(57)【要約】  共有結合以外の方法で結合し集塊した生体粒子を分析する医学診断方法および計測システムを記載した。この方法およびシステムは、生体粒子の調製方法；エレクトロスプレー発生器；α粒子放射線源；微分移動度分析器；粒子計数器；およびデータ取得／分析手段を含む。この医療装置は、リポタンパク質フラクション密度の迅速定量分析によって、心臓疾患のリスク、高脂血症などのヒトの疾患の評価に役立つ。最初に、機器への分析入力用の初期血液試料を削減する精製手法を説明する。測定された分析試料の粒径を密度と相関させ、リポタンパク質の密度スペクトルを得る。次いでこのリポタンパク質密度分布を使用して、心臓の健康リスクおよび脂質に関係した他の健康リスクを明らかにすることができる。
2005509860.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）生体粒子を含む生理的試料を得るステップと、
（ｂ）前記生体粒子を濃縮するステップと、
（ｃ）前記生体粒子を荷電状態でスプレーするステップと、
（ｄ）前記生体粒子の荷電状態を均一な単一の電荷まで低減させるステップと、
（ｅ）電荷を帯びた前記生体粒子を微分移動度分析器に供給し、それによって電荷を帯びた前記生体粒子を粒径に基づいて分離するステップと、
（ｆ）前記生体粒子を分析して、前記生体粒子の粒径分布を形成するステップと、
（ｇ）前記生体粒子の前記粒径分布を基準粒径分布と比較するステップと
を含む、生体粒子の粒径分布を分析するための方法。
【請求項２】
前記生体粒子がリポタンパク質粒子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
リポタンパク質粒子の前記粒径分布を分析して、ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬおよびカイロミクロンならびにこれらのサブクラスを区別するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記微分移動度分析器の選択電圧を走査して、電荷を帯びた前記生体粒子がさまざまな大きさの静電気力を受けるようにし、それによってさまざまな粒径の生体粒子をサンプリングするステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
粒径分布を分析する前記ステップが、約１．７ｎｍから約１２０ｎｍの粒径範囲にわたる、粒径に対する粒子数を示す表示をコンピュータ可読媒体に出力するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
検出器を通過する１秒ごとの所与の粒径の生体粒子の数を計数するための方法であって、
（ａ）希釈された生体試料を、粒径選択可能微分移動度分析器中へエレクトロスプレーするステップと、
（ｂ）単一の電荷を有する生体粒子イオンを形成するステップと、
（ｃ）選択可能微分移動度分析器の少なくとも１つの特定の選択粒径ｓに含まれる、定義されたサンプリング時間ｄｔの間の電荷を帯びた生体粒子イオンのおおよその数ｄｎ＋を計数し、約
【数１】
2005509860.tif 000010
の粒径計数率出力を得るステップと
を含む方法。
【請求項７】
定義された前記サンプリング時間の間に計数された、粒径に対する、電荷を帯びた生体粒子イオンの表示を、コンピュータ可読媒体に出力するステップをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記出力を、密度ρに対する、定義された前記サンプリング時間の間に計数された、電荷を帯びたリポタンパク質粒子イオンの下記ヒストグラム
【数２】
2005509860.tif 000011
に変換する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記出力密度ヒストグラムを、冠状動脈性心疾患リスクの程度に関して評価する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記希釈された生体試料が、１エレクトロスプレー小滴あたり１生体粒子の希釈度となるように希釈されており、前記エレクトロスプレー小滴が、脱溶媒和後に、実質上個別の生体粒子を生じる、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記希釈された生体試料が、酢酸アンモニウム水溶液によって希釈されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
脂質に関係した健康リスクを評価するための方法であって、
（ａ）血球全体、非リポタンパク質タンパク質およびＬｐ（ａ）を生体試料から除去し、これによって血漿試料を形成するステップと、
（ｂ）前記血漿試料に１種または数種の希釈剤を加え、これによって希釈試料を形成するステップと、
（ｃ）前記希釈試料をエレクトロスプレーするステップと、
（ｄ）エレクトロスプレーした前記試料を均一な単一の電荷まで低減させるステップと、
（ｅ）電荷を均一に帯びた前記希釈試料を揮発室へ通して、前記希釈剤を蒸発させ、均一な単一の電荷を有する個々の電荷を帯びた生体粒子イオンを形成するステップと、
（ｆ）電荷を帯びた前記生体粒子イオンを粒径選択可能微分移動度分析器の中へ輸送するステップと、
（ｇ）前記選択可能微分移動度分析器のそれぞれの粒径選択ｓの定義されたサンプリング時間ｄｔの間の電荷を帯びた生体粒子イオンの数ｄｎ＋を計数し、下記粒径出力
【数３】
2005509860.tif 000012
を得るステップと、
（ｈ）粒径選択を、２２０から２８５オングストロームの範囲を含む粒径選択範囲にわたって走査して、粒径に対する、定義された前記サンプリング時間の間に計数された、電荷を帯びた生体粒子の出力ヒストグラムを得るステップと
を含む方法。
【請求項１３】
前記サンプリング時間が一定に保たれ、その結果、粒径に対する、電荷を帯びた生体粒子イオンの出力ヒストグラムｎ＋が得られる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
脂質に関係した健康リスクを評価するための方法であって、
（ａ）アルブミンおよび血球全体を全血試料から除去し、これによって血漿試料を形成するステップと、
（ｂ）１種または数種の希釈剤を用いて前記血漿試料を希釈して、希釈試料を形成するステップと、
（ｃ）前記希釈試料をエレクトロスプレーして、エレクトロスプレー小滴を形成するステップと、
（ｄ）前記エレクトロスプレー小滴にα放射線源を照射し、これによって電荷を中和し、または１つ以下の正電荷を残すステップと、
（ｅ）照射された前記エレクトロスプレー小滴を揮発室へ通して、前記希釈剤を蒸発させ、実質上、前記血漿試料に由来するリポタンパク質粒子からなる、電荷を帯びたリポタンパク質粒子イオンを形成するステップと、
（ｆ）電荷を帯びた前記リポタンパク質粒子イオンを粒径選択可能微分移動度分析器の中へ輸送するステップと、
（ｇ）前記粒径選択可能微分移動度分析器のそれぞれの粒径選択ｓの定義されたサンプリング時間ｄｔの間の電荷を帯びた前記生体粒子イオンの数ｄｎ＋を計数し、下記粒径出力
【数４】
2005509860.tif 000013
を得るステップと、
（ｈ）前記粒径出力を約
【数５】
2005509860.tif 000014
の密度出力に変換するステップと、
（ｉ）前記粒径選択をある粒径選択範囲にわたって走査して、密度ρに対する、定義された前記サンプリング時間の間に計数された所与の密度の電荷を帯びた粒子の出力ヒストグラムを得るステップと
を含む方法。
【請求項１５】
生体試料から抽出したリポタンパク質粒子の粒径分布を決定するための装置であって、
（ａ）複数のリポタンパク質試料を所定の順序で供給する試料供給手段と、
（ｂ）前記リポタンパク質試料をメチル誘導体化された毛細管を通してスプレーし、前記試料を、均一の電荷のスプレー粒子に変換するエーロゾル発生器と、
（ｃ）出口を有する粒子移動度分析器であって、電圧が印加され、それによって電荷を帯びた前記粒子がその粒子の移動度の関数として前記微分移動度分析器を出るところの粒子移動度分析器と、
（ｄ）前記粒子移動度分析器を出る粒子を計数する粒子計数器と、
（ｅ）粒径分布を生成し、この分布を、心臓疾患リスクに応じて識別された人に見られる既知のリポタンパク質粒子分布と比較して、前記リポタンパク質試料のリスク評価を得るコンピュータ化された手段と、
（ｆ）前記リスク評価を含む、この装置に関連づけられたコンピュータ可読媒体と
を備えた装置。
【請求項１６】
前記エーロゾル発生器が、生体粒子を、２ｎｍから１２０ｎｍの粒径分布でスプレーするのに適している、請求項１５に記載の装置。
【請求項１７】
前記粒子計数器が凝縮計数器である、請求項１５に記載の装置。
【請求項１８】
前記粒子計数器が飛行時間計数器である、請求項１５に記載の装置。
【請求項１９】
前記エーロゾル発生器が、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、中間密度リポタンパク質（ＩＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）およびカイロミクロンからなるグループから選択されたエーロゾル粒子をスプレーするのに適している、請求項１５に記載の装置。
【請求項２０】
リポタンパク質粒子を含む試料の粒径分布を決定するための方法であって、
（ａ）前記試料を調製して、非リポタンパク質汚染物質を除去するステップと、
（ｂ）前記試料をエレクトロスプレー装置に導入し、これによって１小滴につき１つのリポタンパク質粒子を生成するステップと、
（ｃ）実質上、複数の前記小滴からなるエーロゾルを形成するステップと、
（ｄ）前記エーロゾルを走査微分移動度分析器に導入し、それによって、帯電した小滴を、空気中でのその移動度に従って分離するステップと、
（ｅ）前記微分移動度分析器を出た前記粒子を計数するステップと、
（ｆ）計数された粒子からのデータを取得して、前記試料中の前記リポタンパク質粒子の粒径分布を生み出すステップであって、前記分布が１９〜２５ｎｍの範囲を含むところのステップと
を含む方法。
【請求項２１】
前記試料がヒトの血液または血液成分である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
脂質に関係した健康リスクの評価を得るために、前記分布をさらに、既知のヒトリポタンパク質プロファイルと比較する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記試料が実質上、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、中間密度リポタンパク質（ＩＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）およびカイロミクロンからなるグループからの粒子からなる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記試料がさらに、ヒトの患者の心臓リスクを評価するために、前記粒径分布を所定の範囲と比較するステップを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
リポタンパク質粒子の粒径分布を分析するための方法であって、
（ａ）濃縮されたリポタンパク質粒子を含む試料を得るステップと、
（ｂ）前記生体粒子を、均一に電荷を帯びた状態でスプレーするステップと、
