(57)【要約】本発明は、微生物の診断、特に歯周炎または虫歯として知られている疾患に関連した微生物の検出に関する。この情報は、ハイブリダイゼーションおよび増幅方法、特に、配列特異的プローブまたはプライマーによる組み合わされた増幅／ハイブリダイゼーション法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
歯周炎および齲食関連細菌を検出する方法であって、
歯周炎もしくは齲食関連細菌のゲノム断片であるか、または該断片と相補的である検出されるべき核酸を、配列および／または種特異的核酸プローブにハイブリダイズする工程、ならびに、その後、検出されるべき核酸または該検出されるべき核酸と配列特異的核酸プローブとのハイブリダイゼーションを検出する工程を含み、
該配列特異的核酸プローブが、配列番号：1〜28の配列から選択されるかもしくは該配列と相補的であるか、またはそれらの断片であるかもしくは該断片と相補的であるか、または該配列もしくは該相補的配列のいずれかを含むことを特徴とする、方法。
【請求項２】
配列特異的核酸プローブが、配列番号：14〜28の配列から選択されるかもしくは該配列と相補的であるか、またはそれらの断片であるかもしくは該断片と相補的であるか、または該配列もしくは該相補的配列のいずれかを含むことを特徴とする、請求項1記載の方法。
【請求項３】
検出されるべき核酸が増幅産物であり、該増幅が、配列特異的増幅プライマーを用いて実施されることを特徴とする、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
検出されるべき核酸が増幅産物であり、少なくとも1つの増幅プライマーが、配列番号：1〜28の配列から選択されるかもしくは該配列と相補的であるか、またはそれらの断片であるかもしくは該断片と相補的であるか、または該配列もしくは該相補的配列のいずれかを含むことを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
【請求項５】
少なくとも1つの増幅プライマーが、配列番号：1〜13の配列から選択されるかもしくは該配列と相補的であるか、またはそれらの断片であるかもしくは該断片と相補的であるか、または該配列もしくは該相補的配列のいずれかを含むことを特徴とする、請求項4記載の方法。
【請求項６】
核酸プローブが固定化されていることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
検出されるべき核酸が標識化されていることを特徴とする、請求項6記載の方法。
【請求項８】
核酸プローブが標識化され、且つ検出されるべき核酸が固定化されていることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
歯周炎および齲食関連細菌を検出する方法であって、
歯周炎もしくは齲食関連細菌のゲノム断片であるか、または該断片と相補的である検出されるべき核酸を増幅する工程であり、該増幅が、その少なくとも1つが本質的に該検出されるべき核酸の部分配列である配列を有するプライマーを用いて行われる工程；ならびに
その後、増幅された検出されるべき核酸を検出する工程を含み、
該プライマーの配列が、配列番号：1〜28の配列から選択されるかもしくは該配列と相補的であるか、またはそれらの断片であるかもしくは該断片と相補的であるか、または該配列もしくは該相補的配列のいずれかを含むことを特徴とする、方法。
【請求項１０】
少なくとも2つのプライマーが、本質的に検出されるべき核酸の部分配列である配列を有し、該プライマーの配列が、配列番号：1〜28の配列から選択されるかもしくは該配列と相補的であるか、またはそれらの断片であるかもしくは該断片と相補的であるか、または該配列もしくは該相補的配列のいずれかを含むことを特徴とする、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
1つまたは複数のプライマーが、本質的に検出されるべき核酸の部分配列である配列を有し、該プライマーの配列が、配列番号：1〜13の配列から選択されるかもしくは該配列と相補的であるか、またはそれらの断片であるかもしくは該断片と相補的であるか、または該配列もしくは該相補的配列のいずれかを含むことを特徴とする、請求項9または10記載の方法。
【請求項１２】
増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて行われることを特徴とする、請求項9〜11のいずれか1項記載の方法。
【請求項１３】
プライマーが標識化されていることを特徴とする、請求項9〜12のいずれか1項記載の方法。
【請求項１４】
歯周炎および齲食関連細菌を検出する装置であって、1つまたは複数の配列および／または種特異的核酸プローブが固定化された固相を含み、該配列特異的核酸プローブが、配列番号：1〜28の配列から選択されるかもしくは該配列と相補的であるか、またはそれらの断片であるかもしくは該断片と相補的であるか、または該配列もしくは該相補的配列のいずれかを含むことを特徴とする、装置。
【請求項１５】
配列特異的核酸プローブが、配列番号：14〜28の配列から選択されるかもしくは該配列と相補的であるか、またはそれらの断片であるかもしくは該断片と相補的であるか、または該配列もしくは該相補的配列のいずれかを含むことを特徴とする、請求項14記載の装置。
【請求項１６】
配列および／または種特異的核酸プローブが、リンカーを介して、装置の固相に結合されている、請求項14または15記載の装置。
【請求項１７】
配列番号：1〜28の配列から選択されるかもしくは該配列と相補的であるか、またはそれらの断片であるかもしくは該断片と相補的であるか、または該配列もしくは該相補的配列のいずれかを含む、核酸。
【請求項１８】
請求項17記載の1つまたは複数の核酸を含む、歯周炎および齲食関連細菌を検出するキット。
【請求項１９】
請求項17記載の1つまたは複数の核酸を含む、歯周炎もしくは齲食関連細菌のゲノム断片であるかまたは該断片と相補的である検出されるべき核酸を増幅するキット。
【請求項２０】
歯周炎もしくは齲食関連細菌のゲノム断片であるかまたは該断片と相補的である検出されるべき核酸を増幅するキットであり、配列番号：1〜13の配列から選択されるかもしくは該配列と相補的であるか、またはそれらの断片であるかもしくは該断片と相補的であるか、または該配列もしくは該相補的配列のいずれかを含む1つまたは複数の核酸を含む、キット。
【請求項２１】
歯周炎および齲食関連細菌を検出するための、請求項14〜16のいずれか1項記載の装置の使用。
【請求項２２】
