(57)【要約】  本発明は、磁性ナノ粒子とコード化粒子で構成された新規なサブライブラリを生成して、そのサブライブラリからコード化磁性粒子の新規ライブラリを生成する方法を提供する。必要に応じて機能化されるこのサブライブラリは、配列を構成するのに有用である。本発明は、サンプル中の大量の検体分子間の結合相互作用の量的及び／又は質的な解析に用いる多重（平行）アッセイを実行するのに特に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
符号化磁性粒子のライブラリを生成する方法において、当該方法が：
ａ．磁性ナノ粒子の第１のサブライブラリを生成するステップと；
ｂ．符号化粒子の第２のサブライブラリを生成するステップと；
ｃ．前記第１のサブライブラリに含まれる磁性ナノ粒子にカップリングサイトを提供するステップと；
ｄ．前記第１のサブライブラリを前記第２のサブライブラリに接触させて、前記磁性ナノ粒子を前記符号化粒子に共有結合的に結合させて、前記ライブラリを形成するステップと：
ｅ．前記ライブラリに含まれる符号化磁性粒子に機能サイトを提供するステップと；
を具えることを特徴とする方法。
【請求項２】
符号化磁性粒子のライブラリを生成する方法において、当該方法が： 
ａ．磁性ナノ粒子の第１のサブライブラリを生成するステップと；
ｂ．符号化粒子の第２のサブライブラリを生成するステップと；
ｃ．前記第１のサブライブラリに含まれる磁性ナノ粒子にカップリングサイトを提供するステップと；
ｄ．前記第１のサブライブラリに含まれる磁性ナノ粒子に機能サイトを提供するステップと；
ｅ．前期第１のサブライブラリを前記第２のサブライブラリに接触させて、前記磁性ナノ粒子を前記符号化粒子に共有結合的に結合させて、前記ライブラリを形成するステップと：
を具えることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法において、前記符号化粒子が光学的識別子で符号化されていることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１または２に記載の方法によって形成された符号化磁性粒子のライブラリ。
【請求項５】
請求項４に記載の符号化磁性粒子のライブラリであって、化学的多様性（chemical diversity）が２以上であることを特徴とするライブラリ。
【請求項６】
請求項５に記載の符号化磁性粒子のライブラリが、基体上に配置されており、当該基体上の所定の領域内の平面アッセンブリに配置されていることを特徴とするライブラリ。
【請求項７】
検体と結合因子間の結合相互作用を分析する方法において、当該方法が：
（ａ）付着した目的物質を含む磁性ナノ粒子の母集団を提供するステップと；
（ｂ）付着した結合因子を含む符号化粒子の母集団を提供するステップと；
（ｃ）前記磁性ナノ粒子と符号化粒子を、前記目的物質と結合因子を結合して、付着した磁性ナノ粒子と符号化粒子を含むこれらの複合体を形成するような条件下で組み合わせるステップと；
（ｄ）目的物質と結合因子間の結合を分析するステップと；
を具えることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法において、前記目的物質がリガンドを具え、前記結合因子がリガンドレセプタを具えることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項７に記載の方法において、前記結合因子がリガンドを具え、前記目的物質がリガンドレセプタを具えることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項７に記載の方法において、前記目的物質がＤＮＡを具え、前記結合因子がオリゴヌクレオチドを具えることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項７に記載の方法において、前記結合因子がオリゴヌクレオチドを具え、前記目的物質がＤＮＡを具えることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項７乃至１１に記載の方法において、当該方法が更に、前記付着した磁性ナノ粒子と符号化粒子を具える複合体に磁界を印加するステップを具えることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法において、前記複合体が、前記磁界の印加によって検出用平面配列中に集成されることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１２に記載の方法において、前記複合体のクラスタが、前記磁界の印加によって、離隔されたクラスタの膨張アッセンブリに分けられることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項７乃至１４のいずれかに記載の方法において、前記符号化粒子が、光学的識別子で符号化されていることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法において、前記符号化粒子が蛍光的に符号化されていることを特徴とする方法。  
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、一般的に材料科学と分析化学の分野に関する。
【０００２】
本発明は、コード化磁性粒子のライブラリの製造プロセスと、これら粒子を含む平面的集成のフォーメーションの方法を開示している。また、本発明は、マルチタイプの検体と結合因子間の結合相互作用の同時解析を用いて、試料調製段階の統合を可能とする多段階バイオ解析プロトコルの方法のためのプラットフォームを開示している。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
親和性精製などの多くのバイオ解析手順や、免疫アッセイやＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイなどの多くの生化学分析では、特定の分子や成分を混合液から分離することが必要である。分子細胞生物学において、磁性化可能なポリマ粒子（ビーズ）は、この点についての試料調製に広く用いられてきている。例えば、短いオリゴ−dT保護プローブを表示した磁性ビーズは細胞のライセートからメッセンジャRNA（ｍＲＮＡ）を抽出するのに用いられる。ライセートの粒子の追加に続けて、分子は、ポリA末端が結合プローブにハイブリダイゼーションすることによって捕獲され、永久磁石によって生じる磁界勾配によってトラップされ、印加された磁界に保持され、磁界を除去することによって懸濁液中にリリースされる。（”Biomagentic Techniques in Molecular Biology,” Technical Handbook, 3rd Edition, DYNAL, 1998）。同様に、特定の細胞表面の抗原に対する抗体を表示した磁性ビーズは、所定の懸濁液から所望のタイプの細胞を選択的に抽出するのに用いられる。（”Cell Separation and Protein Purification”, Technical Handbook, 2nd edition, DYNAL, 1997）。最近の例では、トラップした細胞の光学的関連する磁性粒子を用いた磁性細胞分離の方法が記載されている。（A. G. J. Tibbe et al. “Optical tracking and detection of immunomagnetically selected and aligned cells” Nature Biotech., 17, 1999, 1210-1213）。
【０００４】
分析段階を統合することは、今日の技術では、医療分析や他の実験の自動化の導入の動機となる重要な目標であり、標準ロボット化液体操縦（ピペッティング）とプレート読み取り機による個々のウェルの分析信号を読み取ることに合わせて、多数の個別反応ウェルでできた９６−ウェル（又は、相当）のマイクロウェルフォーマットに依存している。近年、商業ロボット化ピペッティングシステムが導入されて、分離のための磁性ビーズの使用に基づいたサンプル調製の自動化が行われている。しかしながら、サンプル処理と高度同時配列フォーマットの解析の統合は、微小流体操作による生化学と分析アッセイ処置の小型化と関連して強く望まれているが、今日に至るまで開示されていない。
【０００５】
スポットやストライプ形状の平面基体上における、抗体やオリゴヌクレオチドのような多重結合因子のインプリンティングは、同時（複合）結合分析における、抗原や核酸のような多重検体の同時観察を容易にする。分析処理量を上げ、結合速度論の研究のために、この配列形式を小型化することが記載されている。（R, Ekins, F. W. Chu, Clin. Chem. 37, 955-967(1991); E. M. Southern, U. Maskos, J. K. Elder, Genomics 13, 1008-1017 (1992) ）。近年、この研究は特に拡張遺伝子解析を行うことに関連して大きな関心が持たれている。(G. Ramasy, Nat. Biotechnol. 16, 40-44(1998); P. Brown, D. Botstein, Nat. Gene. 21, 33-37(1999); D. Duggan, M. Bittner, Y. Chen, P. Meltzer, J. M. Trent, Nat. Genet. 21 10-14(1999); R. Lipshutz, S. P. A. Fodor, T. R. Gingeras, D.J. Lockhart, Nat. Genet. 21, 20-24(1999))。
【０００６】
今日までに報告されている配列構成の重要な技術には以下のものがある。：様々な基体上で少量に等分されたピントランスファやインクジェットプリンティング形態におけるプローブ溶液のオリジナルの“スポッティング”の改良（V. G. Cheung, et al., Nat. Genet. 21, 15-19(1999) ）、個別に電気的にアドレスで呼び出すことができる基体領域における結合因子の連続電気泳動析出法（J. Cheung, et al., Nat. Biotechnol., 541-546(1998) ）、空間的に溶解したインサイチュにおけるオリゴヌクレオチドの合成を促進する方法（U. Maskos, E. M. Southern, Nucleic Acids Res. 20, 1679-1684 (1992); S. P. A. Fodor, et al., Science 251, 767-773 (1991) ）、又は、オリゴヌクレオチドの共重合化（A. V. Vasiliskov, et al., BioTechniques 27, 592-606 (1999) ）である。これらの技術は、あらゆる組成のプローブの化学的アイデンィティーを表示する配列中の位置が、空間的にコード化された配列を生成する（BioTechniques 27, 592-606 (1999) ）。先行する発明の技術ではすべて、関心のある分析の開始前に配列構成を完成させておく必要がある。従って先行技術における、配列構成に関するどの技術も、関心のある結合相互作用の完了に続けて、リアルタイムで配列構成の分析ができるものではない。
【０００７】
平面基体もしくは界面の制御を受けており、境界面の面に対して直角をなす均一な磁界にある単分散磁性粒子は、様々な規則正しい二次元構造を形成する。（W. Wen, L. Zhang and P. Sheng “Planar Magnetic Colloidal Crystals” Phys. Rev. Lett., 85, (25), 5464-5466, 2000; M.Golosovksy, Y. Saado, D. Davidov "Self-assembly of floating magnetic particles into ordered structures: A promising route for the fabrication of tunable photonic band gap materials" Appl. Phys. Lett., 75, (26), 4186-4170, (1999); K. Zhan, R. Lenke, and G. Maret "Two-stage melting of paramagnetic colloidal crystals in two dimensions" Phys. Rev. Letter., 82, (13), 2721-2724, 1999）。
【０００８】
これらの粒子の合成について様々な技術が提案されている。これらの技術は、所定のアプリケーションを所望できる、所定の特性を具えた磁性粒子に費やされてきた。これらの技術は二つのカテゴリに分けることができる。第一のカテゴリは、磁性コアの合成に関し、第二のカテゴリは、磁性シェルに関する。
【０００９】
第一のカテゴリの対象となる特許は以下の通りである：
ダニエル他に付与された米国特許第４，３５８，３８８号、及びチャーモット他に付与された米国特許第５，３５６，７１３号は、懸濁重合方法を利用したプロセスを開示している。このプロセスの一つの欠点は、磁性ラテックスとなる単分散性の制御が困難であることである。また、この方法は、蛍光磁性粒子の生成に適しているように見えない。
ウーゲルステード他に付与された米国特許第４，６５４，２６７号は、パラ−磁性コアを有する粒子を生成するニトロ化方法を開示している。磁性化に続いて、その粒子は、機能性ポリマで被覆されて、形態、多分散度、孔サイズの配置、磁性装填や表面の化学反応が制御された超パラ磁性粒子を生成する反応シェルを提供する。このような粒子のコード化は、記載されていない。
チャン他に付与された米国特許第４，８７３，１０２号は、孔全体に均一に、磁鉄鉱の結晶を含む磁性ポリマ粒子を形成するプロセスを開示している。この粒子は、親水性条件下でのみ使用可能である。
チャーモット他に付与された米国特許第５，３５６，７１３号は、生物学的応用には有用であるが、粒度分布によって他のアプリケーションが制限される磁性化可能な合成ミクロスフェアを開示している。
ホーンズ他に付与された米国特許第５，５１２，４３９号は、一本鎖核酸に用いることのできる、複数のオリゴヌクレオチド分子を運ぶ単分散、超磁性粒子を開示している。このヌクレオチドは、共有結合か、親和性結合をしうる。
リバティーに付与された米国特許第５，６９８，２７１号は、磁性反応粒子の製造方法を開示している。この粒子は、様々な予備的かつ診断的な技術に応用できる。
オーウェン他に付与された米国特許第５，８６６，０９９号は、免疫分析技術や生物学／医学的応用に有用な磁性−ポリマ粒子を開示している。この粒子は、座標サイトを有するポリマの存在下で、遷移金属の共沈降（co-precipitation）によって生成される。
【００１０】
第二のカテゴリにおける対象となる特許は以下のものを含む：
ササキ他に付与された米国特許第５，７３６，３４９号は、免疫分析法に用いるコアとコーティング層を具える磁性粒子を開示している。抗原もしくは抗体はコーティング層の表面に結合している。
スータ他に付与された米国特許第５，６４８，１２４号は逆の電荷を帯びたコア粒子と磁性粒子を用いたヘテロ凝集による磁性粒子の製造プロセスを開示している。
ワン他に付与された米国特許第６，０１３，５３１号、第５，２８３，０７９号、第５，０９１，２０６号は、磁性応答ポリマ粒子の製造プロセスを開示している。この粒子は、磁性反応金属酸化物を含むポリマ層で均等にコーティングされたポリマコア粒子を具える。これらの磁性応答ポリマ粒子の表面は、さらに機能性ポリマ層でコーティングされている。これらの磁性反応ポリマ粒子は、受動結合もしくは電子共有結合する生物材料として使用することができ、また、様々な免疫分析用の固体相として使用することができる。
【００１１】
染色磁性粒子の合成についての幾つかの方法が、記載されている。ワンに付与された米国特許第５，３９５，６８８号は、磁性に反応する金属酸化物層で均等にコーティングされた蛍光ポリマコア粒子で構成された、磁性に反応する蛍光ポリマ粒子の製造プロセスを開示している。この方法は、水中にスチレンエマルジョンと、磁性酸化物を混合して重合した金属機能性蛍光ポリマコア粒子を利用している。このような二段階反応プロセスは、蛍光色素による重合化の阻害の可能性、もしくは逆にシェル重合化プロセスによる蛍光が漂白されるという、重合化が阻害される可能性がある。所定の固体相分析のキャリブレーション用に、蛍光標識を含んだこのような磁性粒子を利用する旨は、米国特許第６，０１３，５３１号に記載されている。この段階に続いて、粒子は、機能性ポリマによって被覆され、反応シェルを提供する。
【００１２】
