(57)【要約】本発明は、腫瘍内皮マーカー７α（ＴＥＭ７α）ポリペプチドおよびこれをコードする核酸分子を提供する。本発明はまた、選択的結合因子、ベクター、宿主細胞、およびＴＥＭ７αポリペプチドを生成する方法を提供する。本発明はさらに、ＴＥＭ７αポリペプチドに関連する疾患、障害、および状態の診断、処置、改善、および／または予防のための薬学的組成物および方法を提供する。ＴＥＭ７αポリペプチドをコードする核酸分子を含む、トランスジェニック非ヒト動物はまた、本発明に含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）配列番号１または配列番号３のいずれかに示されるヌクレオチド配列；
（ｂ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３１９９またはＰＴＡ−３２００中のＤＮＡインサートのヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｄ）少なくとも中程度にストリンジェントな条件下で、（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヌクレオチド配列の相補鎖にハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、該コードされるポリペプチドは、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；あるいは
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれかのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
を含む、核酸分子。
【請求項２】
単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドと少なくとも約７０％同一なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該コードされるポリペプチドは、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１もしくは配列番号３のいずれかに示されるヌクレオチド配列、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３１９９もしくはＰＴＡ−３２００中のＤＮＡインサートのヌクレオチド配列、または（ａ）のヌクレオチド配列の対立遺伝子改変体またはスプライス改変体をコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）少なくとも約２５アミノ酸残基のポリペプチドフラグメントをコードする、配列番号１もしくは配列番号３のいずれかのヌクレオチド配列、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３１９９もしくはＰＴＡ−３２００中のＤＮＡインサートのヌクレオチド配列、または（ａ）もしくは（ｂ）のヌクレオチド配列の領域であって、該ポリペプチドフラグメントは、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるコードされるポリペプチドの活性を有するかまたは抗原性である、領域；
（ｄ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む、配列番号１もしくは配列番号３のいずれかのヌクレオチド配列、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３１９９もしくはＰＴＡ−３２００中のＤＮＡインサートのヌクレオチド配列、または（ａ）〜（ｃ）のヌクレオチド配列の領域；
（ｅ）少なくとも中程度にストリンジェントな条件下で、（ａ）〜（ｄ）のいずれかのヌクレオチド配列の相補鎖にハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、該コードされるポリペプチドは、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；あるいは
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
を含む、核酸分子。
【請求項３】
単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該コードされるポリペプチドは、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該コードされるポリペプチドは、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該コードされるポリペプチドは、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｄ）Ｃ末端短縮および／またはＮ末端短縮を有する、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該コードされるポリペプチドは、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｅ）少なくとも１つの改変を有する、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該改変は、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端短縮、またはＮ末端短縮であり、該コードされるポリペプチドは、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｆ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む、（ａ）〜（ｅ）のいずれかのヌクレオチド配列；
（ｇ）少なくとも中程度にストリンジェントな条件下で、（ａ）〜（ｆ）のいずれかのヌクレオチド配列の相補鎖にハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、該コードされるポリペプチドは、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；あるいは
（ｈ）（ａ）〜（ｇ）のいずれかのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
を含む、核酸分子。
【請求項４】
請求項１、２、または３のいずれかに記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項６】
真核生物細胞である、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項７】
原核生物細胞である、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項８】
ＴＥＭ７αポリペプチドを生成するプロセスであって、該ポリペプチドを発現するのに適切な条件下で、請求項５に記載の宿主細胞を培養する工程、および必要に応じて、該培養物から該ポリペプチドを単離する工程、を包含する、方法。
【請求項９】
請求項８に記載のプロセスにより生成される、ポリペプチド。
【請求項１０】
前記核酸分子が、ネイティブＴＥＭ７αポリペプチドのプロモーターＤＮＡではないプロモーターＤＮＡを含み、該プロモーターＤＮＡが、ＴＥＭ７αポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結されている、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１１】
請求項２に記載の単離された核酸分子であって、パーセント同一性が、ＧＡＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＸ、ＢｅｓｔＦｉｔ、またはＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムのコンピュータープログラムを用いて決定される、核酸分子。
【請求項１２】
化合物が、ＴＥＭ７αポリペプチド活性またはＴＥＭ７αポリペプチド生成を阻害するか否かを決定するためのプロセスであって、該化合物に、請求項５、６、または７のいずれかに記載の細胞を曝露する工程、および該細胞中のＴＥＭ７αポリペプチド活性またはＴＥＭ７αポリペプチド生成を測定する工程、を包含する、プロセス。
【請求項１３】
単離されたポリペプチドであって、以下：
（ａ）配列番号２もしくは配列番号４のいずれかに示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３１９９もしくはＰＴＡ−３２００中のＤＮＡインサートによってコードされるアミノ酸配列、
を含む、ポリペプチド。
【請求項１４】
単離されたポリペプチドであって、以下：
（ａ）配列番号２または配列番号４のいずれかのオルソログのアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２または配列番号４のいずれかのアミノ酸配列に少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列であって、該ポリペプチドは、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるアミノ酸配列のフラグメントであって、該フラグメントは、少なくとも１４アミノ酸残基を含み、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有するかまたは抗原性である、フラグメント；あるいは
（ｄ）配列番号２もしくは配列番号４のいずれかに示されるアミノ酸配列、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３１９９もしくはＰＴＡ−３２００中のＤＮＡインサートのヌクレオチド配列、または（ａ）もしくは（ｂ）のいずれかのアミノ酸配列の対立遺伝子改変体またはスプライス改変体のアミノ酸配列、
を含む、ポリペプチド。
【請求項１５】
単離されたポリペプチドであって、以下：
（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、該ポリペプチドは、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、該ポリペプチドは、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、該ポリペプチドは、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｄ）Ｃ末端短縮および／またはＮ末端短縮を有する、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、該ポリペプチドは、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；あるいは
（ｅ）少なくとも１つの改変を有する、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、該改変は、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端短縮、またはＮ末端短縮であり、該ポリペプチドは、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列、
を含む、ポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１、２、または３のいずれかに記載の核酸分子によりコードされる単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１４に記載の単離されたポリペプチドであって、パーセント同一性が、ＧＡＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＸ、ＢｅｓｔＦｉｔ、またはＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムのコンピュータプログラムを用いて決定される、ポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１３、１４、または１５のいずれかに記載のポリペプチドに特異的に結合する、選択的結合因子またはそのフラグメント。
【請求項１９】
配列番号２もしくは配列番号４のいずれかに示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的に結合する、請求項１８に記載の選択的結合因子またはそのフラグメント。
【請求項２０】
抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２１】
ヒト化抗体である、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２２】
ヒト抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２３】
ポリクローナル抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２４】
モノクローナル抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２５】
キメラ抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２６】
ＣＤＲ移植抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２７】
抗イディオタイプ抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２８】
可変領域フラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２９】
ＦａｂフラグメントまたはＦａｂ’フラグメントである、請求項２８に記載の選択的結合因子。
【請求項３０】
配列番号２または配列番号４のいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチドに対する特異性を有する少なくとも１つの相補性決定領域を含む、選択的結合因子またはそのフラグメント。
【請求項３１】
検出可能な標識に結合されている、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項３２】
ＴＥＭ７αポリペプチドの生物学的活性と拮抗する、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項３３】
医学的疾患、状態、または障害を処置、予防、または改善する方法であって、有効量の請求項１８に記載の選択的結合因子を患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３４】
前記医学的疾患、状態、または障害が、大理石骨病または骨粗鬆症である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
配列番号２または配列番号４のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドで動物を免疫することにより生成される、選択的結合因子。
【請求項３６】
請求項１、２、または３のいずれかに記載のポリペプチドに結合し得る選択的結合因子を産生する、ハイブリドーマ。
【請求項３７】
請求項１８に記載の選択的結合因子またはフラグメントを用いて、ＴＥＭ７αポリペプチドを検出またはその量を定量する方法。
【請求項３８】
生物学的サンプル中のＧＰＣＲポリペプチドを検出またはその量を定量するためのキットであって、請求項１８に記載の選択的結合因子を含む、キット。
【請求項３９】
請求項１３、１４、または１５のいずれかに記載のポリペプチド、および薬学的に受容可能な処方剤を含む、組成物。
【請求項４０】
前記薬学的に受容可能な処方剤が、キャリア、アジュバント、可溶化剤、安定化剤、または抗酸化剤である、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
請求項１３、１４、または１５のいずれかに記載のポリペプチドの誘導体を含む、ポリペプチド。
【請求項４２】
水溶性ポリマーで共有結合的に改変された、請求項４０に記載のポリペプチド。
【請求項４３】
前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール、またはポリビニルアルコールである、請求項４２に記載のポリペプチド。
【請求項４４】
請求項１、２、または３のいずれかに記載の核酸分子、および薬学的に受容可能な処方剤を含む、組成物。
【請求項４５】
前記核酸分子がウイルスベクター中に含まれる、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
請求項１、２、または３のいずれかに記載の核酸分子を含む、ウイルスベクター。
【請求項４７】
異種アミノ酸配列に融合された、請求項１３、１４、または１５のいずれかに記載のポリペプチドを含む、融合ポリペプチド。
【請求項４８】
前記異種アミノ酸配列が、ＩｇＧ定常領域またはそのフラグメントである、請求項４７に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４９】
医学的疾患、状態、または障害を処置、予防、または改善する方法であって、有効量の請求項１３、１４、もしくは１５のいずれかに記載のポリペプチドまたは請求項１、２、または３のいずれかに記載の核酸によりコードされるポリペプチドを患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項５０】
前記医学的疾患、状態、または障害が、大理石骨病または骨粗鬆症である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
被験体における病理学的状態または病理学的状態に対する感受性を診断する方法であって、以下：
（ａ）サンプル中の、請求項１３、１４、もしくは１５のいずれかに記載のポリペプチドまたは請求項１、２、もしくは３のいずれかに記載の核酸分子によりコードされるポリペプチドの存在または発現量を決定する工程；および
（ｂ）該ポリペプチドの存在または発現量に基づき、病理学的状態または病理学的状態に対する感受性を診断する工程、
を包含する、方法。
【請求項５２】
デバイスであって、以下：
（ａ）移植に適した膜；および
（ｂ）該膜内にカプセル化された細胞であって、請求項１３、１４、もしくは１５のいずれかに記載のタンパク質を分泌する、細胞、
を含み、該膜は、該タンパク質に対して透過性であり、そして該細胞に対して有害な物質に対して不透過性である、デバイス。
【請求項５３】
ＴＥＭ７αポリペプチドに結合する化合物を同定する方法であって、以下：
（ａ）請求項１３、１４、もしくは１５のいずれかに記載のポリペプチドを化合物と接触させる工程；および
（ｂ）該化合物に対するＴＥＭ７αポリペプチドの結合の程度を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項５４】
前記化合物に結合した場合に、前記ポリペプチドの活性を決定する工程をさらに包含する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
動物中のポリペプチドのレベルを調節する方法であって、請求項１、２、または３のいずれかに記載の核酸分子を該動物に登用する工程を包含する、方法。
【請求項５６】
請求項１、２、または３のいずれかに記載の核酸分子を含む、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項５７】
化合物が、ＴＥＭ７αポリペプチド活性またはＴＥＭ７αポリペプチド生成を阻害するか否かを決定するためのプロセスであって、該化合物に、請求項５６に記載のトランスジェニック哺乳動物を曝露する工程、および該トランスジェニック哺乳動物中のＴＥＭ７αポリペプチド活性またはＴＥＭ７αポリペプチド生成を測定する工程、を包含する、方法。
【請求項５８】
固体支持体に結合された、請求項１、２、または３のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項５９】
請求項１、２、または３のいずれかに記載の少なくとも１つの核酸分子を含む、核酸分子のアレイ。
【請求項６０】
少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドであって、該保存的アミノ酸置換は、１０位のバリン；１１位のロイシン；１２位のバリンもしくはロイシン；１３位のロイシン；１４位のロイシン；１６位のグリシン；１７位のアラニン；１９位のアルギニン；２２位のセリン；２８位のグリシン；５０位のセリン；５４位のアラニン；５６位のグリシン；６０位のグリシン；６１位のトリプトファン；６３位のアルギニン；６６位のアルギニン；７２位のグリシンもしくはアラニン；７３位のヒスチジン；７４位のバリン；７５位のロイシン；７６位のグルタミン酸；７９位のリジン；８２位のロイシン；９６位のアラニン；９７位のイソロイシン；１００位のロイシン；１０７位のバリン；１１７位のバリン；１２０位のバリン；１２５位のグルタミン酸；１３０位のグルタミン酸；１３５位のバリンもしくはロイシン；１４０位のアルギニン；１４２位のヒスチジン；１５２位のセリン；１７５位のバリン；１７７位のイソロイシン；１８４位のフェニルアラニン；１８７位のアスパラギン酸；１８９位のイソロイシンもしくはロイシン；１９９位のバリン；２２４位のバリン；２５６位のバリン；２６５位のアラニン；２７２位のセリン；２７３位のグルタミン；２７８位のアラニン；２８６位のイソロイシン；２８７位のロイシン；２９３位のバリン；３００位のセリン；３０２位のフェニルアラニン；３０７位のイソロイシン；３１４位のバリン；３３２位のグルタミン；３４１位のアスパラギン；３４２位のロイシン；３６５位のグルタミン酸；３６７位のロイシン；３８６位のグリシン；３９２位のセリン；３９５位のセリン；３９６位のアラニン；４０１位のセリン；４０２位のセリン；４０９位のセリン；４１４位のセリン；４２９位のロイシン；４３３位のアラニン；４３８位のロイシン；４５２位のバリン；４５４位のロイシン；４６１位のバリン；４６２位のロイシン；４６３位のアラニン；４６６位のロイシン；４６７位のイソロイシン；４７０位のイソロイシン；４７３位のアラニン；４７５位のイソロイシン；４８７位のロイシン；４９６位のヒスチジン；５０３位のヒスチジン；または５２４位のバリンであり、該ポリペプチドは、配列番号４に示されるポリペプチドの活性を有する、ポリペプチド。
【請求項６１】
配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、米国仮特許出願第６０／２９３，８５２号（２００１年５月２５日出願）（この開示は、明確に、本明細書中に参考として援用される）からの優先権の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、腫瘍内皮マーカー７α（ＴＥＭ７α）ポリペプチドおよびこのポリペプチドをコードする核酸分子に関する。本発明はまた、ＴＥＭ７αポリペプチドを産生するための、選択的結合因子、ベクター、宿主細胞、および方法に関する。本発明はさらに、ＴＥＭ７αポリペプチドと関連する疾患、障害、状態の診断、処置、改善、および／または予防のための薬学的組成物および方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
核酸分子の同定、クローニング、発現、および操作における技術進歩ならびにヒトゲノムの解読は、新規治療剤の発見を大きく加速した。現在、高速核酸配列決定技術は、前例のない速度で配列情報を作製し得、そしてコンピュータ分析と合わされて、重複配列を組み合わせて、ゲノムの一部および全体に集合すること、ならびにポリペプチドコード領域の同定を可能にする。既知アミノ酸配列のデータベース編集物に対する推定アミノ酸配列の比較は、以前に同定された配列および／または構造の目印に対する相同性の程度を決定することを可能にする。核酸分子のポリペプチドコード領域のクローニングおよび発現は、構造分析および機能分析のためのポリペプチド産物を提供する。核酸分子およびコードされるポリペプチドの操作は、治療剤としての使用に関して生成物に対して有利な特性を与え得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
