(57)【要約】変異型のDNAポリメラーゼI（該ポリメラーゼは複製の間にエラー率を増加させる、活性ドメイン中のモチーフAおよび／またはモチーフB内の突然変異を有する）。これらの低忠実度ポリメラーゼ突然変異体を発現させるための、発現プラスミド構築物および細胞系が提供される。また、ランダムに突然変異誘発させた遺伝子（これは原核生物性又は真核生物性のものであってもよい）のライブラリを産生するために、これらの低忠実度DNAポリメラーゼI突然変異体を利用する方法が提供される。ランダム突然変異誘発は、簡便に反復させるための連続的な培養において、突然変異誘発および選択を結合させることを含み、これにより多様な範囲の塩基対置換（広く配列に沿って分布する）を生じる。いくつかの利点には、染色体DNAに対する有害なダメージの最小化、および相補性を受け入れる株への適応が含まれ、これにより酵素（変化した特性を有する）の産生および同定が実質的に促進される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然のＤＮＡポリメラーゼのミスインコーポレーション比率よりも高い比率のヌクレオチドのミスインコーポレーションを産生すると確認（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ）された、第一モチーフＡおよび第二モチーフＢを有する活性部位内の突然変異を含む、ＰｏｌＩファミリーのポリメラーゼの組換え型の突然変異体ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２】
前記天然のＤＮＡポリメラーゼはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属のＤＮＡポリメラーゼである、請求項１に記載の突然変異体ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３】
請求項１に記載の突然変異体ＤＮＡポリメラーゼであって、前記第一モチーフＡは１以上の残基で突然変異されるが、前記第二モチーフＢは突然変異されない、突然変異体ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項４】
請求項１に記載の突然変異体ＤＮＡポリメラーゼであって、前記第二モチーフＢは１以上の残基で突然変異されるが、前記第一モチーフＡは突然変異されていない、突然変異体ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項５】
請求項１に記載の突然変異体ＤＮＡポリメラーゼであって、前記第一モチーフＡおよび前記第二モチーフＢが、各々１以上の残基で突然変異された突然変異体ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項６】
請求項１に記載の突然変異体大腸菌ＤＮＡポリメラーゼであって、前記第一モチーフＡ内の突然変異がポジション７０９で生じない、突然変異体大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項７】
請求項１に記載の突然変異体大腸菌ＤＮＡポリメラーゼであって、前記第一モチーフＡ内の突然変異は、ポジション７０９で置換されるアミノ酸残基を含み、該アミノ酸残基はイソロイシンではない、突然変異体大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項８】
前記アミノ酸残基はフェニルアラニンである、請求項７に記載の突然変異体ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項９】
前記アミノ酸残基はメチオニンである、請求項７に記載の突然変異体ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１０】
前記アミノ酸残基はアラニンである、請求項７に記載の突然変異体ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１１】
前記アミノ酸残基はアスパラギンである、請求項７に記載の突然変異体ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１２】
請求項１に記載の突然変異体大腸菌ＤＮＡポリメラーゼであって、前記第二モチーフＢ内の突然変異がポジション７５６または７５９で生じない、突然変異体大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１３】
請求項１に記載の突然変異体大腸菌ＤＮＡポリメラーゼであって、前記第二モチーフＢ内の突然変異は、ポジション７５６で置換されるアミノ酸残基を含み、該アミノ酸残基はセリンではない、突然変異体大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１４】
前記アミノ酸残基はグルタミン酸である、請求項１３に記載の突然変異体ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１５】
請求項１に記載の突然変異体大腸菌ＤＮＡポリメラーゼであって、前記第二モチーフＢ内の突然変異は、ポジション７５９で置換されるアミノ酸残基を含み、該アミノ酸残基はアラニンではない、突然変異体大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１６】
前記アミノ酸残基はアルギニンである、請求項１５に記載の突然変異体ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１７】
前記アミノ酸残基はアスパラギンである、請求項１５に記載の突然変異体ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１８】
前記アミノ酸残基はプロリンである、請求項１５に記載の突然変異体ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１９】
前記アミノ酸残基はセリンである、請求項１５に記載の突然変異体ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２０】
請求項１に記載の突然変異体ＤＮＡポリメラーゼであって、ミスインコーポレーションの比率が、少なくとも１０倍高い突然変異体ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２１】
請求項１に記載の突然変異体ＤＮＡポリメラーゼであって、ミスインコーポレーションの比率が、少なくとも１００倍高い突然変異体ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２２】
請求項１に記載の突然変異体ＤＮＡポリメラーゼであって、ミスインコーポレーションの比率が、少なくとも１０００倍高い突然変異体ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２３】
前記突然変異体ポリメラーゼ内のエキソヌクレアーゼドメインが不活化された、請求項１に記載の突然変異体ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２４】
インビボで機能する、請求項１に記載の突然変異体ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２５】
インビトロで機能する、請求項１に記載の突然変異体ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２６】
請求項１に記載の突然変異体ＤＮＡポリメラーゼをコード化しているベクター。
【請求項２７】
請求項２６に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２８】
標的ＤＮＡ配列内にインビボ突然変異誘発により、ランダム突然変異を発生させるための方法であって：  
第一モチーフＡおよび第二モチーフＢを有する活性部位内に突然変異を含み、天然のＤＮＡポリメラーゼのミスインコーポレーション比率よりも高い比率のヌクレオチドのミスインコーポレーションを産生すると確認（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ）された、ＰｏｌＩファミリーのポリメラーゼの突然変異体ＤＮＡポリメラーゼ、を発現する第一ＤＮＡベクター、を有する適切な宿主細胞を提供することと；  
複製開始点の下流に位置する標的配列、をコード化している第二ＤＮＡベクター（該第二ＤＮＡベクターは、前記第一ＤＮＡベクターから発現される突然変異体ＤＮＡポリメラーゼによる突然変異誘発を受けて、標的ＤＮＡの突然変異型を産生する）、を有する前記宿主細胞を提供することと；および  
形質転換細胞を、実質的にプラスミド特異的突然変異誘発の比率を染色体突然変異誘発の比率よりも高く促進する、条件のセット下で成長させることと；  
を具備する方法。
【請求項２９】
請求項２８記載の方法であって、規定の生物学的機能を与える、突然変異した標的ＤＮＡを選択するために：  
前記形質転換細胞を選択培地（その中で生存している形質転換細胞は、規定の生物学的機能を呈するものである）と接触させることと；および  
突然変異した標的ＤＮＡを生存している形質転換細胞から分離することと；  
を具備する方法。
【請求項３０】
標的ＤＮＡ配列内にインビボ突然変異誘発により、ランダム突然変異を発生させるための方法であって：    
第一モチーフＡおよび第二モチーフＢを有する活性部位内に突然変異を含み、天然のＤＮＡポリメラーゼのミスインコーポレーション比率よりも高い比率のヌクレオチドのミスインコーポレーションを産生すると確認（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ）された、ＰｏｌＩファミリーのポリメラーゼの突然変異体ＤＮＡポリメラーゼを発現する適切な宿主細胞を産生することと；  
複製開始点の下流に位置する標的配列、をコード化しているＤＮＡベクター（該ＤＮＡベクターは、発現された突然変異体ＤＮＡポリメラーゼによる突然変異誘発を受けて、標的ＤＮＡの突然変異型を産生する）、を有する前記宿主細胞を提供することと；および  
形質転換した細胞を、実質的にプラスミド特異的突然変異誘発の比率を染色体突然変異誘発の比率よりも高く促進する、条件のセット下で成長させることと；  
を具備する方法。
【請求項３１】
請求項３０記載の方法であって、規定の生物学的機能を与える、突然変異した標的ＤＮＡを選択するために：  
前記形質転換細胞を選択培地（その中で生存している形質転換細胞は、規定の生物学的機能を呈するものである）と接触させることと；および  
突然変異した標的ＤＮＡを生存している形質転換細胞から分離することと；  
を具備する方法。
【請求項３２】
請求項２８または３０に記載の方法であって、コントロールされる前記条件のセットは：    
形質転換した細胞の培養物を、豊富な培地において成長させることと；および  
前記培養物を、成長期に到達させ且つ維持させることと；  
を含む方法。
【請求項３３】
請求項２８または３０に記載の方法であって、コントロールされる前記条件のセットを取得することは：  
形質転換した細胞の培養を、開始細胞（ｓｔａｒｔｅｒ  ｃｅｌｌｓ）の低い種菌（ａ  ｌｏｗ  ｉｎｏｃｕｌｕｍ）で開始することと；  
形質転換した細胞の培養物を、豊富な培地において成長させることと；  
前記培養物を制限温度で振盪前にインキュベートすることと；および  
前記培養物を、成長期に到達させ且つ維持させることと；  
を含む方法。
【請求項３４】
請求項２８または３０に記載の方法であって、前記標的ＤＮＡは原核生物の又は真核生物の配列に相当（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ）する方法。
【請求項３５】
請求項２８または３０に記載の方法であって、前記適切な宿主細胞は原核生物の株に相当（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ）する方法。
【請求項３６】
請求項３５に記載の方法であって、前記原核生物の株は、温度感受性のＤＮＡポリメラーゼ対立遺伝子を発現する方法。
【請求項３７】
請求項３５に記載の方法であって、前記原核生物の株は、野生型のＤＮＡポリメラーゼを内因性に発現する方法。
【請求項３８】
請求項３５に記載の方法であって、前記原核生物の株は、内因性に野生型のＤＮＡポリメラーゼを発現し、野生型のミスマッチ修復機能を呈する方法。
【請求項３９】
請求項３５に記載の方法であって、前記原核生物の株は、相補性を受け入れる遺伝的欠陥（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｅｆｅｃｔ）を保有する方法。
【請求項４０】
請求項３２または３３に記載の方法であって、前記豊富な培地はヌクレオシド  アナログを含み、前記ヌクレオチド  アナログは蛍光体（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅｓ）、化学発光体（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒｓ）、生物発光体（ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒｓ）または放射性同位体からなる群から選択される群で標識される方法。
【請求項４１】
ＤＮＡ分子内に突然変異を産生させるためのキットであって、以下を具備するキット：
容器；および  
請求項１に記載の突然変異体ＤＮＡポリメラーゼをコード化しているベクター。
【請求項４２】
請求項４１に記載のキットであって、以下を具備するキット：  
第二の容器；および  
デオキシリボヌクレオシド三リン酸または関連するアナログ。
【請求項４３】
請求項４２に記載のキットであって、前記デオキシリボヌクレオシドが標識または非標識されたキット。
【請求項４４】
ＤＮＡ分子内に突然変異を産生させるためのキットであって、以下を具備するキット：
容器；および  
請求項２に記載の突然変異体ＤＮＡポリメラーゼをコード化しているベクター。
【請求項４５】
請求項４４のベクターであって、１以上の以下に記載の突然変異体ポリメラーゼを含む、突然変異体ポリメラーゼをコード化しているベクター：  
アスパラギンをポジション７０９（これにより野生型イソロイシンが置換される）に有している突然変異体；  
フェニルアラニンをポジション７０９（これにより野生型イソロイシンが置換される）に有している突然変異体；  
アラニンをポジション709（これにより野生型イソロイシンが置換される）に有している突然変異体；  
メチオニンをポジション７０９（これにより野生型イソロイシンが置換される）に有している突然変異体；  
アルギニンをポジション７５９（これにより野生型アラニンが置換される）に有している突然変異体；  
アスパラギンをポジション７５９（これにより野生型アラニンが置換される）に有している突然変異体；  
プロリンをポジション７５９（これにより野生型アラニンが置換される）に有している突然変異体；  
セリンをポジション７５９（これにより野生型アラニンが置換される）に有している突然変異体；  
グルタミン酸をポジション７５６（これにより野生型セリンが置換される）に有している突然変異体；  
アスパラギンをポジション７０９（これにより野生型イソロイシンが置換される）に、およびアルギニンをポジション７５９（これにより野生型アラニンが置換される）に有している突然変異体；および  
フェニルアラニンをポジション７０９（これにより野生型イソロイシンが置換される）に、およびアルギニンをポジション７５９（これにより野生型アラニンが置換される）に有している突然変異体。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２００２年５月３１日に出願された、現在継続中の仮出願番号６０／３８４，９４４の優先権を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、ＤＮＡポリメラーゼＩの突然変異体及びその適用のための方法に関する、特に減少した複製の忠実度（ｆｉｄｅｌｉｔｙ）を有するように設計されたＤＮＡ  Ｐｏｌ  Ｉ突然変異体に関する、および連続培養（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｕｌｔｕｒｅ）における標的配列の修飾のためのランダム突然変異誘発（ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）において、それらを適用する方法に関する。
【政府の利益に関する陳述】
【０００３】
本発明は、国立保健研究所により授与された、助成金番号ＲＯＩ  ＣＡ  ７８８８５に基づく政府の支援の基でなされた。政府は、本発明に特定の権利を有している。
【発明の背景】
【０００４】
