(57)【要約】蛍光修飾された脂肪酸結合性タンパク質を含む、試薬を利用する、脳卒中を早期に探知する方法が記載される。結合と非結合の状態間における蛍光の相違が注目されている。血液に拠った、上昇した非結合遊離脂肪酸の濃度が、脳卒中の指標として利用されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における脳卒中を探知する方法であって、
虚血性脳卒中に一致する徴候を示す哺乳動物に由来する体液試料を準備する工程；
試料に、水性溶液と、蛍光成分で標識された脂肪酸結合性タンパク質を含む試薬とを混合する工程、なお、前記試薬は、水性溶液中では第１の蛍光を示し、また、前記脂肪酸結合性タンパク質が脂肪酸に結合された際には、水性溶液中で、測定可能な程度に相違した第２の蛍光を示す；  および
前記体液試料に、前記水性溶液および前記試薬を混合した後、前記第２の蛍光を測定して、前記体液試料中の非結合遊離脂肪酸の濃度を定量する工程を含んでなる方法。
【請求項２】
該体液は、全血、血清、および血漿からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
非結合遊離脂肪酸の体液中濃度を用いて、患者における脳卒中治療の経過をモニターする方法であって、
脳卒中治療の期間を通して、異なる時点における、前記患者から採取した体液試料中の非結合遊離脂肪酸濃度を測定する工程；
測定された非結合遊離脂肪酸の濃度を、非結合遊離脂肪酸の閾値濃度と比較する工程；なお、前記閾値濃度は、脳卒中に関して無症候である健常者群の、体液中の非結合遊離脂肪酸の測定に基いて決定されている、  および
その脳卒中治療の成功を示唆する、脳卒中治療の期間内、ある所与の時点における患者の体液試料に基づく、非結合遊離脂肪酸の濃度が、健常者群に基づく非結合遊離脂肪酸の閾値濃度へと向かう傾向にあるかを判定する工程を含んでなる方法。
【請求項４】
脳卒中に一致する徴候を見せている患者における、脳卒中の発症を判定する方法であって、
前記患者から採取した体液試料中の非結合遊離脂肪酸濃度を測定する工程；
測定された非結合遊離脂肪酸の濃度を、非結合遊離脂肪酸の閾値濃度と比較する工程；なお、前記閾値は、脳卒中を有していない健常者群の、体液中の非結合遊離脂肪酸の測定に基いて決定されている、  および
患者の体液試料に基づく、非結合遊離脂肪酸濃度が、健常者群に基づく非結合遊離脂肪酸の閾値濃度と比べて上昇しているかを判定する工程、なお、前記相対的上昇は、脳卒中のリスクの増大を示唆する；
を含んでなる方法。
【請求項５】
前記体液は、血液、血清、および血漿からなる群から選択される請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記測定工程は、さらに、
前記体液試料に、水性溶液、および蛍光成分で標識された脂肪酸結合性タンパク質を含む試薬を混合する工程；なお、前記試薬は、水性溶液中で第１の蛍光を示し、また、前記脂肪酸結合性タンパク質が脂肪酸と結合した際には、水性溶液中で、測定可能な程度に相違した第２の蛍光を示す；  および
前記体液試料に、前記水性溶液および前記試薬を混合した後、前記第２の蛍光を測定して、前記体液試料中の非結合遊離脂肪酸の濃度を定量する工程を含んでなることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記第２の蛍光の測定工程は、前記試薬が前記第１の蛍光を示す波長とは相違している波長で実施されることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記第２の蛍光の測定用波長は、約４２０ｎｍ〜約４６０ｎｍであり、その際、前記試薬が前記第１の蛍光を示す波長は、約４９５ｎｍ〜約５６０ｎｍであることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記血液試料中の、全遊離脂肪酸並びにアルブミンを測定する工程、および
前記全遊離脂肪酸と前記アルブミンの比を算定する工程をさらに含んでいることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記脂肪酸結合性タンパク質は、ラット腸脂肪酸結合性タンパク質、ヒト脂肪細胞脂肪酸結合性タンパク質、またはラット心臓脂肪酸結合性タンパク質であり、前記蛍光成分は、アクリロダン、ダンジルアジリジン、４−［Ｎ−［（２−ヨードアセトキシ）エチル］−Ｎ−メチルアミノ］−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾールエステル（ＩＡＮＢＤＥ）、または４−［Ｎ−［（２−ヨードアセトキシ）エチル］−Ｎ−メチルアミノ］−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＩＡＮＢＤＡ）であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記混合および測定工程の前記試薬は、アクリロダンで標識された脂肪酸結合性タンパク質であり、前記脂肪酸結合性タンパク質は、残基２７、８１、８２、または８４にシステインを、あるいは、残基７２にアラニンを有するラット腸脂肪酸結合性タンパク質、ないしは、残基２７にリシンを有するラット心臓脂肪酸結合性タンパク質からなる変異タンパク質であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記混合および測定工程の前記試薬は、アクリロダンで標識されたラット腸脂肪酸結合性タンパク質であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
