(57)【要約】  本発明は、複数の金属イオンを含むと推定される試料中の、有害である可能性がある金属イオンの検出、同定およびアッセイの方法に関する。本発明は、キレート剤により機能化された、少なくとも2つのモノマーからなる電気活性ホモポリマーまたはコポリマーのポリマーを含むことを特徴とするプローブを用いること、ならびに、試料中に存在する(複数の)カチオンのレドックス電位に特徴的な電位差を測ることからなることを特徴とする。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
キレート剤により機能化されている少なくとも2つのモノマーのホモポリマーまたはコポリマーである少なくとも1種の電気活性ポリマーを含むことを特徴とする、電気活性プローブ。
【請求項２】
前記電気活性ポリマーが、ポリピロール、ポリアセチレン、ポリアジン、ポリ(p-フェニレン)、ポリ(p-フェニレンビニレン)、ポリピレン、ポリチオフェン、ポリエチレンジオキシチオフェン、ポリフラン、ポリセレノフェン、ポリピリダジン、ポリカルバゾールおよびポリアニリンから選択されることを特徴とする、請求項1に記載のプローブ。
【請求項３】
前記キレート剤が、イミノ二酢酸、ニトリロ三酢酸およびエチレンジアミン四酢酸から選択されることを特徴とする請求項1および2のいずれかに記載のプローブ。
【請求項４】
前記電気活性ポリマーが少なくとも2つのモノマーからなるポリピロールであり、また前記キレート剤がIDAまたはNTAであり、前記キレート剤がカルボキシメチル残基の媒介によりピロール環の3-位に共有結合を介して結合していることを特徴とする、請求項1から3のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項５】
以下の工程:
d) 通常のエステル化法による、活性化された基により置換されたモノマーの合成、
e) 電極上のフィルムの形態へのクーロメトリによる重合と析出、
f) 活性化された基の加水分解による、キレート剤による機能化、
を含むことを特徴とする、請求項1から4のいずれか一項に記載の電気活性プローブの調製方法。
【請求項６】
請求項1から1のいずれか一項に記載の電気活性プローブを使用し、また、試料中に存在する1種のカチオンまたは複数のカチオンのレドックス電位に特徴的な電位差を測ることを特徴とする、複数の金属イオンを含んでいる可能性がある試料中の、有害である可能性のある金属イオンの選択的な検出、同定およびアッセイの方法。
【請求項７】
前記金属イオンの前記検出および/またはアッセイが、金属錯体を形成していない前記機能化電気活性ポリマーと、金属カチオンとキレートを形成した後の同ポリマーについて、電位差または電流の変化を観察および/または測定することにより実施されることを特徴とする、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
請求項1から4のいずれか一項に記載のプローブで、表面の全体または一部分が被覆された電極。
【請求項９】
キレート剤により機能化された少なくとも2つのモノマーを含むことを特徴とする、ホモポリマーまたはコポリマーである電気活性ポリマー。
【請求項１０】
前記モノマーが、ピロール、アセチレン、アジン、p-フェニレン、p-フェニレンビニレン、ピレン、チオフェン、ポリエチレンジオキシチオフェン、フラン、セレノフェン、ピリダジン、カルバゾールおよびアニリンから選択されることを特徴とする、請求項9に記載のポリマー。
【請求項１１】
前記キレート剤が、イミノ二酢酸、ニトリロ三酢酸およびエチレンジアミン四酢酸から選択されることを特徴とする請求項9および10のいずれかに記載のポリマー。
【請求項１２】
少なくとも2つのモノマーからなるポリピロールであり、また、前記キレート剤がIDAまたはNTAであり、前記キレート剤がカルボキシメチル残基の媒介によりピロール環の3-位に共有結合を介して結合していることを特徴とする請求項9から11のいずれか一項に記載のポリマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学的物質(entity)と相互作用することができ、従ってまた、電気活性(electroactive)ポリマーの電気化学的性質の検知できる選択的な変化を測定することにより、それらの検出、アッセイおよび同定を可能にする物質(agent)により機能化された(functionalized)電気活性ポリマーにより調製される有機電極に関する。
【背景技術】
【０００２】
上記の変化は、相互作用の前後の、電気活性ポリマーの酸化電位の変化などのポテンシオメトリ型のもの、あるいは、所定の電位で求められる、相互作用前後のポリマーの酸化または還元電流の変化などのアンペロメトリ型のものである。
【０００３】