酵素は、日常的に薬学および生物工学に関する産業において日常的に使用されており、また化学合成およびバイオレメディエーション（ｂｉｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ）における生体触媒としての適用が増加している。自然の酵素（Ｎａｔｉｖｅ  ｅｎｚｙｍｅｓ）は、直接に産業的または医学的な適用に要求される特性をめったに（ｓｅｌｄｏｍ）有していない、というのも彼らは、特異的な機能を特定の生化学的な環境（一般に産業的および医学的な適用の化学的な環境とは異なる）内で実行するように進化してきたからである。これまで２つの一般的なアプローチを使用して、酵素の性能を変化させた。一方は詳細な構造上の情報に基づく、個々のアミノ酸残基の置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を含み、他方はランダムに置換したバリアント、または突然変異体の大きなライブラリーの産生を含む。親酵素（ｐａｒｅｎｔ  ｅｎｚｙｍｅ）に既に存在する、構造上の特性を修飾し、突然変異誘発と引き続く所望の特性を有する突然変異体の同定とにより、触媒作用および／または基質特異性の至適条件に関して、酵素性能を微調整すること（ｆｉｎｅ−ｔｕｎｉｎｇ）が可能となる。このアプローチは、複合体の生合成および分解経路の改善に、および医学的および産業的な適用に関する律速段階の克服に大きな可能性を有している。
【０００５】
部位特異的突然変異誘発とは異なり、ランダム突然変異誘発は、標的とされた酵素の構造の又は反応の機構的側面（ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ  ａｓｐｅｃｔｓ）の、従来の知識を必要としない。ランダム突然変異誘発の主な制限は、配列スペースの小さいフラクション（ｆｒａｃｔｉｏｎ）のみが効果的に探索できるということである。これは、平均的酵素におけるアミノ酸置換の可能性な組み合わせが天文学的な数（大抵のライブラリーのサイズを大きく超える）であること及び機能的に欠陥性の突然変異体が頻繁に発生すること、による。また、ランダム突然変異体ライブラリーの多様性は、遺伝暗号のエラー修正素因（ｅｒｒｏｒ−ｃｏｒｒｅｃｔｉｎｇ  ｎａｔｕｒｅ）にも拘束（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）される。タンパク質内の特定のアミノ酸残基は、１９の他の天然のアミノ酸のうちの１つで置換されるが、特定のアミノ酸をコード化するコドン内の特定の単一の点突然変異により、平均で僅か６つの異なるアミノ酸置換を生じる。これらの置換は、保存的な傾向にあり、特定のアミノ酸が類似する物理化学的な特性を有する別のアミノ酸で置換される結果となる。
【０００６】
多数の方法がインビトロでのランダムな点突然変異を誘導するために開発されており、これはＰＣＲ媒介の化学的な突然変異誘発（ＰＣＲ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）［Ｒｏｕｆａ，  Ｄ．  Ｊ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５７：  ３５７−６７  （１９９６）］から変異原性ＰＣＲ（ｍｕｔａｇｅｎｉｃ  ＰＣＲ）［Ｃａｄｗｅｌｌ，  Ｒ．  Ｃ．  ａｎｄ  Ｊｏｙｃｅ，  Ｇ．  Ｆ．，  ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．  ３：  Ｓ１３６−４０  （１９９４）］、および縮重オリゴヌクレオチドのライゲーション［Ｂｌａｃｋ，  Ｍ．  Ｅ．  ａｎｄ  Ｌｏｅｂ，  Ｌ．  Ａ．  ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５７：  ３３５−４９  （１９９６）］の範囲にわたる。これらの方法は、突然変異誘発の強度に対してある種のコントロールを提供し、非常に高い突然変異負荷（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｌｏａｄｓ）を達成できる。しかしながら、激烈（ｉｎｔｅｎｓｅ）な突然変異誘発条件下でさえも、酵素内に２または３アミノ酸を超える特定の部分配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）を、突然変異誘発により、発生させる可能性は最小（ｍｉｎｉｍａｌ）である。そのうえ、高い突然変異負荷により、欠陥性の突然変異体の割合が増加する。
【０００７】
変化した特性を有する突然変異体を発生する公算（ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ）を増加させるための１つの戦略は、突然変異誘発を標的遺伝子の領域（触媒作用に直接的に関与する）に限定することからなる［Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｄｉｖｅｒｓ．  ２：  １１１−１８  （１９９６）］。この戦略はいくつかの場合において成功したが［Ｅｎｃｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５８：  １０１３−２０  （１９９８）；  Ｇｌｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｍｂｏ  Ｊ．  ２０：  ７３０３−１２  （２００１）；  Ｐａｔｅｌ，  Ｐ．  Ｈ．  ａｎｄ  Ｌｏｅｂ，  Ｌ．  Ａ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９７：  ５０９５−１００  （２０００）；  Ｓｈｉｎｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６：  １８８３６−４２  （２００１）］、これは、タンパク質の大きな部分を未探索のまま残す結果となり、タンパク質構造および構造機能相関の実質的な知識を必要とし、活性部位の配列が近接しない又は容易に同定可能ではない場合には困難となる。
【０００８】
所望のバリアントを発見することは、一般的に大きな挑戦である。これは、真の選択（ｔｒｕｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）又はスクリーニングの何れかにより達成し得る。真の選択は、所望の活性を示すクローンに成長利点（ｇｒｏｗｔｈ  ａｄｖａｎｔａｇｅ）を与えることからなり、それゆえにインビボで実行される。前記成長利点がどのくらい強いかに依存して、選択に基づく技術を、集団中の所望のバリアントの出現を増加させるために極度に効果的にできる。選択に基づく技術は、欠陥性（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ）および不活性（ｉｎａｃｔｉｖｅ）の突然変異体を排除することにおいて付加的な利点を有する。特定の酵素特性と成長とを連関させる多くの方法が存在し、これには遺伝的相補性、栄養素要求性（ａｕｘｏｔｒｏｐｈｙ）、または薬剤抵抗性が含まれる。残念ながら、選択に基づく技術は、全ての酵素および所望の特性に関して利用可能ではない。選択に基づく技術が利用可能ではない場合、所望のバリアントをスクリーニングにより同定できる。スクリーニングは、より多用途（ｖｅｒｓａｔｉｌｅ）である（選択に基づく技術よりも）、なぜならスクリーニングは生物活性を必要としないからである。
しかしながら、スクリーニングはスループット（ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ）がより制限される。
【０００９】
選択に基づく技術が利用可能な場合、インビボ突然変異誘発により、インビトロ方法と比べて有意な利点が提供される。なぜならインビボ突然変異誘発は、即座にポジティブな遺伝的選択に関連させることが可能だからである。これにより有益な突然変異の蓄積が促進される（「定方向進化（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）」として知られる戦略）。突然変異の所望の表現型におけるポジティブ効果での段階的な選択により、我々は実験の開始時に非常に低い確率である、突然変異の組み合わせを達成することが可能である。この突然変異誘発および選択の反復性プロセス（ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  ｐｒｏｃｅｓｓ）は、突然変異誘発および選択の双方を同時にインビボで実施することにより非常に促進される。
【００１０】
特定のインビボ突然変異誘発システムの効率は、使用された細胞性の宿主（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｈｏｓｔｓ）または「変異誘発株（ｍｕｔａｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎｓ）」のタイプに優先的に依存する。また、現在利用可能な変異誘発株は、多くの理由から不十分（ｉｎａｄｅｑｕａｔｅ）である。例えば、ｍｕｔＤ５は、プルーフリーディング活性において、Ｐｏｌ  ＩＩＩ欠乏性である［Ｓｃｈｅｕｅｒｍａｎｎ，  Ｒ．  Ｈ．  ａｎｄ  Ｅｃｈｏｌｓ，  Ｈ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ  Ｓ  Ａ  ８１：  ７７４７−５１  （１９８４）］。ある種の成長条件下で、このポリメラーゼ（大腸菌における主な複製的ポリメラーゼ）により導入されたエラーにより、ミスマッチ修復の飽和（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ）および突然変異誘発における劇的な増加が生じる［Ｓｃｈａａｐｅｒ，  Ｒ．  Ｍ．  ａｎｄ  Ｒａｄｍａｎ，  Ｍ．  ，  Ｅｍｂｏ．  Ｊ．  ８：  ３５１１−１６  （１９８９）］。他の株は、ミスマッチ修復不活性化［Ｇｌｉｃｋｍａｎ，  Ｂ．  Ｗ．  ａｎｄ  Ｒａｄｍａｎ，  Ｍ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ  Ｓ  Ａ  ７７  ：１０６３−６７  （１９８０）］、またはミスマッチ修復に影響する複合的な突然変異（ｍｕｔ  Ｓ）、ｏｘｏ−ｄＧＴＰ修復活性（ｍｕｔ  Ｔ）、およびＤＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性（ｍｕｔ  Ｄ）［Ｇｒｅｅｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５７：  ３７５−８５  （１９９６）］に基づくものである。しかしながら、主要なＤＮＡ修復経路の不活性化は、これらの変異誘発株の性能を非常に制限する［Ｇｒｅｅｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ７：  １８９−９５  （１９９７）］。突然変異誘発は標的とされた配列（ｔｈｅ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に向けられたものではないので、これらの変異誘発株を培養において成長させることにより、広範な突然変異誘発が一定不変に（ｉｎｖａｒｉａｂｌｙ）生じる。これにより、生物体の適応度（ｆｉｔｎｅｓｓ）の実質的な欠損（ｌｏｓｓ）が導かれ、これは次に（ｉｎ  ｔｕｒｎ）、実施可能な効果的な反復性サイクル（ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  ｃｙｃｌｅｓ）の数を制限する［Ｆｉｊａｌｋｏｗｓｋａ，１．  Ｊ．  ａｎｄ  Ｓｃｈａａｐｅｒ，  Ｒ．  Ｍ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９３：  ２８５６−６１  （１９９６）］。また、非特異的な突然変異により、標的遺伝子における突然変異からの表現型発現が隠蔽（ｏｂｓｃｕｒｅ）［Ｌｏｎｇ−ＭｃＧｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ６８：  １２１−２５  （２０００）；  Ｎｅｇｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ４４：  ２４８５−２４９１  （２０００）］および培養における長期の継代で突然変異誘発の効率が減少［Ｇｒｅｅｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ７：  １８９−９５  （１９９７）］され得る。
【００１１】
要約すると、ランダム突然変異誘発により、酵素修飾が標的タンパク質についての最小の構造上の又は機構的な情報で可能となる、分析を必要とする突然変異体の数によりこの技術の効率が制限される。高い突然変異負荷はインビボで達成できないが、インビボ突然変異誘発をポジティブな遺伝的選択と連結することにより、効果的に分析できる突然変異体の数が拡大される。
【００１２】
特性が詳細に調査された変異誘発株が存在するが、しかし次の制限をランダム突然変異誘発による酵素修飾に関して有している、即ち：  
（１）ＤＮＡポリメラーゼおよび／またはＤＮＡ修復経路における、特定の欠陥（ｄｅｆｅｃｔｓ）への依存性；  
（２）広範な染色体突然変異誘発から及び欠陥性ＤＮＡ修復経路（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ＤＮＡ  ｒｅｐａｉｒ  ｐａｔｈｗａｙｓ）から生じる、宿主細胞の不健康な状態；  
（３）表現型の特性に基づく選択の信頼性を低くする、非特異的な染色体突然変異から生じる表現型ノイズ（ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｎｏｉｓｅ）の増加；および  
（４）長期の培養で生じる突然変異誘発率の進行性の減少（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｄｅｃｒｅａｓｅ）；である。
培養におけるランダム突然変異誘発を改善する必要性は、明らかに存在する。特に、健康的な宿主株および特定の遺伝的背景に非依存的であることが望まれる。
【発明の概要】
【００１３】
本発明の一態様は、変異性ＤＮＡポリメラーゼのＰｏｌＩファミリー内での（ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  Ｐｏｌ  Ｉ  ｆａｍｉｌｙ）設計、および対象の外因性の標的遺伝子のランダム突然変異誘発を、連続的な培養で染色体ＤＮＡの頻度を超えた頻度で実行することにおいてそれらを使用する方法に関する。様々な本発明の態様はＤＮＡポリメラーゼの設計に関し、この設計は、突然変異をそれらの活性部分内の残基に導入することによるもので、これによりポリメラーゼのエラー率が増加する。これらは集合的に「変異性ＰｏｌＩ突然変異体（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  Ｐｏｌ  Ｉ  ｍｕｔａｎｔｓ）」と称される。これらの突然変異は、モチーフＡ、またはモチーフＢの何れか片方、或いはモチーフＡおよびＢ両方に関係する（ｉｎｖｏｌｖｅ）。本発明の様々な態様の組成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）は、ＰｏｌＩ突然変異体（低忠実度を有する）の設計された部位の任意の部分をコード化しているＤＮＡ配列、ＰｏｌＩ突然変異体（低忠実度を与える、設計された部位を含有している）の任意の部分、および宿主株（これらの変異性ＰｏｌＩ突然変異体に相当する、ＤＮＡまたはポリペプチド  配列の何れかを具備する）、を含む。
【００１４】
本発明の他の態様は、これらの変異性ポリメラーゼ突然変異体を、慎重に制御された、または「至適化された（ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ）」  培養条件下で発現させて、突然変異誘発（対象の配列をコード化している外因的に導入したプラスミドを優先的に標的とする）の頻度の上昇を達成する。前記組成物および方法はランダム突然変異誘発に関して提供される。これは連続的な培養において実施され、選択工程間のプラスミド回復は無く、これにより有益な突然変異の蓄積が大きく促進される。前記組成物および方法を、標的遺伝子との相補性に適切な任意の現存している株における使用に関して容易に適用できる。というのも重大な試薬（ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｅａｇｅｎｔｓ）は形質転換可能なベクターにコード化されており、突然変異誘発は前記宿主株における任意の特定の遺伝的欠陥に依存（ｃｏｎｔｉｎｇｅｎｔ）しないからである。
【００１５】
適切な株には、野生型ＤＮＡポリメラーゼおよび／または野生型ＤＮＡ修復機能を内因的に発現している細胞が含まれる。前記組成物および方法により、広域性（ａ  ｂｒｏａｄ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ）の突然変異を任意のＤＮＡ標的配列（原核生物の又は真核生物の）に導入できる。これにより変化した特性（ａｌｔｅｒｅｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）を有するポリペプチドをコード化している配列の同定が達成される。
【発明の詳細記載】
【００１６】
本発明の態様は、集合的に「変異性ＰｏｌＩ突然変異体」と称される、Ｐｏｌ  Ｉ突然変異体の産生に対するものである。これは野生型ＤＮＡポリメラーゼを活性ドメインを形成する特定の残基において変更したものであり、これらのＰｏｌＩ突然変異体により触媒作用の間のミスインコーポレーション（ｍｉｓｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が結果的に増加する。これらの低忠実度（ｌｏｗ−ｆｉｄｅｌｉｔｙ）のＰｏｌ  Ｉ突然変異体は、生化学的反応を行う酵素を用いる、任意の産業において潜在的に有用である（係る酵素の活性における如何なる改善も望ましい）。本発明の態様は、薬学的／医学的な産業、同様に酵素依存的なプロセスに従事する任意の産業における、広範な適用に関して有用である。
