(57)【要約】テザー（Ｔ）によりクエンチャー（Ｑ）に連結したフルオレッサー（Ｐ）を含むバイオコンジュゲートを提供する。テザー（Ｔ）は標的生物分子を認識してそれと相互作用を示すことができるセグメントを含む。酵素またはバイオコンジュゲートを認識する他の標的生物分子とのバイオコンジュゲートの特異的相互作用が無い場合は、重合体（Ｐ）の蛍光は減衰するか、または、クエンチャー（Ｑ）との相対的近接により変調される。バイオコンジュゲートと標的生物分子の会合の結果として、バイオコンジュゲートの切断および蛍光重合体および／またはクエンチャーの放出をもたらすような反応が起こり得る。この一連の事象は、重合体蛍光の増強または増幅によりモニタリングできる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的生物分子を認識してそれと相互作用を示すことができるセグメントを含むテザーと、
複数の会合蛍光種を含み、テザー上の第１の位置にコンジュゲートされるフルオレッサーと、
テザー上の第２の位置にコンジュゲートされるフルオレッサーに対するクエンチャーとを含むバイオコンジュゲートであって、
標的生物分子を認識してそれと相互作用を示すことができるセグメントがテザー上の第１および第２の位置の間に位置する、バイオコンジュゲート。
【請求項２】
標的生物分子を認識してそれと相互作用を示すことができるセグメントがペプチド、核酸、オリゴ糖、およびグリココンジュゲートからなる群より選択される配列を含む、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項３】
フルオレッサーが複数の蛍光性の繰返し単位を含む重合体またはオリゴマーを含む、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項４】
フルオレッサーが複数の蛍光種と会合した固体支持体を含む、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項５】
１種以上のクエンチャーが各々反応性テザーを介して固体支持体に連結している、請求項４に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項６】
固体支持体がストレプトアビジンコーティング球体、重合体微小球、シリカ微小球、有機ナノ粒子、無機ナノ粒子、磁性ビーズ、磁性粒子、半導体ナノ粒子、量子ドット、膜、スライド、プレートおよび試験管からなる群より選択される、請求項４に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項７】
フルオレッサーがコンジュゲートポリ電解質、ビオチニル化コンジュゲートポリ電解質、官能基化コンジュゲートオリゴマー、荷電コンジュゲート重合体、未荷電コンジュゲート重合体、コンジュゲート重合体ブレンド物、およびアセンブルされた単量体またはオリゴマーを含むＪ−凝集重合体アセンブリからなる群より選択される、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項８】
フルオレッサーが仮想重合体である、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項９】
フルオレッサーがシアニン側鎖基を有するポリ（Ｌ−リジン）重合体またはオリゴマーである、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項１０】
フルオレッサーがオリゴ糖から構築される、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項１１】
フルオレッサーが蛍光重合体またはオリゴマーを含む、請求項４に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項１２】
蛍光重合体またはオリゴマーが、固体支持体への共有結合、固体支持体上への吸着により、または、蛍光重合体またはオリゴマー上のビオチン部分と固体支持体表面上のアビジン、ニュートラビジンまたはストレプトアビジン部分との間の相互作用により、固体支持体と会合する、請求項１１に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項１３】
フルオレッサーが蛋白分子を介してテザーにコンジュゲートする、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項１４】
蛋白分子がアビジン、ニュートラビジンおよびストレプトアビジンからなる群より選択される、請求項１３に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項１５】
試料中の標的分析対象の存在および／または量を試験する方法であって、
テザーが標的分析対象を認識してそれと相互作用を示すことができるセグメントを含む、請求項１記載のバイオコンジュゲートと共に試料をインキュベートする工程と、
インキュベートされた試料の蛍光を測定する工程とを包含し、
インキュベートされた試料の測定された蛍光が試料中の標的分析対象の存在および／または量の指標となる、方法。
【請求項１６】
標的分析対象を含有しない対照群の蛍光を測定する工程と、
対照群の蛍光をインキュベートされた試料の蛍光と比較する工程とを更に包含し、
対照群とインキュベートされた試料との間の蛍光の差が試料中の標的分析対象の存在および／または量の指標となる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
インキュベートされた試料の蛍光を測定する工程が、
インキュベートされた試料の蛍光の、インキュベーション後１回目の測定と、
初回より遅い２回目における、インキュベートされた試料の蛍光の、インキュベーション後２回目の測定と、
１回目の蛍光と２回目の蛍光との比較とを包含し、
初回から２回目への蛍光の変化が試料中の標的分析対象の存在および／または量の指標となる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
各々が標的分析対象の種々の既知量を含んでいる複数の対照試料をバイオコンジュゲートと共にインキュベートする工程と、
インキュベートされた対照試料の各々の蛍光を測定する工程と、
各対照試料の測定された蛍光値から分析対象の濃度の関数として蛍光の検量線を作成する工程と、
検量線から試料中の分析対象の量を計算する工程とを更に包含する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
テザーがＲＮＡセグメントを含み、標的分析対象が核酸を含み、該方法が試料を酵素に接触させる工程を更に包含し、ここで、会合がテザーのＲＮＡセグメントと標的のハイブリダイゼーションを包含し、酵素はテザーのハイブリダイズしたＲＮＡセグメントを切断してクエンチャー含有バイオコンジュゲートフラグメントおよびフルオレッサー含有バイオコンジュゲートを生成する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
酵素がリボヌクレアーゼＨである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
