(57)【要約】（ｉ）Ｅ１、Ｅ２Ａ及びＥ４からなる群より選択されるアデノウイルスゲノム領域における少なくとも１つの欠失、（ｉｉ）（ａ）アデノウイルスゲノムのＶＡＩ遺伝子のみにおける少なくとも１つの欠失、又はさらに組み合わせて、アデノウイルスゲノムのＶＡＩＩ遺伝子における少なくとも１つの欠失、（ｂ）組換えＶＡＩ遺伝子のみ、又はさらに組み合わせて、組換えＶＡＩＩ遺伝子（組換え遺伝子は、天然プロモーターの代わりに調節性プロモーター、又は変異天然プロモーター、及び変異天然プロモーターに対し５’にｐｏｌＩＩプロモーターのいずれかを含む）、又は（ｃ）ドミナントネガティブな二本鎖のＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）、並びに、必要に応じて、（ｉｉｉ）コーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩプロモーターを含むポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌＩＩ）構築体、及び／又はコーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩＩプロモーターを含むポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌＩＩＩ）構築体、を含むアデノウイルスゲノムを含んでなるアデノウイルスベクター；並びに、このようなアデノウイルスベクター及び上記アデノウイルスベクターを相補する細胞株を含んでなる系；並びに、関連する系及び方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含むアデノウイルスゲノムを含んでなる、アデノウイルスベクター：
（ｉ）Ｅ１、Ｅ２Ａ及びＥ４からなる群より選択されるアデノウイルスゲノム領域における少なくとも１つの欠失、
（ｉｉ）アデノウイルスゲノムのＶＡＩ遺伝子のみにおける少なくとも１つの欠失、又はさらに組み合わせて、アデノウイルスゲノムのＶＡＩＩ遺伝子における少なくとも１つの欠失、並びに、必要に応じて、
（ｉｉｉ）コーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩプロモーターを含むポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌＩＩ）構築体、及び／又はコーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩＩプロモーターを含むポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌＩＩＩ）構築体。
【請求項２】
Ｅ１、Ｅ２Ａ及びＥ４からなる群より選択されるアデノウイルスゲノムの２つの領域にそれぞれ少なくとも１つの欠失を含む、請求項１記載のアデノウイルスベクター。
【請求項３】
アデノウイルスゲノムのＥ１、Ｅ４、ＶＡＩ及びＶＡＩＩ領域にそれぞれ少なくとも１つの欠失を含む、請求項１記載のアデノウイルスベクター。
【請求項４】
ｐｏｌＩＩＩプロモーターに機能的に連結したコーディング領域が、アンチセンスＲＮＡ分子、リボザイム又はＲＮＡ干渉分子をコードする、請求項１〜３のいずれか１項記載のアデノウイルスベクター。
【請求項５】
ｐｏｌＩＩＩプロモーターが、ＶＡ ＲＮＡプロモーター、トランスファーＲＮＡプロモーター又は核内低分子ＲＮＡプロモーターである、請求項１〜４のいずれか１項記載のアデノウイルスベクター。
【請求項６】
アデノウイルスベクターがビリオンとしてパッケージングされている、請求項１〜５のいずれか１項記載のアデノウイルスベクター。
【請求項７】
以下を含むアデノウイルスゲノムを含んでなる、アデノウイルスベクター：
（ｉ）Ｅ１、Ｅ２Ａ及びＥ４からなる群より選択されるアデノウイルスゲノム領域における少なくとも１つの欠失、
（ｉｉ）組換えＶＡＩ遺伝子のみ、又はさらに組み合わせて、組換えＶＡＩＩ遺伝子（組換え遺伝子は、天然プロモーターの代わりに調節性プロモーター、又は変異天然プロモーター、及び変異天然プロモーターに対し５’にｐｏｌＩＩプロモーターのいずれかを含む）、並びに、必要に応じて、
（ｉｉｉ）コーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩ構築体、及び／又はコーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩＩ構築体。
【請求項８】
Ｅ１、Ｅ２Ａ及びＥ４からなる群より選択されるアデノウイルスゲノムの２つの領域にそれぞれ少なくとも１つの欠失を含む、請求項７記載のアデノウイルスベクター。
【請求項９】
ｐｏｌＩＩＩプロモーターに機能的に連結したコーディング領域が、アンチセンスＲＮＡ分子、リボザイム、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は任意の他のＲＮＡ干渉分子をコードする、請求項７又は８記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１０】
ｐｏｌＩＩＩプロモーターが、ＶＡ ＲＮＡプロモーター、トランスファーＲＮＡプロモーター又は核内低分子ＲＮＡプロモーターである、請求項７〜９のいずれか１項記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１１】
アデノウイルスベクターがビリオンとしてパッケージングされている、請求項７〜１０のいずれか１項記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１２】
以下を含むアデノウイルスゲノムを含んでなる、アデノウイルスベクター：
（ｉ）Ｅ１、Ｅ２Ａ及びＥ４からなる群より選択されるアデノウイルスゲノム領域における少なくとも１つの欠失、
（ｉｉ）ドミナントネガティブな二本鎖のＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）、並びに、必要に応じて、
（ｉｉｉ）コーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩ構築体、及び／又はコーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩＩ構築体。
【請求項１３】
Ｅ１、Ｅ２Ａ及びＥ４からなる群より選択されるアデノウイルスゲノムの２つの領域にそれぞれ少なくとも１つの欠失を含む、請求項１２記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１４】
ｐｏｌＩＩＩプロモーターに機能的に連結したコーディング領域が、アンチセンスＲＮＡ分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡ又は任意の他のＲＮＡ干渉分子をコードする、請求項１２又は１３記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１５】
ｐｏｌＩＩＩプロモーターが、ＶＡ ＲＮＡプロモーター、トランスファーＲＮＡプロモーター又は核内低分子ＲＮＡプロモーターである、請求項１２〜１４のいずれか１項記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１６】
アデノウイルスベクターがビリオンとしてパッケージングされている、請求項１２〜１５のいずれか１項記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１７】
請求項１〜６のいずれか１項記載のアデノウイルスベクター、及び前記アデノウイルスベクターを相補する細胞株を含んでなる系であって、細胞株が前記アデノウイルスベクターを含む、系。
【請求項１８】
アデノウイルスベクターを相補する細胞株が、アデノウイルスＶＡＩ遺伝子及び／又はＶＡＩＩ遺伝子を含み、且つ発現する、請求項１７記載の系。
【請求項１９】
アデノウイルスＶＡＩ遺伝子のプロモーターが天然プロモーターである、請求項１８記載の系。
【請求項２０】
アデノウイルスＶＡＩ遺伝子のプロモーターが調節性プロモーターである、請求項１８記載の系。
【請求項２１】
アデノウイルスＶＡＩ遺伝子のプロモーターが、テトラサイクリンリプレッサーに結合するエレメントを含む、請求項２０記載の系。
【請求項２２】
テトラサイクリンリプレッサーに結合するエレメントが、転写因子ＴＦＩＩＩＤのスプリット結合部位と干渉する、請求項２１記載の系。
【請求項２３】
請求項７〜１１のいずれか１項記載のアデノウイルスベクター、及び前記アデノウイルスベクターを相補する細胞株を含んでなる系であって、細胞株が前記アデノウイルスベクターを含む、系。
【請求項２４】
アデノウイルスベクターを相補する細胞株が、アデノウイルスＶＡＩ遺伝子及び／又はＶＡＩＩ遺伝子を含み、且つ発現する、請求項２３記載の系。
【請求項２５】
アデノウイルスＶＡＩ遺伝子のプロモーターが天然プロモーターである、請求項２４記載の系。
【請求項２６】
アデノウイルスＶＡＩ遺伝子のプロモーターが調節性プロモーターである、請求項２４記載の系。
【請求項２７】
アデノウイルスＶＡＩ遺伝子のプロモーターが、テトラサイクリンリプレッサーに結合するエレメントを含む、請求項２６記載の系。
【請求項２８】
テトラサイクリンリプレッサーに結合するエレメントが転写因子ＴＦＩＩＩＤのスプリット結合部位と干渉する、請求項２７記載の系。
【請求項２９】
請求項１２〜１６のいずれか１項記載のアデノウイルスベクター、及び前記アデノウイルスベクターを相補する細胞株を含んでなる系であって、細胞株が前記アデノウイルスベクターを含む、系。
【請求項３０】
以下を含むアデノウイルスベクターを含んでなる系：
（ｉ）以下を含むアデノウイルスゲノム：
Ｅ１、Ｅ２Ａ、及びＥ４からなる群より選択されるアデノウイルスゲノム領域における少なくとも１つの欠失、及び、必要に応じて、
コーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩ構築体、及び／又はコーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩＩ構築体、並びに、
