(57)【要約】  組織内の或る位置における1又はそれ以上のステインの量を測定することを目的として、組織学的ステインによる光の吸収の物理学的モデルを提供する。これは、後の分析において、スライド上の組織の検出において幾つかの改善をもたらす。すなわち、画像取得の間、フォーカスが組織に限定されるようなオートフォーカス・アルゴリズムについての改善、組織およびその特徴の画像分割および識別に対する改善、複数のステインが使用される場合のステインの識別に対する改善、およびステインの量の定量についての改善などである。本発明はステインの検出および定量に関するこれらの改善を、組織間の客観的比較、およびそのような特徴の表示と、遺伝子又はたんぱく質の同時発現パターンとの間のより密接な関連付けを提供するのに用いるものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織標本におけるステインの量を分析するための方法であって、
組織標本のカラー画像を捕捉する工程と；
背景画像を収集する工程と；
背景画像の各帯域中の平均値を計算する工程と；
該カラー画像から所定数のポイントをランダムにサンプリングする工程と；
主成分分析を行い、3つのベクトルを得る工程と；
該カラー画像をカラースペースに変形し、カラースペースの色により、存在するステインのタイプおよび量を示す工程と；
を具備してなる方法。
【請求項２】
該ステインが、溶液を含むヘマトキシリン染料からのものであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
該ステインが、溶液を含むヘマトキシリン染料およびエオシン染料からのものであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
該カラー画像が３つのカラー帯域を有することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
該３つのカラー帯域が、レッド、グリーンおよびブルーであることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
組織標本におけるステインの量を分析するための方法であって、
組織標本のカラー画像を捕捉する工程と；
該カラー画像をカラースペース表示に変形させ、それにより各点がレッド、グリーンおよびブルーの色の強度からなる数値の三つ組みにより表されるようにする工程と；
光源およびカラー画像の或る点に関して定義されるステイン曲線を確定する工程と；
該ステイン曲線に沿って該光源を表す三つ組みから上記の或る点を表す三つ組みまでのカラースペースにおける距離を計算する工程と；
ステインの量を計算する工程と；
を具備してなる方法。
【請求項７】
該ステインが、溶液を含むヘマトキシリン染料からのものであることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
該ステインが、溶液を含むヘマトキシリン染料およびエオシン染料からのものであることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項９】
組織標本におけるステインの量を分析するための方法であって、
組織標本のカラー画像を捕捉する工程と；
該カラー画像を記述する3次元カラースペースを形成する工程と；
該3次元カラースペースに基づいて主成分分析を行う工程と；
該主成分分析の結果を利用して変換マトリックスと形成する工程と；
該変換マトリックスを利用してステインの量を計算する工程と；
を具備してなる方法。
【請求項１０】
組織標本におけるステインの量を分析するための方法であって、
組織標本を染色する工程と；
該組織標本のカラー画像を作成する工程であって、該画像が複数の画素から構成され、該画素の夫々がレッド、グリーンおよびブルーの副画素から構成され、該副画素の夫々が色の強さを有し、各画素の色の強さが3成分の強度値を画成するようにする工程と；
背景画像を収集する工程と；
該3成分の強度値を3成分の光学濃度値に変換する工程と；
該光学濃度値をランダムに採取して、統計的に有意な結果を得るのに十分に多い数値を得る工程と；
該ランダムに採取した光学濃度値に基づいて主成分分析を行い、新たな座標系を得る工程と；
該新たな座標系を利用して変換マトリックスを画成し該3成分の光学濃度値を3成分値に変換し、該3成分値の成分が、その点におけるステインの量と比例するようにする工程と；
を具備してなる方法。
【請求項１１】
組織標本におけるステインの量を分析するための方法であって、
組織標本を染色し、該組織標本の特徴を染色させる工程と；
該組織標本のカラー画像を作成する工程であって、該画像が複数の画素から構成され、該画素の夫々がレッド、グリーンおよびブルーの副画素から構成され、該副画素の夫々が色の強さを有し、各画素の色の強さが3成分の強度値を画成するようにする工程と；
背景画像を収集する工程と；
該3成分の強度値を3成分の光学濃度値に変換する工程と；
該光学濃度値をランダムに採取して、統計的に有意な結果を得るのに十分に多い数値を得る工程と；
該ランダムに採取した光学濃度値に基づいて主成分分析を行い、新たな座標系を得る工程と；
該新たな座標系を利用して変換マトリックスを画成し該3成分の光学濃度値を3成分値に変換し、該3成分値の成分が、その点におけるステインの量と比例するようにし、かつ、その点におけるステインの量が該組織の特徴の量に比例するようにする工程と；
を具備してなる方法。
【請求項１２】
組織標本におけるステインの量を分析するための方法であって、
第1のステインおよび第２のステインからなる２つのステインを用いて組織標本を染色する工程と；
該組織標本のカラー画像を作成する工程であって、該画像が複数の画素から構成され、該画素の夫々がレッド、グリーンおよびブルーの副画素から構成され、該副画素の夫々が色の強さを有し、各画素の色の強さが3成分の強度値を画成するようにする工程と；
該3成分の強度値をステインの量に直線的に関連する異なる3成分値に変換する工程と；
該異なる3成分値をランダムに採取して、統計的に有意な結果を得るのに十分に多い数値を得る工程と；
