(57)【要約】本発明は、in vivoで使用された場合に実質上非免疫原性であるかいかなる非修飾相当物よりも免疫原性が低いVIII因子(FVIII)タンパク質が結果的に生ずるヒトFVIIIの修飾に関する。更に、本発明は前記非修飾タンパク質に由来するＴ細胞エピトープペプチドに関し、それを手段として用いることにより免疫原性の低下した修飾されたFVIII変異体を作出できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に非免疫原性であるか修飾されていないヒトVIII因子より免疫原性が低く、in vivoで使用された場合には本質的に同じ生物学的特異性および活性を有し、修飾されていない親分子と比較して特定的に変更されたアミノ酸残基を含む修飾されたヒトVIII因子分子であって、前記変更されたアミノ酸残基が、親の非修飾分子内でＭＨＣクラスII結合リガンドとして機能してＴ細胞を刺激するＴ細胞エピトープの１つまたは複数を減らすか脱離させる修飾されたヒトVIII因子分子。
【請求項２】
前記変更が、表１で示された親分子に存在する連続するアミノ酸残基の１つまたは複数のストリングの１つまたは複数の位置で形成される、請求項１に記載の修飾されたVIII因子分子。
【請求項３】
前記変更が、表２で示された親分子に存在する連続するアミノ酸残基の１つまたは複数のストリングの１つまたは複数の位置で形成される、請求項２に記載の修飾されたVIII因子分子。
【請求項４】
前記変更が１から９個のアミノ酸残基の置換である請求項１から３のいずれかに記載の修飾されたVIII因子分子。
【請求項５】
表１に表された配列ストリング内の下記位置のアミノ酸残基の１つまたは複数または全てが置換された請求項４に記載の修飾されたVIII因子分子：
１９７、１９８、１９９、２０１、２０２、４０７、４１１、４１２、４１９、５１５、５１７、６１３、６１７、６３６、６３７、６３８、６３９、８２３、１０１１、１０１３、１２０８、１２０９、１２１０、１２５４、１２５５、１２５７、１２６２、１２６４、１２６８、１１１９、１１２０、１１２１、１１２２、１１２３。
【請求項６】
表２のストリングＰ10において下記アミノ酸残基置換の１つまたは複数または全てが実施された請求項３に記載の修飾されたVIII因子分子：
Ｉ１２０８Ａ、Ｉ１２０８Ｔ、Ｉ１２０８Ｎ；
Ｉ１２０９Ｃ；
Ｍ１２１０Ｋ、Ｍ１２１０Ｎ。
【請求項７】
表２のペプチドＰ８において下記アミノ酸残基置換の１つまたは複数または全てが実施された請求項３に記載の修飾されたVIII因子分子：
Ｍ１０１３Ｋ；
Ｉ１０１１Ａ、Ｉ１０１１Ｃ、Ｉ１０１１Ｄ、Ｉ１０１１Ｅ、Ｉ１０１１Ｇ、Ｉ１０１１Ｈ、Ｉ１０１１Ｋ、Ｉ１０１１Ｐ、Ｉ１０１１Ｑ、Ｉ１０１１Ｒ、Ｉ１０１１Ｓ、Ｉ１０１１Ｔ。
【請求項８】
表２のペプチドＰ７において下記アミノ酸残基置換の１つまたは複数または全てが実施された請求項３に記載の修飾されたVIII因子分子：
Ｖ８２３Ａ、Ｖ８２３Ｄ、Ｖ８２３Ｅ、Ｖ８２３Ｇ、Ｖ８２３Ｈ、Ｖ８２３Ｎ、Ｖ８２３Ｐ、Ｖ８２３Ｓ、Ｖ８２３Ｔ。
【請求項９】
全体として試験したとき、ヒトＴ細胞の誘導細胞増殖のバイオアッセイにおいて同じドナーからの細胞を使って並行して試験した場合、タンパク質が親分子よりも小さく２未満の刺激指数(ＳＩ)を示し、前記指数は前記タンパク質で刺激した後に評価され、タンパク質を受け取っていない対照細胞で評価された細胞増殖値で割られた細胞増殖値であって、細胞増殖が任意の適当な手段で測定される請求項１から８のいずれかに記載の修飾されたVIII因子分子。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれかに記載のVIII因子分子をコードするＤＮＡ配列。
【請求項１１】
前記請求項のいずれかに記載の修飾されたVIII因子分子を含有し、任意に、薬剤として許容される担体、希釈液または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１２】
潜在的なＭＨＣクラスII結合活性を有し、修飾されていないヒトVIII因子の一次配列から形成された表１から選択されたペプチド分子であって、前記ペプチド分子が細胞増殖のバイオアッセイにおいて＞1.8の刺激指数を有し、前記指数がペプチドで刺激した後に評価され、ペプチドを受け取っていない対照細胞で評価された細胞増殖値で割られた細胞増殖値であって、細胞増殖が任意の適当な手段で測定されるペプチド分子。
【請求項１３】
請求項12に記載のペプチド分子に由来しアミノ酸置換によって修飾されたペプチド分子であって、２未満の刺激指数を示して潜在的なＭＨＣクラスII結合活性が低下しているか皆無であり、前記指数がペプチドで刺激した後に評価され、ペプチドを受け取っていない対照細胞で評価された細胞増殖値で割られた細胞増殖値であって、細胞増殖が任意の適当な手段で測定される修飾されたペプチド分子。
【請求項１４】
請求項12または13に記載のペプチドをコードするＤＮＡ配列。
【請求項１５】
請求項１に記載の修飾されたVIII因子分子の製造のための請求項13に記載のペプチドの使用。
【請求項１６】
患者のVIII因子に対して免疫原性を減らすためのワクチンの製造のための請求項12に記載のペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、特にヒトに投与され、そしてとりわけ治療に使用するポリペプチドに関する。このポリペプチドは修飾されたポリペプチドであり、この修飾により、ポリペプチドがヒトに投与された際に免疫反応を誘発する傾向が低減するという結果をもたらす。本発明は特に、インビボで使用した時に、非修飾の相当物に比べて免疫原性が低い、または実質的に非免疫原性である、ヒトVIII因子(FVIII)タンパク質の変異体をもたらすヒトFVIIIの修飾に関する。本発明はさらに、前記非修飾タンパク質に由来するＴ細胞エピトープペプチドに関し、これにより免疫原性の低減された修飾エリスロポエチン変異体の作成を可能にするものである。
【０００２】
（発明の背景）
治療用タンパク質に対して望ましくない免疫反応が起こるために、治療用タンパク質の有効性が制限される例が多々ある。いくつかのマウスモノクローナル抗体はヒトの多数の疾病症状において治療剤としての見込みを示すが、ヒト抗マウス抗体(HAMA)反応が著しく誘導するため失敗したケースもある[Schroff，R.W. et al(1985) Cancer Res.45：879−885；Shawler, D.L. et al(1985)J.Immunol.135：1530−1535]。モノクローナル抗体については、HAMA反応を低減させようと多数の技術が開発されている[WO 89／09622；EP 0239400；EP 0438310；WO 91／06667]。これらの組換えＤＮＡ手法は、一般に最終的な抗体コンストラクトにおいてマウス遺伝子情報を低減させる一方、最終コンストラクト中のヒト遺伝子情報を増加させるものである。それにもかかわらず、得られた「ヒト化」抗体は、依然として患者に免疫反応を誘発する場合があった[Issacs J.D.(1990) Sem.Immunol.2：449,456；Rebello, P.R. et al (1999) Transplantation 68：1417−1420]。
【０００３】
抗体は、治療剤として投与した際にそれに対して免疫反応が発動し得る唯一の種類のポリペプチド分子ではない。ヒトに由来する、しかも人体内に存在するのと同じアミノ酸配列を有するタンパク質でさえ、人体内で免疫反応を引き起こすことがある。顕著な例としては、とりわけ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子[Wadhwa,M. et al(1999) Clin.Cancer Res.5：1353−1361]やインターフェロンアルファ２[Russo,D. et al(1996) Bri.J.Haem. 94：300−305；Stein,R. et al(1988) New Engl.Med. 318：1409−1413]の治療上の使用が挙げられる。これらのヒトタンパク質が免疫原性であるような状況では、さもなければこのような対象でこれらのタンパク質に対して作用していたであろう免疫寛容の破壊が推定される。
【０００４】
この状況は、そのヒトタンパク質が代償療法として投与されている場合は異なり、その例として、例えば血友病Ａ、クリスマス病、ゴーシェ病とその他多数がその例となる生まれつきタンパク質が欠損した遺伝病がある。そのような場合、治療用置換タンパク質は最初から外来分子として免疫学的に作用する可能性があり、また治療薬に対して免疫応答を開始することができる個人では、その治療の効果はかなり低下するかもしれない。
【０００５】
タンパク質治療薬が宿主免疫系によって外来分子として見られるか否か、またはその分子に対する既存の耐性が打破されるか否かに関係なく、そのタンパク質に対する免疫反応性の機構は同じである。免疫反応誘導の鍵は、ＭＨＣクラスII分子上での提示を介してＴ細胞活性を刺激し得るペプチド、いわゆる「Ｔ細胞エピトープ」がタンパク質内に存在することである。このようなＴ細胞エピトープは、ＭＨＣクラスII分子に結合する能力を備えた任意のアミノ酸残基配列として一般に定義される。暗黙にではあるが、「Ｔ細胞エピトープ」は、ＭＨＣ分子に結合する際、Ｔ細胞レセプター(ＴＣＲ)によって認識され、少なくとも原理的には、ＴＣＲと結びつきＴ細胞応答を促進することによって、これらＴ細胞の活性化を引き起こし得るエピトープを意味する。
【０００６】
ＭＨＣクラスII分子は、ヘルパーＴ細胞の選択および活性化に中心的な役割を果たす高度に多型的なタンパク質のグループである。ヒトの白血球抗原グループＤＲ(ＨＬＡ−ＤＲ)はこのグループタンパク質で優性なアイソタイプである。しかしながら、アイソタイプＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ−ＤＰも同様の機能を果たす。ヒト集団では、個人は２〜４個のＤＲ対立遺伝子、２個のＤＱおよび２個のＤＰ対立遺伝子を有する。ＤＲアイソタイプのおよそ70種類の異なるアロタイプがあり、ＤＱについては30種類の異なるアロタイプが、また、ＤＰについては47種類の異なるアロタイプが存在する。多数のＤＲ分子の構造が解明されており、それらの構造は、ペプチドの疎水性残基(ポケット残基)と結合する多数の疎水性ポケットを有する開放端のペプチド結合溝を指している[Brown et al Nature(1993)364：33；Stern et al(1994)Nature 368：215]。ＭＨＣ ＤＲ分子は、アルファ鎖およびベータ鎖で形成され、それらのＣ末端は細胞膜を通して挿入される。各ヘテロダイマーは、９〜20個の範囲のアミノ酸長のペプチドに結合するリガンド結合領域を有するが、結合溝に収容できるのは最高11個のアミノ酸である。ＤＱ分子は、相同的な(homologous)構造を有することが最近示されており、ＤＰ族タンパク質も非常に類似していると予想される。クラスII分子の様々なアロタイプを識別する多型は、ペプチド結合溝内の様々な異なるペプチド結合表面に寄与し、集団レベルで外来タンパク質を認識し病原性有機体への免疫反応を引き起こす能力に関する最大の柔軟性を保証する。
【０００７】
治療のタンパク質に対する免疫反応は、ＭＨＣクラスIIペプチド提示経路経由で進行する。ここに外来タンパク質は、ＤＲ、ＤＱまたはＤＰタイプのＭＨＣクラスII分子と連携した提示のために飲み込まれ処理される。ＭＨＣクラスII分子は、とりわけマクロファージおよび樹状細胞などの専門的な抗原提示細胞(ＡＰＣ)によって発現される。Ｔ細胞表面上の同族のＴ細胞レセプターによるＭＨＣクラスIIペプチド複合体の結合は、ＣＤ４分子などの他のある種のコレセプターの相互結合を伴って、Ｔ細胞内での活性化状態を引き起こすことができる。活性化は、サイトカインの放出をもたらし、Ｂ細胞などの他のリンパ細胞をさらに活性化して抗体を産生するか、完全な細胞性免疫反応としてＴキラー細胞を活性化する。
【０００８】
Ｔ細胞エピトープ識別はエピトープ除去に向けての最初のステップである。しかしながら、当技術分野ではエピトープ認識とエピトープ除去が単一のスキームに統合されている明らかな例はほとんどない。そこでWO98／52976とWO00／34317は、ポリペプチド配列がヒトのＭＨＣクラスII ＤＲアロタイプのサブセットに結合する可能性を識別するための計算によるスレッディング(computational threading)手法を教示する。これらの教示では、予想されたＴ細胞エピトープは、関心のあるたんぱく質内での慎重なアミノ酸置換によって除去される。しかしエピトープ認識のためのこのスキームと他のコンピュータによる手法[例えば、Godkin,A.J. et al.(1998)J.Immunol.161：850−858；Stumiolo,T. et al.(1999) Nat.Biotechnol. 17：555−561]では、ＭＨＣクラスII分子を結合できると予測されるペプチドは、プロセシング経路または他の現象の影響のために全ての状況、特にin vivoでＴ細胞エピトープとして機能するとは限らない。それに加えて、Ｔ細胞エピトープ予測のためのコンピュータ研究法では、ＤＰまたはＤＱ拘束エピトープを予測することは一般にできなかったが、一般的にこれらの系の間に認識の重なりがある。
