-1βcDNAはマウスまたはヒトPGC-1βのヌクレオチド配列に基づいて同定することができる。
【００７７】
本願発明のPGC-1βcDNAの天然の対立遺伝子変異体および相同体に相当する核酸分子は、本願明細書に開示したPGC-1β核酸への相同性に基づいて、本願明細書に開示したcDNAまたはその一部分をハイブリダイゼーションプローブとして使用して、標準のハイブリダイゼーション技術に従って、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において単離することができる。本願発明のPGC-1βcDNAの天然の対立遺伝子変異体および相同体に対応する核酸分子は、さらに、PGC-1β遺伝子に同一の染色体または座位にマッピングすることによって単離することができる。
【００７８】
したがって、別の実施態様では、本願発明の分離された核酸分子は、長さが少なくとも15, 20、25、30、35、40、45、50又はそれ以上のヌクレオチドであって、ストリンジェントな条件下において配列番号1、3、4または6のヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズする。他の実施態様では、前記核酸分子は、長さが少なくとも50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、457、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000、2050、2100、2150、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2600、2650、2700、2750、2800、2850、2900、2950、3000、3050、3100、3150、3200、3250、3300、3350、3400、3450、3500、3550、3600ヌクレオチドまたはそれ以上である。
【００７９】
本願明細書に記載の「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という文言は、相互に著しく同一であるかまたは相同的であるヌクレオチド配列を相互にハイブリダイズさせたまま、ハイブリダイゼーションおよび洗浄を行うための条件を記述することを意図する。好ましくは少なくとも約70%、より好ましくは少なくとも約80%、さらにより好ましくは少なくとも約85%または90%、相互に同一である配列が、相互にハイブリダイズしたままになるような状態である。そのようなストリンジェントな条件は、当業に公知であり、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc. (1995), sections 2, 4, および6に見つけることができる。さらなるストリンジェントな条件は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), chapters 7, 9, および11に見つけることができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい、限定されない例には、4X塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（SSC）中での約65乃至70℃におけるハイブリダイゼーション（または代替的には4X SSCプラス50%ホルムアミド中での約42乃至50℃におけるハイブリダイゼーション）であって、その後に、1X SSCで65乃至70℃において1回以上洗浄する、ハイブリダイゼーションが含まれる。高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい、限定されない例には、1X SSC中での約65乃至70℃におけるハイブリダイゼーション（または代替的には1X SSCプラス50%ホルムアルデヒド中での約42乃至50℃におけるハイブリダイゼーション）であって、その後に0.3X SSC中で約65乃至70℃において洗浄する、ハイブリダイゼーションが含まれる。ストリンジェンシーの低いハイブリダイゼーション条件の好ましい、制限されない例には、4X SSC中での約50乃至60℃におけるハイブリダイゼーション（または代替的には6X SSCプラス50%ホルムアルデヒド中での約40乃至45℃におけるハイブリダイゼーション）であって、その後に2X SSC中で約50乃至60℃において1回以上洗浄する、ハイブリダイゼーションが含まれる。たとえば65乃至70℃、または42乃至50℃という上述の値の中間範囲も、本願発明に包含されることを意図する。SSPE（1xSSPEは0.15M NaCl、10mMNaH2PO4、および1.25mM EDTA、pH7.4）は、前記ハイブリダイゼーションおよび洗浄バッファにおいてSSC（1X SSCは0.15M NaClおよび15mMクエン酸ナトリウム）で代替することができ、洗浄はハイブリダイゼーションが1回終わるごとに15分間行う。長さが50塩基対未満であると予測されるハイブリッド用のハイブリダイゼーション温度は、前記ハイブリッドの融解点（Tm）よりも5乃至10℃低い温度であるべきであって、当該Tm温度においてTmは以下の式に従って決定する。長さが18塩基対未満のハイブリッドでは、Tm(oC) = 2(A塩基の数 +T塩基の数) + 4( G塩基の数 + C 塩基の数)である。長さが18乃至49塩基対のハイブリッドでは、Tm(oC) = 81.5 + 16.6(log10[Na+]) + 0.41(%G+C) - (600/N)であって、当該式においてNはハイブリッド中の塩基の数で、[Na+]はハイブリダイゼーションバッファ中のナトリウムイオンの濃度である（1X SSC = 0.165 Mの[Na+]）。たとえばニトロセルロースまたはナイロン膜などの膜への核酸分子の非特異的なハイブリダイゼーションを減少させるために、たとえば、遮断剤（たとえばBSAまたはシャケもしくはニシン精子キャリアDNA）、界面活性剤（たとえばSDS）、キレート剤（たとえばEDTA）、フィコール、およびPVPなどをそれらに限定せずに含む、さらなる試薬をハイブリダイゼーションおよび／または洗浄バッファに加えてもよいことは、当業者は認識するであろう。特にナイロン膜を使用する場合、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のさらなる好ましい、限定されない例は0.25乃至0.5M NaH2PO4、7% SDS で約 65oCでのハイブリダイゼーションであって、その後0.02M NaH2PO4、1% SDS、または0.2X SSC、1% SDSで65oCで1回以上洗浄するハイブリダイゼーションである。(たとえばChurch and Gilbert (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1991-1995参照)。
【００８０】
好ましくは、ストリンジェントな条件下で配列番号1、3、4または6の配列へハイブリダイズし、天然に存在する核酸分子に対応する、本願発明の単離された核酸分子である。本願明細書に用いられる「天然に存在する」核酸分子とは、天然に生じる（たとえば天然のタンパク質をコードする）ヌクレオチド配列を有するRNAまたはDNA分子を意味する 。
【００８１】
前記の個体群に存在する可能性があるPGC-1β配列の天然に存在する対立遺伝子変異体に加えて、当業者は、配列番号1、3、4または6のヌクレオチド配列に突然変異によって変化を導入することができ、それによって、PGC-1βタンパク質の機能的な能力を変化させずにコードされたPGC-1βタンパク質のアミノ酸配列を変化させることが可能であることをさらに理解するであろう。たとえば、配列番号1、3、4または6の配列に、「必須ではない」アミノ酸残基におけるアミノ酸置換を引き起こすヌクレオチド置換を生じさせることができる。「必須ではない」アミノ酸残基は、生物学的な活性を変化させることなくPGC-1βの野生型配列（たとえば配列番号2または5の配列）から変化させることができる残基であるが、一方、「必須の」アミノ酸残基は生物学的活性に必要である。たとえば、本願発明のPGC-1βタンパク質の中で保存されているアミノ酸残基、たとえば活性化ドメインに存在するアミノ酸残基、LXXLLモチーフ、またはHBMなどは、特に変化させるのが難しいと予測される。さらに、本願発明のPGC-1βタンパク質とPGC-1ファミリのその他のメンバの間で保存されているさらなるアミノ酸残基は、変化させることはできないと考えられる。
【００８２】
したがって、本願発明の別の局面は、活性に必須ではないアミノ酸残基の変化を含むPGC-1βタンパク質をコードする核酸分子に関連する。そのようなPGC-1βタンパク質は、アミノ酸配列が配列番号2または5とは異なるが、生物学的活性は保持している。ある実施態様では、前記の分離された核酸分子はあるタンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、当該配列において前記タンパク質は配列番号2または5に少なくとも約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、99.99%またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む、ヌクレオチド配列を含む。
【００８３】
配列番号2または5のタンパク質と同一のPGC-1βタンパク質をコードする単離された核酸分子は、配列番号1、3、4または6のヌクレオチド配列に1つ以上のヌクレオチドの置換、付加、または欠失を導入して、コードされたタンパク質に1つ以上のアミノ酸の置換、付加、または欠失を導入することによって、作製することができる。突然変異は、部位特異的突然変異誘発法およびPCRよる突然変異誘発法などの標準技術によって、配列番号1、3、4または6に導入することができる。好ましくは、保存的アミノ酸置換を1つ以上の予測される非必須アミノ酸残基に生じさせる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基を同様の側鎖を有するアミノ酸残基と交換する置換である。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリは、当業で定義されている。このようなファミリには、塩基性側鎖（たとえばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（たとえばアスパルギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（たとえばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（たとえばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（たとえばスレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（たとえばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。したがって、PGC-1βタンパク質の中で予測される非必須アミノ酸残基は、好ましくは同一の側鎖ファミリの別のアミノ酸残基と置換される。代替的には、別の実施態様では、突然変異は、飽和突然変異誘導法などによってPGC-1βコード配列の全体または部分に無作為に導入することができ、得られた突然変異体をPGC-1β生物学的アッセイについてスクリーニングして活性を保持している突然変異体を同定することができる。配列番号1、3、4または6の突然変異誘導後、前記のコードされたタンパク質を発現させて、タンパク質の活性を決定することができる。
【００８４】
好ましい実施態様では、突然変異PGC-1βタンパク質は、核内受容体HCFおよび／またはNRF1との相互作用および／または同時活性化能力、褐色脂肪細胞分化の調節能力、および／またはミトコンドリア活性および／もしくは生合成の調節能力について、アッセイすることができる。
【００８５】
上述のPGC-1βタンパク質をコードする核酸分子に加えて、本願発明の別の局面は、それに対してアンチセンスの単離された核酸分子に関連する。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的なヌクレオチド配列であって、たとえば2本鎖cDNA分子のコード鎖に相補的であるか、またはmRNA配列に相補的である、ヌクレオチド配列を含む。したがって、アンチセンス核酸は、センス核酸に水素結合することができる。アンチセンス核酸はPGC-1βコード鎖全体、またはその一部分だけに相補的であってよい。ある実施態様では、アンチセンス核酸分子はPGC-1βをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対してアンチセンスである。「コード領域」とは、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域を意味する（たとえばマウスPGC-1βのコード領域は配列番号3に相当し、ヒトPGC-1βのコード領域は配列番号6に相当する）。別の実施態様では、アンチセンス核酸分子は、PGC-1βをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」に対してアンチセンスである。「非コード領域」とは、コード領域に隣接している、アミノ酸に翻訳されない5’および3’配列を意味する（5’および3’非翻訳領域ともよばれる）。
【００８６】
本願明細書に開示されるPGC-1βをコードするコード鎖配列があれば（たとえば配列番号3または6）、本願発明のアンチセンス核酸は、ワトソン・クリック塩基対の法則に従ってデザインすることができる。アンチセンス核酸分子は、PGC-1βmRNAのコード領域全体に相補的であってよいが、さらに好ましくはPGC-1βmRNAのコード領域または非コード領域の一部分だけにアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。たとえば、アンチセンスのオリゴヌクレオチドは、PGC-1βmRNAの翻訳開始部位の周辺領域に相補的であってよい。アンチセンスヌクレオチドは、たとえば、長さが約5、10、15、20、25、30、35、40、45 または50ヌクレオチドであってよい。本願発明のアンチセンス核酸は、当業に既知の手順を用いて、化学合成および酵素ライゲーションを用いて、作製することができる。たとえば、アンチセンス核酸（たとえばアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、または分子の生物学的安定性を増す、またはアンチセンスとセンス核酸で形成された2本鎖の物理的安定性を増すようにデザインされた各種の修飾されたヌクレオチドを用いて、化学合成することができ、たとえばホスホロチオネート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを用いることができる。アンチセンス核酸を作製するために用いることができる修飾されたヌクレオチドの例には、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β-D-ガラクトシルケオシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルケオシン、5-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸（v）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、ケオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸（v）、5-メチル-2-チオウラシル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシル、(acp3)w、および2,6-ジアミノプリンが含まれる。代替的には、アンチセンス核酸は、アンチセンス配向に核酸をサブクローニングした発現ベクターを用いて生物学的に産生することができる（すなわち、以下のサブセクションにさらに記載されるように、挿入した核酸から転写されたRNAは、目的とする標的核酸に対してアンチセンス配向になるだろう）。
【００８７】
本願発明のアンチセンス核酸分子は、典型的には、対象に投与されるかまたはin situで産生され、PGC-1βタンパク質をコードする、細胞mRNAおよび／またはゲノムDNAにハイブリダイズするか、または結合し、それによってたとえば転写および／または翻訳の阻害などによってタンパク質の発現を阻害する。ハイブリダイゼーションは、安定な2本鎖を形成する従来のヌクレオチド相補性によるか、またはたとえばDNA2本鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合は2重らせんの大溝での特異的な相互作用を介してよい。本願発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例には、組織部位への直接注射が含まれる。代替的には、アンチセンス核酸分子は、特定の細胞を標的とするように修飾して全身投与してもよい。たとえば、全身投与の場合、アンチセンス分子を、たとえば細胞表面の受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体をアンチセンスの核酸分子に結合させることによって、特定の細胞表面上に発現させた受容体または抗原に特異的に結合するように修飾することができる。アンチセンス核酸分子はまた、本願明細書に記載のベクターを用いて細胞に送達することもできる。アンチセンス分子を十分な細胞内濃度にするために、アンチセンス核酸分子を強力なpolIIまたはpolIIIプロモータの制御下においたベクターコンストラクトが好ましい。
【００８８】
さらに別の実施態様では、本願発明のアンチセンス核酸分子はαアノマー核酸分子である。αアノマー核酸分子は、通常のβユニットとは反対に鎖がお互いに平行に並んでいる相補的なRNAと、特異的な2本鎖ハイブリッドを形成している (Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:6625-6641)。アンチセンス核酸分子はまた、2’-o-メチルリボヌクレオチド（Inoue et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:6131-6148）、またはキメラRNA-DNA類似体（Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215:327-330）を含んでもよい。
【００８９】
さらに別の実施態様では、本願発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、リボヌクレアーゼ活性を有する触媒性のRNA分子で、それが相補的な領域を有するmRNAなどの1本鎖核酸を切断する能力がある。したがって、リボザイム（たとえばハンマーヘッドリボザイム（Haseloff and Gerlach (1988) Nature 334:585-591に記載））を用いて、PGC-1βmRNA転写物を触媒的に切断してPGC-1βmRNAの翻訳を阻害することができる。PGC-1βコード核酸への特異性を有するリボザイムは、本願明細書に記載のPGC-1βcDNAのヌクレオチド配列（すなわち配列番号1、3、4または6）に基づいてデザインすることができる。たとえば、テトラヒメナL-19 IVS RNAの誘導体は、活性部位のヌクレオチド配列が、PGC-1βコードmRNA中の解離されるヌクレオチド配列に相補的になるように作製することができる。たとえばCech et al. U.S. Patent No. 4,987,071; and Cech et al. U.S. Patent No. 5,116,7 42参照。代替的にはPGC-1βmRNAを用いてRNA分子プールの中から特異的なリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性RNAを選択することができる。たとえばBartel, D. and Szostak, J.W. (1993) Science 261:1411-1418参照。
【００９０】
代替的には、PGC-1β遺伝子発現を、PGC-1βの調節領域に相補的なヌクレオチド配列（たとえばPGC-1βプロモータおよび／またはエンハンサ）を標的とすることによって阻害し、標的細胞にあるPGC-1β遺伝子の転写を阻害する3重らせん構造を形成することができる。一般的にはHelene, C. (1991) Anticancer Drug Des. 6(6):569-84; Helene, C. et al. (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36; and Maher, L.J. (1992) Bioessays 14(12):807-15参照。
【００９１】
さらに別の実施態様では、本願発明のPGC-1β核酸分子は、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格を修飾して、その分子の安定性、ハイブリダイゼーション、溶解性などを改良することができる。たとえば、核酸分子のリン酸デオキシリボース骨格を修飾して、ペプチド核酸を生成することができる (Hyrup, B. and Nielsen, P.E. (1996) Bioorg. Med. Chem. 4(1):5-23参照)。本願明細書に用いられる、「ペプチド核酸」または「PNA」は、リン酸デオキシリボース骨格を疑似ペプチド骨格に置換し、天然の核酸塩基を4つだけ保持している、たとえばDNA模倣体などの核酸模倣体を意味する。PNAの中性骨格は、低イオン強度条件下においてDNAおよびRNAへ特異的にハイブリダイズできることが明らかになっている。PNAオリゴマーの合成は、Hyrup and Nielsen (1996) 上記 and Perry-O’Keefe et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14670-675に記載の標準の固相ペプチド合成プロトコルを用いて行うことができる。
【００９２】
PGC-1β核酸分子のPNAは、治療および診断用途に用いることができる。たとえば、PNAは、たとえば転写もしくは翻訳停止または複製の阻害を誘導することによって、遺伝子発現の配列特異的な調節のための、アンチセンスまたは抗遺伝子物質として用いることができる。PGC-1β核酸分子のPNAはまた、遺伝子の中の1塩基対の突然変異の解析に用いるか（たとえばPNA特異的PCRクランピング）、または他の酵素と併用して「人工制限酵素」として用いるか（たとえばHyrup and Nielsen (1996) 上記））、またはDNA配列決定またはハイブリダイゼーションのプローブもしくはプライマとして用いる（たとえばHyrup and Nielsen (1996) 上記; Perry-O’Keefe et al. (1996) 上記）こともできる。
【００９３】
別の実施態様では、親油性またはその他のヘルパー基をPNAに結合させるか、PNA-DNAキメラをつくるか、もしくはリポソームを使用するか、またはその他の当業に公知のその他の薬物送達技術によって、PGC-1βのPNAを修飾することができる（たとえば安定性または細胞取り込みを増強させるために）。たとえば、PNAおよびDNAの有利な特性を併せ持つ可能性があるPGC-1β核酸分子のPNA-DNAキメラを作製することができる。そのようなキメラは、一方でDNA認識酵素（たとえばRNAse HおよびDNAポリメラーゼ）がDNA部分と相互作用し、もう一方でPNA部分が高い結合親和性および特異性を提供する。PNA-DNAキメラは塩基スタッキング、核酸塩基間の結合数および配向について選択された適切な長さのリンカーを用いて結合させることができる（Hyrup and Nielsen (1996) 上記）。PNA-DNAキメラの合成は、Hyrup and Nielsen (1996) 上記およびFinn P.J. et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24 (17):3357-63に記載されるように行うことができる。たとえば、DNA鎖は、標準のホスホラミジト結合化学を用いて固体支持体上で合成することができ、たとえば5’-(4-メトキシトリチル)アミノ-5’-デオキシ-チミジンホスホラミジトなどの修飾されたヌクレオシド類似体は、PNAとDNAの5’末端の間に用いることができる（Mag, M. et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:5973-88）。その後、PNAモノマーを順に結合して5’ PNAセグメントおよび3’ DNAセグメントを有するキメラ分子を作製する(Finn P.J. et al. (1996) 上記)。代替的には、キメラ分子は、5’ DNAセグメントおよび3’ PNAセグメントで合成することもできる（Peterser, K.H. et al. (1975) Bioorganic Med. Chem. Lett. 5:1119-11124）。
【００９４】
他の実施態様では、前記オリゴヌクレオチドには、ペプチドなどのその他の付加基（たとえばin vivoにおける宿主細胞受容体を標的とするための）、または細胞膜 (たとえば Letsinger et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6553-6556; Lemaitre et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:648-652、PCT 公報 第 WO 88/09810号参照)もしくは血液脳関門を通る輸送を容易にする物質(たとえば PCT 公報第 WO 89/10134号参照)が含まれてもよい。さらに、オリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーション誘導切断物質(たとえば Krol et al. (1988) Biotechniques 6:958-976参照) またはインターカレート物質 (たとえばZon (1988) Pharm. Res. 5:539-549参照)で修飾することができる。この目的のために、前記オリゴヌクレオチドを別の分子（たとえばペプチド、ハイブリダイゼーション誘導架橋物質、輸送物質、またはハイブリダイゼーション誘導切断物質など）と結合させてもよい。
【００９５】
代替的には、細胞株または微生物内の内因性PGC-1β遺伝子の発現特性を、非相同DNA調節要素を安定な細胞株のゲノムまたはクローン微生物に挿入することによって修飾し、挿入された調節要素が内因性PGC-1β遺伝子に作動的に連結されるようにしてもよい。たとえば、通常「転写的にサイレント」な内因性PGC-1β遺伝子、つまり通常発現しない、または細胞株または微生物中において非常に少量の場合のみ発現するPGC-1β遺伝子は、その細胞株または微生物の通常の発現遺伝子産生物の発現を促進する能力を持つ調節要素を挿入することによって、活性化されることがある。代替的には、転写的にサイレントな内因性PGC-1β遺伝子は、細胞種全体に作用する無差別の調節要素を挿入することによって活性化されることがある。
【００９６】
当業に公知でたとえばChappel, 米国特許第 5,272,071号; PCT 公報第 WO 91/06667号, 1991年5月16日発行、に記載の標的非相同組換えなどの技術を用いて、非相同調節要素を、内因性PGC-1β遺伝子に作動的に連結されるように安定細胞株またはクローン微生物に挿入することもできる。
【００９７】
II.  分離されたPGC-1βタンパク質および抗PGC-1β抗体
本願発明のある局面は、抗PGC-1β抗体を生じさせるための免疫原として用いるのに好適な分離されたPGC-1βタンパク質、生物学的に活性なその部分、およびポリペプチド断片に関する。ある実施態様では、ネイティブPGC-1βタンパク質は、標準タンパク質精製技術を用いて適切な精製スキームによって細胞または組織供給源から分離することができる。別の実施態様では、PGC-1βタンパク質を組換えDNA技術によって産生することができる。組換え発現の代わりに、PGC-1βタンパク質またはポリペプチドは標準ペプチド合成技術を用いて化学的に合成することができる。
【００９８】
「単離された」または「精製された」タンパク質または生物学的に活性なその部分は、そのPGC-1βタンパク質が由来する細胞または組織供給源に由来する細胞物質またはその他の夾雑タンパク質を実質的に含まず、または化学的に合成された場合には化学前駆体またはその他の化学物質を実質的に含まない。「細胞物質を実質的に含まない」という文言には、PGC-1βタンパク質を、分離したまたは組換え的に産生した細胞の細胞成分から分離する、PGC-1βタンパク質の調製が含まれる。ある実施態様では、「細胞物質を実質的に含まない」には、約30%未満（乾燥重量）の非PGC-1βタンパク質（本願明細書では「夾雑タンパク質ともよぶ」を有するPGC-1βタンパク質、さらに好ましくは約20%未満の非PGC-1βタンパク質、よりさらに好ましくは約10%未満の非PGC-1βタンパク質、および最も好ましくは約5%の未満非PGC-1βタンパク質を有するPGC-1βタンパク質の調製が含まれる。PGC-1βタンパク質または生物学的に活性なその部分が組換え的に産生される場合、培養培地を実質的に含まないことが好ましく、すなわちタンパク質調製物の体積のうち、培養培地が約20%未満、より好ましくは約10%未満、および最も好ましくは約5%未満であることが好ましい。
