(57)【要約】本発明は、ＨＩＶおよび／または複製を阻害するためのｓｉＲＮＡ方法および組成物、ならびにＨＩＶを阻害するために有効なｓｉＲＮＡを同定するシステムおよびＨＩＶ感染機構を研究するためのシステムを提供する。本発明はまた、感染性因子の感染、病原力および／または複製を阻害するための方法および組成物（例えば、ｓｉＲＮＡを用いることによって宿主細胞遺伝子の発現を阻害すること）を提供する。本発明の特定の実施形態において、このｓｉＲＮＡは、約１９ヌクレオチド長の相補領域を有する２つのＲＮＡ鎖を含み、必要に応じて、１つまたは２つの１本鎖オーバーハングまたはループをさらに含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的転写物に標的化されたｓｉＲＮＡを含む組成物であって、該標的転写物は、宿主細胞転写物または因子特異的転写物であり、ここで、転写物は、感染性因子か、または感染性因子の複製による感染に関連する、組成物。
【請求項２】
前記標的転写物が、宿主細胞転写物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記標的転写物が、因子特異的転写物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ｓｉＲＮＡが、前記標的転写物のレベルを少なくとも約２分の１に低減させるのに十分なレベルで存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ｓｉＲＮＡが、前記標的転写物のレベルを少なくとも約４分の１に低減させるのに十分なレベルで存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記ｓｉＲＮＡが、前記標的転写物のレベルを少なくとも約８分の１に低減させるのに十分なレベルで存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記ｓｉＲＮＡが、前記標的転写物のレベルを少なくとも約１６分の１に低減させるのに十分なレベルで存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記ｓｉＲＮＡが、前記標的転写物のレベルを少なくとも約６４分の１に低減させるのに十分なレベルで存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記ｓｉＲＮＡが、前記宿主細胞への前記感染性因子の進入を阻害するのに十分なレベルで存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ｓｉＲＮＡが、前記宿主細胞への前記感染性因子の進入を少なくとも約４分の１に阻害するのに十分なレベルで存在する、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ｓｉＲＮＡが、前記宿主細胞への前記感染性因子の進入を少なくとも約８分の１に阻害するのに十分なレベルで存在する、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ｓｉＲＮＡが、前記宿主細胞への前記感染性因子の進入を少なくとも約１６分の１に阻害するのに十分なレベルで存在する、請求項９に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ｓｉＲＮＡが、前記宿主細胞への前記感染性因子の進入を少なくとも約６４分の１に阻害するのに十分なレベルで存在する、請求項９に記載の組成物。
【請求項１４】
前記標的転写物が、前記感染性因子に対するレセプターをコードする宿主細胞転写物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記標的転写物が、細胞の生存または機能にとって必須ではない分子をコードする宿主細胞転写物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ｓｉＲＮＡが、感染性因子の複製を阻害するのに十分なレベルで存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
請求項１に記載の組成物であって、
前記宿主細胞が前記感染性因子で潜伏性感染され、そして前記標的転写物が因子特異的転写物であり、ここで、前記ｓｉＲＮＡが、該標的転写物の発現を低減させる、組成物。
【請求項１８】
前記宿主細胞内の前記ｓｉＲＮＡの存在が、前記標的転写物以外の少なくとも１つの因子特異的転写物のレベルを低減させることを生じる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ｓｉＲＮＡが、約１９ヌクレオチド長の塩基対領域を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ｓｉＲＮＡが、塩基対領域および少なくとも１つの一本鎖オーバーハングを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ｓｉＲＮＡが、ヘアピン構造を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２２】
前記ｓｉＲＮＡが、自己相補領域を有する一本のＲＮＡ鎖を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ｓｉＲＮＡが、２つの相補的ＲＮＡ鎖を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２４】
前記ｓｉＲＮＡが、３’ヒドロキシル基を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２５】
前記ｓｉＲＮＡが、５’リン酸基を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２６】
前記ｓｉＲＮＡが、前記標的転写物の領域と正確に相補的である領域を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２７】
請求項１に記載のｓｉＲＮＡのアナログであって、少なくとも１つの改変を含む点で該ｓｉＲＮＡとは異なる、アナログ。
【請求項２８】
前記改変が、前記ｓｉＲＮＡの安定性を増大させることを生じるか、該ｓｉＲＮＡの吸収を促進させるか、該ｓｉＲＮＡの細胞内進入を促進させるか、またはこれらの任意の組み合わせを生じる、請求項２７に記載のアナログ。
【請求項２９】
前記改変が、塩基、糖、またはヌクレオシド間結合を改変する、請求項２７に記載のアナログ。
【請求項３０】
請求項１に記載のｓｉＲＮＡのアナログであって、少なくとも１つのリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドによって置換されている点で該ｓｉＲＮＡとは異なる、アナログ。
【請求項３１】
前記感染性因子が、ウイルスである、請求項１、２、３または２７のいずれかに記載の組成物。
【請求項３２】
前記ウイルスが、レトロウイルスまたはレンチウイルスである、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記ウイルスが、ＨＩＶである、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記宿主細胞が、免疫系細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３５】
前記免疫系細胞がＴ細胞である、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
前記宿主細胞が初代細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３７】
ハイブリダイズされる場合に、請求項１に記載の組成物を形成する、複数の一本鎖ＲＮＡを含む、組成物。
【請求項３８】
前記一本鎖ＲＮＡが、包括的に、約２１と２３との間のヌクレオチド長の範囲である、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
前記ｓｉＲＮＡが、前記宿主細胞におけるインターフェロン応答を誘発することなく、前記標的転写物レベルを低減させる、請求項１に記載の組成物。
【請求項４０】
請求項３９に記載の組成物であって、
前記ｓｉＲＮＡが、インターフェロン応答が前記宿主細胞への二本鎖ＲＮＡ分子の導入によって誘発される条件下で、該宿主細胞における該インターフェロン応答を誘発することなく、前記標的転写物レベルを低減させ、ここで、該二本鎖ＲＮＡ分子が少なくとも３０塩基対を含む、組成物。
【請求項４１】
ＨＩＶによる感染に感受性のある細胞内に存在する場合に、該細胞の、感染性ＨＩＶ全体による感染に対する感受性を低下させる点で特徴付けられる、ｓｉＲＮＡ組成物。
【請求項４２】
二本鎖ＲＮＡを含む、請求項４１に記載のｓｉＲＮＡ組成物。
【請求項４３】
ｓｉＲＮＡの合成を指向させるベクターを含む、請求項４１に記載のｓｉＲＮＡ組成物。
【請求項４４】
前記細胞の、少なくとも２つのＨＩＶ株による感染に対する感受性を低下させる、請求項４１に記載のｓｉＲＮＡ組成物。
【請求項４５】
前記２つの株が、Ｔ細胞指向性株およびマクロファージ指向性株を含む、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
核酸構築物を含む組成物であって、ＨＩＶによる感染に感受性のある細胞に存在する場合に、該構築物が、感染性ＨＩＶ全体による感染に対する細胞の感受性を低下させる１つ以上のＲＮＡの転写を指向する点で特徴付けられる、組成物。
【請求項４７】
感染性ＨＩＶ全体によって感染された細胞内に存在する場合に、ウイルスタンパク質産生を低下させる点で特徴付けられる、ｓｉＲＮＡ組成物。
【請求項４８】
二本鎖ＲＮＡを含む、請求項４７に記載のｓｉＲＮＡ組成物。
【請求項４９】
ｓｉＲＮＡの合成を指向するベクターを含む、請求項４７に記載のｓｉＲＮＡ組成物。
【請求項５０】
少なくとも２つのＨＩＶ株による感染に対する細胞の感受性を低下させる、請求項４５に記載のｓｉＲＮＡ組成物。
【請求項５１】
前記ＨＩＶ株が、Ｔ細胞指向性株およびマクロファージ指向性株を含む、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５２】
以下：
請求項１に記載の組成物；および
薬学的に受容可能なキャリア
を含む、薬学的組成物。
【請求項５３】
宿主細胞において活性な発現シグナルに作動可能に連結されたＲＮＡをコードする核酸を含む組成物であって、核酸が宿主細胞に導入される場合、宿主転写物または因子特異的転写物に標的化されるｓｉＲＮＡが、該宿主細胞内に産生され、ここで、転写物は、感染性因子による感染か、または感染性因子の複製に関連する、組成物。
【請求項５４】
前記感染性因子が、ウイルスである、請求項５３に記載の組成物。
【請求項５５】
前記ウイルスが、ＨＩＶである、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５６】
前記核酸が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩに対するプロモーターを含む、請求項５３に記載の組成物。
【請求項５７】
前記プロモーターが、Ｕ６プロモーターまたはＨ１プロモーターである、請求項５６に記載の組成物。
【請求項５８】
前記核酸が、誘導性調節エレメントを含む、請求項５３に記載の組成物。
【請求項５９】
前記核酸が、組織型特異的調節エレメントまたは細胞型特異的調節エレメントを含む、請求項５３に記載の組成物。
【請求項６０】
請求項５３に記載の組成物であって、ここで、
前記核酸が、感染性因子に感染していない細胞での発現と比べて、感染性因子に感染している細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指向する調節エレメント、または感染性因子に感染している細胞において、増強されたレベルでヌクレオチド配列の発現を指向する調節エレメントを含む、組成物。
【請求項６１】
請求項５３に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項６２】
選択マーカーまたは検出マーカーをコードする核酸を含む、請求項６１に記載のベクター。
【請求項６３】
遺伝子治療適用に適切なベクターである、請求項６１に記載のベクター。
【請求項６４】
レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターからなる群より選択される、請求項６３に記載のベクター。
【請求項６５】
感染性因子による感染を処置または予防する方法であって、該方法は、
該感染性因子に被検体を曝露する前、曝露と同時にまたは曝露後に、請求項６１に記載のベクターを含む組成物を該被検体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項６６】
前記感染性因子が、ウイルスである、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記感染性因子が、ＨＩＶである、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
感染性因子による感染の間に産生された転写物に標的化されたｓｉＲＮＡの１つまたは両方の鎖をコードする構築物であって、ここで、該組成物の分解が、該感染性因子による感染または該感染性因子の複製の１つ以上の局面を、遅延させるか、防ぐか、または阻害する点で、該転写物が特徴付けられる、構築物。
【請求項６９】
ＨＩＶ感染の間に産生された転写物に標的化されたｓｉＲＮＡの１つまたは両方の鎖をコードする構築物であって、ここで、該組成物の分解が、ＨＩＶ感染またはＨＩＶ複製の１つ以上の局面を、遅延するか、防ぐか、または阻害する点で、該転写物が特徴付けられる、構築物。
【請求項７０】
請求項６８または６９に記載の構築物を含む、ベクター。
【請求項７１】
感染性因子に感染する間に産生された転写物に標的化されたｓｉＲＮＡを含むように設計または操作された細胞であって、ここで、該転写物の分解が、該感染性因子による感染または該感染性因子の複製の１つ以上の局面を、遅延させるか、防ぐか、または阻害する点で、該転写物が特徴付けられる、細胞。
【請求項７２】
前記感染性因子が、ウイルスである、請求項７１に記載の細胞。
【請求項７３】
前記ウイルスが、ＨＩＶである、請求項７２に記載の細胞。
【請求項７４】
請求項１に記載のｓｉＲＮＡ組成物を含むか、または発現するように操作されたトランスジェニック動物。
【請求項７５】
ウイルスインヒビターを同定する方法であって、該方法は、以下の工程：
候補ｓｉＲＮＡを含む細胞を提供する工程であって、該候補ｓｉＲＮＡの配列が、ウイルスに感染する間に産生される、少なくとも１つの転写物に相補的な領域を含み、該転写物の分解が、ウイルスの感染または複製の１つ以上の局面を、遅延させるか、防ぐか、または阻害する点で、該転写物が特徴付けられる、工程；および
細胞において、ウイルスの感染力または複製を阻害するｓｉＲＮＡを同定する工程であって、該ｓｉＲＮＡはウイルスインヒビターである、工程、
を包含する、方法。
【請求項７６】
前記ウイルスが、ＨＩＶである、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記ｓｉＲＮＡが存在しない場合、前記細胞が、少なくとも１つのウイルス転写物を産生する点で特徴付けられる、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
前記細胞が、前記ウイルスに潜伏感染される、請求項７５に記載の方法。
【請求項７９】
前記細胞が、前記ウイルスに産生的に感染している、請求項７５に記載の方法。
【請求項８０】
前記細胞にウイルスゲノムをトランスフェクトするか、または該細胞に前記ウイルスを感染させる工程をさらに包含する、請求項７５に記載の方法。
【請求項８１】
感染性因子による感染を処置または予防する方法であって、該方法は、以下の工程：
該感染性因子による感染の間に産生された転写物に標的化された、有効量のｓｉＲＮＡを含む組成物を、被検体を該感染性因子に曝露する前か、曝露と同時にか、または曝露後に、該被検体に投与する工程であって、該転写物レベルの低減が、該感染性因子による感染または該感染性因子の複製の１つ以上の局面を、遅延するか、防ぐか、または阻害する点で該転写物が特徴付けられる、工程、
を包含する、方法。
【請求項８２】
前記感染性因子が、ウイルスである、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記ウイルスが、ＨＩＶである、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記感染性因子による感染を処置または予防する方法であって、該方法は、
宿主細胞遺伝子についての転写物に標的化された、有効量のｓｉＲＮＡを含む組成物を、被検体を該感染性因子に曝露する前か、曝露と同時にか、または曝露後に、該被検体に投与する工程であって、該転写物レベルの低減が、該感染性因子による感染または該感染性因子の複製の１つ以上の局面を、遅延するか、防ぐか、または阻害する点で該転写物が特徴付けられる、工程、
を包含する、方法。
【請求項８５】
前記感染性因子が、ウイルスである、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記ウイルスが、レンチウイルスまたはレトロウイルスである、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記ウイルスが、ＨＩＶである、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記転写物が、感染性因子に対するレセプターをコードする、請求項８４に記載の方法。
【請求項８９】
感染性因子による感染を処置または予防する方法であって、該方法は、請求項６８に記載のベクターを含む組成物または請求項７１に記載の細胞を含む組成物を、被検体を該感染性因子に曝露する前か、曝露と同時にか、または曝露後に、該被検体に投与する工程、
を包含する、方法。
【請求項９０】
前記ＨＩＶ感染を処置または予防する方法であって、該方法は、請求項６９に記載のベクターを含む組成物または請求項７３に記載の細胞を含む組成物を、被検体をＨＩＶに曝露する前か、曝露と同時にか、または曝露後に、該被検体に投与する工程、
を包含する、方法。
【請求項９１】
ＨＩＶ感染を処置または予防する方法であって、該方法は以下：
ＨＩＶ感染の危険性のある被検体またはＨＩＶ感染を患っている被検体から、細胞集団を取り出す工程；
ＨＩＶ感染の間に産生された転写物に標的化された、有効量のｓｉＲＮＡを含むように、細胞を設計または操作する工程であって、該転写物の分解が、ＨＩＶ感染または複製の１つ以上の局面を、遅延するか、防ぐか、または阻害する点で該転写物が特徴付けられる、工程；
該被検体に該細胞の少なくとも一部分を戻す工程、
を包含する、方法。
【請求項９２】
ＨＩＶ感染を処置または予防する方法であって、該方法は、以下：
ＨＩＶ感染の危険性のある被検体またはＨＩＶ感染を患っている被検体から、細胞集団を取り出す工程；
宿主細胞遺伝子についての転写物に標的化された、有効量のｓｉＲＮＡを含むように、細胞を設計または操作する工程であって、該転写物レベルの低減が、ＨＩＶ感染またはＨＩＶ複製の１つ以上の局面を、遅延するか、防ぐか、または阻害する点で該転写物が特徴付けられる、工程；
該被検体に該細胞の少なくとも一部分を戻す工程、
を包含する、方法。
【請求項９３】
請求項９１または９２に記載の方法であって、ここで、
前記設計または操作する工程が、前記細胞内への前記ｓｉＲＮＡの転写に特異的な構築物またはベクターを導入する工程を包含する、方法。
【請求項９４】
前記ｓｉＲＮＡが、二本鎖部分を有するＲＮＡヘアピンを含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記ｓｉＲＮＡが、２つの相補的ＲＮＡ鎖を含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９６】
前記細胞が、幹細胞を含む、請求項９１または９２に記載の方法。
【請求項９７】
前記幹細胞が、末梢血幹細胞である、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
ＨＩＶに感染していない集団から細胞を選択する工程をさらに包含する、請求項９１または９２に記載の方法。
【請求項９９】
前記細胞の一部分が、培養によって増殖させる工程をさらに包含する、請求項９１または９２に記載の方法。
【請求項１００】
前記戻す工程において前記被検体に戻される前記細胞が、ＨＩＶ耐性細胞を有する該被検体の免疫系を占める、請求項９１または９２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、米国仮特許出願６０／３６５，９２５（２００２年３月２０日出願）および米国仮出願６０／３９６，０４１（２００２年７月１５日出願）に対する優先権を主張する。これらの出願各々の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（政府の支援）
