(57)【要約】本発明は、免疫複合体関連疾患（ＩＣＡＤ）を有するかまたは発症させる危険性のある患者を処置するための方法および組成物を提供する。本発明は、クロマチン含有免疫複合体が、二重のレセプター結合プロセスにより自己反応性Ｂ細胞および樹状細胞を活性化し、このプロセスは、両方の細胞型において、Ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）に関連するという知見に基づく。ＩＣＡＤを処置する方法は、１）ＴＬＲの形成および／もしくはＴＬＲへの結合のいずれかを防ぐことにより免疫複合体の形成を阻害するか、または２）ＴＬＲへの自己抗原含有免疫複合体の結合に干渉するか、または３）免疫複合体もしくは非複合体化自己抗原を介する、ＢＣＲおよびＴＬＲ（Ｂ細胞において）もしくはＦｃＲおよびＴＬＲ（樹状細胞において）の二重の結合により開始されるシグナル伝達経路を阻害するかのいずれかの化合物を、それを必要とする個体に投与する工程を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫複合体関連疾患（ＩＣＡＤ）もしくは全身性自己免疫疾患を有するか、またはＩＣＡＤもしくは全身性自己免疫疾患の危険性がある患者を処置する方法であって、該方法は、該免疫複合体または自己抗原の、Ｔｏｌｌ様レセプターへの結合または該Ｔｏｌｌ様レセプターの活性化を阻害する有効量の化合物を、該患者に投与する工程を包含し、ここで、該免疫複合体は、自己抗体および細胞レセプターに結合される自己抗原を含む、方法。
【請求項２】
前記ＩＣＡＤが、全身性エリテマトーデスである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＩＣＡＤが、慢性関節リウマチである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＩＣＡＤが、Ｃ型肝炎関連免疫複合体疾患である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｔｏｌｌ様レセプターが、Ｔｏｌｌ様レセプター９である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｔｏｌｌ様レセプターが、Ｔｏｌｌ様レセプター３である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記化合物が、以下からなる群より選択される、方法：
（ａ）前記免疫複合体の成分に結合し、そしてその形成または前記Ｔｏｌｌ様レセプターへの結合を防ぐ化合物；
（ｂ）Ｔｏｌｌ様レセプターデコイ；
（ｃ）ＭｙＤ８８またはＴＬＲにより開始されるシグナル伝達カスケードの他の成分の活性を阻害する化合物；
（ｄ）免疫複合体成分の産生を阻害する化合物；および
（ｅ）Ｔｏｌｌ様レセプターアンタゴニスト。
【請求項８】
前記化合物が、Ｔｏｌｌ様レセプターに結合する抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体が、単鎖抗体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
Ｔｏｌｌ様レセプター２、Ｔｏｌｌ様レセプター３、およびＴｏｌｌ様レセプター９のうち少なくとも２つの組み合わせに対する結合を阻害する化合物のカクテルが用いられる、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｔｏｌｌ様レセプターアンタゴニストが、阻害性オリゴヌクレオチドである、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｔｏｌｌ様レセプターアンタゴニストが、ドミナントネガティブＴｏｌｌ様レセプターである、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
免疫複合体の形成またはＴｏｌｌ様レセプターへの結合を阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、該方法は、免疫複合体成分を、該スクリーニングされる化合物と接触させる工程、ならびにＢ細胞の活性化および／もしくは増殖ならびに／またはＴｏｌｌ様レセプターへの免疫複合体の抗原性フラグメントの結合を測定する工程を包含し、ここで、該免疫複合体は、自己抗体および自己抗原を含む、方法。
【請求項１４】
免疫複合体の形成またはＴｏｌｌ様レセプターへの結合を阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、該方法は、免疫複合体成分を、該スクリーニングされる化合物と接触させる工程、ならびに樹状細胞の活性化および／またはＴｏｌｌ様レセプターへの免疫複合体の抗原性フラグメントの結合および／または細胞形態を測定する工程を包含し、ここで、該免疫複合体は、自己抗体ならびに自己抗原を含む、方法。
【請求項１５】
免疫複合体関連疾患（ＩＤＡＣ）もしくは全身性自己免疫疾患を有するか、またはＩＣＤＡもしくは全身性自己免疫疾患の危険性のある患者を処置するために、前記免疫複合体または自己抗原の、Ｔｏｌｌ様レセプターへの結合またはＴｏｌｌ様レセプターの活性化を阻害する化合物の使用であって、ここで、該免疫複合体は、自己抗体および細胞レセプターに結合される自己抗原を含む、使用。
【請求項１６】
請求項１５に記載の化合物であって、ここで、前記化合物が、以下からなる群より選択される、化合物：
（ａ）前記免疫複合体の成分を結合し、そしてその形成または前記Ｔｏｌｌ様レセプターへの結合を防ぐ化合物；
（ｂ）Ｔｏｌｌ様レセプターデコイ；
（ｃ）ＭｙＤ８８またはＴＬＲにより開始されるシグナル伝達カスケードのほかの成分の活性を阻害する化合物；
（ｄ）免疫複合体成分の産生を阻害する化合物；および
（ｅ）Ｔｏｌｌ様レセプターアンタゴニスト。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、国立衛生研究所により授与された契約番号Ｒ０１  ＡＲ−３５２３０およびＫ０８  ＤＫ−０２５９７の下で政府支援を用いてなされた。政府は、本発明における特定の権利を有する。
【０００２】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、免疫複合体関連疾患（好ましくは、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ））および異常なＴｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）／Ｂ細胞レセプター（ＢＣＲ）二重結合（Ｂ細胞において）またはＴＬＲ／Ｆｃγレセプター二重結合（樹状細胞および／またはマクロファージにおいて）を有する被験体に関連する他の全身性自己免疫疾患を処置する方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
自己免疫疾患は、非常に一般的であるが、理解が乏しい疾患群であり、この疾患群において、個体の免疫系は、１）自己抗原を外来として認識し始め、そしてそのような抗原を発現する組織を破壊し始め、それにより疾患を引き起こすか、または２）これらの抗原と免疫複合体を形成し、次いでそれが組織に沈着し、そして炎症性病理を引き起こすかのいずれかである。このような自己免疫疾患としては、例えば、糖尿病（ここで、免疫系は、インスリン産生膵島細胞に対し、そしてこれを破壊する）；多発性硬化症（ここで、標的抗原は、運動ニューロンの機能の破壊を導くミエリン鞘保護ニューロンである）；乾癬（ここで、免疫系の標的は、皮膚である）；慢性関節リウマチ（ここで、標的組織は、軟骨である）；および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）（これは、その標的抗原自体は、完全に一致しかつ特徴的であるが、見かけ上特異性も選択性も示すことなく種々の組織を標的化するものとして生じる）が挙げられる。自己免疫疾患の発症を導く機構が、一般的に、ほとんど未知であるので、これらの処置は、しばしば、一般的に免疫系を抑制することに向けられる。このような一般的な免疫抑制治療は、しばしば、種々の所望されない副作用（癌、不妊症、ならびにウイルス、真菌、酵母、および細菌よる感染に対する増加した感受性が挙げられる）を引き起こす。従って、自己免疫疾患の処置のためのより特定の治療の開発を可能にするために、免疫系を自己抗原に対して指向させる機構を理解することが所望される。
【０００４】
理解が乏しい自己免疫疾患の一例は、一般に、狼瘡としてしられている全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である。ＳＬＥは、抗核抗体の産生、循環性免疫複合体の産生、および補体系の活性化を生じる免疫系の調節不全により特徴付けられる。免疫複合体は、組織および関節中で蓄積して、組織および関節の両方に対する炎症および分解を引き起こす。用語「全身性」は、正しくは、この疾患が身体全体およびほとんどの器官の系統に影響することを示すが、この疾患は、大抵、炎症、および結果として生じる関節、皮膚、腎臓、脳、体腔における膜、肺、心臓、および胃腸管に対する損傷を伴う。ＳＬＥを有する個体は、しばしば、予想外の急性発症または「アウトブレーク」および等しく予想外の寛解を経験する。この疾患の病理の顕著な特徴は、皮膚表面の発疹または変化に似た、再発する、広範で、かつ多様な血管病変である。
【０００５】
合衆国におけるＳＬＥの有病率は、いくつかの議論の争点である。有病率の見積もりは、２５０，０００〜２，０００，０００人の範囲である。非常に高年および非常に若年の両方において報告されているが、この疾患は、主に、妊娠可能年齢の女性に発症する。子供において、ＳＬＥは、女性において、男性より３倍一般的である。思春期から３０〜４０歳の間にこの疾患の発症を経験したＳＬＥ患者の６０％において、女性：男性比は、９：１である。その後、この女性優性は、再び、思春期前の子供において観察される女性優性（すなわち、３：１）になる。さらに、この疾患は、アフリカ人起源およびアジア人起源の人において、白色人種起源の人においてよりも３倍一般的である。
【０００６】
ＳＬＥの病因は、未知のままである。遺伝的素因、性ホルモンの全身性増殖、および種々の環境要因（例えば、ウイルス感染）が、この疾患を典型的に表す異常な免疫応答の誘発において役割を果たすことが示唆されている。遺伝の役割が、ＳＬＥの患者における２つの組織適合性抗原（ＨＬＡ−ＤＲ２およびＨＬＡ−ＤＲ３）の増加した％によって示唆されている。さらに、罹患した個体において拡張されたハプロタイプＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ｂ８およびＨＬＡ−ＤＲ３の頻度が増加する。遺伝の役割は、一卵性双生児の中でのこの疾患についての一致によってさらに支持される。しかし、この遺伝的素因の遺伝的特性および環境因子の寄与は、まさに中程度であり、一致率により示唆され、２５％〜６０％の間であると報告されている。
【０００７】
ＳＬＥの正確な発症要因は未知である。しかし、この疾患の臨床的症状発現のほとんどが、自己抗体産生および引き続く病原性免疫複合体の形成により直接的または間接的のいずれかで引き起こされることが一般に受け入れられている。調節不全Ｂリンパ球により産生された、これらの自己抗体は、別個の核自己抗原（なかでも、ＤＮＡ、ヌクレオソーム、およびサブヌクレオソーム）を認識する明確な特異性を有する。特定のＲＮＡ／タンパク質複合体（Ｓｍ抗原および核内低分子リボ核タンパク質（ｓｎＲＮＰ）が挙げられる）は、さらなる特徴的な自己抗原性特異性を有する。病原性免疫複合体は、自己抗体の、それぞれのそれらの核自己抗原への結合により形成される。
【０００８】
ＳＬＥにおける自己抗体は、しばしば、それらのそれぞれの自己抗原に結合された免疫複合体（ＩＣ）として循環する。クロマチンまたはクロマチンフラグメント（例えば、ＤＮＡ、ヌクレオソームまたはサブヌクレオソーム粒子）は、マウスおよびヒトの両方において特に一般的な自己抗原特異性を有する（Ｔａｎ、Ｅ．Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４４４、９３−１５１（１９８９）；ＭｏｎｅｓｔｉｅｒおよびＮｏｖｉｃｋ、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３：８９−９９．、１９９６）。
【０００９】
従って、ＳＬＥの処置における主要な目的は、機能不全Ｂリンパ球を抑制し、それにより自己抗体の産生を減少させる試み、または一旦、免疫複合体が形成された後、それらの病原性を排除する試みのいずれかである。現在、これらの目的は、コルチゾン、アザチオプリン、ヒドロキシクロロキンおよびシクロホスファミドのような薬物を用いる集中的な免疫抑制剤治療の使用によってのみ、しばしば不完全に、達成され得る。これらの治療は、多くの重篤かつ所望されない副作用（感染、不妊症、網膜症、および癌が挙げられる）に関連する。従って、ＳＬＥ、および他の自己免疫疾患についての新規の処置が所望される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
（発明の要旨）
従って、本発明の目的は、自己免疫複合体関連疾患（ＩＣＡＤ）（例えば、ＳＬＥ、慢性関節リウマチ、およびＣ型肝炎関連免疫複合体疾患（例えば、クリオグロブリン血症））を有するか、またはＩＣＡＤを発症する危険性のある被験体における、ＩＣＡＤを処置する方法および組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、クロマチン含有免疫複合体が、二重レセプター結合プロセスにより自己反応性Ｂ細胞および樹状細胞を、活性化することを発見した。両方の細胞型において、Ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）が、関連する。ＴＬＲ９（細胞質コンパートメント内に位置する）は、細胞活性化のために必要とされる必須の第二のレセプターである。Ｂ細胞の場合、その細胞表面上に位置するＢ細胞抗原レセプターは、細胞活性化のために必要とされる必須の第一のレセプターである。樹状細胞の場合、細胞表面上に位置する刺激性Ｆｃγレセプターは、細胞活性化のために必要とされる必須の第二のレセプターである。本発明者らは、１）形成を防ぎそして／もしくはＴｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）への結合することのいずれかによって免疫複合体（すなわち、自己抗体および核自己抗体）の形成を阻害するか、２）自己抗原含有免疫複合体（もしくはその抗原性成分）のＴＬＲへの結合に干渉するか、または３）免疫複合体化自己抗原または非複合体化自己抗原を介してＢＣＲおよびＴＬＲ（Ｂ細胞において）もしくはＦｃＲおよびＴＬＲ（樹状細胞において）の二重結合により開始されるシグナル伝達経路を阻害するかのいずれかの化合物を、それを必要とする個体に投与することによりＩＣＡＤを処置する方法を見出した。この化合物は、薬学的に需要可能なキャリア中で投与される。
【００１２】
好ましくは、ＩＣＡＤはＳＬＥ、慢性関節リウマチまたはＣ型肝炎関連免疫複合体疾患（例えば、クリオグロブリン血症）である。他の実施形態において、ＩＣＡＤは、臓器移植後の宿主における免疫反応に関連する。
【００１３】
理論に束縛されるように作用しないが、本発明者らは、自己抗原（例えば、クロマチン）を含む免疫複合体（ＩＣ）（しかし、外部抗原を含むＩＣではない）が、自己反応性Ｂ細胞を活性化し得、そしてこの活性化は、自己抗原含有ＩＣが、Ｂ細胞におけるＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）または樹状細胞におけるＦｃγＲのいずれかと、第二のレセプター（Ｔｏｌｌ様レセプター）とを連続的に結合する能力に完全に依存すると考える。この知見は、先天免疫系および適応性免疫系間の新規の連結を確立し、そしてそれによりタンパク質／核酸自己抗原に特異的な自己反応性Ｂ細胞または樹状細胞が活性化される一般的な機構を示唆する。
【００１４】
本発明の１つの局面に従い、ＩＣＡＤを有する個体を同定する工程、そして自己抗原または自己抗原／免疫複合体が活性化Ｂ細胞または樹状細胞を形成および／または活性化することを阻害し得る有効量の化合物を投与する工程による、ＩＣＡＤを有するか、またはＩＣＡＤについての危険性のある患者を処置するための方法が提供される。
【００１５】
ＩＣＡＤまたは全身性自己免疫疾患の危険性のある人とは、ＩＣＡＤまたは全身性自己免疫疾患を有する少なくとも親、祖父母、または兄弟を有する個体である。
【００１６】
