(57)【要約】本発明は、ベクターのエンベロープタンパク質に挿入された外来ペプチドを含むキメラフラビウイルスベクター、およびこのようなベクターの使用法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、キメラフラビウイルス、または遺伝的に弱毒化されたフラビウイルスのエンベロープタンパク質上における、外来ペプチドの挿入を許容する部位を同定する方法であって：
（i）外来ペプチドをコードする核酸分子を、フラビウイルスのエンベロープタンパク質をコードする遺伝子に導入する段階；
（ii）同遺伝子にコードされたエンベロープタンパク質を含むフラビウイルスベクターを作製する段階（ここで該エンベロープタンパク質は外来ペプチドを含む）；ならびに
（iii）段階（ii）で作製されたフラビウイルスベクターが、該挿入を許容するか否かを判定する段階
を含む方法。
【請求項２】
フラビウイルスベクターが、第1のフラビウイルスのカプシドおよび非構造タンパク質、ならびに第2のフラビウイルスのプレ膜タンパク質およびエンベロープタンパク質を含むキメラフラビウイルスベクターである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
第1のフラビウイルス、または第2のフラビウイルスが、日本脳炎、デング熱1型、デング熱2型、デング熱3型、デング熱4型、黄熱病、マレーバレー脳炎、セントルイス脳炎、西ナイル、クンジン、ロシオ脳炎、イルヘウス脳炎、ダニ媒介性脳炎、中央ヨーロッパ脳炎、シベリア脳炎、ロシア春夏脳炎、キャサヌール森林病、オムスク出血熱、跳躍病、ポワッサン、ネギシ、アブセッタロブ、ハンサロバ、アポイ、およびHyprからなる群より選択され、かつ第1および第2のフラビウイルスが異なるフラビウイルスである、請求項2記載の方法。
【請求項４】
外来ペプチドが、ウイルス、細菌、もしくは寄生虫性病原体の抗原に由来するエピトープ、または腫瘍関連抗原に由来するエピトープを含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
核酸分子がトランスポゾン変異誘発法によりで無作為にエンベロープ遺伝子に導入される、請求項1記載の方法。
【請求項６】
段階（ii）で作製されたフラビウイルスベクターが、挿入を許容するか否かの判定が、（a）フラビウイルスベクターの感染性（b）ベクターの複数回の継代時における外来タンパク質の配列の安定性、（c）フラビウイルスベクターの成長特性、または（d）フラビウイルスベクターが、第1のフラビウイルスのエンベロープタンパク質に対する抗体で中和可能か否か、を解析して行われる、請求項1記載の方法。
【請求項７】
フラビウイルスベクターの解析を、それが由来するフラビウイルスの解析と比較する段階をさらに含む、請求項6記載の方法。
【請求項８】
遺伝的に弱毒化されたフラビウイルスが黄熱病YF 17Dである、請求項1記載の方法。
【請求項９】
外来ペプチドを含むエンベロープタンパク質を含む、フラビウイルスベクター。
【請求項１０】
ベクターが、第1のフラビウイルスのprMおよびEタンパク質、ならびに第2のフラビウイルスのCおよび非構造タンパク質を含むキメラフラビウイルスである、請求項9記載のフラビウイルスベクター。
【請求項１１】
第1のフラビウイルス、または第2のフラビウイルスが、日本脳炎、デング熱1型、デング熱2型、デング熱3型、デング熱4型、黄熱病、マレーバレー脳炎、セントルイス脳炎、西ナイル、クンジン、ロシオ脳炎、イルヘウス脳炎、ダニ媒介性脳炎、中央ヨーロッパ脳炎、シベリア脳炎、ロシア春夏脳炎、キャサヌール森林病、オムスク出血熱、跳躍病、ポワッサン、ネギシ、アブセッタロブ、ハンサロバ、アポイ、およびHyprからなる群より選択される、請求項10記載のフラビウイルスベクター。
【請求項１２】
外来ペプチドが、ウイルス、細菌、もしくは寄生虫性病原体の抗原に由来するエピトープ、または腫瘍関連抗原に由来するエピトープを含む、請求項9記載のフラビウイルスベクター。
【請求項１３】
ベクターが、遺伝的に弱毒化されたフラビウイルスを含む、請求項9記載のフラビウイルスベクター。
【請求項１４】
遺伝的に弱毒化されたフラビウイルスが黄熱病YF 17Dである、請求項13記載のフラビウイルスベクター。
【請求項１５】
請求項9記載のフラビウイルスベクター、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む薬学的組成物。
【請求項１６】
ペプチドを患者へ輸送する、請求項15記載の薬学的組成物の用途。
【請求項１７】
ペプチドが抗原であり、組成物を投与し、該抗原が由来する病原体または腫瘍に対する免疫応答を誘導する、請求項16記載の用途。
【請求項１８】
請求項1記載のフラビウイルスのゲノム、またはこの相補物を含む核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、キメラフラビウイルスベクター、およびこのようなベクターを用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
