(57)【要約】  インターロイキン−２２受容体分子およびインターロイキン−２０受容体β分子を含有する、新規クラスIIサイトカイン受容体が同定された。この複合体は、ｍｄａ−７およびＩＬ−２０を含むＩＬ−１０に相同なサイトカインに結合する。インターロイキン−２０、ｍｄａ−７およびＩＬ−１９の細胞における作用を阻害する方法についても併せて記載されている。後者は、例えば、乾癬等の皮膚疾患の治療に対して非常に有効である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターロイキン−２２受容体分子およびインターロイキン−２０受容体β分子を含む、単離複合体。
【請求項２】
前記各分子が哺乳動物の分子である、請求項１に記載の単離複合体。
【請求項３】
前記各分子がヒトの分子である、請求項２に記載の単離複合体。
【請求項４】
細胞におけるインターロイキン−２２の作用を調節（modulate）する方法であって、インターロイキン−１０受容体β分子とインターロイキン−２２受容体分子の相互作用を調節する分子を、前記相互作用を調節するのに十分な量、前記細胞に接触させることを包含する方法。
【請求項５】
前記分子が抗体である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞がインターロイキン−９に関連する疾患に苦しむ患者の細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記疾患が喘息、アトピー性アレルギー、ＩｇＥの生成過剰、腸管炎症、またはＩｇＧの生成不足である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記分子がインターロイキン−１０受容体βまたはインターロイキン−２２受容体のいずれかの可溶型（soluble form）である、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記分子がＩＬ−１９突然変異体またはｍｄａ−７突然変異体であって、前記ＩＬ−１９突然変異体またはｍｄａ−７突然変異体は受容体親和性を保持するが、その活性を失っている、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
インターロイキン−２０（ＩＬ−２０）の細胞における作用を調節する方法であって、前記細胞におけるＩＬ−２０の結合を調節するために十分な量の、（ｉ）ＩＬ−２０Ｒαの調節物質（modulator）、（ｉｉ）ＩＬ−２０Ｒβの調節物質、および（ｉｉｉ）ＩＬ−２２ＲおよびＩＬ−２０Ｒβ複合体の調節物質から選択される一種以上の調節物質を該細胞に接触させることを含有する方法。
【請求項１１】
前記細胞が皮膚細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記阻害剤が抗体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
皮膚細胞の不適切な増殖に特徴づけられる症状に苦しむ被検体の細胞に接触させることを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
該症状がアトピー性皮膚炎、乾癬、脂漏性角化症、ケラトアカントーマ（keratochanthoma）、腫瘍、または角皮症である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記分子がＩＬ−２０Ｒαの可溶型、ＩＬ−２０Ｒβの可溶型、またはＩＬ−２２Ｒの可溶型である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記分子が受容体結合能を有するが、サイトカイン活性が失われているＩＬ−２０突然変異体である、請求項１０記載の方法。
【請求項１７】
物質が上皮細胞増殖阻害活性を有するか否かを測定する方法であって、ＩＬ−２０を提示する上皮細胞サンプルおよび被検物質を混合し、上皮細胞の増殖を測定し、前記増殖と、前記上皮細胞サンプルをＩＬ−２０のみと混合した場合の増殖とを比較することを含有する方法であって、増殖の低下が該物質の上皮細胞増殖阻害活性の指標となることを含有する方法。
【請求項１８】
該上皮細胞が皮膚細胞である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
ＩＬ−２０またはｍｄａ−７の活性を調節する分子を同定する方法であって、ＩＬ−２２ＲおよびＩＬ−２０Ｒβを発現する細胞を、前記分子およびＩＬ−２０またはｍｄａ−７のいずれか一種と混合し、前記分子が前記ＩＬ−２０またはｍｄａ−７の活性を調節するか否かを測定する目的で、前記分子の非存在下における前記細胞における前記ＩＬ−２０またはｍｄａ−７の作用を測定することを含有する方法。
【請求項２０】
ＩＬ−１９またはｍｄａ−７の活性を調節する分子を同定する方法であって、ＩＬ−２０ＲαおよびＩＬ−２０Ｒβを発現する細胞を、前記分子およびＩＬ−１９またはｍｄａ−７のいずれか一種と混合し、前記細胞における前記ＩＬ−１９またはｍｄａ−７の作用を測定し、前記分子が前記ＩＬ−１９またはｍｄａ−７の活性を調節するか否かを測定する目的で、前記分子の非存在下における前記細胞における前記ＩＬ−１９またはｍｄａ−７の作用と比較することを含有する方法。
【請求項２１】
細胞における、ｍｄａ−７およびＩＬ−１９の一種以上の作用を阻害する方法であって、前記細胞を、ＩＬ−２０ＲαおよびＩＬ−２０Ｒβの相互作用を阻害するために十分な量の、前記相互作用を阻害する分子と接触させることを含有する方法。
【請求項２２】
前記分子が抗体である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記分子がＩＬ−２０Ｒαの可溶型またはＩＬ−２０Ｒβの可溶型である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記分子がＩＬ−２０ＲαおよびＩＬ−２０Ｒβの複合体に対する親和性を有する一方、活性を失った、ＩＬ−２０の突然変異体である、請求項２１の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は２００１年７月２６日に出願された出願番号０９／９１５，７３５号の一部継続出願（ＣＩＰ出願）であり、参照によりその全文は本明細書中に援用される。
【０００２】
本発明はサイトカインおよび「レセプタースイッチング（receptor switching）」現象に関する。さらに具体的には、ＩＬ−１０ホモログ（homologous）およびこれらホモログに対する種々の受容体（レセプター）、およびこれらの用途に関する。
【背景技術】
【０００３】
インターロイキン−１０（以下、ＩＬ−１０） は、主要な抗炎症性サイトカインであり、元来ムーア（Moore）らAnnu. Rev. Immunol. １９：６８３（２００１）により特定された、活性化ＴＨ１リンパ球によるサイトカイン生成を抑制する因子として知られる。ＩＬ−１０が同定された後、ＩＬ−１０に対して様々な程度の相同性を有する、更なる種々のサイトカインが同定された。これらの最初のものは、「ｍｄａ−７」と名づけられたが、これは、メラニン細胞分化関連遺伝子７（melanocyte differentiation associated gene 7）の略称であり、その発現がメラノーマ細胞株のインヴィトロ（in vitro）における分化の過程でアップレギュレートされたからである。ジアン（Jiang）らOncogene １１：２４７７（１９９５）を参照のこと。このタンパク質は、２２％のアミノ酸がＩＬ−１０と同一であるが、当初は分泌タンパク質であるとは認識されていなかった。ｍｄａ−７の発現は、アポトーシスまたは分化の誘導を通じて腫瘍の可逆的成長の阻止を引き起こすことで報告が行われたが、この作用がサイトカイン受容体の典型的な経路であるパラクリンループに起因するものであるか、ｍｄａ−７分子の細胞質型（cytoplasmic form）の形成に起因するものであるのかは明らかではない。最近、シェーファー（Schaefer）らJ. Immunol. １６６：５８５９（２００１）により、ＴＨ２特異的サイトカインとしてｍｄａ−７のマウスオルトログ（murine orthologue）が同定され、「ＩＬ−４誘導分泌タンパク質（ＩＬ−４ i nduced secreted protein）」または「ＦＩＳＰ」と名づけられた。ラットにおける相対物はツァン（Zhang）らJ. Biol. Chem. ２７５：２４４３６（２０００）により同定され、「ｍｏｂ５」と称されており、腸管上皮細胞におけるras活性化（ras activation）により発現する。推定ｒａｓ誘導型の細胞表面受容体（a putative, ras-inducible cell surface receptor）を含むオートクリンループを通じて、ｒａｓオンコジーンに媒介される腫瘍（ras oncogene-mediated neoplasia）においてｍｏｂ５が何らかの役割を演じていることを、ツァン（Zhang）らは示唆している。ソー（Soo）ら（J. Cell Biochem. ７４：１（１９９９））は、この遺伝子を創傷の治癒の際、皮膚に過剰に分泌される遺伝子としてクローニングした。
【０００４】
ＩＬ−１０およびｍｄａ−７遺伝子は双方とも染色体ｌｑ３１−３２領域にマッピングされているが、この領域では他にも二種のＩＬ−１０関連遺伝子である「ＩＬ１９」および「ＩＬ２０」が発見されている。ＩＬ−１９は、ギャラガー（Gallagher）らGenes Immun. １：４４２（２０００）に報告されるように、ＬＰＳ活性化末梢血単核球細胞（peripheral blood mononuclear cell）によって発現される。ＩＬ−２０に関し、その生物学的活性は、遺伝子が様々なプロモータの制御下にあり、サイトカインを過剰に発現するトランスジェニックマウスを用いて研究されている。ブラムバーグ（Blumberg）らCell １０４：９（２００１）に報告されるマウスは新生児期の死亡率、およびヒトの乾癬病変を連想させる上皮の異常な分化を含む皮膚の異常に特徴づけられる。ブラムバーグ（Blumberg）らは、ＩＬ−２０受容体複合体（コンプレックス）が二種のオーファンクラスＩＩサイトカイン受容体のサブユニットである異種二量体（ヘテロダイマー）であると記述している。特に、「ＩＬ−２０Ｒα」の名を持つ「ＣＲＦ２−８」および「ＩＬ−２０Ｒβ」の名を持つ「ＤＩＲＳ１」が提唱されている。
【０００５】