米国政府は、本発明の開発に使用された助成金の支援を提供した。特に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ契約番号Ｐ０１−ＣＡ４２０６３、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ契約番号Ｒ３７−ＧＭ３４２７７、同Ｒ０１−ＡＩ３２４８６、および同Ｒ２１−ＡＩ４５３０６が、本発明の開発を支持した。米国政府は、本発明において一定の権利を有し得る。
【０００３】
（発明の背景）
ＡＩＤＳの伝染は、間違いなく、人間が直面した最も壊滅的な医療上の危機である。世界中で約４，０００万人がＨＩＶに感染しており、そして毎年５００万人の割合で新たな感染が起こっている（ＵＮＡＩＤＳ  Ｕｐｄａｔｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  ＡＩＤＳ  Ｅｐｉｄｅｍｉｃ，２００１年１２月）。伝染の影響は、直接的な犠牲により受ける医療費および人的損失にとどまらない。なぜならば、多くの国々の社会機構は、保険金、給付金、長期欠勤、病気、および教育に関連する費用の増加により、病気の愛する人の看護に苦しむ家族および友人によりなされた犠牲により、ならびにそうでなければ高度な政治機構および経済機構に貢献したであろう熟練の男女を失うことにより、負担を強いられているからである。
【０００４】
膨大な量の時間、労力、および金銭が、有効な処置（ＨＩＶ感染について予防的であろうと治療的であろうと）の研究に投資されている。米国において、Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎは、ＨＩＶ治療に使用するための、３つの異なるクラスの化合物：ヌクレオシドアナログ、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター、およびプロテアーゼインヒビターを承認した。多くの患者に対して、これらの化合物の組み合わせは、いくつかの場合、長期間にわたって、ウイルス負荷の減少に対して顕著に有効であることを証明した。残念ながら、治療レジメンは、しばしば、非常に複雑であり、複数のピルの、一日を通じての正確に調整された投与を必要とし、そして投与におけるわずかな変化さえも許されない。さらに、残念なことに、多くの患者は、指示された治療レジメンに正確に従ったとしても、処置に対しての応答が乏しい。ＨＩＶ感染およびＡＩＤＳの処置および予防の代替の治療を開発する必要性が存在するままである。さらに、種々のその他の感染疾患（例えば、細菌、原虫、真菌、および／またはウイルスにより引き起こされる疾患）の処置および予防の改善された治療および／または代替の治療の開発の必要性が存在する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、ＨＩＶの処置のための新規な療法を提供する。特に、本発明は、ウイルスの感染および／または複製に関与する１つ以上のウイルス遺伝子または宿主遺伝子に標的化された短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む組成物を提供する。本発明の特定の実施形態において、このｓｉＲＮＡは、約１９ヌクレオチド長の相補領域を有する２つのＲＮＡ鎖を含み、必要に応じて、１つまたは２つの１本鎖オーバーハングまたはループをさらに含む。本発明の特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、自己相補領域を有する単一のＲＮＡ鎖を含む。この単一のＲＮＡ鎖は、ステムおよびループ、ならびに必要に応じてそのＲＮＡの５’部分および／または３’部分に１つ以上の不対部分を有する、ヘアピン構造を形成し得る。
【０００６】
本発明はさらに、本発明のｓｉＲＮＡ含有組成物を、感染前、感染中、または感染後の適切な時間帯内に、感染した細胞または生物に投与することによりＨＩＶ感染を処置する方法を提供する。ｓｉＲＮＡは、化学的に合成されても、インビトロ転写などを使用して産生されてもよい。
【０００７】
本発明は、遺伝子治療を使用してＨＩＶ感染を処置または予防するさらなる方法を提供する。これらの方法のうちの特定の方法によれば、細胞（感染したかまたは感染していない）を、本発明のｓｉＲＮＡを合成するように遺伝子工学で処理するかまたは操作する。本発明の特定の実施形態によれば、これらの細胞を、細胞内の１つ以上のｓｉＲＮＡの合成を指向する構築物またはベクターを含むように操作する。これらの細胞は、インビトロで操作されても、処置される被験体内に同時に存在してもよい。
【０００８】
本発明はまた、ＨＩＶの複製および／または感染の阻害に有用なｓｉＲＮＡ組成物を同定するためのシステムを提供する。
【０００９】
本発明はさらに、ＨＩＶの複製および／または感染の機構、ならびに複製／感染サイクルに関与する関連ウイルスおよび宿主成分の分析および特徴付けのためのシステムを提供する。
【００１０】
本発明はさらに、ＨＩＶ以外の種々の感染性因子の感染性、病原性、または複製に関与する、宿主細胞転写物または因子特異的転写物に標的化されたｓｉＲＮＡ組成物を提供し、そしてまた、この組成物を投与することによりこのような感染性因子による感染を処置または予防する方法も提供する。
【００１１】
本出願は、種々の特許、雑誌記事、および他の刊行物を参照し、これらの全てが、本明細書中に参考として援用される。
【００１２】
（定義）
本明細書中で使用する場合、用語「ハイブリダイズ」は、２つの相補的核酸配列間の相互作用をいう。句「高度なストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする」は、当該分野で認識されている高度なストリンジェンシー条件下で維持されるのに十分安定である相互作用を記載する。ハイブリダイゼーション反応を実施するための手引きは、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．，６．３．１−６．３．６，１９８９およびより最近のアップデート版（これらは全て、参考として援用される）に見出され得る。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｒｕｓｓｅｌｌ，およびＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，２００１もまた参照のこと。その参考文献においては、水性および非水性の方法が記載されており、そしていずれも使用され得る。代表的には、約５０〜１００ヌクレオチド長以上の核酸配列について、種々のレベルのストリンジェンシーが定義されている（例えば、低度のストリンジェンシー（例えば、約４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、その後の、少なくとも５０℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの２回の洗浄（洗浄温度は中低度のストリンジェンシー条件について５５℃まで上昇され得る））；２）中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、約４５℃での６×ＳＳＣ、その後の、６０℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中での１回以上の洗浄を使用する；３）高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、約４５℃での６×ＳＳＣ、その後の、６５℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中での１回以上の洗浄を使用する；および４）非常に高度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、６５℃の０．５Ｍリン酸ナトリウム、０．１％  ＳＤＳ、その後の、６５℃での０．２×ＳＳＣ、１％  ＳＤＳ中での１回以上の洗浄である）。高ストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションは、非常に高い程度の相補性を有する配列間でのみ生じる。当業者は、異なる程度のストリンジェンシーについてのパラメータが、一般的に、ハイブリダイズする配列の長さ、ＲＮＡを含むかＤＮＡを含むか、などのような種々の因子に基づき異なることを認識する。例えば、高度、中程度、または低度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーションに適した温度は、一般的に、長い配列についての温度よりもオリゴヌクレオチドのような短い配列についての温度の方が低い。
【００１３】
用語「ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）」は、ヒト被験体において疾患を引き起こし得るか、または実験分析についての興味深い候補であるＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２の任意の株をいうために本明細書中で使用される。さらに、文脈から明らかなように、用語「ＨＩＶ」は、しばしば、ＨＩＶに高度に関連するが異なる宿主に感染するウイルス（例えば、ＦＩＶ、ＳＩＶ）をいうために使用される。多数のＨＩＶおよびＳＩＶ単離体が部分的または完全に配列決定されており、付録Ａは、その完全な配列が公的なデータベースに寄託されている（ＧｅｎＢａｎｋ；２００２年３月２０日に調査を行った）ＨＩＶおよびＳＩＶクローンの代表的なリストを表すにすぎない。従って、ＨＩＶ遺伝子の配列は、当業者に容易に利用可能であるか、または決定され得る。
【００１４】
本明細書中で使用される場合、「単離された」は、１）通常天然で関連する成分の少なくともいくつかから分離されていること；および／または２）天然で存在しないことを意味する。
【００１５】
本明細書中で使用される場合、「精製された」は、多くの他の化合物または実体から分離されていることを意味する。化合物または実体は、部分的に精製され得るか、実質的に精製され得るか、または純粋であり得る（ここで、それが、実質的に全ての他の化合物または実体から取り除かれる場合純粋である（すなわち、好ましくは、少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％以上純粋である））。
【００１６】
用語「調節配列」または「調節エレメント」は、作動可能に連結された配列の発現（特に転写、しかしいくつかの場合、他の現象（例えば、スプライシングまたは他のプロセシング））を指向するか、増強するか、または阻害する核酸配列の領域を記載するために、本明細書中で使用される。この用語は、プロモーター、エンハンサー、および他の転写制御エレメントを含む。本発明のいくつかの実施形態において、調節配列は、ヌクレオチド配列の構成性発現を指向し得；他の実施形態において、調節配列は、組織特異的および／または誘導性発現を指向し得る。例えば、哺乳動物細胞における使用に適した組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、リンパ系特異的プロモーター（例えば、Ｃａｌａｍｅら，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５，１９８８を参照のこと）（例えば、Ｔ細胞レセプターのプロモーター）（例えば、Ｗｉｎｏｔｏら，ＥＭＢＯ  Ｊ．８：７２９，１９８９を参照のこと）および免疫グロブリン（例えば、Ｂａｎｅｒｊｉら，Ｃｅｌｌ  ３３：７２９，１９８３；Ｑｕｅｅｎら，Ｃｅｌｌ  ３３：７４１，１９８３）、ならびにニューロン特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；Ｂｙｒｎｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：５４７３，１９８９）が挙げられる。発達調節プロモーターもまた包含され、例えば、マウスｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３７４，１９９０）およびα−フェトタンパク質プロモーター（Ｃａｍｐｅｓら，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３：５３７，１９８９）が挙げられる。本発明のいくつかの実施形態において、調節配列は、感染因子で感染された細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指向し得る。例えば、調節配列は、プロモーターおよび／またはエンハンサー（例えば、ウイルス特異的プロモーターまたはウイルスタンパク質（例えば、ウイルスポリメラーゼ、転写因子など）により認識されるエンハンサー）を含み得る。
【００１７】
短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、約１９塩基対長であるＲＮＡ二重鎖を含み、そして必要に応じてさらに、１つまたは２つの一本鎖オーバーハングまたはループを含む。本発明のｓｉＲＮＡは、ハイブリダイズして一緒になった２つのＲＮＡ鎖を含み得るか、あるいは、自己ハイブリダイズ部分を含む単一のＲＮＡ鎖を含み得る。本発明に従って使用されるｓｉＲＮＡが１つ以上の遊離の鎖末端を含む場合、一般的に、遊離の５’末端が、リン酸基を有し、そして遊離の３’末端がヒドロキシル基を有することが好ましい。本発明のｓｉＲＮＡは、ストリンジェントな条件下で標的転写物とハイブリダイズする部分を含む。本発明の特定の好ましい実施形態において、ｓｉＲＮＡの一本の鎖（またはｓｉＲＮＡの自己ハイブリダイズ部分）は、標的転写物の領域と正確に相補的であり、このことは、ｓｉＲＮＡが、単一のミスマッチを含まず標的転写物にハイブリダイズすることを意味する。完全な相補性が達成されない本発明のほとんどの実施形態において、一般的に、任意のミスマッチが、ｓｉＲＮＡ末端またはその付近に位置することが好ましい。
【００１８】
被験体という用語は、本明細書で使用される場合、感染性の因子による感染が疑われる個体（例えば、ＨＩＶのような免疫不全ウイルスによる感染の疑いがある個体）をいう。好ましい被験体は、哺乳動物であり、特に、飼い慣らした哺乳動物（例えば、イヌ、ネコなど）、霊長類、またはヒトである。
【００１９】
ｓｉＲＮＡは、以下の場合に本明細書に記載される目的のために標的化されることが考えられる：１）標的遺伝子転写物の安定性が、ｓｉＲＮＡの存在下において、その非存在下と比較して低下される場合；および／または２）ｓｉＲＮＡが、少なくとも約１７個、より好ましくは少なくとも約１８または１９個から約２１〜２３個のヌクレオチドの伸長についての標的転写物と、少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％，９９％、または１００％の正確な配列相補性を示す場合；および／または３）ｓｉＲＮＡが、ストリンジェントな条件下で標的転写物にハイブリダイズする場合。
【００２０】
ベクターという用語は、本明細書で使用される場合、別の核酸分子の、細胞への進入（例えば、移入、輸送など）を媒介し得る核酸分子をいう。移入された核酸は、一般的に、ベクター核酸分子に連結（例えば、挿入）される。ベクターは、自律的複製を指示する配列を含み得るか、または宿主細胞ＤＮＡへの組み込みを可能にするのに十分な配列を含み得る。有用なベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、コスミドベクター、およびウイルスベクターが挙げられる。ウイルスベクターとしては、例えば、複製不全レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびレンチウイルスが挙げられる。当業者に明らかなように、ウイルスベクターは、移入された核酸の進入を媒介する核酸に加えて、種々のウイルス成分を含み得る。本発明は、ｓｉＲＮＡが、関連する発現系（例えば、細胞）において発現され得るベクターを提供する。好ましくは、このような発現ベクターは、発現される核酸配列に作動可能に連結された１つ以上の調節配列を含む。
【００２１】
（本発明の特定の好ましい実施形態の詳細な説明）
（ｓｉＲＮＡ組成物）
上記で示されたように、本発明は、ＨＩＶ感染および／または複製に関与する１つ以上のウイルス遺伝子または宿主遺伝子に標的化されたｓｉＲＮＡを含む組成物を提供する。ＨＩＶ感染／複製周期は、図１に模式的に示される。図１Ａに示されるように、ＨＩＶビリオンは、ｐ２４タンパク質カプシド２００の内側にパッケージされたＨＩＶゲノム１００の２つのコピーを含み、このｐ２４タンパク質カプシド２００は、次いで、脂質二重層４００によって囲まれるｐ１７タンパク質マトリクス３００によって包まれ、この脂質二重層からエンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０の細胞外ドメイン５００が突出する。感染周期（図１Ｂ）は、ＨＩＶビリオンが、細胞表面レセプターＣＤ４  ６００およびコレセプター７００と、ｇｐ１２０との相互作用を介して感染しやすい細胞の表面に結合する場合に開始し、それにより、膜融合が生じる。ウイルスが細胞と融合する際に、ウイルスコアは、細胞質に注入され、ここで、マトリクスおよびカプシドは分解されて、その結果、ウイルスゲノム（図２）は、細胞質に放出される。ウイルス逆転写酵素は、次いで、ＲＮＡゲノムをＤＮＡにコピーし、そしてこのＤＮＡは、ウイルスｖｐｒおよびＭＡタンパク質によって補助されながら核へと移動する。ここで、その宿主細胞ＤＮＡへのこの組み込みは、インテグラーゼ酵素によって触媒される。
【００２２】
一旦、宿主ゲノムへ組み込まれると、ウイルスＤＮＡは、長期間、恐らく、数１０年でさえも休止したままである。活性化される場合、このウイルスＤＮＡは、宿主細胞ＲＮＡポリメラーゼによって転写され、その結果、９Ｋｂのゲノム転写物が、生成される。この９Ｋｂの転写物は、新たなビリオンについてのゲノムとウイルスｇａｇ（ｐ５５）ポリタンパク質およびｇａｇ−ｐｏｌ（ｐ１６０）ポリタンパク質が合成される転写物との両方である。これらのポリタンパク質は、その後、マトリクス（ＭＡ）タンパク質、カプシド（ＣＡ）タンパク質，および核カプシド（ＮＣ）タンパク質（ｇａｇの場合）、またはマトリクスタンパク質、カプシドタンパク質、プロテイナーゼ（ＰＲ）タンパク質、逆転写酵素（ＲＴ）タンパク質およびインテグラーゼ（ＩＮＴ）タンパク質（ｇａｇ−ｐｏｌの場合）にプロセッシングされる。全長９ＫｂのウイルスＲＮＡ転写物はまた、スプライシングされて、他のウイルスタンパク質の合成のためのテンプレートとして作用する種々の他の転写物（４Ｋｂおよび２Ｋｂの産物を含む）を生じる。４Ｋｂの転写物は翻訳されて、ｇｐ１６０を生成し、これは、ｇｐｌ２０エンベロープ糖タンパク質およびｇｐ４１エンベロープ糖タンパク質へとプロセッシングされ、そしてまた、タンパク質ｖｉｆ、ｖｐｒ，およびｖｐｕを調節し；２Ｋｂの転写物は翻訳されて、ｔａｔ、ｒｅｖ，およびｎｅｆを生じる（ＨＩＶライフサイクルの間の異なる時間において存在する種々の転写物の議論については、例えば、Ｋｉｍら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３７０８，１９８９（本明細書で参考として援用される）を参照のこと）。
【００２３】
新たに作製されたｇａｇポリタンパク質およびｇａｇ−ｐｏｌポリタンパク質は、互いに、完全ウイルスゲノムと、そして細胞膜中のｇｐ４１と会合し、その結果、新たなウイルス粒子は、膜において集合し始める。集合が継続するにつれて、その構造は、細胞から押し出され、それによって、エンベロープ糖タンパク質により穿刺された脂質コートを得る。未成熟のビリオンが、細胞から放出される場合、それは、ウイルスプロテアーゼのｇａｇポリタンパク質およびｇａｇ−ｐｏｌポリタンパク質に対する作用を介して成熟し、これは、活性な構造タンパク質マトリクスおよびカプシドなどを放出する。
【００２４】
ＨＩＶライフサイクルに関与する宿主とウイルスタンパク質との複雑な相互作用は、本発明に従うｓｉＲＮＡによる抗ＨＩＶ治療のための種々の標的を提供する。例えば、宿主タンパク質を標的化するｓｉＲＮＡ（例えば、レセプターまたはコレセプター）は、ウイルス結合および細胞侵入を阻害し得る。他の宿主タンパク質を標的化するｓｉＲＮＡ（ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、またはｇｐ１６０をｇｐ１２０とｇｐ４１とに切断するプロテアーゼを含む）は、ウイルスライフサイクルの後期の段階を有意に妨害し得た。ウイルス遺伝子を標的化するｓｉＲＮＡは、細胞中に存在する９Ｋｂ転写物の量を低下させ得、それにより、集められ得るビリオンの数、ならびにそれらによってコードされる他のウイルス転写物およびタンパク質の量を減少させた。もちろん、ウイルス遺伝子を標的化するｓｉＲＮＡはまた、４Ｋｂもしくは２Ｋｂのいずれかの転写物のレベル、または標的化された配列を含む他の転写物のレベルを特に減少させる。
【００２５】