フラビウイルスは、小型でエンベロープに包まれた（+）鎖RNAウイルスである。フラビウイルスのタンパク質は、一つの長い読み枠の翻訳によってポリタンパク質が産生された後に、ポリタンパク質が宿主およびウイルスのプロテアーゼの組み合わせによる複雑な一連の翻訳後タンパク質分解切断を受けて成熟ウイルスタンパク質が産生されることで作られる（Ambergら、J.Virol. 73：8083-8094、1999；Rice、「Flaviviridae」、Virology、Fields編、Raven-Lippincott、New York、1995、第1巻、p.937）。このウイルスの構造タンパク質は、ポリタンパク質中にC-prM-Eの順序に配置されている（「C」はカプシドを意味し、「prM」はウイルスのエンベロープに結合したMタンパク質前駆体を意味し、また「E」はエンベロープタンパク質を意味する）。これらのタンパク質はポリタンパク質のN末端領域に存在し、非構造タンパク質（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、およびNS5）はポリタンパク質のC末端領域に存在する。
【０００３】
黄熱病ウイルスワクチン株（YF 17D）のCおよび非構造タンパク質、ならびに弱毒化日本脳炎ウイルス（SA 14-14-2）のある株のprMおよびEタンパク質を含むキメラフラビウイルスが作製されている。このキメラは「ChimeriVax（商標）-JE」と命名されており、非免疫対照と比較して、免疫化されたアカゲザルでJEに対する中和抗体の産生を誘導すること、またこのようなサルが、JEの注射後に臨床的脳炎の発症を予防することが報告されている。ChimeriVax（商標）-JEは、ヒト用ワクチンの前臨床安全基準に適合することが報告されている（Monathら、J.Virol. 74（4）：1742-1751、2000）。
【０００４】
YF 17DのCおよび非構造タンパク質、ならびにデング熱2型ウイルス株のprMおよびEタンパク質を含む類似のキメラが作製されている。このキメラはChimeriVax-D2と命名されており、非免疫化対照と比較して、デング熱2型ウイルスに対する中和抗体をアカゲザルで誘導すること、またこのようなサルが、デング熱2型ウイルスの注射後にウイルス血症の発症を予防することが報告されている。ChimeriVax-D2は、安全で遺伝的に安定であることも報告されている（Guirakhooら、J.Virol. 74（12）：5477-5485、2000）。
【発明の開示】
【０００５】
発明の概要
本発明は、キメラフラビウイルス、または遺伝的に弱毒化されたフラビウイルスのエンベロープタンパク質における、外来ペプチドの挿入を許容する部位を同定する方法を提供する。この方法は以下の段階を含む：（i）外来ペプチドをコードする核酸分子を、フラビウイルスのエンベロープタンパク質をコードする遺伝子に導入する段階；（ii）遺伝子にコードされたエンベロープタンパク質を含むフラビウイルスベクターを作製する段階（エンベロープタンパク質は外来ペプチドを含む）；ならびに（iii）段階（ii）で作製されたフラビウイルスベクターが挿入を許容するか否かを判定する段階。
【０００６】
本発明のフラビウイルスベクターは、例えば、第1のフラビウイルスのCおよび非構造タンパク質、ならびに第2のフラビウイルスのprMおよびEタンパク質を含むキメラフラビウイルスベクターの場合がある。第1および第2のフラビウイルスは、日本脳炎、デング熱（血清型1型、2型、3型、または4型）、黄熱病（例えばYF 17D）、マレーバレー（Murray Valley）脳炎、セントルイス（St. Louis）脳炎、西ナイル（West Nile）脳炎、クンジン（Kunjin）、ロシオ（Rocio）脳炎、イルヘウス（Ilheus）脳炎、ダニ媒介性脳炎、中央ヨーロッパ脳炎、シベリア脳炎、ロシア春夏脳炎、キャサヌール（Kyasanur）森林病、オムスク（Omsk）出血熱、跳躍病、ポワッサン、ネギシ、アブセッタロブ（Absettarov）、ハンサロバ（Hansalova）、アポイ（Apoi）、およびHyprからなる群より選択される。
【０００７】
本発明のベクターに挿入される外来ペプチドは、例えばウイルス、細菌、または寄生虫性病原体の抗原に由来するエピトープを含んでもよく、または腫瘍関連抗原に由来するエピトープを含んでもよい。これらのペプチドを含む例を以下に示す。
【０００８】
本発明の核酸分子は、本発明の方法で、例えばトランスポゾン変異誘発法で無作為にフラビウイルスのエンベロープ遺伝子に導入することができる。また本発明の方法の段階（ii）で作製されたフラビウイルスベクターが、挿入を許容するか否かの判定は、例えば（a）フラビウイルスベクターの感染性、（b）ベクターを複数回継代した時の外来タンパク質の配列の安定性、（c）フラビウイルスベクターの成長特性、および/または（d）フラビウイルスベクターが、第1のフラビウイルスのエンベロープタンパク質に対する抗体で中和されるか否か、を解析することで実施することができる。本発明の方法はさらに、フラビウイルスベクターの解析を、それが由来するフラビウイルスの類似の解析と比較する段階を含む場合がある。
