(57)【要約】血球が治療上及び／又は診断上重要な１つ以上のタンパク質及び／又はエフェクター分子を一時的又は安定的に発現し、場合によっては分泌する誘導血液組成物を血液から調製するための方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液から誘導血液組成物を調製する方法であって、血液に含まれる血球を少なくとも１つの核酸分子により、好ましくは少なくとも１つの治療上及び／又は診断上重要なタンパク質又はエフェクター分子をコードする核酸分子により一時的又は安定的に形質転換して、その血球が治療上及び／又は診断上重要なタンパク質及び／又はエフェクター分子を一時的又は安定的に発現し、場合によっては分泌する誘導血液組成物を得る、上記方法。
【請求項２】
誘導血液組成物が、少なくとも１つの治療上及び／又は診断上重要なタンパク質、例えば天然の又は改変されたＩＬ−１Ｒａ（ＩＲＡＰ；インターロイキン１受容体アンタゴニスト）等のサイトカインを、形質転換しない血液組成物より高い濃度で含む血液組成物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
誘導血液組成物が、形質転換しない血球では全く発現されないか又はその量では発現されない少なくとも１つのエフェクター分子、好ましくはタンパク質又はＲＮＡがその血球中で発現される血液組成物である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
採血装置（Entnahmesystem）により患者から血液を採取し、形質転換する血球を他の血液成分からあらかじめ分離せずに、血液を採血装置の中で少なくとも１つの核酸分子によって形質転換する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
患者から血液を採取し、血球特に核細胞を他の血液成分から分離し、血球を形質転換して、血清を含む若しくは含まない培地又は純血清中でインキュベートする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
採血装置により患者から血液を採取し、別の容器に満たし、形質転換する血球を他の血液成分からあらかじめ分離せずにこの容器の中で形質転換する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
核酸分子、特にＤＮＡ又はＲＮＡを固体担体、例えば大きな又は小さなガラス等の球又は磁性小球又は注射器の壁面に固定化して形質転換のために使用する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
核酸分子、特にＤＮＡ又はＲＮＡを場合によっては標識物質で標識して形質転換に使用する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
核酸分子、特にＤＮＡ又はＲＮＡを、核酸分子のトランスフェクション及び／又は発現を高める添加物とともに形質転換する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
核酸分子をエレクトロポレーションによって形質転換する、上記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
核酸分子が、身体固有のタンパク質の発現を誘導、抑制又は調節する分子、例えばアンチセンス構築物、ＲＮＡ要素、転写因子又は輸送因子をコードする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
核酸分子がベクター、例えばプラスミド又はウイルスに含まれている、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
核酸分子が少なくとも１つの調節要素、例えばプロモーター、エンハンサー又はイントロン、特に血球特異的調節要素に機能的に結合されている、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
核酸分子が細胞からのタンパク質分泌のためのシグナルペプチドをコードするヌクレオチド断片に機能的に結合されている、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも１つの誘導された、治療上及び／又は診断上重要なタンパク質を形質転換及び発現し、形質転換細胞から血清中に分泌させた後に、細胞を血清から分離して、誘導血清を得る、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも１つの核酸分子をリポソーム、ウイルスベクターによって、又は微小ガラス球に結合して形質転換する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
核酸分子による細胞、特に血液中に存在する細胞、例えば血球の形質転換のための方法であって、細胞又は血球を核酸分子と接触させ、細胞又は血液中に存在する血球を形質転換して、安定的又は一時的に形質転換された細胞又は血球を得る、上記方法。
【請求項１８】
形質転換の前に核酸分子を微小ガラス球に特に酸に不安定に共有結合する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ヒト又は動物の身体の治療方法であって、ヒト又は動物の身体から血液を好ましくは注射器で採取し、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法を実施し、誘導血液組成物、場合によっては形質転換血球及びその他の血液成分を分離した血清だけをヒト又は動物の身体に再適用する、上記方法。
【請求項２０】
全血、特に全血中の核細胞の形質転換、特に血液特に血球中のタンパク質の発現及び分泌のための微小ガラス球、特に結合された核酸を有する微小ガラス球の使用。
【請求項２１】
生体細胞、特に動物、植物又はヒト細胞の形質転換のための微小ガラス球、特に結合された核酸を有する微小ガラス球の使用。
【請求項２２】
治療上及び／又は診断上重要なタンパク質又はエフェクター分子をコードする核酸分子を血液の血球に形質転換するため、特に白血病の遺伝子治療及び／又は治療、神経系、運動器官又は各種の内臓の外傷性、変性性、慢性炎症性疾患の治療のための血液、特に全血の使用。
【請求項２３】
白血病の遺伝子治療用及び／又は治療、神経系、運動器官又は各種の内臓の外傷性、変性性、慢性炎症性疾患の治療のための医薬キットの調製のための血液の使用。
【請求項２４】
血液又は血球の形質転換並びに治療上及び／又は診断上重要なタンパク質又はエフェクター分子の発現及び場合によっては分泌のため、例えば白血病治療、神経系、運動器官又は各種の内臓の外傷性、変性性、慢性炎症性疾患の治療のための、特に治療上及び／又は診断上重要なタンパク質又はエフェクター分子をコードするヌクレオチド分子の使用。
【請求項２５】
血液又は血球の形質転換並びに治療上及び／又は診断上重要なタンパク質又はエフェクター分子の発現及び場合によっては分泌のため、例えば神経系、運動器官又は各種の内臓の外傷性、変性性、慢性炎症性疾患の治療のための医薬キットの調製のための、特に治療上及び／又は診断上重要なタンパク質又はエフェクター分子をコードするヌクレオチド分子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は実質的に、血球が治療上又は診断上重要な１種以上のタンパク質及び／又はエフェクター分子を一時的又は安定的に発現し、場合によっては分泌する、血液から誘導血液組成物を調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
真核組換えタンパク質の生産は手数がかかり、高価である。このようなタンパク質の正しいプロセシングも問題がある。タンパク質の治療効果の度合はこのタンパク質のプロセシングに大いに左右される。在来の組換えタンパク質は誤ったプロセシング、例えばグリコシル化の欠如により不十分な効果を示す。組換えタンパク質の正しいプロセシングは治療効果を何倍も高める。
【０００３】
不純物のない組換えタンパク質を調製するのは大変面倒である。しかし純度はその効果及び副作用の回避において大きな役割を果たす。在来の方法で調製された組換えタンパク質は不適合反応を引き起こすことがある。この反応は特にタンパク質製剤に含まれる不純物自体及びタンパク質及び／又は不純物に対して起こり得る生体反応、特に免疫反応に起因する。そこで動物又はヒトの身体の特に自家細胞から得られ、しかも容易に入手できる組換えタンパク質を調製しようと努める。
