(57)【要約】  ホストの免疫系の１以上の反応を調節するか、若しくは抗腫瘍薬または疾患治療剤を前記ホスト体内に送達する治療薬。本治療薬は、調節部分と、該調節部分の活性を不活化するか大幅に低減させる担体タンパク質とを有する。本治療薬は更に本治療薬が開裂する開裂部位を含み、これにより担体タンパク質から調節部分が遊離することによって本治療薬がホスト体内の疾患部位で作用することが可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホストの免疫系の１以上の反応を調節する治療薬であって、
ｉ）免疫調節タンパク質（ＩＲＰ）またはその機能性フラグメントである少なくとも１個の調節部分と、
ｉｉ）前記ＩＲＰを不活性化またはほぼ不活性化する担体タンパク質と、
ｉｉｉ）これらの間に配される少なくとも１個の開裂部位とを有することにより、前記調節部分がホスト体内の標的臓器又は組織中若しくは標的臓器又は組織の付近に存在する場合に前記開裂部位が開裂して調節部分が前記担体タンパク質から遊離することによってその調節活性を回復することを特徴とする治療薬。
【請求項２】
全身的には不活性である治療薬であって、
ｉ）治療活性を有する少なくとも１個の調節部分と、
ｉｉ）前記調節部分を不活性化またはほぼ不活性化する担体タンパク質と、
ｉｉｉ）これらの間に配される少なくとも１個の開裂部位とを有する治療薬において、前記開裂部位がマトリクス・メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）またはアグリカナーゼの基質であることにより、ホスト体内でＭＭＰまたはアグリカナーゼが活性である部位において前記開裂部位が開裂して前記調節部分が前記担体タンパク質から遊離することによってその治療機能を発揮することを特徴とする治療薬。
【請求項３】
ホストの免疫系の１以上の反応を調節するための治療薬であって、
ｉ）免疫調節タンパク質（ＩＲＰ）またはその機能性フラグメントである少なくとも１個の調節部分と、
ｉｉ）前記ＩＲＰを不活性化またはほぼ不活性化する担体タンパク質と、
ｉｉｉ）これらの間に配される少なくとも１個の開裂部位とを有する治療薬において、前記開裂部位が補体系の少なくとも１つの酵素の基質からなることにより、前記治療薬がホスト体内の補体が活性である部位内または付近にある場合に前記開裂部位が開裂して前記免疫調節部分が前記担体タンパク質から遊離することによってその免疫調節活性が発揮されることを特徴とする治療薬。
【請求項４】
前記免疫調節タンパク質（ＩＲＰ）は補体調節タンパク質（ＣＲｅｇ）またはその機能性フラグメントである請求項１または３に記載の治療薬。
【請求項５】
前記（ＣＲｅｇ）は、崩壊加速因子、または血漿プロテアーゼ因子Ｉの補因子、または膜攻撃複合体の形成阻害因子、またはこれらの組合わせとして機能することを特徴とする請求項４に記載の治療薬。
【請求項６】
前記治療薬は、複数の調節部分を有し、そのうちの２個が異なる活性を有することを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の治療薬。
【請求項７】
前記開裂部位は酵素的に開裂可能な部位であることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の治療薬。
【請求項８】
前記開裂部位は補体系の酵素の基質であることを特徴とする請求項１乃至７のいずれかに記載の治療薬。
【請求項９】
前記開裂部位は、複数の開裂部位からなることを特徴とする請求項１乃至８のいずれかに記載の治療薬。
【請求項１０】
前記開裂部位の少なくとも１個は、マトリクス・メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）またはアグリカナーゼの基質からなることを特徴とする請求項１乃至９のいずれかに記載の治療薬。
【請求項１１】
前記開裂部位は、ＭＭＰ３またはＭＭＰ８の基質からなることを特徴とする請求項１０に記載の治療薬。
【請求項１２】
前記開裂部位の少なくとも１個は、アグリカンのｉｎｔｅｒ−ｇｌｏｂｕｌａｒドメイン（ＩＧＤ）の部分からなることを特徴とする請求項１乃至１１のいずれかに記載の治療薬。
【請求項１３】
前記開裂部位は、前記ＩＧＤの１７〜７５個のアミノ酸からなることを特徴とする請求項１２に記載の治療薬。
【請求項１４】
前記開裂部位は、前記アグリカンＩＧＤ（ｉｎｔｅｒ−ｇｌｏｂｕｌａｒドメイン）のアグリカナーゼ開裂部位の最小部分からなることを特徴とする請求項１２に記載の治療薬。
【請求項１５】
前記開裂部位はアミノ酸配列:ＲＮＩＴＥＧＥＡＲGＳＶＩＬＴＶＫを有することを特徴とする請求項１０に記載の治療薬。
【請求項１６】
前記開裂部位はアミノ酸配列：ＴＴＦＫＥＥＧＬＧＳＶＥＬＳＧＬを有することを特徴とする請求項１０に記載の治療薬。
【請求項１７】
前記開裂部位はアミノ酸配列：ＧＹＴＧＥＤＦＶＤＩＰＥＮＦＦＧＶＧＧＥＥＤＩＴＶＱＴＶＴＷＰＤＭＥＬＰＬＰＲＮＩＴＥＧＥＡＲＧＳＶＩＬＴＶＫＰＩＦＥＶＳＰＳＰＬＥＰＥＥＰＦＴＦＡＰを有することを特徴とする請求項１０に記載の治療薬。
【請求項１８】
前記担体タンパク質は抗体またはそのフラグメントであることを特徴とする請求項１乃至１７のいずれかに記載の治療薬。
【請求項１９】
前記抗体は、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ４、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ１であることを特徴とする請求項１８に記載の治療薬。
【請求項２０】
前記免疫グロブリンのＦａｂアームの１以上は、更なる調節部分を含むかまたはこれにより置換されていることを特徴とする請求項１８に記載の治療薬。
【請求項２１】
前記免疫グロブリンのＦａｂアームの１以上は、標的化部分を含むかまたはこれにより置換されていることを特徴とする請求項１８、１９または２０に記載の治療薬。
【請求項２２】
前記標的化部分は、１以上の膜標的化分子からなることを特徴とする請求項２１に記載の治療薬。
【請求項２３】
前記標的化部分は、前記調節部分と前記開裂部位との間に挿入された１以上のアドレシンを有することによって、開裂後に前記アドレシンが調節部分をその標的部位に誘導することを特徴とする請求項２２に記載の治療薬。
【請求項２４】
前記アドレシンはＡＰＴ５４２であることを特徴とする請求項２３に記載の治療薬。
【請求項２５】
前記開裂部位は、前記調節部分と前記担体タンパク質のヒンジ領域との間に配されることを特徴とする請求項１乃至２４のいずれかに記載の治療薬。
【請求項２６】
請求項１乃至２５のいずれかに記載の治療薬を製造する方法であって、前記治療薬をコードした少なくとも１個の核酸分子でトランスフォームまたはトランスフェクトした細胞にタンパク質を発現させることを含む方法。
【請求項２７】
疾患を治療するための薬剤の調製における請求項１乃至２５のいずれかに記載の治療薬の用途。
【請求項２８】
治療する前記疾患として、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、腎炎、多発性硬化症、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、虚血再灌流傷害、脱髄、重症筋無力症、アルツス反応、臓器移植後の拒絶反応などの、その病理に補体が関与する炎症性、免疫性、外傷性、または虚血性疾患の１以上が含まれる請求項２７に記載の用途。
【請求項２９】
請求項１乃至２５のいずれかに記載の治療薬と薬学的に許容される担体を組み合わせて含む医薬組成物。
【請求項３０】
患者の治療方法であって、請求項１乃至２５のいずれかに記載の治療薬または請求項２８に記載の医薬組成物を前記患者に投与することを含む方法。
【請求項３１】
付属の図面に図示、または参照して、本明細書で実質的に説明されている治療薬、医薬組成物、用途ならびに方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はホストの体内で循環する際には効果または作用が低減するように操作可能であり、かつ必要な場合に特定の部位及び時間にて活性化型として放出されるように設計された治療薬に関するものである。詳細には本発明は、ホスト体内における免疫分子または細胞の負の役割を調節するうえで使用が可能な抗補体薬剤などの免疫機能の調節因子に関するものである。本発明は更に、前記治療薬、該治療薬を含む医薬組成物、及び医療上の治療方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
補体（Ｃ）系は、ヒトや動物などのホストの免疫系における重要な要素である。Ｃは、抗原や細胞を標的化するためにタンパク質分解反応のカスケードで作用する多くのタンパク質からなることが知られている。この一連の反応では、抗原への結合によって活性化されたタンパク質が次の反応タンパク質を開裂させて新たな活性化型タンパク質分解酵素を生成し、これが反応シークエンスの次のタンパク質を開裂、活性化させる。活性化の際に生成するタンパク質分解フラグメント及びタンパク質複合体は催炎作用を有し、血管の透過性を増大させ、多形核白血球を動員するなど、炎症性の組織変化を引き起こす。
【０００３】
こうしたタンパク質の例としては、Ｃ５ａ、Ｃ３ａ及びＭＡＣ（細胞溶解性高分子膜攻撃複合体）などが挙げられる。Ｃによって細胞が標的化されると、ＭＡＣの形成により直接的に、あるいは炎症媒介因子（Ｃ５ａ、Ｃ３ａ及びＭＡＣ）の産生や、Ｃによって標的化された細胞が貪食されることにより間接的に細胞傷害または細胞死が引き起こされる。
【０００４】
このような潜在的に有害な防御機構から自らを防御するため、細胞はその表面に補体調節タンパク質（ＣＲｅｇ）を発現し、これが迅速かつ効率的に「偶発的な」Ｃ活性化細胞巣を不活性化する（Ｍｏｒｇａｎ，Ｂ＆ＨａｒｒｉｓＣ．，Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９９９））。
【０００５】
ＣＲｅｇは、Ｃの活性化の際に生成してＣ３及びＣ５の開裂を引き起こすＣ３及びＣ５コンベルターゼなどの酵素を不活性化するか、あるいはＭＡＣの生成を阻害することによって機能する。ヒトでは、Ｃ調節因子膜補因子タンパク質（ＭＣＰ；ＣＤ４６）、崩壊加速因子（ＤＡＦ；ＣＤ５５）、及び補体受容体１（ＣＲ１；ＣＤ３５）が、Ｃ３及びＣ５コンベルターゼの崩壊を加速するか、あるいは（因子Ｉとともに）Ｃ３及びＣ５コンベルターゼ酵素を不可逆的に不活性化することによってＣを阻害する。４つ目の調節因子であるＣＤ５９は、Ｃ８及び／またはＣ９に結合し、ＭＡＣ生成の際のＣ９の重合を阻害することによってＭＡＣ生成を阻害する。
【０００６】
