(57)【要約】皮膚を美白化するために化粧料的に許容され得る成分を含む組成物におけるキナーゼＡタンパク質を不活性化する化合物、特に式（Ｉ）（式中、Ｒ1 は３個〜３０個の炭素原子を含む脂肪酸の特徴鎖を表し、Ｒ2 はアミノ酸の特徴鎖を表し、ｍは１〜５０の範囲にある）の化合物もしくはその塩または前記化合物の混合物もしくはその塩の使用。化粧料的に許容され得る成分およびキナーゼＡタンパク質を不活性化する少なくとも１種の化合物の有効量を含む組成物を投与することにより皮膚を美白化するための皮膚の非治療的処理方法。化粧料的に許容され得る成分およびキナーゼＡタンパク質を不活性化する少なくとも１種の化合物の有効量を含む皮膚を美白化するために皮膚の治療的処理を実施するための薬学組成物。式（Ｉａ）の化合物。【化１】2005521658.tif 000030【化２】2005521658.tif 000031
2005521658.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚を美白化するための化粧料的に許容され得る成分を含む組成物におけるプロテインキナーゼＡを不活性化する化合物の使用。
【請求項２】
化粧料的に許容され得る成分を含む組成物における式（Ｉ）：
【化１】
2005521658.tif 000024
（式中、Ｒ1 は３個から３０個までの炭素原子を含む飽和または不飽和の、直鎖または分枝鎖の脂肪酸の特徴鎖を表し、Ｒ2 はアミノ酸の特徴鎖を表し、ｍは１ないし５０である）の化合物もしくはその塩または式（Ｉ）の化合物の混合物もしくはその塩の請求項１記載の使用。
【請求項３】
基Ｒ1 −Ｃ（＝Ｏ）−が７個から２２個までの炭素原子を含む式（Ｉ）の組成物の請求項２記載の使用。
【請求項４】
基Ｒ1 −Ｃ（＝Ｏ）−がオクタノイル、デカノイル、ウンデシレノイル、ドデカノイル、テトラデカノイル、ヘキサデカノイル、オクタデカノイル、エイコサノイル、ドコサノイル、８−オクタデセノイル、エイコセノイル、１３−ドコセノイル、９，１２−オクタデカジエノイルまたは９，１２，１５−オクタデカトリエノイル基を表す式（Ｉ）の化合物の請求項３記載の使用。
【請求項５】
基Ｒ1 −Ｃ（＝Ｏ）がオクタノイル、ω−ウンデシレノイル、ドデカノイル、ヘキサデカノイル、８−オクタデセノイル、１３−ドコセノイル、９，１２−オクタデカジエノイルおよび９，１２，１５−オクタデカトリエノイル基から選択される式（Ｉ）の化合物の請求項４記載の使用。
【請求項６】
Ｒ2 がグリシン、アラニン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、バリン、スレオニン、アルギニン、リシン、プロリン、ロイシン、フェニルアラニン、イソロイシン、ヒスチジン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン、グルタミン、システイン、シスチン、メチオニン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリシン、サルコシン、およびオルニチンから選択されるアミノ酸の特徴鎖を表す式（Ｉ）の化合物の請求項１ないし５のいずれか１項記載の使用。
【請求項７】
残基
【化２】
2005521658.tif 000025
または
【化３】
2005521658.tif 000026
の少なくとも１つにおいて、Ｒ2 がフェニルアラニン、チロシン、ヒスチジン、メチオニン、システインまたはトリプトファンの特徴鎖を表す式（Ｉ）の化合物の請求項１ないし６のいずれか１項記載の使用。
【請求項８】
ｍが１ないし１０の十進数であり、好ましくは５未満である式（Ｉ）の化合物の請求項１ないし７のいずれか１項記載の使用。
【請求項９】
ｍが２以下であり、特に１．４以下である式（Ｉ）の化合物の請求項８記載の使用。
【請求項１０】
ｍが１に等しい式（Ｉ）の化合物の請求項９記載の使用。
【請求項１１】
化粧料的に許容され得る成分およびプロテインキナーゼＡを不活性化する少なくとも１種の化合物の有効量を含む組成物を個人に投与することを特徴とする皮膚を美白化するために皮膚を処理するための非治療的方法。
【請求項１２】
前記組成物が、プロテインキナーゼＡを不活性化する化合物を、組成物全重量の０．０１％ないし１０％、特に組成物全重量の０．１％ないし５％、特に組成物全重量の１％ないし５％の割合で含む請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
皮膚を美白化し、治療的皮膚処理を実施するための薬学組成物であって、薬学的に許容され得る成分およびプロテインキナーゼＡを不活性化する少なくとも１種の化合物の有効量を含むことを特徴とする組成物。
【請求項１４】
プロテインキナーゼＡを不活性化する化合物を、組成物全重量の０．０１％ないし１０％、特に組成物全重量の０．１ないし５％、特に組成物全重量の１％ないし５％の割合で含む請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
プロテインキナーゼＡを不活性化する化合物が、アデニレートシクラーゼをも不活性化することを特徴とする請求項１ないし１０のいずれか１項記載の使用。
【請求項１６】
アデニレートシクラーゼを不活性化する化合物が式（Ｉ）の化合物またはその塩であることを特徴とする請求項１５記載の使用。
【請求項１７】
Ｒ1 −Ｃ（＝Ｏ）がオクタノイルおよびω−ウンデシレノイル基から選択され、残基
【化４】
2005521658.tif 000027
または
【化５】
2005521658.tif 000028
の少なくとも１つにおいてＲ2 がフェニルアラニンの特徴鎖を表す式（Ｉ）の化合物の請求項７または１６記載の使用。
【請求項１８】
プロテインキナーゼＡを不活性化する化合物が、アデニレートシクラーゼをも不活性化することを特徴とする請求項１１または１２記載の方法。
【請求項１９】
プロテインキナーゼＡを不活性化する化合物が、アデニレートシクラーゼをも不活性化することを特徴とする請求項１３または１４記載の薬学組成物。
【請求項２０】
プロテインキナーゼＡおよびアデニレートシクラーゼを不活性化する化合物が、メラノサイト特異的ホルモン（α−ＭＳＨ）レセプターに対し親和性を有する化合物であることを特徴とする請求項１ないし１０のいずれか１項記載の使用。
【請求項２１】
プロテインキナーゼＡおよびアデニレートシクラーゼを不活性化する化合物が、メラノサイト特異的ホルモンレセプターに対し親和性を有することを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
プロテインキナーゼＡおよびアデニレートシクラーゼを不活性化する化合物が、メラノサイト特異的ホルモンレセプターに対し親和性を有することを特徴とする請求項１９記載の薬学組成物。
【請求項２３】
式（Ｉａ）：
【化６】
2005521658.tif 000029
のＮ−（ω−ウンデシレノイル）フェニルアラニン。
【請求項２４】
化粧品における請求項２３記載の化合物の使用。
【請求項２５】
薬学的に許容され得る成分および請求項２３記載の化合物の有効量を含むことを特徴とする薬学組成物。
【請求項２６】
エマルジョンであって、請求項２３記載の化合物を、エマルジョン全重量の０．０１％ないし１０％、特にエマルジョン全重量の０．１％ないし５％、特にエマルジョン全重量の１％ないし５％の割合で含むことを特徴とするエマルジョン。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本発明は、皮膚を美白化するための化粧用活性剤の新規な使用に関する。
【０００２】
市販の色素脱失性化粧品配合物のほとんどは、コウジ酸、アルブチンまたはリン酸アスコルビルマグネシウムに基づいている。
【０００３】
本発明者らは、先行技術の色素脱失活性剤より皮膚によりすぐれた相容性を有する新規の色素脱失活性剤の開発に関心を持った。本発明者らは、プロテインキナーゼＡを不活性化する分子が、酵素リン酸化チロシナーゼの阻害のみに起因するとこれまで考えられていた皮膚の色素脱失を生じさせることを立証した。
