(57)【要約】リジン官能基を有する高分子を選択的に結合させる方法であって、それぞれがリジン官能基を有する１種類またはそれ以上の高分子を含む試料を調製する工程；一般式Ｘ−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＯＲまたはＸ−Ｌ−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＯＲで表される結合試薬（ここで、Ｘは捕捉試薬に選択的に結合するアフィニティーラベルを、Ｒは残基を、Ｌはリンカー部位をそれぞれ表す。）を提供する工程；上記結合試薬を上記試料に加えて、該結合試薬と上記１種類またはそれ以上の高分子との間でグアニジン化反応を起こさせて、アフィニティーラベルを有する１種類またはそれ以上のホモアルギニン誘導体を生成する工程；必要に応じて、上記アフィニティーラベルを有するホモアルギニン誘導体を修飾して、さらに多くのアフィニティーラベルを有するホモアルギニン誘導体を生成する工程；および上記アフィニティーラベルを有するホモアルギニン誘導体を、Ｘと選択的に結合する捕捉試薬を用いて捕捉する工程；を含む方法が開示されている。
2005528614.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リジン官能基を有する高分子を選択的に結合させる方法であって、
それぞれがリジン官能基を有する１種類またはそれ以上の高分子を含む試料を調製する工程；
下記の一般式
【化１】
2005528614.tif 000012
または
【化２】
2005528614.tif 000013
で表される結合試薬（ここで、Ｘは捕捉試薬に選択的に結合するアフィニティーラベルを、Ｒは残基を、Ｌはリンカー部位をそれぞれ表す。）を提供する工程；
上記結合試薬を上記試料に加えて、該結合試薬と上記１種類またはそれ以上の高分子との間でグアニジン化反応を起こさせて、アフィニティーラベルを有する１種類またはそれ以上のホモアルギニン誘導体を生成する工程；
必要に応じて、上記アフィニティーラベルを有するホモアルギニン誘導体を修飾して、さらに多くのアフィニティーラベルを有するホモアルギニン誘導体を生成する工程；および
上記アフィニティーラベルを有するホモアルギニン誘導体を、Ｘと選択的に結合する捕捉試薬を用いて捕捉する工程；
を含む方法。
【請求項２】
１種類またはそれ以上の試料中の１種類またはそれ以上のタンパク質、タンパク質官能基および／またはペプチドの分析方法であって、
下記の一般式
【化３】
2005528614.tif 000014
または
【化４】
2005528614.tif 000015
で表される結合試薬（ここで、Ｘは捕捉試薬に選択的に結合するアフィニティーラベルを、Ｒは残基を、Ｌはリンカー部位をそれぞれ表す。）を提供する工程；
上記結合試薬を上記１種類またはそれ以上の試料に加えて、該結合試薬とリジン官能基を有するタンパク質および／またはペプチドとの間でグアニジン化反応を起こさせて、アフィニティーラベルを有する１種類またはそれ以上のホモアルギニン誘導体を生成する工程；
必要に応じて、上記アフィニティーラベルを有するホモアルギニン誘導体を修飾し、さらに多くのアフィニティーラベルを有するホモアルギニン誘導体を生成する工程；
上記アフィニティーラベルを有するホモアルギニン誘導体を、Ｘと選択的に結合する捕捉試薬を用いて捕捉する工程；および
上記アフィニティーラベルを有するホモアルギニン誘導体の分析を行う工程；
を含む方法。
【請求項３】
ホモアルギニン誘導体を修飾する工程が、タンパク質をペプチドに変換する工程を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
アフィニティーラベルを有するホモアルギニン誘導体の分析をすることによりタンパク質、タンパク質官能基および／またはペプチドの同定を行う、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
上記分析を行う工程が、分析手法により得たデータを配列データベースと比較する工程を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
請求項２に記載の方法に従い、タンパク質を含有する２種類またはそれ以上の試料中のタンパク質の相対発現レベルを測定する方法であって、
下記の一般式
【化５】
2005528614.tif 000016
または
【化６】
2005528614.tif 000017
で表される結合試薬群（ここで、Ｘは捕捉試薬に選択的に結合するアフィニティーラベルを、Ｒは残基を、Ｌはリンカー部位をそれぞれ表す。）であって、その群に属する結合試薬の化学式は同一であるが、それぞれの結合試薬に含まれる同位体の組み合わせが異なっているため、上記それぞれの結合試薬の分子量が、その群に含まれる他の結合試薬の分子量と異なるように同位体標識された結合試薬群を提供する工程；
上記試料のそれぞれに、上記結合試薬群に由来のそれぞれ異なる結合試薬を加え、上記それぞれの試料において、上記結合試薬とリジン官能基を有する部位との間でグアニジン化反応を起こさせ、複数の同位体標識アフィニティーラベルを有するホモアルギニン誘導体を生成する工程；
試料をひとつに混合する工程；
必要に応じて、タンパク質をペプチドに変換する工程；
上記アフィニティーラベルを有するホモアルギニン誘導体を、Ｘに選択的に結合する捕捉試薬を用いて捕捉する工程；および
アフィニティーラベルを有するホモアルギニン誘導体の分析を行う工程であって、同位体標識のみが異なる一連のホモアルギニン誘導体の相対存在比を測定することにより、上記一連のホモアルギニン誘導体の出発物質となったタンパク質の相対発現レベルを決定する工程；
を含む方法。
【請求項７】
タンパク質をペプチドに変換する工程が、アフィニティーラベルを有するホモアルギニン誘導体に含まれるタンパク質をペプチドに変換することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
アフィティーラベルを有するホモアルギニン誘導体の分析を行うことにより、タンパク質、タンパク質官能基および／またはペプチドの同定を行う、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
上記分析を行う工程が、分析手法により得たデータを配列データと比較する工程を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
上記分析を行う工程が質量分析法を含む、請求項２から９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１】
上記質量分析法がタンデム質量分析法を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
上記分析を行う工程の前に、アフィニティーラベルを有するホモアルギニン誘導体を捕捉試薬から解離させる工程をさらに含む、請求項２から１１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１３】
上記捕捉試薬が、アフィニティーラベルを有するホモアルギニン誘導体であって化学的性質の異なるものを分離するクロマトグラフィー分離システムの一部を構成する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
上記クロマトグラフィー分離システムに液体クロマトグラフィーを用いる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
上記クロマトグラフィー分離システムにガスクロマトグラフィーを用いる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
タンパク質および／またはペプチドの絶対定量値が得られる、請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
