(57)【要約】本発明は、エンティティ(例えば、抗原、粒子、又は放射性核種)へ結合することができ、エンティティを、動物の非角質上皮膜を通してデリバリーするために使用されるボツリヌス菌ＨＣのフラグメントに関する。このフラグメントは、例えば、ワクチン、解毒剤、及び抗毒素の製造に有用であり、動物による薬剤の急速な摂取を目的とする場合にも有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物の非角質上皮を通過してエンティティをトランスロケーションするための組成物であり、上記組成物はボツリヌス菌神経毒(BoNT)の重鎖(ＨＣ)のカルボキシ末端フラグメントへ結合しているエンティティを含有し、上記エンティティのサイズは上皮細胞の小胞の管腔容量を超えない組成物。
【請求項２】
上記BoNTはセロタイプＡ、Ｂ、及びＥのBoNTの群から選ばれる請求項１の組成物。
【請求項３】
上記フラグメントはボツリヌス菌神経毒(BoNT)のＨＣ分子量の約２％以上を含有する請求項１の組成物。
【請求項４】
上記フラグメントはボツリヌス菌神経毒(BoNT)のＨＣ分子量の約５％以上を含有する請求項１の組成物。
【請求項５】
上記フラグメントはボツリヌス菌神経毒(BoNT)のＨＣ分子量の約３０％以上を含有する請求項１の組成物。
【請求項６】
上記フラグメントはボツリヌス菌神経毒(BoNT)のＨＣ分子量の約５０％以上を含有する請求項１の組成物。
【請求項７】
上記フラグメントはボツリヌス菌神経毒(BoNT)のＨＣの約２０〜約５０(アミノ酸)残基を含有する請求項１の組成物。
【請求項８】
上記フラグメントはボツリヌス菌神経毒(BoNT)のＨＣの約３５以上のアミノ酸残基を含有する請求項１の組成物。
【請求項９】
上記フラグメントはボツリヌス菌神経毒のＨＣの約６０以上のアミノ酸残基を含有する請求項１の組成物。
【請求項１０】
上記フラグメントはβ−三葉型ドメイン及びレクチン結合ドメインから選ばれるドメインを含有する請求項１の組成物。
【請求項１１】
上記フラグメントは介在分子によりエンティティへ結合している請求項１の組成物。
【請求項１２】
上記介在分子はアビジン、抗体物質、及びビオチンの群から選ばれる請求項１１の組成物。
【請求項１３】
上記エンティティはペプチド結合によりフラグメントへ結合している請求項１の組成物。
【請求項１４】
上記エンティティはフラグメントのアミノ末端近くに結合している請求項１の組成物。
【請求項１５】
上記エンティティはフラグメントのアミノ末端へ結合している請求項１の組成物。
【請求項１６】
上記エンティティは超分子複合体である請求項１の組成物。
【請求項１７】
上記超分子複合体はマルチサブユニット蛋白質、フラグメントへ結合している蛋白質の１以上のサブユニット、である請求項１６の組成物。
【請求項１８】
上記エンティティはポリペプチドである請求項１の組成物。
【請求項１９】
上記ポリペプチドは、動物の病原体に関連する蛋白質の免疫原性部分である請求項１８の組成物。
【請求項２０】
上記病原体は、炭素菌、百日咳菌、ウシ流産菌、イヌ流産菌、マルタ熱菌、ブタ流産菌、ウェルチ菌、破傷風菌、ジフテリア菌、Ｑ熱リケッチア、クリミア−コンゴ出血熱ウィルス、野兎病菌、偽鼻疽菌、リシン、リフトバレー熱ウィルス、急性呼吸(窮迫)症候群(SARS)の原因物質であるコロナウィルス、サキシトキシン、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ、トリコセシンマイコトキシン、大痘瘡ベネズエラウマ脳炎ウィルス、及びコレラ菌の群から選ばれた請求項１９の組成物。
【請求項２１】
上記動物はヒトであり、上記病原体はボツリヌス菌神経毒である請求項１９の組成物。
【請求項２２】
上記エンティティは抗体物質である請求項１の組成物。
【請求項２３】
上記抗体物質はテトラサブユニット免疫グロブリン及び単鎖抗体の群から選ばれた請求項２２の組成物。
【請求項２４】
更に複数のエンティティを含有する請求項１の組成物。
【請求項２５】
上記動物は哺乳類である請求項１の組成物。
【請求項２６】
上記上皮は、肛門上皮、胃腸上皮、鼻上皮、眼性上皮、肺上皮、及び膣性上皮の群から選ばれる請求項１の組成物。
【請求項２７】
上記エンティティの分子量は約１０００ドルトン以下である請求項１の組成物。
【請求項２８】
上記エンティティの分子量は約３００ドルトン〜約５５０ドルトンである請求項１の組成物。
【請求項２９】
更にSEQ ID No：２０〜１６８及び１７０〜１８８のポリペプチドの群から選ばれる補体成分蛋白質を含む請求項１の組成物。
【請求項３０】
脊椎動物中で抗原に対する免疫反応を発現する組成物であり、上記組成物はボツリヌス菌神経毒(BoNT)のＨＣのカルボキシ末端フラグメントへ結合している抗原のエピトープの１以上を含有し、上記エピトープのサイズは上皮細胞の小胞の管腔容量を超えない組成物。
【請求項３１】
上記免疫反応は全身性免疫反応である請求項３０の組成物。
【請求項３２】
上記免疫反応は粘膜性免疫反応である請求項３０の組成物。
【請求項３３】
上記抗原は、炭素菌、百日咳菌、ウシ流産菌、イヌ流産菌、マルタ熱菌、ブタ流産菌、ウェルチ菌、破傷風菌、ジフテリア菌、Ｑ熱リケッチア、クリミア−コンゴ出血熱ウィルス、野兎病菌、偽鼻疽菌、リシン、リフトバレー熱ウィルス、急性呼吸(窮迫)症候群(SARS)の原因物質であるコロナウィルス、サキシトキシン、天然痘ウィルス、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ、トリコセシンマイコトキシン、大痘瘡ベネズエラウマ脳炎ウィルス、及びコレラ菌、の抗原から選ばれる請求項３０の組成物。
【請求項３４】
上記フラグメントはボツリヌス菌神経毒(BoNT)のＨＣ分子量の約２％以上を含有する請求項３０の組成物。
【請求項３５】
上記フラグメントはボツリヌス菌神経毒(BoNT)のＨＣ分子量の約５％以上を含有する請求項３０の組成物。
【請求項３６】
上記フラグメントはボツリヌス菌神経毒(BoNT)のＨＣ分子量の約３０％以上を含有する請求項３０の組成物。
【請求項３７】
上記フラグメントはボツリヌス菌神経毒(BoNT)のＨＣ分子量の約５０％以上を含有する請求項３０の組成物。
【請求項３８】
上記フラグメントはボツリヌス菌神経毒(BoNT)のＨＣの約２０〜約５０(アミノ酸)残基を含有する請求項３０の組成物。
【請求項３９】
上記フラグメントはボツリヌス菌神経毒(BoNT)のＨＣの約３５以上のアミノ酸残基を含有する請求項３０の組成物。
【請求項４０】
上記フラグメントはボツリヌス菌神経毒のＨＣの約６０以上のアミノ酸残基を含有する請求項３０の組成物。
【請求項４１】
脊椎動物中でボツリヌス菌神経毒に対して免疫反応を発現する組成物であり、ボツリヌス菌神経毒(BoNT)のＨＣのカルボキシ末端フラグメントを含有する組成物。
【請求項４２】
上記免疫反応は全身性免疫反応である請求項４１の組成物。
【請求項４３】
上記免疫反応粘膜性免疫反応である請求項４１の組成物。
【請求項４４】
上記フラグメントはボツリヌス菌神経毒(BoNT)のＨＣ分子量の約２％以上を含有する請求項４１の組成物。
【請求項４５】
上記フラグメントはボツリヌス菌神経毒(BoNT)のＨＣ分子量の約５％以上を含有する請求項４１の組成物。
【請求項４６】
上記フラグメントはボツリヌス菌神経毒(BoNT)のＨＣ分子量の約３０％以上を含有する請求項４１の組成物。
【請求項４７】
上記フラグメントはボツリヌス菌神経毒(BoNT)のＨＣ分子量の約５０％以上を含有する請求項４１の組成物。
【請求項４８】
ボツリヌス菌神経毒(BoNT)のＨＣのカルボキシ末端フラグメントへ結合した抗原を含有するワクチンであり、上記抗原が脊椎動物の循環系ヘデリバリーされた時に、上記抗原は脊椎動物中の病原体に対して感染防御免疫を発現するワクチン。
【請求項４９】
肛門、鼻、肺、眼、口及び膣経路の群から選ばれた経路によりヒトへ投与するために処方された請求項４８のワクチン。
【請求項５０】
複数の病原体への免疫性を発現する複数の抗原を含有し、それぞれの抗原はボツリヌス菌神経毒(BoNT)のＨＣのフラグメントへ結合している請求項４８のワクチン。
【請求項５１】
ボツリヌス菌神経毒(BoNT)のＨＣのカルボキシ末端フラグメントへ結合している抗原を含有するワクチンであり、上記抗原が脊椎動物の循環系ヘデリバリーされた時に、上記抗原は脊椎動物中でボツリヌス菌神経毒に対して感染防御免疫を発現するワクチン。
【請求項５２】
抗原が脊椎動物の非角質上皮へ接触する時に抗原に対する免疫反応を発現する組成物であり、ボツリヌス菌神経毒(BoNT)のＨＣのカルボキシ末端フラグメントへ結合している抗原のエピトープの１以上を含有する組成物。
【請求項５３】
動物の非角質上皮を通してエンティティをトランスロケーションする方法であり、エンティティのサイズは上皮細胞の小胞の管腔容量を超えず、上皮を、ボツリヌス菌神経毒(BoNT)のＨＣのカルボキシ末端フラグメントへ結合しているエンティティを含有する組成物と接触させることを含む方法。
【請求項５４】
上記BoNTはセロタイプＡ、Ｂ、及びＥのBoNTの群から選ばれる請求項５３の方法。
【請求項５５】
上記フラグメントはボツリヌス菌神経毒(BoNT)のＨＣ分子量の約２％以上を含有する請求項５３の組成物。
【請求項５６】
上記フラグメントはボツリヌス菌神経毒(BoNT)のＨＣ分子量の約５％以上を含有する請求項５３の組成物。
【請求項５７】
上記フラグメントはボツリヌス菌神経毒(BoNT)のＨＣ分子量の約３０％以上を含有する請求項５３の組成物。
【請求項５８】
上記フラグメントはボツリヌス菌神経毒(BoNT)のＨＣ分子量の約５０％以上を含有する請求項５３の組成物。
【請求項５９】
上記フラグメントはボツリヌス菌神経毒(BoNT)のＨＣの約２０〜約５０(アミノ酸)残基を含有する請求項５３の組成物。
【請求項６０】
上記フラグメントはボツリヌス菌神経毒(BoNT)のＨＣの約３５以上のアミノ酸残基を含有する請求項５３の組成物。
【請求項６１】
上記フラグメントはボツリヌス菌神経毒のＨＣの約６０以上のアミノ酸残基を含有する請求項５３の組成物。
【請求項６２】
上記フラグメントは介在分子によりエンティティへ結合している請求項５３の方法。
【請求項６３】
上記介在分子はアビジン、抗体物質、及びビオチンの群から選ばれる請求項６１の方法。
【請求項６４】
上記エンティティはペプチド結合によりフラグメントへ結合している請求項５３の方法。
【請求項６５】
上記エンティティはフラグメントのアミノ末端近くに結合している請求項５３の方法。
【請求項６６】
上記エンティティはフラグメントのアミノ末端へ結合している請求項５３の方法。
【請求項６７】
上記エンティティは超分子複合体である請求項５３の方法。
【請求項６８】
上記超分子複合体はマルチサブユニット蛋白質、フラグメントへ結合している蛋白質の１以上のサブユニット、である請求項５３の組成物。
【請求項６９】
上記エンティティはポリペプチドである請求項５３の方法。
【請求項７０】
上記ポリペプチドは、動物の病原体に関連する蛋白質の免疫原性部分である請求項６９の方法。
【請求項７１】
上記病原体は、炭素菌、百日咳菌、ウシ流産菌、イヌ流産菌、マルタ熱菌、ブタ流産菌、ウェルチ菌、破傷風菌、ジフテリア菌、Ｑ熱リケッチア、クリミア−コンゴ出血熱ウィルス、野兎病菌、偽鼻疽菌、リシン、リフトバレー熱ウィルス、急性呼吸(窮迫)症候群(SARS)の原因物質であるコロナウィルス、サキシトキシン、天然痘ウィルス、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ、トリコセシンマイコトキシン、大痘瘡、ベネズエラウマ脳炎ウィルス、及びコレラ菌の群から選ばれた請求項６９の方法。
【請求項７２】
上記動物はヒトであり、病原体はボツリヌス菌神経毒である請求項６９の方法。
【請求項７３】
上記エンティティは抗体物質である請求項５３の方法。
【請求項７４】
上記抗体物質はテトラサブユニット免疫グロブリン及び単鎖抗体の群から選ばれた請求項５３の方法。
【請求項７５】
更に複数のエンティティを含有する請求項５３の方法。
【請求項７６】
上記動物は哺乳類である請求項５３の方法。
【請求項７７】
上記組成物は更にSEQ ID No：２０〜１６８及び１７０〜１８８のポリペプチドの群から選ばれる補体成分蛋白質を含む請求項５４の方法。
【請求項７８】
脊椎動物中のエンティティに対する免疫反応を発現する方法であり、下記ステップを含む方法；
ａ)エンティティをボツリヌス菌神経毒(BoNT)のＨＣのカルボキシ末端フラグメントへ結合するステップ、但しエンティティのサイズは上皮細胞の小胞の管腔容量を超えない；及び
ｂ)フラグメント結合したエンティティを上皮と接触させるステップ。
【請求項７９】
上記脊椎動物はヒトである請求項７８の方法。
【請求項８０】
上記エンティティはヒト病原体の抗原である請求項７９の方法。
【請求項８１】
脊椎動物中でクロストリジウム神経毒(BoNT)に対する免疫反応を発現する方法であり、上記方法は組成物の脊椎動物の上皮への接触を含み、上記組成物はボツリヌス菌神経毒(BoNT)のＨＣのカルボキシ末端フラグメントへ結合したエンティティを含み、上記エンティティは抗原が脊椎動物の循環系ヘデリバリーされた時に、脊椎動物中のボツリヌス菌神経毒に対して感染防御免疫を発現する抗原である方法。
【請求項８２】
脊椎動物の血流へエンティティを急速にデリバリーするための医薬組成物であり、上記組成物はボツリヌス菌神経毒(BoNT)のＨＣのカルボキシ末端フラグメントへ結合したエンティティを含み、肺投与用に配合されている組成物。
【請求項８３】
脊椎動物の血流へエンティティを急速にデリバリーするための医薬組成物であり、上記組成物はボツリヌス菌神経毒(BoNT)のＨＣのカルボキシ末端フラグメントへ結合したエンティティを含み、経口投与用に配合されている組成物。
【請求項８４】
その食品成分のゲノムはボツリヌス菌神経毒のＨＣのカルボキシ末端フラグメントへ結合した、治療用又は免疫原性ポリペプチドを含有する蛋白質を発現的にエンコードするポリヌクレオチドを含有する食品。
【請求項８５】
ボツリヌス菌神経毒のＨＣのカルボキシ末端フラグメントへ結合した免疫原性ポリペプチドを含有するトランスロケーション用ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願のクロスリファレンス
本出願は米国予備特許出願番号第６０／３８４９４９号、２００２年５月３１日出願に対する合衆国法典第３５巻第１１９条(ｅ)に基づく優先権を主張し、それらの内容をここで資料として使用する。
連邦政府による援助研究又は開発に関する記載
この研究の一部は米国政府資金により支援された(国立衛生研究所認可番号第ＧＭ０５７３４２号)。
【背景技術】
【０００２】
ボツリヌス菌毒素は、ヒト及び他の動物(例えば、他の哺乳類、爬虫類、鳥類、及び両生類)のボツリヌス中毒及び他の機能障害の原因物質である。この薬品の病理学的効果は、消化管及び気道上皮を通過して全身循環系へ入ることの出来る神経毒により仲介される。一旦循環系中に入ると、ボツリヌス菌神経毒(BoNT)は神経筋接合部のシナプス前膜へ結合して、後ニューロン細胞質ソルへ入り込むことができる。細胞質ソル中で、BoNTはアセチルコリンのニューロン放出を神経筋接合部でブロックし、筋肉の弛緩性麻痺を引き起こす。
BoNTは約１５０キロドルトンの分子量を有する単鎖不活性プロポリペプチドとして合成される。不活性プロ−BoNTは内因性又は外因性蛋白質分解酵素により、プロ−BoNTの蛋白質分解開裂により活性化される。不活性BoNTプロペプチドの開裂(ニッキング)は２個のポリペプチド鎖(重鎖(ＨＣ)及び軽鎖(ＬＣ))を産出する。ＨＣ及びＬＣは通常、動物細胞の内部に存在するような還元条件下で切断されることのできるジスルフィド結合により結合している。
いくつかの種類のクロストリジウムが現在BoNT毒素を生産することが知られており、例えば、ボツリヌス菌、Ｆ型毒素産生菌(Cl.baratii)、Ｅ型毒素産生菌(酪酸菌、Cl. butyricum)が挙げられる。
【０００３】
BoNTは、現在７個の免疫学的に異なる形態(セロタイプ)、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧとして産出されることが知られている。実際、それぞれのセロタイプは、下記２種類の蛋白質(以下、「補体成分蛋白質」ともいう。)と共にクロストリジウムから放出される。：(ｉ)赤血球凝集素(ＨＡ)ファミリー及び(ｉｉ)単一の、非毒素、非赤血球凝集素蛋白質(NTNH)。
BoNTは、消化管、肺、及び他の上皮膜を通り抜けて、血流に進入出来ることが知られている。血流中で、BoNTは神経筋接合部のニューロンへ入り込むことができ、そこで毒素はその特徴的作用を発現できる。
一部又は全てのＬＣが上皮膜を通過するために削除され変形されるBoNT分子の能力は文献に記載されている(例えば、米国特許第６０５１２３９号)。しかし、これら分子は、種々の理由で実用的でないことが明らかな(変形を受けていない)完全な形のＨＣの産出又は単離を必要とした。BoNTのフラグメントを使用してボツリヌス中毒を予防するための注射可能なワクチンの製造も試みられた。しかし、上皮を通過するトランスサイトーシス可能な、ボツリヌス中毒を予防できるワクチンは未だ報告されていない。
【特許文献１】米国特許第６０５１２３９号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上皮経由で動物体内への、抗原、薬剤、造影剤、放射性核種及び他の試薬をデリバリーするための改良された組成物及び方法が求められている。本発明は、動物上皮膜を通してエンティティをデリバリーするための組成物及び方法を提供して、この要求を少なくとも一部は満たすことができる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、ボツリヌス菌神経毒(BoNT)のＨＣのカルボキシ末端フラグメントは、動物の上皮膜を通過する能力を有する知見を基礎にしている。驚くべきことに、BoNTのＨＣのフラグメントは、エンティティがフラグメントへ結合した時に、広い範囲のエンティティの経上皮輸送を仲介出来ることが、更に発見された。従って、本発明はBoNTのＨＣ(以下「ＨＣ」ともいう。)のカルボキシ末端フラグメントへ結合したエンティティを含有する組成物に関する。本発明は又、それら組成物を使用する方法に関する。
特に、本発明は、動物の非角質上皮を通過してエンティティをトランスロケーションするための組成物を提供する。上記組成物は、BoNTのＨＣのカルボキシ末端フラグメントへ結合したエンティティを含有する。上記エンティティのサイズは、好ましくは上皮細胞の小胞の管腔容量を超えない。本発明の組成物で使用される任意のエンティティは、実際には免疫原性、治療用、及び／又は診断用でもよい。
【０００６】
例えば、本発明の範囲内には、脊椎動物中で抗原に対する(粘膜性又は全身性)免疫反応を発現する組成物が含まれる。これら組成物はBoNTのＨＣのカルボキシ末端フラグメントへ結合した抗原のエピトープの１以上でもよい。エピトープのサイズは、好ましくは上皮細胞の小胞の管腔容量を超えない。
例えば、本発明はBoNTのＨＣのカルボキシ末端フラグメントへ結合した抗原を含むワクチンでもよく、上記抗原が脊椎動物の循環系ヘデリバリーされた時に、上記抗原は脊椎動物の病原体に対して感染防御免疫を発現する。例えば、上記ワクチンはBoNTのＨＣのカルボキシ末端フラグメントへ結合した抗原を含有してもよく、上記抗原が脊椎動物の循環系ヘデリバリーされた時に、抗原は脊椎動物のボツリヌス菌神経毒に対して感染防御免疫を発現する。
【０００７】
本発明では又、動物の非角質上皮を通してエンティティをトランスロケーションする方法が提供される。上記方法は上皮と、BoNTのＨＣのカルボキシ末端フラグメントへ結合したエンティティを含有する組成物との接触を含み、上記エンティティのサイズは上皮細胞の小胞の管腔容量を超えない。
同様に本発明で提供されるのは、脊椎動物中のエンティティに対する免疫反応を発現する方法である。この場合、上記方法は下記ステップを含む；
ａ)エンティティをBoNTのＨＣのカルボキシ末端フラグメントへ結合するステップ、但しエンティティのサイズは上皮細胞の小胞の管腔容量を超えない；及び
ｂ)フラグメント結合したエンティティを上皮と接触させるステップ。
BoNTのＨＣのカルボキシ末端フラグメントへ結合したエンティティを含有する医薬組成物も又、本発明の方法及び／又は組成物で使用できる食品及びトランスロケーション用ポリペプチドと同様に、本発明としてここで記載される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
上皮膜を通過するBoNT(ホロトキシン)のトランスロケーションは、BoNTの上皮細胞の膜への結合、細胞膜の陥入による細胞の小胞内へのBoNTの封入、細胞の一方から他方への(例えば、細胞の頂端面(apical face)からその基底面(basolateral face)へ、又はその反対)小胞のトランスロケーション、細胞膜への小胞の再統合及び細胞からのBoNTの放出、により起こると思われている。いくつかのＨＣのカルボキシ末端フラグメントは、上皮細胞の細胞質ソルへ入らずに上皮膜を通過して輸送(即ち、トランスサイトーシス；経細胞輸送)する能力を、天然分泌性BoNTへ与えることが発見された。特に、本発明者は約２キロドルトン程度の小さいＨＣカルボキシ末端フラグメントは、上皮細胞通過能を有し、１０００ドルトン以上の大きいサイズのエンティティが上皮膜を通過するために使用できることを発見した。
カルボキシ末端ＨＣフラグメントへ結合したエンティティの性質は、フラグメントの細胞通過能に大きく影響を及ぼさない。実質的にはどの種類のエンティティでもこの方法で輸送でき、この方法は上皮小胞のサイズ収容能力及び、エンティティをＨＣフラグメントへ結合する実施者の能力にのみ限定される。
【０００９】
本発明には、動物の非角質上皮を通過してエンティティをトランスロケーションするための組成物も含まれる。上記組成物は、カルボキシ末端ＨＣフラグメントへ結合したエンティティを含有する。好ましくはエンティティのサイズは上皮細胞の小胞の管腔容量を超えない。上皮は非角質上皮であり、好ましくは腎臓上皮ではない。フラグメント結合した単数又は複数のエンティティは、種々の他の成分(医薬的に許容できるビヒクル、通常活性ボツリヌス菌神経毒に付随する防御補体成分蛋白質(抗体)ＨＡ及び／又はNTNH、充填剤及び／又は医薬品に通常使用される他の構成詩成分等)と共に、懸濁又は混合することが出来る。
【００１０】
ここで使用される用語「ボツリヌス菌神経毒のＨＣのカルボキシ末端フラグメント」又は「カルボキシ末端ＨＣフラグメント」は、いずれかのセロタイプ(例えば、SEQ ID No：１−７の重鎖)のBoNTの完全長ＨＣのアミノ酸配列のフラグメントを意味し、そのフラグメントは、カルボキシ末端を含有する完全長ＨＣアミノ酸配列の半分を形成する配列の少なくとも一部を含む。従って、本発明に使用されるカルボキシ末端フラグメントは完全長ＨＣより短い。フラグメントは、例えば完全長ＨＣの１以上のアミノ酸残基を除外(exclude)し、好ましくは完全長ＨＣの５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、又は４００以上の残基を除外する。好ましくは、除外された残基の多くは完全長ＨＣのアミノ末端を含む完全長配列の半分で発生するものである。それにも拘らず、フラグメントの例として、５、１０、１５、２５、５０以上のアミノ酸残基が同様にカルボキシ末端を含有する完全長ＨＣの半分から除外されたものも検討された。
【００１１】
例えば、本発明のカルボキシ末端ＨＣフラグメントは、ボツリヌス菌神経毒のＨＣの約６０残基を含有し、好ましくはフラグメントはボツリヌス菌神経毒のＨＣの約３５残基を含有し、更に好ましくはフラグメントはボツリヌス菌神経毒のＨＣの２０〜約５０アミノ酸残基を含有する。
一方、好ましくは、カルボキシ末端ＨＣフラグメントは、BoNTの完全長ＨＣのアミノ酸配列の(分子量で)２％以上であるアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、上記フラグメントはアミノ末端で開始される完全長ＨＣの目的としない部分の(即ち、図１のセロタイプＡ中の残基４６８で開始される)切除／削除により得られる。更に好ましくは、カルボキシ末端ＨＣフラグメントは、BoNTの完全長ＨＣのアミノ酸配列の、(分子量で)約５％以上、約３０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、及び約９０％以上を含有する部分のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００１２】
例えば、ここで「８８ｋＨＣ」(BoNT ＨＣの８８キロドルトンカルボキシフラグメント)、「６６ｋＨＣ」(BoNT ＨＣの６６キロドルトンカルボキシフラグメント)、及び「５０ｋＨＣ」(BoNT ＨＣの５０キロドルトンカルボキシフラグメント)で表される、カルボキシ末端ＨＣフラグメント、セロタイプＡは、完全長BoNT ＨＣ配列の一部の、それぞれ約８０％以上、約７０％以上、及び約５０％以上のアミノ酸配列を有するポリペプチドであるカルボキシ末端ＨＣフラグメントである。
本発明に使用されるカルボキシ末端ＨＣフラグメントは、公知のいずれかのBoNTセロタイプ(例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧのいずれか)のＨＣ又は次に発見されるいずれかのBoNTセロタイプから誘導できる。好ましくは、カルボキシ末端ＨＣフラグメントは、組成物が投与される動物として同種の動物で病原性であることが公知であるセロタイプ(例えば、ヒトに対するセロタイプＡ、Ｂ、及びＥ)から誘導できる。しかし、選択されたフラグメントが、その動物中に細胞通過能を保有するために所定の動物においては通常は病原性を示すセロタイプから得られなければならない必要はない。
【００１３】
特定のセロタイプから得られるカルボキシ末端フラグメントＨＣ、又は特定のアミノ酸配列を有するフラグメントの本発明での使用適用性は、普通の科学的プロトコルを使用して経験的に評価でき、例えば、投与が意図され、経上皮輸送が観察され、評価される同じ(細胞)種及び(動物)種の細胞と、フラグメントが接触するモデルシステムが使用できる。
【００１４】
全てのフラグメントが全ての(動物)種の全ての上皮細胞種中で最大限に効率の良いトランスサイトーシスを示すとは限らないことが示された。例えば、本発明の開示例として記載された実験は、BoNT ＨＣ、及び／又はセロタイプＡ及びＢのフラグメントが、所定の細胞種(MDCK)のイヌ腎臓上皮膜を高い効率では通過しないことが示された。しかし、特定の(動物)種の特定の上皮細胞種を通過する高度に顕著な細胞通過能の特徴を有さない本発明の一例がある事実は、本発明の組成物及び方法の有効性を損なわない。
【００１５】
好ましくは本発明の方法で使用されるカルボキシ末端ＨＣフラグメント及び本発明の組成物は、細胞膜へ結合する毒素の能力の原因であるＨＣの部分を少なくとも有する。例えば、フラグメントは、β−三葉型ドメイン及び／又は関連するレクチン結合ドメインを含有してもよい。又、カルボキシ末端ＨＣフラグメントは、通常の結合アッセイにより経験的に確認されるとおり、天然ＨＣと同一の結合性を有するＨＣの擬ペプチドを含有してもよい。
【００１６】
カルボキシ末端ＨＣフラグメントへ結合したエンティティの本質又は性質は、上皮表面を通過してトランスロケートさせたいどのようなエンティティでもよい。カルボキシ末端ＨＣフラグメントへ結合された単数又は複数のエンティティは、エンティティのサイズが組成物が投与される細胞の小胞の管腔容量を超えない限り、実質的にどのようなサイズでもよい。好ましくは、BoNT ＨＣフラグメントへ結合された所定の単数又は複数のエンティティは、分子量が約数百ドルトン(約１００ドルトン〜約２００ドルトン)から約数万ドルトン(約１００００ドルトン〜約４００００ドルトン)である。更に好ましくはエンティティは約１０００ドルトン以下の分子量を有し、最も好ましくはエンティティは約３００ドルトン〜約５５０ドルトンの分子量を有する。又、エンティティの分子量は、数十万、数百万、又は数千万ドルトン以上でもよい。従って、非常に大きな超分子複合体(例えば、リポソーム又はウィルスベクター)の経上皮輸送も本発明で意図される。
【００１７】
