(57)【要約】【課題】イオンチャンネル活性を測定する方法を提供する。【解決手段】Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ、Ｄｉｐｔｅｒａ、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ、Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ、Ａｃａｒｉｎａ、Ｔｈｙｓａｎａｐｔｅｒａ、Ｈｅｔｅｒｏｐｔｅｒａ、ＨｙｍｅｎｏｐｔｅｒａまたはＩｓｏｐｔｅｒａの昆虫由来のＧＡＢＡ依存性塩素チャネルでトランスフェクトしたヒト胚腎細胞または細胞系統、及び細胞または細胞系統における膜電位の変化の測定をする。該方法は、タバコガ由来のＧＡＢＡ依存性塩素チャネルに作用する化合物から生じる膜電位の変化を測定する上で特に有効である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
昆虫由来のＧＡＢＡ依存性塩素チャネルでトランスフェクトしたヒト胚腎細胞または細胞系統を含む細胞または細胞系統。
【請求項２】
前記昆虫が、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ（鱗翅目（チョウ目））、Ｄｉｐｔｅｒａ（双翅目（ハエ目））、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ（鞘翅目（コウチュウ目））、Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ（同翅目（ヨコバイ亜目））、Ａｃａｒｉｎａ（ダニ目）、Ｔｈｙｓａｎａｐｔｅｒａ（総翅目（アザミウマ目））、Ｈｅｔｅｒｏｐｔｅｒａ（異翅目（カメムシ亜目））、Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ（膜翅目（ハチ目））またはＩｓｏｐｔｅｒａ（等翅目（シロアリ目））である、請求項１に記載の細胞または細胞系統。
【請求項３】
前記ＧＡＢＡ依存性塩素チャネルが、配列番号１、配列番号４及び配列番号７から成る群より選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の細胞または細胞系統。
【請求項４】
前記ＧＡＢＡ依存性塩素チャネルが、配列番号２、配列番号５及び配列番号８から成る群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の細胞または細胞系統。
【請求項５】
配列番号４のヌクレオチド配列または配列番号５のアミノ酸配列を有する、タバコガＧＡＢＡ依存性塩素チャネルでトランスフェクトしたヒト胚腎細胞または細胞系統を含む細胞または細胞系統。
【請求項６】
（ａ）一定量の膜電位インジケータを試験容器中の試験媒体と接触させること；
（ｂ）前記膜電位インジケータが前記試験媒体と相互作用するのに十分な時間、前記膜電位インジケータを前記試験容器中の前記試験媒体と接触させて保持すること；
（ｃ）試験化合物を前記試験容器に加えること；
（ｄ）ＧＡＢＡと試験化合物の両方が前記試験媒体中でＧＡＢＡ依存性塩素チャネルに作用しようとする、一定量のＧＡＢＡを加えること、及び
（ｅ）蛍光のレベルが上記試験媒体中のＧＡＢＡ依存性塩素チャネルに作用する試験化合物の量に逆比例する、前記試験媒体中の蛍光のレベルを測定すること、
を含む、化学処理後に、昆虫由来のＧＡＢＡ依存性塩素チャネルでトランスフェクトしたヒト胚腎細胞または細胞系統を含む細胞または細胞系統を含有する試験媒体中で膜電位のレベルを測定するための方法。
【請求項７】
前記昆虫が、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ、Ｄｉｐｔｅｒａ、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ、Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ、Ａｃａｒｉｎａ、Ｔｈｙｓａｎａｐｔｅｒａ、Ｈｅｔｅｒｏｐｔｅｒａ、ＨｙｍｅｎｏｐｔｅｒａまたはＩｓｏｐｔｅｒａである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＧＡＢＡ依存性塩素チャネルが、配列番号１、配列番号４及び配列番号７から成る群より選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ＧＡＢＡ依存性塩素チャネルが、配列番号２、配列番号５及び配列番号８から成る群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＧＡＢＡ依存性塩素チャネルがタバコガＧＡＢＡ依存性塩素チャネルであり、前記タバコガＧＡＢＡ依存性塩素チャネルが配列番号４のヌクレオチド配列または配列番号５のアミノ酸配列を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記膜電位インジケータが蛍光染料であり、前記膜電位インジケータが前記試験媒体と相互作用することを可能にする時間が、外界温度で３−５時間の範囲内である、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
ｉ）（ａ）一定量の膜電位インジケータを、試験容器中で、昆虫由来のＧＡＢＡ依存性塩素チャネルでトランスフェクトしたヒト胚腎細胞または細胞系統を含む細胞または細胞系統を含む試験媒体と接触させること；
（ｂ）前記膜電位インジケータが前記試験媒体と相互作用するのに十分な時間、前記膜電位インジケータを前記試験容器中の前記試験媒体と接触させて保持すること；
（ｃ）試験化合物を前記試験容器に加えること；
（ｄ）ＧＡＢＡと試験化合物の両方が前記試験媒体中でＧＡＢＡ依存性塩素チャネルに作用しようとする、一定量のＧＡＢＡを加えること、及び
（ｅ）蛍光のレベルが上記試験媒体中のＧＡＢＡ依存性塩素チャネルに作用する試験化合物の量に逆比例する、前記試験媒体中の蛍光のレベルを測定すること、
の段階を含むトライアルを実施すること、及び
ｉｉ）（ａ）いかなる化合物も前記試験媒体と接触していない陰性対照；
（ｂ）前記試験媒体の蛍光を低下させる化合物である陽性対照化合物を試験化合物として使用する陽性対照；または
（ｃ）陽性対照及び陰性対照の両方；
のいずれかから生じる結果と前記トライアルからの結果を比較することを含み、前記試験媒体の蛍光が陰性対照中の試験媒体において出現する蛍光より低いこと及び前記試験媒体の蛍光が陽性対照中の試験媒体において出現する蛍光より高いかまたは等しいことが、試験媒体において出現する蛍光を低下させうる試験化合物を指示すること、
を含む、試験媒体によって生じる蛍光の量を低下させる化合物を特定する方法。
【請求項１３】
