(57)【要約】本発明は、エネルギー恒常性および中性脂肪の代謝、および本発明において開示したタンパク質を同定およびをコード化するポリヌクレオチドの調節を行なう、Bestrophin タンパク質を開示する。また、本発明は、これらの配列の、例えば、限定するものではないが、肥満症のような代謝疾患ならびに摂食障害、悪質液、真性糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、骨関節炎、胆石症、生殖器官の癌、および睡眠時無呼吸のような関連障害の診断、試験、予防、および治療における使用法に関するものである。
2005507398.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Bestrophin遺伝子ファミリーの核酸分子またはそれによってコードされたポリペプチドまたは断片または当該核酸分子の変異型または当該ポリペプチドまたは抗体、Bestrophin遺伝子ファミリーの核酸分子を認識するアプタマーまたは別の受容体または、医薬的受容が可能なキャリア、希釈液および(または) アジュバントを合わせ、それによってコードされたポリペプチドから成る医薬品組成品。
【請求項２】
核酸分子が脊椎動物または昆虫のBestrophin核酸であり、特にヒト染色体12 (配列認識番号5/6)上のBestrophin相同性タンパク質をコードするヒトBestrophin核酸(i); ヒト卵黄様黄斑変性2様タンパク質3と呼ばれる、ヒト染色体11 (配列認識番号1/2)上のヒトBestrophinタンパク質をコードする(ii); ヒト卵黄様黄斑変性と呼ばれる、VMD2、ヒト染色体1 (配列認識番号7/8)上のBestrophin相同性タンパク質をコードする(iii); ヒト卵黄様黄斑変性2様タンパク質2と呼ばれる、ヒト染色体19 (配列認識番号3/4)上のBestrophin相同性タンパク質をコードする(iv); ヒト卵黄様黄斑変性2様タンパク質1またはその断片またはその変異型と呼ばれる請求項 1に記載の組成物。
【請求項３】
当該核酸分子が下記から成る場合の請求項 1 または 2 に記載の組成物。
(a)  図4に示すBestrophinヌクレオチド配列またはその相補鎖、
(b)  図4に示すようにストリンジェントな条件下でBestrophinアミノ酸配列をコードする核酸分子にハイブリタイズするヌクレオチド配列またはその相補鎖,
(c)  ヌクレオチド遺伝暗号の変性内における(a)または(b)の配列に対応する配列、
(d)  図4に示したように、少なくとも 85％、望ましくは少なくとも 90％、より望ましくは少なくとも 95％、より望ましくは少なくとも 98％および99,6％までアミノ酸配列に同一のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
(e)  突然変異によって(a)〜(d)の核酸分子とは異なるヌクレオチド配列であり、コードされたポリペプチドにおいて、当該突然変異が、改変、削除、複製または早期停止を引き起こすようなヌクレオチド配列、または
(f)  少なくとも 15 塩基、望ましくは少なくとも 20 塩基、より望ましくは少なくとも 25 塩基および最も望ましくは少なくとも 50 塩基の長さを有する、任意の(a)〜(e)配列の部分的ヌクレオチド配列。
【請求項４】
核酸分子が DNA 分子、特に cDNA またはゲノム DNA である請求項 1〜3 の任意の 1 項の成分。
【請求項５】
当該核酸がポリペプチドををコードし、エネルギー恒常性および(または)中性脂肪の代謝の調節に寄与する請求項 1〜4 の任意の 1 項の成分。
【請求項６】
当該核酸分子が修飾核酸分子である、請求項 1〜5 の任意の 1 項の成分。
【請求項７】
組換え核酸分子がベクター、特に発現ベクターである請求項 1〜6 の任意の 1 項の成分。
【請求項８】
ポリペプチドが組換えポリペプチドである請求項 1〜5 の任意の 1 項の成分。
【請求項９】
当該修飾ポリペプチドが融合ポリペプチドである請求項 8 の成分。
【請求項１０】
当該核酸分子が ハイブリダイゼーション プローブ、プライマーおよびアンチセンス オリゴヌクレオチドから選択される請求項 1〜7 の任意の 1 項の成分。
【請求項１１】
診断用組成物である請求項1〜10 の任意の1 項の組成物。
【請求項１２】
診断用組成物である請求項1〜10 の任意の1 項の組成物。
【請求項１３】
肥満症およびその他の体重調節障害のような代謝疾患、ならびに摂食障害、悪質液、真性糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、骨関節炎、胆石症、生殖器官の癌、および睡眠時無呼吸および細胞、細胞塊、臓器および(または)被験者におけるその他の関連障害を始めとする障害の治療、軽減および(または)予防のための検出および(または)検証用薬剤の製造のための請求項 1〜12の任意の1項に記載の組成物。
【請求項１４】
Bestrophin遺伝子ファミリーまたはそのコードされたポリヌクレオチドまたは断片または当該核酸分子の変異型または当該ポリペプチドまたは抗体、Bestrophin遺伝子ファミリーを認識するアプタマーまたは別の受容体またはポリヌクレオチドポリペプチドによって影響および(または)修飾される遺伝子および(または)遺伝子産物の機能を制御するためのコードされたそのポリペプチドの核酸分子の使用法。
【請求項１５】
Bestrophin遺伝子ファミリーまたはポリヌクレオチドまたは断片または当該核酸分子の変異型または当該ポリペプチドまたは抗体、Bestrophin遺伝子ファミリーの核酸分子を認識するアプタマーまたは別の受容体またはBestrophin相同性ポリペプチドと相互作用する能力のある物質を同定するためのコードされたそのポリペプチドの核酸分子の使用法。
【請求項１６】
Bestrophin相同性ポリペプチドの修飾発現を示す非ヒト遺伝子組換え動物。
【請求項１７】
Bestrophin相同性ポリペプチドの発現が増大または減少した請求項 16 の動物。
【請求項１８】
Bestrophin相同性ポリペプチドの修飾発現を示す組換え宿主細胞。
【請求項１９】
ヒト細胞である請求項 18 の細胞。
【請求項２０】
哺乳動物におけるエネルギー恒常性および(または)中性脂肪の代謝に関与する(ポリ)ペプチドを同定する方法のステップは下記の通りである。
(a) Bestrophin相同性ポリペプチドまたはその断片を用い、当該(ポリ)ペプチドの結合を可能にする条件下(ポリ)ペプチドの回収に接触するステップ。
(b)  結合しない(ポリ)ペプチドを除去するステップ、および
(c) 当該Bestrophin相同性ポリペプチドまたはその断片に結合する(ポリ)ペプチドを同定するステップ。
【請求項２１】
Bestrophin相同性ポリペプチドの結合標的および薬剤との相互作用を調整する薬剤をスクリーニングする方法は下記のステップから成る
(a)  下記から成る混合物をインキュベートするステップ。
(aa)  Bestrophin相同性ポリペプチド、またはその断片;
(ab)  当該Bestrophin相同性相同性ポリペプチドまたはその断片の結合標的および薬剤; および
(ac) 候補薬剤
下記参照の親和性にて当該Bestrophinポリペプチドまたはその断片が特異的に当該結合標的と薬剤に結合する条件下;
(b) (候補)薬剤偏向親和性を決定するため、当該結合標的に対する当該Bestrophinポリペプチドまたはその断片の結合親和性を検出するステップ; および
(c) (候補)薬剤偏向親和性とリファレンス親和性間の差異を確定するステップ。
【請求項２２】
Bestrophin相同性ポリペプチドの活性を調整する薬剤をスクリーニングする方法は下記のステップから成る
(a)  下記から成る混合物をインキュベートするステップ。
(aa)  Bestrophin相同性ポリペプチド、またはその断片;
(ab)  候補薬剤;
当該Bestrophinポリペプチドまたはその断片活性を確定できる条件下;
(b)  当該候補薬剤の存在下における当該Bestrophinポリペプチドまたはその断片の活性を確定するステップ
(c)  当該候補薬剤の存在下の活性と標準活性間の差を確定するステップ。
【請求項２３】
活性が塩素チャンネルまたは別のコンダクタンス活性から選択される請求項22の方法。
【請求項２４】
活性がある程度のリン酸化またはその他の脱リン酸修飾から選択される請求項22の方法。
【請求項２５】
医薬用に許容できるキャリア、希釈剤および(または)アジュバントを有する、請求項21〜24の任意の1項の方法によって識別された(ポリ)ペプチド、または請求項 21 の方法によって識別された薬剤、を含む組成物を産出する方法。
【請求項２６】
肥満症およびその他の体重調節障害のような代謝疾患ならびに摂食障害、悪質液、真性糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、骨関節炎、胆石症、生殖器官の癌、および睡眠時無呼吸のような関連障害を始めとするその他の疾患および障害の防止、軽減または治療するための当該組成物が医薬品組成物である請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
疾患および障害、肥満症およびその他の体重調節障害のような代謝疾患ならびに摂食障害、悪質液、真性糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、骨関節炎、胆石症、生殖器官の癌、および睡眠時無呼吸のような関連障害を始めとするその他の疾患および障害の治療、軽減および(または)予防のための医薬品組成物の調製のための請求項20の方法によって同定される(ポリ)ペプチドの使用法または請求項21〜24の任意の1項の方法によって同定される薬剤の使用方法。
【請求項２８】
Bestrophin遺伝子産物を過剰発現または低発現する非ヒト動物の調製のためのファミリーの核酸分子の使用法またはその断片の使用法。
【請求項２９】
下記の最低 1 つを備えたキット。
(a)  Bestrophin 核酸分子またはその断片;
(b)  (a)の核酸を含むベクター;
(c)  (a) の核酸または (b) のベクターを含む宿主細胞;
(d)  (a) の核酸によってコードされたポリペプチド;
(e)  (a) の核酸によってコードされた融合ポリペプチド;
(f)  (a) の核酸または (d) または (e) のポリペプチド に対する抗体、アプタマーまたは別の受容体および
(g)  (a) の核酸の抗センス オリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はBestrophinおよびBestrophin相同性タンパク質の核酸およびアミノ酸配列の使用法(例えば、VMD2、VMD2様タンパク質1、VMD2様タンパク質2、またはVMD2様タンパク質3)、および、例えば、限定するものではないが、肥満症、体重調節、熱産生のような代謝疾患ならびに摂食障害、悪質液、真性糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、骨関節炎、胆石症、生殖器官の癌、および睡眠時無呼吸のような関連障害の疾患および障害の診断、試験、予防、および治療におけるこれらの配列およびそのエフェクターの使用法に関するものである。
【０００２】
肥満症は世界に最も蔓延している代謝障害の1 つである。この肥満症は、西側諸国にとってますます問題となっているヒトの疾病であり、その本質は依然としてほとんど理解されていない。肥満症は体脂肪過多として特定され、多くの場合、深刻な健康障害を招く。肥満症に悩む人は、糖尿病、高血圧症および心臓病のような病気にかかる深刻なリスクを抱えている上に、多くの場合、社会的に孤立している。肥満症は、遺伝的要因、代謝要因、生化学的要因、心理学的要因、および行動的要因によって影響される。このような事情から、肥満症は、持続的な良い臨床結果を達成するためには、さまざまな分野で取り組まなくてはならない複合体障害と言える。肥満した人のかかりやすい病気には真性糖尿病、高血圧症、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、骨関節炎、胆石症、生殖器官の癌、および睡眠時無呼吸が含まれる。
【０００３】
肥満症は単一障害と考慮されるべきでなく、潜在的に複数の原因をともなう異種の条件群から成る障害と考慮されるべきである。例えば、肥満症は、空腹時血漿インシュリンの上昇およびグルコースの経口摂取に対する過度なインシュリン反応をも特徴とし(Koltermann、J. Clin. Invest 65、1980、1272〜1284)、2型真性糖尿病における明らかな肥満症の介入が確認されている(Kopelman、Nature 404、2000、635〜643)。
【０００４】
たとえいくつかの、レプチン、VCPI、VCPL、またはペルオキシソーム増殖活性の受容体(PPAR)ガンマ活性化補助因子のような、体重/重量を調節する恒常性システムに影響を及ぼすはずの候補遺伝子が記述されているとしても、肥満調節または体重/重量調節に影響を及ぼす特有の分子機構および(または)分子は知られていない。
【０００５】
以上の点から、本発明の根底にある技術的問題は、熱産生体重調節および(または)エネルギー恒常性回路に影響を及ぼす(病理学的な)代謝条件の調節のための手段と方法を提供することであった。当該技術的問題に対する解決は、請求項において特徴づけられた実施例を提供することによって達成することができる。
【０００６】
従って、本発明は、体重調節、エネルギー恒常性、代謝、および肥満症ならびに摂食障害、悪質液、真性糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、骨関節炎、胆石症、生殖器官の癌、および睡眠時無呼吸のような関連障害において新規機能を有するBestrophin遺伝子ファミリー、特にヒトBestrophin遺伝子の核酸(例えば、VMD2、VMD2様タンパク質1、VMD2様タンパク質2、またはVMD2様タンパク質3)に関するものである。以上の点から、核酸、タンパク質コーディングおよび抗体、アプタマーまたは、核酸またはタンパク質を認識する別の受容体を、診断または治療上の目的または新規薬剤の開発のための標的として使用することが可能である。
【０００７】
ヒトBestrophinファミリーの遺伝子(VMD2とも呼ばれる)の1つは、網膜色素上皮(RPE) (遺伝子はこのRPEの上皮基底外血漿膜に局在化している)を始めとするいくつかの組織において発現される(Petrukhin らの1998、Nat Genet 19: 241-247; Marmorstein らの2000、Proc Natl Acad Sci U S A、97(23):12758-12763)。Bestrophin(VDM2)遺伝子のヘテロ接合性突然変異はBest黄斑変性(BMD)と関連を有する。Best黄斑変性は優性遺伝性であり、湿式の加齢性黄斑変性に類似する網膜下血管新生を生じ得る黄斑変性症の初期兆候である。黄斑変性は老年人口に影響を及ぼす失明主な原因である。Best卵黄様黄斑変性(VDM2)は、リポフスチン様材料の被着であることおよびRPE内とRPE下方にあることおよびRPと覆っている光受容体の変性に関連を有することを特徴とする黄斑変性である。(Allikmets、1999、Hum Genet 104(6):449-453)。Bestrophinは、VDM2およびおそらくBest疾病に類似の表現型の特性を有する黄斑の他形態に関与しているものとして同定されるタンパク質である。
【０００８】
Bestrophin遺伝子配列のコンピュータ構造解析は、アニオン、具体的には塩素チャンネル(イオン交換体)の新規ファミリーを規定するコードされたペプチドが膜貫通タンパク質であることを示唆する(前出のMarmorstein AD. らの2000、; Gomez A. らの2001、DNA Seq 12(5-6):431-435; Sun らの2002、PNAS 99(6)、4008-4013)。異なる種から取り出したBestrophinは、受性の塩素コンダクタンスに関与するオリゴマー塩素(アニオン、硝酸塩、重炭酸塩)チャンネルを形成する。また、塩素コンダクタンスの損失は、RPE内およびRPE下方のリポフスチン様材料蓄積を始めとするRPEの観察変性につながる、RPEにおける栄養分およびその他の必須分子の共輸送も阻害する (前出のSun H. ら、2002)。
【０００９】
