(57)【要約】  本発明は、ヒダントイナーゼおよびＤ−カルバモイラーゼの存在下で、１ポット反応で行われるエナンチオマーに富むＤ−α−アミノ酸の製造法に関し、上記方法において、Ｎ−カルバモイル−Ｌ−α−アミノ酸が、対応するＤ−α−アミノ酸に転化され、Ｎ−カルバモイル−Ｌ−α−アミノ酸は、対応するＬ−α−アミノ酸から製造され得る。使用される酵素は好ましくは、アグロバクテリウム  ラディオバクター（Agrobacteriumradiobacter）またはアースロバクター  アウレセンス（Arthrobacteraurescens）に由来する。非常に適するα−アミノ酸の例は、ロイシン、メチオニン、システイン、スレオニンおよびフェニルアラニンである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒダントイナーゼおよびＤ−カルバモイラーゼの存在下で、１ポット反応で、エナンチオマーに富むＤ−α−アミノ酸を製造する方法において、Ｎ−カルバモイル−Ｌ−α−アミノ酸が、対応するＤ−α−アミノ酸に転化されることを特徴とする方法。
【請求項２】
方法がＤ−ヒダントイナーゼの存在下で行われることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
方法がＤ−ヒダントイナーゼおよびＬ−ヒダントイナーゼの存在下で行われることを特徴とする、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
Ｎ−カルバモイル−アミノ酸のエナンチオマーの混合物が、対応するＤ−α−アミノ酸に転化されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸が、対応するα−アミノ酸から製造されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
対応するＬ−α−アミノ酸からのＤ−α−アミノ酸の製造が単一容器中で行われることを特徴とする、請求項５記載の方法。
【請求項７】
Ｄ−カルバモイラーゼが少なくとも９９％の選択率を有することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
転化がヒダントインラセマーゼの存在下で行われることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
転化が６．０〜７．５のｐＨで行われることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
転化が３５〜４５℃の温度で行われることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
反応条件が、形成される、エナンチオマーに富むＤ−α−アミノ酸が晶出するように選択されることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
転化のために、アグロバクテリウム  ラディオバクター（Agrobacterium radiobacter）またはアースロバクター  アウレセンス（Arthrobacter aurescens）由来の１以上の酵素が使用されることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
Ｄ−α−アミノ酸がＤ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−システイン、Ｄ−スレオニンまたはＤ−フェニルアラニンであることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒダントイナーゼおよびＤ−カルバモイラーゼの存在下で、１ポット反応で、エナンチオマーに富むＤ−α−アミノ酸を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｄ−α−アミノ酸は、対応するＤ−およびＬ−５位置換ヒダントインの混合物から酵素的に製造され得る。そのような方法は、欧州特許第０７７５７４８号から公知である。上記方法では、Ｄ−およびＬ−５位置換ヒダントインの混合物が、Ｄ−ヒダントイナーゼおよびＤ−カルバモイラーゼの存在下で、１ポット反応で、対応するＤ−α−アミノ酸にエナンチオ選択的に転化される。エナンチオマーに富むα−アミノ酸は、生物学的に活性な調製物、例えばβ−ラクタム抗生物質、ペプチドホルモンおよび農薬のための重要な基礎単位である。