歯周炎および齲食関連細菌を検出するための、請求項17記載の核酸の使用または請求項18〜20のいずれか1項記載のキットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の診断分野、特に歯周炎および齲食障害に関連する細菌の検出に関する。より具体的には、本発明は、配列特異的プローブおよびプライマーを各々使用する、ハイブリダイゼーション法および増幅法、ならびに組み合わされた増幅／ハイブリダイゼーション法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌の検出および正確な同定は、適当な治療の導入を可能にするために歯周療法学において非常に重要な役割を果たしている。
【０００３】
歯周炎は、歯を支える器官(tooth holding apparatus)の感染障害である。歯の硬組織と歯周組織の軟組織の間の移行領域は、微生物感染の理想的条件を提供する。免疫防御の機能は、歯周組織を、微生物により分泌された病原性物質の損傷作用から保護する。免疫適格の宿主は、毎日の微生物の攻撃をうまく回避することが可能であり、その結果感染、すなわち歯周組織内の繁殖を防止する。歯周の炎症は、微生物により放出された毒素に対する局所反応である。感染の第一相において、微生物のプラーク由来のおよび口腔の液体由来の酵素および細胞毒性代謝産物は、その組織を変更する。この組織の免疫応答は、組織-破壊性物質に対する最初の抵抗を示すが、歯肉組織部分の破壊を生じる多くの機構を含んでいる。3種の高度に歯周炎に関連した細菌種アクチノバシラス・アクチノマイセテムコミタンス(Actinobacillus actinomycetemcomitans)、ポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)、およびバクテロイデス・フォルシサス(Bacteriodes forsythus)は、歯周炎の発生において非常に重要であると見なされている。他の細菌であるカンピロバクター・レクタス(Campylobacter rectus)、フゾバクテリウム・ヌクレアタム(Fusobacterium nucleatum)、プレボテラ・インテルメディア(Prevotella intermedius)、エイケネラ・コロデンス(Eikenella corrodens)、ストレプトコッカス・インターメジウス複合体(Streptococcus intermedius-complex)、およびトレポネーマ・デンチコーラ(Treponema denticola)などは、より程度の低い歯周炎関連細菌であると考えられる。進行性のポケットは、非常に多数の歯周病原性の微生物を含むが、健康な組織は、含んだとしても極少数のそれを含んでいる。微生物(germ)またはそれらの毒素(例えば、プロテアーゼ、コラゲナーゼなど)を除去することは、病理学的に臨床的重要性につながる。従って微生物診断は、治療設計、特に抗生物質の投与が意図される場合において、重要な役割を果たしている。治療制御においても、歯周病原性細菌の検出が、時には治療成功の唯一の指標となることがある。別の医学的に重要な歯の感染症は、糖質-発酵細菌により引き起こされる。ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)およびストレプトコッカス・ソルビナス(Streptococcus sobrinus)種と称される連鎖球菌は、ここで特に重要である。粘着性の糖質ポリマーの形成のために、両生物は、滑らかな歯の表面にうまく接着し、酸の生成によりその場の象牙質エナメルを破壊することができる。この過程は、更に先進国におけるショ糖の高消費により助けられる。
【０００４】
近年、核酸増幅反応において非常に種特異的なプライマーを使用することにより生物を検出するために、重要な発明がなされている。これは通常、ELISA技術に類似した、ゲル電気泳動またはマイクロタイタープレート内に固定化されたプローブによる検出に関連している。残念なことに、これらの方法は、多くの可能性のある病原性生物から1種または複数を検出するように行う場合には、適していない。高度に複雑で、多様性が大きくおよび増殖条件が困難である細菌群(例えば、偏性嫌気性菌)は、特に古典的培養鑑別により評価することが非常に困難であり、および／またはそれらの緩徐な増殖のために、かなり診断が遅れる。高い特異性および感度により鑑別される核酸ベースの方法は、当技術分野では革命的なものである。
【発明の開示】
【０００５】
従って本発明の目的は、歯周炎および齲食関連細菌の検出のために高特異性および高感度の方法を提供することである。
【０００６】
この目的は、本発明に従い、歯周炎および齲食関連細菌を検出する方法により達成された。本発明の方法は、歯周炎もしくは齲食関連細菌のゲノム断片であるかまたは該断片と相補的である、検出されるべき核酸を、配列および／または種特異的核酸プローブにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする工程、ならびに、その後、検出されるべき核酸または検出されるべき核酸の配列特異的核酸プローブへのハイブリダイゼーションを検出する工程を含み、配列特異的核酸プローブが、配列番号：1〜28の配列から選択されるかもしくは該配列と相補的であるか、またはそれらの断片であるかもしくは該断片と相補的であるか、または該配列もしくは該相補的配列のいずれかを含むことを特徴とする。
【０００７】
この本発明の態様は、以後単にハイブリダイゼーション法と称す。ハイブリダイゼーション法という用語は、全ての好ましい態様を含む。
【０００８】
本発明において核酸およびオリゴヌクレオチドという用語は、検出されるべきプライマー、試料、プローブおよびオリゴマー断片を意味する。核酸およびオリゴヌクレオチドという用語は更に、総称的にポリデオキシリボヌクレオチド(2-デオキシ-D-リボースを含む)およびポリリボヌクレオチド(D-リボースを含む)またはプリン塩基もしくはピリミジン塩基のN-グリコシドである他の種類のポリヌクレオチドを意味する。本発明において、PNAS、すなわちプリン／ピリミジン塩基を有するポリアミドも含まれる。本発明において、核酸およびオリゴヌクレオチドという用語は、異なるものと見なされず；より詳細に述べると、この用語の使用は、長さに関する差異に関わることは意図されていない。この用語は、二本鎖DNAおよび一本鎖DNAならびに二本鎖RNAおよび一本鎖RNAの両方を含む。
【０００９】
本発明に従い、検出されるべき核酸またはそれらの一部を含有する組成物は、1種または複数のプローブにハイブリダイズされる。原理的に、単独の特異的プローブとのハイブリダイゼーションにより、検出されるべき核酸、その結果例えば、細菌種を決定することが可能である。しかし検出されるべき核酸またはそれらの一部を含有する組成物を、1種よりも多いプローブとハイブリダイズし、これにより本方法の意義を増大することも可能である。その後正確なプロファイルが得られ、検出されるべき核酸、その結果例えば細菌種を、非常に信頼性のあるように決定することが可能になる。