前記方法を、殺虫力を示す化合物を特定するために使用する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記昆虫が、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ、Ｄｉｐｔｅｒａ、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ、Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ、Ａｃａｒｉｎａ、Ｔｈｙｓａｎａｐｔｅｒａ、Ｈｅｔｅｒｏｐｔｅｒａ、ＨｙｍｅｎｏｐｔｅｒａまたはＩｓｏｐｔｅｒａの目である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＧＡＢＡ依存性塩素チャネルが、配列番号１、配列番号４及び配列番号７から成る群より選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＧＡＢＡ依存性塩素チャネルが、配列番号２、配列番号５及び配列番号８から成る群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＧＡＢＡ依存性塩素チャネルがタバコガＧＡＢＡ依存性塩素チャネルであり、前記タバコガＧＡＢＡ依存性塩素チャネルが配列番号４のヌクレオチド配列または配列番号５のアミノ酸配列を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記膜電位インジケータが蛍光染料であり、前記膜電位インジケータが前記試験媒体と相互作用することを可能にする時間が外界温度で３−５時間の範囲内である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
ｉ）（ａ）マイクロタイタープレートにおいて、蛍光染料を、配列番号４のヌクレオチド配列を有するタバコガＧＡＢＡ依存性塩素チャネルでトランスフェクトしたヒト胚腎細胞または細胞系統と接触させること；
（ｂ）前記蛍光染料が配列番号４のヌクレオチド配列を有するタバコガＧＡＢＡ依存性塩素チャネルでトランスフェクトした前記ヒト胚腎細胞または細胞系統と相互作用するのに十分な時間、前記蛍光染料を、マイクロタイタープレートにおいて、配列番号４のヌクレオチド配列を有するタバコガＧＡＢＡ依存性塩素チャネルでトランスフェクトした前記ヒト胚腎細胞または細胞系統と共に保持すること；
（ｃ）試験化合物を前記マイクロタイタープレートに加えること；
（ｄ）ＧＡＢＡと試験化合物の両方が、前記ヒト胚腎細胞または細胞系統にトランスフェクトした配列番号４のヌクレオチド配列を有するタバコガＧＡＢＡ依存性塩素チャネルに作用しようとする、一定量のＧＡＢＡを前記マイクロタイタープレートに加えること；
（ｅ）蛍光のレベルが、前記ヒト胚腎細胞または細胞系統にトランスフェクトした配列番号４のヌクレオチド配列を有するタバコガＧＡＢＡ依存性塩素チャネルに作用する試験化合物の量に逆比例する、配列番号４のヌクレオチド配列を有するタバコガＧＡＢＡ依存性塩素チャネルでトランスフェクトした前記ヒト胚腎細胞または細胞系統の蛍光のレベルを測定すること、
の段階を含むトライアルを実施すること、及び
ｉｉ）（ａ）いかなる化合物も、配列番号４のヌクレオチド配列を有するタバコガＧＡＢＡ依存性塩素チャネルでトランスフェクトした前記ヒト胚腎細胞または細胞系統と接触していない陰性対照；
（ｂ）配列番号４のヌクレオチド配列を有するタバコガＧＡＢＡ依存性塩素チャネルでトランスフェクトした前記ヒト胚腎細胞または細胞系統の蛍光を低下させる化合物である陽性対照化合物を試験化合物として使用する陽性対照；または
（ｃ）陽性対照及び陰性対照の両方；
のいずれかから生じる結果と前記トライアルからの結果を比較することを含み、配列番号４のヌクレオチド配列を有するタバコガＧＡＢＡ依存性塩素チャネルでトランスフェクトした前記ヒト胚腎細胞または細胞系統の蛍光が、陰性対照中の配列番号４のヌクレオチド配列を有するタバコガＧＡＢＡ依存性塩素チャネルでトランスフェクトした前記ヒト胚腎細胞または細胞系統において出現する蛍光より低いこと及び配列番号４のヌクレオチド配列を有するタバコガＧＡＢＡ依存性塩素チャネルでトランスフェクトした前記ヒト胚腎細胞または細胞系統の蛍光が、陽性対照中の配列番号４のヌクレオチド配列を有するタバコガＧＡＢＡ依存性塩素チャネルでトランスフェクトした前記ヒト胚腎細胞または細胞系統において出現する蛍光より高いかまたは等しいことが、試験媒体において出現する蛍光を低下させうる試験化合物を指示すること、
を含む、殺虫力を有する化合物を特定する方法。
【請求項２０】
前記蛍光染料が、配列番号４のヌクレオチド配列を有するタバコガＧＡＢＡ依存性塩素チャネルでトランスフェクトした前記ヒト胚腎細胞または細胞系統と相互作用することを可能にする時間が、外界温度で３−４時間の範囲内である、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般にイオンチャネル活性の分野に関する。特に、本発明は、化学処理後に細胞または細胞系統（ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ）において膜電位レベルを測定することによって化合物の潜在的殺虫力を測定することに関し、より特定すると、化学処理後にＧＡＢＡ依存性塩素チャネルでトランスフェクトした細胞または細胞系統において膜電位を測定することに関する。
【背景技術】
【０００２】
γ−アミノ−ｎ−酪酸（「ＧＡＢＡ」）についての受容体である、ＧＡＢＡ依存性塩素チャネルは、脊椎動物及び無脊椎動物神経系においてシナプス伝達を阻害する上で重要な役割を果たす。多くの既存の生物活性化合物、例えば殺虫剤が、このイオンチャネルを標的する。これらの化合物の多くは、最初、ＧＡＢＡ受容体に作用するそれらの能力に基づいて特定された。この部位に対する化合物は速やかな作用機構を有する。そこで、殺虫剤を含む生物活性化合物を特定するための手段として、このチャネルを標的する方法を開発することが求められている。
【０００３】
昆虫イオンチャネル受容体、特に昆虫ＧＡＢＡ依存性塩素チャネルを発現する細胞または細胞系統は、文献の中で、例えば（特許文献１）、（非特許文献１）、（非特許文献２）、（非特許文献３）、（非特許文献４）、（非特許文献５）、（特許文献２）、（非特許文献６）の中で報告されている。しかし、これらの細胞系統の大部分は増殖が困難であり、安定性が低く、膜電位を測定するためのハイスループット法での使用において導電性がない場合がある。加えて、これらの細胞系統のほとんどは、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ（鱗翅目（チョウ目））、Ｄｉｐｔｅｒａ（双翅目（ハエ目））、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ（鞘翅目（コウチュウ目））、Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ（同翅目（ヨコバイ亜目））、Ａｃａｒｉｎａ（ダニ目）、Ｔｈｙｓａｎａｐｔｅｒａ（総翅目（アザミウマ目））、Ｈｅｔｅｒｏｐｔｅｒａ（異翅目（カメムシ亜目））、Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ（膜翅目（ハチ目））またはＩｓｏｐｔｅｒａ（等翅目（シロアリ目））の目から誘導される昆虫ＧＡＢＡ受容体を発現するヒト胚腎（「ＨＥＫ」）細胞系統ではなく、通常はジエルドリンに耐性である、Ａｅｄｅｓ（ヤブカ属）、Ｓｐｄｏｐｔｅｒａ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ（キンウワバ亜科）またはショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の目から誘導されるか、またはリガンド依存性塩素チャネル同族体３である、昆虫ＧＡＢＡ受容体を発現する昆虫細胞系統を含む傾向がある。結果として、増殖させやすく、安定であり、膜電位の変化を測定するためのハイスループット法における使用のための伝導力があり、昆虫ＧＡＢＡ受容体を発現する昆虫細胞系統ではなくヒト胚腎細胞系統を含む細胞または細胞系統が求められている。