（ｃ）電荷を帯びた前記粒子を微分移動度分析器に供給し、それによって粒子を粒径に基づいて分離するステップと、
（ｄ）７２オングストロームから２８５オングストロームまでを含む範囲にわたって電荷を帯びた前記粒子の前記粒径分布を分析し、これによってＬＤＬおよびＨＤＬ粒子を網羅するステップと、
（ｅ）前記リポタンパク質粒子の前記粒径分布を表するデータをコンピュータ可読媒体に記憶するステップと
を含む方法。
【請求項２６】
前記コンピュータ可読媒体に記憶された前記データを分析して、前記粒径分布を、ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬおよびＨＤＬからなるグループから選択された少なくとも１つのクラスおよびそのサブクラスに分離するステップをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
粒径分布の前記クラスがＬＤＬおよびその少なくとも１つのサブクラスである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
心臓血管疾患または状態、あるいは患者の前記心臓血管疾患または状態を発達させる素因を判定するための方法であって、
（ａ）電荷を帯びたリポタンパク質粒子の移動度分布を、前記患者の血液から得るステップと、
（ｂ）前記患者からのリポタンパク質粒子の前記移動度分布を基準移動度分布と比較するステップと、
（ｃ）前記患者の心臓血管状態を判定するステップであって、少なくとも１種の電荷を帯びた前記リポタンパク質粒子の前記移動度分布が前記基準移動度分布と相関して、心臓血管疾患または状態、あるいは前記心臓血管疾患または状態を発達させる素因を指示するところのステップと
を含む方法。
【請求項２９】
電荷を帯びた前記リポタンパク質粒子が、ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬおよびこれらのサブクラスからなるグループから選択された少なくとも１種のリポタンパク質を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記患者からの電荷を帯びた前記リポタンパク質粒子を、移動度に基づいて微分移動度分析器によって分級し、前記移動度分級を走査して、前記患者からの電荷が低減されたリポタンパク質粒子の移動度分布を生み出す、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
（ａ）前記患者の前記心臓血管状態を判定するに先立って、電荷が低減されたリポタンパク質粒子の前記移動度分布を、粒子移動度、粒径、粒子密度、粒子質量、粒径区間内の粒子数および粒径区間内の粒子質量からなるグループから選択された少なくとも１つの測定値に変換するステップをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
電荷が低減された前記リポタンパク質粒子が、ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬおよびＨＤＬからなるグループから選択された、サブクラスを含めた少なくとも１つのリポタンパク質クラスを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
心臓血管薬または患者の心臓血管状態を対象とした他の治療介入に対する治療応答性のレベルを判定するための方法であって、
（ａ）患者からリポタンパク質粒子を得るステップと、
（ｂ）電荷が低減されたリポタンパク質粒子の移動度分布を得るステップと、
（ｃ）前記患者の心臓血管状態を判定するステップであって、少なくとも１種の電荷が低減された前記リポタンパク質粒子の前記移動度分布が、心臓血管薬または前記患者の前記心臓血管状態を対象とした他の治療介入に対する治療応答性のレベルと相関するところのステップと
を含む方法。
【請求項３４】
電荷を帯びた前記リポタンパク質粒子が、ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬおよびＨＤＬからなるグループから選択された少なくとも１種のリポタンパク質を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記患者からの電荷を帯びた前記リポタンパク質粒子を移動度に基づいて微分移動度分析器によって分級し、前記移動度分級を走査して、前記患者からの電荷が低減されたリポタンパク質粒子の移動度分布を生み出す、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
患者の心臓血管状態を判定するための方法であって、
（ａ）電荷が低減されたリポタンパク質粒子の移動度分布を、前記患者から得るステップと、
（ｂ）電荷が低減されたリポタンパク質粒子の移動度分布のプロファイルを、電荷が低減されたリポタンパク質粒子の移動度分布の基準プロファイルと比較するステップであって、少なくとも１種の電荷が低減された前記リポタンパク質粒子の前記移動度分布が、心臓血管疾患または状態、あるいは前記心臓血管疾患または状態を発達させる素因と相関するところのステップと、
（ｃ）前記患者の前記心臓血管状態を判定するステップと
を含む方法。
【請求項３７】
電荷が低減されたリポタンパク質粒子の前記移動度分布を、リポタンパク質粒子の質量分布プロファイルに変換し、そして、リポタンパク質粒子の質量分布の基準プロファイルと比較するステップをさらに含み、質量分布の前記基準プロファイルが、心臓血管疾患または状態、あるいは前記心臓血管疾患または状態を発達させる素因と相関する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
（ｂ）電荷が低減されたリポタンパク質粒子の移動度分布のプロファイルを比較する前記ステップ、および、（ｃ）前記患者の前記心臓血管状態を判定する前記ステップのうちの少なくとも一方が、確定的アルゴリズムによって実施される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
電荷が低減された前記リポタンパク質粒子が、ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬおよびカイロミクロンからなるグループから選択された少なくとも１種のリポタンパク質を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
患者の心臓血管状態を判定するための方法であって、
（ａ）電荷が低減されたリポタンパク質粒子の移動度分布を、前記患者から得るステップと、
（ｂ）電荷が低減されたリポタンパク質粒子の前記移動度分布を、粒子移動度、粒径、粒子密度、粒子質量、粒径区間内の粒子数および粒径区間内の粒子質量からなるグループから選択された少なくとも１つの測定値に変換するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）からの前記測定値のプロファイルを、前記測定値の標準プロファイルと比較するステップであって、前記測定値が、心臓血管疾患または状態、あるいは前記心臓血管疾患または状態を発達させる素因と相関するところのステップと、
（ｄ）前記患者の前記心臓血管状態を判定するステップと
を含む方法。
【請求項４１】
電荷が低減された前記リポタンパク質粒子が、ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬおよびカイロミクロンからなるグループから選択された少なくとも１種のリポタンパク質を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
空気中に浮遊した、電荷が低減された生体粒子を含み、前記生体粒子が生理的試料から分離されたものである、生体粒子の製剤。
【請求項４３】
前記生体粒子が、リポタンパク質粒子、ウイルス粒子および免疫複合物からなるグループから選択された、請求項４２に記載の製剤。
【請求項４４】
前記生体粒子が、１人の患者から分離されたリポタンパク質から調製されたリポタンパク質粒子である、請求項４２に記載の製剤。
【請求項４５】
電荷が低減された前記リポタンパク質粒子が、ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬおよびカイロミクロンからなるグループから選択された少なくとも１種のリポタンパク質を含む、請求項４４に記載の製剤。
【請求項４６】
電荷が低減された前記リポタンパク質粒子が、主に中性または単一正電荷状態の荷電状態を有する、請求項４２に記載の製剤。
【請求項４７】
前記リポタンパク質粒子が、前記患者の血液、血清または血漿から分離されたリポタンパク質から調製された、請求項４２に記載の製剤。
【請求項４８】
空気中に浮遊した生体粒子小滴であって、（ｉ）生体粒子と、（ｉｉ）過剰電荷と、（ｉｉｉ）ｐＨを有する揮発性緩衝液とを含み、前記生体粒子が構造的に安定であるところの小滴。
【請求項４９】
前記生体粒子が、リポタンパク質粒子、ウイルス粒子および免疫複合物からなるグループから選択された、請求項４８に記載の小滴。
【請求項５０】
前記生体粒子が、１人の患者から分離されたリポタンパク質から調製されたリポタンパク質粒子である、請求項４８に記載の小滴。
【請求項５１】
電荷を帯びた前記リポタンパク質粒子が、ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬおよびこれらのサブクラス、ならびにカイロミクロンからなるグループから選択された、請求項５０に記載の小滴。
【請求項５２】
電荷が低減された前記リポタンパク質粒子が、主に中性または単一正電荷状態の荷電状態を有する、請求項４８に記載の小滴。
【請求項５３】
前記リポタンパク質粒子が、前記患者の血液、血清または血漿から分離されたリポタンパク質から調製された、請求項４８に記載の小滴。
【請求項５４】
前記緩衝液が、中性に近いｐＨの揮発性水性緩衝液である、請求項４８に記載の小滴。
【請求項５５】
患者試料中のリポタンパク質粒子の粒径分布を決定するための方法であって、
（ａ）複数の前記リポタンパク質粒子と希釈剤とからなる混合物を、帯電した状態でスプレーするステップと、
（ｂ）前記混合物の前記希釈剤を乾燥させるステップであって、それによって乾燥した前記混合物が実質上前記生体粒子だけを含むところのステップと、
（ｃ）前記生体粒子の前記荷電状態を、主に中性または単一正電荷の荷電状態にまで低減させるステップと、
（ｄ）電荷が低減された前記生体粒子を電荷を微分移動度分析器（ＤＭＡ）に供給し、それによって電荷が低減された前記生体粒子を移動度に基づいて分級するステップと、
（ｅ）移動度によって分級された電荷が低減された前記生体粒子を検出するステップと、
（ｆ）前記ＤＭＡの前記移動度分級を走査して、前記患者のリポタンパク質粒子の粒径分布を生み出すステップと
を含む方法。
【請求項５６】
前記粒径分布が、粒子移動度、粒径、粒子密度、粒子質量、粒径区間内の粒子数および粒径区間内の粒子質量からなるグループから選択された少なくとも１つの測定値を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