ポリピロール、ポリチオフェン、ポリアニリン、ポリフェニレンおよびこれらの誘導体などの共役ポリマーは、それらの電気活性の故に知られており、発明者たちは、アナライト(analyte)センサを開発するために、それらを機能化することによってこれらのポリマーを使用することに関心を持っていた。
【０００４】
例えば、EP-B-0314009では、有機分子に共有結合することができるピロール環の3-位にグラフトされたチエニルピロールが教示されているが、これらの生成物は、それらの疎水性のために、水性媒体中での検出には適していない。
【０００５】
WO-A-95/29199では、それぞれ、ピロール環の3-位の炭素で、共有結合した核酸プローブにより置換されたピロール環からなるモノマーで構成されたポリピロールが教示されている。こうして得られたポリピロールは、in vitroまたはin vivoでのリガンドの検出に、また場合によってはアッセイに応用される。
【０００６】
NTA(ニトリロ三酢酸)またはIDA(イミノ二酢酸)などのキレート剤が金属に結合する能力は、すでに2または3価金属で研究されてきた。例えば、固定化金属アフィニティクロマトグラフィ(IMAC)は、キレート剤としてIDAを用いてタンパク質の精製に使用されてきた(Poruth et al., Nature, 258, 598-599(1975))。IDAは、Zn2+、Cu2+またはNi2+などの金属イオンを取り込み、タンパク質またはペプチドを精製するために使用された。
【０００７】
特許出願WO 90/02829には、特に、EDTAが組み込まれた電気活性ポリマーフィルムのなどのエレクトロポリマーで被覆された微小電極が開示されている。このエレクトロポリマーの欠点は、後にアナライトに結合している際の抵抗の問題である。
【特許文献１】EP-B-0 314 009
【特許文献２】WO-A-95/29199
【特許文献３】WO 90/02829
【非特許文献１】Poruth et al., Nature, 258, 598-599(1975)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者等は、驚くべきことに、有害である可能性のある金属イオンを含んでいると思われる試料中のそれらの検出が、キレート剤が共有結合した電気活性ポリマーからなる電気活性プローブの使用により大幅に向上することを見出した。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
こうして、本発明の第1の主題は、少なくとも2つのモノマーからなるホモポリマーまたはコポリマーであり、キレート剤により機能化されている電気活性ポリマーを含むことを特徴とする電気活性プローブである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の目的に適する電気活性ポリマーは、水中で電気活性であるポリマーである。
【００１１】
本発明の実施形態によれば、電気活性ポリマーは、ポリピロール、ポリアセチレン、ポリアジン、ポリ(p-フェニレン)、ポリ(p-フェニレンビニレン)、ポリピレン、ポリチオフェン、ポリエチレンジオキシチオフェン、ポリフラン、ポリセレノフェン、ポリピリダジン、ポリカルバゾールおよびポリアニリンから選択される。
【００１２】
本発明のプローブに使用されるキレート剤は、非特異的な、すなわち、複数種の検出が可能なすべてのキレート剤である。
【００１３】
本発明の一実施形態によれば、キレート剤は、イミノ二酢酸、ニトリロ三酢酸およびエチレンジアミン四酢酸から選択される。
【００１４】
IDAには、金属キレートの生成に利用できる3つの部位がある。NTAは、キレート形成に利用できる他の樹脂より安定な方法で金属イオンに結合する、4座配位子である。
【００１５】
EDTAは、そのイオンの形態では、6座配位子錯化剤である。
【００１６】
上で定義された本発明のプローブは、本発明の電気活性ポリマーがキレート剤により機能化されたような構造を示す。別の言い方をすると、その構造は、結合基(connecting group)を介して共有結合でキレート剤が導電性ポリマーに直接結合しているような構造である。
【００１７】
本発明による結合基は、少なくともその一方の化学的物質が、活性化されたか、あるいは活性化可能な基により、結合という相互作用のために、活性化されていたか、あるいは前もって活性化できた2つの化学的物質を、共有結合を介して結合する。このように、結合基は、一方のものの前記活性化された基または活性化可能な基と、他方のものの反応性官能基の反応によるか、またこの逆により、あるいは、一方のものの前記の活性化したか、または活性化可能な基と、他方のものの別の前記の活性化されたか、または活性化可能な基の反応により生成しうる。
【００１８】
