(57)【要約】本発明は、メタニューモウイルス属、又は、ＲＳＶ属、又は、メタニューモウイルス属の種と有意な遺伝的ホモロジーをＦタンパク質中に含むウイルスの種に対するワクチンであって、上記ワクチンは弱毒化生ワクチンであるワクチンに関する。特に、上記ワクチンは、鳥類又はヒト由来のメタニューモウイルスに対するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
メタニューモウイルス属、又は、ＲＳＶ属、又は、メタニューモウイルス属の種と有意な遺伝的ホモロジーをＦタンパク質領域中に有するウイルスの種に対するワクチンであって、
ウイルス又はウイルスの一部分を含み、
前記ウイルスは、野生型ウイルスと比較して、Ｆタンパク質（融合タンパク質）のアミノ酸配列のａａ２９３〜２９６の領域、又は、これと同一の機能を有する、例えばＲＳＶのａａ３２３〜３２８等の領域が改変されている
ことを特徴とするワクチン。
【請求項２】
前記ウイルスは生きたウイルスである
ことを特徴とする請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
前記ウイルスは生きた弱毒化ウイルスである
ことを特徴とする請求項１に記載のワクチン。
【請求項４】
改変は、ａａ２９３〜２９６の領域、又は、これと同一の機能を有する、ＲＳＶのａａ３２３〜３２８等の領域の安定化を含む
ことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項５】
安定化は、前記領域のアミノ酸をコードするコドンを、野生型ウイルスに戻るために更に変異を要するコドンで置換することにより達成される
ことを特徴とする請求項４に記載のワクチン。
【請求項６】
安定化は、前記領域のアミノ酸をコードするコドンを、グルタミン酸をコードするコドンに戻りにくいように変異しているコドンで置換することにより達成される
ことを特徴とする請求項４又は５に記載のワクチン。
【請求項７】
ａａ２９３〜２９６の領域、又は、これと同一の機能を有する、ＲＳＶのａａ３２３〜３２８等の領域における改変は、少なくとも１つの非塩基性アミノ酸の、少なくとも１つの塩基性アミノ酸による置換を含む
ことを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項８】
改変は、少なくとも１つのアミノ酸の付加を含む
ことを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項９】
改変は、少なくとも１つの酸性アミノ酸の削除を含む
ことを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項１０】
改変は、少なくとも１つのグルタミン酸残基の、少なくとも１つの塩基性アミノ酸による置換を含む
ことを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項１１】
少なくとも１つの塩基性アミノ酸は、アルギニン、リシン及び／又はヒスチジンからなる群より選択される
ことを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項１２】
少なくとも１つの塩基性アミノ酸は、アルギニン及び／又はリシンである
ことを特徴とする請求項１１に記載のワクチン。
【請求項１３】
野生型ウイルスのａａ２９３〜２９６の領域は、配列番号２４〜２７のうち１つの中に示す配列を有する
ことを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項１４】
弱毒化ウイルスのａａ２９３〜２９６の領域は、配列番号１〜２３のうち１つの中に示す配列を有する
ことを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項１５】
野生型ウイルスのａａ２９３〜２９６の領域は配列番号２４中に示す配列を有し、
弱毒化ウイルスの前記領域は配列番号１中に示す配列を有する
ことを特徴とする請求項１３又は１４に記載のワクチン。
【請求項１６】
野生型ウイルスのａａ２９３〜２９６の領域は配列番号２７中に示す配列を有し、
弱毒化ウイルスの前記領域は配列番号１、２、１０又は２１の中に示す配列を有する
ことを特徴とする請求項１３又は１４に記載のワクチン。
【請求項１７】
ａａ２９３〜２９６の領域における改変は、ＡＰＶ又はｈＭＰＶに対するワクチンが得られるように選択され、
ａａ３２３〜３２８の領域における改変は、ＲＳＶに対するワクチンが得られるように選択される
ことを特徴とする請求項１〜１６のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項１８】
メタニューモウイルスはヒトメタニューモウイルスである
ことを特徴とする請求項１〜１７のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項１９】
メタニューモウイルスは鳥類のメタニューモウイルス、特にＡＰＶである
ことを特徴とする請求項１〜１７のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項２０】
生きた弱毒化ウイルスを、適切な補助剤及び／又は担体及び／又はアジュバントと共に調剤する
ことを特徴とする請求項１〜１９のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項２１】
ウイルスは、適切な量のインターロイキン６（ＩＬ−６）と共に調剤される弱毒化ウイルスである
ことを特徴とする請求項２０に記載のワクチン。
【請求項２２】
ウイルスは、適切な量のインターロイキン１２（ＩＬ−１２）又はインターロイキン１８（ＩＬ−１８）と共に調剤される弱毒化ウイルスである
ことを特徴とする請求項２０に記載のワクチン。
【請求項２３】
メタニューモウイルス属、又は、ＲＳＶ属、又は、メタニューモウイルス属の種との間に有意な遺伝的ホモロジーをＦタンパク質領域中に有するウイルスの種に対するワクチンの製造方法であって、
以下の段階：
ａ）ワクチンの開発対象である毒性のあるウイルスを得る段階、
ｂ）ウイルスのＦタンパク質のａａ２９３〜２９６の領域、又は、これと同一の機能を有する、ＲＳＶのａａ３２３〜３２８等の領域をコードする核酸配列を改変する段階、及び、
ｃ）前記の改変を含む、生きた弱毒化ウイルスを得る段階：
を含む
ことを特徴とする方法。
【請求項２４】
改変は、請求項２〜１６のいずれか１項に記載の改変に関与している
ことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ウイルスは、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の群より選択されるウイルスである
ことを特徴とする請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項２６】
改変が以下：
ｉ）ワクチンの開発対象であるウイルスのウイルスゲノムの全長ＤＮＡコピーの作成、
ｉｉ）ＰＣＲ産物の全長の一部をライゲーションさせ、ａａ２９３〜２９６の領域、又は、これと同一の機能を有する、ＲＳＶのａａ３２３〜３２８等の領域に変化を導入することによる、全長ＤＮＡコピーの獲得、
ｉｉｉ）例えば水痘Ｔ７ポリメラーゼ組み換え体、又は、細胞のリボソームｐｏｌ１ＲＮＡポリメラーゼを使用することによる、全長ＤＮＡコピーからのウイルスの再生：
のように達成される
ことを特徴とする請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
メタニューモウイルス属又はニューモウイルス属に属する生きた弱毒化ウイルスであって、
Ｆタンパク質のａａ２９３〜２９６の領域、又は、これと同一の機能を有する、ＲＳＶのａａ３２３〜３２８等の領域に改変を含む
ことを特徴とする生きた弱毒化ウイルス。
【請求項２８】
改変は、請求項２〜１６のいずれか１項に記載の改変に関与している
ことを特徴とする請求項２７に記載の生きた弱毒化ウイルス。
【請求項２９】
ウイルスは、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載のウイルスである
ことを特徴とする請求項２７又は２８に記載の生きた弱毒化ウイルス。
【請求項３０】
請求項２７〜２９のいずれか１項に記載のウイルスを含む宿主細胞。
【請求項３１】
配列番号２８〜３４のうち１つの中に定義されるＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列。
【請求項３２】
請求項３１に記載のＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列に対応するＲＮＡ配列。
【請求項３３】
メタニューモウイルス属、又は、ＲＳＶ属、又は、メタニューモウイルス属の種との間に有意な遺伝的ホモロジーをＦタンパク質中に有するウイルスの種のＦタンパク質であって、
請求項１〜１６のいずれか１項に記載されるように、ａａ２９３〜２９６の領域、又は、これと同一の機能を有する、ＲＳＶのａａ３２３〜３２８等の領域に改変を含む
ことを特徴とするＦタンパク質。
【請求項３４】
請求項３１又は３２に記載のＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はＲＮＡ配列を含むベクター。
【請求項３５】
請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の方法によって得ることができる生きた弱毒化ウイルス。
【請求項３６】
請求項３１又は３２に記載のＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はＲＮＡ配列を含むプラスミド。
【請求項３７】
請求項１７〜１９のいずれか１項に記載のウイルスの１種によって引き起こされる障害又は疾患を予防するワクチンを製造するための、請求項３３に記載のＦタンパク質、又は、請求項２７〜２９若しくは請求項３５に記載の生きた弱毒化ウイルスの使用。
【請求項３８】
配列番号３５〜７６のうち１つによって定義されるプライマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メタニューモウイルス属又はＲＳＶ属の種に対するワクチンに関し、上記ワクチンは弱毒生ワクチンである。特に、上記ワクチンは、鳥類又はヒト由来のメタニューモウイルスに対するものである。
【０００２】
本発明はまた、メタニューモウイルス属又はＲＳＶ属の種に対するワクチンの製造方法に関する。
本発明はまた、メタニューモウイルス属の弱毒生ワクチンに関する。
本発明はまた、上記ウイルスを含む宿主細胞に関する。
