(57)【要約】本発明は天然の多量体タンパク質リガンドを模倣することができる多量体分子に関する。本発明は、上記した多量体分子が、下記の一般式Ａ−Ｘｎ〔式中、ｎは３、４、５又は６に等しく、Ａは少なくとも３つのアミン官能基又はＣＯＯＨ官能基により官能化されている化学的基を示し、そしてＸはＤ、Ｂ−Ｄ又はＢ（Ｄ）−Ｄ’基を示し、ここで、Ｂはスペーサーであり、そしてＤ及びＤ’は受容体との界面を形成しておりそして受容体と相互作用することができる残基から選ばれる、リガンド由来の配列に相当するペプチド又は擬ペプチドを表す〕を有することを特徴とする多量体分子に関する。
2005528451.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多量体分子であって、該多量体分子が、下記の一般式
Ａ−Ｘｎ
〔式中、
−ｎは３、４、５又は６に等しく、
−Ａは少なくとも３つのアミノ官能基又はＣＯＯＨ官能基又はＳＨ官能基又はＳ−Ｎｐｙｓ（Ｓ−ニトロ−ピリジンスルフェニル）官能基又はＳ−Ｐｙｓ（Ｓ−ピリジンスルフェニル）官能基により官能化された化学的基であり、そして特にタンパク質とは異なり、
−Ｘは−Ｄ、−Ｂ−Ｄ又は−Ｂ（Ｄ）−Ｄ’基であり、ここで、
＊Ｂはスペーサーアームであり、
＊−Ｄ及び−Ｄ’はリガンド受容体との界面を形成する残基から選ばれるリガンド由来の配列に相当するペプチド又は擬ペプチドを表し、該配列は該受容体と相互作用することができ、該リガンドはＴＮＦスーパーファミリーの受容体のリガンドから選ばれ、特に下記のリガンド：ＥＤＡ、ＣＤ４０Ｌ、ＦａｓＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＡＩＴＲＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＶＥＧＩ、ＬＩＧＨＴ、４−１ＢＢＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＬＴα、ＴＮＦ、ＬＴβ、ＴＷＥＡＫ、ＡＰＲＩＬ、ＢＬＹＳ、ＲＡＮＫＬ及びＴＲＡＩＬから選ばれる〕
に相当することを特徴とする多量体分子。
【請求項２】
−Ｄ及び−Ｄ’がヒト又はネズミＣＤ４０受容体のリガンド（ＣＤ４０Ｌ）由来のペプチドを表し、該ペプチドはＣＤ４０のＣＤ４０Ｌリガンドの一次配列に属しそしてそのアミノ酸の数は３〜１０を含むことを特徴とする請求項１に記載の分子。
【請求項３】
ヒト又はネズミＣＤ４０受容体のリガンド（ＣＤ４０Ｌ）由来のペプチドが、下記の：
Ｌｙｓ１４３−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ１４５、Ｔｙｒ１４５−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ１４３、
Ｌｙｓ１４３−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ１４６
Ｔｙｒ１４６−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ１４３、
Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ、Ｈ−Ｌｙｓ−Ψ（ＣＨ２ＮＨ）Ｐｒｏ−Ａｒｇ、
Ａｒｇ２００−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−ＩＬｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ２０７、
Ａｒｇ２０７−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ２００、
Ａｒｇ２００−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ２０４、
Ｉｌｅ２０４−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ２００、
Ａｒｇ２０３−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ２０７、
Ａｒｇ２０７−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ２０３、
Ｃｙｓ２１８−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ２２３、
Ｉｌｅ２２３−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ２１８、
Ｇｌｙ２００−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ２０７、
Ｌｙｓ２０７−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ２００、
Ｇｌｙ２００−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ２０４、
Ｉｌｅ２０４−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ２００、
Ａｒｇ２０３−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ２０７、
Ｌｙｓ２０７−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ２０３、
Ｃｙｓ２１８−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ２２３、
Ｖａｌ２２３−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ２１８
又は上記した配列の２つの少なくとも２つの連続したアミノ酸により構成されるハイブリッドペプチド、特に配列
Ａｒｇ２０３−Ｉｌｅ２０４−Ｔｙｒ１４５−Ｔｙｒ１４６又は
Ａｒｇ２０３−Ｉｌｅ２０４−Ｔｙｒ１４６−Ｔｙｒ１４５−Ｇｌｙ１４４−Ｌｙｓ１４３
を有するペプチド、
又は上記配列の断片、
から選ばれ、これらのアミノ酸は同等にＬ又はＤ配置であることができる、
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の分子。
【請求項４】
ＡがＣ３対称性を有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の多量体分子。
【請求項５】
●Ａが下記一般式：
【化１】
2005528451.tif 000034
〔式中、
＊ｍ及びｍ’は１〜５の整数であり、
＊ＶはＸとアミド結合を形成する−ＮＨ−又は−ＣＯ−基を表し、
＊Ｚは酸素原子又はＣＨ２基を表し、
＊Ｙは窒素原子又はＲ−Ｃ−基又はＲ−ＣＯＮＨ−Ｃ−基を表し、ここでＲは１〜１０個の炭素原子を有するアルキル基、１〜１０個の炭素原子を有するアルケニル基、１〜１０個の炭素原子を有するアルキニル基、５〜１２個の炭素原子を有するアリール基、５〜１４個の炭素原子を有するアラルキル基又は１〜１０個の炭素原子を有するヘテロアリール基であることができ、これらの基は置換されていなくてもよく又は−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＯＮＨ２又はアルコキシ基から選ばれる１〜６個の置換基により置換されていてもよい〕
を有するＣ３対称性を有する分岐状基であるか、
●又は、Ａが下記一般式：
【化２】
2005528451.tif 000035
2005528451.tif 000036
〔式中、
＊ＲａはＸとアミド結合を形成する−ＮＨ−基又は−ＣＯ−基のいずれかを表し、
＊Ｒｂはタンパク原性アミノ酸の側鎖を表し、
＊ｐは１〜４の整数であり、
＊ｑは０〜４の整数である〕
の１つに相当する環状Ｃ３基であるか、
●又は、Ａが下記一般式：
【化３】
2005528451.tif 000037
〔式中、
＊ｋは３、４、５又は６を表し、
＊Ｒ１は水素原子又はタンパク原性アミノ酸から選ばれるアミノ酸残基又はＲＣＯ−、ＲＯＣＯ−もしくはＲＮＨＣＯ−基のいずれかを表し、ここでＲは上記したとおりであり、
＊Ｒ２は−ＮＨ２基又は−ＮＨＲ基又はタンパク原性アミノ酸から選ばれるアミノ酸残基のいずれかを表し、Ｒは上記したとおりである〕
に相当する非対称性分岐状基であり、
−Ｂが下記一般式：
【化４】
2005528451.tif 000038
〔式中、
＊ＹはＣ１〜Ｃ１０アルキル鎖又はアルキニル、又はアルケニル又はアリール又はアラルキル又はヘテロアリール基を表し、
＊Ｒ３は、ＶもしくはＲａが−ＣＯ−基であるときは−ＮＨ−基を表し又はＶもしくはＲａが−ＮＨ−基であるときは−ＣＯ−基を表し、
＊Ｒ４及びＲ５は互いに独立に−ＣＯ−基又は−ＮＨ−基を表す〕
の１つに相当し、
−Ｄ及び−Ｄ’が請求項１又は２で定義されたペプチド又は擬ペプチドである、
ことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の多量体分子。
【請求項６】
Ａが下記式：
【化５】
2005528451.tif 000039
〔式中、ｉは１より大きいか又は１に等しい整数を表す〕
の１つに相当することを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の分子。
【請求項７】
下記式
【化６】
2005528451.tif 000040
2005528451.tif 000041
の請求項１〜６のいずれか１項に記載の分子。
【請求項８】
医薬学的に許容できるベクターと組み合わせて請求項１〜７のいずれか１項に記載の多量体分子を活性成分として含むことを特徴とする医薬学的組成物。
【請求項９】
医薬学的に許容できるアジュバントと組み合わせて請求項１〜７のいずれか１項に記載の多量体分子を活性成分として含むことを特徴とするワクチン組成物。
【請求項１０】
免疫応答の抑制又は活性化を必要とする病理の処置を目的とした医薬の製造のための請求項１〜７のいずれか１項に記載の多量体分子の使用。
【請求項１１】
免疫応答抑制を含む、病理、例えば、移植片の拒絶又は自己免疫疾患の処置を目的とした医薬の製造のための請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
免疫応答の増加を含む、病理、例えば、癌又は寄生虫、バクテリアもしくはウイルス感染症の処置を目的とした医薬の製造のための請求項１０に記載の使用。
【請求項１３】
Ａが環状Ｃ３基でありそして請求項５で記載された式Ｉａ、Ｉｂ、II、VIｂ、VIｃ又はVIｄの１つに相当する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の多量体分子の固体支持体上での製造方法であって、該方法は、下記の工程：
−成長するペプチド鎖を形成するアミノ酸配列により構成されているＡの線状前駆体を形成（ここで、この線状前駆体は、Ｎ−保護されたアミノ酸の残基の３つがアミン型のＲａ基を有するＮ−保護されたアミノ酸の残基と、成長するペプチド鎖のアミン官能基との連続したカップリングサイクル及び脱保護により合成されたものであり、その際最初のアミノ酸残基は固体支持体に結合されている）し、
−上記保護されたＡの線状前駆体を環化し、
−該保護基を開裂して保護されたアミン官能基を開放し、
−３つの開放されたアミン官能基を、Ｎ−保護されたスペーサーアームＢとカップリングさせ、
−スペーサーアームＢを脱保護し、そしてスペーサーアームＢから開放されたアミン官能基を、既に形成されているＤペプチド又はＤペプチドに相当するアミノ酸残基を連続して結合させることによりその場で形成されたＤペプチドとカップリングさせ、そして
−Ｄペプチドの官能化された側鎖上に存在するすべての保護基を除去した後、固体支持体から分子を開裂させて請求項１〜７のいずれか１項に記載の多量体分子を得る、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
Ａが環状Ｃ３基でありそして請求項５に記載された式Ｉａ、Ｉｂ、II、VIｂ、VIｃ又はVIｄの１つに相当する請求項１〜７のいずれか１項に記載の多量体分子の溶液における製造方法であって、該方法は、下記の工程：
−成長するペプチド鎖を形成するアミノ酸配列により構成されているＡの線状前駆体を形成（ここで、この線状前駆体は、Ｎ−保護されたアミノ酸残基の３つがアミン型Ｒａ基を有するＮ−保護されたアミノ酸残基と、成長するペプチド鎖のアミン官能基との連続したカップリングサイクル及び脱保護により合成されたものである）し、
−上記保護されたＡの線状前駆体を環化し、
−該保護基を開裂して保護されたアミン官能基を開放し、
−３つの開放されたアミン官能基を、保護されたＤペプチドに連結されたスペーサーアームＢに相当する−Ｄ−Ｂペプチドとカップリングさせ、
−Ｄペプチド上に存在する保護基を脱保護して、請求項１〜７のいずれか１項に記載の多量体分子を得る、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