分散したコロイド状のものからのコア−シェル粒子の生成は、マルチステップ（重相）戦略によってなし得る。このプロセスは、層構築のための一次静電相互作用を利用しており、コロイド粒子上の荷電ポリマ、もしくは、ナノ粒子、または、逆の電荷をもった電解質の吸着を、含む。（Caruso et al “Magnetic Core-Shell Particles: Preparation of Magnetite Multilayers on Polymer Latex Microspheres” Adv. Mater. 199, 11, 950-953）。静電気の物理吸収を応用したシェルがバイオ分析に好ましくないのは、分析条件、特に塩分濃度が変化する場合に、化学的に不安定な状態であり、荷電した生体分子の非特異的吸収とその変性を促進するからである：先行技術文献に記載されているこの粒子は、本明細書で意図するアッセイフォーマットには、適さない。
【００１３】
上述の文献も磁性粒子の利用について開示しているが、どの従来技術も適当なサイズの範囲、実質の単一分散度、化学的機能化と合成のフレキシビリティを含む、ここで述べる分析の実行に必要な臨界に合致した特性を有するものはない。後者では必要に応じて機能化するコード化磁性粒子のライブラリを高速で構築することが可能であり、これらのライブラリにおける化学的多様性は２以上である。さらに、磁性粒子は、相当量の分析における定性的性能を保証するために、再生産可能なアセンブリの規定配列を許容する品質基準を満たさなければならない。
【００１４】
発明の概要
本発明は、複合分子相互作用分析のためのバイオ分析アッセイの装置に関する方法、構成およびプロセスを提供する。本発明のプロセスは、そのコード化に基づいて判別可能な、多数のコード化された磁性粒子の多様性を用いる。これらの粒子は、結合因子を表示するものであり、この結合因子はこのような粒子と接触すると、一もしくはそれ以上の特定な検体と相互作用が可能である。
【００１５】
本発明は、コード化された粒子と多数の磁性ナノ粒子でできたコンポジットである粒子（コンポジット粒子）のライブラリを準備するためのプロセスを提供する。このようなコンポジット粒子は、特定の分析に利用できるようにするために機能化することができる。このような機能化の例としては、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ペプチドもしくはタンパク質等の結合因子の含有がある。このようなコンポジット粒子は、例えば表示された結合因子の性質を反映するように選択された符号などの、光学的に区別可能な符号であり、このコンポジット粒子とそれに関連する結合因子は、インサイチュにおける検査によって、リアルタイムで区別可能である。規格ビーズの配列は、このようなライブラリを用いて必要に応じて製作することができる。このような配列は、複合分子相互作用解析を伴う分析等の、バイオ分析に有用である。
【００１６】
ここで開示されているバイオ分析のプラットフォームは、サンプルの獲得と準備、プロセシング及び分析を含む主要分析段階を統合するために、コンポジット粒子のライブラリを使用する。好ましい実施例においては、分析は、高度に平行なビーズ配列フォーマットで行われ、そこでは、試料準備と処理ステップが完結した後、配列がリアルタイムで組み立てられる。
【００１７】
好適な実施例の詳細な説明
アプリケーションに特化したビーズ配列の製造は、従来の液体取扱技術と実験自動化装置を用いて自動化することができる多段シーケンスの連続の多重プロセスを含んでいる。本明細書に記載されたランダムコード化アレイ検出（ＲＥＡＤ）プロセスは、ランダムコード化配列の構成だけでなくバイオ分析におけるこの配列の使用も含む。このバイオ分析はＤＮＡとタンパク質の分析で例証されるように、多重分子間相互作用分析を含むが、検体と結合分子間の相互作用に限定されない。本明細書に記載されているランダムコード化配列と米国特許第６，２５１，６９１号は、多段シーケンスを行うプロセスに関係する多くの欠点を克服している。
【００１８】
ここで用いられているとおり、“検体”と“結合因子”の用語は、結合相互作用に伴う分子を意味する。例として、検体と結合因子は、ＤＮＡもしくはＲＮＡ断片（例えばオリゴヌクレオチド）、アプタマ、ペプチド、タンパク質、抗原、小さな有機分子が含まれうる。特定の分析において、これらの断片のその相補配列（ハイブリダイゼーション）への結合が、分析される。他の特定の分析において、リガンドと受容体間の結合相互作用が分析される。
【００１９】
ここで用いられているとおり、「粒子」の用語は、コロイド粒子やビーズを意味する。また「粒子」の用語は、本発明のコード化粒子や磁性粒子に関連しても、用いられる。
【００２０】
ここで用いられているとおり、「磁性粒子」の用語は、永久もしくは誘導化双極モーメントを有している粒子を意味する。
【００２１】
図１は、規格ビーズ配列を準備し、本発明の複合生体分子分析を実行するのに使用する機能的構成要素とプロセスを示す。この配列は、アプリケーションに特化した基体（例えば、ウェハ−スケールのチップ）を製造するセパレートバッチプロセスを用いて準備され、コード化され機能化（例えば、１０８個／懸濁液１００マイクロリットルのビーズスケール）されているビーズを製造するか、又は、コード化され磁性機能化されたビーズを製造する。ビーズは、配列アセンブリの前に形態学的および電気的特性の決定などの各品質管理（ＱＣ）が行われる。加えて、実際の分析は、ビーズが基体に導入される前に、懸濁液中のビーズ上で行われ、一般的に分析感度と特異性を最大化しビーズ間の変動を最小にする目的で、分析条件を最適化する。基体用の、品質管理段階は光学的検査、偏光解析法や電子伝達測定を含む。
【００２２】
化学的にコード化され及び生物学的に機能化されたビーズが、一旦、基体（例えば、チップ）に結合されると、米国特許第６，２５１，６９１号（“ＬＥＡＰＳ”）に記載されて、ＰＣＴ／ＵＳ９７／０８１５９に記載されているプロセスと関係しているプロセスが、同じ流体相の基体上の所定の領域上での密集した配列の高速集成に用いられて、再編成もしくはプロセスの再設計を必要とすることなくチップ間の変化性だけでなくスポット間の変化性に寄与する問題を防ぐ。さらに、このビーズ配列フォーマットは、配列条件の最適化だけでなくチップに依存しないビーズ特性を許容する。さらに、多重ビーズ配列は、同一チップ上に保持されている別個の流体コンパートメント中で同時に形成することができる。一度形成されると、これらの多重ビーズ配列は多重サンプルの同時発生プロセスに用いられる。微小流体を伴うＬＥＡＰＳは、タンパク質とＤＮＡの平行解析用に、自動保持され、小型化され、光学的にプログラム可能なプラットフォームを製造する。米国特許第６，２５１，６９１号とＰＣＴ／ＵＳ９７／０８１５９はここに引用されている。
【００２３】
本発明の実施例において、化学的コード化は、励起波長、放出波長、励起状態の寿命、もしくは放出強度によってスペクトル的に識別可能なこのような一もしくはそれ以上の蛍光色素などの、光学的に識別可能なタグのセットを伴う染色ビーズによって行うことができる。この光学上判別可能なタグは、例えばフウィラーの米国特許第４，７１７，６５５号において開示されているように、特定の比率でビーズを染色するのに用いられている。染色は、当業者に公知の方法で粒子を膨張させて行われる（Molday, Dreyer, Rembaum & Yen, J. Mol. Biol. 64, 75-88 (1975); L. Bangs, “Uniform Latex Particles”, Seragen Diagnostics, 1984 ）。例えば、１２種までのビーズは、膨張と二色のバルク染色によってコード化され、各々四つの強度レベルで、四つの公称モル比で混合される。外表面及び内表面のカラーコード組合せは、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／１０７１９に開示されている。
【００２４】
ビーズは、例えば、いくつかある公知技術のカップリング反応（G. T. Hermanson, Bioconjugate Techniques (Academic Press, 1966); L. Illum, P. D. E. Jones, Methods in Enzymology 112, 67-84 (1985)）の一つを用いて、公知のプロセスで、ＤＮＡ（オリゴヌクレオチド）もしくはＲＮＡ断片、ペプチドもしくはタンパク質、アプタマと生化学低分子を含む結合検体分子をビーズに付着されることによって、機能化される。本発明の実施例では、機能化されたビーズは、ビーズに共有結合している結合検体分子（例えばＤＮＡ、ＲＮＡもしくはタンパク質）を有している。ビーズは、必要とされるまで緩衝バルク懸濁液内で保持される。機能化は一般的に一段階又は二段階の反応を必要とし、この反応は標準液体ハンドリングロボットと９６ウェルフォーマットを用いて平行に行って、図２に示すように所望の機能を所定のビーズに共有結合させる。好適な実施例においては、コア−シェル構造のビーズが使用される。シェルは好適な構造が選択された薄い重合体ブロッキング層でできていている。機能化は、当技術分野で知られているターゲットの解析アプリケーションに従って行われる。サンプルは、自動品質管理測定用に取り出される。ビーズの各バッチは、何百何千のチップ用材料を供給するため、チップ間の差は最小にする。
【００２５】
本発明で用いられている基体（例えばチップ）は、ＬＥＡＰＳの界面パターン法に従いパターン化を行っている。このパターン法は、例えば、印加したＡＣ電界下で所望のインピーダンス勾配の構築するための、酸化物もしくはその他の誘電性のパターン化された成長などである。パターンは、所望の形状のＡＣ電界で誘導した流体の流れをつくり、これに対応して粒子を移動させるように設計されている。図３に示されているように、基体は、半導体プロセシング技術を用いることによって、ウェハ−スケール上でパターン化される。さらに、基体に、ＵＶ−パターン可能な光学に透明なポリマの薄膜を蒸着してコンパートメントを造り、流体コンジットの所望のレイアウトを基体上に付加して、一もしくはいくつかの別々のコンパートメントに流体を封じ込めて、所定の基体上に多数のサンプルを保持する。
【００２６】
本発明の実施例では、ビーズの配列は、第二の平面電極に実質的に平行な第一の平面電極（“サンドイッチ”構造）を提供することで準備される。“サンドイッチ”構造は、ギャップで離隔された二つの電極を有しており、電解質溶液を含有する。第二の電極の表面もしくは内部は、界面パターン法でパターン化されている。コード化され機能化されたビーズは、ギャップに誘導される。ＡＣ電圧がギャップに印加されると、ビーズは、第二の電極上（例えば、“チップ”）にランダムコード化配列を形成する。そして、ＬＥＡＰＳを用いて、ビーズの配列が感光性電極（“チップ”）上に形成される。好ましくは、上記のサンドイッチ構造は、平面感光性電極やその他の平面電極にも用いられている。同様に、二本の電極は、ギャップにより隔てられており、電解質を含有している。機能化されコード化されたビーズは、ギャップに誘導される。光と合わせてＡＣ電圧を印加すると、ビーズは感光性電極上で配列を形成する。
【００２７】
実施例では、本発明で有用なアプリケーションに特化したビーズ配列は、特定の配列組成によって個々の貯蔵器から所定のコード化されたビーズのアリコートを取り出すことによって製造され、“プールされる”。プールされた懸濁液のアリコートは、アリコート同士の初期の融合を避けるように選択された基体（例えば、チップ）上に分配される。アリコートは、複数のコード化ビーズの平面ランダム副配列を形成し、各副配列は、識別可能なプールより取り出されたビーズを表しており、物理的配列レイアウトは、プールされたビーズ群より取り出されたアリコートの同一性に対応する。
【００２８】
基体上で化学的又は物理的にコード化されたコード化ビーズの平面配列もしくはアセンブリが用いてもよい。これに、空間的コード化も追加して、実行される分析数を増すようにしている。例えば、空間的コード化は、ＬＥＡＰＳを用いた配列アセンブリの過程で、一つの流体相中で行われ、交流電界に応じて、及び／又は、基体上の投影された光のパターンに応じて、所望の形状の平面ビーズ配列を集成する。ＬＥＡＰＳは、シリコンチップと溶液間の界面のインピーダンスで横方向に勾配をつけて、配列アセンブリを行う電気流体学的力を調節する。電気的要件はあまり大きくなく、一般的に１０Ｖｐｐ以下のＡＣ低電圧が、二本の平面電極間の一般的に１００μｍの流体ギャップに印加される。このアセンブリプロセスは高速で、光学的にプログラム可能である：数千のビーズを含有している配列が、電界下で数秒以内で形成される。多重の副配列のフォーメーションは、コンパートメント化されたチップ表面上で保持される多重流体相に生じる。
【００２９】
本発明の多重分析も、一つの配列上でなく、基体表面上で集成されたコード化ビーズを用いて行うようにしてもよい。例えば、ビーズ懸濁液を基体の多重領域にスポッティングし、重力でビーズを定着させることによって、ビーズのアセンブリを基体上に形成することができる。ＬＥＡＰＳによるビーズ配列形成とは反対に、これらのアセンブリは、一般的に低密度で不規則構造と仮定される。しかしながら、基体上の多数の区別できる位置に化学的なコード化がされたビーズの混合液をスポッティングすることで得られる空間と色のコード化の組合せは、所定の生物学分析用に充分な多様性を提供する。
【００３０】
これらのビーズ上の結合因子と検体間の結合相互作用は、コード化配列が基体上に集成される前か、もしくは後に行われる。例えば、ビーズ配列は分析の後に形成して、次いで配列の分析画像と復号画像を撮るようにしてもよい。代替として、ビーズを配列上に集成し、物理的又は化学的手段により固定化して、例えば、図１０に示す配列の外観を伴うランダムコード化配列を製造するようにしてもよい。この配列は、例えば、ＤＣ電圧を印加することで、図１０に示される配列の外観を伴うランダムコード化配列を製造することができる。このＤＣ電圧は、一般的に５−７Ｖ（２−６μｍのビーズ用で、１００−１５０μｍのギャップサイズ用）に設定し、逆バイアスで３０秒間以下の印加をすると、Ｎ−ドープシリコン基体がアノードを形成し、配列を圧縮して、配列中の隣接するビーズ間の接触を促進し、同時に、電極表面の近位で、高電界領域に向かってビーズを移動させる。一旦、充分な近接上にあると、ビーズは物理吸着をおこすファンデルワールス力によって固定される。この吸着プロセスは、ビーズ表面から延在する“鎖”をビーズ表面上に提供することにより促進される。ポリリジンとストレプタビジンが、この目的に用いられる。
【００３１】
実施例では、この粒子配列は化学的手段、例えば、ゲル−粒子フィルムの複合体を構成することにより固定化される。このようなゲル−複合体粒子フィルム形成する例では、微小粒子の懸濁液が提供される。この懸濁液は、続いて起こるインサイチュゲルフォーメーション用のすべての成分、すなわちモノマ、クロスリンカ、イニシエータ、を含む。この粒子は、ＬＥＡＰＳアプリケーションによって基体上の平面的アセンブリに集成される。例えば、数ヘルツから数キロヘルツの周波数範囲で１−２０Ｖｐ−ｐのＡＣ電圧が、電極と流体ギャップ間に印加される。配列アセンブリに続いて、〜４０-４５℃に細胞を加温することにより印加されたＡＣ電圧下で流体相の重合化が生じる。ゲル中に粒子配列を効果的に捕獲するために、この加温には、ＩＲランプや、水銀ランプ源を光度計的に用いる。ゲルは、モノマ濃度が２０％から５％（アクリルアミド：ビスアクリルアミド＝３７．５：１のモル比）の範囲でアクリルアミドとビスアクリルアミドの混合液、から構成されている。または、その他低粘性水溶性モノマやモノマ混合液も使用される。このプロセスで化学的に固定化され機能化された微小粒子配列は、多様な生物学分析、例えばリガンド−レセプタ結合分析に用いられる。
【００３２】
一の実験例では、サーマルハイドロゲルは、サーマルイニシエータとして、アゾジイソブチルアミド基のあるジハイドロクロライドを用いて形成される。このジハイドロクロライドは、重合体混合液全体のイオン強度を、０．１ミリモーラから１．０モーラの範囲に低下させ低濃度で形成される。ＵＶ重合化に用いられるこのイニシエータは、Irgacure 2959?（２−ヒドロキシ−４’−ヒドロキシエトキシ−２−メチルプロピオフェノン、Ciba Geigy、Tarrytown、NY）である。このイニシエータは、重量溶液で１．５％になるようにモノマに付加される。
【００３３】
実施例では、粒子配列は化学的方法によって固定化される。例えば、マイクロウェルの配列は、シリコン基体の低インピーダンス領域で、標準的な半導体製造方法によって製造される。粒子配列は、例えば、ＬＥＡＰＳを用いて流体力学的力とポンデロモーディブ力を利用して、ホール配列上に粒子と移動集積した構造を用いて形成される。ＡＣ電界をオフにすると、粒子がマイクロウェル内に捕獲され、従って、機械的に閉じこめられる。過剰なビーズは、基体表面上の幾何学的に秩序化されたランダムビーズ配列を残して除去される。
【００３４】
