(57)【要約】本発明は、Ｆｃレセプターホモログ（ＦｃＲＨ）サブファミリーのメンバーならびにそのフラグメントおよび改変体に関する。各ＦｃＲＨは、Ｉ型膜貫通レセプターであり、好ましくは、細胞外領域、膜貫通領域および細胞質領域を含む。細胞質領域は、好ましくは１つ以上の免疫レセプターチロシンベースの抑制性または活性化モチーフ（「ＩＴＩＭ」または「ＩＴＡＭ」）を含む。本発明は、ＦｃＲＨに関するポリペプチド、核酸、ベクター、発現系および、抗体および抗体フラグメントならびに、その用途を提供する。この種の用途としては、被験体の造血細胞系統の悪性腫瘍または炎症または自己免疫疾患の診断および処置における用途、ならびに被験体の体液性免疫応答の調節における用途が挙げられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたＦｃＲＨであって、該ＦｃＲＨは、１０７より多くまたは１０４未満のアミノ酸を有する細胞質領域、膜貫通領域および細胞外領域を含む、単離されたＦｃＲＨ。
【請求項２】
前記細胞外領域が４未満のＩｇドメインを含む、請求項１に記載の単離されたＦｃＲＨ。
【請求項３】
前記細胞質領域が１０４未満のアミノ酸を含む、請求項２に記載の単離されたＦｃＲＨ。
【請求項４】
前記膜貫通領域が酸性アミノ酸を含む、請求項３に記載の単離されたＦｃＲＨ。
【請求項５】
前記酸性アミノ酸がグルタメートである、請求項４に記載の単離されたＦｃＲＨ。
【請求項６】
前記細胞質領域が配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の単離されたＦｃＲＨ。
【請求項７】
前記細胞外領域が配列番号２１のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の単離されたＦｃＲＨ。
【請求項８】
配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたＦｃＲＨ。
【請求項９】
レセプターが骨髄性細胞によって発現される、請求項１に記載の単離されたＦｃＲＨ。
【請求項１０】
前記レセプターがＴ細胞によって発現される、請求項９に記載の単離されたＦｃＲＨ。
【請求項１１】
配列番号１のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項１２】
保存的アミノ酸置換を有する配列番号１のアミノ酸を含む、ポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号２１のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項１４】
保存的アミノ酸置換を有する配列番号２１のアミノ酸を含む、ポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号２のアミノ酸を含む、ポリペプチド。
【請求項１６】
保存的アミノ酸置換を有する配列番号２のアミノ酸を含むポリペプチド。
【請求項１７】
前記細胞質領域が９９未満のアミノ酸を含み、レセプターが４つまでのＩｇドメインおよび５つまでのＮ連結グリコシル化部位を有する細胞外領域をさらに含む、請求項１に記載の単離されたＦｃＲＨ。
【請求項１８】
前記細胞質領域が配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の単離されたＦｃＲＨ。
【請求項１９】
前記細胞外領域が配列番号２２のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の単離されたＦｃＲＨ。
【請求項２０】
配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたＦｃＲＨ。
【請求項２１】
配列番号３のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項２２】
保存的アミノ酸置換を有する配列番号３のアミノ酸を含む、ポリペプチド。
【請求項２３】
配列番号２２のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項２４】
保存的アミノ酸置換を有する配列番号２２のアミノ酸を含む、ポリペプチド。
【請求項２５】
配列番号４のアミノ酸を含む、ポリペプチド。
【請求項２６】
保存的アミノ酸置換を有する配列番号４のアミノ酸を含む、ポリペプチド。
【請求項２７】
前記細胞質領域が１０７より多くのアミノ酸を含む、請求項１に記載の単離されたＦｃＲＨ。
【請求項２８】
前記細胞質領域が配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の単離されたＦｃＲＨ。
【請求項２９】
前記細胞質領域が配列番号２３のアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の単離されたＦｃＲＨ。
【請求項３０】
前記細胞外領域が配列番号２４のアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の単離されたＦｃＲＨ。
【請求項３１】
配列番号６のアミノ酸を含む、請求項１に記載の単離されたＦｃＲＨ。
【請求項３２】
配列番号２５のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたＦｃＲＨ。
【請求項３３】
配列番号５のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項３４】
保存的アミノ酸置換を有する配列番号５のアミノ酸を含む、ポリペプチド。
【請求項３５】
配列番号２４のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項３６】
保存的アミノ酸置換を有する配列番号２４のアミノ酸を含む、ポリペプチド。
【請求項３７】
配列番号２３のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項３８】
保存的アミノ酸置換を有する配列番号２３のアミノ酸を含む、ポリペプチド。
【請求項３９】
配列番号６のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項４０】
保存的アミノ酸置換を有する配列番号６のアミノ酸を含む、ポリペプチド。
【請求項４１】
配列番号２５のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項４２】
保存的アミノ酸置換を有する配列番号２５のアミノ酸を含む、ポリペプチド。
【請求項４３】
前記細胞質領域が配列番号２６のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたＦｃＲＨ。
【請求項４４】
前記細胞外領域が配列番号２７のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたＦｃＲＨ。
【請求項４５】
配列番号２８のアミノ酸配列を含む、請求項１の単離されたＦｃＲＨ。
【請求項４６】
請求項２に記載のＦｃＲＨをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項４７】
配列番号１をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項４８】
配列番号２１をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項４９】
配列番号２をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項５０】
配列番号７のヌクレオチド配列を含む、請求項４６に記載の核酸。
【請求項５１】
高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションプローブにハイブリダイズする配列を含む単離された核酸であって、該ハイブリダイゼーションプローブが配列番号７または配列番号７の相補体のヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項５２】
配列番号１３のヌクレオチド配列を含む、請求項４６に記載の核酸。
【請求項５３】
高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションプローブにハイブリダイズする配列を含む単離された核酸であって、該ハイブリダイゼーションプローブが配列番号１３または配列番号１３の相補体のヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項５４】
配列番号８のヌクレオチド配列を含む、請求項４６に記載の核酸。
【請求項５５】
高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションプローブにハイブリダイズする配列を含む単離された核酸であって、該ハイブリダイゼーションプローブが配列番号８または配列番号８の相補体のヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項５６】
ストリンジェントな条件下で、配列番号７、配列番号１３または配列番号８の配列を有する核酸にハイブリダイズする、一本鎖核酸。
【請求項５７】
請求項１７に記載のＦｃＲＨをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項５８】
配列番号３をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項５９】
配列番号２２をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項６０】
配列番号４をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項６１】
配列番号９のヌクレオチド配列を含む、請求項５７に記載の核酸。
【請求項６２】
高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションプローブにハイブリダイズする配列を含む単離された核酸であって、該ハイブリダイゼーションプローブが配列番号９または配列番号９の相補体のヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項６３】
配列番号１４のヌクレオチド配列を含む、請求項５７に記載の核酸。
【請求項６４】
高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションプローブにハイブリダイズする配列を含む単離された核酸であって、該ハイブリダイゼーションプローブが配列番号１４または配列番号１４の相補体のヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項６５】
配列番号１０のヌクレオチド配列を含む、請求項５７に記載の核酸。
【請求項６６】
高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションプローブにハイブリダイズする配列を含む単離された核酸であって、該ハイブリダイゼーションプローブが配列番号１０または配列番号１０の相補体のヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項６７】
ストリンジェントな条件下で、配列番号９、配列番号１４または配列番号１０の配列を有する核酸にハイブリダイズする、一本鎖核酸。
【請求項６８】
請求項２７に記載のＦｃＲＨをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項６９】
配列番号５をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項７０】
配列番号２３をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項７１】
配列番号２４をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項７２】
配列番号６をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項７３】
配列番号２５をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項７４】
配列番号１１のヌクレオチド配列を含む、請求項６８に記載の核酸。
【請求項７５】
高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションプローブにハイブリダイズする配列を含む単離された核酸であって、該ハイブリダイゼーションプローブが配列番号１１または配列番号１１の相補体のヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項７６】
配列番号１６のヌクレオチド配列を含む、請求項６８に記載の核酸。
【請求項７７】
高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションプローブにハイブリダイズする配列を含む単離された核酸であって、該ハイブリダイゼーションプローブが配列番号１６または配列番号１６の相補体のヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項７８】
配列番号１５のヌクレオチド配列を含む、請求項６８に記載の核酸。
【請求項７９】
高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションプローブにハイブリダイズする配列を含む単離された核酸であって、該ハイブリダイゼーションプローブが配列番号１５または配列番号１５の相補体のヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項８０】
配列番号１２のヌクレオチド配列を含む、請求項６８に記載の核酸。
【請求項８１】
高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションプローブにハイブリダイズする配列を含む単離された核酸であって、該ハイブリダイゼーションプローブが配列番号１２は配列番号１２の相補体のヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項８２】
配列番号１７のヌクレオチド配列を含む、請求項６８に記載の核酸。
【請求項８３】
高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションプローブにハイブリダイズする配列を含む単離された核酸であって、該ハイブリダイゼーションプローブが配列番号１１または配列番号１７の相補体のヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項８４】
ストリンジェントな条件下で、配列番号１１、配列番号１５、配列番号１６または配列番号１２の配列を有する核酸にハイブリダイズする、一本鎖核酸。
【請求項８５】
配列番号２６をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項８６】
配列番号２７をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項８７】
配列番号２８をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項８８】
高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションプローブにハイブリダイズする配列を含む単離された核酸であって、該ハイブリダイゼーションプローブが配列番号１８または配列番号１８の相補体のヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項８９】
高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションプローブにハイブリダイズする配列を含む単離された核酸であって、該ハイブリダイゼーションプローブが配列番号１９または配列番号１９の相補体のヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項９０】
高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションプローブにハイブリダイズする配列を含む単離された核酸であって、該ハイブリダイゼーションプローブが配列番号２０または配列番号２０の相補体のヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項９１】
ストリンジェントな条件下で、配列番号１８、配列番号１９または配列番号２０の配列を有する核酸にハイブリダイズする、一本鎖核酸。
【請求項９２】
発現制御配列に作動可能に連結されている請求項４６に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項９３】
請求項９２に記載のベクターを含む、単離された細胞。
【請求項９４】
ＦｃＲＨを作製する方法であって、該方法は、該ＦｃＲＨの発現を許容する条件下で請求項９３に記載の細胞を培養する工程を包含する、方法。
【請求項９５】
発現制御配列に作動可能に連結されている請求項５７に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項９６】
請求項９５に記載のベクターを含む、単離された細胞。
【請求項９７】
ＦｃＲＨを作製する方法であって、該方法は、該ＦｃＲＨの発現を許容する条件下で請求項９６に記載の細胞を培養する工程を包含する、方法。
【請求項９８】
発現制御配列に作動可能に連結されている請求項５６に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項９９】
請求項９８に記載のベクターを含む、単離された細胞。
【請求項１００】
ＦｃＲＨを作製する方法であって、該方法は、該ＦｃＲＨの発現を許容する条件下で請求項９９に記載の細胞を培養する工程を包含する、方法。
【請求項１０１】
発現制御配列に作動可能に連結されている請求項５７に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項１０２】
請求項１０１に記載のベクターを含む、単離された細胞。
【請求項１０３】
ＦｃＲＨを作製する方法であって、該方法は、該ＦｃＲＨの発現を許容する条件下で請求項１０２に記載の細胞を培養する工程を包含する、方法。
【請求項１０４】
発現制御配列に作動可能に連結されている請求項６７に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項１０５】
請求項１０４に記載のベクターを含む、単離された細胞。
【請求項１０６】
ＦｃＲＨを作製する方法であって、該方法は、該ＦｃＲＨの発現を許容する条件下で請求項１０５に記載の細胞を培養する工程を包含する、方法。
【請求項１０７】
発現制御配列に作動可能に連結されている請求項６８に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項１０８】
請求項１０７に記載のベクターを含む、単離された細胞。
【請求項１０９】
ＦｃＲＨを作製する方法であって、該方法は、該ＦｃＲＨの発現を許容する条件下で請求項１０８に記載の細胞を培養する工程を包含する、方法。
【請求項１１０】
発現制御配列に作動可能に連結されている請求項９１に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項１１１】
請求項１１０に記載のベクターを含む、単離された細胞。
【請求項１１２】
ＦｃＲＨを作製する方法であって、該方法は、該ＦｃＲＨの発現を許容する条件下で請求項１１１に記載の細胞を培養する工程を包含する、方法。
【請求項１１３】
精製された抗体またはその免疫学的フラグメントであって、該抗体またはそのフラグメントが、請求項１に記載のＦｃＲＨに選択的に結合する、抗体またはそのフラグメント。
【請求項１１４】
精製された抗体またはその免疫学的フラグメントであって、該抗体またはそのフラグメントが、請求項２に記載のＦｃＲＨに選択的に結合する、抗体またはそのフラグメント。
【請求項１１５】
精製された抗体またはその免疫学的フラグメントであって、該抗体またはそのフラグメントが、請求項１７に記載のＦｃＲＨに選択的に結合する、抗体またはそのフラグメント。
【請求項１１６】
精製された抗体またはその免疫学的フラグメントであって、該抗体またはそのフラグメントが、請求項２７に記載のＦｃＲＨに選択的に結合する、抗体またはそのフラグメント。
【請求項１１７】
前記抗体またはそのフラグメントがモノクローナル抗体またはそのフラグメントである、請求項１１３に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項１１８】
前記抗体またはそのフラグメントがヒト化抗体、完全なヒト抗体、またはそれらのフラグメントである、請求項１１３に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項１１９】
前記抗体またはそのフラグメントが単鎖抗体またはそのフラグメントである、請求項１１３に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項１２０】
前記抗体またはそのフラグメントが標識されている、請求項１１３に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項１２１】
標識が放射性標識である、請求項１１３に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項１２２】
前記抗体またはそのフラグメントが毒素に結合体化されるか、または融合される、請求項１１３に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項１２３】
請求項６に記載のＦｃＲＨと選択的に結合するが、請求項１８、２８または４３に記載のＦｃＲＨとは結合しない、精製された抗体。
【請求項１２４】
請求項１８に記載のＦｃＲＨと選択的に結合するが、請求項６、２８または４３に記載のＦｃＲＨとは結合しない、精製された抗体。
【請求項１２５】
請求項２８に記載のＦｃＲＨと選択的に結合するが、請求項６、１８または４３に記載のＦｃＲＨとは結合しない、精製された抗体。
【請求項１２６】
請求項２９に記載のＦｃＲＨと結合しない、請求項１２５に記載の精製された抗体。
【請求項１２７】
請求項２９に記載のＦｃＲＨと選択的に結合するが、請求項６、１８または４３に記載のＦｃＲＨとは結合しない、精製された抗体。
【請求項１２８】
請求項２８に記載のＦｃＲＨと結合しない、請求項１２７に記載の精製された抗体。
【請求項１２９】
請求項４３に記載のＦｃＲＨと選択的に結合するが、請求項６、１８または２８に記載のＦｃＲＨとは結合しない、精製された抗体。
【請求項１３０】
請求項７に記載のＦｃＲＨと選択的に結合するが、請求項１９、３０または４４に記載のＦｃＲＨとは結合しない、精製された抗体。
【請求項１３１】
請求項１９に記載のＦｃＲＨと選択的に結合するが、請求項７、３０または４４に記載のＦｃＲＨとは結合しない、精製された抗体。
【請求項１３２】
請求項３０に記載のＦｃＲＨと選択的に結合するが、請求項７、１９または４４に記載のＦｃＲＨとは結合しない、精製された抗体。
【請求項１３３】
請求項４４に記載のＦｃＲＨと選択的に結合するが、請求項７、１９または３０に記載のＦｃＲＨとは結合しない、精製された抗体。
【請求項１３４】
被験体における造血細胞系統の疾患を診断する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）請求項１１３に記載の抗体が生物学的サンプル中のＦｃＲＨと結合し得る条件下で、該抗体に該被験体の生物学的サンプルを接触させる工程；
（ｂ）該核酸による結合の量またはパターンを検出する工程であって、コントロールサンプルにおける結合と比較した該結合の量またはパターンの変化が、該被験体の造血細胞系統の悪性腫瘍を示す工程；
を包含する、方法。
【請求項１３５】
前記造血細胞系統の悪性腫瘍がＢ細胞系統の悪性腫瘍である、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３６】
前記造血細胞系統の悪性腫瘍がＴ細胞系統の悪性腫瘍である、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３７】
前記抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を有するＦｃＲＨに選択的に結合する、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３８】
前記抗体が、配列番号２１のアミノ酸配列を有するＦｃＲＨに選択的に結合する、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３９】
前記抗体が、配列番号２のアミノ酸配列を有するＦｃＲＨに選択的に結合する、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１４０】
前記抗体が、配列番号３のアミノ酸配列を有するＦｃＲＨに選択的に結合する、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１４１】
前記抗体が、配列番号２２のアミノ酸配列を有するＦｃＲＨに選択的に結合する、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１４２】
前記抗体が、配列番号４のアミノ酸配列を有するＦｃＲＨに選択的に結合する、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１４３】
前記抗体が、配列番号５のアミノ酸配列を有するＦｃＲＨに選択的に結合する、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１４４】
前記抗体が、配列番号２３のアミノ酸配列を有するＦｃＲＨに選択的に結合する、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１４５】
前記抗体が、配列番号２４のアミノ酸配列を有するＦｃＲＨに選択的に結合する、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１４６】
前記抗体が、配列番号６のアミノ酸配列を有するＦｃＲＨに選択的に結合する、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１４７】
前記抗体が、配列番号２５のアミノ酸配列を有するＦｃＲＨに選択的に結合する、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１４８】