【０００４】
したがって、第１の側面によれば、本発明の主題は、皮膚を美白化する（ｌｉｇｈｔｅｎｉｎｇ）ための化粧料的に許容され得る成分を含む組成物におけるプロテインキナーゼＡを不活性化する化合物の使用である。
【０００５】
皮膚の美白化活性とプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）の不活性化との関係は、以下の生化学的機構により説明することができる。
【０００６】
プロテインキナーゼＡの阻害は、チロシナーゼ酵素のリン酸化チロシナーゼへの変換の減少の結果としてチロシナーゼの活性の減少を誘導する。このチロシナーゼの活性化の減少は、メラニン合成の減少をもたらし、皮膚の色素脱失を生じさせる。
【０００７】
「プロテインキナーゼＡを不活性化する化合物」と言う表現は、特に、アデノシン三リン酸および例えばヒストンＨ１のようなリン酸化されうるタンパク質の存在下でプロテインキナーゼＡをインキュベートすることにより１０％以上の阻害率で、特に２５％以上、好ましくは５０％以上の阻害率でそのリン酸化を阻害するいずれの化合物も表す。
【０００８】
特に本発明の主題は、皮膚を美白化するための化粧料的に許容され得る成分を含む組成物における式（Ｉ）：
【化７】
2005521658.tif 000003
【０００９】
（式中、Ｒ1 は、３個から３０個までの炭素原子を含む飽和または不飽和の、直鎖または分枝鎖の脂肪酸の特徴鎖（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ  ｃｈａｉｎ）を表し、Ｒ2 は、アミノ酸の特徴鎖を表し、ｍは１ないし５０である）の化合物もしくはその塩または式（Ｉ）の化合物もしくはその塩の混合物の使用である。
【００１０】
上記定義の式（Ｉ）の化合物は、遊離酸形態または部分的にもしくは全体的に塩にされた形態で存在し得る。式（Ｉ）の化合物が塩にされた形態であるとき、その塩は、特に、ナトリウム、カリウムまたはリチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム、マグネシウムまたはストロンチウム塩のようなアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩または例えば（２−ヒドロキシエチル）−アンモニウム塩のようなアミノアルコールの塩である。それはまた、二価の亜鉛もしくはマンガン塩、または三価の鉄、ランタン、セリウムもしくはアルミニウム塩のような金属塩であり得る。
【００１１】
本明細書での以下の記載において、式（Ｉ）の化合物という表現は、遊離形態または部分的もしくは全体的に塩にされた形態の式（Ｉ）の化合物を意味する。Ｒ1 基およびＲ2 基を定義するために用いられる「特徴鎖」という表現は、考えられている脂肪酸またはアミノ酸の非官能性主鎖を表す。
【００１２】
したがって、一般式Ｒ1 −Ｃ（＝Ｏ）−ＯＨに対応する脂肪酸について、特徴鎖は、Ｒ1 により表される鎖である。
【００１３】
本発明の主題は主に、基Ｒ1 −Ｃ（＝Ｏ）−が７個から２２個までの炭素原子を含む上記定義の式（Ｉ）の化合物の使用である。
【００１４】
Ｒ1 −Ｃ（＝Ｏ）−は特に、オクタノイル、デカノイル、ウンデシレノイル、ドデカノイル、テトラデカノイル、ヘキサデカノイル、オクタデカノイル、エイコサノイル、ドコサノイル、８−オクタデセノイル、エイコセノイル、１３−ドコセノイル、９，１２−オクタデカジエノイルまたは９，１２，１５−オクタデカトリエノイル基を表す。
【００１５】
本発明の主題は特に、フラグメントＲ1 −Ｃ（＝Ｏ）が、オクタノイル、ω−ウンデシレノイル、ドデカノイル、ヘキサデカノイル、８−オクタデセノイル、１３−ドコセノイル、９，１２−オクタデカジエノイルおよび９，１２，１５−オクタデカトリエノイル基から選択される上記定義の式（Ｉ）の化合物の使用である。
【００１６】
一般式（ＩＩＩａ）：
【化８】
2005521658.tif 000004
【００１７】
により表されるアミノ酸についておよび式（ＩＩＩｂ）：
【化９】
2005521658.tif 000005
【００１８】
により表される環状アミノ酸については、特徴鎖は、Ｒ2 により表される鎖であろう。
【００１９】
Ｒ2 は特に、グリシン、アラニン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、バリン、スレオニン、アルギニン、リシン、プロリン、ロイシン、フェニルアラニン、イソロイシン、ヒスチジン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン、グルタミン、システイン、シスチン、メチオニン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリシン、サルコシンおよびオルニチンから選択されるアミノ酸の特徴鎖を表す。
【００２０】
本発明の主題は主に、残基
【化１０】
2005521658.tif 000006
【００２１】
または
【化１１】
2005521658.tif 000007
【００２２】
の少なくとも１つにおいてＲ2 が、フェニルアラニン、チロシン、ヒスチジン、メチオニン、システインまたはトリプトファンの特徴鎖を表す上記定義の式（Ｉ）の化合物の使用である。
【００２３】
本発明の主題は、特に、ｍが１ないし１０の十進数であり、好ましくは５未満である上記定義の式（Ｉ）の化合物の使用である。
【００２４】
本発明の最も具体的な側面によれば、上記定義の式（Ｉ）において、ｍは２以下であり、特に１．４以下である。
【００２５】
本発明のもう１つの最も具体的な側面によれば、上記定義の式（Ｉ）において、ｍは１に等しい。
【００２６】
本発明のもう１つの具体的な変形態様によれば、上記定義の式（Ｉ）の１つの化合物のみが化粧料的に許容され得る成分を含む組成物において用いられる。
【００２７】
本発明のもう１つの具体的な変形態様によれば、上記定義の式（Ｉ）の化合物の混合物、特に、全てが同じフラグメントＲ1 −Ｃ（＝Ｏ）を含む式（Ｉ）の化合物の混合物か、またはｍが１に等しく、すべてが同じフラグメント
【化１２】
2005521658.tif 000008
【００２８】
を含む式（Ｉ）の化合物の混合物かのいずれかが用いられる。
【００２９】
式（Ｉ）の化合物は、一般的に、上記定義の式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）の化合物のＮ−アシル化により得られる。
【００３０】
式（Ｉ）の化合物の混合物であるとき、それは、例えば、いずれかの起源のタンパク質の全体的または部分的加水分解に由来するアミノ酸混合物のＮ−アシル化により得られる。
【００３１】
それらのタンパク質は、例えば、コラーゲン、エラスチン、魚類タンパク質、魚類ゼラチン、ケラチンまたはカゼインのような動物起源のものであり得るし、例えば、大豆、ヒマワリ、燕麦、コムギ、トウモロコシ、オオムギ、馬鈴薯、ルピナス、えんどう豆、スイートアーモンド、キーウィフルーツ、マンゴーまたはリンゴに由来するタンパク質のような穀物、花卉、または果実由来のタンパク質のような植物起源のものであり得る。それらは、コレラエ（単細胞藻類）、紅藻、酵母または絹から得られるタンパク質でもあり得る。
【００３２】
この加水分解は、例えば、酸性またはアルカリ性成分中に置かれたタンパク質を６０ないし１３０℃の温度に加熱することにより行われる。
【００３３】
この加水分解はまた、任意にアルカリ性または酸性後工程加水分解と組み合わせられて、プロテアーゼにより酵素的にも行うことができる。ｍが１より大きいとき、Ｒ2 は、加水分解されたタンパク質および加水分解の程度に応じて、１つの同一の鎖または異なるアミノ酸を特徴付けるいくつかの鎖を表す。
【００３４】
植物起源のいくつかのタンパク質のアミノグラムが以下の表に与えられている。
【表１】
2005521658.tif 000009
【表２】
2005521658.tif 000010
【００３５】