【００１７】
図１Ａは、変異性ＰｏｌＩ突然変異体により媒介される、連続的な培養におけるランダム突然変異誘発アプローチの概要を示す。対象の標的遺伝子をコード化している第一ベクターおよび変異性ＰｏｌＩ突然変異体をコード化している第二ベクターを含んでいる原核生物の宿主細胞が提示される。適切な宿主細胞は、野生型Ｐｏｌ  Ｉを内因的に発現してもよい又はしなくてもよい。本発明の突然変異誘発システムを用いる、突然変異誘発および選択の反復性サイクルにより、対象の遺伝子の定方向進化（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）が生じる。
【００１８】
図１Ｂは、宿主細胞における低忠実度Ｐｏｌ  １突然変異体の発現が、インビボで発現された場合に原核生物性の宿主の染色体を実質的に修飾することなく、如何にプラスミド特異的突然変異誘発を促進するかの例を示す。示されるとおり、野生型Ｐｏｌ  ＩＩＩ（主要なＤＮＡポリメラーゼ）および温度感受性Ｐｏｌ  Ｉ活性を有する宿主細胞を２つのプラスミドで形質転換できる。突然変異誘発が制限温度（ａ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｖｅ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）で発生する場合、内因性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）の温度感受性Ｐｏｌ  Ｉを不活化できる。第一（「標的」）プラスミド内で、対象の標的遺伝子をＣｏｌＥｌ複製開始点（「ｏｒｉ」）の下流に挿入できる（それはＰｏｌ１により特異的に認識される）。第二プラスミド（「ｐＳＣ１０１  ｏｒｉ」）は突然変異体ＤＮＡポリメラーゼを発現できる。これは活性部位内が設計されており、基質ＤＮＡ（例えば、標的遺伝子を含有している前記第一プラスミド）を誤って（ｅｒｒｏｎｅｏｕｓｌｙ）複製する。ＰｏｌＩによるＤＮＡ合成は染色体中で非常に制限されているので、変異性ＰｏｌＩ突然変異体のインビボでの発現に際し、突然変異誘発は標的プラスミドに大きく限定される。
【００１９】
以下のパラグラフは、本発明の２つの一般的な態様を説明するものである（突然変異誘発システムに関する組成物、および連続的な培養によるインビボでの定方向進化を実行するための本組成物を用いる方法）。
【００２０】
突然変異誘発システムのコンポーネント  
変異性ＰｏｌＩ突然変異体に関する組成物の態様を含む、突然変異誘発システムに関して、以下の事項により次の開示が提供される、即ち：  
（１）モチーフＡおよび／またはＢ  ＰｏｌＩ突然変異体の開発およびキャラクタリゼーション、  
（２）モチーフＡおよび／またはＢ  ＰｏｌＩ突然変異体を発現するために使用できる宿主株、および  
（３）モチーフＡおよび／またはＢ  ＰｏｌＩ突然変異体が使用できる標的配列のタイプ。
これらの組成物に関する特定の実施例が、参照され、以下のセクションにおいて提供される。
【００２１】
変異性ＰｏｌＩ突然変異体の開発およびキャラクタリゼーション  
タイプＩ  ポリメラーゼは、３つの別個のドメインを有する単一ポリペプチドからなる［Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，  Ａ．  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ，  Ｔ．Ａ．，  ＤＮＡ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，  ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｖｏｌ．  １，  ｐ．９３１．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ  （１９９２）］。特に、１つのそのようなポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ポリメラーゼ）の忠実度に重大である、３残基（Ｉ６１４、Ａ６６１、およびＴ６６４）は、本発明者等により以前に同定された［Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２：  １１２２８−３５  （１９９７）；  Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６：  ５０４４−５１  （２００１）］。
【００２２】
ｄＮＴＰ結合に際して、モチーフＡおよびＢは、入ってくる（ｉｎｃｏｍｉｎｇ）ヌクレオチドを収容する（ａｃｃｏｍｍｏｄａｔｅｓ）触媒部位に、ポケットを形成することが示された。これらのモチーフにおける特定のポジションでの、ある種のアミノ酸置換はミスインコーポレーションを好む。これは活性部位腔（ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ  ｃａｖｉｔｙ）の拡大（ｅｎｌａｒｇｅｍｅｎｔ）および／またはより安定な「閉鎖（ｃｌｏｓｅｄ）」コンホメーションに起因する［Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２：  １１２２８−３５  （１９９７）；  Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６：  ５０４４−５１  （２００１）］。
【００２３】
本発明の一態様は、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのバリアント（即ち、変異性ＰｏｌＩ突然変異体）に関する。これらは活性部位（特にモチーフＡおよび／またはモチーフＢにおける）内が設計（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）されて、基質ＤＮＡ内の複製の誤りの頻度を上昇させる。図２は、モチーフＡおよびＢ内のポジション（本発明により同定および特徴づけられた）を示し、これは大腸菌ポリメラーゼの忠実度に関して重大（ｃｒｉｔｉｃａｌ）である。特に、大腸菌ＤＮＡ  ＰｏｌＩの、モチーフＡのポジションＩ７０９およびモチーフＢのポジションＳ７５６およびＡ７５９を設計して、ミスマッチした残基のインコーポレーションを増加させる。これらの突然変異体は、以下のセクションで更に記載される。変異性ＰｏｌＩ突然変異体の構築のための方法は、以下の実施例１で提供される。
【００２４】
一態様は大腸菌変異性ＰｏｌＩ突然変異体（Ｅ．  ｃｏｌｉ  ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  Ｐｏｌ  Ｉ  ｍｕｔａｎｔｓ）に関する。該突然変異体はアミノ酸置換をモチーフＡおよび３’→５’エキソヌクレアーゼドメインの双方において保持（ｂｅａｒｉｎｇ）し、標的ＤＮＡの複製の間のミスインコーポレーションの頻度の上昇を呈する。
【００２５】
モチーフＡ突然変異体は、野生型アスパラギン酸（Ｄ）をポジション４２４でアラニン（Ａ）で置換することにより変化させられて、プルーフリーディングに必須のエキソヌクレアーゼ機能が不活性化された。図２はモチーフＡ突然変異体の例を提供する。該突然変異体はエキソヌクレアーゼ活性を欠損し、これにはＤ４２４Ａ  Ｉ７０９ＮおよびＤ４２４Ａ  Ｉ７０９Ｆ突然変異体（該突然変異体において、野生型イソロイシン（ポジション７０９）がアスパラギン（Ｎ）、またはフェニルアラニン（Ｆ）で置換されている）が含まれる。これらの２つの突然変異体の生化学的なキャラクタリゼーションは、本発明者により行われた。また、彼らの仕事を記載している次の文献は、参照によって本明細書中に援用される［Ｓｈｉｎｋａｉ，  Ａ．  ａｎｄ  Ｌｏｅｂ，  Ｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６：  ４６７５９−６４  （２００１）］。これらの変異性ＰｏｌＩ突然変異体（活性部位のモチーフＡにおいて１以上の突然変異を保持する）は、インビトロおよびインビボの双方での鋳型複製の間に、より頻繁にエラーを生じる、それゆえインビトロおよびインビボにおいて使用し得る。
【００２６】
別の態様は大腸菌変異性ＰｏｌＩ突然変異体に関し、該突然変異体は突然変異をモチーフＢおよび３’→５’エキソヌクレアーゼドメインの双方において保持し、標的ＤＮＡの複製の間のミスインコーポレーションの頻度の上昇を生じる。モチーフＢ突然変異体は、野生型アスパラギン酸（Ｄ）をポジション４２４でアラニン（Ａ）に置換することにより変化させられて、プルーフリーディングに必須のエキソヌクレアーゼ機能が不活性化された。図２はモチーフＢ突然変異体の例を提供する。該突然変異体はエキソヌクレアーゼ活性を欠損し、これにはＤ４２４Ａ  Ｓ７５６ＥおよびＤ４２４Ａ  Ａ７５９Ｒ突然変異体〔該突然変異体において、野生型セリン（Ｓ）（ポジション７５６における）がグルタミン酸（Ｅ）で置換され、野生型アラニン（Ａ）（ポジション７５９における）がアルギニン（Ｒ）で置換される〕が含まれる。これらの変異性ＰｏｌＩ突然変異体（活性部位のモチーフＢにおいて１以上の突然変異を保持する）は、インビトロおよびインビボにおいて使用し得る。
【００２７】
更なる態様は大腸菌変異性ＰｏｌＩ突然変異体に関し、該突然変異体はアミノ酸置換をモチーフＡおよびモチーフＢの双方において保持し、標的ＤＮＡの複製の間のミスインコーポレーションの頻度の高度な上昇を呈する。これらのモチーフＡおよびＢ突然変異体は、彼らの３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を、野生型アスパラギン酸（Ｄ）（ポジション４２４）をアラニン（Ａ）で置換することにより変化させられて、不活性化された。しかし、この修飾は、これらの突然変異体の突然変異誘発に有意な影響力を有していないように思われる（表２を参照）。図２は、モチーフＡおよびモチーフＢにアミノ酸置換を保有（ｃａｒｒｙｉｎｇ）している、変異性ＰｏｌＩ突然変異体の例を提供する。１つの係る突然変異体は「Ｄ４２４Ａ  Ｉ７０９Ｎ  Ａ７５９Ｒ」である。該突然変異体において、野生型イソロイシン（Ｉ）（ポジション７０９における）がアスパラギン（Ｎ）で置換され、野生型アラニン（Ａ）（ポジション７５９における）がアルギニン（Ｒ）で置換される。両方のモチーフにおける別の突然変異体は「Ｄ４２４Ａ  Ｉ７０９Ｆ  Ａ７５９Ｒ」と称される。該突然変異体において、野生型イソロイシン（Ｉ）（ポジション７０９における）はフェニルアラニン（Ｆ）で置換され、野生型アラニン（Ａ）（ポジション７５９における）はアルギニン（Ｒ）で置換される。これらの変異性ＰｏｌＩ突然変異体（活性部位の各モチーフＡおよびモチーフＢにおいて単一もしくはそれ以上のアミノ酸置換を保持する）は、インビトロおよびインビボにおいて使用し得る。
【００２８】
付加的な態様は、上記で議論したモチーフＡおよびＢを保有している大腸菌変異性ＰｏｌＩ突然変異体、およびモチーフＡおよびモチーフＢ突然変異の組み合わせに関し、これにはＰｏｌＩファミリーのＤＮＡポリメラーゼの他のメンバー（黄色ブドウ球菌、肺炎連鎖球菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ、または腸炎菌を含む）中に設計し得る相同突然変異（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）が含まれる。
【００２９】
変異性ＰｏｌＩ突然変異体により媒介される突然変異誘発に使用される宿主株における非制限的な選択（Ｕｎｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）  
変異体  モチーフＡおよび／またはモチーフＢ  ＰｏｌＩ遺伝子の発現に適切な宿主は、不活化されたＤＮＡ修復機構を有する株に又は欠陥性の染色体性ＰｏｌＩ（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ＰｏｌＩ）を有する株に限定されない。それゆえ、前記突然変異誘発システムは、想像可能（ｉｍａｇｉｎａｂｌｅ）な種々の株に独自に（ｕｎｉｑｕｅｌｙ）適合性（ａｄａｐｔａｂｌｅ）である。内因性の野生型ＰｏｌＩ活性を有する又は有さない細胞を用いた様々な態様を使用して変異誘発因子（ｍｕｔａｔｏｒｓ）を発現し得る。
【００３０】
他の態様は、不活化されたＤＮＡ修復機構を有する又は有さない株に関する。変異性ＰｏｌＩ発現により媒介される突然変異誘発を支持する、適切な細胞環境を提供し得る宿主株の例には、大腸菌株（例えば、ＪＳ２００およびＸＬ１−Ｂｌｕｅ）が含まれる。ＪＳ２００株は、ＰｏｌＩの温度感受性の対立遺伝子（ｐｏｌＡ１２）を染色体に有する株を代表する（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ）ものである［Ｍｏｎｋ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｋｉｎｒｏｓｓ，  Ｊ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１０９  ：  ９７１−７８  （１９７２）］。ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株は、内因性の野生型ＰｏｌＩ活性を有し、ＤＮＡ修復に実質的に熟達した株を代表する（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ）ものであり、それゆえ外因性の変異性ＰｏｌＩ突然変異体の共発現を支持することができる。別の態様は多くの存在する株に関し、その株は特定の酵素（この酵素は機能的に相補できる）に欠陥があり、このことにより前記システムの探索が完全な程度（ｆｕｌｌｅｓｔ  ｅｘｔｅｎｔ）まで可能となる。
【００３１】
インビボで使用される場合、モチーフＡおよび／またはモチーフＢアミノ酸置換の何れかをコード化している変異性ＰｏｌＩ突然変異体を、原核生物宿主へと、環状ベクター（例えば、プラスミド）の一部として又は直鎖状の形態（例えば、細菌性ファージにおける）で導入できる。一態様において、モチーフＡおよび／またはモチーフＢ  ＰｏｌＩをコード化しているビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）は、非統合形態（ａｎ  ｕｎｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｆｏｒｍ）で残存（ｒｅｍａｉｎ）していてもよい（例えば、外因性プラスミドとして）。別の態様において、単一の又は複数のコピーの遺伝子（該遺伝子はモチーフＡおよび／またはモチーフＢ  変異誘発因子配列の任意の部分をコード化している）は、原核生物宿主の染色体へと統合され、これにより変異誘発性の（ｍｕｔａｔｏｒ）原核生物の株または細胞系（ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ）の安定株（ｓｔａｂｌｅ  ｌｉｎｅｓ）が発生する。
【００３２】
安定な変異誘発性の細胞系を発生させることに関する一例を以下に記載する。
【００３３】
低忠実度の変異体をコード化しているＰｏｌＡ１座位の３０００ｂｐからなる二重鎖のＤＮＡ断片（これは５’および３’側に約１０００ｂｐの天然のゲノム配列が隣接したものである）を、温度感受性の複製開始点を有するプラスミドにサブクローニングできる。クロラムフェニコールを、マーカーとしてポジティブ選択に使用できる。また、スクロースをネガティブ選択に使用できる。例えば、生じるプラスミドを使用して、ＪＳ２００細胞を形質転換できる、またクロラムフェニコール耐性を３０℃での許容状態（ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）下で選択できる。培養を３７℃に切り替えて、プラスミド複製を温度感受性ＰｏｌＩ対立遺伝子によりブロックすることが可能である。これらの条件は、劇的な成長利点を、変異性ＰｏｌＩ突然変異体がその染色体中に統合された細胞に対して与え、３７℃で成長する大抵のコロニーがＰＣＲにより確認できる安定な統合体（ｉｎｔｅｇｒａｎｔｓ）であることが予想される。この方法が望ましい結果を生じない場合、スクロースを選択工程で添加して、プラスミドの存在に関して積極的に選択することが可能である。当業者により現在実施される、対立遺伝子置換（ａｌｌｅｌｉｃ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）を発生させるための、いくつかの他の方法が意図される。
【００３４】
変異性ＰｏｌＩ突然変異体により媒介される突然変異誘発に使用される標的ＤＮＡにおける非制限的な選択  
インビボ突然変異誘発システムは、複数の適切な鋳型を意図（ｃｏｎｔｅｍｐｌａｔｅｓ）する（図３に図示される）。一態様として、標的とされた（ｔａｒｇｅｔｅｄ）鋳型は、完全長（ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ）のタンパク質又はその任意の断片をコード化している原核生物遺伝子（図３Ａ）であってもよい。
【００３５】
別の態様として、標的とされた鋳型は真核生物遺伝子（図３Ａ）であってもよく、該真核生物遺伝子はｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ（イントロンなしの）、又はその任意の断片の形態であってもよい。例えば、任意のこれらの形態における真核生物遺伝子を、原核生物株（内因的に温度感受性の又は野生型Ｐｏｌ１を発現する）に外因的に導入し、非忠実（ｕｎｆａｉｔｈｆｕｌｌｙ）に複製してもよい。引き続いて、突然変異した真核生物ＤＮＡのライブラリを、それらの原核生物宿主から、例えば、プラスミド調製のための又はファージ回収のための従来の方法を用いることにより分離してもよい。一度プラスミドライブラリが単離されたら、それを１以上のエンドヌクレアーゼによる制限酵素消化に供試してもよい（該エンドヌクレアーゼは、対象の標的とされた遺伝子を前記ベクターから解離させるために、分子生物学の当業者に商業的に利用可能なものである）。