（ａ）前記患者からのリポタンパク質粒子の前記粒径分布を、心臓血管疾患または状態、あるいは前記心臓血管疾患または状態を発達させる素因と相関させるステップをさらに含む、請求項５６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に粒径分析に関し、詳細には、従来の微粒子粒径測定装置または移動度測定装置を利用した診断目的の生体粒子分析に関する。より詳細には、本発明の一態様は、リポタンパク質クラスおよびサブクラスの定量および定性分析のための医学診断、ならびにこれらと、冠状動脈性心疾患および脂質に関連した他の健康リスクの割当てとの関係に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、２００１年１１月１３日出願の「Ｉｏｎ  Ｍｏｂｉｌｉｔｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ」という名称の米国仮特許出願番号６０／３３８，２１４の優先権を主張するものである。
米連邦の助成に関する記載
本発明は、米国政府の支援を受け、米国エネルギー省（ｔｈｅ  Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｎｅｒｇｙ）とカリフォルニア大学理事会（Ｔｈｅ  Ｒｅｇｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）との間で締結されたローレンスバークレー国立研究所（ｔｈｅ  Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｂｅｒｋｅｌｅｙ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）の管理および運営のための契約第ＤＥ−ＡＣ０３−７６ＳＦ０００９８号の下でなされたものである。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
緒言
臨床診療では、リポタンパク質粒子の測定が、心臓血管の健康リスクおよび脂質に関連した他の健康リスクを評価し、治療プロトコルを決定し、治療レジメンの効能を追跡するために使用される。リポタンパク質粒子は、コレステロールおよび他の生化学物質を包み込んだ巨大分子を構成し、これらの物質の血流による輸送を可能にする。リポタンパク質粒子の粒径分布は、遺伝的および非遺伝的影響のため人によって異なる。リポタンパク質粒子の粒径は一般に約７ｎｍから約１２０ｎｍである。この粒径範囲には、心臓血管疾患の重要な予測因子であるリポタンパク質粒子のいくつかのサブフラクションが存在する。例えば、超低密度リポタンパク質はトリグリセリドを血流にのせて輸送し、血流中の高い超低密度リポタンパク質レベルは、高トリグリセリド血症（ｈｙｐｅｒｔｒｉｇｌｙｃｅｒｅｍｉａ）を指示する。これらのサブフラクションは、物質の量をリポタンパク質粒子の粒径または密度の関数として表示する分析技法によって識別される。
【０００４】
血漿脂質／リポタンパク質コレステロールの標準測定技法
一般的な標準脂質測定には、空腹時の総コレステロール、トリグリセリド、ＨＤＬコレステロールおよびＬＤＬコレステロールが含まれる。現在、最も広く使用されているＬＤＬコレステロール測定法は間接Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄ法（Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄ他、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、第１８巻、４９９〜５０２ページ、１９７２年）である。このＦｒｉｅｄｅｗａｌｄ検定法には次の３つのステップが必要である：１）血漿トリグリセリド（ＴＧ）および総コレステロール（ＴＣ）の測定、２）ＶＬＤＬおよびＬＤＬの沈殿、３）ＨＤＬコレステロール（ＨＤＬＣ）の定量。ＶＬＤＬＣを血漿トリグリセリドの１／５（ＴＧ／５）と推定することによって、ＬＤＬコレステロール濃度（ＬＤＬＣ）は次式によって計算される：ＬＤＬＣ＝ＴＣ−（ＨＤＬＣ＋ＶＬＤＬＣ）。Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄ法は全般的に有用ではあるが、ケースによってはその正確さが限定される。上記の３つのステップのいずれにおいても誤差は起こりうる。これは一つには、この方法では、それぞれのステップでさまざまな手法を使用する必要があるためである。Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄ法は、ＶＬＤＬＣ濃度を血漿トリグリセリド濃度の１／５と仮定するので、ある程度間接的な方法である。患者のＶＬＤＬがこの比率から外れるときにはさらに不正確になる。４００ｍｇ／ｄＬを超えるＴＧを有する患者に対してＦｒｉｅｄｅｗａｌｄ法は使用できないので、いくつかの試料に対しては、ＬＤＬコレステロールの分離およびその後の測定のために超遠心法を使用しなければならない。
【０００５】
リポタンパク質亜種の分析手法
現在、リポタンパク質亜種を分析する普及した方法には、核磁気共鳴、バーティカルオートプロファイル（ｖｅｒｔｉｃａｌ  ａｕｔｏ  ｐｒｏｆｉｌｅ）、および電気泳動ゲル分離が含まれる。次に、これらのそれぞれの方法について簡単に論じる。
【０００６】
核磁気共鳴
Ｏｔｖｏｓは、リポタンパク質サブクラスの濃度を求める、Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄ法よりも正確な核磁気共鳴（ＮＭＲ）手法を教示している（米国特許第５３４３３８９号、１９９４年８月３０日発行）。Ｏｔｖｏｓの方法ではまず最初に、血漿または血清試料のＮＭＲ化学シフトスペクトルを得る。次いで、観察された血漿試料全体のスペクトルを、コンピュータソフトウェアプログラム中に記憶されたリポタンパク質サブクラスのＮＭＲスペクトルの既知の加重和と突き合わせる。次いで、試料スペクトルと計算スペクトルの間の最適合致を与える重み係数を使用して、血液試料中の構成リポタンパク質サブクラスの濃度を推定する。この手法は、短時間で済むというの追加の利点を有する。
【０００７】
バーティカルオートプロファイル
臨床的に使用されている他のリポタンパク質サブフラクション測定法が、バーティカルオートプロファイル（ＶＡＰ）である（Ｋｕｌｋａｒｎｉ他、Ｊ．Ｌｉｐ．Ｒｅｓ．、第３５巻、１５９〜１６８ページ、１９９４年）。バーティカルオートプロファイル法では、フローアナライザを使用して、ショートスピンシングルパーティカル超遠心法によって分離したリポタンパク質クラス中のコレステロールの酵素分析を実施し、続いて分光測光法、得られたデータのソフトウェア解析を実施する。役立つ進歩ではあるが、この技法はＬＤＬを、電気泳動勾配ゲル分離によって同定される全７亜種にまでは分割しない。
【０００８】
電気泳動勾配ゲル分離
このゲル分離法は、参照によって本明細書に組み込まれる１９９９年７月２０日発行のＲ．Ｍ．Ｋｒａｕｓｓ他の「Ｌｏｗ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  Ｃａｒｄｉａｃ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｉｓｋ」という名称の米国特許５９２５２２９号（２２９号特許）に示されている。この２２９号特許には、ＬＤＬサブクラスを分離するための勾配ゲル電気泳動手法が開示されている。ＬＤＬフラクションは、超遠心器によって得られる結果に匹敵する結果を生み出す勾配ゲル電気泳動によって分離される。この方法はＬＤＬサブクラスの細分割を生み出し、主に研究機関で使用されている。しかし、勾配ゲル電気泳動は完了までに多くの時間がかかる。勾配ゲル電気泳動の分離時間を短縮し、分析を単純化することができ、その結果、高分解能脂質分析を、臨床検査室での血液試料のルーチンのスクリーニングの一部として、冠状動脈性疾患の危険因子の割当てに使用することができるようになれば有用であろう。
【０００９】
後に光学的に測定する全ての成分を均一に染色することに依存するこのゲル分離法は、色素形成が不均一であることが欠点である。すなわち、全てのリポタンパク質粒子が均一に染色されるというわけではない。この示差的な染料の取込みは誤った定量的結果をもたらし、染色の弱いピークを、実際によりも低い値に読み取ってしまう可能性がある。さらに、この不均一な色素形成が誤った定性的結果をもたらすことがあり、測定されたピークが、あるリポタンパク質クラスまたはサブクラスを他のリポタンパク質クラスまたはサブクラスと混同するのに十分な程度にまでゆがめられている可能性がある。
【００１０】
ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＩＤＬおよびＨＤＬの全てのサブクラスならびにカイロミクロン粒子を測定する正確、直接、完全な高分解能検定が見いだされれば、脂質測定技術の重大な革新となろう。このような検定が安価かつ便利であれば、研究施設だけでなく臨床検査室でも使用することができる。理想的には、臨床医はこの情報を使用して、現在の冠状動脈疾患リスクの推定を改善し、この検定に基づいて妥当な医学リスク管理上の判断をすることができよう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、１）微分移動度分析（「ＤＭＡ」）用の血漿試料を調製する方法、２）生体粒子（好ましくはリポタンパク質粒子）の粒径または密度分布を、計数された１秒ごとの特定の選択された移動度の生体粒子の数に関して測定された粒子移動度計数率に基づいて、流体（空気など）中へスプレーされたイオン化した生体粒子の下記粒径
【００１２】
【数６】
2005509860.tif 000003
または下記密度
【００１３】
【数７】
2005509860.tif 000004
の関数として測定する技法、３）それぞれの粒径クラスおよびサブクラスの生体粒子の数を測定するＤＭＡ装置、４）生体粒子（好ましくはリポタンパク質）の粒径または密度分布情報を低リスク、中間リスクおよび高リスク患者の基準データと比較して冠状動脈性心疾患（ＣＨＤ）のリスクを予測するアルゴリズム、ならびに５）それぞれＣＨＤに対する低リスク、中間リスクおよび高リスクに関連づけられたＡ型、ＡＢ型およびＢ型パターンのどれに試料が対応するのかを判定する具体的な方法、を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
次の移動度分析のために最終的に粒子を気相中に送り込むように設計されたいくつかのステップを使用して血漿試料を処理し、リポタンパク質粒子の全てのクラスおよびサブクラスをバルク血清から分離する。この技法は、リポタンパク質粒子の組成および粒径を保存し、リポタンパク質粒子に汚染をもちこまない。エレクトロスプレープロセスは初め、多くの異なる電荷状態を有するエレクトロスプレー小滴を生成する。これらの多電荷小滴をα放射線源のすぐ近くに通す。α放射線源は、エレクトロスプレー小滴の荷電状態を中性または単一正電荷の状態に低減するα粒子または遊離の２次電子を生成する。あるいは、帯電したこれらの小滴を別の方法で処理して、正電荷を２つ以上持たない均一な荷電状態を達成することもできる。
【００１５】
続いて小滴希釈剤を揮発させて、中性のまたは単一の正電荷を有する個々のリポタンパク質粒子を生み出す。移動度選択を変化させる高電圧選択電圧を走査することによって、ある移動度範囲にわたるリポタンパク質粒子の気相移動度を測定することができる。この走査移動度を走査範囲にわたって計数すると、移動度分布を得ることができる。リポタンパク質の移動度分布の解釈に熟練した人であれば、患者の心臓リスクに関して直接に結論を下すことができる。
【００１６】