この化合物は、免疫複合体の成分を結合し、そしてその形成を防ぐかまたは自己抗原がＴｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）を活性化するのを防ぐかのいずれかの化合物からなる群より選択される。このような化合物としては、Ｔｏｌｌ様レセプターデコイ、ＭｙＤ８８の活性を阻害する化合物、免疫複合体成分の産生を阻害する化合物（例えば、アンチセンスヌクレオチド）、ドミナントネガティブＴＬＲ、Ｔｏｌｌ様レセプターアンタゴニスト、およびＴＬＲへの免疫複合体または自己抗原の相互作用または結合により活性化されるシグナル伝達経路を阻害する化合物が挙げられる。好ましくは、この化合物は、Ｔｏｌｌ様レセプターＴＬＲ２、ＴＬＲ３、およびＴＬＲ９またはその機能的ドメインを結合し、そして／またはこれらの機能を阻害する。より好ましくは、このＴＬＲは、ＴＬＲ３もしくはＴＬＲ９またはそれらの機能的フラグメントである。
【００１７】
免疫複合体の成分を結合し、そしてその形成を阻害するかまたはＴｏｌｌ様レセプターへの複合体の結合体を防ぐ化合物、およびＭｙＤ８８シグナル伝達を阻害する化合物としては、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、野生型ＴＬＲ活性をブロックし得るかまたはＴＬＲ媒介シグナル伝達カスケードの成分をブロックし得るドミナントネガティブタンパク質、阻害性オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）（例えば、Ｓ−ＯＤＮ  ２０８８）（Ｌｅｎａｒｔら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．４、２４７−２５６（２００１））、アンチセンスヌクレオチド（ＲＮＡおよび改変ヌクレオチドを含む）、または他の経路特異的キナーゼインヒビターが挙げられる。この化合物は、クロロキン以外の化合物である。
【００１８】
１つの実施形態において、本発明は、免疫複合体の形成またはＴｏｌｌ様レセプターへの結合を阻害し、そして／またはＢ細胞／樹状細胞活性化を阻害する化合物または薬剤をスクリーニングする方法を提供する。これらの方法は、免疫複合体成分と、試験薬剤と接触させる工程、およびＢ細胞または樹状細胞の活性化および／もしくは増殖ならびに／またはＴｏｌｌ様レセプターへのこの複合体の結合を測定する工程を包含する。
【００１９】
他の実施形態において、ＩＣＡＤを診断する方法が提供される。この方法は、ＩＣＡＤを有する疑いのある個体のＩｇＧを含む生物学的サンプルを取り出す工程、この生物学的サンプルを、ＲＦ＋  Ｂ細胞または樹状細胞と共にインキュベートする工程、およびＲＦ＋  Ｂ細胞または樹状細胞の活性化を測定する工程を包含し、ここで、ＩＣＡＤを有する疑いのある個体由来の生物学的サンプルに曝されたＲＦ＋  Ｂ細胞または樹状細胞培養物における活性の、コントロールの個体由来のＩｇＧを含む生物学的サンプルに曝されたＲＦ＋  Ｂ細胞または樹状細胞と比較した変化は、ＩＣＡＤの指標である。好ましくは、この変化は、活性の増加である。Ｂ細胞の活性化が、例えば、同時刺激分子（例えば、ＣＤ８０およびＣＤ８６）の増殖またはアップレギュレーション、ならびにＭＨＣクラスＩＩ分子のアップレギュレーションを測定することにより測定され得る。樹状細胞の活性化は、同時刺激分子の発現、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α）の産生、または樹状細胞表現型の変化を測定することにより評価され得る。
【００２０】
なお別の実施形態において、本発明は、化合物または薬剤のＩＣＡＤの処置におけるその有効性について評価するためのインビボモデル系を提供する。このモデル系は、ＩＣＡＤモデル動物（マウスモデルおよびラットモデルを含む）に試験薬剤を投与する工程、およびこのような動物におけるＢ細胞または樹状細胞の活性化および／もしくは増殖ならびに／またはＴｏｌｌ様レセプターへのこの複合体の結合を測定する工程を包含し、ここで、減少した活性化は、ＩＣＡＤを処置し得る薬剤の指標である。あるいは、実施者は、Ｔｏｌｌ様レセプターを発現する細胞株を用い得、そしてそのようなレセプターを調節、好ましくは阻害またはブロックする化合物をスクリーニングし得る。
【００２１】
本発明の他の局面を、以下に開示する。
【００２２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、免疫複合体関連疾患（ＩＣＡＤ）を有するかまたはＩＣＡＤの危険性のある被験体において、ＩＣＡＤを処置および／または予防するための方法および組成物を提供する。
【００２３】
本発明の目的のために、用語「免疫複合体関連疾患」すなわち「ＩＣＡＤ」としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない疾患をいう：全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および関連する結合組織疾患、慢性関節リウマチ、Ｃ型肝炎およびＢ型肝炎関連免疫複合体疾患（例えば、クリオグロブリン血症）、ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、自己免疫糸球体腎炎（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｄｅｓ）、ならびにＬＤＬ／抗ＬＤＬ免疫複具体の存在と関連する血管症。
【００２４】
本発明者らは、自己抗原（例えば、クロマチン）を含有する免疫複合体（ＩＣ）は、自己反応性Ｂ細胞を活性化し得るが、外来性抗原を含有するＩＣは、自己反応性細胞を活性化し得ないこと、ならびにこの活性化は、自己抗原含有ＩＣが、Ｂ細胞レセプターおよび第２のレセプターであるＴｏｌｌ様レセプターの両方に連続的に結合する能力に依存することを発見した。この知見は、先天性の免疫系および順応性の免疫系と、その結果としての一般機構との間の新規の関係を確立し、この一般機構によってタンパク質／核酸自己抗原に特異的な自己反応性Ｂ細胞が活性化される。
【００２５】
Ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）は、膜結合レセプタータンパク質のファミリーであり、先天性の免疫応答に強く関与し、そして微生物に独特のものであると思われる病原体関連の分子パターンまたは決定因子を認識し、これらの微生物粒子の供給源に対する免疫細胞の活性化に関与する。
【００２６】
レセプターのＴｏｌｌ様ファミリーは、その細胞外ドメイン中にロイシンリッチリピートを有し、かつその細胞質ドメイン中にＴｏｌｌ／ＩＬ−１レセプターホモロジードメインを有する。このＴｏｌｌファミリーは、進化において著しく保存される。発見された第１のメンバーは、ｔｏｌｌ遺伝子の産物であり、この産物は、ショウジョウバエＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒの初期発生における背側−腹側極性の特異化を担う、シグナル伝達経路の一部である。
【００２７】
現在１０個の哺乳動物ホモログが同定されており、ＴＬＲ１〜ＴＬＲ１０と呼ばれている。ＩＬ−１レセプターとＴＬＲとの両方は、類似の下流効果（例えば、免疫応答遺伝子の活性化）を共有し、そしてこれらのレセプター全てが、アダプタータンパク質ＭｙＤ８８を含むシグナル伝達カスケードを介して働く（Ｍｕｓｓｉｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８：１６１２；Ｗｅｓｃｈｅら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７：８３７）。このＭｙＤ８８は、骨髄性分化タンパク質として以前に記載されている（Ｌｏｒｄら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ５：１０９５）。一般的には、異なるＴＬＲは、異なる型の微生物粒子によって活性化されると考えられる（Ｈｅｍｍｉら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：７４０−７４５（２０００）；Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０２：３９−４３（１９９９）；Ａｌｉｐｒａｎｔｉｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１９：３３２５−３３３６（２０００））。しかし、微生物粒子に加えて、哺乳動物ＴＬＲはまた、特定の自己（哺乳動物）抗原（特に、細胞死の結果として細胞から放出される特定の細胞質成分）を認識するという証拠も蓄積されている（Ａｋｉｒａら、Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２：６７５−６８０（２０００））。
【００２８】
用語「Ｔｏｌｌ様レセプター」は、本明細書中において、インタクトなＴｏｌｌ様レセプター（例えば、Ｏｎｌｉｎｅ  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎに以下のアクセスナンバーで記載されているレセプター：＊６０１１９４  ＴＯＬＬ−ＬＩＫＥ  ＲＥＣＥＰＴＯＲ  １、ＴＬＲ１；＊６０３０２８  ＴＯＬＬ−ＬＩＫＥ  ＲＥＣＥＰＴＯＲ  ２、ＴＬＲ２；＊６０３０２９  ＴＯＬＬ−ＬＩＫＥ  ＲＥＣＥＰＴＯＲ  ３、ＴＬＲ３；＊６０３０３０  ＴＯＬＬ−ＬＩＫＥ  ＲＥＣＥＰＴＯＲ  ４、ＴＬＲ４；＊６０３０３１  ＴＯＬＬ−ＬＩＫＥ  ＲＥＣＥＰＴＯＲ  ５、ＴＬＲ５；＊６０５４０３  ＴＯＬＬ−ＬＩＫＥ  ＲＥＣＥＰＴＯＲ  ６、ＴＬＲ６；＊３００３６５  ＴＯＬＬ−ＬＩＫＥ  ＲＥＣＥＰＴＯＲ  ７、ＴＬＲ７；＊３００３６６  ＴＯＬＬ−ＬＩＫＥ  ＲＥＣＥＰＴＯＲ  ８、ＴＬＲ８；＊６０５４７４  ＴＯＬＬ−ＬＩＫＥ  ＲＥＣＥＰＴＯＲ  ９、ＴＬＲ９；および＊６０６２７０  ＴＯＬＬ−ＬＩＫＥ  ＲＥＣＥＰＴＯＲ  １０、ＴＬＲ１０；またはこれらの機能的フラグメント（例えば、Ｔｏｌｌ様レセプターの可溶形態（すなわち、膜結合ドメインが欠失しているかまたは変化されており、いくつかの実施形態において、細胞質ドメインもまた存在しない）あるいはＭｙＤ８８に結合し得るかもしくはＭｙＤ８８と相互作用し得る、Ｔｏｌｌ様レセプターまたはＴｏｌｌ様レセプターのホモログのＭｙＤ８８結合フラグメントまたはＭｙＤ８８相互作用フラグメント）を含むことを意味する。より好ましくは、ＴＬＲは、ＴＬＲ９である。
【００２９】
この点に対する本発明者らの実験は、ＴＬＲ９とクロマチン含有免疫複合体のクロマチン成分との間の相互作用の重要性を同定した。しかし、ＳＬＥおよび関連する疾患において、免疫複合体は、通常、自己抗体ならびにＳｍ抗原および核内低分子リボ核タンパク質（ｓｎＲＮＰ）を含む別個のＲＮＡ／タンパク質抗原複合体によって生じる（Ｔａｎ、Ｅ．Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４，９３−１５１（１９８９））。さらに、免疫複合体関連疾患（例えば、Ｃ型肝炎）において、病原性免疫複合体は、抗体とＲＮＡ含有ウイルスとの間に生じる。ＴＬＲ３は、二本鎖ＲＮＡに特異的なレセプターとして同定されている（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕ、Ｎａｔｕｒｅ．４１３，７３２−７３８（２００１））。したがって、ＴＬＲ３結合が、これらのＲＮＡ含有免疫応答複合体によって惹起される活性化プロセスにおいて重要であることを予測するのは当然である。
【００３０】
好ましくは、ＴＬＲは、ＴＬＲ３もしくはＴＬＲ９、あるいはこれらの機能的フラグメントまたはＴＬＲ３もしくはＴＬＲ９と相同であり、かつＭｙＤ８８に結合し得るかもしくは相互作用し得るフラグメントである。
【００３１】
本発明に従って有用なＴｏｌｌ様レセプターはまた、融合レセプターであり得、ここで、このＴｏｌｌ様レセプターは、Ｍｙｃタグのような別のタンパク質と融合される。好ましいＴｏｌｌ様レセプターとしては、Ｔｏｌｌ様レセプター−２またはＴｏｌｌ／インターロイキン−１レセプター様４（Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、Ｂｌｏｏｄ  ９１：４０２０−４０２７，１９９８）、Ｔｏｌｌ様レセプター−３（Ｒｏｃｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：５８８−５９３，１９９８）、およびＴｏｌｌ様レセプター−９（ＣｈｕａｎｇおよびＵｌｅｖｉｔｃｈ、Ｅｕｒｏｐ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ．１１：３７２−３７８、２０００；Ｄｕら、Ｅｕｒｏｐ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ．１１：３６２−３７１，２０００）またはこれらの機能的フラグメントもしくは（例えば、ＭｙＤ８８に結合するような）類似の機能を有するホモログが挙げられる。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、用語「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「処置（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、以下を含む：（１）これらの疾患に罹りやすいが、これらの疾患を有しているとまだ診断されていない被験体が、このような疾患を発症するのを予防すること；（２）これらの疾患を抑制すること（すなわち、これらの発症をおさえること）；または（３）これらの疾患の症状を回復または軽減させること（すなわち、疾患状態の後退を引き起こすこと）。
【００３３】
これらの化合物は、好ましくは、以下で議論されるインビトロアッセイまたはインビボアッセイにおいて、Ｂ細胞（ＢＣ）または樹状細胞（ＤＣ）の活性化を少なくとも約５０％阻害する。より好ましくは、これらの化合物は、Ｔｏｌｌ様レセプターを介して、７５％、最も好ましくは９５％、ＢＣまたはＤＣの自己抗原性活性化を阻害する。さらなる化合物が同定され、以下により詳細に議論されるスクリーニングアッセイにおいて試験される。
【００３４】
本発明に従う有用な化合物は、免疫複合体の成分またはＴｏｌｌ様レセプターに結合する化合物からなる群から選択される。これらの化合物は、免疫複合体の形成を防ぐか、あるいは、免疫複合体の自己抗原もしくは自己抗原性フラグメントがＴｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）を活性化するのを防ぐか、または下流分子がＴｏｌｌ様レセプターからの（ＭｙＤ８８を通して媒介されるような）シグナルを伝達するのを防ぐかのいずれかである。このような化合物としては、Ｔｏｌｌ様レセプターデコイ、ＭｙＤ８８の活性を阻害する化合物、免疫複合体成分（例えば、アンチセンスセンスヌクレオチド）の生成を阻害する化合物、ドミナントネガティブＴＬＲ、Ｔｏｌｌ様レセプターアンタゴニストもしくはＴｏｌｌ様レセプターブロッカー（例えば、ＯＤＮ２０８８またはＴＬＲに対する抗体）、およびＴＬＲに対する免疫複合体の抗原性フラグメントの相互作用もしくは結合によって活性化されるシグナル伝達経路を阻害する化合物が挙げられる。好ましくは、この化合物は、Ｔｏｌｌ様レセプターであるＴＬＲ２、ＴＬＲ３、およびＴＬＲ９またはこれらの機能的ドメインに結合するかならびに／あるいはＴｏｌｌ様レセプターであるＴＬＲ２、ＴＬＲ３、およびＴＬＲ９またはこれらの機能的ドメインの機能を阻害する。より好ましくは、ＴＬＲは、ＴＬＲ３もしくはＴＬ９またはこれらの機能的フラグメントである。
【００３５】
本発明は、免疫複合体（またはこれらの抗原性成分）のＴＬＲ（好ましくは、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ９またはこれらの任意の組み合わせであり、最も好ましくは、ＴＬＲ３またはＴＬＲ９）への結合を阻害する薬剤について薬物またはリード化合物を同定するための効率的なスクリーニング法をさらに提供する。これらの方法は、自動化され、費用効率的なハイスループット薬物スクリーニングになじみ、かつ広範な薬物開発プログラムにおける直接の用途を有する。
【００３６】
一般的には、これらのスクリーニング方法は、例えば、ＴＬＲ（好ましくは、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ９またはこれらの任意の組み合わせであり、最も好ましくは、ＴＬＲ３またはＴＬＲ９）との自己抗原相互作用を調節する化合物についてのアッセイを含む。さらに、より好ましくは、これらの化合物は、ＴＬＲ９との相互作用を調節する。結合剤についての広範な種々のアッセイが提供され、これらには、インビトロ標識化タンパク質−タンパク質結合アッセイ、免疫アッセイ、細胞ベースのアッセイなどが含まれる。
【００３７】