「活性化された基」という用語は、その作用により、それが結びついている存在と別の存在との相互作用を可能にする基を意味すると理解されている。例として、-CO-[O-N-フタルイミド]基などは活性化されたエステル基であろう。「活性化可能な基」という用語は、例えば特定の反応条件の下で、あるいはそれと相互作用しうる活性化された基と接触させた時に、活性化された基に変換されうる基、例えば、-CH2-COOHまたは-CH2-CH2-OH基を意味すると理解されている。
【００１９】
本発明はまた、キレート剤により機能化された少なくとも2つのモノマーを含むことを特徴とする、ホモポリマーまたはコポリマーである電気活性ポリマーにも関する。
【００２０】
本発明の電気活性ポリマーは、単独で、あるいは組合せで、次の特性に該当すると有利である:
-  モノマーは、ピロール、アセチレン、アジン、p-フェニレン、p-フェニレンビニレン、ピレン、チオフェン、ポリエチレンジオキシチオフェン、フラン、セレノフェン、ピリダジン、カルバゾールおよびアニリンから選択され、また
-  キレート剤はイミノ二酢酸、ニトリロ三酢酸およびエチレンジアミン四酢酸から選択される。
【００２１】
本発明の好ましい実施形態によれば、本発明の電気活性ポリマーは、それ自体として、あるいは電気活性プローブにおいて、少なくとも2つのモノマーからなるポリピロールであり、またキレート剤はIDAまたはNTAであり、前記キレート剤は、カルボキシメチル残基の媒介によりピロール環の3-位に共有結合を介して結合している。
【００２２】
本発明はまた、キレート剤により機能化された導電性ポリマーの調製方法にも関する。
【００２３】
この方法は以下のステップを含む:
a) 通常のエステル化法による、活性化された基により置換されたモノマーの合成
b) 電極上のフィルムの形態へのクーロメトリ(coulometry)による重合と析出
c) 活性化された基の加水分解による、キレート剤による機能化。
【００２４】
2つの経路、つまりモノマーの機能化とその後の重合による第1のもの、ならびに、ポリマーフィルムの形成後の機能化による第2のものを通じて、キレート剤により導電性ポリマーを機能化することができる。
【００２５】
活性化された基により置換されたモノマーは通常のエステル化法により合成され、例えば、3-ピロール酢酸(3-pyrroleacetic acid)などのカルボン酸では、N-ヒドロキシフタルイミドによりエステル化される。
【００２６】
次に、得られたモノマーは、クーロメトリにより、電極上のフィルムの形態へと重合され析出され、続いて、活性化された基の加水分解によりキレート剤による機能化が実施される。
【００２７】
本発明のプローブは、有害金属イオン、特に2価金属カチオンの検出に使用されるものである。このような検出の対象となりうるカチオンを生じる金属の例は、例えば、カドミニウム、亜鉛、銅、ニッケル、水銀、鉛、クロム、コバルトおよび銀であり、これらは、それらの酸化数に従って、例えば、2価、1価、3価または4価のカチオンを生じうる。
【００２８】
こうして、本発明はまた、本発明によるプローブを利用し、また、試料に存在する1つのカチオンまたは複数のカチオンのレドックス電位に特徴的な電位差が観察および/または測定されることを特徴とする、複数の金属イオンを含んでいる可能性がある試料中の有害である可能性のある金属イオンの選択的な検出、同定およびアッセイの方法にも関する。
【００２９】
この電位差またはこの電流変化は、錯形成前と錯形成後に、すなわち、金属錯体が形成されていない機能化電気活性ポリマーと、金属カチオンとキレート形成した後の同ポリマーについて、観察および/または測定される。
【００３０】
最後になるが、本発明の1つの主題は、電解質と接触するその表面の全体または一部分が前記のプローブで被覆されている電極である。当業者によく知られた通常の方法により、このような電極を得ることができる。こうして、機能化されたポリマーを通常の電極表面に析出させることにより、このような調製を実施することができる。例として、白金、金またはこれらの技術においてよく知られた他の金属または合金からなる電極表面での電流供給量を制御することによるクーロメトリにより、導電性ポリマーを析出させることができる。
【００３１】
本発明の様々な主題は、調製、及び実施例1から10で、及び、以下の実施例で解説されている図1から10で説明される。
【００３２】
（実施例１）
導電性ポリマーをベースとするフィルムの調製
N-ヒドロキシフタルイミド(NHP)により3-位で官能化されたピロールモノマーを合成し、次に重合して、活性エステル基をもつポリ(3-(カルボキシメチルピロール)NHP)ポリマーのフィルムを作製した。
【００３３】
モノマーの合成
室温で、溶剤としてのクロロホルム中で、N-ヒドロキシフタルイミドと、触媒としてのジシクロカルボキシジイミドを用い、3-ピロール酢酸のカルボキシル基をエステル化することにより、3-カルボキシメチルピロール-NHPモノマーを合成した。反応スキームは以下のように表される。
