(57)【要約】本発明は、正常脳組織と比較して原発性脳腫瘍組織において差次的に発現しているタンパク質の、脳腫瘍処置療法のための生体分子標的としての使用に関する。特に、本発明は、同定された脳腫瘍タンパク質標的のうちの1個または複数と特異的に結合する治療剤及びイメージング剤の使用に関する。本発明は、本発明の方法において投与するための化合物及び薬学的に許容される組成物も提供する。これらのバリアントをコードするスプライシングされたmRNAに特異的な核酸プローブ、及び新規タンパク質に特異的なアフィニティ試薬も、提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳腫瘍の診断又は病期決定のための方法であって、脳腫瘍におけるDDR1 mRNA又はDDR1ポリペプチドの発現の上方制御を決定することを含む、方法。
【請求項２】
脳腫瘍が星状細胞腫である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
星状細胞腫が、グレードII、グレードIII星状細胞腫、及びグレードIV星状細胞腫である、請求項2記載の方法。
【請求項４】
DDR1が、DDR1aアイソタイプ、DDR1bアイソタイプ、DDR1eアイソタイプ、可溶性DDR1、及び神経膠腫特異的アイソフォームからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項５】
脳腫瘍を処置する方法であって、DDR1と結合するか又はDDR1を阻害する化合物を、治療的な量、投与することを含む、方法。
【請求項６】
化合物が、侵襲、リガンド結合、血管形成、生存、MMP産生、外部ドメイン切断、生物学的活性、及び星状細胞腫細胞の細胞接着を阻害する、請求項5記載の方法。
【請求項７】
星状細胞腫細胞が、グレードII、グレードIII、又はグレードIV星状細胞腫である、請求項6記載の方法。
【請求項８】
化合物がクモ膜下腔内投与によって投与される、請求項7の方法。
【請求項９】
化合物が、脳における保持及び安定性のため製剤化される、請求項8の方法。
【請求項１０】
化合物が血管内投与によって投与される、請求項6の方法。
【請求項１１】
化合物が、DDR1の特異的結合パートナーである、請求項6の方法。
【請求項１２】
特異的結合パートナーが細胞毒性部分と結合している、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
細胞毒性部分が、放射性部分、化学毒性部分、及び毒素タンパク質部分からなる群より選択される、請求項12の方法。
【請求項１４】
結合パートナーが星状細胞腫細胞に内部移行する、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
特異的結合パートナーが抗体である、請求項11記載の方法。
【請求項１６】
抗体が、ジスコイジンドメイン；F5/8タイプCドメイン；RFRRプロテアーゼ認識部位；アミノ酸配列380-416、及びgly-proリッチドメインからなる群より選択されるエピトープと結合するものである、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
抗体がヒト抗体である、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
特異的結合パートナーが、DDR1と結合するコラーゲン断片である、請求項11記載の方法。
【請求項１９】
特異的結合パートナーが、膜結合型DDR1と共にホモ型ダイマーを形成するDDR1の可溶性断片である、請求項11記載の方法。
【請求項２０】
特異的結合パートナーが、DDR1と結合するフィブロネクチン断片である、請求項11記載の方法。
【請求項２１】
化合物が、DDR1のメカニズムに基づく阻害剤である、請求項5記載の方法。
【請求項２２】
前記のメカニズムに基づく阻害剤が、チロシン類似体を含む、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
第二の治療剤を投与することをさらに含む、請求項6記載の方法。
【請求項２４】
第二の治療剤が、DDR1ではない脳腫瘍標的タンパク質と特異的に結合する抗体である、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
第二の治療剤が、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤である、請求項23記載の方法。
【請求項２６】
第二の治療剤が、第二のDDR1指向化合物である、請求項23記載の方法。
【請求項２７】
第二の薬剤が、化学増感剤である、請求項23の方法。
【請求項２８】
第二の薬剤が、放射線増感剤である、請求項23の方法。
【請求項２９】
脳腫瘍を画像化する方法であって、
イメージング部分と結合している、DDR1と特異的に結合する化合物を、有効量、患者へ投与すること；及び
結合体のイメージング部分を可視化することを含む、方法。
【請求項３０】
結合体がクモ膜下腔内投与によって投与される、請求項29の方法。
【請求項３１】
化合物が血管内投与によって投与される、請求項29の方法。
【請求項３２】
脳腫瘍が、星状細胞腫グレードII、グレードIII、又はグレードIVである、請求項29記載の方法。
【請求項３３】
化合物が抗体又は抗体断片である、請求項29の方法。
【請求項３４】
抗体が、ジスコイジンドメイン；F5/8タイプCドメイン；RFRRプロテアーゼ認識部位；及びgly-proリッチドメインからなる群より選択されるエピトープと結合するものである、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
特異的結合メンバーが、DDR1と結合するコラーゲン断片である、請求項29記載の方法。
【請求項３６】
特異的結合メンバーが、膜結合型DDR1と共にホモ型ダイマーを形成するDDR1の可溶性断片である、請求項29記載の方法。
【請求項３７】
特異的結合メンバーが、DDR1と結合するフィブロネクチン断片である、請求項29記載の方法。
【請求項３８】
イメージング部分が、X線撮影用部分、陽電子放射部分、光学的に可視の色素、光学的に可視の粒子、及び磁気スピンコントラスト部分からなる群より選択される、請求項29の方法。
【請求項３９】
脳腫瘍標的タンパク質の調整のための候補薬剤をスクリーニングする方法であって、
候補の生物学的活性薬剤を、
（a）DDR1ポリペプチド；
（b）DDR1ポリペプチドをコードし発現する核酸を含む細胞；又は
（c）（i）DDR1のノックアウト；（ii）外因性の安定的に伝達されたDDR1配列のうちの一つを含む、脳腫瘍遺伝子機能のための非ヒトトランスジェニック動物モデルのうちのいずれか一つと組み合わせること；並びに
DDR1活性に対する薬剤の効果を決定すること（ポリペプチド活性を調整する薬剤は、脳腫瘍細胞における分子的及び細胞的な変化を提供する）を含む、方法。
【請求項４０】
生物学的活性薬剤が発現を下方制御するものである、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
生物学的活性薬剤がポリペプチドの活性を調整するものである、請求項39記載の方法。
【請求項４２】
活性がDDR1の内部移行である、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
活性が、DDR1により媒介されるマトリックスメタロプロテアーゼ活性の調整である、請求項42記載の方法。
【請求項４４】
活性が細胞外マトリックスの侵襲である、請求項42記載の方法。
【請求項４５】
活性がチロシンキナーゼ活性である、請求項42記載の方法。
【請求項４６】
活性が外部ドメイン切断活性である、請求項42記載の方法。
【請求項４７】
活性がリガンド結合活性である、請求項42記載の方法。
【請求項４８】
活性が血管形成である、請求項42記載の方法。
【請求項４９】
活性が細胞生存性である、請求項42記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
腫瘍の中でも、脳の腫瘍は、長期生存にとって最も都合の悪い予後の1つを有すると考えられており：中枢神経系（CNS）腫瘍を有すると診断された個体の平均余命は、わずか8〜12ヶ月である。脳及びその特定の型の新生物細胞の両方に、いくつかの特有の特徴があるため、脳腫瘍の完璧な処置及び管理は困難となっている。これらの中には、頭蓋内空間の物理的特徴；身体の残部からの脳の相対的な生物学的隔離；器官塊の比較的不可欠の交換不可能な性質；及び脳腫瘍細胞の特有の性質が含まれる。
【０００２】
脳の頭蓋内空間及び物理的レイアウトは、処置及び回復に対する大きな障害を作出している。脳は、脳塊の大半を構成し神経細胞のための足場及び支持体として機能している星状細胞、神経系の実際の電気的衝撃を伝導する神経細胞、並びにミエリンを作製する絶縁性の乏突起膠細胞のような、その他の少数派の細胞集団から主として構成されている。これらの細胞型は、星状細胞腫、神経芽腫、神経膠芽腫、乏突起膠腫等を含む原発性脳腫瘍を生じさせる。
【０００３】
脳は、強固な頭蓋の殻に格納されており、脳脊髄液のクッションにより保護されている。頭蓋腔の比較的小さな体積のため、脳内の組織の体積の微小な変化は、頭蓋内圧力を劇的に増加させ、器官全体の傷害を引き起こし得る。従って、小さな腫瘍ですら、脳の機能に対し、顕著な有害な影響を及ぼす場合がある。頭蓋の窮屈な物理的位置のため、脳の手術及び処置も、困難で微妙な手技である。しかしながら、腫瘍による増加した頭蓋内圧力の危険のため、脳腫瘍の処置においては、手術が最初の攻撃戦略となる場合が多い。
【０００４】
物理的な隔離に加え、脳は、「血液脳関門」（又はBBB）によって、身体の残部から化学的にも生物学的にも隔離されている。この生理学的現象は、脳内の血管の裏打ちにおける上皮細胞間結合の「密着性」による。細胞裏打ちを通り能動輸送される栄養素は、脳に到達することができるが、血流由来のその他の分子は排除される。これは、毒素、ウイルス、及びその他の潜在的に危険な分子が脳腔に進入するのを防止する。しかしながら、それは、他の型の腫瘍において有用な多くの化学療法剤を含む治療用分子が、脳内へ通過することも防止する。従って、脳へと指向化される多くの療法剤は、例えばオマヤレザバー（Ommaya reservoir）により、脳腔へと直接送達されるか、又はBBBを通した有効量の拡散を保証するために上昇させた投薬量で投与されなければならない。
【０００５】
化学療法薬を脳へと投与することは困難であることから、放射線療法アプローチも試行されている。しかしながら、潜在的な腫瘍生成細胞を完全に破壊するのに必要な量の放射線は、許容されない健康な脳組織の損失をも生ずる。腫瘍塊を排除しつつ患者の認知機能を保持することは、脳腫瘍治療におけるもう一つの難題である。新生物脳細胞は、しばしば、蔓延しやすく、脳塊全体に移動する。従って、例えば肺癌又は膀胱癌とは異なり、真の「腫瘍の縁」を画定することは不可能である。生殖器（卵巣、子宮、精巣、前立腺等）の癌、乳癌、腎臓癌、又は肺癌とは異なり、新たな腫瘍の成長を防止するために、器官全体を除去することはできないし、又は相当部分を除去することすらできない。さらに、脳腫瘍は、極めて不均一であり、腫瘍を構成している様々な細胞集団間で、細胞倍加時間、治療抵抗性、及びその他の生化学的特異体質が異なっている。この広範性及び可変性は、正常脳組織の健康及び機能を温存しつつ脳腫瘍を処置することの困難さを大きく増加させる。
【０００６】
現在の外科的方法は、かなり良好な術後生活を患者に提供するようになったが、現在の組み合わせ療法（手術、低線量放射線、及び化学療法）は、30年前の方法と比較して、1ヶ月、患者の平均余命を改善したにすぎない。主要な腫瘍塊の外部に存在する脳腫瘍細胞の成長を防止するための有効な薬剤が存在しないため、これらの患者の予後は大きくは改善され得ない。いくつかのイムノアフィニティ剤が提唱され、脳腫瘍の処置のために試験されているが（例えば、米国特許第5,624,659号に記載されたテネイシンターゲティング剤を参照されたい）、これらの薬剤は、脳腫瘍の処置にとって十分であることが立証されていない。従って、脳腫瘍の処置のため、新たな分子標的へと指向化された、脳腫瘍細胞を特異的にターゲティングし死滅させることができる治療剤が、緊急に必要とされている。
【０００７】
関連文献
膠芽腫における差次的な遺伝子発現の分析は、特に、例えばMarianiら（2001）J Neurooncol 53（2）：161-76；Markertら（2001）Physiol Genomics 5（1）：21-33；Yanoら（2000）Neurol Res 22（7）：650-6；Kroesら（2000）Cancer Lett 156（2）：191-8；及びReisら（2000）Am J Pathol 156（2）：425-32に見い出され得る。
【０００８】
受容体チロシンキナーゼDDR1（MCK-10とも呼ばれる）は、Ullrichらの米国特許第6,051,397号に記載されている。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
本発明は、脳腫瘍において過剰発現されていることが同定されており、従って、これらのタンパク質標的に対する特異的親和性を有する治療用又は可視化用の組成物による細胞機能の選択的な阻害又は可視化のための選択的なマーキングを可能にする脳腫瘍標的タンパク質DDR1を標的とすることによる、治療及びイメージングの両方の目的のため、脳腫瘍新生物細胞を特異的に標的とするための方法及び試薬を提供する。
【００１０】
本発明の一つの態様において、DDR1発現は、グレードII及び／又はグレードIII星状細胞腫の診断及び処置のための特異的マーカーとして使用される。そのような方法には、DDR1aアイソタイプ、DDR1bアイソタイプ、DDR1d及びDDR1eアイソタイプのDDR1、並びにDDR1の可溶性断片、例えばRFRRプロテアーゼ認識部位において切断されたものが含まれる。
【００１１】
DDR1と結合するか又はDDR1機能を阻害する薬剤は、星状細胞腫細胞の侵襲性を阻害することができ、細胞外マトリックス及び基底膜を通った脳腫瘍の蔓延の防止において有効である。阻害剤は、DDR1の活性化により誘導されるマトリックスメタロプロテアーゼを標的とすることもできる（例えば、マリマスタット（marimastat）及びプリノマスタット（prinomastat）のようなチオール、アルキルカルボニル、ホスホンアミデート、及びヒドロキサメートMMP阻害化合物）。
【００１２】
本発明のもう一つの態様において、DDR1に対して特異的な抗体が、治療及び／又は診断において使用される。抗体は、ヒト抗体又はヒト化抗体であり得、DDR1特異的配列；ジスコイジンドメイン；F5/8タイプCドメイン；RFRRプロテアーゼ認識部位；gly-proリッチドメイン；及びチロシンキナーゼ触媒ドメイン、又は
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の領域に存在するエピトープと選択的に結合することができる。この独特のペプチドセグメントに対して作製された抗体は、哺乳動物DDR1受容体に対してのみ特異的であろう。治療目的の場合、抗体は、放射性同位体（放射性核種）、分化誘導剤及び小さい化学毒性（chemotoxic）薬のような化学毒性剤、毒素タンパク質、並びにそれらの誘導体を含む細胞毒性部分と結合させられ得る。DDR1の細胞外配列と結合する抗体は、内部移行し、それにより、そのような細胞毒性部分が標的とされた腫瘍細胞を死滅させるためのメカニズムを提供することが証明されている。
【００１３】
本発明のもう一つの態様において、DDR1に対して特異的な結合メンバーは、フィブロネクチン、コラーゲン、及びホモ型結合し得るDDR1の可溶性断片を含む、DDR1リガンド又はそれらに由来する結合性断片である。
【００１４】
DDR1へとターゲティングされる治療剤、例えば、抗体及びその他のリガンドを含む特異的結合メンバー；DDR1と結合しかつ／又はDDR1を阻害する低分子；DDR1と結合しかつ／又はDDR1シグナル伝達を阻害する低分子、DDR1チロシンキナーゼのメカニズムに基づく阻害剤等の製剤は、脳領域における安定性及び保持のため安定化された形態で、脳腫瘍患者へ投与され得る。製剤は、DDR1指向治療剤を1個、2個、又はそれ以上含むことができ、異なる脳腫瘍標的タンパク質へとターゲティングされた付加的な治療剤をさらに含んでいてもよい。治療用製剤は、腫瘍の外科的処置と組み合わせて投与されてもよいし（術前処置、手術時の投与を含む）、又は手術のフォローアップとして投与されてもよい。治療用製剤は、化学療法剤又はその他のターゲティングされた治療剤と組み合わせて投与されてもよい。DDR1標的化治療剤は、星状細胞腫グレードII及びグレードIII及びグレードIV腫瘍を含む神経膠腫細胞の侵襲の阻害において有効であり；細胞接着、細胞−細胞相互作用、細胞増殖、細胞生存、遊走、侵襲、及び血管形成の阻害をもたらし得る。治療用分子は、構造的機能及びシグナル伝達機能の阻害をもたらし、抗血管形成特性を示し、増殖及び遊走及び腫瘍成長を阻害し、従って、血管及び癌の生物学における診断剤及び治療剤としての役割を示す。
【００１５】
態様の詳細な説明
癌性脳と正常脳との間のディファレンシャルクローニングによって、DNA配列分析により脳腫瘍標的遺伝子DDR1が同定された。高グレード星状細胞腫におけるこのタンパク質の上方制御は、新生物細胞に関する特異的マーカーを提供し、脳腫瘍の開始及び進行を媒介すると予想されるため、重要である。遺伝子及び／又はタンパク質の活性の阻害は、脳腫瘍の処置において有利であり得る。DDR1は、直接的に腫瘍細胞死を促進する細胞毒性剤を送達するか、又は腫瘍細胞の正常な生理学を阻害するため脳腫瘍タンパク質標的の機能を改変する免疫療法剤のための標的を提供する。さらに、脳腫瘍タンパク質標的へとターゲティングされたイムノイメージング剤は、例えばイムノイメージング剤における光学的に可視の色素部分の使用により、診断法、例えば磁気共鳴画像法（MRI）、ラジオグラフィー等において、かつ／又は手術において、腫瘍塊を可視化するために利用され得る。
【００１６】
脳腫瘍に罹患した、又はそのリスクが高い個体のための治療的及び予防的な処置法には、DDR1を阻害するか、又はDDR1と特異的に結合する薬剤を、治療的又は予防的な量、投与することが含まれる。
【００１７】
本発明の一つの態様において、DDR1発現は、神経膠腫の診断及び処置のための特異的マーカーとして使用される。そのような方法には、DDR1aアイソタイプ、DDR1bアイソタイプ、DDR1d及びDDR1eアイソタイプのDDR1、並びにDDR1の切断されたC末端可溶性断片、例えばRFRRプロテアーゼ認識部位において切断されたものが含まれる。
【００１８】
疾患状態
本発明の方法は、脳腫瘍、特に神経膠芽腫に適用可能である。一般に、脳腫瘍処置の目標は、例えば手術により、できる限り多くの腫瘍細胞を除去し、放射線療法及び／又は化学療法により、術後に残った細胞を可能な限り多く死滅させ、放射線療法及び化学療法により、可能な限り長く、残存腫瘍細胞を非分裂性の休止した、非侵襲性の状態に置くことである。腫瘍の再成長は、現在の処置の変更、又は観察期の患者については処置の再開を必要とするため、注意深い画像監視は、医療の重要な部分である。
【００１９】
脳腫瘍は、腫瘍が起因したと考えられる細胞の種類によって分類される。びまん性線維性星状細胞腫は、成人における原発性脳腫瘍のうち最も一般的な型である。これらの腫瘍は、組織病理学的に、世界保健機関（WHO）グレードII星状細胞腫、WHOグレードIII退形成性星状細胞腫、及びWHOグレードIV多形性神経膠芽腫（GBM）という三つの悪性度グレードへと類別される。WHOグレードII星状細胞腫は、びまん性の星状細胞腫スペクトルの中で最も不活性のものである。星状細胞腫は、周囲の脳への顕著な侵襲傾向を示し、従って治療的な局所調節の試みは困難である。これらの侵襲能は、高グレード腫瘍のみならず低グレード腫瘍においても認められる場合が多い。DDR1と結合するか又はDDR1機能を阻害する薬剤は、神経膠芽腫細胞の侵襲性を阻害することができ、コラーゲン及び基底膜を通った脳腫瘍の蔓延の防止において有効である。阻害剤は、DDR1の活性化により誘導されるマトリックスメタロプロテアーゼを標的とすることもできる（例えば、マリマスタット及びプリノマスタットのようなチオール、アルキルカルボニル、ホスホンアミデート、及びヒドロキサメートMMP阻害化合物）。
【００２０】
多形性神経膠芽腫は、最も悪性度が高い星状細胞腫の病期であり、生存期間は、大部分の患者で2年未満である。組織学的には、これらの腫瘍は、高密度細胞性、高い増殖指数、内皮増殖、及び局部的壊死により特徴づけられる。これらの病変の高度の増殖性は、複数の分裂促進効果に起因する可能性が高い。GBMの特徴のうちの一つは、内皮増殖である。GBMにおいては、多数の血管形成性増殖因子及びそれらの受容体が見い出される。
【００２１】
星状細胞腫には生物学的なサブセットが存在しており、それは、これらの腫瘍において観察される臨床的不均一性を反映している可能性がある。これらのサブセットには、悪性の経過をたどる場合が多い、小児びまん性線維性星状細胞腫の一形態である脳幹膠腫が含まれる。脳幹GBMは、比較的低年齢の患者が発症する成人GBMと共通の遺伝学的特質を有している。多形性黄色星状膠細胞腫（PXA）は、低年齢の成人が主に発症する表層性の低グレードの星状細胞腫瘍である。これらの腫瘍は、奇妙な組織学的様相を有するが、典型的には、外科的に治癒されやすい成長の遅い腫瘍である。しかしながら、PXAは、GBMとして再発する場合もある。毛様細胞性星状細胞腫は、小児の最も一般的な星状細胞腫瘍であり、成人で発症するびまん性線維性星状細胞腫とは臨床的にも組織病理学的にも異なっている。毛様細胞性星状細胞腫は、びまん性線維性星状細胞腫と同じゲノム改変は有していない。上衣下巨細胞星状細胞腫（SEGA）は、通常、結節性硬化症（TS）と関連しており、TS患者の脳室を裏打ちしているいわゆる「キャンドルガタリングス（candle-gutterings）」と組織学的には同一の、脳室周囲の低グレードの星状細胞腫瘍である。TSにおける他の腫瘍性病変と同様に、これらは、成長が遅く、真の新生物よりも過誤腫と類似している。乳児線維形成性大脳星状細胞腫（DCAI）及び線維形成性乳児神経節膠腫（DIGG）は、生後1年又は2年の子供が発症する、大きい、表層性の、通常は嚢胞性の、良性星状細胞腫である。
【００２２】
乏突起膠腫及び乏突起星状細胞腫（混合膠腫）は、臨床的にも生物学的にもびまん性線維性星状細胞腫と最も密接に関係している、びまん性の、通常は大脳の腫瘍である。しかしながら、これらの腫瘍は星状細胞腫ほど一般的ではなく、一般に、びまん性星状細胞腫より良好な予後を有する。乏突起膠腫及び乏突起星状細胞腫は、WHOグレードIII退形成性乏突起膠腫もしくは退形成性乏突起星状細胞腫、又はWHOグレードIV GBMへと進行する場合がある。従って、乏突起膠細胞の腫瘍へと至る遺伝学的変化は、さらにもう一つのGBMへの経路を構成している。
【００２３】
上衣腫は、小児の攻撃的な脳室内腫瘍から、成人における良性脊髄腫瘍まである、臨床的に多様な膠腫の群である。上衣腫のGBMへの推移は、稀である。脈絡叢腫瘍も、小児の攻撃的なテント上脳室内腫瘍から、成人の良性小脳橋角腫瘍まである、脳室系に優先的に発生する多様な腫瘍の群である。脈絡叢腫瘍は、リー・フラウメニ（Li-Fraumeni）症候群及びフォン・ヒッペル・リンドウ（von Hippel-Lindau）（VHL）病を有する患者において時々報告されている。
【００２４】
髄芽腫は、主として小児において、後窩で発生する高度に悪性の未分化な腫瘍である。髄膜腫は、髄膜で発生し基底脳を圧迫する一般的な頭蓋内腫瘍である。髄膜腫は、通常、良性であるが、局所的に再発する「非定形」髄膜腫も存在するし、明らかに悪性であり脳に侵入又は転移する髄膜腫も存在する。非定形髄膜腫及び悪性髄膜腫は、良性髄膜腫ほどは一般的でない。神経鞘腫は、末梢神経上で発生する良性腫瘍である。神経鞘腫は、脳神経、特にそれらが小脳橋角塊として存在する第8脳神経の前庭部分（前庭シュワン腫、聴神経腫）に発生する。血管芽腫は、内皮細胞、周皮細胞、及びいわゆる間質細胞から構成される、起源が不明の腫瘍である。これらの良性腫瘍は、低年齢の成人の小脳及び脊髄に最も頻発する。多発性血管芽腫は、フォン・ヒッペル・リンドウ（VHL）病の特徴である。血管周囲細胞腫（HPC）は、局所的に攻撃的な挙動を示し、転移することもある硬膜の腫瘍である。硬膜に基づく血管周囲細胞腫（HPC）の組織発生は、長年議論されており、別個の実体として分類している著者もいるし、髄膜腫のサブタイプとして分類している著者もいる。
【００２５】
原発性脳腫瘍の症状も、転移性脳腫瘍の症状も、脳内の位置及び腫瘍のサイズに主に依存する。脳の各区域が特定の機能を担っているため、症状は大きく変動すると考えられる。脳の前頭葉における腫瘍は、衰弱及び麻痺、精神病、思考の障害、錯乱及び見当識障害、並びに広い気分変動を引き起こし得る。頭頂葉腫瘍は、発作、無感覚又は麻痺、筆記の障害、単純な数学問題に回答する能力の喪失、ある種の動作の障害、及び触感の消失を引き起こし得る。後頭葉の腫瘍は、各視野の半分の視覚の欠損、幻視、及び発作を引き起こし得る。側頭葉腫瘍は、発作、知覚及び空間の障害、及び受容失語症を引き起こし得る。腫瘍が小脳に発生した場合には、運動失調、協調の欠損、頭痛、及び嘔吐が起こり得る。視床下部の腫瘍は、情動の変化、並びに熱さ及び冷たさの知覚の変化を引き起こし得る。さらに、視床下部腫瘍は、小児の成長及び栄養に影響することがある。小脳を例外として、脳の片側の腫瘍は、身体の反対側において症状及び障害を引き起こす。