Ｒがアルキル基である、請求項１から１６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１８】
ＲがＣＨ３である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
Ｘがアルキル基である、請求項１から１８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２０】
ＸがＣＨ３である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
結合試薬が、
【化７】
2005528614.tif 000018
である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
リジン官能基を有する分子を選択的に結合させるための試薬であって、
下記の一般式
【化８】
2005528614.tif 000019
または
【化９】
2005528614.tif 000020
で表される試薬（ここで、Ｘは捕捉試薬に選択的に捕捉されるアフィニティーラベルを、Ｒは残基を、Ｌはリンカー部位をそれぞれ表す。）。
【請求項２３】
Ｘがビオチンあるいは修飾されたビオチンである、請求項２２に記載の試薬。
【請求項２４】
Ｘがアルキル基である、請求項２３に記載の試薬。
【請求項２５】
ＸがＣＨ３である、請求項２４に記載の試薬。
【請求項２６】
Ｒがアルキル基である、請求項２２から２５のいずれか１つに記載の試薬。
【請求項２７】
ＲがＣＨ３である、請求項２６に記載の試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高分子（巨大分子：macromolecules）の選択的結合および分析に関し、特に、複雑な混合物中のタンパク質またはタンパク質官能基の定量分析に関する。
【背景技術】
【０００２】
真核生物で最初に酵母（Saccharomyces
Cerevisiae）についてゲノム配列の解読が完了して以来、あらゆる生物種のゲノム配列データベースが容易に入手可能になっている。現在のところ、集められた膨大なデータは、主に細胞内で発現するタンパク質の同定のために用いられている。細胞内で合成される全てのタンパク質は、「プロテオーム」としても知られている。
【０００３】
プロテオミクスに関する通常の実験においては、細胞抽出物の残りからタンパク質を分離後、より単純な組成のタンパク質混合物を得るために、２次元ゲル電気泳動法（２Ｄ−ＧＥ）および／またはクロマトグラフィー法によるプロテオームの分画操作を行う。その後、前記操作により得られたタンパク質混合物を、タンパク分解酵素（トリプシン）により消化し、得られたペプチド混合物の質量分析法による分析を行う。タンパク質の特性分析は、マトリックス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析法（ＭＳ）や、エレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）のような、ソフトなイオン化法を用いて行う。
【０００４】
ゲノム配列から、理論上いつでも発現しうる全てのタンパク質（仮想プロテオーム）に関する知見を得ることができる。しかし、質量分析法（ペプチドマスフィンガープリント法（ＰＭＦ）を使用するかまたは衝突励起解離（ＣＩＤ）法と組み合わせたタンデム質量分析法を使用する）からは、ある特定の生理的条件下で細胞によりどの遺伝子生成物が実際に合成されたか（真のプロテオーム）が明らかにされる。生体系の機能分析において重要なのは、細胞内のタンパク質存在比が生体内部あるいは外部からの刺激によりどのように変化するかを定量できることである。近年、複雑な組成の混合物中のタンパク質の相対定量分析を行うための化学的手法について、多くの努力がなされている。
【０００５】
通常用いられる手法は、タンパク質／ペプチド群の各々を、化学的には同一の試薬あるいは標識化剤（ラベル）のそれぞれ相異なる同位体置換異性体により修飾することである。次いで、試料はひとつに混合され、精製後、質量分析法を用いて識別される。このアプローチは、相異なる同位体標識をされた２つのペプチドが、サンプルの操作から質量分析までの間を通して同様の挙動を示すという仮定に基づいている。小田らは、細胞の成長の間に、ある細胞状態の間は１５Ｎを含む培地で、他の細胞状態の間は１４Ｎを含む培地で培養することにより、同位体標識を導入した（Y.Oda,T.Nagasu and B.T.Chait,Nature Biotechnology, Vol.19, No.4, 379-382
(2001)：非特許文献１）。２つの異なる同位体標識ペプチドイオンのピーク強度の比較により、２つの細胞状態間の相対定量分析が可能になる。このアプローチは、高価であり、同位体標識の導入が困難な細胞由来のタンパク質には適用が困難である。さらに、ペプチドイオン信号間の質量差は、ペプチドのアミノ酸組成の違いに由来する１５Ｎ導入レベルによって変動する。このような方法では、定量を行う前に、まずタンパク質を同定する工程が必要になる。
【０００６】
その後、同位体標識したアミノ酸の選択的導入に基づく他の手法が提案された。Martinovicらは、最少培地または同位体標識したロイシン（ＬｅｕＤ10）を添加した最少培地で培養した細胞からタンパク質を抽出する方法について報告した（S.Martinovic,
T.D.Veenstra, G.A.Anderson, L.Pasa-Tolic and R.D.Smith, Journal of Mass
Spectrometry, Vol.37, 99-107 (2002)：非特許文献２）。２種類のタンパク質抽出物を混合後、キャピラリー等電点電気泳動（ＣＩＥＦ）と組み合わせたフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析法（ＦＴＩＣＲ）により分析した。同位体標識したアミノ酸を導入しても、ＣＩＥＦによるタンパク質の分離効率は影響を受けないため、特定のタンパク質であって同位体標識が導入されたものと導入されていないものは、両者とも同一のスペクトルとして観測される。同位体標識体と非標識体の質量差を用いて、特定のタンパク質に含まれるロイシン残基の数を決定する。この手法の欠点は、機器が高価なことである。Prattらは、ロイシンの選択的導入を、タンパク分解酵素による消化およびＭＡＬＤＩ分析法と組み合わせて使用する手法について報告している（J.M.Pratt, D.H.L.Robertson, S.J.Gaskell, I.Riba-Garcia, S.J.Hubbard,
K.Sidhu, S.G.Oliver, P.Butler, A.Hayes, J.Petty and R.Beynon, Proteomics,
Vol.2, 157-163 (2002)：非特許文献３）。この手法によれば、ロイシンによる標識は、ペプチドマスフィンガープリント（ＰＭＦ）によるタンパク質の同定に関する信頼性を向上させるための手段として報告されている。ロイシンは、多くのゲノムに豊富に存在するアミノ酸なので、ほとんどのペプチドは少なくとも１つのロイシン残基を含む。個々の消化断片において２種類のロイシンを生体内標識することにより、分子内のアミノ酸残基数を正確に同定することが可能になる。データベース検索エンジンを用いて行われる同定のプロセスにおいては、検索空間を少なくするため、他の方法により得られた情報を活用することができる。原理的に、この方法は定量分析に適用できる。
【０００７】
しかし、質量分析法は、感度および選択性の点では優れるものの、数種類のタンパク質に由来するペプチドを含む混合物に適用することは未だに不可能である。多くの成分が存在すると、化学ノイズが発生し、分析に用いたイオン化法に適しない化学的性質を有する分子イオンの検出が阻害される。そこで、混合物を成分ごとに分割するために、予備分離が用いられる。クロマトグラフィー法においては、液体クロマトグラフィーの前に、ビオチンとアビジンの親和性による捕捉および解離を利用して分離を行う方法が、ゲル電気泳動法（存在比の低いタンパク質の分析には適しないことが知られている。）を回避できる可能性という点で、非常に興味深い。現行の分析法への適用に特に適しているのは、同位体標識アフィニティータグ（ＩＣＡＴ）法である。このアプローチでは、細胞からのタンパク質抽出物について、標識、分離、定量を行うことができる（S.P.Gygi, B.Rist, S.A.Gerber, F.Turecek, M.H.Gelb and R.Aebersold,