【０００９】
本発明は、外来ペプチドを含むエンベロープタンパク質を含む、フラビウイルスベクターも含む。本発明のフラビウイルスベクターは、第1のフラビウイルスのprMおよびEタンパク質、ならびに第2のフラビウイルスのCおよび非構造タンパク質を含むキメラフラビウイルスの場合がある。第1および第2のフラビウイルスは、日本脳炎、デング熱（血清型1型、2型、3型、または4型）、黄熱病（例えばYF 17D）、マレーバレー脳炎、セントルイス脳炎、西ナイル脳炎、クンジン、ロシオ脳炎、イルヘウス脳炎、ダニ媒介性脳炎、中央ヨーロッパ脳炎、シベリア脳炎、ロシア春夏脳炎、キャサヌール森林病、オムスク出血熱、跳躍病、ポワッサン、ネギシ、アブセッタロブ、ハンサロバ、アポイ、およびHyprからなる群より選択することができる。あるいは本発明のフラビウイルスベクターは、黄熱病YF 17Dなどの遺伝的に弱毒化されたフラビウイルスの場合がある。
【００１０】
本発明のベクターに挿入される外来ペプチドは、ウイルス、細菌、または寄生虫性病原体の抗原に由来するエピトープを含む場合がある。あるいは外来ペプチドは、腫瘍関連抗原に由来するエピトープを含む場合がある。
【００１１】
また本発明は、上述のフラビウイルスベクター、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む薬学的組成物、ならびにこのような組成物を患者に投与することによりペプチドを患者に輸送する方法も含む。このような方法は例えば、ペプチドが抗原である場合、抗原が由来する病原体または腫瘍に対する免疫応答を誘導するために実施することができる。本発明は、ペプチドを輸送するための、このような組成物の用途、ならびにペプチドの輸送のための薬剤の調製における用途も含む。
【００１２】
本発明は、上述のフラビウイルスのゲノム、またはその相補物を含む核酸分子も含む。
【００１３】
本発明には複数の利点がある。例えば、本発明で使用可能なキメラフラビウイルスベクターは、安全性を考慮して十分弱毒化されており、さらにキメラのエンベロープタンパク質（特にキメラに挿入されたエピトープ）が由来するフラビウイルスに対する防御免疫を誘導することができる。さらなる安全性は、本発明で使用されるベクターがキメラであり、したがって野生型に復帰する恐れがないという事実によって得られる。本発明で使用されるベクターのさらなる利点は、フラビウイルスが細胞の細胞質で複製し、このためウイルスの複製法が、ウイルスゲノムの宿主細胞への組み込みを伴わず、重要な安全対策を提供する点である。また、詳しく後述するように、本発明の単一のベクターを用いて、単一の抗原に由来する複数のエピトープ、または複数の抗原に由来するエピトープを輸送することができる。
【００１４】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、図面、および特許請求の範囲から明らかになると考えられる。
【００１５】
詳細な説明
本発明は、外来ペプチドを導入可能な、キメラフラビウイルス、または遺伝的に弱毒化されたフラビウイルス（例えばYF 17D）のエンベロープタンパク質中の部位を同定する方法（ここでキメラフラビウイルスベクターは、このようなペプチドを含むエンベロープタンパク質を有する）、および、例えば導入されるペプチドが由来する病原体に対する免疫応答を誘導するために、ベクターを投与することによりこのようなペプチドを輸送する方法を提供する。このようなベクター、ペプチド、および方法の詳細を以下に示す。
【００１６】
キメラフラビウイルスベクター
本発明で使用可能なキメラウイルスは、構造タンパク質（または複数のタンパク質）が、第2のウイルスの対応する構造タンパク質（または複数のタンパク質）と置換された第1のフラビウイルス（バックボーンフラビウイルス）を含む。例えばキメラは、prMおよびEタンパク質が、第2のウイルスのprMおよびEタンパク質と置換された第1のフラビウイルスからなる場合がある。
【００１７】
本発明で使用されるキメラウイルスは、任意の組み合わせのウイルスから作製することができる。第1または第2のウイルスとして、本発明で使用可能な特定のフラビウイルスの例には、蚊が媒介するフラビウイルス（日本脳炎、デング熱（血清型1〜4型）、黄熱病、マレーバレー脳炎、セントルイス脳炎、西ナイル脳炎、クンジン、ロシオ脳炎、およびイルヘウスウイルスなど）；ダニが媒介するフラビウイルス（中央ヨーロッパ脳炎、シベリア脳炎、ロシア春夏脳炎、キャサヌール森林病、オムスク出血熱、跳躍病、ポワッサン、ネギシ、アブセッタロブ、ハンサロバ、アポイ、およびHyprのウイルスなど）；ならびにヘパシウイルス属のウイルス（例えばC型肝炎ウイルス）などが含まれる。
【００１８】