分析前にビーズ配列が固定化されると、配列は、二次元親和性マトリックスとして機能する。二次元親和性マトリックスは、配列に接触させる溶液からの検体もしくはリガンド（ＤＮＡ、タンパク質、又はその他小さな同じ性質のリガンド）を捕獲するためのレセプタ又は結合因子（例えば、オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、アプタマ、抗体、又はその他のタンパク質）を表示する。このビーズ配列のプラットフォームは、例えば、ジェノタイピング、遺伝子発現プロファイリング、タンパク質レベルの伝達や酵素研究である多重分子分析を行うために用いられている。
【００３５】
基体（例えば“チップ”）は、一又はそれ以上の密閉コンパートメント内に配置し、試料と試薬を、流体的インターコネクションを介してこのコンパートメントの内外へ輸送することができる。チップ上のサイトカイン用の免疫分析、例えば、インターロインキン（ＩＬ−６）は、このフォーマットで行われる。血清試料や蛍光ラベル化二次抗体は、反応チャンバにシーケンシャルに導入され、チップ上に固定化されたビーズと反応させる。図５は、本発明による多重分析で用いられる反応チャンバの設計を示している。反応は、マイクロタイタープレートに類似した、オープンコンパートメントフォーマット上で行うようにしてもよい。試薬は、ロボティック液体ハンドリング装置によりチップのトップにピペットで移され、多重の試料が同時に処理される。このようなフォーマットは、標準試料プロセシングとマイクロタイタープレートフォーマット用に液体ハンドリングを適用し、試料プロセシングと配列検出を統合している。
実施例では、検体−結合因子相互作用の存在は、相互作用におけるビーズの光学的サインの変化と、検出され分析されるこれらの光学的変化に関連する。この相互作用に含まれる結合因子のアイデンティティは、これらのビーズと関連する化学的又は物理的に識別可能な特徴を検出することにより決定される。好ましくは、化学的に識別可能な特徴は、結合分析の検出用として用いられる蛍光色素、発色団やその他の化学分子を含む。
【００３６】
化学的又は物理的に識別可能な特徴の検出や、結合相互作用に関連した光学的サインの変化の検出は、粒子が基体上で平面配列で集成されている間に、例えば、分析や配列の復号画像を撮像し、その二つを比較して行われる。比較は、例えば、画像検出器、コンピュータ化された画像捕獲や解析装置を有する光学顕微鏡装置の使用を含む、分析と復号画像の比較である。復号画像は、ビーズ表面上に表示された結合因子をユニークに同定する、化学的及び／又は物理的識別可能な特徴を決定するのに使用される。この同定は、例えば、判別可能な特徴により、配列中の各集成粒子上の結合因子のアイデンティティを決定することで行われる。この配列の集成画像は、結合因子と検体複合体の光学的サインを検出するために撮像される。実施例では、蛍光タグ（蛍光色素）は、検体がビーズに結合すると、蛍光強度が変化し、従ってビーズ上の光学的サインは変化するように検体に付加される。実施例では、ビーズが配列に集成され、固定化された後で、分析画像を撮像する前に、好ましくは、検体を伴うビーズ上の結合因子と接触する前に、復号画像を撮像する。他の例では、ビーズが溶液中にある間に、結合相互作用は生じ、配列に集成された後で、復号と分析画像が得られる。
【００３７】
結合因子−検体複合体の結合因子の同定は、分析画像と復号画像の比較によって行われる。
【００３８】
好適な実施例では、画像解析アルゴリズムは、復号と分析画像より得られたデータの分析において有用である。これらのアルゴリズムは、配列中の各ビーズについての量的なデータを得るのに使用してもよい。図７に要約されているように、解析ソフトウエアは、テンプレートとしての配列の明視野画像を用いて、自動的にビーズの中心を決め、タイプによりビーズをグループ分けし、定量的強度を個々のビーズに割り当て、血清サンプルの不定形な“マトリックス”材料より生じるような“欠点”を排除し、バックグラウンド強度統計を解析し、対応する変化に伴うあらゆるビーズのタイプについて補正されたバックグラウンド強度を評価する。
【００３９】
本発明の方法は、結合定数と解離定数を決定するのに用いる。この決定は、例えば、検体を時間依存的に導入し、時間の関数としての結合を解析するか、もしくは、時間依存的に、結合した検体を洗い流し、時間の関数としての結合を解析するなどによって行う。
【００４０】
本発明の方法は、検体−結合因子間相互作用の親和性定数の決定、形成された検体−結合因子複合体の数を決定するのに用いてもよい。
【００４１】
本発明は、生物学的サンプルの検体濃度を決定する方法も提供する。
【００４２】
本発明は、結合因子のパネルに対して、所定の検体のコアフィニティ（co-affinity）マトリクスの要素の決定にも用いられる。一の例では、競合する、マルチ成分の平衡反応で、パネル上の検体と結合因子間の相互作用の大きさが決定される。コアフィニティ定数の決定は、下記のように有用なアプリケーションを提供する。
【００４３】
数種類の組織の移植の成功率は、提供者と受容者間のヒト白血球抗体（ＨＬＡ）の競合に直接関連している。パネル反応抗体（ＰＲＡ）のための受容者の血清学的試験は、生じうる拒絶反応を避けるための非常に重要なステップの一つである。ＰＲＡ試験の交差反応は、ＨＬＡ抗原のいくつかの構造の類似性と、これらの抗体の発現の性質による共通の現象である。事実、ＨＬＡ抗原は、グループ間の明確な血清学的な交差反応性に基づいてグループに組織化することができる。これらのグループは、クロス−リアクテビティグループ（ＤＲＥＧｓ）と呼ばれる。現在の医療状況において、患者からの抗体は、個々の反応における異なった抗原に対して試験される。抗体の反応性のパターンは、異なった反応の結果を組合せてできるが、異なった抗体と抗原間の相互作用の競合する性質は、このようなパターンに反映されていない。他の場合では、幾つかの抗原が、結合分析用に混合される。このシステムにおける、各抗原のアイデンティフィケーションの欠如は、結合プロファイルの生成を妨げる。この結果、幾つかの抗原からの平均的な信号のみになる。このビーズ配列システムでは、異なる抗原のパネルは、競合する結合環境において抗体の検体に与えられ、各抗原は異なるタイプのビーズとの関係を介して、同定することができる。このように、競合反応における各抗原上の結合強度は、一つの分析において導き出すことができる。このコアフィニティマトリックスシステムは、ＤＲＥＧｓ用の結合プロファイルを提供し、反応の性質の理解を飛躍的に前進させ、関連する医療的な決定の精度を向上させる。例えば、Ｎ−抗体とＭ−抗原のシステムは、Ｎ×Ｍの可能な反応のマトリックスを提供する。ｍ番目の抗原に対するｎ番目の抗体間の（ｍは１、２、、、Ｍ、一方ｎは１、２、、、Ｎとする）相互作用を支配する親和性定数、Ｋ−ｎｍを決定することが可能である。絶対的な親和性定数は必要としないアプリケーション用に、本発明の方法によって、様々な抗体について結合プロファイルが生成され、患者サンプルからの結果はこれらのプロファイル、あるいはこれらのプロファイルの組合せに適合する。
【００４４】
コフィニティマトリクスは、検体の特徴づけにも用いられる。例えば、コフィニティマトリクスの定数と、結合因子複合体のフォーメーションに関係する検体と結合因子の既知の濃度、との組合せは、競合する結合相互作用ディスクリプタを明確にするのに役立つ。例えば、分子相互作用パラメータ、
【数１】
2005514618.tif 000002
は、この結合因子について、すべてが有限の親和性Kｍｊを現す、検体｛Lｊ；１≦ｊ≦Ｎ｝の存在下で、結合因子Rm、と検体Ln間の分子相互作用の特徴化を提供する。すなわち、Ｐｎ、０≦Ｐｎ≦１は、マルチ構造の競合反応において、検体Ｌｍに対する結合因子Ｒｍのノーマライズされた特異度を表し、マルチ構造の競合反応において示されるコフィニティに基づく結合因子の強い特徴付けをおこなう。ここに引用されているP. H. von Hippel et al., Proc. Natl. Sci. USA 83, 1603(1986)、参照。
【００４５】
結合因子のパネルに対する検体の結合相互作用のパターンは、検体の特徴化と検体と他の分子との比較に用いられる。さらに、結合因子の基準パネルを用いた検体のコフィニティマトリックスの作成により、このような親和性は、結合パターンからのずれを観察することで、結合因子のパネルに後から導入されたサンプルが、不純物を含んでいるか否かを決定するのに用いられる。
【００４６】
本発明は、又、米国特許第５、７５９、８２０号と欧州特許第８３９０１４０６．５（sitntef）に記載されている、スーパーパラマグネチック粒子（“磁性粒子”）の使用を提供する。前記特許には、コード化ビーズ配列を含む分析段階を伴うサンプル調整段階の統合に用いることができる。前記二つの文献は、ここで引用されている。
【００４７】
スーパーパラマグネチック粒子は、化学的に又は物理的に識別可能な特徴（例えば、蛍光タグ）でコード化され、本発明のバイオ分析の実行に用いられる。実施例では、粒子はＬＥＡＰＳを用いて、非磁性コード化粒子として集成される。このコード化ナノ粒子は、配列生成にも用いられ、分析される。本発明は、粒子に磁界を印加することにより、基体上のコード化され機能化されたスーパーパラマグネチック粒子の平面配列のフォーメーションも含む。
【００４８】
本発明は、色コード化ビーズを製造するための新規なプロセスであり、十分に制御された量の磁性ナノ粒子を、実行された重合化微小粒子に導入する単純で順応性のある一段階プロセスを提供するものである。十分に制御された量の一もしくはそれ以上の蛍光色素を伴って、色コード化ビーズは、下記工程に従って製造される。本発明の実施例では、磁性ナノ粒子の量を制御して、前記粒子に磁界を印加したときに、基体上の配列を形成する磁性粒子を製造する。このプロセスは、染料と磁性ナノ粒子を含む有機溶剤中でポリマ粒子を膨張させるステップを含み、従って、マイクロ粒子の蛍光色素に関する先行技術で開示されているような標準膨張工程におくことができるあらゆる重合体粒子に適用できる。磁性材料と蛍光色素が、磁性粒子の（コア／シェル）の異なった領域にそれぞれ位置するコード化方法とは異なって、粒子の均一な膨張は、内積中にくまなく磁性粒子を確実に分布させる。このプロセスは、ナノ粒子の色素含有量を広領域にわたって量的に制御し、従って、粒子の磁性感受性だけでなく蛍光強度の調整がなされる。本発明の更なる方法は、ローディングの制御とは別に宿主粒子の磁性特性を制御し、ミセル合成反応（下記参照）の水分を調整することにより、磁性ナノ粒子のサイズを整えることである。粒子表面の生体分子の物理的もしくは化学的カップリングには、既存の官能基を用いる。磁性ナノ粒子の溶出は、粒子上のさらなる重合体シェルの成長によって容易に排除される。
【００４９】
本発明は、又は、二段階プロセスによって、コード化磁性粒子のライブラリを製造する新規プロセスを提供する。プロセスの第一段階は、磁性ナノ粒子のサブライブラリの製造を含み、プロセスの第二段階は、コード化粒子のサブライブラリの製造を含む。下記に更に詳細に述べるとおり、ライブラリフォーメーションに続いて、各サブライブラリのメンバーは、カップリングサイトを付加され、又、機能化される。
【００５０】
磁性ナノ粒子のサブライブラリは、モノマ溶液と金属酸化物の分散を組合せ、金属酸化物の粒子をカプセルに入れた粒子の重合体マトリクスを形成することにより製造することができる。金属酸化物の分散は、金属酸化物を含み、単一でのもしくは別の金属酸化物と組合せて使用する。金属酸化物は、これに限定するものではないが、酸化鉄、マグネシウム、コバルト、亜鉛、ニッケル、銅、他を含む。モノマは、これに限定するものではないが、スチレン、メチル−メタクリル酸、アクリルアミド、アクリル酸エチレン−グリコール、ヒドロキシ−エチル−メタクリル酸、ビニル−トルエン、ジビニル−ベンゼン、他を含む。代替として、重合体溶液が用いられ、セルロース、タンパク質重合体、ガラス、アガロース、ゼラチン、もしくはこの類似物などの重合体材料を含んでいてもよい。この磁性ナノ粒子は、どのようなサイズ形状でもよいが、好適には、球状、単分散で、約０．０１から約１ミクロン、好適には約０．０５から約０．４ミクロンである。
【００５１】
コード化粒子のサブライブラリは、重合体材料中の光学的識別子をカプセル化することによって形成することができる。重合体材料は、一のポリマを含み、単一でもしくは組合せて用いられる。ポリマは、これに限定するものではないが、ポリスチレン、ポリメチル−メタクリル酸、ポリ−アクリルアミド、ポリ−エチレン−グリコール、ポリ−ヒドロキシ−エチル−メタクリル酸、ポリビニル−トルエン、ポリ−ジビニル−ベンゼン、臭素化ポリスチレン、ポリアクロレイン、ポリエチレン、ポリウレタン、ポリビニルクロライド、ポリビニルアルコール、もしくはこれらの組合せ、他を含む。光学的識別子は、一もしくはそれ以上の発光波長が２００ナノミリと１２００ナノミリ間の色素を含む。好適な色素は、ピロメタンとクマリン色素を含むが、これに限定されるものではない。識別可能な発光スペクトルを伴う一以上の染料は、同時に用いられ、発光スペクトラムに基づいて選択される。
【００５２】
本発明のコード化粒子は、どのようなサイズと形状でも良いが、重合体で、球状で、単分散で、約０．６から約１００ミクロン、好適には約１．５から約１０ミクロンのものが好ましい。
【００５３】
以下の実施例と実験例で示されるように関心のあるアプリケーションによって、本発明の各サブライブラリは、規格化することができる。一つの実施例では、このような規格化は、磁性ナノ粒子によって関心のあるアプリケーションに基づいて選択されたカップリングサイトと機能性サイトをもたせることによって行われる。このようなサイトは、磁性粒子の外側表面に、関心のある分子グループを付加することにより形成される。カップリングサイトは、重合化ステップ中に形成され、機能性サイトは後のステージで、図のようなコンポジット粒子の形成前に、形成される。カップリングサイトの作成への本発明の分子の適応性は、これに限定するものではないが、エステル、アミン、アルデヒド、アルコール、もしくはハロゲン化物のような、あらゆる基を含む。機能化サイトの作成に本発明を適用可能な分子は、これに限定されるものではないが、ソトレプタビジン、アビジン、ニュートラビジン、ビオチン、タンパク質Ａ、他を含む。分子をあらかじめの選択することは、本発明の磁性ナノ粒子に特定機能サイトをもたせるために、所定の分析のパフォーマンスで有用な所定のクラスのサブライブラリをコンパイルする能力を提供する。本発明の実施例の図において、関心のある核酸の存在を検出する分析を行うために、一もしくはそれ以上のオリゴヌクレオチドまたはｃＤＮＡのカップリングを可能にする適応可能な機能性サイトを提供する。本発明の実施例の別の図では、関心のあるタンパクの存在を検出する分析を実行するために、関心のあるタンパクの検出、もしくは調整用の、一もしくはそれ以上の抗原又は抗体のカップリングを可能にする機能性サイトを提供する。このような機能性カップリングは、本発明のコンポジット粒子の形成の前に、又は、形成に続いて実行される。
【００５４】
一般的に、前述の官能基とカップリング基は、公知の方法を用いた共有結合的付加により、磁性ナノ粒子の外側表面に付加することができる。磁性ナノ粒子上に関心のあるサイトを形成することに続いて、磁性ナノ粒子のサブライブラリを、コード化粒子と接触させる。磁性ナノ粒子は、周知の方法を用いてカップリングサイトを介してコード化粒子との付加させることができ、一方で、機能性サイトは付加されないままであり、関心のある分析の実行が可能である。
【００５５】
本発明の別のアプリケーションでは、次の実験例で示すように、本発明のコンポジット粒子の金属酸化物のローディングを、関心のある磁性反応を起こすように制御し、調整することができる。これは、コード化粒子の表面に結合する磁性ナノ粒子の数を制御することにより実行することができる。
【００５６】
本発明の別のアプリケーションにおいては、次の実験例で示すように、コード化粒子中の光学的識別子が、特定の比率で混合されており、関心のあるアプリケーションの目的を実行する。光学的識別子の比率の制御は、米国特許第４、７１７、６５５号で開示されている方法のような周知の方法を用いて実行することができる。
【００５７】
磁性ナノ粒子のサブライブラリの規格化に続いて、次の実験例で示すように、コンポジット粒子のライブラリは、多重に機能化された磁性ナノ粒子を、コード化粒子の外側表面に共有結合的に付加することによって形成される。コード化粒子のプロパティは、実行する分析に基づいてあらかじめ選択する。ここで例えられているように、本発明のコンポジット粒子のライブラリ中に存在する化学的多様性は、２以上である。別の実施例では、本発明のコンポジット粒子は、分析自体を実行している間に製造することができる。この分析は、本発明の磁性ナノ粒子上に表示されている一の官能基と、本発明のコード化粒子上に表示され、第二の分子群間の結合相互作用を引き起こして、本発明のコンポジット粒子を生成する。分析の過程で、本発明のコンポジット粒子の検出用配列フォーマットの調整、官能基と分子群間の複合体形成の結果として、磁性粒子と非磁性粒子で構成されたヘテロ構造が形成される。