通常の状況下では、Ｃがホモ接合体であることによる傷害から細胞を防御するにはこれらの調節機構で充分である。しかしながら慢性関節リウマチ（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、腎炎、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、虚血再灌流傷害、脱髄、重症筋無力症、アルツス反応、臓器移植後の拒絶反応、狼瘡性腎炎、及び多発性硬化症などの様々な炎症性疾患でＣが活性化されている証拠が多く見出されている。例えばＲＡではＣ活性化による可溶性産物が関節炎を発症した関節の滑液中に多量に検出される。Ｃ５ａや他の化学誘因物質の勾配によって炎症部位に誘引される白血球（好中球やＴ細胞）とともに、滑液膜組織中には補体の蓄積が見られる。
【０００７】
Ｃ自体は常に疾患の主因となるわけではないが、Ｃは前炎症性サイクルを持続させる作用があり、疾患を悪化させるとともに非特異的な活性のために組織の傷害を永続的に長引かせる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
Ｃのカスケードを阻害し、前炎症性媒介因子の生成を防止することが可能な治療薬を見つけるために研究が行われてきた。ある研究グループはＣを阻害する低分子量の化合物を同定すべく高スループットスクリーニングに重点を置いた研究を行っている。また別の研究グループは、その本来の活性によってＣを阻害する天然細胞由来のＣＲｅｇの可溶性の組換え体を作成することによってこれらの分子を利用している。更に別の研究グループは、Ｃ系の特定成分の活性化を阻害する抗体を開発している。
【０００９】
抗Ｃ薬剤は公知のものであり、その多くはＣ活性化の主要な活性副生成物であるＣ５ａ及びＭＡＣの生成を阻害するものである。最もよく調べられている例として第１にＣ５に結合してその酵素的開裂を阻害するｓｃＦｖがあり、第２にＣの活性化経路の増幅酵素を阻害するＣＲ１（ｓＣＲ１）の可溶性の組換え体がある。これらの薬剤はいずれも、心肺バイパス後の心筋梗塞など多くの臨床的場面で発生する成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）や虚血再灌流傷害などの急性症状で使用されている。
【００１０】
公知の薬剤はｓＣＲ１を例外として例えばＣＤ５９の１２ｋＤａからＤＡＦ、ＭＣＰ及びＣｒｒｙの４０〜５０ｋＤａと低分子量であることから、これらの薬剤は腎臓によって体内から速やかに排出される。
【００１１】
抗Ｃ治療用のｓＣＲ１の開発に加えて、他のヒト及び齧歯類のＣ調節因子の可溶性の組換え体が作成され、アルツス反応や異種臓器移植などのＣによって媒介される炎症状態に対して試験が行われている。多くの組合わせにおいて、ヒトのＣ調節因子は齧歯類のＣをも阻害し、齧歯類のＣ調節因子はヒトのＣを調節する。例えば、ヒト及び齧歯類のＤＡＦはその補体阻害活性において種特異的ではないことが示されている（Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １００  ４６２−４７０（２０００））。しかしながら外因性のＣ調節因子を投与した場合、レシピエントに速やかに免疫応答が起こることから、その機能はたかだか数日に限定されてしまう。このため、慢性疾患モデルにおけるｓＣＲ１などのヒトのＣ調節因子の試験は齧歯類でしか行うことができなかった。
【００１２】
各種のＣ調節因子の改変型が作成され、試験が行われてきた。２つの調節活性を１つの薬剤にまとめる試みがなされてきたが、こうした試みで得られたのはＣＲｅｇ分子の末端同士が融合された柔軟性を欠く直線状の分子であり、標的化が求められる作用には不適当なものであった（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ.,  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５８  ２８７２（１９９７））。マウスＣｒｒｙをマウスＩｇＧ１ドメインに融合させたキメラ分子が作成されている（Ｑｕｉｇｇ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４５５３（１９９８））。この分子はネズミの腎炎の治療に使用されている。
【００１３】
ｓＣＲ１を含む公知の薬剤のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期は短いため（数分〜数時間）、頻繁に全身投与を行う必要があり、その役割は急性状態の治療に限定される。こうした薬剤は慢性疾患の治療における長期的使用には適さないものである。
【００１４】
Ｈａｒｒｉｓ等（２０００）による前出の論文では、ＤＡＦが免疫グロブリン分子のＦｃフラグメントに連結されたヒトＤＡＨ−Ｉｇを作成している。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの試験によって、ＤＡＦ−ＩｇなどのＩｇ融合分子は抗Ｃ活性を有することが示されている。その後のｉｎ  ｖｉｖｏでの試験によって、融合タンパク質が血液循環中に残存し、血漿中でＣ活性を阻害する作用がより長期間にわたって持続することが示された。
【００１５】
現在用いられているＣＲｅｇに基づいた抗Ｃ薬剤の難点として、Ｃ活性が全身で阻害されてしまう点がある。これは急性的な状態ではほとんど問題とならないものであるが、全身でのＣ活性の長期的な低下は望ましくない。これはＣの長期的な阻害によって患者が感染症を起こしやすくなり、免疫複合体可溶化及びクリアランスのＣ依存性プロセスが大きく影響されるためである。
【００１６】
本発明者等は、血液循環中で長期にわたって存在し、血液循環中ではＣの阻害活性をほとんどあるいはまったく示さないが、炎症部位及び／またはＣ活性化が望ましい部位では活性化させることが可能な治療薬を開発することによって従来の薬剤の上記の問題点、特にｉｎ  ｖｉｖｏでの短い半減期及びＣの全身での阻害の問題の解決を図ったものである。このような抗Ｃ「プロドラッグ」はＣ活性化の急性状態を治療する従来の薬剤と比較して多くの利点を有し、Ｃ活性化が関係する慢性疾患の治療における抗Ｃ治療薬の使用を初めて可能とするものである。
【００１７】
本発明者等は、一部のＣＲｅｇ−Ｉｇ融合タンパク質では、Ｃ調節因子のＣ調節機能が大幅に低下しているかあるいはまったく消失しているという本発明者等による研究結果に着目した。ＣＲｅｇがＩｇ部分から分離することによってＣの調節能が回復する。ＣＲｅｇとＩｇ部分のヒンジ領域との間に１以上の特異的酵素開裂部位を配することによって、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期が長いこと、全身でのＣ阻害が最小に抑えられること、炎症や疾患部位で効率的にＣの調節を行えること、という所望の性質を備えた治療薬を提供することが可能である。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
そこで本発明は、血漿中での半減期が長く、全身への影響が最小に抑えられ、病変部位で効率的に機能する治療薬を提供しようとするものである。適当な部位への薬剤の送達を、標的化要素を持たせることによって促進することが可能である。こうした薬剤には抗Ｃ剤が含まれる。本治療薬は、完全な状態の治療薬すなわち「プロドラッグ」が全身的な活性をほとんどあるいはまったく示さないように設計されている点で前述の薬剤と異なるものである。その代わりに、調節部分である活性剤部分と、Ｉｇなどの担体部分との間に所定の部位を配することによって、病変部位で薬剤が活性化型として放出されてその治療効果を発揮するのである。例えば、開裂可能な配列を介してＩｇのＦｃドメインに連結されたＣＲｅｇからなるプロドラッグを使用して炎症部位でのＣカスケードを阻害することが可能である。その際、Ｉｇ部分は、プロドラッグ型で連結されたＣＲｅｇのＣ調節機能が抑制され、血液循環中でのＣＲｅｇ−Ｉｇプロドラッグの半減期が最大となるように選択される。したがって本治療薬は体内での循環時にはプロドラッグとして、また標的部位におけるＣＲｅｇや他の活性剤の放出後には活性薬剤としてみなすことができる。
【００１９】
本治療薬は疾患部位への薬剤の送達を促進する特異的な標的化配列を更に有することが好ましい。
【００２０】
本発明によれば、ホストの免疫系の１以上の反応を調節する治療薬であって、
ｉ）免疫調節タンパク質（ＩＲＰ）またはその機能性フラグメントである少なくとも１個の調節部分と、
ｉｉ）前記ＩＲＰを不活性化またはほぼ不活性化する担体タンパク質と、
ｉｉｉ）これらの間に配される少なくとも１個の開裂部位とを有することにより、前記調節部分がホスト体内の標的臓器又は組織中若しくは標的臓器又は組織の付近に存在する場合に前記開裂部位が開裂して調節部分が前記担体タンパク質から遊離することによってその調節活性を回復することを特徴とする治療薬が提供される。
【００２１】
本発明の更なる別の一局面によれば、全身的には不活性である治療薬であって、
ｉ）治療活性を有する少なくとも１個の調節部分と、
ｉｉ）前記調節部分を不活性化またはほぼ不活性化する担体タンパク質と、
ｉｉｉ）これらの間に配される少なくとも１個の開裂部位とを有する治療薬において、前記開裂部位がマトリクス・メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）またはアグリカナーゼの基質からなることにより、ホスト体内でＭＭＰまたはアグリカナーゼが活性である部位において前記開裂部位が開裂して前記調節部分が前記担体タンパク質から遊離することによってその治療機能を発揮することを特徴とする治療薬が提供される。
【００２２】
本発明の更なる別の一局面によれば、ホストの免疫系の１以上の反応を調節するための治療薬であって、
ｉ）免疫調節タンパク質（ＩＲＰ）またはその機能性フラグメントである少なくとも１個の調節部分と、
ｉｉ）前記ＩＲＰを不活性化またはほぼ不活性化する担体タンパク質と、
ｉｉｉ）これらの間に配される少なくとも１個の開裂部位とを有する治療薬において、前記開裂部位が補体系の少なくとも１つの酵素の基質からなることにより、前記治療薬がホスト体内の補体が活性である部位内または付近にある場合に前記開裂部位が開裂して前記免疫調節部分が前記担体タンパク質から遊離することによってその免疫調節活性が発揮されることを特徴とする治療薬が提供される。
【００２３】
「調節部分」なる用語は、ホスト体内において作用するか所定の効果を奏する治療薬の部分を意味するものである。
【００２４】
好ましくは開裂部位は調節部分と担体タンパク質との間に配される。より好ましくは開裂部位は調節部分／ＣＲｅｇと担体タンパク質／Ｉｇのヒンジ領域との間に配される。
【００２５】
