(57)【要約】本発明は、ＳＥＳ−３タンパク質または変異ＳＥＳ−３タンパク質をコードする単離された核酸分子、ならびに、このような核酸分子を含むベクターおよびトランスジェニック生物に関する。本発明はまた、医薬を製造するため、およびモデル生物を作製するための、このような核酸分子または機能的に類似したものの使用に関する。さらに本発明は、対応するＳＥＳ−３タンパク質および変異ＳＥＳ−３タンパク質、ならびに、それにより誘導された抗体に関する。最後に、本発明は、アルツハイマー病を治療するための、ヒトプレセニリンの発現を増加させる物質の使用、前記物質それ自身、および、それらを含む医薬組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＳ−３をコードする単離された核酸分子。
【請求項２】
変異ＳＥＳ−３をコードする単離された核酸分子。
【請求項３】
変異ＳＥＳ−３が、１またはそれ以上の改変を含む、請求項２に記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
ＤＮＡ分子、特にｃＤＮＡ分子もしくはゲノムＤＮＡ分子、またはＲＮＡ分子である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
ＳＥＳ−３が、配列番号１で示されるアミノ酸配列と同一であるかまたは実質的に同じアミノ酸配列を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離された核酸分子。
【請求項６】
配列番号２またはその相補配列で与えられるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項７】
ヌクレオチド配列が、請求項６に記載の単離された核酸分子と少なくとも７５％の配列類似性を示すか、またはストリンジェントな条件下で請求項６に記載の単離された核酸分子とハイブリダイズする、単離された核酸分子。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離された核酸分子を含むベクター。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離された核酸分子の断片を含むベクター。
【請求項１０】
線虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの細胞における発現のためのプロモーターを含む、請求項８または９に記載のベクター。
【請求項１１】
プラスミド、コスミド、バクミド、ウイルスまたはバクテリオファージである、請求項８〜１０のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１２】
配列番号１で示されるアミノ酸配列またはそれらの断片を有するＳＥＳ−３タンパク質。
【請求項１３】
変異ＳＥＳ−３タンパク質またはそれらの断片。
【請求項１４】
配列番号１で示されるアミノ酸配列の１またはそれ以上のアミノ酸を欠くか、または配列番号１で示されるアミノ酸配列の１またはそれ以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されているか、または１またはそれ以上のアミノ酸が配列番号１で示されるアミノ酸配列に付加されている、請求項１２または１３に記載のＳＥＳ−３タンパク質。
【請求項１５】
請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のＳＥＳ−３タンパク質に対して産生された抗体。
【請求項１６】
モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１７】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸分子を含むトランスジェニック非ヒト生物。
【請求項１８】
線虫、特にＣ．ｅｌｅｇａｎｓである、請求項１７に記載のトランスジェニック非ヒト生物。
【請求項１９】
ＳＥＳ−３の活性を減少させるか、増幅させるか、または除去するＳＥＳ−３対立遺伝子を示す、請求項１８に記載のトランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓ生物。
【請求項２０】
ｓｅｌ−１２のＣ．ｅｌｅｇａｎｓ変異体における産卵異常表現型（Ｅｇｌ）を相殺するＳＥＳ−３対立遺伝子を示す、請求項１９に記載のトランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓ生物。
【請求項２１】
ｈｏｐ−１またはｓｅｌ−１２の活性を増加させるＳＥＳ−３対立遺伝子を示す、請求項１９または２０に記載のトランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓ生物。
【請求項２２】
ｓｅｓ−３に相同なヒト遺伝子（ＫＩＡＡ０６０１）を含むか、または相同Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ遺伝子（ＡＬＴ１）を含むか、または特にＣ．ｅｌｅｇａｎｓ由来の機能的に類似した遺伝子を含む、トランスジェニック非ヒト生物（特にＣ．ｅｌｅｇａｎｓ）。