（ｉｉ）前記アデノウイルスベクターを相補する細胞株であって、ドミナントネガティブな二本鎖のＰＫＲを発現し、且つ前記アデノウイルスベクターを含む、細胞株。
【請求項３１】
アデノウイルスベクターが、Ｅ１、Ｅ２Ａ及びＥ４からなる群より選択されるアデノウイルスゲノムの２つの領域にそれぞれ少なくとも１つの欠失を含む、請求項３０記載の系。
【請求項３２】
ｐｏｌＩＩＩプロモーターに機能的に連結したコーディング領域が、アンチセンスＲＮＡ分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡ又は任意の他のＲＮＡ干渉分子をコードする、請求項３０又は３１記載の系。
【請求項３３】
ｐｏｌＩＩＩプロモーターが、ＶＡ ＲＮＡプロモーター、トランスファーＲＮＡプロモーター又は核内低分子ＲＮＡプロモーターである、請求項３０〜３２のいずれか１項記載の系。
【請求項３４】
アデノウイルスベクターがビリオンとしてパッケージングされている、請求項３０〜３３のいずれか１項記載の系。
【請求項３５】
請求項１又は２記載のアデノウイルスベクターの製造方法であって、以下：
（ｉ）Ｅ１、Ｅ２Ａ、及びＥ４からなる群より選択されるアデノウイルスゲノムの領域に少なくとも１つの欠失を導入すること、
（ｉｉ）アデノウイルスゲノムのＶＡＩ遺伝子のみに少なくとも１つの欠失を、又はさらに組み合わせて、アデノウイルスゲノムのＶＡＩＩ遺伝子に少なくとも１つの欠失を導入すること、並びに、必要に応じて、
（ｉｉｉ）コーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩ構築体、及び／又はコーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩＩ構築体を、前記アデノウイルスベクターに導入すること、
を含み、（ｉ）、（ｉｉ）がいずれの順序でも実行可能である、方法。
【請求項３６】
（ｉｖ）アデノウイルスベクターを相補細胞株で増殖させることをさらに含む、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
請求項３記載のアデノウイルスベクターの製造方法であって、以下：
（ｉ）アデノウイルスゲノムのＥ１、Ｅ４、ＶＡＩ及びＶＡＩＩ領域にそれぞれ少なくとも１つの欠失を導入すること、並びに、必要に応じて、
（ｉｉ）コーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩ構築体、及び／又はコーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩＩ構築体を、前記アデノウイルスベクターに導入すること、
を含み、（ｉ）、（ｉｉ）がいずれの順序でも実行可能である、方法。
【請求項３８】
（ｉｉｉ）アデノウイルスベクターを相補細胞株で増殖させることをさらに含む、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
請求項７又は８記載のアデノウイルスベクターの製造方法であって、以下：
（ｉ）Ｅ１、Ｅ２Ａ及びＥ４からなる群より選択されるアデノウイルスゲノムの領域に少なくとも１つの欠失を導入すること、
（ｉｉ）以下（ａ）又は（ｂ）のいずれか：
（ａ）ＶＡＩ遺伝子及び／又はＶＡＩＩ遺伝子の天然プロモーターに変異を導入し、変異させた天然プロモーターの５’にｐｏｌＩＩプロモーターを導入すること、又は
（ｂ）ＶＡＩ遺伝子及び／又はＶＡＩＩ遺伝子の天然プロモーターを調節性プロモーターに置換すること、並びに、必要に応じて、
（ｉｉｉ）コーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩ構築体、及び／又はコーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩＩ構築体を、前記アデノウイルスベクターに導入すること、
を含み、（ｉ）、（ｉｉ）がいずれの順序でも実行可能である、方法。
【請求項４０】
請求項３９の方法であって、（ｉｖ）アデノウイルスベクターを相補細胞株で増殖させることをさらに含み、調節性プロモーターの誘導剤の存在下でアデノウイルスベクターがＶＡＩ、ＶＡＩＩを発現しない、方法。
【請求項４１】
請求項１２又は１３記載のアデノウイルスベクターの製造方法であって、以下：
（ｉ）Ｅ１、Ｅ２Ａ及びＥ４からなる群より選択されるアデノウイルスゲノムの領域に少なくとも１つの欠失を導入すること、
（ｉｉ）ドミナントネガティブな二本鎖のＰＫＲキナーゼをコードするオリゴヌクレオチド配列を、前記アデノウイルスベクターに導入すること、並びに、必要に応じて、
（ｉｉｉ）コーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩ構築体、及び／又はコーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩＩ構築体を、前記アデノウイルスベクターに導入すること、
を含み、（ｉ）、（ｉｉ）がいずれの順序でも実行可能である、方法。
【請求項４２】
（ｉｖ）アデノウイルスベクターを相補細胞株で増殖させることをさらに含む、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
哺乳動物細胞において、コーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩ構築体、及び／又はコーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩＩ構築体を発現させる方法であって、コーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩ構築体、及び／又はコーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩＩ構築体を含む請求項１又は２記載のアデノウイルスベクターに、哺乳動物細胞を接触させることを含み、それにより、哺乳動物細胞がアデノウイルスベクターをインターナライズし、哺乳動物細胞においてｐｏｌＩＩ構築体及び／又はｐｏｌＩＩＩ構築体が発現される、方法。
【請求項４４】
哺乳動物細胞がインビボである、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
哺乳動物細胞において、コーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩ構築体、及び／又はコーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩＩ構築体を発現させる方法であって、コーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩ構築体、及び／又はコーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩＩ構築体を含む請求項３記載のアデノウイルスベクターに、哺乳動物細胞を接触させることを含み、それにより、哺乳動物細胞がアデノウイルスベクターをインターナライズし、哺乳動物細胞においてｐｏｌＩＩ構築体及び／又はｐｏｌＩＩＩ構築体が発現される、方法。
【請求項４６】
哺乳動物細胞がインビボである、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
哺乳動物細胞において、コーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩ構築体、及び／又はコーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩＩ構築体を発現させる方法であって、コーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩ構築体、及び／又はコーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩＩ構築体を含む請求項７又は８記載のアデノウイルスベクターに、哺乳動物細胞を接触させることを含み、それにより、哺乳動物細胞がアデノウイルスベクターをインターナライズし、哺乳動物細胞においてｐｏｌＩＩ構築体及び／又はｐｏｌＩＩＩ構築体が発現される、方法。
【請求項４８】
哺乳動物細胞がインビボである、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
哺乳動物細胞において、コーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩ構築体、及び／又はコーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩＩ構築体を発現させる方法であって、コーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩ構築体、及び／又はコーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩＩ構築体を含む請求項１２又は１３記載のアデノウイルスベクターに、哺乳動物細胞を接触させることを含み、それにより、哺乳動物細胞がアデノウイルスベクターをインターナライズし、哺乳動物細胞においてｐｏｌＩＩ構築体及び／又はｐｏｌＩＩＩ構築体が発現される、方法。
【請求項５０】
哺乳動物細胞がインビボである、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
請求項１又は２記載のアデノウイルスベクターを相補する細胞株の製造方法であって、以下：
（ｉ）アデノウイルスベクター中で破壊されたＥ１、Ｅ２Ａ及びＥ４からなる群より選択されるアデノウイルスゲノムの領域を細胞に導入すること、並びに
（ｉｉ）プロモーターに機能的に連結したアデノウイルスＶＡＩコーディング領域、及び／又はプロモーターに機能的に連結したアデノウイルスＶＡＩＩコーディング領域を細胞に適切に導入すること、