標的が複数のバイオコンジュゲートにハイブリダイズする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
標的分析対象を認識してそれと相互作用を示すことができるセグメントがペプチド配列を含み、標的分析対象がペプチド配列を切断することができる酵素を含み、テザーの切断によりクエンチャー含有バイオコンジュゲートフラグメントおよびフルオレッサー含有バイオコンジュゲートが形成される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
酵素がプロテアーゼ、グリコシダーゼまたはトランスフェラーゼ酵素である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
酵素がクエンチャー含有バイオコンジュゲートフラグメントまたはフルオレッサー含有バイオコンジュゲートフラグメントのいずれかを受容するトランスフェラーゼ酵素である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
トランスフェラーゼ酵素が切断反応により不活性化される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
切断反応により二次的化学過程が活性化されるか、触媒化学的カスケードが開始される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
標的分析対象を認識してそれと相互作用を示すことができるセグメントがオリゴ糖またはグリココンジュゲート配列を含み、標的分析対象がセグメントを切断することができる酵素を含み、セグメントの切断によりクエンチャー含有バイオコンジュゲートフラグメントおよびフルオレッサー含有バイオコンジュゲートフラグメントが形成される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２８】
酵素がグリコシダーゼまたはトランスフェラーゼ酵素である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
フルオレッサーが複数の蛍光種に会合した固体支持体を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項３０】
１種以上のクエンチャーが各々反応性テザーを介して固体支持体に連結している、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
固体支持体がストレプトアビジンコーティング球体、重合体微小球、シリカ微小球、有機ナノ粒子、無機ナノ粒子、磁性ビーズ、磁性粒子、半導体ナノ粒子、量子ドット、膜、スライド、プレートおよび試験管からなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
試料中の分析対象の存在または量を試験する方法であって、
第１および第２の位置においてテザーにコンジュゲートしたクエンチャーおよび反応性基を含むバイオコンジュゲートと共に試料をそれぞれインキュベートする工程であって、テザーが標的分析対象を認識してそれと相互作用を示すことができる第１および第２の位置の間のセグメントを含む、工程と、
インキュベートされた試料にフルオレッサーを添加することにより試料混合物を形成する工程であって、フルオレッサーが複数の蛍光種と会合した固体支持体を有し、固体支持体はバイオコンジュゲート上の反応性基と反応する表面官能基を有し、これにより、バイオコンジュゲートは固体支持体に連結することができ、バイオコンジュゲートの固体支持体への連結によりフルオレッサーの蛍光がクエンチングされるようにする、工程と、
バイオコンジュゲート上の反応性基を固体支持体の表面官能基と反応させる工程と、
その後試料混合物の蛍光を測定する工程とを包含し、
試料混合物の蛍光の量は試料中の標的分析対象の存在および／または量を示す、方法。
【請求項３３】
バイオコンジュゲートと共にインキュベートされていない第２の試料にフルオレッサーを添加して対照群を形成する工程と、
対照群の蛍光を測定する工程と、
対照群の蛍光を試料混合物の蛍光と比較する工程とを更に包含し、
対照群と試料混合物との間の蛍光の差が試料中の標的分析対象の存在および／または量の指標である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
バイオコンジュゲートと共に標的分析対象を含有しない第２の試料をインキュベートする工程と、
インキュベートされた試料にフルオレッサーを添加して対照群を形成する工程と、
対照群の蛍光を測定する工程と、
対照群の蛍光を試料混合物の蛍光と比較する工程とを更に包含し、
対照群と試料混合物との間の蛍光の差が試料中の標的分析対象の存在および／または量の指標である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
各々が標的分析対象の種々の既知量を含んでいる複数の対照試料をバイオコンジュゲートと共にインキュベートする工程と、
インキュベートされた対照試料の各々にフルオレッサーを添加して複数の対照混合物を形成する工程と、
対照混合物の各々の蛍光を測定する工程と、
各対照混合物の測定された蛍光値から分析対象の濃度の関数として蛍光の検量線を作成する工程と、
検量線から試料中の分析対象の量を計算する工程とを更に包含する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
インキュベートされた試料の蛍光を測定する工程が、
試料混合物の蛍光のフルオレッサー添加後１回目の測定と、
初回より遅い２回目における、試料混合物の蛍光のフルオレッサー添加後２回目の測定と、
初回の試料混合物の蛍光と２回目の試料混合物の蛍光との比較とを包含し、
２回目の試料混合物の蛍光と比較した初回の試料混合物の蛍光が試料中の標的分析対象の存在および／または量の指標である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
蛍光の変化がテザーの切断に起因する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
標的分析対象が酵素である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
バイオコンジュゲートがビオチニル化され、固体支持体の表面がアビジン、ニュートラビジンまたはストレプトアビジンを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項４０】
標的分析対象が細胞内標的分析対象である請求項１記載のバイオコンジュゲートで細胞をトランスフェクトする工程と、
細胞の蛍光を測定する工程とを包含する細胞内試験であって、
測定された細胞の蛍光は細胞中の標的分析対象の存在および／または量を示す、試験。
【請求項４１】
フルオレッサーがシアニン側鎖基を有するポリ（Ｌ−リジン）重合体である、請求項４０に記載の試験。
【請求項４２】
フルオレッサーがオリゴ糖から構築される、請求項４０に記載の試験。
【請求項４３】
分析対象が酵素である、請求項４０に記載の試験。
【請求項４４】
標的分析対象がカスパーゼ酵素であり、細胞内におけるその存在がアポトーシスの開始を示す、請求項４０に記載の試験。
【請求項４５】
複数の会合蛍光種を含むビオチニル化フルオレッサー。
【請求項４６】
