(57)【要約】【課題】  【解決手段】  一方の炭素を、２個のイオウ含有基で置換したＣ−Ｃ二重結合を有する新規化合物を開示した。該化合物は、ペルオキシダーゼ酵素と過酸化物との反応によって迅速に化学ルミネセンスを発生する方法及び組成物として有用である。このようにして発生した化学ルミネセンスを、ペルオキシダーゼ酵素又は過酸化物生産酵素に用いるアッセイに於て、並びに酵素標識化特異的結合対を用いるアッセイに於て、検出可能な信号として使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式、
2005514396.tif 000034
（式中、Ｒ1とＲ2とは相互に無関係に、１〜２０個の炭素原子を有するアルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、アリールアルキル及び置換されたアリールアルキル基から選択される基であり、かつ、相互に結合して環を形成することができ、Ｒ4〜Ｒ11はいずれも相互に無関係に、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉ及びハロゲン原子から選択される１〜５０個の原子を含有することのできる置換基であり、Ｒ3はアルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、アリールアルキル及び置換されたアリールアルキル基から選択される基である）で表されることを特徴とする化合物。
【請求項２】
Ｒ4〜Ｒ11の少なくとも１個が、アルキル、アルコキシ基、ハロゲン原子、アミノ基又は１あるいは２個のアルキル又はアリール基で置換されたアミノ基から選択され、Ｒ4〜Ｒ11の残余のものが水素原子である請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ4〜Ｒ11のいずれもが水素原子である請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ3が、メチル、フェニル、置換されたフェニル、ベンジル、置換されたベンジル、２−ナフチル及びｐ−アニシル基から選択される基である請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ1とＲ2との少なくとも１個が、スルホネート塩の基、サルフェート塩の基、ホスホネート塩の基、ホスフェート塩の基、カルボキシレート塩の基、アンモニウム塩の基及びホスホニウム塩の基から選択される基で置換されるアルキル基である請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ1とＲ2との少なくとも１個がスルホネート塩の基で置換されたアルキル基である請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ1とＲ2との少なくとも１個がホスフェート塩の基で置換されたアルキル基である請求項５に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ3が、フェニル、置換されたフェニル、ベンジン及び置換されたベンジル基から選択される基である請求項６に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ3が、フェニル、置換されたフェニル、ベンジル及び置換されたベンジル基から選択される基である請求項７に記載の化合物。
【請求項１０】
下記式、
2005514396.tif 000035
2005514396.tif 000036
2005514396.tif 000037
で表される化合物の群から選択される請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
下記式、
2005514396.tif 000038
で表される請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
下記式、
2005514396.tif 000039
で表される請求項１０に記載の化合物。
【請求項１３】
下記式、
2005514396.tif 000040
で表される請求項１０に記載の化合物。
【請求項１４】
下記式、
2005514396.tif 000041
で表される請求項１０に記載の化合物。
【請求項１５】
下記式、
2005514396.tif 000042
で表される請求項１０に記載の化合物。
【請求項１６】
下記式、
2005514396.tif 000043
で表される請求項１０に記載の化合物。
【請求項１７】
下記式、
2005514396.tif 000044
で表される請求項１０に記載の化合物。
【請求項１８】
下記式、
2005514396.tif 000045
で表される請求項１０に記載の化合物。
【請求項１９】
下記式、
2005514396.tif 000046
で表される請求項１０に記載の化合物。
【請求項２０】
下記式、
2005514396.tif 000047
で表される請求項１０に記載の化合物。
【請求項２１】
下記式、
2005514396.tif 000048
（式中、Ｒ1とＲ2とは置換したアルキレン又はヘテロアルキレン鎖によって相互に結合して５〜３０個の原子を含有する環を形成する基であり、Ｒ4〜Ｒ11はいずれも相互に無関係に、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉ及びハロゲン原子から選択される１〜５０個の原子を含有することのできる置換基であり、Ｒ3はアルキル、置換されたアルキル、ヘテロアルキル、置換されたヘテロアルキル、アリール、置換されたアリール、アリールアルキル及び置換されたアリールアルキル基から選択される基である）で表されることを特徴とする化合物。
【請求項２２】
アルキレン鎖を含有する環が、水溶性を付与する少くとも１個の基Ｚによって置換されている請求項２１に記載の化合物。
【請求項２３】
基Ｒ3が、水溶性を付与する少くとも１個の基Ｚによって置換されている請求項２１に記載の化合物。
【請求項２４】
Ｒ1とＲ2とを連結する環が、５〜７個の原子を含有する請求項２１に記載の化合物。
【請求項２５】
Ｒ3が、アルキル、ヘテロアルキル、フェニル及びベンジル基から選択される基である請求項２２に記載の化合物。
【請求項２６】
Ｚが、スルホネート塩の基、サルフェート塩の基、ホスホネート塩の基、ホスフェート塩の基、カルボキシレート塩の基、アンモニウム塩の基及びホスホニウム塩の基から選択されるものである請求項２２に記載の化合物。
【請求項２７】
Ｚが、スルホネート塩の基、サルフェート塩の基、ホスホネート塩の基、ホスフェート塩の基、カルボキシレート塩の基、アンモニウム塩の基及びホスホニウム塩の基から選択されるものである請求項２３に記載の化合物。
【請求項２８】
Ｒ4〜Ｒ11の少くとも１個が、アルキル、アルコキシ基、ハロゲン原子、アミノ、又は１〜２個のアルキル若しくはアリール基によって置換されたアミノ基から選択されたものであり、Ｒ4〜Ｒ11の残余のものが水素原子である請求項２１に記載の化合物。
【請求項２９】
Ｒ4〜Ｒ11はいずれもが水素原子である請求項２１に記載の化合物。
【請求項３０】
下記式、
2005514396.tif 000049
で表される化合物の群から選択される請求項２１に記載の化合物。
【請求項３１】
下記式、
2005514396.tif 000050
で表される請求項３０に記載の化合物。
【請求項３２】
下記式、
2005514396.tif 000051
（式中、Ｒ1とＲ2とは、第２の環に縮合した５〜３０個の原子を含有する環によって相互に結合する基であり、Ｒ4〜Ｒ11はいずれも相互に無関係に、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉ及びハロゲン原子から選択される１〜５０個の原子を含有することのできる置換基であり、Ｒ3はアルキル、置換されたアルキル、ヘテロアルキル、置換されたヘテロアルキル、アリール、置換されたアリール、アリールアルキル及び置換されたアリールアルキル基から選択される基であり、更に水溶性を付与する基Ｚを含有する基である）で表されることを特徴とする化合物。
【請求項３３】
縮合した第２の環が、ベンゼン環又は置換されたベンゼン環である請求項３２に記載の化合物。
【請求項３４】
縮合した第２の環が、水溶性を付与する少なくとも１個の基Ｚによって置換されている請求項３２に記載の化合物。
【請求項３５】
下記式、
2005514396.tif 000052
で表される化合物から選択される請求項３２に記載の化合物。
【請求項３６】
下記式、
2005514396.tif 000053
（式中、Ｒ1とＲ2とは相互に無関係に、１〜２０個の炭素原子を有するアルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、アリールアルキル及び置換されたアリールアルキル基から選択される基であり、かつ、それぞれ無関係に各直近の環形成位置Ｒ4又はＲ11に結合して別の環を閉環し、また相互に結合して５〜３０個の原子を有する環を形成することができ、Ｒ4〜Ｒ6及びＲ8〜Ｒ11はいずれも相互に無関係に、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉ及びハロゲン原子から選択される１〜５０個の原子を含有することのできる置換基であり、窒素原子は結合して、別の５〜７員環を閉環する）で表されることを特徴とする化合物。
【請求項３７】
下記式、
2005514396.tif 000054
（式中、イオウ原子の少なくとも１個が各直近の環形成位置Ｒ4又はＲ11と相互に結合して、５〜７原子の環を形成し、イオウ原子の１個のみがかかる結合をなす場合には、Ｒ1は、１〜２０個の炭素原子を有するアルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、アリールアルキル及び置換されたアリールアルキル基から選択される基であり、Ｒ3はアルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、アリールアルキル及び置換されたアリールアルキル基から選択される基であり、また、Ｒ5〜Ｒ11はいずれも相互に無関係に、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉ及びハロゲン原子から選択される１〜５０個の原子を含有することのできる置換基である）で表されることを特徴とする化合物。
【請求項３８】
ペルオキシダーゼ酵素を、過酸化物及び少なくとも１種の化学式Ｉ、
2005514396.tif 000055
（式中、Ｒ1とＲ2とは、置換されたアルキレン又はヘテロアルキレン鎖によって相互に結合して５〜３０個の原子を含有する環を形成する基であり、Ｒ4〜Ｒ11はいずれも相互に無関係に、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉ及びハロゲン原子から選択される１〜５０個の原子を含有することのできる置換基であり、Ｒ3はアルキル、置換されたアルキル、ヘテロアルキル、置換されたヘテロアルキル、アリール、置換されたアリール、アリールアルキル及び置換されたアリールアルキル基から選択される基である）で表される化合物と反応させて、化学ルミネセンスを発生することを包含する化学ルミネセンスの発生方法。
【請求項３９】
アルキレン鎖を含有する環が、少なくとも１個の、水溶性を付与する基Ｚで置換されている請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
基Ｒ3が、少なくとも１個の水溶性を付与する基Ｚで置換されている請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
ペルオキシダーゼの活性を強化する強化剤化合物を供給することを包含する請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
強化剤が、フェノール性化合物、芳香族アミン、置換された及び無置換のアリールボロン酸、アリールボロン酸エステル、アリールボロン酸無水物、フェノキサジン及びフェノチアジンから選択されるものである、ペルオキシダーゼの活性を強化する強化剤化合物を供給することを包含する請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
ペルオキシダーゼ酵素を、過酸化物及び少なくとも１種の化学式Ｉ、
2005514396.tif 000056
（式中、Ｒ1とＲ2とは、第２の環に縮合した５〜３０個の原子を含有する環によって相互に結合する基であり、Ｒ4〜Ｒ11はいずれも相互に無関係に、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉ及びハロゲン原子から選択される１〜５０個の原子を含有することのできる置換基であり、Ｒ3はアルキル、置換されたアルキル、ヘテロアルキル、置換されたヘテロアルキル、アリール、置換されたアリール、アリールアルキル及び置換されたアリールアルキル基から選択される基であり、更に水溶性を付与する基Ｚを含有する基である）で表される化合物と反応させて、化学ルミネセンスを発生することを包含する化学ルミネセンスの発生方法。
【請求項４４】
ペルオキシダーゼの活性を強化する強化剤化合物を供給することを包含する請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
強化剤が、フェノール性化合物、芳香族アミン、置換された及び無置換のアリールボロン酸、アリールボロン酸エステル、アリールボロン酸無水物、フェノキサジン及びフェノチアジンから選択されるものである、ペルオキシダーゼの活性を強化する強化剤化合物を供給することを包含する請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
化学式Ｉで表される化合物における縮合した第２の環が、ベンゼン環又は置換されたベンゼン環である請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
化学式Ｉで表される化合物における縮合した第２の環が、水溶性を付与する少なくとも１個の基Ｚによって置換されている請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
化学式Ｉで表される化合物が、下記式、
2005514396.tif 000057
の化合物から選択されることを特徴とする請求項４３に記載の方法。
【請求項４９】
ペルオキシダーゼ酵素を、過酸化物及び少なくとも１種の化学式、
2005514396.tif 000058
（式中、Ｒ1とＲ2とは相互に無関係に、１〜２０個の炭素原子を有するアルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、アリールアルキル及び置換されたアリールアルキル基から選択される基であり、かつ、それぞれ無関係に各直近の環形成位置Ｒ4又はＲ11に結合して別の環に閉環し、また相互に結合して５〜３０個の原子を有する環を形成することができ、Ｒ4〜Ｒ6及びＲ8〜Ｒ11はいずれも相互に無関係に、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉ及びハロゲン原子から選択される１〜５０個の原子を含有することのできる置換基であり、窒素原子は結合して、別の５〜７員環を閉環する）で表される化合物と反応させて、化学ルミネセンスを発生することを包含する化学ルミネセンスの発生方法。