前記抗体が、配列番号２６のアミノ酸配列を有するＦｃＲＨに選択的に結合する、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１４９】
前記抗体が、配列番号２７のアミノ酸配列を有するＦｃＲＨに選択的に結合する、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１５０】
前記抗体が、配列番号２８のアミノ酸配列を有するＦｃＲＨに選択的に結合する、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１５１】
被験体における造血細胞系統の悪性腫瘍を診断する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）請求項５６に記載の核酸が生物学的サンプル中のＦｃＲＨにハイブリダイズし得る条件下で、該核酸を該被験体の生物学的サンプルに接触させる工程；
（ｂ）該核酸による結合の量またはパターンを検出する工程であって、コントロールサンプルにおける結合と比較した該結合の量またはパターンの変化が、該被験体の造血細胞系統の悪性腫瘍を示す工程；
を包含する、方法。
【請求項１５２】
前記造血細胞系統の悪性腫瘍がＢ細胞系統の悪性腫瘍である、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５３】
前記造血細胞系統の悪性腫瘍がＴ細胞系統の悪性腫瘍である、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５４】
被験体における造血細胞系統の悪性腫瘍を診断する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）請求項６７に記載の核酸が生物学的サンプルにハイブリダイズし得る条件下で、該核酸を該被験体の生物学的サンプルに接触させる工程；
（ｂ）該核酸による結合の量またはパターンを検出する工程であって、コントロールサンプルにおける結合と比較した該結合の量またはパターンの変化が、該被験体の造血細胞系統の悪性腫瘍を示す工程；
を包含する、方法。
【請求項１５５】
前記造血細胞系統の悪性腫瘍がＢ細胞系統の悪性腫瘍である、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５６】
前記造血細胞系統の悪性腫瘍がＴ細胞系統の悪性腫瘍である、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５７】
被験体における造血細胞系統の悪性腫瘍を診断する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）請求項８４に記載の核酸が生物学的サンプルにハイブリダイズし得る条件下で、該核酸を該被験体の生物学的サンプルに接触させる工程；
（ｂ）該核酸による結合の量またはパターンを検出する工程であって、コントロールサンプルにおける結合と比較した該結合の量またはパターンの変化が、該被験体の造血細胞系統の悪性腫瘍を示す工程；
を包含する、方法。
【請求項１５８】
前記造血細胞系統の悪性腫瘍がＢ細胞系統の悪性腫瘍である、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１５９】
前記造血細胞系統の悪性腫瘍がＴ細胞系統の悪性腫瘍である、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１６０】
被験体における造血細胞系統の悪性腫瘍を診断する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）請求項９１に記載の核酸が生物学的サンプルにハイブリダイズし得る条件下で、該核酸を該被験体の生物学的サンプルに接触させる工程；
（ｂ）該核酸による結合の量またはパターンを検出する工程であって、コントロールサンプルにおける結合と比較した該結合の量またはパターンの変化が、自己免疫疾患を示す、工程；
を包含する、方法。
【請求項１６１】
前記造血細胞系統の悪性腫瘍がＢ細胞系統の悪性腫瘍である、請求項１６０に記載の方法。
【請求項１６２】
前記造血細胞系統の悪性腫瘍がＴ細胞系統の悪性腫瘍である、請求項１６０に記載の方法。
【請求項１６３】
被験体における造血細胞系統の悪性腫瘍を処置する方法であって、該方法は、該被験体の悪性腫瘍細胞を請求項１１３に記載の抗体の治療有効量に接触させる工程を包含する、方法。
【請求項１６４】
前記造血細胞系統の悪性腫瘍がＢ細胞系統の悪性腫瘍である、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６５】
前記造血細胞系統の悪性腫瘍がＴ細胞系統の悪性腫瘍である、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６６】
前記抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を有するＦｃＲＨに選択的に結合する、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６７】
前記抗体が、配列番号２１のアミノ酸配列を有するＦｃＲＨに選択的に結合する、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６８】
前記抗体が、配列番号２のアミノ酸配列を有するＦｃＲＨに選択的に結合する、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６９】
前記抗体が、配列番号３のアミノ酸配列を有するＦｃＲＨに選択的に結合する、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１７０】
前記抗体が、配列番号２２のアミノ酸配列を有するＦｃＲＨに選択的に結合する、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１７１】
前記抗体が、配列番号４のアミノ酸配列を有するＦｃＲＨに選択的に結合する、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１７２】
前記抗体が、配列番号５のアミノ酸配列を有するＦｃＲＨに選択的に結合する、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１７３】
前記抗体が、配列番号２３のアミノ酸配列を有するＦｃＲＨに選択的に結合する、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１７４】
前記抗体が、配列番号２４のアミノ酸配列を有するＦｃＲＨに選択的に結合する、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１７５】
前記抗体が、配列番号６のアミノ酸配列を有するＦｃＲＨに選択的に結合する、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１７６】
前記抗体が、配列番号２５のアミノ酸配列を有するＦｃＲＨに選択的に結合する、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１７７】
前記抗体が、配列番号２６のアミノ酸配列を有するＦｃＲＨに選択的に結合する、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１７８】
前記抗体が、配列番号２７のアミノ酸配列を有するＦｃＲＨに選択的に結合する、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１７９】
前記抗体が、配列番号２８のアミノ酸配列を有するＦｃＲＨに選択的に結合する、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１８０】
被験体における造血細胞系統の悪性腫瘍を処置する方法であって、該方法は、該被験体の悪性腫瘍細胞を請求項５６に記載の核酸の治療有効量に接触させる工程を包含する、方法。
【請求項１８１】
被験体における造血細胞系統の悪性腫瘍を処置する方法であって、該方法は、該被験体の悪性腫瘍細胞を請求項６７に記載の核酸の治療有効量に接触させる工程を包含する、方法。
【請求項１８２】
被験体における造血細胞系統の悪性腫瘍を処置する方法であって、該方法は、該被験体の悪性腫瘍細胞を請求項８４に記載の核酸の治療有効量に接触させる工程を包含する、方法。
【請求項１８３】
被験体における造血細胞系統の悪性腫瘍を処置する方法であって、該方法は、該被験体の悪性腫瘍細胞を請求項９１に記載の核酸の治療有効量に接触させる工程を包含する、方法。
【請求項１８４】
被験体における自己免疫疾患を診断する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）請求項１１３に記載の抗体が生物学的サンプルのＦｃＲＨに結合し得る条件下で、該被験体の生物学的サンプルを該抗体に接触させる工程；
（ｂ）該核酸による結合の量またはパターンを検出する工程であって、コントロールサンプルにおける結合と比較した該結合の量またはパターンの変化が、該被験体の自己免疫疾患を示す工程；
を包含する、方法。
【請求項１８５】
被験体における自己免疫疾患を診断する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）請求項５６に記載の核酸が生物学的サンプルにハイブリダイズし得る条件下で、該核酸を該被験体の生物学的サンプルに接触させる工程；
（ｂ）該核酸による結合の量またはパターンを検出する工程であって、コントロールサンプルにおける結合と比較した該結合の量またはパターンの変化が、自己免疫疾患を示す、工程；
を包含する、方法。
【請求項１８６】
被験体における自己免疫疾患を診断する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）請求項６７に記載の核酸が生物学的サンプルにハイブリダイズし得る条件下で、該核酸を該被験体の生物学的サンプルに接触させる工程；
（ｂ）該核酸による結合の量またはパターンを検出する工程であって、コントロールサンプルにおける結合と比較した該結合の量またはパターンの変化が、自己免疫疾患を示す、工程；
を包含する、方法。
【請求項１８７】
被験体における自己免疫疾患を診断する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）請求項８４に記載の核酸が生物学的サンプルにハイブリダイズし得る条件下で、該核酸を該被験体の生物学的サンプルに接触させる工程；
（ｂ）該核酸による結合の量またはパターンを検出する工程であって、コントロールサンプルにおける結合と比較した該結合の量またはパターンの変化が、自己免疫疾患を示す、工程；
を包含する、方法。
【請求項１８８】
被験体における自己免疫疾患を診断する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）請求項９１に記載の核酸が生物学的サンプルにハイブリダイズし得る条件下で、該核酸を該被験体の生物学的サンプルに接触させる工程；
（ｂ）該核酸による結合の量またはパターンを検出する工程であって、コントロールサンプルにおける結合と比較した該結合の量またはパターンの変化が、自己免疫疾患を示す、工程；
を包含する、方法。
【請求項１８９】
被験体における自己免疫疾患を処置する方法であって、該方法は、該被験体のＦｃＲＨを発現している細胞を請求項１１３に記載の抗体の治療有効量に接触させる工程を包含する、方法。
【請求項１９０】
被験体における自己免疫疾患を処置する方法であって、該方法は、該被験体のＦｃＲＨを発現している細胞を請求項５６に記載の核酸の治療有効量に接触させる工程を包含する、方法。
【請求項１９１】
被験体における自己免疫疾患を処置する方法であって、該方法は、該被験体のＦｃＲＨを発現している細胞を請求項６７に記載の核酸の治療有効量に接触させる工程を包含する、方法。
【請求項１９２】
被験体における自己免疫疾患を処置する方法であって、該方法は、該被験体のＦｃＲＨを発現している細胞を請求項８４に記載の核酸の治療有効量に接触させる工程を包含する、方法。
【請求項１９３】
被験体における自己免疫疾患を処置する方法であって、該方法は、該被験体のＦｃＲＨを発現している細胞を請求項９１に記載の核酸の治療有効量に接触させる工程を包含する、方法。
【請求項１９４】
被験体における体液性免疫応答を調整する方法であって、該方法は、請求項１に記載の単離されたＦｃＲＨを該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１９５】
被験体における体液性免疫応答を調整する方法であって、該方法は、請求項１１３に記載の抗体を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１９６】
被験体における体液性免疫応答を調整する方法であって、該方法は、請求項５６に記載の核酸を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１９７】
被験体における体液性免疫応答を調整する方法であって、該方法は、請求項６７に記載の核酸を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１９８】
被験体における体液性免疫応答を調整する方法であって、該方法は、請求項８４に記載の核酸を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１９９】
被験体における体液性免疫応答を調整する方法であって、該方法は、請求項９１に記載の核酸を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２００】
ＦｃＲＨ１の単離されたマウスＦｃＲＨアイソフォームであって、該アイソフォームは、細胞質領域を欠失している、マウスＦｃＲＨアイソフォーム。
【請求項２０１】
配列番号７０のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項２０２】
保存的アミノ酸置換を有する配列番号７０のアミノ酸を含む、ポリペプチド。
【請求項２０３】
ＦｃＲＨ２の単離されたマウスＦｃＲＨアイソフォームであって、該ＦｃＲＨは、膜貫通領域を欠失している、マウスＦｃＲＨアイソフォーム。
【請求項２０４】
配列番号７３のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項２０５】
保存的アミノ酸置換を有する配列番号７３のアミノ酸を含む、ポリペプチド。
【請求項２０６】
配列番号７７のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項２０７】
保存的アミノ酸置換を有する配列番号７７のアミノ酸を含む、ポリペプチド。
【請求項２０８】
配列番号７８のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項２０９】
保存的アミノ酸置換を有する配列番号７８のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項２１０】
請求項２００に記載の単離されたマウスＦｃＲＨアイソフォームをコードする核酸。
【請求項２１１】
請求項２０３に記載の単離されたマウスＦｃＲＨアイソフォームをコードする核酸。
【請求項２１２】
請求項２０１に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項２１３】
請求項２０２に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項２１４】
請求項２０４に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項２１５】
請求項２０５に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項２１６】
請求項２０６に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項２１７】
請求項２０７に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項２１８】
請求項２０８に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項２１９】
請求項２０９に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００２年３月２５日に出願された、米国仮出願番号６０／３６７，６６７の利益を請求する。
【０００２】
（謝辞）
本発明は、ＮＩＡＩＤによって与えられた助成金２Ｒ３７およびＡＩ３９８１６の下、政府の支援によってなされた。政府は、本発明に特定の権利を有する。
【０００３】
（技術分野）
本発明は、一般に炎症性疾患および癌の文脈における免疫学的応答の免疫学および変調に関する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
免疫グロブリンのＦｃ領域（ＦｃＲ）のためのレセプターは、広範な組織分布パターンを有し、それらの抗体リガンドを免疫系のエフェクター細胞に結合することによって、細胞性免疫および体液性免疫を調整し得る（Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．＆Ｋｉｎｅｔ，Ｊ．−Ｐ．（１９９１）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９，４５７−４９２；Ｄａｅｒｏｎ，Ｍ．（１９９７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５，２０３−２３４）。これらの細胞レセプターは、体液の抗体濃度を感作し、宿主の防御の細胞応答を開始し、自己免疫障害に参加する能力を有する（Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．＆Ｂｏｌｌａｎｄ，Ｓ．（２００１）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９，２７５−２９０）。これらの多様な調整の役割は、Ｉｇアイソタイプの特異性および個々のＦｃＲの細胞分布に依存する。これらのＩｇスーパーファミリーメンバーはそれらのリガンドを結合しているサブユニットの類似点を共有し、それらの細胞内ドメインの抑制性シグナル伝達モチーフもしくは活性化シグナル伝達モチーフを有し得るか、またはその代わりに、活性化シグナル伝達モチーフを保有するシグナル伝達サブユニットと対になり得る。
【０００５】
最近、マウスのＦｃＲホモログ、対になったＩｇ様レセプター（Ｋｕｂａｇａｗａ，Ｈ．ら、（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４，５２６１−５２６６；Ｈａｙａｍｉ，Ｋ．ら、（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２７２，７３２０−７３２７））、およびこれらのヒトにおける類似物であるＩｇ様転写物／白血球Ｉｇ様レセプター（Ｂｏｒｇｅｓ，Ｌ．ら、（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｎｕｎｏｌ．１５９，５１９２−５１９６；Ｓａｍａｒｉｄｉｓ，Ｊ．＆Ｃｏｌｏｎｎａ，Ｍ．（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７，６６０−６６５）の特徴が明らかにされた。この多重遺伝子ファミリー（ＦｃαＲ（Ｋｒｅｍｅｒ，Ｅ．Ｊ．ら、（１９９２）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．８９，１０７−１０８）およびナチュラルキラー細胞Ｉｇ様レセプター（Ｗａｇｔｍａｎｎ，Ｎ．ら、（１９９７）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．７，６１５−６１８）を含む）は、白血球レセプター複合体（ＬＲＣ）（Ｗｅｎｄｅ，Ｈ．ら、（１９９９）Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ  １０，１５４−１６０；Ｗｉｌｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．ら、（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７，４７７８−４７８３）として公知のヒト染色体１９ｑ１３領域にある。これらのＩｇ様多重遺伝子ファミリーは、一般的な細胞質のチロシンベースのシグナル伝達モチーフを所有することによって特徴づけられる、レセプターのより大きなクラスに属する。これらは、６〜８つのアミノ酸（Ｅ／Ｄ）−Ｘ−Ｘ−Ｙ−Ｘ−Ｘ−（Ｌ／Ｉ）−Ｘ６−８−Ｙ−Ｘ−Ｘ（Ｌ／Ｉ）（配列番号６４（コンセンサス配列間の６つのアミノ酸を有する）；配列番号６５（コンセンサス配列間の７つのアミノ酸残基を有する）；および、配列番号６６（コンセンサス配列間の８つのアミノ酸残基を有する））によって間隔を置かれるコンセンサス配列Ｙ−Ｘ−Ｘ−Ｌ／Ｉの２回の繰り返しを含む、免疫レセプターチロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、または、６つのアミノ酸コンセンサス配列（Ｉ／Ｖ／Ｌ／Ｓ）−Ｘ−Ｙ−Ｘ−Ｘ（Ｌ／Ｖ）（配列番号６７）を有する免疫レセプターチロシンベースの抑制性モチーフ（ＩＴＩＭ）のいずれかであり得る（Ｒｅｔｈ，Ｍ．（１９９２）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０，９７−１２１；Ｖｅｌｙ，Ｆ．＆Ｖｉｖｉｅｒ，Ｅ．（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９，２０７５−２０７７；Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．＆Ｌａｎｉｅｒ，Ｌ．Ｌ．（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０，８４−８９；Ｇｅｒｇｅｌｙ，Ｊ．ら、（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｆｔ．６８，３−１５）。トリ（Ｄｅｎｎｉｓ，Ｇ．ら、（２０００）Ｐｒｏｃ．ＮａｔＩ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７，１３２４５−１３２５０）および小骨の多い魚（ｂｏｎｙ  ｆｉｓｈ）（Ｙｏｄｅｒ，Ｊ．Ａ．ら、（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８，６７７１−６７１７）におけるこれらの種のレセプターの系統発生学的保存は、これらの生物価を発現す。活性化レセプター複合体にリガンドが結合した後、ＩＴＡＭチロシンがＳｒｃファミリーキナーゼによって急速にリン酸化され、細胞の活性化を誘発するシグナル伝達現象のカスケードを開始する。ＩＴＩＭを有するレセプターの場合、チロシンは、Ｓｒｃ相同性２ドメインを含むホスファターゼのためのドッキング部位を提供し、このホスファターゼは、細胞の活性化を抑制し得る（Ｌｏｎｇ，Ｅ．Ｏ．（１９９９）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７，８７５−９０４；Ｕｎｋｅｌｅｓｓ，Ｊ．Ｃ．＆Ｊｉｎ，Ｊ．（１９９７）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９，３３８−３４３）。これらの活性化レセプター対および抑制性レセプター対の利用のバランスは、種々の刺激への細胞応答を調整するのに役立ち得る。
【０００６】
古典的なＦｃγＲｓ、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＨｌおよびＦｃεＲＩをコードする遺伝子が、ポリマー性Ｉｇレセプター（ｐＩｇＲ）およびＦｃα／μＲ遺伝子（１ｑ３２）の近くの、１番染色体（１ｑ２１−２３）の長腕上に位置する（２０〜２３）。このＦｃＲサブファミリーのメンバーは、１９番染色体上のＬＲＣにあるＦｃＲ関連の遺伝子を有する比較的低い細胞外相同性を有する。ＦｃγＲ活性化レセプターおよびＦｃεＲ活性化レセプターと同様に、ＦｃαＲのリガンド結合鎖は、ＦｃＲの一般的なγ鎖を含むＩＴＡＭと会合する（Ｐｆｅｆｆｅｒｋｏｒｎ，Ｌ．Ｃ．＆Ｙｅａｍａｎ，Ｇ．Ｒ．（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３，３２２８−３２３６；Ｍｏｒｔｏｎ，Ｅ．Ｃ．ら、（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，２９７８１−２９７８７）。多様なシグナルの性質および発癌の可能性を有し得るＦｃＲファミリーの新規なメンバーが探求された。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明の目的に従って、本明細書中で実施されて、広く記載されているように、本発明は、１つの局面において、例えば、ヒト染色体１ｑ２１−２３の領域の遺伝子または非ヒト被験体の類似した領域によってコードされる、ＦｃＲおよびＦｃＲ遺伝子類縁体のクラスターのメンバーに関する。このメンバーは、ＦｃＲファミリーに対して相同性を有するＩ型膜貫通型レセプターまたはその代替的なスプライスされた形態であり、本明細書中で、ＦｃＲＨと称される。各ＦｃＲＨは、細胞外領域、膜貫通領域および細胞質領域を含み得る。細胞質領域は好ましくは１つ以上の免疫レセプターチロシンベースの抑制性モチーフまたは活性化モチーフ（「ＩＴＩＭ」または「ＩＴＡＭ」）を含む。
【０００８】
本発明は、単離されたＦｃＲＨ（例えば、ｈｕＦｃＲＨ１、２、３および６ならびにｍｏＦｃＲＨ１、２および３）に対応するポリペプチド、ならびに、そのフラグメントおよびアイソフォームに関する。本発明は、さらに、ＦｃＲＨをコードする核酸、ならびにそれに関連するハイブリダイゼーションプローブおよび相補的な配列に関する。本発明は、さらに本発明の核酸に関連したベクターおよび細胞を提供する。
【０００９】
本発明は、さらに、ＦｃＲＨまたはそのフラグメントまたは改変体の作製に関し、この作製は、ＦｃＲＨの発現を許容する条件下で本発明のベクターを含む細胞を培養する工程を包含する。本発明はまた、抗体、またはそのフラグメントもしくは改変体、および、抗体、フラグメントまたは抗体改変体のリガンドへの結合を検出するための試薬を含む抗体試薬キットを提供する。
【００１０】
本発明は、さらに、本発明のポリペプチド、核酸および抗体の使用に関する。例えば、本発明は、被験体における造血細胞系統の悪性腫瘍または炎症または自己免疫疾患を診断方法および処置方法に関する。本発明はまた、被験体における体液性免疫応答の調節に関する。
【００１１】
本発明のさらなる利点は、以下の明細書に部分的に示されており、かつ、部分的に明細書から明らかであるか、または本発明の実施によって習得され得る。本発明の利点は、添付の特許請求の範囲に特に示されている要素および組合せによって認識され、達成される。請求されるように、前述の一般的な説明および以下の詳細な説明の両方が例示的かつ説明的なだけで、本発明を制限するものでないことが理解される。