インビトロ結合アッセイは、ＴＬＲポリペプチド（好ましくは、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ９またはこれらの任意の組み合わせであり、最も好ましくは、ＴＬＲ３またはＴＬＲ９、さらにより好ましくは、別のペプチドまたはポリペプチド（例えば、検出または固着のためのタグなど）との融合産物の一部であり得るＴＬＲ９）を含む成分の混合物を使用する。このアッセイ混合物はまた、天然の細胞内ＴＬＲ結合標的（例えば、ＭｙＤ８８）を含み得る。ネイティブな全長結合標的が使用され得るが、アッセイにおいて都合よく測定可能な対象のＭｙＤ８８ポリペプチドに対する結合親和性および結合活性を提供する部分ほどの長さの部分（例えば、ペプチド）を使用することが頻繁に好まれる。このアッセイ混合物はまた、候補薬物を含む。候補薬剤は、多くの化学物質のクラスを包含するが、典型的には、有機化合物であり；好ましくは、小さい有機化合物であって、合成化合物もしくは天然の化合物のライブラリーを含む広範な種々の供給源から得られる。種々の他の試薬もまた、混合物中に含まれ得る。塩、緩衝剤、中性タンパク質（例えば、アルブミン）、界面活性剤、プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗菌剤などを含む試薬が、使用され得る。
【００３８】
得られた混合物は、候補薬理学的因子の存在について、ＴＬＲポリペプチドが、参照結合親和性で、細胞結合標的、部分またはアナログに特異的に結合するような条件下で、インキュベートされる。この混合物の成分は、必要な結合を提供する任意の順序で添加され得、そしてインキュベーションは、最適な結合を促進する任意の温度で実施され得る。インキュベーション時間は、同様に、結合を最適化するために選択されるが、また迅速な高スループットを促進するために最小化される。
【００３９】
インキュベーション後、ＴＬＲポリペプチドと１以上の結合標的との間の、この因子により偏向された結合は、任意の従来方法によって検出される。この因子の存在下での結合親和性と比較した、この因子の非存在下での、ＴＬＲポリペプチドの標的に対する結合親和性の差異は、この因子が、ＴＬＲ結合標的に対するＴＬＲポリペプチドの結合を調節することを示す。同様に、以下にまた記載される細胞ベースのアッセイにおいて、因子の存在下および非存在下でのＴＬＲ依存的転写活性化は、この因子が、ＴＬＲ機能（例えば、ＭｙＤ８８に対する結合）を調節することを示す。本明細書中で使用される場合、差異とは、統計的に有意であり、かつ好ましくは、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％、なおより好ましくは少なくとも９０％の差異を示す。
【００４０】
Ｂ細胞または樹状細胞の活性化を妨害する能力について、薬学的因子を試験するために好ましいアッセイは、適切な細胞培養培地中で、試験因子およびＴＬＲ刺激因子（例えば、ＰＲ１−３、ＰＲ２−３またはＣｐＧ  Ｓ−ＯＤＮ  １８２６（例えば、Ｌｅａｄｂｅｔｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、４１６：６０３−６０７、２００２を参照のこと））と共にインキュベートされるＲＦ＋Ｂ細胞または樹状細胞を含む。試験因子とのインキュベーションは、刺激因子の添加の前または添加と同時に実施され得る。
【００４１】
Ｂ細胞の活性化は、当業者に周知の多数の技術を使用して、観察され得る。例えば、３［Ｈ］チミジン取り込みアッセイは、Ｂ細胞の増殖を測定するために実施され得る。あるいは、Ｂ細胞の活性化は、例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６またはＭＨＣクラスＩＩ分子の細胞表面発現を測定するために、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）を使用して分析され得る。樹状細胞の活性化は、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α、インターフェロン−α、ＩＬ−１２およびＢＡＦＦ）または同時刺激分子（例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６またはＭＨＣクラスＩＩ分子）の産生を測定することによって、観察され得る（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：７６７−８１１、２０００；ＭａｃｋａｙおよびＢｒｏｗｉｎｇ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：４６５−４７５）。
【００４２】
あるいは、樹状細胞活性化は、ＤＣにおける形態学的変化を測定することによって観察され得る（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：７６７−８１１、２０００）。
【００４３】
試験因子の添加後に、例えば同時刺激分子の発現の刺激が減少する場合、この試験因子は、ＩＣＡＤを処置するための強力な因子とみなされる。発現は、試験因子が添加されていない細胞サンプルと比較して、少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約６０〜７５％、最も好ましくは少なくとも約９０％減少した場合に、減少したとみなされる。より詳細な例は、この節の最後の実施例において与えられる。
【００４４】
本発明の好ましいアッセイ混合物は、実施例において示される。本発明のアッセイ混合物はまた、候補薬理学的因子を含む。一般に、複数のアッセイ混合物が、種々の濃度に対する差示的応答を得るために、異なる候補因子濃度で並行して実施される。代表的には、これらのアッセイ混合物の１つは、ネガティブコントロール（すなわち、ゼロ濃度またはアッセイ検出の限界未満）として働く。候補因子は、多数の化学物質のクラスを包含するが、これらは、代表的には、有機化合物であり、そして好ましくは小さい有機化合物である。小さい有機化合物は、適切には、例えば、約５０より大きいが約２，５００未満の分子量を有し得る。候補因子は、タンパク質および／またはＤＮＡと相互作用する機能的化学基を含み得る。
【００４５】
候補因子は、合成化合物または天然化合物のライブラリーを含む、広範な種々の供給源から得られる。例えば、多数の手段が、広範な種々の有機化合物および生体分子（ランダム化オリゴヌクレオチドおよびペプチドの発現を含む）のランダム且つ直接的な合成のために利用可能である。あるいは、細菌、真菌、植物および動物の抽出物の形態での天然化合物のライブラリーが利用可能であるか、または容易に生成される。ライブラリーは、小さいポリペプチドから構成され得る（例えば、Ｌａｍら、Ｎａｔｕｒｅ、３５４：８２、１９９１およびＷＯ  ９２／０００９１；Ｇｅｙｓｅｎら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ、１０２：２５９、１９８７：Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５４：８４、１９９１およびＷＯ  ９２／０９３００、ならびにＬｅｂｌら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｐｒｏｔ  Ｒｅｓ、４１、２０１、１９９３を参照のこと）。あるいは、小さい非ペプチド分子のライブラリーは、一般的なテンプレートまたはコア構造に基づき得る（例えば、ベンゾジアゼピンテンプレートについては、ＥｌｌｍａｎおよびＢｕｎｉｎ、Ｊ  Ａｍｅｒ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ、１１４：１０９９７、１９９２を；オキサゾールおよびアミジンテンプレートについては、ＷＯ  ９５／３２１８４を；ジヒドロベンゾピランテンプレートについてはＷＯ  ９５／３０６４２を；そしてピロリジンテンプレートについては、ＷＯ  ９５／３５２７８を参照のこと）。
【００４６】
さらに、天然および合成的に生成されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的手段、物理的手段および生化学的手段によって、容易に改変される。さらに、既知の薬理学的因子は、指向的化学改変またはランダム化学改変（例えば、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化など）に供され得る。
【００４７】
免疫複合体の成分を結合し、そして形成またはＴＬＲ結合を防止する、抗体およびその結合フラグメントまたはアプタマー（例えば、ＳｏｍａＬｏｇｉｃ  Ｉｎｃ．、Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯから入手可能）もまた、有用である。本発明に従って有用な抗体の例としては、ＴＬＲに対するモノクローナル抗体（例えば、抗ＴＬＲ３モノクローナル抗体（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２９３：１３６４−１３６９、２００２）、抗ＴＬＲ−９（Ｔｏｌｌ様レセプター９、Ｉｍｇｅｎｅｘ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、またはこれらのヒト化バージョンが挙げられる。
【００４８】
用語、ドミナントネガティブなＴｏｌｌ様レセプターは、本明細書中で使用する場合、欠損（例えば、下流のシグナル伝達に必要なドメインの欠失）を有するが、免疫複合体の抗原性部分を結合し得るように操作された、Ｔｏｌｌ様レセプターをいう。
【００４９】
抗体およびその結合フラグメントは、ポリクローナルまたはモノクローナルのいずれかであり得るが、好ましくはモノクローナルである。ポリクローナルの場合、これらの抗体は、抗血清または単一特異的抗体の形態（例えば、精製タンパク質によって動物を免疫することによって生成された、精製抗血清）であり得る。しかし、好ましくは、これらの抗体は、個体への外来性タンパク質の投与を最小化するために、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、周知のプロトコルに従って調製され得る。例えば、Ｓｋａｒｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１６３０２−１６３０８（１９９３）；ならびに米国特許第４，９１８，１６３号および同第５，０５７，５９８号（これらは、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。抗体は、全体、Ｆａｂ、単鎖、単一ドメイン重鎖などであり得る。単鎖抗体が好ましい。単鎖結合ポリペプチドの産生のための方法は、例えば、米国特許第４，９４６，７７８号（これは、本明細書中で参考として援用される）において詳細に記載される。
【００５０】
抗体または他のタンパク質もしくはペプチドが使用される場合、このペプチドは、好ましくは、キャリア（例えば、ビオチンまたはポリ（アルキレンオキシド）（ｐｏｌｙ（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｏｘｉｄｅ）（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））に結合体化される。ポリマー性物質（例えば、デキストラン、ポリビニルピロリドン、ポリサッカリド、デンプン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミドまたは他の類似のポリマー）が使用され得る。ポリ（アルキレンオキシド）（ｐｏｌｙ（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｏｘｉｄｅ）としては、モノメトキシポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコールのブロックコポリマーなどが挙げられ得る。ポリ（アルキレンオキシド）としては、ポリエチレングリコールが好ましい。これらのポリマーはまた、モノメトキシ基の代わりに、Ｃ１〜４アルキルで、遠位でキャップされ得る。
【００５１】
例えば、インビボ処置のための組成物の成分としての、ヒトへの投与のために、これらのモノクローナル抗体は、好ましくは、免疫原性を最小化するために実質的にヒト抗体であるかまたはヒト化抗体であり、そして実質的に純粋な形態である。「実質的にヒト」は、この組成物の免疫グロブリン部分が、一般に、少なくとも約７０％のヒト抗体配列、好ましくは少なくとも約８０％ヒト抗体配列、そして最も好ましくは少なくとも約９０〜９５％またはそれ以上のヒト抗体配列を含む。
【００５２】
治療適用について、これらの化合物は、単独でかまたは薬学的組成物の一部として、被験体（例えば、哺乳動物（特にヒト））に適切に投与され得、この組成物は、この化合物を、１種以上の薬学的に受容可能なキャリアと共に、そして必要に応じて他の治療成分と共に含む。キャリアは、処方物中の他の成分と適合性であり、そしてそのレシピエントに対して有害ではないという意味で、「受容可能」でなければならない。
【００５３】
本発明の薬学的組成物としては、経口投与、直腸投与、鼻腔投与、局所投与（頬および舌下を含む）、膣投与、非経口投与（皮下、筋内、静脈内および皮内を含む）、点眼薬を使用する眼投与、エアロゾル化（ａｅｒｏｓｏｌｕｂｉｌｉｚｅ）または噴霧された薬物を使用する経肺投与に適切な組成物が挙げられる。この処方物は、簡便には、単位投薬形態（例えば、錠剤および徐放性カプセル）で、およびリポソーム中に提示され得、そして薬学の分野で周知の任意の方法によって調製され得る（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ｂｙ  Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（編）第２０版、２０００年１２月１５日、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ；ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２を参照のこと）。
【００５４】
このような調製方法は、投与されるべき分子を、１つ以上の補助成分を構成する成分（例えば、キャリア）と会合させる工程を包含する。一般に、これらの組成物は、活性成分を、液体キャリア、リポソームまたは微細に分割された固体キャリア、あるいはこれら両方と、均一かつ完全に会合させ、次いで必要に応じて、製品を成形することによって、調製される。
【００５５】
経口投与に適切な本発明の組成物は、別個の単位（例えば、カプセル、カシェ剤もしくは錠剤（各々、所定量の活性成分を含む））として；粉末もしくは顆粒として；水性液体もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液として；または水中油液体エマルジョンもしくは油中水液体エマルジョンとして；あるいはリポソーム中にパッケージングされて、そしてボーラスなどとして、提示され得る。
【００５６】
錠剤は、必要に応じて１種以上の補助成分と共に、圧縮または成形によって、作製され得る。圧縮錠剤は、必要に応じて結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤、防腐剤、界面活性剤または分散剤と混合された、自由流動形態（例えば、粉末または顆粒）の活性成分を、適切な機器において圧縮することによって調製され得る。成形された錠剤は、不活性液体希釈剤で加湿された粉末化合物の混合物を、適切な機器において成形することによって、作製され得る。これらの錠剤は、必要に応じて、コーティングされ得るかまたは刻み目を入れられ得、そしてこの錠剤中の活性成分の緩徐放出または制御放出を提供するように、処方され得る。
【００５７】
局所投与に適切な組成物としては、風味付けされた基剤（通常、スクロースおよびアカシアまたはトラガカント）中に活性成分を含むロゼンジ；および不活性基剤（例えば、ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシア）中に活性成分を含む香錠が挙げられる。
【００５８】
非経口投与に適切な組成物としては、この処方物を、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および意図されたレシピエントの血液と等張にする溶質を含み得る、水性および非水性の滅菌注射溶液；ならびに懸濁剤および増粘剤を含み得る、水性および非水性の滅菌注射溶液、が挙げられる。この処方物は、一回用量容器または複数回用量容器（例えば、密封アンプルおよび密封バイアル）で提示され得、そして滅菌液体キャリア（例えば、注射用の水）を使用直前に添加することのみを必要とする凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ  ｄｒｙ（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅ））条件にて、保存され得る。即席注射溶液および懸濁液は、滅菌の粉末、顆粒および錠剤から調製され得る。