過去１０年間にわたるゲノム研究における有意な技術進歩にも関わらず、ヒトゲノムに基づく新規治療剤の開発に関する可能性は、未だほとんど実現されていない。潜在的に有利なポリペプチド治療剤をコードする多くの遺伝子またはこれらがコードするポリペプチド（これらは、治療分子に対して「標的」としてはたらき得る）は、未だ同定されていない。従って、診断的な利点または治療的な利点を有する、新規ポリペプチドおよびこれらをコードする核酸分子を同定することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、新規のＴＥＭ７α核酸分子およびコードされるポリペプチドに関する。
【０００６】
本発明は、以下を含む、単離された核酸分子を提供する：
（ａ）配列番号１または配列番号３のいずれかに示されるヌクレオチド配列；
（ｂ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３１９９またはＰＴＡ−３２００におけるＤＮＡインサートのヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヌクレオチド配列の相補体に、少なくとも中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、ここで、コードされるポリペプチドは、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；あるいは、
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれかのヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列。
【０００７】
本発明はまた、以下を含む、単離された核酸分子を提供する：
（ａ）配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドに少なくとも約７０％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、このコードされるポリペプチドは、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１または配列番号３のいずれかに示されるヌクレオチド配列、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３１９９もしくはＰＴＡ−３２００におけるＤＮＡインサートのヌクレオチド配列、または（ａ）のヌクレオチド配列の対立遺伝子改変体またはスプライス改変体をコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）少なくとも約２５アミノ酸残基のポリペプチドフラグメントをコードする、配列番号１もしくは配列番号３のいずれかのヌクレオチド配列、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３１９９もしくはＰＴＡ−３２００におけるＤＮＡインサートのヌクレオチド配列、または（ａ）もしくは（ｂ）のヌクレオチド配列の領域であって、ここで、このポリペプチドフラグメントは、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるコードポリペプチドの活性を有するか、または抗原性である、領域；
（ｄ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む、配列番号１もしくは配列番号３のいずれかのヌクレオチド配列、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３１９９もしくはＰＴＡ−３２００におけるＤＮＡインサートのヌクレオチド配列、または（ａ）〜（ｃ）のヌクレオチド配列の領域；
（ｅ）少なくとも中程度にストリンジェントな条件下で、（ａ）〜（ｄ）のいずれかの相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、ここで、このコードされるポリペプチドは、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；あるいは
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかに対して相補的なヌクレオチド配列。
【０００８】
本発明は、以下を含む、単離された核酸分子をさらに提供する：
（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、このコードされるポリペプチドは、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、このコードされるポリペプチドは、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、このコードされるポリペプチドは、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｄ）Ｃ末端短縮および／またはＮ末端短縮を有する配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、このコードされるポリペプチドは、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端短縮、またはＮ末端短縮である１つの改変を有する配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、このコードされるポリペプチドは、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｆ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む、（ａ）〜（ｅ）のいずれかのヌクレオチド配列；
（ｇ）少なくとも中程度にストリンジェントな条件下で、（ａ）〜（ｆ）のいずれかのヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、ここで、このコードされるポリペプチドは、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；あるいは
（ｈ）（ａ）〜（ｇ）のいずれかのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列。
【０００９】
本発明は、以下を含む、単離されたポリペプチドを提供する：
（ａ）配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるアミノ酸配列；あるいは
（ｂ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３１９９もしくはＰＴＡ−３２００におけるＤＮＡインサートによりコードされるアミノ酸。
【００１０】
本発明はまた、以下を含む単離されたポリペプチドを提供する：
（ａ）配列番号２または配列番号４のいずれかのオルソログのアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２または配列番号４のいずれかのアミノ酸配列に少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列であって、ここで、このポリペプチドは、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチド活性を有する、アミノ酸配列；
（ｃ）少なくとも約２５アミノ酸残基を含む配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるアミノ酸配列のフラグメントであって、ここで、このフラグメントは、配列番号２もしくは配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有するか、または、抗原性である、フラグメント；あるいは
（ｄ）配列番号２もしくは配列番号４のいずれかに示されるアミノ酸配列、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３１９９もしくはＰＴＡ−３２００におけるＤＮＡインサートによりコードされるアミノ酸、または（ａ）もしくは（ｂ）のアミノ酸配列の対立遺伝子改変体またはスプライス改変体のアミノ酸配列。
【００１１】
本発明は、以下を含む、単離されたポリペプチドをさらに提供する：
（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、このポリペプチドは、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、このポリペプチドは、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、このポリペプチドは、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｄ）Ｃ末端短縮および／またはＮ末端短縮を有する配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、このポリペプチドは、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；ならびに
（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端短縮、またはＮ末端短縮である少なくとも１つの改変を有する配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、このポリペプチドは、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列。
【００１２】
本発明は、なお、１０位のバリン；１１位のロイシン；１２位のバリンもしくはロイシン；１３位のロイシン；１４位のロイシン；１６位のグリシン；１７位のアラニン；１９位のアルギニン；２２位のセリン；２８位のグリシン；５０位のセリン；５４位のアラニン；５６位のグリシン；６０位のグリシン；６１位のトリプトファン；６３位のアルギニン；６６位のアルギニン；７２位のグリシンもしくはアラニン；７３位のヒスチジン；７４位のバリン；７５位のロイシン；７６位のグルタミン酸；７９位のリジン；８２位のロイシン；９６位のアラニン；９７位のイソロイシン；１００位のロイシン；１０７位のバリン；１１７位のバリン；１２０位のバリン；１２５位のグルタミン酸；１３０位のグルタミン酸；１３５位のバリンもしくはロイシン；１４０位のアルギニン；１４２位のヒスチジン；１５２位のセリン；１７５位のバリン；１７７位のイソロイシン；１８４位のフェニルアラニン；１８７位のアスパラギン酸；１８９位のイソロイシンもしくはロイシン；１９９位のバリン；２２４位のバリン；２５６位のバリン；２６５位のアラニン；２７２位のセリン；２７３位のグルタミン；２７８位のアラニン；２８６位のイソロイシン；２８７位のロイシン；２９３位のバリン；３００位のセリン；３０２位のフェニルアラニン；３０７位のイソロイシン；３１４位のバリン；３３２位のグルタミン；３４１位のアスパラギン；３４２位のロイシン；３６５位のグルタミン酸；３６７位のロイシン；３８６位のグリシン；３９２位のセリン；３９５位のセリン；３９６位のアラニン；４０１位のセリン；４０２位のセリン；４０９位のセリン；４１４位のセリン；４２９位のロイシン；４３３位のアラニン；４３８位のロイシン；４５２位のバリン；４５４位のロイシン；４６１位のバリン；４６２位のロイシン；４６３位のアラニン；４６６位のロイシン；４６７位のイソロイシン；４７０位のイソロイシン；４７３位のアラニン；４７５位のイソロイシン；４８７位のロイシン；４９６位のヒスチジン；５０３位のヒスチジン；または５２４位のバリンである、少なくとも１つの保存的置換を有する配列番号４に示されるアミノ酸を含む単離されたポリペプチドであって、ここで、このポリペプチドが、配列番号４に示されるポリペプチドの活性を有する単離されたポリペプチドをさらに提供する。
【００１３】
また、ＴＥＭ７αアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドが提供される。
【００１４】
本発明はまた、本明細書中に示される単離された核酸分子を含む発現ベクター、本明細書中に示される組換え核酸分子を含む組換え宿主細胞、ならびにＴＥＭ７αポリペプチドを産生する方法であって、宿主細胞を培養する工程およびこの産生されたポリペプチドを必要に応じて単離する工程を包含する方法を提供する。
【００１５】
ＴＥＭ７αポリペプチドをコードする核酸分子を含む、トランスジェニック非ヒト動物はまた、本発明に含まれる。ＴＥＭ７α核酸分子は、ＴＥＭ７αポリペプチドの発現および増加したレベル（これは、増加した循環レベルを含み得る）を可能にする様式で、動物中に導入される。あるいは、ＴＥＭ７α核酸分子は、内因性ＴＥＭ７αポリペプチドの発現を予防する（すなわち、ＴＥＭ７αポリペプチド遺伝子ノックアウトを有するトランスジェニック動物を作製する）様式で、動物中に導入される。このトランスジェニック非ヒト動物は、好ましくは、哺乳動物であり、より好ましくは、げっ歯類（例えば、ラットまたはマウス）である。
【００１６】
本発明のＴＥＭ７αポリペプチドの誘導体もまた、提供される。
【００１７】
さらに、本発明のＴＥＭ７αポリペプチドに特異的に結合し得る抗体およびペプチドのような選択的結合因子が、提供される。このような抗体およびペプチドは、アゴニストまたはアンタゴニストであり得る。
【００１８】
本発明のヌクレオチド、ポリペプチド、または選択的結合因子、および１以上の薬学的に受容可能な処方剤を含む、薬学的組成物はまた、本発明に含まれる。この薬学的組成物は、治療有効量の本発明のヌクレオチドまたはポリペプチドを提供するために使用される。本発明はまた、ポリペプチド、核酸分子、および選択的結合因子を使用する方法に関する。
【００１９】
本発明のＴＥＭ７αポリペプチドおよび核酸分子は、疾患および障害（本明細書中で引用されるものを含む）を処置、予防、改善、および／または検出するために使用され得る。
【００２０】
本発明はまた、ＴＥＭ７αポリペプチドに結合する試験分子を同定するために、試験分子をアッセイする方法を提供する。この方法は、ＴＥＭ７αポリペプチドを試験分子と接触させて、ポリペプチドへの試験分子の結合の程度を決定する工程を包含する。この方法は、さらに、このような試験分子が、ＴＥＭ７αポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを決定する工程を包含する。本発明は、さらに、ＴＥＭ７αポリペプチドの発現またはＴＥＭ７αポリペプチドの活性に対する分子の影響を試験する方法を提供する。
【００２１】
ＴＥＭ７αポリペプチドの発現を調節する方法およびレベルを調整（すなわち、増加または減少）する方法もまた、本発明に含まれる。１つの方法は、ＴＥＭ７αポリペプチドをコードする核酸分子を動物に投与する工程を包含する。別の方法において、ＴＥＭ７αポリペプチドの発現を調節または調整するエレメントを含む核酸分子が、投与され得る。これらの方法の例としては、本明細書中でさらに記載されているような、遺伝子治療、細胞治療、およびアンチセンス治療が挙げられる。
【００２２】
ＴＥＭ７αポリペプチドは、それらのリガンドを同定するために使用され得る。「発現クローニング」の種々の形態は、レセプターに対するリガンドをクローニングするために使用される（例えば、Ｄａｖｉｓら、１９９６、Ｃｅｌｌ、８７：１１６１〜６９を参照のこと）。これらおよび他のＴＥＭ７αリガンドクローニング実験は、本明細書中により詳細に記載される。ＴＥＭ７αリガンドの単離は、ＴＥＭ７αシグナル伝達経路の新規なアゴニストおよび／またはアンタゴニストの同定または開発を可能にする。このようなアゴニストおよびアンタゴニストとしては、ＴＥＭ７αリガンド、抗ＴＥＭ７αリガンド抗体およびその誘導体、小分子、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド（これらのいずれかは、１以上の疾患または障害（本明細書中で引用されるものを含む）を処置するために使用され得る）が挙げられる。
【００２３】
（発明の詳細な説明）
本明細書中で使用される項は、構成目的のためであり、そして、記載される構成要件を限定するように解釈されるべきでない。本願中に引用される全ての参考文献は、明確に、本明細書中に参考として援用される。
【００２４】
（定義）
用語「ＴＥＭ７α遺伝子」もしくは「ＴＥＭ７α核酸分子」または「ＴＥＭ７αポリヌクレオチド」とは、配列番号１または配列番号３のいずれかに示されるヌクレオチド配列、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３１９９またはＰＴＡ−３２００のＤＮＡインサートのヌクレオチド配列、および本明細書中で定義される核酸分子を含むかまたはこれらからなる、核酸分子をいう。
【００２５】
用語「ＴＥＭ７αポリペプチド対立遺伝子改変体」とは、生物または生物の集団の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子の、天然に存在する可能ないくつかの代替形態のうちの１つをいう。
【００２６】
用語「ＴＥＭ７αポリペプチドスプライス改変体」とは、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるＴＥＭ７αポリペプチドアミノ酸配列のＲＮＡ転写物中のイントロン配列の選択的プロセシングによって生成される、核酸分子（通常はＲＮＡ）をいう。
【００２７】
用語「単離された核酸分子」とは、（１）総核酸が供給源細胞から単離される場合に、これが天然で一緒に見出されるタンパク質、脂質、炭水化物、または他の物質の少なくとも約５０パーセントから分離された本発明の核酸分子、（２）「単離された核酸分子」が天然で連結しているポリヌクレオチドの全てまたは一部に連結していない本発明の核酸分子、（３）天然では連結しないポリヌクレオチドに作動可能に連結した本発明の核酸分子、または（４）より大きなポリヌクレオチド配列の一部として天然には存在しない本発明の核酸分子、をいう。好ましくは、本発明の単離された核酸分子は、任意の他の混入核酸分子、または天然の環境において見出される他の混入物（これらは、ポリペプチド産生におけるその使用、またはその治療的使用、診断的使用、予防的使用、または研究的使用を妨げる）を実質的に含まない。
【００２８】
用語「核酸配列」または「核酸分子」は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列をいう。この用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基アナログのいずれかから形成される分子を含み、例えば、以下であるがこれらに限定されない：４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニル−シトシン、プソイドイソシトシン（ｐｓｅｕｄｏｉｓｏｃｙｔｏｓｉｎｅ）、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソ−ペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノ−メチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン（β−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボニル−メチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、および２，６−ジアミノプリン。
【００２９】
用語「ベクター」は、コード情報を宿主細胞へと移すために使用される任意の分子（例えば、核酸、プラスミド、またはウイルス）を言及するために使用される。
【００３０】
用語「発現ベクター」は、宿主細胞の形質転換に適切なベクターであって、そして挿入された異種核酸配列の発現を指示および／または制御する核酸配列を含む、ベクターをいう。発現としては、転写、翻訳、およびＲＮＡスプライシング（イントロンが存在する場合）のようなプロセスが挙げられるがこれらに限定されない。
【００３１】
用語「作動可能に連結された」を用いて、本明細書中では、このように記載された隣接配列が、その通常の機能を発揮するように構成または構築されている隣接配列の配置をいう。従って、コード配列に作動可能に連結された隣接配列は、このコード配列の複製、転写および／または翻訳をもたらすことが可能であり得る。例えば、コード配列は、このプロモーターがこのコード配列の転写を指示し得る場合に、プロモーターに作動可能に連結されている。隣接配列は、これが正確に機能する限り、このコード配列と連続する必要はない。したがって、例えば、翻訳されないが転写される介在配列が、このプロモーター配列とこのコード配列との間に存在し得、そしてこのプロモーター配列は、なおこのコード配列に「作動可能に連結」されているとみなされ得る。
【００３２】
用語「宿主細胞」は、核酸配列で形質転換されたか、または核酸配列で形質転換されて、次いで目的の選択された遺伝子を発現し得る細胞を言及するために使用される。この用語は、選択された遺伝子が存在する限り、子孫が形態または遺伝子構造において元々の親と同一であろうとなかろうと、親細胞の子孫を包含する。
【００３３】
用語「ＴＥＭ７αポリペプチド」とは、配列番号２または配列番号４のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド、および関連ポリペプチドをいう。関連ポリペプチドとしては、以下が挙げられる：ＴＥＭ７αポリペプチドフラグメント、ＴＥＭ７αポリペプチドオルソログ、ＴＥＭ７αポリペプチド改変体、およびＴＥＭ７αポリペプチド誘導体であって、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するもの。ＴＥＭ７αポリペプチドは、本明細書中で定義されるような、成熟ポリペプチドであり得、そして調製される方法に依存して、アミノ末端メチオニン残基を有しても有さなくてもよい。
【００３４】
用語「ＴＥＭ７αポリペプチドフラグメント」とは、配列番号２もしくは配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドのアミノ酸末端での短縮（リーダー配列を含むかまたは含まない）および／またはカルボキシル末端での短縮を含むポリペプチドをいう。用語「ＴＥＭ７αポリペプチドフラグメント」はまた、ＴＥＭ７αポリペプチドオルソログ、ＴＥＭ７αポリペプチド誘導体、もしくはＴＥＭ７αポリペプチド改変体のアミノ末端短縮物および／もしくはカルボキシル末端短縮物、またはＴＥＭ７αポリペプチド対立遺伝子改変体もしくはＴＥＭ７αポリペプチドスプライス改変体によってコードされるポリペプチドのアミノ末端短縮物および／もしくはカルボキシル末端短縮物をいう。ＴＥＭ７αポリペプチドフラグメントは、選択的ＲＮＡスプライシングまたはインビボでのプロテアーゼ活性からもたらされ得る。膜結合形態のＴＥＭ７αポリペプチドもまた、本発明によって意図される。好ましい実施形態では、短縮および／または欠失は、約１０アミノ酸、または約２０アミノ酸、または約５０アミノ酸、または約７５アミノ酸、または約１００アミノ酸、または約１００より多くのアミノ酸を含む。このようにして生成されるポリペプチドフラグメントは、約２５個連続したアミノ酸、または約５０アミノ酸、または約７５アミノ酸、または約１００アミノ酸、または約１５０アミノ酸、または約１５０より多くのアミノ酸を含む。このようなＴＥＭ７αポリペプチドフラグメントは、必要に応じて、アミノ末端メチオニン残基を含み得る。このようなフラグメントは、例えば、ＴＥＭ７αポリペプチドに対する抗体を生成するために使用され得ることが理解される。
【００３５】
用語「ＴＥＭ７αポリペプチドオルソログ」とは、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるＴＥＭ７αポリペプチドアミノ酸配列に対応する、別の種由来のポリペプチドをいう。例えば、マウスおよびヒトのＴＥＭ７αポリペプチドは、互いのオルソログであるとみなされる。