【００９９】
「化学前駆体またはその他の化学物質を実質的に含まない」という文言には、PGC-1βタンパク質を、タンパク質の合成に関与する化学前駆体またはその他の化学物質から分離する、PGC-1βタンパク質の調製が含まれる。ある実施態様では、「化学前駆体またはその他の化学物質を実質的に含まない」という文言には、約30%未満（乾燥重量による）の化学前駆体または非PGC-1β化学物質、より好ましくは約20%未満の化学前駆体または非PGC-1β化学物質、さらにより好ましくは約10%未満の化学前駆体または非PGC-1β化学物質、および最も好ましくは約5%未満の化学前駆体または非PGC-1β化学物質を有するPGC-1βタンパク質の調製が含まれる。
【０１００】
本願明細書に記載のPGC-1βタンパク質の「生物学的に活性な部分」には、PGC-1β分子および非PGC-1β分子の相互作用に関与するPGC-1βタンパク質の断片が含まれる。PGC-1βタンパク質の生物学的に活性な部分には、PGC-1βタンパク質の全長よりも短いアミノ酸を含み、PGC-1βタンパク質の少なくとも1つの活性を示す、たとえば配列番号2または5に示されるアミノ酸配列などの、PGC-1βタンパク質のアミノ酸配列と十分に同一のまたはそれに由来するアミノ酸配列を含むペプチドが含まれる。典型的には、生物学的に活性な部分は、たとえば、核内受容体および／または褐色脂肪細胞分化との相互作用および／または同時活性化などの、PGC-1βタンパク質の少なくとも1つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。PGC-1βタンパク質の生物学的に活性な部分は、たとえば長さが25、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000またはそれ以上のアミノ酸であるポリペプチドであってよい。PGC-1βタンパク質の生物学的に活性な部分は、たとえば転写応答などのPGC-1β媒介活性を調節する発達物質への標的として用いることができる。
【０１０１】
好ましい本願発明のPGC-1βタンパク質の生物学的に活性な部分には、少なくとも1つ以上のLXXLLモチーフ、RRM、AD、HBMおよび／またはグルタミン酸／アスパラギン酸リッチ酸性ドメインが含まれてよいということは理解されよう。さらに、前記タンパク質のその他の領域が削除されているその他の生物学的に活性な部分は、組換え技術によって調製することができ、ネイティブPGC-1βタンパク質の1つ以上の機能的な活性について評価することができる。
【０１０２】
好ましい実施態様では、前記PGC-1βタンパク質は配列番号2または5に示されるアミノ酸配列を有する。他の実施態様では、上述のサブセクションIに詳述の通り、前記PGC-1βタンパク質は配列番号2または5と実質的に同一であって、配列番号2または5のタンパク質の機能的な活性を保持しながら天然の対立遺伝子変異または突然変異原性のためにアミノ酸配列が異なる。したがって、別の実施態様では、PGC-1βタンパク質は配列番号2または5に少なくとも約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、99.99%またはそれ以上同一のアミノ酸配列を含むタンパク質である。
【０１０３】
2つのアミノ酸配列または2つの核酸配列の同一性の割合を決定するために、配列を最適な比較目的のために整列させる（たとえば最適な配列比較のために第1および第2のアミノ酸または核酸配列の片方または両方にギャップを導入することもでき、同一でない配列を比較のために無視することもできる）。好ましい実施態様では、比較目的のために整列させた参照配列は、その参照配列の長さの少なくとも30%、好ましくは少なくとも40%、さらに好ましくは少なくとも50%、よりさらに好ましくは少なくとも60%、およびよりさらに好ましくは少なくとも70%、80%、または90%である（たとえば、第2の配列を1014アミノ酸残基を有する配列番号2のマウスPGC-1βアミノ酸配列に整列させる場合、少なくとも304、好ましくは少なくとも406、さらに好ましくは少なくとも507、よりさらに好ましくは少なくとも608、およびよりさらに好ましくは少なくとも710、811、913、またはそれ以上のアミノ酸残基を整列させ、第2の配列を1009アミノ酸残基を有する配列番号5のPGC-1βアミノ酸配列と整列させる場合は、少なくとも303、好ましくは少なくとも404、より好ましくは少なくとも505、さらにより好ましくは少なくとも605、およびよりさらに好ましくは少なくとも706、807、908、またはそれ以上のアミノ酸残基を整列させる）。そして、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第1の配列のある位置が、第2の配列の対応する位置と同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められている場合、その分子はその位置において同一である（本願明細書に記載のアミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸の「相同性」と等価である）。2つの配列の同一性の割合は、その配列が共有する同一位置の数の関数であって、2つの配列の最適な配列比較のために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮する。
【０１０４】
2つの配列の比較と同一性の割合の決定は、数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。好ましい実施態様では、2つの配列の同一性の割合は、GCGソフトエアパッケージ（Genetics Computer Group社のウェブサイトからオンラインで入手可能）のGAPプログラムに組み込まれているNeedleman and Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970))アルゴリズムを用いて、Blosum 62マトリックスまたはPAM250マトリックスのいずれか、およびギャップ重み16、14、12、10、8、6、または4、および長さ重み1、2、3、4、5または6を用いて決定する。さらに別の好ましい実施態様では、2つのヌクレオチド配列の同一性の割合は、GCGソフトエアパッケージ（Genetics Computer Group社のウェブサイトからオンラインで入手可能）のGAPプログラムを用いて、NWSgapdna.CMPマトリックスおよびギャップ重み40、50、60、70、または80 および長さ重み 1、2、3、4、5、または6を用いて決定する。別の実施態様では、2つのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列の同一性の割合は、ALIGNプログラム (バージョン2.0 または2.0U),に組み込まれているMeyers, E. and Miller, W. (Comput. Appl. Biosci. 4:11-17 (1988))のアルゴリズムを用いて、PAM120重み残基表、ギャップ長ペナルティ12、およびギャップペナルティ4を用いて決定する。
【０１０５】
さらに、本願発明の核酸およびタンパク質配列は、公共データベースに対して検索を行うための「クエリ配列」として用い、たとえば他のファミリメンバまたは関連配列を同定することができる。このような検索は、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のNBLASTおよびXBLASTプログラム（バージョン2.0）を用いて行うことができる。本願発明のPGC-1β核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得るためにBLASTヌクレオチド検索を行うには、NBLASTプログラム、スコア=100、ワード長=12を用いることができる。本願発明のPGC-1βタンパク質に相同なアミノ酸配列を得るためにBLASTタンパク質検索を行うには、XBLASTプログラム、スコア=100、ワード長=3を用いることができる。比較目的のギャップを加えた配列を得るために、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に記載のGapped BLASTを用いることができる。BLASTおよびGapped BLASTを用いる場合、それぞれのプログラム（たとえばXBLASTおよびNBLAST）のデフォルトパラメタを用いることができる。国立バイオテクノロジー情報センターのウェブサイトを参照。
【０１０６】
本願発明はPGC-1βキメラタンパク質または融合タンパク質も提供する。本願明細書に用いられるPGC-1β「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、非PGC-1βポリペプチドに作動的に連結されたPGC-1βポリペプチドを含む。「PGC-1βポリペプチド」は、PGC-1β分子に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味し、その一方で「非PGC-1βポリペプチド」は、たとえばPGC-1βタンパク質と異なる、同一なまたは異なる生物に由来するタンパク質など、PGC-1βタンパク質に実質的に相同ではないタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。PGC-1β融合タンパク質の中では、PGC-1βポリペプチドはPGC-1βタンパク質全体または一部分に対応していてよい。好ましい実施態様では、PGC-1β融合タンパク質は、PGC-1βタンパク質の少なくとも1つの生物学的活性部分を含む。別の好ましい実施態様では、PGC-1β融合タンパク質は、PGC-1βタンパク質の少なくとも2つの生物学的活性部分を含む。前記融合タンパク質の中で、「作動的に連結された」という用語は、PGC-1βポリペプチドと非PGC-1βポリペプチドが相互にインフレームで融合していることを示すことを意図する。前記非PGC-1βタンパク質は、PGC-1βポリペプチドのN末端またはC末端に融合することができる。
【０１０７】
たとえば、ある実施態様では、前記融合タンパク質は、PGC-1β配列がGST配列のC末端に融合しているGST-PGC-1β融合タンパク質である。そのような融合タンパク質は組換えPGC-1βの精製を容易にすることができる。
【０１０８】
別の実施態様では、前記融合タンパク質は、N末端に非相同的なシグナル配列を有するPGC-1βタンパク質である。ある宿主細胞（たとえば哺乳類宿主細胞）では、PGC-1βの発現および／または分泌は、非相同的なシグナル配列を用いることによって増加させることができる。
【０１０９】
本願発明のPGC-1β融合タンパク質は、薬学的組成物に組み込んで対象にin vivoに投与することができる。PGC-1β融合タンパク質を用いて、PGC-1β標的分子のバイオアベイラビリティに影響を与えることができる。PGC-1β融合タンパク質の使用は、たとえば（i）PGC-1βタンパク質をコードする遺伝子の異常な修飾または突然変異、（ii）PGC-1βの誤調節、および（iii）PGC-1βタンパク質の異常な転写後修飾、などによって生じる障害の処置に、治療上有用であってよい。
【０１１０】
さらに、本願発明のPGC-1βは、対象において抗PGC-1β抗体を産生し、PGC-1βリガンドを精製し、スクリーニングアッセイにおいてPGC-1βとPGC-1β基質の相互作用を阻害する分子を同定するための、免疫原として用いることができる。
【０１１１】
好ましくは、本願発明のPGC-1βキメラまたは融合タンパク質は、標準の組換えDNA技術によって作製する。たとえば、異なるポリペプチド配列をコードするDNAフラグメントを、たとえばライゲーションへの平滑末端または粘着末端の使用、適切な末端を提供するための制限酵素切断、適切な場合の突出末端の充填、望ましくない結合を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素ライゲーションなどによって、従来の技術に従ってインフレームでライゲートする。別の実施態様では、前記融合遺伝子は、自動化DNA合成装置を含む従来技術によって合成することができる。代替的には、遺伝子フラグメントのPCR増幅は、アンカープライマを使用して、2つの連続した遺伝子フラグメントの間に相補的な突出を生じさせ、次にアニーリングおよび再増幅を行ってキメラ遺伝子配列を作製することによって、行うことができる(たとえば Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992参照)。さらに、融合部分（たとえばGSTポリペプチド）をコード済みの多くの発現ベクターが市販されている。前記融合部分をインフレームでPGC-1βタンパク質に連結するために、PGC-1βコード核酸をそのような発現ベクターにクローニングすることができる。
【０１１２】
本願発明はまた、PGC-1βアゴニスト（模倣体）またはPGC-1βアンタゴニストのいずれかとして機能するPGC-1βタンパク質の変異体に関連する。PGC-1βタンパク質の変異体は、たとえばPGC-1βタンパク質の分散する点突然変異またはトランケーションなどの変異原性によって生成することができる。PGC-1βタンパク質のアゴニストは、天然に存在する型のPGC-1βタンパク質と実質的に同一の生物学的活性であるか、またはその生物学的活性のサブセットを保持することができる。PGC-1βタンパク質のアンタゴニストは、天然に存在する型のPGC-1βタンパク質の1つ以上の活性を、たとえばPGC-1βタンパク質のPGC-1β媒介活性を競合的に調節するなどして、阻害することができる。したがって、特異的な生物学的作用は、制限された機能の変異体で処理することによって誘導することができる。ある実施態様では、天然に存在する型の前記タンパク質の生物学的活性のサブセットを有する変異体で対象を処置すると、天然に存在する型のPGC-1βタンパク質で処置するよりも、対象における副作用が少ない。
【０１１３】
ある実施態様では、PGC-1βアゴニスト（模倣体）またはPGC-1βアンタゴニストのいずれかとして機能するPGC-1βタンパク質の変異体は、PGC-1βタンパク質のたとえば切断突然変異体などの突然変異体のコンビナトリアルライブラリを、PGC-1βタンパク質のアゴニストまたはアンタゴニスト活性についてスクリーニングすることによって同定することができる。ある実施態様では、PGC-1β変異体の斑入りライブラリを核酸レベルのコンビナトリアル突然変異誘導法によって作製し、斑入り遺伝子ライブラリによってコードする。PGC-1β変異体の斑入りライブラリは、たとえば合成したオリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素的にライゲートすることによって、考えうるPGC-1β変異体の変性セットが、個々のポリペプチドとしてか、または代替的にはPGC-1β配列のセットを含む大きな融合タンパク質のセット（たとえばファージディスプレイ用の）として発現可能なように、作製することができる。考えうるPGC-1β変異体のライブラリを、変性オリゴヌクレオチド配列から作製するために用いることができる様々な方法がある。変性遺伝子配列の化学合成は、自動化DNA合成装置で行うことができ、合成された遺伝子は適切な発現ベクターにライゲートされる。遺伝子の変性セットを使用すると、1つの混合物中で、考えうるPGC-1β配列の望ましいセットをコードするすべての配列を提供することが可能になる。変性オリゴヌクレオチドの合成方法は、当業に知られている(たとえば Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11:477を参照。
【０１１４】
さらに、PGC-1βタンパク質コード配列の断片のライブラリを用いて、PGC-1βタンパク質の変異体のスクリーニングおよび次いで行われる選択のためのPGC-1β断片の斑入り群を作製することができる。ある実施態様では、コード配列断片のライブラリは、1分子につき約1回しかニッキングが生じない条件下においてPGC-1βコード配列の2本鎖PCR断片をヌクレアーゼで処理するステップと、2本鎖DNAを変性させるステップと、DNAを異なるニック生成物からセンス／アンチセンス対を含む2本鎖DNAに再生するステップと、S1ヌクレアーゼで処理して再生した2本鎖の1本鎖部分を除去するステップと、得られた発現ベクターのフラグメントライブラリをライゲートするステップによって、作製することができる。この方法によって、さまざまなサイズのPGC-1βタンパク質のN末端、C末端、および内部フラグメントをコードする発現ライブラリを誘導することができる。
【０１１５】
点突然変異またはトランケーションによって作製したコンビナトリアルライブラリの遺伝子産生物のスクリーニングのための、および特定の特性を有する遺伝子産生物についてcDNAライブラリをスクリーニングするためのいくつかの技術が当業に知られている。そのような技術は、PGC-1βタンパク質のコンビナトリアル突然変異誘導法によって作製された遺伝子ライブラリの迅速なスクリーニングに適応可能である。ハイスループット解析にも適用可能な、大規模遺伝子ライブラリのスクリーニングに最も広く用いられている技術には、典型的には、その遺伝子ライブラリを複製可能な発現ベクターにクローニングする技術と、適切な細胞を得られたベクターライブラリにトランスフォームする技術と、望ましい活性の検出によって産生物が検出された遺伝子をコードするベクターの分離が容易になる条件下でコンビナトリアル遺伝子を発現する技術が含まれる。ライブラリの機能的突然変異体の頻度を増やす新しい技術である再帰アンサンブル突然変異誘導法（REM）を、PGC-1β変異体を同定するスクリーニングアッセイと併用して用いることができる(Arkin and Youvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815; Delagrave et al. (1993) Protein Eng. 6(3):327-331)。
【０１１６】
ある実施態様では、細胞を用いたアッセイを、斑入りPGC-1βライブラリの解析に利用することができる。たとえば、発現ベクターのライブラリを、通常は特定のPGC-1β標的分子依存の形でPGC-1β標的分子に応答する、たとえばHIB1Bなどの褐色脂肪細胞株などの細胞株にトランスフェクトすることができる。その後、トランスフェクトした細胞をPGC-1β標的分子と接触させ、突然変異体の発現がたとえばPGC-1βまたは標的分子の転写活性などに及ぼす作用を検出することができる。その後、プラスミドDNAを、PGC-1β標的分子によるシグナル伝達の阻害または代替的には増強をスコアする細胞から回収し、個々のクローンについてさらに特徴付けすることができる。
【０１１７】
分離されたPGC-1βタンパク質またはその部分または断片を免疫原として用い、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体調製の標準技術を用いてPGC-1βに結合する抗体を作製することができる。完全長のPGC-1βタンパク質を用いることができるか、または代替的には、本願発明は免疫原として使用するためのPGC-1βの抗原性ペプチド断片を提供する。PGC-1βの抗原性ペプチドは、配列番号2または5に示されるアミノ酸配列の少なくとも8アミノ酸残基を含み、前記ペプチドに対して生じた抗体がPGC-1βタンパク質との特異的な免疫複合体を形成するようなPGC-1βのエピトープを包含する。好ましくは、前記抗原性ペプチドは、少なくとも10アミノ酸残基、さらに好ましくは少なくとも15アミノ酸残基、よりさらに好ましくは少なくとも20アミノ酸残基、および最も好ましくは少なくとも30アミノ酸残基を含む。
【０１１８】
前記抗原性ペプチドによって包含される好ましいエピトープは、たとえば親水性領域などのタンパク質の表面上、および高い抗原性を有する領域に位置するPGC-1βの領域である。
【０１１９】
PGC-1β免疫原は、典型的には、好適な対象（たとえばウサギ、ヤギ、マウスまたはその他の哺乳類）を前記免疫原で免疫化することによって抗体を調製するために用いられる。適切な免疫原調製物は、たとえば組換え的に発現させたPGC-1βタンパク質または化学的に合成したPGC-1βポリペプチドを含有してよい。前記調製物には、さらに、フロイント完全または不完全アジュバントなどのアジュバント、または同様の免疫刺激物質が含まれてよい。好適な対象の免疫原性PGC-1β調製物での免疫化には、ポリクローナル抗PGC-1β抗体応答が含まれる。
【０１２０】
したがって、本願発明の別の局面は、抗PGC-1β抗体に関連する。本願明細書に記載の「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわちPGC-1βなどの抗原に特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含有する分子を意味する。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部位の例には、抗体をペプシンなどの酵素で処理することによって作製することができるF(ab)およびF(ab’)2フラグメントが含まれる。本願発明には、PGC-1β分子に結合するポリクローナルおよびモノクローナル抗体を提供する。本願明細書に記載の「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、PGC-1βの特定のエピトープと免疫応答することができる抗原結合部位を1種のみ含有する抗体分子の一群である。したがって、モノクローナル抗体組成物は、典型的には、免疫応答を示す特定のPGC-1βタンパク質への結合親和性を1つだけ示す。
【０１２１】
ポリクローナル抗PGC-1β抗体は、上述の通り、好適な対象をPGC-1β免疫原で免疫化することによって調製することができる。免疫化された対象における抗PGC-1β抗体の力価は、固定化したPGC-1βを用いた酵素結合免疫吸収アッセイ（ELISA）などの標準技術によって、経時的に監視することができる。必要であれば、PGC-1βに対する抗体分子を哺乳類（たとえば血液）から分離し、さらにタンパク質Aクロマトグラフィなど公知の技術によって精製してIgG画分を得ることができる。免疫化から好適な時間が経過後、たとえば抗PGC-1β抗体の力価が最高の時、抗体産生細胞をその対象から得て、Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497) が最初に記述したハイブリドーマ技術(さらに、Brown et al. (1981) J. Immunol. 127:539-46; Brown et al. (1980) J. Biol. Chem. 255:4980-83; Yeh et al. (1976) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:2927-31; およびYeh et al. (1982) Int. J. Cancer 29:269-75を参照)、さらに最近のヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor et al. (1983) Immunol. Today 4:72), the EBV-hybridoma technique (Cole et al. (1985), Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96) またはトリオーマ技術などの標準技術によってモノクローナル抗体を調製するために用いることができる。モノクローナル抗体ハイブリドーマを作製する技術は公知である(一般的にはKenneth, R.H. in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980); Lerner, E.A. (1981) Yale J. Biol. Med. 54:387-402; Gefter, M.L. et al. (1977) Somatic Cell Genet. 3:231-36参照)。簡単に説明すると、不死細胞株（典型的には骨髄腫）を上述のPGC-1β免疫原で免疫化した哺乳類から採取したリンパ細胞（典型的には脾細胞）に融合し、得られたハイブリドーマ細胞の培養液上清を、PGC-1βに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定するためにスクリーニングする。
【０１２２】
リンパ球と不死化細胞株を融合するために使用される多くの公知のプロトコルのいずれかを、抗PGC-1βモノクローナル抗体を産生する目的に適用することができる(たとえば Galfre, G. et al. (1977) Nature 266:55052; Gefter et al. (1977) 上記; Lerner (1981) 上記; Kenneth (1980 上記参照)。さらに、通常の当業者は、有用であるそのような方法のバリエーションが数多くあることを理解するだろう。典型的には不死細胞株（たとえば骨髄腫細胞株）は、前記リンパ球と同一の哺乳類種に由来する。たとえば、マウスハイブリドーマは、本願発明の免疫原調製物で免疫化したマウスに由来するリンパ球を不死化マウス細胞株と融合させることによって作製することができる。好ましい不死細胞株は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する培養培地（「HAT培地」）に感受性があるマウス骨髄腫細胞株である。数多くの骨髄腫細胞株のいずれかを、たとえばP3-NS1/1-Ag4-1、P3-x63-Ag8.653またはSp2/O-Ag14骨髄腫株などの、標準技術に従った融合融合パートナーとして用いることができる。これらの骨髄腫株は、ATCCから入手することができる。典型的には、ポリエチレングリコール（PEG）を用いて、HAT感受性マウス骨髄腫細胞をマウス脾細胞に融合する。その融合から得られるハイブリドーマ細胞を、未融合および非生産的に融合された骨髄腫細胞を死滅させるHAT培地を用いて選択する（未融合の脾細胞はトランスフォームされていないために数日後に死滅する）。本願発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、たとえば標準のELISAアッセイを用いて、ハイブリドーマ培養液上清をPGC-1βに結合する抗体についてスクリーニングすることによって検出される。
【０１２３】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製する代わりに、モノクローナル抗PGC-1β抗体を、PGC-1βで組換えコンビナトリアル免疫グロプリンライブラリ（たとえば抗体ファージディスプレイライブラリ）をスクリーニングしてPGC-1βに結合する免疫グロブリンライブラリメンバを分離することによって、同定および分離することができる。ファージディスプレイライブラリの作製およびスクリーニング用のキットは市販されている（たとえばファルマシア社Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 27-9400-01、およびストラタジーン社SurfZAPTM Phage Display Kit, Catalog No. 240612）。さらに、特に抗体ディスプレイライブラリの作製およびスクリーニングに使用することができる方法および試薬の例は、たとえばLadner et al. 米国特許第 5,223,409号; Kang et al. PCT国際公開第 WO 92/18619号、Dower et al. PCT 国際公開第 WO 91/17271号号、Winter et al. PCT国際公開第 WO 92/20791号、Markland et al. PCT国際公開第 WO 92/15679号、Breitling et al. PCT国際公開第 WO 93/01288号、McCafferty et al. PCT国際公開第 WO 92/01047号、Garrard et al. PCT国際公開第 WO 92/09690号、Ladner et al. PCT国際公開第 WO 90/02809号、Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372、Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85、Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281、Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734、Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226:889-896、Clarkson et al. (1991) Nature 352:624-628、Gram et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580、Garrard et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377、Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4133-4137、Barbas et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982、およびMcCafferty et al. (1990) Nature 348:552-554に見いだすことができる。