【請求項２３】
神経疾患、特に神経変性疾患を治療するための医薬を製造するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離された核酸分子または機能的に類似した遺伝子の使用。
【請求項２４】
神経疾患、特に神経変性疾患の調査および解明のためのモデル生物を作製するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離された核酸分子または機能的に類似した遺伝子の使用。
【請求項２５】
ＳＥＳ−３の活性を改変する物質を同定および／または特徴付ける方法における、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載のトランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓ生物の使用。
【請求項２６】
ＳＥＳ−３の活性を減少させる物質または除去する物質を同定および／または特徴付ける方法における、請求項２５に記載のトランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓ生物の使用。
【請求項２７】
ｈｏｐ−１またはｓｅｌ−１２の活性を増加させる物質を同定および／または特徴付ける方法における、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載のトランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓ生物の使用。
【請求項２８】
アルツハイマー病を治療および／または予防するための活性化合物として用いることができる物質を同定および／または特徴付ける方法における、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載のトランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓ生物の使用。
【請求項２９】
アルツハイマー病を治療する医薬品を製造するためのヒトプレセニリン１またはプレセニリン２の発現を増加させる物質の使用。
【請求項３０】
ヒトプレセニリン１またはプレセニリン２の発現を増加させる物質。
【請求項３１】
請求項３０に記載の物質を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｓｅｓ−３または変異ｓｅｓ−３をコードする単離された核酸分子、これら核酸分子を含むベクター及びトランスジェニック生物、医薬製造およびモデル生物生産のためのこれら核酸分子または機能的に類似した核酸分子の使用、ｓｅｓ−３の活性を改変する物質、または、プレセニリン活性（例えばｓｅｌ−１２またはｈｏｐ−１の活性）をそれぞれ増加させる物質を同定する方法におけるトランスジェニック生物の使用、ならびに対応するＳＥＳ−３タンパク質および変異ＳＥＳ−３タンパク質、同様に、これらタンパク質が産生する抗体に関する。その上、本発明は、アルツハイマー病を治療するためのヒトプレセニリンの発現を増加させる物質の使用、これら物質それ自体、および、これら物質を含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
パーキンソン病に加えて、最もよく知られた神経変性疾患としてアルツハイマー病がある。アルツハイマー病の特徴は、神経タンパク質の凝集の発達（プラークと称される）であり、これは実質的に、アミロイドβ−ペプチド（Ａβ４）と称されるサイズが４ｋＤａの不溶性のペプチドから成る。ここ数年で行われた調査によれば、Ａβ４の形成が、原因として病気の進行に関与することが示唆される。３つの遺伝子における優性変異が、病気の家族性形態（ＦＡＤ，家族性アルツハイマー病）をもたらす。関連する遺伝子の一つが、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）をコードし、ＡＰＰは３種のプロテアーゼでプロセシングされ、その結果として特にＡβ４が形成されるということがわかっている。ＡＰＰにおけるＦＡＤ変異により、生産されるＡβ４２（４２個のアミノ酸長のＡβ４変異体）の量が増加する。
【０００３】
アルツハイマー病が発症する家族の分子遺伝学的調査により、ヒト遺伝子プレセニリン１およびプレセニリン２が同定され（Ｒｏｇａｅｖ  ｅｔ  ａｌ．１９９５，Ｎａｔｕｒｅ  ３７６，７７５−７７８；Ｌｅｖｙ−Ｌａｈａｄ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．１９９５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：９７３−９７７）これらが特定の変異により改変された場合、原因としてアルツハイマー病の発症に関与し、これはまた、病気の進行の際に、ノッチシグナル伝達経路において主要な役割を果たす。プレセニリンタンパク質はＥＲ−ゴルジに存在し、少なくとも６回膜貫通ドメインを有する。