アシル化反応は、当業者に公知である。例えば、番号ＷＯ９８／０９６１１の下で公開されている国際特許出願に記載されている。１種のアミノ酸かアミノ酸混合物かのいずれかに対し行われる。アシル化剤は、一般的に、カルボン酸の対称的無水物または例えば酸塩化物または酸臭化物のような酸ハロゲン化物のような式Ｒ1 Ｃ（＝Ｏ）−ＯＨのカルボン酸の活性化された誘導体からなる。それはまた、ココナッツ油、パームカーネル油、ヤシ油、大豆油、菜種油、トウモロコシ油、牛獣脂、鯨ろう油またはニシン油のような動物または植物起源の天然油または脂肪に由来するカルボン酸の活性化された誘導体の混合物からなり得る。
【００３６】
本発明の主題はまた、化粧料的に許容され得る成分およびプロテインキナーゼＡを不活性化する少なくとも１種の化合物の有効量を含む組成物を皮膚に適用することを特徴とする皮膚を美白化するために皮膚を処理するための非治療的方法でもある。
【００３７】
本発明の主題はまた、薬学的に許容され得る成分およびプロテインキナーゼＡを不活性化する少なくとも１種の化合物の有効量を含むことを特徴とする皮膚を美白化するための治療的皮膚処理を行うための薬学組成物でもある。
【００３８】
上記定義の組成物において、プロテインキナーゼＡを不活性化する化合物は、一般的に、組成物重量の０．０１％ないし１０％、特に組成物重量の０．１％ないし５％、特に組成物重量の１％ないし５％の量で用いられる。
【００３９】
もう１つの具体的な側面によれば、本発明の主題は、プロテインキナーゼＡを不活性化する化合物がアデニレートシクラーゼをも不活性化することを特徴とする上記定義の使用である。
【００４０】
皮膚の美白化活性とアデニレートシクラーゼの不活性化との間の関係は、以下の生化学的機構により説明され得る。
【００４１】
アデニレートシクラーゼの不活性化は、細胞内ＡＴＰのサイクリックＡＭＰへの変換の減少をもたらす。サイクリックＡＭＰのレベルの減少は、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）の阻害をもたらす。プロテインキナーゼＡの阻害は、チロシナーゼのリン酸化チロシナーゼへの変換の減少の結果としてチロシナーゼの活性化の減少を誘導する。このチロシナーゼの活性化の減少は、メラニン合成の減少をもたらし、皮膚の色素脱失を生じさせる。
【００４２】
「アデニレートシクラーゼを不活性化する化合物」という表現は、特に、本発明のコンテキストにおいて、アデノシン三リン酸の存在下でこの酵素をインキュベートすることにより１０％以上、特に２５％以上、好ましくは５０％以上の阻害率で、環状アデノシン一リン酸へのその変換を阻害するいずれの化合物も表す。
【００４３】
組成物中に含まれるアデニレートシクラーゼを不活性化する化合物は、特に、上記定義の式（Ｉ）の化合物またはその塩から選ばれ、特に、Ｒ1 −Ｃ（＝Ｏ）がオクタノイル基およびω−ウンデシレノイル基から選択され、かつ残基
【化１３】
2005521658.tif 000011
【００４４】
または
【化１４】
2005521658.tif 000012
【００４５】
の少なくとも１つにおいてＲ2 がフェニルアラニンの特徴鎖を表す上記定義の式（Ｉ）の化合物から選ばれる。
【００４６】
本発明の主題はまた、組成物が化粧料的に許容され得る成分およびプロテインキナーゼＡおよびアデニレートシクラーゼを不活性化する少なくとも１種の化合物の有効量を含むことを特徴とする上記定義の方法でもあり、また、プロテインキナーゼＡおよびアデニレートシクラーゼを不活性化する少なくとも１種の化合物の有効量を含むことを特徴とする上記定義の薬学組成物は、皮膚に適用される。
【００４７】
もう１つの具体的な側面によれば、本発明の主題は、プロテインキナーゼＡおよびアデニレートシクラーゼを不活性化する化合物がメラノサイト特異的ホルモン（α−ＭＳＨ）レセプターに対して親和性を有する化合物であることを特徴とする上記定義の使用である。
【００４８】
皮膚の美白化活性とα−ＭＳＨレセプターに対する親和性との間の関係は、以下の生化学的機構により説明され得る。
【００４９】
ホルモンα−ＭＳＨとα−ＭＳＨレセプターに対し親和性を有する分子との間の競合は、ホルモンの細胞レセプターに対する結合のレベルの減少をもたらす。この競合の結果は、アデニレートシクラーゼの活性の阻害であり、このことは、細胞内ＡＴＰのサイクリックＡＭＰへの変換の減少をもたらす。サイクリックＡＭＰのレベルの減少は、酵素プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）の阻害をもたらす。プロテインキナーゼＡの阻害は、チロシナーゼのリン酸化チロシナーゼへの変換の減少の結果としてチロシナーゼの活性化の減少を誘導する。このチロシナーゼの活性化の減少は、メラニン合成の減少をもたらし、皮膚の色素脱失を生じさせる。連続的阻害のこの組み合わせが、本発明の化合物のα−ＭＳＨアンタゴニストとしての性質の証拠となる。
【００５０】
「メラノサイト特異的ホルモン（α−ＭＳＨ）レセプターに対して親和性を有する化合物」という表現は、本発明のコンテキストにおいて、１０％以上、特に２５％以上、好ましくは５０％以上の阻害率で、ＭＣ１Ｒレセプターとして知られるα−メラノサイト特異的ホルモン（α−ＭＳＨ）タイプ１レセプターに対する放射性リガンド、例えば、ヌクレオシド二リン酸−α−メラノサイト特異的ホルモン（［ 125Ｉ］ＮＤＰ−α−ＭＳＨ）の特異的結合を置換するいずれの化合物も表す。
【００５１】
組成物中に含まれるメラノサイト特異的ホルモンアンタゴニストは特に、上記定義の式（Ｉ）の化合物またはその塩から選択される。
【００５２】
本発明の主題はまた、組成物が化粧料的に許容され得る成分およびメラノサイト特異的ホルモンアンタゴニストであるプロテインキナーゼＡおよびアデニレートシクラーゼを不活性化する少なくとも１種の化合物の有効量を含むことを特徴とする上記定義の方法でもあり、また、メラノサイト特異的ホルモンアンタゴニストであるプロテインキナーゼＡおよびアデニレートシクラーゼを不活性化する少なくとも１種の化合物の有効量を含むことを特徴とする上記定義の薬学組成物が皮膚に適用される。
【００５３】
以下の例により示されるように、上記定義の化粧的または治療的処理において用いられる化合物は、予想外のことに、先行技術の組成物の美白化活性よりも高い活性により特徴付けられる。したがって、それらは、一般的に、特に色素脱失により、そして特に老齢の皮膚上に現れる着色した斑を除去または減衰させるために、皮膚を美白化するための処理にとって適切である。
【００５４】
前記処理で用いられる組成物は、一般的に、油が植物質または鉱物質であり、または粉末の形態にある油中水（Ｗ／Ｏ）、水中油（Ｏ／Ｗ）または水中油中水（Ｗ／Ｏ／Ｗ）型エマルジョンのような単純または多相エマルジョンの形態の希釈水溶液または水−アルコール系溶液の形態で存在する。それらはまた、ワイプ、ペーパータオルまたは衣類のような布帛または不織材料上にも分散または含浸され得る。
【００５５】
上記処理で用いられる組成物は、化粧品および医薬で用いられる通常の形態で個人に投与される。それらは、特に、局所的、経口的、または非経口的投与である。
【００５６】
一般的に、上記定義のこの特許出願の主題である本発明において用いられる、プロテインキナーゼＡ、おそらくアデニレートシクラーゼおよびおそらくメラノサイト特異的ホルモンアンタゴニストを不活性化する式（Ｉ）の化合物は、油性物質、有機溶媒、増粘剤、ゲル化剤、ソフナー、アンチオキシダント、乳白剤、安定化剤、発泡剤、香料、イオン性または非イオン性乳化剤、フィラー、封鎖剤、キレート剤、保存料、化学的スクリーン剤または鉱物質スクリーン剤、精油、染料、顔料、親水性または親油性活性剤、例えばグリセロールのような保湿剤、保存料、染料、香料、化粧品活性剤、鉱質または有機質の日焼け止め、例えば、酸化鉄、酸化チタン、およびタルクのような鉱物フィラー、例えばナイロンおよび架橋されているか架橋されていないポリ（メチルメタクリレート）のような合成フィラー、シリコーンエラストマー、セリサイトまたは植物エキス、または脂質小胞体または化粧品で通常用いられるいずれか他の成分であるかどうかに拘わらず、化粧品配合物で用いられる多数のタイプのアジュバントまたは活性成分と組み合わせられる。