Ａが分岐状Ｃ３基でありそして請求項５に記載された式IV、Ｖ、VI又はVIａの１つに相当する請求項１〜７のいずれか１項に記載の多量体分子の製造方法であって、該方法は、下記の工程：
−式IV、Ｖ、VI又はVIａの基Ａの３つのアミン官能基を保護されたスペーサーアームＢとカップリングさせ、
−スペーサーアームＢを脱保護し、
−脱保護されたスペーサーアームＢをＤペプチドの構成に含まれた保護されたアミノ酸と、上記したアミノ酸のカップリング、精製及び脱保護の連続したサイクルにより結合させ、
−Ｄペプチドの構成に含まれた最後のアミノ酸を脱保護して、請求項１〜７のいずれか１項に記載の多量体分子を得る、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
Ａが請求項５に記載された式VII又はVIIIの１つに相当する非対称性分岐状基である請求項１〜７のいずれか１項に記載の多量体分子の固体支持体上での製造方法であって、該方法が下記の工程：
−それぞれ位置α及びεにおけるリシンの２つのアミン官能基の各々がそれぞれ異なる且つ直交する保護基により保護されているリシンを固体支持体にグラフトさせ、
−リシンから形成されたペプチド鎖を、
＊保護されたアミン官能基が位置εにある式VIIの基Ａを得るために位置αのアミン官能基のみを連続したカップリング及び脱保護すること、又は
＊保護されたアミン官能基が位置αにある式VIIIの基Ａを得るために位置εのアミン官能基のみを連続したカップリング及び脱保護することのいずれかにより、
所望の長さに伸長させ、
−式VIIの基Ａの位置ε又は式VIIIの基Ａの位置αにおける脱保護されたアミン官能基を保護されたアームＢとカップリングさせ、
−脱保護されたスペーサーアームＢを、既に形成されているＤペプチド又はＤペプチドに相当するアミノ酸残基の逐次的結合によりその場で形成されたＤペプチドと結合させ、そして
−このようにして得られた分子を、Ｄペプチドの官能化された側鎖上に存在するすべての保護基を除去した後、固体支持体から開裂させる、
段階を含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の主題は、新規な多量体分子（multimeric molecules）、それらの製造方法及び医薬の製造のためのそれらの使用である。
本発明の主題は免疫応答を活性化又は抑制することができる分子でもある。
【背景技術】
【０００２】
免疫応答におけるＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌカップルの重要性は、治療の目的でこれらの２つの分子に対して指向された抗体を使用して、免疫系を抑制又は活性化するための多数のグループを導いた。抗ＣＤ４０Ｌ抗体の投与は、自己免疫疾患、例えばネズミ実験アレルギー性脳脊髄膜炎（ヒト多発性硬化症のモデル）の処置（Howard et al., 1999）又はサルにおける腎臓同種移植片の拒絶の処置（Kirk et al., 19990003）において希望の持てる結果を与えた。これらの２つの場合に、抗体は免疫系の有害な活性を抑制した。反対に、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体の使用は、一方ではマウスにおけるペプチド抗腫瘍ワクチンに対する応答を強く増加させること（Diehl et al., 1999）及び他方ではネズミ腫瘍の撲滅におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の有効性を増加させること（Sotomayor et al., 1999; Lode etal 2000）を可能とした。ネズミモデルにおける腫瘍の後退はＣＤ４０Ｌをコードするアデノウイルスにより形質転換された樹状細胞（ＤＣｓ）の注入の後検出された（Kikuchi et al.,2000）。最後に、それらのＣＤ４０分子とＣＤ４０Ｌとの相互作用による樹状細胞の活性化は、寄生虫、クルーズトリパノソーマ（Trypanosoma Cruzi）による感染からマウスを保護することができる（Chaussabel et al., 1999）。これらのすべての研究において、三量体の形態で結合してＣＤ４０と６価の複合体を形成するＣＤ４０Ｌ分子の特定の結合価（particular valency）は、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌカップルの機能を妨げることができる機能的抗体を産生することを困難ならしめる。ＣＤ４０Ｌをコードするアデノウイルスの開発は、この欠点に対する部分的応答である。しかしながら、それらの使用はヒトでは問題がなくはない。最後に、この系の特定の結合価はＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用を妨げることができる合成分子を発見することを困難にする。
【発明の開示】
【０００３】
本発明の目的は、タンパク質−タンパク質相互作用に干渉するようにデザインされた多量体リガンド（multimeric ligands）を提供することである。
【０００４】
本発明の目的は、タンパク質−タンパク質多価相互作用に干渉することができる分子の製造でもある。
【０００５】
本発明の目的は、ＴＮＦ及びＴＮＦ−Ｒファミリーのメンバーの活性を調節すること（modulating）ができる分子の製造でもある。
【０００６】
本発明の目的は、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ系に作用する合成分子を提供することである。
【０００７】
本発明の目的は、アジュバント又は免疫抑制剤として作用することができる分子を提供することでもある。
【０００８】
本発明は、アゴニスト又はアンタゴニスト活性を有する、天然のタンパク質多量体リガンドを模倣すること（mimicking）ができる多量体分子に関する。
【０００９】
本発明は、病理学において有益であることができる、ＴＮＦファミリーに属する天然の多量体リガンドにより生じる効果とは異なる効果を生じることができる多量体分子にも関する。
【００１０】
「アゴニスト活性を有するリガンドを模倣することができる分子」とは、天然のリガンドの機能の一部又はすべてを再現することができる分子を意味する。
【００１１】
「アンタゴニスト活性を有するリガンドを模倣することができる分子」とは、天然のリガンドの機能の一部又はすべてを抑制することができる分子を意味する。
【００１２】
「天然のタンパク質多量体リガンド」とは、非共有結合自己結合（non-covalent self-assembly）による多量体形態、即ち、ホモ二量体、ホモ三量体、ホモ四量体又はホモオリゴマーの形態にあるその受容体に対して活性ないかなるタンパク質も意味する。
【００１３】
本発明は、ＴＮＦスーパーファミリーの受容体リガンドを模倣することができる、上記した多量体分子に関する。
【００１４】
「ＴＮＦスーパーファミリー」は、ＴＮＦの構造的又は機能的特徴と同様な構造的又は機能的特徴を有する分子のファミリーを表し、これらの分子は本質的に免疫応答に関与している。
【００１５】
本発明の有利な態様に従えば、本発明の多量体分子はリガンドがＣＤ４０分子のリガンドであることを特徴とする。
【００１６】
ＣＤ４０分子は、「ＴＮＦ受容体」スーパーファミリーに属する４８ｋＤａの膜貫通分子である。それは、抗原提示細胞、例えば、樹状細胞、単球及Ｂリンパ球により構成的に発現される。それは、活性化されたＴ細胞、白血球、（単球／マクロファージ、ＮＫ細胞、好塩基球、好酸球）、活性化された血小板及び非造血細胞（平滑筋細胞、上皮細胞、内皮細胞）上に発現されたＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）と三価で相互作用する。これらの異なる細胞の表面において、その発現は、一過性にすぎない活性化されたT細胞上でのその発現と違って、誘導性でありそして持続性である。ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用は体液性及び細胞性免疫応答の発生及び制御において中心的である。
【００１７】
本発明は、上記した多量体分子であって、該多量体分子が、下記の一般式
Ａ−Ｘｎ
〔式中、
−ｎは３、４、５又は６に等しく、
−Ａは少なくとも３つのアミン官能基（functions）又はＣＯＯＨ官能基により官能化された化学的基であり、
−Ｘは−Ｄ、−Ｂ−Ｄ又は−Ｂ（Ｄ）−Ｄ’基であり、ここで、
＊Ｂはスペーサーアームであり、
＊−Ｄ及び−Ｄ’はリガンド受容体との界面を形成する残基から選ばれるリガンド由来の配列に相当するペプチド又は擬ペプチド（pseudopeptides）であり、該配列は該受容体と相互作用することができる〕
に相当することを特徴とする多量体分子に関する。
【００１８】
化学的基Ａはそれが基Ｘとの結合を可能とするように官能化された化学的基である。Ａは「コア分子」とも呼ばれる。
【００１９】
「コア分子」とは多量体分子のｎ個のＸ基の提示における中心的役割を有する化学的基を意味する。
【００２０】
「スペーサーアーム」とはＡから所望の距離にＤ基を移動させるのに使用される有機鎖を意味する。
【００２１】
「ペプチド又は擬ペプチド」とは、アミド結合により相互連結された天然又は非天然アミノ酸の残基の配列を意味する。擬ペプチドは性質が異なる化学結合によるペプチド中の１個又はそれより多くのアミド結合の置換により得られる。
【００２２】
「リガンド受容体との界面を形成する残基から選ばれるリガンド由来の配列」とは、リガンドの一次配列に属するペプチド配列を意味し、そのアミノ酸の数は３〜１０でありそしてその構造的研究（Ｘ線回折、核磁気共鳴、分子模型化、定方向突然変異誘発（directed mutagenesis））は、それを構成するアミノ酸の少なくとも１つが受容体のアミノ酸残基と非共有結合相互作用（水素結合、カチオン−π相互作用（cation-pi interaction）、塩橋、疎水性相互作用及びファンデルワールス）していることを示した。
【００２３】
本発明は、多量体分子であって、該多量体分子が、下記の一般式
Ａ−Ｘｎ
〔式中、
−ｎは３、４、５又は６に等しく、
−Ａは少なくとも３つのアミン官能基又はＣＯＯＨ官能基又はＳＨ官能基又はＳ−Ｎｐｙｓ（Ｓ−ニトロ−ピリジンスルフェニル）官能基又はＳ−Ｐｙｓ（Ｓ−ピリジンスルフェニル）官能基により官能化された化学的基であり、そして特にタンパク質とは異なり、
−Ｘは−Ｄ、−Ｂ−Ｄ又は−Ｂ（Ｄ）−Ｄ’基であり、ここで、
＊Ｂはスペーサーアームであり、
＊−Ｄ及び−Ｄ’はリガンド受容体との界面を形成する残基から選ばれるリガンド由来の配列に相当するペプチド又は擬ペプチドを表し、該配列は該受容体と相互作用することができ、該リガンドはＴＮＦスーパーファミリーの受容体のリガンドから選ばれ、特に下記のリガンド：ＥＤＡ、ＣＤ４０Ｌ、ＦａｓＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＡＩＴＲＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＶＥＧＩ、ＬＩＧＨＴ、４−１ＢＢＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＬＴα、ＴＮＦ、ＬＴβ、ＴＷＥＡＫ、ＡＰＲＩＬ、ＢＬＹＳ、ＲＡＮＫＬ及びＴＲＡＩＬから選ばれる〕
に相当することを特徴とする多量体分子にも関する。
【００２４】
本発明は、多量体分子であって、該多量体分子が、下記の一般式：
Ａ−Ｘｎ
〔式中、
−ｎは３、４、５又は６に等しく、
−Ａは少なくとも３つのアミン官能基又はＣＯＯＨ官能基により官能化された化学的基であり、そして特にタンパク質とは異なり、
−Ｘは−Ｄ、−Ｂ−Ｄ又は−Ｂ（Ｄ）−Ｄ’基を表し、ここで、
＊Ｂはスペーサーアームであり、
＊−Ｄ及び−Ｄ’はリガンド受容体との界面を形成する残基から選ばれるリガンド由来の配列に相当するペプチド又は擬ペプチドを表し、該配列は該受容体と相互作用することができ、該リガンドはＴＮＦスーパーファミリーの受容体のリガンドから選ばれ、特に下記のリガンド：ＥＤＡ、ＣＤ４０Ｌ、ＦａｓＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＡＩＴＲＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＶＥＧＩ、ＬＩＧＨＴ、４−１ＢＢＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＬＴα、ＴＮＦ、ＬＴβ、ＴＷＥＡＫ、ＡＰＲＩＬ、ＢＬＹＳ、ＲＡＮＫＬ及びＴＲＡＩＬから選ばれる〕
に相当することを特徴とする多量体分子にも関する。
【００２５】