Nature Biotechnology, Vol.17, No.10, 994-999 (1999)：非特許文献４、ＷＯ００／１１２０８国際公開公報（特表２００２−５２３０５８国内公表公報）：特許文献１。これらの報文および公報の記載事項を本明細書において援用する。）。
【０００８】
標識化剤（ラベル）は３つの部分よりなる。第１の部分は、ＩＣＡＴ標識されたペプチドの分離に用いられるアフィニティータグ（通常はビオチン）である。第２の部分は、安定同位体を含むリンカーである。第３の部分は、チオール基に特異性を有する反応基である。ビオチン基は、アフィニティークロマトグラフィーによる分離工程において、クロマトグラフィーカラムに担持されたアビジン残基により、選択的に認識される。
【０００９】
リンカー部位は、一般的に８つの水素（軽い試薬）または重水素（重い試薬）を含んでおり、相対定量分析を可能にする。チオール基に特異性を有する反応基により、標識がシステイン残基と反応することができる。全体としての操作手順は、全タンパク質の修飾およびそれら全ての消化、アフィニティークロマトグラフィーによる分離ならびにタンデム質量分析の各工程よりなる。同位体標識された２種類のイオン種についてのプリカーサーイオンの強度を比較することにより、一方のイオンの他方に対する相対存在比を決定することが可能になる。同様なアプローチとしては、Qiuらが、化学修飾された新規な樹脂について報告している。ＡＬＩＣＥと名づけられたその樹脂は、ビオチンの代わりに酸分解性のアンカー基を有する非生体高分子である（Y.Qiu, E.A.Sousa, R.M.Hewick and J.H.Wang, Acid-labile isotope-coded
extractants: a new class of reagents for quantitative mass spectrometric
analysis of complex protein mixtures 1.Analytical Chemistry, Vol.74, No.19,
4969-4979(2002)：非特許文献５）。
【００１０】
しかしながら、上述したＩＣＡＴ法には、多くの問題や欠点が存在する。第１に、タンパク質におけるシステインアミノ酸残基の存在確率は比較的低い。第２に、チオール特異性基の反応性はあまり高くなく、さらには、副反応が起こる。第３に、ＩＣＡＴ標識のイオン化効率は高くない。溶媒や電解質等の影響と合わせた、これらの実験上の要因がもたらす総合的な影響は２倍である。まず、ＩＣＡＴ法の感度は、所望されている値よりも低い。次に、イオン化効率が標識されたタンパク質やペプチドに依存する結果、定量分析に非定量的な要因がもたらされる。
【００１１】
他の官能基をターゲットとする他の方法について近年報告がなされている。Gosheらは、リンタンパク質同位体標識アフィニティータグ（ＰｈＩＡＴ）を用いる方法を紹介している（M.B.Goshe, T.P.Conrads, E.A.Panisko, N.H.Angell, T.D.Veenstra and
R.D.Smith, Phosphoprotein isotope-coded affinity tags approaches for isolating
and quantating phospeptides in proteome-wide analyses.Analytical Chemistry,
Vol.73, No.11, 2578-2586(2001)：非特許文献６）。この方法は、安定同位体とビオチンによるラベル化を組み合わせることで、タンパク質のＯ−リン酸化状態の相違を増大させ、定量的に測定することを目的とするものである。
【００１２】
同位体標識アフィニティータグ法に基づく手法においては、アフィニティークロマトグラフィーの工程が重要であり、アフィニティークロマトグラフィーは、エレクトロスプレー装置と容易に組み合わせることができるにもかかわらず、ＩＣＡＴ法とＭＡＬＤＩ装置を組み合わせることについて努力がなされてきた。ペプチドがマイクロキャピラリー逆相液体クロマトグラフィーカラムから溶出するまでの工程については、上述した場合と同様である。マトリックスを添加後、試料スポットは、ＱｑＴＯＦ質量分析計により分析される。すなわち、一組の同位体標識ペプチドの存在比を求めるため、個々の試料スポットのペプチドについてマススペクトルを測定する。次いで、タンパク質の同定を行うために、選択した特定のペプチドについてタンデム質量分析を行う（T.J.Griffith, S.P.Gygi, B.Rist, R.Aebersold, A.Loboda, A.Jilkine,
W.Ens and K.G.Standing, Quantitative proteomic analyisis using a MALDI
quadrupole time-of-flight mass spectrometer.Analytical Chemistry, Vol.73, No.5,
978-986 (2001)：非特許文献７）。
【００１３】
【非特許文献１】Y.Oda,T.Nagasu and B.T.Chait, Nature Biotechnology, Vol.19, No.4, 379-382 (2001)
【非特許文献２】S.Martinovic,T.D.Veenstra, G.A.Anderson, L.Pasa-Tolic and R.D.Smith, Journal of MassSpectrometry, Vol.37, 99-107 (2002)
【非特許文献３】J.M.Pratt,D.H.L.Robertson, S.J.Gaskell, I.Riba-Garcia, S.J.Hubbard, K.Sidhu, S.G.Oliver,P.Butler, A.Hayes, J.Petty and R.Beynon, Proteomics, Vol.2, 157-163 (2002)
【非特許文献４】S.P.Gygi,B.Rist, S.A.Gerber,F.Turecek, M.H.Gelb and R.Aebersold, Nature Biotechnology,Vol.17, No.10, 994-999 (1999)
【非特許文献５】Y.Qiu, E.A.Sousa,R.M.Hewick and J.H.Wang, Acid-labile isotope-coded extractants: a new class ofreagents for quantitative mass spectrometric analysis of complex proteinmixtures 1.Analytical Chemistry, Vol.74, No.19, 4969-4979 (2002)
【非特許文献６】M.B.Goshe,T.P.Conrads, E.A.Panisko, N.H.Angell, T.D.Veenstra and R.D.Smith,Phosphoprotein isotope-coded affinity tags approaches for isolating andquantating phospeptides in proteome-wide analyses. Analytical Chemistry,Vol.73, No.11, 2578-2586 (2001)
【非特許文献７】T.J.Griffith,S.P.Gygi, B.Rist, R.Aebersold, A.Loboda, A.Jilkine, W.Ens and K.G.Standing,Quantitative proteomic analyisis using a MALDI quadrupole time-of-flight massspectrometer. Analytical Chemistry, Vol.73, No.5, 978-986 (2001)