【００５９】
所定の治療において使用される所定の化合物の実際の好ましい量は、利用される特定の化合物、処方された特定の組成物、適用様式、特定の投与部位、患者の体重、一般的健康、性別など、処置される特定の適応症など、および所属の医師または獣医師を含む当業者によって認識される他のこのような因子に従って変動する。所定の投与プロトコルについての最適な投与速度は、従来の投薬量決定試験を使用して、当業者によって容易に決定され得る。
【００６０】
本発明はまた、個体においてＩＣＡＤを診断するための方法を提供する。この方法は、自己抗原および自己抗体からなる免疫複合体を含む生物学的サンプルによって誘導される、Ｂ細胞または樹状細胞のＴｏｌｌ様レセプター媒介性活性化を測定する工程を包含する。Ｂ細胞におけるＴｏｌｌ様レセプターの活性化は、例えば、Ｂ細胞の増殖、種々の同時刺激分子（例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６）の発現、またはＭＨＣクラスＩＩ分子のアップレギュレーションを測定することによって、間接的に測定され得る。樹状細胞におけるＴｏｌｌ様レセプターの活性化は、ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルをアッセイすることを含む、多数の異なる技術を使用して、特異的染色を有するかもしくは有さないかのいずれかである樹状細胞の形態学的変化を観察することによってか、または同時刺激分子（例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６）の発現を測定することによってか、または活性化マーカー（例えば、ＣＤ６９）のアップレギュレーションを測定することによってか、またはケモカインレセプター（例えば、ＣＣＲ７）のアップレギュレーションを測定することによってか、またはサイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α）の産生を測定することによって、測定され得る。
【００６１】
例えば、ＴＮＦ−αの発現の変化は、樹状細胞から単離されたＲＮＡを使用して測定され得る。ＲＮＡ定量法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースの方法（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）定量的ＰＣＲ（Ｒｅｓｇｅｎ，Ｉｎｃ．））が挙げられる。ＲＮＡは、ＩＣＡＤを有する疑いのある個体から採取された生物学的サンプル（例えば、血液サンプル）から単離される。Ｔｏｌｌ様レセプターｍＲＮＡの量は、例えば、上記の技術を使用して定量され、そしてコントロール個体由来のサンプルと比較される。
【００６２】
好ましくは、アッセイ（例えば、ＦＡＣＳ分析）は、同時刺激分子のタンパク質発現を測定するために使用される。これらの同時刺激分子の発現が増加する場合、このことは、その個体がＩＣＡＤに罹患していることを示す。コントロールサンプルと比較して、このアッセイが同時刺激分子の量の少なくとも約５％の増大を示す場合に、この活性は増大したとみなされる。
【００６３】
あるいは、ＩＣＡＤを有する疑いのある試験個体由来の血清は、機能的なＴｏｌｌ様レセプター経路を発現する細胞培養物に注入され得る。Ｔｏｌｌ様レセプターの活性は、結果として、コントロール被験体血清および試験被験体血清で並行して処理された細胞培養物から測定される。Ｔｏｌｌ様レセプターの活性が、試験個体の血清で処理された細胞において、コントロール血清で処理された細胞と比較して増大する場合、このことは、その個体が、ＩＣＡＤに罹患していることを示す。発現は、コントロールサンプルと比較して、少なくとも約５％高い場合に、増大したとみなされる。
【００６４】
本発明を、その好ましい特定の実施形態と組み合わせて記載してきたが、前述の説明および以下の実施例は、例示を意図し、そして本発明の範囲を限定しないことが、理解されるべきである。本発明の範囲内の他の局面、利点および改変は、本発明が関する分野の当業者に明らかである。
【実施例】
【００６５】
（実施例１）
自己反応性Ｂ細胞は、健常な個体のリンパ組織中に存在するが、代表的には、静止状態である。この恒常性が乱される場合、自己反応性抗体の形成は、重篤な病理学的結果を有し得る。自己ＩｇＧに特異的な抗原レセプターを発現するＢ細胞は、リウマチ因子（ＲＦ）として公知の自己抗体のクラスを生成する。ここで、本発明者らは、ＲＦ＋Ｂ細胞の効果的な活性化が、ＩｇＧ２ａ／クロマチン免疫複合体によって媒介され、そして抗原レセプターおよびＭｙＤ８８依存性Ｔｏｌｌ様レセプターファミリーメンバーの連続的結合を必要とすることを示す。これらのデータは、全身性自己免疫疾患の発症における生得的免疫系と順応性免疫系との間の重要な関連性を確立し、そして核酸／タンパク質粒子と反応性の自己抗体の優勢を説明する。この二重結合経路の独自の特徴は、自己反応性Ｂ細胞を特異的に標的化する治療剤の開発を容易にするはずである。
【００６６】
本発明者らは、ここで、自己免疫疾患における自己反応性Ｂ細胞および樹状細胞の活性化に関与する因子を分析するための、モデルインビトロ系を開発した。狼瘡傾向のｌｐｒマウスにおける優勢な自己抗体特異性の１つは、リウマチ因子（ＲＦ）である。ＲＦは、自己ＩｇＧと反応性の抗体である。ＲＦ  Ｂ細胞は、自己免疫のマウス株において活性化され、数が増え、そして抗体分泌細胞へと分化するが、非自己免疫バックグラウンドでは、これらは起こらない。この病理学的活性化に関与する機構を調査するために、本発明者らは、特定のＲＦに、ほとんどのＢ細胞に対する特異性を付与する一対の導入遺伝子を発現するように遺伝子操作されたマウスの脾臓由来の初代ＲＦ＋Ｂ細胞を研究した。これらのＢ細胞は、ＳＬＥ患者において見出される自己反応性Ｂ細胞の原型である。
【００６７】
最初に、本発明者らは、これらのＲＦ＋Ｂ細胞が、自己免疫マウス由来の血清サンプルによって活性化されたが、非自己免疫マウス由来の血清によっては、活性化されなかったことを実証した（Ｒｉｆｋｉｎら、２０００）。本発明者らは、血清中の刺激因子が、実際にＩｇＧ２ａであることをさらに証明した。しかし、非自己免疫血清から単離されたかなりの量のＩｇＧ２ａは、刺激性ではなく、このことは、ＩｇＧ２ａの全てがＲＦ＋Ｂ細胞を刺激するのに、充分なわけではなかったことを示す。従って、本発明者らは、自己免疫血清中のＩｇＧ２ａが、独自の特性を有すると結論付けた。優勢なＩｇＧ２ａ成分をさらに同定するために、本発明者らは、ＩｇＧ２ａモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を使用して、自己抗原（例えば、ＤＮＡ−ヒストン複合体）に特異的なｍＡｂは刺激性であったが、一方で、外来または非自己の抗原に特異的な抗体は、刺激性でなかったことを示した。
【００６８】
本発明者らは、次に、自己抗体／自己抗原免疫複合体が、優勢な成分であるという可能性を考慮した。血清およびｍＡｂを用いたアッセイをＤＮＡｓｅの存在下で実施した場合、ＲＦ＋Ｂ細胞の刺激は、劇的に減少した（図１）。これらのデータは、ＤＮＡ骨格の切断が、自己抗体／自己抗原（ＤＮＡ）免疫複合体の解離を生じることを示唆した。このことは、自己抗体／自己抗原免疫複合体が、自己反応性Ｂ細胞を優先的に活性化する独自の特性を有することを強力に示す。非自己抗原を含む免疫複合体が、自己反応性Ｂ細胞を活性化できないことは、図２に示される。
【００６９】
本発明者らは、自己抗体／自己抗原免疫複合体が、第二のレセプター（これは次いで、ＲＦ  Ｂ細胞の活性化を促進する）と結合し得るという可能性を調査した。最近の研究により、Ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）として公知のタンパク質ファミリーが、細菌ＤＮＡに結合し得、そしてマクロファージ、樹状細胞およびＢ細胞の活性化を導き得ることが示されたので、本発明者らは、ＴＬＲが、これらの自己反応性ＲＦ  Ｂ細胞の活性化において役割を果たし得るという可能性を考慮した。ＴＬＲは、最近非常にポピュラーな研究領域であり、そして多くの病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰＳ）の結合および認識を担うことが示されており、従って、生得的免疫応答とのこの関連は、自己免疫についての非常に独自の関連である。全ての既知の哺乳動物ＴＬＲは、アプタマータンパク質を介して、ＭｙＤ８８へとシグナル伝達する。ＭｙＤ８８遺伝子が遺伝子操作によって排除されたマウスにおけるＴＬＲ媒介性の活性化は、非常に損なわれ、そしてＴＬＲ９を介したシグナルは、完全に破壊される。本発明者らは、本発明者らのＲＦ＋マウスを、ＭｙＤ８８−／−バックグラウンドで繁殖させた。得られたマウスは、ＲＦ導入遺伝子について陽性であり（図４Ａ）、そしてＭｙＤ８８シグナル伝達分子を欠いた（図４Ｂ）。
【００７０】
本発明者らは、ＲＦ  ＭｙＤ８８−／−マウスが、そうでなければＲＦ  ＭｙＤ８８＋／＋のＢ細胞の増殖を刺激する自己抗体のいずれに対しても応答できなかったことを見出した（図４Ｃ）。本発明者らは、複数の形態の自己抗体（血清、抗ヌクレオソーム抗体および抗Ｓｍ抗体）を試験した。これは、自己抗体／自己抗原免疫複合体が、反復パターンの成分（例えば、Ｂ細胞の内側（ＤＮＡ／ＴＬＲ９）またはＢ細胞の表面上（ＲＮＡ／ＴＬＲ３）のいずれかでＴｏｌｌレセプターと結合する、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含むという仮定と一致する。自己反応性ＲＦ＋Ｂ細胞の場合、この自己抗体／自己抗原免疫複合体は、おそらく、ＢＣＲおよびＴＬＲと連続的に結合して、活性化および増殖の増加を導く。これは、ＢＣＲおよびＴＬＲの同時結合が、自己反応性Ｂ細胞の活性化を生じ得ることの最初の実証である。この関連は、自己免疫と身体の生得的免疫応答との間の非常に独自の関連を提供し、そして自己免疫疾患（例えば、ＳＬＥおよび慢性関節リウマチ）における病原性応答の多くについての出発機構を提供し得る。
【００７１】
引き続く研究は、ＴＬＲ９を介する刺激性ＣｐＧ  ＯＤＮによるＢ細胞活性化をブロックすることが知られている薬物（例えば、クロロキンおよびコンカナマイシン（ｃｏｎｃａｎａｍｙｃｉｎ）Ａ）が、ＩＣを含有するクロマチンがＲＦ＋Ｂ細胞を刺激する能力を完全にブロックすることを示した。その応答もまた、ＴＬＲ９によって活性化を特異的に阻害する阻害性ＣｐＧ  ＯＤＮによってブロックされ得る。これらのデータは、ＴＬＲ９が、自己反応性Ｂ細胞の活性化における重要なレセプターであることを示している。このデータは、免疫複合体のＩｇＧ成分が、ＢＣＲ（これは、免疫複合体の内在化および内部小胞コンパートメントへの送達を引き起こす）に結合することを示している。この内部コンパートメント内のＩＣのクロマチン成分による、引く続くＴＬＲ９の結合（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）は、Ｂ細胞の活性化を引き起こす。増強した有効性、従って、クロマチンそれ自体の取り込みに寄与する因子（ＳＬＥに対する感受性因子）もまた、類似の機構を介して、Ｂ細胞活性化を引き起こし得る。抗クロマチン抗体は、ＳＬＥ患者および自発的ＳＬＥの動物モデルの血清中に存在する第一の検出可能な抗体であることが、記される。
【００７２】
（実施例２）
ＳＬＥおよび他の全身性自己免疫疾患に罹患した患者は、広範な自己抗体特性を生じる。これらの自己抗体は、かなり頻繁に、クロマチンまたは他の亜細胞核酸／タンパク質粒子に結合する（Ｔａｎ，Ｅ．Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４，９３−１５１（１９８９））。ＭＲＬ／ｌｐｒマウス（全身性エリテマトーデスおよび慢性関節リウマチについて十分に研究されたマウスモデル）もまた、高い力価のＩｇＧ抗ＩｇＧリウマチ因子（ＲＦ）を過度に生じる（Ｔｈｅｏｆｉｌｏｐｏｕｌｏｓら、Ｊ  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６２，１−１８（１９８５）；Ｗｏｌｆｏｗｉｃｚら、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ．４６，３８２−３９５（１９８８））。そのＲＦ応答は、自己抗体調節の研究に非常に適切なトランスジェニックモデルを提供する。ＡＭ１４トランスジェニックマウス株由来のＢ細胞は、ＩｇＧ２ａａ／ｊに特異的な抗原レセプターを発現し、これは本来、病変したＭＲＬ／ｌｐｒマウスの脾臓由来のハイブリドーマ産物として捕捉される（Ｓｈｌｏｍｃｈｉｋら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５，１３２９−１３４１（１９９３））。単量体ＩｇＧ２ａに対するＡＭ１４アロタイプの特異性および相対的に低い親和性は、ＲＦレパートリーに関連した疾患の典型である（Ｊａｃｏｂｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２，４４８９−９９（１９９４））。野生型マウスにおいて、ＡＭ１４  ＲＦ＋Ｂ細胞は、正常に発達し、そして機能的に未処置のままである（Ｈａｎｎｕｍら、Ｊ：Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４，１２６９−１２７８（１９９６））。しかし、同族アロタイプの自己免疫傾向性ｌｐｒバックグラウンドにおいて、これらは活性になり、増殖し、そして自己抗体を分泌する（ＷａｎｇおよびＳｈｌｏｍｃｈｉｋ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０，６３９−６４９（１９９９））。多数の因子が、ｌｐｒマウスのＡＭ１４  Ｂ細胞の活性化に寄与するようであるが、これらの因子のほとんどが、自己抗原（ＩｇＧ２ａ）の状態ではない。
【００７３】
（ＲＦ＋Ｂ細胞は、自己抗体／自己抗原免疫複合体によって活性化される）
本発明者らは、ＡＭ１４  ＲＦ＋Ｂ細胞が、自己免疫マウスの血清から単離されるＩｇＧ２ａａ／ｊによってインビトロで活性化され得るが、野生型マウスから得られる血清中に存在する匹敵したレベルのＩｇＧ２ａによって活性化されないことを以前に示した（Ｒｉｆｋｉｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５，１６２６−１６３３（２０００））。ＲＦ＋Ｂ細胞はまた、ヌクレオソームに特異的なアフィニティー精製されたＩｇＧ２ａｊ  ｍＡｂ（自己抗原）に応答して激しく増殖するが、ヘプタンまたは他の外来性抗原に特異的なＩｇＧ２ａａ／ｊ  ｍＡｂは、たとえあったとしてもほとんど応答しないことが見出された（Ｒｉｆｋｉｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５，１６２６−１６３３（２０００））。これらの研究は、ＩｇＧ２ａヌクレオソーム特異的ｍＡｂと共培養細胞から放出されるクロマチンフラグメントとの間に形成される免疫複合体（ＩＣ）（Ｅｍｌｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，３０４２−３０４８（１９９２））は、有効な活性化ＲＦ＋Ｂ細胞であり得るが、単量体抗ハプテンＩｇＧ２ａ抗体は、有効な活性化ＲＦ＋Ｂ細胞であり得ないことを示唆した。この前提をさらに試験するために、ＤＮａｓｅを、推定ＩＣを分裂させる手段によって、アッセイ媒体に加えた。精製された抗ヌクレオソームｍＡｂ  ＰＬ２−３によってか（ＭｏｎｅｓｔｉｅｒおよびＮｏｖｉｃｋ  Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３，８９−９９（１９９６））または自己免疫血清によって通常誘発される強い増殖性応答は、劇的に減少した（図１）。ＤＮａｓｅの非特異的毒性は、Ｆ（ａｂ’）２抗ＩｇＭに対する応答のような因子ではなく、ＬＰＳは影響を受けなかった（図１）。これらのデータは、ＲＦ＋Ｂ細胞が、ＤＮＡを含むＩｇＧ２ａ  ＩＣに応答し、単量体ＩｇＧ２ａ抗体単独には応答しないことを確証する。
【００７４】
単にＩｇＧ２ａ  ＩＣによるＲＦ＋Ｂ細胞の活性化が、単量体ＩｇＧ２ａを用いて可能であるよりも、より効果的な抗原レセプターの架橋を生じる場合、従来の抗ハプテン／ハプテン−タンパク質複合体はまた、ＲＦ＋Ｂ細胞を強く刺激するはずである。この論点に取り組むために、ＴＮＰ−ＢＳＡの濃度を変化させながら、ＩｇＧ２ａモノクローナル抗ＴＮＰ抗体をプレインキュベートすることによって、ＩＣを調製した；複合体形成を、Ｃｌｑ結合活性の増加を実証することによって、確認した（図２ａ）。予測されるように、Ｃ４０１０のＩＣ（ＩｇＧ２ａｂ抗ＴＮＰ  ｍＡｂ）は、全ての抗ＴＮＰ／ＴＮＰ−ＢＳＡ比で、ＲＦ＋Ｂ細胞を刺激しなかった。驚くべきことに、Ｈｙｌ．２のＩＣ（ＩｇＧ２ａａ抗ＴＮＰ  ｍＡｂ）のみが、抗ヌクレオソームｍＡｂ含有ＩＣによって誘発される増殖性応答に対して、かなり適度な増殖性応答を誘発した。この矛盾は、ＩＣによって誘発されるＲＦ＋Ｂ細胞増殖の程度が、（自己）抗原の抗体および性質の両方に依存することを示した。