を含み、アデノウイルスベクターのアデノウイルスゲノムと、複製能を有するアデノウイルスの産生のために細胞に導入された、アデノウイルスゲノムの前記領域、並びにアデノウイルスＶＡＩコーディング領域及び／又はアデノウイルスＶＡＩＩコーディング領域との間に十分な重複が存在せず、（ｉ）、（ｉｉ）がいずれの順序でも実行可能である、方法。
【請求項５２】
アデノウイルスＶＡＩコーディング領域及び／又はアデノウイルスＶＡＩＩコーディング領域に機能的に連結したプロモーターが天然プロモーターである、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
アデノウイルスＶＡＩコーディング領域及び／又はアデノウイルスＶＡＩＩコーディング領域に機能的に連結したプロモーターが調節性プロモーターである、請求項５１記載の方法。
【請求項５４】
プロモーターが、テトラサイクリンリプレッサーに結合するエレメントを含む、請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
テトラサイクリンリプレッサーが、前記エレメントに結合した場合に、転写因子ＴＦＩＩＩＤのスプリット結合部位と干渉する、請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
プロモーターがＶＡプロモーターであり、テトラサイクリンリプレッサーに結合するエレメントが、ＶＡプロモーターのボックスＡに対し５’に組み込まれている、請求項５４記載の方法。
【請求項５７】
プロモーターがＶＡプロモーターであり、テトラサイクリンリプレッサーに結合するエレメントが、ＶＡプロモーターのボックスＡとボックスＢとの間に組み込まれている、請求項５４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、アデノウイルスベクター、このようなアデノウイルスベクター及び相補細胞株 (complementing cell line) を含んでなる系、アデノウイルスベクターの製造方法、アデノウイルスベクターの相補細胞株の製造方法、並びにポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌＩＩ）構築体及び／又はポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌＩＩＩ）構築体の発現方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
アデノウイルスベクターは、短期間の遺伝子発現を可能とするのに理想的に適している。しかし、長期間遺伝子発現の確保は、第１世代（例えば、Ｅ１欠損）ベクターと第２世代（例えば、Ｅ１とＥ４欠損）ベクターに関して問題であった。より新しいアンプリコンベクターは、幾つかの動物種や組織で、長時間にわたって遺伝子を発現することが示されている。しかし、これらのベクターは、大量に製造するのが非常に困難である。さらに、アンプリコンベクターは、ヘルパーアデノウイルスと共に製造され、最終産物には、ヘルパーウイルス及び複製能を有するアデノウイルスが混入する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、アデノウイルスベクターの上記欠点の回避を試みる。従って、本発明の目的は、現在利用できるベクターの欠点の少なくとも一部を回避するアデノウイルスベクター、並びに、このようなアデノウイルスベクター及び相補細胞株を含んでなる系、このようなアデノウイルスベクターの製造方法、アデノウイルスベクターの相補細胞株の製造方法、このようなアデノウイルスベクターを用いるｐｏｌＩＩ及び／又はｐｏｌＩＩＩ構築体の発現方法を提供することである。これらの目的や他の目的、並びに、本発明の利点や更なる発明の特徴は、本明細書で提供される本発明の記述より明らかとなる。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の要旨
本発明は、（ｉ）Ｅ１、Ｅ２Ａ及びＥ４からなる群より選択されるアデノウイルスゲノム領域における少なくとも１つの欠失、（ｉｉ）アデノウイルスゲノムのＶＡＩ遺伝子のみにおける少なくとも１つの欠失、又はさらに組み合わせて、アデノウイルスゲノムのＶＡＩＩ遺伝子における少なくとも１つの欠失、並びに、必要に応じて、（ｉｉｉ）コーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩ構築体、及び／又はコーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩＩ構築体、を含むアデノウイルスゲノムを含んでなるアデノウイルスベクターを提供する。本発明は、このようなアデノウイルスベクター、及びアデノウイルスベクターを相補 (complement) する細胞株を含んでなる系であって、細胞株がアデノウイルスベクターを含む系をさらに提供する。細胞株は、遺伝子の天然プロモーターの制御下、又は調節性プロモーターの制御下の各々で、ＶＡＩ遺伝子のみを、又は適宜さらに組み合わせてＶＡＩＩ遺伝子を発現できる。
【０００５】
本発明はまた、（ｉ）Ｅ１、Ｅ２Ａ及びＥ４からなる群より選択されるアデノウイルスゲノム領域における少なくとも１つの欠失、（ｉｉ）組換えＶＡＩ遺伝子のみ、又はさらに組み合わせて、組換えＶＡＩＩ遺伝子（組換え遺伝子は、天然プロモーターの代わりに調節性プロモーター、又は変異天然プロモーター、及び変異天然プロモーターに対し５’にｐｏｌＩＩプロモーターのいずれかを含む）、並びに、必要に応じて、（ｉｉｉ）コーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩ構築体、及び／又はコーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩＩ構築体、を含むアデノウイルスゲノムを含んでなるアデノウイルスベクターを提供する。本発明は、このようなアデノウイルスベクター及び細胞株を含んでなる系であって、細胞株がアデノウイルスベクターを含む系をさらに提供する。
【０００６】
本発明によって提供されるさらに別のアデノウイルスベクターは、（ｉ）Ｅ１、Ｅ２Ａ及びＥ４からなる群より選択されるアデノウイルスゲノム領域における少なくとも１つの欠失、（ｉｉ）ドミナントネガティブな二本鎖 (dominant negative, double-stranded) のＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＲ；ＤＡＩ、ｐ６８、ＤｓＩ又はＰ１／ｅＩＦ−２とも呼ばれる）をコードするオリゴヌクレオチド配列、並びに、必要に応じて、（ｉｉｉ）コーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩ構築体、及び／又はコーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩＩ構築体、を含むアデノウイルスゲノムを含んでなるものである。本発明は、このようなアデノウイルスベクター及び細胞株を含んでなる系であって、細胞株がアデノウイルスベクターを含む系をさらに提供する。
【０００７】
（ｉ）Ｅ１、Ｅ２Ａ、及びＥ４からなる群より選択されるアデノウイルスゲノム領域における少なくとも１つの欠失、及び、必要に応じて、コーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩ構築体、及び／又はコーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩＩ構築体、を含むアデノウイルスゲノム、並びに（ｉｉ）上記アデノウイルスベクターを相補する細胞株であって、ドミナントネガティブな二本鎖のＰＫＲを発現し、上記アデノウイルスベクターを含む細胞株、を含むアデノウイルスベクターを含んでなる系もまた、本発明によって提供される。
【０００８】
このようなアデノウイルスベクターの製造方法もまた、本発明によって提供される。１実施形態では、本方法は、（ｉ）Ｅ１、Ｅ２Ａ、及びＥ４からなる群より選択されるアデノウイルスゲノムの領域に少なくとも１つの欠失を導入すること、（ｉｉ）アデノウイルスゲノムのＶＡＩ遺伝子のみに少なくとも１つの欠失を、又はさらに組み合わせて、アデノウイルスゲノムのＶＡＩＩ遺伝子に少なくとも１つの欠失を導入すること、並びに、必要に応じて、（ｉｉｉ）コーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩ構築体、及び／又はコーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩＩ構築体を、アデノウイルスベクターに導入すること、を含み、（ｉ）、（ｉｉ）がいずれの順序でも実行可能である。別の実施形態では、本方法は、（ｉ）アデノウイルスゲノムのＥ１、Ｅ４、ＶＡＩ及びＶＡＩＩ領域にそれぞれ少なくとも１つの欠失を導入すること、並びに、必要に応じて、（ｉｉ）コーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩ構築体、及び／又はコーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩＩ構築体をアデノウイルスベクターに導入すること、を含み、（ｉ）、（ｉｉ）がいずれの順序でも実行可能である。さらにまた別の実施形態では、本方法は、（ｉ）Ｅ１、Ｅ２Ａ及びＥ４からなる群より選択されるアデノウイルスゲノムの領域に少なくとも１つの欠失を導入すること、（ｉｉ）（ａ）ＶＡＩ遺伝子及び／又はＶＡＩＩ遺伝子の天然プロモーターに変異を導入し、変異させた天然プロモーターの５’にｐｏｌＩＩプロモーターを導入すること、又は（ｂ）ＶＡＩ遺伝子及び／又はＶＡＩＩ遺伝子の天然プロモーターを調節性プロモーターに交換すること、並びに／或いは、必要に応じて、（ｉｉｉ）コーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩ構築体、及び／又はコーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩＩ構築体をアデノウイルスベクターに導入すること、を含み、（ｉ）、（ｉｉ）がいずれの順序でも実行可能である。