【特許文献１】ＷＯ００／１１２０８国際公開公報全文（特表２００２−５２３０５８公報全文）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、特にＩＣＡＴ法に関する上述の問題や欠点を解決しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の第１の側面に従えば、リジン官能基（リジン残基：lysine functionality）を有する高分子を選択的に結合させる（selectively binding：高分子に選択的に結合性を付与する）方法であって、下記の工程を含む方法が提供される。
それぞれリジン官能基を有する１種類あるいはそれ以上の高分子を含む試料を調製する工程；
下の一般式
【化１】
2005528614.tif 000003
あるいは
【化２】
2005528614.tif 000004
で表される結合試薬（ここで、Ｘは捕捉試薬に選択的に結合するアフィニティーラベルを、Ｒは残基を、Ｌはリンカー部位をそれぞれ表す。）を提供する工程；
上記結合試薬を、上記試料に加えて、該結合試薬と上記１種類あるいはそれ以上の試料との間でグアニジン化反応を起こさせて、アフィニティーラベルを有する１種類あるいはそれ以上のホモアルギニン誘導体を生成させる工程；
必要に応じてアフィニティーラベルを有する上記ホモアルギニン誘導体を修飾しさらに多くのアフィニティーラベルを有するホモアルギニン誘導体を生成させる工程；および
上記ホモアルギニン誘導体を、アフィニティーラベルＸと選択的に結合する捕捉試薬を用いて捕捉する工程。
【００１６】
本発明の第２の側面に従えば、１種類またはそれ以上の試料中の１種類またはそれ以上のタンパク質、タンパク質官能基および／またはペプチドの分析方法であって、下記の工程を含む方法が提供される。
下の一般式
【化３】
2005528614.tif 000005
あるいは
【化４】
2005528614.tif 000006
で表される結合試薬（ここで、Ｘは捕捉試薬に選択的に結合するアフィニティーラベルを、Ｒは残基を、Ｌはリンカー部位をそれぞれ表す。）を提供する工程；
上記結合試薬を上記１種類あるいはそれ以上の試料に加えて、該結合試薬と、リジン官能基を有するタンパク質および／またはペプチドとの間でグアニジン化反応を起こさせて、アフィニティーラベルを有する１種類またはそれ以上のホモアルギニン誘導体を生成する工程；
必要に応じて、上記アフィニティーラベルを有するホモアルギニン誘導体を修飾して、さらに多くのアフィニティーラベルを有するホモアルギニン誘導体を生成させる工程；
上記アフィニティーラベルを有するホモアルギニン誘導体を、Ｘに選択的に結合する捕捉試薬を用いて捕捉する工程；および
上記アフィニティーラベルを有するホモアルギニン誘導体の分析を行う工程。
【発明の効果】
【００１７】
この方法には、多くの利点がある。本方法は、Gygiらが、上記非特許文献４において分析に用いたアミノ酸であるシステインよりも存在比の高いリジンアミノ酸残基に対し特異的である。Gygiらの方法と異なり、本方法では副反応が起こらないが、これは、イソ尿素部位のε−アミノ基に対する反応は、Gygiらが用いたスルフィドリル部位より特異的であるためである。これまでのところ、Ｎ末端のアミノ基が反応したという証拠はきわめて少なく、Ｎ末端アミノ酸残基がグリシンである場合にＮ末端でグアニジン化が起こったことを報告する報文が１報あるのみである。さらに、Gygiらの方法に比べ、本方法に係る結合試薬はイオン化効率の向上をもたらすという利点をも有している。
【００１８】
上で述べた利点は、本発明の第１の側面についても同様にあてはまる。
【００１９】
ホモアルギニン誘導体の修飾工程は、試料中に存在するタンパク質をペプチドに変換する工程を含んでいてもよい。この変換工程は、酵素反応または化学反応のいずれによっても行うことができる。その他、結合試薬とタンパク質のグアニジン化反応の直接生成物を「直接」、すなわち、タンパク質をペプチドに消化または断片化することなく分析すること（トップダウンアプローチ）も可能である。
【００２０】
タンパク質官能基および／またはペプチドは、アフィニティーラベルを有するホモアルギニン誘導体の分析により同定することができる。当該分析工程は、分析により得られたデータを配列データベースと比較する工程を含んでいてもよい。一般に、これはタンデム質量分析法（ＭＳ／ＭＳ）により行われる。測定データを直接解釈することも可能である。
【００２１】
本発明に従えば、タンパク質を含有する２種類またはそれ以上の試料におけるタンパク質の相対発現レベルを決定する（測定する）ことができ、この方法は以下の工程を含む。
下の一般式
【化５】
2005528614.tif 000007
または
【化６】
2005528614.tif 000008
で表される結合試薬群（ここで、Ｘは捕捉試薬に選択的に捕捉されるアフィニティーラベルを、Ｒは残基を、Ｌはリンカー部位をそれぞれ表す。）であって、その群に属する結合試薬の化学式は同一であるが、それぞれの結合試薬に含まれる同位体の組み合わせが異なっているため、上記それぞれの結合試薬の分子量が、その群に含まれる他の結合試薬の分子量と異なるように同位体標識された結合試薬群を提供する工程；
上記試料のそれぞれに上記結合試薬群に由来のそれぞれ異なる結合試薬を加え、それぞれの試料において、上記結合試薬とリジン官能基を有する部位との間でグアニジン化反応を起こさせ、複数の同位体標識アフィニティーラベルを有するホモアルギニン誘導体を生成する工程；
試料をひとつに混合する工程；
必要に応じて、タンパク質をペプチドに変換する工程；
上記アフィニティーラベルを有するホモアルギニン誘導体を、Ｘに選択的に結合する捕捉試薬を用いて捕捉する工程；および
アフィニティーラベルを有するホモアルギニン誘導体を分析する工程であって、同位体標識のみが異なる一連のホモアルギニン誘導体の相対存在比を測定することにより、上記一連のホモアルギニン誘導体の出発物質となったタンパク質の相対発現レベルを決定する工程。
Ｘは、原子であっても官能基であってもよく、そして、固体担体に結合していてもよい。
【００２２】
一般に、タンパク質をペプチドに変換（分解）する必要がある場合には、タンパク質はアフィニティーラベルを有するホモアルギニン誘導体の状態でペプチドに分解される。しかし、結合試薬で処理する前の試料の状態で、タンパク質をペプチドに変換することもできる。換言すると、上に述べたタンパク質の相対発現レベルを決定するための手順において、タンパク質をペプチドに変換する工程は、他の工程と順番を入れ替えることが可能である。
【００２３】
タンパク質の相対発現レベルの測定に関して、アフィニティーラベルを有するホモアルギニン誘導体の分析により、タンパク質、タンパク質官能基および／またはペプチドを同定することができる。当該分析工程は、分析手法により得たデータと配列データベースを比較する工程あるいは異なる態様で標識した試料の混合物から得たデータを比較する工程を含んでいてもよい。測定データを直接解釈することも可能である。
【００２４】
分析工程は、質量分析を含んでいることが好ましい。電子顕微鏡等の他の手法を用いることもできる。質量分析工程は、例えば、タンデム質量分析から成る。この手法は、タンパク質、タンパク質官能基およびペプチドの同定のための、ペプチド／タンパク質のアミノ酸配列決定（デノボシークエンスまたはデータベースを援用した配列決定）に特に有用である。質量分析を有効に利用することにより、同位体標識のみが異なる一群のホモアルギニン誘導体のそれぞれについて、マススペクトルのイオンピーク強度を比較して、それらの誘導体の相対存在比を決定できる。
【００２５】
それぞれ別個の既知の値だけ質量の異なるプロダクトイオンのタンデム質量分析により、プロダクトスペクトルが得られ、そのスペクトルに含まれるイオン種の比較によってアミノ酸配列の解読が可能となる。イオン間の予測可能な質量差を用い、データベース検索法やデノボ配列決定ソフトウェアと組み合わせることにより、イオン系列の同定を行うことや、データ解釈の迅速化を図ることができる。