本発明で使用可能なキメラウイルス作製の詳細は、例えば、米国特許出願第09/007,664号、第09/121,587号、および第09/452,638号；国際出願第PCT/US98/03894号、および第PCT/US00/32821号；ならびにChambersら、J.Virol. 73：3095〜3101、1999において提供され、それぞれは参照として全体が本明細書に組み入れられる。
【００１９】
本発明で使用可能なキメラウイルスの種類の具体的な例は、prMおよびEタンパク質が、日本脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、マレーバレー脳炎ウイルス、デング熱ウイルス、または上記の一つなどの他の任意のフラビウイルスなどの、別のフラビウイルスのprMおよびEタンパク質と置換された、黄熱病のヒト用ワクチン株YF 17Dである。例えば、American Type Culture Collection（ATCC；Manassas、Virginia、U.S.A.）にブタペスト条約に基づく規定で登録されている（登録日は1998年1月6日）、以下のキメラフラビウイルスを本発明で使用することができる：キメラ黄熱病17D/日本脳炎SA14-14-2ウイルス（YF/JE A1.3；ATCCアクセッション番号ATCC VR-2594）、およびキメラ黄熱病17D/デング熱2型ウイルス（YF/DEN-2；ATCCアクセッション番号ATCC VR-2593）。
【００２０】
キメラフラビウイルスのエンベロープタンパク質中の許容部位の同定法
キメラフラビウイルスのエンベロープタンパク質中の、外来配列の挿入を許容する部位は以下のように同定することができる。ペプチドをコードする核酸配列をエンベロープ遺伝子に、分子生物学の標準的な方法で挿入する。好ましくは、このような核酸配列は、エンベロープ遺伝子中に無作為に挿入されて、挿入変異体のライブラリーの作製が促される。しかし核酸配列は、エンベロープ遺伝子の特定の点に挿入されて、効率に関して試験される場合もある。後者の方法は、例えば特定の部位が第1の外来配列の挿入を許容することがわかっていて、例えば長さまたは推定二次構造が第1の外来配列と異なりうる第2の配列の挿入も許容することを確認することが望ましい場合に、望ましい可能性がある。
【００２１】
核酸配列の無作為な挿入は、例えばトランスポゾン変異誘発法で達成される場合がある。これには例えばTn5転移系を用いることができる（Goryshinら、J.Biol.Chem. 273：7367、1998）。具体的な例として、Epicentre Technologies（Madison、WI、U.S.A.）製のEZ::TN Insertion Systemを使用することができる。本発明における同システムの用途の詳細について以下に提供する。要約すると、クローン化されたフラビウイルスのエンベロープ遺伝子を、ペプチドをコードする配列を含むトランスポゾンを用いた変異誘発法に供する。フラビウイルスのエンベロープ遺伝子に無作為に組み込まれたトランスポゾンを含む変異体のライブラリーを作製し、望ましい場合は挿入部位のマッピングを行うか、および/または配列決定を行う。次に、変異体エンベロープ遺伝子を含む完全長のゲノムRNAを作製し、それを変異体ウイルスの作製に使用し、次にそれをトランスポゾンの挿入許容性に関して特徴付ける。ウイルスは、許容性に関して、例えば感染性、ゲノム安定性、成長特性、および中和の判定によって解析されうる。このトランスポゾン変異誘発系の用途の詳細を、キメラフラビウイルスChimeriVax（商標）-JEに関して以下に説明する（図1も参照）。ただし、この方法は、本明細書に記載された任意のキメラに用いることができる。
【００２２】
外来ペプチド
本発明のベクターは、予防的価値または治療的価値のある任意のペプチドまたはタンパク質の輸送に使用することができる。例えば本発明のベクターは、キメラフラビウイルスのエンベロープタンパク質中に挿入される、任意のタンパク質ベースの抗原に対する（予防的または治療的な）免疫応答の誘導に使用することができる。好ましくは、このような抗原は、キメラの第2のフラビウイルスに由来しない。必要なことは、抗原をコードする核酸配列が、本明細書に記載されているように、キメラフラビウイルスのエンベロープ遺伝子内の許容部位に挿入されることである。本明細書に記載されるようにして同定されるキメラエンベロープ遺伝子の許容部位に、抗原をコードする核酸分子を、分子生物学の標準的な方法を用いて挿入することができる。
【００２３】
本発明のベクターは、それぞれ単一のエピトープを含みうる。あるいは複数のエピトープを、単一の部位に（すなわち異なるエピトープが、アミノ酸のポリグリシンの連続などの柔軟なリンカーで隔てられる、ポリトープとして）、さまざまな部位に、またはその任意の組み合わせでベクターに挿入することができる。さまざまなエピトープは、1種類の病原体に由来してもよく、またはさまざまな種、および/またはさまざまな属に由来してもよい。
【００２４】