前記試薬は、アクリロダンで標識された、残基７２にアラニンを有するラット腸脂肪酸結合性タンパク質であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
非虚血集団から求められた非結合遊離脂肪酸の濃度の平均値より２標準偏差単位を超えて高い非結合遊離脂肪酸の濃度が脳卒中を示すものである請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
非虚血の集団に基づき決定される、非結合遊離脂肪酸濃度の平均値の約２倍を超える非結合遊離脂肪酸の濃度は、脳卒中を示すとすることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１６】
前記測定工程は、さらに、
前記体液試料に、水性溶液、ならびに、７−ヒドロキシクマリン、およびアントラニロイルからなる群から選択された蛍光成分で標識されたアルブミンを含む試薬を混合する工程、なお、前記試薬は、水性溶液中で第１の蛍光を示し、また、前記アルブミンが脂肪酸に結合した際には、水性溶液中で、測定可能な程度に相違した第２の蛍光を示す；  および
前記体液試料に前記水性溶液および前記試薬を混合した後に、前記第２の蛍光を測定して、前記体液試料中の非結合遊離脂肪酸の濃度を決定する工程を含んでなることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項１７】
出血するリスクの高い患者を判別する方法であって、
前記患者から採取した体液試料中の非結合遊離脂肪酸濃度を測定する工程；
測定された非結合遊離脂肪酸の濃度を非結合遊離脂肪酸の閾値濃度と比較する工程、なお、前記閾値濃度は、虚血を有さない健常者群の体液中の非結合遊離脂肪酸の測定に基づき決定されている；  および
患者の体液試料に基づく、非結合遊離脂肪酸濃度が、健常者群に基づく非結合遊離脂肪酸の閾値濃度と比べて上昇しているかを判定する工程、なお、前記相対的上昇は、出血のリスクの増大を示唆する；
を含んでなる方法。
【請求項１８】
脳卒中後３年以内に死亡するリスクの高い患者を判別する方法であって、
前記患者から採取した体液試料中の非結合遊離脂肪酸濃度を測定する工程；
測定された非結合遊離脂肪酸の濃度を非結合遊離脂肪酸の閾値濃度と比較する工程、なお、前記閾値濃度は、脳卒中を有さない健常者群の体液中の非結合または水溶性遊離脂肪酸の測定に基づき決定されている；  および
患者の体液試料に基づく、非結合遊離脂肪酸濃度が、健常者群に基づく非結合遊離脂肪酸の閾値濃度と比べて上昇しているかを判定する工程、なお、前記相対的上昇は、脳卒中後３年以内の死亡のリスク増大を示唆する；
を含んでなる方法。
【請求項１９】
虚血性脳卒中を診断する方法であって、
虚血性脳卒中に一致する徴候を示している患者を特定し；
該患者から体液試料を採取し；
試料中の非結合遊離脂肪酸濃度を測定し；  および
測定された非結合遊離脂肪酸の濃度は、虚血性脳卒中を示唆するに十分に上昇しているかを確かめる
ことを含んでなる方法。
【請求項２０】
さらに、測定された非結合遊離脂肪酸の濃度が、虚血性脳卒中を示唆する際には、該患者に血栓溶解療法を施す
ことを含むことを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
発明の分野
本発明は、全血、血漿、および血清などの体液中の非結合遊離脂肪酸測定による脳卒中の診断に関する。
【０００２】
関連技術の記述
脳卒中は、脳組織への血流の中断と定義される。これは、脳の特定部分に対する遮断、あるいは、例えば、心臓による血液の押し出しが全く不足する際の実質的な全血流の低下であり得る。より多くの場合、脳に供給している血管の閉塞または破裂によって、脳の特定部分への流れが途絶された際、脳卒中が起こる。一般に、脳に血液を供給する動脈内における、例えば、塞栓症または血栓の形成に因る、脈管の閉塞は、虚血性脳卒中として知られている。一般に、動脈瘤に因る、脳内血管の破裂は、出血性脳卒中として知られている。
【０００３】
虚血性脳卒中の場合、血流の中断は一時的である可能性があり、これは、一過性虚血現象（ＴＩＡ）として知られている。この場合、患者は多くの場合、臨床的または測定可能な有害な後遺症を患うことはないが、その後の脳卒中のリスクは高い。対照的に、閉塞が二三時間以内に解消しない患者は、永久的な損傷を被り、しばしば、死に至る。これは、ここで閉塞された脈管によって、通常は栄養物ならびに酸素を供給されていた脳細胞（組織）の死の結果である。この組織の死または梗塞は、コンピュータ支援断層撮影法（ＣＴスキャン）または核磁気共鳴イメージング法（ＭＲＩ）によって検出は可能であるが、但し、脳卒中（最初の症候）が開始した後、長い時間の経過後である。出血の場合、脳は、血液で充満され始め、組織の破壊に至る。
【０００４】
脳卒中は、先進国においては、第３番目の死亡原因である。新たな脳卒中の症例が、米国だけでも毎年約７５０，０００人を冒している。見積もられる治療の費用、ならびに脳卒中に因る死亡および不全症状の結果としての生産性の損失は、米国内で、約４００億ドルである。脳卒中に対する利用可能な唯一の有効な治療は、酵素的に分解するタンパク質よって血餅を破壊する、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）などの血栓溶解剤の配給であり、血餅を回避する。使用が遅すぎる際には有害な作用（出血）があるため、ｔ−ＰＡは、最初の症候から３時間以内に、投与が可能であるのみである。さらには、ｔ−ＰＡは、虚血性脳卒中においてのみ使用可能であり、出血性脳卒中における使用は、一般に死に至る。
