(57)【要約】本発明は、活性化Ｔリンパ球から放出される小胞を含む組成物はもとより、その製造かつ使用の方法にも関する。該小胞は、顕著な特性、たとえば抗原認識、抗原提示その他の調節およびエフェクター機能を与える一連の生物活性分子を含有する。本発明は、該小胞を用いて、抗原性分子（たとえばペプチド、ペプチド／ＭＨＣ複合体、ＴＣＲまたはそのサブユニット等）を抗原提示細胞（ＡＰＣ）に移転または送達して、特異的な免疫応答、特に特異的なＣＴＬ応答を誘導する方法にも関する。本発明は、さらに、該小胞を用いて、分子を標的細胞に選択的または特異的に送達する方法にも関する。
2005528091.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質小胞を生成する方法であって、
（ａ）Ｔリンパ球からの膜小胞の放出を可能にする条件下で、Ｔリンパ球を含む生物学的標品を培養する工程と、
（ｂ）（ａ）で生成された小胞を捕集または精製する工程とを含み、
該リンパ球または小胞を、選ばれた分子を発現するよう機能化する
方法。
【請求項２】
該Ｔリンパ球を、培養体の中で拡張かつ活性化する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ｔ細胞を、ＴＣＲ活性化剤の存在下で培養する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
該Ｔリンパ球を、サイトカイン、マイトジェンまたはカルシウムイオノホアの存在下で培養する、請求項２記載の方法。
【請求項５】
該生物学的標品が、末梢血Ｔ細胞、Ｔ細胞系、Ｔ細胞クローン、ハイブリドーマまたは悪性Ｔ細胞を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
生物学的標品を、Ｔ細胞サブセットについて富化する、請求項１記載の方法。
【請求項７】
生物学的標品が、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、γδＴ細胞、ＣＤ４＋細胞またはＣＤ８＋細胞について富化されるか、またはそれらを本質的に含む、請求項１記載の方法。
【請求項８】
生物学的標品がＴ細胞系である、請求項１記載の方法。
【請求項９】
Ｔ細胞が、生物学的活性分子をコードしている組換えポリヌクレオチドを含むか、またはそれをトランスフェクションしている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
抗原性分子を小胞に直接装荷することによって、小胞の機能化を実施する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ラクトアドヘリンもしくはＥ２糖タンパク質、またはそのフラグメントもしくは変異型に融合させた活性部分を含む、キメラ分子を小胞にキメラ的に装荷することによって、小胞の機能化を実施する、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
単独または併用のいずれかでの濾過、遠心分離、イオンクロマトグラフィーもしくは濃縮によって、小胞を捕集もしくは精製する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
免疫原性小胞を生成する方法であって、
（ａ）Ｔリンパ球からの膜小胞の放出を可能にする条件下で、Ｔリンパ球を含む生物学的標品を培養する工程と、
（ｂ）（ａ）で生成された小胞を捕集または精製する工程と、
（ｃ）分子が該小胞に結合するのを可能にする条件下で、該小胞を抗原性分子に接触させ、免疫原性小胞を生成する工程と
を含む方法。
【請求項１４】
抗原性分子が、ペプチド、タンパク質、脂質または糖脂質である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
抗原性分子が、ＨＣＶのエンベロープ糖タンパク質、またはそのＣＤ８１結合性フラグメントを含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
分子が、ラクトアドヘリンもしくはＨＣＶ糖タンパク質、またはそのフラグメントもしくは変異型に融合させたポリペプチドを含むキメラタンパク質である、請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
機能化された小胞を生成する方法であって、
（ａ）Ｔリンパ球からの膜小胞の放出を可能にする条件下で、Ｔリンパ球を含む生物学的標品を培養する工程（生物学的標品は、選ばれた分子をコードしている組換え核酸を含むＴリンパ球を含む）と、
（ｂ）（ａ）で生成された小胞を捕集または精製する工程（該小胞（または少なくともそのいくつか）は、該選ばれた分子を含む）と、
を含む方法。
【請求項１８】
小胞を生成する方法であって、
（ａ）Ｔリンパ球からの膜小胞の放出を可能にする条件下で、決定されたＴ細胞受容体を有するＴリンパ球のクローンまたはイディオタイプの集団を培養する工程と、
（ｂ）（ａ）で生成された、該特定のＴ細胞受容体をその表面で発現する小胞を捕集または精製する工程と、
を含む方法。
【請求項１９】
小胞を生成する方法であって、
（ａ）Ｔリンパ球からの膜小胞の放出を可能にする条件下で、Ｔ細胞系を培養する工程と、
（ｂ）（ａ）で生成された小胞を捕集または精製する工程と、
を含む方法。
【請求項２０】
脂質小胞を生成する方法であって、
（ａ）Ｔ細胞活性剤の存在下でＴリンパ球を含む生物学的標品を培養して、Ｔリンパ球からの膜小胞の放出を可能にする工程と、
（ｂ）（ａ）で生成された小胞を捕集または精製する工程と、
を含む方法。
【請求項２１】
医薬組成物を生成する方法であって、
（ａ）Ｔリンパ球からの膜小胞の放出を可能にする条件下で、Ｔリンパ球を含む生物学的標品を培養する工程と、
（ｂ）（ａ）で生成された小胞を捕集または精製する工程と、
（ｃ）薬学的に許容され得る担体または賦形剤中に該小胞を調整する工程と
を含む方法。
【請求項２２】
Ｔリンパ球から得られる膜小胞と、薬学的に許容され得る担体または賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項２３】
小胞が、選ばれた分子、たとえば薬物または抗原性分子、より好ましくは該小胞内に存在するＭＨＣ分子と外来抗原性ペプチドとの複合体を含む、請求項２２記載の医薬組成物。
【請求項２４】
対象における抗原に対する免疫応答を刺激する方法であって、請求項２２の組成物の有効量を対象に投与する工程を含む方法。
【請求項２５】
対象における抗原に対する免疫応答を刺激する方法であって、
（ａ）Ｔリンパ球からの膜小胞の放出を可能にする条件下で、Ｔリンパ球を含む生物学的標品を培養する工程と、
（ｂ）（ａ）で生成された、免疫原性である小胞を捕集または精製する工程と、
（ｃ）薬学的に許容され得る担体または賦形剤中に該小胞を調整する工程と、
（ｄ）該小胞を、免疫応答を刺激するのに有効な量にて対象に投与する工程と
を含む方法。
【請求項２６】
抗原性分子を抗原提示細胞に送達する方法であって、抗原提示細胞を、請求項２２記載の組成物または該抗原性分子を含む免疫原性小胞にインビトロもしくはエキソビボで接触させる工程を含む方法。
【請求項２７】
樹状細胞を刺激する方法であって、請求項２２記載の組成物または免疫原性小胞に樹状細胞を接触させる工程を含む方法。
【請求項２８】
標的細胞に分子を送達する方法であって、請求項２２の組成物、または該分子を含む免疫原性小胞に該標的細胞を接触させる工程を含む方法。
【請求項２９】
Ｔ細胞に由来する小胞の標品を特徴づける方法であって、
・Ｔリンパ球を含む生物学的標品からそのような小胞を単離する工程と、
・これを支持体に吸収させ、これらの小胞の表面での特異的マーカーの存在を評価することによって該小胞の量または質を決定する工程と
を含む方法。