【０００９】
コンピュータ手法の他に、合成ペプチドのＭＨＣクラスII分子を結合する能力を測定するin vitroの方法がある。典型的な方法では、ＭＨＣクラスII結合面の供与源として既定のＭＨＣアロタイプのＢ細胞系を使用するが、ＭＨＣクラスIIリガンド識別に応用できるかもしれない[Marshall,K.W. et al.(1994)J.Immunol.152：4946−4956； O'Sullivan et al.(1990) J.Immunol. 145：1799−1808； Robadey,C. et al. (1997) J.Immunol.159：3238−3246]。しかし、そのような手法は多様なＭＨＣアロタイプに対して潜在的な複数のエピトープのスクリーニングには適当ではなく、またそれらを用いて結合ペプチドのＴ細胞エピトープとして機能する能力を確認することもできない。
【００１０】
最近、合成ペプチドと組み合わせた、組み換えＭＨＣ分子の可溶複合体を探索する手法が用いられるようになった[Kern,F. et al.(1998) Nature Medicine 4：975−978；Kwok,W.W. et al. (2001)TRENDS in Immunol. 22：583−588］。これらの試薬と方法は、ヒトまたは実験動物の末梢血液サンプルから特定のＭＨＣ−ペプチド複合体を結合できるＴ細胞クローンの存在を確認するために使用される。これらの方法は、また、多様なＭＨＣアロタイプに対して潜在的な複数のエピトープをスクリーニングするために適応させることは容易ではない。
【００１１】
Ｔ細胞活性化のバイオアッセイは、試験ペプチドまたは総タンパク配列の免疫応答を呼び起こす能力の解釈を提供するための実用的なオプションを提供する。この種の研究法の例としてはPetra他の研究があり、その研究では細菌タンパク質スタフィロキナーゼに対してＴ細胞増殖アッセイを用い、その後合成ペプチドを用いてＴ細胞系を刺激してエピトープマッピングを行った[Petra,A.M. et al.(2002) J.Immunol. 168：155−161]。同様に、テタヌストキシンタンパク質の合成ペプチドを使用したＴ細胞増殖アッセイにより、トキシンの免疫主体領域が確定された[Reece,J.C. et al.(1993)J.Immunol.151：6175−6184]。WO99／53038は、ある試験タンパク質中のＴ細胞エピトープの測定が可能となるかもしれない研究法が開示されており、そこでは単離されたヒトの免疫細胞のサブセットが使用され、関心の合成ペプチド存在下でその細胞のin vitroにおける分化と培養、ならびに培養Ｔ細胞中で誘発された如何なる増殖の測定を促進している。同じ手法がStickler他[Stickler,M.M. et al.(2000) J.Immunotherapy 23：654−660]でも記載され、そこでは、両方の例でその方法が細菌のサブチリシン内のＴ細胞エピトープの検出に応用されている。そのような手法は、所望の免疫細胞サブセット(樹状細胞ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞)を得るためには、細胞単離手法と複数のサイトカイン補助剤を用いた細胞培養の慎重な適用が要求されるので、複数のドナーサンプルを使った迅速スループット・スクリーニングの助けにはならない。
【００１２】
前記したように、またその結果として、Ｔ細胞エピトープを識別し、所定の主要な治療上価値があるが元々免疫原性のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質からＴ細胞エピトープを除去するか若しくは最低でも減らすことが望ましいであろう。これらの治療上価値ある分子の１つは、FVIIIである。本発明は、１つまたは複数のＴ細胞エピトープが取り除かれた、修飾された型のヒトFVIIIを提供する。
【００１３】
FVIIIは、血液凝固の内在性経路内の凝固因子である。FVIIIは、カルシウムイオンとリン脂質の存在下でX因子を活性形態のXaに変えるIXa因子のコファクターである。FVIIIの分子遺伝学は、FVIIIのX関連遺伝子の欠損が血友病Ａを引き起こすことから、かなり研究されている。FVIII遺伝子は、大きな糖タンパク質FVIIIアイソフォームＡとより小さなアイソフォームＢを産生する二者択一的にスプライシングされる２つの転写産物をエンコードする。元の状態では、アイソフォームＡ前駆体に由来する複数の分解またはプロセシングされた形態は識別され、特定の機能上の活性は特定のフラグメントによるものとされた。FVIII分子は６つの構造ドメインに分けられ、これらは３重のＡドメイン(Ａ１、Ａ２、Ａ３)、炭水化物が豊富で必須でない中央のドメイン(Ｂ−ドメイン)と２重のＣドメイン(Ｃ１、Ｃ２)である。トロンビンとXa因子のFVIIIタンパク分解性切断部位は、372残基、740残基および1689残基の後である。活性プロテインＣと連携したXaによる切断は、336残基の後で起こる。
【００１４】
FVIIIタンパク質は、血友病Ａに侵された患者に由来する血漿中の凝固欠損を矯正できる因子として、機能上定義できるかもしれない。血友病Ａの処置のために、FVIIIはヒトまたは豚の血漿から、また最近は組換えＤＮＡ技術によって純粋な形態で生産されている。ヒトFVIII遺伝子は、1984年に少なくとも２つの独立した研究グループによって単離され、また哺乳類の細胞で発現された[Toole,J.J., et al.(1984) Nature 312 342−347]；Gitschier,J., et al.(1984),Nature 312：326−330； Wood,W.I. et al., (1984),Nature 312 330−337； Vehar,G.A., et al.(1984),Nature 312：337−342；WO87／04187；WO88／08035；WO88／03558；米国特許4,757,006］。そのアミノ酸配列は相補ＤＮＡから導かれ、またFVIIIの治療量の組み換えによる生産方法が開発され、例えば米国特許4,965,199は哺乳類の宿主細胞でFVIIIを生成する方法とヒトFVIIIの精製方法を開示している。ＣＨＯ(チャイニーズハムスター卵巣)細胞及びＢＨＫＣ(ベビーハムスター腎細胞)におけるヒトFVIIIの発現が報告され、また最近ではFVIIIが修飾されてＢドメインの一部または全てが欠失し[米国特許No.4,868,112]、またそのような分子は治験で効果を示した[Lusher,J.M. et al.(2003) Haemophilia 9：38−49]。この分子の使用は実際に認可されている−Refactoは、Genetics InstituteとPharmacia Upjohnとの共同によりＣＨＯ細胞で作られている。
【００１５】
治療量のFVIIIが入手可能であるにもかかわらず、性質の向上したFVIII類似体の必要性がまだある。所望される進歩には該タンパク質の形質発現と精製のための代替のスキームとモダリティーが含まれるが、その他にも、特に該タンパク質の生物学的性質の向上が含まれる。治療薬として投与される場合のin vivoでの特性の向上が特に必要である。この点については、ヒトを対象にした場合の免疫応答を誘発する能力が低下したまたは欠落したFVIIIが非常に望まれる。そのようなタンパク質はヒトの患者内での循環時間が長くなることを期し、そのことから血友病Ａの場合など、また特に血友病患者が外因性リコンビナント第VIII因子に敏感でさもなければ処置の効果を制限する抗VIII因子抗体を産生するかもしれない場合などがそうであるように、慢性や再発性の疾患状況で特に有用である。
【００１６】
その他に、FVIII分子、特に組み換えにより修飾したFVIIIが開示されている[米国特許4,757,006；米国特許5,633,150；米国特許5,668,108]が、これらの教示のどれも該タンパク質の免疫原性特性に対するＴ細胞エピトープの重要性を認識していないし、本発明のスキームに従って特有の制御された方式で直接これらの特性に影響するとも考えられなかった。
【００１７】
他にもあるが当技術分野におけるFVIIIの修飾の例としては米国特許5,948,407があり、そこでは治療用タンパク質抗原に対してサプレッサーＴ細胞レパートリーを呼び起こすために該タンパク質の粘膜(例えば経口)投与を可能にする製剤を生産するスキームが開示されている。
【００１８】
他は、血友病患者でin vivo半減期を改善する目的でFVIIIの修飾を試みており、例えば米国特許6,037,452はポリ(酸化アルキレン)VIII因子抱合体を開示している。
【００１９】
血友病Ａの治療において特に困ることは、投与されたFVIII製剤に対する阻害抗体が特定の患者で誘発されることである。血友病患者におけるFVIIIに対する免疫応答を克服するための戦略がいくつか提案されている。寛容誘導治療はそのような取り組み方法の１つであるが、血友病患者の生涯の非常に早い時期から投与するために、現在、非常に高用量(高価)のFVIII製剤を必要とする。この方法で寛容性を達成できるのはある割合のケースのみである[Colowick,A.B. et al.(2000)Blood 96：1698−1702]。過去に治療されていない患者で実施された２つの異なるリコンビナント産物の治験では、約20％のケースで阻害が発生したことを報告している[Lusher,J.M. et al.(1993) N.Engl.J.Med 328：453−459；Bray,G.L. et al.(1994)Blood 83： 2428−2435]。FVIII阻害物質は、血漿中のFVIII活性を中和する免疫グロブリン抗体である。この阻害物質は同種異系抗体として、FVIII濃縮物またはリコンビナントFVIIIで治療される重症の血友病Ａ患者の約25％、また軽症から中等度の患者の５〜15％で見られる。
【００２０】
阻害物質の見られる患者には、IX因子複合体または「プロトロンビン複合体」による処置も行われる。一般に、これらは、例えばII因子、VII因子、IX因子およびＸ因子を含む複数の異なる因子を混合した製剤である。欧州特許0044343−B1は、活性成分(FVIIa)を特徴とするそのようなプロトロンビン複合体を提供している。同様に、米国特許6,358,534は低い割合のFVIIIタンパク質と比較的高い割合の他の凝固タンパク質因子および担体タンパク質を含んでいる免疫寛容プロトロンビン複合体を記載している。
【００２１】
米国特許5,543,145は、例えばFVIIIと混合したＦ(ａｂ')2の形でポリクローナルまたはモノクローナル抗体を含んでいる、FVIII阻害物質生産を抑制する組成物を提供している。米国特許4,769,336は、FVIIIの抗体阻害物質を結合することによって阻止するFVIII断片を提供している。
【００２２】
他の戦略としては、ヒトFVIIIの代わりにブタのFVIII因子を使用するものを含むが、ブタのFVIII因子はそれ自体免疫原性なのでこのような処置は一時的な措置である。
【００２３】
利用できる他のオプションとしては、免疫抑制剤による処置および／または体外の処置による循環からの阻害物質の除去があるが、明らかに、そのような方法は検討中の問題にとっては極端で危険な解決法である。遺伝子操作手法は、治療用のFVIII分子の修飾、更に生産のための広い研究領域を提供した。医薬組成物、および血友病Ａの治療が米国特許4,965,199、米国特許5,618,788、米国特許5,668,108、ならびに諸外国の相当物の教示によって提供されているが、これらは当技術分野で利用できるこの課題に関する膨大な量の研究を代表するものと考えてよい。
【００２４】
組み換え手法を使って行われたFVIIIの修飾の更なる典型的な型が米国特許5,859,204；米国特許6,376,463；米国特許6,485,563および米国特許6,180,371で提供されているが、これらは共通してFVIIIタンパク質とそのコード化遺伝子を提供しており、この遺伝子内の部位特異的置換の結果、阻害抗体に対する反応性が低下している。これら特定の教示では、置換はFVIII Ａドメインのアミノ酸残基484〜509に限定されている。このような修飾は、特定の配座のエピトープが患者血清中の特定の交差反応性抗体によってもはや認識されないようにFVIII分子表面の形態を変化させる一方、Ｂ細胞抗体産生の促進に必要とされる根本的なＴ細胞エピトープには対処していない。
【００２５】
その他、組換えＤＮＡ手段を使用し、部位特異的アミノ酸置換[WO87／07144]または関連分子間のドメインスワッピングを用いて修飾したFVIII分子が提供されている。後者の方法の例が、WO90／05530によって提供され、そこではFVIII Ｂ−ドメインの代わりにヒトＶ因子のＢ−ドメインを含有しているFVIII分子が提供されている。