Bestrophinは物理的および機能的にタンパク質ホスファターゼ2A (PP2A)と相互作用することがことが最近になって証明されている(Marmorstein、2002、J. Biol. Chem. 277(34)、30591-30597)。PP2A (PP2Ac)のβ触媒サブユニットおよびPP2Aの構造的足場サブユニットをBestrophinと共に免疫沈降した。Bestrophinを、タンパク質ホスファターゼ阻害剤オカダ酸に対して感受性を持つRPE-J細胞においてリン酸化した。PP2AがBestrophinを生体外で脱リン酸し、PP2Aを通してBestrophinアニオンのチャンネル活性の調節を暗示することを明らかにした。つまり、Bestrophinは、眼における光ピークを調節する信号伝達経路のメンバーである(前出のMarmorstein ら、2002)。
【００１０】
最近になって、Bestrophinの過剰発現がHEK293細胞の塩素コンダクタンスに直接的に影響ことが明らかにされた。それは著者を塩素チャンネル活性をBestrophinに対して割り当てるという結論に導き、その結果、VMDをチャネル病として提案することとなった(前出のSun ら、2002、)。さらには、Bestrophinとタンパク質ホスファターゼPP2A間の物理的相互作用は、Bestrophinのリン酸化または脱リン酸が、光ピークのオンオフスイッチとしての役割を果たすか、またはその振幅またはタイミングを調節することを示唆する(前出のMarmorstein、2002)。
【００１１】
Best黄斑変性におけるBestrophinの明らかな機能は証明されているが、エネルギー恒常性の調節における機能は今日に至るまで明らかにされていない。驚いたことに、発明者らは、Bestrophinがエネルギー恒常性の調節に関与することを見出した。遺伝子スクリーニングを用いて、Bestrophin相同性遺伝子の突然変異が主要なエネルギー保管物質である中性脂肪含有量の著しい増加による肥満症の原因となることを同定した。本発明においては、BestrophinおよびBestrophin相同性タンパク質の正しい遺伝子投与量がエネルギー恒常性の維持にとって必須であることを実証する。加えて、発明者らは、Bestrophinの発現が、視床下部およびその他の脳領域において高く、代謝調節における役割りを暗示していることを見出した発明者らは、白色および茶色脂肪組織の高い発現を伴う、VDM2様タンパク質3およびVDM2が偏在的に発現されることを明らかに見ることができた。また、発明者らは、VMD2様タンパク質3の発現が遺伝的に肥満したマウスおよび高脂肪食下のマウスにおいて下方制御されること、他方では、VMD2の発現がそれらの肥満したマウスにおいて上方制御されることも明らかに見ることができた。さらに、VMD2発現はヒト前脂肪細胞において上方制御される。
【００１２】
これらの成果に基づくと、Bestrophin (例えば、VMD2、VMD2様タンパク質1、VMD2様タンパク質2、またはVMD2様タンパク質3)に対して相同性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、上記に述べたような疾患および障害を調査研究する機会を提供することが結論できる。つまり、代謝疾患および障害および関連疾患の診断、治療、および予後に有用である新規組成物を提供するものである。
【００１３】
本タンパク質、ヌクレオチド配列、および方法について以下に説明するが、説明した特定の装置、プロトコル、細胞株、ベクターおよび試薬に本発明が限定されるものではなく、改変し得ることは当然のことながら共通認識とする。また、本詳細書で使用する専門用語は特定の実施例を説明する目的で用いたものに過ぎず、特許請求の範囲にのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことも当然のことながら共通認識とする。本明細書中で用いる全ての専門用語および科学用語は、特に定義されている場合を除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有するものとする。本明細書中に記載する方法および材料に類似または等価な方法および材料は、本発明の実践または検査で用いることができるが、好適な方法、装置、および材料をここに記載した。本明細書で言及する全ての刊行物は、本発明に関連し得る刊行物中で報告されている細胞株、ベクターおよび方法論について説明および開示する目的で、ここに引用することをもって本明細書の一部となす。本明細書のいかなる開示内容も、本発明がこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【００１４】
本発明は、Bestrophin遺伝子ファミリーの核酸によっコードされたBestrophin相同性タンパク質(例えば、VMD2、VMD2様タンパク質1、VMD2様タンパク質2、またはVMD2様タンパク質3)がエネルギー恒常性および脂肪代謝、特に中性脂肪の代謝および保管を調節していることを開示する。また、本発明は、抗体、アプタマー、ペプチド、アンチセンス分子、リボザイム、RNAi分子または低分子量の阻害剤または活性剤のようなタンパク質または核酸のベクター、宿主細胞、受容体またはエフェクター、および本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを産出するための組換え方法に関するものである。また、本発明は、上記の疾患および障害の診断、研究、予防、および治療における、これらの分子の使用法に関するものである。
【００１５】
用語「GenBankアクセッション番号」とは、 NCBI GenBank データベースエントリに関するものである(Benson らのNucleic Acids Res. 28, 2000, 15-18)。
【００１６】
よって、Bestrophin相同性タンパク質および核酸分子コーディングは、昆虫または脊椎動物各種、例えば、哺乳動物または鳥から入手可能である。特に好適なのは、ヒトBestrophin相同性核酸、特に下記をコードする核酸である。
(i)  染色体11上のヒトBestrophinタンパク質(またはヒト卵黄様黄斑変性とも呼ばれる、VMD2; Genbankアクセッション番号NM＿004183および番号NP＿004174; Swiss Prot. アクセッション番号076090; 旧番号Genbankアクセッション番号XM＿043405; 図4Aおよび4Bを参照)、または
(ii)  ヒト染色体12のBestrophin相同性タンパク質(ゲノム配列Genbankアクセッション番号AC016153、ヒトVMD2様タンパク質3、卵黄様黄斑変性2様タンパク質3に同一; Genbankアクセッション番号AF440758＿1、図4Eおよび4Fを参照),
(iii)  ヒト染色体1上のBestrophin相同性タンパク質(ゲノム配列Genbankアクセッション番号AL592166、ヒトVMD2様タンパク質2、卵黄様黄斑変性2様タンパク質2に同一; Genbankアクセッション番号AF440757＿1コード化、図4Gおよび4Hを参照)、または
(iv)  ヒト染色体19上のBestrophin相同性タンパク質(cDNA Genbankアクセッション番号NM＿017682およびゲノム配列AC018761から構築、ヒトVMD2様タンパク質1、アミノ末端に追加の43アミノ酸を有する卵黄様黄斑変性2様タンパク質1に類似(Genbankアクセッション番号AF440756＿1)、図4Cおよび4Dまたは図4Iおよび4Jを参照)。
【００１７】
本発明は、特に、エネルギー恒常性および中性脂肪またはその一部の代謝の調節に寄与するポリペプチドをコードする核酸分子に関連するものであり、当該核酸分子には下記が含まれる。
【００１８】
(a)  図4に示すBestrophinヌクレオチド配列またはその相補鎖、
(b)  図4に示すようにストリンジェントな条件下でBestrophinアミノ酸配列をコードする核酸分子にハイブリタイズするヌクレオチド配列またはその相補鎖,
(c)  ヌクレオチド遺伝暗号の変性内における(a)または(b)の配列に対応する配列、
(d)  図4に示したように、少なくとも 85％、望ましくは少なくとも 90％、より望ましくは少なくとも 95％、より望ましくは少なくとも 98％および99,6％までアミノ酸配列に同一のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
(e)  突然変異によって(a)〜(d)の核酸分子とは異なるヌクレオチド配列であり、コードされたポリペプチドにおいて、当該突然変異が、改変、削除、複製または早期停止を引き起こすようなヌクレオチド配列、または
(f)  少なくとも 15 塩基、望ましくは少なくとも 20 塩基、より望ましくは少なくとも 25 塩基および最も望ましくは少なくとも 50 塩基の長さを有する、任意の(a)〜(e)配列の部分的ヌクレオチド配列。
【００１９】
本発明は、Bestrophin相同性タンパク質(例えば、VMD2、VMD2様タンパク質1、VMD2様タンパク質2、またはVMD2様タンパク質3; 本明細書中ではBestrophinとも呼ばれる)およびこれらをコードするポリヌクレオチドが、中性脂肪保管の調節に関与しており、それ故、エネルギー恒常性であるという結果に基づいている。主に好適なのは、VMD2またはVMD2様タンパク質3およびにその対応タンパク質およびエフェクターをコードする核酸である。
【００２０】
本発明では、肥満症のような代謝疾患ならびに摂食障害、悪質液、真性糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、骨関節炎、胆石症、生殖器官の癌、および睡眠時無呼吸のような関連障害を始めとする疾患および障害とその関連の診断、試験、予防、または治療のためのこれらの組成物の使用法が記載されている。
【００２１】
エネルギー恒常性、代謝、および肥満症において新規機能をともなう遺伝子を見出すため、モデル生物体キイロショウジョウバエ(Meigen)を用いて機能的な遺伝子スクリーニングを実施した。スクリーニングのための1つのリソースは、キイロショウジョウバエEP ラインの在庫コレクションであった。このコレクションのPベクターは、UAS部位へのGal4の結合時に、隣接するゲノムショウジョウバエ配列に転写できる基底プロモーターに融合したGal4-UAS結合部位を有する。これによって、EPラインのコレクションの内在性側面遺伝子配列の過剰発現が可能となる。なお、UAS部位の活性化なしでは、EP因子の遺伝子への統合は、遺伝子活性の低下を引き起こす可能性があるので、機能喪失の表現型を評価することにより、その機能を確定することができる。
【００２２】
中性脂肪は細胞における最も効果的なエネルギー保管場所である。肥満者では主に中性脂肪含有量の著しい増加が見られる。エネルギー恒常性において機能を有する遺伝子を分離するため、数千のEPラインの中性脂肪含有量を長期にわたる食餌期間後に検査した。中性脂肪含有量に著しい変化を示したラインをそれ以上の分析のために陽性候補として選択し、例えば、本発明の範囲を制限するものではないが、以下の実施例セクションにおいて記載した。
【００２３】
中性脂肪含有量分析の結果を図1に示した。発明者らは、ホモ接合性HD-EP(3)32517およびHD-EP(3)36237ハエが対照(平均中性脂肪レベル)より高い中性脂肪含有量を有することを見出した。以上の点から、その染色体遺伝子座85F13-85F14 (推定HD-EP(3)32517ハエおよびHD-EP(3)36237ハエのEPベクターが結合している染色体部位)における非常に可能性が高い遺伝子活性の損失は、エネルギー保管中性脂肪代謝における変化の原因であり、以上の点から、両方の事例において、肥満したハエモデルを表している。
【００２４】
遺伝子機能の損失による中性脂肪含有量の増加は、中性脂肪としてエネルギー保管の量を制御する投与量依存型の様式において、エネルギー恒常性における遺伝子活性を示唆する。
【００２５】
本発明のBestrophinタンパク質をコード化をする核酸をプラスミド救出技術を使用して同定した。直接的に5'または3'のEP(3)32517およびHD-EP(3)36237統合に局在するゲノムDNA 配列を分離した。それらの分離したゲノム配列を用いて、Berkeleyショウジョウバエゲノムプロジェクト(アブ)のような公共データベースをスクリーニングし、その結果、Bestrophin相同性遺伝子の5´エキソンまたはエンハンサー/プロモーター領域内で、EP(3)32517およびHD-EP(3)36237の統合側を確認した(図2)。図 2 はこの遺伝子座の分子構造を示す。ゲノムDNA配列をアセンブリによって、EP(3)32517およびHD-EP(3)36237の統合部位を含んだ中間の黒色点線として表した。番号はゲノムDNA座標を表す。2つのcDNA-ライン上の灰色バーは、予測遺伝子(アブおよびカササギ)を表し、Pエレメントライン上の灰色記号はEP-ベクター統合部位を表す。遺伝子CG6264)の予測エキソンは、濃灰色のバーとして、およびEP(3)32517および予測イントロンは薄灰色のバーとしてそれぞれ示した。
【００２６】
Bestrophinは、アブ配列分析プログラムおよび分離されたCG6264クローンによって予測される遺伝子をコードする(アブアクセッション番号CG6264)。本発明においてBestrophinまたはBestrophin相同体と呼ばれる図3、4、および5に示した遺伝子およびタンパク質のために、肥満症の調節および代謝疾患を記述した機能的データは従来の技術には存在しない。
【００２７】
さらに、本発明は上記に述べたように核酸によってコードされたポリペプチドに関するものである。望ましくはポリペプチドにはBestrophinのアミノ酸配列が含まれるものとする。異なる種(ヒト、マウス、およびショウジョウバエ)のBestrophinタンパク質間の比較(Clustal X 1.8またはClustaW 1.82)を行って、図3および5に示した。
【００２８】
TMHMMタンパク質分析用具(A. KroghらのJournal of Molecular Biology, 305(3):567-580, 2001)を用いて、例えば、本発明Bestrophinタンパク質は少なくとも4つの特有のタンパク質モチーフ(例えば、膜貫通ドメイン)を有することを見出した。これらのモチーフは、全Bestrophinファミリーを通して見出された。ショウジョウバエ遺伝子(CG6264)のInterPro分析(ApweilerらのNucleic Acids Research 29:37-40, 2001)は、すべてのBestrophin相同性タンパク質に対して典型的な寄生虫ファミリー8ドメイン(SonnhammerおよびDurbin, Genomics 46:200-216, 1997)が存在することを示した。相同性に基づき、本発明のBestrophinタンパク質および各相同性タンパク質またはペプチドは少なくともある程度の活性を共有する。
【００２９】
図6に示すように、VDM2様タンパク質3は脂肪組織において明らかな発現を示す。高脂肪食下、VDM2様タンパク質3を脂肪組織(WAT)において下方制御し、タンパク質が、おそらくこのプロセスの阻害剤として脂質生成を調節することを示唆した。3つのBestrophin(VMD2、VMD2様タンパク質1、VMD2様タンパク質3)の発現が、脂肪組織、ならびに視床下部、そしてより少ない程度だがその他の脳領域においても観察された。つまり、Bestrophinは、代謝におけるを固有の役割りを示唆する明らかな組織特定の発現示す(実施例4および5および図6、7および8および図9および10をそれぞれを参照)。
【００３０】
また、本発明には、Bestrophinおよび相同性タンパク質をコードするポリヌクレオチドも包含される。それ故に、Bestrophinのアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列を用いて、Bestrophinを発現する組換え分子を生成することができる。特定の実施例において、本発明には、上記に述べたようなヒトBestrophin核酸またはその断片または変異体から選択されたポリヌクレオチドが包含される。当業者にとっては当然のことながら、遺伝暗号の縮重の結果、Bestrophinをコードする多数のヌクレオチド配列(一部は既知であり天然の遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する)を産生することが可能である。したがって本発明では、可能コドン選択に基づいた組み合わせの選択によって作製し得るような、ありとあらゆる可能性のあるヌクレオチド配列変異体が考慮されている。この組み合わせは、天然のBestrophinのヌクレオチド配列に適用されるような標準トリプレット遺伝暗号に従って作製されるものであり、このような変異は全て特異的に開示されているものと考慮される。Bestrophinおよびその変異体をコードするヌクレオチド配列は、適切に選択されたストリンジェントな条件下で、望ましくはBestrophinの天然ヌクレオチド配列(例えば、VDM2、VDM2様タンパク質1、VDM2様タンパク質2、またはVDM2様タンパク質3をコードする配列)にハイブリタイズする能力があるが、実質上異なるコドン使用法を有するヌクレオチド配列またはそれらの誘導体を産生することが有益であ得る。宿主が特定のコドンを利用する頻度に基づいて、特定の真核宿主または原核宿主に発生するペプチドの発現率を高めるようにコドンを選択することが可能である。コードされたアミノ酸配列を変更することなく、Bestrophinおよびその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質上変更する別の理由には、天然の配列から産出される転写物より望ましい、例えば半減期が長いなどの特性を有するRNA 転写物の産出がある。また、本発明には、すべて合成化学による、DNA配列またはその部分およびその誘導体の産出も包含される。その産生後には、本発明の出願時に当分野で周知の試薬を用いて、この合成配列を任意の入手可能な多数の発現ベクターおよび細胞系中に挿入することが可能である。さらに、合成化学を用いて、Bestrophinまたはその任意の部分をコードする配列の中に突然変異を導入することも可能である。