更なる実施形態では、本方法は、（ｉ）アデノウイルスゲノムのＶＡＩ又はＶＡＩＩコーディング領域に少なくとも１つの欠失を導入し、Ｅ１、Ｅ２Ａ及びＥ４からなる群より選択されるアデノウイルスゲノムの領域に少なくとも１つの欠失を導入すること、（ｉｉ）アデノウイルスゲノムのＶＡＩプロモーター（ｐｏｌＩＩＩプロモーター（例えば、Ａボックス））の少なくとも一部を、ヒツジメタロチオネインプロモーターなどの調節性プロモーターに交換すること、又は変異させた上で、ヒツジメタロチオネインプロモーターなどの調節性プロモーターに機能的に連結させること、並びに、必要に応じて、（ｉｉｉ）コーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩ構築体、及び／又はコーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩＩ構築体をアデノウイルスベクターに導入すること、を含み、（ｉ）、（ｉｉ）がいずれの順序でも実行可能である。更なる実施形態では、本方法は、（ｉ）Ｅ１、Ｅ２Ａ及びＥ４からなる群より選択されるアデノウイルスゲノムの領域に少なくとも１つの欠失を導入すること、（ｉｉ）ドミナントネガティブな二本鎖のＰＫＲキナーゼをコードするオリゴヌクレオチド配列をアデノウイルスベクターに導入すること、を含む。本方法は、アデノウイルスベクターを相補細胞株中で増殖させることをさらに含み得る。
【０００９】
哺乳動物細胞において、コーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩ構築体、及び／又はコーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩＩ構築体を発現させる方法もまた、提供される。本方法は、哺乳動物細胞を、コーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩ構築体、及び／又はコーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩＩ構築体を含む上記アデノウイルスベクターと接触させることを含み、それにより、哺乳動物細胞がアデノウイルスベクターをインターナライズし、哺乳動物細胞においてｐｏｌＩＩ構築体及び／又はｐｏｌＩＩＩ構築体が発現される。
【００１０】
上記アデノウイルスベクターを相補する細胞株の製造方法もさらにまた提供される。本方法は、（ｉ）アデノウイルスベクター中で破壊されたＥ１、Ｅ２Ａ及びＥ４からなる群より選択されるアデノウイルスゲノムの上記領域を細胞に導入すること、並びに（ｉｉ）プロモーターに機能的に連結したアデノウイルスＶＡＩコーディング領域、及び／又はプロモーターに機能的に連結したアデノウイルスＶＡＩＩコーディング領域を細胞に導入すること、を含み、それにより、この細胞は、細胞に導入されたアデノウイルスゲノムの上記領域並びにアデノウイルスＶＡＩコーディング領域及び／又はアデノウイルスＶＡＩＩコーディング領域を発現し、ここで、ＶＡＩ及び／又はＶＡＩＩコーディング領域の各々は、その天然プロモーター又は誘導性プロモーターの制御下にあり、そして望ましくは、アデノウイルスベクターのアデノウイルスゲノムと、複製能を有するアデノウイルスの産生のために細胞に導入された、アデノウイルスゲノムの上記領域、並びにアデノウイルスＶＡＩコーディング領域のみと、又はさらなる組み合わせにおいて、アデノウイルスＶＡＩＩコーディング領域との間の少なくとも１つの必須遺伝子機能について重複が存在せず、（ｉ）、（ｉｉ）がいずれの順序でも実行可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明は、アンプリコンと共通の特徴を持ち、さらに望ましくは、その欠点が殆ど又は全くない、永続的な発現を提供するアデノウイルスベクターを提供する。本アデノウイルスベクターは、インビボで僅かな免疫応答しか誘導しないことによって永続的な発現を達成する。従って、本発明は、（ｉ）Ｅ１、Ｅ２Ａ及びＥ４からなる群より選択されるアデノウイルスゲノム領域における少なくとも１つの欠失、並びに（ｉｉ）アデノウイルスゲノムのＶＡＩ遺伝子のみにおける少なくとも１つの欠失、又はさらに組み合わせて、アデノウイルスゲノムのＶＡＩＩ遺伝子における少なくとも１つの欠失、を含むアデノウイルスゲノムを含んでなるアデノウイルスベクターを提供する。本発明によって提供される別のアデノウイルスベクターは、（ｉ）Ｅ１、Ｅ２Ａ及びＥ４からなる群より選択されるアデノウイルスゲノム領域における少なくとも１つの欠失、並びに（ｉｉ）組換えＶＡＩ遺伝子のみ、又はさらに組み合わせて、組換えＶＡＩＩ遺伝子（組換え遺伝子は、遺伝子の天然プロモーターの代わりに調節性プロモーター、又は変異天然プロモーター、及び変異天然プロモーターに対し５’にｐｏｌＩＩプロモーターのいずれかを含む）、を含むアデノウイルスゲノムを含むものである。本発明によって提供されるさらに別のアデノウイルスベクターは、（ｉ）Ｅ１、Ｅ２Ａ及びＥ４からなる群より選択されるアデノウイルスゲノム領域における少なくとも１つの欠失、並びに（ｉｉ）ドミナントネガティブな二本鎖のＰＫＲキナーゼをコードするオリゴヌクレオチド配列、を含むアデノウイルスゲノムを含むものである。ドミナントネガティブな二本鎖のＰＫＲキナーゼの発現は、所望の通り、構成的であっても、誘導性であっても、又は抑制性であってもよい。アデノウイルスベクターは組換えアデノウイルスゲノムから構成され得るが、望ましくは、アデノウイルスベクターは、カプシド化される（即ち、ウイルス粒子又はビリオン）。
【００１２】
少なくとも１つの欠失は、アデノウイルスゲノムの指示 (indicated) 領域、ＶＡＩ遺伝子及び／又はＶＡＩＩ遺伝子の任意の欠失であり得る。アデノウイルスゲノムの指示領域の欠失は、アデノウイルス複製に必要な遺伝子などの遺伝子の欠失、又は該遺伝子に影響を与える欠失であり得（例えば、国際特許出願公開番号WO 95/34671）、アデノウイルスベクターは、複製欠損アデノウイルスベクターである。欠失により、機能破壊が起こり得る。「機能破壊」とは、指示遺伝子又は領域が、通常より実質的に低いレベル、例えば、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍で機能するか、機能を停止することを意味する。あるいは、機能破壊は、アデノウイルスゲノムの指示遺伝子又は指示領域のコーディング配列及び/又は調節エレメントなどにおける、置換、挿入、及び/又は変換から生じうる。
【００１３】
「Ｅ１領域」とは、約１．５６〜約９．７４マップユニット（ｍｕ）又は約５６０〜約３，５０６塩基対（ｂｐ）のアデノウイルスゲノムの領域を意味する。Ｅ１領域は、Ｅ１Ａ領域（約１．５６〜約４．２９ｍｕ又は約５６０〜約１，５４５ｂｐ）、Ｅ１Ｂ領域（約４．７６〜約９．７４ｍｕ又は約１，７１４〜約３，５０６ｂｐ）を含む。「Ｅ２Ａ領域」とは、約６２．３４〜約６６．７６ｍｕ又は約２２，４４３〜約２４，０３２ｂｐのアデノウイルスゲノムの領域を意味する。「Ｅ３領域」とは、約７９．３０〜約８５．６６ｍｕ又は約２８，５４７〜約３０，８３９ｂｐのアデノウイルスゲノムの領域を意味する。指摘されたアデノウイルス領域の上記境界は、Ａｄ２、Ａｄ５アデノウイルスゲノム地図に基づいており、アデノウイルス血清型毎に僅かに変動し得る。
【００１４】
Ａｄ２ゲノムのＶＡ領域は、ＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（約９，８３１ｂｐ〜１１，５５５ｂｐ）に含まれる。より詳細には、ＶＡＩ遺伝子は、約１０，６１０ｂｐ〜約１０，７６６ｂｐに位置し、ＶＡＩＩ遺伝子は、約１０，８６６ｂｐ〜約１１，０２３ｂｐに位置する。
【００１５】
Ｅ１、Ｅ２Ａ及びＥ４からなる群より選択されるアデノウイルスゲノム領域における少なくとも１つの欠失を含むアデノウイルスゲノムを含んでなるアデノウイルスベクターの作製のために、任意のサブタイプ、サブタイプの混合物、又はキメラアデノウイルスが、ＤＮＡ源として使用できる。アデノウイルスゲノムのＥ１、Ｅ２Ａ及び／又はＥ４領域での少なくとも１つの欠失の作製は、国際特許出願公開WO 95/34671記載の方法により行い得る。本発明の好適な実施形態では、アデノウイルスベクターは、Ｅ１、Ｅ２Ａ及びＥ４からなる群より選択されるアデノウイルスゲノムの２つの領域にそれぞれ少なくとも１つの欠失を含む。アデノウイルスゲノムのＶＡＩ遺伝子のみにおける少なくとも１つの欠失、又はさらに組み合わせて、ＶＡＩＩ遺伝子における少なくとも１つの欠失の作製は、本明細書で例示されている。本発明の好適な実施形態では、アデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムのＥ１、Ｅ４領域及びＶＡＩ、ＶＡＩＩ遺伝子のそれぞれに少なくとも１つの欠失を含む。
【００１６】
上記アデノウイルスベクター、例えば、Ｅ１領域に少なくとも１つの欠失及びＥ４領域に少なくとも１つの欠失を含むものは、ＶＡ ＲＮＡを必要とし得ず、アデノウイルスベクター成分に対する炎症及び/又は生来の免疫応答を生じることなく永続する。このようなベクターは、眼、耳などの疾患、及び代謝性疾患の治療用組成物に有用であり得る。このようなベクターはまた、ウイルス（例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、単純ヘルペス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、若しくはマラリア）、又は細菌若しくは寄生虫（例えば、シュードモナス菌、炭疽菌若しくはペスト菌）に対するワクチンなどのワクチン組成物などで、ウイルスコート蛋白質に組み込まれている、及び/又はベクターゲノムから発現しているエピトープに対する特異的免疫応答の誘導に有用であり得る。上記アデノウイルスベクター、例えば、Ｅ１領域のみに少なくとも１つの欠失を含むものは、ＶＡ ＲＮＡの非存在下、インターフェロン放出や炎症を起こし得る。このようなベクターは、免疫応答及び/又は生来の免疫応答を誘導する組成物、例えば、ワクチン組成物に有用であり得る。