【請求項５０】
ペルオキシダーゼ酵素を、過酸化物及び少なくとも１種の化学式、
2005514396.tif 000059
（式中、イオウ原子の少なくとも１個が、各直近の環形成位置Ｒ4又はＲ11と相互に結合して、５〜７原子の環を形成し、Ｒ4〜Ｒ11はいずれも相互に無関係に、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉ及びハロゲン原子から選択される１〜５０個の原子を含有することのできる置換基である）で表される化合物と反応させ化学ルミネセンスを発生することを包含する化学ルミネセンスの発生方法。
【請求項５１】
下記式、
2005514396.tif 000060
で表される化合物の群から選択される請求項１に記載の化合物。
【請求項５２】
下記式、
2005514396.tif 000061
で表される請求項５１に記載の化合物。
【請求項５３】
下記式、
2005514396.tif 000062
で表される化合物の群から選択される請求項１に記載の化合物。
【請求項５４】
下記式、
2005514396.tif 000063
（式中、Ｒ1とＲ2とは相互に無関係に、１〜２０個の炭素原子を有するアルキル、置換されたアルキル、ヘテロアルキル、置換されたヘテロアルキル、アリール、置換されたアリール、アルールアルキル及び置換されたアリールアルキル基から選択される基であり、かつ、相互に結合して環含有の基を形成することができ、Ｒ4〜Ｒ11はいずれも相互に無関係に、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉ及びハロゲン原子から選択される１〜５０個の原子を含有することのできる置換基であり、Ｒ3はアルキル、置換されたアルキル、ヘテロアルキル、置換されたヘテロアルキル、アリール、置換されたアリール、アリールアルキル及び置換されたアリールアルキル基から選択される基である）で表されることを特徴とする化合物。
【請求項５５】
ペルオキシダーゼ酵素を、過酸化物及び少なくとも１種の化学式、
2005514396.tif 000064
（式中、Ｒ1とＲ2とは相互に無関係に、１〜２０個の炭素原子を有するアルキル、置換されたアルキル、ヘテロアルキル、置換されたヘテロアルキル、アリール、置換されたアリール、アリールアルキル及び置換されたアリールアルキル基から選択される基であり、かつ、相互に結合して環含有の基を形成することができ、Ｒ4〜Ｒ11はいずれも相互に無関係に、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉ及びハロゲン原子から選択される１〜５０個の原子を含有することのできる置換基であり、Ｒ3はアルキル、置換されたアルキル、ヘテロアルキル、アリール、置換されたアリール、アリールアルキル及び置換されたアリールアルキル基から選択される基である）で表される化合物と反応させて、化学ルミネセンスを発生することを包含する化学ルミネセンスの発生方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペルオキシダーゼ及び過酸化物と反応して化学ルミネセンスを発生する化学ルミネセンス性化合物並びに組成物に関する。特に、本発明は、ペルオキシダーゼ及び過酸化物と反応して可視的化学ルミネセンスを発生する新規なケテンジチオアセタール化合物を含有する優れた組成物に関する。本発明は更に、イムノアッセイ、核酸プローブアッセイ及び他の特異的結合対アッセイにおけるペルオキシダーゼの検出及びペルオキシダーゼ標識の特異的結合パートナー検出のためのアッセイ法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のようなペルオキシダーゼ酵素は、多くの場合、生体分子や他の重要な分析試料（ａｎａｌｙｔｅ）、例えば、医薬品、ホルモン、ステロイド及びがん標識のための酵素結合アッセイにおいて、標識又はラベルとして使用される。これらの酵素の化学ルミネセンス検出法は、標本中の酵素の量、あるいは、酵素標識化分析試料か、又は、分析試料用の標識化特異的結合パートナーの量を測定する安全、簡便でかつ鋭敏な方法を提供する。
【０００３】
ａ、化学ルミネセンス・ペルオキシダーゼ基質。
アミノ基置換環状アシルヒドラジド、例えば既知のルミノール及びイソルミノールは、Ｈ2Ｏ2及びペルオキシダーゼ触媒（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ＨＲＰ）と、塩基性条件下で反応して発光する。この反応は、Ｈ2Ｏ2の検出のため、及びペルオキシダーゼのための分析方法の基礎として用いられてきている。ルミノールのヘテロ環状類縁物、例えば８−アミノ−５−クロロ−７−フェニルピリド〔３，４−ｄ−ピリダジン−１，４（２Ｈ，３Ｈ）  ジオン（Ｍ．Ｉｉ、ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１９３巻（２）、５４０〜５頁（１９９３年）；ピリダジノキノクサリノン（米国特許第５，３２４，８３５号明細書）及び１，３−二置換ピラゾロ〔４’，３’：５’，６’〕ピリド−〔２，３−ｄ〕−ピラジンジオン（Ｙ．Ｔｏｍｉｎａｇａ，ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，３６巻、８６４１〜４頁（１９９５年））は、ペルオキシダーゼ及び過酸化物と反応して化学ルミネセンスを生成することが既知である。ペルオキシダーゼ及び過酸化物によって酸化された場合、化学ルミネセンス性である他のヒドラジド化合物に、ヒドロキシ基置換フタルヒドラジド（米国特許第５，５５２，２９８号明細書）がある。
【０００４】
本出願人の、米国特許第５，４９１，０７２号明細書、第５，５２３，２１２号明細書及び第５，５９３，８４５号明細書には、ペルオキシダーゼ検出に、及び、アッセイに用いるための、過酸化物及びペルオキシダーゼとの反応によって発光する化学ルミネセンス性Ｎ−アルキルアクリダンカルボン酸エステル、チオエステル及びスルホンイミドが開示されている。ＰＣＴ出願（ＷＯ第９４／０２４８６号公報）には、スピロアクリダン化合物と過酸化水素との化学ルミネセンス性反応が記載されている。この反応は、ホースラディッシュペルオキシダーゼの添加によって強化される。
【０００５】
集合名詞としてルシフェリンと総称される、生物学的起源の各種化合物が、ペルオキシダーゼによって酸化される（Ｌ．Ｊ  Ｋｒｉｃｋａ及びＧ．Ｈ．Ｇ．Ｔｈｏｒｐｅでの、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｋ．Ｖａｎ  Ｄｙｋｅ  ａｎｄ  Ｒ．Ｖａｎ  Ｄｙｋｅ，編集、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９０年、７７〜９８頁に集約されている）。過酸化水素を使用しない場合には、酵素がオキシダーゼとして作用する。
【０００６】
ある種のフェノール化合物は、ペルオキシダーゼによる酸化で化学ルミネセンスを発生する。例えば、ピロガロールＢ−１及びプルプロガリンＢ−２が、Ｋｒｉｃａ及びＴｈｏｒｐｅの同上文献に挙げられており、同様にクマリン系化合物のクマリン、ウンベリフェロン及びエスクリン（Ｄ．Ｓｌａｗｉｎｓｋａ，Ｊ．Ｓｌｏｗｉｎｓｋｉ，Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．，４巻、２２６〜３０頁、（１９８９年））、フロログルシノールＢ−３（Ｍ．Ｈａｌｍａｎｎ，ら、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ，Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．，３０巻、１６５〜７頁（１９７９年））；及びアセトアミノフェンＢ−４（Ｋ．Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｇ．Ｃｉｌｅｎｔｏ，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．，５１巻、７１９〜２３頁（１９９０年））がある。
2005514396.tif 000002
【０００７】
酸素又は過酸化物とペルオキシダーゼとの存在下で、弱い化学ルミネセンスを発生することが報告されている、他の各種の化合物は、合成シッフ塩基含有ポリマー（Ｒ．Ｚｏｕｌｉｋ，ら、Ｃｏｌｌ．Ｃｚｅｃｈ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，６０巻、９５〜１０３頁（１９９５年））；過酸化水素とともに、又は過酸化水素なしでキサンテン染料の存在下でのインドール−３酢酸（Ｓ．Ｋｒｙｌｏｖ，Ａ．Ｃｈｅｂｏｔａｒｅｖａ，ＦＥＢＳ，３２４巻（１）、６〜８頁（１９９３年））；チロシン、トリプトファン及びクロルプロマジン（Ｍ．Ｎａｋａｎｏ，Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．４巻，２３１〜４０頁（１９８９年））及びＭＣＬＡＢ−８Ｍ．（Ｍｉｔａｎｉ，ら、Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．９巻、３５５〜６１頁（１９９４年））で、それぞれ、下記に示す如き構造Ｂ−５〜Ｂ−８を有する。
2005514396.tif 000003
上記文献には、本記載の化合物の、ペルオキシダーゼによる化学ルミネセンス性酸化については、一切開示されてはいない。
【０００８】
ｂ、ＨＲＰによるエノールの反応。  一連の刊行物には、エノール化可能なアルデヒドの、ペルオキシダーゼ接触作用での空気酸化が記載されている（Ｈ．Ｇａｌｌａｒｄｏ，ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７８９巻、５７〜６２頁（１９８４年）；Ｗ．Ｊ．Ｂａａｄｅｒ，ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｄ．，１４巻（４）、１９０〜２頁（１９８６年）；Ｉ．Ｎａｎｔｅｓ，ら、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．，６３巻（６）、７０２〜８頁（１９９６年））。反応性基質は、アルデヒドと平衡しているエノール状態の少量であると考えられる。アルデヒドの反応は、エノールホスフェートによって接触作用を受けるが、エノールホスフェートそのものは消費されない。文献によって、エノールホスフェートは、ペルオキシダーゼと反応して化学ルミネセンスを発生するのではないことが判る。蛍光性のエネルギーアクセプタへのエネルギー移動が発光を増大させる（Ｍ．Ｔ．Ｇｒｉｊａｌｂａ，ら、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．，６３巻（６）、６９７〜７０１頁（１９９６年））。エノール・シリルエーテルとして（Ｂａａｄｅｒ，同上文献）又はエノール・アセテートとして遮蔽したアルデヒドを結合アッセイに使用する場合、最初に脱遮蔽してエノールを現場生成させ、次いでペルオキシダーゼと反応させて化学ルミネセンスを発生させた（Ａ．Ｃａｍｐａ，ら、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．，６３巻（６）、７４２〜５頁（１９９６年））。
【０００９】
ｃ、ペルオキシダーゼ強化剤。  前記のルミノール及びアクリダンカルボン酸誘導体を含む既知の化学ルミネセンス基質とペルオキシダーゼとの反応からの化学ルミネセンスの増量及び持続性増大の目的で、多種の強化剤が使用されている。これらは、Ｇ．Ｔｈｏｒｐｅ，Ｌ．Ｋｒｉｃｋａでの  Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，Ｊ．Ｓｃｈｏｌｍｅｒｉｃｈ，ら、編集、１９９〜２０８頁（１９８７年）に挙げられているように、Ｄ−ルシフェリンのようなベンゾチアゾール誘導体や、各種のフェノール化合物、例えば、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−フェニルフェノール、ナフトール及び芳香族アミンなどである。ペルオキシダーゼによるアミノ置換環状アシルヒドラジッドの化学ルミネセンス性酸化の強化剤として機能する他の化合物には、４−（４−ヒドロキシフェニル）−チアゾール（Ｍ．Ｉｉ，同文献）、米国特許第５，１７１，６６８号明細書記載の化合物群、米国特許第５，２０６，１４９号明細書に開示の２−ヒドロキシ−９−フルオレノン及びヒドロキシ置換ベンズオキサゾール誘導体及び米国特許第５，６２９，１６８号明細書に記載の、ある種のフェニルボロン酸化合物がある。前掲の文献には、ペルオキシダーゼ単独又は強化剤の使用とともによる本発明化合物の化学ルミネセンス性酸化が開示されてはいない。
【００１０】
ｄ、界面活性剤による化学ルミネセンス性ペルオキシダーゼ反応の強化。  高分子の、及び、非重合体の界面活性剤を用いて、ペルオキダーゼ接触反応で発生する化学ルミネセンスを強化することは、当業者に既知である。強化は、一工程以上の出力に作用することによって生起させることができ、例えば、発光体の蛍光量子収率の増加によって、又は励起状態で生じた生成分子の割合の増加によって、あるいは競合する副反応の抑圧による化学ルミネセンス反応生成分子部分の増大によって、若しくは、酵素触媒の作用促進によって生起させることができる。化学ルミネセンス反応についての、高分子及び非重合体の界面活性剤の影響に関しては、明快な、又は不変の型式は存在しない。いずれにしても、どの界面活性化合物が特異な工程からの化学ルミネセンスを強化できるかを予測することは不可能であり、十分な実験によってのみ、決定することができる。
【００１１】
カチオン性の高分子界面活性剤ポリ−Ｎ−エチル−４−ビニルピリジニウムブロミドは、負の電荷のインシュリン−ペルオキシダーゼ抱合体によってルミノールの化学ルミネセンス反応を阻害し、天然の酵素を用いた場合はより小さくなるまで化学ルミネセンスを減少させる。（Ｓ．Ｂ．Ｖｌａｓｅｎｋｏ，ら、Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．，４巻、１６４〜１７６頁（１９８９年））。
【００１２】
特開平０６−２４２１１１号公報及び刊行物（Ｒ．Ｉｗａｔａ，ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３１巻、１７０〜４頁（１９９５年））には、バックグラウンドの投射を低下させ、又は、信号／ノイズを強化する、ルミノールの化学ルミネセンス性過酸化における非イオン界面活性剤とスキムミルクの使用が開示されている。
【００１３】
前記文献には、ペルオキシダーゼ又は界面活性剤による化学ルミネセンス強化による本発明化合物の化学ルミネセンス性酸化の開示はない。
【００１４】