【００３１】
さらに本発明に包含されるのは、種々のストリンジェントな条件下で、請求項に記載のヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列である。ハイブリダイゼーション条件は、Wahl、G. M.およびS.L. Berger (1987:Methods Enzymol. 152:399-407)およびKimmel、A. R. (1987; Methods Enzymol. 152:507-511)で教示されたように、核酸結合複合体またはプローブの溶解温度(Tm)に基づいており、定義されたストリンジェントでの使用が可能である。望ましくは、ストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーションとは、1 時間 1 x SSCおよび0.1％ SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)を用いて50℃ にて、望ましくは55℃ にて、より望ましくは62℃ にて、および最も望ましくは68℃ にて、特に1 時間 0.2 x SSCおよび0.1％ SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)中で 50℃ にて、望ましくは55℃ にて、より望ましくは62℃ にて、および最も望ましくは68℃ にて洗浄後、正のハイブリダイゼーションシグナルが認められることを意味する。本発明に包含されているBestrophinをコードする変異核酸配列には、異なるヌクレオチドの欠損、挿入、または代替が含まれており、同一物または機能に同等なBestrophinをコードするポリペプチドを結果としてもたらす。
【００３２】
コードされたタンパク質には、サイレント変化を産生し、機能的に等価なBestrophin(例えば、VDM2、VDM2様タンパク質1、VDM2様タンパク質2、またはVDM2様タンパク質3)を結果としてもたらす、アミノ酸残基の欠損、挿入、または置換も含まれ得る。計画的アミノ酸代替は、Bestrophinの生物学的活性が保持される限りにおいて、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および(または)両親媒性特性の類似性に基づいて行うことができる。例えば、負に帯電したアミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ; 正に帯電したアミノ酸にはリジンおよびアルギニンが含まれ; そして類似の親水性値を持つ非荷電極性ヘッドグループを有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、およびバリン; グリシンおよびアラニン;アスバラギンおよびグルタミン; セリンおよびトレオニン; フェニルアラニンおよびチロシンが含まれ得る。
【００３３】
また、本発明の範囲内に含まれているものには、Bestrophin(例えば、VDM2、VDM2様タンパク質1、VDM2様タンパク質2、またはVDM2様protein3)をコードする遺伝子の対立遺伝子もある。本明細書で使用されているように、「対立遺伝子」または「対立遺伝子配列」は遺伝子の代替形態であり、核酸配列において少なくとも 1 つの突然変異から生じ得る。対立遺伝子は、構造または機能が変異し得るかどうかわからない変異mRNAsまたはポリペプチドを結果としてもたらし得る。任意の遺伝子は、無、単一、または多くの対立遺伝子形態を持つことが可能である。対立遺伝子を誘発する一般の突然変異性変化は通常、ヌクレオチドの自然欠損、付加、または置換に帰する。これらの各変化は、単独、またはその他の変化と共に、所定の配列内で 1 回以上生じ得る。これらの変化は、当分野で公知であり一般に入手可能なDNAシーケンシング方法によって確定することが可能である。
【００３４】
Bestrophin(例えば、VDM2、VDM2様タンパク質1、VDM2様タンパク質2、またはVDM2様タンパク質3)をコードする核酸配列を、部分的ヌクレオチド配列を利用し、且つ当分野で周知の種々の方法を用いて伸長させ、プロモーターおよび(または)調節要素などの上流配列を検出することが可能である。例えば、使用し得る方法の１つである「制限部位PCR法」は、ユニバーサルプライマーを用いて既知の遺伝子座に対して近傍する未知の配列を読み出す方法である(Sarkar、G. (1993)PCR Methods Applic. 2:318-322)。逆PCR法も、既知の領域に基づいた分岐プライマーを用いて配列を増幅または伸長するために使用することが可能である。(Triglia、T. らのNucleic Acids Res. 16:8186)。使用可能な別の方法としては、キャプチャPCR法があり、これにはヒトおよび酵母菌人工染色体DNAにおける既知の配列に近傍するDNA断片のPCR増幅が含まれる(Lagerstrom、M. らのPCR Methods Applic. 1:111〜119)。未知の配列を読み出すために使用可能な別の方法としては、Parker、J. D. らの方法が挙げられる(1991; Nucleic Acids Res. 19:3055-3060)。加えて、PCR法、ネステッドプライマー、およびPROMOTERFINDERライブラリを用いて、ゲノムDNAの中に入ることが可能である(Clontech社, Palo Alto, Calif.)。このプロセスは、ライブラリをスクリーニングすることを回避し、イントロン接合部およびエキソン接合部を見つけるのに有用である。
【００３５】
完全長cDNAをスクリーニングする際には、より大きなcDNAを含むようにサイズ選択されたライブラリを使用することが望ましい。また、遺伝子の5'領域を含んだ、より多くの配列を含むランダムプライムライブラリも望ましい。ランダムプライムライブラリの使用は、オリゴd(T)ライブラリが完全長 cDNA を産しない状況において特に望ましい。ゲノムライブラリは、5'および3'非転写調節領域への配列の伸長に対して有用であり得る。市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、シーケンシング産生物またはPCR産生物のサイズを分析すること、またはそのヌクレオチド配列を確認することが可能である。
【００３６】
本発明の他の実施例では、Bestrophinをコードするポリヌクレオチド配列、または融合タンパク質またはその機能的等価物またはその断片は、適切な宿主細胞内でBestropinの発現をさせるような組換えDNA分子内で使用することが可能である。遺伝暗号固有の縮重により、実質的に同じ、あるいは機能的に等価のアミノ酸配列をコードする別のDNA配列を産出することができ、これらの配列はBestrophinをクローン化および発現するために利用することが可能である。当事者にとっては当然なことだが、非天然コドンを有するBestrophinがコードするヌクレオチド配列を産出することは有益であろう。例えば、特定の真核宿主または原核宿主によって好適とされるコドンは、タンパク質の発現率を高めるため、または、例えば天然配列から生成された転写物の半減期よりも長い半減期などの好ましい特性を有する組換えRNA転写を産生するために選択することが可能である。本発明のヌクレオチド配列は、種々の目的でBestrophinのコードする配列を変えるために、当分野で公知の方法を使用して組換えることができ、この目的には、遺伝子産物のクローン化、処理、および(または)発現等が含まれるが、これらに限定されるものではない。遺伝子断片および合成オリゴヌクレオチドのランダムなフラグメンテーションおよびPCR再アセンブリによるDNAシャフリングを用い、ヌクレオチド配列を遺伝子操作することが可能である。例えば、部位特異的変異誘導を用いて、新規制限部位を挿入、グリコシル化のパターンを改変、コドン優先の変更、スプライス変異体の産生、または突然変異の導入、等々を行い得る。
【００３７】
本発明の他の実施例によれば、Bestrophin(例えば、VDM2、VDM2様タンパク質1、VDM2様タンパク質2、またはVDM2様タンパク質3)をコードする天然の核酸配列、修飾核酸配列または組換え核酸配列を異種配列に連結反応させ、融合タンパク質をコードすることが可能である。例えば、例えばBestrophin活性の阻害剤に対してペプチドライブラリをスクリーニングするためには、市販の抗体によって識別可能なキメラBestrophinタンパク質を使用することが有用であり得る。また、Bestrophinが異種部分から切断および精製され得るようにするため、融合タンパク質が、Bestrophinのコードする配列と異種タンパク質配列との間にある切断部位を含むように遺伝子操作することが可能である。他の実施例によれば、当分野で周知の化学的方法を用いて、Bestrophinをコードする配列の全部または一部を合成することが可能である(Caruthers, M.H.らの(1980)Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 7:215-223, Horn, T.らの(1980)Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 7:225-232 を参照)。あるいは、化学的な方法を用いて、Bestrophinのアミノ酸配列またはその一部分を合成するためにタンパク質自体を産出することが可能である。例えば、種々の固相技術を使用してペプチド合成を行うことができ(Roberge, J. Y.らの(1995)Science 269:202-204)、例えば ABI 431A ペプチドシンセサイザ(Perkin Elmer 社)を使用して自動合成を達成することが可能である。新規に合成したペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィー(例えば、Creighton, T. (1983)Proteins, Structures and Molecular Principles, WH Freeman and Co., New York, N.Y.)によって実質上精製することが可能である。合成ペプチドの組成物は、アミノ酸分析またはシーケンシングによって確認することが可能である(例えば、Edman degradatイオン procedure; 前出のCreighton)。加えて、Bestrophinのアミノ酸配列またはその任意の一部は、直接合成中に変異させることができ、および(または)変異型ポリペプチドを産生するために、化学的方法を使用して、他のタンパク質またはその任意の一部から得た配列と結合させることが可能である。
【００３８】
生物学的に活性なBestrophin(例えば、VDM2、VDM2様タンパク質1、VDM2様タンパク質2、またはVDM2様タンパク質3)を発現するために、Bestrophinの機能的な等価物をコードするヌクレオチド配列を、好適な発現ベクター、例えば、挿入されたコーディング配列の転写および翻訳に必要な要素を含むベクターに挿入することが可能である。当業者に周知の方法を用いて、Bestrophinをコードする配列、好適な転写及び翻訳調節エレメントを含む発現ベクターを作製することが可能である。これらの方法には、生体外の組換えDNA技術、合成技術、および生体内の遺伝的な組換えが含まれる。その技術は、Sambrook, J. らの(1989)Molecular Cloning、Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.、およびAusubel, F. M. らの(1989)Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y. に記載されている。
【００３９】
種々の発現ベクターおよび宿主系を利用して、Bestrophin(例えば、VDM2、VDM2様タンパク質1、VDM2様タンパク質2、またはVDM2様タンパク質3)をコードする配列を保持および発現することが可能である。 これらには、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換させた細菌や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌や、ウイルス発現ベクター(例えばバキュロウイルス)に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター(例えばカリフラワーモザイクウイルスCaMVまたはタバコモザイクウイルスTMV)または細菌発現ベクター(例えばTiまたはpBR322プラスミド)で形質転換させた植物細胞系、または動物細胞系などの微生物等が含まれているが、これらに限定されるものではない。そのベクターは、「調節要素」または「調節配列」、すなわち転写および翻訳を行なうために宿主細胞タンパク質と相互作用するエンハンサー、プロモーター、5'および3'非翻訳領域を始めとする非翻訳領域を含み得る。このような要素の強度および特異性は様々である。利用されるベクターシステムおよび宿主にもよるが、構成型プロモーターおよび誘導型プロモーターを含んだ任意数の適切な転写要素および翻訳要素を利用することが可能である。例えば、細菌系においてクローニングを行なう場合、BLUESCRIPTファージミドのハイブリッドlacZプロモーターような誘導型プロモーター(カリフォルニア州ラ・ホヤのStratagene)または PSPORT1 プラスミド(Gibco BRL)などを使用することが可能である。バキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターは昆虫細胞において使用することが可能である。植物細胞のゲノム(例えば、熱ショックである RUBISCO; および保管タンパク質遺伝子など)または植物ウィルス(例えば、ウィルスのプロモーターおよびリーダー配列)に由来するプロモーターおよびエンハンサーは、ベクターにクローニングすることが可能である。哺乳動物の細胞系では、哺乳動物の遺伝子または哺乳動物のウィルスからのプロモーターが望ましいとされる。Bestrophinをコードする複数のコピーの配列を含む細胞株を生成する必要がある場合には、SV40 または EBV に基づいたベクターを適切な選択可能マーカーと共に使用することが可能である。
【００４０】
細菌系では、多数の発現ベクターがBestrophinの使用目的に応じて選択することが可能である。例えば、多量のBestrophinが抗体の誘発のために必要な場合には、容易に精製される、融合タンパク質の高レベル発現を誘導するベクターを使用することが可能である。そのようなベクターには、限定されるものではないが、BLUESCRIPT ファージミド(Stratagene 社)、pINベクター(Van Heeke, G. および S. M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509)のような多機能大腸菌クローニングおよび発現ベクターなどが含まれる。 PGEXベクター(ウィスコンシン州マディソン市のPromega社)を用いて、外来ポリペプチドをグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)を有する融合タンパク質として発現することも可能である。一般に、そのような融合タンパク質は可溶であり、グルタチオン アガロース ビーズに対する吸着、それに続く遊離グルタチオンの存在下における溶出によって産生した溶解細胞から容易に精製することができる。そのようなシステムで作られたタンパク質は、所定のクローン ポリペプチドがGST部分から意のままに開放することができるように、ヘパリン、トロンビン、またはXA因子プロテアーゼ切断部位を含むようにデザインすることが可能である。酵母菌、サッカロミセス セレビジエにおいて、α因子、アルコール オキシダーゼ、およびPGHなどの構成型プロモーターまたは誘導型プロモーターを含むいくつかのベクターを使用することが可能である。論評に関しては、前出の Ausubel ら、および Grant らの(1987) Methods Enzymol. 153:516-544 を参照。