該ランダムに採取した異なる3成分値に基づいて主成分分析を行い、新たな座標系を得る工程と；
該新たな座標系を利用して変換マトリックスを画成し該異なる3成分値を3成分値に変換し、該3成分値の１成分が、その点における上記第1のステインの量と比例するようにし、かつ、該3成分値の第2の成分が、その点における上記第２のステインの量と比例するようにする工程と；
を具備してなる方法。
【請求項１３】
3つのステインで染色された組織標本におけるステインの量を分析するための方法であって、
第1のステイン、第２のステインおよび第３のステインからなる３つのステインを用いて組織標本を染色する工程と；
該組織標本のカラー画像を作成する工程であって、該画像が複数の画素から構成され、該画素の夫々がレッド、グリーンおよびブルーの副画素から構成され、該副画素の夫々が色の強さを有し、各画素の色の強さが3成分の強度値を画成するようにする工程と；
背景画像を収集する工程と；
フィルターを用いて該第3のステインの色を濾別する工程と；
該3成分の強度値をステインの量に直線的に関連する異なる3成分値に変換する工程と；
該異なる3成分値をランダムに採取して、統計的に有意な結果を得るのに十分に多い数値を得る工程と；
該ランダムに採取した異なる3成分値に基づいて主成分分析を行い、新たな座標系を得る工程と；
該新たな座標系を利用して変換マトリックスを画成し該異なる3成分値を3成分値に変換し、該3成分値の１成分が、その点における上記第1のステインの量と比例するようにし、かつ、該3成分値の第2の成分が、その点における上記第２のステインの量と比例するようにする工程と；
を具備してなる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、2001年5月29日の出願第60/294097号による優先権を主張するものであり、出願第60/294097号に記載された文章は参照により本明細書中に含まれるものとする。
本発明は、一般的に、組織の構造的特徴（組織情報）の客観的特徴付けおよび分析を行うための組織病理学的組織標本のデジタル画像処理に関するものである。このような組織情報は、その組織の収集、保存および組織学的染色についての異なったプロトコルを用いて異なった時間で行われた検査を介して得られた組織情報との比較および組合せを可能にする。本発明は特に、組織学的ステインによる光の吸収についての物理学的（physical）モデルに基づく、組織内の特定の位置内のステイン（stain；汚染、しみ）の量を測定するためのシステムおよび方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
一般に、組織の正確で再現性良好な定量分析は、種々の病状の進行を特徴づけるたり、新規な治療法の予想される効果を評価したりするのに重要である。今日まで、組織レベル（1ないし1000ミクロン、つまり、顕微鏡ないし拡大鏡の範囲）での信頼できる構造的情報は殆ど得られていなかった。信頼性のある多次元的組織構造情報が、アクセス容易なデータベース中に存在し、このデータベースが臨床的および分子的（遺伝子的）情報を含む新規に得た情報と継続的に同化し得るものであれば、そのような情報は、組織工学、薬剤の設計および発展、遺伝子発見、プロテオミクス（proteomics）、およびゲノミクス(genomics)研究における新たな前進を向上させ、加速させるのに役立つと信じられる。
【０００３】
特に、本発明は組織病理学的組織標本におけるステインの検出および解釈の改善を介して、組織病理学的組織標本のデジタル画像の分析法を改善することに関するものである。組織の構造的特徴を同定、定量化する自動分析システムの開発により、組織間の客観的比較が図られると共に、その特徴の表示と、遺伝子又はたんぱく質の同時発現パターンとの間の密接な関連付けが可能となる。
【０００４】
自動化分析システムに対し幾つかの要件がある。自動化システムは数時間、無人で操作できるものでなければならない。スライド式供給、スライド式位置決め、組織検出、オートフォーカス、画像および画像捕捉は、全て、ステイン分析が始まる前に完了されなければならない工程である。この自動化プロセスは、病理学者による組織画像の捕捉および保存の手動プロセスに似せたものである。この工程の技術的難点は、組織構造および組織配置が満足なものでなくても、このプロセスを頑強なものとしなければならないことである。本発明は、頑強な分析システムの構築を可能にするステイン検出技術を開示するものである。
【０００５】
例を挙げて、解決された問題について説明する。抗体ステイニングは、組織中の特定のたんぱく質の存在を検出するのに使用され、抗体ステイニング中のステインの検出および解釈についての改善された方法は、研究者が治療に役立つ能力を有する抗体を迅速に識別するのを助ける。特定の抗体ステイニングは、客観的分類および定量のための構造的特徴を位置づけする。なぜならば、CD31抗体は、新規な血管形成を示唆する内皮成長因子を標識付けするからである。セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼをマーカーとして使用する場合、形成された着色化合物は優先的にグリーン光およびブルー光を吸収し、赤色光を吸収しない。組織の特定の抗体ステイニングが発生する場合、それは通常、得られた画像がグリーン光およびブルー光の非常に強い吸収を示すように発生する。その結果観察される色は暗赤褐色である。組織が弱いステイニングを示す領域においては、その色は暗赤褐色に至るまでの光の範囲で変化する。例え組織がステイニングの弱い領域を示す場合でも、これは有意なものではない。なぜならば、その組織は暗く染色された領域の存在のため特定のステイニングを示すものとして既に認識されているからである。その結果、特定のステイニングの存在は通常、単色の小さな範囲内での色の存在により検出される。特定のステインは、組織の或るパーセンテージが暗色の特定のステイニングを有し、そのパーセンテージがユーザーにより特定された閾値を超えたとき、組織内に存在するものと判定される。
【０００６】