【０００４】
血球の種々の特異的断片のトランスフェクションは従来周知である。Van Tendelooら（Ge-ne Therapy(2000)7:1431-1437）はエレクトロポレーションによる一次ヒト血球への遺伝子転移システムを記述する。その場合血球として、それぞれ培養形態の活性化ヒトＴリンパ球及び／又はＣＤ３４＋型成人骨髄細胞がエレクトロポレーションによりトランスフェクションされる。トランスフェクションの前にＴリンパ球をＰＨＡ（受動血球凝集）の適用又はＣＤ３「架橋」及びインターロイキン２により活性化する。またHarrisonら（Bio Techniques(1995)19:816-823）も陽イオン性脂質による細胞系又は一次ヒト細胞、特に末梢血の単核細胞及び／又はＣＤ３４＋強化造血細胞への遺伝子転移を記述する。
【０００５】
例えば一次的機械的負荷による真核細胞のトランスフェクションのための代替法が記述されている。Costanzo及びFox（Genetics(1988)120:667-670）はＹＰＤ培地でプラスミドＤＮＡと小さなガラス球（「ガラスビーズ」）による酵母細胞の形質転換を記載する。その場合細胞を機械的に「摩擦し」、プラスミドＤＮＡの酵母細胞への進入を容易にするためにガラス小球が使用される。
【発明の開示】
【０００６】
本発明の根底にある技術問題は、先行技術から出発して、血球、特に自家血球から治療上及び／又は診断上重要な真核タンパク質、特に自家タンパク質を得ることを可能にする方法、及びこの方法の実施のための手段を提供することである。
【０００７】
この技術問題は、おおむね血球の一時的な遺伝的形質転換を行い、好ましくは直ちに、引続き血球を血清中で培養し、血清中で生成されたタンパク質を特に精製せずに、好ましくは引続き適用することによって解決される。本発明によれば、誘導血液組成物を血液から調製する方法において、血液、特に全血、即ち未精製及び／又は未分画の血液に含まれる血球を一時的に、即ちある期間に限って、又は安定的、即ち持続的に少なくとも１つの核酸分子、特にＤＮＡ又はＲＮＡで形質転換する方法によって、問題が解決される。本発明に基づき、少なくとも１つの核酸分子が少なくとも１つの遺伝子産物、好ましくはタンパク質、特に好ましくは治療上及び／診断上重要なタンパク質及び／又は少なくとも１つのエフェクター分子、例えばエフェクタータンパク質、又は好ましくは治療上又は診断上重要なタンパク質の血清濃度を調節し、好ましくは高める少なくとも１つの核酸分子、特にＲＮＡをコードすることが好ましい。本発明の方法の別の手法では、少なくとも１つの形質転換血球を含む誘導血液組成物がこうして得られ、この血液組成物が少なくとも１つの遺伝子産物、特に治療上及び／又は診断上重要なタンパク質及び／又はエフェクター分子を一時的又は安定的に発現し、好ましくは場合によってはこれを放出、即ち分泌する。特に別の手法では、誘導血液組成物から少なくとも１つの遺伝子産物、好ましくは治療上及び／又は診断上重要なタンパク質及び／又はエフェクター分子及び／又は少なくとも１つのエフェクター分子調節性の治療上及び／又は診断上重要なタンパク質が得られる。
【０００８】
その場合特に有利なのは、一方では原料として、他方では少なくとも１つの遺伝子産物のための生産系としての血液の利用が、好ましくは特に血清中で優先的に生産される少なくとも１つのタンパク質の適用とともに、特に簡単かつ安価なことである。また真核血球がタンパク質を正しくプロセシングすることも明らかになっている。しかも本発明に基づく、好ましくは自家又は異種生産系では、遺伝子産物の受容体に不適合反応をもたらす不純物又はその他の免疫原性成分が現われないことが特に有利である。本発明に基づき得られるエフェクター分子、即ち特に治療上及び／又は診断上重要なタンパク質の血清濃度を調節し、好ましくは高める遺伝子産物を利用する場合は、血液組成物が自家の、即ち給血者に由来する治療上及び／又は診断上重要なタンパク質だけを含むことが特に好都合である。こうして調製された血液組成物の適用、好ましくは再適用の際の免疫反応は事実上あり得ない。
【０００９】
本発明に基づく形質転換のために、少なくとも１つのエフェクター分子、特にエフェクタータンパク質をコードする核酸分子、又は多数の、好ましくはあらゆるタンパク質の生産を促すエフェクター分子を利用するならば、血球で同時に複数の、好ましくは自家タンパク質の生産及び／又は放出が促されることが特に好都合である。特にその場合はタンパク質が自然の数量比で生産及び／又は放出される。このようなエフェクター分子の例は、転写因子、シグナル導入鎖の一部であるタンパク質、細胞外シグナル分子、例えばサイトカイン又はアンチセンスＲＮＡである。多くの疾患は多因子の原因を有するから、複数の治療効果タンパク質を個別的生理的タンパク質比率で特に同時に生産することは、特に動物又はヒトの身体の治療のための医薬組成物の作用物質としてこのタンパク質を適用する上で特に好都合である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の方法の特殊な実施形態では、本発明に基づく誘導血液組成物が少なくとも１つの治療上及び／又は診断上重要なタンパク質を、形質転換しない血液組成物より高い濃度で有する。本発明における治療上及び／又は診断上重要なタンパク質は、好ましくはサイトカイン、例えば天然の又は改変されたインターロイキン−１受容体拮抗体、ＩＬ−１Ｒａ（ＩＲＡＰ）である。
【００１１】
本発明によれば、本発明に基づく誘導血液組成物の少なくとも１つの血球で少なくとも１つのエフェクター分子、特にエフェクタータンパク質を発現することが好ましい。形質転換しない血球では、このエフェクター分子が全く発現されないか、又はエフェクター分子、特にエフェクタータンパク質が、本発明の誘導血液組成物の少なくとも１つの血球が生産する量より低い量で発現される。
【００１２】
本発明の方法の別の好ましい実施形態では、誘導血液組成物を調製するために生体、特にヒト又は動物の身体、患者又は被験者から少なくとも１種の採取装置（Entnahmesystem）、好ましくは注射器により血液を採取する。本発明によれば注射器の中で血液を、少なくとも１つの核酸分子で形質転換し、その際形質転換される血球を、採取された血液の他の血液成分から分離、即ち分画しないことが好ましい。本発明の方法の変法においては、血液を少なくとも１つの採取装置、好ましくは注射器により採取し、続いて少なくとも１つの別の容器に満たす。本発明によれば、採取した血液をこの少なくとも１つの別の容器の中で、好ましくは形質転換される血球を他の血液成分から分離せずに、即ち未分画の血液、特に全血として形質転換することが好ましい。一変法では、採取した血液から血球、特に核細胞、例えば単核細胞、ＰＢＭＣを他の血液成分から分離し、血球を形質転換して、血清、特に自家血清、好ましくは上記の分離即ち分画の際に単離された血液成分として得られた自家血清を含む若しくは含まない培地で、又は純粋な、即ち未希釈の血清、特に純自家血清、好ましくは上記の分離の際に単離された血液成分として得られた純自家血清中でインキュベートする。
【００１３】
本発明によれば、少なくとも１つの形質転換される核酸分子はベクター、例えばプラスミド又はウイルスに含まれていることが好ましい。
【００１４】
本発明によれば、形質転換される少なくとも１つの核酸分子は、少なくとも１つの調整要素、例えばプロモーター、エンハンサー又はイントロン、特に少なくとも１つの血球特異的調整要素に機能的に結合されていることが好ましい。一変法では、形質転換される少なくとも１つの核酸分子が、細胞からのタンパク質分泌のためのシグナルペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド断片に機能的に結合されている。
【００１５】
本発明によれば、形質転換される核酸分子、特にＤＮＡ又はＲＮＡを、場合によっては少なくとも１つの標識物質で標識することが好ましい。一変法では、形質転換操作の終了の後に過剰の、即ち形質転換されなかったＤＮＡの除去のために、この標識物質を利用する。
【００１６】
本発明によれば、形質転換される核酸分子、特にＤＮＡ又はＲＮＡを、形質転換される核酸分子のトランスフェクション率及び／又は発現率を調節し、好ましくは増加する別の物質とともに形質転換することが好ましい。本発明によれば、別の物質は下記の機能の少なくとも１つを遂行することが好ましい。ａ）特異的な細胞型の表面を識別して、この細胞を特異的に形質転換する。ｂ）形質転換される核酸分子の、細胞への吸収効率を高める。ｃ）形質転換される核酸分子の核移行を最適化する。ｄ）形質転換細胞の導入遺伝子の転写効率を高める。