【０１２４】
さらに、ヒトと非ヒト部分の両方を含み標準の組換えDNA技術を用いて作製することができるキメラおよびヒト化モノクローナル抗体などの組換え抗PGC-1β抗体も、本願発明の範囲内である。そのようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、たとえばRobinson et al. 国際出願第PCT/US86/02269号、Akira, et al. ヨーロッパ特許出願第184,187号、Taniguchi, M., ヨーロッパ特許出願第171,496号、Morrison et al. ヨーロッパ特許出願第173,494号、Neuberger et al. PCT 国際公開第 WO 86/01533号、Cabilly et al. 米国特許第 4,816,567号、Cabilly et al. ヨーロッパ特許出願第125,023号、Better et al. (1988) Science 240:1041-1043、Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443、Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521-3526、Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218、Nishimura et al. (1987) Cancer Res. 47:999-1005、Wood et al. (1985) Nature 314:446-449、and Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559)、Morrison, S. L. (1985) Science 229:1202-1207、Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214、Winter 米国特許第 5,225,539号、Jones et al. (1986) Nature 321:552-525、Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534、およびBeidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060に記載の方法を用いるなど、当業に公知の組換えDNA技術によって産生することができる。
【０１２５】
抗PGC-1β抗体（たとえばモノクローナル抗体）は、アフィニティクロマトグラフィまたは免疫沈降法などの標準技術によって、PGC-1βを単離するために用いることができる。抗PGC-1β抗体は、細胞由来の天然PGC-1β、および宿主細胞に発現した組換え産生PGC-1βの精製を容易にすることができる。さらに、抗PGC-1β抗体は、PGC-1βタンパク質の発現量およびパターンを評価するためにPGC-1βタンパク質を検出する（たとえば細胞ライセートまたは細胞上清）ために用いることができる。抗PGC-1β抗体を診断的に用いて、たとえば特定の治療計画の有効性を決定するためなど、臨床テストの手順の一部として、組織のタンパク質レベルを監視することができる。前記抗体を検出可能な物質に結合（すなわち物理的に連結）させることによって、検出を容易にすることができる。検出可能な物質の例には、各種酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生体発光物質、および放射性物質が含まれる。好適な酵素の例には西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンステラーゼが含まれ、好適な補欠分子族複合体の例にはストレプタビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが含まれ、好適な蛍光物質にはウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、またはフィコエリスリンが含まれ、発光物質の例にはルミノールが含まれ、生体発光物質にはルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが含まれ、並びに好適な放射性物質には125I、131I、35Sまたは3Hが含まれる。
【０１２６】
III.  組換え発現ベクターおよび宿主細胞
本願発明の別の局面は、PGC-1βタンパク質（またはその一部分）をコードする核酸を含有するベクター、好ましくは発現ベクターに関連する。本願明細書に記載の「ベクター」という用語は、核酸分子であって、連結している別の核酸を輸送する能力を有する核酸分子を意味する。あるタイプのベクターが「プラスミド」で、環状の2本鎖DNAループであってさらなるDNAセグメントをライゲートすることができる2本鎖DNAループを意味する。別のタイプのベクターがウイルスベクターで、さらなるDNAセグメントをそのウイルスゲノムにライゲートすることができるウイルスベクターである。あるベクターは、導入された宿主細胞中で自律複製する能力がある（たとえば細菌の複製開始点を有する細菌ベクター、およびエピソーム哺乳類ベクター）。その他のベクター（たとえば非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞に導入して宿主細胞のゲノムに組み込むことによって、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、あるベクターは、作動的に連結される遺伝子の発現を方向付けることができる。そのようなベクターは、本願明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、組換えDNA技術に有用な発現ベクターは、プラスミドの形状であることが多い。本願明細書では、プラスミドはベクターの最も一般的に用いられる形状であるため、「プラスミド」および「ベクター」は交換可能に用いることができる。しかし、本願発明は、ウイルスベクター（たとえば複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）などの、等価な機能を提供するその他の形状の発現ベクターも含むことを意図する。
【０１２７】
本願発明の組換え発現ベクターには、宿主細胞における核酸の発現に好適な形状の本願発明の核酸を含み、つまり、前記組換え発現ベクターには、発現用に用いられる宿主細胞に基づいて選択され発現させる核酸配列に作動的に連結している1つ以上の調節配列が含まれることを意味する。組換え発現ベクターの中で、「作動的に連結された」とは、目的のヌクレオチド配列が、そのヌクレオチド配列の発現を可能にするように、調節配列に連結されることを意味することを意図する（たとえば、in vitroの転写／翻訳システム、またはベクターが宿主細胞に導入される場合の宿主細胞において）。「調節配列」という用語は、プロモータ、エンハンサおよびその他の発現制御要素（たとえばポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。そのような調節配列は、たとえばGoeddel (1990) Methods Enzymol. 185:3-7に記載されている。調節配列には、多くの種類の宿主細胞でヌクレオチド配列の構成的な発現を方向付けるものと、特定の宿主細胞のみでヌクレオチド配列の発現を方向付けるものが含まれる（たとえば組織特異的な調節配列）。当業者には、発現ベクターのデザインが、トランスフォームされる宿主細胞の選択、および望ましいタンパク質の発現量などの要因に依存しうるということは理解されよう。本願発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入されることによって、本願明細書に記載の核酸によってコードされる融合タンパク質またはペプチドを含む、タンパク質またはペプチド（たとえばPGC-1βタンパク質、PGC-1βタンパク質の突然変異型、および融合タンパク質など）を産生することができる。
【０１２８】
本願発明の組換え発現ベクターは、原核細胞または真核細胞におけるPGC-1βタンパク質の発現のためにデザインすることができる。たとえば、PGC-1βタンパク質はE. coliなどの細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いる）、酵母細胞または哺乳類細胞に発現させることができる。好適な宿主細胞についてはGoeddel (1990) 上記にさらに詳しく考察されている。代替的には、組換え発現ベクターは、たとえばT’7プロモータ調節配列およびT7ポリメラーゼを用いてin vitroで転写および翻訳することができる。
【０１２９】
原核細胞のタンパク質発現は、融合タンパク質または非融合タンパク質の発現を方向付けた構成的なまたは誘導性のプロモータを含有するベクターを有するE. coliにおいて行われる。融合ベクターは、そこにコードされたタンパク質であって、通常は組換えタンパク質のアミノ末端に数多くのアミノ酸を付加する。そのような融合ベクターは、典型的には、1)  組換えタンパク質の発現の増加と、2)  組換えタンパク質の溶解度の増加と、3)  アフィニティ精製においてリガンドとして作用することによる組換えタンパク質の精製の援助、の3つの目的のために働く。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解性切断部位が融合部分の接合部および組換えタンパク質に導入され、融合タンパク質の精製後、融合部分からの組換えタンパク質の分離が可能になる。そのような酵素およびその同族の認識配列には、Xa因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが含まれる。典型的な融合発現ベクトルには、グルタチオンSトランスフェラーゼ（GST）、マルトースE結合タンパク質またはタンパクAをそれぞれ標的組換えタンパク質と融合させる、pGEX (ファルマシア／バイオテック社、Smith, D.B. and Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40)、pMAL (ニューイングランドバイオラブズ社、マサチューセッツ州べバリー) およびpRIT5 (ファルマシア社、ニュージャージー州ピスカタウェイ)が含まれる。
【０１３０】
精製された融合タンパク質は、PGC-1β活性アッセイ（たとえば以下に詳述される直接アッセイまたは競合アッセイなど）、またはたとえばPGC-1βタンパク質に特異的な抗体の作製に用いることができる。好ましい実施態様では、本願発明のレトロウイルス発現ベクターに発現したPGC-1β融合タンパク質は、骨髄細胞に感染させるために用いることができ、その後その細胞を照射したレシピエントに移植する。十分な時間が経過後（たとえば6週間）、その対象レシピエントの病状を検査する。
【０１３１】
好適な誘導性非融合大腸菌発現ベクターの例には、pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69:301-315) およびpET 11d (Studier et al. (1990) Methods Enzymol. 185:60-89)が含まれる。pTrcベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドtrp-lac融合プロモータに由来する宿主RNAポリメラーゼ転写物に依存する。pET 11dベクターからの標的遺伝子発現は、共発現させたウイルスRNAポリメラーゼ（T7 gn1）によって媒介されたT7 gn10-lac融合プロモータに由来する転写物に依存する。このウイルスポリメラーゼは、lacUV 5プロモータの転写制御下のT7 gn1に内包されている常在プロファージに由来する宿主株BL21(DE3)またはHMS174(DE3)によって供給される。
【０１３２】
大腸菌 において組換えタンパク質発現を最大にするある戦略は、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力に欠ける宿主細胞にタンパク質を発現させる方法である (Gottesman, S. (1990) Methods Enzymol. 185:119-128)。別の戦略は、発現ベクターに挿入する核酸の核酸配列を、各アミノ酸の個々のコドンが選択的に大腸菌に利用されるものであるように、改変する方法である(Wada et al., (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118)。本願発明の核酸配列のそのような改変は、標準のDNA合成技術によって行うことができる。
【０１３３】
別の実施態様では、PGC-1β発現ベクターは酵母菌発現ベクターである。酵母菌S. cerevisiaeにおける発現のためのベクターの例には、pYepSec1 (Baldari, et al., (1987) EMBO  EMBO   6:229-234)、pMFa (Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30:933-943)、pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54:113-123)、pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA), およびpicZ (Invitrogen Corp, San Diego, CA)が含まれる。
【０１３４】
代替的には、PGC-1βタンパク質はバキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞中に発現させることができる。培養された昆虫細胞におけるタンパク質の発現のために入手可能なバキュロウイルスベクターには、pAcシリーズ (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) および pVL シリーズ(Lucklow and Summers (1989) Virology 170:31-39)がある。
【０１３５】
さらに別の実施態様では、本願発明の核酸は、哺乳類発現ベクターを用いて哺乳類細胞に発現させる。哺乳類発現ベクターの例には、pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329:840) およびpMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO  EMBO   6:187-195)が含まれる。哺乳類細胞に用いられる場合、発現ベクターの制御機能はウイルス調節要素によって提供されることが多い。たとえば、一般的に用いられるプロモータは、ポリオーマ、アデノウイルス2、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス40に由来する。原核細胞および真核細胞の両方ともに好適なその他の発現系は、chapters 16 and 17 of Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989を参照。
【０１３６】
別の実施態様では、組換え哺乳類発現ベクターは、特定の細胞種に選択的に核酸が発現するように方向付ける（たとえば、組織特異的調節要素を用いて核酸を発現させる）能力がある。組織特異的調節要素は当業に知られている。好適な組織特異的プロモータの、限定されない例には、アルブミンプロモータ (肝特異的、Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1:268-277), リンパ細胞特異的プロモータ (Calame and Eaton (1988) Adv. Immunol. 43:235-275), 特にT細胞受容体のプロモータ (Winoto and Baltimore (1989) EMBO J. 8:729-733) および免疫グロブリン (Banerji et al. (1983) Cell 33:729-740; Queen and Baltimore (1983) Cell 33:741-748), 神経特異的プロモータ(たとえば 神経繊維プロモータ、 Byrne and Ruddle (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477), 膵特異的プロモータ (Edlund et al. (1985) Science 230:912-916), および哺乳類腺特異的プロモータ (たとえば乳清プロモータ、米国特許第4,873,316号およびヨーロッパ出願公開第264,166号) が含まれる。たとえばマウスホメオボックス（hox）プロモータ(Kessel and Gruss (1990) Science 249:374-379)、およびαフェトプロテインプロモータ(Campes and Tilghman (1989) Genes Dev. 3:537-546)などの成長調節プロモータも包含される。 
【０１３７】
本願発明はさらに、発現ベクターにアンチセンス配向にクローニングされた本願発明のDNA分子を含む組換え発現ベクターを提供する。つまり、前記DNA分子は、PGC-1βmRNAにアンチセンスなRNA分子の発現（DNA分子の転写による）が可能になるように、調節配列に作動的に連結されている。アンチセンス配向にクローニングされた核酸に作動的に連結された調節配列は、さまざまな細胞種においてアンチセンスRNA分子の連続的な発現を方向付けるように選択することができ、たとえば、ウイルスプロモータおよび／またはエンハンサ、または調節配列は、アンチセンスのRNAの構成的で組織特異的な、または細胞種特異的な発現を方向付けるように選択することができる。前記アンチセンス発現ベクターは、アンチセンス核酸が高効率調節領域の制御下で産生される、組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒ウイルスの形状であってよく、その活性は、ベクターが導入される細胞種によって決定することができる。アンチセンス遺伝子を用いた遺伝子発現の調節についての考察は、Weintraub, H. et al., Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986を参照。
【０１３８】
本願発明の別の局面は、たとえば組換え発現ベクター内のPGC-1β核酸分子、または宿主細胞のゲノムの特定の部位に相同的に組み換えることができる配列を含有するPGC-1β核酸分子などの、本願発明のPGC-1β核酸分子が導入される宿主細胞に関連する。「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」という用語は、本願明細書では交換可能に用いられる。そのような用語は特定の対象の細胞だけでなく、そのような細胞の子孫、または見込まれる子孫も意味する。ある修飾が、突然変異または環境の影響によって後代に生じるかもしれないため、そのような子孫は、事実上は親細胞と同一ではないかもしれないが、それでも本願明細書に用いられる用語の範囲内に含まれる。
【０１３９】
宿主細胞は任意の原核細胞または真核細胞であってよい。たとえば、PGC-1βタンパク質は大腸菌 などの細菌細胞、昆虫細胞、酵母菌または哺乳類細胞（たとえばチャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）、COS細胞、BOSC細胞、またはHIB1B細胞など）に発現させることができる。その他の好適な宿主細胞が当業に知られている。
【０１４０】
ベクターDNAは、従来のトランスフォーメーションまたはトランスフェクション技術によって原核細胞または真核細胞に導入することができる。本願明細書に記載の「トランスフォーメーション」および「トランスフェクション」という用語は、リン酸カルシウムまたは塩酸カルシウム共沈降法、DEADデキストラントランスフェクション法、リポフェクション、または電気穿孔法などの、宿主細胞に外来性の核酸（たとえばDNA）を導入する当業に公知のさまざまな技術を意味することを意図する。宿主細胞のトランスフォーメーションまたはトランスフェクションの好適な方法は、Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)、およびその他の研究室マニュアルに見いだすことができる。
【０１４１】
哺乳類細胞の安定なトランスフェクションのために、発現ベクターおよびトランスフェクション技術に頼ると、少量の細胞しか外来性DNAをゲノムに組み込めないことがあることが知られている。これら組み込む物質を同定し選択するために、一般に、選択可能なマーカー（たとえば抗生物質に対する抵抗性）をコードする遺伝子を、目的の遺伝子とともに宿主細胞に導入する。好ましい選択可能なマーカーには、薬物に抵抗性を与えるG418、ヒグロマイシン、およびメトトレキセートなどの物質が含まれる。選択可能なマーカーをコードする核酸は、宿主細胞のPGC-1βタンパク質をコードするものと同一のベクター上に導入することもでき、または別のベクターに導入することもできる。導入された核酸が安定にトランスフェクトした細胞は、薬物選択（たとえば選択可能なマーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生存するが、その他の細胞は死滅する）によって同定することができる。
【０１４２】
培養液中の原核細胞または真核細胞などの本願発明の宿主細胞を用いて、PGC-1βタンパク質を作製する（すなわち発現させる）ことができる。したがって、本願発明はさらに、本願発明の宿主細胞を用いたPGC-1βタンパク質の作製方法を提供する。ある実施態様では、前記方法は、PGC-1βタンパク質が産生されるように、安定な培地で本願発明の宿主細胞（PGC-1βタンパク質をコードする組換え発現ベクターを導入してある）を培養するステップを含む。別の実施態様では、前記方法はさらに培地または宿主細胞からPGC-1βタンパク質を分離するステップを含む。
【０１４３】
本願発明の宿主細胞は、非ヒトトランスジェニック動物を作製するために用いることもできる。たとえば、ある実施態様では、本願発明の宿主細胞は、PGC-1βコード配列を組み込んでおいた受精した卵母細胞かまたは胚性幹細胞である。そのような宿主細胞を用いて、内因性PGC-1β配列を改変したゲノムまたは相同組換え動物に外来性PGC-1β配列を導入した、非ヒトトランスジェニック動物を作製することができる。そのような動物は、PGC-1βの機能および／または活性の研究、およびPGC-1β活性のモジュレータを同定および／または評価するために有用である。本願明細書に用いる「トランスジェニック動物」は、1つ以上の動物の細胞に導入遺伝子が含まれている、非ヒト動物であって、好ましくは哺乳類であって、さらに好ましくはラットまたはマウスなどの齧歯類である。トランスジェニック動物の他の例には、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、および両生類などが含まれる。導入遺伝子は、トランスジェニック動物が成長させて成体動物のゲノムに残っている細胞のゲノムに組み込まれて、トランスジェニック動物の1種類以上の細胞種または組織においてコードされた遺伝子産生物の発現を方向付ける、外来性DNAである。本願明細書に記載の「相同組換え動物」は、動物が成長する前に、内因性PGC-1β遺伝子が、内因性遺伝子とたとえば動物の胚性細胞などの動物の細胞にに導入された外来性DNA分子の間で、相同的な組換えが起きることによって改変された、非ヒト動物であって、好ましくは哺乳類であって、より好ましくはマウスである。
【０１４４】
本願発明のトランスジェニック動物は、マイクロインジェクション、レトロウイルス注入法、および偽妊娠メス里親動物で卵母細胞を成長させる方法などによって、受精させた卵母細胞のオス前核にPGC-1βコード核酸を導入することによって作製することができる。配列番号1または4のPGC-1βcDNA配列は、非ヒト動物のゲノムに導入遺伝子として導入することができる。代替的には、ラットPGC-1β遺伝子などのヒトPGC-1β遺伝子の非ヒト相同体を導入遺伝子として用いることもできる。代替的には、別のPGC-1βファミリメンバなどのPGC-1β遺伝子相同体は配列番号1、3、4または6のPGC-1βcDNA配列へのハイブリダイゼーションに基づいて単離し、導入遺伝子として使用することができる。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルも、導入遺伝子の発現の効率を上げるために導入遺伝子に含めることができる。組織特異的調節配列をPGC-1β導入遺伝子に作動的に連結させ、PGC-1βタンパク質の発現を特定の細胞に方向付けることができる。特にマウスなどの動物などの胚操作およびマイクロインジェクションによってトランスジェニック動物を作製する方法は当業で常用されており、たとえばいずれもLeder et al.による米国特許第4,736,866号 および4,870,009号、Wagner et al. による米国特許第4,873,191号、およびHogan, B., Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)に記述されている。同様の方法がその他のトランスジェニック動物の作製に用いられる。トランスジェニック創始動物の同定は、ゲノムにおけるPGC-1β導入遺伝子の存在および／またはその動物の組織または細胞のPGC-1βmRNAの発現に基づいて行うことができる。その後、トランスジェニック創始動物を用いて、導入遺伝子を有する別の動物と交配することができる。さらに、PGC-1βタンパク質をコードする導入遺伝子を有するトランスジェニック動物を、その他の導入遺伝子を有するその他のトランスジェニック動物とさらに交配させることができる。
【０１４５】
相同組換え動物を作製するために、PGC-1β遺伝子をたとえば機能的に障害するなど改変するために欠失、付加または置換を導入したPGC-1β遺伝子の少なくとも一部分を含有するベクターを調製する。PGC-1β遺伝子はヒト遺伝子（たとえば配列番号6のcDNA）であってよいが、さらに好ましくは配列番号3のマウス遺伝子であるか、またはヒトPGC-1β遺伝子の別の非ヒト相同体（たとえば配列番号1または4のヌクレオチド配列と厳密にハイブリダイゼーションすることによって単離されたcDNA）である。たとえば、マウスPGC-1β遺伝子を用いて、マウスゲノムの内因性PGC-1β遺伝子を改変するために好適な、たとえばベクターなどの相同組換え核酸分子を作製することができる。好ましい実施態様では、相同組換え核酸分子は、相同組換えによって内因性PGC-1β遺伝子が機能的に障害されるようにデザインされる（すなわち機能的なタンパク質をコードしなくなる。「ノックアウト」ベクターとも呼ばれる）。代替的には、相同的な組換え核酸分子は、相同組換えによって、内因性PGC-1β遺伝子が突然変異をおこすかまたはその他の改変が生じても機能的なタンパク質をコードするようにデザインされてよい（たとえば、上流の調節領域を改変して内因性PGC-1βタンパク質の発現を変化させることができる）。相同組換え核酸分子において、PGC-1βの改変された部分をPGC-1β遺伝子のさらなる核酸配列によって5’および3’末端に隣接させ、相同組換え核酸分子が有する外来性PGC-1β遺伝子とたとえば胚性肝幹細胞などの細胞中の内因性PGC-1β遺伝子の間に相同的な組換えを生じさせる。さらなる隣接のPGC-1β核酸配列は、内因性遺伝子との相同組換えを成功させるのに十分な長さである。典型的には、数キロ塩基の隣接するDNA（5’ｄよび3’末端の両方）が、相同組換え核酸分子に含まれる（たとえば相同組換えベクターについての記述はThomas, K.R. and Capecchi, M.R. (1987) Cell 51:503を参照）。相同組換え核酸分子は、たとえば胚性幹細胞株などの細胞に導入され（たとえば電気穿孔法などによって）、導入されたPGC-1β遺伝子が内因性PGC-1β遺伝子と相同的に組み換えられた細胞を選択する（たとえば、Li, E. et al. (1992) Cell 69:915参照）。それから、選択された細胞を動物（たとえばマウス）の胚盤胞に注入し、集合キメラを形成することができる（たとえばBradley, A. in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987) pp. 113-152参照）。それから、キメラ胚を好適な偽妊娠メス里親動物に移植して、胚を満産期まで成長させることができる。生殖細胞中に相同的に組み換えたDNAを内包する子孫を、導入遺伝子の生殖細胞系列伝達によって動物の全細胞が相同的に組み換えられたDNAを含有する動物を交配させるために用いることができる。たとえばベクターなどの相同組換え核酸分子または相同組換え動物を作製する方法は、Bradley, A. (1991) Curr. Opin. Biotechnol. 2:823-829 および Le Mouellec et al によるPCT 国際公開第WO 90/11354号、Smithies et al.による第WO 91/01140号、Zijlstra et al.による第WO 92/0968号、およびBerns et al による第WO 93/04169号にさらに説明されている。
【０１４６】