【００２６】
その他、ヒトとブタ(または他の生物種)に由来する配列ドメインを含むように遺伝子操作された組み換えFVIII分子を含むキメラFVIII製剤が提供されている。そのようなハイブリッド分子が米国特許5,744,446；米国特許5,663,060；米国特許5,583,209；米国特許5,364,771；米国特許5,888,974、その他に記載されている。
【００２７】
米国特許5,171,844は、活性を強化された、および／または免疫原性が低下したかもしれない遺伝子操作されたFVIII分子を提供している。後者の特性は、欠失による分子切片の脱落に関するものであった。米国特許4,868,112および外国の相当物に記載された初期の研究は、Ｂ−ドメインが欠落しているFVIIIの機能性欠失突然変異体を提供している。
【００２８】
FVIIIタンパク質に対するその他の遺伝子操作による修飾は、タンパク質の生産プロセスの改善に向けられ、個々の例は米国特許6,271,025によって提供されている。この例は、当技術分野で利用でき既知である、更に類似した大量の研究を代表するものとして提供されている。
【００２９】
（発明の概要および説明）
本発明は、本明細書で「FVIII」と呼ぶヒトVIII因子の修飾形（潜在的なＴ細胞エピトープの数の低減または除去によって免疫の特性は修正されているもの）を提供する。
【００３０】
本発明は、ＭＨＣクラスII結合能力により潜在的なＴ細胞エピトープであるFVIII 一次配列内に識別された配列を開示する。この開示は、具体的には完全なヒトFVIIIタンパク質である2332個のアミノ酸残基のアイソフォームＡ、およびＢ−ドメインがタンパク質から欠落している短いアイソフォームに等しく関係する。
【００３１】
本発明は、また、分子の一次配列内の特定の部位を開示しているが、その部位は本発明に従うと特異的なアミノ酸の置換、添加または欠失によって変更されるがタンパク質の生物学的活性を最大限保持する。免疫原性の損失が生物学的活性も同時に失う時だけであるケースでは、タンパク質のアミノ酸配列内の更なる改変によって活性を回復させることができる。
【００３２】
本発明は、更にそのような修飾された分子の生産方法と、とりわけ免疫原性部位を減らすか除去するために変更を必要とするＴ細胞エピトープを識別する方法を開示する。
【００３３】
本発明は、in vivoで向上した性質を示すと期待される、修飾された形のFVIIIタンパク質を提供する。本発明は、FVIII一次配列のヒトに対して免疫原性を示す主要な領域を開示し、その配列を修飾してこれらの部位の免疫原性効果を除くか減らす。一実施形態では、この免疫原性の領域を含んでいる合成ペプチドを医薬組成物として提供し、分子全体に対する免疫寛容原性応答を促進する目的で使用することができる。
【００３４】
他の実施形態においては、本発明の修飾されたFVIII分子は医薬組成物で使うことができる。
【００３５】
要約すると、本発明は以下の問題に関するものである。
【００３６】
・in vivoで使用された場合、FVIIIの生物学的活性を有し、また実質的に非免疫原性であるかまたは同じ生物学的活性を有するどのような非修飾分子よりも免疫原性が低い修飾された分子
・しかるべく特定された分子であり、前記免疫原性の喪失が、元の非修飾分子に由来するＴ細胞エピトープを１つまたは複数取り除くことによって達成される分子
・しかるべく特定された分子であり、前記免疫原性の喪失が、前記分子に由来するペプチドを結合できるＭＨＣアロタイプの数を減らすことによって達成される分子
・しかるべく特定された分子であり、１個のＴ細胞エピトープが取り除かれている分子
・しかるべく特定された分子であり、前記元々存在しているＴ細胞エピトープが、クラスIIへの提示を通してＴ細胞を刺激するか結合する能力を示すＭＨＣクラスIIリガンドまたはペプチド配列である分子
・しかるべく特定された分子であり、前記ペプチド配列が下記ａからｋのペプチド群から選択される分子
【００３７】
【表１】
2005538694.tif 000002
【００３８】
・しかるべく特定された分子であり、前記ペプチド配列が表１および／または表２で表されたペプチド群から選択される分子
・しかるべく特定された分子であり、前記ペプチド配列が図１で表されたペプチド群から選択される分子
・しかるべく特定された分子であり、元々存在していた如何なるＴ細胞エピトープ中の１〜９個のアミノ酸残基、好ましくは１個のアミノ酸残基が変更されている分子
・しかるべく特定された分子であり、そのアミノ酸残基の変更は、特定の部位における他のアミノ酸残基による元々存在していたアミノ酸残基の置換、添加、または欠失である分子
・しかるべく特定された分子であり、必要に応じて、前記分子の生物学的活性を回復するために、通常、特定のアミノ酸による置換、添加、または欠失による更なる追加の変更を行う分子。
【００３９】
・前記ａからｋのペプチド配列のいずれかと９０％を超えるアミノ酸同一性を共有している前記ペプチド分子
・前記ａからｋのペプチド配列のいずれかと８０％を超えるアミノ酸同一性を共有している前記ペプチド分子
・前記表１または図１のペプチド配列のいずれかと９０％を超えるアミノ酸同一性を共有している前記ペプチド分子
・前記表１または図１のペプチド配列のいずれかと８０％を超えるアミノ酸同一性を共有している前記ペプチド分子
・ＭＨＣクラスIIと結合できる前記ペプチド配列
・しかるべく特定されたFVIII分子であり、前記アミノ酸置換の１つまたは複数が前記ａからｋのいずれかのペプチド内で規定されたアミノ酸のいずれかと対応する位置で行われる分子。
【００４０】
・しかるべく特定されたFVIII分子であり、前記アミノ酸置換の１つまたは複数が表１または図１で規定されたアミノ酸のいずれかと対応する位置で行われる分子
・ＭＨＣクラスIIと結合する活性を有する前記ペプチドまたは修飾されたペプチドのいずれかをも含む医薬組成物
・前記および下記で定義されている、前記特定された修飾された分子のいずれかをコード化するＤＮＡの塩基配列または分子
・FVIIIの生物学的活性を有する修飾された分子を含む医薬組成物
・前記および／または請求項で定義された医薬組成物で、任意に薬剤として許容される担体、希釈液または賦形剤を含む医薬組成物
・以下のステップを含む、上に引用した特許請求の範囲の請求項のいずれかに定義されるFVIIIの生物活性を有する修飾された分子の製造方法：（i）ポリペプチドまたはその一部のアミノ酸配列を決定すること；(ii)インビトロ(in vitro)またはインシリコ(in silico)技術を用いるか生物学的アッセイを用いて、ペプチドのＭＨＣ分子への結合を測定することを含む任意の方法により、タンパク質のアミノ酸配列内の１つまたは複数の潜在的なＴ細胞エピトープを識別すること；（iii）インビトロまたはインシリコ技術を用いるか生物学的アッセイを用いて測定されたペプチドのＭＨＣ分子への結合により示されるＴ細胞エピトープの活性を実質的に低減するか除去するように、識別された潜在的なＴ細胞エピトープ内において１つまたは複数のアミノ酸が修飾(変更)された新規な配列変異体を設計すること；(iv)組換えＤＮＡ技術によってそのような配列変異体を構成し、所望の特性を備えた１つまたは複数の変異体を識別するために前記変異体を試験すること；および(v)場合によってはステップ(ii)〜(iv)を繰り返すこと。
【００４１】
・ステップ(iii)が本来存在するＴ細胞エピトープのうちのいずれかにおいて１〜９個のアミノ酸残基の置換、付加または欠失により行われる、これに応じた特定の方法
・潜在的なＭＨＣクラスII結合活性を有し、非修飾FVIIIから作成され、図１に記載された群から選択される13 merのＴ細胞エピトープペプチド、および、インビボで使用した時に、同一の生物活性を有する非修飾の分子よりも免疫原性が低いまたは実質的に非免疫原性であるFVIII製造のためのその使用
・上記13 merのＴ細胞エピトープペプチドのうち少なくとも９個の連続するアミノ酸残基からなるペプチド配列、および、インビボで使用した時に、非修飾の分子よりも免疫原性が低いまたは実質的に非免疫原性であり、ヒトVIII生物活性を有するFVIIIの製造のためのその使用
・潜在的なＭＨＣクラスII結合活性を有し、非修飾FVIIIから作成され、表１または図１に記載された群から選択される13merのＴ細胞エピトープペプチド、および、インビボで使用した時に、非修飾の分子よりも免疫原性が低いまたは実質的に非免疫原性であり、ヒトVIII生物活性を有するFVIIIの製造のためのその使用
・表１または図１の任意の配列に由来する13merのＴ細胞エピトープペプチドのうち少なくとも９個の連続するアミノ酸残基からなるペプチド配列、および、インビボで使用した時に、非修飾の分子よりも免疫原性が低いまたは実質的に非免疫原性であり、ヒトVIII生物活性を有するFVIIIの製造のためのその使用。
【００４２】
「Ｔ細胞エピトープ」という用語は、本発明についての理解によれば、ＭＣＨ IIを結合可能で、Ｔ細胞を刺激するおよび／または(必ずしも測定可能な程度に活性化せずに)Ｔ細胞を複合体中でＭＨＣ IIに結合可能であるアミノ酸配列を意味する。
【００４３】
本明細書および添付する特許請求の範囲において「ペプチド」という用語は、２個以上のアミノ酸を含む化合物である。アミノ酸はペプチド結合(以下に定義される)によって互いに連結される。ペプチドの生物学的生産に関わる20個の異なる天然アミノ酸が存在し、これらが任意の数、任意の順序で連結して、ペプチド鎖または環を形成する。ペプチドの生物学的生産で使用される天然アミノ酸はすべてＬ−配置である。合成ペプチドは、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸またはこれら２種の異なる配置のアミノ酸の様々な組合せを使用して従来の合成方法を用いて調製できる。ペプチドによっては数単位のアミノ酸しか含まないものもある。短いペプチド、例えばアミノ酸単位が10個未満のものは、時に「オリゴペプチド」と呼ばれる。他のペプチドは多数のアミノ酸残基、例えば100個以上を含み「ポリペプチド」と呼ばれる。従来、「ポリペプチド」は３個以上のアミノ酸を含む任意のペプチド鎖と考えられ、「オリゴペプチド」は通常、特に「短い」タイプのポリペプチドと見なされる。したがって、本願では「ポリペプチド」へのどのような言及もオリゴペプチドを含むと理解される。さらに、「ペプチド」へのどのような言及もポリペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質を含む。アミノ酸の個々の異なる配置は異なるポリペプチドまたはタンパク質を形成する。形成することができるポリペプチドの数、したがって異なるタンパク質の数は、実際上無制限である。
【００４４】
「アルファ炭素(Ｃα)」はペプチド鎖中の炭素水素(ＣＨ)部分の炭素原子である。「側鎖」はＣαへの吊り下がり(ペンダント)基であり、ペプチドの寸法と比較して著しく変動幅の広い物理的な寸法を有する、単純もしくは複雑な基または部分を含むことができる。
【００４５】
本発明は、実質的にここに示されたものと同じ１次アミノ酸配列を有する任意のFVIII分子種に適用でき、従って、遺伝子工学的手段その他の方法によって誘導されたFVIII分子を含み、おおよそ2332個のアミノ酸残基を含まなくてもよい。
【００４６】
特に好ましいFVIII分子種は、分子のＢ−ドメインが欠落しているが、残りの任意のドメインに１個以上のアミノ酸置換があり、その結果配列から１個以上のＴ細胞エピトープが除かれているFVIII分子である。アミノ酸残基1438個の治療用のＢ−ドメイン欠失FVIII分子が、Lusher他およびその文献に記載されている治験成功例の主題であった[Lusher,J.M. et al. (2003) Haemophilia 9：38−49]。そのようなタンパク質のアミノ酸配列が本明細書の図９で表されている。
【００４７】
他の哺乳類の供給源などから同定されたFVIIIタンパク質は、本開示のペプチド配列の多くを共有しており、また開示されたリストのものと実質上同じ配列のペプチド配列を多く共有している。従って、そのようなタンパク質配列も等しく本発明の適用範囲に入る。
【００４８】