【００１７】
本発明の方法の特に好ましい実施形態では、少なくとも１つの形質転換される核酸分子、特にＤＮＡ又はＲＮＡを、少なくとも１種の固体担体、特に大きな又は小さな球、例えばガラス球、磁性小球、形質転換が行われる容器、特に注射器の壁面に固定化して、形質転換のために使用することが好ましい。
【００１８】
球、好ましくは微小ガラス球によるトランスフェクション（「ビーズ・トランスフェクション」）は、球、好ましくはガラス球を核酸分子、好ましくはプラスミドＤＮＡで被覆（「コート」）するシステムである。本発明に関連して「微小ガラス球」又は「ガラス球」とは、ガラス材料からなるガラス球だけでなく、その機能がガラスと同等な、特に核酸分子と共有及び／又は非共有結合することができる別の材料、例えば重合プラスチック、例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチロール、ポリ四フッ化エチレン、ポリアクリレート、ポリアミド、ポリカルボネート、ポリイミド、ポリアセテート、ポリオレフィン、シリコーン、ポリシラン、ラテックス等及び／又はその混合物からなる球をも意味する。また球を本発明に基づき磁性球（「マグネチック・ビーズ」）として形成することが好ましい。球又は粒子の大きさは好ましくは直径２ないし４ｍｍであるが、これより小さな粒子、特に１００μｍ以上の粒子、例えばガラス粉も使用することができる。
【００１９】
細胞がこの球に付着している間に、核酸分子、特にＤＮＡ又はＲＮＡ、好ましくはプラスミドＤＮＡが細胞に吸収され、細胞核に到達し、そこで発現される。本発明に基づき核酸分子を固体担体、例えば大小のガラス球及び／又は好ましくは注射器の形の採取装置の表面及び／又は採取された血液又は分離された血液画分と接触させられる別の容器に被着する。採取した血液の有核血球はこうした担体、例えば大きなガラス球に特異的に付着し、及び／又は小さな球の場合はこの担体を取り込む。
【００２０】
核酸分子による球の被覆は、共有又は非共有結合で行うことが好ましい。共有結合、特に酸に不安定な共有結合は、担体が食作用によって取り込まれる場合に好ましくは効果的である。非共有結合は、ＤＮＡが付着の後に吸収される場合に好ましくは効果的である。
【００２１】
代案及び／又は補助的形質転換方法として、エレクトロポレーションを行う。そこで本発明の方法の別の好ましい実施形態では、形質転換される血球のエレクトロポレーションによって、少なくとも１つの形質転換される核酸分子、特にＤＮＡ又はＲＮＡを形質転換する。好ましい実施形態では、形質転換される核酸分子は、身体固有のタンパク質の発現を誘導、抑制及び／又は調節する核酸分子、例えば少なくとも１種のアンチセンス構築物、ＲＮＡ要素、転位因子、転写因子を含み、特にこれからなる。
【００２２】
特定の電界を適用する場合、細胞は選ばれた電気的パラメーターに応じてある値からトランスフェクションされる。エレクトロポレーションによって、特に有核血球が形質転換される。これは特に血液から有核血球を事前に精製せずに行われる。即ち全血で有核血球を形質転換することが特に好都合である。エレクトロポレーションの際に「裸の」ＤＮＡを利用し、形質転換操作の終了の後に過剰の、即ち形質転換されなかったＤＮＡを再び除去することができるように、このＤＮＡを、場合によっては例えばビオチンで標識することが好ましい。
【００２３】
本発明の方法の特に好ましい実施形態では、形質転換を行い、少なくとも１つの形質転換遺伝子産物、特に治療上及び／又は診断上重要なタンパク質及び／又はエフェクターを少なくとも１つの形質転換血球で発現し、血球から血清に分泌した後、誘導血液組成物の少なくとも１つの血球及び場合によっては少なくとも１つの別の形質転換されなかった血球を血清から分離し、好ましくは無血球の誘導血清を得る。
【００２４】
本発明によれば、形質転換される核酸分子をリポソーム、ウイルスベクターにより、又は大きな及び／又は小さな球、特に微小ガラス球に結合して形質転換することが好ましい。場合によっては少なくとも１つの形質転換される核酸分子が大きな及び／又は小さな球に酸に不安定に結合される。
【００２５】
また本発明の主題は、特に血液中に存在する少なくとも１つの細胞、例えば血球の少なくとも１つの核酸分子による形質転換のための方法において、細胞及び／又は血球を核酸分子と接触させ、細胞及び／又は血液中に存在する血球を形質転換し、安定的又は一時的に形質転換された細胞及び／又は血球を得る方法である。その場合、本発明に基づき形質転換する核酸分子を、形質転換の前に大きな及び／又は小さな球、特に微小ガラス球に共有結合し、特に酸に不安定に結合することが好ましい。
【００２６】
本発明の別の主題は、ヒト又は動物の身体から好ましくは少なくとも１つの注射器により血液を採取し、上記の本発明の方法を実施して、特に誘導血液組成物を調製して行うヒト又は動物の身体の治療方法である。本発明によれば、誘導血液組成物を、好ましくは同じヒト又は動物の身体に再び適用し、好ましくは再適用する。特に血球及び／又はその他の血液成分、特に顆粒状成分、例えば赤血球及び／又はフィブリノーゲンを分離した後に、おおむね誘導血清だけをヒト又は動物の身体に適用することが好ましい。この方法の本発明に基づく変法においては、調製された誘導血液組成物、又は誘導血清を、同じ動物又はヒトの身体に適用するのではなく、むしろ別の動物又はヒトの身体に適用する。
【００２７】
本発明の別の主題は、核酸分子が共有結合された、特に酸に対し不安定に結合された大きな及び／又は小さな球、例えば微小ガラス球の、血液、好ましくは血液の核細胞の形質転換のための、特に全血での使用である。その場合本発明に基づき血液、特に血球でのタンパク質及び／又はエフェクターの発現及び分泌のために使用することが好ましい。また本発明の別の主題は、生体細胞、特に真核細胞、特に好ましくは植物、真菌又は動物、例えば哺乳動物細胞、特にヒト細胞の形質転換のための使用である。
【００２８】
最後に、本発明の別の主題は、治療、特に遺伝子治療の目的のため、好ましくは白血病の遺伝子治療及び／又は治療、神経系、運動器官又は各種の内臓の外傷性、変性性、慢性炎症性疾患の治療のために、少なくとも１つの治療上及び／又は診断上重要なタンパク質及び／又はエフェクター分子をコードする核酸を、血液、特に全血の少なくとも１つの血球に形質転換するために、血液、特に全血を使用することである。そこで本発明の別の主題は、特に本発明に基づき調製された誘導血液組成物及び／又は誘導血清から、上記の治療目的で医薬キットを調製するために血液、特に全血を使用することである。また本発明の別の主題は、上記の治療目的で血液、特に血液に含まれる少なくとも１つの血球の形質転換、並びに少なくとも１つの治療上及び／又は診断上重要なタンパク質及び／又はエフェクター分子の発現及び場合によっては分泌を行うために、特に治療上及び／又は診断上重要なタンパク質及び／又はエフェクター分子をコードする核酸分子を使用することである。また本発明の別の主題は、治療上及び／又は診断上重要なタンパク質及び／又はエフェクター分子をコードするこの核酸分子を、この形質転換のための医薬キットの調製に使用することである。
【００２９】
本発明によれば、患者自身の血球により少なくとも１つの治療上及び／又は診断上重要な好ましくは自家タンパク質の医薬生産を行い、続いて治療のために自家適用することが好ましい。あるいはまた、全血の採取の後に直ちに採取装置の中で血球の形質転換及びインキュベーションを行い、血清を精製して適用する。特に血液成分の分離又は単核末梢血、ＰＢＭＣ（pripheral blood mononuclear cells）の精製の後に形質転換を行う場合は、ａ）例えば分裂促進又は成長刺激物質、例えばインターロイキン２（ＩＬ−２）により成長を誘発せずに、又はｂ）分裂促進又は成長刺激物質、例えばＩＬ−２で成長を誘発して、形質転換を行うことが好ましい。
【００３０】
成長を誘発し、好ましくはリポソーム又はエレクトロポレーションにより形質転換した後に、引続き成長を誘発し又はせずに細胞を引続き培養する。特にエレクトロポレーションの場合は特に電界の利用が細胞の成長及び／又は細胞の発育を刺激することが明らかになっている。従って、電気刺激は公知の成長刺激物質の代替策として行われる。
【００３１】