別の実施態様では、導入遺伝子の調節された発現が可能な、特定の系を含むトランスジェニック非ヒト動物を作製することができる。そのような系のある例は、バクテリオファージP1のcre/loxPリコンビナーゼ系である。cre/loxPリコンビナーゼ系についての記述は、Lakso et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6232-6236を参照。リコンビナーゼ系の別の例は、出芽酵母（サッカロマイセス・セレビシエ）のFLPリコンビナーゼ系である(O’Gorman et al. (1991) Science 251:1351-1355。cre/loxPリコンビナーゼ系を用いて導入遺伝子の発現を調節する場合、Creリコンビナーゼおよび特定のタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含有する動物が必要である。そのような動物は、たとえば一方は特定のタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、もう一方はリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含む2匹のトランスジェニック動物を交配させるなどの「二重」トランスジェニック動物の作製によって提供することができる。
【０１４７】
本願明細書に記載の非ヒトトランスジェニック動物のクローンは、Wilmut, I. et al. (1997) Nature 385:810-813 およびPCT国際公開第 WO 97/07668号および第WO 97/07669号に記載の方法に従って作製することもできる。簡単に説明すると、トランスジェニックマウスのたとえば体細胞などの細胞は、分離して、成長サイクルから離脱してG0期に入るように誘導することができる。休止状態の細胞は、たとえば電気パルスを用いるなどして、前記休止細胞を分離した動物と同一種の動物から採取した除核卵母細胞に融合することができる。その後、再構築した卵母細胞を培養して桑実胚または胚盤胞に成長させ、偽妊娠メス里親動物に移す。このメス里親動物から生まれた子は、たとえば体細胞などの細胞を分離した動物のクローンになるだろう。
【０１４８】
IV.  薬学的組成物
本願発明のPGC-1β核酸分子、PGC-1βタンパク質の断片、PGC-1βモジュレータ、および抗PGC-1β抗体（本願明細書では「活性化合物」ともよぶ）は、投与に好適な薬学的組成物に組み込むことができる。そのような組成物は典型的には前記核酸分子、タンパク質、または抗体、および薬学的に許容される担体を含む。本願明細書に記載の「薬学的に許容される担体」という用語には、薬学的投与に適合する溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、ならびに等張剤および吸収遅延剤のいずれかおよびすべてが含まれることを意図する。薬学的に活性な物質へのそのような媒質および剤の使用は、当業に公知である。従来の媒質または剤が前記活性化合物に適合しない場合でない限り、それらの組成物への使用が考慮される。補充活性化合物も前記組成物に組み込むことができる。
【０１４９】
本願発明の薬学的組成物は、意図される投与経路に適合するように調製する。投与経路の例には、たとえば静脈内、皮内、皮下、口腔内（たとえば吸入）、経皮（局所）、経粘膜、および直腸投与などの非経口投与が含まれる。非経口、皮内、または皮下投与に用いる溶液または懸濁液には、以下の成分が含まれてもよい。その成分とは、注射用の水、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、またはその他の合成溶媒などの滅菌希釈剤、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩などのバッファ、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの等張性を調節する物質である。pHの調節は、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基であってよい。非経口調製物はアンプル、使い捨て注射器、またはガラスまたはプラスチック製の複数回投与用バイアルに封入することができる。
【０１５０】
注射用用途に好適な薬学的組成物には、滅菌水溶液（水溶性）または分散液、および注射用滅菌溶液または分散液の即時調合用調製物用の滅菌粉末が含まれる。静脈投与の場合、好適な担体には、生理食塩水、静菌水、クレモホールELTM（BASF社、ニュージャージー州パーシッパニー）、またはリン酸緩衝食塩水（PBS）が含まれる。すべての場合において、前記組成物は無菌でなければならず、注射器への装填が容易であるようにある程度流動的でなければならない。製造および保存の条件下において安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用を防止しなければならない。前記担体は、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえばグリセロール、プロピレングリコール、および液状ポリエチレングリコールなど）、ならびにそれらの好適な混合物などを含む溶媒または分散媒であってよい。適切な流動性は、たとえばレシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持、および表面活性剤の使用などによって維持することができる。微生物の作用の防止は、たとえばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、およびチメロサールなどの各種の抗菌および抗真菌物質によって実現することができる。多くの場合、たとえば、糖、マンニトールなどのポリアルコール、ソルビトール、塩化ナトリウムなどの等張物質を前記組成物に含むことが好ましいだろう。注射用組成物の持続的な吸収は、組成物にたとえばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなど吸収を遅延する物質を含むことによって実現することができる。
【０１５１】
滅菌注射用溶液は、上述の成分を必要に応じて1種類または組み合わせたものとともに、適切な溶媒に必要な量の活性化合物（たとえばPGC-1βモジュレータ、PGC-1βタンパク質の断片、または抗PGC-1β抗体）を組み入れ、その後ろ過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散液は、前記活性化合物を塩基性の分散媒を含有する滅菌賦形剤および上述の中から選択した必要なその他の成分に組み込むことによって調製する。滅菌注射用溶液の調製に用いる滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であって、活性成分と前もって滅菌ろ過された溶液から得られたさらなる望ましい成分の粉末を得る。
【０１５２】
経口組成物には一般に不活性希釈剤または食用担体が含まれる。それらはゼラチンカプセルに封入するか圧縮成型して錠剤にすることができる。経口治療用投与の目的のために、前記活性物質は、賦形剤に組み込み、錠剤、トローチ、またはカプセル状にして用いることができる。経口組成物はまた、液状担体を用いて洗口剤として調製することもでき、当該組成物において前記の液状担体に入れた組成物を口腔内に適用し、うがい後に吐き出すか、または飲み込む。薬学的に適合な結合剤、および／またはアジュバント物質を前記組成物の一部として含んでもよい。錠剤、ピル、カプセルおよびトローチなどは、以下の成分、または同様な性質の化合物のいずれかを含んでよい。それは、微結晶性セルロース、ガムトラガカント、またはゼラチンなどの結合剤、デンプンまたはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、プリモゲルまたはトウモロコシデンプンなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムまたはステロートなどの潤滑剤、コロイド状二酸化シリコンなどの流動促進剤、ショ糖またはサッカリンなどの甘味剤、またはペパーミント、サリチル酸メチルもしくはオレンジ香味料などの香味料である。
【０１５３】
吸入による投与の場合、前記化合物は、たとえば二酸化炭素などの好適な高圧ガスを含有する圧縮容器またはディスペンサまたはネブライザーからのエアロゾルスプレーの形状で送達する。
【０１５４】
全身投与はまた、経粘膜または経皮の手段によることもできる。経粘膜または経皮投与の場合、透過させるべき障壁に好適な浸透剤を、調製物の中に入れて用いることができる。そのような浸透剤は一般に当業に知られており、たとえば経粘膜投与の場合、洗浄剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体などが含まれる。経皮投与の場合、前記活性化合物は、一般に当業に知られる軟膏（ointment）、軟膏（salve）、ゲル、またはクリームに調製される。
【０１５５】
前記化合物は、坐剤の形状（たとえばカカオバターおよびその他のグリセリドなどの従来の坐剤用基剤とともに）、または直腸送達用の油性停留浣腸の形状として調製することもできる。
【０１５６】
ある実施態様では、前記活性化合物は、インプラントおよび微小カプセル封入送達システムを含む制御放出剤形など、前記化合物を迅速な体外排出から護るであろう担体とともに調製する。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステル、およびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような調製物の調製方法は、当業者に明らかであろう。前記の物質は、アルザ社、およびノバファーマシューティカルズ社から購入することもできる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体で感染させた細胞を標的としたリポソームを含む）も薬学的に許容される担体として使用することができる。これらは、たとえば米国特許第4,522,811号に記載される方法など、当業に知られる方法に従って調製することができる。
【０１５７】
経口または非経口組成物を投与の簡易化のためまたは投与量の均一化のために投与単位剤形に調剤することは、特に有利である。本願明細書に用いられる投与単位剤形は、処置する対象への単回投与に好適な物理的に離散した単位を意味し、各単位は望ましい治療効果を生じるために計算し予め決定された活性化合物の量を必要な薬学的担体とともに含有する。本願発明の投与単位剤形の詳細は、前記活性化合物の固有の特徴および達成されるべき特定の治療上の作用、ならびに個体の治療用の活性化合物を混合する業界に固有の限界によって影響され、およびそれらに直接依存する。
【０１５８】
そのような化合物の毒性および治療上の有効性は、たとえばLD50（個体群の50%に致死的な投与量）およびED50（個体群の50%に治療上有効な投与量）の決定など、標準の薬学的手順によって、細胞培養物または実験動物において決定することができる。毒性および治療作用の投与量の比が治療指数で、LD50/ED50の比として表現することができる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。毒性の副作用を示す化合物が用いられることもあるが、感染していない細胞への損傷の可能性を最小にすることによって副作用を軽減するために、そのような化合物で罹患組織の部位を狙う送達システムをデザインする際には注意が必要である。
【０１５９】
細胞培養物アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための用量の範囲を策定するために用いることができる。そのような化合物の用量は、毒性が少しかまたは皆無のED50を含む循環濃度の範囲内であることが好ましい。用量は、用いられる剤形および利用される投与経路に依存するこの範囲内で変化してよい。本願発明で用いられる任意の化合物の場合、治療上有効な投与量は細胞培養アッセイで初めに見積もることができる。投与量は、動物モデルにおいて、細胞培養物で決定したIC50（すなわち症状の最大半減を達成するテスト化合物の濃度）を含む循環血漿濃度の範囲に到達するように定式化してよい。血漿濃度は、たとえば高性能液体クロマトグラフィによって測定してよい。
【０１６０】
本願明細書に定義されるとおり、タンパク質またはポリペプチドの治療上有効な量（すなわち有効な用量）は、体重1kgあたり約0.001乃至30mg、好ましくは体重1kgあたり約0.01乃至25mg、さらに好ましくは体重1kgあたり約0.1乃至20mg、およびより好ましくは体重1kgあたり約1乃至10mg、2乃至9mg、3乃至8mg、4乃至7mg、5乃至6mgの範囲内である。当業者は、たとえば対象の疾患または障害の重症度、治療歴、一般の健康状態および／または年齢、ならびにその他に有する疾患などをそれらに限定されずに含むいくつかの因子が、前記対象を有効に処置するために必要な用量に影響を及ぼすかもしれないという点を理解するだろう。さらに、タンパク質、ポリペプチド、または抗体の治療上有効な量での対象の治療には、単回治療が含まれてよく、好ましくは一連の治療が含まれてもよい。
【０１６１】
好ましい例では、対象は、体重1kgあたり約0.1乃至20mgの範囲内の抗体、タンパク質またはポリペプチドで、約1乃至10週間に1回、好ましくは2乃至8週間に1回、より好ましくは約3乃至7週間に1回、さらにより好ましくは約4、5、乃至6週間に1回、処置される。処置に用いられる抗体、タンパク質、またはポリペプチドの有効な用量は、特定の処置の経過中に増加または減少させてよいということは理解されよう。本願明細書に記載の診断的アッセイの結果によって投与量を変化させてもよく、投与量の変化が明らかになってもよい。
【０１６２】
本願発明は、発現または活性を調節する剤を包含する。たとえば、剤は低分子であってよい。たとえば、そのような低分子には、ペプチド模倣体、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、分子量が約10000g/mol未満の有機または無機化合物（すなわちヘテロ有機化合物および有機金属化合物を含む）、分子量が約5000g/mol未満の有機または無機化合物、分子量が約1000g/mol未満の有機または無機化合物、分子量が約500g/mol未満の有機または無機化合物、および塩、エステル、ならびに薬学的に許容される形状のそのような化合物が、それらに限定されずに含まれる。低分子剤の適切な投与量は、通常の医師、獣医師、または研究者の知識の範囲内における数多くの因子に依存することは理解されよう。低分子の投与量は、たとえば、対象のアイデンティティ、大きさ、および状態、または処置されるサンプルによって変化し、さらに、適用可能であればその組成物が投与される経路、および施行者が低分子に有してほしいと望む本願発明の核酸またはポリペプチドへの作用によっても変化するだろう。
【０１６３】
例示的な投与量には、対象またはサンプルの重量1kgにつきmgまたはμg単位の低分子の量（たとえば約1μg/kg乃至約500mg/kg、約100μg/kg乃至約5mg/kg、または約1μg/kg乃至50μg/kg）が含まれる。さらに、低分子の適切な投与量が、変調する発現または活性についてのその低分子の効力に依存することは理解されよう。そのような適切な投与量は、本願明細書に記載のアッセイを用いて決定してよい。本願発明のポリペプチドまたは核酸の発現または活性を調節するためにれらの低分子の1つ以上を動物（たとえばヒト）に投与する場合、医師、獣医師または研究者は、たとえば最初は比較的少ない投与量を処方し、適切な応答が得られるまでその投与量を漸増させてよい。さらに、任意の動物対象への特定の投与量は、用いられる特定の化合物の活性、対象の年齢、体重、一般的な健康状態、性別および食生活、投与時間、投与経路、排出速度、任意の併用薬物、および調節する発現または活性の程度を含む、さまざまな要因に依存するであろうことは理解されよう。
【０１６４】
本願発明のある実施態様では、PGC-1β活性のモジュレータを他の物質（たとえば低分子）を併用するか、または別の相補的な治療方法と併せて投与する。たとえば、ある実施態様では、PGC-1β活性のモジュレータを用いて代謝疾患を処置する。したがって、PGC-1β活性のモジュレータはたとえばその疾患を処置するために用いる別の物質（たとえばインスリン、メトホルミン、またはロシグリチゾンもしくはピオグリチゾンなどのチアゾラジンジオンなどの、糖尿病を処置するために用いられる別の物質）と併用してもよい。別の実施態様では、PGC-1β活性のモジュレータは、神経変性障害を処置するために用いられる。したがって、PGC-1β活性の調節は、たとえば、その障害を処置するために用いる別の物質（たとえばトルカポン（タスマー）、または別のCOMT阻害剤もしくはレボドーパ、レボドーパ／カルビドーパ、シンメトレル、抗コリン作用薬、セレギリンまたはデプレニル（エルデプリル）またはドーパミン拮抗剤などのパーキンソン病を処置するために使用される別の物質）と併用してよい。
【０１６５】
さらに、抗体（又はその断片）を、細胞毒、治療用剤、または放射性金属イオンなどの治療成分と結合させてもよい。細胞毒または細胞毒性物質には、細胞に有害な任意の物質が含まれる。例には、タキソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、ミトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルチシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびプロマイシン、ならびにそれらの類似体または相同体が含まれる。治療用剤には、代謝拮抗剤（たとえばメトトレキセート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（たとえばメクロレタミン、チオエパクロランブシル、メルファラン、カルムスチン（BSNU）、およびロムスチン（CCNU）、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ミトマイシンC、およびcis-ジクロロジアミン白金（II）（DDP）シスプラチン）、アントラサイクリン（たとえばダウノルビシン（以前の名称はダウノマイシン）、およびドキソルビシン）、抗生物質（たとえばダクチノマイシン（以前の名称はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン）、並びに抗分裂剤（たとえばビンクリスチンおよびビンブラスチン）が、それらに限定されずに含まれる。
【０１６６】
本願発明の複合体は、特定の生物学的応答を改変するために用いることができ、薬物部分は化学的治療用剤に限定されると解釈されてはならない。たとえば、前記薬物部分は望ましい生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドであってよい。そのようなタンパク質には、たとえば、アブリン、リシンA、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒素などの毒素、腫瘍壊死因子、αインターフェロン、βインターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノゲンアクチベータ、などのタンパク質、またはたとえばリンホカイン、インターロイキン1（「IL-1」）、インターロイキン2（「IL-2」）、インターロイキン6（「IL-6」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「GM-CSF」）、顆粒球コロニー刺激因子（「G-CSF」）、またはその他の成長因子などの生物学的応答改変物質が含まれてよい。
【０１６７】
そのような治療成分を抗体に結合させる技術は公知であり、たとえばArnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)、 Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery”, in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)、 Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”, in Monoclonal Antibodies ‘84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985)、 “Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985)、およびThorpe et al., “The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”, Immunol. Rev. 62:119-58 (1982) を参照のこと。代替的には、抗体を第2の抗体と結合させて、Segal 米国特許第4,676,980号に記載の抗体ヘテロ複合体を形成させることもできる。
【０１６８】
本願発明の核酸分子はベクターに挿入することができ、遺伝子治療用ベクターとして用いることができる。遺伝子治療用ベクターは、たとえば静脈内注射、局所投与（米国特許第5,328,470号参照）または定位注射（たとえばChen et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057参照）によって対象に送達することができる。前記遺伝子治療用ベクターの薬学的調製物には、許容の希釈剤に入れた遺伝子治療用ベクターが含まれてよく、または遺伝子送達賦形剤が埋め込まれた徐放性マトリックスを含んでよい。代替的には、完全な遺伝子送達ベクターがたとえばレトロウイルスベクターなどの組換え細胞から無傷で産生できる場合、前記薬学的調製物には遺伝子送達システムを生じる1つ以上の細胞が含まれてよい。
【０１６９】
前記薬学的組成物は、投与説明書とともに容器、パック、またはディスペンサーにおさめられていてよい。
【０１７０】
V.  本願発明の用途および方法
本願明細書に記載の核酸分子、タンパク質、タンパク質相同体、低分子および抗体は、1つ以上の以下の方法において用いることができる。それは、a)スクリーニングアッセイ、b)予知医学（たとえば診断アッセイ、予後アッセイ、臨床試験の監視、および薬理遺伝学）、c）処置方法（たとえば治療用および予防用）である。本願明細書に記載の通り、本願発明のPGC-1βタンパク質は1つ以上の以下の活性を有する。それは、1）核内受容体（たとえばHNF4? 、PPAR? 、レチノイン酸受容体(RARα)、甲状腺ホルモン受容体(TRβ)、または糖質コルチコイド受容体 (GR)）と相互作用する、2）HCFと相互作用する、3）NRF1と相互作用する、4）基礎転写因子と相互作用する、5）核内受容体および／またはNRF1のたとえば転写活性などの活性を調節する、6）褐色脂肪細胞決定および／または分化を調節する、7）細胞内または細胞間シグナル伝達を調節する、8）ウイルス感染を調節する（HCFとの相互作用を介して）、9）細胞増殖を調節する、10）代謝を調節する、11）ミトコンドリア活性および／または生合成を調節する、および12）脂肪酸β参加を調節する、である。
【０１７１】
本願発明の単離された核酸分子を用いて、たとえばPGC-1βタンパク質を発現し（たとえば遺伝子治療の用途における宿主細胞中の組換え発現ベクターを介して）、PGC-1βmRNA（たとえば生物学的サンプル中の）またはPGC-1β遺伝子の遺伝子変化を検出し、および以下に詳述の通りPGC-1β活性を調節することができる。PGC-1βタンパク質を用いて、PGC-1β標的分子の不十分なまたは過剰な産生、またはPGC-1β阻害因子の産生によって特徴付けられる障害を処置することができる。さらに、PGC-1βタンパク質は天然に存在するPGC-1β標的分子をスクリーニングし、PGC-1β活性を調節する薬物または化合物をスクリーニングし、およびPGC-1βの不十分なまたは過剰な産生またはPGC-1β野生型タンパク質と比較して低い活性、異常な活性または不必要な活性を有するPGC-1βタンパク質型の産生によって特徴づけられる障害（たとえば糖尿病、インスリン抵抗性疾患、肥満、過体重、拒食症、および悪液質などの代謝性障害、細胞成長または分化障害、およびウイルス性障害など）の処置をするために用いることができる。さらに、本願発明の抗PGC-1β抗体を用いて、PGC-1βタンパク質を検出および分離し、PGC-1βタンパク質のバイオアベイラビリティを調節し、およびPGC-1β活性を調節することができる。
A.  スクリーニングアッセイ
【０１７２】
本願発明は、PGC-1βタンパク質に結合するか、たとえばPGC-1β発現またはPGC-1β活性への刺激または阻害作用を有するか、またはたとえばPGC-1β標的分子の発現または活性への刺激または阻害作用を有する、たとえば候補物質もしくはテスト化合物もしくは物質（たとえばペプチド、ペプチド模倣体、低分子またはその他の薬物）などのモジュレータを同定する方法（本願明細書では「スクリーニングアッセイ」ともよぶ）を提供する。本願発明はさらに、HCF結合モチーフ（HBM）を介したPGC-1αおよびHCF間の相互作用を、たとえば上方調節もしくは下方調節などの調節をする、たとえば候補物質もしくはテスト化合物もしくは物質（たとえばペプチド、ペプチド模倣体、低分子またはその他の薬物）などのモジュレータを同定する方法（本願明細書では「スクリーニングアッセイ」ともよぶ）も提供する。当業者は、以下にあげるいずれの方法も、細胞増殖および／またはウイルス感染を調節する化合物を同定するために、PGC-1α-HCF相互作用を調節する化合物を同定するために用いてよいことを認識するであろう。マウスPGC-1αのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号8および9に記述されており、その内容すべてが引用により本願明細書に援用される米国特許第6,166,192号、PCT 国際公開第WO 00/32215号、Puigserver, P. et al. (1998) Cell 92(6):829-39に説明されている。ヒトPGC-1αのヌクレオチドアミノ酸配列は、配列番号10および111にそれぞれ記載されており、PCT国際公開No. WO 00/32215号に記載されている。
【０１７３】
ある実施態様では、本願発明はPGC-1βタンパク質もしくはポリペプチドの標的分子、またはそれらの生物学的に活性な部分（たとえば核内受容体またはその他の転写因子）である候補物質もしくはテスト化合物をスクリーニングするアッセイを提供する。別の実施態様では、本願発明はPGC-1βタンパク質もしくはポリペプチドまたはそれらの生物学的に活性な部分（たとえば補因子もしくは補酵素類似体、または阻害分子）の活性に結合または調節する候補物質またはテスト化合物をスクリーニングするアッセイを提供する。本願発明のテスト化合物は、生物学的ライブラリ、空間アドレス可能固相または液相ライブラリ、逆重畳積分が必要な合成ライブラリ方法、「1ビーズ1化合物」ライブラリ法、およびアフィニティクロマトグラフィ選択を使用した合成ライブラリ方法を含む、当業に知られるコンビナトリアルライブラリ方法における数多くのアプローチのいずれかを用いて得ることができる。前記の生物学的ライブラリアプローチは、ペプチドライブラリに限定されているが、その他の4つのアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマー、または化合物の低分子ライブラリに適用することができる(Lam, K.S. (1997) Anticancer Drug Des. 12:145)。
【０１７４】
分子ライブラリの合成の方法の例は、たとえばDeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann et al. (1994). J. Med. Chem. 37:2678; Cho et al. (1993) Science 261:1303; Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; and in Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37:1233など、当業において見いだすことができる。
【０１７５】
化合物のライブラリは、液中 (e.g., Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421)、またはビーズ(Lam (1991) Nature 354:82-84), チップ (Fodor (1993) Nature 364:555-556), 細菌 (Ladner USP 5,223,409), 胞子 (Ladner USP ‘409), プラスミド (Cull et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869) またはファージ上 (Scott and Smith (1990) Science 249:386-390); (Devlin (1990) Science 249:404-406); (Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382); (Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301-310); (Ladner 上記.)に存在してよい。
【０１７６】