本発明は、自家組織の生物に導入された可溶タンパク質は免疫応答を引き起こし、宿主の抗体が発達してその可溶タンパク質と結合するという実際的な現実を克服すると考えられる。多くの血友病Ａ患者にとって、FVIIIの既存の治療製剤に対する抗体応答は、疾患管理上の重大な問題である。どんな個体でも、少数のＴ細胞エピトープでヘルパーＴ細胞シグナリングが刺激され、元のFVIIIタンパク質の、Ｂ細胞認識面に曝された非常に多くの抗原決定基に対する抗体反応が持続する。血友病Ａ患者の阻害抗体をエンコードしている遺伝子の解析から、そのような抗体の多くは親和性成熟を経ることが分かった[Jacquemin，M.G. et al.(1998)Blood 92：496−506； van den Brink,E.N et al.(2000)Blood 95：558−563]。親和性成熟の基礎をなしている超変異現象は、Ｂ細胞がＴ細胞の助けに応答するときにだけ起こる。FVIII阻害抗体の多くがＩｇＧ４サブクラスであり[Andersen,B.R. ＆Terry,W.D. (1968) Nature 217：174−175]、必要なクラススイッチ反応は同様にヘルパーＴ細胞依存性の事象であることも長く理解されてきた。FVIIIへの抗体反応がＴ細胞によって引き起こされることの更なる証拠は、FVIII阻害物質を有するHIV陽性の患者において、Ｔ細胞数が減るに従ってFVIII抗体反応が失われるという観察からももたらされる[Bray,G.L. et al.(1993)Am.J.Hematol.42：375−379]。従って、本発明はこれに対処するにあたって、ヒト宿主に投与すると免疫応答を引き出す性質を変えたFVIIIタンパク質の提供を目指す。理解されているところでは、複数のＢ細胞エピトープが修飾されたFVIIIの表面上にそのままの状態で残る場合、連続したＴ細胞の支援がないと阻害物質の力価が最後には低下し、またそのような治療を初めて受ける患者では最初から確立されない。本明細書で記載されている方法に従い、発明者らはこのタンパク質に対して免疫応答を引き起こす重要なＴ細胞エピトープを含むFVIII分子の領域を発見した。
【００４９】
修飾されたFVIIIをもたらす本発明の一般的な方法は、次のステップを含む：
(a)ポリペプチドまたはその一部のアミノ酸配列を決定すること；
(b)インビトロまたはインシリコ技術を用いるか生物学的アッセイを用いてペプチドのＭＨＣ分子への結合を測定することを含む任意の方法によりタンパク質のアミノ酸配列内の１つまたは複数の潜在的なＴ細胞エピトープを識別すること；
(c)インビトロまたはインシリコ技術を用いるか生物学的アッセイを用いてペプチドのＭＨＣ分子への結合を測定したＴ細胞エピトープ活性を実質的に低減するか除去するように、識別された潜在的なＴ細胞エピトープ内の１つまたは複数のアミノ酸を用いて新規な配列変異体を設計する。このような配列変異体は、そのような新しい潜在的なＴ細胞エピトープが、設計毎に、Ｔ細胞エピトープの活性を実質的に低減するか除去するように修飾されないのであれば、配列変化によって新しい潜在的なＴ細胞エピトープの生成を回避する方法で作成される。そして、
(d)組換えＤＮＡ技術によってそのような配列変異体を構築し、所望の特性を備えた１つまたは複数の変異体を識別するために前記変異体をよく知られた組換えＤＮＡ技術によって試験する。
【００５０】
ステップ(b)による潜在的なＴ細胞エピトープの識別は従来法によって実行することができる。適当な方法が、WO98／59244；WO98／52976；WO00／34317；WO02／069232で開示されており、FVIIIから誘導されるペプチドのＭＨＣクラスII分子への結合性向を識別するために使用できる。実際には、本発明で具現化された組成物は、生物学的ex vivoヒトＴ細胞増殖アッセイと、WO02／069232に概説されているスキームを利用したソフトウェア、また本発明の実施形態でもあるソフトウェアの調整適用で導かれた。
【００５１】
このソフトウェアは、ペプチドＭＨＣクラスII相互結合作用レベルの抗原提示プロセスをシミュレーションし、与えられたどのペプチド配列に対してでも結合スコアを提供する。このようなスコアは、個体群に優先して実在する多くのＭＨＣクラスIIアロタイプで決定されている。このスキームはどんなペプチド配列でも試験できるので、ＭＨＣクラスII結合溝と相互作用するペプチドの能力に関して、アミノ酸の置換、添加または欠失の結果は予測できる。従って、ＭＨＣクラスIIと相互作用し、その結果免疫原性Ｔ細胞エピトープとして機能するペプチド数が減らされた、新しい配列組成物の設計が可能となる。与えられたどのようなドナーサンプルを用いるバイオアッセイでも最高４個のＤＲアロタイプとの結合を評価できる場合、in silico法では同時に40個を超えるアロタイプを使用して同じペプチド配列を試験できる。実際には、この方法により複数のＭＨＣアロタイプと相互作用する能力が低下している新しい配列変異体のデザインを導くことができる。
【００５２】
このin silico法の例として、ヒトFVIII配列全体の解析結果が図１で提供されている。図には、FVIIIに由来する、かなりの結合スコアを有し、１個以上のＭＨＣクラスIIアロタイプと結合する能力が検出された13量体のペプチド配列が記載されている。全体ではこの13量体ペプチドのデータセットは、高い確実性でヒトFVIIIタンパク質に対して許容されるＭＨＣクラスリガンドの多数を提供していると考えられる。完全なFVIIIポリペプチドのタンパク分解性プロセシングの必要性、およびin vivoでFVIIIペプチドの提示に至る他の生理学的段階の必要性などの理由のために、ペプチドレパートリー全体の比較的マイナーなサブセットが最終的な生物学的関連性を有することが明らかになろう。更にそのような生物学的関連性を有するペプチドを同定するために、発明者らはex vivoヒトＴ細胞増殖アッセイを利用した方法を開発した。
【００５３】
この手法は特に効果的方法であることが分かり、本明細書で発明の一実施形態として開示されている。この方法は、配列の試験部位、例えばＢ−ドメインの全部または一部が脱落しているFVIIIタンパク質などに適用できる。この方法は配列の選択された領域、例えば図１にリストされた全て若しくはその一部などFVIIIペプチドのサブセットなどに適用でき、またはこの方法はFVIII配列全体を試験するために適用してもよい。本研究において、この方法にはＢ−ドメインが脱落したFVIII配列を走査し試験するスキームにおいてFVIII由来の重複するペプチド配列の試験が含まれた。合成ペプチドは、in vitro培養のヒトＴ細胞で増殖反応を呼び起こす能力が試験される。この種の方法が健常ドナーのナイーブなヒトＴ細胞を使用して行われる場合は、そのようなアッセイにおいては2.0以上の刺激指数が誘導増殖の有用な目安であることを発明者らは確認した。この刺激指数は、従来、試験ペプチドで測定された増殖スコア(例えば、3Ｈ−チミジンの取り込みを用いると、放射能の分あたりカウント数)を試験ペプチドと接触しない細胞で測定されたスコアで割って導かれた。
【００５４】
この方法の他の実施形態では、そのＴ細胞が血友病患者に由来するex vivo生物学的Ｔ細胞アッセイを使用してＴ細胞エピトープの存在と位置を調べるためにFVIII配列を走査する方法を発明者らは提供する。一部のそのような患者では、FVIIIタンパク質はin vivoで外来タンパク質および強力な抗原となる。そのような個体のＰＢＭＣからin vitroでポリクローナル、および原則としてモノクローナルなＴ細胞系を導くことが可能であること、また、これらの細胞系がFVIIIタンパク質内でのＴ細胞エピトープのマッピングにおいて効果的試薬として使用できることを発明者らは確認した。
【００５５】
このことは、血友病患者のPBMC Ｔ細胞をin vitroで数回抗原(FVIII)で刺激し、その後直ちにＩＬ−２存在下で増殖させることで達成できる。ポリクローナルＴ細胞系を確立するためには、多数の抗原特異的細胞を生み出すのに２〜３回の抗原による刺激で十分であり、またそのような細胞は必要に応じて後に使用できるように低温貯蔵が可能である。このような細胞は、多数の合成ペプチドの篩い分けに使用された。
【００５６】
この場合は、合成ペプチドは各々８つの異なるペプチド配列を含有するプールの系を使って分析された。このペプチドプールのスキームを図２で例示する。７日間のFVIIIとＰＢＭＣとの共培養を含む初回抗原(FVIII)刺激の後、その抗原による再チャレンジを抗原提示細胞として自家照射ＰＢＭＣの存在下で行った。これらの抗原選択は３〜４日間実施され、３日ごと合計約９日間加えられるＩＬ−２による刺激を含む増殖相が割り込む。最終的な再チャレンジは、「休息させた」Ｔ細胞、つまり約４日間ＩＬ−２で刺激されなかったＴ細胞を使用して行う。これらの細胞は、前と同様、最も好ましくは自己由来の抗原提示細胞を使用して約４日間抗原(例えば、合成ペプチドまたは全タンパク)で刺激し、その後、以降の増殖反応(もしあれば)を測定する。ペプチドプールは、各々のプールがそれに続くプールと重なり合うペプチドを含有するように組まれる。このように、どんな個々のＴ細胞エピトープでも２つの分離したプールで見受けられるので、誘導された増殖はそれらのプールの両方を使った処置から検出される。増殖反応が与えられたどのペプチドプールにでも検出される場合は、そのペプチドプールは、分離された個々のプール構成メンバーを使ったアッセイを繰り返し行って解読される。
【００５７】
本発明のスキームの下で、いわゆる「阻害物質患者」のクラスからのＰＢＭＣサンプルを利用することが特に望まれているが、その訳は、これらの個体からのＴ細胞レパートリーによって定義されるFVIIIタンパク質のエピトープ地図が、in vivoという状況下で提示が可能な最も一般的なペプチドエピトープを代表すると予想できるからである。この意味で、過去に免疫応答が証明された患者からのＰＢＭＣは、in vivoの初回抗原刺激段階の産物を構成し、また、与えられたどのような刺激ペプチドでもそれに対して非常に大きな増殖反応の可能性があることは実際的な有益性が期待される。このことにより、増殖を測定する上での技術的な難題が削減される。
【００５８】
本研究では、約38個の、顕著な増殖反応(つまり、ＳＩ＞2.0)を呼び起こすことのできるペプチド配列が発見された。これらのペプチドは表１に提示され、また本発明の一実施形態である。ペプチドの本セット内で、２つ以上の個々のドナーサンプルで顕著な増殖反応を呼び起こすペプチドのサブセットが更に確認され、これらの反応のいくつかでは反応の程度は実際ＳＩ＝2.0よりもかなり高かった。これらのペプチドは表２に提示され、また本発明の他の一実施形態である。
【００５９】
【表２】
2005538694.tif 000003
【００６０】
【表３】
2005538694.tif 000004
【００６１】
【表４】
2005538694.tif 000005
【００６２】
本明細書で開示されたペプチド配列は、これらのエピトープの１つまたは複数が損傷した修飾されたFVIII分子の構築に必要な重要情報を表す。本発明のスキームの下では、エピトープは突然変異によって欠陥が生じ、もはやＴ細胞エピトープとして機能することができない配列となる。標的配列の誘導突然変異を達成するために組換えＤＮＡ方法を使用でき、そのような手法の多くは当技術分野で利用でき、既知である。
【００６３】
上記表１に表示されているペプチドの少なくとも１つまたは複数のアミノ酸配列を修飾することが本発明の目的である場合、表２に規定されているＰ１からＰ11のペプチドの１つまたは複数の配列を修飾することが最も好ましい。ＭＨＣクラスIIの１つまたは複数のアロタイプのリガンドであることにより、または特にＴ細胞がin vitro培養のヒトＴ細胞である場合そのＴ細胞の増殖を特に誘発することにより、対象のペプチド配列のＴ細胞エピトープとして機能する能力を低下させるか取り除くという２重の目的を達成するための適当な修飾が本明細書で開示されている。
【００６４】
そのような１組の好ましい修飾の例が、配列ＩＳＱＦＩＩＭＹＳＬＤＧＫＫＷのペプチドＰ10に含まれているＴ細胞エピトープの破壊である。このエピトープはFVIIIのＣ１ドメインに位置し、血友病患者血液と健常非血友病患者個体の細胞から取り出されたex vivoＴ細胞の増殖を呼び起こすことができるエピトープの典型である。
【００６５】
このペプチド配列のＭＨＣクラスIIリガンド活性に関するin silico分析の結果に導かれて、部位特定突然変異を応用して残基F1207、I1208、I1209およびM1210の置換を行った。残基の番号振りは、Ｂ−ドメイン欠失成熟FVIII配列に従った(図９)。F1207残基の突然変異によりFVIII発現が喪失し、用いたアッセイでは活性は検出されなかった。対照的に、I1208A若しくはI1208T若しくはI1208Nおよび／またはI1209Cおよび／またはM1210KまたはM1210Nの置換を含む活性FVIII分子が形成された。従って、上記リストされた置換の１つまたは複数を有する活性FVIIIタンパク質が、本発明のスキームの下では好ましい組成である。特に好ましい置換は、I1208A、I1209C、M1210KまたはM1210Nであり、そのような置換されたFVIIIタンパク質は本発明の他の実施形態である。
【００６６】
同じように好ましい実施形態には、配列ＣＮＩＱＭＥＤＰＴＦＫＥＮＹＲを有するペプチドＰ８に含まれたＴ細胞エピトープ内で置換が起きているFVIII分子が含まれる。このエピトープはFVIIIタンパク質のＡ３ドメインに位置する。部位特定突然変異手法がこの配列に応用され、M1013KおよびI1011A、またはＣまたはＤまたはＥまたはＧまたはＨまたはＫまたはＰまたはＱまたはＲまたはＳまたはＴの置換は、in silicoにおけるコーテストアッセイ(coatest assay)および免疫学的なパラメータならびにin vitro免疫学的アッセイに関して機能上の活性が保持された分子を提供することが確立された。M1013KおよびI1011A又はＣまたはＤまたはＥまたはＧまたはＨまたはＫまたはＰまたはＱまたはＲまたはＳまたはＴの置換を含むFVIII分子は、従って本発明の他の実施形態である。