「−Ｄ及び−Ｄ’がリガンド由来の配列に相当し、該配列は該受容体と相互作用することができる」という表現は、下記のとおり定義することができる：−Ｄ及び−Ｄ’配列は対応する受容体との相互作用におけるそれらの関与について入手可能な構造的データ（Ｘ線回折又は分子模型化及び定方向突然変異誘発）に基づいて選ばれる。かくして、天然のタンパク質では、これらの配列のすべて又は一部が対応する受容体（１つ又は複数）の一部と相互作用する（水素結合、疎水性結合、Ｈ結合、カチオン−π結合、塩橋、ファンデルワールス相互作用）。それにもかかわらず、単離されたペプチド−Ｄ又は−Ｄ’は測定されるにはあまりにも弱すぎる受容体に対するアフィニティーを有することができる。アフィニティーの増加は本発明に記載の多量体化により与えられる。
【００２６】
ＴＮＦスーパーファミリーのリガンドはLocksley et al.(2001)により与えられたリストから選ばれそして特に下記のものである：
【００２７】
【表１】
2005528451.tif 000003
【００２８】
本発明の有利な態様に従えば、本発明の分子は、−Ｄ及び−Ｄ’がヒト又はネズミＣＤ４０受容体のリガンド（ＣＤ４０Ｌ）由来のペプチドを表し、該ペプチドはＣＤ４０のＣＤ４０Ｌリガンドの一次配列に属しそしてそのアミノ酸の数は３〜１０を含む、ことを特徴とする。
【００２９】
本発明の有利な多量体分子は、ＡがＣ３対称性（Ｃ３ symmetry）を有することを特徴とする多量体分子である。
【００３０】
Ｃ３対称性を有する分子は下記の如く定義される：分子が３のオーダー（order）の軸を有するならば、分子はＣ３グループに属する（“Physical Chemistry”,PW Atkins,Oxford University Press,p430における定義参照）。
本発明は、上記した多量体分子であって、
●Ａが下記一般式
【００３１】
【化７】
2005528451.tif 000004
【００３２】
〔式中、
＊ｍ及びｍ’は１〜５の整数であり、
＊ＶはＸとアミド結合を形成する−ＮＨ−又は−ＣＯ−基を表し、
＊Ｚは酸素原子又はＣＨ２基を表し、
＊Ｙは窒素原子又はＲ−Ｃ−基又はＲ−ＣＯＮＨ−Ｃ−基のいずれかを表し、ここでＲは１〜１０個の炭素原子を有するアルキル基、１〜１０個の炭素原子を有するアルケニル基、１〜１０個の炭素原子を有するアルキニル基、５〜１２個の炭素原子を有するアリール基、５〜１４個の炭素原子を有するアラルキル基又は１〜１０個の炭素原子を有するヘテロアリール基であることができ、これらの基は置換されていなくてもよく又は−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＯＮＨ２又はアルコキシ基から選ばれる１〜６個の置換基により置換されていてもよい〕
を有するＣ３対称性を有する分岐状基であるか、
●又はＡが下記一般式：
【００３３】
【化８】
2005528451.tif 000005
2005528451.tif 000006
【００３４】
〔式中、
＊ＲａはＸとアミド結合を形成する−ＮＨ−基又は−ＣＯ−基のいずれかを表し、
＊Ｒｂはタンパク原性（proteinogenic）アミノ酸の側鎖を表し、
＊ｐは１〜４の整数であり、
＊ｑは０〜４の整数である〕
の１つに相当する環状Ｃ３基（cyclic Ｃ３ radical）であるか、
●又は、Ａが下記一般式
【００３５】
【化９】
2005528451.tif 000007
【００３６】
〔式中、
＊ｋは３、４、５又は６を表し、
＊Ｒ１は水素原子又はタンパク原性アミノ酸から選ばれるアミノ酸残基又はＲＣＯ−、ＲＯＣＯ−もしくはＲＮＨＣＯ−基のいずれかを表し、ここでＲは上記したとおりであり、
＊Ｒ２は−ＮＨ２基又は−ＮＨＲ基又はタンパク原性アミノ酸から選ばれるアミノ酸残基のいずれかを表し、Ｒは上記したとおりである〕
に相当する非対称性分岐状基であり、
−Ｂが下記一般式：
【００３７】
【化１０】
2005528451.tif 000008
【００３８】
式中、
＊ＹはＣ１〜Ｃ１０アルキル鎖又はアルキニル、又はアルケニル又はアリール又はアラルキル又はヘテロアリール基を表し、
＊Ｒ３は、ＶもしくはＲａが−ＣＯ−基であるときは−ＮＨ−基を、又はＶもしくはＲａが−ＮＨ−基であるときは−ＣＯ−基のいずれかを表し、
＊Ｒ４及びＲ５は互いに独立に−ＣＯ−基又は−ＮＨ−基を表す〕
の１つに相当し、
−Ｄ及び−Ｄ’が受容体と相互作用するリガンド由来の配列に相当するペプチド又は擬ペプチドである、
ことを特徴とする多量体分子に関する。
【００３９】
本発明は、−Ｄ及び−Ｄ’が下記の：
Ｌｙｓ１４３−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ１４５、Ｔｙｒ１４５−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ１４３、
Ｌｙｓ１４３−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ１４６
Ｔｙｒ１４６−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ１４３、
Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ、Ｌｙｓ−Ψ（ＣＨ２ＮＨ）Ｐｒｏ−Ａｒｇ、
Ａｒｇ２００−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−ＩＬｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ２０７、
Ａｒｇ２０７−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ２００、
Ａｒｇ２００−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ２０４、
Ｉｌｅ２０４−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ２００、
Ａｒｇ２０３−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ２０７、
Ａｒｇ２０７−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ２０３、
Ｃｙｓ２１８−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ２２３、
Ｉｌｅ２２３−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ２１８、
Ｇｌｙ２００−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ｌｙｓ２０７、
Ｌｙｓ２０７−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ２００、
Ｇｌｙ２００−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ２０４、
Ｉｌｅ２０４−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ２００、
Ａｒｇ２０３−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ２０７、
Ｌｙｓ２０７−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ２０３、
Ｃｙｓ２１８−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ２２３、
Ｖａｌ２２３−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ２１８
又は上記した配列の２つの少なくとも２つの連続したアミノ酸により構成されるハイブリッドペプチド、特に配列
Ａｒｇ２０３−Ｉｌｅ２０４−Ｔｙｒ１４５−Ｔｙｒ１４６又は
Ａｒｇ２０３−Ｉｌｅ２０４−Ｔｙｒ１４６−Ｔｙｒ１４５−Ｇｌｙ１４４−Ｌｙｓ１４３
のペプチド、
又は上記配列の断片、
から選ばれるヒト又はネズミＣＤ４０受容体リガンド（ＣＤ４０Ｌ）由来の残基を表し、ここでアミノ酸は同等にＬ又はＤ配置であることができる、
ことを特徴とする上記した分子にも関する。
【００４０】
本発明の有利な態様に従えば、上記した分子は、Ａが下記式
【００４１】
【化１１】
2005528451.tif 000009
【００４２】
〔式中、ｉは１より大きいか又は１に等しい整数を表す〕
の１つに相当することを特徴とする。
【００４３】
本発明の有利な分子は、下記式
【００４４】
【化１２】
2005528451.tif 000010
2005528451.tif 000011
2005528451.tif 000012
【００４５】
の上記した分子である。
【００４６】
本発明は、医薬学的に許容できるベクターと組み合わせて上記した多量体分子を活性成分として含むことを特徴とする医薬学的組成物にも関する。
【００４７】
本発明は、医薬学的に許容できるアジュバントと組み合わせて上記した多量体分子を活性成分として含むことを特徴とするワクチン組成物にも関する。
【００４８】
本発明は、免疫応答の抑制又は活性化を含む病理の処置を目的とした医薬の製造のための上記した多量体分子の使用にも関する。
【００４９】
免疫応答は、炎症性疾患（炎症性リウマチ）、自己免疫疾患、一般に過敏症反応及び特にアレルギー、移植片拒絶、宿主に対する移植片の反応の間は抑制されなければならない。
【００５０】
免疫応答は、一般にワクチン接種、癌免疫治療、免疫抑制を誘発するバクテリア又はウイルス疾患（はしか、ＡＩＤＳ、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス等）においては活性化されなければならない。
【００５１】
本発明は、免疫応答の抑制を必要とする病理、例えば移植片拒絶又は自己免疫疾患の処置を目的とした医薬の製造のための上記した使用にも関する。
【００５２】
免疫応答の抑制を必要とする疾患は、自己免疫疾患、例えば、糖尿病、多発性硬化症、播種性エリテマトーデス（disseminated lupes erythematous）又は慢性関節リウマチ、移植片拒絶、特に同種移植片、異種移植片の状況における移植片拒絶又は宿主に対する移植片の反応、並びに過敏症反応、例えば、アレルギー、特にアレルギー性鼻炎及びアトピー性皮膚炎又は肉芽腫（granulomas）を含む。
【００５３】
免疫応答の抑制の状況で使用される本発明に従う化合物は、静脈内経路、粘膜（口、気道、鼻、膣）経路、皮下経路、皮内経路又は上皮経路（epicutaneous route）により投与することができる。
【００５４】
本発明は、医薬学的組成物が免疫応答の抑制を必要とする病理の処置のための本発明に従う化合物を含み、該化合物は、それが個体当り１日当り約１００ng〜約５mgの割合で投与されうるような量で医薬学的組成物中に存在することを特徴とする医薬学的組成物にも関する。
【００５５】
本発明は、免疫応答の増強を必要とする病理、例えば癌、又は寄生虫、バクテリアもしくはウイルス感染症の処置を目的とした医薬の製造のための上記した使用にも関する。
【００５６】
免疫応答の活性化を必要とするケースは、一般にワクチン接種、特にインフルエンザ又は子供の病気に対するワクチン、特に黒色腫又は転移性の癌の状況における癌免疫治療、又は特にはしか、ＡＩＤＳ、ヘルペスウイルス又はサイトメガロウイルスの状況における免疫抑制を誘発するバクテリア又はウイルス疾患を含む。
【００５７】
免疫応答の活性化の状況で使用される本発明に従う化合物は、静脈内経路、粘膜（口、気道、鼻、膣）経路、皮下、皮内または上皮経路により投与することができる。
【００５８】
本発明は、医薬学的組成物が免疫応答の活性化を必要とする病理の処置のための本発明に従う化合物を含み、該化合物は、それが個体当り１日当り約１００ng〜約５mgの割合で投与されうるような量で医薬学的組成物中に存在することを特徴とする医薬学的組成物にも関する。
【００５９】
本発明は、免疫系に関連していない疾患、例えば、リンパ腫、アテローム性動脈硬化症又は血栓症の処置を目的とした医薬の製造のための上記した使用にも関する。
【００６０】
本発明は、Ａが環状Ｃ３基でありそして上記した式Ｉａ、Ｉｂ、II、VIｂ、VIｃ又はVIｄの１つに相当する上記した多量体分子の固体支持体上での製造方法であって、該方法は、下記の工程：
−成長するペプチド鎖を形成するアミノ酸配列により構成されているＡの線状前駆体を形成（ここで、この線状前駆体は、Ｎ−保護されたアミノ酸残基の３つがアミン型のＲａ基を有するＮ−保護されたアミノ酸残基と、成長するペプチド鎖のアミン官能基との連続したカップリングサイクル及び脱保護により合成されたものであり、その際最初のアミノ酸残基は固体支持体に結合されている）し、
−上記保護されたＡの線状前駆体を環化し、
−該保護基を開裂させて保護されたアミン官能基を開放し、
−３つの開放されたアミン官能基をＮ−保護されたスペーサーアームＢとカップリングさせ、