ビオチニル化フルオレッサーがビオチニル化蛍光重合体またはオリゴマーを含む、請求項４５に記載のビオチニル化フルオレッサー。
【請求項４７】
ビオチニル化フルオレッサーがビオチニル化ポリ（フェニレンエチニレン）重合体を含む、請求項４５に記載のビオチニル化フルオレッサー。
【請求項４８】
ビオチニル化フルオレッサーが複数の蛍光種を自らに会合して保有するビオチニル化固体支持体を含み、固体支持体が反応に利用できるビオチン基を含む、請求項４５に記載のビオチニル化フルオレッサー。
【請求項４９】
固体支持体がストレプトアビジンコーティング球体、重合体微小球、シリカ微小球、有機ナノ粒子、無機ナノ粒子、磁性ビーズ、磁性粒子、半導体ナノ粒子、量子ドット、膜、スライド、プレートおよび試験管からなる群より選択される、請求項４８に記載のビオチニル化フルオレッサー。
【請求項５０】
標的生物分子を認識してそれと相互作用を示すことができるセグメントを含むテザーと、
テザー上の第１の位置にコンジュゲートされ、会合した蛍光種複数を含むフルオレッサーの蛍光をクエンチングできるクエンチャーと、
クエンチャー上の第２の位置にコンジュゲートされたビオチン分子とを含み、
標的生物分子を認識してそれと相互作用を示すことができるセグメントがテザーの第１および第２の位置の間に位置する、クエンチング剤。
【請求項５１】
標的生物分子を認識してそれと相互作用を示すことができるセグメントがペプチド配列を含む、請求項５０に記載のクエンチング剤。
【請求項５２】
標的生物分子を認識してそれと相互作用を示すことができるセグメントを含むテザーと、
テザー上の第１の位置にコンジュゲートされた第１のアビジン分子と、
テザー上の第２の位置にコンジュゲートされた第２のアビジン分子とを含み、
標的生物分子を認識してそれと相互作用を示すことができるセグメントがテザー上の第１および第２の位置の間に位置する、バイオコンジュゲート。
【請求項５３】
標的生物分子を認識してそれと相互作用を示すことができるセグメントがペプチド配列を含む、請求項５２に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項５４】
第１のアビジン分子にコンジュゲートされた複数の会合蛍光種を含むフルオレッサーと、
第２のアビジン分子にコンジュゲートされたフルオレッサーの蛍光をクエンチングすることのできるクエンチャーとを更に含む、請求項５２に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項５５】
フルオレッサーが複数の蛍光種を自らに会合させて保有する固体支持体である、請求項５４に記載のバイオコンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は２００１年８月２３日出願の米国出願６０／３１４，０９４の優先権を主張し、その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は一般的に分子の相互作用を検出するための分子センサーに関する。特に本発明はクエンチャー（Ｑ）、フルオレッサー（Ｐ）および蛍光重合体をクエンチャーに連結するテザー（Ｔ）を含むバイオコンジュゲート（すなわちＱＴＰ）に関し、ここで、フルオレッサー（Ｐ）は複数の会合蛍光種（例えば蛍光重合体、オリゴマーまたは「仮想重合体」）を含み、テザーは標的生物分子を認識してそれと相互作用を示すことができるセグメントを含む。バイオコンジュゲートは核酸および酵素等の生物学的分子を検出および定量するために用いることができる。
【背景技術】
【０００３】
酵素結合免疫吸着試験（即ちＥＬＩＳＡ）は広範囲の蛋白、抗体、細胞、ウィルス等の存在および生物学的活性を同定するための最も広範に用いられ、許容されている手法である。ＥＬＩＳＡは多工程の「サンドイッチ」試験であり、分析対象生物分子は先ず表面に連結した抗体に結合する。次に第２の抗体を生物分子に結合させる。場合により、第２の抗体を触媒酵素に連結させ、その後これは増幅反応を「展開」する。或いは、この第２の抗体をビオチニル化して第３の蛋白（例えばアビジンまたはストレプトアビジン）に結合させる。この蛋白は増幅された比色変化のための化学的カスケードをもたらす酵素または蛍光タッギングのための蛍光団のいずれかに連結される。
【０００４】
広範に使用されているにもかかわらず、ＥＬＩＳＡには多くの不都合な点がある。例えば多工程の操作法は試薬と展開時間の双方に渡って厳密な管理を要するため、時間がかかり、「擬陽性」の結果を与えやすい。更に、非特異的吸着試薬を除去するために慎重な洗浄が必要である。
【０００５】
蛍光共鳴エネルギー転移（即ちＦＲＥＴ）法はポリメラーゼ連鎖反応系（ＰＣＴ）の遺伝子配列決定および免疫試験の双方に適用されている。ＦＲＥＴは分析対象生物分子の同種結合を用いてオフ状態ではクエンチングされている染料の蛍光を活性化させる。典型的なＦＲＥＴの例においては、蛍光染料は抗体に連結され（Ｆ−Ａｂ）、そしてこのダイアドがクエンチャーに連結している抗原（Ａｇ−Ｑ）に結合する。結合複合体（Ｆ−Ａｂ：Ａｇ−Ｑ）はエネルギー転移によりクエンチングされる（即ち非蛍光）。Ｑにテザーリングされていない同一の分析対象抗原（Ａｇ）の存在下では、Ａｇ−Ｑダイアドは相対濃度［Ａｇ−Ｑ］／［Ａｇ］により決定される平衡結合確率に従って定量的に置きかえられる。これがＦＲＥＴ法を抗原が既に十分特定されている定量的試験に限定しており、抗原をＱに結合させる化学的機序を各々の新しい例について検討しなければならない。
【０００６】
他のＦＲＥＴ基質および試験法は米国特許６，２９１，２０１号並びに以下の文献、即ちＡｎｎｅら，“Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ  Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｙｐｅ  Ｂ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ”，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２９１，２５３−２６１（２００１）；Ｃｕｍｍｉｎｇｓら，“Ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂａｓｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ａｎｔｈｒａｃｉｓ  Ｌｅｔｈａｌ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅ．９９，６６０３−６６０６（２００２）；およびＭｏｃｋら，“Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｒａｐｉｄ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ａｎｔｈｒａｃｉｓ  Ｌｅｔｈａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｆａｃｔｏｒ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９，６５２７−６５２９（２００２）に記載されている。
【０００７】