【００６７】
同じように好ましい実施形態には、配列ＭＳＳＳＰＨＶＬＲＮＲＡＱＳＧを有するペプチドＰ７に含まれたＴ細胞エピトープ内で置換が起きているFVIII分子が含まれる。このエピトープもFVIIIタンパク質のＡ３ドメインに位置する。V823位置の置換は特に望まれる修飾と考えられ、本発明の一実施形態である。部位特定突然変異手法がこの配列に応用され、V823AまたはＤまたはＥまたはＧまたはＨまたはＮまたはＰまたはＳまたはＴの置換は、in silicoにおけるコーテストアッセイおよび免疫学的パラメータならびにin vitro免疫学的アッセイに関して機能上の活性が保持された分子を提供することが確立された。V823AまたはＤまたはＥまたはＧまたはＨまたはＮまたはＰまたはＳまたはＴの置換を含むFVIII分子は、従って本発明の他の実施形態である。
【００６８】
血友病患者血液サンプルで活性を示したＴ細胞エピトープペプチド配列の他の例は、配列ＩＡＲＹＩＲＬＨＰＴＨＹＳＩＲＳＴＬＲＭを有するペプチドＰ11で提供される。このエピトープは、FVIIIタンパク質のＣ１ドメインに位置して、以前にFVIII阻害物質生産の重要な促進剤として同定されている[Lacquemin,M. et al.(2003)Blood 101：1351−1358]。Y1254、I1255、L1257、Y1262、I1264およびL1268位置の置換は特に望まれる修飾と考えられ、本発明の一実施形態である。
【００６９】
同様に好ましい他の実施形態は下記置換が含まれるFVIII分子を含む。ペプチドＰ９(ＳＴＬＦＬＶＹＳＮＫＣＱＴＰＬ)に含まれるエピトープのL1119、F1120、L1121、V1122およびY1123位置の置換とペプチドＰ６(ＶＡＹＷＹＩＬＳＩＧＡＱＴＤＦ)に含まれるエピトープのY636、Y638、I637、L638およびI639位置の置換、ペプチドＰ５(ＡＳＮＩＭＨＳＩＮＧＹＶＦＤＳ)に含まれるエピトープのI613およびI617位置の置換、ペプチドＰ４(ＹＫＷＴＶＴＶＲＤＧＰＴＫＳＤ)に含まれるエピトープのV515およびV517位置の置換、ペプチドＰ３(ＧＰＱＲＩＧＲＫＹＫＫＶＲＦＭ)に含まれるエピトープのI419位置の置換、ペプチドＰ２(ＳＹＫＳＱＹＬＮＮＧＰＱＲＩＧ)に含まれるエピトープのY407、Y411およびL412位置の置換、ならびにペプチドＰ１(ＩＬＬＦＡＶＦＤＥＧＫＳＷＳＨ)に含まれるエピトープのL197、L198、F199、V201およびF202位置の置換。
【００７０】
上記から、本発明によって多くの変異体FVIIIタンパク質が生成され、望まれる免疫学的および機能的形質のために検査できることが理解される。そのようなFVIII変異体タンパク質の典型的な製造および試験方法は、実施例(EXAMPLES)で記載されている。そのような機能性蛋白質は、全て本発明の実施形態である。更に、修飾の結果、WO02／069232の予測的in silico ＭＨＣクラスII結合ツールを使用して親または「野生型」(wt)ペプチド配列と同じ親和性でＭＨＣクラスII分子と結合することができないペプチド配列が生じることが証明された。更に、ex vivoヒトＴ細胞生物学的増殖アッセイを使って行った典型的な変異体ペプチドエピトープの物理試験は、これらのペプチドがＴ細胞増殖を助けそれによってＴ細胞エピトープとして機能する能力の望ましい喪失を裏付けている。この場合は、これにはバイオアッセイを使って確認され、それによってＴ細胞活性化を助けることができることが確認されたペプチド配列が含まれる。そのようなペプチドのかなり多くは、血友病患者血液に由来するＴ細胞のin vitro増殖を促進でき、それにより処理されたエピトープを代表するものであるので、不可解なものおよび免疫学的に無関係な決定因子と考えることはできない。
【００７１】
変異体タンパク質は組換えＤＮＡ技術によって最も好ましく形成されるが、FVIII断片の化学合成を含む他の方法を考慮してもよい。任意の好ましい変異体FVIII分子または断片をエンコードしているポリヌクレオチド(DNA)を導くために、本明細書で提供されるタンパク質配列情報を使うことは容易な方法である。このことは、DNAstarソフトウェア・スイート[DNAstar Inc.Madison WI,USA］のようなコンピュータソフトウェアを使うと最も容易に達成できる。本発明のポリペプチドまたはその重要な同族体をエンコードしているそのようなＤＮＡ塩基配列は、どんなものでも本発明の実施形態と考えるべきである。
【００７２】
本発明は、少なくとも１つのアミノ酸残基の置換が行われた結果、１つまたは複数の潜在的なＴ細胞エピトープの活性がかなり低下したかそのエピトープがタンパク質から脱離したFVIII類似体に関する。図１で特定された任意の潜在的ＭＨＣクラスIIリガンド内、またはより好ましくは表１と２のペプチドエピトープ配列内の特定の位置における１つまたは複数のアミノ酸置換の結果として、ヒト宿主に治療薬として投与された場合の免疫原性が低下したFVIII分子が生じるかもしれない。
【００７３】
アミノ酸修飾(例えば置換)が親分子で最も免疫原性の強い領域内で行われたFVIII分子を提供することが最も好ましい。Ｔ細胞エピトープの除去のためには、Ｔ細胞エピトープ活性の相当な低下または除去を達成すると予測されるペプチド配列内の適当な位置でアミノ酸置換が行われるのが好ましい。実際には、適当な位置は、ＭＨＣクラスII結合溝内にあるポケットの１つで結合しているアミノ酸残基に相当するのが好ましい。裂溝の最初のポケット内のいわゆるペプチドのＰ１またはＰ１アンカー位置で結合を変えるのが最も好ましい。ペプチドのＰ１アンカー残基とＭＨＣクラスII結合溝の最初のポケットの間の結合相互作用の質は、ペプチド全体に対する結合の全体的な親和性の主要な決定因子であると認識されている。ペプチドのこの位置の適当な置換は、ポケット内への収容の容易さの程度が低い残基のためであり、例えばより親水性の高い残基への置換がそうである。ペプチドの、ＭＨＣ結合裂溝内の他のポケット領域内における結合に相当する位置のアミノ酸残基も考慮されており、本発明の適用範囲内である。
【００７４】
当業者に明らかになるように、望まないエピトープを除去するという目的を達成する置換の複数の他のセットに到達することができる。しかし、結果として生じる配列は本明細書で開示される特定の組成と極めて相同的であると認められるので、本発明の適用範囲内である。
【００７５】
所定の潜在的なＴ細胞エピトープ内の単一アミノ酸の置換が、エピトープの除去ができる最も好ましい経路であると理解されている。単一のエピトープ内の置換の組み合わせも考えられ、例えば、個々に定義済みのエピトープが相互に重なり合っている場合は特に適当である。更に、所定のエピトープ内の単一のアミノ酸置換、または単一のエピトープ内のアミノ酸置換の組み合わせを、ＭＨＣクラスII結合溝に関して「ポケット残基」に相当しないがそのペプチド配列内のどの位置でも生じさせることができる。置換は、当技術分野で既知のin silico手法を使用して形成された同族体構造または構造的方法を参照して生じさせることができ、また本発明に従った分子の既知の構造的特徴に基づいてもよい。そのような置換も全て本発明の適用範囲に入る。
【００７６】
上で同定されたペプチド以外におけるアミノ酸置換は、記載されたペプチド内で形成された置換と組み合わせて形成される場合に特に考慮してもよい。例えば、変異体分子の構造または生物学的活性を回復させるために変更を考慮してもよい。そのような代償的な変更、およびFVIIIポリペプチドに関して特定のアミノ酸残基の削除または追加が含まれ、その結果所望の活性を有する変異体が形成され、また開示された任意のペプチドの変化と組み合わされた変更は、本発明の適用範囲に入る。
【００７７】
本発明が修飾されたFVIIIに関する限り、そのような修飾されたFVIIIタンパク質または修飾されたFVIIIタンパク質の断片を含有する組成物および関連組成物は、本発明の適用範囲内であると考えるべきである。この点に関係する例として、ペプチド媒介寛容誘導手法の発展があり、そこでは開示されたペプチドの１つまたは複数が免疫療法を意図して患者に投与される。従って、合成ペプチド分子、例えば表１に記載の内１つまたは複数が本発明の実施形態と考えられる。別の態様では、本発明は修飾されたFVIII実体をエンコードする核酸に関する。更なる態様では、本発明は修飾されたFVIIIタンパク質を使用したヒトの治療処置の方法に関する。更なる態様では、本発明は本明細書で開示された配列と配列同一性若しくは部分同一性を有するペプチドまたは誘導体分子を含んでいる医薬品を使用した治療処置のための方法に関する。
【００７８】
以下、本発明は例示されるが、下記の例によって限定されるものではない。上記本文と下記例は、以下の図に関連する。
【００７９】
図１は、潜在的なヒトＭＨＣクラスII結合活性を有するヒトVIII因子内のペプチド配列のリストを提供する。ペプチドは13量体であり、アミノ酸は一文字コードを使って識別されている。
【００８０】
図２は、プールされたペプチドをスクリーニングするスキームを表す。本研究において、ペプチドは15量体であって、各々12個の連続したペプチドが重複していた。
【００８１】
図３は、FVIII由来合成ペプチドによる処置に対する、in vitro Ｔ細胞増殖アッセイの結果を表しているヒストグラムを提供する。この例では、血友病患者ドナーから分離されたFVIIIのＴ細胞系が、FVIII配列上の重複したペプチドプールのスクリーニングに使われた。矢印は、Ｔ細胞増殖を誘発するプールを示し、このプールはその後解読された。
【００８２】
図４は、FVIII由来合成ペプチドによる処置に対する、in vitro Ｔ細胞増殖アッセイの結果を表しているヒストグラムを提供する。この例では、血友病患者ドナーから分離されたFVIIIに特異的なＴ細胞系が、Ｔ細胞増殖を誘発する２個のペプチドプールの解読に使われた。Ｔ細胞エピトープを含有しているペプチドは、矢印で示されている。
【００８３】
図５は、FVIII由来合成ペプチドによる処置に対する、in vitro Ｔ細胞増殖アッセイの結果を表しているヒストグラムを提供する。この例では、２名のドナーからの細胞が、FVIII配列上のペプチドのスクリーニングに使用された。ドナー#1(A)とドナー#2(B)の両方とも、同一のＨＬＡ−ＤＲアロタイプを有していた(DRB1＊03、DRB1＊04、DR3およびDR4＊01)。矢印は、Ｔ細胞エピトープを含有するペプチドを示す。
【００８４】
図６は、ペプチド８(Ｐ８)の変異体の活性データとタンパク質発現レベルを示しているグラフを提供する。陽性対照は、wt VIII因子である。M1013Kは、M10103K置換を含有しているFVIII分子の発現および活性データを表す。残りのコラムは、M1013K置換と示されたアミノ酸へのI1011位置における追加の変更を組み合わせたFVIII分子である。
【００８５】
図７は、ペプチド７(Ｐ７)の変異体の活性データとタンパク質発現レベルを示しているグラフを提供する。陽性対照はwt VIII因子であり、陰性対照はトランスフェクション無しのＤＮＡである。残りのサンプルは表示されたアミノ酸変化を有するV823変異体である。
【００８６】
図８は、wt配列ペプチドが刺激指数＞2.0を示す条件下で＜2.0の刺激指数を示す変異体ペプチドを示している典型的なＴ細胞アッセイデータを提供する。ペプチド配列とＰＢＭＣドナーのアロタイプデータが表にされている。
【００８７】
図９は、ペプチドＭＨＣクラスII結合のソフトウェアによるシミュレーションを用いて得られた結果を表したものである。18の異なるＨＬＡ−ＤＲアロタイプの結果を示すが、各垂直コラムは単一のアロタイプの結合を示す。パネルＡは、ペプチド７周辺のwt FVIII配列で検出された結合のプロフィールを示す。ペプチド７配列は強調表示されている。パネルＢは、Ｖ823Ａ置換が含まれる修飾されたペプチド７配列で検出された結合のプロフィールを示し、複数のアロタイプに対する高親和性のリガンドの喪失を証明している。各パネルで、予測されたＭＨＣ結合は各13量体ＭＨＣクラスIIリガンドの最初の残基を示すことで表されている。結合強度は、示されているように各アロタイプの各リガンドの計算された結合スコアに基づき、Ｈ、ＭまたはＬで表示される。以前に行われた結合の物理的研究は、＜500,000のスコアの結合は無視できる作用であることを示している。
【００８８】
図10は、野生型(ＷＴ)Ｂ−ドメイン欠失ヒトFVIII配列のアミノ酸配列と番号付けを示す。アミノ酸は、一文字コードを使って表示されている。
【００８９】
（実施例１）
Ｔ細胞系とクローンの樹立方法