【００１７】
必要に応じて、アデノウイルスベクターは、コーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩ構築体、及び／又はコーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩＩ構築体をさらに含む。プロモーターへのコーディング領域の機能的な連結は、当該分野の技術の範囲内である。好ましくは、ｐｏｌＩＩＩプロモーターと機能的に連結したコーディング領域は、アンチセンスＲＮＡ分子、リボザイム、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は任意の他のＲＮＡ干渉分子をコードする。好ましくは、ｐｏｌＩＩＩプロモーターは、ＶＡ ＲＮＡプロモーター、トランスファーＲＮＡプロモーター又は核内低分子ＲＮＡ (small nuclear) プロモーターである。好適なｐｏｌＩＩプロモーターとしては、構成的プロモーター（例えば、ラウス肉腫ウイルス長末端反復（ＲＳＶ ＬＴＲ）プロモーター／エンハンサー、又は特に好ましいサイトメガロウイルスの主要即時初期型 (major immediate early) 遺伝子（ＣＭＶ ＩＥ）プロモーター）、誘導性プロモーター（例えば、成長ホルモンプロモーター、メタロチオネインプロモーター、熱ショック蛋白質プロモーター、Ｅ１Ｂプロモーター、低酸素誘導プロモーター、又はＭＬＰプロモーター及び３部構成 (tripartite) リーダー）、誘導抑制性プロモーター、発生段階関連プロモーター（例えば、グロビン遺伝子プロモーター）、又は組織特異的プロモーター（例えば、平滑筋細胞α−アクチンプロモーター、ＶＥＧＦレセプタープロモーター、ミオシン軽鎖１Ａプロモーター、血管内皮カドヘリンプロモーター）が挙げられる。幾つかの場合、宿主の天然プロモーターが、非天然プロモーターに対し好適であり得、特に、宿主の免疫学的反応による遺伝子発現サイレンシングの厳格な回避が所望される場合には、好適であり得る。
【００１８】
アデノウイルスベクターは、任意の数の更なる、又は代わりの修飾を受け得る。例えば、特に好適なベクターは、修飾アデノウイルス蛋白質、非アデノウイルス蛋白質、又は両方を含み、又は発現し、このことは、野生型アデノウイルスと比較して、ベクターが細胞に感染する効率を増大させ、野生型アデノウイルスが通常感染しない細胞に、ベクターが感染することを可能にし、野生型アデノウイルス又は任意のその組合せと比較して、哺乳動物宿主における免疫応答の減少を引き起こす。任意の適切な型の修飾がベクターに対して施され得、幾つかの適切な修飾が当該分野で公知である。例えば、アデノウイルスベクターコート蛋白質が修飾され得る。このような修飾の例としては、アデノウイルスファイバー、ペントン、ｐＩＸ、ｐＩＩＩａ、又はヘキソン蛋白質の修飾、及び／又はこのようなコート蛋白質の一部への種々の天然又は非天然リガンドの挿入が挙げられる。このようなコート蛋白質の操作は、ウイルスベクターが感染する細胞の範囲を拡大すること、又はウイルスベクターの特定の細胞型へのターゲティングを可能とする。ウイルスコート操作の１つの直接的結果は、アデノウイルスが野生型ウイルスよりも広範囲の真核細胞に結合、侵入し得ることである。このような修飾を含むアデノウイルスの例は、国際特許出願WO 97/20051に記載されている。あるいは、アデノウイルスに対する免疫応答の減少はまた、米国特許第6,093,699号記載の方法により達成できる。他の実施形態では、ウイルスが特定の細胞型、例えば、特有のレセプターを発現する細胞にターゲティングされるように、ウイルスコートが操作される。このような修飾されたアデノウイルスベクターの例は、米国特許第5,559,099号, 同第5,731,190号, 同第5,712,136号, 同第5,770,442号, 同第5,846,782号, 同第5,962,311号, 同第5,965,541号, 及び同第6,057,155号、並びに国際特許出願公開番号WO 96/07734, WO 96/26281, WO 97/20051, WO 98/07865, WO 98/07877, WO 98/40509, WO 98/54346、及びWO 00/15823に記載されている。宿主による免疫学的認識、及びその結果生じる、コート蛋白質に対する中和抗体の産生の潜在性を低減させるアデノウイルスベクター蛋白質の他の修飾は、例えば、国際特許出願公開番号WO 98/40509、WO 00/34496に記載されている。アデノウイルスベクターは、ビリオンとしてパッケージングされ得る。コートの他の実施形態では、修飾を用いて、ファイバー、ペントン、ヘキソン又はｐＩＸ蛋白質に免疫学的エピトープを組み込み得る。このようなベクターは、ワクチン生産のための、ウイルスコート蛋白質に組み込まれたエピトープに対する特異的免疫応答の誘導に有用でありうる。例えば、国際特許出願公開番号WO 01/58478（2001年8月16日公開）参照。
【００１９】
従って、以上の観点から、本発明はまた、上記アデノウイルスベクターの製造方法を提供する。１実施形態では、本方法は、（ｉ）Ｅ１、Ｅ２Ａ、及びＥ４からなる群より選択されるアデノウイルスゲノムの領域に少なくとも１つの欠失を導入すること、（ｉｉ）アデノウイルスゲノムのＶＡＩ遺伝子のみに少なくとも１つの欠失を、又はさらに組み合わせて、アデノウイルスゲノムのＶＡＩＩ遺伝子に少なくとも１つの欠失を導入すること、並びに、必要に応じて、（ｉｉｉ）コーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩ構築体、及び／又はコーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩＩ構築体をアデノウイルスベクターに導入すること、を含み、（ｉ）、（ｉｉ）がいずれの順序でも実行可能である。本方法はさらに、（ｉｖ）アデノウイルスベクターを相補細胞株中で増殖させることを含み得る。
【００２０】
上記アデノウイルスベクターの製造方法における別の実施形態では、本方法は、（ｉ）アデノウイルスゲノムのＥ１、Ｅ４、ＶＡＩ及びＶＡＩＩ領域にそれぞれ少なくとも１つの欠失を導入すること、並びに、必要に応じて、（ｉｉ）コーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩ構築体、及び／又はコーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩＩ構築体をアデノウイルスベクターに導入すること、を含み、（ｉ）、（ｉｉ）がいずれの順序でも実行可能である。本方法はさらに、（ｉｉｉ）アデノウイルスベクターを相補細胞株中で増殖させることを含み得る。
【００２１】
上記アデノウイルスベクターの製造方法におけるさらにまた別の実施形態では、本方法は、（ｉ）Ｅ１、Ｅ２Ａ及びＥ４からなる群より選択されるアデノウイルスゲノムの領域に少なくとも１つの欠失を導入すること、（ｉｉ）（ａ）ＶＡＩ遺伝子及び／又はＶＡＩＩ遺伝子の天然プロモーターに変異を導入し、変異させた天然プロモーターの５’にｐｏｌＩＩプロモーターを導入すること、又は（ｂ）ＶＡＩ遺伝子及び／又はＶＡＩＩ遺伝子の天然プロモーターを調節性プロモーターに置換すること、並びに、必要に応じて、（ｉｉｉ）コーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩ構築体、及び／又はコーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩＩ構築体をアデノウイルスベクターに導入すること、を含み、（ｉ）、（ｉｉ）がいずれの順序でも実行可能である。本方法は、（ｉｖ）アデノウイルスベクターを相補細胞株中で増殖させることをさらに含み得る。
【００２２】
上記アデノウイルスベクターの製造方法におけるさらに別の実施形態では、本方法は、（ｉ）アデノウイルスゲノムのＶＡＩ又はＶＡＩＩコーディング領域に少なくとも１つの欠失を導入し、Ｅ１、Ｅ２Ａ及びＥ４からなる群より選択されるアデノウイルスゲノムの領域に少なくとも１つの欠失を導入すること、（ｉｉ）アデノウイルスゲノムのＶＡＩプロモーター（ｐｏｌＩＩＩプロモーター（例えば、Ａボックス））の少なくとも一部を、ヒツジメタロチオネインプロモーターなどの調節性プロモーターに交換すること、又は変異させた上で、ヒツジメタロチオネインプロモーターなどの調節性プロモーター（相補細胞株においてアデノウイルス産生サイクルの始めに誘導され得る（ヒツジメタロチオネインプロモーターは、亜鉛で誘導され得る））に機能的に連結させること、並びに、必要に応じて、（ｉｉｉ）コーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩ構築体、及び／又はコーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩＩ構築体をアデノウイルスベクターに導入すること、を含み、（ｉ）、（ｉｉ）がいずれの順序でも実行可能である。本方法は、（ｉｖ）アデノウイルスベクターを相補細胞株中で増殖させることをさらに含み得、調節性プロモーターのリプレッサーの存在下でＶＡＩ及び／又はＶＡＩＩを発現しないか、又はＶＡＩ及び/又はＶＡＩＩを構成的に妥当なレベルで発現しない。
【００２３】
上記アデノウイルスベクターのさらにまた別の製造方法では、本方法は、（ｉ）Ｅ１、Ｅ２Ａ及びＥ４からなる群より選択されるアデノウイルスゲノムの領域に少なくとも１つの欠失を導入すること、（ｉｉ）ドミナントネガティブな二本鎖のＰＫＲキナーゼをコードするオリゴヌクレオチド配列をアデノウイルスベクターに導入すること、並びに、必要に応じて、（ｉｉｉ）コーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩ構築体、及び／又はコーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩＩ構築体をアデノウイルスベクターに導入すること、を含み、（ｉ）、（ｉｉ）がいずれの順序でも実行可能である。本方法は、（ｉｖ）アデノウイルスベクターを相補細胞株で増殖させることをさらに含み得る。ドミナントネガティブな二本鎖のＰＫＲキナーゼの発現は、目的に応じて、構成的、誘導的又は抑制的であり得る。