【００５８】
本発明のコンポジット粒子は、米国特許第６、２５１、６９１号に開示されている界面のパターン化に従って、パターン化された基体上に的確に処理される。パターン化に続いて、本発明のコンポジット粒子の配列が、“サンドイッチ”構造を利用して提供される。
【００５９】
本発明のコンポジット粒子も、的確に処理され、磁界に応じて規則的配列に集成される。磁界の勾配は、コンポジット粒子（〜1/2（XV/μo）del(B2)）上に力を与える。ここでXはコンポジット粒子の磁性感受性、Vはその量、Bは磁界の大きさ（磁束密度）であり、その方向と大きさは、磁界分布と磁界強度の性質に依存する。均一な軸方向と局所的な磁界勾配発生構造の適切な組み合せは、配列フォーマット中で本発明のコンポジット粒子を捕獲し、固定化（可逆的）するのに用いられる。二次元配列の形成だけでなく、粒子の固定化をするこの能力は、緩衝液の交換と多重洗浄段階を含むマルチステップ分析の実行に関連する、特定の適応性を有する。均一な軸方向だけでなく垂直方向に変化する勾配をつける特定の有用な構造は、各々の電界、磁界方向が逆向きであるような電磁コイルである。従って、コイル間のギャップ、もしくは一対のコイルに対するサンプルの相対的な位置の調整、及びコイルの電流を変化させることにより、本発明のコンポジット粒子上の力（〜1/2（XV/μo）Bdb/dz）を、制御することができる。
【００６０】
磁界強度が増大する作用として、場に依存した数密度（もしくは同等なものとして、平均的な粒子間距離）の秩序化された平面アセンブリと基体に垂直に向いたリニア直線ビーズが、形成される。
【００６１】
好適な実施例においては、平面構造が、基体に垂直に向いた均一な磁界の印加によって、基体に、もしくは基体付近に形成される。ここで提供されている実験例に記載されているとおりに準備した、平均直径３．２マイクロメートルの典型的なコンポジット粒子は、約１、０００から２，０００ガウスの範囲の磁性誘導を生じる磁界で、十分に平面アセンブリを製造できる。永久磁石を使用可能であり、基体のすぐ近位にある時に、アセンブリの所望の平面配置の実現に十分な強度の場を基体表面付近に生成する。必要不可欠な磁界構造も、例えば、周知技術のソレノイドもしくは、ヘルムホルツ構造中の電磁界により生成される。基体は、磁石の内孔内に誘導され、もしくは、磁界が確実に基体面に実質的に垂直に向くように、孔の外側のコイルのすぐ近くに位置される。このような配置によって生じた磁界は、電磁石のコイルに加えられる電流に伴って増加し、これによって、例えば、直線状のランプ波（時間により直線的に増加する電流用）もしくは、正弦波（時間機能として正弦波のように変化する電流；例えば、ＡＣ電流）の形で、時間により変化する磁界の印加を提供する。
【００６２】
平面アセンブリもしくは配列中の場に依存する数密度は、リアルタイムでの電流制御を介した電磁界構造を与えることにより、アセンブリの数密度のリアルタイムでの可逆的調節をする方法を提供する。好適な実施例では、１０ヘルツから１０メガヘルツ、より典型的には１０ヘルツから１０キロヘルツの範囲の周波数のＡＣ電流を、ＤＣ電流に重畳する。このＡＣ電流の振幅は、ＤＣ電流の大きさと比較して小さくなるよう選択される。ＡＣ電流をＤＣ電流に重畳することは、アセンブリ中の粒子間距離の経時的変化を提供し、一方このＡＣ電流の振幅は、平均密度を設定する。平面アセンブリの誘導された密度変化は、エレクトロカイネティック応答と周辺の流体媒体のローカルフローを調節する。この磁界誘導の流れは、有用である。例えば、基体近辺及び／又は粒子表面近辺で発生する関心のあるすべての反応の運動エネルギーを増強する局所混合を提供する。さらに、空間的に調整された磁界は、周知の方法を用いてパーマロイで基体をパターン化することによってつくることができる。
【００６３】
本発明は、本発明のコンポジット粒子のライブラリを用いたマルチステップバイオ解析的分析工程の装置のプラットフォームを開示して、サンプル調整と処理段階を伴う多重分子相互作用解析を統合するようにした。サンプル調整は、所定の混合液から所望の検体を捕獲し、分離することを含み、サンプル処理は、捕獲した検体及び／又は結合因子上で実行される所望のトランスフォーメーションを含む。解析は、典型的には、ビーズに表示された結合因子と検体分子間の分子相互作用度の指標を検出し記録することを含む。これは、蛍光もしくは化学発光などの光学的サインは、上記指標の典型的な例である。さらに、解析は個々の粒子と関係する結合因子のアイデンティティをインサイチュでの復号化することを含む。
【００６４】
本発明の特定のライブラリの各々において、所望の分析における関心の結合因子は、色符号の形式で識別可能なタグに関連している。本発明の特別な関心は、リアルタイムの復号化を可能とし、ゆえに結合因子の化学的アイデンティティの決定することとなる、コード化粒子のサブライブラリである。本発明において、あらかじめ選択された結合因子は、本発明の磁性ナノ粒子に別々に付加され、機能化された磁性ナノ粒子のサブライブラリを生成する。このサブライブラリは、別々に用意されたコード化粒子のサブライブラリと組合せる。コード化粒子は、ビーズタグとして、第一のサブライブラリに含まれる各々が機能化された磁性ナノ粒子とユニークに関連するように作用する。このプロセスは、官能基の構成と入れ替え及び結果物としてのライブラリ中のタグを制御する際にユニークな柔軟性を提供する。
【００６５】
本発明の実施例において、本発明のコンポジット粒子のライブラリは、標準マイクロウェルフォーマットと液体操作ロボットを共に用いる。このマイクロウェルは、対象となる分析の必要に応じてライブラリから選択された粒子のセットを含む。多重相互作用解析は、一もしくはそれ以上のウェル、もしくは、他の同等の反応容器中で実行される。好適な反応速度に達し、反応の光学的混合を維持するために本発明のコンポジット粒子が確実に懸濁液に維持される条件下で行われる。ここに書かれている実験例に記述されているとおり、反応中の各コンポジット粒子は、多重分析フォーマットにおいて多重結合因子複合体を同時形成するように、同じ検体分子の混合液と相互作用することができる。分子相互作用の完了と個々の粒子上の結合因子複合体の形成に続いて、各反応容器内に含まれるセット中で、例えば、解析を連続する方法でフローサイトメトリを用いることにより、粒子は解析され、復号化され、連続的に分析信号を記録する。もしくは、基体に一の粒子もしくは粒子セットを移動することにより、平面アセンブリの形成を可能とする。例えば、重力で粒子を固定することなどである。
【００６６】
好適な実施例において、分析の統合は、マイクロウェルフォーマットを排除する微小流体環境で達成される。後に述べるように、サンプル捕獲、それに続くビーズに表示された結合因子、もしくは検体のトランスフォーメーション及び、結合相互作用完了に続くコード化粒子のランダムコード化アセンブリのリアルタイムでの形成は、すべて高度に平行な分析フォーマット内に統合される。ここで、後者は、ＲＥＡＤプロセスによって、容易な画像検出を行う。本発明による磁界を印加することによりリアルタイムで形成された本発明のコンポジット粒子を構成する、ランダムコード化ビーズ配列は、マルチステップ分析シークエンスを実行するのに有用なプラットフォームを提供する。
【００６７】
本発明の図の目的である、４セットのステップ（いわゆる捕獲、トランスフォーメーション、トラスフォーメーション後の配列アセンブリ、及びランダムコード化配列検出）は、図２２に示されているように実行される。これらのステップは、統合されたバイオ解析分析を実行する能力を提供する実験例に、さらに示されている。この配列プロトコルは、標準的設計の微小流体装置に組み込むようにしてもよい。この微小流体装置は、一もしくはそれ以上の流体コンデューイットに接続された流体コンパートメントで構成され、標準ポンピング方法を用いて、アリコートの継時的輸送を提供する。好適な実施例では、サンプル捕獲とトランスフォーメーションは、第一のコンパートメントで実行される。このトランスフォーメーションに続いて、磁界が設定され、トランスフォーメーション後のアセンブリとＲＥＡＤプロセスを完遂する第二のコンパートメントにビーズが移送される。
【００６８】
関心のあるサンプルと規格化されたコンポジット粒子セットは、第一のコンパートメントに導入され、サンプルからビーズを表示する結合因子へ検体を捕獲させる相互作用を可能とする。マグネチックトラップを適用した後、一もしくはそれ以上の洗浄サイクルが実行される。この洗浄サイクルは、新しい緩衝液のアリコートによる第一のコンパートメントの内容物の置き換えを含み、最終的にトランスフォーメーション段階と、ここで提供されている実験例に記載されているように、トランスフォーメーション反応に必要な試薬のアリコートの導入を開始する。
本発明のより詳細な四段階のプロセスを記述する。
【００６９】
１．捕獲
生物学的サンプルの解析は、典型的には、血液、血清、もしくは細胞懸濁液のような複雑な混合液より始まる。サンプルには、抗体、抗原、ＲＮＡ、ＤＮＡもしくはその他生体分子である検体だけでなく、意図する解析を阻害する非常に多様な成分が含まれている。標準的解析の化学的分離では、必要がなければ、残存物からサンプルの検体フラクションを分離することが、一般的に所望される。この目的のための所定の磁性粒子の適応性は、先行技術で広く述べられている。前記粒子は、マイクロウェルフォーマットに用いられた時、一般的に、高い磁性感受性を必要としており、永久磁石を用いた研究室での設定で生成することができる磁界勾配で、適当な時間内に収集と固定を可能にする。この段階で、例えばゲノミックＤＮＡフラグメント他を含む第一セットの磁性粒子に対する関心のある官能基の捕獲を行うことができる。この捕獲ステップの直線には、新しい緩衝液を導入し、原混合液の可動（非固定的）成分を置き換えることを含む、一もしくはそれ以上の洗浄サイクルが続く。誘導要素も記載されており、小型化された環境中で磁界と磁界勾配を生成する。
【００７０】
所定の例では、様々なタイプの関心のある検体間を識別をすることは、必要とされない。実験例は、共通のポリ−アデニン末端配列が標準的磁性粒子に表示されたオリゴ−デオキシチミジル酸とハイブリダイゼーションすることによる細胞溶出物からの全体のメッセンジャＲＮＡの抽出、もしくは、標準的親和性精製におけるのように、Ｆｃタンパク質分子とビーズに表示されたタンパク質Ａとの結合による、抗体クラス、すなわちＩｇＧの親和性精製を含む。
【００７１】
しかし、多くの例では、検体特異的に所与のサンプルから多重検体を捕獲することが所望もしくは必要とされる。本発明のコンポジット粒子のライブラリが無い場合、試料は、多重のアリコートに分ける必要がある。ピペッティングエラーもしくは汚染のような不正確さが生じる可能性があるだけでなく、極少量しか入手できないサンプルの使用が必要とである。一方、本発明のコンポジット粒子のライブラリは、検体特異的に同時捕獲する方法により、複雑化が促進される。実験例は、細胞溶出物からの関心のある多重メッセンジャＲＮＡターゲットを配列特異的に捕獲し、ビーズに表示された捕獲シーケンスをマッチングさせること；ｃＤＮＡライブラリからの多重のｃＤＮＡターゲットの選択、もしくは希少なタイプのリンパ球のビーズに表示されたモノクロナール抗体への捕獲を含む。このリンパ球は、表示された細胞表面の抗原の各レパートリによりよって同定される。実験例２５に記述されているように、特定の捕獲段階に導入されたサンプルは、例えば本発明の磁性ナノ粒子のように、非−特異的捕獲段階で製造される。
【００７２】
洗浄サイクル中にコンポジット粒子を磁気的に捕獲する実施例では、周知の技術である永久磁石を、一時的な固定化のために用いてもよい。ここで、分析環境の小型化により、粒子が、反応器の最も近い結合表面から典型的には、１００マイクロメートル以内の近距離中に常に存在することになる。これによって、所与の磁性感受性の粒子を懸濁液から磁性勾配に収集する時間を短縮し、もしくは逆に、磁界と磁界勾配の所与の強度により、必要とする磁性感受性を最小化し、所与の収集時間内、典型的には、５分以内で、好適には３０秒以内に捕獲することを保証する。本発明のコンポジット粒子については、コアよりもむしろシェルの構成により決定された磁性感受性が、分析環境の最小化に特によく適合している。
【００７３】
本発明の実施例では、平面基体表面、もしくはその近傍での、粒子トラッピングとしての周知の技術である誘導要素の設計を用いるようにしている。好適な実施例では、捕獲は、磁界が印加され得る第一の微小流体コンパートメント中で実行される。例えば、平坦な流体コンパートメントを、二つの永久磁石間にサンドイッチするようにしてもよい。これは、充分に連続したトラップを提供し、所定の比率までは横方向の流れがあるコンパートメントの、二つの結合表面に対して粒子を保持するが、フロー比率がより高くなると、前記粒子を放出するように構成されている。ソレノイド磁石の組合せによる同等の磁界構造を、容易に製造することができる。さらなる代替は、直径１０−１００マイクロメートルのキャピラリーチューブのような軸に対し対称な配置により提供されるこのチューブは、四極子を中心に挿入して捕獲を行う。
【００７４】
２．トランスフォーメーション
捕獲された検体のトランスフォーメーション、もしくは、ＤＮＡ解析に関する場合が、ビーズに表示されたプローブ自身の検体を介したトランスフォーメーションは、重要な処理ステップである。分子生物学では、もっとも重要な処理工程段階は、幾つかの充分に研究されたＲＮＡもしくはＤＮＡの酵素を介する変異を含む。注目すべきは、ＲＮＡの場合は、逆転写、ＤＮＡの場合は、ライゲーション、ビーズに表示されたプローブの伸長（プライマーとしても周知）もしくは、もっとも一般に行われている周知の技術であるポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）プロトコルのアプリケーションによるの伸長反応のサイクルによる増幅である。本発明の特別な興味は、ビーズ上のＲＮＡの場合とＤＮＡの修飾反応の装置である。捕獲段階と同様に、ビーズタグのプライマーを用いたＰＣＲのような反応の複雑化は、本発明のコンポジット粒子のライブラリを用いることを必要とする。捕獲した“粒子−タグを付けた”フラグメントの固相アプリケーションがその一例である。トランスフォーメーション工程では、“タグ付き粒子”のＤＮＡフラグメントは、例えばＰＣＲ増幅のような、“多重”トランスフォーメーション工程のセットが行われる。別の例は、その組成が捕獲されたＲＮＡターゲットに相補的なビーズに表示されたｃＤＮＡ鎖を製造するために、ビーズに表示されたプローブのポリメラーゼを介した伸長である。このトランスフォーメーションの結果、溶液ボーン生成物を生成することができる。ここで実施されている発明のコンポジット粒子の第二にセットに捕獲される。
【００７５】
捕獲されたタンパク質検体も、さらなる解析を行う前に変形される。例えば、ヒスチジン誘導体を含むように変形された、タンパク質は、キレート剤によってニッケル機能化試薬と周知の方法を用いたタグに変形される。
【００７６】
３．トランスフォーメーション後の配列アセンブリ
本発明は、本発明のコンポジット粒子を具える配列の磁界誘導フォーメーションを、ランダムコード化アセンブリとして、トランスフォーメーション完了に続くリアルタイムでの高度バイオ解析の同時並行分析フォーマット中で粒子配列を製造するための手段として用いられる。このプロセスは、続くアセンブリの撮像を行うために基体表面の設計指定領域内で、本発明のコンポジット粒子の平面アセンブリを製造することができる。又、広域に変化する条件下で、このようなアセンブリや秩序化された配列を製造でき、好結果の分子相互作用解析と結合因子複合体の安定性を保証する。これらの条件は、緩衝液のフォーメーション（塩分濃度、ｐＨ）、界面活性剤もしくはアジュバンドのような付加的な構成要素の存在、温度やその他に関係する。基体という有限の領域は、ＬＥＡＰＳプロセスで記載されている界面パターン化により線引きされている。又、空間的に変形された磁界は、例えば標準工程によるパーマロイを用いて、基体をパターン化して製造することができる。
【００７７】
本発明の粒子は、印加された磁界に応じて、平面アセンブリもしくは秩序化された平面配列に集成される。例えば、二枚の実質的に平坦な面によって結合されている流体コンパートメント中の懸濁液中に提供されており、平面アセンブリを形成する。この面は、上記結合面の法線方向にむいている磁界にさらされると、サンドイッチ構造で相互に平行になるように構成される。本発明の方法により制御された所与の粒子磁性感受性のために、秩序化された平面アセンブリの特徴的な数密度が、磁界強度の増加に応じて形成される。さらに、基体に垂直に向く直線的な（従って印加された実質的に磁界に平行）ビーズストリングスが形成される。
【００７８】