末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)は、血友病患者から得た血液から分離し、液体窒素下で低温保存した。血液サンプルは、Addenbrooke's Health Care Trustの地方倫理承認の元、十分な情報に基づいた同意(インフォームド・コンセント)を得て提供された。Ｔ細胞系は、FVIIIを用いて大量培養の抗原特異的Ｔ細胞を刺激し、その後ＩＬ−２誘導の増殖を数サイクル行って樹立した。最初に、24穴プレートを用い、ＰＢＭＣを４μｇ／ｍｌのFVIIIを含有しているAIM V培地(Refacto(商標))２ｍｌ中で２×１０6の濃度で培養した(５％ＣＯ2の加湿環境で37℃の条件)。７日間培養後、100Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を加え、培養物を更に３日間培養した。Ｔ芽球を採取し、10日間の抗原／ＩＬ−２刺激終了後、計数した。抗原特異性を保持するために、Ｔ芽球に、抗原提示細胞としてガンマ線照射自己ＰＢＭＣを使って２回目の抗原刺激を行った。この処理は、１穴あたり１×１０6の自己ＰＢＭＣを0.75mlのAIM V培地(５％の熱不活化ヒトＡＢ血清を含有)の入った24穴プレートで４μｇ／mlのFVIIIと共に１時間培養し、その後4000 radのガンマ線を照射して達成した。自己Ｔ芽球は、0.25mlのAIM V培地中で４×１０5細胞数／ｍｌの濃度でガンマ線照射抗原提示細胞(FVIIIで前負荷)に加え、３日間培養した。Ｔ芽球は細胞を100Ｕ／ｍｌのＩＬ−２で３日間刺激することによって増殖した。培養物にはその後３日間隔で合計９日間、新鮮なＩＬ−２(100Ｕ／ｍｌの最終濃度)を供給した。全ての増殖されたＴ芽球が抗原特異的であるように、３回目の抗原刺激を行い、そこでＴ芽球を採取し、AIM V培地中で４×１０5細胞数／ｍｌの濃度で再懸濁した。前記したように、抗原提示細胞の形成は、１×１０6のガンマ線照射自己ＰＢＭＣを0.75mlのAIM V培地(５％の熱不活化ヒトＡＢ血清を含有)の入った24穴プレートで４μｇ／ｍｌのFVIIIと共に１時間培養して行った。自己Ｔ芽球は、0.25mlのAIM V培地中で４×１０5細胞数／ｍｌの濃度でガンマ線照射抗原提示細胞に加え、３日間培養した。最終増殖は10Ｕ／ｍｌのＩＬ−２中で行われ、３日後Ｔ芽球を採取してペプチドプールのスクリーニングのために用いた。
【００９０】
大量培養からのクローニング
FVIII抗原による３回目の刺激の後、Ｔ芽球を採取して、連続希釈により４×１０2〜１×１０4細胞数／ｍｌ(２×最終培養密度)の密度に再懸濁した。自家ＰＢＭＣは解凍し、ポリプロプレン管中で２×１０6細胞数／ｍｌ(２×最終培養密度)に再懸濁した。ＰＢＭＣはその後4000 radでガンマ照射し、限界希釈により抗原反応Ｔ細胞クローンを選択するために抗原提示細胞として使用した。ガンマ照射抗原提示細胞(１×１０6の最終密度)は、Ｔ芽球(２×１０2〜５×１０3の最終密度)、１〜10μｇ／ｍｌのFVIII抗原および100Ｕ／ｍｌのＩＬ−２と混合した。Ｔ細胞クローンは、テラサキプレートを使用し、各穴に20μｌのＡＰＣ、Ｔ芽球、FVIIIおよびＩＬ−２混合液を加えることによって樹立した。限界希釈クローニングは、テラサキプレートの２〜50Ｔ芽球数／穴を使って行った。
【００９１】
Ｔ細胞クローンの選択と維持
Ｔ芽球は、FVIII抗原、ＩＬ−２およびガンマ照射自家抗原提示細胞と共に約14日間培養した。明確な増殖を示している細胞を含有した穴を確認後、Ｔ芽球を１×１０5のガンマ照射アロジェニックＰＢＭＣ、100Ｕ／ｍｌのＩＬ−２および１μｇ／ｍｌのフィトヘマグルチニン(ＰＨＡ)を含有している丸底96穴プレートの１穴の、最終体積200μｌのAIM V培地(１％の熱不活化ヒトＡＢ血清を含有)に移した。Ｔ細胞クローンは集密に達したときに分割し、最終的には１×１０6のガンマ照射アロジェニックＰＢＭＣ(支持細胞)、100Ｕ／ｍｌのＩＬ−２および１μｇ／ｍｌのフィトヘマグルチニン(ＰＨＡ)を含有している24穴プレートの１穴の、最終体積２ｍｌのAIM V培地(１％の熱不活化ヒトＡＢ血清を含有)に移した。Ｔ細胞クローンの日常の維持には、２〜３週ごと(細胞増殖により)の新鮮なＰＨＡおよびアロジェニックな支持細胞による刺激、ならびに週２回の100Ｕ／ｍｌのＩＬ−２による刺激が含まれた。FVIII特異的であることが分かったＴ細胞クローンだけが増殖され、FVIIIペプチドのスクリーニングに用いられた。
【００９２】
自家Ｂ細胞のＥＢＶトランスフォーメーション
ＰＢＭＣ調製物からのＢ細胞は、３ｍｌの濾過された(0.45μ)Ｂ95.8上清を４×１０6のＰＢＭＣに加え、37℃で１時間培養することによって、Ｂリンパ芽細胞系(ＢＬＣＬ)を生み出すために不死化された。ＰＢＭＣは、ペレットされ、５％の熱不活化ウシ胎仔血清(ＦＣＳ)と１μｇ／ｍｌのサイクロスポリンＡを含有する２ｍｌのＲＰＭＩの中に再懸濁された。７日間培養後、培地１ｍｌを５％のＦＣＳと２μｇ／ｍｌのサイクロスポリンＡ(サイクロスポリンＡの最終濃度は１μｇ／ｍｌ)を含有する新しいＲＰＭＩと入れ替えた。この供給法を14日目および21日目に繰り返し、その後に必要に応じて５％のＦＣＳを含むＲＰＭＩを使って細胞を分割し、組織培養フラスコで増殖した。
【００９３】
Ｔ細胞系／クローンを用いたFVIIIペプチドのスクリーニング
長さ15残基でアミノ酸12個の増分が前のペプチドと重複しているペプチドが合成された(Pepscan、オランダ)。ペプチドは、最初に貯蔵のために100％のジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)を使用して、10ｍＭの濃度で可溶化された。FVIII特異的Ｔ細胞系に対して多数のペプチドを同時にスクリーニングするために、ペプチドプールが形成された。プールは、各々のプールが以降のプールの重複するペプチドを含有するようにこの手法を用いて組み立てた。２個のペプチドが重複するＴ細胞エピトープは、２つの別々のプールの増殖を誘発する。各プールは、一般的に８個のペプチドからなり、それぞれが１μＭまたは５μＭで試験された。このペプチドプールの方法を図２で例示する。
【００９４】
自家ＰＢＭＣ(Ｔ細胞系用)またはＥＢＶ形質転換ＢＬＣＬ(Ｔ細胞クローン用)を、１×１０5のＰＢＭＣまたはＢＬＣＬを50μｌのAIM V培地の中に再懸濁し、それを丸底96穴プレートの各穴に加えることによって抗原提示細胞として使用した。ペプチドプールは、両濃度(１μＭまたは５μＭ)で各プールに対して３組の穴に加えた。抗原提示細胞とペプチドプールは37℃で１時間培養し、その後4000 radのガンマ線で照射した。ＢＬＣＬは、Ｔ細胞クローン用の抗原提示細胞(ガンマ照射自家ＰＢＭＣの代わりに)として使う場合、１μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣで37℃・１時間前処理され、その後AIM V中で４回洗浄した。抗原特異的Ｔ細胞系またはＴ細胞クローンはその後１穴あたり５×１０4個の細胞密度で加え、培養物は３日間培養した。３日目に、各穴に１μＣｉ[3Ｈ]チミジンを最低８時間適用した。フィルターマット上へプレートを収穫した後に、Wallac Microplate Beta計数器を使って１穴あたりのｃｐｍ数を測定した。図３は、Ｔ細胞系を用いて作られたエピトープ地図を示し、そこではＴ細胞エピトープを含有するペプチドプールを確認するのにＴ芽球が用いられ、それらのプールはその後Ｔ細胞エピトープを含有する個々のペプチドを確認するために解読された。
【００９５】
健常ドナーのＰＢＭＣを使用したナイーブなＴ細胞エピトープ地図
40名の健常ＨＬＡ−ＤＲ型ドナーからの血液を用いてＰＢＭＣを分離し、これを用いて個々のFVIIIペプチドを２つの濃度(１μＭおよび５μＭ)で選別した。全てのFVIIIペプチドを選別するには各ドナーからのＰＢＭＣ数は不十分であったので、ドナーは２つの群に分け、最初の20名のドナーは分子の前半上のペプチドを選別し、ドナーの第２組で残りのペプチドを選別した。世界の母集団に存在する多数のアロタイプをカバーするために、ドナーは発現されたＭＨＣクラスIIアロタイプに従って選択された。ＭＨＣアロタイプは用いて検出された。
【００９６】
全てのＰＢＭＣサンプルの組織型は市販の試薬系(Dynal、Wirral、英国）を使って検定された。検定は業者の推奨プロトコルに従い標準の付属試薬とアガロース電気泳動系により行った。
【００９７】
ＰＢＭＣは生理学的数のナイーブＴ細胞と抗原提示細胞を含有する。これらの細胞を２×１０5細胞数／穴(96平底プレート)の密度で使用して、３組の200μｌ培養物中の１μＭおよび５μＭのペプチドを選別した。細胞はペプチドと共に37℃で６日間培養し、その後各穴に１μＣｉ[3Ｈ]チミジンを最低８時間適用した。培養物をフィルターマット上へ収穫し、Wallac Microplate Beta計数器を使って１穴あたりのｃｐｍ数を測定した。図５は、２名のドナーを用いて分子の別々の半分をスクリーニングするために作成したFVIIIのエピトープ地図を示す。
【００９８】
（実施例２）
VIII因子のクローニングおよび発現のための方法
ｍＲＮＡ抽出とｃＤＮＡの合成
ヒト肝臓組織を病院の病理部から得た。サンプルをさいの目に切り、50ｍｇに等分して液体窒素で保存した。50ｍｇ分をホモジナイズし、製造業者の使用説明書に従ってPolyATract System 1000キット(Promega)を使用して直接ｍＲＮＡを抽出し、約10μｇのｍＲＮＡを得た。製造業者の使用説明書に従い、オリゴ(ｄＴ)15プライマーを用いるImProm-II逆転写システム(Promega)を使用して20μｌ反応液中で１μｇ分のｍＲＮＡを逆転写した。逆転写酵素は、その後70℃で15分間加熱して不活化した。
【００９９】
VIII因子配列のポリメラーゼ連鎖反応法増幅
VIII因子のＢドメイン欠失変異体をクローニングするために、ｃＤＮＡを二等分したものからｃＤＮＡを増幅した。ｍＲＮＡの５'末端を下記プライマーを用いて増幅した。
【０１００】
【表５】
2005538694.tif 000006
【０１０１】
配列番号１は、クローニングを容易にする２つの制限酵素部位と、ＡＴＧ開始コドン(太字)を囲んでいるVIII因子ｍＲＮＡ配列の24個のヌクレオチドを含んでいる。配列番号２は、VIII因子ｍＲＮＡのヌクレオチド2420〜2454と相補的で、2445および2448位置(太字で示す)に変更されたヌクレオチドを含み、これらは新しい制限酵素部位を導入するもののタンパク質配列には影響しない。
【０１０２】
ＶIII因子遺伝子の３'末端を、下記プライマー対を用いて増幅した。
【０１０３】
【表６】
2005538694.tif 000007
【０１０４】
配列番号３はクローニングを容易にする制限酵素部位Nhelと、ヌクレオチド5140〜5164と結合したVIII因子ｍＲＮＡのヌクレオチド2442〜2457を有する。このプライマーは、従って、ほとんど全てのＢドメインが存在しない重鎖および軽鎖の間で結合を作る。このプライマーも、2445および2448位置(太字で示す)にヌクレオチドの変更があり、これらは同じく配列番号２に新しい制限酵素部位を形成する。配列番号４は、VIII因子コード配列の最終の24個のヌクレオチドとクローニングを容易にする制限酵素部位を含む。
【０１０５】
ＰＣＲ反応は、Expand HiFiポリメラーゼ(Roche)を用い、ＭｇＣｌ2を含有する支給バッファを使用して最終体積50μｌで行った。反応液は200μＭの各ｄＮＴＰ、50ｐｍｏｌの各プライマー(配列番号１プラス２または配列番号３プラス４)、2.5単位のRnaseHおよび５μｌの逆転写酵素反応混合物を含む１×バッファとした。ＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドのＲＮＡをRnaseHによって分解しＰＣＲ反応の効率を高めるために、反応液は37℃で30分間培養した。その後、反応液は最初の変性のために２分間94℃で加熱し、その後以下の温度と時間の周期で処理した：94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で2.5分。最初のアニーリングの段階では、推奨されたポリメラーゼの量を加え、反応を20回繰り返した。20回目の伸長の後のアニーリング段階では、２回目の分量のポリメラーゼを加え、反応を更に20回繰り返した。その後全ての鎖が完全に重合するように反応液を72℃で10分間培養した。
【０１０６】
VIII因子遺伝子のクローニングおよび組み立て
ＰＣＲ反応液の半分は１％アガロースゲル上で分離し、VIII因子ｃＤＮＡの５'末端と一致している2286bpバンドおよび３'末端と一致している2015bpバンドを切り取り、Qiagen Gel Extractキットを通してアガロースから精製した。ＰＣＲ産物はその後、製造業者の指示に従ってＰＣＲ産物クローニングベクタ(ｐＧＥＭ−Ｔ Easy Vector System、Promega)に連結した。業者の推奨通り0.1cmのギャップキュベットを使用して、各連結反応液の１μｌを電気穿孔法により20μｌの電気応答性大腸菌株XL1-Blue(Stratagene)に入れた。業者の推奨通り、細胞を再懸濁し、回復させた。10μｌおよび100μｌの分量の電気穿孔処理された細胞を、100μｇ／ｍｌのアンピシリン、80μｇ／ｍｌのXgalおよび0.5ｍＭのＩＰＴＧを含有するＬＢ寒天プレート上に塗布し、37℃で一晩生育させた。