【００３６】
用語「ＴＥＭ７αポリペプチド改変体」は、配列番号２もしくは配列番号４（リーダー配列を有するかまたは有さない）のいずれかに示されるＴＥＭ７αポリペプチドアミノ酸配列と比較して、１つ以上のアミノ酸配列の置換、欠失（例えば、内部欠失および／またはＴＥＭ７αポリペプチドフラグメント）、および／または付加（例えば、内部付加および／またはＴＥＭ７α融合ポリペプチド）を有するアミノ酸配列を含むＴＥＭ７αポリペプチドをいう。改変体は、天然に存在する（例えば、ＴＥＭ７αポリペプチド対立遺伝子改変体、ＴＥＭ７αポリペプチドオルソログ、およびＴＥＭ７αポリペプチドスプライス改変体）か、または、人工的に構築され得る。このようなＴＥＭ７αポリペプチド改変体は、配列番号１、または配列番号３のいずれかに示されるＤＮＡ配列から変化するＤＮＡ配列を有する、対応する核酸分子から調製され得る。好ましい実施形態において、これらの改変体は、１〜３、または１〜５、または１〜１０、または１〜１５、または１〜２０、または１〜２５、または１〜５０、または１〜７５、または１〜１００、または１００より多くのアミノ酸の置換、挿入、付加および／または欠失を有し、ここで、これらの置換は、保存的、または非保存的、あるいはその任意の組み合わせであり得る。
【００３７】
用語「ＴＥＭ７αポリペプチド誘導体」は、化学的に改変された、本明細書中に定義されるような、配列番号２もしくは配列番号４のいずれかに記載されるポリペプチド、ＴＥＭ７αポリペプチドフラグメント、ＴＥＭ７αポリペプチドオルソログ、またはＴＥＭ７αポリペプチド改変体をいう。用語「ＴＥＭ７αポリペプチド誘導体」はまた、化学的に改変された、本明細書中に定義されるような、ＴＥＭ７αポリペプチド対立遺伝子改変体またはＴＥＭ７αポリペプチドスプライス改変体によってコードされるポリペプチドをいう。
【００３８】
用語「成熟ＴＥＭ７αポリペプチド」は、リーダー配列を欠失したＴＥＭ７αポリペプチドをいう。成熟ＴＥＭ７αポリペプチドはまた、他の改変（例えば、アミノ末端（リーダー配列を有するかまたは有さない）および／またはカルボキシル末端のタンパク質分解性プロセシング、より大きな前駆体からのより小さなポリペプチドの切断、Ｎ結合型および／またはＯ結合型グリコシル化など）を含み得る。
【００３９】
用語「ＴＥＭ７α融合ポリペプチド」とは、本明細書中に定義されるような、配列番号２もしくは配列番号４のいずれかに示されるポリペプチド、ＴＥＭ７αポリペプチドフラグメント、ＴＥＭ７αポリペプチドオルソログ、ＴＥＭ７αポリペプチド改変体、またはＴＥＭ７αポリペプチド誘導体の、アミノ末端またはカルボキシル末端での１つ以上のアミノ酸（例えば、異種タンパク質または異種ペプチド）の融合体をいう。用語「ＴＥＭ７α融合ポリペプチド」とはまた、本明細書中に定義されるような、ＴＥＭ７αポリペプチド対立遺伝子改変体またはＴＥＭ７αポリペプチドスプライス改変体によってコードされるポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端での、１つ以上のアミノ酸の融合体をいう。
【００４０】
用語「生物学的に活性なＴＥＭ７αポリペプチド」とは、配列番号２または配列番号４のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドに特徴的な少なくとも１つの活性を有するＴＥＭ７αポリペプチドをいう。さらに、ＴＥＭ７αポリペプチドは、免疫原として活性であり得る；すなわち、ＴＥＭ７αポリペプチドは、抗体が惹起され得る少なくとも１つのエピトープを含む。
【００４１】
用語「単離されたポリペプチド」とは、（１）供給源細胞から単離される場合に、天然で一緒に見出されるポリヌクレオチド、脂質、糖質、または他の物質の少なくとも約５０％から分離された本発明のポリペプチド、（２）「単離されたポリペプチド」が天然で連結ているポリペプチドの全てまたは一部に（共有結合的相互作用によっても非共有結合的相互作用によっても）連結していない、本発明のポリペプチド、（３）天然では連結していないポリペプチドに（共有結合的相互作用または非共有結合的相互作用によって）作動可能に連結している、本発明のポリペプチド、または（４）天然には存在しない本発明のポリペプチドをいう。好ましくは、この単離されたポリペプチドは、あらゆる他の混入ポリペプチドも、その治療的使用、診断的使用、予防的使用、または研究的使用を妨げるその天然の環境において見出される他の混入物も、実質的に含まない。
【００４２】
用語「同一性」とは、当該分野で公知のように、配列の比較によって決定される、２つ以上のポリペプチド分子または２つ以上の核酸分子の、配列間の関係をいう。当該分野において、「同一性」はまた、場合に応じて、２つ以上のヌクレオチド配列の鎖（ｓｔｒｉｎｇ）間または２つ以上のアミノ酸配列の鎖間の一致によって決定したときの、核酸分子間またはポリペプチド間の配列関連性の程度を意味する。「同一性」は、２つ以上の配列のうち小さなものと、特定の数理的モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によってアドレス指定されるギャップアラインメント（存在する場合）との間の同一一致のパーセントを評価する。
【００４３】
用語「類似性」は、関連した概念であるが、「同一性」とは対照的に、「類似性」は、同一一致および保存的置換の一致の両方を含む関連性尺度をいう。２つのポリペプチド配列が、例えば１０／２０個同一のアミノ酸を有し、そして残りが全て非保存的置換である場合、パーセント同一性および類似性は、どちらも５０％である。同じ例において、保存的置換であるさらに５つの位置が存在する場合、パーセント同一性は５０％のままであるが、パーセント類似性は７５％（１５／２０）である。したがって、保存的置換が存在する場合、２つのポリペプチド間のパーセント類似性は、これら２つのポリペプチド間のパーセント同一性よりも高い。
【００４４】
用語「天然に存在する」または「ネイティブの」は、核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞などのような生物学的物質と関連して使用される場合、天然において見出され、そして人によって操作されていない物質をいう。同様に、「天然に存在しない」または「ネイティブではない」は、本明細書中で使用される場合、天然で見出されないか、または人によって構造的に改変もしくは合成された物質をいう。
【００４５】
用語「有効量」および「治療有効量」は、各々、本明細書中に示されるＴＥＭ７αポリペプチドの１つ以上の生物学的活性の観察可能なレベルを支持するために使用されるＴＥＭ７αポリペプチドまたはＴＥＭ７α核酸分子の量をいう。
【００４６】
用語「薬学的に受容可能なキャリア」または「生理学的に受容可能なキャリア」は、本明細書中で使用される場合、薬学的組成物としてのＴＥＭ７αポリペプチド、ＴＥＭ７α核酸分子、またはＴＥＭ７α選択的結合因子の送達の達成または増強に適切な１つ以上の処方材料をいう。
【００４７】
用語「抗原」とは、選択的結合因子（例えば、抗体）により結合され得、そしてさらに動物において使用されて、その抗原のエピトープに結合し得る抗体を産生し得る、分子または分子の一部をいう。抗原は、１つ以上のエピトープを有し得る。
【００４８】
用語「選択的結合因子」とは、ＴＥＭ７αポリペプチドについての特異性を有する分子をいう。本明細書中で使用される場合、用語「特異的」および「特異性」とは、選択的結合因子が、ヒトＴＥＭ７αポリペプチドに結合し、かつヒト非ＴＥＭ７αポリペプチドに結合しない能力をいう。しかし、選択的結合因子がまた、配列番号２または配列番号４のいずれかに記載されるようなポリペプチドのオルソログ（すなわち、その種間バージョン（例えば、マウスＴＥＭ７αポリペプチドおよびラットＴＥＭ７αポリペプチド））に結合し得ることが、理解される。
【００４９】
用語「形質導入」とは、通常はファージによる、１つの細菌から別の細菌への遺伝子の移入をいうために使用される。「形質導入」はまた、レトロウイルスによる真核生物細胞配列の獲得および移入をいう。
【００５０】
用語「トランスフェクション」は、細胞による外因性ＤＮＡまたは異種ＤＮＡの取り込みをいうために使用され、そして細胞は、外因性ＤＮＡが細胞膜内に導入された場合に「トランスフェクト」されている。多数のトランスフェクション技術が、当該分野で周知であり、そして本明細書中に開示される。例えば、Ｇｒａｈａｍら、１９７３、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，１９８９）；Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８６）；およびＣｈｕら、１９８１、Ｇｅｎｅ  １３：１９７を参照のこと。このような技術を使用して、１つ以上の外因性ＤＮＡ部分を適切な宿主細胞に導入し得る。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、用語「形質転換」とは、細胞の遺伝的特徴における変化をいい、そして細胞が新しいＤＮＡを含有するように改変された場合、その細胞は形質転換されている。例えば、細胞がそのネイティブな状態から遺伝子改変された場合、その細胞は形質転換されている。トランスフェクションまたは形質導入に続いて、形質転換ＤＮＡは、細胞の染色体に物理的に組み込まれることにより細胞のＤＮＡと組換わり得るか、複製されることなしにエピソームエレメントとして一過的に維持され得るか、またはプラスミドとして独立して複製し得る。ＤＮＡが細胞分裂と共に複製される場合に、細胞は、安定に形質転換されたとみなされる。
【００５２】
（核酸分子および／またはポリペプチドの関連性）
関連した核酸分子が、配列番号１、または配列番号３の核酸分子の対立遺伝子改変体またはスプライス改変体を含むこと、および上記のヌクレオチド配列のいずれかに相補的である配列を含むことが理解される。関連した核酸分子はまた、配列番号２または配列番号４のいずれかにおけるポリペプチドと比較して１以上のアミノ酸残基の置換、改変、付加および／または欠失を含むかまたは本質的にこれからなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。このような関連したＴＥＭ７αポリペプチドは、例えば、１以上のＮ結合型および／もしくはＯ結合型グリコシル化部位の付加および／もしくは欠失、または１以上のシステイン残基の付加および／もしくは欠失を含み得る。
【００５３】
関連した核酸分子はまた、配列番号２または配列番号４のいずれかのＴＥＭ７αポリペプチドのうちの少なくとも約２５個連続したアミノ酸、または約５０アミノ酸、または約７５アミノ酸、または約１００アミノ酸、または約１５０アミノ酸、または約１５０よりも多くのアミノ酸残基のポリペプチドをコードする、ＴＥＭ７α核酸分子のフラグメントを包含する。
【００５４】
さらに、関連したＴＥＭ７α核酸分子としてはまた、本明細書中で定義したような中程度または高度にストリンジェントな条件下で、配列番号１、もしくは配列番号３のいずれかのＴＥＭ７α核酸分子の十分に相補的な配列、またはポリペプチド（このポリペプチドは、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるアミノ酸配列を含む）をコードする分子の十分に相補的な配列、または本明細書中に定義したような核酸フラグメントの十分に相補的な配列、または本明細書中に定義したようなポリペプチドをコードする核酸フラグメントの十分に相補的な配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む分子が挙げられる。ハイブリダイゼーションプローブは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリーまたは合成ＤＮＡライブラリーを、関連した配列についてスクリーニングするために、本明細書中に提供されるＴＥＭ７α配列を用いて調製され得る。ＴＥＭ７αポリペプチドのＤＮＡ配列および／またはアミノ酸配列のうちの、既知配列に対して顕著な同一性を示す領域は、本明細書中に記載されるような配列アラインメントアルゴリズムを用いて容易に決定され、そしてこれらの領域を用いて、スクリーニングのためのプローブを設計し得る。
【００５５】
用語「高度にストリンジェントな条件」とは、配列が高度に相補的であるＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを許容し、かつ著しく不一致なＤＮＡのハイブリダイゼーションを排除するように設計された条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、温度、イオン強度および変性剤（例えば、ホルムアミド）の濃度によって主に決定される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄についての「高度にストリンジェントな条件」の例は、６５〜６８℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムまたは４２℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムおよび５０％ホルムアミドである。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８９）；Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第４章（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）を参照のこと。
【００５６】
よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミドまたは他の変性剤）もまた用いられ得るが、ハイブリダイゼーションの速度は影響を受ける。他の薬剤は、非特異的ハイブリダイゼーションおよび／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少させる目的のために、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液中に含まれ得る。例は、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、ＮａＤｏｄＳＯ４（ＳＤＳ）、フィコール、デンハルト溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（または別の非相補的ＤＮＡ）および硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤もまた用いられ得る。これらの添加剤の濃度および型は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施される；しかし、代表的なイオン強度の条件では、ハイブリダイゼーションの速度は、ｐＨにほとんど依存しない。Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第４章（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）を参照のこと。
【００５７】
ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基組成、長さおよび塩基対の不一致の程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、これらの変動要因を適応させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にするために当業者によって調整され得る。完全に一致したＤＮＡ二重鎖の融解温度は、以下の方程式によって推定され得る：
Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｎ−０．７２（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基の百分率である。不完全に一致したハイブリッドについては、融解温度は、不一致１％毎に約１℃下げられる。
【００５８】
用語「中程度にストリンジェントな条件」とは、「高度にストリンジェントな条件」下で形成され得るよりも程度が高い塩基対不一致を有するＤＮＡ二重鎖が形成され得る条件をいう。代表的な「中程度にストリンジェントな条件」の例は、５０〜６５℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムまたは３７〜５０℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムおよび２０％ホルムアミドである。例として、０．０１５Ｍナトリウムイオン中で５０℃の、「中程度にストリンジェントな」条件は、約２１％の不一致を可能にする。
【００５９】
「高度にストリンジェントな条件」と「中程度にストリンジェントな条件」との間に絶対的な区別が存在しないことが当業者によって理解される。例えば、０．０１５Ｍナトリウムイオン（ホルムアミドなし）では、完全に一致した長いＤＮＡの融解温度は、約７１℃である。６５℃で（同じイオン強度で）の洗浄を用いると、このことは、約６％の不一致を可能にする。より遠く関連した配列を捕捉するために、当業者は、単純に、温度を低くし得るかまたはイオン強度を高くし得る。
【００６０】
約２０ｎｔまでのオリゴヌクレオチドプローブについての１Ｍ  ＮａＣｌ＊中での融解温度の良好な推定は、以下によって与えられる：
Ｔｍ＝Ａ−Ｔ塩基対あたり２℃  ＋  Ｇ−Ｃ塩基対あたり４℃
＊６×塩クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中のナトリウムイオン濃度は、１Ｍである。Ｓｕｇｇｓら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｇｅｎｅｓ、６８３（ＢｒｏｗｎおよびＦｏｘ編、１９８１）を参照のこと。
【００６１】
オリゴヌクレオチドについての高いストリンジェンシーの洗浄条件は、通常、６×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中で、そのオリゴヌクレオチドのＴｍよりも０℃〜５℃低い温度においてである。
【００６２】
別の実施形態において、関連した核酸分子は、配列番号１、もしくは配列番号３に示されるようなヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０パーセント同一であるヌクレオチド配列を含むかもしくはこれからなるか、または配列番号２もしくは配列番号４のいずれかに示されるようなポリペプチドに対して少なくとも約７０パーセント同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むかもしくは本質的にこれからなる。好ましい実施形態において、ヌクレオチド配列は、配列番号１、または配列番号３のいずれかに示されるようなヌクレオチド配列に対して約７５パーセント、または約８０パーセント、または約８５パーセント、または約９０パーセント、または約９５、９６、９７、９８、もしくは９９パーセント同一であるか、あるいはヌクレオチド配列は、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるようなポリペプチド配列に対して約７５パーセント、または約８０パーセント、または約８５パーセント、または約９０パーセント、または約９５、９６、９７、９８、もしくは９９パーセント同一であるポリペプチドをコードする。関連した核酸分子は、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドの少なくとも１つの活性を保有するポリペプチドをコードする。
【００６３】
核酸配列における差異は、配列番号２または配列番号４のいずれかのアミノ酸配列と比較して、アミノ酸配列の保存的改変および／または非保存的改変を生じ得る。
【００６４】
配列番号２または配列番号４のいずれかのアミノ酸配列に対する保存的改変（およびコードするヌクレオチドに対する対応する改変）は、ＴＥＭ７αポリペプチドの機能的特徴および化学的特徴と類似の機能的特徴および化学的特徴を有するポリペプチドを生成する。対照的に、ＴＥＭ７αポリペプチドの機能的特徴および／または化学的特徴における実質的な改変は、以下を維持することに対するその影響が顕著に異なる、配列番号２または配列番号４のいずれかのアミノ酸配列における置換を選択することによって達成され得る：（ａ）例えば、シートもしくはヘリックスコンホメーションのような、置換領域における分子骨格の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のかさ。
【００６５】
例えば、「保存的アミノ酸置換」は、その位置でのアミノ酸残基の極性にも電荷にもほとんどまたは全く影響がないような、非ネイティブな残基によるネイティブなアミノ酸残基の置換を含み得る。さらに、ポリペプチド中の任意のネイティブな残基はまた、「アラニンスキャニング変異誘発」について以前に記載されたように、アラニンによって置換され得る。
【００６６】
保存的アミノ酸置換はまた、生物学的系における合成によるよりむしろ、化学的なペプチド合成によって代表的に組み込まれる、天然には存在しないアミノ酸残基を含む。これらとしては、ペプチド模倣物、およびアミノ酸部分の他の逆転形態または反転形態が挙げられる。
【００６７】
天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて、複数のクラスに分割され得る：
１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）鎖の配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【００６８】
例えば、非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーの、別のクラス由来のメンバーとの交換を含み得る。このような置換された残基が、非ヒトＴＥＭ７αポリペプチドオルソログと相同なヒトＴＥＭ７αポリペプチドの領域、またはこの分子の非相同領域に導入され得る。
【００６９】
このような変更を行う際に、アミノ酸のハイドロパシー指数（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｉｎｄｅｘ）が考慮され得る。各アミノ酸は、その疎水性および電荷特性に基づいて、ハイドロパシー指数を割り当てられている。ハイドロパシー指数は、以下である：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。
【００７０】
タンパク質に対する相互作用的な生物学的機能を確認する際の、ハイドロパシーアミノ酸指数の重要性は、当該分野において一般的に理解されている（Ｋｙｔｅら、１９８２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５７：１０５−１３１）。特定のアミノ酸が、類似のハイドロパシー指数またはスコアを有する他のアミノ酸の代わりに使用され得、そして依然として類似の生物学的活性を維持し得ることが、公知である。ハイドロパシー指数に基づいて変更を行う際に、ハイドロパシー指数が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるものが特に好ましく、そして±０．５以内であるものが、なおより特に好ましい。
【００７１】
類似のアミノ酸の置換が、親水性に基づいて効果的になされ得る（特に、これによって作製された生物学的に機能的に等価なタンパク質またはペプチドが、この場合と同様に、免疫学的実施形態における使用のために意図される）場合もまた、当該分野において理解されている。その隣接するアミノ酸の親水性によって支配されるような、タンパク質の最も大きな局所的な平均親水性は、その免疫原性および抗原性、すなわち、そのタンパク質の生物学的特性に相関する。
【００７２】
以下の親水性の値が、これらのアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。類似の親水性の値に基づいて変更を行う際に、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±ｌ以内であるものが特に好ましく、そして±０．５以内であるものが、なおより特に好ましい。エピトープをまた、一次アミノ酸配列から、親水性に基づいて同定し得る。これらの領域はまた、「エピトープコア領域」と呼ばれる。