【００１２】
添付の図面（本明細書中に援用され、本明細書の一部を構成する）は、本発明の（１つの）いくつかの実施形態を例示し、本明細書と共に、本発明の原則を説明するのに役立つ。
【００１３】
（好ましい実施形態の説明）
本発明は、以下の本発明の好ましい実施形態の詳細な説明および、そこに含まれる実施例、ならびに、添付の図面およびそれらの以前および以下の説明を参照して、より容易に理解され得る。
【００１４】
本明細書および添付の特許請求の範囲において、以下の意味を有すると定義される多数の用語について参照がなされる：
本明細書中および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が特に明確に示さない限り、複数の指示物を含む。このように、例えば、レセプターとの言及は種々のレセプターの混合物を含み、「薬学的キャリア」との言及は２つ以上のこの種のキャリアなどの混合物を含む。
【００１５】
範囲は、「約」１つの特定の値から、および／または「約」別の特定の値までとして本明細書中で表され得る。この種の範囲が表される場合、別の実施形態は、１つの特定の値から、および／または、他の特定の値までを含む。同様に、値が近似値として表される場合、前に「あたりを」を使用することにより、特定の値が別の実施形態をなすことが理解される。各範囲の終点が両方とも他の終点に関して、そして、それぞれに他の終点に関しての両方において有意であることがさらに理解される。
【００１６】
「任意の（必要に応じて）」または「任意に（必要に応じて）」は、その後記載されている現象または状況が生じても生じなくてもよく、そして、その説明が上記現象または状況が生じる場合と生じない場合を含むことを意味する。例えば、句「２つのＩＴＡＭコンセンサスモチーフを必要に応じて含む」は、２つのＩＴＡＭがあってもなくてもよく、そして、この説明が２つのＩＴＡＭコンセンサスモチーフの存在および不在の両方を含むことを意味する。
【００１７】
全体にわたって使用されるように、「被験体」は、個体を意味する。好ましくは、被験体は哺乳動物（例えば、霊長類、より好ましくは、ヒト）である。用語「被験体」としては、家畜化された動物（例えばネコ、イヌなど）、家畜（例えば、牛、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）および実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモットなど）が挙げられ得る。
【００１８】
「単離された核酸」は、天然に存在する核酸または、３つ以上の別個の遺伝子にわたる天然に存在するゲノム核酸の任意のフラグメントと同一でない構造の核酸を意味する。従って、この用語は、例えば、以下を網羅する：（ａ）天然に存在するゲノムＤＮＡ分子の一部の配列を有するが、それが天然に存在している生物体のゲノムの分子の一部を挟むコード配列の両方によって挟まれていないＤＮＡ；（ｂ）結果として生じる分子がいかなる天然に存在するベクターまたはゲノムＤＮＡとも同一でないように、ベクターまたは原核生物のゲノムＤＮＡもしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた核酸；（ｃ）別々の分子（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムフラグメント、ポリメラーゼ連鎖反応によって生じるフラグメントまたは制限フラグメント）；ならびに（ｄ）ハイブリッド遺伝子（すなわち、融合タンパク質をコードする遺伝子）の一部である組換えヌクレオチド配列。
【００１９】
「標識」は、目的の分子に、直接（例えば、ポリペプチドまたは核酸に組み込まれる蛍光分子）または、間接的に（例えば、一次抗体、二次抗体に統合した蛍光分子を結合させる方法で）取りつけられ得る任意の検出可能なタグを意味する。「標識」は、画像化方法によって視覚化され得る任意のタグである。検出可能なタグは、放射線不透過性物質、放射標識、蛍光標識または磁気標識であり得る。検出可能なタグは、局在化に適した、γ放出体、β放出体およびα放出体、γ放出体、陽電子放出体、Ｘ線放出体および蛍光放出体からなる群から選択され得る。適切な蛍光化合物としては、フルオレセインナトリウム、フルオレセインイソチオシアネート、フィコエリトリンおよびテキサスレッド塩化スルホニルが挙げられる。ｄｅ  Ｂｅｌｄｅｒ＆Ｗｉｋ（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｌａｂｅｌｌｅｄ  ｈｙａｌｕｒｏｎａｔｅ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．４４（２）：２５１−５７（１９７５）を参照のこと。当業者は、分子を標識するのに適した他の蛍光化合物を知っているか、または、慣習的な実験の範囲内で、確認することが可能である。
【００２０】
（ポリペプチド）
本発明は、ヒト染色体１ｑ２１−２３領域または非ヒト被験体の類似した領域（例えば、マウスの３番染色体を含む）の遺伝子によってコードされる、ＦｃＲおよびＦｃＲ遺伝子類縁体のクラスターのメンバーを提供する。コンセンサスアミノ酸モチーフ（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびｐＩｇＲ細胞外領域に基づく）をＧｅｎＢａｎｋタンパク質データベースクエリーに用いて、この遺伝子サブファミリーのメンバーを同定した。ＦｃＲ類縁体を含むことが見出され、Ｆｃレセプターホモログ（ＦｃＲＨ）サブファミリーと呼ばれる、ゲノムクローンが同定された：具体的には、ＦｃＲＨ１、ＦｃＲＨ２、ＦｃＲＨ３およびＦｃＲＨ６。また、マウスＦｃレセプターホモログ（ｍｏＦｃＲ１、ｍｏＦｃＲ２およびｍｏＦｃＲ３と命名された）も見出された。
【００２１】
「相同」とは、約２５％またはそれ以上の相同性を意味する。コンポジット分析法で同定される場合、相同性はまた、遺伝子の位置の近似によって、類似性によって特徴づけられる。本明細書中で使用される場合、２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の「パーセント相同性」は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８（１９９０））を使用して決定される。この種のアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム（スコア１００、ワード長（ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ）＝１２）で実行され、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝５０、ワード長＝３）で実行され、参照ポリペプチドに相同なアミノ酸配列を得る。比較のためにすき間を作られた配列を得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７））に記載されるように、Ｇａｐｐｅｄ  Ｂｌａｓｔを利用する。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータが使われる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照のこと。
【００２２】
「ＦｃＲＨ」とは、古典的Ｆｃレセプターファミリーに相同な、Ｉ型膜貫通レセプターまたはその代替的なスプライスされた形態（例えば、分泌形態またはＧＰＩアンカー形態を含む）を意味する。好ましい実施形態において、ＦｃＲＨは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩまたはｐＩｇＲの細胞外領域と相同性を示す。より具体的には、ＦｃＲＨは、ＦｃγＲの第２のＩｇドメイン、およびｐＩｇＲまたはＦｃγＲＨ１の第３のＩｇドメインのアミノ末端配列に対応するアミノ酸配列と相同性を示す。ＦｃＲＨは、細胞外領域、膜貫通領域および細胞質領域を含み得る。細胞外領域は、好ましくは、１つ以上のＩｇドメインより、好ましくは９つ未満、なおより好ましくは、７つ未満、または８つ未満のＩｇドメインを含む。好ましくは、細胞質領域は、１０７以上（１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４または１４５以上を含む）のアミノ酸を含む。あるいは、細胞質領域は、１０４未満（１０３、１０２、１０１、１００、９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８９、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０未満を含む）のアミノ酸を含む。細胞質領域は、好ましくは１つ以上の免疫レセプターチロシンベースの抑制性モチーフまたは活性化モチーフ（「ＩＴＩＭ」または「ＩＴＡＭ」）を含む。
【００２３】
本発明は、単離されたＦｃＲＨ（例えば、以下に詳述するような、ｈｕＦｃＲＨ１、ｈｕＦｃＲＨ２、ｈｕＦｃＲＨ３およびｈｕＦｃＲＨ６、ならびにｍｏＦｃＲＨ１〜３）、ならびに、そのフラグメントおよびアイソフォームを提供する。本明細書中に提供される単離されたアミノ酸配列は、必要に応じて、ヒトシグナル配列（例えば、ＭＬＰＲＬＬＬＬＩＣＡＰＬＣＥＰ（配列番号２９）、ＭＬＬＷＳＬＬＶＩＦＤＡＶＴＥＱＡＤＳ（配列番号３０）、ＭＬＬＷＬＬＬＬＩＬＴＰＧＲＥＱＳ（配列番号３１）、ＭＬＬＷＴＡＶＬＬＦＶＰＣＶＧ（配列番号３２））またはマウスシグナル配列（例えば、ＭＰＬＣＬＬＬＬＶＦＡＰＶＧＶＱＳ（配列番号６９）、ＭＬＰＷＬＬＬＬＩＣＡＬＰＣＥＰＡ（配列番号７２）、ＭＳＧＳＦＳＰＣＶＶＦＴＱＭＷＬＴＬＬＶＶＴＰＶＮ（配列番号７９））と組合わされる。
【００２４】
１つの実施形態において、本発明は、ｈｕＦｃＲＨ１ならびにそのフラグメントおよびアイソフォームを提供する。このように、単離されたＦｃＲＨの１つの実施形態において、細胞外領域は、４つ未満のＩｇドメインを含む。好ましくは、細胞質領域は、１０４未満のアミノ酸を含み、さらにより好ましくは、１０４未満であり８６より多いアミノ酸を含む。１つの実施形態において、膜貫通領域は、酸性アミノ酸（例えば、グルタミン酸またはアスパラギン酸）を含む。保存的アミノ酸置換の存在下または不在下で、本発明の単離されたＦｃＲＨは、配列番号１のアミノ酸配列を有する細胞質領域を含む。保存的アミノ酸置換の存在下または不在下で、そして、シグナル配列の存在下および不在下で、細胞外領域が配列番号２１のアミノ酸配列を含む、単離されたＦｃＲＨがさらに提供される。より具体的には、単離されたＦｃＲＨは、保存的アミノ酸置換の存在下または不在下で、そして、シグナル配列の存在下または不在下で、配列番号２のアミノ酸配列を含む。１つの実施形態において、シグナル配列は、ＭＬＰＲＬＬＬＬＩＣＡＰＬＣＥＰ（配列番号２９）である。好ましい実施形態において、本発明のＦｃＲＨは、骨髄細胞（例えば、顆粒白血球および単球）によって発現される。全長ＦｃＲＨ１のさらなる特徴としては以下が挙げられる：約４６〜４７のｋダルトンの予測された分子量；約３５の強塩基性（＋）アミノ酸（Ｋ、Ｒ）、約４５の強酸性（−）アミノ酸（Ｄ、Ｅ）、約１４４の疎水性アミノ酸（Ａ，Ｉ，Ｌ，Ｆ，Ｗ，Ｖ）、および約１２７の極性アミノ酸（Ｎ，Ｃ，Ｑ，Ｓ，Ｔ，Ｙ）を有する、約４２５〜４３５（例えば４２９）アミノ酸長；約５〜５．５（例えば、５．３１０）の予測された等電点；ならびに、ＰＨ７．０で約−９の電荷。
【００２５】
別の実施形態において、本発明は、ｈｕＦｃＲＨ２、そのフラグメントまたはアイソフォームに対応する単離されたＦｃＲＨを提供する。このように、本発明は、細胞質領域が９９未満（例えば、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８）のアミノ酸を含み、そして、レセプターが、さらに４つまでのＩｇドメイン、５つまでのＮ連結グリコシル化部位を有する細胞外ドメインを含む、ＦｃＲＨを提供する。より具体的には、単離されたＦｃＲＨは、保存的アミノ酸置換の存在下もしくは不在下で配列番号３のアミノ酸配列を含む細胞質領域、または、保存的アミノ酸置換の存在下もしくは不在下で、そして、シグナル配列の存在下もしくは不在下で、配列番号２２を含む細胞外領域を有する。なおより具体的には、単離されたＦｃＲＨは、保存的アミノ酸置換の存在下もしくは不在下で、そして、シグナル配列の存在下もしくは不在下で、配列番号４のアミノ酸配列を含む。１つの実施形態において、シグナル配列はＷＳＬＬＶＩＦＤＡＶＴＥＱＡＤＳ（配列番号３０）である。全長ＦｃＲＨ１のさらなる特徴としては、以下が挙げられる：約５０〜６０ｋダルトンの予測された分子量；約４４の強塩基性（＋）アミノ酸（Ｋ、Ｒ）、約４９の強酸性（−）アミノ酸（Ｄ，Ｅ）、約１７５の疎水性アミノ酸（Ａ，Ｉ，Ｌ，Ｆ，Ｗ，Ｖ）および約１６１の極性アミノ酸（Ｎ，Ｃ，Ｑ，Ｓ，Ｔ，Ｙ）を有する約４９５〜５１５（例えば、５０８）のアミノ酸長；約６〜６．５（例えば、６．１８８）の予測された等電点；ならびに、ＰＨ７．０で約−４の電荷。
【００２６】
別の実施形態において、本発明は、ｈｕＦｃＲＨ３、そのフラグメントおよびアイソフォームを提供する。より具体的には、本発明は、１０７より多くのアミノ酸（例えば、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、２１２、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、２４７、１４８、１４９、１５０のアミノ酸）を含む細胞質領域を有する単離されたＦｃＲＨを提供する。必要に応じて、単離されたＦｃＲＨは、１つのＩＴＡＭおよび１つのＩＴＩＭを含む細胞質領域を有する。より具体的には、保存的アミノ酸置換の存在下または不在下で、細胞質領域は、配列番号５または配列番号２３のアミノ酸配列を含む。１つの実施形態において、ＦｃＲＨの細胞外ドメインは、保存的アミノ酸置換の存在下または不在下で、そして、シグナル配列の存在下または不在下で、配列番号２４のアミノ酸配列を含む。１つ以上のアミノ酸置換の存在下または不在下で、そして、シグナル配列の存在下または不在下で、配列番号６または配列番号２５のアミノ酸配列を含む単離されたＦｃＲＨがまた提供される。１つの実施形態において、シグナル配列はＭＬＬＷＬＬＬＬＩＬＴＰＧＲＥＱＳ（配列番号３１）を含む。全長ＦｃＲＨ１のさらなる特徴としては以下が挙げられる：約８０〜９０ｋダルトンの予測された分子量；約６８の強塩基性（＋）アミノ酸（Ｋ，Ｒ）、約７５の強酸性（−）アミノ酸（Ｄ，Ｅ）、約２３２の疎水性アミノ酸（Ａ，Ｉ，Ｌ，Ｆ，Ｗ，Ｖ）および約２２４の極性アミノ酸（Ｎ，Ｃ，Ｑ，Ｓ，Ｔ，Ｙ）を有する約７２５〜７４０（例えば、７３４）のアミノ酸長；約６．５〜７．０（例えば、６．８５２）の予測された等電点；ならびに、ＰＨ７．０で約−２の電荷。
【００２７】
本発明は、単離されたｈｕＦｃＲＨ６、そのフラグメントおよびアイソフォームをさらに提供する。より具体的には、１つ以上の保存的アミノ酸置換の存在下または不在下で、ＦｃＲＨは、配列番号２６のアミノ酸配列を有する細胞質領域を含む。細胞外ドメインは、保存的アミノ酸置換の存在下または不在下で、そして、シグナル配列の存在下または不在下で、配列番号２７のアミノ酸配列を含む。保存的アミノ酸置換の存在下または不在下で、そして、シグナル配列の存在下または不在下で、配列番号２８のアミノ酸置換を有する、ＦｃＲＨがまた、本発明によって提供される。１つの実施形態において、シグナル配列は、ＭＬＬＷＴＡＶＬＬＦＶＰＣＶＧ（配列番号３２）である。
【００２８】
本発明はさらに、保存的アミノ酸置換の存在下または不在下で、本発明は、さらに配列番号１、２１、２、３、２２、４、５、２３、２４、６、２５、２６、２７または２８のアミノ酸配列を含む、ポリペプチドを提供する。本発明はまた、配列番号１、２１、２、３、２２、４、５、２３、２４、６、２５、２６、２７または２８と少なくとも８０、８５、９０または９５％の相同性を有するポリペプチドを提供する。
【００２９】
本発明はさらに、単離されたｍｏＦｃＲＨ１アイソフォーム、そのフラグメントおよびアイソフォームを提供する。ｍｏＦｃＲＨ１は、配列番号６８のアイソフォームである。より具体的には、ＦｃＲＨは４つのＩｇドメインを含み、そして、必要に応じて、１つ以上の保存的アミノ酸置換の存在下または不在下で、そして、シグナル配列（例えば、配列番号７１の配列）の存在下または不在下で、配列番号７０の配列を有する。
【００３０】
本発明はさらに、単離されたｍｏＦｃＲＨ２、そのフラグメントおよびアイソフォームを提供する。提供されたアイソフォームは、膜貫通領域を有する１つのアイソフォームおよび膜貫通領域を欠失している１つのアイソフォームを含む。より具体的には、ＦｃＲＨは、１つ以上の保存的アミノ酸置換の存在下または不在下で、配列番号７６のアミノ酸配列を有する細胞質領域を含む。細胞外ドメインは、保存的アミノ酸置換の存在下または不在下で、そして、シグナル配列の存在下または不在下で、配列番号７４のアミノ酸配列を含む。膜貫通領域を含む配列番号７３、または膜貫通領域を欠失している配列番号７７のアミノ酸配列を有するＦｃＲＨがまた本発明によって提供される。いずれの場合においても、ＦｃＲＨ配列は、保存的アミノ酸置換の有無およびシグナル配列の有無を含み得る。１つの実施形態において、シグナル配列は、配列番号７２の配列である。
【００３１】
本発明はまた、ｍｏＦｃＲＨ３、そのフラグメントおよびアイソフォームを提供した。保存的アミノ酸置換の存在下または不在下で、細胞質領域は、配列番号８１のアミノ酸配列を含み得る。必要に応じて、細胞外ドメインは、保存的アミノ酸置換の存在下もしくは不在下で、または、シグナル配列（例えば、配列番号７９の配列）の存在下もしくは不在下で、配列番号８０のアミノ酸配列を含む。全長配列は、必要に応じて、保存的アミノ酸置換の存在下もしくは不在下で、またはシグナル配列（例えば、配列番号７９の配列）の存在下もしくは不在下で、配列番号７８のアミノ酸配列を有する。
【００３２】
本発明のＦｃＲＨのフラグメント、改変体またはアイソフォームが提供される。これらの用語が機能的な改変体を含むことが理解される。フラグメントは、細胞質領域、細胞外領域、膜貫通領域、または少なくとも１０のアミノ酸の任意の部分、または領域もしくは部分の任意の組合せも含み得る。改変体は、アミノ酸置換、欠失および挿入、ならびに翻訳後修飾によって作製される。翻訳後修飾における変化は、タンパク質コアの炭化水素部分またはその任意のフラグメントもしくは誘導体の型または量の変化を含み得る。アミノ酸配列における変化が、対立遺伝子の変化（例えば、遺伝子多型による）として自然に起こり得るかまたは人間の介入（例えば、クローン化されたＤＮＡ配列の変異誘発）によって、（例えば、誘導された点、欠失、挿入および置換変異体）作製され得る。これらの修飾は、アミノ酸配列の変化を生じ得るか、サイレントな変異誘発を提供し得るか、制限部位を変更し得るか、または、他の特定の変異誘発を提供し得る。
【００３３】
アミノ酸配列修飾体は、３のクラス（置換改変体、挿入改変体または欠失改変体）の１つ以上に分類される。挿入としては、アミノ末端融合および／またはカルボキシル末端融合ならびに、単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。挿入は、通常、例えば、１〜４つの残基のオーダーで、アミノ末端融合またはカルボキシル端末融合の挿入より小さい挿入である。欠失は、タンパク質配列から１つ以上のアミノ酸残基の除去によって特徴づけられる。代表的に、約２〜６つ以内の残基は、タンパク質分子内の任意の１つの部位で欠失される。これらの改変体は通常、タンパク質をコードするＤＮＡのヌクレオチドの部位特異的変異によって調製され、それによって、改変体をコードするＤＮＡを生産し、その後、組換え細胞培養物においてＤＮＡを発現する。既知の配列を有するＤＮＡの予め定められた部位で置換変異を作製するための技術は、周知であり、例えば、Ｍ１３プライマー変異誘発およびＰＣＲ変異誘発が挙げられる。アミノ酸置換は、代表的には１つの残基であるが、異なる位置で多数の置換を含み得る；挿入は、通常、約１〜１０のアミノ酸残基のオーダーであるが、それより多くであり得る；そして、欠失は、約１〜３０の残基の範囲であるが、より多くであり得る。欠失または挿入は、好ましくは、隣接する対（すなわち、２つの残基の欠失または２つの残基の挿入）でなされる。置換、欠失、挿入またはこれら任意の組合せが、最終的な構築物に到達するために組合され得る。変異誘発は、リーディングフレームから外れて配列を配置してはならず、好ましくは、二次ｍＲＮＡ構造を産生し得る相補領域を作製しない。置換改変体は、少なくとも１つの残基が取り除かれ、そして、異なる残基がその位置に挿入されたものである。この種の置換は、一般に、表Ｉに従ってなされ、そして、保存的な置換と称される。
【００３４】
【表１】
2005521429.tif 000002
【００３５】
機能または免疫学的同一性のかなりの変化は、表１のものより保存的でない置換を選ぶことによって（すなわち、（ａ）置換の領域のポリペプチド骨格の構造（例えば、シート状構造またはらせん状構造）、（ｂ）標的部位での分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖の大きさを維持することに対するそれらの効果の、より有意に異なる残基を選ぶことによって）なされる。一般に、タンパク質特性において最も大きな変化をもたらすと期待される置換は、（ａ）親水性残基（例えば、セリルまたはスレオニル）が、疎水性の残基（例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたは、アラニル）と（または、で）置換される置換；（ｂ）システインまたはプロリンが、任意の他の残基と（または、で）置換される置換；（ｃ）電気陽性側鎖（例えば、リジル、アルギニルまたはヒスチジル）を有する残基が、電気陰性残基（例えば、グルタミルまたはアスパルチル）と（または、で）置換される置換；あるいは（ｄ）大きな側鎖を有する残基（例えば、フェニルアラニン）が、側鎖を持たない残基（例えば、グリシン）と（または、で）置換される置換、そして、この場合において、（ｅ）硫酸化および／またはグリコシル化部位の数を増やすことによる置換である。
【００３６】
置換または欠失の変異誘発は、Ｎ−グリコシル化（Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ）またはＯ−グリコシル化（ＳｅｒまたはＴｈｒ）の部位を挿入するために使用され得る。システインまたは他の変化しやすい残基の欠失もまた、望ましくあり得る。潜在的なタンパク質分解部位（例えば、Ａｒｇ）の欠失または置換は、例えば、塩基性残基のうちの１つを削除することによってか、または、グルタミニル残基もしくヒスチジル残基によって１つを置換することによって達成される。
【００３７】
特定の翻訳後誘導体化は、発現されたポリペプチド上の組換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミニル残基およびアスパラギニル残基は、しばしば、対応するグルタミル残基およびアスパリル残基に、翻訳後脱アミド化される。あるいは、これらの残基は、弱酸性の状況下で脱アミド化される。他の翻訳後修飾としては、プロリンおよびリジンの水酸化、セリル残基またはトレオニル残基の水酸基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のＯ−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ７９−８６頁［１９８３］）、Ｎ末端アミンのアセチル化、ならびに、いくつかの場合において、Ｃ末端のカルボキシルのアミド化が挙げられる。ＦｃＲＨの修飾体はまた、グリコシル化の修飾体も含み得る。
【００３８】
全ての変異誘発の現象において、変異の制御の局面が次のタンパク質が所有している機能であると理解される。好ましい変異は、所望の機能を検出可能的に変えないか、または、所望の機能を増すものである。
【００３９】
（核酸）
本発明のＦｃＲＨをコードする単離された核酸がまた提供される。核酸は、一本鎖または二本鎖であり得、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。より具体的には、本発明は、単離された核酸を提供し、そして、これは、必要に応じて保存的アミノ酸置換を有する、配列番号１、配列番号２１、配列番号２、配列番号３、配列番号２２、配列番号４、配列番号５、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８または配列番号６、配列番号７０、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８１をコードするヌクレオチド配列を含む。必要に応じて、核酸はさらに、シグナル配列（例えば、配列番号２９、３０、３１、３２、７１、７５、７９のシグナル配列）をコードする。単離された核酸は、必要に応じて、８０、８５、９０または９５％の同一性を有する配列をコードする。より具体的には、本発明は単離された核酸を提供し、そして、これは、配列番号７、配列番号１３、配列番号８、配列番号３４、配列番号９、配列番号１４、配列番号１０、配列番号３６、配列番号１１、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１２、配列番号３８、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号４０、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１または配列番号１０２のヌクレオチド配列を含む。必要に応じて、単離された核酸はさらに、シグナル配列をコードする塩基を含み得、従って、細胞外領域または全長ｈｕＦｃＲＨ１、２、３または６をコードするヌクレオチド配列は、必要に応じて、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９のヌクレオチド配列をさらに含み得る。必要に応じて、ｍｏＦｃＲＨについて単離された核酸は、シグナル配列（例えば、配列番号１０１、配列番号９７、配列番号９４、配列番号９１、配列番号８８、配列番号８４の核酸配列のこれらの部分を含む）もまたコードする核酸配列を含む。
【００４０】
好ましくは、全長ＦｃＲＨ１をコードする核酸は、約１２９０塩基を含む。全長ＦｃＲＨ２をコードする核酸は約１５２７塩基を含み、そして、全長ＦｃＲＨ３をコードする核酸は約２２０５塩基を含む。
【００４１】
本発明はまた、ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションプローブにハイブリダイズする配列を含む、単離された核酸を提供し、ここで、ハイブリダイゼーションプローブは、配列番号７、配列番号１３、配列番号８、配列番号３４、配列番号９、配列番号１４、配列番号１０、配列番号３６、配列番号１１、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１２、配列番号３８、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０、配列番号４０、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１もしくは配列番号１０２のヌクレオチド配列またはいずれかの配列の相補体を含む。