【請求項３０】
Ｔリンパ球から得られ、抗原性分子を装荷した、免疫原性膜小胞を含む組成物。
【請求項３１】
Ｔリンパ球、およびＨＣＶのエンベロープ糖タンパク質またはそのＣＤ８１結合性フラグメントに由来する小胞を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性化されたＴリンパ球から放出された小胞を含む組成物はもとより、その製造および使用の方法にも関するものである。該小胞は、顕著な特性、たとえば抗原認識、抗原提示その他の調節およびエフェクター機能を与える各種の生物活性分子を含有する。本発明は、該小胞を用いて、抗原性分子（たとえばペプチド、ペプチド／ＭＨＣ複合体、ＴＣＲまたはそのサブユニット等）を抗原提示細胞（ＡＰＣ）に移転または送達して、特異的な免疫応答、特に特異的なＣＴＬ応答を誘導する方法にも関する。本発明は、さらに、該小胞を用いて、分子を標的細胞に選択的または特異的に送達する方法にも関する。
【０００２】
本発明は、特にヒト被検者を含む対象における免疫応答を調節するために、研究、診断および治療の分野に用いることができる。
【背景技術】
【０００３】
免疫系は、二つの主要な構成要素：すなわち白血球および可溶性メジエーターからなる。様々な白血球サブセットは、免疫調節ネットワークを構成していて、集団の成熟および活性化は、その中で相互に影響される。免疫細胞間の連絡は、主に二つの方法で生じる：すなわち、一方は、膜結合分子とそのリガンドとの細胞−細胞接触による結合である。他方は、一つの細胞が生成する可溶性メジエーターに基づき、それが拡散して、別の細胞上のその受容体に結合する。いくつかの、しばしばエキソソームと呼ばれる膜外小胞（直径６０〜８０nm）が、異なる多くの細胞型から、特に造血系統の細胞から細胞外空間内に放出される現象が注目される。Ｂ細胞からの［Raposo et al., 1996］、マスト細胞からの［Raposo et al., 1997］、樹状細胞からの［Zitvogel et al., 1998］、活性化された血小板からの［Heijnen, 1999］、Ｔ細胞からの［Denzer et al., 2000］、マクロファージからの［Denzer et al., 2000］、腫瘍細胞からの［Wolfers et al., 2001］、および腸上皮細胞からのエキソソーム［Van Niel et al., 2001］が記載されている。エキソソームは、エンドソーム内で特定のタンパク質として形成され、脂質が動員されて、内側に発芽する小胞（budding vesicles）となる。それらは、特定の細胞区画、すなわち多胞体（ＭＶＢ）に蓄積される。ＭＶＢの限定膜が原形質膜と融合したときに、エキソソームが放出される。エキソソームの放出は、いくつかの細胞型における特定の刺激によって調節される。異なる起源のエキソソームは、分子の一部の別個のセットを示す［Escola et al., 1998；Thery et al., 1999, 2001；Clayton et al., 2001］。ＣＤ９、ＣＤ８１のようなテトラスパニンタンパク質は、すべてのエキソソームに大量に存在する。樹状細胞（ＤＣ）のエキソソームは、専門的なＡＰＣであって、ＭＨＣクラスＩ／II分子に特に富む。強い免疫原性を有し、マウスに予め確立された腫瘍を根絶することができる［Zitvogel et al., 1998］。Ｂ細胞エキソソームは、ＭＨＣクラスII複合体を濾胞性樹状細胞に移転する［Denzer et al., 2000］。エキソソームは、膜結合タンパク質を遠隔の標的に細胞−細胞接触なしに送達し、細胞間の物質交換を可能にすることができる。抗原提示細胞由来のエキソソームを、ヒトにおける特異的な免疫応答を誘発するのに用いることが提唱されている（WO9705900、WO9903499）。
【０００４】
Ｔリンパ球は、Ｂ細胞とともに、細胞免疫系の二つの抗原特異的な構成要素を代表する。Ｔ細胞の活性化は、ほとんどの免疫応答に決定的に重要であり、他の免疫細胞がその機能を発揮するのを可能にする。Ｔ細胞は、明確な二つのクラス：すなわちＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞にさらに区分されることがある。Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ、およびその他のＴ細胞サブセットのような標的細胞に対するＣＤ４＋Ｔ細胞の調節機能、ならびに腫瘍細胞、または細胞内微生物に感染した細胞を殺すＣＤ８＋Ｔ細胞のエフェクター機能は、細胞表面分子を介しての細胞−細胞接触と、活性化されたときにそれらが分泌する多彩なサイトカインとの双方に依存する。エキソソームが免疫細胞間の連絡を補完する経路になり得るとすれば、Ｔ細胞エキソソームは、特定の調節またはエフェクター機能を発揮することができるメジエーターとなり得る可能性がある。しかし、現在まで、これらのＴ細胞エキソソームについて、生物学的機能は全く記載されておらず、これらの小胞を生物学的活性を有する状態で調製する効率的な方法は、全く報告されていない。
【０００５】
発明の要約
ここに、本発明は、Ｔ細胞由来エキソソームが、予想外の組成物および生物学的活性を示すことを開示する。本発明は、生物活性分子の様々なセットを担持する、大量のＴ細胞由来エキソソームを生成、単離かつ／または精製するための、好都合で効率的な方法も提供する。これらの方法は、特定の好適な条件下では、該小胞の放出、増加した収量、またはその特性の変化の誘発を可能にする。本発明は、好都合な小胞は、様々なＴ細胞サブセット、Ｔ細胞系、クローン、ハイブリドーマ等を包含する、様々な種のＴ細胞から生成し得ることも開示する。本発明は、これらの小胞を、その直接装荷、または生成細胞の処理によって機能化する方法も開示する。本発明は、さらに、これらの小胞が、特に（ヒトを含む）哺乳動物における免疫応答を生成または調節するために、分子を標的細胞および抗原提示細胞へと効率的かつ／または選択的に送達するのに使用できることを立証する。本発明に記載された方法は、様々なＴ細胞起源の生物活性分子の別個のセットを有する、充分に画定されたＴ細胞エキソソームの、治療もしくは予防の分野でか、あるいは研究手段として用いるための生成および提供を可能にする。
【０００６】
本発明の一つの目的は、より詳しくは、脂質小胞を生成する方法であって、
（ａ）Ｔリンパ球からの膜小胞の放出を可能にする条件下で、Ｔリンパ球を含む生物学的標品を培養する工程と、
（ｂ）（ａ）で生成された小胞を捕集または精製する工程と
を含む方法にある。
【０００７】
生物学的標品は、単離直後のＴ細胞、インビトロで拡張された（expanded）Ｔ細胞、Ｔ細胞クローン、Ｔ細胞系、またはＴ細胞ハイブリドーマを含んでよい。さらに、生物学的標品は、特定のＴ細胞下位集団、たとえばＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、γδＴ細胞、ＮＫ−Ｔ細胞、またはＮＫ細胞等が富化もしくは枯渇されていてよい。細胞は、所望のいかなる生成物または活性をコードするよう遺伝的に改変されるか、またはその活性を制御するよう別途処理もしくは変更されていてもよい。
【０００８】
好適実施態様によれば、生物学的標品は、インビトロもしくはエキソビボで拡張されたＴ細胞を含む。
【０００９】
もう一つの好適実施態様によれば、生物学的標品は、Ｔ細胞系を含む。
【００１０】
もう一つの好適実施態様によれば、Ｔ細胞を活性化処理に付す。
【００１１】
さらに一つの好適実施態様によれば、この方法は、Ｔ細胞による小胞の放出の前、間または後のいずれかにその機能化の工程を含む。小胞の機能化の結果、１種類または数種類の選ばれた分子を含む、改変された小胞の生成を生じる。これは、小胞への分子の直接もしくはキメラ的装荷によってか、または生成するＴ細胞を改変（間接装荷）することによって達成し得る。
【００１２】
