(57)【要約】転移性結腸直腸癌の包括的な遺伝子発現プロファイルの、原発性癌、良性結腸直腸腫瘍、および正常結腸直腸上皮の発現プロファイルとの比較で同定された遺伝子の中で、PRL-3タンパク質チロシンホスファターゼ遺伝子に特に関心がもたれた。この遺伝子は、調べた18の癌転移それぞれにおいて高レベルで発現されていたが、非転移腫瘍および正常結腸直腸上皮では低レベルで発現されていた。試験した12の転移のうち3つにおいて、PRL-3遺伝子の複数のコピーが染色体8q24.3に位置する小さな単位複製配列内に見出された。これらのデータによりPRL-3遺伝子が結腸直腸癌転移に重要であることが示唆され、これらの難治性病変の新規な治療標的が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質チロシンホスファターゼIVA型メンバー3；FLJ23603；LOC54675；ZD52F10；DNAJドメイン含有；GRO3発癌遺伝子/T45117 hU1-70Kタンパク質；アトラクチン；Bcl-2結合成分3；核内受容体サブファミリー4；マイトジェン活性化プロテインキナーゼ8相互作用タンパク質2；ヘアリー（ショウジョウバエ）相同体；LUC7（出芽酵母）様；スプリット2のトランスデューシン様エンハンサー、ショウジョウバエE (sp1)の相同体；脂肪滴構成タンパク質；ケラチン17；カゼインキナーゼ2、αプライムポリペプチド；ミニ染色体維持欠損（出芽酵母）7；v-junトリ肉腫ウイルス17発癌遺伝子相同体/LSFR2遺伝子2/MGC2550タンパク質；プレキシン（plexin）B1；トランスフォーミング増殖因子、β1；EST、GTP-rho結合タンパク質1（ロフィリン）類似；（ショウジョウバエ）様ホメオボックス1；mago-nashi（ショウジョウバエ）相同体、増殖関連；推定Rab5結合タンパク質；血管内皮増殖因子；PTD008タンパク質；タンパク質/リボゾームタンパク質L10；wee1+（S. pombe）相同体/タンパク質x 013；cDNA: FLJ12683；PTK7タンパク質チロシンキナーゼ7；v-fos FBJマウス骨肉腫ウイルス発癌遺伝子相同体B；FLJ20297タンパク質；SET転座（骨髄性白血病関連）；TCP1含有シャペロニン、サブユニット6A（ζ1）；アタキシン2関連タンパク質；サイクリン依存性キナーゼ阻害因子3（CDK2関連二重特異性ホスファターゼ）；およびマトリックスメタロプロテアーゼ14（膜挿入）からなる群より選択される腫瘍増殖のタンパク質マーカーに特異的に結合する抗体を人体に投与する段階、
抗体が特異的に結合した人体の部位を検出する段階
を含む、人体において腫瘍増殖の部位を同定する方法。
【請求項２】
抗体が結合するタンパク質マーカーがタンパク質チロシンホスファターゼIVA型メンバー3である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
抗体が検出可能な程度に標識されている、請求項1記載の方法。
【請求項４】
検出する段階以前に、検出可能な程度に標識された、抗体に特異的に結合する薬剤を人体に投与する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
ヒトの組織試料において、タンパク質チロシンホスファターゼIVA型メンバー3をコードする遺伝子のすべてまたは一部にハイブリダイズするハイブリダイゼーションプローブを用いて、または前記遺伝子のすべてまたは一部を増幅するプライマーを用いて、タンパク質チロシンホスファターゼIVA型メンバー3をコードする第一の染色体セグメントの増幅を検出する段階を含み、増幅の検出により組織の転移傾向が示唆される、
転移の予測に役立つ方法。
【請求項６】
第一の染色体セグメントの量の、8qに位置する第二の染色体セグメントの量に対する比を測定することにより増幅が検出される、請求項5記載の方法。
【請求項７】
第二の染色体セグメントが8q24.3よりもセントロメアに近い、請求項6記載の方法。
【請求項８】
比が10を超える、請求項6記載の方法。
【請求項９】
比が15を超える、請求項6記載の方法。
【請求項１０】
比が20を超える、請求項6記載の方法。
【請求項１１】
第一の染色体セグメントの量が、プライマー
2005514918.tif 000011
を用いたPCRにより測定される、請求項5記載の方法。
【請求項１２】
第二の染色体セグメントが、プライマー
2005514918.tif 000012
を用いたPCRにより測定される、請求項7記載の方法。
【請求項１３】
ヒトの組織試料において、タンパク質チロシンホスファターゼIVA型メンバー3；FLJ23603；LOC54675；ZD52F10；DNAJドメイン含有；GRO3発癌遺伝子/T45117 hU1-70Kタンパク質；アトラクチン；Bcl-2結合成分3；核内受容体サブファミリー4；マイトジェン活性化プロテインキナーゼ8相互作用タンパク質2；ヘアリー（ショウジョウバエ）相同体；LUC7（出芽酵母）様；スプリット2のトランスデューシン様エンハンサー、ショウジョウバエE (sp1)の相同体；脂肪滴構成タンパク質；ケラチン17；カゼインキナーゼ2、αプライムポリペプチド；ミニ染色体維持欠損（出芽酵母）7；v-junトリ肉腫ウイルス17発癌遺伝子相同体/LSFR2遺伝子2/MGC2550タンパク質；プレキシンB1；トランスフォーミング増殖因子、β1；EST、GTP-rho結合タンパク質1（ロフィリン）類似；（ショウジョウバエ）様ホメオボックス1；mago-nashi（ショウジョウバエ）相同体、増殖関連；推定Rab5結合タンパク質；血管内皮増殖因子；PTD008タンパク質；タンパク質/リボゾームタンパク質L10；wee1+（S. pombe）相同体/タンパク質x 013；cDNA: FLJ12683；PTK7タンパク質チロシンキナーゼ7；v-fos FBJマウス骨肉腫ウイルス発癌遺伝子相同体B；FLJ20297タンパク質；SET転座（骨髄性白血病関連）；TCP1含有シャペロニン、サブユニット6A（ζ1）；アタキシン2関連タンパク質；サイクリン依存性キナーゼ阻害因子3（CDK2関連二重特異性ホスファターゼ）；およびマトリックスメタロプロテアーゼ14（膜挿入）からなる群より選択される遺伝子による過剰発現を検出する段階を含み、過剰発現がヒトの非病的試料に対する組織試料における発現増加であり、それによって組織試料が非病的試料と比較して転移する傾向を有すると同定される、
転移の予測に役立つ方法。
【請求項１４】
過剰発現が検出される遺伝子がタンパク質チロシンホスファターゼIVA型メンバー3である、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
発現増加が非病的試料に対して少なくとも2倍である、請求項13記載の方法。
【請求項１６】
発現増加が非病的試料に対して少なくとも5倍である、請求項13記載の方法。
【請求項１７】
発現増加が非病的試料に対して少なくとも10倍である、請求項13記載の方法。
【請求項１８】
発現増加が選択された遺伝子によってコードされるmRNAで測定される、請求項13記載の方法。
【請求項１９】
発現増加が選択された遺伝子によってコードされるタンパク質で測定される、請求項13記載の方法。
【請求項２０】
PCRを用いて過剰発現を測定する、請求項13記載の方法。
【請求項２１】
核酸アレイへのハイブリダイゼーションを用いて過剰発現を測定する、請求項13記載の方法。
【請求項２２】
免疫測定法を用いて過剰発現を測定する、請求項13記載の方法。
【請求項２３】
酵素アッセイ法を用いて過剰発現を測定する、請求項13記載の方法。
【請求項２４】