開裂部位は、開裂条件下で治療薬が切り離されるような外因性の部分を含むことが好ましい。より好ましくは開裂部位は調節部分と担体タンパク質との間に挿入される外因性のアミノ酸またはタンパク質配列を含む。「外因性」とは、そのアミノ酸またはタンパク質配列がもともと調節部分または担体タンパク質の要素ではなく、したがって治療薬中に調節部分及び担体タンパク質とともに挿入されなければならないことを意味するものである。開裂部位はマトリクス・メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）及びアグリカナーゼファミリーの酵素によって開裂されるものであることが理想的である。二番目として、開裂部位は補体系の酵素の作用を受けるものであることが好ましい。したがってこれらの後者の開裂部位を利用した治療薬は、補体酵素が開裂部位を切断して調節部分を放出し、これが調節的に機能してその治療効果を発揮することから、補体が活性である部位において活性となるのである。
【００２６】
しかしながら、開裂部位は例えば担体タンパク質や調節部分の一部などの既に存在する内在性のアミノ酸またはタンパク質を含んでもよい。この場合もやはり当該アミノ酸またはタンパク質が特定の部位において酵素の作用を受けることによって調節部分と担体タンパク質とが開裂し、よって治療薬がホスト体内の所定の部位で作用することが可能である。しかしながらいずれの場合においても、標的臓器または組織内若しくはその付近以外の場所で治療薬が開裂して調節部分を活性化型として放出してしまうような開裂部位が治療薬中に存在しないようにしなければならない。開裂部位が補体酵素によって開裂されるものであれば、こうした開裂は補体が活性を有する部位において起こる。
【００２７】
好ましくは調節部分はＣ調節タンパク質（ＣＲｅｇ）などの免疫調節タンパク質である。また調節部分は、他のタイプの免疫応答に関与する調節タンパク質であってもよい。ＣＲｅｇは、崩壊加速因子または血漿プロテアーゼ因子１の補因子として作用するか、若しくは膜攻撃複合体の形成を阻害する免疫調節タンパク質であることが理想的である。本発明の一実施形態では、調節部分としてＣＲｅｇと他の調節タンパク質との組合わせを用いることも可能である。ＣＲｅｇは、上記に述べたもの、特にＤＡＦ、ＣＤ５９、Ｃｒｒｙ、ＣＲ１及びＭＣＰの活性フラグメントなどの公知のもの（Ｍｏｒｇａｎ  ＆  Ｈａｒｒｉｓ，  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  （１９９９））のいずれであってもよく、また、Ｈ因子（ＦＨ）や他のＣ調節因子の活性フラグメントを含んでいてもよいことが想到される。更に調節部分は、複数のＣＲｅｇなどの複数の活性薬剤を含んでもよい。また、更に好ましくは、１つの活性薬剤を含む治療薬を１つの異なる調節部分を有する別の治療薬と同時投与することも可能である。
【００２８】
担体タンパク質は免疫グロブリン（Ｉｇ）のＦｃフラグメントであることが好ましい。好ましいＩｇとしては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４が挙げられ、この内ＩｇＧ４が好ましいＩｇであり、ＩｇＧ２が特に好ましい。Ｉｇの改変には、プロドラッグに結合したＣＲｅｇの活性を抑制したり、血漿中の半減期を長くしたり、又はＦｃのエフェクター機能を抑制することも含まれる。本発明の一実施形態では、ＩｇのＦａｂアームを２個のＣＲｅｇ部分で置換することが可能である。理想的には免疫グロブリンはヒト免疫グロブリンである。
【００２９】
本治療薬には、一方のアームがＣＲｅｇからなり、他方のアームが特定の細胞や組織に対して特異的なＦａｂまたは特定の細胞や組織に対して特異的な接着分子などの標的化部分を有する免疫グロブリンが含まれる。標的化薬剤はＩｇの一方のアームにＦａｂを有し、他方のアームには、抗サイトカイン剤やサイトカイン受容体ブロッカーなど、異なるタイプの免疫応答を調節するタンパク質などの異なる調節部分を有するものでもよい。
【００３０】
本治療薬の開裂部位は酵素に基づいたものであることが好ましい。
【００３１】
開裂部位は、特異的な酵素によって切断されるプロドラッグ中のポリペプチド／アミノ酸配列を含んでいてもよい。この酵素は例えばマトリクス・メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）及び／またはアグリカナーゼなどの炎症部位または免疫病理部位に存在するものである。本治療薬の開裂部位は、標的部位においてＭＭＰやアグリカナーゼなどの特異的酵素によって開裂し、これによりＣＲｅｇや免疫調節部分として作用する他の活性薬剤がＩｇのＦｃドメインなどの担体タンパク質から放出されることによって活性薬剤が機能を回復するのである。
【００３２】
好ましい一局面において、本治療薬はそれ自身が調節部分／ＣＲｅｇとＩｇのヒンジ領域の間に位置するポリペプチド／アミノ酸配列からなる開裂部位を有し、開裂部位は、ＭＭＰ３、ＭＭＰ８及びＭＭＰファミリーの他のメンバー、及びアグリカナーゼファミリーの酵素から選択される１以上の酵素によって開裂されるような治療薬である。その例はＭｅｒｃｕｒｉ等によって述べられている（Ｍｅｒｃｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４  ３２３８７（１９９９））。幾つかの文献に組換えアグリカナーゼの調製について記載されている（例、Ｔｏｒｔｏｒｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４  １６６４（１９９９）  ［ａｇｇｒｅｃａｎａｓｅ−１］  ａｎｄ  Ｈｏｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌ  １９  ５３３（２０００））。開裂部位を適宜改変し、標的部位で特異的に発現するか標的部位により多く存在する他の酵素を利用することも可能である。
【００３３】
後述の実施例においては、好ましい開裂配列は、およそ１２０個のアミノ酸からなるアグリカンのｉｎｔｅｒ−ｇｌｏｂｕｌａｒドメイン（ＩＧＤ）の部分である。この開裂配列は開裂が起きるうえで必要な最小数のアミノ酸からなることが理想的である。このアグリカナーゼまたはＭＭＰによる開裂配列は、１７〜７５個のアミノ酸からなることが好ましい。より詳細には、この開裂配列はアグリカナーゼによるＩＧＤ開裂部位そのものである。
【００３４】
好ましいＭＭＰまたはアグリカン開裂アミノ酸配列としては、
アミノ酸配列：ＲＮＩＴＥＧＥＡＲＳＶＩＬＴＶＫを有するＩＧＤ１、
アミノ酸配列：ＴＴＦＫＥＥＥＧＬＧＳＶＥＬＳＧＬを有するＩＧＤ２、及び、
アミノ酸配列：ＧＹＴＧＥＤＦＶＤＩＰＥＮＦＦＧＶＧＧ−ＥＥＤＩＴＶＱＴＶＴＷＰＤＭＥＬＰＬＰＲＮＩＴＥＧＥＡＲＧＳＶＩＬＴＶＫＰＩＦＥＶＳＰＳＰＬＥＰＥＥＰＦＴＦＡＰを有するＩＧＤ７５がある。
【００３５】
本治療薬は開裂前には機能的にほぼ不活性であることが好ましい。「ほぼ不活性」であるとは、調節部分が遊離及び／または可溶化した状態にある場合と比較して本治療薬がホストに作用する能力をまったく有さないかあるいはその能力が少なくとも大幅に低減していることを意味する。したがってこの状態では本治療薬はプロドラッグであるということができる。ＣＲｅｇを含む治療薬の場合、ＣＲｅｇが担体に結合していない場合と比較して治療薬がホストのＣ系に作用する能力は大幅に低い。例えば、１０〜６０倍低下するなど、少なくともヒト桁の活性の低下が見られる。薬剤の質量ではなく、「ＣＲｅｇのモル数」に基づいて分子を比較した場合（即ちＩｇドメインの質量を考慮する）、
（１）ラットＤＡＦ−ＩｇＧ１では、可溶性のＤＡＦ（４個の短いコンセンサス反復配列（ｓｈｏｒｔ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｒｅｐｅａｔｓ）（ＳＣＲｓ）からなる）と比較して、補体の古典的経路の調節能が１０倍低下している。
【００３６】
（２）ラットＣＤ５９−ＩｇＧ１では、可溶性の遊離ＣＤ５９と比較して、補体の末端経路の調節能が３５倍低下している。
【００３７】
（３）ヒトＤＡＦ−ＩｇＧ２またはＤＡＦ−ＩｇＧ４では、可溶性のＤＡＦ（４個のＳＣＲ）と比較して、活性（古典的経路）が１０倍低下している。
【００３８】
（４）ヒトＤＡＦ（３個のアミノ末端側ＳＣＲ）−ＩｇＧ２では、可溶性のＤＡＦ（３個のＳＣＲ）と比較して、古典的経路の調節能が６０倍低下している。
【００３９】
本治療薬は開裂が起こると担体タンパク質から免疫調節部分／ＣＲｅｇが放出されることによって活性化され、例えばＣＲｅｇの場合にはＣの調節に参加する。この原理はＩｇ融合タンパク質として送達される他の免疫調節因子にも同様にあてはまる。したがって「活性化された」とは、ＣＲｅｇや他の活性薬剤の活性が、その薬剤がプロドラッグに結合していない可溶性の形態であるときの活性とほぼ同等であることを意味するものである。
【００４０】
特にヒトＤＡＦでは、抗体のアイソタイプの選択によってＤＡＦ−Ｉｇ融合タンパク質のヒンジ領域の柔軟性が大きく影響され、ひいてはｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでのＤＡＦの活性が影響される。調節部分の活性の変化を利用して体内を循環する際のホストへの影響を制御することが可能である。ＩｇＧ２またはＩｇＧ４のＦｃドメインとの融合がＤＡＦの機能に対する抑制効果が最も高い。これは恐らくヒンジ領域周辺の立体障害によるものと考えられる。同様な原理を他のプロドラッグの設計に適用して、大幅に抑制された機能を有するが開裂によってＦｃが除去されると活性化される薬剤を得ることができる。
【００４１】
こうした開裂部位は、調節部分／ＣＲｅｇと、担体タンパク質／抗体の接合領域すなわちヒンジ領域との間に配することが考えられる。
【００４２】
本治療薬は放出時に機能するうえで必要なＣＲｅｇや他の薬剤の最小部分を含むことが好ましい。
【００４３】
本発明の更なる一実施形態は、上述したような調節部分−担体タンパク質のプロドラッグからなる標的化可能な治療薬であって、ＩｇのＦａｂアームの一方がＣＲｅｇまたは他の免疫調節分子によって置き換えられ、他方のアームが、Ｆａｂまたは標的組織において特異的結合を与える別のタンパク質によって置き換えられた治療薬に関するものである。
【００４４】
したがって本発明は更に、ホストの１以上の病理を調節するための治療薬であって、免疫調節部分と担体タンパク質とからなる治療薬において、前記免疫調節部分と前記担体タンパク質との間に開裂部位が配されることにより、免疫調節部分がホスト体内の標的内またはその付近にある場合に、治療薬が前記開裂部位において開裂して担体タンパク質から調節部分が遊離することと、該治療薬は所定の組織または細胞特異的な標的化部分と組み合わされることとを特徴とする治療薬を提供するものである。
【００４５】