【００７３】
所望のアミノ酸置換（保存的であれ非保存的であれ）は、当業者によって、このような置換が所望される時点で決定され得る。例えば、アミノ酸置換を使用して、ＴＥＭ７αポリペプチドの重要な残基を同定し得るか、または本明細書中に記載されるＴＥＭ７αポリペプチドの親和性を増加もしくは減少させ得る。例示的なアミノ酸置換を、表Ｉに示す。
【００７４】
【表１】
2005516582.tif 000002
2005516582.tif 000003
当業者は、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるようなポリペプチドの適切な改変体を、周知の技術を使用して、決定し得る。活性を破壊することなく変更され得る分子の適切な領域を同定するために、当業者は、生物学的活性のために重要であるとは考えられない領域を標的化し得る。例えば、同じ種由来かまたは他の種由来の、類似の活性を有する類似のポリペプチドが既知である場合、当業者は、ＴＥＭ７αポリペプチドのアミノ酸配列を、このような類似のポリペプチドに対して比較し得る。このような比較を用いて、類似のポリペプチド間で保存される分子の残基および部分を同定し得る。このような類似のポリペプチドに対して保存されていないＴＥＭ７αポリペプチドの領域における変化が、ＴＥＭ７αポリペプチドの生物学的活性および／または構造にさほど不利に影響を与えない可能性があることが、理解される。当業者にはまた、比較的保存された領域においてさえ、天然に存在する残基を、活性を維持しながら化学的に類似のアミノ酸で置換し得ることが公知である（保存的アミノ酸残基置換）。従って、生物学的活性または構造のために重要であり得る領域でさえ、生物学的活性を破壊することもなく、ポリペプチド構造に悪影響を与えることもなく、保存的アミノ酸置換に供され得る。
【００７５】
さらに、当業者は、活性または構造のために重要である類似のポリペプチド中の残基を同定する、構造−機能研究を再検討し得る。このような比較の観点において、類似のポリペプチドにおける活性または構造のために重要なアミノ酸残基に対応する、ＴＥＭ７αポリペプチドにおけるアミノ酸残基の重要性を予測し得る。当業者は、ＴＥＭ７αポリペプチドのこのような予測された重要なアミノ酸残基について、化学的に類似のアミノ酸での置換を選択し得る。
【００７６】
当業者はまた、類似のポリペプチドにおいて、三次元構造および三次元構造に関連するアミノ酸配列を分析し得る。このような情報を考慮して、当業者は、その三次元構造に対するＴＥＭ７αポリペプチドのアミノ酸残基のアライメントを、予測し得る。当業者は、そのタンパク質の表面に存在すると予測されるアミノ酸残基に急激な変化を起こさないように、選択し得る。なぜなら、このような残基は、他の分子との重要な相互作用に関与し得るからである。さらに、当業者は、単一のアミノ酸置換を所望のアミノ酸残基各々に含む、試験改変体を作製し得る。これらの改変体は、当業者に公知の活性アッセイを使用して、スクリーニングされ得る。このような改変体は、適切な改変体に関する情報を集めるために使用され得る。例えば、特定のアミノ酸残基に対する変更が、破壊された活性、望ましくない減少した活性、または適切でない活性を生じたことを発見した場合には、このような変化を有する改変体は、回避される。換言すれば、このような慣用的な実験から集めた情報に基づいて、当業者は、さらなる置換が単独でかまたは他の変異と組み合わせてかのいずれかで回避されるべきであるアミノ酸を、容易に決定し得る。
【００７７】
多数の科学刊行物が、二次構造の推定に充てられてきた。Ｍｏｕｌｔ、１９９６、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７：４２２−４２７；Ｃｈｏｕら、１９７４、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：２２２−４５；Ｃｈｏｕら、１９７４、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１１３：２１１−２２；Ｃｈｏｕら、１９７８、Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４７：４５−４８；Ｃｈｏｕら、１９７８、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：２５１−２７６；およびＣｈｏｕら、１９７９、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．２６：３６７−８４を参照のこと）。さらに、コンピュータプログラムが、二次構造の推定を補助するために、現在利用可能である。
【００７８】
二次構造を推定する１つの方法は、相同性モデリングに基づく。例えば、３０％より大きな配列同一性または４０％より大きな類似性を有する２つのポリペプチドまたはタンパク質は、しばしば、類似の構造トポロジーを有する。タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の近年の成長は、二次構造（ポリペプチドまたはタンパク質の構造における可能な折り畳みの数を含む）の増強された推定性を提供してきた。Ｈｏｌｍら、１９９９、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．２７：２４４−４７を参照のこと。所定のポリペプチドまたはタンパク質において制限された数の折り畳みが存在すること、および一旦、重要な数の構造が解明されると、構造推定は劇的により正確となることが、示唆されてきた（Ｂｒｅｎｎｅｒら、１９９７、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３６９−７６）。二次構造を予測するさらなる方法としては、「スレッディング（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」（Ｊｏｎｅｓ、１９９７、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３７７−８７；Ｓｉｐｐｌら、１９９６、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４：１５−１９）、「プロフィール分析」（Ｂｏｗｉｅら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５３：１６４−７０；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、１９９０、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：１４６−５９；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：４３５５−４３５８）、および「進化的連鎖（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｌｉｎｋａｇｅ）」（Ｈｏｍｅ、前出、およびＢｒｅｎｎｅｒ、前出を参照のこと）が、挙げられる。
【００７９】
好ましいＴＥＭ７αポリペプチド改変体としては、グリコシル化部位の数および／または型が配列番号２または配列番号４のいずれかに記載のアミノ酸配列と比較して変化している、グリコシル化改変体が挙げられる。１つの実施形態において、ＴＥＭ７αポリペプチド改変体は、配列番号２または配列番号４のいずれかに記載のアミノ酸配列より多いかまたはより少ない数のＮ結合グリコシル化部位を含む。Ｎ結合グリコシル化部位は、配列Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒによって特徴付けられ、ここで、Ｘとして示されるアミノ酸残基は、プロリン以外の任意のアミノ酸残基であり得る。この配列を作製するためのアミノ酸残基の置換は、Ｎ結合糖質鎖の付加のための潜在的な新たな部位を提供する。あるいは、この配列を排除する置換は、存在するＮ結合糖質鎖を除去する。１つ以上のＮ結合型グリコシル化部位（代表的に、天然に存在するグリコシル化部位）が排除され、そして１つ以上の新たなＮ結合部位が作製されている、Ｎ結合糖質鎖の再配列もまた、提供される。さらなる好ましいＴＥＭ７α改変体としては、１つ以上のシステイン残基が、配列番号２または配列番号４のいずれかに記載のアミノ酸配列と比較して欠失しているか、または別のアミノ酸（例えば、セリン）で置換されている、システイン改変体が挙げられる。システイン改変体は、ＴＥＭ７αポリペプチドが、例えば不溶性の封入体の単離の後に、生物学的に活性な配置にリフォールディングされなければならない場合に、有用である。システイン改変体は、一般に、ネイティブタンパク質より少ないシステイン残基を有し、そして代表的には偶数のシステイン残基を有し、対合していないシステインから生じる相互作用を最小にする。
【００８０】
別の実施形態において、関連の核酸分子は、少なくとも１つのアミノ酸の挿入を有する、配列番号２もしくは配列番号４のいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むかもしくはその配列からなり、そしてここで、このポリペプチドは配列番号２または配列番号４のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有するか、または、少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する、配列番号２もしくは配列番号４のいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むかもしくはその配列からなり、そしてここで、このポリペプチドは配列番号２または配列番号４のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有する。関連の核酸分子はまた、配列番号２もしくは配列番号４のいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むかもしくはその配列からなり、ここで、このポリペプチドはカルボキシル末端および／またはアミノ末端の短縮を有し、そしてさらにここで、このポリペプチドは配列番号２または配列番号４のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有する。関連の核酸分子はまた、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、カルボキシル末端短縮、およびアミノ末端短縮からなる群より選択される少なくとも１つの改変を有する、配列番号２もしくは配列番号４のいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか、もしくはその配列からなり、そしてここで、このポリペプチドは配列番号２または配列番号４のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有する。
【００８１】
さらに、配列番号２もしくは配列番号４のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは他のＴＥＭ７αポリペプチドは、相同なポリペプチドに融合されてホモダイマーを形成し得るか、または異種のポリペプチドに融合されてヘテロダイマーを形成し得る。異種のペプチドおよびポリペプチドとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＴＥＭ７α融合ポリペプチドの検出および／または単離を可能するためのエピトープ；膜貫通レセプタータンパク質またはその一部分（例えば、細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン）；膜貫通レセプタータンパク質に結合するリガンドまたはその一部分；触媒活性である酵素またはその一部分；オリゴマー化を促進するポリペプチドまたはペプチド（例えば、ロイシンジッパードメイン）；安定性を増加するポリペプチドまたはペプチド（例えば、免疫グロブリン定常領域）；ならびに配列番号２もしくは配列番号４のいずれかに記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはＴＥＭ７αポリペプチド改変体とは異なる治療活性を有するポリペプチド。
【００８２】
融合は、配列番号２もしくは配列番号４のいずれかに記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは他のＴＥＭ７αポリペプチドの、アミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかでなされ得る。融合は、リンカー分子またはアダプター分子なしで直接的であり得るか、あるいはリンカー分子またはアダプター分子を使用してであり得る。リンカー分子またはアダプター分子は、１つ以上のアミノ酸残基、代表的には約２０〜約５０個のアミノ酸残基であり得る。リンカー分子またはアダプター分子はまた、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼ、またはプロテアーゼの切断部位を有するように設計され得、融合部分の分離を可能にする。一旦構築されると、融合ポリペプチドは、本明細書中に記載される方法に従って誘導体化され得ることが理解される。
【００８３】
本発明のさらなる実施形態において、配列番号２もしくは配列番号４のいずれかに記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは他のＴＥＭ７αポリペプチドは、ヒトＩｇＧのＦｃ領域の１つ以上のドメインに融合される。抗体は、２つの機能的に独立した部分（「Ｆａｂ」として公知の可変ドメイン（抗原に結合する）および「Ｆｃ」として公知の定常ドメイン（食細胞による攻撃および補体活性化のようなエフェクター機能に関係する）を含む。Ｆｃは、長い血清半減期を有し、一方、Ｆａｂは短寿命である（Ｃａｐｏｎら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ、３３７：５２５−３１）。治療タンパク質と一緒に構築される場合、Ｆｃドメインは、より長い半減期を提供し得るか、またはＦｃレセプター結合、プロテインＡ結合、補体固定およびおそらく胎盤輸送のような機能を組込み得る（同書）。表ＩＩは、当該分野で公知の特定のＦｃ融合物の使用を要約する。
【００８４】
【表２】
2005516582.tif 000004
一つの例において、ヒトＩｇＧヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３領域の全てまたは一部は、当業者に公知の方法を使用してＴＥＭ７αポリペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合され得る。別の例において、ヒトＩｇＧヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域は、ＴＥＭ７αポリペプチドフラグメント（例えば、ＴＥＭ７αの推定細胞外部分）のアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかに融合され得る。
【００８５】
得られるＴＥＭ７α融合ポリペプチドは、プロテインＡアフィニティーカラムの使用によって精製され得る。Ｆｃ領域に融合されたペプチドおよびタンパク質は、融合されていない対応物よりもインビボで実質的に長い半減期を示すことが見出された。また、Ｆｃ領域への融合は、融合ポリペプチドの二量化／多量体化を可能にする。Ｆｃ領域は、天然に存在するＦｃ領域であり得るか、または特定の質（例えば、治療的質、循環時間、凝集の減少など）を改善するために変更され得る。
【００８６】
関連する核酸分子およびポリペプチドの同一性および類似性は、公知の方法によって容易に計算され得る。このような方法としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，（Ａ．Ｍ．編，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，（Ｄ．Ｗ．編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，（Ｐａｒｔ  １，Ａ．Ｍ．ＧｒｉｆｆｉｎおよびＨ．Ｇ．Ｇｒｉｆｆｉｎ，編，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  １９９４）Ｇ．ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｍ．ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＪ．Ｄｅｖｅｒｅｕｘ編，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ  １９９１）；ならびにＣａｒｉｌｌｏら，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８：１０７３，（１９８８）に記載される方法。
【００８７】
同一性および／または類似性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間に最も大きな一致を与えるように設計される。同一性および類似性を決定するための方法は、公に利用可能なコンピュータプログラムに記載される。２つの配列間の同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータプログラム方法としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＧＣＧプログラムパッケージ（ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，１２：３８７；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を含む）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−１０）。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）および他の供給源（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ（ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）；Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０，上記）から公に入手可能である。周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムもまた同一性を決定するために使用され得る。
【００８８】
２つのアミノ酸配列を整列させるための特定の整列スキームは、２つの配列の短い領域のみの一致を生じ得、この小さな整列された領域は、２つの全長配列間に有意な関係がないとしても非常に高い配列同一性を有し得る。従って、好ましい実施形態においては、選択された整列方法（ＧＡＰプログラム）は、標的ポリペプチドの少なくとも５０個の連続するアミノ酸にわたる整列を生じる。
【００８９】
例えば、コンピュータアルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、配列同一性パーセントが決定される２つのポリペプチドが、それらのそれぞれのアミノ酸の最適の一致（アルゴリズムによって決定される「一致したスパン（ｍａｔｃｈｅｄ  ｓｐａｎ）」）について整列される。ギャップオープニングペナルティー（ｇａｐ  ｏｐｅｎｉｎｇ  ｐｅｎａｌｔｙ）（これは、平均対角の３倍として計算され；「平均対角」は、使用される比較マトリクスの対角の平均であり；「対角」は、特定の比較マトリクスによってそれぞれの完全なアミノ酸一致に割り当てられるスコアまたは数である）およびギャップエクステンションペナルティー（これは、通常ギャップオープニングペナルティーの１／１０である）、ならびにＰＡＭ２５０またはＢＬＯＳＵＭ６２のような比較マトリクスがこのアルゴリズムとともに使用される。標準比較マトリクスもまたこのアルゴリズムによって使用される（Ｄａｙｈｏｆｆら、５  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（補遺３、１９７８）（ＰＡＭ２５０比較マトリクス）；Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８９：１０９１５−１９（ＢＬＯＳＵＭ６２比較マトリクス））。
【００９０】
ポリペプチド配列の比較に好ましいパラメーターとしては、以下が挙げられる：
アルゴリズム：ＮｅｅｄｌｅｍａおよびＷｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−５３；
比較マトリクス（Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｍａｔｒｉｘ）：ＢＬＯＳＵＭ  ６２（Ｈｅｎｉｋｏｆｆら，上記）より；
ギャップペナルティー（Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ）：１２
ギャップレングスペナルティー（Ｇａｐ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｅｎａｌｔｙ）：４
類似性の閾値：０。
ＧＡＰプログラムは、上記パラメーターを用いて有用である。上記パラメーターは、ＧＡＰアルゴリズムを使用するポリペプチド比較についてのデフォルトパラメーター（末端ギャップについてペナルティーなしで）である。
【００９１】
核酸分子配列比較についての好ましいパラメーターとしては、以下が挙げられる：
アルゴリズム：ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，上記；
比較マトリクス：一致＝＋１０、不一致＝０
ギャップペナルティー：５０
ギャップレングスペナルティー：３。
ＧＡＰプログラムはまた、上記パラメーターを用いて有用である。上記パラメーターは、核酸分子比較についてのデフォルトパラメーターである。
【００９２】
他の例示的なアルゴリズム、ギャップオープニングペナルティー、ギャップエクステンションペナルティー、比較マトリクス、類似性の閾値が使用され得、これには、Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，１９９７に記載されるものを含む。なされる特定の選択は、当業者に明らかであり、なされる特定の比較（例えば、ＤＮＡ−ＤＮＡ間、タンパク質−タンパク質間、タンパク質−ＤＮＡ間）；比較が所定の配列の対間である（この場合、ＧＡＰまたはＢｅｓｔＦｉｔが一般的に好ましい）か、一つの配列と配列の大きなデータベースとの間（この場合、ＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴＡが好ましい）であるか）に依存する。
【００９３】
（核酸分子）
ＴＥＭ７αポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子は、化学合成、ｃＤＮＡライブラリースクリーニングもしくはゲノムライブラリースクリーニング、発現ライブラリースクリーニング、および／またはｃＤＮＡのＰＣＲ増幅が挙げられるがこれらに限定されない種々の方法で容易に取得され得る。
【００９４】
本明細書中で使用される組換えＤＮＡ法は、一般に以下に示される方法である：Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）および／またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  １９９４）。本発明は、本明細書中に記載されるような核酸分子およびこのような分子を得るための方法を提供する。
【００９５】