胃腸腫瘍を有するヒト患者の便検体において、タンパク質チロシンホスファターゼIVA型メンバー3；FLJ23603；LOC54675；ZD52F10；DNAJドメイン含有；GRO3発癌遺伝子/T45117 hU1-70Kタンパク質；アトラクチン；Bcl-2結合成分3；核内受容体サブファミリー4；マイトジェン活性化プロテインキナーゼ8相互作用タンパク質2；ヘアリー（ショウジョウバエ）相同体；LUC7（出芽酵母）様；スプリット2のトランスデューシン様エンハンサー、ショウジョウバエE (sp1)の相同体；脂肪滴構成タンパク質；ケラチン17；カゼインキナーゼ2、αプライムポリペプチド；ミニ染色体維持欠損（出芽酵母）7；v-junトリ肉腫ウイルス17発癌遺伝子相同体/LSFR2遺伝子2/MGC2550タンパク質；プレキシンB1；トランスフォーミング増殖因子、β1；EST、GTP-rho結合タンパク質1（ロフィリン）類似；（ショウジョウバエ）様ホメオボックス1；mago-nashi（ショウジョウバエ）相同体、増殖関連；推定Rab5結合タンパク質；血管内皮増殖因子；PTD008タンパク質；タンパク質/リボゾームタンパク質L10；wee1+（S. pombe）相同体/タンパク質x 013；cDNA: FLJ12683；PTK7タンパク質チロシンキナーゼ7；v-fos FBJマウス骨肉腫ウイルス発癌遺伝子相同体B；FLJ20297タンパク質；SET転座（骨髄性白血病関連）；TCP1含有シャペロニン、サブユニット6A（ζ1）；アタキシン2関連タンパク質；サイクリン依存性キナーゼ阻害因子3（CDK2関連二重特異性ホスファターゼ）；およびマトリックスメタロプロテアーゼ14（膜挿入）からなる群より選択される遺伝子による過剰発現を検出する段階を含み、過剰発現が胃腸腫瘍を有していないヒトの便検体に対する便検体における発現増加であり、それによってヒト患者が転移または転移傾向を伴う癌を有すると同定される、
転移の検出または予測に役立つ方法。
【請求項２５】
過剰発現が検出される遺伝子がタンパク質チロシンホスファターゼIVA型メンバー3である、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
発現増加が胃腸腫瘍を有していないヒトの便検体に対して少なくとも2倍である、請求項24記載の方法。
【請求項２７】
発現増加が胃腸腫瘍を有していないヒトの便検体に対して少なくとも5倍である、請求項24記載の方法。
【請求項２８】
発現増加が胃腸腫瘍を有していないヒトの便検体に対して少なくとも10倍である、請求項24記載の方法。
【請求項２９】
発現増加が選択された遺伝子によってコードされるmRNAで測定される、請求項24記載の方法。
【請求項３０】
発現増加が選択された遺伝子によってコードされるタンパク質で測定される、請求項24記載の方法。
【請求項３１】
PCRを用いて過剰発現を測定する、請求項24記載の方法。
【請求項３２】
核酸アレイへのハイブリダイゼーションを用いて過剰発現を測定する、請求項24記載の方法。
【請求項３３】
免疫測定法を用いて過剰発現を測定する、請求項24記載の方法。
【請求項３４】
酵素アッセイ法を用いて過剰発現を測定する、請求項24記載の方法。
【請求項３５】
タンパク質チロシンホスファターゼIVA型メンバー3；FLJ23603；LOC54675；ZD52F10；DNAJドメイン含有；GRO3発癌遺伝子/T45117 hU1-70Kタンパク質；アトラクチン；Bcl-2結合成分3；核内受容体サブファミリー4；マイトジェン活性化プロテインキナーゼ8相互作用タンパク質2；ヘアリー（ショウジョウバエ）相同体；LUC7（出芽酵母）様；スプリット2のトランスデューシン様エンハンサー、ショウジョウバエE (sp1)の相同体；脂肪滴構成タンパク質；ケラチン17；カゼインキナーゼ2、αプライムポリペプチド；ミニ染色体維持欠損（出芽酵母）7；v-junトリ肉腫ウイルス17発癌遺伝子相同体/LSFR2遺伝子2/MGC2550タンパク質；プレキシンB1；トランスフォーミング増殖因子、β1；EST、GTP-rho結合タンパク質1（ロフィリン）類似；（ショウジョウバエ）様ホメオボックス1；mago-nashi（ショウジョウバエ）相同体、増殖関連；推定Rab5結合タンパク質；血管内皮増殖因子；PTD008タンパク質；タンパク質/リボゾームタンパク質L10；wee1+（S. pombe）相同体/タンパク質x 013；cDNA: FLJ12683；PTK7タンパク質チロシンキナーゼ7；v-fos FBJマウス骨肉腫ウイルス発癌遺伝子相同体B；FLJ20297タンパク質；SET転座（骨髄性白血病関連）；TCP1含有シャペロニン、サブユニット6A（ζ1）；アタキシン2関連タンパク質；サイクリン依存性キナーゼ阻害因子3（CDK2関連二重特異性ホスファターゼ）；およびマトリックスメタロプロテアーゼ14（膜挿入）からなる群より選択される遺伝子によりコードされるタンパク質に特異的に結合する効果的な量の抗体を患者に投与する段階を含み、それによって癌の増殖が阻害される、
進行癌または転移癌を有する患者を治療する方法。
【請求項３６】
抗体が細胞溶解性である、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
抗体が細胞毒性薬に複合化されている、請求項35記載の方法。
【請求項３８】
抗体が化学療法薬に複合化されている、請求項35記載の方法。
【請求項３９】
抗体が毒素に複合化されている、請求項35記載の方法。
【請求項４０】
タンパク質がタンパク質チロシンホスファターゼIVA型メンバー3である、請求項35記載の方法。
【請求項４１】
タンパク質チロシンホスファターゼIVA型メンバー3の阻害剤を患者に投与する段階を含む、
進行癌または転移癌を有する患者を治療する方法。
【請求項４２】
薬剤がオルトバナジン酸ナトリウムである、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
薬剤がビスペロキソ（ビピリジン）オキソバナジン酸カリウム (V)である、請求項41記載の方法。
【請求項４４】
薬剤がビスペロキソバナジウム（フェニル）である、請求項41記載の方法。
【請求項４５】
薬剤がビスペロキソバナジウム（ビピリジン）である、請求項41記載の方法。
【請求項４６】
薬剤がビスペロキソバナジウム（アンモニウム陽イオン）である、請求項41記載の方法。
【請求項４７】
薬剤がビスペロキソバナジウム（ピコリン酸二価陰イオン）である、請求項41記載の方法。
【請求項４８】
薬剤がビスペロキソバナジウム （5-ヒドロキシピリジン-2-カルボン酸陰イオン）である、請求項41記載の方法。
【請求項４９】
試験化合物がPRL-3活性を阻害する能力を測定する段階；
PRL-3活性を阻害する試験化合物を、進行性腫瘍また転移性腫瘍の治療に有用な可能性がある化合物として同定する段階
を含む、進行性腫瘍または転移性腫瘍を治療するための有用な候補薬剤を同定する方法。
【請求項５０】
測定段階において基質としてDiFMuP（6,8-ジフルオロ-4-メチルウンベリフェリルホスフェート）を利用する、請求項49記載の方法。
【請求項５１】
測定段階において基質としてp130casを利用する、請求項49記載の方法。
【請求項５２】
PRL-3を阻害する化合物を、インビトロにおいて癌細胞の増殖を阻害する能力について試験する段階
をさらに含む、請求項49記載の方法。
【請求項５３】
癌細胞が胃腸癌細胞である、請求項52記載の方法。
【請求項５４】
癌細胞が前立腺癌細胞である、請求項52記載の方法。
【請求項５５】
癌細胞が乳癌細胞である、請求項52記載の方法。
【請求項５６】
癌細胞が結腸直腸癌細胞である、請求項52記載の方法。
【請求項５７】
癌細胞が転移性肝細胞である、請求項52記載の方法。
【請求項５８】
試験化合物が、PRL-2およびPRL-1からなる群より選択される酵素と比較してPRL-3を阻害する能力について試験される、請求項49記載の方法。
【請求項５９】
PRL-3を阻害する化合物を、実験動物において腫瘍の進行を阻害する能力について試験する段階
をさらに含む、請求項49記載の方法。
【請求項６０】
PRL-3を阻害する化合物を、実験動物において腫瘍の転移を阻害する能力について試験する段階
をさらに含む、請求項49記載の方法。
【請求項６１】
腫瘍が胃腸腫瘍である、請求項59記載の方法。
【請求項６２】
腫瘍が前立腺腫瘍である、請求項59記載の方法。
【請求項６３】
腫瘍が乳房腫瘍である、請求項59記載の方法。
【請求項６４】
腫瘍が結腸直腸腫瘍である、請求項59記載の方法。
【請求項６５】
癌が胃腸癌である、請求項1記載の方法。