【０００３】
この方法の欠点は、エナンチオマーに富むα−アミノ酸の製造のための出発物質、対応する５位置換ヒダントイン、が、ほとんどの５位置換ヒダントインの小さい水溶性故に、通常取扱いにくいということである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、５位置換ヒダントインよりも取扱いの容易な出発物質が使用され得るところのＤ−α−アミノ酸の簡単な製造法を提供することを目的とする。本発明によれば、これは、Ｎ−カルバモイル−Ｌ−α−アミノ酸を対応するＤ−α−アミノ酸に転化することによって達成される。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
Ｎ−カルバモイル−Ｌ−α−アミノ酸の対応するＤ−α−アミノ酸への転化が比較的迅速にかつ高収率で進むこと、およびヒダントイナーゼのエナンチオ選択性は本発明の方法において重要でないことが判った。これは驚くべきことである。なぜならば、非選択的ヒダントイナーゼ工程は、単位反応体積当たり、単位時間当たりに製造される生成物の量の尺度であるところの空間／時間収率を制限するであろうことが、Syldatkら(1999), Appl. Microbiol. Biotechnol., vol.51, p293-309に開示されているからである。Ｎ−カルバモイル−Ｌ−α−アミノ酸は、対応するＬ−α−アミノ酸から容易に製造され得るので、本発明は、Ｄ−α−アミノ酸が、対応するＬ−α−アミノ酸から迅速にかつ高収率で製造され得るところの方法をも提供する。Ｌ−α−アミノ酸は通常安価であり、広く入手可能である。さらに、本発明に従う方法は、対応するヒダントインに化学的に転化されるときに安定なヒダントインをあまり生じない（その結果、これらのＬ−α−アミノ酸の対応するヒダントインへの化学的転化において多量の副生物が生成する）ところのＬ−α−アミノ酸からＤ−α−アミノ酸を製造する場合に非常に適する。そのようなα−アミノ酸の例は、セリン、アスパラギン、グルタミン、リシン、スレオニンおよびシステインである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
用語「カルバモイラーゼ」は、文献から公知である。専門家は、カルバモイラーゼを、カルバモイラーゼ活性、すなわち、Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸の対応するα−アミノ酸への転化を触媒する能力を有する酵素であると理解する。専門家は、Ｄ−カルバモイラーゼを、Ｎ−カルバモイル−Ｄ−α−アミノ酸の対応するＤ−α−アミノ酸への転化を好ましくは触媒する酵素であると理解する。本発明に従うＤ−α−アミノ酸の製造法に関与するＤ−カルバモイラーゼは、好ましくは少なくとも９０％の選択率、より特には少なくとも９５％、さらに特には少なくとも９８％、最も特には少なくとも９９％の選択率を有する。本発明の文脈において、Ｄ−カルバモイラーゼの９０％選択率は、Ｄ−カルバモイラーゼが、５０％の総転化でＮ−カルバモイル−（Ｄ、Ｌ）−α−アミノ酸を９０％のＤ−α−アミノ酸および１０％のＬ−α−アミノ酸に転化することを意味すると理解される。これは、５０％転化でＤ−α−アミノ酸の８０％のエナンチオマー過剰（ｅ．ｅ．）に相当する。
【０００７】