従って、本発明によると、ｓｉＲＮＡ治療のための標的であり得る潜在的な細胞性転写物としては、以下についての転写物が挙げられるが、これらに限定されない：１）ＣＤ４レセプター；２）ＨＩＶ株によって利用される種々の任意のケモカインレセプター（例えば、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ３、ＣＣＲ２、ＣＣＲ１、ＣＣＲ４、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＸＣＲ２、ＳＴＲＬ３３、ＵＳ２８、Ｖ２８、ｇｐｒ１、ｇｐｒ１５、Ａｐｊ、ＣｈｅｍＲ２３など）；３）ウイルス進入に関与し得る他の細胞表面分子（例えば、ＣＤ２６、ＶＰＡＣ１など）または、このような細胞表面分子を生成するタンパク質（例えば、硫酸ヘパランプロテオグリカン、ガラクトセラミドを合成する酵素など）；４）ウイルスライフサイクルに関与する細胞酵素（例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、Ｎ−ミリストイルトランスフェラーゼ、グリコシル化酵素、ｇｐ１６０−プロセッシング酵素、リボヌクレオチドレダクターゼ、ポリアミン生合成に関与する酵素、ウイルス発生に関与するタンパク質（例えば、ＴＳＧ１０１）など）；５）細胞転写物因子（例えば、Ｓｐ１、ＮＦκＢなど）；６）サイトカインおよびセカンドメッセンジャー（例えば、ＴＮＦα、ＩＬ−ｌα、ＩＬ−６、ホスホリパーゼＣ、プロテインキナーゼＣ、細胞内カルシウムの調節に関与するタンパク質）；７）細胞アクセサリ分子（例えば、シクロフィリン、ＭＡＰキナーゼ、ＥＲＫキナーゼなど）。前述の説明から明らかなように、適切な標的としては、ウイルスのライフサイクルの任意の段階または局面に関与する任意の宿主細胞ＲＮＡまたはタンパク質（例えば、ウイルスの融合、進入、逆転写、組み込み、転写、複製、集合、発生、感染性、毒性、および／または病原性に関与するＲＮＡまたはタンパク質）が挙げられる。
【００２６】
本発明に従う、ｓｉＲＮＡ治療のための標的として機能し得る潜在的なウイルス転写物としては、例えば、以下が挙げられる：１）ＨＩＶゲノム（ウイルスＬＴＲを含む）；２）任意のウイルスタンパク質（カプシド（ＣＡ、ｐ２４）、マトリクス（ＭＡ，ｐ１７），ＲＮＡ結合タンパク質ｐ９およびｐ７、他のｇａｇタンパク質ｐ６、ｐ２およびｐ１、ポリメラーゼ（ｐ６１、ｐ５５）、逆転写酵素、ＲＮａｓｅ  Ｈ、プロテアーゼ（ｐ１０），インテグラーゼ（ｐ３２）、エンベロープ（ｐ１６０、ｐ１２０、ならびに／またはｐ４１）、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、および／またはｖｐｘ）についての転写物。Ｇｒｅｅｎｅ，Ｗ．およびＰｅｔｅｒｌｉｎ，Ｍ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，８（７），ｐｐ．６７３−６８０，２００２、ならびにそこに記載される、ウイルスのライフサイクルにおける宿主およびウイルス遺伝子およびそれらの役割についてのさらなる考察についての参考文献を参照のこと。
【００２７】
本発明のｓｉＲＮＡ治療のための特に好ましい標的は、細胞の本質的な活性に必要ではない転写物である。例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩは、宿主細胞の生存力に必須であり、それゆえに、本発明のｓｉＲＮＡ治療のための標的としては理想的ではない。対照的に、ＣＤ４レセプター、コレセプター、および任意のまたは全てのウイルスタンパク質は、一般的に、細胞生存力に必須であると考えられない。それにもかかわらず、ＣＤ４レセプターは、種々の重要な細胞内機能に関与する。幾つかのコレセプターもまた、特定の細胞型において、そして／または発生の特定の段階において、重要であり得るか、あるいは、必須でさえあり得る。トランスジェニックマウスにおける研究が、ＣＸＣＲ４の混乱が、胚性致死を生じることを示す（Ｔａｃｈｉｂａｎａら，Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：５９１，１９９８）ように、例えば、ＣＸＣＲ４レセプターは、適切な脈管形成に明らかに必要であり、そして発生の早期の段階において必須であり得る。それにもかかわらず、このような分子は、ｓｉＲＮＡ治療に好ましい標的であり得る。なぜなら、それらの重要なまたは必須の役割は、早期の発生段階に限定され得、そしてそれらの活性が、発達した生物、または成体の生物に必ずしも必要でなくてもよいためである。一般的に、ｓｉＲＮＡが送達される細胞および／または生物において、活性が重要ではなく、そして／または必須でない分子をコードするウイルス転写物そしてまた宿主転写物は、本発明に従うｓｉＲＮＡ治療について特に好ましい標的である。このような宿主細胞転写物は、ＣＣＲ５コレセプター転写物を含む。
【００２８】
どのような遺伝子標的が選択されようとも、本発明に従う使用のためのｓｉＲＮＡの設計は、好ましくは、特定の単純な指針に従う。一般的に、（宿主と比較して）ウイルスに特異的であり、そして好ましくは、ウイルス機能に重要であるか、または必須である配列を標的化することは、望ましい。ＨＩＶウイルスは、高い突然変異率によって特徴付けられ、そして突然変異に耐性であり得るが、当業者は、特定の領域および／または配列が、保存される傾向にあることを認識する；このような配列は、特に、有効な標的であり得る。当業者は、ＨＩＶ遺伝子配列の文献および／または比較の総説により、このような保存された領域を容易に同定し得、これらの領域の多くは、一般に入手可能である（例えば、Ｅｘｈｉｂｉｔ  Ａを参照のこと）。また、多くの場合、本発明に従って細胞に送達される因子は、活性な抑制因子になる前に、１つ以上のプロセッシング工程を受けてもよい（以下のさらなる考察を参照のこと）；このような場合において、当業者は、関連する因子が、好ましくは、そのプロセッシングに必要であり得る配列を含むように設計されることを理解する。一般的に、本発明者らは、これらの設計パラメータを使用して本発明者らが選択する配列の重要な部分（一般的に、約半分より多い）が、本明細書で記載されるようにｓｉＲＮＡに含まれ、そして試験される場合に有効な抑制配列であることを証明することを見出した。
【００２９】
例えば、小さな阻害ＲＮＡは、ＷＯ０１／７５１６４に記載されるように、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａにおけるＲＮＡ妨害（ＲＮＡｉ）の現象の研究において初めに発見された。特に、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａにおいて、長い二本鎖ＲＮＡが、ＤＩＣＥＲと呼ばれるＲＮａｓｅＩＩＩ様酵素（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３６３，２００１）によって２つの２１ｎｔ鎖から構成される、より小さなｄｓＲＮＡへとプロセッシングされることを見出された。この２つの２１ｎｔ鎖の各々は、５’リン酸基および３’ヒドロキシル基を有し、そして、他方の鎖と正確に相補的な１９ｎｔ領域を含み、その結果、２ｎｔ−３’オーバーハングに隣接する１９ｎｔ二重鎖領域が存在する（図３を参照のこと）。これらの小さなｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、ｄｓＲＮＡ鎖の１つに相補的な領域を含む任意の遺伝子の発現をサイレンシングするように作用する。なぜなら、恐らく、ヘリカーゼ活性が、ｓｉＲＮＡにおける１９ｂｐ二重鎖を解き、これにより、代替の二重鎖が、ｓｉＲＮＡの１本の鎖と標的転写物との間に形成されるためである。次いで、この新たな二重鎖は、標的ＲＮＡに対するエンドヌクレアーゼ複合体（ＲＩＳＣ）を誘導し、ここで、これは、単一の位置で切断（スライス）し、細胞機序によって即座に分解される保護されていないＲＮＡ末端を生じる（図４を参照のこと）。
【００３０】
ＤＩＣＥＲ酵素のホモログは、いまや、Ｅ．ｃｏｌｉからヒトまでの範囲にわたる種々の種において見出されており（Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５；４８５，２００１；Ｚａｍｏｒｅ，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．８：７４６，２００１）、ＲＮＡｉ様機構が、種々の細胞型（哺乳動物を含む）、またはヒト細胞においてでさえ、遺伝子発現をサイレンシングし得る可能性を生じる。しかしながら、不運にも、長いｄｓＲＮＡ（例えば、約３０ヌクレオチドより長い二本鎖領域を有するｄｓＲＮＡ）は、哺乳動物細胞におけるインターフェロン応答を活性化することが知られている。従って、図４に示されたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ＲＮＡｉ機構で観察された特定の遺伝子サイレンシングを達成すること以外に、哺乳動物細胞に長いｄｓＲＮＡを導入することは、翻訳のインターフェロン媒介性非特異的抑制をもたらし、潜在的に、細胞死を生じる。それゆえに、長いｄｓＲＮＡは、哺乳動物細胞における特定の遺伝子の発現を阻害するのに有用であるとは考えられない。
【００３１】
他方、本発明者らは、哺乳動物細胞に導入された場合、ｓｉＲｎＡが、宿主遺伝子および／またはウイルス遺伝子の発現を有効に低下させ得ることを見出した。特に、本発明者らは、ヒトＣＤ４に標的化されたｓｉＲＮＡが、ヒト細胞において産生されるＣＤ４  ｍＲＮＡおよびタンパク質の量を減少させることを示す（実施例１）。本発明者らはまた、ＨＩＶ  ｐ２４遺伝子に標的化されたｓｉＲＮＡが、ｐ２４タンパク質のレベルを減少させ、そしてまた、種々のウイルス転写物のレベルを減少させることを示す（実施例３）。さらに、本発明者らは、これらのｓｉＲＮＡがまた、ＨＩＶの進入、感染、および／または複製を抑制し得ることを見出した（実施例１〜４）。これらの効果は、細胞株（ＨＩＶに潜伏的に感染された細胞株を含む）、そしてまた、初代細胞においても実証された。従って、本発明は、ｓｉＲＮＡによる処置が、ＨＩＶ感染および／または複製を阻害するための有効なストラテジーであることを実証する。
【００３２】
本発明に従う使用に好ましいｓｉＲＮＡは、約１９ｎｔ長の塩基対領域を含み、そして必要に応じて、遊離しているか、またはループの末端を有し得る。例えば、図５は、本発明に従うｓｉＲＮＡとして利用され得る種々の構造を表す。図５Ａは、上記のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ系において活性であると見出された構造を示し、そして、哺乳動物細胞において活性である種を表し得る；本発明は、ＨＩＶ感染を処置または予防するために、図５Ａに示される構造を有するｓｉＲＮＡの哺乳動物細胞への投与を包含する。しかし、投与される因子が、この構造を有する必要はない。例えば、投与される組成物は、投与される因子が他のネガティブな事象（例えば、インターフェロン応答の誘導）を誘導しない限り、図５Ａの構造にインビボでプロセッシングされ得る任意の構造を含み得る。本発明はまた、因子の投与が本明細書に記載されるように宿主転写物またはウイルス転写物のレベルを十分に減少させる限り、図５Ａに示される正確な構造にプロセッシングされないこのような因子の投与を含む。図５Ｂおよび５Ｃは、本発明に従うｓｉＲＮＡとしての使用のための２つの代替的な構造を表す。
【００３３】
図５Ｂは、互いにハイブリダイズして、幹（エレメントＢ）、ループ（エレメントＣ）、およびオーバーハング（エレメントＡ）を形成する２つの相補的なエレメントを含有するＲＮＡ鎖を含む因子を示す。好ましくは、この幹は、およそ１９ｂｐ長であり、このループは、約１〜２０ｎｔ長、好ましくは約４〜１０ｎｔ長、そして最も好ましくは、約６〜８ｎｔ長であり、そして／またはこのオーバーハングは、約１〜２０ｎｔ長であり、そしてより好ましくは、約２〜１５ｎｔ長である。本発明の特定の実施形態において、幹は、最も小さくて１９ヌクレオチド長であり、そして、およそ２９ヌクレオチド長までであり得る。当業者は、４ヌクレオチドより大きいループは、より短いループより立体的な制限に供される可能性は低く、それゆえに、好ましいものであり得ることを理解する。幾つかの実施形態において、このオーバーハングは、５’リン酸および３’ヒドロキシルを含む。以下に考察されるように、図５Ｂに示される構造を有する因子は、インビボまたはインビトロでの転写によって容易に生成され得；幾つかの好ましい実施形態において、転写物のテールは、オーバーハング中に含まれ、その結果、しばしば、このオーバーハングは、複数のＵ残基（例えば、１個と５個との間のＵ残基）を含む。哺乳動物系において研究されている合成ｓｉＲＮＡが、しばしば、２つのオーバーハングＵ残基を有することに留意すること。
【００３４】
図５Ｃは、約１９ｂｐ長の幹（エレメントＢ）を形成するのに十分に相補的なエレメントを含有するＲＮＡ環を含む因子を示す。このような因子は、本明細書に記載される種々の他のｓｉＲＮＡと比較して、改善された安定性を示し得る。
【００３５】
図５に示された任意の構造を有する因子、または本明細書に記載される任意の他の有効な構造が、全体的に天然のＲＮＡヌクレオチドから構成され得るか、または１つ以上のヌクレオチドアナログを代わりに含み得ることが、当業者によって理解される。広範な種々のこのようなアナログは、当該分野で公知であり；ホスホロチオエートが、治療用核酸の研究において最も一般的に使用される（ホスホロチオエートを利用する際に関与する考察の議論については、例えば、Ａｇａｒｗａｌ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １４８９：５３，１９９９を参照のこと）。特に、本発明の特定の実施形態において、例えば、エキソヌクレアーゼによる消化を減少させるために、例えば、１つ以上の遊離の鎖の末端においてヌクレオチドアナログを含むことによってｓｉＲＮＡ構造を安定化させることは望ましいことであり得る。１つ以上の遊離の末端においてデオキシヌクレオチド（例えば、ピリミジン（例えば、デオキシチミジン））を含むことは、この目的に役立ち得る。あるいは、または、さらに、特に、ｓｉＲＮＡの１本の鎖と標的転写物との相互作用によって形成される任意のハイブリッドと比較して、１９ｂｐの幹の安定性を増加または減少させるために、１つ以上のヌクレオチドアナログを含むことは望ましいことであり得る。
【００３６】
多くのヌクレオチドアナログおよびヌクレオチド改変は、当該分野において公知であり、それらの特性（例えば、ハイブリダイゼーションおよびヌクレアーゼ耐性）に対する影響が、調査されている。例えば、塩基、糖およびヌクレオチド間結合に対する種々の改変は、選択された位置においてオリゴヌクレオチドに導入され、そして未改変オリゴヌクレオチドに対して生じる効果が比較される。多くの改変が、オリゴヌクレオチドの１つ以上の局面（例えば、その相補的核酸にハイブリダイズする能力、その安定性など）を変更することが示されている。例えば、有用な２’−改変としては、ハロ基、アルコキシ基およびアリルオキシ基が挙げられる。米国特許第６，４０３，７７９号；同第６，３９９，７５４号；同第６，２２５，４６０号；同第６，１２７，５３３号；同第６，０３１，０８６号；同第６，００５，０８７号；同第５，９７７，０８９号およびそれらの参考文献は、本発明の実施において有用であり得る、多様なヌクレオチドアナログおよび改変を開示する。また、Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．（編）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ（第１版），Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ；ＩＳＢＮ：０８２４７０５６６１；第１版（２００１）ならびにそれらの参考文献を参照のこと。当業者によって理解されるように、アナログおよび改変は、例えば、本明細書に記載されるアッセイまたは他の適切なアッセイを使用して試験され、宿主遺伝子および／またはウイルス遺伝子の発現を効率的に減少させるアナログおよび改変を選択し得る。
【００３７】
本発明の特定の実施形態において、アナログまたは改変は、経口吸収性が増加し、血流における安定性が増加し、細胞膜の横切る能力が増加したｓｉＲＮＡを生じる。当業者によって理解されるように、アナログまたは改変は変更されたＴｍを生じ得、これにより、有効な抑制をなおも生じながら、ｓｉＲＮＡ配列と標的との間のミスマッチの許容性は増加し得る。
【００３８】
本発明に従う使用に有効なｓｉＲＮＡ因子が、ヌクレオチドでもヌクレオチドアナログでもない１つ以上の部分を含み得ることは、当業者によってさらに理解される。
【００３９】
一般的に、本発明のｓｉＲＮＡは、好ましくは、標的転写物の一部において見出される領域と実質的に相補的な領域（「阻害領域」）を含み、その結果、正確なハイブリッドを、ｓｉＲＮＡのうちの１本の鎖と標的転写物との間で、インビボで形成し得る。好ましくは、この実質的に相補的な領域は、図５に示される幹構造のほとんどまたは全てを含む。本発明の特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡの関連する阻害領域は、標的転写物と完全に相補的であり；他の実施形態において、１つ以上の非相補的残基は、ｓｉＲＮＡ／テンプレート二重鎖の末端か、またはその付近に位置する。当業者によって理解されるように、このｓｉＲＮＡ／テンプレート二重鎖の中心部分におけるミスマッチが避けられることが、一般的に、好ましい（例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒら，ＥＭＢＯ  Ｊ．２０：６８７７，２００１（本明細書で参考として援用される）を参照のこと）。
【００４０】
本発明の好ましい実施形態において、ｓｉＲＮＡは、標的転写物中のエキソン配列を含む標的部位とハイブリダイズする。イントロン配列とのハイブリダイゼーションは、除外されないが、概して、哺乳動物細胞では好ましくないようである。本発明の特定の好ましい実施形態において、ｓｉＲＮＡは、もっぱらエキソン配列とハイブリダイズする。本発明のある実施形態において、ｓｉＲＮＡは、１つのエキソン中の配列のみを含む標的部位とハイブリダイズする；他の実施形態において、標的部位は、１次転写物のスプライシングまたは他の改変によって作製される。結果として転写物のスプライシングおよび分解を生じるｓｉＲＮＡとのハイブリダイゼーションに利用可能である任意の部位が、本発明に従って利用され得る。それにもかかわらず、いくらかの例において、標的の遺伝子転写物の特定の領域をｓｉＲＮＡのハイブリダイゼーションの標的として選択することが、望ましいことであり得ることを、当業者は理解する。例えば、分解が所望されない他の転写物と共有され得る標的遺伝子転写物の部分を避けることが、望ましいことであり得る。
【００４１】
あるいはまたはさらに、１つのヌクレオチドの長い列（例えば、１列中３つより長い）を含有する標的部位（そのために、ｓｉＲＮＡが不正確にハイブリダイズし得る）を避けることが、望ましいことであり得る。同様に、１つの残基が多数回繰り返される配列を避けるために、高い複雑性を有する標的部位（例えば、大部分または全ての残基を、好ましくは確率的パターンで含む部位）を利用することが、望ましいことであり得る。例えば、配列ＧＧＧＣＣＣＡＡＡＴＴＴ（配列番号１５）および配列ＧＴＣＡＣＴＧＣＴＡＧＡ（配列番号１６）は両方とも、３つのＧ残基、３つのＣ残基、３つのＡ残基、および３つのＴ残基を含んでいるにもかかわらず、二番目の配列は、Ｇ、Ｃ、Ａ、またはＴの連続的な塊を欠くために、最初の配列よりもより大きな複雑性を示す。さらに、ｓｉＲＮＡ／テンプレート二重鎖中のＧＣ塩基対とＡＵ塩基対との比が、およそ０．７５：１〜およそ１．２５：１の範囲内である、好ましくはおよそ０．９：１〜およそ１．１：１の範囲内である、さらに好ましくはおよそまたは正確に１：１により近い標的部位を選択することが、しばしば望ましいことであり得る。個々のヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡ／テンプレート二重鎖の両鎖上で、好ましくはおよそ等量で提示されている標的部位を選択することが、さらに望ましいことであり得る。本発明者らは、３’末端付近の標的部位を選択することが、転写物のどこか他の標的部位を選択した場合と比較して、より良い遺伝子サイレンシングをしばしば生じることを発見したために、本発明に従って、標的転写物の３’側の半分の中でハイブリダイズするｓｉＲＮＡを利用することが、しばしば望ましいことであり得る。
【００４２】
適切な標的部位を選択するアプローチの１つは、以下のように進行する。：最初に、標的転写物が、対応する２本鎖ＤＮＡの形式に変換される。この配列が精査されて、１９ヌクレオチドの配列が、同定され、その各ＤＮＡ鎖上の３’末端に続く２つのヌクレオチドの中の１つかまたは両方がピリミジンである。好ましくは、両方の２１ヌクレオチドの鎖の３’末端にあるヌクレオチドは、ピリミジンである。次いで、上で概説したように、この１９ヌクレオチドの配列が、ヌクレオチドの組成および複雑性について評価される。好ましい配列は、いずれの鎖にも３つ以上の同じヌクレオチドの配列（例えば、ＧＧＧ、ＣＣＣ、ＡＡＡ、ＴＴＴ）を含まない。配列が、紙またはスクリーン上に示された場合、３’末端に２ヌクレオチドの延長を有する１９ヌクレオチドの２本鎖領域に対応する大きさの「ウインドウ（ｗｉｎｄｏｗ）」が切り出されるデバイス（例えば、１切れの紙）を使用することが、便利であり得る。このウインドウによって、適切な大きさと配向を有する配列部位に、容易に目の焦点が合う。上記の方法は、容易に改変され、１９塩基対以外の長さの２本鎖領域および／または２ヌクレオチド以外の長さの３’突出部を持つ候補ｓｉＲＮＡを同定し得る。概して、転写物のコード領域および５’末端よりも３’末端により近い領域が、好ましい。いずれの理論によっても制限されるつもりはないが、標的転写物の３’部分は、（例えば、接近可能性を減少させることによって）ｓｉＲＮＡ活性を阻害または干渉し得る２次構造をあまり示し得ないことを、本発明者らは示唆する。