【００４１】
植物発現ベクターを使用する事例においては、Bestrophinをコードする配列の発現をプロモーターの任意の1つによって駆動することが可能である。例えば、CaMV の 35S および 19S プロモーターのようなウィルス プロモーターを単独または TMV からのオメガ リーダー配列(Takamatsu, N. (1987) EMBO J. 6:307-311)と共に使用することが可能である。あるいは、RUBISCO の小サブユニットのような植物プロモーターまたは熱ショック プロモーターを使用することが可能である(Coruzzi, G.らの(1984) EMBO J. 3:1671-1680、Broglie, R.らの(1984) Science 224:838-843、および Winter, J. らの(1991) Results Probl. Cell Differ. 17:85-105)。これらの作成物は、直接DNA形質転換または病原体媒介性の形質移入によって、植物細胞内に導入することができる。そのような技術は、一般に入手できるいくつかの論評に記載されている(例えば、『マグローヒル科学技術年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology)(1992) McGraw Hill New York NY のHobbs, S. または Murry, L. E. を参照。ページ番号191-196)。
【００４２】
また、昆虫システムを用いてBestrophinを発現することも可能である。例えば、昆虫系の1 つでは、オートグラファ カリフォルニア ニュークレアの多面性ウィルス(AcNPV)がベクターとして使用され、ハスモンヨウ近似種(Spodoptera frugiperda)細胞またはウワバ（Trichoplusia)の幼虫における外来遺伝子を発現している(Engelhard、E. K. らの(1994)Proc. Nat. Acad. Sci. 91:3224-3227)。
【００４３】
哺乳動物の宿主細胞においては、いくつかの非ウィルス発現系またはウィルス発現系を利用することが可能である。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、後発プロモーターおよび3連リーダー配列から成るアデノウイルス転写物/翻訳複合体にBestrophinをコードする配列を結合し得る。ウィルス ゲノムの非必須 E1 または E3 領域における挿入を用いて、感染した宿主細胞においてBestrophinを発現する能力のある生ウィルスを得ることが可能である(Logan、J. および Shenk、T. (1984)Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659)。加えて、ラウス肉腫ウイルス(RSV)エンハンサーのような転写エンハンサーを用いて、哺乳動物の宿主細胞における発現を高めることが可能である。
【００４４】
加えて、宿主細胞株は、挿入した配列の発現を調節する能力、または発現したタンパク質を所望の形態で処理する能力に対して選択することも可能である。このようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、およびアシル化が含まれるが、それらに限定されるものではない。タンパク質の「プレプロ」形を切断する翻訳後の処理を用いて、正しい挿入、折りたたみ、および(または)機能を促進することが可能である。CHO、HeLa、MDCK、HEK293、および WI38 などの翻訳後の活性のための固有の細胞装置および特徴のある機構を有する種々の宿主細胞は、外来タンパク質の正しい修飾および処理を確実にするように選択することが可能である。
【００４５】
長期にわたる、組換えタンパク質の高歩留産生のためには、安定した発現が望ましい。例えば、安定してBestrophinを発現する細胞株は、複製発現因子および(または)内在性発現因子のウィルス起源を含み、選択可能マーカー遺伝子を同一ベクター上または別個のベクター上に含み得る発現ベクターを使用して、形質転換することが可能である。 ベクターの導入後、細胞は選択培地に移行せしめる前に強化培地において1〜2日間増殖せしめることが可能である。選択可能マーカーの目的は、選択への抵抗性を与えることであり、その存在によって導入された配列を首尾良く発現する細胞の成長および回収が可能となる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖することが可能である。任意数の選択系を用いて、形質転換細胞株を回収することが可能である。この選択系には、単純ヘルペス ウイルス チミジン キナーゼ(Wigler, M. らの(1980) Cell 22:817-23)、および tk−細胞またはaprt−細胞にそれぞれ用いることができるアデニン ホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowy, I. らの(1980) Cell 22:817-23)遺伝子が含まれるが、これらに限定されるものではない。また、代謝拮抗物質、抗生物質または除草剤の耐性は、その選択基準として用いることができ、例としてはメトトレキセートに耐性を与える dhfr (Wigler, M. らの(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-70)、アミノグリコシッド ネオマイシンおよび G-418 に耐性を与える npt (Colbere-Garapin, F.らの(1981) J. Mol. Biol. 150:1-14)、およびクロルスルフロン(chlorsulfuron)とホスフィノトリシン アセチルトランスフェラーゼ(phosphinotricin acetyltransferase)にそれぞれ耐性を与える als または pat (前出の Murry)などが挙げられる。追加の選択可能遺伝子、例えば、細胞がトリプトファンの代替としてインドールを利用することを可能にする trpB、または細胞がヒスチジンの代替としてヒスチノルを利用することを可能にする hisD などは(Hartman、S. C.およびR. C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:8047-51)に記載されている。最近、可視マーカーは好評を博しており、アントシアニン、β−グルクロニダーゼおよびその基質GUS、ルシフェラーゼおよびその基質ルシフェリンなどのマーカーは、形質転換体を同定するためだけではなく、特定のベクター系に依存する一過性または安定したタンパク質発現を定量化するために広範に使用されている(Rhodes、C. A. らの (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131)。
【００４６】
マーカー遺伝子発現の有無は、所定の遺伝子の有無も示唆するが、その存在および発現は確認する必要がある。例えば、Bestrophinをコードする配列がマーカー遺伝子配列内に挿入された場合、Bestrophinをコードする配列を含む組換え細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により同定することが可能である。または、１つのプロモーターの制御下でマーカー遺伝子がBestrophinをコードする配列と一列に配置することも可能である。マーカー遺伝子の発現は通常、誘発または選択に応答してタンデム遺伝子の発現も示す。あるいは、Bestrophinをコードする核酸配列を含み、Bestrophinを発現する宿主細胞は、当業者に周知の種々の方法を用いて同定することが可能である。これらの手順には、DNA-DNA、または DNA-RNA ハイブリダイゼーション、および核酸またはタンパク質の検出および(または)定量化のための膜系、溶液ベース、またはチップベースのテクノロジを含むタンパク質の生物学的試験法または免疫学的測定法が含まれるが、それらに限定されるものではない。
【００４７】
Bestrophinをコードするポリヌクレオチド配列の存在は、プローブ、またはBestrophinをコードするポリヌクレオチドの部分またはその断片を用いて、DNA-DNA または DNA-RNA ハイブリッド形成法、または増幅によって検出することが可能である。核酸の増幅基調アッセイは、オリゴヌクレオチドの使用、またはBestrophinをコードするDNAまたはRNAを含んだ形質転換体を検出するためにBestrophinをコードする配列に基づいたオリゴマーに関与する。本詳細書で使用する「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」は、 最低約 10 ヌクレオチド、および約 60 ほどのヌクレオチド、望ましくは約 15〜30 ヌクレオチド、およびより望ましくは 約 20〜25 ヌクレオチドの核酸配列を言及し、プローブまたはアンプリマーとして使用することが可能である。
【００４８】
タンパク質に固有のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらかを用いるBestrophinの発現を検出および計測のためのさまざまなプロトコルは、当分野で周知である。実施例には、酵素免疫測定(吸着)法(ELISA)、放射免疫測定(RIA)、および蛍光細胞分析分離装置(FACS)が含まれる。Bestrophin上の2つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を利用する、2部位モノクローナルベースの免疫学的測定法は好適ではあるが、競合結合アッセイを用いることが可能である。これらを含めた他の測定法は、Hampton、R. らの(ミネソタ州セントポール市、1990; Serological Methods, Laboratory Manual, APS Press)および Maddox、D. E. らの(1983; J. Exp. Med. 158:1211-1216)の諸所に記載されている。
【００４９】
多岐にわたる標識技術および抱合技術が当業者に知られており、種々の核酸およびアミノ酸測定法において使用することが可能である。標識ハイブリダイゼーションを産生するための手段、またはBestrophinをコード化するポリヌクレオチドに関連する配列検出するためのPCRプローブには、標識ヌクレオチドを使用するオリゴ標識、ダコン翻訳、末端標識または PCR 増幅が含まれる。
【００５０】
あるいは、Bestrophin(例えば、VDM2、VDM2様タンパク質1、VDM2様タンパク質2、またはVDM2様タンパク質3)をコードする配列、または その任意の一部分を mVDM2様プローブの産生のためのベクターにクローニングすることも可能である。このようなベクターは、当分野で周知であり、市販もされており、T7、T3、または SP6 および標識ヌクレオチドのような適切な RNA ポリメラーゼを追加することによって、生体外 RNA プローブの合成に使用することが可能である。このような手順は、市販されている種々のキット(ミシガン州カラマズーの Pharmacia & Upjohn 社)、Promega (ウィスコンシン州マディソン)、および U.S. Biochemical Corp.(オハイオ州クリーブランド)を用いて実行することが可能である。
【００５１】
また、使用可能な好適レポーター分子または標識には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、または発色剤のほかに、基質、補助因子、阻害剤、磁力粒子なども含まれる。
【００５２】
Bestrophinをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培地でのこのタンパク質の発現及び回収に好適な条件下で培養される。組換え細胞によって産生されたタンパク質は、使用される配列および(または)ベクターによるが、分泌または細胞内に含有せしめることが可能である。Bestrophinをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜及び真核細胞膜を透過するBestrophinの分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理解されよう。別の組換え作成物を用いて、Bestrophinをコードする配列を、水溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチド ドメインをコード化するヌクレオチド配列に結合することが可能である。そのような精製促進ドメインには、固定化金属上の精製を可能にするヒスチダイン トライトファン分子のような金属キレートペプチド、固定化免疫グロブリン上の精製を可能にするタンパク質 A ドメインおよびフラグ伸長・親和性精製システム(ワシントン州シアトル市の Immunex Corp.)において利用されるドメインが含まれるが、これらに限定されるものではない。XA 因子または精製ドメインとBestrophin間のエンテロキナーゼ(腸活素)(Invitrogen, San Diego, Callif.)等に対して特異的な切断可能リンカー配列の抱合は、精製を促進するために使用することが可能である。そのような単一発現ベクターは、Bestrophinを含む融合タンパク質の発現、チオレドキシンまたはエンテロキナーゼ(腸活素)切断部位に先行する、6 ヒスチダイン残基をコード化する核酸を提供する。エンテロキナーゼ(腸活素)切断部位は、融合タンパク質からBestrophinを精製する手段を提供する一方、ヒスチジン残基は、IMIAC (Porath、J. らの(1992、Prot. Exp. Purif. 3: 263-281)に記載された固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー)上での精製を促進する。融合タンパク質を含むベクターの論考は、Kroll, D. J. らの(1993; DNA Cell Biol. 12:441-453)で提供されている。組換え産出に加えて、Bestrophinの断片は、固相技術 (Merrifield J. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154)を用いてペプチド合成を誘導することによって産生することができる。タンパク質合成は、手動または自動の何れの技術によっても実行することが可能である。自動合成は、例えば Applied Biosystems 431A ペプチド シンセサイザ(Perkin Elmer社)を用いて達成することが可能である。Bestrophinの種々の断片は、完全長分子を産生するために化学的方法を使用して、個別に化学的な合成および結合を行なうことが可能である。
【００５３】
本発明において開示したデータは、本発明の核酸およびタンパク質およびそのエフェクターが関連する診断用および治療用、例えば、限定するものではないが、肥満症のような代謝障害、ならびに高コレステロール血症、骨関節炎、胆石症、生殖器官の癌、および睡眠時無呼吸のような関連障害として有用であることを示す。従って、Bestrophin核酸およびタンパク質の診断用途および治療用途は、例えば、これらに限定されるものではないが、次の通りである: (i)タンパク質治療、(ii)小分子薬剤標的、(iii)抗体標的 (治療、診断、薬剤標的・細胞毒性抗体)、(iv)診断および(または)予後マーカー、(v)遺伝子療法(遺伝子送達と遺伝子除去)、(vi)研究ツール、および(vii)生体外および生体内 における組織再生(これらの組織に由来する組織型および細胞型を構成する全ての組織型および細胞型の再生)。
【００５４】
本発明の核酸およびタンパク質は、下記に記載した診断用途および治療用途において特に有用である。例えば、限定するものではないが、遺伝子療法、および本発明のBestrophinタンパク質および特にそのヒト相同体において有用であり得る、本発明のBestrophinタンパク質をコードする cDNAs および特にそのヒト相同体は、それを必要とする被験体に投与された場合に有用であり得る。例証として、本発明の組成物は、上記に述べたような疾患および障害に苦しむ患者の予防または治療に対して有効性を有する。
【００５５】
さらに、Bestrophin核酸またはその断片は、核酸またはタンパク質の存在または量が算定されるべき診断用途においても有用であり得る。さらに、Bestrophinタンパク質またはその断片は、治療法または診断法における使用のための、本発明のタンパク質に免疫特異的に結合する抗体の生成においての有用である。