本発明はまた、特定のＤＮＡ又はｃＤＮＡ又はＲＮＡ配列、及び、上記ＤＮＡ又はｃＤＮＡ又はＲＮＡ配列を含むベクター又はプラスミドに関する。
【０００３】
最後に、本発明は、
改変されたＦタンパク質、及び、
メタニューモウイルス属又はＲＳＶ属に属するウイルスによる障害又は疾患を予防するワクチンを製造するための上記Ｆタンパク質の使用
に関する。
【背景技術】
【０００４】
パラミクソウイルスファミリーのサブファミリー、パラミクソウイルス及びニューモウイルスには、人間及び動物にとって重要な病原体がいくつか含まれる。分類学上、ニューモウイルスはニューモウイルス属及びメタニューモウイルス属に更に分類される。ニューモウイルス属の一種であるヒト呼吸器合胞体ウイルス（下記にも記載）は、乳児期初期の赤ん坊の呼吸器下部疾患における唯一の非常に大きな誘因であると世界中で考えられている。この他のニューモウイルス属の種としては、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、ヒツジ呼吸器合胞体ウイルス及びマウス肺炎ウイルスが含まれる。また、下記に記載する鳥類ニューモウイルスＡＰＶは、従来はシチメンチョウ鼻気管炎ウイルス（ＴＲＴＶ）として知られていたものである。鳥類ニューモウイルスＡＰＶは、上部ＲＴＩに関与すると考えられ、従来は、近年見出されたメタニューモウイルス属の唯一の種であると考えられていた。
【０００５】
パラミクソウイルスファミリーは、多かれ少なかれ重度の人間及び動物の様々な障害又は疾患に関する多様なウイルスを多数含む。パラミクソウイルスは、一本鎖（−）ＲＮＡ分子をゲノムとして１つ含み、全てのパラミクソウイルスは宿主の急性呼吸器疾患に関与している（非特許文献１）。このファミリーの多数のウイルスのうち、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳウイルス）は、人間に対して麻疹ウイルスの次に著しい臨床症状を呈する。ヒトＲＳウイルスは、毎年世界的に流行する、子供の深刻な呼吸器下部疾患の主要な要因である（非特許文献２）。ＲＳウイルスを含むニューモウイルス及びこれ以外のパラミクソウイルスのヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の間にはホモロジーはあまりないが、（主要な核タンパク質（Ｎ）及びＦタンパク質（Ｆ）等といった）構造上重要な特徴がいくつか、様々なウイルスにおいて機能の類似するタンパク質に保存されて存在する（非特許文献３及び４）。パラミクソウイルスについて、ゲノムのＲＮＡ、核タンパク質、リンタンパク質（ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ）（Ｐ）及びポリメラーゼ（Ｌ）タンパク質の会合によって形成されるヘリオヌクレオカプシド（ｈｅｌｉｏｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ）複合体を用いて、ＲＮＡの合成がいろいろと実施されている。核タンパク質複合体の機能は、互いに相互作用し、かつ、ゲノムのＲＮＡ並びに恐らく他のウイルス及び／又は細胞構成成分とも相互作用する３種のタンパク質全ての存在によって変わる（非特許文献５）。ビリオンの成熟は、改変された細胞膜中に埋め込まれた、リボ核タンパク質複合体、マトリックス（Ｍ）タンパク質及びウイルス糖タンパク質の間で起こる一連の相互作用に依存する。ＲＳ等のニューモウイルスにおいては、更に２種のタンパク質（すなわち膜結合性小型疎水性（ＳＨ）タンパク質及び第二のマトリックスタンパク質（Ｍ２））がビリオン構造に関与しているが、その会合方法はおそらくまだ明らかになっていない。ＮＳ１及びＮＳ２と称されるニューモウイルスタンパク質は、その機能について知られておらず、ウイルス粒子の一部を形成してはいないようである（非特許文献６）。
【０００６】
パラミクソウイルスファミリーに属する、経済的に更に重要なウイルスは、従来はＴＲＴウイルスと呼ばれていたＡＰＶウイルスである。ＡＰＶウイルスはメタニューモウイルス属の一種である。このウイルスは、シチメンチョウの急性呼吸器疾患であるシチメンチョウ鼻気管炎を引き起こす。これは、南アフリカにおいて１７世紀の終わりに初めて文献に記載され、その後ヨーロッパや世界の他の地域でも記載された。この疾患は、昨年のシチメンチョウ産業における経済的損失の主要な理由の１つである。ＡＰＶの血清型Ａ及びＢはヨーロッパで広く見られ、一方、同様の感染症がアメリカ・コロラド州で見られる。これから分離されたＡＰＶ株は、いわゆるコロラド株又はＣ株である。別のＡＰＶ株がフランスにおいてアヒルから分離されている。Ａ型、Ｂ型及びＣ型以外にも、非Ａ非Ｂ型のＡＰＶがおそらく存在する。従って、ＡＰＶは、鳥から初めて分離されたメタニューモウイルス属の鳥類の種である。また、鳥類のメタニューモウイルスは、鶏の深刻な生産減につながる可能性のある「頭部腫張症候群」にもおそらく関係がある。鳥類のメタニューモウイルス（ＡＰＶ）は、融合タンパク質（Ｆ）を殻内に有し、かつ、糖タンパク質（Ｇ）からなるスパイク（ｓｐｉｋｅ）を有する多型性ＲＮＡウイルスである。これを「メタニューモウイルス」と称する。このウイルスは血球凝集特性を持たない。糖タンパク質（Ｇ）のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列から、ＡＰＶは最初、２つのサブタイプに分類された。まず、南アフリカ及びグレートブリテン由来のＡＰＶはサブタイプＡに、それ以外のヨーロッパのＡＰＶ種はサブタイプＢに分類された。また、上述のように、これら以外のサブタイプであると推定される非Ａ非Ｂ型以外にも、サブタイプＣが現在のところ知られている。
【０００７】
鳥類のメタニューモウイルスは、繊毛安定効果を有する気管環状培養（ｔｒａｃｈｅａｌ  ａｎｎｕｌａｒ  ｃｕｌｔｕｒｅ）中で培養できる。また、このウイルスは、胚化した卵の中や上記以外の細胞培養においても培養できる。アメリカの種は、ＨＥＦ（鶏の胚繊維芽細胞（ｈｅｎ  ｅｍｂｒｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ））、ベロ細胞（Ｖｅｒｏ  ｃｅｌｌ）及び胚化した卵の中で培養された。
【０００８】
シチメンチョウ鼻気管炎の臨床症状は、急性鼻気管炎感染症の臨床症状と一致する。すなわち、感染して２〜３日後に、刺激に対する反応が鈍くなって、咳、くしゃみをし、頭を振る。感染がこれより悪化しなければ、感染して７〜８日後に再び正常に戻る。鶏の臨床症状はシチメンチョウの症状と一致するが、概してシチメンチョウほど深刻ではない。大腸菌等の細菌が更に関与すると症状が悪化する可能性があり、好ましくないことに、事実上、疾病期間が長引く可能性がある。しかしながら、鶏のＡＰＶが「頭部腫張症候群」を引き起こして重大な損失につながることは稀である。それよりもおそらく、軽度の臨床疾患による連続的な損失の方が深刻である。従来のＡＰＶに感染した後、鶏及びシチメンチョウが血清中に中和抗体を産生することがＥＬＩＳＡによって検出できる。この抗体は鼻気管炎の制御においてそれほど重要ではないようである。
【０００９】
母の抗体（ｍａｔｅｒｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、ウイルス性ＡＰＶによる感染初期のひな鳥に対しては有効ではない。しかしながら、循環抗体は、動物成体が感染した場合の生殖腺の保護において重要であるようである。
【００１０】
局所抗体は、重要な保護効果を持つようである。ウイルス中和作用を持つウイルス特異的ＩｇＡ及びＩｇＧ抗体は、毒性のあるＡＰＶに感染した後の涙液中に存在する。現在、ＡＰＶ感染症に対する治療法は知られていない。アメリカ以外では、予防接種によってＡＰＶを制御する試みがなされている。
【００１１】
パラミクソウイルスの別の重要な種としては新しく発見されたヒトメタニューモウイルスがあり、呼吸器疾患を患う幼児から分離された。このウイルスはオランダにおいて幼児２８人から分離され、ウイルス学的データ、配列のホモロジー及び遺伝子群に基づいて、メタニューモウイルス属の新種であると確認された（非特許文献７）。この新種のメタニューモウイルスが発見されるまで、ＡＰＶは、上述のように、近年見出されたメタニューモウイルス属の唯一の種であると考えられていた（非特許文献８）。しかしながら、この文献において著者らは、ヒトのウイルスは、配列のホモロジー及び遺伝子群に基づいて、メタニューモウイルス属の新種であるように思われることから、ヒトメタニューモウイルスと予備的に称すると結論づけている。例えば、ヒトＭＰＶとＡＰＶの間におけるＦタンパク質領域の遺伝的ホモロジーは、例えば８０％と高率である。従って、ヒトメタニューモウイルスは、最初は鳥から生じ、最近になってヒトに広がったのではないかと仮定されている。
【００１２】
上述のように、現在、上記に示した疾患の治療法は見つかっていない。
【００１３】
この理由から、予防接種に注目が集まった。しかしながら、現在、例えばメタニューモウイルス属等による上記ウイルス性疾患から長期間安全に保護できる予防接種に使用するようなワクチンはない。
【００１４】
ＲＳＶについては、この病原体が臨床上重要であることから、ワクチンの開発は依然として大きな目標とされる。現在のところ、温度感受性突然変異体を使用して研究が行われている。ＲＳウイルスに対して適切なワクチンを提供する試みは、ＡＴＰ結合部位と推定される領域と良く保存されたポリメラーゼの中央ドメインとを含むポリメラーゼの特定の領域（Ｌ遺伝子）、及び、融合タンパク質（Ｆ）の細胞外ドメインにおける変異という２つの興味深い分野に着目したものであった。この試みによって、これとは関係なく得られ、コードされた活性型弱毒化突然変異体中にも存在するということが分かった（非特許文献９及び１０）。
【００１５】
この試みはＡＰＶの制御を目標として実施され、この研究において、例えば、毒性のある鳥類メタニューモウイルスを使用して弱毒生ワクチンがｉｎ  ｖｉｔｒｏで作成された。気管環状培養を約１００回行っても毒性は減少しなかったが、鶏の胎芽細胞中で３９回培養すると免疫原性と毒性との両方が減少したことが分かった。ベロ細胞中で培養すると、毒性がゼロにまで減少したが、本質的に免疫原性は維持されている。これにより、許容できるワクチンが作成できた。
【００１６】
概して、生ワクチンは、誕生後１日のひな鳥に対して、スプレー又は点眼薬として使用する。生ワクチンによる免疫を１回又は数回繰り返すことを推奨する作成者もある。現在市販されている生ワクチンは、異なる種類の様々な株から作成され、多かれ少なかれ弱毒化されたものである。また、不活性型ワクチンを動物成体に使用することもあるが、この場合、概して、その成体は最初に生ワクチンで予防注射を受ける。
【００１７】