−スペーサーアームＢを脱保護し、そしてスペーサーアームＢから開放されたアミン官能基を、既に形成されているＤペプチド又はＤペプチドに相当するアミノ酸残基を連続して結合させることによりその場で（ｉｎ  ｓｉｔｕ）形成されたＤペプチドとカップリングさせ、そして
−Ｄペプチドの官能化された側鎖上に存在するすべての保護基を除去した後、固体支持体から該分子を開裂させて本発明に従う多量体分子を得る、
段階を含むことを特徴とする方法に関する。
【００６１】
Ｃ３対称性を有しそして一般式Ｉａ、Ｉｂ、II、VIｂ、VIｃ又はVIｄに相当する環状基Ａを含む化合物は、以下に記載する方法に従って固体支持体上での合成により得られる。基Ａは、その線状前駆体の合成及び環化により最初に固体支持体上に構成される。かくして、その酸官能基が適当に保護されている（例えばアリルエステル）最初のアミノ酸残基を、アルデヒドにより官能化された樹脂（市販の樹脂）を使用することにより還元アミノ化反応により支持体に結合させる。次いで、Ｎ−保護されたアミノ酸（例えば、Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｘａａ−ＯＨ、ここでＸａａはアミノ酸又は成長しているペプチドを表す）との連続したカップリングサイクル（標準ペプチド合成方式）及び脱保護（Ｆｍｏｃ基の開裂のためのＤＭＦ中の２０％ピペリジン）によりＡの線状前駆体を合成する。樹脂洗浄及びろ過技術並びにＦｍｏｃ基脱保護技術は固相ペプチド合成で普通に使用されるこれらの技術である。Ra鎖を有する３つのアミノ酸（式Ｉａ、Ｉｂ又はII参照）はアミン官能基によりそれらの側鎖上で官能化され、アミン官能基は他に対して直交性の（orthogonal）保護基（例えばＴＥＯＣ又はメチルトリチル）により保護される。合成の終わりに、最後のＮ−保護基を開裂させ（Ｆｍｏｃ基の場合にＤＭＦ中の２０％ピペリジンの存在下に）そしてＣ−末端エステルの保護を開裂させる。次いで線状前駆体をカップリング剤（ペプチド合成における標準）及び第三級塩基例えばＤＩＥＡ又は例えばコリジンの存在下に「頭−尾」で環化させる。環化反応の後比色試験、例えばＫａｉｓｅｒの試験（Kaiser et al.,1970）を行うことができる。環化の終わりに、保護されたアミン官能基を有するアミノ酸の保護基を開裂させそして適当に保護されたスペーサーアーム（例えば、Ｆｍｏｃ−Ａｈｘ（６−アミノヘキサン酸）−ＣＯＯＨ）を３つの遊離アミン官能基にカップリング剤の存在下にカップリングさせる。このカップリングの終わりに、スペーサーアームの保護基を開裂させそしてＤペプチドを標準ペプチド合成方法により合成する。合成の終わりにそして一旦最後の保護基が除去されると、分子を例えばトリフルオロ酢酸による処理により樹脂から開裂させ、エーテルによる沈殿の後凍結乾燥しそして例えばＣ１８カラムで分取逆相ＨＰＬＣにより精製する。
【００６２】
本発明は、Ａが環状Ｃ３基でありそして上記した式Ｉａ、Ｉｂ、II、VIｂ、VIｃ又はVIｄの１つに相当する上記した多量体分子の溶液中の製造方法であって、該方法は、下記の工程：
−成長するペプチド鎖を形成するアミノ酸配列により構成されているＡの線状前駆体を形成（ここで、この線状前駆体は、Ｎ−保護されたアミノ酸残基の３つがアミン型Ｒａ基を有するＮ−保護されたアミノ酸残基と、成長するペプチド鎖のアミン官能基との連続したカップリングサイクル及び脱保護により合成されたものである）し、
−上記保護されたＡの線状前駆体を環化し、
−該保護基を開裂させて保護されたアミン官能基を開放し、
−３つの開放されたアミン官能基を保護されたＤペプチドに連結されたスペーサーアームＢに相当する−Ｄ−Ｂペプチドとカップリングさせ、
−Ｄペプチド上に存在する保護基を脱保護して、本発明に従う多量体分子を得る、
段階を含むことを特徴とする方法にも関する。
【００６３】
本発明は、Ａが分岐状Ｃ３基でありそして上記した式IV、Ｖ、VI又はVIａの１つに相当する上記した多量体分子の製造方法であって、該方法は、下記の工程：
−式IV、Ｖ、VI又はVIａの基Ａの３つのアミン官能基を保護されたスペーサーアームＢとカップリングさせ、
−スペーサーアームＢを脱保護し、
−脱保護されたスペーサーアームＢをＤペプチドの構成に含まれた保護されたアミノ酸と、上記したアミノ酸のカップリング、精製及び脱保護の連続したサイクルにより結合させ、
−Ｄペプチドの構成に含まれた最後のアミノ酸を脱保護して、本発明に従う多量体分子を得る、
段階を含むことを特徴とする方法に関する。
【００６４】
Ｃ３対称性の分岐状基でありそして特に式IV、Ｖ、VI又はVIａに相当する基Ａ
含む本発明の化合物は、以後詳細に述べる方法に従って固相又は溶液中で合成することができる。
【００６５】
基Ａがアミン官能基により官能化されているとき、適当に保護されたスペーサーアーム（例えばＢｏｃ−Ａｈｘ−ＯＨ）は、Ａの３つのアミン官能基にペプチド合成方法に従ってカップリング試薬の存在下にカップリングされる。その反応が薄層クロマトグラフィーにより監視されうるこのカップリングの終わりに、生成物を標準有機合成技術に従ってシリカカラム上で単離しそして精製する。次いでＢｏｃ基をトリフルオロ酢酸により開裂させそしてＤペプチドをカップリング、精製及びＢｏｃ基の脱保護の連続した工程により溶液中で合成する。合成の終わりに、側鎖上の保護基を接触水素化により又はフッ化水素酸（ＨＦ）による処理により開裂させる。次いで三量体分子を例えばＣ１８カラムでの分取逆相ＨＰＬＣにより精製する。
【００６６】
基Ａがカルボン酸官能基により官能化されているとき、適当に保護されたスペーサーアーム（例えばＢｏｃ基によりモノ保護されたヘキサメチレンジアミン）をＡの３つのカルボン酸官能基にペプチド合成方法に従ってカップリング試薬の存在下にカップリングさせる。その反応が薄層クロマトグラフィーにより監視されうるこのカップリングの終わりに、生成物を標準有機合成技術に従ってシリカカラム上で単離しそして精製する。次いでＢｏｃ基をトリフルオロ酢酸により開裂させそしてＤペプチドをカップリング、精製及びＢｏｃ基の脱保護の連続した段階により溶液中で合成する。合成の終わりに、側鎖上の保護基を接触水素化により又はフッ化水素酸（ＨＦ）による処理により開裂させ。次いで三量体分子を例えばＣ１８カラムでの分取逆相ＨＰＬＣにより精製する。
【００６７】
本発明は、Ａが上記した式VII又はVIIIの１つに相当する非対称性分岐状基である上記した多量体分子の固体支持体上での製造方法であって、該方法が下記の工程：
−それぞれ位置α及びεにおけるリシンの２つのアミン官能基の各々がそれぞれ異なる且つ直交する（orthogonal）保護基により保護されているリシンを固体支持体にグラフト（graft）させ、
−リシンから形成されたペプチド鎖を、
＊保護されたアミン官能基が位置εにある式VIIの基Ａを得るために位置αのアミン官能基のみを連続したカップリング及び脱保護すること、又は
＊保護されたアミン官能基が位置αにある式VIIIの基Ａを得るために位置εのアミン官能基のみを連続したカップリング及び脱保護することのいずれかにより、
所望の長さに伸張させ、
−式VIIの基Ａの位置ε又は式VIIIの基Ａの位置αにおける脱保護されたアミン官能基を保護されたアームＢとカップリングさせ、
−脱保護されたスペーサーアームＢを、既に形成されているＤペプチド又はＤペプチドに相当するアミノ酸残基の逐次的結合によりその場で形成されたＤペプチドと結合させ、そして
−このようにして得られた分子を、Ｄペプチドの官能化された側鎖上に存在するすべての保護基を除去した後、固体支持体から開裂させる、
段階を含むことを特徴とする方法に関する。
【００６８】
非対称分岐状基である基Ａを含む本発明の化合物は、以下詳細に述べる方法に従って固相で合成することができる。
【００６９】
Ｆｍｏｃ−Ｘａａ−Ｗａｎｇ樹脂（Ｘａａはいかなるアミノ酸又は成長するペプチドであってもよい）又は市販のＦｍｏｃ−Ｒｉｎｋ−アミド樹脂が使用される。ＤＭＦ
（ジメチルホルムアミド）中の２５％ピペリジンによりＦｍｏｃ基を開裂させた後（２×１５分）、特にアミン官能基の場合にはＦｍｏｃ基又はＭｔｔ（メチルトリチル）基により直交方式（orthogonal manner）で適当に保護された官能化されたアミン鎖を有するアミノ酸（例えば、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＯＨ）を、第三級塩基の存在下にカップリング剤で活性化しそして樹脂にカップリングさせる。Ｍｔｔ又はＦｍｏｃ基を８５％ジクロロメタン（ＤＣＭ）、１０％トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）、５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の溶液（６ml）による処理（３×３分）（Ｍｔｔの場合）又はＤＭＦ中の２５％ピペリジンによる処理（Ｆｍｏｃの場合）により選択的に開裂させる。同じアミノ酸（例えば、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＯＨ）を使用して連続したカップリング及び脱保護により鎖を所望の長さ（ｋは３〜６を含む整数である）に伸長させる。最後のＦｍｏｃ又はＭｔｔ基の脱保護の後、保護基の残り（Ｍｔｔ又はＦｍｏｃ）を開裂させ、そして適当に保護されたスペーサーアーム（例えば、Ｆｍｏｃ−Ａｈｘ−ＣＯＯＨ）を遊離アミン官能基にカップリング剤の存在下にカップリングさせる。このカップリングの終わりに、スペーサーアームの保護基を開裂させそしてＤペプチドを標準ペプチド合成方法により合成する。合成の終わりにそして一旦最後の保護基が除去されると、ペプチドを樹脂から開裂させ（例えばトリフルオロ酢酸による処理）、エーテルからの沈殿の後凍結乾燥しそして例えばＣ１８カラムで分取逆相ＨＰＬＣにより精製する。
【００７０】
化合物Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４の製造
Ａ）化合物Ｌ１の製造
化合物Ｌ１は下記式：
【００７１】
【化１３】
2005528451.tif 000013
に相当する。
【００７２】
化合物Ｌ１を２００μモルのスケールで市販のＷａｎｇ−Ａｌａ−Ｆｍｏｃ樹脂上で固相で合成する。ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）中の２５％ピペリジンによるＦｍｏｃ基の開裂（２×１５分）の後、ＤＭＦ中のＢｏｐ（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（３当量）、ＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）（３当量）及びＤＩＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）（９当量）で活性化されたＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＯＨアミノ酸（３当量）を樹脂にカップリングさせる（２×１５分）。樹脂洗浄及びろ過ならびにＦｍｏｃ基の脱保護の技術は、固相ペプチド合成で普通に使用されるこれらの技術である。Ｍｔｔ（４−メチルトリチル）基を８５％ＤＣＭ（ジクロロメタン）、１０％ＴＩＳ（トリイソプロピルシラン）、５％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）の溶液（６ml）により開裂させる（３×３分）。第２及び第３のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＯＨを同じストラテジー及び同じ量の上記試薬によりカップリングさせる。第４のリジンをＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨの形態でカップリングさせる。ＤＭＦ中の２５％ピペリジンによるＦｍｏｃ基の脱保護（２×１５分）の後、ＤＭＦ中のＢｏｐ（１５当量）、ＨＯＢｔ（１５当量）及びＤＩＥＡ（４５当量）で活性化されたＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ及びＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨアミノ酸（１５当量）を１５分にわたりカップリングさせる（各カップリングを２回繰り返す）。１％酢酸を含有するＤＭＦ中のＮａＢＨ３ＣＮ（２．５当量）の存在下にＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＣＨＯアルデヒド（２．５当量）の還元アミノ化反応を使用して樹脂上に、リシンとプロリンとの間の還元されたアミド結合を形成させる。生成物を８０％ＴＦＡ、１０％ＤＣＭ、１０％ＴＩＳの溶液（５ml）で２時間にわたり樹脂から開裂させる。冷エーテルからの沈殿の後、粗生成物をＨ２Ｏ／アセトニトリル／酢酸混合物（８０／１５／５）中において凍結乾燥させる。生成物を質量分光法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ
（マトリックス支援式レーザー脱着イオン化質量分光法（Matrix assisted laser desorption ionization mass spectrometry）））及び分析ＨＰＬＣによりチェックし、そして水中のアセトニトリルの勾配を使用してＣ１８カラムでの分取ＨＰＬＣにより精製する。
【００７３】
Ｂ）化合物Ｌ２の製造
化合物Ｌ２は下記式：
【００７４】
【化１４】
2005528451.tif 000014
に相当する。
【００７５】
化合物Ｌ２を第４リジンまでＬ１と同じように合成する。ＤＭＦ中の２５％ピペリジンによるＦｍｏｃ基の脱保護（２×１５分）の後、遊離アミン基を、ＤＩＥＡ（１ml）の存在下にＤＣＭ（２ml）中の無水酢酸（１ml）の溶液でアセチル化する。生成物を８０％ＴＦＡ、１０％ＤＣＭ、１０％ＴＩＳの溶液（５ml）で２時間にわたり樹脂から開裂させる。冷エーテルからの沈殿の後、粗生成物をＨ２Ｏ／アセトニトリル／酢酸混合物（８０／１５／５）中において凍結乾燥させる。生成物を質量分光法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）及び分析ＨＰＬＣによりチェックし、そして水中のアセトニトリルの勾配を使用してＣ１８カラムでの分取ＨＰＬＣにより精製する。
【００７６】
Ｃ）化合物Ｌ３の製造
化合物Ｌ３は下記式：
【００７７】
【化１５】
2005528451.tif 000015
に相当する。
【００７８】
化合物Ｌ３を第４リジンまでＬ１と同じように合成する。ＤＭＦ中の２５％ピペリジンによるＦｍｏｃ基の脱保護（２×１５分）の後、ＤＭＦ中のＢｏｐ（１５当量）、ＨＯＢｔ（１５当量）及びＤＩＥＡ（４５当量）で活性化されたＦｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ及びＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨアミノ酸（１５当量）を１５分にわたりカップリングさせる（各カップリングを２回繰り返す）。生成物を８０％ＴＦＡ、１０％ＤＣＭ、１０％ＴＩＳの溶液（５ml）で２時間にわたり樹脂から開裂させる。冷エーテルからの沈殿の後、粗生成物をＨ２Ｏ／アセトニトリル／酢酸混合物（８０／１５／５）において凍結乾燥させる。生成物を質量分光法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）及び分析ＨＰＬＣによりチェックし、そして水中のアセトニトリルの勾配を使用してＣ１８カラムでのプレパラティブＨＰＬＣにより精製する。
【００７９】
Ｄ）化合物Ｌ４及びＬ４ａの製造
化合物Ｌ４は下記式：
【００８０】
【化１６】
2005528451.tif 000016
に相当する。
【００８１】
化合物Ｌ４ａは下記式：
【００８２】
【化１７】
2005528451.tif 000017
に相当する。
【００８３】
１）シントン（ｓｙｎｔｈｏｎｓ）の製造
ａ）Ｂｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＡｌｌ
Ｂｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨアミノ酸（１．８９ｇ、１０ミリモル）をＡＣＮ（アセトニトリル）７０mlに可溶化し、そして溶液を０℃に冷却する。ＤＢＵ（１，８−ジアザビシクロ［５，４，０］ウンデセン−７−エン）１．５ml（１．２当量）を加えた後、アセトニトリル１０ml中の臭化アリル（０．７２ml、１当量）の溶液を約１５分間滴下により加える。反応を周囲の温度で２１時間にわたり行い、次いで薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）にかける。アセトニトリルを蒸発させた後、粗生成物を酢酸エチルに溶解させそして有機溶液を５％ＮａＨＣＯ３、Ｈ２Ｏ、１ＮのＫＨＳＯ４及びＨ２Ｏで洗浄する。Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥しそして有機相を蒸発させた後、生成物を７３％の収率で油の形態で回収する。生成物をＮＭＲ及びＦＴ−ＩＲ分光法により特徴付けそしてその後精製しないで次の反応に使用する。
【００８４】
ｂ）ＨＣｌ×Ｈ−（Ｄ）Ａｌａ−ＯＡｌｌ
Ｂｏｃ−（Ｄ）Ａｌａ−ＯＡｌｌアミノ酸（１．６７ｇ；７．３ミリモル）をアルゴン雰囲気下にジオキサン中のＨＣｌ（４Ｍ）５mlの溶液に３０分間可溶化する。反応の後ＴＬＣにかける。酸溶液を蒸発させた後、生成物が９０％収率で真空下に固体として得られる。生成物をＮＭＲ及びＦＴ−ＩＲ分光法により特徴付けそしてその後精製しないで次の反応に使用する。
【００８５】
ｃ）Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＯＡｌｌ
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＯＨアミノ酸（６２５mg、１ミリモル）を、ＨＯＢｔ（１当量）及びＥＤＣ×ＨＣｌ（ＥＤＣ：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドメチオジド（１．１当量）の存在下にジクロロメタン（ＤＣＭ）５mlに可溶化する。５分後、アリルアルコール（１当量）及びＤＭＡＰ（４−ジメチルアミノピリジン）（０．１当量）を加える。２７時間の後、ＨＯＢｔ、ＥＤＣ×ＨＣｌ、アリルアルコール０．５当量及びＤＡＭＰ０．１当量を加える。全体で、反応を４４時間にわたって行う。ジクロロメタンを蒸発させた後、粗生成物を酢酸エチルに溶解させそして有機溶液を５％ＮａＨＣＯ３、Ｈ２Ｏ、１ＮのＫＨＳＯ４及びＨ２Ｏで洗浄する。Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥しそして有機相を蒸発させた後、生成物を９４％の収率で油の形態で回収する。生成物をＮＭＲ及びＦＴ−ＩＲ分光法により特徴付けそしてその後精製しないで次の反応に使用する。
【００８６】
ｄ）Ｈ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＯＡｌｌ
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＯＡｌｌ（２４０mg、０．３６ミリモル）をＤＣＭ（１０ml）中のＤＥＡ（ジエチルアミン）２０％中に可溶化する。反応を、ＴＬＣにより監視して、ＤＥＡ３mlを更に加えた後５時間にわたり行う。溶液を蒸発させた後、粗生成物をジエチルエーテルに可溶化しそして１ＮのＫＨＳＯ４溶液で抽出する。酸溶液を固体ＮａＨＣＯ３で塩基性にしそして生成物を酢酸エチルで再抽出する。有機相をＨ２Ｏで洗浄し、Ｎ２ＳＯ４上で乾燥しそして蒸発させる。生成物を定量的収率で油の形態で回収し、そして次の反応で使用する。
【００８７】
２）固体支持体上での還元アミノ化
市販の２−（３，５−ジメトキシ−４−ホルミルフェノキシ）エチルポリスチレン樹脂上で６２μモルのスケールで固相で還元アミノ化反応を行う。ＨＣｌ×Ｈ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＡｌｌ（１０当量）及びＮａＢＨ３ＣＮ（１０当量）をＤＭＦ中に可溶化しそして樹脂に加える。反応を、ＦＴ−ＩＲ分光法により監視して、攪拌下に２４時間にわたって行う。
【００８８】
３）線状ジペプチド、Ｌ４及びＬ４ａの前駆体の製造
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＯＨアミノ酸（５当量）を、コリジン（１４当量）の存在下にジクロロメタン１mlに可溶化しそしてトリホスゲン（１．６５当量）で１分間活性化する。次いで溶液を樹脂（６２μモル）に加えそして３０分間にわたってカップリング反応を行う。樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦで徹底的に洗浄しそしてエーテルで乾燥する。
【００８９】
４）線状トリペプチド、Ｌ４及びＬ４ａの前駆体の製造
ジペプチド−樹脂コンジュゲート（６２μモル）を、Ｐｄ（Ｐｈ３）４（２当量）で処理し、１８５０：１００：５０の割合のＤＣＭ：ＡｃＯＨ（酢酸）：ＮＭＭ（Ｎ−メチルモルホリン）の溶液２ml中でアルゴン下に６時間可溶化する。反応をＦＴ−ＩＲ分光法により監視する。次いで、ＨＡＴＵ［Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウラニウムヘキサフルオロホスファート］（４当量）、ＨＯＡｔ（７−アザベンゾトリアゾール）（４当量）、ＣｕＣｌ２（０．５当量）及びコリジン（９当量）を、ＤＭＦ１．５ml及びＤＣＭ６００μlに可溶化されたＨ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＯＡｌｌアミノ酸（５．８当量）に加える。溶液を樹脂（６２μモル）に加えそしてカップリング反応を２時間行う。樹脂をＤＭＦ、ＤＣＭ、メタノールで徹底的に洗浄し、エーテルで乾燥しそしてＦＴ−ＩＲ分光法によりチェックする。
【００９０】
５）環状ヘキサペプチドＬ４及びＬ４ａの製造
ＤＭＦ中の２５％ピペリジンによるＦｍｏｃ基の脱保護（２×１５分）の後、ＤＭＦ中のＢｏｐ（５当量）、ＨＯＢｔ（５当量）及びＤＩＥＡ（１５当量）で活性化されたＦｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＯＨ及びＦｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨアミノ酸（５当量）を１時間にわたりカップリングさせる（各カップリングを２回繰り返す）。アリル基をＰｄ（Ｐｈ３）４（２当量）で開裂させ、１８５０：１００：５０の割合のＤＣＭ：ＡｃＯＨ：ＮＭＭの溶液２ml中にアルゴン下に６時間可溶化する。Ｆｍｏｃ基をＤＭＦ中のピペリジンの２５％溶液で開裂させる（２×１５分）。遊離Ｎ−末端及びＣ−末端を有する線状ヘキサペプチド−樹脂誘導体をＤＭＦ／ＤＣＭ５：２（２．１ml）の溶液でＨＯＡｔ（４当量）、ＤＩＣ（ジイソプロピルカルボジイミド）（４．４当量）の存在下に３時間にわたって環化させる。Ｍｔｔ基を８５％ＤＣＭ、１０％ＴＩＳ、５％ＴＦＡの溶液（２ml）で開裂させる（３×２分）。ＤＭＦ中のＢｏｐ（１５当量）、ＨＯＢｔ（１５当量）及びＤＩＥＡ（４５当量）で活性化されたＦｍｏｃ−Ａｈｘ−ＯＨ（Ｈ−Ａｈｘ−ＯＨ：６−アミノヘキサン酸）、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（ｔＢｕ）−ＯＨ及びＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨアミノ酸（１５当量）を１時間にわたりカップリングさせる（各カップリングを２回繰り返す）。環状ペプチドを９０％ＴＦＡ、５％Ｈ２Ｏ、５％ＴＩＳの溶液（３ml）で２時間にわたって樹脂から開裂させる。開裂を同じ条件下に３時間にわたって二回目を繰り返す。冷エーテルからの沈殿の後、生成物Ｌ４及び副生物Ｌ４ａの両方が得られ、次いでこれをＨ２Ｏ／アセトニトリル／酢酸混合物（８０／１５／５）において凍結乾燥させる。生成物を質量分光法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）及び分析ＨＰＬＣによりチェックし、そして水中のアセトニトリルの勾配を使用してＣ１８カラムでの分取ＨＰＬＣにより精製しそして分離する。
【００９１】
Ｅ）化合物Ｌ７の製造
リガンドＬ７は下記式：
【００９２】
【化１８】
2005528451.tif 000018
に相当する。
【００９３】
反応略図：モノマー６（中間生成物）の製造
【００９４】
【化１９】
2005528451.tif 000019
【００９５】
ａ．２ｇ（１当量）のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン１を攪拌下にＴＨＦに溶解しそして４０％水性ＫＯＨを加え、次いでアクリロニトリル４．３４ml（４当量）を加えた。反応混合物を攪拌しながら周囲の温度に２４時間維持した。ＴＨＦの部分を蒸発させた後、水を加え、次いでジクロロメタン（ＤＣＭ）により抽出を行い、次いで硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶媒を蒸発により除去した後、粗生成物２が得られた。それを次いでクロマトグラフィー（ＥＡ／ＨＥＸ／ＭｅＯＨ＝３．５／３．５／１）により精製した。質量：２．５ｇ；収率：５４％。
【００９６】
ｂ．２ｇ（１当量）の化合物２を攪拌しながらＴＨＦに溶解し、そして氷浴で冷却した。（Ｂｏｃ）２Ｏの２．１４ｇ（１．５当量）を他のフラスコ中のＴＨＦに溶解し、次いでこれを、反応媒体にＤＩＥＡの２．３ml（１．５当量）を加えた後、反応媒体にゆっくりと加えた。反応媒体を攪拌しながら一夜周囲の温度に保った。ＴＨＦの部分を蒸発させた後、酢酸エチルを加え、次いでＫＨＳＯ４（１Ｎ）Ｈ２Ｏ、ＮａＨＣＯ３（飽和（ｓｔ））及びＮａＣｌ（飽和（ｓｔ））で逐次洗浄した。次いで生成物３をクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＥＡ＝１０／１）により精製した。重量：２．３９ｇ；収率：７１％。