形質転換を行った後の形質転換されなかった核酸分子、特にＤＮＡ及びＲＮＡの除去、特にインキュベーションの後のヒト血清からのＤＮＡの除去のために、本発明に基づきおおむね次の方法が行われる。好ましい変法では、形質転換のための核酸分子を担体に結合し、インキュベーションの後に血清を遠心分離し、遠心分離の後に所望のタンパク質を含む血清を取り出して、最後の担体及び細胞残留物を除去するために濾過し、その際形質転換されなかった核酸分子は担体とともに除去される。別の変法では、標識核酸分子を使用し、インキュベーションの後に標識核酸分子に対してアフィニティーを有する添加物、特に担体を加える。本発明に基づき、好ましくはビオチンで標識した核酸分子の場合は、ビオチン標識分子を結合するストレプトアビジンで被覆した担体を使用する。続いて遠心分離により、及び／又は磁性担体の場合は磁気により、担体を血清から取り除き、形質転換されないで担体に結合されている核酸分子を血清から除去する。別の変法では、形質転換されなかった核酸分子を含む血清を、核酸分子に対してアフィニティーを有する少なくとも１個のフィルターで精製する。例えば、ビオチンで標識した核酸分子はストレプトアビジンで被覆されたフィルターに結合する。この変法では、細胞残留物も形質転換されなかった過剰の核酸分子も１段階で除去されることが特に有利である。
【００３２】
下記の実施例と図に基づき、本発明を詳述する。
【実施例１】
【００３３】
ＤＮＡ被覆微小ガラス球による血球培養物の形質転換（「ビーズ・トランスフェクション」）
ａ）血球培養物
血球培養物は主として研究及び開発のために使用される系である。血球培養は全血の培養のために使用される。この方法は「ビーズ・トランスフェクション」およびＤＮＡの毒性試験のために利用される。
【００３４】
そのために研究プロトコルに従って４８ウエル型細胞培養プレート（Nunc、ウィースバーデン）を準備し、「ビーズ・トランスフェクション」のため、又はＤＮＡの毒性試験のために、微小ガラス球を用いる。続いて未凝固の全血を空洞部に入れる。４８ウエル型プレートでは空洞部当り約１ｍｌが使用される。全血の一部をゼロ試料として５０００×ｇで約５分間遠心分離し、続いて上澄み液を取り出し、９６ウエル型プレートの空洞部に入れる。ゼロ試料入りのプレートを密閉し、−８０℃で冷凍保存する。４８ウエル型細胞培養プレートも同じく密閉し、５％ＣＯ２飽和及び飽和大気湿度のもとで約３７℃で約２４時間インキュベートする。インキュベーションの後に４８ウエル型細胞培養プレートの試料の血清上澄み液を取り出し、同じく９６ウエル型プレートに入れる。試料入りの９６ウエル型プレートを分析まで−８０℃で冷凍保存する。
【００３５】
毒性試験又は発熱原性試験ではインターロイキン−１β含量を決定し、トランスフェクション実験では発現したリポーター又は標的タンパク質の含量を決定する。
【００３６】
別の構成の試験では容積をそれぞれ適当に調整する。
【００３７】
ｂ）プラスミドＤＮＡ、pcDNA-IL-1Raの生産
プラスミドpcDNA-IL-1Raはタンパク質をコードする少なくとも１つの配列（「コーディング領域」）及び真核細胞で有効な制御ユニット（「プロモーター」）を含む。それはｐｃＤＮＡ−１ベクター（Invitrogen社、カールスルーエ）中のコーディング領域、ＩＬ−１Ｒａ−ｃＤＮＡからなる。細菌懸濁液からのプラスミドＤＮＡの単離は市販の系（Quiagen Maxiprep（商標） endofree-Kit（商標）、Quiagen社）により製造元の指示書に従って行う。製造元が提案するすべてのチェックを行う。単離されたプラスミドの品質管理は周知のように特異的ＰＣＲ、制限消化（Restriktionsverdau)及び血液培養物の毒性試験又は発熱原性試験によってそれぞれ行われる。
【００３８】
ｃ）プラスミドＤＮＡ、pcDNA-IL-1Raの発熱原性試験
使用するＤＮＡは発熱原性がないことが必要である。発熱原性ＤＮＡを含む血球培養物（ａ)を参照）ではＩＬ−１β含量が平均２５００ｐｇ／ｍｌである。潜在的発熱物質とともにインキュベートした後のＩＬ−１β含量がＩＬ−１β−ＥＬＩＳＡテストの最低基準、即ち１５．２ｐｇ／ｍｌを超えなければ、ＤＮＡは発熱原性がない又は内毒素がないとみなされる。図１に発熱原性試験の結果を示す。
【００３９】
pcDNA-IL-1Raとともにインキュベートした場合、ＩＬ−１β含量の増加を検出することはできない。血球培養物でインキュベートしたpcDNA-IL-1Ra希釈系列の血清上澄み液のＩＬ−１β濃度は１５．２ｐｇ／ｍｌ未満であり、ＤＮＡは発熱原として作用しない。
【００４０】
ｄ）ガラス球の被覆
プラスミドＤＮＡを特定のｐＨ及び塩条件のもとでガラス球の表面に結合する。すべての種類及び品質のガラスがＤＮＡを非共有結合するわけでない。以下のようにして、担体がＤＮＡを非共有結合するのに適しているか否かを確かめる。
【００４１】
まず、被覆されるガラス球からすべての残留物、例えばガラス粉や不純物を除去するのに、どれだけの数の洗浄処理が必要であるかを確かめる。球として通常、下記の性質を有するRoth社（カールスルーエ）のガラス球が使用される。
【００４２】
大きさ          ２．８５ないし３．３ｍｍ
化学組成
ＳｉＯ２              ６８％
ＣａＯ                 ３％
ＢａＯ                 ６％
Ｋ２Ｏ                  ８％
Ｎａ２Ｏ              １０％
Ａｌ２Ｏ３               １％
Ｂ２Ｏ３                 ２％
無鉛
そのために球を５０ｍｌ小管に詰めて、ｐＨ５．５のリン酸緩衝液（１／１５ｍｏｌ／ｌＫＨ２ＰＯ３、１／１５ｍｏｌ／ｌＮａ２ＰＯ３）を注ぎ足すことによって、球を順次何回も洗浄する。何回も反転して球を洗浄し、続いて液を再び注出する。
【００４３】
ガラス球の高い清浄度を得るために、まず極めて低いｐＨ、即ち０．０１ないし２、又は極めて高いｐＨ、即ち１０ないし１４で、もしくは初めに高いｐＨ、続いて低いｐＨで、もしくは初めに低いｐＨ、続いて高いｐＨで予備洗浄することが好ましい。洗浄処理当りの洗浄時間は２分ないし１時間、好ましくは３０分である。酸又はアルカリ溶液による処理時間は２分ないし１時間、好ましくは３０分である。この酸またはアルカリ溶液処理と同時に、ガラス表面の修飾が行われる。この予備処理又は修飾は、慣用の有機及び／又は無機酸、例えば塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、クエン酸又は酢酸等、及び好ましくはクロム硫酸、好ましくは５０％クロム硫酸（例えばMerck（ダルムシュタット）、注文番号１．０２４９９．２５００、クロム硫酸をBiochrom超純水Ultra Pure Water Ｎｏ．Ｌ００４０で所望の希釈度まで希釈する）又はアルカリ溶液例えばカ性ソーダ溶液、カリ溶液、アンモニア水等を使用して行う。
【００４４】
汚染度は２００ないし８００、好ましくは２８０ｎｍ（ＯＤ２８０）の１つ以上の波長で光学密度（ＯＤ）の測光測定によって決定する。
【００４５】
通常は４回の洗浄処理の後にＯＤ２８０は一定である（表１を参照）。このことは除去可能な不純物粒子がガラス球から除去されたことを示す。
【００４６】
選択によっては、球をさらに純水（導電度最大約１μＳ）で、洗浄水の導電度が再び元の導電度に相当するまで洗浄する。次に洗浄処理をもう一度繰返す。この処置は、ＤＮＡの結合と臨床使用に悪影響を及ぼす恐れのある万一のイオン残留物を除去する。
【００４７】
結合緩衝液として、生理的溶液、例えばＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）を使用するのが理想的である。その場合は、細胞生理学的又は臨床的使用のために緩衝液のイオン強度と組成を調整しないでよいからである。５ないし７のｐＨ値範囲のＰＢＳでｐＨ値勾配を整え、ガラス球へのＤＮＡの結合をテストする。このために球を当該の緩衝液で１回ないし１０回、好ましくは４回洗浄し、pcDNA-IL-1Ra（１０μｇ／ｍｌＰＢＳ）とともに９０分インキュベートする。個々の処理の前後に２６０ないし２８０ｎｍでＯＤ測定により球の清浄度とＤＮＡの結合を検査する。
【００４８】
表１はガラス球から不純物粒子を除去するために４回の洗浄処理を行った後のＯＤ測定の代表的結果を示す。
【表１】
2005529857.tif 000002
【００４９】
球のＤＮＡ被覆の検査のために、球をＰＢＳ（表に示したｐＨ値）で４回洗浄して、球を緩衝液のイオンで飽和し、次にＤＮＡを含む緩衝液とともに種々の期間（３０、６０、９０、１２０、１５０及び１８０分）の間インキュベートする。個々の処理の前後に２６０及び２８０ｎｍでＯＤ測定を行なって、まず全ての粉末粒子が除去されたか、次いでどれだけのＤＮＡが付着しているかをチェックする。最大量のＤＮＡが球に結合する緩衝液のｐＨ値はｐＨ５．５である（図２を参照）。最大量のＤＮＡが付着しているインキュベーション時間は１．５時間である（図３を参照）。