因みに、本発明の特定の目的は、機能化された小胞を生成する方法であって、
（ａ）Ｔリンパ球からの膜小胞の放出を可能にする条件下で、Ｔリンパ球を含む生物学的標品を培養する工程と、
（ｂ）（ａ）で生成された小胞を捕集または精製する工程と、
（ｃ）選ばれた分子が小胞に作用するのを可能にする条件下で、該小胞を該分子に接触させ、機能化された小胞を生成する工程と
を含む方法である。
【００１３】
選ばれた分子は、抗原性分子、たとえばペプチド、タンパク質、脂質、糖脂質等であってよい。それは、核酸、酵素、ホルモン、小有機分子、マーカー等のような、いかなる分子であってもよい。代表的な例は、ウイルスタンパク質またはそのフラグメント、たとえばＨＣＶの糖タンパク質Ｅ２はもとより、糖タンパク質Ｅ２もしくはラクトアドヘリンまたはその変異型もしくはフラグメントに融合させたポリペプチドを含む、キメラ性タンパク質も包含する。
【００１４】
好適実施態様では、この分子は、抗原性分子であり、該接触を、該分子が小胞の表面で抗原提示分子（たとえばＭＨＣ分子）と会合するのを可能にする条件下で実施する。
【００１５】
もう一つの特定の実施態様では、この分子は、ラクトアドヘリンまたはその変異型もしくはフラグメントに融合させたポリペプチドその他の活性部分を含む、キメラ分子であり、該接触を、該キメラ分子が小胞の表面でホスファチジルセリンと会合するのを可能にする条件下で実施する。
【００１６】
もう一つの特定の実施態様では、この分子は、糖タンパク質Ｅ２またはその変異型もしくはフラグメントに融合させたポリペプチドその他の活性部分を含む、キメラ分子であり、該接触を、該キメラ分子が小胞の表面でＣＤ８１と会合するのを可能にする条件下で実施する。
【００１７】
もう一つの変形態様（間接装荷）では、機能化小胞を生成する方法は、
（ａ）Ｔリンパ球からの膜小胞の放出を可能にする条件下で、Ｔリンパ球を含む生物学的標品を培養する工程（生物学的標品は、選ばれた分子をコードしている組換え核酸を有するＴリンパ球を含む）と、
（ｂ）（ａ）で生成された小胞を捕集または精製する工程（該小胞（または少なくともそのいくつか）は、該選ばれた分子を含む）と、
を含む。
【００１８】
もう一つの変形態様では、この方法は、
（ａ）Ｔリンパ球からの膜小胞の放出を可能にする条件下で、決定されたＴ細胞受容体を有するＴリンパ球のクローン集団を培養する工程と、
（ｂ）（ａ）で生成された、該特異的Ｔ細胞受容体をその表面で発現する小胞を捕集または精製する工程と、
を含む。
そのような小胞は、特異的なＭＨＣクラスＩまたはII／ペプチド複合体をその表面で発現する細胞を標的化して、該細胞へのいかなる選ばれた分子の標的化された送達も可能にすることができる。
【００１９】
本発明のさらに一つの目的は、医薬組成物を生成する方法であって、
（ａ）Ｔリンパ球からの膜小胞の放出を可能にする条件下で、Ｔリンパ球を含む生物学的標品を培養する工程と、
（ｂ）（ａ）で生成された小胞を捕集または精製する工程と、
（ｃ）薬学的に許容され得る担体または賦形剤中に該小胞を調整する工程と
を含む方法にある。
【００２０】
本発明のさらに一つの目的は、Ｔリンパ球から得られる膜小胞と、薬学的に許容され得る担体または賦形剤とを含む医薬組成物である。より好ましくは、該小胞は、選ばれた分子、たとえば薬物または抗原性分子を含む。最も好ましくは、小胞は、該小胞内に存在するＭＨＣ分子と外来抗原性ペプチドとの複合体を含む。
【００２１】
本発明のもう一つの目的は、対象における抗原に対する免疫応答を刺激する方法であって、上記に定義されたとおりの組成物または小胞の有効量を該対象に投与する工程を含む方法にある。より詳しくは、本発明の方法は、
（ａ）Ｔリンパ球からの膜小胞の放出を可能にする条件下で、（たとえばＴ細胞系、自己Ｔ細胞またはそのサブセットのような）Ｔリンパ球を含む生物学的標品を培養する工程と、
（ｂ）小胞を抗原性分子に、該分子が、該小胞に結合すること、好ましくは小胞の表面で抗原提示分子と会合することを可能にする条件下で接触させて、それらを免疫原性にさせることによって、該小胞を機能化する工程と
（ｃ）（ｂ）で生成された小胞を捕集または精製する工程と、
（ｄ）薬学的に許容され得る担体または賦形剤中に該小胞を調整する工程と、
（ｅ）小胞を、免疫応答を刺激するのに有効な量にて対象に投与する工程と
を含む。
【００２２】
ある変形態様では、小胞を、精製工程（ｃ）の後で機能化する。
【００２３】
もう一つの変形態様では、小胞を、免疫細胞（たとえば抗原提示細胞）をインビトロまたはエキソビボで免疫感作、刺激または拡張するのに用いて、次いで、免疫細胞をその必要性がある対象に投与する。
【００２４】
本発明のもう一つの目的は、抗原性分子を抗原提示細胞、特に樹状細胞に送達する方法であって、抗原提示細胞を、上記に定義されたとおりの組成物、または該抗原性分子を含む免疫原性小胞に接触させる工程を含む方法である。接触は、インビトロ、エキソビボまたはインビボで実施してよい。インビボ接触のためには、組成物または免疫原性小胞を、該細胞をインビボで接触させたときに抗原性分子をＡＰＣに送達するのに有効な量にて、対象に投与する。
【００２５】
本発明のもう一つの目的は、上記に定義されたとおりの組成物または免疫原性小胞に樹状細胞を接触させる工程を含む、樹状細胞を刺激する方法である。接触は、インビトロまたはエキソビボで実施してよい。インビボ接触のためには、該組成物または免疫原性小胞を、該細胞をインビボで接触させたときに抗原性分子をＡＰＣに送達するのに有効な量にて、該対象に投与する。
【００２６】
本発明のさらに一つの目的は、標的細胞に分子を送達する方法であって、上記に定義されたとおりの組成物、または該分子を含む免疫原性小胞に該標的細胞を接触させる工程を含む方法である。送達は、最も好ましくは、小胞の表面に存在する特異的なマーカー、たとえばリガンド、受容体、抗原等、またはその機能性フラグメントもしくは誘導体を用いて標的化される。特定の実施態様では、標的化は、小胞上に存在する特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して行う。本発明を実施するこの特定の方法では、選ばれた（生物活性）分子を担持する小胞は、ＴＣＲが認識する抗原性ペプチド／ＭＨＣ複合体を発現する細胞に対して特異的に標的化することができる。
【００２７】
この分子は、小胞の表面に露出させるか、または該小胞に含まれていてもよい。分子は、様々な性質を有し、広範囲の特性または活性を示してよい。接触は、インビトロ、エキソビボまたはインビボで実施してよい。インビボ接触のためには、該組成物または免疫原性小胞を、該分子を該細胞にインビボで送達するのに有効な量にて、対象に投与する。
【００２８】
本発明のさらに一つの態様は、Ｔ細胞に由来する小胞の標品を特徴づける方法であって、
・Ｔリンパ球を含む生物学的標品からそのような小胞を単離する工程と、
・該小胞の量または質を、これを支持体（たとえばビーズ、プレート、カラム等）に吸収させ、これらの小胞の表面での特異性マーカーの存在を査定することによって決定する工程と
を含む方法に関する。代表的には、支持体は、ビーズ、たとえばアルデヒドビーズ（非特異的結合）、または特異的な抗体で被覆した磁気ビーズ（特異的結合）、またはプレート、たとえばマイクロウェルプレートである。特徴づけは、表現型分析（たとえばＦＡＣＳによる）またはＥＬＩＳＡ（WO01/82958）によって実施することができる。特定の実施態様では、該小胞または生物学的標品を濃縮、限外濾過、透析濾過、および／または勾配上での超遠心分離に付すことによって、該小胞を単離する。
【００２９】
本発明は、分子を細胞にインビボ、インビトロまたはエキソビボで送達する医薬組成物の製造のための、上記に開示されたとおりのＴ細胞由来小胞の使用にも関する。
【００３０】
発明の詳細な説明