【０００４】
【特許文献１】米国特許第５，８５４，００２号明細書
【特許文献２】米国特許第６，３２９，５１６Ｂ１号明細書
【非特許文献１】Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，３３５（３），ｐｐ．３１５−３１８（１９９３）
【非特許文献２】Ｓｈｏｔｋｏｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，３８０（３），ｐｐ．２５７−２６２（１９９６）
【非特許文献３】Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，３５（９／１０），ｐｐ．１３９３−１４０１（１９９６）
【非特許文献４】Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｒｅｃｅｐｔ．Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｒｅｓ．，１５（１−４），ｐｐ．３３−４１（１９９５）
【非特許文献５】Ｍｉｌｌａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ，Ｓｅｒ  Ｂ．２５８（１３５３）ｐｐ．３０７−１４（１９９４）
【非特許文献６】Ｓｈｏｔｋｏｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３（４）ｐｐ．２８３−７（１９９４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
化合物が昆虫ＧＡＢＡ受容体に作用する能力を測定するための方法は当業者に既知である。例えば、当業者は、機能性チャネルを発現する卵母細胞における電気生理的測定を使用して殺虫力を試験できることを理解している。また、（特許文献３）、（特許文献４）、及び（特許文献５）も参照のこと。しかし、これらの方法の大部分は、増殖が困難であり、安定ではなく、通常はジエルドリンに耐性である、Ａｅｄｅｓ、Ｓｐｄｏｐｔｅｒａ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａまたはショウジョウバエの目から誘導されるかまたはリガンド依存性塩素チャネル同族体３である昆虫ＧＡＢＡ受容体を発現する昆虫細胞系統を組み込んだ細胞系統を含む傾向がある。これらの方法はまた、特殊な取扱いを必要とし、かつ高価でありうる放射性同位体または検出可能同位体で放射能標識したリガンドを組み込む；蛍光を通してではなく電気生理学的方法によって膜電位を測定する；多数の反応容器を使用する；及び時間がかかり、一定時間に実施できる測定の数が限られるという傾向があるので、ハイスループット法における使用のためには伝導力がない傾向がある。そのため、これらの方法は、蛍光を使用する、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ、Ｄｉｐｔｅｒａ、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ、Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ、Ａｃａｒｉｎａ、Ｔｈｙｓａｎａｐｔｅｒａ、Ｈｅｔｅｒｏｐｔｅｒａ、ＨｙｍｅｎｏｐｔｅｒａまたはＩｓｏｐｔｅｒａの昆虫由来のＧＡＢＡ依存性塩素チャネルでトランスフェクトしたＨＥＫ細胞または細胞系統において膜電位の変化を測定するためのハイスループット法をあらかじめ排除してしまう。加えて、文献の中で報告されているハイスループット法、例えばモレキュラー・ディバイシズ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から市販されているＦＬＩＰＲ（登録商標）膜電位アッセイキット（ＦＬＩＰＲ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ）（カリフォルニア州サニーベイルのモレキュラー・ディバイシズ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓａｎｎｙｖａｌｅ  ＣＡ）より入手可能）は、必ずしもすべての状況に容易に適合させることができず、感受性が低い傾向があり、再現性が低い。結果として、ＧＡＢＡ受容体遺伝子を発現するＨＥＫ細胞または細胞系統において蛍光によって膜電位の変化を測定するための低コストのハイスループット法が必要とされている。
【０００６】
【特許文献３】国際公開公報第ＷＯ０１／４９８４８号公報
【特許文献４】米国特許第６，３２９，５１６Ｂ１号明細書
【特許文献５】米国特許第５，８５４，００２号明細書
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の１つの実施形態は、試験媒体中で膜電位の変化を測定する上で有用な細胞または細胞系統を述べる。本発明は、昆虫、好ましくはＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ、Ｄｉｐｔｅｒａ、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ、Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ、Ａｃａｒｉｎａ、Ｔｈｙｓａｎａｐｔｅｒａ、Ｈｅｔｅｒｏｐｔｅｒａ、ＨｙｍｅｎｏｐｔｅｒａまたはＩｓｏｐｔｅｒａの昆虫由来のＧＡＢＡ依存性塩素チャネルを含むＨＥＫ細胞または細胞系統を包含する。
【０００８】
本発明のもう１つの実施形態は、配列番号４に示すヌクレオチド配列または配列番号５に示すアミノ酸配列を有する、タバコガＧＡＢＡ依存性塩素チャネルでトランスフェクトしたＨＥＫ細胞または細胞系統を含む細胞または細胞系統を述べる。
【０００９】
本発明のさらにもう１つの実施形態は、膜電位を測定するためのハイスループット法を述べる。本発明は、試験化合物の添加に応答した蛍光の変化を測定する。本発明は、上述した細胞または細胞系統における蛍光の変化を測定する上で特に有効である。
【００１０】
本発明のさらにもう１つの実施形態では、試験化合物を試験媒体単独または蛍光を低下させる化合物による化学処理後の試験媒体と比較することにより、蛍光を低下させる化合物を特定するハイスループット法を開示する。この方法は、殺虫力を示すと考えられる化合物を特定する上で有用でありうる。
【００１１】
本発明のさらにもう１つの実施形態では、上述した細胞または細胞系統における蛍光の低下を通して殺虫力を有する化合物を特定するハイスループット法を開示する。