本発明で使用可能な抗原は、例えば、ウイルス、細菌、および寄生性生物などの感染性因子に由来する場合がある。例えば、表2に挙げた病原体に由来する抗原を使用することができる。このような抗原の具体的な例には、表3に挙げた抗原などがある。また、本発明のベクターに挿入可能なエピトープの具体的な例を表4に示す。表4に示すように、本発明のベクターに使用されるエピトープは、B細胞のエピトープ（中和エピトープ）、またはT細胞のエピトープ（Tヘルパーおよび細胞傷害性T細胞に特異的なエピトープ）の場合がある。
【００２５】
本発明のベクターを用いて、病原体に由来する抗原の他に、抗原を輸送することができる。例えば本発明のベクターを用いて、癌の免疫療法に使用するための腫瘍関連抗原を輸送することができる。数多くの腫瘍関連抗原が当技術分野で公知であり、本発明で使用することができる。癌（および対応する腫瘍関連抗原）の例を以下に示す：黒色腫（NY-ESO-1タンパク質（具体的にはアミノ酸157〜165位に位置するCTLエピトープ）、CAMEL、MART 1、gp100、チロシン関連タンパク質TRP1および2、ならびにMUC1））；腺癌（ErbB2タンパク質）；結腸直腸癌（17-1A、791Tgp72、および癌胎児性抗原）；前立腺癌（PSA1およびPSA3）。熱ショックタンパク質（hsp 110）も、このような抗原として使用することができる。
【００２６】
本発明の別の態様では、免疫応答が望まれる、アレルギー誘導性抗原のエピトープをコードする外来タンパク質を使用することができる。また本発明のベクターは、抗原などのペプチドを、ベクターが投与される被験者の特定の細胞（例えばリガンドに対する受容体を含む細胞）へ輸送するようにベクターを導くために使用されるリガンドを含みうる。
【００２７】
本発明のベクターに挿入されるペプチドまたはタンパク質の大きさは、長さが例えば5〜500アミノ酸、例えば長さが10〜100アミノ酸、20〜55アミノ酸、25〜45アミノ酸、または35〜40アミノ酸の範囲にあってよい。任意の特定の所望のペプチドを使用できる可能性は、本明細書に記載された方法で容易に判定することができる。
【００２８】
外来ペプチドを輸送するためのキメラフラビウイルスベクターの用途
本発明のベクターは、当業者が容易に決定可能な量および方法で投与される。本発明のベクターは、例えば黄熱病17Dワクチンの場合と同様に、例えば、感染ニワトリ胚組織の清澄化懸濁物（clarified suspension）、またはキメラ黄熱病ウイルスが感染した細胞培養物から回収した液体として、投与かつ製剤化することができる。したがって本発明のベクターは、例えば筋肉内経路、皮下経路、または皮内経路で投与される、0.1〜1.0 mlの投与用量中に100〜1,000,000感染単位（例えば、プラーク形成単位または組織培養感染用量）を含む無菌水溶液として製剤化することができる。また、フラビウイルスはヒト宿主に経口経路などの粘膜経路を介して感染可能なので（Gresikovaら、「Tick-borne Encephalitis」、The Arboviruses, Ecology and Epidemiology、Monath編、CRC Press、Boca Raton、Florida、1988、第IV巻、177-203）、本発明のベクターを粘膜経路で投与することができる。
【００２９】
免疫化法で使用する場合は、本発明のベクターを、一次予防的薬剤として、特定の病原体の感染リスクがある成人または小児に投与することができる。本発明のベクターは、ペプチド抗原が由来する病原体に対する免疫応答を刺激することにより、感染患者治療用の二次薬剤として使用されうる。
【００３０】
ワクチン適用に関しては、当業者に周知のアジュバントを使用することができる。本発明のキメラベクターの免疫原性を促進するために使用可能なアジュバントには、例えばリポソーム製剤、例えば（例えばQS21）、ムラミルジペプチド、モノホスホリル脂質A、またはポリホスファジン（polyphosphazine）などの合成アジュバントなどがある。これらのアジュバントは、典型的には、不活性化ワクチンに対する免疫応答を高めるために使用されるが、生ワクチンとともに使用することもできる。例えば、粘膜経路（例えば経口）で輸送されるキメラベクターの場合、大腸菌の易熱性毒素（LT）、またはLTの変異体誘導体などの粘膜アジュバントをアジュバントとして使用することができる。また、アジュバント活性をもつサイトカインをコードする遺伝子をベクターに挿入することができる。したがって、GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-13、またはIL-5などのサイトカインをコードする遺伝子を、外来抗原遺伝子とともに挿入して、強い免疫応答を生じるワクチンを作ることができ、または、より具体的には細胞性、体液性、または粘膜性の反応に向けられる免疫を調節することができる。
【００３１】
ワクチン適用に加えて、当業者であれば容易に理解できるように、本発明のベクターは、治療的遺伝子産物を患者の細胞に導入する遺伝子治療法、および癌の治療法に使用することができる。このような方法では、治療的遺伝子産物をコードする遺伝子を、ベクターの許容部位に挿入する。