【００４３】
ｓｉＲＮＡが、前記の原理に従ってある範囲の融解温度（Ｔｍ）および解離温度（Ｔｄ）を示し得ることを、当業者は理解する。Ｔｍは、核酸およびその完全な相補物の５０％が、溶液中で二重鎖である温度として定義され、一方Ｔｄは、特定の塩濃度および総核酸鎖濃度における、オリゴヌクレオチドの５０％およびフィルターに結合しているその完全な相補物が、二重鎖である温度として定義され、１つの分子がフィルターに固定される状況に関連する。受容可能なＴｍの代表例は、当該分野で周知の方法を使用して、本明細書中の実施例において開示されているｓｉＲＮＡ配列に基づいて、実験的に、あるいは経験的または理論的に導かれた適切な方程式を用いて、容易に決定され得る。実際のＴｍを決定する一般的な方法の１つは、ＵＶ分光光度計中で温度が保たれたセルを使用することである。温度を吸光度に対してプロットした場合、２つのプラトーを有するＳ型カーブが観察され得る。プラトー間の半分の位置にある吸光度の値が、Ｔｍに対応する。最も簡単なＴｄの方程式は、ウォーラス（Ｗａｌｌａｃｅ）規則：Ｔｄ＝２（Ａ＋Ｔ）＋４（Ｇ＋Ｃ）  Ｗａｌｌａｃｅ，Ｒ．Ｂ．；Ｓｈａｆｆｅｒ，Ｊ；Ｍｕｒｐｈｙ，Ｒ．Ｆ．；Ｂｏｎｎｅｒ，Ｊ．；Ｈｉｒｏｓｅ，Ｔ；Ｉｔａｋｕｒａ，Ｋ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．６，３５４３（１９７９）である。固定された標的核酸鎖の性質により、標的とプローブの両方が、溶液中で自由である場合の値と比較して、観察されるＴｍに正味の減少が与えられる。その減少の大きさは、およそ７〜８℃である。一価の陽イオンの濃度中適切な値内の、ｐＨ５〜９における５０ヌクレオチドよりも長い配列に対して妥当である、ＤＮＡについての別の有用な方程式は、Ｔｍ＝８１．５＋１６．６ｌｏｇＭ＋４１（ＸＧ＋ＸＣ）−５００／Ｌ−０．６２Ｆであり、ここでＭは、一価の陽イオンのモル濃度、ＸＧおよびＸＣは、配列中のＧおよびＣのモル分率、Ｌは、二重鎖の最も短い鎖の長さ、およびＦは、ホルムアミドのモル濃度である（Ｈｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ；Ｉｓｒａｅｌ，Ｍ．Ｆ．；Ｌａｗ，Ｍ−Ｆ．；Ｍａｒｔｉｎ，Ｍ．Ａ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４、４８７６）。ＲＮＡについての類似の方程式は、Ｔｍ＝７９．８＋１８．５ｌｏｇＭ＋５８．４（ＸＧ＋ＸＣ）＋１１．８（ＸＧ＋ＸＣ）２−８２０／Ｌ−０．３５Ｆであり、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドについての類似の方程式は、Ｔｍ＝７９．８＋１８．５ｌｏｇＭ＋５８．４（ＸＧ＋ＸＣ）＋１１．８（ＸＧ＋ＸＣ）２−８２０／Ｌ−０．５０Ｆである。これらの方程式は、固定化した標的ハイブリッドについて導かれる。いくつかの研究により、最隣接の相互作用についての熱力学的な基本集合を使用して、Ｔｍについての正確な方程式が導かれた。ＤＮＡおよびＲＮＡについての方程式は、Ｔｍ＝（１０００ΔＨ）／Ａ＋ΔＳ＋Ｒｌｎ（Ｃｔ／４）−２７３．１５＋１６．６ｌｎ［Ｎａ＋］であり、ここでΔＨ（Ｋｃａｌ／ｍｏｌ）は、最隣接のエンタルピー変化のハイブリッドについての合計、Ａ（ｅｕ）は、ヘリックスイニシエーション（ｈｅｌｉｘ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ）についての較正を含む定数、ΔＳ（ｅｕ）は、最隣接のエントロピー変化の合計、Ｒは、気体定数（��．９８７ｃａｌ  ｄｅｇ−１  ｍｏｌ−１）、およびＣｔは、（核酸）鎖の総モル濃度である。その鎖が自己相補的である場合、Ｃｔ／４がＣｔで置き替えられる。熱力学的パラメーターの値は、文献中で入手可能である。ＤＮＡについては、Ｂｒｅｓｌａｕｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３、３７４６〜３７５０、１９８６を参照のこと。ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖については、Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，Ｎ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３４（３５）：１１２１１〜６、１９９５を参照のこと。ＲＮＡについては、Ｆｒｅｉｅｒ，Ｓ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８３、９３７３〜９３７７、１９８６、Ｒｙｃｈｌｉｋ，Ｗ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８（２１）、６４０９〜６４１２、１９９０を参照のこと。Ｔｍ計算用の種々のコンピュータープログラムが、広く利用可能である。例えば、ＵＲＬ  ｗｗｗ．ｂａｓｉｃ．ｎｗｕ．ｅｄｕ／ｂｉｏｔｏｏｌｓ／ｏｌｉｇｏｃａｌｃ．ｈｔｍｌのウェブサイトを参照のこと。
【００４４】
標的転写物の種々の部分への接近可能性は、ＲＮａｓｅ  Ｈ保護技術（ＲＮａｓｅ  ＨのＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ部分を選択的に切断する能力を利用する）を使用して、調査され得る。そのようなアッセイの１つにおいて、候補ｓｉＲＮＡのいずれかの（ＲＮＡ）鎖の配列を有するオリゴヌクレオチドを、標的ＲＮＡ転写物にハイブリダイズさせる。この標的転写物は、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性に適合する条件下で、ＲＮａｓｅ  Ｈに曝露される。オリゴヌクレオチドが、このＲＮＡの相補的な配列とアニールし得る場合、ＲＮａｓｅ  Ｈは、２本鎖のＤＮＡ／ＲＮＡ領域の中にあるＲＮＡを切断する。しかし、２次構造を形成し得る標的ＲＮＡの領域（例えば、自己相補領域）は、そのような構造を形成しない領域に比べて、ＲＮａｓｅ  Ｈ消化に対してより耐性があるようである。そのような曝露を生き抜くＲＮＡの部分が、単離され、配列決定される。これらの部分は、接近可能性が低く、従ってｓｉＲＮＡの設計について好ましくないかもしれない配列を代表する。試験されるＲＮＡは、化学的に合成されてもよいし、インビトロ転写を使用して合成されてもよいし、または細胞から精製されてもよい。後者のアプローチはまた、（例えば、タンパク質によって）オリゴヌクレオチドへの結合を妨げられ得、従ってｓｉＲＮＡの設計における使用に対して好ましい領域ではない可能性があるＲＮＡの領域を明らかにする（例えば、Ｇｕｎｚｌ，Ａ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ、２６（２）：１６２〜９、Ｆｅｂ．、２００２を参照のこと）。もちろん、前記の方法で実施される一般的なアプローチは、ＲＮａｓｅＨには限定されず、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ部分を優先的に消化する他の任意のヌクレアーゼを使用し得る。２本鎖ＲＮＡは優先的に分解または切断するが、１本鎖ＲＮＡは無傷にしておく（またはその逆）酵素が、類似の形式で使用され、ｓｉＲＮＡを設計する上で利用するために、標的の好ましい部分（例えば、他の部位に比べて、２次構造が取る傾向が小さい部位）が単離され得る。
【００４５】
本発明のある実施形態において、ｓｉＲＮＡは、１つ以上の３’ＵＴＲ配列を含む標的部位にハイブリダイズする。実際には、本発明の特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、３’ＵＴＲ内に完全にハイブリダイズする。本発明のそのような実施形態は、ｓｉＲＮＡ／テンプレート二重鎖中の非常に多くのミスマッチを許容し得、特に二重鎖の中央領域中のミスマッチを許容し得る。実際には、３’ＵＴＲでのｓｉＲＮＡ／テンプレート二重鎖の形成によって、古典的なＲＮＡ阻害に関連はするが異なる機構で、テンプレートの転写物にコードされるタンパク質の発現が阻害され得るので、数個のミスマッチが好ましいことがあり得る。特に、テンプレートの転写物の３’ＵＴＲに結合するｓｉＲＮＡが、転写物の安定性の低下よりもむしろ、転写物の翻訳を減少させることを示唆する証拠がいくつかある。詳細には、図６に示すように、上記で議論したＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ系において、および種々の生体においてもｓｉＲＮＡを生じるＤＩＣＥＲ酵素はまた、小さい一時的なＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）の基質を処理して、阻害的薬剤（標的転写物の３’ＵＴＲに内に結合した場合に、転写物の翻訳を阻止する）に変え得ることが、公知である。（図６；Ｇｒｉｓｈｏｋ，Ａ．ら、Ｃｅｌｌ  １０６、２３〜２４、２００１；Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ，Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９３、８３４〜８３８、２００１；Ｋｅｔｔｉｎｇ，Ｒ．ら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、１５、２６５４〜２６５９を参照のこと）。
【００４６】
従って、二重鎖構造を含む多様なＲＮＡ分子の集合が、種々の機構を介してサイレンシングを媒介し得ることは、明白である。本発明の目的のために、任意のそのようなＲＮＡ（その１部分が標的転写物に結合し、分解の誘発、翻訳の阻害、または他の手段のいずれかによって、その発現を減少させる）が、ｓｉＲＮＡであると考えられる。また、そのようなｓｉＲＮＡを生じる任意の構造（すなわち、ＲＮＡの前駆体として機能する）が、本発明の実施において有用である。
【００４７】
本発明の他の実施形態において、１つ以上の転写物の５’非翻訳領域に標的化されたｓｉＲＮＡを設計することが、望ましいことであり得る。特に、５’リーダーパッケージング（ｌｅａｄｅｒ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ）配列のような配列を標的とすることが、望ましいことであり得る（例えば、Ｃｈａｄｗｉｃｋら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１３６２、２０００を参照のこと）。
【００４８】
本発明のｓｉＲＮＡ薬剤は、任意の利用可能な技術（化学的合成、インビボまたはインビトロでの酵素的切断または化学的切断、あるいはインビボまたはインビトロでのテンプレートの転写が挙げられるが、これらに限定はされない）に従って調製され得ることを、当業者は容易に理解する。上記のように、本発明のｓｉＲＮＡは、自己相補的部分を含む１つのＲＮＡ鎖、または互いにハイブリダイズした２本（可能であればそれ以上）の（ＲＮＡ）鎖として、送達され得る。例えば、２つの別々の２１ｎｔの（ＲＮＡ）鎖（その各々が、他のＲＮＡと相補的な１９ｎｔ領域を含む）が、生じ得、個々の（ＲＮＡ）鎖が、一緒にハイブリダイズして、図５Ａに示すような構造を生じ得る。
【００４９】
あるいは、それぞれの（ＲＮＡ）鎖は、インビボまたはインビトロのいずれかにおいて、プロモーターからの転写によって、生じ得る。例えば、２つの別々の転写可能領域（その各々が、他の転写物と相補的である１９ｎｔの領域を含む２１ｎｔの転写物を生じる）を含む構築物（プラスミドまたは他のベクター）が、提供され得る。あるいは、２つの異なる転写物（その各々が、他の転写物と少なくとも部分的には相補的である）が、図７で示すように生じるように配置された、反対側のプロモーター（ならびに、必要に応じてエンハンサー、ターミネーター、および／または他の調節配列）を含む１つの構築物が、利用され得る。
【００５０】
別の実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ薬剤は、例えば、自己相補領域をコードする１つの転写単位の転写によって、１つの転写物として生じる。図８は、そのような本発明の実施形態の１つを示す。示すように、第１の相補領域および第２の相補領域、および必要に応じてループ領域を含むテンプレートが、使用される。そのようなテンプレートは、適切なプロモーター（必要に応じて他の調節要素）が選択され、インビトロでのまたはインビボでの転写のために利用され得る。本発明は、１つ以上のｓｉＲＮＡ鎖をコードする遺伝子構築物を含む。
【００５１】
インビトロでの転写は、種々の利用可能な系（Ｔ７、ＳＰ６、およびＴ３プロモーター／ポリメラーゼ系（例えば、これらは、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓなどから市販されている）が挙げられる）を使用して、実行され得る。当業者が理解するように、Ｔ７プロモーターまたはＴ３プロモーターの使用は、代表的には、５’末端に２つのＧ残基を有するｓｉＲＮＡ配列を必要とし、一方ＳＰ６プロモーターは、代表的には、５’末端にＧＡ配列を有するｓｉＲＮＡ配列を必要とする。Ｔ７プロモーター、ＳＰ６プロモーター、またはＴ３プロモーターを含むベクターは、当該分野で周知であり、容易に改変されて、ｓｉＲＮＡの転写を導き得る。ｓｉＲＮＡがインビトロで合成された場合、それらは、被験体へのトランスフェクションまたは送達の前にハイブリダイズし得る。本発明のｓｉＲＮＡ組成物は、必ずしも２本鎖の（ハイブリダイズした）分子から構成される必要がないことが、理解されるべきである。例えば、ｓｉＲＮＡ組成物は、少しの割合で１本鎖ＲＮＡを含み得る。例えば、センスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖の等しくない比、自己相補的なＲＮＡの両方の部分の合成に先立つ転写の終了などのために、ハイブリダイズした分子とハイブリダイズしていない分子との間の平衡の結果として、このようなことが生じ得る。概して、好ましい組成物は、少なくともおよそ８０％の２本鎖ＲＮＡ、少なくともおよそ９０％の２本鎖ＲＮＡ、少なくともおよそ９５％の２本鎖ＲＮＡ、または少なくともおよそ９９〜１００％の２本鎖ＲＮＡをも含む。
【００５２】
本発明のｓｉＲＮＡ薬剤が、インビボで生成される場合、それらは１つ以上の転写単位の転写を介して生産されることが、概して好ましいことを、当業者は理解する。１次転写物は、遺伝子阻害を起こす最終的な薬剤を生成するために、必要に応じて（例えば、１つ以上の細胞内酵素によって）処理され得る。適切なプロモーターおよび／または調節要素が容易に選択され、哺乳動物細胞での関連する転写単位の発現を可能とし得ることが、さらに理解されるべきである。
【００５３】
上記のアプローチの中の任意のもの（例えば、１つのプロモーターの使用、２つのプロモーターの使用など）に従って、本発明のｓｉＲＮＡがインビボで生成される本発明のいくつかの実施形態において、１つ以上の調節可能なプロモーターまたは他の調節配列（例えば、誘導可能なプロモーターおよび／または抑制可能なプロモーター）を利用することは、望ましいことであり得る；他の実施形態においては、構成的な発現が望まれ得る。本発明の特定の実施形態に従って、１つ以上の調節配列は組織特異的または細胞種特異的であり、そのためプロモーターが活性である特定の細胞および／または特定の組織においてのみ、ｓｉＲＮＡが、十分な量で生産され得る。例えば、免疫系細胞（例えば、Ｔ細胞、マクロファージなど）でのみ活性であるプロモーターおよび／またはエンハンサーを利用することが、望ましいことであり得る。本発明のある実施形態において、調節配列は、ＨＩＶに感染している細胞において、ヌクレオチド配列の発現を、ＨＩＶに感染していない細胞と比べて増強されたレベルの範囲内でのみ誘導し得る。例えば、調節配列はＨＩＶ  ＬＴＲ要素、ｔａｔ応答性要素を含むプロモーターなどを含み得る。本発明の特定の実施形態に従って、構築物は、選択マーカーまたは検出可能なマーカーをコードする核酸配列を含む。多数のそのようなマーカーが、公知である。例えば、構築物は、抗生物質耐性遺伝子、蛍光分子（例えば、ＧＦＰ）をコードする遺伝子、化学反応を触媒し、容易に検出できる分子を生産する酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼ）をコードする遺伝子などを含み得る。そのようなマーカーは、例えば、（例えば、細胞集団が構築物と接触した後で）構築物が転写的に活性である細胞の選択および／または単離において有用である。特定の選択マーカーの場合において、構築物が転写的に活性である細胞のみが、選択環境下で生存し得る。検出可能なマーカーの場合において、構築物が転写的に活性である細胞は、種々の手段の内の任意のもの（例えば、ＦＡＣＳ）によって、転写的に活性な構築物を含まない細胞から分離され得る。
【００５４】
本発明の特定の好ましい実施形態において、１つ以上のｓｉＲＮＡ転写単位のインビボでの発現を導くために利用されるプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ＰｏｌＩＩＩ）のプロモーターである。ＰｏｌＩＩＩは、４〜５Ｔ残基の配列の範囲内で終了する小さな転写物の合成を導く。特定のＰｏｌＩＩＩプロモーター（例えば、Ｕ６プロモーターまたはＨ１プロモーター）は、転写領域中にシス（ｃｉｓ）作用性の調節要素（最初に転写されたヌクレオチド以外）を必要とせず、従って、所望のｓｉＲＮＡ配列の選択が容易に可能となるため、本発明の特定の実施形態に従って、好ましい。天然のＵ６プロモーターの場合において、最初に転写されるヌクレオチドは、グアノシンであり、一方天然のＨ１プロモーターの場合において、最初に転写されるヌクレオチドは、アデニンである（例えば、Ｙｕ，Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９９（９）、６０４７〜６０５２（２００２）；Ｓｕｉ，Ｇ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９９（８）、５５１５〜５５２０（２００２）；Ｐａｄｄｉｓｏｎ，Ｐ．ら、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．、１６、９４８〜９５８（２００２）；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，Ｔ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９６、５５０〜５５３（２００２）；Ｍｉｙａｇａｓｈｉ，Ｍ．およびＴａｉｒａ，Ｋ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２０、４９７〜５００（２００２）；Ｐａｕｌ，Ｃ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２０、５０５〜５０８（２００２）；Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２０、４４６〜４４８（２００２）を参照のこと）。従って、本発明の特定の実施形態（例えば、転写が、Ｕ６プロモーターによって推進されている場合）において、好ましいｓｉＲＮＡ配列の５’ヌクレオチドは、Ｇである。他の特定の本発明の実施形態（例えば、転写が、Ｈ１プロモーターによって推進されている場合）において、５’ヌクレオチドは、Ａであり得る。
【００５５】
図７および８に示したような構築物のインビボでの発現は、構築物をベクター（例えば、ウイルスベクター）の中に導入し、そしてベクターを哺乳動物細胞に導入することによって、所望のように達成され得ることが理解される。種々のベクターの中の任意のものが選択され得るが、特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡをコードする構築物を１つ以上のＨＩＶ感染を受けやすい細胞に送達し得るベクターを選択することが、望ましいことであり得る。本発明は、ｓｉＲＮＡ転写単位を含むベクター、およびそのようなベクターを含む細胞または別の１つ以上のＲＮＡ鎖をコードする発現可能な転写単位を含むように操作された細胞を含む。本発明の特定の好ましい実施形態において、本発明のベクターは、ｓｉＲＮＡを発現する構築物の哺乳動物細胞、好ましくは家畜哺乳動物の細胞、および最も好ましくはヒト細胞への送達に適した遺伝子治療ベクターである。そのようなベクターは、ＨＩＶまたはその関連ウイルス（例えば、ＦＩＶ、ＳＩＶ）への曝露の前または後で、ＨＩＶ感染の予防または処置のために被験体に投与され得る。好ましい遺伝子治療ベクターとしては、例えば、レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターが挙げられる。特定の実施形態（例えば、ＨＩＶに対する遺伝子治療の適用）において、レンチウイルスは、休止しているＴ細胞、樹状細胞、およびマクロファージに感染するその能力に起因して、しばしば特に好まれる。レンチウイルスベクターはまた、これらの細胞の再集団化する能力に影響を与えることなく、優れた遺伝子移転効率で、造血幹細胞に遺伝子を移転し得る。例えば、ＭａｕｔｉｎｏおよびＭｏｒｇａｎ、ＡＩＤＳ  Ｐａｔｉｅｎｔ  Ｃａｒｅ  ＳＴＤＳ  ２００２  Ｊａｎ；１６（１）：１１〜２６を参照のこと。また、Ｌｏｉｓ，Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９５：８６８〜８７２、Ｆｅｂ．１、２００２（ＦＵＧＷレンチウイルスベクターを記載）；Ｓｏｍｉａ，Ｎ．らＪ．Ｖｉｒｏｌ．７４（９）：４４２０〜４４２４、２０００；Ｍｉｙｏｓｈｉ，Ｈ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３：６８２〜６８６、１９９９；および米国特許第６，０１３，５１６号も参照のこと。