【００９７】
ｃ．化合物３をＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３（５５／１）に溶解した。１０％ＰｔＯ２を加え、次いでフラスコを水素でフラッシュしそして一夜水素雰囲気下に維持した。ろ過しそして溶媒を蒸発させた後、化合物４が得られそして真空下に乾燥した。
【００９８】
ｄ．化合物４を攪拌しながら水に溶解した。ＮａＨＣＯ３の６当量を粉末の形態で加えた。ＦｍｏｃＯＳｕの３．６当量をＴＨＦに溶解しそして反応混合物に加えた。反応を４時間続け、次いでＴＨＦを蒸発させた。残りの混合物をＤＣＭで抽出し、次いで有機相を１ＮのＫＨＳＯ４溶液で洗浄した。硫酸ナトリウム上で乾燥した後、溶媒を蒸発により除去した。最終化合物をクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン／酢酸＝３／７／０．５）により精製した。
【００９９】
ｅ．化合物５を３０分間攪拌しながら純粋なＴＦＡに溶解し、次いでＴＦＡを蒸発により除去して化合物６（モノマー）を生成させた。最後の２つの工程の全体の収率は７３．３％であった。
【０１００】
樹脂上での反応を攪拌しながら注射器で行った。
【０１０１】
【化２０】
2005528451.tif 000020
2005528451.tif 000021
【０１０２】
ｆ．Ｒｉｎｋアミド樹脂Ｒ−１を０．６２ミリモル／ｇの添加量で、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で膨潤させた。Ｆｍｏｃ基を２５％ピペリジン／ＤＭＦにより除去した。反応を各回２０分で２回行った。
【０１０３】
ｇ．樹脂Ｒ−２をＤＣＭ中で膨潤させ、そしてコハク酸１０当量及びピリジン１当量を加えた。ニンヒドリン試験がネガティブとなるまで反応を続けた。樹脂をろ過しそしてＤＣＭ及びＤＭＦで洗浄した。
【０１０４】
ｈ．樹脂Ｒ−３をＤＭＦ中で膨潤させ、次いで化合物６（モノマー１）６当量、ＢＯＤ（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスファート）５当量、ＨｏＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）５当量及びＤＩＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）１５当量を順次に加えた。６時間後、樹脂をろ過しそしてＤＭＥ、ＤＣＭ、エーテルで洗浄し、そして真空下に乾燥してＲ−４を生成させた。添加量はフルオレニル基の定量的紫外線アッセイの後０．２４ミリモル／ｇであり、そして全体の転化率は８４％である。
【０１０５】
ｉ．Ｆｍｏｃ基を２５％ピペリジン／ＤＭＦにより除去してＲ−５を生成させた。反応を各回２０分で２回行った。
【０１０６】
ｊ．樹脂Ｒ−５をＤＭＦ中に膨潤させた。Ｆｍｏｃ−６−アミノカプロン酸の１５当量、ＢＯＰの１５当量、ＨｏＢｔの１５当量及びＤＩＥＡの６０当量を加えそして４時間にわたってカップリングさせてＲ−６を生成させた。反応はニンヒドリン試験により確認された。
【０１０７】
ｋ．Ｆｍｏｃ基を２５％ピペリジン／ＤＭＦにより除去した。Ｆｍｏｃ−Ｘａａ−ＯＨの１５当量、ＢＯＰの１５当量及びＨｏＢｔの１５当量をＤＭＦに溶解し、次いで溶液を、ＤＩＥＡの６０当量を加えた後、樹脂に加えた。各アミノ酸について、カップリング反応を各回３０分で２回行った。最後に、樹脂Ｒ−７をニンヒドリン試験により確認した。
【０１０８】
ｌ．合成されたペプチドをＴＦＡ／Ｈ２Ｏ（９５／５）により３０分間開裂させ、次いで樹脂をろ過した。溶液を回収しそして冷エーテルから沈殿させた。エーテルを除去した後、最終のペプチドＬ７を乾燥しそしてＨＰＬＣにより精製しそして質量分光法により分析した。
【０１０９】
Ｌ−７類似体を同じ合成略図に従いしかしＣＤ４０との相互作用のためのペプチド配列を変えることにより合成した。
それは、構造Ｌ７−１
【０１１０】
【化２１】
2005528451.tif 000022
を生成するアセチル化された配列：Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−であり、
そして、構造Ｌ７−２
【０１１１】
【化２２】
2005528451.tif 000023
【０１１２】
を生成する逆の配列：Ｈ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−であり、
又はスペーサーアームの修飾：グリシンによるアミノヘキサン酸の置換：Ｌ７−３
【０１１３】
【化２３】
2005528451.tif 000024
【０１１４】
である。
【０１１５】
Ｆ）化合物Ｌ１１の製造
リガンドＬ１１は下記式
【０１１６】
【化２４】
2005528451.tif 000025
に対応する。
【０１１７】
反応略図
【０１１８】
【化２５】
2005528451.tif 000026
【０１１９】
ａ）Ｆｍｏｃ−６−アミノカプロン酸、ＤＩＥＡ、ＤＣＭ；ｂ）２５％ピペリジン／ＤＭＦ；ｃ）Ｆｍｏｃ−Ｘａａ−ＯＨ  ＢＯＰ、ＨｏＢｔ、ＤＩＥＡ、ＤＭＦ；ｄ）１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール／ＤＣＭ（６０／４０）。
【０１２０】
１）保護されたペンタペプチド：Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ａｈｘ−ＯＨの製造
樹脂上での反応を注射器中で攪拌しながら行った。
２−クロロトリチルクロリド樹脂（Ｒ１−Ａ）（０．９６ミリモル／ｇ）１．５ｇ（１当量）を注射器中で攪拌しながら蒸留されたＤＣＭで２回洗浄した。ＤＣＭ中のＦｍｏｃ−６−アミノカプロン酸１．０２ｇ（２当量）及びＤＩＥＡ１．５ml（６当量）の混合物を調製しそして樹脂に加えた。３時間後、樹脂をろ過しそしてＤＣＭで洗浄した。それを再び攪拌しながら１時間メタノール中に膨潤させた。次いでそれをろ過しそしてＤＭＦ、ＩｐＯＨ（イソプロパノール）、ＤＣＭ、エーテルで洗浄した。次いでそれを真空下に乾燥してＲ−２Ａを生成させた。
【０１２１】
樹脂Ｒ−２Ａを２５％ピペリジン／ＤＭＦの溶液で２０分間処理し、次いで樹脂をろ過してＲ−３Ａを生成させそして溶液を回収した。反応を２回行った。樹脂２の添加量は回収された溶液の定量的紫外線アッセイにより０．６ミリモル／ｇでありそしてカップリング反応の転化率は８１％であった。
【０１２２】
アミノ酸のカップリングのための一般的方法：Ｆｍｏｃ−Ｘａａ−ＯＨの５当量、ＢＯＰの５当量及びＨｏＢｔの５当量をＤＭＦに溶解し、次いで混合物を、ＤＭＦ中で予め膨潤された樹脂に加えた。ＤＩＥＡの１５当量を反応系に加えた。カップリング反応を各回３０分間で２回行った。樹脂をニンヒドリン試験により試験した。
【０１２３】
ペプチドの合成に必要なアミノ酸を用いてこれらの脱保護及びカップリングプロセスを繰り返したのち、樹脂Ｒ−４Ａが得られた。
【０１２４】
樹脂Ｒ−４Ａを注射器に入れた。１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール及びＤＣＭの混合物（６０／４０）を樹脂に加えた。注射器を２時間攪拌下に維持し、次いで樹脂をろ過しそして溶液を回収した。溶媒を蒸発させた後、残りの生成物を冷エーテルから沈殿させ、次いでＨＰＬＣにより精製して１−Ａを製造した。
【０１２５】
２）ペプチド１−ＡをＴＥＦで水及びトリイソプロピルシランの存在下に（９５：５：５）処理してＬ１１を生成させ、これを冷エーテルから沈殿させ、遠心し、凍結乾燥しそして逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により精製した。
【０１２６】
Ｇ）化合物Ｌ９の製造
１）Ｚ−β−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（４Ｂ）及びＺ−β−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＭｅ（５Ｂ）の製造
【０１２７】
【化２６】
2005528451.tif 000027
【０１２８】
ａ）ＥｔＯＣＯＣｌ、ＮＭＭ、ＴＨＦ；ｂ）ＣＨ２Ｎ２／Ｅｔ２Ｏ；ｃ）ＣＦ３ＣＯＯＡｇ、ＮＭＮ、ＴＨＦ／１０％Ｈ２Ｏ  ｄ）ヨードメタン、Ｋ２ＣＯ３、アセトニトリル
ａ）Ｚ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨの４０ミリモル（１当量）を攪拌しながらＴＨＦの１００ml中に溶解した。ＮＭＮの５．２７ml（１．２当量）を加え、次いで反応混合物を−２０℃に冷却した。クロロギ酸エチルの４．５９ml（１．２当量）をＴＨＦの３０mlに溶解し、次いで混合物を反応系に滴下により加えた。２−Ｂを含有する反応混合物を更に２０分間冷たく保った。
【０１２９】
ｂ）ジアゾメタンの製造
ＫＯＨの７．７６ｇを水１２．５ml、エーテル１０ml及び２−（２−エトキシエトキシ）エタノール３５mlの混合物中に攪拌しながら溶解し、次いで７５℃で加熱した。ジアザルド（Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソ−ｐ−トルエンスルホンアミド；Ａｌｄｒｉｃｈ）１５．５２ｇをエーテル１４０mlに溶解しそして混合物を反応混合物に滴下により加えた。このようにして生成されたジアゾメタンをアセトン中の氷浴中で−７５℃で凝縮させた。このようにして製造されたジアゾメタンのエーテル溶液を２−Ｂの反応溶液に加え、次いで反応混合物を一夜周囲の温度に維持した。エチルアミン（ＥＡ）１mlを加え、次いで多量のＮａＨＣＯ３（飽和（ｓｔ））を加えた。有機相と水性相との分離の後、有機相をＮａＨＣＯ３で２回及びＮａＣｌ（飽和（ｓｔ））で１回洗浄した。硫酸ナトリウム上で乾燥した後、溶媒を蒸発させ、そしてこのようにして製造されたジアゾケトン３−Ｂを真空下に乾燥した。質量：１５．４ｇ；収率：９５％。
【０１３０】
ｃ）転移反応
ジアゾケトン３−Ｂ、７ｇ（１当量）をＴＨＦの１１０mlと水１８mlの混合物中に光の不存在下に攪拌しながら溶解し、そして混合物を−２０℃に冷却した。安息香酸銀４３５mg（０．１１当量）及びトリエチルアミン６．０７ml（２．５当量）を加えた。反応混合物を暗所で一夜周囲の温度に維持した。ＴＨＦの部分を蒸発させ、エーテル２０mlを加え、それをＮａＨＣＯ３で数回抽出した。水性相を一緒にしそしてＫＨＳＯ４粉末によりｐＨ３に酸性化した。溶液をＤＣＭで抽出しそして硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶媒を蒸発させた後、４最終生成物４−Ｂを真空下に乾燥した。質量：５ｇ；収率：７３％。
【０１３１】
ｄ）先に得られたβアミノ酸４−Ｂ１．６７ｇ（１当量）をアセトニトリルに溶解しそして混合物を氷浴により０℃に冷却した。１時間後ヨードメタン１．３２ml（５当量）を加えた。反応混合物を一夜周囲の温度に維持した。アセトニトリルを蒸発させそして酢酸エチルを加え、これをＮａＨＣＯ３（飽和（ｓｔ））、ＫＨＳＯ４（１Ｎ）及びＮａＣｌ（飽和（ｓｔ））により順次に洗浄した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥しそして溶媒を蒸発により除去して５−Ｂを製造した。質量：１．５３ｇ；収率：８８％。
【０１３２】
２）保護されたコア分子の構成
反応略図
【０１３３】
【化２７】
2005528451.tif 000028
【０１３４】
ｅ）化合物５−Ｂの７６５mg（１当量）を攪拌しながらエタノール中に溶解し、そしてＰｄ／Ｃの１０％（重量）を加えた。フラスコを水素で３回フラッシュしそして水素雰囲気下に２時間維持した。ろ過の後、溶媒を蒸発により除去しそして残りの生成物６−Ｂを真空下に乾燥した。質量：４００mg；収率：９８％。
【０１３５】
ｆ）化合物４−Ｂの６５７mg（１当量）を攪拌しながらＤＭＦの３mlに溶解し、次いで化合物６−Ｂの４０mg（１．１当量）、ＢＯＰの７３８mg（１当量）及びＤＩＥＡの７２６μｌ（２．５当量）を順次に加えた。２時間後、反応混合物をＮａＨＣＯ３（飽和（ｓｔ））から沈殿させた。ろ過の後、固体をＨ２Ｏ、ＫＨＳＯ４及びＮａＣｌ（飽和（ｓｔ））で洗浄し、次いで真空下に乾燥した。質量：１ｇ；収率：８４％。この化合物をＭｅＯＨ中で水素化して定量的収率で７−Ｂを製造した。
【０１３６】
ｇ）化合物４−Ｂの１当量を攪拌しながらＤＭＦの３mlに溶解し、次いで化合物７−Ｂの１．１当量、ＢＯＰの１当量、ＤＩＥＡの２．５当量を順次に加えた。２時間後、反応混合物をＮａＨＣＯ３（飽和（ｓｔ））から沈殿させた。ろ過の後、固体をＨ２Ｏ、ＫＨＳＯ４、ＮａＣｌ（飽和（ｓｔ））で洗浄し、次いで真空下に乾燥して生成物８−Ｂを製造した。