【０１０７】
白いコロニーを選び、20μｌの水に分散した。各再懸濁コロニーからのサンプルは、Taqポリメラーゼ(Roche)を支給バッファと共に使用してＰＣＲにより20μｌの反応溶液中で分析した。反応液は200μＭの各ｄＮＴＰ、標準のM13フォアワード(forward)およびリバース(reverse)プライマーである各プライマー(本明細書では配列番号５および６)50ｐｍｏｌならびに１μｌの再懸濁コロニーを含有している１×バッファで作られた。その後、反応液は最初の変性のために２分間94℃で加熱し、その後以下の温度と時間の周期を20回繰り返した：94℃で30秒、60℃で30秒、72℃で２分。その後、全ての鎖が完全に重合するように、反応液を72℃で10分間培養した。
【０１０８】
各反応液の５μｌサンプルを１％アガロースゲル上で分離した。約2300bpでバンドを有するサンプルはVIII因子５'ハーフインサートが陽性であると考えられ、約2150bpでバンドを有するサンプルはVIII因子３'ハーフインサートが陽性であると考えられた。各インサートに関し、８個のコロニーをそれぞれ２ＹＴブロス／100μg／ｍｌアンピシリンの液体培地５ｍｌに接種し、37℃で一晩振盪培養した。プラスミドはQiangen mini-prepキットを使って各培養の1.5mlから調製し、このプラスミドは配列決定のために契約施設に送られ、そこで下記プライマーを使用して配列を決定した。
【０１０９】
【表７】
2005538694.tif 000008
【０１１０】
プラスミドｐＣＦ85は、VIII因子遺伝子の５'側半分の正しいアミノ酸配列をコードしていることが分かった。プラスミドｐＣＦ83は、VIII因子遺伝子の３'側半分の正しいアミノ酸配列をコードしていることが分かった。
【０１１１】
ｐＣＦ83をBst98IおよびXhoIで消化し、VIII因子遺伝子の３'側半分を含む2.0Ｋｂｐ断片をアガロースゲル電気泳動で精製し、同様に切断し精製したpLitmus(ＮＥＢ)に標準の手法を用いてクローニングした。陽性の細菌コロニーは上述のようにＰＣＲで同定し、１つのクローン、ｐＣＬＦ83を選択して増殖させ、ＤＮＡを調製した。
【０１１２】
ｐＣＦ85はBssHIIで消化し、末端は100μＭの各ｄＮＴＰの存在下でＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ(ＮＥＢ)を使用して平滑にした。反応液は、その後70℃で10分間加熱し、更にAvrIIで消化した。放出された2.3ｋｂｐ断片はアガロースゲル電気泳動で精製し、Bst98Iで消化され先と同じく平滑末端のｐＣＬＦ83にクローニングし、AvrIIで消化してゲルで精製した。陽性の細菌コロニーは、上述のようにプライマー配列番号11および17(ＡＴＣＡＧＴＡＡＡＴＴＣＣＴＧＧＡＡＡＡＣ[VIII因子ｍＲＮＡ nt5448−5428])を使用してＰＣＲスクリーニングで同定された。これらのプライマーはVIII因子遺伝子の２つの半分の間の結合部を横断する断片を増幅し、従ってクローニングが成功した場合に限って約570ｂｐの産物が見られる。陽性コロニーを選択し、ｐＣＬＦ８と名付けた。このコロニーを増殖し、ＤＮＡを調製して配列決定した。正しい接合部配列は、プライマー配列番号６および配列番号５を使って確認した。５'側および３'側の半分の間の結合部も、プライマー配列番号17を使って確認した。
【０１１３】
VIII因子の発現と活性分析
FVIIIタンパク質は、ベクターｐＣＩ(Promega，Southampton，英国)の修飾された変異体を使って発現された。修飾されていないｐＣＩベクターは長さが4.0ｋｂｐであり、哺乳類での発現のためにはＣＭＶエンハンサー／プロモーターおよびＳＶ40後期ポリアデニル化シグナルを含有し、また細菌での増殖に必要な配列を含有する。このベクターもバクテリオファージＦ１ originを含有し、これはプラスミドを制限酵素BamHIとEcoO1091で消化することによって取り除かれた。消化生成物は、先に述べたようにＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを使って平滑末端化され、その後１％アガロースゲルを通して分離された。3.2ｋｂｐベクター断片をゲルから精製し、自己連結し、先に述べたように細菌菌株XL1-blueに形質転換された。コロニーを選択して一晩増殖させ、プラスミドは先に述べたようにmini-prepで調製した。精製されたプラスミドのサンプルを、Ｆ１ origin配列内にある制限酵素NgoMIVで消化し、アガロースゲル電気泳動を通して分析した。抵抗性プラスミドが選択されてｐＣＩΔと名付けられた。
【０１１４】
ｐＣＩΔを制限酵素NhelおよびXholで消化し、ベクター断片をアガロースゲル電気泳動を通して精製した。ｐＣＬＦ８も同様に消化し、VIII因子遺伝子を含有している4.4ｋｂｐ断片をアガロースゲル電気泳動を通して精製し、標準手法を用いて切断ｐＣＩΔにクローニングした。陽性の細菌コロニーは、上述のようにプライマー配列番号11および17を使用してＰＣＲ分析で同定された。
【０１１５】
ｐＣＩＦ８と名付けられた１個の陽性コロニーを選択し、100μｇ／ｍｌアンピシリンを含有している２ＹＴブロス50ｍｌに接種して、激しく振とうしながら37℃で一晩増殖させた。非常に純粋なプラスミドＤＮＡをQiagen mini-prepキットを使って調製した。プラスミドＤＮＡは分光測光法で定量化し、0.2μｇ／μｌに希釈し、0.2μｍ孔、直径1.5ｃｍのろ過装置(Nalgene)を通してろ過滅菌した。
【０１１６】
ＨＥＫ 293細胞(ATCC CRL−1573)を、Glutamax-I、ピルビン酸ナトリウムおよび4500ｍｇ／ｍｌのグルコースを含有したＤＭＥＭ(Invitrogen cat.no.31966−021)の入った75ｃｍ2組織培養フラスコで、10％熱不活化胎児ウシ血清(Perbio cat.no.CH30160.03)を補って連続培養で維持した。細胞は、37℃／５％ＣＯ2で増殖させ、48時間ごとに１／５に希釈して継代培養した。ＨＥＫ 293細胞は組織培養プラスチックには弱くしか接着しないので、フラスコ表面を洗うことによって分離できる。
【０１１７】
製造業者の説明に従って、ＨＥＫ 293細胞をリポフェクトアミン2000(Invitrogene)を使って24穴ポリ−Ｌ−リジン塗布組織培養皿(Beckton Dickinson)中でトランスフェクションした。75ｃｍ組織培養フラスコ中のほとんど集密状態の細胞は、リン酸緩衝食塩水(ＰＢＳ)で洗浄後、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を用いて組織培養フラスコから分離した。このトリプシンは、等量の成長培地の添加によって不活化された。細胞は血球計で計数し、細胞懸濁液は1200 rpmで５分間遠心分離した。上清を除去し、細胞ペレットは４×１０5細胞数／ｍｌの密度で成長培地の中に再懸濁した。細胞懸濁液の0.5ｍｌを24穴組織培養皿の各穴に分注し、37℃／５％ＣＯ2で一晩培養した。トランスフェクションの前に、培地は各穴から取り除かれて0.5ｍｌの新鮮培地と入れ替えられた。0.8μｇのプラスミドｐＣＩＦ８および陰性対照プラスミドｐＣＩΔは、それぞれOptimem (Invitrogene cat.no.51985-026)で50μｌに希釈された。各トランスフェクションでは、２μｌのリポフェクトアミン2000は50μｌまで希釈し、室温で５分間培養し、その後希釈プラスミドと結合させて更に室温で20分間培養した。トランスフェクションは３組で行われ、各100μｌのプラスミド／脂質混合液をその後24穴プレートの１穴へ１滴ずつ加えた。その後プレートを37℃／５％ＣＯ2で培養した。10μｌの分量を24時間、48時間および72時間後に各トランスフェクションから取り出した。３組からそれぞれ取り出した分量を合わせて１サンプルにつき合計30μｌの体積にして、活性分析まで−80℃で冷凍させた。
【０１１８】
上清中のVIII因子活性は、製造業者の説明に従いコーテスト Ｆ８：Ｃ／４キット(Chromogenix)をマイクロタイターフォーマットで使用して検定した。上清サンプルは、氷上で解凍し、検定バッファで１／20および１／100に希釈し、２組で検定した。標準物質は、VIII因子活性の国際標準(Chromogenix)に対して定量化された凍結乾燥血漿サンプルであった。製造業者の記載に従い、１バイアルの血漿を１ｍｌの水で復元した。血漿中のVIII因子の活性レベルに関しては添付のデータシートを参照しつつ、血漿は検定バッファを加えて100％(１ＩＵ／ｍｌ)まで希釈した。その標準物質はその後製造業者のマイクロタイターアッセイプロトコルで記載されているように希釈した。24時間後、ｐＣＩＦ８でトランスフェクションした細胞からの上清は0.16ＩＵ／ｍｌの活性を有することが分かり、それが48時間後には0.74ＩＵ／ｍｌに上昇し、72時間後には0.5ＩＵ／ｍｌに後退した。対照ベクターでトランスフェクションした細胞からの上清では、活性は見られなかった。従って、VIII因子は変異体の活性を決定するための十分な量の発現に成功した。
【０１１９】
ペプチドＰ10(表２)のアミノ酸の突然変異
ペプチド10は、ＭＨＣクラスII分子であるF1207、I1208、I1209およびM1210(番号付けは成熟Ｂドメイン欠失配列に従う)との相互作用のための一次アンカーとなる可能性のある４つの疎水性残基を含有する。従ってこれら４つの残基は、一次アンカーの可能性のあるもの以外の残基に対する突然変異の対象とされた。F1207は以下に変更された：Ａ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、ＱおよびＲ。I1208は以下に変更された：Ａ、Ｔ、ＤおよびＮ。I1209は以下に変更された：Ａ、Ｃ、Ｄ、ＮおよびＰ。M1210は以下に変更された：Ａ、Ｋ、Ｎ、およびＱ。突然変異生成は、当業者には既知の確立されたプロトコルを使用して重複ＰＣＲを通して行った。ペプチド10は、PspOMIおよびSphI制限部位に囲まれたVIII因子ヌクレオチド配列の断片内にある。こうした断片の増幅のためのＰＣＲプライマーは、この領域のすぐ外側の配列に対応させて合成された(下記配列番号18および19)。F1207の突然変異生成のために、下記のように内部プライマーが合成された。
【０１２０】
【表８】
2005538694.tif 000009
【０１２１】
ＰＣＲは、Expand HiFiポリメラーゼ(Roche)を用い、ＭｇＣｌ2を含有する支給バッファを使用して最終体積50μｌで行った。５'断片反応には、各ｄＮＴＰ200μＭ、各プライマー50ｐｍｏｌ(配列番号18プラス20)、100ｎｇのpCIF8および2.5ユニットのExpandポリメラーゼを含有している１×バッファが含まれた。６つの３'断片反応が設定され、これには各ｄＮＴＰ200μＭ、各プライマー50ｐｍｏｌ(配列番号19プラス配列番号21、22、23、24、25または26)、100ｎｇのpCIF8および2.5ユニットのExpandポリメラーゼを含有している１×バッファが含まれた。その後、反応液は最初の変性のために94℃で２分間加熱し、次に以下の温度と時間の周期で処理した：94℃で30秒、50℃で30秒、72℃で30秒。反応を20回繰り返し、その後全ての鎖が完全に重合するように72℃で10分間培養した。
【０１２２】
各ＰＣＲの半分を１％アガロースゲルで分離し、226ｂｐの５'断片および292ｂｐの６個の異なる３'断片をゲルから切り離してQiagen Gel Extractキットを使って精製した。次に５'断片を以下のように３'断片の各々に連結させた：更に６回のＰＣＲをExpand HiFiポリメラーゼを用いて上述のように行ったが、これにはテンプレートとして２μｌの溶出５'断片を６つの溶出３'断片のそれぞれ２μｌとプライマー配列番号18および配列番号19と共に使用した。これらの反応物の各半分を１％アガロースゲルで分離し、486ｂｐの６つのバンドを先に述べたように精製した。各ＰＣＲ産物は、制限酵素PspOMIおよびSphIを用い、総反応体積を50μｌにして37℃で一晩消化した。４μｇのプラスミドｐＣＩＦ８を同様に37℃で２時間消化し、プラスミドとＰＣＲ断片消化物の半分を１％アガロースゲルに通した。7.2ｋｂｐのベクターバンドおよび391ｂｐのＰＣＲ断片をゲルから切り離して前記同様精製し、水溶液中での最終体積をそれぞれ30μｌとした。標準の10μｌライゲーション反応液中でＴ４ ＤＮＡリガーゼおよび支給バッファ(Invitrogen)を用いて、１μｌのベクターを６つの断片の各々の３μｌに連結した。反応物は室温で４時間培養した。業者の推奨通り0.1ｃｍのギャップキュベットを使用して、各連結反応液の１μｌを電気穿孔法により20μｌの電気応答性大腸菌株XL1-Blue(Stratagene)に入れた。同じく業者の推奨通り、細胞を再懸濁し、回復させた。10μｌおよび100μｌの分量の電気穿孔処理された細胞を、100μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上に塗布し、37℃で一晩増殖させた。
