(57)【要約】宿主細胞によって生産された医薬品の精製プロセスの間に汚染物質除去の監視をするための方法であって、医薬品の精製プロセスの間に取られた少なくとも２つの異なるサンプルが少なくとも１つのプロテインバイオチップアレイでインキュベーションされること及びプロテインバイオチップアレイに結合された汚染物質が引き続き検出される方法。好ましくは、第１の精製ステップの前に及び後の個々の精製ステップの後にサンプルが取られる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞によって生産された医薬品の精製プロセスの間に汚染物質除去の監視をするための方法であって、医薬品の精製プロセスの間に取られた少なくとも２つの異なるサンプルが少なくとも１つのプロテインバイオチップアレイでインキュベーションされること及びプロテインバイオチップアレイに結合された汚染物質が次に検出されることを特徴とする方法。
【請求項２】
第１の精製ステップの前に及び個々の後の精製ステップの後にサンプルが取られることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
所与の精製ステップの後に得られたサンプルが、本発明における方法において、異なる相互作用表面を有する、少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つ、最も好ましくは少なくとも４つの異なるプロテインバイオチップアレイでインキュベーションされることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
プロテインバイオチップアレイに結合された汚染物質が直接的に検知されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
質量分析的なアプローチが、汚染物質の直接検知のために使用されることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
検知された汚染物質が蛋白質であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項７】
検知された汚染物質が宿主細胞蛋白質であることを特徴とする、請求項６に記載のプロセス。
【請求項８】
宿主細胞によって生産された医薬品の精製プロセスの間に汚染物質除去の監視のために１つ又はそれ以上のプロテインバイオチップアレイを使用する方法。
【請求項９】
異なる相互作用表面を有する少なくとも２つの異なるプロテインバイオチップアレイが使用されることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
宿主細胞蛋白質除去が監視されることを特徴とする、請求項８又は９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、宿主細胞によって生産された医薬品の精製プロセスの間に汚染物質除去の監視をするための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
宿主細胞によって生産された医薬品の精製プロセスの間に汚染物質の除去を監視することは、医薬品の市場承認を獲得するために必要である。医薬品の市場承認のために、精製プロセスが再現可能であり且つ医薬品が一定の品質（すなわち純度）で生産されることが示されなければならない。それ故に、医薬品の精製プロセスの間に汚染物質除去を監視するための信頼できる方法の必要がある。
【０００３】
宿主細胞によって生産された医薬品の精製プロセスの間に汚染物質除去の監視のために使用される検出方法は、当業者に知られている。既知の方法は、免疫学に基づかない他の既知の方法例えば一次元及び二次元ゲル電気泳動又は（逆相）HPLCとたいていは組み合わされた免疫学的方法例えばELISA又はウェスタンブロットの利用である。
【０００４】
既知の免疫学的方法の不利点は、使用される抗体がある蛋白質のみに対して引き起こされるということである。典型的には、抗体は、免疫原の宿主細胞蛋白質に対してのみ引き起こされる。それ故に、前記免疫原の宿主細胞蛋白質以外の汚染物質は、免疫学的方法によって検出され得ない。
【０００５】
免疫学的方法では、宿主動物（例えば、ウサギ、ヤギ、マウス)での（宿主細胞）蛋白質に対して引き起こされたポリクロナール抗体が、通常使用される。それ故に、免疫学的方法は、宿主動物で免疫学的応答を誘導することができる(宿主細胞)蛋白質をのみ検知できる。典型的には、これは、総(宿主細胞)蛋白質の20〜30%のみの検出を占める。ポリクロナール抗体はヒトの中で通常引き起こされないので、残りの検出されない宿主細胞蛋白質は、ヒトにおいて免疫学的反応を十分に生じうる。その上、(宿主細胞)蛋白質の他の他の汚染物質も検出されていない。