【０００５】
従って、血栓溶解療法は、迅速に診断され、かつ、出血性脳卒中が除外される場合にのみ使用可能である。実質的には、現行の診断方法は、完全に臨床所見、一般に、救急医の見解に依存している。医師が脳卒中と推断し、その患者は、恐らく血栓溶解療法の候補であると考えたならば、それから、出血（ＣＴスキャンは初期段階に出血を検出可能である）を除外するために、患者は迅速にＣＴスキャンを受けなければならない。一般に、これらの決定および手順には時間を要するため、極少数の潜在的に適格である患者が、血栓溶解療法を受けるのみである。
【０００６】
そのため、個体における虚血性脳卒中の存在または不在を判定でき、かつ、虚血性と出血性の脳卒中間の区別ができる、簡単で迅速な血液検査の利用に対する長い間の待望がある。ここに記載される診断手法、血液、血清、または血漿のような体液中の非結合遊離脂肪酸の測定は、虚血現象を見つける上で高い潜在的な能力を有する、簡単、安価で、実質的に即時性であり、容易に利用可能な測定をもたらす。
【０００７】
（発明の概要）
本発明者は、脳卒中の間、非結合遊離脂肪酸の濃度が高められることを見出した。この知見は、脳卒中を探知および診断する、かつ可能であれば、虚血性脳卒中を、出血性の脳卒中、片頭痛、および発作などの、類似の徴候を示す可能性のある他の症状から、区別する上で便利な手段を提供する。
【０００８】
一形態において、
虚血性脳卒中に一致する徴候を示す哺乳動物に由来する体液試料を準備する工程；
試料に、水性溶液と、蛍光成分で標識された脂肪酸結合性タンパク質を含む試薬とを混合する工程、なお、該試薬は、水性溶液中では第１の蛍光を示し、また、該脂肪酸結合性タンパク質が脂肪酸に結合された際には、水性溶液中で、測定可能な程度に相違した第２の蛍光を示す；  および
該体液試料に、水性溶液および試薬を混合した後、該第２の蛍光を測定して、体液試料中の非結合遊離脂肪酸の濃度を定量する工程を含んでいる、
哺乳動物における脳卒中を探知する方法が記載される。好ましい態様において、体液は、全血、血清、および血漿を含んでいる群から選択される。
【０００９】
他の形態において、
脳卒中治療の期間を通して、異なる時点における、前記患者から採取した体液試料中の非結合遊離脂肪酸濃度を測定する工程；
測定された非結合遊離脂肪酸の濃度を、非結合遊離脂肪酸の閾値濃度と比較する工程；なお、閾値濃度は、脳卒中に関して無症候である健常者群の、体液中の非結合遊離脂肪酸の測定に基いて決定されている、  および
その脳卒中治療の成功を示唆する、脳卒中治療の期間内、ある所与の時点における患者の体液試料に基づく、非結合遊離脂肪酸の濃度が、健常者群に基づく非結合遊離脂肪酸の閾値濃度へと向かう傾向にあるかを判定する工程を含んでいる、
非結合遊離脂肪酸の体液中濃度を用いて、患者における脳卒中治療の経過をモニターする方法が記載される。
【００１０】
他の形態において、
患者から採取した体液試料中の非結合遊離脂肪酸濃度を測定する工程；
測定された非結合遊離脂肪酸の濃度を、非結合遊離脂肪酸の閾値濃度と比較する工程；なお、閾値は、脳卒中を有していない健常者群の、体液中の非結合遊離脂肪酸の測定に基いて決定されている、  および
患者の体液試料に基づく、非結合遊離脂肪酸濃度が、健常者群に基づく非結合遊離脂肪酸の閾値濃度と比べて上昇しているかを判定する工程、なお、前記相対的上昇は、脳卒中のリスクの増大を示唆する；  を含んでいる
脳卒中に一致する徴候を見せている患者における、脳卒中の発症を判定する方法が記載される。一実施態様では、体液は、血液、血清、または血漿であってよい。
【００１１】
一実施態様においては、該測定工程は、さらに、
体液試料に、水性溶液、および蛍光成分で標識された脂肪酸結合性タンパク質を含む試薬を混合する工程；なお、試薬は、水性溶液中で第１の蛍光を示し、また、脂肪酸結合性タンパク質が脂肪酸と結合した際には、水性溶液中で、測定可能な程度に相違した第２の蛍光を示す；  および
体液試料に、水性溶液および試薬を混合した後、第２の蛍光を測定して、体液試料中の非結合遊離脂肪酸の濃度を定量する工程を含んでもよい。一実施態様においては、第２の蛍光の測定工程は、該試薬が第１の蛍光を示す波長とは相違している波長で実施される。好ましい実施態様では、第２の蛍光の測定用波長は、約４２０ｎｍ〜約４６０ｎｍであり、その際、該試薬が第１の蛍光を示す波長は、約４９５ｎｍ〜約５６０ｎｍである。
【００１２】
好ましい実施態様においては、脂肪酸結合性タンパク質は、ラット腸脂肪酸結合性タンパク質、ヒト脂肪細胞脂肪酸結合性タンパク質、またはラット心臓脂肪酸結合性タンパク質である。蛍光成分は、これらに限定されるものではないが、アクリロダン、ダンジルアジリジン、４−［Ｎ−［（２−ヨードアセトキシ）エチル］−Ｎ−メチルアミノ］−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾールエステル（ＩＡＮＢＤＥ）、または４−［Ｎ−［（２−ヨードアセトキシ）エチル］−Ｎ−メチルアミノ］−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＩＡＮＢＤＡ）を含んでなる群から選択することができる。
【００１３】
好ましい実施態様では、混合および測定工程の該試薬は、アクリロダンで標識された脂肪酸結合性タンパク質であり、かつ、該脂肪酸結合性タンパク質は、これに限定されるものではないが、残基２７、８１、８２、または８４にシステインを、あるいは、残基７２にアラニンを有するラット腸脂肪酸結合性タンパク質、ないしは、残基２７にリシンを有するラット心臓脂肪酸結合性タンパク質からなる変異タンパク質である。最も好ましい実施態様では、混合および測定工程の該試薬は、アクリロダンで標識されたラット腸脂肪酸結合性タンパク質である。それに代わる好ましい実施形態では、該試薬は、アクリロダンで標識され、残基７２にアラニンを有するラット腸脂肪酸結合性タンパク質である。