ｅ、ＨＲＰ使用の分析（アッセイ）。  酵素ホースラディッシュペルオキシダーゼは、基質としてルミノール又はイソルミノールを用いる化学ルミネセンス検出による酵素イムノアッセイ及びＤＮＡハイブリッド形成アッセイに、広い用途が見出されている。ＨＲＰ抱合体と、強化ルミノール化学ルミネセンス検出を用いる市販品キットが利用可能である。化学ルミネセンス性ペルオキシダーゼアッセイも又、前記米国特許第５，４９１，０７２号明細書、第５，５２３，２１２号明細書及び第５，５９３，８４５号明細書に開示されている。基質として、本発明化合物を用いる化学ルミネセンス・ペルオキシダーゼアッセイを開示している文献はない。
【００１５】
ｆ、新規な化学ルミネセンス・ペルキシダーゼ基質。  新規な種類の化学ルミネセンス・ペルオキシダーゼ基質が、出願人によって、先行の米国特許第５，９２２，５５８号明細書及び公開されたＰＣＴ出願第ＷＯ９９／１４２２０号公報で開示されている。これら出願の開示内容は、全て本明細書に含まれている。これら刊行物の開示は、本発明の化合物の類に属する、ヘテロ環化合物の種類を記載するものであるが、本発明の化合物は、ペルオキシダーゼ酵素と過酸化物の源泉との反応からの発光において予想外に優れたものである。
【００１６】
ｇ、ベンゾジチアフルバレン。  下記の構造、
2005514396.tif 000004
を有するベンゾジチアフルバレンの合成が開示されている（Ｋ．Ａｋｉｂａ，Ｋ．Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｎ．Ｉｎａｍｏｔｏ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１２巻、８６１〜２頁（１９７７年））。化学ルミネセンス・ペルオキシダーゼ基質として機能する、その能力に関しては、なんらの情報もない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の目的は、ペルオキシダーゼ及び過酸化物と反応して化学ルミネセンスを供給する化合物を含有し、ペルオキシダーゼ検出のための優れた組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明の特に重要な目的は、優れた化合物と、これを含有する組成物とを提供することであり、ここで、この優れた化合物とは、下記式、
2005514396.tif 000005
で表され、炭素−炭素二重結合を含有していて、該二重結合の一端は、いずれも別の基Ｒ1又はＲ2と結合している２個のイオウ原子で置換されており、該二重結合の他の一端には窒素原子を含有する多環式ヘテロ環系の一部を形成したもので置換されている。
【００１９】
本発明の化合物を含有する組成物は、好ましくは、本発明の化合物とペルオキシダーゼとの反応において生成する化学ルミネセンスを促進し、本発明の分析的利用を高めるための、強化剤（エンハンサー）化合物を含有する。
【００２０】
本発明の、更なる目的は、本発明の化合物及び組成物を使用してペルオキシダーゼと過酸化物との反応において化学ルミネセンスを迅速に発生させる方法を提供することである。
【００２１】
本発明の更に他の目的は、イムノアッセイ、核酸プローブアッセイ、ウェスタンブロットアッセイ、サザンブロットアッセイ及び分析試料の検出のための酵素標識を用いる、一般的に既知の方法による他のアッセイにおけるペルオキシダーゼ及び抱合体の検出に用いるための化学ルミネセンス性組成物及び方法を提供することである。従って、該アッセイは、ペルオキシダーゼ又は抱合体を検出し、かつそれによって発生した化学ルミネセンスを分析試料の有無又は量と関連付けることによるかかるアッセイにおいて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
定義：
アルキル−１〜２０個の炭素原子を含有する、分枝、直鎖又は環状の炭化水素基。ここで、低級アルキルとは、約８個以下の炭素原子を含有するアルキル基に関して用いる。
【００２３】
アルキレン−２価のアルキル鎖の基。
【００２４】
アルケニル−少くとも１個のＣ−Ｃ二重結合を含有し、２〜２０個の炭素原子を含有する、分枝、直鎖又は環状の炭化水素基。ここで、低級アルケニルとは、約８個以下の炭素原子を含有するアルケニル基に関して用いる。
【００２５】
アルキニル−少くとも１個のＣ−Ｃ三重結合を含有し、２〜２０個の炭素原子を含有する、分枝又は直鎖の炭素水素基。ここで、低級アルキニルとは、約８個以下の炭素原子を含有するアルキニル基に関して用いる。
【００２６】
分析試料−その存在の有無又は量を、アッセイにより、標本について測定をすべき物質。分析試料には、特異的結合親和性を有する特異的結合パートナーが存在する、有機及び生体分子が含まれる。分析試料を例示すれば、これらの例に制限されるものではないが、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ錯体、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体フラグメント、抗体−ＤＮＡキメラ、抗原、ハプテン、たんぱく質、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン及びビオチンがある。その他の分析試料の例として、オキシダーゼ酵素及びペルオキシダーゼ酵素もある。
【００２７】
アリール−１〜５個の炭素環式芳香環を含有する芳香環含有の基であり、１個以上のＨ以外の置換基で置換することができる。
【００２８】
ハロゲン−フッ素、塩素、臭素又はヨウ素原子。
【００２９】
ヘテロアルキル−少くとも１個の非末端炭素原子を、窒素、酸素又はイオウ原子によって置換している一価のアルキル鎖の基。
【００３０】
ヘテロアルキレン−少なくとも１個の非末端炭素原子を、窒素、酸素又はイオウ原子によって置換している二価のアルキレン鎖の基。
【００３１】
ルミネセンス性−電子の励起状態に励起された場合の、光放射の可能性。光は、一重項励起状態からの崩落の場合、蛍光として放射され得るか、または三重項励起状態からの崩落の場合、燐光として放射され得るかのいずれかである。
【００３２】
過酸化物−Ｏ−Ｏ結合を含有する化合物で、好ましくは過酸化水素、又は過酸化水素の錯体、例えば、尿素過酸化物、過硼酸塩又は過炭酸塩。
【００３３】
標本−アッセイしようとする１種以上の分析試料を含有するか、又は含有すると想定される流体。化学ルミネセンス反応の方法によって分析される代表的な標本は、体液、例えば血液、血漿、血清、尿、精液、唾液、セルリゼート、組織抽出物などの生物学的標本である。他の種類の標本には、食品の標本及び環境的標本で、例えば、汚物又は水がある。
【００３４】
特異的結合対−相互の結合親和性を示す２種の物質。その例には、抗原−抗体、ハプテン−抗体又は抗体−抗体対、相補的オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、アビジン−ビオチン、ストレプトアビジン−ビオチン、ホルモン−レセプター、レクチン−炭水化物、ＩｇＧ−たんぱく質Ａ、核酸−核酸結合たんぱく質及び核酸−抗核酸抗体がある。
【００３５】
置換−ある基について少なくとも１個の水素原子の、非水素原子の基による置き換えを意味する。置換基に関しては、別に明示されているのではなければ、多くの置換点が存在し得る意味であることに留意すべきである。
【００３６】
後述の化学式Ｉで表される化合物が過酸化物及びペルオキシダーゼと反応して予想外に優れた性能を有する化学ルミネセンスを発生することが見出された。本発明のケテンジチオアセタール化合物は、化学式Ｉ、
2005514396.tif 000006
（式中、Ｒ1とＲ2とはいずれも基中の原子の原子価を満たすに必要なＨ原子の所要数に加えて、１〜約５０個の非水素原子を含有する有機の基であり、また、Ｒ1とＲ2とは相互に結合して環を形成し得るものである）で表される。基Ｒ1及びＲ2は、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉ及びハロゲン原子から選択される１〜約５０個の非水素原子を、より好ましくは１〜２０個の同様な原子を含有することができる。Ｒ1及びＲ2として好ましい基は、アルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、アリールアルキル及び置換されたアリールアルキル基である。より好ましいのはアルキル、置換されたアルキル、アリール、及び置換されたアリール基である。Ｈ原子以外の置換基、例えばイオン性の基又は極性基を、化合物の性能を改良するため、又は合成に便宜を供するために、炭素鎖又は環上に多数、かつ選ばれた位置に含有させることができる。かかる性能とは、例えば、化学ルミネセンス量子収率、酵素との反応速度、発光の最大強度、発光の持続時間、発光の波長、反応媒体への溶解度である。水溶性を与える好ましい基は、スルホネート塩の基  −ＳＯ3-、サルフェート塩の基  −ＯＳＯ3-、ホスホネート塩の基  −ＰＯ3-、ホスフェート塩の基  −ＯＰＯ3-2、カルボン酸塩の基  −ＣＯＯ-及びアンモニウム塩の基  −ＮＲ3+並びにホスホニウム塩の基  −ＰＲ3+である。特異的結合パートナーのような、他の分子に共有カップリングさせる１個以上の基もまた、Ｒ1及びＲ2上の置換基として含ませることができる。特異的置換基として例を挙げれば、これらに制限されるものではないが、アルコキシ、アリールオキシ、ヒドロキシ基、ハロゲン原子、アミノ、置換されたアミノ、カルボキシル、カルボアルコキシ、カルボキシアミド、シアノ及びスルホネート基である。
【００３７】
Ｒ1とＲ2とが相互に結合して環を形成する場合は、環は好ましくは５〜３０個の原子であり、アルキレン鎖、ヘテロアルキレン鎖及び二重結合を含む不飽和鎖から選択される、追加の炭素及び／又は酸素原子を含有する。鎖中の炭素原子は、基Ｒ1とＲ2とに関連して上記の如く、非水素原子で置換することもできる。好ましい環の大きさは、５〜７原子である。
【００３８】
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2005514396.tif 000008
【００３９】
好適実施形態においては、Ｒ1及びＲ2は結合して、上述の如き少くとも１種の水溶性付与基Ｚで環上に置換している六員環を完成する。別の実施形態として、基Ｚを基Ｒ3に結合する。結合しているＲ1とＲ2とによって形成される環もまた、ベンゾ縮合環の如き第二の環に縮合した５〜７員環であり得る。同様に少なくとも１個の水溶性付与の基Ｚは、縮合環の一つに、又は基Ｒ3上に置換してもよい。例示構造式を上記に示した。
【００４０】
本発明の化合物において、基Ｒ3は、基中の原子の原子価を満たすに必要なＨ原子の所要数に加えて、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉ及びハロゲン原子から選択される１〜５０個の非水素原子を含有する有機の基である。より好ましくは、Ｒ3は、１〜２０個の非水素原子を含有する。その有機の基は、好ましくは、アルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、アリールアルキル及び置換されたアリールアルキル基から成る群から選択される。Ｒ3としてより好ましい基は、置換又は無置換のＣ1〜Ｃ4アルキル基、置換又は無置換のフェニル又はナフチル基、及び置換又は無置換のベンジル基である。置換される場合には、例示の置換基には、下記のものに限定するものではないが、アルコキシ、アリールオキシ、ヒドロキシ基、ハロゲン原子、アミノ、置換されたアミノ、カルボキシル、カルボアルコキシ、カルボキシアミド、シアノ、スルホネート及びホスフェート基がある。好ましいＲ3基は、少なくとも１個の水溶性付与基で置換されたアルキル基又はヘテロアルキル基である。
【００４１】
化合物の性能を改良するため、又は、最終化合物の合成に便宜を供することを目的として、多量に、かつ、ヘテロ環における選ばれた環又は連鎖の位置に、置換基を含有させることができる。かかる性能とは、下記のものに限定するものではないが、化学ルミネセンス量子収率、酵素との反応速度、最大の光強度、発光の持続性、発光の波長及び反応媒体における溶解性である。基Ｒ4〜Ｒ11は、同一でも異なっていてもよく、いずれもＣ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉ及びハロゲン原子から選択される１〜５０個の原子を含有することのできる置換基であり、発光することのできるものであり、下記の基に限定されるものではないが、アルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリールオキシ基、ハロゲン原子、アミノ、置換されたアミノ基、カルボキシル、カルボアルコキシ、カルボキシアミド、シアノ、スルホネート及びホスフェート基であり得る。好ましくはＲ4〜Ｒ11は、水素原子、ハロゲン原子、アルコキシ基、アミノ、又は１個或いは２個のアルキル又はアリール基で置換されたアミノ基から選択される基である。化合物の好ましい基は、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ12又はＲ10の１個が塩素原子であり、Ｒ4〜Ｒ11のうちの他のものが水素原子であるものである。
【００４２】
隣接する基の対、即ちＲ4とＲ5、又はＲ5とＲ6、又はＲ6とＲ7、又はＲ8とＲ9、又はＲ9とＲ10、又はＲ10とＲ11は、環外二重結合を有する環に縮合している少なくとも１個の５又は６員環を含む炭素環又はヘテロ環系として相互に結合し得る。更に他の縮合環が存在する場合、得られる化合物がベンゾアクリダン誘導体となる、縮合ベンゼン環の追加であることが好ましい。
【００４３】
本発明の範囲内にある特有の化合物には、下記のものがあるが、これに限定されるものではない。
【００４４】
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【００４５】
基Ｒ1〜Ｒ3の好ましい組合わせには、Ｒ1とＲ2のうちの１個又は両方が、スルホネート塩の基又はホスフェート塩の基で置換されたアルキル基を含み、Ｒ3がフェニル、置換されたフェニル、ベンジル又は置換されたベンジル基である化合物がある。スルホネート又はホスフェート置換のアルキル基が唯一の場合には、その他のＲ1又はＲ2は、アルキル又はベンジル基が好適である。
【００４６】
また、本発明化合物種類の範囲内と考えられるものとして、Ｒ1又はＲ2、若しくは両方が、アクリダン環の最も近い位置、即ち、Ｒ4又はＲ11と結合して閉環し、環を追加する実施形態もある。
【００４７】
更に実施形態の追加として、窒素原子がアクリダン環の最も近い位置、Ｒ7又はＲ8のいずれかに結合して、追加となる５〜７員環を閉環し、Ｒ1とＲ2とが相互に無関係に、１〜２０個の炭素原子を有するアルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、アリールアルキル及び置換されたアリールアルキル基から選択され、相互に結合して５〜３０個の原子を有する環を形成するか、又は、Ｒ1あるいはＲ2、若しくは両方が、アクリダン環の最も近い位置に結合して追加となる環を閉環する。構造の例示は下記である。
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【００４８】