ＴＥＭ７αポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子がある種から同定された場合、この遺伝子の全てまたは一部をプローブとして使用して、同一種由来のオルソログまたは関連遺伝子を同定し得る。このプローブまたはプライマーを使用して、ＴＥＭ７αポリペプチドを発現すると考えられている種々の組織供給源からｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし得る。さらに、配列番号１または配列番号３のいずれかに示される配列を有する核酸分子の一部または全てを使用して、ゲノムライブラリーをスクリーニングしてＴＥＭ７αポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子を同定および単離し得る。代表的には、中程度のストリンジェンシー条件または高ストリンジェンシー条件が、スクリーニングから得られる偽陽性の数を最小化するためのスクリーニングに使用される。
【００９６】
ＴＥＭ７αポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子はまた、発現したタンパク質の特性に基づくポジティブクローンの検出を使用する発現クローニングによって同定され得る。代表的には、核酸ライブラリーは、宿主細胞に発現されかつその表面上に提示されるクローニングされたタンパク質に、抗体または他の結合パートナー（例えば、レセプターまたはリガンド）を結合させることによってスクリーニングされる。抗体または結合パートナーは、所望のクローンを発現する細胞を同定するために、検出可能な標識で改変される。
【００９７】
以下に示される記載に従って行われる組換え発現技術を、これらのポリヌクレオチドを産生するために、そしてコードされるポリペプチドを発現するために続け得る。例えば、、ＴＥＭ７αポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列を適切なベクターに挿入することによって、当業者は、多量の所望のヌクレオチド配列を容易に産生し得る。次いで、この配列を使用して、検出プローブまたは増幅プライマーを作製し得る。あるいは、ＴＥＭ７αポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、発現ベクターに挿入され得る。適切な宿主にこの発現ベクターを導入することによって、コードされたＴＥＭ７αポリペプチドは、多量に産生され得る。
【００９８】
適切な核酸配列を得るための別の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。この方法において、ｃＤＮＡは、酵素（逆転写酵素）を使用してポリ（Ａ）＋ＲＮＡまたは総ＲＮＡより調製され得る。次いで、２つのプライマー（代表的には、ＴＥＭ７αポリペプチドのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの２つの別々の領域に相補的な）が、ＴａｑポリメラーゼのようなポリメラーゼとともにｃＤＮＡに添加され、そしてこのポリメラーゼは、２つのプライマー間のｃＤＮＡ領域を増幅する。
【００９９】
ＴＥＭ７αポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子を調製する別の手段は、Ｅｎｇｅｌｓら，１９８９，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．２８：７１６−３４に記載される方法のような、当業者に周知の方法を使用する化学合成である。これらの方法としては、とりわけ、核酸合成のためのホスホトリエステル法、ホスホルアミダイト法およびＨ−ホスホネート法が挙げられる。このような化学合成に好ましい方法は、標準的なホスホルアミダイト化学を使用するポリマー支持された合成である。代表的には、ＴＥＭ７αポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、数百ヌクレオチド長である。約１００ヌクレオチドより長い核酸は、これらの方法を使用していくつかのフラグメントとして合成され得る。次いで、このフラグメントを一緒に連結して、ＴＥＭ７α遺伝子の全長ヌクレオチド配列を形成し得る。通常、ポリペプチドのアミノ末端をコードするＤＮＡフラグメントは、メチオニン残基をコードするＡＴＧを有する。このメチオニンは、宿主細胞中で産生されたＴＥＭ７αポリペプチドがこの細胞から分泌されるように設計されているか否かに依存して、このポリペプチドの成熟形態上に存在してもしなくてもよい。当業者に既知の他の方法もまた使用され得る。
【０１００】
特定の実施形態において、核酸改変体は、所定の宿主細胞において最適なＴＥＭ７αポリペプチド発現のために変更されているコドンを含む。特定のコドン変更は、ＴＥＭ７αポリペプチドおよび発現のために選択された宿主細胞に依存する。このような「コドン最適化」は、種々の方法によって（例えば、所定の宿主細胞中で高度に発現される遺伝子における使用のために好ましいコドンを選択することによって）行われ得る。高度に発現される細菌性遺伝子のコドン嗜好（ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）のための「Ｅｃｏ＿ｈｉｇｈ．Ｃｏｄ」のようなコドン頻度表を組み込むコンピューターアルゴリズムが使用され得、そしてＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって提供される。他の有用なコドン頻度表としては、以下が挙げられる：「Ｃｅｌｅｇａｎｓ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｃｅｌｅ＿ｇａｎｓ＿ｌｏｗ．ｃｏｄ」、「Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｈｕｍａｎ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｍａｉｚｅ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」および「Ｙｅａｓｔ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」。
【０１０１】
いくつかの場合において、ＴＥＭ７αポリペプチド改変体をコードする核酸分子を調製することが望ましくあり得る。改変体をコードする核酸分子は、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ増幅、または他の適切な方法を使用して産生され得、ここで、プライマーは、所望の点変異を有する（変異誘発技術の記載については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上述、およびＡｕｓｕｂｅｌら、上述、を参照のこと）。Ｅｎｇｅｌら（上述）によって記載される方法を使用する化学合成もまた、このような改変体を調製するために使用され得る。当業者に既知の他の方法もまた、使用され得る。
【０１０２】
（ベクターおよび宿主細胞）
ＴＥＭ７αポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子は、標準的連結技術を使用して適切な発現ベクターに挿入される。ベクターは、代表的には、使用される特定の宿主細胞中で機能的であるように選択される（すなわち、ベクターは、宿主細胞機構に適合可能であり、その結果、遺伝子増幅および／または遺伝子発現が生じ得る）。ＴＥＭ７αポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子は、原核生物宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞（バキュロウイルス系）および／または真核生物宿主細胞において増幅／発現され得る。宿主細胞の選択は、ＴＥＭ７αポリペプチドが翻訳後修飾されるべきか否かに一部依存する（例えば、グリコシル化および／またはリン酸化）。そうならば、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞または哺乳動物宿主細胞が好ましい。発現ベクターの総説については、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，ｖｏｌ．１８５（Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９０）を参照のこと。
【０１０３】
代表的には、宿主細胞のいずれかにおいて使用される発現ベクターは、プラスミド維持のための配列、ならびに外因性ヌクレオチド配列のクローニングおよび発現のための配列を含む。特定の実施形態において、このような配列（「隣接配列」と総称される）は、代表的には１つ以上の以下のヌクレオチド配列を含む：プロモーター、１つ以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナースプライシング部位およびアクセプタースプライシング部位を含む完全イントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されるべきポリペプチドをコードする核酸の挿入のためのポリリンカー領域、ならびに選択マーカーエレメント。これらの配列の各々は、以下に論じられる。
【０１０４】
必要に応じて、ベクターは、「タグ」コード配列（すなわち、ＴＥＭ７αポリペプチドコード配列の５’末端または３’末端に位置するオリゴヌクレオチド分子）を含み得；そのオリゴヌクレオチド配列は、ｐｏｌｙＨｉｓ（例えば、ｈｅｘａＨｉｓ）、または別の「タグ」（例えば、ＦＬＡＧ、ＨＡ（インフルエンザウイルス赤血球凝集素）またはｍｙｃ（これらに対しては、市販の抗体が存在する））をコードする。このタグは、代表的には、ポリペプチドの発現の際にそのポリペプチドに融合され、宿主細胞からの、ＴＥＭ７αポリペプチドのアフィニティー精製のための手段として役立ち得る。アフィニティー精製は、例えば、親和性マトリクスとしてのタグに対する抗体を使用する、カラムクロマトグラフィーによって達成され得る。必要に応じて、そのタグは、続いて、切断のために特定のペプチダーゼを使用するような種々の手段によって、精製されたＴＥＭ７αポリペプチドから除去され得る。
【０１０５】
隣接配列は、同種（すなわち、宿主細胞と同じ種由来および／または同じ系統由来）であり得るか、異種（すなわち、宿主細胞種以外または宿主細胞系統以外の種由来）であり得るか、ハイブリッド（すなわち、１つより多くの供給源由来の隣接配列の組み合わせ）であり得るか、または合成であり得るか、あるいは隣接配列は、ＴＥＭ７αポリペプチド発現を調節するために正常に機能するネイティブな配列であり得る。このように、隣接配列の供給源は、任意の原核生物または真核生物、任意の脊椎生物または無脊椎生物、あるいは任意の植物であり得、但し、その隣接配列は、宿主細胞の機構において機能的であり、そして宿主細胞の機構によって活性化され得る。
【０１０６】
本発明のベクター中において有用な隣接配列は、当該分野において周知であるいくつかの方法のいずれかによって得られ得る。代表的には、ＴＥＭ７α遺伝子隣接配列以外の、本明細書中で有用な隣接配列は、マッピングおよび／または制限エンドヌクレアーゼ消化によって以前に同定されており、従って、適切な制限エンドヌクレアーゼを使用して、適切な組織供給源から単離され得る。いくつかの場合において、隣接配列の全長ヌクレオチド配列は、公知であり得る。ここで、その隣接配列は、核酸合成またはクローニングのための本明細書中で記載される方法を使用して合成され得る。
【０１０７】
その隣接配列の全てまたは一部のみが既知である場合、ＰＣＲを使用して、そして／あるいは適切なオリゴヌクレオチドおよび／または同じ種もしくは別の種由来の隣接配列フラグメントを用いてゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって、その隣接配列は得られ得る。その隣接配列が既知でない場合、隣接配列を含むＤＮＡフラグメントが、例えば、コード配列または別の遺伝子さえ含み得る、より大きなＤＮＡ片から単離され得る。単離は、適切なＤＮＡフラグメントを生成するための制限エンドヌクレアーゼ消化、その後のアガロースゲル精製を使用する単離、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィー（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）、または当業者に公知の他の方法によって、達成され得る。この目的を達成するための適切な酵素の選択は、当業者に容易に明らかである。
【０１０８】
複製起点は、代表的には、市販の原核生物発現ベクターの一部であり、その起点は、宿主細胞においてそのベクターの増幅に役立つ。特定のコピー数へのベクターの増幅は、いくつかの場合において、ＴＥＭ７αポリペプチドの最適な発現に重要であり得る。選択されたベクターが複製起点部位を含まない場合、既知の配列に基づいて複製起点が化学合成され得、そしてそのベクター中に連結され得る。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）由来の複製起点は、ほとんどのグラム陰性細菌に適切であり、そして種々の起点（例えば、ＳＶ４０の起点、ポリオーマの起点、アデノウイルスの起点、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の起点、またはパピローマウイルス（例えば、ＨＰＶもしくはＢＰＶ）の起点）は、哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般的に、複製起点の成分は、哺乳動物発現ベクターには必要とされない（例えば、ＳＶ４０起点は、初期プロモーターを含むという理由だけで、しばしば使用される）。
【０１０９】
転写終結配列は、代表的には、ポリペプチドコード領域の末端の３’側に位置し、そしてその転写終結配列は、転写を終結させる働きをする。通常、原核生物細胞における転写終結配列は、Ｇ−Ｃリッチフラグメント、続いてポリＴ配列である。この配列は、ライブラリーから容易にクローニングされるか、またはベクターの一部として市販さえされているが、この配列はまた、本明細書中に記載される方法のような核酸合成方法を使用して、容易に合成され得る。
【０１１０】
選択マーカー遺伝子エレメントは、選択培養培地において増殖される宿主細胞の生存および増殖に必要なタンパク質をコードする。代表的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）原核生物宿主細胞に、抗生物質または他の毒素（例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、またはカナマイシン）に対する耐性を与えるタンパク質をコードするか、（ｂ）細胞の栄養要求性欠損を補うタンパク質をコードするか、あるいは（ｃ）複合培地から入手可能ではない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。好ましい選択マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、およびテトラサイクリン耐性遺伝子である。ネオマイシン耐性遺伝子もまた、原核生物宿主細胞および真核生物宿主細胞における選択のために使用され得る。
【０１１１】
他の選択遺伝子は、発現される遺伝子を増幅するために使用され得る。増幅は、増殖に重要なタンパク質の産生のために大いに要求される遺伝子が、組換え細胞の連続する世代の染色体においてタンデムに反復されるプロセスである。哺乳動物細胞に適切な選択マーカーの例としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）およびチミジンキナーゼが挙げられる。哺乳動物細胞形質転換体は、選択圧下に置かれ、その選択圧下で、その形質転換体のみが、そのベクター中に存在する選択遺伝子によって生存するように独自に適合される。選択圧は、培地中の選択因子の濃度が連続的に変化し、それによって選択遺伝子とＴＥＭ７αポリペプチドをコードするＤＮＡとの両方の増幅を導く条件下で、形質転換された細胞を培養することによって課される。結果として、増加した量のＴＥＭ７αポリペプチドが、増幅されたＤＮＡから合成される。
【０１１２】
リボソーム結合部位は、通常、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要であり、そしてＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（原核生物）またはＫｏｚａｋ配列（真核生物）によって特徴付けられる。このエレメントは、代表的には、発現されるべきＴＥＭ７αポリペプチドのプロモーターの３’側でありかつコード配列の５’側に位置する。そのＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列は、可変であるが、代表的には、ポリプリン（すなわち、高いＡ−Ｇ含量を有する）である。多くのＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列は、同定されており、それぞれが、本明細書中に記載の方法を使用して容易に合成され得、そして原核生物ベクター中で使用され得る。
【０１１３】
リーダー配列すなわちシグナル配列は、宿主細胞から外へとＴＥＭ７αポリペプチドを指向させるために使用され得る。代表的には、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列は、ＴＥＭ７α核酸分子のコード領域に位置するか、または直接ＴＥＭ７αポリポリペプチドコード領域の５’末端に位置する。多くのシグナル配列が同定されており、選択された宿主細胞において機能性であるシグナル配列のいずれもが、ＴＥＭ７α核酸分子と組み合わせて使用され得る。従って、シグナル配列は、ＴＥＭ７α核酸分子に対して同種であっても（天然に存在しても）または異種であってもよい。さらに、シグナル配列は、本明細書中に記載される方法を使用して化学合成され得る。多くの場合、シグナルペプチドの存在を介する宿主細胞からのＴＥＭ７αポリペプチドの分泌は、分泌されたＴＥＭ７αポリペプチドからのシグナルペプチドの除去を生じる。そのシグナル配列は、ベクターの成分であり得るか、またはそのシグナル配列は、ベクター中に挿入されたＴＥＭ７α核酸分子の一部であり得る。
【０１１４】
ＴＥＭ７αポリペプチドコード領域に結合されたネイティブなＴＥＭ７αポリペプチドシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、またはＴＥＭ７αポリペプチドコード領域に結合された異種シグナル配列をコードするヌクレオチド配列のいずれかの使用が、本発明の範囲内に含まれる。選択された異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識され、プロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものであるべきである。ネイティブなＴＥＭ７αポリペプチドシグナル配列を認識せずプロセシングしない原核生物宿主細胞のために、そのシグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列によって置換される。酵母分泌のために、そのネイティブなＴＥＭ７αポリペプチドシグナル配列は、酵母インベルターゼ、α因子、または酸ホスファターゼリーダーによって置換され得る。哺乳動物細胞発現において、このネイティブシグナル配列は十分であるが、他の哺乳動物シグナル配列が適切であり得る。
【０１１５】
グリコシル化が真核生物宿主細胞発現系において望ましいようないくつかの場合において、グリコシル化または収量を改善するために種々のプレ配列が操作され得る。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を変更し得るかまたはプロ配列を加え得、このことはまた、グリコシル化を影響し得る。最終タンパク質産物は、（成熟タンパク質の最初のアミノ酸に対して）−１位に、発現に付随して１つ以上のさらなるアミノ酸を有し得、この１つ以上のさらなるアミノ酸は、完全に除去されていないかもしれない。例えば、その最終タンパク質産物は、アミノ末端に結合された、ペプチダーゼ切断部位において見出される１つまたは２つのアミノ酸残基を有し得る。あるいは、いくつかの酵素切断部位の使用は、その酵素が成熟ポリペプチド内のこのような領域で切断する場合、所望のＴＥＭ７αポリペプチドの少し短縮した形態を生じ得る。
【０１１６】
多くの場合において、核酸分子の転写は、ベクター内の１つ以上のイントロンの存在によって増加する；これは、ポリペプチドが真核生物宿主細胞（特に、哺乳動物宿主細胞）において産生される場合、特に当てはまる。使用されるイントロンは、特に、使用される遺伝子が全長ゲノム配列またはそのフラグメントである場合に、ＴＥＭ７α遺伝子内に天然に存在し得る。そのイントロンが遺伝子内に天然には存在しない場合（ほとんどのｃＤＮＡの場合）、そのイントロンは、別の供給源から得られ得る。隣接配列およびＴＥＭ７α遺伝子に関するイントロンの位置は、そのイントロンが有効に転写されなければならないので、一般的に重要である。従って、ＴＥＭ７α  ｃＤＮＡ分子が転写される場合、そのイントロンに好ましい位置は、転写開始部位の３’側でありかつポリＡ転写終結配列の５’側である。好ましくは、そのイントロンは、コード配列を中断しないように、そのｃＤＮＡの一方の側または他方の側（すなわち、５’側または３’側）に位置する。任意の供給源（ウイルス生物、原核生物および真核生物（植物または動物）を含む）由来の任意のイントロンが本発明を実行するために使用され得るが、但し、このイントロンは、挿入される宿主細胞と適合性である。合成イントロンもまた、本明細書中に含まれる。必要に応じて、１つより多くのイントロンが、ベクター内で使用され得る。
【０１１７】
本発明の発現ベクターおよびクローニングベクターは、代表的には、宿主生物によって認識され、そしてＴＥＭ７αポリペプチドをコードする分子に作動可能に連結された、プロモーターを含む。プロモーターは、構造遺伝子の転写を制御する、その構造遺伝子の開始コドンに対して上流（すなわち、５’側）に（一般的に、約１００〜１０００ｂｐ内に）位置する非転写配列である。プロモーターは、従来、２つのクラス（誘導プロモーターおよび構成的プロモーター）のうちの１つに分類される。誘導プロモーターは、培養条件におけるいくらかの変化（例えば、栄養の存在または非存在、あるいは温度の変化）に応答して、その誘導プロモーターの制御下にあるＤＮＡからの増加したレベルの転写を開始する。他方、構成的プロモーターは、継続的な遺伝子産物産生を開始する；すなわち、遺伝子発現に対する制御がほとんど存在しないかまたは全く存在しない。多数のプロモーター（種々の潜在的な宿主細胞によって認識される）が、周知である。適切なプロモーターは、供給源のＤＮＡからプロモーターを制限酵素消化によって取り出し、そして所望のプロモーター配列をベクター中に挿入することによって、ＴＥＭ７αポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結される。ネイティブなＴＥＭ７αプロモーター配列は、ＴＥＭ７α核酸分子の増幅および／または発現に指向させるために使用され得る。しかし、ネイティブなプロモーターと比較して発現タンパク質のより多い転写およびより高い収率が可能である場合、および使用のために選択された宿主細胞系と適合性である場合、異種プロモーターが好ましい。
【０１１８】
原核生物宿主との使用に適切なプロモーターとしては、β−ラクタマーゼ系およびラクトースプロモーター系；アルカリホスファターゼ；トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系；およびハイブリッドプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター）が挙げられる。他の公知の細菌プロモーターもまた、適切である。これらのプロモーター配列は、公開されており、その結果、当業者は、任意の有用な制限部位を供給するのに必要とされるリンカーまたはアダプターを使用して、所望のＤＮＡ配列にそれらのプロモーター配列を連結し得る。
【０１１９】
酵母宿主との使用に適切なプロモーターもまた、当該分野において周知である。酵母エンハンサーが、酵母プロモーターと共に有利に使用される。哺乳動物宿主細胞との使用に適切なプロモーターは周知であり、そして限定されないが、ウイルス（例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ２）、ウシパピローマウイルス、ニワトリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０））のゲノムから得られるプロモーターが挙げられる。他の適切な哺乳動物プロモーターとしては、異種哺乳動物プロモーター（例えば、熱ショックプロモーターおよびアクチンプロモーター）が挙げられる。