好ましくは前記標的化部分は１以上の膜攻撃分子である。こうした分子によって治療薬を細胞膜に局在させることができる。例えば、標的化部分を、治療薬の調節部分と開裂部位との間に組み込まれたアドレシン（後述する）とすることにより、開裂によって調節部分とアドレシンとが結合状態で放出されて、このアドレシンによって調節部分を細胞膜に誘導またはターゲティングすることが可能である。
【００４６】
例えば、ＣＲｅｇ−Ｉｇ融合タンパク質の場合、膜標的化分子を組み込むことによって、全身性の抗Ｃ活性が抑制されているとともに、膜に結合可能であるが関連酵素の発現部位で放出される際にのみ活性化されるような治療薬が与えられる。膜の標的としては、接着分子や炎症組織中または周囲に蓄積されるＣフラグメントが含まれる。
【００４７】
これまでに述べられているように、膜を標的化するには、負に帯電したアミノ酸の配列とともにミリスチン酸基を「アドレシン」と呼ばれるタンパク質に組み込むことが可能である（Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｓｍｉｔｈ．，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３８  ２４９−５５（２００１））。これらの改変によって、このタンパク質は、ミリスチン酸の挿入ならびにアミノ酸と負に帯電したリン脂質ヘッドグループとの電荷相互作用によって脂質膜と結合する性質を有するようになる。アドレシンで改変されたＣＲｅｇの一例としてＡＰＴ０７０がある。ＡＰＴ０７０はＣＲ１の３個のアミノ末端側ＳＣＲが、アドレシンのカルボキシ末端に結合したものである。このようにして改変された抗Ｃプロドラッグは脂質膜に結合し、次いで酵素による開裂によって組織部位で活性化型Ｃ調節因子が放出される。またこの逆もあり得る。更なる標的化の方法としては、活性化した内皮のＥ−及びＰ−セレクチンのリガンドであるｓＬｅＸ炭水化物部分を利用してもよい。
【００４８】
本発明の更なる一実施形態は、上記の治療薬をコードしたＤＮＡに関するものである。詳細には本発明は、こうした治療薬の調製方法であって、該治療薬を構成する前記調節部分、前記担体タンパク質、及び前記開裂部位をそれぞれがコードしたＤＮＡ分子をライゲートすることと、該治療薬をコードしたＤＮＡ配列を発現させることを含む方法を提供するものである。
【００４９】
本治療薬タンパク質は高発現ベクターを用いて真核細胞系で発現させることが好ましい。好ましい発現ベクターとしてはｐＤＲ２ΔＥＦ１α（Ｃｈａｒｒｅａｕ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５８  １２２２（１９９４））があるが、他のベクターの使用も可能である。
【００５０】
本発明の更なる一実施形態は、上記の治療薬タンパク質をコードしたｃＤＮＡを高発現ベクターに組み込んでＣＨＯ細胞または他の適当な真核細胞発現系にトランスフェクトした培養系であって、開裂部位をコードしたＤＮＡによって隔離された調節部分と担体タンパク質とをコードしたＤＮＡを有する培養系に関するものである。
【００５１】
本発明の更なる一局面に基づけば、疾患の治療用の薬剤の調製における上述のような治療薬の用途が提供される。
【００５２】
本発明の更なる一局面には、ホストの疾患を治療する方法であって、本発明の治療薬の治療上の有効量をホストに投与することを含む方法が含まれる。
【００５３】
前記治療薬はヒトの治療に適したものであることが好ましく、したがって好ましいホストはヒトである。
【００５４】
治療可能な疾患としては、補体がその病理に所定の役割を有するすべての疾患が含まれる。こうした疾患には、慢性関節リウマチなどの炎症性疾患、アルツス反応などの免疫疾患、虚血性疾患や癌が含まれる。治療可能な更なる状態としては、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症及び他の脱髄性疾患、腎炎、卒中や心筋梗塞などの虚血再灌流傷害、重症筋無力症、喘息や皮膚科学的疾患などのアレルギー反応、及び臓器移植における拒絶反応が含まれる。
【００５５】
本治療薬は、静脈内、筋内、または皮下経路などを介して全身投与することが可能である。自己免疫性疾患における場合のように体内の複数の部位が関与する場合では静脈内投与が特に適切である。状況によっては関節炎で炎症を起こした関節に動脈内投与する場合のように、本治療薬を炎症部位に直接注射することも可能である。
【００５６】
本発明の更なる別の一局面に基づけば、上記に述べたような治療薬を薬学的に許容される担体と組み合わせた医薬組成物が提供される。こうした担体としては当該技術分野で従来知られているものが含まれる。
【００５７】
以上本発明を特定のＣＲｅｇに関連して説明してきたが、調節部分が例えば身体に対して免疫調節作用を及ぼす分子であるような他の免疫応答の調節因子にも本発明が適用可能であることは認識されよう。本治療薬はヒト及び獣医学の用途において広範な疾患に対して使用が可能である。
【００５８】
本発明を付属の図面を参照しながら以下の実施例によって更に説明する。
実施例
組換えタンパク質の調製
方法例１：−ラットＤＡＦ−Ｉｇ及びＣＤ５９−Ｉｇ
ラットＤＡＦの４個のＳＣＲをコードしたＤＮＡを発現ベクターＳｉｇｐＩｇ（Ｒ＆Ｄシステムズ）にクローニングし、ＣＤ５９のシグナルペプチドとＧＰＩアンカーシグナル配列を除いた細胞外ドメインの全体をコードしたＤＮＡを、ベクターｐＩｇＰｌｕｓ（Ｒ＆Ｄシステムズ）にクローニングした。いずれの場合も調節因子をコードしたＤＮＡを、ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域及びＦｃドメインをコードしたＤＮＡの上流かつ同じフレーム内にクローニングした。高レベルの発現を実現するため、シグナルペプチド、調節因子、及びＩｇドメインをコードしたＤＮＡをＰＣＲによって高発現ベクターであるｐＤＲ２ΔＥＦ１αにサブクローニングした。製造者の指示にしたがってリポフェクタミン（ライフテクノロジーズ）を使用してＣＨＯ細胞をトランスフェクトし、４００μｇ／ｍｌのヒグロマイシンＢ（ライフテクノロジーズ）による選択を行って安定した細胞系を確立した。上清を回収してＰｒｏｓｅｐＡカラム（バイオプロセシング社、コンセット  英国）に流して融合タンパク質を精製した。このカラムをＰＢＳ次いで０．１Ｍクエン酸塩緩衝液（ｐＨ５．０）にて洗ってコンタミナントとなるウシＩｇを除去し、０．１Ｍグリシン／ＨＣｌ（ｐＨ２．５）で融合タンパク質を溶出した。溶出したタンパク質はＴｒｉｓにて中和し、限外濾過で濃縮してＰＢＳ中に透析した。
【００５９】
方法例２：−可溶性ラットＤＡＦ及び可溶性ＣＤ５９
ラットＤＡＦ（Ｃ−末端残基はＬｙｓ２５４）の４個のＳＣＲ及びシグナルペプチドをコードしたＤＮＡを発現ベクターｐＤＲ２ΔＥＦ１に直接クローニングした。ＣＨＯ細胞を上記のようにトランスフェクトした。モノクローナル抗ＤＡＦ（ＲＤＩＩ-２４）カラムでアフィニティークロマトグラフィを行ってｓＤＡＦを調製した。５０ｍＭのジエチルアミン（ｐＨ１１）を用いてタンパク質を溶出し、直ちに凍結乾燥した。乾燥したタンパク質を１Ｍ  ＮａＣｌを含むリン酸緩衝液中に可溶化し、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２ゲル濾過カラム（アマシャム・ファルマシア・バイオテックＡＢ、ウプサラ  スウェーデン）にかけた。タンパク質をＰＢＳで溶出し、ＤＡＦを含む画分を特定した。限外濾過によって純粋なＤＡＦを濃縮した。トランスフェクトしたＣＨＯ細胞で細胞外部分の全体（ＧＰＩアンカーを除く）を含む可溶性のＣＤ５９も生産されており、ｉｄＥＮＴＩＧＥＮｃｙｆ（カーディフ  英国）から入手した。
【００６０】
方法例３：−コントロールとしてのＳＣＲ融合タンパク質
コントロールとしてＳＣＲを含む融合タンパク質を実施例１と同様にして更に調製した。このタンパク質はＣ調節機能を持たないものであった。
【００６１】
方法例４：  本発明に基づいたＣＤ５９−スペーサー−Ｉｇ
２段階ＰＣＲによってアミノ酸（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）２−ＳｅｒがＣＤ５９と抗体のヒンジ領域の間に挿入されたＣＤ５９含有融合タンパク質を更に調製した。簡単に述べると、ＣＤ５９とＩｇドメインをコードしたＤＮＡを２つの別々の反応で、ＣＤ５９の３’末端及びＩｇのヒンジ領域の５’末端にスペーサードメインの配列が組み込まれた新規なプライマーを用いて再増幅した。これら２種類のＰＣＲ産物を混合してスペーサードメインをコードした相補的ＤＮＡ配列でアニールさせた。外側プライマーを用いたＰＣＲの後、その産物を発現ベクターｐＤＲ２ΔＥＦ１αにライゲートした。上述のように細胞をトランスフェクトし、第２のＣＤ５９−Ｉｇタンパク質を精製した。ピアース・クーマシーアッセイ（Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＵＫ  Ｌｔｄ，タッテンホール  英国）を用い、ウシ血清アルブミンをスタンダードとして用いてタンパク質の濃度を決定した。
【００６２】
ＣＤ５９−Ｉｇは質量７７ｋＤａ、ＣＤ５９−スペーサー−Ｉｇは質量７８．５ｋＤａ、ＤＡＦ−Ｉｇは質量１２２ｋＤａであり、これらの質量は質量分析法で確認した。
方法例５：−本発明に基づくヒトＤＡＦ−ＩｇＧ２及びヒトＤＡＦ−ＩｇＧ４
Ｈａｒｒｉｓ  ＣＬ等（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１００，４６２（２０００））によって述べられるようにしてヒトＤＡＦ−ＩｇＧ１を作成した。ヒトＤＡＦとＩｇＧ２またはＩｇＧ４のいずれかとからなる融合タンパク質を以下のようにして作成した。すなわち、ヒトＩｇＧ４またはＩｇＧ２のヒンジ領域及びＦｃをコードしたＤＮＡをヒト末梢血白血球ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。抗体のヒンジ領域のアミノ末端配列は次のとおり。
【００６３】
ＩｇＧ４短鎖ヒンジ：    ＫＹＧＰＰＣ…
ＩｇＧ４長鎖ヒンジ：    ＶＤＫＲＶＥＳ…
ＩｇＧ２：              ＥＲＫＣＣＶ…
プライマーは後の高発現ベクターｐＤＲ２ΔＥＦ１αへのライゲーションを可能とする制限部位を組み込んだものである（５’末端のＢａｍＨ１及び３’末端のＥｃｏＲＶ）。ＤＡＦ配列を有するプラスミドを鋳型として用いたＰＣＲによって、シグナルペプチドと、ｈＤＡＦの最初の３個あるいは４個のＳＣＲドメインのいずれかをコードしたＤＮＡを増幅した。ＤＡＦドメインのカルボキシ末端配列は次のとおり。
【００６４】
３ＳＣＲ型：…ＰＥＣＲＥＩＹ
４ＳＣＲ型（ＩｇＧ４長鎖ヒンジを有する）：…ＫＳＬＴＳＫ
４ＳＣＲ型（ＩｇＧ４短鎖ヒンジ及びＩｇＧ２を有する）：…ＰＰＰＥＣＲＧ