分子内でクエンチングされる蛍光基質を用いた他の試験は、以下の文献、即ちＺｈｏｎｇら，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｌｌｙ  Ｑｕｅｎｃｈｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｆｏｒ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉ  Ｌｅａｄｅｒ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ”，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５５，６６−７３（１９９８）；Ｒｏｓｓｅら，Ｒａｐｉｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｆｏｒ  Ｎｏｖｅｌ  Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｙ，Ｊ．Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．２００２，２，４６１−４６６；およびＴｈｏｍｐｓｏｎら，“Ａ  ＢＯＤＩＰＹ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｐａｉｎｓ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ”，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７９，１７０−１７８（２０００）に記載されている。蛍光分極の変化を測定し、分析対象の量を定量するために使用する試験も開発されている。例えば、Ｌｅｖｉｎｅら，“Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ”，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４７，８３−８８（１９９７）を参照できる。更に、Ｓｃｈａｄｅら，ＢＯＤＩＰＹ−α−Ｃａｓｅｉｎ，“ａ  ｐＨ−Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ａｓｓａｙｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ”，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４３，１−７（１９９６）も参照できる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら高い感度で生物学的に関連のある分子を迅速に正確に検出して定量することがなお必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第１の局面によれば、バイオコンジュゲートが提供される。バイオコンジュゲートは標的生物分子を認識してそれと相互作用を示すことができるセグメントを含むテザーと、複数の会合蛍光種を含み、テザー上の第１の位置にコンジュゲートされるフルオレッサーと、テザー上の第２の位置にコンジュゲートされたフルオレッサーに対するクエンチャーとを含み、標的生物分子を認識してそれと相互作用を示すことができるセグメントがテザー上の第１および第２の位置の間に位置する。標的生物分子を認識してそれと相互作用を示すことができるセグメントはペプチドまたは核酸配列を含むことができる。フルオレッサーは複数の蛍光リピート単位を含む重合体またはオリゴマーであることができる。或いは、フルオレッサーは複数の蛍光種と会合した固体支持体であることができる。
【００１０】
本発明の第２の局面によれば試料中の標的分析対象の存在および／または量を試験する方法が提供される。該方法は、上記したバイオコンジュゲートと共に試料をインキュベートする工程と、インキュベートされた試料の蛍光を測定する工程とを包含し、インキュベートされた試料の測定された蛍光が試料中の標的分析対象の存在および／または量の指標となる。
【００１１】
本発明の第３の局面によれば、試料中の分析対象の存在または量を試験する方法が提供される。該方法は、各々が第１および第２の位置においてテザーにコンジュゲートされたクエンチャーおよび反応性基を含むバイオコンジュゲートと共に試料をインキュベートする工程であって、テザーが標的分析対象を認識してそれと相互作用を示すことができる第１および第２の位置の間のセグメントを含む、工程と、インキュベートされた試料にフルオレッサーを添加することにより試料混合物を形成する工程であって、フルオレッサーが複数の蛍光種と会合した固体支持体を有し、固体支持体がバイオコンジュゲート上の反応性基と反応する表面官能基を有し、これにより、バイオコンジュゲートが固体支持体に連結することができ、バイオコンジュゲートの固体支持体への連結によりフルオレッサーの蛍光がクエンチングされるようにする、工程と、バイオコンジュゲート上の反応性基を固体支持体の表面官能基と反応させる工程、その後試料混合物の蛍光を測定する工程とを包含し、試料混合物の蛍光の量は試料中の標的分析対象の存在および／または量を示す。
【００１２】
本発明の第４の局面によれば、細胞内標的分析対象の試験が提供される。該試験は上記したバイオコンジュゲートで細胞をトランスフェクトする工程であって、テザーが細胞内の標的生物分子を認識してそれと相互作用を示すことができるセグメントを含む、工程と、細胞の蛍光を測定する工程とを包含する。測定された細胞の蛍光は細胞中の標的分析対象の存在および／または量を示す。
【００１３】
本発明の第５の局面によれば、複数の会合蛍光種を含むビオチニル化フルオレッサーが提供される。該ビオチニル化フルオレッサーはビオチニル化蛍光重合体またはオリゴマー、例えばビオチニル化ポリ（フェニレンエチニレン）重合体であることができる。ビオチニル化フルオレッサーはまた複数の蛍光種を自らに会合して保有するビオチニル化固体支持体を含み、固体支持体は反応に利用できるビオチン基を含む。
【００１４】
本発明の第６の局面によれば、クエンチング剤が提供される。該クエンチング剤は、標的生物分子を認識してそれと相互作用を示すことができるセグメントを含むテザーと、テザー上の第１の位置にコンジュゲートされ、会合した蛍光種複数を含むフルオレッサーの蛍光をクエンチングできるクエンチャーと、クエンチャー上の第２の位置にコンジュゲートされたビオチン分子とを包含する。本発明のこの局面によれば、標的生物分子を認識してそれと相互作用を示すことができるセグメントはテザーの第１および第２の位置の間に位置する。標的生物分子を認識してそれと相互作用を示すことができるセグメントは（Ａｓｐ）4Ｌｙｓ等のペプチド配列を含むことができる。クエンチャーはＱＳＹ−７であることができる。
【００１５】
本発明の第６の局面によればバイオコンジュゲートが提供される。該バイオコンジュゲートは、標的生物分子を認識してそれと相互作用を示すことができるセグメントを含むテザーと、テザー上の第１の位置にコンジュゲートされた第１のアビジン分子と、テザー上の第２の位置にコンジュゲートされた第２のアビジン分子とを含む。本発明のこの局面によれば、標的生物分子を認識してそれと相互作用を示すことができるセグメントはテザー上の第１および第２の位置の間に位置する。バイオコンジュゲートは、第１のアビジン分子にコンジュゲートした会合蛍光種複数を含むフルオレッサーと、第２のアビジン分子にコンジュゲートしたフルオレッサーの蛍光をクエンチングすることのできるクエンチャーとを更に含む。フルオレッサーは複数の蛍光種を自らに会合させて保有する固体支持体（例えば微小球またはビーズ）であることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は以下の添付図面を参照することにより更に理解できる。