【００１２】
本発明は、複雑ではなく、よりコスト効果的であり、感受性においては当技術分野で開示されているものに匹敵するハイスループット法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
（定義）
ここで使用する「外界温度」の語は、実験室または他の作業区域において認められる適切な温度を意味するものとし、一般には約１５℃以下でなく、約３０℃を超えない。
【００１４】
ここで使用する「試験容器」の語は、アッセイ、反応、方法、実験または他の手順を実施するために使用しうる、ペトリ皿、マイクロタイタープレート、試験管またはビーカーなどの何らかの装置を意味するものとする。
【００１５】
ここで使用するとき、「膜電位インジケータ」の語は、蛍光によって膜電位の変化を指示することができる、蛍光染料などの何らかの物質を意味するものとする。
【００１６】
本発明の１つの実施形態は、昆虫由来のＧＡＢＡ依存性塩素チャネルでトランスフェクトしたヒト胚腎（「ＨＥＫ」）細胞または細胞系統を含む細胞または細胞系統を包含する。好ましくは、該昆虫は、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ、Ｄｉｐｔｅｒａ、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ、Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ、Ａｃａｒｉｎａ、Ｔｈｙｓａｎａｐｔｅｒａ、Ｈｅｔｅｒｏｐｔｅｒａ、ＨｙｍｅｎｏｐｔｅｒａまたはＩｓｏｐｔｅｒａの目であり、より好ましくはＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａまたはＨｏｍｏｐｔｅｒａの目であり、さらに一層好ましくはＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａの目である。本発明において使用できる昆虫の例は、アワノメイガ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｃｏｒｎ  ｂｏｒｅｒｓ）、ヨトウムシ（ｃｕｔｗｏｒｍｓ）、ヨトウガ（ａｒｍｙｗｏｒｍｓ）、タバコガ（ｔｏｂａｃｃｏ  ｂｕｄｗｏｒｍｓ）、タネバエ（ｓｅｅｄ  ｍａｇｇｏｔｓ）、カ（ｍｏｓｑｕｉｔｏｅｓ）、ｎｕｉｓａｎｃｅ  ｆｌｉｅｓ、甲虫（ｂｅｅｔｌｅｓ）、根切り虫（ｒｏｏｔｗｏｒｍｓ）、ヨコバイ（ｌｅａｆｈｏｐｐｅｒｓ）、アブラムシ（ａｐｈｉｄｓ）、ダニ（ｍｉｔｅｓ）、コナジラミ（ｗｈｉｔｅｆｌｉｅｓ）、カイガラムシ（ｓｃａｌｅｓ）、タガメ（ｓｔｉｎｋ  ｂｕｇｓ）、アザミウマ（ｔｈｒｉｐｓ）、スズメバチ（ジガバチ）（ｗａｓｐｓ）、アリ（ａｎｔｓ）、ｆｒｕｉｔ  ｗｏｒｍｓ、モンシロチョウ（ｃａｂｂａｇｅ  ｗｏｒｍｓ）、ガ（ｍｏｔｈｓ）、ｌｏｐｐｅｒｓ、Ｌｙｇｕｓ  ｂｕｇｓ、ゾウムシ（ｗｅｅｖｉｌｓ）、ブヨ（ｍｉｄｇｅｓ）、ハモグリバエ（ｌｅａｆｍｉｎｅｒｓ）、ハムシ（ｌｅａｆｂｅｅｔｌｅｓ）またはシロアリ（ｔｅｒｍｉｔｅｓ）である。好ましい昆虫は、タバコガ及びアブラムシである。特に好ましい昆虫はタバコガである。本発明において使用できるＴＢＷ  ＧＡＢＡ依存性塩素チャネルの例は、ここで記述し、及び（特許文献６）に開示されている、配列番号１、配列番号４または配列番号７に示すヌクレオチド配列、好ましくは配列番号４に示すヌクレオチド配列、あるいは配列番号２、配列番号５または配列番号８に示すアミノ酸配列、好ましくは配列番号５に示すアミノ酸配列である。
【００１７】
【特許文献６】米国特許第６，３２９，５１６Ｂ１号明細書
【００１８】
本発明のもう１つの実施形態は、ここで記述し、及び（特許文献７）米国特許第６，３２９，５１６Ｂ１号に開示されている、配列番号４のヌクレオチド配列または配列番号５のアミノ酸配列を有するタバコガＧＡＢＡ依存性塩素チャネルでトランスフェクトしたＨＥＫ細胞または細胞系統を述べる。
【００１９】
【特許文献７】米国特許第６，３２９，５１６Ｂ１号明細書
【００２０】
本発明のさらにもう１つの実施形態は、化学処理後に上述した細胞または細胞系統における膜電位の変化を測定するための方法を含み、該方法は：
（ａ）一定量の膜電位インジケータを試験容器中の試験媒体と接触させること；
（ｂ）該膜電位インジケータが該試験媒体と相互作用するのに十分な時間、該膜電位インジケータを該試験容器中の該試験媒体と接触させて保持すること；
（ｃ）試験化合物を該試験容器に加えること；
（ｄ）ＧＡＢＡと試験化合物の両方が該試験媒体中でＧＡＢＡ依存性塩素チャネルに作用しようとする、一定量のＧＡＢＡを加えること、及び
（ｅ）蛍光のレベルが上記試験媒体中のＧＡＢＡ依存性塩素チャネルに作用する試験化合物の量に逆比例する、該試験媒体中の蛍光のレベルを測定すること、
を含む。
【００２１】
上述したように、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ、Ｄｉｐｔｅｒａ、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ、Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ、Ａｃａｒｉｎａ、Ｔｈｙｓａｎａｐｔｅｒａ、Ｈｅｔｅｒｏｐｔｅｒａ、ＨｙｍｅｎｏｐｔｅｒａまたはＩｓｏｐｔｅｒａの目、好ましくはＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａまたはＨｏｍｏｐｔｅｒａの目、より好ましくはＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａの昆虫がこの実施形態において使用しうる。上述したように、有用な昆虫の例は、アワノメイガ、ヨトウムシ、ヨトウガ、タバコガ、タネバエ、カ、ｎｕｉｓａｎｃｅ  ｆｌｉｅｓ、甲虫、根切り虫、ヨコバイ、アブラムシ、ダニ、コナジラミ、カイガラムシ、タガメ、アザミウマ、スズメバチ（ジガバチ）、アリ、ｆｒｕｉｔ  ｗｏｒｍｓ、モンシロチョウ、ガ、ｌｏｐｐｅｒｓ、リガス・バグ、ゾウムシ、ブヨ、ハモグリバエ、ハムシまたはシロアリを含むが、これらに限定されない。好ましい昆虫はタバコガ及びアブラムシである。特に好ましい昆虫はタバコガである。上述したように、該ＧＡＢＡ依存性塩素チャネルは、配列番号１、配列番号４または配列番号７のヌクレオチド配列、好ましくは配列番号４のヌクレオチド配列、あるいは配列番号２、配列番号５または配列番号８のアミノ酸配列、好ましくは配列番号５のアミノ酸配列を有しうる。
【００２２】
本発明の好ましい実施形態では、該ＧＡＢＡ依存性塩素チャネルは、配列番号４のヌクレオチド配列または配列番号５のアミノ酸配列を有するＴＢＷ  ＧＡＢＡ依存性塩素チャネルである。
【００２３】
好ましくは、該試験媒体は、昆虫由来のＧＡＢＡ依存性塩素チャネルでトランスフェクトした細胞系統である。より好ましくは、該試験媒体は、ＴＢＷ  ＧＡＢＡ依存性塩素チャネルでトランスフェクトしたＨＥＫ細胞系統である。さらに一層好ましくは、配列番号４のヌクレオチド配列または配列番号５のアミノ酸配列を有するＴＢＷ  ＧＡＢＡ依存性塩素チャネルでトランスフェクトしたＨＥＫ細胞系統である。