永久磁石又は電磁石の配置により生成された、好適に設計された磁界を印加することは、周知の技術である。永久磁石は、所望のアセンブリ配置を実現するために必要な磁界強度となるように設計することができる。必要な磁界配置は、例えば、周知の技術であるソレノイドもしくはヘルムホルツ構造の電磁石により生成され、基体は、磁石の内孔内に誘導されるか、もしくは、磁界が確実に基体面に実質的に垂直に向くように、孔の外側のコイルのすぐ近くに配置される。
【００７９】
他の実施例では、捕獲ステップで記載されたタイプのマグネチックトラップを、分子相互作用解析に使用する緩衝液を、ＬＥＡＰＳアプリケーションによる高速配列アセンブリを保証する条件の実現に最適化された、第二緩衝液と交換するために用いられる。
【００８０】
４．ランダムコード化配列検出
一旦集成されると、本発明のコンポジット粒子のランダムコード化配列を、画像化して分析信号を記録し、続いて複号化し、ここで記載されている方法と処理工程により配列中の各ビーズとに関連する結合因子を同定することができる。
【００８１】
本発明のコンポジット粒子を伴う配列の形成に続いて、この配列は、マルチステップの分析シークエンスの結果を解読するのに用いるプラットフォームを提供する。ここで開示されているこの方法は、プロセスの再設計を必要としないＤＮＡ又はタンパク質配列を高速に規格化することを可能とし、スポット間だけでなくチップ間の変動に寄与する問題を回避することができる。さらに、この粒子配列フォーマットは、チップに依存しない粒子の特徴付けだけでなく配列条件の最適化を可能とする。さらに、多重粒子配列は、同一のチップ上に保持される別個の流体コンパートメント内に同時に形成され、多重サンプルの同時処理を可能にする。
【００８２】
ここで記載された本発明を、より完全に理解するために、続いて実験例を示す。これらの実験例は、例示を目的とするものであり、本発明を限定するものとして解釈すべきではない。
【００８３】
実験例
実験例１：  光学的プログラム可能な配列フォーメーション
図９に示されるように、ＬＥＡＰＳは、多重ランダムコード化副配列を同時に集成し、これらの副配列を共通の密封された液体環境中で、チップ上の離れてはいるが近位の位置に“ドラッグしてドロップ”するよう作用する。別々の貯蔵器ＡとＢから必要量供給された、２セットのビーズ（２．８マイクロメートルのオリゴ−デオキシチミジル酸２５、オスロ、ノルウェー）を、同一の流体中で同時に識別される副配列に集成された。続いて、副配列は、空間的に変化するイルミネーションプロファイルにより方向づけて同時に、所望の目的位置に置かれる。このイルミネーションプロファイルは、パーソナルコンピュータでプログラム可能なイルミネーションパターン発生装置（ここで引用され、１９９９年９月１７日に出願された米国出願番号０９／３９７，７９３に記載されている）により基体上に生成され、投影された。このドラッグしてドロップする操作により、約２５０マイクロメートルから２０マイクロメートルに二つの副配列間の距離は減少した。ビーズは、２キロヘルツの周波数の５Ｖｐｐで移動し、基体表面上にかかる全体の力は、５ｍＷだった。化学的コード化と空間的コード化の組み合せにより、化学的ビーズ指標の所与のセットを多数回で用いることが可能となり、大きなコード化能力の実現を促進する一方で、各々のコード化範囲における必要量は減少する。
【００８４】
実験例２：パターン化された表面上の配列フォーメーション
図１０に示すように、コード化ビーズの配列は、パターン化されたシリコンチップ上の、アクエアスビーズ懸濁液で満たされた１００マイクロメートルの電極ギャップ間に印加された周波数１００−１５０ヘルツの１−２ＶｐｐのＡＣ電圧を用いて、集成される。基体上のサーマル酸化物（〜１０００オングストローム）は、１３０マイクロメートルの中心にスクエア形状（〜３０×３０平方マイクロメートル）のセットの５０−１００オングストロームの厚さの酸化物をエッチングすることよってパターン化される。同様のレイアウトの配列も、適切なイルミネーションパターンに応じて、製造できる。ここで示す各副配列は、抗サイトカインモノクロナール抗体がカップリングされた約８０のビーズを含む。カルボン酸で修飾された直径５．５マイクロメートルのポリスチレンビーズ（Bang Laboratory, Fishers, IN）は、二種類の蛍光色素の組み合せで染色され、抗サイトカイン−モノクロナール抗体を伴って機能化された。このアセンブリプロセスは、基体表面のすべてのビーズの収集を確実にする。ビーズのコード化は次のとおりであった：インターロイキン（ＩＬ）−２（明るい赤）、ＩＬ―４（暗い赤）、ＩＬ−６（明るい緑）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）（暗い緑）と腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）（黄色）。
【００８５】
実験例３：  磁性ナノ粒子の配列フォーメーション
有限の反磁性感受性を示すコロイド状粒子は、平面基体上に配列された時、磁界が増強するのに応じて秩序化された配列に集成される。流動性のある細胞が結合している二つの平行な結合（“サンドイッチ”構造）の低位の平面上にある流動的懸濁液より分散された、商業的に入手可能なスーパーパラマグネチック粒子（Dynal, Oslo, No）は、均一な軸方向の磁界（基体平面に対し法線方向）にさらされたとき、秩序化されたアセンブリを形成する。磁界を増強することによる機能として、又周知技術の製造プロセスにより制御される所与の粒子の反磁性感受性のために、秩序化された平均アセンブリと基体の法線方向を向いたリニア直線のビーズが形成される。永久磁石は、アセンブリの所望の配置を認識するのに必要な磁界強度が発生するように設計する。必要な磁界配置は、周知技術のソレノイド又はヘルムホルツ配置の電磁石により、発生される。この基体は、磁石の内孔内に誘導されるか、もしくは、磁界方向が確実に基体面に実質的に垂直に向くように、孔の外側のコイルのすぐ近くに位置される。空間的に変調された磁界は、周知の方法を用いて、パーマロイの基体をパターンニングすることによって発生させることができる。
【００８６】
実験例４：  ランダムビーズアセンブリのフォーメーション
懸濁されたビーズを含有している溶液のアリコートを、薄い酸化物層でキャップして、平面なシリコン基体上で、幾つかの区別できる位置に置いた（他の基体を用いてもよい）。ビーズは、重力で沈降し、ランダムアセンブリを形成した。基体上に別個の位置を明確に線引きするために、次にあげる二つの方法のうち一つを用いた。第一の方法に従うと、直径１ミリ又は２ミリの多数の丸いホールのグリッド（Grace Bio-labs, Bend, Oregon）を表示するシリコンガスケット（厚さ２５０マイクロメートル）が、親水性表面上に直接置かれ、多数の識別できるビーズ懸濁液サンプル用に、マイクロウェル（０．２５から０．５マイクロリットル容量）を規定する。第二の方法に従うと、ビーズ（０．２から０．５マイクロリットル容量）を含有する少量の流体アリコートは、別個のドロップレットを確実に形成するために、一又はそれ以上の所定領域で親水性表面上に直接置かれ、この場合、スペーサは不要である。溶剤が蒸発すると（室温もしくは、高速で乾燥させるために高温（約６０℃）で）、ビーズは、基体上のランダムな位置に置かれる。ＤＮＡ多型反応は、両方の方法で形成されたアセンブリで、テストされた。選択的に、重力で沈降させたビーズは、基体上に設けた化学的捕獲層により固定化される。多重化したフォーマット中の親和性定数を決定するためのランダムビーズアセンブリのアプリケーションは、実験例６に記載する。
【００８７】
実験例５：  自動化チップスケールの製造プロセス
図１１に示すように、このプロセスは、液体のハンドリングと、シングルチップカートリッジ、もしくはマルチチップカートリッジに装備したチップ上へのビーズのピペッティングを含む。ビーズ配列を、実験例１、２又は３のような方法を用いて形成し、次いで、配列の固定化と復号化を行う。この結果としての復号画像は、付属的チップＩＤ（“バーコード”）と共に後に使用するために保存する。
【００８８】
実験例６：  ビーズアセンブリの分析後の解析による親和性定数の決定
サイトカインのＴＮＦ−αとＩＬ−６の量的結合曲線。結合曲線は、チップ上に線引きされた一又はそれ以上の反応コンパートメント又は、チップの外の一又はそれ以上の反応コンパートメントに封じ込められている懸濁液中で、化学的コード化ビーズを用いてサンドイッチ免疫分析を実行することにより、作成される。懸濁液に保持したビーズで反応を完結することにより、均一な分析と同様の分析反応速度が得られる。結合反応の完結に続いて、ビーズはチップ上に集成され、多様な量的画像解析が可能となる。実験例４に従って準備したランダムアセンブリ、又は、実験例１又は２の秩序化されたビーズを使用することができる。実験例１又は２の方法により製造された、秩序化され、密集したアセンブリの利点は、より高い空間的密度と非常に多くのビーズの処理によるより高い分析スループットである。
【００８９】
図１２は、ランダムに分散したビーズから得たＴＮＦ−αとＩＬ−６の量的結合曲線を示す。商業規格の８ビットのビデオ−ＣＣＤカメラ（Cohu, San Diego, CA）を、マルチフレームを統合したモードで用いた。二つの分析で使用した抗体の濃度範囲は、ＴＮＦ−αが７００フェムトモーラから５０ピコモーラ、ＩＬ−６が２ピコモーラから５０ピコモーラだった。各濃度で、ビーズ当たりの結合している分子数を、ビーズ当たりシアニン５．５でラベル化された既知量の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）でコートされたキャリブレーションビーズと比較して、評価した。必要なアジャストメントは、ラベル化された二次抗体とＢＳＡ間の蛍光量子効率の差異より試算した。
【００９０】
この解析フォーマットにより、親和性定数、ＫＡ＝［ＬＲ］／（［Ｒ０−ＬＲ］［Ｌ］）を決定できる。質量作用の法則に従い、［ＬＲ］は、ビーズ当たりのレセプタ−リガンドペアの数を示し、［Ｌ］は、リガンドの溶液濃度を示す。ミリリットル当たりのビーズ数ｎＢを特定し、ビーズ当たりのレセプタ数から［Ｒ０］濃度を特定することにより、所与のKAについてコンピュータで算出した理論的な結合曲線を、リガンドのバルク濃度を関数としてビーズ当たりの結合した分子数のプロットと比較する。ビーズ当たりに結合するリガンドの絶対数を、ビーズ当たりの平均蛍光強度の測定と所与のバルク濃度について、配列に含まれるキャリブレーションビーズから記録した蛍光強度を参照することにより、決定してもよい。
予測されるビーズ当たりの結合する分子数を、質量作用の法則より導かれる理論的な結合曲線と比較する。ここに示した三つの曲線は、親和性定数ＫＡ、１０１１モーラ、１０１０モーラ、１０９モーラ、の値にそれぞれ対応する。ビーズ当たりの初期の抗体数Ｒ０は、ビーズ当たり２×１０５に等しく、ｎＢは１０５ミリリットルに等しい。各データポイントは、配列と配列のバリエーションが４５％以下で、３回繰り返して行った平均を表す。分析画像中のユニティの、シグナル／ノイズ比レベルが生じる蛍光レベルに応じた分析感度を設定すると、図１２で特性が示されているサイトカイン分析の感度は、７００フェムトモーラのＴＮＦ−αと２ピコモルのＩＬ−６の各検出濃度に応じて、〜２０００の結合しているリガンド／ビーズに設定される。
商業規格のＥＬＩＳＡキットは、感度を増強するのに酵素を用いて増幅している。しかし、分析条件と制御に関連した付加的な複雑さにかかる費用から、本ビーズ配列分析フォーマットは、むしろ酵素的増幅を用いず、、循環レベルで（血清中のノーマルＴＮＦレベルは、５０−２８０フェムトモーラで、血清中のノーマルＩＬ−６レベルは、０−７５０フェムトモーラである。www.apbiotech.com/technical/technical_index.html）、サイトカインのモニタリングを可能とし、動的な範囲を提供する。この範囲は、標準的なすなわち、単一検体のＥＬＩＳＡ分析（R & D SystemsとAmershamの分析キット（近年の高感度分析ではない））の範囲に近い。さらにハードウェアとソフトウェアレベルでの改良が可能である。
【００９１】
実験例７：  多型分析によるジェノタイピング
本発明のアプリケーションであるジェノタイピング装置を示すために、図１３に、遺伝子の四つの多型領域に応じて５対の２０マーの結合因子が色コード化されたビーズにカップリングされている分析設計を示す。この結合因子α１、α２、及びβ１，β２のペアは、各々、そのシーケンスにおける一のヌクレオチドの相違を表示する。δ３、δ４のペアは、三つのヌクレオチドの相違を示し、γ１、γ２、γ３、γ４の結合因子のセットは、少量の挿入と欠損を示す。この１０個の結合因子は、５個からなる二のサブグループに分けた。２のサブグループは、二つの副配列に組み込まれている。この実験例では、各タイプにつき数百のビーズがある。ビーズの固定化に続いて、チップ上のハイブリダイゼーション反応を、ＴＭＡＣバッファ（２．２５モーラ、テトラメチル塩化アンモニウム、３７ｍＭトリスｐＨ８．０、３ミリモーラＥＤＴＡｐＨ８．０と、０．１５％ＳＤＳ）中で５５℃で３０分行った。この検体は、患者のサンプルから得られ、ＢＯＤＩＰＹ６３０／６５０（Molecular Probes, Eugene, OR）で５’プライムが蛍光ラベルされた末端２５４塩基のＰＣＲフラグメントである。画像の撮像は、分析バッファを新しいＴＭＡＣバッファに置き換えた後に行った。
【００９２】
図１４は、一の副配列の復号画像と分析画像を示す。ハイブリダイゼーション後に得られる分析画像に示された各ビーズを、分析し、蛍光強度とビーズタイプを決定する。サイトカイン分析のように、ビーズタイプを決定する操作は、アルゴリズムと適合するテンプレートを用いて、分析画像と復号画像を比較する。図１５は、各ビーズタイプについての結果として得られた強度のヒストグラムを示す。これらのヒストグラムのプロットでは、水平軸は、０から１の相対的シグナル強度を示し、垂直軸はビーズの数を示す。このヒストグラムでは、プローブα１を表示するビーズは、どの検体とも結合しない。一方プローブα２を表示するビーズの大半は、有意の結合をする。α２のビーズの平均的シグナルレベルは、〜３．２の割合で、α１でなくα２に相補的なＤＮＡ配列を含む検体であることを示唆するα２ビーズのシグナルレベルを超える。ここの患者のサンプルでは、ヒストグラムは、遺伝子の多型領域における結合因子α１、β２、γ３、γ４及びδ４との相補性により特徴づけられる、ＤＮＡ検体のジェノタイプを示す。
【００９３】
実験例８：  遺伝子発現検体：ｃＤＮＡフラグメント
本発明の方法は、オリゴヌクレオチドだけでなくＤＮＡフラグメント（例えば１０００塩基長まで）を表示するビーズで構成された配列を作成するのに用いる。鎖は、ニックトランスレーションによって多数の位置でビオチン化され、ストレプタビジン機能化されたビーズ（M-280, Dynal, Oslo, NO）を付着させた。配列は、１０Ｖppで８００ヘルツのＡＣ電圧を用いて形成する。
【００９４】
実験例９：  ユニバーサルラベリング用のループ状プローブの設計
図１６のループ状プローブの設計は、蛍光エネルギーの輸送に利用し、ラベル化されたターゲットの不足を事前に取り除くことができる。分子ビーコン設計（S. Tyagi, D. P. Bratu. F. R. Kramer. Nature Biotech. 16, 49-53(1998)）によって、図１６のプローブは、閉じたループと開口のループ構造で異なると仮定するが、分子ビーコンとは反対に、競合ハイブリダイゼーション分析で厳密に分子を制御することを可能とする基幹構造中に結合モティーフ部分を含む。
【００９５】
実験例１０：  サイトカイン発現の定量的な多重プロファイリング
図１７は、多重のサンドイッチ免疫分析における、シングルランダム配列より記録された分析画像と復号画像のペアを示す。ある配列は、五つの異なるタイプのビーズを含み、各々モノクロナ−ル抗サイトカイン抗体（ｍＡｂ）を表示している。この配列は、二つのサイトカイン抗原（Ａｇ）を含むサンプル溶液（血清のような）に暴露させた。続いて、シアニン５．５でラベルされた二次抗体（ｐＡｂ＊）を添加すると、三つの複合体、ｍＡｂ−Ａｇ−ｐＡｂ＊が形成される。このチップ上の免疫分析は、分析緩衝液（２０ミリモーラＮａＰｉｐＨ７．４、１５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍｇ／ｍｌＢＳＡ）中に７ナノモーラのサイトカインを有する３００マイクロリットルのサンプルをチップ上に固定したビーズ配列に加え、３７℃で一時間処理反応させることにより実行される。この緩衝液は、分析バッファ中にラベル化された二次抗体１２ナノモーラの溶液を加えて、置換した。３７℃で一時間インキュベーションした後、新しい緩衝液を、チップ上面に加えて、撮像した。分析に用いる抗体と抗原は、Ｒ＆Ｄシステム（Minneapolis, MN）より取得した。二次抗体は、標準キット（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）を用いてシアニン５．５でラベル化した。