本発明のカルボキシ末端ＨＣフラグメントへ結合できる適切なエンティティとして例えば、有機的又は無機材料(例えば、セラミック粒子)、小さな有機又は無機化学的化合物(テトラフルオロエチレンポリマー、キトサン)、ポリペプチド(例えば、酵素、抗体、及び病原体のポリペプチドエピトープ等のシングル−及びマルチ−サブユニット蛋白質を含む。)、核酸、及び核酸ベクター(例えば、発現可能な核酸を含有するウィルスベクター)、の粒子が挙げられる。
【００１８】
エンティティは例えば、動物の病原体の免疫原性エピトープを含有してもよい。カルボキシ末端ＨＣフラグメントへ結合した免疫原性エピトープを有する組成物は、エピトープの動物の血流へのデリバリーを促進し、その結果エピトープに対する免疫応答の発現を誘起する。免疫原性エピトープは蛋白質でも非蛋白質でもよい。有機された免疫応答は、その後、動物中で病原体により引き起こされる病理を阻止し、予防することができる。適切なエピトープが獲得される非蛋白質抗原として炭水化物及び核酸が挙げられる。
【００１９】
従って、本発明の組成物は例えば、カルボキシ末端ＨＣフラグメントが結合されたエンティティが免疫原性である場合、哺乳類、爬虫類又は魚類等の脊椎動物中の感染防御免疫発現用のワクチンとして有用である。本発明の組成物及び方法は、実質的にはいずれのヒト又は他の脊椎動物の、当分野で公知又は開発された生物戦の薬剤として兵器化でき、使用できる病原体等の病原体(ウィルス性、細菌性、プリオン)、に対するワクチン接種として使用できる。
【００２０】
例えば、本発明の組成物が処方されるワクチンが対象とする病原体として、熱帯熱マラリア原虫(マラリアの原因物質)、百日咳菌(百日咳の原因物質)、麻疹ウィルス、おたふく風邪ウィルス、風疹ウィルス、インフルエンザウィルス、肝炎ウィルス、肺炎球菌ウィルス、水痘ウィルス、狂犬病ウィルス、及びヒト免疫不全性ウィルスが挙げられる。更に、エンティティとして使用するための免疫原性エピトープは、例えば、炭素菌(炭素の原因物質)、偽鼻疽菌、ボツリヌス菌毒素(ボツリヌス中毒の原因物質)、ペスト菌(ペストの原因物質)、コレラ菌、大痘瘡(天然痘の原因物質)、野兎病菌(野兎病の原因物質)、ウィルス性出血熱の原因物質であるウィルス(例えば、クリミア−コンゴ出血熱ウィルス)、ジフテリア菌、Ｑ熱リケッチア(Ｑ熱の原因物質)、ブルセラ菌属の微生物(例えば、ウシ流産菌、ブタ流産菌、マルタ熱菌、イヌ流産菌)(ブルセラ症の原因物質)、サキシトキシン、つち骨類鼻疽菌(鼻疽の原因物質)、ヒマのリシン毒素、ウェルチ菌のイプシロン毒素、破傷風菌、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ、ニパウィルス、ハンタウィルス、リフトバレー熱ウィルス、ダニ媒介脳炎の原因物質であるウィルス、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ、トリコセシンマイコトキシン、黄熱病の原因物質、多剤耐性結核の原因物質、及び急性呼吸(窮迫)症候群(SARS)の原因物質であるコロナウィルス等の病原体に対する免疫反応を発現するために選択できる。本発明のエンティティである免疫原性エピトープは又、昆虫又は爬虫類毒及び種々の寄生虫に対する免疫性を発現するエピトープでもよい。
【００２１】
単数又は複数のエンティティは、組成物が投与された動物の血流中で別の分子と特異的に結合できる分子を含有してもよい。これらエンティティとして、本発明を制限するものではないが、テトラサブユニット免疫グロブリン及び単鎖抗体等の抗体物質、並びに受容体−リガンド結合対の個々のメンバー又はフラグメント(例えば、腫瘍壊死因子アルファ及びその細胞−表面受容体)が挙げられる。「抗体物質」とは、免疫グロブリン分子又は免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、即ち、抗原と特異的結合をする抗原結合サイト、を有する分子を意味する。抗原と特異的結合をする分子は、抗原と結合するが他の分子と実質的に結合しない分子である。免疫グロブリン分子の免疫学的活性部位の例として、抗体をパパイン又はペプシン等を酵素で処理することにより得られるそれぞれＦ(ａｂ)及びＦ(ａｂ’)2フラグメントが挙げられる。この用語は又、ポリクローナル及びモノクローナル抗体を含む。用語「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」は、特別なエピトープと免疫応答できる部位に結合しているただ１種類の抗原を含有する抗体分子の母集団を言う。
【００２２】
又、他の重要な例として、エンティティは、in vivoで触媒活性又は生物活性を示す試薬でもよい。これら試薬の例として、リシン等の細胞毒素；蛋白質分解酵素(例えば、組織型プラスミノゲン・アクチベータ又はウロキナーゼ型プラスミノゲン・アクチベータ)等の酵素；及び酵素阻害物質が挙げられる。エンティティは又、造影剤、放射性標識化した抗体物質、又は3Ｈ、35Ｓ、123Ｉ、及び／又は131Ｉ等の放射性同位元素等の検出可能な標識でも良い。
結合されたエンティティは、多数のより小さな治療用又は免疫原性試薬を封入又は取り込むようなより大きなエンティティであることが好ましい。例えば、多数のより小さい治療用、診断用又は免疫原性試薬を輸送するために使用できるエンティティとして、リポソーム、再封入したＲＢＣ、ミセル、ミクロスフィア、及び微粒子が挙げられる。
【００２３】
本発明の組成物中、任意の１又は複数のエンティティは、任意のカルボキシ末端ＨＣフラグメントへ結合してもよい。シングルフラグメントは同一又は異なる１以上のエンティティへ結合してもよい。又、シングルエンティティが、複数のフラグメント(それぞれは同一又は異なる。)と結合してもよい。
エンティティは、フラグメントの細胞通過能が非常に損なわれない限り、どの位置のカルボキシ末端ＨＣフラグメントへ結合してもよい。例えば、エンティティはフラグメントのカルボキシ末端またはその近傍へ結合してもよい。好ましくはエンティティは、フラグメントのアミノ末端又はその近傍へ結合される。
【００２４】
リンカーの実体は、様々でよい。結合に使用される詳細な化学的手法、リンカー又は方法、エンティティ及びBoNT ＨＣフラグメントの種類等のは、重要な要素ではない。結合は単に、上皮細胞によるフラグメントの小胞カプセル化において、フラグメントがエンティティから分離しないような充分な強度があるか弾力性がある必要がある。エンティティ及びフラグメントは例えばペプチド結合等の共有結合により結合されてもよい。しかし、強い非共有結合も又、使用できる。
又、リンカーは介在分子でもよく、その介在分子はその結合機能と共に化学的、治療用又は診断用機能を有しても有さなくても良い。リンカーとして使用できる介在分子の例として、ビオチン、アビジン、又は抗体物質が挙げられる。この種のリンカーは、エンティティ及びフラグメントの間に介在できる。
【００２５】
任意の単数又は複数のエンティティがペプチド又はポリペプチドの場合、エンティティは任意のフラグメントへペプチド結合により結合されて、エンティティ及びフラグメントを含有する一体化したポリペプチドを形成しても良い。例えば、カルボキシ末端ＨＣフラグメント及び任意のエンティティの両方を含有するように一体化したポリペプチドを調製できる。これらポリペプチドは、組み換え型発現ベクターからの融合ポリペプチドの発現により、又は例えば、固相方法等の化学的合成により、当分野で公知又は開発されたどのような方法ででも製造できる。
エンティティは又、エンティティそれ自身の中へフラグメントを組み込むことにより結合されてもよい。例えば、エンティティがリポソームの場合、フラグメントは、フラグメントの細胞通過機能部位が損なわれない状態でフラグメントの部分がリポソームの構造内に貫通し留まることが可能な特定のドメインを含む。
【００２６】
最終組成物を使用した、目的とする使用／投与経路に応じて、本発明の方法は化学的又は生物学的に不安定であるか可逆的手段でエンティティ及びフラグメントを結合する場合にも使用できる。例えば、その結合は、患者へ共投与された酵素により、又は組成物がデリバリーされる解剖学的域中に存在する公知のものにより、酵素開裂可能でもよい。又、１以上のジスルフィド結合が使用されてもよい。
エンティティ及びフラグメントは分離して調製されてから結合されてもよく、同時に調製されてもよい。
【００２７】
例えば、本発明の組成物はボツリヌス菌毒素に対するワクチンでもよく、ワクチン中ではエンティティ及びカルボキシ末端ＨＣフラグメントは内在性ポリペプチド分子として存在し、その場合リンカーはペプチド結合である。この本発明の例では、カルボキシ末端ＨＣフラグメント／エンティティ内在性ポリペプチド分子は、ワクチンの対象である動物中の免疫反応を発現する免疫原性エピトープをエンコードする完全長BoNTの配列の部分を、少なくとも含有する。
【００２８】
使用されるエンティティのエピトープ又は特定のタイプに関係なく、引き起こされる免疫反応は、全身性免疫反応又は粘膜性免疫反応でもよい。本発明の組成物及び方法が適用される状況に応じて、特にそれに対して免疫性が発現されるべき抗原が有益及び有害／毒性のいずれの態様でも使用できる場合、全身性応答よりはむしろ粘膜性免疫反応を発現することが望ましい。
【００２９】
例えば、ボツリヌス菌毒素が生物戦又は生物テロの薬品として使用できる毒素であることは公知である。従って、本発明の組成物及び方法をボツリヌス菌毒素に対して使用する免疫手段が求められている。しかし、ボツリヌス菌毒素はアセチルコリンの過剰かつ不随意の放出により特徴つけられる機能障害を治療する治療薬として、通常使用されている。従って、ボツリヌス菌毒素への全身性免疫性を有する個体(患者)は、その後実質的にボツリヌス菌毒素治療の恩恵を受けることができない。
【００３０】
実質的には粘膜性免疫性のみを発現してこの問題を避けることのできるワクチンである本発明の組成物は、本発明のワクチン及び、実質的には粘膜性免疫性のみを選択的に発現するアジュバントを含有する組成物を使用して調製できる。このようなアジュバントとして、例えば、コレラ毒素Ｂサブユニット又は非メチル化オリゴヌクレオチドが挙げられる。アジュバントは、フラグメント結合した抗原又はフラグメント自体へ強く又は弱く結合してもよく、アジュバントが動物へ共投与されてもよい。
又、本発明のワクチンは動物中で実質的に粘膜性免疫性のみを発現するように調製でき、ワクチンはその動物へ、本発明の組成物中に粘膜性免疫反応を促進し、及び／又は全身性免疫反応を抑制するシグナル分子を含有させて投与される。これらシグナル分子として、インターロイキン又はトランスフォーミング増殖因子が挙げられる。シグナル分子は、フラグメント結合した抗原へ強く又は弱く結合しても、フラグメント自体でもよく、又、本発明の組成物と一緒に動物へ共投与してもよい。
【００３１】
本発明の組成物及び方法を使用する場合、多くの場合本発明の組成物の経上皮輸送は、一定方向に(即ち、上皮の頂端面から基底面へ、又は基底面から頂端面へ)行われる。トランスサイトーシスの効率は、脊椎動物の種類、選択された特定の上皮、及び／又は他の化学的又は生理学的因子に応じて変化するが、選択される上皮は公知のいずれのものでもよい。例えば、所定のイヌ腎臓上皮細胞培養物中で、セロタイプＡ及びＢのＨＣのカルボキシ末端フラグメントを使用した輸送は効率が良くない。従って、腎臓上皮は好ましくないことが示された。
エンティティ結合したカルボキシ末端ＨＣフラグメントにより通過される上皮は、好ましくは非角質であるか非角質化されたものである。皮膚以外の多くの上皮は通常非角質である。しかし、皮膚組織の脱角質化又は部分可溶化は、本発明の組成物及び方法の経皮使用を可能とする。一般的に適切な上皮の例として、消化器系(例えば、口、食道、胃、回腸、十二指腸、空腸、結腸、及び肛門)、鼻、肺、膣、及び眼性上皮が挙げられる。本発明の組成物の腹膜投与により(組成物が)到達する上皮も又、適切である。
【００３２】
広い種類の動物がボツリヌス菌による感染又は転移増殖に罹患する。本発明の組成物及び方法はこれら動物に好ましく適用される。従って、本発明の組成物は、好ましくは実質的に全ての脊椎動物で使用され、昆虫等の無脊椎動物における生理学的応答も発現する。
本発明の組成物及び方法が対象とする動物の種類の１種はヒトである。ヒト用には、Ａ、Ｂ、及びＥセロタイプの完全長ＨＣに由来するカルボキシ末端ＨＣフラグメントの使用が好ましい。更に、全てのBoNTセロタイプからの多くのフラグメントが家庭愛玩動物及び農場家畜等の通常の動物で使用できる。従って、本発明の医薬的用途に類似する獣医学的使用も本発明の範囲内である。
【００３３】
当業者に理解されるとおり、特定の動物の上皮を通過するトランスサイトーシスへのフラグメントの能力は、フラグメントの主要配列、それに結合されたエンティティの種類／性質、フラグメントが由来するBoNTのセロタイプ等の種々の因子に応じて変化できる。例えば、セロタイプＣに由来するフラグメントは、ヒトで最も効率の良い経上皮デリバリーを示さないかもしれないが、非ヒト動物で比較的効果的な効率の良いデリバリーを促進するために使用できる。
【００３４】
この(動物)種により異なる能力は、(毒剤であるエンティティと共にヒト上皮を通過してトランスサイトーシスしないフラグメントを結合することにより)病虫菌予防用及び、殺虫目的のための本発明の組成物の使用を促進する。適切な病虫菌予防剤又は殺虫剤は、ヒトに対するよりも病虫菌又は害虫に対するより大きな有毒性を示し、多くの現在入手可能なものよりもより安全な病虫菌予防剤又は殺虫剤を製造するために使用できる。これらの試薬は、ヒトへの暴露が避けられない環境下(例えば、児童用設備又は食品製造設備等の状況)で特に有益である。
【００３５】
本発明には又、食品が含まれ、その場合、食品成分のゲノムがカルボキシ末端ＨＣフラグメントへ結合した、免疫原性又は治療用ポリペプチドを含有するキメラ蛋白質を発現的にエンコードするポリヌクレオチドを含有するように設計されている。必要であれば、キメラ蛋白質は又、１以上の補体成分蛋白質(ＨＡ又はNTNH；SEQ ID NO：２０〜１６８及び１７０〜１８８)、又は他の蛋白質又はポリペプチドを含有するように設計されてもよい。
【００３６】
このように遺伝学的に改変されることのできる成分の例として、バナナ、ジャガイモ、ほうれん草、大豆、及びトマトが挙げられる。成分は、ヒトへ別々に投与でき(例えば、加熱していない組み換え型バナナ、トマト、又はジャガイモの経口摂取により)、又、成分は、成分を含有する調理済み食品へ組み合わせることもできる(例えば、組み換え型バナナ片を含有するフルーツサラダ)。
【００３７】
本発明は、それにエンティティが活性成分として結合されたカルボキシ末端ＨＣフラグメントを含有する薬物及び医薬的又は獣医学的組成物の調製及び使用を含む。これら医薬組成物は、被検体投与用の適切な形態の、結合された活性成分のみから構成されても良い。又、医薬組成物は、結合された活性成分及び１以上の医薬的に許容できるビヒクル、１以上の追加的成分、又はこれらの幾つかの組み合わせを含有してもよい。被検体へのこれら医薬組成物の１種の投与は、本明細書の開示のいずれかに記載された被検体中の種々の機能障害のいずれかを、治療し、回復し、緩和し、それに対する免疫反応を引き起こし、予防し、抑制し、又は軽減するために有用である。活性成分は、当分野で公知のように生理学的に許容できるカチオン又はアニオンと組み合わせるような、生理学的に許容できるエステル又は塩の形で医薬組成物中に存在できる。
【００３８】
ここで使用される用語「医薬的に許容できるビヒクル」は、それと活性成分を組み合わせることができ、その組み合わせの後、活性成分を被検体へ投薬するために使用できる化学的組成物を意味する。
ここで使用される用語「生理学的に許容できる」エステル又は塩は、医薬組成物の他の成分のいずれとも親和性があり、組成物が投与される被検体に有毒でない活性成分のエステル又は塩形状を意味する。
【００３９】
本発明の医薬組成物の配合は、公知の又は薬理学の分野で公知又は開発されたいずれかの方法により調製できる。一般に、これらの調製方法は、活性成分をビヒクル又は１以上の他の副成分と接触させ、次に必要ならば又は望ましくは、生成物を成形又は包装して、目的とする単回用又は複数回の服用単位とするステップを含む。
【００４０】
上記医薬組成物の記載は処方箋でのヒトへの投与用に適切な医薬組成物を主な対象としているが、これら組成物は全ての種類の動物への投与にも一般的に適切なことは当業者には当然である。本発明の組成物を種々の動物への投与用に適切とするために、ヒトへの投与用に適切な医薬組成物を改変することは、良く理解でき、獣医学や薬理学の当業者は通常、必要であれば試験して、これら改良を簡単に設計及び実施することができる。本発明の医薬組成物の投与が意図される被検体として、ヒト及び他の霊長類；ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、及びイヌ等の市販されている哺乳類を含む哺乳類；ニワトリ、カモ、ウズラ、ガン、及び七面鳥を含む市販されている鳥類等の鳥類；養殖魚及び鑑賞魚等の魚；及び養殖貝及び軟体類等の甲殻類が挙げられるが本発明を制限するものではない。
【００４１】
本発明の方法に使用できる医薬組成物は、胃腸、口、直腸、膣、腸管外(非経口)、局所的(経皮的)、肺、鼻内、口腔、眼、又は別の投与経路用に適切な配合で製造され、包装され、又は販売されることができる。他の意図される配合物として、放射状ナノ粒子、リポソーム製薬品、活性成分を含有する再封入した赤血球、及び免疫学的ベースの配合が挙げられる。
本発明の医薬組成物はバルクで、単回服用量、複数の単回服用量として製造され、包装され、又は販売できる。ここで使用される「服用量」とは、活性成分の所定量を含有する医薬組成物の別々の量である。活性成分量は、一般的には被検体へ投与される活性成分の投薬量、又は例えばその投薬量の二分の一又は三分の一の投薬量等の便利な分割部分と同じである。
【００４２】
本発明の医薬組成物中の活性成分、医薬的に許容できるビヒクル、及びいずれかの追加的成分の関係量は、治療される被検体の実体、サイズ、及び状態に依存し、更に組成物が投与される経路に依存して変化できる。例えば、組成物は０．１％〜１００％(ｗ／ｗ)の活性成分を含有してもよい。本発明の医薬組成物の１の服用単位は、一般的に約１μｇ〜約１グラムの活性成分、好ましくは約１００μｇ〜約１００ｍｇの活性成分を含有できる。
【００４３】
活性成分に加えて、本発明の医薬組成物は更に、１以上の追加的医薬剤を含有してもよい。特に意図される追加的試薬として、胃腸管部分の酸性ｐＨ環境の影響からBoNT ＨＣフラグメント−エンティティ複合体を遮蔽出来る成分が挙げられる。公知又は開発された腸内デリバリー作用のための実質的に全ての配合物及び器具が使用できる。更に、上記のとおり特に組成物が経口又は胃腸管のいずれかの部分経由で投与される場合、医薬組成物は実際にBoNT毒素(ＨＡ及びNTNH)と弱く結合された１以上の補体成分蛋白質(例えば、SEQ ID No：２０〜１６８及び１７０〜１８８)を含有してもよい。蛋白質の変化はBoNTのセロタイプの変化に関連することは当分野で公知であるが、この関係が本発明の実施においても維持されることは必要ではない。
本発明の医薬組成物の制御−又は徐放性配合物は、従来技術を使用して製造できる。
【００４４】
経口投与用に適切な本発明の医薬組成物の配合物は、本発明を制限するものではないが、それぞれ所定の活性成分量を含有する錠剤、ハード又はソフトカプセル、カシェ剤、トローチ、又はロゼンジ等の別々の固体服用単位の形で製造され、包装され、又は販売されることができる。他の経口投与用の適切な配合物として、本発明を制限するものではないが、粉状又は粒子状配合物、水性又は油性懸濁液、水性又は油性溶液、又はエマルジョンが挙げられる。
ここで使用される「油状」液体とは、炭素含有液体分子を含有し、水より低い極性を示すものである。
【００４５】
活性成分を含有する錠剤は、例えば任意で１以上の追加的成分と共に、活性成分を圧縮又は成形して製造できる。圧縮錠は適切な器具中で、粉又は粒子状調剤等の易流動性形状の活性成分を圧縮して製造でき、任意で１以上の結合剤、滑剤、賦形剤、表面活性剤、及び分散剤を混合してもよい。成形錠は適切な器具中で、活性成分、医薬的に許容できるビヒクル、及び混合物を湿らせるために少なくとも充分な液体の混合物を成形して製造できる。錠剤の製造に使用される医薬的に許容できる賦形剤として、本発明を制限するものではないが、不活性希釈剤、粒状化剤及び崩壊剤、結合剤、及び潤滑剤等が挙げられる。適切な分散剤として、本発明を制限するものではないが、ジャガイモスターチ及びスターチグリコレートナトリウムが挙げられる。公知の表面活性剤として、本発明を制限するものではないが、ナトリウムラウリルサルフェートが挙げられる。公知の希釈剤として、本発明を制限するものではないが、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、微晶質セルロース、リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、及びリン酸ナトリウムが挙げられる。適切な粒状化剤、崩壊剤として、本発明を制限するものではないが、コーンスターチ及びアルギン酸が挙げられる。結合剤として、本発明を制限するものではないが、ゼラチン、アカシア、予備ゼラチン化トウモロコシスターチ、ポリビニルピロリドン、及びヒドロキシプロピルメチルセルロースが挙げられる。潤滑剤として、本発明を制限するものではないが、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、シリカ、及びタルクが挙げられる。
【００４６】
錠剤は被覆されていなくてもよく、又、被検体の胃腸管中での崩壊遅延とそれによい生じる活性成分の徐放及び吸収を達成するために公知又は開発された方法を使用して被覆されてもよい。例えば、グリセリルモノステアレート又はグリセリルジステアレート等の材料が、錠剤を被覆するために使用できる。更に例えば、錠剤は、浸透圧制御性放出錠剤を形成するための、米国特許第４２５６１０８、４１６０４５２、及び４２６５８７４号に記載された方法を使用して被覆されてもよい。医薬的に洗練され、口当たりの良い調剤を提供するために、錠剤は更に甘味剤、風味剤、着色剤、防腐剤、又はこれらの組み合わせを含有してもよい。
【００４７】
活性成分を含有するハードカプセルは、ゼラチン等の生理学的分解性組成物を使用して製造できる。これらハードカプセルは活性成分を含有し、更に、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、又はカオリン等の不活性固体希釈剤等の追加的成分を含有してもよい。
活性成分を含有するソフトゼラチンカプセルは、ゼラチン等の生理学的分解性組成物を使用して製造できる。これらソフトカプセルは活性成分を含有し、それは、水又は；落花生油、液体パラフィン若しくはオリーブ油等の油媒体；と混合されてもよい。
【００４８】
経口用組成物は、ヒト患者の小腸又は大腸中で経口投与される試薬を特異的に放出する公知の技術を使用して製造できる。例えば、結腸を含む胃腸システムへのデリバリー用配合物として、例えば、ｐＨ６以上でのみ易溶性であり、ポリマーが小腸へ進入したときのみ溶解を開始するようなポリ(メタクリル酸、メチルメタクリレート)等のメタクリレートコポリマーベースの腸内的に被覆されたシステムが挙げられる。これらポリマー配合物が崩壊する部位は、腸内通過速度及び存在するポリマー量に依存する。例えば、比較的厚いポリマー被膜が近位の結腸へのデリバリーのために使用される(Hardyら、1987 Aliment.Pharmacol.Therap.1:273-280)。その場合、部位特定型結腸用デリバリー可能なポリマーも又、使用でき、ポリマーが大腸の細菌性フロラによりポリマー被覆の酵素的分解が引き起こされて医薬を放出する。例えば、アゾポリマー(米国特許第４６６３３０８号)、グリコシド(Friendら、1984、J.Med.Chem.27:261-268)及び種々の天然由来の及び修飾されたポリサッカリド(国際公開第ＰＣＴＧＢ８９／００５８１号)がこれら配合物中で使用できる。
【００４９】
米国特許第４７７７０４９号に記載されたようなパルス放出技術も又、活性剤を胃腸管内の特定の部位へ投与するために使用できる。これらシステムは、in vivoで、医薬を所定の時間にデリバリーすることを可能とし、薬剤の安定性及び(直接的に結腸での)摂取を促進するために局所的ミクロ環境を変化させ、活性剤のin vivo投与のために水の存在以外の外部の条件に影響されない他の任意の添加剤と一緒にデリバリーするために使用できる。
【００５０】
経口投与に適切な本発明の医薬組成物の液体配合物は、液状又は使用前に水又は別の適切なビヒクルで再成可能な乾燥品の形状のいずれかで、製造され、包装され、及び販売されることができる。
【００５１】
液体懸濁液は、水性又は油性ビヒクル中で活性成分の懸濁液を得るために従来の方法を使用して調製できる。水性ビヒクルとして、例えば、水及び生理(等張性)食塩水が挙げられる。油性ビヒクルとして、例えば、アーモンド油；油性エステル；エチルアルコール；落花生、オリーブ、ゴマ、又はヤシ油等の野菜油；分留精製野菜油；及び液体パラフィン等の鉱物油が挙げられる。液体懸濁液は更に、本発明を制限するものではないが、懸濁剤、分散剤又は湿潤剤、乳化剤、粘滑剤、防腐剤、緩衝剤、塩、香味料、着色剤、及び甘味剤等の１以上の追加的成分を含有してもよい。油性懸濁液は、更に増粘剤を含有してもよい。懸濁剤として、本発明を制限するものではないが、ソルビトールシロップ、水素化食用脂、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガム、アカシアガム、並びにカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、及びヒドロキシプロピルメチルセルロース等のセルロース誘導体が挙げられる。分散剤又は湿潤剤として、本発明を制限するものではないが；レシチン等の天然分泌性リン脂質；アルキレンオキシドの、脂肪酸との縮合物、長鎖脂肪族アルコールとの縮合物、脂肪酸及びヘキシトールに由来する部分エステルとの縮合物、又は脂肪酸及びヘキシトール無水物に由来する部分エステルとの縮合物(例えばポリオキシエチレンステアレート、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート、及びポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、それぞれ)が挙げられる。乳化剤として、本発明を制限するものではないが、レシチン及びアカシアが挙げられる。防腐剤として、本発明を制限するものではないが、メチル、エチル、又はｎ−プロピル−para−ヒドロキシベンゾエート、アスコルビン酸、及びソルビン酸が挙げられる。甘味剤として、例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、スクロース、及びサッカリンが挙げられる。油性懸濁液用の増粘剤として、例えば、蜜ロウ、ハードパラフィン、及びセチルアルコールが挙げられる。
【００５２】
水性又は油性溶媒中の活性成分の液体溶液は、液体懸濁液と実質的に同じ方法で調製でき、主な違いは、活性成分は溶媒中で懸濁するのではなく溶解することである。本発明の医薬組成物の液体溶液は、液体懸濁液に関して記載されたそれぞれの成分を含有してもよく、懸濁剤は、溶媒中に活性成分を溶解することを必ずしも促進しないことは当然である。水性溶媒として、例えば水及び生理食塩水が挙げられる。油性溶媒として、例えばアーモンド油；油性エステル；エチルアルコール；落花生、オリーブ、ゴマ、又はヤシ油等の野菜油；分留精製野菜油；及び液体パラフィン等の鉱物油が挙げられる。
【００５３】
本発明の医薬的調剤の粉状及び粒子状配合物は、公知の方法を使用して調製できる。これら配合物は、例えば、錠剤を形成して、カプセル中に充填して、又は水性又は油性ビヒクルを添加することにより水性又は油性懸濁液又は溶液を調製して、直接被検体へ投与されてもよい。これら配合物のそれぞれは更に、１以上の分散剤又は湿潤剤、懸濁剤、及び防腐剤を含有してもよい。充填剤及び甘味剤、香味料又は着色剤等の追加的賦形剤も又、これら配合物へ含有されてもよい。
【００５４】
本発明の医薬組成物は又、水中油滴型エマルジョン又は油中水滴型エマルジョンの形状で製造され、包装され、又は販売されてもよい。油相はオリーブ油又は落花生油等の野菜油；液体パラフィン等の鉱物油、又はこれらの組み合わせでもよい。これら組成物は更に、アカシアガム又はトラガカントガム等の天然分泌性ガム；大豆又はレシチンリン脂質等の天然分泌性リン脂質；ソルビタンモノオレエート等の脂肪酸及びヘキシトール無水物の組み合わせに由来するエステル又は部分エステル；及びポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート等の、上記部分エステルとエチレンオキシドとの縮合物等の１以上の乳化剤を含有してもよい。これらエマルジョンは又、例えば、甘味剤又は香味料等の追加的成分を含有してもよい。