ある実施態様では、アッセイは細胞を用いたアッセイであって、PGC-1βタンパク質またはその生物学的に活性な部分が発現する細胞をテスト化合物と接触させて、テスト化合物がPGC-1β活性を調節する能力を測定するアッセイである。前記テスト化合物がPGC-1β活性を調節する能力の測定は、たとえば、既知の標的分子（たとえば核内受容体またはHCF）との相互作用および／または同時活性化の監視、PGC-1βの自律転写活性の監視、PGC-1βを発現する細胞中の1つ以上の特定の代謝物（たとえば14Cグルコース）の産生の監視、ミトコンドリア遺伝子の発現の監視、または細胞中のミトコンドリア内容物または機能の監視によって、実施することができる。細胞は、たとえば、HIB1B細胞などの褐色脂肪細胞、心細胞、または肝細胞など、哺乳類由来のものであってよい。
【０１７７】
テスト化合物が標的分子（たとえば核内受容体またはHCF）に結合したPGC-1βを調節する能力も測定することができる。テスト化合物が標的分子に結合しているPGC-1βを調節する能力の測定は、たとえばPGC-1β標的分子のPGC-1βへの結合が複合体の中にある標識されたPGC-1β標的分子を検出することによって測定することができるように、PGC-1β標的分子に放射性同位体または酵素標識を結合させることによって、実行することができる。代替的には、PGC-1βを放射性同位体または酵素標識と結合させて、テスト化合物が複合体の中でPGC-1β標的分子に結合しているPGC-1βを調節する能力を監視することもできる。テスト化合物がPGC-1βに結合する能力の測定は、たとえば、PGC-1βへの前記化合物の結合を、複合体の中にある標識されたPGC-1β化合物が検出されることによって測定することができるように、前記化合物と放射性同位体または酵素標識を結合させることによって、実行することができる。たとえば、化合物（たとえば低分子を含むPGC-1β標的分子など）を直接的かまたは間接的に125I、35S、14Cまたは3Hで標識することができ、放射性同位体の検出は、放射線を直接計数するか、またはシンチレーション計数によって検出することができる。代替的には、化合物は、たとえば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素標識することができ、酵素標識は、生成物に適切な基質の変換の決定によって検出することができる。
【０１７８】
相互作用対のいずれも標識せずに、化合物がPGC-1βと相互作用する能力を測定する方法も本願発明の範囲内である。たとえば、マイクロフィジオメータを用いて、前記化合物またはPGC-1βのいずれかを標識せずに化合物とPGC-1βとの相互作用を検出することができる。McConnell, H.M. et al. (1992) Science 257:1906-1912。本願明細書に記載の通り、「マイクロフィジオメータ」（たとえばサイトセンサー）は光アドレス可能電位計測法（LAPS）を用いて細胞が環境を酸性化させる速度を測定する分析機器である。この酸性化速度の変化を、化合物とPGC-1βの相互作用の指標として用いることができる。
【０１７９】
テスト化合物がPGC-1β活性を調節する能力は、たとえば未分化HIB1B細胞などの細胞を接触させて、その化合物がその細胞の褐色脂肪細胞への分化を調節する能力を測定することによって測定することができる。テスト化合物がPGC-1β活性を調節する能力はまた、細胞（たとえば褐色脂肪細胞）をテスト化合物と接触させて、テスト化合物と接触させていない対照細胞と比較した細胞中のミトコンドリアの数またはミトコンドリア機能のレベルを測定することによって、測定することもできる。ミトコンドリアの数は、たとえば、細胞の電子顕微鏡用切片に存在するミトコンドリアを数えることによって、または細胞中に存在するミトコンドリアDNAの量をたとえばサザンブロッティング法によって分析することによって、測定することができる。ミトコンドリア機能は、シトクロームcオキシダーゼなどのミトコンドリア遺伝子の発現レベルを測定するか、またはその細胞の酸素消費量を測定することによって、決定することができる。
【０１８０】
ミトコンドリア機能を測定する例示的な方法は、その内容全体を引用によって本願明細書に援用する、米国特許第 6,166,192号、PCT 国際公開第WO 00/32215号、Puigserver, P. et al. (1998) Cell 92(6):829-39、Vidal-Puig, A.J. et al. (2000) J. Biol. Chem. 275(21):16258-66、および Wu, Z. et al. (1999) Cell 98(1):115-24に、さらに見いだすことができる。
【０１８１】
テスト化合物が細胞のインスリン感受性を調節する能力は、たとえばHIB1B細胞などの褐色脂肪細胞など、PGC-1βを発現する細胞を、たとえばテスト化合物を発現するようにトランスフォームし、放射標識グルコース（14Cグルコース）でインキュベートし、インスリンで処理したテスト化合物と接触させるアッセイを行うことによって測定することができる。対照細胞と比較したテスト化合物を含有する細胞中のグルコースの増加または減少は、前記テスト化合物が細胞のインスリン感受性を調節できることを示す。代替的には、テスト化合物を含有する細胞を放射標識下でリン酸塩供給源（たとえば[32P]ATP）とともにインキュベートし、インスリンで処理することができる。そして、たとえばインスリン受容体などのインスリン経路におけるタンパク質のリン酸化を測定することができる。テスト化合物を含有する細胞のインスリン経路におけるタンパク質のリン酸化の、対照細胞と比較した増加または減少は、テスト化合物が細胞のインスリン感受性を調節することができることを示す。
【０１８２】
別の実施態様では、アッセイは、PGC-1β標的分子（たとえば核内受容体またはHCF）を発現する細胞をテスト化合物と接触させるステップと、テスト化合物がPGC-1β標的分子の活性を調節（たとえば刺激または阻害）する能力を測定するステップを含む、細胞を用いたアッセイである。テスト化合物がPGC-1β標的分子の活性を調節する能力の測定は、たとえばPGC-1βタンパク質がPGC-1β標的分子に結合するまたは相互作用する能力を測定することによって、行うことができる。テスト化合物がPGC-1β標的分子の活性を調節する能力の測定は、たとえばPGC-1β標的分子の転写活性を測定することによって、行うことができる。
【０１８３】
PGC-1βタンパク質または生物学的に活性なその断片がPGC-1β標的分子と結合するまたは相互作用する能力の測定は、直接的な結合を測定するための上述の方法の1つによって行うことができる。好ましい実施態様では、PGC-1βタンパク質がPGC-1β標的分子に結合または相互作用する能力の測定は、標的分子の活性を測定することによって行うことができる。たとえば、前記標的分子の活性は細胞応答の誘導（すなわち細胞増殖、ミトコンドリア活性もしくは内容物、または糖新生の変化）の検出、適切な基質上の標的の触媒／酵素活性の検出、レポータ遺伝子（たとえばルシフェラーゼなどの検出可能なマーカをコードする核酸に作動的に連結した標的応答性調節要素を含む）の誘導の検出、または標的調節細胞応答の検出によって測定することができる。
【０１８４】
さらに別の実施例では、本願発明のアッセイは、PGC-1βタンパク質または生物学的に活性なその部分をテスト化合物に接触させて、前記テスト化合物がPGC-1βタンパク質または生物学的に活性なその部分に結合する能力を測定する無細胞アッセイである。本願発明のアッセイに用いられる、好ましい生物学的に活性なPGC-1βタンパク質の部分には、たとえば表面への露出しやすさのスコアが高いフラグメントなど、非PGC-1β分子との相互作用に関与する断片が含まれる。テスト化合物のPGC-1βタンパク質への結合は、上述の通り、直接的かまたは間接的に測定することができる。好ましい実施態様では、前記アッセイには、PGC-1βタンパク質または生物学的に活性なその部分をPGC-1βに結合する既知の化合物に接触させてアッセイ混合物をつくるステップと、そのアッセイ混合物をテスト化合物と接触させるステップと、前記テスト化合物がPGC-1βタンパク質と相互作用する能力を測定するステップであって、当該ステップにおいて前記テスト化合物がPGC-1βタンパク質と相互作用する能力を測定するステップが、前記の既知の化合物と比較した、前記テスト化合物がPGC-1βまたは生物学的に活性なその部分と優先的に結合する能力を測定するステップを含むステップである、ステップを含む。
【０１８５】
別の実施態様では、前記アッセイは、PGC-1βタンパク質または生物学的に活性なその部分をテスト化合物に接触させて、前記テスト化合物がPGC-1βタンパク質または生物学的に活性なその部分の活性を調節（たとえば刺激または阻害）する能力を測定する無細胞アッセイである。前記テスト化合物がPGC-1βタンパク質または生物学的に活性なその部分の活性を調節する能力の測定は、たとえば直接的な結合を測定するための上述の方法の1つによって、PGC-1βタンパク質がPGC-1β標的分子に結合する能力を測定することによって、行われる。PGC-1βタンパク質がPGC-1β標的分子に結合する能力の測定は、リアルタイム生物分子相互作用解析（BIA）などの技術を用いて行うこともできる。Sjolander, S. and Urbaniczky, C. (1991) Anal. Chem. 63:2338-2345 and Szabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705。本願明細書に用いられる「BIA」とは、相互作用体（たとえばBIAコア）のいずれも標識しない、リアルタイムの生物特異的相互作用の研究のための技術である。表面プラスモン共鳴（SPR）の光学的現象の変化は、生物分子同士のリアルタイムの反応の指標として用いることができる。
【０１８６】
代替的な実施態様では、テスト化合物がPGC-1βタンパク質の活性を調節する能力の測定は、PGC-1βタンパク質がPGC-1β標的分子の下流のエフェクタの活性をさらに調節する能力を測定することによって、行われる。たとえば、適切な標的上のエフェクタ分子の活性、または適切な標的への前記エフェクタの結合は、既報の通り測定することができる。
【０１８７】
さらに別の実施態様では、前記無細胞アッセイは、PGC-1βタンパク質または生物学的に活性なその部分を、アッセイ混合物をつくるためにPGC-1βタンパク質と結合させる既知の化合物と接触させるステップと、前記アッセイ混合物をテスト化合物を接触させるステップと、前記テスト化合物がPGC-1βタンパク質と相互作用する能力を測定するステップであって、当該ステップにおいて前記テスト化合物がPGC-1βタンパク質と相互作用する能力を測定するステップが、前記PGC-1βタンパク質が選択的に前記標的基質に結合するか、または水素化物部分の前記標的基質へのまたはそこからの移行を触媒する能力を測定するステップを含む、ステップを含む。
【０１８８】
本願発明の上述のアッセイ方法の1つ以上の実施態様において、PGC-1βまたはその標的分子を固定化し、それらのタンパク質の一方または両方の複合体形成した形状を、複合体形成していない形状から分離することを容易にし、前記アッセイを自動化させることが望ましいと考えられる。テスト化合物のPGC-1βタンパク質への結合、または候補化合物の存在下および非存在下におけるPGC-1βタンパク質と標的分子の相互作用は、反応物質を収容するのに好適な任意の容器に入れて行うことができる。そのような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管、および微量遠心管が含まれる。ある実施態様では、一方または両方の前記タンパク質をマトリックスに結合させるようなドメインを付加させた融合タンパク質を提供することができる。たとえば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ／PGC-1β融合タンパク質、またはグルタチオン-S-トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズ（シグマケミカル社、ミズーリ州セントルイス）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートに吸着させて、前記テスト化合物または前記テスト化合物および吸着されていない標的タンパク質またはPGC-1βタンパク質を混合し、前記混合物を複合体形成をもたらす条件下（たとえば塩およびpHについての生理学的な条件下）においてインキュベートすることができる。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレートのウエルを洗浄して、結合しなかった成分をいずれも除去し、そのマトリックスをビーズのケースに固定して、たとえば上述の通り、複合体を直接または間接的に測定する。代替的には、前記複合体を前記マトリックスから取り外し、標準の技術を用いてPGC-1βの結合または活性のレベルを測定する。
【０１８９】
タンパク質をマトリックスに固定するその他の技術を、本願発明のスクリーニングアッセイに用いることもできる。たとえば、PGC-1βタンパク質またはPGC-1β標的分子を、ビオチンとストレプタビジンの複合体を用いて固定化することができる。ビオチニル化PGC-1βタンパク質または標的分子は、当業に知られる技術（たとえばビオチニル化キット、ピアースケミカルズ社、イリノイ州ロックフォード）を用いて、ビオチン-NHS（N-ヒドロキシ-スクシンイミド）から調製し、ストレプタビジンコート96穴プレート（ピアースケミカルズ社）のウエルに固定化することができる。代替的には、PGC-1βタンパク質または標的分子には反応するがPGC-1βタンパク質のその標的分子への結合を妨害しない抗体を、プレートのウエルに誘導体化し、結合しなかった標的またはPGC-1βタンパク質を抗体複合体によってウエルにトラップすることができる。GST固定化複合体における上述の方法に加えて、そのような複合体を検出する方法には、PGC-1βタンパク質または標的分子と反応する抗体を用いた複合体の免疫検出、およびPGC-1βタンパク質または標的分子に関連した酵素活性の検出に依存する酵素結合アッセイが含まれる。
【０１９０】
別の実施態様では、PGC-1β発現のモジュレータは、細胞を候補化合物と接触させ、前記細胞中のPGC-1βmRNAまたはタンパク質の発現を測定する方法において同定される。前記候補化合物の存在下におけるPGC-1βmRNAまたはタンパク質の発現量を、前記候補化合物の非存在下におけるPGC-1βmRNAまたはタンパク質の発現量と比較する。そうすることで、この比較に基づいて、前記候補化合物をPGC-1β発現のモジュレータとして同定することができる。たとえば、PGC-1βmRNAまたはタンパク質の発現量が、前記候補化合物の存在下の方が非存在下よりも多い（統計学的に有意に多い）場合には、前記候補化合物はPGC-1βmRNAまたはタンパク質発現の刺激物質として同定される。代替的には、PGC-1βmRNAまたはタンパク質の発現が前記候補化合物の存在下の方が非存在下よりも少ない（統計学的に有意に少ない）場合には、前記候補化合物はPGC-1βmRNAまたはタンパク質の発現の阻害物質として同定される。前記細胞中のPGC-1βmRNAまたはタンパク質の発現量は、PGC-1βmRNAまたはタンパク質を検出する本願明細書に記載の方法によって決定することができる。
【０１９１】
本願発明のさらなる別の局面では、前記PGC-1βタンパク質は、２ハイブリッドアッセイまたは３ハイブリッドアッセイ(たとえば 米国特許第 5,283,317号、Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:12046-12054、Bartel et al. (1993) Biotechniques 14:920-924、Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696、およびBrent WO94/10300参照)の「ベイトタンパク質」として用いることができ、PGC-1βに結合するか相互作用して（「PGC-1β結合タンパク質」または「PGC-1β-bp」）PGC-1β活性に関与するその他のタンパク質を同定することができる。そのようなPGC-1β結合タンパク質は、たとえばPGC-1β媒介シグナル伝達経路の下流要素などとして、PGC-1βタンパク質またはPGC-1β標的によるシグナルの伝播に関与している可能性もある。代替的には、そのようなPGC-1β結合タンパク質はPGC-1β阻害物質である可能性がある。
【０１９２】
２ハイブリッドシステムは、ほとんどの転写因子のモジュラーとしての性質に基づいており、分離可能なDNA結合および活性ドメインからなる。簡単に説明すると、このアッセイは、2つの異なるDNAコンストラクトを利用する。あるコンストラクトでは、PGC-1βタンパク質をコードする遺伝子が、既知の転写因子のDNA結合ドメインをコードする遺伝子に融合している（たとえばGAL-4）。その他のコンストラクトでは、DNA配列のライブラリから選択された、未同定のタンパク質（「プレイ」または「サンプル」）をコードするDNA配列が、既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合している。前記の「ベイト」および「プレイ」タンパク質が、in vivoにおいて、相互作用してPGC-1β依存複合体を形成する場合、転写因子のDNA結合ドメインと活性化ドメインは近接する。この近接した状態によって、転写因子に反応する転写調節部位に作動的に連結したレポータ遺伝子（たとえばLacZ）の転写を可能にする。前記レポータ遺伝子の発現を検出することは可能で、機能性転写因子を含有する細胞コロニーを分離して、前記PGC-1βタンパク質と相互作用するタンパク質をコードするクローン遺伝子を得るために用いることができる。
【０１９３】
別の局面では、本願発明は2つ以上の前記アッセイの組み合わせに関する。たとえば、調節物質を細胞を用いたアッセイまたは無細胞アッセイを用いて同定することができ、その物質がPGC-1βタンパク質の活性を調節する能力を、たとえば肥満、糖尿病、拒食症、または悪質液の動物モデルなどの動物においてなど、in vivoにおいて確認することができる。使用可能な動物の例には、内因性メラノコリチン-4-受容体(MC4-R)遺伝子に突然変異を含有する、米国特許第 5,932,779 号に記載のトランスジェニックマウス、肥満症候群を含む症候群を引き起こす突然変異を有する動物(たとえば Friedman, J. M. et al. (1991) Mamm. Genome 1:130-144; Friedman, J. M. and Liebel, R. L. (1992) Cell 69:217-220; Bray, G. A. (1992) Prog. Brain Res. 93:333-341; and Bray, G. A. (1989) Amer. J. Clin. Nutr. 5:891-902に記載)、Stubdal H. et al. (2000) Mol. Cell Biol. 20(3):878-82 (the mouse tubby phenotype characterized by maturity-onset obesity)に記載の動物、Abadie J.M. et al. Lipids (2000) 35(6):613-20 (肥満ズッカーラット (ZR), ヒト若年発症性肥満および2型糖尿病の遺伝子モデル)に記載の動物、Shaughnessy S. et al. (2000) Diabetes 49(6):904-11に記載の動物(含脂肪細胞脂肪結合タンパク質を持たないマウス)、またはLoskutoff D.J. et al. (2000) Ann. N. Y. Acad. Sci. 902:272-81 (太ったマウス)に記載の動物が含まれる。用いられてもよいその他の動物の例には、たとえばウサギ、マウス、またはラットモデルなど、その動物が長時間低温状態にさらされるか、長期間過食状態にさらされたために、BATの肥大が生じてBAT熱産生が上昇する、非組換え、非遺伝性の肥満の動物モデルが含まれる(Himms-Hagen, J. (1990), 上記)。さらに、毒素遺伝子の標的発現を用いてBATを除去してつくられた動物も使用してよい（Lowell, B. et al. (1993) Nature 366:740-742）。PGC-1が欠損している動物（たとえばPGC-1ノックアウトマウス）は、熱産生を引き起こす能力が欠損しているかもしれず、したがって、テスト化合物がPGC-1を飛び越えて直接DHDR-2活性の調節を行うことによって熱産生を引き起こすことができるかどうかを決定するのに有用である可能性がある。
【０１９４】
本願発明の別の実施態様では、その物質がPGC-1βタンパク質の活性を調節する能力は、たとえば腫瘍形成などの細胞増殖障害の動物モデルなどの動物によってテストすることができる。in vivoにおいて腫瘍形成を研究する動物ベースのモデルは当業に公知で(Animal Models of Cancer Predisposition Syndromes, Hiai, H. and Hino, O. (eds.) 1999, Progress in Experimental Tumor Research, Vol. 35; Clarke, A.R. (2000) Carcinogenesis 21:435-41に概説される)、たとえば発癌性物質誘発腫瘍(Rithidech, K. et al. (1999) Mutat. Res. 428:33-39; Miller, M.L. et al. (2000) Environ. Mol. Mutagen. 35:319-327)、動物への腫瘍細胞の注射および／または移植、ならびに発癌性遺伝子（たとえばras）(Arbeit, J.M. et al. (1993) Am. J. Pathol. 142:1187-1197; Sinn, E. et al. (1987) Cell 49:465-475; Thorgeirsson, SS et al. Toxicol Lett (2000) 112-113:553-555) および 腫瘍抑制遺伝子 (たとえばp53) (Vooijs, M. et al. (1999) Oncogene 18:5293-5303; Clark A.R. (1995) Cancer Metast. Rev. 14:125-148; Kumar, T.R. et al. (1995) J. Intern. Med. 238:233-238; Donehower, L.A. et al. (1992) Nature 356215-221)などの成長調節遺伝子に突然変異を有する動物が含まれる。さらに、たとえば卵巣癌 (Hamilton, T.C. et al. (1984) Semin. Oncol. 11:285-298; Rahman, N.A. et al. (1998) Mol. Cell. Endocrinol. 145:167-174; Beamer, W.G. et al. (1998) Toxicol. Pathol. 26:704-710)、胃癌(Thompson, J. et al. (2000) Int. J. Cancer 86:863-869; Fodde, R. et al. (1999) Cytogenet. Cell Genet. 86:105-111)、乳癌(Li, M. et al. (2000) Oncogene 19:1010-1019; Green, J.E. et al. (2000) Oncogene 19:1020-1027)、黒色腫(Satyamoorthy, K. et al. (1999) Cancer Metast. Rev. 18:401-405)、および前立腺癌 (Shirai, T. et al. (2000) Mutat. Res. 462:219-226; Bostwick, D.G. et al. (2000) Prostate 43:286-294)などの研究用の実験用モデル系が入手可能である。パーキンソン病の研究用の動物を用いたモデルは、当業に公知である(Dawson et al., Neuron. 2002 Jul 18;35(2) : 219-22)。
【０１９５】
本願発明はさらに、上述のスクリーニングアッセイによって同定された新規物質に関する。したがって、さらに上述の適切な動物モデルにおいて本願明細書に記載のとおり同定された物質を使用することは、本願発明の範囲内である。たとえば、本願明細書に記載の通り同定された物質（たとえば、PGC-1β調節物質、アンチセンスPGC-1β核酸分子、PGC-1β特異的抗体、またはPGC-1β結合パートナー）を動物モデルに使用し、そのような物質を用いた処置の有効性、毒性または副作用を決定することができる。代替的には、本願明細書に記載の通り同定された物質を動物モデルに用いて、そのような物質の作用機序を決定することができる。さらに、本願発明は、本願明細書に記載の処置のための上述のスクリーニングアッセイによって同定される新規物質の使用に関する。
B.  検出アッセイ
【０１９６】
本願明細書において同定されたcDNA（および対応する完全な遺伝子配列）の部分または断片は、ポリヌクレオチド試薬としてさまざまな用途に使用することができる。たとえば、これらの配列を用いて、（i）それぞれの遺伝子を染色体上にマッピングし、遺伝的疾患に関連する遺伝子領域の位置を特定する、（ii）わずかな生物学的サンプルから個体を識別する（組織型識別）、および（iii）生物学的サンプルの法医学的な鑑定を助ける、ことができる。これらの用途について、以下のサブセクションで説明する。
【０１９７】
1.  染色体マッピング
遺伝子の配列（またはその配列の部分）を単離したら、この配列を用いてその遺伝子の位置を染色体上にマッピングすることができる。このプロセスを染色体マッピングという。したがって、本願明細書に記載のPGC-1βヌクレオチド配列の部分または断片を用いて、PGC-1β遺伝子の位置を染色体上にマッピングすることができる。PGC-1β配列の染色体へのマッピングは、これらの配列と疾患に関連する遺伝子を関連づける重要な第１歩である。
【０１９８】
簡単に説明すると、PGC-1βヌクレオチド配列からPCRプライマ（好ましくは長さ15乃至25bp）を調製することによって、PGC-1β遺伝子を染色体へマッピングすることができる。PGC-1β配列のコンピュータ解析を用いて、ゲノムDNAの中で1エキソンを超えず増幅プロセスを複雑化させないプライマを予測する。そして、これらのプライマを用いて、個別のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドをPCRスクリーニングすることができる。PGC-1β配列に対応するヒト遺伝子を含有するハイブリッドだけが、増殖断片を産生するだろう。
【０１９９】
体細胞ハイブリッドは、異なる哺乳類（たとえばヒトおよびマウス細胞）の体細胞を融合することによって調製する。ヒトとマウス細胞のハイブリッドが成長し分裂するに従って、次第にランダムな順序でヒト染色体が失われるが、マウス染色体は保持される。ある酵素が欠如しているためにマウス細胞は成長できないがヒト細胞は成長できる培地を用いることによって、その必要な酵素をコードする遺伝子を含有する1種類のヒト染色体が保持されるであろう。さまざまな培地を用いることによって、ハイブリッド細胞株のパネルを確立することができる。パネルにある各細胞株は、単一のヒト染色体または少数のヒト染色体のいずれかと、完全なセットのマウス染色体を含み、個別の遺伝子を特定のヒト染色体にマッピングすることを容易にする (D’Eustachio P. et al. (1983) Science 220:919-924)。ヒト染色体の断片のみを含有する体細胞ハイブリッドも、転位および欠損を有するヒト染色体を用いることによって作製することができる。
【０２００】
体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、ある配列をある染色体に割り当てる、迅速な方法である。1台のサーマルサイクラーを用いて1日に3つ以上の配列を割り当てることができる。PGC-1βヌクレオチド配列を用いてオリゴヌクレオチドプライマをデザインし、ある染色体の断片のパネルを用いてサブローカライゼーションを行うことができる。PGC-1β配列をその染色体上にマッピングするために同様に使用することができるその他のマッピング戦略には、in situハイブリダイゼーション (Fan, Y. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6223-27に記載)、標識してフローで分類した染色体を用いた前スクリーニング、および染色体特異的cDNAライブラリへのハイブリダイゼーションによる前選択が含まれる。
【０２０１】
DNA配列の分裂中期の染色体スプレッドへの蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）をさらに用いて、正確な染色体位置を1段階で提供することができる。染色体スプレッドは、紡錘体を障害するコルセミドなどの化学物質によって分裂が分裂中期で阻害された細胞を用いてつくることができる。染色体を短時間トリプシンで処理し、ギムザで染色することができる。バンドの明暗パターンが各染色体上に現れ、染色体を個別に判別することができる。FISH技術は、最も短くて500または600塩基のDNA配列で使用することができる。しかし、1000塩基を超えるクローンは、十分なシグナル強度で固有の染色体位置に結合する可能性が高く、簡単に検出できる。妥当な時間内によい結果を得るには、好ましくは1000塩基、およびさらに好ましくは2000塩基で十分だろう。この技術の概説は、Verma et al., Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques (Pergamon Press, New York 1988)を参照。