【００２４】
本発明において使用しうる膜電位インジケータの例は、スチリル染料、シアニン、ローダミンプローブ及びオキソノールを含むが、これらに限定されない。
【００２５】
該試験化合物は、ニート（そのまま）でまたは溶媒中の溶液として接触させうる。好ましくは、該試験化合物を溶液として接触させる。ここで使用するとき、「ニート」の語は、その中に含まれるあらゆる不純物を伴った非混合または非希釈原体を指す。本発明において使用しうる溶媒の例は、塩類溶液、例えばカリウム、ナトリウムまたはマグネシウム塩溶液、組織培養用培地、緩衝液、例えば酸性、塩基性または中性緩衝液、水、酸、ケトン、アルコール、スルホキシド、またはそれらの混合物である。好ましくは、該試験媒体は溶媒中の溶液として添加され、増殖して試験容器に付着する生細胞の層から成る。上述した溶媒はまた、該試験媒体と結合して使用しうる。
【００２６】
膜電位インジケータが試験媒体と相互作用するのに十分な時間は、外界温度で好ましくは３−約５時間、より好ましくは３．５−４．５時間の範囲内である。
【００２７】
上記試験媒体中のＧＡＢＡ依存性塩素チャネルに作用する試験化合物の量に逆比例する、該試験媒体中の蛍光のレベルは、ＦＬＩＰＲ３８４（登録商標）蛍光イメージングプレートリーダー（Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ）システム（モレキュラー・ディバイシズ社より入手可能）などの、当技術分野で知られている装置を使用して、蛍光光度法などの当業者に既知の方法によって測定することができる。
【００２８】
本発明のもう１つの実施形態では、試験媒体によって生成される蛍光の量を低下させる化合物を特定する方法を開示する。該方法は、上述した方法を用いてトライアルを実施し、その後トライアルからの結果を、
（ａ）いかなる化合物も該試験媒体と接触していない陰性対照；
（ｂ）該試験媒体の蛍光を低下させる化合物である陽性対照化合物を試験化合物として使用する陽性対照；または
（ｃ）陽性対照及び陰性対照の両方；
のいずれかから生じる結果と比較することを含み、該試験媒体の蛍光が陰性対照中の試験媒体において出現する蛍光より低いこと及び該試験媒体の蛍光が陽性対照中の試験媒体において出現する蛍光より高いかまたは等しいことが、試験媒体において出現する蛍光を低下させうる試験化合物を指示する。
【００２９】
好ましくは、トライアルからの結果を陽性対照と陰性対照の両方から生じる結果と比較する；その場合、該試験媒体の蛍光が陰性対照中の試験媒体において出現する蛍光より低いこと及び該試験媒体の蛍光が陽性対照中の試験媒体において出現する蛍光より高いかまたは等しいことが、試験媒体において出現する蛍光を低下させうる試験化合物を指示する。
【００３０】
本発明において使用できる陽性対照化合物の例は、フィプロニル、エンドスルファン、ジエルドリン及びピクロトキシンである。好ましくかつ経済的な陽性対照化合物はフィプロニルである。
【００３１】
該方法は、殺虫力を示す化合物を特定する上で特に有用である。上記で開示した、好ましい試験容器、昆虫の目、昆虫、ＧＡＢＡ依存性塩素チャネル、ヌクレオチド及びアミノ酸配列、及び膜電位インジケータを含むがこれらに限定されない、試験容器、昆虫の目、昆虫、ＧＡＢＡ依存性塩素チャネル、ヌクレオチド及びアミノ酸配列、及び膜電位インジケータがこの実施形態においても使用できる。
【００３２】
上述したように、膜電位インジケータが試験媒体と相互作用するのに十分な時間は、外界温度で好ましくは３−５時間、より好ましくは３．５−４．５時間の範囲内である。上述した試験媒体の蛍光のレベルを測定する方法がこの実施形態においても使用できる。
【００３３】
本発明のもう１つの実施形態では、殺虫力を有する化合物を特定する方法を開示する。該方法は：
ｉ）（ａ）マイクロタイタープレートにおいて蛍光染料を、配列番号４のヌクレオチド配列を有するタバコガＧＡＢＡ依存性塩素チャネルでトランスフェクトしたヒト胚腎細胞または細胞系統と接触させること；
（ｂ）該蛍光染料が配列番号４のヌクレオチド配列を有するタバコガＧＡＢＡ依存性塩素チャネルでトランスフェクトした該ヒト胚腎細胞または細胞系統と相互作用するのに十分な時間、マイクロタイタープレートにおいて、該蛍光染料を、配列番号４のアミノ酸を有するタバコガＧＡＢＡ依存性塩素チャネルでトランスフェクトした該ヒト胚腎細胞または細胞系統と接触させて保持すること；
（ｃ）試験化合物を該マイクロタイタープレートに加えること；
（ｄ）ＧＡＢＡと試験化合物の両方が、該ヒト胚腎細胞または細胞系統にトランスフェクトした配列番号４のヌクレオチド配列を有するタバコガＧＡＢＡ依存性塩素チャネルに作用しようとする、一定量のＧＡＢＡを該マイクロタイタープレートに加えること；
（ｅ）蛍光のレベルが、該ヒト胚腎細胞または細胞系統にトランスフェクトした配列番号４のヌクレオチド配列を有するタバコガＧＡＢＡ依存性塩素チャネルに作用する試験化合物の量に逆比例する、配列番号４のヌクレオチド配列を有するタバコガＧＡＢＡ依存性塩素チャネルでトランスフェクトした該ヒト胚腎細胞または細胞系統の蛍光のレベルを測定すること、
の段階を含むトライアルを実施すること、及び
ｉｉ）（ａ）いかなる化合物も、配列番号４のヌクレオチド配列を有するタバコガＧＡＢＡ依存性塩素チャネルでトランスフェクトした該ヒト胚腎細胞または細胞系統と接触していない陰性対照；
（ｂ）配列番号４のヌクレオチド配列を有するタバコガＧＡＢＡ依存性塩素チャネルでトランスフェクトした該ヒト胚腎細胞または細胞系統の蛍光を低下させる化合物である陽性対照化合物を試験化合物として使用する陽性対照；または
（ｃ）陽性対照及び陰性対照の両方；
のいずれかから生じる結果と該トライアルからの結果を比較することを含み、配列番号４のヌクレオチド配列を有するタバコガＧＡＢＡ依存性塩素チャネルでトランスフェクトした該ヒト胚腎細胞または細胞系統の蛍光の量が、陰性対照中の配列番号４のヌクレオチド配列を有するタバコガＧＡＢＡ依存性塩素チャネルでトランスフェクトした該ヒト胚腎細胞または細胞系統において出現する蛍光よりも低いこと及び配列番号４のヌクレオチド配列を有するタバコガＧＡＢＡ依存性塩素チャネルでトランスフェクトした該ヒト胚腎細胞または細胞系統の蛍光が、陽性対照中の配列番号４のヌクレオチド配列を有するタバコガＧＡＢＡ依存性塩素チャネルでトランスフェクトした該ヒト胚腎細胞または細胞系統において出現する蛍光より高いかまたは等しいことが、試験媒体において出現する蛍光を低下させうる試験化合物を指示すること、
を含む。
【００３４】
上記で開示した陽性対照化合物がこの実施形態においても使用できる。好ましくは、陽性対照化合物はフィプロニルである。
【００３５】
好ましくは、該染料が、配列番号４のヌクレオチド配列を有するタバコガＧＡＢＡ依存性塩素チャネルでトランスフェクトした該ヒト胚腎細胞または細胞系統と相互作用するのに十分な時間は、外界温度で３−４時間の範囲内である。上記で開示した方法と同様に、上述した試験媒体の蛍光のレベルを測定する方法がこの実施形態においても使用できる。
【００３６】