【００２４】
上記アデノウイルスベクター、及びアデノウイルスベクターを相補する細胞株を含んでなる系であって、細胞株がアデノウイルスベクターを含む系もまた、本発明によって提供される。アデノウイルスベクターが、（ｉ）Ｅ１、Ｅ２Ａ及びＥ４からなる群より選択されるアデノウイルスゲノム領域における少なくとも１つの欠失、（ｉｉ）アデノウイルスゲノムのＶＡＩ遺伝子のみにおける少なくとも１つの欠失、又はさらに組み合わせて、アデノウイルスゲノムのＶＡＩＩ遺伝子における少なくとも１つの欠失、並びに、必要に応じて、（ｉｉｉ）コーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩ構築体、及び／又はコーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩＩ構築体、を含むアデノウイルスゲノムを含んでなる場合、細胞株は、ＶＡＩのみを、又は適宜さらに組み合わせてＶＡＩＩを産生する。ＶＡＩ及び/又はＶＡＩＩ遺伝子は、コードされた産物が構成的に発現するように、該遺伝子の天然プロモーターの制御下にあり得る。あるいは、ＶＡＩ及び/又はＶＡＩＩ遺伝子は、調節性プロモーター、例えば、テトラサイクリンリプレッサーに結合するエレメント（例えば、転写因子ＴＦＩＩＩＤのスプリット結合部位 (split binding site) と干渉するテトラサイクリンリプレッサーと結合するもの）を含むものの制御下にある。アデノウイルスベクターが、（ｉ）Ｅ１、Ｅ２Ａ及びＥ４からなる群より選択されるアデノウイルスゲノム領域における少なくとも１つの欠失、（ｉｉ）組換えＶＡＩ遺伝子のみ、又はさらに組み合わせて、組換えＶＡＩＩ遺伝子（組換え遺伝子は、遺伝子の天然プロモーターの代わりに調節性プロモーター、又は変異天然プロモーター、及び変異天然プロモーターに対し５’にｐｏｌＩＩプロモーターのいずれかを含む）、並びに、必要に応じて、（ｉｉｉ）コーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩ構築体、及び／又はコーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩＩ構築体、を含むアデノウイルスゲノムを含んでなる場合、細胞株によるＶＡＩ及び/又はＶＡＩＩの発現は、必要でなくともよい。アデノウイルスベクターが、（ｉ）Ｅ１、Ｅ２Ａ及びＥ４からなる群より選択されるアデノウイルスゲノム領域における少なくとも１つの欠失、（ｉｉ）ドミナントネガティブな二本鎖のＰＫＲキナーゼをコードするオリゴヌクレオチド配列、並びに、必要に応じて、（ｉｉｉ）コーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩ構築体、及び／又はコーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩＩ構築体、を含むアデノウイルスゲノムを含んでなる場合、細胞株は、ＶＡＩ、ＶＡＩＩ、又はＰＫＲキナーゼを発現する必要はない。アデノウイルスベクターが、（ｉ）Ｅ１、Ｅ２Ａ及びＥ４からなる群より選択されるアデノウイルスゲノム領域における少なくとも１つの欠失、及び、必要に応じて、コーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩ構築体、及び／又はコーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩＩ構築体を含むア��ノウイルスゲノム、を含んでなる場合、細胞株は、ドミナントネガティブな二本鎖のＰＫＲを発現する。ドミナントネガティブな二本鎖のＰＫＲキナーゼの発現は、目的に応じて、構成的、誘導的又は抑制的であり得る。
【００２５】
細胞株が上記ベクターに必要である場合、このような細胞株は、標準的な分子生物学技術に従って作製できる。アデノウイルスベクターにおける欠失を相補する遺伝子を含む細胞株は、少なくとも１つの必須遺伝子機能について重複が存在せず、それによって、アデノウイルスベクターゲノムが細胞ＤＮＡと組換えを生じる可能性を排除する。従って、複製能を有するアデノウイルスは、このような細胞株によって産生されるベクターストックから除去され、それ故、ベクターストックは、遺伝子治療やワクチンなどのある種の治療目的に適している。このことによってまた、非相補細胞でのアデノウイルスの複製が防止される。
【００２６】
相補細胞株が、アデノウイルスゲノムのＥ１、Ｅ２Ａ及び／又はＥ４領域で少なくとも１つの欠失、並びにアデノウイルスゲノムのＶＡＩ及び／又はＶＡＩＩ遺伝子における少なくとも１つの欠失を有する産物を発現する場合、相補細胞株は、組換えアデノウイルスベクターのストック、好ましくは、高力価ストックを産生するために、これら産物の適切なレベルでそのようにする必要がある。例えば、アデノウイルスＤＮＡ複製のために、化学量論的レベル、即ち、相対的に高レベルにおいて、Ｅ２Ａ産物であるＤＢＰを発現する必要がある。組換えアデノウイルスベクターのストック、好ましくは高力価ストックを確保するために、産物のレベルが適切である必要ばかりか、産物の一時的な発現は、通常の細胞ウイルス感染で見られるものと一致する必要がある。例えば、ウイルスＤＮＡ複製に必要な成分は、ビリオン構築に必要な成分の前に発現される必要がある。ウイルス産物の高レベル発現にしばしば伴う細胞毒性を回避するために、且つ、産物の一時的な発現を調節するために、望ましくは、調節性プロモーター系が用いられる。例えば、ヒツジメタロチオネイン調節性プロモーター系を用いて、完全Ｅ４領域、Ｅ４領域のオープンリーディングフレーム６（例えば、米国特許第5,994,106号参照）、及びＥ２Ａ領域が発現され得る。適切な調節性プロモーター系の他の例としては、細菌ｌａｃオペロン、テトラサイクリンオペロン、Ｔ７ポリメラーゼ系、並びに、真核と原核の転写因子、リプレッサー、及び他の成分の組合わせやキメラ構築体が挙げられるが、それらに限定されない。発現されるウイルス産物の毒性が強い場合、２部構成 (bipartite) 誘導系を用いるのが望ましい。２部構成誘導系では、リプレッサーは、相補細胞株のクロマティン内に運ばれ、ウイルスベクターは、抑制性プロモーターの制御下、毒性のある遺伝子産物をコードする。テトラサイクリン発現系やｌａｃ発現系などの抑制／誘導発現系もまた使用できる。アデノウイルスＶＡＩ遺伝子のプロモーターが調節可能である場合、好ましくは、それは、テトラサイクリンリプレッサーに結合するエレメントを含む（例えば、米国特許第5,972,650号参照）。好ましくは、該エレメントと結合したテトラサイクリンリプレッサーは、転写因子ＴＦＩＩＩＤのスプリット結合部位と干渉する。一部の細胞株では、誘導又は抑制の非存在下でＶＡＩ／ＶＡＩＩ遺伝子産物を適切なレベルで発現するために、ＶＡＩ／ＶＡＩＩ天然プロモーター又は構成的プロモーターが用いられ得る。
【００２７】
一部のトランスフェクト細胞に入り込むＤＮＡは、さらに一部が安定に維持されるようになる。１つ以上のトランスフェクトされた遺伝子を発現する細胞株の単離は、例えば、抗生物質、薬剤又は他の化合物に耐性を付与する第２の遺伝子（マーカー遺伝子）を同一細胞に導入することによって達成される。この選別は、抗生物質、薬剤又は他の化合物の存在下において移入遺伝子を保有しない細胞が死滅するが、移入遺伝子を含む細胞が生存するという事実に基づく。次いで、生存細胞は、クローンとして単離され、個々の細胞株として増殖する。これらの細胞株は、マーカー遺伝子及び目的の遺伝子の両方を発現するであろうものである。細胞の増殖は、親細胞株及び選別方法に依存する。また、細胞のトランスフェクションは細胞型に依存する。トランスフェクションに使用される最も一般的な技術は、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム又はＤＥＡＥデキストラン媒介ＤＮＡ移入である。
【００２８】
従って、上記観点から、本発明は、上記アデノウイルスベクターを相補する細胞株の製造方法をさらに提供する。本方法は、（ｉ）アデノウイルスベクター中で破壊されたＥ１、Ｅ２Ａ及びＥ４からなる群より選択されるアデノウイルスゲノムの領域を細胞に導入すること、並びに（ｉｉ）プロモーターに機能的に連結したアデノウイルスＶＡＩコーディング領域、及び／又はプロモーターに機能的に連結したアデノウイルスＶＡＩＩコーディング領域を細胞に導入することを含み、それにより、この細胞が、細胞に導入されたアデノウイルスゲノムの上記領域、並びにアデノウイルスＶＡＩコーディング領域及び／又はアデノウイルスＶＡＩＩコーディング領域を発現し、そして望ましくは、アデノウイルスベクターのアデノウイルスゲノムと、複製能を有するアデノウイルスの産生のために細胞に導入された、アデノウイルスゲノムの前記領域、並びにアデノウイルスＶＡＩコーディング領域及び／又はアデノウイルスＶＡＩＩコーディング領域との間に、少なくとも１つの必須遺伝子機能について重複が存在せず、（ｉ）、（ｉｉ）がいずれの順序でも実行可能である。アデノウイルスベクターのアデノウイルスゲノムと、細胞に導入されたアデノウイルスゲノムの前記領域、並びにアデノウイルスＶＡＩ及び／又はＶＡＩＩコーディング領域との少なくとも１つの必須遺伝子機能について重複が存在する場合、望ましくは、重複が最小にて維持される。好ましくは、プロモーターは、天然プロモーター又は調節性プロモーター、例えば、テトラサイクリンリプレッサーに結合するエレメントを含むものなどである。好ましくは、該エレメントと結合したテトラサイクリンリプレッサーは、転写因子ＴＦＩＩＩＤのスプリット結合部位と干渉する。あるいは、また好ましくは、プロモーターはＶＡプロモーターであり、テトラサイクリンリプレッサーに結合するエレメントは、ＶＡプロモーターのボックスＡに対し５’に、又はＶＡプロモーターのボックスＡとボックスＢとの間に組み込まれる。上記の他に、ヌクレオチドレベルで異なるが、同一の２次構造および３次構造を維持するＶＡプロモーターが使用され得る。