【００７５】
（ＩＣによる活性化は、相補性レセプターの共結合（ｃｏ−ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）に依存しない）
抗ヌクレオソームおよび抗ＴＮＰ  ＩＣの刺激性能力の劇的な差異について考えられる説明は、前者のみがＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）とそのＢ細胞表面上の第二のレセプターとの両方に相乗的に結合することができるというものであった。相補性成分は、自己抗原ＩＣに結合することが示されており、かつ理論上、ＣＤ１９／ＣＤ２１およびＢＣＲと効果的に共結合するように働き得る場合、１つの潜在的な候補レセプターは、相補性レセプターＣＤ２１であった（Ｃａｒｔｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１，４５７−４６３（１９８８））。しかし、ＡＭ１４の重鎖トランスジェニックおよび軽鎖トランスジェニックを、ＣＲｌ／２Ｃｒ２欠乏性マウスから繁殖させた場合（Ａｈｅａｒｎら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４，２５１−２６２（１９９６））、ＣＲｌ／２の欠乏した同腹仔およびＣＲｌ／２の十分な同腹仔由来のＲＦ＋Ｂ細胞は、ＩｇＧ２ａ抗ヌクレオソームｍＡｂおよび自己免疫血清に対して同等に応答した（図３）。コントロールのＲＦ同腹仔由来のＢ細胞は、いかなる形態のＩｇＧ２ａに対しても応答せず、これにより、この研究において使用したリガンドの特定の性質が確認された。マイトジェン低メチル化ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドを、コントロール刺激として含めた。これらのデータは、相補性レセプターが自己抗体／自己抗原ＩＣに対するＲＦ＋Ｂ細胞応答に必要とされないことを示す。
【００７６】
（ＭｙＤ８８依存性レセプターの役割）
潜在的な候補レセプターは、Ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）ファミリーのメンバーを含んだ。これらのパターン認識レセプターは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａにおいて最初に記載され、ここで、これらは、抗真菌ペプチドの放出を誘発することが示されている（Ｌｅｍａｉｔｒｅら、Ｃｅｌｌ  ８６，９７３−９８３（１９９６））。その後に同定された哺乳動物ホモログは、保存的微生物産物（すなわち、ＬＰＳ、微生物リポタンパク質、および低メチル化ＣｐＧ  ＤＮＡ）（病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰＳ）と呼ばれる（Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８８，３２３−３２４（１９９７）；Ａｋｉｒａら、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２，６７５−６８０（２００１）））の種を認識することが見出された。初期の研究は、先天性免疫系の細胞に対する微生物産物の効果に焦点を当てており、ここで、これらは、広範な炎症性メジエーターの放出を刺激することが見出された（Ａｋｉｒａら、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２，６７５−６８０（２００１））。しかし、外因性の微生物リガンドに加えて、ＴＬＲもまた、損傷性またはストレス性（ｓｔｒｅｓｓｅｄ）の哺乳動物細胞から放出される外因性リガンドを認識し得ることが、後に示された（Ｌｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６，７１２８−７１３５（２００１））。全ての公知の哺乳動物ＴＬＲシグナル伝達経路は、アダプタータンパク質ＭｙＤ８８を使用するが（Ａｋｉｒａら、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２，６７５−６８０（２００１））、ＴＬＲ４の場合において、さらなるＭｙＤ８８依存性経路が、記載されている（Ｈｏｒｎｇら、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２，８３５−８４１（２００１））。
【００７７】
自己抗体／自己抗原ＩＣに対するＲＦ＋Ｂ細胞応答を媒介する際のＴＬＲの潜在的な役割を研究するために、本発明者らは、ＡＭ１４導入遺伝子を、ＭｙＤ８８−／−バックグラウンド上に交雑させた（Ａｄａｃｈｉら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ９，１４３−１５０（１９９８））。ＲＦ−ＭｙＤ８８＋／＋子孫（野生型）、ＲＦ＋ＭｙＤ８８＋／＋子孫、およびＲＦ＋ＭｙＤ８８−／−子孫由来のＢ細胞（ＰＣＲ分析とＦＡＣＳ分析との組み合わせによって同定される（図４Ａ〜４Ｂ））を、それらが抗ＩｇＭ、ＣｐＧ  ＯＤＮ、およびＬＰＳに応答する能力、ならびに抗ヌクレオソームｍＡｂｓおよび自己免疫血清のパネルに応答する能力について評価した。ＭｙＤ８８欠乏性マウス由来のＢ細胞は、抗ＩｇＭに正常に応答したが、刺激性ＣｐＧ  ＤＮＡには応答することができなかった（Ｈａｃｋｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２，５９５−６００（２０００））。これらのＬＰＳに対する応答は、野生型マウスにおけるよりもかなり低かったが、ＭｙＤ８８による部分的な活性化と一致して、依然として検出可能であり、そしてＬＰＳに対してのみ弱く応答した（これは、ＭｙＤ８８依存性機構を介して部分的に刺激することが知られている（Ｈｏｒｎｇら、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２，８３５−８４１（２００１）））（図４Ｃ）。最も劇的には、ＲＦ＋ＭｙＤ８８−欠乏性マウス由来のＢ細胞は、完全に、抗ヌクレオソームｍＡｂｓ  ＰＲ１−３またはＰＬ２−３に対して無応答性であるか、またはＲＦ＋ＭｙＤ８８＋／＋Ｂ細胞を効果的に刺激するいかなる自己免疫血清に対して無応答性であった（図４Ｃ）。これらの結果は、自己抗体／自己抗原ＩＣが、ＲＦ＋Ｂ細胞に対して部分的に刺激性であることを明確に示している。なぜなら、これらは、ＢＣＲとＭｙＤ８８依存性レセプターとの両方に相乗的に結合するからである。
【００７８】
低メチル化ＣｐＧモチーフは、細菌ＤＮＡの共通の特徴であるが、これらはまた、哺乳動物ＤＮＡプロモーターエレメントにも存在する（ＳｉｎｇａｌおよびＧｉｎｄｅｒ  Ｂｌｏｏｄ  ９３，４０５９−４０７０（１９９９））。ＣｐＧオリゴデオキシリボヌクレオチド（ＯＤＮ）に対するＢ細胞応答は、ＴＬＲ９によって媒介されるので（Ｈｅｍｍｉら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０８，７４０−７４５（２０００））、本発明者らは、クロマチン含有ＩＣが、ＴＬＲ９に共結合することによってＲＦ  Ｂ細胞を刺激し得ると仮定した。ＣｐＧ  Ｓ−ＯＤＮに対するＴＬＲ９媒介性応答は、クロロキンおよび塩化アンモニウムに対する感受性によって決定されるように、エンドソームの酸化および／または成熟のための推定される必要条件によって、他の公知のＴＬＲシグナル伝達経路と区別される（Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０，４７５５−４７６１（１９９８）；Ｈａｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１７，６２３０−６２４０（１９９８））。コンカナマイシンＢおよびバフィロマイシンＡは、エンドソームの酸化を担うＶ型ＡＴＰａｓｅの特定のインヒビターである（Ｂｅｎａｒｏｃｈら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１４，３７−４９（１９９５））。ＲＦ＋Ｂ細胞の酸化におけるＴＬＲ９の役割を評価するために、ｍＡｂ  ＰＬ２−３および公知のＴＬＲ２（リポペプチド、ポリン（ｐｏｒｉｎ）Ｂ）（Ｍａｓｓａｒｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８：１５３３−１５３７，２００２）、ＴＬＲ４（ＬＰＳ）、およびＴＬＲ９（ＣｐＧ  Ｓ−ＯＤＮ  １８２６）リガンドの刺激性能力に対するクロロキン、コンカナマイシンＢ、バフィロマイシンＡ、および塩化アンモニウムの効果を決定した。予測されるように、クロロキンは、ＣｐＧ  Ｓ−ＯＤＮ応答を阻害し、そしてこれらのインヒビターは、ＴＬＲ２リガンドおよびＴＬＲ４リガンドに対してほとんど効果がなかった。特に、クロロキンをブロックする４つ全ての因子はまた、ｍＡｂ  ＰＬ２−３に対するＲＦ＋Ｂ細胞応答を阻害した（図５Ａおよび５Ｂ）。クロロキンは、慢性関節リウマチおよびＳＬＥを含む自己免疫疾患に対する有効な処置であるので、クロロキンへの関連は興味深い（Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｈｙｄｒｏｘｙｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２４，１５０−１５４（１９９１）；Ｆｕｒｓｔら、Ａｒｔｈ．Ｒｈｅｕ．４２，３５７−３６５（１９９９））。従って、本発明者らのデータは、クロロキンの治療効果が、ＴＬＲ媒介性シグナル（これは、自己抗体産生または炎症誘発性メジエーターの産生に寄与する）と干渉するその能力に、少なくとも部分的に起因することを示唆している。
【００７９】
刺激性ＣｐＧ  Ｓ−ＯＤＮ  １８２６に対するＢ細胞応答はまた、密接に関連したインヒビターＣｐＧ  Ｓ−ＯＤＮ（例えば、Ｓ−ＯＤＮ  ２０８８）の群によってブロックされ得る（Ｌｅｎａｒｔら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．４，２４７−２５６（２００１））。本発明者らは、Ｓ−ＯＤＮ  ２０８８が、Ｓ−ＯＤＮ  １８２６に対する増殖性応答を大いに阻害するが、抗ＩｇＭまたは本発明のＴＬＲ２リガンドおよびＴＬＲ４リガンドに対する応答に効果がないことを見出した（図５Ｃおよび５Ｂ）。最も有意には、Ｓ−ＯＤＮ  ２０８８はまた、ｍＡｂ  ＰＬ２−３に対するＲＦ＋Ｂ細胞応答を劇的にブロックした。全体的に、これらのデータは、ＲＦ＋Ｂ細胞活性化における、エンドソームプロセシングおよび／またはエンドソーム関連ＴＬＲ（最も好ましくは、ＴＬＲ９）の結合に強く関連する。
【００８０】
外来性抗原に対する従来型のＢ細胞応答のＴ依存性特性と同様に、自己反応性Ｂ細胞クローンがアイソタイプスイッチングおよび体細胞性変異を受け得ることが明確に示された（Ｓｈｌｏｍｃｈｉｋら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２８，８０５〜８１１（１９８７））。しかし、より最近の報告によって、自己反応性Ｂ細胞は、末梢リンパ組織における従来型のＢ細胞と分離し得ることが示唆され；自己反応性Ｂ細胞は脾性白脾髄２６髄質（ｓｐｌｅｎｉｃ  ｗｈｉｔｅ  ｐｕｌｐ２６ｐｕｌｐ）の周辺帯に局在する傾向がある（Ｚｅｎｇら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４，５０００〜５００４（２０００））が、その一方で、従来型のＢ細胞は、濾胞性領域を目指すことが示唆されている。さらに、いくつかの例において、自己反応性Ｂ細胞の増殖および体細胞性変異は、その胚中心（ｇｅｒｍｉｎａｌ  ｃｅｎｔｅｒ）の外側で起こり得る。これらの分散性局在パターンは、刺激性の自己抗体／自己抗原ＩＣのこれらの部位における優勢な集積を反映し得る。あるいは、この相対的に特有のホーミングパターン（ｈｏｍｉｎｇ  ｐａｔｔｅｒｎ）は、ＢＣＲ／ＴＬＲ結合の総合効果に応答して誘発される特徴的なケモカインレセプタープロファイルから生じ得る。将来の研究では、ＢＣＲ／ＴＬＲ二重結合を通して活性化されたＢ細胞からＢＣＲクロスリンキングのみを通して活性化されたＢ細胞の機能特性を比較する必要がある。
【００８１】
ＤＮＡ／ヌクレオソームを認識する自己抗体は、ＳＬＥ患者およびＳＬＥのマウスループスモデルにおいて限定的かつ最も優勢な特異性であるが、ＲＦは、ＳＬＥ患者、自己免疫易発性ｌｐｒマウス、およびＲＡ患者のサブセットの特徴である。注目すべきことに、これらの同じ自己抗原は、リンパ球の恒常性または自己抗原代謝を破壊する変異によって生じる多くの新規マウス自己免疫モデルにおける標的である（Ｂｏｔｔｏら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９，５６−５９（１９９８）；Ｂｉｃｋｅｒｓｔａｆｆら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５，６９４〜６９７（１９９９）；Ｎａｐｉｒｅｉら，Ｎａｔ．Ｇｅｎ．２５，１７７〜１８０（２０００）；Ｓｃｏｔｔら，Ｎａｔｕｒｅ  ４１１，２０７〜２１１（２００１））。これらの特徴的な特異性の優勢の理由は、長い間探し求められてきた。本発明者らのデータは、説明、すなわち、クロマチン含有免疫複合体によって媒介されるＢＣＲ／ＴＬＲシグナル伝達事象の強力な相乗的効果を提供する。本発明者らの実験系（この系は、エンドソーム／リソソーム局在ＴＬＲ９に依存している（Ｈａｃｋｅｒら，ＥＭＢＯ  Ｊ.１７，６２３０−６２４０（１９９８）））において、このＢＣＲの自己抗体／自己抗原ＩＣ結合が、ＩＣ関連抗原のエンドサイトーシスを誘発して、これによって、エンドソーム結合ＴＬＲ９に対するクロマチンフラグメントの高効率送達が生じると結論付けることが妥当である。公開された研究（Ｂｅｌｌら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８５，１４８７〜１４９６（１９９０）；Ｂｅｌｌら，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ．６０，１３２６（１９９１））とは対照的に、本発明者らが培養上清またはクロマチンフラグメントのいずれかのみを用いてＢ細胞を活性化させることは不可能であった。マウスの他の系統が本発明者らのフラグメントに対してより応答性であるか否かということは未だ決定されていない。
【００８２】
現存の実験モデルを超越して、ＢＣＲ／ＴＬＲ二重結合の原理は、一般にいう自己免疫についての広範な意味を有する。ハプテン化ＬＰＳおよびハプテン化ＬＰＳＬＰＳ結合ＳＲＢＣのようなモデルリガンドはまた、ＢＣＲおよびＴＬＲを同時刺激し得、そして、それらの関連レセプターを有するＢ細胞に対して、驚くほどに、強力かつ特異的である（Ｐｉｋｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８７；１５０：２６５〜７５，１９８７）。従って、この様式での活性化は、広範で多様な設定における末梢Ｂ細胞寛容性の消失における基礎的な事象である可能性があり；他の自己抗原は、ＴＬＲ９よりもＴＬＲを通じてシグナル伝達し得る。全体として、これらのデータは、自己免疫における適応免疫系の異常な活性化での内因性ＴＬＲリガンドの重要な役割を確立し、そして、如何にして、この自己抗体レパートリーが、しばしば、細胞下の核酸／タンパク質粒子を認識する傾向にあるかを説明する（Ｔａｎ，Ｅ．Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４，９３〜１５１（１９８９））。
【００８３】
（方法）