増幅されたＤＮＡはアガロースゲル上での電気泳動によって鋳型から分離した。このインサートをゲルから抽出し、ＰＣＲプライマーにコードされた部位（３’末端のＢａｍＨ１及び５’末端のＸｂａｌ）で適当な制限酵素により切断し、ヒト免疫グロブリンのヒンジ領域及びＦｃドメインをコードしたＤＮＡの上流かつ同じフレーム内となるようにｐＤＲ２ΔＥＦ１αにライゲートした。ＰＣＲ反応でＤＮＡプルーフリーディングポリメラーゼを使用し、ＰＣＲによってエラーが導入されなかったことを配列決定により確認した。製造者の指示にしたがってリポフェクタミン（ライフテクノロジーズ）を使用してＣＨＯ細胞をトランスフェクトし、４００μｇ／ｍｌのヒグロマイシンＢ（ライフテクノロジーズ）による選択を行って安定した細胞系を確立した。上清を回収してＰｒｏｓｅｐＡカラム（バイオプロセシング社、コンセット  英国）に流して融合タンパク質を精製した。このカラムをＰＢＳ次いで０．１Ｍクエン酸塩緩衝液（ｐＨ５．０）にて洗ってコンタミナントとなるウシＩｇを除去し、０．１Ｍグリシン／ＨＣｌ（ｐＨ２．５）で融合タンパク質を溶出した。溶出したタンパク質はＴｒｉｓにて中和し、限外濾過で濃縮してＰＢＳ中に透析した。精製したタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【００６５】
機能アッセイのプロトコール
プロトコール例１：−ＤＡＦ−Ｉｇ及びｓＤＡＦの機能分析
ラットＤＡＦの機能を評価するため、抗体でコートしたヒツジ赤血球（Ｅ；２％（ｖ：ｖ））を、ＰＢＳ中で３０分間、１／５００に希釈したウサギ抗ヒツジＥ（Ａｍｂｏｃｅｐｔｏｒ，  Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）とともに細胞をインキュベートすることによって調製した。感作したＥは、ＧＶＢ（ＣＦＤ（Ｃ−固定希釈液に０．１％（ｗ／ｖ）ゼラチンを加えたもの（Ｉｍｍｕｎｏｌ  １００  ４６３（２０００）））からなるゼラチンベロナール緩衝液）中で３回洗い、２％に再懸濁した。部分的溶血（５０〜８０％）が起こるラット血清濃度を求めるため、抗体コート抗ヒツジＥ（ＥＡ）を３７℃で３０分間、異なる希釈度の血清とともにインキュベートした。細胞を遠心してペレットとした後、少量の上清（５０μｌ）を水（１００μｌ）に加え、４１５ｎｍでの吸光度を測定することによって溶血量を定量した。血清の代わりに、緩衝液のみ（０％コントロール）または０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００（１００％コントロール）をＥに加えることによってコントロール試料を調製した。溶血率（％）は次のように計算した。溶血率（％）＝１００ｘ（試料のＡ４１５−０％コントロールのＡ４１５）／（１００％コントロールのＡ４１５−０％コントロールのＡ４１５）。この組換え阻害剤の機能を試験するため、５０〜８０％の溶血率を与える所定の希釈度のラット血清及び異なる希釈度の試験タンパク質とともにＥＡをインキュベートした。３７℃でのインキュベーションの後、溶血率（％）を上述のように求めた。
【００６６】
プロトコール例２：−ＣＤ５９の機能分析
モルモットＥ（ＧＰＥ）をＧＶＢ中で洗い２％（ｖ：ｖ）となるようにＧＶＢに再懸濁した。これを、モノクローナル抗Ｃ８アフィニティーカラムに流すことによってＣ８を除去した等量の２５％（ｖ：ｖ）正常ヒト血清と３７℃で３０分間インキュベートした。得られた細胞（ＧＰＥ−Ｃ５ｂ７）を１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳで洗い、２％となるように再懸濁した。ＰＢＳ／ＥＤＴＡ中でＧＰＥ−Ｃ５ｂ７を異なる希釈度のラット血清と３７℃で３０分間インキュベートすることによって、５０〜８０％の溶血率を与えるラット血清量を求めた。可溶性ＣＤ５９の機能を評価するため、ＰＢＳ／ＥＤＴＡ中でＧＰＥ−Ｃ５ｂ７を異なる希釈度の試験薬剤及び所定濃度のラット血清とインキュベートした。０％及び１００％コントロールを含め、溶血率（％）を上述のように求めた。
【００６７】
説明のための既知の実験の結果
説明例１：ＤＡＦ−Ｉｇのｉｎ  ｖｉｖｏでのクリアランスはｓＤＡＦと比較して遅くなる。
【００６８】
可溶性ＤＡＦ（ｓＤＡＦ）のクリアランスに対するＦｃドメイン（免疫グロブリンの結晶化可能なフラグメント）の影響を調べるため、ＤＡＦ−Ｉｇ及びｓＤＡＦを１２５Ｉで放射性標識した。ラットに各薬剤を一回投与し、血液の試料を特定の時点で採取した。ＴＣＡを用いてタンパク質を沈降させ、タンパク質結合カウントをガンマカウンターで測定した。投与１時間後には、ｓＤＡＦのレベルは３分後と比較して２０％に低下したが、ＤＡＦ−Ｉｇのレベルは３分後と比較して依然８０％であり、Ｉｇドメインとの融合によって半減期が延びたことを示している（図１）。
説明例２：−ＤＡＦ−Ｉｇは抗原誘導関節炎（ＡＩＡ）の発症を遅らせ、進行を阻害する。
【００６９】
Ｗｉｓｔｅｒ系ラットにＡＩＡを誘導した（Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９７），  １１０，  ４５）。簡単に説明すると、メチル化したＢＳＡ（ｍＢＳＡ）を予めｍＢＳＡで感作した５匹のラットの右膝に注入した。このとき０．４５ｍｇのＤＡＦ−Ｉｇまたは同量の生理食塩水（コントロール群）を抗原とともに注入した。１週間にわたって右膝の腫れを左膝と比較することによって病気の進行を観察した。ラットＤＡＦ−Ｉｇにより、２日目以降、腫れ及び疾患の重篤度はコントロールと比較して大きく低下した（図２）。これらの結果はＤＡＦ−Ｉｇ融合タンパク質がｉｎ  ｖｉｔｒｏで長期的効果を有することを示すものである。
【００７０】
本発明に関連する新たな研究の結果
実施例１：−ＤＡＦ−Ｉｇ、ｓＤＡＦ、ＣＤ５９−Ｉｇ及びＣＤ５９のパパインによる開裂のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの機能分析
溶血アッセイによって、ＤＡＦ−Ｉｇ及びｓＤＡＦがＣの古典的経路を阻害する能力について分析を行い、ｓＣＲ１による溶血の阻害と比較した。ｓＤＡＦ及びｓＣＲ１がいずれも強力な溶血の阻害剤であったのに対し、ＤＡＦ−Ｉｇの溶血阻害能は低かった（図３）。パパインを用いてＩｇをＤＡＦから切断する実験によって、ＤＡＦのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの機能活性はＩｇの切断によって回復することが示された。このことは、パパインによる消化によってＩｇドメインから切り離されたＤＡＦが、ＣＨＯ細胞から分泌されたｓＤＡＦと同等の活性を有することによって示された。
【００７１】
末端経路に特異的な溶血アッセイによってＣＤ５９−Ｉｇ及びＣＤ５９−スペーサー−ＩｇがＣを阻害する能力についても試験を行った。この場合にもやはり、パパインによってＣＤ５９−Ｉｇから切り離されたＣＤ５９と比較して融合タンパク質がＭＡＣ生成を阻害する能力は大幅に低かった。これは上記のＤＡＦの分析と同様、ＣＤ５９からＩｇが切り離されることによって活性が高まることを示すものである（図４）。更にスペーサードメインの存在は、スペーサードメインによる調節部分の活性の調節能を示し、立体効果がプロドラッグの調節機能の喪失の要因であることを示すものである。スペーサードメインの存在によってＣＤ５９−Ｉｇの調節機能は高くなったが、活性はｓＣＤ５９と比較して依然低かった。
【００７２】
図３及び４は、ＤＡＦ−Ｉｇ及びＣＤ５９−Ｉｇは、Ｆｃを欠いた可溶性型と比較していずれもその補体調節能が低いことを示している。これは恐らく、調節タンパク質の活性部位がＣ３／Ｃ５コンベルターゼやＭＡＣなどの大型の多分子基質に接近、結合できないという立体制約によるものと考えられる。Ｆｃドメインの酵素的除去によって、放出された調節タンパク質が完全な機能を回復するという観察結果はこのことを支持するものである。
【００７３】
上述の図４に示したようなスペーサードメインを用いた治療薬の活性の調節の他に、担体タンパク質として使用される抗体の種類によっても治療薬の作用は影響される。これは抗体のヒンジ領域における変化の立体的影響によるものと考えられる。図５に示す実験は、ＩｇＧ２のようにヒンジ領域の柔軟性が低いＩｇでは、連結した治療薬のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの機能活性に対する制限が大きくなることを示している。ヒトＤＡＦの４番目のＳＣＲを欠失させることによりＣＲｅｇの機能活性は更に制限される（図５）。
【００７４】
実施例２：−ＩＧＤ１、ＩＧＤ２及びＩＧＤ７５開裂部位を組み込んだ新規な融合タンパク質の調製
図６は本発明に基づく治療薬のプロドラッグ型を模式的に示したものであり、調節部分と担体タンパク質のヒンジ領域の間の標的酵素開裂部位の位置が示されている。
【００７５】
この実施例では、関節炎などの炎症性疾患に関与する酵素に適した開裂部位を用いた実験を行った。ＭＭＰ及びアグリカナーゼは関節の炎症に関与しており、主要な構成プロテオグリカンであるアグリカンをタンパク質分解することによって軟骨組織を破壊する。これらの酵素のあるもの（ＭＭＰ３、ＭＭＰ８及びアグリカナーゼ（ＡＤＡＭ−ＴＳ４））に対する３個の異なる開裂部位を有するポリペプチドを、ＣＲｅｇ−Ｉｇ融合タンパク質のＣＲｅｇとヒンジ領域の間に組み込んだ。
【００７６】
このポリペプチドの長さは、それぞれアミノ酸１７個（ＩＧＤ１及びＩＧＤ２と呼ぶ。それぞれ異なる開裂部位を有する。）またはアミノ酸７５個（ＩＧＤ７５と呼ぶ。ＩＧＤ１からの部位と別の部位の２個の開裂部位を有する。）に制限した。スクランブルしたＩＧＤは開裂部位を含まないコントロール配列である（図７に配列を示す）。
【００７７】
ＩＧＤ１はアミノ酸配列：ＲＮＩＴＥＧＥＡＲＧＳＶＩＬＴＶＫを有し、ＩＧＤ２はアミノ酸配列：ＴＴＦＫＥＥＥＧＬＧＳＶＥＬＳＧＬを有し、ＩＧＤ７５はアミノ酸配列：ＧＹＴＧＥＤＦＶＤＩＰＥＮＦＦＧＶＧＧＥＥ−ＤＩＴＶＱＴＶＴＷＰＤＭＥＬＰＬＰＲＮＩＴＥＧＥＡＲＧＳＶＩＬＴＶＫＰＩＦＥＶＳＰＳＰＬＥＰＥＥＰＦＴＦＡＰを有する。
【００７８】
酵素部位を組み込むため、両端に適当な制限部位を有する短いＩＧＤ部位をコードした相補的ＤＮＡオリゴマーを使用した（ＢａｍＨ１）。これらを互いにアニールし、ＢａｍＨ１で制限し、発現ベクターのＤＡＦをコードしたＤＮＡと抗体ヒンジ領域の間にライゲートした。ＩＧＤのアミノ酸７５個の部分をコードしたより長いＤＮＡを、鋳型プラスミドからＰＣＲによって増幅し、ベクターのＢａｍＨ１部位に同様にライゲートした（制限部位を含むプライマーを用いた）。上述のようにしてＣＨＯ細胞をトランスフェクトし、培養の上清を回収した。図８は、標的酵素開裂部位を有するＤＡＦ−Ｉｇの培養上清中での存在を証明するための抗ヒトＩｇ（ヤギ抗ヒトＦｃ−ＨＲＰＯとのコンジュゲート。希釈度１：１０００（シグマ））を使用したウエスタンブロットによる分析結果を示したものである。アグリカンでは、ＩＧＤの複数の部分を使用することができる。図９は、精製したＤＡＦ−ＩｇプロドラッグのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果を示したものである。図１０は、ＤＡＦ−Ｉｇプロドラッグの酵素ＭＭＰ３及びＭＭＰ８による消化と、ウエスタンブロットによる放出されたＤＡＦの検出の結果を示したものである。