【００３２】
実施例
以下の実験例は、ChimeriVax（商標）-JE中の許容部位の同定に関する。この実施例に記載された方法は、上記のような他のキメラフラビウイルスについても使用することができる。
【００３３】
黄熱病17D（YF 17D）弱毒生ワクチン株は、過去60年間にわたってヒトで使用されており、優れた安定性の記録があり、1回の投与で長期間の免疫をもたらす。上述したように、ChimeriVax（商標）-JEは、YF 17Dの構造タンパク質（PrME）をコードする遺伝子が、遺伝的に弱毒化された日本脳炎（JE）ウイルスSA14-14-2に由来する対応遺伝子と置換された弱毒生組換え体ワクチン株である。カプシド、およびこのキメラの細胞内複製に関連するすべての非構造（NS）遺伝子のいずれもYF 17Dワクチン株に由来する。上述したように、ChimeriVax（商標）-JEの感染分子クローン（YF/JE）については既に説明されている。後述する実験で、ChimeriVax（商標）-JEを対象に、生物学的に関連のあるペプチドの輸送用媒介物としての妥当性に関する評価を行った。
【００３４】
EZ::TN In-Frame Linker Insertion Kit（商標）（Epicentre）は、さまざまな適用のために、クローン化されたDNAにコードされたタンパク質に、19アミノ酸のペプチドをインフレームで無作為に挿入するための、迅速かつ効率のよい方法である。この方法で発明者らは、外来DNAを許容するChimeriVax（商標）-JEのエンベロープ遺伝子内の部位を同定することにした。以下に詳述するように、JEエンベロープタンパク質をコードする遺伝子の、EZ::TNを用いた大腸菌における無作為変異誘発法により、19アミノ酸のペプチドをコードする57塩基対の断片をもつ、多くの安定な挿入変異体を同定した。DNA配列解析、制限酵素マッピング、およびPCR法で、トランスポゾンの正確な位置と、挿入が無作為に起こることの両方を確認した。変異型のJEエンベロープ遺伝子を操作して、ChimeriVax（商標）-JE感染クローンに戻すことにより細胞培養物の感染を調べることが可能となり、かつ外来抗原の輸送用媒介物としての組換え型フラビウイルスの用途に関する有用な情報を提供することが可能となる。発明者らは、ベロ（Vero）細胞に感染する変異体クローンのパネルを同定し、その生物学的性質を調べた。具体的には、発明者らは、細胞培養物中の親ChimeriVax（商標）-JEキメラに対する、安定な感染クローンの成長特性、ならびにJE特異的ポリクローナル抗血清を用いたプラーク減少中和試験（PRNT）による被中和能力の比較を行った。発明者らは、JEエンベロープ内の外来DNAの挿入を許容する部位を同定し、これらの部位は、生物学的に関連のあるエピトープの輸送のために活用されうる。詳細を以下に説明する。
【００３５】
JEエンベロープをコードする遺伝子のpUC19へのクローニング
YF/JEウイルスRNAを、感染ベロ細胞からTrizol試薬（Gibco BRL）を用いて抽出した。FNORアンチセンスプライマー（下記参照）を用いてcDNAを合成した後に、JE SA14-14-2エンベロープをコードする遺伝子を、TN1.F/TN2.Rプライマー（下記参照）を用いたXL-PCRで増幅し、pUCl9（New England Biologicals、NEB、U.S.A.）に、各オリゴヌクレオチドの5'端に組み込んだKpnIおよびPstIの認識配列を利用して、従来の方法で指向的にクローン化してpJEe1を得た。PCRは、GeneAmp PCR System 2400（Perkin Elmer）を使用して実施した。
【００３６】
トランスポゾン変異誘発法および挿入部位のマッピング
挿入変異誘発法は、pJEe1を対象にEZ::TN（商標）In-Frame Linker Insertion Kit（EPICENTRE Technologies、U.S.A.）を用いて、製造業者の指示書にしたがって実施した。EZ::TN <NotI/Kan-3>トランスポゾンは、NotI制限部位に隣接するカナマイシン耐性遺伝子を含む。詳しく後述するように、NotIによる切断と再連結によってカナマイシン耐性遺伝子を除去することで、3つすべての読み枠で読まれうる19コドンの挿入が生じた。
【００３７】
挿入変異体は、カナマイシン（50 μg/ml）を添加したLB寒天上で大腸菌を選択することにより同定した。転移後に、選択カナマイシン耐性クローンを対象にTN1.F/TN2.Rを用いてPCRを行ったところ、40%のクローンがJEエンベロープ内にトランスポゾンを安定に維持していることがわかった（図2）。挿入部位を、Tn5特異的プライマーTN1.FおよびNotI/KAN-3 RP-2を用いたPCR（Pwo DNAポリメラーゼ、Boehringer Mannheim/Roche）でマッピングし、Tn5トランスポゾンがJEエンベロープに無作為に挿入されていることを示した（図3）。特有のクローンを選択して、配列決定と、完全長変異体ゲノムRNAの作製に用いた。