本発明の医薬組成物は、直腸投与に適切な配合物として製造され、包装され、又は販売されてもよい。これら組成物は、例えば、坐剤、停滞用浣腸医薬品、及び直腸又は結腸の洗浄用溶液の形状でもよい。
【００５５】
坐剤配合物は、活性成分を刺激性の少ない医薬的に許容できる賦形剤と組み合わせて製造できる。その賦形剤は通常の室温(即ち、約２０℃)で固体であり、被検体の直腸温度(即ち健康なヒトでは約３７℃)では液体である。適切な医薬的に許容できる賦形剤として、本発明を制限するものではないが、ココアバター、ポリエチレングリコール、及び種々のグリセリドが挙げられる。坐剤配合物は更に、本発明を制限するものではないが、酸化防止剤及び防腐剤等の種々の追加的成分を含有してもよい。
【００５６】
停滞用浣腸剤又は直腸又は結腸洗浄用溶液は、活性成分を医薬的に許容できる液体ビヒクルと組み合わせて製造できる。当分野で公知のように、浣腸剤は、被検体の解剖学的直腸部位へ適用できるデリバリー器具を使用して、その中に封入されて投与されても良い。浣腸剤は、本発明を制限するものではないが、酸化防止剤及び防腐剤等の更に種々の追加的成分を含有してもよい。
【００５７】
本発明の医薬組成物は膣内投与に適切な配合物として、製造され、包装され、又は販売されてもよい。これら組成物は、例えば、坐剤；タンポン等の含浸(充填)され又は被覆された膣内挿入可能な材料、圧注用剤、又は膣内洗浄用溶液等の形でもよい。
化学的組成物による材料の含浸又は被膜方法は、当分野で公知であり、本発明を制限するものではないが、化学的組成物を表面上へ付着又は結合する方法、化学的組成物を材料の構造中へ材料(即ち、生理学的分解性材料等)の合成中に組み込む方法、及び水性若しくは油性溶液又は懸濁液を吸収性材料中に吸収させ、次に乾燥してもしなくてもよい方法、が挙げられる。
【００５８】
圧注用剤又は膣内洗浄用溶液は、活性成分を医薬的に許容できる液体ビヒクルと組み合わせて製造できる。当分野で公知のように、圧注用剤は、被検体の解剖学的膣部位へ適用できるデリバリー器具を使用して、その中に封入されて投与されても良い。圧注用剤は、本発明を制限するものではないが、酸化防止剤、抗生物質、抗カビ剤、及び防腐剤等の更に種々の追加的成分を含有してもよい。
【００５９】
ここで使用される、医薬組成物の「腸管外投与」とは、被検体の組織の物理的進入及び組織中へのその進入による医薬組成物の投与が行なわれるいずれの投与経路も含む。従って腸管外投与として、本発明を制限するものではないが、組成物の注入、外科的切開部を通しての組成物の適用、組織貫入的非外科的損傷を通しての組成物の適用等による医薬組成物の投与が挙げられる。特に、意図される腸管外投与として、本発明を制限するものではないが、皮下、腹膜内、静脈内、動脈内、筋肉内、又は胸骨内注射技術及び静脈内、動脈内、又は腎臓透析点滴技術が挙げられる。
【００６０】
腸管外投与に適切な本発明の医薬組成物の配合物として、無菌水又は無菌生理食塩水等の医薬的に許容できるビヒクルと組み合わせたフラグメント結合した活性成分が挙げられる。これら配合物は、ボーラス投与又は連続的投与に適切な形状で製造され、包装され、又は販売されてもよい。注入可能な配合物は、アンプル中、防腐剤を含有する複数回服用容器中、又は自己注射若しくは医者による注射用使い捨て器具中等の投薬単位の形状で製造され、包装され、又は販売されてもよい。腸管外投与用配合物として、本発明を制限するものではないが、懸濁液、溶液、油性又は水性ビヒクル中のエマルジョン、ペースト、及び埋込み可能な徐放性又は生分解性配合物が挙げられる。これら配合物は更に、本発明を制限するものではないが、懸濁剤、安定剤、又は分散剤等の１以上の追加的成分を含有してもよい。腸管外投与用配合物の例として、活性成分は、再生可能な乾燥状態(即ち、粉又は粒子状)であり、組成物の腸管外投与前に適切なビヒクル(例えば、無菌パイロジェンフリー水)で再成される形で提供されてもよい。
【００６１】
医薬組成物は、無菌注入可能な水性又は油性懸濁液又は溶液の形状で製造され、包装され、又は販売されてもよい。この懸濁液又は溶液は、当分野の方法により配合され、活性成分に加えて、上記分散剤、湿潤剤、又は懸濁剤等の追加的成分を含有してもよい。これら無菌注入可能な配合物は、たとえ水又は１，３−ブタンジオール等の無毒性腸管外適用可能な希釈剤又は溶媒を使用して調製されることができる。他の適用可能な希釈剤及び溶媒として、本発明を制限するものではないが、リンゲル液、生理食塩水、及び合成モノ−又はジ−グリセリド等の不揮発性油が挙げられる。他の使用できる腸管外投与可能配合物として、微晶質性形状で、リポソーム調剤で、又は生分解性ポリマーシステムの構成要素として、活性成分を含有するものが挙げられる。徐放性又は埋込み用組成物は、エマルジョン、イオン交換樹脂、難溶性ポリマー、又は難溶性塩等の医薬的に許容できるポリマー性又は疎水性材料を含有してもよい。
【００６２】
局所的(経皮的)投与に適切な配合物として、本発明を制限するものではないが、リニメント剤、ローション剤、クリーム等の水中油滴型若しくは油中水滴型エマルジョン、軟膏若しくはペースト及び溶液若しくは懸濁液等の液体又は半流動体調剤が挙げられる。局所的投与可能配合物は約１％〜約１０％(ｗ／ｗ)の活性成分を含有してもよいが、活性成分の濃度は溶媒中の活性成分の溶解限度と同じ程度の濃度である。局所投与用配合物は、更に上記追加的成分を１以上含有してもよい。局所的に投与される配合物は非角質上皮組織(例えば、口、鼻、又は喉の内側)へ投与され、これら投与を行なうためのアプリケーター又はディスペンサーと一緒に提供されてもよい。
【００６３】
本発明の医薬組成物は、口腔経由の肺投与用に適切な配合物として製造され、包装され、又は販売されてもよい。これら配合物は、活性成分を含有し、直径が約０．５〜約７ｎｍの範囲、好ましくは約１〜約６ｎｍである乾燥粒子を含有してもよい。これら組成物は、噴射剤の流れが粉を分散する方向に向けられている乾燥粉リザーバーを備えた器具を使用して、又は密封容器中の低沸点噴射剤に溶解又は懸濁された活性成分を含む器具等の自己噴射性溶媒／粉−投与用容器を使用して、投与するための乾燥粉の形状が便利である。好ましくは、これら粉は、９８重量％以上の粒子が０．５ｎｍを超える直径を有し、粒子の数で９５％以上が７ｎｍ未満の直径を有する粒子を含有する。更に好ましくは、９５重量％以上の粒子が１ｎｍを超える直径を有し、粒子の数の９０％以上が６ｎｍ未満の直径を有する。乾燥粉組成物は好ましくは、糖等の固体微粉希釈剤を含有し、単回服用単位剤形で便利に提供される。
【００６４】
低沸点噴射剤として一般的に、大気圧下で６５°Ｆ以下の沸点を有する液体噴射剤が挙げられる。一般的には、噴射剤は、組成物の５０〜９９．９％(ｗ／ｗ)を構成し、活性成分は組成物の０．１〜２０％(ｗ／ｗ)を構成する。噴射剤は更に、液体非イオン性又は固体アニオン性界面活性剤又は固体希釈剤(好ましくは活性成分含有粒子と同じオーダーの粒子サイズを有する。)等の追加的成分を含有してもよい。
【００６５】
肺デリバリー用に配合された本発明の医薬組成物は又、溶液又は懸濁液の小滴の形状の活性成分として提供できる。これら配合物は、任意で無菌で、活性成分を含有する水性又は希アルコール性溶液又は懸濁液として製造され、包装され、又は販売されてもよく、いずれの噴霧(nebulization、atomization)用器具を使用しても便利に投与できる。これら配合物は更に、本発明を制限するものではないが、サッカリンナトリウム等の風味剤、揮発性油、緩衝剤、表面活性剤、又はメチルヒドロキシベンゾエート等の防腐剤等の１以上の追加的成分を含有してもよい。この投与経路で提供される小滴は、好ましくは平均直径が約０．１〜約２００ｎｍの範囲である。
ここで記載された肺デリバリーに使用できる配合物は又、本発明の医薬組成物の鼻内デリバリーにも使用できる。
【００６６】
鼻内投与に適切な別の配合物は、活性成分を含有し、約０．２〜５００μｍの平均粒子を有する粗粉である。これら配合物は、鼻性呼吸が行なわれる方法、即ち、外鼻孔近くに設けられた粉容器から鼻経路を通じて急速吸入することにより、投与される。
鼻投与に適切な配合物として、例えば活性成分を約０．１％(ｗ／ｗ)の少量から１００％(ｗ／ｗ)の多量まで含有してもよく、更に１以上の上記追加的成分を含有してもよい。
【００６７】
本発明の医薬組成物は口腔投与に適切な配合物として製造され、包装され、又は販売されてもよい。これら配合物は、例えば、従来法を使用して製造された錠剤又はロゼンジ錠の形状でもよく、例えば、０．１〜２０％(ｗ／ｗ)の活性成分と、その残部は口内で溶解可能又は分解性組成物、更に任意で１以上の上記追加的成分を含有してもよい。又、口腔投与に適切な配合物は、活性成分を含有する粉又は、エアロゾル化若しくは噴霧化した溶液又は懸濁液を含んでもよい。これら粉状化、エアロゾル化、又は噴霧化した配合物は、分散される場合、好ましくは約０．１〜約２００ｎｍの範囲の平均粒子径又は平均小滴径を有し、更に１以上の上記追加的成分を含有してもよい。
【００６８】
本発明の医薬組成物は、眼投与に適切な配合物として製造され、包装され、又は販売されてもよい。これら配合物として、例えば、水性又は油性液体ビヒクル中の活性成分０．１〜１．０％(ｗ／ｗ)溶液又は懸濁液等の目薬の形状が挙げられる。これら目薬は更に、緩衝剤、塩、又は１以上の他の上記追加的成分を含有してもよい。
他の使用できる眼科的投与可能配合物として、微晶質性形状又はリポソーム調剤での活性成分が挙げられる。
【００６９】
ここで使用される「追加的成分」として、本発明を制限するものではないが、１以上の下記成分が挙げられる：賦形剤；表面活性剤；分散剤；不活性希釈剤；粒状化剤及び崩壊剤；結合剤；潤滑剤；甘味剤；香味料剤；着色剤；防腐剤；ゼラチン等の生理学的分解性組成物；水性ビヒクル及び溶媒；油性ビヒクル及び溶媒；懸濁剤；分散剤又は湿潤剤；乳化剤；粘滑剤；緩衝剤；塩；増粘剤；充填剤；乳化剤；酸化防止剤；抗生物質；抗カビ剤；安定剤；及び医薬的に許容できるポリマー性又は疎水性材料。本発明の医薬組成物中に含有できる他の「追加的成分」として、例えばGenaro、ed.、1985、「Remington's Pharmaceutical Sciences」Mack Publishing Co.、Easton、PA、米国(ここで資料として使用する。)に記載されている当分野で公知であるものが挙げられる。
【００７０】
通常医師又は獣医であれば、被検体の機能障害を治療、回復、軽減、抑制、予防、緩和し、又は免疫反応を発現するための本発明の化合物の有効量を容易に決定し、処方できることは当然である。その手続中、医師又は獣医は、例えば、最初に比較的定量の投薬量を処方し、続いて適切な応答が得られるまで投薬量を増加させることができる。しかし、特定の被検体に対する特定の投薬レベルは、使用される特定の化合物の活性、被検体の年齢、体重、身体の健康、性別、及び食事、投与時間、投与経路、排出速度、医薬品の組み合わせ、並びに機能障害の程度等の種々の因子に依存する。
【００７１】
本発明は又、本発明の医薬組成物及び取扱い説明書を含むキットに関する。ここで使用される、「取扱い説明書」として、被検体の機能障害を、治療、回復、軽減、抑制、予防、又は緩和するため、又はこれら組成物を上記経路を通して投薬するための本発明の医薬組成物の有用性を伝達するために使用される、印刷物、記録物、図表、又は他の表現媒体が挙げられる。取扱い説明書は又、例えば本発明の医薬組成物の適切な投薬量も表す。本発明のキットの取扱い説明書は、例えば、本発明の医薬組成物を備えた容器へ貼り付けられ、又は医薬組成物を含む容器に一緒に載置されてもよい。一方、取扱い説明書は、取扱い説明書及び医薬組成物が患者により協同的に使用されることを意図して、容器と分離して載置されてもよい。
【００７２】
本発明は又、本発明の医薬組成物及び、組成物を被検体へデリバリーするためのデリバリー器具を含むキットに関する。例えば、デリバリー器具として、圧縮式スプレーボトル、投薬目盛り付きスプレーボトル、エアロゾルスプレー器具、アトマイザー、乾燥粉デリバリー器具、自己噴射性溶媒／粉投与用器具、シリンジ、針、タンポン、又は投薬量測定容器が挙げられる。キットは更に上記取扱い説明書を含有してもよい。
【００７３】
本発明を下記実施例を参照して記載する。これら実施例は、本発明の例示にのみ提供されるものである。本発明は、これら実施例により制限されるものではなく、ここで提供された知見の結果として明らかな全ての変更をも含むものである。
【実施例】
【００７４】
実施例に詳述した実験結果を表１に示す。
【００７５】
【表１】
2005538954.tif 000002
【００７６】
A略語は下記の通り：
ＢｏＮＴ＝ボツリヌス菌神経毒(ホロトキシン)；
ｎＢｏＮＴ＝切れ目のある(nicked)BoNT、即ち、ＨＣ及びＬＣに開裂し、ジスルフィド結合により結合されているBoNT前駆体ポリペプチド；
ｕＢｏＮＴ＝切れ目のない(un-nicked)BoNT、即ち、開裂されずにいるBoNT前駆体ポリペプチド(１５０ｋＤａ)；
ＨＣ＝ボツリヌス菌神経毒の重鎖；
８８ｋＨＣ＝８８キロドルトンＨＣカルボキシ末端フラグメント(図２参照)；
６６ｋＨＣ＝６６キロドルトンＨＣカルボキシ末端フラグメント(図２参照)；
５０ｋＨＣ＝５０キロドルトンＨＣカルボキシ末端フラグメント(図２参照)；
４８ｋＨＣ＝２キロドルトンのカルボキシ末端が切除された５０ｋＨＣフラグメント(図２参照)；
ＡＦ＝商標「ALEXAFLUOR」５６８蛍光染料；
ｂｔ＝ビオチン；
ＧＦＰ＝緑色蛍光蛋白質；
ＧＳＴ＝グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ；
Ｓｔａｇ＝商標「S-TAG」システム(１５ａａS-TAGペプチド及びリボヌクレアーゼＳ−蛋白質、Novagen社製、Madison、Wisconsin、米国)；
６×ｈｉｓ＝ヘキサヒスチジン標識；並びに
ＣＴＢＳ＝コレラ毒素Ｂサブユニット。
B細胞種は下記の通り：
Ｔ−８４＝T-84ヒト消化管上皮細胞；
ＭＤＣＫ＝Madin-Darbyイヌ腎臓上皮細胞；
Ｃａｃｏ−２＝Caco−２ヒト消化管上皮細胞；
Ｃａｌｕ−３＝Calu−３ヒト肺上皮細胞；
ＲＡＥＣ＝ラット肺胞上皮細胞；並びに
ｍＲＴ＝ネズミ気道細胞(in vivo)。
CＡ＝細胞の頂端面、及び、Ｂ＝細胞の基底面。
D率は平均±平均の標準誤差を上皮表面のフェムトモル／ｈｒ／ｃｍ2で表した。
【００７７】
ここに記載した実施例で使用した材料及び方法は、個々の実施例で特記する場合を除き、下記の通りである。
天然及び組み換え型蛋白質、天然毒素及び天然鎖。
ボツリヌス菌神経毒(BoNT)並びにＨＣ及び軽鎖(ＬＣ)構成要素を資料に記載されている標準技術(「DasGupta and Sathyamoorthy」1984;Simpsonら、1988)を使用して単離した。
【００７８】
BoNTＬＣを発現するプラスミドの構築
ＤＮＡフラグメント単離用標準技術、ＤＮＡポリメラーゼＩのKlenowフラグメントによる張り出し末端の修復、及びＴ４ＤＮＡリガーゼによるライゲーションを使用した。全てのクローン化ステップ及び発現は、ｐＲＥＰ４リプレッサープラスミドを含有するＥ．ｃｏｌｉＭ−１５(Qiagen社製、Chatsworth、CA、米国)中で行なった。BoNTＬＣ(ｒＬ鎖)をコードするＤＮＡフラグメントは、下記配列を有するプライマーを使用してプラスミドｐＣＬ８から増幅した：forward、ＣＣＣＡＡＴＡＡＣＡ  ＡＴＴＡＡＣＡＡＣＴ  ＴＴＡＡＴ(SEQ ID NO：８)；及びreverse、ＴＴＴｃｔｇｃａｇＣ  ＴＡＴＴＴＡＴＴＡＴ  ＡＴＡＡＴＧＡＴＣＴ  ＡＣＣＡＴＣ(SEQ ID NO：９)、但し、ＰｓｔＩ制限酵素切断部位は、下付(小)文字で表す。１個のシトシンをforwardプライマーの５’末端へ添加し、ＢａｍＨＩ制限酵素切断部位の再構築を行い、又、翻訳メチオニンのｐＱＥ−３０開始フレーム中の軽鎖ＤＮＡのクローン化を行った。reverseプライマー中で、ＰｓｔＩ制限酵素切断部位を終止コドンのすぐ下流に導入した。増幅した生成物を精製し、Ｔ４ポリメラーゼで処理し、ＰｓｔＩで切断し、発現ベクターｐＱＥ−３０のKlenow−充填ＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩ制限酵素切断部位との間に挿入し、プラスミドｐＱＥ−ＬＣ１を生成した。ｐＱＥ−ＬＣ１の構造はＤＮＡシークエンシングで確認した。
【００７９】
ＨＣ(カルボキシ末端ＨＣフラグメント)の短縮(truncation)突然変異体を発現するプラスミドの構築
(商標「GENBANK」登録番号Ｘ７３４２３で記載されているヌクレオチド配列SEQ ID NO：１０、を有する。)構造遺伝子は、BoNTセロタイプＡ(BoNT A)のＨＣの８８キロドルトン(８８Ｋ)、６６キロドルトン(６６Ｋ)、又は５０キロドルトン(５０Ｋ)フラグメントをエンコードしており、ＰＣＲにより産出した。これらＨＣフラグメントはここで表される「８８ｋＨＣ」「６６ｋＨＣ」及び「５０ｋＨＣ」である。
【００８０】
８８ｋＨＣをエンコードするＤＮＡフラグメント(SEQ ID NO：１０；SEQ ID NO：１１のヌクレオチド残基１６０９−３９８７)を、下記オリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅した：forwardプライマー(SEQ ID NO：１０のヌクレオチド残基１６０９−１６３２)ＣＧＣｇｇｔａｃｃＡ  ＣＣＴＴＴＡＡＴＴＴ  ＴＧＡＴＡＡＴＧＡＡ  ＣＣＴ(SEQ ID NO：１２)、reverseプライマー(SEQ ID NO：１０のヌクレオチド残基３９８７−３９６８)ＡＡＣＣＣｃｔｇｃａ  ｇＴＴＡＣＡＧＴＧＧ  ＣＣＴＴＴＣＴＣＣＣ  Ｃ(SEQ ID NO：１３)、ただしforwardプライマー配列中のＫｐｎＩ制限酵素切断部位及びreverseプライマー配列中のＰｓｔＩ制限酵素切断部位は、下付(小)文字で表す。
【００８１】
６６ｋＨＣをエンコードするＤＮＡフラグメント(SEQ ID NO：１０；SEQ ID NO：１４のヌクレオチド残基２１７０−３９８７)を下記オリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅した：forwardプライマー(ヌクレオチド残基SEQ ID NO：１０の２１７０−２１９３)ＣＧＣｇｇｔａｃｃＧ  ＴＴＣＡＡＡＣＡＡＴ  ＡＧＡＴＡＡＴＧＣＴ  ＴＴＡ(SEQ ID NO：１５)、reverseプライマー(SEQ ID NO：１０のヌクレオチド残基３９８７−３９６８)ＡＡＣＣＣｃｔｇｃａ  ｇＴＴＡＣＡＧＴＧＧ  ＣＣＴＴＴＣＴＣＣＣ  Ｃ(SEQ ID NO：１３)、ただしforwardプライマー配列中のＫｐｎＩ制限酵素切断部位及びreverseプライマー配列中のＰｓｔＩ制限酵素切断部位は、下付(小)文字で表す。
【００８２】
５０ｋＨＣをエンコードするＤＮＡフラグメント(SEQ ID NO：１０；SEQ ID NO：１６のヌクレオチド残基２６８９−３９８７)を、下記オリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅した：forwardプライマー(SEQ ID NO：１０のヌクレオチド残基２６８９−２７１２)ＴＣＴＴｇｇａｔｃｃ  ＡＣＡＴＴＴＡＣＴＧ  ＡＡＴＡＴＡＴＴＡＡ  ＧＡＡＴ(SEQ ID NO：１７)、reverseプライマー(ヌクレオチド残基SEQ ID NO：１０の３９８７−３９６８)ＴＴＣＴｇａｇｃｔｃ  ＴＴＡＣＡＧＴＧＣＣ  ＴＴＴＣＴＣＣＣＣ(SEQ ID NO：１４)、ただしforwardプライマー配列中のＢａｍＨＩ制限酵素切断部位及びreverseプライマー配列中のＳａｃＩ制限酵素切断部位は、下付(小)文字で表す。
【００８３】
BoNT ＨＣの欠失誘導体をエンコードするＰＣＲ増幅したフラグメントをそれぞれの制限エンドヌクレアーゼで処理し、ＡＴＧコドン及び６×ｈｉｓ標識のフレーム中のプラスミドｐＱＥ−３０へクローン化した。その結果得られた３個のクローンを、ｐＱＥ−BoNT／ＡＨＣ８８、ｐＱＥ−BoNT／ＡＨＣ６６及びｐＱＥ−BoNT／ＡＨＣ５０で表し，それらは８８ｋＨＣ、６６ｋＨＣ及び５０ｋＨＣをそれぞれエンコードするBoNT AＨＣ遺伝子の欠失フラグメントを含有する。全てのクローン化及び発現はE．coli菌株BL21コドンplus(DE3)−RIL(Stratagene社製、LaJolla、CA、米国)内で行われた。全ての組み換え型クローンはＤＮＡシークエンシングで確認した。
【００８４】
ＧＦＰ−６６ｋＨＣ融合を発現するプラスミドの構築
緑色蛍光蛋白質(ＧＦＰ)の配列コードをＰＣＲにより産出した。２６キロドルトン(２６Ｋ)ＧＦＰ蛋白質をエンコードするＤＮＡフラグメントを、下記ヌクレオチド配列を有するプライマーを使用して増幅した：forwardプライマーＡＣＡＴｇｃａｔｇｃ  ＡＴＧＡＧＴＡＡＡＧ  ＧＡＧＡＡＧＡＡＣＴ  ＴＴＴＣＡ(SEQ ID NO：１８)、reverseプライマーＣＣｇｇｔａｃｃＣＣ  ＡＧＧＣＣＣＡＴＴＴ  ＧＴＡＧＡＧＣＴＣＡ  ＴＣ(SEQ ID NO：１９)、ただしforwardプライマー配列中のＳｐｈＩ制限酵素切断部位及びreverseプライマー配列中のＫｐｎＩ制限酵素切断部位は、下付(小)文字で表す。ＧＦＰ遺伝子を含有する増幅したフラグメントはＳｐｈＩ及びＫｐｎＩと共に処理され、プラスミドｐＱＥ−６６ｋＨＣ中の、ＳｐｈＩ及びＫｐｎＩ制限酵素切断部位の間に挿入される。得られたプラスミドｐＱＥ−ＧＦＰ−６６ｋＨＣは、ＡＴＧコドン、６×ｈｉｓ標識及び６６ｋＨＣ遺伝子フレーム中にＧＦＰ遺伝子を含有する。
【００８５】
組み換え型蛋白質の発現及び精製
Lennoxブロス中３７℃で振とうして、６００ｎｍ(Ａ600)での吸収値が０．６〜０．８となるまでインキュベートを行った。イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド(ＩＰＴＧ)を１．０ミリモル濃度(最終濃度)となるよう添加し、インキュベートを更に５時間続けた。１リットルの誘発培養物からの細菌を４℃で遠心分離して回収し、５０ミリモル濃度リン酸ナトリウムの緩衝剤(ｐＨ．７．４)２０ｍｌ中で３００ミリモル濃度ＮａＣｌと再懸濁した。細胞懸濁液を、１分２回のパルスでそれぞれ７５％出力で、モデルl60 sonic dismembrator(Fisher Scientific社製、Malvern、PA、米国)により音波粉砕により氷上に溶解した。溶解産物を２００００×ｇ、３０分４℃で遠心分離した。清澄化した浮遊物を２ｍｌの充填されたニトリル三酢酸樹脂と共に混合し、１時間４℃で回転装置上でインキュベートし、最終的に２５ｍｌカラム中へ注いだ。
【００８６】
カラムを３０倍体積の洗浄緩衝剤(５０ミリモル濃度リン酸ナトリウム(ｐＨ６．０)、３００ミリモル濃度ＮａＣｌ、２５ミリモル濃度イミダゾール)で洗浄した。結合された蛋白質は溶離緩衝剤(５０ミリモル濃度リン酸ナトリウム(ｐＨ４．５)、３００ミリモル濃度ＮａＣｌ)で溶離した。精製蛋白質をナトリウムドデシルサルフェート−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)及びウェスタンブロット法により分析した。
【００８７】
BoNTのニッキング
ボツリヌス菌毒素は比較的不活性な単鎖分子として表される。完全に活性とするために、毒素は蛋白質分解プロセシング(ニッキング)」を受けてその二鎖形状を産出しなければならない。実験室的には、これは通常トリプシンにより達成される。
次に続く毒素のニッキング酵素からの分離を容易にするために、ＴＰＣＫ(Ｌ−１−トシルアミド−２−フェニルエチルクロロメチルケトン)を４％ビーズ化アガロースへ架橋(固定化)したトリプシン(固定化トリプシン；PIERCE社製、Rockford、IL、米国)処理したものを使用した。トリプシンスラリーを反応緩衝剤(１０ミリモル濃度リン酸ナトリウム緩衝剤、ｐＨ７．５)で３回洗浄した。毒素を酵素へ添加し、室温で(２３℃)１時間、毒素に対するトリプシン比１：１０でインキュベートした。インキュベート後、反応混合物を毎分１００００回転で５分間、Eppendorf 卓上型遠心分離機中で遠心分離した。「切れ目のある(nicked)」毒素を含有する浮遊物を収集し、−２０℃で貯蔵した。又、「切れ目のある」毒素は、０．２ミクロン遠心分離フィルター(Schleicher&Schuell Centrexミクロフィルターユニット)を通して、清浄無菌管へろ過して、ビーズ化トリプシンから分離しても良い。材料サンプルは電気泳動によりニッキングを確認するために試験した。
【００８８】
BoNTの還元
二鎖毒素は、ジスルフィド結合により結合されたＬＣ(酵素部分)及びＨＣ(結合及びトランスロケーション部分)から構成される。この結合はその酵素活性、神経伝達物質放出を引き起こす蛋白質の開裂、を発揮するために、(ジスルフィド結合が)還元(破壊)され軽鎖とされる必要がある。in vitro開裂試験を行うために、天然毒素は還元させなければならなかった。
ボツリヌス菌毒素は、生理学的ｐＨ(ｐＨ７．２〜７．４)でのリン酸緩衝剤中又はリン酸緩衝食塩水(ＰＢＳ)中で、ジチオトレイトール(ＤＴＴ；クリランド試薬)でインキュベートされ、還元された。通常使用されるＤＴＴの濃度は、試験に応じて５ミリモル濃度〜２０ミリモル濃度である。ＤＴＴ及び毒素反応混合物を、室温で(２３℃)１時間インキュベートした。毒素還元は、非還元性ゲル上での電気泳動により確認した。
【００８９】
125Ｉ−ボルトンハンター試薬(ＭＷ３８７．２)の精製BoNT及びそのフラグメントへの付着
ボルトンハンター試薬は、Perkin Elmer Life Sciences社(Boston、Massachusetts、米国)から市販されている。この分子へ、蛋白質(例えば、リシン残基)の第１級アミンと反応する、反応性サクシンイミジルエステル成分を供給した。毒素、ＨＣ又はそのフラグメントを(125Ｉ)−ボルトンハンター試薬を本質的に製造者の指示に従い使用してヨウ素化した。得られる生成物の生物活性の損失を減少させるため、反応時間を少くした。蛋白質を標識化して、５００キュリー／ミリモル以下の平均特定活性とした。
【００９０】
ホウ酸塩緩衝剤(ｐＨ７．８；２００μｌ)中の精製蛋白質(３５０μｇ)を乾燥した、ヨウ素化したエステルへ添加し、１５分間氷上で反応させた。反応を１モル濃度グリシンの５０μｌホウ酸塩緩衝剤を１５分間添加して終了した。合計反応混合物(２５０μｌ)及び洗浄液(２５０μｌ)を、ろ過緩衝剤(１５０ミリモル濃度Ｎａ2ＨＰＯ4、１５０ミリモル濃度ＮａＣｌ、０．１％(ｗ／ｖ)ゼラチン、ｐＨ７．４)で予備平衡にした商標「SEPHADEX」Ｇ−２５カラム上にかけた。標識化毒素がろ過緩衝剤で溶離し、０．５ｍｌフラクションを収集した。それぞれのフラクションの分取(５μｌ)を放射能分析した。空隙容量で溶離した標識化毒素ピークを貯留し、３℃で貯蔵した。貯留したフラクションの毒素濃度を、り１．６３Å278／ｍｌ＝１ｍｇの関係式を使用して、２７８ｎｍの分光光度分析で決定した。このサンプルの部分を標識化毒素を定量化するためにガンマカウンターで測定した。サンプル濃度及び関連する数値を特定の活性を計算するために使用した。標識化毒素を３℃で貯蔵した。
【００９１】
商標「ALEXAFLUOR」５６８(ＭＷ７９２)の精製BoNTへの付着
商標「ALEXAFLUOR」５６８は、５７７ｎｍで吸収(励起)最大値、６０３ｎｍで発光最大値を有する染料分子である。この染料は、Molecular Probes社(Eugene、OR、米国)から市販されており、製造者の指示に従い使用した。この分子を、蛋白質(例えば、リシン残基)の第１級アミンと反応する反応性サクシンイミジルエステル成分へ供給した。精製BoNT Aの１．０ｍｇ／ｍｌＰＢＳ溶液０．５０ｍｌへ５０μｌの１．０モル濃度重炭酸ナトリウムを供給し、続いて混合物を染料へ添加した。反応を１時間室温で攪拌して連続した。ヒドロキシルアミン溶液(１７μｌ)を添加し、インキュベートを更に３０分間室温で続けてから反応を停止した。完全な反応体積を次にＰＢＳで平衡化してＰＢＳで溶離するゲルろ過カラムを通してろ過した。最初にカラムから溶離した染色帯(標識化毒素)を収集し、３℃で貯蔵した。標識化の量は、製造者の指示に従い、商標「ALEXAFLUOR」染料及び毒素の吸光度係数を使用して計算した。トランスサイトーシス実験で使用した毒素は３〜７モル／モル毒素の染料で標識化した。
【００９２】
トランスサイトーシスアッセイ