【０２０２】
染色体マッピングの試薬を個別に用いて、1つの染色体、またはその染色体上の1つの部位をマークすることができ、または試薬のパネルを用いて複数の部位および／または複数の染色体をマークすることができる。マッピング用には、前記遺伝子の非コード領域に対応する試薬が、事実上好ましい。コード配列は遺伝子ファミリの中で保存されている可能性が高く、したがって染色体マッピング中のクロスハイブリダイゼーションの確率が高くなる。
【０２０３】
正確な染色体位置に配列がマッピングされたら、その配列の染色体上での物理的な位置を遺伝子マップデータ（そのようなデータはたとえばJohns Hopkins University Welch Medical Library からオンラインで入手可能なMcKusick, V., Mendelian Inheritance in Manに見つけることができる）と関連づけることができる。同一の染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患の関係は、たとえばEgeland, J. et al. (1987) Nature 325:783-787に記載の連鎖解析（物理的に隣接する遺伝子の共同遺伝）によって同定することができる。
【０２０４】
さらに、PGC-1β遺伝子に関連する疾患を有する個体および罹患していない個体の間でのDNA配列の差を決定することができる。突然変異が有する個体の一部またはすべてに見られるが罹患していない個体にはまったく見られない場合、その突然変異は特定の疾患の原因因子である可能性が高い。罹患個体と非罹患個体の比較は、一般に、染色体スプレッドに見られる、またはそのDNA配列に基づくPCRを用いて検出される欠損または転位などの染色体の構造的な変化の一瞥を要する。最終的には、いくつかの個体の遺伝子の完全な配列決定を行い、突然変異の存在を確認することによって、突然変異と多型を区別することができる。
【０２０５】
2.  組織型識別
本願発明のPGC-1β配列を用いて、微量な生物学的サンプルから個体を識別することもできる。たとえば、米軍は、人員の識別のために制限断片長多型（RFLP）の使用を検討している。この技術では、個人のゲノムDNAを1種類以上の制限酵素で切断して、サザンブロットでプローブし、識別のための固有のバンドを得る。この方法には、「ドッグタグ（認識票）」がかかえる紛失、取り違え、盗難の可能性といった限界のせいで積極的な識別が困難になるという問題がない。本願発明の配列は、RFLPのさらなるDNAマーカとして有用である(米国特許第 5,272,057号)。
【０２０６】
さらに、本願発明の配列を用いて、個体のゲノムの特定部分を実際の塩基ごとにDNA配列を決定する代替的な技術を提供することができる。したがって、本願明細書に記載のPGC-1βヌクレオチド配列を用いて、前記配列の5’末端および3’末端から得た2つのPCRプライマを調製することができる。そして、これらのプライマを用いて個体のDNAを増幅して配列を決定することができる。
【０２０７】
このようにして調製された、個体から得た対応するDNA配列のパネルは、各個体が対立遺伝子の相異のせいでそのようなDNA配列の固有のセットを持っているために、固有の個別の識別を提供することができる。本願発明の配列は、個体または組織からそのような識別配列を得るために用いることができる。本願発明のPGC-1βヌクレオチド配列は、ヒトゲノムの部分を独自に表す。対立遺伝子の変異はこれらの配列のコード領域にある程度生じ、大半は非コード領域に生じる。個別のヒト同士の対立遺伝子の変異は、500塩基ごとに約1回の頻度で生じると見積もられている。本願明細書に記載の各配列は、ある程度は、個体から得たDNAを識別の目的で比較することができる標準物質として用いることができる。数多くの多型が非コード領域に生じるため、個体を分化するために必要な配列は少ない。配列番号1または4の非コード配列は、それぞれが100塩基の非コード増殖配列を産生するおそらく10乃至1000プライマのパネルを用いて、積極的な個体識別を十分提供することができる。配列番号3または6のコード配列などの予測されたコード配列が用いられる場合、積極的な個体識別により適しているプライマの数は500乃至2000であろう。
【０２０８】
本願明細書に記載のPGC-1βヌクレオチド配列から得た試薬のパネルを用いて、個体に固有の識別データベースを作成すれば、その同一の試薬を後に用いてその個体から得た組織を識別することができる。当該固有の識別データベースを用いれば、その生死に関係なく、個体の明確な識別が非常に小さな組織サンプルから行える。
【０２０９】
3.  法生物学におけるPGC-1β配列の用途
DNAを用いた識別技術はまた、法生物学においても用いることができる。法生物学は、犯行現場で発見された生物学的な証拠の遺伝子型決定を、たとえば犯罪者などを積極的に同定する手段として用いる、科学的な分野である。そのような識別を行うために、PCR技術を用いて、犯行現場で発見されたたとえば毛髪または皮膚、もしくな血液、唾液、もしくは精液などの体液などの組織など、極少量の生物学的サンプルから得られたDNA配列を増幅することができる。増幅された配列は、標準物質と比較し、それによって生物学的サンプルの由来を識別することができる。
【０２１０】
本願発明の配列を用いて、ヒトゲノムの特定の座位を標的とした、たとえばPCRプライマなどのポリヌクレオチド試薬であって、たとえば別の「識別マーカ」（すなわちある個人に固有の別のDNA配列）を提供することによってDNAを用いた法的識別の信頼性を高めることができる試薬を提供することができる。上述のように、実際の塩基配列情報は、制限酵素が産生したフラグメントによって形成されたパターンの正確な代替物として、識別に使用することができる。非コード領域に多数の多型が生じるために、配列番号1または4の非コード領域を標的とした配列は特にこのような用途に適しており、この技術を用いると個体の識別を容易にする。ポリヌクレオチド試薬の例には、PGC-1βヌクレオチド配列またはその部分であって、たとえば少なくとも20塩基、好ましくは少なくとも30塩基を有する配列番号1または4の非コード領域に由来するフラグメントが含まれる。
【０２１１】
本願明細書に記載のPGC-1βヌクレオチド配列は、さらに、たとえば胸腺または脳組織などの特定の組織を識別するための、たとえばin situハイブリダイゼーション技術に用いることができる、たとえば標識されたまたは標識可能なプローブなどのポリヌクレオチド試薬を提供するために用いることができる。これは、法病理学者が由来がわからない組織を提示された場合には、非常に有用である。そのようなPGC-1βプローブのパネルを用いて、生物種および／または臓器種によって組織を識別することができる。
【０２１２】
同様に、たとえばPGC-1βプライマまたはプローブなどこれらの試薬を用いて、夾雑について組織培養物をスクリーニングする（つまり、培養物中の異なる細胞種の混合物の存在をスクリーニングする）ことができる。
【０２１３】
C.  予知医学
本願発明は、診断アッセイ、予後アッセイ、および臨床試験の監視を、予後（予知）の目的に使用することによって個体を予防的に処置する、予知医学の分野に関する。したがって、本願発明のある局面は、生物学的サンプル（たとえば血液、血清、細胞、腹水、組織）との関連において、PGC-1βタンパク質および／または核酸発現、ならびにPGC-1β活性を決定し、個体が異常なまたは望ましくないPGC-1β発現または活性に関連する疾患または障害（たとえば代謝障害または細胞増殖障害）を有するかどうか、またはそのような障害を発症するリスクがあるかどうかを決定する、診断アッセイに関連する。本願発明はまた、個体が、PGC-1βタンパク質、核酸発現または活性に関連する障害を発症するリスクがあるかどうかを決定する予後（予知）アッセイも提供する。たとえば、PGC-1β遺伝子における突然変異は、生物学的サンプルの中でアッセイすることができる。そのようなアッセイを予後または予知目的に用い、PGC-1βタンパク質、核酸発現または活性に特徴づけられる、または関連する障害の発症前に、個体を予防的に処置することができる。
【０２１４】
本願発明の別の局面は、臨床試験における、物質（たとえば薬物、化合物）がPGC-1βの発現または活性に与える影響の監視に関する。
【０２１５】
これらおよびその他の物質について、以下のセクションでさらに詳細に説明する。
【０２１６】
1.  診断アッセイ
生物学的サンプル中におけるPGC-1βタンパク質または核酸の有無を検出する例示的な方法には、テスト対象から生物学的サンプルを採取するステップと、前記生物学的サンプル中にPGC-1βタンパク質または核酸の存在を検出できるように、前記生物学的サンプルをPGC-1βタンパク質またはPGC-1βタンパク質をコードする核酸（たとえばmRNAまたはゲノムDNA）を検出することができる化合物または物質と接触させるステップと、が含まれる。PGC-1βmRNAまたはゲノムDNAを検出する好ましい物質は、PGC-1βmRNAまたはゲノムDNAとハイブリダイズすることができる標識された核酸プローブである。前記核酸プローブは、たとえば、配列番号1、3、4、または6に記載のPGC-1β核酸か、またはそれらの一部であって長さが少なくとも15、30、50、100、250または500ヌクレオチドであって、ストリンジェントな条件下においてPGC-1βmRNAまたはゲノムDNAに特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドなどであってよい。本願発明の診断アッセイに用いるのに好適なその他のプローブは、本願明細書に記載されている。
【０２１７】
PGC-1βタンパク質を検出する好ましい物質は、PGC-1βタンパク質に結合する能力のある抗体であって、好ましくは検出可能な標識を有する抗体である。抗体は、ポリクローナルであってよく、より好ましくはモノクローナルであってよい。完全な抗体またはその断片（たとえばFabまたはF(ab’)2）を用いることができる。プローブまたは抗体に関する「標識された」という用語は、検出可能な物質を前記プローブまたは抗体に結合（つまり物理的に連結）することによるプローブまたは抗体の直接的な標識、および直接的に標識された別の試薬との反応によるプローブまたは抗体の間接的な標識を包含することを意図する。間接的な標識の例には、蛍光標識した2次抗体およびビオチンによるDNAプローブの末端標識を用いて、蛍光標識したストレプトアビジンを検出できるようにした1次抗体の検出が含まれる。「生物学的サンプル」という用語には、対象から単離した組織、細胞、および生物学的液体、ならびに対象の体内にある組織、細胞、および液体が含まれることを意図する。つまり、本願発明の検出方法を用いて、in vitroの生物学的サンプル、およびin vivoにおいて、PGC-1βmRNA、タンパク質またはゲノムDNAを検出することができる。たとえば、PGC-1βmRNAを検出するためのin vitro技術には、ノーザンハイブリダイゼーションおよびin situハイブリダイゼーションが含まれる。PGC-1βタンパク質DNAを検出するためのin vitro技術には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）ウエスタンブロット法、免疫沈降法および免疫蛍光法が含まれる。PGC-1βタンパク質のゲノムDNAを検出するためのin vitro技術には、サザンハイブリダイゼーションが含まれる。さらに、PGC-1βタンパク質を検出するためのin vivo技術には、対象に標識された抗PGC-1β抗体を導入する方法が含まれる。たとえば、その抗体を、被験者における存在および位置が標準の画像化技術によって検出できる放射性マーカで標識することができる。
【０２１８】
ある実施態様では、前記生物学的サンプルは、前記テスト対象から採取したタンパク質分子を含有する。代替的には、前記生物学的サンプルは、前記テスト対象から採取したmRNA分子または前記テスト対象から採取したゲノムDNAを含有してよい。好ましい生物学的サンプルは、従来の手法によって対象から単離された血清サンプルである。
【０２１９】
別の実施態様では、前記方法にはさらに対照となる対象から対照生物学的サンプルを採取するステップと、前記生物学的サンプル中でPGC-1βタンパク質、mRNA、またはゲノムDNAの存在が検出されるように、前記対照サンプルをPGC-1βタンパク質、mRNA、またはゲノムDNAを検出する能力がある化合物または物質と接触させるステップと、前記対照サンプルにおけるPGC-1βタンパク質、mRNA、またはゲノムDNAの存在と、前記テストサンプルにおけるPGC-1βタンパク質、mRNA、またはゲノムDNAの存在を比較するステップと、を含む。
【０２２０】
本願発明はまた、生物学的サンプル中でPGC-1βの存在を検出するキットを包含する。たとえば、前記キットは、生物学的サンプル中でPGC-1βタンパク質またはmRNAを検出する能力がある標識された化合物または物質と、前記サンプル中のPGC-1βの量を決定する手段と、前記サンプル中のPGC-1βの量と標準物質とを比較する手段と、が含まれてよい。前記化合物または物質は、好適な容器に梱包することができる。前記キットはさらに、PGC-1βタンパク質または核酸を検出するためのキットの使用説明書を含んでもよい。
【０２２１】
2.  予後アッセイ
本願明細書に記載の診断方法はさらに、異常なまたは望ましくないPGC-1β発現または活性に関連する疾患または障害（たとえば代謝障害または細胞増殖障害）を有するまたは発症するリスクのある対象を同定するために用いることができる。本願明細書に用いられる「異常な」という用語には、野生型PGC-1β発現または活性からはずれたPGC-1β発現または活性が含まれる。異常な発現または活性には、高いまたは低い発現または活性、および野生型の発現の発生パターンまたは細胞内の発現パターンに従わない発現または活性が含まれる。たとえば、異常なPGC-1β発現または活性には、PGC-1β遺伝子の突然変異がPGC-1β遺伝子の発現不足または過剰発現を生じる場合、およびそのような突然変異の結果、非機能性PGC-1βタンパクが生じるか、またはたとえばPGC-1β標的分子と相互作用しないタンパク質もしくはPGC-1β標的ではない分子と相互作用するタンパク質などの野生型の様式で機能しないタンパク質を生じる場合が含まれる。本願明細書に記載の「望ましくない」という用語には、細胞増殖などの生物学的応答に関与する望ましくない現象が含まれる。たとえば、望ましくないという用語には、対象において望ましくないPGC-1β発現または活性が含まれる。
【０２２２】
前診断アッセイまたは診断後アッセイなど、本願明細書に記載のアッセイは、代謝障害または細胞増殖障害などの、PGC-1βタンパク質活性または核酸発現における誤調節に関連する障害を有するまたは発症するリスクのある対象を同定するために用いることができる。代替的には、予後アッセイを用いて、代謝障害または細胞増殖障害などの、PGC-1βタンパク質活性または核酸発現における誤調節に関連する障害を有するまたは発症するリスクのある対象を同定することができる。したがって、本願発明は、テストサンプルを対象から採取してPGC-1βタンパク質または核酸（たとえばmRNAまたはゲノムDNA）が検出される、異常なまたは望ましくないPGC-1β発現または活性に関連する疾患または障害を同定する方法であって、当該方法において、PGC-1βタンパク質または核酸の存在が異常なまたは望ましくないPGC-1β発現または活性に関連する疾患または障害を有するまたは発症するリスクのある対象を診断する方法を提供する。本願明細書に記載の「テストサンプル」は、目的の対象から得た生物学的サンプルを意味する。たとえば、テストサンプルは生物学的液体（たとえば血液、腹水、脳髄液、または血清）、細胞サンプル、または組織サンプル（たとえば脂肪、心、または肝サンプル）を意味する。
【０２２３】
さらに、本願明細書に記載の予後アッセイを用いて、異常なまたは望ましくないPGC-1β発現または活性に関連する疾患または障害を処置するために、対象に物質（たとえばアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣体、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子、またはその他の薬物候補）を投与できるかどうかを決定することができる。たとえば、そのような方法を用いて、代謝障害または細胞増殖障害のための物質で対象を効果的に処置できるかどうかを決定することができる。したがって、本願発明は、テストサンプルを採取してPGC-1βタンパク質または核酸の発現もしくは活性が検出される対象を、異常なまたは望ましくないPGC-1β発現または活性に関連する障害のための物質で効果的に処置することができるかどうかを決定するための（たとえば当該方法において、PGC-1βタンパク質または核酸の発現または活性が高いことが、異常なまたは望ましくないPGC-1β発現または活性に関連する障害を処置するためにその物質を投与することができる対象にとって、診断的である）方法を提供する。
【０２２４】
本願発明の方法はまた、PGC-1β遺伝子の遺伝子変化を検出して、変化した遺伝子を有する対象が代謝障害または細胞増殖障害などのPGC-1βタンパク質活性または核酸発現における誤調節に特徴づけられる障害のリスクがあるかどうかを決定するために用いることもできる。好ましい実施態様では、前記方法には、前記対象から採取した細胞のサンプル中に、PGC-1βタンパク質をコードする遺伝子の完全性に悪影響を及ぼす少なくとも1つの変化、またはPGC-1β遺伝子の誤発現によって特徴づけられる遺伝子変化の有無を検出するステップを含む。たとえば、そのような遺伝子の変化は、1）PGC-1β遺伝子からの1つ以上のヌクレオチドの欠失、2）PGC-1β遺伝子への1つ以上のヌクレオチドの付加、3）PGC-1β遺伝子の1つ以上のヌクレオチドの置換、4）PGC-1β遺伝子の染色体再編成、5）PGC-1β遺伝子のメッセンジャーRNA転写物の量の変化、6）ゲノムDNAのメチル化パターンなど、PGC-1β遺伝子の異常な修飾、7）PGC-1β遺伝子のメッセンジャーRNA転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、8）PGC-1βタンパク質の非野生型の量、9）PGC-1β遺伝子の対立遺伝子の消失、および10）PGC-1βタンパク質の不適切な転写後修飾、のうちの少なくとも1つの存在を確認することによって検出することができる。本願明細書に記載の通り、PGC-1β遺伝子の変化を検出するために用いることができる当業に知られるアッセイは、多数ある。好ましい生物学的サンプルは、従来の手段によって対象から単離される、組織（たとえば脂肪、心、または肝サンプル）、血液、または血清サンプルである。
【０２２５】
ある実施態様では、前記変化の検出には、アンカーPCRまたはRACE PCRなど(たとえば Landegran et al. (1988) Science 241:1077-1080; and Nakazawa et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:360-364参照) のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）(たとえば 米国特許第4,683,195号および4,683,202号参照)、またはライゲーション連鎖反応（LCR）（たとえばAbravaya et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23:675-682）におけるプローブ／プライマの使用を要し、後者の場合、PGC-1β遺伝子の点変異を検出するために特に有用になる可能性がある。この方法は、対象から細胞のサンプルを採取するステップと、前記サンプルの細胞から核酸（たとえばゲノム、mRNAまたは両方）を単離するステップと、前記核酸サンプルをPGC-1β遺伝子（存在する場合）のハイブリダイゼーションおよび増幅が生じるような条件下でPGC-1β遺伝子と特異的にハイブリダイズする1つ以上のプライマと接触させるステップと、増幅産生物の有無を検出するステップか、または増幅産生物の大きさを検出して対照サンプルの長さと比較するステップが含まれてよい。PCRおよび／またはLCRは、本願明細書に記載の突然変異体を検出するために使用される任意の技術とともに、予備の増幅ステップとして用いられることがあることは理解されよう。
【０２２６】
代替的な増幅方法には、自己維持性配列複製(Guatelli, J.C. et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878)、転写増幅システム (Kwoh, D.Y. et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), Q-ベータレプリカーゼ (Lizardi, P.M. et al. (1988) Bio-Technology 6:1197)、またはその他の任意の核酸増幅方法が含まれ、その後に当業に公知の技術を用いた増幅分子の検出を行う。これらの検出スキームは、核酸分子が非常に少数だけ存在する場合には、それらの分子の検出に特に有用である。
【０２２７】
代替的な実施態様では、サンプル細胞に由来するPGC-1β遺伝子における突然変異は、制限酵素による切断パターンの変化によって同定することができる。たとえば、サンプルおよび対照DNAを単離し、増幅し（任意で）、1種類以上の制限エンドヌクレアーゼで切断して、断片長をゲル電気泳動法によって決定、比較する。サンプルと対照DNAの断片長が異なる場合、サンプルDNAに突然変異があることを示している。さらに、配列特異的リボザイム（たとえば米国特許第5,498,531号）を使用すると、リボザイム切断部位の発生または消失によって特定の突然変異の存在をスコアすることができる。
【０２２８】
他の実施態様では、PGC-1βの遺伝子突然変異は、たとえばDNAまたはRNAなどのサンプルおよび対照核酸を、数百または数千のオリゴヌクレオチドプローブを含有する高密度アレイにハイブリダイズすることによって同定することができる(Cronin, M.T. et al. (1996) Hum. Mutat. 7:244-255; Kozal, M.J. et al. (1996) Nat. Med. 2:753-759)。たとえば、PGC-1βの遺伝子突然変異は、Cronin, M.T. et al. 上記に記載の光生成DNAプローブを含有する2次元アレイにおいて同定することができる。簡単に説明すると、第1のプローブのハイブリダイゼーションアレイを用いて、サンプルおよび対照中にある長いDNAをスキャンして、系列重複プローブの直線アレイをつくることによって、配列同士の塩基変化を同定することができる。このステップによって、点変異の同定が可能になる。このステップの後に、検出されたすべての変異体および突然変異に相補的な、小規模で特化したプローブアレイを用いることによって、特異的な突然変異の特徴付けを行うことができる第2のハイブリダイゼーションアレイを行う。各突然変異アレイは平行プローブセットからなり、1つは野生型遺伝子に相補的であって、もう一つは突然変異遺伝子に相補的である。
【０２２９】
さらに別の実施態様では、当業に知られる各種の配列決定反応を用いて、PGC-1β遺伝子を直接配列決定し、サンプルPGC-1βの配列と対応する野生型（対照）配列を比較することによって突然変異を検出することができる。配列決定反応の例には、Maxam and Gilbert ((1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:560) or Sanger ((1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463) によって開発された技術をもとにしたものが含まれる。各種の自動化配列決定法のいずれかを、質量分光法による配列決定(たとえば PCT International Publication No. WO 94/16101; Cohen et al. (1996) Adv. Chromatogr. 36:127-162; and Griffin et al. (1993) Appl. Biochem. Biotechnol. 38:147-159参照)を含めた診断アッセイ((1995) Biotechniques 19:448)を行う場合に用いることができることも考慮されよう。
【０２３０】
PGC-1β遺伝子の突然変異を検出するその他の方法には、切断物質からの保護を用いてRNA/RNAまたはRNA/DNAヘテロ2本鎖のミスマッチ塩基を検出する方法 (Myers et al. (1985) Science 230:1242)が含まれる。一般に、当業の「ミスマッチ切断」技術は、野生型PGC-1β配列を含有する（標識された）RNAまたはDNAを組織サンプルから採取した突然変異の可能性があるRNAまたはDNAとハイブリダイズすることによってつくられたヘテロ2本鎖を提供するステップから始まる。この2本鎖を、対照鎖とサンプル鎖の間の塩基対ミスマッチによって存在するであろう2本鎖の1本鎖領域などを切断する物質で処理する。たとえば、RNA/DNA 2本鎖をリボヌクレアーゼで処理し、DNA/DNAハイブリッドをS1ヌクレアーゼで処理して、ミスマッチ領域を酵素で切断することができる。他の実施態様では、DNA/DNAまたはRNA/DNA 2本鎖のいずれかを、ミスマッチ領域を切断するために、ヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウム、およびピペリジンで処理することができる。ミスマッチ領域の切断後、変性ポリアクリルアミドゲル上で、得られた物質をサイズで分離し、突然変異部位を決定する。たとえば、, Cotton et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4397; Saleeba et al. (1992) Methods Enzymol. 217:286-295参照。好ましい実施態様では、対照DNAまたはRNAを検出のために標識することができる。
【０２３１】
さらに別の実施態様では、前記のミスマッチ切断反応は、細胞のサンプルから得たPGC-1βcDNAの点変異を検出してマッピングするための所定のシステムにおいて、2本鎖DNAの中にあるミスマッチ塩基対を認識する1つ以上のタンパク質を用いる。たとえば、大腸菌のmutY酵素は、G/AミスマッチのAを切断し、HeLa細胞のチミジンDNAグリコシラーゼはG/TミスマッチのTを切断する(Hsu et al. (1994) Carcinogenesis 15:1657-1662)。例示的な実施態様に従って、たとえば野生型PGC-1β配列などのPGC-1β配列に基づくプローブを、テスト細胞から得たcDNAまたはその他のDNA産生物にハイブリダイズする。2本鎖をDNAミスマッチ修復酵素で処理し、もし切断産生物があれば、電気泳動プロトコルなどによって検出することができる。たとえば米国特許第5,459,039号参照。
【０２３２】
その他の実施態様では、電気泳動の易動度の変化を用いて、PGC-1β遺伝子の突然変異を同定することができるだろう。たとえば、1本鎖高次構造多型（SSCP）を用いて、突然変異体と野生型核酸の電気泳動の易動度の差違を検出してもよい (Orita et al. (1989) Proc Natl. Acad. Sci USA:86:2766, see also Cotton (1993) Mutat. Res. 285:125-144; and Hayashi (1992) Genet. Anal. Tech. Appl. 9:73-79)。サンプルおよび対照PGC-1β核酸の1本鎖DNA断片を変性させ、再生させる。1本鎖核酸の2次構造は配列によって変化し、電気泳動度に現れる変化によって、1塩基の変化さえも検出することができる。DNA断片を、標識したプローブで標識するかまたは検出してもよい。このアッセイの感度を（DNAよりも）RNAを用いることによって向上させることもできる。それは、2次構造が、配列の変化に対する感受性がより高いからである。好ましい実施態様では、当該方法は、ヘテロ2本鎖解析を利用して、電気泳動度の変化に基づいてヘテロ2本鎖分子を分離する (Keen et al. (1991) Trends Genet. 7:5)。
【０２３３】
別の実施態様では、勾配をつけた変性剤を含有するポリアクリルアミドゲル中の突然変異体または野生型断片の移動を、変性勾配ゲル電気泳動法（DGGE）を用いてアッセイする(Myers et al. (1985) Nature 313:495)。DGGEを分析方法として用いる場合、PCRによってDNAが完全に変性することないことを確実にするために、たとえば高融解点GCリッチDNAの約40bpのGCクランプを加えることによって、DNAを修飾するだろう。さらなる実施態様では、温度勾配を変性勾配の代わりに用いて、対照およびサンプルDNAの移動度の差違を同定する（Rosenbaum and Reissner (1987) Biophys. Chem. 265:12753）。
【０２３４】