【００１７】
蛍光重合体（Ｐ）と会合してこれをクエンチングするクエンチャー（Ｑ）にテザーリングされた標的生物分子（Ｔ）に対するリガンド（Ｌ）を含むバイオコンジュゲートは米国特許出願０９／８５０，０７４号に開示されており、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。これらのバイオコンジュゲート（「ＱＴＬバイオコンジュゲート」という）は例えば電子転移またはエネルギー転移クエンチングにより蛍光ポリ電解質のスーパークエンチングを利用する。蛍光重合体（Ｐ）は、通常は蛍光重合体と逆の電荷を有するＱＴＬバイオコンジュゲートとの会合複合体を形成できる。ＱＴＬバイオコンジュゲートは特定の生物分子に特異的なリガンド（Ｌ）に共有結合テザーを介して連結しているクエンチャー（Ｑ）を含む。生物分子とのＱＴＬバイオコンジュゲートのリガンドの会合はＱＴＬバイオコンジュゲートを蛍光重合体から分離するか、または容易に検出できる態様でそのクエンチングを変調させ、その結果、蛍光の変化により生物分子の検知を可能とする。この様式においては、生物分子は極めて低い濃度で検出することができる。
【００１８】
本発明はフルオレッサー（Ｐ）をフルオレッサーに対するクエンチャー（Ｑ）と連結させる反応性のテザー（即ち、標的生物分子を認識してそれと相互作用を示すことができるセグメントを含むテザー）を含むバイオコンジュゲートに関する。以下、バイオコンジュゲートは「ＱＴＰバイオコンジュゲート」と称する。従ってＱＴＰバイオコンジュゲートはフルオレッサー（Ｐ）（例えば蛍光重合体またはオリゴマー）に反応性テザー（Ｔ）を介して連結したクエンチャー（Ｑ）を含む反応性分子センサーである。酵素または他の標的生物分子とのＱＴＰバイオコンジュゲートのテザーの特異的会合の非存在下においては、Ｐのフルオレッサーは減衰するか、Ｑの相対的近接により変調される。
【００１９】
本発明によれば、反応性テザー（Ｔ）は標的生物分子を認識してこれと会合することができる。ＱＴＰ分子と標的生物分子の会合の結果、ＱＴＰバイオコンジュゲートの切断と遊離のＰおよび／またはＱの放出をもたらすような反応が起こる。標的生物分子それ自体がテザーを切断する酵素であることができる。或いは、標的生物分子は、テザーとハイブリダイズした場合に、テザーが酵素により切断されるようにする生物分子（例えば核酸）であることができる。この一連の事象の結果蛍光の増強が起こる。特定の実施形態においては反応は触媒性のものであってよい。即ち、蛍光応答の増幅が起こってよい。
【００２０】
バイオ検出およびバイオアッセイのための切断性ＱＴＰ（クエンチャー−テザー−重合体）基質
本発明のバイオコンジュゲートはＰの蛍光を消光する（例えばエネルギー転移または電子転移クエンチングによる）クエンチャー成分（Ｑ）によるクエンチング（例えばスーパークエンチング）にその発光が付されるようなフルオレッサー（Ｐ）を組み込んでいる。フルオレッサーは本明細書においては重合体（Ｐ）と称されるが、他のフルオレッサー、例えばオリゴマー、重合体セグメントまたは仮想重合体も使用できるが、これらに限定されない。更にまた、本発明のフルオレッサーは複数の会合蛍光種（即ち、相互に会合した複数の蛍光種）を含む。フルオレッサーの蛍光種は複数の蛍光リピート単位を含む重合体またはオリゴマーの形態で相互に会合することができる。
【００２１】
或いは、蛍光種は固体支持体への連結を介して相互に会合することができる。本発明における使用に適する固体支持体の例は、ストレプトアビジンコーティング球体、重合体微小球、シリカ微小球、有機ナノ粒子、無機ナノ粒子、磁性ビーズ、磁性粒子、半導体ナノ粒子、量子ドット、膜、スライド、プレートおよび試験管を包含する。蛍光重合体またはオリゴマーは例えば固体支持体への共有結合、固体支持体表面への吸着、またはビオチン部分（例えば蛍光重合体またはオリゴマー上のもの）と固体支持体表面上のアビジン、ニュートラビジンまたはストレプトアビジンとの間の相互作用を介するなど、いずれかの適当な手段により固体支持体に会合することができるが、これらに限定されない。
【００２２】
本発明のフルオレッサーの例としては、例えば、コンジュゲートポリ電解質、ビオチニル化コンジュゲートポリ電解質、官能基化コンジュゲートオリゴマー、荷電コンジュゲート重合体、未荷電コンジュゲート重合体、コンジュゲート重合体ブレンド物、および、アセンブルされた単量体またはオリゴマーを含むＪ−凝集重合体アセンブリが包含されるが、これらに限定されない。本発明の好ましい実施形態によれば、フルオレッサーはオリゴ糖から構築することができる。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態によれば、フルオレッサーは、粒子または他の支持体の表面上に単量体またはオリゴマーの成分をアセンブリングし、これによりアセンブリングされた成分の間の励起性相互作用が個々の成分と比較して増幅されたスーパークエンチングを促進することにより得られる「仮想重合体」であることができる。本発明の好ましい実施形態によれば、仮想重合体を含むＱＴＰバイオコンジュゲート基質はクエンチャー−テザー−ビオチンコンジュゲート（即ち「ＱＴＢ」分子）およびフルオレッサー（例えばビオチニル化蛍光重合体）の混合物から構築してよい。フルオレッサーおよび「ＱＴＢ」分子は固体支持体（例えばビーズまたは微小球）の表面に連結し、本発明のＱＴＰバイオコンジュゲートを形成することができる。
【００２４】
本発明における使用に適するフルオレッサー（例えば蛍光オリゴマー、重合体および「仮想重合体」）は同時係争中の米国特許出願１０／０９８，３８７号に開示されており、その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【００２５】
ＱＴＰバイオコンジュゲートのフルオレッサー成分が官能基化されていない蛍光重合体（またはオリゴマー）のアレイを含む支持体上に係留されている場合、未反応のＱＴＰ分子は集団で表面活性化されたスーパークエンチングを示す。クエンチャーを同時排除しながらＱＴＰ分子を切断すると、全重合体集団の蛍光を「ターンオン」することにより、更なる増幅が起こり得る。
【００２６】
本発明の１つの実施形態によれば、ＱＴＰバイオコンジュゲートのフルオレッサーおよびクエンチャーは、酵素触媒反応により選択的に切断されるセグメントを含むテザーＴにより相互に連結される。テザー（Ｔ）のセグメントには、例えば、標的生物分子と会合する認識成分およびＱＴＰが標的生物分子と会合する場合に反応する切断部位の両方を含むことができる。従って標的生物分子はＱＴＰの切断を促進または触媒してよい。或いは、切断は酵素の添加により（または単一または複数の酵素コファクターを介して）開始してよい。
【００２７】
ＱＴＰ（クエンチャー−テザー−重合体）によるスーパークエンチングを用いた超高感度の核酸検出