用語「ヒダントイナーゼ」は、文献から公知である。専門家は、ヒダントイナーゼを、ヒダントイナーゼ活性、すなわち、対応するＮ−カルバモイル−α−アミノ酸を形成するための５位置換ヒダントインの反応を触媒する能力を有する酵素であると理解する。本発明に従う方法に要求されるヒダントイナーゼ活性は、１以上のヒダントイナーゼによって提供され得る。Ｎ−カルバモイル−Ｌ−α−アミノ酸の対応するＤ−α−アミノ酸への転化に関与するヒダントイナーゼのエナンチオ選択性はあまり重要でない。例えば、Ｄ−ヒダントイナーゼ、Ｌ−ヒダントイナーゼまたは非エナンチオ選択性ヒダントイナーゼがそれらの混合物とともに使用され得る。専門家は、Ｄ−ヒダントイナーゼを、５位置換されたＤ−ヒダントインの対応するＮ−カルバモイル−Ｄ−α−アミノ酸への可逆的加水分解を好ましくは触媒するヒダントイナーゼであると理解する。Ｄ−ヒダントイナーゼが本発明の方法において使用され得ることは驚くべきことである。というのは、Ｄ−ヒダントイナーゼは厳密にＤ−選択的であると一般に思われており（Drauz, K., Waldmann, H, 有機合成における酵素触媒作用（Enzyme catalysis in organic synthesis）、 総合ハンドブック、完全に改訂増補された第２版、volume III, Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim 2002）、従って、当業者は、Ｎ−カルバモイル−Ｌ−α−アミノ酸がＤ−ヒダントイナーゼによって転化され得ることを予想しないだろうからである。
【０００８】
好ましくは、本発明に従う、Ｎ−カルバモイル−Ｌ−α−アミノ酸の対応するＤ−α−アミノ酸への転化は、ヒダントインラセマーゼの存在下で行われる。ヒダントインラセマーゼは文献（例えば、国際特許出願公開第０１／２３５８２  Ａ１号）から公知である。専門家は、ヒダントインラセマーゼを、ヒダントインラセマーゼ活性、すなわちＬ−５位置換ヒダントイン（またはＤ−５位置換ヒダントイン）のラセミ化を触媒する能力を有する酵素であると理解する。
【０００９】
本発明に従う方法では、もちろん、対応するＤ−α−アミノ酸の製造においてＮ−カルバモイル−α−アミノ酸のエナンチオマーのランダム混合物を使用することも可能である。
【００１０】
本発明に従う、Ｎ−カルバモイル−Ｌ−α−アミノ酸の対応するＤ−α−アミノ酸への転化において、温度およびｐＨはあまり重要でない。しかし、好ましくは、転化は５〜１０のｐＨで行われる。特に、転化は、６．０〜７．５のｐＨで行われる。Ｎ−カルバモイル−Ｌ−α−アミノ酸の対応するＤ−α−アミノ酸への転化の温度は、好ましくは、０〜８０℃、特に１０〜５０℃、より特に３５〜４５℃から選択される。好ましくは、本発明に従う方法における反応条件は、形成される、エナンチオマーに富むＤ−α−アミノ酸が晶出し、エナンチオマーに富むＤ−α−アミノ酸の回収を容易にするように選択される。
【００１１】
好ましくは、Ｎ−カルバモイル−Ｌ−α−アミノ酸を対応するＤ−α−アミノ酸へ転化する方法は、対応するＬ−α−アミノ酸からのＤ−α−アミノ酸の製造において使用される。上記と同じ方法であって、余分の工程、すなわち対応するＬ−α−アミノ酸からのＮ−カルバモイル−Ｌ−α−アミノ酸の製造が追加された方法が使用される。対応するα−アミノ酸からのＮ−カルバモイル−α−アミノ酸の製造は、例えば、α−アミノ酸を例えばＭＯＣＮ（ここで、Ｍはアルカリ金属、好ましくはカリウムまたはナトリウムを表す）と、水の存在下で接触させることによって化学的に行われ得る。使用される温度は重要でない。反応は好ましくは、約−５〜１００℃の温度、好ましくは０〜８０℃の温度で行われる。上記化学反応のｐＨは好ましくは、８〜１１、特に９〜１０から選択される。
【００１２】
好ましくは、対応するＮ−カルバモイル−Ｌ−α−アミノ酸を介しての対応するＬ−α−アミノ酸からのＤ−α−アミノ酸の製造は、単一容器中で行われる。これは、Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸の中間の回収が必要ないという利点を有する。
【００１３】