（マウス）  以前に記載される（Ｈａｎｎｕｍら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４，１２６９〜１２７８（１９９６）；Ｒｉｆｋｉｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５，１６２６〜１６３３（２０００））ＭＲＬ＋／＋ＡＭ１４  ＢＣＲ  Ｔｇマウスを、Ｃｒ２欠失マウス（Ｄｒ．Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｃａｒｒｏｌｌ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ，Ｂｏｓｔｏｎ）の好意により提供された）とかけ合わせ、そして、そのＦ１子孫を交雑してＡＭ１４  Ｃｒ２欠失マウスおよびＣｒ２の十分なコントロールマウスを作製した。ＭｙＤ８８−／−マウス（もともとは、Ｄｒ．Ｓｈｉｚｕｏ  Ａｋｉｒａ（Ｏｓａｋａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）により作製され（Ａｄａｃｈｉら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ９，１４３−１５０（１９９８））、そして、Ｄｒ．Ｄｏｕｇｌａｓ  Ｇｏｌｅｎｂｏｃｋ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ）の好意により提供された）をＡＭ１４  ＭＲＬ＋／＋マウスとかけ合わせ、ＡＭ１４  ＭｙＤ８８−／−およびコントロール同腹仔である子孫を作製した。ＲＦ＋子孫を、まずＰＣＲによって同定し、そして、これらの同一性を、記載された（Ｓｈｌｏｍｃｈｉｋら，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５，１３２９−１３４１（１９９３））４−Ｇ７モノクローナル抗イディオタイプを使用して、末梢血リンパ球および脾臓細胞のフローサイトメトリー分析によって確認した。補完的レセプターの遺伝子型を、ＦＩＴＣ結合７Ｇ６抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用するフローサイトメトリーによって決定した。ＭｙＤ８８遺伝子型を以下のプライマーを使用してＰＣＲによって決定し、それぞれ約５５０ｂｐおよび約７５０ｂｐの野生型産物およびノックアウト産物を得た：ＭｙＤ８８Ｆ（５’−ＴＧＧ  ＣＡＴ  ＧＣＣ  ＴＣＣ  ＡＴＣ  ＡＴＡ  ＧＴＴ  ＡＡＣ  Ｃ−３’）［配列番号１］、ＭｙＤ８８Ｒ（５’−ＧＴＣ  ＡＧＡ  ＡＡＣ  ＡＡＣ  ＣＡＣ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＣ−３’）［配列番号２］、およびｎｅｏＲ（５’−ＡＴＣ  ＧＣＣ  ＴＴＣ  ＴＡＴ  ＣＧＣ  ＣＴＴ  ＣＴＴ  ＧＡＣ  Ｇ−３’）［配列番号３］（ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｈｉｇｈ  Ｐｏｉｎｔ，ＮＣ）。
【００８４】
（細胞培養および試薬）  脾臓細胞調製物を、Ｔ減損（Ｔ−ｄｅｐｌｅｔｅ）させ、そして、４０時間〜４８時間に亘って適切なリガンドを使用して培養した。いくつかの実験において、Ｂ細胞を、前述（Ｒｉｆｋｉｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５，１６２６〜１６３３（２０００））のように、ＣＤ４０Ｌを用いてプレインキュベートした。最終的な１６時間の培養の間の３［Ｈ］−チミジン取り込みによって、増殖をアッセイした。三連の培養からの抗ＩｇＭ応答の平均パーセンテージとして、データを表す。この抗ＩｇＭ応答のパーセンテージは、以下の式に従って計算した：
［（ｃｐｍ実験条件−ｃｐｍ  ＣＤ４０Ｌ単独）／（ｃｐｍ  抗ＩｇＭ−ｃｐｍ  ＣＤ４０Ｌ単独）×１００］。
【００８５】
（含まれたリガンド）：  ヤギ抗マウスＩｇＭ  Ｆ（ａｂ’）２（１５μｇ／ｍｌ，Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）；ヌクレオソーム特異的ｍＡｂである、ＰＲ１−３（ＩｇＧ２ａｊ）、ＰＬ２−３（ＩｇＧ２ａｊ）、およびＰＬ２−８（ＩｇＧ２ｂ）（これらの全ては、５０μｇ／ｍｌであった）（これらは、Ｄｒ．Ｍａｒｃ  Ｍｏｎｅｓｔｉｅｒ（Ｔｅｍｐｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）のご好意によって提供された（Ｍｏｎｅｓｔｉｅｒ  ａｎｄ  Ｎｏｖｉｃｋ  Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３，８９−９９（１９９６））；１０μｇ／ｍｌ  ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）；０．３〜２μｇ／ｍｌ刺激性ＣｐＧ  Ｓ−ＯＤＮ  １８２６（Ｙｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０，４７５５−４７６１（１９９８））（Ｏｌｉｇｏ’ｓ  Ｅｔｃ，Ｗｉｌｓｏｎｖｉｌｌｅ，ＯＨ）、１０μｇ／ｍｌ  Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ＭｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓポリンＢ（Ｄｒ．Ｌｅｅ  Ｗｅｔｚｌｅｒ（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）のご好意によって提供された）；１０μｇ／ｍｌ合成リポペプチドＰａｍ３Ｃｙｓ−Ｓｋ４（これは、Ｄｒ．Ｇ．Ｊｕｎｇ，Ｕｎｉｖ．ｏｆ  Ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙにより，Ｄｒ．Ｄｏｕｇ  Ｇｏｌｅｎｂｏｃｋのご好意によって提供された）；ならびに種々の濃度のＴＮＰ−ＢＳＡに複合体化された抗ＴＮＰ  ｍＡｂ  Ｈｙｌ．２（ＩｇＧ２ａａ）およびＣ１０４０（ＩｇＧ２ａｂ）（Ｈａｎｎｕｍら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４，１２６９〜１２７８（１９９６））（双方とも５０μｇ／ｍｌであった）。いくつかの実験において、ＤＮａｓｅ  Ｉ（ＩＶ型）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ），クロロキン（Ｓｉｇｍａ）、コンカナマイシンＢ（ｃｏｎｃａｎａｍｙｃｉｎ  Ｂ）、バフィロマイシンＡ（ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ  Ａ）（Ｓｉｇｍａ）、または１２μｇ／ｍｌの阻害性ＣｐＧ  Ｓ−ＯＤＮ  ２００８（Ｌｅｎａｒｔら，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．４，２４７−２５６（２００１））（Ｏｌｉｇｏ’ｓ  Ｅｔｃ．）を、リガンドの添加の、１５分間〜３０分間から２時間前に培養物に添加した。全てのｍＡｂおよびＯＤＮの調製物を、Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ  ＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏ−Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）によって、遊離した内毒素であったことを示した。
【００８６】
（実施例３）
本発明者らは、樹状細胞が、ＦｃレセプターおよびＴＬＲ９のその後の結合を介するクロマチン含有免疫複合体により活性化されることをさらに示した。これは、Ｂ細胞について記載した機構に類似の機構であるが、但し、Ｂ細胞の場合に、関連する細胞表面レセプターは、Ｂ細胞抗原レセプターであるが、樹状細胞において、この関連する細胞表面レセプターは、Ｆｃγレセプター（ＦｃγＲ）である。両方の細胞表面レセプターとも、エンドソーム／リソソーム画分中のＴＬＲ９に、クロマチンを送達する役割を担う。
【００８７】
図８Ａ〜図８Ｃにおいて、樹状細胞はＴＬＲ９を介して特異的に活性化され得て、そしてこの活性化はＯＤＮ２０８８でのＴＬＲ９阻害によってブロックされ得るということを発明者らは示す。特異的なＴＬＲ９活性化リガンドＯＤＮ１８２６が、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１２の産生を樹状細胞（８Ａ，８Ｂ）により誘導し、そしてさらに同時刺激分子（８Ｃ）のアップレギュレートを誘導するという点において、本発明者らがその後の実験（以下の表１および表２において示される）において使用した樹状細胞は機能的ＴＬＲ９を発現するということが、上記の実験によって実証された。ＯＤＮ２０８８がＯＤＮ１８２６媒介性活性をブロックするがＬＰＳ媒介性活性化に対してはなんら影響を持たないので、ＯＤＮ  ２０８８は、ＴＬＲ９媒介性活性化の特異的なインヒビターである（８Ａ、８Ｂ、８Ｃに示される）。
【００８８】
６日間に亘るＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４のインビトロ培養によって、樹状細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの骨髄から作製した。第６日目において、ＣＤ１１ｃ陽性の樹状細胞を、磁性ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して単離し、そして、ＯＤＮ２０８８（ＴＬＲ９を介するシグナルで伝達を特異的にブロックする阻害性オリゴデオキシヌクレオチド）とともに、３０分間のプレインキュベートしたかまたは、プレインキュベートをしなかった。次いで、刺激性ＯＤＮ１８２６（ＣｐＧ，３μｇ／ｍｌ）（ＴＬＲ９を介して特異的に活性化する）またはリポポリサッカリド（ＬＰＳ，１０μｇ／ｍｌ）（これは、ＴＬＲ４を介して活性化する）あるいは培養培地単独（培地）を、これらの培養物に添加した。４８時間後、培養物の上清中のＴＮＦ−α（８Ａ）およびＩＬ−１２（８Ｂ）のレベルを、ＥＬＩＳＡによって測定した（結果を、４０５ｎｍの吸収によって決定されるＯＤ単位として示す）。この上清の除去の後に、細胞を回収して、そして同時刺激分子ＣＤ８６（８ｃ）の発現についてフローサイトメトリーによって分析した。培地単独の存在下のＣＤ８６の発現レベルは、刺激されなかったとしてみなされるが、刺激（ＯＤＮ  １８２６またはＬＰＳ）の存在下のＣＤ８６の発現レベルは刺激されたとしてみなされる。
【００８９】
以下の表１は、クロマチン含有免疫複合体（クロマチン自己抗原と複合体化している自己抗体を含む）は、樹状細胞を活性化して、ＴＮＦ−αを産生するが、その一方で、外来性の抗原（ＴＮＰ−ＢＳＡ）を含む免疫複合体は、樹状細胞の活性化を誘導しないことを示す。さらに、クロマチン含有免疫複合体によって誘導される活性化は、ＴＬＲ９特異的インヒビターＯＤＮ２０８８によって完全にブロックされ、このことは、（おそらくは、このクロマチン含有免疫複合体中のクロマチンによる）ＴＬＲ９の結合が、活性化プロセスの本質的な構成要素であることを示している。
【００９０】
（表１）
【００９１】
【表１】
2005501917.tif 000002
表１は、クロマチン含有免疫複合体によって誘導される樹状細胞ＴＮＦ−α産生は、ＴＬＲ９特異的インヒビターＯＤＮ２０８８によってブロックされることを示している。６日間に亘るＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４とのインビトロ培養によって、樹状細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの骨髄から作製した。第６日目において、ＣＤ１１ｃ陽性の樹状細胞を、磁性ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して単離した。次いで、これらの樹状細胞を、１２μｇ／ｍｌのＯＤＮ２０８８とともに、３０分間に亘って、プレインキュベートしたかまたは、プレインキュベートをしなかった。次いで、刺激性ＯＤＮ１８２６（３μｇ／ｍｌ）（ＴＬＲ９を介して特異的に活性化する）、リポポリサッカリド（ＬＰＳ，１０μｇ／ｍｌ）（これは、ＴＬＲ４を介して活性化する）、抗クロマチン抗体ＰＬ２−３（５０μｇ／ｍｌ）、３つの異なる抗体／タンパク質比のα−ＴＮＰ／ＴＮＰ−ＢＳＡ免疫複合体（５０μｇ／ｍｌ）、あるいは培養培地単独（培地）を、これらの培養物に添加した。４８時間後、培養物の上清中のＴＮＦ−αのレベルを、ＥＬＩＳＡによって測定した（結果を、ｐｇ／ｍｌとして示す；アッセイの感度の低レベルは５０ｐｇ／ｍｌであった）。３つの類似の実験のうちの代表的実験を示す。
【００９２】
表２は、クロマチン含有免疫複合体が、野生型マウス由来の樹状細胞によりＴＮＦ−α産生を誘導する（これはまた、ＯＤＮ２０８８の非存在下で、表１中に示された研究においても示される）が、Ｆｃレセプターγ鎖欠失マウスに由来する樹状細胞によるＴＮＦ−αの産生は全く誘導されないことを示す。このことは、活性化Ｆｃレセプターが、クロマチン含有免疫複合体による樹状細胞活性化にとって絶対に必要とされることを実証している。
【００９３】
（表２）
【００９４】
【表２】
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表２は、クロマチン含有免疫複合体が、野生型マウス由来の樹状細胞によるＴＮＦ−α産生を誘導するが、Ｆｃレセプターγ鎖欠損マウス由来の樹状細胞によるＴＮＦ−α産生を誘導しないことを立証する。Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスの骨髄およびＦｃレセプターγ鎖を欠くＣ５７ＢＬ／６マウスから、骨髄細胞をＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４とともに６日間インビトロ培養することにより、樹状細胞を産生した。６日目に、ＣＤ１１ｃポジティブ樹状細胞を、磁性ビーズを使用して単離した。次いで、刺激性ＯＤＮ  １８２６（３μｇ／ｍｌ）（これは、ＴＬＲ９を介して特異的に活性化する）、リポポリサッカリド（ＬＰＳ、１０μｇ／ｍｌ）、抗クロマチン抗体ＰＬ２−３（５０μｇ／ｍｌ；ＩｇＧ２ａ）およびＰＬ２−８（５０μｇ／ｍｌ；ＩｇＧ２ｂ）、２つの異なる抗体／タンパク質比のα−ＴＮＰ／ＴＮＰ−ＢＳＡ免疫複合体（５０μｇ／ｍｌ）、または培養培地のみ（培地）を、樹状細胞培養物に添加した。４８時間後、培養上清中のＴＮＦ−αのレベルを、ＥＬＩＳＡにより測定した（結果をｐｇ／ｍｌとして示す；アッセイの感度の低いレベルは、５０ｐｇ／ｍｌである）。２つの類似の実験の代表的な実験を示す。
【００９５】
まとめると、上記の表１および表２に示すデータは、クロマチン含有免疫複合体によって誘導される樹状細胞の活性化が、活性化Ｆｃγレセプターを介するシグナルおよびＴＬＲ９を介して媒介されるシグナルを必要とすることを立証する。
【００９６】
このＦｃγＲ／ＴＬＲ二重関与経路の機構および結果を評価するためのさらなる実験を、以下に概説する。
【００９７】
（ＩＦＮ−α産生樹状細胞サブセットの特徴づけ）
（マウス系統）自己免疫性狼瘡様マウス系統と非自己免疫性マウス系統との間の、樹状細胞およびマクロファージの機能における差が、記載されている。これらとしては、免疫複合体操作（Ｊｏｎｅｓら、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．３６：３０−３９，１９８５；Ｍａｇｉｌａｖｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３１：２７８４−２７８８，１９８３）、食作用（Ｒｕｓｓｅｌｌ，およびＳｔｅｉｎｂｅｒｇ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．２７：３８７−４０２，１９８３）、Ｆｃレセプターの発現および機能（Ｐｒｉｔｃｈａｒｄら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．１０：２２７−２３０，２０００；Ｊｉａｎｇら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．５１：４２９−４３５．，２０００）ならびにサイトカイン産生（Ａｌｌｅｖａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：５６１０−５６１９．，１９９７；Ｋｏｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：４１９０−４２０１．，２０００）における差が挙げられる。従って、自己免疫性系統および非自己免疫性系統の両方由来の樹状細胞を直接比較することが重要である。ＭＲＬ＋／＋および（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ１は、２種の自己免疫性狼瘡様系統であり、そしてＣ５７ＢＬ／６およびＢＡＬＢ／ｃは、使用した２種の非自己免疫性系統である。
【００９８】