【００２６】
DDR1
DDR1は、神経膠芽腫組織からcDNAライブラリーを作出することにより脳腫瘍において同定された。対照状態及び疾患状態に由来するcDNAが、動力学的リアニーリングハイブリダイゼーションに供され、その間、転写物の存在量の規準化及び差次的に発現された転写物の濃縮（即ち、サブトラクション）が行われた。有意な転写の誘導及び／又は抑制を示すクローンのみが、配列決定され、多様な時間的な、空間的な、及び疾患に関係のあるプローブセットを使用した発現プロファイリングへと進められた。有意な転写の誘導及び／又は抑制を示す選択されたクローンが、配列決定され、専有データベース構造における機能アノテーションに供された（国際公開広報第01/13105号参照）。大きな配列断片が配列決定工程において利用されたため、生じたデータは、SAGEのような他のアプローチよりはるかに高い信頼性及び特異性を有している。得られた配列情報は、BLAST（blastn）及びタンパク質配列比較のための反復スミス・ウォーターマン分析を使用して、公共データベースと比較された。
【００２７】
【表１】
2005521420.tif 000003
【００２８】
DDR1は、913アミノ酸（125kd）の細胞表面受容体である。それは、コラーゲン活性化により、リン酸化されタンパク質分解的なプロセシングを受ける。タンパク質の特性には、シグナル配列（配列番号：1、残基1-18）；コラーゲン結合及びコラーゲンにより誘導される受容体ダイマー形成に関与しているジスコイジンドメイン（配列番号：1、残基34-107）；細胞表面炭水化物結合に関与しているF5/8タイプCドメイン（配列番号：1、残基31-185）；RFRRプロテアーゼ認識部位（配列番号：1、残基304-307）；受容体結合及びダイマー形成の後に構造変化を起こし、キナーゼドメインのトランスリン酸化をもたらすシグナルを伝達するストーク（stalk）領域（配列番号：1、残基199-412）；リガンド又は基質の結合において重要なgly-proリッチドメイン（配列番号：1、残基377-415及び476-601）；膜貫通ドメイン（配列番号：1、残基417-443）；並びにチロシンキナーゼ触媒ドメイン（配列番号：1、残基610-905）が含まれる。
【００２９】
DDR1は、コラーゲンI型〜VI型によって活性化され、DDR2は、原繊維コラーゲンによってのみ活性化される。コラーゲン結合にとって不可欠の160aa長のジスコイジンドメインの後に、200aa長のストーク領域が続いている。いずれの領域も、受容体シグナル伝達にとって重要である。DDR1はフィブロネクチンとも結合することができ、ホモ型ダイマーを形成し得る。細胞外ドメイン発現細胞は、増殖の減少を示し、このことは、可溶性52kd細胞外DDR1型が、細胞と結合し、リガンドとして作用することを示している。
【００３０】
ヒトDDR1の細胞外ドメイン内の特異的抗体の標的である領域（エピトープ）を同定するため、ヒトDDR1の細胞外領域（残基1-416）を、タンパク質及び核酸のデータベースにおいてオルソログ又はパラログを見出すためクエリーとして使用した。検索により、ラット及びマウスにおいてオルソログが同定された。パラログDDR2は、ヒト、ハムスター、及びマウスにおいて同定され、DDR1の細胞外部分全体で有意な類似性を示した。ヒト、ラット、及びマウスのDDR1、並びにヒト、ハムスター、及びマウスのDDR2の細胞外領域のマルチプルアラインメントによって、DDR1が、細胞外領域のC末端部分においてDDR2と最も有意に異なっていることが示された。ヒト、ラット、及びマウスのDDR1の細胞外部分のマルチプルアラインメントは、DDR2と最も異なっている領域を含め、細胞外領域全体にわたり有意な保存が存在することを示している。後者の領域には、ラット、マウス、及びヒトにおいて100％同一な長いアミノ酸ストレッチ：
2005521420.tif 000004
が存在する。この配列は、DDR1とのマッチのみを有することが見出され、他の哺乳動物タンパク質との有意な類似性は観察されなかった。従って、このペプチドセグメントに対して作製された抗体は、哺乳動物DDR1受容体に対してのみ特異的であり、DDR2受容体又は他の哺乳動物タンパク質とは交差反応しないであろう。この領域は、フューリン切断部位のC末端側でもある。
【００３１】
DDR1は、選択的スプライシングにより生成する、a、b、c、d、及びeを含む複数のアイソフォームとして出現する。DDR1bは、膜近傍領域に存在する付加的な37アミノ酸を含有している。DDR1cアイソフォームは、エキソン13と14との間のキナーゼドメインの開始部分に付加的な6アミノ酸を含有しており、最も長いアイソフォームである。DDR1aアイソフォームは、エキソン11を欠いている。エキソン11及び12の欠失により、アイソフォームDDR1dが生じる。ラットの出生後の発達中、DDR1bの量はDDR1aアイソフォームと比較して大きく増加する。DDR1eアイソフォームにおいては、エキソン10の初めの半分並びにエキソン11及び12が欠如している。DDR1d及びDDR1eは、キナーゼデッド（kinase dead）変異体である。DDR1は、未同定のプロテアーゼにより、63kd膜固定DDR1bサブユニット及び可溶性54kd DDR1aサブユニットへの部分的プロセシングを受ける。
【００３２】
DDR1アイソフォームの配列又は例えばGenbankにおいて公に入手可能である。
2005521420.tif 000005
【００３３】
DDR1は、ヒトの乳腺、腎臓、肺、結腸、甲状腺、脳、及びランゲルハンス島の上皮細胞に主に発現している。DDR1bタンパク質は、胚形成中に発現される優勢なアイソフォームであり、aアイソフォームは、ある種の乳癌細胞系において上方制御されている。最も長いアイソフォームはDDR1cである。DDR1aは、三次元コラーゲン格子中の白血球の遊走を促進する。3個のDDR1アイソフォーム（a、b、及びc）のうち、DDR1aは、白血球における主要転写物であった。DDR1a又はDDR1bいずれかの過剰発現は、これらの細胞において接着の増加をもたらした。しかしながら、DDR1a過剰発現細胞のみならずDDR1b過剰発現細胞も、顕著な偽足伸長を示し、三次元コラーゲン格子中を遊走することができた。DDR1は、メサンギウム細胞の成長及び接着を調節することも示されている。
【００３４】
2個の新規のDDR1のアイソフォーム、DDR1d及びDDR1eが、ヒト結腸癌細胞から同定された。新たなアイソフォームは、いずれも、膜固定型であるがキナーゼ欠損の受容体であると予想される。選択的スプライシングイベントは、細胞基質及び制御タンパク質との相互作用にとって不可欠な配列モチーフを含有している膜近傍領域において起こる。構造に基づき、変異又は欠失したキナーゼドメインを有する受容体は、ヘテロダイマーを形成しドミナントネガティブにシグナル伝達を阻止することにより、全長酵素活性受容体の抑制剤として作用すると提唱されている。しかしながら、DDR1d及びDDR1eは、コラーゲンにより媒介されるDDR1シグナル伝達には影響しない。細胞接着、又はDDR1全長受容体へのリガンドとしてのコラーゲンの隔離及び提示における役割が仮定されている。これらの新規のDDR1アイソフォームは、胚形成及び腫瘍進行における役割も有しているかもしれない。
【００３５】
野生型マウス及びDDR1（-/-）マウスに由来する平滑筋細胞（SMC）を用いた研究により、ジスコイジンドメイン受容体1のチロシンキナーゼ活性が、平滑筋細胞の遊走及びマトリックスメタロプロテイナーゼ発現にとって必要であることが示されている。DDR1（-/-）SMCは、I型コラーゲン基質への付着及びI型コラーゲン基質へ向かう遊走の障害を示した。これらの結果は、DDR1キナーゼのリン酸化が、細胞遊走にとって重要であることを示唆している。
【００３６】
DDR1シグナル伝達経路における遺伝子の同定は、遺伝子産物の物理的会合によって、又は既知の生理学的経路のデータベース同定によって実施され得る。タンパク質−タンパク質会合の検出のための方法としては、共免疫沈降、架橋、及び勾配又はクロマトグラフィーカラムによる共精製がある。Chienら（1991）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：9578-9582により記載されたようなツーハイブリッド系は、インビボにおけるタンパク質の会合を検出する。ツーハイブリッド系又はその関連方法論は、既知の「ベイト」遺伝子タンパク質と相互作用するタンパク質に関して活性化ドメインライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。
【００３７】
機能バリデーションは、その遺伝子が、腫瘍の開始、進行、又は維持において役割を果たしているか否かの決定において有用である。「機能バリデーション」という用語は、本明細書において使用されるように、候補遺伝子又はそのような遺伝子のセットの発現又は機能の調整が、組織又は生物全体のような細胞集団であり得る参照細胞に関する細胞活性又は細胞状態の検出可能な変化を引き起こすか否かを決定するための過程をさす。検出される検出可能な変化又は改変は、参照細胞により実施される任意の活性であり得る。改変が検出され得る活性又は状態の具体例には、表現型の変化（例えば、細胞形態学、細胞増殖、細胞生存性、及び細胞死）；過去の感受性に対する抵抗性、又は以前には存在しなかった感受性の細胞による獲得；タンパク質／タンパク質相互作用；細胞運動；細胞内又は細胞間のシグナル伝達；細胞／細胞相互作用；細胞活性化；細胞コンポーネント（例えば、ホルモン、ケモカイン等）の放出；並びに代謝反応又は異化反応が含まれるが、これらに制限はされない。
【００３８】
候補遺伝子の機能バリデーションには、多様な別法が利用可能である。RNAi技術のような方法が、使用され得る。アンチセンス技術も、候補遺伝子の機能バリデーションに利用され得る。このアプローチでは、候補遺伝子のコーディング配列のセグメントと特異的にハイブリダイズするアンチセンスポリヌクレオチドが、それが導入される細胞における候補遺伝子の発現を阻害するために投与される。候補遺伝子が細胞内で果たしている機能的な役割は、候補遺伝子を一方又は両方の対立遺伝子において欠失させるか、修飾するか、又は阻害する遺伝子「ノックアウト」アプローチを使用して査定されてもよい。細胞又は動物は、場合により、さらなる分析の一部として野生型候補遺伝子を用いて再構成され得る。
【００３９】
本発明の一つの態様において、RNAi技術が、機能バリデーションにおいて使用される。本明細書において使用されるように、RNAi技術とは、候補遺伝子の発現を阻害するため、即ちその発現の「サイレンシング」のため、候補遺伝子を発現している細胞へ二本鎖RNAが導入される過程をさす。dsRNAは、候補遺伝子との実質的な同一性を有するよう選択される。一般に、そのような方法は、まず、候補遺伝子の全部又は一部を含有している核酸を、一本鎖又は二本鎖のRNAへと転写することを含む。センスRNA鎖とアンチセンスRNA鎖とが、dsRNAが形成されるよう適切な条件の下でアニーリングさせられる。得られたdsRNAが、様々な方法を介して参照細胞へと導入され、候補遺伝子の発現の減弱の程度が、様々な技術を使用して測定される。一般的には、阻害が細胞状態又は細胞活性を改変するか否かが検出される。dsRNAは、候補遺伝子の少なくとも一つのセグメントと実質的に同一であるよう調製される。遺伝子とdsRNAとの間の実質的な配列類似性のみが必要であるため、遺伝学的変異、進化上の分岐、及び多形から発生する二つの種の間の配列バリエーションは、容認され得る。さらに、dsRNAは、様々な修飾された又はヌクレオチド類似体を含み得る。一般的に、dsRNAは2本の別々の相補的なRNA鎖からなる。しかしながら、いくつかの例において、dsRNAは、鎖が巻き戻りヘアピンループを形成するような、自己相補的な一本のRNA鎖により形成されていてもよい。形態に関わらず、RNA二重鎖形成は、細胞の内部又は外部で起こり得る。
【００４０】
多数の別法が、候補遺伝子発現の妨害を検出するために（即ち、候補遺伝子サイレンシングを検出するために）利用可能である。一般に、発現の阻害は、候補遺伝子によってコードされたタンパク質のレベルの減少の検出、遺伝子から転写されたmRNAのレベルの決定、及び／又は候補遺伝子発現と関連した表現型の変化の検出により検出される。
【００４１】
化合物スクリーニング
DDR1タンパク質配列は、抗体及び有機低分子を含む候補化合物の、DDR1タンパク質と結合しかつ／又はその活性を阻害する能力に関するスクリーニングにおいて使用される。DDR1タンパク質を阻害する薬剤は、脳腫瘍の処置のための治療剤として重要である。そのような化合物スクリーニングは、インビトロモデル、遺伝学的に改変された細胞もしくは動物、又はDDR1タンパク質もしくはその断片に対応する精製されたタンパク質を使用して実施され得る。コードされたポリペプチドと結合するか、その作用を調整するか、又は模倣するリガンド又は基質が同定され得る。
【００４２】
スクリーニングにおいて有用なポリペプチドには、DDR1遺伝子によってコードされるもののみならず、遺伝暗号の縮重のため、開示された核酸と配列が同一でない核酸、及びそれらのバリアントによってコードされるものが含まれる。バリアントポリペプチドは、アミノ酸（aa）の置換、付加、又は欠失を含み得る。アミノ酸置換は、非必須アミノ酸を排除するための、例えばグリコシル化部位、リン酸化部位、もしくはアセチル化部位を改変するための、又は機能にとって必要でない1個または複数のシステイン残基の置換もしくは欠失による誤折り畳みを最小限に抑えるための、1個または複数の保存的アミノ酸置換または保存的置換であり得る。バリアントは、タンパク質の特定の領域（例えば、機能性ドメイン、及び／又は、ポリペプチドがタンパク質ファミリーのメンバーである場合には、コンセンサス配列に関連した領域）の生物学的活性を保持するか又は増強された生物学的活性を有するよう設計され得る。バリアントには、本明細書に開示されたポリペプチドの断片、特に生物学的活性断片及び／又は機能性ドメインに相当する断片も含まれる。目的の断片は、典型的には、少なくとも約10aa乃至少なくとも約15aa長、一般的には少なくとも50aa長であり、300aa長又はそれ以上の長さであってもよいが、一般的には約500aa長を超えず、DDR1又はそのホモログもしくはバリアントと同一の連続アミノ酸ストレッチを有するであろう。
【００４３】
トランスジェニック動物又はそれらに由来する細胞も、化合物スクリーニングにおいて使用される。トランスジェニック動物は、DDR1に対応する正常な遺伝子座が改変される相同的組み換えによって作成され得る。又は、核酸構築物がランダムにゲノムへ組み込まれる。安定的組み込みのためのベクターには、プラスミド、レトロウイルス及びその他の動物ウイルス、YAC等が含まれる。酵素活性、発癌、シグナル伝達等における異なるエキソンの役割を決定するために、一連の小さな欠失及び／又は置換が、コーディング配列内に作成され得る。特定の目的の構築物には、標的とされた遺伝子の発現及びドミナントネガティブ変異の発現を阻止するアンチセンス配列が含まれる。lacZのような検出可能マーカーが、目的の遺伝子座へ導入されてもよく、その場合、発現の上方制御により、容易に検出される表現型の変化がもたらされるであろう。例えば神経細胞における過剰発現により、通常は発現されない細胞もしくは組織における、又は異常な発生時点における、標的遺伝子もしくはそのバリアントの発現を提供することも可能である。通常は産生されない細胞における標的タンパク質の発現を提供することにより、細胞挙動の変化を誘導することが可能である。
【００４４】
化合物スクリーニングにより、DDR1の機能を調整する薬剤が同定される。特に重要であるのは、正常ヒト細胞に対する低い毒性を有している薬剤に関するスクリーニングアッセイ法である。標識されたインビトロタンパク質−タンパク質結合アッセイ法、電気泳動移動度シフトアッセイ法、タンパク質結合に関するイムノアッセイ法等を含む極めて多様なアッセイ法が、この目的のために使用され得る。精製された組換えタンパク質の結晶化から導出されたコードされたタンパク質の三次元構造に関する知識は、活性を特異的に阻害する小さな薬物の合理的設計に結びつくかもしれない。これらの薬物は、特定のドメインに指向化され得る。
【００４５】
「薬剤」という用語は、本明細書において使用されるように、DDR1タンパク質の生理学的機能を改変又は模倣する能力を有する任意の分子、例えばタンパク質又は医薬品を記載するものである。一般に、様々な濃度に対する差次的な応答を得るために、複数のアッセイ混合物が、異なる薬剤濃度で平行に実行される。典型的には、これらの濃度のうちの一つは、陰性対照として、即ち、ゼロ濃度又は検出レベル未満で使用される。
【００４６】
候補薬剤には多数の化学的クラスが包含されるが、典型的には、それらは、有機分子、好ましくは50ダルトン超、約2,500ダルトン未満の分子量を有する小さな有機化合物である。候補薬剤は、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含み、典型的には、少なくとも1個のアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基、又はカルボキシル基を含み、好ましくは、官能化学基のうちの少なくとも2個を含む。候補薬剤は、上記の官能基のうちの1個または複数で置換された環式炭素又は複素環式構造、及び／又は芳香族もしくは多環芳香族構造を含む場合が多い。候補薬剤は、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、それらの誘導体、構造類似体、又は組み合わせを含む生体分子の中にも見い出され得る。
【００４７】
候補薬剤は、合成又は天然の化合物のライブラリーを含む極めて多様な起源より得られる。例えば、ランダム化されたオリゴヌクレオチド及びオリゴペプチドの発現を含む、極めて多様な有機化合物及び生体分子のランダム合成及び指向化された合成のための多数の手段が利用可能である。又は、細菌、真菌、植物、及び動物の抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが、利用可能であるか、又は容易に作製される。さらに、天然の又は合成的に作製されたライブラリー及び化合物は、従来の化学的、物理学的、及び生化学的な手段によって容易に修飾され、コンビナトリアルライブラリーを作製するために使用され得る。既知の薬理学的薬剤は、構造類似体を作製するため、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化等のような、指向化された又はランダムな化学的修飾に供され得る。被験薬剤は、例えば天然生成物ライブラリー又はコンビナトリアルライブラリーのようなライブラリーから入手され得る。
【００４８】
候補化合物のライブラリーは、合理的設計によっても調製され得る（一般には、各々参照として完全に本明細書に組み込まれるChoら、Pac.Symp.Biocompat.305-16,1998；Sunら、J.Comput.Aided Mol.Des.12：597-604,1998を参照のこと）。例えば、ホスファターゼ阻害剤のライブラリーは、コンビナトリアル化学的ライブラリーの合成によって調製され得る（一般には、全て参照として完全に本明細書に組み込まれるDeWittら、Proc.Nat.Acad.Sci.USA 90：6909-13,1993；国際公開公報第94/08051号；Baum、Chem.＆Eng.News,72：20-25,1994；Burbaumら、Proc.Nat.Acad.Sci.USA 92：6027-31,1995；Baldwinら、J.Am.Chem.Soc.117：5588-89,1995；Nestlerら、J Org.Chem.59：4723-24,1994；Borehardtら、J.Am.Chem.Soc.116：373-74,1994；Ohlmeyerら、Proc.Nat.Acad.Sci.USA 90：10922-26を参照のこと）。
【００４９】
「コンビナトリアルライブラリー」とは、コレクションを構成する化合物が、1個または複数の型のサブユニットから構成されている、化合物のコレクションである。コンビナトリアルライブラリーを作成する方法は、当技術分野において既知であり、参照として本明細書に組み込まれる米国特許第5,958,792号；同第5,807,683号；同第6,004,617号；同第6,077,954号を含む。サブユニットは、天然又は非天然の部分より選択され得る。コンビナトリアルライブラリーの化合物は、化合物を構成するサブユニットのうちの1個または複数になされた修飾の数、順序、又は型に関して1個または複数の方式で異なっている。又は、コンビナトリアルライブラリーとは、それらが含有しているR基の数、型、もしくは位置、及び／又はコア分子を構成する分子の同一性に関して変動する「コア分子」のコレクションをさす場合もある。化合物のコレクションは、系統的な方式で作製される。上記の方式のうちの1つ以上で互いに異なる化合物のコレクションを系統的に作製する任意の方法が、コンビナトリアルライブラリーである。
【００５０】
コンビナトリアルライブラリーは、1個または複数の固相結合樹脂出発材料から固体支持体上で合成され得る。ライブラリーは、互いに異なる有機分子を五（5）個又はそれ以上、好ましくは十（10）個又はそれ以上含有し得る。異なる分子は、各々、検出可能な量で存在する。その存在が決定され得るために必要とされる異なる各分子の実際の量は、使用される実際の手法により変動し、単離、検出、及び分析のための技術が進歩するにつれ変化し得る。分子が実質的に等しいモル量で存在する場合、100ピコモル又はそれ以上の量が検出され得る。好ましいライブラリーは、実質的に等しいモル量の所望の各反応生成物を含み、比較的大量又は少量の所定の分子の存在は、アッセイ法において優勢となるか又は完全に抑制されるため、そのような分子は含まない。
【００５１】
コンビナトリアルライブラリーは、一般に、（ビーズのような）固相支持体上で出発化合物を誘導体化することにより調製される。一般に、固体支持体には、リンク（Rink）又はメリフィールド（Merrifield）レジン（Resin）のような商業的に入手可能な樹脂が付着している。出発化合物の付着の後、置換基が出発化合物に付着させられる。置換基は、出発化合物に添加され、置換基を含む反応体の混合物を提供することにより変動させられ得る。適当な置換基の例には、炭化水素置換基、例えば、脂肪族、脂環式置換基、芳香族、脂肪族、及び脂環で置換された芳香核等、並びに環式置換基；置換された炭化水素置換基、即ち、炭化水素置換基を主に改変しない非炭化水素ラジカルを含有している置換基（例えば、ハロ（特にクロロ及びフルオロ）、アルコキシ、メルカプト、アルキルメルカプト、ニトロ、ニトロソ、スルホキシ等）；並びにヘテロ置換基、即ち、ヒドロカルビル属性を主に有しつつ、炭素原子以外のものを含有している置換基が含まれるが、これらに制限はされない。適当なヘテロ原子には、例えば、硫黄、酸素、窒素、及びピリジル、フラニル、チオフェニル、イミダゾリル等のような置換基が含まれる。ヘテロ原子は、炭化水素に基づく置換基の各炭素原子に関して、典型的にはわずか1個のみ、存在し得る。又は、炭化水素に基づく置換基に、そのようなラジカル又はヘテロ原子は存在しなくてもよく、従って、置換基は純粋に炭化水素であってもよい。
【００５２】
目的の候補薬剤には、ペプチド及びそれらの誘導体、例えば酵素又は輸送体であるDDR1の高親和性ペプチド又はペプチド模倣体（peptidomimetic）基質、特に阻害剤として作用するよう修飾された基質も含まれる。DDR1は、チロシンキナーゼであり、メカニズムに基づく阻害剤には、阻害性類似体に交換されたチロシン残基を有する類似体が含まれる（Liljebrisら（2002）Bioorg Med Chem 10（10）：3197-212；Liljebrisら（2002）J Med Chem 45（9）：1785-98；及びJiaら（2001）J Med Chem 44（26）：4584-94参照）。
【００５３】
一般に、本明細書に提供された方法に包含されるペプチド剤のサイズは、約3アミノ酸から約100アミノ酸までの範囲であり、約3〜約25の範囲のペプチドが典型的であり、約3〜約12がより典型的である。ペプチド剤は、例えば自動ペプチド合成装置のような、当技術分野において既知の標準的な化学的方法によって合成され得る（例えば、Hunkapillerら、Nature 310：105-11,1984；Stewart及びYoung、Solid Phase Peptide Synthesis、第2版（Pierce Chemical Co.,Rockford,IL）（1984）参照）。さらに、そのようなペプチドは、当技術分野において既知の方法を使用して、ペプチドをコードする核酸配列を有するベクターからの翻訳によっても作製され得る（例えば、Sambrookら、Molecular Cloning,A Laboratory Manual、第3版（Cold Spring Harbor Publish.,Cold Spring Harbor,NY）（2001）；Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、第4版（John Wiley and Sons,New York）（1999）参照）