【００４２】
ストリンジェントな条件下で、配列番号７、配列番号１３、配列番号８、配列番号３４、配列番号９、配列番号１４、配列番号１０、配列番号３６、配列番号１１、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１２、配列番号３８、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０、配列番号４０、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１または配列番号１０２の配列を有する核酸にハイブリダイズする一本鎖核酸が、さらに提供される。
【００４３】
「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」または「高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」によって、ハイブリダイズする核酸のハイブリダイズする部分（代表的には、少なくとも１５（例えば、２０、２５、３０または５０のヌクレオチド）を含む）が、ストリンジェントな条件下で、所定のヌクレオチド配列の全てまたは部分にハイブリダイズすることを意味する。用語「ハイブリダイゼーション」は、代表的には、少なくとも２つの核酸分子（例えば、プライマーまたはプローブと遺伝子との間）の間の配列駆動相互作用を意味する。配列駆動相互作用は、ヌクレオチド特異的な様式で、２つのヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド誘導体の間で起こる相互作用を意味する。例えば、Ｃと相互作用するＧ、またはＴと相互作用するＡは、配列駆動相互作用である。代表的には、配列駆動相互作用は、ヌクレオチドのＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ表面またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ表面で起こる。２つの核酸のハイブリダイゼーションは、当業者に公知の多くの条件およびパラメータに影響される。例えば、塩濃度、ｐＨおよび反応温度は全て、２つの核酸分子がハイブリダイズするかどうかに影響する。通常、ハイブリダイズする核酸のハイブリダイズする部分は、少なくとも８０％（例えば、少なくとも９０％、９５％または９８％）、本発明のＦｃＲＨをコードする核酸の配列もしくは部分、またはその相補体に同一である。本発明のハイブリダイズする核酸は、例えば、クローニングプローブ、プライマー（例えば、ＰＣＲのための）、診断用プローブまたはアンチセンスプローブとして使用され得る。核酸サンプルに対するオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションは、代表的には、ストリンジェントな条件下で実施される。核酸二重鎖または核酸ハイブリッドの安定性は、融点または、Ｔｍ（プローブが標的ＤＮＡから解離する温度）として表現される。この融点は、必要とされるストリンジェントな条件を規定するのに使用される。プローブに関連し、そして、プローブと同一であるよりむしろ実質的にプローブと同一である配列が同定される場合、この配列は、特定の塩濃度（例えば、ＳＳＣまたはＳＳＰＥ）で相同なハイブリダイゼーションのみが生じる、最低温度をまず最初に確立するのに有用である。１％のミスマッチがＴｍを１℃下降させると推定すると、ハイブリダイゼーション反応の最終的な洗浄の温度はそれに従って漸減される（例えば、プローブと＞９５％の同一性を有する配列が想定される場合、最終的な洗浄温度は５℃下がる）。実際、Ｔｍの変化は、１％のミスマッチあたり０．５℃〜１．５℃の間であり得る。ストリンジェントな条件は、５×ＳＳＣ／５×デンハート溶液／１．０％  ＳＤＳ中６８℃でのハイブリダイゼーション、および０．２×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ中で室温での洗浄を包含する。中程度にストリンジェントな条件は、３×ＳＳＣ中４２℃での洗浄を包含する。塩濃度および温度のパラメータは、プローブと標的核酸との間の同一性の最適レベルを達成するために変化し得る。このような条件を考慮するためのさらなるガイダンスは、当該分野で容易に入手可能であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；およびＡｕｓｕｂｅｌら（編）、１９９５，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ）のユニット２．１０において入手可能である。
【００４４】
本発明の核酸は、必要に応じて、直接または間接的に標識される。この種の標識された核酸は、例えば、インサイチュハイブリダイゼーション、ＦＩＳＨ、インサイチュＰＣＲおよびＰＲＩＮＳを含む種々の診断技術に有用である。両方の方法が、ＦｃＲＨをコードする核酸配列に相補的な一本鎖核酸プローブの短い配列の調製を包含する。例えば、Ｍ．ＡｎｄｒｅｅｆｆおよびＤ．Ｐｉｎｋｅｌ（１９９９），Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｔ  Ｉｎ−Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ；Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（２０００），Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ；Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９９），ＰＣＲ  Ｍａｎｕａｌ，第２版（これらはその全体が核酸を用いる方法について援用される）を参照のこと。
【００４５】
（ベクター、細胞および使用方法）
本発明の核酸を含む発現ベクターがまた提供され、この核酸は、発現制御配列に作動可能に連結されている。多種多様な発現系／調節配列の組合せが、本開示を発現させる際に使用され得る。この種の有用な調節配列としては、例えば、ＳＶ４０ウイスル、ＣＭＶウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオーマウイルスまたはアデノウイルスの初期または後期プロモーター、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣシステム、ＴＲＣシステム、ＬＴＲシステム、ファージλの主要なオペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄ被膜タンパク質の調節領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の糖分解酵素のためのプロモーター、酸ホスファターゼ（例えば、Ｐｈｏ５）のプロモーター、メチロトローフの（ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ）酵母のＡＯＸ１プロモーター、酵母ａ−交配因子のプロモーター、および原核生物もしくは真核生物細胞またはそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することが知られている他の配列、ならびにこれらの種々の組合せが挙げられる。
【００４６】
この種の発現ベクターは、真核細胞または原核細胞によって発現されるように設計され得る。本発明のベクターは、このように、原核生物または真核生物の染色体への挿入および発現が可能なＤＮＡ分子を提供する。ウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターに挿入された遺伝子は、通常、所望の遺伝子生成物の発現を調節するのを補助するためのプロモーターおよび／またはエンハンサーを含む。プロモーターは通常、転写開始部位に関して相対的に固定された位置にある場合に機能するＤＮＡの配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼと転写制御因子との基本的な相互作用のために必要なコアエレメントを含み、上流のエレメントおよび応答エレメントを含み得る。全ての特定の調節エレメントがクローン化され得、特定の細胞型において選択的に発現される発現ベクターを構築するために用いられ得ることが示されている。例えば、膠線維素酸性（ａｃｅｔｉｃ）タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターは、膠起源の細胞において選択的に遺伝子を発現するために用いられている。真核生物宿主細胞（例えば、酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは有核細胞）において使用される発現ベクターはまた、ｍＲＮＡ発現に影響を及ぼし得る、転写の終了に必要な配列を含み得る。これらの領域は、組織因子タンパク質をコードするｍＲＮＡの未翻訳部分のポリアデニル化セグメントとして転写される。３’の未翻訳領域もまた、転写終結点を含む。転写ユニットがまたポリアデニル化領域を含むことが好ましい。この領域の１つの利点は、転写されたユニットが処理されて、ｍＲＮＡのように輸送されるという可能性を増やすということである。発現構築物におけるポリアデニル化シグナルの同定および使用は、十分に確立されている。相同なポリアデニル化シグナルがトランスジーン構築物において使用されることが好ましい。特定の転写ユニットにおいて、ポリアデニル化領域は、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナルに由来し、約４００塩基からなる。転写されたユニットが単独でまたは、構築物からの発現または構築物の安定性を向上させる上記の配列と組合せて他の標準配列を含むことがまた好ましい。
【００４７】
本発明はさらに、導入ベクターを提供し、これは細胞に遺伝子を送達するのに用いられる任意のヌクレオチド構築物（例えば、プラスミド）、または、遺伝子を送達するための一般的なストラテジーの部分として、例えば、組換えレトロウイルスもしくはアデノウイルス（Ｒａｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：８３−８８，（１９９３））の部分としての任意のヌクレオチド構築物を含む。本明細書中で使用する場合、プラスミドまたはウイルスベクターは、分解せずに細胞に本発明の核酸を輸送する薬剤であって、送達される細胞に遺伝子の発現を得るためのプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、ＦｃＲＨは、ウイルスまたはレトロウイルスのいずれかに由来する。ウイルスベクターとしては、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、エイズウイルス、ニューロン栄養性ウイルス、シンドビスウイルスおよび他のＲＮＡウイルス（ＨＩＶ骨格を有するウイルスを含む）が挙げられる。ベクターとしての使用に適するようにされた、これらのウイルスの特性を共有する任意のウイルスファミリーもまた好ましい。レトロウイルスとしては、マウスマロニー白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、およびベクターとしてのＭＭＬＶの望ましい特性を発現すレトロウイルスが挙げられる。レトロウイルスベクターは、他のウイルスベクターより大きい遺伝子の荷重（ｐａｙｌｏａｄ）（すなわち、トランスジーンまたは標識遺伝子）を運ぶことが可能で、このため、一般的に用いられるベクターである。しかしながら、レトロウイルスベクターは、非増殖細胞では有用でない。アデノウイルスベクターは、比較的安定していて、扱いやすく、高い力価を有し、そして、エアゾール処方で送達され得、非分裂細胞に感染し得る。痘瘡ウイルスベクターは大きく、そして、遺伝子を挿入するためのいくつかの部位を有し、これらは耐熱性で、室温で保存され得る。好ましい実施形態は、ウイルス抗原によって誘発される宿主生物体の免疫応答を抑制するように操作された、ウイルスベクターである。
【００４８】
ウイルスベクターは、遺伝子を細胞に導入するための化学的方法または物理的方法より高い処理（遺伝子を導入する能力）能力を有し得る。代表的には、ウイルスベクターは、非構成的な初期の遺伝子、構成的な後期の遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写物、複製およびキャプシド化に必要とされる逆方向末端反復、ならびにウイルスゲノムの転写および複製を調節するためのプロモーターを含む。ベクターとして設計される場合、ウイルスは代表的には、取り除かれた１つ以上の初期の遺伝子を有し、そして、遺伝子または遺伝子／プロモーターカセットは取り除かれたウイルスＤＮＡの代わりにウイルスゲノムに挿入される。この型の構築物は、約８ｋｂまでの外来の遺伝物質を運び得る。取り除かれた初期の遺伝子の必須の機能は、代表的に、初期遺伝子のトランス状態での遺伝子産物を発現するように操作されている細胞株によって供給される。
【００４９】
レトロウイルスは、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅのウイルスファミリーに属し、任意の型、サブファミリー、属または向性を含む、動物ウイルスである。レトロウイルスベクターは、一般に、Ｖｅｒｍａ、Ｉ．Ｍ．，Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ−１９８５，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２２９−２３２頁，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，（１９８５）（本明細書中に援用される））に記載されている。遺伝子治療のためのレトロウイルスベクターの使用方法の例は、米国特許第４，８６８，１１６号および同第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ出願ＷＯ  ９０／０２８０６およびＷＯ  ８９／０７１３６；ならびにＭｕｌｌｉｇａｎ，（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３））；に記載されている（これらの教示は本明細書中に参考として援用される）。レトロウイルスは、本質的に、その核酸積荷（ｃａｒｇｏ）封入パッケージである。核酸積荷は、それにと共にパッケージングシグナルを運び、このシグナルは、複製された娘分子がパッケージ皮膜内に効率的に封入されることを確実にする。パッケージシグナルに加えて、複製されたウイルスの複製およびパッケージングに必要な、シス形態の多数の分子が存在する。代表的には、レトロウイルスのゲノムは、タンパク質皮膜を構成するのに関与する、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、およびｅｎｖ遺伝子を含む。標的細胞へ移入される外来ＤＮＡによって置き換えられるのは、代表的にはｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子である。レトロウイルスベクターは代表的には、パッケージ皮膜への組み込みに必要とされるパッケージングシグナル、ｇａｇ転写ユニットの開始を知らせる配列、逆転写のために必要なエレメント（逆転写のｔＲＮＡプライマーを結合するプライマー結合部位を含む）、ＤＮＡ合成の間にＲＮＡ鎖の切り替えを導く末端反復配列、ＤＮＡ合成の第二鎖の合成のための開始部位として機能するプリンリッチな配列５’〜３’ＬＴＲ、および、ＤＮＡ状態のレトロウイルスを宿主ゲノムに挿入し得るＬＴＲの末端の近くの特定の配列を含む。ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子およびｅｎｖ遺伝子の除去は、約８ｋｂの外来配列がウイルスゲノムに挿入されて、逆転写され、複製の際に、新しいレトロウイルス粒子に封入される。核酸のこの量は、各転写物のサイズに依存して、１つ〜多くの遺伝子を送達するのに十分である。インサートに、他の遺伝子と共に、ポジティブまたはネガティブな選択マーカーを含むことが好ましい。
【００５０】
大部分のレトロウイルスベクターの複製機構およびパッケージングタンパク質（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）が除去されているので、ベクターは代表的には、これらをパッケージング細胞株に入れることによって作製される。パッケージング細胞株は、複製およびパッケージング機構を含むが、パッケージングシグナルのいずれかを欠いているレトロウイルスでトランスフェクトされたかまたは形質転換されている細胞株である。選択されたＤＮＡを有するベクターがこれらの細胞株にトランスフェクトされる場合、シスで供給される機構によって、ヘルパー細胞によって、目的の遺伝子を含むベクターが複製され、新しいレトロウイルス粒子に封入される。必要なシグナルを欠いているので、機構のためのゲノムは封入されない。
【００５１】
複製に欠陥があるアデノウイルスの構築物が記載されている（Ｂｅｒｋｎｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６１：１２１３−１２２０（１９８７）；Ｍａｓｓｉｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８７２−２８８３（１９８６）；Ｈａｊ−Ａｈｍａｄら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５７：２６７−２７４（１９８６）；Ｄａｖｉｄｓｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６１：１２２６−１２３９（１９８７）；Ｚｈａｎｇ，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｂｙ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＰＣＲ  ａｎａｌｙｓｉｓ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １５：８６８−８７２（１９９３））。ベクターとしてのこれらのウイルスの使用の利点は、それらが最初に感染した細胞内では複製し得るが、新規の感染性ウイルス粒子を形成し得ないため、他の細胞型に広がり得る程度までは制限される。組換えアデノウイルスは、気道上皮、肝細胞、脈管内皮、中枢神経系実質および多くの他の組織部位にインビボで直接送達された後、高効率の遺伝子移送を達成することが示されている（Ｍｏｒｓｙ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１５８０−１５８６（１９９３）；Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：３８１−３８７（１９９３）；Ｒｏｅｓｓｌｅｒ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１０８５−１０９２（１９９３）；Ｍｏｕｌｌｉｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４：１５４−１５９（１９９３）；Ｌａ  Ｓａｌｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：９８８−９９０（１９９３）；Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７．２５１２９−２５１３４（１９９２）；Ｒｉｃｈ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：４６１−４７６（１９９３）；Ｚａｂｎｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：７５−８３（１９９４）；Ｇｕｚｍａｎ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７３：１２０１−１２０７（１９９３）；Ｂｏｕｔ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：３−１０（１９９４）；Ｚａｂｎｅｒ，Ｃｅｌｌ  ７５：２０７−２１６（１９９３）；Ｃａｉｌｌａｕｄ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ５：１２８７−１２９１（１９９３）；およびＲａｇｏｔ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７４：５０１−５０７（１９９３））。組換えアデノウイルスは、特異的な細胞表面レセプターに結合することによって遺伝子移入を達成し、その後、野生型または複製に欠陥があるアデノウイルスと同じ様式で、ウイルスがレセプター媒介性のエンドサイトーシスにより内在化される（ＣｈａｒｄｏｎｎｅｔおよびＤａｌｅｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４０：４６２−４７７（１９７０）；ＢｒｏｗｎおよびＢｕｒｌｉｎｇｈａｍ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １２：３８６−３９６（１９７３）；ＳｖｅｎｓｓｏｎおよびＰｅｒｓｓｏｎ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５５：４４２−４４９（１９８５）；Ｓｅｔｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６５０−６５５（１９８４）；Ｓｅｔｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１５２８−１５３３（１９８４）；Ｖａｒｇａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６５：６０６１−６０７０（１９９１）；Ｗｉｃｋｈａｍら、Ｃｅｌｌ  ７３：３０９−３１９（１９９３））。
【００５２】
ウイルスベクターは、Ｅ１遺伝子が取り除かれているアデノウイルスに基づくベクターであり得、これらのビリオンは、細胞株（例えば、ヒト２９３細胞株）において作製される。別の好ましい実施形態において、Ｅ１遺伝子およびＥ３遺伝子の両方が、アデノウイルスゲノムから除去される。
【００５３】
別の種類のウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づく。多くの細胞型に感染し得、ヒトに対して非病原性であるので、この不完全なパーボウイルスは好ましいベクターである。ＡＡＶ型ベクターは、約４〜５ｋｂを輸送し得、野生型のＡＡＶは、１９番染色体に安定して挿入することが知られている。この部位特異的組込み特性を含むベクターが好ましい。この種のベクターの特に好ましい例はＡｖｉｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡによって生産されるＰ４．１  Ｃベクターである。これは、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ｔｋ）および／または標識遺伝子（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子）を含み得る。
【００５４】
別の種類のＡＡＶウイルスにおいて、ＡＡＶは、異種遺伝子に作動可能に連結されている細胞特異的発現を指向するプロモーターを含む少なくとも１つのカセットに隣接する、１対の逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む。この文脈において、異種は、ＡＡＶまたはＢ１９パーボウイルスに対してネイティブでない任意のヌクレオチド配列または遺伝子を指す。
【００５５】
代表的には、ＡＡＶおよびＢ１９コード領域は欠失しており、安全な、非細胞障害性のベクターを生じる。ＡＡＶ  ＩＴＲまたはその修飾体は、感染性および部位特異的組込みを付与するが、細胞毒性でなく、そして、このプロモーターは、細胞特異的発現を導く。米国特許第６，２６１，８３４号は、ＡＡＶベクターに関する材料について、本明細書中に参考として援用される。
【００５６】
大きなヒトの単純疱疹ウイルスを用いる分子遺伝学実験は、大きな異種ＤＮＡフラグメントがクローン化され得、増殖し得、そして、ヘルペスウイルスでの感染に寛容な細胞において確立され得る手段を提供している（Ｓｕｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８：３３−４１，１９９４；ＣｏｔｔｅｒおよびＲｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ５：６３３−６４４，１９９９）。この大きなＤＮＡウイルス（単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）およびＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ））は、特定の細胞に、ヒトの異種ＤＮＡのフラグメント（１５０ｋｂ以上）を送達する能力を有する。ＥＢＶ組換え体は、エピソームＤＮＡとして感染されたＢ細胞のＤＮＡの大きな部分を維持し得る。個々のクローンは、遺伝的に安定と見られる３３０ｋｂまでのヒトゲノムのインサートを運んだ。これらのエピソームの維持は、ＥＢＶでの感染の間に構成的に発現される、特異的なＥＢＶ核タンパク質（ＥＢＮＡ１）を必要とする。さらに、これらのベクターはトランスフェクションに用いられ得、ここで、大量のタンパク質がインビボで一過性に発生し得る。ヘルペスウイルスアンプリコンシステムはまた、２２０ｋｂ以上のＤＮＡ片を封入して、エピソームとして、ＤＮＡを安定に維持し得る細胞を感染するために用いられる。他の有用なシステムとしては、例えば、複製型痘疹ウイルスベクター、宿主を制限された非複製型痘疹ウイルスベクターが挙げられる。
【００５７】
本発明はまた、本発明のベクターを含む単離された細胞を提供する。単離された細胞は、真核生物細胞または原核生物細胞のいずれか（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）；酵母のような菌類（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびメチロトローフの酵母（例えば、Ｐｉｃｈｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、ＨａｎｓｅｎｕｌａおよびＴｏｒｕｌｏｐｓｉｓ））；および、動物性細（例えば、ＣＨＯ細胞、Ｒ１．１細胞、Ｂ−Ｗ細胞およびＬＭ細胞）、アフリカミドリザル腎臓細胞（例えば、ＣＯＳ  １、ＣＯＳ  ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０およびＢＭＴ１０）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）およびヒト細胞および植物細胞）であり得る。
