(57)【要約】ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有し、かつ、553位におけるアミノ酸置換によりザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）ピルビン酸デカルボキシラーゼから誘導した、ポリペプチド。【特許請求の範囲】
【請求項１】
553位におけるアミノ酸置換によりザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）ピルビン酸デカルボキシラーゼから誘導される、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
553位のアミノ酸がアラニンまたはアルギニンである、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
ピルビン酸デカルボキシラーゼの存在下、式(I)：
【化１】
2005501555.tif 000004
［式中、Rは、H、F、ClまたはBrである］で表される光学異性体として純粋なフェニルアセチルカルビノールを、アセトアルデヒドまたはピルビン酸および式(II)：
【化２】
2005501555.tif 000005
で表されるベンズアルデヒドから製造する方法であって、該ピルビン酸デカルボキシラーゼが請求項１または２記載のポリペプチドである、前記方法。
【請求項４】
バイオトランスフォーメーション進行中に、反応媒質中のアセトアルデヒドまたはピルビン酸の濃度が20〜50 mMol/lとなるように、アセトアルデヒドまたはピルビン酸を連続的にまたは非連続的に計量供給する、請求項３記載の方法。
【請求項５】
式中RがHであるベンズアルデヒド(II)を使用する、請求項３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ(PDC)存在下での、α-ケトカルボン酸および／またはアルデヒドの酵素的変換によるアシロインの製造方法、ならびに該製造方法に適する新規PDCおよびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アシロイン、すなわち、α-ヒドロキシケトンは、光学的に活性な炭素原子を有し、かつ、より複雑な化合物、例えば、特に、エフェドリン製造のために経済的関心が高い(R)-(-)-フェニルアセチルカルビノール(PAC)の合成において重要な役割を果たす化合物である。R型光学異性体は、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）を使用してベンズアルデヒドの存在下でピルビン酸を発酵的に変換することにより生成され(DE-PS 548 459, 1932年)、この異性体は上記目的のために必要である。
【０００３】
酵母細胞を使用するこのPAC合成法においては、多数の副生成物が酵母中に存在する多くの酵素活性の結果として形成され、細胞の増殖はベンズアルデヒドの存在により抑制される。
【０００４】
酵母から単離された場合であっても、この反応において、ピルビン酸デカルボキシラーゼ(PDC)は、PACの異性体である2-ヒドロキシプロピオフェノンを相当な割合で生成する。
【０００５】
チアミン２リン酸-依存性かつMg++-依存性のPDC (E.C. 4.1.1.1)は広く分布しており、多くの植物、酵母、その他の菌類、およびいくつかの細菌類で見られる。この酵素は、ピルビン酸(pyruvate)のアセトアルデヒドへの非酸化的脱炭酸反応を触媒し、α-ヒドロキシケトンの形成を伴うアシロイン縮合が副反応として起こる。
【０００６】
この特徴を有する酵素反応は、α-ケトカルボン酸の代わりに、出発化合物としてアルデヒドを使用する場合にも起こり、脱炭酸により生成するアルデヒドもホモアシロイン R-CHOH-CO-R’（式中、R = R’である）の生成を伴う縮合反応に「共基質」として関与し得る。
【０００７】
国際公開WO 96/37620には、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）から得られた組換え改変ピルビン酸デカルボキシラーゼを使用した触媒反応による、アセトアルデヒドおよびベンズアルデヒドからのアシロインの製造方法について記載されている。392位のトリプトファン残基が立体的により小さな残基、例えば、アラニン、グリシン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、アルギニン、ヒスチジン、セリンまたはトレオニンによって置換されている酵素が、特に好適なものとして記載されている。しかしながら、アセトアルデヒドはこれら全ての酵素を不活化することが報告されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、本発明の目的は、上記欠点を全く示さないかまたは実質的に上記欠点の減少を示すが、本発明の新規酵素の合成能力を減少させることのない、新規ピルビン酸デカルボキシラーゼを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）PDCと比較した場合に、553位のアミノ酸位置にあるリジンを、類似した空間充填特性および／または荷電特性を示すアミノ酸、特に、リジンもしくはアラニンに置換したものである553位にアミノ酸置換を有するピルビン酸デカルボキシラーゼを使用することによって、上記目的が達成されることを見出した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