問題は、組織が弱い特定のステイニングのみを示す場合である。非特異的ステイニングは更に小さな程度のステイニングを示し、その結果得られる画像はグリーン光およびブルー光のより少ない吸収を示すものとなる。その結果の色は、ライトブラウンである。特定のステイン検出に対する単色のアプローチはうまく働かない。その代わりに、特定のステイニングを示唆する色は2色の間の範囲、つまり、暗赤褐色ないし明赤褐色の範囲内になる。問題は次に、非特異的ステイニングを排除しつつ、更に低い偽のポジティブ検出速度を維持しつつ、弱い特定のステイニングを検出することである。
【０００７】
本発明は現時点における問題を克服しようとするものである。現在の組織の可視的/手動的分析は、遅く、困難を伴い、誤認が生じ易く、主観的である。標本調製およびステイン・フォーミュレーションの可変性のため、可視的分析を介して、あるいはステインの色を或る組織成分と関連づけるための外部的照合を適用する自動化又はコンピュータ操作の分類装置を介しての組織又は組織セット間の比較可能性が損なわれることになる。本発明は、染色組織画像の色情報をどのように変形させて、染色組織画像の各画素におけるステインのタイプおよび量を検知するかを記述するものである。更に、本発明はどのようにして、統計的に有意な結果を迅速に得るかを記述するものである。
【発明の開示】
【０００８】
本発明は、一般的に、頑強な自動化分析システムによる組織の構造的特徴（組織情報）の客観的特徴付けおよび分析を行うための組織病理学的組織標本のデジタル画像処理に関するものである。組織の構造的特徴を識別し定量化する頑強なシステムの開発により、組織間の客観的比較が図られると共に、そのような特徴の表示と、遺伝子又はたんぱく質の同時発現パターンとの間のより密接な関連付けを可能にするものである。
【０００９】
本発明は特に、染色された組織学的標本の領域に存在するステインの量を、上記標本を介して伝達された光の色および強度と関係づけるステイン吸収の物理学的モデル開示するものである。本発明は染色された組織領域の改善された自動的検出、並びに各組織領域に存在するステイン量の定量を可能にする。異なるステインの相対的吸収が、組織構造の可視化を可能にする手段であるから、コンピュータを利用してこれらのステインを検出することにより、組織構造の分析が容易となる。
【００１０】
一般的形態として、本発明は組織標本におけるステインの量を分析するための方法を提供するものであって、その方法は、組織標本の画像を捕捉することを含む。背景画像は、基材（例えば、組織片を装着するために使用される顕微鏡用スライド）の組織が付着していない領域から集められる。背景画像の各帯域における平均値が計算される。背景画像からの情報はカラー画像の調節のために使用される。このカラー画像から、所定数の点がランダムに採取される。
【００１１】
次に、3つのベクトルを得るための主成分分析が行われる。最後にカラー画像がカラースペースに変形され、そこで、カラースペースの色が、存在するステインのタイプおよび量を示すことになる。
【００１２】
吸収媒体を通過する単色光の強度は、I=I０e-αsにより測定される（ここで、I０は入射光の強度；αは吸収媒体の吸光係数として知られているもの；sは染色された標本（媒体）中の染料の濃度と、光を通過する或るステインを含む組織の厚みとの積である）。
【００１３】
1つの形態として、本発明は組織標本におけるステインの量を分析するための方法を提供するものであって、その方法は、染色された組織標本の画像を捕捉する工程と；組織標本を支持するのに使用された基材から背景画像を収集する工程と；背景画像の各帯域中の平均値を計算する工程と；カラー画像から所定数のポイントをランダムにサンプリングする工程と；主成分分析を行い、3つのベクトルを得る工程と；カラー画像をカラースペースに変形し、カラースペースの色により、存在するステインのタイプおよび量を知る工程とを具備してなる。
【００１４】
ステイニング反応において、染料（ヘマトキシリンおよび/又はエオシン（H&Eステインの場合））は染色された物質中に溶解させてもよい。染料は構造体（例えば、抗体）の表面にて吸収されるか、又は染料は、ステイニング溶液のpH、温度などに依存しながら構造体内に析出されることになる。着色は使用されるステイニング溶液の種類により変化する。塩基性染料（例えばH&Eステイン）により染色された物質は好塩基性となる。ヘマトキシリンおよびエオシンを含有するステイニング溶液は１つのそうようなステイニング溶液である。
【００１５】
他の形態として、組織標本におけるステインの量を分析するための方法が提供され、その方法は、染色された組織標本の画像を捕捉する工程と；カラー画像をカラースペース表示に変形させ、それにより各点がレッド、グリーンおよびブルーの色の強度からなる数値の三つ組みにより表されるようにする工程と；光源およびカラー画像の或る点に関して定義されるステイン曲線を確定する工程と；該ステイン曲線に沿って該光源を表す三つ組みから上記の或る点を表す三つ組みまでのカラースペースにおける距離を計算する工程と；ステインの量を計算する工程とを具備してなる。
【００１６】
更に他の形態として、組織標本におけるステインの量を分析するための方法が提供され、その方法は、染色された組織標本のカラー画像を捕捉する工程と；カラー画像を記述する3次元カラースペースを形成する工程と；該3次元カラースペースに基づいて主成分分析を行う工程と；該主成分分析の結果を利用して変換マトリックスと形成する工程と；該変換マトリックスを利用してステインの量を計算する工程とを具備してなる。
【００１７】
更に他の形態として、組織標本におけるステインの量を分析するための方法が提供され、その方法は、組織標本を染色する工程と；該組織標本のカラー画像を作成する工程であって、該画像が複数の画素から構成され、該画素の夫々がレッド、グリーンおよびブルーの副画素から構成され、該副画素の夫々が色の強さを有し、各画素の色の強さが3成分の強度値を画成するようにしたものと；背景画像を収集する工程と；該3成分の強度値を3成分の光学濃度値に変換する工程と；該光学濃度値をランダムに採取して、統計的に有意な結果を得るのに十分に多い数値を得る工程と；該ランダムに採取した光学濃度値に基づいて主成分分析を行い、新たな座標系を得る工程と；該新たな座標系を利用して変換マトリックスを画成し該3成分の光学濃度値を3成分値に変換し、該3成分値の成分が、その点におけるステインの量と比例するようにした工程とを具備してなる。