ＩＬ−１０サイトカインとしてその他二種、すなわち「ＡＫ１５５」および「ＩＬ−２２」は、ＩＦＮ−γ遺伝子の領域付近であるヒト染色体１２ｑ１５に位置している。ＡＫ１５５は、Ｔリンパ球のヘルペス  サイミリ（Herpes saimiri）ウイルス感染によりアップレギュレートされることで知られている。クナッペ（Knappe）ら（J. Virol. ７４：３３８１（２０００））を参照されたい。ＩＬ−２２分子は元々、ＩＬ−９誘導性（inducible）遺伝子として記述されており、「ＩＬ−１０関連Ｔ細胞由来誘導因子（ＩＬ−１０ related T cell derived inducible factor）」、すなわち「ＩＬ−ＴＩＦ」と称されていた。ドゥムティエール（Dumoutier）らJ. Immunol. １６４：１８１４（２０００）が参照により本明細書中に援用されるとともに、ＰＣＴ出願ＷＯ  ００／２４７５８号が参照により本明細書中に援用され、その米国優先権主張出願が参照される。ＩＬ−２２の活性には、急性期反応（acute phase response）の誘導、特に肝細胞におけるもの、が含まれ、ＣＲＦ２−９／ＩＬ−２２Ｒサブユニットを構成する異種二量体（ヘテロダイマー）受容体およびＩＬ−１０受容体のβ鎖を通じて媒介される。ドゥムティエール（Dumoutier）らProc. Natl. Acad. Sci. USA ９７：１０１４４（２０００）、コテンコ（Kotenko）らJ. Biol. Chem. ２７６：２７２５（２０００）、シエ（Xie）らJ. Biol. Chem. ２７５：３１３３５（２０００）を参照されたいが、これらすべては参照により本明細書中に援用される。急性期反応の誘導は炎症、アレルギー反応および癌に関連していることから、ＩＬ−９とＩＬ−２２との相互作用の調節がこれらの症状に関連することが示唆される。その細胞受容体に加えて、ＩＬ−２２は、天然のＩＬ−２２拮抗物質（アンタゴニスト）である「ＩＬ−２２ＢＰ」または「ＩＬ−２２結合タンパク質」と呼ばれる、クラスＩＩサイトカイン受容体ファミリーの分泌メンバー（secreted member）にも結合する。ドゥムティエール（Dumoutier）ら（J. Immunol. １６６：７０９０（２００１））およびコテンコ（Kotenko）ら（J. Immnol. １６６：７０９６（２００１））は参照により本明細書中に援用される。
【０００６】
以上のことから理解されるように、サイトカイン受容体には、二つのクラス、すなわちクラスＩおよびクラスＩＩが存在する。クラスＩサイトカイン受容体内における受容体サブユニットの共有（sharing）は、非常によく知られた現象である。サブファミリーはこの現象の結果として定義されており、βｃ、ｇｐ１３０、およびＩＬ−２Ｒγファミリーが含まれる。一方クラスＩＩ受容体の場合、現在までに知られる共有受容体はＩＬ−１０Ｒβ鎖の一例のみであり、これはＩＬ−１０およびＩＬ−２２シグナリング（signaling）の双方に関与している。ドゥムティエール（Dumoutier）らProc. Natl. Acad. Sci. USA ９７：１０１４４（２０００）、コテンコ（Kotenko）らJ. Biol. Chem. ２７６：２７２５（２０００）、およびシエ（Xie）らJ. Biol. Chem. ２７５：３１３３５（２０００）を参照されたい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
いずれのクラスＩＩサイトカイン受容体が、特定のサイトカインに対する結合に関する作用を行うことができるのかを同定することは興味深い。これは本発明の特徴のひとつであり、本発明の他の特徴とともに以下の開示に記述される。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
以下の実施例では、特にＩＬ-２２Ｒ分子およびＩＬ−２０Ｒβ分子を含有する新規サイトカイン受容体複合体に関して記述する。先に示したように、この受容体複合体はｍｄａ−７およびＩＬ−２０等のサイトカインの結合を促進する。また、これらの実施例は、ＩＬ−２０ＲαおよびＩＬ−２０Ｒβを含む複合体が、ＩＬ−１９等のこれらのサイトカインに結合することを示している。この両複合体は、特に、サンプル中に個々の結合パートナーが存在するか否かを特定するための薬剤として用いることができる。たとえば、ＩＬ−２０ＲαおよびＩＬ−２０Ｒβが、ｍｄａ−７、ＩＬ−１９およびＩＬ−２０に対する受容体を形成することを本願は示している。ＩＬ−２２ＲとＩＬ−２０Ｒβの複合体はｍｄａ−７およびＩＬ−２０に対する受容体を形成するが、ＩＬ−１９に対する受容体は形成しない。したがって、これらの受容体の種々の組み合わせを利用することによって、ＩＬ−１０関連サイトカインがサンプル中に存在するか否かを決定することが可能である。ＩＬ−２２ＲおよびＩＬ−２０Ｒβの複合体、または以下に記載の変異体等の受容体は、ＩＬ−２２ＲおよびＩＬ−２０Ｒβ間における会合または相互作用に影響を与えることにより、ＩＬ−２０および／またはｍｄａ−７の機能をイン  ヴィヴォで調節する薬剤および物質をアッセイするために利用することが可能である。同様に、ＩＬ−２０ＲαおよびＩＬ−２０Ｒβ、またはその変異体との間における会合または相互作用に影響を与えることにより、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０およびｍｄａ−７の機能を生体内で制御する物質を測定することが可能である。このようなアッセイに用いることができると考えられるフォーマットについては以下に詳述するが、端的には、被検物質の存在下または非存在下における構成成分ポリペプチド鎖同士の結合を測定すること、および／または被検物質の存在下または非存在下において、本発明の受容体が有する、サイトカイン等のリガンドに結合する能力を確認すること、および／または被検物質が有する、受容体が影響を与える部位における、生物学的機能あるいは細胞機能、あるいは活性の調節能力を測定すること、が含まれる可能性があるが、その機能または活性は、受容体への結合を示すものの中から選択される前述の結合パートナーにより影響を受ける可能性、あるいは生物学的経路において受容体の下流の活性（activity downstream）を含む可能性がある。受容体複合体の構成成分間の結合およびこのような結合における被検物質の作用を測定することを含むアッセイ方法が、全長ポリペプチド鎖を用いることを必ずしも必要とするわけではない。たとえば、受容体のコンパニオンポリペプチド鎖の構成成分の一部に対する結合能を有するフラグメントも使用されるであろう。実際、以下で議論するように、ポリペプチドの自身のフラグメントは、受容体ポリペプチド構成成分間の結合を阻害する目的で使用される可能性がある潜在的阻害物質（putative inhibitor）のカテゴリーの代表である。
【０００９】
さらに、このようにサイトカインに対する結合能を有する単離された受容体またはフラグメントは、それらに結合するサンプル中または被検物質中におけるサイトカイン、すなわちＩＬ−２２ＲおよびＩＬ−２０Ｒβを含む受容体に対するＩＬ−２０またはｍｄａ−７、およびＩＬ−２０Ｒα／ＩＬ−２０Ｒβを含む受容体に対するＩＬ−１９またはｍｄａ−７、の存在の測定に使用できる可能性がある。これら二者については以下に詳述する。
【００１０】
本発明による受容体複合体は、関連する構成成分ポリペプチド鎖を内因的に産生する細胞から精製する方法により、単離された形態で提供される可能性がある。しかしながら、より一般的かつより好ましくは、適切な発現系においてコードされた核酸（ＤＮＡ）分子から発現を行うことによる組み換え体を産生する手段により、次に、たとえば適切な結合抗体分子または自身のリガンドや受容体に結合するために十分な量のリガンドの一部を含む融合タンパク質等の融合タンパク質の使用を介して精製を行うことによって、この受容体複合体が提供される。
【００１１】
受容体ポリペプチド鎖をコードする、単離核酸分子はさまざまな側面において利用されており、本発明の実施態様は、当技術分野において実施可能である。
【００１２】
このような核酸分子は、ここで同定される受容体ポリペプチド鎖をコードするベクター構築物を提供するために利用される可能性がある。
【００１３】
本明細書において同定される、ポリペプチド鎖のコンビネーションを含む受容体は、双方の鎖をコードする核酸分子の共発現（co-expression）によって、あるいは、個別に産生され、そして、会合が許容されるポリペプチド鎖をコンビネーションすることによって製造することが可能である。本発明の受容体分子はグリコシル化または非グリコシル化、硫酸化または非硫酸化のいずれでもよく、また、これに限定されるものではないが、たとえばアセチル化、アシル化、リン酸化、パルミトイル化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、水酸化、グルコシル化ホスファチジルイノシチド（glucosyl phopophatidylinositide）付加、酸化、還元等の、他の翻訳後の改変を含む形態であってもかまわない。
【００１４】
所望の分子の製造のための、コード配列の操作、および、コード化ポリペプチドおよびペプチド組み換え体産生に関する実施可能ないずれの技術も、当業者によって採用することができる。
【００１５】
一般的に、本発明による受容体の産生、および、そのペプチド鎖またはそのフラグメントの産生に使用される核酸分子、たとえば本明細書中で同定される受容体ポリペプチド鎖の新規なコンビネーションをコードするそれぞれの配列をもつ核酸分子は、単離または精製された状態の単離物として提供されるか、発現に対する調節塩基配列の一種以上である可能性を持つ場合を除いて、本来は付随して会合する物質、たとえばその遺伝子に、（たとえばヒト）ゲノム内で隣接する核酸から、遊離または実質的に遊離して、提供される。核酸分子は、その全長またはその部分配列が合成によるものであってもよく、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびＲＮＡを含み得る。
【００１６】
本発明のペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸分子は、本明細書中に記載の情報ないし参照文献、および当該技術分野に周知の技術（たとえばサムブルック（Sambrook）およびラッセル（Russell）による「Molecular Cloning, A Laboratory Manual」、第三版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、２００１年、およびオースベル（Ausubel）らによる「Current Protocols in Molecular Biology」、John Wiley and Sons、１９９２年、あるいはそれ以降の版）を用いて、当業者により容易に調製することが可能である。コード化分子（encoding molecule）を取り出し、発現部位の両端における適切な制限酵素認識部位を同定し、この分子から、前記部位を切り出すことを含む、当該技術分野に周知の手法を用いて、ペプチドフラグメントをコードする核酸分子を産生および使用することが可能である。次に、標準的な市販の（商業的に入手可能な）発現システムにおいて、当該部位を操作できる状態で適切なプロモータに連結させることが可能である。組み換え手法による他の取り組みとしては、適切なＰＣＲプライマーによりＤＮＡの関連部位を増幅させることが挙げられる。
【００１７】
核酸分子の改変は、たとえばポリペプチドのアレル体または突然変異体等改変ポリペプチドの産生を行うため、または核酸の発現に使用される宿主細胞にとって好ましいコドンを考慮するために、たとえば部位特異的突然変異（site directed mutagenesis）を用いて行うことが可能である。
【００１８】