【００９６】
図１７Ｂの復号画像は、偽色で表示した５種類のビーズを示す。図１０と同じコード化パターンを有する。すべてのビーズは、同じサイズ（直径５．５マイクロメートル）で、復号画像中のタイプの異なるビーズのサイズの明らかな相違は、ビーズ内部の染色レベルとＣＣＤが復号画像を記録している間の、“ブルーミング”を反映するアーティファクトである。図１４Ａの分析画像と復号画像を比較（ここで開示されている画像分析方法を用いる）すると、黄色及び明るい緑のタイプの活性ビーズは、それぞれ、ＴＮＦ−αとＩＬ−６を捕獲したことを示す。この分析プロトコルは、次の１２個のサイトカインセット：ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＥＧＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１、及びＴＮＦ−に拡張された。このチップ上の免疫分析は、分析ステップ間の試薬溶液交換以外に追加の洗浄を必要としない。分析画像と復号画像の比較は、二つの異なるサイトカイン、すなわちＩＬ−６とＴＮＦ−αがそのサンプル中に存在を示す。この実験例に記載されているあらかじめ形成された配列は、実験例６に記載された解析に類似する方法で、アフィニティ定数を決定することが可能である。
【００９７】
実験例１１：  タンパク質プロファイル用のアプタマ
血清タンパク質に高いアフィニティをもたせるために、アプタマは、組合せた大ライブラリより選択してもよい（L. Gold, B. Polisky, O. Uhlenbeck, M. Yarus, Annu. Rev. Biochem. 64: 763-797. (1995)）。アプタマで機能化されたビーズのランダムコード化配列は血清タンパク質のレベルをモニタし、配列上の結合パターンにおける相互関係（実験例１０参照）は、疾患状態の表現型として作用する。
【００９８】
実験例１２：  混合ＤＮＡ−タンパク質配列
本発明の方法が、配列製造方法論を変更することなく、タンパク質配列とＤＮＡ配列を適応する旨は、遺伝子機能解析に有意な関心である。特に、ＤＮＡとその対応するタンパク質を表示するビーズで構成された混合配列は、同じ流体サンプル中で遺伝子とその遺伝子生成物を解析するのに使用できる。
【００９９】
これは、免疫分析とＤＮＡハイブリダイゼーションを組合せることを明らかにしている。例えば、抗サイトカインモノクロナール抗体（ｍＡｂ）とオリゴヌクレオチドで機能化されたビーズで構成された混合配列を、製造した。二つの連続的な分析が、この一つのチップ上で実行された。初めに、実験例１０で記載されているプロトコルにより免疫分析が行われた。チップ上の免疫分析を完了すると、画像が撮像され、ＤＮＡ検体を終濃度が２０ナノモーラのハイブリダイゼーションバッファ（２×ＳＳＣ、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ）に加えて、３７℃で１時間反応させた。新しいバイブリダイゼーションバッファを、チップに加えて、画像を撮像し、付加的なハイブリダイゼーション分析を記録した。
【０１００】
実験例１３：  アフィニティフィンガープリント
先行技術の方法に関連したレセプタ−リガンド相互作用解析は、理想的な特異性を想定している。すなわち、溶液中の一のリガンドがそれに適合するレセプタと反応する、もしくは逆の場合という理想的な状態のみを考慮している。しかし、ほとんどのマルチ分析システムでは、相当レベルのクロスリアクティビティが存在する。すなわち、一のリガンドが、幾つかのレセプタと関連し、一方、一のレセプタ型が、一以上のリガンドに対して限定的な親和性を有しているかもしれないことである。
本発明は、次に掲げる仮定下でこのようなシステム用の多重のＲＥＡＤ分析を解析するために開発されたモデルを含む。仮定とは、これらの各可逆反応が、それ自身の親和性定数により特徴付けられ、バルクスピーシズ間で反応の発生はなく、表面上に形成された複合体間相互作用がないことである。これらの仮定は、複合体モデルリングの増大を犠牲にして、バルク中及び表面スピーシズ間での反応を考慮することにより、緩めることができる。シングルレセプタ−リガンドペア形成に関するの標準反応−拡散方程式（R. W. Glaser, Anal. Biochem. 213, 152-161(1993)）は、各ビーズ表面でのマルチ反応を考慮して方程式化される。
【数２】
2005514618.tif 000003
【０１０１】
方程式（１）右辺の最初の項は、複合体のリガンドとレセプタの関連を表し、表面上のフリーサイトの濃度を含む。第二項は、リガンドを放出することによる複合体の解離を表し、これによって、さらなる反応用のレセプタサイトがフリーになる。生体分子複合体の最大値（ｉ×ｊ）が形成されると、上記方程式より生じる多くの境界条件を作ることができる。平衡の場合は、方程式（１）の左辺は、ゼロに設定され、マトリックスのコフィニティ、［Ｋｉｊ］＝Ｋｏｎ，ｉｊ／Ｋｏｆｆ，ｉｊは、バルク内、及び表面上の多重の種類間のクロスリアクティビティに適応するように決定できる。平衡状態下のバッチリアクタでは、異なる平衡状態のシステムを解決し、各タイプのビーズ上に結合した各リガンドの分子数を得る。
【表１】
2005514618.tif 000004
【０１０２】
例証のとおり、リガンド参照セットと二つの異なるビーズセット上に固定化された二種類のタイプのレセプタについて（方程式のモデルより）リガンドの分布を計算した。このアフィニティマトリックスは、参照セットにおけるリガンド−レセプタの各組合せとして、仮定する。第三のリガンドの検出を行うために、非対角要素と比較して大きい２×２のマトリックス［Ｋｉｊ］の対角要素を調べる。二つの元のリガンドのそばにあるリアクタ中の第三のリガンドの存在は、参照システムでの様々な複合体とリアクタント間の平衡を乱す。又、蛍光ラベルでタグをしたリガンド分子により、乱れたシステムに観察される強度は、参照時に得た強度と異なる。
【０１０３】
図１８Ａは、参照例を示すものであり、ここでは濃度とコアフィニティマトリックスを、付随の表の値で設定した。ビーズの強度は、０−２５５のリニアスケールで定義した。２５５は、もっとも明るいビーズの強度を示す。図１８Ａは、各リガンドのビーズの強度に対する寄与度を示す。Ｌ１は濃度が低いため、ビーズ１の強度は、ビーズ２に比べて低く、クロスリアクティビティは、基本的に検出されない。
【０１０４】
次に、濃度Ｌ３を１ピコモーラとして、新規リガンドが各レセプタと相当量のクロスリアクティビティをＫ３，１＝１×１０１１／モーラ、Ｋ３，１＝１×１０１１／モーラを有すると仮定すると、システムは、第三のリガンドにより乱される。第三のリガンドの存在下で、各ビーズの蛍光強度を計算すると、図１８Ａのパターンが算出される。図１８Ａは、第三のリガンドによるビーズ１の強度の増加を表す。一方、ビーズ２の強度は、システムにおける高い濃度Ｌ２と、Ｒ２に対してより低いアフィニティＬ３により影響されない。従って、Ｌ３がレセプタのひとつに対して比較的高いアフィニティを有し、競合するリガンドと比べて有意量がある条件下で、Ｌ３を検出できる。
【０１０５】
リガンドの混合液が、ランダムコード化ビーズ配列フォーマット中の多数のレセプタと相互作用できる条件下で、コアフィニティマトリックスの評価（ここで開示されているとおりの理論的なモデルと比べて）は、多数のリガンドとのレセプタの相互競合的結合アフィニティにおける特徴的なクロスコリレーションを確立する方法論を提供する。これらのコアフィニティは、これらのアフィニティ指標パターンによってレセプタ−リガンド結合平衡を特徴付ける手段を提供する。よく定義されている参照ケースからの逸脱で、溶液中で“さまよっている（perturbing）”リガンドを検出することができる。
【０１０６】
実験例１４：  反応速度の多重解析
上述の実験例で示すように、一般的に、蛍光溶液のバックグラウンドからビーズを認識するのに、洗浄の延長を必要としない。その結果、分析画像シークエンスは、均一な分析フォーマットで記録され、結合反応が次第に進んでいくのを報告し、発生した結合反応の各々の反応速度のデータを決定する。
【０１０７】
均一な結合分析は、単純な“サンドイッチ”流体カートリッジ中で実行され、ビーズ配列の光学顕微鏡的撮像を可能にして、ランダムコード化したビーズ配列を含むチャンバ中に検体溶液を導入できる。より一般的には、流体アリコートの注入を制御した状態、又は反応体又は緩衝液が継続的に流れている状態で配列を検出又は他の反応混合物に暴露する。理論的モデル用いて、ビーズ配列リアクタの関連する実行制御パラメータの最適な組合せを同じにして、平衡に達するまでの時間を最小化するか、もしくは、配列が検体を捕獲する割合を最大化する。[K. Podual and M. Seul, TM KP-99/02]。フローレートは、様々な入手可能なポンピング装置で、制御できる[M. Freemantle, C&EN, 77:27-36]。
【表２】
2005514618.tif 000005
【０１０８】
撮像シークエンス解析では、反応速度のデータが得られる。このデータから図１９の実験例で示す反応拡散速度の種類に関する理論モデルを用いてオン−レートとオフ−レートが決定される。図１９Ａは、溶液由来の検体と“サンドイッチ”反応チャンバの底に固定されたビーズ配列を含む、吸着−脱着サイクルにおけるステップを示す。第一のパネルは、吸着プロセスの開始を示し、第二のパネルは、大半のビーズが平衡に達しているときの平衡に接近したリアクタを示し、最後のパネルは、脱着サイクル下でのリアクタの状態を示す。脱着サイクルでは、リガンドの無い流体が導入され、吸着した分子がビーズ表面から脱着する。図１９Ｂは、シングルタイプのレセプタ−リガンド反応用の反応−分散システムの数値上のソリューションより得た、シングルのレセプタシングルリガンドシステムの吸着−脱着反応速度を表示し、リガンド濃度が異なる二つの場合を示す。シミュレーションで用いたパラメータを付属の表に掲げる。
【０１０９】
先行技術の方法[D. G. Myszka, Curr. Opin. Biotechnol. 8:50-57.]とは逆に、本発明は、イメージングに依存して、多重化を可能とする。さらに、実験例６で紹介したタイプを一般化したモデルでは、多数のリガンドとレセプタ間のクロス反応の存在下でも、多重で同時のレセプタ−リガンド相互作用に関する複合体の結合反応速度を解析できる。
【０１１０】
配列フォーマット中の反応速度をモニタする能力により、複合体混合液でのレセプタ−リガンド、又は結合因子−検体相互作用レセプタの特異性を増長させるいくつかのアプローチが可能になる。例えば、濃度調節のプログラミングにより、ＤＮＡハイブリダイゼーション反応の特異性を増長させることができる。同様に、配列応答をモニタしている間に、ハイブリダイゼーション反応に適応するストリンジェンシ条件を変化させることができる。例えば、ハイブリダイゼーションは、過剰な“非特異的”結合を誘導する条件下で、ハイブリダイゼーション緩衝液中で行われ、配列の応答をモニタする間に、ストリンジェンシを増加する洗浄緩衝液を交換することによって、特異性は増強する。
【０１１１】
実験例１５：  磁性粒子のコード化された配列を用いたマルチステップ分析シークエンス
分子生物学及び細胞生物学におけるサンプル調整用及び酵素を触媒としたビーズ上の多様な反応用の生化学的に機能化されたスーパーパラ磁性粒子を用いた方法と装置が記載されている[“Biomagnetic Techniques in Molecular Biology”, Technical Handbook, 3rd Edition, 1998 Dynal, Oslo, No]。ビーズを基本としたこれらの方法を、本発明のランダムコード化配列検出フォーマットと組合せてマルチステップのビーズ上の配列操作を実行することができる。
【０１１２】
例えば、図２０は、多数のコンパートメントを伴うシングルチップを用いて、多数のジェノタイピング用の小型化したフォーマットのシークエンスステップの統合を示す。はじめに、機能化された磁性ビーズを用いたアフィニティ選択により、患者サンプルから細胞を捕獲する。この細胞は第一のコンパートメントで電気的、化学的に溶解され、ゲノミックＤＮＡの非特異的結合により、多数の磁性ビーズ表面に捕獲される。次に、ビーズは第一のコンパートメントに流動的に接触する第二のコンパートメントに磁力により集められ、第二のコンパートメント内でビーズとＤＮＡは所望の緩衝液で洗浄される。次に、ビーズは、ビーズとカップリングしたテンプレートとしてのＤＮＡを用いてＰＣＲが実行される位置に更に移動する。この段階で、先行技術として公知のマルチプルＰＣＲ戦略が可能である[L. Lellmann, Et. Al., Biotechniques, 21:766-770]。次に、ＰＣＲ生成物がリリースされ、結合因子を表示したあらかじめ集成されたランダムコード化配列にハイブリダイゼーションすることにより捕獲される。結合因子は、ＰＣＲで増幅した多型に特異的である。
【０１１３】
ＬＥＡＰＳの光学的プログラミング可能性を組合せたコード化磁性粒子の使用により、可逆的に固定化配列を形成し、プログラム可能なマルチステップ分析シークエンスを実行する能力は、例えば反応速度を上げる最適時に、懸濁液中にビーズを用いた条件下で得られる。また、例えば、画像検出と分析読出用の並列フォーマットを提供するのに最適時にリアルタイムで配列が形成される。
【０１１４】
例えば、図２１に示すように、以下のシークエンスステップを、ｃＤＮＡビーズ配列の形成用に小型化したフォーマットに統合することができた。第一に、各ビーズが遺伝子特異的なプローブを表示している符号化磁性ビーズのプールは、メッセンジャＲＮＡプールに導入され、メッセンジャＲＮＡ分子は、対応するビーズとハイブリダイゼーションする。次にビーズ上の逆転写（ＲＴ）が、テンプレートとしてビーズに付着したメッセンジャＲＮＡを用いて実行される[E. Horenes, L. Korsnes, US005759820]。次にメッセンジャＲＮＡは、ビーズからリリースされ、次いでビーズは規格チップ表面に向けられ、ｃＤＮＡビーズ配列がＬＥＡＰＳを用いて形成される。このような配列は、別の標的メッセンジャＲＮＡセットを用いて遺伝子プロファイリング実験で結合因子を表示するよう作用した。代替としては、ｃＤＮＡ配列を、配列中の関心のある遺伝子をプロファイルするために、ラベル化したＤＮＡ結合因子のプールを適用して、ｃＤＮＡ配列自身の発現により解析できた。
【０１１５】
実験例１６：  スーパーパラマグネチック酸化鉄  γ-Fe2O3  （マグヘタイト）粒子の合成
この合成は、アニオン界面活性剤、ビス（２−エチルヘキシル）ソディウムスルホスクシネート（ＡＯＴ）と、イソオクタンからなる逆ミセル溶液(Kommareddi et al., Chem. Mater. 1996, 8, 801-809)中で行った。この溶液は、ウイスコンシン州、ミルウオーキィ所在の、アルドリッヒケミカルカンバニィから入手できる。０．５モーラのＡＯＴのストック溶液を用いて、FeSO4（Sigma Chemical Co., St. Louis, ＭO）とNH4OH(Sigma Chemical Co., St. Louis, ＭO)反応体を含有する逆ミセル溶液を調整した。特に、０．９モーラの  FeSO4、0.45ｍlを、イソオクタン中の０．５モーラの  ＡＯＴ  ５ｍｌに加え、別に、０．９モーラの  FeSO４  0.45ｍl を、イソオクタン中の０．５モーラの  ＡＯＴ  ５ｍｌに加えた。ＮＨ４ＯＨ逆ミセラ溶液をＦｅＳＯ４逆ミセラ溶液に加えて、強く攪拌することによって、反応が開始した。この反応を２〜３時間行い、その後溶媒を〜４０℃の温度で蒸発させて、ドライ界面活性剤酸化鉄コンポジットを得た。このコンポジットは、上等の有機溶媒中に再分散させて深い赤色の透明溶液とした。
【０１１６】
実験例１６ａ：  機能サイトを有する磁性ナノ粒子の合成
この実験は、磁性ナノ粒子への機能サイトの生成に関する。界面活性剤を油中に溶解させて、実験例１６の磁性ナノ粒子の合成に使用される逆ミセラ溶液を得た。結果としての反応混合物を乾燥させて、ドライ界面活性剤ペーストを得た。このペーストは、上等のオイル中に再分散させた。モノマ水溶液および／またはあらかじめ形成されたポリマ、架橋剤、および開始剤を加えた。この混合物に、多重化工程を行い、多重化した反応生成物を乾燥させた。乾燥させた反応生成物の塊を、水性緩衝液に分散させた。この方法を、ＲＥＡＤと組み合わせて、マルチステップのオンチップ分析操作を行った。
【０１１７】
実験例１６ｂ：  生体分子のカップリング