【００１４】
一実施態様においては、脳卒中を示唆する非結合遊離脂肪酸の濃度は、非虚血群に基づき決定された、非結合遊離脂肪酸濃度の平均値よりも、２標準偏差単位を超えて高い。他の実施態様においては、脳卒中を表す非結合遊離脂肪酸の濃度は、非虚血群に基づき決定された、非結合遊離脂肪酸濃度の平均値の約２倍を超える。
【００１５】
一実施態様において、該方法は、さらに、
血液試料中の、全遊離脂肪酸ならびにアルブミンを測定する工程；  および
全遊離脂肪酸とアルブミンとの比を決定する工程を含む。
【００１６】
脂肪酸を結合する他のタンパク質を用いることもできる。一形態において、脳卒中に一致する徴候を見せている患者における、脳卒中の発症を判定する該方法は、
体液試料に、水性溶液、ならびに、例えば、７−ヒドロキシクマリンまたは、アントラニロイルのいずれかであってもよい、蛍光成分で標識された脂肪酸結合性タンパク質を含む試薬を混合する工程；なお、試薬は、水性溶液中で第１の蛍光を示し、また、脂肪酸結合性タンパク質が脂肪酸と結合した際には、水性溶液中で、測定可能な程度に相違した第２の蛍光を示す；  および
体液試料に、水性溶液および試薬を混合した後、第２の蛍光を測定して、体液試料中の非結合遊離脂肪酸の濃度を定量する工程を含んでもよい。
【００１７】
一形態において、
患者に由来する体液試料中の非結合遊離脂肪酸濃度を測定する工程；
測定された非結合遊離脂肪酸の濃度を非結合遊離脂肪酸の閾値濃度と比較する工程、なお、閾値濃度は、虚血を有さない健常者群の体液中の非結合遊離脂肪酸の測定に基づき決定されている；  および
患者の体液試料に基づく、非結合遊離脂肪酸濃度が、健常者群に基づく非結合遊離脂肪酸の閾値濃度と比べて上昇しているかを判定する工程、なお、前記相対的上昇は、出血のリスクの増大を示唆する；
を含んでいる出血するリスクの高い患者を判別する方法が記載される。
【００１８】
他の形態において、
患者に由来する体液試料中の非結合遊離脂肪酸濃度を測定する工程；
測定された非結合遊離脂肪酸の濃度を非結合遊離脂肪酸の閾値濃度と比較する工程、なお、閾値濃度は、脳卒中を有さない健常者群の体液中の非結合または水溶性遊離脂肪酸の測定に基づき決定されている；  および
患者の体液試料に基づく、非結合遊離脂肪酸濃度が、健常者群に基づく非結合遊離脂肪酸の閾値濃度と比べて上昇しているかを判定する工程、なお、前記相対的上昇は、脳卒中後３年以内の死亡のリスク増大を示唆する；
を含んでいる脳卒中後３年以内に死亡するリスクの高い患者を判別する方法が記載される。
【００１９】
他の形態において、
虚血性脳卒中に一致する徴候を示している患者を特定する工程；
該患者から体液試料を採取する工程；
試料中の非結合遊離脂肪酸濃度を測定する工程；  および
測定された非結合遊離脂肪酸の濃度は、虚血性脳卒中を示唆するに十分に上昇しているかを確かめる工程を含んでいる虚血性脳卒中を診断する方法が記載される。好ましい実施態様においては、測定された非結合遊離脂肪酸の濃度が虚血性脳卒中を示唆する際には、次いで、その患者に血栓溶解療法を施す。
【００２０】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
記載される実施態様は本発明の好ましい実施形態を代表しているが、当業者には、本発明の真意から逸脱することなく、変形を行うことができることが理解される。従って、本発明の技術的範囲は、添付される請求の範囲によってのみ決定される。
【００２１】
本発明は、脳卒中の診断およびモニタリングを記載する。一実施態様において、脂肪酸などの脂質成分を測定することによって、脳卒中の診断、あるいは脳卒中の治療経過のモニターがなされる。全脂肪酸は、参照により本明細書の一部とする、米国特許第４，０７１，４１３号、第５，５１２，４２９号、第５，４４９，６０７号、および第４，３６９，２５０号に教示されているような、当分野では周知方法によって求めることができる。これらの方法によって入手される全脂肪酸濃度は、個体内の虚血症状を検出するために、正常な個体から取得された濃度と比較してもよい。好ましい実施態様において、全脂肪酸のアルブミンに対する比を求めた上で、健常者群と対比する。
【００２２】
他の実施態様において、以下に記載のように、体液中の非結合遊離脂肪酸濃度を測定する。好ましくは、脳脊髄液、間質液、血液、血清、血漿、尿、唾液、リンパ、胃液、または胆汁などの体液中の非結合遊離脂肪酸が、測定される。非結合遊離脂肪酸（ＦＦＡu）は、水相に可溶な遊離脂肪酸の部分である。好ましい実施態様において、試験試料に用いられる体液は、脳脊髄液、血液、血漿、または血清から選択する。大半の体液において、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）は、大部分、タンパク質、例えばアルブミン、あるいは、膜に結合しているが、意味を有する少数は、非結合（ＦＦＡu）で、かつ水相に可溶である。ＦＦＡuは、水溶性遊離脂肪酸とも呼ばれる。
【００２３】
本方法は、有益に、選択された患者群に適用される。従って、例えば、ＦＦＡuが存在する可能性のある体液の試料は、虚血性脳卒中に一致する徴候を示す患者、または神経機能不全を示唆する症候を有する患者から採取することができる。本発明の方法は、その際、例えば、虚血性脳卒中に因る徴候と、発作、出血性脳卒中、片頭痛などの他の症状に因る徴候とを弁別するために利用することができる。脳卒中の症候は、医学界において周知であり、部分または完全麻痺、言語障害、混濁、手足の無感覚または衰弱、特に体の片側での四肢の無感覚または衰弱、片眼または両眼の突然の視力喪失または障害、重度の頭痛、平衡感覚または他の運動技能の喪失、および眩暈を含む。