ＰＳ１およびＰＳ２における変異が、Ａβ４の形成に影響を及ぼし、おそらくアミロイド沈着が形成されることによりアルツハイマー病発症に関与するということがわかっている。プレセニリンファミリーのメンバーは、特に、マウス、キイロショウジョウバエ、アフリカツメガエル、および、線虫Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓで同定されている。ヒトにおいて変異プレセニリンはＡＰＰのプロセシングに影響を与えるが、ヒトにおけるそれらの天然の機能は、詳細にはわかっていない；それらはＡＰＰプロテアーゼ（γ−セクレターゼ）として機能する可能性があると仮定されている。ヒト細胞培養物で行われたその他の調査によれば、プレセニリンは、それらがリガンド結合により活性化された後の細胞内のノッチ様受容体のタンパク質分解において役割を果たすということが示されている。それゆえに、プレセニリンが、少なくとも２種の異なる膜タンパク質（ＡＰＰおよびノッチ）のプロセシングに関与すると考えられる。目下、プレセニリンそれ自体がこのプロセシングにおいてプロテアーゼであるのかどうか、または、それらがこれら反応の補因子なのか、もしくは間接的にタンパク質分解に影響を与えるのかについて物議を醸している（Ｈａａｓｓ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６（５４４１）：９１６−９１９）。
【０００４】
上述のプレセニリン遺伝子を出発点として、分子レベルの病気のプロセスを明らかにし、アルツハイマー病を治療および予防するための医薬を開発するために集中的なリサーチが行われている。プレセニリン遺伝子の活性に影響を与える因子が探索されており、特に、この点において、プレセニリン変異体表現型のサプレッサーの探索が特に重視されている。サプレッサーは、プレセニリン機能の必要性を除去するその他の遺伝子における変異であってもよいし、または、プレセニリン変異体の欠陥が表現型の結果にいかなる影響も及ぼさないようにその他の遺伝子またはプレセニリンの活性を調節する物質であってもよい。
【０００５】
線虫、特にＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓは、このような調査における好ましいモデル生物として頻繁に用いられてきた。線虫モデル、特にＣ．ｅｌｅｇａｎｓモデルの利点は、特に、ハイスループット法（ＨＴＳ；ハイスループットスクリーニング）に適していること、世代時間が短いために（２〜３日）速い遺伝分析が可能であること、および、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの神経系の分子および機能的特性の知識が詳細であることにある。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓはマイクロタイタープレート上で維持できるために、この試験系を用いて、ＨＴＳにより１００００またはそれ以上の物質を、生きた線虫において短い期間で試験することが可能である。
【０００６】
これまでのところ、ｓｅｌ−１２、ｈｏｐ−１およびｓｐｅ−４と指定される３種のプレセニリン遺伝子が線虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓで同定されている。ｓｐｅ−４は、最も分岐したファミリーメンバーである。ｓｐｅ−４における変異により、精子形成の際の細胞質分配において異常が生じる（Ｌ’Ｈｅｒｎａｕｌｔ，Ｓ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．１９９２，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １１９：５５−６８）。ｈｏｐ−１における変異は目に見える表現型を全く示さないが、その変異とｓｅｌ−１２の変異とを組み合わせると、合成的な致死性の表現型がもたらされる（Ｌｉ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．１９９７，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：１２２０４−１２２０９）。ｓｅｌ−１２は、ヒトＰＳ１およびＰＳ２に最もよく似た遺伝子であり、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおいて最もよく研究されたプレセニリン遺伝子でもある。特定のｓｅｌ−１２変異体は産卵異常を示し、さらに産卵口発達における形態学的変化も示すということがわかっている（Ｌｅｖｉｔａｎ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．１９９５，Ｎａｔｕｒｅ  ３７７：３５１−４）。ｓｅｌ−１２はヒトプレセニリンと５０％同一であり、ｓｅｌ−１２変異体における産卵異常は、ｓｅｌ−１２プロモーターからＰＳ１またはＰＳ２を遺伝子導入により発現させることにより相殺される（Ｂａｕｍｅｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ.，１９９７，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  １：１４９−１５９）。これは、ＰＳ１およびＰＳ２が、ｓｅｌ−１２と機能的に相同であることを示している。当初は、ｓｅｌ−１２変異は、ｌｉｎ−１２およびｇｌｐ−１ノッチ受容体遺伝子における機能獲得型突然変異体の複数の産卵口の表現型のサプレッサーとして同定された。ノッチ受容体は、多くの多細胞生物における細胞運命の決定を制御する。加えて、ｓｅｌ−１２変異体の表現型が、ｌｉｎ−１２の弱い機能喪失型変異体の表現型と類似していることが示されている。要約すれば、哺乳動物など多数の生物におけるノッチシグナル伝達においてプレセニリンは重要な役割を果たすと言える。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで本発明の発明者等は、驚くべきことに、他の遺伝子における特定の変異、すなわち本発明者により初めて同定されたＣ．ｅｌｅｇａｎｓのｓｅｓ−３遺伝子における変異が、欠陥、特にｓｅｌ−１２変異体の産卵異常を抑制することができることを見出した。これら変異は、ｓｅｓ−３の発現または活性を改変する、特に減少させることを特徴とする。これは、ｓｅｓ−３遺伝子における特定の変異により、例えば、特定のｓｅｌ−１２変異により生じる産卵異常が除去され、二重変異体（ｓｅｌ−１２-；ｓｅｓ−３-）が再び正常な野生型表現型を示すようになることを意味する。より詳細な調査によれば、ｓｅｓ−３遺伝子におけるこれら変異により、ｓｅｌ−１２変異体において、ｈｏｐ−１が活性化されるようになり、すなわちｈｏｐ−１プレセニリンタンパク質が、欠陥ｓｅｌ−１２プレセニリンタンパク質の機能に取って代わることが示された（図１）。
【０００８】
本発明の発明者により、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのゲノムにおいて新規のｓｅｓ−３遺伝子の位置決定がなされ、さらに、それを配列決定した。
【０００９】
その結果として、本発明はまず、ＳＥＳ−３タンパク質をコードする単離された核酸分子に関し、および、変異ＳＥＳ−３タンパク質をコードする他の核酸分子に関する。
【００１０】
これに加えて、本発明は、これら単離された核酸分子、またはそれらの断片を含むベクターに関する。
【００１１】
その上、本発明は、前記核酸分子によりコードされたＳＥＳ−３タンパク質および変異ＳＥＳ−３タンパク質またはそれらの断片に関し、および、これらタンパク質を用いて生産された抗体に関する。
【００１２】
加えて、本発明は、ＳＥＳ−３タンパク質または変異ＳＥＳ−３タンパク質をコードする単離された核酸分子を含むトランスジェニック非ヒト生物に関する。特に、本発明は、ｓｅｓ−３の活性を減少させ、ｓｅｌ−１２またはｈｏｐ−１の活性をそれぞれ増加させるｓｅｓ−３対立遺伝子を示すトランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓ生物に関する。この点において、トランスジェニック生物は、ゲノムが変異により改変され、その結果として変異ｓｅｓ−３遺伝子が示される、または、ｓｅｓ−３遺伝子が除去された生物と理解される。
【００１３】
最後に、本発明は、アルツハイマー病に向けられた医薬を製造するため、および、この病気をさらに調査するためのモデル系を作製するためのこれら核酸分子の使用に関する。
【００１４】
特に、本発明は、ｓｅｓ−３の活性を減少させる物質またはｓｅｌ−１２またはｈｏｐ−１の活性をそれぞれ増加させる物質を同定および／または特徴付ける方法における、トランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓの使用に関する。
【００１５】
その上本発明はまた、アルツハイマー病に向けられた医薬を製造するため、および、この病気をさらに調査するためのモデル系を作製するための、相同ヒト遺伝子、相同キイロショウジョウバエ遺伝子、または、機能的にｓｅｓ−３と類似した遺伝子の使用に関する。
【００１６】
最後に、本発明はまた、アルツハイマー病を治療するためのヒトプレセニリン１または２の発現を増加させる物質の使用、および、これら物質それ自体、および、これら物質を含む医薬組成物に関する。
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおいて新規の遺伝子ｓｅｓ−３を同定することができたという事実に基づき、この遺伝子は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓプレセニリン遺伝子ｓｅｌ−１２およびｈｏｐ−１と相互作用し、それによりアルツハイマー病の進行において重要な役割を果たす。
【００１８】
従って、ｓｅｓ−３遺伝子の完全な欠失もまた含むｓｅｓ−３遺伝子における様々な変異は、ｓｅｌ−１２変異が抑制されることにより引き起こされる特定の改変された表現型を生じる。ｓｅｓ−３変異体におけるこれらｓｅｌ−１２の欠陥の抑制は、ｈｏｐ−１発現を後半に目立って活性化すること、および、ＨＯＰ−１タンパク質がおそらく欠陥ＳＥＬ−１２タンパク質の機能に取って代わることが可能なことにより達成される。