以下の実施例はサイクリングプローブ技法（ＣＰＴ）に蛍光重合体スーパークエンチングの使用を組み合わせたものである。サイクリングプローブ技法は例えばＤｕｃｋら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，９，１４２−１４９（１９９０）に開示されている。図１Ａ〜図１Ｃに示すとおり、本実施例に使用されるバイオコンジュゲートは以下の成分、即ち、ＤＮＡまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）１６の配列、ＲＮＡ１８のセグメント、および、第２のＤＮＡまたはＰＮＡのセグメント２０を含む認識鎖１４（Ｔ）を介してクエンチャー１２（Ｑ）に共有結合したフルオレッサー１０（即ち、オリゴマー、重合体または仮想重合体）を含む合成バイオコンジュゲートである。本発明のこの実施形態によれば、ＲＮＡ１８のセグメントは標的ＤＮＡに相補的な配列を含む。標的ＤＮＡとのＲＮＡ１８のセグメントのハイブリダイゼーションがない場合、重合体の蛍光はクエンチングされる。
【００２８】
図１Ａに模式的に示すとおり、重合体成分１０およびクエンチャー１２は鎖１４内部のセグメント上に位置してよい。或いは、図１Ｂに示すとおり、重合体成分１０およびクエンチャー１２は鎖１４の各末端に位置してよい。クエンチャーはエネルギー転移または電子転移クエンチャーであることができる。しかしながら、クエンチャーと重合体との間が比較的広く隔離されている場合は、エネルギー転移クエンチャーが一般的には好ましい。
【００２９】
ＱＴＰ分子はＲＮＡセグメントを含んでいるものの、核酸にハイブリダイズした場合（例えばＲＮＡ：ＤＮＡ２本鎖）のみＲＮＡを特異的に消化する酵素であるリボヌクレアーゼＨ（即ちＲＮａｓｅＨ）の存在下には切断されない。しかしながら標的ＤＮＡの存在下においては、標的とのＱＴＰバイオコンジュゲートの核酸セグメントのハイブリダイゼーションにより図１Ｃに示すとおり２本鎖の形成２２が起こる。したがって、バイオコンジュゲートのＲＮＡセグメントは標的核酸にハイブリダイズした場合のみＲＮａｓｅＨにより消化され得る。その結果生じるＱＴＰバイオコンジュゲートのテザーの切断により重合体（Ｐ）からのクエンチャー（Ｑ）の分離が起こり、クエンチャー含有フラグメント２６およびフルオレッサー含有フラグメント２４が生成する。この分離により蛍光の変化が起こり得る。
【００３０】
ＱＴＰ分子のＲＮＡのみが切断されるため、標的核酸は別のＱＴＰ分子とハイブリダイズするべくリサイクルされ、即ち、標的ＤＮＡの１つの分子を用いて複数の重合体蛍光団および／またはクエンチャーの放出を起こすことができる増幅を可能とするのである。図１Ｃに示すサイクリングプローブ増幅はクエンチャー−ＤＮＡ（またはＰＮＡ）および重合体ＤＮＡ（またはＰＮＡ）フラグメント２４、２６の双方の蓄積をもたらすが、有意な蛍光の分子間クエンチングは、生成したフラグメント間に実質的な全体的斥力があるように、これらのフラグメント上の電荷を「チューニング」することにより回避できる。即ち、ＱＴＰバイオコンジュゲートは、ＱおよびＰ含有フラグメント２４、２６がテザー切断後に逆の電荷を帯びているように調節することができる。
【００３１】
上記した例はまた前の逆転写工程を介してＲＮＡ標的と共に使用することができる。本発明のこの実施形態は、使用および自動化が遥かに簡素である様式（例えば等温、均一系操作）においてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と同等の感度を与える点において診断用途に特に興味深いものである。別の利点として、図１Ｃに示した工程は線状増幅スキームに関するものであるため、工程は本質的に内標準検量線作成と標的ＤＮＡ（またはＲＮＡ）の定量に関与でき、これはウィルス負荷試験のように定量結果が望まれるような分野において極めて有用である。
【００３２】
プロテアーゼ、グリコシダーゼおよびトランスフェラーゼ酵素のＱＴＰ試験
「テザー」成分がポリペプチドから構築される合成ＱＴＰバイオコンジュゲートは、テザー中のペプチドまたは他の切断されやすい連結部を切断することができる酵素を感知するために使用することができる。感知は例えば単一のプロテアーゼに対して特異的であるか、または、より広いファミリーの酵素に対して普遍的であるように合成により調節してよい。
【００３３】
前述した通り、特異的フルオレッサーの使用はまた細胞内にＱＴＰ分子をデリバリーする手段、または、支持体または膜上へＱＴＰ分子を係留する手段を提供することもできる。単純なプロテアーゼ酵素の場合は、ＱＴＰコンジュゲートの使用により上記した増幅と同じタイプの感知が可能となる。
【００３４】
以下に記載する実施例は特定のプロテアーゼ（即ちエンテロキナーゼ）にかかわるものであるが、本発明の試験は、例えば炭疽菌致死因子、ボツリヌスＢ型神経毒、カスパーゼ酵素またはレトロウィルスプロテアーゼ等の、普遍的または特異的な対象である如何なる標的にも拡張して適用できるが、これらに限定されない。
【００３５】
ペプチドまたは炭水化物セグメントを含むテザーを有するＱＴＰバイオコンジュゲートは図２Ａおよび図２Ｂに説明する通りである。図２Ａに示す通り、クエンチャー３０およびフルオレッサー３２はテザー３４内部の単位上に位置することができる。或いは、図２Ｂに示す通り、クエンチャー３０およびフルオレッサー３２はテザー３４のいずれかの端部に位置してよい。いずれの場合においてテザー上の切断部位３６はフルオレッサーとクエンチャーの連結部の間に位置する。
【００３６】
図２Ａに示すバイオコンジュゲートを用いた試験は、それぞれ切断酵素およびトランスフェラーゼ酵素に関る図２Ｃおよび図２Ｄにおいて説明する通りである。図２Ｃに示す通り、ＥＮＺと標記した酵素（例えばプロテアーゼ）を用いてＱＴＰバイオコンジュゲート３８のテザーを切断することができる。酵素は複数のＱＴＰバイオコンジュゲートを切断するために触媒的に機能できるため、スーパークエンチングの「放出」により可能となる既に高い感度を有している蛍光検出の増幅結果を増幅することができる。図２Ａに示すとおり、テザーの切断によりクエンチャー含有およびフルオレッサー含有のフラグメント４０、４２が生成する。図１Ｃに示す試験を用いた場合、蛍光の分子間クエンチングの大部分は、発生したフラグメント間の実質的全体的斥力があるようにこれらフラグメント上の電荷を「チューニング」することにより、回避することができる。
【００３７】
図２Ｄはトランスフェラーゼ酵素（ＥＮＺという）を用いたテザーの切断を説明するものである。図２Ｄに示すとおり、トランスフェラーゼ酵素はテザーを切断し、ＱＴＰバイオコンジュゲート３８のクエンチャーフラグメント４４を受容する。フルオレッサーフラグメント４６もまた図示する。しかしながら、ＱＴＰバイオコンジュゲートは、ＱＴＰバイオコンジュゲートのトランスフェラーゼ酵素との反応の際に、トランスフェラーゼ酵素が切断されたＱＴＰバイオコンジュゲートのクエンチャーフラグメントまたはフルオレッサーフラグメントのいずれかを受容するように合成的に操作できる。いずれの場合も、トランスフェラーゼは工程により不活性化し、同時に感知されてよい。これにより「キラーセンサー」、即ち、反応性分子を中和し、二次的な化学過程を活性化し、または、触媒化学カスケードを開始させるセンサーの１例が与えられる。
【００３８】