【請求項６６】
癌が胃腸癌である、請求項5記載の方法。
【請求項６７】
癌が前立腺癌である、請求項5記載の方法。
【請求項６８】
癌が乳癌である、請求項5記載の方法。
【請求項６９】
癌が胃腸癌である、請求項13記載の方法。
【請求項７０】
癌が胃腸癌である、請求項35記載の方法。
【請求項７１】
癌が胃腸癌である、請求項41記載の方法。
【請求項７２】
タンパク質チロシンホスファターゼIVA型メンバー3；FLJ23603；LOC54675；ZD52F10；DNAJドメイン含有；GRO3発癌遺伝子/T45117 hU1-70Kタンパク質；アトラクチン；Bcl-2結合成分3；核内受容体サブファミリー4；マイトジェン活性化プロテインキナーゼ8相互作用タンパク質2；ヘアリー（ショウジョウバエ）相同体；LUC7（出芽酵母）様；スプリット2のトランスデューシン様エンハンサー、ショウジョウバエE (sp1)の相同体；脂肪滴構成タンパク質；ケラチン17；カゼインキナーゼ2、αプライムポリペプチド；ミニ染色体維持欠損（出芽酵母）7；v-junトリ肉腫ウイルス17発癌遺伝子相同体/LSFR2遺伝子2/MGC2550タンパク質；プレキシンB1；トランスフォーミング増殖因子、β1；EST、GTP-rho結合タンパク質1（ロフィリン）類似；（ショウジョウバエ）様ホメオボックス1；mago-nashi（ショウジョウバエ）相同体、増殖関連；推定Rab5結合タンパク質；血管内皮増殖因子；PTD008タンパク質；タンパク質/リボゾームタンパク質L10；wee1+（S. pombe）相同体/タンパク質x 013；cDNA: FLJ12683；PTK7タンパク質チロシンキナーゼ7；v-fos FBJマウス骨肉腫ウイルス発癌遺伝子相同体B；FLJ20297タンパク質；SET転座（骨髄性白血病関連）；TCP1含有シャペロニン、サブユニット6A（ζ1）；アタキシン2関連タンパク質；サイクリン依存性キナーゼ阻害因子3（CDK2関連二重特異性ホスファターゼ）；およびマトリックスメタロプロテアーゼ14（膜挿入）からなる群より選択される腫瘍増殖のタンパク質マーカーに特異的に結合するペプチドを人体に投与する段階；
ペプチドが特異的に結合した人体の部位を検出する段階
を含む、人体において腫瘍増殖の部位を同定する方法。
【請求項７３】
ペプチドが結合するタンパク質マーカーがタンパク質チロシンホスファターゼIVA型メンバー3である、請求項72記載の方法。
【請求項７４】
ペプチドが検出可能な程度に標識されている、請求項72記載の方法。
【請求項７５】
検出する段階以前に、検出可能な程度に標識された、ペプチドに特異的に結合する薬剤を人体に投与する段階をさらに含む、請求項72記載の方法。
【請求項７６】
タンパク質チロシンホスファターゼIVA型メンバー3；FLJ23603；LOC54675；ZD52F10；DNAJドメイン含有；GRO3発癌遺伝子/T45117 hU1-70Kタンパク質；アトラクチン；Bcl-2結合成分3；核内受容体サブファミリー4；マイトジェン活性化プロテインキナーゼ8相互作用タンパク質2；ヘアリー（ショウジョウバエ）相同体；LUC7（出芽酵母）様；スプリット2のトランスデューシン様エンハンサー、ショウジョウバエE (sp1)の相同体；脂肪滴構成タンパク質；ケラチン17；カゼインキナーゼ2、αプライムポリペプチド；ミニ染色体維持欠損（出芽酵母）7；v-junトリ肉腫ウイルス17発癌遺伝子相同体/LSFR2遺伝子2/MGC2550タンパク質；プレキシンB1；トランスフォーミング増殖因子、β1；EST、GTP-rho結合タンパク質1（ロフィリン）類似；（ショウジョウバエ）様ホメオボックス1；mago-nashi（ショウジョウバエ）相同体、増殖関連；推定Rab5結合タンパク質；血管内皮増殖因子；PTD008タンパク質；タンパク質/リボゾームタンパク質L10；wee1+（S. pombe）相同体/タンパク質x 013；cDNA: FLJ12683；PTK7タンパク質チロシンキナーゼ7；v-fos FBJマウス骨肉腫ウイルス発癌遺伝子相同体B；FLJ20297タンパク質；SET転座（骨髄性白血病関連）；TCP1含有シャペロニン、サブユニット6A（ζ1）；アタキシン2関連タンパク質；サイクリン依存性キナーゼ阻害因子3（CDK2関連二重特異性ホスファターゼ）；およびマトリックスメタロプロテアーゼ14（膜挿入）からなる群より選択される遺伝子によりコードされるタンパク質に特異的に結合する効果的な量の薬剤を患者に投与する段階を含み、それによって癌の増殖が阻害される、
進行癌または転移癌を有する患者を治療する方法。
【請求項７７】
薬剤が細胞毒性薬に複合化されている、請求項76記載の方法。
【請求項７８】
薬剤が化学療法薬に複合化されている、請求項76記載の方法。
【請求項７９】
薬剤が毒素に複合化されている、請求項76記載の方法。
【請求項８０】
タンパク質がタンパク質チロシンホスファターゼIVA型メンバー3である、請求項76記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本発明は、国立衛生研究所助成金第CA57345号および第CA43460号による支援を受けてなされたものである。したがって、米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、癌の診断および治療の分野に関する。具体的には、転移を含む、より進行した段階への癌の進行に有意に関連しているように思われる遺伝子に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
先行技術の背景
転移は、原発腫瘍が通常外科的に除去され得る場合の、癌による大部分の死の原因である腫瘍過程である。転移細胞では、細胞骨格が変化し、接着が損なわれ、運動性が増し、基底膜を分解するタンパク質分解酵素が発現される（1〜3）。しかし、この致死的過程については多くが依然として不明であり、さらなる進歩には、転移病巣において一貫してかつ特異的に変化する新規の遺伝子および経路の同定が条件である。
【０００４】
結腸直腸の腫瘍形成の場合、浸潤（癌）段階への開始および進行に関連する遺伝子は周知である（4）。しかし、一般に結腸直腸癌患者の死をもたらす病変である肝臓転移において、一貫してかつ特異的に活性化される遺伝子は未だ明らかになっていない。当技術分野において、転移癌において一貫してかつ特異的に活性化される標的の継続的必要性が存在する。
【発明の開示】
【０００５】
発明の概要
第一の態様において、本発明は、人体において腫瘍増殖の部位を同定する方法を提供する。腫瘍増殖のタンパク質マーカーに特異的に結合する抗体を、人体に投与する。タンパク質マーカーは、タンパク質チロシンホスファターゼIVA型メンバー3；FLJ23603；LOC54675；ZD52F10；DNAJドメイン含有；GRO3発癌遺伝子/T45117 hU1-70Kタンパク質；アトラクチン（attractin）；Bcl-2結合成分3、核内受容体サブファミリー4、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ8相互作用タンパク質2、ヘアリー（hairy）（ショウジョウバエ）相同体、LUC7（出芽酵母）様、スプリット（split）2のトランスデューシン様エンハンサー、ショウジョウバエE (sp1)の相同体、脂肪滴構成タンパク質、ケラチン17、カゼインキナーゼ2、αプライム（prime）ポリペプチド、ミニ染色体維持欠損（出芽酵母）7、v-junトリ肉腫ウイルス17発癌遺伝子相同体/LSFR2遺伝子2/MGC2550タンパク質、プレキシン（plexin）B1、トランスフォーミング増殖因子、β1、EST、GTP-rho結合タンパク質1（ロフィリン（rhophilin)）類似、（ショウジョウバエ）様ホメオボックス1、mago-nashi（ショウジョウバエ）相同体、増殖関連、推定Rab5結合タンパク質、血管内皮増殖因子、PTD008タンパク質、タンパク質/リボゾームタンパク質L10、wee1+（S. pombe）相同体/タンパク質x 013、cDNA: FLJ12683、PTK7タンパク質チロシンキナーゼ7、v-fos FBJマウス骨肉腫ウイルス発癌遺伝子相同体B、FLJ20297タンパク質、SET転座（骨髄性白血病関連）、TCP1含有シャペロニン、サブユニット6A（ζ1）、アタキシン（ataxin）2関連タンパク質、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子3（CDK2関連二重特異性ホスファターゼ）、およびマトリックスメタロプロテアーゼ14（膜挿入）からなる群より選択される。抗体が特異的に結合した人体の部位が検出される。