【００１９】
同定されたｓｅｓ−３遺伝子は、アミノ酸１３７〜アミノ酸２６４のＦＡＤ結合部位、および、アミノ酸２６４〜アミノ酸６７７のアミノオキシダーゼモチーフを含むタンパク質をコードする（図２）。ＳＥＳ−３タンパク質は、ヒトタンパク質ＫＩＡＡ０６０１およびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒタンパク質ＡＬＴ１と系統発生的関係を示し、加えて、コンピューター検索（ＢＬＡＳＴ検索プログラム）では、その他の類似のＣ．ｅｌｅｇａｎｓタンパク質Ｔ０８Ｄ１０．２に関する遺伝子が同定された。相同性の程度を図３および４に示す。
【００２０】
その結果として、本発明は、ＳＥＳ−３タンパク質をコードする単離された核酸分子を提供する。
【００２１】
その上、本発明は、変異ＳＥＳ−３タンパク質をコードする単離された核酸分子を含む。特に、本発明は、変異ＳＥＳ−３タンパク質をコードする単離された核酸分子を提供する。
【００２２】
これに加えて、本発明の他の観点は、単離された核酸分子、特にＤＮＡ分子、例えばｃＤＮＡ分子またはゲノムＤＮＡ分子、さらにＲＮＡ分子に関し、これらは、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するＣ．ｅｌｅｇａｎｓのＳＥＳ−３タンパク質をコードし、特に配列番号２で示される核酸配列を示す核酸分子である。
【００２３】
本発明はまた、ヌクレオチド配列が、上述の核酸分子と、少なくとも７５％、特に少なくとも８０％、特に少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の配列類似性を示し、特にストリンジェントな条件下で上述の核酸分子とハイブリダイズする単離された核酸分子を含む。このようなハイブリダイゼーションは、好ましくは、低いストリンジェンシー条件で起こり；他の実施形態においては、高いストリンジェンシー条件下でも起こる。本明細書においては、低いストリンジェンシーの条件は、３×ＳＳＣ中の、室温〜６５℃でのハイブリダイゼーションを意味するものと理解され、高いストリンジェンシーの条件は、０.１×ＳＳＣ中の、６８℃でのハイブリダイゼーションを意味するものと理解される。ＳＳＣとは、０.１５Ｍ塩化ナトリウム、０.０１５Ｍクエン酸三ナトリウム緩衝液の略語である。
【００２４】
配列番号２で示される核酸配列に類似した核酸配列を有する本発明に係る核酸分子はまた、特に所定の核酸配列の対立遺伝子変異体を含み、この変異体は、特に上述の変異を含む。
【００２５】
本発明はまた、それぞれの場合において上述の核酸配列に相補的な核酸配列を含む核酸分子にも及ぶ。
【００２６】
本明細書において、用語「単離された核酸分子」は、初発細胞または生産細胞から生じた性質が異なる核酸分子の主な量から実質的に精製された形態で存在する核酸分子を意味する。しかしながら、本発明に係る単離された核酸分子の調製物は、その他の成分、例えば塩、培地からの物質または生産細胞の残留成分、例えば様々なタンパク質を含んでいてもまったく問題がない。
【００２７】
本発明はまた、ＳＥＳ−３タンパク質または変異ＳＥＳ−３タンパク質をコードする本発明に係る核酸分子を含むベクターを含む。本発明はまた、本発明に係る核酸分子の断片を含むベクターを含む。この点において、該核酸分子は、発現のために用いられる生物で該核酸分子を発現させるプロモーターに連結される。この点において、既知のＣ．ｅｌｅｇａｎｓプロモーターの一つ（http://chinook.uoregon.edu/promoters.html）が、特にＣ．ｅｌｅｇａｎｓで発現させるために用いられる。
【００２８】
ベクターとしては、例えば、プラスミド、コスミド、バクミド、ウイルスまたはバクテリオファージが可能である。
【００２９】
他の観点は、上記核酸分子でコードされたポリペプチドまたはタンパク質、特に配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するＣ．ｅｌｅｇａｎｓのＳＥＳ−３タンパク質、および、上述の変異ＳＥＳ−３タンパク質に関し、また、アミノ酸の置換、修飾、欠失、挿入または付加によりそれらから誘導され、かつ、上述のアミノ酸配列と、少なくとも７５％、特に少なくとも８０％、特に少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の配列類似性を示すポリペプチドまたはタンパク質に関する。本発明はまた、融合タンパク質を含み、該融合タンパク質は、性質が異なるタンパク質または性質が異なるタンパク質セグメント（例えばマーカータンパク質または指標タンパク質）に融合した本発明に係るポリペプチド、タンパク質またはタンパク質断片を含む。本発明はまた、上述のタンパク質またはポリペプチドの断片を含む。
【００３０】
同様に、これらタンパク質を用いて得られ、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る抗体も本発明に含まれる。
【００３１】