上記に示したものを含め、化学式Ｉで表されるケテンジチオアセタール化合物の、過酸化物及びペルオキシダーゼとの反応は迅速に極めて高い強度に到達する化学ルミネセンスを発生する。最大発光には、１分以下で到達し、数分間一定に保持される。他の既知の化学ルミネセンス・ペルオキシダーゼ基質で、これほど迅速に高強度の化学ルミネセンスを発生するものはない。構造的に相関のある化合物の、化学ルミネセンス時間の概要に関する、予想外で著るしい差の有る動力学的挙動については、前出の米国特許第５，９２２，５５８号明細書に開示されている。例えば、下記式、
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で表される化合物は、ＨＲＰと反応して、７分で最大ルミネセンス強度に達することが記載されている。本発明の化合物は、極めて迅速に安定な最大強度に到達し得る能力があるので、今日要請されている迅速な高処理量アッセイには、他の化合物よりも、より好適なものである。
【００４９】
本発明の化合物は、少くとも５〜１０．５のｐＨ範囲に亘って予想外に高い安定性を示し、酸性とアルカリ性両方のｐＨ値でのその処方及び使用を可能とする。化学式Ｉで表される化合物の水性緩衝溶液は、室温で長期の貯蔵安定性を示し、４℃で無期限に安定である。水溶性の基を有する化学式Ｉで表される化合物の溶液を、実用的な濃度で調製することができ、補助溶剤を必要としない。強化剤配合組成物を調製することにより、ホースラディッシュペルオキシダーゼの最適活性化ｐＨである、ｐＨ５〜６で鋭敏な検出を可能にする。
【００５０】
化学式Ｉの化合物を調製する方法は、下記２種のスキーム、
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に従って、好適なカルボニル化合物に、リチオシラン（Ｌｉｔｈｉｏｓｉｌａｎｅ）化合物又はホスホラスイリドを求核付加することを含む（Ｆ．Ａ．Ｃａｒｅｙ，Ａ．Ｓ．Ｃｏｕｒｔ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，３７巻、１９２６〜２９頁、（１９７２年））。別の方法として、Ｅ．Ｊ．Ｃｏｒｅｙ及びＡ．Ｐ．Ｋｏｚｉｋｏｗｓｋｉ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，９２５〜８頁（１９７５年）に開示されているように、ビス（ジアルキルアルミニウム）−ジチオール試薬との反応によって、エステルをケテンジチオアセタールに転化する方法で、下記に示す通りである。
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更に別の方法では、活性メチレン基のアニオンをＣＳ2と反応させ、ジチオカルボキシレートを、Ｒ1基を含む試薬Ｒ1−ＬＧと反応させて、ジチオエステルを形成する。後者の方法論の例は、Ｉ．Ｓｈａｈａｋ及びＹ．Ｓａｓｓｏｎ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，４２０７〜１０頁（１９７３年）に開示されている。ジチオエステルをエノラートに転化し、化学式Ｒ2−ＬＧ試薬と反応させる。代表的な脱離基には、ハロゲン原子、例えば塩素化物、臭素化物及びヨウ素化物、スルホネート、例えば、メタレンスルホネート及びｐ−トルエンスルホネート並びにトリフルオロメタンスルホネート、カルボキシレート、例えば、アセテート及びベンゾエート、特に、Ｘがアシル基の場合には、Ｘ−ＬＧは酸無水物、メトサルフェートのようなサルフェート及び他の基、例えばイミダゾール、トリアゾール、及びテトラゾール、マレイミド、スクシンイミドキシ基がある。
【００５１】
2005514396.tif 000018
上記、方法Ｄは、反応性アリール化剤の一種としてのベンザイン中間体の生成を伴う。ベンザイン中間体は、例えば、臭素化ベンゼン化合物の、強塩基、例えば、ｓｅｃ−ブチルリチウム又はＬＤＡによる処理によって、現場生成し得る（Ｍ．Ｗａｔａｎａｂｅ，ら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，３７巻（１），３６〜４１頁、（１９８９年））。
【００５２】
その他の合成法としては、アクリドン化合物とベンゾジチオールから誘導されるホスホラスイリドの反応から成るものがある。手順と条件は、一般的には前述のＡｋｉｂａらの文献並びにＫ．Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｋ．Ａｋｉｂａ及びＮ．Ｉｎａｍｏｔｏ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，４１巻、３６９５〜３６９８頁（１９７６年）に記載されている。
【００５３】
本発明の化合物及び組成物は、ペルオキシダーゼとの反応による化学ルミネセンス発生方法において有用である。緩衝水溶液での、本発明化合物のペルオキシダーゼ及び過酸化物との反応は、検出可能な可視的化学ルミネセンスを容易に発生する。光強度は、室温で迅速に、代表的には約１分以内に最大水準に到達する。反応は、随意には強化剤の存在下で行われる。
2005514396.tif 000019
【００５４】
化学ルミネセンスの好適発生方法において、化合物Ｉは、約８〜１０の間のｐＨのアルカリ性緩衝液で、ペルオキシダーゼ、過酸化物及び強化剤と反応して連続的な化学ルミネセンス信号を発生するが、それは酵素と化合物Ｉとの反応で開始される。分析感度は、非イオン性界面活性剤の含有によって強化し得るが、下記に更に詳述する。
【００５５】
化合物Ｉとペルオキシダーゼとの反応から発光する好適方法においては、反応は５℃と５０℃との間、好ましくは２０℃と４０℃との間の温度で、約５と１０．５との間のｐＨ、好ましくは７と１０との間のｐＨの緩衝水溶液において行われる。化合物Ｉを、１μＭと２０ｍＭとの間の、好ましくは１０μＭと５ｍＭとの間の濃度で使用する。酵素は遊離のペルオキシダーゼ又はペルオキシダーゼ抱合体であり得る。
【００５６】
本発明の化合物は、一般に放射線の１００〜２００ｎｍの広域帯に亘って発光し、電磁スペクトルの可視領域への近紫外の波長で最大強度を示す。最大強度λｍａｘの典型的な波長は３５０〜５００ｎｍの範囲内である。共有結合した発蛍光団を有する式Ｉの化合物は、発蛍光団の励起状態から、より長い波長での照射を生じる分子内エネルギー転移を行うことができるものと予想される。
【００５７】
化学式Ｉの、２個以上の化合物を、ペルオキシダーゼの作用による発光法に同時に使用することができる。ある場合には、２個以上の化学式Ｉの化合物をペルオキシダーゼと同時に反応させる方が有利である。２個以上の化合物が、異なるルミネセンス性能又は物理的性能を有する場合は、いずれか１個の化合物の使用によって容易には得られない特徴を持った発光反応を得るのに、２個の化合物の組合わせが望ましいことがあり得る。化合物Ｉの間で変わり得るルミネセンス性能及び物理的性能の実例としては、照射スペクトル、発光の持続性、酵素の種類別、最高照射までの上昇速度、疎水性／親水性バランス及び溶解度がある。
【００５８】
過酸化物の成分は、ペルオキシダーゼと反応し得る任意の過酸化物又はアルキルヒドロペルオキシドである。好適な過酸化物としては、過酸化水素、尿素過酸化物及び過硼酸塩がある。
【００５９】
化学ルミネセンス反応を行うことができるペルオキシダーゼには、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、例えばバナジウム・ブロモペルオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、カビペルオキシダーゼ、例えば、リグニンペルオキシダーゼ並びにアルトロマイセス・ラモサスからのペルオキシダーゼ及び白腐れ病に生じるＭｎ依存ペルオキシダーゼ及び大豆ペルオキシダーゼがある。ルミノールの化学ルミネセンス性酸化の接触作用をすることで知られる鉄錯体やＭｎ−ＴＰＰＳ4を含む、酵素ではないがペルオキシダーゼ様活性を有する、他のペルオキシダーゼ模擬化合物は、（Ｙ．−Ｘ．Ｃｉ，ら、Ｍｉｋｒｏｃｈｅｍ．Ｊ．，５２巻、２５７〜６２頁（１９９５年））ここで用いられるペルオキシダーゼの意味合の範囲内にあることは、明白である。
【００６０】
ペルオキシダーゼと生体分子との抱合体又は錯体もまた、抱合体ペルオキシダーゼ活性を示す場合に限り、化学ルミネセンス生成方法に使用することができる。ペルオキシダーゼの１個又はそれ以上の分子に抱合され得る生体分子には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体フラグメント、抗体−ＤＮＡキメラ、抗原、ハプテン、たんぱく質、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン及びビオチンがある。ペルオキシダーゼを包含し、又は合体させる錯体、例えば、リポソーム、ミセル、小胞及び生体分子へ結合する機能を有するポリマーもまた、本発明の方法に用いることができる。
【００６１】
反応混合物に、ある種の強化化合物を含有させることによって、酵素の反応性を促進する。これらの強化剤の内に含まれるものとしては、他のペルオキシダーゼ反応を強化することが知られているフェノール性化合物及び芳香族アミンであって、Ｔｈｏｒｐｅ及びＫｒｉｃｋａにより、並びに、Ｉｉ，らによる前出の文献、及び米国特許第５，１７１，６６８号明細書並びに第５，２０６，１４９号明細書に記載されており、これらは参考のために本明細書に取り入れられているものである。米国特許第５，５１２，４５１号明細書に開示され、参考のために本明細書に取り入れられている置換又は無置換のアリールボロン酸化合物及びそのエステル並びに無水物誘導体もまた、本発明に有用な強化剤の範囲内にあると考えられる。好適な強化剤を挙げると、これらに限定されるものではないが、ｐ−フェニルフェノール、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−ブロモフェノール、ｐ−ヒドロキシ桂皮酸、ｐ−イミダゾリルフェノール、アセトンアミノフェン、２，４−ジクロロフェノール、２−ナフトール及び６−ブロモ−２−ナフトールがある。上掲の類別のものから、２種以上の強化剤の混合物もまた、使用することができる。
【００６２】
本発明の化合物からの化学ルミネセンスの生成を強化するのに有効なことが見出されたその他の強化剤は、下記式、
2005514396.tif 000020
で表されるフェノキサジン及びフェノチアジンである。但し、式中、フェノキサジン及びフェノチアジン強化剤の窒素原子に置換されるＲ基としては、１〜８個の炭素原子を有するアルキル基、及び、スルホネート塩又はカルボキシレート塩の基で置換された１〜８個の炭素原子を有するアルキル基がある。好適な強化剤としては、３−（Ｎ−フェノチアジニル）プロパンスルホン酸塩、３−（Ｎ−フェノキサジニル）プロパンスルホン酸塩、４−（Ｎ−フェノキサジニル）ブタンスルホン酸塩、５−（Ｎ−フェノキサジニル）ペンタン酸塩及びＮ−メチルフェノキサジン並びに関連同族体がある。
【００６３】
本発明の化学ルミネセンス試薬における添加剤の非イオン界面活性剤は、可溶化目的に有用である。ペルオキシダーゼの使用による化学ルミネセンス生成のための反応に、非イオン界面活性剤を含有させることにより、ペルオキシダーゼに関する分析感度の向上を図ることができる。本発明の実施上有用な非イオン界面活性剤として例示をすれば、ポリオキシエチレン化アルキルフェノール、ポリオキシエチレン化アルコール、ポリオキシエチレン化エーテル及びポリオキシエチレン化ソルビトールエステルがある。
【００６４】
ＣＴＡＢのような第４級アンモニウム塩化合物を包含する陽イオン界面活性剤は、本発明のある種の化合物をペルオキシダーゼ及び過酸化物と反応させる場合、照射する化学ルミネセンスの水準を高めるのに用いて有利である。例えば、ＣＴＡＢが反応混合物に含有される場合には、本発明による後述の化合物１１の反応によって得られる光強度を２０倍以上増加される。
【００６５】
本発明の反応を、ペルキシダーゼで被覆した固形支持体、例えば、ビーズ、管、膜又はミクロウェルプレート（ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）の表面と接触できる水性緩衝液などの溶液中で実施する。好適緩衝液は、ｐＨを約５〜約１０．５の範囲内に維持可能な通常用いられる任意の緩衝液で、例えば、ホスフェート、ボレート、アセテート、カルボネート、トリス（ヒドロキシメチルアミノ）メタン、グリシン、トリシン、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、ジエタノールアミンなどである。これに関する本発明の好適実施方法は、特に使用しようとする目的での必要性によって決定される。
【００６６】
本発明方法による照射光は、任意の好適な既知の方法、例えば、ルミノメーター、Ｘ線フィルム、高速写真フィルム、ＣＣＤカメラ、シンチレーション計数管、化学光量計又は視覚的な方法によって検出することができる。各検出方法は異なるスペクトル感度を有する。人間の眼は緑色の光に最適の感度を有し、ＣＣＤカメラは赤色光に最大感度を示し、Ｘ線フィルムは、紫外線から青色光又は緑色光への感応が最大であることを利用可能である。検出装置の選択は、適用分野及びコスト、便利さ及び永久記録の作成が必要かどうかの考慮によって支配される。
【００６７】
本発明の化学ルミネセンス法の重要な用途は、化学ルミネセンス反応による検定手順における分析試料での存在の有無又は量の検出である。この方法は、分析試料を含有すると思われる標本を、本発明の化学ルミネセンス化合物と接触させ、定性法では発生した光を検出し、また、定量を必要とする場合には、分析試料の量に対して発生した光の量を関係付ける工程を包含する。光強度と分析試料の量との関係は既知量の分析資料によって描いた検量線の構成により、容易に認識できる。一般的に、化合物Ｉを、約１０-5Ｍ〜約１０-2Ｍ、好ましくは、約１０-4Ｍ〜約１０-3Ｍの濃度で使用する。溶液中で検出する場合は、ペルオキシダーゼは、約１０-9Ｍ以下が好適である。化学ルミネセンス反応法によって分析する代表的な標本は、体液、例えば、血液、血漿、血清、尿、精液、唾液、ＣＳＦなどである。
【００６８】
本発明の方法によって検定することのできる分析試料には、ペルオキシダ−ゼがあり、この場合には、別のペルオキシダーゼを添加する必要はなく、他に、ペルオキシダーゼによって標識を付けることが可能であるか、又は、酵素標識化特異的結合パートナーによって特異的に検出できるペルオキシダーゼの阻害剤及び各種の有機分子並びに生体分子がある。分析試料結合化合物に標識として酵素を直接含有させ得る。これとは別に、分析試料結合化合物用の、少なくとも１種の酵素標識化特異的結合物質に対して、分析試料結合化合物を結合させることが可能である。また別に、分析試料結合化合物を、少なくとも１種の、第２特異的結合物質で標識付けすることが可能であり、次いで、第２特異的結合物質用酵素標識化結合パートナーに、それを結合させる。
【００６９】