単層の極性化した上皮細胞を、０．４μｍ孔径のポリカーボネート膜、商標「TRANSWELL」(Corning-Costar社製、Cambridge、Massachusetts、米国)多孔質ボトムインサート上に成長させた。商標「TRANSWELL」装置は、上皮細胞培養物の頂端面の又は基底面のいずれかの上に生成物を封じ込め可能である。上皮細胞層を通過する生成物のトランスサイトーシスのない場合、実質的には全ての生成物が装置により上皮の一方の側の上に保持される。従って、商標「TRANSWELL」装置は、生成物の上皮通過性トランスサイトーシスの評価に有用である。
【００９３】
それぞれの商標「TRANSWELL」インサート中の細胞増殖面積は、１ｃｍ2と同じ大きさである。細胞接種の前に、インサート膜は、ラット尾タイプＩコラーゲン１０μｇ／ｃｍ2で被覆した。コラーゲン貯蔵液(６．７ｍｇ／ｍｌ)を無菌１％(ｖ／ｖ)酢酸で調製し、３℃で貯蔵した。このコラーゲン貯蔵液を、必要に応じて氷冷６０％(ｖ／ｖ)エタノールで希釈し、１０μｇの希釈コラーゲンを含有する得られた溶液の１５０μｌを、それぞれのウェルへ添加した。
【００９４】
コラーゲン溶液を室温で一晩(約１８時間)乾燥した。乾燥後、ウェルをＵＶ光下で１時間殺菌し、細胞インキュベート媒体で予備インキュベート(３０分間インキュベート)した。予備インキュベート媒体を、細胞及び新鮮な媒体の添加の直前に除去した。細胞を融合的密度で商標「TRANSWELL」装置中に接種した。添加した媒体の体積は、上部室(ウェル)へ０．５ｍｌ、底部(下部)室(ウェル)へ１．０ｍｌであった。インキュベート媒体は２日毎に交換した。１２ウェルプレート中の培養物は、使用前に最小１０日間分化された。細胞単層の完全性及び接着結合の形成を、インサート中の培養液のメニスカス(曲面表面)が、底部ウェルに比較してやや高く維持されることことを監視して観察した。接着結合の形成は、上部ウェルから底部室への(3Ｈ)−イヌリン拡散速度のアッセイ又は単層を通過する経上皮抵抗の測定により実験室的に確認した。
【００９５】
トランスサイトーシスを、通常上部室(ウェル；細胞の頂端面)中の媒体を対象とする(125Ｉ)−標識化蛋白質を種々の濃度で含有する、適切な体積の媒体で置換することによりアッセイした、放射性標識化蛋白質の輸送を、通常底部室(ウェル；細胞の基底面)である反対側のウェルの全内容物をサンプリングして検知した。サンプルとした媒体の分取(０．５ｍｌ)を商標「SEPHADEX」Ｇ−２５カラムを通してろ過し、０．５ｍｌフラクションを採取した。フラクション中の放射性量をガンマカウンターを使用して決定した。トランスサイトーシスされた蛋白質の量をノーマライズし、インキュベートした細胞表面のフェムトモル／ｈｒ／ｃｍ2として表した。１条件当り少なくとも２回実験値を測定し、実験は通常少なくとも３回行なった。
【００９６】
有毒性試験(In vitro有毒性試験)
発現した蛋白質の有毒性を、マウス横隔膜神経片側横隔膜調製物上でバイオアッセイした。組織を切除し、９５％Ｏ2、５％ＣＯ2で通気した生理学的緩衝剤中で懸濁し、３５℃で維持した。生理学的溶液は下記組成物であった：１３７ミリモル濃度ＮａＣｌ；５ミリモル濃度ＫＣｌ；１．８ミリモル濃度ＣａＣｌ2；１．０ミリモル濃度ＭｇＳＯ4；２４ミリモル濃度ＮａＨＣＯ3；１．０ミリモル濃度ＮａＨ2ＰＯ4；１１ミリモル濃度Ｄ−グルコース；及び０．０１％(ｗ／ｖ)ゼラチン。横隔膜神経を連続的に刺激し(１．０Hertz；０．１〜０．３ミリ秒持続)、筋肉痙攣を記録した。毒素誘発された麻痺の測定結果は、神経性刺激への筋肉痙攣応答の５０％減少であった。
【００９７】
(In vivo有毒性試験)
発現した蛋白質の有毒性を、蛋白質を実験マウスへ投与して試験した。ヒスチジン親和性樹脂又はGST親和性樹脂からの溶離により精製蛋白質を、ｌｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)を含むＰＢＳで希釈し、マウスへ腹膜内(ｉ．ｐ．)注射した。組み換え型蛋白質を、濃度１〜１００μｇ／動物(平均重量約２５グラム)で、ＰＢＳ−ＢＳＡ１００μｌ分取物へ投与した。時間の長さを変化させて監視して、動物への非特定の有毒性を検知した。
【００９８】
胃又は腸への毒素又はフラグメントの外科的投与
スイス・ウェブスターマウス(メス、それぞれ２５グラム)を、Ace Animals社(Boyertown、PA、米国)から購入し、食物及び水を無制限に与えた。
手術前プロトコルでは、手術前に動物を１８時間固定したが、水は自由に与えた。又、手術前操作では、腹部を剃毛し、ゲンタマイシンサルフェート(６ｍｇ／ｋｇ体重(FujusawaUSA社製、Deerfield、IL、米国)の予防用の皮下投与量を投薬した。手術当日に、動物を獣医学手術室へ移し、次に続く全てのステップは、無菌外科環境内で行った。
【００９９】
動物をイソフルラン(商標「ISO-THESIA」、Abbott Laboratories North社製、シカゴ、IL、米国)及び酸素の投与で麻酔し、同一の吸入麻酔を手術中行った。開腹手術(マウスのサイズに応じて約１．５〜２．５ｃｍ)を行い、胃又は胃の直近の小腸のいずれかを部分的に外側にとり出した。プロトコルで必要な場合、商標「３−０PROLENE」(ポリプロピレン縫合材料、Ethicon社製、Somerville、NJ、米国)を使用して、結紮を幽門括約筋の真上(胃の近位)に設けた。この結紮が胃液の腸への流れ(又は腸内内容物の胃への逆流)を阻止するのに充分であるが、包まれた組織への物理的損傷が生じないように注意した。神経毒を、０．５インチ、２７ゲージ針を備えた１ｍｌツベリクリンシリンジを通して投与した。注入体積は、投与部位(胃又は腸)に関係なく動物当たり１００μｌ定量にした。全ての注入で、ビヒクルは１ｍｇ／ｍｌＢＳＡを有する無菌ダルベッコＰＢＳ(ｐＨ７．４)から構成された。神経毒を、より大きい曲率を有する胃壁を通して、胃大網脈管を避けるよう注意しながら注入して胃の内腔へ投与した。神経毒を、体節に平行で常に胃から離れた方向にした針を斜めに挿入して小腸の内腔へ投与した。注入時間を記録した。
【０１００】
神経毒の投与後、器官を丁寧に原位置に戻し、腹部筋肉の切開部を３−０商標「PROLENE」を使用して縫合した。動物へ塩酸ブプレノルフィン(２ｍｇ／ｋｇ体重、皮下注射可能；商標「BUPRENEX」、Reckitt&Colman Pharmaceuticals社製、Richmond、VA、米国)の鎮痛剤注射及びゲンタマイシンの別投薬をした後、皮膚を数個の小型創傷クリップを使用して閉鎖した。
外科操作は１動物当り約１５分間続き、麻酔薬の懸濁液は１０〜１５分間内の完全回復を示した。次に動物を実験室に移し、それらをアッセイ終点まで監視した。死亡時間を記録し、注入時間から死亡時間までの合計所用時間(分)を計算した。
【０１０１】
免疫方法
結合保持能力並びに消化管及び気道上皮細胞の通過保持能力を示す毒素変種の、下記経口及び／又は鼻内投与で免疫性を発現するそれらの能力を試験した。更に評価されるためには、経口又は吸入可能なワクチンは、１０００ＭＬＤ50以上の親毒素に対する免疫防御を引き起こす必要がある。特定の病原体フリーのスイス・ウェブスターマウス(メス)をこの実施に使用した。
皮下(ｓ．ｃ．)免疫用に、動物へ０．１ｍｌのＰＢＳ中の１〜２０μｇ蛋白質を投与した。４回投薬を１４日間隔で与えた。第２回、第３回及び第４回の免疫後、マウスを７日間飼育し、毒素変種への免疫反応性用免疫ブロット法により分析した。マウスに腹膜内(ｉ．ｐ．)経路を経由して１×１０3ＭＬＤ50以上の親毒素の負荷をかけた。注入前に、毒素を１％(ｗ／ｖ)ゼラチン含有ＰＢＳで希釈した。マウスに１４日間負荷をかけ、次にそれらに最終ワクチン接種した。又、未処理のマウスをコントロールとして使用した。
【０１０２】
鼻内免疫用に、マウスに２０μｌのＰＢＳ中に懸濁した１〜２０μｇの蛋白質を投与した。マウスをイソフルラン(商標「ISO-THESIA」、Abbott Laboratories North社製、シカゴ、IL、米国)で軽く麻酔した。蛋白質を外鼻孔へ１０〜２０μｌの懸濁液の単回投与で投与した。動物の頭部は後部咽頭中へのドレナージを最小化するために垂直位置で保持した。５回投薬を７日間隔で投与した。第３回、第４回及び第５回の免疫後、マウスを７日間飼育し、試験体を、毒素変種への免疫反応性用免疫ブロット法で分析した。マウスにｉ．ｐ．経路を経由して１×１０3ＭＬＤ50以上の親毒素の負荷１０日をかけ、次にそれらに最終ワクチン接種した。
【０１０３】
経口免疫を１００μｌのＰＢＳ中に懸濁した１〜２０μｇの蛋白質を接種して行った。マウスをイソフルラン(商標「ISO-THESIA」、Abbott Laboratories North社製、シカゴ、IL、米国)で軽く麻酔し、蛋白質を(栄養)補給管を経由して単回投与で投与した。５回投薬を７日間隔で投与した。第３回、第４回及び第５回の免疫後、マウスを７日間飼育し、試験体を、毒素変種への免疫反応性用免疫ブロット法で分析した。マウスにｉ．ｐ．経路を経由して１×１０3ＭＬＤ50以上の親毒素の負荷１０日をかけ、次にそれらに最終ワクチン接種をした。
【０１０４】
経口免疫
スイス・ウェブスターマウス(メス、それぞれ２０−２５グラム)を、Ace Animals社(Boyertown、PA、米国)から購入し、食物及び水を無制限に与えた。マウスを経口で(ｐ．ｏ．)免疫化した。ｐ．ｏ．投与用に、それぞれの動物へ、０．２ｍｌ溶離緩衝剤中に懸濁した４μｇの蛋白質を胃内栄養(補給)針を経由して投与した。マウスを０日に免疫化し、ブースター(追加抗原)を１４、２８、及び４２日に与えた。同一に免疫化したマウスからの血清サンプルを、２１、３５、及び４９日に採取して貯留した．血清採取用に、イソフルラン麻酔下のマウスの眼窩後部叢(retro-orbital plexus)からキャピラリー管により血液を抜き取った。
【０１０５】
免疫化した又はコントロールマウスからの血清を、免疫ブロット分析を使用して抗体のアッセイをした。組み換え型抗原(ホロトキシン又はフラグメント；０．１μｇ／ｌａｎｅ)をSDS-PAGEにより分離し、ニトロセルロース膜へ移した。膜をトリス−緩衝食塩水(ＴＢＳ)中の５％(ｗ／ｖ)粉状無脂肪乳でブロックし、帯状に切断し、種々の血清サンプルを使用して免疫反応性蛋白質の検出を行った。
一次インキュベートを一晩(１８時間)室温で１：１０００希釈血清で行った。次にホースラディッシュペルオキシダーゼ−標識化抗マウスＩｇＧを、１：１００００希釈で１時間室温で使用した。充分な洗浄後、膜を強化型化学発光試薬(商標「ＥＣＬ」、Amersham Biosciences社製、Piscataway、NJ、米国)を使用して処理した。
【０１０６】
酵素結合した免疫吸着剤アッセイ(ELISA)
ELISAを、微小な変更を行った以外はSiegelの記載した方法で行った。高度に精製(＞９５％)BoNT Aを、リン酸緩衝食塩水(ｐＨ７．４)濃度５μｇ／ｍｌとなるように希釈し、次にミクロタイタープレート(１００μｌ／ウェル)へ添加し、４℃で一晩密封容器中でインキュベートした。
１％ＢＳＡの０．１％(ｖ／ｖ)商標「TWEEN」２０を有するＴＢＳ溶液を、不特定の結合をブロックするために使用した。血清サンプルを最初に１：３０に希釈し、続いて４倍希釈して合計７個の希釈液(１：３０〜１：１２２、８８０)とした。希釈血清を毒素被覆したウェル正副２個へ添加した(１００μｌ／ウェル)。第２の抗体は１：１０００に希釈したアルカリホスファターゼ−結合ヤギ抗ヒト又は抗マウスＩｇＡ又はＩｇＧであった。第１及び第２抗体を６０分間３７℃でインキュベートした。ｐ−ニトロフェニルリン酸(１００μｌ／ウェル)を基質として添加した。プレートを室温で３０分間インキュベートし、吸収を４０５ｎｍでミクロプレートリーダーで測定した。上記より、ELISAタイターを、吸収０．２(吸収ユニット)を与える最も高い血清希釈の逆数として定義した。
【０１０７】
鼻内投与後のマウス血漿中の組み換え型BoNTフラグメントの検出用ELISAの獲得
ミクロタイタープレートを、１：１０００希釈したウサギ抗ボツリヌス菌トキソイドＡを含有する被膜緩衝剤(０．１モル濃度Ｎａ2ＣＯ3、ｐＨ９．６)溶液で、１００μｌ／ウェルで、一晩４℃で被覆した。次に吸着残存部位を、洗浄緩衝剤(２０ミリモル濃度ＴＢＳ、０．１％(ｖ／ｖ)商標「TWEEN」２０、ｐＨ７．６)中の１％(ｗ／ｖ)ＢＳＡを添加して１時間３７℃でブロックした。次にプレートを洗浄緩衝剤で４回洗浄した。適切な体積のアッセイ緩衝剤(２０ミリモル濃度ＴＢＳ、ｐＨ７．６)又は適切なマウス血清で抗原を希釈して標準カーブを作成した。標準及び血清のサンプル(１００μｌ／ウェル)を、１時間３７℃でインキュベートし、プレートを上記の様に洗浄した。１：５００希釈したマウス抗BoNT AＨＣを添加し、１時間３７℃でインキュベートした。プレートを緩衝剤で３回洗浄し、洗浄緩衝剤で希釈(１：５０００)したアルカリホスファターゼ−標識化ヤギ抗マウスＩｇＧ結合体１００μｌを添加し、１時間３７℃でインキュベートした。プレートを洗浄後、１００μｌの基質(ｐ−ニトロフェニルリン酸)のグリシン緩衝剤、ｐＨ１０．４(０．１モル濃度グリシン、１ミリモル濃度ＭｇＣｌ2、及び１ミリモル濃度ＺｎＣｌ2)溶液をそれぞれのウェルへ添加した。室温で３０分間インキュベート後、反応を停止し、４０５ｎｍの吸収を測定した。
【０１０８】
実施例で使用した細胞タイプは、T-84ヒト消化管上皮細胞(T-84及びCaco−２細胞)、ヒト肺上皮細胞(Calu−３)、及びMadin-Darbyイヌ腎臓上皮細胞(MDCK細胞)である。これらタイプの細胞は、例えばAmerican Tissue CultureCollection(ATCC)社(Manassas、VA、米国)から市販されている。又、ラット上皮肺胞(alveolar)細胞の第１培養物も使用した。
【０１０９】
実施例１(T-84細胞の頂端面から細胞の基底面へのBoNT Aのトランスサイトーシスのウェスタンブロット法による検知)
この試験は、天然BoNT A及びヒト消化管上皮細胞(T-84細胞)を使用して行った。トランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してT-84細胞培養物を分析した。アッセイを、１×１０-8モル濃度の天然、精製BoNT Aを装置の上部室へ添加して開始した。続いて培養物を１８時間、３７℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、１条件当り３個の、装置の底部室の内容物を集め、商標「CENTRICON」ミクロ濃縮機中で濃縮した。得られた溶液を７．５％(ｗ／ｖ)SDS-PAGE上に流し、続いてニトロセルロース膜へ移した。トランスサイトーシスされた分子の実体及び分子量は、抗ＨＣ抗体を使用したウェスタンブロット法により確認した。
ウェスタンブロットは、トランスサイトーシス前のコントロール(BoNT A)及びT-84細胞を通してトランスサイトーシスされた(即ち、底部室から集めた)BoNT Aは、ほとんど同一のサイズを有することを示した。従って、BoNT Aが効率良くT-84細胞を通過するだけではなく、分子の分子量も変化せず、トランスサイトーシスが行われる機構はBoNTの変性を生じないことを示した。
【０１１０】
実施例２(MDCK細胞中の頂端面から基底面へトランスサイトーシスしたBoNT Aのウェスタンブロット)
この試験は、BoNT A及びMadin-Darbyイヌ腎臓細胞(MDCK細胞)を使用して行った。トランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してMDCK細胞培養物を分析した。アッセイを、１×１０-8モル濃度の天然、精製BoNT Aを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を１８時間、３７℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、１条件当り３個の底部室の内容物を集め、商標「CENTRICON」ミクロ濃縮機中で濃縮した。得られた溶液を７．５％(ｗ／ｖ)SDS-PAGE上に流し、続いてニトロセルロース膜へ移した。トランスサイトーシスされた分子の実体及び分子量は、抗ＨＣ抗体を使用したウェスタンブロット法により確認した。
ウェスタンブロットは、天然BoNT AはMDCK細胞により、弱く結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、放出されたことを示した。結論は、BoNT Aは、細胞の基底面から採取した媒体中には検知されず、BoNT Aは効率良くMDCK細胞を通過しないことを示した。
【０１１１】
実施例３(T-84細胞中の頂端面から基底面へのBoNT Aのトランスサイトーシス)
リシン残基で125Ｉへ結合したBoNT Aのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してヒト消化管上皮細胞(T-84)細胞培養物を分析した。アッセイを１×１０-8モル濃度(125Ｉ)−BoNT Aを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を１８時間、３７℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に底部室の内容物を集め、ゲルろ過した。空隙容量フラクションを放射能アッセイし、毒素ピークを合計して合計数を決定した。トランスサイトーシスの量は、標識化BoNT Aの特定の活性を基礎にして計算した。
結果は、125Ｉｔへ結合したBoNT Aは細胞の頂端面から基底面へ輸送されたことを示した。それは、トランスサイトーシス率１１．２９±０．３０フェムトモル／ｈｒ／ｃｍ2で効率良くT-84細胞を通過した。
実験結果から３つの主要な結論が得られた。第１に、精製ボツリヌス菌神経毒は、分化し、極性化したヒト消化管上皮細胞により、結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、放出される。第２に、125Ｉの結合によるリシン残基の改質は、これら性質を示すホロトキシンの能力を変化させない。第３に、BoNT Aはヒト消化管上皮細胞の頂端面から基底面へ125Ｉ−ボルトンハンター試薬を輸送可能である。
【０１１２】
実施例４(T-84細胞中の基底面から頂端面へのBoNT Aのトランスサイトーシス)
リシン残基で125Ｉへ結合したBoNT Aのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してT-84細胞培養物を分析した。アッセイを１×１０-8モル濃度(125Ｉ)−BoNT Aを底部室へ添加して開始した。続いて培養物を１８時間、３７℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に上部室の内容物を集め、ゲルろ過した。空隙容量フラクションを放射能アッセイし、毒素ピークを合計して合計数を決定した。トランスサイトーシスの量は、標識化BoNT Aの特定の活性を基礎にして計算した。
結果は、125Ｉへ結合したBoNT Aが細胞の基底面から頂端面へ輸送されたことを示した。それは効率良くT-84細胞を通過し、トランスサイトーシス率は８．９８±０．２０フェムトモル／ｈｒ／ｃｍ2と定量された。
【０１１３】
実験結果から３つの主要な結論が得られた。第１に、精製ボツリヌス菌神経毒は、分化し、極性化したヒト消化管上皮細胞により、結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、放出される。このプロセスは、基底面から頂端面への方向では反対の方向よりも幾分効率が良くない。第２に、リシン残基の修飾はこれら性質を示すホロトキシンの能力を変えない。第３に、BoNT Aはヒト消化管上皮細胞の基底面から頂端面へ125Ｉ−ボルトンハンター試薬を輸送可能である。
【０１１４】
実施例５(Caco−２細胞中の頂端面から基底面へのBoNT Aのトランスサイトーシス)
リシン残基で125Ｉへ結合したBoNT Aのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してCaco−２細胞培養物を分析した。アッセイを１×１０-8モル濃度(125Ｉ)−BoNT Aを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を１８時間、３７℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、底部室の内容物を集め、ゲルろ過した。空隙容量フラクションを放射能アッセイし、毒素ピークを合計して合計数を決定した。トランスサイトーシスの量を標識化毒素の特定の活性に基づいて計算した。
【０１１５】
結果は、精製神経毒は細胞の頂端面から基底面へ輸送されたことを示した。BoNT Aは効率良くCaco−２細胞を通過した。トランスサイトーシス率は８．４２±０．４９フェムトモル／ｈｒ／ｃｍ2と定量された。
実験結果から４つの主要な結論が得られた。第１に、精製ボツリヌス菌神経毒は、分化し、極性化したヒト消化管上皮細胞により、結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、放出される。第２に、リシン残基の修飾はこれらの性質を示すホロトキシンの能力を変えない。第３に、BoNT Aはヒト消化管上皮細胞の頂端面から基底面へ125Ｉ−ボルトンハンター試薬を輸送可能である。第４に、ＨＣはヒト消化管上皮細胞通過時に１を超える分子(ＬＣ及びボルトンハンター試薬)を輸送可能である。
【０１１６】
実施例６(MDCK細胞中の頂端面から基底面へのBoNT Aのトランスサイトーシス)
リシン残基で125Ｉへ結合したBoNT Aのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してMadin-Darbyイヌ腎臓(MDCK)細胞培養物を分析した。アッセイを１×１０-8モル濃度(125Ｉ)−BoNT Aを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を１８時間、３７℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、底部室の内容物を集め、ゲルろ過した。空隙容量フラクションを放射能アッセイし、毒素ピークを合計して合計数を決定した。トランスサイトーシスの量は、標識化BoNT Aの特定の活性を基礎にして計算した。
結果は、BoNT Aは細胞の頂端面から基底面へあまり輸送されなかったことを示した。精製神経毒は効率良くMDCK細胞を通過しなかったことが、トランスサイトーシス率の０．０５±０．０１フェムトモル／ｈｒ／ｃｍ2で示された。
BoNT Aは、極性化したMDCK細胞による、結合、内在化、トランスサイトーシス、及び放出は不充分になされた。
【０１１７】
実施例７(T-84細胞中の頂端面から基底面への切れ目のないボツリヌス菌神経毒セロタイプＢのトランスサイトーシス)
リシン残基で125Ｉへ結合した切れ目のないボツリヌス菌神経毒のトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してT-84細胞培養物を分析した。アッセイを１×１０-8モル濃度(125Ｉ)−ｕBoNT Bを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を１８時間、３７℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に底部室の内容物を集め、ゲルろ過した。空隙容量フラクションを放射能アッセイし、毒素ピークを合計して合計数を決定した。トランスサイトーシスの量は、標識化ｕBoNTの特定の活性を基礎にして計算した。
結果は、ｕBoNTは細胞の頂端面から基底面へ輸送されたことを示した。それは９．０１±０．４４フェムトモル／ｈｒ／ｃｍ2の割合で効率良くT-84細胞を通過した。
【０１１８】
実験結果から４つの主要な結論が得られた。第１に、精製、切れ目のないボツリヌス菌神経毒、セロタイプＢは、分化し、極性化したヒト消化管上皮細胞により、結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、放出される。第２に、リシン残基の修飾は、これら性質を示すｕBoNTの能力を変化させない。第３に、ｕBoNTはヒト消化管上皮細胞の頂端面から基底面へ125Ｉ−ボルトンハンター試薬を輸送可能である。第４に、ｕBoNTのＨＣはヒト消化管上皮細胞通過時に１を超える分子(ＬＣ部分及びボルトンハンター試薬)を輸送可能である。
【０１１９】
実施例８(MDCK細胞中の頂端面から基底面への切れ目のないボツリヌス菌神経毒セロタイプＢのトランスサイトーシス)
リシン残基で125Ｉへ結合した切れ目のないボツリヌス菌神経毒のトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してMadin-Darbyイヌ腎臓(MDCK)細胞培養物を分析した。アッセイはｌｘ１０-8モル濃度(125Ｉ)−ボツリヌス菌毒素タイプＢを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を１８時間、３７℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、底部室の内容物を集め、ゲルろ過した。空隙容量フラクションを放射能アッセイし、毒素ピークを合計して合計数を決定した。トランスサイトーシスの量を標識化毒素の特定の活性に基づいて計算した。
結果は、ｕBoNT Bは細胞の頂端面から基底面へあまり輸送されなかったことを示した。それは効率良くMDCK細胞(０．０５±０．００フェムトモル／ｈｒ／ｃｍ2)を通過しなかった。ｕBoNTセロタイプＢは、極性化したMDCK細胞による、結合、内在化、トランスサイトーシス、及び放出は不充分になされた。
【０１２０】
実施例９(T-84細胞中の基底面から頂端面への切れ目のないボツリヌス菌神経毒セロタイプＢのトランスサイトーシス)
リシン残基で125Ｉへ結合した切れ目のないボツリヌス菌神経毒のトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してT-84細胞培養物を分析した。アッセイを１×１０-8モル濃度(125Ｉ)−ｕBoNT Bを底部室へ添加して開始した。続いて培養物を１８時間、３７℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に上部(頂端面)室の内容物を集め、ゲルろ過した。空隙容量フラクションを放射能アッセイし、毒素ピークを合計して合計数を決定した。トランスサイトーシスの量は、標識化ｕBoNTの特定の活性を基礎にして計算した。
結果は、ｕBoNTは細胞の基底面から頂端面への側面へ輸送されたことを示した。ｕBoNTは４．４８±０．００フェムトモル／ｈｒ／ｃｍ2の割合で、効率良くT-84細胞を通過した。
【０１２１】
上記よりいくつかの結論が得られた。第１に、ｕBoNTは分化し、極性化したヒト消化管上皮細胞により結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、放出される。第２に、リシン残基の修飾は、これら性質を示すｕBoNTの能力を変化させない。第３に、ｕBoNTは、ヒト消化管上皮細胞の基底面から頂端面へ125Ｉ−ボルトンハンター試薬を輸送可能である。第４に、ｕBoNTのＨＣはヒト消化管上皮細胞通過時に１を超える分子(ＬＣ及びボルトンハンター試薬)を輸送可能である。
【０１２２】
実施例１０(MDCK細胞中の切れ目のないボツリヌス菌神経毒セロタイプＢの基底面から頂端面へのトランスサイトーシス)
リシン残基で125Ｉへ結合した切れ目のないボツリヌス菌神経毒のトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してMadin-Darbyイヌ腎臓(MDCK)細胞培養物を分析した。アッセイを１×１０-8モル濃度(125Ｉ)−ｕBoNTを底部室へ添加して開始した。続いて培養物を１８時間、３７℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、上部(頂端面)室の内容物を集め、ゲルろ過した。空隙容量フラクションを放射能アッセイし、毒素ピークを合計して合計数を決定した。トランスサイトーシスの量は、標識化ｕBoNTの特定の活性を基礎にして計算した。
結果は、精製ｕBoNTは細胞の基底面から頂端面へあまり輸送されなかったことを示した。精製ｕBoNTは効率良くMDCK細胞(０．０５±０．００フェムトモル／ｈｒ／ｃｍ2)を通過しなかった。
精製ｕBoNT Bは、極性化したMDCK細胞による、結合、内在化、トランスサイトーシス、及び放出は不充分になされた。