【００５６】
本発明の特定の実施形態において、２つの別個の相補的ｓｉＲＮＡ鎖は、そのそれぞれが、１つのｓｉＲＮＡ鎖の転写を導く２つのプロモーターを含む１つのベクターを使用して、転写される。本発明の他の実施形態において、２つの相補領域（例えば、ヘアピン)を含有する１つのｓｉＲＮＡ鎖の転写を引き起こすプロモーターを含むベクターが、使用される。本発明の特定の実施形態において、そのそれぞれが、２つの相補領域を含有する１つのｓｉＲＮＡ鎖の転写を引き起こす多数のプロモーターを含むベクターが、使用される。あるいは、ベクターは、１つまたは多数のプロモーターによって、多くの異なるｓｉＲＮＡの転写を引き起こし得る。種々の配置が可能である。例えば、１つのプロモーターは、多数の自己相補領域を含み、そのそれぞれが、ハイブリダイズし複数のステムループ（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ）構造を生じ得る１つのＲＮＡ転写物の合成を引き起こし得る。これらの構造は、（例えば、ＤＩＣＥＲによって）インビボで切断され、多数の異なるｓｉＲＮＡを生じ得る。好ましくはそのような転写物は、その転写物の３’末端に終止シグナルを含むが、個々のｓｉＲＮＡ単位の間には含まないことが、理解される。そこから多数のｓｉＲＮＡが生じ得る１つのＲＮＡは、インビボで生成される必要はないが、代わりに化学的に合成され、またはインビトロの転写を使用して生成され、そして外因的に提供され得ることが、理解される。
【００５７】
本発明の別の実施形態において、ベクターは、多数のプロモーターを含み、そのそれぞれが、ハイブリダイズしｓｉＲＮＡを形成する自己相補的ＲＮＡの合成を引き起こす。多数のｓｉＲＮＡは全て、同じ転写物を標的とし得、またはそれらは、異なる転写物を標的とし得る。ウイルスの転写物および／または宿主細胞の転写物の任意の組合せが、標的とされ得る。
【００５８】
当業者は、本発明に従うｓｉＲＮＡのインビボ発現によって、長期間（例えば、数日よりも長期間、好ましくは少なくとも数ヶ月、さらに好ましくは少なくとも１年以上、可能なら生涯）にわたってｓｉＲＮＡを生ずる細胞の生成を可能に成り得ることを、さらに理解する。そのような細胞は、ＨＩＶの感染またはＨＩＶの無限の複製から保護され得る。
【００５９】
本発明のｓｉＲＮＡは、任意の利用可能な方法によって、細胞内に導入され得る。例えば、ｓｉＲＮＡまたはそれらをコードするベクターは、従来の形質転換技術またはトランスフェクション技術を介して、宿主細胞内に導入され得る。本明細書中で使用する場合、用語「形質転換」および用語「トランスフェクション」は、当該分野で理解されている、外来性の核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を宿主細胞内に導入するための種々の技術を参照することが企図され、これらの技術としては、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウムによる共沈降、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクション、注入、あるいはエレクトロポレーションが挙げられる。
【００６０】
本発明は、本発明のｓｉＲＮＡを含むように操作された任意の細胞を包含する。これらの細胞は、好ましくは哺乳動物細胞、特にヒトである。必要に応じて、そのような細胞はまた、ＨＩＶ  ＲＮＡを含む。本発明のある実施形態において、これらの細胞は、生体内の非ヒト細胞である。例えば、本発明は、本発明のｓｉＲＮＡを含むかまたは発現するように作製されたトランスジェニック動物を包含する。そのような動物は、本発明のｓｉＲＮＡおよび／またはＨＩＶの感染／複製システムの機能および／または活性を研究する上で、有用である。本明細書中で使用する場合、「トランスジェニック動物」は、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはげっ歯類（例えば、ウサギまたはマウス）であり、その動物の１つ以上の細胞が、導入遺伝子を含む。遺伝子導入動物の他の例としては、非ヒト霊長類、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類などが挙げられる。導入遺伝子は、外因性ＤＮＡまたは組換え（例えば、内因性染色体ＤＮＡの除去）であり、それらは、好ましくはトランスジェニック動物の細胞のゲノム中に統合されるか、またはゲノム中で起きる。導入遺伝子は、遺伝子導入動物中の１つ以上の細胞種または組織において、コードするｓｉＲＮＡ産物の発現を導き得る。本発明の特定の実施形態に従って、遺伝子導入動物は、潜在的なＨＩＶ治療法を試験するために動物モデル（例えば、ネズミまたは霊長類）として使用される、種々の動物である。そのようなモデルとしては、ＳＩＶに感染した霊長類モデル、免疫系がヒト免疫系細胞によって再構築されたネズミモデル、その他が挙げられる。
【００６１】
（ＨＩＶインヒビターの同定）
上記のように、本発明は、ＨＩＶの感染および／またはＨＩＶの複製の阻害剤として有用であるｓｉＲＮＡを同定するためのシステムを提供する。詳細には、本発明は、ウイルスの感染および／またはウイルスの複製を防止するあるいは阻害するために、宿主遺伝子またはウイルス遺伝子に対して標的化されたｓｉＲＮＡの首尾良い調製を実証する。本明細書中に記載される技術および試薬は、本明細書中で開示されるように、潜在的な新しいｓｉＲＮＡを設計するために容易に適用され得、他の遺伝子または遺伝子領域に容易に標的化され得、ならびにＨＩＶの感染および／またはＨＩＶの複製の阻害におけるそれらの活性が容易に試験され得る。本明細書中で議論されるように、治療を受けている１つの個体への投与が企図される場合において、ＨＩＶが変異し続けること、および異なるように標的化された新しいｓｉＲＮＡを開発し試験することが常に望ましいことが、予想される。
【００６２】
ウイルス遺伝子を標的にする場合、内在化したウイルス（例えば、非被覆ウイルス（すなわち、ウイルスエンベロープを欠いたウイルス）および／または（例えば、統合に先だって）非カプシド化したウイルス）中に存在する利用可能な配列を標的にすることが、しばしば望ましいことを本発明者らは提案するが、任意の特定の理論によって制限されることを望まない。もちろん、後で生じる妥当な配列を含む転写物を標的にする能力のみならず、内在化されたウイルス、非被覆化されたウイルス、および／または非カプシド化したウイルスを標的にする能力は、選択される送達方法および送達のタイミング、ならびに配列の選択に依存し得ることが理解される。それにもかかわらず、そのような標的化によって、最初の段階のＲＮＡを初期に破壊し、下流のＲＮＡおよび子孫の製造を必然的に阻害することを通じて、阻害効果の増幅が可能になる。
【００６３】
本明細書中に記載されるように、前統合ウイルス（例えば、内在化、非被覆化、および／または非カプシド化されているウイルス）を標的とするｓｉＲＮＡは、容易に同定され得る。例えば、そのような薬剤は、個々の転写物に対して特定の効果を有するのではなく、全てのウイルスＲＮＡに対して同様の阻害効果を有することが予想される。
【００６４】
本発明の種々の実施形態において、潜在的なＨＩＶインヒビターは、（例えば、外因性の投与、またはｓｉＲＮＡの内因性の合成を導くベクターまたは構築物を細胞内に導入することによって）候補ｓｉＲＮＡを細胞中に導入することで試験され得る。それは、ＨＩＶゲノムまたはその一部を用いてトランスフェクションされる前に、トランスフェクションされるのと同時に、またはトランスフェクションされたすぐ後（例えば、数分、数時間、または大体数日以内）に行われ得、またはＨＩＶを用いた感染の前に、感染と同時に、または感染のすぐ後に行なわれ得る。あるいは、潜在的なＨＩＶインヒビターは、候補ｓｉＲＮＡを生産的にＨＩＶに感染させられた細胞（すなわち、子孫ウイルスを製造している細胞）内に、または潜伏的にＨＩＶに感染させられた細胞（すなわち、宿主ゲノムに統合されたウイルスゲノムを含むが、特定の使用条件下では子孫ウイルスを製造していない細胞）内に導入することで、試験され得る。潜伏的に感染した細胞は、刺激されてウイルスを生成し得る。次いで、候補ｓｉＲＮＡの標的転写物レベルを低下させる能力および／あるいはウイルスの生活環の１つ以上の局面または特徴（例えば、ウイルスの複製、病原性、および／または感染性）を阻害または抑制する能力が、調査される。例えば、細胞溶解、合胞体の形成、ウイルス粒子の製造、その他が、当該分野で周知の方法を用いて、直接的または間接的いずれによっても調査され得る。本発明のｓｉＲＮＡ組成物が送達される細胞（試験細胞）は、本発明の組成物を受容していない同様のまたは比較可能な細胞（コントロール細胞）と比較され得る。試験細胞のＨＩＶ感染に対する感受性は、コントロール細胞の感染に対する感受性と比較され得る。ウイルスタンパク質および／または子孫ウイルスの生成は、コントロール細胞と比較する試験細胞において、比較され得る。ウイルスの感染性、複製、病原性、その他についての他の指標が、同様に比較され得る。概して、試験細胞およびコントロール細胞は、同じ種に由来し得、類似または同一の細胞種（例えば、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、その他）であり得る。例えば、同一の細胞系由来の細胞が、比較され得る。試験細胞が始原細胞である場合、代表的にはコントロール細胞もまた、始原細胞であり得る。代表的には、同じＨＩＶ株は、試験細胞とコントロール細胞とを比較するために使用され得る。
【００６５】
概して、特定の好ましいＨＩＶインヒビターは、標的転写物レベルを少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約４倍、さらに好ましくは少なくとも８倍、少なくとも１６倍、少なくとも６４倍またはインヒビターの不存在下（例えば、ＨＩＶインヒビターを欠く比較可能なコントロールマウスにおいて）で存在するレベルと比べて極めて大きな程度まで低下させる。概して、特定の好ましいＨＩＶインヒビターは、宿主細胞内への感染性因子の侵入を少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約４倍、さらに好ましくは少なくとも８倍、少なくとも１６倍、少なくとも６４倍またはインヒビターの不存在下（例えば、ＨＩＶインヒビターを欠く比較可能なコントロールマウスにおいて）で存在するレベルと比べて極めて大きな程度まで阻害する。概して、特定の好ましいＨＩＶインヒビターは、ＨＩＶの複製を阻害し、インヒビターを含む細胞において、ＨＩＶ複製のレベルがインヒビターを含まないコントロールよりも少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約４倍、さらに好ましくは少なくとも８倍、少なくとも１６倍、少なくとも６４倍または極めて大きな程度まで低下する。同様のことが、他の感染性因子の潜在的インヒビターの試験についても言える。
【００６６】
潜在的なＨＩＶインヒビターはまた、開発されている種々の動物モデル（例えば、ネズミまたは霊長類）を使用することで試験され得る。宿主細胞内、またはｓｉＲＮＡを含むように作製、または操作された細胞内で次のようなｓｉＲＮＡの合成を導き得る候補ｓｉＲＮＡ、候補構築物または候補ベクターを含有する組成物は、ＨＩＶ感染に先だって、ＨＩＶ感染と同時に、またはＨＩＶ（または関連ウイルス（例えば、ＳＩＶ）を使用するモデル動物においては、その適切な関連ウイルス）感染の後で、動物に投与され得る。ＨＩＶ感染の予防する組成物の能力、および／あるいはＨＩＶに関連する症状の発症を遅らせるかまた予防する組成物の能力、および／あるいは潜在的なＨＩＶインヒビターを受容していないＨＩＶに感染した動物に比べて、その重度を軽減する組成物の能力が、調査される。
【００６７】
（ＨＩＶの感染／複製の分析）
上記のように、本発明のｓｉＲＮＡの１つの用途は、ＨＩＶの感染／複製サイクルの分析および特徴付けである。ｓｉＲＮＡは、１つ以上のウイルスの感染および／またはウイルスの複製サイクルの１つ以上の段階に加わる種々の宿主遺伝子およびウイルス遺伝子のうちの任意のものに標的化されるように、設計され得る。そのようなｓｉＲＮＡは、ＨＩＶ感染に先だって、ＨＩＶ感染の間に、またはＨＩＶ感染の後で、細胞内に導入され得、そして感染／複製サイクルの種々の段階に対するそれらの効果が、所望のように調査され得る。本発明の１つの特徴は、宿主遺伝子がＨＩＶの感染および／または複製を阻害するように標的化され得ることを証明する点である。従って、このシステムは、ウイルスの生活環に寄与または関与する宿主遺伝子の同定および／または特徴付けするために活用され得る。例えば、ウイルスの変異から防護するまたはウイルスの変異に関与する遺伝子が、同定され得る。当業者は、すぐに広範囲にわたる、さらなる適用または代替可能な適用を理解する。
【００６８】
（治療的適用）
本発明のｓｉＲＮＡを含む組成物は、ＨＩＶの感染または複製を阻害または軽減するために使用され得る。そのような適用において、本発明のｓｉＲＮＡ組成物の有効量が、ＨＩＶへの曝露に先だって、ＨＩＶへの曝露と同時に、またはＨＩＶへの曝露の後で細胞または生体に送達される。好ましくは、ｓｉＲＮＡの量は、ＨＩＶ感染の１つ以上の症状を軽減または遅らせるために十分である。
【００６９】
本発明のｓｉＲＮＡを含む組成物は、１つの標的転写物中の１つの部位に標的化された１つのｓｉＲＮＡ種を含み得、あるいは１つ以上の標的転写物中の１つ以上の部位に標的化された複数の異なるｓｉＲＮＡ種を含み得る。本発明のある実施形態において、異なる遺伝子に標的化された異なるｓｉＲＮＡ種の集合体を含む組成物を利用することが望ましい。ある実施形態は、ウイルス遺伝子と宿主遺伝子の両方に標的化されたｓｉＲＮＡを含み得る。また、ある実施形態は、１つの宿主転写産物またはウイルス転写産物に標的化された複数のｓｉＲＮＡ種を含み得る。ほんの一例を挙げると、少なくとも１つの標的転写物のコード領域に標的化されたｓｉＲＮＡおよび少なくとも１つの３‘ＵＴＲに標的化されたｓｉＲＮＡを含むことが望ましい。この戦略により、組成物中の少なくとも１つのｓｉＲＮＡが転写物を分解へと標的化し、一方、他の少なくとも１つのｓｉＲＮＡが分解を避けた任意の転写物の翻訳を阻害するので、適切な転写物よりコードされる生産物が生じ得ないことをより確実にし得る。多数の転写物が標的化されている本発明の適当な実施形態によると、転写物は、多数の異なるウイルス株由来の配列を含有する。これらは、一般的な改変体およびウイルス耐性の発生に関連する配列を含み得る。当該分野で周知であるように、抗ウイルス治療および／または抗ウイルス薬剤の存在下でのウイルスのインビトロ培養の後で、適当な「エスケープ（ｅｓｃａｐｅ）」変異体が、一般的に見出される。そのような変異は、耐性の原因であり得る。例えば、それらの変異によって、コードされたＲＮＡまたはタンパク質が抗ウイルス薬剤の存在下で機能できるようになり得る。上記のように、本発明は、そのような「治療的カクテル」（１つのベクターが、多数の標的を阻害するｓｉＲＮＡまたは処理されて複数のｓｉＲＮＡを生じるＲＮＡの合成を導くようなアプローチが挙げられる）を包含する。
【００７０】
本発明者らが、すべての感染性ウイルスを（例えば、トランスフェクトした遺伝子、統合された導入遺伝子、統合されたウイルスゲノム、感染性分子クローンなどとは対照的に）使用して、標的転写物の発現およびＨＩＶの侵入および複製に対する効果的なｓｉＲＮＡ媒介性阻害を証明したことは、重要である。さらに、本発明者らが、２つの異なるＨＩＶ株を使用して、ＨＩＶの侵入および感染にたいする効果的なｓｉＲＮＡ媒介性阻害を証明したことが、重要である。このＲ５（ＢＡＬ）株およびＸ４（ＮＬ４３）株は、２つの主要なＨＩＶ改変体であり、Ｒ５はマクロファージ指向性を有し、Ｘ４はＴ細胞指向性を有する。同じｓｉＲＮＡが、これら２つの主要なＨＩＶ改変体株の両方に対して効果的であることが証明されたことは、治療的立場から重要である。
【００７１】
ＨＩＶは、その変異性について周知であり、そしてそれによる治療的薬剤への耐性の発生が一般的な問題であることが認識されている。ウイルス投与量を低く維持することにより、耐性の発生が、最小限にされ得る（低いウイルス投与量は、ウイルスがより少なく、従って耐性改変体が生産される全可能性がより低いことを示すためである）。宿主細胞の転写物および／またはウイルスの転写物を志向する種々のｓｉＲＮＡを使用して、ウイルスの生活環の多数の部位でウイルスを攻撃することは、耐性改変体の発生を最小限にするための魅力的なアプローチを示す。それにもかかわらず、本発明の組成物が、ＨＩＶに感染した細胞に投与された後で、ある場合には、このウイルスが変異し、もはや提供される特定のｓｉＲＮＡによって阻害されなくなり得ることが、予測される。従って、本発明は、さらに進んだ治療的療法を企図する。ある場合において、一連の予め選択されたｓｉＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡの混合物が、計画的な時間計画でまたは耐性の進化に対応して、投与され得る。他の場合には、1つ以上の新しいｓｉＲＮＡが、特定の変異に対応する特定の場合において、選択され得る。例えば、ウイルスに導入された任意の変異を取り込んでいること以外は元々のｓｉＲＮＡと同じである新しいｓｉＲＮＡを設計することが、しばしば可能であり得る；別の場合では、同じ遺伝子中の新しい配列を標的にすることが、望ましい；さらに別の場合では、全く新しい遺伝子を標的にすることが、望ましい。
【００７２】
1つ以上の感染の症状または特徴を阻害し、軽減し、または予防するために、本発明のｓｉＲＮＡの投与を1つ以上の他の抗ＨＩＶ薬剤と組み合わせることが、しばしば望ましい。適当な本発明の好ましい実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡは、承認された薬剤（例えば、付録Ｂに列挙される薬剤）と組み合わされる。；しかし、この戦略を利用して、本発明のｓｉＲＮＡ組成物を1つ以上の種々の薬剤の中の任意のもの（例えば、付録Ｃに列挙される薬剤）と組み合わされることがあり得る。
【００７３】
本発明のある実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡ組成物の投与をＨＩＶに感染した細胞、または少なくともＨＩＶ感染の受けやすい細胞（例えば、ＣＤ４を発現している細胞（免疫系細胞（例えば、マクロファージおよびＴ細胞）が挙げられるが、これに限定はされない））に標的化することが、望ましいことであり得る。従って、本発明者らが、Ｔ細胞内の標的の発現に対する効果的なｓｉＲＮＡ媒介性の抑制を証明したことが、重要である。他の実施形態において、利用可能である最大限の範囲の送達についての選択肢を有することが、望ましい。
【００７４】
上記のように、本発明の治療的プロトコルは、ＨＩＶへの曝露に先立って、ＨＩＶへの曝露と同時に、またはＨＩＶへの曝露の後で、効果量のｓｉＲＮＡを投与する工程を伴う。例えば、未感染の個体は、ＨＩＶへの曝露に先立って、本発明の組成物を使用して「免疫され」得る。；危険性のある個体（例えば、売春婦、ＩＶ薬剤使用者、またはその他の最近、ＨＩＶ感染が疑われる者、ＨＩＶ感染して可能性の高い者、ＨＩＶ感染を知っている者との体液の交換を経験した者）は、疑われる曝露または知っている曝露と実質的に同時に（例えば、４８時間以内、好ましくは２４時間以内、およびさらに好ましくは１２時案以内に）処置され得る。もちろん、感染を知っている個体は、任意の時期に（ウイルス投与が検出できないほどに低い場合が挙げられる）本発明の処置を受容することができる。
【００７５】
遺伝子治療プロトコルは、ＨＩＶ感染の前に、ＨＩＶ感染と実質的に同時に、ＨＩＶ感染と共に、ＨＩＶ感染の後で、被験体に、阻害的ｓｉＲＮＡの発現を導き得る遺伝子治療用ベクターの効果量を投与する工程を含み得る。前記のプロトコルとは別にまたは前記のプロトコルと組み合わせて使用され得る別のアプローチは、細胞集団（例えば、被験体由来の肝細胞または免疫系細胞）を単離し、必要に応じてこの細胞を組織培養で拡張し、そして細胞の拡張の前または後のいずれかにおいて（代表的には前に）、この細胞に、阻害的ｓｉＲＮＡ遺伝子の発現を導き得る治療用ベクターをインビトロで投与することである。遺伝子治療用ベクターを取り込む細胞および／またはその中でベクターが転写について活性を有する細胞を選択するために、選択工程が、行われる。