【００２４】
本発明の他の形態は、患者が虚血性脳卒中であったかどうかを示す、本明細書に論じる診断と、脳卒中関連治療との組み合わせである。本発明において用いることのできる、かかる療法の一典型例は、血栓溶解療法（ｔＰＡまたはストレプトキナーゼなど）である。好ましくは、かかる治療は、虚血性脳卒中の発症から短時間以内に施され、また、有益には、虚血性脳卒中を示す、ＦＦＡu濃度を明らかにするアッセイ工程から、３時間または２時間以内、好ましくは１時間以内に施される。
【００２５】
無症候性集団と比較した、体液中のＦＦＡu濃度の指標を提供する、何れのアッセイも、記載の診断方法に利用することができる。好ましくは、閾値は、脳卒中を有さない健常者群に基づき決定される。一実施態様においては、該閾値は、脳卒中を有さない対照集団の体液中のＦＦＡu濃度より、有意に高い体液中のＦＦＡu濃度とする。一実施態様においては、該閾値は、脳卒中を有さない対照集団の体液中のＦＦＡu平均濃度よりも、少なくとも約２標準偏差高い体液中のＦＦＡu濃度とする。他の実施態様においては、体液中のＦＦＡu濃度の閾値は、脳卒中を有さない対照集団の体液中のＦＦＡu平均濃度より、少なくとも約２倍高い。
【００２６】
一実施態様において、本発明は、蛍光標識した脂肪酸結合性タンパク質（ＦＡＢＰ）を利用することで、ＦＦＡu分子の蛍光標識ＦＡＢＰへの結合に付随する蛍光のシフトを定量的に検出することによって、脳卒中に伴う、血液、血清、または血漿試料中の非結合遊離脂肪酸（ＦＦＡu）の増加量を測定する。本発明は、参照により本明細書の一部とする、米国特許第５，４７０，７１４号中に実質的に記載されるような手法を用いる。ないしは、ＦＡＢＰのＦＦＡuへの結合を示すことのできる、何れかのその他の標識を利用することもできる。多種多様なアッセイ形式および標識手法が知られており、本発明の少なくともいくつかの態様において、特定の標識またはアッセイ形式は重要ではなく、寧ろ、当分野で公知である、適切なアッセイ形式および標識のいずれかを利用することができる。
【００２７】
脳卒中の指標となる、血液、血清、または血漿などの体液中のＦＦＡu濃度検出において、多様なＦＡＢＰおよび蛍光標識を利用することができる。これらには、例えば、ラット腸ＦＡＢＰ（Ｉ−ＦＡＢＰ）、ヒト脂肪細胞ＦＡＢＰ（Ａ−ＦＡＢＰ）、およびラット心臓ＦＡＢＰ（Ｈ−ＦＡＢＰ）が含まれる。１つまたは複数のアミノ酸残基が改変（挿入、削除、および／または置換）されている、これらのＦＡＢＰの部位特異的な変異形態も、本方法では有用であり、例えば、Ｉ−ＦＡＢＰの２７、８１、８２、８４位におけるＣｙｓ置換、Ｉ−ＦＡＢＰの残基７２におけるＡｌａ置換、およびＨ−ＦＡＢＰの残基２７におけるＬｙｓ置換が含まれる。
【００２８】
このＦＡＢＰ分子は、これに限定されるものではないが、アクリロダン、ダンジルアジリジン、４−［Ｎ−［（２−ヨードアセトキシ）エチル］−Ｎ−メチルアミノ］−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾールエステル（ＩＡＮＢＤＥ）、および４−［Ｎ−［（２−ヨードアセトキシ）エチル］−Ｎ−メチルアミノ−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＩＡＮＢＤＡ）を含む、公知の標識を用いて、蛍光標識することができる。これに限定されるものではないが、アルブミンを含む、ＦＦＡと結合し、ＦＦＡの結合に際して、それらの蛍光が変化する、他のタンパク質を利用することもできる。好ましい実施態様において、アルブミンは、７−ヒドロキシクマリン、またはアントラニロイルなどの蛍光標識を有する。本発明の実施において、遊離脂肪酸の結合に際して、測定可能な相違が検出できる限り、何れの標識を使用することができる。例えば、波長、またはシグナル強度の相違をモニターしてもよい。利用することのできる標識のさらなる例には、これに限定されるものではないが、吸光度および光学活性の変化をもたらす発色団、ならびに、その変化が電子スピン共鳴によって検出可能なスピン標識が含まれる。
【００２９】
好ましい実施態様において、蛍光標識ＦＡＢＰは、アクリロダン修飾・組換えラット腸脂肪酸結合性タンパク質（ＡＤＩＦＡＢと呼ばれる）である。アクリロダンによる修飾は、実質的に以前に記載されている（米国特許第５，４７０，７１４号、およびＲｉｃｈｉｅｒｉ  Ｇ．Ｖ．等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９２）２７６：２３４９５〜２３５０１）公知の方法を用いて実施されたが、また、ＡＤＩＦＡＢは市販され入手可能である（ＦＦＡ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＬＬＣ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。ＦＦＡuの濃度は、蛍光標識脂肪酸結合性タンパク質（ＦＡＢＰ）に対するＦＦＡuの結合によって定量が可能である。蛍光標識ＦＡＢＰに、ＦＦＡが結合していない際には、異なる蛍光が示される。ＦＦＡuの濃度は、該蛍光の差異に基づき決定することが可能である。蛍光標識ＦＡＢＰによる発光波長は、用いている標識およびタンパク質に依存している。一実施態様においては、標識がアクリロダンである場合、タンパク質は、Ｉ−ＦＡＢＰ、または７２位のＬｅｕをＡｌａへの置換を持つＩ−ＦＡＢＰのいずれかである。これら二種は、それぞれＡＤＩＦＡＢ、およびＡＤＩＦＡＢ２と呼ばれる。ＡＤＩＦＡＢ２の結合親和力は、ＡＤＩＦＡＢより約１０倍強いことが見出されている。ＦＦＡが存在しない際には、これらの蛍光標識Ｉ−ＦＡＢＰにより発光される最大強度の波長は、約４２０〜４４０ｎｍである。蛍光標識Ｉ−ＦＡＢＰに対してＦＦＡの結合したものにおける、最大強度の発光波長は、約４９５〜５８０ｎｍである。開示している該アッセイにおいて、当業者は容易に他の蛍光標識ＦＡＢＰに置き換えが可能であることは理解されるであろう。