【０１２３】
実施例１１(T-84細胞中の頂端面から基底面への切れ目のあるボツリヌス菌神経毒セロタイプＢのトランスサイトーシス)
リシン残基で125Ｉへ結合した切れ目のあるBoNT Bのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してT-84細胞培養物を分析した。アッセイを１×１０-8モル濃度(125Ｉ)−ｎBoNT Bを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を１８時間、３７℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に底部室の内容物を集め、ゲルろ過した。空隙容量フラクションを放射能アッセイし、毒素ピークを合計して合計数を決定した。トランスサイトーシスの量は、標識化ｎBoNT Bの特定の活性を基礎にして計算した。
【０１２４】
結果は、切れ目のある精製神経毒は細胞の頂端面から基底面へ輸送されたことを示した。精製神経毒は、６．５７±０．０７フェムトモル／ｈｒ／ｃｍ2の割合で効率良くT-84細胞を通過した。
上記よりいくつかの結論が得られた。第１に、分化し、極性化したヒト消化管上皮細胞により、精製ｎBoNT Bは、結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、放出される。第２に、リシン残基の修飾はこれら性質を示すホロトキシンの能力を変えない。第３に、ｎBoNT Bはヒト消化管上皮細胞の頂端面から基底面へ125Ｉ−ボルトンハンター試薬を輸送可能である。第４に、ｎBoNT BのＨＣはヒト消化管上皮細胞通過時に１を超える分子(ＬＣ及びボルトンハンター試薬)を輸送可能である。
【０１２５】
実施例１２(MDCK細胞中の頂端面から基底面への切れ目のあるボツリヌス菌神経毒セロタイプＢのトランスサイトーシス)
リシン残基で125Ｉへ結合したｎBoNT Bのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してMadin-Darbyイヌ腎臓(MDCK)細胞培養物を分析した。アッセイを１×１０-8モル濃度(125Ｉ)−ｎBoNT Bを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を１８時間、３７℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、底部室の内容物を集め、ゲルろ過した。空隙容量フラクションを放射能アッセイし、毒素ピークを合計して合計数を決定した。トランスサイトーシスの量は、標識化ｎBoNTの特定の活性を基礎にして計算した。
【０１２６】
結果は、精製ｎBoNTは細胞の頂端面から基底面へあまり輸送されなかったことを示した。精製ｎBoNTは効率良くMDCK細胞(０．０５±０．００フェムトモル／ｈｒ／ｃｍ2)を通過しなかった。
精製ｎBoNT Bは、極性化したMDCK細胞による、結合、内在化、トランスサイトーシス、及び放出は不充分になされた。
【０１２７】
実施例１３(T-84細胞中の基底面から頂端面への切れ目のあるボツリヌス菌神経毒セロタイプＢのトランスサイトーシス)
リシン残基で125Ｉへ結合したｎBoNT Bのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してヒト消化管上皮(T-84)細胞培養物を分析した。アッセイは１ｘ１０-8モル濃度(125Ｉ)−ｎBoNT Bを底部室へ添加して開始した。続いて培養物を１８時間、３７℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に上部(頂端面)室の内容物を集め、ゲルろ過した。空隙容量フラクションを放射能アッセイし、毒素ピークを合計して合計数を決定した。トランスサイトーシスの量は、標識化ｎBoNT Bの特定の活性を基礎にして計算した。
結果は、ｎBoNTは細胞の基底面から頂端面への側面へ輸送されたことを示した。精製ｎBoNTは、５．５４±０．００フェムトモル／ｈｒ／ｃｍ2の割合で効率良くT-84細胞を通過した。
【０１２８】
上記よりいくつかの結論が得られた。第１に、精製ｎBoNT Bは、分化し、極性化したヒト消化管上皮細胞により結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、放出される。第２に、リシン残基の修飾は、これら性質を示すｎBoNT Bの能力を変化させない。第３に、ｎBoNT Bはヒト消化管上皮細胞の基底面から頂端面へ125Ｉ−ボルトンハンター試薬を輸送可能である。第４に、ｎBoNT BのＨＣはヒト消化管上皮細胞通過時に１を超える分子(ＬＣ及びボルトンハンター試薬)を輸送可能である。
【０１２９】
実施例１４(MDCK細胞中の基底面から頂端面への切れ目のあるボツリヌス菌神経毒セロタイプＢのトランスサイトーシス)
リシン残基で125Ｉへ結合したｎBoNT Bのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してMadin-Darbyイヌ腎臓(MDCK)細胞培養物を分析した。アッセイを１×１０-8モル濃度(125Ｉ)−BoNT Bを底部室へ添加して開始した。続いて培養物を１８時間、３７℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、上部(頂端面)室の内容物を集め、ゲルろ過した。空隙容量フラクションを放射能アッセイし、毒素ピークを合計して合計数を決定した。トランスサイトーシスの量は、標識化ｎBoNTの特定の活性を基礎にして計算した。
結果は、精製ｎBoNT Bは細胞の基底面から頂端面へあまり輸送されなかったことを示した。精製ｎBoNT Bは効率良くMDCK細胞(０．０５±０．００フェムトモル／ｈｒ／ｃｍ2)を通過しなかった。精製ｎBoNT Bは、極性化したMDCK上皮細胞による、結合、内在化、トランスサイトーシス、及び放出は不充分になされた。
【０１３０】
実施例１５(T-84細胞中の頂端面から基底面へトランスサイトーシスしたＨＣのウェスタンブロット)
ＨＣ、セロタイプＡのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してヒト消化管上皮(T-84)細胞培養物を分析した。アッセイを１×１０-8モル濃度ＨＣを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を１８時間、３７℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、１条件当り３個の底部室の内容物を集め、商標「CENTRICON」ミクロ濃縮機中で濃縮した。得られた溶液を７．５％(ｗ／ｖ)SDS-PAGE上に流し、続いてニトロセルロース膜へ移した。トランスサイトーシスした分子の実体及び分子量は、抗ＨＣ抗体を使用したウェスタンブロット法により確認した。
【０１３１】
結果は、ＨＣは細胞の頂端面から基底面へ輸送したことを確認した。ＨＣが効率良くT-84細胞を通過しただけでなく、分子の分子量は変化しなかった。
実験結果から２つの主要な結論が得られた。第１に、ボツリヌス菌神経毒のＨＣは分化し、極性化したヒト消化管上皮細胞により結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、放出される。第２に、トランスサイトーシス後、基底面上へ放出される天然ＨＣの分子サイズは変化していなかった。そのことからトランスサイトーシスのプロセスはＨＣの物理的構造を変えないという結論が導かれる。
【０１３２】
実施例１６(MDCK細胞中の頂端面から基底面へトランスサイトーシスしたＨＣのウェスタンブロット)
ＨＣ、セロタイプＡのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してMadin-Darbyイヌ腎臓(MDCK)細胞培養物を分析した。アッセイを１×１０-8モル濃度ＨＣを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を１８時間、３７℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、１条件当り３個の底部(基底面)室の内容物を集め、商標「CENTRICON」ミクロ濃縮機中で濃縮した。得られた溶液を７．５％(ｗ／ｖ)SDS-PAGE上に流し、続いてニトロセルロース膜へ移した。トランスサイトーシスした分子の実体及び分子量は、抗ＨＣ抗体を使用したウェスタンブロット法により確認した。
結果は、ＨＣは細胞の基底面から採取した媒体中には検知されなかったことを示した。従って、ＨＣは効率良くMDCK細胞を通過しなかった。ボツリヌス菌神経毒のＨＣは、極性化したMDCK細胞による、結合、内在化、トランスサイトーシス、及び放出は不充分になされた。
【０１３３】
実施例１７(T-84細胞中の頂端面から基底面へのＨＣのトランスサイトーシス)
リシン残基で125Ｉへ結合したＨＣ、セロタイプＡのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してヒト消化管上皮(T-84)細胞培養物を分析した。アッセイを１×１０-8モル濃度(125Ｉ)ＨＣを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を１８時間、３７℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、底部室の内容物を集め、ゲルろ過した。空隙容量フラクションを放射能アッセイし、毒素ピークを合計して合計数を決定した。トランスサイトーシスの量は、標識化ＨＣの特定の活性を基礎にして計算した。
結果は、ＨＣは細胞の頂端面から基底面へ輸送されたことを示した。ＨＣが効率良くT-84細胞を通過しただけでなく、得られたトランスサイトーシス率(７．１０±０．００フェムトモル／ｈｒ／ｃｍ2)は精製BoNT Aのトランスサイトーシス率(１１．３４フェムトモル／ｈｒ／ｃｍ2)に匹敵した。
３つの主要な結論が得られた。第１に、ＨＣ、セロタイプＡは、分化し、極性化したヒト消化管上皮細胞により、結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、放出される。第２に、リシン残基の修飾は、これら性質を示すＨＣの能力を変化させない。第３に、ＨＣはヒト消化管上皮細胞の頂端面から基底面へ125Ｉ−ボルトンハンター試薬を輸送可能である。
【０１３４】
実施例１８(MDCK細胞中の頂端面から基底面へのBoNT AＨＣのトランスサイトーシス)
リシン残基で125Ｉへ結合したＨＣ、セロタイプＡのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してMadin-Darbyイヌ腎臓(MDCK)細胞培養物を分析した。アッセイを１×１０-8モル濃度(125Ｉ)−ＨＣを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を１８時間、３７℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、底部室の内容物を集め、ゲルろ過した。空隙容量フラクションを放射能アッセイし、毒素ピークを合計して合計数を決定した。トランスサイトーシスの量は、標識化ＨＣの特定の活性を基礎にして計算した。
結果は、ＨＣは細胞の頂端面から基底面へあまり輸送されなかったことを示した。ＨＣは効率良くMDCK細胞を通過しなかったことが、トランスサイトーシス率の０．０６±０．００フェムトモル／ｈｒ／ｃｍ2で示された。ＨＣ、セロタイプＡは、極性化した腎臓上皮細胞による、結合、内在化、トランスサイトーシス、及び放出は不充分になされた。
【０１３５】
実施例１９(T-84細胞中の頂端面から基底面へトランスサイトーシスした６６ｋＨＣのウェスタンブロット)
６６ｋＨＣ、セロタイプＡのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してヒト消化管上皮(T-84)細胞培養物を分析した。アッセイを１×１０-8モル濃度６６ｋＨＣを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を１８時間、３７℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、１条件当り３個の底部室の内容物を集め、商標「CENTRICON」ミクロ濃縮機中で濃縮した。得られた溶液を７．５％(ｗ／ｖ)SDS-PAGE上に流し、続いてニトロセルロース膜へ移した。トランスサイトーシスされた分子の実体及び分子量は、抗ＨＣ抗体を使用したウェスタンブロット法により確認した。
【０１３６】
結果は、６６ｋＨＣは細胞の頂端面から基底面へ輸送されたことを確認した。６６ｋＨＣが効率良くT-84細胞を通過したばかりでなく、分子の分子量は変化しなかった。
これら結果から３つの主要な結論が下記の通り得られた。第１に、６６ｋＨＣは分化し、極性化したヒト消化管上皮細胞により、結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、放出される。第２に、トランスサイトーシス後、基底面に放出された６６ｋＨＣの分子サイズは、変化していなかった。第３に、６６ｋＨＣはヒト消化管上皮細胞の頂端面から基底面へ６×−ヒスチジン標識を輸送可能である。
【０１３７】
実施例２０(MDCK細胞中の頂端面から基底面へトランスサイトーシスした６６ｋＨＣのウェスタンブロット)
６６ｋＨＣ、セロタイプＡのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してMadin-Darbyイヌ腎臓(MDCK)細胞培養物を分析した。アッセイを１×１０-8モル濃度６６ｋＨＣを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を１８時間、３７℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、１条件当り３個の底部室の内容物を集め、商標「CENTRICON」ミクロ濃縮機中で濃縮した。得られた溶液を７．５％(ｗ／ｖ)SDS-PAGE上に流し、続いてニトロセルロース膜へ移した。トランスサイトーシスされた分子の実体及び分子量は、抗ＨＣ抗体を使用したウェスタンブロット法により確認した。
結果は、６６ｋＨＣは細胞の基底面から採取した媒体中には検知されなかったことを示した。従って、６６ｋＨＣは効率良くMDCK細胞を通過しなかった。６６ｋＨＣは、極性化したMDCK細胞による、結合、内在化、トランスサイトーシス、及び放出は不充分になされた。
【０１３８】
実施例２１(T-84細胞中の頂端面から基底面へトランスサイトーシスした５０ｋＨＣのウェスタンブロット)
５０ｋＨＣ、セロタイプＡのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してヒト消化管上皮(T-84)細胞培養物を分析した。アッセイを１×１０-8モル濃度５０ｋＨＣを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を１８時間、３７℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、１条件当り３個の底部室の内容物を集め、商標「CENTRICON」ミクロ濃縮機中で濃縮した。得られた溶液を７．５％(ｗ／ｖ)SDS-PAGE上に流し、続いてニトロセルロース膜へ移した。トランスサイトーシスされた分子の実体及び分子量は、抗ＨＣ抗体を使用したウェスタンブロット法により確認した。
結果は、５０ｋＨＣフラグメントは細胞の頂端面から基底面へ輸送されたことを確認した。５０ｋＨＣは効率良くT-84細胞を通過するだけではなく、分子の分子量は変化しなかった。
【０１３９】
実験結果から３つの主要な結論が得られた。第１に、５０ｋＨＣは、分化し、極性化したヒト消化管上皮細胞により結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、放出される。第２に、トランスサイトーシス後、基底面に放出された５０ｋＨＣフラグメントの分子サイズは変化していなかった。第３に、５０ｋＨＣフラグメントはヒト消化管上皮細胞の頂端面から基底面へ６×−ヒスチジン標識を輸送可能である。
【０１４０】
実施例２２(MDCK細胞中の頂端面から基底面へトランスサイトーシスした５０ｋＨＣのウェスタンブロット)
５０ｋＨＣ、セロタイプＡのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してMadin-Darbyイヌ腎臓(MDCK)細胞培養物を分析した。アッセイを１×１０-8モル濃度５０ｋＨＣを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を１８時間、３７℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、１条件当り３個の底部室の内容物を集め、商標「CENTRICON」ミクロ濃縮機中で濃縮した。得られた溶液を７．５％(ｗ／ｖ)SDS-PAGE上に流し、続いてニトロセルロース膜へ移した。トランスサイトーシスされた分子の実体及び分子量は、抗ＨＣ抗体を使用したウェスタンブロット法により確認した。
結果は、５０ｋＨＣは細胞の基底面から採取した媒体中には検知されなかったことを示した。従って、５０ｋＨＣは効率良くMDCK細胞を通過しなかった。従って、５０ｋボツリヌス菌神経毒のＨＣは、極性化したMDCK細胞による、結合、内在化、トランスサイトーシス、及び放出は不充分になされた。
【０１４１】
実施例２３(T-84細胞中の頂端面から基底面への５０ｋＨＣのトランスサイトーシス)
リシン残基で125Ｉへ結合した５０ｋＨＣ、セロタイプＡのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してヒト消化管上皮(T-84)細胞培養物を分析した。アッセイを１×１０-8モル濃度(125Ｉ)−５０ｋＨＣを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を１８時間、３７℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、底部室の内容物を集め、ゲルろ過した。空隙容量フラクションを放射能アッセイし、毒素ピークを合計して合計数を決定した。トランスサイトーシスの量は、標識化５０ｋＨＣの特定の活性を基礎にして計算した。
結果は、５０ｋＨＣは細胞の頂端面から基底面へ輸送されたことを示した。５０ｋＨＣは効率良くT-84細胞を通過するだけではなく、トランスサイトーシス率(１３．９７±０．００フェムトモル／ｈｒ／ｃｍ2)は精製BoNT Aのトランスサイトーシス率(１１．３４フェムトモル／ｈｒ／ｃｍ2)に匹敵した。
【０１４２】
実験結果から５つの主要な結論が得られた。第１に、ボツリヌス菌神経毒の５０ｋＨＣフラグメントは、分化し、極性化したヒト消化管上皮細胞により結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、放出される。第２に、リシン残基の修飾は、これら性質を示す５０ｋＨＣフラグメントの能力を変化させない。第３に、５０ｋＨＣはヒト消化管上皮細胞の頂端面から基底面へ125Ｉ−ボルトンハンター試薬を輸送可能である。第４に、５０ｋＨＣフラグメントはヒト消化管上皮細胞の頂端面から基底面へ６×−ヒスチジン標識を輸送可能である。第５に、５０ｋＨＣフラグメントはヒト消化管上皮細胞通過時に１を超える分子(ポリヒスチジン標識及びボルトンハンター試薬)を輸送可能である。
【０１４３】
実施例２４(MDCK細胞中の頂端面から基底面への５０ｋＨＣのトランスサイトーシス)
リシン残基で125Ｉへ結合した５０ｋＨＣ、セロタイプＡのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してMadin-Darbyイヌ腎臓(MDCK)細胞培養物を分析した。アッセイを１×１０-8モル濃度(125Ｉ)−５０ｋＨＣを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を１８時間、３７℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、底部室の内容物を集め、ゲルろ過した。空隙容量フラクションを放射能アッセイし、毒素ピークを合計して合計数を決定した。トランスサイトーシスの量は、標識化５０ｋＨＣの特定の活性を基礎にして計算した。
結果は、５０ｋＨＣは細胞の頂端面から基底面へあまり輸送されなかったことを示した。５０ｋＨＣが効率良くMDCK細胞を通過しなかったことが、トランスサイトーシス率の０．０６±０．００フェムトモル／ｈｒ／ｃｍ2で示された。従って、ボツリヌス菌神経毒の５０ｋＨＣフラグメントは、極性化したMDCK上皮細胞による、結合、内在化、トランスサイトーシス、及び放出は不充分になされた。
【０１４４】
実施例２５(T-84細胞中の頂端面から基底面への商標「ALEXAFLUOR」−５６８BoNT Aのトランスサイトーシス)
リシン残基で125Ｉへ結合した商標「ALEXAFLUOR」５６８BoNT Aのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してヒト消化管上皮(T-84)細胞培養物を分析した。アッセイを１×１０-8モル濃度商標「ALEXAFLUOR」５６８−BoNT Aを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を１８時間、３７℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に底部室の内容物を集め、蛍光分光法で分析した。関連するトランスサイトーシスの量は商標「ALEXAFLUOR」５６８BoNT A結合体の発光ピークに基づいて示した。
結果は、精製BoNT Aは小分子を細胞の頂端面から基底面輸送したことを示した。精製BoNT Aは効率良くT-84細胞を通過し、小分子が共輸送された。
【０１４５】
実験結果から３つの主要な結論が得られた。第１に、精製BoNT Aは分化し、極性化したヒト消化管上皮細胞により結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、放出される。第２に、リシン残基の修飾はこれら性質を示すホロトキシンの能力を変えない。第３に、BoNT Aはヒト消化管上皮細胞の頂端面から基底面へ商標「ALEXAFLUOR」５６８を輸送可能である。
【０１４６】
実施例２６(MDCK細胞中の頂端面から基底面への商標「ALEXAFLUOR」５６８BoNT Aのトランスサイトーシス)
リシン残基で125Ｉへ結合した商標「ALEXAFLUOR」５６８BoNT Aのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してMadin-Darbyイヌ腎臓(MDCK)細胞培養物を分析した。アッセイを１×１０-8モル濃度商標「ALEXAFLUOR」５６８−BoNT Aを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を１８時間、３７℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に底部室の内容物を集め、蛍光分光法で分析した。関連するトランスサイトーシスの量は商標「ALEXAFLUOR」５６８−標識化BoNT A結合体の発光ピークに基づいて示した。
結果は、精製BoNT Aは細胞の頂端面から基底面へ効率良く小分子を輸送しなかったことを示した。精製BoNT Aは効率良くMDCK細胞培養物中の小分子を共輸送しなかった。精製BoNT Aは、分化し、極性化したイヌ腎臓上皮細胞による、結合、内在化、トランスサイトーシス、及び放出は不充分になされたため、これら細胞を通して小分子を輸送できなかった。
【０１４７】
実施例２７(T-84細胞中の頂端面から基底面へのビオチン−５０ｋＨＣのトランスサイトーシス)
ビオチン−５０ｋＨＣ、セロタイプＡのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してヒト消化管上皮(T-84)細胞培養物を分析した。アッセイを１×１０-7モル濃度ビオチン−５０ｋＨＣを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を１８時間、３７℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、１条件当り３個の底部室の内容物を集め、商標「CENTRICON」ミクロ濃縮機中で濃縮した。得られた溶液を７．５％(ｗ／ｖ)SDS-PAGE上に流し、続いてニトロセルロース膜へ移した。トランスサイトーシスされた分子の実体及び分子量は、抗ＨＣ抗体を使用したウェスタンブロット法及びコピーしたブロットをアビジン−ＨＲＰでプローブすることにより確認した。
結果は、ビオチン−５０ｋＨＣは細胞の頂端面から基底面へ輸送されたことを確認した。ビオチン−５０ｋＨＣは効率良くT-84細胞を通過するだけではなく、分子の分子量及び受容体結合性は変化しなかった。
【０１４８】
６つの結論が得られた。第１に、ビオチン−５０ｋＨＣは分化し、極性化したヒト消化管上皮細胞により結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、放出される。第２に、ビオチン添加によるフラグメントの改質は、これら性質を示す５０ｋＨＣフラグメントの能力を変化させない。第３に、５０ｋＨＣフラグメントはヒト消化管上皮細胞の頂端面から基底面へビオチンを輸送可能である。第４に、輸送されたビオチン分子は、そのリガンド結合性及びアビジンとの関連性を保持する。第５に、５０ｋＨＣフラグメントはヒト消化管上皮細胞の頂端面から基底面へ６×−ヒスチジン標識を輸送可能である。第６に、５０ｋＨＣフラグメントはヒト消化管上皮細胞通過時に１を超える分子(ポリヒスチジン標識及びビオチン)を輸送可能である。
【０１４９】
実施例２８(MDCK細胞中の頂端面から基底面へのビオチン−５０ｋＨＣのトランスサイトーシス)
ビオチン−５０ｋＨＣ、セロタイプＡのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してMadin-Darbyイヌ腎臓(MDCK)細胞培養物を分析した。アッセイを１×１０-7モル濃度ビオチン−５０ｋＨＣを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を１８時間、３７℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、１条件当り３個の底部室の内容物を集め、商標「CENTRICON」ミクロ濃縮機中で濃縮した。得られた溶液を７．５％(ｗ／ｖ)SDS-PAGE上に流し、続いてニトロセルロース膜へ移した。トランスサイトーシスされた分子の実体及び分子量は、抗ＨＣ抗体を使用したウェスタンブロット法及びコピーしたブロットをアビジン−ＨＲＰでプローブすることにより確認した。
結果は、ビオチン−５０ｋＨＣは細胞の頂端面から基底面へ効率良く輸送されなかったことを確認した。精製５０ｋＨＣはMDCK培養物中の２４４ドルトン−ビオチン分子を効率良く共輸送しなかった。
実験結果から２つの主要な結論が得られた。第１に、ビオチン−５０ｋＨＣは、分化し、極性化したイヌ腎臓上皮細胞により結合されず、内在化せず、トランスサイトーシスせず、放出されなかった。第２に、５０ｋＨＣはイヌ腎臓上皮細胞のの頂端面から基底面へビオチンを輸送しなかった。
【０１５０】
実施例２９(T-84細胞中の頂端面から基底面への緑色蛍光蛋白質６６ｋＨＣのトランスサイトーシス)
緑色蛍光蛋白質６６ｋＨＣ、セロタイプＡのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してヒト消化管上皮(T-84)細胞培養物を分析した。アッセイを１×１０-8モル濃度ＧＦＰ−６６ｋＨＣを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を１８時間、３７℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、底部室の内容物を集め、蛍光分光法で分析した。関連するトランスサイトーシスの量はＧＦＰ−６６ｋＨＣ結合体の発光ピークを基礎に示した。