【００１０】
当業者は、本発明の内容から始め、更に本発明のプローブからわずかに逸脱しているがそれにも関わらず機能するプローブをデザインすることが可能であることを理解する。従って考えられるプローブは、配列番号：1〜28の配列を有する本発明のプローブと比較して、少なくとも1個、2個または3個のヌクレオチドが、5'および／または3'末端で延長されたまたは切断されたものである。同様に、プローブの特異性およびプローブの融解温度がひどく変更されない限りは、プローブの個々のまたは数個のヌクレオチドは、他のヌクレオチドと交換することができることが考えられる。これは、修飾されたプローブの融解温度が、当初のプローブの融解温度から余り大きく逸脱しないような修飾を含む。融解温度は、G(＝4℃)＋C(＝2℃)ルールに従い決定される。当業者には、通常のヌクレオチドA、G、CおよびTに加え、イノシンなどの修飾されたヌクレオチドの使用が可能であることも明らかであろう。本発明の内容は、「特許請求の範囲」の主題から出発し、このような修飾を提供する。
【００１１】
ハイブリダイゼーションという用語は、相補的塩基対形成に帰する、2個の一本鎖核酸による二重鎖構造の形成を意味する。ハイブリダイゼーションは、相補的核酸鎖間または比較的小さいミスマッチ領域を有する核酸鎖間で生じることができる。核酸二重鎖の安定性は、融解温度Tmにより測定される。融解温度Tmは、塩基対の50％が解離されている温度(規定されたイオン強度およびpHにおいて)である。
【００１２】
完全に相補的な核酸だけがハイブリダイズする条件は、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件と称される。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、当業者に公知である(例えば、Sambrookら、1085、「Molecular Cloning-  A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory社、コールドスプリングハーバー、NY)。一般にストリンジェント条件は、規定されたイオン強度およびpHで、特異的配列のTmよりも5℃低い融解温度になるように選択される。ハイブリダイゼーションが、低いストリンジェント条件下で行われる場合、配列のミスマッチは容認される。ハイブリダイゼーション条件を変更することにより、配列ミスマッチの程度を制御することが可能である。
【００１３】
ハイブリダイゼーション法の実施は、それ自身当業者に公知である。従って、ハイブリダイゼーションパートナーを含み得る溶液とのインキュベーション後、これらの固相は通常、非特異的に結合した核酸分子を除去するために、ストリンジェント条件に曝される。ハイブリダイゼーションは、常法において、ナイロンまたはニトロセルロース膜上で行うことができる(Sambrookら、「Molecular Cloning」、Cold Spring Harbor Laboratory社、1989)。ここで言及された原理は、当業者により、他の態様に変更することができる。
【００１４】
ストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションの実施は、本発明の方法にとって特に重要である。本発明におけるストリンジェントとは、その検出法が、その小片の反応野(reaction field)において、陽性反応と陰性反応の間の曖昧でない識別を可能にすることを意味する。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、下記の測定により改善することができる：
プローブ構造：プローブの標的配列相補的構造の長さを介して；好ましくは15〜20merである。
泳動緩衝液：塩含量は、ストリンジェンシーに影響を及ぼす。イオン強度は、好ましくは100〜500mMであり、特に好ましくは250mMである。
更に、泳動緩衝液(DMSO、ホルムアミド、尿素)中の物質をゆるやかに変性することにより、ストリンジェンシーを個別に調節および最適化することが可能である。ストリンジェンシーは、泳動緩衝液のpHによっても影響を受ける。
【００１５】
標的核酸の長さも、ハイブリダイゼーション感度に重要な役割を果たす。好ましくは、100〜500塩基対の長さの核酸鎖である。好ましくは、二本鎖標的核酸は、ハイブリダイゼーション前に変性されなければならない。これは、通常塩基性化学物質により、または二本鎖構造に寄与する水素結合を加熱、融解することにより作用を受ける。好ましい塩基性化学物質は、NaOHであり、濃度は0.1〜0.5Mである。特に好ましくは、濃度0.25 M NaOHである。核酸水溶液の少なくとも95℃への加熱およびその後の4℃への急冷は、同様に一本鎖構造を形成する。例えばNASBA反応の産物としての一本鎖アンプリコンは、分子内構造を融解するために、ハイブリダイゼーション前に同様に変性されなければならない。RNAの高pHに対する感受性のために、変性は、例えばDMSOまたはホルムアミドなどの穏やかな変性化学物質により作用を受けることが好ましい。
【００１６】
標的配列およびプローブの構造の他に、望ましいハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション緩衝液およびストリンジェンシー洗浄緩衝液の組成により決定される。使用されるハイブリダイゼーション緩衝液は、通常塩含量0.1〜0.5MおよびpH 7.5〜8.0を有する水性緩衝液である。プローブ-保持相の良好な湿潤のために、界面活性剤が使用される。ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)濃度0.1〜7％が好ましい。特に好ましい高濃度7％で、SDSは、酵素複合体の非特異的結合を抑制することにより、シグナル／バックグラウンド比に関して更なる有益な作用をもたらす。好ましくは、ハイブリダイゼーション後のストリンジェンシー洗浄緩衝液とのインキュベーションであり、これは低いイオン強度のために二本鎖を脱安定化する。従って100％相補的でないハイブリッドは、再度分離される。G/CおよびA/T対の結合強度を調節するために、ハイブリッドの水素結合に影響を及ぼす化学物質(例えば、テトラメチルアンモニウムクロリド)を添加することが可能であり、これは複合のプローブシステムにおいておそらく有利である。
【００１７】
ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイゼーションの程度は、本発明に従い、通常固相へ結合された標識の量を決定することにより決定され、標識は、プローブまたは検出されるべき核酸のいずれかに結合されている。この種の検出反応および検出方法は、それ自身当業者に公知である。