【０００６】
免疫学的検出方法及び免疫学的検出に基づかない他の既知の検出方法の両方の不利点は、それらが個々の蛋白質を検出する能力と結合された高感度を有しないということであり；既知の方法は、比較的低感度(ウェスタンブロット、HPLC、一次元及び二次元ゲル電気泳動)で個々の蛋白質を検出するか又はより高感度（例えば、ELISA）で総蛋白質シグナルを検出するかのいずれかである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
宿主細胞によって生産された医薬品の精製の間に汚染物質除去の監視のための方法を提供することが本発明の目的であり、該方法は比較的高感度で個々の蛋白質を検出する能力を有する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
この目的は、医薬品の精製プロセスの間に取られた少なくとも２つの異なるサンプルを少なくとも１つの蛋白質バイオチップアレイでインキュベーションすること、次に該プロテインバイオチップアレイに結合された汚染物質を検出することによって達成される。
【０００９】
プロテインバイオチップアレイは、従来技術おいて知られ且つ例えばBiacore社(ウプサラ、スウェーデン)及びCiphergen Biosystems社(フリーモント、カリフォルニア州、米国)から商業的に入手可能である。これまで、プロテインバイオチップアレイは、製品の分離及び細胞構成成分の解析のため(例えば、差示的遺伝子発現研究のため(米国特許第6,225,047号))に使用されている。
【００１０】
プロテインバイオチップアレイは、宿主細胞によって生産された医薬品の精製プロセスの間に汚染物質除去を監視することを非常に可能にすること及び個々の蛋白質の検知が比較的高感度で生じることが驚くべきことに見つけられた。既知の免疫学的方法は蛋白質のみを検出できるのに対して及び免疫学に基づかない他の既知の方法は蛋白質のみ又は汚染物質のいずれかのみを検出することができるのに対して、その上、プロテインバイオチップアレイは、蛋白質及び他の汚染物質の両方を結合することが可能である。
【００１１】
用語「医薬品」は、医薬調製において活性成分として使用されうる蛋白質（例えば、抗体、受容体、酵素、融合蛋白質など）、医療用途例えば遺伝子治療における使用での（プラスミド）DNA、又はワクチンを意味する。
【００１２】
用語「汚染物質」は、所望の医薬品自体以外の、医薬品中に存在する全ての化合物を意味する。汚染物質は、例えば(宿主細胞)蛋白質、医薬品が宿主細胞によって生産されるための細胞培養培地からの汚染物質、精製プロセスの間に添加された添加剤（例えばカラム浸出物（column leechables）、安定化剤、ウィルス不活性化剤、小さな有機分子など）である。
【００１３】
宿主細胞によって生産された医薬品の精製プロセスは、色々な組み合わせ及び順序での幾つかの精製ステップを一般に含む。精製ステップの例は、分離ステップ（例えばアフィニティクロマトグラフィー及び／又はイオン交換クロマトグラフィーによる）であり、他のステップは例えば医薬品を濃縮するために必要であり（例えば限外濾過又はダイアフィルトレーション）、バッファーを交換するためのステップ、又はウィルスを除去し若しくは不活性化するためのステップ（例えばウィルス濾過、pHシフト又は溶媒洗浄剤処理）である。
【００１４】
本発明に従い医薬品の精製を監視することは、医薬品の精製プロセスの間に取られた少なくとも２つの異なるサンプルを少なくとも１つのプロテインバイオチップアレイでインキュベーションし、そして引き続きプロテインバイオチップアレイに結合された汚染物質の検出によって行われる。該得られた検出結果の比較は、精製の効果を示す。精製の効果が、異なるサンプルの検出結果の比較から見られ得る限り、いつ該サンプルが取られるかは実際に重要ではない。実際には、好ましくは、サンプルは、２つの精製ステップの間で取られる。より好ましくは、サンプルは少なくとも、第１の精製ステップの前に及び最後の精製ステップの後に取られる。最も好ましくは、サンプルは、第１の精製ステップの前に及び後の個々の精製ステップの後に取られる。
【００１５】
