(57)【要約】  分離手段および濃縮手段を含んでなるサンプルタンパク質の混合物の統合型逐次分離濃縮を行うためのデバイスであって、それにより、盆と流路のエッチング加工された系内でフリーフロー電気泳動−等電点電気泳動（ＦＦＥ−ＩＥＦ）が起こるように配置され、好ましくは分離ステップで用いられ、分離されたタンパク質フラクションを濃縮段階に誘導するために多流路の導路が用いられ、固相微小抽出手順が、任意にドッキング可能な形式で、好ましくは濃縮ステップで用いられる。分離されたフラクションは次に後続のマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）分析のためのＭＡＬＤＩプレート上に分配されることが好ましい。
2005513452.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液中のサンプル分子の混合物を分離および濃縮するために使用可能なデバイスであって、
小プレートで流体により連通して配置され、かつ、１つの層流部分から他の部分への生体分子の有意な拡散を防止するために十分に小さな、分離手段のフォーカスライン（Ｌ）から抽出手段のフロントライン（Ｆ）までの距離を有する、分離手段（３１）および濃縮手段を備えたことを特徴とするデバイス。
【請求項２】
前記分離手段（３１）が、入口（１）、盆（３）、および前記入口（１）から流れる流体をフリーフロー等電点電気泳動により異なる等電点を有する生体分子を含有するフラクション（１２０）に分離できるように前記盆（３）の側部に配置された電極（１１０，１１１）を備えた、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記電極が、前記盆（３）との流体接続を有する盆（３）の側部区画内に配置される、請求項２に記載のデバイス。
【請求項４】
前記抽出手段（５）が２つの外側表面（５１，５２）および多数の流路を分離する多数の分離壁を備え、各流路が吸着手段を備えた、請求項１に記載のデバイス。
【請求項５】
多数のノズル開口（１３０）を備えたディスペンサー盆（８）を含んでなる分配ゾーン（７）を更に備え、前記ゾーンが前記抽出手段と流体により連通して配置され、前記ディスペンサー盆の区画表面（７１，７２）が前記抽出手段の外側表面（５１，５２）の延長部を含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項６】
濃縮手段およびドッキング手段を備え、他のユニット、例えば分配ユニットとのドッキングが可能である、固相抽出ユニット。
【請求項７】
フリーフロー電気泳動手段およびドッキング手段を備え、他のユニット、例えば固相抽出ユニットとのドッキングが可能である、フリーフロー電気泳動ユニット。
【請求項８】
前記分離手段が、前記タンパク質を含有する前記溶液の流れの方向に対して直交する方向にタンパク質を分離するように構成されている、請求項１に記載のデバイス。
【請求項９】
溶液中のサンプル生体分子の混合物を分離および濃縮するための方法であって、
- 分離デバイスに溶液の流れを送るステップと、
- 同分離デバイスにバッファー両性電解質の流れを送るステップと、
- 前記流れの方向と直交して前記流れにわたって電圧を印加することにより、前記バッファー両性電解質中にｐＨ勾配を生じさせ、タンパク質をその等電点に向かって移動させ、それにより異なる等電点を有するタンパク質を分離するステップと
を含んでなることを特徴とする方法。
【請求項１０】
- 前記異なる等電点を有するタンパク質を含有する流れの分離フラクションを収集するステップ
を更に含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
濃縮デバイスに分離されたタンパク質を送るステップを更に含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記濃縮デバイスが固相濃縮デバイスである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