【００１８】
本方法の好ましい態様において、配列特異的核酸プローブは、配列番号：14〜28の配列から選択されるかもしくは該配列と相補的であるか、またはそれらの断片であるかもしくは該断片と相補的であるか、または該配列もしくは該相補的配列のいずれかを含む。
【００１９】
本発明の方法の好ましい態様は、検出されるべき核酸が増幅産物であり、増幅が配列特異的増幅プライマーを使用し実施されることを特徴としている。特に好ましくは、少なくとも1種の増幅プライマーが、配列番号：1〜28の配列から選択されるかもしくは該配列と相補的であるか、またはそれらの断片であるかもしくは該断片と相補的であるか、または該配列もしくは該相補的配列のいずれかを含むことである。最も好ましくは、少なくとも1種の増幅プライマーが、配列番号：1〜13の配列から選択されるかもしくは該配列と相補的であるか、またはそれらの断片であるかもしくは該断片と相補的であるか、または該配列もしくは該相補的配列のいずれかを含むことである。
【００２０】
増幅プライマーは、固定化されたプローブとの組み合わせにおいて、増幅産物が良好な立体的条件を有するような方法で選択されなければならない。分子内のフォールディングを生じることがあるパリンドローム構造は、適当なプライマーを選択することにより避けることができる。ハプテンによる標識の場合、プローブ／標的核酸ハイブリッド内のハプテン(例えば、ビオチン)の空間的配置は、重要である。抗体酵素複合体について、ハプテンは容易にアクセス可能でなければならない。
【００２１】
本方法の1つの態様は、核酸プローブが固定化されていることを特徴としている。この場合、検出されるべき核酸が標識化されていれば利点となる。この方法の別の形において、核酸プローブは標識される。この場合、検出されるべき核酸が固定化されていれば利点となる。
【００２２】
従って本発明は更に、歯周炎および齲食関連細菌を検出する方法に関し、
歯周炎もしくは齲食関連細菌のゲノム断片であるか、または該断片と相補的である検出されるべき核酸を増幅する工程であり、増幅が、本質的に検出されるべき核酸の部分配列である配列を有する少なくとも1種のプライマーを用いて行われる工程；ならびに
その後、増幅された検出されるべき核酸を検出する工程を含み、
プライマーの配列が、配列番号：1〜28の配列から選択されるかもしくは該配列と相補的であるか、またはそれらの断片であるかもしくは該断片と相補的であるか、または該配列もしくは該相補的配列のいずれかを含むことを特徴とする。この本発明の態様は、以後単に増幅法と称される。増幅法という用語は、全ての好ましい態様を含む。
【００２３】
当業者は、本発明の内容から出発し、本発明のプライマーからわずかに逸脱しているがそれにもかかわらず機能するプライマーをデザインすることも可能であることを理解している。従って考えられるプライマーは、本発明のプライマーと比べ、5'および／または3'末端で、少なくとも1個、2個または3個のヌクレオチドにより、伸長または切断されているものである。特に本発明に従い使用することができる依然として機能的なプライマーを提供するために、プライマーの5'末端で、伸長または切断することが可能である。同様に、プライマーの個別のまたは数個のヌクレオチドを、プライマーの特異性およびプライマーの融解点が余り変わらない限りは、他のヌクレオチドと交換することができるとも考えられる。当業者には、通常のヌクレオチドA、G、CおよびTに加え、イノシンなどの修飾されたヌクレオチドの使用も可能であることことは明らかである。本発明の内容は、「特許請求の範囲」の主題から始まるそのような修飾を提供する。
【００２４】
最も好ましくは、少なくとも2つのプライマーが、本質的に検出されるべき核酸の部分配列である場合に、プライマーの配列が、配列番号：1〜28の配列から選択されるかもしくは該配列と相補的であるか、またはそれらの断片であるかもしくは該断片と相補的であるか、または該配列もしくは該相補的配列のいずれかを含むような、本発明の増幅方法である。
【００２５】
特に好ましくは、本質的に検出されるべき核酸の部分配列である配列を有するプライマーであり、プライマーの配列は、配列番号：1〜13の配列から選択されるかもしくは該配列と相補的であるか、またはそれらの断片であるかもしくは該断片と相補的であるか、または該配列もしくは該相補的配列を含む。本発明に従って、標識されているプライマーが好ましい。
【００２６】
下記の説明は、本発明のハイブリダイゼーション法および本発明の増幅法の両方、ならびに組み合わされた増幅／ハイブリダイゼーション法にも適用される。特に好ましくは、組み合わされた増幅／ハイブリダイゼーション法である。この場合増幅は、本発明の配列特異的プライマーを用いて実施され、およびこの方法で得られた増幅産物は、本発明の配列特異性プローブを用いて検出される。この「多重式方法」は、特に細菌を同定および識別するために非常に有用である。
【００２７】
様々な反応を、核酸増幅反応として利用することができる。好ましくは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の使用である。PCR技術の様々な態様は、当業者には公知であり、例えばMullis、「Target amplification for DNA analysis by the polymerase chain reaction」、Ann. Biol Chem、(パリ)、48(8):579-582(1990)を参照のこと。適用することができる更なる増幅技術には、「核酸鎖ベースの増幅(Nucleic acid strand-based amplification)」(NASBA)、「トランスクリプターゼ媒介型増幅(transcriptase mediated amplification)」(TMA)、「逆転写ポリメラーゼ連鎖反応」(RT-PCR)、「Q-βレプリカーゼ増幅」(β-Q-レプリカーゼ)、および「一本鎖交換増幅(single strand displacement amplification)」(SDA)がある。NASBAおよび他の転写ベースの増幅法は、ChanおよびFox、Reviews in Medical Microbiology、10(4):185-196(1999)において考察されている。
【００２８】
検出されるべき核酸を検出する最も簡単な形は、例えば制限酵素での消化により、アンプリコンを特異的に切断すること、およびアガロースゲル上で作成された臭化エチジウム染色した断片を分析することを含む。ハイブリダイゼーションシステムも、非常に一般的である。このハイブリダイゼーションは、通常増幅産物を含有する組成物もしくはそれらの一部またはプローブのいずれかの固相上の固定化、ならびにそれの各場合における他のハイブリダイゼーションパートナーとの接触により実施される。可能性のある固相は、非常に多様な材料であり、例えば、ナイロン、ニトロセルロース、ポリスチレン、シリカ系(silicatic)材料などである。固相としてのマイクロタイタープレートの使用も考えられる。これも、標的配列を、事前に溶液中の捕獲プローブにハイブリダイズし、およびその後捕獲プローブが固相に結合することが含まれる。