【０００６】
本発明の別の態様により、転移の予測に役立つ方法が提供される。ヒトの組織試料において、タンパク質チロシンホスファターゼIVA型メンバー3をコードする第一の染色体セグメントの増幅を検出する。タンパク質チロシンホスファターゼIVA型メンバー3をコードする遺伝子のすべてまたは一部にハイブリダイズするハイブリダイゼーションプローブ、またはタンパク質チロシンホスファターゼIVA型のすべてまたは一部を増幅するプライマーを用いて、その増幅を検出する。そのような増幅の検出により、組織の転移傾向が示唆される。
【０００７】
本発明のさらに別の態様は、転移の予測に役立つ方法である。ヒトの組織試料において、遺伝子の過剰発現を検出する。遺伝子は、タンパク質チロシンホスファターゼIVA型メンバー3；FLJ23603；LOC54675；ZD52F10；DNAJドメイン含有；GRO3発癌遺伝子/T45117 hU1-70Kタンパク質；アトラクチン；Bcl-2結合成分3；核内受容体サブファミリー4；マイトジェン活性化プロテインキナーゼ8相互作用タンパク質2；ヘアリー（ショウジョウバエ）相同体；LUC7（出芽酵母）様；スプリット2のトランスデューシン様エンハンサー、ショウジョウバエE (sp1)の相同体；脂肪滴構成タンパク質；ケラチン17；カゼインキナーゼ2、αプライムポリペプチド；ミニ染色体維持欠損（出芽酵母）7；v-junトリ肉腫ウイルス17発癌遺伝子相同体/LSFR2遺伝子2/MGC2550タンパク質；プレキシンB1；トランスフォーミング増殖因子、β1；EST、GTP-rho結合タンパク質1（ロフィリン）類似；（ショウジョウバエ）様ホメオボックス1；mago-nashi（ショウジョウバエ）相同体、増殖関連；推定Rab5結合タンパク質；血管内皮増殖因子；PTD008タンパク質；タンパク質/リボゾームタンパク質L10；wee1+（S. pombe）相同体/タンパク質x 013；cDNA: FLJ12683；PTK7タンパク質チロシンキナーゼ7；v-fos FBJマウス骨肉腫ウイルス発癌遺伝子相同体B；FLJ20297タンパク質；SET転座（骨髄性白血病関連）；TCP1含有シャペロニン、サブユニット6A（ζ1）；アタキシン2関連タンパク質；サイクリン依存性キナーゼ阻害因子3（CDK2関連二重特異性ホスファターゼ）；およびマトリックスメタロプロテアーゼ14（膜挿入）からなる群より選択される。ヒトの非病的試料と比較して組織試料において発現の増加が見られた場合に、過剰発現と判定する。過剰発現の観察により、組織試料が非病的試料と比較して転移する傾向を有することが示唆される。
【０００８】
本発明により、転移の予測の助けとして使用され得る態様もまた提供される。胃腸腫瘍を有するヒト患者の便検体において、遺伝子の過剰発現を検出する。遺伝子は、タンパク質チロシンホスファターゼIVA型メンバー3；FLJ23603；LOC54675；ZD52F10；DNAJドメイン含有；GRO3発癌遺伝子/T45117 hU1-70Kタンパク質；アトラクチン；Bcl-2結合成分3；核内受容体サブファミリー4；マイトジェン活性化プロテインキナーゼ8相互作用タンパク質2；ヘアリー（ショウジョウバエ）相同体；LUC7（出芽酵母）様；スプリット2のトランスデューシン様エンハンサー、ショウジョウバエE (sp1)の相同体；脂肪滴構成タンパク質；ケラチン17；カゼインキナーゼ2、αプライムポリペプチド；ミニ染色体維持欠損（出芽酵母）7；v-junトリ肉腫ウイルス17発癌遺伝子相同体/LSFR2遺伝子2/MGC2550タンパク質；プレキシンB1；トランスフォーミング増殖因子、β1；EST、GTP-rho結合タンパク質1（ロフィリン）類似；（ショウジョウバエ）様ホメオボックス1；mago-nashi（ショウジョウバエ）相同体、増殖関連；推定Rab5結合タンパク質；血管内皮増殖因子；PTD008タンパク質；タンパク質/リボゾームタンパク質L10；wee1+（S. pombe）相同体/タンパク質x 013；cDNA: FLJ12683；PTK7タンパク質チロシンキナーゼ7；v-fos FBJマウス骨肉腫ウイルス発癌遺伝子相同体B；FLJ20297タンパク質；SET転座（骨髄性白血病関連）；TCP1含有シャペロニン、サブユニット6A（ζ1）；アタキシン2関連タンパク質；サイクリン依存性キナーゼ阻害因子3（CDK2関連二重特異性ホスファターゼ）；およびマトリックスメタロプロテアーゼ14（膜挿入）からなる群より選択される。過剰発現とは、胃腸腫瘍を有していないヒトの便検体に対する便検体における発現の増加である。過剰発現により、ヒト患者を、転移を有するまたは癌が転移する傾向を有すると同定することが可能になる。
【０００９】
本発明の別の局面は、進行癌または転移癌を有する患者を治療する方法である。患者に抗体を投与する。抗体は、タンパク質チロシンホスファターゼIVA型メンバー3；FLJ23603；LOC54675；ZD52F10；DNAJドメイン含有；GRO3発癌遺伝子/T45117 hU1-70Kタンパク質；アトラクチン；Bcl-2結合成分3；核内受容体サブファミリー4；マイトジェン活性化プロテインキナーゼ8相互作用タンパク質2；ヘアリー（ショウジョウバエ）相同体；LUC7（出芽酵母）様；スプリット2のトランスデューシン様エンハンサー、ショウジョウバエE (sp1)の相同体；脂肪滴構成タンパク質；ケラチン17；カゼインキナーゼ2、αプライムポリペプチド；ミニ染色体維持欠損（出芽酵母）7；v-junトリ肉腫ウイルス17発癌遺伝子相同体/LSFR2遺伝子2/MGC2550タンパク質；プレキシンB1；トランスフォーミング増殖因子、β1；EST、GTP-rho結合タンパク質1（ロフィリン）類似；（ショウジョウバエ）様ホメオボックス1；mago-nashi（ショウジョウバエ）相同体、増殖関連；推定Rab5結合タンパク質；血管内皮増殖因子；PTD008タンパク質；タンパク質/リボゾームタンパク質L10；wee1+（S. pombe）相同体/タンパク質x 013；cDNA: FLJ12683；PTK7タンパク質チロシンキナーゼ7；v-fos FBJマウス骨肉腫ウイルス発癌遺伝子相同体B；FLJ20297タンパク質；SET転座（骨髄性白血病関連）；TCP1含有シャペロニン、サブユニット6A（ζ1）；アタキシン2関連タンパク質；サイクリン依存性キナーゼ阻害因子3（CDK2関連二重特異性ホスファターゼ）；およびマトリックスメタロプロテアーゼ14（膜挿入）からなる群より選択される遺伝子によってコードされるタンパク質に特異的に結合する。その結果、癌の増殖が阻害される。
【００１０】
本発明の別の局面により、進行性胃腸癌または転移性胃腸癌を有する患者を治療する方法が提供される。タンパク質チロシンホスファターゼIVA型メンバー3の阻害剤を、患者に投与する。
【００１１】
本発明のさらに別の局面では、進行性腫瘍または転移性腫瘍の治療に有用な候補薬剤を同定する方法を提供する。試験化合物が、PRL-2およびPRL-1からなる群より選択される酵素に対して、PRL-3活性を阻害する相対的能力を測定する。PRL-2またはPRL-1と比較して選択的にPRL-3活性を優先的に阻害する試験化合物は、進行性腫瘍または転移性腫瘍の治療に有用な可能性がある化合物として同定される。
【００１２】
発明の詳細な説明
進行癌と比較しておよび早期癌と比較して、ならびにそれらの由来である正常細胞と比較して、一連の遺伝子が転移癌においてより高いレベルで特異的に発現されることは、本発明者らの発見である。そのような遺伝子を表1に明らかにしている。1つの遺伝子、転移性結腸直腸癌において一貫して過剰発現されるチロシンホスファターゼ（タンパク質チロシンホスファターゼIVA型メンバー3、PRL-3としても知られる）が特に有用であると思われる。表1の遺伝子は、診断および治療に使用するための優れた標的、ならびに薬剤スクリーニングプログラムの標的を表す。