【００１８】
更に他の形態として、組織標本におけるステインの量を分析するための方法が提供され、その方法は、組織標本を染色し、該組織標本の特徴を染色させる工程と；該組織標本のカラー画像を作成する工程であって、該画像が複数の画素から構成され、該画素の夫々がレッド、グリーンおよびブルーの副画素から構成され、該副画素の夫々が色の強さを有し、各画素の色の強さが3成分の強度値を画成するようにしたものと；背景画像を収集する工程と；該3成分の強度値を3成分の光学濃度値に変換する工程と；該光学濃度値をランダムに採取して、統計的に有意な結果を得るのに十分に多い数値を得る工程と；該ランダムに採取した光学濃度値に基づいて主成分分析を行い、新たな座標系を得る工程と；該新たな座標系を利用して変換マトリックスを画成し該3成分の光学濃度値を3成分値に変換し、該3成分値の成分が、その点におけるステインの量と比例するようにし、かつ、その点におけるステインの量が該組織の特徴の量に比例するようにした工程とを具備してなる。
【００１９】
更に他の形態として、組織標本におけるステインの量を分析するための方法が提供され、その方法は、第1のステインおよび第２のステインからなる２つのステインを用いて組織標本を染色する工程と；該組織標本のカラー画像を作成する工程であって、該画像が複数の画素から構成され、該画素の夫々がレッド、グリーンおよびブルーの副画素から構成され、該副画素の夫々が色の強さを有し、各画素の色の強さが3成分の強度値を画成するようにしたものと；該3成分の強度値をステインの量に直線的に関連する異なる3成分値に変換する工程と；該異なる3成分値をランダムに採取して、統計的に有意な結果を得るのに十分に多い数値を得る工程と；該ランダムに採取した異なる3成分値に基づいて主成分分析を行い、新たな座標系を得る工程と；該新たな座標系を利用して変換マトリックスを画成し該異なる3成分値を3成分値に変換し、該3成分値の１成分が、その点における上記第1のステインの量と比例するようにし、かつ、該3成分値の第2の成分が、その点における上記第２のステインの量と比例するようにした工程とを具備してなる。
【００２０】
更に他の形態として、組織標本におけるステインの量を分析するための方法が提供され、この場合、染色された組織標本に対し３つのステインが使用される。つまり、その方法は、第1のステイン、第２のステインおよび第３のステインからなる３つのステインを用いて組織標本を染色する工程と；該組織標本のカラー画像を作成する工程であって、該画像が複数の画素から構成され、該画素の夫々がレッド、グリーンおよびブルーの副画素から構成され、該副画素の夫々が色の強さを有し、各画素の色の強さが3成分の強度値を画成するようにしたものと；背景画像を収集する工程と；フィルターを用いて該第3のステインの色を濾別する工程と；該3成分の強度値をステインの量に直線的に関連する異なる3成分値に変換する工程と；該異なる3成分値をランダムに採取して、統計的に有意な結果を得るのに十分に多い数値を得る工程と；該ランダムに採取した異なる3成分値に基づいて主成分分析を行い、新たな座標系を得る工程と；該新たな座標系を利用して変換マトリックスを画成し該異なる3成分値を3成分値に変換し、該3成分値の１成分が、その点における上記第1のステインの量と比例するようにし、かつ、該3成分値の第2の成分が、その点における上記第２のステインの量と比例するようにした工程とを具備してなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
一般的に、本発明は、手動による測定の場合に見られる不確実性、不正確性、遅延および主観性を回避しつつ、組織を定量的に評価する自動測定および分析システムに対する新規なアプローチを提供するものである。更に、本発明は頑強なデータベースに関するもので、これは異なる研究から均一に調査され、抽出された入力パラメータに基づいている。更に、本発明は、異なる時間、異なるプロコトコル、異なるシステムによりなされた測定でなされた研究と比較するのに必要なデータおよび画像の入力および検索を可能にするデータベースに関するものである。更に、本発明は、後に得られた情報との継続的、非損失的組合せおよび比較を介しての貯蔵された情報の利用性並びに自動再分析のための保存画像のアクセス性を維持したデータベースに関するものである。
【００２２】
特に、本発明は、組織内の或る位置におけるステインの量を測定することを目的として、組織学的ステインによる光の吸収の物理学的モデルを提供する。これは、後の分析において、スライド上の組織の検出において幾つかの改善をもたらす。すなわち、画像取得の間、フォーカスが組織に限定されるようなオートフォーカス・アルゴリズムについての改善、組織およびその特徴の画像分割および識別に対する改善、複数のステインが使用される場合のステインの識別に対する改善、およびステインの量の定量についての改善などである。本発明はこれらの改善を、ステインの検出および定量に適用すること、並びに特定の抗体ステイニングの検出に適用することを開示するものである。
【００２３】
ステイン吸収の物理学的モデルは、透過光の色および強度を有する染色された組織学的標本の領域内に存在するステインの量に関係する。これは染色された組織領域の検出の改善および各組織領域に存在するステインの量の判定の改善を可能にする。これらの改善は、翻って、デジタル画像における組織の検出の改善を可能にし、これはオートフォーカス・アルゴリズムの速度に強い影響を与える。異なるステインの相対的吸光度が、組織構造を可視化させる手段となるから、コンピュータを利用したこれらの構造の検出が容易となる。最後に、画像中の色帯域の数よりも少ない数のステインで染色された組織のデジタル画像にとって、画像中のあらゆる点でのステイン量の定量は、基本的画像圧縮を見込むことができる。
【００２４】