本発明は、一連の予想外の観察および所見に基づく。初め、本発明者らは、末梢血から富化された、培養されたヒト樹状細胞の上清から精製されたエキソソームが、Ｔ細胞に特異的なマーカーを有する小胞の小画分を含むことを観察した。これは、培養体を汚染するＴ細胞がエキソソームも放出することを示唆した。本発明者らは、さらに研究した後、様々な刺激物とともに培養された精製Ｔ細胞は、実際に、Ｔ細胞に特異的な機能性タンパク質その他のマーカーを含有する小胞を生成できることを見出した。Ｔ細胞に由来する膜小胞の大きさ、密度、および電子顕微鏡（ＥＭ）下での形態学に基づき、該小胞は、他の種類の免疫細胞に由来するエキソソームに類似する物理的特性を有するとの結論に、本発明者らは達した。
【００３１】
しかし、Ｔ細胞から生成された小胞は、特異的な特性を与える独特の特徴および成分を有する。これらのＴ細胞由来小胞が示すマーカーまたは成分は、その生物活性に基づいて、四つのカテゴリーに入れることができる：
・抗原認識タンパク質、たとえばＴ細胞受容体（ＴＣＲ）およびＣＤ８；
・抗原提示タンパク質、たとえばＭＨＣクラスＩおよびクラスII分子；
・調節エフェクタータンパク質、たとえばＣＴＬＡ−４およびパーフォリン；ならびに
・不明確な機能を有するその他のＴ細胞タンパク質およびマーカー。
【００３２】
ここに、本願は、様々な起源のＴ細胞が、特定の小胞を分泌すること、この放出が、様々な処理によって活性化または制御され得ること、小胞が、大量に単離できること、小胞が、機能的な構造および生物活性を有する、分子の特定のセットを示すこと、ならびにこれらの小胞がさらに機能化し得ることの証拠を提供する。たとえば、小胞上で富化されたＭＨＣクラスＩ／II分子は、抗原性ペプチドを結合し、それぞれ特異的な、細胞毒性であるか（ＣＴＬ）、またはヘルパーＴリンパ球応答を誘導することが可能である。これらの小胞のＭＨＣクラスII分子は、超抗原を送達して、Ｔ細胞を活性化することもできる。したがって、これらの小胞は、その様々な生物活性分子に基づいて、異なる疾病を処置するための免疫干渉法として用いることができる。
【００３３】
意外にも、本発明は、Ｔ細胞に由来する小胞が、大量のＭＨＣクラスＩ分子を（たとえば、同じ量のＰＢＭＣからの樹状細胞由来小胞のそれとほぼ同じ総量で）発現するが、Ｔ細胞は、専門的な抗原提示細胞とは見なされないことを立証する。
【００３４】
本出願人らは、これらの小胞が、クラスＩペプチドを装荷することができ、クラスＩ／ペプチドの複合体をＡＰＣに移転して、特定のＴ細胞の活性化を刺激することができる証拠も提供する。これは、（小胞が由来する）Ｔ細胞自体は、抗原提示細胞ではないことから、特に驚異的である。
【００３５】
本願は、小胞が、生成するＴ細胞の効率的なトランスフェクションを通じて新たな分子を発現するよう、誘導できることも立証する。これは、樹状細胞のようなその他の細胞型はトランスフェクションするのが困難であることから、特に好都合である。
【００３６】
本願の予想外かつ好都合なもう一つの態様は、これらの小胞は、他の細胞型よりはるかに大量にＴ細胞から生成できることである。特に、本発明は、培養中に増殖および／または拡張するよう誘導されたＴ細胞から、機能性小胞を調製できることを示す。
【００３７】
本発明は、さらに、好都合な小胞を、確立されたヒトＴ細胞系から生成することができ、そのため、再現できるロットの製造を促進できることを示す。さらに、確立されたＴ細胞系を、適切な核酸（たとえばＤＮＡベクター）により容易にトランスフェクションすることができ、エキソソーム中で選択的に富化された抗原その他の（ポリペプチドを包含する）タンパク質の発現を可能にする。
【００３８】
本発明は、Ｔ細胞系が、有意に異なるタンパク質組成物を有する小胞を生成できることも示す。例として、ジャーカットＴ細胞系は、非常に小量のＨＬＡクラスＩおよびII、高レベルのＣＤ１ｃ、ならびに有意なレベルのＣＤ１ｄを発現することが示される。したがって、これらの小胞は、ＣＤ１特異的な抗原刺激に用いることができる。そのようなＴ細胞系を、治療を目的として、特異的なＨＬＡクラスＩまたはIIハプロタイプによりトランスフェクションして、合致した特異的なＨＬＡハロタイプを有する小胞を、同種応答を回避しつつ生成することもできる。
【００３９】
したがって、本発明は、治療または予防接種の分野に、特に分子を標的細胞に送達するのに用いることができる、新規な生物学的生成物および組成物を提供する。これらの生成物は、抗原特異性免疫応答をインビトロ、エキソビボまたはインビボで生起するのに特に役立つ。
【００４０】
生物学的標品
本発明によれば、この小胞および組成物は、Ｔリンパ球の供給源として用いて様々な生物学的標品を製造することができる。特に、該生物学的標品は、
・ＰＢＭＣ、血液サンプル、血清サンプル、血漿、大量培養されたＴ細胞、および富化された、たとえばＣＤ８＋細胞毒性／サプレッサーＴ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５−ヘルパーＴ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節Ｔ細胞、γ／δＴ細胞およびＮＫＴ細胞のような、Ｔ細胞サブセットを包含する、様々な種から新鮮に調製されたＴ細胞；
・たとえばＴ細胞系、Ｔ細胞クローン、Ｔハイブリドーマ、および形質転換Ｔ細胞のような、インビトロで維持かつ拡張することができるＴ細胞；
・Ｔ細胞を起源とする悪性細胞、たとえばＴ細胞起源の白血病細胞；
・特異的なタンパク質をコードしている、ウイルスに感染したか、または遺伝学的構成体をトランスフェクションしたＴ細胞
を含み得る。
【００４１】
この生物学的標品は、特定の細胞下位集団、特に特定の抗原に特異的であるか、または特定の活性を有するＴリンパ球を除去もしくは拡張するよう処理し得る。
【００４２】
特定の好適実施態様によれば、該生物学的標品またはＴ細胞は、小胞の生成を誘発するか、またはその収率を増大させる条件下で培養される。実際、本発明は、ここに、Ｔ細胞からの小胞生成を向上させるための特定の処理、たとえば
・Ｔリンパ球の特性を維持、拡張または変更するための、サイトカインまたはその他の試薬とともに小胞生成細胞を培養すること、たとえば、ＩＬ１−ａ、β、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−４および／もしくはＩＬ−１３；ならびに／またはインターフェロンγ、および／もしくはＴ細胞表面マーカー、たとえばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＴｃＲ、および／または可溶性ＭＨＣクラスＩもしくはII四量体および／もしくは可溶性ＣＤ１四量体に対する抗体の存在下での培養；
・細胞の成熟および／または活性化を誘導するための、薬学的試薬もしくは特定の処理とともに小胞生成細胞を培養すること、たとえば、特異的な抗原もしくは超抗原、マイトジェン（すなわちＰＨＡ）、アグリン、抗体（たとえば抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体）もしくはそのフラグメント、ＰＫＣの活性化を誘発する試薬（すなわちホルボールエステル）、細胞質Ｃａ++放出（すなわちカルシウムイオノホア）、ホスファターゼの阻害（すなわちオカダ酸）等を装荷した抗原、自己もしくは同種ＡＰＣの存在下での培養
を適用し得ることを立証する。
【００４３】
好適実施態様では、生物学的標品は、培養体の中で拡張かつ／または活性化されたＴリンパ球を含む。
【００４４】
もう一つの好適実施態様では、生物学的標品は、ＴＣＲ活性剤の存在下で培養されたＴリンパ球を含む。
【００４５】
もう一つの好適実施態様では、生物学的標品は、Ｔ細胞系、特に内在性ＨＬＡクラスＩおよびII分子を本質的に欠く小胞を生成する、Ｔ細胞系である。
【００４６】