（樹状細胞サブセットの精製）ＳＬＥの病因において特に重要な２つの樹状細胞のサブセットがある：ＣＤ１１ｃ＋  ＣＤ８α＋およびＣＤ１１ｃ＋  Ｂ２２０＋  Ｇｒ−１＋。これらの細胞は、脾臓から直接得られるか（Ｈｏｃｈｒｅｉｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：５４４８−５４５５，２０００；Ｎａｋａｎｏら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９４：１１７１−１１７８，２００１）、またはＦｌｔ３リガンドの存在下で骨髄細胞のインビトロ培養によって産生されるかのいずれかである（Ｂｒａｓｅｌら、Ｂｌｏｏｄ．９６：３０２９−３０３９，２０００；Ｇｉｌｌｉｅｔら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９５：９５３−９５８，２００２）。脾臓の樹状細胞を、記載されるとおり（Ｖｒｅｍｅｃら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：２９７８−２９８６，２０００）に単離し、そして適切な蛍光抗体染色の後、特定の樹状細胞サブセットを、ＭｏＦｌｏセルソーター（Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｆｏｒｔ  Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ）を用いて、分画および収集する。ＣＤ１１ｃ＋  ＣＤ８α−樹状細胞サブセット（これもまた脾臓中に見られる）を、標的のＣＤ１１ｃ＋  ＣＤ８α＋樹状細胞サブセットと同時に単離し、そして実験コントロールとして使用する。
【００９９】
骨髄由来樹状細胞を産生するために、骨髄細胞を収集し、そして確立されたプロトコル（Ｇｉｌｌｉｅｔら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９５：９５３−９５８，２００２；Ｌａｂｅｕｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：１６８−１７５，１９９９）を用いて、組換えマウスＦｌｔ３リガンドの存在下でインビトロで６〜１０日間培養する。Ｆｌｔ３リガンド中で増殖した骨髄細胞は、標的の集団（すなわち、ＣＤ１１ｃ＋  ＣＤ８α＋樹状細胞およびＣＤ１１ｃ＋  Ｂ２２０＋  Ｇｒ−１＋樹状細胞）が濃縮されている。これらの集団を、脾臓由来の樹状細胞について、上記のとおりにセルソーティングにより分画する。
【０１００】
（特定の樹状細胞サブセットにおけるＴＬＲ９の発現の決定）ＴＬＲ９メッセンジャーＲＮＡを、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により測定する。さらに、ＴＬＲ９特異的刺激性リガンド（Ｓ−ＯＤＮ  １８２６（Ｂａｌｌａｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：４８７８−４８８６，２００１））に対する樹状細胞サブセットの応答を、同時刺激性（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）分子の発現およびサイトカイン産生を測定することにより比較する。マウスＴＬＲ９に対する特異的抗体を、当業者に公知の技術を用いて産生し得る。
【０１０１】
（ＩＣの調製ならびに樹状細胞によるＩＣの結合および取り込みの評価）
（免疫複合体の調製）抗ヌクレオソーム／クロマチンＩＣを、抗ヌクレオソームモノクローナル抗体ＰＬ２−３（ＩｇＧ２ａ）、ＰＬ２−８（ＩｇＧ２ｂ）およびＰＬ９−７（ＩｇＧ３）を、脾臓細胞の２４時間インビトロ培養物から得た上清と共にインキュベートすることにより調製する。クロマチンは、培養脾臓細胞から自発的に放出され（Ｂｅｌｌら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８５：１４８７−１４９６，１９９０）、そしてこのクロマチンに対する抗ヌクレオソーム抗体の結合は、Ｃ１ｑ免疫アッセイ（Ｒｉｆｋｉｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１６５：１６２６−１６３３，２０００）を使用して測定され得るＩＣの形成を生じる。本発明者らは、培養液と予めインキュベートしたビオチン化ＰＬ２−３が、フローサイトメトリーによって検出されるように、リウマチ因子Ｂ細胞に特異的に結合し；単量体のビオチン化ＰＬ２−３は、結合しないことをさらに示している。非自己抗原コントロールＩＣは、抗ＴＮＰモノクローナル抗体Ｈｙ１．２（ＩｇＧ２ａ）またはＣ４０１０（ＩｇＧ２ｂ）を使用し、そしてそれらをＴＮＰ−ＢＳＡと共にインキュベートして作製し、ＩＣ形成もまた、示されたように（Ｌｅａｄｂｅｔｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ．４１６：６０３−６０７，２００２）、Ｃ１ｑ結合によって確認する。さらなる非自己抗原コントロールＩＣを、本研究所で調製した抗オボアルブミンモノクローナル抗体Ｏｖ１（ＩｇＧ２ａ）およびＯｖ２（ＩｇＧ２ｂ）を使用し、そしてそれらをオボアルブミンとインキュベートすることにより作製する。Ｃ１ｑ結合アッセイにおいてＩＣ形成を立証するのと同時に、さらなる確証的なアッセイとして、ＦＰＬＣをまた使用する。
【０１０２】
（樹状細胞による免疫複合体の結合および取り込み）ＩＣおよび樹状細胞を含む実際の実験的培養物をセットアップする前に、異なる系統由来の精製した樹状細胞サブセットがＩＣを結合および取り込み得る程度を決定することが必要である。このことは、ＩＣ操作（Ｊｏｎｅｓら、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．３６：３０−３９，１９８５；Ｍａｇｉｌａｖｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３１：２７８４−２７８８，１９８３）、およびＦｃレセプターの発現（Ｐｒｉｔｃｈａｒｄら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．１０：２２７−２３０，２０００；Ｊｉａｎｇら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．５１：４２９−４３５．，２０００）に関して、自己免疫性マウス系統と非自己免疫性マウス系統との間の報告された差を考慮すると、特に重要である。実験的アプローチは、フローサイトメトリーおよび共焦点顕微鏡の組合せを使用して、免疫複合体の抗体構成要素を追跡することである。抗ヌクレオソーム抗体ＰＬ２−３（ＩｇＧ２ａ）、ＰＬ２−８（ＩｇＧ２ｂ）およびＰＬ９−７（ＩｇＧ３）を、標準的な手順を用いてビオチン結合体化し、そしてビオチン−抗ヌクレオソーム／クロマチンＩＣを、上記のとおりに調製する。ビオチン−抗ヌクレオソーム／クロマチンＩＣが、機能性を保持していることを立証するために、ビオチン−ＰＬ２−３／クロマチンＩＣが、非ビオチン−ＰＬ２−３／クロマチンＩＣと同じ程度にリウマチ因子Ｂ細胞の増殖を誘導し得るかどうか評価する（Ｒｉｆｋｉｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１６５：１６２６−１６３３，２０００）。ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３がリウマチ因子Ｂ細胞によって認識されないので、このようにしてビオチン−ＰＬ２−８／クロマチンＩＣおよびビオチン−ＰＬ９−７／クロマチンＩＣを、試験し得ないが、ビオチン結合体化の機能的影響は、アイソタイプに関わらず同様であると推定される。アイソタイプが一致するビオチン−抗ＴＮＰ／ＴＮＰ−ＢＳＡ  ＩＣおよびビオチン−抗オボアルブミン／オボアルブミンＩＣを、同様に調製する。複合体中に組み入れられていないビオチン結合体化抗体単独を、コントロールとして使用する。ビオチン結合体化ＩＣおよびビオチン結合体化抗体単独を、異なる樹状細胞サブセットに添加し、そしてフローサイトメトリーを使用して、細胞表面の結合を検出する。ビオチン標識化化合物を、特定の蛍光色素に結合体化された抗ビオチンモノクローナル抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ：抗ビオチンマウスモノクローナル抗体２Ｆ５  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８結合体）を用いて可視化する。続いて、抗ヌクレオソーム抗体（ビオチン−抗ヌクレオソーム／クロマチンＩＣ）、抗ＴＮＰ抗体（ビオチン−抗ＴＮＰ／ＴＮＰ−ＢＳＡ  ＩＣ）または抗オボアルブミン抗体（ビオチン−抗オボアルブミン／オボアルブミンＩＣ）の樹状細胞内部移行を、１〜１２時間のインキュベーション期間および３％パラホルムアルデヒドでの固定後に、共焦点顕微鏡を使用して評価する。
【０１０３】
さらに、エンドソーム／リソソームコンパートメントに特異的な蛍光標識化モノクローナル抗体での同時染色によってか、または酸性オルガネラに区分化する蛍光ｐＨ指示薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）の使用によって、共局在研究を実施する。
【０１０４】
（クロマチン含有ＩＣならびにＴｏｌｌ様レセプターおよびＦｃγレセプターの役割の確立による樹状細胞活性化の測定）
（ＩＣによる樹状細胞活性化の測定）上記で概説した抗ヌクレオソーム／クロマチンＩＣ、抗ＴＮＰ／ＴＮＰ−ＢＳＡ  ＩＣおよび抗オボアルブミン／オボアルブミンＩＣを、樹状細胞サブセットと共にインキュベートし、同時刺激性分子産生およびサイトカイン産生の上方制御を測定することにより樹状細胞活性化を決定する。コントロールとしては、単量体の非複合体化抗体単独、抗原単独、ＴＬＲ９シグナル伝達に対するポジティブコントロールとして刺激性ＣｐＧ  Ｓ−ＯＤＮ  １８２６、ＴＬＲ４シグナル伝達に対するポジティブコントロールとしてＬＰＳおよびＴＬＲ２シグナル伝達に対するポジティブコントロールとしてｐｏｒｉｎ  Ｂが挙げられる。サイトカインを、ＥＬＩＳＡによって測定する。サイトカインとしては、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−αが挙げられる。ＩＬ−１２およびＴＮＦ−αは、樹状細胞活性化のマーカーとして最も一般的に使用される２つのサイトカインであり（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：７６７−８１１，２０００）、そしてＩＦＮ−αは、ＣＤ１１ｃ＋  ＣＤ８α＋樹状細胞サブセットおよびＣＤ１１ｃ＋  Ｂ２２０＋  Ｇｒ−１＋樹状細胞サブセットの活性化に最も強く関連したサイトカインである。マクロファージにおけるＦｃレセプター結合が、それに続く刺激により誘導されるＩＬ−１０産生を導き得、この刺激は、Ｆｃレセプター結合の非存在下では、ＩＬ−１２産生を導き、そしてＩＬ−１０産生を導かないことが示されているので（ＧｅｒｂｅｒおよびＭｏｓｓｅｒ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：６８６１−６８６８．，２００１）、ＩＬ−１０を測定することが必要である。ＭＨＣクラスＩＩならびに同時刺激性分子ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ４０の増加した発現を、フローサイトメトリーによって決定する。
【０１０５】
（ＩＣ媒介樹状細胞活性化におけるＴｏｌｌ様レセプターおよびＦｃγレセプターの役割）Ｓ−ＯＤＮ  ２０８８は、ＴＬＲ９を介するシグナル伝達を特異的にブロックする阻害性ＣｐＧ  Ｓ−ＯＤＮである（Ｌｅｎｅｒｔら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１１：２４７−２５６，２００１）。本発明者らは、Ｓ−ＯＤＮ  ２０８８が、リウマチ因子Ｂ細胞レセプタートランスジェニックマウス由来のＢ細胞のクロマチン含有ＩＣに誘導される増殖を強く阻害することを示している（Ｌｅａｄｂｅｔｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ．４１６：６０３−６０７，２００２（Ｌｅａｄｂｅｔｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ．４１６：６０３−６０７，２００２）。また、本発明者らは、Ｓ−ＯＤＮ  ２０８８が、ＴＬＲ９を介して作用する刺激性ＣｐＧ  Ｓ−ＯＤＮ（例えば、Ｓ−ＯＤＮ  １８２６）による樹状細胞活性化を完全に抑制することを示している。上記で概説した実験を、Ｓ−ＯＤＮ  ２０８８の存在下または非存在下で実施して、ＩＣ媒介樹状細胞活性化におけるＴＬＲ９の役割を評価する。それらをまた、ＴＬＲ９を介するシグナル伝達を抑制するエンドゾームの酸性化のインヒビター（クロロキン、コンカナマイシンＢおよびバフィロマイシンＡが挙げられる）の存在下および非存在下で実施する。さらに、Ｃ５７ＢＬ／６  ＭｙＤ８８＋／＋マウス由来の樹状細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６  ＭｙＤ８８−／−マウス由来の樹状細胞と比較して、ＴＬＲシグナル伝達についての要件を確立する。
【０１０６】
Ｆｃγレセプター（ＦｃγＲ）シグナル伝達についての要件を評価するために、２．４．Ｇ２（マウスＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを特異的にブロックするモノクローナル抗体）（Ａｒａｕｊｏ−Ｊｏｒｇｅら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．６１：４９２５−４９２８．，１９９３）の存在下および非存在下で、実験をまた実施する。しかし、第３の型のマウスＦｃγレセプター、ＦｃγＩは、２．４Ｇ２によってブロックされず、そしてＩＣ誘導炎症応答を媒介し得る（Ｉｏａｎ−Ｆａｃｓｉｎａｙら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．１６：  ３９１−４０２．，２００２，Ｂａｒｎｅｓら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．１６：３７９−３８９，２００２）。樹状細胞は、３つのクラスのＦｃγＲ（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩ）全てを発現する（ＲａｖｅｔｃｈおよびＢｏｌｌａｎｄ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：２７５−２９０，２００１）。従って、ＦｃγＲノックアウトマウスを使用して、さらなる研究を実施し得る。マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能であり、そしてこれらとしては、ｉ）これらの２つのレセプターにより共有される、共通の刺激性シグナル伝達γ鎖のノックアウトによってＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩを遺伝的に欠損させられたマウス（Ｔａｋａｉら、Ｃｅｌｌ．７６：５１９−５２９．，１９９４）、ｉｉ）ＦｃγＲＩＩノックアウトマウス（Ｔａｋａｉら、Ｎａｔｕｒｅ．３７９：３４６−３４９．，１９９６）ならびにｉｉｉ）ＦｃγＲＩＩＩノックアウトマウス（Ｈａｚｅｎｂｏｓら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．５：１８１−１８８．，１９９６）が挙げられる。
【０１０７】
（樹状細胞による抗原プロセッシングおよび抗原提示におけるＩＣおよびＴＬＲ９の役割）ＣＤ４＋自己反応性Ｔ細胞は、ヒトおよびこの疾患のマウスモデルの両方においてＳＬＥの食作用の要である（Ｃｒａｆｔら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．１９：，１９９９；Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：Ｄ１３６９−７８，２００１；Ｓｈｌｏｍｃｈｉｋら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：１４７−１５３．，２００１）。樹状細胞は、Ｔ細胞応答の開始に関与する重要な抗原提示細胞であり（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：７６７−８１１，２０００）、そしてＴＬＲ９結合が、Ｔｈ１型免疫応答の進行を強く促進することが示されている（Ｊａｋｏｂら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：３０４２−３０４９，１９９８；Ｌｉｐｆｏｒｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：１２２８−１２３５．，２０００）。ＴＬＲ９結合が、免疫複合体内に含まれる抗原に対するＴ細胞応答を変えるかどうかを示すために、オボアルブミンを、記載されるように（Ｓｈｉｒｏｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：５５７５−５５８２．，２０００）、刺激性ＣｐＧ  Ｓ−ＯＤＮ  １８２６に結合体化する。抗オボアルブミンモノクローナル抗体Ｏｖ１（ＩｇＧ２ａ）またはＯｖ２（ＩｇＧ２ｂ）と共に、非結合体化オボアルブミンまたはオボアルブミン−ＣｐＧ結合体をインキュベートすることにより、結果的にＩＣを作製する。ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈ−２ｄ）由来の樹状細胞サブセットを、これらのＩＣでパルスする。ＣＤ４＋Ｔ細胞（これは、Ｈ−２Ａｄの状況でオボアルブミンを認識する）を、オボアルブミン特異的Ｔ細胞レセプタートランスジェニックマウス（ＤＯ１１．１０マウス）のリンパ節から精製する（Ｍｕｒｐｈｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２５０：１７２０−１７２３，１９９０）。これらのＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＩＣパルスした樹状細胞と共に培養し、そして１次Ｔ細胞応答および２次Ｔ細胞応答の間のＴ細胞の増殖およびサイトカイン産生（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＩＬ−２）を測定する。Ｓ−ＯＤＮ  ２０８８およびエンドゾーム酸性化のインヒビターを使用して、ＴＬＲ９の役割を評価する。