本発明は、酵素が本発明のために使用されるところの形態によって決して限定されない。種々の酵素は、各々独立して、ある一定の形態で存在し得る。酵素は例えば、粗製の酵素溶液として、または精製された酵素として存在し得る。酵素はまた、例えば、本来的にまたは遺伝子修飾によって所望の酵素活性を有するところの（浸透性にされたおよび／または固定化された）細胞中に、あるいはそのような活性を有する細胞の溶解物中に存在し得る。酵素はまた、例えば、固定化された形態で、または化学的に修飾された形態で使用され得る。ヒダントイナーゼおよび／またはエナンチオ選択的カルバモイラーゼおよび／またはヒダントインラセマーゼ活性を有する天然に存在する（野生型）酵素の変異体も本発明に従う方法において使用され得ることは、平均的な当業者には明らかであろう。野生型酵素の変異体は例えば、野生型酵素と少なくとも１のアミノ酸によって異なる酵素をＤＮＡがコードするように、当業者に公知の突然変異誘発技術（ランダム突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、誘導された進化(directed evolution)、遺伝子シャッフルなど）を使用して、野生型酵素をコードするＤＮＡを修飾することにより、およびこうして修飾されたＤＮＡの発現を適する（宿主）細胞中で行うことにより、作られ得る。
【００１４】
本発明に従う方法に適するヒダントイナーゼおよび／またはＤ−カルバモイラーゼおよび／またはヒダントインラセマーゼは、例えばヒダントイナーゼ−カルバモイラーゼプロセスのための酵素をも通常供給する微生物中に存在し、または上記微生物から生じ得る。上記微生物としては例えば、シュードモナス属（Pseudomonas）、好ましくはシュードモナスｓｐ．、特にシュードモナスｓｐ．ＦＥＲＭ  ＢＰ  １９００、ハンセニュラ属（Hansenula）、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）、好ましくはアグロバクテリウムｓｐ．またはアグロバクテリウム  ラディオバクター(radiobacter)、特にアグロバクテリウムｓｐ．  ＩＰ Ｉ−６７１またはアグロバクテリウム  ラディオバクター  ＮＲＲＬＢ  １１２９１、アエロバクター属（Aerobacter）、好ましくはアエロバクター  クロアカエ(cloacae)、特にアエロバクター  クロアカエ  ＩＡＭ  １２２１、アエロモナス属（Aeromonas）、バシルス属（Bacillus）、好ましくはバチルス  マクロイデス(macroides)、特にバチルス  マクロイデス  ＡＴＣＣ  １２９０５、ブレビバクテリウム属（Brevibacterium）、フラボバクテリウム属（Flavobacterium）、セッラティア属（Serratia）ミクロコッカス属（Micrococcus）、アースロバクター属（Arthrobacter）、好ましくはアースロバクター  アウレセンス(aurescens)、特にアースロバクター  アウレセンス  ＤＳＭ３７４７、ノカルディア属（Nocardia）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）、アクチノプラネス属（Actinoplanes）、ストレプトマイセス属（Streptomyces）、またはパラコッカス属（Paracoccus）が挙げられる。ヒダントイナーゼおよび／またはＤ−カルバモイラーゼおよび／またはヒダントインラセマーゼの最適な選択は、特異的基質／所望のＤ−α−アミノ酸に依存して変わり、当業者によって容易に決定され得る。最も好ましくは、本発明に従う、Ｎ−カルバモイル−Ｌ−α−アミノ酸の対応するＤ−α−アミノ酸への転化において使用される酵素の１以上が、アグロバクテリウム  ラディオバクターまたはアースロバクター  アウレセンスに由来する。
【００１５】
本発明は、式Ｒ−ＣＨ（ＮＨ2）−ＣＯＯＨ（ここで、Ｒはアミノ酸残基(restgroup)を表し、例えば、例えば１〜２０個の炭素原子を有する置換されたもしくは非置換のアルキル基または例えば１〜２０個の炭素原子を有する置換されたもしくは非置換の（ヘテロ）アリール基である）を有するα−アミノ酸のタンパク質生成性および非タンパク質生成性の両Ｄ−エナンチオマーの製造において使用され得る。式Ｒ−ＣＨ（ＮＨ2）−ＣＯＯＨを有するα−アミノ酸の例は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、メチオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リシン、アルギニン、シトルリン、フェニルアラニン、３−フルオロフェニルアラニンである。好ましくは、本発明は、メチオニン、ロイシン、システイン、スレオニンまたはフェニルアラニンのＤ−エナンチオマーの製造において使用される。