【００５４】
ペプチドライブラリーは、天然又は合成のアミノ酸から構築され得る。例えば、長さN（ここで、Nは正の整数である）のあらゆる可能なアミノ酸配列を表す合成ペプチドの集団、又はあらゆる可能な配列のサブセットが、ペプチドライブラリーを構成し得る。そのようなペプチドは、例えば自動ペプチド合成装置のような、当技術分野において既知の標準的な化学的方法によって合成され得る（例えば、Hunkapillerら、Nature 310：105-11,1984；Stewart及びYoung、Solid Phase Peptide Synthesis、第2版（Pierce Chemical Co.,Rockford,IL）（1984）参照）。非古典的アミノ酸又は化学的アミノ酸類似体が、古典的アミノ酸の置換又はそれらへの付加において使用され得る。非古典的アミノ酸には、一般的なアミノ酸のD異性体、α-アミノイソ酪酸、4-アミノ酪酸、2-アミノ酪酸、γ-アミノ酪酸、6-アミノヘキサン酸、2-アミノイソ酪酸、3-アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β-アラニン、セレノシステイン、フルオロ-アミノ酸、β-メチルアミノ酸、Cα-メチルアミノ酸、Nα-メチルアミノ酸、及びアミノ酸類似体全般のような遺伝子工学により改変された（designer）アミノ酸が含まれるが、これらに制限はされない。さらに、アミノ酸は、D（右旋性）又はL（左旋性）であり得る。
【００５５】
スクリーニングアッセイ法が結合アッセイ法である場合、分子のうちの1個または複数が、直接的又は間接的に検出可能シグナルを提供することができる標識と接合させられ得る。様々な標識には、放射性同位体、蛍光団、化学発光団、酵素、特異的結合分子、粒子、例えば磁性粒子等が含まれる。特異的結合分子には、ビオチンとストレプトアビジン、ジゴキシンとアンチジゴキシン等のような対が含まれる。特異的結合メンバーの場合には、相補メンバーが、通常、既知の手法に従い、検出を提供する分子で標識されるであろう。
【００５６】
その他の多様な試薬が、スクリーニングアッセイ法に含まれ得る。これらには、最適なタンパク質−タンパク質結合を容易にし、かつ／又は非特異的相互作用もしくはバックグラウンド相互作用を減少させるために使用される塩、中性タンパク質、例えばアルブミン、界面活性剤等のような試薬が含まれる。プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗微生物剤等のようなアッセイ法の効率を改善する試薬が、使用されてもよい。コンポーネントは、必要な結合を提供する任意の順序で添加される。インキュベーションは、任意の適当な温度、典型的には4〜40℃で実施される。インキュベーション時間は、最適な活性のため選択されるが、迅速なハイスループットスクリーニングを容易にするために最適化されてもよい。典型的には、0.1〜1時間で十分であろう。
【００５７】
DDR1と結合し得る化合物に関してスクリーニングすることによる予備スクリーニングを実施してもよく、そのようにして同定された化合物のうちの少なくともいくつかは、阻害剤である可能性が高い。結合アッセイ法は、一般的に、DDR1を1個または複数の被験化合物と接触させること、及びタンパク質と被験化合物とが結合複合体を形成するために十分な時間を経過させることを含む。形成された任意の結合複合体は、多数の確立されている分析技術のうちの任意のものを使用して検出され得る。タンパク質結合アッセイ法には、共沈殿、非変性SDS-ポリアクリルアミドゲル上の共移動、及びウェスタンブロット上の共移動を測定する方法が含まれるが、これらに制限はされない（例えば、Neurotransmitter Receptor Binding（Yamamura,H.I.ら編）61〜89頁のBennet,J.P.及びYamamura,H.I.（1985）「Neurotransmitter,Hormone or Drug Receptor Binding Methods」参照）。
【００５８】
ある種のスクリーニング法は、DDR1の発現を調整する化合物に関するスクリーニングを含む。そのような方法は、一般に、DDR1を発現している細胞1個または複数と被験化合物を接触させる、細胞に基づくアッセイ法を実施すること、及び、次いで発現の増加を検出することを含む。いくつかのアッセイ法は、内因性DDR1を発現する腫瘍細胞を用いて実行される。その他の発現アッセイ法は、外因性DDR1遺伝子を発現する非ニューロン細胞を用いて実施される。
【００５９】
発現又は活性のレベルは、基線値と比較され得る。既に示されたように、基線値は、対照試料に関する値、又は対照集団に関する発現レベルを代表する統計値であり得る。発現レベルは、陰性対照としてのDDR1を発現していない細胞に関して決定されてもよい。そのような細胞は、一般に、その他の点では実質的に遺伝学的に被験細胞と同じである。レポーター構築物を欠く細胞を用いた平行反応を実行すること、又はレポーター構築物を保有している細胞を試験化合物と接触させないことを含む、様々な対照が、観察された活性が真正のものであることを保証するために実施され得る。化合物は、下記のようにして、さらにバリデートされてもよい。
【００６０】
前述のスクリーニング法のうちのいずれかにより最初に同定された化合物は、明白な活性をバリデートするためにさらに試験され得る。そのような方法の基本的なフォーマットは、ヒトのモデルとして活用される動物へ、一次スクリーニングにおいて同定されたリード化合物を投与すること、及び、次いで、DDR1遺伝子が実際に上方制御されるか否かを決定することを含む。バリデーション研究において利用される動物モデルは、一般に、哺乳動物である。適当な動物の具体例には、霊長類、マウス、及びラットが含まれるが、これらに制限はされない。
【００６１】
本明細書に記載されたスクリーニング法により同定された、DDR1タンパク質活性及び／又は腫瘍成長を阻害する活性被験薬剤は、類似体化合物の合成のためのリード化合物として活用され得る。典型的には、類似体化合物は、リード化合物と類似した電子配置及び分子コンフォメーションを有するよう合成される。類似体化合物の同定は、自己無撞着場（SCF）分析、配置間相互作用（CI）分析、及び正規モードダイナミクス分析のような技術の使用により実施され得る。これらの技術を実行するためのコンピュータープログラムが利用可能である。例えば、Reinら（1989）Computer-Assisted Modeling of Receptor-Ligand Interactions（Alan Liss,New York）を参照されたい。
【００６２】
薬学的製剤
DDR1へとターゲティングされた治療剤、例えば抗体及びその他のリガンドを含む特異的結合メンバー；DDR1と結合しかつ／又はDDR1を阻害する低分子；DDR1チロシンキナーゼのメカニズムに基づく阻害剤等の製剤は、脳領域における安定性及び保持のために安定化された形態で、脳腫瘍患者に投与され得る。製剤は、1個、2個、又はそれ以上のDDR1指向治療剤を含むことができ、異なる脳腫瘍標的タンパク質へとターゲティングされた付加的な治療剤をさらに含んでいてもよい。治療用製剤は、腫瘍の外科的処置と組み合わせて（術前処置、手術時の投与を含む）、又は手術のフォローアップとして、投与され得る。DDR1へとターゲティングされた治療剤は、星状細胞腫グレードII及びグレードIII腫瘍を含む膠芽腫細胞の侵襲の阻害において有効であり；腫瘍細胞の壊死をもたらし得る。
【００６３】
血液脳関門（BBB）を通した薬物送達のための一つの戦略は、マンニトールもしくはロイコトリエンのような浸透圧手段による、又は生化学的な、ブラジキニンのような血管作用物質の使用によるBBBの破壊、又は薬剤を直接導入するための外科的方法を要する。特定の薬剤を脳腫瘍へとターゲティングするためにBBB開口（opening）を使用するという可能性も、一つのオプションである。BBB破壊剤は、組成物が血管内注射によって投与される場合、本発明の治療用組成物又はイメージング組成物と共投与され得る。BBBを貫通させるためのその他の戦略は、グルコース担体及びアミノ酸担体のような担体により媒介される輸送体、インスリン又はトランスフェリンのための受容体により媒介されるトランスサイトーシス、並びにp糖タンパク質のような能動流出輸送体を含む、内因性の輸送系の使用を要する。血管の上皮壁を横切った輸送を容易にするため、能動輸送部分を、本発明において使用するための治療用化合物又はイメージング化合物と結合させることもできる。又は、BBBの後ろへの薬物送達は、例えばオマヤレザバーによる、治療薬又はイメージング剤の頭蓋への直接的なクモ膜下腔内送達による。
【００６４】
治療薬のための戦略に依って、製剤は、いくつかのカテゴリに類別され得る。例えば、抗体製剤には、天然型抗体、（同位体もしくは毒素とカップリングした）アーム化（armed）抗体、又は（遺伝子的に操作された、もしくはT細胞誘引性の）異種二機能性抗体が含まれる。（同位体又は毒素とカップリングした）アーム化抗体は、脳室が開かれない限り、一般に、原発性腫瘍又は再発性腫瘍いずれかの切除後に腔内に与えられる。その方法は、頭蓋内コンパートメントにおける標的の過剰発現に基づいており、脳内の他の場所における交差反応はほとんど又は全く起こらない。現在の試験は、全て、局所的な腔内又は腫瘍内の適用を扱っている。異種二機能性抗体は、細胞表面と結合し、次いで、免疫応答を誘起するため他のアームによりT細胞を腫瘍へと誘引するよう設計される。この送達の方法は、腔又は組織自体のいずれかへの局所適用のため指定される。
【００６５】
製剤、例えば抗体製剤は、脳における保持及び安定化のため最適化され得る。薬剤が頭蓋コンパートメントへ投与される場合、薬剤は、コンパートメント内に保持され、拡散したり脳血液関門を通過したりしないことが望ましい。安定化技術には、分子量の増加を達成するための、架橋、マルチマー形成、又はポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド、中性タンパク質担体等のような基との連結による、抗体のサイズの増強が含まれる。
【００６６】
保持を増加させるためのその他の戦略は、生分解性又は生物侵食性（bioerodible）のインプラントへの薬剤の捕捉を含む。治療的活性を有する薬剤の放出の速度は、ポリマーマトリックス中の輸送の速度、及びインプラントの生分解によって調節される。ポリマー関門中の薬物の輸送は、化合物の可溶性、ポリマーの親水性、ポリマー架橋の程度、ポリマー関門を薬物に対してより透過性にするための吸水によるポリマーの膨張、インプラントの幾何学等によっても影響を受けるであろう。インプラントは、移植の部位として選択された領域のサイズ及び形に釣り合った寸法を有する。インプラントは、粒子、シート、パッチ、プラーク、繊維、マイクロカプセル等であり得、選択された挿入の部位と適合性の任意のサイズ又は形を有し得る。
【００６７】
インプラントは、モノリシック（monolithic）であり得る、即ちポリマーマトリックス中に均一に分布しているか、又は活性薬剤の貯蔵庫がポリマーマトリックスによりカプセル化される場合には、均一にカプセル化されている活性薬剤を有し得る。利用されるポリマー組成物の選択は、投与の部位、所望の治療の期間、患者の容認、処置される疾患の性質等によって変動するであろう。ポリマーの特徴には、移植の部位における生分解性、目的の薬剤との適合性、カプセル化の容易さ、生理学的環境における半減期が含まれるであろう。
【００６８】
利用され得る生分解性ポリマー組成物は、分解した場合に、モノマーを含む生理学的に許容される分解生成物をもたらす、有機のエステル又はエーテルであり得る。単独の、又は他のモノマーと組み合わせられた、無水物、アミド、オルトエステル等が、有益であり得る。ポリマーは縮合ポリマーであろう。ポリマーは、架橋されていてもよいし、又は架橋されていなくてもよい。特に重要であるのは、ヒドロキシ脂肪族カルボン酸のポリマー、同種ポリマー又は共ポリマー、及び多糖である。目的のポリエステルには、D-乳酸、L-乳酸、ラセミ乳酸、グリコール酸、ポリカプロラクトン、及びそれらの組み合わせのポリマーが含まれる。L-ラクテート又はD-ラクテートを利用することによって、生分解が遅いポリマーが達成され、ラセミ化合物により分解は実質的に増強される。グリコール酸と乳酸との共ポリマーは特に重要であり、この場合、生分解の速度は、グリコール酸と乳酸との比率によって調節される。最も急速に分解するコポリマーは、およそ等しい量のグリコール酸と乳酸とを有しており、いずれかの同種ポリマーは分解に対してより抵抗性である。より柔軟なインプラントが、より大きな幾何学にとっては望ましいが、グリコール酸と乳酸との比率は、インプラントの脆性にも影響を与えるであろう。目的の多糖には、アルギン酸カルシウム、及び官能化セルロース、特に水に不溶性であることを特徴とする分子量約5kD〜500kDのカルボキシメチルセルロースエステルが含まれる。生分解性ヒドロゲルも、本発明のインプラントにおいて利用され得る。ヒドロゲルは、典型的には、液体を吸収する能力を特徴とするコポリマー材料である。使用され得る例示的な生分解性ヒドロゲルは、Hydrogels in Medicine and Pharmacy、N.A.Peppes編、第III巻（CRC Press,Boca Raton,Fla.）1987年、137〜149頁のHellerに記載されている。
【００６９】
動物又はヒトへの投与用の薬学的組成物を製剤化するために通常使用される媒体と定義される、薬学的に許容される非毒性の希釈剤の担体が、望まれる製剤に依って、薬学的組成物に含まれ得る。希釈剤は、組み合わせの生物学的活性に影響を与えないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、緩衝水、生理食塩水、PBS、リンゲル液、デキストロース溶液、及びハンクス液である。さらに、薬学的組成物又は製剤には、その他の担体、佐剤、又は非毒性の非治療的な非免疫原性の安定化剤、賦形剤等が含まれ得る。組成物には、pH調整緩衝剤、毒性調整剤、湿潤剤、及び界面活性剤のような生理学的条件に近づけるための付加的な物質も含まれ得る。
【００７０】
組成物には、例えば抗酸化剤のような多様な安定剤のうちの任意のものが含まれ得る。薬学的組成物がポリペプチドを含む場合、ポリペプチドは、ポリペプチドのインビボ安定性を増強するか、又は薬理学的特性を増強する（例えば、ポリペプチドの半減期を増加させる、毒性を減少させる、可溶性又は取り込みを増強する）、様々な周知の化合物と複合体化され得る。そのような修飾又は複合体化剤の例には、サルフェート、グルコネート、シトレート、及びホスフェートが含まれる。組成物のポリペプチドは、インビボ属性を増強する分子と複合体化されてもよい。そのような分子には、例えば、炭水化物、ポリアミン、アミノ酸、その他のペプチド、イオン（例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、マンガン）、及び脂質が含まれる。
【００７１】
様々な型の投与に適した製剤に関するさらなる指針は、Remington's Pharmaceutical Sciences（Mace Publishing Company,Philadelphia,PA）第17版（1985）に見い出され得る。薬物送達のための方法の簡潔な概説については、Langer、Science 249：1527-1533（1990）を参照されたい。
【００７２】
薬学的組成物は、予防的及び／又は治療的な処置のため投与され得る。活性成分の毒性及び治療効力は、例えばLD50（集団の50％にとって致死的な用量）及びED50（集団の50％において治療的に有効な用量）を決定することを含む、細胞培養物及び／又は実験動物における標準的な薬学的手法に従い決定され得る。毒性効果と治療効果との用量比が、治療指数であり、比率LD50／ED50として表され得る。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。
【００７３】
細胞培養物及び／又は動物研究から得られたデータは、ヒトのための投薬量の範囲を規定するのに使用され得る。活性成分の投薬量は、典型的には、低い毒性と共にED50を含む循環血中濃度の範囲内にある。投薬量は、利用される剤形及び利用される投与経路に依って、この範囲内で変動し得る。
【００７４】
本明細書に記載された薬学的組成物は、多様な異なる方式で投与され得る。例には、経口、鼻腔内、直腸内、局所、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下、真皮下、経皮、クモ膜下腔内、及び頭蓋内の方法を介した、薬学的に許容される担体を含有している組成物の投与が含まれる。
【００７５】
経口投与の場合、活性成分は、カプセル剤、錠剤、及び散剤のような固体剤形、又はエリキシル剤、シロップ剤、及び懸濁剤のような液体剤形で投与され得る。（1個または複数の）活性コンポーネントは、グルコース、乳糖、ショ糖、マンニトール、デンプン、セルロース又はセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、サッカリンナトリウム、タルク、炭酸マグネシウムのような不活性成分及び粉末化担体と共にゼラチンカプセル内にカプセル化され得る。望ましい色、味、安定性、緩衝能、分散、又はその他の既知の望ましい特質を提供するために添加され得る付加的な不活性成分の例は、べんがら、シリカゲル、ラウリル硫酸ナトリウム、二酸化チタン、及び食用白色顔料である。類似の希釈剤が、圧縮錠を作成するために使用され得る。錠剤及びカプセル剤は、いずれも、数時間にわたり医薬品の連続的な放出を提供するための徐放性製品として製造され得る。圧縮錠は、不快な味をマスキングし、環境から錠剤を保護するための糖コーティングもしくはフィルムコーティング、又は胃腸管における選択的な崩壊のための腸溶コーティングを施され得る。経口投与用の液体剤形は、患者による受け入れを増加させるため、着色剤及び風味剤を含有し得る。
【００７６】
活性成分は、単独で、又は他の適当なコンポーネントと組み合わせられて、吸入を介して投与されるエアロゾル製剤にされ得る（即ち、「噴霧」され得る）。エアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素のような加圧された許容される噴霧剤の中に置かれ得る。
【００７７】
例えば、関節内経路（関節の中）、静脈内経路、筋肉内経路、皮内経路、腹腔内経路、及び皮下経路による、非経口投与に適した製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び製剤を意図された受容者の血液と等張にする溶質を含有し得る水性及び非水性の等張無菌注射液剤、並びに懸濁化剤、可溶化剤、濃化剤、安定剤、及び保存剤を含み得る水性及び非水性の無菌懸濁剤が含まれる。
【００７８】
薬学的組成物を製剤化するために使用されるコンポーネントは、好ましくは高純度であり、潜在的に有害な汚染物質を実質的に含まない（例えば、少なくともナショナルフード（National Food）（NF）等級、一般には、少なくとも分析的等級、より典型的には少なくとも薬学的等級）。さらに、インビボ使用を目的とする組成物は、通常、無菌である。所定の化合物が使用前に合成されなければならない場合、得られた生成物は、典型的には、合成又は精製の過程で存在する可能性のある潜在的に毒性の薬剤、特に内毒素を実質的に含まない。非経口投与用の組成物も、無菌であり、実質的に等張であり、GMP条件下で作成される。
【００７９】
投与
神経膠腫療法に関して、いくつかの処置の状況が可能である：腫瘍が除去され、術後に治療剤が投与される；腫瘍が存在しており、腫瘍塊又はその一部を処置するために治療剤が添加される；腫瘍が再発し、再発塊を処置するために治療剤が添加される；再発性腫瘍が除去され、腔内に治療剤が添加される。
【００８０】
手術は、一般的に、大部分の脳腫瘍の処置における第一工程である。大部分の脳腫瘍手術の目的は、可能な限り多くの容積を除去するか又は減少させることである。サイズを減少させることにより、その他の療法、特に放射線療法が、より効率的になり得る。手術の目標は、以下の通りである：1）補助療法のため、腫瘍負荷がより少なくなるよう、可能な限り多くの腫瘍を除去すること、2）付加的な処置を案内するための正確な診断を得るための、顕微鏡検査用の腫瘍組織を提供すること、及び3）遺伝子治療用のインプラントのようなその他の処置への直接のアクセスを悪性腫瘍細胞に提供すること。外科的除去が直ちに実現可能でない場合、又は腫瘍が到達不可能である、即ち、深く手術不可能な脳のエリアにある場合には、定位生検が診断を確立するために実施され得る。これは、コンピュータ案内が、頭蓋の小さな穴を通してプローブを脳のほぼ任意のエリアに到達させることを可能にする最小限に侵襲性の方法である。
【００８１】
神経外科医が腫瘍を覆う脳のエリアを露出させるために頭蓋骨片を除去する標準的な手技は、開頭術と呼ばれる。腫瘍の位置が突き止められ、次いで、除去される。外科医は、標準的な外科的手技；（大量の熱を発生させ、腫瘍細胞を気化させる）レーザー顕微手術；（超音波を使用して神経膠腫腫瘍を小片へと破壊し、次いで、それを吸引除去する）超音波吸引等を含む、腫瘍を破壊し除去するための様々な外科的オプションを有している。
【００８２】
健康な脳細胞を防御しつつ腫瘍の最大限の除去を可能にするための特別な技術が開発されている。例えば、定位法は、手術（定位手術）及び放射線療法（定位放射線療法）の両方への有用な付属技術となっている。皮質の局在化又は刺激は、脳の特定のエリアを精巧に刺激するための微弱電流を通すプローブを使用する。これは、（脚のけいれんのような）脳の刺激された領域が調節している身体部分の可視の応答を生じさせる。それにより、外科医は、手術中にそれらのエリアを回避することを知る。画像により案内される手術（image guided surgery）は、コンピューター断層撮影（CT）又は磁気共鳴画像（MRI）スキャンにより得られた患者の脳の三次元像を使用する。様々な方向から見た脳の画像が、手術室のモニター上に表示される。手術中、外科医の器具が脳の一部に触れると、カメラが画像をコンピュータに送り、コンピュータが、手術道具の位置を計算し、3D画像上の妥当な位置にそれを表示する。それにより、外科医はモニターを見て、どの構造を回避すべきであるかを知ることができる。神経外科医は、外部磁場によって、マグネット付きの軟カテーテル（magnet-tipped flexible catheter）を、傷害を引き起こし得る脳のエリアを回避する進路を通って、腫瘍部位へと差し向ける技術の使用も調査している。
【００８３】
本発明の組成物は、任意の医学的に適切な手法、例えば血管内（静脈内、動脈内、毛細血管内）投与、脳脊髄液への注射、腔内注射、又は腫瘍への直接注射を使用して投与され得る。クモ膜下腔内投与は、既知の技術に従い、オマヤレザバーの使用により実施され得る（F.Balisら、Am J.Pediatr.Hematol.Oncol.11,74,76（1989）。本発明のイメージング組成物に関して、術前の腫瘍の可視化のためには、血管内注射を介した投与が好ましい。術後の可視化又は手術と同時の可視化は、例えばオマヤレザバーによる、クモ膜下腔内もしくは腔内投与によってもよいし、又は血管内投与によってもよい。
【００８４】
本発明の治療用組成物の投与のための一つの方法は、（必要であれば、注射シリンジの定位固定によって補助される）直接注射、又は投与のための腔もしくは嚢胞へのオマヤレザバーのチップの設置のような、任意の適当な技術による嚢胞性腫瘍の内腔への沈着による。腫瘍が固形腫瘍である場合には、まず、腫瘍の位置に切除腔を作出することにより、抗体が投与され得る。この手法は、少数の微細な点でのみ通常の開頭及び腫瘍切除と異なっている。腫瘍切除は、一般的な処置法であり、圧力を緩和するために指示される場合が多いため、本発明の治療用組成物の投与は、腫瘍切除の後に実施され得る。標準的な神経外科的な全切除の後、全ての出血が焼灼によって止められるまで、腔は好ましくは生理食塩水で濯がれる。次に、表面で腫瘍腔を囲んでいる軟膜くも膜が、繊維芽細胞反応及び軟膜くも膜エリアにおける斑痕の形成を増強するために焼灼される。その結果、脳組織内の腫瘍が除去された位置に、閉鎖された体液で満たされた腔が形成される。嚢胞が形成された後、ポンプ装置に接続され腔への抗体溶液の連続注入を可能にするオマヤレザバーのチップ又はミクロカテーテルが、腔内に設置され得る。例えば、参照として完全に本明細書に組み込まれる米国特許第5,558,852号を参照されたい。
【００８５】
又は、対流増強（convection-enhanced）送達カテーテルが、腫瘍塊、天然もしくは外科的に作出された嚢胞、又は正常脳塊へと直接移植されてもよい。そのような対流増強薬学的組成物送達装置は、脳塊全体への組成物の拡散を大きく改善する。これらの送達装置の移植されたカテーテルは、脳及び／又は腫瘍塊へと治療用組成物又はイメージング組成物を送達するため、拡散流ではなく高流速微量注入（約0.5〜15.0μl/分の範囲の流速）を利用する。そのような装置は、参照として完全に本明細書に組込まれる米国特許第5,720,720号に記載されている。