本発明はまた、トランスジェニック生物、特に微生物、例えば細菌、ウイルス、原生動物、菌類および酵母、藻類、植物または動物、ならびに、部分（例えば細胞）、ならびに、これらトランスジェニック生物からの繁殖のための物質（例えば種子）にも及び、該トランスジェニック生物は、必要に応じて染色体または染色体外に組込まれるか、組換え核酸配列を含み、この組換え核酸配列は導入遺伝子としてＳＥＳ−３タンパク質もしくは変異ＳＥＳ−３タンパク質またはそれらの断片をコードする本発明に係る核酸分子を含む。好ましい観点において、トランスジェニック生物はまた、上述の導入遺伝子でコードされたポリペプチドまたはタンパク質、すなわちＣ．ｅｌｅｇａｎｓのＳＥＳ−３タンパク質またはそれらから誘導されたポリペプチドもしくはタンパク質を発現し得る。
【００３２】
本発明の一つの観点によれば、トランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓ生物は、ｓｅｓ−３の活性を減少させるか、増幅させるか、または除去するｓｅｓ−３対立遺伝子を示す。本発明はまた、ｓｅｓ−３遺伝子が完全に除去されたトランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓ生物を含む。特に、本発明は、ｓｅｌ−１２変異体における産卵異常表現型（Ｅｇｌ）を相殺するｓｅｓ−３対立遺伝子を示すトランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓ生物に関する。加えて、本発明は、ｈｏｐ−１またはｓｅｌ−１２の活性を増加させるｓｅｓ−３対立遺伝子を示すトランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓ生物に関する。
【００３３】
本発明はまた、神経疾患、特に神経変性疾患、特に好ましくはアルツハイマー病を治療するための医薬を製造するため、または、神経疾患、特に神経変性疾患のさらなる調査および解明のためのモデル生物を作製するための、本発明に係る核酸分子の使用を含む。
【００３４】
上述の医薬は、例えば、遺伝子治療剤として本発明に係る核酸分子自体を用いることにより、または、このような核酸分子を用いてモデル生物を構築し、このモデル生物を用いて見出された物質を製剤化することにより得ることができる。これに関するさらなる詳細については、読者は、例えば同出願人が所有する国際出願ＰＣＴ／ＥＰ０１／０３２１４を参照することができる。
【００３５】
特に、本発明は、ｓｅｓ−３の活性を改変する、特に減少または除去する物質を同定および／または特徴付ける方法における、本発明に係る核酸分子を含むトランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓ生物の使用に関する。その上、本発明は、ｈｏｐ−１またはｓｅｌ−１２の活性を増加させる物質を同定および／または特徴付ける方法における、本発明に係る核酸分子を含むトランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓ生物の使用に関する。
【００３６】
その上、本発明は、アルツハイマー病を治療および／または予防するための活性化合物として用いることができる物質を同定および／または特徴付ける方法における、この同じトランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓ生物の使用に関する。ヒト細胞との類似性を考慮し、さらに、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓおよびヒトにおいて実証されたノッチシグナル経路およびプレセニリン機能の機能的類似性という背景において、ＦＡＤプレセニリン変異体の機能不全は、ヒトにおけるｓｅｓ−３と相同または機能的に同等な遺伝子に変異を入れることにより同じような方法で相殺され得ると考えられる。このような相同遺伝子は、特に、遺伝子ＫＩＡＡ０６０１である。それゆえに、本発明の内容において、ヒトｓｅｓ−３相同体または機能的に同等な遺伝子における欠陥により、ＦＡＤ変異により影響を受けないプレセニリン遺伝子の発現が増加すると予想される。
【００３７】
それゆえに、本発明はまた、アルツハイマー病を治療するためのヒトプレセニリンの発現を増加させる物質の使用、および、これら物質それ自体に関する。特に、本発明に係る物質としては、ヒトプレセニリン遺伝子１またはプレセニリン遺伝子２を活性化し、ヒトプレセニリンタンパク質１またはヒトプレセニリンタンパク質２の発現を増加させる物質が挙げられる。また、本発明に係る物質としては、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおいてｓｅｓ−３の活性を変化させる物質、および／または、ｓｅｌ−１２またはｈｏｐ−１プレセニリン活性を増加させる物質も挙げられる。本発明はまた、これら物質を含む医薬組成物も含む。
【００３８】
類似の様式において、本発明はまた、年齢依存性であり変異とは関連しない散発性のアルツハイマー病ケースの治療においても利点を有する可能性がある。この点において、発現の減少は、プレセニリン活性を増加させることによりＡβ４、特にＡβ４２の形成を減少させ、それにより、年代順に病気の発症を遅らせることができると予想される。