【００３６】
これはゲル電気泳動を用い、形態およびサイズの差に基づいてＤＮＡ断片を分離することにより容易に実施できる。単離および再精製（ｒｅｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）に際し、遺伝子ライブラリを真核生物発現ベクターへのサブクローニングに使用し得る。対象の標的遺伝子を、真核生物細胞または従来の細胞系へと形質転換して、所望の性質または機能に関して選別してもよい。当業者の範囲内の、ＤＮＡを操作するための他の手順も意図される。一例として、χ２９１３ｒｅｃＡ株（この株はチミジンシンターゼ（ΔｔｈｙＡ５７２）に欠陥がある）を、ｏｒｉの下流に配置されるヒトＴＳ  ｃＤＮＡをコード化しているベクターおよび変異性ＰｏｌＩ突然変異体を発現するベクターで共形質転換してもよい。
【００３７】
選択は、５−フルオロウラシル（「５ＦＵ」）（チミジンシンターゼ（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）の強力な阻害物質）の増加濃度の存在下で実施し得る。５ＦＵに対する抵抗性が増加したクローンを分離できる。また、それらの突然変異を当業者により利用される材料および方法を用いることにより特徴づけることが可能である［Ｌａｎｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６１：  ６６６−７２  （２０００）］。
【００３８】
ＰｏｌＩ変異誘発因子によるインビボ突然変異誘発に供試される鋳型は、環状形態（例えば、プラスミド）で、または直鎖状形態で搬送（ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ）し得る。一態様において、鋳型を、ファージゲノム物質（ｐｈａｇｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｍａｔｅｒｉａｌ）を１つの変異性ＰｏｌＩ突然変異体を発現する原核生物宿主へと注射できるバクテリオファージにより搬送し得る。
【００３９】
バクテリオファージが複製に関してＰｏｌＩに依存する場合（例えば、ＲＮＡｓｅＨ欠乏性のバックグラウンドにおけるバクテリオファージＴ４［Ｈｏｂｂｓ，  Ｌ．  Ｓ．  ａｎｄ  Ｎｏｓｓａｌ，  Ｎ．  Ｇ．  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７８：  ６７７２−６７７７  （１９９６）］）、宿主におけるウイルス性の複製が鋳型の増幅（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）および突然変異誘発を生じて、突然変異体のライブラリが産生される。別の態様として、標的とされた遺伝子（ｓ）をＰｏｌ１依存的プラスミドに外因的に導入できる、それにはプラスミド  ＣｏｌＥｌ、ｐＢＲ３２２、ｐ１５Ａ、ｐＭＢ、ｐＮＴ７、ｐＶＨ５１、ＲＳＦ１０３０、ＣｌｏＤＦ１３、ＣｏｌＥ２、ｐＬＭＶ１５８、ｐＬＳ１、及びそれらの派生物（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）が含まれる。
【００４０】
標的プラスミドは、変異性ＰｏｌＩ突然変異体（Ｐｏｌ１非依存性の）をコード化しているプラスミドとは別個（ｄｉｓｔｉｎｃｔ）である。その最も単純な形態において、前記システムは、１つのプラスミド（変異性ＰｏｌＩ突然変異体をコード化している）および別のプラスミドまたはファージ（標的とされた遺伝子をコード化している）を含む。当業者に知られ且つ実施される遺伝子搬送（ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）の他の方法は、これらの態様に含まれる。
【００４１】
酵素修飾に関する変異性ＰｏｌＩランダム突然変異誘発の効力（ｅｆｆｉｃａｃｙ）の例として、βラクタマーゼ遺伝子（「ＴＥＭ−１」）のアイソフォーム（何らかの原核生物性の又は真核生物性の遺伝子に代えて、仮定上の対象の遺伝子を代表する）を、プラスミドに、インビボ突然変異誘発に対する標的として挿入した（以下に提供される実施例２に記載される）。変異性ＰｏｌＩ発現に関連するインビボ突然変異誘発の頻度を測定するため、以下に記載されるβラクタマーゼの復帰アッセイ（ｒｅｖｅｒｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ）を使用できる。図３Ｂに説明されるように、β−ラクタマーゼ遺伝子を鋳型プラスミドに、ｏｒｉのポジションから（即ち、ＣｏｌＥｌプラスミドの複製の起点から）増加間隔（ａｎ  ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｃｅ）で挿入した（「ｐＬＡ２３０」、「ｐＬＡ７００」、「ｐＬＡ１４００」、「ｐＬＡ２８００」、および「ｐＬＡ３７００」）。全ての構築物において、オーカー（ｏｃｈｒｅ）終止コドン（ＴＡＡ）により、ＴＥＭ−１  β−ラクタマーゼ遺伝子の翻訳開始から２６コドン下流のグルタミン酸（ＧＡＡ）が置換される。例えば、レポータープラスミドｐＬＡ２３０において、オーカー終止コドンはｏｒｉの約２３０ｂｐ下流に配置される。オーカー終止コドン内の大抵の突然変異は、アミノ酸をコード化しているコドンへの復帰を発生し、そしてβ−ラクタマーゼ発現を許容し、突然変異はカルベニシリン耐性コロニーとして計数できる。これらは、これらのコロニーから分離されたプラスミドをシークエンシングすることにより確認し得る。ＣｏｌＥｌプラスミド配列における変異性ＰｏｌＩの変異原性効果（ｍｕｔａｇｅｎｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ）を評価して、変異性ＰｏｌＩを発現している細胞におけるオーカー復帰の頻度と野生型ＰｏｌＩを発現している細胞における前記頻度とを比較できる。染色体ＤＮＡ内の突然変異頻度を確認（ｅｓｔａｂｌｉｓｈ）するために、リファンピシン抵抗性（染色体にコード化されるＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩ遺伝子における点突然変異から発生する）を評価し得る［Ｏｖｃｈｉｎｎｉｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  １９０：  ３４４−３４８  （１９８３）］。
【００４２】
β−ラクタマーゼ遺伝子をインビボ突然変異誘発に、アズトレオナムの増加濃度（ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ）が存在する条件下で供試して、アズトレオナムのβ−ラクタマーゼ基質認識を改善する突然変異を選択する。β−ラクタマーゼのＴＥＭ−１アイソフォームは、最も頻繁に発生するβ−ラクタマーゼであり、グラム陰性の臨床分離株中に発見される。これはアミド結合加水分解（ａｍｉｄｅ−ｂｏｎｄ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）によるβラクタムの触媒的分解（ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）において機能する［Ｗｉｅｄｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ２４Ｓｕｐｐｌ．  Ｂ：  １−２２  （１９８９）］。β―ラクタマーゼの触媒効力（ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）は、基質として使用されたβ−ラクタムに依存して、非常に変化する。β−ラクタマーゼはペニシリンを高効率で分解するが、β−ラクタマーゼによるセファロスポリンの加水分解は不十分（ｐｏｏｒ）であり、より新しい広範囲スペクトル抗生物質に対しては残効性（ｒｅｓｉｄｕａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）のみを有している。広範囲スペクトル抗生物質（Ｅｘｔｅｎｄｅｄ−ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）は、アズトレオナムおよび第三世代のセファロスポリン（例えば、セフォタキシムおよびセフタジジム）を含み、これらは特異的にデザインされて、β−ラクタマーゼによる認識が最小化されるバルキー付加物（ｂｕｌｋｙ  ａｄｄｕｃｔｓ）を保有するものである。図４は、これらβ−ラクタム基質の各々の代表の構造を説明する（ペニシリン、セファロスポリン、およびアズトレオナムを含む）。アズトレオナムは、実施例４および７において選択剤（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）として使用された。
【００４３】
β−ラクタマーゼの進化（診療所における広範囲スペクトル抗生物質の広範な使用における圧力下で自然に生じる）［Ｍｅｄｅｉｒｏｓ，  Ａ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  ２４Ｓｕｐｐｌ．  １：  Ｓ１９−４５  （１９９７）に論評される］を、研究室でシミュレートできる［Ｌｏｎｇ−ＭｃＧｉｅ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ６８：  １２１−５  （２０００）；  Ｚａｃｃｏｌｏ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｇｈｅｒａｒｄｉ，  Ｅ．，  Ｊ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２８５：  ７７５−８３  （１９９９）；  Ｏｒｅｎｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ８：  ２３８−４２  （２００１）］。臨床分離株および研究室での選択から、少なくとも２つの特定のアミノ酸置換が、広範囲スペクトルβ−ラクタムに対する実質的な抵抗性に対して必要であることが知られている［Ｋｎｏｘ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈ．  ３９：  ２５４３−２６０１  （１９９５）に論評される］。抵抗性の突然変異は、全体で３７の異なるポジションで同定されており、これらはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌａｈｅｙ．ｏｒｇ／ｓｔｕｄｉｅｓ／ｔｅｍｔａｂｌｅ／ｈｔｍにリストされている。これらの突然変異は、大きく２つのカテゴリーに分類される、即ち：  突然変異の１つのグループ〔Ｒ１６４  Ｓ／Ｈ（アルギニンからセリンまたはヒスチジン）およびＧ２３８Ｓ（グリシンからセリン）を含む〕は、活性部位の近くで発生し、β−ラクタマーゼ酵素の触媒効力を増加させる。
【００４４】
Ｅ１０４Ｋ（グルタミン酸からリジン）およびＭ１８２Ｔ（メチオニンからスレオニン）を含む第二のグループに属する突然変異は、典型的には活性部位から離れて位置する。それらは、触媒部位における突然変異に応答して選択される可能性が最も高く、これらの突然変異から生じる不安定効果（ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔｓ）を抑制する［Ｐｅｔｒｏｓｉｎｏ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ８：  ３２３−３２７  （１９９８）］。
【００４５】
β−ラクタマーゼ遺伝子の突然変異誘発（アズトレオナム選択と連結した）を選択することにより、酵素修飾に関する変異性ＰｏｌＩランダム突然変異誘発の使用が確証（ｖａｌｉｄａｔｅ）された。以下の２つの考慮が、標的の選択において重大であった、即ち：
【００４６】
（１）臨床分離株および研究室における選択の研究により確立されたこと、即ちβ−ラクタマーゼ遺伝子を突然変異を介してアズトレオナムを基質として認識するよう修飾できること；および（２）少なくとも２つの特異的なアミノ酸置換が、実質的なアズトレオナム抵抗性を達成するために必要であること、である。このことにより自発性（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ）の突然変異が一因となる潜在的なバックグラウンドが減少する。というのも、それらが１を超えるアミノ酸置換を発生することは非常にありそうもない（その頻度は低いため（ＪＳ２００細胞において１０−７））ためである。
【００４７】
変異性ＰｏｌＩ突然変異体により媒介される標的ＤＮＡのインビボ突然変異誘発に関する方法（選択またはスクリーニングとの組み合わせ）
変異性ＰｏｌＩ突然変異体により媒介されるインビボ突然変異誘発を実行するために具現化された方法に関連して、以下は次の開示を提供する：  （１）連続的な培養における変異性Ｐｏｌ１媒介性の突然変異誘発の利点および適用、および（２）至適化された培養条件のパラメーター。これらの態様に関する特定の実施例が、参照され、以下のセクションにおいて提供される。
【００４８】
酵素修飾のための培養における変異性Ｐｏｌ１媒介性の突然変異誘発の利点および適用
ランダム突然変異誘発の方法（選択またはスクリーニングが引き続く）により、酵素の配列、構造、および機能的なスペースの連続的な探索が、詳細な機構的な又は構造上の情報がない条件下で可能である［Ｓｋａｎｄａｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  ４：  ８８９−９８  （１９９７）］。突然変異誘発および選択／スクリーニングを反復性の様式（ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  ｆａｓｈｉｏｎ）で反復し得る。これは配列スペース（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｐａｃｅ）が、「定方向進化（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）」と称されるアプローチにおいて、性能を改善する変化に対して方向付けられるように行われる。突然変異誘発および選択を、同時に連続的な培養において実行することにより、選択工程間で標的ＤＮＡを回収する必要性が回避される。
【００４９】
定方向進化により、配列スペースの小さいフラクションのみがなお探索（ｅｘｐｌｏｒｅｓ）される。従って、至適な溶液（ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）を達成すること又は新しい触媒機能を進化させることはなさそうである。
【００５０】
配列における大きな跳躍（Ｌａｒｇｅｒ  ｌｅａｐｓ）は、活性に関して前選別（ｐｒｅｓｃｒｅｅｎｅｄ）された突然変異体のライブラリー内の又は酵素のファミリー内の、配列のシャッフリングにより達成することが可能である［Ｓｍｉｔｈ，  Ｇ．  Ｐ．  ，  Ｎａｔｕｒｅ．  ３７０：  ３２４−５  （１９９４）；  Ｃｒａｍｅｒｉ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ．  ３９１：  ２８８−９１  （１９９８）］。一態様において、本発明は、これらのシャッフリング技術と組み合わせて使用することも可能である。変異性ＰｏｌＩ突然変異体は、インビトロおよびインビボにおける、これらのシャッフリングのプロセスの間に、付加的な突然変異を産生し得る。
【００５１】
本発明の変異性ＤＮＡポリメラーゼは、医学的分野において、薬剤開発および遺伝子治療の双方において潜在的な適用を有している。例えば、ランダム突然変異誘発は、癌の管理（ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ）に関して修飾された酵素の産生を助けて（ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｌ）いる［Ｅｎｃｅｌｌ  Ｌ．Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １７：  １４３−７  （１９９９）］。
【００５２】
これらは、癌治療の副作用を減少させるよう設計された突然変異体および改善されたプロドラッグ活性化特性（ｐｒｏ−ｄｒｕｇ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）を有する突然変異体を含む。前者の例には、次の事項が含まれる：  ５−フルオロウラシル（５−ｆｌｏｕｒｏｕｒａｃｉｌ）に対するチミジル酸シンターゼ耐性；アルキル化薬に対する及び６−ベンゾグアニン（６−ｂｅｎｚｏｇｕａｎｉｎｅ）に対する６−メチルグアニン−メチルトランスフェラーゼ耐性；およびメトトレキセートに対するジヒドロ葉酸レダクターゼ耐性。後者の例には、ガンシクロビル（ｇａｎｃｙｃｌｏｖｉｒ）またはアシクロビル（ａｃｙｃｌｏｖｉｒ）に対して増強された特異性を有するチミジル酸キナーゼ、Ａｒａ−Ｃに対して特異的なデオキシシチジン−キナーゼ突然変異体、および５−フルオロシトシン（５−ｆｌｕｏｒｏｃｙｔｏｓｉｎｅ）に対して特異的なシトシンデアミナーゼ（ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ｄｅａｍｉｎａｓｅ）が含まれる。