【００７９】
（図１１）は、本発明に基づく治療薬の異なる開裂部位、ならびに抗ネオエピトープ抗体によるこれらの開裂部位の検出可能性を示した概略図である。
【００８０】
分泌された融合タンパク質をタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィで精製した。ＩＧＤ７５を含む融合タンパク質を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏで平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ１２ゲル濾過カラム（アマシャム・ファルマシア・バイオテックＡＢ）でゲル濾過によって更に精製した（図９）。溶出したタンパク質をＭＭＰ３、ＭＭＰ８及びアグリカナーゼで消化した（図１０）。
【００８１】
本発明の治療薬（３．５μｇ）を、０．３μｇのｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ＭＭＰ８（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）または組換えアグリカナーゼとともに３７℃で２４時間インキュベートした。この試料を凍結乾燥し、還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファに再溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットにかけた（１μｇ  タンパク質／レーン）。ブロットはアグリカンの「切断端」を認識する抗ネオエピトープ抗体でプローブした。１次抗体を、ＨＲＰＯを結合させた２次抗体によって検出し、バンドを強調化学発光（ＥＣＬ）によって可視化した。ＢＣ３抗体（Ｈｕｇｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３０５  ７００（１９９５））は主要なアグリカナーゼ開裂部位（図１１の部位１）での開裂後に形成される新たなＮ末端を認識し、ＢＣ１４抗体（Ｃａｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ  ｉｎ  Ａｃｔａ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｓｃａｎｄ  Ｓｕｐｐｌ  ２６６  １２１（１９９５））は、主要なＭＭＰ部位（ＦＦＧ  図１１の部位３）での開裂後に形成される新たなＮ末端を認識するものである。ＢＣ１３は主要なアグリカナーゼ部位（ＥＧＥ）での開裂後に形成される新たなＣ末端を認識する。ＢＣ４は主要なＭＭＰ部位（ＰＥＮ  図７の部位３）での開裂後に形成される新たなＣ末端を認識する。これらの抗体を使用して１：１００（組織培養上清）にてブロットをプローブした。ＭＭＰ８による両酵素部位でのプロドラッグの開裂を検出し（図１２、レーン１及び２）、アグリカナーゼによるアグリカナーゼ部位での開裂を更に検出した（図１２、レーン３）。
【００８２】
プロドラッグ型の治療薬をＭＭＰ８で消化して上述のようにウエスタンブロットで分析した。このブロットを、主要ＭＭＰ部位での開裂後に形成される新たなＣ末端を認識する抗ネオエピトープ抗体でプローブした。ＢＣ４は主要ＭＭＰ部位（ＰＥＮ  部位３）での開裂後に形成される新たなＣ末端を認識する。このタンパク質フラグメントはｈＤＡＦとアグリカンＩＧＤの短い部分とを有する（図１３）。
【００８３】
図１１〜１３に示された結果は、Ｉｇ融合タンパク質に短い酵素部位を導入することが可能であり、標的酵素による開裂によって活性薬剤が放出されることを実証するものである。図１４は、ＤＡＦがＩＧＤ７５リンカー（図７）を介してＩｇＧ４のＦｃに連結されたプロドラッグをＭＭＰ８及びＭＭＰ３によって開裂したものを銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果を示したものである。図１５は、ＤＡＦがＩｇＤ１リンカー（図７）を介してＩｇＧ４のＦｃに連結されたプロドラッグをＭＭＰ８によって開裂したものを銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果を示したものである。
【００８４】
実施例３：「ＤＩＰＥＮ」酵素部位を有するＳ３−ＤＡＦ−ＩｇＧ２プロドラッグの生成
ヒトＩｇＧ２のヒンジ領域（ＥＲＫＣＣＶ・・・のアミノ酸配列で始まる）、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインをコードしたＤＮＡを、末梢血単核細胞の全ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって増幅し、高発現ベクターＰＤＲ２ΔＥＦ１αにライゲートした（Ｃｈａｒｒｅａｕ  ｅｔ  ａｌ  ｉｎ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５８  １２２２（１９９４）。ヒトＤＡＦのシグナルペプチドと最初の３個のＳＣＲ（・・・ＣＲＥＩＹのアミノ酸配列で終わる）をコードしたＤＮＡを鋳型プラスミドからＰＣＲにより増幅して、前述の方法例５で述べたように、抗体ヒンジ領域をコードしたＤＮＡの上流かつ同じフレーム内となるように同ベクターにライゲートした。ＣＨＯ細胞をトランスフェクトして融合タンパク質（Ｓ３ＤＡＦ−ＩｇＧ２。「親」分子とも呼ぶ。開裂部位を持たない。）を方法例１で述べたように精製した。「ＤＩＰＥＮ」とここで呼ぶ酵素部位をコードしたＤＮＡ（購入したオリゴマー）をＤＡＦとＩｇをコードしたＤＮＡの間に挿入することにより、実施例２で述べたようにＢａｍＨ１制限部位を用いた治療薬の所定のプロドラッグ型（「ＤＩＰＥＮプロドラッグ」と呼ぶ）を調製した。挿入した酵素部位の配列はＧＥＤＦＶＤＩＰＥＮＦＦＧＶＧＧＥＥＤである。これを図１６に示し、開裂部位を示した（ＤＩＰＥＮ配列の直ぐ上流）。この部位は多くのＭＭＰによって切断されるものである。
【００８５】
Ｓ３ＤＡＦ−ＩｇＧ２及び対応するＤＩＰＥＮプロドラッグの機能活性
Ｓ３ＤＡＦ−ＩｇＧ２（親分子）及びＤＩＰＥＮプロドラッグを、実施例２で述べたようにタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィ及びＳｕｐｅｒｏｓｅ１２カラムでのゲル濾過により精製した。基本的にプロトコール例１で述べたようにして抗体コートヒツジ赤血球（ＥＡ）の溶血の阻害によって機能活性を評価した（図１７）。このとき、各インキュベーション液で緩衝液の組成（ＧＶＢ，ＰＢＳまたはＴｒｉｓ／Ｃａ２＋）が等しくなるようにした。コントロールのインキュベーション液は、非調節性ＳＣＲを有する融合タンパク質（ネガティブコントロール）と、酵母に産生させたＤＡＦの３個のＳＣＲ部分を含んだものである。ＩＨ５０の計算とモル濃度の調節（等モル数のＤＡＦ）によって、ＤＩＰＥＮプロドラッグはＤＡＦの３ＳＣＲ型よりも活性が約２０倍低いことが示された。酵素部位の挿入が「スペーサー」ドメインとして機能し、Ｓ３ＤＡＦ−ＩｇＧ２の活性が一部回復した（「親分子」をＤＩＰＥＮプロドラッグと比較した）。
【００８６】
Ｓ３ＤＡＦ−ＩｇＧ２及びＤＩＰＥＮプロドラッグの安定性
実施例２に述べたようにして両薬剤をＴｒｉｓ／ＮａＣｌ／Ｃａ２＋中にゲル濾過し（図１８、プロドラッグの濾過）、３７℃で２４時間インキュベートした。ＭＭＰ３（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、組換え触媒ドメイン）の存在下でＳ３ＤＡＦ−ＩｇＧ２をインキュベートして標的酵素による非特異的開裂を評価した。各インキュベーション液から所定の時点に少量づつを採取して、還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファ中で実験の終了まで凍結保存した。Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙの方法（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ．，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １１７  ３０７−１０（１９８０））にしたがって試料を１０％ゲルに流して銀染色した（図１９）。３７℃で保存した場合、いずれの分子も安定であった。親分子はＭＭＰ３の存在下でも安定であった。
【００８７】
ＤＩＰＥＮプロドラッグのＭＭＰ３による開裂
下記の表に示した濃度でプロドラッグを１、２．５、５、７．５及び２４時間にわたってＭＭＰ３とインキュベートした。
【００８８】
【表１】
2005516016.tif 000002
【００８９】
各インキュベーション液から少量を分取し、上述のように銀染色法によって分析した。１００：１（ｗ：ｗ）の比であってもＭＭＰ３によってプロドラッグは開裂された（図２０）。上側の開裂産物のバンド（?３５ｋＤａ）は放出されたＦｃドメインを表し（ウエスタンブロットで確認した）、下側の開裂産物のバンド（?３０ｋＤａ）は放出されたＤＡＦ（３個のＳＣＲ）を表す。ＤＩＰＥＮプロドラッグはＭＭＰ８によっても開裂され（図示せず）、異なるメタロプロテアーゼの標的となりうる。
【００９０】
放出されたＤＡＦならびにネオエピトープ形成のウエスタンブロットによる検出
プロドラッグがメタロプロテアーゼ部位で開裂されたことを確認するため、上記のインキュベーション液（図２０）の一部を１１％還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに流してウエスタンブロットし、ＢＣ１４でプローブして開裂後に生成した（抗体「側」の）ネオエピトープを検出した（実施例２及び図１１で述べたようにして行った）。ＤＩＰＥＮプロドラッグをＭＭＰ３とインキュベートした場合にはＢＣ１４反応性のネオエピトープが検出されたが、プロドラッグのみをインキュベートした場合（プロドラッグコントロール）や、親分子をＭＭＰ３とインキュベートした場合には反応性ネオエピトープは検出されなかった（図２１）。同様のインキュベーション液（ＤＩＰＥＮプロドラッグ  ２００μｇ／ｍｌ、ＭＭＰ３  ５μｇ／ｍｌ）から得た試料を、非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びモノクローナル抗ＤＡＦ抗体を使用したウエスタンブロットによって分析した。コントロールとしてプロドラッグをＭＭＰ３の非存在下でインキュベートした。プロドラッグを酵素とインキュベートした場合に、放出されたＤＡＦが検出された（図２２）。