【０１２０】
ＴＥＭ７α遺伝子発現を制御する際に興味深くあり得るさらなるプロモーターとしては、限定されないが、以下が挙げられる：ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−１０）；ＣＭＶプロモーター；ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９８０，Ｃｅｌｌ  ２２：７８７−９７）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４４−４５）；メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８２，Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２）；β−ラクタマーゼプロモーターのような原核生物発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら、１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７５：３７２７−３１）；またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：２１−２５）。組織特異性を示しかつトランスジェニック動物において利用されている、以下の動物転写制御領域もまた興味深い：膵臓腺房細胞において活性な、エラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔら、１９８４，Ｃｅｌｌ  ３８：６３９−４６；Ｏｒｎｉｔｚら、１９８６  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９（１９８６）；ＭａｃＤｏｎａｌｄ、１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ７：４２５−５１５）；膵臓β細胞において活性な、インシュリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ、１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：１１５−２２）；リンパ球において活性な、免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら、１９８４，Ｃｅｌｌ  ３８：６４７−６５８；Ａｄａｍｅｓら、１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：５３３−３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４３６−４４）；精巣細胞、乳房細胞、リンパ球細胞、および肥満細胞において活性な、マウス乳腺癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒら、１９８６，Ｃｅｌｌ  ４５：４８５−９５）；肝臓において活性な、アルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら、１９８７，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−７６）；肝臓において活性な、α−フェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら、１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：１６３９−４８；Ｈａｍｍｅｒら、１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：５３−５８）；肝臓において活性な、α１−抗トリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙら、１９８７，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−１７１）；骨髄性細胞において活性な、β−グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍら、１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：３３８−４０；Ｋｏｌｌｉａｓら，１９８６，Ｃｅｌｌ  ４６：８９−９４）；脳の稀突起神経膠細胞において活性な、ミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら、１９８７，Ｃｅｌｌ  ４８：７０３−１２）；骨格筋において活性な、ミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ、１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２８３−８６）；なら���に視床下部において活性な、性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎら、１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：１３７２−１３７８）。
【０１２１】
エンハンサー配列は、高等真核生物による本発明のＴＥＭ７αポリペプチドをコードするＤＮＡの転写を増加させるように、ベクターに挿入され得る。エンハンサーは、転写を増加させるためにプロモーターに作用する、通常約１０〜３００ｂｐの長さのＤＮＡのシス作用エレメントである。エンハンサーは、比較的方向および位置に依存しない。これらは、転写単位に対して５’側および３’側に見出された。哺乳動物遺伝子から入手可能ないくつかのエンハンサー配列が公知である（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインシュリン）。しかし、代表的には、ウイルス由来のエンハンサーが、使用される。ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーは、真核生物プロモーターの活性化に対する例示的な増強エレメントである。エンハンサーは、ＴＥＭ７α核酸分子に対して５’側または３’側の位置でベクターにスプライシングされ得るが、代表的には、プロモーターから５’側の部位に配置される。
【０１２２】
本発明の発現ベクターは、市販のベクターのような出発ベクターから構築され得る。このようなベクターは、全ての所望の隣接配列を含んでもよいし、含まなくてもよい。本明細書中に記載される隣接配列のうちの１つ以上がこのベクター内に予めない場合、これらは、個々に得られ得、ベクターに連結され得る。それぞれの隣接配列を得るために使用される方法は、当業者に周知である。
【０１２３】
本発明を実行するために好ましいベクターは、細菌宿主細胞、昆虫宿主細胞、および哺乳動物宿主細胞と適合性のベクターである。このようなベクターとしては、特に、ｐＣＲＩＩ、ｐＣＲ３、およびｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ｐＢＳＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、ｐＥＴ１５（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）、ｐＥＴＬ（ＢｌｕｅＢａｃＩＩ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＤＳＲ−α（ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９０／１４３６３）ならびにｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）が挙げられる。
【０１２４】
さらなる適切なベクターとしては、コスミド、プラスミド、または改変ウイルスが挙げられるがこれらに限定されず、これらのベクター系は、選択された宿主細胞と適合性でなければならないことが理解される。このようなベクターとしては、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）プラスミド誘導体（高コピー数ＣｏｌＥｌベースのファージミド、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  ＣＡ）、Ｔａｑ増幅ＰＣＲ産物をクローニングするために設計されたＰＣＲクローニングプラスミド（例えば、ＴＯＰＯＴＭ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）Ｋｉｔ、ＰＣＲ２．１（登録商標）プラスミド誘導体、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）のようなプラスミド、ならびに哺乳動物ベクター、酵母ベクターまたはバキュロウイルス発現系のようなウイルスベクター（ｐＢａｃＰＡＫプラスミド誘導体、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１２５】
ベクターが構築され、そしてＴＥＭ７αポリペプチドをコードする核酸分子がベクターの適切な部位に挿入された後に、完全なベクターが増幅および／またはポリペプチド発現に適切な宿主細胞に挿入され得る。ＴＥＭ７αポリペプチドついての発現ベクターを、選択された宿主細胞へ形質転換することは、以下の方法を含む周知の方法によって達成され得る：例えば、トランスフェクション法、感染法、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、または他の公知の方法。選択された方法は、部分的に、使用される宿主細胞の種類と相関関係にある。これらの方法および他の適切な方法は、当業者に周知であり、そしてこれらは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に示されている。
【０１２６】
宿主細胞は、原核生物宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）であっても、真核生物宿主細胞（例えば、酵母細胞、昆虫細胞、または脊椎動物細胞）であってもよい。宿主細胞は、適切な条件下で培養された場合、ＴＥＭ７αポリペプチドを合成し、これは、引き続き、培養培地から収集され得る（宿主細胞がこれを培地に分泌する場合）か、またはこれを産生する宿主細胞から直接収集され得る（これが分泌されない場合）。適切な宿主細胞の選択は、種々の因子（例えば、所望の発現レベル、活性に望ましいかもしくは必要とされるポリペプチド修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）、および生物学的に活性な分子への折り畳みの容易さ）に依存する。
【０１２７】
多くの適切な宿主細胞が当該分野において公知であり、多くが、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡから入手可能である。例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＣＨＯ  ＤＨＦＲ（−）細胞（Ｕｒｌａｕｂら、１９８０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７：４２１６−２０）、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞または２９３Ｔ細胞、あるいは３Ｔ３細胞のような哺乳動物細胞。適切な哺乳動物宿主細胞の選択、ならびに形質転換、培養、増幅、スクリーニング、産物生成、および精製のための方法が当該分野において公知である。他の適切な哺乳動物細胞株は、サルＣＯＳ−１およびＣＯＳ−７細胞株、およびＣＶ−１細胞株である。さらなる例示的な哺乳動物宿主細胞としては、霊長類細胞株および齧歯動物細胞株（形質転換細胞株を含む）が挙げられる。正常な二倍体細胞、初代組織のインビトロ培養物から誘導される細胞株、ならびに初代外植片もまた適切である。候補細胞は、選択遺伝子を遺伝子型的に欠き得るか、または優性に作用する選択遺伝子を含み得る。他の適切な哺乳動物細胞株としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：マウス神経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞、ＨｅＬａ、マウスＬ−９２９細胞、Ｓｗｉｓｓ、Ｂａｌｂ−ｃまたはＮＩＨマウスから誘導された３Ｔ３株、ＢＨＫまたはＨａｋハムスター細胞株（これらは、ＡＴＣＣから入手可能である）。これらの細胞株の各々は、タンパク質発現の当業者によって公知であり入手可能である。
【０１２８】
同様に、細菌細胞が、本発明に適切な宿主細胞として有用である。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉの種々の菌株（例えば、ＨＢ１０１、ＤＨ５α、ＤＨ１０、およびＭＣ１０６１）は、生物工学の分野において宿主細胞として周知である。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、他のＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．などの種々の菌株がまた本方法において使用され得る。
【０１２９】
当業者に公知の酵母細胞の多くの菌株はまた、本発明のポリペプチドの発現のための宿主細胞として利用可能である。好ましい酵母細胞としては、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｉｖｉｓａｅおよびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓが挙げられる。
【０１３０】
さらに、所望される場合、昆虫細胞系が、本発明の方法において利用され得る。このような系は、例えば、Ｋｉｔｔｓら、１９９３、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１４：８１０−１７；Ｌｕｃｋｌｏｗ、１９９３、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：５６４−７２；およびＬｕｃｋｌｏｗら、１９９３、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７：４５６６−７９に記載される。好ましい昆虫細胞は、Ｓｆ−９およびＨｉ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。
【０１３１】
グリコシル化ＴＥＭ７αポリペプチドを発現するためにトランスジェニック動物もまた使用し得る。例えば、トランスジェニック乳汁産生動物（例えば、ウシまたはヤギ）を使用し、本発明のグルコシル化ポリペプチドをその動物の乳汁中に得ることができる。ＴＥＭ７αポリペプチドを産生するために植物もまた使用し得るが、しかし、一般的に、植物において生じるグリコシル化は、哺乳動物細胞において産生されるものとは異なり、ヒト治療用途に適切ではないグリコシル化産物を生じ得る。
【０１３２】
（ポリペプチド産生）
ＴＥＭ７αポリペプチド発現ベクターを含む宿主細胞は、当業者に周知の標準的な培地を使用して培養され得る。この培地は、通常、細胞の増殖および生存に必要な全ての栄養分を含む。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を培養するために適切な培地としては、例えば、Ｌｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）および／またはＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）が挙げられる。真核生物細胞を培養するために適切な培地としては、Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ培地１６４０（ＲＰＭＩ  １６４０）、Ｍｉｎｉｍａｌ    Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）および／またはＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）が挙げられ、これらの全ては、培養される特定の細胞株に必要な血清および／または増殖因子を補充され得る。昆虫培養物についての適切な培地は、必要に応じて、イーストレート（ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ）、ラクトアルブミン加水分解産物、および／またはウシ胎仔血清を補充したグレース培地である。
【０１３３】
代表的に、トランスフェクトまたは形質転換された細胞の選択的な増殖に有用な抗生物質または他の化合物が、培地に補充物として加えられる。使用される化合物は、宿主細胞が形質転換されたプラスミドに存在する選択マーカーエレメントによって指示される。例えば、選択マーカーエレメントがカナマイシン耐性である場合、培養培地に加えられる化合物は、カナマイシンである。選択的増殖のための他の化合物としては、アンピシリン、テトラサイクリン、およびネオマイシンが挙げられる。
【０１３４】
宿主細胞によって産生されるＴＥＭ７αポリペプチドの量は、当該分野において公知の標準的な方法を使用して評価され得る。このような方法としては、限定しないが、ウェスタンブロット分析、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、非変性ゲル電気泳動、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分離、免疫沈降、および／またはＤＮＡ結合ゲルシフトアッセイのような活性アッセイが挙げられる。
【０１３５】
ＴＥＭ７αポリペプチドが宿主細胞から分泌されるように設計された場合、ポリペプチドの大部分は、細胞培養培地中で見出され得る。しかし、ＴＥＭ７αポリペプチドが宿主細胞から分泌されない場合、これは、細胞質および／または核（真核生物宿主細胞について）に、あるいは、細胞質ゾル（グラム陰性細菌宿主細胞について）に存在する。
【０１３６】
宿主細胞細胞質および／または核（真核生物宿主細胞について）に位置するかあるいは細胞質ゾル（細菌宿主細胞について）に位置するＴＥＭ７αポリペプチドについて、細胞内物質（グラム陰性細菌について封入体を含む）が、当業者に公知の任意の標準的技術を使用して宿主細胞から抽出され得る。例えば、宿主細胞は、フレンチプレス、ホモジナイゼーション、および／または超音波処理、それらに続く遠心分離によって、ペリプラズム／細胞質の中身を放出するように溶解され得る。
【０１３７】
ＴＥＭ７αポリペプチドが細胞質ゾル内に封入体を形成した場合、この封入体は、しばしば、細胞内膜および／または細胞外膜に結合され得、従って、主に、遠心分離後にペレット物質において見出される。次いで、ペレット物質は、ｐＨ極限値で処理され得るか、あるいはジチオトレイトールのような還元剤の存在下でアルカリ性のｐＨにて、またはトリスカルボキシエチルホスフィンの存在下で酸性のｐＨにて、界面活性剤、グアニジン、グアニジン誘導体、尿素、または尿素誘導体のようなカオトロピック剤で処理して、封入体を放出させ、分断させ、そして可溶化させ得る。次いで、可溶化したＴＥＭ７αポリペプチドは、ゲル電気泳動、免疫沈降などを使用して分析され得る。ＴＥＭ７αポリペプチドを単離することが所望される場合、単離は、本明細書中およびＭａｒｓｔｏｎら、１９９０、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，１８２：２６４−７５に記載される方法のような標準的な方法を使用して達成され得る。
【０１３８】
いくつかの場合、ＴＥＭ７αポリペプチドは、単離の際、生物学的に活性でなくてもよい。「再折り畳みする」、つまり、ポリペプチドをその三次構造に変換し、ジスルフィド結合を生成するための種々の方法を使用して、生物学的活性を回複し得る。このような方法は、可溶化ポリペプチドをあるｐＨ（通常７より上）および特定の濃度のカオトロピック剤（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ）の存在下に曝露する工程を包含する。カオトロピック剤の選択は、封入体可溶化に使用される選択に非常に類似するが、通常、カオトロピック剤はより低い濃度で使用され、可溶化に使用されるカオトロピック剤と必ずしも同一ではない。ほとんどの場合、再折り畳み／酸化溶液はまた、還元剤、または特定の比の還元剤およびその酸化形態を含んで、特定の酸化還元電位を生成し、タンパク質のシステイン架橋の形成においてジスルフィドシャフリングを生成させる。通常使用される酸化還元対のいくつかとしては、システイン／シスタミン、グルタチオン（ＧＳＨ）／ジチオビスＧＳＨ、塩化銅（ＩＩ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）／ジチアンＤＴＴ、および２，２−メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ジチオ−ｂ（ＭＥ）が挙げられる。多くの場合、共溶媒が、再折り畳みの効率を増加するために使用され得るかまたは必要とされ得、この目的のために使用されるさらに一般的な試薬としては、グリセロール、種々の分子量のポリエチレングリコール、アルギニンなどが挙げられる。
【０１３９】
封入体がＴＥＭ７αポリペプチドの発現において有意な程度まで形成されない場合、ポリペプチドは、主に、細胞ホモジネートの遠心分離後に上清中に見出される。ポリペプチドは、さらに、本明細書中に記載される方法のような方法を使用して上清から単離され得る。
【０１４０】
溶液からのＴＥＭ７αポリペプチドの精製は、種々の技術を使用して達成され得る。そのポリペプチドがそのカルボキシル末端またはアミノ末端のいずれかに、ヘキサヒスチジンのようなタグを含む（ＴＥＭ７αポリペプチド／ヘキサＨｉｓ）かまたはＦＬＡＧ（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏ．、Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）もしくはｍｙｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のような他の小さいペプチドを含むように合成されている場合、そのポリペプチドは、カラムマトリックスがそのタグに高い親和性を有するアフィニティーカラムにその溶液を通すことによって、１工程のプロセスで精製され得る。
【０１４１】
例えば、ポリヒスチジンはニッケルに大きな親和性および特異性で結合する。従って、ニッケルのアフィニティーカラム（例えば、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）ニッケルカラム）が、ＴＥＭ７αポリペプチド／ポリＨｉｓの精製に使用され得る。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１０．１１．８節、（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．およびＷｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ１９９３）を参照のこと。
【０１４２】
さらに、ＴＥＭ７αポリペプチドは、ＴＥＭ７αポリペプチドに特異的を認識し得そして結合し得るモノクローナル抗体の使用を介して、精製され得る。
【０１４３】
精製に適切な他の手順としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：アフィニティークロマトグラフィー、イムノアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、電気泳動（ネイティブゲル電気泳動を含む）に続くゲル溶出、ならびに分取等電点電気泳動（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｏｃｕｓｉｎｇ）（「Ｉｓｏｐｒｉｍｅ」マシーン／技術、Ｈｏｅｆｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）。いくつかの場合、２つ以上の精製技術が、純度の増大を達成するために組み合わされ得る。