パートナー（対を形成する）ポリペプチド鎖および／またはリガンドに対する結合能を有する場合、アミノ酸の変異体、アレルアイソフォーム（allelic isoform）、誘導体、または特定の野生型アミノ酸配列の突然変異体であるポリペプチドを本発明、とりわけ本発明におけるアッセイ、において利用することは可能である。変異体、アレルアイソフォーム、誘導体または突然変異体は、既知の配列に対する配列の同一性が６０％を超える、約７０％を超える、約８０％を超える、約９０％を超える、または約９５％を超えるアミノ酸配列を有するものであってかまわない。この配列は、本明細書に記載のアミノ酸配列に対する類似性が約７０％を超える、約８０％を超える、約９０％を超える、または約９５％を超えるものであってもかまわない。配列の比較は、本明細書中に示される関連配列（relevant sequence）の全長に対して、あるいは、より好ましくは特定のタンパク質ドメインの配列に対して行うことが可能である。
【００１９】
配列に関するアミノ酸の「同一性（identidy）」および「類似性（similarity）」は、当業者にとって既に確立された原理に基づく周知の用語であり、例えば、アルゴリズムＧＡＰ（algorithm GAP）（Genetics Computer Group、ウィスコン州マディソン）を用いた試験によって測定することが可能である。ＧＡＰは、マッチを最大限とし、ギャップが最小限となるような二つの完全配列をアラインメントするために、ニードルマン（Needleman）およびウンシュ（Wunsch）のアルゴリズムを用いている。一般的に、ギャップ開始ペナルティー（gap creation penalty）＝１２、ギャップ伸張ペナルティー（gap creation penalty）＝４とともにデフォルトパラメータが用いられる。ＧＡＰの使用を好ましいものとしてもよいが、その他のアルゴリズムで一般的にデフォルトパラメータを採用するもの、たとえばＢＬＡＳＴ（アルチュル（Altschul）ら、J. Mol. Biol. ２１５：４０５〜４１０（１９９年）の手法）、ＦＡＳＴＡ（ピアソン（Pearson）およびリップマン（Lipman）、PNAS USA ８５：２４４４〜２４４８（１９８８年））、またはスミス−ウォーターマン（Smith-Waterman）のアルゴリズム（スミス（Smith）およびウォーターマン（Waterman）、J. Mol. Biol. １４７：１９５〜１９７（１９８１年））等を利用してもよい。
【００２０】
核酸レベルにおいて、配列の相関性（relatedness of sequence）は、ストリンジェントな条件下における分子間の選択的ハイブリダイゼーション（selective hybridization）によって調べることができる。
【００２１】
たとえば、サムブルック（Sambrook）の方法に従い、５ＸのＳＳＣ（ここで「ＳＳＣ」＝０．１５Ｍの塩化ナトリウム；０．１５Ｍのクエン酸ナトリウム；ｐＨ７）、５Ｘのデンハルト（Denhardt）試薬、０．５〜１．０％のＳＤＳ、１００μｇ／ｍＬの変性フラグメント化サケ精子ＤＮＡ、０．０５％のピロリン酸ナトリウムおよび５０％以下のホルムアミドを含有するハイブリダイゼーション溶液を用いてハイブリダイゼーションを行うことが可能である。ハイブリダイゼーションは３７〜４２℃、６時間以上行われた。以下のハイブリダイゼーションにおいて次のようにフィルターを洗浄した。（１）２ＸのＳＳＣおよび１％ＳＤＳ中、室温にて５分間、（２）２ＸのＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中、室温にて１５分間、（３）１ＸのＳＳＣおよび１％ＳＤＳ中、３７℃にて３０分〜１時間、（４）１ＸのＳＳＣおよび１％ＳＤＳ中、４２〜６５℃にて２時間、３０分毎に溶液を交換した。
【００２２】
特定の配列相同性を有する核酸分子間のハイブリダイゼーションを行うために必要なストリンジェント条件を計算するための一般式のひとつ（サムブルック（Sambrook））は以下のとおり：
Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６  Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋０．４１（Ｇ＋Ｃ、％）−０．６３（ホルムアミド、％）−６００／＃ｂｐ、二本鎖中。
この公式の実例として、［Ｎａ＋］＝［０．３６８］および５０％のホルムアミドを用い、ＧＣ含有率を４２％、平均プローブのサイズを２００塩基、Ｔｍは５７℃とした。二本鎖ＤＮＡのＴｍは、相同性が１％減少するごとに、１〜１．５℃減少した。したがって、ハイブリダイゼーション温度を４２℃とすることで、約７５％を超える配列の同一性を有する目的物質が観察されるであろう。
【００２３】
その他の好ましい条件として、たとえば約８０〜９０％の同一性を有する配列の検出には、０．２５ＭのＮａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．２、６．５％のＳＤＳ、１０％のデキストラン硫酸中における４２℃、一晩のハイブリダイゼーション、および０．１Ｘ（０．１倍量）のＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中、５５℃における最終洗浄が含まれる。約９０％を超える同一性を有する配列の検出の好ましい条件には、０．２５ＭのＮａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．２、６．５％のＳＤＳ、１０％のデキストラン硫酸中における６５℃、一晩のハイブリダイゼーション、および０．１ＸのＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳ中での、６０℃における最終洗浄が含まれる。
【００２４】
本発明の製造に使用する核酸分子の発現を得るには、前記配列は、その発現を調節する核酸が操作可能に連結した一つ以上のコントロール配列を有するベクターに組み込まれる。ベクターは選択、あるいは構築することができる。これらは、プロモータ配列、ターミネーターフラグメント、ポリアデニル化配列（polyadenylation sequence）、エンハンサー配列、マーカー遺伝子およびその他の適切な配列、たとえばペプチドまたはポリペプチドが融合物として産生される核酸配列、および／または、宿主細胞で産生されたペプチドが細胞から分泌されるように、分泌シグナルをコードする核酸、を含む、制御配列（regulatory sequence）を適宜含み得る。適宜、ベクターはプラスミド、ファージ等のウイルスやファージミド（phagemid）であってかまわない。次に、ベクターが機能する宿主細胞をベクターにて形質転換し、宿主細胞を培養して産物を生産し、この産物を宿主細胞または周囲の培地から回収することにより、コード化産物を得ることができる。この方法には、既に開示した受容体ポリペプチド鎖のコンビネーションをコードする本発明の核酸分子の宿主細胞への導入が含まれる。この導入（特にインヴィトロの導入）は「形質転換（トランスフォーメーション）」または「トランスフェクション」の範疇を超えるものを一般的に指すことが可能であり、利用可能な技術のすべてを含み得る。真核細胞に対する、好ましい技術には、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、電気穿孔法、リポソームの介在によるトランスフェクション（liposome-mediated transfection）およびレトロウイルスまたは他のウイルス、たとえばワクシニアや昆虫細胞に感染するバキュロウイルスを用いた形質導入が含まれ得る。バクテリア細胞に対する好ましい技術には、塩化カルシウムトランスフォーメーション、電気穿孔法およびバクテリオファージを用いたトランスフェクションが含まれ得る。代替法として、核酸の直接注入を用いることもできるであろう。抗生物質に対する耐性または感受性をもつ遺伝子等のマーカー遺伝子は、対象となる核酸を含むクローンの同定に利用することができる。
【００２５】
この導入の後、核酸分子の発現が引き起こされ、または許容される。たとえば核酸分子の発現のための条件の下、宿主細胞（該細胞には実際に形質転換されたものが含まれ得るが、形質転換細胞の子孫である可能性のほうが高い）を培養することにより、コード化産物が産生される。もし、リーダーペプチドのような適切なシグナルペプチドと連結した産物が発現すれば、この産物は細胞内から培地中に分泌され得る。発現による産生に続いて、この産物は宿主細胞および／または培養培地から単離および／または精製することが可能であり、その場合は、引き続き本明細書中に開示されるアッセイあるいは試験等に利用できる。
【００２６】
上記の事実に基づき、本発明は明細書に記載の受容体複合体の作成方法をも提供するが、この方法には、受容体ポリペプチド鎖をコードする核酸分子からの発現を引き起こし、または発現を許容され、この鎖が受容体複合体を形成するべくコンビネーションし、そして、複合体を精製することが含まれる。複合体を形成する２つの鎖の発現には、宿主細胞等の単一の発現系における共発現が含まれ得るが、または２つの鎖を別々に産生し、これを任意の中間工程である精製工程に供した後、受容体を形成するためにコンビネーションさせ、次いでこれを精製することも可能である。
【００２７】
ペプチドの発現を引き起こし、または発現を許容するために適当な条件の下、核酸分子を含む宿主細胞を培養液中で増殖させることにより、簡便に発現を行うことが可能である。しかしながら網状赤血球ライセート等のイン  ヴィトロシステムであっても発現を行うことは可能である。
【００２８】
本明細書中に記載のポリペプチド鎖のコンビネーション等を含む受容体複合体の産生に続いて、サイトカインの結合能を試験することができる。たとえばＩＬ−２２ＲおよびＩＬ−２０Ｒβを含む受容体の、ＩＬ−２０およびｍｄａ−７の１以上に対する結合を調べることが可能であり、ＩＬ−２２ＲβおよびＩＬ−２０Ｒαを含む受容体の、ＩＬ−２０、ＩＬ−１９およびｍｄａ−７の１以上に対する結合を調べることが可能である。
【００２９】
本発明におけるさらなる側面において、本明細書中に開示される受容体ポリペプチド鎖をコードする、異種核酸分子を含む宿主細胞が提供される。本発明の核酸分子は、宿主細胞のゲノム（たとえば染色体等）に組み込まれ得る。組み込み（integration）は、標準的手法に従い、ゲノムの組み換えを促進する配列を包含することにより促進され得る。核酸は、細胞内の染色体外のベクター上に存在するか、さもなければ細胞に対して識別可能に異種または外来性であってよい。
【００３０】
このようにして、たとえば核酸を細胞または該細胞の先祖（ancestor）に導入した結果であるような、本発明の製造において、有用な核酸分子を含む宿主細胞は、本発明の受容体を発現することが可能であり、当該受容体は、開示されるひとつ以上のサイトカインに対する応答性を当該細胞に与えることが可能である。
【００３１】
本発明による受容体、そのポリペプチド鎖およびフラグメントを使用するアッセイは種々のフォーマットのいずれを採用してもかまわない。
【００３２】
以下の議論では、便宜上、本発明の受容体の「第一ポリペプチド鎖」および「第二ポリペプチド鎖」に対する言及を行う。別の実施態様においては、これは、本明細書中で特定される受容体コンビネーションの各ポリペプチド鎖、すなわちＩＬ−２２Ｒ／ＩＬ−２０Ｒβ等を指すものと理解される。
【００３３】
第一および第二ポリペプチド鎖間の相互作用を調節する薬剤のアッセイは、以下を含むことができる：
（ａ）受容体の第一ポリペプチド鎖または第一ポリペプチド鎖のフラグメントであって、受容体の第二ポリペプチド鎖に結合することができる、該鎖または該フラグメント；受容体の第二ポリペプチド鎖または第二ポリペプチド鎖のフラグメントであって、受容体の第一ポリペプチド鎖に結合することができる、該鎖または該フラグメント；と被検化合物の接触を図り、