本発明の更に別の実施形態によれば、ＱＴＰバイオコンジュゲートは適切な基質の結合および切断の部位を含むオリゴ糖またはグリココンジュゲートから構築されたテザーを有するように合成することができ、これにより、加水分解または転移の産物をもたらす特異的なグリコシド結合を切断することのできるグリコシダーゼやトランスフェラーゼ等の酵素を感知できるようになる。従ってこのようなＱＴＰバイオコンジュゲートはペプチド系ＱＴＰバイオコンジュゲートに関して上記し、そして図２Ｃおよび図２Ｄにおいて説明したものと同様の工程において使用することができる。このスキームによりトランスフェラーゼの酵素活性をモニタリングする特に有用な用途の１つは、細胞外または細胞内の様式におけるチロシンキナーゼのファミリーの試験である。
【００３９】
細胞内試験を可能とするための蛍光重合体の適合化（テーラリング）
ＱＴＰ分子の重合体（またはオリゴマー）成分はコンジュゲートしたセグメントまたは個々の発色団が直接にはコンジュゲートしていないがエン定の凝集作用を介して相互作用を示すセグメントのいずれかより構築してよい。シアニン誘導ポリ−Ｌ−リジンに関して説明した通り、蛍光重合体またはオリゴマーの立体配座は発色団を連結するビルディングブロックにより制御してよい。シアニン誘導ポリ−Ｌ−リジンは主にベータシート構造に適合することがわかっている。合成の染料誘導ポリペプチドと天然のペプチドの間の立体配座の同様性のため、蛍光オリゴマーまたは重合体をデリバリーベヒクルとして用いることにより本発明のＱＴＰバイオコンジュゲートを細胞内に導入して適合化された細胞内試験を行なうことができる。同様の様式において、官能基化オリゴ糖から構築された蛍光重合体またはオリゴマーを含むＱＴＰバイオコンジュゲートもまた、分子センサーを膜または細胞の表面にもたらし、その後細胞内に導入するためのデリバリーベヒクルとして機能できる。
【００４０】
この方法の応用例は、その細胞内の存在がアポトーシスの開始を意味する一連のカスパーゼ（蛋白分解）酵素の基質として機能するように構築されたＱＴＰバイオコンジュゲートである。アポトーシスの開始または抑制をモニタリングする能力は細胞死（ＡＩＤＳの場合等）または細胞の増殖、またはヒトパピローマウィルスまたはＢリンパ球を評価するための診断用ツールを与えるが、これらに限定されない。
【００４１】
エンドプロテアーゼの試験
以下の実施例の全てはプロトタイプのプロテアーゼである酵素エンテロキナーゼを使用している。実施例においては、（Ａｓｐ）4Ｌｙｓのエンテロキナーゼ分解ポリペプチド配列はクエンチャーにテザーリングされたビオチンを有する分子（以下、「ＱＴＢ」試薬と称する）のテザー成分に取り込んだ。この試薬は例えば、ビオチン−ストレプトアビジン会合を介して遊離のストレプトアビジン部位を担持する固体支持体に容易に連結することができる。本発明の好ましい実施形態によれば、試薬はビーズを支持体とするポリ（フェニレンエチニレン）（例えばＰＰＥ−Ｂ）蛍光重合体に連結できる。ビーズに連結させる場合は、固体支持体（例えばビーズ）上のポリ（フェニレンエチニレン）の蛍光はテザーリングされたクエンチャー（Ｑ）の近接によりクエンチング（即ちスーパークエンチング）される。しかしながら、テザーが切断されると、クエンチャーは遊離し、その結果、クエンチングは低減される。
【実施例】
【００４２】
（実施例１）
本試験は図３において説明されている。表面に共有結合によりテザーリングされたストレプトアビジンを含む市販のポリスチレンビーズ５４（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｉｓｈｅｒｓ，ＩＮより購入した０．４６ミクロンの微小球）に蛍光種５２（図４に示す例えばビオチニル化アニオン系コンジュゲート重合体ＰＰＥ−Ｂ）でコーティングし、フルオレッサーコーティングビーズ５０を形成した。図４に示すＰＰＥ−Ｂ重合体はポリ（フェニレンエチニレン）（ＰＰＥ）のビオチニル化誘導体である。
【００４３】
本発明によれば、ビーズ５４の表面上の蛍光種５２の負荷量を制御することができる。利用可能なビオチン結合部位の数（最大ビオチン−ＦＩＴＣ結合能＝１．３５ｍｇ／ｍｇ微小球）もまた可変であり、本発明により制御することができる。
【００４４】
本実施例においては、図５に示す構造を有するＱＴＢ試薬５６の４ｍＭ溶液２ｍｌを水中のＰＰＥ−Ｂコーティングストレプトアビジン微小球の懸濁液０．９ｍＬ（濃度＝１．６３ｅ１０微小球／ｍＬ）に添加した。図５に示す分子はビオチン部分にペプチドテザーを介して連結しているクエンチャー（即ちＱＳＹ−７）を含む。ＱＴＢ試薬のこの量は微小球上の使用可能な遊離のビオチン結合部位の数を基にすると約１０倍過剰量である。懸濁液を室温で、２時間回転混合器上で穏やかに振とうした。次に混合物を６０分間２０℃で、１３０００ｒｐｍで遠心分離し、微小球をペレット化した。上澄み液を慎重に取り除き、新しい水と交換した。次に残存物を穏やかに回転混合して再懸濁させた。交互に遠心分離／再懸濁の工程を行なう洗浄操作を４回行なうことにより全ての緩結合および未結合のＱＴＢを完全に除去した。清浄化された微小球５８を最後に水１ｍｌに再懸濁し、保存ＱＴＰ懸濁液を得た。
【００４５】
次にＰＰＥ−Ｂ発色団の発光強度に対するＰＰＥ結合ストレプトアビジン微小球にＱＴＢを結合することの影響を蛍光光度計で分析した。ＱＴＢ微小球は、結合ＱＳＹ−７発色団によるエネルギー転移クエンチングによりその初期の蛍光の約８０％を失っていることが判った。
【００４６】
図３に示すとおり、エンテロキナーゼでＱＴＰ懸濁液を処理することにより、テザーの切断６０およびクエンチャーフラグメント６４およびフルオレッサーフラグメント６２の生成が起こる。フラグメント６２および６４の分離の結果、フルオレッサーフラグメント６２の蛍光が変化する。
（実施例２）
より迅速な試験は、均質な反応においてエンテロキナーゼでＱＴＢの水溶液を処理することにより達成された。ＱＴＢの加水分解はＥＫＭａｘの０．１Ｕに０．５３ｍＭ溶液を反応させた場合には３０分で終了した（ＥＫＭａｘとはエンテロキナーゼ酵素の触媒サブユニットのクローンであり、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡにより入手できる）。１ユニットは５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１ｍＭ  ＣａＣｌ2および０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（１Ｘ  ＥＫＭａｘ  Ｂｕｆｆｅｒ）中３７℃で１６時間で９０％完全にチオレドキシン−クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ融合蛋白２０ｍｇを消化するＥＫＭａｘの量として定義される。１定量のＰＰＥ−Ｂ結合ストレプトアビジン微小球懸濁液を種々の時間間隔で反応溶液の一部に添加することにより、反応の進行をモニタリングした。重合体蛍光のクエンチングは、最初は強力であり、ペプチドの加水分解が増大するに従って低減し、最終的に加水分解終了時には完全に蛍光が回復した。
【００４７】