【００２９】
通常、検出されるべき核酸の増幅は、少なくとも1つの標識されたプローブまたは少なくとも1つの標識されたプライマーが関与する。
【００３０】
本発明の方法の1つの態様において、核酸プローブは、固相上に固定化され、および固相はその後、検出されるべき標識された核酸またはそれらの一部を含有する組成物と接触される。好ましくは、少なくとも2種のプローブ、より好ましくは少なくとも5種のプローブ、更により好ましくは少なくとも10種のプローブの固相上への固定化である。異なるプローブは、異なるゾーンに固定化され得る。検出されるべき核酸またはそれらの一部を含む増幅産物または試料を、この方法で調製され、固定化されたプローブを含む固相と共にインキュベーションすることにより、1回のハイブリダイゼーション工程により、増幅産物の全ての固定化されたプローブとのハイブリダイゼーションに関する情報を得ることが可能である。従って固相は、好ましくは、固相上に固定化されたプローブのマイクロアレイである。この種の「DNAチップ」は、多数の様々なオリゴヌクレオチドが小さい領域に固定化されることを可能にする。DNAチップに適した固相は、好ましくは、ガラスなどの、シリカ系材料を含む。この態様において、プライマー標識は、蛍光標識であることが好ましい。検出されるべき核酸またはそれらの一部を含む増幅産物または試料とインキュベーションした後、走査装置を用い、DNAチップの迅速な分析が可能になる。このような装置は、当業者に公知である。チップ技術の検証は、McGlennen、「Miniaturization technologies for molecular diagnostics」、Clin Chem、47(3):393-402(2001)に見ることができる。
【００３１】
本発明の方法のこの態様において、検出されるべき核酸は標識される。ここでは非常に多様な標識が可能であり、例えば蛍光色素、ビオチンまたはジゴキシゲニンなどがある。
【００３２】
公知の蛍光標識は、フルオレセイン、FITC、シアニン色素、ローダミン、ローダミン600Rフィコエリスリン、テキサスレッドなどである。例えば125I、35S、32P、35Pなどの放射性標識も考えられる。
【００３３】
例えばラテックスのような、粒子標識も考えられる。このような粒子は、通常乾燥しており、μmの範囲でありかつ均一である。
【００３４】
これらの標識は、通常オリゴヌクレオチドに共有結合している。例えば蛍光標識は直接検出される一方で、ビオチンおよびジゴキシゲニン標識は、適当な結合分子または複合されたパートナーと共にインキュベーションした後検出することができる。ビオチン／ストレプトアビジン以外の結合パートナーの例は、抗原／抗体システム、ハプテン／抗ハプテンシステム、ビオチン／アビジン、葉酸／葉酸結合タンパク質、相補的核酸、プロテインA、Gおよび免疫グロブリンなどがある(M.N. Bobrovら、J. Immunol. Methods、125:279(1989))。
【００３５】
例えば、ビオチンで標識されたオリゴヌクレオチドを、酵素に結合したストレプトアビジンを含有する溶液と接触することにより、これを検出することが可能であり、酵素は、例えばペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼであり、これは色素を生成する基質を転換するかまたは化学発光を生じる。この使用目的に関して可能性のある酵素は、加水分解酵素、リアーゼ、酸化還元酵素、転移酵素、異性化酵素およびリガーゼがある。更なる例は、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、リン酸化酵素、エステラーゼおよびグリコシダーゼがある。この種の方法はそれ自身当業者に公知である(Wetmur JG、Crit Rev Biochem Mol Biol、(3-4):227-59(1991)；Temsamani J.ら、Mol Biotechnol、5(3):223-32(1996年6月))。酵素が複合体パートナーとして作用する一部の方法においては、色を変化する物質が存在しなければならない(Tijssen, P.、「Practice and Theory of Enzyme Immunoassays in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology」、R.H. BurtonおよびP.H. van Knippenberg編集、(1998))。
【００３６】
別の好ましい複合体は、抗体に結合された酵素を含む(Williams、J. Immunol. Methods,、79:261(1984))。更に、検出されるべき核酸を金-ストレプトアビジン複合体で標識し、ビオチン標識オリゴヌクレオチドを検出可能にすることが一般的である。しかし、例えばマレイミドおよびハロゲン化アセチル誘導体のようなスルフヒドリル-反応性基、ならびにイソチオシアナート、スクシンイミジルエステルおよびハロゲン化スルホニルのようなアミン反応性基などの互いに共有結合を形成する結合パートナーも考えられる。
【００３７】
検出されるべき核酸が標識される場合、その結果これらのプローブは通常標識されない。検出されるべき核酸は、本質的に先行技術において説明された方法に従い標識される(米国特許第6,037,127号)。
【００３８】
この標識は、化学的もしくは酵素的方法により、または標識された塩基の検出されるべき核酸への直接組込みにより、検出されるべき核酸へ導入することができる。好ましい態様において、組込まれた標識を有する検出されるべき配列は、検出されるべき核酸の増幅時に、標識された塩基または標識されたプライマーにより作成される。標識されたプライマーは、化学合成により調製することができ、例えば、プライマー合成時に、標識されたホスホロアミダイト塩基をプライマー塩基と置換することによる、ホスホロアミダイト法による。これの代わりに、プライマー合成後に標識が化学的に結合されている修飾された塩基を含むプライマーを調製することが可能である。検出されるべき核酸を増幅することおよび／またはこれに修飾を提供することなく、検出されるべき核酸を標識する方法も可能である。例えばリボソームRNA種は、DNAプローブと特異的にハイブリダイズすることができ、およびRNA/DNA特異的抗体を用い、RNA/DNAハイブリッドとして検出される。
【００３９】