【００３９】
加えて、本発明はまた、相同ヒト遺伝子（ＫＩＡＡ０６０１）の使用、図４で示される相同Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ遺伝子（ＡＬＴ１）の使用、および、アルツハイマー病を治療および／または予防するための活性化合物として用いることができる物質を発見するための、特にＣ．ｅｌｅｇａｎｓから得られた機能的に類似した遺伝子の使用に関する。特に、本発明は、ヒトプレセニリン活性を増加させることができる物質を発見するためのこれら遺伝子の使用に関する。本発明はまた、これら相同または機能的に類似した遺伝子を含むトランスジェニック生物に関し、ｈｏｐ−１またはｓｅｌ−１２活性を増加させる物質、または、ｓｅｓ−３の活性を減少させる物質を同定および／または特徴付ける方法における、これら生物、特にＣ．ｅｌｅｇａｎｓ生物の使用に関する。
【００４０】
図面および配列表の簡単な説明
図１：ｓｅｓ−３対立遺伝子におけるｈｏｐ−１濃度である。ｈｏｐ−１特異的プローブでハイブリダイズしたノーザンブロットである。
図２：ＳＥＳ−３タンパク質のドメイン構造である。
図３：ＳＥＳ−３のアミノ酸配列と相同タンパク質のアミノ酸配列との比較である。
図４：ＳＥＳ−３の系統発生的関係および相同性である。
図５：異なる変異に依存するｓｅｓ−３ｍＲＮＡの検出である。ノーザンブロットである。
図６：ｓｅｓ−３領域のゲノム構造、および、ｓｅｓ−３変異体を補足するゲノムＤＮＡ導入遺伝子の図解である。
【００４１】
配列番号１：ＳＥＳ−３のアミノ酸配列である。
配列番号２：ｓｅｓ−３のｃＤＮＡ配列である。
配列番号３：ｓｅｓ−３変異体を補足することができるＹ４０Ｂ１Ｂ．６のサブフラグメントのゲノム配列である。その結果として、この断片は、ｓｅｓ−３の発現に必要な全配列およびプロモーターセグメントを含む。
【００４２】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明する。
【実施例】
【００４３】
ｓｅｓ−３変異体の単離
ｓｅｌ−１２変異動物でみられる産卵異常のサプレッサーをＣ．ｅｌｅｇａｎｓにおいて単離するために、ｓｅｌ−１２（ａｒ１７１）変異を、突然変異誘発系統ｍｕｔ−７（ｐｋ７０４）に交雑した。得られた系は、２０℃で、全てのＣ．ｅｌｅｇａｎｓトランスポゾンの温度依存性の活性化を示す。変異誘発のために、ｓｅｌ−１２（ａｒ１７１）ｕｎｃ−１（ｅ５３８）；ｍｕｔ−７（ｐｋ７０４）動物を、２０℃で、３．５ｃｍのＯＰ５０を含むＮＧＭ寒天プレートで培養した。それぞれを作製した後、産卵可能な動物の出現を調べた。約３００００の一倍体ゲノムを分析した結果、再現可能に産卵できる２匹の独立した変異動物を単離した。これら動物の産卵行動を、野生型動物の産卵行動と比較した。これら変異のうちの一つはｓｅｓ−３（ｂｙ１０１）と名付けられた。
【００４４】
ｓｅｌ−１２；ｓｅｓ−３表現型
ｓｅｓ−３における変異は、ｓｅｌ−１２変異体の産卵異常を、実質的に完全に抑制する。９５％のｓｅｌ−１２（ａｒ１７１）；ｓｅｓ−３（ｂｙ１０１）二重変異動物は、野生型の産卵行動と類似した産卵行動を示したが、一方で、５％の動物は、産卵における欠陥を示し、この欠陥は、ｓｅｌ−１２単一変異体における欠陥に相当する。ｓｅｓ−３における変異は、全ての既知のｓｅｌ−１２変異を抑制することができる。このことから、ｓｅｓ−３は対立遺伝子特異的な方法で作用しないと結論付けることができる。ｓｅｌ−１２（ａｒ１７１）；ｓｅｓ−３（ｂｙ１０１）二重変異動物は１８０〜２８０個の子孫を生じる卵を産み、これは、平均６０匹の子孫が生じるｓｅｌ−１２（ａｒ１７１）単一変異体と対照的である。ｓｅｌ−１２（ａｒ１７１）；ｓｅｓ−３（ｂｙ１０１）二重変異動物は約２〜３日後に産卵をやめ、ｓｅｌ−１２単一変異の場合に通例的な「ｂａｇ−ｏｆ−ｗｏｒｍ」表現型では死なない。野生型動物と比較すれば、ｓｅｌ−１２（ａｒ１７１）；ｓｅｓ−３（ｂｙ１０１）二重変異動物は、成長が１世代あたり約１日遅れるという挙動を示す。
【００４５】
ｓｅｓ−３遺伝子座のクローニング
典型的な遺伝学を用いて、第１染色体右腕における劣性変異としてｓｅｓ−３を位置付けた。トランスポゾン変異誘発によりｓｅｓ−３変異が作製されることから、トランスポゾンをｓｅｓ−３遺伝子のコーディング領域に挿入することにより変異を発生させることができた。これにより、ｓｅｌ−１２単一変異体系と比較したいわゆる多型が生じる。これは、ｍｕｔ−７バックグラウンドにより生じた残存する多型を除去した後、野生型Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ系Ｎ２との外部交雑により得ることができる。このようにして外部交雑されたｓｅｌ−１２（ａｒ１７１）；ｓｅｓ−３（ｂｙ１０１）系におけるトランスポゾンは、トランスポゾンディスプレイにより可視化することができる。野生型ｓｅｌ−１２系との比較により、ｓｅｌ−１２（ａｒ１７１）；ｓｅｓ−３（ｂｙ１０１）二重変異動物のみに存在するトランスポゾンを同定することが可能である。この方法を用いたところ、Ｔｃ３挿入が遺伝子Ｙ４０Ｂ１Ｂ．６のエキソン７中に同定され、これは、さらなる外部交雑によりｓｅｓ−３変異から分離することができなかった。