現在のところ、生ワクチンはサブタイプＡ又はＢのものである。様々な実験の結果、異なる株間の交差反応性は良好であるが、同種保護性の方がより良好のようであることが分かっている。ヒトメタニューモウイルスはごく最近発見されたため、これに対するワクチンはまだ全くない。しかしながら、ヒトメタニューモウイルスについては、子供の重度の疾患を導くウイルスから十分効果的に保護できるワクチンが特に望まれている。
【００１８】
しかしながら、現在知られている全てのワクチンは、不安定で、適切な条件の下で毒性を回復する可能性があると判明するかもしれない。
【００１９】
このような性質は、ワクチンにおいて当然不適当である。
【非特許文献１】Ｐｒｉｎｇｅ，Ｃ．Ｒ．（１９８７）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ”，ｐｕｂ．Ｗ．Ｃ．Ｒｕｓｓｅｌｌ  ａｎｄ  Ｊ．Ｗ．Ａｌｍｏｎｄ，Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．４０，９１〜１３８頁，ケンブリッジ大学出版
【非特許文献２】Ｃｈａｎｏｃｋら，１９９１，“Ｖｉｒａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎｓ”，５２５〜５４４頁，ｐｕｂ．Ａ．Ｓ．Ｅｖａｎｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ
【非特許文献３】Ｂａｒｒら，１９９１，Ｊ．ｏｆ  Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２，６７７〜６８５
【非特許文献４】Ｃｈａｍｂｅｒｓら，１９９０，Ｊ．ｏｆ  Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１，３０７５〜３０８０
【非特許文献５】Ｂａｒｉｋ，１９９２，Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌ．６６，６８１３〜６８１６
【非特許文献６】Ｃｏｌｌｉｎｓ，１９９１，“Ｔｈｅ  Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓｅｓ”，１０３〜１６２頁，ｐｕｂ．Ｄ．Ｗ．Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ
【非特許文献７】Ｖａｎ  Ｄｅｎ  Ｈｏｏｇｅｎら，Ｎａｔｕｒｅ，Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｖｏｌ．７，ｎｏ．６，２００１年６月，７１９〜７２４頁
【非特許文献８】Ｖｉｒｕｓ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ，Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｓｅｓ（Ｐｕｂ．Ｖａｎ  Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ，Ｍ．Ｈ．，Ｆａｕｑｕｅｔ，Ｃ．Ｍ．ａｎｄ  Ｂｉｓｈｏｐ，Ｄ．Ｈ．）５５１，５５７，５５９〜５６０（Ａｃａｄｅｍｉｃ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，２０００）
【非特許文献９】Ｃｏｎｎｏｒｓら，１９９５，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０８，４７８〜４８４頁
【非特許文献１０】Ｔｏｌｌｅｙら，１９９６，Ｖａｃｃｉｎｅ  １４，１６３７〜１６４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
従って、本発明の目的は、弱毒生ワクチンである可能性があり、かつ、メタニューモウイルス属及びＲＳＶ属のウイルスの種に対するワクチンを提供することである。
【００２１】
特に、メタニューモウイルス属、特にヒトメタニューモウイルス属及びＡＰＶ属の種の病原体に対して、かつ、ＲＳＶに対して有効である弱毒生ワクチンを提供することが目的である。
【００２２】
また、上記ウイルスに対する適切なワクチンを提供する方法を提供することも本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
この目的は、独立する請求項の主題によって達成される。好ましい実施形態を、従属する請求項中に示す。
【００２４】
請求項１によれば、ワクチンは、メタニューモウイルス属及びＲＳＶ属の種に対して、かつ、メタニューモウイルス属の種と重要な遺伝的ホモロジーをＦタンパク質領域中に有するウイルスに対して提供され、
上記ワクチンは、ウイルス又はウイルスの一部分を含み、
上記ウイルスは、野生型ウイルスと比較して、Ｆタンパク質（融合タンパク質）のアミノ酸配列のａａ２９３〜２９６の領域、又は、これと同一の機能を示す領域（例えばａａ３２３〜３２８等）が改変されている
ことを特徴とする。
【００２５】
「ウイルスの一部分」とは、Ｆタンパク質のａａ２９３〜２９６の領域又はこれと類似する機能を有する領域に改変を含んでいて、かつ、ウイルスがワクチンとして作用する（すなわち免疫原性を呈するが毒性は呈さない）ために必要なウイルス構成成分全てをも含んでいるようなウイルスの少なくとも一部分をワクチンが有していなければならない、という意味である。このようなウイルスの作成方法は、当業者の一般的な専門知識の範囲内である。
【００２６】
本発明を、本明細書中に図示する図面に従って更に記載する。図面は以下のことを示す。
図１、弱毒化及び復帰の間に起こる配列変化の例。
図２、クローニング方法。
図３、全ゲノムに対するＥＴＣ。
図４、融合タンパク質のａａ２９３〜２９６の位置における変化。
【００２７】
（例えば、Ａ型ＡＰＶ等のＡＰＶ及びそれ以外のパラミクソウイルス種とで一致している）融合タンパク質Ｆの切断部位には通常、おそらくａａ９９〜１０９の位置に塩基性アミノ酸を有するモチーフがある。この部位でプロテアーゼにより分割すると、Ｆタンパク質がＦ１とＦ２とに分かれて融合関連ドメインが露出する。このことから、（第二の切断部位を示す可能性のある）ａａ２９３〜２９６の領域又はこれと同一の機能を有する部位において塩基性アミノ酸の数を増加させれば、同様に、プロテアーゼに対する切断部位を導ける可能性があった。
【００２８】
概して、全ウイルスは、Ｆタンパク質のアミノ酸配列のａａ２９３〜２９６の領域、又は、これと同一の機能を有する領域における改変を含んで使用される。図１を参照して、典型的なウイルス、特にメタニューモウイルスにおけるＦタンパク質について説明する。図１は、ウイルスの弱毒化、並びに、ウイルスワクチン及び毒性のあるウイルスへの転換の間に起こる可能性のある配列変化の例を示す。
【００２９】
図１中の略語は以下の意味である。
Ｎ：ヌクレオカプシド；遺伝子：約１２００塩基
Ｐ：リンタンパク質；遺伝子：約８５０塩基
Ｍ：マトリックス；遺伝子：約８００塩基
Ｆ：融合；遺伝子：約１６００塩基
Ｍ２：第二マトリックス；遺伝子：約６００塩基
ＳＨ：小型疎水性物質；遺伝子：約５００塩基
Ｇ：糖タンパク質；遺伝子：約１１００塩基
Ｌ：ポリメラーゼ；遺伝子：約７０００塩基
【００３０】
融合タンパク質は、標的である膜との融合に関与すると仮定されている。Ｍ２は、ウイルスの再生において重要と推測される転写−伸張因子であると仮定されている。これは、エクスプライムされて（ｅｘｐｒｉｍｅｄ）いないようである第二のリーディングフレームを含む。Ｇタンパク質は、標的細胞の受容体への付着に関与している可能性がある。このＧタンパク質は高い割合でグリコシル化されており、異なる株間で大きく異なる。Ｌポリメラーゼは、ゲノムの転写及び複製に関与する。Ｎ、Ｐ及びＬは、結合して、ヌクレオカプシドと称される最小複製単位を形成する。
【００３１】
融合タンパク質は、特に、ウイルスと標的細胞との融合に関与している。これはＦ０として翻訳され、細胞のプロテアーゼによってａａ９９〜１０２（ＲＲＲＲ）の位置で切断され、（膜結合性融合関連ドメインを含む）Ｆ１及び（切断後、システインと切断部残基との間のジスルフィド架橋によりＦ１に付着したままである）Ｆ２ができる。以下に詳細に説明するように、更なる潜在的な切断部位（ＡＰＶ及びｈＭＰＶのａａ２９３〜２９６、並びに、ＲＳＶの３２３〜３２８）が何らかの形で融合に変化を与えるという仮説、及び、これにより組織への親和性に影響が及ぶという仮説を立てた。
【００３２】
図１中の実線矢印は、弱毒化の際にＤＮＡレベルで配列変化が起こったことを示し、点線矢印は、弱毒化及び復帰の際にタンパク質レベルで配列変化が起こったことを示す。左側のウイルスの配置は野生型ウイルスの配置である。白で示す図１中央のウイルスの配置は弱毒化ウイルスの配置であり、右側のウイルスの配置は毒性を回復したウイルスの配置である。
【００３３】
図１から、変化する可能性のある配列が複数あると推測できる。弱毒化及び復帰の間に起こる可能性がある図１中に示す配列変化は、単に例として示すものである。
【００３４】
野生型の配列、弱毒化ウイルス及び復帰したウイルスを比較すると、弱毒化及び復帰の間に起こる突然変異及び突然変異の組み合わせは複数ある可能性があることが明らかに分かる。
【００３５】
本発明によって、ａａ２９３〜２９６の領域又はこれと同一の機能を有する領域を改変すると、メタニューモウイルス属又はＲＳＶ属の種に対するワクチンとして使用できる弱毒化ウイルスを作成できることが予想外に明らかになった。本発明者らは、この領域を改変すると、毒性を失っても完全な免疫原性を呈する弱毒化ウイルスを作成できるであろうということを見出した。また、この領域を改変すると、毒性を回復する危険性を小さくできるであろうということも見出した。
【００３６】
次の表１は、更に議論を進めるにあたってより理解を深めるために示すものである。この表は、アミノ酸２０個、その１文字表記（ＳＬＣ）及び対応するＤＮＡコドンの調査結果を示す。
【００３７】
表１：アミノ酸２０個、その１文字表記（ＳＬＣ）及び対応するＤＮＡコドン
【００３８】
【表１】
2005538702.tif 000002
【００３９】
ａａ２９３〜２９６の領域は、メタニューモウイルス属のウイルスのＦタンパク質（すなわち融合タンパク質）中に、及び、ＲＳＶ属において位置する。ａａ２９３〜２９６の領域の位置は、例えば、配列番号２８〜３４から推測できる。
【００４０】
本発明者らは、Ｆ遺伝子において、ａａ２９３〜２９６の領域又はこれと同一の機能を有する領域（ＲＳＶのａａ３２３〜３２８等）のアミノ酸をコードするコドンを改変すると、免疫原性を維持しつつ毒性を消失した弱毒化ウイルス株を作成できることを明らかにできた。
【００４１】
この、ＡＰＶ及びｈＭＰＶのａａ２９３〜２９６の領域、又は、ＲＳＶの３２３〜３２８の領域は、毒性の変化に関与しているようである。
【００４２】