点変異を検出するためのその他の技術の例には、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマ伸長が、それらに限定されずに含まれる。たとえば、オリゴヌクレオチドプライマを、既知の突然変異が中心に来るように調製し、完全なマッチが見つかる場合のみハイブリダイズできるような条件下において標的DNAにハイブリダイズさせることもできる (Saiki et al. (1986) Nature 324:163); Saiki et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6230)。そのような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズ膜に結合し、標識された標的DNAとハイブリダイズされた時に、PCRで増幅した標的DNAまたは多数の異なる突然変異にハイブリダイズさせる。
【０２３５】
代替的には、選択的PCR増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅技術を、本願発明とともに用いてもよい。特異的な増幅のためのプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドは、その分子の中心か（増幅が異なるハイブリダイゼーションに依存するように）(Gibbs et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:2437-2448) 、または適切な条件下でミスマッチがポリメラーゼ伸長を阻害するか減らすことができる1つのプライマの3’末端に (Prossner (1993) Tibtech 11:238)、目的の突然変異を有してよい。さらに、突然変異領域に新規の制限部位を導入し、切断による検出をつくることが望ましいかもしれない(Gasparini et al. (1992) Mol. Cell Probes 6:1)。特定の実施態様において、増幅用Taqリガーゼを用いて増幅することもできる(Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci USA 88:189)。そのような場合、5’配列の3’末端に完全なマッチがある場合のみライゲーションが生じ、増幅の有無を探すことによって特異的部位の既知の突然変異の存在を検出することが可能になる。
【０２３６】
本願明細書に記載の方法は、たとえば、本願明細書に記載のプローブ核酸または抗体試薬を少なくとも1つを含む、予めパッケージされた診断キットであって、たとえば、PGC-1β遺伝子が関与する疾患または病気の症状または家族歴を呈する患者を診断するために、臨床現場などで便利に用いることができる診断キットを利用することによって、実施することができる。
【０２３７】
さらに、PGC-1βが発現する任意の細胞型または組織が、本願明細書に記載の予後アッセイに用いられてもよい。
【０２３８】
3.  臨床試験中の効果の監視
PGC-1βタンパク質の発現または活性（たとえば褐色脂肪分化、代謝、および／または細胞増殖）に与える物質（たとえば薬物）の影響の監視は、基本的な薬物スクリーニングだけでなく、臨床試験にも適用することができる。たとえば、本願明細書に記載のスクリーニングアッセイによって、PGC-1β遺伝子発現、タンパク質量の増加、またはPGC-1β活性の上方調節が認められた物質の有効性を、PGC-1β遺伝子の低発現、低タンパク質量、または下方調節されたPGC-1β活性を呈する対象の臨床試験において監視することができる。代替的には、スクリーニングアッセイによって、PGC-1β遺伝子発現タンパク質量の減少、またはPGC-1β活性の下方調節が認められた物質の有効性を、PGC-1β遺伝子の高発現、高タンパク質量、または上方調節されたPGC-1β活性を呈する対象の臨床試験において監視することができる。そのような臨床試験では、PGC-1β遺伝子、および好ましくは、たとえばPGC-1β関連疾患を示唆しているその他の遺伝子の発現または活性を、特定の細胞の表現型の「読み取り」またはマーカーとして用いることができる。
【０２３９】
たとえば、限定的ではないが、PGC-1β活性を調節する物質（たとえば化合物、薬物、または低分子）で処理することによって細胞中で調節される、PGC-1βを含む遺伝子（たとえば本願明細書に記載のスクリーニングアッセイで同定されたもの）を同定することができる。したがって、たとえば臨床試験において、PGC-1β関連疾患（たとえば誤調節された褐色脂肪分化、糖新生、および／または細胞分化によって特徴づけられる障害）に与える物質の作用を研究するために、細胞を分離してRNAを調製し、PGC-1βおよびPGC-1β関連障害に示唆されるその他の遺伝子のそれぞれの発現レベルを分析することができる。遺伝子発現のレベル（たとえば遺伝子発現パターン）を、本願明細書に記載の通りノーザンブロット解析もしくはRT-PCRによって、または代替的には産生タンパク質の量の測定によるか、本願明細書に記載の方法の1つによるか、またはPGC-1βもしくはその他の遺伝子の活性のレベルの測定によって、定量化することができる。このように、遺伝子発現のパターンは、前記物質に対する細胞の生理学的応答を示すマーカーとして用いることができる。したがって、この応答状態は、個体を前記物質で処置する前、および処置中の各時点において決定することができる。
【０２４０】
好ましい実施態様では、本願発明は、（i）前記物質の投与前に対象から投与前サンプルを採取するステップと、（ii）投与前サンプル中のPGC-1βタンパク質、mRNA、またはゲノムDNAの発現レベルを検出するステップと、（iii）前記対象から1つ以上の投与後サンプルを採取するステップと、（iv）前記投与後サンプル中のPGC-1βタンパク質、mRNA、またはゲノムDNAの発現または活性のレベルを検出するステップと、（v）前記投与前サンプル中のPGC-1βタンパク質、mRNA、またはゲノムDNAの発現または活性レベルと、投与後サンプル（単一または複数）中のPGC-1βタンパク質、mRNA、またはゲノムDNAの発現または活性レベルを比較するステップと、（vi）その結果に従って前記対象への前記物質の投与を変更するステップと、を含む、物質（たとえばアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣体、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子、または本願明細書に記載のスクリーニングアッセイによって同定されたその他の薬物候補など）による対象の処置の有効性を監視する方法を提供する。たとえば、前記物質の投与量の増加は、PGC-1βの発現または活性を検出レベルよりも高いレベルに増加させる、つまり前記物質の効果を上昇させるために、望ましいことがある。代替的に、前記物質の投与量の減少は、PGC-1βの発現または活性を検出レベルよりも低いレベルに低減させる、つまり前記物質の効果を低下させるために、望ましいことがある。そのような実施態様に従って、PGC-1β発現または活性は、観察可能な表現型の応答がない場合でも、物質の効果の指標として用いてよい。
【０２４１】
D.  処置方法
本願発明は、たとえば代謝障害または細胞増殖障害などの異常なまたは望ましくないPGC-1β発現または活性に関連する障害のリスクがある、またはそのような障害を有する対象を処置する予防および治療方法の両方を提供する。本願明細書に記載の対象の「処置」には、疾患もしくは障害、疾患もしくは障害の症状、または疾患もしくは障害のリスク（もしくは感受性）を治療、治癒、緩和、軽減、改変、改善、向上、またはそれに作用する目的で、治療用物質の対象への適用もしくは投与、または疾患または障害を有する、疾患または障害の症状を有する、もしくは疾患または障害のリスク（もしくは感受性）がある対象から採取した細胞または組織への治療物質の適用または投与が含まれる。本願明細書に記載の「治療物質」には、低分子、ペプチド、ポリペプチド、抗体、リボザイム、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドが、それらに限定されずに含まれる。
【０２４２】
処置の予防および治療方法の両方に関して、そのような処置は薬理ゲノミクスの分野から得られた知識に基づいて特異的にオーダーメードまたは改変してよい。本願明細書に用いられる「薬理ゲノミクス」は、遺伝子配列決定、統計学的遺伝学、遺伝子発現解析などのゲノミクス技術を、臨床開発および市場における薬物に応用することを意味する。さらに具体的には、この用語は、患者の遺伝子が患者自身の薬物への応答（たとえば患者の「薬物応答表現型」または「薬物応答遺伝子型」）をどのように決定しているのかを究明する研究を意味する。したがって、本願発明の別の局面は、本願発明のPGC-1β分子かまたはPGC-1βモジュレータのいずれかを用いた個別の予防または治療処置を、個別の薬物応答の遺伝子型に従ってオーダーメードする方法を提供する。薬理ゲノミクスによって、臨床医師または医師は、その処置から最も利益を得る患者に対して予防または治療処置を施し、薬物に関連する有害な副作用を経験する患者にはその処置を施すのを避けることができる。
【０２４３】
1.  予防方法
ある局面では、本願発明は対象において、PGC-1βまたはPGC-1β発現または少なくとも1つのPGC-1β活性を調節する物質を前記対象に投与することによって、異常なまたは望ましくないPGC-1β発現に関連する疾患または症状を防止する方法を提供する。異常なまたは望ましくないPGC-1β発現または活性によって生じるまたはそれに寄与する疾患のリスクがある対象は、たとえば、本願明細書に記載の診断または予後アッセイのいずれかまたは組み合わせによって、同定することができる。予防物質の投与は、疾患または障害を防止するか、または代替的には進行を遅延するように、PGC-1βの異常に特徴的な症状の発現前に行うことができる。PGC-1β異常のタイプによって、たとえばPGC-1βアゴニストまたはPGC-1βアンタゴニスト物質を対象の処置に用いることができる。適切な物質は、本願明細書に記載のスクリーニングアッセイに基づいて決定することができる。
【０２４４】
2.  治療方法
本願発明の別の局面は、治療目的でPGC-1β発現または活性を調節する方法に関する。したがって、例示的な実施態様では、本願発明の調節方法には、細胞を、PGC-1βまたはその細胞に関連するPGC-1βタンパク質活性の1つ以上の活性を調節する物質と接触させるステップを含む。PGC-1βタンパク質活性を調節する物質は、核酸またはタンパク質、天然に存在するPGC-1βタンパク質の標的分子（たとえば核内受容体またはHCF）、PGC-1β抗体、PGC-1βアゴニストもしくはアンタゴニスト、PGC-1βアゴニストもしくはアンタゴニストのペプチド模倣体、またはその他の低分子などの、本願明細書に記載の物質であってよい。ある実施態様では、前記物質は1つ以上のPGC-1β活性を刺激する。そのような刺激物質の例には、活性PGC-1βタンパク質および細胞内に導入されたPGC-1βをコードする核酸分子が含まれる。別の実施態様では、前記物質は1つ以上のPGC-1β活性を阻害する。そのような阻害物質の例には、アンチセンスPGC-1β核酸分子、抗PGC-1β抗体、およびPGC-1β阻害物質が含まれる。これらの調節方法は、in vitro（たとえば細胞を物質とともに培養することによる）か、または代替的にin vivo（たとえば対象に前記物質を投与することによる）において実行することができる。このように、本願発明はPGC-1βタンパク質または核酸分子の異常なまたは望ましくない発現または活性によって特徴づけられる疾患または障害を罹患した個体を処置する方法を提供する。ある実施態様では、本願方法には、PGC-1β発現または活性を調節（たとえば上方調節または下方調節）する物質、または物質の組み合わせを投与することが含まれる。別の実施態様では、本願方法には、低減した、異常な、または望ましくないPGC-1β発現または活性を補うために、PGC-1βタンパク質または核酸分子を治療薬として投与するステップが含まれる。
【０２４５】
PGC-1β活性の刺激は、PGC-1βが異常に下方調整される状況、および／またはPGC-1β活性の増加が有効な作用を有する可能性がある状況において望ましい。同様に、PGC-1β活性の阻害は、PGC-1βが異常に上方調整される場合、および／またはPGC-1βの低減が有効な作用を有する可能性がある状況において望ましい。
【０２４６】
3.  薬理ゲノミクス
本願発明のPGC-1β分子、および本願明細書のスクリーニングアッセイによって同定されたPGC-1β活性（たとえばPGC-1β遺伝子発現）への刺激または阻害作用を有するモジュレータは、異常なまたは望ましくないPGC-1β活性に関連するPGC-1β関連障害（たとえば代謝障害または細胞増殖障害）を処置（予防的にまたは治療的に）するために、個体に投与することができる。そのような処置とともに、薬理ゲノミクス（つまり、個体の遺伝子型と個体の外来性の化合物または薬物に対する応答の関連性の研究）を考慮してもよい。治療物質の代謝の差違は、薬理学的に活性な薬物の投与量と血中濃度の関係を変化させることによって、重篤な毒性または治療上の失敗を引き起こす可能性がある。したがって、医師または臨床医師は、PGC-1β分子またはPGC-1βモジュレータを投与するかどうかの決定、およびPGC-1β分子またはPGC-1βモジュレータでの処置の投与量および／または治療計画のオーダーメードに関連する薬理ゲノミクス研究において得られた知識の適用を考慮した方がよいかもしれない。
【０２４７】
薬理ゲノミクスは、変化した薬物の性質と患者における異常な作用によって生じる、薬物への応答における、臨床的に顕著な遺伝的変化を扱う。たとえばEichelbaum, M. et al. (1996) Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23(10-11):983-985 and Linder, M.W. et al. (1997) Clin. Chem. 43(2):254-266を参照。一般に、薬理学的な状態は2種類に分かれることがある。薬物が体に与える作用を変化させる単一の要因（薬物作用の変化）として伝達される遺伝的な状態か、または体が薬物に与える作用を変化させる単一の要因（薬物代謝の変化）として伝達される遺伝的な状態である。これらの薬理学的な状態は、まれな遺伝的欠損としてか、または天然に存在する多型としてのいずれかとして生じることがある。たとえば、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ欠損（G6PD）は、一般的な遺伝的な酵素異常症で、主な臨床合併症は酸化薬（抗マラリア剤、スルホンアミド、鎮痛剤、ニトロフラン）の摂取および空豆の摂取後に生じる溶血である。
【０２４８】
薬物応答を予測する遺伝子を同定する、「ゲノムワイド相関解析」として知られるゲノミクスアプローチは、すでに知られている遺伝子関連マーカからなるヒトゲノムの高分解能地図（たとえば、ヒトゲノム上の、それぞれが2つの変異体を有する60,000乃至100,000個の多型部位または変異部位からなる「2対立遺伝子」マーカ地図など）に依存する。そのような高分解能遺伝子マップを、統計学的に有意な人数の第II／III相試験に参加する患者それぞれのゲノムの地図と比較し、観察された特定の薬物応答または副作用に関連するマーカを特定することができる。代替的には、そのような高分解能地図を、ヒトゲノムに含まれる数千万種類の既知の一塩基多型を組み合わせて作製することができる。本願明細書に記載の「SNP」は、1本のDNAの一ヌクレオチド塩基に生じる、一般的な変化である。たとえば、SNPは、DNAの塩基1000個につき1つに生じる可能性がある。SNPは疾患のプロセスに関与することもあるが、大半は疾患に関連していないかもしれない。そのようなSNPの発生に基づく遺伝子地図の場合、個体を、個別のゲノムのSNPの特定のパターンによる遺伝子カテゴリーに分類することができる。そのような様式で、治療計画を遺伝子が類似する個体のグループに合わせて、そのような遺伝子が類似する個体の中で共通するかもしれない形質を考慮しながら、オーダーメードすることができる。
【０２４９】
代替的には、「候補遺伝子アプローチ」とよばれる方法を用いて、薬物応答を予測する遺伝子を同定することができる。この方法に従って、薬物標的をコードする遺伝子が既知の場合（たとえば本願発明のPGC-1βタンパク質）、個体群の中からその遺伝子のすべての共通する変異体を同定することは非常に容易で、その遺伝子のあるバージョンと別のバージョンを有することが特定の薬物応答に関連しているのかを明らかにすることができる。
【０２５０】
ある具体的な実施態様では、薬物代謝酵素の活性は薬物の作用の強度および持続時間の両方を決定する主要な決定因子である。薬物代謝酵素（たとえばN-アセチルトランスフェラーゼ2（NAT2）およびシトクロームP450酵素CYP2D6およびCYP2C19）の遺伝子多型の発見は、患者によって期待される薬物効果が得られなかったり、または薬物の標準的で安全な投与量を服用した後で過剰な薬物応答や深刻な毒性が現れなかったりするのはなぜか、説明することができた。これらの多型は個体群の中で2つの表現型、高代謝群（EM）と低代謝群（PM）として発現する。PMの発症率は個体群によって異なる。たとえば、CYP2D6をコードする遺伝子は高度に多型で、いくつかの突然変異がPMで特定されており、それらはすべて機能的CYP2D6の欠如につながっている。CYP2D6およびCYP2D19の低代謝群は、標準の投与量を投与されると過剰な薬物応答および副作用を経験することが非常に多い。代謝産物が活性な治療成分である場合、PMは治療応答をまったく示さず、これはコデインのCYP2D6形成代謝産物、モルフィンによって媒介されたコデインの鎮痛作用に実証されているとおりである。反対がいわゆる超高代謝群であって、標準の投与量に応答を示さない。最近、超高代謝群は、分子レベルで、CYP2D6遺伝子増幅によるということが明らかになった。
【０２５１】
代替的には、「遺伝子発現プロファイリング」とよばれる方法を用いて、薬物応答を予測する遺伝子を同定することができる。たとえば、薬物（たとえば本願発明のPGC-1β分子またはPGC-1βモジュレータなど）を投与した動物の遺伝子発現は、毒性に関連する遺伝子経路がオンになったかどうかを示す指標にすることができる。
【０２５２】
1つ以上の上述の薬理ゲノミクスアプローチで作成した情報は、個体を予防的または治療的に処置する適切な投与および処置計画を決定するために用いることができる。この知識を投与または薬物選択に応用すると、PGC-1β分子または本願明細書に記載の例示的なスクリーニングアッセイの1つによって同定したモジュレータなどのPGC-1βモジュレータで対象を処置した場合、有害作用または治療上の失敗を避けることができ、したがって治療的または予防的有効性を増強することができる。
【０２５３】
E.  電子機器可読媒体およびアレイ
PGC-1β配列情報を含む電子機器可読媒体も提供する。本願明細書に記載の「PGC-1β配列情報」とは、本願発明のPGC-1β分子に特有の任意のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列情報を意味し、全長ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列、部分的ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列、一塩基多型（SNP）などを含む多型配列、およびエピトープ配列などが、それらに限定されずに含まれる。さらに、前記PGC-1β配列情報に「関連する」情報には、配列の有無の検出（たとえば配列、断片、多型などの発現の検出）、配列のレベルの決定（たとえば量的検出などの発現レベルの検出）、配列への反応性の検出（たとえば配列特異的抗体を用いたタンパク質の発現および／またはレベルの検出）、および配列への反応性の検出（たとえば、配列特異的抗体を用いた、タンパク質発現および／またはレベルの検出）などが含まれる。本願明細書に用いられる「電子機器可読媒体」は、電子機器によって直接読み取りおよびアクセスができるデータまたは情報を記憶、維持、または収容することができる任意の好適な媒体を意味する。そのような媒体には、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク保存媒体、および磁気テープなどの磁気記憶媒体、コンパクトディスクなどの光学的記憶媒体、RAM、ROM、EPROM、およびEEPROMなどの電子記憶媒体、および一般的なハードディスク並びに磁気／光学記憶媒体などのカテゴリーのハイブリッドなどが、それらに限定されずに含まれる。その媒体は、本願発明のPGC-1β配列情報を記録するために適合または構成されている。
【０２５４】
本願明細書に記載の「電子機器」という用語には、データまたは情報を記憶するために構成または適合させた任意の好適な計算またはプロセシング機器またはその他の機器が含まれることを意図する。本願発明の使用に好適な電子機器の例には、独立型コンピュータ機器、ローカルエリアネットワーク（LAN）、広域ネットワーク（WAN）、インターネット、イントラネット、エクストラネットを含むネットワーク、携帯情報端末（PDA）、携帯電話、およびポケベルなどの電子機器、並びにローカル型および分散型プロセシングシステムが含まれる。
【０２５５】
本願明細書に記載の「記録された」は、電子機器可読媒体上に情報を記憶またはコードさせるプロセスを意味する。当業者は、容易に、既知の媒体上に情報を記録する現在既知の任意の方法を採用し、PGC-1β配列情報を含む製造物を作製することができる。
【０２５６】
各種のソフトウエアプログラムおよびフォーマットを用いて、電子機器可読媒体上に配列情報を記憶させることができる。たとえば、前記配列情報は、ASCIIファイルの形で表されたワードパーフェクトおよびマイクロソフトワードなどの市販のソフトウエアにフォーマットされているワープロテキストファイルで表すか、またはDB2、サイベース、またはオラクルなど、およびその他の様式のデータベースアプリケーションに記憶させることができる。任意の数のデータプロセッサ構築フォーマット（たとえばテキストファイルまたはデータベース）を、前記PGC-1β配列情報を記録させた媒体を得る、または作製するために用いてよい。
【０２５７】
可読な様式のPGC-1β配列情報を提供することにより、各種の目的のために前記配列情報に定期的にアクセスすることができる。たとえば、当業者は、可読な形態の配列情報を用いて、標的配列または標的構造モチーフをデータ記憶手段の中に保存された配列情報と比較することができる。検索手段を用いて、特定の標的配列または標的モチーフとマッチする本願発明の配列の断片または領域を同定することができる。
【０２５８】
したがって、本願発明は、対象が代謝または細胞増殖疾患、障害または罹患前症状もしくは代謝または細胞増殖細胞、障害、罹患前症状への素因を有するかどうかを決定する方法であって、当該方法が前記対象に関連し、PGC-1β配列情報を決定するステップ、PGC-1β配列情報に基づいて、前記対象が代謝または細胞増殖疾患、障害または罹患前症状もしくは代謝または細胞増殖細胞、障害、罹患前症状への素因を有するかどうかを決定するステップ、および／または前記疾患、障害、または罹患前症状の特定の処置を推奨するステップを含む、方法を実行するための命令を保持する媒体を提供する。
【０２５９】
本願発明はさらに、電子システムおよび／またはネットワークに、対象が代謝または細胞増殖疾患、障害または罹患前症状もしくは代謝または細胞増殖細胞、障害、罹患前症状への素因を有するかどうかを決定する方法であって、当該方法が前記対象に関連し、PGC-1β配列情報を決定するステップ、PGC-1β配列情報に基づいて、前記対象が代謝または細胞増殖疾患、障害または罹患前症状もしくは代謝または細胞増殖細胞、障害、罹患前症状への素因を有するかどうかを決定するステップ、および／または前記疾患、障害、または罹患前症状の特定の処置を推奨するステップを含む、方法を提供する。前記方法はさらに、前記対象に関連する表現型の情報を受け取るステップ、および／または前記対象に関連する表現型の情報をネットワークから獲得するステップが含まれてよい。
【０２６０】
本願発明はまた、ネットワークに、対象が代謝または細胞増殖疾患、障害、または罹患前症状、もしくは代謝または細胞増殖疾患、障害、または罹患前症状の素因を有するかどうかを決定する方法であって、当該方法が、前記対象からPGC-1β配列情報および／またはそれに関連する情報を受け取るステップと、前記対象に関連する表現型の情報を受け取るステップと、PGC-1βおよび／または代謝または細胞増殖疾患、障害、または罹患前症状、および1つ以上の前記表現型情報に基づいて、PGC-1βの情報（たとえば配列情報および／またはそれに関連する情報）および獲得した情報に対応するネットワークから情報を獲得するステップと、前記対象が代謝または細胞増殖疾患、障害、または罹患前症状または代謝もしくは細胞増殖疾患、障害、もしくは罹患前症状を有するかどうかを決定するステップを含む、方法を提供する。前記方法はさらに、前記疾患、障害、または罹患前症状の特定の処置を推奨するステップを含んでよい。
【０２６１】
本願発明はまた、ネットワークに、対象が代謝または細胞増殖疾患、障害、または罹患前症状、もしくは代謝または細胞増殖疾患、障害、または罹患前症状の素因を有するかどうかを決定する方法であって、当該方法が、前記対象からPGC-1βに関連する情報（配列情報および／またはそれに関連する情報）を受け取るステップと、前記対象に関連する表現型の情報を受け取るステップと、PGC-1βに関連するネットワーク、および／または代謝または細胞増殖疾患、障害、または罹患前症状、および1つ以上の前記表現型情報に基づいて、PGC-1βの情報、および獲得した情報に関連するネットワークから情報を獲得するステップと、前記対象が代謝または細胞増殖疾患、障害、または罹患前症状、または代謝もしくは細胞増殖疾患、障害、もしくは罹患前症状の素因有するかどうかを決定するステップを含む、ビジネス方法も提供する。前記方法はさらに、前記疾患、障害、または罹患前症状の特定の処置を推奨するステップを含んでよい。
【０２６２】
本願発明にはまた、本願発明のPGC-1β配列を含むアレイも含まれる。前記アレイは、そのアレイの1つ以上の遺伝子の発現をアッセイするために用いることができる。ある実施態様では、前記アレイを用いて、組織の遺伝子発現をアッセイし、前記アレイの遺伝子の組織特異性を確認することができる。この様式で、最高7600個の遺伝子の発現を同時にアッセイすることができ、そのうちの1つがPGC-1βである可能性がある。これにより、1つ以上の組織に特異的に発現する一組の遺伝子を示すプロフィールを展開することができる。
【０２６３】
そのような定量的な決定に加えて、本願発明は遺伝子発現の定量化も可能にする。したがって、組織特異性だけでなく、前記組織にある一組の遺伝子の発現レベルも確かめることができる。したがって、遺伝子を、組織の発現自体およびその組織の発現レベルに基づいて分類することができる。これは、たとえば、組織同士の遺伝子発現の関連性を確かめるのに有用である。したがって、ある組織をかく乱し、第2の組織にある遺伝子発現への影響を決定することができる。この関連で、生物学的刺激の応答で生じる、ある細胞種の別の細胞種への作用を決定することができる。そのような決定は、たとえば、遺伝子発現のレベルにおける細胞-細胞間の相互作用を知るために有用である。ある物質をある細胞種を治療的に処置するために投与するが別の細胞種には望ましくない影響を与える場合、本願発明は、分子レベルでの望ましくない作用を決定し、相殺物質を動じ投与するか、その望ましくない作用を他の形で処置する機会を提供する。同様に、1つの細胞種内であっても、望ましくない生物学的作用を分子レベルで決定することができる。したがって、物質の標的遺伝子以外の発現への作用を確認し、相殺することができる。
【０２６４】
別の実施例では、前記アレイを用いて、前記アレイにある1つ以上の遺伝子の発現の時間経過を監視することができる。これは、たとえば、代謝または細胞増殖疾患、障害、または罹患前症状の発症、代謝または細胞増殖疾患、障害または罹患前症状の進行、および、代謝または細胞増殖疾患、障害、または罹患前症状に関連する細胞の形質変換などのプロセスなど、本願明細書に記載の通りのさまざまな生物学的関連性において生じることがある。
【０２６５】
前記アレイはまた、遺伝子発現が、同一の細胞または異なる細胞におけるその他の遺伝子の発現に与える作用を確認（たとえば、PGC-1β発現がその他の遺伝子の発現に与える作用を確認）するために有用でもある。これは、たとえば、最終的な標的または下流の標的を制御できない場合に、代わりの治療介入の分子標的の選択を提供する。
【０２６６】
前記アレイはまた、正常または異常細胞における1つ以上の遺伝子のディファレンシャルな発現パターンを確認するために有用でもある。これは、診断または治療介入の分子標的として働くことができる一組の遺伝子（たとえばPGC-1βを含む）を提供する。
【０２６７】
本願発明は、以下の実施例によってさらに具体化されるが、それらは本願発明を制限するものと解釈されてはならない。本願明細書全体に引用されたすべての参考文献、特許、および公開された特許出願、ならびに図および配列リストは、引用によりここに明白に援用される。
【実施例】
【０２６８】
材料および方法
すべての実験は、他に記載のない限り、マウスPGC-1βを用いて行われた。
【０２６９】
プラスミドの作製