リポタンパク質の移動度と粒径との間の逆線形関係によって、移動度分布データを粒径分布に変換することができ、これによって、粒径に対する、単位時間ごとに計数される粒子数のスペクトルまたは分布を表示する方法が提供される。時間を一定にすれば、この測定値を、粒径に対する粒子数と考えることができ、元に戻って、原試料中のリポタンパク質の定量的フラクション分布に関係づけることができる。得られるリポタンパク質粒径分布は成分領域からなる。これらの領域は、元々の血清試料中のリポタンパク質粒子の量およびタイプを区別する。ある領域のあるピークの相対位置を求めることによって、心臓リスクに関する予測を実施することができる。リポタンパク質密度の従来の比較のために、この粒径分布は、密度に対する粒子数の分布に変換することもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
Ａ．定義
「生体粒子」は、共有結合以外の方法で結合した生物由来分子の集合体を有する物質を意味する。その例には、アポリポタンパク質と脂質とから形成されたリポタンパク質粒子、共有結合以外の方法で結合したコートタンパク質と糖タンパク質とから形成されたウイルス構成要素、抗体とその同系抗原とから形成された免疫複合物などが含まれるが、細胞全体は含まれない。
【００１８】
「生理的試料」は、血液、組織、髄質、細胞質など、生物体から得られる試料を意味する。
【００１９】
「ＣＨＤ」は冠状動脈性心疾患を意味する。
【００２０】
「ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬおよびＨＤＬ」は、図２に示したクラスの名称、略称、サブクラスおよび密度範囲によって記述される。
【００２１】
「カイロミクロン」は、粒径が７０〜１２０ｎｍ、対応する密度が１．００６ｇ／ｍＬ未満の生体粒子を意味する。
【００２２】
「微分移動度分析器」は、イオン電気移動度に基づいて電荷を帯びた粒子を分級する装置を意味する。電荷を帯びた粒子が均一な既知の電荷を有するとき、分級する粒子の粒径は粒子の移動度から求めることができる。
【００２３】
「Ｌｐ（ａ）」は、リポタンパク質Ａに共有結合したＬＤＬからなる生体粒子を意味する。
【００２４】
「リポタンパク質粒子」は、哺乳動物の血液から得られる粒子であって、共有結合以外の結合で生物学的に集合してコレステロールおよび脂質を包み込んだアポリポタンパク質を含む粒子を意味する。好ましくはリポタンパク質粒子が、７ｎｍから１２００ｎｍの範囲の粒径を有する生体粒子を指す。本明細書で使用するとおり、リポタンパク質粒子は実質上、ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬおよびカイロミクロンを含む。
【００２５】
「遠心法」は、高速回転によって適当な機器の内部に生み出される遠心力の中に溶液を置くことによって、その溶液中の物質を、密度および密度に関係した分子量の関数として分離または分析する方法を意味する。
【００２６】
「パターンＡ」は、図５に示すように、ＣＨＤに対する相対的に低いリスクを指示する特性リポタンパク質粒子分布を有する人に適用される呼称である。
【００２７】
「パターンＢ」は、図５に示すように、ＣＨＤに対する相対的に高いリスクを指示する特性リポタンパク質粒子分布を有する人に適用される呼称である。
【００２８】
「パターンＡＢ」は、図５に示すように、ＣＨＤに対する中程度のリスクを指示する特性リポタンパク質粒子分布を有する人に適用される呼称である。パターンＡＢは、パターンＡとパターンＢとの両方の特徴を部分的に備えた分布を有する。
【００２９】
本明細書で使用する用語「素因」は、リスク、傾向、性向、偏向または感受性と実質的に同義である。
【００３０】
「基準粒径分布」は、後に図５に関して詳細に論じるパターンＡ、ＢまたはＡＢなどのリポタンパク質粒子の粒径分布を意味する。
【００３１】
「コンピュータ可読媒体」は、コンピュータが処理できる編成された情報を供給する任意の供給源を意味し、これには、磁気可読記憶システム；直接法、光学反射／透過スキャニング、または光学的文字認識法によって読むことができるパンチカード、印刷物などの光学可読記憶媒体；コンパクトディスク（ＣＤ）、ディジタルバーサタイルディスク（ＤＶＤ）、リライタブルＣＤおよび／またはリライタブルＤＶＤなどの他の光学記憶媒体；プログラマブルリードオンリーメモリ（ＰＲＯＭ）、電気消去可能なプログラマブルリードオンリーメモリ（ＥＥＰＲＯＭ）、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、フラッシュランダムアクセスメモリ（フラッシュＲＡＭ）などの電気可読媒体；および電磁気的または光学的方法によって伝送される遠隔伝送情報が含まれる。ただしこれらに限定されるわけではない。
【００３２】
「分布」は、１つまたは複数の変量の一般関数を意味し、一般に、分散チャート、グラフ、プロットまたはヒストグラムとして図示される。
【００３３】
Ｂ．生体粒子のイオン移動度分析の概要
図１に、生体粒子のイオン移動度分析に関与する主要な機能構成要素を示す。マイクロ遠心管４１０に試料を入れ、次いでこれを遠心器４２０にかけて、後に「Ｄ．精製リポタンパク質粒子試料の調製」の項で説明するＬｐ（ａ）や他の細胞成分などの望ましくない成分を除去する。細胞成分およびＬｐ（ａ）を除去し、さらに密度超遠心法でリポタンパク質だけを選択した後、試料溶液４５５を試験用マイクロ遠心管４５０に入れ、次いでこれを加圧室４６０に入れる。高圧可変電源４３０によって、加圧室４６０および試料溶液４５５にＰｔ線４３５を通して正バイアスをかける。この正バイアスおよび高い相対圧力によって、毛細管１００が、テイラー円錐（Ｔａｙｌｏｒ  ｃｏｎｅ）１５０を形成して加圧室４６０から粒子小滴を発射する。図３には毛細管１００がより詳細に示されている。
【００３４】
図１をさらに参照する。小滴が形成されると、乾燥ガス２１０が小滴を、α放射線源４８０の発射領域まで運ぶ。α放射線源４８０は、揮発性希釈剤以外の成分を含む小滴が乾燥して単一の粒子となるときに、小滴の荷電状態を、小滴１つにつき正電荷が１つ以下の状態まで低減させる。あるいは、電気を帯びたこの小滴を他の方法で処理して、１正電荷以下の均一な荷電状態を達成することもできる。このような他の１つの方法は、α線源と同じ荷電状態低減作用を有する２次電子を生成する交流電流コロナを使用する方法である。
【００３５】
電荷低減後、乾燥ガス２１０は粒子を微分移動度分析器２００に運ぶ。微分移動度分析器２００は図４に詳細に示されている。層状過剰ガス流２２０および追加の乾燥ガス流２３０を導入して、乾燥ガス流２１０の速度と一致させる。高圧電源２０５を変化させることによって、この結合流によって運ばれた粒子が選択的に移動度選択粒子流２４０に入り、移動度選択粒子流２４０は粒子計数器４９０に流入する。
【００３６】
粒子計数器４９０は、異なる粒径の粒子の走査分布出力を記録する１つまたは複数のコンピュータ可読媒体への記憶能力を有するコンピュータシステム（図示せず）と通信することが好ましい。後に「Ｆ．微分移動度分析」の項で論じるが、単一正電荷粒子、固定乾燥ガス流２１０および追加の乾燥ガス流２３０、ならびに走査型高圧電源２０５の特定の電圧設定によって、出口環状選択スリット２９０に入る選択粒子流２８５が分類される。選択粒子流２８５は、特定の移動度および対応する粒径を有する粒子を有する。
【００３７】
本発明の１つの特徴は、共有結合以外の方法でゆるく結合した生体粒子を、その生物学的アイデンティティが失われたり、または分割されたりすることなく、このシステムを介して処理できることである。具体的には、リポタンパク質粒子（例えばＶＬＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬおよびＨＤＬ、ならびにこれらのサブクラス）を、その粒子移動度、したがって粒径および密度を迅速に求めることができるような方法で、リポタンパク質粒子が分割することなく処理することができる。
【００３８】
粒径と密度との間の関係が分かれば、粒径または移動度の分布を、粒子質量、元々の血漿の密度μｇ／ｃｍ３、粒径区間内の粒子数、および粒径区間内の粒子質量の分布に変換することができる。
【００３９】
Ｃ．リポタンパク質粒子
リポタンパク質は、ヒトの血漿中に見られる複雑な巨大分子であり、脂質を包み込んでリポタンパク質粒子となっている。循環系中のリポタンパク質粒子は特に、細胞で使用するコレステロールを輸送する機能を有する。リポタンパク質粒子は、密度および粒径に基づいてさまざまなクラスおよびサブクラスに区分されている。リポタンパク質粒子の密度は、平衡密度超遠心法および分析超遠心法によって直接に求めることができる。リポタンパク質粒子の密度は、粒径ならびに粒径と密度との間の既知の関係に基づいて、間接的に求めることもできる。粒径は、ゲル電気泳動を含むいくつかの方法によって求めることができる。
【００４０】
図２は、従来のゲル電気泳動測定値を使用してさまざまなリポタンパク質フラクションに割り当てられた現時点の標準のクラスおよびサブクラスの表であり、これには超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、そのサブクラスＶＬＤＬ  ＩおよびＩＩ、中間密度リポタンパク質（ＩＤＬ）、そのサブクラスＩＤＬ  ＩおよびＩＩ、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）ならびに高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）が含まれる。ＨＤＬは一般に、ＨＤＬ  ＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩＩａ、ＩＩＩｂおよびＩＩＩｃなどのいくつかのサブクラスを含む。
【００４１】
カイロミクロンは、心疾患の予測における臨床的意義がまだ見い出されていないので図２には含まれていない。
【００４２】
異なる２段階の塩類密度背景での分析超遠心法によって、超遠心法によって分離されたリポタンパク質粒子の浮揚特性を分析することができ、これによって水和ＬＤＬ粒子密度を決定することができる。これについては、参照によって本明細書に含まれるＬｉｎｄｇｒｅｎ他「Ｂｌｏｏｄ  Ｌｉｐｉｄｓ  ａｎｄ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ，Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ」、Ｇ．Ｌ．Ｎｅｌｓｏｎ編、Ｗｉｌｅｙ、１９９２年、１８１〜２７４ページに示されている。
【００４３】
図２に指示されているように、ＬＤＬクラスは、平衡密度勾配超遠心法（ＥＤＧＵ）として知られる予備分離技法を使用することによって、密度または粒径に基づいて７つのサブクラスに分けることができる。特定のＬＤＬサブクラスＬＤＬ−ＩＩＩａ、ＩＩＩｂ、ＩＶａおよびＩＶｂのレベルが高いことは、アテローム性動脈硬化症を含むＣＨＤに対するリスクが高いことと密接に関連する臨床知見であることが知られている。
【００４４】
血清総コレステロールレベルならびにＬＤＬおよびＨＤＬフラクション中のコレステロールレベルの測定は、冠状動脈性心疾患のリスクの診断検査として日常的に使用されている。リポタンパク質クラスおよびサブクラスの分布の検査ほうが予測には役立つが、費用と時間がかかるので、一般に、限られた数の患者にしか実施されない。
【００４５】