この現象の機構はまだ明らかではない。この仮説に拘束されることは意図しないが、本発明者らは、Ｆ−１及びＦ−２の場合と同様に、この領域はセリンプロテアーゼで切断されるがＳ−Ｓ結合で付着したままであるという理論を提示した。ワクチンをＰＡＧＥすると、上記事象と関係がある可能性のある移動度が、野生型ウイルスとは異なることが分かる。
【００４３】
ＡＰＶ及びｈＭＰＶのａａ２９３〜２９６の領域、並びに、ＲＳＶの３２３〜３２８の領域は、アミノ酸の大部分が荷電している（Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｅ、Ｄ）か、又は、極性を有していて（Ｓ）、本質的に親水性であるようである。アミノ酸グリシン（Ｇ）のみがわずかに疎水性である。
【００４４】
以下のアミノ酸配列は、異種のメタニューモウイルス属のａａ２９３〜２９６の領域において特有である。
Ａ型ＡＰＶ：ＲＫＥＫ（配列番号２４）、ＲＫＫＥ、ＲＥＥＫ
Ｂ型ＡＰＶ：ＲＨＥＲ（配列番号２５）
Ｃ型ＡＰＶ：ＳＧＫＤ（配列番号２６）
ヒトメタニューモウイルス：ＳＧＫＫ（配列番号２７）
【００４５】
以下のアミノ酸配列は、異種のＲＳＶのａａ３２３〜３２８の領域において特有である。
１：ＴＴＤＮＫＥ（配列番号７９）
２：ＴＴＮＩＫＥ（配列番号７８）
３：ＴＴＮＴＫＥ（配列番号７７）
【００４６】
以下にヒトメタニューモウイルスを参照するが、ヒトメタニューモウイルスは、Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｏｇｅｎらの文献に定義されるように関与している（Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｏｇｅｎら，Ｎａｔｕｒｅ，Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｖｏｌ．７，ｎｏ．６，２００１年６月，７１９〜７２４頁）。親水性の領域は機能性タンパク質に機能と構造を与えるために必要であるようだと考えられる。従って、塩基性アミノ酸が存在すると、セリンプロテアーゼによる切断が促進されるようである。このことから、ＡＰＶ又はｈＭＰＶのａａ２９３〜２９６の領域のアミノ酸４つを適切に改変すること、及び、ＲＳＶの３２３〜３２８の領域を適切に改変することにより、例外なく弱毒化効果が得られるようである。
【００４７】
好ましい実施形態によれば、上記ウイルスは、生きた弱毒化ウイルスである。生きた弱毒化ウイルスは従来技術において公知であり、当業者によれば単純な方法で十分に作成できる。本発明によれば、生きた弱毒化ウイルスは、野生型ウイルスと比較して、融合タンパク質のアミノ酸配列のａａ２９３〜２９６の領域又はこれと同一の機能を有する領域（ＲＳＶのａａ３２３〜３２８等）に改変を含んでいなければならない。ウイルスの弱毒化は、上記領域を改変することによって達成できる。上記ウイルスについて既に知られている公知の弱毒化法を使用できる。
【００４８】
好ましくは、改変は、ウイルスのａａ２９３〜２９６の領域又はこれと同一の機能を有する領域（ＲＳＶのａａ３２３〜３２８等）の安定化を含む。
【００４９】
「安定化」という記載は、ａａ２９３〜２９６の部位又はこれと同一の機能を有する領域（ＲＳＶのａａ３２３〜３２８等）のアミノ酸が、野生型に容易に戻れないコドンでコードされている状態を意味する。このような安定化は、好ましくは、上記領域のアミノ酸をコードするコドンを、野生型に戻るために更に変異を要するコドンで置換することにより達成される。このような安定化は、例えば以下のように説明できる。
【００５０】
この例は、アミノ酸グルタミン酸（Ｅ）の塩基性アミノ酸による置換を対象とする。グルタミン酸は、ＤＮＡコドンＧＡＡ又はＧＡＧでコードされる。グルタミン酸を置換するためにアミノ酸リシン（Ｋ）を選択すると、次の状態が生じる。リシンはＤＮＡコドンＡＡＡ又はＡＡＧでコードされる。リシンについてＤＮＡコドンＡＡＡを選択すると、ＤＮＡコドンＧＡＡ（すなわちグルタミン酸）に戻るためには変異を１つ要する。同様のことが、ＤＮＡコドンＡＡＧを選択すると、グルタミン酸をコードするＤＮＡコドンＧＡＧに戻るためには変異を１つ要するという場合にも当てはまる。しかしながら、例えば、（塩基性アミノ酸アルギニン（Ｒ）をコードする）ＤＮＡコドンＣＧＴを選択すると、グルタミン酸をコードするＤＮＡコドンＧＡＡ又はＧＡＧを再度得るためには変異を３つ要する。従って、グルタミン酸をコードするコドンの代わりとして（アルギニンをコードする）コドンＣＧＴを選択することによって、グルタミン酸をコードするＤＮＡコドンに戻るために更に多くの変異を要し、これにより、より高度な安定化を達成できる。
【００５１】
この理由から、更に好ましい実施形態によれば、安定化は、上記領域のアミノ酸、好ましくはこの領域の酸性アミノ酸をコードするコドンを、グルタミン酸をコードするコドンになりにくいように変異しているコドンで置換することによって達成される。本発明者らは、Ｆタンパク質のａａ２９３〜２９６の領域又はこれと同一の機能を有する領域（例えばＲＳＶのａａ３２３〜３２８等）にグルタミン酸が存在すると、弱毒化が制限又は阻害され、かつ、ウイルスの毒性が増大するということを見出した。
【００５２】
従来技術の文献からは、この発見に関しての示唆は得られない。他の酸性アミノ酸と同様、グルタミン酸も、Ｆタンパク質のａａ２９３〜２９６の領域又はこれと同一の機能を有する領域（ＲＳＶのａａ３２３〜３２８等）に位置する場合に、ウイルスの毒性に寄与しているようである。上述のように、弱毒化と同時にこのように毒性が増大する状態又は弱毒化が消失する状態においては、Ｆタンパク質が機能構造を得るには親水性の領域が必要であるということができ、一方、塩基性アミノ酸が存在するとセリンプロテアーゼによる切断が促進されるかもしれない、ということができる。
【００５３】
この理由から、更に好ましい実施形態によれば、（好ましくはメタニューモウイルス属の）ウイルスのＦタンパク質のａａ２９３〜２９６の領域又はこれと同一の機能を有する領域（ＲＳＶのａａ３２３〜３２８等）における改変は、少なくとも１つの非塩基性アミノ酸の塩基性アミノ酸による置換を含む。より好ましくは、少なくとも２つの非塩基性アミノ酸が塩基性アミノ酸によって置換される。更に好ましくは、少なくとも３つの非塩基性アミノ酸が塩基性アミノ酸によって置換される。特に好ましい実施形態によれば、ｈＭＰＶ又はＡＰＶのＦタンパク質のａａ２９３〜２９６の領域のアミノ酸が、アミノ酸４つが全て塩基性アミノ酸となるように改変される。
【００５４】
本発明の更に好ましい実施形態によれば、ＲＳＶのａａ３２３〜３２８の領域のアミノ酸６つは全て塩基性アミノ酸である。
【００５５】
別の好ましい実施形態によれば、改変は、少なくとも１つのアミノ酸の付加を含んでいてよい。この少なくとも１つのアミノ酸の付加は、上記置換に加えて行ってもよい。好ましくは、少なくとも１つのアミノ酸の付加は、少なくとも１つの塩基性アミノ酸（好ましくはアルギニン、リシン及び／又はヒスチジン、特に好ましくはアルギニン又はリシン）の付加を意味する。
【００５６】
更に別には、改変は、少なくとも１つのアミノ酸の削除を更に含んでいてよい。この少なくとも１つの削除されるアミノ酸は、好ましくは酸性アミノ酸である。
【００５７】
特に好ましい実施形態によれば、改変は、少なくとも１つのグルタミン酸残基の、少なくとも１つの塩基性アミノ酸による置換を含む。塩基性アミノ酸は、好ましくは、アルギニン、リシン及び／又はヒスチジンからなる群より選択される。特に好ましくは、アルギニン及び／又はリシンを使用することである。
【００５８】
特に好ましい実施形態によれば、野生型ウイルスのａａ２９３〜２９６の領域は、配列番号２４〜２７のうち１つの中に示す配列を有する。
例えば、配列番号２４は、野生型Ａ型ＡＰＶ株第８５４４番のａａ２９３〜２９６の領域のアミノ酸、すなわちＲＫＥＫを表わす。
例えば、配列番号２５は、Ｂ型ＡＰＶウイルスのａａ２９３〜２９６の領域の典型的なアミノ酸、すなわちＲＨＥＲを表わす。
例えば、配列番号２６は、Ｃ型ＡＰＶウイルスのａａ２９３〜２９６の位置の典型的なアミノ酸、すなわちＳＧＫＤを表わす。
例えば、配列番号２７は、ヒトメタニューモウイルスのａａ２９３〜２９６の位置のアミノ酸、すなわちＳＧＫＫを表わす。
【００５９】
本発明において使用する「野生型ウイルス」とは、Ｆタンパク質の２９３〜２９６の位置又はこれと同一の機能を有する領域（例えばＲＳＶのａａ３２３〜３２８等）に変異のないウイルスに関する。概して、このような野生型ウイルスは毒性のあるウイルスである。しかしながら、既に弱毒化した生きたウイルスを本発明の野生型ウイルスとして使用し、本発明によって、Ｆタンパク質のａａ２９３〜２９６の位置又はこれと同一の機能を有する領域（ＲＳＶのａａ３２３〜３２８等）を改変して、更に弱毒化することもできる。
【００６０】
本発明で使用できる野生型ウイルスとして好ましいウイルスは、ヒトメタニューモウイルス、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型又は非Ａ非Ｂ型のＡＰＶウイルス、又は、ＲＳウイルスである。
【００６１】
弱毒化ウイルスのａａ２９３〜２９６の領域は、好ましくは配列番号１〜２３のうち１つの中に示す配列を有する。
【００６２】
また、配列番号１〜２３は、ＲＳウイルスのａａ３２３〜３２８の領域の構成成分を形成するために選択される。
【００６３】
配列番号１は、ａａ２９３〜２９６の位置のアミノ酸配列の例であり、これにより、例えば、（例えば第８５４４番の株（Ａ型ＡＰＶ）に対する）ワクチンとして使用される弱毒化株が得られる。また、この配列番号１（すなわちＲＲＲ）から、例えば、弱毒化ヒトメタニューモウイルス、又は、Ｂ型、Ｃ型又は非Ａ非Ｂ型の弱毒化ＡＰＶウイルスが得られる。
【００６４】
本発明に示すように、Ｆタンパク質のａａ２９３〜２９６の領域若しくはこれと同一の機能を有する領域（例えばＲＳＶのａａ３２３〜３２８等）のアミノ酸、又は、このアミノ酸をコードするコドンを改変すると、ワクチンとして使用できる生きた弱毒化ウイルスを得ることができる。
【００６５】
特に好ましい実施形態によれば、野生型ウイルスのａａ２９３〜２９６の領域は配列番号２４の中に示すアミノ酸配列を有し、弱毒化ウイルスの上記領域は配列番号１の中に示す配列を有する。この実施形態により、Ａ型ＡＰＶ（例えば第８５４４番の株）に対する生きた弱毒化ウイルスを得ることができる。
【００６６】
本発明の更に好ましい実施形態によれば、野生型ウイルスのａａ２９３〜２９６の領域は配列番号２７の中に示す配列を有し、弱毒化ウイルスの上記領域は配列番号１、２、１０又は２１の中に示す配列を有する。このようにａａ２９３〜２９６の領域を改変すると、例えば、ヒトメタニューモウイルスに対する生きた弱毒化ウイルスを得ることができる。また、配列番号１〜２３の中に示す好ましい配列は、リシン又はアルギニンのいずれかの代わりに１つ以上のヒスチジンを更に含んでいてよい。上述した事柄は、適切な変更を加えて、ＲＳＶのａａ３２３〜３２８の領域にも適用できる。