【００５８】
ＦｃＲＨまたはそのフラグメントもしくは改変体の作製方法もまた提供され、この方法は、ＦｃＲＨの発現を許容する条件下で、本発明のベクターを含む細胞を培養する工程を包含する。この方法は、ＦｃＲＨ、フラグメントまたは改変体をコードする外因性核酸を含む細胞を培養する工程であって、この外因性核酸は、発現制御配列に作動可能に連結されており、この培養条件は発現制御配列の制御下でＦｃＲＨ、フラグメントまたは改変体の発現を許容する、工程；培養細胞から培地を回収する工程、および、細胞または培養培地からＦｃＲＨ、フラグメントまたは改変体を単離する工程、を包含する。必要に応じて、外来性の核酸は、配列番号７、配列番号１３、配列番号８、配列番号３４、配列番号９、配列番号１４、配列番号１０、配列番号３６、配列番号１１、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１２、配列番号３８、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０、配列番号４０、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１もしくは配列番号１０２またはその組合せのヌクレオチド配列である。必要に応じて、外来性の核酸は、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。組換え方法において、細胞は、任意の公知の宿主細胞であって、これらには、例えば、原核生物細胞または真核生物細胞が挙げられる。一般にプラスミドまたは他のベクターで、細胞に送達される核酸は、代表的に、発現制御システムを含む。例えば、ウイルスおよびレトロウイルスのシステム中の挿入された遺伝子は、通常、プロモーターおよび／またはエンハンサーを含み、所望の遺伝子産物の発現を制御するのを補助する。
【００５９】
分子生物学の当業者は、多種多様な発現系が本発明の方法において使用するための組換えＦｃＲＨポリペプチド（ならびに、治療活性を有するフラグメント、融合タンパク質およびアミノ酸配列改変体）を作製するために使用され得ることを理解する。このように、ＦｃＲＨは、原核生物宿主細胞（例えば、大腸菌）または真核生物宿主細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）、または哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−１、ＮＩＨ  ３Ｔ３またはＨｅＬａ細胞）を使用して作製され得る。これらの細胞は、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから市販されている（また、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９８も参照のこと）。形質転換の方法および発現ベクターの選択は、選択される宿主系に依存する。形質転換およびトランスフェクションの方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、前出に記載され、発現ベクターは、多数の当該分野で公知の例から選択される。
【００６０】
ＦｃＲＨをコードする核酸配列は、プラスミドまたは他のベクターに導入され、次いで、生きた細胞を形質転換するために用いられる。ｃＤＮＡが、完全なＦｃＲＨのコード配列、ＦｃＲＨコード配列のフラグメント、ＦｃＲＨコード配列のアミノ酸改変体、または、発現プラスミドに正しい方向で挿入される前述の融合タンパク質を含む構築物が、タンパク質発現のために用いられ得る。場合によっては、例えば、誘導可能であるか組織特異的プロモーターの制御下のＦｃＲＨコード配列を発現することが、望ましくあり得る。
【００６１】
真核生物発現系は、発現されたタンパク質に適切な翻訳後修飾を可能にする。このように、真核生物発現系、より好ましくは、哺乳動物発現系は、天然に発現されるＦｃＲＨと同等のグリコシル化パターンを可能にする。真核生物発現プラスミドの一過性のトランスフェクションは、トランスフェクトされる宿主細胞によるＦｃＲＨの一過性の産生を可能にする。ＦｃＲＨはまた、安定にトランスフェクトされた哺乳動物細胞株によって産生され得る。哺乳動物細胞の安定したトランスフェクションに適している多くのベクターは、一般に入手可能であり（例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら、Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１９８５，Ｓｕｐｐ．１９８７を参照のこと）、この種の細胞株を構築する方法もまた公開されている（例えば、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９８を参照のこと）。別の好ましい真核生物発現系は、例えば、ベクターｐＢａｃＰＡＫ９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）から入手可能）を使用する、バキュロウイルス系である。所望される場合、この系は、他のタンパク質発現技術（例えば、Ｅｖａｎら（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５：３６１０−３６１６，１９８５）によって記載されているｍｙｃタグアプローチ、または、例えばヘマグルチニン（ＨＡ）タグを用いる類似したタグ化アプローチ）と組み合せて用いられ得る。
【００６２】
一旦、組換えタンパク質が発現されると、これは、細胞溶解、その後のタンパク質精製技術（例えば、アフィニティクロマトグラフィー）によって発現細胞から単離され得る。この例において、当該分野で周知の方法によって作製され得るＦｃＲＨと特異的に結合する抗体が、カラムに取り付けられ、ＦｃＲＨを単離するのに用いられ得る。一旦単離されると、組換えタンパク質は、所望される場合、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；例えば、Ｆｉｓｈｅｒ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＷｏｒｋおよびＢｕｒｄｏｎ編，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８０を参照のこと）によって、さらに精製され得る。
【００６３】
（抗体）
本発明はまた、精製抗体またはその免疫学的フラグメントを提供し、この抗体またはそのフラグメントはＦｃＲＨと選択的に結合する。本明細書中で使用される場合、「抗体」は、任意のクラスの完全免疫グロブリン（すなわち、インタクトな抗体）を包含するが、これらに限定されない。ネイティブな抗体は、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖と２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成される、ヘテロ四量体糖タンパク質である。代表的には、各軽鎖が、１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に連結され、一方で、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変化する。重鎖および軽鎖の各々はまた、規則的に間隔を置かれた鎖間ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、１つの末端で、可変ドメイン（Ｖ（Ｈ））と、その後に続く多くの定常ドメインを有する。各軽鎖は、１端に可変ドメイン（Ｖ（Ｌ））を、その他の端に、定常ドメインを有する；軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと整列され、そして、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列される。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間の接点を形成すると考えられている。任意の脊椎動物種由来の抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、κ（ｋ）およびλ（ｌ）と呼ばれる２つの明らかに異なる型のうちの１つに割り当てられ得る。それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは、異なるクラスに割り当てられ得る。免疫グロブリンの５つの主要なクラス（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）が存在し、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３およびＩｇＧ−４；ＩｇＡ−１およびＩｇＡ２）に、さらに分けられ得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γおよびμと呼ばれている。
【００６４】
用語「可変」は、抗体の中の配列において異なり、その特定の抗原について、各特定の抗体への結合および特異性において使用される、可変ドメインの一定部分を記載するために、本願明細書において使われる。しかしながら、可変性は通常、抗体の可変ドメインに、均一に分布されない。可変性は、代表的に、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインの両方における、相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに、集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。ネイティブの重鎖および軽鎖の可変ドメインは、各々、広くｂシート構造を取り入れ、ループ接続を形成する３つのＣＤＲによって接続され、場合によってはｂシート構造を形成する４つのＦＲ領域を含む。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域の近く一緒に保たれ、他の鎖からのＣＤＲは、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ  Ｅ．Ａ．ら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７））。定常ドメインは、抗原に対する抗体の結合に、直接関与しないが、種々のエフェクター機能（例えば、抗体依存性の細胞毒性における抗体の関与）を呈する。
【００６５】
用語「抗体またはそのフラグメント」はまた、二重抗原もしくは多重抗原またはエピトープ特異性を有するキメラ抗体およびハイブリッド抗体、ならびにフラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂなど（ハイブリッドフラグメントを含む））を包含し得る。このように、それらの特定の抗原に結合する能力を保持する抗体のフラグメントが、提供される。例えば、ＦｃＲＨ結合活性を維持する抗体のフラグメントは、用語「抗体またはそのフラグメント」の意味の範囲内に含まれる。この種の抗体およびフラグメントは、当該分野で公知技術の技術によって作製され得、実施例に示される方法ならびに、抗体を産生する一般的な方法、ならびに特異性および活性について抗体をスクリーニングする一般的な方法に従って、特異性および活性についてスクリーニングされ得る（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８８）を参照のこと）。
【００６６】
また、「抗体またはそのフラグメント」の意味に含まれるのは、例えば、米国特許第４，７０４，６９２号（本明細書中に参考として援用される）に記載されているような、抗体フラグメントと抗原結合タンパク質との結合体（単鎖抗体）である。
【００６７】
１つの実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体である。本明細書中で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」は、抗体の実質的に均質な集団から得られた抗体をいう（すなわち、集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る天然に存在する変異の可能性を除いて、同一である）。本明細書中におけるモノクローナル抗体は、具体的には、重鎖および／または軽鎖の部分が、特定の種由来の抗体の対応する配列、または、特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する配列と同一であるか、または、相同である一方で、鎖の残りは、別の種由来であるか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるかまたは相同である、「キメラ」抗体、ならびに、これらが所望の活性を示す限りは、このような抗体のフラグメントを含む（米国特許第４，８１６，５６７号、および、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４）を参照のこと）。
【００６８】
本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）またはＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８８）によって記載されているもの）を使用して調製され得る。ハイブリドーマ法において、マウスまたは他の適当な宿主動物は、代表的には、免疫剤で免疫されて、免疫剤に特異的に結合する抗体を生じるかまたは生じ得るリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫され得る。好ましくは、免疫剤は、ＦｃＲＨを含む。従来、モノクローナル抗体の産生は、免疫原としての使用のための精製されたタンパク質またはペプチドの入手可能性に依存していた。より近年、ＤＮＡベースの免疫は、強い免疫応答を誘発して、モノクローナル抗体を産生する方法としての将来性を示した。このアプローチでは、ＤＮＡベースの免疫が用いられ得、一部のＦｃＲＨ（好ましくはＮ末端領域またはＣ端末領域）をコードするＤＮＡは、当該分野で公知の方法に従って宿主動物に注射される。
【００６９】
一般に、ヒト起源の細胞が所望される場合、いずれかの末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）もモノクローナル抗体を産生する方法で用いられるか、または、ヒト以外の哺乳動物の供給源が所望される場合、脾臓細胞またはリンパ節細胞が用いられる。次いで、リンパ球は、適切な融合剤（例えば、ポリエチレングリコール）を用いて、不死化細胞株と融合してハイブリドーマを形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ」Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）５９−１０３頁）。不死化細胞株は通常、形質転換された哺乳動物細胞であり、マウス、ウシ、ウマ、およびヒト起源の骨髄細胞を含む。通常、ラットまたはマウスの骨髄腫細胞株が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、融合していない、不死化細胞の増殖または生存を阻害する１つ以上の物質を含む、適切な培養培地中で培養され得る。例えば、親の細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシル転移酵素（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠いている場合、ハイブリドーマのための培養培地は、代表的にはヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含み（「ＨＡＴ培地））、これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を防止する。
【００７０】
好ましい不死化細胞株はまた、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定で高レベルな発現を支持する細胞株であり、そして、ＨＡＴ培地のような培地に感受性である。より好ましい不死化細胞株は、例えば、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．およびＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ）から得られ得る、マウス骨髄腫細胞株である。ヒト骨髄腫細胞株およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株がまた、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８７）５１−６３頁）。
【００７１】
次いで、ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地は、ＦｃＲＨに対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイされ得る。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって、またはインビトロ結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素連結イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ））によって測定される。この種の技術およびアッセイは、当該分野において公知であり、さらにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８８）に記載されている。
【００７２】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンは限界希釈またはＦＡＣＳソーティング手順によってサブクローニングされ得、標準的な方法によって増殖され得る。この目的に適切な培養培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地およびＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物の腹水としてインビボで増殖され得る。
【００７３】
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順（例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティクロマトグラフィ）によって、培養培地または腹水から単離または精製され得る。
【００７４】
モノクローナル抗体はまた、組換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されているもの）によって作製され得る。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、容易に単離され得、そして、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に選択的に結合し得るヌクレオチドプローブを用いて）配列決定され得る。本発明のハイブリドーマ細胞は、この種のＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。一旦単離されると、ＤＮＡは発現ベクターに入れられ得、次いで、通常は免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞（例えば、サルのＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、形質細胞腫細胞または骨髄腫細胞）にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞のモノクローナル抗体の合成を得る。ＤＮＡはまた、例えば、類似するマウス配列（米国特許第４，８１６，５６７号）の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインについてのコード配列を置換することによってか、または非免疫グロブリンポリペプチドについてのコード配列全てまたは一部の免疫グロブリンコード配列に共有結合することによって、修飾され得る。この種の非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインと置換され得るか、またはＦｃＲＨに対する特異性を有する１つの抗原結合部位および異なる抗原に対する特異性を有する他の抗原結合部位を含むキメラ二価抗体を作成するために、本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインと置換され得る。
【００７５】
インビトロ法はまた、単価抗体を調製するのに適している。そのフラグメント（特に、Ｆａｂフラグメント）を産生するための抗体の消化は、当該分野で公知の慣習的な技術を使用して達成され得る。例えば、消化は、パパインを使用して実行され得る。パパイン消化の実施例は、１９９４年１２月２２日に公開されたＷＯ  ９４／２９３４８、米国特許第４，３４２，５６６号およびＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８８）に記載されている。抗体のパパイン消化は、代表的には、２つ同一の抗原結合フラグメント（Ｆａｂフラグメントと呼ばれ、各々が単一の抗原結合部位および残余のＦｃフラグメントを有する）を生じる。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有するフラグメント（Ｆ（ａｂ’）２と呼ばれる）を得、なお抗原を架橋し得る。
【００７６】
抗体消化において産生されるＦａｂフラグメントはまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメインを含む。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む重鎖領域のカルボキシ末端での２〜３の残基の追加の分だけ、Ｆａｂフラグメントと異なる。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、ヒンジ領域でのジスルフィド架橋によって連結されている２つのＦａｂ’フラグメントを含む二価フラグメントである。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書において、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’を指す省略語である。抗体フラグメントは、最初はＦａｂ’フラグメントの対として産生され、このフラグメントは、それら間のヒンジシステインを有する。抗体フラグメントの他の化学カップリングもまた、公知である。
【００７７】
抗体の単離された免疫原性上特異的なエピトープまたはフラグメントがまた、提供される。抗体の特定の免疫原性エピトープは、分子の化学的または機械的な破壊によって、完全抗体から単離され得る。このように得られる精製フラグメントは、本明細書中に教示される方法によって、それらの免疫原性および特性を測定するために試験され得る。抗体の免疫反応性エピトープはまた、直接合成され得る。免疫反応性フラグメントは、抗体アミノ酸配列に由来する少なくとも約２〜５の連続的なアミノ酸のアミノ酸配列として定義される。
【００７８】
本発明の抗体を含むタンパク質を生産する１つの方法は、タンパク質化学技術によって２つ以上のペプチドまたはポリペプチドを結合することである。例えば、ペプチドまたはポリペプチドは、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）またはＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルカルボニル）化学のいずれかを使用する、現在利用可能研究所の装置を使用して、化学的に合成され得る。（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）。当業者は、本発明の抗体に対応するペプチドまたはポリペプチドが、例えば、標準の化学反応によって合成され得ることを容易に理解し得る。例えば、ペプチドまたはポリペプチドは、合成され得、その合成樹脂から切断され得ないのに対し、抗体の他のフラグメントは、合成され、その後、樹脂から切断され得、これにより他のフラグメントに機能的にブロックされる末端基を露出させる。ペプチド縮合反応によって、これらの２つのフラグメントはそれぞれ、それらのカルボキシル末端およびアミン末端でのペプチド結合を介して共有結合され得、抗体またはそのフラグメントを形成する（Ｇｒａｎｔ  ＧＡ（１９９２）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．（１９９２）；Ｂｏｄａｎｓｋｙ  ＭおよびＴｒｏｓｔ  Ｂ．編（１９９３）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｉｎｃ．，ＮＹ）。あるいは、ペプチドまたはポリペプチドは、上記のようにインビボで独立して合成され得る。一旦単離されると、これらの独立したペプチドまたはポリペプチドは、類似したペプチド縮合反応を介して抗体またはそのフラグメントを形成するように連結され得る。
【００７９】
例えば、クローニングされたかまたは合成されたペプチドセグメントの酵素的連結は、比較的短いペプチドフラグメントが、より大きなペプチドフラグメント、ポリペプチドプチドまたはタンパク質ドメイン全体に結合されることを可能にする（Ａｂｒａｈｍｓｅｎ  Ｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：４１５１（１９９１））。あるいは、合成ペプチドのネイティブな化学連結は、より短いペプチドフラグメントから、大きなペプチドまたはポリペプチドを合成的に構築するために利用され得る。この方法は、二工程化学反応からなる（Ｄａｗｓｏｎら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６：７７６−７７９（１９９４））。第１の工程は、最初の共有結合生成物としてチオエステル連結中間体を与えるための、アミノ末端Ｃｙｓ残基を含む別の保護されていないペプチドセグメントを有する保護されていない合成ペプチド−α−チオエステルの化学選択的な反応である。反応条件の変化なしで、この中間体は、自然な急速な分子内反応を受け、連結部位でネイティブなペプチド結合を形成する。タンパク質分子の全合成へのこのネイティブ化学連結法の適用は、ヒトインターロイキン８（ＩＬ−８）の調製によって例示される（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ  Ｍら、（１９９２）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３０７：９７−１０１；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ  Ｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：１６０７５（１９９４）；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ  Ｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：３１２８（１９９１）；Ｒａｊａｒａｔｈｎａｍ  Ｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：６６２３−３０（１９９４））。