【００２６】
結合試薬を用いることにより、タンパク質や１級アミンを有する他の種類の分子を、特性分析の前処理として、複雑な組成の混合物から捕捉し単離するために用いることができる。
【００２７】
上記の方法は、捕捉されたアフィニティーラベルを有するホモアルギニン誘導体を、捕捉試薬から解離させる工程を、分析を行う工程の前にさらに含んでいてもよい。捕捉試薬は、アフィニティーラベルを有するホモアルギニン誘導体であって、化学的性質の異なるものを分離するクロマトグラフィー分離システムの一部とすることができる。クロマトグラフィーシステムは、液体クロマトグラフィー法を用いているのが好ましい。ＬＣ−ＭＳシステムを用いることもできる。ガスクロマトグラフィー等の他のクロマトグラフィー分離システムを用いることもできる。ホモアルギニン誘導体は、チップもしくは他の固体表面またはマトリックス上に固定化することによってインサイチュー分離することもできるが、この場合において、前記の捕捉されたアフィニティーラベルを有するホモアルギニン誘導体を解離させる工程は、必ずしも必要ではない。
【００２８】
本発明の方法によれば、タンパク質および／またはペプチドの絶対的定量が得られる。
【００２９】
本発明の第１または第２の側面において、Ｒは、グアニジン化反応と両立し得る部位である。Ｒは、例えば、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５またはＣ３Ｈ７のようなアルキル基である。結合試薬は、例えば、下の化学式
【化７】
2005528614.tif 000009
で表される化合物である。Ｌは、例えば、アルキル鎖である。
【００３０】
本発明の第３の側面に従えば、リジン官能基を有する高分子を選択的に結合させるための試薬であって、下記の一般式
【化８】
2005528614.tif 000010
あるいは
【化９】
2005528614.tif 000011
（ここで、Ｘは、捕捉試薬に選択的に結合するアフィニティーラベルを、Ｒは残基を、Ｌはリンカー部位をそれぞれ表す。）で表される試薬が提供される。Ｘは、例えば、ビオチンもしくは化学修飾されたビオチンまたはＣＨ３のようなアルキル基である。Ｒは、グアニジン化反応に支障を来さない部位である。Ｒは、例えば、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５またはＣ３Ｈ７のようなアルキル基である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明において使用する方法および試薬について、図面を参照しつつ以下に説明する。
【００３２】
図１は、リジンのグアニジン化反応によるホモアルギニンの生成を示す。
【００３３】
図２は、結合試薬を用いたリジン官能基を有する高分子のグアニジン化反応によるホモアルギニン誘導体の生成を示す。
【００３４】
図３は、タンパク質の発現量の差の定量スキームを示す。
【００３５】
図４は、結合試薬の取りうる他の構造を示す。
【００３６】
図５は、結合試薬の合成反応スキームを示す。
【００３７】
図６は、Ｏ−メチルイソ尿素で処理した、リジン末端を有する標準ペプチドのＬＣ／ＥＳ−ＭＳ分析の結果を示す。リジン末端を有するペプチド（Ｋ）およびこれに対応するホモアルギニン末端を有するペプチド（Ｋ＊）の、１価および２価イオンを選択し、これら４つのマーカーイオンについて、選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）を行う。
図６ａは、35pmolのインターロイキンについての結果を示す。２＋および１＋の符号は、それぞれ、ｍ／ｚ値503.2および1005.4に位置する［Ｍ＋２Ｈ］２＋および［Ｍ＋Ｈ］＋イオンを示す。
図６ｂは、50pmolのＡＦＬＤＡＳＫについての結果を示す。２＋および１＋の符号は、それぞれ、ｍ／ｚ値376.25および751.25に位置する［Ｍ＋２ＨＦ］２＋および［Ｍ＋Ｈ］＋イオンを示す。
矢印は、未標識のリジンを有するペプチドの期待される保持時間を表す。
【００３８】
図７ａは、インターロイキン（Ｋ、12.5pmol）と、そのグアニジン化体（Ｋ＊、12.5pmol）の等量混合物について選択イオンモニタリングにより測定したＬＣ／ＥＳ−ＭＳ分析の結果を示す。２価イオンの信号には２＋、１価イオンの信号には＋と、それぞれ標記した。
図７ｂは、20pmolのＡＦＬＤＡＳＫおよびＡＦＬＤＡＳＫ＊等量混合物のＳＩＭ  ＬＣ／ＥＳ−ＭＳ分析の結果を示す。
【００３９】
図８は、等量（15pmol）のＡＦＬＤＡＳＫ、ＡＦＬＤＡＳＲおよびＡＦＬＤＡＳＫ＊を含む溶液のＬＣ／ＥＳ−ＭＳ分析の結果を示す。まず、リジン末端を有するペプチドが溶出し、続いてアルギニン末端を有する対応するペプチドが溶出する。６つのイオン全てについてのＳＩＭ分析の結果より、ＭＳにおいて、イオンの荷電によらずホモアルギニン末端を有するイオンのピークが最も強いことがわかる。
【００４０】
図９は、等量（31.5pmol）のＡＦＬＤＡＳＫ、ＡＦＬＤＡＳＲおよびＡＦＬＤＡＳＫ＊を含む溶液についての、イソクラティックな条件での分離実験の結果を示す。用いた条件は、グラジエントモードでペプチドを溶出する際に用いた移動相の濃度（0.05％（v/v）ＴＦＡおよび32.6％（v/v）アセトニトリル）と同一である。
【００４１】
図１０は、一連の標的分子を示す。
【００４２】
図１１は、標的分子Ａとの反応によるＡＦＬＤＡＳＫの誘導体の生成を示す。ｍ／ｚ値1019に位置する［Ｍ＋Ｈ］＋イオンの信号は、標的分子Ａとリジン末端を有するペプチドＡＦＬＤＡＳＫとの反応により生じた１：１付加体に対応する。
【００４３】
図１２は、１−アセチル−２−メチルイソ尿素との反応によるＡＦＬＤＡＳＫの誘導体の生成を示す。ｍ／ｚ値835.2に位置する［Ｍ＋Ｈ］＋イオンの信号は、ＡＭＩＵとリジン末端を有するペプチドとの反応により生じた１：１付加体に対応する。
【００４４】
図１３は、標的分子Ａとの反応より生成したペプチド誘導体のＰＳＤ  ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦスペクトルを示す。
【００４５】
図１４は、標的分子Ｂ（ＡＭＩＵ）との反応より生成したＡＦＬＤＡＳＫペプチド誘導体のＰＳＤ  ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦスペクトルを示す。
【００４６】
図１５は、ＡＦＬＤＡＳＫのＰＳＤ  ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦスペクトルを示す。
【００４７】
図１６は、異なる態様で同位体標識されたＡＦＬＤＡＳＫのＭＡＬＤＩスペクトルを示す。
【００４８】
本発明は、Gygiらにより報告された方法およびＷＯ００／１１２０８広報に開示された方法に特に改良を施したグアニジン化反応を利用するものである。
【００４９】
図１は、Ｏ−メチルイソ尿素を用いて、通常ｐＨ１０付近あるいはそれ以上の条件下で行われるリジンのグアニジン化反応を示す。図２は、本発明に従う改良されたスキームであって、リジン官能基を有する高分子１とイソ尿素誘導体２を反応させ、ホモアルギニン誘導体３を生成させるグアニジン化反応を示す。ここで高分子１は、例えばタンパク質またはペプチドである。イソ尿素誘導体２は、本発明により得られる結合試薬で、Ｘは、捕捉試薬と選択的に結合するアフィニティーラベルである。Ｘが、いろいろな同位体置換異性体（isotopic variants）を含む部位となり得る。イソ尿素誘導体２を用い、リンカー基Ｌを介して、アフィニティーラベルＸをＯ−メチルイソ尿素部位に結合させることができる。
【００５０】