【００６７】
上述のように、Ｆタンパク質のａａ２９３〜２９６の領域又はこれと同一の機能を有する領域（ＲＳＶのａａ３２３〜３２８等）を本発明のように改変すると、（例えばメタニューモウイルス属又はＲＳＶ属の）生きた弱毒化ウイルスを得ることができる。上記ウイルスのＦタンパク質は、上記ウイルスそれぞれのＦタンパク質の配列間で本質的に遺伝的ホモロジーがある、という共通の性質がある。
【００６８】
特に好ましい実施形態によれば、本発明に従って作成したワクチンは、ヒトメタニューモウイルスに対して有効である。更に好ましくはメタニューモウイルス属鳥類メタニューモウイルスであり、特に好ましくはＡＰＶである。
【００６９】
本発明はメタニューモウイルスに限定されるものではなく、非常に厳しい条件下での配列ホモロジー研究に基づき、Ｆタンパク質の領域において、メタニューモウイルス属の種（特にＡＰＶ又はヒトメタニューモウイルス）との間に（例えば配列ホモロジーが５０％を越える、好ましくは６５％を越える、特に好ましくは７５％を越えるというように）明らかな遺伝的ホモロジーを有する全てのウイルスに適用できる。
【００７０】
生きた弱毒化ウイルスを、好ましくは、適切な補助剤及び／又は担体及び／又はアジュバントと共に調剤する。好ましい実施形態によれば、ウイルスは、適切な量のインターロイキン６（ＩＬ−６）と共に調剤する、生きた弱毒化ウイルスである。インターロイキン６を共に用いた製剤は、ウイルスが鳥類メタニューモウイルスである場合、特に好ましい。
【００７１】
更なる実施形態によれば、ウイルスは弱毒化ウイルスであり、適切な量のインターロイキン１２（ＩＬ−１２）及び／又はインターロイキン１８（ＩＬ−１８）と共に調剤する。ウイルスがヒトメタニューモウイルス又はＲＳＶである場合、弱毒化ウイルスは、好ましくは、インターロイキン１２及び／又はインターロイキン１８と共に調剤する。
【００７２】
本発明の範囲における「適切な量」とは、本発明による弱毒化ウイルスと共に調剤する場合には所望の効果を与え、生きた弱毒化ウイルスをワクチンとして使用する場合には悪影響を及ぼさない量を示す。
【００７３】
適切な量は、当業者であれば決定することができ、使用する弱毒化ウイルス及び治療対象によって、例えば年齢、体重、体調及び治療する疾患を考慮して、変わり得る。
【００７４】
本発明のワクチンの製造方法は、例えばメタニューモウイルス属の種を対象とし、以下の段階：
ａ）ワクチンの開発対象である毒性のあるウイルスを得る段階、
ｂ）ウイルスのＦタンパク質のａａ２９３〜２９６の領域、又は、これと同一の機能を有する領域（ＲＳＶのａａ３２３〜３２８等）をコードする核酸配列を改変する段階、及び、
ｃ）上記の改変を含む、生きた弱毒化ウイルスを得る段階：
を含む。
【００７５】
改変は、好ましくは、上述の改変、特に別添の請求項２〜１６による改変に関する。
【００７６】
更に好ましくは、ウイルスは、上記群より選択される、特に別添の請求項１７〜１９によるウイルスである。
【００７７】
上記段階ｂ）中に示す改変は、特に、ＡＰＶ又はｈＭＰＶについてはａａ２９３〜２９６の領域に関し、ＲＳＶについてはａａ３２３〜３２８の領域に関する。
【００７８】
また、改変は、好ましくは以下のように達成される。
ｉ）ワクチンの開発対象であるウイルスのウイルスゲノムの全長ＤＮＡコピーを作成する、
ｉｉ）ＰＣＲ産物の全長の一部をライゲーションさせ、ａａ２９３〜２９６の領域又はこれと同一の機能を有する領域（ＲＳＶのａａ３２３〜３２８等）に変化を導入することによって、全長ＤＮＡコピーを得る、
ｉｉｉ）例えば水痘Ｔ７ポリメラーゼ組み換え体、又は、細胞のリボソームｐｏｌ１ＲＮＡポリメラーゼを使用することによって、全長ＤＮＡコピーからウイルスを再生する。
【００７９】
ゲノム中の特定の位置に変異を導入するために使用する特定の方法は、間違いなく当業者に公知である、かつ／又は、一般的な方法を本発明において適用できる。
【００８０】
例えば元の配列とは変えたプライマーを用いてＰＣＲにより増幅して、融合タンパク質の配列を変える。プライマー３．８２  Ｓｓｔ  ｎｅｇ及び３．８２  Ｓｓｔ  ｐｏｓの配列は、ａｇｇ  ａａａ  ａａｇ  ａａａをａｇｇ  ａｇａ  ｃｇｃ  ｃｇｃで置換する以外は実施形態の配列に従う。ＰＣＲは、リーダーの側から３．８２  Ｓｓｔ  ｎｅｇへ、及び、３．８２  Ｓｓｔ  ｐｏｓから下流（トレーラー方向）への二回行う。ＬＴＺ  ３．１Ｘｈｏ＋から３．８２Ｓｓｔ−へのＰＣＲ（３ａと称する）は、変えた配列（ＲＲＲＲをコードするようにａａを変える）を含んでいてよく、かつ、Ｓｓｔ１１  ＲＥ位置（隣接するｇｇと共に、この配列のすぐ上流に、［Ｓｓｔ１１認識位置ｃｃｇｃｇｇ］）を更に含んでいてよい。プライマー３．８２  Ｓｓｔ１１  ｐｏｓとプライマーＬＴＺ  ４．６  Ｓａｌ−との間のＰＣＲ（３ｂと称する）により、隣接する断片が同様に変わる。従って、２つのＰＣＲ産物をＳｓｔ１１で切断して互いにライゲーションすると、その産物は、元のＬＴＺ  ３．１Ｘｈｏ＋からＬＴＺ  ４．６  Ｓａｌ−の配列を上記のように変えた配列を有する。
【００８１】
実際には、まず３ａを（平滑に（ｂｌｕｎｔｌｙ））クローニングして配列を調べた後、（プラスミドと３ｂの両方をＳｓｔ１１及びＳａｌ１で切断した後）ＰＣＲ３ｂを加える。
【００８２】
また、上記方法を、同じプライマー（３．８２  Ｓｓｔ  ｎｅｇ及び３．８２  Ｓｓｔ  ｐｏｓ）を用いて更に長いＰＣＲに対して実施してよい。これをライゲーションした結果得られるＤＮＡは、Ｓｓｔ１１で切断した後で互いにライゲーションさせることができ、これによって、ウイルスの再生に直接使用できる。従って、任意のクローニング段階を省略できる。この研究によって、野生型分離株又はＲＮＡ抽出物から弱毒化ウイルスを迅速に製造できるであろう。
【００８３】
図２及び図３は、好ましいクローニング方法を示す。まず、ゲノム断片をＴＷＦ  １８中にクローニングした（ＬＴＺ  Ｔ７  １からＬＴＺ  ９＋１０  ＨＤＶＲ）。クローニングした各領域（ＬＴＺ  Ｔ７  １から始まってＬＴＺ  ９＋１０  ＨＤＶＲで終わる）をＸｈｏ１及びＳａｌ１で消化した後、それぞれを別々に連続してＣＴＰＥ中にクローニングした。各段階において、上記断片の切断したＳａｌ１−（プラスミド）及びＸｈｏ−（ＬＴＺ断片のリーダー末端）の位置をライゲーションすることにより、リーダーが両酵素に対して耐性のあるゲノム内配列となった。トレーラー末端においてＳａｌ１切断末端２つを組み合わせることにより、Ｓａｌ１が依然として存在して、次の断片を受け入れることができる可能性があることが確認された。このようにして、各ゲノム領域に由来する付加及びその後のクローニングの後に、プラスミドをインサートＳａｌ１で再度消化し、（ＴＷＦからＸｈｏ１及びＳａｌ１で切断した）次の領域をその中にクローニングした。
【００８４】
本発明によれば、２種以上の生きた弱毒化ウイルスの混合物を含むワクチンを得ることもできる。ここで、１種又は複数の生きた弱毒化ウイルスは、本発明によって、すなわちＦタンパク質のａａ２９３〜２９６の位置又はこれと同一の機能を有する領域（ＲＳＶのａａ３２３〜３２８等）の改変によって得られるものである。
【００８５】
本発明はまた、
メタニューモウイルス属、又は、ＲＳＶ属、又は、メタニューモウイルス属のウイルスとの間に有意な遺伝的ホモロジーをＦタンパク質中に有するウイルスに属し、
Ｆタンパク質のａａ２９３〜２９６の領域又はこれと同一の機能を有する領域（例えばＲＳＶのａａ３２３〜３２８等）に改変を含む
ことを特徴とする生きた弱毒化ウイルス
にも関する。
改変及びウイルスは、両方とも上述したものである。
【００８６】
本発明はまた、
上述の改変によって弱毒化されたウイルスを含む宿主細胞
にも関する。
【００８７】
更に好ましい実施形態によれば、本発明はまた、
配列番号２８〜３４のうち１つの中に定義されるＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列
にも関する。
上記配列番号２８〜３４の全ての配列はヒトメタニューモウイルスのＦタンパク質の全長配列であり、ａａ２９３〜２９６の領域に適切な改変を含んでいて、弱毒化ヒトメタニューモウイルスを提供する。
【００８８】
本発明はまた、
配列番号２８〜３４の中に定義されるＤＮＡ配列に対応するＲＮＡ配列
にも関する。
【００８９】
本発明はまた、
上述のＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はＲＮＡ配列を含むベクター及びプラスミド
にも関する。
【００９０】
本発明はまた、
上述の方法によって得ることができる生きた弱毒化ウイルス
にも関する。
【００９１】
本発明はまた、
メタニューモウイルス属、又は、ＲＳＶ属、又は、メタニューモウイルス属の種との間に有意な遺伝的ホモロジーをＦタンパク質領域中に有するウイルスの種のＦタンパク質であって、
上述のように、改変、すなわち、ａａ２９３〜２９６の位置又はこれと同一の機能を有する領域（例えばＲＳＶのａａ３２３〜３２８等）のアミノ酸の改変を含む
ことを特徴とするＦタンパク質
にも関する。
本発明のＦタンパク質に含まれていてよい改変は、上述のものである。
【００９２】
最後に、本発明はまた、
上述のように、ウイルスによる障害又は疾患を予防するワクチンを製造するための、上述のＦタンパク質、及び、上述の生きた弱毒化ウイルスの使用
にも関する。
【００９３】
本発明のＦタンパク質又は生きた弱毒化ウイルスを、以下のウイルス：
−Ａ型、Ｂ型、Ｃ型又は非Ａ非Ｂ型のＡＰＶ
−ヒトメタニューモウイルス
−ＲＳウイルス：
の１種によって引き起こされる障害又は疾患を予防するワクチンを製造するために使用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００９４】
本発明を、以下の実施例によって記載する。
【００９５】
実施例は本発明をより詳細に記載することを意図するものであって、本発明の範囲を特定の実施例に限定するものではない。
【実施例１】
【００９６】
１．ウイルスのゲノムの全長ＤＮＡコピーの作成
ＲＮＡを、ベロ細胞（ドイツの野生型分離株、ＬＴＺから回収）中で増殖させたＡＰＶ株ＬＴＺ  １からＱｕｉａｇｅｎ社Ｒｎｅａｓｙキット（Ｑｕｉａｇｅｎ社、クローリー、英国）を使用して抽出した。ＲＮＡの逆転写を、４２℃で１．５時間、プライマーＡＰＶ−Ｌｅａｄ（５’−ＣＧＡＧＡＡＡＡＡＡＡＣＧＣＡＴＴＣＡＡＧＣＡＧＧ−３’）（配列番号３５）及びＭ２Ｓｔａｒｔ＋（５’−ＧＡＴＧＴＣＴＡＧＧＣＧＡＡＡＴＣＣＣＴＧＣ−３’）（配列番号３６）を使用して、ウイルスのリーダーから行った（Ｓｕｐｅｒｓｋｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（インビトロジェン社、ペーズリー、英国））。そして、１２サイクルのＰＣＲ（９４℃５秒、６０℃２０秒、６８℃６分［５サイクル目以降は１サイクルにつき３０秒ずつ増やす］１１回繰り返す、Ｂｉｏ−Ｘ−Ａｃｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ社、ロンドン、英国）使用）を２回行って、リーダー領域及びトレーラー領域のｃＤＮＡを増幅した。