【００９１】
開裂後の機能の回復
ＤＩＰＥＮ薬剤をＭＭＰ３とインキュベートすることによって補体調節活性が回復することを証明するため、下記のインキュベーション液を調製した。
【００９２】
（１）プロドラッグ（２００μｇ／ｍｌ）
（２）プロドラッグ（２００μｇ／ｍｌ）；ＭＭＰ３（５μｇ／ｍｌ）
（３）ＢＳＡ（２００μｇ／ｍｌ）；ＭＭＰ３（５μｇ／ｍｌ）
タンパク質は最大で２４時間インキュベートしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色によって分析した（図２３の挿図）。補体調節活性についてプロトコール例で述べたように溶血アッセイによって、プロドラッグの３時間及び６時間のインキュベーション（ＭＭＰの存在下及び非存在下）、及びＢＳＡの６時間のインキュベーション（ＭＭＰの存在下）を分析した。溶血率（％）ならびに阻害率（％）を算出した（ネガティブコントロール（非調節性融合タンパク質）との比較。）（図２３）。ＢＳＡのインキュベーション中のＭＭＰ３の存在によって補体によって媒介されるＥＡの溶血に影響は見られなかった。図２３から分かるように、ＤＩＰＥＮプロドラッグをＭＭＰ３と３時間インキュベートすることによってほぼ完全なＤＡＦ活性が回復した。
【００９３】
活性化軟骨細胞から放出される天然酵素を用いた抗補体プロドラッグの開裂
精製酵素ではなく、後炎症性サイトカインで処理した軟骨細胞から放出された酵素によってプロドラッグが開裂されるかを判定するため、実施例２で述べた治療薬（ヒトＤＡＦの４個のＳＣＲ部分をヒトＩｇＧ４及び挿入された酵素部位としての「ＩＧＤ７５」と融合させたもの（図７））を用いて実験を行った。
【００９４】
Ｈｕｇｈｅｓ等により述べられる方法（Ｈｕｇｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２  ２０２６９  （１９９７））に類似の方法によって、ブタ軟骨細胞をアガロース中に包埋し、各種サイトカイン（レチノイン酸、ＩＬ−１、ＴＮＦ−α）及びプロドラッグの存在下で培養した。４日後に培地試料を水に対して透析し、乾燥状態まで凍結乾燥し、１０％（ｖ／ｖ）メルカプトエタノールを含んだ還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファでもどした。試料を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、ニトロセルロースメンブレンにトランスファーし、抗ネオエピトープ抗体でウエスタンブロット分析を行った。ＢＣ３によってアグリカナーゼ部位が検出されたのに対し、ＢＣ４（Ｈｕｇｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３０５  ７００  （１９９５））及びＢＣ１４ではＭＭＰ部位での開裂が検出された（図１１）。
【００９５】
図２４Ａは、３．４μｇのプロドラッグ及び抗ＡＲＧ（ＢＣ３）モノクローナル抗体（１：１００）を用い、レチノイン酸、ＩＬ−１α、またはＴＮＦのいずれかで刺激した培養から放出されたアグリカナーゼによるプロドラッグの開裂を示したものである。アグリカナーゼ部位におけるプロドラッグの開裂は刺激性サイトカインの存在下でのみ認められた。
【００９６】
更に図２４Ｂは、ＢＣ３を用いて検出された、アグリカナーゼによるプロドラッグのＩＬ−１の用量に依存した開裂を示したものである。図２４Ｃは、ＢＣ１４を用いたＭＭＰ部位での開裂を示したものである。この場合、刺激性サイトカインの存在下で開裂が認められた。
【００９７】
結果
これらのデータは、理想的にはＩｇＧ２を主鎖とし、メタロプロテアーゼによる短い開裂部位を含んだ新規なプロドラッグの調製法を説明するものである。「親」分子への酵素部位の挿入によってある程度の機能は回復するものの、本プロドラッグは放出されるＤＡＦと比較して活性が大幅に低減している。この酵素部位を更に短縮化することによってプロドラッグの機能阻害を最大化することが可能である。親分子（酵素部位を含まない）では機能はほぼ二桁低下している。ＤＩＰＥＮプロドラッグは、試験を行った複数のメタロプロテアーゼによって開裂された。消化後のＤＡＦの放出ならびにネオエピトープの生成が銀染色及びウエスタンブロットによって実証された。銀染色による評価によれば開裂反応はほぼ完全であった。プロドラッグをＭＭＰ３とインキュベートすることによって薬剤はほぼ完全な補体調節機能を回復した。標的細胞である軟骨細胞から放出された天然酵素を用いてこれらの薬剤の開裂の分析が行われた点は重要である。
【００９８】
培養系を用いてメタロプロテアーゼ部位及びアグリカナーゼ部位の両方においてＤＡＦ−ＩＧＤ７５−ＩｇＧ４が開裂することが証明された。各種の後炎症性サイトカインを用いることによって開裂が引き起こされた。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】ＤＡＦ−Ｉｇ及び可溶性のＤＡＦ（ｓＤＡＦ）のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期に関する新規な実験の結果を示す図。放射性同位体標識したＤＡＦ−Ｉｇ（●）及びｓＤＡＦ（○）をラットに投与し、血液を所定の時点で採取し、タンパク質の放射能を測定した。結果は３分後のレベルに対するパーセントで示し、ラット５匹の平均±ＳＤで表した。
【図２】慢性関節リウマチのラットモデルにおいて抗原で誘導した関節炎に対するＤＡＦ−Ｉｇの治療効果を示す図。免疫ラットの右膝にメチル化したＢＳＡを導入した。ＤＡＦ−Ｉｇ（●）またはコントロールとして生理食塩水（○）を同時に関節に投与した。関節の腫れを毎日測定し、左膝との比較を行った。結果はラット５匹の平均±ＳＤで表した。これらの結果は、コントロール群と比較して処置群では腫れ及び疾患の重篤度が２日目以降低下したことを示すものである（＊ｐ＜０．０１,＊＊ｐ＜０．００１）。
【図３】ＤＡＦ−Ｉｇのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの補体調節機能、ならびにＤＡＦ−Ｉｇを開裂して活性ＤＡＦを放出させる酵素パパインによる開裂の効果に関する新規な実験を示す図。ａ）抗体で感作した赤血球をラット血清及び異なる濃度のｓＣＲ１（□）、ＤＡＦ−Ｉｇ（△）、ｓＤＡＦ（▽）、または非調節性Ｉｇ融合タンパク質（○）とともにＧＶＢ中でインキュベートした。ｂ）パパイン処理後の結果を示す。上清中へのヘモグロビンの放出によって溶血を評価し、溶血率を求めた。結果は３つの測定値の平均値±ＳＤで表した。
【図４】ａ）ＣＤ５９−Ｉｇのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの補体調節機能、ならびにＣＤ５９融合タンパク質でスペーサーを用いた効果に関する新規な実験の結果を示す図。Ｃ５ｂ−７部位を有するモルモット赤血球を、ラット血清及び異なる濃度の試験タンパク質とともにＰＢＳ／ＥＤＴＡ中でインキュベートした。結果は、ＣＤ５９−Ｉｇ（□）、ＣＤ５９−スペーサー−Ｉｇ（◇）、非調節性Ｉｇ融合タンパク質（○）、及びｓＣＤ５９（●）の機能比較を示す３つの測定値の平均値±ＳＤで表した。ｂ）パパイン処理後の結果を示す。図で理解されるように、開裂したＣＤ５９の活性はｓＣＤ５９活性と同等である。
【図５】異なるヒトＤＡＦ−Ｉｇ融合タンパク質（ＤＡＦ−Ｇ２、ＤＡＦ−Ｇ４、Ｓ３−Ｇ４、Ｓ３−Ｇ２）の補体阻害能を、ｓＣＲ１及びＦｃが連結されていない可溶性ＤＡＦによる阻害と比較した溶血アッセイの結果の一例を示す図。ＤＡＦ−Ｇ２、ＤＡＦ−Ｇ４は、それぞれＩｇＧ２及びＩｇＧ４のＦｃに連結されたＤＡＦの４個のＳＣＲ；Ｓ３−Ｇ２、Ｓ３−Ｇ４は、それぞれＩｇＧ２及びＩｇＧ４のＦｃに連結されたＤＡＦの３個のＳＣＲ；ＳＣＲ１−３、ＳＣＲ１−４は、それぞれＦｃが連結されていない３個及び４個のＳＣＲドメインを有する可溶性ＤＡＦ。
【図６】開裂部位とともにＣＲｅｇ及びＩｇＦｃ部分を有する本発明に基づく治療薬を示す概略図。
【図７】本発明のＤＡＦ−Ｉｇの抗体ヒンジ領域とＤＡＦの間に挿入されたアグリカンのＩＧＤの部分（アミノ酸１７〜７５個）を示す図。一重下線：ＭＭＰによる主要開裂部位（ＭＭＰ３及びＭＭＰ８を含む）。二重下線：アグリカナーゼによる主要開裂部位。ＭＭＰ８によっても開裂される。破線の下線：アグリカナーゼによる別の開裂部位。
【図８】異なる長さのアグリカンのＩＧＤをコードしたＤＮＡを、発現ベクターのヒトＤＡＦとヒトＩｇＧ４ヒンジ領域との間にクローニングした。レーン（１）ＩＧＤを組み込んでいないもの、（２）ＩＧＤ１、（３）ＩＧＤ２、（４）コントロールとしての「スクランブルした」ポリペプチド配列、（５）ＩＧＤのアミノ酸７５個の部分。発現細胞から得た上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットにかけた。ブロットを（ａ）抗ヒトＦｃまたは（ｂ）抗ヒトＤＡＦでプローブした。
【図９】ＩＧＤのアミノ酸７５個の部分を含むヒトＤＡＦ−Ｉｇをタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィで精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。下側のバンドはヒンジ領域にジスルフィド結合していないＤＡＦ−Ｉｇを表し、ヒトＩｇＧ４に特徴的である。ゲル濾過実験によってこれらの「ハーフ型」は非変性条件下で非共有結合によって連結されることが示された。
【図１０】図９に示したプロドラッグ（１．５μｇ）をＭＭＰ３またはＭＭＰ８で消化して非還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットにかけた。ブロットはポリクローナル抗ヒトＤＡＦでプローブした。レーン１：酵素を加えないもの；レーン２〜４：それぞれ４１４、１３８及び４６ｎｇのｃｄＭＭＰ３；レーン５〜７：それぞれ３００、１００及び３７ｎｇのＭＭＰ８。
【図１１】本発明で記載されるプロドラッグの開裂後の治療薬の開裂部位を抗ネオエピトープ抗体で検出した状態を示す概略図。ＢＣ３は、部位１における新たなＮ末端；ＢＣ４は、部位３における新たなＣ末端；ＢＣ１４は、部位３における新たなＮ末端。
【図１２】図６に示したプロドラッグをＭＭＰ８またはアグリカナーゼで消化して、還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットにかけた状態を示す図。抗ネオエピトープ抗体を使用して、上述のようにして開裂した後の新たなＮ末端を検出した。