【００１６】
Ｄ−α−アミノ酸の製造が、Ｎ−カルバモイル−Ｌ−α−アミノ酸／Ｌ−α−アミノ酸から出発して、ヒダントイナーゼおよびＤ−カルバモイラーゼの存在下で１ポット反応で進むと思われる方法を図１に示す。図１は、Ｌ−α−アミノ酸のＤ−α−アミノ酸への転化を示す。化合物１、２および３はＬ配置を有する化合物を表し、化合物４、５および６はＤ配置を有する化合物を表す。Ｒは上記したアミノ酸残基を表す。
【００１７】
Ｎ−カルバモイル−Ｌ−α−アミノ酸の対応するＬ−α−アミノ酸からの転化は、１から２への反応において示される。Ｎ−カルバモイル−Ｌ−α−アミノ酸の対応するＤ−α−アミノ酸への転化のありうる経路は２から６への反応において示される。図１によれば、Ｎ−カルバモイル−Ｌ−α−アミノ酸（２）が、ヒダントイナーゼおよびＤ−カルバモイラーゼの存在下で対応するＬ−５位置換ヒダントイン（３）に転化される。Ｌ−５位置換ヒダントインは次いで、インシチューで（in situ）ラセミ化される。Ｌ−５位置換ヒダントインのラセミ化は自然に起こり得るが、例えば加熱によってまたはヒダントインラセマーゼの使用によっても行われ得る。形成された５位置換ヒダントインのエナンチオマーの混合物中に存在するＤ−５位置換ヒダントイン（４）は、次いで、対応するＮ−カルバモイル−Ｄ−α−アミノ酸（５）に転化され、その後、Ｎ−カルバモイル−Ｄ−α−アミノ酸は対応するＤ−α−アミノ酸（６）を形成するために転化される。ヒダントイナーゼおよびＤ−カルバモイラーゼの存在が使用される。
【００１８】
本発明を、以下の実施例を参照してさらに説明するが、これらに限定されない。
【実施例１】
【００１９】
１７．４ｇ（０．１０モル）のＮ−カルバモイル−Ｌ−ロイシンを１００ｍｌの水に添加し、その後、１０Ｎ  ＮａＯＨによってｐＨを７．２に調整した。次いで、水を用いて体積を１５０ｍｌにした。この混合物を４０℃に加熱した。次いで、窒素雰囲気下で、１８ｇのアグロバクテリウム  ラディオバクター細胞懸濁物を添加することによって酵素反応を開始させた。反応混合物のｐＨは、３モル／リットルのＨ3ＰＯ4による滴定によってｐＨ７．２で一定に保たれた。反応混合物の組成をＨＰＬＣ分析によってモニターした。４３時間の反応時間の後、６７ｇ／リットルのＤ−ロイシン濃度が測定された。これは、Ｎ−カルバモイル−Ｌ−ロイシンに基づいて＞９５％の転化に相当する。形成されたＤ−ロイシンのエナンチオマー過剰は＞９８％であった。
【実施例２】
【００２０】
１１５ｍｌの水中の１７．９ｇ（０．０９３モル）のＮ−カルバモイル−Ｄ，Ｌ−メチオニンのスラリーを二重壁のガラス反応器に移した。混合物を４０℃に加熱し、そのｐＨを１０Ｎ  ＮａＯＨによって７．２に調整した。その後、混合物の体積を１７０ｍｌにした。次いで、１２ｇのアグロバクテリウム  ラディオバクター細胞懸濁物を添加し、その後、反応混合物のｐＨを、３モル／リットルのＨ3ＰＯ4の添加によってｐＨ７．２で一定に保った。反応は窒素雰囲気下で行われた。反応混合物の組成をＨＰＬＣ分析によって分析した。２９時間の反応時間の後、Ｎ−カルバモイル−Ｄ，Ｌ−メチオニンに基づいて＞８８％の転化に達成した。形成されたＤ−メチオニンのエナンチオマー過剰は＞９６％であった。
【実施例３】
【００２１】
２４．０ｇ（０．１２モル）のＮ−カルバモイル−Ｌ−ロイシンを１００ｍｌの水に添加し、その後、１０Ｎ  ＮａＯＨによってｐＨを７．２に調整した。次いで、水を用いて体積を１７０ｍｌにした。この混合物を４０℃に加熱した。次いで、窒素雰囲気下で、１４．２ｇのアグロバクテリウム  ラディオバクター細胞懸濁物を添加することによって酵素反応を開始させた。反応混合物のｐＨは、３モル／リットルのＨ3ＰＯ4による滴定によってｐＨ７．２で一定に保たれた。反応混合物の組成をＨＰＬＣ分析によってモニターした。４４時間の反応時間の後、反応を停止した。この実験の結果を図２に示す。転化（％）（ｃ）は、時間（時間）（ｔ（ｈ））の関数として示される。図２は、反応時間が４０時間を超えると、Ｎ−カルバモイル−Ｌ−メチオニン（Ｓ）に基づいて約６５％の転化に達することを示す。形成されたＤ−メチオニン（Ｐ）のエナンチオマー過剰は＞９７．８％であった。