【０１４４】
ＴＥＭ７αポリペプチドもまた、当該分野で公知の技術を使用して化学合成法（例えば、固相ペプチド合成）により調製され得、その公知技術は、たとえば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら、１９６３、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、１９８５、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：５１３２；ならびにＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、１９８４）に示される技術である。このようなポリペプチドは、アミノ末端にメチオニンを含んで合成され得るか、またはこれを含まずに合成され得る。化学合成されたＴＥＭ７αポリペプチドは、これらの参考文献に示される方法を使用して、ジスルフィド架橋を形成するように酸化され得る。化学合成されたＴＥＭ７αポリペプチドは、組換え産生されるかもしくは天然の供給源から精製された対応するＴＥＭ７αポリペプチドに匹敵する生物学的活性を有すると予測され、従って、組換えＴＥＭ７αポリペプチドもしくは天然のＴＥＭ７αポリペプチドと互換可能に使用され得る。
【０１４５】
ＴＥＭ７αポリペプチドを得る別の手段は、ＴＥＭ７αポリペプチドが天然に見出される供給源の組織および／または流体のような生物学的サンプルからの精製による。このような精製は、本明細書中に記載されるようなタンパク質精製のための方法を使用して行われ得る。精製の間、ＴＥＭ７αポリペプチドの存在が、例えば、組換え的に産生されたＴＥＭ７αポリペプチドまたはそのペプチドフラグメントに対して調製される抗体を使用してモニターされ得る。
【０１４６】
核酸およびポリペプチドを産生するための多くのさらなる方法は、当該分野において公知であり、この方法は、ＴＥＭ７αポリペプチドに対して特異性を有するポリペプチドを産生するために使用され得る。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら、１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１２２９７−３０３を参照のこと。これは、ｍＲＮＡとそのコードされるペプチドとの間の融合タンパク質の産生を記載する。Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９９，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．３：２６８−７３もまた参照のこと。さらに、米国特許第５，８２４，４６９号は、特定の生物学的機能を発揮し得るオリゴヌクレオチドを得るための方法を記載する。この手順は、オリゴヌクレオチドの不均一プールを生成する工程を包含し、このオリゴヌクレオチドは、それぞれが、５’ランダム化配列、中心予備選択配列、および３’ランダム化配列を有する。得られる不均一プールは、所望の生物学的機能を示さない細胞の集団に導入される。次いで、細胞の部分集団を、所定の生物学的機能を示すものについてスクリーニングする。その部分集団から、所望の生物学的機能を発揮し得るオリゴヌクレオチドが単離される。
【０１４７】
米国特許第５，７６３，１９２号；同第５，８１４，４７６号；同第５，７２３，３２３号；および同第５，８１７，４８３号は、ペプチドまたはポリペプチドを産生するためのプロセスを記載する。これは、確率論的遺伝子またはそのフラグメントを産生し、次いで、宿主細胞にこれらの遺伝子を導入することによって達成され、この細胞によって、確率論的遺伝子によってコードされた１以上のタンパク質が産生される。次いで、この宿主細胞はスクリーニングされて、所望の活性を有するペプチドまたはポリペプチドを産生するクローンが同定される。
【０１４８】
ペプチドまたはポリペプチドを産生するための別の方法は、Ａｔｈｅｒｓｙｓ，Ｉｎｃ．によって出願されたＰＣＴ／ＵＳ９８／２００９４（ＷＯ９９／１５６５０）に記載される。これは、「Ｒａｎｄｏｍ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」（ＲＡＧＥ−ＧＤ）として知られており、このプロセスは、インサイチュ組換え方法によって、内因性遺伝子の発現または遺伝子の過剰発現の活性化を含む。例えば、内因性遺伝子の発現は、非相同組換えまたは非正統的（ｉｌｌｅｇｉｔｉｍａｔｅ）組換えによって、遺伝子の発現を活性化し得る標的細胞中に、調節配列を組み込むことによって、活性化または増大される。この標的ＤＮＡは、まず、照射に供せられ、そして遺伝子プロモーターが挿入される。このプロモーターは、遺伝子の前方に最終的に小休止を置き、遺伝子の転写を開始する。これは、所望のペプチドまたはポリペプチドの発現を引き起こす。
【０１４９】
これらの方法はまた、包括的なＴＥＭ７αポリペプチド発現ライブラリーを作製するために使用され得、これは、続いて、種々のアッセイ（例えば、生化学的アッセイ、細胞アッセイおよび生物全体のアッセイ（例えば、植物、マウスなど））において、ハイスループット表現型スクリーニングのために使用され得ることが理解される。
【０１５０】
（合成）
本明細書中に記載される核酸分子およびポリペプチド分子が、組換え手段および他の手段によって産生され得ることは、当業者によって認識される。
【０１５１】
（選択的結合因子）
用語「選択的結合因子」は、１以上のＴＥＭ７αポリペプチドに対して特異性を有する分子を言及する。適切な選択的結合因子としては、抗体およびその誘導体、ポリペプチド、ならびに低分子が挙げられるが、これらに限定されない。適切な選択的結合因子は、当該分野で公知の方法を使用して調製され得る。本発明の例示的なＴＥＭ７αポリペプチド選択的結合因子は、ＴＥＭ７αポリペプチドの特定の部分を結合し得、これにより、このポリペプチドのＴＥＭ７αポリペプチドレセプターへの結合を阻害する。
【０１５２】
ＴＥＭ７αポリペプチドを結合する抗体および抗体フラグメントのような選択的結合因子は、本発明の範囲内である。この抗体は、単一特異性ポリクローナル抗体を含むポリクローナル抗体；モノクローナル抗体（ＭＡｂ）；組換え抗体；キメラ抗体；ヒト化（例えば、相同性決定領域（ＣＤＲ）グラフト化抗体；ヒト抗体；単鎖抗体；および／または二重特異性抗体；ならびにそれらのフラグメント；改変体；または誘導体であり得る。抗体フラグメントとしては、この抗体のうちのＴＥＭ７αポリペプチド上のエピトープに結合する部分を含む。このようなフラグメントの例としては、全長抗体の酵素学的切断によって産生されたＦａｂおよびＦ（ａｂ’）フラグメントが挙げられる。他の結合フラグメントとしては、組換えＤＮＡ技術（例えば、抗体可変領域をコードする核酸配列を含む、組換えプラスミドの発現）によって産生されたフラグメントが挙げられる。
【０１５３】
ＴＥＭ７αポリペプチドに対して指向されるポリクローナル抗体は、一般に、ＴＥＭ７αポリペプチドおよびアジュバントの複数回の皮下注射または腹腔内注射によって動物（例えば、ウサギまたはマウス）において産生される。免疫される種において免疫原性であるキャリアタンパク質にＴＥＭ７αポリペプチドを結合させることは有用であり得、キャリアタンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン、血清、アルブミン、ウシサイログロブリン、またはダイズトリプシンインヒビターである。また、ミョウバンのような凝集剤は、免疫応答を増強させるために使用される。免疫化後、この動物は採血され、そして血清を、抗ＴＥＭ７α抗体力価についてアッセイする。
【０１５４】
ＴＥＭ７αポリペプチドに対して指向されるモノクローナル抗体は、培養中の連続的な細胞株によって抗体分子を産生するために提供される任意の方法を使用して産生される。モノクローナル抗体を調製するのに適切な方法の例としては、Ｋｏｈｌｅｒら、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７のハイブリドーマ法、およびヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ、１９８４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ５１−６３頁（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９８７））が挙げられる。ＴＥＭ７αポリペプチドと反応する、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株もまた、本発明によって提供される。
【０１５５】
本発明のモノクローナル抗体は、治療剤として使用するために、改変され得る。１実施形態は、この重（Ｈ）鎖および／または軽（Ｌ）鎖の一部が、特定の種から誘導されるかまたは特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるかまたは相同性である一方で、この鎖の残りは、別の種から誘導されるかまたは別の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるかまたは相同性である、「キメラ」抗体である。抗体のフラグメントが所望の生物学的活性を示す限り、このような抗体のフラグメントもまた含まれる。米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８１：６８５１−６８５５を参照のこと。
【０１５６】
別の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、「ヒト化」抗体である。非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該分野で周知である。米国特許第５，５８５，０８９号および同第５，６９３，７６２号を参照のこと。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入された１以上のアミノ酸残基を有する。ヒト化は、例えば、当該分野で記載される方法（Ｊｏｎｅｓら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−３６）を使用して、齧歯動物の相補的決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも一部でヒトの抗体の対応する領域を置換することによって、実施され得る。
【０１５７】
ＴＥＭ７αポリペプチドに結合するヒト抗体もまた、本発明によって包含される。内因性の免疫グロブリン産物の非存在下で、ヒト抗体のレパートリーを産生し得る、トランスジェニック動物（例えば、マウス）を使用して、このような抗体は、ＴＥＭ７αポリペプチド抗原（すなわち、少なくとも６個の連続アミノ酸を有する）（必要に応じて、キャリアに結合される）を用いて免疫することによって産生される。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．，９０：２５５１−５５；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−５８；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら，１９９３，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．７：３３を参照のこと。１つの方法において、このようなトランスジェニック動物は、本明細書中の重鎖免疫グロブリンおよび軽鎖免疫グロブリンをコードする内因性遺伝子座を無能にし、そしてヒトの重鎖タンパク質および軽鎖タンパク質をコードする遺伝子座をそのゲノムに挿入することによって産生される。次いで、部分的に改変された動物（この動物は、完全ではない相補体の改変を有する）は、全ての所望の免疫系の改変を有する動物を得るために交雑される。免疫原が投与される場合、これらのトランスジェニック動物が、ヒト（むしろ、例えば、マウス）アミノ酸配列（このアミノ酸配列は、これらの抗原に対して免疫特異性である可変領域を含む）を有する抗体を産生する。ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５９２８およびＰＣＴ／ＵＳ９３／０６９２６を参照のこと。さらなる方法は、米国特許第５，５４５，８０７号、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９１／２４５およびＰＣＴ／ＧＢ８９／０１２０７、ならびに欧州特許第５４６０７３Ｂ１号および同第５４６０７３Ａ１号に記載される。ヒト抗体はまた、宿主細胞中の組換えＤＮＡの発現または本明細書中に記載されるようなハイブリドーマ細胞中での発現によって産生され得る。
【０１５８】
代替の実施形態において、ヒト抗体または、ファージディスプレイライブラリから産生され得る（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１；Ｍａｒｋｓら，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１）。これらのプロセスは、糸状のバクテリオファージの表面上の抗体レパートリーのディスプレイを介した免疫選択、および選択した抗原への結合によるファージの続く選択を模倣する。１つのこのような技術は、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／１７３６４に記載されており、これには、このようなアプローチを使用して、ＭＰＬ−レセプターおよびｍｓｋ−レセプターに対する、高い親和性かつ機能的なアゴニスト抗体の単離が記載される。
【０１５９】
キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、およびヒト化抗体は、代表的に、組換え方法によって産生される。抗体をコードする核酸は、宿主細胞中に導入され、そして本明細書中に記載される材料および手順を使用して発現される。好ましい実施形態において、この抗体は、哺乳動物宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）中で産生される。モノクローナル（例えば、ヒト）抗体は、本明細書中に記載されるように、宿主細胞中での組換えＤＮＡの発現またはハイブリドーマ細胞中での発現によって産生され得る。
【０１６０】
本発明の抗ＴＥＭ７α抗体は、ＴＥＭ７αポリペプチドの検出および定量のために、任意の公知のアッセイ方法（例えば、競合結合アッセイ、直接的および間接的サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイ）（Ｓｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４７−１５８頁（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７））において使用され得る。これらの抗体は、使用されるアッセイ方法に適切な親和性でＴＥＭ７αポリペプチドに結合する。
【０１６１】
診断適用のために、特定の実施形態において、抗ＴＥＭ７α抗体は、検出可能な部分で標識され得る。この検出可能な部分は、直接的または間接的のいずれかで、検出可能なシグナルを発生し得る任意の部分であり得る。例えば、この検出可能な部分は、放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎまたは６７Ｇａ）、蛍光化合物もしくは化学発光化合物（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、もしくはルシフェリン）；または酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、もしくは西洋ワサビペルオキシダーゼ）であり得る（Ｂａｙｅｒら，１９９０，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，１８４：１３８−６３）。
【０１６２】
競合結合アッセイは、標識した標準（例えば、ＴＥＭ７αポリペプチド、またはその免疫学的に反応性の部分）が、限定された量の抗ＴＥＭ７α抗体との結合に関して、試験サンプル検体（ＴＥＭ７αポリペプチド）と競合する能力に依存する。試験サンプル中のＴＥＭ７αポリペプチドの量は、抗体に結合する標準の量と反比例する。結合する標準の量を決定するのを容易にするために、この抗体は、代表的には、競合の前または後に不溶化され、その結果、この抗体に結合する標準および検体は、結合しないままの標準および検体から好都合に分離され得る。
【０１６３】
サンドイッチアッセイは、２つの抗体の使用を代表的に含み、各々は、検出および／または定量される予定のタンパク質の異なる免疫原部分またはエピトープに結合し得る。サンドイッチアッセイにおいて、この試験サンプル分析物は、固体支持体上に固定された第１の抗体によって代表的に結合され、その後、第２の抗体が、この分析物に結合され、このようにして不可溶性の３部の複合体を形成する。例えば、米国特許第４，３７６，１１０号を参照のこと。第２の抗体は、検出可能な部分でそれ自体標識され得るか（直接的なサンドイッチアッセイ）、または検出可能な部分で標識された抗免疫グロブリン抗体を使用して測定され得る（間接的なサンドイッチアッセイ）。例えば、サンドイッチアセイの１つの型は、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）（この場合、検出可能な部分は、酵素である）である。
【０１６４】
抗ＴＥＭ７α抗体を含む、選択的結合因子はまた、インビボでの画像化に有用である。検出可能な部分で標識された抗体は、動物、好ましくは血流に投与され得、そして宿主中の標識された抗体の存在および位置が、アッセイされる。抗体は、核磁気共鳴、放射線医学、または当該分野において公知の他の検出手段のもいずれによるかに関わらず、動物中で検出可能な任意の部分で標識され得る。
【０１６５】
抗体を含む、本発明の選択的結合因子は、治療剤として使用され得る。これらの治療剤は、一般に、ＴＥＭ７αポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を、それぞれ、増強または減少させるかのいずれかであるという点で、アゴニストまたはアンタゴニストである。１実施形態において、本発明のアンタゴニスト抗体は、ＴＥＭ７αポリペプチドに特異的に結合し得、そしてインビボまたはインビトロでＴＥＭ７αポリペプチドの機能活性を阻害または排除し得る、抗体またはその結合フラグメントである。好ましい実施形態において、選択的結合因子（例えば、アンタゴニスト抗体）は、少なくとも約５０％、そして好ましくは、少なくとも約８０％、ＴＥＭ７αポリペプチドの機能活性を阻害する。別の実施形態において、選択的結合因子は、ＴＥＭ７αポリペプチド結合パートナー（リガンドまたはレセプター）と相互作用し得る抗ＴＥＭ７αのポリペプチド抗体であり得、これにより、インビトロまたはインビボにおいてＴＥＭ７αポリペプチド活性を阻害または排除する。アゴニストおよびアンタゴニストの抗ＴＥＭ７αポリペプチド抗体を含む、選択的結合因子は、当該分野で周知であるスクリーニングアッセイによって同定される。
【０１６６】
本発明はまた、生物学的サンプル中のＴＥＭ７α選択結合因子（例えば、抗体）およびＴＥＭ７αポリペプチドのレベルを検出するために有用な他の試薬を含むキットに関する。このような試薬は、検出可能な標識、ブロッキング血清、ポジティブコントロールサンプルおよびネガティブコントロールサンプル、ならびに検出試薬を含み得る。
【０１６７】
（マイクロアレイ）
ＤＮＡマイクロアレイ技術が、本発明に従って利用され得ることが理解される。ＤＮＡマイクロアレイは、固体支持体（例えば、ガラス）上に配置される核酸の、小型で高密度のアレイである。アレイ内の各セルまたはエレメントは、相補的な核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ）とのハイブリダイゼーションのための標的として働く単一の核酸種の多数のコピーを含む。ＤＮＡマイクロアレイ技術を用いた発現プロファイリングにおいて、ｍＲＮＡはまず、細胞または組織サンプルから抽出され、次いで、蛍光標識されたｃＤＮＡに酵素的に転換される。この物質は、このマイクロアレイにハイブリダイズされ、そして未結合のｃＤＮＡが洗浄によって除去される。次いで、このアレイ上に示された個々の遺伝子の発現は、各標的核酸分子に特異的に結合する標識されたｃＤＮＡの量を定量化することによって可視化される。このように、幾千もの遺伝子の発現が、生物学的材料の単一サンプルから、ハイスループットの並列様式で定量化され得る。
【０１６８】
このハイスループット発現プロファイリングは、以下を含むが、これらに限定されない、本発明のＴＥＭ７α分子に関する。広い範囲の適用を有する：治療のための標的としてのＴＥＭ７α疾患関連遺伝子の同定および検証；関連ＴＥＭ７α分子およびそのインヒビターの分子毒物学；治験のための代理マーカーの集団および世代の階層化；ならびに、ハイスループットスクリーニングにおける選択的化合物の同定に役立つことによって向上する関連ＴＥＭ７α低分子薬物発見。
【０１６９】
（化学的誘導体）
ＴＥＭ７αポリペプチドの化学的に改変された誘導体は、本明細書中に記載された開示を考慮して、当業者によって調製され得る。ＴＥＭ７αポリペプチド誘導体は、このポリペプチドに天然に結合した分子の型または位置のいずれかにおいて異なる様式で改変される。誘導体は、１以上の天然に結合した化学的な基の欠失によって形成される分子を含み得る。配列番号２もしくは配列番号４または他のＴＥＭ７αポリペプチドのいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドは、１以上のポリマーの共有結合によって改変され得る。例えば、選択されたポリマーは、代表的に水溶性であり、その結果、それが結合するタンパク質は、水性環境（例えば、生理学的な環境）下で沈殿しない。ポリマーの混合物が、適切なポリマーの範囲内に含まれる。好ましくは、最終生成物の調製物の治療学的用途のために、このポリマーは、薬学的に受容可能である。
【０１７０】
このポリマーの各々は、任意の分子量であり得、そして分枝であっても非分枝であってもよい。このポリマーの各々は、代表的に、約２ｋＤａと約１００ｋＤａとの間の平均分子量を有する（この用語「約（およそ）」は、水溶性ポリマーの調製の際に、いくつかの分子が示された分子量より多く、いくつかは少ない分子量を有することを示す）。各ポリマーの平均分子量は、好ましくは、約５ｋＤａと約５０ｋＤａの間、より好ましくは、約１２ｋＤａと約４０ｋＤａとの間、そして最も好ましくは、約２０ｋＤａと約３５Ｄａとの間である。
【０１７１】
適切な水溶性ポリマーまたはその混合物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｎ−結合型またはＯ−結合型の炭水化物、糖、ホスフェート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（これは、モノ−（Ｃ１−Ｃ１０）のアルコキシ−ポリエチレングリコール、またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールを含む、タンパク質を誘導体化するために使用されてきたＰＥＧの形態を含む）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン（例えば、約６ｋＤの低分子量デキストラン）、セルロース、または他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、およびポリビニルアルコール。共有結合したＴＥＭ７αポリペプチドマルチマーを調製するために使用され得る二官能性架橋分子もまた、本発明に包括される。
【０１７２】
一般に、化学的誘導体化は、タンパク質と活性化ポリマー分子とを反応させるために用いられる任意の適切な条件下で実施され得る。ポリペプチドの化学的誘導体を調製するための方法は、一般に、（ａ）ポリペプチドと活性化ポリマー分子（例えば、反応性エステルまたはポリマー分子のアルデヒド誘導体）とを反応させる工程であって、配列番号２または配列番号４あるいはＴＥＭ７αポリペプチドのいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドが、１つ以上のポリマー分子との結合する条件下で行われる、工程、および（ｂ）反応生成物を得る工程、を包含する。最適反応条件は、公知のパラメーターおよび所望の結果に基づいて決定される。例えば、タンパク質に対するポリマー分子の比がより大きくなればなるほど、結合したポリマー分子の割合がより多くなる。１つの実施形態において、ＴＥＭ７αポリペプチド誘導体は、アミノ末端に単一のポリマー分子の部分を有し得る。例えば、米国特許第５，２３４，７８４号を参照のこと。