【００５３】
また、本発明の変異性ＰｏｌＩ突然変異体は、ランダム突然変異誘発による酵素修飾の促進において潜在的な適用を有しており、その領域は化学合成、バイオレメディエーション、および食物加工（ｆｏｏｄ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）のように多岐にわたる［Ｃｈｉｒｕｍａｍｉｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２２４：  １５９−６８  （２００１）；  Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｄａｎｎｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １７：  １３５−６  （１９９９）に論評される］。本発明のＰｏｌＩ突然変異体を使用して、変更された基質特異性を有する酵素を作出でき、これには変更された、エステラーゼ、リパーゼ、チトクロムオキシダーゼ、およびジオキシゲナーゼ、および非天然環境（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ）（例えば、アルカリ性条件、高温（ｈｅａｔ）、低温（ｃｏｌｄ）、および／または金属キレーターの存在）において改善された触媒作用を有する酵素が含まれる。例えば、ＰｏｌＩ突然変異体を使用して、変更された基質特異性を有する酵素を作出し、化学合成の効率および鏡像異性上の純度（ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｉｃ  ｐｕｒｉｔｙ）を改善し得る。高温に対して及び金属キレーターの存在に対して抵抗性の酵素を、変異性ＰｏｌＩ突然変異誘発により取得して、化学合成における生体触媒（ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ）の速度（ｒａｔｅｓ）を改善し得る。また、ＰｏｌＩ突然変異体を使用して、クリーニング店において色素の分解に対するアルカリ条件への抵抗性を与える、又は食物加工の適用において低温条件への抵抗性を与える、酵素を産生し得る。
【００５４】
本発明は、新たに出現した分野（ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｆｉｅｌｄｓ）における、予知可能な（ｆｏｒｅｓｅｅａｂｌｅ）適用を有し、これには生物工学、遺伝子治療、およびバイオレメディエーションが含まれる。ＤＮＡ特異的な試薬（例えば、リコンビナーゼおよび制限酵素）による基質認識のカスタマイゼーション（ｃｕｓｔｏｍｉｚａｔｉｏｎ）［Ｂｕｃｈｈｏｌｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １９：  １０４７−５２  （２００１）；  Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ  Ｓ  Ａ，  ９９：  ４１８５−９０（２００２）］、またはアルカン分解（ａｌｋａｎｅ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）に関する酵素の改善［Ｂｅｌｈａｊ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｅｓ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １５３：  ３３９−３４４  （２００２）］は、本発明の態様の使用により利益を得られる、新たに出現した領域の２例である。
【００５５】
至適化された培養条件下でのインビボ突然変異誘発および選択／スクリーニング  
対象の配列を標的にできる、増強された突然変異誘発を発生させるための方法が提供される。ここで、モチーフＡおよび／またはＢにアミノ酸置換を保持する変異性ＰｏｌＩ突然変異体（例えば、ポジションＩ７０９Ｎ／ＦおよびＡ７５９Ｒでのアミノ酸置換を含む）は、宿主株において、慎重にコントロールされた培養条件下で発現される（以下の実施例２に記載）。一態様において、前記方法は、原核生物性の宿主株を発現ベクター（該発現ベクターは、１以上の変異性ＰｏｌＩ突然変異体をコード化する、任意の多数の形態を有する）で形質転換することと、および第二ベクター（例えば、１以上の標的遺伝子をコード化するプラスミド）を形質転換することと、を含む。別の態様において、前記方法は、変異性ＰｏｌＩ突然変異体をコード化する、１以上のコピーの遺伝子または断片を、細胞系または宿主株の染色体内に導入することと、および引き続いて、前記突然変異体を発現している細胞の集団を、ベクター（例えば、１以上の標的遺伝子をコード化するプラスミド）で形質転換することと、を含む。一態様において、コントロールされた条件は、形質転換された細胞の培養物を、豊富な培地（ｒｉｃｈ  ｍｅｄｉａ）中で成長させることと、および培養物を固定された成長期（ａ  ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ  ｇｒｏｗｔｈ  ｐｈａｓｅ）（例えば、接種後の１５時間に得られる成長ステージ）に至らせ且つ維持（ｒｅａｃｈ  ａｎｄ  ｍａｉｎｔａｉｎ）することと、を含む。好適な態様として、変異性ＰｏｌＩが至適な変異原性の性能を達成する培養条件は：（１）形質転換された宿主株培養物を、指数的増加（例えば、ＯＤ６００〜０．５）の細胞密度指標（ａ  ｃｅｌｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｉｎｄｉｃａｔｉｖｅ）で成長させることと；（２）前記培養物を低濃度（例えば、１：１０５）に、栄養分豊富な培地（例えば、２ＸＹＴ）を３７℃で予熱した培地中で希釈することと；（３）前記培養物を付加的な時間（例えば、１５分間、３７℃で）インキュベートすることと；および（４）前記培養物を３７℃振盪機に配置して、飽和点（例えば、１５時間）に至らせることと、を含む。
【００５６】
別の態様として、変異性ＰｏｌＩ突然変異体を使用して、標識プラスミドＤＮＡ又はその断片をインビボで産生し得る。例えば、１以上の標識ヌクレオチドまたはヌクレオシド  アナログを前記培養基（ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍ）に添加して、標的プラスミドＤＮＡ（ｔａｒｇｅｔ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ）を複製したコピーへと導入させ得る。関連した態様として、変異性ＰｏｌＩ突然変異体を、細胞抽出物から組換え型タンパク質として精製し、そしてマイクロアレイ分析または他のハイスループットなＤＮＡ標識化手順のための或いはシークエンシング目的のための標的配列を含有しているインビトロ反応へと添加し得る。修飾されたデオキシヌクレオシド三リン酸（「ｄＮＴＰｓ」）またはヌクレオチド  アナログには、ｄＡＴＰｓ、ｄＧＴＰｓ、ｄＣＴＰｓ、ｄＴＴＰｓ、ｄＵＴＰｓ、およびｄＩＴＰｓが含まれる。また、関連するアナログを、任意の組み合わせでインビトロＤＮＡ重合反応に添加し得る［Ｇｌｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３３  （５）：  １１３６−４２  （２００２）］。これらのヌクレオチドおよびヌクレオシドを、蛍光（ローダミン緑色、フルオレッセイン）、化学発光（ビオチン）、または放射能（γ［３２Ｐ］）による検出のための基（ｇｒｏｕｐｓ）を共有結合性に付着（ｃｏｖａｌｅｎｔ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）させることにより修飾し得る。前記ヌクレオシドおよびヌクレオチド  アナログは、当業者に既知の方法で合成し得る。
【００５７】
提供された組成物および方法を用いると、モチーフＡおよび／またはモチーフＢに突然変異を保持する変異性ＰｏｌＩ突然変異体は突然変異誘発の頻度を増加させる、この突然変異誘発の頻度は４および５桁分、野生型ＰｏｌＩの頻度よりも大きく、４００倍までの差を染色体に比例して有している（以下に提供される実施例３に示される）。前記組成物および方法により、ｏｒｉから離れて位置するヌクレオチド（以前に研究者によって報告された４００ｂｐの限度をはるかに超える、３７００ｂｐの距離を含む）をターゲティング（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）する突然変異誘発が可能となる。従って、多様な原核生物及び真核生物の遺伝子を、本発明により標的化し得る。
【００５８】
本発明の組成物および方法は、対象の配列のターゲティングを可能にし、多様な突然変異スペクトル（ａ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ）および広い分布の突然変異（ａ  ｗｉｄｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）を生じる（以下に提供される実施例４に示される）。本発明の突然変異誘発システムは、現存の変異誘発株（ｍｕｔａｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎｓ）に関連して、付加的な利点を提供する。結果的に、本発明の一態様が代表する突然変異誘発システムは、異なる株に容易に適用され得る（以下に提供される実施例６に示される）。適切な宿主株は以下を含む：  （１）内因的に温度感受性のＤＮＡ  ＰｏｌＩ対立遺伝子を発現する株、（２）野生型ＤＮＡポリメラーゼ；および（３）野生型ＤＮＡｐｏｌおよび野生型ＤＮＡ修復表現型の双方。ランダム突然変異誘発を達成させる、多様な株において変異性ＰｏｌＩの至適な発現レベルを調整するために、誘導性のプロモータを使用し得る。インビボ突然変異誘発システムの他の態様は多数の現存の株に関し、これらの株は、特定の酵素に欠陥がある及び相補性を受け入れることが知られる株である（例えば、上記のチミジンシンターゼに欠陥のあるχ２９１３ｒｅｃＡ株）。
【００５９】
前記組成物および方法の態様は、標的遺伝子内の有益な突然変異の蓄積を可能とする（連続培養において）。アズトレオナムの濃度を増加することによる２つの独立した選択を、至適化した変異原性条件（ｍｕｔａｇｅｎｉｃ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）下で実施して、各選択からβ−ラクタマーゼバリアントを提示している２３配列を取得した（以下に提供される実施例４および７に示される）。２つの既知のアミノ酸置換が、これらの選択において同定された、即ち：  Ｅ１０４Ｋ（グルタミン酸がリジンにポジション１０４で変化した）およびＲ１６４Ｈ（アルギニンがヒスチジンにポジション１６４で変化した）が選択１において及びＳへの変化（アルギニンがセリンにポジション１６４で変化した）が選択２において。加えて、新規の変異、Ｇ２６７Ｒ（グリシンがアルギニンにポジション２６７で変化した）が、選択１において同定された。前記突然変異は、Ｇ２６７Ｒ突然変異（Ｅ１０４ＫおよびＲ１６４Ｈ突然変異に引き続いた）により例示されたとおり、この系において経時的（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｌｙ）に発生し得る。これはサイレント突然変異をコード化する単一のクローンにおいて発見され、該サイレント突然変異はシークエンシングされたＥ１０４ＫおよびＲ１６４Ｈ突然変異を保有している全ての他のプラスミドにも存在している。他のサイレント突然変異はみつからなかった。実施例７における表４は、ベクターへのサブクローニング後の、これらのアミノ酸置換の異なる組み合わせに対応するアズトレオナム表現型を示す（これらは変異性ＰｏｌＩ突然変異体により複製されず、他の突然変異が存在しなかったことを保証（ｅｎｓｕｒｅ）している）。図１０は、アズトレオナム抵抗性の用量反応曲線を示す（これらのアズトレオナム抵抗性  突然変異の代表的なサブセット（ｓｕｂｓｅｔ）により取得された）。全ての非同義突然変異（ｎｏｎ−ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）がアズトレオナム抵抗性に寄与した。無関係（ｉｒｒｅｌｅｖａｎｔ）の突然変異のほとんど完全な非存在は、予期された低い突然変異負荷と矛盾するものではなく、そして各突然変異がβ−ラクタマーゼ抗生物質への抵抗性の自然な進化を刺激するプロセスにおいて、経時的に出現することを示唆している［Ｎｅｇｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ４４：  ２４８５−２４９１  （２０００）；  Ｖｕｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ３３：  ７５７−７６１  （１９８９）］。相対的に穏やかな突然変異誘発条件は、大きいサイズのプール（約１０１１プラスミド）による及び反復性の機能的な選択の識別力（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｎｇ  ｐｏｗｅｒ）によるオフセット（ｏｆｆｓｅｔ）を超えるものである。単一のβ−ラクタマーゼ配列における３つの関連性のある突然変異の発見〔１０−１０の確率［Ｌｏｎｇ−ＭｃＧｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ６８：  １２１−５  （２０００）］〕は、本発明の態様により可能となった配列スペースの効率的な探索の実例（ｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｏｎ）である。
【００６０】
前記組成物および方法を、新規の抵抗性突然変異（例えば、Ｇ２６７Ｒ）の進化を予想する予後的な目的（ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｐｕｒｐｏｓｅｓ）で、選択工程により臨床分離株において発見される最も一般的な突然変異を同定できるとの事実に基づいて使用できる。本発明の態様は、自然に発生する突然変異体と比較して、より偏った（ｂｉａｓｅｄ）表現（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を産する、多くの他の突然変異誘発アプローチとは似ていない［Ｏｒｅｎｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ８：  ２３８−２４２  （２００１）を参照］。突然変異（ポジションＥ１０４およびＲ１６４）は、自然に発生する臨床分離株において最も頻繁に発見される（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌａｈｅｖ．ｏｒｇ／ｓｔｕｄｉｅｓ／ｔｅｍｔａｂｌｅ．  ｈｔｍ）。このことは、多様で広く分布した（ａ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ａｎｄ  ｗｅｌｌ−ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ）突然変異スペクトル（内因的に発生する突然変異に近似（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｓ）する）と矛盾しない［Ｓｃｈａａｐｅｒ  Ｒ．，  Ｒ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｄｕｎｎ，  Ｒ．Ｌ．  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２９，３１７−３２６  （１９９１）］。突然変異はポジションＧ２６７において以前に報告されておらず、それゆえにＧ２６７Ｒはアズトレオナム抵抗性を付与する新規の決定要因（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）を代表する。この突然変異は、Ｂ５β−シートをＮ末端Ｈ１１ヘリックスに連結しているループに位置しており、これは臨床分離株において三番目に頻繁な突然変異であるＧ２３８Ｓ（グリシンがセリンにポジション２３８で変化する）の存在下でシフトを受ける。
【００６１】
これらの態様に関するサポートを提供するため、実験データを実施例２から７に提供する、これら実施例は本セクションの終わりに引き続いて記載される。特定の本発明の態様が本明細書中に例示の目的で記載されるが、様々な修飾を本発明の精神（ｓｐｉｒｉｔ）および範囲（ｓｃｏｐｅ）を逸脱することなく達成し得ることを理解すべきである。従って、本発明は、本願に添付された特許請求の範囲による以外には限定されない。
【実施例】
【００６２】
以下の実施例は、様々な状況（ｃｏｎｔｅｘｔ）における本発明の態様を実証する。実施例１において、低忠実度の大腸菌ＰｏｌＩ突然変異体（該突然変異体はモチーフＡおよび／またはＢにおいて操作される）を構築する方法が提供される。実施例２において、プラスミド特異的なインビボ突然変異誘発の頻度の上昇に関して、至適化された培養条件が提供される。実施例３において、Ｄ４２４Ａ  Ｉ７０９Ｎ  Ａ７５９Ｒ  ＰｏｌＩ変異体により媒介される、インビボでターゲッティングされるプラスミドの効率における相乗効果及び培養条件に対するその感受性が提供される。実施例４において、Ｄ４２４Ａ  Ｉ７０９Ｎ  Ａ７５９Ｒ  ＰｏｌＩ変異体の発現に際する、標的配列／β−ラクタマーゼに導入された突然変異のスペクトルおよび頻度が提供される。実施例５において、複製開始点（ｏｒｉ）からの距離の関数（ｆｕｎｃｔｉｏｎ）として、標的プラスミドにおける突然変異の頻度が提供される。実施例６において、宿主細胞におけるインビボ突然変異誘発の頻度における、Ｄ４２４Ａ  Ｉ７０９Ｎ  Ａ７５９Ｒ  Ｐｏｌ発現の効果（該宿主細胞は内因的に野生型ＰｏｌＩを産生し、ＤＮＡ修復に熟達（ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔ）している細胞である）が提供される。実施例７において、選択圧（例えば、アズトレオナムの濃度の増加）下での定方向進化の例が提供される。