【００９７】
リーダー領域のＰＣＲは、ＡＰＶｌｅａｄで始めるＲＴ反応を基盤として使用することによって行い、ＰＣＲプライマーは、ＡＰＶ−Ｌｅａｄ  ｅｘｔ（５’−ＡＣＧＡＧＡＡＡＡＡＡＡＣＧＣＡＴＴＣＡＡＧＣＡＧＧＴＴＣＴ−３’）（配列番号３７）及びＬＴＺ  ８．２  ｓａｌ  ｎｅｇ（５’−ＧＧＧＴＡＴＣＴＡＴＧＡＴＧＧＴＣＧＡＣＡＧＡＴＧＴＧ−３’）（配列番号３８）であった。
【００９８】
トレーラー領域には、Ｍ２Ｓｔａｒｔ＋で始めるＲＴ反応を基盤として使用することによって行い、ＰＣＲプライマーは、ＬＴ７（５’−ＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＡＣＣＡＡＴＡＴＧＧＡＡＡＴＡＴＣＣＧＡＴＧＡＧ−３’）（配列番号３９）及びＡＰＶ  ｔｒａｉｌ  ｅｘｔ（５’−ＧＣＴＡＡＡＡＡＴＴＴＧＡＴＧＡＡＴＡＣＧＧＴＴＴＴＴＴＴＣＴＣＧＴ−３’）（配列番号４０）であった。
【００９９】
基盤として更に３０サイクルのＰＣＲ（９４℃５秒、６０℃２０秒、６８℃２分［５サイクル目以降は１サイクルにつき１０秒ずつ増やす］、２９回繰り返す）をｐｆｕ（ストラタジーン社、アムステルダム、オランダ）を使用して２回行い、８つの領域における全ゲノムを増幅し、ＬＴＺ１〜１０と名付けた。
【０１００】
ＰＣＲプライマーは、制限エンドヌクレアーゼ認識部位を導入するという配列の改変、又は、それ以外の、ＤＮＡ末端及び３’末端における変化を含む。また、ＬＴＺ  ３以外では、コードされたタンパク質配列は変わらない。ＬＴＺ  １Ｔ７中のウイルスのリーダー配列にＴ７プロモーターを付加し、ＬＴＺ  １  ｐｏｌ中のウイルスのリーダー配列にヒトＲＮＡポリメラーゼ−１−プロモーター（ｐｏｌ  １）の短縮型を付加した。融合タンパク質のａａ２９３〜２９６をコードする領域を、ＬＴＺ  ３中においてＲＫＫＫがＲＲＲＲになるように変化させた。ＬＴＺ  １０において、ＨＤＶＲ（デルタ型肝炎ウイルスのリボザイム）をウイルスのトレーラー領域（ＬＴＺ  ９＋１０）に付加した。
【０１０１】
Ｆタンパク質の遺伝子配列を変えると、酸性アミノ酸をコードする配列へのこの配列の変異を可能にするために要する変異の数が増加した。図４中に詳細に示す。
【０１０２】
表２：末端がＳａｌ１／Ｘｈｏ１であるゲノム領域の作成に使用したＰＣＲプライマーの配列
【０１０３】
【表２】
2005538702.tif 000003
【０１０４】
ＬＴＺ  ３を除いて、ＰＣＲ産物の各平滑末端を、意図的に構築したプラスミドｐＴＷＦ  １８中にライゲーションさせた。このプラスミドは、ｐＵＣ  １８由来で、Ｓａｌ１の位置をＥｃｏＲ１に変えたプラスミドである。改変したプライマー（ｐ１８−ｅｃｏ４２０−５’−ＴＡＧ  ＡＡＴ  ＴＣＡ  ＣＣＴ  ＧＣＡ  ＧＧＣ  ＡＴＧ  Ｃ−３’（配列番号６０））を使用し、もう１種のプライマーとしてｐ１８−４００＋（５’−ＧＡＧ  ＧＡＴ  ＣＣＣ  ＣＧＧ  ＧＴＡ  ＣＣＧ  ＡＧＣ−３’（配列番号６１））を使用して、ｐｆｕに基づくＰＣＲ（９４℃５秒、６０℃２０秒、６８℃３分［５サイクル目以降は１サイクルにつき１０秒ずつ増やす］２９回繰り返す）で、このプラスミドを複製及び変化させた。
【０１０５】
ＰＣＲ産物自身を一晩かけてライゲーションさせ（Ｂｉｏｌｉｎｅ社ＱＳリガーゼ、一晩、１４℃）、その後これを使用して、コンピテントＤＨ５α細胞（インビトロジェン社）を標準的な条件下（ＬＢ寒天／培養液、Ｘｇａｌプレート、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ、３７℃）で形質転換した。青いコロニーを選択して特定の制限エンドヌクレアーゼによる消化を実施し、ＥｃｏＲ１部位が２つ存在していてＳａｌ１部位が削除されていることを確認した。
【０１０６】
（Ｔ７１及びＴ７３を除く）ＬＴＶの領域をｐＴＷＦ１８のｓｍａ１の位置にライゲーションさせた（Ｂｉｏｌｉｎｅ社ＱＳリガーゼ、一晩、１４℃）。ライゲーション混合物を使用して、コンピテントＤＨ５α細胞を形質転換した。安定性を考慮して、ＬＴＺゲノム又はその一部分を含むプラスミドを用いた細菌の培養実験全体を３０℃で実施した。ＬＴＺ  ３をｐＵＣ  １８の中に半分の長さのものを２つという形でクローニングした。
【０１０７】
プライマーＬＴＺ  ３．１  Ｘｈｏ＋及びＦ  ３．８２  Ｓｓｔ  ｎｅｇ（表２参照）を使用して、３０サイクルのＰＣＲ（９４℃５秒、４５℃２０秒、６８℃２分［５サイクル目以降は１サイクルにつき１０秒ずつ増やす］２９回繰り返す）でｐｆｕポリメラーゼを使用して、５’末端から半分（３ａ、抗ゲノムセンス）を増幅及び改変した。これをｐＵＣ１８のＳｍａ１の位置中にライゲーションさせ、ＤＨ５α中にクローニングした（ｐＵＣ１８−３ａ）。Ｓｓｔ１１とＥｃｏＲ１との二重消化によって方向を調べた。プライマーＦ  ３．８２  Ｓｓｔ  ｐｏｓ及びＬＴＺ  ４．６  ｓａｌ−（表２参照）を使用して、ＰＣＲ（９４℃５秒、５０℃２０秒、６８℃２分のサイクル［５サイクル目以降は１サイクルにつき１０秒ずつ増やす］２９回繰り返す）でｐｆｕポリメラーゼを使用して、３’末端から半分（３ｂ）を増幅した。
【０１０８】
これをＳｓｔ１１及びＳａｌ１で切断し、断片ｐＵＣ１８−３ａ（Ｂｉｏｌｉｎｅ社ＱＳリガーゼ）をＳｓｔ１１及びＳａｌ１中にライゲーションさせた。得られたライゲーション混合物を使用してＤＨ５αを形質転換し、得られたクローンをｐＬＴＺ  ３  ＲＲＲＲと名付けた。
【０１０９】
クローニングしたＬＴＺ領域全ての配列を決定し（インペリアルカレッジ医学部）、タンパク質配列が関係しない場合を除いて、変異が存在する領域を再度クローニングした。ローコピープラスミドｐＣＴＰＥはｐＯＬＴＶ５（Ｐｅｅｔｅｒｓら（１９９９），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２３，５００１〜５００９）の変形体であり、これは、ｐＴＷＦ１８作成に使用する方法と似た方法でＨＤＶＲ、Ｔ７ターミネーター及び残存する（その一部はｌａｃ  ｚである）ゲノム領域を削除することによってクローニング効率を高めたものである。この場合、ＰＣＲプライマーは両方とも、改変し（Ｖ５  ６３０ＢＥ＋  ５’−ＣＧＧ  ＡＴＡ  ＴＣＣ  ＡＣＡ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＧＧＧ  ＧＡＴ  ＡＡＣ  ＧＣ−３’（配列番号６２）、及び、Ｖ５  １９０  Ｂａｍ−  ５’−ＣＧＡ  ＧＡＴ  ＣＣＴ  ＣＧＡ  ＧＣＣ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＣ−３’（配列番号６３））、ＢａｍＨ１部位を各側に有する新規のＥｃｏＲＶ平滑末端部位を導入したものである。増殖培地は全てカナマイシン１５μｇ／ｍｌ（Ｇｉｂｃｏ、インビトロジェン社、ペーズリー、英国）を含むものであった。
【０１１０】
ＰＣＲ産物ＬＴＺ  Ｔ７１をｐＣＴＰＥのＥｃｏＲＶ部位中にクローニングし、ｐＣＴＰＥ−ＬＴＺＴ７１を作成して、挿入断片の全配列を調べた。次に、ｐＴＷＦ１８から切断（Ｘｈｏ１及びＳａｌ１の二重消化）したＬＴＺ２をこれにライゲーションしてクローニングしたもの（ＤＨ５α（インビトロジェン社）、カナマイシンプレート及びカナマイシン培地）をＳａｌ１で消化した。ＢａｍＨ１消化とＢａｍＨ１及びＳａｌ１による二重消化とを比較することにより方向を調べた。挿入断片を正しい方向に挿入したプラスミド（ｐＣＴＰＥ−ＬＴＺＴ７１、２）を単にＳａｌ１で切断し、Ｘｈｏ１及びＳａｌ１で消化したＬＴＺ  ３  ＲＲＲＲをこれに添加して、上述の方法でライゲーションさせた。この方法を類似する方法で、５’末端（抗ゲノムセンス）から、全ゲノムとＴ７プロモーター及びＨＤＶＲとをクローニングできるまで続けた（ｐＣＴＰＥ−ＬＴＺＴ７、１、２、３ＲＲＲＲ、４＋５、６＋７、８、９＋１０−ＨＤＶＲ、ｐＬＴＺ  ｆ１Ｔ７又はｐＬＴＺｆ１ｐｏｌ１がよりよい）。
【０１１１】
２．担体タンパク質
ＬＴＺ１株のヌクレオカプシド（Ｎ）、リン（Ｐ）及びマトリックス２（Ｍ２）の配列を複製してクローニングした。ＲＮＡを抽出して（Ｒｎｅａｓｅ、Ｑｕｉａｇｅｎ社）、その後これをＲＴ−ＰＣＲ（Ｓｕｐｅｒｓｋｒｉｐｔ  ２、インビトロジェン社；ＢｉｏＸ−Ａｃｔ、Ｂｉｏｌｉｎｅ社；９４℃５秒、５０℃２０秒、６８℃２分のサイクル［５サイクル目以降は１サイクルにつき１０秒ずつ増やす］、２９回繰り返す）により、プライマー（下記参照）を使用して逆転写して増幅した。この増幅は、各遺伝子の開始コドンのすぐ前にＴ７プロモーター配列を導入し、各停止コドンを越えて更に続けた。
【０１１２】
表３：担体タンパク質の遺伝子の増幅に使用したＰＣＲプライマーの配列
【０１１３】
【表３】
2005538702.tif 000004
【０１１４】
Ｔ７をあらかじめ固定した遺伝子を、上記のＴＷＦについて使用した方法と同様の方法によって、ｐＵＣ１８のｓｍａ１部位中にクローニングした。Ｔ７プロモーターを有していないＰＣＲ産物を、ｐＴａｒｇｅｔ（哺乳類発現、プロメガ社、サウサンプトン、英国）のｓｍａ１部位中にクローニングした
【０１１５】
完全なウイルスのゲノムについて使用した連続調製により、ウイルスのポリメラーゼ遺伝子（Ｌ）をｐＣＴＰＥのＥｃｏＲＶ部位中の領域中にクローニングした。ライゲーションは次の順序で実施した。ｐＣＴＰＥにおいて、Ｔ７  Ｌ  ｓｔａｒｔ、ＬＴＺ  ６＋７、ＬＴＺ８、ＬＴＺ  ９＋１０。ＬＴＺ  Ｔ７  Ｌ  ｓｔａｒｔは、プライマーＴ７−Ｌ（表３）及びＬＴＺ  ７．６Ｘｈｏ−（表２）を使用した上述の１２サイクルトレーラーＰＣＲから実施した、ＰＣＲ（９４℃５秒、６０℃２０秒、６８℃２分を３０サイクル［５サイクル目以降は１サイクルにつき１０秒ずつ増やす］、２９回繰り返す、ｐｆｕ（ストラタジーン社）使用）の産物である。ＬＴＺ  Ｔ７ｓｔａｒｔを、ＣＰＴＥ  ＥｃｏＲＶ部位中にライゲーションさせ、一方、これに続くｐＴＷＦ１８の領域（Ｓａｌ１及びＸｈｏ１）を切断して、各クローニング段階で導入された新しい特有のＳａｌ１部位中にライゲーションさせた。全長ゲノムについて使用した方法と同様の方法で、方向を調べた。
【０１１６】
また、Ｌ遺伝子についても、（プライマーＬ  Ｓｔａｒｔ  Ｘｈｏ＋（表２）及びＬＴＺ  ７．６Ｘｈｏ−（表２）を使用して得られた）スターター配列について記載した方法と似た方法で、Ｔ７プロモーターを前もってここに付加せずに、ｐＴａｒｇｅｔ中にクローニングした。