別の可能性は、T4ポリヌクレオチドキナーゼまたはターミナルトランスフェラーゼ酵素の助けによる、標識の導入である。従って放射性標識または蛍光標識を導入することが考えられる(Sambrookら、「Molecular Cloning」、Cold Spring Harbor Laboratory Press社、第2巻、9.34-9.37(1989)；Cardulloら、PNAS、85:8790；Morrison、Anal. Biochem、174:101(1988)。
【００４０】
標識は、検出されるべき核酸の核酸配列の片端または両端に導入することができる。標識は、検出されるべき核酸の核酸配列内部に導入することもできる。複数の標識を検出されるべき核酸に導入することも可能である。
【００４１】
様々な態様において、少なくとも1種のプローブは標識を有する。これらのプローブは、既に検出されるべき核酸の標識において先に例証されたような、先行技術において説明された方法と同じ方法に従い標識される。通常、増幅産物またはその一部を含有する組成物が、固相上に固定化され、ならびに少なくとも1種のプローブを含有する組成物と接触される。同じくこの態様において、好ましくは1種よりも多いプローブとのハイブリダイゼーションの実施である。この目的のために、検出されるべき核酸を含む増幅産物または試料が固定化された複数の固相が提供される。しかし複数の空間的に分離された領域で、固相上に少量の増幅産物を固定化することも可能である。次にこれらの異なるスポットは、各場合に異なるプローブと接触(ハイブリダイゼーション)される。
【００４２】
本発明は更に、1個または複数の配列および／または種特異的核酸プローブが固定化されている固相を備える、歯周炎および齲食関連細菌を検出する装置に関し、これは、配列および／または種特異的核酸プローブが、配列番号：1〜28の配列から選択されるかもしくは該配列と相補的であるか、またはそれらの断片であるかもしくは該断片と相補的であるか、または該配列もしくは該相補的配列のいずれかを含むことを特徴としている。本発明に従って、好ましくは、配列番号：14〜28の配列から選択されるかもしくは該配列と相補的であるか、またはそれらの断片であるかもしくは該断片と相補的であるか、または該配列もしくは該相補的配列のいずれかを含む配列特異的核酸プローブである。複数のオリゴヌクレオチドが固定化される場合、オリゴヌクレオチドは、固相上に空間的に分離された様式で存在する。この固相は、DNAチップの形でデザインされることが好ましい。
【００４３】
本発明の装置の固相は、クロマトグラフィー材料であってもよい。被検体は主として親水性であるので、試験ストリップのクロマトグラフィー材料の親水性の特性は、本発明の方法を実施する上で重要である。クロマトグラフィー材料は、シリカ系材料、硫酸マグネシウムおよびアルミニウムなどの無機粉末を含むことができ、ならびに更に合成または改質された天然の高分子、例えばニトロセルロース、酢酸セルロース、セルロース、ポリ塩化ビニルまたはポリ酢酸ビニル、ポリアクリルアミド、ナイロン、架橋したデキストラン、アガロース、ポリアクリレートなどを含むことができ、ならびに更にセラミック材料およびガラスのような被覆された材料を含んでもよい。最も好ましくは、クロマトグラフィー材料としてのニトロセルロースの使用である。加えて、ニトロセルロースまたはナイロン膜への正に帯電したイオン基の導入は、例えばクロマトグラフィー材料の親水特性を改善することができる。
【００４４】
クロマトグラフィー材料は、ハウジング内などに収容することができる。ハウジングは通常、水に不溶性で、硬質であり、ならびに有機および無機材料の多様性を備えることができる。ハウジングはクロマトグラフィー材料の毛管特性を妨害しないこと、ハウジングは被験成分に非特異的に結合しないこと、およびハウジングが検出システムを妨害しないことが重要である。
【００４５】
配列および／または種特異的核酸プローブが、装置の固相にリンカーを介して結合した場合に、本発明の装置は好ましい。このリンカーは、プローブと膜の間のスペーサーとして作用する。本方法においてリンカーは、通常5'または3'末端でプローブの標的配列相補的部分に広がるが、それ自身は非コードであるポリマーである。これらは、非コード核酸構造の塩基配列、または例えばポリエーテル、ポリエステルなどのような他のポリマー単位であることができる。リンカーの性質は、これらがプローブのハイブリダイゼーション特性に有害に作用することがないかまたは単に弱く作用するようでなければならない。これは、自己相補的構造が存在しないことにより避けることができる。プローブの支持体材料への不可逆的結合のための化学的な前条件も存在しなければならない。プローブの適当な機能のための重要な要件は、標的配列と安定したハイブリッドを形成するその特性に加え、表面への結合の化学である。使用された固定化技術により可能な不可逆的結合を形成するような化学基が、存在しなければならない。このような基は、アミン基、チオール基、カルバミド、スクシンイミドなどであってよい。
【００４６】
しかし、プローブと膜の間にスペーサーまたはリンカーを形成する他の可能性も、当業者に公知である。プローブオリゴヌクレオチドは、例えば、タンパク質を介して膜表面に結合することができる。プローブにより帯電されたタンパク質は、その後常法に従い、多孔質膜に結合することができる。この常法の例は、ホモ二官能性結合剤またはヘテロ二官能性結合剤による結合である。ホモ二官能性のものは、同じ反応性基を有する。これらは典型的には、アミンおよび／またはチオールである。チオールは、合成により直接オリゴヌクレオチドへ結合することができ、ならびに例えば酸化的条件下でシステイン残基と反応し、ジスルフィド橋を生じることができる。アミン-アミン結合に関して、アミンは、ホモ二官能性結合剤として、合成的に直接オリゴヌクレオチドへ結合し、かつイミドエステルまたはスクシンイミドエステルを介して表面またはタンパク質へ結合することができる。ヘテロ二官能性結合剤は、異なる反応性基を有し、かつ様々な官能基の結合をもたらす。好ましくは、アミノ-チオール結合の形成である。スクシンイミドエステルマレイミドまたはイオドアセトアミドの両方を含むヘテロ二官能性結合剤を使用し、チオール化されたオリゴヌクレオチドに結合することができる。別の重要な結合剤は、カルボニルラジカルをアミンに結合するカルボジイミドである。ここで最も重要な代表は、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDAC)である。ここで、アミノ修飾オリゴヌクレオチドのカルボニルラジカルを含む膜への結合が可能である。この化学において、結合剤は、本化合物には組込まれない。
【００４７】