【図１３】主要ＭＭＰ部位で開裂した後の、図６に示したプロドラッグの新たなＣ末端を検出した状態を示す図。
【図１４】銀染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いたＭＭＰ３及びＭＭＰ８によるＤＡＦ（４ＳＣＲ）−ＩＧＤ７５−ＩｇＧ４の開裂を示す図。
【図１５】銀染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いたＭＭＰ８によるＤＡＦ（４ＳＣＲ）−ＩＧＤ１−ＩｇＧ４の開裂を示す図。
【図１６】ＤＩＰＥＮ開裂部位を挿入したヒトＳ３−ＤＡＦ−Ｉｇ２（ＩｇＧ２のＦｃに連結されたＤＡＦの３個のＳＣＲ）を示す概略図。
【図１７】図１６のプロドラッグを用いた機能試験の結果を示すグラフ。
【図１８】（図１８〜図２２は図１６のプロドラッグに行った試験の結果を示す。）ゲル濾過による精製。
【図１９】３７℃でのＭＭＰ３による開裂に対する親分子の耐性、ならびに３７℃でのプロドラッグの安定性（分解されなかった）。
【図２０】３７℃にて異なる用量で最大２４時間、ＭＭＰ３とともにインキュベートしたプロドラッグの開裂。
【図２１】ＭＭＰ３による開裂後のネオエピトープの検出。
【図２２】プロドラッグからのＤＡＦの放出を抗ＤＡＦｍＡｂで検出。
【図２３】プロドラッグの機能の回復ならびに阻害活性をコントロールに対して示したグラフ。コントロール：ＭＭＰ３を用いないプロドラッグ。挿入図：３、６及び２４時間後におけるＭＭＰ３によるプロドラッグの開裂を示すゲル。
【図２４】精製酵素ではなく、炎症性サイトカインで処理した軟骨細胞から放出された酵素によってプロドラッグが開裂されるか否かを判定するためにプロドラッグに行った、ＤＡＦの４個のＳＣＲ、ＩｇＤのアミノ酸７５個の部分、及びＩｇＧ４のＦｃからなる３つの実験の結果（Ａ、Ｂ及びＣ）を示す図。図から理解されるようにそれぞれの場合で酵素は有効でありプロドラッグは活性化されている。
【図１】
2005516016.tif 000003
【図２】
2005516016.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2005516016.tif 000009
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
2005516016.tif 000019
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
2005516016.tif 000022
【図２１】
2005516016.tif 000023
【図２２】
2005516016.tif 000024
【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年10月23日(2003.10.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホストの免疫系の１以上の反応を調節する治療薬であって、
ｉ）免疫調節タンパク質（ＩＲＰ）またはその機能性フラグメントである少なくとも１個の調節部分と、
ｉｉ）抗体またはそのフラグメントである担体タンパク質であって、前記ＩＲＰを不活性化またはほぼ不活性化する担体タンパク質と、
ｉｉｉ）これらの間に配される少なくとも１個の開裂部位とを有することにより、前記調節部分がホスト体内の標的臓器又は組織中若しくは標的臓器又は組織の付近に存在する場合に前記開裂部位が開裂して調節部分が前記担体タンパク質から遊離することによってその調節活性を回復することを特徴とする治療薬。
【請求項２】
全身的には不活性である治療薬であって、
ｉ）免疫調節剤としての治療活性を有する少なくとも１個の調節部分と、
ｉｉ）前記調節部分を不活性化またはほぼ不活性化する担体タンパク質と、
ｉｉｉ）これらの間に配される少なくとも１個の開裂部位とを有する治療薬において、前記開裂部位がマトリクス・メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）またはアグリカナーゼの基質であることにより、ホスト体内でＭＭＰまたはアグリカナーゼが活性である部位において前記開裂部位が開裂して前記調節部分が前記担体タンパク質から遊離することによってその治療機能を発揮することを特徴とする治療薬。
【請求項３】
ホストの免疫系の１以上の反応を調節するための治療薬であって、
ｉ）免疫調節タンパク質（ＩＲＰ）またはその機能性フラグメントである少なくとも１個の調節部分と、
ｉｉ）前記ＩＲＰを不活性化またはほぼ不活性化する担体タンパク質と、
ｉｉｉ）これらの間に配される少なくとも１個の開裂部位とを有する治療薬において、前記開裂部位が補体系の少なくとも１つの酵素の基質からなることにより、前記治療薬がホスト体内の補体が活性である部位内または付近にある場合に前記開裂部位が開裂して前記免疫調節部分が前記担体タンパク質から遊離することによってその免疫調節活性が発揮されることを特徴とする治療薬。
【請求項４】
前記免疫調節タンパク質（ＩＲＰ）は補体調節タンパク質（ＣＲｅｇ）またはその機能性フラグメントである請求項１または３に記載の治療薬。
【請求項５】
前記（ＣＲｅｇ）は、崩壊加速因子、または血漿プロテアーゼ因子１の補因子、または膜攻撃複合体の形成阻害因子、またはこれらの組合わせとして機能することを特徴とする請求項４に記載の治療薬。
【請求項６】
前記治療薬は、複数の調節部分を有し、そのうちの２個が異なる活性を有することを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の治療薬。
【請求項７】
前記開裂部位は酵素的に開裂可能な部位であることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の治療薬。
【請求項８】
前記開裂部位は補体系の酵素の基質であることを特徴とする請求項１乃至７のいずれかに記載の治療薬。
【請求項９】
前記開裂部位は、複数の開裂部位からなることを特徴とする請求項１乃至８のいずれかに記載の治療薬。
【請求項１０】
前記開裂部位の少なくとも１個は、マトリクス・メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）またはアグリカナーゼの基質からなることを特徴とする請求項１乃至９のいずれかに記載の治療薬。
【請求項１１】
前記開裂部位は、ＭＭＰ３またはＭＭＰ８の基質からなることを特徴とする請求項１０に記載の治療薬。
【請求項１２】
前記開裂部位の少なくとも１個は、アグリカンのｉｎｔｅｒ−ｇｌｏｂｕｌａｒドメイン（ＩＧＤ）の部分からなることを特徴とする請求項１乃至１１のいずれかに記載の治療薬。
【請求項１３】
前記開裂部位は、前記ＩＧＤの１７〜７５個のアミノ酸からなることを特徴とする請求項１２に記載の治療薬。
【請求項１４】
前記開裂部位は、前記アグリカンＩＧＤ（ｉｎｔｅｒ−ｇｌｏｂｕｌａｒドメイン）のアグリカナーゼ開裂部位の最小部分からなることを特徴とする請求項１２に記載の治療薬。
【請求項１５】
前記開裂部位はアミノ酸配列ＤＩＰＥＮを含むことを特徴とする請求項１０に記載の治療薬。
【請求項１６】
前記開裂部位はアミノ酸配列：ＧＥＤＦＶＤＩＰＥＮＦＦＧＶＧＧＥＥＤを有することを特徴とする請求項１０または１５に記載の治療薬。
【請求項１７】
前記開裂部位はアミノ酸配列：ＲＮＩＴＥＧＥＡＲＧＳＶＩＬＴＶＫを有することを特徴とする請求項１０に記載の治療薬。
【請求項１８】
前記開裂部位はアミノ酸配列：ＴＴＦＫＥＥＧＬＧＳＶＥＬＳＧＬを有することを特徴とする請求項１０に記載の治療薬。
【請求項１９】
前記開裂部位はアミノ酸配列：ＧＹＴＧＥＤＦＶＤＩＰＥＮＦＦＧＶＧＧＥＥＤＩＴＶＱＴＶＴＷＰＤＭＥＬＰＬＰＲＮＩＴＥＧＥＡＲＧＳＶＩＬＴＶＫＰＩＦＥＶＳＰＳＰＬＥＰＥＥＰＦＴＦＡＰを有することを特徴とする請求項１０に記載の治療薬。
【請求項２０】
前記担体タンパク質は抗体またはそのフラグメントであることを特徴とする請求項２乃至１９のいずれかに記載の治療薬。
【請求項２１】
前記抗体は、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ４、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ１であることを特徴とする請求項２０に記載の治療薬。
【請求項２２】
前記免疫グロブリンのＦａｂアームの１以上は、更なる調節部分を含むかまたはこれにより置換されていることを特徴とする請求項２０に記載の治療薬。
【請求項２３】
前記免疫グロブリンのＦａｂアームの１以上は、標的化部分を含むかまたはこれにより置換されていることを特徴とする請求項２０、２１または２２に記載の治療薬。
【請求項２４】
前記標的化部分は、１以上の膜標的化分子からなることを特徴とする請求項２３に記載の治療薬。
【請求項２５】
前記標的化部分は、前記調節部分と前記開裂部位との間に挿入された１以上のアドレシンを有することによって、開裂後に前記アドレシンが調節部分をその標的部位に誘導することを特徴とする請求項２４に記載の治療薬。
【請求項２６】
前記アドレシンはＡＰＴ５４２であることを特徴とする請求項２５に記載の治療薬。
【請求項２７】
前記開裂部位は、前記調節部分と前記担体タンパク質のヒンジ領域との間に配されることを特徴とする請求項１乃至２６のいずれかに記載の治療薬。
【請求項２８】
請求項１乃至２７のいずれかに記載の治療薬を製造する方法であって、前記治療薬をコードした少なくとも１個の核酸分子でトランスフォームまたはトランスフェクトした細胞にタンパク質を発現させることを含む方法。
【請求項２９】
疾患を治療するための薬剤の調製における請求項１乃至２７のいずれかに記載の治療薬の用途。
【請求項３０】
治療する前記疾患として、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、腎炎、多発性硬化症、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、虚血再灌流傷害、脱髄、重症筋無力症、アルツス反応、臓器移植後の拒絶反応などの、その病理に補体が関与する炎症性、免疫性、外傷性、または虚血性疾患の１以上が含まれる請求項２９に記載の用途。
【請求項３１】
請求項１乃至２７のいずれかに記載の治療薬と薬学的に許容される担体を組み合わせて含む医薬組成物。
【請求項３２】
患者の治療方法であって、請求項１乃至２７のいずれかに記載の治療薬または請求項３０に記載の医薬組成物を前記患者に投与することを含む方法。
【請求項３３】
付属の図面に図示、または参照して、本明細書で実質的に説明されている治療薬、医薬組成物、用途ならびに方法。
【国際調査報告】
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