【００１３】
本発明で同定された標的が使用され得る1つの方法は、画像診断法である。抗体を用いて、造影剤（検出標識）を、転移が浸潤した身体の位置に特異的に標的にすることができる。標的の1つに特異的に結合し、人体の他のタンパク質または成分に感知できるほどまたは検出可能な程度に結合しない抗体が、好ましい。人体の他の成分と比較して、同定された標的に優先的に結合する抗体は、それほど好ましくない。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル、完全な分子または断片であってよい。完全な抗体の結合活性を保持する多くの抗体断片が、典型的に使用される。そのような抗体断片には、Fab、Fab2、Fab'、Fab'2、および一本鎖Fv（ScFv）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。抗体またはその断片（まとめて抗体と称す）は、検出標識に、混合、複合化、付着、共役、またはさもなくば結合させることが可能である。検出標識への結合は、共有結合性であっても非溶融結合性であってもよく；強い結合が好ましい。検出標識は、標的に特異的な抗体に直接結合させてもよいし、一次抗体に特異的な二次抗体、またはビオチン/アビジン型もしくはビオチン/ストレプトアビジン型の結合を介するような、第二の成分を介して共役させてもよい。検出標識は、標的に特異的な抗体と同時に、またはその後に送達することができる。そのような検出標識には、放射性同位元素、蛍光性成分、酵素性標識等が含まれる。内視鏡検査により検出標識の局在する部位を同定することも可能であるが、非侵襲的な方法を用いて容易に検出可能な任意の標識が好ましい。
【００１４】
同様に、ペプチドを用いて、同定された標識の1つに特異的に結合させることも可能である。ペプチドは、ペプチド発現ライブラリーのスクリーニングによって同定され得るが、ファージディスプレイライブラリーが特に好ましい。コンビナトリアルペプチドライブラリーをスクリーニングすることも可能である。そのようなペプチドは、人体での検出のため、抗体と同様の方法で標識することができる。小さな有機分子等の非ペプチド剤を用いることもできる。これらは、コンビナトリアル・ケミストリーもしくは他の技術、または多数の多様な分子をもたらす技術の集合体の結果であってよい。場合によっては、コンビナトリアル・ライブラリー作製の基準として、リード化合物を用いることが可能である。別の場合には、ライブラリーはランダムに作製されることになる。
【００１５】
分子ライブラリーの合成法は、当技術分野において周知である（例えば、
2005514918.tif 000002
を参照のこと）。化合物のライブラリーは、溶液中（例えば、Houghten, BioTechniques 13, 412-421, 1992）、またはビーズ上（Lam, Nature 354, 82-84, 1991）、チップ上（Fodor, Nature 364, 555-556, 1993）、細菌もしくは胞子上（Ladner, 米国特許第5,223,409号）、プラスミド上（Cullら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 1865-1869, 1992）、もしくはファージ上（ScottおよびSmith、Science, 249, 386-390, 1990；Devlin, Science 249, 404-406, 1990；Cwirlaら、Proc. Natl. Acad. Sci. 97, 6378-6382, 1990；Felici, J. Mol. Biol. 222, 301-310, 1991；およびLadner, 米国特許第5,223,409号）に提示させることができる。
【００１６】
または、ヒトの標的ポリペプチドを、ツーハイブリッドアッセイ法またはスリーハイブリッドアッセイ法において「ベイトタンパク質」として使用し（例えば、米国特許第5,283,317号；Zervosら、Cell 72, 223-232, 1993；Maduraら、J. Biol. Chem. 268, 12046-12054, 1993；Bartelら、BioThchniques 14, 920-924, 1993；Iwabuchiら、Oncogene 8, 1693-1696, 1993；およびBrent, 国際公開公報第94/10300号を参照のこと）、標的ポリペプチドに結合するかまたは相互作用し、その活性を調節する他のタンパク質を同定することができる。
【００１７】
ツーハイブリッドシステムは大部分の転写因子のモジュール状の性質に基づくものであり、これは分離可能なDNA結合ドメインおよび活性化ドメインからなる。簡潔に説明すると、アッセイでは2つの異なるDNA構築物を利用する。例えば、一方の構築物では、ヒトの標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、既知の転写因子（例えばGAL-4）のDNA結合ドメインをコードするポリヌクレオチドに融合され得る。もう一方の構築物では、未同定のタンパク質（「プレイ」または「試料」）をコードするDNA配列が、既知の転写因子の活性化ドメインをコードするポリヌクレオチドに融合され得る。「ベイト」タンパク質と「プレイ」タンパク質がインビボで相互作用しタンパク質依存性複合体を形成できる場合に、転写因子のDNA結合ドメインと活性化ドメインが近接する。この近接によって、転写因子応答性の転写調節部位に機能的に結合されているレポーター遺伝子（例えばLacZ）の転写が可能となる。レポーター遺伝子の発現を検出し、機能的転写因子を含む細胞コロニーを同定し、これを用いて標的ポリペプチドと相互作用するタンパク質をコードするDNA配列を取得することができる。
【００１８】
同定された標識に特異的な抗体および抗体断片は、治療法において使用することも可能である。そのような抗体は細胞溶解性であってよい。または、抗体は、細胞毒性薬もしくは化学療法薬または毒素もしくは放射性核種に付着させてもよい。抗体に付着させる適切な薬剤には、カペシタビン、ミトキサントロン、アフロトキシン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、5-フルオロウラシル、イリノテカン、マイトマイシン、パクリタキセル、シスプラチン、シュードモナス外毒素、ブンガロトキシン、リシン毒素が含まれる。そのような薬剤は抗体に共有結合的に付着されてもよいし、ビオチン/アビジン、ビオチン/ストレプトアビジン、抗体/抗原を含む特異的結合対をそれ自身が含み得るリンカー部分を介して付着されてもよい。そのような治療目的のために、同定された標識の1つに特異的に結合するペプチドおよび他の薬剤も、細胞毒性薬または化学療法薬に結合させることができる。
【００１９】
抗体は、当技術分野において周知の手段により患者に送達され得る。一般にこれらには、静脈内、筋肉内、皮下、腫瘍内注射または注入が含まれる。抗体は典型的に、抗体の構造および結合能を維持し、患者にとって薬学的に許容されるように設計された水性製剤で提供される。望ましくは、そのような製剤は無菌であって発熱物質を含まない。
【００２０】