【００３８】
配列決定
ベロ細胞のトランスフェクション用に選択された5個の変異体クローンのアミノ酸配列を図4に示す。JEウイルスのエンベロープタンパク質上の、確定された構造エピトープに対する挿入物の位置を図5に示す。挿入部位をDNA配列決定法で決定し、JEエンベロープの推定3次元構造の比較により挿入物の位置を決定した（Kolaskarら、Virology 261：31-42、1999）。5か所の挿入部位のうち4か所が表面に露出していると考えられる。配列決定はCEQ（商標） 2000 DNA Analysisシステム（Beckman Coulter）、およびCEQ 2000 Dye Terminator Cycle Sequencing Kitを用いて行った。データは、SEQUENCHER（商標）、バージョン4.0.5.（Gene Codes Corporation）を使用して解析した。
【００３９】
Tn5挿入を含む感染クローンの構築
安定な大腸菌クローンから抗生物質耐性マーカーを除去して再連結し、トランスポゾンに隣接する9塩基対の標的部位配列の重複を含む57塩基対の、インフレームの挿入を残した。次に、再連結後のJEエンベロープを含む試料クローン（n=5）をNheI/NarI（NEB、U.S.A.）で切断し、完全長のYF/JEゲノムの作製に関する文献（Chambersら、1999、前掲）に既に記載されている2つのプラスミド系へのクローニングに適合可能とした。
【００４０】
転写およびトランスフェクション
JEエンベロープをコードする遺伝子中に外来DNAを有する、直線化された完全長のゲノムDNAの転写を、AmpliScribe（商標）SP6 High Yield Transcription Kit（EPICENTRE Technologies）を用いてSP6プロモーターから行った。ベロ細胞を播種した6ウェルプレートに、インビトロで転写したゲノムRNAをLIPOFECTIN試薬（Life Technologies）の存在下でトランスフェクトし、5% FBS（Hyclone）、NEAA（Life Technologies）、および1%ペニシリン-ストレプトマイシン（Sigma Chemicals）を添加したMEM（Life Technologies）中で維持した。細胞上清（500 mL）を、新鮮な細胞に6日毎にP6まで継代し、単層を対象に細胞変性効果（CPE）に関してモニターした。ウイルスRNAを、各継代時に単層細胞および上清から抽出した。
【００４１】
図6に示すように、すべての変異体クローンはP2においてベロ細胞に対して感染性を示した。特に、単層細胞のRNA抽出物から合成したcDNAを対象とする、TN1.F/TN2.Rを用いたRT-PCRでは、57塩基対のリンカーを有する1.9キロ塩基対の挿入物が増幅され、子孫ウイルスの産生が確認された。P2〜P6のクローンI-10を対象としたPCR解析から、同クローンがP6まで安定であること、またアミノ酸287位における挿入部位が外来DNAの挿入を許容することがわかる。PCRは、JEエンベロープ遺伝子に特異的なプライマー（TN1.F/TN2.R）、およびトランスポゾンに特異的なプライマー（TN1.F/TMOS.R）（図7）を用いて実施した。
【００４２】
P2〜P6のRT-PCR産物のDNA配列を決定したところ、図8に示すように、各継代時の配列は元のクローンI-10の配列と同一であった。興味深いことに、I-10トランスポゾン挿入物は、エンベロープタンパク質上の外来ペプチドを安定化させ、これを分子の表面に呈示しうる、ジスルフィド結合を形成する可能性を有する2個のシステイン残基を含んでいる。図9は、JEウイルスのエンベロープ糖タンパク質の3次元構造を示し、287位が中央（I）ドメインと二量体化（II）ドメイン間に位置し、表面に露出していると考えられることを示す。
【００４３】
トランスポゾン変異体I-10の生物学的性質を決定し、ChimeriVax（商標）-JEの性質と比較した。最初に、クローンI-10の成長特性を決定した。図10に示すように、変異体感染クローンI-10は、ChimeriVax（商標）-JE親に似た成長動態を示すが、わずかにより低い力価で成長し、YF/JEの場合の1×107 PFU/mlと比較して8×105 PFU/mlである。また、変異体感染クローンI-10は、ベロ細胞においてYF/JE親に似た細胞変性効果を誘導することがわかった。
【００４４】
次にプラーク減少中和（PRNT）アッセイ法を行った。抗JEポリクローナル抗血清の調製物は、クローンI-10およびChimeriVax（商標）-JEを同程度（1：64,000）に中和することが示され、ウイルスエンベロープの構造の完全性に過度に影響を及ぼすことなく、外来DNAをJEキメラのエンベロープに挿入可能であることが確認された（図11および図12）。以上の実験から、ChimeriVax（商標）-JE中のJEエンベロープのアミノ酸の287位が、外来DNAの挿入を許容することがわかる。発明者らは、アミノ酸59位、231位、340位、および436位が、外来配列の挿入を許容する証拠も提供する。