【００８０】
あるいは、化学連結の結果として、ペプチドセグメントの間で形成される結合が不自然な（非ペプチド）結合（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ，Ｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：２２１（１９９２））である場合、保護されていないペプチドセグメントは化学的に連結され得る。この技術は、タンパク質ドメインのアナログの合成ならびに完全な生物学的活性を有する比較的純粋なタンパク質の大規模合成に用いられている（ｄｅＬｉｓｌｅ  Ｍｉｌｔｏｎ  ＲＣら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＩＶ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２５７−２６７頁（１９９２））。
【００８１】
本発明はまた、生物活性を有する抗体のフラグメントを提供する。本発明のポリペプチドフラグメントは、そのポリペプチドフラグメントを生産し得る発現系（例えば、アデノウイルスまたはバキュロウイルス発現系）にポリペプチドプチドをコードする核酸をクローニングすることによって得られる組換えタンパク質であり得る。例えば、ＦｃＲＨを有する抗体の相互作用に関する生物学的効果を生じ得る特定のハイブリドーマから、抗体の活性なドメインを決定し得る。例えば、抗体の活性または結合特異性または親和性のいずれにも寄与しないことが見出されたアミノ酸は、それぞれの活性を損なうことなく欠失され得る。
【００８２】
例えば、アミノ末端またはカルボキシ末端のアミノ酸は、ネイティブまたは修飾された非免疫グロブリン分子または免疫グロブリン分子のいずれかから除去され得、それぞれの活性が多くの利用可能なアッセイのうちの１つでアッセイされ得る。別の例において、抗体のフラグメントは、少なくとも１つのアミノ酸が特定の位置で天然に存在するアミノ酸と置換された、修正された抗体を含み得、そして、アミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかのアミノ酸の部分（または抗体の内部領域さえ）は、ポリペプチドフラグメントまたは他の部分（例えば、ビオチン）と置きかえられ、そして、これは修飾された抗体の精製を容易にし得る。例えば、コード領域の発現がハイブリッドポリペプチドを生じるように、発現ベクターに２つのポリペプチドフラグメントをコードするそれぞれの核酸をクローニングする、いずれかのペプチド化学によって、修飾された抗体は、マルトース結合タンパク質に融合され得る。ハイブリッドポリペプチドは、アミロースアフィニティカラム上を通過させることによってアフィニティ精製され得、次いで、修飾された抗体レセプターが特定のプロテアーゼ因子Ｘａでハイブリッドポリペプチドを切断することによって、マルトース結合領域から切り離され得る（例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｃａｔａｌｏｇ，１９９６，ｐｇ．１６４．を参照のこと）。類似した精製手順は、同様にハイブリッドタンパク質を真核生物細胞から単離することに利用できる。
【００８３】
他の配列に結合されていようといまいと、フラグメントはまた、挿入、欠失、置換または、特定の領域もしくは特定のアミノ酸残基の他の選択された修飾を含み得るが、フラグメントの活性は有意に変えられないか、または修飾されていない抗体または抗体フラグメントと比較して損なわれない。これらの修飾は、例えば、ジスルフィド結合し得るアミノ酸を取り除くかまたは追加するため、生物の寿命を延ばすため、その分泌特性を変更するため、などのために、いくらかのさらなる特性を提供し得る。いずれの場合でも、フラグメントは生理活性特性（例えば、結合活性、結合ドメインでの結合の調節、など）を所有しなければならない。抗体の機能領域または活性領域は、タンパク質の特定の領域の変異誘発によって識別され得、その後、発現されたポリペプチドの発現および試験される。この種の方法は、当業者にとって容易に明らかで、抗原をコードする核酸の部位特異的な変異誘発を含み得る（Ｚｏｌｌｅｒ  ＭＪら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：６４８７−５００（１９８２））。
【００８４】
本明細書中で使用される場合、句「特定の結合」または「選択的な結合」は、タンパク質および他の生物学的物質の異種の集団中のＦｃＲＨの存在に決定的な結合反応を指す。このように、指定された状況下で、本発明の抗体またはそのフラグメントは、特定のＦｃＲＨ（例えば、ヒトＦｃＲＨ１またはその任意の改変体）、そのフラグメントまたは改変体と結合し、被験体に存在する他のタンパク質（例えば、ヒトＦｃＲＨ２、３、４、５または６）に有意な量で結合しない。本発明の結合の欠如は、１．５倍未満のバックグラウンド（すなわち、非特異的結合レベルまたはわずかに非特異的結合レベルを上回るレベル）である結合であると考えられる。
【００８５】
このような条件下での抗体への選択的な結合は、特定のタンパク質、改変体またはフラグメントに対するその特異性について選択される抗体を必要とし得る。１つの実施形態において、精製抗体は、１０７以上または１０４未満のアミノ酸を有する細胞質領域、膜貫通領域および細胞外領域を含むＦｃＲＨに選択的に結合する。より具体的には、代替的な実施形態における抗体は、ＦｃＲＨ２〜６でなくＦｃＲＨ１に選択的に結合する；１または３〜６ではなくＦｃＲＨ２に選択的に結合する；ＦｃＲＨ１〜２または４〜６ではなくＦｃＲＨ３に選択的に結合する；１〜５ではなくＦｃＲＨ６に選択的に結合する。こうして、１つの実施形態として、抗体は、配列番号１、２１もしくは２またはそのサブセットのアミノ酸配列を含むポリペプチドプチドに選択的に結合するが、配列番号３、２２、４、５、２３、２４、６、２５、２６、２７、２８またはそのサブセットのアミノ酸を含むポリペプチドには結合しない。別の実施形態において、精製抗体は、配列番号３、２２または４のアミノ酸配列を含むＦｃＲＨに結合するが、配列番号１、２１、２、５、２３、２４、６、２５、２６、２７または２８のアミノ酸を含むＦｃＲＨには結合しない。なお別の実施形態において、精製抗体は、配列番号５、２３、２４または６のアミノ酸配列を含むＦｃＲＨに結合するが、配列番号１、２１、２、３、２２、４、２６、２７、２８のアミノ酸を含むＦｃＲＨに結合しない。同様に、本発明の抗体は、ｍｏＦｃＲＨ１のみに結合し得、ｍｏＦｃＲＨ２またはｍｏＦｃＲＨ３には結合しない；ＦｃＲＨ３のみに結合し得、ＦｃＲＨ２およびＦｃＲＨ１に結合しない、そして、ＦｃＲＨ２のみに結合し得、ＦｃＲＨ３およびＦｃＲＨ１に結合しない。
【００８６】
ある種の実施形態において、抗体は１つ以上のＦｃＲＨの細胞外領域に結合し、そして、他の実施形態において、抗体は１つ以上のＦｃＲＨの細胞質領域に結合する。他の実施形態において、抗体は、ＦｃＲＨの１つのアイソフォームを選択的に結合し得る。例えば、抗体は、配列番号２３のアミノ酸配列を有するポリペプチドプチドには結合し得るが、配列番号２４のアミノ酸配列を有するポリペプチドを結合することができない。その逆もまた同様である。さらに、抗体は、配列番号７０のアミノ酸配列を有するｍｏＦｃＲＨ１と結合し得るが、配列番号６８のアミノ酸配列を有するｍｏＦｃＲＨ１には結合しない。抗体は、膜貫通領域を有するｍｏＦｃＲＨ２（例えば、配列番号７３のアミノ酸配列を有する）に選択的に結合し得るが、膜貫通領域を欠いているｍｏＦｃＲＨ２（例えば、配列番号７７のアミノ酸配列を有する）と結合しない。必要に応じて、本発明の抗体は、ｍｏＦｃＲＨを選択的に結合し得、ヒトＦｃＲＨには結合せず、その逆もまた同様である。
【００８７】
種々のイムノアッセイ形式は、特定のタンパク質、改変体またはフラグメントと選択的に結合する抗体を選択するために用いられ得る。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、タンパク質、その改変体またはフラグメントと選択的に免疫反応性である抗体を選択するために慣習的に用いられる。選択的な結合を決定するために用いられ得るイムノアッセイ形式および条件の説明について、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８８）を参照のこと。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｍｕｎｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）のスキャッチャード分析で測定され得る。
【００８８】
本発明はまた、本発明の抗体またはそのフラグメント、および抗体またはそのフラグメントのリガンドへの結合を検出するための試薬を含む抗体試薬キットを提供する。キットは、本発明の抗体またはそのフラグメントを含む容器および試薬を含んでいる容器をさらに含み得る。好ましくは、リガンドは、ＦｃＲＨ、その改変体またはフラグメントである。特に、キットは、抗体またはその免疫反応性フラグメントによって１つ以上の特異的な反応性のＦｃＲＨの存在を検出し得る。キットは、基質に結合した抗体、抗原と反応性の二次抗体および抗原と二次抗体の反応を検出するための試薬を含み得る。この種のキットは、ＥＬＩＳＡキットであり得、基質、適当な場合、一次抗体および二次抗体、ならびに他の任意の必要な試薬（例えば、上記の検出可能な部分、酵素基質および着色試薬）を含み得る。診断用キットは、あるいは、通常、構成要素および本明細書中に記載される試薬を含む免疫ブロットキットであり得る。あるいは、キットは、ラジオイムノアッセイキット、ウエスタンブロットアッセイキット、免疫組織学的アッセイキット、免疫細胞化学的な分析キット、ドットブロットアッセイキット、蛍光分極化アッセイキット、シンチレーション近似アッセイキット、均一な時間分解された蛍光アッセイキットまたはＢＩＡｃｏｒｅ分析キットであり得る。
【００８９】
全体に使われるように、ＦｃＲＨまたは抗原／抗体複合体（ＦｃＲＨおよび任意に本発明の抗体を含む複合体を含む）を検出する方法は、ＥＬＩＳＡ（競合またはサンドイッチ）、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、免疫組織学的アッセイ、免疫細胞化学的アッセイ、ドットブロットアッセイ、蛍光分極化アッセイ（Ｊｏｌｌｅｙ（１９８１）；Ｊｉｓｋｏｏｔら（１９９１）；Ｓｅｅｔｈａｌａら（１９９８）；Ｂｉｃａｍｕｍｐａｋａら（１９９８））、シンチレーション近似アッセイ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５）Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ｎｅｗｓ．Ｉｓｓｕｅ  １７；Ａｍｅｒｓｈａｒｎ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５）ＰｒｏｘｉｍｉｔｙＮｅｗｓ．Ｉｓｓｕｅ  １８；Ｐａｒｋら（１９９９））、均一の時間分解蛍光アッセイ（Ｐａｒｋら（１９９９）；Ｓｔｅｎｒｏｏｓら（１９８８）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９８８））またはＢＩＡｃｏｒｅアッセイ（Ｆｄｇｅｒｓｔａｍら（１９９２）Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ５９７：３９７−４１０）を含み得る。好ましくは、抗原／抗体複合体は、直接または間接的に、検出可能なタグを付けられる。蛍光タグ、放射性同位元素標識、磁気タグまたは酵素反応生成物のような、任意の所望のタグが利用され得る。
【００９０】
必要に応じて、抗体またはフラグメントは、ヒト化抗体または完全ヒト抗体である。例えば、抗体はまた、他の種において作製され得、ヒトへの投与のために「ヒト化」され得る。あるいは、完全ヒト抗体はまた、完全ヒト抗体（例えば、ヒト抗体を産生するために遺伝子組換えされたマウス）を産生し得るマウスまたは他種を免疫し、ＦｃＲＨに結合するクローンをスクリーニングにすることによって作られ得る。例えば、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ（１９９５）Ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（完全ヒト抗体を産生する方法について、その全体が本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。本明細書中で使用される場合、抗体に関する用語「ヒト化」および「完全にヒト」は、ヒト被験体の治療的に許容できる弱い免疫原性応答を誘発することが期待される任意の抗体を指す。
【００９１】
非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の抗原結合サブ配列）であり、それは、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含む。ヒト化抗体は、レシピエントの相補鎖決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が非ヒト種（ドナー抗体）（例えば、所望の特性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギ））のＣＤＲ由来の残基と交換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含む。いくつかの場合、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は対応する非ヒト残基と交換される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体においても外来性（ｉｍｐｏｒｔ）のＣＤＲまたはフレームワーク配列においても見出されない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、実質的に全てまたは少なくとも１つ、代表的には２つの可変ドメインを含み、非ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものに対応するＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体はまた、最適には、少なくとも一部の免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）（代表的には、ヒト免疫グロブリンのもの）を含む（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２））。
【００９２】
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当該分野で周知である。通常、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入される１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は「輸入」残基としばしば称される。そして、それは代表的には、「輸入」可変ドメインから取り出される。ヒト化は、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））に従って、げっ歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列と置換することによって基本的に実施され得る。従って、この種の「ヒト化」抗体は、キメラ抗体（米国特許Ｎｏ．４．８１６，５６７号）であり、実質的にインタクトなヒト可変ドメインは非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている。実際には、ヒト化抗体は、代表的には、若干のＣＤＲ残基およびおそらく数ＦＲの残基がげっ歯類の抗体の類似した部位由来の残基によって置換される、ヒト抗体である。
【００９３】
ヒト化抗体を作る際に使われるヒト可変ドメイン（軽鎖および重鎖の両方）の選択は、抗原性を減らすために、非常に重要である。「ベストフィット」法によれば、げっ歯類の抗体の可変ドメインの配列は、既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリに対してスクリーニングされる。次いで、げっ歯類の配列に最も近いヒト配列は、ヒト化抗体に対するヒトフレームワーク（ＦＲ）として受け入れられる（Ｓｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２２９６（１９９３）およびＣｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１（１９８７））。別の方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークが、いくつかの異なるヒト化抗体について用いられ得る（Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｄ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３））。
【００９４】
抗体が、抗原および他の有利な生物学的特性のための高い親和性を保持することによってヒト化されることが、さらに重要である。この目的を達成するために、好ましい方法によれば、ヒト化抗体は、親の配列の分析プロセスならびに親配列およびヒト化配列の三次元モデルを用いた種々の概念上のヒト化生成物によって調製される。三次元の免疫グロブリンモデルは、一般的に利用でき、当業者になじみがある。選択された候補免疫グロブリン配列の可能性がある三次元的な立体配置構造を例示し、表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらのディスプレイの点検は、候補免疫グロブリン配列の機能を決定する際の残基の類似の役割の分析（すなわち、その抗原に結合する候補免疫グロブリンの能力に影響を与える残基の分析）を可能にする。このような方法で、ＦＲ残基は、選択されて、コンセンサス配列および輸入配列から組み合わせられ得、その結果、所望の抗体特性（例えば、標的抗原に対する増加した親和性）が達成される。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合に影響を与えることに、直接かつ最も実質的に関与する（ＷＯ  ９４／０４６７９（１９９４年３月３日に公開）を参照のこと）。
【００９５】
免疫の際に、内因性免疫グロブリンの産生の不在下にて、ヒト抗体の完全なレパートリーを産生し得るトランスジェニック動物（例えば、マウス）が使用され得る。例えば、キメラおよび生殖細胞系変異マウスの抗体重鎖連結領域（Ｊ（Ｈ））遺伝子のホモ接合性の欠失が、内因性の抗体産生を完全に阻害することが記載されている。この種の生殖細胞系変異マウスのヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子配列の移入は、抗原チャレンジに応じてヒト抗体の産生を生じる（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１−２５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）を参照のこと）。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーにおいて産生され得る（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１））。ＣｏｔｅらおよびＢｏｅｒｎｅｒらの技術はまた、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用できる（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（ｌ）：８６−９５（１９９１））。
【００９６】
１つの実施形態において、抗体またはそのフラグメントは、単鎖抗体である。別の実施形態において、抗体またはフラグメントは、標識される。必要に応じて、抗体またはフラグメントは、毒素またはそのフラグメントに結合体化されるかまたは融合する。毒素または毒素部分の例は、ジフテリア、リシンおよびその修飾体を含む。
【００９７】
（診断および処置）
本発明は、被験体の造血細胞系統の悪性腫瘍または自己免疫疾患を診断および処置する、インビトロおよびインビボの方法における、本明細書に記載されている試薬の使用を提供する。本発明の試薬はまた、疾患発現のスクリーニングに有用である。この種のスクリーニングは他の臨床症状の発症の前にさえ有用であり得、疾患の危険がある被験体をスクリーニングするのに用いられる得る。その結果、予防的処置は他の徴候（ｓｉｇｎ）または症状の発現（ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎ）の前に開始され得る。
【００９８】
「悪性腫瘍」によって、細胞が、１つ以上の核または細胞質の異常（例えば、高い核対細胞質の比率、顕著な核小体／核小体変化、核サイズの変化、異常な有糸分裂図または多核形成が挙げられる）を有する腫瘍または新生物が意味される。「造血細胞系統の悪性腫瘍」としては以下が挙げられるがこれらに限定されない：骨髄腫、白血病、リンパ腫（ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫）、Ｔ細胞の悪性腫瘍、Ｂ細胞の悪性腫瘍およびリンパ肉腫、または、ＲＥＡＬ分類制度または血液学的悪性腫瘍の世界保健機構の分類に記載されている他の悪性腫瘍。特定のＦｃＲＨの不在または存在が、造血細胞系統の特定の悪性腫瘍に対して診断的であり得るかまたは悪性腫瘍の特定の型（例えば、白血病の特定の型）に対して診断的であり得る点に留意する必要がある。
【００９９】
「炎症および自己免疫疾患」によって、全身エリテマトーデス、橋本病、慢性関節リウマチ、対宿主性移植片病、シェーグレン症候群、悪性貧血、アジソン病、硬皮症、グッドパスチャー症候群、クローン病、自己免疫性貧血症、無菌性、重症筋無力症、多発性硬化症、バセドー病、血小板減少紫斑病、インシュリン依存性真性糖尿病、アレルギー；喘息アトピー性疾患；動脈硬化；心筋炎；心筋症；糸球腎炎；再生不良性貧血；臓器移植の後の拒絶ならびに肺、前立腺、肝臓、卵巣、結腸、頸部、リンパおよび胸部組織の多数の悪性腫瘍が例として含まれる。
【０１００】
具体的には、診断法は、抗体が造血細胞系統の細胞と結合するか、または、核酸が、好ましくは、ストリンジェントな条件下で、生物学的サンプルの核酸とハイブリダイズし得る条件下で、本発明の抗体または核酸と被験体の生物学的サンプルとを接触させる工程；および結合の量またはパターンを検出する工程を包含する。コントロールサンプルの結合と比較して、結合の量またはパターンの変化は、悪性腫瘍または炎症または自己免疫疾患を示す。
【０１０１】
種々の実施形態において、診断法で使用する抗体は、配列番号１、２１、２、３、２２、４、５、２４または６のアミノ酸配列を有するＦｃＲＨと、選択的に結合し得る。
【０１０２】
診断法の検出工程は、当該分野における慣習的な方法から選択され得る。例えば、検出工程は、非侵襲性の医学技術（例えば、Ｘ線撮影、蛍光透視法、音波ホログラフィ、画像化技術（例えば磁気共鳴画像化法）など）を使用して、インビボで実施され得る。インビトロ検出方法は、免疫組織化学的に、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＦＡＣＳ、ＩＨＣ、ＦＩＳＨその他のアッセイにおいて結合された抗体またはそのフラグメントを検出するために用いられ得る。
【０１０３】
全体を通して使用されるように、「生物学的サンプル」は任意の生物体由来のサンプルをさす。サンプルは以下であり得るがこれらに限定されない：末梢血、血漿、尿、唾液、胃液分泌、糞便、骨髄標本、原発性腫瘍、包埋組織切片、冷凍組織切片、細胞調製物、細胞学的調製物、剥離サンプル（例えば、痰）、細針吸引、羊膜細胞、新鮮な組織、乾燥組織および培養細胞または組織。本発明の生物学的サンプルはまた、全ての細胞または細胞小器官（例えば核）であり得ることがさらに意図される。サンプルは、当該分野において広く利用できる標準のプロトコルに従って固定されなくて固定されてもよく、また、サンプルの調製の適切な媒体に包埋され得る。例えば、サンプルは、本発明の検出方法のための生物学的標本の準備を促進するために、パラフィンまたは他の適切な媒体（例えばエポキシまたはアクリルアミド）に包埋され得る。
【０１０４】
本発明はまた、被験体における造血細胞系統の悪性腫瘍または炎症または自己免疫疾患を処置する方法を提供し、この方法は、被験体の悪性腫瘍細胞または炎症性細胞を本発明の試薬（例えば、抗体または核酸）の治療組成物の治療有効量に接触させる工程を包含する。接触工程は、当該分野において利用できる任意の多数の手段を用いて、試薬または組成物の投与によってなされ得る。代表的には、試薬または組成物は、従来の方法を用いて、皮下（例えば、経皮パッチまたは局所適用クリーム、軟膏などによって）、経口的に、肺内に、経粘膜、腹膜内に、子宮内に、舌下的に、髄膜下に、筋肉内、関節内で投与される。さらに、試薬または組成物は、ｌ、３または６ヵ月の貯蓄注射可能または生分解性の材料および方法を用いて、例えば貯蓄注射可能経路で投与され得る。
【０１０５】