【００５７】
式（Ｉ）の化合物と組み合わせられ得る油の例として、パラフィン、イソパラフィン、白色鉱油、植物油、動物油、合成油、シリコーンオイルおよびフルオロオイル、特に、
−  スイートアーモンド油、ココナッツ油、ひまし油、ジョジョバ油、オリーブ油、菜種油、グラウンドナッツ油、ヒマワリ油、コムギ胚芽油、トウモロコシ胚芽油、大豆油、綿実油、アルファルファ油、ケシ油、カボチャ油、イブニングプリムローズ油、ミレット油、大麦油、ライ麦油、サフラワー油、キャンドルナッツ油、トケイソウ油、へーゼルナッツ油、ヤシ油、シアバター、アプリコットカーネル油、ビューティーリーフ油、シシンブリウム油、アボカド油、またはカレンデュラ油のような植物起源の油、
−  エトキシル化植物油、
−  スクアレンまたはスクアランのような動物起源の油、
−  液体パラフィン、液体石油ゼリーおよびイソパラフィンのような鉱油、
−  合成油、特に、ブチルミリステート、プロピルミリステート、セチルミリステート、イソプロピルパルミテート、ブチルステアレート、ヘキサデシルステアレート、イソプロピルステアレート、オクチルステアレート、イソセチルステアレート、ドデシルオレエート、ヘキシルラウレート、プロピレングリコールジカプリレートのような脂肪酸エステル、イソプロピルラノレート、イソセチルラノレートのようなラノリン酸から誘導されたエステル、例えばグリセリルトリヘプタノエートのような脂肪酸モノグリセリド、ジグリセリドおよびトリグリセリド、アルキルベンゾエート、ポリ−α−オレフィン、例えばポリイソブテンのようなポリオレフィン、例えばイソヘキサデカンまたはイソドデカンのような合成イソアルカン、ペルフルオロ油、およびシリコーンオイルに言及がなされ得る。シリコーンオイルの中で、特に、ジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、アミンで修飾されたシリコーン、脂肪酸で修飾されたシリコーン、アルコールで修飾されたシリコーン、アルコールと脂肪酸で修飾されたシリコーン、ポリエーテル基で修飾されたシリコーン、修飾されたエポキシシリコーン、フルオロ基で修飾されたシリコーン、環状シリコーン、およびアルキル基で修飾されたシリコーンを挙げることができる。
【００５８】
この活性剤と組み合わせられ得る他の脂肪材料として、脂肪アルコールまたは脂肪酸を挙げることができる。
【００５９】
本発明において用いられる増粘用および／または乳化用ポリマーの中では、例えば、名称、カーボポール（登録商標）、ウルトレッツ（登録商標）１０、パーミュレン（登録商標）ＴＲ１、パーミュレン（登録商標）ＴＲ２、サイマルゲル（登録商標）Ａ、サイマルゲル（登録商標）ＮＳ、サイマルゲル（登録商標）ＥＰＧ、サイマルゲル（登録商標）ＥＧ、ルビゲル（登録商標）ＥＭ、サルケア（登録商標）ＳＣ９１、サルケア（登録商標）ＳＣ９２、サルケア（登録商標）ＳＣ９５、サルケア（登録商標）ＳＣ９６、フロケア（登録商標）ＥＴ１００、ヒスパゲル（登録商標）、セピゲル（登録商標）３０５、セピゲル（登録商標）５０１、セピゲル（登録商標）５０２、フロケア（登録商標）ＥＴ５８およびスタビリーズ（登録商標）０６の下で販売される、アクリル酸またはアクリル酸誘導体のホモポリマーまたはコポリマー、アクリルアミドホモポリマーまたはコポリマー、アクリルアミドから誘導されるホモポリマーまたはコポリマー、アクリルアミドメチルプロパンスルホン酸、ビニルモノマー、または塩化トリメチルアミノエチルアクリル酸塩のホモポリマーまたはコポリマー、例えば、キサンタンガム、カラヤガム、カラギーネートまたはアルギネートのような植物または生合成起源のヒドロコロイド、シリケート、セルロールおよびその誘導体、デンプンおよびその親水性誘導体、ポリウレタンがある。
【００６０】
本発明のコンテキストにおいて用いられ得るワックスの中で、挙げることのできる例には、蜜蝋、カルナウバろう、キャンデリラろう、ウーリキュリーろう、木ろう、コルク繊維ろうまたはサトウキビろう、パラフィンろう、リグナイトろう、微結晶性ワックス、ラノリンろう、オゾケライト、ポリエチレンろう、水素化油、シリコーンオイル、植物ろう、室温で固体である脂肪アルコールおよび脂肪酸、室温で固体であるグリセリドが含まれる。
【００６１】
本発明のコンテキストにおいて用いられ得る乳化剤の中で、挙げることのできる例には、フランス特許出願２６６８０８０、２７３４４９６、２７５６１９５、２７６２３１７、２７８４６８０、２７８４９０４、２７９１５６５、２７９０９７７、２８０７４３５および２８０４４３２において記載されている脂肪酸、エトキシル化脂肪酸、ソルビトールの脂肪酸エステル、エトキシル化脂肪酸エステル、ポリソルベート、ポリグリセロールエステル、エトキシル化脂肪アルコール、シュークロースエステル、アルキルポリグリコシド、硫酸化され、リン酸化された脂肪アルコール、またはアルキルポリグリコシドと脂肪アルコールの混合物が含まれる。
【００６２】
特性を相乗作用的に高めるために式（Ｉ）の化合物と組み合わせられ得る活性成分の例として、美白化または色素脱失活性を有する化合物、例えば、アルブチン、コウジ酸、ヒドロキノン、エラグ酸、ビタミンＣ、リン酸アスコルビルマグネシウム、ポリフェノールエキス、ブドウエキス、パインエキス、ワインエキス、オリーブエキス、ポンドエキス、Ｎ−アシルタンパク質、Ｎ−アシルペプチド、Ｎ−アシルアミノ酸、Ｎ−アシルタンパク質、Ｎ−アシルアミノ酸、Ｎ−アシルペプチドの部分加水分解物、全タンパク質加水分解物、部分タンパク質加水分解物、ポリオール（例えばグリセロール、ブチレングリコールなど）、尿素、ピロリドンカルボン酸またはその酸の誘導体、グリシレチン酸、α−ビサボロール、糖または糖誘導体、多糖またはその誘導体、例えば乳酸のようなヒドロキシ酸、例えばレチノール、ビタミンＥおよびその誘導体のような、ビタミン、ビタミン誘導体、ミネラル、酵素、例えばコエンザイムＱ１０のような補酵素、ホルモンまたは「ホルモン様」物質、例えばラファーマイン（登録商標）のような大豆エキス、例えばテンサイン（登録商標）またはグリアダイン（登録商標）のような小麦エキス、タンニン富化エキス、イソフラボン富化エキス、またはテルペン富化エキスのような植物エキス、淡水藻または海水藻のエキス、エッセンシャルワックス、細菌エキス、ミネラル、脂質一般、セラミドまたはリン脂質のような脂質、例えばカフェインまたはその誘導体のような減量効果を有する活性剤、リパサイド（登録商標）ＰＶＢのような脂ぎった皮膚上で抗微生物活性または浄化作用を有する活性剤、例えばセピトニック（登録商標）Ｍ３またはフィシオジェニル（登録商標）のような精力賦活特性または刺激特性を有する活性剤、例えばセピキャップ（登録商標）ＭＰのようなパンテノールおよびその誘導体、例えばセピリフト（登録商標）ＤＰＨＰ、リパサイド（登録商標）ＰＶＢ、セピビノール（登録商標）またはセピバイタル（登録商標）のような老化防止活性剤、例えばセピコーム（登録商標）Ｓ、セピコーム（登録商標）ＶＧ、およびリパサイド（登録商標）ＤＰＨＰのような保湿活性剤、「抗光老化」老化防止活性剤、真皮−表皮接合の一体性を保護するための活性剤、細胞外マトリックスの成分の合成を増加させるための活性剤を挙げることができる。
【００６３】
本発明による組成物に含まれ得る日焼け止めとして、化粧品指令書７６／７６８／ＥＥＣの改訂された付録ＶＩＩに扱われているもののいずれかを挙げることができる。
【００６４】
本発明の最後の側面によれば、本発明の主題は、式：
【化１５】
2005521658.tif 000013
【００６５】
のＮ−（ω−ウンデシレノイル）フェニルアラニン、その化粧料としての使用、並びに組成物全重量の０．０１％ないし１０％、特に０．１％ないし５％、特に１％ないし５％の該化合物の含有量を有することを特徴とする該化合物を含む薬学組成物およびエマルジョンである。
【００６６】
以下の実験的研究は、発明を限定することなく発明を例示する。
【００６７】