【００３０】
水性試料中のＦＦＡu濃度を定量するアッセイは、ＦＦＡが結合していない際に、修飾したＦＡＢＰが蛍光を発する第１の波長から、ＦＦＡ分子が結合している際に、修飾したＦＡＢＰが蛍光を発する第２の波長へと、蛍光シフトの強度を測定し、次いで、共に参照により本明細書の一部とする、米国特許第５，４７０，７１４号、およびＲｉｃｈｉｅｒｉ等（１９９５）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ｖｏｌ．３６：２２９〜２４０頁に記載されるように、該蛍光波長における２つの強度の比（「Ｒ」値）に基づき、ＦＦＡuの濃度が決定される。簡単に述べると、この比は、次の式を用いて算出される。
【００３１】
【数１】
2005513417.tif 000002
式中、Ｉ（１）およびＩ（１）blankは、それぞれ波長「１」において、ＡＤＩＦＡＢあるいはＡＤＩＦＡＢ２を含有する試料、ならびにＡＤＩＦＡＢまたはＡＤＩＦＡＢ２以外の全ての試薬を含むブランク試料に関して測定された蛍光強度であり、Ｉ（２）およびＩ（２）blankは、波長「２」における、対応する蛍光強度である。ＡＤＩＦＡＢに対しては、波長「１」は、好ましくは（絶対的にではない）４９５〜５１５ｎｍの範囲であり、波長「２」は、４２２〜４４２ｎｍの範囲である。蛍光強度の測定は、常法によって達成できる。当業者に認識される通り、適切な条件下では、上記の等式中のＩblankの強度は、無視することが可能である。
【００３２】
健常者においてで見いだされる血液、血清、または血漿ＦＦＡu濃度を超えて上昇している、血液、血清、または血漿ＦＦＡu濃度の定量的な検出は、脳卒中を診断するために使用することが可能である。一実施態様においては、脳卒中を有さない対照集団の血液、血清、または血漿試料中のＦＦＡu濃度よりも、有意に高い血液、血清、または血漿試料中のＦＦＡu濃度によって、脳卒中が示唆される。一実施態様においては、血液、血清、または血漿中のＦＦＡuの平均正常濃度より、約２標準偏差で超えている、血液、血清、または血漿中のＦＦＡu濃度によって、脳卒中が検出される。他の実施態様においては、対照集団のＦＦＡuの平均濃度より２倍高いＦＦＡu濃度が、脳卒中を示唆している。大幅に高くなっている、血液、血清、または血漿中のＦＦＡuの上昇した濃度を検出してもよい。
【００３３】
本発明の診断方法は、脳卒中を患っている患者は、健常者における血液、血清、または血漿ＦＦＡuの正常濃度と比較して、血液、血清、または血漿などの体液中の上昇したＦＦＡu濃度を示しているという発見に基づいている。該診断方法は、任意の時点で実施することができるものの、好ましくは、試験は、虚血の発症より２４時間以内に行う。より好ましくは、試験は、虚血発症の１０時間以内に行う。最も好ましくは、試験は虚血発症の３時間以内に行うことで、治療に着手できる。心虚血などの虚血症状に対する治療の多くは、効果を発揮するために、迅速に（数時間のうちに）着手しなければならない。一方、正確な診断がされていない治療は、患者にとって非常に有害であり得る。例えば、出血性脳卒中の場合、血栓溶解療法を始めると死に至る可能性がある。
【００３４】
この試験は、虚血性脳卒中と、片頭痛、発作、および出血性脳卒中などの他の症状とを判別するために利用することができる。最低限でも、この試験は、その患者が脳卒中を患っていることを医療担当者に注意喚起するであろう。従って、ＣＴまたはＭＲＩスキャンをより迅速に始めることを可能とし、血栓溶解療法までの時間を短縮できる。この試験は救急担当者によって容易に施すことができるので、救急車内であっても、かかる注意喚起がなされることも可能であろう。さらに、救急車内で試験を完了することは、この試験に基づいて、適切な療法を開始することのできる適切な施設へと救急車を向かわせることができるため、脳卒中の治療に必要な人員および設備を備えた施設から遠い患者にとって、特に有益であろう。虚血性脳卒中の場合、この治療には、ｔ−ＰＡなどの血栓溶解剤の投与を含まれるかもしれない。出血性脳卒中においては、ｔ−ＰＡの使用は一般に死に至るので、その使用は禁忌である。
【００３５】
実施例１：血液試料中のＦＦＡuのアッセイ
簡単に述べると、ＦＦＡuアッセイおよび判定は、次のように行われた。血液試料を、緩衝液（２０ｍＭ  Ｎ−２−ヒドロキシエチル−ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、および１ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、ｐＨ７．４に調整）に１００倍に希釈し、血清のアルブミン濃度を約６μＭにした。脂肪酸を含まないアルブミンに、ＡＤＩＦＡＢまたはＡＤＩＦＡＢ２を添加した溶液を、陰性対照とした。各ドナーに関して、血清の２分液：１％血清の「バックグラウンド」または「ブランク」試料、およびＡＤＩＦＡＢまたはＡＤＩＦＡＢ２を添加した１％血清の「実験」試料を用意した。陰性対照、ブランク、および実験試料は、２２℃または３７℃で測定した。
【００３６】