該ＳＰＥ濃縮部分の各々を微小分配手段によりプレートに付着させるステップを更に含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記分配がアレイディスペンサーにより行われる、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生体高分子の分離、濃縮および分析のための方法およびデバイスに関する。より詳しくは、本発明はタンパク質の統合型逐次分離濃縮(integrated sequential separation and enrichment）のためのデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノム研究により支援される医学関連の新たな生物学的標的の同定は、拡大しつつある現代薬物研究の領域である。これらの標的は、例えば、体内の特定の応答の誘発に関与する受容体である。これらの標的と相互作用し、それによりこれらの応答を遮断、低減あるいは向上できる潜在的な薬物分子を設計および合成することに注目が集まっている一方、標的タンパク質および標的タンパク質複合体それ自体を同定する仕事も注目を集めており、改善を必要としている。
【０００３】
有用タンパク質の迅速かつ効率的な同定を可能とする方法とともに、複雑な生物学的サンプル中に存在する関連のあるペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質を選択および同定するための方法に対する必要性がある。このような方法は存在するが、これらの多くは遅くかつ労働集約的であることが示されている。さらに、これらの方法は、比較的多量の試験材料を消費するものであり、そのスクリーニング効率において制限されているので、サンプルの使用を効率的に行うものでない。
【０００４】
分離および同定を伴うペプチドおよびタンパク質の特性付けのための方法は大部分が数十年間不変のままである。最も一般的な２つの方法として、硫酸ドデシルナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびキャピラリー電気泳動（ＣＥ）があり、例えば、Westermeier, R. "Electrophoresis in Practice: A Guide to Methods and Applications of DNA and Protein Separations（実用電気泳動：ＤＮＡおよびタンパク質分離の方法および応用への案内）", 3rd Ed., Wiley-VCH, Weinheim を参照。他の方法は等電点電気泳動法であり、例えば、ファルマシア・ファイン・ケミカルズ（Pharmacia Fine Chemicals）より刊行された "Isoelectric Focusing, principles & methods（等電点電気泳動、原理および方法）" を参照。
【０００５】
以下の多数の特許文献において最近の先行技術が開示されている。
【０００６】
ＷＯ００／４６５９４は、キャピラリー電気泳動原理の変形に基づいてタンパク質を特性付けるための方法、デバイス、キットおよびシステムを記載しており、ここでポリペプチドは、キャピラリー流路(channel）内に含まれるポリマー分離マトリックスを通過する該ポリペプチドの電気泳動移動度によるポリペプチドの分子量によって区別化される。この発明における分離マトリックスは、ポリマーマトリックス、緩衝剤、界面活性剤および親脂性色素を含んでなる。分析されるタンパク質またはポリペプチドサンプルは、分離前にタンパク質を変性させるために界面活性剤含有バッファーで最初に前処理される。処理されたサンプルは次にキャピラリー流路に導入され、ここで該チャネルの長さを横切って電場が印加される。実質的な電荷を帯びた界面活性剤により被覆されたポリペプチドがキャピラリー流路を通じて移動することになる。
【０００７】
異なるサイズまたは分子量のポリペプチドは、ポリマー溶液またはマトリックスを通じて異なる電荷／質量比に起因して異なる速度で移動し、そして分離されることになる。移動中に、ポリペプチドは検出を可能とする親脂性色素を捕捉する。この発明で主張される重要な利点として、従来のＳＤＳ−ＰＡＧＥに比較して、著しく少量の界面活性剤（例えばＳＤＳ）しか必要としないことがあり、このことは界面活性剤ミセルに結合する色素を減量し、それによりバックグラウンドノイズを減少させるとともに検出能を向上する。
【０００８】