【００８６】
特定の患者へと与えるべき治療用組成物の有効量は、多様な要因に依存し、それらのいくつかは、患者によって異なるであろう。有能な医師であれば、腫瘍細胞の成長を遅延させ死滅を促進するため患者に投与すべき治療剤の有効量、又は腫瘍の可視化を容易にするため患者に投与すべきイメージング組成物の有効量を決定することができるであろう。抗体結合体の投薬量は、腫瘍の処置、投与の経路、治療薬の性質、治療薬に対する腫瘍の感受性等に依存するであろう。結合させられた細胞毒性部分又はイメージング部分に関して入手可能なLD50動物データ及びその他の情報を利用して、医師は、投与の経路に依って、個体のための最大安全用量を決定することができる。例えば、静脈内投与される用量は、治療用組成物が投与される体液がより多量であるため、クモ膜下腔内投与される用量よりも大きい。同様に、身体から迅速に排除される組成物は、治療的濃度を維持するため、より高い用量で又は繰り返し投与され得る。イメージング部分は、典型的には、細胞毒性部分より低毒性であり、いくつかの態様において、より高い用量で投与され得る。有能な医師であれば、通常の技術を利用して、ルーチンの臨床試験の過程で、特定の治療用組成物又はイメージング組成物の投薬量を最適化することができよう。
【００８７】
組成物は、一連の複数回の投与で対象へと投与され得る。治療用組成物の場合には、規則的な周期的な投与（例えば、2〜3日毎）が、毒性を減少させるため、必要とされるか、又は望ましいかもしれない。反復用量計画において利用されるであろう治療用組成物の場合には、免疫応答を惹起しない抗体部分が好ましい。
【００８８】
腫瘍内適用のインビボモデルにおける効力を試験するためには、頭蓋内の画定されたスポットへの腫瘍細胞沈着物の設置、及びそのスポットにおける腫瘍の発達を可能にするガイドスクリュー（guidescrew）システムが使用され得る。その後、このスポットが、頭蓋内に固定された注射針を案内するため中空であるこのスクリューを通した注射により、繰り返し標的とされ得る。これは長期的な処置スケジュール、及びそうでなければ腫瘍へと到着しないであろう大きな分子の適用を可能にする。
【００８９】
組み合わせ療法
脳腫瘍は、不均一な形質を有し、脳組織全体に蔓延する傾向がある。この組み合わせのため、それらの処置は困難である場合が多い。いくつかの場合には、腫瘍原性特徴を示す細胞全てをより完全に標的とするため、様々な治療剤の組み合わせを使用することが好ましいかもしれない。目的の組み合わせには、化学療法剤及び／又は化学増感（chemosensitizing）剤と併せたDDR1阻害剤の投与が含まれる。化学療法剤は、当技術分野において既知であり、例えば、ナイトロジェンマスタード系、例えばメクロレタミン、シクロホスファミド、メルファラン（L-サルコリシン）等；及びニトロソウレア系、例えばカルムスチン（BCNU）、ロムスチン（CCNU）、セムスチン（メチル-CCNU）、ストレプトゾシン、クロロゾトシン等のようなアルキル化剤を含む。代謝拮抗剤には、ピリミジン系、例えばシタラビン（CYTOSAR-U）、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル（5-FU）、フロクスウリジン（FUdR）等；プリン系、例えばチオグアニン（6-チオグアニン）、メルカプトプリン（6-MP）、ペントスタチン、フルオロウラシル（5-FU）等；及び葉酸類似体、例えばメトトレキサート、10-プロパルギル-5,8-ジデアザ葉酸（10-propargyl-5,8-dideazafolate）（PDDF、CB3717）、5,8-ジデアザテトラヒドロ葉酸（5,8-dideazatetrahydrofolic acid）（DDATHF）、ロイコボリン等が含まれる。その他の化学療法剤には、アザチオプリン；ブレキナー（brequinar）；アルカロイド系及びその合成又は半合成の誘導体、例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン等；ポドフィロトキシン系、例えばエトポシド、テニポシド等；抗生物質、例えばアントラサイクリン、ダウノルビシン塩酸塩（ダウノマイシン、ルビドマイシン、セルビジン（cerubidine））、イダルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、及びモルホリノ誘導体等；フェノキシゾンビスシクロペプチド系（phenoxizone biscyclopeptides）、例えばダクチノマイシン；塩基性糖ペプチド、例えばブレオマイシン；アントラキノン配糖体、例えばプリカマイシン（ミトルマイシン（mithrmycin））；アントラセンジオン系、例えばミトキサントロン；アジリノピロロインドールジオン系（azirinopyrrolo indolediones）、例えばマイトマイシン等を含む。その他の化学療法剤には、金属錯体、例えばシスプラチン（cis-DDP）、カルボプラチン等；尿素系、例えばヒドロキシ尿素；及びヒドラジン系、例えばN-メチルヒドラジンが含まれる。
【００９０】
もう一つの目的の組み合わせは、放射線及び／又は放射線増感（radiation sensitizing）剤と組み合わせられたDDR1阻害剤の投与である。放射線増感剤とは、放射線と組み合わせられた場合、単純な相加効果から予測されるより大きな腫瘍細胞死滅を生じさせる化合物である。増感剤には、メトロニダゾール（metronidazole）、ミソニダゾール（misonidazole）、エタニダゾール（etanidazole）、タキソール、5フルオロウラシル、ヒドロキシ尿素、血管形成阻害剤、プロテインキナーゼC阻害剤、モテキサフィンガドリニウム（motexafin gadolinium）のような化合物等が含まれる。又は、DDR1阻害剤が、増感剤として作用し得る。
【００９１】
脳腫瘍のための放射線治療は、広く使用されており、典型的には放射線増感剤の投与と組み合わせて使用されるであろう。例えば、X線又はγ線からの電離放射線が、外部発生源から送達され得る。癌細胞に放射線を送達するためのもう一つの技術は、放射線量が小さなエリアに集中するよう腫瘍内に直接放射性インプラントを設置する内部放射線療法である。
【００９２】
抗体は、DDR1に対して製剤化されてもよいし、又は標的が他の脳腫瘍標的、例えばPTPζ、クラスII MHC抗原、RPTP等と組み合わせてDDR1を含む場合には、2個またはそれ以上の標的に対して反応性の抗体を含むカクテルとして製剤化されてもよい。
【００９３】
そのような組み合わせ処置は、記載されたような患者に、第二の薬剤と共にDDR1阻害剤を投与することができ、混和された治療薬を投与し得る。そのような組み合わせ薬剤を投与する場合、投与を行う熟練した医師は、組み合わせ毒性及び個々の薬剤の効力のような要因を考慮に入れることができるであろう。さらに、当業者は、各薬剤の完全な効力を確実にするため、可能性のある相互の交差反応に関してスクリーニングすることができるであろう。
【００９４】
又は、いくつかの個々の脳腫瘍タンパク質標的組成物が、組み合わせ療法のため同時に又は連続的に投与され得る。これは、数個の試薬からの毒性の蓄積を回避するため、又は個々の試薬に対する可能性のある有害反応をより精密にモニタリングするため、望ましいかもしれない。従って、治療剤を1日目に投与し、続いて第二を2日目に投与し、次いで投与を行わない期間の後、異なる連続日に治療薬を再投与するというようなサイクルが、本発明に包含される。もう一つの組み合わせ療法には、低分子薬物、並びに参照として完全に本明細書に組み込まれる米国特許第6,455,026号；同時係属中の米国特許出願第10/328,544号；同第10/329,258号；同第09/983,000号；同第60/369,743号；同第60/369,991号；同第60/369,985号；同第60/378,588号；及び同第60/452,169号に記載されている個々の脳腫瘍タンパク質標的に対する抗体治療薬のものが含まれるであろう。
【００９５】
核酸
DDR1遺伝子の配列は、診断及び治療の方法、並びにコードされたポリペプチドの組み換え作製等において有益である。本発明の核酸には、DDR1コーディング配列との高度の配列類似性又は配列同一性を有する核酸が含まれる。配列同一性は、ストリンジェントな条件の下、例えば50℃以上及び0.1×SSC（9mM NaCl/0.9mMクエン酸Na）でのハイブリダイゼーションにより決定され得る。ハイブリダイゼーションの方法及び条件は、当技術分野において周知であり、例えば、米国特許第5,707,829号を参照されたい。提供された核酸配列と実質的に同一の核酸、例えば対立形質バリアント、遺伝学的に改変された遺伝子のバージョン等は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下で、DDR1配列と結合する。核酸の調製に関するさらなる具体的な指針は、Fleuryら（1997）Nature Genetics 15：269-272；Tartagliaら、国際公開公報第96/05861号；及びChenら、国際公開公報第00/06087号（各々、完全に本明細書に組み込まれる）により提供される。
【００９６】
適当な核酸は、化学合成され得る。直接化学合成法には、例えばNarangら（1979）Meth.Enzymol.68：90-99のホスホトリエステル法；Brownら（1979）Meth.Enzymol.68：109-151のホスホジエステル法；Beaucageら（1981）Tetra.Lett.,22：1859-1862のジエチルホスホロアミダイト法；及び米国特許第4,458,066号の固相法が含まれる。化学合成により、一本鎖オリゴヌクレオチドが作製される。これは、相補的な配列とのハイブリダイゼーションによって、又はその一本鎖を鋳型として使用したDNAポリメラーゼによる重合によって、二本鎖DNAへと変換され得る。DNAの化学合成は、約100塩基の配列に制限される場合が多く、それより長い配列は、より短い配列のライゲーションによって入手され得る。又は、部分配列をクローニングし、適切な制限酵素を使用して適切な部分配列を切断してもよい。
【００９７】
核酸は、cDNA又はゲノムDNA、並びにそれらの断片であり得る。「cDNA」という用語は、本明細書において使用されるように、天然型の成熟mRNA種に見い出される配列要素（エキソン並びに3'及び5'の非コーディング領域）の配置を共有している核酸を全て含むものとする。通常、mRNA種は、介在するイントロンが存在する場合にはそれが核RNAスプライシングによって除去された連続的なエキソンを有しており、本発明のポリペプチドをコードする連続的なオープンリーディングフレームを作出している。
【００９８】
目的のゲノム配列は、天然型染色体に通常存在するイントロンを全て含む、挙げられた配列において定義されたような開始コドンと終止コドンとの間に存在する核酸を含む。それは、成熟mRNAに見い出される3'及び5'の非翻訳領域をさらに含んでいてもよい。それは、転写された領域の5'末又は3'末のいずれかに隣接している約1kb（それより大きくてもよい）ゲノムDNAを含む、プロモーター、エンハンサー等のような特定の転写及び翻訳の制御配列をさらに含んでいてもよい。コーディング領域の3'もしく5'のいずれかに隣接するゲノムDNA、又はイントロンに時々見い出されるような内部制御配列は、適正な組織特異的、段階特異的、又は疾患状態特異的な発現に必要とされる配列を含有しており、腫瘍細胞における発現の上方制御を調査するのに有用である。
【００９９】
DDR1に特異的なプローブは、提供された核酸配列を使用して生成させられ得る。プローブは、好ましくは、提供された配列のうちの一つの対応する連続配列の少なくとも約18nt、25nt、又は50nt、又はそれ以上であり、通常、約2、1、又は0.5kb長未満である。好ましくは、プローブは、低い複雑度のマスキングのためのマスキングプログラムの適用の後、マスキングされずに残る連続配列に基づき設計される。二本鎖又は一本鎖の断片は、従来の方法によるオリゴヌクレオチドの化学合成、制限酵素消化、PCR増幅等によって、DNA配列から入手され得る。プローブは、例えば放射性タグ、ビオチン化タグ、又は蛍光性タグにより標識され得る。
【０１００】
本発明の核酸は、一般的には完全な染色体以外として、実質的に純粋に単離され入手され得る。通常、核酸、DNA又はRNAのいずれかは、他の天然に存在する核酸配列を実質的に含まずに得られ、一般的には少なくとも約50％、通常は少なくとも約90％純粋であり、典型的には「組換え体」であり、例えば、天然に存在する染色体においては通常会合していない1個またはそれ以上のヌクレオチドと隣接している。
【０１０１】
本発明の核酸は、直鎖状分子として提供されてもよいし、又は環状分子内に提供されてもよく、自律複製性分子（ベクター）、又は複製配列を含まない分子の中に提供されてもよい。核酸の発現は、当技術分野において既知の自己又は他の制御配列によって制御され得る。本発明の核酸は、トランスフェリンポリカチオン媒介DNA移入、裸の核酸又は封入された核酸を用いたトランスフェクション、リポソーム媒介DNA移入、DNAでコーティングされたラテックスビーズの細胞内輸送、プロトプラスト融合、ウイルス感染、電気穿孔、遺伝子銃、リン酸カルシウム媒介移入等のような、当技術分野において使用可能な多様な技術を使用して、適当な宿主細胞へと導入され得る。
【０１０２】
PCRのような増幅反応において使用するため、1対のプライマーが使用されると考えられる。プライマー配列の正確な組成は、本発明にとって重大ではないが、大部分の適用の場合、プライマーは、当技術分野において知られているようなストリンジェントな条件の下で本発明の配列とハイブリダイズすると考えられる。少なくとも約50nt、好ましくは少なくとも約100ntの増幅産物を生成させると考えられる1対のプライマーを選択することが好ましい。プライマー配列の選択のためのアルゴリズムは、一般に既知であり、商業的なソフトウェアパッケージにおいて使用可能である。増幅プライマーは、DNAの相補鎖とハイブリダイズし、相互に向かって複製を開始させると考えられる。ハイブリダイゼーションプローブの場合、安定性及び結合親和性を改良するため、核酸類似体を使用することが望ましい場合がある。「核酸」という用語には、そのような類似体が包含されるものと理解されたい。
【０１０３】
ポリペプチド
DDR1ポリペプチドには、スクリーニング法のための用途、抗体を作製するための試薬としての用途、治療薬としての用途等がある。そのようなポリペプチドは、天然起源からの単離、組換え法、及び化学合成により作製され得る。さらに、サイレント変化をもたらすアミノ酸残基の欠失、付加、又は置換を含有しており、従って機能的に等価な差次的に発現される、又は経路の遺伝子産物を産生する、機能的に等価なポリペプチドも、有益であり得る。アミノ酸置換は、含まれる残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性に基づき作成され得る。「機能的に等価な」とは、本明細書において使用されるように、DDR1ポリペプチドと実質的に類似のインビボ活性を示すことができるタンパク質をさす。
【０１０４】
ポリペプチドは、当技術分野において周知の技術を使用して、組換えDNA技術によって作製され得る。当業者に周知の方法が、コーディング配列及び適切な転写／翻訳調節シグナルを含有している発現ベクターを構築するために使用され得る。これらの方法には、例えば、インビトロ組換えDNA技術、合成技術、及びインビボ組換え／遺伝学的組換えが含まれる。又は、目的のポリペプチドをコードすることができるRNAが、化学合成されてもよい。
【０１０５】
典型的には、コーディング配列は、比較的大量の遺伝子産物を作製するため、所望の宿主細胞において機能性のプロモーターの調節下に置かれる。極めて多様なプロモーターが周知であり、特定の適用に応じて、本発明の発現ベクターにおいて使用され得る。通常、選択されるプロモーターは、プロモーターが活性を有する細胞に依存する。リボソーム結合部位、転写終結部位等のようなその他の発現調節配列も、場合により含まれていてもよい。これらの調節配列を1個またはそれ以上含む構築物は、「発現カセット」と呼ばれる。発現は、プロモーター、及び特定の宿主細胞にとって適切なその他の制御剤を使用して、原核生物及び真核細胞において達成され得る。例示的な宿主細胞には、大腸菌、その他の細菌宿主、酵母、並びにCOS細胞系、CHO細胞系、及びHeLa細胞系、並びに骨髄腫細胞系のような様々な高等真核細胞（これらに制限はされない）が含まれる。
【０１０６】
哺乳動物宿主細胞においては、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等を含む多数のウイルスに基づく発現系が使用され得る。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、目的のコーディング配列は、アデノウイルス転写／翻訳調節複合体、例えば後期プロモーター及び三成分リーダー配列とライゲートさせられる。次いで、このキメラ遺伝子が、インビトロ又はインビボの組換えによってアデノウイルスゲノムへと挿入され得る。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域E1又はE3）における挿入は、生存可能であり、感染宿主において差次的に発現される又は経路の遺伝子タンパク質を発現することができる組換えウイルスをもたらすと考えられる。
【０１０７】
特定の開始シグナルも、遺伝子の効率的な翻訳のために必要とされる場合がある。これらのシグナルには、ATG開始コドン及び隣接配列が含まれる。自己の開始コドン及び隣接配列を含む完全遺伝子が適切な発現ベクターに挿入される場合には、付加的な翻訳調節シグナルは必要とされない場合がある。しかしながら、遺伝子コーティング配列の一部のみが挿入される場合には、外因性の翻訳調節シグナルが提供されなければならない。これらの外因性翻訳調節シグナル及び開始コドンは、天然であってもよいし合成であってもよい様々な起源のものであり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーター等の包含によって増強され得る。
【０１０８】
さらに、宿主細胞株としては、挿入された配列の発現を調整するか、又は所望の特定の様式で遺伝子産物の修飾及びプロセシングを行うものが選択され得る。そのようなタンパク質産物の修飾（例えば、グリコシル化）及びプロセシング（例えば、分解）は、タンパク質の機能にとって重要である場合がある。異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳後プロセシング及び修飾のための特徴的な特定のメカニズムを有している。発現された外来タンパク質の正確な修飾及びプロセシングを保証するため、適切な細胞系又は宿主系が選択され得る。この目標のため、一次転写物の適正なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化及びリン酸化のための細胞機構を保有している真核宿主細胞が使用され得る。そのような哺乳動物宿主細胞には、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、WI38等が含まれるが、これらに制限はされない。
【０１０９】
組換えタンパク質の長期的な高収量の作製のためには、安定的な発現が好ましい。例えば、差次的に発現された又は経路の遺伝子タンパク質を安定的に発現する細胞系が工作され得る。ウイルスの複製開始点を含有している発現ベクターを使用するのではなく、適切な発現調節要素によって調節されたDNA及び選択可能マーカーにより、宿主細胞が形質転換され得る。外来DNAの導入の後、工作された細胞は、濃縮培地中で1〜2日間増殖させられ、次いで選択培地へと切り替えられ得る。組換えプラスミド中の選択可能マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞が、染色体へプラスミドを安定的に組み込み、フォーカスを形成するよう増殖することを可能にする。そのフォーカスが、クローニングされ、細胞系へと繁殖させられ得る。この方法は、有利には、標的タンパク質を発現する細胞系を工作するために使用され得る。そのような工作された細胞系は、DDR1タンパク質の内因性の活性に影響する化合物のスクリーニング及び評価において特に有用であり得る。単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（これらに制限はされない）を含む多数の選択系が使用され得る。代謝拮抗薬耐性は、メトトレキサートに対する耐性を付与するdhfr、ミコフェノール酸に対する耐性を付与するgpt；アミノグリコシドG-418に対する耐性を付与するneo；及びハイグロマイシンに対する耐性を付与するhygroのための選択の基礎として使用され得る。
【０１１０】
ポリペプチドは、直接的又は間接的に標識され得る。125Iのような放射性同位体；基質に露された場合に、検出可能な比色シグナル又は光を発生する酵素標識系；及び蛍光性標識（これらに制限はされない）を含む、多様で適当な標識系のうちの任意のものが使用され得る。間接標識には、目的のポリペプチドと特異的に結合する標識された抗体のようなタンパク質の使用が含まれる。そのような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Fab断片、及びFab発現ライブラリーにより産生された断片（これらに制限はされない）が含まれる。
【０１１１】
発現の後、組換えポリペプチドは、硫安沈殿、アフィニティカラム、イオン交換及び／又はサイズ排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動等を含む、当技術分野の標準的な手法によって精製され得る（一般には、R.Scopes、Protein Purification、Springer--Verlag、N.Y.（1982）、Deutscher、Methods in Enzymology 第182巻：Guide to Protein Purification.、Academic Press,Inc.N.Y.（1990）を参照されたい）。
【０１１２】
組換え法の別法として、ポリペプチド及びオリゴペプチドは化学合成されてもよい。そのような方法には、典型的には、固相アプローチが含まれるが、溶液に基づく化学及び組み合わせ又は固相アプローチと溶液アプローチとの組み合わせが使用されてもよい。タンパク質を合成するための固相方法論の例は、Merrifield（1964）J.Am.Chem.Soc.85：2149；及びHoughton（1985）Proc.Natl.Acad.Sci.、82：5132に記載されている。DDR1タンパク質の断片を合成し、次いでつなぎ合わせてもよい。そのような反応を実施するための方法は、Grant（1992）Synthetic Peptides：A User Guide、W.H.Freeman and Co.、N.Y.；及び「Principles of Peptide Synthesis」（Bodansky及びTrost編）、Springer-Verlag,Inc.N.Y.、（1993）に記載されている。
【０１１３】
完全DDR1ポリペプチド又はそれに由来する断片は、様々な目的のため、例えば免疫原として使用され得る。好ましくは、1個または複数の8〜30アミノ酸ペプチド部分、例えば細胞外ドメインが利用され得るが、10〜20の範囲のペプチドがより経済的な選択である。目的の領域には、配列
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；F5/8タイプCドメイン（配列番号：1、残基31-185）；RFRRプロテアーゼ認識部位（配列番号：1、残基304-307）；ストーク領域（配列番号：1、残基199-412）；gly-proリッチドメイン（配列番号：1、残基377-415及び476-601）；並びにチロシンキナーゼ触媒ドメイン（配列番号：1、残基610-905）が含まれる。この範囲のカスタム合成ペプチドは、多数の供給元から入手可能であり、KLH又はBSAと結合していてもよい。又は、30アミノ酸を超えるペプチドは、固相法によって合成されてもよいし、又は適当な組換えタンパク質産生系において組み換え作製されてもよい。適正なタンパク質のグリコシル化及びプロセシングを保証するため、動物細胞系（例えば、Sf9又はその他の昆虫細胞、CHO又はその他の哺乳動物細胞）が好ましい。
【０１１４】
特異的結合メンバー
「特異的結合メンバー」又は「結合メンバー」という用語は、本明細書において使用されるように、特異的結合対、即ち一方の分子（即ち、第1の特異的結合メンバー）が、化学的又は物理的な手段により他方の分子（即ち、第2の特異的結合メンバー）と特異的に結合するような2個の分子、通常2個の異なる分子のメンバーをさす。特異的結合対の相補メンバーは、リガンドと受容体；又は受容体と対応受容体、と呼ばれる場合もある。本発明の目的のため、例えばアッセイ法が、既知の結合対の会合を妨害する化合物を検出するため行われる場合、2個の結合メンバーは、相互に会合することが既知のものであり得る。又は、目的の化合物の結合パートナーであると予測される候補化合物が使用されてもよい。
【０１１５】