本発明はまた、化学式Ｉで表わされる化合物と、ペルオキシダーゼ酵素を用いる化学ルミネセンス反応による検定手順における過酸化水素を検出するための本方法の使用に関するものであり、この場合、発光量が、存在する過酸化物の存在有無又は量に相関する。本発明方法をオキシダーゼ酵素及びデヒドロゲナーゼ酵素の検出に使用可能なことは、化学ルミネセンス・アッセイ関係の当業者には明らかである。これらの酵素は酸素の還元及びその生来の基質の酸化によって過酸化水素を発生する。次いで、このようにして発生した過酸化水素を、発生と同時にか、乃至は本発明の化合物Ｉ及びペルオキシダーゼと次工程において反応させ、発光させることが可能である。この時発生した光の性能は、オキシダーゼ又はデヒドロゲナーゼ酵素の量に相関する。更にオキシダーゼ又はデヒドロゲナーゼ酵素は、分析試料検定における生体分子、或いは特異的結合対の一員への抱合体として存在し得る。
【００７０】
化学式Ｉで表される化合物とペルオキシダーゼとの、化学ルミネセンスを発生する反応は、ペルオキシダーゼの存在の有無又は量を検出するための迅速かつ鋭敏な方法を構成する。従って、標本と化学式Ｉで表される化合物との反応による発光の量又は強度の測定による、標本中のペルオキシダーゼの存在の有無又は量を測定する目的で、本発明方法を用いることができる。かかる測定は、例えば、法廷検討における証拠としての哺乳類動物血液のペルオキシダーゼ活性検出に用途を見出すことができる。
【００７１】
ペルオキシダーゼ活性の化学ルミネセンス測定に関する第２の応用分野は、酵素阻害剤の検出と測定に関するものである。例えば、ペルオキシダーゼ阻害剤には、シアン化物、硫化物及び高濃度過酸化水素がある。阻害剤の量又は特性、例えば、阻害定数Ｋi、又は阻害半減期ｔ1/2の測定は、検出可能な生成物を発生する、化学式Ｉで表される基質の存在下、ペルオキシダーゼ酵素を含有する標本の活性と、阻害剤の量とを測定することによってなされる。酵素と、化学ルミネセンス性化合物との反応は、阻害剤の存在下と不存在下で行われ、その結果を比較して、阻害剤の存在の有無又は量を測定する。阻害剤の効果としては、光強度の低減、光強度上昇速度の遅延、又は光放射開始前期間の遅延の３種の効果のうち、いずれか１種以上を有する。
【００７２】
反応がペルオキシダーゼによって接触作用を受けるので、酵素の極めて少い量で、検出可能な光量を充分発生する。１ａｍｏｌ（１×１０-18モル）以下の感度が達成されている。かかる少量のペルオキシダーゼを検出できる能力によって、本発明の化学ルミネセンス技術は、標本中に少量しか存在しない分析試料、又は、限られた大きさの標本中の少量の分析試料を検出できる酵素結合アッセイを用いる多種分析試料の分析に好適なものとなっている。この種のアッセイにおいては、ペルオキシダーゼを特異的結合対の一員として抱合する。一例は、化学ルミネセンス性酵素結合イムノアッセイ、例えばエリザ（ＥＬＩＳＡ）である。免疫化学の進歩を達成するための各種アッセイの企画及び実験計画は、当業者にはよく知られており、競合アッセイとサンドイッチアッセイの二つがある。このように形成された、検出可能な標識化結合対を、本発明の化合物及び方法をもって検定し得る。検出可能な標識がペルオキシダーゼ酵素である場合には、直接検出する。検出可能な標識が、他の特異的結合対の一員、例えば、ハプテンである場合には、ペルオキシダーゼとの結合パートナーの抱合体を先に反応させ、次いで、本発明方法に従ってペルオキシダーゼを検出する。業界既知の固体表面又は支持体に付着しているか、又は、溶液中に遊離しているか、あるいは有機的アッセンブリー、例えばリポソーム内に包含された酵素標識化の種で測定を実施できるが、リポソームの場合には、溶解剤を使用してリポソームを溶解し、検出可能な酵素を遊離させる。
【００７３】
他の例示的使用法には、ウェスタンブロッティングの技術によるたんぱく質の検出がある。たんぱく質分析試料を含有する標本を、特異的一次抗体、及び、認知して一次抗体に結合する酵素標識化二次抗体によって検出する。本発明の薬剤を用いる化学ルミネセンス・アッセイのように、標識酵素を、本発明の化合物を使用して、化学ルミネセンスによって検出する。ビオチン化抗体やアビジンＨＲＰを使用する本技術の変法も、本発明方法を用いて遂行し得るアッセイの範囲内であると考えられる。
【００７４】
本発明の化合物は、酵素標識化核酸プローブの使用による核酸の検出にも有用である。例示となる方法には、溶液ハイブリッド形成アッセイ、サザンブロッティングにおけるＤＮＡ検出、ノーザンブロッティングによるＲＮＡ、ＤＮＡアミノ酸配列分析（ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、ＤＮＡフィンガープリント法、コロニーハイブリッド形成法及びプラークリフト法があり、実施方法については、当業者によく知られている。これらの方法を、本発明化合物とともに用いるためには、ペルオキシダーゼ酵素を標識として使用する。ペルオキシダーゼは、プローブ、オリゴヌクレオチド又は捕獲（ｃａｐｔｕｒｅ）オリゴヌクレオチドとの直接抱合体として存在し得るか、あるいは、業界既知の方法を用いる間接的結合方法によって含有される。
【００７５】
上記の抗原−抗体、ハプテン−抗体又は抗体−抗体の対に加えて、特異的結合対には、相補的オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、アビジン−ビオチン、ストレプトアビジン−ビオチン、ホルモン受容体、レクチン−炭水化物、ＩｇＧ−たんぱく質Ａ、核酸−核酸結合たんぱく質及び核酸−抗核酸抗体も有り得る。
【００７６】
他の側面としては、本発明は、約５〜約１０．５の間のｐＨを有する水性緩衝液と、０．０１〜１０ｍＭの濃度での化学式Ｉで表される化合物並びに、０．０１〜１０ｍＭの濃度の過酸化物とを含有する、ペルオキシダーゼとの反応によって化学ルミネセンスを発生する試薬組成物に関する。該組成物は、任意に、化学ルミネセンスを強化するために有効な量の、好ましくは０．００１〜１０ｍｇ／ｍＬの、少なくとも１種の強化剤を含有することができる。該組成物はまた、任意に、０．０１〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度の界面活性剤を含有し得る。
【００７７】
ペルオキシダーゼとの反応によって化学ルミネセンスを発生する好適な試薬組成物は、約７．５〜約９の間のｐＨを有する水性緩衝液と０．０１〜１０ｍＭの濃度での、化学式Ｉで表される化合物と、０．０１〜１０ｍＭの濃度での過酸化物と、０．００１〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度の強化剤と、化学ルミネセンスを強化するに有効な量、好ましくは０．００１〜１０ｍｇ／ｍＬの界面活性剤とを含有する。該組成物は更にキレート剤、例えばＥＤＴＡを０．０１〜１０ｍＭの濃度で含有し得る。
【００７８】
本発明の種々の面を更に詳細に説明するため、下記に実施例を示すが、いずれの場合も、これによって本発明の範囲が限定されるものではない。
【実施例】
【００７９】
実施例１、ケテンジチオアセタールの合成。  下記の化合物を調製した。
2005514396.tif 000021
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Ｍｅ＝メチル、Ｅｔ＝エチル、Ｐｒ＝ｎ−プロピル、Ｐｈ＝フェニル、Ｎｐ＝２−ナフチル、Ａｎ＝ｐ−アニシル（４−ＭｅＯＰｈ）、Ｒ4〜Ｒ11は指示ない場合はＨである。化合物３、４及び６は二重結合異性体の混合物として得られた。これらの化合物はいずれも、本発明において、化学ルミネセンスを発生する。
実施例２、Ｎ−アリールアクリダン先駆物質の調製。  化合物、Ｎ−フェニルアクリダン、Ｎ−（４−メトキシ）フェニルアクリダン及びＮ−（２−ナフチル）アクリダンを、アクリダンとハロゲン化芳香族化合物、好ましくはヨウ素化アリール又は臭素化アリールとの、パラジウム触媒カップリング反応により調製した。例えば、ブロモベンゼン、４−ブロモアニソール及び２−ブロモナフタレンをカップリング反応に使用できる。パラジウム触媒工程は、３級ホスフィンとパラジウム化合物、例えば、ＰｄＣｌ2又はＰｄ（ＯＡｃ）2から得られたパラジウム触媒を用い、一般に文献既知の方法を使用して実施した。
実施例３、代表的合成手順。
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化合物１．の合成。  ＴＨＦ（１５０ｍＬ）中、−７８℃で、ジイソプロピルアミンとｎ−ブチルリチウムとから調製したＬＤＡ溶液（３７ミリモル）に、ＴＨＦ（５０ｍＬ）中のＮ−フェニルアクリダン（９．００ｇ、３５ミリモル）を添加した。混合物を−７８℃で１時間撹拌し、次いで、ＣＳ2（２．３５ｍＬ、３９ミリモル）を添加した。−７８℃で１時間後、反応物を徐々に（１時間）、室温まで加温した。次に、再び反応混合物を−７８℃に冷却し、ＭｅＩ（２．８６ｍＬ、４６ミリモル）を添加した。添加後、ドライアイス浴を取り除き、反応を２時間室温で継続した。反応混合物を真空中で蒸発し、残渣をカラムクロマトグラフィ（ヘキサン／ＣＨ2Ｃｌ2  ７：１）にかけ、９．２１ｇのメチルＮ−フェニルアクリダン−９−ジチオカルボキシレートを黄色結晶固体として得た。収率７６％。  1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：ｄ２．５４（ｓ，３Ｈ），６．０２（ｓ，１Ｈ），６．３７（ｄ，２Ｈ），６．９２（ｔ，２Ｈ），７．０７（ｔ，２Ｈ），７．３５−７．４３（ｍ，４Ｈ），７．５３（ｍ，１Ｈ），７．６４（ｍ，２Ｈ）．
【００８０】
ＴＨＦ（３０ｍＬ）中のＬＤＡ溶液（１．１ミリモル）に、−７８℃で、ＴＨＦ（５ｍＬ）中のジチオエステル（０．３４７ｇ、１ミリモル）を添加し、混合物を−７８℃で１時間撹拌した。次いで、ＭｅＩ（０．１０ｍＬ、１．６ミリモル）を、ピペットにより−７８℃で添加し、得られた混合物を室温で一夜、撹拌した。真空中で溶媒を除去後、残渣をシリカゲル上（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ  ２０：１）、クロマトグラフィにかけ、０．３１７ｇの化合物１を淡黄色固体として得た（収率８８％）。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：ｄ２．３７（ｓ，６Ｈ），６．５２（ｄ，２Ｈ），７．０７−７．１８（ｍ，４Ｈ），７．４１（ｄ，２Ｈ），７．５７（ｍ，１Ｈ），７．６７（ｍ，２Ｈ），７．９７（ｄｄ，２Ｈ）．
【００８１】
化合物２、６、８、９、１０、１６、１７、１９、２０、２１、２３、２６、及び３０もまた、同様の手順により、基礎原料としてＬＤＡ又はＮａＨのいずれかを用い、対応するジチオエステル中間体から調製した。
【００８２】
化合物２  収率８０％。  1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ２．２９（ｓ，６Ｈ），３．４８（ｓ，３Ｈ），７．０１−７．０９（ｍ，４Ｈ），７．３０（ｍ，２Ｈ），７．８２（ｄｄ，２Ｈ）．
【００８３】
化合物６．  収率２９％。  1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ０．８８（ｔ，３Ｈ），１．２０（ｂｒ，１０Ｈ），１．４９（ｍ，２Ｈ），２．３２（ｓ，３Ｈ），２．７１（ｔ，２Ｈ），６．４７（ｔ，２Ｈ），７．０４−７．１０（ｍ，４Ｈ），７．３６（ｄ，２Ｈ），７．５４（ｍ，１Ｈ），７．６４（ｍ，２Ｈ），７．９０（ｄｄ，１Ｈ），７．９６（ｄｄ，１Ｈ）．
【００８４】
化合物８．  収率６３％。  1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ１．１９（ｔ，３Ｈ），２．２５（ｓ，３Ｈ），３．５６（ｓ，２Ｈ），４．０８（ｑ，２Ｈ），６．４９（ｄ，２Ｈ），７．０３−７．１２（ｍ，４Ｈ），７．３８（ｄ，２Ｈ），７．５５（ｍ，１Ｈ），７．６５（ｍ，２Ｈ），７．９３（ｄｄ，１Ｈ），８．００（ｄｄ，１Ｈ）．
【００８５】
化合物９．  収率８３％。  1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ１．２１（ｄ，６Ｈ），２．３２（ｓ，３Ｈ），３．２２（ｍ，１Ｈ），６．４４−６．５０（ｍ，２Ｈ），７．０４−７．１２（ｍ，４Ｈ），７．３５（ｄ，２Ｈ），７．５４（ｍ，１Ｈ），７．６４（ｍ，２Ｈ），７．８５（ｄｄ，１Ｈ），８．０３（ｄｄ，１Ｈ）．
【００８６】
化合物１０．  収率６５％。アルキル化剤として、１，２−エポキシブタンを使用。  1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ０．８６（ｔ，３Ｈ），１．３８（ｐ，２Ｈ），１．７４（ｂｒ，１Ｈ），２．３７（ｓ，３Ｈ），２．４９（ｄｄ，１Ｈ），３．０２（ｄｄ，１Ｈ），３．３０（ｍ，１Ｈ），６．５１（ｄｄ，２Ｈ），７．０３−７．１６（ｍ，４Ｈ），７．３５（ｄ，２Ｈ），７．５５（ｔ，１Ｈ），７．６２（ｔ，２Ｈ），７．９２（ｄｄ，１Ｈ），８．００（ｄｄ，１Ｈ）．
【００８７】
化合物１６．  収率９６％。  1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ２．３５（ｓ，６Ｈ），６．５１（ｍ，２Ｈ），７．０８（ｍ，４Ｈ），７．４３（ｄｄ，１Ｈ），７．６０（ｍ，２Ｈ），７．９３（ｍ，４Ｈ），８．００（ｄ，１Ｈ），８．１２（ｄ，１Ｈ）．
【００８８】
化合物１７．  収率４９％。  1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ２．３１（ｓ，６Ｈ），３．６７（ｓ，３Ｈ），５．９９（ｄ，１Ｈ），６．４３（ｄｄ，１Ｈ），６．６３（ｄｄ，１Ｈ），７．００−７．１１（ｍ，２Ｈ），７．３６（ｄ，２Ｈ），７．５２（ｍ，１Ｈ），７．６３（ｍ，２Ｈ），７．８０（ｄ，１Ｈ），７．９３（ｄｄ，１Ｈ）．
【００８９】
化合物１９．  収率９０％。  1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ２．２９（ｓ，３Ｈ），２．４０（ｓ，３Ｈ），６．３７（ｄ，１Ｈ），６．４８（ｍ，１Ｈ），６．９７（ｔ，１Ｈ），７．０１−７．１７（ｍ，３Ｈ），７．３６（ｄ，２Ｈ），７．５４（ｍ，１Ｈ），７．６４（ｍ，２Ｈ），７．７３（ｍ，１Ｈ）．
【００９０】
化合物２０．  収率８６％。  1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ２．２０（ｓ，３Ｈ），３．９４（ｍ，２Ｈ），６．５２（ｍ，２Ｈ），７．００−７．１６（ｍ，４Ｈ），７．２５（ｍ，５Ｈ），７．３７（ｄ，２Ｈ），７．５８（ｔ，１Ｈ），７．６８（ｔ，２Ｈ），７．８０（ｄｄ，１Ｈ），７．９３（ｄｄ，１Ｈ）．
【００９１】
化合物２１．  収率９６％。  1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ２．３０（ｓ，６Ｈ），３．９２（ｓ，３Ｈ），６．５０（ｄ，２Ｈ），７．００−７．１５（ｍ，６Ｈ），７．２８（ｄ，２Ｈ），７．８７（ｄｄ，２Ｈ）．
【００９２】
化合物２３．  収率８４％。  1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ１．８９（ｐ，２Ｈ），２．３５（ｓ，３Ｈ），２．７７（ｔ，２Ｈ），２．９０（ｔ，２Ｈ），６．４８（ｔ，２Ｈ），７．０１−７．１３（ｍ，４Ｈ），７．３７（ｄ，２Ｈ），７．５４（ｍ，１Ｈ），７．６４（ｍ，２Ｈ），７．８６（ｄ，１Ｈ），７．９５（ｄ，１Ｈ）．
【００９３】