【００５０】
表２は洗浄工程の検査及び球被覆試料中のＤＮＡ含量決定のためのＯＤ測定結果を示す。
【表２】
2005529857.tif 000003
【００５１】
別の研究のためのガラス球を無菌の５０ｍｌ小管に１５ｍｌまで詰め（約４００球）、ｐＨ値５．５のＰＢＳで４回洗浄し、個々の洗浄処理の際に入念に混合する。洗浄水中の不純物粒子を２８０ｎｍのＯＤ測定によりチェックする。次にｐＨ値５．５のリン酸緩衝液（１／１５ｍｏｌ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ３，１／１５ｍｏｌ／ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ３）にプラスミドＤＮＡを混合し（１５μｇ／ｍｌ）、１０ｍｌのこの溶液を洗浄した球に加える。１．５時間のインキュベーションの後にＤＮＡ溶液を取り除き、ＯＤ測定によって残留ＤＮＡ量を決定する。未結合のＤＮＡを除去するために、球をＰＢＳ（ｐＨ値５．５）で繰返し洗浄する。
【００５２】
ｅ）球の滅菌
滅菌がＤＮＡ及び結合を損傷してはならない。従って蒸気殺菌（ＤＮＡの変性をもたらす）や放射（ＤＮＡに突然変異を誘発する）は使用しない。
【００５３】
ＤＮＡで被覆した球の滅菌は、滅菌装置で４０ｍｌの７０％エタノールを加えて行う。２４時間のインキュベーションの後にエタノールを除去し、球をＰＢＳ（PAA Laboratories社、ケルベ）で４回洗浄する。エタノ−ルと洗浄水を２６０及び２８０ｎｍの測光吸収によりＤＮＡ分子について検査する。
【００５４】
ｆ）ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）による球上のＤＮＡの検出
ガラス球を上記のように被覆し、滅菌する。ガラス球へのＤＮＡの結合の一層明確な検出を行うために、敏感なＰＣＲ法を開発する。そのためにDNASTAR（商標）ソフトウエアによってプライマーを生じさせ、プライマーの反応条件（アニーリング温度、ＭｇＣｌ２濃度、延長時間等）を最適化する。
【００５５】
被覆した球からＤＮＡを解離するために、処理済の球と未処理の球を２００μｌのＴＥ中で９５℃に熱し、氷の上で１０分間インキュベートする。次にプラスミドＤＮＡの既知の濃度の希釈系列と比較することによって、球上のＤＮＡが検出されるか否かを調べる（図４を参照）。シュウ化エチジウムでバンド染色を行う。球の上澄み液のＰＣＲバンドの強さと既知のプラスミド濃度のバンドの強さを比較することによって、球の上澄み液のpcDNA-IL-1Ra含量を決定することができる。
【００５６】
未処理の球ではＤＮＡを検出することができなかったが（図示せず）、被覆した球にはＤＮＡが存在する。ＰＣＲ及びゲル電気泳動（図４を参照）により検出した後、球の上澄み液中のＤＮＡ濃度が少なくとも１μｇ／ｍｌであることを計算することができた。各球に０．２μｇのＤＮＡが付着している。
【００５７】
ｇ）細胞のトランスフェクション
血球培養物中でトランスフェクションを行う。ＤＮＡで被覆したガラス球を４８ウエル型細胞培養プレートＭＴＰ（Nunc社、ウィースバーデン）に入れ、１ｍｌのヘパリン処理全血とともに３７℃、５％ＣＯ２中でインキュベートする。２４時間のインキュベーションの後に血清上澄み液中の全タンパク質含量とリポーター又は標的タンパク質の含量を分析する。
【００５８】
ｈ）トランスフェクション後のヒト血清中のプラスミドＤＮＡのＰＣＲ検出限界の決定
臨床現場で本発明の方法を適用するためには、血清中にプラスミドＤＮＡがないことを保証しなければならない。これをＰＣＲにより検査する。
【００５９】
ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑポリメラーゼ）及びｄＮＴＰをQiagen社（ヒルデン）から「Supermix（商標）」として入手し、使用する。プライマーはInvitrogen（カールスルーエ）から入手する。その濃度を蒸留水で２０μｍｏｌ／ｌに調整する。
【００６０】
ＰＣＲ増幅のために次のプライマー対、配列番号１／配列番号２を使用する。
【００６１】
（配列番号１）GCGCTTGTCCTGCTTTCTGTTCTC
（配列番号２）TGGAGTTCCGCGTTACATA
ＰＣＲ増幅は、９４℃の変性（３０秒）、５８℃のアニーリング（３０秒）及び７２℃の伸長（４５秒）の３０サイクルで行う。増幅の検査はアガロースゲル電気泳動で行う。
【００６２】
プラスミドＤＮＡ量の検出限界を決定するために、ヒト血清とプラスミドＤＮＡの希釈系列を１：１で混合する。ＰＣＲにより検出された最小プラスミド濃度は１０ｎｇ／ｍｌである（図５を参照）。既知のプラスミド濃度の希釈系列でのＰＣＲにより１μｇ／ｍｌのＰＣＲ感度を決定することができる（図５のバンド２を参照）。
【００６３】
高い感度を得るために、「nested」ＰＣＲを行う。「nested」ＰＣＲを行うために別のプライマー対、配列番号３／配列番号４を使用する。
【００６４】
（配列番号３）GTCCTGCTTTCTGTTCTCGCTCAG
（配列番号４）AACTAGAGAACCCACTGCTTAC
ＰＣＲの検出限界を検出するために、血清とプラスミドＤＮＡ希釈系列を１：１で混合する。ヒト血清中のpcDNA-IL-1Raの検出可能な最終濃度は１０ｐｇ／ｍｌである（図６）。
【００６５】
ｉ）被覆した球の使用後のヒト血清中のpcDNA-IL-1Raの検出
トランスフェクションしないヒト血清をプラスミドＤＮＡ、pcDNA-IL-1Raの希釈系列と混合し、トランスフェクション後のヒト血清とＰＣＲで比較する。pcDNA-IL-1Raの希釈系列に基づきＰＣＲの感度を確かめることができる。それは１０ｐｇ／ｍｌである。図７はトランスフェクション後のヒト血清のＰＣＲによる分析を示す。トランスフェクション後のヒト血清では１０ｐｇ／ｍｌ以上のＤＮＡ量を検出することができない。このことはトランスフェクション後に血清中にＤＮＡが残留しないことを意味する。
【００６６】
ｋ）導入遺伝子の発現
標的細胞を、あらかじめ被覆した球とともに２４時間インキュベートし、続いてＩＬ−１Ｒａ及びＩＬ−１β測定を行う。対照として下記を使用する。
【００６７】
１．試験開始時の血清上澄み液
２．同様に処理した未被覆の球とともにインキュベートした後の血清上澄み液
３．球なしでインキュベートした後の血清上澄み液
試料の分析によれば、被覆した球とともにインキュベートした試料では、未被覆の球とともにインキュベートした試料及び球なしでインキュベートした試料と比較してＩＬ−１Ｒａ含量の増加を検出することができる（図８を参照）。ＩＬ−１β測定によれば、増加を検出することはできず、測定値は８．３２ないし１１．５１ｐｇ／ｍｌの間であった（図示せず）。このことは、ＩＬ−１Ｒａ生産が発熱原反応に起因せず、一時的形質転換の結果であるに違いないことを示す。
【実施例２】
【００６８】
注射器内のＤＮＡ被覆ガラスビーズによる形質転換
ａ）注射器の準備
無菌のガラス球、例えばRoth社（カールスルーエ）の顆粒、注文番号１７５５７．１又は下記のタイプの顆粒を使用する。
【００６９】
１）Roth
大きさ            ２．８５ないし３．３ｍｍ
化学組成（％）
ＳｉＯ２            ６８  
ＣａＯ               ３
ＢａＯ               ６
Ｋ２Ｏ                ８
Ｎａ２Ｏ            １０
Ａｌ２Ｏ３             １
Ｂ２Ｏ３               ２
無鉛
【００７０】
２）SiLi  5506／89-6
大きさ            ２．３ないし２．５ｍｍ
材料              硼珪ガラス
処理              １．研削法
２．研摩法
化学組成（％）
ＳｉＯ２            ８２  
Ｎａ２Ｏ              ２
Ａｌ２Ｏ３             ２
Ｂ２Ｏ３             １４
比重（ｋｇ／ｄｍ３）             ２２３
モース硬さ                          ７  
線膨張係数（２０−３００℃）    ３２５
加水分解階級（DIN ISO 719）         １
酸階級（DIN 12116）                 １
アルカリ溶液階級（DIN ISO 695）     ２
変態温度（℃）                  ５３０
【００７１】
３）SiLi 5004/99-5
大きさ              ２．５ｍｍ
材料                ソーダ石灰ガラス