【０１１７】
３．ＰＣＲ複製による全長コピー
前もってＴ７プロモーターを付加した全ゲノムを、ＰＣＲを３回実施して（Ｂｉｏｌｉｎｅ社、Ｂｉｏ−Ｘ−ａｃｔ、９４℃５秒、６０℃２０秒、６８℃４分を３０サイクル［５サイクル目以降は１サイクルにつき１０秒ずつ増やす］、マトリックスについての記載で既に述べたローコピー（１２）ＰＣＲを使用）コピーして複製した。リーダー領域及び中央領域にはＡＰＶ  ｌｅａｄ  ｅｘｔ及びＬＴＺ  ８．２ｓａｌ産物を使用し、トレーラー領域にはＬＴ７及びＡＰＶ  ｔｒａｉｌ  ｅｘｔ産物を使用した。
【０１１８】
使用したプライマーは下記の通りである：リーダー領域にはＴ７−ＡＰＶ  ｌｅａｄ  １及びＦ  ３．８２  ｓｓｔ  ｐｏｓ（５’−ＣＣＡ  ＣＴＣ  ＴＧＴ  ＡＧＧ  ＡＧＡ  ＣＧＣ  ＣＧＣ  ＧＧＣ  ＡＡＴ  ＴＡＴ  ＧＣＴ  ＴＧ−３’）（配列番号７５）；中央領域にはＦ  ３．８２  ｓｓｔ  ｎｅｇ（５’−ＣＡＡ  ＧＣＡ  ＴＡＡ  ＴＴＧ  ＣＣＧ  ＣＧＧ  ＣＧＴ  ＣＴＣ  ＣＴＡ  ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＧＧ−３’）（配列番号７６）及びＬＴＺ  ８．２  Ｓａｌ−；トレーラー領域にはＬＴＺ  ８．２  Ｘｈｏ＋及びＡＰＶ  ｔｒａｉｌ  ｅｘｔを使用した。この方法で、ＳｓｔＩＩ及びＸｈｏ／Ｓａｌの制限エンドヌクレアーゼ部位を、結合部位３８２６〜３８３１及び８２０４〜８２０９にそれぞれ添加し、その後３つの領域のライゲーションを可能にした。更に、タンパク質コードのＲＲＲＲへの変化をＦ遺伝子のａａ部位２９３〜２９６中に導入した。この領域をＳｓｔＩＩで（リーダー領域）、ＳｓｔＩＩ及びＳａｌ１で（中央領域）、及び、Ｘｈｏ１で（トレーラー領域）切断し、高濃縮Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用して連結させた（一晩、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、ドイツ、３０Ｕ／μｌ）。
【０１１９】
４．ウイルスの再生
ａ）水痘Ｔ７ポリメラーゼ組み換え体の使用
３５ｍｍの孔中のベロ細胞（７０％コンフルエント）を、１．０ｍＬのＯｐｔｉｍｅｍ  １で１回洗浄し、ＭＯＩが０．２の水痘Ｔ７ポリメラーゼ組み換え体を感染させた。１時間インキュベートした後、培地を除去して細胞を１ｍＬのＯｐｔｉｍｅｍ  １で洗浄し、続いて２ｍｌのＯｐｔｉｍｅｍ  １で洗浄した。
【０１２０】
ＭＥＭ（５％）ＦＣＳを添加した。クローニングした担体タンパク質遺伝子４種（ｐＵＣ１８におけるＮ、Ｐ及びＭ２（各０．５μｇ）並びにｐＴＷＦ１８におけるＬ（５０ｎｇ））を混合し、全長ゲノム（ｐＣＰＴＥ中にクローニングした、又は、ライゲーションしたＰＣＲ産物、１μｇ）及び１０μｌのＦｕｇｅｎｅ６（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）を得てこれを３００μｌのｄＭＥＭ中に溶解することによって、ＤＮＡ／Ｆｕｇｅｎｅ  ６（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、ルイス、英国）複合体をクローニングした。完全に混合した後、この混合物を、注意深く震盪しながら細胞に少しずつ添加した。
【０１２１】
５日後に上清を回収し、０．２μｍの濾紙でろ過し、これを使用して新しいベロ細胞を接種した。ＣＰＥを観察し、細胞を染色して間接的免疫蛍光染色法によってＴＲＴ抗原の存在を調べた。これより、そのウイルスは得られた全長コピー由来であることが分かり、Ｆ遺伝子の特有のＲＲＲＲ領域及びそれ以外のＳａｌ１／Ｘｈｏ１結合領域のＰＣＲコピーの配列を調べた。
【０１２２】
ｂ）細胞のリボソームのｐｏｌ１ＲＮＡポリメラーゼの使用
３５ｍｍの孔中のベロ細胞（７０％コンフルエント）又はＣＥＦを１．０ｍＬのＯｐｔｉｍｅｍ  １で１回洗浄した後、２ｍｌのＭＥＭ（５％）ＦＣＳを添加した。クローニングした担体タンパク質遺伝子４種（ｐＴａｒｇｅｔにおけるＮ、Ｐ、Ｍ２（各０．５μｇ）及びＬ（５０μｇ））、ｐｏｌ１全長ゲノム（ｐＣＰＴＥ中にクローニングした、１μｇ）及びＦｕｇｅｎｅ  ６（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）１０μｌを混合してこれを３００μｌのｄＭＥＭ中に溶解することにより、ＤＮＡ／Ｆｕｇｅｎｅ  ６（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）複合体を得た。完全に混合した後、この混合物を、注意深く震盪しながら細胞に少しずつ添加した。
【０１２３】
５日後に細胞を凍結乾燥させ、透明になった上清を使用して新しい細胞を感染させた。ＣＰＥを観察し、細胞を染色して間接的免疫蛍光染色法によってＴＲＴ抗原の存在を調べた。これより、そのウイルスは得られた全長コピー由来であることが分かり、Ｆ遺伝子の特有のＲＲＲＲ領域及びＳａｌ１／Ｘｈｏ１結合領域からＰＣＲコピーの配列を調べた。
【０１２４】
配列調査
「改変ａａ２９３〜２９６」
配列番号
１：  
ＲＲＲＲ
２：  
ＲＲＲＫ
３：  
ＲＲＫＫ
４：  
ＲＫＫＫ
５：  
ＫＫＫＫ
６：  
ＫＫＫＲ
７：  
ＫＫＲＲ
８：
ＫＲＲＲ
９：  
ＳＫＫＫ
１０：  
ＳＲＲＲ
１１：  
ＳＫＫＲ
１２：  
ＳＫＲＲ
１３：  
ＳＲＲＫ
１４：  
ＳＲＫＲ
１５：  
ＳＫＲＫ
１６：  
ＫＧＫＫ
１７：  
ＫＧＲＲ
１８：  
ＫＧＲＫ
１９：  
ＫＧＫＲ
２０：  
ＲＧＫＫ
２１：  
ＲＧＲＲ
２２：  
ＲＧＲＫ
２３：  
ＲＧＫＲ
「野生型ａａ２９３〜２９６  ＡＰＶ及びｈＭＰＶ」
２４：  
ＲＫＥＫ
２５：  
ＲＨＥＲ
２６：  
ＳＧＫＤ
２７：  
ＳＧＫＫ
「ａａ２９３〜２９６を改変したｈＭＰＶのＦタンパク質」
２８：
ＭＳＷＫＶＶＩＩＦＳＬＬＩＴＰＱＨＧＬＫＥＳＹＬＥＥＳＣＳＴＩＴＥＧＹＬＳＶＬＲＴＧＷＹＴＮＶＦＴＬＥＶＧＤＶＥＮＬＴＣＡＤＧＰＳＬＩＫＴＥＬＤＬＴＫＳＡＬＲＥＬＲＴＶＳＡＤＱＬＡＲＥＥＱＩＥＮＰＲＱＳＲＦＶＬＧＡＩＡＬＧＶＡＴＡＡＡＶＴＡＧＶＡＩＡＫＴＩＲＬＥＳＥＶＴＡＩＫＮＡＬＫＫＴＮＥＡＶＳＴＬＧＮＧＶＲＶＬＡＴＡＶＲＥＬＫＤＦＶＳＫＮＬＴＲＡＩＮＫＮＫＣＤＩＡＤＬＫＭＡＶＳＦＳＱＦＮＲＲＦＬＮＶＶＲＱＦＳＤＮＡＧＩＴＰＡＩＳＬＤＬＭＴＤＡＥＬＡＲＡＶＳＮＭＰＴＳＡＧＱＩＫＬＭＬＥＮＲＡＭＶＲＲＫＧＦＧＦＬＩＧＶＹＧＳＳＶＩＹＭＶＱＬＰＩＦＧＶＩＤＴＰＣＷＩＶＫＡＡＰＳＣＲＲＲＲＧＮＹＡＣＬＬＲＥＤＱＧＷＹＣＱＮＡＧＳＴＶＹＹＰＮＥＫＤＣＥＴＲＧＤＨＶＦＣＤＴＡＡＧＩＮＶＡＥＱＳＫＥＣＮＩＮＩＳＴＴＮＹＰＣＫＶＳＴＧＲＨＰＩＳＭＶＡＬＳＰＬＧＡＬＶＡＣＹＫＧＶＳＣＳＩＧＳＮＲＶＧＩＩＫＱＬＮＫＧＣＳＹＩＴＮＱＤＡＤＴＶＴＩＤＮＴＶＹＱＬＳＫＶＥＧＥＱＨＶＩＫＧＲＰＶＳＳＳＦＤＰＶＫＦＰＥＤＱＦＮＶＡＬＤＱＶＦＥＳＩＥＮＳＱＡＬＶＤＱＳＮＲＩＬＳＳＡＥＫＧＮＴＧＦＩＩＶＩＩＬＩＡＶＬＧＳＴＭＩＬＶＳＶＦＩＩＩＫＫＴＫＫＰＴＧＡＰＰＥＬＳＧＶＴＮＮＧＦＩＰＨＮ
２９：
ＭＳＷＫＶＶＩＩＦＳＬＬＩＴＰＱＨＧＬＫＥＳＹＬＥＥＳＣＳＴＩＴＥＧＹＬＳＶＬＲＴＧＷＹＴＮＶＦＴＬＥＶＧＤＶＥＮＬＴＣＡＤＧＰＳＬＩＫＴＥＬＤＬＴＫＳＡＬＲＥＬＲＴＶＳＡＤＱＬＡＲＥＥＱＩＥＮＰＲＱＳＲＦＶＬＧＡＩＡＬＧＶＡＴＡＡＡＶＴＡＧＶＡＩＡＫＴＩＲＬＥＳＥＶＴＡＩＫＮＡＬＫＫＴＮＥＡＶＳＴＬＧＮＧＶＲＶＬＡＴＡＶＲＥＬＫＤＦＶＳＫＮＬＴＲＡＩＮＫＮＫＣＤＩＡＤＬＫＭＡＶＳＦＳＱＦＮＲＲＦＬＮＶＶＲＱＦＳＤＮＡＧＩＴＰＡＩＳＬＤＬＭＴＤＡＥＬＡＲＡＶＳＮＭＰＴＳＡＧＱＩＫＬＭＬＥＮＲＡＭＶＲＲＫＧＦＧＦＬＩＧＶＹＧＳＳＶＩＹＭＶＱＬＰＩＦＧＶＩＤＴＰＣＷＩＶＫＡＡＰＳＣＲＲＲＫＧＮＹＡＣＬＬＲＥＤＱＧＷＹＣＱＮＡＧＳＴＶＹＹＰＮＥＫＤＣＥＴＲＧＤＨＶＦＣＤＴＡＡＧＩＮＶＡＥＱＳＫＥＣＮＩＮＩＳＴＴＮＹＰＣＫＶＳＴＧＲＨＰＩＳＭＶＡＬＳＰＬＧＡＬＶＡＣＹＫＧＶＳＣＳＩＧＳＮＲＶＧＩＩＫＱＬＮＫＧＣＳＹＩＴＮＱＤＡＤＴＶＴＩＤＮＴＶＹＱＬＳＫＶＥＧＥＱＨＶＩＫＧＲＰＶＳＳＳＦＤＰＶＫＦＰＥＤＱＦＮＶＡＬＤＱＶＦＥＳＩＥＮＳＱＡＬＶＤＱＳＮＲＩＬＳＳＡＥＫＧＮＴＧＦＩＩＶＩＩＬＩＡＶＬＧＳＴＭＩＬＶＳＶＦＩＩＩＫＫＴＫＫＰＴＧＡＰＰＥＬＳＧＶＴＮＮＧＦＩＰＨＮ
３０：
ＭＳＷＫＶＶＩＩＦＳＬＬＩＴＰＱＨＧＬＫＥＳＹＬＥＥＳＣＳＴＩＴＥＧＹＬＳＶＬＲＴＧＷＹＴＮＶＦＴＬＥＶＧＤＶＥＮＬＴＣＡＤＧＰＳＬＩＫＴＥＬＤＬＴＫＳＡＬＲＥＬＲＴＶＳＡＤＱＬＡＲＥＥＱＩＥＮＰＲＱＳＲＦＶＬＧＡＩＡＬＧＶＡＴＡＡＡＶＴＡＧＶＡＩＡＫＴＩＲＬＥＳＥＶＴＡＩＫＮＡＬＫＫＴＮＥＡＶＳＴＬＧＮＧＶＲＶＬＡＴＡＶＲＥＬＫＤＦＶＳＫＮＬＴＲＡＩＮＫＮＫＣＤＩＡＤＬＫＭＡＶＳＦＳＱＦＮＲＲＦＬＮＶＶＲＱＦＳＤＮＡＧＩＴＰＡＩＳＬＤＬＭＴＤＡＥＬＡＲＡＶＳＮＭＰＴＳＡＧＱＩＫＬＭＬＥＮＲＡＭＶＲＲＫＧＦＧＦＬＩＧＶＹＧＳＳＶＩＹＭＶＱＬＰＩＦＧＶＩＤＴＰＣＷＩＶＫＡＡＰＳＣＲＲＫＫＧＮＹＡＣＬＬＲＥＤＱＧＷＹＣＱＮＡＧＳＴＶＹＹＰＮＥＫＤＣＥＴＲＧＤＨＶＦＣＤＴＡＡＧＩＮＶＡＥＱＳＫＥＣＮＩＮＩＳＴＴＮＹＰＣＫＶＳＴＧＲＨＰＩＳＭＶＡＬＳＰＬＧＡＬＶＡＣＹＫＧＶＳＣＳＩＧＳＮＲＶＧＩＩＫＱＬＮＫＧＣＳＹＩＴＮＱＤＡＤＴＶＴＩＤＮＴＶＹＱＬＳＫＶＥＧＥＱＨＶＩＫＧＲＰＶＳＳＳＦＤＰＶＫＦＰＥＤＱＦＮＶＡＬＤＱＶＦＥＳＩＥＮＳＱＡＬＶＤＱＳＮＲＩＬＳＳＡＥＫＧＮＴＧＦＩＩＶＩＩＬＩＡＶＬＧＳＴＭＩＬＶＳＶＦＩＩＩＫＫＴＫＫＰＴＧＡＰＰＥＬＳＧＶＴＮＮＧＦＩＰＨＮ
３１：
ＭＳＷＫＶＶＩＩＦＳＬＬＩＴＰＱＨＧＬＫＥＳＹＬＥＥＳＣＳＴＩＴＥＧＹＬＳＶＬＲＴＧＷＹＴＮＶＦＴＬＥＶＧＤＶＥＮＬＴＣＡＤＧＰＳＬＩＫＴＥＬＤＬＴＫＳＡＬＲＥＬＲＴＶＳＡＤＱＬＡＲＥＥＱＩＥＮＰＲＱＳＲＦＶＬＧＡＩＡＬＧＶＡＴＡＡＡＶＴＡＧＶＡＩＡＫＴＩＲＬＥＳＥＶＴＡＩＫＮＡＬＫＫＴＮＥＡＶＳＴＬＧＮＧＶＲＶＬＡＴＡＶＲＥＬＫＤＦＶＳＫＮＬＴＲＡＩＮＫＮＫＣＤＩＡＤＬＫＭＡＶＳＦＳＱＦＮＲＲＦＬＮＶＶＲＱＦＳＤＮＡＧＩＴＰＡＩＳＬＤＬＭＴＤＡＥＬＡＲＡＶＳＮＭＰＴＳＡＧＱＩＫＬＭＬＥＮＲＡＭＶＲＲＫＧＦＧＦＬＩＧＶＹＧＳＳＶＩＹＭＶＱＬＰＩＦＧＶＩＤＴＰＣＷＩＶＫＡＡＰＳＣＫＫＲＲＧＮＹＡＣＬＬＲＥＤＱＧＷＹＣＱＮＡＧＳＴＶＹＹＰＮＥＫＤＣＥＴＲＧＤＨＶＦＣＤＴＡＡＧＩＮＶＡＥＱＳＫＥＣＮＩＮＩＳＴＴＮＹＰＣＫＶＳＴＧＲＨＰＩＳＭＶＡＬＳＰＬＧＡＬＶＡＣＹＫＧＶＳＣＳＩＧＳＮＲＶＧＩＩＫＱＬＮＫＧＣＳＹＩＴＮＱＤＡＤＴＶＴＩＤＮＴＶＹＱＬＳＫＶＥＧＥＱＨＶＩＫＧＲＰＶＳＳＳＦＤＰＶＫＦＰＥＤＱＦＮＶＡＬＤＱＶＦＥＳＩＥＮＳＱＡＬＶＤＱＳＮＲＩＬＳＳＡＥＫＧＮＴＧＦＩＩＶＩＩＬＩＡＶＬＧＳＴＭＩＬＶＳＶＦＩＩＩＫＫＴＫＫＰＴＧＡＰＰＥＬＳＧＶＴＮＮＧＦＩＰＨＮ