【００６３】
実施例１  
変異性ＰｏｌＩ突然変異体の構築  
【００６４】
実施例１〜７に使用される、本発明の変異性ＰｏｌＩ突然変異体をコード化しているプラスミドの構築は、以下の方法で作出された。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αｐｏｌＡを、コロニー  ポリメラーゼ連鎖反応法で５９−ＡＴＡＴＡＴＡＴＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＴＴＣＡＧＡＴＣＣＣＣＣＡＡＡＡＴＣＣＡＣＴＴＡＴＣ−３９および５９−ＡＴＡＴＡＴＡＴＧＡＡＴＴＣＴＴＡＧＴＧＣＧＣＣＴＧＡＴＣＣＣＡＧＴＴＴＴＣＧＣＣＡＣＴ−３９をプライマーとして用いて増幅した。ｐＥＣｐｏｌ  Ｉを作出するため、３キロベースペアの増幅した断片をＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲｌで消化して、次にラクトースプロモーターの支配下にｐＨＳＧ５７６へとクローン化した（これは低コピー数のプラスミドであり、ｐｏｌ１−非依存性の起点および選択可能なマーカーとしてクロラムフェニコールを有する）。部位特異的突然変異誘発をｐＥＣｐｏｌ  Ｉで実施して、サイレント突然変異  ＣからＡをポジション２，０６７に及びＧからＣをポジション２，２１４（ｐｏｌＡ遺伝子中の）に導入し、それぞれＡｃｃｌおよびＥａｇＩ部位を作出した（これらはモチーフＡをコード化している配列に隣接（ｆｌａｎｋ）する）。結果的に生じるプラスミドは、ｐＥＣｐｏｌ  ＩＳと命名された。
【００６５】
ＤＮＡポリメラーゼのＩ７０９ＮおよびＩ７０９Ｆ  モチーフＡ突然変異体をコード化しているプラスミドを、ＰｏｌＩライブラリから遺伝的な選択（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）により分離した。ランダムライブラリ（ｒａｎｄｏｍ  ｌｉｂｒａｒｙ）を、ランダムな配列を有するセグメントを含有している、２つの単一鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドをアニーリングすることにより構築した：  オリゴ１は、１０４−ｍｅｒで、センスヌクレオチド２，０５３〜２，１５６に対応し、クローニングのためのＡｃｃｌ部位を含有していた（５’−ＧＡＡＧＧＴＣＧＴＣＧＴＡＴＡＣＧＣＣＡＧＧＣＧＴＴＴＡＴＴＧＣＧＣＣＡＧＡＧＧＡＴＴＡＴ［ＧＴＧＡＴＴＧＴＣＴＣＡＧＣＧＧＡＣＴＡＣＴＣＧＣＡＧＡＴＴＧＡＡＣＴＧＣＧＣ］ＡＴＴＡＴＧＧＣＧＣＡＴＣＴＴＴＣＧＣＧ−３’）；オリゴ２は、８９−ｍｅｒで、アンチセンス鎖ヌクレオチド２，２２５〜２，１３７に対応し、ＥａｇＩ部位を含有していた（５’−ＡＡＣＡＣＴＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＴＴＧＣＣＣＧＧＴＧＧＡＴＡＴＣＴＴＴＴＣＣＴＴＣＣＧＣＧＡＡＴＧＣＧＧＴＣＡＧＣＡＡＧＣＣＴＴＴＧＴＣＡＣＧＣＧＡＡＡＧＡＴＧＣＧＣＣＡＴＡＡＴ−３’）。前記の角型括弧で囲ったヌクレオチド（オリゴ１における）は、８８％野生型のヌクレオチドと他の３つのヌクレオチドの各４％とを含有する（全てのポジションで）ように合成された。ハイブリダイゼーションの２０塩基対の相補的な領域には下線を引いた。オリゴ１およびオリゴ２を、それらの非ランダムの相補的な領域で、各々２５０ｐｍｏｌを２０μｌのＨ２０中で混合すること、および９５℃で５分間加熱すること、次に２ｈ室温で冷却することによりアニールした。部分的に二重のオリゴヌクレオチドを５０ユニットの大腸菌ｐｏｌＩクレノー断片（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ）で２ｈ、３７℃で０．３−ｍｌの反応混合物（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、Ｐｈ７．５、５ｍＭ  ＭｇＣ１２、７．５ｍＭ  ＤＴＴ、および０．５ｍＭの４つ全てのｄＮＴＰｓを含む）中でインキュベーションすることにより伸長させた。生じたＤＮＡをＡｃｃｌおよびＥａｇｌで消化し、精製し、そしてｐＥＣｐｏｌｄｕｍ（スタッファー断片の代わりに）に挿入した。プラスミド（ランダムライブラリを含有している）を、大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅに形質転換し、形質転換した細胞の数を、ＬＢ寒天プレート（３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有している）上にアリクウォットをプレーティングすることにより決定した。前記ライブラリの残りを、形質転換した大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅを３リッターの２ＸＹＴ培地に、１６時間３７℃で成長させることにより増幅した。そして前記ランダムライブラリ（ｐＥＣｐｏｌＬｉｂ）を次に精製した。ｐＥＣｐｏｌＬｉｂをＪＳ２００細胞に形質転換（プラスミド  ｐＨＳＧ５７６、ｐＥＣｐｏＩＩＳ、ｐＥＣｐｏｌｄｕｍ  コントロールとして）し、生存に関して栄養寒天プレート上で３７℃で一晩選択した。ペアのサンプル（１，５００コロニー未満を含む、３０℃で）のみを分析した（というのも前記細胞の高密度なプレーティングにより、３７℃でのバックグラウンドの上昇が誘導されたので）。約２８０コロニー（３７℃で成長させた）を、ランダムに抜き取り、配列決定し、１および２の間のアミノ酸置換を含有することが発見された。
【００６６】
Ａ７５９ＲおよびＳ７５６Ｅアミノ酸置換（モチーフＢにおける）を、部位特異的突然変異誘発によりプラスミドＩ７０９Ｎ、Ｉ７０９Ｆ、Ｄ４２４Ａ  Ｉ７０９ＮおよびＤ４２４Ａ  Ｉ７０９Ｆに導入して、突然変異体Ｉ７０９Ｎ  Ａ７５９Ｒ、Ｄ４２４Ａ  Ｉ７０９Ｆ  Ａ７５９Ｒ、Ｄ４２４Ａ  ＤＩ７０９Ｎ  Ａ７５９Ｒ、およびＤ４２４Ａ  Ｉ７０９Ｆ  Ａ７５９Ｒを産生した。部位特異的突然変異誘発に関して、Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ（ストラタジーン（登録商標）、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）を次の変異原性プライマー（ｍｕｔａｇｅｎｉｃ  ｐｒｉｍｅｒｓ）と共に使用した：    
Ｐｏｌ  Ｉ  Ｓ７５６Ｅ−Ｆ５’−ＣＣＡＧＣＧＡＧＣＡＡＣＧＣＣＧＴＧＡＧＧＣＧＡＡＡＧＣＧＡＴＣＡＡＣＴＴＴＧＧ−３’；
Ｐｏｌ  Ｉ  Ｓ７５６Ｅ−Ｒ５’−ＣＣＡＡＡＧＴＴＧＡＴＣＧＣＴＴＴＣＧＣＣＴＣＡＣＧＧＣＧＴＴＧＣＴＣＧＣＴＧＧ−３’；
Ｐｏｌ  Ｉ  Ａ７５９Ｒ−Ｆ５’−ＣＧＣＣＧＴＡＧＣＧＣＧＡＡＡＣＧＧＡＴＣＡＡＣＴＴＴＧＧＴＣＴＧＡＴＴＴＡＴＧＧＣ−３’；
Ｐｏｌ  Ａ７５９Ｒ−Ｒ５’−ＧＣＣＡＴＡＡＡＴＣＡＧＡＣＣＡＡＡＧＴＴＧＡＴＣＣＧＴＴＴＣＧＣＧＣＴＡＣＧＧＣＧ−３’。
【００６７】
エキソヌクレアーゼ機能を枯渇させるために、部位特異的突然変異誘発をｐＥＣｐｏｌ  Ｉに実施して、Ａ−ｔｏ−Ｃトランスバージョンをポジション１２７１で生じさせ、したがってＡｓｐ４２４からＡｌａに変化させて、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を不活性化した［Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：  １９９−２０１  （１９８８）］。同じ様式において、３’→５’エキソヌクレアーゼドメイン−不活性化  突然変異をプラスミド（Ｉ７０９ＮおよびＩ７０９Ｆ突然変異をコード化している）に導入して、それぞれＤ４２４Ａ  Ｉ７０９ＮおよびＤ４２４Ａ  Ｉ７０９Ｆ突然変異体を産生した。
【００６８】
実施例２  
培養条件の最適化  
【００６９】
図５Ａは「初期（ｉｎｉｔｉａｌ）」の培養条件の例およびインビボ突然変異誘発を変異性ＰｏｌＩの発現により誘導するための方法を提供する。これは、本発明における「至適（ｏｐｔｉｍａｌ）」な培養条件および具体化された方法の開発前に、当業者により使用される通常の方法を代表する。３−１０倍の増加をプラスミド突然変異誘発において生じる（初期条件に類似する培養条件を用いた、染色体突然変異誘発と比較して）との２つの以前の報告がある。１つの場合において、使用されるポリメラーゼは、不活化されたプルーフリーディング  ドメインを含んでいるＰｏｌＩであった［Ｆａｂｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２８：  Ｅ９５  （２０００）］。本発明者等により開発された他の例は、Ｄ４２４Ａ  Ｉ７０９Ｆを変異性ＰｏｌＩとして使用した［Ｓｈｉｎｋａｉ，  Ａ．  ，  ａｎｄ  Ｌｏｅｂ，  Ｌ．  Ａ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６：  ４６７５９−６４  （２００１）］。突然変異誘発の頻度における及びターゲティングにおける改善は、次の４つの変数（ｖａｒｉａｂｌｅ）に属するものであった：（１）初期種菌（ｉｎｉｔｉａｌ  ｉｎｏｃｕｌｕｍ）の希釈（少なくとも１：１０５まで）、（２）２ＸＹＴにおける細胞の成長、（３）細胞の３７℃での予熱、および（４）飽和点を過ぎた、培養物の継続的な成長（典型的には１５〜１７ｈ）。
【００７０】
結果：  
実施例２は、突然変異誘発に変異性ＰｏｌＩ発現により影響を与えることが認められた個々の培養パラメータを示す。理想的には、ランダムなインビボ突然変異誘発に関するシステムは、標的とされた遺伝子の全体（５’末端から３’末端）に頻繁な突然変異を、非−標的特異的（ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ）な数個の突然変異として呈すべきである。
【００７１】
培養条件を変化させて、これらの判定基準にしたがう、至適な変異原性の性能を達成した。培養物が、飽和に達することを容認すべきである。ランダム突然変異誘発の有効性に寄与する他の変数には、培養基のタイプ、接種時の培地の温度、および初期の種菌の濃度が含まれる。試行錯誤により達成される、培養条件の慎重な至適化は、突然変異誘発を得るために重大である。これにより高い標的特異性および突然変異の広い分布が得られる。
【００７２】
ＪＳ２００株は、初めＳＣ１８−１２と記載され［Ｗｉｔｋｉｎ，  Ｅ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｒｏｅｇｎｅｒ−Ｍａｎｉｓｃａｌｃｏ，  Ｖ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７４：  ４１６６−８  （１９９２）］、次の遺伝子型を有する：ＳＣ−１８  ｒｅｃＡ７１８  ｐｏｌＡ１２  ｕｖｒＡ１５５  ｔｒｐＥ６５  ｌｏｎ−１１  ｓｕｌＡ１。ＳＣ−１８は、テトラサイクリン抵抗性を保有し、λファージに非感受性である。ＰｏｌＡ１２は、ＰｏｌＩの温度感受性対立遺伝子である［Ｍｏｎｋ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｋｉｎｒｏｓｓ，  Ｊ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １０９：  ９７１−８  （１９７２）］。ｐｏｌＡ１２は誤って折り畳まれるように思われ、これはポリメラーゼおよび５’→３’エキソヌクレアーゼの機能的部位の空間的な配置を混乱させる様式で生じ、これらの２つの活性の間の誤調和（ｍｉｓｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ）を生じる（ニックトランスレーションアッセイにおいてみられるとおり）。上昇した温度は、更に誤った折り畳みを増加させ、ニックでの効果的な重合を完全に崩壊させる［Ｕｙｅｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５１：  ４０８５−９  （１９７６）］。Ｒｅｃ７１８対立遺伝子は、ｒｅｃＡ４４１  Ｋ１２ドナーとｒｅｃＡ＋  Ｂ／ｒ−由来レシピエントとの間の抱合において得られた不安定な組換え型に由来する［Ｗｉｔｋｉｎ，  Ｅ．  Ｍ．，  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  １８５：  ４３−５０  （１９８２）］。それは２つの塩基置換を保有し、１つはＲｅｃＡタンパク質を構成的に活性化させ、１つは部分的なサプレッサである［（ＭｃＣａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １６９：  ７２８−３４  ［１９８７）］。
【００７３】
レポータープラスミドの調製は、以下の通り記載される。β−ラクタマーゼ遺伝子の復帰頻度を測定するためのレポータープラスミドは、プラスミドｐＧＰＳ３の修飾物である（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ）。このプラスミドは、ｐＵＣ１９（ＣｏｌＥ１型）複製開始点およびｎｐｔおよびａｍｐ遺伝子（カナマイシンおよびカルベニシリン選択に対して）を含む。復帰頻度を測定するため、Ｇ−ｔｏ−Ｔトランスバージョン（β−ラクタマーゼ遺伝子のポジション７６で）を部位特異的突然変異誘発により導入し、コドンＧＡＡ（Ｇｌｕ２６に対する）をオーカー終止コドンＴＡＡに変化させた。β−ラクタマーゼ復帰頻度を測定するために使用されたレポータープラスミドは、ｐＬＡ２３０、およびｐＬＡ２８００であった（ｐＵＣ１９複製開始点から２３０ｂｐおよび２８００ｂｐ下流を保有する）［Ｓｈｉｎｋａｉ，  Ａ．  ＆  Ｌｏｅｂ，  Ｌ．Ａ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６，  ４６７５９−４６７６４  （２００１）］。プラスミドｐＧＰＳｏｒｉはｐＬＡ２３０に対応するが、断続性バージョン（ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ  ｖｅｒｓｉｏｎ）の代わりに、野生型β−ラクタマーゼ遺伝子を有する。それはｐＬＡ２００と同じ様式で取得されたが、この場合ではｐＧＰＳ３がプライマー５’−ＧＣＡＣＣＣＧＡＣＡＴＡＣＡＴＧＴＣＣＴＡＴＴＴＧＴＴＴＡＴＴ−３’および５’ＡＡＡＣＴＴＧＧＴＣＧＧＴＡＣＣＴＴＡＣＣＡＡＴＧＣＴＴＡＡＴＣ−３に対する鋳型として使用された。前記ｐＬＡ２８００は、β−ラクタマーゼ遺伝子のポジション７６でオーカー終止コドンをコード化しているｐＧＰＳ３に対応する（複製開始点から２７４８ｂｐ）。
【００７４】
コンピテント細胞の調製は、以下の通り記載される。ＬＢプレート（適切な抗生物質選択を有する）上で成長させた単一コロニーを、抜き取り、そして３０℃で５０ｍｌのＬＢ  プラス  抗生物質中で振盪せずに一晩インキュベーションした。細菌の培養物を１ｈ、３０℃で振盪した後、それをフラスコ（４５０ｍｌ  ＬＢ  抗生物質を含有する）に移し、そして３０℃振盪機に３〜４時間放置した（０．５−１のＯＤ６００まで）。細胞を氷上で２０分間冷やし、Ｓｏｒｖａｌ（登録商標）ＲＣ  ５Ｂ  Ｐｌｕｓ遠心分離機中で遠心し、１０％グリセリン中で２回洗浄した。ペレットを〜２ｍｌ  １０％グリセリン中に再懸濁し、１２０μ１中にアリクウォット（ａｌｉｑｕｏｔｅｄ）し、ドライアイス上で急速凍結（ｑｕｉｃｋ−ｆｒｏｚｅｎ）した。復帰突然変異体（ｒｅｖｅｒｔａｎｔｓ）のおよび／またはサプレッサ（ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ）の増殖（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）を回避するため、コンピテント細胞を最初にＰｏｌｌプラスミドを用いて作出し、引き続いてレポータープラスミドで形質転換した。
【００７５】
形質転換を、バイオラド・ジーンパルサーＴＭ装置（４００Ω、２．２０Ｖおよび２．５μＦＤにセット）を用いて実施した。電気ショック後、細胞を１ｍｌのＬＢ培地に再懸濁し、１ｈ、３０℃で振盪し、ＬＢプレート（プラスミド選択に関して適切な抗生物質を有する）で培養した。シングルコロニー（Ｓｉｎｇｌｅ  ｃｏｌｏｎｉｅｓ）を５ｍｌ  ＬＢ（適切な抗生物質を有する）中に抜き取り、一晩、３０℃で振盪せずに成長させた。ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞の場合（温度または培地は問題ではないので）、２ＸＹＴ培地中での再懸濁、３７℃での３０分間の振盪、単一コロニーのＬＢ培地  ３７℃振盪機中での１６ｈの成長を伴う、より標準プロトコールが引き続く。形質転換（レポーター遺伝子での）は、温度感受性の表現型の欠損を最も頻繁に生じる。レポータープラスミドの複製（これはＰｏｌＩ依存的および多コピー）により、ＪＳ２００細胞の限定的でＰｏｌＩ機能的な蓄えが、許容状態下でさえも枯渇するように思われ、復帰突然変異体および／またはサプレッサの増殖に好都合である。それ故、ＰｏｌＩを保有するプラスミドを第一の形質転換に使用して、コンピテント細胞を作出した。これを引き続いて使用して、レポータープラスミドで形質転換した。