（ｂ）該被検化合物の非存在下における、第一および第二ポリペプチド鎖またはフラグメント間の相互作用または結合と比較し、該被検化合物の存在下における、第一および第二ポリペプチド鎖またはフラグメント間の相互作用または結合を測定する。
【００３４】
受容体の第一および第二ポリペプチド鎖間の相互作用または結合を低下あるいは阻害する被検化合物、または、薬剤は、阻害物質である被検化合物の非存在下、第一および第二物質が相互に作用または結合する条件において、同定および／または獲得される。
【００３５】
受容体の第一および第二ポリペプチド鎖間の相互作用または結合を増加あるいは促進する被検化合物、または、薬剤は、試験で陽性を示す薬剤（positively-testing agent）の非存在下、ポリペプチド鎖の相互作用または結合を妨害または障害する状況において、同定および／または獲得される。
【００３６】
本発明の他の側面では、受容体の第二ポリペプチド鎖に結合する、本発明の受容体の第一ポリペプチド鎖の関連部分、または受容体の第一ポリペプチド鎖に結合する、本発明の受容体の第二ポリペプチド鎖の関連部分、と相互に影響を与えることができる物質のアッセイ方法が提供されるが、この場合、以下の方法を含むことが可能である：
（ａ）受容体の第二ポリペプチド鎖に結合することができる、本発明の受容体の第一ポリペプチド鎖またはそのフラグメント；あるいは、該第一ポリペプチド鎖に結合することができる、該第二ポリペプチド鎖またはそのフラグメント；と被検化合物の接触を図り、
（ｂ）第一または第二ポリペプチド鎖あるいはそのフラグメントと該被検化合物間の相互作用または結合を測定する。
【００３７】
第一または第二ポリペプチド鎖の関連部分と相互に作用、または結合することがわかった被検化合物は、第一および第二ポリペプチド鎖間の結合の調節能力（たとえば、破壊または干渉する能力）、あるいは本発明の受容体によって媒介される活性の調節能力に関する試験に供されることが可能である。
【００３８】
本発明の他の側面において、本発明の受容体の、リガンド（たとえばサイトカイン）に対する結合を調節する薬剤のアッセイ方法であって、以下を含有する方法が提供される：
本発明の受容体と、リガンドおよび被検物質とを、該リガンドの該受容体への結合への阻害物質である該被検物質が存在しない条件下で接触させ、該リガンドの該受容体に対する結合を測定する。
【００３９】
結合が調節されると、前記被検物質がリガンドの受容体に対する結合を調節する薬剤であると特定される。
【００４０】
リガンドは、本発明の受容体の調節物質（モジュレーター）として本明細書において同定されるものの中から選択されるサイントカインであることが可能である。
【００４１】
本発明の他の側面において、本発明の受容体の生物学的活性を調節する因子のアッセイ方法が提供されるが、この方法には、宿主細胞内で該受容体を提供させて、被検物質の存在下または非存在下で、該受容体の活性を測定することが含まれる。
【００４２】
該受容体の活性は、該受容体に対するアゴニストまたはアンタゴニストである分子による処理に対する、該細胞の応答の手段により測定される。たとえば、本発明の受容体を発現する細胞をサイトカイン（たとえば、ＩＬ−２２ＲおよびＩＬ−２０Ｒβを含む受容体に対するＩＬ−２０等）で処理することであってもかまわない。
【００４３】
本発明のその他のアッセイにおいて、被検化合物または被検物質の存在下における成分の相互作用および／または結合、および／または活性を、被検化合物の非存在下における、比較用の反応培地中、および条件における、相互作用および／または結合、および／または活性と比較することが可能である。相互作用および／または活性を調節可能な被検化合物が同定され得る。当業者であれば、アッセイ方法を遂行する際の適切な実験管理について熟知している。
【００４４】
スクリーニングされ得る化合物は、薬物スクリーニングのプログラムに使用される天然または合成による化学物質であり得る。既に特徴付けされた、あるいは未だ特徴付けされていない種々の化合物を含む、植物、微生物あるいは他の生物体からの抽出物を利用することもまた可能である。
【００４５】
コンビナトリアルライブラリーテクノロジー（combinatorial library technology）もまた、相互作用を調節する能力に関して、さまざまな物質を大量に検査することを可能にするために有効な方法である。他種と混在するすべての種類の天然産物、小分子およびペプチドに対するこのようなライブラリーおよびその使用は当該技術分野で周知事項である。
【００４６】
ペプチドライブラリーの使用は特定の環境において好ましいものとなり得る。該ポリペプチド鎖のペプチドフラグメントによる阻害されるべき本発明の受容体のポリペプチド鎖間の結合に対する潜在力は、既に述べてきた。こうしたペプチドフラグメントは、たとえば１０〜４０個のアミノ酸、具体例としては約１０、約２０、約３０または約４０個のアミノ酸、または約１０〜２０、約２０〜３０または約３０〜４０個のアミノ酸から構成され得る。これらは既存の技術を用いて、遺伝子組み換え的、化学的または人工的に合成することができる。
【００４７】
本発明のリガンドに対する本発明の受容体の結合の阻害物質であって、その他のクラスのものとしては、エフェクター機能が無効である一方、サイトカイン等のリガンドに結合する能力は保持するように改変された受容体が含まれる。サイトカイン受容体は通常４のドメインを有しており、第一ドメインはシグナルペプチドであり、１５〜３０個（通常約２０個）のアミノ酸領域であり、主に疎水性であり、タンパク質が小胞体にトランスファーされた後、開裂（cleave）する（このため細胞表面の成熟タンパク質には存在しない）。第二ドメインは細胞外ドメインである。本発明の受容体に関しては、このドメインはアミノ酸長が約２００個であり、該受容体との間にいくらかのホモロジー（アミノ酸同一性がおよそ２０〜３０％）を有している。第三ドメインは膜貫通ドメインであり、約２０個の疎水性アミノ酸が伸長している。最後に、細胞内ドメインはサイトカイン受容体においてさまざまなサイズ（２０〜３０００アミノ酸）を有し、同ファミリーの受容体との間のホモロジーをほとんど示さない。シグナルペプチドおよび膜貫通ドメインの予想のためのプログラムはウェブ上で入手可能である。（たとえば、www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/を参照されたい。引用文献としては、S. Moller、M.D.R. Croning、R. ApweilerによるEvaluation of methods for the prediction of membrane spanning regions（膜貫通領域の予想のための方法の評価）、Bioinfomatics、１７（７）：６４６〜６５３、２００１年７月、またはA. Krogh、B. Larsson、G. von HeijneおよびE.L.L. SonnhammerによるPredicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model（ハイデンマルコフ  モデルでの膜貫通タンパク質トポロジーの予想）；Application to complete genomes、Journal of Molecular Biology、３０５（３）：５６７〜５８０、２００１年１月を参照されたい。）これは、阻害物質として利用できると考えられる細胞外ドメインの定義に役立つ。このような可溶性受容体の作成方法は、膜貫通ドメイン手前に終止コドンを挿入することによることが可能であると考えられる。他の方法として、精製をより簡単にするために使用されるペプチド（たとえばＮｉ２＋のような金属イオンに結合するポリ-hisペプチド）、受容体の二量体化を可能にする（これによりリガンドに対する結合活性が増加する）イムノグロブリンＦcフラグメント等の、他のタンパク質と融合した形で細胞外ドメインを産生することが可能である。また、２つの受容体鎖に対するＩｇとの融合構築物の細胞における共発現は、ヘテロダイマーの産生を導き、イムノグロブリンＦcフラグメントを通して連結した１型または２型（type 1 or type 2）ＩＬ−２０Ｒの複合体を再構築する。第一鎖および第二鎖の配列間に「スペースペプチド（space peptide）」を含む一本鎖として、二つの細胞外ドメインを作成することも可能である。このようなタンパク質は、元になる別個のタンパク質の複合体として折りたたまれる（fold）ことができる。
【００４８】
本発明のいずれのアッセイ方法においても、本発明のアッセイ方法に添加し得る被検物質または化合物の量は使用される化合物のタイプに応じて試行錯誤することにより通常、決定されるであろう。一般的に約０．００１ｎＭ〜１ｍＭまたはそれを超える濃度、たとえば０．０１ｎＭ〜１０ｍＭ、具体的には０．１〜５０μＭ、より具体的な例としては約１０μＭ、の潜在的阻害物質（putative inhibitor compound）が使用され得る。たとえ作用の弱い分子であったとしても、さらなる研究および開発に対する、有用なリード化合物になり得る。
【００４９】
スクリーニングまたはアッセイ方法には、混合物または抽出物からの対象となる被検化合物および／または対象の物質の精製および／または単離、すなわち該混合物または抽出物に含まれる一種以上の成分、たとえば元来は該被検物質に会合している成分等の含有量を低減させることを含むことができる。スクリーニングまたはアッセイ方法には、被検混合物または抽出物中の一つ以上のフラクション（分画）が本発明のポリペプチド鎖または受容体に結合する能力の測定、または被検混合物または抽出物中の一つ以上のフラクションが受容体に結合する、または受容体の活性に影響を与える能力の測定が含まれ得る。
【００５０】
該分子の精製および／または単離には、たとえば抗体分子を利用する等、当業者に周知のいかなる方法を採用してもかまわない。
【００５１】
本発明のポリペプチド鎖および受容体の精製におけるこれらの使用に加えて、抗体分子は、それ自体が受容体機能の潜在的調節物質の更なるクラスを意味する。
【００５２】
その受容体の他方のポリペプチド鎖に対する受容体の一方のポリペプチド鎖の結合部位に直接作用、またはリガンドに対する受容体の結合部位に直接影響を与える抗体は、受容体活性の潜在的調節物質の更なるクラスを形成する。候補となる阻害物質および／またはａｇａｏｎｉｓｔ抗体は特徴付けられ、その結合領域が、結合を切断する原因となる一本鎖の抗体およびそのフラグメントが提供するため、測定される。
【００５３】
抗体は当該技術分野で標準的な技術を用いることにより得ることが可能である。抗体を産生する方法には、関連受容体、それらのポリペプチド鎖またはペプチドフラグメントによる哺乳動物（たとえば、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヤギ、ヒツジまたはサル等）の免疫化が含まれる。抗体は、当該技術分野において知られる種々の技術のいずれかを用いて免疫化動物より得られ、好ましくは対象の抗原に対する抗体の結合を利用してスクリーニングが行われることが可能である。たとえば、ウエスタンブロット法または免疫沈降反応を使用することができる（アーミテージ（Armitage）ら、Nature ３５７：８０〜８２，１９９２年、参照により本明細書に援用する）。動物由来の抗体および／または抗体産生細胞の単離には、動物を犠牲にする工程を伴う場合がある。