ウンデシレノイルフェニルアラニンの色素脱失活性のインビトロでの評価
この研究の目的は、ＭＣ１Ｒレセプターとして知られるα−メラニン細胞特異的ホルモン（α−ＭＳＨ）タイプ１レセプター上で分子のアンタゴニスト効果を伴う機構によりＮ−ウンデシレノイルフェニルアラニンの色素脱失活性を立証することであった。このタイプの薬理学的レセプターは、メラノサイトにおいて主に見出される。
【００６８】
このレセプターを用いてのメラニン生成の制御は、図１に示される。それは特に、アデニレートシクラーゼ、ｃＡＭＰ、プロテインキナーゼＡおよびチロシナーゼを含む。レセプターＭＣ１Ｒに結合することにより、α−ＭＳＨは、刺激性プロテインＧのαサブユニット（Ｐｒｏｔ  ＧαＳ）を刺激する。このタンパク質は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）に変換する酵素アデニレートシクラーゼを活性化する。ｃＡＭＰは、チロシナーゼをメラニン生成を刺激するリン酸化チロシナーゼに変換するＡプロテインキナーゼを活性化する。
【００６９】
したがって、第１の段階では、研究は、メラノサイト中に見出されるレセプターＭＣ１Ｒに対するＮ−ウンデシレノイルフェニルアラニンの結合能力を評価することであった。
【００７０】
第２の段階では、アデニレートシクラーゼ、プロテインキナーゼＡおよびチロシナーゼの活性に対するＮ−ウンデシレノイルフェニルアラニンの効果を評価した。
【００７１】
第３の段階では、Ｂ１６／Ｆ１系統のメラノサイト培養に対するＮ−ウンデシレノイルフェニルアラニンの色素脱失活性を、細胞内および細胞外メラニン含有量を測定することによりおよびチロシナーゼ活性を測定することによりインビトロで決定した。
【００７２】
第４の段階では、Ｎ−ウンデシレノイルフェニルアラニンの色素脱失活性を、現実の適用条件（配合された生成物の局所的適用）の下で生成物の効力を試験するために、色素沈着し再構成されたヒト表皮（フォトタイプ４）のモデルで評価した。
【００７３】
生成物の効果を、様々の対照色素脱失性生成物ヒドロキノン、コウジ酸およびアルブチンの場合に観察された効果と比較した。
【００７４】
１−ＭＣ１Ｒレセプターについての親和性の研究
Ｎ−ウンデシレノイルフェニルアラニン、コウジ酸およびアルブチンの親和性を比較した。
【００７５】
ＭＣ１Ｒレセプターを、シーグリスト  Ｗ．、エストライヒャー  Ｍ．、ストゥッツ  Ｍ．、ジラール  Ｊ．およびエバーレ  Ａ．Ｅ．；Ｊ．Ｒｅｃｅｐ．Ｒｅｓ．，８，１９８８，３２３−３４３において記載される方法により、Ｂ１６／Ｆ１系統のマウスメラノサイトの細胞膜から単離する。
【００７６】
Ｎ−ウンデシレノイルフェニルアラニン、アルブチンおよびコウジ酸を１０分の１規定の水酸化ナトリウム水溶液中に１０ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈する。これらをそれぞれ別に、０．１ｍｇ／ｍｌと１ｍｇ／ｍｌの濃度で試験する。水酸化ナトリウムは、研究されるパラメーターについて影響を有さない。
【００７７】
ＭＣ１Ｒレセプターは、０．０５ｎＭの濃度で、９０分間２２℃で、これらの生成物の存在下または不在下で、ヨウ素−１２５でラベルされた放射性リガンド、すなわちヌクレオシド二リン酸α−メラノサイト特異的ホルモン［ 125Ｉ］ＮＤＰ−α−ＭＳＨとともにインキュベートする。
【００７８】
対照の培養は、生成物の不在下で、放射性リガンドの存在下でインキュベートする。それぞれの試験は、３重測定で実施する。
【００７９】
９０分間のインキュベーションの後、細胞膜を素早くろ過し、フィルターを冷却されたバッファーで数回洗浄する。ＭＣ１Ｒレセプターに結合した放射性リガンドの量をシンチレーションカウンター（トップカウント、パッカード）を用いて測定する。
【００８０】
下記の表に示された結果は、生成物のそれぞれについて実施した３回の試験の平均である。それらは、対照群に対する特異的結合のパーセンテージとして、およびこの結合の阻害のパーセンテージとして表現されている。
【表３】
2005521658.tif 000014
【００８１】
結果は、試験濃度において、対照の色素脱失性化合物であるアルブチンもコウジ酸もリガンド［ 125Ｉ］ＮＤＰ−α−ＭＳＨの特異的結合を置換せず、対照的に、Ｎ−ウンデシレノイルフェニルアラニンは、ＭＣ１Ｒレセプターに対する［ 125Ｉ］ＮＤＰ−α−ＭＳＨの結合の、それぞれ、４２％および９６％を置換することを立証している。
【００８２】
２−アデニレートシクラーゼ活性化の研究
ＡＴＰのｃＡＭＰへの変換に対するＮ−ウンデシレノイルフェニルアラニン、コウジ酸およびアルブチンの影響を、ラジオイムノアッセイにより比較した。
【００８３】
ＡＴＰをｃＡＭＰに変換するアデニレートシクラーゼは、サラモン  Ｙ．、ロンドス  Ｃ．およびロドベル  Ｍ．；Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５８，１９７４，５４１〜５４８において記載される方法によりラット脳から抽出し、次いで、１０μＭのフォルスコリンにより活性化させる。
【００８４】
Ｎ−ウンデシレノイルフェニルアラニン、アルブチン、およびコウジ酸を１０分の１規定の水酸化ナトリウム水溶液中に１０ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈する。これらをそれぞれ、１ｍｇ／ｍｌの濃度で別々に試験する。水酸化ナトリウムは、研究されるパラメーターに影響を有さない。
【００８５】
活性化された酵素を、これらの生成物の存在下または不在下で、０．５ｍＭのＡＴＰの存在下で３０℃で３０分間インキュベートする。
【００８６】
対照の培養を、生成物の不在下で、ＡＴＰの存在下で、インキュベートする。それぞれの試験を３重測定で実施する。
【００８７】
３０分間のインキュベーション後、生成するｃＡＭＰの量は、市販のキットを用いて行うラジオイムノアッセイにより評価する。放射能は、シンチレーションカウンター（トップカウント、パッカード）により測定し、小さな放射能のカウントは、アデニレートシクラーゼの小さな活性化を反映する。
【００８８】
下記の表に示される結果は、生成物のそれぞれについて実施した３回の試験の平均である。それらは、対照群に対する酵素活性のパーセンテージとして、および阻害のパーセンテージとして表現されている。
【表４】
2005521658.tif 000015
【００８９】
結果は、１ｍｇ／ｍｌでは、アルブチンはこの酵素に対して効果を有さないけれども、コウジ酸は穏やかな効果を誘発し、Ｎ−ウンデシレノイルフェニルアラニンは完全な不活性化を誘発することを立証している。
【００９０】
３−プロテインキナーゼＡ活性の研究
プロテインキナーゼＡ（ＰＫ  Ａ）によるチロシナーゼのリン酸化に対するＮ−ウンデシレノイルフェニルアラニン、コウジ酸、およびアルブチンの影響を比較した。
【００９１】
プロテインキナーゼＡは、チジワ  Ｔ．、ミシマ  Ａ．、ハギワラ  Ｍ．、サノ  Ｍ．、ハヤシ  Ｋ．、イノウエ  Ｔ．、ナイトウ  Ｋ．、シオカ  Ｔ．、ヒダカ  Ｈ．；Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，２６５，１９９０，５２６７〜５２７２において記載される方法によりウシの脳から抽出する。次いで、それは３μＭのｃＡＭＰにより活性化させる。
【００９２】
Ｎ−ウンデシレノイルフェニルアラニン、アルブチンおよびコウジ酸は、１０分の１規定の水酸化ナトリウム水溶液中に１０ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈する。これらをそれぞれ、１ｍｇ／ｍｌの濃度で別々に試験する。水酸化ナトリウムは、研究されるパラメーターに対して影響を有さない。
【００９３】
活性化された酵素を、これらの生成物の存在下か不在下で、33Ｐ−ラベルされた放射性ＡＴＰ（［γ−33Ｐ］ＡＴＰ）および２００μｇ／ｍｌのヒストンＨ1 の存在下で３０℃で２０分間インキュベートする。
【００９４】