目的の特異的結合対には、炭水化物とレクチン；相補的なヌクレオチド配列；ペプチドリガンドと受容体；エフェクター分子と受容体分子；ホルモンとホルモン結合タンパク質；酵素補因子と酵素；酵素阻害剤と酵素；脂質と脂質結合タンパク質等が含まれる。特異的結合対には、最初の特異的結合メンバーの類似体、誘導体、及び断片が含まれ得る。例えば、受容体とリガンドの対には、ペプチド断片、化学合成されたペプチド模倣体、標識されたタンパク質、誘導体化されたタンパク質等が含まれ得る。
【０１１６】
本発明のもう一つの態様において、DDR1の特異的結合メンバーは、DDR1リガンド、又はフィブロネクチン、コラーゲン、及びホモ型結合することができるDDR1の可溶性断片を含む、それに由来する結合性断片である。そのような結合メンバーは、細胞毒性部分と結合させられ得る。
【０１１７】
好ましい態様において、特異的結合メンバーは抗体である。「抗体」又は「抗体部分」という用語には、1個またはそれ以上の非共有結合性の結合相互作用が分子構造とエピトープとの間の複合体を安定化するような、エピトープに適合し、それを認識する特異的な形状を有する、任意のポリペプチド鎖含有分子構造が含まれるものとする。この用語には、モノクローナル抗体、多選択性抗体（1つ以上のドメイン特性を含む抗体）、ヒト抗体、ヒト化抗体、および所望の生物学的活性を持つ抗体断片が含まれる。  
【０１１８】
脳腫瘍タンパク質標的のうちの一つと特異的に結合する抗体は、抗α（DDR1）と呼ばれる。特定の構造とその特異的エピトープとの特異的又は選択的な適合は、「鍵と鍵穴（lock and key）」適合と呼ばれることもある。原型抗体分子は免疫グロブリンであり、全ての起源、例えばヒト、げっ歯動物、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、その他の哺乳動物、ニワトリ、その他のトリ等に由来する全ての型の免疫グロブリン、IgG、例えば、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4、IgM、IgA、IgE、IgD等が、「抗体」と見なされる。本発明において使用される抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体は、細胞培養又は組換えによって作製すること、及び抗原性を減少させるために修飾することが可能であるため、モノクローナル抗体が好ましい。
【０１１９】
ポリクローナル抗体は、前記のように製剤化された抗原組成物を産生動物に注射することによる標準的なプロトコルにより作製され得る。例えば、HarlowとLane、Antibodies：A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、1988を参照されたい。一つのそのような技術においては、まず、ポリペプチドの抗原性部分を含むDDR1抗原が、極めて多様な哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、又はヤギ）のうちの任意のものに注射される。完全タンパク質、又はタンパク質の比較的大きなセクションを使用する場合、抗体は、タンパク質及び適当なアジュバント（例えば、フロイントアジュバント、フロイント完全アジュバント、水中油乳剤等）で産生動物を免疫感作することにより作製され得る。比較的小さなペプチドが使用される場合には、免疫刺激性（immunostimulatory）結合体を作成するため、ペプチドを比較的大きな分子と結合させることが有利である。そのような使用のための商業的に入手可能な一般的に使用されている結合タンパク質には、ウシ血清アルブミン（BSA）及びスカシガイヘモシアニン（KLH）が含まれる。特定のエピトープに対する抗体を作製するためには、完全配列に由来するペプチドが使用され得る。又は、脳腫瘍タンパク質標的の比較的短いペプチド部分に対する抗体を生成させるためには、ポリペプチドが、オボアルブミン、BSA、又はKLHのような担体タンパク質につながれた場合、優れた免疫応答が誘発され得る。ペプチド結合体が、好ましくは1回またはそれ以上の追加免疫感作が組み込まれた予定されたスケジュールに従い、動物宿主へと注射され、動物から定期的に採血が行われる。次いで、ポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体が、例えば適当な固体支持体とカップリングしたポリペプチドを使用したアフィニティクロマトグラフィーによって、そのような抗血清から精製され得る。
【０１２０】
又は、モノクローナル抗体については、接種を受けた動物の脾臓に由来する細胞のような、刺激された免疫細胞を単離することにより、ハイブリドーマが形成され得る。次いで、これらの細胞を、細胞培養物中で無限に複製することができる、骨髄腫細胞又は形質転換細胞のような不死化細胞と融合させ、それにより免疫グロブリン分泌細胞系を生成させることができる。使用される不死細胞系としては、好ましくは、ある種の栄養素の使用に必要な酵素が欠損しているものが選択される。（骨髄腫のような）多くのそのような細胞系が、当業者に既知であり、例えば、チミジンキナーゼ（TK）又はヒポキサンチン−グアニンホスフォリボシルトランスフェラーゼ（HGPRT）を含む。これらの欠損は、例えばヒポキサンチンアミノプテリンチミジン（HAT）上で増殖する能力による、融合細胞の選択を可能にする。
【０１２１】
好ましくは、使用される不死融合パートナーは、免疫グロブリンを分泌しない系に由来する。得られた融合細胞、又はハイブリドーマは、融合細胞の生存を可能にし、非融合細胞の生存は可能にしない条件の下で培養され、得られたコロニーが、所望のモノクローナル抗体の産生に関してスクリーニングされる。そのような抗体を産生するコロニーは、クローニングされ、繁殖させられ、大量の抗体を産生するよう増殖させられる。例えば、Kohler及びMilstein、1975 Nature 256：495（これの開示は参照として本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０１２２】
次いで、分泌ハイブリドーマに由来する大量のモノクローナル抗体が、マウスの腹腔にクローンを注射し、そこから腹水を採取することにより作製され得る。好ましくはプリスタン、又はその他の何らかの腫瘍プロモーターでプライミングされ、化学的又は放射線的に免疫抑制されるマウスは、当業者に既知の様々な適当な系統のうちの任意のものであり得る。腹水がマウスから採取され、例えばCMセファロース（Sepharose）カラム又はその他のクロマトグラフィー手段によって、それらからモノクローナル抗体が精製される。又は、ハイブリドーマを、インビトロで又は懸濁培養物として培養してもよい。回分培養、連続培養、又はその他の適当な培養法が使用され得る。次いで、モノクローナル抗体が、培地又は上清から回収される。
【０１２３】
さらに、抗体、又は抗原結合断片は、遺伝子工学によって作製され得る。この技術においては、標準的なハイブリドーマ手法と同様に、抗体産生細胞が、所望の抗原又は免疫原に対して感作される。免疫脾臓細胞又はハイブリドーマから単離されたメッセンジャーRNAが、PCR増幅を使用してcDNAを作成するための鋳型として使用される。各々、初期の抗原特異性を保持している1個の重鎖遺伝子及び1個の軽鎖遺伝子を含有しているベクターのライブラリーが、増幅された免疫グロブリンcDNAの適切なセクションの発現ベクターへの挿入によって作製される。コンビナトリアルライブラリーは、重鎖遺伝子ライブラリーを軽鎖遺伝子ライブラリーと組み合わせることにより構築される。これは、（抗体分子のFab断片又は抗原結合断片と類似している）重鎖及び軽鎖を共発現するクローンのライブラリーをもたらす。これらの遺伝子を保持しているベクターは、宿主（例えば、細菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞、又はその他の適当なタンパク質産生宿主細胞）へと共にトランスフェクトされる。トランスフェクトされた宿主において抗体遺伝子合成が誘導された場合、重鎖タンパク質及び軽鎖タンパク質が自己会合し、抗原又は免疫原を用いたスクリーニングにより検出され得る活性抗体が生成する。
【０１２４】
好ましくは、組換え抗体は、昆虫細胞又は哺乳動物細胞のような免疫グロブリン鎖のグリコシル化及びプロセシングを正確に行う組換えタンパク質産生系において作製される。抗体の作製のため組換えバキュロウイルスを使用する、昆虫細胞の使用の利点は、バキュロウイルス系が、安定的にトランスフェクトされた哺乳動物細胞系よりはるかに迅速に、変異抗体の産生を可能にするという点である。さらに、昆虫細胞は、原核細胞が行わない真核生物タンパク質のプロセシング及びグリコシル化を正確に行うことが示されている。最後に、外来タンパク質のバキュロウイルス発現は、ウイルス感染後期の全細胞タンパク質の50〜75％もを構成することが示されており、従って、この系は、ミリグラム量の組換え抗体を作製する優れた手段である。
【０１２５】
（アナフィラキシーショックのような）ヒトにおける激烈又は有害な免疫応答を誘導する傾向が低く、抗体治療剤又はイメージング剤の反復投薬を防止すると考えられる免疫応答のプライミングの傾向も低い抗体は、本発明における使用にとって好ましい。脳は血液脳関門の背後に比較的隔離されているにも関わらず、やはり、増加した白血球侵襲及び炎症という形態で免疫応答が起こる場合がある。腫瘍に対する増加した免疫応答は望ましいが、同時に起こる治療剤又はイメージング剤の結合及び不活化は、一般に、この利益を上回る。従って、ヒトに投与された場合に、より少ない免疫応答を生じるヒト化抗体、単鎖、キメラ抗体、又はヒト抗体が、本発明における使用にとって好ましい。本発明には、多領域抗体及びDDR1を「模倣する」抗イディオタイプ抗体も含まれる。例えば、DDR1ドメインと結合し、DDR1とリガンドとの結合を競合的に阻害する抗体が、DDR1を「模倣」し、従って、DDR1、DDR1リガンド、DDR1受容体、又はDDR1リガンドと結合するか、それらを活性化するか、又は中和する抗イディオタイプ抗体を生成させるために使用され得る。そのような抗イディオタイプ抗体又はそのような抗イディオタイプのFab断片は、DDR1により媒介される経路を含む治療計画において使用され得る（例えば、Greenspan及びBona（1993）FASEB J 7（5）：437-444；Nissinoff（1991）J.Immunol.147（8）：2429-2438を参照のこと。
【０１２６】
キメラ抗体とは、異なる部分が異なる動物種に由来する分子、例えば、マウスmAbに由来する可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域とを有するものである。キメラ抗体の開発のための技術は、文献に記載されている。例えば、Morrisonら（1984）Proc.Natl.Acad.Sci.81：6851-6855；Neubergerら（1984）Nature 312：604-608；Takedaら（1985）Nature 314：452-454を参照のこと。単鎖抗体は、アミノ酸架橋を介してFv領域の重鎖断片と軽鎖断片とを連結させ、単鎖ポリペプチドとすることにより形成される。例えば、Hustonら、Science 242：423-426；Proc.Natl.Acad.Sci.85：5879-5883；及びWardらNature 341：544-546を参照のこと。
【０１２７】
特異的エピトープを認識する抗体断片は、当技術分野において周知の技術によって生成させられ得る。これらの断片には、抗体分子のペプシン消化により作製され得るF（ab'）2断片及びF（ab'）2断片のジスルフィド架橋を還元することにより生成させられ得るFab断片が含まれるが、これらに限定はされない。
【０１２８】
本発明の一つの態様において、高い親和性でDDR1の細胞外領域と特異的に結合するヒト抗体又はヒト化抗体が提供される。抗体の細胞外領域との結合により、受容体の下方制御又は生物学的活性の減少、それによる細胞の増殖、侵襲、及び／又は腫瘍サイズの減少、細胞接着、遊走、ならびに生物機能的な活動としての血管形成が起こり得る。低親和性結合剤も、いくつかの免疫療法のために有用であり得る。Lonbergら（1994）Nature 368：856-859；並びにLonberg及びHuszar（1995）Internal Review of Immunology 13：65-93を参照のこと。本発明のもう一つの面において、高い親和性でDDR1の細胞外領域と特異的に結合し、かつヒト抗体との類似性を保持しているヒト化抗体が提供される。これらの抗体は、ヒト抗体と類似しており、従って最小限の負の副作用でヒト患者に投与され得る。
【０１２９】
ヒト化抗体は、ヒト型の非ヒト抗体である。それらは、非ヒト免疫グロブリンに由来する配列を最小限に有するキメラである。マウスモノクローナル抗体に固有の有害な特性を克服するため、やはり「ヒト化抗体」と呼ばれる、ヒト抗体の領域を取り込むよう工作された組換えマウス抗体が開発中である。この代替戦略は、細胞表面分子のようなヒト抗原に対するヒト抗体を生成させることが困難であるため、採用された。ヒト化抗体は、マウス抗体の相補性決定領域（CDR）領域及びその他の少数のアミノ酸を含有しており、抗体の残りはヒト起源である。
【０１３０】
キメラ抗体は、主にヒトドメインを有する抗体を作製するために、マウス（又は、その他の動物に由来する）ハイブリドーマクローンから得られたマウスの軽鎖及び重鎖の可変領域（VK及びVH）を、ヒトの軽鎖及び重鎖の定常領域と組み合わせることにより、組換え手段によって作成され得る。そのようなキメラ抗体の作成は、当技術分野において周知であり、（例えば、参照として完全に本明細書に組み込まれる米国特許第5,624,659号に記載されたような）標準的な手段によって達成され得る。ヒト化抗体は、はるかにヒト様の免疫グロブリンドメインを含有し、動物由来の抗体の相補性決定領域のみを取り込むよう、工作される。これは、モノクローナル抗体の可変領域の超可変ループの配列を注意深く検討し、それらをヒト抗体鎖の構造に適合させることにより達成される。一見複雑であるが、そのプロセスは実際は簡単である。例えば、参照として完全に本明細書に組み込まれる米国特許第6,187,287号を参照されたい。
【０１３１】
又は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリンを産生するよう遺伝学的に改変された動物から作製され得る。そのような動物を生成させ、それらから抗体を導出するための技術は、参照として完全に本明細書に組み込まれる米国特許第6,162,963号及び第6,150,584号に記載されている。
【０１３２】
又は、単鎖抗体（下記のようなFv）が、ヒト可変領域を含有しているファージライブラリーから作製され得る。米国特許第6,174,708号を参照されたい。単鎖免疫毒素LMB-7［B3（Fv）-PE38］のクモ膜下腔内投与は、ラットモデルにおいて癌性髄膜炎を治癒させることが示されている（全て参照として完全に本明細書に組み込まれるProc.Natl.Acad.Sci. U S A 92、2765-9）。
【０１３３】
完全免疫グロブリン（又はそれらの組換え対応物）に加え、エピトープ結合部位を含む免疫グロブリン断片（例えば、Fab'断片、F(ab')2断片、又はその他の断片）が、本発明における抗体部分として有用である。そのような抗体断片は、フィシン、ペプシン、パパイン、又はその他のプロテアーゼによる分解により、完全免疫グロブリンから生成し得る。「断片」又は最小免疫グロブリンは、組換え免疫グロブリン技術を使用して設計され得る。例えば、本発明において使用するための「Fv」免疫グロブリンは、ペプチドリンカー（例えば、αヘリックス又はβシートモチーフを形成しないポリグリシン又はその他の配列）を介して、軽鎖可変領域を重鎖可変領域と連結することにより作製され得る。
【０１３４】
Fv断片は、重鎖可変ドメイン（VH）と軽鎖可変ドメイン（VL）とのヘテロダイマーである。完全IgGに存在する重鎖ドメインと軽鎖ドメインとのヘテロダイマーは、例えば、ジスルフィド結合によって接続されている。VHとVLとがペプチドリンカーによって接続されている組換えFvは、典型的には安定である。例えば、Hustonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883（1988）及びBirdら、Science 242：423-426（1988）（いずれも完全に参照として本明細書に組み込まれる）を参照されたい。これらは、特異性及び親和性を保持していることが見出されており、腫瘍のイメージング及び腫瘍療法用の組換え免疫毒素の作成に有用であることが示されている単鎖Fvである。しかしながら、研究者らは、単鎖Fvの一部は減少した抗原に対する親和性を有していること、及びペプチドリンカーが結合を妨害する場合があることを見出した。完全に参照として本明細書に組み込まれる米国特許第6,147,203号に記載されるように、VH領域とVL領域との間の安定化ジスルフィド結合を含む、改良されたFvも、作成されている。これらの最小抗体のうちの任意のものが、本発明において使用され得るが、HAMA反応を回避するためにヒト化されたものが、本発明の態様における使用にとって好ましい。
【０１３５】
さらに、化学的リンカー、蛍光色素、酵素、基質、化学発光部分等のような検出可能部分、又はストレプトアビジン、アビジン、もしくはビオチン等のような特異的結合部分が追加された誘導体化された免疫グロブリンが、本発明の方法及び組成物において使用され得る。便宜上、「抗体」又は「抗体部分」という用語は、一般に、脳腫瘍タンパク質標的のエピトープと特異的に結合する分子をさすために使用されるが、この用語には、前記のような免疫グロブリン、誘導体、断片、組換え又は工作された免疫グロブリン、及び修飾された免疫グロブリンが全て包含されると考えられる。
【０１３６】
候補抗DDR1抗体は、任意の適当な標準的な手段、例えば、ELISA法などにより、試験され得る。一次スクリーニングとして、抗体は、免疫原、又は完全な脳腫瘍タンパク質標的細胞外ドメインもしくはタンパク質との結合に関して試験され得る。二次スクリーニングとして、抗DDR1候補は、適切な腫瘍細胞系、又は原発性腫瘍組織試料との結合に関して試験され得る。これらのスクリーニングのため、抗DDR1候補抗体は検出のために標識され得る。脳腫瘍タンパク質標的との選択的な結合が確立された後、候補抗体、又は下記のようにして作製された抗体結合体は、下記のように、適切な腫瘍細胞系のようなインビボモデル、又はマウスもしくはラットのヒト脳腫瘍モデルにおいて、適切な活性（即ち、腫瘍細胞成長を減少させ、かつ／又は腫瘍細胞の可視化を補助する能力）に関して試験され得る。好ましい態様において、抗DDR1タンパク質抗体化合物は、インビトロ及びインビボで多様な方法を使用してスクリーニングされ得る。これらの方法には、標的との結合親和性、動物又は細胞における化合物の生物学的分布、又は化合物により媒介される細胞毒性を測定する方法が含まれるが、これらに限定はされない。これら及び当技術分野において既知のその他のスクリーニング法は、化合物の効力の尺度となる、指定された標的と結合又は相互作用する化合物の能力に関する情報を提供する。
【０１３７】
DDR1タンパク質の生物学的活性を改変する抗体は、星状細胞腫細胞培養物研究又はマウス／ラットCNS腫瘍モデル研究のような機能的なフォーマットにおいてアッセイされ得る。活性の星状細胞腫細胞モデルにおいては、まず、タンパク質の発現が、使用される特定の細胞株において確認される。必要であれば、細胞系は、原発性腫瘍に見い出されるものに匹敵するレベルでタンパク質を発現するよう、適切な構成性プロモーターの調節下にあるタンパク質のコーディング配列により安定的にトランスフェクトされ得る。次いで、候補機能改変抗タンパク質抗体の存在下での星状細胞腫細胞の生存能力が決定される。細胞生存アッセイ法に加え、細胞侵襲アッセイ法、及び、細胞接着アッセイ法が、細胞の腫瘍様挙動に対する候補抗体療法剤の効果を決定するために使用され得る。又は、DDR1が血管形成に関与している場合には、候補抗体治療薬の、腫瘍生物学における重要な機能である血管新生を阻害する能力を決定するためのアッセイ法が使用され得る。
【０１３８】
DDR1抗体の結合親和性は、当技術分野において既知のような、ビアコア（Biacore）SPR技術を使用して決定され得る。この方法においては、第一の分子が、デキストランCM-5センサーチップ（Pharmacia）にカップリングさせられ、結合した分子が、試験される抗体を捕獲するために使用される。次いで、抗原が特定の流速で適用され、そして解離が起こるよう同じ流速で緩衝液が適用される。会合速度及び解離速度、及び対応する速度定数は、BIAエバリュエーション（evaluation）ソフトウェアを使用することにより決定される。例えば、Malmqvist（1993）「Surface plasmon resonance for detection and measurement of antibody-antigen affinity and kinetics.」第5巻：282-286；及びDavies（1994）Nanobiology 3：5-16を参照のこと。抗体の逐次導入によって、エピトープマッピングが可能となる。抗原が導入された後は、第二の抗体の抗原との結合能が試験され得る。多分子複合体の連続的な形成において、各反応体を個々にモニタリングすることができ、これによって、多部位結合実験を実施することが可能となる。
【０１３９】
いくつかのリガンドのそれらの受容体との結合によって、受容体により媒介される内部移行が起こる場合がある。この特性は、例えばイムノリポソームのような抗体治療薬の場合には望ましいかもしれず；又は、例えば非活性プロドラッグを活性細胞毒性分子へと変換するために酵素が細胞表面に存在する必要がある、抗体指向化酵素プロドラッグ療法（antibody directed enzyme-prodrug therapy）（ADEPT）の場合には、有害であることがある。
【０１４０】
同様に、ヒト脳腫瘍のインビボモデル、特にヌードマウス／SCIDマウスモデル又はラットモデルが記載されており、例えばAntunesら（2000）J Histochem Cytochem 48、847-58；Priceら（1999）Clin Cancer Res 5、845-54；及びSennerら（2000）Acta Neuropathol（Berl）99、603-8を参照されたい。腫瘍モデルにおいてタンパク質の正確な発現が確認された後は、これらのモデルにおける腫瘍塊に対する候補抗タンパク質抗体の効果が評価され、その際、腫瘍成長の減少又は腫瘍塊の縮小を、抗タンパク質抗体候補のタンパク質活性を改変する能力の指標とする。従って、タンパク質の発癌における特定の生物分子的役割に関する直接的な知識なしに、適切な抗腫瘍効果を示す抗体が選択され得る。インビボモデルも、DDR1機能の低分子修飾物質をスクリーニングするために使用することができる。
【０１４１】
抗体結合体
DDR1の天然型活性が腫瘍細胞において改変されている場合、本発明において使用するための抗DDR1抗体は、結合なしに、有用性を有し得る。前記のようにして選択され得るそのような抗体は、治療剤とすることなしに使用され得る。本発明のもう一つの態様において、標的ポリペプチドの活性を改変してもよいし、又は改変しなくてもよいDDR1特異的抗体が、抗体に機能性を追加する細胞毒性剤又はイメージング剤と結合させられる。
【０１４２】
抗DDR1抗体は、1個またはそれ以上の治療用細胞毒性部分又はイメージング部分とカップリング又は結合させられ得る。本明細書において使用されるように、「細胞毒性部分」とは、細胞と接近しているか又は細胞に吸収された場合に、細胞成長を阻害するか又は細胞死を促進する部分である。この点に関して適当な細胞毒性部分には、放射性同位体（放射性核種）、分化誘導剤及び小さな化学毒性薬物のような化学毒性剤、毒素タンパク質、並びにそれらの誘導体が含まれる。「イメージング部分」（I）とは、可視化技術（例えば、ラジオグラフィー、陽電子放射断層撮影、核磁気共鳴イメージング、直接的又は間接的な視覚的検査）における腫瘍と周囲の健康な組織との対比を増加させるために使用され得る部分である。従って、適当なイメージング部分には、ラジオグラフィー部分（例えば、重金属及び放射線放射部分）、陽電子放射部分、磁気共鳴造影部分、及び光学的に可視の部分（例えば、蛍光性又は可視スペクトル色素、可視粒子等）が含まれる。治療用部分とイメージング部分との間にいくらかのオーバーラップが存在することは、当業者には理解されると思われる。例えば、212Pb及び212Biは、両方とも、治療用組成物のための有用な同位体であるが、高電子密度でもあり、従ってX線ラジオグラフィーイメージング技術のための対比を提供し、シンチレーションイメージング技術においても使用され得る。
【０１４３】