【００７６】
次いで、この細胞は、被験体に戻され得、そこでそれらはＨＩＶ耐性の細胞集団を提供し得る。必要に応じてｓｉＲＮＡを発現する細胞（従って、ＨＩＶ耐性になり得る細胞）は、それらの被験体への導入に先立って、インビトロで選択され得る。本発明のある実施形態では、1つの細胞系または被験体ではない個体に由来する細胞集団が、使用され得る。被験体から幹細胞、免疫系細胞、その他を単離し、それらをその被験体に戻す方法は、当該技術分野では周知である。そのような方法は、例えば、化学治療を受けている患者において、骨髄移植、抹消血液肝細胞移植、その他のために使用される。
【００７７】
さらに別のアプローチでは、経口遺伝子治療が、使用され得る。例えば、米国特許第６，２４８，７２０号は、プロモーターの制御下にある遺伝子が、微粒子に保護的に含まれており、有効な形態で細胞に送達され、それによって非侵襲的な遺伝子送達を達成する方法および組成物を記載している。微粒子の経口投与に続いて、この遺伝子は、上皮細胞（吸収的小腸上皮細胞が挙げられる）に取り込まれ、腸に関連するリンパ組織に取り込まれ、そして粘膜上皮から離れた細胞へと輸送される。本明細書中で記載するように、この微粒子は、遺伝子を粘膜上皮から離れた部位へと送達し得る。例えば、微粒子は、上皮障壁を越えて、一般的な血液循環に侵入し、それによって他の位置の細胞をトランスフェクトし得る。
【００７８】
（薬学的処方物）
本発明の組成物は、非経口（例えば、静脈内）、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経被（局所的）、経粘膜、直腸、および膣が挙げられるが、これらに限定されないいくつかの利用可能な経路によって送達するために処方され得る。送達の好ましい経路としては、非経口、経粘膜、直腸、および膣が挙げられる。本発明の薬学的組成物としては、代表的には、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて、ｓｉＲＮＡまたは他の薬剤（例えば、送達後ｓｉＲＮＡの生成において生じるベクター）を含む。本明細書中で使用される場合、言語「薬学的に受容可能なキャリア」としては、薬学的投与に適合する、溶媒、分散媒体、被覆、抗細菌薬剤および抗真菌性の因子、等張性薬剤および吸収遅延薬剤等が挙げられる。補充活性化合物もまた、この組成物中に取り入れられ得る。
【００７９】
薬学的組成物は、投与のその意図された経路に適合するように処方される。非経口適用、皮内適用、または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：滅菌希釈剤（例えば、注入のための水、生理食塩溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒）；抗細菌薬剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸）；緩衝液（例えば、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩）および張度の調節のための薬剤（例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース）。ｐＨは、酸または塩基（例えば、塩酸またはっ水酸化ナトリウム）を用いて調整され得る。非経口調製物は、アンプル、使い捨てのシリンジ、またはガラスもしくはプラスチックから製造される複数の投与バイアル中に封入され得る。
【００８０】
注入可能な使用のために適切な薬学的組成物としては、代表的には、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散および滅菌の注入可能溶液もしくは分散物の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与のために、適切なキャリアとしては、生理学的食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）またはリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は、滅菌であるべきであり、そして容易なシリンジ注入ができる程度まで流体であるべきである。好ましい薬学的処方物は、製造および貯蔵条件下で安定であり、そして微生物（例えば、細菌および真菌）の汚染作用に対して保存されなければならない。一般的には、適切なキャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）ならびにこれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、被覆（例えば、レシチン）の使用によって、分散物の場合において必要とされる粒子サイズの維持、および界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の作用の防止は、様々な抗細菌薬剤および抗真菌薬剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等）によって達成され得る。多くの場合、組成物中に等張薬剤（例えば、糖、マンニトール、ソルビトールのようなポリアルコール、塩化ナトリウム）を含むことが好ましい。注入可能な組成物の延長された吸収は、組成物中に吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を含むことによってもたらされ得る。
【００８１】
滅菌の注入可能溶液は、上に列挙された成分の１つまたは組み合わせと共に適切な溶媒中に必要とされる量で活性な化合物を取り入れることによって調製され得、必要ならば、続いてろ過され得る。一般的に、分散物は、活性な化合物を滅菌ビヒクル中に取り入れることによって調製され、このビヒクルは、基礎分散媒体および上に列挙されたものから必要とされる他の成分を含む。滅菌注入可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合において、調製の好ましい方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これは、これらの前記滅菌ろ過溶液から活性な成分および任意のさらに所望される成分の粉末を生じる。
【００８２】
経口組成物は、一般的に、不活性な希釈剤または食用のキャリアを含む。経口治療剤投与の目的のために、活性な化合物は、賦形剤とともに取り入れられ得、そして錠剤、トローチ、またはカプセル（例えば、ゼラチンカプセル）の形態において使用され得る。経口組成物はまた、口内洗浄としての使用のため流体キャリアを使用して調製され得る。薬学的に適合する結合剤、および／またはアジュバント物質は、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル、トローチ等は、任意の以下の成分、または類似の性質の化合物を含み得る：結合剤（例えば、微小結晶セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、デンプンまたはラクトース）、崩壊剤（例えば、アルギニン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはコーンデンプン）；潤滑油（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓ）；グリダント（ｇｌｉｄａｎｔ）（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘味剤（例えば、スクロースまたはサッカリン）；あるいは香料剤（例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ香料）。経口送達のための処方は、有利に薬剤を取り入れ、胃腸管中の安定性を改善し、そして／または吸収を増強する。
【００８３】
吸入による投与のため、本発明のｓｉＲＮＡ薬剤は、好ましくは、加圧容器もしくはディスペンサーまたは噴霧器からエアロゾルスプレーの形態で送達され、この容器またはディスペンサーは、適切な噴霧剤（例えば、二酸化炭素のような気体）を含む。
【００８４】
全身投与はまた、経粘膜手段または経皮手段によってであり得る。経粘膜投与または経皮投与のため、浸透されるべき障壁に対して適切な浸透剤が、処方物において使用される。このような浸透剤は、一般的に、当該分野において公知であり、そして例えば、経粘膜投与のために、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻スプレーまたは坐剤の使用を通して達成され得る。経皮投与のため、活性な化合物は、当該分野において一般的に公知な、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲル、またはクリーム中に処方される。
【００８５】
化合物はまた、坐剤（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドのような従来の坐剤基剤）または直腸送達のための保持浣腸の形態で調製され得る。
【００８６】
１つの実施形態において、活性な化合物は、身体からの迅速な排出に対して化合物を保護するキャリアを用いて調製される（例えば、移植物および微小カプセル化された送達系を含む、制御された放出処方物）。生分解性の、生体適合性のポリマー（例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸）が、使用され得る。このような処方物の調製のための方法は、当業者にとって明らかである。これらの材料はまた、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から市販され得る。リポソーム懸濁物（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を有する、感染された細胞に対して標的化されたリポソームを含む）はまた、薬学的に受容可能なキャリアとして使用され得る。これらは、例えば、米国特許番号第４，５２２，８１１号に記載されるような、当業者に公知の方法に従い、調製され得る。
【００８７】
容易な投与および投薬の均質性のために、単位投薬形態で経口的組成物または非経口的組成物を処方することは、有利である。本明細書中で使用される場合、単位投薬形態とは、処置されるべき被験体についての単一投薬量として適切な物理的に別個の単位をいう；各単位は、必要な薬学的キャリアに関連する所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性な化合物を含む。
【００８８】
このような化合物の毒性および治療効果は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％までの致死用量）およびＥＤ５０（集団の５０％中で治療的に有効な用量）を決定するため、細胞培養物または実験動物において標準の薬学的手順によって決定され得る。毒性効果と治療効果との間の用量の比率は、治療的指数であり、これは、比率ＬＤ５０／ＥＤ５０として表現され得る。高い治療的指数を示す化合物は、好ましい。毒性副作用を示す化合物が使用され得る一方、医療は、非感染細胞に対する潜在的な損失を最小化し、それによって副作用を低減するために、離環した組織の部位にこのような化合物を標的化する送達系を設計するために行われ得る。
【００８９】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投薬量の範囲を処方する際に使用され得る。このような化合物の投薬量は、好ましくは、毒性をほとんど有さないかまたは毒性を有さずに、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内に存在する。投薬量は、使用される投薬形態および利用される投与の経路に依存して、この範囲内で変化し得る。本発明の方法において使用される任意の化合物について、治療的有効用量は、細胞培養アッセイから最初に概算され得る。用量は、動物モデルにおいて処方され得、細胞培養物において決定されるような、ＩＣ５０（すなわち、症状の最大の半分の阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成する。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。血漿におけるレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定され得る。
【００９０】
薬学的組成物の治療的有効量は、代表的には、約０．００１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．０１〜２５ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、そしてなおより好ましくは約１〜１０ｍｇ／ｋｇ、２〜９ｍｇ／ｋｇ、３〜８ｍｇ／ｋｇ、４〜７ｍｇ／ｋｇ、または５〜６ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。薬学的組成物は、必要な場合、様々な間隔および異なる時間（例えば、約１〜１０週間の間、２〜８週間の間、約３〜７週間の間、約４、５、または６週間などにわたって、一週間当たり１回）で投与され得る。特定の状態（例えば、ＨＩＶ）について、不明確な基礎に関して治療組成物を投与し、この疾患を制御下に置くことが、必要であり得る。当業者は、特定の因子（疾患または障害の重症度、以前の処置、被験体の全体的な健康および／または年齢、ならびに他の疾患の存在を含むが、これらに限定されない）が、被験体を効果的に処置するために必要とされる投薬量およびタイミングに影響し得ることを認識する。一般的に、本明細書中に記載されるようなｓｉＲＮＡを用いた被験体の処置は、単一処置を含み得、または多くの場合、一連の処置を含み得る。
【００９１】
代表的な用量としては、被験体またはサンプル重量の１ｋｇ当たり本発明のｓｉＲＮＡのミリグラムまたはマイクログラムの量（例えば、１キログラム当たり約１マイクログラム〜１キログラム当たり約５００ミリグラム、１キログラム当たり約１００マイクログラム〜１キログラム当たり約５ミリグラム、または１キログラム当たり約１マイクログラム〜１キログラム当たり約５０マイクログラム）が挙げられる。ｓｉＲＮＡの適切な用量が、ｓｉＲＮＡの効力に依存し、そして必要に応じて、例えば、予め選択された所望の応答が達成されるまで、増加する用量の投与を通して、特定のレシピエントに合わせられ得ることがさらに理解される。任意の特定の動物被験体についての特定の用量レベルは、使用される特定の化合物の活性、被験体の年齢、体重、全体的健康、性別および食事、投与の時間、投与の経路、排泄の速度、任意の薬物の組み合わせ、ならびに調節されるべき発現または活性の程度を含む様々な因子に依存し得ることが理解される。
【００９２】
本発明の核酸分子は、ベクター内に挿入され得、そして本明細書中に記載されるような遺伝子治療ベクターとして使用され得る。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注入、局所的投与、または定位注入によって被験体に送達され得る（例えば、Ｃｈｅｎら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３０５４−３０５７を参照のこと）。本発明の特定の実施形態において、遺伝子治療ベクターは、経口的にまたは吸入的に送達され得、そしてカプセル化されるか、またはそうでなければ分解からそれらを保護し、組織または細胞等の中への取り込みを増強するように操作され得る。遺伝子治療ベクターの薬学的調製物は、受容可能な希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含み得、または遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれる緩徐放出マトリックスを含み得る。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターが、組換え細胞からインタクトに作製され得る場合（例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター）、薬学的調製物は、遺伝子送達系を生成する１つ以上の細胞を含み得る。
【００９３】
本発明の薬学的組成物は、投与のための指示書とともに容器、パック、またはディスペンサー中に含まれ得る。
【００９４】
（さらなる実施形態）
本明細書中で提供される多くの教示は、ＨＩＶ以外の感染性因子での感染に容易に適用され得ることが理解される。宿主細胞タンパク質および因子特異的タンパク質が、効果的に標的化され得、ウイルスの感染性および／または複製もしくは増殖に関して減少を生じるという本明細書中に提供される説明は、関連する宿主細胞タンパク質に依存する任意のウイルスまたは他の感染性因子に明確に適用される。従って、本発明は、ｓｉＲＮＡ薬剤の投与を通じて、任意の感染性因子による感染および／または複製を阻害するための方法および組成物を提供し、このｓｉＲＮＡ薬剤は、感染性因子のライフサイクルに関与する１つ以上の宿主細胞遺伝子または因子特異的遺伝子の発現または活性を阻害する。
【００９５】
このような状態としては、細菌、ウイルス、原生動物、および／または真菌性の因子に起因するものが挙げられる。それぞれの場合において、当業者は、感染性因子の効果的な感染複製、生存、成熟などに必要なまたは重要な１つ以上の宿主転写物（一般的に宿主細胞遺伝子に対応する）およびあるいはこの因子の効果的な感染、生存、複製、成熟などに必要または重要な１つ以上の因子特異的転写物を選択する。因子特異的転写によって、非感染宿主細胞中で見出される通常の転写物の配列とは異なる配列を有する転写物が意味される。因子特異的転写物は、感染性因子のゲノム中に存在し得るか、または感染工程の間に引き続いて産生され得る。次いで、１つ以上のｓｉＲＮＡは、本明細書中で示される判定基準に従い設計される。
【００９６】
標的転写物の発現を抑制する候補ｓｉＲＮＡの能力および／または治療薬剤としてのｓｉＲＮＡの潜在的有効性は、適切なインビトロおよび／またはインビボ（例えば、動物）モデルを使用して試験され、標的転写物の発現を阻害し得、そして／または感染性因子の感染性、病原性、複製などを減少または妨害し得るｓｉＲＮＡを選択し得る。適切なモデルは、感染性因子に依存して変化し、そして当業者によって容易に選択され得る。例えば、特定の感染性因子のためおよび特定の目的のため、宿主細胞を提供することが必要であるが、一方他の場合において、因子に対するｓｉＲＮＡの有効性は、宿主細胞の非存在下で評価され得る。ＨＩＶ感染について上記されるように、感染および／または複製サイクルの１つ以上の段階に関する任意の様々な宿主または因子遺伝子に標的化されたｓｉＲＮＡが設計され得る。このようなｓｉＲＮＡは、感染前、感染中、または感染後、細胞中に導入され得、そして感染および／または複製サイクルの様々な段階に関するこれらの効果は、所望に応じて評価され得る。
【００９７】
好ましい宿主細胞転写物としては、（１）感染性因子またはその一部（例えば、このような分子を作製するか、または処理するゲノムまたはタンパク質）の侵入および／または細胞内輸送に必要であるか、またはこれを容易にするレセプターまたは他の分子；（２）感染性因子のライフサイクルに関与する細胞分子（例えば、感染性因子ゲノムの複製に必要な酵素、宿主細胞ゲノムへのレトロウイルスゲノムの組み込みに必要な酵素、病原体の侵入および／または遺伝子送達を増強する細胞シグナル伝達分子、ウイルス成分のプロセジング、ウイルスアセンブリ、および／または細胞からのウイルスの輸送もしくは放出のに必要であるか、またはこれを容易にする細胞分子、をコードする転写物が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｇｒｅｂｅｒ、Ｕ．ら、「Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｒａｌ  ｅｎｔｒｙ」、Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ２００２  Ａｐｒ；５９（４）：６０８−２６）、Ｆｕｌｌｅｒ  ＡおよびＰｅｒｅｚ−Ｒｏｍｅｒｏ  Ｐ、「Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：ｅｎｔｒｙ  ａｎｄ  ｅａｒｌｙ  ｅｖｅｎｔｓ」、Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ  ２００２  Ｆｅｂ  １；７：ｄ３９０−４０６を参照のこと。様々な感染性因子の効果的な感染、複製、生存、成熟、病原性などについて必要または重要な宿主転写物（一般的に宿主細胞遺伝子に対応する）は、当該分野で公知であり、そして関連する科学文献を参照することによって特定され得るが、さらなるこのような転写物は、多くの技術のいずれかを使用して将来的に特定される可能性がある。例えば、候補としては、感染性因子に物理的に会合する分子をコードする宿主転写物が挙げられる。感染性因子のライフサイクルでの宿主転写物の重要性は、宿主細胞転写物の存在下または非存在下で複製または宿主細胞に感染する、感染性因子の能力を比較することによって決定され得る。例えば、感染性因子についての適切なレセプターを欠乏する細胞は、一般的に、この因子による感染に対して抵抗性がある。