【０１３７】
ｈ）化合物８−Ｂの１００mgを攪拌しながらメタノールに溶解しそして１０％のＰｄ／Ｃ（重量）を加えた。フラスコを水素で３回フラッシュしそして水素雰囲気下に２時間維持した。ろ過の後、溶媒を蒸発により除去しそして残りの生成物を真空下に乾燥して９−Ｂを製造した。質量：７８mg；収率９２％。
【０１３８】
ｉ）化合物９−Ｂの７８mg（１当量）の化合物９−Ｂをメタノールに溶解し、次いで水性２Ｎ  ＮａＯＨの１０当量を加えた。反応を薄層クロマトグラフィーＴＬＣ（溶媒：酢酸エチル／ピリジン／酢酸／水）により監視した。反応の終わりに、メタノールを蒸発させそして水を加えた。混合物を酢酸によりｐＨ３に酸性化しそして沈殿を形成した。固体をろ過により回収しそして真空下に乾燥して１０−Ｂを製造した。質量：５０mg；収率：６５％。
【０１３９】
ｊ）化合物１０−Ｂの５０mg（１当量）をＤＭＦの３mlに溶解しそしてＤＩＥＡの４２μｌ（３．５当量）を加えた。ＢＯＰの３６mg（１．２当量）を攪拌しながらＤＭＦの３mlに溶解した。先に調製した溶液を滴下により加えた。反応混合物を２日間周囲の温度に維持し、次いでＮａＨＣＯ３（飽和（ｓｔ））から沈殿させた。沈殿を回収しそしてＨ２Ｏ／ＫＨＳＯ４及びＨ２Ｏで洗浄し、次いで真空下に乾燥して１１−Ｂを製造した。質量：３７mg；収率７６％。
３）コア分子の脱保護及びＬ−９の合成
【０１４０】
反応略図
【０１４１】
【化２８】
2005528451.tif 000029
【０１４２】
ａ）化合物１１−Ｂの５０mg（１当量）を攪拌しながら３０分間ＴＦＡに溶解し、次いでＴＦＡを蒸発により除去した。生成物を真空下に乾燥して１２−Ｂ（Ｌ−１０とも呼ばれる）を製造した。
【０１４３】
ｂ）化合物１２−Ｂを攪拌しながらＤＭＦに溶解した。上記した固相で合成されるペンタペプチド１−Ａの２１７mg（３．３当量）、ＢＯＰの１００mg（３．３当量）、ＤＩＥＡの３９．５μｌ（１０当量）を反応系に加えた。反応を２５時間続け、次いで反応混合物を多量のＮａＨＣＯ３（水性（ａｑ））から沈殿させた。沈殿をろ過しそしてＨ２Ｏ／ＫＨＳＯ４、Ｈ２Ｏ及びエチルアミン（ＥＡ）で洗浄した。固体を真空下に乾燥して１３−Ｂを製造した。質量：１５３mg；収率６９％。
【０１４４】
ｃ）ＴＦＡにより１３−Ｂを処理して定量的収率で表題の化合物を製造した。純粋な化合物Ｌ９がＲＰ−ＨＰＬＣ（逆相クロマトグラフィー）による精製により得られた。
【０１４５】
Ｈ）Ｌ１２の製造
【０１４６】
【化２９】
2005528451.tif 000030
【０１４７】
ａ）化合物８−Ｂの１当量を攪拌しながら３０分間ＴＦＡに溶解し、次いでＴＦＡを蒸発により除去した。生成物を真空下に乾燥して１−Ｃを製造した。
【０１４８】
ｂ）化合物１Ｃを攪拌しながらＤＭＦに溶解した。上記した固相で合成されるペンタペプチド１−Ａの３．３等量、ＢＯＰの３．３当量及びＤＩＥＡの１０当量を反応系に加えた。反応を２５時間続け、次いで反応混合物を多量のＮａＨＣＯ３（水性（ａｑ））から沈殿させた。沈殿をろ過しそしてＨ２Ｏ／ＫＨＳＯ４、Ｈ２Ｏ及びエチルアミンで洗浄した。固体を真空下に乾燥して２−Ｃを製造した。質量：１５３mg；収率６９％。
【０１４９】
ｃ）２−ＣをＴＦＡにより処理して、定量的収率で化合物Ｌ−１２を生成させた。純粋な化合物Ｌ−１２がＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラフィーによる精製により得られた。
【０１５０】
生物学的試験
これらの試験を３つの段階で行う。最初に最も興味深いリガンドを簡単な試験により選び、次いでそれらの生理学的効果をインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で細胞活性化モデルにおいて試験する。最後に、最も興味深いリガンドをインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でネズミモデルで試験する。
【０１５１】
Ｉ−リガンドの選択
これらのリガンドの構造的完全性（integrity）が分析されると、それらの結合を可溶性又は膜ＣＤ４０分子で試験する。これをするために、プラスチックに吸着されたＣＤ４０分子又は正常なもしくは形質転換されたＢ細胞（バーキットリンパ腫（Burkitt's lymphoma））により提示されたＣＤ４０分子に対する可溶性のＣＤ４０Ｌの結合の抑制。この段階はＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ結合の可視化を可能とするＥＬＩＳＡ試験及びフローサイトメトリーラベリングを使用して評価する。
【０１５２】
次いで、ＣＤ４０分子に対するこれらのリガンドのアフィニティをバイオセンサ（ＢＩＡｃｏｒｅ登録商標）を使用して評価する。リガンドのアゴニスト又はアンタゴニスト効果を２つの簡単な生物学的試験を使用して試験した。最初に、形質転換されたＢ細胞（バーキットリンパ腫）による膜分子ＣＤ９５の発現をＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用による活性化（Schattner et al.,1996）の後調べる。このようなモデルにおいて、ＣＤ４０Ｌパートナーをトランスフェクションされた繊維芽細胞（３Ｔ６−ＣＤ４０Ｌ）（Buelens et al.,1997）上に発現させる。ＢＬ４１バーキットリンパ腫細胞をトランスフェクションされていない３Ｔ６繊維芽細胞とインキュベーションする（図３Ａ及び３Ｃ）か又はＣＤ４０Ｌによりトランスフェクションされた３Ｔ６繊維芽細胞とインキュベーションする（図３Ｂ及び３Ｄ）。４８時間後、ＣＤ９５の発現をフローサイトメトリーにより評価する。ＣＤ９５の発現はＣＤ４０Ｌの存在下に誘発される（図３Ｂ）。市販の抗ＣＤ４０Ｌ抗体はＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用の結果を抑制する（図３Ｄ）。
【０１５３】
第２の試験は、膜ＣＤ４０分子のブリッジング期間中増殖を停止しそしてアポトーシスに入るあるＢリンパ腫の性質に基づいている（Tong et al .,1999）。この試験においては、ＢＬ４１細胞をリガンドＣＤ４０とインキュベーションしそして２４時間後これらの細胞の増殖の抑制を、トリチウム化されたチミジンの取り込みを調べることにより測定するか、又はアポトーシス細胞の百分率をフローサイトメトリー調査により測定する（図４Ａ及び図４Ｂ）。
【０１５４】
リガンドのアゴニスト効果を、リガンドとＢ細胞のインキュベーションの後、又はフローサイトメトリーによるＣＤ９５の発現の測定、又は増殖の抑制の測定及び／又はアポトーシスによる死亡の増加の測定により評価する。
【０１５５】
異なる化学的リガンドの存在下におけるＣＤ４０Ｌにより誘発されたＣＤ９５の発現の減少の測定によりアンタゴニスト効果を評価する（表Ｉ）。これらの試験の助けにより、最も興味深いリガンドを選んで、より複雑なモデルにおいてインビボ及びインビトロでのそれらの活性を評価する。
【０１５６】
Ａ）生物学的試験の原理
１−  ＣＤ４０Ｌにより誘発されるＣＤ９５の発現
リンパ腫Ｂ細胞は、それらが構成的方式で発現するＣＤ４０分子を介してシグナルを受け取るとき、ＣＤ９５分子を発現する。このシグナルは他の細胞により発現されるＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）分子により一般に運ばれる。アンタゴニストリガンドはＣＤ４０Ｌに対するＣＤ４０の結合を抑制し、かくしてＣＤ９５の発現をまねる。アゴニストリガンドはＣＤ４０Ｌ分子を模倣しそしてＣＤ４０Ｌを発現する細胞の不存在下においてさえＣＤ９５の発現を誘発する。
【０１５７】
操作方法
ＢＬ４１バーキットリンパ腫細胞（５．１０５／ml）をＣＤ４０Ｌによりトランスフェクションされた３Ｔ６繊維芽細胞（１０５／ml）（３Ｔ６−ＣＤ４０Ｌ）又はＣＤ４０Ｌでトランスフェクションされていない３Ｔ６繊維芽細胞（３Ｔ６）の存在下に培養し、そしてマイトマイシンで処理してそれらの増殖を停止させる。リガンドを、選ばれた濃度で培養の開始時に加える。４８時間の培養の後、ＣＤ９５分子の発現をフローサイトメトリーにより測定する。ＢＬ４１細胞は抗ＣＤ１９抗体（Ｂ細胞の特異的マーカー）を使用して繊維芽細胞から区別される。
【０１５８】
結果
３Ｔ６細胞の存在下に培養されたＢＬ４１細胞はＣＤ９５分子を発現しない（図３Ａ）。他方、ＣＤ９５の発現は３Ｔ６−ＣＤ４０Ｌ細胞の存在下にＢＬ４１細胞の表面で誘発される（図３Ｂ）。ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用をブロックする市販の抗ＣＤ４０Ｌ抗体は、３Ｔ６−ＣＤ４０Ｌ細胞の存在下にＢＬ４１細胞上に誘発されるＣＤ９５の発現を完全に抑制する（図３Ｄ）。
【０１５９】
ＣＤ９５の発現は１００及び５０μMのリガンドＬ１により抑制される（表Ｉ）。Ｌ１と同じコア構造を有するが異なるアミノ酸配列を有するリガンドＬ３は、１００〜２５μMでＣＤ４０Ｌにより誘発されるＣＤ９５の発現を大きく抑制する。リガンドＬ１及びＬ３のコア構造に相当するリガンドＬ２は、ＣＤ９５の発現に対する効果を持たない。Ｌ３と同じペプチド配列を有する分岐状コア構造により構成されたリガンドＬ７は、ＣＤ４０Ｌにより誘発されるＣＤ９５の発現に対する効果を持たない。他方、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ界面によく似たペプチド配列の３つの例を有する環状コア構造を有するリガンドＬ４は、５０〜０．５μMの濃度の範囲でＣＤ４０Ｌにより誘発されるＣＤ９５の発現を抑制する。ゆえに、その活性は、同じペプチドを有する線状リガンド（Ｌ３）の約１０倍大きい。１０μMの濃度で最大の抑制が得られ、５０μMの濃度は実質的な細胞死亡状態（cell mortality）を誘発することに留意することは興味深い（パート２参照）。同じコア分子により構成されているがＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ界面によく似たペプチド配列の２つの例しか有していないリガンドＬ４ａは、ＣＤ４０Ｌにより誘発されるＣＤ９５の発現を極めて弱くしか抑制しない。
【０１６０】
【表２】
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【０１６１】
２−  ＣＤ４０ＬによるＢリンパ腫のアポトーシスの誘発
ある種のＢリンパ腫は、それらのＣＤ４０分子が抗ＣＤ４０抗体又はＣＤ９５分子とは独立に可溶性のＣＤ４０Ｌによりブリッジされると、アポトーシスに入る。このアポトーシスの誘発は、トリチウム化されたチミジンの取り込みにより測定される増殖の減少として発現される。ＣＤ４０のアゴニストリガンドはアポトーシスの増加を誘発しそして結果としてトリチウム化されたチミジンの取り込みの減少を誘発するであろう。
【０１６２】
操作方法
ＢＬ４１バーキットリンパ腫細胞（４．１０５／mL）を、選ばれた濃度の種々のリガンドの存在下に培養する。２４時間後、細胞をトリチウム化されたチミジン（１μｃｉ／ウエル）と８時間インキュベーションして増殖を測定するか、又はアネキシン  Ｖ−ＦＩＴＣ及びヨウ化プロピジウムで標識してフローサイトメトリーによりアポトーシス細胞の百分率を評価する。
【０１６３】
結果
リガンドＬ４（環状構造コア＋ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ界面によく似たペプチド配列の３つの例）は、可溶性ＣＤ４０Ｌ分子と同様にＢＬ４１細胞の増殖を大きく抑制する。しかしながら、リガンドＬ７（Ｌ４と同じペプチド配列を有する分岐状コア構造）及びその誘導体Ｌ７−１、Ｌ７−２及びＬ７−３はＢＬ４１細胞の増殖に対する少しの効果を持つか又は効果を持たない（図４Ａ）。
【０１６４】
この増殖の抑制は、リガンドＬ４ではアポトーシスの強い増加を伴うが、リガンドＬ４ａ（環状コアー構造＋ペプチド配列の２つの例）は非常に弱いアポトーシスを誘発する。単一コアー構造により構成されたリガンドＬ８及び単一ペプチド配列により構成されたリガンドＬ１１はＢＬ４１細胞のアポトーシスによる死に対する効果を持たない（図４Ｂ）。
【０１６５】
同じペプチド配列の３つの例を有するリガンドＬ４のコア構造とは異なる環状コア構造により構成されるリガンドＬ９はまさに強くＢＬ４１のアポトーシスを誘発する（図４Ｂ）。
【０１６６】
結論として、リガンドＬ４及びＬ９はアゴニスト活性を有しておりそしてＣＤ４０Ｌによく似ている。
【０１６７】
Ｂ）ＣＤ４０及びＣＤ４０Ｌ及びリガンドＬ１〜Ｌ１２間の相互作用の調査
方法の原理