処理                プレス法
化学組成（％）
ＳｉＯ２              ６７
Ｎａ２Ｏ              １６
ＣａＯ                 ７
Ａｌ２Ｏ３               ５
Ｂ２Ｏ３                 ３
ＭｇＯ                 ２
ＰｂＯ                なし
モース硬さ                        ６以上
【００７２】
４）Worf
大きさ              ２ないし３．５ｍｍ
材料                ソーダ石灰ガラス
処理                研摩及び熱固化
化学組成（％）
ＳｉＯ２              ６５
Ｎａ２Ｏ              １６
ＣａＯ                 ７
Ａｌ２Ｏ３               ５
Ｂ２Ｏ３                 ３
Ｍｇ                   ２
鉛含量                なし
密度（ｇ／ｄｍ３）                  ２．５４
モース硬さ                                  ６
加水分解階級                                ３
変形温度（℃）                          ５３０±１０
【００７３】
５）Duran
大きさ                ２ないし３．５ｍｍ
材料                  硼珪ガラス                
処理                  １．研削法
２．研摩法
化学組成（％）
ＳｉＯ２              ８１
Ｎａ２Ｏ，Ｋ２０        ４
Ａｌ２Ｏ３              ２
Ｂ２Ｏ３              １３
密度（ｇ／ｄｍ３）                   ２．２３
線膨張係数（２０−３００℃）        ３．２５
加水分解階級（DIN ISO 719）            １
酸階級（DIN 12116）                    １
アルカリ溶液階級（DIN ISO 695）        ２
変態温度（℃）                        ５２５
【００７４】
顆粒の表面を通常、市販のクロム硫酸製剤により、実施例１で説明したようにバッチ法で修飾するが、実施例１に挙げた他の酸及び／又はアルカリ溶液も使用することができる。続いて酸／アルカリ溶液残留物を洗い流すために、顆粒を水で洗浄する。次に顆粒を滅菌し、水で飽和するために、顆粒を２バールの圧力のもとで１２１℃で少なくとも２０分インキュベートする。続いて顆粒を８０℃で２０分間乾燥する。
【００７５】
最初の洗浄処理は無菌の５０ｍｌ小管で行う。次に約１５０個のガラス球を例えばＮｏ．００１３７型のプラスチック潅流注射器（Becton,Dickinson and Company、ハイデルベルク）に移し、注射器の中でＤＮＡで被覆する。ＤＮＡ溶液を放出し、球を洗浄する。その後のすべての処理は無菌室で行う。滅菌のために７０％エタノールを注入し、注射器を閉鎖し、約２４時間インキュベートする。次にＰＢＳ（PAA Laboratories、ケルベ）による洗浄処理が続き、その際ＰＢＳを上から注入し、再び流出させる。注射器の大きさに合わせて１、２、４又は１０ｃｍ３、場合によってはそれ以上又は以下の処理済の球を第２の無菌の注射器に詰め替える。場合によっては注射器に滅菌及び修飾した顆粒のほかに、十分な量の抗凝固物質例えばヘパリン（Liquemin（商標）, Heparin-Natrium（商標） 2500 I.E.）又はクエン酸ナトリウムを充填する。この注射器を閉じて、溶封する。
【００７６】
ｂ）注射器の一般的使用
利用者は包装から無菌の器具を取り出し、患者から血液を採取する。注射器はシールキャップの表面に隔膜を備えている。採血のために購入付属品即ちアダプターの針でこの隔膜を刺し通す。アダプターを取り除くと、隔膜が自動的に再び閉鎖される。採血の後、注射器のピストンを予定破断点で折る。図１２はこの注射器の好ましい実施形態を示す。
【００７７】
次に血液入りの注射器を約３７℃ないし４１℃で２４時間インキュベートする。インキュベーションは横置きで行う。血液を詰め替えて、遠心分離することが好ましい。遠心分離の後に例えば０．２μｍの無菌の付属フィルターで血漿を取り除く。
【００７８】
ｃ）臨床使用のための注射器の実験的適用
処理済の注射器で自発的給血者から血液を採取する。対照としてORTHOKIN（登録商標）注射器（ORTHOGEN社、ジュッセルドルフ）、ゼロ試料として球なしの潅流注射器及び１０ｍｌ血清管（Sarstedt社、ニュンブレヒト）を購入する。ゼロ試料は購入の後直ちに４℃で４０００×ｇで１０分間遠心分離し、血清上澄み液を−２０℃で冷凍保存する。注射器を３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートする。インキュベーションの後に血清を取り出し、すべての血球を除去するために、４℃で４０００×ｇで１０分間遠心分離する。上澄み液を２０ｍｌ注射器（Sas-tedt社、ニュンブレヒト）で吸引し、０．２μｍフィルター（Minisart（商標）、Satorius社）で濾過除菌し、１．８ｍｌ小管に充填する。血清を−２０℃で冷凍し、分析のために保存する。
【００７９】
系の臨床使用可能性を判断するために、得た血清を入念に分析する。輸血医療で慣用の血液製品の品質検査、例えばＨＣＶ、ＨＢＶ、ＨＩＶ及び梅毒のスクリーニングのほかに無菌性試験及び導入遺伝子活性の測定を行う。慣用の品質検査が実行可能であり、不利な影響を受けないことが保証されなければならない。
【００８０】
採取装置としての注射器の利用は臨床的適用を可能にする。輸血医療で慣用の血液製品の品質検査、例えばＨＣＶ、ＨＢＶ、ＨＩＶ及び梅毒のスクリーニングは、テストしたすべての系で同じ結果をもたらす。無菌性試験は、すべての系で血清の処理の後に細菌が現われないことを示した。
【００８１】
ゼロ試料及びORTHOKIN（登録商標）注射器（比較例）と比較して、本発明に基づく調合物のＩＬ−１Ｒａ含量の増加を確かめることができる（図９）。一方、ＩＬ−１β含量の増加を検出することはできず、測定値は７．２ないし１０．９ｐｇ／ｍｌである（図示せず）。このことは、ＩＬ−１Ｒａ生産が発熱原反応に原因せず、一時的形質転換の結果であるに違いないことを示す。
【００８２】
ｄ）臨床成績
患者集団で上記の系により１８回の治療的適用を行い、臨床的に評価する。運動器官の変性性および炎症性疾患により膝又は踝関節の軟骨欠損がある患者を取り上げる。
【００８３】
効果及び副作用の判定は放射線で記録し、WOMAC評点、VAS評点及び既往歴データに基づいて判定した。
【００８４】
効果については、検査及び治療を受けたすべての患者の治療した関節で半年の観察期間中に顕著かつ意外な、極めて有意義な苦痛抑制、可動性の改善、一般所見の改善を観察することができる。重大な副作用は現われない。
【実施例３】
【００８５】
単核血球（ＰＢＭＣ）の形質転換
ａ）ＰＢＭＣの単離と培養
ＰＢＭＣ（単核血球）の単離のために密度勾配溶液を使用する。この目的のために未凝固の全血を等量部の培地又は生理的塩溶液（例えばダルベッコのＰＢＳ）で希釈する。５０ｍｌ遠心分離管に１２．５ｍｌの分離液（密度１．０７７ｇ／ｍｌ）を仕込み、希釈した全血を分離液上に入念に積層する（管当り約２５ｍｌまで）。１５ないし２５℃で管を４００×ｇで３０分間遠心分離する。遠心分離の後に単核細胞は血漿と勾配溶液の間に白色の境界層を形成する。赤血球と顆粒球は沈殿物中にあり、血小板は血清中にある。
【００８６】
まず血漿を、次いで単核細胞をピペットで入念に取り出し、別々に無菌の小管に移す。単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む細胞懸濁液を等量部の培地又は生理的塩溶液（ダルベッコのＰＢＳ）と混合し、２５℃で２５０×ｇ、無制動で１０分間遠心分離する。ペレットを再懸濁し、細胞を細胞培地RPMI 1640（Ｌ-グルタミンを含む）（Invitrogen、カールスルーエ、注文番号21875034）で２ないし３回洗浄する。
【００８７】
ｂ）エレクトロポレーション