【００９８】
従って、発明者らは、宿主細胞分子（ＣＤ４）（すなわち、感染性因子（ＨＩＶ）による感染に対して感受性があり、そして感染性因子によってレセプターとして使用される細胞内に通常存在する分子）の発現の効果的なｓｉＲＮＡ媒介抑制を実証し、そしてこのような抑制が感染性因子の侵入および複製を阻害したことを示唆するデータを獲得したことを注意する。これに関連して、発明者らは、例えば、トランスフェクトされた遺伝子、組み込まれた導入遺伝子、組み込まれたウイルスゲノム、感染性分子クローンなどと対照的に、感染性ウイルス全体を使用して、標的転写物発現ならびに感染性因子の侵入および複製の、効果的なｓｉＲＮＡ媒介阻害を実証したことに注意する。従って、本発明は、感染性因子による複製、病原性、または感染に関与する宿主細胞転写物に標的化されたｓｉＲＮＡを包含し、そしてさらに、この因子に対して感受性のある細胞にｓｉＲＮＡを送達することによって感染性因子による複製、病原性、または感染を阻害する方法を包含する。本発明の特定の好ましい実施形態において、ｓｉＲＮＡは、例えば、宿主細胞分子を発現するように操作される細胞と対照的に、遺伝子を天然に発現する宿主細胞中でこの分子の発現を阻害する。一般的に、細胞の本質的な活性に必要ない細胞標的を選択することが、好ましい。
【００９９】
本発明は、感染性因子による複製、病原性、または感染に関与する因子特異的転写物を標的化するｓｉＲＮＡをさらに包含する。本発明に従い標的化され得る好ましい因子特異的転写物としては、この因子のライフサイクルの間に作製される因子ゲノムおよび／または任意の他の転写物が挙げられる。好ましい標的は、感染性因子に特異的であり、そして宿主細胞内で見出されない転写物が挙げられる。例えば、好ましい標的としては、因子特異的なポリメラーゼ、シグマ因子、転写因子などが挙げられ得る。このような分子は、当該分野において周知であり、そして当業者は、この因子のライフサイクルの知識に基づいて適切な標的を選択し得る。これに関し、有用な情報は、例えば、Ｆｉｅｌｄｓ’Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第４版、Ｋｎｉｐｅ，Ｄ．ら（編）Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、２００１；Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ、Ｗｉｌｌｉａｍｓら（編）Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９８で見出され得る。
【０１００】
本発明のいくつかの実施形態において、好ましい転写物は、感染性因子（例えば、毒性遺伝子の発現産物）の毒性と特に関連する転写物である。毒性遺伝子を同定する種々の方法が当該分野で公知であり、そして多数のこのような遺伝子が同定されている。多数の病原性および非病原性のウイルス、細菌などのゲノム配列の利用可能性は、毒性遺伝子の同定を容易にする。同様に、病原性および非病原性の株について、ならびに／またはそのライフサイクル因子における異なる段階での単一の株について、遺伝子およびタンパク質発現プロフィールを決定および比較するための方法は、その発現が毒性に関連する遺伝子の同定を可能にする。例えば、Ｗｉｎｓｔａｎｌｅｙ、「Ｓｐｏｔ  ｔｈｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ  ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ」、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２００２  Ｊｕｎ；５１（６）：４５９−６７；Ｓｃｈｏｏｌｎｉｋ，Ｇ、「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ」、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２００２  Ｆｅｂ；５（１）：２０−６を参照のこと。例えば、宿主細胞に対して毒性であるタンパク質をコードする因子遺伝子は、毒性遺伝子とみなされ、そしてｓｉＲＮＡのための好ましい標的であり得る。従来の治療に対して耐性の因子に関連する転写物はまた、本発明の特定の実施形態における好ましい標的である。これに関して、本発明のいくつかの実施形態において、この標的転写物は、因子ゲノムによってコードされる必要はないが、その代わり、プラスミドまたはこの因子内の他の染色体外エレメントによってコードされ得ることに、留意すべきである。
【０１０１】
本発明のいくつかの実施形態において、感染性因子は、薬物耐性細菌である。本発明のいくつかの実施形態において、この感染性因子は、ウイルスである。本発明のいくつかの実施形態において、このウイルスは、レトロウイルスまたはレンチウイルスである。本発明の特定の実施形態において、このウイルスは、ＤＮＡウイルスである。本発明のいくつかの実施形態において、このウイルスは、ＲＮＡウイルスである。本発明の特定の実施形態において、このウイルスは、細胞質ライフサイクルを有するネガティブストランドのＲＮＡウイルス（例えば、ＲＳウイルス）以外のウイルスである。
【０１０２】
ｓｉＲＮＡは、上記のような種々の構造（例えば、２本の相補的ＲＮＡ鎖、ヘアピン構造など）のいずれかを有し得る。これらは、化学的に合成され得るか、インビトロの転写によって産生され得るか、または宿主細胞内で産生され得る。本発明は、宿主細胞転写物または因子特異的転写物に対して標的化された本発明のｓｉＲＮＡを直接合成し得る構築物およびベクター、このような構築物またはベクターを含む細胞、ならびにｓｉＲＮＡ、構築物、ベクターおよび／または細胞が、感染の処置または予防を必要とする被験体に投与される、処置方法を包含する。
【実施例】
【０１０３】
（例示）
（実施例１：ＣＤ４−ｓｉＲＮＡを用いたトランスフェクションは、ＣＤ４転写物レベルを低減させる）
以下の材料および方法を、本実施例および以下の実施例において使用した。
【０１０４】
（細胞培養）Ｍａｇｉ−ＣＣＲ５細胞を、２００ｕｇ／ｍｌのネオマイシン、１００ｕｇ／ｍｌのハイグロマイシンおよび１０％の熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ中で増殖させた。ＨｅＬａ−ＣＤ４細胞を、２００ｕｇ／ｍｌのネオマイシンおよび１０％の熱不活化ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中で増殖させた。
【０１０５】
（ｓｉＲＮＡの調製）以下のセンス配列およびアンチセンス配列を有するｓｉＲＮＡを使用した（ここで、ＲＮＡの５’末端のリン酸の存在は、Ｐで示される）：
ＣＤ４（センス）：５’−ＧＡＵＣＡＡＧＡＧＡＣＵＣＣＵＣＡＧＵｄＧｄＡ−３’（配列番号１）
ＣＤ４（アンチセンス）：５’−ＡＣＵＧＡＧＧＡＧＵＣＵＣＵＵＧＡＵＣｄＴｄＧ−３’（配列番号２）
ｐ２４（センス）：５’−Ｐ．ＧＡＵＵＧＵＡＣＵＧＡＧＡＧＡＣＡＧＧＣＵ−３’（配列番号３）
ｐ２４（アンチセンス）：５’−Ｐ．ＣＣＵＧＵＣＵＣＵＣＡＧＵＡＣＡＡＵＣＵＵ−３’（配列番号４）
ＧＦＰ（センス）：５’−Ｐ．ＧＧＣＵＡＣＧＵＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＣ−３’（配列番号５）
ＧＦＰ（アンチセンス）：５’−Ｐ．ＵＧＣＧＣＵＣＣＵＧＧＡＣＧＵＡＧＣＣＵＵ−３’（配列番号６）
ＨＰＲＴ（センス）５’−Ｐ．ＧＵＧＵＣＡＵＵＡＧＵＧＡＡＡＣＵＧＧＡＡ−３’（配列番号７）
ＨＰＲＴ（アンチセンス）５’−Ｐ．ＣＣＡＧＵＵＵＣＡＣＵＡＡＵＧＡＣＡＣＡＡ−３’（配列番号８）。
【０１０６】
全てのｓｉＲＮＡを、２’ＡＣＥ保護化学を使用して、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）によって合成した。これらのｓｉＲＮＡ鎖を、製造業者の指示に従って脱保護し、等モル比で混合し、そして９５℃まで加熱し、温度を、３５℃までは３０秒毎に１℃ずつ、そして５℃まで１分毎に１℃ずつ、ゆっくりと下げることによって、アニーリングさせた。
【０１０７】
（ｓｉＲＮＡトランスフェクション）Ｍａｇｉ−ＣＣＲ５細胞およびＨｅＬａ細胞をトリプシン処理し、そしてトランスフェクション前に１２〜１６時間、１ウェル当たり１×１０５細胞で６ｃｍウェルにプレートした。１００ｐｍｏｌの示されたｓｉＲＮＡを３ｕｌのオリゴフェクタミン（ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）と共に、１００ｕｌのＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で２０分間インキュベートすることによって調製したカチオン性脂質複合体を、最終容量１ｍｌでウェルに添加した。一晩のインキュベーション後、細胞を洗浄し、そしてＨＩＶ−１での感染に使用した。浮遊細胞のトランスフェクションについて、カチオン性脂質複合体を、５０ｕｌのＡＩＭ  Ｖ  Ｔ細胞培地（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中での、１００ｐｍｏｌの示されたｓｉＲＮＡおよび０．５ｕｌのオリゴフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）との２０分間のインキュベーションによって調製した。Ｈ９細胞の対数期培養物を、１ウェル当たり１×１０５細胞で、５０ｕｌのＡＩＭ  Ｖ培地中に再懸濁し、そして９６ウェルの平底プレート中でカチオン性脂質複合体と合わせた。細胞を一晩トランスフェクトし、洗浄し、そして血清を含むＲＰＭＩ培地中で再懸濁し、そしてＨＩＶ−１の感染のために使用した。
【０１０８】
（フローサイトメトリー）フィコエリトリン（ＰＥ）結合体化αＨＩＶ−１  ｐ２４モノクローナル抗体を、染色のために使用した（Ｓｈａｎｋａｒ，Ｐ．ら、Ｂｌｏｏｄ  ９４，３０８４−３０９３（１９９９））。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを備えるＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）で、データを獲得し、そして分析した。
【０１０９】
（ノーザン分析）ノーザンブロット分析を、５〜１０ｕｇの総ＲＮＡ（ＲＮＡＥａｓｙ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で実施し、そしてブロッティングを、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｍａｘプロトコル（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を使用して実施した。
【０１１０】
ＣＤ４プローブを、以下のプライマーを用いて、Ｔ４ｐＭＶ７プラスミド（Ｍａｄｄｏｎ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ  ４７，３３３−３４８（１９８６））からＰＣＲ増幅した：
ＣＤ４−順方向  ５’−ＴＧＡＡＧＴＧＧＡＧＧＡＣＣＡＧＡＡＧＧ−３’（配列番号９）
ＣＤ４−逆方向  ５’−ＣＴＴＧＣＣＣＡＴＣＴＧＧＡＧＧＣＴＴＡＧ−３’（配列番号１０）。
【０１１１】
ｐ２４プローブおよびｎｅｆプローブを、以下のプライマーを用いて、ＨＸＢ２プラスミド（Ｒａｔｎｅｒら、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ３，５７−６９（１９８７）からＰＣＲ増幅した：
ｐ２４−順方向  ５’−ＣＣＡＧＧＧＧＣＡＡＡＴＧＧＴＡＣＡＴＣＡＧＧＣＣＡＴＡ−３’（配列番号１１）
Ｐ２４−逆方向  ５’−ＣＣＴＣＣＴＧＴＧＡＡＧＣＴＴＧＣＴＣＧＧＣＴＣＴＴＡ−３’（配列番号１２）
ｎｅｆ−順方向  ５’−ＡＴＧＧＧＴＧＧＣＡＡＧＴＧＧＴＣＡＡＡＡＡＧＴＡＧＴＧＴＧ−３’（配列番号１３）
ｎｅｆ−逆方向  ５’−ＧＴＧＧＣＴＡＡＧＡＴＣＴＡＣＡＧＣＴＧＣＣＴＴＧＴＡＡＧＴ−３’（配列番号１４）。
【０１１２】
β−アクチンプローブ（Ａｍｂｉｏｎ）を、内部標準として使用した。ＰＣＲ産物（２５〜３０ｎｇ）を、α−［３２Ｐ］ｄＡＴＰ（ＤＥＣＡｐｒｉｍｅＩＩ，Ａｍｂｉｏｎ）で標識し、ＮｕｃＡｗａｙスピンカラム（Ａｍｂｉｏｎ）で精製し、９５℃まで加熱し、そしてノーザンブロットにおいてプローブとして使用した。
【０１１３】
（ＨＩＶ感染）Ｍａｇｉ−ＣＣＲ５細胞に、１ウェル当たり１０ｎｇのｐ２４  ｇａｇ抗原を使用して、ＨＩＶ−１のＲ５  ＢＡＬ株およびＸ４  ＮＬ４３株を感染させた。ＨｅＬａ−ＣＤ４細胞に、１ウェル当たり１０〜２０ｎｇの、Ｘ４  ＨＩＶＩＩＩＢウイルスのｐ２４抗原を感染させた。示された時間に、細胞をトリプシン処理し、そしてＨＩＶ−１  ｐ２４発現について評価した。Ｈ９細胞に、０．１のＭＯＩで、ｐＲ７−ＧＦＰ（Ｌｉｕ，Ｒ．ら、Ｃｅｌｌ  ８６，３６７−３７７（１９９６））トランスフェクトした２９３Ｔ細胞由来のウイルス上清を感染させた。
【０１１４】
（β−ｇａｌ染色）Ｍａｇｉ−ＣＣＲ５細胞を、ＤＥＡＥ−デキストラン（２０ｕｇ／ｍｌ）の存在下で感染させ、次いで固定し、そして２日後に染色した（Ｃｈａｃｋｅｒｉａｎ，Ｂ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１，３９３２−３９３９（１９９７））。細胞数は、１０倍の倍率の視野当たりの青色細胞の数に相当する。細胞から遊離したｐ２４抗原を、示された時間で、上清中のＥＬＩＳＡによって測定した（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）。
【０１１５】
（結果）ｓｉＲＮＡを使用してＨＩＶ複製を抑制することの信頼性を調査するために、本発明者らは、このウイルスに対する基本的なレセプターであるＣＤ４分子を標的化した（Ｋｌａｔｚｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：７６７，１９８４；Ｍａｄｄｏｎら、Ｃｅｌｌ  ４７：３３３，１９８６）。具体的には、本発明者らは、ＨｅＬａ由来の細胞株であるＭａｇｉ−ＣＣＲ５（これは、ヒトＣＤ４、ならびにＣＸＣＲ４（向Ｔ細胞性ＨＩＶのコレセプター）およびＣＣＲ５（向マクロファージ性ウイルスの共レセプター）を発現する）を利用した（Ｃｈａｃｋｅｒｉａｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：３９３２，１９９７）。さらに、Ｍａｇｉ−ＣＣＲ５細胞は、Ｔａｔ媒介性のトランス活性化を反映する、組み込まれたＨＩＶ−ＬＴＲ−β−ガラクトシダーゼ遺伝子を有し、そしてウイルスの侵入および初期の遺伝子発現をスコア付けするために使用され得る。
【０１１６】
Ｍａｇｉ−ＣＣＲ５細胞を、ヒトＣＤ４に対するｓｉＲＮＡまたはコントロールｓｉＲＮＡのいずれかでトランスフェクトし、そしてフローサイトメトリーによって、ＣＤ４発現について分析した。図９Ａに示されるように、ＣＤ４−ｓｉＲＮＡは、これらの細胞の約７５％において、ＣＤ４発現を８分の１に特異的に低減させた。図９Ｂに示されるノーザン分析は、ＣＤ４  ｍＲＮＡが約８分の１に減少したことを明らかにし、ＣＤ４のサイレンシングが、ｍＲＮＡ安定性のレベルで生じたことを確認した。定量に使用したブロットの露光は、図９Ｆに示される。
【０１１７】
（実施例２：ＣＤ４−ｓｉＲＮＡは、ＨＩＶの侵入および感染を抑制する）
ウイルス侵入に対するＣＤ４サイレンシングの影響を評価するために、Ｍａｇｉ−ＣＣＲ５細胞を、まず、ＣＤ４−ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。６０時間後（遺伝子サイレンシングが最大の時点）、細胞に、Ｒ５（ＢＡＬ）向マクロファージ性株のＨＩＶおよびＸ４（ＮＬ４３）向Ｔ細胞性株のＨＩＶを感染させた。図９Ｃは、感染の４８時間後に観察されたβ−ガラクトシダーゼ活性のレベル（これは、ウイルス侵入の指標である）を示す（β−ガラクトシダーゼを発現する細胞は、図中で暗く見える）；図９Ｃは、シンシチウム形成の程度（ウイルス感染の指標）を示す。理解され得るように、β−ガラクトシダーゼレベルは、４分の１に減少し、そしてシンシチウム形成は、ほぼ消滅した。さらに、感染の４８時間後のｐ２４  ＥＬＩＳＡによって測定された、細胞から遊離したウイルスの初期の産生は、アンチセンスｓｉＲＮＡまたはコントロールｓｉＲＮＡのいずれかで処理した細胞と比較して、４分の１に減少した（図９Ｅを参照のこと）。これらの知見は、実施例１の報告と合わせて、ＣＤ４のｓｉＲＮＡにより指向されたサイレンシングが、細胞へのＨＩＶ侵入を特異的に阻害し、従って、ウイルス複製をブロックしたことを実証した。
【０１１８】
（実施例３：ｐ２４−ｓｉＲＮＡは、ｐ２４およびウイルス転写物のレベルを低減させる）
ＨＩＶカプシドは、ｇａｇポリタンパク質としてインタクトなウイルスＲＮＡから発現され、このｇａｇポリタンパク質は、ｐ２４ポリペプチド、ｐ１７ポリペプチドおよびｐ１５ポリペプチドへとタンパク質分解的に切断されて、ウイルスの主要な構造的コアを形成する。ｐ２４ポリペプチドはまた、ビリオンを脱外皮およびパッケージングする際に機能する。ｓｉＲＮＡ媒介性の、ウイルス遺伝子のＨＩＶサイレンシングについてスコア付けするために、本発明者らは、ｇａｇ遺伝子を標的化した。なぜなら、この領域における切断は、ウイルスＲＮＡ蓄積およびｐ２４産生の両方を阻害し得るからである。ヒトＣＤ４を発現するＨｅＬａ細胞（ＨｅＬａ−ＣＤ４；Ｍａｄｄｏｎら、Ｃｅｌｌ  ４７：３３３，１９８６）を、ｐ２４−ｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、２４時間後に、ＨＩＶＩＩＩＢに感染させた。感染の２日後に、ｐ２４−ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞は、コントロールと比較して、ウイルスタンパク質の４分の１より下までの減少を示した（図１０Ａ）。さらに、全長ウイルスｍＲＮＡレベルのサイレンシング（ｐ２４発現についてのノーザンブロッティングによって評価される）が、ｐ２４−ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＨｅＬａ−ＣＤ４細胞においてのみ観察された（図１０Ｂ）。ｐ２４−ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞の１４．５％のみが、感染の５日後にバックグラウンドレベルを上回ってｐ２４抗原を発現したが、コントロールｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞の９２％が、フローサイトメトリーによって検出可能なｐ２４発現を有した（図１０Ｃを参照のこと）。ウイルス粒子の産生を、感染の５日後にｐ２４  ＥＬＩＳＡによって測定した場合、培養物上清中のｐ２４力価は、モックトランスフェクトした細胞またはコントロールｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞と比較して、２５分の１まで減少した（図１０Ｄを参照のこと）。感染の５日後に回収した細胞ＲＮＡのノーザンブロットは、ｐ２４−ｓｉＲＮＡでのトランスフェクション後、ｇａｇ  ｐ２４  ｍＲＮＡを含む９．２Ｋｄのウイルス転写物の量は、コントロールトランスフェクト細胞におけるそのレベルと比較して、１０分の１に減少したことを示した（図１０Ｅを参照のこと）。
【０１１９】
本発明者らはまた、ｐ２４−ｓｉＲＮＡの存在下（または非存在下）での種々のＨＩＶ転写物のレベルを評価した。少なくとも１０種のＨＩＶ転写物（Ｐａｖｌａｋｉｓら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．（Ｋｅｎｎｅｄｙら、編）Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ：ｐｐ．４１−６３，１９９１）、ならびにウイルスのライフサイクルの種々の段階において、組み込まれたＨＩＶプロウイルスから発現される、いくつかの一箇所または複数箇所スプライシングされたメッセンジャーを含む複数のメッセンジャーＲＮＡ（Ｋｉｍら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３７０８，１９８９）が存在する。全長ＨＩＶ−１転写物は、組み込まれたプロウイルスからのみ発現され、そしてｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子のｍＲＮＡおよび子孫ウイルスのゲノムＲＮＡの両方として働く。対照的に、いくつかの遺伝子（Ｔａｔ、ＲｅｖおよびＮｅｆを含む）は、宿主ゲノムへの組み込みの前に、プロウイルスから発現され得る（Ｗｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３：１５０３，２００１）。
【０１２０】
Ｎｅｆは、最も３’側の遺伝子であり、多くのウイルス由来の転写物中に含まれるので、Ｎｅｆに対するプローブを使用して、異なるウイルス転写物に対する、ｓｉＲＮＡによって指示されたノックダウンの影響を試験した。図１０Ｃに示されるように、４．３Ｋｂおよび２．０ＫｂのＮｅｆ含有転写物は、ｐ２４遺伝子プローブまたはＮｅｆ遺伝子プローブで検出された全長転写物のノックダウンと同等に、約１０分の１に減少した。