ＷＯ９９／２２２２８は、全レーンまたはカラムにおいてサンプル例えばＤＮＡ断片からの全フラクションの自動化された並列分離と包括的な収集を可能にするモジュール式複レーン微小調製フラクション収集システムを、サンプルフラクションの更なるオン・ライン自動化サンプル分析のオプションとともに、記載している。分離はキャピラリー電気泳動、キャピラリー等電点電気泳動およびキャピラリー電気クロマトグラフィなど幾つかの代替法を用いて行いうる一方、検出段階は、例えば、オン・カラムまたはオン・レーン検出を用いるレーザー励起蛍光、吸光（ＵＶ、可視またはＩＴ）など代替光学法を用いうる。
【発明の開示】
【０００９】
本発明は分子の分離、濃縮および分析のための方法およびデバイスに関する。より詳しくは、本発明は生体分子、例えばタンパク質の統合型逐次分離濃縮のためのデバイスに関する。
【００１０】
本発明によるデバイスの好ましいものは、盆(basin）と流路(channel）の配置された系を有し、かつ前記盆と流路を封止するためのカバープレートを備えた、数ミリメートルの長さをもったプレートを含んでなる。前記盆と流路は、フリーフロー等電点電気泳動を実行する手段、固相抽出を実行する手段、および流体を分配する手段を備えており、該プレートに導入されるサンプル溶液がフラクションに分離され、次に各フラクションが関連のある分子の抽出の対象となり、次に抽出された分子が濃縮および分配され、その後に該プレートを出るようにされている。これらの溶液は、好ましくは、後続のマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）分析のためのＭＡＬＤＩプレート上に分配される。
【００１１】
該デバイスのプレートフォーマットは、多数の並列流路を単一の処分可能プレートまたはチップに小型化および統合することを可能にする。
【００１２】
ＷＯ００／４６５９４およびＷＯ９９／２２２２８は両方とも、ペプチドおよびタンパク質の改善された分離および分析を可能とする方法およびデバイスに関するが、いずれも本発明に見られるような検出能向上を可能とするタンパク質のオン・ライン濃縮のための付加的な段階を有しない。この濃縮段階は、分離ステップの直後の分離流路に配置された多孔性床での固相微小抽出手順、次に該サンプルを小領域標的に分配することを含んでなる２ステッププロセスであり、ここで蒸発が該サンプルを更に濃縮し、すなわち、固相床で濃縮されたタンパク質は次に多孔性床から流出し、微小分配（micro-dispensing）手段、例えば、インクジェット印刷と同様の、濃縮され流出したタンパク質サンプルの一連の液滴をマイクロリットル〜ナノリットル範囲の全体量で放出する圧電微小デバイスにより、受取標的プレートに微小液滴として移動する。
【００１３】
また、最も重要なこととして、分配されたサンプル液滴は、配置された微小フォーマットによる分配プロセス中の急速な溶媒蒸発によって濃縮されるため、分配されたサンプル液滴はこのステップで濃縮され、それにより、次に乾燥されるサンプルスポット上の分析物密度は付着(deposit）される液滴毎に増大する。
【００１４】
この２ステッププロセスの濃縮段階の第１ステップは、追加的構成として、ドッキング可能ユニットで実行してよい。本発明による１実施形態において、分離段階は、タンパク質分解にとって強力な方法であることが分かっている液系の等電点電気泳動（ＩＥＦ）法を含むフリーフロー電気泳動（ＦＦＥ）を伴う。また、分離流路のデザインは、分離されたサンプルを、例えばアレイフォーマットで、後続して並列処理することを可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
添付図面を参照して本発明を以下に説明する。
【００１６】
以下の説明において、「仮想流路」という用語は、層状に流れる流体の微視的な流れ部分を意味することが意図され、前記部分は流れ方向に平行な長軸を有し、かつ前記部分は流れ方向に直交する幅と深さを有し、前記部分は前記層流および小（微小）寸法ゆえに前記流れる流体の残りの部分とは混合しない入力とみなすことができ、そのため「仮想路」を構成する。代替的な用語として「仮想路流」、「仮想流線」および「仮想流レーン」がある。
【００１７】