プロテインバイオチップアレイは、蛋白質がそれに結合できる相互作用表面を有する。相互作用表面は、例えば化学的性質(例えばある受容体のリガンド又はクロマトグラフィー表面又は生物学的表面)でよい。クロマトグラフィー表面は、脂肪族疎水性表面；芳香族疎水性表面；マイナスに荷電されたカチオン交換表面；プラスに荷電されたアニオン交換表面；固定化された金属アフィニティクロマトグラフィー表面；及び例えばマイナスに荷電されたカチオン交換表面及びプラスに荷電されたアニオン交換表面を含む混合モード表面を含むが、これらに限られない。クロマトグラフィー表面は、例えば米国特許第6,225,047号にまた記載されている。生物学的表面は、共有的に結合された抗体、DNA、酵素、受容体、リガンド及び一本鎖可変抗体（single chain variable antibodies）又は抗体様リガンド（後者２つは、フェーズディスプレイライブラリーから得られ得る）を含むが、これらに限られない。
【００１６】
相互作用表面の性質は、どの汚染物質が結合されるかを決定する。例えば、プロテインバイオチップアレイが、宿主細胞蛋白質に対するフェーズディスプレイライブラリーから得られた一本鎖可変抗体又は抗体様リガンドを含む相互作用表面を有する場合、ほとんどの宿主細胞蛋白質は検出されるだろう(宿主動物内で免疫学的応答を導出することができる宿主細胞蛋白質だけでなく)。
【００１７】
本発明の好ましい実施態様では、所定の精製ステップ後に得られたサンプルが、本発明に従う方法において異なる相互作用表面を有する、少なくとも２個、より好ましくは少なくとも３個、最も好ましくは少なくとも４個の異なるプロテインバイオチップアレイでインキュベーションされる。お互いに並べられたより多くの異なるプロテインバイオチップアレイの使用は、より多くの異なる汚染物質が検出され得るという利点を有する。
【００１８】
プロテインバイオチップアレイ表面に結合された汚染物質は、直接的に検出されうる。直接検出に適切な技術の例は、屈折率変化を監視する測光アプローチ（例えば表面プラズモン共鳴(SPR)、蛍光又は偏光変化を使用するアプローチ）；及び質量分析アプローチ（例えばセルディ（SELDI(surface enhanced laser desorption ionization)））を含む。
【００１９】
代わりに、汚染物質が間接的にまた検出されてもよい；この場合、プロテインバイオチップアレイに結合された汚染物質は、アレイから溶出されそして溶出剤の流れ中で検出器に運ばれる。間接検出に適した技術の例は、エレクトロスプレーイオン化（ESI）又はマトリックス支援レーザー脱着／イオン化(MALDI)を含む。好ましくは、本発明に従う方法において、汚染物質は、好ましくは質量分析アプローチを使用して、直接的に検出される。
【００２０】
好ましくは、本発明に従う方法では直接検出方法が、より好ましくは質量分析が、本発明に従う方法においてプロテインバイオチップアレイに結合された汚染物質の検出のために使用される。
【００２１】
本発明に従う方法は、好ましくは蛋白質除去の監視、より好ましくは医薬品からの宿主細胞蛋白質除の監視のために使用される。
【００２２】
医薬生成物を生成するために使用されうる宿主細胞は、原則として従来技術で知られており、医薬蛋白質、（プラスミド）DNA又はワクチンを生産するための能力を有するいる全ての細胞である。宿主細胞の例は、真核細胞例えばphilamentus fungi（例えば、Aspergillus niger、Aspergillus oryzae、Trichoderma reesei、Penicillium chrysogenum）、酵母（例えば、Saccharomyces cerevisiae、Phaffia rhodozyma、Pichia pastoris）、哺乳動物細胞（例えば、CHO(Chinese Hamster Ovary)細胞、ハイブリドーマ、BHK (Baby Hamster Kidney)細胞、骨髄腫細胞、ヒト細胞（例えば、HEK-293 細胞、ヒトリンパ芽球状細胞）、及び原核細胞例えば、大腸菌、バチラス菌（例えばB. licheniformis、B. subtilis、B. amyloliquefaciens、B. alkalophilus）、ストレプトマイセス菌、corynebacterium  glutamicum、シュードモナス菌である。真核細胞の例は、例えばChu, L.、Robinson, D. K.、(2001年) Curr. Opinion Biotechn.、第12巻、180-187頁にまた記載されている。
【００２３】