本発明は以下の説明により、一層容易に理解されるであろう。デジタルカラー画像における全ての画素は数種の色帯域のそれぞれに或る強度が割り当てられる。殆どのカラー画像において、3種のカラー帯域（レッド、グリーンおよびブルー）が存在する。（大抵の場合、特に断りのない限り、以下の説明において、3種の色帯域が存在するものと推定する）。従って、各画素について、3つの値を3次元空間（カラースペースと呼ばれる）中にプロットすることができ、それにより画像の別の記述が生じることになる。図1は画像中に画素の幾つかをプロットしたものである。
【００２５】
画像の限界操作（限界を定める操作）を行うため、このカラースペースにおいて容積を画定する必要があり、更に、画素を2つのクラス、すなわち、カラースペースの値の三つ組が、画成された容積内に該当するクラスと、カラースペースの値の三つ組がその容積外にあるクラスとに分割する必要がある。一般には、この容積は球又は軸がカラースペースの軸と平行な平行六面体として画成される。しかし、カラースペースにおける点の構成を判定したり、画像境界画定（image thresholding）を改善するために、画像を形成させる物理的プロセスを考慮したりすることも可能である。僅か単一のタイプのステインのみを有する小さな領域の染色組織を考慮してみる。顕微鏡光源のためのカラースペース・トリプレット（三つ組み）が（I0ｒ，I0ｇ，I0ｂ）であるとする。（従って、これは顕微鏡を介して見たときの組織のデジタル画像中の“背景”又は非組織領域のためのトリプレットでもある）。光が組織領域を透過したとき、ステインにより減衰し、ステインの量が大きいほど、減衰も大きくなる。このように、異なるステイン量を有する点のカラースペース・トリプレットはカラースペース中の曲線に沿って横たわり、この曲線は背景又は光源を表すトリプレットから始まり、伝達された光の無い位置又は（0,0,0）で終わるであろう。この曲線の方程式は現在知られていないが、指数関数的又は直線的減衰に従うものと思われる。指数関数的減衰については、つまり、先に形成されたステインの上にステインが蓄積されることによりステインの増大が発生する場合、曲線上の点（トリプレット）、つまり、（Iｒ，Iｇ，Iｂ）で表されるものは以下の式で与えられる：
（Iｒ，Iｇ，Iｂ）＝（I０ｒe-αrs，I０ｇe-αgs，I０ｂe-αbs）     (1)
ここで、αr、αg、αbは各帯域についての減衰係数であり；xは存在するステインの量である。直線的減衰については、つまり、ステインが組織領域の大きい割合を占めたときに、ステインの増大が発生する場合、曲線上の点（トリプレット）は以下の式で与えられる：
（Iｒ，Iｇ，Iｂ）＝（I０ｒ[1-αrs]，I０ｇ[1-αgs]，I０ｂ[1-αbs]）     (2)
組織切片に存在する各ステインについて、別の曲線がカラースペース中に存在する。例えば、図2は2つのステインを有する免疫組織化学的に染色された組織の画像から採取された点を示している。
【００２６】
組織上の各点についてのカラースペース・トリプレットは、その点での組織中に存在する各ステインについてのカラースペース・トリプレットの合計となるであろう。各付加的ステインはカラースペース中に付加的曲線を生じさせ、適用されるステインの数については理論的に制限はない。
【００２７】
染色された組織学的標本の画像の形成を物理的に記述することにより、ステイニングをより正確に検出することができる。ステイン検出の一般的な方法は、上述のように、球又は軸がカラースペースの軸と平行な平行六面体を画成することにより境界を画像に適用するものであるが、物理学的モデルの使用により、より適当な容積の選択を可能にする。例えば、図３において、曲線の周りに断面四角形の容積が描かれている。なお、この曲線は検体組織に存在するステインの1つの異なる量を表している。この容積は組織学における変数を補償するような方法で自動的に判定することができる。
【００２８】
組織病理学的組織標本の作成において変化性に取り組むようにしたこの能力により、本発明を従来の分析のための組織画像処理方法とは特異的に区別させるものとなる。このような変化性の存在において、組織の特徴又は構造的特徴の客観的測定の自動的比較は困難となる。組織上の特定の位置でのステインの存在を類別するための固定的参照は、ステインが僅かに適用された組織の関連する特徴を専断的に除外することになる。
【００２９】
特定のステインの色を表すカラースペース中の領域を明確に画定するこの能力により、画像中の任意の点におけるステインの量の測定が可能になり、この作業は他の方法では困難である。組織中の任意の点に存在するステインの量は、光源を表すトリプレットから、問題の点を表すトリプレットまでのステイン曲線に沿うカラースペースにおける距離を計算することにより判定することができる。このステインの量はついで、式１又は２を用いて計算することができる。生物学的パラメータの見積りは存在するステインの量から類推することができる。この分析から利益を受ける最も重要な生物学的パラメータは、明らかに、ステインが向上しようとし、そのためにステインが適用されたところの特徴である。例えば、ヘマトキシリンを正確に検出する能力により、H&E-染色組織切片中の核を検出する能力が改善され、van Gieson染色プロトコルで使用される酸フクシンによりステインの量を正確に検出する能力により、Verhoeff-van Gieson染色組織切片におけるコラーゲンを検出する能力が改善され、CD31抗体ステイニングを検出する能力により、アニオジェニシス（aniogenesis）の研究における新規な血管形成の探索、測定の能力が改善されるであろう。
【００３０】
デジタル画像におけるステインの特徴をモデル化する能力により、他の画像処理アルゴリズムの機能、とりわけ、最も重要であるオートフォーカスおよび画像圧縮の機能が改善される。オートフォーカス・アルゴリズムの最も困難な点の１つは、画像が組織の領域を含んでいるか否かの判定である。なぜならば、このようなアルゴリズムは、組織又は他の特徴を含まない画像に対してはうまく働かないからである。画像の各帯域について画素強度のヒストグラムを検査することにより画像中の組織の存在を判定する試みが一般に行われている。この方法はしかしながら、しきい値を適用する通常の方法と同様の欠点を有している。画像中のステインの特徴を良好に判定する能力、つまり、カラースペース表示から画像が組織を含むか否かを正確に判定する能力は、オートフォーカス・アルゴリズムの失敗を防止することができる。