図１から導かれるように、本発明の実施形態の１つは、タンパク質の統合型逐次ゲル無し分離濃縮のためのデバイスに関する。また、前記デバイスの使用により前記タンパク質を分離および濃縮するための方法も企図される。前記分離および濃縮の方法およびデバイスは、新規な方法およびデバイスとともに、公知の原理および方法の便利な組合せである。この組合せは、難儀な手入力の少なさによるサンプル処理時間の点ならびに同定ステップにおけるタンパク質分解能の点で、本発明によるデバイスの効率に改善された効果を与えることになる。
【００１８】
タンパク質分子および溶媒の混合物中のタンパク質の統合型逐次分離濃縮を行うための該デバイスは、図１で模式的に概説される。該デバイスは分離手段および濃縮手段を含んでなる。
【００１９】
サンプル入口２およびバッファー入口１（これらは任意に同一であってよい）により、サンプルタンパク質をサンプルバッファー流と直交して分離する分離部分３１にサンプルが送られる。前記分離部分３１は、小プレートで前記入口１，２と流体により連通して配置され、かつ、電極１１０，１１１の対の最下流部の間の想像線と考えられる分離手段のフォーカスライン（Ｌ）から（分離壁の上流開始部に相当する）抽出手段のフロントライン（Ｆ）までの距離が、１つの分離されたフラクション／層流部分から層流のパターンを通る他の部分への生体分子の有意な拡散を防止するために十分に小さい、分離盆３および分離手段を備えている。分離後、流路４が、分離されたサンプルを、タンパク質の濃縮に適したデバイスの微小抽出手段を含んでなる微小抽出部分である第２部分５に導く。この部分５は微小抽出手段（図示せず）および分離壁６を含んでなる。微小抽出部分５は任意にドッキング可能ユニットであってよい。この用語は前記部分が他のデバイス／ユニットと取り付け可能、取り外し可能および再び取り付け可能なユニットを含んでなることを意味する。
【００２０】
該デバイスは、多数のノズル開口１３０を備えたディスペンサー盆８を含んでなる分配部分７を更に含み、前記部分７は前記抽出手段と流体により連通して配置され、前記ディスペンサー盆の区画表面７１，７２が前記抽出手段の外側表面５１，５２の延長部を含む。前記盆８は寸法を可能な限り小さくするために分割壁を用いないで構成されている。拡散が分離された部分を混合するという問題は、流れの速度、すなわち層流条件を制御することに起因して流れがノズル開口１３０を越えて流出または分配される前に流れが拡散により横方向に混ざり合うために十分な時間がないことによって解決される。
【００２１】
図２は、流れをディスペンサーノズル開口まで分離する分離壁を含んでなる代替的な設計を有するデバイスの第２実施形態を示す。
【００２２】
前述した部分は、代替的な組合せにおいて、相互にドッキング可能な分離ユニットを含んでなり、例えば、フリーフロー電気泳動手段の形の分離手段とドッキング手段を含んでなる分離ユニットは、固相濃縮手段とドッキング手段を含んでなる濃縮ユニットとドッキングすることができる。前記ドッキング手段は、サンプル溶液が１つのユニットから他のユニットへ流れることを可能にするような接続を含んでなる。
【００２３】
該デバイスを使用する方法では、サンプルタンパク質は第１部分３においてゲル無し分離プロセスで最初に分離され、それゆえに第１部分３は好ましくはフリーフロー電気泳動（ＦＦＥ）の使用により構成されている。サンプルタンパク質／分子は、好ましくはｐＨ（等電点電気泳動，ＩＥＦ）により分離される。流れるサンプル溶液がＦＦＥにかけられてタンパク質が並列して自由に流れる層流に分離されるようになったＦＦＥの終了時に、分離されたサンプルタンパク質は、（流れ方向に）ＦＦＥの直後に配置された分離壁６を有する分離流路において分離されたままである。これらの流路４は、その分離されたサンプルの後続の並列処理、例えば９６ウェル、３８４ウェルまたは更に高次のウェルフォーマットの、或いは例えば１２行またはそれ以上の行の便宜なストリップフォーマットの、アレイフォーマットプレートに注入するように繰り返して多数の並列サンプルを最終的に分配することによって、例えばアレイフォーマットで後続の並列処理を行うことを可能にする、第２部分を構成する。
【００２４】
第２部分５において実行することができる典型的なステップは、濃縮手順であり、好ましくは、例えば粒子の使用による、多孔性床での固相微小抽出手順（ＳＰＥ）である。前記ＳＰＥは、分析されるタンパク質に対して高い親和性を有する適当な表面官能性をもったポリマー構造または高多孔性シリコン構造を含むことができるか、或いはチップに充填されたビーズ粒子を含むことができる、統合型微小抽出アレイチップで実行することができる。