配列番号４のヌクレオチド配列を有するタバコガＧＡＢＡ依存性塩素チャネルでトランスフェクトしたヒト胚腎細胞または細胞系統の蛍光のレベルは、直ちにまたは設定した間隔で一定期間にわたって測定しうる。例えば、配列番号４のヌクレオチド配列を有するタバコガＧＡＢＡ依存性塩素チャネルでトランスフェクトしたヒト胚腎細胞または細胞系統の蛍光のレベルは、一定の期間にわたって１−１０秒の間隔で連続的に測定しうる。上記で開示した方法と同様に、上述した試験媒体の蛍光のレベルを測定する方法がこの実施形態においても使用できる。
【００３７】
本発明は、昆虫由来のＧＡＢＡ依存性塩素チャネルでトランスフェクトしたヒト胚腎細胞または細胞系統の膜電位の変化を測定するためのハイスループット法であるということ、ならびに、複雑でなく、よりコスト効果的であり、しかも感受性においては当技術分野で開示されているものに匹敵する殺虫力を備えた化合物を特定する手段であるという点で、当技術分野で開示されている他の方法に比べて改善を提供する。
【００３８】
ここで、下記の実施例を参照することによって本発明をより詳細に説明するが、本発明がそれらに限定されると解釈されないことは明白である。
【実施例１】
【００３９】
この実施例は、タバコガ（「ＴＢＷ」）ＧＡＢＡ−Ａ受容体のための哺乳類発現ベクターの構築を説明する。
【００４０】
ＴＢＷ  ＧＡＢＡ−Ａ受容体についての遺伝子（参照してここに組み込まれる、米国特許第第６，３２９，５１６Ｂ１号に開示されている、ＴＢＷ−ａ３、配列番号４）をプラスミドベクターｐＭＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ  Ａ（「ｐｍｔＡＬＡ１」、カリフォルニア州カールスバッドのインビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）より入手可能）に組み込んだ。試験管において、ｐｍｔＡＬＡ１を、当業者に既知の方法によってメチル化欠損（ｄａｍ）細胞または細胞系統菌株、ＤＭ１コンピテント細胞（メリーランド州ロックビルのライフ・テクノロジー社（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）より入手可能）に形質転換した。該細菌を３７℃で約１６時間増殖させた。この時間後に、キアゲン・プラスミド・ミニ・キット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ）（カリフォルニア州バレンシアのキアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）より入手可能）を使用してＴＢＷ−ａ３を含むｐｍｔＡＬＡ１プラスミドＤＮＡを単離し、ＴＢＷ−ａ３を含む単離ｐｍｔＡＬＡ１プラスミドＤＮＡを生成した。
【００４１】
別の試験管で、上記ｐｍｔＡＬＡ１プラスミド１７μｌ（０．１ｇ／μｌ）をリアクト２（Ｒｅａｃｔ２）緩衝液（ライフ・テクノロジー社より入手可能）２μｌ及び制限酵素ＸｂａＩ（ライフ・テクノロジー社より入手可能）１μｌと混合した。その反応混合物を３７℃で１時間インキュベートした。この期間の終了時に、該反応混合物を１％アガロースゲル上で分離し、線状ＴＢＷ−ａ３ＤＮＡのバンドを切り出した。切り出したＴＢＷ−ａ３ＤＮＡを、次に、キアクイック・ゲル・抽出キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）（キアゲン社より入手可能）を用いて精製し、両末端にＸｂａＩ部位を有するＴＢＷ−ａ３ＤＮＡを作製した。
【００４２】
もう１つ別の試験管において、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（ヒトサイトメガロウイルス前初期（ＣＭＶ）プロモーターを含むＤＮＡ、インビトロジェン社より入手可能）２μｌをリアクト２緩衝液２μｌ、ＸｂａＩ  １μｌ及び水１５μｌと混合した。その反応混合物を３７℃で１時間インキュベートした。この期間の終了時に、該反応混合物を１％アガロースゲル上で分離し、線状ｐｃＤＮＡ３．１（＋）のバンドを切り出した。線状ｐｃＤＮＡ３．１（＋）を、キアクイック・ゲル・抽出キットを用いて精製した。精製の完了後、線状ｐｃＤＮＡ３．１（＋）１μｌ（０．７μｇ／μｌ）を１０Ｘコエビアルカリホスファターゼ（「ＳＡＰ」）緩衝液（ライフ・テクノロジー社より入手可能）４μｌ、水１５μｌ及びＳＡＰ（ライフ・テクノロジー社より入手可能）２０μｌと混合することにより、線状ｐｃＤＮＡ３．１（＋）を脱リン酸化した。生じた混合物を３７℃で２５分間インキュベートし、次に６５℃で２０分間インキュベートして熱不活化し、脱リン酸化プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）を作製した。
【００４３】
さらにもう１つ別の試験管で、上記脱リン酸化プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）１μｌを、両末端にＸｂａＩ部位を有するＴＢＷ−ａ３ＤＮＡ６μｌ、５Ｘリガーゼ緩衝液（ニューヨーク州ハンプステッドのギブコ−ＢＲＬ社（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｈａｍｐｓｔｅａｄ，ＮＹ）より入手可能）２μｌ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ（ギブコ−ＢＲＬ社より入手可能）１μｌと反応させた。生じた混合物を１６℃で約１６時間インキュベートした。この期間の終了時に、生じた混合物１μｌを水で１０倍に希釈し、１μｌアリコートを、当業者に既知の方法によって上位１０個の化学物質コンピテント細菌に形質転換した。形質転換細胞を、次に、ＬＢ培地を含む寒天平板上で複製させた。当業者に既知の方法によって許容されるクローンを選択し、増殖させた。キアゲン・プラスミド・ミニ・キットを用いてＴＢＷ−ａ３を含むプラスミドＤＮＡを単離し、以下ここでは「ＣＭＶ−ＧＡＢＡ−Ａ」と称する、ＴＢＷ−ａ３  ＧＡＢＡ−Ａ受容体を発現するプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）を作製した。ＡｐａＩでの制限消化によってＣＭＶ−ＧＡＢＡ−Ａの方向を決定した。
【実施例２】
【００４４】
この実施例は、ＴＢＷ  ＧＡＢＡ−Ａ受容体を構成的に発現する安定なＨＥＫ細胞（以下ここでは「ＨＥＫ  ａ−３細胞」と称する）の生成を説明する。
【００４５】