対照の培養は、生成物の不在下で、放射性ＡＴＰおよびヒストンＨ1 の存在下でインキュベートする。それぞれの試験は、３重測定で実施する。
【００９５】
２０分間のインキュベーションの後、33Ｐ−ラベルされたリン酸化ヒストンＨ1 の量は、シンチレーションカウンター（トップカウント、パッカード）を用いて測定し、小さな放射線のカウントは、プロテインキナーゼＡの小さな活性化を反映する。
【００９６】
下記の表に示される結果は、生成物のそれぞれについて実施した３回の試験の平均である。それらは、対照群に対する酵素活性のパーセンテージとして、および阻害のパーセンテージとして表現されている。
【表５】
2005521658.tif 000016
【００９７】
結果は、１ｍｇ／ｍｌでは、Ｎ−ウンデシレノイルフェニルアラニンは、コウジ酸またはアルブチンと対照的にプロテインキナーゼＡ活性を完全に阻害することを立証している。
【００９８】
４−リン酸化チロシナーゼ活性の研究
リン酸化チロシナーゼの活性に対するＮ−ウンデシレノイルフェニルアラニン、ヒドロキノン、コウジ酸およびアルブチンの影響を、Ｌ−ドーパおよび分光分析（４９０ｎｍで）により定量されうる着色生成物であるドーパキノンへのＬ−チロシンの変換を測定することにより比較した。
【００９９】
用いたチロシナーゼは、真菌から抽出された市販の生成物である。
【０１００】
Ｎ−ウンデシレノイルフェニルアラニン、ヒドロキノン、アルブチンおよびコウジ酸を、１０分の１規定の水酸化ナトリウム水溶液中に１０ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈する。これらをそれぞれ、０．１ｍｇ／ｍｌおよび１ｍｇ／ｍｌの濃度で別々に試験する。水酸化ナトリウムは、研究されるパラメーターに対して影響を有さない。
【０１０１】
６６．６６ＩＵ／ｍｌのチロシナーゼを、これらの生成物の存在化または不在下で、０．２ｍＭのチロシンの存在下で３７℃で１０分間インキュベートする。
【０１０２】
対照の培養を、生成物の不在下で、チロシナーゼとＬ−チロシンの存在下でインキュベートする。それぞれの試験を３重測定で実施する。
【０１０３】
１０分間のインキュベーションの後、生成するドーパキノンヒストンの量を、４９０ｎｍで分光光度計を用いて測定する。
【０１０４】
下記の表において示された結果は、生成物のそれぞれについて実施した３回の試験の平均である。
【０１０５】
それらは、チロシナーゼ活性のＩＵ／ｌとして、および対照に対する酵素活性の阻害のパーセンテージとして表現されている。
【表６】
2005521658.tif 000017
【０１０６】
結果は、０．１ｍｇ／ｍｌおよび１ｍｇ／ｍｌの濃度で、全ての試験生成物がチロシナーゼの活性を有意に阻害することを立証している。しかしながら、ウンデシレノイルフェニルアラニンの阻害活性は、他の試験生成物の阻害活性より大きい。
【０１０７】
５−Ｂ１６／Ｆ１メラノサイト培養中の色素脱失活性の研究
Ｂ１６／Ｆ１メラノサイト培養中の細胞内メラニンおよび細胞外メラニンの生成に対するおよびリン酸化チロシナーゼの活性に対するＮ−ウンデシレノイルフェニルアラニン、ヒドロキノン、コウジ酸およびアルブチンの影響を比較した。
【０１０８】
Ｂ１６／Ｆ１系統のマウスメラノサイトを、１５００細胞／ウエルの密度で９６−ウエル培養プレート内に接種する。５％ＣＯ2 を含む有湿度雰囲気の下で３７℃で培養培地（ＭＣＭ培地）中で細胞を培養する。細胞を６０％の集密度で、すなわち、接種の４日後に用いる。
【０１０９】
ＭＣＭ培地は以下の組成を有する：Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（５０ＩＵ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）およびウシ胎児血清（１０％ｖ／ｖ）を補足された４．５ｇ／ｌのグルコースを含むＤＭＥＭ培地（ダルベッコの修正されたイーグル培地）。
【０１１０】
Ｎ−ウンデシレノイルフェニルアラニンを、１０分の１規定の水酸化ナトリウム水溶液中に４ｍｇ／ｍｌに希釈する。これを、ＭＣＭ培地中で４０μｇ／ｍｌで試験する。水酸化ナトリウムは、分析されるパラメーターに対して影響を有さない。
【０１１１】
ヒドロキノンは、ＭＣＭ培地中５μｇ／ｍｌで試験する。その毒性のために、４０μｇ／ｍｌでは試験しない。
【０１１２】
アルブチンおよびコウジ酸は、ＭＣＭ培地中４０μｇ／ｍｌで試験する。
【０１１３】
メラニン細胞培養を、試験生成物の存在下でまたは対照生成物の存在下で５％ＣＯ2 を含む有湿度雰囲気の下で３７℃で７２時間インキュベートする。
【０１１４】
対照培養を、ＭＣＭ培地中で生成物の不在下でインキュベートする。これらの対照培養を、それぞれの培養プレート上で調製する。
【０１１５】
それぞれの試験を６回実施する。
【０１１６】
５．１−細胞外メラニン含有量の測定
７２時間のインキュベーションの後、細胞のインキュベーション培地（ｎ＝６）を取り出し、効果の評価の時間まで−８０℃で貯蔵する。細胞外メラニンを４５０ｎｍで分光分析により定量する。メラニン検量線範囲を並行して準備する。
【０１１７】
結果を、μｇ／ｍｌの細胞外メラニンとしておよび対照群に対する阻害のパーセンテージとして表現する。
【表７】
2005521658.tif 000018
【０１１８】
５．２−細胞内メラニン含有量の測定
７２時間のインキュベーションの後、細胞のカーペット（ｎ＝３）の一部をリン酸バッファー生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ＝７．４）ですすぐ。リン酸バッファー生理食塩水の組成は、以下のとおりである：ＮａＣｌ：８ｇ／ｌ、Ｎａ2 ＨＰＯ4 ：１．１５ｇ／ｌ、ＫＨ2 ＰＯ4 ：０．２ｇ／ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／ｌ、ＣａＣｌ2 ：０．１ｇ／ｌ、ＭｇＣｌ2 ：０．１ｇ／ｌ。細胞内メラニンは、１０分の１規定の水酸化ナトリウムの存在下で室温で３０分間攪拌しながらのインキュベーションにより可溶化させる。
【０１１９】
細胞内メラニンを、４５０ｎｍで分光分析により定量する。メラニン検量線範囲を並行して準備する。
【０１２０】
結果をμｇ／ｍｌの細胞内メラニンとして、および対照群に対する阻害のパーセンテージとして表現する。
【表８】
2005521658.tif 000019
【０１２１】
５．３−リン酸化チロシナーゼ活性の測定
７２時間のインキュベーション後、細胞のカーペット（ｎ＝３）の第２の部分をＰＢＳですすぐ。細胞を、室温で３０分間０．１％（ｗ／ｖ）の濃度のトリトン（登録商標）Ｘ１００により溶解させる。内因性チロシナーゼの活性を０．１％（ｗ／ｖ）のＬ−ドーパを加えることにより評価し、続いて、空気と光の欠如の下で３７℃で３時間インキュベーションする。チロシナーゼとＬ−ドーパとの間の反応により生成するドーパキノンを４５０ｎｍで分光分析により測定する。精製したチロシナーゼの検量線範囲を並行して準備する。
【０１２２】
結果をＩＵ／ｍｌのチロシナーゼ活性としておよび対照群に対する阻害のパーセンテージとして表現する。
【表９】
2005521658.tif 000020
【０１２３】
５．４−細胞内タンパク質含有量の測定
このアッセイは、試験生成物の細胞毒性を評価することを可能とする。それは、前述の段落で記載されたように調製された細胞溶解物中で実施する。
【０１２４】
そのタンパク質アッセイは、ブラッドフォード  Ｍ．；Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７２，１９７６，２４８〜２５４により記載されたクーマシーブルー法により実施する。測定は、６４０ｎｍで分光分析により実施する。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）検量線範囲を並行して準備する。
【０１２５】
結果をｍｇ／ｍｌのタンパク質としておよび対照群に対する阻害のパーセンテージとして表現する。
【表１０】