概説すると、本発明はリジン官能基を有する高分子に選択的に結合を形成し（結合性を付与し）、それを捕捉する方法およびそれに用いる試薬を提供する。結合され、捕捉された高分子は、質量分析法あるいは分光分析法などの適当な方法により分析することができる。重要な実施の態様として、本発明は、タンパク質またはペプチドの混合物中に含まれるタンパク質またはペプチドの単離、精製および同定のための分析方法および分析試薬を提供する。本発明の方法においては、リジンのアミノ基とイソ尿素の反応性を利用した結合試薬を用いて混合物からタンパク質またはペプチドを単離、精製および同定する。リジンを含むタンパク質およびペプチドの単離のために、ホモアルギニン誘導体が生成される。
【００５１】
リジン側鎖のアミノ基とイソ尿素部位の化学反応についてはよく知られている。ほとんどの場合、リジンのアミノ基で起こる反応はＮ末端のアミノ基によって阻害されることはない。
【００５２】
ペプチドの配列決定にグアニジン化を用いる更なる利点は、ペプチド構造へのグアニジノ基の付加が予測可能であることに由来する。ε−アミノ基に選択的に修飾を行うことにより、Ｃ末端にプロトンが結合したイオン（ｘ、ｙ、ｚ−イオン）に対してのみ影響する４２Ｄａのシフトが生じる。２つのプロダクトイオンスペクトルに由来するイオン信号を比較することにより、問題のイオンがどのようなものであるかの評価が可能になる。
【００５３】
図３は、タンパク質の発現量の差を定量するためのスキームを表したものである。異なる細胞状態に由来する２種類のタンパク質混合物１０および１２を、化学的には同一だが同位体組成の異なる結合試薬１４および１６と反応させる。たとえば、第１のタンパク質混合物１０を「軽い」同位体を含む試薬１４で処理し（反応させ）、第２のタンパク質混合物１２を「重い」同位体を含む試薬１６と反応させる。グアニジン化反応により、反応に使用した結合試薬により「軽い」ホモアルギニン誘導体混合物１８と、同じように反応に使用した結合試薬により「重い」ホモアルギニン誘導体混合物２０が得られる。混合物１８と２０をひとまとめにし、タンパク質（ホモアルギニン誘導体に変化した部分を含む）を公知の方法により消化し、ペプチドに変換する。ホモアルギニン誘導体（この段階においてはペプチドを含む）を、アフィニティーラベルの性質に適した方法（クロマトグラフィーなど）により単離する。単離されたホモアルギニン誘導体は次いで、液体クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー法と質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）により分離され分析に供される。マイクロ／ナノキャピラリー液体クロマトグラフィー（ｉＬＣ）法を用いることもできる。
【００５４】
混合物１０、１２に由来する同一のペプチドからは、化学的に同一でＬＣから幾分かは同時に溶出するホモアルギニン誘導体が生成する。しかしながら、結合試薬に「軽い」ものと「重い」ものがあるため、これらのホモアルギニン誘導体は分子量が異なっており、異なる質量／電荷比の位置に現れるためマススペクトル上で同定することが可能である。したがって、ホモアルギニン誘導体の「軽い」ものと「重い」ものに対応するイオンピークの相対強度比を比較することで、タンパク質発現量の相対定量が可能である。溶出物のＭＳ／ＭＳ分析からは、アミノ酸配列に関する情報が得られる。この実験的に得られた配列に関する情報をもとにコンピュータによるデータベース検索を行うことで、タンパク質の同定が可能になる。適当な分析スキームの詳細については、ＷＯ００／１１２０８国際公開公報またはＧｙｇｉらの報告（前記非特許文献４）を参照されたい。相対発現量の定量を行わずに、ＭＳ／ＭＳ分析によりタンパク質またはペプチドの同定を行うことも可能であり、この場合には、結合試薬の同位体置換異性体は不要である。
【００５５】
結合試薬の同位体置換異性体は、ＷＯ００／１１２０８国際公開公報またはGygiらの報告にまとめられているように、リンカー部位に異なる同位体を導入することにより調製することができる。１つの方法として、炭素骨格上の水素原子を重水素に置換する方法がある。さらに、これに追加する方法または代わる方法として、イソ尿素残基の窒素原子のうち１つまたは双方を１５Ｎに置換したものを用いることも可能である。
【００５６】
原試料からホモアルギニン誘導体を分離するために、クロマトグラフィー法による単離および分離工程の代わりに他の方法を用いてもよい。例えば、アフィニティーラベルは固体表面またはマトリックスに結合していてもよい。関連する実施例としては、図４に示すように、固体担体またはマトリックスに結合した結合試薬を用いてもよい。このようなスキームにおいては、試料中に存在するタンパク質で結合試薬と反応しないものは、洗浄により取り除くことができる。タンパク質を、固体担体に結合したままの状態でタンパク分解酵素により消化し、質量分析法などでそのまま分析することが可能である。この反応の手順は自動化することが可能である。
【００５７】
本発明の更なる実施態様として、分析により得られるペプチドの信号と試料中に存在するタンパク質の絶対量の間の定量的な関係を得るために、既知の量のタンパク質を用いて校正を行う。
【００５８】
〔実施例〕
結合試薬の合成法
結合試薬の合成には、下記の合成経路を使用することができる。
【００５９】
ビオチン−２，３，５，６−テトラフルオロフェニルエステルの合成
本化合物の合成は、ＷＯ００／１１２０８国際公開公報の４３ページに記載された方法により行うことができる。合成例は、同公報の８３ページに記載の合成例２において、エステル残基として２を用いたものである。
【００６０】
１４Ｎおよび１５Ｎ標識されたＯ−メチルイソ尿素の合成および同化合物0.5Ｍ溶液の調製
ここで述べる方法は、同一の化合物についてBurgoyneらによって報告された方法（D.L.Burgoyne,Journol of Organic
Chemistry,Vol.65,152-155(2000)）を改良したものである。１４Ｎ（または１５Ｎ）標識された尿素（Aldrich社（米国ウィスコンシン州ミルウォーキー）製）60mg（1mmol）を硫酸ジメチル（Aldrich社（米国ウィスコンシン州ミルウォーキー）製）95μL（126mg、1mmol）に溶解した溶液を、50℃で５時間加熱撹拌した。アセトン250μLを加え溶液を１時間撹拌した。次いで、ジエチルエーテル（Aldrich社（米国ウィスコンシン州ミルウォーキー）製）1mLを加え、得られた混合物を撹拌した。上の層を捨て、ジエチルエーテルを加え撹拌する操作を２度繰り返し、約60ｍｇ（約100μL）のＯ−メチルイソ尿素ヘミ硫酸塩（約0,5mmol、収率49％）を得た。生成物を900μLの水に溶解し、約0.5Ｍ水溶液を得た。
【００６１】
ビオチン−２，３，５，６−テトラフルオロフェニルエステルとＯ−メチルイソ尿素の反応
本反応は図５に示すとおりである。ビオチン−２，３，５，６−テトラフルオロフェニルエステル４をＯ−メチルイソ尿素５と反応させ、５の１級アミンと４のエステル基の反応により６を得る。
【００６２】
ビオチンを有する結合試薬６は、アビジンアフィニティークロマトグラフィー法に利用できる点で有用である。
【００６３】
ビオチンのＯ−メチルイソ尿素付加体の合成
ビオチン（244mg、1mmol）、Ｏ−メチルイソ尿素（123mg、1mmol）およびＥＤＣ（384mg、2mmol）を、ジイソプロピルエチルアミン（0.18mL、1mmol）およびＤＭＦ（19mL）に懸濁し、終夜撹拌した。反応混合物から、バス（浴）温40℃で、高真空ポンプを用いてロータリーエバポレータで溶媒を留去した。溶媒を留去後、メタノールを加え溶液とした。得られた溶液を、10％メタノールを含むジクロロメタンを溶出液とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供した。生成物のカラムからの流出は非常に遅かった。単離された少量の生成物の１ＨＮＭＲスペクトル（メタノールｄ４およびＤＭＳＯｄ６）は、少量の不純物に由来するピークが見られるものの目的物のそれと一致した。この生成物についてメタノールからの再結晶によるさらなる精製を試みたところ、最初はメタノールに可溶だったが、メタノールを加え加熱したところ、一部不溶の物質が残った。この不溶物のＤＭＳＯｄ６溶媒中での１ＨＮＭＲスペクトルから、尿素のビオチン付加体であることがわかった（図１０、化合物Ｂ）。