投与経路に関係なく、投与される試薬の量または投与スケジュールは、年齢、サイズ、体重、処理される状態、投与様式および状態の重篤度に基づいて個体間で変化する。当業者は投薬量が開業医によって最適化されると理解し、そして、投薬量を決定する方法は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（最新版）に記載されている。抗体のための適切な服用を選ぶ際のガイダンスは、抗体の治療的使用に関する文献（例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｆｅｒｒｏｎｅら編、Ｎｏｇｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐａｒｋ  Ｒｉｄｇｅ，Ｎ．Ｊ．，（１９８５）ｃｈ．２２および３０３−３５７頁；Ｓｍｉｔｈら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｈａｂｅｒら編、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７７）３６５−３８９）において見出される。使用する抗体の代表的な用量は、上述の要因に依存して、１日当たり体重の１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ（好ましくは、１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ）の間で変化し得る。抗体またはそのフラグメントの静脈内注射は、例えば、前述の要因に依存して、１０ｎｇ〜１ｇの抗体またはそのフラグメントであり得る。局所注射について、抗体の代表的な用量は、１ｐｇ〜１ｍｇで変動する。好ましくは、局所注射は、１〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは１〜２０μｇ／ｍｌの抗体濃度である。
【０１０６】
本発明の核酸は、種々の方法において細胞に送達され得る。例えば、本発明の核酸がアデノウイルスベクターで被験体の細胞に送達される場合、人間へのアデノウイルス投用量は１回の注射につき約１０７〜１０９プラーク形成単位（ｐｆｕ）で変動し得るが、１回の注射につき１０１２ｐｆｕまでであり得る。理想的には、被験体は、単回の注射を受ける。さらなる注射が必要な場合、不確定期間の間に６ヵ月間隔で、そして／または、処置の有効性が確立されるまで繰り返され得る。本明細書中に示すように、処置の有効性は、臨床パラメータを評価することによって決定され得る。
【０１０７】
必要とされる核酸またはベクターの正確な量は、上記のように変化する。このように、全ての核酸またはベクターについての正確な量を特定することは不可能である。適当な量は、本明細書中の教示に与えられる慣習的な試験のみを使用して、当業者によって決定され得る。
【０１０８】
本発明は、さらに本発明の試薬の治療組成物を提供する。このような組成物は、薬学的に受容可能なキャリア中に、代表的には約０．１〜９０重量％（例えば、１〜２０％または１〜１０％）の本発明の治療剤を含む。経口投与のための組成物の固形処方は、適切なキャリアまたは賦形剤（例えば、コーンスターチ、ゼラチン、ラクトース、アカシア、ショ糖、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、二カルシウムリン酸塩、炭酸カルシウム、塩化ナトリウムまたはアルギン酸）を含み得る。使用され得る崩壊剤としては、微結晶性セルロース、穀物澱粉、ナトリウム澱粉、グリコール酸塩およびアルギン酸が挙げられるが、これらに限定されない。使用され得る錠剤結合剤としては、アカシア、メチルセルロース、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン（ＰｏｖｉｄｏｎｅＴＭ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ショ糖、デンプンおよびエチルセルロースが挙げられる。使用され得る滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、シリコーン流体、タルク、ワックス、油およびコロイド状の二酸化ケイ素が挙げられる。
【０１０９】
水または他の水性ビヒクル中で調製される経口投与のための液体処方物は、種々の懸濁剤（例えば、メチルセルロース、アルギン酸塩、トラガカントゴム、ペクチン、ケルジン、カラゲーニン、アカシア、ポリビニルピロリドンおよびポリビニルアルコール）を含み得る。液体処方物はまた、溶液、エマルジョン、シロップおよび活性化合物を一緒に含むエリキシル、湿潤剤、甘味料、および着色料および香料を含み得る。種々の液体処方物および粉末処方物は、処置される哺乳動物の肺への吸入のために、従来の方法によって調製され得る。
【０１１０】
組成物の注射可能な処方物は、種々のキャリア（例えば、植物油、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、乳酸エチル、炭酸エチル、イソプロピルミリステート、エタノール、多価アルコール（グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール、など））を含み得る。静脈内注射について、化合物の水溶性のバージョンが、滴下方法で投与され得、それによって、抗真菌剤および生理的に受入れ可能な賦形剤を含む薬学的処方物が注入される。生理的に受入れ可能な賦形剤は、例えば、５％のブドウ糖、０．９％の生理食塩水、リンガー溶液または他の適切な賦形剤を含み得る。筋肉内調製物（例えば、化合物の適切な可溶性塩形態の滅菌処方物）は、医薬賦形剤（例えば、注射用水、０．９％生理食塩水または５％ブドウ糖溶液）中に溶解されて投与され得る。化合物の適切な不溶性の形態は、水ベースまたは薬学的に受容可能な油（例えば、長鎖脂肪酸のエステル（例えば、オレイン酸エチル（ｅｈｙ；ｐｌｅａｔｅ）））ベースとして調製されて投与され得る。
【０１１１】
局所用の半固体の軟膏処方物は、代表的には、医薬クリーム基剤のようなキャリア中に約１〜２０％（例えば、５〜１０％）の濃度の活性成分を含む。局所使用のための種々の処方物としては、活性成分ならびに種々の支持体およびビヒクルを含む、ドロップ、チンキ、ローション剤、クリーム、溶液、および軟膏が挙げられる。各薬学的処方物における治療剤の最適なパーセンテージは、処方物自体、および、特定の病原体において所望される治療効果、および関連する治療レジメンに従って変化する。
【０１１２】
処置方法の効果は、処置される状態の公知の徴候または症状について患者をモニタリングすることによって評価され得る。例えば、造血細胞系統の悪性腫瘍の処置において、異常増殖細胞の数の減少または安定化は、成功した処置を示す。関節炎の治療において、例えば、関節の炎症の量の減少は、成功した処置を示す。このように、「治療有効」によって、所望の治療効果を提供する量が意味される。
【０１１３】
本発明はさらに、被験体の体液性免疫応答を調整する方法を提供し、この方法は、被験体に本発明の単離されたＦｃＲＨ、抗体または核酸を投与する工程を包含する。「変調」によって、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのいずれかが意味される。このように、アレルギー反応の場合、当業者は、体液性免疫応答のダウンレギュレーションを選択する。感染性薬剤（例えばウイルスまたは細菌製剤）に対する被験体の暴露の場合、当業者は、体液性抗体反応のアップレギュレートを選択する。
【実施例】
【０１１４】
（実験）
以下の実施例は、本願で特許請求される化合物、組成物、物品、デバイスおよび／または方法がどのようにして作製および評価されるかについての完全な開示および説明を当業者に提供するために示され、単に本発明で例示することが意図され、発明者がそれらの本発明とみなす本発明の範囲を制限することを目的としない。数（例えば、量、温度など）に関して、精度を確実にするための努力がなされているが、いくらかの誤差および偏差が考慮されなければならない。特に示されない限り、部は重量部であって、温度は℃であるかまたは気温であり、そして、圧力は、大気圧またはその近くである。
【０１１５】
（実施例１：ＦｃＲＨ１、ＦｃＲＨ２およびＦｃＲＨ３の同定）
ＦｃＲＨ  ｃＤＮＡクローンを単離するために、ｃＤＮＡ端（ＲＡＣＥ）−ＰＣＲの迅速な増幅を、Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙヒトリンパ節ｃＤＮＡライブラリー（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用いて実行した。遺伝子特異的なプライマーは、以下の通りであった：ＦｃＲＨ３、前向き５’−ＴＧＡＧＴＣＴＣＡＧＧＧＴＣＡＣＡＧＴＴＣＣＧ−３’（配列番号４１）および逆向き５’−ＧＣＴＣＴＴＧＡＡＣＴＴＧＧＡＴＡＴＴＴＡＧＧＧＧＴ−３’（配列番号４２）；ＦｃＲＨ２、前向き５’−ＣＣＡＧＴＧＴＡＴＧＴＣＡＡＴＧＴＧＧＧＣＴＣＴＧ−３’（配列番号４３）および逆向き５’−ＣＧＴＴＧＡＡＡＧＡＧＣＴＣＴＴＧＧＡＣＴＴＴＴＡＴＣ−３’（配列番号４４）；そして、ＦｃＲＨ１、前向き５’−ＧＣＣＴＣＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＴＡＧＧＡＡＧＡＣＧＴＴ−３’（配列番号４５）および逆向き５’−ＡＡＧＣＴＣＡＣＡＴＣＡＧＣＧＡＣＡＧＧＧＡＣ−３’（配列番号４６）。ＲＡＣＥ生成物は、入れ子にされたＰＣＲの２回目に供され、アガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロマイド染色によって視覚化した。
【０１１６】
全長相ｃＤＮＡを生成するための末端から末端の増幅において使用するプライマーは、以下の通りであった：ＦｃＲＨ３、前向き５’−ＴＣＴＴＧＧＡＧＡＴＡＡＧＴＣＧＧＧＣＴＴＴ−３’（配列番号４７）および逆向き５’−ＡＴＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＡＧＣＣＴＣＧＴＡＧＧＡＧ−３’（配列番号４８）；ＦｃＲＨ２、前向き５’−ＧＧＴＣＣＴＣＡＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＴＣＡＴＴ−３’（配列番号４９）および逆向き５’−ＧＣＴＧＴＴＧＡＴＣＴＴＣＣＣＴＴＣＴＧＡＴＴＣ−３’（配列番号５０）；そして、ＦｃＲＨ１、前向きの５’−ＡＴＧＣＴＧＣＣＧＡＧＧＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＴＧ−３’（配列番号５１）および逆向き５’−ＣＡＴＡＧＣＡＴＣＴＴＣＡＴＡＧＴＣＣＡＣＡＴＣ−３’（配列番号５２）。各増幅反応は、９４℃３０秒間の最初の変性、その後の、９４℃で５秒間の変性、６８℃で４分間のアニーリングの３０サイクル、および７２℃で６分間の最終伸長を受けた。
【０１１７】
ＰＣＲ生成物は、ｐＣＲ２．１  ＴＯＰＯ  Ｔ／Ａベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結した。インサートは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）および自動シーケンサー（Ｌｉ−Ｃｏｒ，Ｌｉｃｈｏｌｎ，ＮＥ）を用いるジデオキシ鎖停止反応によって、両方の鎖についてＤＮＡ配列決定した。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の整列を、ＤＮＡＳＴＡＲ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）ソフトウェアパッケージによって分析し、そして、ホモロジー検索をＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０）を用いて実行した。
【０１１８】
その後、ＲＮＡブロット分析を実行した。ノーザンブロット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を、以下の３２Ｐ−ｄＣＴＰ−標識プローブを用いてハイブリダイズした：ＦｃＲＨ３  ｃＤＮＡの５’非翻訳（ＵＴ）−ＥＣ１領域に対応する５２８ｂｐのＥｃｏＲＩフラグメント、ＦｃＲＨ２  ｃＤＮＡの３’ＵＴ領域の一部に対応する２００ｂｐのＰＣＲ生成物、およびＦｃＲＨ１  ｃＤＮＡの３’ＵＴ領域の一部に対応する２５７ｂｐのＰＣＲ生成物。膜は、６５℃で１時間ハイブリダイズさせ、洗浄し、Ｘ線フィルムに露光した（Ｋｕｂａｇａｗａ，Ｈ．ら、（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４，５２６１−５２６６）。
【０１１９】
逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲを行った。ヒト扁桃腺細胞（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄの了承を受けて得られた）を、磁気細胞ソーティング（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）によってＣＤ１９＋およびＣＤ１９部分母集団に分けた。生存可能なＣＤ１９＋細胞を、ＦＩＴＣ標識した抗ＣＤ３８（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ，ＭＥ）およびフィコエリトリン標識した抗ＩｇＤ  ｍＡｂｓ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）で染色し、その後、ＲＮＡ単離のために、ＦＡＣＳｔａｒＰｌｕｓ計測器（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）に細胞をソートした。全細胞ＲＮＡを、ランダムヘキサマーおよびオリゴ（ｄＴ）プライマーで初回刺激し、ＳｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて一本鎖ｃＤＮＡに逆転写した。ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、扁桃腺Ｂ細胞および細胞株由来のＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲを実行した。以下の遺伝子特異的なプライマー対を、細胞株および扁桃腺Ｂ細胞部分母集団におけるＦｃＲＨ１〜５発現のＲＴ−ＰＣＲ分析に使用した：前向きＦｃＲＨ１、５’−ＣＴＣ  ＡＡＣ  ＴＴＣ  ＡＣＡ  ＧＴＧ  ＣＣＴ  ＡＣＴ  ＧＧＧ−３’（配列番号５３）および後向き５’−ＴＣＣ  ＴＧＣ  ＡＧＡ  ＧＴＣ  ＡＣＴ  ＡＡＣ  ＣＴＴ  ＧＡＧ−３’（配列番号５４）；前向きＦｃＲＨ２、５’−ＣＣＡ  ＧＴＧ  ＴＡＴ  ＧＴＣ  ＡＡＴ  ＧＴＧ  ＧＧＣ  ＴＣＴ  Ｇ（配列番号５５）および後向き５’−ＣＡＴ  ＴＣＴ  ＴＣＣ  ＣＴＣ  ＡＡＡ  ＴＣＴ  ＴＴＡ  ＣＡＣ−３’（配列番号５６）；前向きＦｃＲＨ３、５’−ＣＡＧ  ＣＡＣ  ＧＴＧ  ＧＡＴ  ＴＣＧ  ＡＧＴ  ＣＡＣ−３’（配列番号５７）および後向き５’ＣＡＧ  ＡＴＣ  ＴＧＧ  ＧＡＡ  ＴＡＡ  ＡＴＣ  ＧＧＧ  ＴＴＧ−３’（配列番号５８）；前向きＦｃＲＨ４、５’ＴＣＴ  ＴＣＡ  ＧＡＧ  ＡＴＧ  ＧＣＧ  ＡＧＧ  ＴＣＡ−３’（配列番号５９）および後向き５’−ＴＴＴ  ＴＧＧ  ＧＧＴ  ＧＴＡ  ＣＡＴ  ＣＡＡ  ＣＡＴ  ＡＣＡ  ＡＧ−３’（配列番号６０）；ならびに前向きＦｃＲＨ、５’−ＴＧＴ  ＴＧＣ  ＣＣＴ  ＧＴＴ  ＴＣＴ  ＴＣＣ  ＡＡＴ  ＡＣＡ−３’（配列番号６１）および後向き５’−ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＴＧＧ  ＣＣＧ  ＡＣＣ  ＴＡＣ  ＧＣ−３’（配列番号６２）。各増幅反応は、９４℃で５分間の最初の変性、その後の、９４℃で３０秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で１分間の伸長の３０サイクル、そして、７２℃で７分間の最終伸長を受けた。増幅生成物をエチジウムブロマイドを含む１％ａがロースゲルで可視化し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｆｌｕｏｒ−Ｓ  Ｉｍａｇｅｒで文書化した。
【０１２０】
以下のヒト細胞株を用いた：ＲＥＨおよびＮａｌｍ  １６プロＢ細胞株（Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒ，Ｓ．Ｊ．ら、（１９８３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７１，３０１−３１３）；６９７、２０７およびＯＢ５プレＢ細胞株（Ｆｉｎｄｌｅｙ，Ｈ．Ｗ．ら、（１９８２）Ｂｌｏｏｄ  ６０，１３０５−１３０９；Ｍａｒｔｉｎ，Ｄ．ら、（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３，６３９−６４５）；Ｒａｍｏｓ、ＤａｕｄｉおよびＲａｊｉ  Ｂ細胞株（Ｐｕｌｖｅｒｔａｆｔ，Ｒ．Ｊ．Ｖ．（１９６４）Ｌａｎｃｅｔ  １，２３８−２４０；Ｋｌｅｉｎ，Ｅ．ら、（１９６８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２８，１３００−１３１０；Ｋｌｅｉｎ，Ｇ．ら、（１９７５）Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５，３１９  ３３）；ＴＨＰ−１およびＵ９３７単球細胞株、ＨＬ−６０前骨髄球細胞株およびＫＧ−ｌ骨髄球細胞株、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞株およびＫ５６２赤血球細胞株（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）。
【０１２１】
ＦｃＲ（ＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩ／ＩＩＩ）の第２のＩｇ様ドメインのＧｅｎＢａｎｋ由来のアミノ末端配列、および重合Ｉｇレセプターの第３のＩｇ様ドメインに対応するコンセンサス配列を作製した：ＧＥＰＩＸＬＲＣＨＳＷＫＤＫＸＬＸＫＶＴＹＸＱＮＧＫＡＸＫＦＦＨ（配列番号６３）。この配列を有するＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎタンパク質データベースの検索は、２つの重なり合うヒトゲノム細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローン、ＡＬ１３５９２９およびＡＬ３５６２７６を同定した。そして、これらはｌｑ２ｌ．２−２２に位置する。第２のクローンは、ＦｃＲＨ１、ＦｃＲＨ２およびＦｃＲＨ３と称された相補的なアミノ酸配列をコードする３つの推定のＩｇスーパーファミリー遺伝子を含んだ。図１を参照のこと。これらの遺伝子セグメントの予測されたアミノ酸配列は、互いに２３〜５７％の同一性を共有し、ヒトＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）と１４〜２８％の同一性を共有した。ＦｃＲＨ位置のさらなる分析は、２つのさらなる遺伝子（ＦｃＲＨ４およびＦｃＲＨ５）および１つの偽遺伝子（ＦｃＲＨ４Ψ）（ＦｃＲＨ１〜３の直ぐ動原体より）の同定につながり、このうちの２つは最近、ＩＲＴＡＩ（ＦｃＲＨ４）およびＩＲＴＡ２（ＦｃＲＨ５）として記載されている（Ｈａｔｚｉｖａｓｓｉｌｉｏｕ，Ｇ．ら、（２００１）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １４，２７７−２８９）。
【０１２２】
これらの遺伝子がリンパ球によって発現されるかどうかを決定するために、これらのタンパク質生成物の予測されたアミノ酸配列を用いて、ＴＢＬＡＳＴＮアルゴリズム（Ａｌｉｚａｄｅｈ，Ａ．Ａ．ら、（２０００）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）４０３，５０３−５１１）により、Ｌｙｍｐｈｏｃｈｉｐ発現配列タグデータベースを検索した。これらの翻訳されたＯＲＦの２３アミノ酸にわたって完全な同一性をＦｃＲＨ１のＮ末端と共有する、２つの発現配列タグ（ＡＡ５０５０４６およびＡＡ２８２４３３）を同定した。Ｌｙｍｐｈｏｃｈｉｐマイクロ配列データ分析はこれらの発現配列タグが、末梢リンパ組織（リンパ節、扁桃腺、静止末梢Ｂ細胞よび正常な胚中心（ＧＣ）細胞を含む）にて比較的高いレベルで発現されることを示した。異なるリンパ急性悪性腫瘍の中で、これらの発現は、Ｂ血統の慢性リンパ球性白血病、小胞リンパ腫および若干のびまん性巨細胞リンパ腫で最も高いと判明した。
【０１２３】
ＦｃＲＨ１、ＦｃＲＨ２およびＦｃＲＨ３のｃＤＮＡは、５’方向および３’方向の両方で、ヒトリンパ節ｃＤＮＡライブラリから、ＲＡＣＥ−ＰＣＲによって単離した。ＦｃＲＨ１、ＦｃＲＨ２およびＦｃＲＨ３についてのコード領域の全長ｃＤＮＡは、５’ＵＴおよび３’ＵＴ領域について線引きされたｃＤＮＡ配列から作製された固有のプライマーを用いる、末端から末端のＰＣＲによって得た。各ｃＤＮＡの３’ＵＴ領域に特異的なｃＤＮＡプローブを用いた、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩまたはＨｉｎｄＩＩＩで消化したヒトゲノムＤＮＡのサザンブロット分析は、１つまたは２つのいずれかのハイブリダイズするフラグメントを明らかにし、これは、ＦｃＲＨ１、ＦｃＲＨ２およびＦｃＲＨ３が１つの遺伝子によってコードされることを示唆した。全長ｃＤＮＡ配列の分析は、ＦｃＲＨ１、ＦｃＲＨ２およびＦｃＲＨ３がそれぞれ、１，２８７ｂｐ、１，５２４ｂｐ、および２，２０２ｂｐのＯＲＦを有し、そして、それぞれ、４２９ａａ、５０８ａａおよび７３４ａａのＩ型膜貫通タンパク質をコードすることを示した。予測されたコンセンサスシグナルペプチド切断部位（Ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ，Ｇ．（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１４，４６８３−４６９０；Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｈ．（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１０，１−６）に基づいて、関連コアペプチドの分子量を、ＦｃＲＨ１について４５，１５８、ＦｃＲＨ２について５３，４０７およびＦｃＲＨ３について７８，８４９と推定した。これらのＩ型膜貫通タンパク質は、３〜７個の潜在的なＮ連結グリコシル化部位、非荷電膜貫通セグメントならびにＩＴＩＭおよび／またはＩＴＡＭに対するコンセンサスモチーフを含む比較的長い細胞質尾部を有する、３〜６の細胞外Ｃ２（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ａ．Ｆ．＆  Ｂａｒｃｌａｙ，Ａ．Ｎ．（１９８８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６，３８１−４０５；Ｂｏｒｋ，Ｐ．ら、（１９９４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４２，３０９−３２０；Ｖａｕｇｈｎ，Ｄ．Ｅ．＆  Ｂｊｏｒｋｍａｎ，Ｐ．Ｊ．（１９９６）Ｎｅｕｒｏｎ  １６，２６１−２７３）型Ｉｇ様ドメインを保有する。図２Ａを参照のこと。
【０１２４】
翻訳されたｃＤＮＡの多数の配列分析は、比較のインデックス配列としてＦｃＲＨ３を使用して、ＦｃＲＨ１、ＦｃＲＨ２およびＦｃＲＨ３が疎水性シグナルペプチドおよび対応するＩｇ様細胞外ドメイン（図２Ｂ）を高く保存したことを示す。これらの疎水性膜貫通（酸性ドメインを含むＦｃＲＨ１を除いて非荷電）ドメイン（Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ，Ｅ．Ｌ．Ｌ．ら、（１９９８）Ａ  Ｈｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖ  Ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｈｅｌｉｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，Ｇｌａｓｇｏｗ，Ｊ．，Ｌｉｔｔｌｅｊｏｈｎ，Ｔ．，Ｍａｊｏｒ，Ｆ．，Ｌａｔｈｒｏｐ，Ｒ．，Ｓａｎｋｏｆｆ，Ｄ．＆  Ｓｅｎｓｅｎ，Ｃ．編（Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．ｆｏｒ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ），１７５−１８２頁）はまた、かなり保存されているが、これらの細胞質ドメインは保存されていない。ＦｃＲＨ１は、３つの潜在的ＩＴＡＭを含む長い細胞質の尾部を有し、このうち、１番目および３番目は、コンセンサス配列（Ｅ／Ｄ）−Ｘ−Ｘ−Ｙ−Ｘ−Ｘ（Ｌ／Ｉ）−Ｘ６−８−Ｙ−Ｘ−Ｘ（Ｌ／Ｉ）（配列番号６４（コンセンサス配列間の６つのアミノ酸残基を有する）；配列番号６５（コンセンサス配列間の７つのアミノ酸残基を有する）；および配列番号６６（コンセンサス配列間の８つのアミノ酸残基を有する））にフィットするが、２番目は、１つのチロシン残基だけを有する。ＦｃＲＨ２のより短い細胞質ドメインは、１つの潜在的なＩＴＡＭおよび、２２アミノ酸によって隔てられている２つのＩＴＩＭコンセンサス配列（Ｉ／Ｖ／Ｌ／Ｓ）−Ｘ−Ｙ−Ｘ−Ｘ（Ｌ／Ｖ）（配列番号６７）を有する。ＦｃＲＨ３は、最も長い細胞質の尾部を有する。これは、また、単一のチロシン残基を有する、１つの潜在的なＩＴＡＭ、１つのＩＴＡＭおよび別の潜在的ＩＴＡＭを含む。
【０１２５】
遺伝子特異的なプローブを用いるＲＮＡブロット分析を、１６のヒト組織（６の原発性または続発性リンパ組織を含む）について実施した。ＲＮＡブロットを、それぞれのＦｃＲＨ  ｃＤＮＡから作製したα３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識したプローブで分析した。以下のプローブを用いた：（上部）ＦｃＲＨ１の３’ＵＴ領域に特異的な２５７ｂｐのプローブ；（中間）ＦｃＲＨ２の３’ＵＴ領域に対応する２９０ｂｐのプローブ、ＰＣＲ生成の；および（下段）ＦｃＲＨ２の５’ＵＴ領域に対応するＦｃＲＨ３  ｃＤＮＡの５’末端の５２８ｂｐ  ＥｃｏＲＩ消化フラグメント（Ｓ１、Ｓ２、および、ＥＣ１ドメイン）。相対的なｍＲＮＡ量は、β−アクチンプローブによって示した。全３つのＦｃＲＨ遺伝子プローブは、続発性リンパ器官である、脾臓およびリンパ節における転写物とハイブリダイズした。ＦｃＲＨ１特異的なプローブは、脾臓（約３．５ｋｂ）およびリンパ節（約６．０ｋｂ）の転写物にハイブリダイズした。約０．７ｋｂおよび約１．５ｋｂのさらなるハイブリダイゼーションバンドは、心臓、骨格筋、腎臓、肝臓について観察され、より少ない量が胎盤組織で観察された。より大きな転写物がまた、骨格筋（約６．０ｋｂ）において、そして、腎臓および胎盤において（約４．４ｋｂ）見られた。ＦｃＲＨ２に特異的なプローブは、脾臓およびリンパ節で最も豊富に、約３．０ｋｂ、約４．４ｋｂおよび約５．５ｋｂの転写物にハイブリダイズした。約２ｋｂの転写物は、腎臓において顕著であった。ＦｃＲＨ３プローブは、主に脾臓およびリンパ節で、約３．５ｋｂ、約５．５ｋｂおよび約７．０ｋｂの転写物にハイブリダイズした。これらはまた、末梢血リンパ球、胸腺および骨髄のサンプルで、わずかに少ない量で見られた。さらに、約１．３５ｋｂの固有の転写物が、骨格筋で明らかだった。これらの結果は、末梢リンパ器官においてＦｃＲＨ１、ＦｃＲＨ２およびＦｃＲＨ３の発現を示したのに対し、選択的スプライシングまたはポリアデニル化の組織特異的な違いが、非リンパ系組織の可変的なサイズを有する転写物の差次的な発現によって示唆された。しかし、非リンパ組織骨格筋の今日までのＲＴＰＣＲ分析では、ノーザン分析の結果にもかかわらず転写物が現れていない。