2005521658.tif 000021
【０１２６】
５．５−結果の分析
７２時間のインキュベーションの後、５μｇ／ｍｌで試験されたヒドロキノンは、細胞外メラニン含有量を８５％まで、細胞内メラニン含有量を１００％まで、およびチロシナーゼ活性を６９％までそれぞれ阻害する。しかしながら、ヒドロキノンの色素脱失効果は部分的にはその細胞毒性効果に由来する。というのは、全タンパク質量の３８％減少が観察されるからである。
【０１２７】
４０μｇ／ｍｌで試験されるアルブチンは、４７％まで細胞外メラニン含有量を、１９％まで細胞内メラニン含有量を、および２３％までチロシナーゼ活性をそれぞれ阻害する。この濃度では、アルブチンは、全タンパク質含有量に対して影響を有さない。
【０１２８】
４０μｇ／ｍｌで試験されたコウジ酸は、７０％まで細胞外メラニン含有量を、１７％まで細胞内メラニン含有量を、および３１％までチロシナーゼ活性を、それぞれ阻害する。この濃度では、コウジ酸は、全タンパク質含有量に対して有意な影響を有さない。
【０１２９】
４０μｇ／ｍｌで試験したＮ−ウンデシレノイルフェニルアラニンは、７２％まで細胞外メラニン含有量を、６６％まで細胞内メラニン含有量を、および６７％までチロシナーゼ活性を、それぞれ阻害する。この濃度ではＮ−ウンデシレノイルフェニルアラニンは、１７％まで全タンパク質含有量を減少させる。
【０１３０】
このようにＮ−ウンデシレノイルフェニルアラニンは、細胞内メラニン含有量および細胞外メラニン含有量とチロシナーゼ活性の同時の減少により立証される色素脱失活性を有する。ヒドロキノンの色素脱失活性と違って、その色素脱失活性は、細胞毒性効果に結びついていない。それは、アルブチンおよびコウジ酸より高い色素脱失活性を有する。
【０１３１】
６−再構成ヒト表皮における色素脱失活性の研究
Ｂ１６／Ｆ１メラノサイト培養における細胞内メラニンおよび細胞外メラニンの生成に対する、および表皮の染色に対するＮ−ウンデシレノイルフェニルアラニン、ヒドロキノン、コウジ酸およびアルブチンの影響を比較した。
【０１３２】
０．６３ｃｍ2 のスキンエシックにより供給された色素沈着ヒト表皮（フォトタイプＩＶ）を、正常ヒトケラチノサイト（前腕の皮膚、３歳児のドナー、第２継代）のおよび正常ヒトメラノサイト（前腕の皮膚、フォトタイプＩＶの４歳児のドナー、第３継代）の共培養から再構成する。ケラチノサイト／メラノサイト比は、１０：１である。共培養を不活性ポリカーボネートフィルター上に接種する。それらは、５μｇ／ｍｌのインスリン、１．５ｍＭのカルシウムおよび成長因子を補足されたＭＣＤＢ１５３培地からなるスキンエシックにより供給された培地中で１０日間培養する。
【０１３３】
それらの試験については、生成物は、水相、１０重量％の脂肪相（ラノール（登録商標）１６８８）、２重量％の乳化剤（サイマルゲル（登録商標）ＥＧ）、０．５重量％の保存剤（０．３％のセピサイド（登録商標）ＨＢ＋０．２％のセピサイド（登録商標）ＣＩ）を含むエマルジョンからなる化粧品配合物に含めた後試験する。活性成分を含めた後、配合物はpＨ＝５．５に調節する。
【０１３４】
Ｎ−ウンデシレノイルフェニルアラニン、アルブチンおよびコウジ酸を、単位体積当り１重量％または３重量％の比率（ｗ／ｖ）で上昇温度（７５℃）でその中に含める。
【０１３５】
その毒性のために、ヒドロキノンは、単位体積（ｗ／ｖ）当り０．１重量％の濃度でその中に含める。
【０１３６】
表皮は、上記１ｍｌの培地を含む６−ウエルプレート中で培養する。それらは、５％ＣＯ2 を含む有湿度雰囲気の下で３７℃でインキュベートする。
【０１３７】
さまざまの活性成分を含む配合物が、無菌の細菌学的接種装置を用いて２μｌ／表皮の割合で表皮の表面に適用する。適用は、連続４日間毎日実施する。再構成表皮のインキュベーション培地は連続４日間毎日更新する。
【０１３８】
対照の表皮は、活性成分のない配合物により処理する。それぞれの試験は、２重測定で実施する。
【０１３９】
６．１−表皮色素沈着の彩度測定
最終の局所適用の３日後、表皮の色は、以下のパラメーターＬ* 、ａ* およびｂ* を測定することによりクロマメーター（ミノルタ）を用いて評価する。
【０１４０】
Ｌ* は明度指数である。色素脱失性生成物は、このパラメーターを増加させるものである。
【０１４１】
ａ* は青から緑までの色彩スペクトルを表す。色素脱失性生成物はこのパラメーターを減少させるものである。
【０１４２】
ｂ* は赤から黄色までの色彩スペクトルを表す。色素脱失性生成物はこのパラメーターを減少させるものである。
【０１４３】
結果は、それぞれのパラメーターの任意単位（ＡＵ）として、および対照群のパーセンテージとして表現されている。
【表１１】
2005521658.tif 000022
【０１４４】
６．２−細胞内メラニン含有量の測定
最終の局所適用および彩度測定の３日後、細胞内メラニンを、オゼキ  Ｈ．、イトウ  Ｓ．、ワカマツ  Ｋ．、ヒロベ  Ｔ．；Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１０５，１９９５，３６１〜３６６に記載されているようにソルエン（登録商標）３５０（２００μｌ／表皮）において１００℃で４５分間のインキュベーションにより表皮から抽出する。試料は、１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。
【０１４５】
抽出された細胞内メラニンは、５００ｎｍで分光分析により測定する。メラニン検量線範囲を並行して準備する。
【０１４６】
結果は、細胞内メラニンのｍｇ／ｍｌとして、および対照群に対する阻害のパーセンテージとして表現されている。
【表１２】
2005521658.tif 000023
【０１４７】
６．３−結果の分析
エマルジョン中０．１％（ｗ／ｖ）の濃度での局所適用で試験したヒドロキノンは、彩度測定パラメーターＬ* 、ａ* およびｂ* 、並びに再構成ヒト表皮のメラニン含有量のいずれに対しても有意な効果を有さない。ヒドロキノンの色素脱失効果の欠如は、細胞毒性がないものとして故意に選択された低い試験濃度のためかまたは短い処理時間のためかのいずれかのためである。
【０１４８】
エマルジョン中１％および３％（ｗ／ｖ）での局所適用で試験したアルブチンは、彩度測定パラメーターＬ* 、ａ* およびｂ* に対して有意な影響を有する。しかしながら、それは、それぞれ、２８％および２４％だけ再構成ヒト表皮のメラニン含有量を阻害する。
【０１４９】
エマルジョン中１％（ｗ／ｖ）および３％（ｗ／ｖ）での局所適用で試験したコウジ酸は、彩度測定パラメーターＬ* 、ａ* およびｂ* に対して有意な影響を有さない。しかしながら、それは、それぞれ、２１％および３３％だけ再構成ヒト表皮のメラニン含有量を阻害する。
【０１５０】
エマルジョン中１％（ｗ／ｖ）での局所適用で試験したＮ−ウンデシレノイルフェニルアラニンは、１５％だけｂ* 色彩パラメーターを阻害し、２４％だけ再構成ヒト表皮のメラニン含有量を阻害する。
【０１５１】
３％（ｗ／ｖ）の濃度で、Ｎ−ウンデシレノイルフェニルアラニンは、９％だけＬ* パラメーターを増加させ、同時に１４％だけａ* 色彩パラメーターを、２９％だけｂ* 色彩パラメーターをおよび２４％だけ再構成表皮のメラニン含有量を減少させる。
【０１５２】
再構成表皮に対するこれらの試験は、Ｎ−ウンデシレノイルフェニルアラニンが彩度測定パラメーターに対しておよび細胞内メラニン含有量に対して両方に影響を有する限り対照生成物の色素脱失活性と比較して向上した色素脱失活性を有することを示している。
【０１５３】
７−結論
この研究で得られた結果は、合せて、Ｎ−ウンデシレノイルフェニルアラニンの強力な色素脱失活性を立証している。この活性は、メラノサイト培養および再構成ヒト表皮で構成された３Ｄモデルの両方において定量される。対照生成物とは対照的に、Ｎ−ウンデシレノイルフェニルアラニンの色素脱失活性は、ＭＣ１Ｒレセプターを伴う。Ｎ−ウンデシレノイルフェニルアラニンは、ＭＣ１Ｒレセプターアンタゴニストであり、メラニン生成に関与するα−ＭＳＨサイクルのすべての段階を阻害する。