【００５６】
例えば一実施態様においては、アンタゴニストとして直接的に、またはBestrophinを発現する細胞や組織に薬剤をもたらす標的または輸送機構として間接的に、Bestrophinに特異な抗体を用いることが可能である。その抗体は当分野で周知の方法を用いて生成することが可能である。このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖、Fab 断片、および Fab 発現ライブラリによって産生された断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。中和抗体(すなわち、二量体の形成を阻害する抗体)は特に治療用に望ましい。
【００５７】
抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト、その他を含む種々の宿主は、Bestrophinの任意の断片またはオリゴペプチドであって免疫抗原性の特性を有するものを注入することによって免疫化することができる。宿主の種によるが、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることが可能である。そのようなアジュバントには、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、およびリゾレシチン、プルオニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳濁液、キーホールリンペットヘモシニアン、およびジニトロフェノールのような表面活性物質などが含まれるが、それらに限定されるものではない。ヒトに使用されるアジュバントの中では、BCG (カルメット‐ゲラン杆菌)およびコリネバクテリウム パルヴムが特に望ましい。Bestrophinに対する抗体を誘導するために用いるペプチド、断片またはオリゴペプチドは、少なくとも約 5 のアミノ酸からなり、より望ましくは少なくとも約 10 のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するものが望ましい。これらが、天然タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であること、および小さな天然分子の全アミノ酸配列を含み得ることが望ましい。Bestrophinアミノ酸の短い伸長部は、キメラ分子に対して産生されたキーホールリンペットヘモシニアンおよび抗体などの異種のタンパク質の伸長部と融合することが可能である。
【００５８】
Bestrophinに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって、抗体分子を産生する任意の技術を用いて作製することが可能である。これらには、ハイブリドーマ技術、ヒト B 細胞ハイブリドーマ技術、および EBV ハイブリドーマ技術(Koehler、G. らの (1975) Nature 256:495-497; Kozbor、D. らの (1985)J. Immunol. Methods 81:31-42; Cote、R. J. らの Proc. Natl. Acad. Sci. 80:2026-2030; Cole、S. P. らの (1984)Mol. Cell Biol. 62:109-120)が含まれるが、それらに限定されるものではない。
【００５９】
加えて、「キメラ抗体」を産出するために開発された技術、好適な抗原特異性および生物学的活性を有する分子を得るためにマウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子に対するスプライシングを使用することが可能である (Morrison, S. L. らの (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855; Neuberger, M. S. et al (1984) Nature 312:604-608; Takeda, S. らの (1985) Nature 314:452-454)。別法では、当分野で周知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用し、Bestrophin特異性一本鎖抗体を生成する。関連特異性を有するが、固有イディオタイプ成分の一部でもある抗体は、ランダムな組み合わせの免疫グロブリンライブラリからのチェーンシャフリングによって生成することが可能である(Burton、D. R. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88:11120-3)。抗体はまた、リンパ球集団における生体内産生の誘導によって産生することが可能であり、または組換え免疫グロブリン ライブラリまたは文献に開示したされているような高特異結合試薬パネルのスクリーニングによっても産生することが可能である(Orlandi、R. らの(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86:3833-3837; Winter、G. らの(1991) Nature 349:293-299)。
【００６０】
また、Bestrophinに対する特異的な結合部位を含む抗Bestrophin抗体の断片を生成することもできる。例えば、そのような断片には、抗体分子のペプシン消化によって産生できる F(ab')２ 断片、および F(ab')２ のスルフィド架橋を還元することによって生成できる Fab 断片が含まれるが、それらに限定されるものではない。あるいは、Fab 発現ライブラリを作製することによって、所望の特異性を有するモノクローナル Fab 断片の迅速かつ容易な同定を行なうことができる(Huse, W. D. らの(1989) Science 254:1275-1281)。
【００６１】
種々の免疫学的測定法をスクリーニングに対して用い、所望の特異性を有する抗体を同定することが可能である。既存の特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを使用する競合結合および免疫放射定量測定法のための幾多のプロトコルは、当分野では周知である。通常このようなイムノアッセイには、Bestrophinとその特異性抗体との間の複合体調整の計測が含まれる。
【００６２】
本発明の別の実施例によれば、ポリヌクレオチドをコードするBestrophin、またはその任意の断片、またはアプタマー、アンチセンス分子、リボザイムまたはRNAi分子のようなエフェクター核酸を治療目的のために使用することが可能である。一実施態様においては、アプタマー、すなわち、標的タンパク質に結合する能力およびその活性を調節する能力のある核酸分子を既知の方法、例えば組み合わせ核酸ライブラリの親和性選択によって得ることが可能である。
【００６３】
さらなる実施態様では、mRNAの転写を阻止することが望ましいような状況において、アンチセンス分子を使用することが可能である。具体的には、Bestrophinをコードするポリヌクレオチドに補遺的な配列を利用して細胞を形質転換することができる。このように、アンチセンス分子を用いてBestrophin活性を調節すること、または遺伝子機能を調節することができる。今このような技術は当分野では周知であり、センスまたはアンチセンスのオリゴマーまたは大きな断片を、Bestrophinをコードする配列のコード領域および(または)制御領域に沿ったさまざまな位置から設計することが可能である。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスまたはワクチニア ウィルス、または種々の細菌プラスミドに由来する発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的器官、組織または細胞集団に送達することが可能である。当業者に周知の方法を用いて、Bestrophinをコードする遺伝子のポリヌクレオチドに補遺的なアンチセンス分子を発現する組換えベクターを構築することが可能である。これらの技術は、Sambrook ら(前出)および Ausubel ら(前出)の両方の文献に記載されている。Bestrophinをコードする遺伝子は、ハイレベルのポリヌクレオチドを発現する発現ベクターまたはBestrophinをコードするその断片を用いて、細胞または組織を形質転換することによって、オフにすることがでる。そのような作成物を用いて、翻訳不可能なセンス配列またはアンチセンス配列を細胞に導入することが可能である。DNA への組み込みが不在の場合でさえ、そのようなベクターは、RNA 分子が内在性ヌクレアーゼ(核酸分解酵素)によって使用不可能になるまで継続して RNA 分子を転写することが可能である。一過性の発現は、非複製ベクターによって 1 ヶ月以上持続することが可能であり、さらに適切な複製要素がそのベクター系の一部である場合には、より長く持続することが可能である。
【００６４】
上述したとおり、遺伝子発現の修飾は、アンチセンス分子、例えば、DNA、RNA、またはPNAのような核酸アナログを、Bestrophinすなわち、プロモーター、エンハンサー、および(または)イントロンをコードする遺伝子の制御領域に対してデザインすることによって得ることができる。転写開始部位(例えば始動部位から-10〜+10の間)由来のオリゴヌクレオチドが望ましい。同様に、「三重らせん」塩基対の形成方法を用いて抑制が可能となる。三重らせん対合が有用であるのは、三重らせん対合は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合に対して二重らせんが充分に開くような能力を阻害するためである。三重らせん DNA を用いる最近の治療の進歩は文献に記載がある(Gee, J. E. らの (1994) In; Huber, B. E. and B. I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, N. Y.)。また、アンチセンスは、転写物のリボソームに対する結合を防止することによって、mRNA の翻訳を阻止する目的でデザインすることも可能である。
【００６５】
また、酵素性 RNA 分子であるリボソームを用いて、RNA の特異的切断を触媒することも可能である。リボザイム作用の機構は、内ヌクレオチド結合分解性の切断に先立つ、相補的標的 RNA へのリボザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションに関与する。使用できる実施例には、標的配列の内ヌクレオチド結合分解性の切断を特異的かつ効果的に触媒する組換え型のハンマーヘッド型リボザイム分子が含まれる。任意の潜在的 RNA 標的内の特異性リボザイム切断部位は、GUA、GUU、およびGUC 配列を含めたリボザイム切断部位に対する標的分子を走査することによって、初めに同定する。ひとたび同定すると、標的遺伝子の領域に対応し、切断部位を含む 15〜20 リボヌクレオチド間の短い RNA配列は、オリゴヌクレオチドを機能不全にするような二次構造機能に対して評価することが可能となる。候補標的の適合性もまた、リボヌクレアーゼ保護測定法を使用して、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのアクセス容易性をテストすることにより、評価することが可能である。
【００６６】
アンチセンス分子およびリボザイムのようなエフェクター核酸は、核酸分子合成のための当分野で周知の任意の方法を用いて調製することが可能である。これらの方法には、固相フォスフォアミダイト化合合成のようなオリゴヌクレオチドを化学的に合成する技術が含まれる。或いは、DNA配列の生体内および生体外転写によってRNA分子を産出することも可能である。このような DNA 配列は、T7 または SP6 のような好適なRNA ポリメラーゼ プロモーターを用いて、種々のベクターに組み込むことが可能である。あるいは、RNAを構成的または誘導的に合成するこれらのcDNA作成物は、細胞株、細胞、または組織内に導入することができる。RNA分子を修飾して、細胞内の安定性および半減期を向上することが可能である。可能な修飾には、分子の 5' 末端および(または) 3' 末端でのフランキング配列の追加、または ホスホロチオネートの使用、または分子の背骨連鎖内のホスホジエステラーゼ連鎖ではなく 2' O-メチルが含まれるが、それらに限定されるものではない。この概念は、PNA の産出に固有のものであり、例えばイノシン、クエオシン、ワイブトシンのほかに、アセチル系、メチル系、チオ系、および内在性エンドヌクレアーゼによって容易には認識されない、アデニン、シチジン、グアニン、チミン、およびウリジンに類似の修飾態様なども含めた非従来型塩基の抱合によって、これら全ての分子に適用することができる。
【００６７】
ベクターを細胞または組織に導入するための多数の方法を利用することが可能であり、それらの方法は生体内、生体外、および生体内外交通の使用に等しく適している。生体内外交通治療では、ベクターは、患者から採取した幹細胞内に導入し、同一患者に自家移植で戻すためにクローン増殖することが可能である。形質移入およびリポソーム注入による送達は、当分野で周知である方法を用いて達成することが可能である。上記の治療方法はいずれも、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、および最も望ましくはヒトなどの哺乳動物を含めた、好適な被験体に適用することが可能である。
【００６８】
本発明の追加実施例は、上述した任意の治療効果対して医薬用に許容できるキャリアと併せて、医薬品組成物の投与に関するものである。そのような医薬品組成物は、活性成分タンパク質としてのBestrophin、その核酸コーディングまたはタンパク質または核酸、例えばBestrophinに対する抗体を認識する受容体、Bestrophinの擬態、アゴニスト、アンタゴニスト、活性剤または阻害剤で構成され得る。本組成物は単独で投与することができるが、少なくとも 1 つの安定化化合物などの他剤と共に投与することもでき、その場合には、限定するものではないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロースおよび水などを含めた、任意の消毒した、生物学的に適合な医薬品キャリアを用いて投与することが可能である。本組成物は単独で患者に投与することができるが、他剤、薬剤またはホルモンと共に投与することも可能である。本発明で使用した医薬品組成物は、幾つもの経路によって投与することが可能であり、その経路には経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸などが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００６９】
その活性成分に加えて、これらの医薬品成分は、医薬用に使用することができる活性化合物の製剤への処理を促進する、賦形剤および助剤を備えている好適な医薬用に許容できるキャリアを包含し得る。および投与に関する技術の詳細は、Remington's Pharmaceutical Sciences (ペンシルベニア州イーストンの Maack Publishing Co.)の最新版を参照。
【００７０】
本発明の医薬品成分は、当分野で周知の様式、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠製造、研和、乳化、カプセル化、取り込み、または凍結乾燥プロセスなどの手段によって製造することが可能である。医薬品成分を調製した後には、適切な容器に充填して治療の対象となる適応症状を標識する。Bestrophinの投与に対する標識には、投与の量、頻度、および方法が明記される。
【００７１】