【００３４】
【化１】
2005513423.tif 000003
【００３５】
ポリマーの合成
3-カルボキシメチルピロール-NHPモノマーの0.1M溶液を、新しく蒸留した無水のアセトニトリルで、電解質(LiClO4、0.5M)の存在下に調製する。このモノマーを、0.9Vに電位を制御して、0.7cm2の白金電極、補助白金電極および参照電極としての飽和カロメル電極を用い、4区画セルで重合して、ポリ(3-(カルボキシメチルピロール)NHP)のフィルムを生成させた。得られたフィルムをアセトンで洗浄し乾燥する。次に、電気活性を、アルゴンでパージして酸素を除去した後、電解質として0.1MのLiClO4を含むアセトニトリル媒体中で測定する。サイクロックボルタンメトリを、20mV/sの速度で記録する。酸化ピークEox=317mV/SCEをもつ安定した可逆的な電気化学的信号と、有機媒体中での電気化学活性の確認が得られる。分析後、電極をアセトンで洗浄し乾燥する。
【００３６】
（実施例２）
導電性3-カルボキシメチルピロールポリマーフィルムへのイミノ二酢酸(IDA)またはN-(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸(NTA)のグラフト化
実施例1に記載されたように、ポリ(3-(カルボキシメチルピロール)NHP)フィルムを作製し分析した後、電極を、NTAまたはIDAの飽和水溶液に室温で12時間浸漬し、超純水で洗浄し乾燥する。ポリ(3-カルボキシメチルピロール-IDA)またはポリ(3-カルボキシメチルピロール-NTA)の合成は以下のように表される。
【００３７】
【化２】
2005513423.tif 000004
【００３８】
得られた電極を超純水で洗浄し乾燥し、電気活性を、0.5MのNaClを含む水性媒体中でモニタする。電気化学的分析が図2に示されている。
【００３９】
水性媒体中で、電気化学信号は安定しており可逆的である。
【００４０】
様々な厚さのポリ(3-カルボキシメチルピロール-NHP)フィルムを調製し、得られたフィルムにNTAをグラフトした。0.5MのNaClの存在する水性媒体中で記録された電気化学的応答により、水性媒体中で電気化学的に活性なフィルムの存在が確認される。電極に始めに析出したポリ(3-カルボキシメチルピロール-NHP)の量と、そのフィルムにグラフトしたNTAの計算量との比較は、フィルムへのNTAまたはIDAのグラフト効率は100%であることを示唆する。つまり、ポリ(3-カルボキシ)ピロールフィルムへのNTAまたはIDAのグラフト量は、図3の曲線により示されるように、電極に存在する3-カルボキシメチルピロール-NHP単位の量に依存する。
【００４１】
（実施例３）
修飾導電性ポリマーフィルムによる金属の検出
電極上でのポリ(3-カルボキシメチルピロール-NTA)フィルムと銅の錯形成
【００４２】
【化３】
2005513423.tif 000005
【００４３】
ポリ(3-カルボキシメチルピロール-NTA)フィルムを備える電極を、水性媒体中で電気化学的に分析し、脱イオン水で洗浄し乾燥し、次にそれを、室温で0.5MのNaClの存在下にCuCl2の水溶液に3時間浸漬する。
【００４４】
次に、電極を脱イオン水で洗い乾燥し、0.5MのNaClを含む水溶液中で電気化学的に分析する。ポリ(3-カルボキシメチルピロール-NTA)の電気化学的信号の消失と、水性媒体中で安定しているが可逆的でなく電気活性である、-0.2V〜0.35VでのCu+からCu2+への酸化に特徴的なピークの出現により、銅とポリ(3-カルボキシメチルピロール-NTA)との錯形成が確認される(図4)。
【００４５】
対照フィルムとしてのポリ(3-カルボキシメチルピロール-NTA)フィルムへの、0.5MのNaClと水の影響を調べるために、同じ電気量を投入して、別の電極をポリ(3-カルボキシメチルピロール-NHP)により調製し、次に、このポリ(3-カルボキシメチルピロール-NHP)フィルムを前記のようにしてNTAで修飾した。次に、得られた電極を再び、室温で3時間、0.5MのNaClを含む水溶液に浸漬した。これらの電極の電気化学的分析が図4に示されている。
【００４６】
サイクリックボルタンメトリの分析により、ポリ(3-カルボキシメチルピロール-NTA)フィルムは、同じ時間の間、0.5MのNaClで処理することにより、フィルムの疎水性のために、水性媒体中のその電気活性を失い、一方、銅を錯化すると、ポリ(3-カルボキシメチルピロール-NTA)の信号が変更されるだけでなく、水性媒体中でその電気活性が増加し、信号は電気化学的に安定で可逆的なままであることが示される。
【００４７】
（実施例４）
銅の電気化学的応答に対する導電性ポリマーフィルムの厚さの影響