【０１５４】
化粧品配合物の例
例２：成人の皮膚のための美白ケアエマルジョン
モンタノフ（登録商標）２０２                  ０２．００％
モンタノフ（登録商標）６８                    ０２．００％
カプリル酸・カプリン酸トリグリセリド          １０．００％
スクアラン                                    １０．００％
水                                            １００％とする量
Ｎ−ウンデシレノイルフェニルアラニン          ０１．００％
セピゲル（登録商標）３０５                    ００．７０％
リン酸アスコルビルマグネシウム                ０２．００％
セピサイド（登録商標）ＨＢ                    ００．３０％
セピサイド（登録商標）ＣＩ                    ００．２０％
香料                                          ００．５０％
例３：美白・引き締めケアエマルジョン
モンタノフ（登録商標）２０２                  ０３．００％
２４％水酸化ナトリウム                        ００．０６％
エチルヘキシルメトキシシンナメート            ０６．００％
ラノール（登録商標）１６８８                  ０８．００％
ベンゾフェノン−３                            ０４．００％
水                                            １００％とする量
Ｎ−ウンデシレノイルフェニルアラニン          ０２．００％
サイマルゲル（登録商標）ＮＳ                  ００．５０％
セピリフト（登録商標）ＤＰＨＰ                ００．５０％
ジメチコーン                                  ０２．００％
シクロメチコーン                              ０２．００％
アルブチン                                    ０．３％
セピサイド（登録商標）ＨＢ                    ００．３０％
セピサイド（登録商標）ＣＩ                    ００．２０％
香料                                          ００．１０％
例４：α−ヒドロキシ酸を含む美白クリームゲル
ヒドロキシエチルセルロース                    ００．８０％
エチルヘキシルオクタノエート                  ０５．００％
６０％乳酸ナトリウム                          １４．００％
水                                            １００％とする量
Ｎ−ウンデシレノイルフェニルアラニン          ０３．００％
セピゲル（登録商標）３０５                    ０４．２０％
セピサイド（登録商標）ＨＢ                    ０２．００％
セピサイド（登録商標）ＣＩ                    ０３．００％
香料                                          ００．１０％
例５：美白ケアエマルジョン
モンタノフ（登録商標）Ｌ                      ０１．００％
セチルアルコール                              ０２．００％
イソデシルネオペンタノエート                  １２．００％
セテアリールオクタノエート                    １０．００％
グリセロール                                  ０３．００％
水                                            １００％とする量
Ｎ−ウンデシレノイルフェニルアラニン          ０１．００％
サイマルゲル（登録商標）ＥＧ                  ０２．００％
コウジ酸                                      ０１．００％
セピサイド（登録商標）ＨＢ                    ００．３０％
セピサイド（登録商標）ＣＩ                    ００．２０％
香料                                          ００．１０％
例６：美白ローション
オラミックス（登録商標）ＣＧ１１０            ０５．００％
カトン（登録商標）ＣＧ                        ００．０８％
水                                            １００％とする量
Ｎ−ウンデシレノイルフェニルアラニン          ０１．００％
香料                                          ００．１０％
このローションは、ボトルで販売するかまたはワイプに含浸させることができる。
【０１５５】
例において用いられる市販の製品の定義は、以下の通りである。
【０１５６】
セピリフト（登録商標）ＤＨＰ（ＩＮＣＩ名：ジパルミトイルヒドロキシプロリン）、ＳＥＰＰＩＣ社により販売されている。
【０１５７】
セピサイド（登録商標）ＨＢは、フェノキシエタノール、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベンおよびブチルパラベンを含む保存混合物であり、ＳＥＰＰＩＣ社により販売されている。
【０１５８】
セピサイド（登録商標）ＣＩは、イミダゾリジニル尿素であり、ＳＥＰＰＩＣ社により販売されている。
【０１５９】
セピコーム（登録商標）ＶＧ（ＩＮＣＩ名：パルミトイルプロリンナトリウムおよびスイレンの花のエキス）、ＳＥＰＰＩＣ社により販売されている。
【０１６０】
カトン（登録商標）ＣＧ（ＩＮＣＩ名：メチルイソチアゾリノン／メチルクロロイソチアゾリノン）。
【０１６１】
サイマルゲル（登録商標）ＥＧは、コポリマー逆相ラテックス（ＩＮＣＩ名：ナトリウムアクリレート／ナトリウムアクリロイルジメチルタウレートコポリマーおよびイソヘキサデカンおよびポリソルベート８０）であり、ＳＥＰＰＩＣ社により販売されている。
【０１６２】
サイマルゲル（登録商標）ＮＳは、コポリマー逆相ラテックス（ＩＮＣＩ名：ヒドロキシエチルアクリレート／ナトリウムアクリロイルジメチルタウレートコポリマーおよびスクアランおよびポリソルベート６０）であり、ＳＥＰＰＩＣ社により販売されている。
【０１６３】
ラノール（登録商標）１６８８はセテアリールエチルヘキサノエートであり、ＳＥＰＰＩＣ社により販売されている。
【０１６４】
セピゲル（登録商標）３０５は、ポリマー逆相ラテックスである（ＩＮＣＩ名：ポリアクリルアミドおよびＣ13〜Ｃ14イソパラフィンおよびラウレス７）。
【０１６５】
モンタノフ（登録商標）Ｌは、Ｃ14〜Ｃ22アルコールおよびＣ12〜Ｃ20アルキルポリグルコシドに基づく乳化剤である。
【０１６６】
モンタノフ（登録商標）６８は、セテアリールアルコールおよびセテアリールポリグリコシドに基づく乳化剤である。
【０１６７】
モンタノフ（登録商標）２０２は、アラキジルアルコール、ベヘニルアルコールおよびアラキジルポリグルコシドに基づく乳化剤である。
【国際調査報告】
2005521658.tif 000032
2005521658.tif 000033
2005521658.tif 000034
2005521658.tif 000035
2005521658.tif 000036
2005521658.tif 000037
2005521658.tif 000038
2005521658.tif 000039