【００６４】
Ｏ−メチルイソ尿素硫酸水素塩の合成
尿素（20g、0.33mol）を、110−115℃に加熱した硫酸ジメチル（30.1mL、0.33mol）に、撹拌しながら少量ずつ１時間かけて加えた。110℃で２時間撹拌後、反応物を室温まで冷却した。濃硫酸（18.5mL、0.33mol）を、エーテル（171mL）に、冷却しながら注意深く溶解した。これを油状の反応物にアセトン（171mL）と共に加えた。
【００６５】
Ｎ−アセチル−Ｏ−メチルイソ尿素の合成
Ｏ−メチルイソ尿素硫酸水素塩（1.23g、10mmol）を無水酢酸（20mL）およびピリジン（2.4mL、30mmol）に懸濁させ、窒素気流下30℃で終夜撹拌した。揮発分を留去後、メタノールを加えた。わずかしか溶解しない白い固体をろ過し、分析した。
【００６６】
Ｏ−メチルイソ尿素（１５Ｎ２）硫酸水素塩の合成
尿素（１５Ｎ２標識）（4g、0.064mol）を、114−115℃に加熱した硫酸ジメチル（5.8mL、0.065mol）に、撹拌しながら少量ずつ15分かけて加えた。110−115℃で1.5時間撹拌後、反応物を室温まで冷却した。濃硫酸（3.6mL、0.064mol）を、エーテル（33mL）に、冷却しながら注意深く溶解した。これを油状の反応物にアセトン（33mL）と共に加えた。
【００６７】
（１５Ｎ２標識）Ｏ−メチルイソ尿素硫酸塩の合成
60℃に加熱した水酸化バリウム１水和物（1.94g、0.01mol）の不透明な水溶液（10.6mL）を、冷却しながら撹拌しているＯ−メチルイソ尿素（１５Ｎ２標識）硫酸水素塩（3.52g、0.021mol）水溶液（約30mL）に加えると、乳白色の沈殿を生じた。これを2500rpmで５分間遠心分離した。上澄みをデカンテーションし、他の遠沈管に入れ再度2500rpmで５分間回転させたが、固体物は得られなかった。無色の溶液をデカンテーション後、溶媒を留去し乾固させた。アセトンを加えると結晶化し、生成物が白色固体として得られた。収量2.07g（82％）。融点159.0−159.5℃。
【００６８】
Ｎ−アセチルｄ３−Ｏ−メチルイソ尿素（１５Ｎ２標識）の合成
Ｏ−メチルイソ尿素（１５Ｎ２標識）硫酸塩（0.818g、6.5mmol）を無水酢酸ｄ６（13.1mL、139mmol）およびピリジン（0.53mL、6.5mmol）に懸濁し、27℃で終夜撹拌した。揮発分を、30℃以下で、トルエンと共沸させることで留去した。無水メタノール（約8mL）を加え、混合物を撹拌した。溶解しなかったものをろ過すると、目的化合物であると同定された0.392gの白色固体が得られた。濾液にエーテルを加え得られた沈殿をろ過し、乾燥後、無水メタノール（約4mL）で洗浄し、さらに0.01gの純粋な目的物を得た。全収量0.400g（51％）。
【００６９】
吉草酸Ｏ−メチルイソ尿素付加体の合成
吉草酸（0.22mL、2mmol）、Ｏ−メチルイソ尿素（246mg、2mmol）およびＥＤＣ（0.77g、4mmol）を、ジイソプロピルエチルアミン（0.36mL、2mmol）およびＤＭＦ（20mL）に懸濁し、終夜撹拌した。反応混合物から、バス温35℃で、高真空ポンプを用いてロータリーエバポレータで溶媒を留去した。溶媒を留去後、粗生成物をＤＣＭ、メタノールおよびアセトンの混合物に溶解し、ＤＣＭを含有するシリカゲルカラムに加えた。目的物は最初の３つのフラクションに溶出し、純度は非常に高かった（ＮＭＲ分光法により確認。）。この物質のカラムクロマトグラフィー（溶離液＝ジクロロメタン／メタノール）による再精製を試みたが、対応する物質が得られなかった。
【００７０】
スケールを大きくして上記反応の追試を行った。吉草酸（0.44mL、4mmol）、Ｏ−メチルイソ尿素（492mg、4mmol）およびＥＤＣ（1.53g、8mmol）を、ジイソプロピルエチルアミン（0.72mL、4mmol）およびＤＭＦ（150mL）に懸濁し、終夜撹拌した。反応混合物から、バス温35℃で、高真空ポンプを用いてロータリーエバポレータで溶媒を留去した。溶媒を留去後、ジオキサンを加えて反応混合物をろ過することにより、未反応のＯ−メチルイソ尿素硫酸塩を除去した。ジオキサンに可溶な物質を、ジオキサンを溶出液とするカラムクロマトグラフィーにより精製した。生成物は0.27g（42％）の灰白色の固体として得られ、純度は、上記反応例で単離されたものほど高くなかった。
【実施例１】
【００７１】
ペプチド混合物の分析に際しては、エレクトロスプレーに対する応答性に影響を与える多くの因子が存在する。イオン信号について選択的な抑制の存在は、スペクトルにおいて観測される全成分についての定量分析の妨げとなる。そこで、Ｃ末端アミノ酸がペプチドのエレクトロンスプレーイオン化（ＥＳＩ）に対する応答に与える影響について検討を行った。より具体的には、リジン、アルギニンおよびホモアルギニンをＣ末端に有するペプチドのイオン化効率およびペプチド構造のわずかな変化がＥＳＩに対する応答性の違いに及ぼす影響について検討を行った。
【００７２】
実験方法
インターロイキン、ＶＧＱＥＥＳＮＤＫ（シグマ社製）、ＡＦＬＤＡＳＲおよびＡＦＬＤＡＳＫの純度96％以上のもの（ニューイングランドペプチド社製）を、２−20pmol／μＬの濃度で用いた。実験はすべてエレクトロスプレーイオン源を装着した単四重極質量分析計ＬＣＭＳ−２０１０（島津製作所製）を用いて行った。イオン源の状態は、分析の全過程を通して一定に保持した。選択した全部で１２種のイオンについて、データの取込みは選択イオンモニター（ＳＩＭ）モードで行った。成分の分離は、フェノメネックスＬｕｎａＣ１８カラム（内径2.0mm×50mm）により行った。グラジエントモードにおいては、移動相の組成は、水相については0.05％（v/v）ＴＦＡ、有機相については0.05％ＴＦＡを含むアセトニトリル／水（９：１v/v）とした。溶媒の送液には、ＬＣ１０ＡＤＶｐＨＰＬＣポンプ（島津製作所製）を使用し、流速は250μL／分とした。
【００７３】
結果
グアニジン化反応の進行度
出発物質が含まれていないことを確認するため、リジンを含有するペプチドをＯ−メチルイソ尿素で処理したものを、ＥＳ分析の前にＣ１８カラムに装填し、液体クロマトグラフィーに供した。この分離操作には、２つの利点がある。第１に、これによりイオン化過程を阻害するＯ−メチルイソ尿素を取り除くことができるという点である。第２に、反応混合物に含まれる全成分を分離し、それぞれ別個に質量分析計に注入できる点である。次いで、ＥＳ／ＭＳにより検出を行うことで、末端にリジンを有するペプチドおよびそれに対応するホモアルギニンを有するペプチドの相対強度の比較および定量が可能になる。Ｏ−メチルイソ尿素と反応させたリジンを末端に有する標準ペプチドのＬＣ／ＥＳ−ＭＳによる分析について図６に示す。１価または２価に荷電した、リジンまたはホモアルギニンを末端に有するペプチドに対応する、４つの特異的なマーカーイオンについての選択イオンモニタリング法（ＳＩＭ）を用いて、全イオンクロマトグラムがリジンを末端に有するペプチドの信号を含むかどうかをモニターした。
【００７４】
これらの結果は、グアニジン化反応が定量的に進行したことを示している。
【００７５】
リジンおよびアルギニンを末端に有するペプチドを含む混合物のＬＣ−ＭＳ分析
グアニジン化反応が定量的に進行することから、ホモアルギニンを末端に有するペプチドの溶液を既知の濃度で調製することが可能になる。リジンを末端に有するペプチドと、ホモアルギニンを末端に有する、対応するペプチドを等量ずつ含む２成分混合物を調製し、２つのイオン信号について比較を行った。20pmolのインターロイキンと、そのグアニジン化したアナローグについてＬＣ分離中にＥＳ分析を行ったＭＳクロマトグラムを図７ａに示す。クロマトグラフィーによる分離の際用いた条件（移動相組成、グラジエント等）は、上述の実験（図６参照）と同様とした。全イオンクロマトグラム（ＴＩＣ）における、ホモアルギニンを末端に有するペプチドのクロマトグラム曲線（１価および２価に荷電したイオン信号の総和に対応する。）は、リジンを末端に有するペプチドよりも高い相対強度を有する。主な要因は、２価イオンのＥＳに対する相対的な応答によるものである。ＡＦＬＤＡＳＫとそのグアニジン化体であるＡＦＬＤＡＳＫ＊の等量混合物についても測定を行った（図７ｂ）。