化合物２６．  収率９４％。  1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ２．３０（ｓ，６Ｈ），５．２９（ｓ，２Ｈ），６．８７（ｄ，２Ｈ），７．０６（ｔ，２Ｈ），７．１３−７．２０（ｍ，４Ｈ），７．２７−７．３５（ｍ，３Ｈ），７．８８（ｄ，２Ｈ）．
【００９４】
化合物３０．  収率９０％。  1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ２．３２（ｓ，６Ｈ），５．２５（ｓ，２Ｈ），６．８３（ｄ，２Ｈ），７．１０（ｍ，４Ｈ），７．１９（ｄ，２Ｈ），７．１２（ｄ，２Ｈ），７．９１（ｄ，２Ｈ）．
【００９５】
ジチオカルボキシル化の別法手順。  ＴＨＦ（８００ｍＬ）中、Ｎ−ベンジルアクリダン（４３．８ｇ）の溶液に、アルゴン気流下、６７ｍＬ、２．５Ｍのｎ−ＢｕＬｉ溶液を−７８℃で添加した。混合物を−７８℃で３時間撹拌し、冷却浴を取り外し、更に３０分撹拌を継続した。溶液を再び−７８℃に冷却し、１０．６５ｍＬのＣＳ2を加えた。−７８℃で１時間後、反応物を徐々に（１時間）室温まで加温した。ヨウ素メチル（２９．７１ｇ）を添加し、反応を室温にて一夜継続した。次いで、反応混合物を真空蒸発し、残渣をＣＨ2Ｃｌ2に溶解し、溶液を短いシリカの充填物に通液し、溶媒を蒸発してオレンジ色の固形物を得、熱酢酸エチル（固形物１ｇ当り１０ｍＬ）から再結晶した。
【００９６】
2005514396.tif 000024
化合物３の合成。  ＴＨＦ（６０ｍＬ）中のＬＤＡ溶液（１１．０ミリモル）に、−７８℃でＴＨＦ（２０ｍＬ）中のＮ−フェニルアクリダン（１．２８５ｇ、５．０ミリモル）を添加した。得られた混合物を−７８℃で１時間撹拌し、ＣＳ２（０．３３ｍＬ、５．５ミリモル）を添加した。−７８℃で３０分後、反応物を徐々に（１時間）室温まで昇温し、３０分間撹拌した。反応物を−７８℃に冷却し、ベンジルブロミド（１．６７ｍＬ、１４ミリモル）を添加した。−７８℃で２０分後、反応物を加温し、１．５時間室温で撹拌した。終了後、シリカ上クロマトグラフィにかけ（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ  ２０：１）、１．５６５ｇの３を得た（６１％収率）。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ３．９０（ｓ，４Ｈ），６．４２（ｄ，２Ｈ），６．９７（ｔ，２Ｈ），７．０９（ｔ，２Ｈ），７．１８−７．３０（ｍ，１２Ｈ），７．５５（ｍ，１Ｈ），７．６２−７．７１（ｄｄ，４Ｈ）ｐｐｍ．
【００９７】
化合物４と２５とを、同様にして調製した。
化合物４．  収率２６％。  1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ５．９５（ｓ，４Ｈ），６．３８（ｄ，２Ｈ），６．８８（ｔ，２Ｈ），７．０７（ｔ，２Ｈ），７．１２（ｄ，２Ｈ），７．２１−７．３０（ｍ，２０Ｈ），７．４０（ｄ，２Ｈ），７．５３（ｍ，１Ｈ），７．６１（ｍ，２Ｈ）．
【００９８】
化合物２５．  収率１６％。  1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ２．２８（ｄ，６Ｈ），３．４４（ｓ，３Ｈ），３．８６（ｓ，３Ｈ），６．５４（ｄ，１Ｈ），６．６３（ｄｄ，１Ｈ），７．００−７．０８（ｍ，２Ｈ），７．２９（ｍ，１Ｈ），７．７２（ｄ，１Ｈ），７．８７（ｄ，１Ｈ）．
【００９９】
同様に、化合物５を、ＴＨＦ中の１，３−ジヨウ素化プロパンを用いて、対応するジチオカルボキシレートのアルキル化により、調製し、収率４４％を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ２．１６（ｐ，２Ｈ），２．９０（ｔ，４Ｈ），６．４４（ｄ，２Ｈ），６．９９−７．１０（ｍ，４Ｈ），７．３８（ｄ，２Ｈ），７．５４（ｍ，１Ｈ），７．６４（ｍ，２Ｈ），７．７１（ｄｄ，２Ｈ）．
【０１００】
化合物１１、１２、１４、１５、１８、２２、２４、２７、２８、２９、３２、３３、及び３８は、いずれも１又は２個のプロパンスルホン酸塩の基を有しており、ジチオカルボキシレート又はジチオカルボキシレートアルキルエステルを、プロパンサルトンを用いてアルキル化することにより調製した。
【０１０１】
化合物１１  （収率９８％）。  1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）：δ１．９２（ｐ，２Ｈ），２．２６（ｓ，３Ｈ），２．６７（ｔ，２Ｈ），２．８１（ｔ，２Ｈ），６．４１（ｔ，２Ｈ），６．９０−７．１０（ｍ，４Ｈ），７．３７（ｄ，２Ｈ），７．５７（ｔ，１Ｈ），７．６７（ｔ，２Ｈ），７．８７（ｄ，２Ｈ）．
【０１０２】
化合物１２  （収率６８％）。  1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）：δ１．９９（ｐ，４Ｈ），２．７３（ｔ，４Ｈ），２．９１（ｔ，４Ｈ），６．４２（ｄ，２Ｈ），６．９７−７．０６（ｍ，４Ｈ），７．３８（ｄ，２Ｈ），７．５５（ｔ，１Ｈ），７．６７（ｔ，２Ｈ），７．８９（ｄｄ，２Ｈ）．
【０１０３】
化合物１４  （収率５３％）。  1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）：δ１．８８（ｐ，２Ｈ），２．２２（ｓ，３Ｈ），２．６３（ｔ，２Ｈ），２．７８（ｔ，２Ｈ），６．３７（ｔ，２Ｈ），６．９０−７．０５（ｍ，４Ｈ），７．３２（ｄ，２Ｈ），７．５２（ｔ，１Ｈ），７．６３（ｔ，２Ｈ），７．８３（ｄ，２Ｈ）．
【０１０４】
化合物１５  収率９４％。  1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）：δ１．８７（ｐ，２Ｈ），２．２１（ｓ，３Ｈ），２．６４（ｔ，２Ｈ），２．８１（ｔ，２Ｈ），３．４５（ｓ，３Ｈ），６．９０−７．０９（ｍ，４Ｈ），７．２４（ｍ，２Ｈ），７．７９（ｍ，２Ｈ）．
【０１０５】
化合物１８  収率８４％。  1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）：δ１．９３（ｍ，２Ｈ），２．２６（ｓ，３Ｈ），２．６９（ｍ，２Ｈ），２．８２（ｍ，２Ｈ），３．６１（ｓ，３Ｈ），５．９１（ｄｄ，１Ｈ），６．３９（ｔ，１Ｈ），６．６２（ｍ，１Ｈ），６．９０−７．０８（ｍ，２Ｈ），７．３７（ｄ，２Ｈ），７．５７（ｔ，１Ｈ），７．６８（ｔ，２Ｈ），７．７９（ｄｄ，１Ｈ），７．９０（ｄｄ，１Ｈ）．
【０１０６】
化合物２２  収率９０％。  1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）：δ１．９１（ｐ，２Ｈ），２．２６（ｓ，３Ｈ），２．６７（ｔ，２Ｈ），２．８０（ｔ，２Ｈ），３．９０（ｓ，３Ｈ），６．４６（ｔ，２Ｈ），６．９９（ｍ，２Ｈ），６．０７（ｍ，２Ｈ），７．１８−７．２９（ｍ，４Ｈ），７．８６（ｄ，２Ｈ）．
【０１０７】
化合物２４  収率７８％。  1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）：δ１．９５（ｐ，２Ｈ），２．２９（ｓ，３Ｈ），２．７０（ｔ，２Ｈ），２．８３（ｔ，２Ｈ），６．４４（ｄｄ，２Ｈ），７．０３（ｍ，４Ｈ），７．４０（ｄｄ，１Ｈ），７．５９（ｍ，２Ｈ），７．９０（ｄ，２Ｈ），８．０１（ｍ，３Ｈ），８．１６（ｄ，１Ｈ）．
【０１０８】
化合物２７  収率８３％。  1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）：δ１．８５（ｐ，２Ｈ），２．２２（ｓ，３Ｈ），２．５９（ｔ，２Ｈ），２．８０（ｔ，２Ｈ），５．３２（ｓ，２Ｈ），６．８８（ｄ，２Ｈ），６．９８（ｍ，２Ｈ），７．１０（ｍ，４Ｈ），７．２０−７．２７（ｍ，３Ｈ），７．８３（ｄｄ，２Ｈ）．
【０１０９】
化合物２８．  収率８７％。  1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）：δ１．８５（ｐ，２Ｈ），２．２２（ｓ，３Ｈ），２．６０（ｔ，２Ｈ），２．８０（ｔ，２Ｈ），５．３０（ｓ，２Ｈ），６．８６（ｄ，２Ｈ），６．９６−７．１７（ｍ，６Ｈ），７．２７（ｄ，２Ｈ），７．８０−７．８７（ｄｄ，２Ｈ）．
【０１１０】
化合物２９．  収率９１％。  1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）：δ１．８５（ｐ，２Ｈ），２．２２（ｓ，３Ｈ），２．６１（ｔ，２Ｈ），２．８０（ｔ，２Ｈ），３．７４（ｓ，３Ｈ），５．２５（ｓ，２Ｈ），６．８２（ｄ，２Ｈ），６．８９−７．０２（ｍ，６Ｈ），７．１３（ｔ，２Ｈ），７．８０−７．８７（ｄｄ，２Ｈ）．
【０１１１】
化合物３２． 1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）：δ１．１４（ｔ，３Ｈ），１．８９（ｐ，２Ｈ），２．６３（ｔ，２Ｈ），２．７２（ｑ，２Ｈ），２．８３（ｔ，２Ｈ），５．３２（ｓ，２Ｈ），６．９０（ｍ，２Ｈ），６．９９（ｍ，２Ｈ），７．０９−７．２６（ｍ，７Ｈ），７．８３（ｄ，１Ｈ），７．８９（ｄ，１Ｈ）．
【０１１２】
化合物３３． 1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）：δ０．８２（ｔ，３Ｈ），１．４６（ｍ，２Ｈ），１．９２（ｐ，２Ｈ），２．６８（ｍ，４Ｈ），２．８３（ｔ，２Ｈ），５．３２（ｓ，２Ｈ），６．９１（ｍ，２Ｈ），６．９７（ｍ，２Ｈ），７．１−７．２５（ｍ，７Ｈ），７．８６（ｔ，２Ｈ）．
【０１１３】
化合物３８． 1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）：δ１．９（ｐ，２Ｈ），２．６（ｔ，２Ｈ），２．８（ｔ，２Ｈ），３．９３（ｓ，２Ｈ），５．３１（ｓ，２Ｈ），６．９（ｍ，３Ｈ），７．２（ｍ，１３Ｈ），７．６（ｄ，１Ｈ），７．８（ｄ，１Ｈ）．
【０１１４】
化合物７の合成。  ＴＨＦ（３０ｍＬ）中のＬＤＡ（２．５ミリモル）の溶液に、ＴＨＦ（１０ｍＬ）中のメチルＮ−フェニルアクリダン−９−ジチオカルボキシレート（０．３４７ｇ、１．０ミリモル）を添加した。−７８℃で１時間後、反応物を−２０℃に加温し、次いで、臭素化ベンゼンを加えた。添加後、反応物を徐々に加温し、室温で３時間撹拌した。真空中で溶媒除去した後、クロマトグラフィにかけ（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ  ２０：１）、０．２５５ｇの化合物７を得た（６０％収率）。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ２．２０（ｓ，３Ｈ），６．４５（ｄ，１Ｈ），６．５３（ｄ，１Ｈ），６．９２（ｔ，１Ｈ），７．０３−７．２４（ｍ，４Ｈ），７．３３−７．４７（ｍ，６Ｈ），７．５６（ｍ，１Ｈ），７．６６（ｍ，２Ｈ），７．８７−７．９４（ｍ，２Ｈ）．
【０１１５】
化合物１３の合成。  Ｎ−フェニルアクリダン−９−ジチオカルボキシレートを、１−ヨウ素化オクタンとの反応によってｎ−オクチルチオエステルに転化した。−７８℃で、ＴＨＦ（７０ｍＬ）中のＬＤＡ（４．４８ミリモル）溶液に、ＴＨＦ（２０ｍＬ）中のｎ−オクチルＮ−フェニルアクリダン−９−ジチオカルボキシレート（１．９０ｇ、４．２６ミリモル）を添加した。得られた混合物を−７８℃で１時間撹拌し、次に、ＴＨＦ（１０ｍＬ）中、１，３−プロパンサルトン（０．７８ｇ、６．３９ミリモル）を添加した。−７８℃で４５分後、反応物を室温まで加温し、更に３時間撹拌した。溶媒を除去して固体残渣を得、これを最小量のＣＨ2Ｃｌ2に溶解し、ヘキサンを用いて沈澱させた。溶液がＴＬＣプレート上で蛍光性成分を示さなくなるまで、この操作を繰返した。真空乾燥後、２．２７０ｇの１３を黄色粉末として得た。収率９３％。  1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ０．８４（ｔ，３Ｈ），１．１３−１．４０（ｍ，１２Ｈ），２．０２（ｑ，２Ｈ），２．６８（ｔ，２Ｈ），２．７７（ｔ，２Ｈ），２．９０（ｔ，２Ｈ），６．４２（ｄｄ，２Ｈ），６．９４−７．０８（ｍ，４Ｈ），７．３４（ｄ，２Ｈ），７．５６（ｍ，１Ｈ），７．６７（ｍ，２Ｈ），７．８６（ｄ，１Ｈ），７．９２−（ｄ，１Ｈ）．
【０１１６】
化合物３１の合成。ＣＨ2Ｃｌ2（５ｍＬ）中の化合物１６（０．２５０ｇ、０．４９ミリモル）を、室温で２．５日間、トリエチルアミン（９ｍＬ）と共に撹拌した。揮発成分を真空中で除去し、残渣を最小量のＣＨ2Ｃｌ2に溶解し、エーテルで沈澱させた。この操作を洗浄液が蛍光成分を示さなくなるまで操返した。真空乾燥後、０．１４０ｇの化合物３１を黄色固体として得た。収率４７％。  1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）：δ１．０６（ｍ，９Ｈ），１．１７（ｍ，２Ｈ），２．３２（ｓ，３Ｈ），２．９１−３．０８（ｍ，１０Ｈ），６．３７（ｄ，１Ｈ），６．５１（ｄ，１Ｈ），６．９８−７．１８（ｍ，４Ｈ），７．２５（ｄ，２Ｈ），７．５９（ｍ，１Ｈ），７．６７（ｍ，２Ｈ），７．８２（ｍ，１Ｈ），８．０２（ｄ，１Ｈ）．
【０１１７】
化合物３５の合成。  ＴＨＦ（８０ｍＬ）中、メチルＮ−フェニルアクリダン−９−ジチオカルボキシレート（１．７３５ｇ、５．００ミリモル）に、ＮａＨ（０．４６０ｇ、鉱油中６０％懸濁液、１１．５ミリモル）を添加した。得た混合物を室温で３時間撹拌し、次いで、ＴＨＦ（２０ｍＬ）中、１１−臭素化ウンデカン−１−オール（１．６３３ｇ、６．５０ミリモル）を添加した。一夜撹拌後、４ｍＬのＭｅＯＨを反応混合物に添加し、過剰のＮａＨを分解した。真空中で溶媒を除去し、得られた残渣をシリカゲル上でクロマトグラフィにかけ（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ  ４：１）シロップ状液体として１１−ヒドロキシウンデシルケテンジチオアセタール誘導体２．５５０ｇを得た。収率９８％。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ１．１９−１．６０（ｍ，１９Ｈ），２．３２（ｓ，３Ｈ），２．７０（ｔ，２Ｈ），３．６４（ｍ，２Ｈ），６．４６（ｔ，２Ｈ），７．０５（ｍ，４Ｈ），７．３５（ｄ，２Ｈ），７．５４（ｍ，１Ｈ），７．６４（ｍ，２Ｈ），７．８８（ｄｄ，１Ｈ），７．９５（ｄｄ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【０１１８】
ＣＨ2Ｃｌ2（６０ｍＬ）中の、上記調製剤化合物（２．５５ｇ、４．９２ミリモル）に、０℃でピリジン（０．５２ｍＬ、６．４０ミリモル）を、次いでＰＯＣｌ3（０．６０ｍＬ、６．４０ミリモル）を添加した。０℃で１時間反応を継続した後、アイスバスを取外して反応物を室温まで昇温させた（３０分）。次いで、３−ヒドロキシプロピオニトリル（１．３５ｍＬ、１９．７ミリモル）を、ピリジン（３．１８ｍＬ、３９．４ミリモル）に添加した。一夜撹拌後、反応混合物を分液漏斗で水洗いした。有機相をＮａ2ＳＯ4上で乾燥、蒸発させて残渣をシリカゲル上でクロマトグラフィにかけ（ＥｔＯＡｃ）、ビス（シアノエチル）ホスフェート誘導体２．７０ｇ、収率７９％を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ１．１９−１．５０（ｍ，１６Ｈ），１．７１（ｍ，２Ｈ），２．３１（ｓ，３Ｈ），２．７０（ｔ，２Ｈ），２．７９（ｔ，４Ｈ），４．１３（ｑ，２Ｈ），４．３８（ｑ，４Ｈ），６．４５（ｔ，２Ｈ），７．０５（ｍ，４Ｈ），７．３５（ｄ，２Ｈ），７．５４（ｍ，１Ｈ），７．６４（ｍ，２Ｈ），７．８８（ｄｄ，１Ｈ），７．９４（ｄｄ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【０１１９】