【００５４】
哺乳動物のペプチドを用いた免疫化に対する代替、またはこれに対する追加として、たとえば、その表面に機能的イムノグロブリン結合領域（functional immunoglobulin binding domain）を持つラムダバクテリオファージまたは糸状菌バクテリオファージを用いて発現されたイムノグロブリン可変領域の組み換え産生ライブラリーから抗体を得ることが可能である。たとえばＰＣＴ出願ＷＯ  ９２／０１４７号、これは引用により本明細書に援用される、を参照のこと。これらの方法論は、ヒト化、キメラ化またはその他の型のハイブリッド抗体、あるいはたとえばヒト−ネズミ型、ヒト−ラット型、ヒト−ウサギ型、あるいはヤギ、ヒツジ、チンパンジー、霊長類およびその他の動物を含む、げっ歯類以外の他の動物同士のハイブリッドである完全抗体のフラグメントを調製する際にとりわけ好ましい。
【００５５】
本発明において有用な抗体分子はさまざまな方法で改変されることが可能である。実際、「抗体分子」という用語は抗原に結合可能な抗体フラグメントおよび誘導体を含めるように構築されなければならない。抗原またはその他の結合パートナーに結合する抗体フラグメントの例は、ＶＬ、ＶＨ、Ｃ１、およびＣＨ１ドメインで構成されるＦａｂフラグメント、ＶＨおよびＣＨ１ドメインで構成されるＦｄフラグメント、抗体である、単一のＶＬおよびＶＨドメインで構成されるＦｖフラグメント、ＶＨドメインで構成されるｄＡｂフラグメント、単離ＣＤＲ領域、およびヒンジ領域のジスルフィド架橋により連結した二つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメントが挙げられる。一本鎖Ｆｖフラグメントもまた含まれる。
【００５６】
所望の結合特性を有する抗体の産生が可能なハイブリドーマは、抗体（抗体フラグメントを含む）をコードする核酸を含み、これらの発現が可能な宿主細胞、真核細胞または原核細胞として、本発明の権利範囲に含まれる。また、本発明は、抗体の産生が可能な、好ましくは分泌が可能な条件下、抗体の産生が可能な細胞を増殖することを含有する抗体の産生方法を提供する。
【００５７】
検体に対する抗体の応答性は適切な手法のいずれかを用いて測定される。可能性の一つとして、個々のレポーター分子（reporter molecule）でタグ化することが挙げられる。該レポーター分子は直接的または間接的に検定可能な、好ましくは測定可能なシグナルを生成する。レポーター分子の連結は、直接的、間接的、（たとえばペプチド結合を介して）共有結合的に、あるいは非共有結合的に行うことができる。ペプチド結合を介した連結は、抗体およびレポーター分子をコードする融合遺伝子（gene fusion）の組み換え発現の結果として起こり得る。結合を測定する機序は本発明の特徴ではなく、当業者であれば自己の優先度とその幅広い知識にしたがって、好適な形態を選択することが可能である。
【００５８】
本発明のポリペプチド鎖または受容体、あるいはペプチドフラグメントの精製および／または単離において、具体的にはコードする核酸に由来する発現によって以下のペプチド産生を行う場合においても、抗体を利用することが可能である。関連する生物学的機能または活性を阻害するという観点により、受容体のポリペプチド鎖同士の結合あるいは受容体とリガンドの結合を分裂するためには、治療の場（予防を含めることも可能である）において、抗体が有用となる可能性がある。抗体は、（たとえば腫瘍部位の）細胞内に、たとえば微量注射することが可能である。
【００５９】
本発明のアッセイ方法により検査される被検化合物の性質にかかわらず、本発明の受容体のポリペプチド鎖等の物質間の相互作用又は結合は、当該技術分野で利用されている技術のいずれかにより、定性的または定量的に測定することが可能である。ラジオイムノアッセイ、共免疫沈降反応（co-immunoprecipitation）、シンチレーション近接アッセイ（scintillation proximity assay）およびＥＬＩＳＡ法などの技術がこれらに含まれる。
【００６０】
一方の成分の他方に対する結合は、いずれかを検出可能なラベルによりラベル化し、これを、あらかじめ固相支持体上に固定化した、他方の化合物に接触させることにより調べることが可能である。好適な検出可能なラベル、特にペプチジル物質（peptidyl substance）には、組み換え産生ペプチドまたはポリペプチドに取り込まれることが可能である３５Ｓ−メチオニンが含まれる。組み換え産生ペプチドおよびポリペプチドは、抗体で標識されることが可能なエピトープを含む融合タンパク質として発現させることも可能である。
【００６１】
固相支持体上に固定化されるポリペプチドおよびペプチドは、固相支持体に結合するポリペプチドに対する抗体を使用して、あるいはそれ自体が既知である他の技術を用いて固定化され得る。好適なインヴィトロ（生体外）における相互作用には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を含む融合タンパク質を用いることができる。グルタチオンアガロースビーズ上にこれを固定化することが可能である。前記のタイプのインヴィトロにおけるアッセイ形態では、ラベル化ペプチドまたはポリペプチド（たとえば、固定化ＧＳＴ融合ペプチド〔ＧＳＴおよびＩＬ−２２ＲまたはＩＬ−２０Ｒαの融合ペプチドを固定化したものなど〕に結合したラベル化ＩＬ−２０Ｒβ）の量を減少させる能力を測定することにより被検モジュレーターのアッセイが行われる。これは、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法を用いてグルタチオンアガロースビーズを分画化することにより測定される。別の方法としては、非結合のペプチドまたはポリペプチドを除去するために該ビーズを洗浄し、たとえば好適なシンチレーションカウンターで存在するラベルの量を算定することにより、結合したペプチドまたはポリペプチドの量を測定する。
【００６２】
二種の成分における結合および相互作用は、２ハイブリッドアッセイ（two-hybrid assay）を用いて測定することも可能である。
【００６３】
たとえば、本発明の受容体の第一ポリペプチド鎖を、酵母転写因子ＧＡＬ４等におけるＤＮＡ結合ドメインと融合することが可能である。ＧＡＬ４転写因子は二つの機能ドメインを含有している。これらのドメインはＤＮＡ結合ドメイン（ＧＡＬ４ＤＢＤ）およびＧＡＬ４転写活性化ドメイン（ＧＡＬ４ＴＡＤ）である。受容体の第一ポリペプチド鎖をこれらのドメインの一方に融合し、受容体の第二ポリペプチド鎖を夫々の対応物に融合することにより、この二つのポリペプチドが相互に作用した場合のみ、機能的ＧＡＬ４転写因子が再建される。したがって、これらのポリペプチドの相互作用は、レポーター遺伝子の転写を活性化する（activating）ことができるＧＡＬ４ＤＮＡ結合部位に連結されたレポーター遺伝子を利用して測定することが可能である。
【００６４】
この２ハイブリッドアッセイのフォーマットはフィールズ（Fields）およびソング（Song）、Nature ３４０；２４５〜２４６、（１９８９年）に記載されている。これは、哺乳動物細胞および酵母のいずれでも利用可能である。その他のＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインのコンビネーションは、当該技術分野において入手可能であるが、ＬｅｘＡ  ＤＮＡ結合ドメインおよびＶＰ６０転写活性化ドメインが好ましいものであろう。
【００６５】
本発明のスクリーニングおよびアッセイ方法の形態の詳細なフォーマットについては、定型的な技術および知識を用いて当業者により変更される場合がある。当業者であれは、適切な実験管理を採用することが必要であることを十分に理解している。
【００６６】
本発明はさらに、受容体のポリペプチド鎖間の結合に影響を与える、または受容体とリガンド間の結合に影響を与える、あるいは受容体活性に影響を与える物質または化合物のスクリーニングにおける、本発明の受容体のポリペプチド鎖またはそのペプチドフラグメントの利用、あるいは本明細書中に開示される受容体の利用を提供する。
【００６７】
本発明に係るアッセイ方法を行った後、関連（relevant）相互作用を調節する能力、または関連生物学的機能あるいは活性に影響を与える能力に関して陽性を示した化合物、物質または分子を単離および／または製造および／または使用することが可能である。好ましい薬剤の同定に続いて、さらに、この薬剤について検討を行うことが可能であり、関連相互作用を調節する能力または関連生物学的機能に影響を与える能力を変調（モジュレート）せずに一種以上の特性を変化させるために、この薬剤を改変または誘導体化することが可能である。たとえば、一本鎖Fv抗体分子は、定常部位を含む完全抗体（たとえばＩｇＧ抗体）に再編成することが可能である。いずれのペプチジル分子も一以上のアミノ酸の付加、置換、挿入または欠失により、あるいは付加成分またはタンパク質ドメインを連結させることにより改変することが可能である。活性薬剤はコンピューターシュミレーション（in  silico）で分子モデリングに供することが可能であり、元来同定された薬剤のミメチックが作り出され得る。
【００６８】
さらに、本発明の活性薬剤は製造され、および／または医薬品（medicament）、医薬組成物または薬物（drug）といった組成物の調製（すなわち製造または調合）に利用され得る。これらは個体に投与されることが可能である。
【００６９】
ペプチド、抗体、小分子またはその他の因子であって、本発明の受容体のポリペプチド鎖間の結合に影響を与える能力、またはこのような受容体とリガンドの結合に影響を与える能力を有する化合物は、さまざまな場面で治療またはその他の潜在能力を有する。治療を目的として、このような化合物を、他のいずれかの活性物質とコンビネーションさせて使用することが可能である。
【００７０】
一般的に、本発明にしたがって同定され、また、これに引き続き使用される、このような物質は、単離および／または精製された状態、すなわち実質的に純粋な状態で提供される。これには、少なくとも約９０％の活性成分、より好ましくは約９５％の活性成分、さらに好ましくは約９８％の活性成分を示す組成物が含まれ得る。しかしながら、このような組成物には不活性担体（キャリア）物質あるいは他の薬学的、生理学的に許容可能な賦形剤（excipient）を含有することができる。したがって、組成物は、本発明を用いて得られた活性成分および不活性担体によって構成され得る。さらに、本発明による組成物は、本明細書に開示のモジュレーター化合物に加えて、一つ以上の治療用分子、たとえば抗腫瘍剤、を含有することが可能である。
【００７１】
さらに本発明は、本発明による受容体のポリペプチド鎖間の相互作用に影響を与える薬剤、または本発明の受容体とリガンドの結合に影響を与える薬剤を含む組成物を患者に投与することを含む治療方法を提供する。このような治療における治療的／予防的目的は、本発明の受容体に結合する分子に関連するか、本発明の受容体の活性または機能に関連するいかなる疾患とも係わり得る。本発明の実施態様にしたがって治療され得る疾患には、皮膚疾患、たとえばアトピー性皮膚炎、乾癬、脂漏性角化症、角皮症およびその他表皮（上皮）および／または皮膚細胞の過剰な増殖を含む状態、が含まれる。たとえば、報告によれば、ｍｄａ−７タンパク質は、マウスにおけるインヴィトロおよびインヴィヴォ（生体外および生体内）双方で、この遺伝子を発現するアデノウイルスが抗腫瘍効果を有することから、抗腫瘍活性を持つとされている。したがって、この結果からＩＬ−２０および、さらにいくらか拡大して、ＩＬ−１９が、同様の活性を持つことを示唆しており、抗腫瘍剤としての効力が示唆される。