本発明は更に、配列番号：1〜28を持つ配列から選択されるかもしくは該配列と相補的であるか、またはそれらの断片であるかもしくは該断片と相補的であるか、または該配列もしくは該相補的配列のいずれかを含むような核酸に関連している。本発明は更に、1個または複数の本発明の核酸を含む、歯周炎および齲食関連細菌を検出するための組成物またはキットに関連している。本発明は特に、歯周炎もしくは齲食関連細菌のゲノム断片であるか、または該断片と相補的である、検出されるべき核酸を増幅するためのキットに関し、このキットは、1種または複数の本発明の核酸を備えている。
【００４８】
このキットは、本発明の核酸に加え、標的配列を増幅するために必要な成分全て、例えばプライマー、緩衝液システム、酵素などを備えている。
【００４９】
最も好ましくは、歯周炎もしくは齲食関連細菌のゲノム断片であるかまたは該断片と相補的である検出されるべき核酸を増幅するキットであり、このキットは、配列番号：1〜13の配列から選択されるかもしくは該配列と相補的であるか、またはそれらの断片であるかもしくは該断片と相補的であるか、または該配列もしくは該相補的配列のいずれかを含む1個または複数の核酸を含んでいる。
【００５０】
本発明は更に、歯周炎および齲食関連細菌を検出するための本発明の装置の使用にも関する。更に本発明は、歯周炎および齲食関連細菌を検出するための、本発明の核酸または本発明のキットの使用に関する。
【００５１】
検出されるべき核酸は、細菌、特に歯周病原性および齲食関連細菌を含むことが疑われるいずれかの組成物中に存在することができる。これは、例えば、分泌液、歯肉溝液、スワブおよび血液などの原材料であることができる。これは、液体または固形培地において既に増殖された微生物の培養物であってもよい。
【００５２】
増幅産物を、実施例1に説明したように、配列番号：15、19、21、22、25、28、27のプローブにハイブリダイズし、膜に塗布し、ならびにデンシトメーター(Vilber Lourmat、Bio-Profil、Frobel Laborgerate、Lindau、独国)を用い、オートラジオグラフにより評価した。
【００５３】
実施例
実施例1
DNA/RNA単離：
細菌核酸は、固形栄養培地、液体培地または適当な前処理後の原材料のいずれかから得た。
【００５４】
下記の細菌種を試験した：アクチノバシラス・アクチノマイセテムコミタンス、ポルフィロモナス・ジンジバリス、プレボテラ・インテルメディア、バクテロイデス・フォルシサス、トレポネーマ・デンチコーラ、ストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・ソルビナス。この目的のために、細菌材料を、滅菌した接種用白金ループを用い、固形培地から取り出し、10mM Tris/HCl(pH7.5)の300μl中に懸濁した。1mlを液体培地から取り出し、小型卓上遠心機(bench centrifuge)により13000rpmで5分間遠心し、10mM Tris/HCl(pH7.5)の300μl中に再懸濁した。原材料を、「ペーパーポイント」を用い、歯嚢から採取した。この方法で得たスワブを、Thermomixer(Eppendorf社、Hamburg、独国)中で、95℃で15分間インキュベーションし、超音波浴(Bandelin社)で15分間音波処理し、小型卓上遠心機において、13000rpmで10分間遠心した。各場合に、上清5μlを、増幅反応に用いた。
【００５５】
増幅：
全てのプライマーは、商業的に合成された(Interactiva社、Ulm、独国)。前述の微生物の標的配列の増幅に使用したプライマーは、配列番号：1〜13であった。
【００５６】
PCR混合物は、各々、1μMプライマー、200μM dNTP(Roche社)および1UのHotstar Taqポリメラーゼ(Qiagen社、Hilden、独国)を伴う、1xTaq緩衝液(Qiagen社、Hilden、独国)を含んだ。PCR増幅は、サーモサイクラーPE 9600(ABI社、Weiterstadt、独国)を、95℃で15分間；95℃で30分間および60℃で2分間を10サイクル；ならびに95℃で10秒、55℃で50秒および70℃で30秒を20サイクル行った。
【００５７】
NASBA技術によるRNA増幅のために、NucliSens増幅キット(Organon Technika社、Boxtel、オランダ)を、製造業者の指示に従い用いた：
1.増幅混合物の調製：「試薬希釈」緩衝液(反応に必要な酵素を含有する)中に溶解した「試薬スフェア(reagent sphere)」8μl、KCl溶液5μl(最終濃度70mM KCl)、およびプライマー溶液2μl(最終濃度0.5μMプライマー)；
2. RNA溶液5μlを添加し、41℃で60分間水浴中でインキュベーションした。
【００５８】
DNA/RNAアンプリコンは、臭化エチジウムで染色したアガロースゲルまたはハイブリダイゼーションのいずれかにより検出した。
【００５９】
プローブハイブリダイゼーションによるアンプリコン検出：
全てのプローブは、ストレプトアビジンに結合したレポーター酵素を介して標的配列／プローブのハイブリッドを検出することができるように、5'末端でビオチン化した。使用したプローブは、配列番号：14〜28(図2参照)の配列を有するオリゴヌクレオチドである。
【００６０】
ブロット用ペーパー(Blotting Papier GB002、Schleicher & Schull社、Dassel、独国)およびナイロン膜(Biodyne A、Pall、Portsmouth、英国)を、ブロッティング装置(Minifold Schleicher & Schull、Dassel、独国)のサイズに合わせて切断し、10xSSCに含浸した。変性溶液(50mM NaOH；1.5M NaCl)250μlを、集成装置の開口部に最初に導入し、アンプリコン20μlをピペッティングにより添加した。真空にした後、液体全てを、完全に全体に含浸させた。これに続けて、10xSSC緩衝液で洗浄した。完全に乾燥した後、膜をUV架橋剤(UV Stratalinker 2400、Stratagene社、La Jolla、米国)中に、1200ジュール/cm2で固定し、蒸留水で洗浄し乾燥した。
【００６１】
全てのハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーションオーブン(Hybaid Mini Oven MkII、MWGBiotech社、Ebersberg、独国)中のガラスチューブにおいて45℃で行った。DNA/RNAアンプリコンで被覆した膜は、乾燥状態で巻き、ガラスチューブに入れた。その後、この膜を、予め温めたハイブリダイゼーション緩衝液と、定速で回転しながら5分間インキュベーションした。ビオチン化したプローブ2pmol添加後、ハイブリダイゼーション反応を1時間行った。未結合または部分的にのみ結合したプローブは、ストリンジェント緩衝液と45℃で30分間インキュベーションし、この予め温めたストリンジェント緩衝液を1回交換することにより取り除いた。これに続けて、ブロッキング試薬を添加し、更に37℃15分間インキュベーションした。これらのハイブリッドを、ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼ複合体により、NBT/BCIPの添加により比色的に、またはケミルミネセント基質(Lumi-Phos 530、Cellmark Diagnostics社、Abindon、英国)への噴霧によるオートラジオグラフ的に、検出した。この目的のために、ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼ複合体を添加し、および37℃で30分間インキュベーションした。その後膜を基質緩衝液で各々15分間2回洗浄した。次に膜を取り外し、Lumi-Phos試薬を噴霧し、X線フィルムに2時間曝した。これの代わりに、NBT/BCIPを含有する基質緩衝液を添加し、発色するまで待った。