【実施例４】
【００２２】
６６．０ｇ（０．５０モル）のＬ−ロイシンおよび４４．０ｇ（０．５２５モル）のＫＯＣＮを３００ｍｌの水に添加した。混合物を室温で窒素雰囲気下で一夜攪拌した。ＨＰＬＣによって転化が＞９９％であると決定された。この溶液の体積は３５０ｍｌであった。反応混合物を冷却した後、この混合物の７０ｍｌのｐＨを、濃リン酸によって７．２に調整し、その後、窒素雰囲気下で４０℃に加熱した。反応混合物の体積を１５０ｍｌにした。次いで、１９ｇのアグロバクテリウム  ラディオバクター細胞懸濁物を添加し、その後、反応混合物のｐＨを、３モル／リットルのＨ3ＰＯ4によってｐＨ７．２で一定に保った。
【００２３】
反応混合物の組成をＨＰＬＣ分析によってモニターした。４２時間の反応時間の後、６７ｇ／リットルのＤ−ロイシン濃度が測定された。それは、Ｎ−カルバモイル−Ｌ−ロイシンに基づいて＞９５％の転化に相当する。形成されたＤ−ロイシンのエナンチオマー過剰は＞９８％であった。
【実施例５】
【００２４】
Ｎ−カルバモイル−Ｌ−システインおよびＮ−カルバモイル−Ｌ−スレオニンの転化
１００ｍｌの水に、Ｎ−カルバモイル−Ｌ−アミノ酸（Ｎ−カルバモイル−Ｌ−システインの場合は１８．４ｇ（８０ミリモル）およびＮ−カルバモイル−Ｌ−スレオニンの場合は１７．８ｇ（１１０ミリモル））を添加した。混合物のｐＨを５モル／リットルのＮａＯＨを使用して７．２にし、その後、体積を１５０ｍｌに調整した。混合物をサーモスタット付き反応容器に移し、温度を４０℃に調整した。２２ｇのアグロバクテリウム  ラディオバクター細胞懸濁物を添加することによって酵素反応を開始した。ｐＨを、３モル／リットルのＨ3ＰＯ4を使用してｐＨスタット滴定によってｐＨ７．２で一定に保った。定期的にサンプルを採取し、ＨＰＬＣによって分析した。全ての場合において、形成されたＤ−アミノ酸が＞９８％のエナンチオマー過剰を有することが分かった。
【実施例６】
【００２５】
Ｎ−カルバモイル−Ｌ−フェニルアラニンの転化
アースロバクター  アウレセンス  ＤＳＭ  ３７４７からのＬ−ヒダントイナーゼのＥ．ｃｏｌｉ（大腸菌）へのクローニング
一般的手法
標準的な分子クローニング技術、例えば、プラスミドＤＮＡ単離、ゲル電気泳動、核酸の酵素的制限修飾、大腸菌形質転換などが、Sambrookら、１９８９、「分子クローニング：実験室マニュアル」、Cold spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbr, NYに記載されているように、あるいは供給者のマニュアルに従って、行われた。合成オリゴデオキシヌクレオチドはInvitrogen Life Technologies (英国スコットランド、ペーズリー)から入手された。 
【００２６】
実施例６Ａ：プラスミドｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯｈｙｕＨの構築
アースロバクター  アウレセンス  ＤＳＭ  ３７４７のｇＤＮＡの単離
Invitrogen製のｐＥＴ１０１ダイレクショナルＴＯＰＯ発現キットを使用してヒダントイナーゼｈｙｕＨを単離するために菌株アースロバクター  アウレセンス  ＤＳＭ  ３７４７を使用した。
【００２７】
Ａ．アウレセンスからのゲノムＤＮＡを以下のプロトコルによって単離した。
Ａ．アウレセンス  ＤＳＭ３７４７を、Ｋ２倍地（４ｇのバクトペントン、４ｇの酵母エキス、７．５ｇのグリシン、２ｇのＫＨ2ＰＯ4、３．６２ｇのＫ2ＨＰＯ4を水に入れて１リットルにし、ｐＨ７．０に調整した）中で２８℃で培養した。前培養物の１０ｍｌを７５ｍｌのＫ２倍地に添加し、２８℃でインキュベートした。３時間インキュベートした後、７５μｌのリゾチーム（１００ｍｇ／ｍｌ）および１．５ｍｌのカルベニシリン（５０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、インキュベートをさらに１時間、２８℃で続けた。