もう一つの特定の実施態様では、生物学的標品は、Ｔ細胞サブセット、たとえばＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、ＮＫＴ細胞について富化されているか、もしくはそれらを本質的に含むか、またはＮＫ細胞について富化されている。ＭＨＣクラスＩ／IIペプチドを送達するのに特に好適なＴ細胞サブセットは、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞である。ＮＫ細胞も、本発明による生物学的活性小胞を生成し得る。
【００４７】
もう一つの特定の実施態様では、生物学的標品は、一つの抗原に特異的であるＴリンパ球（Ｔリンパ球のクローン集団）を含む。
【００４８】
生物学的標品は、より好ましくは、Ｔリンパ球の少なくとも５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上を含む。小胞を生成する最も好適な方法は、基本的にＴリンパ球、たとえば少なくとも９０％以上のＴリンパ球を含む生物学的標品を用いる。代表的な実施態様では、生物学的標品は、少なくとも１０Ｅ５の細胞、より一般的には少なくとも１０Ｅ６の細胞を含む。さらに、特定の実施態様では、Ｔ細胞は、処置しようとする患者に関して自己由来であるが、同種、または異種細胞でさえ用いてもよい
【００４９】
さらに一つの実施態様では、Ｔ細胞は、生物学的活性分子をコードしている組換えポリヌクレオチドを含む。下記で、この実施態様を、より詳しく開示することにする。
【００５０】
精製
Ｔ細胞が生成または放出した小胞は、いくつかの手法を用いて単離かつ／または精製してよい。これらは、単独または併用のいずれかでの濾過、遠心分離、イオンクロマトグラフィーまたは濃縮を包含する。
【００５１】
最も好ましい精製法は、密度勾配遠心分離の工程を包含する。もう一つの好適な方法は、単独でか、または遠心分離工程と結び付けてかのいずれかでの、限外濾過の工程を含む。
【００５２】
適切な精製法は、WO99/03499、WO00/44389およびWO01/82958（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【００５３】
機能化
本願は、さらに、このＴ細胞由来小胞は、様々な生物学的活性を示すよう機能化し得ることを立証する。特に、小胞は、問題のいかなる分子、たとえばタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、脂質、糖脂質、核酸、小薬物、糖類等も含むように改変し得ることを立証する。これは、本願が、これらの小胞が分子を様々な標的細胞へと、特に抗原提示細胞（ＡＰＣ）へとインビトロ、エキソビボまたはインビボで効率的に送達することができる証拠も与えることから、特に好都合である。
【００５４】
以下で考察するように、この小胞は、Ｔ細胞由来によるその放出または生成の前か、間か、または後に機能化し得る。より正確には、それらは、分子の直接装荷、キメラ的装荷、または（生成Ｔ細胞の改変による）間接装荷によって機能化し得る。直接またはキメラ的装荷は、小胞においてその放出後に実施してよい。
【００５５】
機能化する分子は、小胞の内部にか、その膜内にか、またはその表面に存在し得る。細胞質ゾル内に存在する分子は、様々な可溶性因子、たとえば、サイトカイン、成長因子、ホルモン、アンチセンスＲＮＡ、抗体、腫瘍サプレッサータンパク質等を包含する、生物学的活性タンパク質またはポリペプチドであり得る。分子は、受容体、センサー等のように、小胞膜内に部分的にか、または全体的に挿入されていてもよい。それらは、膜の内面もしくは外面にか、または双方（すなわち膜貫通分子）に挿入されていてよい。分子は、共有結合、静電結合、疎水結合または水素結合等を包含する、様々な種類の結合によって、小胞の表面で会合してもよい。分子は、膜の内面または外面で会合していてもよい。会合は、膜内に存在する特異的なマーカーまたはモチーフ、たとえば受容体、脂質等となされていてよい。
【００５６】
直接装荷は、本発明の特に好適な実施態様である。特異的な抗原性ペプチドを装荷した免疫原性小胞を生成するのに特に適している。
【００５７】
特定の実施態様では、たとえば、抗原性分子を、小胞の表面で、抗原提示分子、たとえばＭＨＣクラスＩ、クラスIIまたはＣＤ１分子の直接装荷によって会合していてよい。因みに、本発明のさらに一つの目的は、Ｔ細胞由来小胞の表面でのＭＨＣ分子の予想外の富化に基づく。本発明者らは、ここに、そのようなＭＨＣ分子は、外来抗原性ペプチド（たとえばクラスＩまたはクラスIIペプチド）を直接装荷できることを示した。本発明の特定の目的は、免疫原性生成物を生成する方法であって、
・Ｔ細胞由来小胞を与える工程と、
・該小胞を抗原性分子に、該分子がＭＨＣ複合体と作用し合い、それによって免疫原性生成物を生成するのを可能にする条件下で接触させる工程と
を含む方法にある。
【００５８】
本発明は、抗原性ペプチド（たとえばＭＨＣ結合性ペプチド）またはペプチド／ＭＨＣ複合体をＡＰＣに移転して、特異的なＴ細胞応答を誘導する方法であって、
（ａ）ＭＨＣ分子との結合を可能にする条件下でＴ細胞由来小胞に、抗原性ペプチドを装荷する工程と、
（ｂ）インビトロ、エキソビボまたはインビボ、すなわち対象への小胞の直接投与によって、該装荷した小胞を、抗原提示細胞に接触させる工程と
をを含む方法にも関する。
【００５９】
直接装荷は、WO01/82958（参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されたような様々な条件下で実施し得る。好適実施態様では、この方法は、単離または精製された膜小胞を、該小胞を該免疫原性化合物に接触させて、その装荷を可能もしくは容易にする前か、間か、または後に、選ばれた酸培地もしくは処理に付す工程を含む。因みに、選ばれた酸培地もしくは処理の仕様は、小胞の表面で会合させた内在性ペプチドもしくは脂質を少なくとも部分的に除去し、かつ／または免疫原性化合物の交換を容易にするのを可能にする。さらに一つの好適実施態様では、免疫原性化合物と接触させた後に、小胞を遠心分離、好ましくは密度遠心分離、または透析濾過に付して、未結合免疫原性化合物を除去する。
【００６０】
この免疫原性化合物は、抗原提示分子と会合して免疫系内に存在する、たとえばいかなるペプチドまたは脂質であってもよい。このペプチドは、単独、または他のペプチドとの混合物もしくは組合せのいずれかでのクラスＩ限定ペプチド、クラスII限定ペプチド、あるいは腫瘍細胞のペプチド溶出液でさえあり得る。本発明は、特に、クラスＩ限定ペプチドの直接装荷に適している。脂質は、単離形態、または様々な組合せもしくは混合物のいずれかでの、微生物脂質、微生物糖脂質、または脂質もしくは糖脂質腫瘍抗原であってよい。
【００６１】
好適実施態様では、直接装荷は、（ｉ）単離または精製された膜小胞を、選ばれた酸培地に付すこと、（ii）該単離または精製された膜小胞を、クラスＩ限定ペプチドに、ペプチドが該膜小胞の表面でＨＬＡクラスＩ分子と複合するのを可能にする条件下で接触させること、および（iii）装荷された膜小胞を捕集することを含む。用語「外来性」は、ペプチドが組成物に加えられることを意味する。
【００６２】
さらに特定の変形態様では、この方法は、（ｉ）単離または精製された膜小胞を、選ばれた酸培地に付す工程と、（ii）該単離または精製された膜小胞をクラスＩ限定ペプチドに、ペプチドが該膜小胞の表面でＨＬＡクラスＩ分子と複合するのを可能にする条件下で、β2ミクログロブリンの存在下で接触させる工程と、（iii）装荷された膜小胞を捕集する工程とを含む。より好ましくは、工程（ｉ）は、単離または精製された膜小胞を、約３〜５．５、さらに好ましくは約３．２〜４．２からなるpHの酸培地に５分間未満付す工程を含む。β2ミクログロブリンの存在下での直接装荷という手法は、非常に小量の免疫原性化合物のみ入手できるにすぎない場合でさえ、効率的な装荷を可能にすることから、好都合である。