【００７２】
さまざまな他の側面において、本発明は、医薬組成物、医薬品、薬剤またはそのような目的を持つ他の組成物；一つ以上のこのような物質を含む組成物；医療方法におけるこのような物質の使用；たとえば、疾患の治療（予防的処置を含み得る）のための、このような物質を患者に投与することを含む方法；組成物の製造におけるこのような物質の使用；たとえば、疾患の治療を目的として等、このような目的で投与するための、医薬品または薬物、および；このような物質を、医薬的に許容可能な賦形剤、溶媒（vehicle）または担体、および任意の他の成分と混合することを含む医薬組成物の製造方法、を提供する。
【００７３】
本発明の医療方法に使用される物質が何であれ、「予防的に有効な量」または「治療的に有効な量」（場合によっては、予防は治療行為とみなされ得るのであるが）の投与が行われることが好ましく、これは個体に恩恵を与えるためには十分である。投与される実際の量および投与レートないし時間経過は治療を行う疾患の性質および重症度に左右される。投与量の決定等の治療の処方は、一般開業医および他の医師の責任の範疇に属する。
【００７４】
本発明による医薬組成物および本発明に基づくその使用には、活性成分に加えて医薬的に許容可能な賦形剤、担体、緩衝剤、安定化剤または当該技術分野で熟知される他の物質を含有することが可能である。このような物質は無毒かつ活性成分の効力に決して影響を与えないものでなければならない。担体または他の物質の性質の詳細は、投与経路に依存すると考えられ、投与形態は経口あるいは（たとえば皮膚、皮下、あるいは静脈内）注射であってよい。
【００７５】
経口投与用医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末吸入スプレー（たとえば噴霧器）あるいは液体の形状をとり得る。錠剤は、ゼラチンあるいはアジュバント等の固形担体を含むことが可能である。液体医薬組成物は、一般的に、水、石油、動植物油、鉱油、合成油等の液性担体を含むことが可能である。生理学的食塩水、ブドウ糖または他の糖類溶液、あるいはエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のグリコールが、含まれ得る。
【００７６】
静脈内、皮膚あるいは皮下注射あるいは疾患部位への注射用には、活性成分は非経口的に許容可能で、パイロジェンフリーであり、好適なｐＨ、等張性および安定性を有する水溶液の形状とされるであろう。当業者であれば、たとえば塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸加リンゲル注射液等の等張性を有する溶媒を用いて好適な溶液を調製する能力を十分に有している。必要に応じて防腐剤、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤および／または他の添加剤を含むことが可能である。先述の技術およびプロトコールの例は、Remington’s   Pharmaceutical Sciences、第１６版、Osol, A.（編集者）、１９８０年、の中に見つけることができる。
【００７７】
このような物質は、直接投与を行うかわりに、たとえばウイルスベクターから、あるいは体内に投与された「ネイキッドＤＮＡ（“naked DNA”）」として等、細胞に導入されたコード化された核酸（encoding nucleic acid）からの発現により標的細胞内で産生することが可能である。こうして、たとえば第一および第二ポリペプチド鎖の相互作用に対して、たとえば干渉する等の、調節能を有するペプチド等の物質をコードする核酸が、たとえば疾患の予防や回復（部分的または完全な回復）を目的とした、個体の治療等の遺伝子治療方法に用いることが可能である。
【００７８】
本発明の受容体の結合特性によって、特定のサイトカインやこのような受容体の他のリガンドが例えば個体から採取された、検体中に存在するか否かを確立するための、物質の使用および方法が、さらに提供される。たとえば、ＩＬ−２０ＲαおよびＩＬ−２０Ｒβの複合体は、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０およびｍｄａ−７のすべてに結合する。したがって、対象となるサンプルをＩＬ−２０ＲαおよびＩＬ−２０Ｒβを含む受容体、またはこのような受容体を提示する細胞に接触させ、何らかの結合が起きたか否かを測定することが可能である。結合が起こる場合には、これらのサイトカインのいずれかが存在している。第二工程では、サンプルをＩＬ−２０ＲβおよびＩＬ−２２Ｒを含む受容体またはこのような受容体を提示する細胞に接触させる。結合が検出されない場合には、これによってＩＬ−１９はサンプル中に存在するが、ＩＬ−２０およびｍｄａ−７は存在しないことが示される。結合が検出された場合には、これによってｍｄａ−７およびＩＬ−２０のいずれか一方あるいは両方がサンプル中に存在することが示される。サンプル成分に関するより詳しい情報は、この物質とＩＬ−２２Ｒ／ＩＬ−２０Ｒβ複合体との結合を、ＩＬ−２０Ｒα／ＩＬ−２０Ｒβ複合体との結合と比較することにより検証することが可能であるが、これは前者が後者よりもｍｄａ−７対してより強力に結合するためである。
【００７９】
本発明の別の側面によれば、サンプル中の一種類またはそれ以上のサイトカインの存在を測定する方法であって、該サンプルを（本明細書に開示の）本発明の受容体と接触させて、該受容体が該サンプルに結合するか否かを確認することを含有する方法が提供される。この側面の好ましい実施態様において、該サンプルは、該サンプル中に存在する一種またはそれ以上のサイトカインを同定するために、それぞれに異なる本発明の受容体の一以上のコンビネーションに接触させられる。
【００８０】
先に強調したように、トランスジェニックマウスの実験により、ＩＬ−２０が新生児期の致命性およびさまざまな皮膚異常と関連することが検証されている。したがって、受容細胞へのＩＬ−２０の作用を阻害することが、たとえば該細胞をＩＬ−２０との結合において競合する他のサイトカインと接触させる、あるいは該受容体を、受容体の結合に対する阻害剤、たとえば抗体あるいは他の形状の阻害分子等、と接触させることにより、可能である。このようなアンタゴニストまたは阻害剤の代表的なものとして、たとえば受容体に対する親和性は失わずに、活性が失われるように突然変異されたｍｄａ−７またはＩＬ−１９突然変異体やＩＬ−２０受容体の可溶性細胞外フラグメント等のＩＬ−２０に対する可溶性結合パートナー等が挙げられる。
【００８１】
このメカニズムは、皮膚細胞等の上皮細胞の増殖が禁忌である場合の治療へのアプローチを提供する。このような症状の代表例としてはアトピー性皮膚炎、乾癬、脂漏性角化症（seborrhoeic keratitis）、角皮症、および上皮および／または皮膚細胞の過剰な増殖を含むその他の症状が挙げられる。このような治療的アプローチにおいて、ＩＬ−２０に結合する薬剤は被検体に対して必要に応じた量が投与される。このような薬剤は上記のいずれの阻害剤でもよく、抗体、一種以上のＩＬ−２０受容体に結合する抗体分子の一部、受容体に結合する能力を持つがエフェクター物質としての機能は持たないＩＬ−２０自身のフラグメント、受容体親和性は保持するが活性を失っているＩＬ−２０の突然変異型が含まれる。このような形態の分子としては、他のインターロイキン、ＩＬ−２０受容体の可溶型等が知られている。
【００８２】
この知見、すなわちＩＬ−２０が皮膚細胞等の上皮細胞の増殖を刺激するということに基づいて、当業者は対象となる被検物質がこのような細胞の増殖に対して阻害作用を有するかどうかを測定するためのアッセイ方法を確立することができる。実際には、対象となる物質をＩＬ−２０および皮膚細胞等の上皮細胞とコンビネーションさせ、増殖を確認し、同システムにおいてＩＬ−２０のみを用いたときの結果と比較する。増殖の減少は、被検物質の阻害効果を意味する。その表面にＩＬ−２２ＲおよびＩＬ−２０Ｒβの複合体を提示する細胞サンプルと、ＩＬ−２０ＲαおよびＩＬ−２０Ｒβの複合体を提示する細胞サンプルを用いた平行試験により、被検物質の具体的な活性をさらに特定することができる。たとえば、被検物質およびＩＬ−２０による細胞への刺激に引き続いて阻害が起こり、その値が同等であった場合、阻害剤はＩＬ−２０自身またはＩＬ−２０Ｒβのいずれかに作用しているであろう。ＩＬ−２２Ｒ／ＩＬ−２０Ｒβ複合体を提示する細胞における阻害のほうがＩＬ−２０Ｒα／ＩＬ−２０Ｒβ複合体を提示する細胞における場合よりも大きかった場合、阻害剤はＩＬ−２２Ｒまたはもう一方を介して作用しているであろう。
【００８３】
同様に、ＩＬ−２０がＩＬ−２２ＲおよびＩＬ−２０Ｒβの複合体に応答するとの知見は、細胞に対するＩＬ−２０の結合を増強させる、または結合を引き起こす方法を示唆する。たとえば、補足的な「ＩＩ型（type II）」受容体複合体を形成するために十分量の、ＩＬ−２０Ｒβをコードする核酸分子で、標的細胞をトランスフェクトすることにより達成することができる。先に指摘したように、ＩＬ−２０およびｍｄａ−７は細胞に対して特定の作用を持つことが知られている。たとえば標的細胞を形質転換あるいはトランスフェクトして大量のＩＬ−２２ＲおよびＩＬ−２０Ｒβを提示することによって、これらの作用を増強することが可能となる。したがって、標的細胞がＩＬ−２２Ｒを発現するが、ＩＬ−２０Ｒβを発現しない場合、補足的な受容体を生成するために、ＩＬ−２０Ｒβを発現するベクターでその細胞を形質転換またはトランスフェクトすることができる。かわりに、一方の完全な分子および他方の結合部位、または二つの結合部位、これらの分子の両方をコードする核酸分子、または二分子の融合タンパク質をコードする構築物で、この細胞を形質転換またはトランスフェクトすることが可能である。関連部位または分子は、リンカー配列またはその分子の適正な折りたたみ構造および機能性をもたらすことを促すことができる、その他の構築物等を介して連結されることができるであろう。
【００８４】
この結果は、適切なトランスフェクタントを選択することによって、特定のサイトカインが存在するかどうかを確認し、それらの定量化を行なうために患者から採取した検体等のサンプルの「類型分類を行なう（type）」ことが可能であることを示している。上述したように、たとえばＩＬ−２０ＲαおよびＩＬ−２０Ｒβの複合体はＩＬ−１９、ＩＬ−２０およびｍｄａ−７のすべてに結合する。したがって、アッセイの第一段階において、対象となるサンプルをＩＬ−２０ＲαおよびＩＬ−２０Ｒβの複合体を提示する細胞に接触させて、何らかの結合が起きるかどうかを確認する。結合が起こった場合、これらのサイトカインの一つが存在している。第二段階において、サンプルをＩＬ−２０ＲβおよびＩＬ−２２Ｒの複合体でアッセイさせることが可能である。このアッセイの結果が陰性であれば、サンプル中にはＩＬ−１９が存在するが、ＩＬ−２０またはｍｄａ−７は存在しないとの判断を行うことができる。
【００８５】