標的が酵素である場合、酵素の特異的阻害剤を用いて酵素を阻害し、それにより腫瘍または癌の増殖または転移の過程の進行を阻害することが可能である。タンパク質チロシンホスファターゼIVA型メンバー3の場合には、バナジン酸部分を有する化合物が特に有用である。これらには、オルトバナジン酸ナトリウム、ビスペロキソ（ビピリジン）オキソバナジン酸カリウム（potassium bisperoxo (bipyridine) oxovanadate) (V)、ビスペロキソバナジウム（bisperoxo vanadium)（フェニル）、ビスペロキソバナジウム（ビピリジン）、ビスペロキソバナジウム（アンモニウム陽イオン）、ビスペロキソバナジウム（ピコリン酸二価陰イオン）、ビスペロキソバナジウム（5-ヒドロキシピリジン-2-カルボン酸陰イオン）、およびPosner、「Peroxovanadium Compounds, a new class of potent phophotyrosine phosphatase inhibitors which are insulin mimetics」、J. Biol. Chem. 269: 4596-4804、1994によって開示されるその他のものが含まれる。そのような化合物は、特定の化合物に対して任意の効果的な手段によって投与することができ、これには、静脈内、皮下、くも膜下腔内、筋肉内、および経口投与、ならびに持続放出装置の外科的移植を含むが、これらに限定されるわけではない。タンパク質ホスホチロシナーゼホスファターゼIVAに対して同定される他の阻害剤も、用いることができる。表1に記載する他の酵素の阻害剤も、単独でまたは組み合わせて使用することが可能である。
【００２１】
特異的な阻害剤は副作用が少ないため、非特異的な阻害剤よりも好ましいと思われる。したがって、PRL-1またはPRL-2と比較してPRL-3に特異的な阻害剤が好ましい。そのような化合物は、これらの酵素のそれぞれに対してスクリーニングすることによって同定され得る。同様に、他のホスファターゼまたは他の酵素と比較して、PRL-3に特異的な阻害剤が好ましい。PRL-3を優先的に阻害する試験化合物を同定する。標準的な酵素アッセイ法を用いることもできるし、ハイスループットアッセイ法を確立することも可能である。PRL-3活性を試験するために使用され得る基質には、DiFMuP（6,8-ジフルオロ-4-メチルウンベリフェリルホスフェート）、ヒストン2B、およびp130casが含まれる。アッセイでは、蛍光基質（DiFMuPのような）、または、例えば基質からの放出時に容易に検出され得る放射標識されたホスホチロシンを有する基質を利用することができる。その開示が本明細書内に明示的に組み入れられるPosner、前記、およびMatter (13)を参照されたい。有望な候補は、続いて、インビトロでの癌細胞に対する増殖阻害活性、および実験動物の腫瘍に対する増殖阻害活性について試験することができる。
【００２２】
興味深いことに、いくつかの転移性腫瘍では、8q24.3において増幅されたゲノム部分を保有する。その部分は、増幅されていない染色体8qの他の部分のレベルの少なくとも10倍、15倍、20倍、25倍、または30倍増幅され得る。チロシンホスファターゼIVA型の遺伝子は、この単位複製配列内に含まれる。増幅は、少なくともいくつかの転移における遺伝子の過剰発現を表す。組織試料内に増幅された部分が存在することにより、その組織が転移する傾向を有することが示唆され得る。増幅セグメントを試験する場合には、染色体8qの第二の部分に対して結果を標準化し、8q24.3部分のコピー数に見られる増加が、腫瘍細胞で頻繁に見られる異数性によるものではないことを確実にすることが望ましい。遺伝子セグメントのコピー数は、核酸プローブへのハイブリダイゼーションまたはプライマーによる増幅を含む、当技術分野において周知の任意の技術によって測定され得る。8q部分の増幅は、前立腺癌、乳癌、および結腸直腸癌において見出されている。したがって、このアッセイ法を用いて、任意のそのような腫瘍組織において転移傾向を検出することが可能である。
【００２３】
転移傾向を予測するまたは判定する別の方法は、組織試料において表1の任意の遺伝子の発現を測定することである。そのような遺伝子の1つまたは複数の発現増加は、転移傾向を示す。発現増加の測定は、典型的に、ヒトの非病的組織試料における発現量と比較することによって行われる。好ましくは、非病的組織試料の細胞種は、試験する腫瘍の組織試料の細胞種と同じであるかまたはほぼ同じである。発現増加は、典型的に、非病的対照組織のレベルと比較して、少なくとも2倍、5倍、または10倍増加のレベルである。タンパク質レベルまたはRNAレベルで発現レベルを測定する、任意の簡便な方法を使用することができる。これらには、RT-PCR法、リアルタイムPCR法、核酸アレイへのハイブリダイゼーション、免疫ブロット法、酵素結合免疫測定法、他の免疫学的アッセイ法、および酵素活性アッセイ法が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００２４】
胃腸癌の試験には、便検体が用いられる場合が多い。本発明で同定された標的は、便検体においても同定され得る。RNAまたはタンパク質の過剰発現は、便に見出されるRNAまたはタンパク質の量に反映され得ることが多い。したがって、便中の標的発現産物の量を検出し、胃腸腫瘍を有さない一人または複数のヒト由来の便検体中のレベルと比較することにより、転移を検出することまたは転移傾向を予測することが可能である。レベルが少なくとも2倍、5倍、または10倍高いと認められた場合、発現上昇が判定され得る。発現産物を測定する上記の任意の方法を、この目的にも同様に使用することができる。
【００２５】
PRL-3遺伝子がこれらの腫瘍の一部の小さな単位複製配列に含まれるという事実により、転移におけるこの遺伝子の役割の重要な補足的証拠が提供される。自然発生癌において増幅されることがこれまでに示されている主要な遺伝子は、すべて発癌遺伝子である（18, 23, 24）。染色体8q DNA配列の過剰なコピーは、進行性大腸癌を含む多くの様々な腫瘍種の進行期において観察されている（25〜28）。染色体8q24.12上のc-MYC遺伝子が、そのような8q過剰発現の標的であることが示唆されてきた。本発明者らが試験した3つの転移病巣において、c-MYC遺伝子は増幅されておらず、実際はRPL-3単位複製配列の境界から約14 Mb離れていた。
【００２６】
本明細書に記載する本研究の最も重要な派生的効果の一つは、その可能性ある治療への示唆に関する。結腸直腸癌におけるこれまでに記載されている遺伝子変化の大部分は、腫瘍抑制遺伝子の不活化が関与している。これらの遺伝子から産生されるタンパク質は、癌細胞において不活性であるかまたは存在しないために、薬剤の標的にするには困難である（29）。これに対して、PRL-3によってコードされる酵素のように癌細胞において発現が増加している酵素は、創薬目的の優れた標的を提供する。
【００２７】
実施例
実施例1：肝臓転移のSAGE解析
どの遺伝子がこの過程に関与しているのかを知るため、遺伝子発現の連続解析（Serial Analysis of Gene Expression）（SAGE）技術により、肝臓転移の包括的な遺伝子発現プロファイルを行った（5）。まず始めに、顕微解剖した転移からSAGEライブラリーを調製した（6）。驚いたことに、これらのライブラリーで同定された転写産物の多くが、正常肝細胞または炎症細胞に特有であることが認められ、定量的解析が妨げられた（7）。より特異的な転移性上皮細胞のプロファイルを作製するため、本発明者らはイムノアフィニティー分画手順を開発し、混入する間質細胞および肝細胞から結腸直腸上皮細胞を精製した（8）。この方法で精製した細胞からSAGEライブラリーを調製し、少なくとも17,324個の転写産物を表す約95,000個のタグが得られた（6）。これらのタグを、特に正常および悪性（しかし非転移性の）結腸直腸上皮のものである、多種多様なSAGEライブラリー由来の約400万個のタグと比較した（9）。144個の転写産物が他のライブラリーよりも転移ライブラリーにおいて有意に高いレベルで表され、一方79個の転写産物が転移ライブラリーにおいて有意に低いレベルで表された（10）。
【００２８】
結腸直腸上皮細胞の精製
結腸上皮細胞は、以前に記載された上皮細胞を精製するためのイムノアフィニティー精製スキームを改変したものを用いて精製した（St Croixら、Science 289, 1197 (2000)）。外科的除去後直ちに組織を入手し、コラゲナーゼを用いて37℃で1時間消化した。400 mm、50 mm、および25 mmのナイロンメッシュを通す一連の連続的ろ過を行い、単一細胞懸濁液を得た。抗CD14および抗CD45の免疫磁気ビーズ（Dynal）混合物を用いて、造血細胞および磁気ビーズに非特異的に結合する細胞を除去した（負の選択）。続いて、細胞懸濁液中に残存する上皮細胞を、抗BerEP4免疫磁気ビーズ（Dynal）への結合によって単離した（正の選択）。BerEP4抗体は、正常結腸上皮上および腫瘍結腸上皮上には存在するが肝細胞または間質細胞上には存在しない全上皮抗原を認識する（U. Latza, G. Niedobitek, R. Schwarting, H. Nekarda, H. Stein, J. Clin. Pathol. 43, 213 (1990)）。上皮に結合したBerEP4は、血球計数器で定量した。