一般に、治療剤又はイメージング剤は、薬物動態学的安定性及び減少した患者への全体毒性の必要を適切に考慮しつつ、任意の適当な技術によって抗DDR1部分と結合させられ得る。治療剤は、直接的又は間接的に（例えば、リンカー基を介して）、適当な抗体部分とカップリングさせられ得る。各々が相互に反応することができる官能基を保有している場合には、薬剤と抗体との間の直接反応が可能である。例えば、アミノ基又はスルフヒドリル基のような求核性の基は、無水物もしくは酸ハロゲン化物のようなカルボニル含有基、又は優れた脱離基（例えば、ハライド）を含有しているアルキル基と反応することができる場合がある。又は、適当な化学的リンカー基が使用されてもよい。リンカー基は、結合能の妨害を回避するために、抗体を薬剤から隔離するためのスペーサーとして機能し得る。リンカー基は、部分又は抗体の上の置換基の化学的反応性を増加させ、従ってカップリング効率を増加させるためにも活用され得る。化学的反応性の増加は、そうでなければ不可能であると考えられる部分又は部分上の官能基の使用も容易にし得る。
【０１４４】
適当な結合化学には、（抗体部分上のスルフヒドリルと反応する）マレイミジルリンカー及びハロゲン化アルキルリンカー、並びに（抗体部分上の第一級アミンと反応する）スクシンイミジルリンカーが含まれる。数個の第一級アミン及びスルフヒドリル基が、免疫グロブリン上に存在しており、組換え免疫グロブリン分子へと付加的な基が設計されてもよい。（Pierce Chemical Co.、Rockford、Illのカタログに記載されているもののような）多様な二官能性又は多官能性の試薬（同種官能性及び異種官能性の両方）が、リンカー基として使用され得ることは、当業者には明らかであると考えられる。カップリングは、例えばアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、又は酸化型炭水化物残基によって達成され得る。多数の参照が、そのような方法論を記載している（例えば、米国特許第4,671,958号）。別のカップリング方法として、米国特許第5,057,313号及び第5,156,840号に記載されたように、細胞毒性部分又はイメージング部分は、グリコシル化部位において酸化型炭水化物基によって抗DDR1抗体部分とカップリングさせられてもよい。抗体部分を細胞毒性部分又はイメージング部分とカップリングさせるためのさらにもう一つの別法は、ストレプトアビジン／ビオチン又はアビジン／ビオチンのような非共有結合性の結合対の使用によるものである。これらの態様においては、対の一方のメンバーが、抗体部分と共有結合的にカップリングさせられ、結合対の他方のメンバーが、細胞毒性部分又はイメージング部分と共有結合的にカップリングさせられる。
【０１４５】
本発明の免疫結合体の抗体部分がない場合に、細胞毒性部分がより強力である場合には、細胞への侵入の間もしくは後に分解可能であるか、又は細胞外環境において経時的に徐々に分解可能であるリンカー基を使用することが望ましいと思われる。多数の異なる分解可能リンカー基が、記載されている。これらのリンカー基からの細胞毒性部分剤の細胞内放出のメカニズムには、ジスルフィド結合の還元による分解（例えば、米国特許第4,489,710号）、光不安定結合の放射による分解（例えば、米国特許第4,625,014号）、誘導体化されたアミノ酸側鎖の加水分解による分解（例えば、米国特許第4,638,045号）、血清中の補体により媒介される加水分解による分解（例えば、米国特許第号4,671,958）、及び酸触媒加水分解による分解（例えば、米国特許第4,569,789号）が含まれる。
【０１４６】
同じであってもよいし又は異なっていてもよい2個またはそれ以上の細胞毒性部分及び／又はイメージング部分が、抗体と結合させられてもよい。抗DDR1抗体の多重誘導体化によって、いくつかの細胞毒性戦略が同時に実行され得る。抗体は、いくつかの可視化技術のための造影剤として有用になる場合がある；又は、治療用抗体は、可視化技術による追跡のため標識され得る。複数個の部分を有する免疫結合体は、多様な方式で調製され得る。例えば、複数個の部分が、抗体分子に直接カップリングさせられてもよいし、又は付加のための複数の部位を提供するリンカー（例えば、デンドリマー）が使用されてもよい。又は、複数個の細胞毒性部分又はイメージング部分を担持する能力を有する担体が使用され得る。
【０１４７】
担体は、直接的な又はリンカー基を介した共有結合、及び非共有結合性の会合を含む様々な方式で、細胞毒性部分又はイメージング部分を保持し得る。適当な共有結合担体には、各々、部分の付加のための部位を複数個有しているアルブミンのようなタンパク質（例えば、米国特許第4,507,234号）、ペプチド、及びアミノデキストランのような多糖（例えば、米国特許第4,699,784号）が含まれる。担体は、非共有結合のような非共有結合性の会合、又はリポソーム小胞（例えば、米国特許第4,429,008号及び第4,873,088号）への封入のような封入により、薬剤を保持していてもよい。封入担体は、検出のための十分な量のイメージング部分（色素、磁気共鳴造影試薬等）を、より容易に、抗体部分と会合させ得るため、本発明において使用するための抗DDR1抗体部分へのイメージング部分の結合に特に有用である。さらに、腫瘍細胞の近傍に集中させながら、治療用組成物が経時的に徐々に化学毒性部分を放出することを可能にし得るため、封入担体は、化学毒性治療態様においても有用である。
【０１４８】
放射性核種薬剤（細胞毒性部分として使用するためのもの又は陽電子放射イメージング部分として使用するためのもの両方）に特異的な担体及びリンカーには、放射性ハロゲン化低分子及びキレーティング化合物が含まれる。例えば、米国特許第4,735,792号は、代表的な放射性ハロゲン化低分子及びそれらの合成を開示している。放射性核種キレートは、金属、又は金属酸化物、放射性核種との結合のためのドナー原子としての窒素原子及び硫黄原子を含有しているものを含むキレーティング化合物から形成され得る。例えば、Davisonらの米国特許第4,673,562号は、代表的なキレーティング化合物及びそれらの合成を開示している。そのようなキレーション担体は、磁気共鳴イメージング腫瘍可視化法において使用するための磁気スピンコントラストイオン、及びラジオグラフィー可視化法において使用するための重金属イオンのキレーションにも有用である。
【０１４９】
細胞毒性部分として使用するための好ましい放射性核種は、薬理学的投与に適した放射性核種である。そのような放射性核種には、123I、125I、131I、90Y、211At、67Cu、186Re、188Re、212Pb、及び212Biが含まれる。ヨウ素及びアスタチンの使用に関しては大量の文献が蓄積されているため、ヨウ素及びアスタチンの同位体は、本発明の治療用組成物において使用するためのより好ましい放射性核種である。131Iは、数ミリメートルの有効域を有している他のβ線放射核種と同様に、特に好ましい。123I、125I、131I、又は211Atは、ヨウ素、N-スクシンイミジル3-［211At］アスタトベンゾエート、N-スクシンイミジル3-[131I］ヨードベンゾエート（SIB）、及びN-スクシンイミジル5-［131I］ヨード-3-ピリジンカルボキシレート（SIPC）を含むいくつかの既知の結合試薬のうちの任意のものを使用して、組成物及び方法において使用するための抗体部分と結合させられ得る。任意のヨウ素同位体が、列挙されたヨード試薬において使用され得る。放射性核種は、核医学分野の当業者に既知の適当なキレーション剤により、抗DDR1抗体部分として結合させられてもよい。
【０１５０】
好ましい化学毒性薬剤には、カルボプラチン、シスプラチン、ビンクリスチン、パクリタキセル及びドセタキセルのようなタキサン類、ヒドロキシ尿素、ゲムシタビン、ビノレルビン、イリノテカン、チラパザミン、マトリリシン、メトトレキサート、ピリミジン及びプリンの類似体、並びに当技術分野において既知のその他の適当な小さな毒素のような低分子薬物が含まれる。好ましい化学毒素分化誘導剤には、ホルボールエステル及び酪酸が含まれる。化学毒性部分は、化学的リンカーを介して直接的に抗DDR1抗体部分と結合させられてもよいし、又は担体へと封入され、それが抗DDR1抗体部分と結合させられてもよい。
【０１５１】
化学療法は、高グレードの膠腫の調節において役に立つ。化学療法薬の一般的な組み合わせは、プロカルバジン、CCNU、及びビンクリスチンという3個の薬物をさす「PCV」である。テモゾロミド（Temozolomide）（テモダー（Temodar））は、退形成性星状細胞腫の処置のためFDAによって承認されており、この薬物は、現在、高グレードの膠腫のために広く使用されている。ノイポゲン（Neupogen）は、化学療法の後に白血球数が極めて低いレベルにまで減少した患者へと投与され得る。
【０１５２】
細胞毒性部分として使用するための好ましい毒素タンパク質には、リシンA及びB、アブリン、ジフテリア毒素、ブリオジン（bryodin）1及び2、モモルジン（momordin）、トリコキリン（trichokirin）、コレラ毒素、ゲロニン（gelonin）、シュードモナス外毒素、シゲラ毒素、アメリカヤマゴボウ抗ウイルス性タンパク質、並びに医学生化学分野において既知のその他の毒素タンパク質が含まれる。非毒性リシンB鎖は、細胞と結合する部分であり、A鎖が、タンパク質合成を不活化する毒性部分である（ただし、ガラクトース末端膜タンパク質と結合するジスルフィド結合B鎖により細胞質へと送達された後にのみ）。アブリン、ジフテリア毒素、及びシュードモナス外毒素は、全て、類似した二本鎖構成成分を有しており；一本は、細胞膜結合及び侵入を媒介する鎖であり、A鎖が毒性の酵素的な鎖である。コレラは、毒性A鎖とカップリングされたペンタマーの結合サブユニットを有している。これらの毒素剤は、血管内に注射された場合には特に、患者において望ましくない免疫応答を誘発し得るため、抗DDR1抗体部分とのカップリングのためには担体へと封入されることが好ましい。
【０１５３】
本発明においてイメージング部分として使用するための好ましいラジオグラフィー部分には、金、イリジウム、テクネチウム、バリウム、タリウム、ヨウ素、及びそれらの同位体のような比較的大きな原子を含む化合物及びキレートが含まれる。本発明の組成物及び方法においては、ヨウ素又はヨウ素同位体のような低毒性のラジオグラフィーイメージング部分が使用されることが好ましい。X線ラジオグラフィーのため使用され得る組成物の例は、参照として完全に本明細書に組み込まれる米国特許第5,709,846号に記載されている。そのような部分は、許容される化学的リンカー又はキレーション担体によって抗DDR1抗体部分と結合させられ得る。さらに、スカル（scull）頭蓋を透過することができる放射線を放射する放射性核種が、シンチレーションイメージング技術に有用であり得る。結合のための適当な放射性核種には、99Tc、111In、及び67Gaが含まれる。本発明において使用するための陽電子放射部分には、米国特許第6,187,284号に記載された方法に従い、抗DDR1抗体部分とのフッ素化反応によって容易に結合させられ得る18Fが含まれる。
【０１５４】
好ましい磁気共鳴コントラスト部分には、クロミウム（III）イオン、マンガン（II）イオン、鉄（II）イオン、ニッケル（II）イオン、銅（II）イオン、プラセオジム（III）イオン、ネオジウム（III）イオン、サマリウム（III）イオン、及びイッテルビウム（III）イオンのキレートが含まれる。ガドリニウム（III）イオン、テルビウム（III）イオン、ジスプロシウム（III）イオン、ホルミウム（III）イオン、エルビウム（III）イオン、及び鉄（III）イオンは、極めて強い磁気モーメントのため、特に好ましい。磁気共鳴スピンイメージングに適したそのようなキレートの例は、参照として完全に本明細書に組み込まれる米国特許第5,733,522号に記載されている。核スピンコントラストキレートは、適当な化学的リンカーによって抗DDR1抗体部分と結合させられ得る。
【０１５５】
イメージング部分として使用するための光学的に可視の部分には、蛍光色素、並びに可視スペクトル色素、可視の粒子、及びその他の可視の標識部分が含まれる。アレキサ（ALEXA）色素、フルオレセイン、クマリン、ローダミン、ボディピー（bodipy）テキサスレッド、及びシアニン色素のような蛍光色素が、視覚的に検査すべき部位に十分な励起エネルギーが提供された場合、有用である。内視鏡的可視化法は、そのような標識の使用と比較的適合性であり得る。脳腫瘍を切除する手術のような、イメージング剤が有用である多くの手法については、可視スペクトル色素が好ましい。許容される色素には、非毒性のFDAにより承認されている食用の色素及び着色料が含まれるが、内用として承認された薬学的に許容される色素が好ましい。好ましい態様において、そのような色素は、担体部分に封入され、それらが、抗DDR1抗体と結合させられる。又は、コロイド金粒子又はラテックス粒子のような可視の粒子が、適当な化学的リンカーを介して抗DDR1抗体部分とカップリングさせられ得る。
【０１５６】
アレイ
アレイは、試料中の多数のポリヌクレオチドをアッセイすることができるハイスループット技術を提供する。本発明の一つの面において、他の脳腫瘍標的、例えば参照として本明細書に組み込まれる米国特許第6,455,026号；同時係属中の米国特許出願第10/328,544号；同第10/329,258号；同第09/983,000号；同第60/369,743号；同第60/369,991号；同第60/369,985号；同第60/378,588号；及び同第60/452,169号に記載されている標的と組み合わせて、DDR1の遺伝子、タンパク質、又は抗体を含むアレイが構築される。
【０１５７】
この技術は、差次的な発現に関して試験するための道具として使用され得る。結合したプローブを有する二次元マトリックス又はアレイとして、ポリヌクレオチドプローブを基板（例えば、ガラス、ニトロセルロース等）へとスポットすることにより、アレイは作出され得る。プローブは、共有結合、又は疎水性相互作用のような非特異的相互作用のいずれかにより、基板へと結合させられ得る。アレイを構築するための技術、及びこれらのアレイを使用する方法は、例えば、Schenaら（1996）Proc Natl Acad Sci U S A.93（20）：10614-9；Schenaら（1995）Science 270（5235）：467-70；Shalonら（1996）Genome Res.6（7）：639-45、米国特許第5,807,522号、欧州特許第799 897号；国際公開広報第97/29212号；国際公開広報第97/27317号；欧州特許第785 280号；国際公開広報第97/02357号；米国特許第5,593,839号；米国特許第5,578,832号；欧州特許第728 520号；米国特許第5,599,695号；欧州特許第721 016号；米国特許第5,556,752号；国際公開広報第95/22058号；及び米国特許第5,631,734号に記載されている。
【０１５８】
アレイにおいて使用されるプローブは、様々な型のものであってよく、例えば、比較的短い長さ（例えば、20mer又は25mer）の合成プローブ、cDNA（全長又は遺伝子の断片）、増幅されたDNA、（例えば制限酵素により生成した）DNAの断片、及び逆転写されたDNAを含み得る。カスタムアレイ及び一般的アレイの両方が、差次的な発現レベルの検出において使用され得る。カスタムアレイは、mRNA遺伝子配列の特定の予め選択された内部配列、又はそれらから調製された増幅産物とハイブリダイズするプローブを使用して調製され得る。
【０１５９】
アレイは、例えば、遺伝子の差次的な発現を検討するため、および遺伝子機能を決定するために使用され得る。例えば、アレイは、試験細胞と対照細胞との間で比較されたDDR1の差次的な発現を検出するために使用され得る。アレイの例示的な使用は、例えばPappalaradoら（1998）Sem.Radiation Oncol.8：217；及びRamsay.（1998）Nature Biotechnol.16：40にさらに記載されている。さらに、アレイを使用した検出法に対する多くのバリエーションは、充分に、当技術分野の技術の範囲内、および本発明の範囲内にある。例えば、プローブを固体支持体へと固定化するのではなく、被験試料を固体支持体へと固定化し、次いでそれをプローブと接触させることが可能である。発現分析におけるマイクロアレイの使用に関するさらなる考察は、例えば、Dugganら、Nature Genetics Supplement 21：10-14（1999）；Bowtell、Nature Genetics Supplement 21：25-32（1999）；Brown及びBotstein、Nature Genetics Supplement 21：33-37（1999）；Coleら、Nature Genetics Supplement 21：38-41（1999）；Debouck及びGoodfellow、Nature Genetics Supplement 21：48-50（1999）；Bassett,Jr.ら、Nature Genetics Supplement 21：51-55（1999）；並びにChakravarti、Nature Genetics Supplement 21：56-60（1999）に見い出され得る。
【０１６０】
発現レベルの検出のためには、通常、核酸が被験試料から得られ、直接標識されるか又は標識されたcDNAへと逆転写される。次いで、標識された核酸を含有している被験試料が、アレイと接触させられる。試料中に存在する任意の標識された核酸がプローブとハイブリダイズするのに十分な時間を経た後、典型的には、未結合の核酸を除去し、アレイの核酸プローブとの非特異的な結合を最小限に抑えるため、アレイは1回またはそれ以上の高ストリンジェンシー洗浄に供される。標識された配列の結合は、多様な商業的に入手可能なスキャナー及び添付のソフトウェアプログラムのうちの任意のものを使用して検出される。
【０１６１】
例えば、試料由来の核酸が蛍光標識で標識される場合、ハイブリダイゼーション強度は、例えば光子計数モードの走査型共焦点顕微鏡により決定され得る。適切な走査装置は、例えばTrulsonらの米国特許第5,578,832号及びSternらの米国特許第5,631,734号により記載されており、GeneChip（商標）標識としてAffymetrix,Inc.より入手可能である。いくつかの型の標識は、酵素法によって増幅され得るシグナルを提供する（例えば、Broudeら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91、3072-3076（1994）を参照されたい）。例えば、放射性同位体、発色団、磁性粒子、及び高電子密度粒子を含む、その他の多様な標識も適当である。
【０１６２】
標識された核酸とハイブリダイズするプローブアレイ上の位置は、米国特許第5,143,854号、国際公開公報第90/15070号、及び米国特許第5,578,832号に記載されたような読み取り装置を使用して検出される。カスタマイズされたアレイの場合には、次いで、国際公開公報第97/10365号に記載されるようにして分析される試料中の既知のmRNA種の存在及び／又は相対量もしくは絶対量を決定するため、ハイブリダイゼーションパターンが分析され得る。
【０１６３】
診断及び予後判定の方法
腫瘍におけるDDR1の差次的な発現は、これらが、治療適用のみならず、診断適用、イメージング適用のためのマーカーとしても活用され得ることを示す。一般に、そのような診断法は、血漿、血液、CSF、及びその他の同様の試料を含む個体の細胞もしくは組織、又はそれらに由来する試料におけるDDR1遺伝子転写物又はDDR1遺伝子産物の上昇した発現レベルを検出することを含む。遺伝子転写物のレベルを検出する方法及びタンパク質のレベルを検出する方法の両方を含む、多様な異なるアッセイ法が、遺伝子発現の増加を検出するために使用され得る。より具体的には、本明細書に開示された診断及び予後判定の方法は、個体から試料を得ること、試料中のDDR1遺伝子産物発現のレベルを、少なくとも定性的に、好ましくは定量的に決定することを含む。通常、この決定された値又は試験値は、何らかの型の参照又は基線値と比較される。
【０１６４】
DDR1に特異的な核酸、又は抗体のような結合メンバーが、対応するmRNA又はタンパク質の増加した発現、又は細胞中の増幅されたDNAの存在に関して患者の試料をスクリーニングするために使用される。試料は、多様な起源から入手され得る。試料は、典型的には、ヒト対象から得られる。しかしながら、方法は、霊長類、例えば類人猿及びチンパンジー、マウス、ネコ、ラット、及びその他の動物のような様々なその他の哺乳動物から得られた試料で使用されてもよい。そのような試料は、患者の試料と呼ばれる。
【０１６５】
試料は、細胞培養物又は組織ホモジネートのみならず、個体の組織又は体液からも入手され得る。例えば、試料は、脊髄液、又は腫瘍生検試料から入手され得る。この用語には、そのような細胞及び体液の誘導体及び画分も含まれる。試料は、増殖培地、組換え細胞、及び細胞構成成分を含むインビトロ細胞培養物に由来してもよい。診断用試料は、脳腫瘍を有しているか又は有していると推測される個体から収集される。特異的マーカーの存在は、腫瘍の同定及び病期決定において有用である。
【０１６６】
核酸スクリーニング法
DDR1遺伝子転写物の検出を含む診断及び予後判定の方法のうちのいくつかは、細胞の溶解、及びその後の他の細胞材料からの核酸、特にmRNA転写物の精製から出発する。mRNA転写物から派生した核酸とは、その合成のためにmRNA転写物又はその部分配列が鋳型として最終的に活用された核酸をさす。従って、mRNAから逆転写されたcDNA、そのcDNAから転写されたRNA、cDNAから増幅されたDNA、増幅されたDNAから転写されたRNAは、全て、mRNA転写物から派生したものであり、そのような派生産物の検出は、試料中の最初の転写物の存在及び／又は存在量の指標となる。
【０１６７】
多数の方法が、特定の配列の存在、例えば上方制御又は下方制御された発現に関して核酸を分析するために使用可能である。核酸は、分析にとって十分な量を提供するために、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のような従来の技術によって増幅され得る。ポリメラーゼ連鎖反応の使用は、Saikiら（1985）Science 239：487に記載されており、技術の概説は、Sambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、CSH Press 1989、14.2〜14.33頁に見出され得る。
【０１６８】
増幅反応には検出可能標識が含まれていてもよい。適当な標識には、蛍光色素、例えばALEXA色素（Molecular Probes,Inc.より入手可能）；フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、ローダミン、テキサスレッド、フィコエリトリン、アロフィコシアニン、6-カルボキシフルオレセイン（6-FAM）、2,7-ジメトキシ-4,5-ジクロロ-6-カルボキシフルオレセイン（JOE）、6-カルボキシ-X-ローダミン（ROX）、6-カルボキシ-2,4,7,4,7-ヘキサクロロフルオレセイン（HEX）、5-カルボキシフルオレセイン（5-FAM）、又はN,N,N,N-テトラメチル-6-カルボキシローダミン（TAMRA）、放射性標識、例えば32P、35S、3H等が含まれる。標識は、増幅されたDNAが、アビジン、特異的抗体等の高親和性結合パートナーを有するビオチン、ハプテン等と結合され、結合パートナーが検出可能標識と結合されている、二段階系であってもよい。標識は、プライマーの一方又は両方と結合されてもよい。又は、標識が増幅産物に取り込まれるよう、増幅において使用されるヌクレオチドのプールが標識される。
【０１６９】
試料核酸、例えば増幅され、標識され、クローニングされた断片等は、当技術分野において既知の多数の方法のうちの一つによって分析される。プローブがノーザンブロットもしくはドットブロットへとハイブリダイズさせられてもよいし、又は液体ハイブリダイゼーション反応が実施されてもよい。核酸が、ジデオキシ法又はその他の方法によって配列決定され、塩基配列が野生型配列と比較されてもよい。一本鎖高次構造多型（SSCP）分析、変性勾配ゲル電気泳動（DGGE）、及びゲルマトリックス中のヘテロ二重鎖分析が、DNA配列バリエーションによって作出された高次構造の変化を電気泳動移動度の改変として検出するために使用される。分画は、ゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動、特にアクリルアミドゲル又はアガロースゲルによって実施される。
【０１７０】
インサイチューハイブリダイゼーション法は、ハイブリダイゼーションの前に細胞を溶解させないハイブリダイゼーション法である。この方法はインサイチューで実施されるため、細胞からRNAを調製する必要がないという利点を有する。この方法は、通常、まず支持体（例えば、マイクロタイターウェルの壁）に被験細胞を固定し、次いで適切な透過性化溶液により細胞を透過性化することを含む。次いで、標識されたプローブを含有している溶液を、細胞と接触させ、プローブをハイブリダイズさせる。過剰のプローブを消化し、洗浄除去し、ハイブリダイズしたプローブの量を測定する。このアプローチは、Nucleic Acid Hybridization：A Practical Approach（Hamesら編、1987）に、より詳細に記載されている。
【０１７１】