ＨＥＫ細胞のＴ７５フラスコ（「ＨＥＫ２９３ＴＳＡ−Ｏ細胞」、ニュージャージー州フィリップスバーグのセル・アンド・モレキュラー・テクノロジーズ社（Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）より入手可能）を、リポフェクタミン・プラス（商標）（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ＰＬＵＳ）試薬パッケージ（ライフ・テクノロジーズ社より入手可能）を製造者の指示に従って使用することにより、ＣＭＶ−ＧＡＢＡ−Ａ  ２−５μｇ及びピューロマイシン耐性遺伝子を含む哺乳類発現ベクター（「ｐＰｕｒ  Ｖｅｃｔｏｒ」、カリフォルニア州パロアルトのＢＤバイオサイエンシズ・クロンテック社（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）より入手可能）２−５μｇと共にコトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を、当業者に既知の方法により４μｇ／ｍｌのピューロマイシン（クロンテック・ラボラトリーズ社より入手可能）を含むダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）（バージニア州マナサスのＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）より入手可能）で増殖させることによる安定発現のために選択した。合計４８個の耐性クローンを、上述したように４μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地で増殖させ、その後液体窒素を用いて２つの別々のバイアル中で凍結させた。平行して、トリゾール（ＴＲＩＺＯＬ）試薬を製造者の指示に従って使用して（ライフ・テクノロジーズ社）、各々の耐性クローンから全ＲＮＡを作製し、各々の試料１μｇをニトラン（Ｎｙｔｒａｎ）フィルター（ニューハンプシャー州キーン（Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）のＳｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｕｌｌ社より入手可能）に点滴した。該フィルターを、ＧＡＢＡ−Ａ遺伝子ＴＢＷ−ａ３遺伝子のオープンリーディングフレームに対応する放射性プローブとハイブリダイズし、塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム／ドデシル硫酸ナトリウム水溶液で洗浄した。放射性プローブの作製のために、Ｔ７ランダムプライム標識キット（ニュージャージー州レイクウッドのワーシントン・バイオケミカル社（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｌａｋｅｗｏｏｄ，ＮＪ）を製造者の指示に従って使用して、線状ＴＢＷ−ａ３ｃＤＮＡを標識した。塩化ナトリウム２．１９ｇ、クエン酸ナトリウム１．１０ｇ及びドデシル硫酸ナトリウム１ｇを水８００ｍｌに溶解して塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム／ドデシル硫酸ナトリウム水溶液を調製し、ｐＨを７．０に調整して、その後水を加えて１リットルの容積に調整した。洗浄後、該フィルターをサランラップで包み、コダックフィルムを背にして置き、フィルムの反対側に増感紙を置いて、露光カセットに入れた。その露光カセットを−８０℃で約１６時間保存した。この時間後、該フィルムを現像し、２５個のクローンが検出可能レベルのＧＡＢＡ−Ａ  ｍＲＮＡ発現を有すると特定した。次にこれら２５個のクローンを、上述したように４μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地で増殖させ、膜電位を測定する��ッセイにおいて使用しうるＨＥＫ  ａ−３細胞の２５クローンを作製した。
【実施例３】
【００４６】
この実施例は、ＦＬＩＰＲ（登録商標）膜電位アッセイキットのためのプロトコールに述べられている方法でのＨＥＫ  ａ−３細胞における蛍光の測定を説明する。
【００４７】
実験を実施する日より前または当日に、下記の溶液を調製した：
溶液Ａ：脱イオン水約１ｌに、塩化ナトリウム８．０ｇ、塩化カリウム０．３９５ｇ、塩化カルシウム０．２９４ｇ、塩化マグネシウム０．２０３ｇ、グルコース４．５ｇ及び［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（「ＨＥＰＥＳ」）を加えた（すべてウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチ・ケミカル社（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）より入手可能）。
生じた溶液を、溶解が完了するまで攪拌し、その後１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを７．３−７．４に調整した。
【００４８】
溶液Ｂ：ＦＬＩＰＲ（登録商標）膜電位アッセイキットに含まれる染料（「ＦＬＩＰＲ（登録商標）膜電位アッセイ試薬、成分Ａ」）１バイルに、溶液Ａ約１０ｍｌを加えた。生じた混合物を、バイルの内容物が完全に溶解するまでピペットによる分注を繰り返すことによって混合し、直ちに使用するかまたは以後の使用のために２０℃で保存した。
【００４９】
下記の溶液は、実験を実施する当日に調製した：
溶液Ｃ：溶液Ｂに溶液Ａ約９０ｍＬを加えた。生じた混合物を溶解が完了するまで混合した。
【００５０】
溶液Ｄ：ＧＡＢＡ（ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）より入手可能）３０ｇを溶液Ａ３０ｍｌ中にとった。生じた溶液を溶解が完了するまで混合し、１０Ｍ  ＧＡＢＡ溶液を生成した。
【００５１】
溶液Ｅ：溶液Ｄ１．２ｍｌに溶液Ａ３８．８ｍｌを加えた。生じた混合物を、溶解が完了するまでピペットによる分注を繰り返すことによって混合し、３００μＭ  ＧＡＢＡ溶液を生成した。
【００５２】
実験の１日前に、ＨＥＫ  ａ−３細胞を、透明底でポリ−Ｄ−リシン被覆した黒壁９６穴マイクロプレートの２つの穴に約１００，０００細胞／穴の細胞密度で接種した。添加の完了後、該細胞を、下記での使用のために細胞培養インキュベーターにおいて３７℃で２４時間インキュベートした。
【００５３】
実験の当日、最初の段階を実施するときに、ＨＥＫ  ａ−３細胞を含む９６穴マイクロプレートをインキュベーターから取り出し、溶液Ｃ１００μｌを９６穴マイクロプレートの２つの穴に加えた。添加の完了後、マイクロプレートを細胞培養インキュベーターにおいて３７℃で０．５−１時間インキュベートした。この時間後、該マイクロプレートをＦＬＩＰＲ３８４（登録商標）蛍光イメージングプレートリーダーシステム上に置き、システムのレーザー強度を約１０，０００蛍光単位の基線値を得るための適切なレベルに設定し、最初の１分間は１秒ごとに、その後は６秒ごとに蛍光読取りを得て、冷却ＣＣＤカメラによって蛍光測定を捕捉した。蛍光測定の開始から１０秒後に、該システムによって溶液Ｅ２５μｌを２５μｌ／秒の速度で９６穴マイクロプレートの２つの穴の１つに加えた。添加の完了後、ＦＬＩＰＲ３８４（登録商標）蛍光イメージングプレートリーダーシステムを用いてＨＥＫ  ａ−３細胞の蛍光のレベルを測定した。上述したように及びＦＬＩＰＲ（登録商標）膜電位アッセイキットについての標準プロトコールにおいて実験を実施したとき、蛍光の変化を認めなかったことに留意されたい。図１参照。
【実施例４】
【００５４】
この実施例は、蛍光染料と相互作用するＨＥＫ  ａ−３細胞を長期間外界温度で放置したときの、ＨＥＫ  ａ−３細胞における蛍光の測定を説明する。
【００５５】
実験を実施する当日に、溶液Ａ−Ｅを上記で述べたようにして再び調製する。
【００５６】
実験の１日前に、ＨＥＫ  ａ−３細胞を、透明底でポリ−Ｄ−リシン被覆した黒壁９６穴マイクロプレートの２つの穴に約１００，０００細胞／穴の細胞密度で接種した。添加の完了後、該細胞を、下記での使用のために細胞培養インキュベーターにおいて３７℃で２４時間インキュベートした。