【００６３】
より多量の免疫原性化合物が入手できる場合は、β2ミクログロブリンは、全く必要とされず、この方法は、（ｉ）単離または精製された膜小胞を、β2ミクログロブリンの不在下でクラスＩ限定免疫原性化合物（たとえばペプチドまたは脂質）に接触させる工程と、（ii）（ｉ）の混合物を、該免疫原性化合物が、該膜小胞の表面でＨＬＡクラスＩ分子と結合するために、いかなる内在性化合物とも交換するのを可能にする条件下で、選ばれた酸培地または処理に付す工程と、（iii）交換を停止し、かつ／または（ii）で形成された複合体を安定化するために、培地を中和する工程と、（iv）装荷された膜小胞を捕集する工程とを含む。より好ましくは、工程（ii）は、混合物を、約４〜５．５からなるpHの酸培地に、いかなる内在性分子と免疫原性化合物との間の、ＭＨＣ複合体に結合するための交換を生じるのにも充分な時間付す工程を含む。
【００６４】
直接装荷は、より大きい抗原、たとえばウイルスタンパク質を有する小胞を機能化するために実施してもよい。特にウイルスタンパク質は、Ｔ細胞由来エキソソームの表面に存在するマーカー、たとえばＣＤ８１と直接作用し合う可能性がある。具体的な例として、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のエンベロープ糖タンパク質は、ＣＤ８１がＣ型肝炎の受容体、かつＴ細胞由来小胞の主要な成分の一つであることから、小胞の表面でＣＤ８１と作用し合うことができる。したがって、機能化小胞を生成する方法は、上記に開示されたようなＴ細胞由来小胞を、ＨＣＶエンベロープタンパク質またはそのフラグメントに、該エンベロープタンパク質またはそのフラグメントがＣＤ８１に結合するのを可能にする条件下で接触させる工程を含む。
【００６５】
因みに、本発明のさらなる目的は、対象のＣ型肝炎（ＨＣＶ）感染を処置するか、または対象のＨＣＶに対する免疫応答を生起させる方法であって、その必要がある対象に、ＨＣＶエンベロープタンパク質またはそのＣＤ８１結合性フラグメントを装荷したＴ細胞由来小胞の有効量を投与する工程を含む方法である。エンベロープタンパク質は、より好ましくは、ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質Ｅ２またはそのＣＤ８１結合性フラグメントである。より具体的な方法は、
（ａ）Ｔ細胞から小胞を調製する工程と、
（ｂ）ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質もしくはそのフラグメント、代表的にはＨＣＶのＥ２糖タンパク質もしくはそのフラグメント、またはＥ２糖タンパク質と、ＨＣＶの追加的な免疫原性タンパク質フラグメントとを組み込んだキメラ性構成体を、小胞に装荷する工程と、
（ｃ）装荷された小胞を、その必要がある対象に注入して、それによって、該対象のＨＣＶ感染に対する特異的な免疫応答を生起または刺激する工程と
を含む。
【００６６】
これに代えて、装荷した小胞を、対象に投与しようとする免疫細胞をエキソビボまたはインビトロで刺激するのに用いてもよい。本発明は、ＨＣＶ糖タンパク質またはそのフラグメントを装荷したＴ細胞由来小胞を含む組成物はもとより、該小胞を用いて、ＨＣＶ感染に対してインビボで処置または予防接種することにも関する。本発明は、Ｔ細胞由来小胞を用いて、ＣＤ８１とのウイルスの結合、およびＡＰＣへのウイルスの移転によって循環ＨＣＶを中和し、それによって、ＨＣＶに対する免疫応答を誘導することも包含する。
【００６７】
キメラ的装荷は、本発明のもう一つの特定の好適実施態様である。これは、小胞の抗原提示機能を増強するために、ＡＰＣまたはＴ細胞に作用し得る、いかなる種類の選ばれた分子、特にタンパク質も装荷した小胞を生成するのにも適している。キメラ的装荷は、小胞の膜に結合できる能力を有する第一のドメインと、選ばれた活性を有する第二のドメインとを含むキメラ的タンパク質の使用によって達成し得る。第一ドメインは、好ましくは、ラクトアドヘリンまたはＥ２糖タンパク質もしくはそのフラグメント、代表的には、ラクトアドヘリン、またはそのＣ１および／もしくはＣ２ドメインを含むそのフラグメント、あるいはＨＣＶＥ２糖タンパク質もしくはそのＣＤ８１結合性フラグメントを含む。そのようなキメラ的タンパク質を生成する方法は、US60/313,159（引用によって本発明に組み込まれる）に開示されている。
【００６８】
特に、キメラ的ポリペプチドまたは化合物は、遺伝学的または化学的な融合によって製造することができる。遺伝学的融合のためには、キメラ的遺伝子の問題のポリペプチドをコードしている領域を、ラクトアドヘリンまたはＥ２糖タンパク質の上流、下流、もしくはいかなる内部のドメイン結合部で融合させてもよい。さらに、このドメインは、互いに直接融合させるか、またはキメラ的ポリペプチドの特性を変えないスペーサー領域によって分離してもよい。そのようなスペーサー領域は、クローニング部位、切断部位、柔軟なドメイン等を包含する。加えて、このキメラ的な遺伝学的構成体は、コードされているキメラ的ポリペプチドの分泌を利するように、リーダーシグナル配列をさらに含んでもよい。化学的融合のためには、チオール、アミノ、カルボキシル基のような遊離の反応性基をその末端で提示して、可溶性ポリペプチド、糖脂質またはいかなる小分子も架橋結合させるように、部分的または完全長ラクトアドヘリン配列を選択もしくは改変してもよい。好適実施態様では、ラクトアドヘリン構成体は、少なくとも、Ｃ１ドメインおよびアミノ酸のシステインをコードして、他の分子との化学的架橋結合のために遊離のチオール残基を与える。ペプチド、化学物質をＳＨ基に架橋結合することは、充分に確立された方法によって達成することができる［総説：G.T. Hermanson (1996), Biocojugate Techniques, San Diego Academic Press, pp.789］。
【００６９】
ラクトアドヘリンまたはＥ２糖タンパク質に融合させるドメインは、いかなるポリペプチド、タンパク質、ペプチド、脂質等であってもよい。改変された選ばれた分子に特異的に結合することができる、反応性ドメインであってもよい。
【００７０】
代表的な実施態様では、機能化小胞を生成する方法は、Ｔ細胞由来小胞を与え、該小胞を、問題の分子に融合したラクトアドヘリン（またはそのＣ１および／もしくはＣ２ドメインを含むそのフラグメント）を含むキメラ的タンパク質に接触させる工程を含む。例として、キメラ的タンパク質は、ラクトアドヘリンＣ１〜Ｃ２−アグリン分子を含んでいてもよく、これが、ラクトアドヘリンのＣ１〜Ｃ２ドメインを通じて小胞に結合し、かつアグリン部分を通じてＴ細胞応答を始動する、抗原の結合活性を増大させることができる。
【００７１】
もう一つの代表的な実施態様では、機能化小胞を生成する方法は、Ｔ細胞由来小胞を与え、該小胞を、問題の分子に融合したＨＣＶ糖タンパク質エンベロープ（またはＣＤ８１結合性ドメインを含むそのフラグメントもしくは変異型）を含むキメラ的タンパク質に接触させる工程を含む。例として、キメラ的タンパク質は、ＨＣＶＥ２−アグリン分子を含んでいてもよく、これが、ＣＤ８１マーカーを通じて小胞に結合し、かつアグリン部分を通じてＴ細胞応答を始動する、抗原の結合活性を増大させることができる。
【００７２】