【００２９】
RNAの調製方法および解析方法
RNAgents（Promega、ウィスコンシン州マディソン）を用いて全RNAを単離し、メッセージメーカー・リージェンツ・アッセンブリー（MessageMaker Reagent Assembly）（Gibco BRL）を用いてmRNAを選択した。スーパースクリプトII逆転写酵素（Superscript II Reverse Transcriptase）（Gibco BRL）を用いて、製造業者の説明に従って一本鎖cDNAを作製した。同時に、逆転写酵素を添加せずに擬鋳型調製物を調製した。ピコグリーン（Pico Green）色素（Molecular Probes、オレゴン州ユージーン）を用いてiCycler（Bio-Rad、カリフォルニア州ヘラクレス）により定量的PCRを行い、iCyclerソフトウェアv2.3を用いて閾値サイクル数を求めた。解析する各配列用のプライマーセットを、補足の表2に記載する。増幅の条件は、95℃で2分間の1サイクル、その後、95℃で15秒間、58℃で15秒間、72℃で15秒間の35サイクルとした。定量的PCR反応は3通り行い、閾値サイクル数を平均化した。RT-PCR産物は、この研究に含まれる2つの基準を満たす必要があった。第一に、逆転写酵素（RT）由来cDNAによるシグナルは、逆転写酵素なしで行った対照反応のシグナルの少なくとも100倍高い必要があった。第二に、RTを用いた反応によるPCR産物は、ゲル電気泳動において予測した大きさである必要があった。遺伝子発現は、SAGEによって評価される場合にすべての結腸直腸組織において均一に発現される遺伝子である、b-アミロイド前駆タンパク質（APP）の遺伝子発現に対して標準化した。相対的発現は、以下の式を用いて算出した。式2(Rt-Et)/2(Rn-En)、式中、Rtは実験試料においてAPPについて観察された閾値サイクル数であり、Etは実験試料においてRPL-3について観察された閾値サイクル数であり、Rnは6つの腺腫で観察されたAPPについての平均閾値サイクル数であり、Enは6つの腺腫で観察されたRPL-3についての平均閾値サイクル数である。
【００３０】
DNAの調製方法および解析方法
Qiagen DNA簡便精製キット（Qiagen DNA Easy Purification Kit）（Qiagen）を用いて、精製した上皮細胞からゲノムDNAを調製した。遺伝子のコピー数を評価するため、各DNA試料に対して6回の独立した反復を行った。ゲノムDNA鋳型なしで対照反応を行ったことを除いては、発現解析について上記したようにリアルタイムPCRを行った。
【００３１】
プライマー3（http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi）により、ゲノムPCR用のプライマーを設計した。コピー数の最初の測定用に用いたプライマーセットは、PRL-3用の
2005514918.tif 000003
および染色体8q上の近位用の
2005514918.tif 000004
（Celeraスカフォールド：GA_x5HB7VCY1B9）であった。増幅の条件は、95℃で2分間の1サイクル、その後、95℃で15秒間、58℃で15秒間、72℃で15秒間の35サイクルとした。
【００３２】
実施例2：複数の転移病巣におけるリアルタイムPCR
転移ライブラリーにおいて欠失しているよりも濃縮されている転写産物の方が、診断および治療の明らかな可能性を有する。したがって、本発明者らは、さらなる解析のために最も興味深い濃縮転写産物38個を選択した（表1）（11）。SAGEデータを確認するため、定量的リアルタイムPCRにより、いくつかの顕微解剖した転移、原発性癌、前悪性腺腫、および正常上皮におけるこれらの転写産物の発現を比較した（8）。これらの転写産物38個はすべて、試験した転移病巣の少なくとも一部において増加していることが見出されたが、1つの遺伝子PRL-3のみが一貫して過剰発現していることが見出された。
【００３３】
表1において、SAGEタグとは、各転写産物のNlaIII制限部位（CATG）のすぐ近傍にある10 bp配列を表す。SAGEライブラリーは、2つの正常結腸組織（一方のライブラリーは48,479個のタグを含み、もう一方のライブラリーは49,610個のタグを含む）、2つの原発性結腸直腸癌（一方のライブラリーは55,700個のタグを含み、もう一方のライブラリーは41,371個のタグを含む）、および結腸直腸転移（94,445個のタグ）から構築した。転写産物の説明は、SAGEタグのUnigene指定（www.ncbi.nlm.nih.gov/SAGE/SAGEtag.cgi）を引用する。タグが2つのUnigene割り当てと一致した場合には、両方とも記載する。各欄に記載した数は、表示した組織から作製したライブラリーで観察された、表示した遺伝子に対応するSAGEタグの数を表す。例えば、転移のSAGEライブラリーではPRL-3について12個のSAGEタグが観察されたが、他の4つのライブラリーではPRL-3 SAGEタグは観察されなかった。
【００３４】
実施例3：PRL-3の発現と転移との関連性
PRL-3（PTP4A3としても知られる）は小さな22 kDチロシンホスファターゼをコードしているが、これはカルボキシル末端がプレニル化された場合には細胞膜に位置し、この脂質に複合化しなかった場合は核に存在する（12）。正常なヒト成人組織中で、PRL-3は主に筋肉および心臓で発現されている（13）。PRL-3はこれまでヒトの癌と関係づけられていなかったが、PRL-3の過剰発現がヒト胎児腎臓線維芽細胞の増殖を増強することが見出され（13）、PRL-3に近縁であるPRL-1またはPRL-2の過剰発現が、培養においてマウス線維芽細胞およびハムスター膵上皮細胞を形質転換すること、およびヌードマウスにおいて腫瘍増殖を促進することが見出された（14, 15）。この情報、本発明者らの予備実験データ、および細胞のシグナル伝達および異常増殖における他のホスファターゼの重要性に基づき、本発明者らはPRL-3をさらに詳細に調べた。まず、上記の手順により、様々な段階の結腸直腸腫瘍の結腸直腸組織から精製した上皮細胞におけるPRL-3の発現を調べた（8）。この精製は、その発現の正確な定量化には必須であることが判明した。PRL-3は正常結腸直腸上皮および良性腫瘍（腺腫）由来の上皮において低レベルで発現し、悪性I期またはII期の癌の一部において中レベルで発現していた（図2）。それに対し、12の結腸直腸癌転移のそれぞれにおいて比較的高レベルで発現していた（図2の例）。
【００３５】
実施例4：複数の患者試料におけるPRL-3発現の一貫した関連性
図2で評価した転移は、初期の病変を入手した同じ患者由来ではなかった。以前の解析から、多くの遺伝子の発現パターンは個人間で異なり、別の患者由来の組織の比較により誤解を招くことになり兼ねないことが明らかになっている（16）。この事柄に対処するため、6人の別々の患者それぞれの肝臓転移、転移を起こす進行性（III期）結腸直腸癌、および正常結腸直腸上皮から上皮細胞を精製した。これらの場合の正常上皮では発現はほとんど見られず、進行性原発性癌において中程度の発現が見られ、対応する転移病巣それぞれにおいて有意に高い発現が見られた（図3）。
【００３６】
実施例5：PRL-3は一部の転移病巣において増幅される