(カッコ間の対応する医薬の商標名を有する)医薬調製品で活性成分として使用されうる蛋白質の例は例えば、Tenecteplase (TN Kase、商標)、(組み換え) 抗血友病因子(ReFacto、商標)、リンパ芽球状インターフェロンα-n1(Wellferon、商標)、(組み換え) 凝固因子(NovoSeven、商標)、Etanercept (Enbrel、商標)、Trastuzumab (Herceptin、商標)、Infiximab (Remicade、商標)、Palivizumab (Synagis、商標)、Basiliximab (Simulect、商標)、Daclizumab (Zenapaz、商標)、Rituximab (Rituxan、商標)、(組み換え) 凝固因子IX (Benefix、商標) 及びインターフェロン β-1a(Avonex、商標)である。
【００２４】
ありうる医学用途を有するDNAの例は、遺伝子治療プラスミドDNAである。幾つかの遺伝子治療プラスミドDNAは、それらの医学用途のために臨床試験で現在テストされている。
【００２５】
ワクチンの例は、生きている、口腔の、4価のロータウイルス・ワクチン(RotaShield、商標)、狂犬病ワクチン(RanAvert、商標)及び不活性化されたA型肝炎ワクチン(VAQTA、商標)である。
【００２６】
本発明は、宿主細胞によって生産された医薬品の精製プロセスの間における、汚染物質除去の監視のための１つ又はそれ以上のプロテインバイオチップアレイの使用にまた関連する。好ましくは、異なる相互作用表面を有する、少なくとも２個、より好ましくは少なくとも３個、最も好ましくは少なくとも４個の異なるプロテインバイオチップアレイの使用である。好ましくは、汚染物質は、蛋白質、より好ましくは、宿主細胞蛋白質である。
【００２７】
さて本発明は、次の実施例によって説明されるが、しかしながらそれらに限定されない。
【００２８】
実施例
１．０  はじめに
本研究では、我々が、SELDI-TOF-MS(Ciphergen社)によって、ヒト組み換えIgG1(2)の部分的精製の間に汚染物質の除去を進めた。このIgG1は、網膜由来の初期ヒト細胞から生成されたPER.C6細胞株内で発現される。PER.C6細胞株は、ヒトモノクロナール抗体（グリカンを含む）を完全に生成できる（文献１、２）。
【００２９】
精製プロセスの間に集められたサンプル中に存在する汚染物質は、プロテインチップ（ProteinChips）を使用することによって分析された。プロテインチップ（Ciphergen社）は蛋白質がそれに結合できる相互作用表面を有する。我々は、種々の結合条件下で、通常フェーズプロテインチップ(NP20)、強アニオン交換プロテインチップ(SAX2)、弱カチオン交換プロテインチップ(WCX2)及び疎水的相互作用プロテインチップ(H4)を使用した。
【００３０】
2.0  材料及び方法
2.1  発酵及び精製
ヒトIgG1(2)を発現するPER.C6細胞が、２つの摺拌翼を使用して75rpmの回転速度で37℃、13日間、バッチ培養で2リットルのEX-CELL VPRO培地(JRH Biosciences社、米国)で培養された。細胞及び上清は、室温 (R. T. )で、300gで５分間の遠心分離によって分離され、該上清は引き続き  22 μmフィルタ(Millipak 20、ミリポア社)で濾過された。この精製された物質から、サンプルが、SELDI-TOF-MS(サンプル1、表１）による分析のために取られた。100mlの容量の明澄にされた及び濾過された収穫物は、Akta Explorerクロマトグラフィー・システム(Pharmacia Biotech社)に接続された組み換えプロテインAカラム(13.8cmベッド高さ及び13.1 mLの容積、Pharmacia Biotech社)に与えられた。該明澄にされた収穫物の適用前に、該カラムは、1.67 mL/minで、20 mM Tris(pH 7.5)、150 mM 塩化ナトリウムの３倍カラム容量で平衡にされた。該明澄にされた収穫物が1.67mL/minで与えられている間に、サンプルが、フロースルーから取られた(サンプル2、表１）。1.67mL/分で、20 mMトリス(pH 7.5)、150 mM 塩化ナトリウムの10倍カラム容量でカラムを洗浄後、該カラムは1.67mL/分で、10倍カラム容量の0.1Mのクエン酸塩（pH 5.0）にもたらされた。IgG1は、5カラム容量の0.1M クエン酸塩（pH 3.3）によってカラムから溶出され、そして引き続き1M トリス-HCl(pH 9)で中和された(サンプル3、表1)。蛋白質の溶出が、280nmでの吸収を測定することによって追跡された。
【００３１】
【表１】
2005524835.tif 000002