【００４５】
（表１）PCRプライマー
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【００４６】
（表２）抗原/ペプチドが由来する病原体の例
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【００４７】
（表３）ウイルスの選択用抗原の例
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【００４８】
（表４）上記ウイルス/抗原に由来するB細胞およびT細胞のエピトープの例
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【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】JEエンベロープをコードする遺伝子を用いて実施されるトランスポゾン変異誘発法の略図。
【図２】JEエンベロープをコードする遺伝子のTn5挿入変異体のPCR解析の結果を示す。JEエンベロープにトランスポゾンを有する安定なクローンをレーン1、2、8、および10に示し、pUC19ベクター内にトランスポゾンを有するクローンをレーン3および4に示し、JEエンベロープ内にトランスポゾンを有する不安定なクローンをレーン5〜7、および9に示し、また1キロベースのマーカーをレーン11に示す。
【図３】選択変異体プラスミドのPCRマッピングの結果。この解析によって、JEエンベロープへの挿入が無作為に起こることが確認された。レーン1〜13は、13個のクローンのPCR産物を示し、レーン14は、1キロベースのマーカーを含む。
【図４】ベロ細胞のトランスフェクションで選択された5個の変異体クローンのアミノ酸配列。JEエンベロープの配列を太字で示し、転移による挿入配列に下線を付す。3個のアミノ酸が繰り返される残りの配列（各ラインで、第1のダッシュの左側、および第2のダッシュの左側）は、トランスポゾン変異誘発法で生じた人為産物である。
【図５】JEのエンベロープ糖タンパク質の略図（タンパク質の確定された高次構造エピトープに対する挿入物の位置を示す）。矢印は、ベロ細胞のトランスフェクションに関して選択された、5種の独立したJEエンベロープ変異体のおおよその挿入部位を示す。括弧内の数字は、19残基のアミノ酸挿入物に先行するJEエンベロープのアミノ酸を意味する。
【図６】5個の特有のクローン（2個は2つ組）から作製したRNAをトランスフェクトした、ベロ細胞から抽出したRNAから合成したcDNAのRT-PCR解析の結果（2回実施）を示す。57塩基対のリンカーを含む1.9キロベースの挿入物を各クローンから増幅し、子孫ウイルスの産生を確認した。1キロベースのマーカーをレーン1で分画した。レーン2〜8は、クローンI-10-2、クローンI-10-3、クローンII-4-3、クローンII-4-6、クローンI-1、クローンIII-6、およびクローンIV-8-1にそれぞれ対応する。
【図７】P2〜P6（それぞれレーン2〜6および8〜12）におけるクローンI-10 cDNAのPCR解析の結果を示す。左側のパネルで分画された試料は、JEエンベロープに特異的なプライマーを用いて得た。また右側のパネルで分画された試料は、トランスポゾンに特異的なプライマーで得た。1キロベースのマーカーをレーン1において分画し、100塩基対のマーカーをレーン7において分画する。
【図８】トランスフェクション前のプラスミドI-10の配列と並べた、P2〜P6における感染クローンI-10のRT-PCR産物のヌクレオチド配列。矢印は、ジスルフィド結合を形成する可能性を有し、エンベロープタンパク質上のペプチドを安定化させ、それを分子の表面に呈示しうる、挿入物中の2個のシステイン残基を示す。
【図９】アミノ酸287位における許容部位が、中央ドメイン（I）と二量体化ドメイン（II）との間に位置し、表面に露出されると考えられることを示す、JEエンベロープ糖タンパク質の3次元構造の略図。
【図１０】I-10感染クローンの成長特性を示すグラフ。三角形の印を有する線は、トランスポゾン変異体I-10の力価に対応し、四角形の印を有する線は、YF/JE親ウイルスの力価に対応する。
【図１１】トランスポゾン変異体I-10の中和アッセイ法の結果を示すグラフ。ダイヤモンドの印を有する線は、抗JE血清とインキュベートした試料の力価に対応し、四角形の印を有する線は、正常血清とインキュベートした試料に対応し、点線は平均を示す。
【図１２】YF/JE標準の中和アッセイ法の結果を示すグラフ。ダイヤモンドの印を有する線は、抗JE血清とインキュベートした試料の力価に対応し、四角形の印を有する線は、正常血清とインキュベートした試料に対応する。また点線は平均を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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