ポリ(3-カルボキシメチルピロール-NHP)のモノマーを、2つの異なる電気量(Q=50mCと150mC)で、2つの電極上に重合により析出させる。次に、それは前記のように電気化学的に存在し、これらの電極を、NTAを含む水溶液に浸漬する。次に、これらの電極を、同じ濃度のCuCl2と0.5MのNaClを含む水溶液に、室温で3時間浸漬し、次に、脱イオン水で洗浄し乾燥して、0.5MのNaClを含む水性媒体中で分析する。
【００４８】
ポリ(3-カルボキシメチルピロール-NTA)フィルムと錯形成した銅の量は、ポリマーフィルム上のNTAの量に依存し、このNTAの量は、白金電極上に重合したピロールモノマーの、官能化された単位の量に依存する。すなわち、これは、ポリマーフィルム上の銅錯体の量は、ポリマーフィルムの厚さによることを意味する。このことは図5に示されており、図では、厚さの異なる2つの電極が異なる量の銅と錯形成することが認められる。
【００４９】
（実施例５）
ポリマーフィルムの電気化学的応答への銅濃度の影響
この効果は、同量のモノマーからなり、同量のNTAをグラフトしたポリ(3-カルボキシメチルピロール-NHP)ポリマーフィルムを含む4つの同じ電極で調べられる。3つの同じ電極を、0.5MのNaClを含み、それぞれ、2x10-3m/l、2x10-6m/lおよび2x10-7m/lの銅を含む、異なる濃度のCuCl2水溶液に、室温で4時間浸漬し、4番目の電極を、参照電極として、0.5MのNaClを含み銅を含まない水溶液に浸漬した。電極を数回水で洗浄し乾燥して、次に0.5MのNaClを含む水性媒体中で分析した。
【００５０】
結果は図6に示されており、Cu2+による電気化学的応答へのCu2+の濃度の影響を示している。
【００５１】
ポリマーフィルムの電気化学的応答への銅の濃度の影響を、下の表1にまとめて示す。
【００５２】
【表１】
2005513423.tif 000006
【００５３】
これらのボルタモグラムの分析により、信号電流強度の感度は、ポリ(3-カルボキシメチルピロール-NTA)フィルムへの銅の錯化に関連していることが示される。ポリ(3-カルボキシメチルピロール-NTA)フィルムにより、水中で、2x10-7m/lまでの銅濃度に対する、最小の電流強度信号を読み取ることができる。
【００５４】
図6は、電気化学的信号が安定しており、可逆的であることを示している。
【００５５】
（実施例６）
電極の電気化学的可逆性
下のスキームは、電極上のポリ(3-カルボキシメチルピロール-NHP)フィルムによる、銅および水銀の錯形成と脱離(decomplexing)を示している。
【００５６】
【化４】
2005513423.tif 000007
【００５７】
ポリ(3-カルボキシメチルピロール-NTA)ポリマーフィルムにCu2+が存在することを確認するために、また、ポリ(3-カルボキシメチルピロール-NTA)フィルムを、ポリ(3-カルボキシメチルピロール-EDTA)フィルムに替えることが可能かどうか調べるために、Cu2+と錯形成したポリ(3-カルボキシメチルピロール-NTA)ポリマーフィルムを備える電極を、0.1MのEDTA(エチレンジアミン四酢酸)溶液に15分間浸漬した。次に、電極を水で洗い乾燥して分析する。ポリ(3-カルボキシメチルピロール-NTA)の最初のボルタモグラムの分析は、電気化学的信号が可逆的であり安定であることを示している。ポリ(3-カルボキシメチルピロール-NTA)ポリマーフィルムのCu2+による再錯化を同じ手順で繰り返すと、Cu2+の存在がやはり認められる。このことから、図7に示されるように、2価金属Cu2+が、ポリ(3-カルボキシメチルピロール-NTA)フィルムに錯化することが確認される。図7の分析により、ポリ(3-カルボキシメチルピロール-NTA)と銅の錯体の形成が確認され、銅はフィルム上に析出しているのでないことが示される。ポリ(3-カルボキシメチルピロール-NTA)フィルムへの銅の錯形成と脱離は、その系で可逆的であり安定している。
【００５８】
ポリ(ピロール-NTA)と水銀の錯形成およびEDTAによる脱離の場合に、同じことが認められた。
【００５９】
（実施例７）  
電極上のポリ(3-カルボキシメチルピロール-NTA)フィルムと水銀の錯形成
水銀とポリ(3-カルボキシメチルピロール-NTA)フィルムとの錯形成が、下のスキームに示されている。
【００６０】
【化５】
2005513423.tif 000008
【００６１】
水性媒体での分析の後、ポリ(3-カルボキシメチルピロール-NTA)フィルムを脱イオン水で洗浄し乾燥して、電極を、0.5MのNaClを含むHgCl2の飽和水溶液(脱イオン水)に、室温で3時間浸漬した。
【００６２】