【００２５】
他の実施形態において、前記微小抽出手順は、前述した分離流路の直後に配置された任意にドッキング可能な微小抽出ユニットで進行する。サンプルタンパク質を特定の小体積、例えばマイクロリットル〜ナノリットル範囲、で流出／分配することによって、多孔性床からのサンプル流出、ならびに微小分配（「インクジェット処理」）および急速蒸発による統合されたオン・ライン・フラクション収集により、サンプルタンパク質は２ステッププロセスで濃縮される。
【００２６】
記載されるタンパク質分離濃縮手順に必要とされる高レベルの統合を達成するために、本システムはマイクロ−およびナノテクノロジーにより加工されることが好ましい。小型化およびコンパクトなシステム統合に対する必要性は、元々のタンパク質サンプルは非常に希薄または極小体積であってよいという事実から由来し、したがって生物分析プロトコルの実行時に分析物分子の損失を回避するために分析手順における最小限のサンプル処理ステップを必要とする。
【００２７】
図３は該デバイスの３つの他の実施形態を示し、ここで分離、微小抽出、分配および標的分析段階は全て、種々の代替方法で組み立てることができるドッキング可能ユニットの形態である。
【００２８】
２ステップＦＦＥ
図４に示す、本発明の１実施形態による２ステップデバイス４００において、第１分離部分／チップ４０１から得られるサンプル溶液が、複数の分離チップ４２１，４２２等を備えかつ前記第１ステップチップ４０１との流体接続４１１，４１２等を有しかつより多くの流体部分への分離を達成し得るように印加される電圧および適当な両性電解質バッファーを備えた第２分離ステップ４０２に送られるように、ＦＦＥ部分／チップが構成される、。典型的な実施形態では、流入するサンプル溶液を第１ステップ４０１で１０の流体部分に分離し、次にそれらの部分を各々１０の小部分に分離し、１００の流体部分への全体分離をなし得る。次に、これらの流体部分の各々が、有利に、後続のＭＡＬＤＩ分析のための１以上のＭＡＬＤＩ標的プレートへのアレイ分配の対象となる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明によるデバイスの第１実施形態を示す図である。
【図２】本発明によるデバイスの第２実施形態を示す図である。
【図３】本発明による異なる実施形態のブロック図である。
【図４】２ステップＦＦＥデバイスの原理図である。
【図１ａ】
2005513452.tif 000003
【図１ｂ】
2005513452.tif 000004
【図２ａ】
2005513452.tif 000005
【図２ｂ】
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【図３】
2005513452.tif 000007
【図４】
2005513452.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成16年1月20日(2004.1.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2005513452.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成16年2月26日(2004.2.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液中のサンプル分子の混合物を分離および濃縮するために使用可能なデバイスであって、
分離手段（３１）および濃縮手段を備え、前記分離手段（３１）は、前記溶液が電極（１１０，１１１）を越えて層状に流れるときに異なるサンプル分子を前記流れる溶液の異なる層流部分に移動させるように前記溶液に作用する電場を生成可能な電極（１１０，１１１）を備え、前記分離手段および前記濃縮手段は小プレートで流体により連通して配置され、分離壁の最上流部に接する線に相当する微小抽出部分（５）のフロントライン（Ｆ）が電極（１１０，１１１）の最下流部に接する線に相当する分離手段のフォーカスライン（Ｌ）に一致するように前記濃縮手段の多数の分離壁が配置され、あるいは流れが前記分離壁間で形成された多数の流路に入る前の１つの層流部分から他の部分への生体分子の有意な拡散を防止するために前記ライン間の距離が十分に小さくなるように前記壁が前記電極の近くに配置され、前記抽出手段（５）が２つの外側表面（５１，５２）を備え、各流路が吸着手段を備えたことを特徴とするデバイス。