同様に、両方の検定で陽性であれば、ｍｄａ−７およびＩＬ−２０のいずれか一方あるいは双方が存在するとの判断を行うことができる。サンプル成分をさらに確認することは、物質のＩＬ−２２Ｒ／ＩＬ−２０Ｒβ複合体に対する結合と、ＩＬ−２０Ｒα／ＩＬ−２０Ｒβ複合体に対する結合を比較することによって確認することができるが、これは、前者が後者より強力にｍｄａ−７に結合するからである。
【００８６】
本発明のさらなる側面および実施態様は、当該技術分野において通常の技術知識を有する者にとって明白であろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８７】
実施例１
種々のＩＬ−１０ホモログと、クラスＩＩサイトカイン受容体ファミリーに属する受容体との間の相互作用を特徴づけるために、一連の実験を行った。
【００８８】
このため、ＩＬ−１０ホモログであるｍｄａ−７、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、およびＩＬ−２２に対するコード配列は、抗ＣＤ３抗体によって刺激したＴ細胞由来のＲＮＡを用いて、標準的な当業界で周知の技術を用いて、ＲＴ−ＰＣＲにより増幅された。ＩＬ−２０に対するコード配列は皮膚ＲＮＡから増幅された。
【００８９】
得られたｃＤＮＡ分子は、ＣＭＶプロモータの制御の下、商業的に入手可能なプラスミドであるｐＣＥＰ４にクローニングされた。「ｍｄａ−７−ｆｌａｇ」、「ＩＬ−１９−ｆｌａｇ」および「ＩＬ−２２−ｆｌａｇ」と称される融合タンパク質が産生された。産生のため、ｐＣＥＰ４のクローニング部位の手前にセンスプライマーおよびｃＤＮＡのＳＴＯＰコドンを突然変異させたアンチセンスプライマーを、ｆｌａｇ分子の最初の部分をコードする塩基配列とともに挿入し、ｃＤＮＡ構築物が調製された。使用された配列は、
gtccttgtag tcacctcccc cgagcttgta gaatttctg （配列番号１、ｍｄａ−７とともに使用）、
gtccttgtag tcacctcccc cagctgagga catacttc （配列番号２、ＩＬ−１９とともに使用）、
gtccttgtag tcacctcccc cttctgtctc ctccatcca （配列番号３、ＩＬ−２０用）、および
gtccttgtag tcacctcccc cgacgcaagc atttctcag （配列番号４、ＩＬ−２２とともに使用）、である。
最初のＰＣＲ産物が調製された後、同一のセンスプライマー、全ｆｌａｇ配列、およびＮｈｅＩ制限酵素認識部位、を含んだオリゴヌクレオチド、すなわち
actgctagct cacttgtcgt catcgtcctt gtagtcacct （配列番号５）、
を用いて第二回目のＰＣＲ増幅が行われた。
【００９０】
これにより、ｐＣＥＰ４プラスミドに直接クローニング（direct cloning）が行われた。
【００９１】
標準的技法および商業的に入手可能な自動蛍光分析装置（automated fluorescence based system）を用いて、サイトカインｆｌａｇ融合ｃＤＮＡを含むクローンの配列を決定した。
【００９２】
ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞における一過性発現（transient expression）により融合タンパク質が産生された。そのために、トランスフェクションの一日前に、６ウェルのプレートに８×１０５細胞／ウェルの細胞を播種した。トランスフェクションは、下記の製造元の指導の下、２μｇのプラスミドＤＮＡを用い、標準化リポフェクタミン（standard lipofectamine）を用いて行われた。
【００９３】
続いて、タンパク質の産生を最大化するために、この細胞を４日間、２ｍｌの培地中でインキュベートした。
【００９４】
ｆｌａｇペプチドに特異的な抗体を用いて、１０μｌの細胞の上清にＬａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液（sample buffer）を配合させ、続いて５分間沸騰させることにより、ウェスタンブロット法を介して組み換えタンパク質を測定した。タンパク質を１４％ポリアクリルアミドゲルのプレキャスト上にて分離した。次の転写では、ＰＶＤＦ膜を５％脱脂粉乳中でブロッキングし、洗浄して、ビオチン化（biotinylated）抗ｆｌａｇ抗体（２５μｇ／ｍｌ）で探索（probe）した後、ストレプトアビジンペルオキシダーゼ（streptavidin peroxidase）（１／５０００）とともにインキュベートした。商業的に入手可能な装置を用いて、電気化学発光測定（electrochemiluminescence）を行った。
【００９５】
ＨＥＫ−２９３細胞は、２３〜３０キロダルトンの範囲の異なる分子量を有するｍｄａ−７、ＩＬ−１９、およびＩＬ−２２のｆｌａｇ融合タンパク質を分泌した。この異種性はグリコシル化に起因するによるものである可能性が非常に高い。ＩＬ−２０のｆｌａｇ融合タンパク質は、１８キロダルトンの単一のバンドとして分泌された。このことは、このタンパク質がグリコシル化されていないことを示唆している。
【００９６】
化学発光シグナルの定量化により、ＩＬ−１９およびＩＬ−２２は同レベルで産生されたことが示された。これとは対照的に、ＩＬ−２０およびｍｄａ−７は７倍量未満のレベルで産生された。
【００９７】
実施例２
上述のＨＥＫ−２９３トランスフェクタントの上清が、サイトカインとクラスＩＩサイトカイン受容体との相互作用を検討するために使用された。
【００９８】
細胞ラインＨＴ−２９はＩＬ−２２ＲおよびＩＬ−１０Ｒβを内因的に発現する。これらの細胞のサンプルはｐＧＲＲ５構築物でトランスフェクトされた。この構築物は、５コピーのＦｃγＲＩ遺伝子のＳＴＡＴ結合部位を含有し、これはＴＫプロモータによる制御されるルシフェラーゼ遺伝子の上流に挿入されており、ＩＬ−２２によるＳＴＡＴの活性化の検定に利用することができる。他のＩＬ−２２ホモログに対する作用のメカニズムが同様であるとすれば、その検出のためホモログに同様のアッセイが利用できると想定される。
【００９９】
ＨＴ−２９サンプルを、１５μｇのｐＧＲＲ５で電気穿孔（４００μＬ中１０７細胞、２５０Ｖ、１９２Ω、１２００μＦ）を行った。細胞を９６ウェルのプレートに１０５細胞／ウェルで播種し、３７℃にて５時間インキュベートした後、抗ＩＬ−２２Ｒ抗血清（１／５００）または抗ＩＬ−１０Ｒβ抗体（６μｇ／ｍＬ）のいずれかと１時間のプレインキュベートを行うか、またはプレインキュベートは行わなかった。次に、それぞれの上清で細胞を２時間刺激した。商業的に入手可能な物質を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【０１００】
抗ｈＩＬ−２２Ｒ抗体は、Ｐ８１５肥満細胞を、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ  ｐｕｒｏに組み込まれたヒトＩＬ−２２ＲをコードするｃＤＮＡでトランスフェクトすることにより製造した。産生のため、センスプライマーである、
ggaggactag ttgccagccc cgatgagga （配列番号６）
を用いて、肝癌細胞ライン、すなわち「Ｈｅｐ  Ｇ２」から、ＩＬ−２２Ｒに対するｃＤＮＡが増幅された。このセンスプライマーはＳｐｅｌに対する制限酵素認識部位を有している。ＮｏｔＩに対する制限酵素認識部位を有するアンチセンスプライマーである、
gtgtggcggc cgcaggcatg ggattgacag c （配列番号７）
もまた使用された。これらのプライマーは、ｐＥＦ−ＢＯＳ  ｐｕｒｏ発現ベクター内における直接クローニングを促進する。デモウリン（Demoulin）ら（Mol. Cell Biol. １６：４７１０（１９９６））を参照されたいが、これは参照により本明細書中に援用される。このトランスフェクタントをＤＢＡ／２マウスに注射した。マウスの腫瘍が排除された後、得られた血清には、高力価の中和された抗−ｈＩＬ−２２抗体が含まれていた。これは上記に参照される抗血清である。
【０１０１】
ＨＴ−２９細胞はＩＬ-２２に反応したが、他のサイトカインには反応しなかった。
【０１０２】
実施例３
ＨＴ−２９細胞を、ｐＧＲＲ５、およびＩＬ-２０ＲβまたはＩＬ−２０Ｒαのいずれかに対するｃＤＮＡ（１５μｇ）によってコトランスフェクト（cotransfecting）を行い、実施例２の実験を拡大した。ここで用いたその他のすべての手法は、実施例２とまったく同一であった。
【０１０３】
ＨＴ−２９細胞がＩＬ−２０Ｒβ  ｃＤＮＡでトランスフェクトされた場合、ｍｄａ−７およびＩＬ−２０のいずれもルシフェラーゼ産生を誘導したものの、この作用は抗ＩＬ−２２Ｒ抗血清により完全に遮断された。このことは、以前は観察されなかった、ＩＬ−２２ＲおよびＩＬ−２０Ｒβを含むＩＬ−２０Ｒが形成されたことを示している。
【０１０４】
ＨＴ−２９細胞がおよびＩＬ−２０ＲαおよびＩＬ−２０Ｒβの両方に対するｃＤＮＡでトランスフェクトされた場合、ｍｄａ−７、ＩＬ−２０およびＩＬ−１９のいずれに対しても受容性を示すようになった。さらに、ルシフェラーゼ生成は抗ＩＬ−２２Ｒ抗体による影響を受けなかったことから、この活性がその鎖から独立していることが示された。
【０１０５】
ＩＬ−２０ＲαｃＤＮＡ単独でトランスフェクトされた場合、どの反応も誘発されなかった。
【０１０６】
これらの結果から、ＩＬ−２０Ｒβが上述のプロセスに必要であることが示された。
【０１０７】
実施例４
さらに異なるタイプの受容体複合体を特徴付けるために、さらなる一連の実験が行われた。
【０１０８】
ＨＥＫ−２９３細胞は、内因的にＩＬ−１０Ｒβを発現するが、ＩＬ−２２Ｒは発現しない。トランスフェクションを行っていない細胞を先述の上清と混合したが、いずれのホモログとも反応しなかった。トランスフェクションの前日に、ＨＥＫ−２９細胞のサンプルを２ラ１０５細胞／ウェルにて２４ウェルのプレートに播種し、続いて実施例１に記載のリポフェクタミン法により、１００ｎｇのｐＧＲＲ５、および５００ｎｇのＩＬ−２０Ｒα、ＩＬ−２０ＲβまたはＩＬ−２２Ｒをコードするプラスミドを用いてトランスフェクションを行った後、先述の上清でアッセイした。ＩＬ−２０Ｒαに対するｃＤＮＡは、胎盤ライブラリーの増幅により獲得した。細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡフラグメントは、
gccggatcca tgcggccgct gccgctgccg （配列番号８）、および
atcgctagcc atttagcctt gaactctgat g （配列番号９）、
を用いて増幅し、ＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、商業的に入手可能なｐｃＤＥＦ３ベクターのＢａｍＨＩ部位およびＥｃｏＲＶ部位にクローニングした。得られたプラスミドを、「ｐＥＦ２−ＣＲＦ２−８ＥＣ」と称した。膜貫通（transmembrane）ドメインおよび細胞内ドメインをコードするＰＣＲ産物は、ｐＥＦ２−ＣＲＦ２−８ＥＣへのクローニングを行うために、それぞれＮｈｅＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位を有する、
gtggctagcc tggtatgttt tgcccat （配列番号１０）、および
gcgaattcgt ctggcaaaca tttattga （配列番号１１）、
を用いて産生された。
【０１０９】