【０１２１】
機構的に、これらのデータは、少なくとも３つの可能性を示唆する：１）ｓｉＲＮＡは、ウイルスが細胞に最初に侵入する際にウイルスゲノムＲＮＡを直接的に標的化し、それによって、引き続いて発現される全てのＨＩＶ転写物に影響を与え得る；２）ｓｉＲＮＡは、核において予めスプライシングされたｍＲＮＡを阻害し得る；そして／または３）ｓｉＲＮＡは、子孫ウイルスゲノムを直接標的化するか、および／もしくはウイルスカプシド構築を阻害するかのいずれかにより、ウイルスの増幅および再感染をブロックすることによって、ウイルスライフサイクルの後期におけるｇａｇ遺伝子の発現を阻害し得る（例えば、図１３を参照のこと）。いずれの特定の理論によっても束縛されることを望まないが、本発明者らは、第二の可能性は最も低いことを提唱する。特に、本発明者らは、イントロン配列が、ｓｉＲＮＡについての良好な標的であることが報告されていないことを注記する。さらに、ＢｉｔｋｏおよびＢａｒｉｋは、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）に感染した哺乳動物細胞におけるウイルス遺伝子のｓｉＲＮＡサイレンシングを、最近報告した（ＢＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３４：１，２００１）。ＲＳＶが核相を有さないことを考えると、ｓｉＲＮＡの影響が核における予めスプライシングされたｍＲＮＡの阻害にのみ帰するものであり得る可能性は、低いと思われる。この観点と一致して、本発明者らは、ｓｉＲＮＡ含有ＲＮＡ誘導性のサイレンシング複合体（ＲＩＳＣ；Ｈａｍｍｏｎｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０４：２９３，２０００）が、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞のリボソームペレットから単離されたこと（Ｈａｍｍｏｎｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０４：２９３，２０００；Ｈａｍｍｏｎｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３：１１４６，２００１）を注記する。この複合体が、核においてのみ作動する場合に、リボソームと会合して見出された可能性は低い。
【０１２２】
本発明者らはさらに、このｓｉＲＮＡが、組み込み後にウイルス産生を抑制することができるか否かを調査することによって、ｐ２４−ｓｉＲＮＡの影響を特徴付けた。具体的には、本発明者らは、ＨｅＬａ−ＣＤ４細胞にＨＩＶを感染させた４日後に、ｐ２４−ｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。感染の２日後に、本発明者らは、ｐ２４発現の平均蛍光強度を、１細胞当たりを基準にして評価した。図１１に示されるように、本発明者らは、８０〜９０％のＨＩＶ感染の状況において、ｐ２４発現の平均蛍光強度は、モックまたはコントロールのトランスフェクションと比較して、５０％低下したことを見出した。これらの結果は、ｓｉＲＮＡにより指示されたサイレンシングが、確立された感染の状況においてさえ、ウイルスの定常状態レベルを低減させ得ることを示唆する。
【０１２３】
宿主ゲノムへの組み込み前の、親ウイルスゲノムに対するトランスフェクトされたｓｉＲＮＡの任意の潜在的な影響をさらに排除するために、本発明者らは、潜在的に感染したＴ細胞クローン（ＡＣＨ２）（これは、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）刺激によって、高レベルの感染性ＨＩＶ−１を産生するように誘導され得る）をアッセイした。ＡＣＨ２細胞を、１０％の熱不活化ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ中で増殖させた。ＡＣＨ２細胞を、ｐ２４−ｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、次いで、１μｇ／ｍｌのＰＭＡでの処理によって誘導した。誘導の２日後、ｐ２４−ｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞の２３％と比較して、コントロール細胞の７０％が、ｐ２４を発現した（図１４）。
【０１２４】
（実施例４：ＨＩＶ遺伝子発現のｓｉＲＮＡサイレンシングの時間経過）
本発明者らはまた、ヒトＴ細胞株におけるウイルス感染性の時間過程を実施した。ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡを感染させたＨ９細胞に、Ｎｅｆ遺伝子がＧＦＰで置換されたＨＩＶ株（Ｐａｇｅ，Ａ．ら、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，１３，１０７７−１０８１（１９９７））を感染させた。トランスフェクションの２日後、ウイルスｐ２４およびＧＦＰタンパク質のレベルの低下が、検出された（図１２を参照のこと）。５日目までに、ＨＩＶタンパク質発現は、コントロール細胞よりもなお３分の１〜４分の１の低さであったが、トランスフェクションの９日後までに、ウイルス産生の阻害は、最小であった（図１２Ａを参照のこと）。同様に、培養物上清のｐ２４  ＥＬＩＳＡによって、感染５日後に、コントロール細胞と比較して、ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞によるウイルス産生が、約３分の１の低さであったことが明らかとなった。しかし、９日後に、ｓｉＲＮＡの保護効果は、もはや検出不能であった（図１２Ｂを参照のこと）。これらの結果は、遺伝子発現の阻害が感染後４８〜６０時間の間で最大であり、そして遺伝子発現の野生型レベルが９６時間目までに回復した（示さず）ので、ｓｉＲＮＡにより指示された最大の遺伝子サイレンシングの時間を超えたウイルス阻害を実証した。ウイルス遺伝子発現の延長したノックダウンは、複数回の感染におけるウイルス増幅の阻害と一致する。最大のウイルス遺伝子サイレンシングの点を超えた、細胞から遊離したウイルス力価の減少は、細胞への侵入時のウイルスゲノムの、または組み込まれたプロウイルスから転写されたウイルスｍＲＮＡの、ｓｉＲＮＡにより指示された分解を反映し得る。
【０１２５】
本発明者らは、Ｈ９細胞において観察された細胞から遊離したウイルス力価の減少（図１２Ｂ）が、ＨｅＬａ−ＣＤ４細胞において観察された減少（図１０Ｂ）よりも小さいことを注記する。ＨｅＬａ細胞におけるｓｉＲＮＡのトランスフェクション効率は、ＣＤ４レベルの減少によって測定する場合、１００％に近く、一方で、Ｈ９細胞におけるトランスフェクション効率は、約３０％である（データ示さず）。従って、増幅および再感染は、ＨｅＬａ−ＣＤ４細胞において効果的に低減されるが、Ｈ９細胞においては、約３分の２の細胞が、最初のウイルスに対してあまり保護されない；このような細胞は、子孫ウイルスの産生およびその後の再感染をなし得る。
【０１２６】
（実施例５：初代Ｔ細胞におけるＨＩＶ遺伝子発現の阻害）
ウイルス遺伝子発現の阻害をまた、初代Ｔ細胞において研究した。ＣＤ４＋芽細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を用いた免疫磁気選択によって、正常ドナーの末梢血リンパ球からＣＤ４＋Ｔ細胞を単離し、そしてこれらの細胞を、４μｇ／ｍｌのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）の存在下で、１５％のウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ  １６４０中で培養することによって、生成した。４日間ＰＨＡで活性化したＣＤ４＋細胞を、モック、ｐ２４−ｓｉＲＮＡまたはＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ（コントロールｓｉＲＮＡ）でトランスフェクトした。２４時間後、ＣＤ４＋芽細胞に、ＨＩＶＩＩＩＢを感染させた。細胞を、２日後に、ｐ２４発現（ｐ２４−ＲＤｌ）について、フローサイトメトリーによって分析した。図１５に示されるように、初代Ｔ細胞における、ｓｉＲＮＡによって指示されるサイレンシングによるウイルス遺伝子発現の阻害は、特異的であったが、ウイルス遺伝子発現のサイレンシングは、２倍と３倍との間にすぎなかった。これらの細胞における、低減したｓｉＲＮＡによって指示されるウイルス遺伝子サイレンシングは、サイレンシング機構のより低い効率、または細胞株と比較して、初代細胞におけるトランスフェクション効率の乏しさのいずれかを反映し得る。それにもかかわらず、これらの結果は、サイレンシング機構が、初代細胞において活性であり、そして初代細胞におけるウイルス遺伝子発現の阻害が、ｓｉＲＮＡを用いて達成され得ることを実証する。
【０１２７】
（等価物）
当業者は、本明細書中に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または慣用にすぎない実験を使用して、確認し得る。本発明の範囲は、上記の説明に限定されることを意図せず、添付の特許請求の範囲において示される。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１Ａ】図１Ａは、ＨＩＶビリオンの概略図を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＨＩＶビリオンの複製サイクルの概略図を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、ＨＩＶのゲノム構造を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＨＩＶゲノムから生成された転写物を示す。
【図３】図３は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ系において観察されたｓｉＲＮＡの構造を示す。
【図４】図４は、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａにおけるＲＮＡ干渉に関与する工程の概略図を示す。
【図５】図５は、本発明に従う使用に有用な種々の代表的なｓｉＲＮＡ構造を示す。
【図６】図６は、代替の阻害経路の概略図を示す。ここで、ＤＩＣＥＲ酵素は、幹（ステム）において塩基ミスマッチを有する基質を切断して、標的転写物の３’ＵＴＲに結合し、翻訳を阻害する阻害産物を生成する。
【図７】図７は、本発明のｓｉＲＮＡの両方の鎖の転写を指向するために使用され得る構築物の１つの例を示す。
【図８】図８は、本発明に従う一本鎖ｓｉＲＮＡの転写を指向するために使用され得る構築物の１つの例を示す。
【図９−１】図９は、ＣＤ４−ｓｉＲＮＡがＭａｇｉ−ＣＣＲ５細胞におけるＨＩＶの侵入および感染を阻害することを示す実験結果を示す。パネルＡは、Ｍａｇｉ−ＣＣＲ５細胞をモックトランスフェクトしたかまたはＣＤ４−ｓｉＲＮＡ、ＣＤ４−ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖のみ（ＣＤ４−ａｓＲＮＡ）もしくはＨＰＲＴ−ｓｉＲＮＡ（コントロールｓｉＲＮＡ）でトランスフェクトした後６０時間後のＣＤ４発現（ＣＤ４−ＰＥ）のフローサイトメトリ分析を示す。各パネルにおける細胞数は、門を通過したＣＤ４ポジティブ細胞の存在を示す。パネルＢは、コントロール（ＣＤ４ネガティブ）ＨｅＬａ細胞（レーン１）、モック（レーン２）トランスフェクト細胞、ＣＤ４−ｓｉＲＮＡ（レーン３）トランスフェクト細胞、ＣＤ４−ａｓＲＮＡ（レーン４）トランスフェクト細胞、およびコントロールｓｉＲＮＡ（レーン５）トランスフェクト細胞におけるＣＤ４発現についてのノザンブロットを示す。β−アクチンの発現を、ローディングコントロールとして使用した。パネルＣは、ＨＩＶ−１  ＮＬ４３（左）またはＢＡＬ（右）で感染した後２日後の、ＣＤ４−ｓｉＲＮＡ（レーン１）トランスフェクト細胞、ＣＤ４−ａｓＲＮＡ（レーン２）トランスフェクト細胞、およびコントロールｓｉＲＮＡ（レーン３）トランスフェクト細胞におけるβ−ｇａｌ発現を示す。コントロールｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞と比較した場合のＣＤ４−ｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞におけるβ−ｇａｌポジティブ細胞の数の減少は、ＨＩＶ−１  Ｔａｔによる内因性ＬＴＲ−β−ｇａｌ発現の減少したトランス活性化を示す。エラーバーは、２回の実験の平均である。パネルＤは、モックトランスフェクション、ＣＤ４−ｓｉＲＮＡトランスフェクション、ＣＤ４−ａｓＲＮＡトランスフェクション、またはコントロールｓｉＲＮＡトランスフェクション後に感染しなかったかまたはＨＩＶ−１  ＮＬ４３で感染した、β−ｇａｌ染色Ｍａｇｉ−ＣＣＲ５細胞の顕微鏡写真を示す。シンチウム形成およびＬＴＲ活性化は、コントロールと比較して、ＣＤ４−ｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞において減少する。
【図９−２】図９Ｅは、トランスフェクトＭａｇｉ−ＣＣＲ５細胞をＨＩＶ−１株ＮＬ４３（左）またはＢＡＬ（右）で感染した後２日後にＥＬＩＳＡにより測定した場合に、Ｃに記載されたサンプルからの無細胞ＨＩＶ産物のウイルスｐ２４抗原のレベルを示す。エラーバーは、２回の実験の平均である。パネルＦは、パネルＢに示されるノザンブロットの代替の洗浄を示す。このパネルの上部は、遺伝子サイレンシング後の転写物の定量に使用された低ストリンジェンシーの洗浄を示す。中央パネルは、ＣＤ４サイレンシングレーン付近のぼやけが非特異的であることを実証するために使用された同じブロットのより高いストリンジェンシーの洗浄である。
【図１０】図１０は、ｐ２４−ｓｉＲＮＡが、ＨｅＬａ−ＣＤ４細胞におけるウイルス複製を阻害することを実証する実験結果を示す。パネルＡは、ＨＩＶＩＩＩＢで感染した２日後の非感染細胞、コントロール細胞、ならびにモックトランスフェクトＨｅＬａ−ＣＤ４細胞、ｐ２４−ｓｉＲＮＡトランスフェクトＨｅＬａ−ＣＤ４細胞、ｐ２４−ｓｉＲＮＡ−アンチセンス鎖トランスフェクトＨｅＬａ−ＣＤ４細胞、およびＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ（コントロールｓｉＲＮＡ）トランスフェクトＨｅＬａ−ＣＤ４細胞におけるウイルス遺伝子発現（ｐ２４ＲＤ１）のｐ２４−ｓｉＲＮＡ指向性阻害のフローサイトメトリ分析を示し、阻害効果の特異性を実証している。パネルＢは、非感染（レーン１）トランスフェクト細胞、モック（レーン２）トランスフェクト細胞、ｐ２４−ｓｉＲＮＡ（レーン３）トランスフェクト細胞、ｐ２４−ｓｉＲＮＡ−アンチセンス鎖（レーン４）トランスフェクト細胞、およびコントロールｓｉＲＮＡ（レーン５）トランスフェクト細胞におけるｐ２４発現についてのノザンブロットを示す。ローディングコントロールとして、β−ｇａｌ発現を使用した。パネルＣは、ＨＩＶＩＩＩＢで感染した５日後の、非感染コントロールトランスフェクトＨｅＬＡ−ＣＤ４細胞、ならびにモックトランスフェクトＨｅＬＡ−ＣＤ４細胞、ｐ２４−ｓｉＲＮＡトランスフェクトＨｅＬＡ−ＣＤ４細胞、およびＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ（コントロールｓｉＲＮＡ）トランスフェクトＨｅＬＡ−ＣＤ４細胞におけるｐ２４発現（ｐ２４ＲＤ１）のフローサイトメトリ分析を示す。各パネルにおける細胞数は、門を通過したｐ２４細胞のパーセントを示す。パネルＢは、非感染コントロール（レーン１）トランスフェクト細胞、ならびにＨＩＶＩＩＩＢで感染したモック（レーン２）トランスフェクト細胞、ｐ２４−ｓｉＲＮＡ（レーン３）トランスフェクト細胞、およびコントロールｓｉＲＮＡ（レーン４）トランスフェクト細胞においてＥＬＩＳＡにより測定したウイルスｐ２４抗原のレベルを示し、ｐ２４−ｓｉＲＮＡトランスフェクトＨｅＬａ−ＣＤ４細胞においてのみ無細胞ウイルス産物が減少することを実証している。エラーバーは、３回の実験の平均を示す。パネルＣは、安定に感染したコントロール（レーン１）トランスフェクト細胞、非感染（レーン２）トランスフェクト細胞、モック（レーン３）トランスフェクト細胞、ｐ２４−ｓｉＲＮＡ（レーン４）トランスフェクト細胞、およびコントロールｓｉＲＮＡ（レーン５）トランスフェクト細胞におけるｐ２４発現、Ｎｅｆ発現、およびβ−アクチン発現につてのノザンブロットである。モックまたはコントロールｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞と比較して、ｐ２４−ｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞は、全長９．２Ｋｂ  ＨＩＶ転写物および／またはゲノムＲＮＡ、ならびに４．３Ｋｂおよび２．０Ｋｂ  Ｎｅｆ含有転写物の減少した発現を示した。ローディングコントロールとして、β−アクチン発現を使用した。
【図１１】図１１は、確立されたＨＩＶ感染内での、ＨｅＬａ−ＣＤ４細胞におけるウイルス遺伝子発現のｓｉＲＮＡ指向性ノックダウンを実証する。ＨＩＶＩＩＩＢによる感染の４日後、ＨｅＬａ−ＣＤ４細胞をモックトランスフェクトしたかまたはｐ２４−ｓｉＲＮＡもしくはＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ（コントロールｓｉＲＮＡ）でトランスフェクトし、そしてフローサイトメトリにより、ｐ２４発現（ｐ２４−ＲＤ１）について２日後に分析した。重ねたヒストグラムは、パネル１に示される非感染コントロールを示す。各パネルにおける細胞数は、ｐ２４を発現する細胞の平均蛍光強度を示す。
【図１２】図１２は、Ｈ９  Ｔ細胞におけるサイレンシングＨＩＶ遺伝子の発現およびウイルス複製の阻害のタイムコースを分析する実験結果を示す。パネルＡは、Ｎｅｆ領域に挿入されたＧＦＰを含有するＨＩＶで２４時間後に感染し、そしてトランスフェクションの２、５、および９日後に分析したモックＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ、またはＣＤ１９−ｓｉＲＮＡ（コントロールｓｉＲＮＡ）トランスフェクトＨ９細胞おけるｐ２４（ｐ２４−ＲＤ１）およびＧＦＰ発現フローサイトメトリを示す。各パネルにおける細胞数は、ｐ２４およびＧＦＰの両方の発現についてポジティブな細胞のパーセントを示す。パネルＢは、感染後２日、５日、および９日のモック（レーン１）、ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ（レーン２）、またはコントロールｓｉＲＮＡ（レーン３）のウイルスｐ２４  ＥＬＩＳＡ力価を示す。
【図１３】図１３は、生産性のＨＩＶ感染の阻害についてのＲＮＡ干渉の経路のモデルを示す。ウイルスレセプターに対して指向するｓｉＲＮＡは、標的細胞へのウイルス侵入を阻害する（工程１）。予め組み込まれたＨＩＶのサイレンシングは、組み込みを防止するために、ＨＩＶゲノムに直接ＲＩＳＣ複合体を標的化するｐ２４−ｓｉＲＮＡにより生じ得る（工程２）。さらに、ＨＩＶ子孫ウイルス産生は、組み込みプロウイルスから発現された全長ＨＩＶ遺伝子発現（ｍＲＮＡまたはゲノムＲＮＡ）をサイレンシングすることにより阻害され得る（工程３）。
【図１４】図１４は、ＨＩＶ組み込み後のウイルス遺伝子発現のｓｉＲＮＡ指向性サイレンシングを実証する実験結果を示す。ＡＣＨ２細胞をモックトランスフェクトし、そして誘導せずにおいたか、あるいはモックトランスフェクトしたか、またはｐ２４−ｓｉＲＮＡもしくはＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ（コントロールｓｉＲＮＡ）でトランスフェクトし、そしてＰＭＡで誘導した。サンプルを、フローサイトメトリにより、ｐ２４発現（ｐ２４−ＲＤ１）についての誘導の２日後に分析した。各パネルにおける数は、ｐ２４を発現する細胞のパーセントを示す。ｐ２４指向性ｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞についてはスケールが異なることに注意されたい。
【図１５】図１５は、一次Ｔ細胞におけるウイルス遺伝子発現のｓｉＲＮＡ指向性サイレンシングを実証する実験からの結果を示す。４日間ＰＨＡで活性化したＣＤ４＋細胞を、モックトランスフェクト、ｐ２４−ｓｉＲＮＡトランスフェクト、またはＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ（コントロールｓｉＲＮＡ）トランスフェクトした。２４時間後、ＣＤ４＋芽細胞をＨＩＶＩＩＩＢで感染させた。細胞を、フローサイトメトリにより、ｐ２４発現（ｐ２４−ＲＤ１）について２日後に分析した。各パネルにおける細胞数は、ｐ２４発現についてポジティブな細胞のパーセントを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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