多様ないわゆる「リアルタイム増幅」法又は「リアルタイム定量的PCR」法も、試料中に存在するmRNAの量を決定するために使用され得る。そのような方法は、増幅プロセスの間に形成された増幅産物の量を測定することを含む。蛍光発生ヌクレアーゼアッセイ法は、転写物を検出し定量するために使用され得るリアルタイム定量法の一つの具体例である。一般に、そのようなアッセイ法は、二重標識された蛍光発生性オリゴヌクレオチドプローブを使用して、PCR産物蓄積を連続的に測定する（文献では単に「タックマン（TaqMan）」法と呼ばれることが多いアプローチ）。増幅産物の濃度をリアルタイムに決定するための蛍光発生法の理論及び操作に関するさらなる詳細は、例えば、各々、参照として完全に組み込まれる、Gelfandの米国特許第5,210,015号、Livakらの米国特許第5,538,848号、及びHaalandの米国特許第5,863,736号に記載されている。
【０１７２】
ポリペプチドスクリーニング法
DDR1アイソフォームを検出するために設計された様々なイムノアッセイ法が、スクリーニングにおいて使用され得る。検出は、DDR1ポリペプチドと特異的に結合する抗体又はその他の特異的結合メンバーを使用して、従来の方式に従い実施される、細胞又は組織学的切片の染色を利用し得る。目的の抗体又はその他の特異的結合メンバーを細胞試料へと添加し、エピトープとの結合を可能にするために十分な時間、一般的には少なくとも約10分間、インキュベートする。抗体は、直接検出のための放射性同位体、酵素、蛍光団、化学発光団、又はその他の標識で標識され得る。又は、二次の抗体又は試薬が、シグナルを増幅するために使用される。そのような試薬は、当技術分野において周知である。例えば、一次抗体をビオチンと結合させ、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合アビジンを二次試薬として添加することができる。最終検出は、ペルオキシダーゼの存在下で色が変化する基質を使用する。抗体結合の欠如又は存在は、解離させた細胞のフローサイトメトリー、顕微鏡検、ラジオグラフィー、シンチレーション計数等を含む様々な方法によって決定され得る。
【０１７３】
別の診断法は、溶解物中の、抗体と、DDR1に対応するポリペプチドとの間の結合のインビトロの検出に依存する。試料又はその画分の中の標的タンパク質の濃度の測定は、多様な特異的アッセイ法よって達成され得る。従来のサンドイッチ型アッセイ法が使用されてもよい。例えば、サンドイッチアッセイ法は、まず、特異的抗体を不溶性の表面又は支持体に付着させる。本発明の試薬及び全体的な方法と適合性である限り、特定の結合様式は重大ではない。それらは、共有結合的又は非共有結合的、好ましくは非共有結合的にプレートに結合させられ得る。
【０１７４】
不溶性の支持体は、ポリペプチドが結合することができ、可溶性材料から容易に分離され、かつその他の点において全体的な方法と適合性である、任意の組成物であり得る。そのような支持体の表面は、固体又は多孔性であってよく、任意の便利な形状であり得る。受容体が結合させられる適当な不溶性支持体の例には、ビーズ、例えば磁性ビーズ、膜、及びマイクロタイタープレートが含まれる。これらは、典型的には、ガラス、プラスチック（例えば、ポリスチレン）、多糖、ナイロン、又はニトロセルロースで作成されている。マイクロタイタープレートは、少量の試薬及び試料を使用して、多数のアッセイ法を同時に実施することができるため、特に便利である。
【０１７５】
次いで、患者の試料の溶解物は、抗体を含有している別々にアッセイ可能な支持体（例えば、マイクロタイタープレートの別々のウェル）に添加される。好ましくは、既知の濃度の被験タンパク質を含有している一連の標準が、対照として活用するため、試料又はその一部分と平行にアッセイされる。好ましくは、試料及び標準は、各々、各々の平均値が得られるよう、複数のウェルに添加されると考えられる。インキュベーション時間は、結合にとって十分なものであるべきである。インキュベーションの後は、一般に、不溶性支持体から未結合構成成分が洗浄される。洗浄後、二次抗体を含有している溶液が適用される。抗体は、存在するその他の構成成分と区別され得るよう十分な特異性で、目的のタンパク質のうちの一つと結合すると考えられる。二次抗体は、直接的又は間接的な結合の定量を容易にするため、標識され得る。好ましい態様において、抗体は、適当な基質の添加の後に検出可能な生成物シグナルを提供することができる共有結合した酵素で標識される。結合体物中に使用するのに適した酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ等が含まれる。商業的に入手可能でない場合、そのような抗体−酵素結合体は、当業者に既知の技術によって容易に作製される。インキュベーション時間は、標識されたリガンドが使用可能な分子と結合するのに十分なものであるべきである。
【０１７６】
第二結合工程の後は、非特異的に結合した材料が除去されるよう再び不溶性支持体を洗浄し、標的タンパク質と特異的結合メンバーとの間で形成された特異的複合を残す。結合した結合体から生成したシグナルが、従来の手段によって検出される。酵素結合体が使用される場合には、検出可能産物が形成されるよう適切な酵素基質が提供される。
【０１７７】
その他のイムノアッセイ法は当技術分野において既知であり、診断薬として有益であり得る。オクタロニープレートは、抗体結合の単純な決定を提供する。ウェスタンブロットは、サンドイッチアッセイ法に関して記載されたような標識法を便利に使用して、標的とされたポリペプチドに特異的な検出系を使用して、タンパク質ゲル又はフィルター上のタンパク質スポットに対して実施され得る。
【０１７８】
いくつかの場合には、競合アッセイ法が使用されると考えられる。患者の試料に加え、標的とされたタンパク質に対する競合剤が反応混合物に添加される。競合剤と標的とは、特異的結合パートナーとの結合に関して競合する。通常、以前に記載されたようにして、競合剤分子が標識され検出されると考えられる。その場合、競合剤結合の量が、存在する標的タンパク質の量に比例すると考えられる。競合剤分子の濃度は、検出の範囲を最も高感度で直線的なものにするため、最大予想タンパク質濃度の約10倍乃至ほぼ等しい濃度までであると考えられる。
【０１７９】
インビボイメージング
いくつかの態様において、方法は、例えば腫瘍細胞が存在する部位を位置決定又は同定するための、インビボのイメージングにおける使用に適合している。これらの態様においては、DDR1に特異的な検出可能に標識された部分、例えば抗体が、（例えば、注射により）個体に投与され、標識された細胞が、磁気共鳴イメージング、コンピュータ連動断層撮影法等（これらに制限はされない）を含む、標準的なイメージング技術を使用して位置決定される。
【０１８０】
診断インビボイメージングの場合、使用可能な検出装置の型が、特定の放射性核種の選択における主な要因である。選択された放射性核種は、特定の型の装置によって検出可能な型の崩壊を有していなければならない。一般に、診断イメージングを可視化するための任意の従来の方法が、本発明に従い使用され得る。インビボ分析用の放射性核種の選択におけるもう一つの重要な要因は、その半減期が、標的組織による最大取り込みの時点でまだ検出可能である程度に長く、しかし宿主への有害な照射が最小限に抑えられる程度に短いということである。99mTcによる標識のための現在使用されている方法は、キレーティング前駆体の存在下で過テクネチウム酸塩を還元して、不安定な99mTc-前駆体複合体を形成させ、それを、次に、二官能修飾された走化性ペプチドの金属結合基と反応させ、99mTc-走化性ペプチド結合体を形成させるというものである。
【０１８１】
検出可能に標識されたDDR1特異的抗体は、標的の発現を分析するため、イメージング技術と共に使用される。一つの態様において、イメージング法は、放射性核種が合成的又は局所的に患者に投与されるイメージング技術であるPET又はSPECTのうちの一つである。その後の放射性トレーサーの取り込みが経時的に測定され、標的とされた組織に関する情報を得るために使用される。使用された特定の同位体の高エネルギー（γ線）放射、並びにそれらを検出するために使用された装置の感度及び精度のため、放射能の二次元分布が体外から推量される。
【０１８２】
PETにおいて最も一般的に使用されている陽子放射核種には、11C、13N、150、及び18Fが含まれる。SPECTにおいては、電子捕捉及び／又はγ放射により崩壊する同位体が使用されており、それには123I及び99mTcが含まれる。
【０１８３】
遺伝子発現の改変
DDR1の活性を調整する薬剤、特にポリペプチドの活性又は遺伝子の発現を阻害する薬剤は、治療的又は予防的な介入のポイントを提供する。発現を直接調整する薬剤、例えば発現ベクター、標的とされたポリペプチドに特異的なアンチセンス；及びタンパク質に作用する薬剤、例えば特異的抗体及びその類似体、触媒活性を阻止する有機低分子等を含む多数の薬剤が、この活性の調整において有用である。
【０１８４】
ある種の細胞に選択的に核酸を送達するための方法が、設計され得る。そのような細胞の例には、ニューロン、小膠細胞、星状細胞、内皮細胞、乏突起膠細胞等が含まれる。ある種の処置法は、ニューロン細胞へ発現ベクターを選択的に発現させるため、かつ／又はCNS由来細胞への送達のため核酸をターゲティングするために設計される。神経細胞における選択的発現を達成するための一つの技術は、コーディング配列を、神経細胞において主として活性なプロモーターと機能的に連結させることである。そのようなプロモーターの例には、プリオンタンパク質プロモーター、カルシウム−カルモジュリン依存性プロテインキナーゼプロモーターが含まれるが、これらに制限はされない。別法として、又はさらに、核酸は、核酸をCNS由来細胞へとターゲティングする薬剤と共に投与され得る。例えば、核酸は、神経細胞上の細胞表面抗原と特異的に結合する抗体、又はニューロン細胞上の受容体に対するリガンドと共に投与され得る。
【０１８５】
リポソームを利用する場合には、リポソームを神経細胞へとターゲティングし、取り込みを容易にするため、エンドサイトーシスと関連した細胞表面膜タンパク質と結合する基質を、リポソームに付着させることができる。付着させられ得るタンパク質の例には、神経細胞と結合するカプシドタンパク質又はそれらの断片、サイクリング中に内部移行する神経細胞上の細胞表面タンパク質と特異的に結合する抗体、及びCNS由来細胞内の細胞内局在を標的とするタンパク質が含まれる（例えば、Wuら（1987）J.Biol.Chem.262：4429-4432；及びWagnerら（1990）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：3410-3414参照）。遺伝子マーキング及び遺伝子治療のプロトコルは、Andersonら（1992）Science 256：808-813により概説されている。様々な他の送達オプションも利用され得る。例えば、目的の配列を含有している核酸を、脳脊髄液へと直接注射することができる。又は、脳室内注射によって、そのような核酸を投与してもよい。
【０１８６】
アンチセンス分子は、細胞における発現を下方制御するために使用され得る。アンチセンス試薬は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ODN）、特に天然型核酸からの化学修飾を有する合成ODN、又はRNAのようなアンチセンス分子を発現する核酸構築物であり得る。アンチセンス配列は、標的とされた遺伝子のmRNAに相補的であり、標的とされた遺伝子産物の発現を阻害する。アンチセンス分子は、様々なメカニズムによって、例えばRNAseHの活性化又は立体障害により、翻訳に利用可能なmRNAの量を減少させることによって、遺伝子発現を阻害する。1個のアンチセンス分子が投与されてもよいし、又は複数の異なる配列を含み得るアンチセンス分子の組み合わせが投与されてもよい。
【０１８７】
アンチセンス分子は、適切なベクターの中の標的遺伝子配列の全部又は一部の発現によって産生され得、この場合、転写開始は、アンチセンス鎖がRNA分子として産生されるようが方向付けられる。又は、アンチセンス分子は、合成オリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一般に、少なくとも約7ヌクレオチド長、一般的には少なくとも約12ヌクレオチド長、より一般的には少なくとも約20ヌクレオチド長であり、約500ヌクレオチド長、一般的には約50ヌクレオチド長、より一般的には多くても約35ヌクレオチド長であり、長さは、阻害の効率、特異性（交差反応性の欠如を含む）等により支配される。7〜8塩基長の短いオリゴヌクレオチドは、遺伝子発現の強力かつ選択的な阻害剤となり得ることが見出されている（Wagnerら（1996）Nature Biotechnology 14：840-844参照）。
【０１８８】
内因性のセンス鎖mRNA配列の特定の1個または複数の領域が、アンチセンス配列と相補的であるよう選択される。オリゴヌクレオチドのための特定の配列の選択は、数個の候補配列が、インビトロ又は動物モデルにおける標的遺伝子の発現の阻害に関してアッセイされる、経験的方法を使用し得る。mRNA配列の数個の領域がアンチセンス相補のために選択される、配列の組み合わせが使用されてもよい。
【０１８９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、当技術分野において既知の方法によって化学合成され得る（Wagnerら（1993）（前記）及びMilliganら（前記）参照）。好ましいオリゴヌクレオチドは、細胞内安定性及び結合親和性を増加させるため、天然型ホスホジエステル構造から化学的に修飾される。骨格、糖、又は複素環式塩基の化学を改変するそのような修飾は、多数、文献に記載されている。
【０１９０】
骨格化学の有用な変化としては、ホスホロチオエート；非架橋酸素が両方とも硫黄で置換されているホスホロジチオエート；ホスホロアミダイト；アルキルホスホトリエステル及びボラノホスフェートがある。アキラルなホスフェート誘導体には、3'-O'-5'-S-ホスホロチオエート、3'-S-5'-O-ホスホロチオエート、3'-CH2-5'-O-ホスホネート、及び3'-NH-5'-O-ホスホロアミダイトが含まれる。ペプチド核酸は、完全なリボースホスホジエステル骨格をペプチド結合に交換したものである。糖修飾も、安定及び親和性を増強するために使用される。塩基が天然のβアノマーと逆であるデオキシリボースのαアノマーも使用され得る。リボース糖の2'-OHは、親和性を含まずに、分解に対する抵抗性を提供する2'-O-メチル糖又は2'-O-アリル糖を形成するよう改変され得る。複素環式塩基の修飾は、適正な塩基対形成を維持しなければならない。いくつかの有用な置換には、デオキシウリジンとデオキシチミジンとの置換；5-メチル-2'-デオキシシチジン及び5-ブロモ-2'-デオキシシチジンとデオキシシチジンとの置換が含まれる。5-プロピニル-2'-デオキシウリジン及び5-プロピニル-2'-デオキシシチジンは、それぞれデオキシチミジン及びデオキシシチジンに置換された場合、親和性及び生物学的活性を増加させることが示されている。
【０１９１】
実験
以下の実施例は、本発明をいかにして作成及び使用するかの完全な開示及び記載を当業者に提供するために示されるものであり、本発明者らが本発明と見なすものの範囲を制限するためのものではないし、実施された実験が下記の実験のみであることを表すためのものでもない。使用された数（例えば、量、温度等）に関しては正確さを保証すべく努力がなされたが、いくつかの実験の誤差及び偏差は斟酌されるべきである。特記しない限り、部分は重量部分であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧又は大気圧付近である。
【０１９２】
この明細書中に引用された全ての出版物及び特許出願は、個々の出版物又は特許出願が各々特別に個別に参照として組み込まれると示されたかのごとく、参照として本明細書に組み込まれる。
【０１９３】
本発明は、本発明の実施のための好ましい様式を含むことが本発明者らによって見出された又は提唱された特定の態様に関して記載された。本開示を考慮することにより、本発明の意図された範囲を逸脱することなく、例証された特定の態様に多数の修飾及び変化を施し得ることが、当業者には理解されると思われる。例えば、コドンの縮重により、タンパク質配列に影響を与えることなく、基となるDNA配列を変化させることが可能である。さらに、生物学的機能的等価性の考察により、生物学的作用の種類又は量に影響を与えることなく、タンパク質構造を変化させることが可能である。そのような修飾は全て、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれるものとする。
【０１９４】
実施例1
脳腫瘍：
未詳の患者に由来する、神経病理学によって神経膠芽腫グレードIVと確認された腫瘍組織を、手術室において急速凍結させ、実験試料として活用した。ヒト全脳組織（Clontech Laboratrories,Palo Aloto,USA）を、対照試料として活用した。2000年7月28日出願の同時係属中の米国特許出願第09/627,362号に記載されたようにして、細胞から調製されたポリA+RNAを、二本鎖cDNA（dscDNA）へと変換し、規準化した。腫瘍に由来するdscDNAを、非癌性脳の同じ領域から調製された過剰のdscDNAと共に使用して、サブトラクティブハイブリダイゼーションを実施した。差次的に発現された遺伝子断片を、プラスミドベクターへとクローニングし、得られたライブラリーを大腸菌細胞へと形質転換した。組換えクローンの挿入断片を、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって増幅した。PCR産物（200〜2000bpサイズの断片）を、一般的なベクター配列に相補的なオリゴヌクレオチドを使用して配列決定した。得られた配列情報を、BLAST（blastn）及びスミス・ウォーターマンアルゴリズムを使用して、公共データベースと比較した。
【０１９５】
定量リアルタイムPCR
正常脳組織試料及び腫瘍試料からの全RNAを、製造業者の指示に従い、トライゾール（Trizol）（Gibco BRL）を用いて単離する。SYBRグリーン（Green）リアルタイムPCR増幅は、アイサイクラーリアルタイム検出システム（iCycler Real-Time Detection System）（Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA）において実施される。その反応は、12.5μlの2×SYBRグリーンマスターミックス（Green Master Mix）（PE Applied Biosystems）、各0.9μMの濃度の順方向プライマー及び逆方向プライマー、200ngの全cDNAを含有しており、ヌクレアーゼフリーH20（Promega）が25μlになるまで補足された25μl反応溶液で96穴プレートにおいて実施される。プライマーは、Whitehead Institute for Biomedical Researchによって開発されたプライマー（Primer）3を使用して設計され、プライマー（Operon Technologies,Alameda,CA）濃度は、SYBRグリーンPCRマスターミックス試薬キットとの使用のために最適化される。アンプリコンのサイズは、1.5％アガロースゲル上でPCR産物を泳動させることによりチェックされる。全てのSYBRグリーンPCRのための熱プロファイルは、50℃2分及び95℃10分、続いて95℃15秒、60℃30秒、続いて72℃40秒を45サイクルである。臨界しきいサイクル（critical threshold cycle）（Ct）とは、蛍光が、バックグラウンドを超えて検出可能になり、鋳型分子の最初の数の対数に反比例するサイクルと定義される。標準曲線が、脳全体から得られたcDNAの10倍希釈物の増幅から得られたCt値を用いて各プライマーセットについてプロットされる。標準曲線は、プライマーセットのPCR効率を計算するために使用される。
【０１９６】
PCR反応は全て二通りで実施される。定量は、比較サイクルしきい値（comparative cycle threshold）（CT）法を使用して実施される。ここで、CTとは、蛍光が設定されたしきい値に達するサイクル数と定義される。標的転写物を内因性参照に対して規準化し、相対差を、Pfaffl（Nucleic Acids Research,2001）に従い、PCR効率を使用して計算する。正常脳組織に対する腫瘍における上方制御を証明するため、腫瘍試料及び正常対照脳組織を、（切除組織、針生検材料、又はその他の組織の起源を含む）様々な起源から、外科的に除去する。確立されている方法を使用して、これらの試料から全RNAを抽出し、cDNAを、リアルタイム定量PCR法において使用するため作製した。
【０１９７】
免疫組織化学
免疫組織化学には、ヒト正常脳及び腫瘍の切片が使用され得る。ヒト癌組織アレイスライドが、抗体により組織特異的発現を評価するために使用される。これらのパラフィン包埋組織アレイスライドは、脱ロウされ、水で洗浄され、標的賦活化（target retrieval）法により処理される。又は、腫瘍及び正常組織のその他の起源が免疫組織化学により分析されてもよく、これらには凍結保存材料及び針生検材料が含まれる。次いで、従来の免疫組織化学的反応が、抗DDR1抗体を使用して実施される。組織切片は、染色の局在部位、並びに強度及び組織切片の超微細構造を決定するため、光学顕微鏡検を使用して分析される。腫瘍組織における腫瘍タンパク質のタンパク質発現レベル及び局在が決定される。これらの研究は、脳腫瘍の病期決定及び診断に関する情報を提供する。さらに、免疫組織化学は、療法を綿密に調整し、処置終点を決定するために使用され得る。免疫組織化学は、抗DDR1抗体のスクリーニングにも有用である。
【０１９８】
抗原調製及び免疫感作：
抗原の量及び質が、免疫感作されるマウスの数及び免疫応答の程度を決定する。抗原は、標的タンパク質のサブドメイン又は領域を含み得る。マウス（トランスジェニック又は正常）が、高親和性及び指向化された免疫応答を誘起し駆動するために免疫感作される。免疫感作された動物からリンパ細胞が回収され、次いでアレイ化され、不死化B細胞（ハイブリドーマ）細胞又は初代B細胞のいずれかとしてマイクロタイターディッシュで培養される。
【０１９９】
抗体スクリーニング：
アレイ化されたハイブリドーマ又は培養B細胞の増幅された集団が、多様なアッセイフォーマットを使用して、例えばELISAによって、抗原と結合する抗体に関してスクリーニングされる。その過程は、γ／κ融合に関するスクリーニングからの陽性結果の数、及び抗原の性質に依存し、典型的には、10〜5,000個のモノクローナル抗体の同定をもたらす。抗体は、動力学的に分類されたメンバーの階層的連続として各々組織化される別個のエピトープファミリーに属し得る。不可欠の動力学的基準を満たす抗体、典型的には10〜30個が、リードとしてさらなる評価へと進められる。
【０２００】
抗体バリデーション：
腫瘍標的の生物学に対する抗体の効力を査定するため、リード抗体は、一連のアッセイ法においてバリデートされる。これらのアッセイ法は、裸の抗体（非アーム化抗体）又は（毒素もしくは放射性同位体でアーム化された、又はビオチン化された）結合抗体のため設計され得る。抗体を特徴決定するために使用されるアッセイ法には、親和性測定、内部移行、リガンドの阻止、免疫応答、機能的細胞アッセイ法における活性、インビボ効力、インビボ毒性、安定性、及び可溶性が含まれる。
【０２０１】
内部移行を誘発する能力に関する標的抗体の特徴決定
神経膠腫に由来する腫瘍細胞への抗体-DDR1複合体の内部移行は、効率的な毒素イムノ結合体送達に必要である。抗体-脳腫瘍標的複合体の内部移行の測定は、毒素-抗体結合体が、特異的に腫瘍細胞に送達され得、効率的な腫瘍細胞死滅を可能にすることを証明する。抗体は、腫瘍標的の外部ドメインと結合し、ヒト星状細胞腫細胞へ内部移行する能力に関してスクリーニングされる。セロミクスアレイスキャン（Cellomics Array Scan）蛍光顕微鏡装置が、内部移行した抗体-脳腫瘍複合体を同定し定量するために使用される。ヒト神経膠腫細胞が、黒壁透明底96穴プレートに、1ml当たり25,000個（1ウェル当たり2500個）の密度で播種される。播種の後日、抗体のパネルが、0.1ug/mlから最大100ug/mlまでの濃度で（5回、各々三通りで）細胞に添加され、0.5時間及び2時間、インキュベートされる。細胞の抗体とのインキュベーションは、異なる時点で行われる。
【０２０２】
細胞は、HBSSで1回濯がれ、3.7％中性緩衝ホルマリンで固定される。固定液が吸引され、プレートがブロッキング緩衝剤で洗浄され、次いで、10分間透過性化緩衝液と共にインキュベートされる。次いで、細胞は、室温で30分間、10ug/mlヘキスト（Hoechst）33342（核染色用）を含有している蛍光結合二次抗体溶液で染色される。プレートは2回洗浄され、密封され、4CのHBSS中に保管される。アレイスキャン（ArrayScan）HCSシステムを使用して画像が取得され、内部移行した受容体が専有アルゴリズムを使用して定量される。そのアルゴリズムは、細胞内の蛍光性受容体凝集物の出現及び強度を測定する。これらの測定は、平均細胞質強度（細胞内の抗体-受容体複合体の量）及び平均細胞質テクスチャー（texture）（エンドソーム凝集物の測定）として表される。受容体内部移行を誘発する抗体は、さらに評価される。ヒト神経膠腫細胞上のDDR1と結合し、内部移行する抗体は、特定に重要である。いくつかの場合、エンドサイトーシスが、成長阻害のようなその他の治療的な生物学的効果のための代理マーカーとして活用され得る。