【００３１】
上記モデルは画像圧縮を助けることができる。もし、組織に対し２つのステインが使用される場合、カラースペース表示における全ての点は平面中に存在しなければならない。もし、３つのステインが使用される場合、全ての点は3次元の超平面中に存在しなければならない（以下同様）。もし、新たなカラースペース軸をカラースペース・ステイン曲線に沿って存在するように選択した場合、画像はステインの数と同じ数のカラー帯域で表示することができる。例えば、H&E-染色組織切片の画像（2つのステインを有する）は、通常のレッド、グリーンおよびブルーの３つではなく、2つのカラー帯域で表示されることになる。これは画像を最初のサイズの2/3に圧縮するものである。
【００３２】
具体例の詳細
ベア‐ランベルトの吸光度の法則（これはほぼ正確に過ぎない）に従って、吸収媒体を透過した単色光の透過強度が下記式で与えられる：
I＝I０e-αs
ここで、I０は入射光の強さ；αは吸収媒体の吸光係数として知られているもの；sは吸収媒体の濃度と、光路の長さとの積である。ベア‐ランベルトの法則は入射光のあらゆる波長について、又、あらゆる波長についてαの値が異なる場合でも有効である。従って、N帯域を有する画像表示装置に対し、ベア‐ランベルトの法則は以下のように表すことができる：
2005509140.tif 000002
ここで、I０jは帯域jにおける入射光の強さであり；αjは帯域jにおける吸光係数である。もし、多数の吸収媒体が存在する場合（組織学的に作られた組織標本の場合の多重ステイン）、吸光作用は増殖性のものとなる。従って、例えば、2つのステインの場合、透過した光の強さは以下のようになる：
2005509140.tif 000003
2005509140.tif 000004
ここで、β値は第2のステインについての吸光係数；tは第2のステインについての濃度と、光路の長さとの積である。
【００３３】
計算を更に容易にするため、光学濃度が計算される。もし、Djが帯域jにおける光学濃度を表すとすると、光学濃度は以下の式によって与えられる：
2005509140.tif 000005
従って、2つのステインの場合、光学濃度は以下の式によって与えられる：
2005509140.tif 000006
【００３４】
2つのステインを有する組織学的に作成された組織については、α値およびβ値は2つのステインのいずれについても一定であるが、sとtの値については、ステインの濃度および光路の長さが変化することにより、1つの画素の位置と、次の画素の位置とでは異なることになる。従って、画像から計算される光学濃度の値は、全ての可能な光学濃度値の空間における面内に存在しなければならない。
【００３５】
組織学的に作成、染色された組織標本の画像における伝達された光の強さの行動についてのこの知識に基づいて、各画素位置に存在するステインの各タイプの量（濃度と光路の長さとの積）を示す画像を作成することができる。明確を期するため、2つのステインの場合について記述するが、この方法はこれに限定されるものではない。
【００３６】
以下のものは1つの方法であり、ステイニングの光学濃度の記述および画像形成を利用する唯一の方法ではない。
【００３７】
１．画像中の全ての点での光学濃度（各帯域）が、画像中の各画素の値を背景画像中の対応する画素の値で割り、ついでこの値の自然対数の負号を取ることにより計算される。これを式で表すと以下の通りとなる。
（Dr，Dg，Db）＝（-ln(r/r0), -ln(g/g0), -ln(b/b0)）
ここで、（Dr，Dg，Db）は画素でのレッド、グリーンおよびブルーチャンネルにおける光学濃度を夫々示す。同様に、ｒ、ｇ、ｂは画素でのレッド、グリーンおよびブルーチャンネルにおける値を夫々示し、ｒ０、ｇ０、ｂ０は背景画像における対応する画素でのレッド、グリーンおよびブルーチャンネルにおける値を夫々示す。[これらレッド、グリーンおよびブルーチャンネルを副画素と呼んでもよい]
【００３８】
２．所定数の点が、結果的に得られた光学濃度画像からランダムに採取され、それらの（Dr，Dg，Db）トリプレットが記録される。採取された点の数は統計的に有意な結果を得るのに十分に大きくなくてはならないが、しかし、計算を迅速に行うために十分に小さくなくてはならない。一般に、1000個の点が採取される。図４はランダムに選択された点の（Dr，Dg，Db）トリプレットを示すグラフである。これらの点はほぼ三角形の平面領域に分布しており、三角形の頂点は（０００）に位置している。
【００３９】
３．主成分分析がこの採取された点で行われる。その結果、3つのベクトル又は主成分並びに主値と呼ばれる関連のスカラーが得られる。最も大きい主値の主成分が分布に最も適合する（ベストフィット）ラインに沿って存在し、2つの最も大きい主値を有する2つの成分が上記分布に最も適合する面を画成し、最も小さい主値を有する主成分が上記の最も適合する面に対して垂直となっている。図2は光学濃度トリプレットの分布に重複する主方向に沿うベクトルを示している。
【００４０】
４．上記分布中のトリプレットの全てが第2の最も大きい主成分に向けて投影される。結果的に得られた値は分類される。
【００４１】
５．全ての投影の或る割合よりも大きい値が見出され、x1と表示され；全ての投影の或る割合よりも小さい値が見出され、x２と表示される。例えば、x1およびx２は、投影値の９５％がx１よりも小さく、投影値の９５％がx２よりも大きくなるように設定することができる。
【００４２】
６．投影により値x１およびx２を生じさせるトリプレット（複数）が見出される。これらのトリプレットは、P1＝（Dr１，Dg１，Db１）およびP２＝（Dr２，Dg２，Db２）で表される。
【００４３】
７．これらのトリプレットの、最も大きい主成分へ向けての投影が見出される。
【００４４】
８．第1および第2の最も大きい主成分に向けての投影から、ベストフィット面に向けてのP1およびP2の投影を見出すことができる。ベストフィット面に向けての投影のトリプレットは、P３＝（Dr３，Dg３，Db３）およびP４＝（Dr４，Dg４，Db４）で表される。