【０１２６】
ＦｃＲＨ発現が異なる血液生成血統を発現する細胞株のＲＴ−ＰＣＲ分析によって調べられる場合、ＦｃＲＨ１、ＦｃＲＨ２およびＦｃＲＨ３の発現は、試験される全ての成熟したＢ細胞株において見出された。ＦｃＲＨ２およびＦｃＲＨ３の発現は、成熟したＢ細胞株に限定されており、試験される細胞の他の型においては見られなかった。対照的に、赤血球細胞株においては見いだされないが、ＦｃＲＨ１の発現は、プロＢ細胞株、Ｔ細胞株および脊髄細胞株において見出された。
【０１２７】
【表２】
2005521429.tif 000003
【０１２８】
末梢血細胞のソートされた集団のＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＦｃＲＨ１、ＦｃＲＨ２、ＦｃＲＨ３およびＦｃＲＨ５が、ＣＤ１９＋Ｂ細胞において比較的高いレベルで発現されることを示したが、ＦｃＲＨ４はかすかなレベルだけ発現された。ＦｃＲＨ１の転写物がかろうじて検出可能だったのに対して、ＦｃＲＨ３発現はＣＤ３＋Ｔ細胞において観察された。ＦｃＲＨ１発現はまた、循環する顆粒球において観察された。
【０１２９】
二次的なリンパ組織のＦｃＲＨ発現の分析を洗練するために、扁桃腺のリンパ球部分母集団を単離した。Ｂ血統細胞（細胞表面ＩｇＤおよびＣＤ３８のそれらの差次的な発現によって特徴づけられ得る）の５つの別々の部分母集団は、Ｂ細胞分化の異なる段階を示した：小胞マントル（ＩｇＤ＋ＣＤ３８）、前ＧＣ（ＩｇＤ＋ＣＤ３８＋）、ＧＣ（ＩｇＤＣＤ３８＋）、記憶（ＩｇＤＣＤ３８）、および成熟した形質細胞（ＣＤ３８２＋）（Ｐａｓｃｕａｌ，Ｖ．（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．ｍｅｄ．１８０：３２９−３３９）。扁桃腺のＢ細胞部分母集団のＦｃＲＨ１〜５発現のＲＴ−ＰＣＲ分析が実施された。生細胞は、ＣＤ１９−非Ｂ型細胞およびＣＤ１９＋Ｂ細胞に磁気的にソートされた。後者は抗ＩｇＤ抗体および抗ＣＤ３８  ｍＡｂｓで染色され、そして、５つの部分母集団（ＣＤ３８−ＩｇＤ−、ＣＤ３８−ＩｇＤ＋、ＣＤ３８＋ＩｇＤ＋、ＣＤ３８＋ＩｇＤ−およびＣＤ３８２＋）はフローサイトメトリーによってソートされた。非Ｂ型細胞およびＢ細胞部分母集団におけるＦｃＲＨ転写物のＲＴ−ＰＣＲ分析がまた、実施された。ｃＤＮＡを調製した後、ほぼ１０ｋの細胞の等価な鋳型についてＰＣＲ増幅が実行された。グリセルアルデヒド３−リン酸塩デヒドロゲナーゼ（ＧＡＤＰＨ）が、ポジティブコントロールとして増幅された。
【０１３０】
ＲＴ−ＰＣＲ分析は、非Ｂ型血統ＣＤ１９−細胞（そのほとんどがＴ細胞である）におけるＦｃＲＨ転写物の発現をほとんど示さなかったか、全く示さなかった。しかしながら、ＣＤ１９＋部分母集団は、小胞マントル、ナイーブ、ＧＣおよび記憶Ｂ細胞部分母集団におけるＦｃＲＨ１、ＦｃＲＨ２およびＦｃＲＨ３転写物の強調した発現を示したが、前ＧＣ  Ｂ細胞または形質細胞におけるＦｃＲＨ転写物の証拠を得なかった。対照的に、ＦｃＲＨ４転写物は、小胞マントルおよび記憶Ｂ細胞に限定されたのに対し、ＦｃＲＨ５発現は成熟した形質細胞に及んだ。
【０１３１】
５つのＦｃＲＨの間の関係は、その全長、細胞外、および個々のＩｇ様ドメインのアミノ酸配列を比較することによって調べられた。この分析（最近同定されたマウスＦｃＲＨオーソログ（ｍｏＦｃＲＨ）およびＦｃＲファミリーのメンバーを含む）は、ＣＬＵＳＴＡＬ法アルゴリズム（Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．＆  Ｓｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．（１９８９）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．５，１５１−１５３）を使用した。ＦｃＲＨ３をもつ他のＦｃＲＨファミリーメンバーの全長配列の比較は、４０〜４７％の同一性を示した。比較として、ｍｏＦｃＲＨとのＦｃＲＨ３の相同性の程度が３５％であると見出され、そして、１番染色体上のＦｃＲメンバー（ＦｅγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃεＲＩ）との相同性は２１〜２４％であると見出された。最も低いレベルのアミノ酸同一性（１４％）は、１９番染色体上のＬＲＣメンバー（ＦｃαＡ）について観察された。細胞外の相同性のわずかにより高い程度は、明白だった。個々のＩｇ様サブユニットのペアワイズ分析は、ファミリーメンバー間の細胞外ドメイン構成の膜近位の順序に対し、膜遠位での保存を示した。類似したＩｇドメインサブユニットがファミリーメンバー間で分配されたにもかかわらず、個々のレセプターが独特のドメインの組合せを含むことが見出された。ｍｏＦｃＲＨの細胞外ドメイン構成は、ＦｃＲＨ２のものと最も密接に類似しており、それは４６％の同一性を有する。ＦｃＲＨファミリーと公知のＦｃＲとの拡張したペアワイズ比較は、より大きなファミリーの全体にわたって、ある程度、これらのＩｇ様ドメインの保存を示した。類似性は、特に、３つのＦｃγＲＩドメインおよびＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲγ鎖の２つのドメインに対応するＦｃＲＨ３膜遠位のドメインに明らかである。この分析は、差次的な重複およびそれぞれのＦｃＲＨファミリーメンバーの個々のＩｇ様サブユニットの多様化の祖先からの存在を示唆する。データはまた、ＦｃＲＨが１９番染色体上のそれらのＦｃＲ類縁体よりも１番染色体上のそれらのＦｃＲ隣接体と類似していることを示す。
【０１３２】
関連した染色体ｌｑ２１  ＢＡＣクローンのゲノム配列分析は、全てのＦｃＲＨ場所が３００ｋｂにわたることを示唆した。ＦｃＲＨ遺伝子は、セントロメアに向かう同じ転写方向に存在する。エキソンイントロンの境界線は、それらのそれぞれのｃＤＮＡクローンおよびＡＧ／ＧＴ支配の配列比較によって特徴づけられた。ＦｃＲＨ１遺伝子は、１１のエキソンと、約２８ｋｂにわたる１０のイントロンからなる。第一エキソン（５’ＵＴ／Ｓ１）は、５’ＵＴ領域、ＡＴＧ翻訳開始コドンおよび分裂シグナルペプチドの最初の半分をコードする。Ｓ２（第２のエキソン）は、１２．９ｋｂの長いイントロンによって５’ＵＴＲから離されて、隣接するＦｃＲと同様に、長さ２１ｂｐである（ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，Ｊ．Ｇ．＆  Ｃａｐｅｌ，Ｐ．Ｊ．（１９９３）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １４，２１５−２２１；Ｋｕｌｃｚｙｃｋｉ，Ａ．，Ｊｒ．ら、（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，２８５６−２８６０；Ｐａｎｇ，Ｊ．ら、（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１，６１６６−６１７４）。細胞外領域は、３つの密接に集まったエキソン（ＥＣ１〜ＥＣ３、３つのＩｇ様ドメインをコードする）によってコードされる。膜近位ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインは、単一の第６のエキソン（ＴＭ）によってコードされる。細胞質の尾部は、５つのエキソン（ＣＹ１〜ＣＹ５）によってコードされ、そして、ＣＹ５はまた３’ＵＴ領域の開始をコードする。
【０１３３】
ＦｃＲＨ２は、１２のエキソンおよび３０ｋｂにわたる１１のイントロンを含む。これはまた、割れたシグナルペプチドをコードする２つのエキソンを含み、その中での最初のもの（５’ＵＴ／Ｓ１）は、５’ＵＴ領域、ＡＴＧ翻訳開始コドンおよびシグナルペプチドの最初の半分を含む。第２のエキソン（Ｓ２）は、長さ２１ｂｐである。エキソン３〜６は、４つの細胞外ドメイン（ＥＣ１〜ＥＣ４）をコードする。第７エキソンは、膜近位ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードする。ＦｃＲＨ２細胞質の尾部は５つのエキソン（ＣＹ１〜ＣＹ５）によってコードされ、その最後のエキソンは、ＯＲＦの終了および３’ＵＴ領域の始まりを含む。
【０１３４】
ＦｃＲＨ３遺伝子は、１６のエキソンと、約２４ｋｂにわたる１５のイントロンからなる。ＦｃＲＨ１およびＦｃＲＨ２とは異なり、その５’ＵＴ領域は、ＡＴＧ翻訳開始コドンおよび割れたシグナルペプチドの始まりまたをコードする２つのエキソン（５’ＵＴ１および第２のエキソン（５’ＵＴ２／Ｓ１）によってコードされる。第３のエキソン（Ｓ２）はまた、長さ２１ｂｐである。６つのエキソン（ＥＣ１〜ＥＣ６）によってコードされる細胞外ドメインの後に、膜近位ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードするエキソン１０が続く。細胞質の尾部は、５つのエキソン（ＣＹ１〜ＣＹ５）によってコードされる；最後は、３’ＵＴ領域の始まりを含む。
【０１３５】
（実施例２：ｈｕＦｃＲＨ６の同定）
ＦｃＲＨ６は、ｌｑ２ｌ−２３にある古典的なＦｃＲの中央に位置する。そのゲノム構造は、古典的なＦｃＲおよびＦｃＲＨ１〜５のような、２つのエキソンによってコードされる分かれた疎水性シグナルを示し、そのうちの２番目は、２１ｂｐである。
【０１３６】
ＦｃＲＨ６を、実施例１に記載されている方法を使用して特徴づけた。他のｈｕＦｃＲＨとの相関性のためのＩｇ様ドメインのコンポジット分析を、実行した。図ｘｘｘを参照のこと。ｈｕＦｃＲＨ６の配列分析は、そのＩ型膜貫通形態が、単一のＩＴＡＭまたは単一もしくは２つのＩＴＩＭについてのコンセンサスモチーフを含むことを示す。
【０１３７】
ヒト組織および細胞株におけるｈｕＦｃＲＨの最初のＲＴ−ＰＣＲ分析は、（実施例１にて説明したように）、通常の扁桃腺およびリンパ節の転写物の発現を明らかにする。細胞株において、ｈｕＦｃＲＨ６の発現は、脊髄細胞株ＴＨＰ−１（単核球性）、Ｕ９３７（骨髄単核球性）およびＫＧ−１（骨髄球）において同定した。ある場合、限定的な発現を、２０７前Ｂ細胞株およびダウディＢ細胞株において同定した。
【０１３８】
（実施例３：トランスフェクト体および抗体の作製）
トランスフェクションおよびｈｕＦｃＲＨ１〜５の安定した発現のための組換え構築物を作製した。これらの構築物を、ＣＭＶ駆動の哺乳動物の発現ベクターに、そのカルボキシル末端に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を融合の有無で連結した。ｈｕＦｃＲＨ１およびｈｕＦｃＲＨ３の表面発現を、抗体上清で染色することによって、ＧＦＰおよび非ＧＦＰの形態の両方について検出した。抗体上清は、それぞれのＦｃＲＨの組換え細胞該タンパク質で免疫されたマウスによって産生されたハイブリドーマ由来であった。ｈｕＦｃＲＨ２、４および５についての構築物は、ＦｃＲＨ４についての表面発現と同様に緑色蛍光によって検出した。
【０１３９】
モノクローナル抗体を産生させた。これは例えば、ＦｃＲＨ１に結合する抗体を含む。正常なボランティアから末梢血のＦＩＴＣ結合体（マウス抗ヒトＦｃＲＨ１）で標識したモノクローナル抗体１−５Ａ３を用いる、ＦｃＲＨ１発現についてのＦＡＣＳ染色の予備分析は、実質的に、全てのＣＤ１９＋Ｂ細胞が、ＣＤ１４＋単球およびＣＤ１３＋顆粒球のように、ｈｕＦｃＲＨ１発現を有することを示す。ＣＤ３＋Ｔ細胞は、ＦｃＲＨ１の発現に制限されなかった。２つの異なる患者の抹消血液サンプルからのＢ−ＣＬＬサンプルの染色は、実質的に、全てのＣＤ５＋／ＣＤ１９＋Ｂ−ＣＬＬ細胞がＦｃＲＨ１  １−５Ａ３抗原に対して陽性であることを示す。組換えタンパク質のウエスタンブロット分析によって、ＦｃＲＨ１〜５の細胞外領域１−５Ａ３が、ＦｃＲＨ１特異的であることを明らかにする。１−５Ａ３はまた、Ｂ細胞株であるダウディおよびＲａｊｉを染色する。
【０１４０】
（実施例４：ＭｏＦｃＲＨ１〜３の同定）
３つのマウスＦｃレセプターホモログ（ＭｏＦＣＲＨ）のファミリーを同定し、クローニングした。ｈｕＦｃＲＨ１〜５の膜近位のＩｇ様ドメインからのアミノ酸配列は、それぞれ、タンパク質ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴＰ）または翻訳されたヌクレオチドＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴＮ）アルゴリズムを用いて、ＮＣＢＩデータベースまたはＣｅｌｅｒａのゲノム、ＥＳＴおよびタンパク質のデータベースの推定のマウスＦｃＲＨオーソログを同定するのに用いた。ｍｏＦｃＲファミリーの位置は、ヒト染色体１ｑ２１−２３とシンテニーな領域の１番染色体と３番染色体との間で分かれている。図４を参照のこと。ｍｏＦｃＲＨは、マウスの３番染色体に位置する。近似の位置は、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＣｅｌｅｒａおよびＭｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓのデータベースから決定した。ＥＳＴのコンティグを推定のｃＤＮＡ配列を決定するために作製した。
【０１４１】
ゲノム組織は、ＧｅｎＢａｎｋおよびＣｅｌｅｒａのゲノム配列とＲＡＣＥ  ＰＣＲから作製されたｃＤＮＡクローンとを比較することによって決定した。ＤＮＡＳｔａｒソフトウェアを、配列比較およびＡＧ／ＧＴ支配によって特徴づけられたエキソンイントロンの境界の分析のために用いた。全３つの遺伝子は、ヒトの１番染色体上の全てのＦｃＲおよびｈｕＦｃＲＨ遺伝子において見出される、２１ｂｐのＳ２エキソン（エキソン２）を有する分裂したシグナル配列を含む。
【０１４２】
ＦｃＲＨ細胞質の尾部のチロシンベースのモチーフの比較は、ｈｕＦｃＲＨファミリーとの相同性を示した。図５を参照のこと。配列相同性の保存の分析は、図６および７に、さらに示す。
【０１４３】
組織および細胞株のｍｏＦｃＲＨの表示はまた、実施例１にて説明したように、特徴づけた。簡潔には、ＲＴ−ＰＣＲを、遺伝子特異的なプライマーを用いて、マウス組織および細胞株について実行した。生存可能な組織を、ＲＮＡ抽出のためにＴＲＩｚｏｌ試薬中に配置した。ｃＤＮＡを調製した後、ＰＣＴ増幅を、等価量の鋳型について実行した。アクチンを、ポジティブコントロールとして増幅した。ＭｃＦｃＲＨ３は、Ｂ血統の細胞に優位な発現があるようである。結果を、表３〜４に示す。
【０１４４】
【表３】
2005521429.tif 000004
【０１４５】
【表４】
2005521429.tif 000005
【０１４６】
Ｆｃレセプターホモログは、分泌されるか、または、潜在的な活性化モチーフおよび抑制性モチーフを備える固有の細胞質の尾部を有するＩ型膜貫通アイソフォームを含む。それらの染色体位置、Ｉｇドメイン相同性およびゲノム組織は、マウスＦｃレセプターホモログが非常に有意なレベルの多様性有するｈｕＦｃＲＨのオーソログであることを示す。ｍｏＦｃＲＨ１、ｍｏＦｃＲＨ２およびｍｏＦｃＲＨ３は、分泌されるかまたは、そのアミノ酸配列に基づくＩ型膜貫通タンパク質をコードすることが予測される。ｍｏＦｃＲＨ１は、２つの分泌されたアイソフォームを有し、この両方が、４つのＮ連結グリコシル化のための潜在的な部位を結合し得る４つのＩｇ様ドメインの細胞外（ＥＣ）領域を有する。１つのアイソフォームは、８つのシステインを含むＢ型スカベンジャーのレセプタードメインを有する融合タンパク質である。ｍｏＦｃＲＨ２は分泌されるか、または、５つのＮ連結グリコシル化部位を備える２つのＩｇ様ドメインを含むＩ型アイソフォームである。Ｉ型アイソフォームは、分泌されたアイソフォームを欠く、非荷電の膜貫通領域を有する。両方のアイソフォームは膜貫通形態で長く、１つの潜在的な免疫レセプターチロシンベースの活性化モチーフに対するコンセンサス配列を含む、５のチロシンを含む、細胞質の部分を含む。ｍｏＦｃＲＨ３は、６つのＮ連結グリコシル化の潜在的な部位を有する５つのＩｇ様ドメインを含む。その膜貫通ドメインはまた、非荷電であり、細胞質領域は１つの潜在的なＩＴＡＭおよび１つの潜在的免疫レセプターチロシンベースの抑制性モチーフ含む。個々の領域および全長（ＦＬ）アイソフォーム形態のアミノ酸（ａａ）長、ならびに、近似の分子量（ＭＷ）（ダルトン（Ｄａ））は、図８の模式図に示す。
【０１４７】
本出願の全体にわたって、種々の刊行物が、参照される。これらの刊行物の開示は、本発明が関する技術水準をより完全に記載するために、その全体が参考として本願明細中に援用される。
【０１４８】
種々の改変および変更が、本発明の範囲または精神から逸脱することなく、本発明においてなされ得ることは、当業者にとって明らかである。本発明の他の実施形態は、本明細書中に開示される本発明の説明および実施を考察して、当業者に明らかである。明細書および実施例が例示のみとして考慮され、本発明の真の範囲および精神については、添付の特許請求の範囲によって示されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】図１は、１番染色体上のＦｃＲクラスター内の、ＦｃＲＨ遺伝子座の相対的な位置を示す。ＦｃＲ遺伝子の細胞発生座は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｍａｐｖｉｅｗデータベースから近似される。この座にわたるＢＡＣクローン（４（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ１３９４０９）；３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ３５６２７６）；２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ１３５９２９）；および１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ３５３７２１））を、それぞれのＦｃＲＨ遺伝子（斜線の領域）に関して正しい位置に置く。
【図２】図２は、ＦｃＲＨ１、ＦｃＲＨ２およびＦｃＲＨ３の構造および配列多様性を示す。図２Ａは、ＦｃＲＨ分子の概略図である。３つのｃＤＮＡは、類似の細胞外ドメインを有するが、異なる細胞質領域を有するＩ型膜貫通タンパク質をコードする。細胞外（ＥＣ）領域は、異なる数のＣ２様ＩｇドメインおよびＮ連結グリコシル化の潜在的部位を含む。膜貫通（ＴＭ）ドメインは、非荷電であるが、ＦｃＲＨ１の場合を除く。ＦｃＲＨ１の細胞質（ＣＹ）領域は、２つのＩＴＡＭ（薄灰色の四角）および１つのＩＴＡＭ様領域（小さな斜線の四角）を含み、一方で、ＦｃＲＨ２は１つのＩＴＡＭおよび２つのＩＴＩＭ（濃い灰色の四角）を含む。ＦｃＲＨ３は、１つのＩＴＡＭ、１つのＩＴＩＭおよびＩＴＡＭ様領域を有する長い細胞質の尾部を有する。各領域のアミノ酸長が示される。図２Ｂは、ＦｃＲＨ３配列に基づいたＦｃＲＨ１、ＦｃＲＨ２およびＦｃＲＨ３アミノ酸配列（１文字コード）の多重配列比較を示す。アミノ酸の同一性を点によって表し、そして、ギャップはダッシュによって示す。予測されたＮ連結グリコシル化部位および膜貫通ドメインは、黒で下線を付される。コンセンサスＩＴＡＭ（太字）およびＩＴＩＭ（太字、下線を付される）のモチーフが示される。推定の構造ドメインに、注釈をつけられる：ＳＰ（シグナルペプチド）；ＥＣ（細胞外ドメイン）；ＭＰ−ＴＭ（膜近位膜貫通）；および、ＣＹ（細胞質領域）。アミノ酸長は、括弧内に示される。
【図３】図３は、ＦｃＲＨとＦｃＲのファミリーメンバーの間の細胞外相同性の複合分析を示す。個々のＩｇ様サブユニットのペアワイズ分析は、比較の指標としてＦｃＲＨ３を用いるＣＬＵＳＴＡＬ法アルゴリズムによって実行された。個々の相同なドメインは、相関性を示すために符号を付される。関連したドメインに対するパーセントアミノ酸同一性が示され、比較ＦｃＲＨ３サブユニットに関して整列される。ＦｃＲＨ５の膜近位ドメイン（薄灰色のサブユニット）についてのアミノ酸同一性が、全ての個々の関連ドメインについての同一の範囲として提供される。適用できない比較は、空白のままにされる。アミノ酸配列は、ＩＲＴＡ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ３４３６５９）、ＩＲＴＡ２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ３４３６４）、ｍｏＦｃＲＨ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＧ２８７７５）、ＦｃγＲＩ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＡ３５６７８）、ＦｃγＲＩＩ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ３１９９４）、ＦｃγＲＩＩＩ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ０８６３７）、ＦｃεＲＩ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ１２３１９）およびＦｃαＲＩ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ２４０７１）由来であった。
【図４】図４は、マウスＦｃＲファミリーの相対的な位置を示す。位置は、染色体１ｑ２１−２３のヒトＦｃＲ関連遺伝子、およびマウス３番染色体および１番染色体上のこれらのオルソログの座に関して示される。マイクロサテライトマーカーｄ３Ｍｉｔ１８７は、ｍｏＦｃＲＨ１内に位置する。
【図５】図５は、ＦｃＲＨ３配列に基づいた、ｈｕＦｃＲＨ１〜５ならびにマウスＦｃＲＨ１および２のアミノ酸配列（１文字コード）の多重配列比較を示す。アミノ酸のギャップは、ダッシュによって示される。コンセンサスＩＴＡＭ（下線を付される）およびＩＴＩＭ（斜字、下線を付される）のモチーフが示される。アミノ酸長は、括弧内に示される。
【図６】図６は、Ｉｇ様サブユニットの相関性を示すように印をつけられたドメインを示す。Ｉｇ様ドメイン同一性は、ＣＬＵＳＴＡＬプログラムを用いるＤＮＡＳｔａｒソフトウェアを使用し、任意の色を所定の分岐の個々のＩｇドメインに割り当てる、系統発生樹の作製によって測定された。全長のアミノ酸同一性、細胞外ドメイン、および細胞質ドメインの比較は、ｈｕＦｃＲＨ３に基づく。最も近い細胞質の類縁体を、括弧内に示す。マウス類縁体とヒト類縁体との間の最も同一な細胞外比較を、水平線で強調する。適用できない比較は、空白のままにされる。
【図７】図７は、ｈｕＦｃＲＨ１〜６、ｍｏＦｃＲＨ１〜３および関連タンパク質のドメインを示す。ドメインは、Ｉｇ様サブユニットの相関性を示すように色付けられる。Ｉｇ様ドメイン相同性は、ＣＬＵＳＴＡＬプログラムを用いるＤＮＡＳｔａｒソフトウェアを使用し、任意の色を所定の分岐の個々のＩｇドメインに割り当てる、系統発生樹の作製によって測定された。全長のアミノ酸同一性、細胞外ドメイン、および細胞質ドメインの比較は、ｈｕＦｃＲＨ３に基づく。最も近い細胞質の類縁体は、括弧内に示す。マウス類縁体とヒト類縁体との間の最も同一な細胞外比較を、赤で強調する。適用できない比較は、空白のままにされる。
【図８】図８は、マウスＦｃＲＨのアイソフォームの構造特徴を示す。
【配列表】
2005521429.tif 000006
2005521429.tif 000007
2005521429.tif 000008
2005521429.tif 000009
2005521429.tif 000010
2005521429.tif 000011
2005521429.tif 000012
2005521429.tif 000013
2005521429.tif 000014
2005521429.tif 000015
2005521429.tif 000016
2005521429.tif 000017
2005521429.tif 000018
2005521429.tif 000019
2005521429.tif 000020
2005521429.tif 000021
2005521429.tif 000022
2005521429.tif 000023
2005521429.tif 000024
2005521429.tif 000025
2005521429.tif 000026
2005521429.tif 000027
2005521429.tif 000028
2005521429.tif 000029
2005521429.tif 000030
2005521429.tif 000031
2005521429.tif 000032
2005521429.tif 000033
2005521429.tif 000034
2005521429.tif 000035
2005521429.tif 000036
2005521429.tif 000037
2005521429.tif 000038
2005521429.tif 000039
2005521429.tif 000040
2005521429.tif 000041
2005521429.tif 000042
2005521429.tif 000043
2005521429.tif 000044
2005521429.tif 000045
2005521429.tif 000046
2005521429.tif 000047
2005521429.tif 000048
2005521429.tif 000049
2005521429.tif 000050
2005521429.tif 000051
2005521429.tif 000052
2005521429.tif 000053
2005521429.tif 000054
2005521429.tif 000055
2005521429.tif 000056
2005521429.tif 000057
【図１】
2005521429.tif 000058
【図２Ａ】
2005521429.tif 000059
【図２Ｂ−１】
2005521429.tif 000060
【図２Ｂ−２】
2005521429.tif 000061
【図３】
2005521429.tif 000062
【図４】
2005521429.tif 000063
【図５】
2005521429.tif 000064
【図６】
2005521429.tif 000065
【図７】
2005521429.tif 000066
【図８】
2005521429.tif 000067
【手続補正書】
【提出日】平成16年12月20日(2004.12.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2005521429000001.app
【国際調査報告】
2005521429.tif 000068
2005521429.tif 000069
2005521429.tif 000070
2005521429.tif 000071
2005521429.tif 000072
2005521429.tif 000073
2005521429.tif 000074
2005521429.tif 000075
2005521429.tif 000076