シアノエチル保護基の加水分解を、保護されたホスフェート２．７０ｇ（３．８４ミリモル）アセトン（４０ｍＬ）中、１ＭＮａＯＨ（７．６８ｍＬ、７．６８ミリモル）による、一夜に亘る処理によって実施し、２．３６ｇの化合物３５を得た（９６％収率）。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）：δ１．０８−１．３４（ｍ，１６Ｈ），１．５６（ｍ，２Ｈ），２．２５（ｓ，３Ｈ），２．６４（ｔ，２Ｈ），３．７９（ｑ，２Ｈ），６．４２（ｄ，２Ｈ），６．９５−７．０９（ｍ，４Ｈ），７．３１（ｄ，２Ｈ），７．５８（ｍ，１Ｈ）７．６９（ｍ，２Ｈ），７．８４（ｄ，１Ｈ），７．８９（ｄ，１Ｈ）．
【０１２０】
化合物３４、３６、及び３７を同様の方法で調製し、うち３６は、ウンデシルジチオエステルから出発した。
化合物３４ 1ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）：δ１．７７（ｐ，２Ｈ），２．２４（ｓ，３Ｈ），２．８５（ｔ，２Ｈ），３．７９（ｑ，２Ｈ），６．３９（ｔ，２Ｈ），６．９４−７．０７（ｍ，４Ｈ），７．３２（ｄ，２Ｈ），７．５６（ｍ，１Ｈ），７．６７（ｍ，２Ｈ），７．８３（ｄｄ，１Ｈ），７．８９（ｄｄ，１Ｈ）  
【０１２１】
化合物３６ 1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）：δ０．８８（ｔ，３Ｈ），１．０９−１．３５（ｍ，１８Ｈ），１．８７（ｐ，２Ｈ），２．６６（ｔ，２Ｈ），２．９０（ｔ，２Ｈ），３．８４（ｑ，２Ｈ），６．４０（ｍ，２Ｈ），６．９４−７．０８（ｍ，４Ｈ），７．３１（ｄ，２Ｈ），７．５６（ｍ，１Ｈ），７．６７（ｍ，２Ｈ），７．８２（ｄ，１Ｈ），７．９５（ｄ，１Ｈ）
【０１２２】
化合物３７ 1ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）：δ１．７５（ｍ，２Ｈ），２．２４（ｓ，３Ｈ），２．８９（ｔ，２Ｈ），３．８３（ｑ，２Ｈ），５．３５（ｓ，２Ｈ），６．９２（ｄ，２Ｈ），７．０１（ｔ，２Ｈ），７．１５（ｍ，４Ｈ），７．２９（ｍ，３Ｈ），７．８８（ｍ，２Ｈ）．
【０１２３】
実施例４、化合物３９の合成。
2005514396.tif 000025
化合物３９を、下記合成法によって調製した。Ｎ−ベンジルアクリダンの陰イオンと、ＴＨＦ中のＣＳ2との、−７８℃での反応を、徐々に（１時間）室温まで加温し、次いで、ベンジルブロミドを添加して、Ｎ−ベンジルアクリダンのベンジルジチオエステルを得た。ＴＨＦ中の該ジチオエステル溶液をＮａＨを用いて処理し、得られた混合物を室温で撹拌した。次いで、３−ブロモプロパン−１−オール（１．６３３ｇ、６．５０ミリモル）を加え、反応を一夜実施した。生成したケテンジチオアセタールを、化合物３５の合成に関して記載した方法に従い、ホスホリル化した。
【０１２４】
実施例５、ケテンジチオアセタール化合物からの化学ルミネセンスの強化。  強化剤、過酸化物、ＥＤＴＡ及び化合物１又は１４のいずれかを、ツィン２０を含む緩街液中の溶液を用いて、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼと反応することを包含する試験計画により、各種の強化剤を試験し、光強度の最高値を測定した。そのうち、好適なものは、２−ナフトール、６−ブロモ−２ナフトール、ｐ−ヒドロキシ桂皮酸、１，６−ジブロモ−２−ナフト−ル、７−メトキシ−２−ナフトール、４−フェニルフェノール、３−（Ｎ−フェノチアジニル）プロパンスルホン酸塩、３−（Ｎ−フェノキサジニル）プロパンスルホン酸塩、４−（Ｎ−フェノキサジニル）ブタンスルホン酸塩、５−（Ｎ−フェノキサジニル）ペンタン酸塩及びＮ−メチルフェノキサジンであった。
【０１２５】
実施例６、化合物１によるＨＲＰの化学ルミネセンス検出。  ０．０１Ｍトリス緩衝液、ｐＨ７．０の０．５ｍＭ尿素過酸化物、０．１ｍＭのｐ−フェニルフェノール、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２５％のツィン２０及び５×１０-5Ｍの化合物１を含有する試薬組成物を、３個１組とした１００μＬの等分液と、１．４×１０-15〜１．４×１０-20モルの範囲内のＨＲＰ１０μＬとを反応させることによって、化学ルミネセンス発生の試験を行った。発光は混合と同時に生起し、約１分以内に最高強度に到達した。化学ルミネセンス強度対酵素量の両対数プロットは、全試験範囲に亘って直線であった。
【０１２６】
実施例７、化合物１４によるＨＲＰの化学ルミネセンス検出。  ０．０２５Ｍトリス緩衝液、ｐＨ８．０の２．５ｍＭ尿素過酸化物、４ｍＭのｐ−ヒドロキシ桂皮酸、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のツィン２０及び３×１０-4Ｍの化合物１４を含有する試薬組成物を、３個１組とした１００μＬの等分液と、１．４×１０-16〜１．４×１０-20モルの範囲内のＨＲＰ１０μＬとを反応させることによって、化学ルミネセンス発生の試験を行った。発光は混合と同時に生起し、約１分以内に最高強度に到達した。化学ルミネセンス強度と酵素量との関係図を、図１に描いた。比較のために、Ｓ−Ｂと、ＨＲＰの量との関係を、下記式、
2005514396.tif 000026
で表される比較化合物１についても示した。比較化合物についての結果は、１．４×１０-15〜１．４×１０-19モルの間の酵素を含むＨＲＰ溶液１０μＬを、０．０５５Ｍトリス緩衝液、ｐＨ８．６、０．２５ｍＭの尿素過酸化物、０．０５ｍＭのｐ−フェニルフェノール、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１２５％のツィン２０及び３．３×１０-4Ｍの比較化合物１を含有する試薬１００μＬに対して添加し、１５分後に測定したものである。
【０１２７】
実施例８、化合物２７によるＨＲＰの化学ルミネセンス検出。  ０．０２５Ｍトリス緩衝液、ｐＨ８．０、２．５ｍＭの尿素過酸化物、４ｍＭのｐ−ヒドロキシ桂皮酸、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のツィン２０及び３×１０-4Ｍの化合物２７を含有する試薬組成物を、３個１組とした１００μＬの等分液と、１．４×１０-16〜１．４×１０-20モルの範囲内のＨＲＰ１０μＬとを反応させることによって、化学ルミネセンス発生の試験を行った。発光は混合と同時に生起し、約１分以内に最高強度に到達した。１．５分での化学ルミネセンス強度と酵素量との関係図を図２に描くとともに、上述の如く、比較化合物１についての、１５分における結果をも併記した。
【０１２８】
実施例９、信号強度の比較。  ０．０１Ｍトリス緩衝液、ｐＨ８、０．５ｍＭの尿素過酸化物、０．１ｍＭのｐ−フェニルフェノール、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２５％のツィン２０及び比較化合物１と名付けた化合物以外の下記表中の各化合物、５×１０-5Ｍを含有する試薬組成物を、１００μＬ等分液を、３．５×１０-16モルのＨＲＰと反応させることによる化学ルミネセンスの発光につき、試験をした。比較化合物１についての試薬組成物は、０．０５Ｍトリス緩衝液、ｐＨ８．６、０．２５ｍＭの尿素過酸化物、０．０５ｍＭのｐ−フェニルフェノール、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１２５％のツィン２０及び３．３×１０-4Ｍの比較化合物１を含有した。比較のために、データには比較化合物１と２とを提示した。
【０１２９】
2005514396.tif 000027
【０１３０】
実施例１０、信号強度の比較。  化合物１４及び２７〜２９により発光した最大信号について、０．０２５Ｍのトリス緩衝液、ｐＨ８の２．５ｍＭ尿素過酸化物、４ｍＭのｐ−ヒドロキシ桂皮酸、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のツィン２０及び３×１０-4Ｍの試験化合物を含有する試薬組成物１００μＬ等分液と、３．５×１０-16モルのＨＲＰとの反応により比較した。各試薬とも約１分以内に、最大光度に到達した。
【０１３１】
2005514396.tif 000028
【０１３２】
実施例１１、ケテンジチオアセタール２６を用いた化学ルミネセンス時間の分布（ｐｒｏｆｉｌｅ）。    ０．０１Ｍのトリス緩衝液、ｐＨ８．０、０．５ｍＭの尿素過酸化物、０．０１ｍＭのｐ−フェニルフェノール、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２５％のツィン２０及び５×１０-5Ｍの化合物２６を含有する試薬組成物を１００μＬ等分液と、３．５×１０-16モルのＨＲＰとの反応よる化学ルミネセンス発生について試験した。相対的化学ルミネセンス時間の分布を図３に示すが、比較化合物２と名付けた構造的に類似の化合物よりも早い化学ルミネセンスの発生が見られる。実施例１に挙げた他のケテンジチオアセタールを用いた化学ルミネセンス分布も、同様に早い立上りを示した。
【０１３３】
実施例１２、ケテンジチオアセタール２７を用いた化学ルミネセンス時間の分布    ０．０２５Ｍのトリス緩衝液、ｐＨ８．０の２．５ｍＭ尿素過酸化物、４ｍＭのｐ−ヒドロキシ桂皮酸、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のツィン２０及び３×１０-4Ｍの化合物２７を含有する試薬組成物を１００μＬ等分液と、３．５×１０-6モルのＨＲＰとの反応よる化学ルミネセンス発生について試験した。相対的な化学ルミネセンス時間の分布を図４に示すが、この図では迅速な化学ルミネセンスの発生を示しており、前出実施例の薬剤より高水準の信号が発生している。
【０１３４】
実施例１３、ケテンジチオアセタール基質を用いたウェスタンブロット。  試験抗体としてのβ−ガラクトシダーゼについてのウェスタンブロットアッセイを、ＰＶＤＦ膜を用いて、Ｕ．Ｋ．Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ（ロンドン）、２２７巻、６８０頁（１９７０年）に記載された手順に従って実施した。５０００〜５ｐｇの範囲にあるβ−ガラクトシダーゼ標準品である。化合物１を含有する検出試薬は、１分以下での検出を遂行できる。図５は、１１分の後、５秒の露出によるβ−ガル（β−ガラクトシダーゼの略）の検出を示すものである。比較すると、米国特許第５，９２２，５５８号明細書に記載されている比較化合物１を含有する試薬を用いたウェスタンブロットの結果では、より低い強度の化学ルミネセンスしか発生せず、より多くのバンド（ｂａｎｄ）のある、同様な画像に到達するには、より長時間の露出を必要とする。更に、本発明の薬剤は、参考文献にある化合物を含有する薬剤では画像形成が不可能であった１ｐｇ以下の、少ないバンドでの画像形成が可能である。
【０１３５】
実施例１４、別箇のケテンジチオアセタール基質を用いたウェットステンブロット。  β−ガラクトシダーゼのウェスタンブロットアッセイを、実施例１３に従い、化合物２７乃至化合物３７のいずれか、及び強化剤と過酸化物とを用いて実施した。図６に化合物２７を用いて、６０分後、１分の露出によるもの、並びに、化合物３７を用いて８分後、１分の露出によるもので、β−ガルの検出を示す。
【０１３６】
実施例１５、その他のケテンジチオアセタール。  下記の化合物を調製した。
【０１３７】
2005514396.tif 000029
【０１３８】
2005514396.tif 000030
【０１３９】
化合物５１を、前出のＡｋｉｂａ論文に記載された通りに調製した。
【０１４０】
実施例１６、その他のものの、合成と性質。
化合物４０：1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ２．２８（ｓ，６Ｈ），４．７４（ｓ，１Ｈ），５．２１（ｓ，２Ｈ），６．７６（ｄ，２Ｈ），６．８７（ｄ，２Ｈ），７．００（ｍ，４Ｈ），７．１２（ｔ，２Ｈ），７．８５（ｄ，２Ｈ）．
【０１４１】
化合物４１：1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ２．０３（ｐ，２Ｈ），２．７８（ｔ，２Ｈ），２．９４（ｔ，２Ｈ），３．８６（ｓ，２Ｈ），５．２９（ｓ，２Ｈ），６．８０−７．１５（ｍ，１２Ｈ），７．２８（ｍ，３Ｈ），７．５９（ｄ，１Ｈ），７．９３（ｄ，１Ｈ）．
【０１４２】
化合物４２：1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ１．８２（ｐ，２Ｈ），２．６０（ｔ，２Ｈ），２．７５（ｔ，２Ｈ），３．８３（ｓ，２Ｈ），６．２９−６．３６（ｍ，２Ｈ），６．８０−６．８５（ｔ，１Ｈ），６．９０−７．０３（ｍ，３Ｈ），７．１２（ｓ，５Ｈ），７．２２−７．２５（ｄ，２Ｈ），７．４８−７．６３（ｍ，４Ｈ），７．７８−７．８０（ｄ，１Ｈ）．
【０１４３】
化合物４３：1Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）：δ１．７７（ｐ，４Ｈ），２．８８（ｔ，４Ｈ），３．６９（ｑ，４Ｈ），５．３０（ｓ，２Ｈ），６．９８（ｄ，２Ｈ），７．０６（ｍ，４Ｈ），７．１８−７．２９（ｍ，５Ｈ），７．８８（ｄ，２Ｈ）．
【０１４４】
化合物４４：1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）：δ１．７０（ｐ，２Ｈ），１．８８（ｐ，２Ｈ），２．７８（ｔ，２Ｈ），２．９２（ｔ，２Ｈ），３．１５（ｔ，２Ｈ），３．８５（ｑ，２Ｈ），５．２９（ｓ，２Ｈ），６．９０（ｔ，２Ｈ），６．９８（ｍ，２Ｈ），７．０８−７．２６（ｍ，７Ｈ），７．７４（ｄ，１Ｈ），７．９５（ｄ，１Ｈ）．
【０１４５】
化合物４５の合成。  −７８℃で、ＴＨＦ（２５０ｍＬ）中のＬＤＡ（３０．８ミリモル）溶液に、ＴＨＦ（２０ｍＬ）中のＮ−フェニルアクリダン（３．８６ｇ、１５．０ミリモル）を添加した。得られた混合物を、−７８℃で１．５時間撹拌し、次いで、ＣＳ2（０．９９ｍＬ、１６．５ミリモル）を添加した。−７８℃で４５分後、反応物を室温まで加温し、更に３０分間撹拌した後、ＴＨＦ（１３０ｍＬ）中で、〔２−（１，３−ジブロモ）プロポキシ〕−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラン（５．２３ｇ、１５．８ミリモル）を加えた。一夜撹拌後、溶媒を除去し、残渣をカラムクロマトグラフィにかけた（シリカゲル上、ヘキサン／ＣＨ2Ｃｌ2：１／２．５）。化合物４５（６．１５ｇ）を得た（８１％収率）。ＴＢＡＦによるシロキシ基の脱離により、４５を８５％収率で得た。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ２．７６（ｄｄ，２Ｈ），２．８２（ｂｒ，１Ｈ），３．１９（ｄｄ，２Ｈ），４．２２（ｍ，１Ｈ），６．７６（ｄ，２Ｈ），７．０１−７．１３（ｍ，４Ｈ），７．３８（ｄ，２Ｈ），７．５５（ｔ，１Ｈ），７．６２−７．７２（ｍ，４Ｈ）．