【００４５】
９．原点からP３およびP4に向けての単位ベクトルが計算される。これら単位ベクトルはv1およびv2で表され、これらは画像中に存在する2つの純粋なステインの夫々についての光学濃度空間における曲線に対する近似を表している。
【００４６】
１０．新規な座標系がベクトルがv1、v2およびv3で画成される。ここで、v3は最も小さい主成分の方向のユニットベクトルであり、v1、v2およびv3は右手方向の座標系を形成する。図6はサンプル点の分布に重複した新規な座標系基底ベクトルに平行なベクトルを示している。
【００４７】
１１．当初の光学濃度空間の基底ベクトル、すなわち、Dr、DgおよびDb方向に沿うユニットベクトルがvr、vgおよびvbで表される。変換マトリックスMは以下のように形成される。つまり、M=
v1・vr    v1・vg    v1・vb 
v2・vr    v2・vg    v2・vb 
v3・vr    v3・vg    v3・vb 
v1・vrの表示はv1とvrとの間のベクトルドットの積を表している。
【００４８】
１２．工程1で発生させた光学濃度画像の全ての点について、そのトリプレット（Dr，Dg，Db）を見出し、それを以下の式に従って変換し：
（a,b,c）＝（Dr，Dg，Db）M-1
当初のトリプレット（Dr，Dg，Db）を新規なトリプレット（a,b,c）によって置き換える。その結果得られた画像の第1および第2のチャンネルは夫々、当初の画像に存在した2つのステインの１つについての情報を含み、第3の帯域はノイズを含む。或る点において或るチャンネルにおける値は、その点に存在するチャンネルのより表されるタイプのステインの量に比例する。
【００４９】
ベア‐ランベルトの法則を以下のように近似させることも可能である。
2005509140.tif 000007
2つのステインの場合、それにより以下の関係式が得られる：
2005509140.tif 000008
【００５０】
存在する吸収媒体が少なければ少ないほど、この近似法はより正確になる。この近似法により、光学濃度のコンピュータ操作による高価な計算が少なくて済む。更に、入力光と、伝達される光の強さとの間に直線的関係が或るため、光学濃度について行われるものと類似の計算を光の強度に対して直接的に行うことができる。この場合、以下の式が成り立つ：
2005509140.tif 000009
【００５１】
入射光が略白色光に近い場合に見られるように、もし、各帯域について入射光の強さが略等しい場合（殆どの透過型顕微鏡の適用ではそうなる）は、上記式は以下のように簡略化することができる：
2005509140.tif 000010
【００５２】
以下の計算は光学濃度の場合のものと平行的なものとなる。
以下のものは1つの方法であり、ステイニングの近似的強さに基づく記述および画像形成を利用する唯一の方法ではない。
【００５３】
１３．背景画像の各帯域中の平均値が計算され、カラースペース・トリプレットとして保存される。このトリプレットは（r0，g０，b０）として表される。
【００５４】
１４．所定数の点が試験されている画像からランダムに採取され、そのカラースペース・トリプレット（r,g,b）が記録される。この採取される点の数は、統計的に有意な結果を得るのに十分に大きくなくてはならないが、しかし、計算を迅速に行うために十分に小さくなくてはならない。一般に、1000個の点が採取される。図１はランダムに採取した点をカラースペースにプロットしたものである。背景画像についての平均的カラースペース・トリプレットは、（234, 218, 201）で、点の三角形クラウド（cloud）の頂点に近似する。
【００５５】
１５．あらゆる採取点について、量（r0-r，g０-g，b０-b）が計算される。
【００５６】
１６．主成分分析がこれらの値の分布について行われる。その結果、3つのベクトル又は主成分並びに主値と呼ばれる関連のスカラーが得られる。最も大きい主値の主成分が分布に最も適合する（ベストフィット）ラインに沿って存在し、2つの最も大きい主値を有する2つの成分が上記分布にベストフィット面を画成し、最も小さい主値を有する主成分が上記のベストフィット面に対して垂直となっている。当初のカラースペースに戻って変換させるため、値（r0，g０，b０）が各主成分に付加される。図７はカラースペース・トリプレットの分布および主成分の方向に沿うベクトルを示している。
【００５７】
１７．この分布において全てのトリプレットは第2の最も大きい主成分に向けて投影されている。その結果得られた数値は分類される。
【００５８】
１８．全ての投影の或る割合よりも大きい値が見出され、x1と表示され；全ての投影の或る割合よりも小さい値が見出され、x２と表示される。例えば、x1およびx２は、投影値の９５％がx１よりも小さく、投影値の９５％がx２よりも大きくなるように設定することができる。
【００５９】
１９．投影により値x１およびx２を生じさせるカラースペース・トリプレット（複数）が見出される。これらのトリプレットは、P1＝（r１，g１，b１）およびP２＝（r２，g２，b２）で表される。
【００６０】
２０．これらのトリプレットの、最も大きい主成分へ向けての投影が見出される。
【００６１】
２１．第1および第2の最も大きい主成分に向けての投影から、ベストフィット面に向けてのP1およびP2の投影を見出すことができる。ベストフィット面に向けての投影のトリプレットは、P３＝（r３，g３，b３）およびP４＝（r４，g４，b４）で表される。
【００６２】
２２．背景画像のカラースペース・トリプレットからP３およびP4に向けての単位ベクトルが計算される。これら単位ベクトルはv1およびv2で表され、これらは画像中に存在する2つのステインの夫々についてのカラースペース曲線に対する近似を表している。
【００６３】
２３．新規な座標系がベクトルがv1、v2およびv3で画成される。ここで、v3は最も小さい主成分の方向のユニットベクトルである。図８はサンプル点のカラースペース分布並びに新規な座標系基底ベクトルに平行なベクトルを示している。
【００６４】