【００５７】
実験の当日、最初の段階を実施するときに、ＨＥＫ  ａ−３細胞を含む９６穴マイクロプレートをインキュベーターから取り出し、溶液Ｃ１００μｌを９６穴マイクロプレートの２つの穴に加えた。添加の完了後、マイクロプレートを外界温度で３．５−４時間放置した。この時間後、該マイクロプレートをＦＬＩＰＲ３８４（登録商標）蛍光イメージングプレートリーダーシステム上に置き、システムのレーザー強度を約１０，０００蛍光単位の基線値を得るための適切なレベルに設定し、最初の１分間は１秒ごとに、その後は６秒ごとに蛍光読取りを得て、冷却ＣＣＤカメラによって蛍光測定を捕捉した。蛍光測定の開始から１０秒後に、該システムによって溶液Ｅ２５μｌを２５μｌ／秒の速度で９６穴マイクロプレートの２つの穴の１つに加えた。添加の完了後、ＦＬＩＰＲ３８４（登録商標）蛍光イメージングプレートリーダーシステムを用いてＨＥＫ  ａ−３細胞の蛍光のレベルを測定した。該細胞を外界温度で３．５−４時間放置したとき、ＨＥＫ  ａ−３細胞における蛍光の上昇が認められたことに留意されたい。図２参照。
【実施例５】
【００５８】
この実施例は、蛍光染料を膜電位インジケータとして使用してフィプロニルから生成したＨＥＫ  ａ−３細胞における蛍光の測定を説明する。
【００５９】
実験を実施する当日に、溶液Ａ−Ｅを上記で述べたようにして再び調製する。
【００６０】
実験の１日前に、ＨＥＫ  ａ−３細胞を、透明底でポリ−Ｄ−リシン被覆した黒壁９６穴マイクロプレート（ニュージャージー州フランクリンレイクスのベクトン・ディキンソン社（Ｂｅｃｋｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）より入手可能）の各々の穴に約１００，０００細胞／穴の細胞密度で接種した。添加の完了後、該細胞を、下記での使用のために細胞培養インキュベーターにおいて３７℃で２４時間インキュベートした。
【００６１】
実験の当日、最初の段階を実施するときに、ＨＥＫ  ａ−３細胞を含む９６穴マイクロプレートをインキュベーターから取り出し、溶液Ｃ１００μｌを９６穴マイクロプレートの各々の穴に加えた。添加の完了後、マイクロプレートを外界温度で３．５−４時間保存した。この時間後、Ｎ，Ｎ−ジメチルスルホキシド（「ＤＭＳＯ」、Ｊ．Ｔ．ベーカー社（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）より入手可能、最終濃度０．０６％）２２μｌを対照穴として選定した穴に加え、ＤＭＳＯ中、約０．００３μＭ−３０μＭの濃度範囲の様々な希釈のフィプロニル（ノースカロライナ州リサーチトライアングルパークのローヌ−プーラン社（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ，Ｉｎｃ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，ＮＣ）より入手可能）２２μｌを試験用に選定した穴に加えた。添加の完了後、該マイクロプレートを外界温度で２０分間−１時間放置した。この時間後、該マイクロプレートをＦＬＩＰＲ３８４（登録商標）蛍光イメージングプレートリーダーシステム（モレキュラー・ディバイシズ社より入手可能）上に置き、システムのレーザー強度を約１０，０００蛍光単位の基線値を得るための適切なレベルに設定し、最初の１分間は１秒ごとに、その後は６秒ごとに蛍光読取りを得て、冷却ＣＣＤカメラによって蛍光測定を捕捉した。蛍光測定の開始から１０秒後に、該システムによって溶液Ｅ２５μｌを試験用に選定した穴に加えた。添加の完了後、ＦＬＩＰＲ３８４（登録商標）蛍光イメージングプレートリーダーシステムを用いてＨＥＫ  ａ−３細胞の蛍光のレベルを測定した。結果については表１参照。
【実施例６】
【００６２】
この実施例は、蛍光染料を膜電位インジケータとして使用してエンドスルファンから生成したＨＥＫ  ａ−３細胞における膜電位の測定を説明する。
【００６３】
この方法は、フィプロニルではなくエンドスルファンを使用したことを除いて実施例５で開示したように実施した。
【００６４】
表１及び表２の結果が示すように、本発明は、ＧＡＢＡ受容体に作用することが知られる試験化合物すべてが、低レベルの濃度であっても該細胞系統において蛍光のレベルを低下させたが（例えば、０．０１μＭ濃度レベルで４３％の阻害を示したフィプロニル参照）、対照及びＧＡＢＡ受容体に作用しないことが知られる化合物は全く蛍光を低下させなかった（例えば１０μＭ濃度レベルで５％の阻害を示したビキュキュリン参照）ことを測定した。それ故、本発明は、上述したように細胞または細胞系統における蛍光の低下が大きいほど、化合物が有しうる殺虫力が高いので、期待される化合物が殺虫力を示す可能性が高いかどうかを予測する上で有用でありうることがわかる。
【００６５】
好ましい実施形態に力点を置いて本発明を説明したが、好ましい装置及び方法のバリエーションが使用できること及び本発明はここで特定して述べる以外でも実施しうることが意図されていることは、当業者には明白であろう。従って、本発明は、特許請求の範囲によって定義される精神及び範囲内に包含されるすべての修正を含む。
【００６６】
本発明は、昆虫、好ましくはＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目の昆虫由来のＧＡＢＡ依存性塩素チャネルでトランスフェクトしたヒト胚腎細胞または細胞系統において生じる膜電位の変化を測定するための改善された方法、ならびに殺虫力を測定するための改善された方法を述べる。上記方法は、よりコスト効果的であり、より良好な再現性を有し、感受性において当技術分野で開示されているものに匹敵する、ハイスループット法であるという点で、当技術分野で開示されているものに対する改善である。上記方法はまた、電気生理学的方法あるいは細胞応答を指示するための放射性同位体または検出可能同位体で放射能標識したリガンドの使用を通しての結合能力ではなく、蛍光によって測定される膜電位を使用するという点でも、当技術分野で開示されているものに対する改善である。
【００６７】
【表１】
2005538699.tif 000002
【００６８】
【表２】
2005538699.tif 000003
【００６９】
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１は、ＦＬＩＰＲ（登録商標）膜電位アッセイキットに関する標準プロトコールに従ってタバコガのヌクレオチド配列（配列番号４）でトランスフェクトしたヒト胚腎細胞系統の蛍光のレベルを示す。
【図２】図２は、本発明を使用してタバコガのヌクレオチド配列（配列番号４）でトランスフェクトしたヒト胚腎細胞系統の蛍光のレベルを示す。
【配列表】
2005538699.tif 000004
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【図１】
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【図２】
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