細胞を遠心分離によって単離し、１２５μｌの１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８、２５０μｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８および２．１２５ｍｌのMilli-Qから成る２．５ｍｌの溶液に再懸濁した。次いで、５０μｌのリゾチーム（１００ｍｇ／ｍｌ）および２０μｌのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）を添加した。この懸濁物を３７℃で３０分間インキュベートした。Promaega（オランダ国ライデン）のNuclei Lysis 溶液３ｍｌを添加した後、溶液を８０℃で１５分間、再インキュベートした。その溶液に、５μｌのＲＮａｓｅＡ（１００ｍｇ／ｍｌ、Promaega）を添加した後、３７℃で３０分間インキュベートした。Promaegaのプロテイン析出溶液（Protein Precipitation Solution）１ｍｌを添加した後、その溶液を２０秒間攪拌し、１５分間氷に移した。４５００ｒｐｍで４℃で１０分間遠心分離した後、上清を０．１体積のＮａＡｃ（３Ｍ、ｐＨ５）および２体積の無水エタノールに移した。
【００２８】
ＤＮＡを取り出し、１ｘＴＥ中に再溶解させた。純度および濃度を分光光度アッセイおよびアガロースゲル電気泳動により決定した。ｇＤＮＡをＰＣＲのために使用した。
【００２９】
プラスミドｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯｈｙｕＨの構築
ヒダントイナーゼＨｙｕＨのためのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む１３７７ｂｐ断片を、アースロバクター  アウレセンス  ＤＳＭ  ３７４７由来の染色体ＤＮＡ（受理番号ＡＦ１４６７０１のヌクレオチド４６５１−６０２７）から、下記プライマーを使用して、ＰＣＲによって増幅した。
ｈｙｕＨ−前進：
５’−ＣＡＣＣＡＴＧＴＴＴＧＡＣＧＴＡＡＴＡＧＴＴＡＡＧＡＡＣＴＧＣＣＧＴＡＴＧＧ−３’［配列ＩＤ：Ｎｏ．１］
（下線部は、ｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯベクターへの方向性(directional)クローニングのために突き出ている）、および
ｈｙｕＨ−復帰
５’−ＴＣＡＣＴＴＣＧＡＣＧＣＣＴＣＧＴＡＧＴＧＧＴＧＡＣＧ−３’ ［配列ＩＤ：Ｎｏ．２］
【００３０】
大腸菌でのより良好な発現のために開始コドンがＧＴＧからＡＴＧへ変えられた。ＯＲＦを増幅するために、InvitrogenのPlatinum Pfx ＤＮＡポリメラーゼが使用された。
【００３１】
増幅された断片の正確な大きさ（１３８１ｂｐ）がアガロースゲル電気泳動によって確認された。合計４つの独立したＰＣＲが行われ、これらの反応の得られた生成物がプールされ、Invitrogenのマニュアルに従って方向性ＴＯＰＯクローニングに使用された。
【００３２】
いくつかのランダムに選択された形質転換体からのプラスミドの単離および制限酵素HindIIIによる消化の後、５つのプラスミドが正確な制限パターンを示した。これらをｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯＨｙｕＨと命名し、更なる実験に使用した。
【００３３】
６Ｂ．Ａ．アウレセンス由来のヒダントイナーゼ遺伝子ＨｙｕＨの発現
Invitrogenのマニュアルに従って、５つのｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯＨｙｕＨプラスミドを大腸菌ＢＬ２１  ＳＴＡＲ（ＤＥ３）One Shot細胞（Invitrogen）に入れて形質転換を行った。Invitrogenのプロトコルにしたがって、その形質転換体を、１００ｍｇ／リットルのカルベニシリンを含むＬＢ培地中で２８℃で培養し、０．５ｍＭのＩＰＴＧ（最終濃度）によって誘発した。一夜インキュベートした後、細胞を遠心分離によって採取し、０．２Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７）を用いて洗浄した。