次に、電極を、0.5MのNaClを含む水溶液中で分析した。ポリ(3-カルボキシメチルピロール-NTA)の電気化学的信号の消失と、水性媒体で安定で可逆的で電気活性である、-0.1Vと+0.02Vでの、Hg+からHg2+への酸化に特徴的なピークの出現により、水銀とポリ(3-カルボキシメチルピロール-NTA)の錯形成が確認される。ポリ(3-カルボキシメチルピロール-NTA)フィルムへの0.5MのNaClと水の影響を調べるために、フィルムに同じ電気量を投入し、NTAで修飾した別のポリ(3-カルボキシメチルピロール-NHP)電極を、0.5MのNaClだけを含む水溶液に浸漬し、水で洗い乾燥して、電気化学的に分析した。結果は図9に示されており、水性媒体中で可逆的で安定な電気化学的信号の変化により、ポリ(3-カルボキシメチルピロール-NTA)と水銀の錯体の形成が示される。
【００６３】
（実施例８）
ポリマーフィルムの電気化学的応答への水銀の濃度の影響
ポリ(3-カルボキシメチルピロール-NTA)ポリマーフィルムと電気化学的修飾への水銀の濃度の影響を調べるために、同量のモノマーを含み、同量のNTAでグラフトされたポリ(3-カルボキシメチルピロール-NHP)ポリマーフィルムを備える4つの同じ電極を電気化学的に調べた。3つの電極を、NaClを含み、水銀がそれぞれ、2x10-3m/l、2x10-6m/lおよび2x10-7m/lである、水銀濃度の異なるHgCl2水溶液に浸漬し、4番目の電極を、0.5MのNaClだけを含む水溶液に浸漬した。この処理を室温で3時間実施した。次に、電極を数回水で洗浄し乾燥して、次に0.5MのNaClを含む水性媒体中で分析する。
【００６４】
結果は下の表2に示されており、水銀濃度の影響を要約している。
【００６５】
【表２】
2005513423.tif 000009
【００６６】
ボルタモグラムの分析により、信号電流強度の感度は、ポリ(3-カルボキシメチルピロール-NTA)フィルムに錯化した水銀の濃度に関連していることが示される。ポリ(3-カルボキシメチルピロール-NTA)フィルムにより、読むことができる最小の電流信号強度は水中で2x10-7m/lの水銀濃度に相当する。
【００６７】
（実施例９）
電極の選択性
銅は、CuII/CuIおよびCuI/Cu0の変化のレドックス電位により特徴づけられる。
【００６８】
金属はそれぞれ、それらに特有の酸化電位をもつ。様々な金属について文献に記載された酸化電位を下の表3にまとめて示す。
【００６９】
【表３】
2005513423.tif 000010
【００７０】
したがって、電気化学的にこれらの金属を検出するのに、標準電位の値と、金属カチオンと錯形成した後の電極の電気化学的分析の際に認められる酸化ピークの値を比較することにより、そのことを行うことが可能である。例えば、ポリ(3-カルボキシメチルピロール-NTA)フィルム電極により、銅では、Cu2+/Cu+の特性酸化ピークは-0.1V/SCEであり、一方、水銀では、Hg2+/Hg+で、それは、0.1V/SCEである。
【００７１】
このことにより、これらの電極では、Cu2+またはHg2+を選択的に検出することが可能である。
【００７２】
（実施例１０）
キレート剤機能化導電性ポリマー修飾電極の銅と水銀の検出限界
銅と水銀の検出限界を求めるために、ポリ(3-カルボキシメチルピロール-NTA)電極により検出可能な最小量の銅と水銀を含む溶液の電気化学的分析を実施した。2x10-7m/lの銅の濃度で銅と錯形成したポリ(3-カルボキシメチルピロール-NTA)フィルムの電気化学的応答と、水中の0.5MのNaClのポリマーフィルムへの影響だけを示している、銅と錯形成していないポリ(3-カルボキシメチルピロール-NTA)電極の対照ボルタモグラムとの比較が図10に示されている。
【００７３】
電気化学的応答への2価金属の濃度の効果により、これらの電極の感度が、水溶液中のCu2+の3x10-8μA/mlに相当する、2μA/2x10-7m/lのCu2+の溶液、の程度であることを示すことが可能であった。別の言い方をすると、Cu2+の検出限界は水溶液で4ppbである。
【００７４】
水銀では、電極の感度は、水溶液中のHg2+の1x10-8μA/mlに相当する、0.3μA/2x10-7m/lの溶液、の程度である。Hg2+の検出限界は水溶液で4ppbの程度である。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】3ポリ(3-(カルボキシメチルピロール)NHP)のフィルムをアセトンで洗浄し乾燥し、アルゴンでパージして酸素を除去した後、電解質として0.1MのLiClO4を含むアセトニトリル媒体中で、電気活性を測定した結果を示す図である。
【図２】得られた電極を超純水で洗浄し乾燥し、電気活性を0.5MのNaClを含む水性媒体中でモニタした、電気化学的分析を示す図である。
【図３】ポリ(3-カルボキシ)ピロールフィルムへのNTAまたはIDAのグラフト量は、電極に存在する3-カルボキシメチルピロール-NHP単位の量に依存することを示す図である。
【図４】電極上でのポリ(3-カルボキシメチルピロール-NTA)フィルムと銅の錯形成を行った際の、電極の電気化学的分析を示す図である。