【０２０３】
腫瘍細胞成長アッセイ法におけるDDR1標的抗体の特徴決定
神経膠腫は、急速に増殖する細胞であることを特徴とする。従って、抗体は、神経膠腫細胞成長を阻害する能力に関して評価される。そのアッセイ法は、培養ヒト神経膠腫細胞の成長特性に対する抗体の効果を試験する。細胞が、1ウェル当たり3000〜10,000個の密度で96穴プレートに播種される。細胞播種の後日、抗体が、0.1ug/mlから最大100ug/mlまでの濃度で（5回、各々三通りで）細胞に添加される。細胞は、細胞成長及び細胞生存に対する脳腫瘍標的抗体の効果を決定するため、阻害剤（例えば、MMP阻害剤、MAPK阻害剤）の存在下又は非存在下で、リガンドの存在下又は非存在下で、血清と共に又は血清なしで成長させられる。
【０２０４】
神経膠腫細胞成長に対する抗DDR1抗体の効果は、セルタイターグロ（Cell Titer Glo）（Promega）と呼ばれる同種混合読み取りアッセイ法（homogenous mix and read assay）を使用して決定されるであろう。これは、細胞溶解物中のATPのレベルを測定する、発光に基づくアッセイ法である。存在している存在細胞が多いほど、ATPレベルが大きくなり、そのため発光シグナルが強くなる。この試薬及び発光測定は、頑強かつ便利であり、細胞接着に対する抗体により媒介される効果は、読み取りに干渉しない（剥離された細胞は、処理中にプレートから洗浄除去されないであろう）。細胞毒性又は神経膠腫細胞成長の阻害を示す抗体が、さらに特徴決定される。これ及び類似のアッセイ法（例えば、BRDUアッセイ法）は、神経膠腫細胞成長及び細胞生存を阻害する効力を示す抗体のサブセットの同定を可能にする。
【０２０５】
腫瘍細胞侵襲アッセイ法における脳腫瘍標的抗体の特徴決定：神経膠腫の主要な形態学的特質である局所腫瘍細胞侵襲性は、局所的に修飾された微小環境による、腫瘍細胞の接着、タンパク質分解、及び遊走を含む、腫瘍細胞と細胞外マトリックスとの相互作用を含む。これは、腫瘍細胞と間質細胞との相互作用も含む。従って、抗DDR1抗体は、ヒト神経膠腫細胞の侵襲及び遊走を阻害する能力に関して評価され得る。
【０２０６】
アッセイ法は、培養ヒト神経膠腫細胞の侵襲特性に対する脳腫瘍抗体の効果を評価する、細胞遊走／侵襲の定量的決定である。脳腫瘍標的抗体の細胞侵襲を阻害する能力を査定するため、ヒト神経膠腫細胞系が使用される。プレートが、細胞播種の前に、細胞外マトリックス溶液で、又は溶液なしでコーティングされる。マトリゲル（Matrigel）（BD Biosciences）は、腫瘍微小環境を模倣する細胞外マトリックスコンポーネントの混合物である。侵襲／遊走におけるDDR1の役割を研究するために、チャンバーは、マトリゲルに加え、種々の型のコラーゲン、フィブロネクチン、及びその他の細胞外マトリックスでもコーティングされるであろう。細胞は、1ウェル当たり10,000〜25,000個の密度で遊走アッセイプレート上に播種される（修飾ボイデンチャンバー）。複数のプレートセットが、異なる時点（例えば、0時間、4時間及び24時間、48時間）を測定するために使用される。0.1ug/mlから最大100ug/mlの濃度のDDR1抗体が（5回、各々三通りで）ウェルに添加される。5％血清を含む又は含まないDMEMを、化学誘引物質の存在下又は非存在下で下室に添加した。0時間、4時間及び24時間、48時間後、膜の下側に接着している遊走／侵襲細胞が、カルセイン（Calcein）で染色され、侵襲した細胞によって放射される蛍光が測定される。神経膠腫細胞侵襲の調節は、脳腫瘍標的治療薬の重要な特徴である。
【０２０７】
結果
DDR1の発現
機能ゲノミクスによる研究によって、14個の高グレード神経膠腫腫瘍試料のパネルにおいて、DDR1タンパク質をコードする遺伝子が1.7倍上方制御されていることが証明された（P値2.07E-07）。正常脳組織におけるDDR1 mRNAの発現も、ノーザンブロット分析によって調査され、DDR1タンパク質の存在が、ウェスタンブロット分析によって試験された。図1Aに示されるように、DDR1は、脳梁、髄質、及び脊髄を含む脳の様々な領域に発現している。ノーザンブロット分析により、4.4kbに単一のバンドが明らかとなった。図1Bは、図1Aにおけるノーザンブロットからの各バンドの相対強度を測定したものである。ブロットはβ-アクチンに対して規準化された。
【０２０８】
高グレード神経膠腫におけるDDR1タンパク質の過剰発現を立証するため、ヒト神経膠腫に由来する細胞系、肺、肝臓、脳、及びGBM組織のコレクションを試験した（図2A及び2B）。DDR1のC末端領域に対する抗体を使用したウェスタンブロット分析によって、DDR1a/1bアイソフォーム及びDDR1eアイソフォームに相当するおよそ125kDa及び110kDa、及び62kd kDa膜貫通タンパク質の3本のバンドが検出された。培養神経膠腫由来細胞の溶解物、正常脳、肺、肝臓、及び神経膠芽腫からの組織試料をイムノブロットし、ポリクローナル抗DDR1 Ab（C-20）で探索した。タンパク質負荷の対照としてのβ-アクチンに関しても、ウェスタンブロットによって溶解物を分析した。この分析は、DDR1がGBM腫瘍組織で上方制御されていること、神経膠腫細胞系に差次的に発現していることを証明している。
【０２０９】
DDR1タンパク質の局在は、原発性腫瘍のパラフィン切片に対する免疫組織化学によって分析した（図3A及び3B及び表1）。この研究において、19個の高グレード星状細胞腫腫瘍のうちの15個（79％）が、DDR1に関して陽性に染色され、正常脳切片においては、極めて低レベルのDDR1発現が同定された（図3A、3B及び表1）。ウェスタンブロット分析と一致して、これらの結果は、高グレード神経膠腫腫瘍組織におけるDDR1タンパク質の上方制御を証明している。従って、神経膠腫腫瘍によるDDR1の発現は、DDR1がCNS内の腫瘍細胞の潜在的に有用な診断的及び治療的なマーカーであることを証明している。
【０２１０】
原発性脳腫瘍におけるDDR1の発現を、抗DDR1（C-20、C末端抗体、Santa Cruz Biotechnology Inc.）で染色することにより、腫瘍型の特異性に関して試験した。その結果は、表2に示される。星状細胞腫グレードIII及びグレードIIは、DDR1発現と強く相関していたが、その他の型の脳腫瘍は、低いDDR1の発現を有するか、又は全く有していなかった。DDR1は、リンパ腫を含むその他の腫瘍にも過剰発現していることが見出された。
【０２１１】
【表２】
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【０２１２】
DDR1は基底膜を通った神経膠腫細胞遊走を促進する
高グレード神経膠腫腫瘍は、高度に遊走性かつ侵襲性の挙動に関して顕著である。高グレード星状細胞腫の処置における局所的再発及び治療失敗の主因は、周囲の正常な脳への腫瘍細胞の侵襲である。遊走するためには、これらの細胞は、MMP（メタロプロテアーゼ）のための主要な基質であるコラーゲンIV及びコラーゲンIに富む内皮下マトリックスを分解しなければならない。細胞遊走におけるDDR1の重要性を研究するため、空のベクター（モック）、DDR1aアイソフォーム、又はDDR1bアイソフォームを発現する星状細胞腫細胞を作製した。
【０２１３】
DDR1及びDDR1bを過剰発現する安定細胞系の作製
G122星状細胞腫細胞を、DDR1a、DDR1b、又はベクター単独で安定的にトランスフェクトした。細胞を抗DDR1抗体を用いたイムノブロッティングにより分析したところ、適切な表現型を有することが示された。その他の神経膠腫細胞系（G140、D566、D245、U87）も、DDR1アイソフォームを過剰発現するようトランスフェクトした。
【０２１４】
DDR1a及びDDR1bのcDNAを、哺乳動物発現ベクター（pcDNA）へクローニングし、製造業者のプロトコルに従い、フュージーン（fugene）トランスフェクション法（Roche）を使用して、神経膠芽腫細胞系へ安定的にトランスフェクトした。トランスフェクション後3日目に、500μg/mlのジェネテシン（G418；Gibco BRL）を含有している培地を、トランスフェクタントを選択するために適用した。40個を越えるジェネテシン耐性コロニーを入手し選択した；残りの細胞は、コロニー選択の後にプールした。選択されたコロニーを、さらなる実験のため成長させ増幅し、100μg/mlジェネテシンを含有している培地の中で維持した。プール及びDDR1発現クローンを、さらなる実験に使用した。
【０２１５】
DDR1の過剰発現を確認するため、ベクターのみでトランスフェクトされた対照と比較して、プール及びクローンにおいてDDR1が過剰発現されていることを示すために、イムノブロッティングを使用した。これによって、DDR1a及びDDR1bを発現する細胞が、増加したレベルのDDR1を有することが示された。DDR1過剰発現神経膠腫細胞における表現型の違いを証明するため、トランスフェクタントの形態学を観察した。DDR1の過剰発現は、形質転換上皮細胞の特徴である、多層の二極形の細胞を誘導した。DDR1による、細胞とECMとの相互作用の変化が、細胞が形質転換し遊走形質を有するための刺激シグナルであり得るため、DDR1の発現は細胞形態学及び遊走の改変に必要であるかもしれない。従って、DDR1は、細胞が遊走し、かつ形態学を変化させるために必要な因子であるかもしれず、糸状仮足形成及び細胞移動に必要である。DDR1b過剰発現クローンが対照細胞より遅く成長することも観察された。
【０２１６】
DDR1の細胞外ドメインの機能的特性を特徴決定するため、本発明者らは、DDR1exを発現する安定的な神経膠腫細胞系を作製した。哺乳動物構築物は、ポリヒスチジン金属結合タグ及びc-myc-エピトープを含有しているC末端ペプチドを含むpcDNA3.1/myc-His（-）（invitrogen Life Technologies）骨格から発現される。myc-エピトープ及びポリヒスチジンタグの取り込みは、生化学的アッセイ法により細胞外ドメインの発現及び精製を査定することを可能にする。これらの細胞系は、ヒト神経膠腫由来細胞系において標的を発現させ特徴決定するための適当なツールとして活用され、それらは、抗体のスクリーニングに有用である。
【０２１７】
神経膠腫細胞におけるDDR1細胞外ドメイン構築物の過剰発現は、細胞生存を阻害した。U87細胞を96穴プレートに播種し、細胞の成長を、セルタイターグロ発光型細胞生存性アッセイ法（Cell Titer Glo Luminescent Cell Viability Assay）（Promega）を使用して測定した。このアッセイ法は、代謝的に活性な細胞の存在の合図である、存在している細胞ATPの定量に基づいている。そのデータは、図6に示される。
【０２１８】
細胞増殖におけるDDR1の役割を調査するため、細胞生存性アッセイ法を、RNAiトランスフェクションと組み合わせて実施した。siRNAによる一過性トランスフェクションの後、神経膠腫細胞系からの細胞溶解物を、DDR1の発現に関して試験したところ、DDR1発現のノックダウンを有することが見出された。
【０２１９】
遊走アッセイ法
DDR1aアイソフォームの過剰発現は、マトリゲルへの細胞の遊走及び侵襲を増加させた。DDR1a、DDR1b、ベクター単独（モック）を発現する細胞を、DMEM＋1％FBSに懸濁させ、コーティングされていないか又はマトリゲルで予めコーティングされたフルオロブロック（FluoroBlok）インサート（Becton Dickenson  8μm孔サイズ）の上に置いた。5％血清を含む又は含まないDMEMを下室に添加した。4時間又は16時間後、膜の下側に接着している遊走又は侵襲細胞を染色し、マトリゲルを通って侵襲した細胞によって放射された蛍光を測定した。そのデータは、図4に示される。類似した研究を、DDR1a及びDDR1bを過剰発現するその他の細胞系でも実施したところ、類似した侵襲性及び遊走挙動の増強が見られた。これらの細胞は、コラーゲン1、コラーゲンIV、及びフィブロネクチンのマトリックスへも侵襲した。安定的にDDR1aを過剰発現する細胞は、DDR1b及び空のベクターを過剰発現する細胞と比較して、増強されたマトリゲルへの侵襲を示した。これらの活性は、増加した活性マトリックスメタロプロテイナーゼの発現と直接関係がある。
【０２２０】
簡単に説明すると、細胞をトリプシン処理し、100μlの細胞懸濁物（1×106個/ml）を三通りウェルに添加した。DDR1a、DDR1b、ベクター単独（モック）、DDR1ex、pcDNA（モック）を発現する神経膠腫細胞を、DMEM＋1％FBSに懸濁させ、100μg/cm2のマトリゲル（侵襲研究用）で予めコーティングされた白色不透明のフルオロブロックインサート（Becton Dickenson）（8μm孔サイズ）の上に置いた。5％血清を含有しているDMEMを下室に添加した。4時間又は16時間後、膜の下側に接着している遊走細胞を、4ug/mlカルセインで染色し、マトリゲルへと侵襲した細胞によって放射された蛍光を、サイトフロア（CytoFlor）プレートリーダーを使用して、530/590nmのλで測定した。DDR1aを発現する神経膠腫細胞の数は、ベクター単独又はアイソフォームDDR1bを発現する細胞と比較して、増加した遊走を示した（図4A）。細胞をマトリゲル上に播種した場合にも、類似した結果が見られた（図4B）。DDR1aを過剰発現する細胞は、モック又はDDR1bを発現する細胞と比較した場合、増加した遊走を示した。Ht1080細胞（繊維肉腫細胞系）及びヒト繊維芽細胞を、陽性対照及び陰性対照として使用した。
【０２２１】
DDR1過剰発現神経膠腫細胞は、MMP-9、MMP-2、及びMMP-1の増加した存在を明らかにする。DDR1a及びDDR1b、DDR1ex（細胞外ドメイン構築物）及びエンプリン（Emmprin）ex（細胞外ドメイン構築物）を過剰発現する細胞、Ht1080細胞、及びヒト繊維芽細胞、空のベクターを発現する細胞を、プレート上に播種した。播種の24時間後、培地を、20ug/ml 1型コラーゲンを含む又は含まない無血清培地と交換し、37℃で48時間インキュベートした。細胞からの培地を収集し濃縮した。各試料からの培地10ugを、0.1％ゼラチンを含有しているポリアクリルアミドゲル（10％）上で分離した。電気泳動の後、ゲルを5％トライトンX-100（各30分）で2回洗浄した。洗浄の後、ゲルを、50mMトリスHCl、5mM CaCl2、5μM ZnCl2、pH7.5の存在下で37℃で24時間インキュベートし、30分間クーマシーブリリアントブルーR-250で染色し、次いで、脱染した。MMP-1、MMP-2、及びMMP-9の産生は、天然型I型コラーゲンによって誘導された。1型コラーゲンによる増加したプロMMP-2及びプロMMP-1の活性化も見られた。
【０２２２】
興味深いことに、ヒトDDR1は、フューリンエンドプロテアーゼのコンセンサス部位に従う配列であるストーク領域に、配列RFRR（アミノ酸304-307）を示す。しかしながら、フューリン阻害剤を用いた研究は、この部位が、リガンドにより誘導されるDDR1分断に関与していないことを示唆している。DDR1切断は、バチマスタット（batimastat）によって阻害されるため、MT-MMPのファミリーの酵素が、DDR1分断に関与している可能性が最も高い。DDR1のジスコイジンドメインへのコラーゲンの結合は、特に原形質膜に近い配列において、ストーク領域のコンフォメーションの変化を誘導し得る。これらのコンフォメーション変化が、プロテアーゼ部位を開裂させるのかもしれない。リガンドにより誘導されるDDR1のチロシンリン酸化が、多様なシグナル伝達分子のクラスター形成を誘導し、それが、プロテアーゼ分子を動員するのかもしれない。DDR1の活性化は、プロテアーゼの転写上方制御ももたらし得る。神経膠腫細胞を用いた上記の研究は、Mt1-MMP（示されないデータ）、MMP-9、MMP-2、及びMMP-1の上方制御／活性化を示している。この上方制御は、受容体自体を切断するプロテアーゼを含んでいるかもしれない。Mt1-MMPは、プロMMP-2の活性型への活性化を促進し、多くの腫瘍細胞の侵襲性を増強することが既知である。本発明者らの神経膠腫細胞系は、Mt1-MMPを発現する。
【０２２３】
局所環境に侵襲し、原発部位から肝臓、肺、及び脳のような生命にとって不可欠の器官へと転移する多くの腫瘍細胞の能力は、生命を脅かす可能性がある。従って、細胞外マトリックスの分解は、限局された部位からの蔓延を可能にするため、この過程は、腫瘍細胞侵襲における重大なイベントである。このマトリックスは、コラーゲンI型、III型、及びIV型を含む多数の構造的巨大分子から構成されている。ほとんどの分解は、マトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）によって媒介される。実験的及び臨床的な研究は、上昇したMMPの発現が、腫瘍侵襲性及び不利な予後と相関していることを示唆している。72kDゼラチナーゼ（MMP-2）及び92kDゼラチナーゼ（MMP-9）は、基底膜内のIV型コラーゲンを分解する能力を有するため、それらの役割は大いに注目されている。多数の腫瘍細胞によるこれらの酵素の産生が立証されており、侵襲性と相関させられている。腫瘍細胞は、基底膜に加え、コラーゲンI及びIIIlからなる間質を通過しなければならない。従って、間質コラーゲンの分解は、三段階からなる侵襲／転移の過程（接着、分解、及び遊走）のうちの不可欠のコンポーネントである。この分解が、間質コラゲナーゼ、MMP-1、MMP-8、及びMMP-13により最も効率的に達成され、MMP-2及び膜型MMP、MT1-MMP（MMP14）によりある程度達成されるという事実は、有意義である。
【０２２４】
要約すると、これらの所見は、神経膠腫細胞におけるDDR1の発現が、マトリックス分解及び基底膜侵襲を刺激することを証明している。DDR1a及びDDR1bを過剰発現する細胞系を使用して、DDR1aを過剰発現する細胞が、マトリゲルへの増強された侵襲（増加した活性マトリックスメタロプロテイナーゼの発現と関係のある活性）を示すことが示されている。
【０２２５】
以前の研究によって、MMPによる腫瘍侵襲を媒介又は強化するいくつかの型の宿主／腫瘍細胞相互作用が記載されている。これらには、腫瘍細胞による刺激に応答して起こる間質細胞によるMMPの分泌、又は反対に宿主刺激に応答して起こる腫瘍細胞によるMMP産生の誘導が含まれる。これらのメカニズムの中には、間質と腫瘍細胞との直接の接触を必要とするものもあるし、そうでないものもある。当研究は、膠芽腫腫瘍細胞によるMMP-1、MMP-2、MMP-9、及びMT1-MMPの誘導が、1型コラーゲン及びマトリゲルへの腫瘍侵襲を容易にすることを明白に示している。さらに、侵襲はMMP阻害剤によって阻害された。
【０２２６】
成長中の神経膠腫腫瘍において、DDR1は、最初の侵襲性細胞のコラーゲンとの接着にとって重要であるかもしれない。DDR1活性化の後、外部ドメイン切断によって細胞／マトリックス接触が終結し、それにより細胞のさらなる遊走が可能となる。DDR1の62kD膜貫通タンパク質サブユニットは、プロセシング後に依然としてチロシンリン酸化されているため、全長受容体により最初に誘発されたシグナル伝達経路は活性なままである。DDR1の機能的役割は、コラーゲン以外のリガンドに依存するかもしれない。フィブロネクチンは、神経膠腫細胞においてDDR1をリン酸化するよう作用することができ、52kD可溶性タンパク質又はDDR1細胞外ドメインは、DDR1と結合することによりリガンドとして機能することができる。
【０２２７】
DDR1リン酸化
受容体チロシンキナーゼ（RTK）は、細胞の微小環境とのコミュニケーションにおいて中心的な役割を果たしている。これらの分子は、細胞の成長、分化、及び代謝の制御に関与している。DDR1によってコードされたタンパク質は、正常上皮細胞及び形質転換上皮細胞に広く発現しており、様々な型のコラーゲンによって活性化されるRTKである。このタンパク質は、細胞性粘菌（Dictyostelium discoideum）タンパク質ジスコイジンIとの相同領域を細胞外ドメインに有するチロシンキナーゼ受容体のサブファミリーに属する。その自己リン酸化は、現在までに試験された全てのコラーゲン（I型〜VI型）によって刺激される。コラーゲン処理に応答して、DDR1は、125kD（全長）タンパク質、並びに52kd可溶性タンパク質及び62kd膜貫通タンパク質へのC末端分解産物としてリン酸化される。
【０２２８】
神経膠腫細胞におけるDDR1活性化
DDR1神経膠腫細胞を、60分間、10ug/ml 1型コラーゲン、10ug/mlビトロジェン（Vitrogen）、10ug/mlフィブロネクチン、及び20ng/ml EGFで刺激した。刺激の後、細胞をRIPA緩衝液で溶解させ、10％ポリアクリルアミドゲル（10％）ゲルで分離した。レーン1、刺激なし、レーン2、1型コラーゲン（10ug/ml）、レーン3  ビトロジェン（10μg/ml）による刺激、レーン4  ヒトフィブロネクチン（10μg/ml）による刺激、レーン5  EGF（20ng/ml）による刺激、60分間。細胞溶解物を、ウェスタンブロッティングにより、抗ホスホチロシン（4G10、Upstate Biotechnology）（パネルa）、抗DDR1（C-20、Santa Cruz Biotechnology Inc.）（パネルb）、及び抗DDR1 N末端H-126（SCBT）（パネルc）によって分析した。抗ホスホチロシン抗体により、チロシンリン酸化された62kD及び125kdのタンパク質が、パネルAにおいて検出され、このことは、1型コラーゲン、フィブロネクチン、及びEGFによる刺激が、DDR1のチロシンリン酸化をもたらしたことを示唆している。コラーゲン刺激の期間の増加と共に、DDR1リン酸化の増加が見られた。C末端抗DDR1抗体により、刺激による62kD C末端断片タンパク質の増加が見られた（パネルb）。DDR1は、リガンド刺激に応答してタンパク質分解的に切断される。N末端抗DDR1抗体H-126により、52kD可溶性タンパク質が培地中に検出された（パネルc）。
【０２２９】
DDR1内部移行
ヒト神経膠腫由来を、30分間可溶性コラーゲンIで処理し、次いで、DDR1に関して染色した。セロミクスアレイスキャン（Cellomics ArrayScan）蛍光顕微鏡装置を、内部移行したDDR1を同定し定量するために使用した（図8）。データは、コラーゲンIが、DDR1の細胞質への出現を誘導する（平均細胞質強度が増加する）こと、及びDDR1特異的蛍光シグナルが点状（punctuate）であること（増加した細胞質テクスチャ）（エンドソームへの保持を示す）を証明している。DDR1の内部移行の測定は、結合抗体が、腫瘍細胞に特異的に送達され得、効率的な腫瘍細胞死滅を可能にすることを証明する。
【０２３０】
以上は、本発明の態様を例示するためのものであって、決して本発明を制限するためのものではない。本発明は特定の修飾に関して記載されたが、それらの詳細は制限として解釈されるべきではなく、様々な等価物、変化、及び改変が、本発明の本旨及び範囲から逸脱することなく可能であることが明白であろう。そして、そのような等価な態様は、本発明に含まれることを理解されたい。全ての出版物及び特許出願が、個々の出版物又は特許出願が各々参照として組み込まれると特別にかつ個々に示されたかのごとく、参照として本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０２３１】
【図１】DDR1の発現に関して探索された正常ヒト脳組織試料のブロットである。図1Aはノーザンブロットであり、図1Bは、図1Aに示されたような脳の種々の領域におけるDDR1 mRNA発現に関する相対強度を測定したグラフ表示である。
【図２】ヒト神経膠腫由来細胞系及び組織のウェスタンブロットである。この図は、神経膠腫細胞におけるDDR1アイソフォームの発現プロファイルを示す。C末端抗体が使用され、DDR1により切断されたC末端断片が検出され得る。
【図３】DDR1の腫瘍特異的発現を証明する正常脳及び神経膠腫組織の免疫組織化学的分析である。
【図４】DDR1が、神経膠腫細胞による基底膜マトリックスへの遊走（4A）及び侵襲（4B）を促進することを示す。
【図５】U87細胞におけるDDR1過剰発現が、増加したMMP-2（プロMMP-2及び活性型MMP-2）の存在を促進することを証明する。MMP-1及びMMP-9の増加したレベルも見られる。
【図６】DDR1細胞外ドメイン構築物を過剰発現する細胞の生存性を図示するグラフである。
【図７】リガンド刺激時のDDR1タンパク質の自己リン酸化及びプロセシングを示すウェスタンブロットである。DDR1は、1型コラーゲン、フィブロネクチン、及びEGFによってリン酸化される。
【図８】DDR1リガンドにより誘導される内部移行の棒グラフ定量化である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ−１】
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【図１Ｂ−２】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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