【請求項２】
前記分離手段（３１）が、入口（１）、盆（３）、および前記入口（１）から流れる流体をフリーフロー等電点電気泳動により異なる等電点を有する生体分子を含有するフラクション（１２０）に分離できるように前記盆（３）の側部に配置された電極（１１０，１１１）を備えた、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記電極が、前記盆（３）との流体接続を有する盆（３）の側部区画内に配置される、請求項２に記載のデバイス。
【請求項４】
溶液中のサンプル分子の混合物を分離および濃縮するために使用可能なデバイスであって、
小プレートで流体により連通して配置され、かつ、１つの層流部分から他の部分への生体分子の有意な拡散を防止するために十分に小さな、分離手段のフォーカスライン（Ｌ）から抽出手段のフロントライン（Ｆ）までの距離を有する、分離手段（３１）および濃縮手段を備えたこと、ならびに
多数のノズル開口（１３０）を備えたディスペンサー盆（８）を含んでなる分配ゾーン（７）を更に備え、前記ゾーンが抽出手段（５）と流体により連通して配置され、前記ディスペンサー盆の区画表面（７１，７２）が前記抽出手段（５）の外側表面（５１，５２）の延長部を含むことを特徴とする、デバイス。
【請求項５】
濃縮手段およびドッキング手段を備え、他のユニット、例えば分配ユニットとのドッキングが可能である、固相抽出ユニット。
【請求項６】
フリーフロー電気泳動手段およびドッキング手段を備え、他のユニット、例えば固相抽出ユニットとのドッキングが可能である、フリーフロー電気泳動ユニット。
【請求項７】
前記分離手段が、前記タンパク質を含有する前記溶液の流れの方向に対して直交する方向にタンパク質を分離するように構成されている、請求項１に記載のデバイス。
【請求項８】
溶液中のサンプル生体分子の混合物を分離および濃縮するための方法であって、
- 分離デバイスに溶液の流れを送るステップと、
- 同分離デバイスにバッファー両性電解質の流れを送るステップと、
- 前記流れの方向と直交して前記流れにわたって電圧を印加することにより、前記バッファー両性電解質中にｐＨ勾配を生じさせ、タンパク質がその等電点に向かって移動するようにし、それにより異なる等電点を有するタンパク質を、前記溶液の流れの異なる層流部分に分離するステップと、
- 前記異なる等電点を有するタンパク質を含有する流れの分離フラクションを収集するステップと、
２つの外側表面（５１，５２）および多数の流路を分離する多数の分離壁を備え、各流路が吸着手段を備えた濃縮デバイスに、分離されたタンパク質を送るステップと
を含んでなり、
前記分離デバイスおよび前記濃縮デバイスは小プレートで流体により連通して配置され、前記分離壁の最上流部に接する線に相当する前記濃縮デバイスのフロントライン（Ｆ）が前記分離デバイスの電極（１１０，１１１）の最下流部に接する線に相当する前記分離デバイスのフォーカスライン（Ｌ）に一致するように前記多数の分離壁が配置され、あるいは流れが前記流路に入る前の１つの層流部分から他の部分への生体分子の有意な拡散を防止するために前記ライン間の距離が十分に小さくなるように前記壁が前記電極の近くに配置されることを特徴とする方法。
【請求項９】
前記濃縮デバイスが固相濃縮デバイスである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
該ＳＰＥ濃縮部分の各々を微小分配手段によりプレートに付着させるステップを更に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記分配がアレイディスペンサーにより行われる、請求項１０に記載の方法。
【国際調査報告】
2005513452.tif 000010
2005513452.tif 000011
2005513452.tif 000012
2005513452.tif 000013
2005513452.tif 000014