【０１２３】
平板培養されたライゲーションのそれぞれから４つのコロニーを選択し、２ＹＴブロスと100μｇ／ｍｌのアンピシリンの入った５ｍｌの液体培地で、37℃で一晩激しく振とうしながら増殖させた。プラスミドＤＮＡは、Qiagen mini-Prepキットを使って各培養の1.5mlから調製した。各プラスミドのサンプルは、プライマー配列番号18を使ってＤＮＡ配列決定を行った。正しい配列を有する１つのプラスミドを４つの群のそれぞれから選択し、トランスフェクションを通した活性と発現レベルの分析のために保存した。
【０１２４】
この同じ一般的方法に従ってI1208、I1209およびM1210で突然変異を起こした。各アミノ酸のために使われたプライマーは以下の通りである。
【０１２５】
【表９】
2005538694.tif 000010
【０１２６】
配列分析によって確認された各突然変異のクローンは、前記したように24穴ポリ−Ｌ−リジンプレートのＨＥＫ 293細胞に２組でトランスフェクションした。トランスフェクションは37℃／５％ＣＯ2で48時間培養した。各トランスフェクションの２組の上清をプールし、前記同様VIII因子活性につき検定した。上清は、ペアード抗VIII因子抗体ELISAキット(Affinity Biologicals)を使ってVIII因子発現レベルについても検定した。このアッセイは、効果的に組織培養上清材料を定量化するように修正され、次のように実施された。捕獲抗体をｐＨ9.6炭酸ナトリウム／重炭酸塩バッファで１／100に希釈し、１穴あたり100μｌをDynex Immulon ４ 96穴ELISAプレートに加えた。プレートは４℃で一晩培養した。穴は洗浄バッファ(0.1％のTween 20を含有しているトリス緩衝食塩水[ＴＢＳ：25ｍＭのトリス、137ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌ、25℃でｐＨ7.4])各100μｌで４回洗浄し、１穴あたり標準希釈液の100μｌを２分量と組織培養上清を加えた。標準は、VIII因子活性の国際標準(Chromogenix)に対して定量化された凍結乾燥血漿サンプルであった。製造業者の記載に従い、１バイアルの血漿を１ｍｌの水で復元した。血漿中のVIII因子の活性レベルに関しては添付のデータシートを参照しつつ、血漿はサンプル希釈バッファ(１％ｗ／ｖウシ血清アルブミンを含むＴＢＳ)を加えて100％(１ＩＵ／ｍｌ)まで希釈した。これをサンプル希釈バッファで１／４に希釈し、100％ ELISA標準を得た。これを更にサンプル希釈バッファで希釈し、75％、50％、25％および５％の標準を得た。組織培養上清をサンプル希釈バッファで１／４に希釈した。プレートは室温で２時間培養し、１穴あたり100μｌの洗浄バッファで４回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ複合抗体を１穴あたり100μｌ加え、プレートは室温で１時間培養した。プレートは前記同様洗浄し、１穴あたり100μｌの基質(既製ＴＭＢ／過酸化物溶液：Sigma cat.no.T0440)を加えた。プレートは室温で15分間培養し、その後停止液(２Ｍの硫酸)を加えた。プレートは、450ｎｍのフィルターを使ってAnthos HTIIプレートリーダーで読み取った。
【０１２７】
活性値と発現レベルの比較により、F1207への全ての変更の結果、発現とそれ故に活性が無くなることが分かった。I1208のＡへの突然変異の結果、発現と活性は非修飾のVIII因子と類似し、一方、ＴおよびＮへの変更の結果、活性は25％および50％低下した。I1209に関しては、Ｃへの突然変異だけが発現を可能にし、この変異体の活性は非修飾のVIII因子と類似していた。M1210への全ての変更の結果、かなりの活性のあるタンパク質が発現し、ＫおよびＮは非修飾のVIII因子とは見分けがつかなかった。従って、I1208A、I1209C、M1210KおよびM1210Nは、ペプチド10内のＴ細胞エピトープの除去に役立つ突然変異である。
【０１２８】
ペプチドＰ８(表２)のアミノ酸の突然変異
ペプチド８は、ＭＨＣクラスII分子と結合する可能性のある一次アンカーである２つのアミノ酸を含有する。これらはI1011とＭ1013である(番号振りは、成熟Ｂドメイン欠失配列に従った)。従ってこれら２つの残基は、一次アンカーの可能性のあるもの以外の残基に対する突然変異の対象とされた。他の生物種(イヌ、マウスおよびラット)のVIII因子配列との比較で、イヌVIII因子では、M1013はＫであることが分かった。Ｋは、ペプチド10の突然変異生成のためのM1210の最も優れた代替物であることも分かった。従って、M1013はＫだけに、また一次アンカーを形成する可能性のないI1011の全てのアミノ酸(つまり、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＴ)と組み合わせて突然変異させた。
【０１２９】
突然変異生成は、当業者には既知の確立されたプロトコルを使用して重複ＰＣＲを通して行った。ペプチド８は、Pf1M1およびPspOMI制限部位に囲まれたVIII因子ヌクレオチド配列の490ｂｐ断片内にある。こうした断片の増幅のためのＰＣＲプライマーは、この領域のすぐ外側の配列に対応させて合成された(下記配列番号40および41)。M1013Kに加えてI1011Xの突然変異生成のために、下記のように内部プライマーを合成して使用した。
【０１３０】
【表１０】
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【０１３１】
突然変異生成は、５'断片長が62ｂｐであり３'断片長が492ｂｐであった点を除いて、上のペプチド10の突然変異生成で説明したのと同じ一般的方法で行った。連結した断片は長さ534ｂｐで、PspOMIおよびPf1MIで消化して同じように消化されたｐＣＩＦ８にクローニングした。
【０１３２】
正しい配列のクローンを各変異体から１つ選択し、その活性と発現レベルを前記同様分析したが、発現／活性の変動が評価できるようにトランスフェクションは３組で行われ各上清を個々に分析した。
【０１３３】
上記変異体の発現レベルと活性の比較により、M1013Kだけが非修飾のVIII因子と非常に類似していることが明らかになった。更に、M1013Kに加えてI1011A、Ｅ、Ｐ、ＳまたはＴを含有している複合変異体も、非修飾のVIII因子と区別できなかった。従ってこれらの突然変異はペプチド８と関連するＴ細胞エピトープの除去に役立つ。
【０１３４】
ペプチドＰ７(表２)のアミノ酸の突然変異
ペプチド７は、ＭＨＣクラスII分子であるV823(番号付けは成熟Ｂドメイン欠失配列に従う)と結合するための一次アンカーとなる可能性のある１つのアミノ酸を含有する。従ってこの残基は、一次アンカーの可能性のあるもの(つまり、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＴ)以外の残基に対する突然変異の対象とされた。
【０１３５】
突然変異生成は、上と同様に確立されたプロトコルを使用して重複ＰＣＲを通して行った。ペプチド７は、AvrIIおよびPf1M1制限酵素に囲まれたVIII因子ヌクレオチド配列の766ｂｐ断片内にある。この断片の増幅のためのＰＣＲプライマーは、この領域のすぐ外側の配列に対応させて合成された(下記配列番号57および58)。V823Xの突然変異生成のために、下記のように内部プライマーが合成され使用された。
【０１３６】
【表１１】
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【０１３７】
突然変異生成は、５'断片長が310ｂｐであり３'断片長が606ｂｐであった点を除いて、上のペプチド10の突然変異生成で説明したのと同じ一般的方法で行った。連結した断片は長さ894ｂｐで、AvrIIおよびPf1MIで消化して同じように消化されたｐＣＩＦ８にクローニングした。
【０１３８】
正しい配列のクローンを各変異体から１つ選択し、その活性と発現レベルを前記同様分析した。トランスフェクションは２組で行い、上清はプールしてから検定に供した。
【０１３９】
上記変異体の発現レベルと活性の比較により、発現レベルおよび活性に実質的に影響せずに各種変更が可能であることが明らかになった。これらのデータは図７で示す。Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｎ、Ｐ、ＳまたはＴへのV823の変更により、最低でもwt VIII因子と同等の発現と活性を有する変異体が形成された。従って、これらの突然変異はペプチド７と関連するＴ細胞エピトープの除去に役立つ。
【０１４０】
（実施例３）
突然変異を含むFVIII由来ペプチド類が合成されて、ex vivo検定によりそのＴ細胞増殖を継続的に促進する能力が試験された。これらのペプチドは15量体の配列であり、M1013Kと組み合わせてI1011AまたはI1011T置換を試験できるように設計されていた。これらのペプチドは、以前に野生型ペプチド配列に反応することが示された４つのＰＢＭＣドナーサンプルを使用して試験された。全ての例で、試験された変異体ペプチドはＳＩ＞2.0となって増殖を刺激することができなかった。ドナーとペプチド配列のアロタイプ詳細を含むこの検定の結果を図８に示す。
【０１４１】
ＰＢＭＣは、96穴平底プレートを使用し、１穴あたり２×１０6のＰＢＭＣ密度で、タンパク質およびペプチドの抗原で刺激した。ＰＢＭＣは、37℃で７日間培養し、その後3Ｈ−チミジンを適用した。ペプチドを特定の置換で生成し、各ペプチドは、事前にFVIII Ｐ８ペプチド配列に反応することが示された４名の健康ドナーから分離されたＰＢＭＣに対して個々にスクリーニングした。インフルエンザ血球凝集素由来のコントロールペプチドおよび強力な非リコール抗原キーホールリンペットヘモシアニン(ＫＬＨ）を各ドナー検定で使用した。
【０１４２】
ペプチドをＤＭＳＯに溶かして最終濃度10ｍＭにし、これらの原液は次にAIM V培地で１／500に希釈した(最終濃度20μＭ)。ペプチドを平底96穴プレートに加えて最終濃度を100μｌ中で２μＭおよび20μＭとした。解凍したＰＢＭＣの生存能力をトリパンブルー色素排除によって評価し、次に細胞を２×１０6／ｍｌの密度で再懸濁し、100μｌ(２×１０5ＰＢＭＣ／穴)をペプチドが含まれる各穴に移した。各ペプチド濃度に対して３穴の培養を検定した。プレートは５％ＣＯ2の加湿条件下で、37℃で７日間培養した。細胞は、18〜21時間１μＣｉ3Ｈ−Ｔｈｙ／穴を適用した後、フィルターマット上に収穫した。ＣＰＭ値は、ウォーレス・マイクロプレート・ベータ・トップ・プレート計数器(パーキン・エルマー)を使って測定した。結果は、試験ペプチドに対するＣＰＭ値を無処理穴のＣＰＭ値で割ることによって、刺激指数として表された。２を超える刺激指数は、増殖陽性とされる。
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１】潜在的なヒトＭＨＣクラスII結合活性を有するヒトVIII因子内のペプチド配列のリストである。
【図２】プールされたペプチドをスクリーニングするスキームを表す。
【図３】FVIII由来合成ペプチドによる処置に対する、in vitro Ｔ細胞増殖アッセイの結果を表しているヒストグラムである。
【図４】FVIII由来合成ペプチドによる処置に対する、in vitro Ｔ細胞増殖アッセイの結果を表しているヒストグラムである。
【図５Ａ】FVIII由来合成ペプチドによる処置に対する、in vitro Ｔ細胞増殖アッセイの結果を表しているヒストグラムである。
【図５Ｂ】FVIII由来合成ペプチドによる処置に対する、in vitro Ｔ細胞増殖アッセイの結果を表しているヒストグラムである。
【図６】ペプチド８(Ｐ８)の変異体の活性データとタンパク質発現レベルを示しているグラフである。
【図７】ペプチド７(Ｐ７)の変異体の活性データとタンパク質発現レベルを示しているグラフである。
【図８】wt配列ペプチドが刺激指数＞2.0を示す条件下で＜2.0の刺激指数を示す変異体ペプチドを示している典型的なＴ細胞アッセイデータである。
【図９】ペプチドＭＨＣクラスII結合のソフトウェアによるシミュレーションを用いて得られた結果を表したものである。
【図１０】野生型(ＷＴ)Ｂ−ドメイン欠失ヒトFVIII配列のアミノ酸配列と番号付けを示す。
【図１】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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