【００２９】
哺乳動物細胞において、コーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩ構築体、及び／又はコーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩＩ構築体を発現させる方法もまた提供される。本方法は、コーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩ構築体、及び／又はコーディング領域に機能的に連結したｐｏｌＩＩＩプロモーターを含むｐｏｌＩＩＩ構築体を含む上記アデノウイルスベクターに哺乳動物細胞を接触させることを含み、それにより、哺乳動物細胞がアデノウイルスベクターをインターナライズし、哺乳動物細胞においてｐｏｌＩＩ構築体及び／又はｐｏｌＩＩＩ構築体が発現される。好ましくは、哺乳動物細胞はインビボである。
【００３０】
哺乳動物細胞は、当該分野で公知の任意の適切な手段により上記方法に従って接触させることができる。哺乳動物細胞がインビボのとき、治療目的、例えば、遺伝子治療、ワクチン接種などのために哺乳動物に上記アデノウイルスベクターを投与する適切な方法（例えば、Rosenfeldら, Science 252: 431-434 (1991); Jaffeeら, Clin. Res. 39 (2): 302A (1991); Rosenfeldら, Clin. Res. 39 (2): 311A (1991); 及び Berkner, BioTechniques 6: 616-629 (1988)参照）が利用できること、並びに、２以上の経路を用いてベクターを投与できるが、特定の経路が、他の経路よりもより迅速且つ有効な反応を提供できることを当業者は理解する。生理的に許容できる、又は医薬として許容できる担体などの適切な担体を用いて、ベクターを投与できること、並びに、適切な担体が容易に入手できることは、当業者に周知である。担体の選択は、ベクターの投与に使用される特定の方法によって部分的に決定される。従って、ベクター及びその担体を含む種々の適切な製剤が存在する。以下の製剤と投与方法は単なる例示であり、決して限定的なものではない。
【００３１】
経口投与に適した製剤は、（ａ）液体溶液、例えば、水、生理食塩水又はオレンジジュースなどの希釈剤に溶解した有効量の化合物；（ｂ）固体又は顆粒として所定量の活性成分を各々含む、カプセル、サッシェ (sachet)、又は錠剤；（ｃ）適切な液体の懸濁液；及び（ｄ）適切な乳剤；からなることができる。本発明のベクターは、単独で、又は他の適切な成分と組合わせて、吸入により投与するためのエアロゾル製剤に製造することができる。非経口投与に適した製剤としては、水性及び非水性の等張滅菌注射溶液、水性及び非水性の滅菌懸濁液が挙げられる。注射溶液は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び製剤を、意図したレシピエントの血液と等張にする溶質を含有し得る。懸濁液は、懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、及び保存剤を含有し得る。例えば、米国特許第6,225,289号、WO 00/34444を参照のこと。
【００３２】
本発明の状況では、哺乳動物、特にヒトへのベクター投与量は、所定の遺伝子若しくは他の配列、使用する組成物、投与方法、処置すべき特定の部位および器官に応じて変動する。ベクター投与量は、所望の時間枠内で所望の応答、例えば、治療応答や免疫応答を生じるのに十分であるべきである。
【００３３】
本発明のアデノウイルスベクター及び系はまた、インビトロでの有用性を有する。例えば、それらは、ゲノム研究の干渉に使用できる（これはまた、インビボで行うことができる）。
【実施例】
【００３４】
以下の実施例は、本発明をさらに説明するが、勿論、本発明の範囲を限定するものとして決して解釈されるべきではない。
【００３５】
実施例１
本実施例では、VAIが破壊され、且つVAIIが部分的又は完全に破壊されたアデノウイルスベクターの構築を記載する。
【００３６】
HEK293細胞を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション (ATCC; CRL.1537) から入手し、10%ウシ血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) で維持する。HEK293/ORF6細胞は、米国特許第5,851,806号に従って構築した。
【００３７】
293VAI細胞株と293/ORF6 VAI細胞株は、pAdVantageから200 bpのXbaI/NheI Ad2プロモーターと遺伝子を切り出し、切り出したフラグメントを真核生物発現ベクターpREP10 (Introgene) に挿入し、得られたプラスミドを293細胞と293/ORF6細胞にトランスフェクトし、ハイグロマイシン耐性とVA遺伝子発現で選択することによって作出する。
【００３８】
293VAI/VAII細胞株は、pAdVantageからVAI/VAII Ad2遺伝子を含む465bpのXbaI/NsiIフラグメントを切り出し、フラグメントを真核生物発現ベクターpREP10 (RSVプロモーターとSV40ポリA配列を除去するために、予めXbaIとSalIで切断されている) に挿入し、得られたプラスミド (Nsi部位とSal部位をインタクトに保持する) を293細胞と293/ORF6細胞にトランスフェクトし、ハイグロマイシン耐性とVA遺伝子発現で選択することによって作出する。
【００３９】
293VAIと293VAI/VAII細胞株を用いて、VA欠失ベクターを構築する。293VAI細胞株は、VAI領域中に、VA欠失ベクターとの重複配列を保有せず、293VAI/VAII細胞株又は293/ORF6細胞株は、E4領域中に重複配列を保有しない。従って、細胞株とベクター配列との間の組換えが最小になり、複製能を有するアデノウイルスの可能性が大いに減少する (Kovesdiら，米国特許第5,994,106号参照)。
【００４０】
対照アデノウイルスベクターＡｄＬは以前に記載されている (Broughら, J. Virol. 70: 6497-6501 (1996); Broughら, J. Virol. 71: 9206-9213 (1997))。導入遺伝子の発現は、サイトメガロウイルス即時初期型 (immediate early) プロモーターの制御下にあり、ルシフェラーゼが発現される (GenVec, Inc., Rockville, MD)。
【００４１】
ルシフェラーゼ遺伝子を発現するAdL(VA-) アデノウイルスベクターは、McVeyら (国際特許出願公開番号WO 99/15686) に記載されるプラスミド系を用いて構築する。ベクター中のVAI領域、及びVAII領域の一部を欠失させるために、シャトルベクタープラスミド (pDSC-VA) を構築する。pDSC-VAは、VA領域を囲む配列由来の相同領域に囲まれる二重選択カセットを含む。
【００４２】
pAdVantageベクターは、XbaIとFseIで切断される。Ad2 VAI遺伝子およびVAII遺伝子の半分を含むフラグメントを、二重選択カセットと交換し、それにより、pAdVantage (VA-) シャトルベクターを作出する。McVeyら (国際特許出願公開番号WO 99/15686) と同様の方法を用いて、E1-、E3-、VA-欠失アデノウイルスベクターが作製される。該方法では、シャトルベクタープラスミドpAdVantageベクター (VA-) を、相同組換えのために、pACE (E1.L) プラスミドと共にE.coliにトランスフェクトし、それによりpACE (VA-) プラスミドを作製する。このプラスミドを精製し、293VA細胞にトランスフェクトし、増殖させ (Grahamら, J. Gen. Virol. 36: 59-77 (1977))、塩化セシウム勾配での3回の逐次バンディングにより精製する。精製ウイルスを緩衝液に対し透析し、使用まで-80℃で保存する (例えば、米国特許第6,225,289号参照)。1×107プラーク形成単位で1未満の複製能を有するアデノウイルスが存在すると予想される。
【００４３】
本実施例のベクターのために、細胞株はVA RNA転写物を発現する。細胞株は、天然プロモーター又は調節性プロモーターの制御下でＶＡＩを発現できる。例えば、tet抑制系は、VAIプロモーターのAボックス又はBボックスに配置され得、細胞が増殖している場合にはVA産生が抑制され、ウイルスの産生が所望される場合には、tetの活性化により、VA産生が誘導される。
【００４４】
実施例２
本実施例では、VAI遺伝子とVAII遺伝子の各々で正確な欠失が施されるアデノウイルスベクターの構築が記載される。
【００４５】
実施例１と同様に、Ad2配列の代わりにAd5配列を使用することによって、ベクターを作出した。この場合に、Ad5 VAシャトルプラスミドを、pAdVantageの代わりに用いた (pVAI+2+)。pVAI+2+プラスミドは、SacI (nt 10,267) - HindIII (nt 11,565) のAd5配列を含む。VAI及び/又はVAIIの特定領域を、標準的PCR法によって正確に欠失させた。アデノウイルスは、既知のVAI及びVAII部分欠失 (それぞれ、VA機能を完全には不活化しない) を施され、それらを組み合わせることによりVAI又はVAII活性を全く有しない単一の構築体へと構築された。変異ウイルスd1331 (VAI配列内29 bp欠失、転写開始部位に対し+49〜+79) からのVAIプロモーター欠失を、d1328 (VAII配列内17 bp欠失、転写開始部位に対し+56〜+74) のVAIIプロモーター欠失と組み合わせた。
【００４６】
このアデノウイルスは、VAI領域中に、VAI相補細胞株との重複配列を保有する。
【００４７】
実施例３