実際の試験における上記した操作法の使用の模式図を図６Ａ〜図６Ｃに示す。ブレークシールまたは除去可能なディバイダー７２を２つのコンパートメント７４および７６の間に有する２コンパートメント容器（例えばキュベット）を図６Ａに示す。本発明の試験においては、酵素溶液７８（即ち分析対象）を上部コンパートメントに添加し、ＱＴＢ試薬８０とインキュベートしながら反応させる。図６Ａに示すとおり、下部コンパートメント７６にはＰＰＥ−Ｂコーティングビーズ８２を含む溶液が入っている。ディバイダー７２（例えばブレークシール）を除去することにより２液が混合され、ビオチニル化試薬８０といずれかのビオチニル化切断産物がＰＰＥ−ビーズ８２上の結合部位に会合する。未反応のＱＴＢはＰＰＥ−Ｂの蛍光をクエンチングするのに対し、切断されたビオチニル化フラグメントはクエンチングしない。
【００４８】
対照群は図６Ｂに示すとおりであり、ここでＱＴＢは上部コンパートメント中に存在しない（即ち１００％対照）。最大クエンチングの対照は図６Ｃに示すとおりであり、ここで上部コンパートメントに酵素（例えばプロテアーゼ）を添加しない。
（実施例３）
溶液中のエンテロキナーゼによるＱＴＢの迅速加水分解は均質な溶液の試験様式において好都合であり、その場合、ＰＰＥ−Ｂ重合体およびＱＴＢはアビジン分子と複合体を形成する。第１にＱＴＢを溶液中の所定量のアビジン中に存在するビオチン結合部位の僅かの部分と複合体形成させ、その後残余の結合部位をＰＰＥ−Ｂ重合体と複合体形成することにより、可溶性の架橋ＱＴＰを構築することができる。蛍光クエンチング応答はＱＴＢに結合する結合ＰＰＥ−Ｂ重合体の比率を変化させることにより適合化することができる。この重合体様式をエンテロキナーゼ含有試料に曝露すると、適切な蛍光回復応答が起こり、これにより酵素を定量できる。
（実施例４）
図７Ａに示すとおり、２つのアビジンコア結合カセット８８および９０によりフランキングされたエンテロキナーゼ切断部位［例えば（Ａｓｐ）4Ｌｙｓ］を含むペプチドテザー８６を含むプラスミドコンストラクト８４を合成することができる。ペプチドテザーは例えば以下の配列を含むことができる。
【００４９】
【化１】
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【００５０】
プラスミドコンストラクト８４からのＱＴＰバイオコンジュゲートの合成および試験におけるＱＴＰバイオコンジュゲートの使用は図７Ｂに示すとおりである。図７Ｂに示すとおり、一方の結合カセット９０をビオチニル化クエンチャー（例えばＱＳＹ−７）と複合体化し、他方の結合カセット８８をビオチニル化フルオレッサー（例えばＰＰＥ重合体）とコンジュゲートすることにより本発明のＱＴＢバイオコンジュゲートを形成できる。先ず表面カルボン酸表面基を有する固体支持体９２（ビーズを示す）をＥＤＣを用いてビオチニル化する。次に一方のアビジンコア結合カセット８８を固体支持体上のビオチン基と反応させる。その後残りのアビジンコア結合カセットをＱＴＢ試薬９４と反応させ、ＱＴＰバイオコンジュゲート９６を形成する。
【００５１】
図７Ｂに示すとおり、テザーの切断の前に、ＱＴＰバイオコンジュゲート９４の蛍光はクエンチャーおよびフルオレッサーの近接によりクエンチングされる。しかしながら、ペプチドテザーが切断されると、フルオレッサー含有フラグメント９８およびクエンチャー含有フラグメント１００は分離し、蛍光が増大する。
【００５２】
試薬はＱＴＰの他の可溶性様式を提供する。この様式はＰＰＥ重合体上のビオチン負荷密度を変えることにより溶液中の酵素への応答の感度を制御できるという点において前記した様式と同様の好都合な点を有する。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明によれば、試料中の標的生物分子（即ち標的分析対象）の量を既知の方法を用いて測定することができる。例えば、種々の既知量の標的分析対象を含有する対照試料複数検体をバイオコンジュゲートと共にインキュベートする。次にインキュベートされた対照試料の各々の蛍光を測定する。次に分析対象濃度の関数として蛍光の検量線を作成する。次に試料中の分析対象の量を検量線から計算する。
【００５４】
以上、本発明の特定の実施形態を説明目的で本明細書に記載したが、本発明の精神および範囲を逸脱することなく様々な変更が行なえる。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１Ａ】クエンチャーおよびフルオレッサーがテザー内のセグメント上に各々位置する、本発明の核酸検出用ＱＴＰバイオコンジュゲートを示す。
【図１Ｂ】クエンチャーおよびフルオレッサーがテザーの対向する端部に位置する、本発明の核酸検出用ＱＴＰバイオコンジュゲートを示す。
【図１Ｃ】試料中の核酸標的の存在および／または量を検出するために図１ＡのＱＴＰバイオコンジュゲートを使用する、本発明の試験を説明する。
【図２Ａ】クエンチャーおよびオリゴマーがペプチドまたは炭水化物のテザー内のセグメント上に各々位置する、本発明の酵素検出用ＱＴＰバイオコンジュゲートを示す。
【図２Ｂ】クエンチャーおよびオリゴマーがペプチドまたは炭水化物のテザーの対向する端部に位置する、本発明の酵素検出用ＱＴＰバイオコンジュゲートを示す。
【図２Ｃ】試料中の切断酵素の存在および／または量を検出するために図２ＡのＱＴＰバイオコンジュゲートを使用する、本発明の酵素を検出するための試験を説明する。
【図２Ｄ】試料中のトランスフェラーゼ酵素の存在および／または量を検出するために図２ＡのＱＴＰバイオコンジュゲートを使用する、本発明の酵素を検出するための試験を説明する。
【図３】微小球と会合している複数の蛍光種をフルオレッサーが有し、標的生物分子を認識してそれと相互作用を示すことができるテザーセグメントを介して微小球の表面にコンジュゲートした複数のクエンチャー部分をクエンチャーが有する、本発明の試験を説明する。
【図４】ビオチン／ストレプトアビジン会合を介して固体支持体表面に結合でき、本発明のフルオレッサーとして使用できるビオチニル化アニオンコンジュゲート重合体（即ちＰＰＥ−Ｂ）の構造を示す。
【図５】エンテロキナーゼの試験に用いることができるテザーにコンジュゲートしたクエンチャーおよびビオチン分子を有する、本発明のＱＴＢバイオコンジュゲートの構造を示す。
【図６Ａ】インキュベートされた混合物をフルオレッサーに接触させる前に、酵素を含有する試料をＱＴＢバイオコンジュゲートと共にインキュベートする、本発明の試験を説明する。
【図６Ｂ】ＱＴＢ反応体を、酵素を含む試料に添加することなく、その後試料をフルオレッサーに接触させる、図６Ａの試験の対照群を説明する。
【図６Ｃ】酵素を試料に添加することなく、その後試料をフルオレッサーに接触させる、図６Ａの試験の対照群を説明するものである。
【図７Ａ】本発明のＱＴＰバイオコンジュゲートを合成するために使用できるアビジンコア結合カセットを示す。
【図７Ｂ】図７Ａのアビジンコア結合カセットを用いたＱＴＰバイオコンジュゲートの合成およびこのバイオコンジュゲートの試験における使用を説明する。
【図１Ｃ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図５】
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【図７Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
2005501248.tif 000008
2005501248.tif 000009
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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