各試料に関して、ＡＤＩＦＡＢに対しては、約４３２ｎｍと５０５ｎｍ、ＡＤＩＦＡＢ２に対しては、約４５０ｎｍと５５０ｎｍにおける、一対の強度の複数の測定値を採取して、ブランク試料の強度を減じた後、Ｒ値を決定した。各血清試料に関して、異なる日に、少なくとも２つの別個の測定を行い、ＦＦＡu濃度の平均値および標準偏差を求めた。測定の各群間における差異の確度を鑑定するために、平均値の差異を、スチューデントｔ検定を用いて評価し、０．０５未満のｐ値を有意とみなした。
実施例２：救急治療室での評価において、［ＦＦＡu］は、脳卒中症状を示す患者において、上昇している。
【００３７】
病院の救急部に収容された３９人の患者から、受け入れ時、および続く数日間にわたって、その後の数回の時点で、血液試料を採取した。米国特許第５，４７０，７１４号に記載されるように、蛍光修飾脂肪酸結合性タンパク質を用いて、非結合遊離脂肪酸（ＦＦＡu）濃度を測定した。各試料中の、ＦＦＡu濃度およびクレアチンキナーゼ（ＣＫ−ＭＢ）濃度の両方を測定した。患者の１人は、最終的に脳卒中と診断された。この期間中、ＦＦＡu濃度は、正常濃度より２倍を超えて高いことが見出され、なお、ＣＫ−ＭＢの値は全て正常範囲内であった。
実施例３：局所性脳虚血のラット・モデルにおいて［ＦＦＡu］は上昇している。
【００３８】
ラット・モデルを用いて、局所性脳虚血に伴う、血漿ＦＦＡu濃度をモニターする。Ｊａｃｋｓｏｎ−Ｆｒｉｅｄｍａｎ等（１９９７）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．１４７：３４６〜３５２頁に記載の通りに、左中大脳動脈（ＭＣＡ）の可逆性局所性脳虚血を、管内閉塞によって誘発する。血漿を、末梢循環からサンプリングする。成体ラットを麻酔する。４−０ナイロン縫合糸（加熱鈍化した先端）を総頚動脈に挿入し、内頚動脈を経て先に進めて、先端が前大脳動脈に到達して、その管腔に侵入することなくＭＣＡの発端を閉塞させる。縫合糸フィラメントの自由な近位端は、動脈切開を閉じた後も、外部に露出させる。指定されている時間に、フィラメントを引き戻し、それによって、ＭＣＡ内への血流を回復させる。閉塞の前後、様々な時間に、約０．１ｍｌの血液を採血する。血液試料は、緩衝食塩水を入れたヘパリン処理シリンジに移し、溶血を最小限にするために直ちに氷上に置いた。希釈した血液を遠心分離し、１％に希釈された血漿を用いて、ＡＤＩＦＡＢに対して、Ｒｉｃｈｉｅｒｉ等（１９９９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｖｏｌ．１９２、８７〜９４頁の記載と本質的に同様にして、ＡＤＩＦＡＢ２を用いて２２℃でＦＦＡuを定量する。
【００３９】
簡単に述べると、ＡＤＩＦＡＢ２は次のように得た。最初に、Ａｌａ72変異および適切な相補末端を有する制限断片を、Ｉ−ＦＡＢＰのｃＤＮＡ配列（Ａｌｐｅｒｓ等（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：３１３〜３１７）の２１１位のＳａｌＩ部位から、部位特異的突然変異誘発によって導入された２９１位のＰｍｅＩ部位へと及ぶ野生型の制限断片と置換した。所望の配列を有する相補的な合成オリゴヌクレオチドを部分的にアニーリングし、１本鎖領域をＤＮＡポリメラーゼによって「埋め」てＫｌｅｎｏｗ断片とし、適切な末端を得るためにＳａｌＩおよびＰｍｅＩで消化することによって、この変異制限断片を構築した。Ａｌａ72置換Ｉ−ＦＡＢＰｃＤＮＡは、ｐＥＴ１１ベクターに挿入し、ＢＬ２１（ＤＥ３）株において発現させた。この変異Ｉ−ＦＡＢＰは、本質的にＬｏｗｅ等の方法（Ｌｏｗｅ等（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：５９３１〜５９３７頁）で精製して、大腸菌培養物１ｌ当たり精製タンパク質約１００ｍｇを得た。本質的に前にＡＤＩＦＡＢに対して記載されたように（参照により本明細書の一部とする、米国特許第５，４７０，７１４号を参照）、アクリロダン修飾を行った。Ｌｉｐｉｄｅｘ−５０００クロマトグラフィを用いて、遊離アクリロダンを除去した。
【００４０】
アクリロダン修飾・Ｌｅｕ７２→Ａｌａ  Ｉ−ＦＡＢＰ（ＡＤＩＦＡＢ２）の蛍光特性は、ＡＤＩＦＡＢと有意に異なっている。発光最大位置は、アポＡＤＩＦＡＢ２では約４４０ｎｍ、ホロＡＤＩＦＡＢ２では５５０ｎｍであり、ＡＤＩＦＡＢの約４３２ｎｍと５０５ｎｍに比べて、より長い波長で生じており、また、最適励起波長は、ＡＤＩＦＡＢの約３８６ｎｍに比べて、ＡＤＩＦＡＢ２では約３７５ｎｍである。さらに、平衡結合特性を定義するパラメータ、Ｒ0、ＲMAX、およびＱ（米国特許第５，４７０，７１４号を参照のこと）も、ＡＤＩＦＡＢとは対照的に、ＡＤＩＦＡＢ２では大きく異なり、これらのパラメータの値は、脂肪酸および温度に依存している。従って、４４０ｎｍおよび５５０ｎｍ、ならびにオレイン酸塩の場合、１０℃〜３７℃の間の温度に対して、それぞれ、ＲMAXとＱは、それぞれ、１．６〜２．５の間、７．５〜１２の間に広がっており、そして、パルミチン酸塩およびステアリン酸塩の場合、これらの値は、何れも約１０％高くなる。
【００４１】
測定は、約１５分から２時間の時間、可逆性ＭＣＡ閉塞を受けた動物を用いて行う。血液試料を、手術の直前、切開を閉じた時点、ならびに、手術後の様々な時点（例えば、１、２、３、４、および２４時間）で採取した。異なる閉塞について、［ＦＦＡu］の時間的経過を平均する。［ＦＦＡu］濃度は、増加し、１〜２時間で最大に達し、その後、基準値に戻る、２４時間にわたって、徐々に減少する。閉塞後、ＦＦＡu濃度は急速に上昇し、４時間を超える間、上昇したままである。虚血性脳卒中の唯一の治療は、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）などの血栓溶解剤の投与であり、これは初期徴候の３時間以内に投与しなければならないので、この挙動は重要である。さらに、より早期にｔ−ＰＡを投与することができれば、治療効果がより高くなる。虚血発症に続く、ＦＦＡu濃度の急速な上昇は、理想的な治療時間を提供する。