【００３２】
2.2 NP20 プロテインチップでの中間物
この実験において、2つの異なるエネルギー吸収マトリックス(EAM)（50 %アセトニトリル（ACN）、0.5%  トリフルオロ酢酸（TFA）中にいずれにもある、飽和されたシナピン酸（SPA）及びアルファ−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（CHCA）の20%飽和溶液）が使用された。サンプルは、下記（2.2.1)の実験手順に記載されるように分析された。0.15g/Lの生成物濃度を得るために、サンプル2及びサンプル4が、リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)（pH 7.4）で、3.3倍及び6.6倍に夫々希釈された。その後、各サンプル(希釈されサンプル2及び4、並びに希釈されていないサンプル1及び3)から、3μlがスポットに添加された。サンプル1、2、3及び4は、スポットA、B、C及びD上に、そして再びE、F、G及びH上に施与された。スポットA〜DはCHCAで、及びスポットE〜HはSPAで分析された。
【００３３】
2.2.1 実験手順
−  製造会社によって提供されたプロトコルに従い、分子量基準C100-0003(Ciphergen社)を使用して、低分子量分析のためにSELDI-TOF-MSを較正する。
−  製造会社によって提供されたプロトコルに従い、分子量基準C100-0004(Ciphergen社)を使用して、高分子量分析のためにSELDI-TOF-MSを較正する。
−  EAM(SPA及びCHCAの両方、5mg、Ciphergen社)で1カップをとり、そして125μL ACN及び125μL 1% TFA(5μL TFAを495μL HPLC等級水に添加することによって新たに調製された)を添加する。5分間ボルテックスし、そして5分間室温で放置する。
−  最高速度で5分間、マイクロフュージ（microfuge）する。
−  飽和されたSPA溶液としてSPAの上清を使用する。
−  100μL の飽和されたCHCA溶液を取ることによって20% CHCA溶液を作成し、そして200μL ACN、200μL 1% TFAに添加する。
−  使用まで、4℃、暗所でEAM溶液を保存する。
−  3μL HPLC等級水で各スポットを予め湿らせる。
−  HPLC等級水を除去し、そしてスポット当たり3μLの1つのサンプルを直ちに施与する。
−  該スポットを風乾させる。
−  各スポットを5μL HPLC等級水で洗浄する。
−  放置乾燥し、そして洗浄を１回繰り返す。
−  0.8 μL SPA/CHCAを施与する。
−  該チップを風乾（フード内で5分間）させる。
−  他の0.8 μL SPA/CHCA を施与し、そして乾燥する
−  該チップを下記に与えられた機器設定で分析する。
【００３４】
2.2.2  機器設定
低分子量0-10 kDa(EAMとしてSPA)用
−  ハイマス（high  mass）を10000ダルトンに設定し、1000ダルトンから7500ダルトンに最適化されている。
−  開始レーザー強度(LI)を180に設定する。
−  開始検出器感度を6に設定する。
−  ラグタイムを600 nsで焦点をあわせる。
−  データ捕捉方法をセルディ（Seldi）評価法に設定する。
−  セルディ（Seldi）獲得パラメーターを21、デルタを2に、トランジエントを5ずつ（transient per to 5）、終点を81にセットする。
−  ２ショットを有するウォーミング位置を強度185で設定し、そしてウォーミングショットを含めない。
−  サンプルを処理する。
【００３５】
高分子量10-200 kDa(EAMとしてSPA)用
−  ハイマスを200000ダルトンに設定し、10000ダルトンから150000ダルトンに最適化されている。
−  開始LIを230に設定する。
−  開始検出器感度を9に設定する。
−  最適中心によって焦点をあわせる。
−  データ捕捉方法をセルディ評価法に設定する。
−  セルディ獲得パラメーターを20、デルタを4に、トランジエントを10ずつ（transient per to 10）、終点を80にセットする。
−  ２ショットを有するウォーミング位置を強度240で設定し、そしてウォーミングショットを含めない。
−  サンプルを処理する。
【００３６】
低分子量(EAMとしてCHCA)用
−  ハイマスを15000ダルトンに設定し、1000ダルトンから10000ダルトンに最適化されている。
−  開始LIを180に設定する。