本発明に好適な医薬品成分には、活性成分が所望の目的を達成するために有効な量で含有されているような成分が含まれる。有効投与量の決定は、当業者の能力の範囲内で行うものとする。任意の化合物の場合には、細胞培養アッセイ、例えば 前脂肪細胞の細胞株の細胞培養アッセイおいて、または通常マウス、ウサギ、イヌまたはブタなどの動物モデルにおいてのいずれかで、初めに治療に有効な投与量を推定することができる。また、動物モデルを好適な濃度範囲および投与経路を決定するために使用することも可能である。次にはこのような情報を用いて、ヒトに対する有益な投与量および投与経路を決定することができる。治療的に効果的な投薬量は、例えばBestrophin、その断片、特定の条件に有効なBestrophinの抗体の活性処方成分の量に関連する。治療有効度および毒性は、細胞培養または実験用動物における標準的な調剤手順によって決定することが可能であり、その例としては、ED50(集団の 50％ において治療に有効な量)およびLD50(集団の 50％ に対する致死量)などが挙げられる。治療効果と毒性効果の間の投与量の比は、治療指数であり、LD50/ED50 比率として表すことができる。高い治療指数を示す医薬品成分が望ましい。細胞培養アッセイおよび動物実験から得たデータは、ヒト用のさまざまな投与量の製剤に使用する。そのような組成物に含まれる投与量は、毒性を殆ど持たない ED50 を含む循環濃度の範囲内にあることが望ましい。投与量は、投与量の使用元、患者の感受性、および投与の経路によって、この範囲内で変わる。正確な投与量は、治療を必要とする被験者に関する要因を考慮して、現場の医師が決定することになる。投与量および投与法は、十分なレベルの活性部を提供するため、または所望の効果を維持するように調節する。配慮される要因には、疾患の重症度、被験者の身体全体の健康状態、被験者の年齢、体重、および性別、食習慣、投与の時間と頻度、薬剤の組み合わせ、反応感受性、および治療に対する耐性と反応が含まれる。長時間効果のある医薬品成分は、特定の製剤の半減期およびクリアランス率にもよるが、3〜4 日毎、1 週間毎、または 2 週間毎に 1 回の間隔で投与することが可能である。通常の投与量は、投与経路にもよるが、約 0.1〜100,000 マイクログラムと異なり、合計投与量は約 1 グラムまでとする。特定の投与量および送達の方法に関する指針は文献に記載されており、当分野の実務者はそれを利用することができる。当業者であれば、タンパク質または阻害剤とは異なったヌクレオチドの製剤を利用するであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達も、特定の細胞、状態、位置などに対して特異的なものとなる。
【００７２】
別の実施例では、抗体は、Bestrophinの過剰発現または低発現と関連を有することによって特徴付けられる状態または疾患の診断、またはBestrophin、アゴニストまたは阻害剤で治療を受けている患者を監視するためのアッセイに用いられる。診断目的に有用な抗体は、上記の治療で記載した方法と同様の様式で調製することが可能である。Bestrophinの診断アッセイには、抗体および標識を利用してヒトの体液、または細胞や組織の抽出物にあるBestrophinを検出する方法が含まれる。その抗体は、修飾の有無に拘わらず使用することが可能であり、共有結合または非共有結合のいずれかでレポーター分子と結合することによって標識化することが可能である。当分野で周知の種々のレポーター分子を使用することが可能であり、そのいくつかのレポーター分子を上記した。
【００７３】
ELISA、RIA、および  FACS を始めとしたBestrophin を測定するための種々のプロトコルは当分野では周知であり、改変または異常レベルのBestrophinの発現を診断する基準を提供する。Bestrophin発現のための正常値または標準値は、複合体の形成に適した条件下で、正常な哺乳動物対象、望ましくはヒト被験者から抽出した体液または細胞とBestrophinに対する抗体と結合することにより樹立することが可能である。標準複合体の形成量は、種々の方法によって定量化することが可能であるが、測光的な手段を用いることが望ましい。対照サンプルおよび疾患サンプル、例えば生検組織において発現したBestrophinの量を標準値と比較することが可能である。標準値と被験体の値の偏差は、疾患の診断のためのパラメータを樹立する。
【００７４】
本発明の別の実施例によれば、Bestrophinに特定のポリヌクレオチドを診断のために用いることも可能である。使用可能なポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、アンチセンスRNAおよびDNA分子、およびPNAのような核酸アナログが含まれる。ポリヌクレオチドを用いて、サンプル、例えば発現が疾患と相関関係にある生検組織において遺伝子発現を検出して定量化することが可能である。診断アッセイを用いて、不在、存在および過剰タンパク質発現を区別すること、および(または)治療介入中のBestrophinレベルの調節を監視することが可能である。
【００７５】
一実施形態では、Bestrophin近縁の分子をコードするゲノム配列を始めとするポリヌクレオチド配列を検出する能力のあるプローブおよび(または)プライマーを用いたハイブリダイゼーションを用いて、Bestrophinをコードする核酸配列を同定することが可能である。プローブの特異性は、それが高度に特異的な領域、例えば 5' 調節領域における独特のヌクレオチド、またはあまり特異的ではない領域、例えば 特に 3' コーディング領域のいずれから作られたに拘わらず、またそのハイブリダイゼーションまたは増幅(最大、高、中、または低)のストリンジェントの度合に拘わらず、そのプローブがBestrophinをコードする天然の配列、対立遺伝子、または関連配列のみを同定するかどうかを確定する。また、プローブは、関連する配列の検出に用いることもでき、望ましくは少なくとも50％のBestrophinをコードする任意の配列からのヌクレオチドが含まれているべきである。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、望ましくはヒトBestrophincDNAまたはRNAのヌクレオチド配列、またはプロモーター、エンハンサーエレメント、および(または)天然配列のイントロンを始めとするゲノム配列に由来するDNA、RNAまたは核酸アナログであり得る。BestrophinをコードするDNAに対する特異的ハイブリダイゼーションプローブを作製する方法には、Bestrophin誘導体をコードする核酸配列を、mRNAプローブを作製するためのベクターにクローニングする方法が含まれる。当業者に知られ、市販されている、このようなベクターを用いて、好適な RNA ポリメラーゼおよび好適な標識されたヌクレオチドを加えることによって、生体内で RNA プローブを合成することが可能である。ハイブリダイゼーションプローブは、種々のレポーター集団によって標識することが可能であり、その例としては、32P または 35S のような放射性核種、またはアビジン結合系やビオチン結合系を介してプローブに結合されたアルカリホスファターゼのような酵素標識が挙げられる。
【００７６】
Bestrophin(例えば、VDM2、VDM2様タンパク質1、VDM2様タンパク質2、またはVDM2様タンパク質3)に特異的なポリヌクレオチド配列は、Bestrophin発現に関連する状態または疾患の診断のために使用することが可能である。そのような状態または疾患の実施例には、肥満症および糖尿病.のような代謝疾患および障害が含まれるが、それらに限定されるものではない。また、ポリヌクレオチド配列を用いて、肥満症および糖尿病.を始めとする代謝疾患および障害に対する治療を受けている患者の進歩状況を監視することが可能である。Bestrophinをコードするポリヌクレオチド配列は、変異Bestrophinの発現を検出するために患者の生検から採取した体液または組織を利用して、サザン法、ノーザン法、ドットブロット法またはその他の膜ベースの技術、および PCR 法、またはディップスティック法、ピン ELISA 法またはチップアッセイにおいて使用することが可能である。このような定量方法または定性方法は当分野で公知である。
【００７７】
特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、さまざまな肥満症のような代謝疾患、ならびに摂食障害、悪質液、真性糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、骨関節炎、胆石症、生殖器官の癌、および睡眠時無呼吸のような関連障害の活性または誘発を検出する測定法において有用であり得る。ヌクレオチド配列は、標準法で標識化されることが可能であり、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件下で、患者から採取した体液または組織のサンプルに添加することが可能である。好適なインキュベーション期間の後、そのサンプルを洗浄し、そのシグナルを定量化し、標準値と比較する。試料におけるヌクレオチドBestrophin配列の変異レベルのに対応するシグナルの存在は、関連疾病の存在を示すものである。また、このような測定法を用いて、動物研究、臨床試験、または個々の患者の治療の監視において、特定の治療上の療法の有効性を評価することも可能である。
【００７８】
Bestrophinの発現に関連する疾患の診断基準を提供するため、発現に対する正常概要または標準概要を確定する。これは、ハイブリダイゼーション或いは増幅に好適な条件下で、動物或いはヒト被験者の何れかの正常な被験者から抽出された体液或いは細胞と、プローブまたはプライマーとして好適な配列とを結合させることにより達成され得る。標準ハイブリダイゼーションの定量化は、正常な被験体から得た値を、既知量の実質的に精製されたポリヌクレオチドを使用する実験から得た値に対して比較することによって行なうことが可能である。正常試料から得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得た試料から得た値と比較することが可能である。標準値と被験体値との間の偏差を用いて疾患の存在を確定する。ひとたび疾患の存在を確定し、治療プロトコルを開始すると、ハイブリダイゼーションアッセイを定期的に繰り返し、患者の発現レベルが正常な患者に観察されるレベルに近づき始めたかどうかを評価することが可能である。連続アッセイから得られた結果を用いて、数日〜数ヶ月の期間にわたる治療の効果を示すことが可能である。
【００７９】
肥満症のような代謝疾患、ならびに摂食障害、悪質液、真性糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、骨関節炎、胆石症、生殖器官の癌、および睡眠時無呼吸のような関連障害に関して、個々から取り出した生検組織におけるかなり高い量転写物存在は、疾病発生の素因を示すか、または実際の臨床症状の出現に先行する疾病を検出する手段を提供することが可能である。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防手段または積極的な早期治療を施し、膵臓の疾病および障害の発達またはさらなる進行を防止することが可能となる。オリゴヌクレオチドのさらなる診断への利用にはPCRの利用が関与し得る。このようなオリゴマーは、化学的に合成するか、酵素的に生成するか、または組換えソースから産出することが可能である。オリゴマーは望ましくは 2 つのヌクレオチド配列から成り、1 つはセンス方向(5'.fwdarw.3')を有し、別の 1 つアンチセンス方向(3'.rarw.5')を有し得、特定の遺伝子または条件を同定するために、最適化された条件下で用いられる。オリゴマーのネスト化したセット、または縮重オリゴマーの集積である、 2 つの同一のオリゴマーを、あまりストリンジェントでない条件下で用い、緊密に関連した DNA 配列または RNA 配列の検出あるいは(または)定量化を行なうことが可能である。
【００８０】
Bestrophinの発現を定量するために用いことができる方法には、放射標識またはビオチン ヌクレオチド、調節核酸の相互増幅、および実験結果が補間された標準曲線等が含まれる(Melby, P. C. らの (1993) J. Immunol. Methods, 159:235-244; Duplaa, C. らの (1993) Anal. Biochem. 212:229-236)。複数試料の定量化速度は、目的のオリゴマーが種々の希釈液中に存在し、そして分光光度法または非色応答が迅速な定量に関与するような状態にあるELSA形態のアッセイを実行することによって加速することが可能である。
【００８１】
本発明の別の実施例によれば、Bestrophinに特異的な核酸配列を用いても、天然のゲノム配列をマッピングするために有用であるハイブリダイゼーションプローブ生成することが可能である。その配列は、特定の染色体にマッピングするか、または公知の方法を用いて染色体の特定領域にマッピングすることが可能である。このような技術には、FISH、FACS、または酵母人工染色体、細菌人工染色体、細菌 P1 構築または単一染色体 cDNA ライブラリのような人工染色構造があり、Price, C. M. (1993) Blood Rev. 7:127-134, および Trask, B.J. (1991) Trends Genet. 7:149-154. FISH (Verma らによって記述されているとおり、(1988) Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York, N.Y.)などの文献で論評されているように、他の物理的な染色体のマッピング技術および遺伝マップデータと相関することが可能である。遺伝マップデータの例は、1994 Genome Issue of Science (265:1981f)に見出すことができる。物理的染色体マップ上のBestrophinをコードする遺伝子の位置と、特定の疾患または特定の疾患に対する素因との間にある相関性は、遺伝子の疾病に関連する DNA の領域を画定するのに役立ち得る。
【００８２】
本発明のヌクレオチド配列を用いて、健常者、保有者、または感染者の三者間における遺伝子配列の相違を検出することが可能である。確定した染色体マーカーを用いた染色体標本および結合分析などの物理的マッピング技術の原位置ハイブリッド形成法を用いて、遺伝マップを拡張することが可能である。マウスのような別の哺乳動物種の染色体上への遺伝子の配置は、多くの場合、特定のヒト染色体の数またはアームが未知の場合でさえも、関連するマーカーを明らかにすることが可能である。新配列は、物理的マッピングによって、染色体アーム、またはその部分に指定することができる。これは、位置クローニングまたはその他の遺伝子発見技術を用いて疾病遺伝子を探索する研究者にとって貴重な情報を提供する。一旦疾患または症候群が、例えば AT〜11q22-23 (Gatti, R.A. らの(1988) Nature 336:577-580)などの特定ゲノム領域への遺伝的結合によって大まかに位置決めがされると、その領域に対してマッピングする全ての配列は、さらなる究明用の関連遺伝子または調節遺伝子に相当することになる。本発明のヌクレオチド配列を用いて、転座、反転などに起因する、健常者、保有者、感染者の三者間における染色体位置の相違を検出することが可能である。
【００８３】
本発明の別の実施例によれば、、本発明のタンパク質、それらの触媒作用断片または免疫抗原断片またはそのオリゴペプチド、生体外モデル、遺伝子操作を受けた細胞または動物を用いて、あらゆる薬剤スクリーニング技術を利用して化合物のライブラリをスクリーニングすることができる。1 つ以上の本発明のタンパク質の作用に結合し、その作用を調節するか、または模倣するエフェクター、例えば受容体、酵素、リガンドまたは基質を同定することはできるであろう。このようなスクリーニングで用いたタンパク質またはその断片は、溶液中に遊離していても、固体支持物に付着していても、細胞表面上にあっても、または細胞内にあっても構わない。本発明のタンパク質とテストされる薬剤との間の結合複合物の形成は測定することが可能である。また、薬剤が直接的または間接的に本発明のタンパク質の活性に影響を及ぼすこともできる。標的機構には、例えば塩素チャンネルまたはBestrophinの他のコンダクタンス活性、ならびにリン酸化および脱リン酸またはその他の翻訳後の修飾によるBestrophin活性の調節が含まれる。その上に、薬剤は、Bestrophinの二量体化またはオリゴマー形成を妨害すること、またはBestrophinの他の異種様式において、その他のタンパク質、例えばイオン チャンネルを妨害することもできる。特に興味深いのは、哺乳動物の細胞に対して低毒性を有する薬剤のスクリーニングアッセイである。本明細書中で使用した用語「薬剤」は、1 つ以上の本発明のタンパク質の生理機能を改変または 模倣する能力を有する任意の分子、例えばタンパク質または医薬品である。候補薬剤は、典型的には有機分子であり、望ましくは50〜約2,500ドルトンの分子量を有する小有機化合物であるが、幾多の化学的クラスを包含する。候補薬剤には、タンパク質、特に水素結合との構造上の相互作用に必要な機能グループが含まれ、および典型的には少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基、望ましくは少なくとも2つの機能化学グループが含まれる。候補薬剤には多くの場合、炭素環式構造または複素環式構造、および(または)1つ以上の上記機能グループと置換された芳香族構造またはポリ芳香族構造が包含される。
【００８４】