これらの新規酵素(PDC)は、当業者に公知の組換え法（例えば、部位特異的突然変異誘発法）を使用して、公知のザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）PDC遺伝子配列から製造することができる。これに関しては、国際公開WO 96/37620の実験の項に、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）由来の変異型PDCの組換え構築、発現および精製について記載されている。なお、本文献は参照により本明細書中に組み入れるものとする。PDCをコードするザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）の核酸配列が、5’− 3’方向で国際公開第WO 96/37620号パンフレット１４ページに示されている。ヌクレオチド番号1〜3の第１コドン(ATG)は翻訳のための開始コドン(メチオニン、アミノ酸位 +1)を構成し、ヌクレオチド番号1705〜1707(TAG)は終止コドンを構成する。ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）PDCのアミノ酸配列は、遺伝子コードにしたがい翻訳することによりこのヌクレオチド配列から得ることができる。
【００１１】
本発明の好ましい実施形態は、553位のリジン(K)がアルギニン(R)と置換されているPDC(R553)に関する。
【００１２】
出発分子(K553)と比較した場合、この酵素はアセトアルデヒドに対して優れた安定性を示す(図１)。すなわち、アセトアルデヒドの存在下(+ACA)で、R553は、K553と比較して活性の実質的な減少が少ない。
【００１３】
この酵素のさらなる利点は、K553と比較した場合に、その合成能力（空間的/時間的収率として測定可能)が流加(fed batch)実験において実質的に高いということである。
【００１４】
本発明の別の主題は、式(I)：
【化１】
2005501555.tif 000002
【００１５】
[式中、Rは、H、F、ClまたはBrである]
で表される光学異性体として純粋なフェニルアセチルカルビノールを、新規ピルビン酸デカルボキシラーゼの存在下、アセトアルデヒドまたはピルビン酸および式(II)：
【化２】
2005501555.tif 000003
【００１６】
で表されるベンズアルデヒドから製造する方法である。
【００１７】
この新規方法の特に好適な実施形態は、バイオトランスフォーメーション中に、アセトアルデヒドまたはピルビン酸の濃度が反応媒質中で20〜50 mMol/lとなるように、アセトアルデヒドまたはピルビン酸を連続的にまたは非連続的に計量供給する方法である。
【００１８】
この方法のさらなる詳細に関しては、国際公開第WO 99/9195号パンフレットを参照することができ、この内容は参照により本明細書中に組み入れるものとする。この新規方法の実施は、使用する触媒(ピルビン酸デカルボキシラーゼ)以外は、国際公開WO 99/9195に記載の方法と実質的に同一である。
【実施例】
【００１９】
実施例１
アセトアルデヒドによるPDCの不活性化
PDC 553Rを、以下の条件下アセトアルデヒドで処理した:
30 mM アセトアルデヒド、
50 mM モルホリノエタンスルホン酸、
20 mM MgCl2、および
20 μg 無細胞粗タンパク質抽出物、
を100 μlのH2O, pH 7.0に溶解させたもの。
【００２０】
酵素により触媒されるアセトイン生成が、アセトアルデヒドの濃度を減少させるのを防ぐために、インキュベーションは４℃にて行った。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、アセトアルデヒド存在下(+ACA)における、出発分子 K553と比較した場合の新規タンパク質 R553の活性の損失を表す。アセトアルデヒドが存在しない場合(-ACA)には、30時間の観察期間にわたり両酵素は同等に安定である。
【図１】
2005501555.tif 000006
【国際公開パンフレット】
2005501555.tif 000007
2005501555.tif 000008
2005501555.tif 000009
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2005501555.tif 000012
2005501555.tif 000013
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005501555.tif 000014
【国際調査報告】
2005501555.tif 000015
2005501555.tif 000016
2005501555.tif 000017
2005501555.tif 000018
2005501555.tif 000019
2005501555.tif 000020