転移においてPRL-3が比較的高レベルで発現されるという知見は、それが転移において原因となる役割を果たすことと一致している。しかし、ヒトの癌において遺伝子を意味づける最も決定的な方法は、その遺伝子の遺伝子改変を同定することである（17）。したがって、ヒトの癌において増殖制御遺伝子の発現を増加させるよく知られた機構である遺伝子増幅を通じて、PRL-3が遺伝子改変されているか否かを判定した（18）。放射線ハイブリッドマッピングおよびシンテニーマッピングにより、PRL-3遺伝子は、染色体バンド8q24.3に相当する位置である、染色体8qのテロメアから約3 Mbに位置することが見出された（19）。それぞれ別の患者由来の12の転移病巣の精製上皮細胞から調製したゲノムDNAのリアルタイムPCR解析を行い、PRL-3遺伝子の含有量を測定した。発現解析と同様に、そのような精製が信頼のおける定量化に重要であることが明らかになった。それぞれの場合において、染色体8qのセントロメア近傍の配列のゲノム含有量に対する、PRL-3配列のゲノム含有量を測定した（8）。この比較により、真の増幅を異数性による染色体数の単なる増加と識別することが可能となった（18）。試験した12の転移のうち3つが、二倍体ゲノム当たり約25コピー、26コピー、および37コピーレベルの増幅を示した。
【００３７】
実施例6：PRL-3は単位複製配列における唯一の既知発現遺伝子である
次に、染色体8qにわたって分配される配列のゲノム含有量を比較し、これら3つの転移において増幅された配列を限定した（8）。ほとんど完全なヒトのゲノム配列が入手可能であることから、このマッピングへの試みが大幅に促進された（20, 21）。PRL-3遺伝子はヒトゲノム解析計画で作成された公的データベース中には認められなかったが、染色体8pのテロメアから約145 Mbおよび染色体8qのテロメアから約3 Mbに位置するCeleraスカフォールドに見出され、本発明者らの放射線ハイブリッドマッピングのデータと一致した（19, 22）（図4）。すべての場合において、増幅は、PRL-3を含む染色体8qの非常に小さな領域に制限されていた（図4）（22）。この小さな単位複製配列中に存在する既知遺伝子または予測遺伝子は、PRL-3およびTATA結合タンパク質と相同的な推定遺伝子のみであった。後者の遺伝子の発現は、RT-PCRにより評価したところ、転移病巣において検出されなかった。しかし、PRL-3が位置するCeleraスカフォールドの領域は（22）、大きさ<20 kbと推定されるギャップを含んでいる。これらのギャップが実際には予想を上回るとすれば、単位複製配列の全体の大きさは図4で示す100 kbよりも大きいことになり、さらなる遺伝子を含む可能性が出てくる。
【００３８】
本発明を、ここまで本発明を実施する好ましい態様を含む特定の実施例について記載してきたが、当業者は、添付の特許請求の範囲に記載の本発明の精神および範囲に含まれる上記の系および技術の幾多の変更および置換が存在することを理解すると思われる。
【００３９】
（表１）大腸癌転移において上方制御される選択された遺伝子
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【００４０】
（表２）大腸癌転移において上方制御される選択された遺伝子をRT-PCRにより調べるために用いたプライマー
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【００４１】
（表３）PRL-3単位複製配列をゲノムPCRによりマッピングするために用いたプライマー
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【００４２】
参照文献および注釈
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【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】上皮細胞の精製。結腸上皮細胞は、以前に記載された上皮細胞を精製するためのイムノアフィニティー精製スキームを改変したものを用いて精製した（St Croixら、Science 289, 1197 (2000)）。外科的除去後直ちに組織を入手し、コラゲナーゼを用いて37℃で1時間消化した。400 m、50 m、および25 mのナイロンメッシュを通す一連の連続的ろ過を行い、単一細胞懸濁液を得た。抗CD14および抗CD45の免疫磁気ビーズ（Dynal）混合物を用いて、造血細胞および磁気ビーズに非特異的に結合する細胞を除去した（負の選択）。続いて、細胞懸濁液中に残存する上皮細胞を、抗BerEP4免疫磁気ビーズ（Dynal）への結合によって単離した（正の選択）。BerEP4抗体は、正常結腸上皮上および腫瘍結腸上皮上には存在するが肝細胞または間質細胞上には存在しない全上皮抗原を認識する（U. Latza, G. Niedobitek, R. Schwarting, H. Nekarda, H. Stein, J. Clin. Pathol. 43, 213 (1990)）。上皮に結合したBerEP4は、血球計数器で定量した。
【図２】様々な段階のヒト結腸直腸腫瘍におけるPRL-3発現。リアルタイムPCRを用いてPRL-3の発現を評価し（8）、正常結腸直腸組織および腫瘍結腸直腸組織においてほぼ同じレベルで発現されることがこれまでに示されているβ-アミロイド前駆タンパク質（APP）遺伝子の発現と比較した（9）。本実験で解析した転移は、正常上皮および他の病変の由来の元となった患者とは別の患者由来であった。上皮細胞は、（8）の記載のように精製した。（図2A）正常結腸直腸上皮（N1〜N3）、腺腫（A1〜A3）、原発性癌（C1〜C3）、および転移（M1〜M3）由来のRT-PCR産物のゲル。リアルタイムPCRは24時間行ったが、この時点で転移由来のRT-PCR産物は明らかであったが他の病変由来のシグナルは出現する以前であった。矢印は、198 bpのPRL-3 RT-PCR産物を示す。（図2B）結果をPRL-3発現とAPP発現間の比率として表し、腺腫における平均発現に対して標準化する。各解析について、二通りの実験を示す。
【図３】対応する転移および進行性の原発性癌におけるPRL-3発現。6人の患者それぞれの肝臓転移、転移を起こす原発性癌、および正常結腸直腸上皮から、結腸上皮細胞を精製した。（図3A）4人の患者の対応する正常、原発性癌、および転移由来のRT-PCR産物のゲル。リアルタイムPCRは24時間行ったが、この時点で転移由来のRT-PCR産物は明らかであったが他の病変由来のシグナルは出現する以前であった。矢印は、198 bpのPRL-3 RT-PCR産物を示す。（図3B）発現の相対的レベルは、図2と同様に測定した。
【図４】PRL-3の単位複製配列マッピング。リアルタイムPCRにより、示された遺伝子座のそれぞれに相当する配列のコピー数を測定した。それぞれの場合において、正常細胞の等量のDNAと比較することにより、二倍体ゲノム当たりのコピー数を測定した（8）。3人の別々の患者の転移の精製した上皮細胞由来のゲノムDNAを、これらの実験に使用した。別の9人の患者では、PRL-3配列の増幅は観察されなかった。上のパネルは、様々な染色体8q配列に相当するプライマーおよび対照としての2つの別の染色体腕の配列に相当するプライマーを用いた、転移の1つから得られた結果を表す。下のパネルは、染色体8pのテロメアから約145 Mbの小さな領域内の配列に相当するプライマーを用いた（染色体8のセントロメアは約45 Mbに位置する）、3つの転移すべてのより詳細なマッピングを示す。下のパネルにおいて示した位置は、145 Mbの位置より遠位のヌクレオチドを表す（例えば、「152,861」は8pのテロメアから145,452,861 bpの位置を表す）。3つの転移はすべて、近位の染色体8q配列の増幅を欠くことが示された（95 Mbおよび135 Mbの位置において）。これらの病変の精製上皮細胞から得られたDNA量は限られているため、すべての転移においてすべてのマーカーを調べることができたわけではない。バーは少なくとも3回の独立した測定の平均値を表し、標準偏差は常に測定したサイクル数の<5%であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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