候補薬剤は、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、プリミジン(pyrimidies)、核酸および誘導体、構造上の類似体またはその組み合わせを含んだ生体分子間に見出される。候補薬剤は、合成化合物または天然化合物のライブラリを含んださまざまなソースから取得する。例えば、任意に抽出されたオリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を始めとして、さまざまな有機化合物および生体分子のランダム合成および直接合成のための多くの手段が利用可能である。或いは、細菌、真菌、植物、および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリは入手可能であるか、または容易に産生することができる。その上、従来の化学的、物理的、および生化学的な手段を通して、天然または合成的に産生したライブラリおよび化合物は容易に修飾でき、それらを用いて組み合わせライブラリを産生することが可能である。アシル化、アルキル化、エステル化、アミジン化(amidification)などのような公知の薬剤は、構造上の類似体を産出するために、有向またはランダムな化学的修飾の対象となり得る。スクリーニングアッセイが結合アッセイである場合、1 つ以上の分子が標識に結合することが可能であり、その標識は直接的または間接的に検出可能な信号を提供する。
【００８５】
使用可能な別の薬剤スクリーニング技術は、公開 PCT 出願番号WO84/03564に記載されているように、目的タンパク質に対して好適な結合親和性を有する化合物の高処理能力スクリーニングを提供する。この方法においては、本発明のタンパク質に対して適用されたように、多数の異なる小さな試験用化合物、例えばアプタマー、ペプチド、低分子重量化合物などをプラスチックピンまたはその他の表面上などの固体基質上で合成する。試験用化合物は、タンパク質またはその断片と反応させ、洗浄した。次に、結合したタンパク質を、当分野で周知の方法で検出した。精製したタンパク質は、前記した薬剤スクリーニング技術で使用するプレート上で直接被覆することもできる。あるいは、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持物上に固定することもできる。別の実施例では、タンパク質と結合可能な中和抗体がタンパク質と結合するため試験用化合物と特に競合し、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる。この方法では抗体を用いて、タンパク質と1つ以上の抗原決定因子を共有する全てのペプチドの存在を検出することができる。
【００８６】
本発明のタンパク質をコードする核酸を用いて、遺伝子組換え細胞株および動物を生成することができる。これらの遺伝子組換え動物は、本発明生体外のタンパク質の機能および調節の研究において有用である。遺伝子組換え動物、特に哺乳動物の遺伝子組換え動物は、ヒトに共通する多くの発生プロセスおよび細胞プロセスの調査のためのモデルシステムとして役立つことができる。遺伝子組換え動物は、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の正常な遺伝子座が突然変異される場合、胚幹細胞における相同性組換を通して作製することができる。別法として、タンパク質をコードする核酸作成物を卵母細胞に注入し、ゲノムにランダムに統合する。また、本発明の遺伝子またはその変異体を、通常には発現されないか、または異常発生するような場所に発現することも可能であろう。さらには、アンチセンス分子を発現する特定の作成物のような本発明の遺伝子の変異体、または本発明のタンパク質の発現を阻止または変質する優性阻害突然変異の発現はゲノムにランダムに統合し得る。lac Zまたはルシフェラーゼのような検出可能なマーカーを、本発明の遺伝子の発現の上方制御が表現型における容易に検出可能な変化を結果としてもたらす本発明の遺伝子の遺伝子座に導入することが可能である。安定した統合のベクターには、プラスミド、レトロウィルスおよびその他の動物ウィルス、酵母菌人工染色体(YACs)などが含まれる。相同性組換えDNA構成物には、所望の遺伝的な修飾を有する本発明の遺伝子の一部が少なくとも含まれており、標的遺伝子座に対する相同性領域が含まれる。好都合なことには、ポジティブ選択およびネガティブ選択用のマーカーが含まれている。ランダム統合のためのDNA作成物には、組換えを仲介するための相同性の領域が含まれる必要はない。ランダム統合のためのDNA作成物は、本発明のタンパク質、調節元素(プロモーター)、イントロンおよびポリアデニル化信号をコードする核酸から成る。相同性組換えを通して標的遺伝子修飾を有する細胞を生成する方法は、本分野で周知である。胚幹(ES)細胞に関しては、ES細胞株を用いるか、または胚細胞を宿主、例えばマウス、ラット、モルモットなどから新たに取得することが可能である。そのような細胞は、適切は線維芽細胞-支持細胞層上で増殖し、そして白血病抑制因子(LIF)の存在下で増殖する。ES細胞または胚細胞を形質移入してから、遺伝子組換え動物を産生するために用いることができる。形質移入後、ES細胞を適切な培地の支持細胞層にプレーティングする。その構成物を含んでいる細胞は、選択培地を用いることによって選択することが可能である。コロニーを十分な時間をかけて増殖した後、コロニーを摘出し、相同性組換えの発生率を分析する。陽性反応を示すコロニーは、胚操作および桑実胚凝集に用いることが可能である。つまり、桑実胚を4〜6週間目の過排卵メスから取得し、透明帯を除去し、桑実胚を組織培養皿の小さなくぼみに置く。ES細胞をトリプシン処理し、修飾細胞を桑実胚の近くのそのくぼみに置く。次の日に、凝集体を偽妊娠のメスの子宮角に移す。次に、メスに出産させる。キメラの子孫は、外殻の変化によって容易に検出することができ、引き続いて突然変異の次世代への伝達のためにスクリーニングする(F1-世代)。F1-世代の子孫を修飾遺伝子の存在に対してスクリーニングし、修飾を有するオスおよびメスを交尾させ、ホモ接合性の子孫を産生する。その遺伝子改変が成長の過程で死亡率の原因となる場合には、組織または器官は、同種間移植または類遺伝子性移植、または生体外培養用として維持することができる。遺伝子組換え動物は、実験動物、家畜など、例えば、マウス、ラット、モルモット、ヒツジ、ウシ、ブタ、のような任意の非ヒト哺乳動物でよい。遺伝子組換え動物は、機能的研究、薬物[スクリーニング、およびその他の用途において使用され、本発明の生体内のタンパク質の機能および調節の試験おいて有用である。
【００８７】
また、最終的に、本発明は少なくとも下記の1つから成るキットに関するものである。
(a)  Bestrophin核酸分子またはその断片;
(b)  (a)の核酸を含むベクター;
(c)  (a) の核酸または (b) のベクターを含む宿主細胞;
(d)  (a) の核酸によってコードされたポリペプチド;
(e)  (a) の核酸によってコードされた融合ポリペプチド;
(f)  (a) の核酸または (d) または (e) のポリペプチド に対する抗体、アプタマーまたは別の受容体および
(g)  (a) の核酸の抗センス オリゴヌクレオチド。
【００８８】
本キットは、診断用または治療用に使用することが可能であり、または上記に述べたようにアプリケーションをスクリーニングするため使用することが可能である。さらに、キットには、取扱説明書が含まれることが可能である。
【００８９】
各図は、下記を示す:
図1 は、Pベクター(コントロール群と比較して)のホモ接合性の生存結合に起因する、EP(3)32517およびHD-EP(3)36237ハエの中性脂肪含有率の増加を示す。
【００９０】
図2 は、変異型Bestrophin(Best1、CG6264)遺伝子の遺伝子座の分子構造 を示す。
【００９１】
図3 は、ヒトBestrophinタンパク質の相同体ショウジョウバエBestrophinタンパク質との比較 (CLUSTAL X 1.8)を示す。アライメントにおけるギャップは、- として表す。図において、染色体12'ヒトVDM2様タンパク質3を指し、 染色体1GENSCAN＿predicted＿peptide'はヒトVDM2様タンパク質2を指し、hsXP＿043405'はヒトVDM2タンパク質を指し、 hs NP＿060152＿mod'はタンパク質に類似ヒトVDM2様タンパク質1を指し、およびdmbest'はキイロショウジョウバエbestrophinを指す。
【００９２】
図4 は、4つのヒトBestrophin相同体(配列認識番号 1-8)のヌクレオチド配列を示す。
【００９３】
図5 は、ヒト、マウス、およびショウジョウバエBestrophinタンパク質間の比較 (CLUSTAL W 1.82 複数配列アライメント)を示す。アライメントにおけるギャップは、- として表す。
Bestrph＿Hsは、|SWISS-PROTアクセッション番号O76090またはGenBankアクセッション番号NP＿004174を指し;
Bestrph＿Mmは、マウスEnsEMBL Genscan 予測ペプチド19.9000001-10000000.20.329852.331536をを指し;
VMDY2＿3＿Hs GenBankアクセッション番号AF440758＿1、ヒト卵黄様黄斑変性2様タンパク質3;
VMDY2＿3＿Mmは、ENSEMBLアクセッション番号ENSMUSP00000020378を指し;
VMDY2＿1＿Hsは、GenBankアクセッション番号AF440756＿1、ヒト卵黄様黄斑変性2様タンパク質1を指す;
VMDY2＿1＿Mmは、GenBankアクセッション番号NP＿663363またはENSEMBL GenBankアクセッション番号ENSMUSP00000005276を指し;
VMDY2＿2＿Hsは、GenBankアクセッション番号AF440757＿1、ヒト卵黄様黄斑変性2様タンパク質2 [ホモサピエンス]を指し;
VMDY2＿2＿Mmは、ENSEMBLアクセッション番号ENSMUSP00000049289を指し;およびBestrph＿Dm'は、GenBankアクセッション番号NP＿652603.1を指す。
【００９４】
図6:
哺乳動物の組織における卵黄様黄斑変性2様タンパク質3の発現の分析を示す。
図 6A. マウス野生型組織におけるVDM2様タンパク質3 mRNA 発現のリアルタイムPCR法
図 6B. レプチンを発現するマウス(wtマウス)におけるVDM2様タンパク質3のmRNA発現のレプチンを発現しない遺伝的に肥満した(ob/ob)マウスとの比較、および絶食マウスとの比較。
図 6C. レプチン受容体発現のない遺伝的に肥満した(db/db)マウスにおける卵黄様黄斑変性2 (VDM2)様タンパク質3 mRNAの野生型(wt)マウスに対する比較のリアルタイムPCR法間接分析
図 6D. 高脂肪(パルミチン酸)食マウスにおけるVDM2様タンパク質3 mRNAの発現の通常食マウスに対する比較
図 6E.  細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中の哺乳動物の線維芽細胞(3T3-L1)細胞におけるVDM様タンパク質3 mRNAの発現
図7A は、異なるマウス組織におけるマウス卵黄様黄斑変性タンパク質(VDM2)mRNAの発現を示す。
図7B は、異なる実験用マウス、(野生型マウス、wt; 遺伝的に肥満したマウス、ob/ob 絶食マウス)における卵黄様黄斑変性(VDM2)タンパク質mRNAの発現を示す。
図7C は、高脂肪(パルミチン酸)食下のマウスにおけるVDM2の発現の通常食マウスに対する比較を示す。
図8 は、マウス卵黄様黄斑変性2様タンパク質1 mRNAの発現プロフィールの作成を示す。
図9 は、異なるヒト組織におけるVMD2のmRNA発現を示す。
図10 は、異なるヒト組織におけるVMD2様タンパク質3 mRNAの発現を示す。
【００９５】
実施例は本発明 を図示する。
【００９６】
実施例 1: 変異型ハエの中性脂肪含有量の測定
ホモ接合性HD-EP(3)32517およびHD-EP(3)36237ハエの中性脂肪含有量の平均増加を対照ハエと比較して検討した (図1)。中性脂肪の確定のため、ハエを、5 分間、90℃ にて水溶性の緩衝液中において水浴を使用してインキュベートした後に熱抽出を行なった。さらなる 5 分間 90℃ にてインキュベーションし、マイルドな遠心分離を行なった後、Sigma 中性脂肪(INT 336-10 または-20)測定法を使用し、製造者のプロトコルに従って光学的な濃度における変化を測定することによって、ハエの中性脂肪含有量抽出を確定した。参照として、BIO-RAD DC タンパク質測定法 を使用し、製造者のプロトコルに従って、同一抽出のタンパク質含有量を測定した。その測定法を何度か繰返した。
【００９７】
EPコレクションの中性脂肪平均レベルを100％として図1に示した。HD-EP(3)32517 ホモ接合性ハエは、対照(260 ％)に比べて常により高い中性脂肪含有量を示した。加えて、HD-EP(3)32517 ホモ接合性ハエは、対照(260 ％)に比べて常により高い中性脂肪含有量も示した。つまり、遺伝子座85F13-85F14 (推定)における遺伝子活性の損失は、HD-EP(3)32517およびHD-EP(3)36237ハエのEP-ベクターがホモ接合性生存結合している場合、エネルギー保管中性脂肪代謝における変化の原因であり、以上の点から両方の事例において、肥満したハエモデルを表している。
【００９８】
実施例 2: Bestrophin遺伝子の同定
図2において、ゲノムDNA配列は、HD-EP(3)32517およびHD-EP(3)36237の統合部位が含まれている黒色の点線としてアッセンブリによって表されている(染色体3R上のポジション5985465から5997965まで)。転写されたDNA配列(EST)および予想エキソンは下部の 2 行にバーとして示した。Bestrophin(Best1;アブ開放3、Bestrophin1)をコードする遺伝子CG6264の予測エキソンは、濃灰色のバーとしておよびイントロンは薄灰色のバーとしてそれぞれ示した。Bestrophinは、アブ配列分析プログラムによってCG6264 (Genbankアクセッション番号NP＿652603.1)として予測される遺伝子をコードする。プラスミド救出方法を用いて、ゲノムDNA配列を直接的に局在化した5'または3'のHD-EP(3)32517およびHD-EP(3)36237統合部位を分離した。公共配列データベースをスクリーニングし、その結果HD-EP(3)32517およびHD-EP(3)36237の統合部位同定し、中性脂肪含有量の上昇を引き起した。HD-EP(3)32517を、遺伝子Best1 (CG6264)の5´エキソンにおいて統合し、およびHD-EP(3)36237をエンハンサー/プロモーター領域5'のBest1 (CG6264)に統合した。以上の点から、遺伝子Best1 (CG6264)の発現は、HD-EP(3)32517およびHD-EP(3)36237のホモ接合性生存統合によって影響され、エネルギー保管中性脂肪の増大につながる。
【００９９】
実施例 3: ヒトBestrophin相同体同定
よって、Bestrophin相同性タンパク質および核酸分子コーディングは、昆虫または脊椎動物各種、例えば、哺乳動物または鳥から入手可能である。特に好適なのは、ヒトBestrophin相同性核酸およびそれによってコードされたポリペプチド、特に (i) 染色体11上のヒトBestrophinタンパク質(またはヒト卵黄様黄斑変性とも呼ばれる、VMD2; Genbankアクセッション番号NP＿004174; Swiss Prot.アクセッション番号076090; 旧番号Genbankアクセッション番号XM＿043405、図4Aおよび4Bを参照; 配列認識番号1/2)のコード化、または (ii) ヒト染色体12上のBestrophin相同性タンパク質(ゲノム配列Genbankアクセッション番号AC016153、図4Eおよび4Fを参照; 配列認識番号5/6); ヒト卵黄様黄斑変性2様タンパク質3に同一; Genbankアクセッション番号AF440758＿1、(iii) ヒト染色体1上のBestrophin相同性タンパク質(ゲノム配列Genbankアクセッション番号AL592166、図4Gおよび4Hを参照; 配列認識番号7/8) ヒト卵黄様黄斑変性2様タンパク質2のコード化に同一; Genbankアクセッション番号AF440757＿1)または (iv) 染色体19上のBestrophin相同性タンパク質ヒトのをコード化(cDNA Genbankアクセッション番号NM＿017682およびゲノム配列AC018761から構築、4Cおよび4Dまたは4Iおよび4Jを参照図; 配列認識番号3/4; アミノ末端に追加の43アミノ酸を有するヒト卵黄様黄斑変性2様タンパク質1 (Genbankアクセッション番号AF440756＿1)に類似)である。異なる種から取り出したBestrophinのアライメントをClustaWプログラムによって行い、図3および図5に図解した。