本実施例では、VAIのみが調節性polIIプロモーターの制御下にあるか、又はVAI、VAIIの両方が調節性プロモーターの制御下にあるアデノウイルスベクターの構築を記載する。
【００４８】
Ad5からのVAI配列を含む変異オリゴヌクレオチドをアニールさせ、pKSIIプラスミドベクター (Stratagene) にクローニングした。pKSIIプラスミドベクターは、BamHI/PstIで切断され、プラスミドpKSVAIMIが作出された。4つの連続的な点変異がオリゴヌクレオチドに導入され、VAIプロモーターを不活化した。プロモーター変異は、Ad5配列中で位置10632-10635であり、GTGGからCGCAへの変化が生じた。ステム−ループ構造の維持のため、相補的な変異は、Ad5配列中で位置10759-10762であり、配列CAACからTGCGに変化させた。
【００４９】
変異VAI配列を、pKSVAIMIから切り出し、亜鉛で誘導可能なヒツジメタロチオネイン蛋白質1a遺伝子 (sMT-Ia遺伝子) のプロモーターと、単純ヘルぺスTKポリアデニル化シグナルとの間にクローニングした。Ad5配列は、包括的に10620-10775である。Ad5 bp 10620は、pSMT-VAIM1を生成するプロモーターの近位である。
【００５０】
sMT-VA-TK配列を含むプラスミドの一部を、実施例１のpACE (VA-) プラスミドに再挿入し、アデノウイルスを293細胞で産生させ、100 μM ZnCl2を補充した培地で増殖させた。
【００５１】
VAII遺伝子は、単独で、又は上記VAI構築体と組み合わせて、調節性polIIプロモーターの制御下に配置できる。
【００５２】
本実施例のベクターは、VAI又はVAII相補細胞株を必要としない。
【００５３】
実施例４
本実施例では、アデノウイルスゲノムのE1、E3領域の破壊、VAI、VAII遺伝子の破壊を有するアデノウイルスベクターの構築を記載する。
【００５４】
McVeyら, J. Virol. 76 (8): 3670-3677 (2002), 米国特許第6,329, 200号, 及び国際特許出願WO 99/15686の方法を用いて、アデノウイルス5 (Ad5) ベースのベクターゲノムを構築した。レシピエントプラスミドpACEl(L)E3(10X)VA(ZZeo)は、DrdI部位とDraI部位との間でpACYC177 (New England BioLabs) にクローニングされたAd5ゲノムから構成され、p15複製起点とカナマイシン耐性遺伝子を保持した。アデノウイルス左ITRは、DraI部位により近い。ラムダファージcosパッケージング部位は、アデノウイルス左ITRから32 bpである。LacIQ発現カセットは、cos部位の方に転写を指向するように配向している。PacI制限部位は、LacIQ遺伝子の5’末端と右アデノウイルスITRの隣に位置する。CMVプロモーター制御下のルシフェラーゼ遺伝子とSV40ポリアデニル化シグナルは、E1配列356-3,327と交換している。アデノウイルスゲノムはまた、塩基対28,597-30,470にまたがるE3領域での欠失を含む。アデノウイルス配列10,546-11,050は、pCMV/Zeo (Invitrogen, Inc.) のEM7 Sc-ble部分を含むPstI/SalIフラグメントで交換した。このフラグメントは、Sc-bleにフレームが適合したEM-7プロモーターの直ぐ3’にクローニングされたLacZのアミノ末端57アミノ酸をコードするDNA配列を含むように修飾された。ウイルスゲノムはまた、bp 10,594と10,595が欠失している。
【００５５】
ベクターゲノムは、pACEl(L)E3(lOX)VA(ZZeo)、及び種々の欠失を含む一連のVAシャトルプラスミドを用いて構築した。Ad5配列10,293-11,769のVA領域をPCRで増幅した。PCR産物を、SacIとHindIIIで制限し、pBlueskriptKSH+の同一部位にクローニングし、pKSVAI+2+を作製した。標準的分子生物学技術を用いて、一連の重複オリゴヌクレオチドを用い、pKSVAI+2+から、一連のシャトルVA欠失プラスミドを構築した。シャトルプラスミドとそれらの欠失は以下の通りである：pKSVAI-2+では、Ad5塩基対10,620-10,779 (包括的) を欠失させ、pKSVAI-2-では、Ad5塩基対10,620-10,779と10,928-10,944 (包括的) を欠失させ、pKSVAIb-2+では、Ad5塩基対10,620-10,698 (包括的) を欠失させ、pKSVAIb-2-では、Ad5塩基対10,620-10,698と10,928-10,944 (包括的) を欠失させた。ＶＡ欠失シャトルプラスミドを用いて、E. coliでの相同組換えにより、pACEl(L)E3(10X)VA(ZZeo) のEM7 Sc-ble部分を含むPstI/SalIフラグメントを交換した。
【００５６】
pACEl(L)E3(10X)VA(1-2+)は、VA領域を除き、pACEl(L)E3(10X)VA(ZZeo) にアイソジェニックである。VA領域は、Ad5塩基対10,620-10,779 (包括的) の欠失を除き、野生型である。
【００５７】
pACEl(L)E3(10X)VA(1b-2-) は、VA領域を除いて、pACEl(L)E3(10X)VA(ZZeo) にアイソジェニックである。VA領域は、Ad5塩基対10,620-10,698と10,928-10,994 (包括的) の欠失を除いて、野生型である。
【００５８】
これらのpACEプラスミドを用い、上記McVeyら (2002) の方法を用いて、293細胞でE1-アデノウイルスベクターAdL.VA(1-2+) とAdL.VA(1b-2+) を作製した。AdL.VA(1-2+) ベクターを3回のCsCl勾配で精製し、保存緩衝液に対し透析した。ベクターは、VAトランス−相補細胞株を必要とすることなく、他のウイルスベクターと同様に増殖した。
【００５９】
pACEl(L)E3(10)VA(1-2+)E4(BGGus) は、以下の点を除いてpACEl(L)E3(10X)VA(1-2+) とアイソジェニックである：E3欠失が、Ad5塩基対 28,593-30,470であり、Ad5 E4塩基対32,832-35,564を、その5’末端と3’末端でそれぞれウシ成長ホルモン (BGH) とSV40ポリアデニル化配列に隣接するβ-グルクロニダーゼ遺伝子で交換した。
【００６０】
pACEl(L)E3(10X)VA(lb-2-)E4(BGGus) は、以下の点を除いて、pACEl(L)E3(10X)VA(lb-2-) とアイソジェニックである：E3欠失が、Ad5塩基対28,593-30,470であり、Ad5 E4塩基対32,832-35,564を、その5’末端と3’末端でそれぞれBGHとSV40ポリアデニル化配列に隣接するβ-グルクロニダーゼ遺伝子で交換した。
【００６１】
これらのpACEプラスミドを用い、上記McVeyら (2002) の方法を用いて、293-ORF6細胞でE1-E4-アデノウイルスベクターAdL.VA(1-2-) とAdL.VA(1b-2-) を作製した。AdL.VA(1-2-) ベクターを3回のCsCl勾配で精製し、保存緩衝液に対し透析した。ベクターは、低レベルの産生であったが、VAトランス−相補細胞株を必要とすることなく増殖した。
【００６２】
実施例５
本実施例では、アデノウイルスゲノムのE1、E3、E4領域の破壊、VAI、VAII遺伝子の破壊を有するアデノウイルスベクターの構築を記載する。
【００６３】
実施例４と同様に、上記McVeyら (2002) の方法を用いて、ベクターゲノムを構築した。pACE1(L)E3(10)VA(1-2+)E4(BGGus) は、以下の点を除いてpACEl(L)E3(10X)VA(1-2+) とアイソジェニックである：E3欠失は、Ad5塩基対28,598-30,475であり、Ad5 E4塩基対32,832-35,564を、5’末端と3’末端でそれぞれBGHとSV40ポリアデニル化配列に隣接するβ-グルクロニダーゼ遺伝子と交換した。
【００６４】
pACEl(L)E3(10X)VA(lb-2-)E4(BGGus) は、以下の点を除いてpACEl(L)E3(10)VA(lb-2-) とアイソジェニックである：E3欠失は、Ad5塩基対28,598-30,475であり、Ad5 E4塩基対32,832-35,564を、5’末端と3’末端でそれぞれBGHとSV40ポリアデニル化配列に隣接するβ-グルクロニダーゼ遺伝子と交換した。
【００６５】
これらのpACEプラスミドを用い、上記McVeyら (2002) の方法を用いて、293-ORF6細胞でE1-E4-アデノウイルスベクターAdL.VA(1-2-) とAdL.VA(1b-2-) を作製した。AdL.VA(1-2-) ベクターは、3回のCsCl勾配で精製し、保存緩衝液に対し透析した。ベクターは、低レベルの産生であったが、VAトランス−相補細胞株を必要とすることなく増殖した。
【００６６】
本出願が優先権を主張する米国仮特許出願第60/318,997号を含む、特許、特許出願及び刊行物を含む、本明細書で引用した全ての参考文献は、引用によりその内容の全てが本明細書に含まれるものとする。
【００６７】
好適な実施形態を強調して本発明を説明したが、好適な実施形態のバリエーションを用いてもよく、本発明は、本明細書中で詳細に記載した以外でも実施してもよいこと意図する。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲で規定される本発明の思想と範囲内に包含される全ての改変を含むものである。
【国際公開パンフレット】
2005503797.tif 000002
2005503797.tif 000003
2005503797.tif 000004
2005503797.tif 000005
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2005503797.tif 000027
2005503797.tif 000028
【国際調査報告】
2005503797.tif 000029
2005503797.tif 000030
2005503797.tif 000031