エレクトロポレーションではＤＮＡ溶液の存在下で細胞懸濁液に１回以上の電気パルスをかける。こうして細胞膜に穴が作られ、この穴を通ってＤＮＡが細胞中に侵入することができる。穴の形成は様々な要因に左右され、エレクトロポレーションの後に穴が再び閉鎖されなければならない。このためには特に温度とエレクトロポレーション媒質が決定的である。ＤＮＡの取り込みの後、ＤＮＡは核内に移動し、核で転写される。パルスによって核内への移動が電気泳動的に促進される。通常、様々なパルスが使用される。最初の１以上のパルスは短くて強く、即ち高い電界強度を有し、後続のパルスは場合によってはより弱く、種々のパラメータ（下記を参照）を有することができる。
【００８８】
ＰＢＭＣのエレクトロポレーションのために下記の条件が使用される。
【００８９】
細胞数              細胞１０４ないし１０１０個／ｍｌ、好ましくは細胞１０７個／ｍｌ
ＤＮＡ量            １回当り１ないし１００μｇ、好ましくは１回当り２０μｇ
電界強度            １０ないし２５００Ｖ／ｃｍ、即ち４ｍｍキュベットで４ないし１０００Ｖ、好ましくは１５００Ｖ／ｃｍ、即ち６００Ｖ
パルス数            １ないし１００、好ましくは１０
パルス持続時間      １ないし１５００μ秒、好ましくは０．１秒
パルス間隔          ０．０１ないし１秒、好ましくは１秒
容量                １０ないし４０００μＦ、好ましくは１０５０μＦ
エレクトロポレーション媒質      RPMI
RPMI+10-30%FCS
RPMI+10-30%AP, PBS
好ましくはRPMI+10%AP
ｃ）成長刺激因子の影響
成長刺激因子を混合した培地でＰＢＭＣをインキュベートする。３７℃、５％ＣＯ２で、好ましくは成長刺激物質、例えば１０−３０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（Roche、マンハイム）又は２−１０μｇ／ｍｌのＰＨＡ−Ｍ（Roche、マンハイム）を加えた１０％自家血漿を含む、ＲＰＭＩ  １６４０中で培養を行う。
【００９０】
３日間のインキュベーションの後にエレクトロポレーションを行う。培地の組成はＲＰＭＩ＋１０％ＡＰ＋１０Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２である。エレクトロポレーションは下記の条件で行う。即ちｍｌ当りの細胞１０７個、ＤＮＡ２０μｇ、４ｍｍキュベットで１５００Ｖ／ｃｍ、パルス数１０、パルス持続時間０．１秒、パルス間隔１秒、続いて氷上で１５分インキュベーション。
【００９１】
図１０はpVaxLacZでＰＢＭＣをエレクトロポレーションした後のβガラクトシダーゼ比活性を示す。ＤＮＡとともにエレクトロポレーションした試料のβガラクトシダーゼ比活性は、エレクトロポレーションしない、又はＤＮＡなしでエレクトロポレーションした対照試料と比較して著しく増加することが明らかである。
【実施例４】
【００９２】
顆粒入りガラス注射器の調製
注射器の調製のために新品の製造元包装の注射器の内部構造表面及び新品の製造元包装のガラス粒を実施例１に従って洗浄し、修飾する。そのために酸及び／又はアルカリ溶液を１回ないし１０回、好ましくは３回完全に吸引及び射出することによって注射器を処理し、これにより清浄又は修飾される。最後の吸引の後に、密封した充填状態で注射器を酸及び／又はアルカリ溶液とともに５ないし３０分インキュベートする。続いて注射器ピストンを取り除き、新しい超純水を完全に充填及び放出することにより注射器シリンダーを２回ないし１０回、好ましくは４回よく洗浄する。その際洗浄水を完全に充填し、空にするように注意する。次に注射器ピストンを酸及び／又はアルカリ溶液にひたし、蒸留水でよく洗浄する。
【００９３】
注射器の迅速な乾燥を保証するために、注射器の中におそらくある残水はリュエル型コネクターを軽く叩いて毛管作用で吸い出す。互いに切り離されたピストンと、注射器及び場合によってその中に収容されたガラス粒を表示区画付きのMelagフィルム（Melag，Melafol 1502）に溶封する（Melag，Melaseal）。こうして包装した注射器を乾燥棚（Melag乾燥滅菌装置）で８０℃で６０分間乾燥する。乾燥した包装注射器を続いて１３２℃、２バールで３０分高圧滅菌し、８０℃で少なくとも６０分間もう一度乾燥する。
【００９４】
顆粒は塩溶液／緩衝液で何回も洗浄し、プラスミド−塩溶液中で少なくとも２時間インキュベートする。このプラスミドは、タンパク質及び／又はエフェクター分子をコードする少なくとも１つの配列及び真核細胞で有効な少なくとも１つの調節要素、例えばプロモーター例えばpcDNA1-IL-1Raを含む。高いタンパク質及び／又はエフェクター生産のために決定的なのは、使用するＤＮＡが発熱物質を含まないことである。被覆した球又は顆粒はインキュベーションの後に洗浄し、周知のように、好ましくは実施例１に示したようにエタノール又はガスで滅菌する。
【００９５】
ガラス注射器を使用する前に、その後収容される血液の凝固を防止するために、注射器にヘパリン（例えばLiquemin（商標） N2500、Heparin-Natrium（商標） 2500I.E.）又はクエン酸塩（例えばＡＣＤＡ）を入れる。ＩＬ−１Ｒａ含有血清を処理するときに凝固剤の使用が好都合である。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】プラスミドpcDNA-IL-1Raの発熱原性試験による血球培養中のＩＬ−１β含量の図を示す。
【図２】ガラス球へのＤＮＡ結合と緩衝液のｐＨ値との関係図を示す。
【図３】ガラス球へのＤＮＡ結合とＤＮＡ含有緩衝液中のインキュベーション時間との関係図を示す。
【図４】ＴＥ中のpcDNA-IL-1Raの希釈系列及び球洗浄水のＰＣＲの後のアガロースゲル（２％）電気泳動の結果を示す（シュウ化エチジウム染色）。矢印は比較可能な希釈段階を示す。
【図５】ヒト血清中のpcDNA-IL-1Raの希釈系列のＰＣＲの後のアガロースゲル（２％）電気泳動の結果を示す（シュウ化エチジウム染色）。対照は「鋳型」ＤＮＡを含まない（「水対照」）。
【図６】ヒト血清中のpcDNA-IL-1Raの「nested」ＰＣＲの後のアガロースゲル（２％）電気泳動の結果を示す（シュウ化エチジウム染色）。対照は「鋳型」ＤＮＡを含まない（「水対照」）。
【図７】ヒト血清中のpcDNA-IL-1Raの希釈系列のＰＣＲの後のアガロースゲル（２％）電気泳動の結果を示す（本発明に基づく「ビーズ・トランスフェクション」注射器系及びORTHOKIN（登録商標）系の試料、シュウ化エチジウム染色）。
【図８】血球培養中での「ビーズ・トランスフェクション」の後のＩＬ−１Ｒａ含量の図を示す。
【図９】全血を２４時間インキュベートした後の血清上澄み液中のＩＬ−１Ｒａ含量の図、即ち本発明に基づく「ビーズ・トランスフェクション」注射器系とORTHOKIN（登録商標）系、球なしの潅流注射器及びゼロ試料との比較を示す。
【図１０】ｐＶａｘＬａｃＺによるＰＢＭＣのエレクトロポレーションの後のβガラクトシダーゼ比活性の図を示す。
【図１１】ピストン（３）、任意のねじ戻し可能な蓋（５）、蓋突出部（１３）及びその上に配置され、これを密閉する取外し可能な隔膜付きキャップ（７）を有するガラス又はプラスチック製の本発明に基づき使用される注射器の概略図である。ピストン（３）は予定破断点（１５）を有することが好ましい。注射器の空洞の中に本発明に基づく被覆された顆粒（９）も示されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年3月2日(2004.3.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液から誘導血清組成物を調製する方法であって、血液に含まれる血球を少なくとも１つの核酸分子により、好ましくは少なくとも１つの治療上及び／又は診断上重要なタンパク質又はエフェクター分子をコードする核酸分子により一時的又は安定的に形質転換して、その血球が治療上及び／又は診断上重要なタンパク質及び／又はエフェクター分子を一時的又は安定的に発現し、場合によっては分泌する誘導血液組成物を得、続いて細胞を血清から分離し、誘導血清組成物を得る、上記方法。
【請求項２】
誘導血液組成物が少なくとも１つの治療上及び／又は診断上重要なタンパク質、例えばサイトカイン、例えば天然の又は改変されたＩＬ−１Ｒａ（ＩＲＡＰ；インターロイキン１受容体アンタゴニスト）を、形質転換しない血液組成物より高い濃度で含む血液組成物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
誘導血液組成物が、形質転換しない血球では全く発現されないか又はその量では発現されない少なくとも１つのエフェクター分子、好ましくはタンパク質又はＲＮＡがその血球中で発現される血液組成物である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