【００７６】
ＡＦＬＤＡＳＫ、ＡＦＬＤＡＳＲおよびホモアルギニン末端を有する対応物ＡＦＬＤＡＳＫ＊を含有する混合物のＬＣ−ＭＳ分析
ペプチド構造のわずかな変化が信号強度に及ぼす影響について検討するため、アルギニン末端アナローグＡＦＬＤＡＳＲを上記混合物に加えた。図８は、ＡＦＬＤＡＳＫ、ＡＦＬＤＡＳＲおよびホモアルギニンを末端に有する誘導体ＡＦＬＤＡＳＫ＊を、それぞれ31.5pmol含む溶液を、ＬＣで分離後ＭＳで検出した分析結果を示す。アルギニンを末端に有するペプチドは、アルギニンの塩基性がより高くなるにしたがって、イオンクロマトグラフィーにおいて、対応するＡＦＬＤＡＳＫより高い信号強度を示す。ＡＦＬＤＡＳＲとＡＦＬＤＡＳＫ＊から生成する２組のペプチドイオンを比較すると、後者の方が一般に高いイオン信号強度を示す。リジンを末端に有するペプチドと、アルギニン／ホモアルギニンを末端に有するペプチドの場合（ＡＦＬＤＡＳＫと、ＡＦＬＤＡＳＲ／ＡＦＬＤＡＳＫ＊）のような、イオン化効率が、プロトン化されたペプチドのより高い安定化に関連づけられる場合と異なり、ＡＦＬＤＡＳＫとＡＦＬＤＡＳＫ＊の場合には、両者とも末端にグアニジノ基を有するため、ＥＳに対する応答性の差をグアニジノ基の効果に単純に関連づけることはできない。この相違は、ペプチド骨格にメチレン基が１つ増えたことにより、プロトンの溶媒和がより強まったことに帰することができる。
【００７７】
ＡＦＬＤＡＳＫ、ＡＦＬＤＡＳＲおよびＡＦＬＤＡＳＫ＊ペプチドイオンのＥＳＩ応答性に及ぼすイソクラティック分離の効果
３つのペプチドの同時溶出が、ＥＳＩに対する応答性にどのような影響を及ぼすかについて検討した。上記において（図８参照）分析に使用した混合物について、イソクラティックな条件で実験を行った。移動相は、グラジエントモードでＡＦＬＤＡＳＫ、ＡＦＬＤＡＳＲおよびＡＦＬＤＡＳＫ＊の分離に用いたものと同一の組成のものを調製した。したがって、分離は起こらず３つのペプチドは全て同時に質量分析計に注入された。ＬＣ−ＭＳによる実験（図８参照）で得られたＭＳクロマトグラムと比較しても、ＭＳクロマトグラムにおけるどのイオン信号にも抑制は見られない。気相中での塩基性の異なる３種類のペプチドが存在しても、ＥＳＩ応答性は影響を受けない。図９は、ＡＦＬＤＡＳＫ、ＡＦＬＤＡＳＲおよびＡＦＬＤＡＳＫ＊の１価および２価イオンのＭＳクロマトグラムを示す。
【００７８】
結論
リジンが完全にホモアルギニンに変換できるため、Ｃ末端の修飾がいかにＥＳＩ応答性に影響を及ぼすかについて定量的な評価が可能になる。グアニジン化により気相中での塩基性（リジンとホモアルギニンとの間）あるいはペプチド構造（アルギニンとホモアルギニンとの間）に変化をもたらすことができ、その結果、グアニジン化したペプチドにおいて信号強度が増大する。３種類のペプチドを全て同時に溶出させ、同時にイオン化しても、ＥＳＩに対する相対応答性は影響を受けない。
【実施例２】
【００７９】
標的分子
ビオチン誘導体（標的分子Ａ）、１−アセチル−２−メチルイソ尿素（ＡＭＩＵ）（標的分子Ｂ）および１５Ｎならびに１３Ｃを含む重原子置換異性体（標的分子Ｃ）の構造を図１０に示す。図１０には、その他、１３Ｃの代わりに重水素を含む１−アセチル−２−メチルイソ尿素の重原子置換異性体である標的分子Ｄおよび吉草酸誘導体（標的分子Ｅ）の構造も示す。
【００８０】
標的分子（Ａ、Ｂ）とリジンを末端に有するペプチドの反応性
新規に合成した化合物Ａ、Ｂと、標準ペプチド（ＡＦＬＤＡＳＫ）の反応について、ペプチド100pmolを用いて試験した。リジンを末端に有するペプチドと標的分子Ａ（図１１）および標的分子Ｂ（図１２）との反応性を評価するために実験を行った。これらの化合物の純度の評価のためＭＡＬＤＩ分析法を使用した。ＭＡＬＤＩスペクトルにおいて、誘導体を形成したペプチドに対応する１つのイオン信号のみが観測される。分析結果から、反応は定量的であり、反応混合物には原料が残っていないことが確認できる。さらに、それぞれのスペクトルにおいて唯一のメインイオンピークしか存在しないことから、Ｎ末端アミノ基により多数の誘導体化反応が起こる可能性は排除される。
【００８１】
ＡＦＬＤＡＳＫ誘導体のＭＳ／ＭＳ分析
Ｎ末端アミノ基が反応を阻害し得るため、誘導体イオンについてタンデム質量分析を行った。プロダクトイオンのスペクトルから、ｙイオンのみが、リジンアミノ基と試薬との反応によるシフトの影響を受けることが示された。Ｎ末端のアミノ基が結合反応を起こしている証拠は見いだせなかった。ＭＳ／ＭＳ分析は、飛行時間型質量分析装置の無電場領域でのイオンの自然分解（ＰＳＤ）を用いて行った。標的分子Ａと反応して誘導体を形成したＡＦＬＤＡＳＫのＭＳ／ＭＳスペクトルを図１３に示す。ｙイオンが主にスペクトル上に現れ、268amuだけシフトしている。同様に、ＡＦＬＤＡＳＫとＡＭＩＵの反応物のプロダクトイオンスペクトルも類似の傾向を示す（図１４）。誘導体を形成していないＡＦＬＤＡＳＫのフラグメント化パターンを図１５に示す。
【００８２】
異なる態様で同位体標識されたリジンを末端に有するペプチドのＭＡＬＤＩスペクトル
標識分子Ｂ（下段）および標識分子Ｄ（上段）で標識されたＡＦＬＤＡＳＫのＭＡＬＤＩスペクトルを図１６に示す。予期されるとおり、２つのペプチドイオンの質量差は５Ｄａである。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】リジンのグアニジン化反応によるホモアルギニンの生成を示す。
【図２】結合試薬を用いたリジン官能基を有する高分子のグアニジン化反応によるホモアルギニン誘導体の生成を示す。
【図３】タンパク質の発現量の差の定量スキームを示す。
【図４】結合試薬の取りうる他の構造を示す。
【図５】結合試薬の合成反応スキームを示す。
【図６】Ｏ−メチルイソ尿素で処理した、リジン末端を有する標準ペプチドのＬＣ／ＥＳ−ＭＳ分析の結果を示す。  ａ：35pmolのインターロイキンについての結果を示す。  ｂ：50pmolのＡＦＬＤＡＳＫについての結果を示す。
【図７】ａ：インターロイキン（Ｋ、12.5pmol）と、そのグアニジン化体（Ｋ＊、12.5pmol）の等量混合物について選択イオンモニタリングにより測定したＬＣ／ＥＳ−ＭＳ分析の結果を示す。  ｂ：20pmolのＡＦＬＤＡＳＫおよびＡＦＬＤＡＳＫ＊等量混合物のＳＩＭ  ＬＣ／ＥＳ−ＭＳ分析の結果を示す。
【図８】等量（15pmol）のＡＦＬＤＡＳＫ、ＡＦＬＤＡＳＲおよびＡＦＬＤＡＳＫ＊を含む溶液のＬＣ／ＥＳ−ＭＳ分析の結果を示す。
【図９】等量（31.5pmol）のＡＦＬＤＡＳＫ、ＡＦＬＤＡＳＲおよびＡＦＬＤＡＳＫ＊を含む溶液についての、イソクラティックな条件での分離実験の結果を示す。
【図１０】一連の標的分子を示す。
【図１１】標的分子Ａとの反応によるＡＦＬＤＡＳＫの誘導体の生成を示す。
【図１２】１−アセチル−２−メチルイソ尿素との反応によるＡＦＬＤＡＳＫの誘導体の生成を示す。
【図１３】標的分子Ａとの反応より生成したペプチド誘導体のＰＳＤ  ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦスペクトルを示す。
【図１４】標的分子Ｂ（ＡＭＩＵ）との反応より生成したＡＦＬＤＡＳＫペプチド誘導体のＰＳＤ  ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦスペクトルを示す。
【図１５】ＡＦＬＤＡＳＫのＰＳＤ  ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦスペクトルを示す。
【図１６】異なる態様で同位体標識されたＡＦＬＤＡＳＫのＭＡＬＤＩスペクトルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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