【００３４】
１ｍＭのＭｎＣｌ2を有する０．２Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７）（１ｇの湿重量細胞につき１０ｍｌの緩衝液）中での音波処理によって粗製抽出物を調製した。これらのサンプルを２０，０００ｒｐｍおよび４℃で１５分間遠心分離し、上清（無細胞抽出物）を−２０℃で貯蔵し、活性アッセイにおいて使用した。
【００３５】
６Ｃ．Ａ．アウレセンス由来のヒダントイナーゼＨｙｕＨの分析
フェニルアラニンヒダントインおよびトリプトファンヒダントインに対する活性
１０ｍｌのアッセイ混合物は、０．１Ｍのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）をａ）４ｍＭのフェニルアラニンヒダントインまたはｂ）１．８ｍＭのトリプトファンヒダントインとともに含んでいた。
【００３６】
アッセイは３７℃で行われ、０．７５ｍｌの無細胞抽出物の添加によって開始された。０．５ｍｌのいくつかのサンプルがちょうどよいときに採取され、これらのサンプルに５μｌの８５％リン酸を添加することによって反応が停止された。次に、それらサンプルをＨＰＬＣおよび２２０ｎｍの波長でのＵＶ検出によって分析した。Nucleosil-120-5 C18カラム（５０ｘ４ｍｍ、５μ、Macherey-Nagel（ドイツ国デューレン）製）が使用された。カラムを溶出液Ａ（５０ｍＭのＨ3ＰＯ4、ｐＨ２．７）および溶出液Ｂ（５０ｖ／ｖ％の溶出液Ａおよび５０ｖ／ｖ％のアセトニトリル）によって溶出した。勾配：０〜１．５分、０％Ｂ；１．５〜６．５分、０％〜５０％Ｂ；６．５〜７．０分、５０％Ｂ；７．０〜７．１分、５０％〜０％Ｂ；７．１〜１２分、０％Ｂ。流速は１．０ｍｌ／分であり、カラム温度は４０℃に設定され、注入体積は２μｌであった。
【００３７】
試験された大腸菌／ｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯＨｙｕＨの５つ全てのクローンから誘導された無細胞抽出物によって、１時間以内にＮ−カルバモイル−フェニルアラニンまたはＮ−カルバモイル−トリプトファンが製造された。
【００３８】
Ｄ−フェニルアラニンの製造における、アグロバクテリウム  ラディオバクターおよび大腸菌／ｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯＨｙｕＨ  Ｌ−ヒダントイナーゼクローン由来の無細胞抽出物の使用
１．８ｇ（８．６ミリモル）のＮ−カルバモイル−Ｌ−フェニルアラニンを含む４５ｍｌの溶液を、５モル／リットルのＮａＯＨを使用してｐＨ７．２にした。反応は、４０℃で温度一定にされた。アグロバクテリウム  ラディオバクター細胞懸濁物２ｍｌおよび大腸菌／ｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯＨｙｕＨ  Ｌ−ヒダントイナーゼクローンからの無細胞抽出物（これは、アースロバクター  アウレセンス  ＤＳＭ  ３７４７由来のＬ−ヒダントイナーゼを含んでいた）２ｍｌを添加することによって酵素反応を開始した。反応のｐＨはｐＨ７．２で一定にされた。定期的に、サンプルを採取し、転化および形成されたＤ−アミノ酸の光学的純度を追跡するためにＨＰＬＣによって分析した。４０℃で４時間インキュベートした後、４６％のＮ−カルバモイル−Ｌ−フェニルアラニンがＤ−フェニルアラニンに転化されたことが判った。形成されたＤ−フェニルアラニンのエナンチオマー過剰は＞９８％であった。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】Ｌ−α−アミノ酸のＤ−α−アミノ酸への転化を示す。
【図２】Ｎ−カルバモイル−Ｌ−メチオニン（Ｓ）のＤ−メチオニン（Ｐ）への転化における転化（％）（ｃ）と時間（時間）（ｔ（ｈ））との関係を示すグラフである（実施例３）。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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