採血装置（Entnahmesystem）により患者から血液を採取し、形質転換する血球を他の血液成分からあらかじめ分離せずに、血液を採血装置の中で少なくとも１つの核酸分子によって形質転換する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
患者から血液を採取し、血球特に核細胞を他の血液成分から分離し、血球を形質転換して、血清を含む又は含まない培地もしくは純血清中でインキュベートする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
採血装置により患者から血液を採取し、別の容器に満たし、形質転換する血球を他の血液成分からあらかじめ分離せずにこの容器の中で形質転換する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
核酸分子、特にＤＮＡ又はＲＮＡを固体担体、例えば大きな又は小さなガラス等の球又は磁性小球又は注射器の壁面に固定化して形質転換のために使用する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
核酸分子、特にＤＮＡ又はＲＮＡを場合によっては標識物質で標識して形質転換に使用する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
核酸分子、特にＤＮＡ又はＲＮＡを核酸分子のトランスフェクション及び／又は発現を高める添加剤とともに形質転換する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
核酸分子をエレクトロポレーションによって形質転換する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
核酸分子が身体固有のタンパク質の発現を誘導、抑制又は調節する分子、例えばアンチセンス構築物、ＲＮＡ要素、転写因子又は輸送因子をコードする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
核酸分子がベクター、例えばプラスミド又はウイルスに含まれている、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
核酸分子が少なくとも１つの調節要素、例えばプロモーター、エンハンサー又はイントロン、特に血球特異的調節要素に機能的に結合されている、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
核酸分子が細胞からのタンパク質分泌のためのシグナルペプチドをコードするヌクレオチド断片に機能的に結合されている、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも１つの核酸分子をリポソーム、ウイルスベクターによって、又は微小ガラス球に結合して形質転換する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
核酸分子による細胞、特に血液中に存在する細胞、例えば血球の形質転換のための方法であって、細胞又は血球を核酸分子と接触させ、細胞又は血液中に存在する血球を形質転換して、安定的又は一時的に形質転換された細胞又は血球を得、かつ形質転換の前に核酸分子を微小ガラス球に共有結合し、特に酸に不安定に結合する方法。
【請求項１７】
ヒト又は動物の体の治療方法であって、ヒト又は動物の体から好ましくは注射器で血液を採取し、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法を実施し、形質転換された血球及び血液成分を分離した後に、誘導血清組成物を該ヒト又は動物の体に再適用する、上記方法。
【請求項１８】
全血、特に全血中の核細胞の形質転換、血液特に血球中のタンパク質の発現及び分泌のための微小ガラス球、特に結合された核酸を有する微小ガラス球の使用。
【請求項１９】
生体細胞、特に動物、植物又はヒト細胞の形質転換のための微小ガラス球、特に結合された核酸を有する微小ガラス球の使用。
【請求項２０】
治療上及び／又は診断上重要なタンパク質又はエフェクター分子をコードする核酸分子により血球を形質転換するための、血液、特に全血の使用。
【請求項２１】
白血病の治療のために、治療上及び／又は診断上重要なタンパク質又はエフェクター分子をコードする核酸分子により血球を形質転換するための、血液、特に全血の使用。
【請求項２２】
神経系の外傷性、変性性、慢性炎症性疾患の治療のために、治療上及び／又は診断上重要なタンパク質又はエフェクター分子をコードする核酸分子により血球を形質転換するための、血液、特に全血の使用。
【請求項２３】
運動器官の外傷性、変性性、慢性炎症性疾患の治療のために、治療上及び／又は診断上重要なタンパク質又はエフェクター分子をコードする核酸分子により血球を形質転換するための、血液、特に全血の使用。
【請求項２４】
内臓の外傷性、変性性、慢性炎症性疾患の治療のために、治療上及び／又は診断上重要なタンパク質又はエフェクター分子をコードする核酸分子により血球を形質転換するための、血液、特に全血の使用。
【請求項２５】
治療上及び／又は診断上重要なタンパク質又はエフェクター分子をコードする核酸分子により血液の血球を形質転換する医薬キットの調製のための血液の使用。
【請求項２６】
白血病の治療用の医薬キットの調製のための血液の使用。
【請求項２７】
神経系の外傷性、変性性、慢性炎症性疾患の治療用の医薬キットの調製のための血液の使用。
【請求項２８】
運動器官の外傷性、変性性、慢性炎症性疾患の治療用の医薬キットの調製のための血液の使用。
【請求項２９】
内臓の外傷性、変性性、慢性炎症性疾患の治療用の医薬キットの調製のための血液の使用。
【請求項３０】
請求項１６に記載の方法による血液又は血球の形質転換並びに治療上及び／又は診断上重要なタンパク質又はエフェクター分子の発現及び分泌のための、特に治療上及び／又は診断上重要なタンパク質又はエフェクター分子をコードする核酸分子の使用。
【請求項３１】
白血病の治療のための、血液又は血球の形質転換並びに治療上及び／又は診断上重要なタンパク質又はエフェクター分子の発現及び場合によっては分泌のための、特に治療上及び／又は診断上重要なタンパク質又はエフェクター分子をコードする核酸分子の使用。
【請求項３２】
神経系の外傷性、変性性、慢性炎症性疾患の治療のための、血液又は血球の形質転換並びに治療上及び／又は診断上重要なタンパク質又はエフェクター分子の発現及び場合によっては分泌のための、特に治療上及び／又は診断上重要なタンパク質又はエフェクター分子をコードする核酸分子の使用。
【請求項３３】
運動器官の外傷性、変性性、慢性炎症性疾患の治療のための、血液又は血球の形質転換並びに治療上及び／又は診断上重要なタンパク質又はエフェクター分子の発現及び場合によっては分泌のための、特に治療上及び／又は診断上重要なタンパク質又はエフェクター分子をコードする核酸分子の使用。
【請求項３４】
内臓の外傷性、変性性、慢性炎症性疾患の治療のための、血液又は血球の形質転換並びに治療上及び／又は診断上重要なタンパク質又はエフェクター分子の発現及び場合によっては分泌のための、特に治療上及び／又は診断上重要なタンパク質又はエフェクター分子をコードする核酸分子の使用。
【請求項３５】
請求項１６に記載の方法により血液又は血球を形質転換するための医薬キットを調製するための、特に治療上及び／又は診断上重要なタンパク質又はエフェクター分子をコードする核酸分子の使用。
【請求項３６】
白血病の治療用の医薬キットの調製のための、特に治療上及び／又は診断上重要なタンパク質又はエフェクター分子をコードする核酸分子の使用。
【請求項３７】
神経系の外傷性、変性性、慢性炎症性疾患の治療用の医薬キットの調製のための、特に治療上及び／又は診断上重要なタンパク質又はエフェクター分子をコードする核酸分子の使用。
【請求項３８】
運動器官の外傷性、変性性、慢性炎症性疾患の治療用の医薬キットの調製のための、特に治療上及び／又は診断上重要なタンパク質又はエフェクター分子をコードする核酸分子の使用。
【請求項３９】
内臓の外傷性、変性性、慢性炎症性疾患の治療用の医薬キットの調製のための、特に治療上及び／又は診断上重要なタンパク質又はエフェクター分子をコードする核酸分子の使用。
【国際調査報告】
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