図２に使用されている粒径の値は、ゲル電気泳動法によって決定されたものであることに留意されたい。本明細書に開示するイオン移動度法では、イオン移動度を用いて得られるリポタンパク質粒子の粒径の測定値が、ゲル電気泳動を用いて得られたデータに比べて全てが小粒径側へシフトすることが観察されている。この違いはゲルの較正によるものと推測される。このシフトはほぼ下式の線形関係で表されるようである。
【００４６】
０．８６×ゲル粒径＝イオン移動度粒径
イオン移動度粒径とゲル電気泳動粒径との間で観察される差は、電気泳動ゲルの固有印加電界の影響下でゲルマトリックスに衝突するときにリポタンパク質粒子がゆがめられることに起因するとも考えられる。この粒径の差は、（分析超遠心分離によって得られた）粒子密度を電子顕微鏡法から得られた粒径に変換するのに使用された歴史的データによるものとも考えられる。図２は、一般的な科学文献に公表されているゲル電気泳動ランに対して受け入れられたリポタンパク質の粒径を表している。イオン移動度粒径のほうがゲル粒径よりも正確であるというのが本発明の発明者の意見だが、これは確認を要する。
【００４７】
Ｄ．精製リポタンパク質粒子試料の調製
試料調製は一般に以下のステップを含む：血液試料を採取するステップ、細胞物質から血漿を分離するステップ、超遠心法、親和ゲルへの吸着など、いくつかあるうちの１つの方法によって非リポタンパク質タンパク質を血漿から除去するステップ、透析ろ過をおこなって、粒子揮発性および／または粒径に影響を及ぼすと思われる密度調整用成分を除去するステップ、エレクトロスプレー小滴の形成を容易にするために揮発性試薬を添加するステップ、リポタンパク質粒子試料溶液を希釈するステップ、および試料溶液のｐＨを調整するステップ。
【００４８】
まず最初に、空腹時血液試料５０から１００μＬを採取する。少なくとも１２時間絶食した人の体内にはカイロミクロンは一般に存在しないので、ＶＬＤＬとカイロミクロンとの粒径の重なりは絶食することによって排除される。次いでこの試料をまず遠心器にかける。試料は、２０００Ｇで約１０分間、回転させることが好ましい。これによって試料から細胞成分が十分に除去できる。このプロセスの間に、相対的に高密度の細胞成分は試料の底に層をなす。次いで、上に残った相対的に低密度の血漿標本を抜き取る。
【００４９】
次いでこの血漿標本の密度を、高純度の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）溶液および臭化ナトリウム（ＮａＢｒ）溶液を使用して特定の密度に調整する。一実施形態では、選択するこの特定の密度を、分析する最も密度の高いリポタンパク質物質の密度か、またはそれよりも大きい密度にして、密度によって成層させたときにリポタンパク質物質が浮遊するようにする。これらの密度は、図２のリポタンパク質クラス、サブクラス、密度および粒径の表から見つけることができる。最も低い密度調整密度から最も高い密度調整密度まで順番に遠心処理することによって、さまざまなリポタンパク質クラスおよびサブクラスを順番に抽出することができる。
【００５０】
本発明で使用される好ましい方法では、一連の順次密度調整／遠心処理の代わりに、ＮａＣｌおよびＮａＢｒ塩を使用した密度調整を１度だけ実施する。この好ましい実施形態では密度調整に対して特定の１つの密度が選択される。試料密度調整を、図２に密度に従って１〜１．２１ｇ／ｍＬの範囲で選択することによって、その密度に等しいかまたはそれよりも小さい密度を有するリポタンパク質クラスを分離することができる。好ましい実施形態では、１．２１ｇ／ｍＬに密度を調整する。ＨＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬおよびＶＬＤＬの密度は１．２１ｇ／ｍＬよりも小さいので、このようにするとこれらが全て同時に抽出される。
【００５１】
次いで、リポタンパク質粒子から非リポタンパク質タンパク質を分離するために、密度調整したこの血漿試料を市販の１００μＬ超遠心管に入れ、１００，０００Ｇすなわち１０６ｍ／ｓ２で約１８時間超遠心処理する。次いで、好ましくはこの超遠心ステップによって、非リポタンパク質タンパク質、具体的にはアルブミンを血漿標本から除去する。リポタンパク質粒子は、超遠心処理の間に試料の表面に浮いてくる。
【００５２】
Ｌｐ（ａ）は、ＩＤＬ粒子やＬＤＬ粒子とは異なる分子組成を有する血清中に見られる他のタイプのリポタンパク質粒子である。Ｌｐ（ａ）は、ＬＤＬおよびＩＤＬ粒子と重なる粒径を有し、したがって、Ｌｐ（ａ）粒子が血清中に存在するときには粒径分析を妨害する。Ｌｐ（ａ）濃度が元々低い患者もいるが、ＬＤＬ粒子の粒径測定の前にＬｐ（ａ）を除去しておくことは、かなり高いＬｐ（ａ）濃度を有する患者の測定値が不正確になることを防ぐためによいことである。こうすると、Ｌｐ（ａ）による潜在的な粒径の干渉の問題が回避される。
【００５３】
Ｌｐ（ａ）を除去していない試料溶液では、ＬＤＬ測定値の１／２がＬｐ（ａ）からなることもある。したがって、エレクトロスプレー分析の前に、血漿試料からＬｐ（ａ）を除去しておくことが好ましい。この除去は、マトリックスに付着させたレクチンまたは特異抗体を使用したＬｐ（ａ）タンパク質の固相吸収によって達成することができる。Ｌｐ（ａ）の濃度は、（例えば免疫検定法によって）別個に測定し、または吸収前の血漿と吸収後の血漿を使用した免疫検定結果の差によって決定することができる。Ｌｐ（ａ）は、レクチンアフィニティクロマトグラフィによって除去するのが最も好ましい。Ｌｐ（ａ）除去ステップは密度調整／超遠心処理の後に実施することが好ましい。この後に、選択した１．２１ｇ／ｍＬフラクションの透析を実施する。
【００５４】
超遠心処理した試料のうち密度の最も低い一番上の部分を、リポタンパク質粒子を含む液体試料として、その後の透析のために抜き取る。次いでこの液体を、１０，０００ダルトン分子量カットオフフィルタの後ろに配置して、リポタンパク質粒子はフィルタの後ろに保持し、Ｈ２Ｏ、ＮａＣｌおよびＮａＢｒイオン成分は自由に拡散させる。このフィルタを、密度調整用のＮａＣｌおよびＮａＢｒを含んだこの液体とともに、０．２２μｍ粒子を除去した１８メガオームの脱イオン水に浸して、ＮａＣｌおよびＮａＢｒを、周囲の水と濃度平衡させる。この方法では、移動度測定時に粒子重量に影響を及ぼすと思われるＮａＣｌおよびＮａＢｒが除去、すなわち透析される。検査室では、カットオフ膜を水と接触させて置き、この膜の上に試料滴を単純に付着させるだけでよいことが分かっている。次いで、試料滴中のＮａＣｌおよびＮａＢｒレベルを水希釈剤と平衡させる。
【００５５】
次いで、リポタンパク質粒子が１つまたは複数の構成分子に分解することを防ぐために、十分に中性（ｐＨ７．０）に近いｐＨの揮発性水性緩衝液中で、試料溶液を調製する。好ましい緩衝液は、粒子をろ別した１８メガオーム脱イオン水に溶解し、高純度の水酸化アンモニウムでｐＨを中性に調整した２０〜３０ｍＭ、好ましくは２５ｍＭの酢酸アンモニウムである。後の粒子移動度測定に影響を及ぼすであろうリポタンパク質粒子の汚染を防ぐために、酢酸アンモニウム溶液および水酸化アンモニウム溶液は非常に高い純度の試薬を用いて調製することが重要である。
【００５６】
この揮発性水性緩衝液は以下の主要な３つの機能を果たす：１）エレクトロスプレーしたときにそれぞれのエレクトロスプレー小滴にリポタンパク質粒子が１つだけ含まれるように、試料を十分に希釈し、２）毛細管の中の試料内容物が、均一に高圧電源とほぼ等電位となるように電気伝導性を与え、３）バルク溶液により高い蒸気圧を与え、これによって希釈試料の揮発性を高め、小滴の乾燥時間を短縮する。ここでは酢酸アンモニウムを使用したが、当業者なら、これと同じ３つの機能を達成するいくつかの代替製剤に思い至るであろう。
【００５７】
希釈およびその後の揮発のあとに残る不溶性物質および残留物の量は、特定の品質の試薬を選択する重要な仕様である。これらの量はできる限り少なく抑えなければならない。それぞれの試薬が、０．００５重量パーセント未満の不純物を有することが好ましい。続いて、リポタンパク質試料をこの試薬を含む溶液中で調製し、またはこの試薬で約１０１１粒子／ｍＬ以下まで希釈する。
【００５８】
１０１１粒子／ｍＬ未満のリポタンパク質粒子濃度で、１滴のエレクトロスプレー小滴中にリポタンパク質粒子は２粒子以上存在してはならない。エレクトロスプレー小滴中にリポタンパク質粒子が１つだけあるように希釈プロセスを設計することによって、リポタンパク質粒子集団を人為的に結合し、それによって塊になった粒子集団をより大きなリポタンパク質として検出しまう潜在的なエイリアシング（ａｌｉａｓｉｎｇ）の問題が回避される。言い換えると、重量の小さい２つのリポタンパク質粒子が単一の小滴に入った場合、その結果得られるこの複合粒子の粒径測定値はずっと大きくなってしまい、元のリポタンパク質試料を代表しない。したがって、エイリアシングが起こる場合には、２つ以上の小さなＨＤＬ粒子を１つのＶＬＤＬ粒子として測定してしまい、移動度測定がゆがめられ、不正確な粒径分布が指示される。
【００５９】
酢酸アンモニウム溶液に懸濁させたリポタンパク質粒子を次いでエレクトロスプレーする。エレクトロスプレーは、試料溶液を、小毛細管、好ましくはＯｓａｇｅ０６２４４２番毛細管を通して約５０ｎＬ／分の速度でポンピングすることによって供給する。試料溶液２０から５０μＬをマイクロ遠心管に入れ、内径２０μｍのシリカ毛細管の入口をこの試料溶液の中へ入れる。このマイクロ遠心管および毛細管の入口端を正圧容器に入れて密封する。毛細管に３ｐｓｉｇ程度の正差圧をかけ、毛細管の中に試料溶液流を生じさせる。ほぼ周囲大気圧に維持された毛細管の出口側を、エレクトロスプレー小滴発生器、好ましくはＴＳＩモデル３４８０エレクトロスプレーエーロゾルジェネレータ（ＴＳＩ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒｅｔｅｄ、米ミネソタ州Ｓｔ．Ｐａｕｌ）に挿入する。
【００６０】
Ｅ．試料のエレクトロスプレー
本発明で使用するエレクトロスプレー毛細管を図３に軸対称に示す。毛細管本体１００は、その中を試料溶液１３０が輸送される中空の中心部を有する。試料溶液１３０をエレクトロスプレーするときに試料溶液１３０中の物質が吸着しないように、毛細管１００は、毛細管１００の内孔１１０の中空心に沿ってメチル誘導体化などのコーティングで不活性化されたものを使用することが好ましい。このような付着が生じると毛細管が詰まる傾向があり、十分に清掃されるまで管が使用できなくなるからである。メチル化試薬で誘導体化された毛細管は、内孔１１０の表面のシラノールおよびＳｉ−Ｏ−基をメチル基で置換し、これによって毛細管への試料の吸着およびその後の目詰まりを最小化する。
【００６１】
安定なエレクトロスプレーが得られるのは、毛細管１００の長さを約２５ｃｍとし、試料１３０に約２ｋＶの正電圧をかけたときである。これは、図１に示すように、Ｐｔ線４３５を試験用マイクロ遠心管４５０の中に入れ、試料溶液４３５と電気的に接触させることによって実施される。Ｐｔ線４３５は、高圧可変電源４３０の正極に接続されている。毛細管１２０の出口端の壁にテーパを付けて、先端が平らに切り取られた約９０°のテーパを有する円錐１４０を生み出すことも必要である。したがって毛細管のテーパの付いた領域は円錐台に似る。
【００６２】
次に図３を参照する。毛細管１００のテーパ付き出口端１２０は、５０ｒｐｍＤＣモータに取り付けられたピンバイス（ｐｉｎ−ｖｉｓｅ）に毛細管１００をしっかりと固定し、続いて毛細管の縦方向から約４５°の角度で研磨することによって生成する。
【００６３】