−  開始検出器感度を9に設定する。
−  最適中心によって焦点をあわせる。
−  データ捕捉方法をセルディ評価法に設定する。
−  セルディ獲得パラメーターを21、デルタを5に、トランジエントを10ずつ（transient per to 10）、終点を79にセットする。
−  ２ショットを有するウォーミング位置を強度185で設定し、そしてウォーミングショットを含めない。
−  サンプルを処理する。
【００３７】
スペクトルは、ソフトウェア・パッケージCiphergen ProteinChipソフトウェア3.0.1において製造者(Ciphergen社、フリーモント、カリフォルニア州、米国)によって提供されたピーク検出ソフトウェアを使用して解析された。2又はそれ以上の信号/ノイズ比率(S/N)を有するピークが、比較研究に含まれた。ショルダーピークの面積は、0として与えられる。
【００３８】
2.3  EAMとしてSPAを使用し、種々の条件下でのSAX2、WCX2、NP20及びH4 プロテインチップでの検出
サンプル1〜4が、SAX2、WCX2、NP20及びH4 プロテインチップ上に施与された。サンプル1及び4は、第1のNP20のために示されたのと同じ稀釈率で使用された。該サンプルは、2.3.2の機器設定で2.3.1に記載された実験手順に従い解析された。
【００３９】
【表２】
2005524835.tif 000003
【００４０】
2.3.1  実験手順
−  種々のチップを有するバイオプロセッサーを作る。
−  各スポットへ50μL平衡バッファー(表2)を添加することによって、H4及びNP20チップを平衡化し、そして300rpmで5分間振とうする。
−  その後、表2で示されるような適切なバインディングバッファーの50μLを加えることによって、すべてのプロテインチップのスポットを平衡化する。
−  ウェル内にバインディングバッファーの90μLを分配する。
−  分けられたサンプルの10μLを溶液中に加える。
−  ウェルの底で泡を形成しないように極度に注意をする。
−  4回、ピペットを上下することによって混合する。
−  このようにしてサンプルをすべて添加する。
−  シール箔でバイオプロセッサーを覆う。
−  ボルテックス振とう機で60分間アレイアセンブリを振とうする(室温、350回転/秒）。
−  流しに溶液をはじき飛ばし、そしてクリーンルームワイプ上でバイオプロセッサーを覆う。
−  室温で5分間振とうすることによって、150μl バインディングバッフで3回アレイを洗浄する。
−  各アレイを150μl脱イオン化(DI)水で1分間素早く洗浄する。
−  バイオプロセッサーからチップを除く。
−  ペーパーティッシュでスポットの外側の過剰な液体を乾燥する。
−  空気で乾燥することを許す。
−  0.8μl の飽和されたSPA溶液(調製について2.2.1を参照)を施与する。
−  乾燥することを許す。
−  2回目の0.8μl の飽和されたSPA溶液を施与する。
−  乾燥することを許す。
−  チップを読む。
−  解析まで室温、暗所中でチップを保存する。
【００４１】
2.3.2  機器設定
−  ハイマスを200000ダルトンに設定し、10000ダルトンから150000ダルトンに最適化されている。
−  開始LIを230又は270に夫々設定する。
−  開始検出器感度を9に設定する。
−  最適中心によって焦点をあわせる。
−  データ捕捉方法をセルディ評価法に設定する。
−  セルディ獲得パラメーターを夫々20又は21、デルタを5に、トランジエントを10ずつ（transient per to 10）、終点を夫々80又は81にセットする。
−  2ショットを有するウォーミング位置を夫々強度235又は275で設定する。
−  ウォーミングショットを含めない。
−  サンプルを処理する。
【００４２】
3.0  結果
追加のピークは、プロテインチップ NP20上でEAMとしてCHCA又はSPAのいずれかを使用して、低分子範囲で見つからなかった。それ故に、他のプロテインチップが、高及び低分子範囲の両方で不純物の検出を可能にしてEAMとしてのSPAで解析された。
【００４３】
培地及び明澄にされた収穫物のスペクトルとの間での相違から、宿主細胞(製品を含む)による生成された蛋白質/不純物が識別された。フロースルーのスペクトルにおいて、これらの不純物ピークの多くが見つかり、これは不純物が製品から分離されたことを示す(添付の図及び／又は表を参照)。該製品はその単一の荷電した形式(IgG1+H)でほぼ148 kDaに存在し、それはその2倍に荷電した形式(IgG1+2H)で74 kDaで、及び時々その3倍に荷電した形式で約49 KDa(IgG1+3H)でさえ存在し、これらのピークは太字で示される。