【０１０８】
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１２．  Ａｈｅａｒｎら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４，２５１−２６２（１９９６）．
１３．  Ｌｅｍａｉｔｒｅら、Ｃｅｌｌ  ８６，９７３−９８３（１９９６）．
１４．  Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８８，３２３−３２４（１９９７）．
１５．  Ａｋｉｒａら、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２，６７５−６８０（２００１）．
１６．  Ｌｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６，７１２８−７１３５（２００１）．
１７．  Ｈｏｒｎｇら、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２，８３５−８４１（２００１）．
１８．  Ａｄａｃｈｉら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ９，１４３−１５０（１９９８）．
１９．  Ｈａｃｋｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２，５９５−６００（２０００）．
２０．  ＳｉｎｇａｌおよびＧｉｎｄｅｒ  Ｂｌｏｏｄ  ９３，４０５９−４０７０（１９９９）．
２１．  Ｈｅｍｍｉら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０８，７４０−７４５（２０００）．
２２．  Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６０，４７５５−４７６１（１９９８）．
２３．  Ｈａｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１７，６２３０−６２４０（１９９８）．
２４．  Ｂｅｎａｒｏｃｈら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１４，３７−４９（１９９５）．
２５．  Ｍａｓｓａｒｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（印刷中）．
２６．  Ｇｒｏｕｐ，Ｔ．Ｃ．Ｈ．Ｓ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２４，１５０−１５４（１９９１）．
２７．  Ｆｕｒｓｔら、Ａｒｔｈ．Ｒｈｅｕ．４２，３５７−３６５（１９９９）．
２８．  Ｌｅｎａｒｔら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．４，２４７−２５６（２００１）．
２９．  Ｓｈｌｏｍｃｈｉｋら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２８，８０５−８１１（１９８７）．
３０．  Ｚｅｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４，５０００−５００４（２０００）．
３１．  Ｂｏｔｔｏら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９，５６−５９（１９９８）．
３２．  Ｂｉｃｋｅｒｓｔａｆｆら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５，６９４−６９７（１９９９）．
３３．  Ｎａｐｉｒｅｉら、Ｎａｔ．Ｇｅｎ．２５，１７７−１８０（２０００）．
３４．  Ｓｃｏｔｔら、Ｎａｔｕｒｅ  ４１１，２０７−２１１（２００１）．
３５．  Ｂｅｌｌら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８５，１４８７−１４９６（１９９０）．
３６．  Ｂｅｌｌら、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ．６０，１３２６（１９９１）．
３７．  Ｍｏｌｌｅｒら、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４，４１６−４２４（１９７２）．
３８．  Ｂｌａｎｃｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２９４：１５４０−１５４３．，２００１．
３９．  Ｖａｌｌｉｎら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１５：１９６−２０２，１９９９．
４０．  Ｖａｌｌｉｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：６３０６−６３１３，１９９９．
４１．  Ｃｅｌｌａら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：９１９−９２３．，１９９９．
４２．  Ｓｉｅｇａｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２８４：１８３５−１８３７．，１９９９．
４３．  Ｈｏｏｋｓら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３０１：５−８．，１９７９．
４４．  Ｙｔｔｅｒｂｅｒｇら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．２５：４０１−４０６．，１９８２．
４５．  Ｂｅｎｇｔｓｓｏｎら、Ｌｕｐｕｓ．９：６６４−６７１．，２０００．
ここで引用される参考文献および本明細書全体を通して引用される参考文献は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
本明細書中に組みこまれ、そして本明細書の一部を構成する添付の図面は、本発明の実施形態を図示し、詳細な説明と共に、本発明の目的、利益、および原理を説明し、例示するために用いられる。
【図１】図１は、ＡＭ１４  ＲＦ＋Ｂ細胞の抗ヌクレオソーム抗体（ＰＬ２−３）刺激が、ＤＮａｓｅ感受性であることを示す。ＩｇＧ２ａ抗ヌクレオソーム抗体は、培地中のＢ細胞から放出されたクロマチンに結合し、そのＩｇＧ２ａ特異的抗原レセプターを介してＢ細胞に認識される、免疫複合体を形成する。ＡＭ１４  ＲＦ＋脾臓細胞を、ヤギ抗マウスＩｇＭ  Ｆ（ａｂ’）２、ＰＬ２−３（ＩｇＧ２ａｊ抗ヌクレオソームｍＡｂ）、またはＬＰＳの添加前に、１５分間、種々の濃度のＤＮａｓｅ  Ｉ（０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、または５０μｇ／ｍｌ）と共にプレインキュベートした。結果を、ＤＮａｓｅの非存在下における、各リガンドに対する最大応答のパーセントとして示す。
【図２ａ】図２は、抗ＴＮＰ／ＴＮＰ−ＢＳＡ  ＩＣが、ＡＭ１４  ＲＦ＋Ｂ細胞の増殖を効果的に刺激できなかったことを示す。抗ＴＮＰ  ｍＡｂｓ  Ｈｙｌ．２（ＩｇＧ２ａａ）およびＣ４０１０（ＩｇＧ２ａｂ）を、種々の濃度のＴＮＰ−ＢＳＡ［５０μｇ／ｍｌ（丸）、１２．５μｇ／ｍｌ（四角）、３．１μｇ／ｍｌ（上向き三角）］と混合し、それぞれ、１：１、４：１、および１６：１の抗体／タンパク質比を有するＩＣを形成した。図２ａにおいて、ＩＣ形成を、複合体化されていない抗体（下向き三角）に対するＣ１ｑ結合活性のシフトによって確認した。
【図２ｂ】図２は、抗ＴＮＰ／ＴＮＰ−ＢＳＡ  ＩＣが、ＡＭ１４  ＲＦ＋Ｂ細胞の増殖を効果的に刺激できなかったことを示す。抗ＴＮＰ  ｍＡｂｓ  Ｈｙｌ．２（ＩｇＧ２ａａ）およびＣ４０１０（ＩｇＧ２ａｂ）を、種々の濃度のＴＮＰ−ＢＳＡ［５０μｇ／ｍｌ（丸）、１２．５μｇ／ｍｌ（四角）、３．１μｇ／ｍｌ（上向き三角）］と混合し、それぞれ、１：１、４：１、および１６：１の抗体／タンパク質比を有するＩＣを形成した。図２ｂにおいて、ＲＦ＋Ｂ細胞増殖を刺激するための、上記の抗ＴＮＰ／ＴＮＰ−ＢＳＡ  ＩＣの能力を、抗ヌクレオソームｍＡｂ  ＰＲ１−３、非複合体化Ｈｙ１．２、Ｃ４０１０、または５０μｇ／ｍｌ  ＴＮＰ−ＢＳＡによって誘導される刺激と比較した。
【図３】図３は、ＲＦ＋Ｂ細胞の自己抗体／自己抗原−ＩＣ刺激が、補体レセプター依存性ではないことを示す。各２匹のＷＴコントロールマウス（灰色）、ＲＦ＋ＣＲ＋／＋マウス（白色）、およびＲＦ＋ＣＲ−／−マウス（網掛け）由来の脾臓細胞を、ヤギ抗マウスＩｇＭ  Ｆ（ａｂ’）２、ＣｐＧ  Ｓ−ＯＤＮ  １８２６、抗ヌクレオソームｍＡｂであるＰＲ１−３（ＩｇＧ２ａｊ）、ＰＬ２−３（ＩｇＧ２ａｊ）、ＰＬ２−８（ＩｇＧ２ｂ）、またはそれぞれの自己免疫マウス（ｌｐｒ／ｇｌｄおよびｇｌｄ）由来の３％血清で刺激した。
【図４ａ】図４ａ〜４ｃは、ＲＦ＋Ｂ細胞の自己Ａｂ／自己Ａｇ−ＩＣ刺激が、ＭｙＤ８８依存性であることを示す。図４ａにおいて、野生型（ＷＴ）およびＲＦ＋ＭｙＤ８８−／−マウス由来のＴ−枯渇脾臓細胞を、Ｂ２２０およびイディオタイプ特異的抗体である４Ｇ７で染色した。
【図４ｂ】図４ａ〜４ｃは、ＲＦ＋Ｂ細胞の自己Ａｂ／自己Ａｇ−ＩＣ刺激が、ＭｙＤ８８依存性であることを示す。図４ｂにおいて、ＭｙＤ８８  ＷＴまたはノックアウトマウスをＰＣＲによって同定した。
【図４ｃ】図４ａ〜４ｃは、ＲＦ＋Ｂ細胞の自己Ａｂ／自己Ａｇ−ＩＣ刺激が、ＭｙＤ８８依存性であることを示す。図４ｃにおいて、各２匹のＷＴ（灰色）、ＲＦ＋ＭｙＤ８８＋／＋（白色）、ＲＦ＋ＭｙＤ８８−／−（網掛け）マウス由来の脾臓細胞を、抗ＩｇＭ  Ｆ（ａｂ’）２、ＣｐＧ  Ｓ−ＯＤＮ  １８２６、ＬＰＳ、抗ヌクレオソームｍＡｂであるＰＲ１−３、ＰＬ２−３、ＰＬ２−８、または３％  ｌｐｒ／ｇｌｄ血清で刺激した。抗ＩｇＭ刺激培養物についての総ｃｐｍは、８３，４１４／３９，０４９（ＷＴ）；９３，１２６／６１，３１５（ＲＦ＋ＭｙＤ８８＋／＋）；および３９，８２６／５７，４８４（ＲＦ＋ＭｙＤ８８−／−）であった。結果を、抗ＩｇＭ応答のパーセントとして示し、これらの結果は、４つの別々の実験を示す。
【図５】図５ａ〜５ｃは、ＲＦ＋Ｂ細胞の自己Ａｂ／自己Ａｇ−ＩＣ刺激が、ＴＬＲ９シグナル伝達経路のインヒビターによってブロックされ得ることを示す。図５ａにおいて、ＲＦ＋Ｂ細胞を、１μｇ／ｍｌまたは２μｇ／ｍｌのクロロキンで１５分間プレインキュベートするか（ａ）、コンカナマイシンＢで２時間プレインキュベートするか（ｂ）、または阻害性ＣｐＧ  Ｓ−ＯＤＮ  ２０８８と共に（３０分間）プレインキュベートし（ｃ）、その後刺激性リガンドである抗ＩｇＭ  Ｆ（ａｂ’）２、５〜５０μｇ／ｍｌ  ＰＬ２−３、０．３〜２．０μｇ／ｍｌ  ＣｐＧ  Ｓ−ＯＤＮ  １８２６、ＬＰＳ、リポペプチド、もしくはポリン（ｐｏｒｉｎ）Ｂを添加した。図５Ｂにおいて、ＲＦ＋Ｂ細胞を、刺激性リガンドの添加前に、１２μｇ／ｍｌのＣｐＧ  Ｓ−ＯＤＮ  ２０８８と共に３０分間プレインキュベートした。結果を、インヒビターの非存在下における抗ＩｇＭ応答のパーセントとして示す。（図５ａ）および（図５ｃ）中のデータは、２〜４回の実験を示し、一方（図５ｂ）のデータは、２回の実験の平均値である。
【図６】図６Ａ〜Ｂは、ＭｙＤ８８欠損（ＭｙＤ８８−／−）Ｆａｓ充足マウスを、ＭｙＤ８８−充足（ＭｙＤ８８＋／＋）Ｆａｓ−欠損（ｌｐｒｌｐｒ）自己免疫マウスと交配して、ＭｙＤ８８−／−  ｌｐｒ／ｌｐｒマウスおよび適切なコントロール群を作成した実験の結果を示す。同一年齢のＭｙＤ８８＋／＋  ｌｐｒｌｐｒ（図６Ａ）およびＭｙＤ８８−／−ｌｐｒ／ｌｐｒ（図６Ｂ）の同腹子（１２〜１３週齢）の血清中の抗核抗体（ＡＮＡ）を、以前に記載されたように（Ｒｉｆｋｉｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１６１：５１６４−５１７０、１９９８）、基質としてＨＥｐ−２細胞を使用して間接的な免疫蛍光によって検出した。罹患した自己免疫ＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウス由来の血清をポジティブコントロールとして利用し、そして非自己免疫ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の血清をネガティブコントロールとして利用した。このインビボ実験は、標準マウス株および広範に使用された狼瘡マウス株において、抗体産生が、ＭｙＤ８８を介するシグナル伝達を必要とすることを示す。このことは、ＴＬＲ活性化が、このモデルにおいて狼瘡の発症のために必要であることを強く示唆する。
【図７】図７Ａ〜７Ｂは、Ｂ細胞が、ＴＬＲ９を介して活性化され得ること、およびこの活性化がＯＤＮ２０８８でのＴＬＲ９阻害によってブロックされ得ることを示す。Ｂ細胞は、ＭＲＬ＋／＋マウスの脾臓から精製され、そして種々の用量のＯＤＮ２０８８（ＴＬＲ９を介するシグナル伝達を特異的にブロックする阻害オリゴデオキシヌクレオチド）と共に３０分間プレインキュベートされるかまたはプレインキュベートされないかのいずれかであった。次いで、抗ＩｇＭ  Ｆ（ａｂ’）２（抗−ＩｇＭ）（Ｂ細胞レセプターを介して活性化する（７Ａ））または刺激性ＯＤＮ１８２６（ＴＬＲ９を介して特異的に活性化する（７Ｂ））を、培養物に添加した。２０〜２４時間後、３［Ｈ］チミジンを培養物に加え、さらに１４〜１８時間後、増殖を、ＬＫＢ  Ｗａｌｌａｃ  １２１２  Ｒａｃｋｂｅｔａ計数器を使用してチミジン取りこみを測定することによって決定した。ＴＬＲ９を介する刺激のみがＯＤＮ２０８８によってブロックされ、このことは阻害効果（Ｂ細胞レセプター架橋によって誘導された刺激が阻害されないこと）の特異性を示している。
【図８Ａ】図８Ａ〜８Ｃは、ＴＬＲ９を介して特異的に活性化され得る樹状細胞およびこの活性化が、ＯＤＮ２０８８でのＴＬＲ９阻害によってブロックされ得ることを示す。
【図８Ｂ】図８Ａ〜８Ｃは、ＴＬＲ９を介して特異的に活性化され得る樹状細胞およびこの活性化が、ＯＤＮ２０８８でのＴＬＲ９阻害によってブロックされ得ることを示す。
【図８Ｃ】図８Ａ〜８Ｃは、ＴＬＲ９を介して特異的に活性化され得る樹状細胞およびこの活性化が、ＯＤＮ２０８８でのＴＬＲ９阻害によってブロックされ得ることを示す。
【図９】図９は、クロマチン含有免疫複合体媒介性Ｂ細胞増殖に対するＯＤＮ２０８８の阻害効果が持続性であることを示す。Ｂ細胞は、ＭＲＬ＋／＋マウスの脾臓から精製され、１２μｇ／ｍｌのＯＤＮ２０８８と共に１６〜２０時間、プレインキュベートされるかまたはプレインキュベートされないかのいずれかであった。このプレインキュベーション後、この細胞を洗浄し、培養物からＯＤＮ２０８８を除去し、次いで、このＢ細胞を培地のみでかまたは１２μｇ／ｍｌの新たなＯＤＮ２０８８と共にかのいずれかで培養した。３０分後、抗クロマチンモノクローナル抗体ＰＬ２−３（５０μｇ／ｍｌ）またはＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）を培養物に加えた。２０〜２４時間後、３［Ｈ］チミジンを培養物に加え、さらに１４〜１８時間後、増殖を、ＬＫＢ  Ｗａｌｌａｃ  １２１２  Ｒａｃｋｂｅｔａ計数器を使用してチミジン取りこみを測定することによって決定した。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４ｃ】
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【図５】
2005501917.tif 000009
【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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