エレクトロスプレーは、毛細管１２０の先が平らなテーパ付き出口端に生じる。管を出ていく試料液１３０のメニスカスは、安定なエレクトロスプレーの特徴であるテイラー円錐１５０の特性形状をとるが、一般に使用される非常に導電性の高い液体のエレクトロスプレーの際には先端の鋭い円錐１６０しか見ることができない。これは、形成する小滴流１７０が、あまりに小さくて光を散乱させることができず、したがって顕微鏡で観察できない小滴からなるためである。
【００６４】
小滴流１７０は、ＴＳＩの工場推奨に従って確立されたＣＯ２と空気との層流によって小室の中へ運ばれ、そこで、（以前に図１に示した）α放射線源４８０に暴露される。α放射線源４８０は、小滴希釈剤が蒸発すると、小滴の正味の荷電状態をゼロまたは１に引き下げる。初期の小滴の直径は一般に約１５０ｎｍである。
【００６５】
「Ｂ．生体粒子のイオン移動度分析の概要」の項で論じたとおり、小滴は、ＣＯ２／空気流の中で急速に乾燥し、脱溶媒和（ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ）して、中性の、または電荷が１のリポタンパク質粒子を形成する。リポタンパク質粒子は、最初にレクトロスプレーした小滴と同じ量の電荷を担持する。一般的な実施では、小滴、ここではリポタンパク質粒子を分割するクーロン力を防ぐために、乾燥と電荷低減とを同時に実施することができる。これによって生じガスによって運ばれる粒子は主に、電気的に中性であるか、または１つの正電荷を担持する。このα線源による電荷低減プロセスは、信頼性の高いよく特徴づけられた荷電粒子流を生じる。この場合、よく特徴づけられたという表現は、単一電荷粒子の割合は粒径によって変化するが、単一の電荷を有する粒子の割合と粒径との関係は十分に確立されていることを意味する。エレクトロスプレーエーロゾル発生器は、中性および単一電荷リポタンパク質粒子を、粒子の粒径分布を決定する微分移動度分析器２００の入力に供給する。
【００６６】
他の方法を使用して、入ってきた荷電粒子流が、正電荷を１つ以下しか待たない粒子を含んで出ていくことを保証することもできる。これらの方法の１つは、α放射線源と同じ荷電状態低減作用を有する２次電子を生成する交流電流コロナを使用することを含む。
【００６７】
Ｆ．微分移動度分析
イオン電気移動度分析は、分析を受ける荷電粒子が電界にさらされているときに、その荷電粒子の粒径を決定する技法である。以下に、荷電粒子の粒径決定に使用する分析方法を説明する。
【００６８】
イオン電気移動度はイオンの物理的性質であり、電界を受けたときにイオンが獲得する速度に関係する。電気移動度Ｚは下式で定義される。
【００６９】
【数８】
2005509860.tif 000005
上式で、Ｖ＝終端速度、Ｅ＝粒子の移動を引き起こしている電界、である。さらに、下式から粒子の粒径を得ることができる。
【００７０】
【数９】
2005509860.tif 000006
上式で、ｎ＝粒子の電荷数（この場合は単一電荷）、ｅ＝１．６×１０−１９クーロン／電荷、Ｃｃ＝粒径依存のすべり補正係数、η＝ガス粘度、ｄ＝粒径、である。ｄについて解くと下式が得られる。
【００７１】
【数１０】
2005509860.tif 000007
このように、粒径の明確な関係が周知のパラメータの関数として得られた。これらのパラメータをさまざまな値にセットすることによって、後に説明するように、荷電粒子のさまざまな粒径を選択することができる。具体的には、荷電粒子に作用する電界の強さＥを変化させることが最もたやすい。
【００７２】
微分移動度分析器は、電気を帯びた入力リポタンパク質粒子群をそれらの粒径および電荷に従って分級する。好ましい微分移動度分析器は、ＴＳＩモデル３０８０静電分級機（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ）である。
【００７３】
次に図４を参照すると、中心線で切った、一般的な軸対称微分移動度分析器２００の断面が示されている。この分析器は、特定の粒径の単一電荷陽イオン２８５だけをこの機器の出口環状選択スリット２９０に通すように設計されており、そのように操作される。図解のため、選択粒径２８５とは異なるいくつかの粒子、すなわち中性粒子２９５、荷電小粒子２６０および荷電大粒子２８０が示されている。
【００７４】
微分移動度分析器２００は、中心に配置された管２７０を有する中空円筒領域２４５を有する円筒形キャニスタ２７５の中に収容されている。中心に配置された管２７０は、ある電界が存在するときに粒子（例えば中空円筒領域２４５の粒子２８５）がそこを通過する環状選択スリット２９０を備えている。粒子２８５は、その粒子の粒径および粒子に加えられた起電力の関数として環状選択スリット２９０に入る。起電力は、中心に置かれた管２７０および円筒形キャニスタ２７５に高電圧源２０５から選択電圧が印加されることによって生じる。選択スリット２９０を通って粒子２８５が中心に置かれた管２７０の中へ入ると、中心に置かれた管２７０の中を流れるガス流２３０が、粒子を含んだガス流２４０を粒子計数装置４９０（図１に示されている）へ運ぶ。
【００７５】
図解のため、図４には、４つの異なるタイプの粒子が示されている。４つの異なる記号は、３つの異なる粒径を有する単一電荷リポタンパク質粒子２６０、２８０および２８５、ならびに非荷電粒子２９５を表している。中心に置かれた管２７０と外側円筒２７５との間に高電圧源２０５を印加すると、これらの正荷電粒子は、電界の強さによって発揮される力と、周囲の媒質の中を移動している粒子の抗力に起因する粘性抵抗力との間のバランスによって決まる半径方向速度で、中心に置かれた管２７０に向かって移動し始める。
【００７６】
この粘性抗力は粒子の粒径に関係するので、同じ起電力では、より断面積が小さい、より小径の粒子ほど抗力は小さく、起電力の影響を最も受け、従ってより高い移動度を有する。これに対応して、より大きな粒子はより大きな断面積を有し、同じ起電力による影響が最も小さく、従ってより小さい移動度を有する。
【００７７】
分析器の頂部２２５から分析器の底部２３５へ移動するガスの軸方向の流速は、ベクトル速度成分の追加によって、粒子が中心に置かれた管２７０に衝突する位置に影響を及ぼす。図４は、１つのタイプの粒子イオン２８５の移動度が、選択されたイオンを検出器４９０まで導く検出スリット２９０の中へ自体を沈積させるような移動度であることを示している。すなわち、指定された高電圧２０５、中空円筒領域２４５の中の特定の層状ガス流速では、選択された粒径のまわりに分布した狭い範囲の粒径だけが検出スリット２９０を出ていく。
【００７８】
粒子を含んだ乾燥ガス２１０が微分移動度分析器２００に粒子を導入し、あらゆる種類の乱流渦を最小化するために層状過剰ガス流２２０が導入される。分析器の頂部２２５に追加の乾燥ガス２３０が導入され、このガスは最終的に、移動度によって分級された粒子流２４０として分析器の底部２３５から出ていく。
【００７９】
図４では、特定の粒径を有する粒子２８５だけが選択されている。より小径の粒子２６０は検出スリット２９０に達する前に中心管と衝突する。より大径の粒子２８０はスロットを過ぎた後で中心管と衝突し、またはバルクガス流とともに運び去られ、いずれの場合も測定はされない。非荷電粒子２９５は起電力の影響を受けず、したがって検出スリット２９０を通過することなく退出ガス流２５０の中を進む。次いで、中心に置かれた管２７０および円筒キャニスタ２７５に印加する高電圧源２０５を関心の粒子の粒径に対応した電圧範囲にわたって走査することによって、移動度スペクトルを得ることができる。微分電圧を走査すると、上記の３種類のイオンがそれぞれに導かれてスリットに入り、下流に位置する検出器に送られる。この例では、小径２６０、中間径２８５および大径粒子２８０がそれぞれ例えばＨＤＬ、ＬＤＬおよびＶＬＤＬを表す。
【００８０】
この選択可能微分移動度分析器は、定義されたサンプリング時間ｄｔの間の選択された特定の粒径ｓの荷電生体粒子イオンの数ｄｎ＋を計数し、下記粒径計数率出力
【００８１】
【数１１】
2005509860.tif 000008
を得ることによって動作する。
【００８２】
選択可能微分移動度分析器を、所望の特定の粒径範囲にわたって走査して、粒径に対する、定義されたサンプリング時間の間に計数された荷電生体粒子イオンの出力を得ることができる。粒径と密度との関係はよく分かっているので、この粒径計数率出力を、密度ρに対する、計数された１秒ごとの特定の密度の下記生体粒子数
【００８３】
【数１２】
2005509860.tif 000009
のデータセットに変換することができる。
【００８４】
次に、生体粒子がリポタンパク質である具体的なケースを検討する。このケースでは、ヒトの体内に存在する最も密度の低いリポタンパク質および最も密度の高いリポタンパク質の粒径に対応する３ｎｍから１２０ｎｍの走査粒径範囲が適当である。計数された１秒ごとの特定の粒径のリポタンパク質粒子数の従来のフォーマットで走査データセットを生成すると、密度に対する特定のリポタンパク質量を計算することができる。さまざまなリポタンパク質クラスおよびサブクラスに対応する密度範囲内のリポタンパク質量を数値的に積分することによって、従来の心臓リスク分析を評価することができる。
【００８５】
Ｇ．データの取得および分析
移動度スペクトルの記録に使用する検出器４９０は凝縮粒子検出器、好ましくはＴＳＩ社のモデル３０２５Ａ凝縮粒子検出器（Ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）である。凝縮粒子検出器は、リポタンパク質粒子などの粒子を過飽和状態の蒸気凝縮室に通し、粒子の表面で蒸気を凝縮させる。粒子は凝縮核の生成場所となる。１つ１つの全てのリポタンパク質粒子が凝縮核を生成し溶媒小滴を生み出すので、この装置は単一粒子レベルの感度を有する。それぞれの凝縮小滴の内側には１つのリポタンパク質粒子が完全に包み込まれている。この凝縮プロセスは事実上リポタンパク質粒子の粒径を大きくし、その粒径を数十ｎｍから数μｍにまで成長させる。
【００８６】
μｍ規模の小滴は、レーザビームを横切るときに光検出器の中へ光を効率的に散乱させる。このプロセスの結果生じる小滴は十分に光を散乱させ、レーザビームまたは他の光源の透過または反射（散乱）の変化を測定することによって個々の小滴を計数することを可能にする。それぞれの小滴にはリポタンパク質粒子がただ１つだけ含まれるので、これは、１つ１つのリポタンパク質粒子を間接的に計数する方法となる。
【００８７】
大気に近い気相中での粒子移動度測定によるリポタンパク質粒子の密度測定は、リポタンパク質粒子の粒径分布を迅速に求める新しい方法を提供する。図２を参照すると、主要なリポタンパク質サブフラクションの密度および粒径を含む表が示されている。リポタンパク質粒子の粒径と密度とは非常によく相関するので、一方を他方に換算しなおすのは簡単である。この相関を、測定された粒径と対応する密度とのプロットに示すことができる。これは線による曲線の当てはめである。これが図６に示されており、これについては「Ｊ．密度に対する線形性」の項で論じる。したがって、特定の粒径のリポタンパク質粒子移動度測定を、その対応する粒子密度に関係づけることができる。
【００８８】
ヒトの血液から得た一般的な６つのリポタンパク質試料の移動度スペクトルを図５に示す。以前に論じたとおりに調製したそれぞれのリポタンパク質粒子試料溶液を、２５ｍＭ酢酸アンモニウム溶液を用いて、リポタンパク質粒子の濃度が１０１１個／ｍＬ未満になるように希釈した。この試料を１８５０ボルトの正電圧を使用して５０ｎＬ／分の速度でエレクトロスプレーして、形のよい安定なエレクトロスプレーを発生させた。安定なエレクトロスプレーとは、テイラー円錐に目に見えるゆらぎがないことを言う。ＣＯ２  ０．５Ｌ／分を乾燥空気１．０Ｌ／分と結合して、このエレクトロスプレー小滴を、電荷中和器および微分移動度分析器に通し、凝縮粒子検出器まで運んだ。得られたリポタンパク質粒子スペクトルを図５に示す。これについては後に詳細に説明する。