【００４６】
ｓｅｓ−３の導入遺伝子レスキュー
ｓｅｓ−３表現型をレスキューするために、ｓｅｓ−３ゲノム領域を含むフォスミドＨ１４ｏ４、Ｈ３７ｏ１９およびＨ１８Ｎ７を単離した。この点において、フォスミドＨ１４ｏ４およびＨ３７ｏ１９は、Ｙ４０Ｂ１Ｂ．６の完全なゲノム配列を含むが、一方、Ｈ１８Ｎ７はエキソン７および８を欠くＹ４０Ｂ１Ｂ．６ゲノム配列の一部しか含まない。これらフォスミドの個々の例を含む導入遺伝子を、系ｓｅｌ−１２（ａｒ１７１）；ｓｅｓ−３（ｂｙ１０１）に注入し、トランスジェニック動物の抗サプレッサー活性を試験した。すべてのクローンに、所定のフォスミドを１μｌあたり５０ｎｇの濃度で、１μｌあたり１００ｎｇの優性の形質転換マーカーｐＲＦ４（Ｍｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ.，１９９１）／μｌと共に注入した。ｓｅｓ−３によるｓｅｌ−１２−変異動物の産卵異常の抑制は、フォスミドＨ１４ｏ４およびＨ３７ｏ１９の存在により実質的に完全に相殺され（レスキューされ）、一方で、フォスミドＨ１８Ｎ７は、ｓｅｌ−１２のｓｅｓ−３介在抑制をレスキューすることができなかった（図６を参照）。
【００４７】
ｓｅｓ−３の構造
ｓｅｓ−３（Ｙ４０Ｂ１Ｂ．６）は８個のエキソンで構成され、遺伝子Ｙ４０ｂ１Ｂ．５と共にオペロンを形成する（図６を参照）。Ｙ４０Ｂ１Ｂ．６と予想されたｃＤＮＡは、２３１３個の塩基対のｃＤＮＡと計算され（配列番号２）、これがｓｅｓ−３と決定された。ｓｅｓ−３は、７７０個のアミノ酸からなるタンパク質をコードする（配列番号１）。ｓｅｓ−３を用いたモチーフ検索によれば、ｓｅｓ−３は、その長さの大部分にわたりアミノオキシダーゼモチーフを有し、Ｎ末端にＦＡＤ結合部位を有することが示された（図２）。データベースでの配列比較によれば、他のＣ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子、すなわちＴ０８Ｄ１０．２、および、ヒトＥＳＴ  ＫＩＡＡ０６０１、および、予想されたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ遺伝子ａｌｔ１と相同性を示した（図３）。図４は、どのように遺伝子が互いに関連するかを示す。
【００４８】
ｓｅｓ−３の発現
発生段階特異的なノーザンブロットによれば、ｓｅｓ−３が全ての発生段階において発現されていることが示される。
【００４９】
ｓｅｓ−３における変異
ｂｙ１０１：ｃＤＮＡの１８１７位におけるＹ４０Ｂ１Ｂ．６のエキソン７におけるＴｃ３挿入であり、ｍＲＮＡ発現に影響を与える（図５）。
ｂｙ１１３：ＥＭＳ変異誘発から単離され、ｍＲＮＡ発現に対する作用をまったくもたない（図５）。
ｂｙ１１９：ＥＭＳ変異誘発から単離され、ｍＲＮＡ発現を減少させる（図５）。
ｂｙ１２８：ＵＶ／ＴＭＰ変異誘発から単離され、ｍＲＮＡ発現の減少、ならびにｍＲＮＡおよびゲノム領域の再構成を起こす（図５）。
ｂｙ１３４：ＵＶ／ＴＭＰ変異誘発から単離され、ｍＲＮＡ発現を減少させる（図５）。
ｂｙ１３９：ＵＶ／ＴＭＰ変異誘発から単離され、ｍＲＮＡ発現の減少、バンドのサイズ減少、第二のより大きいバンドの出現、および、ｃＤＮＡのエキソン８、２０１５〜２１６９位の欠失を起こす（図５）。
【００５０】
ｓｅｓ−３によるｓｅｌ−１２抑制のメカニズム
ｓｅｓ−３変異は、ｓｅｌ−１２；ｈｏｐ−１ｓｅｓ−３の生殖不能を抑制することができない。これは、ｈｏｐ−１がｓｅｌ−１２を抑制するのに必要であることを実証する。ｓｅｓ−３対立遺伝子ｂｙ１０１、ｂｙ１１９、ｂｙ１２８およびｂｙ１３９を含むｓｅｌ−１２；ｓｅｓ−３二重変異体のノーザンブロットによれば、ｈｏｐ−１発現は、ｓｅｌ−１２および野生型系Ｎ２と比べて、Ｌ１段階でアップレギュレートされることが示される。ｈｏｐ−１はｓｅｌ−１２に取って代わることが可能であるため、ｈｏｐ−１は、初期の幼生段階でｓｅｌ−１２に取って代わる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】ｓｅｓ−３対立遺伝子におけるｈｏｐ−１濃度である。ｈｏｐ−１特異的プローブとハイブリダイズさせたノーザンブロットである。
【図２】ＳＥＳ−３タンパク質のドメイン構造である。
【図３Ａ】ＳＥＳ−３のアミノ酸配列と相同タンパク質のアミノ酸配列との比較である。
【図３Ｂ】３Ａの続きである。
【図４】ＳＥＳ−３の系統発生的関係および相同性である。
【図５】異なる変異に依存するｓｅｓ−３ｍＲＮＡの検出である。ノーザンブロットである。
【図６】ｓｅｓ−３領域のゲノム構造、および、ｓｅｓ−３変異体を補足するゲノムＤＮＡ導入遺伝子の図解である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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