結果は、６６ｋＨＣは細胞の頂端面から基底面へ緑色蛍光蛋白質６６ｋＨＣを輸送したことを示した。精製フラグメントは効率良くT-84細胞を通過し、緑色蛍光蛋白質６６ｋＨＣが共輸送された。
【０１５１】
４(６？)つの結論が得られた。第１に、６６ｋＨＣは分化し、極性化したヒト消化管上皮細胞により結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、放出される。第２に、ＧＦＰ添加による６６ｋＨＣの改質は、これら性質を示す６６ｋＨＣの能力を変化させない。第３に、６６ｋＨＣはヒト消化管上皮細胞の頂端面から基底面へＧＦＰを輸送可能である。第４に、輸送されたＧＦＰ分子はその蛍光発光性を保持する。第５に、６６ｋＨＣはヒト消化管上皮細胞の頂端面から基底面へ６×−ヒスチジン標識を輸送可能である。第６に、６６ｋＨＣはヒト消化管上皮細胞を通して１を超える分子を同時に(ポリヒスチジン標識及びＧＦＰ)輸送可能である。
【０１５２】
実施例３０(MDCK細胞中の頂端面から基底面への緑色蛍光蛋白質６６ｋＨＣのトランスサイトーシス)
緑色蛍光蛋白質６６ｋＨＣのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してMadin-Darbyイヌ腎臓(MDCK)細胞培養物を分析した。アッセイを１×１０-8モル濃度ＧＦＰ−６６ｋＨＣを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を１８時間、３７℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、底部室の内容物を集め、蛍光分光法で分析した。関連するトランスサイトーシスの量はＧＦＰ−６６ｋＨＣ結合体の発光ピークを基礎に示した。
結果は、６６ｋＨＣはＧＦＰ細胞の頂端面から基底面へは効率良く輸送しなかったことを示した。精製６６ｋＨＣフラグメントはMDCK細胞培養物中のＧＦＰを効率良く輸送しなかった。６６ｋＨＣは、分化し、極性化したイヌ腎臓上皮細胞による、結合、内在化、トランスサイトーシス、及び放出は不充分になされた。
【０１５３】
実施例３１(T-84細胞中の頂端面から基底面への商標「S-TAG」−５０ｋＨＣのトランスサイトーシス)
商標「S-TAG」５０ｋＨＣ、セロタイプＡのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してヒト消化管上皮(T-84)細胞培養物を分析した。アッセイを１×１０-8モル濃度商標「S-TAG」−５０ｋＨＣを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を１８時間、３７℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、１条件当り３個の底部室の内容物を集め、商標「CENTRICON」ミクロ濃縮機中で濃縮した。得られた溶液を７．５％(ｗ／ｖ)SDS-PAGE上に流し、続いてニトロセルロース膜へ移した。トランスサイトーシスされた分子の実体及び分子量は、抗ＨＣ抗体を使用したウェスタンブロット法により確認した。
結果は、商標「S-TAG」−５０ｋＨＣは細胞の頂端面から基底面へ輸送されたことを確認した。商標「S-TAG」−５０ｋＨＣは効率良くT-84細胞を通過するだけではなく、分子の分子量は変化しなかった。
【０１５４】
６つの結論が得られた。第１に、商標「S-TAG」−５０ｋＨＣは分化し、極性化したヒト消化管上皮細胞により結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、放出される。第２に、商標「S-TAG」の添加による５０ｋＨＣの改質は、これら性質を示す５０ｋＨＣの能力を変化させない。第３に、５０ｋＨＣはヒト消化管上皮細胞の頂端面から基底面へ商標「S-TAG」を輸送可能である第４に、輸送された商標「S-TAG」分子はその抗体結合性を保持する。第５に、５０ｋＨＣはヒト消化管上皮細胞の頂端面から基底面へ６×−ヒスチジン標識を輸送可能である。第６に、５０ｋＨＣはヒト消化管上皮細胞通過時に１を超える分子(ポリヒスチジン標識及び商標「S-TAG」)を輸送可能である。
【０１５５】
実施例３２(MDCK細胞中の頂端面から基底面への商標「S-TAG」−５０ｋＨＣのトランスサイトーシス)
商標「S-TAG」−５０ｋＨＣ、セロタイプＡのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してMadin-Darbyイヌ腎臓(MDCK)細胞培養物を分析した。アッセイを１×１０-8モル濃度商標「S-TAG」−５０ｋＨＣを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を１８時間、３７℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、１条件当り３個の底部室の内容物を集め、商標「CENTRICON」ミクロ濃縮機中で濃縮した。得られた溶液を７．５％(ｗ／ｖ)SDS-PAGE上に流し、続いてニトロセルロース膜へ移した。トランスサイトーシスされた分子の実体及び分子量は、抗ＨＣ抗体を使用したウェスタンブロット法により確認した。
結果は、商標「S-TAG」−５０ｋＨＣは、細胞の基底面から採取した媒体中には検知されなかったことを示した。従って、商標「S-TAG」−５０ｋＨＣは効率良くMDCK細胞を通過しなかった。商標「S-TAG」−５０ｋＨＣは、極性化したMDCK細胞による、結合、内在化、トランスサイトーシス、及び放出は不充分になされた。
【０１５６】
実施例３３(T-84細胞中の頂端面から基底面へのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ(GST)−８８ｋＨＣ結合体のトランスサイトーシス)
GST−８８ｋＨＣ、セロタイプＡのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してヒト消化管上皮(T-84)細胞培養物を分析した。アッセイを１×１０-8モル濃度GST−８８ｋＨＣを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を１８時間、３７℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、１条件当り３個の底部室の内容物を集め、商標「CENTRICON」ミクロ濃縮機中で濃縮した。得られた溶液を７．５％(ｗ／ｖ)SDS-PAGE上に流し、続いてニトロセルロース膜へ移した。トランスサイトーシスされた分子の実体及び分子量は、抗ＨＣ抗体を使用したウェスタンブロット法及びコピーしたブロットを抗GST抗体でプローブすることによりにより確認した。
結果は、GST−８８ｋＨＣは細胞の頂端面から基底面へ輸送されたことを確認した。GST−８８ｋＨＣは効率良くT-84細胞を通過するだけではなく、分子の分子量は変化しなかった。
【０１５７】
実験結果から６つの主要な結論が得られた。GST−８８ｋＨＣは分化し、極性化したヒト消化管上皮細胞により、結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、放出される。第２に、GST添加による８８ｋＨＣの改質は、これら性質を示す８８ｋＨＣの能力を変化させない。第３に、９９ｋＨＣはヒト消化管上皮細胞の頂端面から基底面へGSTを輸送可能である。第４に、輸送されたGST分子はその酵素的性質を保持する。第５に、８８ｋＨＣはヒト消化管上皮細胞の頂端面から基底面へ６×−ヒスチジン標識を輸送可能である。第６に、８８ｋＨＣはヒト消化管上皮細胞通過時に１を超える分子(ポリヒスチジン標識及びGST)を輸送可能である。
【０１５８】
実施例３４(MDCK細胞中の頂端面から基底面へのGST−８８ｋＨＣのトランスサイトーシス)
GST−８８ｋＨＣ、セロタイプＡのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してMDCK細胞培養物を分析した。アッセイを１×１０-8モル濃度GST−８８ｋＨＣを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を１８時間、３７℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、１条件当り３個の底部室の内容物を集め、商標「CENTRICON」ミクロ濃縮機中で濃縮した。得られた溶液を７．５％(ｗ／ｖ)SDS-PAGE上に流し、続いてニトロセルロース膜へ移した。トランスサイトーシスされた分子の実体及び分子量は、抗ＨＣ抗体を使用したウェスタンブロット法及びコピーしたブロットを抗GST抗体でプローブすることにより確認した。結果は細胞の頂端面から基底面へGST−８８ｋＨＣを効率良く輸送しなかったことを示した。
【０１５９】
実施例３５(T-84細胞中のGST−６６ｋＨＣの頂端面から基底面へのトランスサイトーシス)
GST−６６ｋＨＣ、セロタイプＡのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してヒト消化管上皮(T-84)細胞培養物を分析した。アッセイを１×１０-8モル濃度GST−６６ｋＨＣを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を１８時間、３７℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、１条件当り３個の底部室の内容物を集め、商標「CENTRICON」ミクロ濃縮機中で濃縮した。得られた溶液を７．５％(ｗ／ｖ)SDS-PAGE上に流し、続いてニトロセルロース膜へ移した。トランスサイトーシスされた分子の実体及び分子量は、抗ＨＣ抗体を使用したウェスタンブロット法及びコピーしたブロットを抗GST抗体でプローブすることによりにより確認した。
結果は、GST−６６ｋＨＣは細胞の頂端面から基底面へ輸送されたことを確認した。GST−６６ｋＨＣは効率良くT-84細胞を通過するだけではなく、分子の分子量は変化しなかった。
【０１６０】
実験結果から６つの主要な結論が得られた。第１に、GST−６６ｋＨＣは分化し、極性化したヒト消化管上皮細胞により結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、放出される。第２に、GSTの添加による６６ｋＨＣの改質は、これら性質を示す６６ｋＨＣの能力を変化させない。第３に、６６ｋＨＣはヒト消化管上皮細胞の頂端面から基底面へGSTを輸送可能である。第４に、輸送されたGST分子はその酵素的性質を保持する。第５に、６６ｋＨＣはヒト消化管上皮細胞の頂端面から基底面へ６×−ヒスチジン標識を輸送可能である。第６に、６６ｋＨＣはヒト消化管上皮細胞通過時に１を超える分子(ポリヒスチジン標識及びGST)を輸送可能である。
【０１６１】
実施例３６(MDCK細胞中のGST−６６ｋＨＣの頂端面から基底面へのトランスサイトーシス)
GST−６６ｋＨＣ、セロタイプＡのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してMDCK細胞培養物を分析した。アッセイを１×１０-8モル濃度GST−６６ｋＨＣを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を１８時間、３７℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、１条件当り３個の底部室の内容物を集め、商標「CENTRICON」ミクロ濃縮機中で濃縮した。得られた溶液を７．５％(ｗ／ｖ)SDS-PAGE上に流し、続いてニトロセルロース膜へ移した。トランスサイトーシスされた分子の実体及び分子量は、抗ＨＣ抗体を使用したウェスタンブロット法及びコピーしたブロットを抗GST抗体でプローブすることにより確認した。
結果は、GST−６６ｋＨＣは細胞の頂端面から基底面へ効率良く輸送されなかったことを示した。精製GST−６６ｋＨＣは効率良くMDCK培養物を通過しなかった。GST−６６ｋＨＣは、極性化したイヌ腎臓上皮細胞による、結合、内在化、トランスサイトーシス、及び放出は不充分になされた。
【０１６２】
実施例３７(Calu−３細胞中の頂端面から基底面へのBoNT Aのトランスサイトーシス)
トランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してCalu−３細胞培養物を分析した。アッセイを１×１０-8モル濃度(125Ｉ)−BoNT Aを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を１８時間、３７℃でインキュベートした。それぞれの段階で実験の底部室の内容物を集め、ゲルろ過した。空隙容量フラクションを放射能アッセイし、毒素ピークを合計して合計数を決定した。トランスサイトーシスの量を標識化毒素の特定の活性に基づいて計算した。
結果は、BoNT Aは細胞の頂端面から基底面へ輸送されたことを示した。精製神経毒は効率良くCalu−３細胞を通過した。トランスサイトーシス率は０．４２３±０．０７６フェムトモル／ｈｒ／ｃｍ2と定量された。
【０１６３】
実験結果から５つの主要な結論が得られた。第１に、精製ボツリヌス菌神経毒は分化し、極性化したヒト肺胞上皮細胞により結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、放出される。第２に、リシン残基の修飾はこれら性質を示すホロトキシンの能力を変えない。第３に、ホロトキシンはヒト肺胞上皮細胞の頂端面から基底面へ125Ｉ−ボルトンハンター試薬を輸送可能である。第４に、ＨＣはヒト肺胞上皮細胞の頂端面から基底面へＬＣを輸送可能である。第５に、ＨＣはヒト肺胞上皮細胞を通過する時に１を超える分子(ＬＣ及びボルトンハンター試薬)を輸送可能である。
【０１６４】
実施例３８(Calu−３細胞中の基底面から頂端面へのBoNT Aのトランスサイトーシス)
トランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してCalu−３細胞培養物を分析した。アッセイを１×１０-8モル濃度(125Ｉ)−BoNT Aを底部室へ添加して開始した。続いて培養物を１８時間、３７℃でインキュベートした。それぞれの段階で実験の上部室の内容物を集め、ゲルろ過した。空隙容量フラクションを放射能アッセイし、毒素ピークを合計して合計数を決定した。トランスサイトーシスの量は、標識化BoNT Aの特定の活性を基礎にして計算した。
結果は、BoNT Aは細胞の基底面から頂端面への側面へ輸送されたことを示した。精製神経毒は効率良くCalu−３細胞を通過した。又、トランスサイトーシス率は０．２０６±０．０３７フェムトモル／ｈｒ／ｃｍ2と定量された。
【０１６５】
実験結果から５つの主要な結論が得られた。第１に、精製ボツリヌス菌神経毒は分化し、極性化したヒト肺胞上皮細胞により結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、放出される。このプロセスは、基底面から頂端面への方向では反対の方向よりも幾分効率が良くない。第２に、リシン残基の修飾はこれら性質を示すホロトキシンの能力を変えない。第３に、ホロトキシンは125Ｉ−ボルトンハンター試薬をヒト消化管上皮細胞の基底面から頂端面へ輸送可能である。第４に、ＨＣはヒト消化管上皮細胞の基底面から頂端面へＬＣを輸送可能である。第５に、ＨＣはヒト肺胞上皮細胞を通過する時に１を超える分子(ＬＣ及びボルトンハンター試薬)を輸送可能である。
【０１６６】
実施例３９(Calu−３細胞中の頂端面から基底面へのＡＨＣのトランスサイトーシス)
トランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してCalu−３細胞培養物を分析した。アッセイを１×１０-8モル濃度(125Ｉ)−ＨＣ(セロタイプＡ)を上部室へ添加して開始した。続いて培養物を１８時間、３７℃でインキュベートした。それぞれの段階で実験の底部室の内容物を集め、ゲルろ過した。空隙容量フラクションを放射能アッセイし、毒素ピークを合計して合計数を決定した。トランスサイトーシスの量は、標識化ＨＣの特定の活性を基礎にして計算した。
結果は、ＨＣは細胞の頂端面から基底面へ輸送されたことを示した。ＨＣが効率良くCalu−３細胞を通過しただけでなく、得られたトランスサイトーシス率(０．１９８±０．００７フェムトモル／ｈｒ／ｃｍ2)は精製ホロトキシンのトランスサイトーシス率(０．４２３フェムトモル／ｈｒ／ｃｍ2)に匹敵した。
【０１６７】
３つの主要な結論が得られた。第１に、ボツリヌス菌神経毒のＨＣフラグメントは分化し、極性化したヒト肺胞上皮細胞により結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、放出される。第２に、リシン残基の修飾は、これら性質を示すＨＣの能力を変化させない。第３に、ＨＣはヒト肺胞上皮細胞の頂端面から基底面へ125Ｉ−ボルトンハンター試薬を輸送可能である。
【０１６８】
実施例４０(Calu−３細胞中の基底面から頂端面へのＨＣのトランスサイトーシス)
トランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してCalu−３細胞培養物を分析した。アッセイを１×１０-8モル濃度(125Ｉ)−ＨＣ(セロタイプＡ)を底部室へ添加して開始した。続いて培養物を１８時間、３７℃でインキュベートした。それぞれの段階で実験の上部室の内容物を集め、ゲルろ過した。空隙容量フラクションを放射能アッセイし、毒素ピークを合計して合計数を決定した。トランスサイトーシスの量は、標識化ＨＣの特定の活性を基礎にして計算した。
結果は、ＨＣは細胞の基底面から頂端面への側面へ輸送されたことを示した。ＨＣが効率良くCalu−３細胞を通過しただけでなく、得られたトランスサイトーシス率(０．１１２±０．０３３フェムトモル／ｈｒ／ｃｍ2)は精製ホロトキシンのトランスサイトーシス率(０．２０６フェムトモル／ｈｒ／ｃｍ2)に匹敵した。
【０１６９】
３つの主要な結論が得られた。第１に、ボツリヌス菌神経毒のＨＣフラグメントは分化し、極性化したヒト肺胞上皮細胞により結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、放出される。この現象は頂端面から基底面方向及び基底面から頂端面方向の両方で発生するが、前者がより効率が良い。第２に、リシン残基の修飾は、これら性質を示すＨＣの能力を変化させない。第３に、ＨＣはヒト肺胞上皮細胞の基底面から頂端面へ125Ｉ−ボルトンハンター試薬を輸送可能である。
【０１７０】
実施例４１(ラット肺胞上皮細胞中の頂端面から基底面へのBoNT Aのトランスサイトーシス)
トランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してラット肺胞上皮細胞(RAEC)をインキュベートして分析した。アッセイを１×１０-8モル濃度(125Ｉ)−BoNT Aを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を１８時間、３７℃でインキュベートした。それぞれの段階で実験の底部室の内容物を集め、ゲルろ過した。空隙容量フラクションを放射能アッセイし、毒素ピークを合計して合計数を決定した。トランスサイトーシスの量は、標識化BoNT Aの特定の活性を基礎にして計算した。
結果は、BoNT Aは細胞の頂端面から基底面へ輸送されたことを示した。精製神経毒は効率良くラット肺胞上皮細胞を通過し、トランスサイトーシス率は０．３７６±０．０１４フェムトモル／ｈｒ／ｃｍ2と定量された。
【０１７１】
実験結果から５つの主要な結論が得られた。第１に、精製ボツリヌス菌神経毒は分化し、極性化したラット肺胞上皮細胞により結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、放出される。第２に、リシン残基の修飾はこれら性質を示すホロトキシンの能力を変えない。第３に、ホロトキシンはラット肺胞上皮細胞の頂端面から基底面へ125Ｉ−ボルトンハンター試薬を輸送可能である。第４に、ＨＣはラット肺胞上皮細胞の頂端面から基底面へＬＣを輸送可能である。第５に、ＨＣはラット肺胞上皮細胞を通過する時に１を超える分子(ＬＣ及びボルトンハンター試薬)を輸送可能である。
【０１７２】
実施例４２(RAEC中の基底面から頂端面へのBoNT Aのトランスサイトーシス)
トランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してラット肺胞上皮細胞培養物を分析した。アッセイを１×１０-8モル濃度(125Ｉ)−BoNT Aを底部室へ添加して開始した。続いて培養物を１８時間、３７℃でインキュベートした。それぞれの段階で実験の上部室の内容物を集め、ゲルろ過した。空隙容量フラクションを放射能アッセイし、毒素ピークを合計して合計数を決定した。トランスサイトーシスの量は、標識化BoNT Aの特定の活性を基礎にして計算した。
結果は、BoNT Aは細胞の基底面から頂端面への側面へ輸送されたことを示した。精製神経毒は効率良くラット肺胞上皮細胞を通過し、トランスサイトーシス率は０．１５９±０．０２７フェムトモル／ｈｒ／ｃｍ2と定量された。
【０１７３】
実験結果から５つの主要な結論が得られた。第１に、精製ボツリヌス菌神経毒は分化し、極性化したラット肺胞上皮細胞により結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、放出される。この現象は頂端面から基底面方向及び基底面から頂端面方向の両方で発生するが、前者がより効率が良い。第２に、リシン残基の修飾はこれら性質を示すホロトキシンの能力を変えない。第３に、ホロトキシンはラット肺胞上皮細胞の基底面から頂端面へ125Ｉ−ボルトンハンター試薬を輸送可能である。第４に、ＨＣはラット肺胞上皮細胞の基底面から頂端面へＬＣを輸送可能である。第５に、ＨＣはラット肺胞上皮細胞を通過する時に１を超える分子(ＬＣ及びボルトンハンター試薬)を輸送可能である。
【０１７４】
実施例４３(RAEC中の頂端面から基底面へのＨＣのトランスサイトーシス)
トランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してラット肺胞上皮細胞(RAEC)をインキュベートして分析した。アッセイを１×１０-8モル濃度(125Ｉ)−ＨＣ(セロタイプＡ)を上部室へ添加して開始した。続いて培養物を１８時間、３７℃でインキュベートした。それぞれの段階で実験の底部室の内容物を集め、ゲルろ過した。空隙容量フラクションを放射能アッセイし、毒素ピークを合計して合計数を決定した。トランスサイトーシスの量は、標識化ＨＣの特定の活性を基礎にして計算した。
結果は、ＨＣは細胞の頂端面から基底面へ輸送されたことを示した。ＨＣは効率良くラット肺胞上皮細胞を通過するだけではなく、トランスサイトーシス率(０．１４０±０．０５０フェムトモル／ｈｒ／ｃｍ2)はボツリヌス菌神経毒タイプＡのトランスサイトーシス率(０．３７６フェムトモル／ｈｒ／ｃｍ2)に匹敵した。
【０１７５】
３つの主要な結論が得られた。第１に、ボツリヌス菌神経毒のＨＣフラグメントは分化し、極性化したラット肺胞上皮細胞により結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、放出される。第２に、リシン残基の修飾は、これら性質を示すＨＣの能力を変化させない。第３に、ＨＣはヒト肺胞上皮細胞の頂端面から基底面へ125Ｉ−ボルトンハンター試薬を輸送可能である。
【０１７６】
実施例４４(RAEC中の基底面から頂端面へのＨＣのトランスサイトーシス)
トランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してラット肺胞上皮細胞培養物を分析した。アッセイを１×１０-8モル濃度(125Ｉ)−ＨＣ(セロタイプＡ)を底部室へ添加して開始した。続いて培養物を１８時間、３７℃でインキュベートした。それぞれの段階で実験の上部室の内容物を集め、ゲルろ過した。空隙容量フラクションを放射能アッセイし、毒素ピークを合計して合計数を決定した。トランスサイトーシスの量は、標識化ＨＣの特定の活性を基礎にして計算した。
結果は、ＨＣは細胞の基底面から頂端面への側面へ輸送されたことを示した。ＨＣは効率良くラット肺胞上皮細胞を通過するだけではなく、トランスサイトーシス率(０．１３２±０．０２６フェムトモル／ｈｒ／ｃｍ2)はボツリヌス菌神経毒タイプＡのトランスサイトーシス率(０．１５９フェムトモル／ｈｒ／ｃｍ2)に匹敵した。
【０１７７】
３つの主要な結論が得られた。第１に、ボツリヌス菌神経毒のＨＣフラグメントは分化し、極性化したラット肺胞上皮細胞により結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、放出される。この現象は頂端面から基底面方向及び基底面から頂端面方向の両方で発生するが、前者がより効率が良い。第２に、リシン残基の修飾は、これら性質を示すＨＣの能力を変化させない。第３に、ＨＣはラット肺胞上皮細胞の基底面から頂端面へ125Ｉ−ボルトンハンター試薬を輸送可能である。
【０１７８】
実施例４５(マウスの気道からのBoNT Aの吸収)
この実施例は、ボツリヌス菌毒素は、生きている動物の上皮細胞の頂端面上に受容体が結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、及び上皮細胞の基底面に放出されるために必要な全ての情報を含有することを示した。これら実験は均一なBoNT及びスイス・ウェブスターメスマウス(２５〜３０グラム体重)を使用して行った。
BoNT Aを鼻内経路で投与した。マウスをイソフルラン(商標「ISO-THESIA」、Abbott Laboratories North社製、シカゴ、IL、米国)で軽く麻酔した後、３６．４μｇ／ｋｇ体重(125Ｉ)−BoNT Aを２０μｌ溶液の外鼻孔への単回投与で投与した。動物の頭部は後部咽頭中へのドレナージを最小化するために垂直位置で保持した。個々の集団はそれぞれ１、２、又は３時間後にＣＯ2ガスで犠牲にされ、心臓穿刺により血液を採取した。血漿を１０分間の３０００×ｇで遠心分離して血液から分離し、アッセイするまで−２０℃で貯蔵した。続いて血漿サンプル(１００μｌ)をＰＢＳ(４００μｌ)と混合し、商標「SEPHADEX」Ｇ−２５カラムを通してろ過した。フラクション(０．５ｍｌ)を集め、ガンマカウンターでフラクション中の放射性量を測定した。空隙容量で溶離した標識化BoNT A、及び空隙容量フラクション中に含有された放射能を、存在する蛋白質の合計量を決定するために合計した。
【０１７９】
図２３に示される結果は、ボツリヌス菌毒素は気道から吸収されたことを表す。血液中の蛋白質濃度最大値の時点は、約２時間であり、ピーク値の達成後急速に浄化された。
実験結果から５つの主要な結論が得られた。第１に、精製ボツリヌス菌神経毒はin vivoの気道上皮細胞により結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、放出される。第２に、リシン残基の修飾はこれら性質を示すホロトキシンの能力を変えない。第３に、ホロトキシンはin vivoのマウス気道上皮細胞の頂端面から基底面へ125Ｉ−ボルトンハンター試薬を輸送可能である。第４に、ＨＣはin vivoのマウス気道上皮細胞の頂端面から基底面へＬＣを輸送可能である。第５に、ＨＣはin vivoのマウス気道上皮細胞を通過する時に１を超える分子(ＬＣ及びボルトンハンター試薬)を輸送可能である。
【０１８０】
実施例４６(マウスの気道からの天然ＨＣの吸収)
この実施例は、ＨＣ(セロタイプＡ)は、生きている動物の上皮細胞の頂端面上に受容体が結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、及び上皮細胞の基底面に放出されるために必要な全ての情報を含有することを示した。これら実験は均一に単離したBoNTのＨＣ及びスイス・ウェブスターメスマウス(２５〜３０グラム体重)を使用して行った。
ＨＣを鼻内経路で投与した。マウスをイソフルラン(商標「ISO-THESIA」、Abbott Laboratories North社製、シカゴ、IL、米国)で軽く麻酔した後、２４．４μｇ／ｋｇ体重(125Ｉ)−ＨＣを２０μｌ溶液の外鼻孔への単回投与で投与した。動物の頭部は後部咽頭中へのドレナージを最小化するために垂直位置で保持した。個々の集団はそれぞれ１、２、４又は６時間後にＣＯ2ガスで犠牲にされ、心臓穿刺により血液を採取した。血漿を１０分間の３０００×ｇで遠心分離して血液から分離し、アッセイするまで−２０℃で貯蔵した。続いて血漿サンプル(１００μｌ)をＰＢＳ(４００μｌ)と混合し、商標「SEPHADEX」Ｇ−２５カラムを通してろ過した。フラクション(０．５ｍｌ)を集め、ガンマカウンターでフラクション中の放射性量を測定した。空隙容量で溶離した標識化ＨＣ、及び空隙容量フラクション中に含有された放射能を存在するＨＣの合計量を決定するために合計した。