実施例４：出血性脳卒中のラット・モデルにおいて、ＦＦＡu濃度は上昇したままではない。
【００４２】
虚血性脳卒中の診断において主要な問題は、非脳虚血性症候群を罹患している患者が、多くの場合、脳卒中に類似した徴候を示すことにある。これらの「脳卒中の類似」のなかでも、主要なものは、出血性脳卒中と発作である。出血性発症の場合、誤った診断は、ｔ−ＰＡはそのような患者にとって致命的となる可能性があるので、特に重大である。
【００４３】
出血性脳卒中の可能なモデルは、ラット血液１００〜２００ｍｌを尾状核に注射することによって得る。出血（血腫）モデルは、注射（０）時点で［ＦＦＡu］の非常に急速な上昇を示し、その後、１〜２時間で基準値に戻る。この［ＦＦＡu］の時間的経過は、０時点から減少し、２時間までに基準の３０％以内となる。
実施例５：ＦＦＡu濃度は発作中上昇しない。
【００４４】
発作のラット・モデルを、発作を誘発するビククリンを尾状核に注入することによって得る。発作モデルにおける［ＦＦＡu］の時間的経過は、２４時間にわたって基準から実質的に変化のないことを明らかにする。
実施例６：脳卒中媒介の血漿ＦＦＡ上昇は脂肪組織の脂肪分解に起因する。
【００４５】
動物において誘発された脳虚血は、脳組織内にＦＦＡの蓄積をもたらすことは、以前より知られている。かかる判定には、脳組織を採取し、組織の脂質成分を単離するために、有機抽出を必要とする。虚血脳のＦＦＡ含量は、虚血の誘発の数分以内に増加し、最終的には、対照組織と対比して、８倍程度（完全虚血）まで上昇することもあることが見出された。従って、虚血脳におけるＦＦＡ含量の増加の明白な結果として、血漿ＦＦＡの上昇が、次に起こると思われる。しかしながら、完全虚血（断頭）の場合でさえも、生成されるＦＦＡの絶対量は、ＦＦＡの血漿濃度と比較して、［ＦＦＡu］を有意に上昇させるには、少なすぎる。例えば、完全虚血では、約０．８μモルのＦＦＡがラット脳に蓄積する。はるかに軽症である、可逆性脳虚血に伴う血漿中のＦＦＡ量は、約１００倍多い。
【００４６】
脳虚血において、観測される多量のＦＦＡを産生するに十分な能力を備える唯一の組織は、脂肪組織である。本発明者等の研究は、脳虚血の数分以内に、脳が１種または複数の脂肪分解活性因子を放出することを示唆している。少なくとも、２種のかかる活性化因子、ノルエフィネフリンおよびＴＮＦαが、脳虚血によって放出される。同一の血液検体中の［ＦＦＡu］およびＴＮＦαは、ラット脳卒中モデル（実施例３）における、２時間の可逆性閉塞において採取される。両量ともに、上昇させられ、その後、同じ時間的経過をたどる。
実施例７：脳虚血を示すヒト患者において、［ＦＦＡu］は早期に上昇する。
【００４７】
脳卒中患者における［ＦＦＡu］の測定は、迅速で感度の高い虚血性脳卒中の指標となりえるであろうし、また、かかる患者を、脳卒中に類似する疾患と区別することを可能にするであろう。
【００４８】
表面上健康なヒト対象（正常者）集団における［ＦＦＡu］の測定の結果は、前に、Ｒｉｃｈｉｅｒｉ等（１９９５）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．ｖｏｌ．３６：２２９〜２４０頁に報告されている。これらの測定は、ＦＦＡuの主要な蛍光プローブ、ＡＤＩＦＡＢを用いて、３７℃で行われた。これらの測定の結果は、それぞれ、７．５ｎＭおよび２．５ｎＭの平均と標準偏差を示した。ＡＤＩＦＡＢ２プローブを用いた、２２℃での［ＦＦＡu］の測定は（Ｒｉｃｈｉｅｒｉ等（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．ｖｏｌ．２７１：１１２９１〜１１３００頁）、２．８ｎＭおよび０．７ｎＭの平均と標準偏差を提供した。２種のプローブにおける、得られた値の相違は、一部は、温度低下に伴う［ＦＦＡu］の減少のためであり、ならびに、ＡＤＩＦＡＢ２プローブと比較して、ＡＤＩＦＡＢのより短波長の蛍光を優先的に吸収する、ヘモグロビンなどの血漿中の因子に対するＡＤＩＦＡＢプローブのより高い感度によっている。
【００４９】
広範な疾患を有する患者における［ＦＦＡu］の測定は、脳または心虚血、ならびに、恐らくは敗血症を有する患者は例外として、この疾患集団における［ＦＦＡu］の分布は、正常な無症状個体の分布に非常に類似していることを示す。これらの結果と対照的に、脳虚血を有する患者は、有意に上昇した［ＦＦＡu］を示す。
【００５０】
いくつかの異なる病院に入院している、脳卒中の可能性を示す患者から血液試料を採取する。血液検体は、各患者から入院加療中１回または複数回採取する。来院時（発症から２〜５時間後）に採取した試料における［ＦＦＡu］測定の結果は、無症状個体と比較して、有意に高い濃度側に偏移している分布を示す。これらの結果は、［ＦＦＡu］の測定は、ヒトにおいて、虚血性脳卒中の早く正確な診断を提供することを示唆している。
【００５１】
当業者は、本発明の真意から逸脱することなく、多数かつ多様な変更を加えることが可能であることを理解するであろう。従って、本発明の該形態は、単に例示的なものであり、本発明の技術的範囲を限定することを意図するものではないことは明瞭に理解されるべきである。
【国際調査報告】
2005513417.tif 000003