３２：
ＭＳＷＫＶＶＩＩＦＳＬＬＩＴＰＱＨＧＬＫＥＳＹＬＥＥＳＣＳＴＩＴＥＧＹＬＳＶＬＲＴＧＷＹＴＮＶＦＴＬＥＶＧＤＶＥＮＬＴＣＡＤＧＰＳＬＩＫＴＥＬＤＬＴＫＳＡＬＲＥＬＲＴＶＳＡＤＱＬＡＲＥＥＱＩＥＮＰＲＱＳＲＦＶＬＧＡＩＡＬＧＶＡＴＡＡＡＶＴＡＧＶＡＩＡＫＴＩＲＬＥＳＥＶＴＡＩＫＮＡＬＫＫＴＮＥＡＶＳＴＬＧＮＧＶＲＶＬＡＴＡＶＲＥＬＫＤＦＶＳＫＮＬＴＲＡＩＮＫＮＫＣＤＩＡＤＬＫＭＡＶＳＦＳＱＦＮＲＲＦＬＮＶＶＲＱＦＳＤＮＡＧＩＴＰＡＩＳＬＤＬＭＴＤＡＥＬＡＲＡＶＳＮＭＰＴＳＡＧＱＩＫＬＭＬＥＮＲＡＭＶＲＲＫＧＦＧＦＬＩＧＶＹＧＳＳＶＩＹＭＶＱＬＰＩＦＧＶＩＤＴＰＣＷＩＶＫＡＡＰＳＣＫＲＲＲＧＮＹＡＣＬＬＲＥＤＱＧＷＹＣＱＮＡＧＳＴＶＹＹＰＮＥＫＤＣＥＴＲＧＤＨＶＦＣＤＴＡＡＧＩＮＶＡＥＱＳＫＥＣＮＩＮＩＳＴＴＮＹＰＣＫＶＳＴＧＲＨＰＩＳＭＶＡＬＳＰＬＧＡＬＶＡＣＹＫＧＶＳＣＳＩＧＳＮＲＶＧＩＩＫＱＬＮＫＧＣＳＹＩＴＮＱＤＡＤＴＶＴＩＤＮＴＶＹＱＬＳＫＶＥＧＥＱＨＶＩＫＧＲＰＶＳＳＳＦＤＰＶＫＦＰＥＤＱＦＮＶＡＬＤＱＶＦＥＳＩＥＮＳＱＡＬＶＤＱＳＮＲＩＬＳＳＡＥＫＧＮＴＧＦＩＩＶＩＩＬＩＡＶＬＧＳＴＭＩＬＶＳＶＦＩＩＩＫＫＴＫＫＰＴＧＡＰＰＥＬＳＧＶＴＮＮＧＦＩＰＨＮ
３３：
ＭＳＷＫＶＶＩＩＦＳＬＬＩＴＰＱＨＧＬＫＥＳＹＬＥＥＳＣＳＴＩＴＥＧＹＬＳＶＬＲＴＧＷＹＴＮＶＦＴＬＥＶＧＤＶＥＮＬＴＣＡＤＧＰＳＬＩＫＴＥＬＤＬＴＫＳＡＬＲＥＬＲＴＶＳＡＤＱＬＡＲＥＥＱＩＥＮＰＲＱＳＲＦＶＬＧＡＩＡＬＧＶＡＴＡＡＡＶＴＡＧＶＡＩＡＫＴＩＲＬＥＳＥＶＴＡＩＫＮＡＬＫＫＴＮＥＡＶＳＴＬＧＮＧＶＲＶＬＡＴＡＶＲＥＬＫＤＦＶＳＫＮＬＴＲＡＩＮＫＮＫＣＤＩＡＤＬＫＭＡＶＳＦＳＱＦＮＲＲＦＬＮＶＶＲＱＦＳＤＮＡＧＩＴＰＡＩＳＬＤＬＭＴＤＡＥＬＡＲＡＶＳＮＭＰＴＳＡＧＱＩＫＬＭＬＥＮＲＡＭＶＲＲＫＧＦＧＦＬＩＧＶＹＧＳＳＶＩＹＭＶＱＬＰＩＦＧＶＩＤＴＰＣＷＩＶＫＡＡＰＳＣＳＲＲＲＧＮＹＡＣＬＬＲＥＤＱＧＷＹＣＱＮＡＧＳＴＶＹＹＰＮＥＫＤＣＥＴＲＧＤＨＶＦＣＤＴＡＡＧＩＮＶＡＥＱＳＫＥＣＮＩＮＩＳＴＴＮＹＰＣＫＶＳＴＧＲＨＰＩＳＭＶＡＬＳＰＬＧＡＬＶＡＣＹＫＧＶＳＣＳＩＧＳＮＲＶＧＩＩＫＱＬＮＫＧＣＳＹＩＴＮＱＤＡＤＴＶＴＩＤＮＴＶＹＱＬＳＫＶＥＧＥＱＨＶＩＫＧＲＰＶＳＳＳＦＤＰＶＫＦＰＥＤＱＦＮＶＡＬＤＱＶＦＥＳＩＥＮＳＱＡＬＶＤＱＳＮＲＩＬＳＳＡＥＫＧＮＴＧＦＩＩＶＩＩＬＩＡＶＬＧＳＴＭＩＬＶＳＶＦＩＩＩＫＫＴＫＫＰＴＧＡＰＰＥＬＳＧＶＴＮＮＧＦＩＰＨＮ
３４：
ＭＳＷＫＶＶＩＩＦＳＬＬＩＴＰＱＨＧＬＫＥＳＹＬＥＥＳＣＳＴＩＴＥＧＹＬＳＶＬＲＴＧＷＹＴＮＶＦＴＬＥＶＧＤＶＥＮＬＴＣＡＤＧＰＳＬＩＫＴＥＬＤＬＴＫＳＡＬＲＥＬＲＴＶＳＡＤＱＬＡＲＥＥＱＩＥＮＰＲＱＳＲＦＶＬＧＡＩＡＬＧＶＡＴＡＡＡＶＴＡＧＶＡＩＡＫＴＩＲＬＥＳＥＶＴＡＩＫＮＡＬＫＫＴＮＥＡＶＳＴＬＧＮＧＶＲＶＬＡＴＡＶＲＥＬＫＤＦＶＳＫＮＬＴＲＡＩＮＫＮＫＣＤＩＡＤＬＫＭＡＶＳＦＳＱＦＮＲＲＦＬＮＶＶＲＱＦＳＤＮＡＧＩＴＰＡＩＳＬＤＬＭＴＤＡＥＬＡＲＡＶＳＮＭＰＴＳＡＧＱＩＫＬＭＬＥＮＲＡＭＶＲＲＫＧＦＧＦＬＩＧＶＹＧＳＳＶＩＹＭＶＱＬＰＩＦＧＶＩＤＴＰＣＷＩＶＫＡＡＰＳＣＲＧＲＲＧＮＹＡＣＬＬＲＥＤＱＧＷＹＣＱＮＡＧＳＴＶＹＹＰＮＥＫＤＣＥＴＲＧＤＨＶＦＣＤＴＡＡＧＩＮＶＡＥＱＳＫＥＣＮＩＮＩＳＴＴＮＹＰＣＫＶＳＴＧＲＨＰＩＳＭＶＡＬＳＰＬＧＡＬＶＡＣＹＫＧＶＳＣＳＩＧＳＮＲＶＧＩＩＫＱＬＮＫＧＣＳＹＩＴＮＱＤＡＤＴＶＴＩＤＮＴＶＹＱＬＳＫＶＥＧＥＱＨＶＩＫＧＲＰＶＳＳＳＦＤＰＶＫＦＰＥＤＱＦＮＶＡＬＤＱＶＦＥＳＩＥＮＳＱＡＬＶＤＱＳＮＲＩＬＳＳＡＥＫＧＮＴＧＦＩＩＶＩＩＬＩＡＶＬＧＳＴＭＩＬＶＳＶＦＩＩＩＫＫＴＫＫＰＴＧＡＰＰＥＬＳＧＶＴＮＮＧＦＩＰＨＮ
「プライマー」
３５：
ＡＰＶ  ｌｅａｄ
ＣＧＡＧＡＡＡＡＡＡＡＣＧＣＡＴＴＣＡＡＧＣＡＧＧ
３６：  
Ｍ２ｓｔａｒｔ＋  
ＧＡＴＧＴＣＴＡＧＧＣＧＡＡＡＴＣＣＣＴＧＣ  
３７：
ＡＰＶ  ｌｅａｄ  ｅｘｔ  
ＡＣＧＡＧＡＡＡＡＡＡＡＣＧＣＡＴＴＣＡＡＧＣＡＧＧＴＴＣＴ
３８：
ＬＴＺ  ８．２  ｓａｌ  ｎｅｇ  
ＧＧＧＴＡＴＣＴＡＴＧＡＴＧＧＴＣＧＡＣＡＧＡＴＧＴＧ
３９：
ＬＴ７  
ＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＡＣＣＡＡＴＡＴＧＧＡＡＡＴＡＴＣＣＧＡＴＧＡＧ
４０：
ＡＰＶ  ｔｒａｉｌ  ｅｘｔ  
ＧＣＴＡＡＡＡＡＴＴＴＧＡＴＧＡＡＴＡＣＧＧＴＴＴＴＴＴＴＣＴＣＧＴ
４１：
Ｔ７  ＡＰＶ  ｌｅａｄ１    
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＡＣＧＡＧＡＡＡＡＡＡＡＣＧＣＡＴＴＣＡＡＧＣＡＧＧ
４２：
ＬＴＺ  １．１  ｓａｌ  −
ＣＴＣＡＡＧＧＴＴＧＧＧＧＧＧＴＣＧＡＣＣ
４３：
ｐｏｌ  １  ｓｔａｒｔ＋
ＡＣＧＧＧＣＣＧＧＣＣＣＣＣＴＧＣＧＴＧ
４４：
Ｌｅａｄ  Ｓａｐ  １
ＡＡＡＡＧＣＴＣＴＴＣＡＡＴＴＡＣＧＡＧＡＡＡＡＡＡＡＣＧＣＡＴＴＣＡＡＧＣＡＧＧＴＴＣ
４５：
ＬＴＺ  １．１  ｓａｌ  −  
ＣＴＣＡＡＧＧＴＴＧＧＧＧＧＧＴＣＧＡＣＣ
４６：
ＬＴＺ  １．１  Ｘｈｏ＋
ＧＧＣＡＴＧＴＡＣＡＡＡＧＣＴＣＧＡＧＣＣＣ
４７：
ＬＴＺ  ３．１  ｓａｌ  −
ＣＡＴＴＧＣＡＡＧＴＧＡＴＧＴＴＧＴＣＧＡＣＡＴＴＣＣＣ
４８：
ＬＴＺ  ３．１  Ｘｈｏ＋
ＣＣＴＣＧＡＡＡＴＡＧＧＧＡＡＴＣＴＣＧＡＧＡＡＣＡＴＣＡＣ
４９：
Ｆ  ３．８２  Ｓｓｔ−      
ＣＡＡＧＣＡＴＡＡＴＴＧＣＣＧＣＧＧＣＧＴＣＴＣＣＴＡＣＡＧＡＧＴＧＧ
５０：
Ｆ  ３．８２  Ｓｓｔ＋      
ＣＣＡＣＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＧＣＣＧＣＧＧＣＡＡＴＴＡＴＧＣＴＴＧ
５１：
ＬＴＺ  ４．６  ｓａｌ  −  
ＧＣＡＧＧＧＡＴＴＴＣＧＣＧＴＧＧＡＣＡＴＣＴＴＣ
５２：
ＬＴＺ  ４．６  Ｘｈｏ＋    
ＣＡＡＧＴＧＡＡＧＡＴＣＴＣＧＡＧＧＣＧＡＡＡＴＣＣＣ
５３：
ＬＴＺ  ７．６  ｓａｌ−    
ＧＡＴＣＧＴＡＴＴＣＡＡＣＴＣＧＡＧＡＡＣＴＴＡＣＣＴＧＡＣ
５４：
ＬＴＺ  ７．６  Ｘｈｏ＋    
ＧＡＴＣＧＴＡＴＴＣＡＡＣＴＣＧＡＧＡＡＣＴＴＡＣＣＴＧＡＣ
５５：
ＬＴＺ  ９．９  ｓａｌ−    
ＧＣＴＡＴＧＡＴＣＴＴＴＴＧＣＧＴＣＧＡＣＡＡＡＧＣＡＣ
５６：
ＬＴＺ  ９．９  ｘｈｏ＋    
ＧＴＡＣＡＴＣＣＡＧＴＧＣＴＴＴＣＴＣＧＡＧＧＣ
５７：
ＬＴＺ１１．９  ｓａｌ−    
ＣＡＧＴＧＡＣＡＧＧＴＴＴＴＴＧＧＴＣＧＡＣＴＡＴＧ
５８：
ＬＴＺ１１．９  ｘｈｏ＋    
ＧＣＴＧＡＧＧＧＴＧＡＣＡＴＡＣＴＣＧＡＧＣ
５９：
ＨＤＶＲ  Ｘｈｏ−   
ＧＣＡＧＣＣＧＧＡＣＴＣＧＡＧＣＴＣＴＣＣＣ
６０：
ｐ１８−ｅｃｏ４２０−    
ＴＡＧＡＡＴＴＣＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧＣ
６１：
ｐ１８−４００＋  
ＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣ．
６２：
Ｖ５  ６３０ＢＥ＋  
ＣＧＧＡＴＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡＴＣＣＧＧＧＧＡＴＡＡＣＧＣ
６３：
Ｖ５  １９０  Ｂａｍ−  
ＣＧＡＧＡＴＣＣＴＣＧＡＧＣＣＧＧＡＴＣＣＴＣ
６４：
Ｔ７−Ｎ      
ＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＣＡＡＧＴＣＡＡＡＡＡＴＧＴＣＴＣＴＴＧ
６５：
Ｎ  ｓｔａｒｔ＋            
ＧＴＣＡＡＡＡＴＧＴＣＴＣＴＴＧＡＡＡＧ
６６：
Ｐｓｔａｒｔ−              
ＣＡＧＧＧＡＡＡＧＡＣＡＴＴＧＴＴＡＣ
６７：
Ｔ７−Ｐ             
ＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＣＡＡＧＴＡＡＣＡＡＴＧＴＣＴＴＴＣＣ
６８：
Ｐｓｔａｒｔ  ＋            
ＧＴＡＡＣＡＡＴＧＴＣＴＴＴＣＣＣＴＧ
６９：
Ｐｓｔｏｐ  ｎｅｇ  ｅｘｔ  
ＧＡＣＴＴＧＴＣＣＣＡＴＴＴＴＴＴＣＡＴＡＡＣＴＡＣＡＧＡＴＣＡＡＧ
７０：
Ｔ７−Ｍ２           
ＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＣＡＡＧＴＧＡＡＧＡＴＧＴＣＴＡＧ
７１：
Ｍ２ｓｔａｒｔ＋            
ＧＡＴＧＴＣＴＡＧＧＣＧＡＡＡＴＣＣＣ
７２：
Ｍ２−１ｓｔｎｅｇ   
ＧＣＡＴＴＧＣＡＣＴＴＡＡＴＴＡＴＴＧＣＴＧＴＣＡＣＣＣ
７３：
Ｔ７−Ｌ             
ＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＡＣＣＡＡＴＡＴＧＧＡＡＡＴＡＴＣＣＧＡＴＧＡＧＴＣ
７４：
Ｌ  ｓｔａｒｔ  Ｘｈｏ＋    
ＧＡＡＴＧＡＡＡＡＡＣＡＡＧＧＡＣＣＡＡＴＡＴＧＧＡＡＡＴＡＴＣＣＧＡＴＧＡＧ
７５：
Ｆ３．８２ｓｓｔｐｏｓ
ＣＣＡＣＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＧＣＣＧＣＧＧＣＡＡＴＴＡＴＧＣＴＴＧ
７６：
Ｆ３．８２ｓｓｔｎｅｇ
ＣＡＡＧＣＡＴＡＡＴＴＧＣＣＧＣＧＧＣＧＴＣＴＣＣＴＡＣＡＧＡＧＴＧＧ
「ＲＳＶの野生型ａａ３２３〜３２８」
７７：  
Ｈｕｍａｎ  ＲＳＶ  Ｆ  ３２３−３２８
ＴＴＮＴＫＥ
７８：  
ｈｕｍａｎ  ＲＳＶ  Ｆ  ３２３−３２８
ＴＴＮＩＫＥ
７９：  
Ｂｏｖｉｎｅ  ＲＳＶ  Ｆ  ３２３−３２８
ＴＴＤＮＫＥ
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】弱毒化及び復帰の間に起こる配列変化の例。
【図２】クローニング方法。
【図３】全ゲノムに対するＥＴＣ。
【図４】融合タンパク質のａａ２９３〜２９６の位置における変化。
【図１】
2005538702.tif 000005
【図２】
2005538702.tif 000006
【図３】
2005538702.tif 000007
【図４】
2005538702.tif 000008
【配列表】
2005538702000001.app
【国際調査報告】
2005538702.tif 000009
2005538702.tif 000010
2005538702.tif 000011
2005538702.tif 000012
2005538702.tif 000013
2005538702.tif 000014