【００７６】
β−ラクタマーゼ復帰アッセイを、以下の方法で実施した。ｐＨＳＧ５７６プラスミド（クロラムフェニコール耐性（ｃｍｒ））中にＰｏｌＩ（野生型または異なる低忠実度の突然変異体）を保有する大腸菌ＪＳ２００形質転換体株を、レポータープラスミド（カナマイシン（ｋａｎｒ））で再形質転換した。二重の抵抗性（ｃｍｒ、ｋａｎｒ）を呈している単一コロニーを、５ｍｌ  ＬＢ（プラス  ｔｅｔ、ｋａｎ、ｃｍ）中に抜き取り、一晩の振盪せずに成長させた。１時間３０℃で振盪した後、培養物（ＯＤ〜０．５）を、５ｍｌの２ＸＹＴ培地（３７℃で予熱した）中で１：１０５に希釈した。これらの新しい培養物を、３７℃で１５分間維持し、１５時間３７℃振盪機中でインキュベーションした。β−ラクタマーゼ終止コドン復帰を、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリン（Ｉｓｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｂａｉｎｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｌａｎｄ，  ＷＡ）をカナマイシンおよびクロラムフェニコールに加えて含有しているプレート上の飽和した培養物の適切な希釈物をプレーティング（少なくとも二通り）することにより検出した。
【００７７】
リファンピン抵抗性に関して、細胞を２５μｇ／ｍｌリファンピン中で培養した。結果は、生存可能なコロニー（ｋａｎ  ｃｍ単独において成長）と比較した頻度として表現され、少なくとも２つのクローン（独立に保有される）の平均を示す。
【００７８】
実施例３  
インビボでのモチーフＡおよびモチーフＢ突然変異の相乗効果およびプラスミド配列の有意なターゲティング  
【００７９】
以下の表１は、突然変異誘発ターゲティングの頻度および程度を特徴付けるアッセイの結果を要約する（結果を図６に示す）。ＪＳ２００細胞は、野生型ＰｏｌＩ又はそれぞれのＰｏｌＩ突然変異体の何れか、およびレポータープラスミドｐＬＡ２３０で形質転換された。β−ラクタマーゼ復帰の頻度（野生型に対して標準化された）は、特定の標的遺伝子における突然変異の頻度の指標である。リファンピシン抵抗性のカルベニシリン抵抗性に対する比率は、染色体の突然変異誘発の頻度を反映する。
【００８０】
初期条件は３０℃でＯＤ６００〜０．５まで成長した培養物を提示し、これを１：５０へと栄養ブロス中で希釈し、ＯＤ＝０．７まで３７℃振盪機中で到達させた［Ｓｈｉｎｋａｉ，  Ａ．  ａｎｄ  Ｌｏｅｂ，  Ｌ．Ａ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６：  ４６７５９−６４  （２００１）］。至適化された条件により、許容状態下でＯＤ６００〜０．５にまで成長した培養物を呈し、これは２ＸＹＴ（３７℃で予熱された）中で１：１０５に希釈され、付加的に１５分間３７℃でインキュベーションされ、３７℃振盪機に１５時間配置された（飽和）。突然変異誘発頻度は、β−ラクタマーゼ復帰アッセイ（プラスミド内の標的）により又はリファンピン耐性コロニーを計数すること（染色体内の標的）により決定された。また、報告された値は、野生型に対して標準化された。各突然変異体ポリメラーゼに関する、プラスミド  対（ｖｅｒｓｕｓ）  染色体の突然変異誘発の相対的頻度を、野生型ポリメラーゼに関して認められたところまで正規化した後に取得した。これにより、異なる性質のアッセイ（フォワードアッセイ（Ｒｉｆｒ）  対  β−ラクタマーゼ復帰アッセイ）、および標的数における差（単一コピー（Ｒｉｆｒ）  対  多コピーβ−ラクタマーゼ）などの変数が導入される。
【００８１】
【表１】
2005528114.tif 000002
【００８２】
結果：  
実施例３では、異なる変異性ＰｏｌＩ突然変異体の発現及び培養条件に対するその感受性に関連する、突然変異誘発の特性を調査する（図５Ａおよび５Ｂ）。モチーフＡにおける及びモチーフＢにおける低忠実度突然変異の効果を樹立するために、単独および組み合わせで次のＰｏｌＩ突然変異体を試験した：  Ｄ４２４Ａ  Ｉ７０９Ｎ、Ａ７５９Ｒ、Ｄ４２４Ａ  Ａ７５９Ｒ、Ｉ７０９Ｎ  Ａ７５９ＲおよびＤ４２４Ａ  Ｉ７０９Ｎ  Ａ７５９Ｒ（そのサブセットは図６に示される）。表１は、これらの結果の要約である。Ｄ４２４Ａ  Ｉ７０９Ｎ発現の効果（初期条件下での）は、公開されたデータ［Ｓｈｉｎｋａｉ，  Ａ．，  ａｎｄ  Ｌｏｅｂ，  Ｌ．  Ａ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ５０：  ４６７５９−６４  （２００１）］に匹敵する。Ｄ４２４Ｄ  Ａ７５９Ｒ突然変異の発現は、突然変異誘発（Ｄ４２４Ａ  Ｉ７０９Ｎと匹敵する）の頻発を生じる。モチーフＡ突然変異と類似して、上昇した突然変異誘発は、プルーフリーディングドメインの同時の不活性化に依存する。これらの結果は、ポジションＡ７５９（モチーフＢにおける）が、大腸菌における忠実度の重大な決定要因であることを確証する。驚くべきことに（Ｓｔｒｉｋｉｎｇｌｙ）、Ｉ７０９Ｎ  Ａ７５９Ｒ  Ｄ４２４Ａ三重突然変異体の発現は、突然変異の頻発を生じ、これは相加的効果を超えるものであり（ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  ａｄｄｉｔｉｖｅ）、上記の各二重突然変異体のものよりも６から２６倍高いものである（同じ事項はＩ７０９Ｆ  Ａ７５９Ｒ  Ｄ４２４Ａに適用される）。単一のモチーフＡまたはモチーフＢ突然変異体とは異なり、二重のモチーフＡおよびモチーフＢ  ＰｏｌＩ突然変異体による突然変異誘発は、プルーフリーディングの不活性化に若干の依存性を示している。このことは、突然変異の組み合わせ（ポジションＩ７０９ＦおよびＡ７５９Ｒにおける）が、プルーフリーディングの機能的な不活性化を生じることを示唆している。
【００８３】
至適化された条件下で、野生型より１５，０００倍高い、突然変異誘発の頻度が達成された（他の実験において、１００，０００倍の増加が観察されている（図８Ｂ））。このことは、「初期（ｉｎｉｔｉａｌ）」条件下で達成された頻度を超える、実質的な増加を示している（３，６００倍）。また、至適化された条件は、更に突然変異誘発を標的プラスミドに限定する。Ｉ７０９Ｎ  Ａ７５９Ｒ  Ｄ４２４Ａ三重突然変異体の場合において、プラスミド特異性は４００倍増加する。要約すると（Ｉｎ  ｓｕｍ）、Ｉ７０９（モチーフＡ）およびＡ７５９（モチーフＢ）突然変異は、相乗的に標的プラスミド突然変異誘発を増強する。また、突然変異の頻度およびターゲティングの双方は、成長条件（ｇｒｏｗｔｈ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）に感受性である。
【００８４】
実施例４  
標的配列に導入された突然変異のスペクトルおよび頻度の決定（Ｄ４２４Ａ  Ｉ７０９Ｎ  Ａ７５９Ｒ  Ｐｏｌ  Ｉの発現に際した）  
【００８５】
以下の表２は、Ｄ４２４Ａ  Ｉ７０９Ｎ  Ａ７５９Ｒ  ＰｏｌＩを発現している細胞において同定された、β−ラクタマーゼ遺伝子におけるオーカー終止コドンの外側に位置する突然変異の突然変異スペクトルを示す。項目内の番号は、配列の位置を示す（複製開始点と比較した）。機能的な発現が要求される、使用されたアッセイの性質上（Ｇｉｖｅｎ  ｔｈｅ  ｎａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｓｓａｙ）、フレームシフトおよび欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ）は決定されなかった。
【００８６】
【表２】
2005528114.tif 000003
【００８７】
結果：  
実施例４は、変異性ＰｏｌＩ発現から生じる、変異原性スペクトル（ｍｕｔａｇｅｎｉｃ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ）の例示を提供する。Ｉ７０９Ｎ  Ａ７５９Ｒ  Ｄ４２４Ａ  ＰｏｌＩ発現と関連するヌクレオチド変化を特徴付けるため、１５８のカルベニシリン耐性クローンがシークエンスされた。全て１５５のこれらのクローンが、オーカーコドンにおいて突然変異を示した。
【００８８】
これらの中で、２つのみが別の終止コドン（両方がオパールに）に変化し、９６．８％の全体の特異性（ｏｖｅｒａｌｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を復帰アッセイに関して呈する。野生型配列は残りの１５３配列のうちの１４８に存在し、様々な量において（微量から約９０％）、これは多コピープラスミド（多様な程度の優性（ｄｏｍｉｎａｎｃｅ）を有する）においてコード化される突然変異と矛盾のないものである。塩基対置換の完全なスペクトルを確立するため、少なくとも６５０ｂｐの良質の配列を、これらの１５８クローンの全てに関して取得した。全体で４６の二次的な突然変異が、この６５０ｂｐインターバル内で検出された。これらのうち、４０はオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内に位置し、そのうち２２はサイレントであった。僅か２つの突然変異が、この分析において２度以上検出された。このことは多様性の程度が高いことを指摘している。表２は、これらの４６の二次的な突然変異の突然変異スペクトルを示す。
【００８９】
Ｄ４２４Ａ  Ｉ７０９Ｎ  Ａ７５９Ｒ  ＰｏｌＩの発現は、本分析中の６５０ヌクレオチド内で多様な突然変異スペクトルを生じた。しかし、トランジションに対するバイアス（８０％）が検出され、ＧＣ→ＡＴ突然変異（５６％）が優位（ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｃｅ）であった。
【００９０】
Ｉ７０９Ｎ  Ａ７５９Ｒ  Ｄ４２４Ａ  ＰｏｌＩを発現している細胞に存在する標的プラスミドの数が、突然変異負荷を推定するために決定され、僅か１０コピー／細胞であることが認められた（図７）。このことは、野生型ＰｏｌＩを発現している培養物において〜１００コピー／細胞であったことと対照的である。標的プラスミドコピー数におけるＰｏｌＩ点突然変異の本効果は、突然変異体ライブラリーのサイズを１０倍減少させる。しかしながら、この細胞毎の標的数の減少は、選択効率を改善したと思われる。というのも各々の新しい突然変異は、発現されたタンパク質の大部分を説明すると期待され、そしてそれ故に表現型に大きな影響力を有している。
【００９１】
至適化された突然変異誘発条件下で、終止コドン復帰の頻度は、５００細胞に１のオーダーであった（図６）。１０標的プラスミド／細胞が予期される場合、これは５０００コドンにおいて１復帰であると解釈される。９の可能性のある塩基対置換（オーカーコドンでの）のうち２つは許容されないので、これは３，９００コドンに１突然変異と同等である。突然変異の均等な分布を仮定する場合（即ち、オーカー終止コドンでの突然変異は、タンパク質における夫々の他のコドンのものを代表する）、１１，５００ｂｐ（３ｘ３９００）に１突然変異の推定突然変異頻度（ａｎ  ｅｓｔｉｍａｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）と計算される。インビボで既報告の最高突然変異頻度は、０．５突然変異／Ｋｂｐである［Ｇｒｅｅｎｅｒ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  ７：  １８９−９５  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  （１９９７）］、しかし、この突然変異誘発は、連続的な培養に際して不安定であった、そして宿主における重度に有害な効果を有していた［Ｇｒｅｅｎｅｒ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  ７：  １８９−９５  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  （１９９７）］。
【００９２】
Ｄ４２４Ａ  Ｉ７０９Ｎ  Ａ７５９Ｒポリメラーゼを発現し、レポータープラスミドｐＬＡ２３０を有するＪＳ２００細胞を、突然変異誘発に関して至適な条件下で成長させ、そしてプレート（５０μｇ／ｍｌカルベニシリンを含有している）上で培養した。単一のカルベニシリン耐性コロニーを成長させた。これらのプラスミドを抽出し、オーカーコドンの配列をオリゴヌクレオチドＢｌａｃ−５を用いて決定した。二次的な突然変異を、次のオリゴヌクレオチドを用いて確認した：  
Ｂｌａｃ−５  ５’−ＴＴＡＣＧＧＴＴＣＣＴＧＧＣＣＴＴＴＴＧＣ−３’；  
Ｂｌａｃ−６  ５’−ＧＧＴＴＧＡＧＴＡＣＴＣＡＣＣＡＧＴＣＡＣ−３’；  
Ｂｌａｃ−７  ５’−ＴＣＣＧＡＴＣＧＴＴＧＴＣＡＧＡＡＧＴＡＡ−３’；および  
Ｂｌａｃ−８  ５’−ＣＣＡＴＴＴＣＣＡＣＣＣＣＴＣＣＣＡＧＴＴ−３’。
配列をシークエンチャー（Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ）ソフトウェアを用いて分析した。
【００９３】
実施例５  
変異性ＰｏｌＩ突然変異体によるインビボ突然変異誘発（複製開始点からの距離の関数として）  
【００９４】
図８Ｂは、突然変異誘発の頻度を複製開始点（ｏｒｉ）からの距離の関数として示しており、これは変異性ＰｏｌＩ突然変異体（単一および二重の突然変異を活性部位に含有している）による変異原性の適用範囲（ｍｕｔａｇｅｎｉｃ  ｃｏｖｅｒａｇｅ）のレベルを評価するために決定された。ＪＳ２００細胞を、野生型または異なる変異性ＰｏｌＩ突然変異体の何れかと、複製開始点およびオーカー終止コドンのポジション間の距離が増加している以下のレポーターの１つとで形質転換した：ｐＬＡ２３０、ｐＬＡ７００、ｐＬＡ１４００、ｐＬＡ２８００、およびｐＬＡ３７００。許容状態下でＯＤ６００〜０．５にまで成長した培養物を、２ＸＹＴ（３７℃で予熱された）で１：１０５に希釈し、付加的に１５’、３７℃でインキュベーションし、３７℃振盪機に１５時間配置された（飽和）。結果は、１つの代表的な実験を示す。各ポイントは、２つの独立した培養物（各々は重複して培養された）の平均を示す。
【００９５】
結果：  
ＰｏｌＩが、ＣｏｌＥｌ起点の下流のリーディング鎖において〜４００ｂｐを合成することが報告され［Ｓａｋａｋｉｂａｒａ，  Ｙ．  ＆  Ｔｏｍｉｚａｗａ，  Ｊ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ７１：  １４０３−１４０７  （１９７４）］、このポイントで、リーディング（ｌｅａｄｉｎｇ）およびラギング（ｌａｇｇｉｎｇ）鎖の双方がＰｏｌＩＩＩレプリソーム（ｒｅｐｌｉｓｏｍｅ）により引き継がれる（ｔａｋｅｎ  ｏｖｅｒ）［Ｓｔａｕｄｅｎｂａｕｅｒ，  Ｗ．  Ｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  １４９：  １５１−１５８  （１９７６）］．従って、多くのＰｏｌ１−依存的な突然変異は、標的遺伝子の５’末端でクラスター形成していると予期された。この見込みに反して、５００ｂｐよりも更に下流の突然変異が、開始リーダー（ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｌｅａｄｅｒ）に相当する配列における突然変異と比較される場合、類似する頻度のヒット（ａ  ｓｉｍｉｌａｒ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆ  ｈｉｔｓ）および同等のスペクトル（ａ  ｃｏｍｐａｒａｂｌｅ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ）が検出された。しかしながら、レポーター遺伝子におけるオーカー終止コドンが更に複製開始点から図３Ｂに示すとおり配置された場合（実施例５、図８にも例示される）、突然変異誘発の減少が明らかとなり、このことは長い距離での変異性ＰｏｌＩによるリーディング鎖の合成の非存在から生じる。しかしながら、プラスミド突然変異誘発（７００ｂｐポイントでの）において観察された減少は、ほんの中等度のものであった、そして三重ＰｏｌＩ変異体突然変異の場合において、頻度は一定のままであった（別の３Ｋｂに関するバックグラウンドを４桁超える）。ＰｏｌＩによる有意なプラスミド突然変異誘発（プラスミド配列における開始リーダー鎖に相当する配列を超えた）は、当業者が予想できたものではなかった。従って、実施例５は次のことを指摘する。つまりｏｒｉから少なくとも３７００ｂｐの距離での標的配列は、変異性ＰｏｌＩ発現による突然変異を受け入れる（ａｍｅｎａｂｌｅ）。
【００９６】
ｐＬＡ２３０およびｐＬＡ２８００の調製は実施例２に提供される。また、他のレポーターは、以下に示すプラスミド  ｐＬＡ２８００およびｐＧＰＳΔに由来した：  ｐＬＡ３８００は、完全なｎｐｔ（ｋａｎｒ）遺伝子を合成オリゴヌクレオチド５’−ＣＡＴＣＧＧＴＡＣＣＴＴＡＡＣＣＡＡＴＴＣＴＧＡＴＴＡＧＡＡＡＡＡＣ−および−ＧＡＴＧＧＧＴＡＣＣＣＴＡＧＡＴＴＴＡＡＡＴＧＡＴＡＴＣＧＧＡＴＣＣ−３’（隣接するＫｐｎＩ制限酵素認識部位を含有している）を用いて増幅することにより産生された。９８０ｂｐの増幅された断片を、プラスミドｐＬＡ２８００のＫｐｎＩ部位にクローン化した（ｎｐｔの１つの追加のコピーが添加され、終止コドンがプラスミド複製開始点の３６９１ｂｐに移動する）。ｐＬＡ２２００は、Ｓａｌ１  １５１７ｂｐ断片をプラスミドｐＬＡ３８００から摘出すること、およびプラスミド  バックボーンを再連結することにより産生された。