【００６２】
使用した溶液：
10xSSC溶液(標準生理食塩水クエン酸)：
1.5M NaCl、0.15Mクエン酸三ナトリウム；
ハイブリダイゼーション緩衝液：
7％SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)、0.25Mリン酸緩衝液、pH7.5；
ストリンジェント洗浄液(ストリンジェント緩衝液)：
3M TMCL(テトラメチルアンモニウムクロリド)、50mM Tris/Cl、2mM EDTA、0.1％SDS；
膜結合部位を飽和するための溶液：
マレイン酸緩衝液(pH7.5)(水500ml中NaCl 4.13gおよびマレイン酸5.53g、pHは5M NaOHにより7.5に調節)中の5g/lブロッキング試薬(Roche社)；
基質緩衝液：
274mM Tris/Cl(pH7.5)、68.6mM クエン酸三ナトリウム、200mM NaCl、27.4mM MgC12*6H2O；
BCIP：
50mg/ml 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドニルリン酸トルイジン塩、100％ジメチルホルムアミド溶媒；
NBT：
75mg/mlニトロブルーテトラゾリウム塩、70％ジメチルホルムアミド溶媒；
【００６３】
オートラジオグラムは、デンシトメーターにより評価した。使用した100％基準値は、このプローブ配列が由来している種のアンプリコンドットであった。常にドットとして膜に同時塗布される対照は、核酸溶液ではなく水が添加された試料、および単離されたヒトDNA 100ngを含有する試料であった。
【００６４】
図3は、実施例1の結果を示している。デンシトメーター評価の％値を記した。これらの種に相同なプローブの値を、100％と設定した。本明細書に説明した方法を用い、原材料(例えば、歯科的スワブ、血液など)または細菌の液体または固形培地のいずれか由来の対応する細菌を同定および識別することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】配列番号：1〜13。
【図２】配列番号：14〜28。
【図３】配列番号：15、19、21、22、25、28、27のプローブの特異性を決定するための、ドットブロットハイブリダイゼーションのデンシトメーター評価。略号は以下の意味を有する：Aa＝アクチノバシラス・アクチノマイセテムコミタンス(Actinobacillus actinomycetemcomitans)；Pg＝ポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)；Pi＝プレボテラ・インテルメディア(Prevotella intermedius)；Bf＝バクテロイデス・フォルシサス(Bacteriodes forsythus)；Td＝トレポネーマ・デンチコーラ(Treponema denticola)；Smut＝ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)；Ssob＝ストレプトコッカス・ソルビナス(Streptococcus sobrinus)；E.col＝大腸菌；hDNA＝ヒトDNA；N-Kon＝陰性対照(標的核酸を用いずに増幅)。
【図１】
2005508193.tif 000002
【図２】
2005508193.tif 000003
【図３】
2005508193.tif 000004
【国際公開パンフレット】
2005508193.tif 000005
2005508193.tif 000006
2005508193.tif 000007
2005508193.tif 000008
2005508193.tif 000009
2005508193.tif 000010
2005508193.tif 000011
2005508193.tif 000012
2005508193.tif 000013
2005508193.tif 000014
2005508193.tif 000015
2005508193.tif 000016
2005508193.tif 000017
2005508193.tif 000018
2005508193.tif 000019
2005508193.tif 000020
2005508193.tif 000021
2005508193.tif 000022
2005508193.tif 000023
2005508193.tif 000024
2005508193.tif 000025
2005508193.tif 000026
2005508193.tif 000027
2005508193.tif 000028
2005508193.tif 000029
2005508193.tif 000030
2005508193.tif 000031
2005508193.tif 000032
2005508193.tif 000033
2005508193.tif 000034
2005508193.tif 000035
2005508193.tif 000036
2005508193.tif 000037
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005508193.tif 000038
【国際調査報告】
2005508193.tif 000039
2005508193.tif 000040
2005508193.tif 000041
2005508193.tif 000042
2005508193.tif 000043
2005508193.tif 000044
2005508193.tif 000045
2005508193.tif 000046
2005508193.tif 000047
2005508193.tif 000048
2005508193.tif 000049
2005508193.tif 000050
2005508193.tif 000051
2005508193.tif 000052