【００８９】
ゲル電気泳動によって得られるリポタンパク質の粒径と微分移動度分析によって得られる粒径との間にはスカラ差があることを思い出してほしい。その目盛係数によれば０．８６×ゲル粒径＝イオン移動度粒径であり、図２のリポタンパク質クラスおよびサブクラスに対応するように、図５の移動度粒径を８６％だけシフトする。
【００９０】
Ｈ．一般的な試料ランの例
次に、生体粒子、具体的にはリポタンパク質のイオン移動度分析の実施に関与するハードウェア構成要素を示す図１を参照する。試料溶液は、ほぼ中性のｐＨに緩衝された２５ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液を含む。
【００９１】
試料溶液１０から５０μＬを小さなプラスチックびん、好ましくは１．５ｍＬマイクロ遠心管４１０に導入する。このマイクロ遠心管４１０は先に説明したとおりに超遠心器４２０で超遠心処理されていることが好ましいが、免疫吸収（ｉｍｍｕｎｏａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）、レクチン親和結合などの他の方法を使用して、リポタンパク質の測定をゆがめるＬｐ（ａ）を除去することができる。試験用マイクロ遠心管４５０を、加圧室４６０の中のエレクトロスプレー発生器に取り付ける。加圧室４６０に約３ｐｓｉｇの正圧を加え、試料溶液４５５を、エレクトロスプレー毛細管１００を通して面取りした先端から押し出す。３ｐｓｉｇといった小さな差圧では、試料が毛細管を満たし、面取りされた先端から試料４５５が出るのを検出するまでに数分かかる。毛細管を満たす速度を速める改良された代替法は、加圧室４６０の圧力を約１５ｐｓｉｇに高める方法である。この圧力ではわずか約３０秒で毛細管が満たされる。エレクトロスプレー毛細管が満たされたら、差圧を３ｐｓｉｇに下げ、流量を約５０ｎＬ／分に戻す。
【００９２】
次いで、高圧可変電源４３０から正の高電圧を試料４５５に印加する。次いで、この高電圧を約５，０００から約５，１００ボルトまで走査する。次いで、高電圧４３０の走査の間に毛細管１００のテイラー円錐１５０を調べて、エレクトロスプレーが安定する特定の電圧を見つける。安定なエレクトロスプレーが得られるのは、テイラー円錐１５０がそのままの位置に固定され、毛細管１００の軸からまっすぐにのび、先端が鋭く、１本の定常物質流が発射されているときである。テイラー円錐の顕微鏡像は一般に、テーパ付き毛細管１００の端の平らな先端に４５°の等辺三角形がくっついているように見える。
【００９３】
流量約１．５Ｌ／分の乾燥ガス２１０を使用して、テイラー円錐１５０から生じた小滴流を、まず最初にα放射線源４８０を用いて中性状態または単一正電荷状態まで電荷を低減させた後に、接続された管を通して微分移動度分析器２００に導入する。１５Ｌ／分の層状過剰ガス流２２０を微分移動度分析器２００に追加する。追加の乾燥ガス２３０を導入して、移動度によって選択された粒子を集める。その結果、移動度によって分級された１．５Ｌ／分の粒子流２４０が微分移動度分析器２００を出ていき、微分移動度分析器２００は、移動度によって選択されたこれらの粒子２４０を凝縮粒子計数器４９０に送る。微分移動度分析器２００の高圧電源２０５を走査することによって、移動度に対する計数された１秒ごとの粒子数のデータセットを生み出すことができる。
【００９４】
エレクトロスプレー電流を知ることによって、安定なエレクトロスプレーを追加的に確認することができる。ＴＳＩエレクトロスプレーエーロゾル発生器は、エレクトロスプレー高圧電源２０５によって出力されたエレクトロスプレー電流を表示する電流計を有する。安定なエレクトロスプレーは、分析の間、一般的な総エレクトロスプレー電流３００ｎＡから±１ｎＡ未満しか電流が変化しない長期安定性を示す。
【００９５】
一般に、毛細管がきれいであることを確認するために、酢酸アンモニウム緩衝液からなる実質上純粋な試料を機器に通す。これを背景スペクトルチェックと呼ぶ。一般的な背景スペクトルは、粒径３〜４ｎｍで７個／ｍＬ未満の粒子数を指示する。
【００９６】
ＴＳＩモデル３９８０気相電気泳動移動度巨大分子／ナノパーティクル分析（Ｇａｓ−ｐｈａｓｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ−Ｍｏｂｉｌｉｔｙ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ／ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：ＧＥＭＭＡ）ユニットとともに供給されるソフトウェアは、オペレータ定義のいくつかの条件を提供する。このデータ記録ソフトウェアでは、粒径デカード（ｄｅｃａｄｅ）ごとに記録される粒径細区分の数に対するいくつかの選択が可能である。一般に、１デカードあたり６４個の粒径細区分が記録される。走査範囲も選択することができる。一般に、一般的なＬＤＬ試料に対しては３ｎｍから１００ｎｍの走査範囲が走査されるが、ＩＤＬおよびカイロミクロンを測定するときには、この範囲が１２００ｎｍまで拡張される。走査時間は一般に３分に設定される。イオン移動度スペクトル中のピークの位置は、このメーカのソフトウェアを用いて決定する。コンピュータマウスの移動を使用し、ドラッグ可能な指示子を観察することによってピークの最大値を選択する。
【００９７】
Ｉ．冠状動脈性心疾患リスク分析
得られるリポタンパク質粒径分布を分析することによって、リポタンパク質の微分移動度分光法をさらに、冠状動脈性心疾患（ＣＨＤ）リスクの迅速な判定に使用することができる。
【００９８】
勾配ゲル電気泳動によって以前に特徴づけられたリポタンパク質パターンを有する６人から血漿を採取した。これらの人たちのリポタンパク質粒子を、１．２０ｇ／ｃｍ３未満の密度を有する成分を分離する超遠心法を使用して血漿から分離した。次いで、このリポタンパク質粒子を脱塩し、イオン移動度分光法を用いて分析して粒径分布を求めた。エレクトロスプレー移動度分光法によって得られた６タイプのリポタンパク質パターンを図５に示す。
【００９９】
図５には、微分移動度分析の結果として６つの個々のリポタンパク質粒径スペクトル（５１０、５２０、５３０，５４０、５５０および５６０）が示されている。移動度は、以前に説明したとおりに粒径に変換されている。そうしないと重なり合ってしまうグラフを区別するために、最も低い質量値のトレース５６０を除く全てのトレースは縦に移動されている。縦に移動された質量値を読み取るためには、そのトレースの最も小さな粒径の質量をゼロまで縦に移動させる。質量を示す縦軸は、相対的に基準化された任意のグラム単位である。
【０１００】
パターンＡは、ＣＨＤのリスクが相対的に低い人に適用される呼称である。パターンＡのリポタンパク質は、ＬＤＬ粒子が、冠状動脈性心疾患のリスクが相対的に高い人、すなわちパターンＢの人から得られたＬＤＬ粒子よりも大きいのが特徴である（粒径中央値で約２２．５ｎｍ対約２０．８ｎｍ）。さらに、パターンＡのリポタンパク質は、ＨＤＬ粒子の集団が一般にいくつかのサブタイプを示すことを特徴とする。これらのサブタイプは、パターンＡスペクトルのＨＤＬ領域（約７〜１３ｎｍ）のいくつかのピークに現れている。約８．９ｎｍのところの縦線は、パターンＡ、パターンＢおよび中間パターンＡＢを有する患者の主要なＨＤＬピークを指示している。パターンＡスペクトルは、約１１ｎｍの第２のＨＤＬピークを観察することによって容易に識別される。これらの特徴に留意すると、トレース５１０、５２０および５３０は、低リスクのＡ型パターンである。パターンＢの人の粒子のＬＤＬ集団のピークは、パターンＡの人のＬＤＬ粒子よりも数ナノメートル小さい位置にある。パターンＡからパターンＢへのシフトは、約２０．８ｎｍ（破線）および約２２．５ｎｍ（実線）のＬＤＬピークの上に引かれた２本の縦線によっておおよそ表されている。トレース５５０および５６０に示されたパターンＢの人のＨＤＬ粒子は一般に異質性が相対的に低く、この図でも、パターンＢのＨＤＬピークは予想どおり１つの鋭い主要なピークしか示していない。このようにイオン移動度測定は勾配ゲル測定と一致し、ＣＨＤを評価する代替の測定方法となる。
【０１０１】
図５をさらに参照する。トレース５４０は、中間のＡＢ型パターンを有する患者を表す。このトレース５４０は、Ａ型の一般的な２２．５ｎｍのピークとＢ型の一般的な２０．８ｎｍのピークの中間に位置するＬＤＬピークを示す。さらにトレース５４０では、ＨＤＬのピークが１つしかない。これは相対的に高リスクのＢ型パターンの特徴である。
【０１０２】
イオン移動度分光法は定量法であり、この方法を使用して、それぞれのリポタンパク質クラスおよび／またはサブクラスのリポタンパク質粒子の総量を直接に測定することができる。この独立変数（粒径、密度、移動度など）に対する粒子質量分布の曲線の下の面積はリポタンパク質粒子の質量を直接に表す。この測定技法は、個々の粒子を粒径（直径）の関数として計数することに依存する。したがって、粒子の体積および密度を使用して特定の粒径の粒子の数を質量値に変換することができる。リポタンパク質粒子の密度は、粒径の周知の関数であり、文献から得ることができる。この図に関連づけられた質量値は、相対値を指示するために単純な形に基準化されているが、希釈係数、ならびにイオン移動度分光計を通過する試料および空気の流量を使用して、血漿中のリポタンパク質の実際の質量に変換することもできる。
【０１０３】
図５のスペクトルはさらに、ＶＬＤＬ粒径クラスに含まれるリポタンパク質粒子の存在を示している。この粒子の存在は、粒径約３０ｎｍから上のスペクトルの小さな隆起によって指示されている。この図のプロットの下側の陰影のついた部分の面積は粒子質量に比例しており、この面積を使用して、３０ｎｍから４０ｎｍまたは３５ｎｍから４０ｎｍ、あるいは他のビンサイズの選択など、選択された任意の粒子区間の粒子の質量を評価することができる。
【０１０４】
Ｊ．密度に対する線形性
どのようにしてイオン移動度分析を実施できるかを示す他の例を図６のデータを用いて示す。リポタンパク質粒子を、ＮａＣｌ／Ｄ２Ｏ中での非平衡超遠心法を用いて分画した。１．０から１．０８ｇ／ｃｍ３の範囲の粒子を、複数の液体フラクションとして超遠心管から取り出した。粒子が超遠心器管内の平衡浮選位置に達する前に超遠心ステップは終了したので、それぞれのフラクションとともに取り出されたリポタンパク質粒子の密度は、その粒子の真の密度の推定値だが合理的な推定値であり、推定密度として表示した。図６は、それぞれのフラクションの溶液密度に対するリポタンパク質粒子の粒径のプロットであり、粒径と密度との間の予想される逆線形関係を明らかにしている。図６の縦軸は、イオン移動度分析によって測定した粒径（ｎｍ）、横軸は、非平衡超遠心法によって得た推定粒子密度（ｇ／ｃｍ３）である。
【０１０５】
図６の粒径は、イオン移動度分析を使用して測定されたものである。この結果は、粒径と粒子密度との間に予想どおりに逆線形相関関係があることを指示している。この逆線形相関関係と必ずしも一致しないデータ点は、データ試料を得るのに使用した非平衡浮選法に起因する。
【０１０６】
Ｋ．リポタンパク質質量測定の線形性