【００９７】
これにより、終止コドンがプラスミド複製開始点の２１７４ｂｐに移動した。ｐＬＡ１４００は、ＰＣＲ増幅されたｎｐｔ遺伝子をｐＬＡ２８００のＳａｃＩおよびＡｆｌｌｌ部位にクローニングすることにより産生された（β−ラクタマーゼ  オーカーコドンがｏｒｉから１４０３ｂｐに移動する）。増幅に使用されたＳａｃＩおよびＡｆｌＩＩＩアダプターを含有しているオリゴヌクレオチドは、５’−ＣＡＴＣＧＡＧＣＴＣＴＴＡＡＣＣＡＡＴＴＣＴＧＡＴＴＡＧＡＡＡＡＡＣ−３’および５’−ＧＡＴＧＡＣＡＴＧＴＣＴＡＧＡＴＴＴＡＡＡＴＧＡＴＡＴＣＧＧＡＴＣＣ−３’であった。
【００９８】
ｐＬＡ７００は、ＰＣＲ増幅したβ−ラクタマーゼ  レポーターをｐＧＰＳΔのＳｗａＩおよびＳｐｅＩ部位へとサブクローニングすることにより生じた。使用されたオリゴヌクレオチドは、５’−ＣＡＴＣＧＡＴＡＴＣＴＴＡＣＣＡＡＴＧＣＴＴＡＡＴＣＡＧＴＧ−３’および５’−ＧＡＴＧＡＣＴＡＧＴＣＣＣＴＡＴＴＴＧＴＴＴＡＴＴＴＴＴＣＴ−３’であった（それぞれＥｃｏＲＶおよびＳｐｅＩアダプターを含有している）。これにより、オーカー終止コドン（β−ラクタマーゼ遺伝子における）が、僅か７０９ヌクレオチド、複製開始点から離れたところに配置される。
【００９９】
実施例６  
野生型ＰｏｌＩを発現している細胞のインビボ突然変異誘発における、変異性ＰｏｌＩ突然変異体の効果  
【０１００】
図９（表３のデータの図解）は、プラスミド特異的な突然変異頻度を実証する。このプラスミド特異的な突然変異頻度は、染色体の野生型ＰｏｌＩの発現が変異性ＰｏｌＩ突然変異誘発に干渉するかどうかを決定するために、ＰｏｌＩ熟達した株（ａ  Ｐｏｌ  Ｉ  ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｔｒａｉｎ）中で変異性ＰｏｌＩ突然変異体により媒介される。ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ細胞（野生型ＰｏｌＩを発現する株）を、ＰｏｌＩ変異誘発因子（Ｄ４２４  Ｉ７０９Ｎ  Ａ７５９Ｒ）およびレポータープラスミドｐＬＡ２３０で形質転換した。それらを３０℃でＯＤ〜０．５まで成長させた。そしてその１０−５希釈を１７時間２ＸＹＴ培地中で１００μｇ／ｍｌ  ＩＰＴＧの存在または非存在下で成長させ、カルベニシリン  プレート上で三通り（ｉｎ  ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）培養した。ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞における及びＪＳ２００細胞におけるβ−ラクタマーゼ復帰の頻度を、同じ濃度のＩＰＴＧの存在または非存在下で、比較のためにプロットした。
【０１０１】
【表３】
2005528114.tif 000004
【０１０２】
結果：  
重大な遺伝物質はベクターにおいて提供される。そして、野生型ＰｏｌＩの発現および／または無傷のＤＮＡ修復（宿主における）は、突然変異誘発により有意に干渉されない。従って、ランダム突然変異誘発を、標的とされた遺伝子による相補性に関して特異的にデザインした株において、実施し得る。図９および表３（実施例６における）は、この点を説明しており、変異性ＰｏｌＩ突然変異体が、野生型ＰｏｌＩを発現し、ＤＮＡ修復に熟達（ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔ）した宿主（ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ）において共優性（ｃｏ−ｄｏｍｉｎａｎｔ）であることを実証している。変異性ＰｏｌＩのＰｏｌＩ過剰発現により、これらの細胞における標的プラスミド突然変異誘発が増加する（標的プラスミドの複製に関して、野生型ＰｏｌＩと競合することにより）。過剰発現させた場合、変異性ＰｏｌＩが野生型をアウトコンピート（ｏｕｔｃｏｍｐｅｔｅ）することが期待できる。このことは図９に説明される。この図は、ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ細胞におけるＤ４２４Ａ  Ｉ７０９Ｎ  Ａ７５９Ｒ  ＰｏｌＩ（ｔａｃプロモーターからの発現をＩＰＴＧで誘導することにより）が、プラスミド突然変異誘発を、ＪＳ２００において取得された頻度に匹敵する頻度にまで更に増加させることを示している。観察されたより高いバックグラウンド（ＪＳ２００と比較して）は、ＧｌｎＶ突然変異（オーカーに対して若干の活性を有する、アンバー抑制因子）に依存するものであろう。従って、この結論に影響しないはずである。リファンピシン抵抗性は２つの株間で同等であり、このことはＰｏｌＩ突然変異誘発がＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞中でなおプラスミド限定的（ｐｌａｓｍｉｄ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ）であることを指摘している。
【０１０３】
ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ細胞は、Ｆ’：：Ｔｎ１Ｏ  ｐｒｏＡ＋Ｂ＋  ｌａｃＩｑ  Δ（ｌａｃＺ）  Ｍ１５／ｒｅｃＡ１  ｅｎｄＡ１  ｇｙｒＡ９６  （Ｎａｌｒ）  ｔｈｉ  ｈｓｄＲｌ７  （ｒｋ−  ｍｋ＋）  ｇｌｎＶ４４  ｒｅｌＡ１  ｌａｃ  であり、そして市販されている（例えば、Ｓｔａｔａｇｅｎｅ（登録商標）から購入できる）。細胞を適切な抗生物質選択下で成長させた：即ち、テトラサイクリン（Ｓｉｇｍａ（登録商標）；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）を１２．５μｇ／ｍｌで、クロラムフェニコール（Ｓｉｇｍａ（登録商標）；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）を３０μｇ／ｍｌで、および／またはカナマイシン（Ｉｓｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｂａｉｎｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｌａｎｄ，  ＷＡ）を５０μｇ／ｍｌの濃度で使用した。
【０１０４】
実施例７  
定方向進化により産生されたアズトレオナム耐性突然変異の表現型分析  
【０１０５】
表４はＴＥＭ−１突然変異の表現型を示す。これらは、前記システムの定方向進化（酵素の）に対する適用可能性を樹立するために実施した選択の結果、同定された。ＪＳ２００細胞（Ｄ４２４Ａ  Ｉ７０９Ｎ  Ａ７５９Ｒ  ＰｏｌＩをコード化しているプラスミドおよび標的ＴＥＭ−１  β−ラクタマーゼをコード化している第二のプラスミドで共形質転換した）を、アズトレオナムの濃度を増加させた選択圧下に供試した。コントロールには、次の形質転換体が含まれる：（ａ）野生型ＰｏｌＩ（野生型β−ラクタマーゼを有する）；（ｂ）Ｄ４２４Ａ  Ｉ７０９Ｎ  Ａ７５９Ｒ  ＰｏｌＩ（β−ラクタマーゼを欠くプラスミド）および（ｃ）野生型ＰｏｌＩ（β−ラクタマーゼを欠くプラスミド）。２つの独立した選択を、至適化した変異原性条件下で実行した。選択なしの１ラウンドの突然変異誘発の後に、１：１０種菌（ａ  １：１０  ｉｎｏｃｕｌｕｍ）を０．５μｇ／ｍｌ  アズトレオナム（ＩＣ９９＝０．２μｇ／ｍｌ）とインキュベーションした。１：１０希釈（ａ  １：１０  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）を同濃度の薬物の存在下で成長させることにより、生細胞を増殖させ、その後、別の１：１０希釈を３２μｇ／ｍｌ  アズトレオナム中で選択した。この濃度で、如何なるコントロールも、有意な成長を示さなかった。生存細胞（Ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌ）を６４μｇ／ｍｌ  アズトレオナムで培養した。プラスミドを単一コロニー（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｏｌｏｎｉｅｓ）から取得し、ＴＥＭ−１  β−ラクタマーゼを直接的に特異的なプライマーを用いてシークエンスした。
【０１０６】
ベクターの他の場所における突然変異の潜在的な効果を排除するために並びに単一、二重、および三重のアミノ酸置換を発生させるために、サブクローニングされた関連性のある突然変異を野生型標的プラスミドへとサブクローニングした。表現型の分析のために、前記突然変異体を、野生型ＰｏｌＩを含有しているＪＳ２００細胞に再形質転換した（更なる突然変異誘発が回避される）。アズトレオナムに対して選択された突然変異の用量反応曲線を、図１０に示す。また、全ての形質転換体に関するＩＣ５０ｓ（２つの個々の形質転換体の平均）を、表４に示す。フォールド  アズトレオナム抵抗性ａ（Ｆｏｌｄ  ａｚｔｒｅｏｎａｍ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａ）は、２つの実験の平均に基づいたＩＣ５０を示す（野生型＝１００に対して正規化された）。
【０１０７】
【表４】
2005528114.tif 000005
【０１０８】
アズトレオナムをワシントン大学の薬局（Ｄｒｕｇ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）から購入し、水に５０ｍｇ／ｍｌの濃度で再懸濁した。ＪＳ２００に対するアズトレオナム用量反応曲線は、ＰｏｌＩ突然変異誘発（１：１０５種菌、予熱した２ＸＹＴ、３７℃振盪機で１５ｈ）に関して使用した条件下で取得された。細胞の＞９９％を殺傷するアズトレオナムの阻害濃度（ＩＣ９９）は、０．２μｇ／ｍｌであった。このことは、ｐＧＰＳ３ｏｒｉで形質転換したＪＳ２００細胞及びｐＧＰＳ３Δで形質転換した細胞の双方に関して真実であり、野生型β−ラクタマーゼが有意なアズトレオナム抵抗性を与えないことを確証している。
【０１０９】
ＪＳ２００細胞を、プラスミド（Ｄ４２４Ａ  Ｉ７０９Ｎ  Ａ７５９Ｒ  ＰｏｌＩをコード化している）およびｐＧＰＳｏｒｉ（ｏｒｉから１５０ｂｐ下流で開始する、野生型β−ラクタマーゼをコード化しているプラスミド）で形質転換した。コントロールには、以下を発現している細胞が含まれる：（ａ）野生型ＰｏｌＩおよび野生型β−ラクタマーゼ；（ｂ）Ｄ４２４Ａ  Ｉ７０９Ｎ  Ａ７５９Ｒ  ＰｏｌＩおよび標的プラスミド（大きいβ−ラクタマーゼ欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）を保有する）；並びに（ｃ）野生型ＰｏｌＩおよび欠失型β−ラクタマーゼ。２つの独立した選択を、「至適化した」変異原性条件下で実行した。選択なしの１ラウンドの突然変異誘発の後に、培養物の１：１０希釈（ａ  １：１０  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）を０．５μｇ／ｍｌ  アズトレオナム（ＩＣ９９＝０．２μｇ／ｍｌ）とインキュベーションした。
【０１１０】
１：１０希釈（ａ  １：１０  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）を同濃度の薬物の存在下で成長させることにより、生細胞を増殖させ、その後、別の１：１０希釈を３２μｇ／ｍｌ  アズトレオナム中で選択した。如何なるコントロールも、このポイントで生存しなかった。このことは変異性ＰｏｌＩおよびβ−ラクタマーゼの双方の存在が、これらの条件下の抵抗性に必須であったことを指摘している。生存細胞（Ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌ）を６４μｇ／ｍｌ  アズトレオナムで培養した。プラスミドを単一コロニー（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｏｌｏｎｉｅｓ）から取得し、ＴＥＭ−１  β−ラクタマーゼを直接的に特異的なプライマーを用いてシークエンスした。
【０１１１】
個々のコロニーを、アズトレオナム  プレートから抜き取り、そして許容状態（３０℃、振盪なし）下で成長させて、１０μｇ／ｍｌ  アズトレオナム存在下で更なる突然変異誘発を回避した。プラスミドを３ｍｌの各々のこれらのクローンから、Ｐｅｒｆｅｃｔｐｒｅｐ（登録商標）ミニプレップキット（エッペンドルフＡＧより）を用いて抽出し、そして５０μｌの水に再懸濁した。それらをプライマーＢｌａｃ−５、−６、−７、−８（実施例４）を用いてシークエンスした。
【０１１２】
部位ＨａｅＩＩＩ、Ｓｃａｌ、およびＦｓｐＩ（標的プラスミド内でユニーク）を使用して、β−ラクタマーゼ  ＯＲＦにおいて同定された突然変異を、アズトレオナム選択により、β−ラクタマーゼをコード化しているベクターへとサブクローニングし、そして全ての可能性のある突然変異体の組み合わせを生じさせた。これらの構築物を、ＪＳ２００細胞（野生型ＰｏｌＩプラスミドを保有している）へと形質転換して、更なる突然変異誘発を誘発することなく、同じ遺伝的バックグラウンドを保持させた。そしてβ−ラクタムの非存在下で成長させた。細胞を、１０５ｃｆｕ／ｍｌの標準種菌（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｉｎｏｃｕｌｕｍ）に希釈し、そして１６ｈ、増加させた各種濃度のアズトレオナムの存在下で成長させた。ＩＣ５０Ｓは、ＯＤ６００を薬濃度に対してプロットすること、および生存を５０％に減少させる濃度を見出すこと、により達成された。個々のクローンの発現におけるバリエーションを説明するために、２つの独立した実験を実行し、平均した。２つの実験間の標準偏差は、３０％のオーダーであった。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１Ａ】図１Ａは、２−プラスミド突然変異誘発システム（変異性ＰｏｌＩおよび外因的に導入したＤＮＡ鋳型の共発現を利用する）の概要図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、２−プラスミド突然変異誘発システム（変異性ＰｏｌＩおよび外因的に導入したＤＮＡ鋳型の共発現を利用する）の概要図である。
【図２】図２は、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼの活性部位におけるモチーフＡおよびモチーフＢ内の残基を示す。これらはヌクレオチドの取り込みの間の複製の忠実度に関して重要である。
【図３】図３Ａは、変異性ＰｏｌＩによるインビボ突然変異誘発に標的化される、鋳型ＤＮＡ（原核生物の及び真核生物のＤＮＡを含む）の態様を示す。図３Ｂは、いくつかの標的プラスミドを示す。これらは、複製開始点（ｏｒｉ）と突然変異誘発のためのレポーターとして使用されるβ−ラクタマーゼ遺伝子内のオーカー終止コドンとの間に様々な距離を有している。
【図４】図４は、β−ラクタマーゼ基質：ペニシリン、セファロスポリン、およびアズトレオナムの３つのクラスの化学構造を説明する。アズトレオナムは、実施例７における選択的な薬剤として供試された。
【図５Ａ】図５Ａは、培養において、標的プラスミドの存在下で変異性ＰｏｌＩを発現させることにより、突然変異誘発を誘導する初期条件および方法を示す（実施例２において議論された）。
【図５Ｂ】図５Ｂは、培養において、標的プラスミドの存在下で変異性ＰｏｌＩを発現させることにより、突然変異誘発を誘導する至適化条件および方法を示す（実施例２で議論した）。
【図６】図６は、突然変異誘発（変異性ＰｏｌＩ突然変異体の発現による）における培養条件の効果を示す（実施例３で議論した）。
【図７】図７は、標的プラスミドのコピー数を示す（Ｄ４２４Ａ  Ｉ７０９Ｎ  Ａ７５９Ｒ変異性ＰｏｌＩが、至適化された条件下で発現される場合）。
【図８】図８Ａは、突然変異のポジションを示す。これらの突然変異は、ＣｏｌＥｌ複製開始点（ｏｒｉ）から１００ｂｐの距離で開始される、６５０ｂｐインターバル内に同定された（実施例５で議論した）。図８Ｂは、どれほど距離が、標的プラスミドにおける突然変異の頻度に影響するかを示す（実施例５で議論した）。
【図９】図９は、宿主（ＰｏｌＩに関して野生型で、ＤＮＡ修復の主経路に熟達している）におけるプラスミド突然変異誘発の割合（ｒａｔｅｓ）における、変異性Ｐｏｌ１発現の効果を示す（実施例６で議論した）。
【図１０】図１０は、アズトレオナム抵抗性の用量反応曲線を示す（アズトレオナムでの選択に続いて同定された突然変異の代表的なサブセット（ｓｕｂｓｅｔ）により得られた）。
【図１Ａ】
2005528114.tif 000006
【図１Ｂ】
2005528114.tif 000007
【図２】
2005528114.tif 000008
【図３】
2005528114.tif 000009
【図４】
2005528114.tif 000010
【図５Ａ】
2005528114.tif 000011
【図５Ｂ】
2005528114.tif 000012
【図６】
2005528114.tif 000013
【図７】
2005528114.tif 000014
【図８】
2005528114.tif 000015
【図９】
2005528114.tif 000016
【図１０】
2005528114.tif 000017
【国際調査報告】
2005528114.tif 000018
2005528114.tif 000019
2005528114.tif 000020