Ｂｉａｃｏｒｅ３０００は、表面プラズモン共鳴に基づいて２つの分子間の相互作用を調べることを可能とする装置である。それはリアルタイムでの測定を可能とし、それゆえアナライト（注入された溶液である）とリガンド（測定を支持するマイクロチップに固定化された）の相互作用（会合及び解離）の動力学を監視することを可能とする。アナライトの種々の濃度での動力学的測定はリガンドとアナライトとの相互作用のアフィニティー定数の計算を可能とする。マイクロチップは異なる測定のための４つのセルを含有し、これは、適切ではないが（調査されるリガンドとのアフィニィーを持たないタンパク質）リガンドに類似したタンパク質が固定化されている参照セルと、リガンドが固定化されているセルとの直接の比較を可能とする。
【０１６８】
操作方法
マウス免疫グロブリンの定常部に向けられたウサギ抗体をマイクロチップに固定化した。参照セルにおいては、４０nMのアイソタイプＩｇＧ２ａ（ＬＧ１１２）のモノクローナルマウス抗体が５μL／分の流量で２分間固定化され；リガンドのセルでは、マウスＩｇＧ２ａ重鎖の定常部と会合した組換えＣＤ４０（ヒトＣＤ４０ｍｕＩｇ融合タンパク質、ANCELL Corporation, Bayport, MN）を同じ条件下に固定化させる。
【０１６９】
２つのセル（参照及びリガンド）において、種々の濃度のＣＤ４０Ｌ（ヒトＣＤ１５４ｍｕＣＤ８融合タンパク質、ANCELL Corporation）又は１μMもしくは１２５nMの濃度のＣＤ４０Ｌを、種々の濃度のリガンドの存在下に、アナライトとして注入する。アナライトの存在下の流量は会合を調べるのには１０μL／分で５分間であり、そしてアナライトの不存在下では、解離を調べるのに条件は同じである。
【０１７０】
セルを再生する（即ち、非共有結合で吸着されたすべてのタンパク質を除去する）ために、１０mMのＨＣｌの溶液を５μL／分で１分間注入する。次いでセルを他の分析のために準備する。
【０１７１】
結果
ＣＤ４０に対するＣＤ４０Ｌのアフィニティー定数を調べるために、６２．５〜５００nMの４つの濃度のＣＤ４０Ｌを使用する。平衡定数を５４nMで計算する。
【０１７２】
Ｌ１との会合を調べるために、アナライトを１μMのＣＤ４０Ｌ及び５０μMのＬ１により構成した。相互作用の最初の数秒間は抑制が観察されるけれども、それは５分の会合期間中に消失し、Ｌ１の平衡定数の計算を不可能にする。ゆえに、これは５０μMより大きい。
【０１７３】
Ｌ３の会合は１２５nMのＣＤ４０Ｌの存在下に調べた。２．５μMのＬ３の存在下の動力学的分析は１０μMのＬ３の平衡定数を生じた。
【０１７４】
Ｌ４、Ｌ７（及びその誘導体の）、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１１及びＬ１２の会合を１００nMのＣＤ４０Ｌの存在下に調べた。Ｌ４及びＬ９分子のみはＣＤ４０に結合しそしてＣＤ４０Ｌを追いだした。４０及び８０nMのＬ４の存在下の動力学的分析は、１８０nMのＬ４の平衡定数を生じた。リガンドＬ４は８０nMでＣＤ４０Ｌの結合の５０％を抑制した（ＩＣ５０）。同じ条件下に試験されたリガンドＬ９は、５０nMより小さいＩＣ５０を有し、ゆえにその平衡定数はＬ４の平衡定数より小さい。Ｌ９の線状バージョンである分子はＣＤ４０に結合しないことに留意することは興味深い。これらの結果は、活性なＣＤ４０リガンドの概念は、十分に堅固で（rigid）且つＣ３対称性を有するコア分子（一般式：Ａ−ＸｎにおけるＡ）の使用を必要とすることを示唆する。
【０１７５】
II−インビトロでのモデルにおけるリガンドの試験
ヒト単球からインビトロで分化された未成熟樹状細胞は、それらの成熟を誘発するＣＤ４０Ｌに対して非常に感受性である。この成熟は、（ｉ）深い表現型転移（profound phenotype rearrangements）、（ｉｉ）サイトカイン及びケモカインの分泌、（ｉｉｉ）ＣＤ９５により媒介されるアポトーシスに対する抵抗（Koppi et al.,1997;Bjorck et al.,1997）、（ｉｖ）増加した樹状細胞寿命（Miga et al.,1997）及び（ｖ）成熟樹状細胞の同種Ｔリンパ球を刺激する明らかに増加した能力を伴う。ＣＤｓに対するこれらのリガンドの効果を調べる。最初に、可能性のある（potential）アゴニストリガンドの未成熟ＣＤｓの表現型を修飾する能力をフローサイトメトリーにより調べる。この調査は、ＥＬＩＳＡ試験を使用して、アゴニストリガンドによるサイトカインの分泌の開始を証明することを追求することにより続けられる。最後に、この調査はアゴニスト分子の存在下に予備インキュベーションされたＣＤｓの同種Ｔ細胞を刺激する能力を調べることにより完了する。アンタゴニストリガンドの効果は、アンタゴニスト分子の存在下にＣＤｓを予備インキュベーションすることにより観察される、ＣＤ４０Ｌにより普通に誘発される変化の減少の測定により評価される。リガンドの効果は、（ｉ）サイトカインの存在下にＣＤ４０による扁桃腺のＢ細胞の活性化によりインビトロで模倣されうるＢリンパ球のクラスのスイッチ及び（ｉｉ）ＣＤ４０により活性化された樹状細胞及び前駆細胞障害性Ｔ細胞の共インキュベーションにより模倣されうる細胞障害性Ｔリンパ球の分化に関して試験することもできる。
【０１７６】
III−インビボでのモデルにおけるリガンドの試験
リガンドＬ４及びＬ９はアゴニストであることが示されたが、それらは我々の分子の治療効果を試験するための興味深いてがかりを示す。全身性エリテマトーデスはＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用の重要性が十分に証明されている全身性自己免疫疾患である。アゴニスト抗ＣＤ４０抗体による狼瘡性マウス（lupic mice）の処理は、狼瘡疾患を顕著に促進する。種々のリガンドのインビボでの効果を試験するために、我々はヒト全身性エリテマトーデスのような症状を示す狼瘡疾患を自然に発生するマウスにそれらを注入した。我々は疾患の発生に対するリガンドの効果を調べた。
【０１７７】
操作方法
プレ自己免疫（preautoimmune）ＭＲＬ−ｌｐｒマウス（Koopman et al., 1988）（５週齢）に、リガンドＬ４の１００μｇを含有するＰＢＳ又は含有しないＰＢＳをマウス当り１００μLで静脈内経路により注入する。注入を２週間間隔で２回繰り返す。これらのマウスの血清を後方眼窩（retro-orbital）出血により規則的にサンプリングする。狼瘡疾患の発生は、尿中のタンパク尿の測定、ＥＬＩＳＡ試験による血清中の抗ＤＮＡ抗体の存在の測定及びマウスの生存率により監視される。これらの２つのマーカーはＭＲＬ−ｌｐｒマウスにおける狼瘡疾患の発生の特徴である。
【０１７８】
結果
リガンドＬ４で処理されたマウスはＰＢＳで処理されたマウスより有意に（ｐ＝０．０１０１）より速く死ぬ（図５Ａ）。この死亡の促進は、血清中の抗ＤＮＡのより早期の出現を伴い（図５Ｂ）そして尿中のタンパク尿のより早期の出現（図５Ｃ）を伴い、死亡は明白に狼瘡疾患の促進によることを示す。これらの結果はリガンドＬ４がインビボでアゴニスト効果を有することを明らかに示す。
【０１７９】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【０１８０】
【図１Ａ】三価ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ複合体の分子モデルを示す。
【図１Ｂ】ＣＤ４０との界面に位置しそしてＣＤ４０との相互作用に必須であるＣＤ４０Ｌ残基を示す。星印を有する残基は界面を形成する第２ＣＤ４０Ｌサブユニットに属する。
【図２】本発明の三量体リガンドの構造を示す。
【図３Ａ】フローサイトメトリーにより測定された、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用期間中のＢＬ４１バーキットリンパ腫細胞の表面におけるＣＤ９５の発現を示す。灰色の面は、イソタイプのコントロールを表わし、明灰色の曲線は細胞上で固定された抗９５の量に比例した蛍光を表わす。図３Ａは、上記したＢＬ４１細胞（５．１０５／ml）がトランスフェクションされていない３Ｔ６繊維芽細胞とインキュベーションされるときのＣＤ９５の発現を示す。
【図３Ｂ】フローサイトメトリーにより測定された、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用期間中のＢＬ４１バーキットリンパ腫細胞の表面におけるＣＤ９５の発現を示す。灰色の面は、イソタイプのコントロールを表わし、明灰色の曲線は細胞上で固定された抗９５の量に比例した蛍光を表わす。図３Ｂは、上記したＢＬ４１細胞（５．１０５／ml）がＣＤ４０Ｌによりトランスフェクションされた３Ｔ６繊維芽細胞とインキュベーションされるときのＣＤ９５の発現を示す。
【図３Ｃ】フローサイトメトリーにより測定された、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用期間中のＢＬ４１バーキットリンパ腫細胞の表面におけるＣＤ９５の発現を示す。灰色の面は、イソタイプのコントロールを表わし、明灰色の曲線は細胞上で固定された抗９５の量に比例した蛍光を表わす。図３Ｃは、上記したＢＬ４１細胞（５．１０５／ml）が、抗ＣＤ４０Ｌ抗体の存在下に、トランスフェクションされていない３Ｔ６繊維芽細胞とインキュベーションされるときのＣＤ９５の発現を示す。
【図３Ｄ】フローサイトメトリーにより測定された、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用期間中のＢＬ４１バーキットリンパ腫細胞の表面におけるＣＤ９５の発現を示す。灰色の面は、イソタイプのコントロールを表わし、明灰色の曲線は細胞上で固定された抗９５の量に比例した蛍光を表わす。図３Ｄは、上記したＢＬ４１細胞（５．１０５／ml）が、抗ＣＤ４０Ｌ抗体の存在下に、ＣＤ４０Ｌによりトランスフェクションされた３Ｔ６繊維芽細胞とインキュベーションされるときのＣＤ９５の発現を示す。
【図４Ａ】種々の濃度のリガンド（Ｌ４、Ｌ７、Ｌ７−１、Ｌ７−２又はＬ７−３）又は可溶性ＣＤ４０Ｌ（ｓＣＤ４０Ｌ）の存在下に２４時間の培養の後ＢＬ４１バーキットリンパ腫細胞（４．１０５細胞／ml）のトリチウム化されたチミジンの取り込みの抑制を示す。黒の柱は５０μMに等しい濃度に相当し、水平ハッチングを有する柱は５μMに等しい濃度に相当し、白色の柱は０．５μMに等しい濃度に相当し、灰色の柱は１００nMに等しい濃度に相当し、そしてクロスハッチングされた柱は５０nMに等しい濃度に相当する。  トリチウム化チミジンを培養の最後の８時間に１μci／ウエル（０．８．１０５細胞／ウエル）の濃度で加えそしてトリチウム化チミジンの取り込みをガスシンチレーションβカウンターを使用して測定した。
【図４Ｂ】種々の濃度のリガンド（Ｌ４、Ｌ４ａ、Ｌ８、Ｌ７、Ｌ９及びＬ１１）の存在下に２４時間の培養の後ＢＬ４１バーキットリンパ腫細胞（４．１０５細胞／ml）に特異的なアポトーシスの百分率を示す。黒の柱は５０μMに等しい濃度に相当し、白色の柱は２５μMに等しい濃度に相当し、水平ハッチングを有する柱は１２．５μMに等しい濃度に相当しそして、斜めのハッチングの柱は６μMに等しい濃度に相当する。  アポトーシスは、アネキシンＶ  ＦＩＴＣ及びヨウ化プロピジウムにより標識した後フローサイトメトリーにより測定する。アネキシンＶのみ又はアネキシンＶ及びヨウ化プロピジウムで標識された細胞はアポトーシス性である（apoptotic）と考えられる。特異的アポトーシスの百分率は、下記式［（リガンドを用いた場合の％アポトーシス−リガンドなしの％アポトーシス）／（１００−リガンドなしの％アポトーシス）］×１００により計算される。
【図５Ａ】リガンドＬ４、１００μgを含有するＰＢＳ又は含有しないＰＢＳをマウス当り１００μLを静脈内注入した後種々の齢で生きているＭＴＬ−ｌｐｒマウス（Koopman et al.,1998）の百分率を示す。注入は、７、９及び１１週の齢で行った。実線曲線はリガンドＬ４なしのＰＢＳの注入に相当しそして点線曲線はリガンドＬ４を有するＰＢＳの注入に相当する。
【図５Ｂ】図５Ａにおけると同じ処理の後種々の齢においてＭＲＬ−ｌｐｒマウスの血清中に抗ＤＮＡ抗体（ＥＬＩＳＡ試験により評価された）を有するＭＲＬ−ｌｐｒマウスの百分率を示す。白色の柱はリガンドＬ４なしのＰＢＳの注入に相当しそして黒の柱はリガンドＬ４を有するＰＢＳの注入に相当する。
【図５Ｃ】図５Ａにおけると同じ処理の後種々の齢においてＭＲＬ−ｌｐｒマウスの尿中にポジティブなタンパク尿を有するＭＲＬ−ｌｐｒマウスの百分率を示す。白色の柱はリガンドＬ４なしのＰＢＳの注入に相当しそして黒の柱はリガンドＬ４を有するＰＢＳの注入に相当する。＊リガンドＬ４で処理されたマウスのすべてが死亡した。
【図１Ａ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2005528451.tif 000046
【図３Ｃ】
2005528451.tif 000047
【図３Ｄ】
2005528451.tif 000048
【図４Ａ】
2005528451.tif 000049
【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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