【０１８１】
ＨＣを投与した動物を６時間監視した。図２４に示される結果はＨＣは気道から吸収されたことを表す。血液中の蛋白質濃度最大値の時点は約２時間であり、ピーク値の達成後急速に浄化された。
３つの主要な結論が得られた。第１に、ボツリヌス菌神経毒のＨＣフラグメントはin vivoの気道上皮細胞により結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、放出される。第２に、リシン残基の修飾は、これら性質を示すＨＣの能力を変化させない。第３に、ＨＣはin vivoのマウス気道上皮細胞の頂端面から基底面へ125Ｉ−ボルトンハンター試薬を輸送可能である。
【０１８２】
実施例４７(マウスの気道からの組み換え型５０ｋＨＣの吸収)
この実施例は、５０ｋＨＣは、生きている動物の上皮細胞の頂端面上に受容体が結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、及び上皮細胞の基底面に放出されるために必要な全ての情報を含有することを示した。これら実験は精製６×ｈｉｓ標識融合型組み換え型５０ｋＨＣ及びスイス・ウェブスターメスマウス(それぞれ２５〜３０グラム体重)を使用して行った。
５０ｋＨＣを鼻内経路で投与した。マウスをイソフルラン(商標「ISO-THESIA」、Abbott Laboratories North社製、シカゴ、IL、米国)で軽く麻酔した後、０．４ｍｇ／ｋｇ体重の蛋白質を２０μｌ溶液の外鼻孔への単回投与で投与した。動物の頭部は後部咽頭中へのドレナージを最小化するために垂直位置で保持した。個々の集団はそれぞれ０．５、１、２、又は４時間後にＣＯ2ガスで犠牲にされ、心臓穿刺により血液を採取した。血漿を１０分間の３０００×ｇで遠心分離して血液から分離し、アッセイするまで−２０℃で貯蔵した。ＨＣフラグメントの血漿中濃度を捕獲ELISAにより決定した。
【０１８３】
５０ｋＨＣを投与した動物を４時間監視した。図２５に示される結果から、５０ｋＨＣは気道から吸収され、血液中の蛋白質濃度最大値の時点は約１時間であり、ピーク値の達成後急速に浄化された。
実験結果から２つの主要な結論が得られた。第１に、ボツリヌス菌神経毒の５０ｋＨＣフラグメントはin vivoのマウス気道上皮細胞により結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、放出される。第２に、５０ｋＨＣはin vivoのマウス気道上皮細胞の頂端面から基底面へ６×−ヒスチジン標識を輸送可能である。
【０１８４】
実施例４８(マウスの気道からのGST−５０ｋＨＣの吸収)
この実施例は、５０ｋＨＣは、生きている動物の上皮細胞の頂端面上に受容体が結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、及び上皮細胞の基底面に放出されるために必要な全ての情報を含有することを示した。更に、５０ｋＨＣは上皮細胞を通過してGSTを輸送できる。これら実験は精製組み換え型GST−５０ｋＨＣ及びスイス・ウェブスターメスマウス(それぞれ２５〜３０グラム体重)を使用して行った。
GST−５０ｋＨＣ融合蛋白質を鼻内経路で投与した。マウスをイソフルラン(商標「ISO-THESIA」、Abbott Laboratories North社製、シカゴ、IL、米国)で軽く麻酔した後、０．６μｇ／ｋｇ体重の蛋白質を２０μｌ溶液の外鼻孔への単回投与で投与した。動物の頭部は後部咽頭中へのドレナージを最小化するために垂直位置で保持した。個々の集団はそれぞれ１，２，４又は６時間後にＣＯ2ガスで犠牲にされ、心臓穿刺により血液を採取した。血漿を１０分間の３０００×ｇで遠心分離して血液から分離し、アッセイするまで−２０℃で貯蔵した。GST−５０ｋＨＣの血漿中濃度を捕獲ELISAにより決定した。
【０１８５】
GST−５０ｋＨＣを投与した動物を６時間監視した。図２６に示される結果は、GST−５０ｋＨＣは気道から吸収されたことを表す。血液中の蛋白質濃度最大値の時点は約２時間であり、ピーク値の達成後急速に浄化された。
実験結果から４つの主要な結論が得られた。第１に、GST−５０ｋＨＣはin vivoのマウス気道上皮細胞により結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、放出される。第２に、５０ｋＨＣはin vivoのマウス気道上皮細胞の頂端面から基底面へGSTを輸送可能である。第３に、５０ｋＨＣはin vivoのマウス気道上皮細胞の頂端面から基底面へ６×−ヒスチジン標識を輸送可能である。第４に、５０ｋＨＣはin vivoのマウス気道上皮細胞を通過する時に１を超える分子(GST及び６×−ヒスチジン標識)を輸送可能である。
【０１８６】
実施例４９(GST−５０ｋＨＣでのマウスの鼻内免疫)
この実施例は、５０ｋＨＣは、生きている動物の上皮細胞の頂端面上に受容体が結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、及び上皮細胞の基底面に放出されるために必要な全ての情報を含有することを示した。更に、５０ｋＨＣは免疫反応を発現するために適切な構造の異種の分子を輸送できる。これら実験は精製組み換え型GST−５０ｋＨＣ及びスイス・ウェブスターメスマウス(それぞれ２５−３０グラム体重)を使用して行った。
鼻内免疫のために、マウスへ０．６ｍｇ／ｋｇ体重のGST−５０ｋＨＣを２０μｌのＰＢＳ溶液で投与した。マウスをイソフルラン(商標「ISO-THESIA」、Abbott Laboratories North社製、シカゴ、IL、米国)で軽く麻酔した。蛋白質を２０μｌ溶液の外鼻孔への単回投与で投与した。動物の頭部は後部咽頭中へのドレナージを最小化するために垂直位置で保持した。５回投薬を７日間隔で投与した。第５回の免疫後、マウスを１０日間飼育し、試験体を、GST、５０ｋＨＣ、及びGST−５０ｋＨＣへの免疫反応性用免疫ブロット法で分析した。
【０１８７】
GST−５０ｋＨＣで免疫化された動物の特定の抗体の存在を監視した。図２７の免疫化されたマウス血清のウェスタンブロットに示される結果は、これら動物はGST及びBoNT AＨＣの両方に対する抗体、次ぎにGST−５０ｋＨＣ鼻内免疫を発達させたことを示す。これら結果は、鼻内免疫により、５０ｋＨＣはin vivoで気道から血流へGST分子を運搬し、GST及び５０ｋＨＣに対する特定の免疫反応を引き起こしたことを表す。
実験結果から５つの主要な結論が得られた。第１に、GST−５０ｋＨＣはin vivoのマウス気道上皮細胞により結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、放出される。第２に、５０ｋＨＣはin vivoのマウス気道上皮細胞の頂端面から基底面へGSTを輸送可能である。第３に、５０ｋＨＣはin vivoのマウス気道上皮細胞の頂端面から基底面へ６×−ヒスチジン標識を輸送可能である。第４に、５０ｋＨＣはin vivoのマウス気道上皮細胞を通過する時に１を超える分子(GST及び６×−ヒスチジン標識)を輸送可能である。第５に、トランスサイトーシスしたGST−５０ｋＨＣはin vivoでGST及び５０ｋＨＣに対する特定の免疫反応を発現することが可能である。
【０１８８】
実施例５０(BoNT A４８キロドルトンＨＣ部分でのマウスの鼻内免疫)
この実施例はＨＣカルボキシ末端の２キロドルトンセグメントは、生きている動物の上皮細胞の頂端面上に受容体が結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、及び上皮細胞の基底面に放出されるために必要な情報を含有することを示した。これを示すため、ＨＣの４８キロドルトン部分を、トリプシン消化で５０ｋＨＣのカルボキシ末端の２キロドルトンフラグメントを削除して生成した。
この試験は、精製組み換え型４８ｋＨＣ及びスイス・ウェブスターメスマウス(２５〜３０グラム体重)を使用して行った。
【０１８９】
鼻内免疫のために、マウスへ０．４ｍｇ／ｋｇの４８ｋＨＣを含む１０μｌのＰＢＳ溶液で投与した。マウスをイソフルラン(商標「ISO-THESIA」、Abbott Laboratories North社製、シカゴ、IL、米国)で軽く麻酔した。蛋白質を１０μｌ溶液の外鼻孔への単回投与で投与した。動物の頭部は後部咽頭中へのドレナージを最小化するために垂直位置で保持した。３回投薬を２週間隔で投与した。第３回の免疫後、マウスを７日間飼育し、試験体をELISAでボツリヌス菌毒素Ａへの免疫反応性を分析した。又、マウスは第３免疫１０日後、致死量のボツリヌス菌毒素Ａ(１μｇ／マウス)の負荷をかけ、生存率を２週間観察した。
すべての動物は、ボツリヌス菌毒素の致死量負荷後２４時間以内に死亡した(即ち、保護効果はほとんど無かった。)。更に、抗原に対する血清ＩｇＧの濃度はほんの僅かだった。これらの結果は切除したＨＣのカルボキシ末端の２キロドルトンフラグメントはin vivoのマウス気道上皮細胞による結合、内在化、トランスサイトーシス、及び放出に関する重要な作用を有することを示した。
【０１９０】
実施例５１(５０ｋＨＣ及びコレラ毒素Ｂサブユニットを使用したマウスの鼻内免疫)
この実施例は、鼻内経路により５０ｋＨＣを共投与した時、コレラ毒素Ｂサブユニット(CTB)はBoNTに対する全身性免疫反応及び粘膜性免疫反応を発現することを示した。これら実験は精製組み換え型５０ｋＨＣ、コレラ毒素Ｂサブユニット(sigma)及びスイス・ウェブスターメスマウス(それぞれ２５〜３０グラム体重)を使用して行った。
マウスへ０．１ｍｇ／ｋｇ体重のCTBを含む１０μｌのＰＢＳ溶液、４０μｇ／ｋｇ体重の５０ｋＨＣを含む１０μｌのＰＢＳ溶液、又は５０ｋＨＣ及びCTBを含む１０μｌのＰＢＳ溶液を鼻内経路で投与した。マウスをイソフルラン(商標「ISO-THESIA」、Abbott Laboratories North社製、シカゴ、IL、米国)で軽く麻酔した。蛋白質を１０μｌ溶液の外鼻孔への単回投与で投与した。動物の頭部は後部咽頭中へのドレナージを最小化するために垂直位置で保持した。３回投薬を２週間隔で投与した。第３回の免疫後、マウスを７日間飼育し、試験体をELISAでボツリヌス菌毒素Ａへの免疫反応性を分析した。又、マウスは第３免疫１０日後、致死量のボツリヌス菌毒素Ａ(１μｇ／マウス)の負荷をかけ、生存率を２週間観察した。
【０１９１】
CTBで免疫化された動物は、ボツリヌス菌毒素の致死量負荷後２時間以内に死亡した。低投薬量の５０ｋＨＣで免疫化された動物はBoNT Aに対する負荷及び中程度のレベルの血清Ｉｇ応答に対する４０％の保護作用を示した(図２８)。５０ｋＨＣ及びCTBで免疫化された動物は、顕著な高レベルの血清Ｉｇ応答及び粘膜性ＩｇＧ応答を発展させ、すべての動物はBoNT Aの致死量負荷に対して保護された。
これらの結果は、５０ｋＨＣの鼻内投与は、０．４ｍｇ／ｋｇ(体重)の高い投薬量でさえ、BoNT Aの致死量負荷に対する、中程度のレベルの血清Ｉｇ応答及び僅か４０％の動物の保護を発現するが粘膜性免疫反応を引き起こさないことを示した。しかし、粘膜性ＩｇＧ応答はCTBの共投与により誘発されることができ、毒素の複合的致死量(multilethal dose;１μｇ／マウス)に対する保護を達成した。
【０１９２】
実施例５２(精製セロタイプＡＨＣ(１００ｋＤａＨＣ)でのマウスの経口免疫)
この実施例は、１００ｋＤａＨＣは、生きている動物の、腸内細胞の頂端面上に受容体が結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、及び上皮細胞の基底面に放出されるために必要な全ての情報を含有することを示した。これら実験は天然ボツリヌス菌神経毒セロタイプＡから精製ＨＣを使用して、スイス・ウェブスターメスマウス(体重２５−３０グラム)へ(栄養)補給管を経由して投与して行った。
経口免疫のために、マウス当り１０μｇの１００ｋＤａＨＣを２００μｌのＰＢＳ溶液でマウスへ投与した。ＨＣを含む２００μｌのＰＢＳ溶液をそれぞれのマウスへ栄養(補給)針を使用して投与した。最初の投薬の次に３個のブースターを２週間隔で与えた。マウスをイソフルラン(商標「ISO-THESIA」、Abbott Laboratories North社製、シカゴ、IL、米国)で麻酔し、それぞれのブースターの７日後、眼窩後部洞(sinus)から血液を採取した。抗体の生成はELISAによりアッセイされ、タイターを計算した。
【０１９３】
それぞれのブースターに続く抗体タイターを図２９に示す。これらの結果は経口で１００ｋＤａＨＣで免疫化されたマウスは毒素ＨＣへの抗体を産生したことを示した。これらの結果は、１００ｋＤａＨＣがin vivoで胃腸システムから循環系へ吸収され、特定の免疫反応が１００ｋＤａＨＣでの経口免疫により引き起こされたことを表す。更に、結果は精製１００ｋＤａＨＣはボツリヌス菌神経毒に対する経口用ワクチンであることを示した。
【０１９４】
実施例５３(In vitro及びIn vivoの上皮細胞を通過する異なる分子サイズ及び異なる分子の機能を有する種々の分子の輸送)
この実施例はボツリヌス菌毒素のＨＣ及びＨＣのフラグメントは、上皮細胞を通過して分子を広い範囲で輸送できることを示した。
これは輸送分子(即ち、ＨＣ又はＨＣのフラグメント)は、上皮細胞の表面へ結合されてエンドサイトーシス及びトランスサイトーシスを受けることで、豊富な積載分子(リガンド、酵素、抗原等)を全身循環系中へ運搬し、次に血液及びリンパ液中へ放出できることを意味する。
In vitro実験及びin vivo実験は実施例１〜５２で記載したとおり行った。これら実験の結果は、ＨＣ又はそのフラグメントは、広く異なる分子量(下記表２に示すように)及び広く異なる機能(下記表２に示すように)を有する分子を輸送し、上皮細胞を通過可能なことを示した。
【０１９５】
【表２】
2005538954.tif 000003
【０１９６】
【表３】
2005538954.tif 000004
【０１９７】
実験結果から８つの主要な結論が得られた。第１に、ボツリヌス毒素のＨＣは体外及び全身循環間の境界を形成する上皮細胞により結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ放出される。第２に、ボツリヌス菌毒素のＨＣのフラグメントは体外及び全身循環間の境界を形成する上皮細胞により結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ放出される。第３に、ＨＣ及びそのフラグメントは、個々の分子の付着が可能となるように改変された場合でも、上皮バリアを通過するために必要な全ての性質を保持する。第４に、ＨＣ及びそのフラグメントは種々の分子を上皮細胞を個別的に通過して輸送できる。第５に、１を超える分子の付着が可能となるように改変された場合でも、ＨＣ及びそのフラグメントは上皮細胞を通過するために必要な全ての性質を保持する。第６に、ＨＣ及びそのフラグメントは上皮細胞を通過する時に１を超える分子を輸送できる。第７に、ＨＣ及びそのフラグメントは同時に異なる分子量の分子を輸送できる。第８に、ＨＣ及びそのフラグメントは同時に異なる機能の分子を輸送できる。
【０１９８】
上記記載の態様は、本発明の範囲を逸脱しない限り変更できることは、当業者により理解されるとおりである。従って、本明細書は本発明を制限するものではない特定の態様を開示したが、それらは特許請求の範囲で定義される本発明の変更を含むものであることは当然である。
【図面の簡単な説明】
【０１９９】
上記本発明の開示は添付図面を参照することにより更に容易に理解できる。本発明の例示のために、好ましいと思われる例を図に示す。しかし、本発明は、示された配列、配列、化合物、及び手段のみに厳格に制限されない。
【図１】図１Ａ〜１ＢＢで構成される図１は、ボツリヌス菌神経毒のアミノ酸配列の配列である：(i)セロタイプAHC(SEQ ID NO：1、商標「GENBANK」登録番号Q45894より得られる。)；(ii)セロタイプBHC(SEQ ID NO：2、商標「GENBANK」登録番号P10844より得られる。)；(iii)セロタイプCHC(SEQ ID NO：3、商標「GENBANK」登録番号P18640より得られる。)；(iv)セロタイプDHC(SEQ ID NO：4、商標「GENBANK」登録番号P19321より得られる。)；(v)セロタイプEHC(SEQ ID NO：5、商標「GENBANK」登録番号P30995より得られる。)；(vi)セロタイプFHC(SEQ ID NO：6、商標「GENBANK」登録番号P30996より得られる。)；及び(vii)セロタイプGHC(SEQ ID NO：7、商標「GENBANK」登録番号Q60393より得られる。)。  配列中、ＨＣの８８キロドルトンフラグメントのアミノ酸配列(セロタイプＡ)(SEQ ID NO：8)(即ち、ここで表される「８８ｋＨＣ」のフラグメント、開始点は残基５２４の位置)は太字で示される。ＨＣ(セロタイプＡ)(SEQ ID NO：9)(即ち、ここで表される「６６ｋＨＣ」のフラグメント、開始点は残基７１４の位置)の６６キロドルトンフラグメントのアミノ酸配列は下線(その一部は二重下線)部で示される。ＨＣ(セロタイプＡ)(SEQ ID NO：10)の５０キロドルトンフラグメントのアミノ酸配列(即ち、ここで表される「５０ｋＨＣ」のフラグメント、開始点は残基８８６の位置)は二重下線部で示される。又、ＨＣ(セロタイプＡ)の４８キロドルトン部分のアミノ酸配列(SEQ ID NO：169)(即ち、５０ｋＨＣフラグメントからそのカルボキシ末端の２キロドルトンを引いたものは、「４８ｋＨＣ」で表され、開始点は残基８８６の位置であり、終了点は残基１３４３の位置)は斜字体で示される。
【図２】天然ボツリヌス菌(セロタイプＡ)、そのＨＣ；８８ｋＨＣ、６６ｋＨＣ及び５０ｋＨＣを表すそれぞれのフラグメント、並びに４８ｋＨＣを表す部分の関連する位置の構造を示す概略図である。
【図３】極性化した消化管上皮細胞培養物(T-84)中でトランスサイトーシスした天然ボツリヌス菌神経毒タイプＡ(BoNT A)のウェスタンブロットである。線は下記を表す：(Ａ)天然毒素のトランスサイトーシス前のコントロール。(Ｂ)T-84細胞を通してトランスサイトーシスした天然毒素(底部室から回収した。)。
【図４】極性化したイヌ腎臓上皮細胞培養物(MDCK)中でトランスサイトーシスした天然ボツリヌス菌神経毒タイプＡのウェスタンブロットである。線は下記を表す：(Ａ)天然毒素のトランスサイトーシス前のコントロール。(Ｂ)MDCK細胞を通してトランスサイトーシスした天然毒素(底部室から回収した。)。
【図５】極性化した上皮細胞培養物(T-84)中でトランスサイトーシスしたＨＣ(ＨＣ)のウェスタンブロットである。線は下記を表す：(Ａ)ＨＣのトランスサイトーシス前のコントロール。(Ｂ)T-84細胞を通してトランスサイトーシスしたＨＣ(底部室から回収した。)。
【図６】極性化したイヌ腎臓上皮細胞培養物(MDCK)中でトランスサイトーシスしたＨＣのウェスタンブロットである。線は下記を表す：(Ａ)ＨＣのトランスサイトーシス前のコントロール。(Ｂ)MDCK細胞を通してトランスサイトーシスしたＨＣ(底部室から回収した。)。
【図７】極性化した上皮細胞培養物(T-84)中でトランスサイトーシスした６６ｋＤａＨＣカルボキシ末端フラグメント(６６ｋＨＣ)のウェスタンブロットである。線は下記を表す：(Ａ)６６ｋＨＣのトランスサイトーシス前のコントロール。(Ｂ)T-84細胞を通してトランスサイトーシスした６６ｋＨＣ(底部室から回収した。)。
【図８】極性化したイヌ腎臓上皮細胞培養物(MDCK)中でトランスサイトーシスした６６ｋＤａＨＣカルボキシ末端フラグメント(６６ｋＨＣ)のウェスタンブロットである。線は下記を表す：(Ａ)６６ｋＨＣのトランスサイトーシス前のコントロール。(Ｂ)MDCK細胞を通してトランスサイトーシスした６６ｋＨＣ(底部室から回収した。)。
【図９】極性化した上皮細胞培養物中でトランスサイトーシスした５０ｋＤａＨＣフラグメント(５０ｋＨＣ)のウェスタンブロットである。線は下記を表す：(Ａ)５０ｋＨＣのトランスサイトーシス前のコントロール。(Ｂ)T-84細胞を通してトランスサイトーシスした５０ｋＨＣ(底部室から回収した。)。
【図１０】極性化したイヌ腎臓上皮細胞培養物中でトランスサイトーシスした５０ｋＨＣフラグメントのウェスタンブロットである。線は下記を表す：(Ａ)５０ｋＨＣのトランスサイトーシス前のコントロール。(Ｂ)MDCK細胞を通してトランスサイトーシスした５０ｋＨＣ(底部室から回収した。)。
【図１１】極性化した上皮細胞培養物(T-84)中でトランスサイトーシスされたＡｌｅｘａ５６８〜ボツリヌス菌毒素タイプＡの蛍光発光スペクトルである。図中：◆＝Ａｌｅｘａ５６８〜毒素；■＝インキュベート媒体。
【図１２】極性化したMDCK上皮細胞培養物中でトランスサイトーシスされたＡｌｅｘａ５６８〜ボツリヌス菌毒素タイプＡの蛍光発光スペクトルである。図中：◆＝Ａｌｅｘａ５６８〜毒素；■＝インキュベート媒体。
【図１３】極性化したT-84上皮細胞培養物中でトランスサイトーシスされたビオチン〜５０ｋＨＣのウェスタンブロットである。線は下記を表す：(Ａ)ビオチン〜５０ｋＨＣのトランスサイトーシス前のコントロール。(Ｂ)T-84細胞を通してトランスサイトーシスしたビオチン〜５０ｋＨＣ(底部室から回収した。)。
【図１４】極性化したMDCK上皮細胞培養物中でトランスサイトーシスされたビオチン〜５０ｋＨＣのウェスタンブロットである。線は下記を表す：(Ａ)ビオチン〜５０ｋＨＣのトランスサイトーシス前のコントロール。(Ｂ)MDCK細胞を通してトランスサイトーシスしたビオチン〜５０ｋＨＣ(底部室から回収した。)。
【図１５】極性化したT-84上皮細胞培養物中でトランスサイトーシスされたＧＦＰ〜６６ｋＨＣの蛍光発光スペクトルである。図中：●＝ＧＦＰ〜６６ｋＨＣ；○＝インキュベート媒体。
【図１６】極性化したMDCK上皮細胞培養物中でトランスサイトーシスされたＧＦＰ〜６６ｋＨＣの蛍光発光スペクトルである。図中：●＝ＧＦＰ〜６６ｋＨＣ；○＝インキュベート媒体。
【図１７】極性化した上皮細胞培養(T-84)中でトランスサイトーシスされたS-TAG〜５０ｋＨＣ結合体のウェスタンブロットである。線は下記を表す：(Ａ)S-TAG〜５０ｋＨＣのトランスサイトーシス前のコントロール。(Ｂ)T-84細胞を通してトランスサイトーシスしたS-TAG〜５０ｋＨＣ(底部室から回収した。)。
【図１８】極性化したイヌ腎臓上皮細胞培養物(MDCK)中でトランスサイトーシスされたS-TAG〜５０ｋＨＣ結合体のウェスタンブロットである。線は下記を表す：(Ａ)S-TAG〜５０ｋＨＣのトランスサイトーシス前のコントロール。(Ｂ)MDCK細胞を通してトランスサイトーシスしたS-TAG〜５０ｋＨＣ(底部室から回収した。)。
【図１９】極性化したT-84上皮細胞培養物中でトランスサイトーシスされたGST〜８８ｋＨＣのウェスタンブロットである。線は下記を表す：(Ａ)GST〜８８ｋＨＣのトランスサイトーシス前のコントロール。(Ｂ)T-84細胞を通してトランスサイトーシスしたGST〜８８ｋＨＣ(底部室から回収した。)。
【図２０】極性化したMDCK上皮細胞培養物中でトランスサイトーシスされたGST〜８８ｋＨＣのウェスタンブロットである。線は下記を表す：(Ａ)GST〜８８ｋＨＣのトランスサイトーシス前のコントロール。(Ｂ)融合MDCK細胞を通してトランスサイトーシスしたGST〜８８ｋＨＣフラグメント(底部室から回収した。)。
【図２１】極性化したT-84上皮細胞培養物中でトランスサイトーシスされたGST〜６６ｋＨＣのウェスタンブロットである。線は下記を表す：(Ａ)GST〜６６ｋＨＣのトランスサイトーシス前のコントロール。(Ｂ)T-84細胞を通してトランスサイトーシスしたGST〜６６ｋＨＣ(底部室から回収した。)。
【図２２】極性化したMDCK上皮細胞培養物中でトランスサイトーシスされたGST〜６６ｋＨＣのウェスタンブロットである。線は下記を表す：(Ａ)GST〜６６ｋＨＣのトランスサイトーシス前のコントロール。(Ｂ)MDCK細胞を通してトランスサイトーシスしたGST〜６６ｋＨＣ(底部室から回収した。)。
【図２３】マウスへの鼻内投与後のボツリヌス菌神経毒セロタイプＡの血液中濃度を示すグラフである。
【図２４】マウスへの鼻内投与後のセロタイプＡＨＣの血液中濃度を示すグラフである。
【図２５】マウスへの鼻内投与後の６×ｈｉｓ−５０ｋＨＣの血液中濃度を示すグラフである。
【図２６】マウスへの鼻内投与後のGST〜５０ｋＨＣの血液中濃度を示すグラフである。
【図２７】GST〜５０ｋＨＣで鼻内免疫化したマウスから得られた免疫血清でプローブされたGST〜５０ｋＨＣフラグメントのウェスタンブロットである。
【図２８】コレラ毒素Ｂサブユニット(CTB)を共投与した、５０ｋＨＣの鼻内投与の強化された免疫反応を示すグラフである。図中：■＝５０ｋＨＣ；□＝５０ｋＨＣ＋CTB
【図２９】マウスへの経口免疫後の１００ｋＤａＨＣへの特定の抗体応答の発達を示す。１００ｋＤａＨＣの第２(ブースター１)、第３(ブースター２)、及び第４(ブースター３)投与の７日後に得られたELISAタイターを示すグラフである。
【図３０】図３０Ａ〜３０Ｃで構成される図３０は、種々のセロタイプのボツリヌス菌毒素と関連する、いくつかの１７キロドルトン(１７ｋＤａ)赤血球凝集素(「ＨＡ」)蛋白質のアミノ酸配列の配列である：(１)17kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号CAA44260、SEQ ID NO：20；(２)17kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号BAA75081、SEQ ID NO：21；(３)17kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号P46083、SEQ ID NO：22；(４)17kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号BAA90658、SEQ ID NO：23；(５)17kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号BAB71742、SEQ ID NO：24；(６)17kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号BAA89710、SEQ ID NO：25；(７)17kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号S49104、SEQ ID NO：26；(８)17kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号AAA99056、SEQ ID NO：27；(９)17kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号CAA70496、SEQ ID NO：28；(１０)17kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号AAB42188、SEQ ID NO：29；(１１)17kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号CAA61226、SEQ ID NO：30；(１２)17kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号B44644、SEQ ID NO：31；(１３)17kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号AAB21357、SEQ ID NO：32；(１４)17kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号S67990、SEQ ID NO：33；及び(１５)17kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号AAB21356、SEQ ID NO：34。