【図５】銅の電気化学的応答に対する導電性ポリマーフィルムの厚さの影響を示す図である。
【図６】ポリマーフィルムの電気化学的応答への銅濃度の影響を示す図である。
【図７】電極上のポリ(3-カルボキシメチルピロール-NHP)フィルムによる、銅の錯形成と脱離(decomplexing)を示す図である。
【図８】縦軸をI（μA）とし、横軸をSCEに対するE(mV)とする図である。
【図９】ポリ(3-カルボキシメチルピロール-NTA)フィルムへの0.5MのNaClと水の影響を調べるために、フィルムに同じ電気量を投入し、NTAで修飾した別のポリ(3-カルボキシメチルピロール-NHP)電極を、0.5MのNaClだけを含む水溶液に浸漬し、水で洗い乾燥して、電気化学的に分析した結果を示す図である。
【図１０】銅と水銀の検出限界を求めるために、ポリ(3-カルボキシメチルピロール-NTA)電極により検出可能な最小量の銅と水銀を含む溶液の電気化学的分析を実施した際の、2x10-7m/lの銅の濃度で銅と錯形成したポリ(3-カルボキシメチルピロール-NTA)フィルムの電気化学的応答と、水中の0.5MのNaClのポリマーフィルムへの影響だけを示している、銅と錯形成していないポリ(3-カルボキシメチルピロール-NTA)電極の参照ボルタモグラムとの比較を示す図である。
【図１】
2005513423.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2005513423.tif 000015
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年8月3日(2004.8.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キレート剤により機能化された少なくとも2つのモノマーのホモポリマーまたはコポリマーである少なくとも1種の電気活性ポリマーを含む電気活性プローブを使用し、前記キレート剤は前記ポリマーに共有結合しており、また、試料中に存在する1種のカチオンまたはまたは複数のカチオンのレドックス電位に特徴的な電位差を測ることを特徴とする、複数の金属イオンを含んでいる可能性がある前記試料中の、有害である可能性がある金属イオンの選択的な検出、同定およびアッセイのための方法。
【請求項２】
前記金属イオンの前記の検出および/またはアッセイが、金属錯体を形成していない前記機能化電気活性ポリマーと、金属カチオンとキレートを形成した後の同ポリマーについて電位差または電流の変化を観察および/または測定することにより実施されることを特徴とする請求項2に記載の方法。
【請求項３】
前記電気活性ポリマーが、ポリピロール、ポリアセチレン、ポリアジン、ポリ(p-フェニレン)、ポリ(p-フェニレンビニレン)、ポリピレン、ポリチオフェン、ポリエチレンジオキシチオフェン、ポリフラン、ポリセレノフェン、ポリピリダジン、ポリカルバゾールおよびポリアニリンから選択されることを特徴とする請求項1および2のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記キレート剤が、イミノ二酢酸、ニトリロ三酢酸およびエチレンジアミン四酢酸から選択されることを特徴とする請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記電気活性ポリマーがポリピロールであり、また、前記キレート剤がイミノ二酢酸(IDA)またはニトリロ三酢酸(NTA)であり、前記キレート剤がカルボキシメチル残基の媒介によりピロール環の3-位に共有結合を介して結合していることを特徴とする請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
キレート剤により機能化された少なくとも2つのモノマーのホモポリマーまたはコポリマーである少なくとも1種の電気活性ポリマーを含み、前記キレート剤が前記ポリマーに共有結合しており、さらにニトリロ三酢酸およびエチレンジアミン四酢酸から選択されることを特徴とする電気活性プローブ。
【請求項７】
前記電気活性ポリマーが、ポリピロール、ポリアセチレン、ポリアジン、ポリ(p-フェニレン)、ポリ(p-フェニレンビニレン)、ポリピレン、ポリチオフェン、ポリエチレンジオキシチオフェン、ポリフラン、ポリセレノフェン、ポリピリダジン、ポリカルバゾールおよびポリアニリンから選択されることを特徴とする請求項6に記載のプローブ。
【請求項８】
前記電気活性ポリマーがポリピロールであり、また、前記キレート剤がニトリロ三酢酸であり、前記キレート剤がカルボキシメチル残基の媒介によりピロール環の3-位に共有結合を介して結合していることを特徴とする請求項6および7のいずれかに記載の電気活性プローブ。
【請求項９】
請求項6から8のいずれか一項に記載のプローブで、その表面の全体または一部分が被覆された電極。