この検出方法の線形性を、特定のＬＤＬ粒子セットの一連の希釈を分析することによって確認した。このＬＤＬ粒子は、ゲルろ過によって他のクラスのリポタンパク質粒子から分離した。このＬＤＬ粒子の出発濃度を、溶液のアポリポタンパク質Ｂの濃度を測定することによって求めた。それぞれのＬＤＬ粒子にはアポリポタンパク質Ｂ分子が１つずつ存在する。アポリポタンパク質Ｂの濃度を使用することによって、試料中のＬＤＬ粒子の数を計算することができる。この特定の試料を順番に希釈し、それぞれの希釈物中の粒子の数（「ＩＭＳピーク高さ、個／ｃｍ３」軸）を微分移動度分光測定によって求め、それぞれの希釈物の計算アポリポタンパク質Ｂ濃度（「粒子、個／ｍＬ」軸）に対してプロットした。このＴＳＩ社製機器と一緒に供給される商業ソフトウェアで使用可能な１つのオプションは、微分移動度分析器を通過する空気１ｃｍ３当たりの検出粒子数をプロットする。図７には、イオン移動度ピーク高さが、アポリポタンパク質Ｂの測定から求めたＬＤＬ粒子の個数濃度に対してプロットされている。このプロット（図７）は、この測定が、１０１２粒子／ｍＬから１０１４粒子／ｍＬまでの３桁を超える範囲にわたって線形であることを示している。さらなる詳細として、図７のはめ込みグラフは、８×１０１２粒子／ｍＬまでの範囲を示している。図７は、リポタンパク質サブクラスの濃度の変動は、１０００：１すなわち０．１％の範囲で正確に測定されることを示唆している。
【０１０７】
Ｌ．リポタンパク質分析の線形独立性
微分移動度分析は、さまざまなリポタンパク質クラスおよびサブクラスにわたって非常に線形独立であるように見える。この線形独立性を、図８〜２３に示すように検証した。これらの図では、１つのヒト血液試料を１６個の異なる平均密度に分画した。使用した方法は非平衡超遠心法である。このタイプの分画の１つの副産物は、平均密度を中心とした密度分布が常に存在することである。ここでは生体粒子を取り扱っているので、特定の平均密度を有するフラクションの中に幅の広い範囲の粒径が含まれる。それぞれのリポタンパク質粒子サブクラスを表す密度フラクションを選択することを試みた。
【０１０８】
図８〜２３に、さまざまなヒトリポタンパク質クラスおよびサブクラスにまたがるある範囲の選択平均密度の、ヒトのリポタンパク質の１６個のフラクションの微分移動度分析走査を示す。リポタンパク質粒子はヒトの血漿から上記のとおりに調製し、超遠心法にかけた。超遠心管の中の密度勾配はＤ２Ｏに溶解したＮａＣｌを用いて調製した。勾配組成の選択は、約１．０００ｇ／ｃｍ３（図８）から約１．０９０ｇ／ｃｍ３（図２３）までの範囲の平均密度を有するリポタンパク質粒子を、血漿中の他の物質から分離する方法を提供した。参照のため、ゲル電気泳動勾配８を使用して、約１．０００ｇ／ｃｍ３（図８）から約１．０６２ｇ／ｃｍ３（図１９と図２０の間に入る）の範囲の平均密度を分離する。この密度勾配は、超遠心管の長手方向に沿ってリポタンパク質粒子を分布させる。ＨＤＬなどのより高い密度を有するリポタンパク質は、タンパク質分子がするように超遠心管の下部へ移動する。ＶＬＤＬなどのより低い密度のリポタンパク質は超遠心プロセスの間に管の上部に移動する。
【０１０９】
得られた超遠心管の中の液体を１６のフラクションに分配し、続いて、１０，０００分子量カットオフ透析膜を使用して２５ｍＭ酢酸アンモニウムに対して３時間、透析した。
【０１１０】
次いで、それぞれのフラクションのリポタンパク質粒子の粒径分布を、イオン移動度スペクトル分析を使用して求めた。これらの粒径分布を図８〜２３に示す。これらの粒径分布は、以下に指示するリポタンパク質クラスおよびサブクラスに対応する密度を有する：ＶＬＤＬ  Ｉ（図８〜１０）およびＩＩ（図１１）、ＩＤＬ  Ｉ（図１２）およびＩＩ（図１３）、ＬＤＬ  Ｉ（図１４）、ＩＩａ（図１５）、ＩＩｂ（図１６）、ＩＩＩａ（図１７）およびＩＶａ（図１８および１９）、ならびにＨＤＬ  ＩＩａ（図２０〜２３）。フラクションの元々の検査室試料ラベルはそれぞれ、１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３〜１０、１１ａ、１１ｂ、１２ａおよび１２ｂとなっているので、図８〜２３のフラクション、およびそれらのその後の密度分析は、いくぶん混乱する。その結果、試料ラベルはリポタンパク質サブクラスと似た点もある。このフラクションの選択には、リポタンパク質サブクラスＩＩＩｂを示さなかったが、図８〜２３の補足に基づけば、ＩＩＩｂの分布も同様に、図２に指示されている１．０４１から１．０４４ｇ／ｃｍ３の範囲に含まれるピークを有するはずである。それぞれの粒径分布は、粒径に対する質量としてプロットされている。それぞれの図では、質量値が、それぞれの指示された粒径の粒子の１ｍ３あたりの質量を示す。ただしｍ３は、微分移動度分析器に入るリポタンパク質を含んだガスの体積を基準とする。ＤＭＡは選択起電力分級を使用しているため、単一正電荷粒子だけが測定されるが、所与の粒径区間の荷電粒子のフラクションに対してμｇ／ｍ３数は補正される。このレートは、試料溶液をエレクトロスプレーする速度も、ＤＭＡに向かって粒子を運ぶフローガスの流量も考慮していない。この質量値は、ガス流量、エレクトロスプレーした試料の流量、粒子の転送効率および液体希釈係数の情報を使用することによって、原試料血漿中に存在するリポタンパク質粒子の質量に変換することができる。
【０１１１】
図９〜１８、２０、２１および２３は、約１．００３〜１．０９０ｇ／ｃｍ３の範囲のリポタンパク質密度について、この特定のヒト試料では、超遠心法を経たそれぞれの密度試料が、質量対粒径グラフに１つの主要なピークを生じることを指示している。
【０１１２】
図８、１９および２２では、双峰およびピークの広幅化が見られる。これらの幅広いリポタンパク質分布および双峰のリポタンパク質分布が何を表しているのかは今のところ分からない。この双峰は、先に論じた試料調製法のアーチファクトである可能性がある。すなわち、使用した試料調製技法が、集塊した生体粒子の一部を破壊し、その結果、より小さな粒径の断片を生じるだけの十分に破壊的な技法である可能性がある。これが事実ならば、試料調製方法を修正することによって、これらの試料を、比較的にきれいな単一ピークの粒径スペクトルに分割することができよう。
【０１１３】
この双峰および広幅化は、この特定の実験のサブフラクションの生成に使用した非平衡超遠心法に起因するアーチファクトである可能性もある。この問題は追加実験によって解決される。
【０１１４】
さらに、非平衡超遠心法の結果、図８〜２３で求められた密度は非定常状態密度である。そのため、これらの図８〜２３の密度は全ておおよその密度である。
【０１１５】
Ｍ．リポタンパク質サブクラスの線形重ね合わせ
原則として、これらのサブクラスに表現されたリポタンパク質に関しては、それぞれのリポタンパク質サブクラスの線形重ね合わせによって、血漿試料全体を数学的に表現することができる。最終的にたとえ複数のピークが残っても、最小２乗法、特異値分解などの従来の数値的データ相関方法を使用して、試料全体のそれぞれのリポタンパク質サブクラスの量を求めることができる。したがって、１回の微分移動度スペクトル走査で、血漿試料中のそれぞれのリポタンパク質サブクラスの量を決定することができる。これが決定されれば、それぞれのリポタンパク質の量およびタイプも分かるであろう。結果として得られるサブクラス情報を、集団死亡率および危険因子と統計学的に相関させることによって、冠状動脈性心疾患リスクのより正確な評価が得られると考えられる。具体的には、複峰対単峰ＨＤＬ分布、およびＬＤＬ分布のピークリポタンパク質粒径のこの既知の特徴を、１００％Ａ型パターン（低リスク）から１００％Ｂ型パターン（高リスク）までの危険因子に容易に変換することができる。
【０１１６】
Ｎ．結語
本明細書で言及した全ての文献、特許および特許出願は、それぞれを特に個別に本明細書に組み込むと指示したのと同じ程度に、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１１７】
本明細書の説明および本発明を実施する最良の形態は、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく多くの変更、代替構造および等価物を使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】生体粒子のイオン移動度分析のハードウェアおよび分析シーケンスの概要を示す図である。
【図２】ゲル電気泳動の結果から報告された主要なリポタンパク質クラス、サブクラス、密度および粒径を示す表である。
【図３】安定なテイラー円錐を有し、適正に動作している軸対称エレクトロスプレー毛細管の拡大断面図である。
【図４】中心線で切った軸対称微分移動度分析器の断面図である。
【図５】走査型微分移動度分析器の出力である、６人から得たリポタンパク質の粒径分布を示す図である。ただし質量はずれている。
【図６】リポタンパク質の粒径とリポタンパク質試料の推定密度との間のおおよその逆線形関係を指示するグラフである。
【図７】リポタンパク質粒子計数と対応するリポタンパク質試料の粒子計数との間のおおよその線形関係を指示するグラフである。
【図８】ＶＬＤＬ  Ｉに対応する平均密度約１．０００ｇ／ｃｍ３のリポタンパク質試料の微分移動度スペクトル走査を示す図である。
【図９】ＶＬＤＬ  Ｉに対応する平均密度約１．００３ｇ／ｃｍ３のリポタンパク質試料の微分移動度スペクトル走査を示す図である。
【図１０】ＶＬＤＬ  Ｉに対応する平均密度約１．００５ｇ／ｃｍ３のリポタンパク質試料の微分移動度スペクトル走査を示す図である。
【図１１】ＶＬＤＬ  ＩＩに対応する平均密度約１．００７５ｇ／ｃｍ３のリポタンパク質試料の微分移動度スペクトル走査を示す図である。
【図１２】ＩＤＬ  Ｉに対応する平均密度約１．０１０５ｇ／ｃｍ３のリポタンパク質試料の微分移動度スペクトル走査を示す図である。
【図１３】ＩＤＬ  ＩＩに対応する平均密度約１．０１６１ｇ／ｃｍ３のリポタンパク質試料の微分移動度スペクトル走査を示す図である。
【図１４】ＬＤＬ  Ｉに対応する平均密度約１．０２１７ｇ／ｃｍ３のリポタンパク質試料の微分移動度スペクトル走査を示す図である。
【図１５】ＬＤＬ  ＩＩａに対応する平均密度約１．０２７３ｇ／ｃｍ３のリポタンパク質試料の微分移動度スペクトル走査を示す図である。
【図１６】ＬＤＬ  ＩＩｂに対応する平均密度約１．０３３０ｇ／ｃｍ３のリポタンパク質試料の微分移動度スペクトル走査を示す図である。
【図１７】ＬＤＬ  ＩＩＩａに対応する平均密度約１．０３８６ｇ／ｃｍ３のリポタンパク質試料の微分移動度スペクトル走査を示す図である。
【図１８】ＬＤＬ  ＩＶａに対応する平均密度約１．０４４２ｇ／ｃｍ３のリポタンパク質試料の微分移動度スペクトル走査を示す図である。
【図１９】ＬＤＬ  ＩＶａに対応する平均密度約１．０４９８ｇ／ｃｍ３のリポタンパク質試料の微分移動度スペクトル走査を示す図である。
【図２０】ＨＤＬ  ＩＩｂに対応する平均密度約１．０６９２ｇ／ｃｍ３のリポタンパク質試料の微分移動度スペクトル走査を示す図である。
【図２１】ＨＤＬ  ＩＩｂに対応する平均密度約１．０７６７ｇ／ｃｍ３のリポタンパク質試料の微分移動度スペクトル走査を示す図である。
【図２２】ＨＤＬ  ＩＩｂに対応する平均密度約１．０８４４ｇ／ｃｍ３のリポタンパク質試料の微分移動度スペクトル走査を示す図である。
【図２３】ＨＤＬ  ＩＩｂに対応する平均密度約１．０９０ｇ／ｃｍ３のリポタンパク質試料の微分移動度スペクトル走査を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際調査報告】
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