間接装荷は、本発明のもう一つの特定の好適実施態様である。それは、様々な種類の選ばれた分子を装荷した小胞を生成するのに適している。間接装荷は、Ｔ細胞を生成することについての改変に基づく。そのような改変は、組換えＤＮＡ技術（遺伝学的改変）によってか、またはＴ細胞への抗原性分子の直接装荷によって達成し得る。特定の好適実施態様では、Ｔ細胞は、問題の分子をコードしている組換え核酸を含む。核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってよい。これは、Ｔ細胞をトランスフェクションまたは感染させるのに適した様々な種類のベクター、たとえばプラスミド、ウイルスベクター、裸のＤＮＡ等に組み込んでよい。トランスフェクションすると、組換えＤＮＡは、細胞内で発現され、発現産物が小胞に送達される。発現させる分子の小胞に対する標的化をさらに増強するために、たとえば膜固定配列のような、特定の輸送シグナルを、組換え核酸に含ませてよい。コードされる分子は、抗原、ペプチド、サイトカイン、成長因子、リガンド受容体、受容体リガンド、ＴＣＲまたはそのサブユニット等であり得る。
【００７３】
特定の実施態様では、間接装荷を用いて、規定されたＴＣＲまたはＭＨＣ分子を提示する小胞を生成する。特に、Ｔ細胞系に、特定のＭＨＣハプロタイプをコードしている核酸をトランスフェクションして、こうして、同種Ｔ細胞の供給源から免疫適格小胞を生成し得る。そうして、そのような小胞を、上記のとおり、決定された抗原ペプチドの直接装荷によって、さらに機能化し得る。
【００７４】
これら様々な方法は、問題の別個の分子を含むＴ細胞由来小胞の生成を可能にする。これらの小胞は、改良された生物学的特性を有し、インビボで抗原を送達して、免疫細胞をインビボまたはインビトロで刺激し、免疫応答を生起し、特定の組織に分子を送達する等に用いることができる。
【００７５】
免疫応答の生起
本発明は、免疫応答、特に抗原特異性免疫応答、たとえばＣＴＬ応答を生起、刺激または調節するのに適している。
【００７６】
実際、Ｔ細胞は、専門的な抗原提示細胞と考えられるが、本発明は、意外にも、Ｔ細胞に由来する小胞が、多量のＭＨＣクラスＩ分子を発現し、これらの小胞が、クラスＩペプチドを装荷することができ、それらが、クラスＩ／ペプチドという複合体をＡＰＣに移転して、特定のＴ細胞の活性化を刺激することができることを立証している。
【００７７】
本願の特定の態様は、対象における免疫応答を生起または調節する方法であって、Ｔ細胞由来小胞の有効量を対象に投与する工程を含む方法にある。より好適な方法は、対象における抗原特異的な免疫応答を生起または調節することを目的として、方法は、該抗原またはそのエピトープを装荷した、Ｔ細胞由来小胞の有効量を対象に投与する工程を含む。これらの方法は、予防接種として、感染および腫瘍に対する患者の免疫を増大させるのに用いることができる。抗原は、ウイルス抗原、細菌性抗原、腫瘍抗原、寄生生物、自己抗原等であり得る。
【００７８】
本発明は、小胞上に存在する特異的なＴＣＲをＡＰＣに送達して、このＴＣＲの特異的なエピトープに対する免疫応答を誘導できることも与える。特に、Ｔ細胞クローン、Ｔ細胞系、Ｔ細胞を起源とするハイブリドーマまたは悪性細胞が生成する、本発明の小胞は、その表面でクローンのＴＣＲを発現する。そのようなクローンのＴＣＲは、抗原として、特異的な免疫応答を生起するのに使用され得る。特に、そのような小胞は、特別な（抗原として作用する）ＴＣＲをＡＰＣに送達して、ＴＣＲのエピトープに特異的な免疫応答を生起するのに使用され得る。
【００７９】
したがって、本発明の特定の目的は、そのＴＣＲによって特異的な自己抗原を認識する、培養されたＴ細胞クローン／系から生成された小胞を用いて、担持されるＴＣＲをＡＰＣに送達して、有害なＴＣＲに対する免疫応答を誘導することにある。この種の小胞は、ＴＣＲワクチンとして、自己免疫疾患を処置するのに使用され得る。
【００８０】
もう一つの特定の目的は、（クローニングされたＴＣＲを有してよい）Ｔ細胞に起源を有する悪性細胞から生成された小胞を用いて、担持されるＴＣＲを特異的な腫瘍抗原としてＡＰＣに送達して、抗原性ＴＣＲに対する免疫応答を誘導することにある。この種の小胞は、イディオタイプＴＣＲワクチンとして、Ｔ細胞白血病を処置するのに用いることができる。
【００８１】
本発明の、小胞が示す調節性およびエフェクター分子に基づくさらなる目的は、生物活性膜結合タンパク質、または小胞が担持するタンパク質を通じて標的細胞の活性化、阻害または細胞毒性を誘導する方法である。
【００８２】
小胞は、いかなる哺乳動物にも、好ましくはヒトである対象に用い得る。代表的には、注射、たとえば皮内、皮下、静脈内、動脈内、腹腔内、筋内、腫瘍内（または腫瘍近辺に）等の注射によって投与される。適切ならば、反復的注射を実施してよい。小胞は、様々な媒体、たとえば生理食塩水、等張液、緩衝液等中で調整してよい。注入される用量は、たとえば、１投与分あたり約１ｘ１０13〜約１ｘ１０14個のＭＨＣクラスＩ分子の範囲にわたることができる。
【００８３】
分子の標的化送達
本発明のさらなる目的は、小胞の表面に存在する抗原特異性ＴＣＲに基づく。実際に、ＴＣＲは、標的化剤として、いかなる分子を特異的に標的細胞に送達するのにも用いてよい。したがって、本発明は、そのＴＣＲ成分を用いて、ＴＣＲが認識できる抗原を発現する標的細胞へと、小胞を照準させる方法にも関する。
【００８４】
そのような方法は、小胞が実施する、生物活性分子を、小胞上のＴＣＲが認識できるＭＨＣ−抗原複合体を発現する標的細胞へと特異的に送達することはもとより、小胞に装荷された追跡用または機能性分子を、該小胞上のＴＣＲが認識できる抗原を発現する標的細胞へと、特異的に送達する方法にも用い得る。
【００８５】
本発明のそれ以上の態様および利点を、下記の実施例中に開示するが、該実施例は、例示であり、保護の対象範囲を限定するものではないと考えなければならない。本願に引用されたすべての参考文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【００８６】
材料および方法
１．初代Ｔ細胞およびＴ細胞系からの小胞の生成
１．１．初代Ｔ細胞からの小胞の生成
ＰＢＭＣの非付着細胞からのＣＤ３＋Ｔ細胞を、ナイロンウールカラムを用いて非Ｔ細胞を除去することによって、９０％の純度まで富化した。富化されたＣＤ３＋Ｔ細胞を、４〜５ｘ１０6個／mlまで希釈し、濾過したＡＩＭＶ培地中で、下記の方法の一つを用いて培養した：
ａ．１μg/mlのＰＨＡ、３日間；
ｂ．５ng/mlのＰＨＡ＋２５０ng/mlのイオノマイシン、３日間；
ｃ．１μg/mlのＰＨＡ、２日間。培地を新鮮な、濾過されたＡＩＭＶ培地に置き換え、さらに４日間連続して培養。
【００８７】
１．２．Ｔ細胞系（ジャーカット）からの小胞の生成
ジャーカット細胞を４〜５ｘ１０6個／mlまで希釈し、濾過したＡＩＭＶ培地中で１μg/mlのＰＨＡとともに４日間培養した。
【００８８】
１．３．Ｔ細胞からの小胞の精製
例１．１および１．２に従って生成した小胞を、WO01/82958に開示された方法を用いて、Ｔ細胞培養上清から精製した。次いで、１５０〜２００倍に濃縮した。
【００８９】
２．小胞の特徴づけ
２．１．アルデヒドビーズアッセーによって測定された小胞の表現型
小胞を、アルデヒドポリスチレンラテックスビーズ（Interface Dynamics Corporation）に結合し、蛍光標識化した抗ＣＤ抗原抗体で染色してから、ＦＡＣＳ分析に付した。
【００９０】
２．２．小胞上のクラスＩ／II分子の量の、アルデヒドビーズアッセーおよび吸着ＥＬＩＳＡを用いた定量的ＦＡＣＳ分析による測定
初めに、小胞の表面のクラスＩおよびクラスII分子の比率を、アルデヒドビーズアッセーとともに定量的ＦＡＣＳ分析によって測定した。小胞をアルデヒドビーズに結合し、クラスＩ／IIに対する非標識化マウス抗体、および蛍光標識化した二次抗体で染色した。二次抗体の平均蛍光強度を、１ビーズあたりのマウスＩｇの既知の数を有するアルデヒドビーズ上のそれと比較した。その結果、小胞表面のクラスＩおよびクラスII分子の１ビーズあたりの数を生成し、小胞表面のクラスＩおよびクラスII分子の比を推算した。
【００９１】
小胞のクラスIIの１μlあたりの絶対量を、WO01/82958に記載されたとおりに、吸着ＥＬＩＳＡによって測定した。
【００９２】