【図３１】図３１Ａ〜３１Ｄで構成される図３１は、種々のセロタイプのボツリヌス菌毒素と関連する、いくつかの２１キロドルトン(２１ｋＤａ)赤血球凝集素(「ＨＡ」)蛋白質のアミノ酸配列の配列である：(１)21kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号CAA55717、SEQ ID NO：35；(２)21kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号S68219、SEQ ID NO：36；(３)21kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号AAB42190、SEQ ID NO：37；(４)21kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号S58864、SEQ ID NO：38；(５)21kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号AAB64349、SEQ ID NO：39；(６)21kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号S58856、SEQ ID NO：40；(７)21kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号NB 783832、SEQ ID NO：41；(８)21kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号CAA07094、SEQ ID NO：42；(９)21kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号CAA61227、SEQ ID NO：43；(１０)21kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号CAA73969、SEQ ID NO：44；(１１)21kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号CAA65350、SEQ ID NO：45；(１２)21kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号CAA65347、SEQ ID NO：46；(１３)21kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号CAA65345、SEQ ID NO：47；(１４)21kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号BAA90656、SEQ ID NO：48；(１５)21kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号BAA89708、SEQ ID NO：49；(１６)21kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号S46426、SEQ ID NO：50；(１７)21kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号CAA65346、SEQ ID NO：51；(１８)21kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号BAA75074、SEQ ID NO：52；(１９)21kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号BAB71744、SEQ ID NO：53；(２０)21kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号CAC19890、SEQ ID NO：54；(２１)21kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号NP 781286、SEQ ID NO：55；(２２)21kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号JC5340、SEQ ID NO：56；及び(２３)21kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号AAK17956、SEQ ID NO：57。
【図３２】図３２Ａ〜３２Ｉで構成される図３２は、種々のセロタイプのボツリヌス菌毒素と関連する、いくつかの３５キロドルトン(３５ｋＤａ)赤血球凝集素(「ＨＡ」)蛋白質のアミノ酸配列の配列である：(１)35kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号AAA99055、SEQ ID NO：58；(２)35kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号S58865、SEQ ID NO：59；(３)35kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号CAA73965、SEQ ID NO：60；(４)35kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号H44644、SEQ ID NO：61；(５)35kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号S58857、SEQ ID NO：62；(６)35kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号AAB42189、SEQ ID NO：63；(７)35kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号CAA74632、SEQ ID NO：64；(８)35kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号BAB71747、SEQ ID NO：65；(９)35kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号BAA75077、SEQ ID NO：66；(１０)35kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号S46429、SEQ ID NO：67；(１１)35kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号P46084、SEQ ID NO：68；(１２)35kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号BAA90659、SEQ ID NO：69；(１３)35kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号BAA89711、SEQ ID NO：70；及び(１４)35kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号CAA61226、SEQ ID NO：71。
【図３３】図３３Ａ〜３３Ｊで構成される図３３は、種々のセロタイプのボツリヌス菌毒素と関連する、いくつかの７０キロドルトン(７０ｋＤａ)赤血球凝集素(「ＨＡ」)蛋白質のアミノ酸配列の配列である：(１)70kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号BAA89709、SEQ ID NO：72；(２)70kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号BAA90657、SEQ ID NO：73；(３)70kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号AAB42187、SEQ ID NO：74；(４)70kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号AAM75949、SEQ ID NO：75；(５)70kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号CAA70495、SEQ ID NO：76；(６)70kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号CAA73963、SEQ ID NO：77；(７)70kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号CAA61225、SEQ ID NO：78；(８)70kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号CAA75931、SEQ ID NO：79；(９)70kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号QLCLBF、SEQ ID NO：80；(１０)70kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号AAA72120、SEQ ID NO：81；(１１)70kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号CAA04327、SEQ ID NO：82；(１２)70kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号CAA57443、SEQ ID NO：83；(１３)70kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号AAA99057、SEQ ID NO：84；(１４)70kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号P01558、SEQ ID NO：85；(１５)70kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号BAA07575、SEQ ID NO：170；(１６)70kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号P46085、SEQ ID NO：171；及び(１７)70kDaHA、商標「GENEBANK」登録番号BAA75075、SEQ ID NO：188。
【図３４】図３４Ａｉ〜３４ＡＡｉで構成される図３４は、種々のセロタイプのボツリヌス菌毒素と関連する、いくつかの非毒素、非赤血球凝集素蛋白質(「NTNH」)蛋白質のアミノ酸配列の配列である：(１)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号CAA55073、SEQ ID NO：86；(２)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号CAA73967、SEQ ID NO：87；(３)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号CAA55074、SEQ ID NO：88;(４)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号AAB64350、SEQ ID NO：89；(５)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号CAA61125、SEQ ID NO：90；(６)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号CAA74634、SEQ ID NO：91；(７)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号S68218、SEQ ID NO：92；(８)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号CAA63550、SEQ ID NO：93；(９)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号AAB42191、SEQ ID NO：94；(１０)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号CAA61228、SEQ ID NO：95；(１１)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号BAA90660、SEQ ID NO：96；(１２)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号BAA89712、SEQ ID NO：97；(１３)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号BAB71748、SEQ ID NO：98；(１４)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号BAA75083、SEQ ID NO：99；(１５)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号S46430、SEQ ID NO：100；(１６)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号AAB36016、SEQ ID NO：101；(１７)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号P46081、SEQ ID NO：102；(１８)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号JC4901、SEQ ID NO：103；(１９)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号BAA12299、SEQ ID NO：104；(２０)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号CAA74630、SEQ ID NO：105；(２１)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号CAA61123、SEQ ID NO：106；(２２)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号CAA67511、SEQ ID NO：107；(２３)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号CAA61233、SEQ ID NO：108；(２４)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号AAC60474、SEQ ID NO：109；(２５)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号I40644、SEQ ID NO：110；(２６)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号CAA73971、SEQ ID NO：111；(２７)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号CAA72807、SEQ ID NO：112；(２８)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号P46082、SEQ ID NO：113；(２９)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号A47708、SEQ ID NO：114；(３０)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号Q06366、SEQ ID NO：115；(３１)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号AAM75953、SEQ ID NO：116；(３２)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号I40631、SEQ ID NO：117；(３３)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号P10844、SEQ ID NO：118；(３４)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号1EPWA、SEQ ID NO：119；(３５)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号BAA75078、SEQ ID NO：120；(３６)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号AAL11498、SEQ ID NO：121；(３７)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号AAK97132、SEQ ID NO：122；(３８)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号CAA73968、SEQ ID NO：123；(３９)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号P30995、SEQ ID NO：124；(４０)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号BAC05434、SEQ ID NO：125；(４１)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号BAB12249、SEQ ID NO：126；(４２)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号BAB03512、SEQ ID NO：127；(４３)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号S21178、SEQ ID NO：128；(４４)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号Q00496、SEQ ID NO：129；(４５)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号Q45894、SEQ ID NO：130；(４６)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号CAA65352、SEQ ID NO：131；(４７)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号CAA65348、SEQ ID NO：132；(４８)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号AAB22656、SEQ ID NO：133；(４９)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号CAA71744、SEQ ID NO：134；(５０)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号A49777、SEQ ID NO：135；(５１)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号P18640、SEQ ID NO：136；(５２)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号1F83A、SEQ ID NO：137；(５３)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号IF82A、SEQ ID NO：138；(５４)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号BAA89713、SEQ ID NO：139；(５５)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号BAA08418、SEQ ID NO：140；(５６)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号A49928、SEQ ID NO：141；(５７)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号BAC22064、SEQ ID NO：142；(５８)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号1906297A、SEQ ID NO：143；(５９)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号AAC37720、SEQ ID NO：144；(６０)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号NP 783831、SEQ ID NO：145；(６１)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号S39791、SEQ ID NO：146；(６２)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号1906297B、SEQ ID NO：147；(６３)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号CAA37321、SEQ ID NO：148；(６４)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号AAK72964、SEQ ID NO：149；(６５)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号Q60393、SEQ ID NO：150；(６６)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号AAO21363、SEQ ID NO：151；(６７)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号AAA23210、SEQ ID NO：152;(６８)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号CAA61124、SEQ ID NO：153；(６９)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号AAL66183、SEQ ID NO：154；(７０)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号1717342A、SEQ ID NO：155；(７１)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号S33411、SEQ ID NO：156；(７２)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号3BTAA、SEQ ID NO：157；(７３)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号CAA36289、SEQ ID NO：158；(７４)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号P10845、SEQ ID NO：159；(７５)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号BTCLAB、SEQ ID NO：160；(７６)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号AAD09563、SEQ ID NO：161；(７７)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号CAA73972、SEQ ID NO：162；(７８)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号CAA77991、SEQ ID NO：163；(７９)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号AAB24244、SEQ ID NO：164；(８０)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号BAA90661、SEQ ID NO：165；(８１)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号S70582、SEQ ID NO：166；(８２)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号BAA75084、SEQ ID NO：167；(８３)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号P19321、SEQ ID NO：168；(８４)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号S48110、SEQ ID NO：173；(８５)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号S48109、SEQ ID NO：174；(８６)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号CAA50145、SEQ ID NO：175；(８７)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号CAA50150、SEQ ID NO：176；(８８)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号AAA23282、SEQ ID NO：177；(８９)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号AAG01403、SEQ ID NO：178；(９０)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号AAA80610、SEQ ID NO：179；(９１)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号1DIWA、SEQ ID NO：180；(９２)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号1FV2A、SEQ ID NO：181；(９３)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号1D0HA、SEQ ID NO：182；(９４)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号1DLLA、SEQ ID NO：183；(９５)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号1AF9、SEQ ID NO：184；(９６)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号1DFQA、SEQ ID NO：185；(９７)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号AAF73267、SEQ ID NO：186；(９８)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号AAA230209、SEQ ID NO：187；及び(９９)NTNH、商標「GENEBANK」登録番号CAB43706、SEQ ID NO：188。
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【国際調査報告】
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