【０１４６】
化合物４６の合成。  アルゴン気流下に、ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の４５（１．００ｇ、２．５７ミリモル）の溶液に、ナトリウム・ヒドリド（０．１０８ｇ、ミネラルオイル中６０％、２．７０ミリモル）を加えた。約１時間２０分後、透明溶液を得、次いで３−プロパンサルトンを添加し、混合物を室温で６０時間撹拌した。反応混合物を、真空中でＤＭＦを除去して、容量約３ｍＬまで濃縮し、アセトン（７ｍＬ）を加えて生成物を沈澱させた。混合物を２０分間混合した後、固形分を濾過して蒐集し、この固形分をアセトン（３×５ｍＬ）で洗浄、乾燥して１．１２ｇの粗製生成物を得た。水とイソプロパノールによる再結晶で、０．８０ｇの純粋な４６を黄色固体として得た（５８％収率）。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ２．１６（ｐ，２Ｈ），２．９０（ｔ，４Ｈ），６．４４（ｄ，２Ｈ），６．９９−７．１０（ｍ，４Ｈ），７．３８（ｄ，２Ｈ），７．５４（ｍ，１Ｈ），７．６４（ｍ，２Ｈ），７．７１（ｄｄ，２Ｈ）．
【０１４７】
化合物４７． Ｈ1  ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）：δ  ．０３（２Ｈ，ｍ），２．８７（４Ｈ，ｍ），３．０８（２Ｈ，ｍ），３．６２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），４．００（１Ｈ，ｍ），５．２６（２Ｈ，ｓ），６．８１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），６．９４（２Ｈ，ｍ），７．０７（４Ｈ，ｍ），７．２１−７．２９（３Ｈ，ｍ），７．６５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）．
【０１４８】
化合物４８． Ｈ1  ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）：δ  １．８５（２Ｈ，ｍ），２．８４（２Ｈ，ｍ），３．０６（２Ｈ，ｍ），３．６３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），３．８７（２Ｈ，ｍ），３．９９（１Ｈ，ｍ），５．２１（２Ｈ，ｓ），６．７８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），６．９３（２Ｈ，ｍ），７．０５（４Ｈ，ｍ），７．１９−７．２７（３Ｈ，ｍ），７．６４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）．Ｐ31ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）：ｄ１０．２７（ｓ）．
【０１４９】
化合物４９． Ｈ1  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ  ２．９２（４Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），３．５１−３．６３（１６Ｈ，ｍ），５．２７（２Ｈ，ｓ），６．８５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），７．０２（２Ｈ，ｍ），７．１１−７．１６（４Ｈ，ｍ），７．２５−７．３０（３Ｈ，ｍ），７．９３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）．
【０１５０】
化合物５０． Ｈ1  ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）：δ  ２．０３（ｍ，４Ｈ），２．８５（ｔ，２Ｈ），３．４８（ｔ，４Ｈ），４．１４（ｔ，２Ｈ），７．０２−７．１０（ｍ，４Ｈ），７．１８−７．３３（ｍ，６Ｈ），７．４５（ｄ，２Ｈ）．
【０１５１】
実施例１７、信号強度の比較。  化合物４０〜５１の各々によって発光される最大信号を、０．０２５Ｍトリス緩衝液、ｐＨ８、２．５ｍＭの尿素過酸化物、４ｍＭのｐ−ヒドロキシ桂皮酸、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のツィン２０及び１ｍＭ、０．３ｍＭ、０．１５ｍＭ又は０．０５ｍＭのうち、いずれかの試験化合物を含有する試薬組成物１００μＬ等分液と、３．５×１０-16モルのＨＲＰとを反応させることによって比較した。各薬剤は、１〜３分内に最大光強度に達した。
【０１５２】
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化合物４９及び５１は、水性処方中にごく僅かな溶解度しか無かった。
【０１５３】
実施例１８、ケテンジチオアセタール基質４６を用いたウェスタンブロット。  β−ガラクトシダーゼのウェスタンブロットアッセイを、ニトロセルロース膜、及び、０．０２５Ｍのトリス緩衝液、ｐＨ８．０、２．５ｍＭの尿素過酸化物、４ｍＭのｐ−ヒドロキシ桂皮酸、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のツィン２０並びに１ｍＭの化合物４６を含有する検出試薬を用いたこと以外は、実施例１３に従って行った。図７に、１２０分までの種々の時点における卓越した感度を有するβ−ガルについての、迅速かつ簡便な検出を示した。
【０１５４】
実施例１９、その他の化合物。
化合物５２．  １Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）：δ  １．５９−１．７０（ｍ，４Ｈ），１．９５（ｍ，２Ｈ），２．７２−２．８３（ｍ，６Ｈ），３．１８（ｔ，２Ｈ），３．３４（ｔ，２Ｈ），３．４５（ｔ，２Ｈ），５．２９（ｓ，２Ｈ），６．９１−７．０２（ｍ，４Ｈ），７．０９−７．２５（ｍ，７Ｈ），７．８２（ｄ，１Ｈ），７．８８（ｄ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【０１５５】
化合物５３． １Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）：δ１．５４（ｐ，２Ｈ），１．９２（ｍ，２Ｈ），２．２１（ｓ，３Ｈ），２．７０−２．８２（ｍ，４Ｈ），３．１０（ｔ，２Ｈ），３．２９（ｔ，２Ｈ），５．３０（ｓ，２Ｈ），６．９０−７．０２（ｍ，４Ｈ），７．０８−７．２６（ｍ，７Ｈ），７．７８（ｄ，１Ｈ），７．８９（ｄ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【０１５６】
化合物５６．  １Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）：δ  １．６０（ｐ，２Ｈ），１．９３（ｍ，２Ｈ），２．２７（ｓ，３Ｈ），２．７１−２．８２（ｍ，４Ｈ），３．１４（ｔ，２Ｈ），３．３２（ｔ，２Ｈ），６．４３（ｔ，２Ｈ），６．９８−７．１０（ｍ，４Ｈ），７．３２（ｄ，２Ｈ），７．５７（ｍ，１Ｈ），７．６９（ｍ，２Ｈ），７．８２（ｄ，１Ｈ）．７．９２（ｄ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【０１５７】
実施例２０、化合物５４の合成。  ＤＭＦ（１０ｍＬ）中、化合物１６（０．５００ｇ、０．９７ミリモル）と、カリウム・チオアセテート（０．１６６ｇ、１．４５ミリモル）との混合物を、アルゴン気流下、室温にて一夜、撹拌した。真空中ＤＭＦを除去後、残渣をＣＨ2Ｃｌ2で取り出し、シリカゲル充填物を通液した。溶媒を除去して０．４６ｇのＡを発泡体状固形物として得た。
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【０１５８】
化合物Ａを、アルゴン気流下でＭｅＯＨ（１０ｍＬ）とＴＨＦ（１０ｍＬ）との混合物に溶解し、この溶液にＮａＯＭｅ（０．０５４ｇ、０．９７ミリモル）を加えた。得られた混合物を３時間室温で撹拌し、次いで、ダウエックス（Ｄｏｗｅｘ）５０ＷＸ８−１００イオン交換樹脂を用いて、ｐＨを５〜６に調整した。樹脂を濾別し、濾液を蒸発・乾燥し、残渣をアセトンで取り出し、シリカゲル充填物に通液した。溶媒除去後、０．４１ｇのＢを発泡体状固形物として得た。
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Ｂ：1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：ｄ  １．２１（ｔ，１Ｈ），１．７２（ｐ，２Ｈ），２．３０（ｍ，２Ｈ），２．３５（ｓ，３Ｈ），２．８０（ｔ，２Ｈ），６．４９（ｔ，２Ｈ），７．０２−７．１４（ｍ，４Ｈ），７．３８（ｄ，２Ｈ），７．５５（ｔ，１Ｈ），７．６５（ｍ，２Ｈ），７．８８（ｄ，１Ｈ），７．９５（ｄ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【０１５９】
化合物Ｂを、上述した通りにＤＭＦ中でプロパンサルトン及びＮａＨを用いて反応させ、化合物５４に転化させた。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）：δ１．５９（ｐ，２Ｈ），１．９２（ｐ，２Ｈ），２．２２（ｔ，２Ｈ），２．２７（ｓ，３Ｈ），２．４５（ｔ，２Ｈ），２．７３−２．８５（ｍ，４Ｈ），６．４３（ｄｄ，２Ｈ），６．９８−７．１０（ｍ，４Ｈ），７．３５（ｄ，２Ｈ），７．５８（ｍ，１Ｈ），７．６７（ｍ，２Ｈ），７．８０（ｄ，１Ｈ），７．９２（ｄ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【０１６０】
実施例２１、化合物５５の合成。  ＤＭＦ中、ジチオエステル（１．００ｇ、２．７７ミリモル）とＮａＨ（２．７７ミリモル）との混合物を、アルゴン気流下、１時間撹拌した。次いで、１，３−プロパンジオール環式サルフェートを添加し、得られた混合物を室温で、一夜撹拌した。ＤＭＦ除去後、残渣をアセトン／エーテル（１：３）  を用いて洗浄し、ＭｅＯＨ／２−プロパノールを用いて再結晶して、１．４０ｇの５５を得た（収率９６％）。1Ｈ  ＮＭＲ（３００  ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ）：δ１．６９（ｐ，２Ｈ），２．２１（ｓ，３Ｈ），２．７６（ｔ，２Ｈ），３．８３（ｔ，２Ｈ），５．３１（ｓ，２Ｈ），６．９０（ｍ，２Ｈ），６．９９（ｍ，２Ｈ），７．１０（ｍ，４Ｈ），７．２４（ｍ，３Ｈ），７．８３−７．８８（ｄｄ，２Ｈ）ｐｐｍ．
【０１６１】
実施例２２、化合物５２及び５３によるＨＲＰの化学ルミネセンス検出。  ０．０２５Ｍトリス緩衝液、ｐＨ８．０の２．５ｍＭの尿素過酸化物、４ｍＭのｐ−ヒドロキシ桂皮酸、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のツィン２０及び３×１０-4Ｍの化合物５２又は５３を含有する試薬組成物を、３個１組とした１００μＬの等分液と、１．４×１０-16〜１．４×１０-21モルの範囲内の１０μＬのＨＲＰと反応させることによる化学ルミネセンス発光の試験を行った。発光は混合と同時に生起し、急速に最高強度に到達した。化学ルミネセンス強度のピークと、酵素量との関係図を図８に示す。
【０１６２】
上記の詳細な説明及び実施例は、本発明の説明のために記載したものであり、本発明の技術思想と技術範囲は、これによって制限を受けるべきものではない。本発明の範囲は、特許請求の範囲によってのみ判断されるべきものである。
【図面の簡単な説明】
【０１６３】
【図１】室温でトリガーされた、化合物１４を含有する実施例７に記載した試薬の１００μＬによって放射された１．５分における化学ルミネセンス強度と、ＨＲＰの量とに関するグラフである。化学ルミネセンス放射は、白色ミクロプレートのウェル中の、１．４×１０-16〜１．４×１０-20モルの間の酵素１００μＬを添加することによって開始された。術語Ｓ−Ｂは、ＨＲＰの存在の場合の相対光量単位（ＲＬＵ）で表した化学ルミネセンス信号（Ｓ）について、ＨＲＰの存在しない場合のバックグラウンドの化学ルミネセンス（Ｂ）を補正したものをいう。比較のために、Ｓ−ＢとＨＲＰの量との関係は、１５分で測定した比較化合物１についても示されている。
【図２】室温でトリガーされた、化合物２７を含有する実施例８に記載した試薬の１００μＬによって放射された１．５分における化学ルミネセンス強度と、ＨＲＰの量とに関するグラフである。比較のために、Ｓ−ＢとＨＲＰの量との関係は、１５分で測定した比較化合物１についても示されている。
【図３】３．５×１０-16モルのＨＲＰと２５℃で、実施例１１に記載した化合物２６を含有する試薬１００μＬとの反応から得られた化学ルミネセンスの経時的分布を示すグラフである。この関係の化学ルミネセンスの経時的分布は、構造的に類似する比較化合物２と命名した化合物より、迅速な化学ルミネセンスの発生を示している。
【図４】３．５×１０-16モルのＨＲＰと２５℃で、実施例１２に記載した化合物２７を含有する試薬１００μＬとの反応から得られた化学ルミネセンスの経時的分布を示すグラフである。
【図５】ＰＶＤＦ膜上のＨＲＰ−標識抗体によるβ−ガラクトシダーゼと、化学ルミネセンス試薬組成物とのウェスタンブロット・アッセイからのＸ線フィルムの画像である。たんぱく質の、夫々、５０００、１０００、１８０、３０及び５ｐｇを含有するβ−ガラクトシダーゼの希釈液を、化合物１を含有する本発明の試薬によって、若しくは比較の為に、米国特許第５，９２２，５５８号明細書に記載された比較化合物１を含有する試薬によって検出した。膜を、各検出試薬中で、１１分培養後、Ｘ線フィルムに５秒露出した。
【図６】ＰＶＤＦ膜上のＨＲＰ−標識抗体によるβ−ガラクトシダーゼと、化学ルミネセンス試薬組成物とのウェスタンブロット・アッセイからのＸ線フィルムの画像である。たんぱく質の、夫々、５０００、１０００、１８０、３０及び５ｐｇを含有するβ−ガラクトシダーゼの希釈液を、化合物２７又は化合物３７を含有する本発明の試薬によって検出した。
【図７】ニトロセルロース膜上のＨＲＰ−標識抗体によるβ−ガラクトシダーゼと、化合物４６を含有する化学ルミネセンス試薬組成物とのウェスタンブロットアッセイからのＸ線フィルムの画像である。たんぱく質の、夫々、５０００、１０００、１８０、３０及び５ｐｇを含有するβ−ガラクトシダーゼの希釈液を、図の如く２時間に亘って、容易に検出した。
【図８】室温でトリガーされた、化合物５２又は５３のいずれかを含有する実施例２２に記載した試薬の１００μＬによって放射された化学ルミネセンス強度とＨＲＰの量とに関するグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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