【請求項１０】
キレート剤により機能化された少なくとも2つのモノマーを含み、前記キレート剤がそのポリマーに共有結合しており、さらにニトリロ三酢酸およびエチレンジアミン四酢酸から選択されることを特徴とする、ホモポリマーまたはコポリマーである電気活性プローブ。
【手続補正書】
【提出日】平成16年11月9日(2004.11.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２】
前記金属イオンの前記の検出および/またはアッセイが、金属錯体を形成していない前記機能化電気活性ポリマーと、金属カチオンとキレートを形成した後の同ポリマーについて電位差または電流の変化を観察および/または測定することにより実施されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
本発明の電気活性ポリマーは、単独で、あるいは組合せで、次の特性に該当すると有利である:
-  モノマーは、ピロール、アセチレン、アジン、p-フェニレン、p-フェニレンビニレン、ピレン、チオフェン、エチレンジオキシチオフェン、フラン、セレノフェン、ピリダジン、カルバゾールおよびアニリンから選択され、また
-  キレート剤はイミノ二酢酸、ニトリロ三酢酸およびエチレンジアミン四酢酸から選択される。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
モノマーの合成
室温で、溶剤としてのクロロホルム中で、N-ヒドロキシフタルイミドと、触媒としてのジシクロヘキシルカルボジイミドを用い、3-ピロール酢酸のカルボキシル基をエステル化することにより、3-カルボキシメチルピロール-NHPモノマーを合成した。反応スキームは以下のように表される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
様々な厚さのポリ(3-カルボキシメチルピロール-NHP)フィルムを調製し、得られたフィルムにNTAをグラフトした。0.5MのNaClの存在する水性媒体中で記録された電気化学的応答により、水性媒体中で電気化学的に活性なフィルムの存在が確認される。電極に始めに析出したポリ(3-カルボキシメチルピロール-NHP)の量と、そのフィルムにグラフトしたNTAの計算量との比較は、フィルムへのNTAまたはIDAのグラフト効率は100%であることを示唆する。つまり、ポリ(3-カルボキシメチルピロール)フィルムへのNTAまたはIDAのグラフト量は、図3の曲線により示されるように、電極に存在する3-カルボキシメチルピロール-NHP単位の量に依存する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
（実施例４）
銅の電気化学的応答に対する導電性ポリマーフィルムの厚さの影響
3-カルボキシメチルピロール-NHPのモノマーを、2つの異なる電気量(Q=50mCと150mC)で、2つの電極上に重合により析出させる。次に、それは前記のように電気化学的に存在し、これらの電極を、NTAを含む水溶液に浸漬する。次に、これらの電極を、同じ濃度のCuCl2と0.5MのNaClを含む水溶液に、室温で3時間浸漬し、次に、脱イオン水で洗浄し乾燥して、0.5MのNaClを含む水性媒体中で分析する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
ポリ(カルボキシメチルピロール-NTA)と水銀の錯形成およびEDTAによる脱離の場合に、同じことが認められた。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
（実施例８）
ポリマーフィルムの電気化学的応答への水銀の濃度の影響
ポリ(3-カルボキシメチルピロール-NTA)ポリマーフィルムと電気化学的修飾への水銀の濃度の影響を調べるために、同量のモノマーを含み、同量のNTAでグラフトされたポリ(3-カルボキシメチルピロール-NHP)ポリマーフィルムを備える4つの同じ電極を電気化学的に調べた。3つの電極を、0.5MのNaClを含み、水銀がそれぞれ、2x10-3m/l、2x10-6m/lおよび2x10-7m/lである、水銀濃度の異なるHgCl2水溶液に浸漬し、4番目の電極を、0.5MのNaClだけを含む水溶液に浸漬した。この処理を室温で3時間実施した。次に、電極を数回水で洗浄し乾燥して、次に0.5MのNaClを含む水性媒体中で分析する。
【国際調査報告】
2005513423.tif 000021
2005513423.tif 000022
2005513423.tif 000023
2005513423.tif 000024
2005513423.tif 000025
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