この実験は、本発明の磁性ナノ粒子への生体分子のカップリングに関する。実験例１６の磁性ナノ粒子を更に機能化して、例えば、ＤＮＡ（オリゴヌクレオチド）またはＲＮＡフラグメント、ペプチド又はタンパク質、アプタマおよび小有機分子などの、磁性ナノ粒子の分子に機能サイトを結合することによって、関心のある分析を行うことができる。これらの分子の結合は、例えば、一またはいくつかのカップリング反応（例えば、Ｇ．Ｔ．Hermanson, Bioconjugate  Techniques (Academic Press, 1996); L. Illum, P.D. E. Jones, Methods in Enzymology 112, 67-84(1985)参照）を利用した公知のプロセスを用いて行うことができる。関心のある分子を機能サイトへ付着させるには、一般的に、一段階、あるいは二段階の反応が必要である。この反応は、標準型液体操作ロボットと、９６ウエルフォーマットを用いて並行して行う。いずれの分子も磁性ナノ粒子の機能サイトに共有結合的に付着させることができる。
【０１１８】
特に、この実験例は、しっかり確立されているカルボジイミド化学を用いて、本発明の磁性ナノ粒子の機能サイトにプローブ（例えばタンパク質）を付着させる方法を例証するものである。２ｍｌのバイアル中で、カルボキシ酸機能化磁性ナノ粒子を含むアリコート１０ｍｇを、１０ミリモーラの硼酸塩緩衝液（ｐH＝８．５）１ｍｌと混合した。次いで、結果物としての粒子を、永久磁石セパレータを用いて磁気的に分離し、上澄みをサイホンで除去した。この分離したペレットを、０．１モーラのＭES 緩衝液（ｐH=4.5）中で２回洗浄して（上記と同じプロトコルを用いる）、最後に６００μｌの同じ緩衝液中に再度懸濁させた。別のバイアル中で、ニュートラビジン（ビオチン結合タンパク質、Pierce Chemicals, Rockford, IL）３ｍｇをＭＥＳ緩衝液３００μｌの中に溶解させ、その溶液を磁性荷電粒子の懸濁液にゆっくりと加えた。この懸濁液は、プローブソニケータを用いてソニケートされる。ソニフィケーションに続いて、ＥＤＡＣ（１-エチル-３-（３-ジメチルアミノプロピル）-カルボジイミド）（Aldrichi-Sigma, Milwaukee, WI）溶液(２００ｍｇ／ｍｌ)を加えた。この混合液を室温で２時間反応させ、次いで、結果物としての磁性ナノ粒子を磁気的に分離して、カップリング緩衝液を用いて１回洗浄し、硼素酸緩衝液で２回洗浄し、２-８℃の保存用緩衝液（ＰＢＳ  ｐＨ＝７．４、０．１％（ｗ/ｖ）ＢＳＡ、０．５％（ｗ／ｖ）ツィーン（Tween）２０、１０ミリモーラのＥＤＴＡおよび０．０２％（ｗ/ｖ）ＮａＮ３）中に再度懸濁させ、保存した。
【０１１９】
実験例１６ｃ：  コンポジット粒子の調整
この実験は、コード化した磁性粒子の生成を例証するものである。コード化した粒子を、実験１６ｂの磁性ナノ粒子と反応させた。より一般的な実施例では、スーパーパラマグネチックポリマナノ粒子（ＭＡＣＳマイクロビーズ、Miletnyi Biotech Inc. Auburn, CA；カプチベートフェロフルイド粒子（Captivate ferrofluid particles）, Molecular Probes, Eugene, OR; ナノマグ粒子（Nanomag particles）, Micromod, Rostock, Gerｍanyから得られるようなもの）も使用することができる。
【０１２０】
図２３は、１２種類の符号化した磁性粒子のサブライブラリを示す図である。この符号化粒子は、直径３．２μｍの架橋ポリスチレン粒子を用いて、トシル表面基(Bangs Labs, Fishers, IN)と、膨張およびバルク染色によって各々導入した二つの疎水性ピロメタン（pyrromethane）染料と合成した。この染料は。別々に導入して、４つの強度レベルを得た。また、４つの公称モル比で混合した。次いで、カラーラテックスの１％溶液（ＰＢＳ中）１００μｌを、カプチベートフェロフルイド（Captivate ferrofluid）１００μｌまたは２００μｌ、（ストレプタビジンコンジュゲート、直径２００ｎｍ、供給時に使用した）（Molecular Probes, Eugene, OR）または、デキシトランコートしたナノマグ（Nanomag dextran coated）１００μｌと混合した。直径１３０ｎｍのストレプタビジン機能化磁性粒子（Nanomag particules, Micromod, Rostock, Germany）を供給時に使用した。全反応量を、リン酸塩緩衝液、ｐＨ７．８を用いて最大５００μｌとして、カップリング反応を一晩行った。結果物としての粒子は、磁気的に分離され、１回洗浄して、保存用緩衝液（ＰＢＳ  ｐＨ＝７．４、０．１％（ｗ/ｖ）ＢＳＡ、０．５％（ｗ/ｖ）ツィーン（Tween） 20、 １０ミリモーラの  EDTA、および０．０２（ｗ/ｖ）NaN3）内に、２−８℃の温度で保存した。
【０１２１】
実験例１６ｄ：  金属酸化物の含有物の制御
この実験は、金属酸化物の含有物を調整して、本発明の符号化した磁性粒子に磁性モーメントを付与する方法を例証する。これは、符号化粒子の表面に結合可能な磁性ナノ粒子の数を変化させることによって行われる。モニタを容易にするために、磁性ナノ粒子の代わりに、フルオロナノゴールド（Fluoronanogold）、蛍光性ゴールドナノ粒子、すなわち、ストレプタビジンコンジュゲート（Nanoprobes, Yaphank, NYから提供された）を用いて、粒子の数をモニタした。試薬は〜０．０８ｍｇ／ｍｌのストレプタビジンを含んでおり、これは受けとってすぐに使用した。
【０１２２】
この実験例では、ビオチンで機能化した直径３．３６μｍのポリスチレンビーズ（Spherotech, Libertyville, IL）０．５ｍｇを、０．１％のＢＳＡを含有する２０ミリモーラの燐酸緩衝液塩水（１５０ｍＭ）ｐＨ７．４、 ５００μｌ中に懸濁させた。フルオロナノゴールドの量を変化させながら、ビーズ溶液に加え、ストレプタビジン−ビオチン結合反応を室温で１時間行い、次いで、遠心分離によってマイクロ粒子を分離して、上澄みを除去した。図２４は、加えたフルオロナノゴールド試薬の量を関数とする表面に結合した粒子の蛍光強度を示す図である。
【０１２３】
実験例１７：  蛍光色を付した磁性ポリマビーズコンポジットの合成
乾燥させた磁性コンポジットと染料を、例えば、CHCl3(Aldrich Chemical Co. Milwaukee, WI)、 あるいは、CH2Cl／CH3OH混合液（７０／３０（ｖ/ｖ））（Aldrich Chemical Co, Milwaukee, WI）などの上等の溶液中に再度分散させることによって、疎水性蛍光染料と酸化鉄粒子のストック溶液を作った。予め決められた量のポリマビーズを、メタノール中で完全に洗浄し(３Ｘ)、蒸発させて乾燥させた。同時に、有機溶剤／ナノ粒子／染料の混合液中でビーズを膨張させて、蛍光染料と酸化鉄ナノ粒子を含有させた。膨張プロセスは、１時間以内に完了した。次いで、このポリマビーズを、遠心分離によって分離して、メタノールで洗浄し(３Ｘ)、次いでイソオクタンで洗浄し（２Ｘ）、更に、メタノールで洗浄して（２Ｘ）、最終的に、０．２％のＳＤＳ−ＤＩ水溶液中に再分散させた。
【０１２４】
実験例１８：  磁界の印加による配列のフォーメーション
本発明のコンポジット粒子は、均質な磁界を軸方向（基体平面に直交する方向）にかけたときに、２次元配列フォーマットを構成する。コンポジット粒子のパラマグネチック感受率に応じて磁界強度を増加させると、平面アッセンブリが形成される。永久磁石は、所望のアッセンブリ形状を実現するのに必要な磁界強度となるように設計することができる。必要な磁界形状は、公知のソレノイドまたはヘルムホルツ状の電磁石によっても生成することができる。基体を、磁石の内孔内に取り入れるか、内孔の外側のコイルのすぐ近傍に位置させることで、磁界の向きを確実に基体平面に実質的に直交させることができる。パーマロイでできた基体を公知の方法でパターンニングして、空間的に変形した磁界を形成するようにしても良い。
【０１２５】
この実験例では、サイズの異なる３つのコンポジット粒子をここに述べたように合成した。コンポジット粒子中のコード化した粒子サイズは、３．２ミクロン、６．９ミクロン、１０．９ミクロンである、予想通り、粒子サイズが大きくなるにつれてコンポジット粒子の磁性が増大した。
【０１２６】
図２５は、永久磁石を用いて約１０００ガウスの磁界を印加して形成した、３．２ミクロンの２次元ジオメトリのコンポジット粒子を示す図である。
【０１２７】
実験例１９：  ２次元コロイド状配列：  磁性「ビグナ（Wigner）」クリスタルの形成
この実験例は、本発明のコンポジット粒子の操作能力を例証する。スーパーパラマグネチック Oligo(dT)25 マイクロ粒子（Dynal, Lake Success, NY）などのスーパーパラマグネチック粒子懸濁液を操作することによって、この実験を行った。これらの粒子の懸濁液は、スタビライザとして０．０５％のトリトン-Ｘ１００（Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI）を含有する０．０１ミリモーラの塩水に、〜５ｘ１０７（ビーズ/ｍｌ）の濃度で粒子を混合して作成する。この粒子の磁性は、完全に可逆性であり、磁界強度が低い場合は、効率的な時間変化磁気感受性（＝０．１９２）で外部磁界に比例している。これらの懸濁液は、顕微鏡ステージ上に保持されており、厚さ〜１００μｍの接着性スペーサによって分離されているシリコン電極と、ＩＴＯで被覆したガラス電極で形成されたサンドイッチセル中に保持されている。このサンドイッチセルの下に位置する銅線コイルによってサンプル中に名目的に均一な磁界が発生する。磁界を印加した後、懸濁液構造の発生が、ＶＣＲに取り付けられているＣＣＤカメラで記録され、この映像は更なる分析のためにデジタル化される。図２６は、実験的なセットアップを示すものであり、図２７は、２次元磁性配列のフォーメーションを示す一連のスナップ写真である。
【０１２８】
磁界が印加されると、粒子は、ｍ＝４/３πａ３μ０χＨの磁気モーメントを得る。ここで、ａは粒子半径、μ０は、真空中の磁気透過性、Ｈは外部磁界である。
【０１２９】
実験例２０：  蛍光磁性マイクロ粒子を用いたストレプタビジン−ビオチン結合分析
この実験例では、実験例１６ｃに記載されているニュートラビジン（１％）固体で機能化した、本発明のコンポジット粒子の懸濁液１００μｌを、１．５ｍｌのバイアルに加えて、０．０１％（ｗ/ｖ）のツィーン（Tween）20(PBST)を含むＰＢＳ９００μｌで希釈した懸濁液を加えた。本発明のコンポジット粒子を、渦状に混合して磁気的に分離し、上澄みを吸い取った。このペレットを、９８０μｌのPBS、２０μｌのビオチン-オリゴ（dT）５-ＣＹ５．５(ＩＤＴ、Coralville, IA)濃度（２６．７ｎｇ/ｍｌ）中に再懸濁させた。この混合液を室温で３０分間インキュベートした。これに続いて、本発明の粒子を磁気的に分離して、ＰＢＳＴ中で２回洗浄し、ＰＢＳＴ１ｍｌ中に再懸濁させた。次いで本発明の粒子をチップ上に集成させ、その表面の蛍光を上述の方法を用いて評価した。この結果を図２８に示す。比較のために、本発明の磁性ナノ粒子は有していないが、共有結合的に付着したニュートラビジンを有する本発明の符号化粒子も、この実験例で述べた工程を用いてビオチン化したプローブに反応させた。
【０１３０】
実験例２１：  ターゲット分子のオンチップハイブリダイゼーション
本実験は、本発明のコンポジット粒子に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブへのターゲット分子のオンチップハイブリダイゼーションを例証する。まず、公知の基本シーケンスでビオチン化したオリゴヌクレオチドを、表面をニュートラビジンで予め被覆した所定のタイプのカラー符号化コンポジット粒子にカップリングさせた。カップリング反応は、０．１ｍｌのカップリング緩衝液（１５０ミリモーラの  塩化ナトリウム、０．０５ミリモーラのエチレンジアミンテトラ−酢酸（ＥＤＴＡ）、０．５％のウシ血清アルブミン、０．５ミリモーラのトリス-塩化水素、および１００ミリモーラの燐酸ナトリウム、ｐＨ７．２）中で、０．４μｍビオチン化オリゴヌクレオチドを用いて行われ、約６．７ｘ１０５の粒子を得た。このカップリング反応混合液を、室温で、３０分間渦状にインキュベートした。このカップリング反応終了後、遠心分離により粒子を収集した。表面のニュートラビジンの未反応サイトは、０．０５％のツィーン（Tween）２０を含む、１５０ミリモーラの塩化ナトリウムと１００ミリモーラの燐酸ナトリウム、ｐＨ７．２中で、０．１％のビオチンでブロックした。ブロッキングは、室温で、２０分間、渦状に行った。ブロッキングの後、粒子を、０．０５％のツィーン（Tween）２０を含む、１５０ミリモーラの塩化ナトリウムと１００ミリモーラの燐酸ナトリウム、ｐＨ７．２、０．２ｍｌで洗浄した。上述の工程は、関心のあるどのようなビオチン化オリゴヌクレオチドでも、本発明のニュートラビジンで被覆した粒子の様々なカップリングに使用することができる。
【０１３１】
公知のシーケンスで、本発明のいくつかのタイプのカラー符号化粒子をビオチン化オリゴヌクレオチドにカップリングさせ、シリコンチップ上の配列アッセンブリ用の一のチューブに組み込んだ。このようにして形成した配列は、次いで、ペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマのオンチップハイブリダイゼーションに用いられ、本発明のマイクロ粒子に予めカップリングさせておいた相補オリゴヌクレオチドを特定した。特に、ハイブリダイゼーションは、２１８ｎｍのビオチン化ＰＮＡオリゴマを含む、ハイブリダイゼーション溶液（９０ミリモーラの塩化ナトリウム，８３ミリモーラの  グアニジン  チオシアネート、８ミリモーラの  ＭｇＣｌ２、１７ｎｍ  ＥＤＴＡ、０．０２％ビオチン、０．１％ツィーン（Tween）20、７０ミリモーラの  トリス−塩化水素、ｐＨ７．５）３０ｍｌ中で行った。ハイブリダイゼーション混合液中の配列を、４０℃で、６０分間インキュベートした。ハイブリダイゼーションが終了した後、配列を、５０μｌの２５０ミリモーラの塩化ナトリウム、１０ミリモーラのトリス−塩化水素、ｐＨ７．５、０．１％のツィーン（Tween）20で、室温で１０分間洗浄した。本発明のコンポジット粒子上にハイブリダイズされたビオチン化ＰＮＡオリゴマの検出用に、配列をＣｙ５．５−コンジュゲート  ストレプタビジン（１８μｌ／ｍｌ）を用いて、１５０ミリモーラの塩化ナトリウムと１００ミリモーラの燐酸ナトリウム、ｐＨ７．２中で、室温で３０分間インキュベートした。これを、１５ミリモーラの塩化トリウム，１０ミリモーラのトリス-塩化水素、ｐＨ７．５で洗浄した後、蛍光顕微鏡を用いて配列を検査した。本発明の粒子と、Ｃｙ５．５−ラベル化ＰＮＡオリゴマとから発光する蛍光を、特定波長の光学フィルタを用いて決定した。本発明の粒子は、そのカラーコードに基づいて復号され、特定の粒子から発光するＣｙ５．５の蛍光を、コンピュータプログラム（ＲＥＡＤ）を用いて評価した。磁気特性のないカラーコード化粒子を、分析におけるコントロールとして使用した。分析の結果を図２９に示す。これは、ＰＮＡｓが、コンポジット粒子にカップリングしている相補オリゴヌクレオチドに対して特別にハイブリダイズすることを示すものである。蛍光信号の強度は、オンチップハイブリダイゼーション分析中に二つの配列（それぞれ、チップＡおよびＢ、パネルＡおよびＢ用）から、本発明の４つのタイプの粒子（I、II、III、およびIV）によって決定した。タイプＩの粒子は、本発明のコンポジット粒子であり、一方、タイプII、III、およIVの粒子は、本発明のタイプの異なる３つのコード化粒子である。タイプIおよびIIは、ＰＮＡオリゴマに相補であるビオチン化オリゴヌクレオチドで機能化され符号化された粒子である。タイプIIIの符号化粒子は、ＰＮＡに無関係の基本シーケンスによってオリゴヌクレオチドで機能化されている。タイプIVの符号化粒子は、その表面にオリゴヌクレオチドを持たない。チップＢは、チップＡに対して負の「コントロールとして作用する。チップＢは、ターゲットＰＮＡを含まないハイブリダイゼーション混合液でインキュベートされる。符号「ｎ」は、各タイプの粒子数であり、バーは、平均値の標準公差を表す。
【０１３２】
実験例２２：  蛍光磁気マイクロ粒子を用いた免疫分析
この実験例では、免疫分析の実行に本発明のコンポジット粒子を使用している。本発明のコンポジット粒子は、その表面上の関心のある抗体を表示するようにカスタマイズすることができる。本発明のコンポジット粒子配列は、関心のある抗原を含むサンプル溶液（血清溶液など）に暴露させることができる。蛍光ラベル化した二次抗体を順次加えると、三次蛍光複合体が形成される。この濃度は、本発明に開示されている方法を用いてコンポジット粒子表面からの蛍光を記録することでモニタすることができる。本発明の抗体機能化コンポジット粒子の配列は、したがって、血清タンパク質レベルのモニタに使用することができ、関心のある抗原の結合パターンは、タンパク質のプロファイル作成に使用することができる。
【０１３３】
実験例２３：  代替I：磁界誘導型配列のフォーメーション