ＩＬ−２０Ｒβに対するｃＤＮＡは、ｐＣＥＰ４へのクローニングを行うために、ＮｈｅＩ部位およびＮｏｔＩ部位を有する、
ttggctagca acaatgttct aggtc （配列番号１２）、および
tgggcgcggc cgcaaaccta tgagat （配列番号１３）、
を用いて、Ｋ５６２白血病細胞から増幅された。
【０１１０】
ＩＬ−２２ＲのｃＤＮＡが細胞内にトランスフェクトされる際、ルシフェラーゼ産生およびＳＴＡＴ−３のリン酸化は、ＩＬ−２２により誘導されたが、いずれのホモログによっても誘導されなかった。ＩＬ−２２ＲおよびＩＬ−２０Ｒβの双方でトランスフェクトされた細胞は、ＩＬ−２２、ＩＬ−２０およびｍｄａ−７に応答した。ＩＬ−２０Ｒβ単独でのトランスフェクションでは、いずれからも応答性が得られなかった。ＩＬ−２０ＲαおよびＩＬ−２０Ｒβの両者でトランスフェクトされた場合、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０およびｍｄａ−７のすべてが応答を誘発したが、ＩＬ−２２だけ誘発しなかった。ＩＬ−２０Ｒαが単独で用いられた場合、応答は見られなかった。
【０１１１】
上記いずれの実施例においても、ルシフェラーゼの誘導はＳＴＡＴ−３のリン酸化と相関関係にあった。
【０１１２】
実施例５
これまでの上記の実験では、２種の異なる複合体がＩＬ−２０およびｍｄａ−７に結合することが示された。このことから、いずれか一方の複合体が、他方のサイトカインよりもより好ましく反応を示すのかどうか、との疑問が生じた。
【０１１３】
この疑問を検討するために、先の記載と同一の手法で、ＩＬ−２０Ｒβ単独、またはＩＬ−２０ＲαおよびＩＬ−２０Ｒβの両者、のいずれかにより、ＨＴ−２９細胞をトランスフェクトした。さまざまな希釈度（１０％、１％および０．１％）の上清が使用された。ルシフェラーゼ活性は、刺激を与えた２時間後に測定した。
【０１１４】
ＩＬ−２０ＲαおよびＩＬ−２０Ｒβの両者を細胞内にトランスフェクトした場合、ｍｄａ−７およびＩＬ−２０いずれの希釈液も同様の用量応答曲線を示したことから、いずれのサイトカインに対しても同様の感受性を有していることが示された。ＩＬ−２０Ｒβを単独でトランスフェクトした場合、不飽和状態（１％および０．１％）では、ＨＴ−２９細胞はｍｄａ−７に対してより良い応答性を示したことから、このタイプの複合体はｍｄａ−７に対してより感受性が高いことが示された。
【０１１５】
ＨＥＫ−２９３細胞を用いてこれらの実験を繰り返したところ、同様の結果が得られた。
【０１１６】
実施例６
これまでの上記の実験では、ＩＬ−２２ＲはＩＬ−１０ＲβおよびＩＬ−２０Ｒβの両者と結合できることが示され、ＩＬ−２０ＲβおよびＩＬ−２２Ｒの複合体がＩＬ−２２の応答を媒介する可能性があることが示唆された。この可能性を確認するための試験は、ＩＬ−１０Ｒβが偏在的に発現しているとの事実を立証するものでなければならない。したがって、抗ＩＬ−１０Ｒβが抗体で、ＩＬ−１０Ｒβの役割が検討された。ｐＧＲＲ５および前記ＩＬ−２０ＲβｃＤＮＡにより、ＨＴ−２９細胞のトランスフェクションを行った。トランスフェクタントを培養し（これも先に記載されている）、次にＩＬ−２２のｃＤＮＡでトランスフェクトされたか、あるいは偽トランスフェクトされた、ＨＥＫ−２９３由来の１０％上清とともにインキュベートした。ルシフェラーゼ活性は２時間後にモニターした。
【０１１７】
抗ＩＬ−１０Ｒβ抗体は、コントロール（対照）細胞、およびＩＬ−２０ＲβのｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞のいずれにおいてもＩＬ−２２活性を阻害した、という結果が示された。これにより、ＩＬ−２２に接触しない場合、ＩＬ−２０ＲβはＩＬ−１０Ｒβの代用物となることができないことが示された。
【０１１８】
関連試験によると、同一細胞において、この抗体はｍｄａ−７またはＩＬ−２０の活性に影響を与えなかった。
【０１１９】
実施例７
ドゥムティエール（Dumoutier）らJ. Immunol. １６６：７０９０（２００１）およびコテンコ（Kotenko）らJ. Immunol. １６６：７０９６（２００１）の研究（両報告は参照により本明細書中に援用される）は、ＩＬ−２２ＢＰがＩＬ−２２に結合することが示された。この分子が他のサイトカインに結合するか否かに関する報告は見られない。この分子が、ＩＬ−２２ＲおよびＩＬ−２０Ｒαの細胞外ドメインと同程度の相同性を示したことから、ＩＬ−２２ＢＰもＩＬ−２０および他の分子に結合するであろうことが示唆された。
【０１２０】
これを検証するために、まず最初に、無水マレイン酸活性化ポリスチレンプレートを４℃ にて、ＰＢＳ中の１２．５μｇ／ｍＬの抗体とともに一晩インキュベートすることによって、ビオチン化抗ｆｌａｇ抗体（biotinylated anti-flag antibody）でコーティングした。Ｔｗｅｅｎ２０（０．０１％）を含むＰＢＳ緩衝液中でプレートを洗浄し、ウシ血清アルブミン（ＰＢＳ中１％）で２時間ブロッキングした後、上記の記載により産生したＨＥＫ−２９３上清に基づく５０μＬのサイトカインｆｌａｇ融合タンパク質とともに２時間インキュベートした。洗浄後、ＩＬ−２２ＢＰ−Ｉｇを産生するベクターでトランスフェクトされた細胞の１０％上清が加えられた。この融合タンパク質の産生に関する情報は、先に参照により援用したドゥムティエール（Dumoutier）らを参照されたい。上清は２時間後に取り除かれ、ＩＬ−２２ＢＰ−Ｉｇに結合したもののすべてを、ペルオキシダーゼと共役した（coupled to peroxidase）抗マウスＩｇＧ３ポリクローナル抗体を添加することによって検出した。酵素活性は、３，３’,５,５’−テトラメチルベンジジンの添加により測定された。２０μＬのＨ２ＳＯ４（２Ｍ）を添加して反応を停止させた。反応性は４５０ｎｍにおける吸光度を解読することにより測定された。
【０１２１】
ＩＬ−２２だけがＩＬ−２２ＢＰ−Ｉｇに対して結合した。いずれのホモログも活性を示さなかった。
【０１２２】
関連実験において、ＩＬ−２２ＢＰとＩＬ-２２との結合に対する、ＩＬ−１０ホモログの阻害作用を測定した。このため、参照により本明細書中に援用される、ドゥムティエール（Dumoutier）らProc. Natl. Acad. Sci USA ９７：１０１４４（２０００）、に記載されるように、先に記載のプレートを組み換えヒトＩＬ２２でコーティングした。接触前２時間の間に種々のＩＬ-１０ホモログとともにプレインキュベートしたＩＬ−２２ＢＰ−Ｉｇ（１０％上清）とプレートを接触させた。あらゆる結合ＩＬ−２２ＢＰ−Ｉｇは、実験の最初のセットにおいて示された同じ方法において測定された。ＩＬ−２２およびＩＬ−２２ＢＰの相互作用は抗Ｉｇ抗体により検出可能であり、ＩＬ−２２上清のみがＩＬ−２２ＢＰ結合の阻害が可能であった。
【配列表】
2005508879.tif 000002
2005508879.tif 000003
2005508879.tif 000004
2005508879.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】平成16年2月17日(2004.2.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２２】
関連実験において、ＩＬ−２２ＢＰとＩＬ-２２との結合に対する、ＩＬ−１０ホモログの阻害作用を測定した。このため、参照により本明細書中に援用される、ドゥムティエール（Dumoutier）らProc. Natl. Acad. Sci USA ９７：１０１４４（２０００）、に記載されるように、先に記載のプレートを組み換えヒトＩＬ２２でコーティングした。接触前２時間の間に種々のＩＬ−１０ホモログとともにプレインキュベートしたＩＬ−２２ＢＰ−Ｉｇ（１０％上清）とプレートを接触させた。あらゆる結合ＩＬ−２２ＢＰ−Ｉｇは、実験の最初のセットにおいて示された同じ方法において測定された。ＩＬ−２２およびＩＬ−２２ＢＰの相互作用は抗Ｉｇ抗体により検出可能であり、ＩＬ−２２上清のみがＩＬ−２２ＢＰ結合の阻害が可能であった。
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110>  LUDWIG INSTITUTE FOR CANCER RESEACH
<120>  Novel Class II Cytokine Receptors and Uses Thereof
<130>  LUD5734.1
<140>  PCT/US02/23694
<141>  2002-07-24
<150>  US09/915,735
<151>  2001-07-26
<160>  13    
<170>  PatentInversion 3.1
<210>  1
<211>  39
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  oligonucleotide primer
<400>  1
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<210>  2
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<220>
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<220>
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<223>  oligonucleotide primer
<400>  9
atcgctagcc atttagcctt gaactctgat g                                    31
<210>  10
<211>  27
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  oligonucleotide primer
<400>  10
gtggctagcc tggtatgttt tgcccat                                         27
<210>  11
<211>  28
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  oligonucleotide primer
<400>  11
gcgaattcgt ctggcaaaca tttattga                                        28
<210>  12
<211>  25
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  oligonucleotide primer
<400>  12
ttggctagca acaatgttct aggtc                                           25
<210>  13
<211>  26
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  oligonucleotide primer
<400>  13
tgggcgcggc cgcaaaccta tgagat                                          26