【００４４】
第1のNP20 プロテインチップ(NP20(1))について、LI 230で解析されたSPA(スポットE-H)で得られたデータが与えられる。他のクロマトグラフィー表面について、Ll 230又はLI 270のいずれかで得られたデータが与えられる。製品ピークが存在するときのみ、不純物のパーセントが計算され、したがって明澄にされた収穫物(サンプル2)及び溶出物(サンプル3)についてのみである。計算について、次の定式(1)が使用された。
【００４５】
100% * (1- IgG ピーク総面積/総面積)    (1)
【００４６】
【表３】
2005524835.tif 000004
妥当する場合、前向スラッシュの前にスポットA-Dからの結果が及び前向スラッシュの後にスポットE-Hからの結果が与えられる。
*，LI270で得られた
゜，LI230で得られた
n.a.,IgGが検出されなかった故に適用可能でない
【００４７】
醗酵の前及び後の培地のスペクトルを比較することによって、宿主細胞によって生産された汚染物質は識別され得、そして引き続き精製の間に追跡される。各スペクトルの質量を比較することによって、プロテインチップあたりの中間物当たりのユニークなピークが識別され得、それは、不純物の量又は除去についての追加的な洞察を与えうる。0.5%差内の質量を有する不純物は、同一であると考えられる。
【００４８】
4.0  結論
6.0以下で示されたスペクトル及び表から結論されうるように、SELDI-TOF-MS技術を用い高感度で個々の汚染物質を検出することが可能である(図5)。さらに、精製プロセスからの少なくとも2つの中間物を比較することによって、これらの汚染物質の除去が追跡され得る。不純物の適用範囲をさらに改善するために、より多くの異なるバッファー条件が必要でありうる。さらに、より低い質量のより多くの不純物が、より低いレーザー強度を使用して得られうる。
【００４９】
表３で示された結果は、プロテインAカラムでの組み換えIgG1の精製の間の汚染物質の除去を明瞭に示す。より理想的には、より多くの精製ステップが実行されたときに、該除去は示されうる。
【００５０】
5.0  文献
文献１  Jones, D. H.、van Berkel、P. H. C.、Logtenberg, T. 及び Bout, A. 、2002年、「PER.C6 cell line for human antibody production.」、 Gen.編、第22巻、5月15日。
文献２  Jones, D.等、 2003年、「High-level expression of recombinant IgG in the human cell line PER.C6.」、Biotechnol. Prog.、第19巻、163-168頁。
【００５１】
6.0  表
【００５２】
【表４】
2005524835.tif 000005
2005524835.tif 000006
2005524835.tif 000007
2005524835.tif 000008
【００５３】
【表５】
2005524835.tif 000009
2005524835.tif 000010
2005524835.tif 000011
【００５４】
【表６】
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【００５５】
【表７】
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【００５６】
【表８】
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【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】プロテインチップNP20(1)のスペクトル図である。
【図２】プロテインチップNP20(2)のスペクトル図である。
【図３】プロテインチップSAX2のスペクトル図である。
【図４】プロテインチップWCX2のスペクトル図である。
【図５】プロテインチップWCX2のより詳細なスペクトル図である。
【図６】プロテインチップH4のスペクトル図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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