この実験例は、図２２の操作と、シーケンスを特定したｍＲＮＡ分子の捕獲から、ＥＦＭビーズを表示したｃＤＮＡ配列までの反応ステップのシーケンスを例証する。このような配列は、様々なアプリケーションに有益である。例えば、遺伝子プロファイリングにおいては、平面ｃＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ濃度のプロファイルを作るのに有益である。代替として、ｃＤＮＡ配列は、ラベル化したＤＮＡ結合因子のプールを用いて直接的にプローブとすることができ、あるは、配列内の関心のある遺伝子をプロファイルするプローブとすることができる。プロトコルは、温度管理された装置の中で実行され、以下のステップを具える：（１）本発明のコンポジット粒子セットを、ｍＲＮＡ分子のプールを含む第１のコンパートメント内に導入する。各粒子タイプは、遺伝子特定オリゴヌクレオチドプローブを表示している。ｍＲＮＡ分子は、その対応するプローブにアニールすることができる。この捕獲ステップのための分析条件は、公知であり、ここで適用可能である。（２）粒子を付着したｍＲＮＡをテンプレートとして用いて粒子上で可逆トランスクリプション（ＲＴ）を実行し、粒子からｍＲＮＡを開放する。（３）永久磁石で得た磁界を印加して、粒子を保持したまま洗浄する。（４）磁界を解除して粒子を緩衝液中に再懸濁させ、ＬＥＡＰＳ工程を実行する。（５）粒子を、カスタム設計されたチップを含むコンパートメントへ向けて、ＬＥＡＰＳを用いて、本発明のコンポジット粒子の平面配列を形成する。
【０１３４】
実験例２４：  代替II：磁界誘導型配列のフォーメーション
この実験例は、図２２の動作と、ｍＲＮＡ分子のシーケンス特定捕獲から、ＥＦＭ粒子を表示したｃＤＮＡ配列の形成までの反応ステップのシーケンスを例証する。磁界を印加することによって本発明のコンポジット粒子の平面配列を形成する点を除いて、実験例２１で述べたプロトコルを用いることができる。ただし、実験例２１のステップ（４）と（５）は削除する。
【０１３５】
実験例２５：  コード化磁性ビーズの配列を用いたマルチステップ配列シーケンス
この実験例は、遺伝子ＤＮＡフラグメントの捕獲を、磁性ナノ粒子の第１セットと統合した、マルチステップ生化学反応プロトコルを例証する。このプロトコルに続いて、図２２に記載された一般的なプロセスによる、捕獲した「粒子−タグ」をつけたフラグメントの磁気的分離および固相増幅が行われる。この捕獲ステップに続いて、同時「マルチプレックス」PCR増幅反応の変形ステップが行われる。各反応は、硼素アンプリコン溶液を生成するプライマ対のセットを含み、これらをプールして、マルチプレックス分析用の本発明のコンポジット粒子セットに接触する場所に位置させる。これは、磁界の印加による後の変形を起こす。
【０１３６】
これは、以下のステップで行うことができる。
１．サンプル捕獲および第１の変形
遺伝子DNAのフラグメントを含む溶液を、４つに等分して、アリコートを４つの別々の反応コンパートメントに注入する。このコンパートメントは、標準PCR温度循環プロトコルに応じて温度制御を行うように設定されている。各コンパートメントに、一またはそれ以上の磁性ナノ粒子タグをつけたプライマを注入する。粒子タグをつけたプライマは、関心のある遺伝子DNAターゲットに対向する方向を向いているオリゴヌクレオチドプローブを表示する磁性ナノ粒子でできており、このプローブは、順次のポリメラーゼ結晶プライマ伸張反応の第１プライマとしても作用する。次のステップでは、粒子表示プローブのマッチングのための選択されたフラグメントのハイブリダイゼーションによる捕獲が行われ、前記ターゲットは、順次の伸張反応でテンプレートとして作用する。各コンパートメントに、ポリメラーゼが加えられ、一またはそれ以上の第２プライマが必要に応じて加えられ、粒子がカップリングした捕獲プローブのテンプレートで方向付けられた伸張がすべてのコンパートメントで同時に生じるような温度サイクル下で行われる。これによって、第１の伸張生成物を生成して、磁性ナノ粒子に固定する。このコンパートメントは、粒子を固定した伸張生成物を保持したままで洗浄する。
【０１３７】
遺伝子ＤＮＡのフラグメントを増幅する粒子タグを付けたプライマを用いた典型的なPCRプロトコルは、以下の通りである。関心のあるフラグメント内の特定ターゲット位置に対応するオリゴヌクレオチドプローブは、ターゲット位置に、あるいはターゲット近くに整列した変動可能な３’末端を伴うように設計されている。プローブは、１２Cスペーサ（Synthegen TX）を有する５’ビオチン−ＴＥＧを含むように合成される。プローブは、標準的な反応プロトコルによって、ストレプタビジンで被覆した磁性ビーズに付着させる。このプロトコルは：磁性ビーズ懸濁液を１ＸＴＥ（１００ミリモーラのトリス-塩化水素、１０ミリモーラのEDTA）、５００ミリモーラの塩化ナトリウムに加え、室温で４５分間置く；ビーズを１X ＴＥ１５０ミリモーラの塩化ナトリウムで３回洗浄し；同じ溶液５０μｌ中に懸濁させる。次いで、各ビーズ懸濁液１μｌを、１Ｘ緩衝液（１００ミリモーラのトリス-塩化水素、ｐＨ．９．０、１．５ミリモーラの塩酸マグネシウム、５００ミリモーラのＫＣＬ）と、４０モーラのＣｙ５でラベル化したｄＣＴＰ（Amershaｍ Pharmacia Biotech NJ）と、残りの３つのｄＮＴＰｓ８０μモーラと、３単位のTaq DNAポリメラーゼ（Amersham Pharmacia Biotech NJ）とを含むＰＣＲ混合液に加える。遺伝子DNAターゲットフラグメント（４０ｎｇ）を、伸張が開始する直前に、このＰＣＲ混合液に加える。これらの条件の下では、ペルキンエルマ（Perkin  Elmer）９６００熱サイクラを用いて、１０回の増幅サイクルで十分なビーズ固定伸張生成物を生成できる。温度サイクルは、変性(９０℃で３０秒)、アニーリング（５５℃で３０秒）、および伸張（７２℃で２０秒）からなる。伸張反応が完了した後、ビーズを典型的には４回、１XＴＥ緩衝液中で、遠心分離により、洗浄する。
【０１３８】
２． 第２の増幅を同時に行う例
各反応コンパートメントに、ポリメラーゼを一またはそれ以上のプライマペアと共に注入した。このプライマペアは、粒子に固定された第１の伸張生成物内の領域を選択するように設計されており、各コンパートメントは、このようなプライマペアの独自のセットを受け取る。温度が循環している状態でビーズに固定されたフラグメントの同時増幅が起こり、これによって、各コンパートメントでは、コンパートメントの中に入った対応するプライマセットによって方向付けられる特定アンプリコンのセットを生成する。標準ＰＣＲ反応プロトコル（ＲＥＦ）をこのステップに適用する。
【０１３９】
３． 反応生成物のプール、後の分析、配列集成、および、検出
アンプリコンを含有する溶液を組み合わせて、検体溶液を作り、検出コンパートメントに移動させ、本発明の符号化した磁性ナノ粒子セットに接触させる。各粒子は、検体溶液中のアンプリコンの一つに対して独自に方向付けられたシーケンス特定オリゴヌクレオチドプローブを表示している。ビーズ表示プローブにアンプリコンをアニーリングしてハイブリダイゼーション複合体を形成し、例えば、ハイブリダイゼーション複合体や、プローブ伸張などの差動熱安定性などの方法で、ターゲットシーケンスの選択された領域の分析が行われる。磁界が印加されて、本発明の粒子の平面配列が形成される。分析画像信号が記録される。復号画像が記録され、捕獲したプローブのアイデンティティを復号する。
【０１４０】
符号化した機能化磁性ビーズの平面配列を形成する条件も与えて、多型分析用の標準的な分析条件をこのステップに適用する。この条件は、実験例ＮＮと図ＭＭ（永久磁石で誘導されたＳＢ：ＥＦＭビーズ配列）として明示されている。
【０１４１】
実験例２６：  混合クラスタと配列
この実験例は、ターゲットＤＮＡ鎖が本発明の磁性ナノ粒子に付着している配列フォーマットを例証する。化学的付着は、公知のバイオ共役化学物質の標準プロトコルを用いて、容易に行うことができる。例えば、ＤＮＡの鎖は容易にビオチン化して、次いでストレプタビジンで被覆した磁性ナノ粒子に付着させることができる。代替的に、粒子で表示したＤＮＡ鎖を、実験例２１で述べたように、ビーズタグを付したプライマを用いたＰＣＲで生成する。本発明の符号化粒子の必要なセットは、ここに述べられている方法によって生成することができる。粒子は、公知技術のバイオ共役化学物質の標準方法を用いて特定のオリゴヌクレオチドプローブで機能化される。分析中に、結合パートナ間に複合体が形成される結果として、磁性ナノ粒子と符号化粒子で構成されたヘテロ構造が形成される。また、これらの複合体は、平面配列中に集成され、検出される。
【０１４２】
ここで、二つの代替について述べる。第１の代替は、光学的に符号化したビーズのサイズが、典型的に、磁性ビーズのサイズを有意に超える例である。各々の半径の典型的な比率は、１００：１である。直径１００Åのストレプタビジンで被覆した磁性ナノ粒子は、実験例２２で述べたとおり、商業的に入手可能である。次いで、磁性ビーズ-タグターゲットをプローブにマッチングさせるハイブリダイゼーションを可能とする条件下で、磁性粒子表示ＤＮＡターゲット鎖の混合物を、オリゴヌクレオチドプローブを表示するカラー符号化ビーズセットに組み合わせる。ハイブリダイゼーション複合体の形成は、各カラー符号化ビーズを、多数の磁性ナノ粒子で「装飾」して、磁性シェルを生成し、その結果ここで述べる構造と組成の粒子が形成される。
【０１４３】
本発明の方法による磁界の印加は、本発明の符号化磁性ナノ粒子の平面配列を生成し、マルチカラー蛍光画像を記録して、捕獲されたＤＮＡターゲットを同定することができる。代替的に、分析条件を、クラスタの形成に都合がよいように選択するようにしても良い。すなわち、マルチ歯状「リガンド」として作用する本発明の磁性ナノ粒子は、本発明の符号化および磁性粒子のクラスタ中へ本発明の符号化粒子を「凝集」させる。磁界、典型的には１０００ガウスを超えるような磁界をかけると、これらのクラスタを、溶液から離隔したクラスタの膨張アッセンブリへ分離することができる。
【０１４４】
第２の代替では、本発明の磁性符号化粒子の役割、すなわち、相対的なサイズが反転して、より大きな磁性ナノ粒子が、符号化粒子で装飾される。実験例１９に記載されている条件にしたがって磁界を印加すると、（ダイナルビーズ（Dynal beads）−ソレノイド）が、磁性ナノ粒子の平面配列を生成する。ここで、各粒子は、当該粒子が光学的識別子を与えられているか否かに応じて、光学的信号を表示し、あるいは光学的信号を表示しない。
【０１４５】
この実験例の両代替は、捕獲されたターゲットを同定するためには、マルチ光学サインを読み取ることが必要である。粒子を光学的にローディングすると、典型的には２または３の、少数の符号化カラーを適用することによって符号化が行われる。このような符号化カラーの比率を一般的な方法によって変化させることは公知である。マルチカラー撮像は、公知のマルチプルフィルタセットを用いた標準的なマルチカラー蛍光撮像によって容易に行うことができる。さもなければ、多重識別カラーの組み合わせを使用してカラーコードを作成する場合は、一般的に、マルチスペクトラル撮像法を使用して分析画像を記録することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
上記に簡単に説明した本発明の以下の実施例の目的、特徴及び効果は、実施例として理解される詳細な説明と、実施例の特徴を反映する添付の図面を合わせて考察することによって、より明確に理解される。：
【図１】図１は、複合分析におけるランダムビーズ配列の生成と利用の工程の流れを表した図である。
【図２】図２は、ビーズの機能化を示す図である。
【図３】図３は、チップの設計の段階とウェハ−スケールの製品を示す図である。
【図４】図４は、ランダムコード化配列の必要に応じたアセンブリを示す図である。
【図５】図５は、パルムトップマイクロラボを示す図である。
【図６】図６は、本発明のランダムコード化配列検出プロセスで用いられる分析と復号画像の概略を示す図である。
【図７】図７は、画像分析におけるアルゴリズムとステップを要約したフローチャートである。
【図８】図８は、図７で要約された画像分析アルゴリズムのアプリケーションによって、ビーズのタイプに応じて分析画像を分解するステップを示す図である。
【図９】図９は、ランダムコード化配列の光学的プログラム可能な配列アセンブリを示す図である。
【図１０】図１０は、ランダムコード化副配列で構成された配列を示す図である。
【図１１】図１１は、自動化されたチップ規模のビーズ配列の製造と品質制御プロセスにおける位置を示す図である。
【図１２】図１２は、二つのサイトカインを表す量的結合曲線を示す図である。
【図１３】図１３は、多型解析のための配列設計を示す図である。
【図１４】図１４は、多型解析における図１３に示す一の副配列より記録された、分析と復号画像の蛍光顕微鏡写真である。
【図１５】図１５は、図１４に示す一の分析画像の分析より得た、蛍光強度のヒストグラムの形で分析結果を示す図である。
【図１６】図１６は、ハイブリダイゼーション分析用の環状プローブの設計を示す図である。
【図１７】図１７Ａと図１７Ｂは、多数のサイトカインの分析中に記録された復号画像分析の蛍光顕微鏡写真である。
【図１８】図１８Ａと図１８Ｂは、複数競合受容体−リガンド相互作用を伴う受容体−リガンド系において交錯する相互関係の数値シミュレーションを示す図である。
【図１９】図１９は、受容体−リガンドの会合と解離の速度論の数値シミュレーションを示す図である。
【図２０】図２０は、磁性捕獲粒子を用いたサンプル獲得と、本発明のランダムコード化配列検出プロセスを用いた配列ベースの検出とをまとめた図である。
【図２１】図２１は、遺伝子特異的捕獲、ビーズ上での逆転写及び分析後の配列アセンブリの統合のためのコンポジット粒子を利用した多段階分析を示す図である。
【図２２】図２２は、広い範囲で生化学分析に応用可能なマルチステップ分析の順序を示す図である。
【図２３】図２３（I）は、一の光学粒子の四つの異なる型を表しているヒストグラムを示す図であり、図２３（II）は八つの双コード化粒子のドットブロットである。
【図２４】図２４は、磁性ローディングによる変化を示す図である。
【図２５】図２５は、磁界にある本発明のコンポジット粒子を示す図である。
【図２６】図２６は、磁界の適用のための実験的なアセンブリの概要を示す図である。
【図２７】図２７（I）は、磁界の適用前のビーズ集成の二次元構造を示す図である。図２７（II）は、約１００ガウスの磁界適用後のビーズ集成の二次元構造を示す図である。図２７（III）は、図２７（II）の二次元集成を拡大した図である。図２７（IV）は、約２０ガウスの磁界における二倍のビーズ濃度のための二次元配列を示す図である。
【図２８】図２８は、本発明によるコード化された磁性粒子を利用したストレプトビジン−ビオチン結合分析の結果を表している。
【図２９】図２９は、本発明によるコード化された磁性粒子を利用したハイブリダイゼーション分析の結果を表している。
【図１】
2005514618.tif 000006
【図２】
2005514618.tif 000007
【図３】
2005514618.tif 000008
【図４】
2005514618.tif 000009
【図５】
2005514618.tif 000010
【図６】
2005514618.tif 000011
【図７】
2005514618.tif 000012
【図８】
2005514618.tif 000013
【図９】
2005514618.tif 000014
【図１０】
2005514618.tif 000015
【図１１】
2005514618.tif 000016
【図１２】
2005514618.tif 000017
【図１３】
2005514618.tif 000018
【図１４】
2005514618.tif 000019
【図１５】
2005514618.tif 000020
【図１６】
2005514618.tif 000021
【図１７】
2005514618.tif 000022
【図１８Ａ】
2005514618.tif 000023
【図１８Ｂ】
2005514618.tif 000024
【図１９】
2005514618.tif 000025
【図２０】
2005514618.tif 000026
【図２１】
2005514618.tif 000027
【図２２】
2005514618.tif 000028
【図２３】
2005514618.tif 000029
【図２４】
2005514618.tif 000030
【図２５】
2005514618.tif 000031
【図２６】
2005514618.tif 000032
【図２７】
2005514618.tif 000033
【図２８】
2005514618.tif 000034
【図２９】
2005514618.tif 000035
【国際調査報告】
2005514618.tif 000036
2005514618.tif 000037