２４．当初のカラースペースの基底ベクトルは、vr, vgおよびvbで表される。変換マトリックスMは以下のように形成される。つまり、M=
v1・vr    v1・vg    v1・vb 
v2・vr    v2・vg    v2・vb 
v3・vr    v3・vg    v3・vb
【００６５】
２５．画像中の全ての点について、そのカラースペース・トリプレット（r,g,b）が見られ、それは、（a,b,c）= （r,g,b）M-1に従って変形され、当初のカラースペース・トリプレット（ｒ,ｇ,ｂ）は新規なカラースペース・トリプレット（a,b,c）により置き換えられる。この画像の色は、今や、各画素に存在するステインのタイプと、近似量を示すものとなる。
【００６６】
本発明の特徴
本発明は従来技術と多くの点で異なる。本発明の具体例は染色された組織の画像および背景画像を用いて開始される。[“背景画像”組織のない画像の部分であり得る。この背景画像を波長の範囲を意味する帯域で定義づけすることができる。例えば、この背景画像をレッド、グリーンおよびブルー帯域として定義づけすることができ、更に、各大域について平均背景強さを計算することができる]。染色された組織の画像のあらゆる点について、この平均背景強さから光学濃度および強さの相違が計算される。組織サンプルの異なる領域から画像中の多数点が選択される。主成分分析が行われ、これらのサンプル点を最もよく記述する方向付けが見出される。第1の主成分が、点の分布に最もよく適合する線又はその分布の最も長い軸に沿って存在する。次に大きい主成分は上記第1の主成分に垂直であって、上記分布の次に大きい軸に沿って存在する。本発明の好ましい具体例はこれらの主成分を最終出力として使用しないが、これらの成分を組織の特徴の量を得る手段として使用し、これらの特徴の量はそれ自体がステインの量に比例する。この好ましい具体例において、組織標本中の各点に存在する各ステインの量が定量される。主成分および点の分布に基づいて、この好ましい具体例によって、各タイプの純粋なステインが存在するところの光学濃度空間中のベクトルを判定することが可能となる。これらのベクトルに基づいて、どの程度の多くの各タイプのステインが組織中の選択された点に存在するかを判定することが可能となる。これは、組織の画像中の任意の点の光学濃度および色が、その点に存在する各ステインの量によって全体的に判定され、各光学濃度および色が2つのステインの量の僅か1つの組合せから生じるという理由から可能となるものである。次に、画像中の全ての点について、実施例の方法は、各ステインがどの程度多く、その点における組織中に存在するかを計算することを可能にする。この実施例の方法は、新規な画像の形成を可能にし、それにおいて、第1の帯域（例えばレッドの帯域）は第1のタイプのステインの量を示し、第２の帯域（例えばグリーンの帯域）は第２のタイプのステインの量を示す。或る点でより多くのステインが存在する場合は、その点の出力画像がより明るくなる。従って、第1のタイプのステインを大量に有し、第２のタイプのステインを殆ど含まない組織中の点の入力画像内の画素については、出力画像中の対応する画素は明るいレッドを示すことになる。ステインの双方のタイプの量が僅かである組織中の点の入力画像内の画素については、出力画像中の対応する画素はぼやけたイエローを示すことになる。いずれのタイプのステインも含まない組織中の点の入力画像内の画素については、出力画像は黒くになる。この場合、画像中に存在するかも知れないブルーは単なるノイズであり、除去してもよい。
【００６７】
本発明はその他の特徴を有する。
１．ベア‐ランベルトの吸光度の法則およびそれに対し直線的に近似するものの双方についての実施例が記述されている。
２．主成分を使用した実施例および純粋なステインの光学濃度の曲線を表す光学濃度空間中の複数の線を計算する他の方法を使用した実施例が記述されている。
３．光学濃度空間中の純粋なステインについて計算された複数のラインを使用し、ステイン空間から光学濃度空間への転換マトリックスを形成することを可能にする実施例が記述されている。
４．上記マトリックスを逆にし、光学濃度空間からステイン空間への転換を見出す実施例が記述されている。
５．光学濃度画像中の全ての画素をステイン空間へ転換させ、ステイン空間画像を生じさせ、各画像の個々の帯域が組織中の個々のステインの量を与えるようにした実施例が記述されている。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】画像から採取された画素のカラースペース分布を示すカラースペース（強度）表示グラフ図。
【図２】２つのステインを有する免疫組織化学的染色組織のカラー画像から選択された点のカラースペース（強度）表示グラフ図。
【図３】検体組織中に存在するステインの１つの異なる量を表す曲線の周りに描かれた四角形断面を有する容積からなるカラースペース（強度）表示グラフ図。
【図４】ランダムに選択された点の光学濃度（吸光度）の三つ組みを表すグラフ図。
【図５】光学濃度（吸光度）の三つ組みの分布上に重複する主方向に沿うベクトルを表すグラフ図。
【図６】採取点の分布上に重複する新規座標系基底ベクトルと平行なベクトルを表すグラフ図。
【図７】カラースペース三つ組みの分布および主成分方向に沿うベクトルを示すと共に、該分布のベストフィット面を画成する２つの最も大きいベクトル（より長い複数の直線で表されている）を説明するカラースペース（強度）表示グラフ図。
【図８】採取された画素のカラースペース分布を示すと共に、新規座標系基底ベクトル、ｖ１、ｖ２およびｖ３を説明するカラースペース（強度）表示グラフ図。
【図１】
2005509140.tif 000011
【図２】
2005509140.tif 000012
【図３】
2005509140.tif 000013
【図４】
2005509140.tif 000014
【図５】
2005509140.tif 000015
【図６】
2005509140.tif 000016
【図７】
2005509140.tif 000017
【図８】
2005509140.tif 000018
【国際調査報告】
2005509140.tif 000019