【０１００】
実施例 4: 哺乳動物組織におけるポリペプチドの発現
本発明において開示した哺乳動物の組織におけるポリペプチドの発現を分析するため、いくつかのマウス菌株 (望ましくは、標準モデル系における肥満症および糖尿病の研究であるマウス菌株 C57Bl/6J、C57Bl/6 肥満型および C57Bl/KS db/db)は、Harlan Winkelmann (33178 Borchen、Germany)から購入し、一定の温度下に維持した(望ましくは 22℃)、湿度 40 パーセントおよび明/暗サイクルの望ましくは14/10 時間。 マウスには標準食を与えた(例えば、ssniff Spezialitaeten 有限責任会社、製品番号 ssniff M-Z V1126-000)。動物は6〜8 週間目に達した年令で屠殺した。動物組織は、当業者であれば既知の標準手順に従って分離し、液体窒素で簡易冷凍し、必要となるまで -80℃にて保管した。
【０１０１】
本発明において開示した生体外分化におけるタンパク質の役割の分析のため、異なる哺乳動物細胞の培養細胞、前脂肪細胞の脂肪細胞への変換、哺乳動物の線維芽細胞(3T3-L1)細胞(例えば、Green & Kehinde、Cell 1: 113-116、1974)を American Tissue Culture Collection(米国バージニア州ハナサスの ATCC、; ATCC- CL 173)から入手した。3T3-L1 細胞は線維芽細胞として維持し、従来の技術に記述されたように脂肪細胞へ分化した(例えばQiu. らの J. Biol. Chem. 276:11988-95、2001; Slieker らのBBRC 251: 225-9、1998)。分化手順のいくつかの時点、第0 日目(密集日) を始めに、第2 日目(ホルモン追加; 例えば、デキサメタゾンおよび3-イソブチル-1-メチルキサンチン)、および10日間を最大とする分化中には、好適な細胞のアリコットを2日毎に採取した。
【０１０２】
RNA をTrizol 試薬 (例えば、ドイツ、Karlsruhe のInvitrogen社製)を使用して、マウス組織または細胞の培養細胞から分離した。およびさらに、RNeasy キット(例えば、ドイツ、Qiagen 社製)と共に、DNase-treatment を使用し、製造者の指示に従って当業者であれば既知の方法で精製した。全 RNA を逆転写した(望ましくは Superscript II RNaseH- Reverse Transcriptase を利用する。Invitrogen社、Karlsruhe、ドイツ) また、全 RNA は Taqman 分析の対象となり、望ましくは Taqman 2xPCR Master Mix を使用して(Applied Biosystems社、Weiterstadt、ドイツ; このミックスには、製造者によれば、例えば、AmpliTaq ゴールド DNA ポリメラーゼ、AmpErase UNG、dUTP  を有する dNTP、 GeneAmp 5700配列検出システム上(Applied Biosystems より、Weiterstadt、ドイツ)上の受動的な参照 Rox および最適化された緩衝液成分)などが含まれている。
【０１０３】
Taqman 分析は、望ましくは下記のプライマー/プローブ ペアを用いて実施する:
マウス卵黄様黄斑変性タンパク質(VMD; マウスEnsEMBL Genscan 予測ペプチド19.9000001-10000000.20.329852.331536)の増幅用:
マウスVMD タンパク質フォーワードプライマー(配列識別番号9): 5'-AAG GCC TAT CTT GGA GG TCG A-3'; マウスVMD タンパク質逆プライマー(配列識別番号10): 5'-GTA CAC ACC TCA TTC ATC AGG CTC-3'; Taqman プローブ (配列識別番号11): (5/6-FAM)TCC GGG ACA CCG TCC TGC TCC (5/6-TAMRA)
マウス卵黄様黄斑変性2様タンパク質1 (VMD2L1; GenBankアクセッション番号NP＿663363またはENSEMBL GenBankアクセッション番号ENSMUSP00000005276)の増幅用:
マウスVMD2L1 フォーワードプライマー(配列識別番号12): 5'- GCG CTA CGC AGG GCT CT-3'; マウスVMD2L1 逆プライマー(配列識別番号13): 5'- CCG TTT GAA GAC TGC TGT GC-3'; Taqman プローブ (配列識別番号14):   (5/6-FAM)CGC GGT GCT GAT CCT TCG TTC TG (5/6-TAMRA)
卵黄様黄斑変性2様タンパク質3 (VMD2L3; ENSEMBLアクセッション番号ENSMUSP00000020378)の増幅用:
マウスVMD2L3 フォーワードプライマー(配列識別番号15): 5'- AGG TGG AGC CTG CCA GAG T-3'; マウスVMD2L3 逆プライマー(配列識別番号16): 5'-AGG ATC TGG ACC TAA GTT TCC  C-3'; Taqman プローブ (配列識別番号17):   (5/6-FAM)TCT GGA GTC CAG GCA CAC CTC GC (5/6-TAMRA)。
【０１０４】
図6Aに示すように、哺乳動物の(マウス)組織におけるVMD2様タンパク質3 mRNAの発現のリアルタイムPCR法(Taqman)分析は、VMD2様タンパク質3mRNAが、異なる哺乳動物の組織において偏在的に(白色脂肪組織(WAT)および茶色脂肪組織(BAT)でクリアーな発現が)より多く発現されることを明らかにした。加えて、筋肉、精巣、心臓、肺、腎臓、視床下部、および脳 組織において高いレベルの発現が見られる。つまり、発明者らの分析によって、VMD2様タンパク質3 mRNAの発現が代謝の制御下にあることが明らかに示された。遺伝的に肥満した(ob/ob)マウス(レプチン発現のないマウス)において、WATにおけるVMD2様タンパク質3 mRNAの発現レベルが、野生型マウスのレベルに比較して著しく下方制御(85％)されている(図 6B)。加えて、ob/obマウスのWATのVMD2様タンパク質3 mRNA発現における下方制御は、レプチン受容体が欠損している遺伝的に肥満したマウスモデルdb/dbにおいても見られた(図 6Cを参照)。VMD2様タンパク質3 mRNAの発現は、絶食マウスの肝臓において強く誘導された(24倍の上方制御) (図 6B)。高脂肪(パルミチン酸)食マウスにおけるVMD2様タンパク質3 mRNAのレベルは、標準食を与えられたマウスに比較してWATマウスにおいて著しく(86％)低減した(図 6D)。
【０１０５】
哺乳動物の線維芽細胞のの前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中(例えば、3T3-L1)、VDM2様タンパク質3の発現が著しく(81％)下方制御された(図 6E)。これは、VDM2様タンパク質3 が脂肪細胞脂質蓄積の阻害剤であることを示しす。
【０１０６】
図7Aに示すように、哺乳動物(マウス)組織におけるVMD2タンパク質mRNAの発現のリアルタイムPCR法(Taqman)分析は、VMD2 mRNAが異なる哺乳動物の組織において(脂肪組織(WATおよびBAT)ではクリアーな発現)偏在的に発現されることを明らかにした発現(図 7A)。発明者らの結果で、VDM2 mRNAの発現が代謝の制御下にあることが明らかに示された。遺伝的に肥満した(ob/ob)マウスにおいては、 VDM2 mRNAの発現がWATにおいて強力に誘導される(図 7B)。高脂肪食下のマウスにおいて、VDM2 mRNAの強力な上方制御が筋肉 (11倍)およびBATにおいて見られた。図 7を参照。
【０１０７】
図8に示すように、哺乳動物の(マウス)組織におけるVMD2様タンパク質1タンパク質mRNAの発現のリアルタイムPCR法(Taqman)分析は、VMD2様タンパク質1 mRNAが異なる哺乳動物の組織において発現し、結腸において最も高いレベルの発現を示し、視床下部、脳および精巣(精巣)において高いレベルの発現を示すことを明らかにした。
VDM2様タンパク質2に対する結果は示していない。
【０１０８】
すべてのタンパク質は視床下部において発現し、その他の脳領域においても低いレベルで発現するが、それらは明らかな組織特定の発現を示し、さまざまな組織の異なる代謝要求における固有の役割りを暗示している。
【０１０９】
実施例 5: 哺乳動物(ヒト)の組織におけるポリペプチドの発現
哺乳動物の組織における本発明において開示したポリペプチド発現の分析のため、ヒトRNAをInvitrogen社(Karlsruhe、ドイツ)から得た異なる組織 から分離した: (i) 全RNA から取り出した成体骨格筋 (Invitrogen Corp. 注文番号735030); (ii) 全RNA から取り出した成体肺 (Invitrogen Corp. 注文番号735020); (iii) 成体肝臓から取り出した全RNA  (Invitrogen Corp. 注文番号 735018); (iv)  成体胎盤から取り出した全RNA (Invitrogen Corp. 注文番号735026); (v) 成体精巣から取り出した全RNA (Invitrogen Corp. 注文番号64101-1); (vi)  通常ヒト脂肪組織から取り出した全RNA (Invitrogen Corp. 注文番号D6005-01); (vii) 通常ヒトすい臓から取り出した全RNA (Invitrogen Corp. 注文番号DG6101); (viii)  通常ヒト脳から取り出した全RNA (Invitrogen Corp. 注文番号D6030-01)。
【０１１０】
RNAをDNaseを用いて製造者(例えば、ドイツのQiagen社)の指示および当業者であれば周知の方法に従って処理した。 全RNAを逆転写し(望ましくはInvitrogen社、Karlsruhe、ドイツからのSuperscript II RNaseH-逆転写酵素)、Taqman分析を、望ましくはTaqman 2xPCR Master Mix' (Biosystems社、Weiterstadt、ドイツ)を用いて行う。Taqman 2xPCR Master Mix には、製造者によれば、例えば AmpliTaq Gold DNAポリメラーゼ、AmpErase UNG、UTP付きのdNTPd、GeneAmp 5700 配列検出システムのパッシブリファレンスRoxおよび最適化された緩衝剤成分(すべてBiosystems社、Weiterstadt、ドイツより取得)が含まれています。
【０１１１】
Taqman 分析は、望ましくは下記のプライマー/プローブ ペアを用いて実施する:
VMD2 増幅用:
ヒトVMD2 フォーワードプライマー(配列識別番号18): 5'- TCA CGC TGG CAT CAT TGG A-3'; ヒトVMD2 逆プライマー(配列識別番号19): 5'-CCC TGG GAG GAT GG TGA TC -3'; Taqman プローブ (配列識別番号20):   (5/6-FAM)CGC TTC CTA GGC CTG CAG TCC CA (5/6-TAMRA)
VMD2様タンパク質3増幅用:
ヒトVMD2 様3 フォーワードプライマー(配列識別番号21): 5'- CCC ACC ATA CAC ATT GGC AG -3'; ヒトVMD2 様3 逆プライマー(配列識別番号22): 5'- TTT CCC CAT CTG GAC TGT TGA -3'; Taqman プローブ (配列識別番号23):   (5/6-FAM)TGC TGA CTA CTG CAT ACC CTC ATT TCT GGG T (5/6-TAMRA)
VMD2様タンパク質1増幅用:
ヒトVMD2 様1 フォーワードプライマー(配列識別番号24): 5'- AGG TCC CTG CAC GGC A -3'; ヒトVMD2 様1 逆プライマー(配列識別番号25): 5'- TTT ACA AAG GCA CAC GAG GCT -3'; Taqman プローブ (配列識別番号26):   (5/6-FAM)CCA CGC AGG TGT CCC GGT CTG (5/6-TAMRA)
VMD2様タンパク質2増幅用:
ヒトVMD2 様2 フォーワードプライマー(配列識別番号27): 5'- CAT CAC GGA AGG TCT TGT CAA A -3'; ヒトVMD2 様2 逆プライマー(配列識別番号28): 5'- TCC CAA ATC TAA CGT GCC AGA -3'; Taqman プローブ (配列識別番号29):   (5/6-FAM)TGC TGG GCA CCA CTC CCA GCA T (5/6-TAMRA)
図9に示すように、ヒト組織におけるVDM2タンパク質の発現のリアルタイムPCR法(Taqman)分析は、VDM2が異なる哺乳動物の組織において発現され、高いレベルの発現を脳、精巣、肺および脂肪組織において示し、エネルギー恒常性の調節における役割を明らかにした。ヒト組織を用いて得たデータはマウス組織を用いて得たデータと良く一致している(図7Aを参照)。特に、ヒト前脂肪細胞におけるVMD2の上方制御を発見した。
【０１１２】
図10に示すように、ヒト組織におけるVDM2様タンパク質3の発現のリアルタイムPCR法(Taqman)分析は、VDM2様タンパク質3が異なるヒト組織において発現され、筋肉において最も高いレベルの発現を示し、脳および精巣においてはより低いレベルで発現を示すことを明らかにした。マウス組織でも類似の結果を得た(図 6Aを参照)。
【０１１３】
VDM2様タンパク質1およびVDM2様タンパク質2の結果は、これらの遺伝子が分析した組織において検出可能な発現を示さなかったので図示していない。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】図1 は、Pベクター(コントロール群と比較して)のホモ接合性の生存結合に起因する、EP(3)32517およびHD-EP(3)36237ハエの中性脂肪含有率の増加を示す
【図２】図2 は、変異型Bestrophin(Best1、CG6264)遺伝子の遺伝子座の分子構造 を示す
【図３】図3 は、ヒトBestrophinタンパク質の相同体ショウジョウバエBestrophinタンパク質との比較 (CLUSTAL X 1.8)を示す
【図４】図4 は、4つのヒトBestrophin相同体(配列認識番号 1-8)のヌクレオチド配列を示す
【図５】図5 は、ヒト、マウス、およびショウジョウバエBestrophinタンパク質間の比較 (CLUSTAL W 1.82 複数配列アライメント)を示す
【図６Ａ】図 6A はマウス野生型組織におけるVDM2様タンパク質3 mRNA 発現のリアルタイムPCR法を示す
【図６Ｂ】図 6B は、レプチンを発現するマウス(wtマウス)におけるVDM2様タンパク質3のmRNA発現のレプチンを発現しない遺伝的に肥満した(ob/ob)マウスとの比較、および絶食マウスとの比較を示す
【図６Ｃ】図 6C は、レプチン受容体発現のない遺伝的に肥満した(db/db)マウスにおける卵黄様黄斑変性2 (VDM2)様タンパク質3 mRNAの野生型(wt)マウスに対する比較のリアルタイムPCR法間接分析を示す
【図６Ｄ】図 6D は、高脂肪(パルミチン酸)食マウスにおけるVDM2様タンパク質3 mRNAの発現の通常食マウスに対する比較を示す
【図６Ｅ】図 6E は、細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中の哺乳動物の線維芽細胞(3T3-L1)細胞におけるVDM様タンパク質3 mRNAの発現を示す
【図７Ａ】図7A は、異なるマウス組織におけるマウス卵黄様黄斑変性タンパク質(VDM2)mRNAの発現を示す
【図７Ｂ】図7B は、異なる実験用マウス、(野生型マウス、wt; 遺伝的に肥満したマウス、ob/ob 絶食マウス)における卵黄様黄斑変性(VDM2)タンパク質mRNAの発現を示す
【図７Ｃ】図7C は、高脂肪(パルミチン酸)食下のマウスにおけるVDM2の発現の通常食マウスに対する比較を示す
【図８】図8 は、マウス卵黄様黄斑変性2様タンパク質1 mRNAの発現プロフィールの作成を示す
【図９】図9 は、異なるヒト組織におけるVMD2のmRNA発現を示す
【図１０】図10 は、異なるヒト組織におけるVMD2様タンパク質3 mRNAの発現を示す
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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