小胞のクラスＩ分子の１μlあたりの絶対量を、クラスＩ対クラスIIの比に小胞のクラスIIの１μlあたりの絶対量を乗じることによって算出した。
【００９３】
２．３．機能アッセイ：ＳＥＥアッセイ
小胞に超抗原ＳＥＥを装荷し、それがRaji抗原提示細胞の存在下でジャーカットＴ細胞のＩＬ−２分泌を誘導できる能力について試験した（WO01/82958）。
【００９４】
３．クラスＩペプチドの装荷
小胞のＭＨＣクラスＩ分子に、ビオチン標識化参照ペプチドを直接装荷した。クラスＩ分子への参照ペプチドの結合を、小胞のクラスＩ分子がプレート上に捕捉された後にビオチンに結合した、ユーロピウム−アビジンから生成された蛍光シグナルによって立証した。
【００９５】
該小胞のＭＨＣクラスＩ分子に、ビオチン標識化参照ペプチドおよび標的ペプチドの混合物を直接装荷した。クラスＩ分子への標的ペプチドの結合を、WO01/82958に記載されたとおりに、ビオチン標識化ペプチドに結合した、ユーロピウム−アビジンからの減少した蛍光シグナルに反映された、ビオチン−参照ペプチドの結合の低下によって立証した。
【００９６】
４．Ｍａｒｔ−１クラスＩペプチドを装荷した小胞の生物学的活性
ＨＬＡ−Ａ２＋Ｔ細胞から生成した小胞に、Ｍａｒｔ−１ペプチドを直接装荷し、それがＭａｒｔ−１特異性Ｔ細胞ＬＴ１１のＩＦＮ−γ分泌を誘導できる能力について試験した。
【００９７】
結果
５．活性化された初代Ｔ細胞から富化された小胞は、Ｔ細胞特異性マーカーおよびエキソソーム特異性テトラスパンタンパク質を発現する。
上記セクション１に開示したとおり、ＰＨＡで活性化されたＴ細胞が生成した膜小胞の表現型を、アルデヒドビーズアッセーによって分析した。結果を図１に提示する。
【００９８】
図１ａは、活性化されたＴ細胞に由来する小胞が、ＣＤ３、ＣＤ８、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）およびＣＤ１５２のような特定のマーカーを発現することを示す。これは、他の細胞型、たとえば、ＣＤ３、ＣＤ８、ＴＣＲおよびＣＤ１５２のようなマーカーを本質的に示さない、樹状細胞に由来する小胞（Ｄｅｘ）とは対照的である。Ｔ細胞エキソソームとＤｅｘとのマーカーの平均的な蛍光強度の比は、ＣＤ３、ＣＤ８、ＴＣＲおよびＣＤ１５２について、それぞれ、９．０、４．７、３．９および２．０であった。
【００９９】
図１ｂは、活性化されたＴ細胞に由来する小胞が、意外にも、クラスIIより多くのクラスＩを発現することを示す（クラスＩとクラスIIとの間の平均蛍光強度比は、１２．２である）。これは、クラスＩより多くのクラスIIを発現するＤｅｘとは対照的である（クラスＩとクラスIIとの間の平均蛍光強度比は、０．１１である）。
【０１００】
図１ｃは、活性化されたＴ細胞に由来する小胞が、ＣＤ６３、ＣＤ８１およびＣＤ９のようなテトラスパンタンパク質を発現することを示す。
【０１０１】
６．ジャーカットＴ細胞系から生成された小胞は、Ｔ細胞特異性マーカーを発現する。
上記セクション１に開示したとおり、ＰＨＡで活性化されたジャーカットＴ細胞が生成した膜小胞の表現型を、アルデヒドビーズアッセーによって分析した。結果を、図２に提示する。驚異的にも、小胞は、非常に低レベルのクラスＩ／II、および高レベルのＣＤ１ｃ，ｄを発現した。
【０１０２】
７．活性化されたＴ細胞から生成された小胞の総クラスＩ数は、樹状細胞からのそれとほぼ同じである。
表１は、活性化されたＴ細胞から生成された小胞、および３種類のロイコパック（leukopack）から生成されたＤｅｘの総クラスＩ数を列挙している。クラスＩ数は、該小胞についてと、細胞の拡張なしの各ロイコパックからのＤｅｘについてとでほぼ同じである。
【０１０３】
Ｔ細胞が、人為的な抗原提示細胞によって１０，０００倍まで容易に拡張できることは、充分に文書化されている［Maus, M.V. et al., 2000］。それらは、不死化することもできる［Hoojiberg, E. et al., 2000、Kaltof, K., 1998］。したがって、同じ量の血液またはロイコパックを用いて、Ｄｅｘよりはるかに多くのクラスＩ分子の総数を担持する小胞を生成することができる。
【０１０４】
８．Ｔ細胞からの小胞上のクラスII分子は、超抗原Ｅ（ＳＥＥ）を装荷し、ＩＬ−２を分泌するようジャーカット細胞を刺激することができる。
図３は、３種類のロイコパックの、活性化されたＴ細胞から生成され、超抗原ＳＥＥを装荷した小胞が、ＡＰＣの存在下でＩＬ−２を生成するようジャーカット細胞を刺激することを示す。これは、そのような小胞が、抗原ＨＬＡ複合体を抗原提示細胞へと移転し、それらを完全に機能的にさせられることを立証している。
【０１０５】
９．Ｔ細胞からの小胞上のクラスＩ分子には、ビオチン標識化参照ペプチドを装荷することができる。
図４は、ＨＬＡ−Ａ２−ロイコパックではなく、ＨＬＡ−Ａ２＋ロイコパックのＴ細胞からの小胞上のクラスＩ分子が、ＨＬＡ−Ａ２−特異的なビオチン標識化参照ペプチドを、pH４．２でβ２ｍの存在下で直接装荷できることを示す。これは、ペプチド装荷が、ＨＬＡが制限されているため、特異的であることの証拠を与える。
【０１０６】
図５は、ＨＬＡ−Ａ２＋Ｔ細胞からの小胞上のクラスＩ分子が、ＨＬＡ−Ａ２−特異的なペプチドであるＭａｒｔ−１を、pH５．２でβ２ｍの不在下で直接装荷できることを示す。Ｍａｒｔ−１ペプチドは、ビオチン標識化参照ペプチドの結合を競争阻害する。これは、Ｍａｒｔ−１ペプチドが、ＨＬＡ制限される方法で小胞のＭＨＣクラスＩに特異的に装荷できることを示す。
【０１０７】
１０．Ｍａｒｔ−１ペプチドを装荷したＨＬＡ−Ａ２＋Ｔ細胞からの小胞上のクラスＩ分子は、ＩＦＮ−γを分泌するよう、Ｍａｒｔ−１特異性Ｔ細胞を誘導する。
図６は、Ｍａｒｔ−１特異性Ｔ細胞であるＬＴ１１が、Ｍａｒｔ−１ペプチドを装荷した該小胞（ＨＬＡ−Ａ２＋）の刺激に応答し、ＩＦＮ−γを分泌することを明確に示す。これは、小胞が、機能化されていて、ＭＨＣクラスＩペプチド複合体を標的ＡＰＣに移転できることを立証している。
【０１０８】
【表１】
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【０１０９】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１ａ】フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）で活性化されたＴ細胞により生成された膜小胞の表現型を示すグラフである。
【図１ｂ】フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）で活性化されたＴ細胞により生成された膜小胞の表現型を示すグラフである。
【図１ｃ】フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）で活性化されたＴ細胞により生成された膜小胞の表現型を示すグラフである。
【図２】ＰＨＡで活性化されたジャーカットＴ細胞により生成された膜小胞の表現型を示すグラフである。
【図３】異なる３種類のロイコパック（leukopack）由来の活性化Ｔ細胞から生成された、超抗原ＳＥＥを装荷した小胞が、ＡＰＣの存在下でジャーカット細胞によるＩＬ２の放出を誘導することを示すグラフである。
【図４】Ｔ細胞からの小胞へのＨＬＡ−Ａ２−特異性ペプチドの直接装荷を示すグラフである。
【図５】Ｔ細胞からの小胞へのＨＬＡ−Ａ２−特異性Ｍａｒｔ−１ペプチドの直接装荷を示すグラフである。
【図６】Ｍａｒｔ−１ペプチドを装荷した小胞が、抗原提示細胞の存在下でＭａｒｔ−１に特異的なＴ細胞応答を誘導することを示すグラフである。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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