完全長マウスPGC-1βcDNAクローンを、GENERACER（インビトロジェン社、カリフォルニア州）によって作製したPGC-1βcDNAの5’末端を、3’末端を含有するEST cDNAクローン（ジェンバンク受入番号AA288169）にライゲートして得た。in vivoにおけるPGC-1β転写物の存在を、cDNA配列によって位置を特定したプライマを用いてRT-PCRによって確認した。GST-PGC-1? (N350)を、配列番号2のインフレームのN末端350アミノ酸をコードするPCR断片をpGEX-5X1 ベクターに挿入して作製した。GAL4-DBDとPGC-1βまたはHCFのさまざまな領域とを融合したコンストラクトを、インフレームのPCR増幅cDNA断片をpCMX-Gal4 プラスミドにサブクローニングすることによって作成した(Puigserver, P. et al. (1998) Cell 92:829-839)。N末端フラッグ標識PGC-1β（配列番号2のアミノ酸2乃至1014）を、前記cDNA挿入物をpCATCH フラッグプラスミドにサブクローニングすることによって得た (Georgiev, O. et al. (1996) Gene 168:165-167)。すべてのPCR断片をシーケンシングによって検証した。
【０２７０】
一過的トランスフェクション
BOSC細胞およびCOS細胞を、10%ウシ胎児血清(FBS)を加えたダルベッコ変法イーグル培地で維持した。その細胞を、FuGENE (ロシュ社、スイス) を製造者の指示に従って用いてトランスフェクトした。ある実験では、トランスフェクションから24時間後、0.5%ウシ血清アルブミン（BSA）を加えたDMEM中の培養物に、T3の場合は50 nM 、デキサメタゾンの場合は1μMのリガンドを加えた。リガンドを加えてから24時間後に、ルシフェラーゼアッセイを行った。
【０２７１】
RNA発現解析
総RNAをトリゾール（ギブコ社、ニュージャージー州）を用いて冷凍マウス組織から単離した。低温に曝露させるために、C57/Bl6マウスを屠殺前の6時間、4℃に維持した。HIB1B細胞を10%のコズミック仔牛血清を加えたDMEMで維持した。分化を誘発するために、コンフルエントな細胞を10% FBS、1μMデキサメタゾン、50nM T3、50nMインスリン、および0.5mMイソブチルメチルキサンチン（IBMX）を加えたDMEMで、48時間成長させた。分化細胞を10% FBS、50nM T3、および50nMインスリンを加えたDMEMで維持した。UCP-1 発現を誘発するために、分化したHIB 1B細胞を、RNA単離前の6時間、10μMフォルスコリンで処理した。RNA解析のために、総RNA 20 μgをゲル電気泳動法で分離し、ナイロン膜に移して、各種遺伝子に特異的なプローブとハイブリダイズさせた。
【０２７２】
タンパク質相互作用の研究
結合アッセイをPuigserver et al. (1998) 上記に記載の通り行った。簡単に説明すると、約1μgのGST、またはGST-PGC-1α、またはPGC-1β融合タンパク質を含有するグルタチオンビーズを、250μl結合バッファ（20 mM HEPES、pH 7.9、75 mM KCl、0.1 mM EDTA、 2.5 mM MgCl2 、0.05% NP40、2 mM DTT、および 10% グリセロール； TNT 結合転写／翻訳システム、プロメガ社、ウィスコンシン州）中で室温で1時間、in vitroで翻訳されたタンパク質5μlとともにインキュベートした。リガンドは指示の通り、一部の結合反応物に含まれていた。その後、このビーズを結合バッファで4回洗浄して、SDS-PAGEバッファに再懸濁させた。このサンプルを変性SDSゲル上で分離し、乾燥させて、オートラジオグラフィにかけた。
【０２７３】
共免疫沈降アッセイのために、BOSC細胞を、FuGENEを用いて、プラスミドのさまざまな組み合わせに一過的にトランスフェクトさせた。36時間のトランスフェクション後、細胞をIPバッファに溶解し（100 mM Tris、pH 8.0、250 mM NaCl、1% NP40、1 mM EDTA、1 mM MgCl2 、およびプロテアーゼ阻害物質）、そのライセートを1時間室温で、抗フラッグセファロースビーズ（シグマ社、ミズーリ州）10μMとともにインキュベートした。このビーズをIPバッファで４回洗浄し、SDS-PAGEバッファに再懸濁させた。そして、このサンプルを免疫ブロッティング解析法のために処理した。
【０２７４】
例１：マウスおよびヒトPGC-1β cDNAの同定および特徴付け
この例では、マウスおよびヒトPGC-1βをコードする遺伝子の同定および特徴付けについて記述する。
【０２７５】
PGC-1β cDNAの単離
本願発明は、本願明細書においてPGC-1βと呼ばれる新規タンパク質をコードする新規遺伝子の発見に、少なくとも部分的に基づく。マウスPGC-1αのN末端を用いて、ゲノムおよびESTデータベースを検索した。セレラマウスゲノムデータベースにある部分的な転写物（受入番号mCT4723）がPGC-1αと高度の配列同一性を共有する新規タンパク質をコードしており、PGC-1βと命名された。完全長マウスPGC-1βcDNA配列は、RACEで作成したcDNAの5’末端をESTクローン（ジェンバンク受入番号AA288169）に由来する断片にライゲートすることによって得られた。マウスPGC-1βは、第18番染色体に位置づけられる（図6）。
【０２７６】
3.6kbマウスPGC-1β cDNAの完全配列を決定し、1014アミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームが含まれることを明らかにした。マウスcDNA配列は、図1A乃至1Bおよび配列番号1に記載されている。マウスPGC-1βのアミノ酸配列は、図2および配列番号2に記載されている。配列番号1のコード領域（オープンリーディングフレーム）は配列番号3に記載されている。ヒトPGC-1βは、ヒトゲノム計画の公開配列データベースで（ジェンバンク受入番号NT_023152）、マウスPGC-1β配列との相同性に基づいて同定された。ヒトPGC-1β cDNAの完全配列を決定し、1009アミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームが含まれることを明らかにした。そのヒトcDNA配列は、図3A乃至3Bおよび配列番号4に記載されている。ヒトPGC-1βのアミノ酸配列は、図4および配列番号5に記載されている。
【０２７７】
配列番号5のヒトPGC-1βタンパク質は、約70%が配列番号2のマウスPGC-1βタンパク質に相同で、染色体領域5q33に位置づけられる（図６）。BLAST検索によって、PGC-1ファミリがニワトリ(ジェンバンク受入番号BG709977)、ゼブラフィッシュ(ジェンバンク受入番号AI477804)、およびアフリカツメガエル(ジェンバンク受入番号 BI448917 and BI448253)などのその他の種にもよく保存されていることを明らかにした。
【０２７８】
PGC-1β分子の解析
配列解析によって、マウスPGC-1βタンパク質は、N末端のLXXLLモチーフ3つおよびC末端のRNA認識モチーフ（RRM）1つを含め（図2および5参照）、分子全長にわたってPGC-1αに類似性があることを明らかにした。ヒトPGC-1βも類似の構造を有するが、LXXLLモチーフは2つしかない（図4参照）。マウスPGC-1αとマウスPGC-1βの同一性は、図5に示されるように、N末端活性化ドメイン（同一性は40%）およびC末端RNA結合ドメイン（同一性は48%）において特に高い。
【０２７９】
PGC-1関連活性補助因子（PRC）（Andersson, U. and Scarpulla, R.C. (2001) Mol. Cell. Biol. 21(11):3738-49）を含む、すべてのPGC-1ファミリーメンバの配列比較によって、配列番号2の約683乃至686残基および配列番号5の約677乃至680残基に位置する、テトラペプチドモチーフを含有する新規の保存領域（DHDY; 配列番号7）が明らかになった。この領域は以前、他のタンパク質の中で、単純ヘルペスウイルス（HSV）感染中の細胞周期の進行の調節と多タンパク質転写複合体の構築に関与するタンパク質である、宿主細胞因子（HCF）の推定結合部位として同定されている(Freiman, R.N. and Herr, W. (1997) Genes Dev. 11:3122-3127; Andersson, U. and Scarpulla, R.C. (2001) Mol. Cell. Biol. 21:3738-3749)。PGC-1βアミノ酸配列の解析の結果、さらに、グルタミン酸／アスパラギン酸リッチ酸性ドメインが同定された。しかし、PGC-1αとは異なり、PGC-1βは、RNAプロセシングの調節が示唆される領域である、アルギニン／セリンリッチ領域（RS）の大半を欠失している。
【０２８０】
例２：マウスPGC-1β発現パターンの解析
ノーザンハイブリダイゼーション解析により、PGC-1βが高度に組織選択的に発現するということが明らかになった。PGC-1β mRNAは、褐色脂肪組織（BAT）、心および脳といった、非常に高濃度のミトコンドリアが顕著に含有されている組織すべてに最も豊富に存在する。これらの結果は、PGC-1βがミトコンドリア機能、呼吸、および／または熱産生に重要な役割を果たしている可能性があることを強く示唆している。PGC-1β mRNAの2つの優勢な種（5kbおよび9kb）が検出され、PGC-1β遺伝子の3’末端に存在する、2つの代替的なポリアデニル化シグナルを用いている結果であろうと考えられる。中程度レベルのPGC-1βmRNAも、骨格筋、肝、および白色脂肪組織（WAT）に認められた。BATとWATのmRNA量の差は、10倍を超える。
【０２８１】
PGC-1αは、もともと、骨格筋および褐色脂肪においてミトコンドリア生合成および適応熱産生を制御する転写活性補助因子として同定された。PGC-1αの発現が低温で誘導されるのとは対照的に、BATにおけるPGC-1βの発現は低温環境への曝露に応答して増加するわけではない。BATで豊富に発現することから、PGC-1βは褐色脂肪細胞の決定および／または分化に関与していると仮定された。PGC-1βがBAT分化の間に調節されているかどうかをテストするために、マウス褐色脂肪細胞株HIB1Bの分化を誘発し、PGC-1β発現を検証した。未分化の細胞と比較して、PGC-1β発現は、分化3日目および5日目に上方調節され、PGC-1α発現の夾雑下方調節と平行している。アデニリルシクラーゼの活性因子であるフォルスコリンで処理すると、PGC-1αの発現は褐色脂肪の主要な非結合タンパク質、UCP1とともに速やかに誘発される（Klaus, S. et al. (1994) J. Cell Sci. 107:313-319）。反対に、PGC-1β発現はわずかに減少する。これらの結果は、PGC-1αとPGC-1βは褐色脂肪調節、および適応熱産生などのその他の褐色脂肪機能の調節に、著しい役割を果たしている可能性が高いことを示唆している。
【０２８２】
PGC-1α発現は、絶食中の肝に高度に誘発され、培養された一次肝細胞およびラットにおいて、肝の糖新生の活性化に直接的な役割を果たしていることが明らかになっている(Yoon, J.C. et al. (2001) Nature 413:131-138; Herzig, S. et al. (2001) Nature 413:179-183)。PGC-1αの高発現はまた、1型および2型糖尿病の両方のモデルにも認められている（Yoon et al. (2001) 上記）。PGC-1β発現は、絶食中の肝で有意に増加し、そのパターンはPGC-1α発現の調節と驚くほどよく似ている。これらの結果は、PGC-1βが、糖新生、脂肪酸のβ酸化、およびケトン体生成の上昇などの、絶食中の肝の適応性を活性化する調節経路の一部分であるかもしれないことを示唆している。
【０２８３】
PGC-1βが培養された一次肝細胞およびラットにおいて肝の糖新生の活性化に直接的な役割を果たしているかどうかをテストするために、FAO肝癌細胞（図10A）または一次ラット肝細胞（図10B）に、さまざまな投与量の組換えGFP、PGC-1α、またはPGC-1βウイルスを48時間かけて感染させた。総RNAを単離して、ノーザンハイブリダイゼーションで解析し、糖新生についてはPEPCKおよびG6Pase、ならびに脂肪酸酸化についてはCPT-1、MCAD、およびCytCなどの遺伝子特異的なプローブを用いて各種遺伝子の発現を検証した。その結果は、PGC-1αは、PEPCK、G6Pase、CPT-1、MCADおよびCytCが高発現だったことから、糖新生および脂肪酸酸化の両方を活性化しているのに対し、PGC-1? はミトコンドリア脂肪酸酸化遺伝子のCPT-1、MCADおよびCytCしか誘発しないことを示唆している。したがって、PGC-1βは、肝細胞において、ミトコンドリア遺伝子の発現を誘発するが、糖新生は誘発しない。PGC-1αとは対照的にPGC-1βに糖新生の誘発能力がなく、このことは、糖新生関連の副作用が望ましくないたとえば糖尿病などの代謝障害の治療分野においてPGC-1βを識別するための重要な特徴である。
【０２８４】
例３：マウスPGC-1βと核内受容体との相互関係
PPARαおよびHNF4αは絶食期間中の肝脂肪酸酸化および糖新生にかかわる重要な転写制御因子である（Kersten, S. et al. (1999) J. Clin. Invest. 103:1489-1498）。したがって、PGC-1αと同様に、PGC-1βもこれらの転写因子と物理的に相互作用して同時活性化できるかどうかを決定した。推定の核内受容体結合モチーフ（LXXLLモチーフ）3つを含有するPGC-1βのN末端（配列番号2のアミノ酸残基1乃至350）は、PGC-1αと同様の効率性で、in vitro で翻訳されたHNF4αおよびPPARαを「プルダウン」することができる。さらに、完全長PGC-1βは、BOSC細胞中で共発現させれば、HNF4αで共免疫沈降させるのが容易である。PGC-1βとPPARα間の相互作用は、aPPARαリガンドであるWy-14643の存在下においては、わずかに増加する。反対に、RARα（レチノイン酸受容体α）およびTRβ（甲状腺ホルモン受容体β）によるPGC-1βの補充は、それぞれのリガンドに高く依存する。肝の糖新生を調節する潜在的な役割と一致して、PGC-1βは、多量体化した認識結合領域を含有するレポータコンストラクト上のGR（糖質コルチコイド受容体）およびHNF4αの転写活性を強力に増強する（それぞれ図7Aおよび7B）。PGC-1βによるGRの同時活性化は、合成糖コルチコイドであるデキサメタゾンの存在に厳密に依存しており、前記レポータの活性化補助因子のリガンドに依存した補充を示唆しており、後者はTRβおよびRARαについても観察される（図7D）。NRの同時活性化に加えて、PGC-1βはまた、ミトコンドリア生合成の制御下にある中央転写因子であるNRF1の転写活性の強力な制御物質である（図7C）。これらの結果は、PGC-1βが、核内受容体およびその他の転写因子のアレイの転写活性を、それらの因子の直接的な物理的関連によって調節しているということを立証している。注目すべきは、これらがミトコンドリア生合成、脂肪酸酸化および糖新生に重要だと知られている因子を含んでいることである。
【０２８５】
例４：PGC-1β転写活性の分析
この例では、PGC-1βが非相同DNA結合ドメインと融合した場合に、自律転写活性を有するかどうかを検証する。PGC-1βは、酵母GAL4のDNA結合ドメインに融合した時に、UASルシフェラーゼレポータ作成物からの転写を、強力に活性化する（図８）。C末端の欠失によって、さらにその転写活性が増加する。PGC-1βのトランス活性化ドメインは、そのタンパク質のN末端に局在する。
【０２８６】
すべてのPGC-1ファミリメンバの配列アラインメントによって、その機能に重要だと考えられる、保存されたアミノ酸パッチがいくつか明らかになった。あるそのような領域は、[D/E]-H-X-Yのコンセンサス配列を有する推定上のHCF結合モチーフ（HBM）であって、当該配列において[D/E]はDまたはEを表し、Xは任意のアミノ酸残基を意味するHCF結合モチーフである、テトラペプチドモチーフDHDY（配列番号7）を含有する。このモチーフを含有するタンパク質は、HSVウイルスタンパク質VP16および塩基性ロイシンジッパータンパク質LZIPを含むHCFと関連することが示されている(Freiman, R.N. and Herr, W. (1997) Genes Dev. 11:3122-3127)。HCFはそれ自体はDNAと結合しないが、Oct-1などのDNA結合転写因子によって補充され、トランス活性複合体の構築のための足場として機能する(Vogel, J. L. and Kristie, T.M. (2000) EMBO J. 19:683-690)。
【０２８７】
PGC-1αおよびPGC-1βは、HCF含有タンパク質複合体のNR結合部位への補充を媒介し、NR調節転写を調節すると考えられる。PGC-1αおよびPGC-1βがin vivoにおいてHCFと物理的に関連しているかどうかを調べるために、フラッグ標識HCFをGAL-PGC-1? またはPGC-1? とともに同時トランスフェクトして、免疫沈降法で解析し、その後ウエスタンブロット解析法を行った。HCFはPGC-1αおよびPGC-1βの両方と強く相互作用するため、PGC-1関連活性化補助因子の新規相互作用パートナーを同定できる。HCFをPGC-1βに補充すると、同時トランスフェクションアッセイにおいてPGC-1β転写活性が3倍に増加する（図9A）。一方で、PGC-1βは、HBM含有タンパク質と相互作用することが明らかになっているドメインであるHCFのN末端380アミノ酸によって補充され、GAL4 DBDに融合されたHCFの転写活性を強力に増加することができる（図9B）。HCFの同時活性化はまた、PGC-1αでも認められた。これらの結果は、HCFがPGC-1αまたはPGC-1βと複合体を形成して、標的遺伝子からの転写を活性化するように機能することができることを立証している。
【０２８８】
例５：細菌細胞の組換えPGC-1βタンパク質の発現
この例では、PGC-1βを大腸菌の中に組換えグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）融合ポリペプチドとして発現させ、その融合ポリペプチドを単離して特徴付けする。特に、PGC-1βをGSTと融合させて、この融合ポリペプチドをたとえばPEB199株などの大腸菌に発現させる。PEB199でのGST-PGC-1β融合タンパク質の発現は、IPTGで誘発される。この組換え融合ポリペプチドは、アフィニティクロマトグラフィまたはグルタチオンビーズによって、誘発PEB199株の粗細菌ライセートから精製される。その細菌ライセートから精製されたポリペプチドをポリアクリルアミドゲル電気泳動法で解析し、得られた融合ポリペプチドの分子量を決定する。
【０２８９】
例６：哺乳動物細胞における組換えPGC-1βタンパク質の発現
COS細胞にPGC-1β遺伝子を発現させるために、インビトロジェン・コーポレーション社（カリフォルニア州サンディエゴ）製のpcDNA/Ampベクターを用いる。このベクターは、SV40複製開始点、アンピシリン耐性遺伝子、大腸菌複製開始点、CMVプロモータ、それに続くポリリンカー領域、ならびにSV40イントロンおよびポリアデニル化部位を含有する。DNA断片であって、当該DNA断片において完全なPGC-1βタンパク質およびその断片の5’末端にインフレームで融合させたFLAGタグをコードするDNA断片を前記ベクターのポリリンカー領域にクローニングし、前記組換えタンパク質の発現をCMVプロモータの制御下におく。
【０２９０】
プラスミドを作製するために、PGC-1β DNA配列を、PCRによって2つのプライマを用いて増幅する。前記5’プライマは、目的の制限部位とそれに続く開始コドンから始まるPGC-1βコード配列の約20ヌクレオチドを含有し、3’末端配列は、目的のその他の制限部位に相補的な配列、翻訳終止コドン、およびPGC-1β DNAの3’非翻訳領域を含有する。PCRで増幅した断片およびpCDNA/Ampベクターを適切な制限酵素で切断し、そのベクターをCIAP酵素（ニューイングランド・バイオラブズ社、マサチューセッツ州べバリー）を用いて脱リン酸する。好ましくは、PGC-1β遺伝子が正しい配向に挿入されるように、選択された2つの制限部位は異なる。ライゲーション混合物を大腸菌細胞（ストラタジーン・クローニング・システムズ社、カリフォルニア州ラホーヤのHB101、DH5α、SUREを用いることができる）にトランスフォームし、トランスフォームした培養物をアンピシリン培地プレート上に播蒔し、耐性コロニーを選択する。プラスミドDNAを形質転換体から単離し、正しい断片の存在を制限解析法によって検証する。
【０２９１】
その後、哺乳類細胞に、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈降法、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、または電気穿孔法を用いて、PGC-1β-pcDNA/Amp プラスミドDNAをトランスフェクトする。宿主細胞のトランスフェクションに好適なその他の方法は、Sambrook, J., Fritsh, E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に見つけることができる。PGC-1βポリペプチドの発現は、放射標識（NEN社、マサチューセッツ州ボストンの35Sメチオニンまたは35Sシステインを用いることができる）、および免疫沈降法 (Harlow, E. and Lane, D. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988)によって、FLAG特異的モノクローナル抗体を用いて検出する。簡単に説明すると、細胞を35Sメチオニン（または35Sシステイン）で8時間かけて標識する。その細胞を界面活性剤（RIPA バッファ、150 mM NaCl、1% NP-40、0.1% SDS、0.5% DOC、50 mM Tris、pH 7.5）で溶解し、HA特異的モノクローナル抗体で沈降させる。そして、沈降したポリペプチドを、PGC-1β特異的モノクローナル抗体を用いてSDS-PAGEによって解析する。
【０２９２】
例７：細胞分化におけるPGC-1の役割
PGC-1βがマウス筋管のミトコンドリア生合成を誘発するかどうかをテストするために、C2C12筋管に組換えアデノウイルスを感染させた。総RNA（図11A）またはDNA（図11B）を単離し、それぞれについて遺伝子発現またはミトコンドリア内容物を調べた。その結果から、PGC-1αおよびPGC-1βの両方がミトコンドリア遺伝子発現を活性化させることを明らかにした。
【０２９３】
PGC-1αおよびPGC-1βに応答した、スーパーオキシドジスムターゼ（Mn-SOD）およびグルタチオンペルオキシダーゼ（GPx）などのフリーラジカル代謝に関与する酵素の発現もテストした（図11A）。その結果は、フリーラジカル代謝に関与する酵素はPGC-1αおよびPGC-1βの両方に応答して高度に上昇することを示している。したがって、PGC-1ファミリの活性補助因子はフリーラジカルによる損傷に対する細胞防御に重要な役割を果たしている。
【０２９４】
例８：神経芽腫細胞におけるPGC-1βタンパク質の発現
PGC-1βが神経芽腫細胞のミトコンドリア遺伝子発現を誘導するかどうかテストするために、ヒト細胞芽腫細胞を培養し、PGC-1αおよびPGC-1βを発現する組換えアデノウイルスにそれぞれ感染させた。総RNAを単離し、特異的なプローブを用いたハイブリダイゼーションによって解析した。その結果は、PGC-1αおよびPGC-1βの両方がミトコンドリア遺伝子発現を有意に増加させることを示している。PGC-1補助活性因子が神経細胞のミトコンドリア遺伝子発現を調節する能力は、PGC-1が脳のエネルギー代謝の重要な調節物質である可能性があることを示唆している。異常なミトコンドリア機能は、通常、パーキンソン病などの神経疾患に関係していることから、PGC-1は神経変性疾患の分野で重要な治療標的になるかもしれない。
【０２９５】
等価物
当業者であれば、ごく普通の実験を用いるのみで、ここに説明した本願発明の特定の実施態様の等価物を数多く認識し、または確認できることであろう。このような等価物は、添付の請求の範囲の包含するところである。
【図面の簡単な説明】
【０２９６】
【図１Ａ−１Ｂ】マウスPGC-1βのcDNA配列を示す。ヌクレオチドの配列は配列番号1の核酸1乃至3664に対応する。翻訳開始コドンおよび終止コドンには下線を施す。
【図２】マウスPGC-1βの予測されるタンパク質配列を示す。アミノ酸配列は配列番号2の残基1乃至1014に対応する。３つのLXXLLモチーフには下線を施し、RRM（RNA結合モチーフ）は太字で示し、HBM（宿主細胞結合因子モチーフ）は四角で囲ってある。
【図３Ａ−３Ｂ】ヒトPGC-1βのcDNA配列を示す。ヌクレオチド配列は配列番号4の核酸1乃至3030に対応する。翻訳開始コドンおよび終止コドンには下線を施す。
【図４】ヒトPGC-1βの予測されるタンパク質配列を示す。アミノ酸配列は配列番号5の残基1乃至1009に対応する。２つのLXXLLモチーフには下線を施し、RRM（RNA結合モチーフ）は太字で示し、およびHBM（宿主細胞結合因子モチーフ）は四角で囲ってある。
【図５】マウスPGC-1α、PGC-1β、およびPRC間のアラインメントの概略図を示す。PGC-1βと同一である各タンパク質領域の割合が表示されている。保存されているドメインおよび／またはモチーフには、活性化ドメイン（AD）、LXXLLおよびHBMモチーフ、RSドメイン、およびRRMモチーフが含まれる。HBMモチーフはPGC-1関連タンパク質の3種類すべてに保存されている。
【図６】マウスおよびヒトPGC-1β遺伝子のゲノム構造および染色体位置の概略図を示す。
【図７Ａ−７Ｄ】マウスPGC-1βによる核内受容体の同時活性化の転写解析の結果を示す。COS細胞に、レポータプラスミドのみを加えるか、またはPGC-1βの存在下において、GR（図７A）、HNF4α（図７B ）、NRF1（図７C）、またはTRβ（図７D）を発現するベクターを同時にトランスフェクトした。GRおよびTRβをトランスフェクトするために、細胞を溶解する24時間前にリガンド（それぞれDex、1μMデキサメタゾン、および50 nM T3）を加え、ルシフェラーゼ活性についてアッセイした。
【図８】マウスPGC-1βの転写活性化ドメインのマッピングを示す。完全長PGC-1βまたはその断片をGAL4-DBDに融合し、一過的にトランスフェクトしたBOSC細胞において5xUASルシフェラーゼレポータコンストラクト（5xUAS、上流活性化配列5コピー分）からの転写の活性をアッセイした。GAL4-DBD-PGC-1α融合プラスミドを比較のために誘発した。ルシフェラーゼ活性は、ベクターのみの場合の活性の倍数で表した。エラーバーは、3種類の独立の実験をそれぞれ２回ずつ繰り返して得られたSEMを表す。
【図９】HCFによるPGC-1の相互作用および活性化を示す。図９Aでは、表示の通り、BOSC細胞に一時的にGAL4-PGC-1βおよびFLAG-HCF発現コンストラクトをトランスフェクトさせた。図９Bでは、HCFのN末端380アミノ酸をGAL4-DBDに融合させた。得られたコンストラクトを一過的にBOSC細胞のみか、またはFlag-PGC-1βの存在下においてトランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性は、ベクターのみの場合の活性の倍数で表した。エラーバーは、3種類の独立の実験をそれぞれ２回ずつ繰り返して得られたSEMを表す。
【図１０Ａ−１０Ｂ】PGC-1βが、肝においてミトコンドリア遺伝子発現は誘発するが糖新生は誘発しないことを示す。FAO肝癌細胞（図１０A）または一次ラット肝細胞（図１０B）にさまざまな投与量の組換えGFP、PGC-1α、またはPGC-1βウイルスを、48時間感染させた。総RNAを単離し、ノーザンハイブリダイゼーションで解析し、糖新生の場合にはPEPCKおよびG6Pアーゼ、脂肪酸酸化の場合にはCPT-1、MCAD、およびシトクロームCなどの遺伝子特異的プローブを用いて各種の遺伝子の発現を検証した。その結果は、PGC-1αでは、PEPCK、G6Pアーゼ、CPT-1、MCAD、およびシトクロームCの高発現に実証されたように、糖新生および脂肪酸酸化の両方を活性化したが、PGC-1βはミトコンドリア脂肪酸酸化遺伝子であるCPT-1、MCAD、およびシトクロームCしか誘発しないことを示している。
【図１１Ａ−１１Ｂ】PGC-1βはマウス筋管においてミトコンドリア生合成を誘発し、フリーラジカル代謝が関与する酵素はPGC-1αおよびPGC-1βに応答して高度に上昇することを示す。C2C12筋管に組換えアデノウイルスを感染させ、総RNA（図１１A）および総DNA（図１１B）を単離して、遺伝子発現およびミトコンドリアDNA内容物をそれぞれ検証した。
【図１２】PGC-1αおよびPGC-1βが神経芽腫細胞のミトコンドリア遺伝子発現を誘発することを示す。
【配列表】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ−７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ−１０Ｂ】
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【図１１Ａ−１１Ｂ】
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【図１２】
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