【０１７３】
ポリペプチドのペグ化は、当該分野で公知のペグ化反応のいずれかを使用して実施され得る。このような反応は、例えば、以下の参考文献に記載される：Ｆｒａｎｃｉｓら、１９９２，Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ，３：４−１０；欧州特許第０１５４３１６および同第０４０１３８４；ならびに米国特許第４，１７９，３３７号。例えば、ペグ化は、本明細書において記載されるように、反応性ポリエチレングリコール分子（または、類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して実施され得る。アシル化反応について、選択されたポリマーは、単一の反応性エステル基を有するべきである。還元的アルキル化について、選択されたポリマーは、単一の反応性アルデヒド基を有するべきである。反応性アルデヒドは、例えば、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（これは、水溶性である）であるか、またはモノＣ１−Ｃ１０アルコキシもしくはそのアリールオキシ誘導体である（米国特許第５，２５２，７１４号を参照のこと）。
【０１７４】
別の実施形態において、ＴＥＭ７αポリペプチドは、ビオチンと化学的に結合し得る。次いで、ビオチン／ＴＥＭ７αポリペプチド分子は、アビジンへの結合が可能となり、その結果、四価のアビジン／ビオチン／ＴＥＭ７αポリペプチド分子を生じる。ＴＥＭ７αポリペプチドはまた、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）またはトリニトロフェノール（ＴＮＰ）に共有結合し得、そして得られた結合体は、抗ＤＮＰまたは抗ＴＮＰ−ＩｇＭによって沈澱され１０の結合価の十量体の結合体を形成し得る。
【０１７５】
一般に、本発明のＴＥＭ７αポリペプチド誘導体の投与によって緩和され得るかまたは調節され得る状態は、ＴＥＭ７αポリペプチドについて本明細書において記載される状態を含む。しかし、本明細書において開示されるＴＥＭ７αポリペプチド誘導体は、誘導体化されていない分子と比較した場合、さらなる活性、増強した生物学的活性もしくは減少した生物学的活性、または他の特性（例えば、増加した半減期もしくは減少した半減期）を有し得る。
【０１７６】
（遺伝子操作された非ヒト動物）
非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、または他のげっ歯類；ウサギ、ヤギ、ヒツジ、または他の家畜）は、本発明の範囲内にさらに含まれ、ここで、ネイティブＴＥＭ７αポリペプチドをコードする遺伝子は、破壊（すなわち、「ノックアウト」）されており、その結果、ＴＥＭ７αポリペプチドの発現レベルは、有意に減少するかまたは完全に消失する。このような動物は、米国特許第５，５５７，０３２号に記載されるような技術および方法を用いて調製され得る。
【０１７７】
本発明はさらに、非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、または他のげっ歯類；ウサギ、ヤギ、ヒツジ、または他の家畜）を含み、ここで、この動物についてのＴＥＭ７α遺伝子のネイティブな形態または異種ＴＥＭ７α遺伝子のいずれかは、この動物によって過剰発現され、これによって、「トランスジェニック」動物を作製する。このようなトランスジェニック動物は、米国特許第５，４８９，７４３号およびＰＣＴ出願番号ＷＯ９４／２８１２２に記載されるような、周知の方法を用いて調製され得る。
【０１７８】
本発明はさらに、非ヒト動物を含み、ここで、本発明の１つ以上のＴＥＭ７αポリペプチドについてのプロモーターは、１つ以上のネイティブＴＥＭ７αポリペプチドの発現のレベルを変更するために、（例えば、相同組換え方法を用いることによって）活性化されるかまたは不活性化されるかのいずれかである。
【０１７９】
これらの非ヒト動物は、薬物候補スクリーニングのために用いられ得る。このようなスクリーニングにおいて、動物に対する薬物候補の影響が測定され得る。例えば、薬物候補は、ＴＥＭ７α遺伝子の発現を減少または増加させ得る。特定の実施形態において、産生されるＴＥＭ７αポリペプチドの量は、薬物候補への動物の曝露後、測定され得る。さらに、特定の実施形態において、動物に対する薬物候補の実際の影響を検出し得る。例えば、特定の遺伝子の過剰発現は、疾患または病的状態を生じる得るか、あるいは疾患または病的状態に関連し得る。このような場合、遺伝子の発現を減少させる薬物候補の能力または病的状態を予防もしくは抑制する薬物候補の能力を試験し得る。他の例において、特定の代謝産物（例えば、ポリペプチドのフラグメント）の産生は、疾患または病的状態を生じ得るか、あるいは疾患または病的状態に関連し得る。このような場合、このような代謝産物の産生を減少させる薬物候補の能力または病的状態を予防するかもしくは抑制する薬物候補の能力を試験し得る。
【０１８０】
（ＴＥＭ７αポリペプチド活性の他のモジュレーターについてのアッセイ）
いくつかの状況において、ＴＥＭ７αポリペプチドの活性のモジュレーターである分子（すなわち、アゴニストまたはアンタゴニスト）を同定することが所望され得る。ＴＥＭ７αポリペプチドを調節する天然の分子または合成分子は、１つ以上のスクリーニングアッセイ（例えば、本明細書において記載されるアッセイ）を用いて同定され得る。このような分子は、エキソビボ様式、または注射もしくは経口送達、移植装置などによるインビボ様式のいずれかによって投与され得る。
【０１８１】
「試験分子」とは、ＴＥＭ７αポリペプチドの活性を調節（すなわち、増加または減少）する能力についての評価されている分子をいう。最も一般的には、試験分子は、ＴＥＭ７αポリペプチドと直接相互作用する。しかし、試験分子はまた、ＴＥＭ７αポリペプチド活性を、例えば、ＴＥＭ７α遺伝子発現に影響することによってか、またはＴＥＭ７αポリペプチド結合パートナー（例えば、レセプターまたはリガンド）に結合することによって、間接的に調節し得ることも企図される。１つの実施形態において、試験分子は、少なくとも約１０−６Ｍ、好ましくは約１０−８Ｍ、より好ましくは約１０−９Ｍ、そしてなおより好ましくは約１０−１０Ｍの親和性定数で、ＴＥＭ７αポリペプチドと結合する。
【０１８２】
ＴＥＭ７αポリペプチドと相互作用する化合物を同定するための方法は、本発明によって包含される、特定の実施形態において、ＴＥＭ７αポリペプチドは、試験分子とＴＥＭ７αポリペプチドとの相互作用を可能にする条件下で、試験分子とともにインキュベートされ、そして相互作用の程度が測定され得る。試験分子は、実質的に精製された形態または粗混合物でスクリーニングされ得る。
【０１８３】
特定の実施形態において、ＴＥＭ７αポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストは、ＴＥＭ７αポリペプチドと相互作用して、その活性を調節する、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、または低分子量の分子であり得る。ＴＥＭ７αポリペプチド発現を調節する分子は、ＴＥＭ７αポリペプチドをコードする核酸に相補的であるか、またはＴＥＭ７αポリペプチドの発現を指向するかまたは制御する核酸配列に相補的である核酸を含み、そしてこれらの核酸は、発現のアンチセンス調節因子として作用する。
【０１８４】
一旦、試験化合物がＴＥＭ７αポリペプチドと相互作用するとして同定されると、この分子は、ＴＥＭ７αポリペプチド活性を増加または減少させる能力についてさらに評価され得る。試験分子とＴＥＭ７αポリペプチドとの相互作用の測定は、いくつかの形式で実施され得、これには、細胞ベースの結合アッセイ、膜結合アッセイ、溶液相アッセイ、および免疫アッセイが挙げられる。一般に、試験分子は、特定の期間、ＴＥＭ７αポリペプチドと共にインキュベートされ、そしてＴＥＭ７αポリペプチド活性が、生物学的活性を測定するための１以上のアッセイによって決定される。
【０１８５】
試験分子とＴＥＭ７αポリペプチドとの相互作用はまた、免疫アッセイにおいて、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を使用して直接的にアッセイされ得る。あるいは、本明細書中に記載されるようなエピトープタグを含むＴＥＭ７αポリペプチドの改変形態は、溶液および免疫アッセイ中で使用され得る。
【０１８６】
ＴＥＭ７αポリペプチドが、結合パートナー（例えば、レセプターまたはリガンド）との相互作用を介して生物学的活性を示す事象において、種々のインビトロアッセイが、対応する結合パートナー（例えば、選択的結合因子、レセプター、またはリガンド）へのＴＥＭ７αポリペプチドの結合を測定するために使用され得る。これらのアッセイは、その結合パートナーに対するＴＥＭ７αポリペプチドの結合の速度および／または程度を増加または減少させるその能力について、試験分子をスクリーニングするために使用され得る。１つのアッセイにおいて、ＴＥＭ７αポリペプチドは、マイクロタイタープレートのウェル中に固定化される。次いで、放射標識したＴＥＭ７αポリペプチド結合パートナー（例えば、ヨウ素化したＴＥＭ７αポリペプチド結合パートナー）および試験分子は、このウェルに、一時に一方を（いずれかの順序で）または同時に添加され得る。インキュベーション後に、このウェルを洗浄し、そしてシンチレーション計数器を使用して放射活性を計数し、結合パートナーがＴＥＭ７αポリペプチドに結合する程度を決定し得る。代表的に、分子は、ある濃度範囲にわたって試験され、そして試験アッセイの１以上の要素を欠く一連のコントロールウェルが、結果の評価の正確性のために使用され得る。この方法の代わりは、タンパク質の「位置」を逆にする工程（すなわち、マイクロタイタープレートウェルに対してＴＥＭ７αポリペプチド結合パートナーを固定化し、試験分子および放射標識したＴＥＭ７αポリペプチドと共にインキュベートし、そしてＴＥＭ７αポリペプチド結合の程度を決定する工程）を包含する。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１８章（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．，ａｎｄ，Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  １９９５）を参照のこと。
【０１８７】
放射性標識に対する代替として、ＴＥＭ７αポリペプチドまたはその結合パートナーは、ビオチンと結合体化され得、そしてビオチン化されたタンパク質の存在が、次いで、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼ（ＡＰ））（これらは、比色定量的に検出され得る）に結合したストレプトアビジンを使用して検出され得るか、またはストレプトアビジンの蛍光タグ化によって検出され得る。ＴＥＭ７αポリペプチドまたはＴＥＭ７αポリペプチド結合パートナー（これらは、ビオチンに結合されている）に対する抗体はまた、ＡＰまたはＨＲＰに連結した酵素連結ストレプトアビジンとの複合体のインキュベーションに続いて、検出の目的のために使用され得る。
【０１８８】
ＴＥＭ７αポリペプチドまたはＴＥＭ７αポリペプチド結合パートナーはまた、アガロースビーズ、アクリルビーズ、または他の型のこのような不活性な固相基材への付着によって固定化され得る。基材−タンパク質複合体は、相補的タンパク質および試験化合物を含む溶液内に配置され得る。インキュベーション後、これらのビーズは、遠心分離によって沈澱され得、そしてＴＥＭ７αポリペプチドとその結合パートナーとの間の結合の量が、本明細書中に記載の方法を使用して評価され得る。あるいは、基材−タンパク質複合体は、カラムを通過する試験分子および相補的タンパク質を用いてカラム内に固定化され得る。ＴＥＭ７αポリペプチドとその結合パートナーとの間の複合体の形成が、次いで、本明細書中に記載の技術（例えば、放射性標識または抗体結合）のいずれかを使用して評価され得る。
【０１８９】
ＴＥＭ７αポリペプチド結合タンパク質とＴＥＭ７αポリペプチド結合パートナーとの間の複合体の形成を増加または減少させる試験分子を同定するために有用な別のインビトロアッセイは、表面プラズモン共鳴検出器システム（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））である。ＢＩＡｃｏｒｅシステムは、製造業者によって指定されるように利用される。このアッセイは、本質的に、ＴＥＭ７αポリペプチドまたはＴＥＭ７αポリペプチド結合パートナーのいずれかの、デキストランでコートされたセンサーチップ（これは、検出器中に位置する）への共有結合を含む。次いで、この試験化合物および他の相補的タンパク質が、同時にかまたは連続的にかのいずれかで、センサーチップを含むチャンバーに注入され得る。結合する相補的タンパク質の量は、センサーチップのデキストランコート側に物理的に会合する分子の質量の変化に基づいて評価され得、この分子の質量の変化は、検出器システムによって測定される。
【０１９０】
いくつかの場合において、２つ以上の試験化合物を一緒に、ＴＥＭ７αポリペプチドとＴＥＭ７αポリペプチド結合パートナーとの間の複合体の形成を増加または減少させるそれらの能力について評価することが所望され得る。これらの場合において、本明細書中に記載のアッセイは、第一の試験化合物と同時にか、またはそれに続いてのいずれかで、このようなさらなる試験化合物を添加することによって容易に改変され得る。このアッセイにおける残りの工程は、本明細書中に記載される。
【０１９１】
インビトロアッセイ（例えば、本明細書中に記載されるもの）は、ＴＥＭ７αポリペプチドとＴＥＭ７αポリペプチド結合パートナーとの間の複合体の形成に対する効果について、多数の化合物をスクリーニングするために、有利に使用され得る。これらのアッセイは、ファージディスプレイ、合成ペプチド、および化学合成ライブラリーにおいて生成された化合物をスクリーニングするために、自動化され得る。
【０１９２】
ＴＥＭ７αポリペプチドとＴＥＭ７αポリペプチド結合パートナーとの間の複合体の形成を増加または減少される化合物はまた、ＴＥＭ７αポリペプチドまたはＴＥＭ７αポリペプチド結合パートナーのいずれかを発現する細胞および細胞系統を使用して、細胞培養物においてスクリーニングされ得る。細胞および細胞系統は、任意の哺乳動物から得られ得るが、好ましくは、ヒト、または他の霊長類、イヌ類もしくはげっ歯類の供給源由来である。ＴＥＭ７αポリペプチドの、ＴＥＭ７αポリペプチド結合パートナーをその表面で発現する細胞への結合は、試験分子の存在または非存在下で評価され、そして結合の程度が、例えば、ＴＥＭ７αポリペプチド結合パートナーに対するビオチン化抗体を使用するフローサイトメトリーによって決定され得る。細胞培養アッセイは、本明細書中に記載されるタンパク質結合アッセイにおいて、陽性であるとスコア付けされる化合物をさらに評価するために有利に使用され得る。
【０１９３】
細胞培養物はまた、薬物候補の影響をスクリーニングするために使用され得る。例えば、薬物候補は、ＴＥＭ７α遺伝子の発現を減少または増加させ得る。特定の実施形態において、生成されるＴＥＭ７αポリペプチドまたはＴＥＭ７αポリペプチドフラグメントの量は、細胞培養物の薬物候補への曝露の後に測定され得る。特定の実施形態において、細胞培養物に対する薬物候補の実際の影響を検出し得る。例えば、特定の遺伝子の過剰発現は、細胞培養物に対する特定の影響を有し得る。このような場合に、遺伝子の発現を増加または減少させる薬物候補の能力、または細胞培養物に対する特定の影響を予防または阻害するその能力が試験され得る。他の例において、特定の代謝産物（例えば、ポリペプチドのフラグメント）の生成が、疾患または病的状態を生じ得るか、またはそれらと関連し得る。このような場合、細胞培養物におけるこのような代謝産物の生成を減少する薬物候補の能力が試験され得る。
【０１９４】
（内部移行（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅ）タンパク質）
ｔａｔタンパク質配列（ＨＩＶ由来）は、細胞にタンパク質を内部移行するために使用され得る。例えば、Ｆａｌｗｅｌｌら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：６６４−６８を参照のこと。例えば、ＨＩＶ  ｔａｔタンパク質の１１アミノ酸配列（Ｙ−Ｇ−Ｒ−Ｋ−Ｋ−Ｒ−Ｒ−Ｑ−Ｒ−Ｒ−Ｒ：配列番号７）（「タンパク質伝達ドメイン」、またはＴＡＴ  ＰＤＴを呼ばれる）は、細胞の細胞膜および核膜を横切る送達を媒介するとして記載されている。Ｓｃｈｗａｒｚｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５：１５６９−７２（１９９９）；およびＮａｇａｈａｒａら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：１４４９−５２（１９９８）を参照のこと。これらの手順において、静脈投与後に組織を貫くＦＩＴＣ−構築物（ＦＩＴＣ標識化−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｒ−Ｋ−Ｋ−Ｒ−Ｒ−Ｑ−Ｒ−Ｒ−Ｒ；配列番号８）が、調製され、そしてこのような構築物の細胞への結合は、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）分析によって検出される。ｔａｔ−β−ｇａｌ融合タンパク質で処理された細胞は、β−ｇａｌ活性を示す。注入に続いて、このような構築物の発現は、多くの組織（肝臓、腎臓、肺、心臓、および脳組織を含む）において検出され得る。これらの構築は、細胞への侵入のためにある程度のアンフォールディングを受け；細胞への侵入後にリフォールディングが必要とされ得ることが信じられている。
【０１９５】
従って、ｔａｔタンパク質配列が所望のポリペプチドの細胞内へ内部移行するために使用され得ることは明白である。例えば、ｔａｔタンパク質配列を使用して、ＴＥＭ７αアンタゴニスト（例えば、抗ＴＥＭ７α選択結合因子、低分子、可溶性レセプター、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、細胞内へ投与されてＴＥＭ７α分子の活性を阻害し得る。本明細書中で使用される場合、用語「ＴＥＭ７α分子」は、本明細書中で規定されるようなＴＥＭ７α核酸分子およびＴＥＭ７αポリペプチドの両方をいう。所望の場合、ＴＥＭ７αタンパク質自身はまた、これらの手順を使用して細胞内部に投与され得る。Ｓｔｒａｕｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５：１４６６−６７（１９９９）をまた参照のこと。
【０１９６】
（ＴＥＭ７αポリペプチドを使用する細胞供給源同定）
本発明の特定の実施形態に従って、ＴＥＭ７αポリペプチドに結合する特定の細胞型の供給源を決定し得ることは有用であり得る。例えば、適切な治療の選択における補助として疾患または病理学的状態の起源を決定することは、有用であり得る。特定の実施形態において、ＴＥＭ７αポリペプチドをコードする核酸は、プローブとして使用されて、このようなプローブを用いて細胞の核酸をスクリーニングすることによって、本明細書中に記載される細胞を同定し得る。他の実施形態において、抗ＴＥＭ７αポリペプチド抗体を使用して、細胞におけるＴＥＭ７αポリペプチドの存在について、従って、このような細胞が、本明細書中に記載される型の細胞であるかどうかを、試験し得る。
【０１９７】
（ＴＥＭ７αポリペプチド組成物および投与）
治療組成物は、本発明の範囲内である。このようなＴＥＭ７αポリペプチド薬学的組成物は、治療有効量のＴＥＭ７αポリペプチドまたはＴＥＭ７α核酸分子を、投与の様式と適合するように選択された薬学的にまたは生理学的に受容可能な処方薬剤との混合物で、含み得る。薬学的組成物は、治療有効量の１以上のＴＥＭ７αポリペプチド選択的結合因子を、投与の様式と適合するように選択された薬学的にまたは生理学的に受容可能な処方薬剤との混合物で、含み得る。
【０１９８】
受容可能な処方物材料は、好ましくは、使用される投薬量および濃度で、レシピエントに対して非毒性である。
【０１９９】
薬学的組成物は、例えば、ｐＨ、浸透圧、粘度、清澄性、色、等張性、におい、無菌性、安定性、溶解もしくは放出の速度、吸着、または組成物の浸透を改変、維持または保存するための処方物材料を含み得る。適切な処方物材料としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジン）、抗菌剤、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、または亜硫酸水素ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｓｕｌｆｉｔｅ））、緩衝液（例えば、ホウ酸塩、炭酸水素塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、または他の有機酸）、バルキング剤（例えば、マンニトールまたはグリシン）、キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））、錯化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）、フィラー（充填剤）、単糖類、二糖類、および他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノースまたはデキストリン）、タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン）、着色剤、香味剤および希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）、保存剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン（ＴＥＭ７αｏｒｈｅｘｉｄｉｎｅ）、ソルビン酸、または過酸化水素）、溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコール）、糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）、懸濁剤、界面活性剤または湿潤剤（例えば、プルオニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）；ＰＥＧ；ソルビタンエステル；ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０）；トリトン；トロメタミン；レシチン；コレステロールまたはチロキサポール（ｔｙｌｏｘａｐａｌ））、安定性増強剤（例えば、スクロースまたはソルビトール）、張度増強剤（例えば、ハロゲン化アルカリ金属（好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム）、またはマンニトール  ソルビトール）、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または薬学的アジュバント）。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  １９９０）。
【０２００】
最適な薬学的組成物は、当業者によって、例えば、意図される投与経路、送達形式、および所望の投薬量に依存して決定される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，前出を参照のこと。このような組成物は、ＴＥＭ７α分子の物理的な状態、安定性、インビボ放出の速度、およびインビボクリアランスの速度に影響し得る。
【０２０１】
薬学的組成物における主要なビヒクルまたはキャリアは、本質的には、水性または非水性のいずれかであり得る。例えば、適切なビヒクルまたはキャリアは、注射用の水、生理食塩水溶液または人工脳脊髄液であり得、これらは、非経口投与のための組成物において一般的な他の材料で補充され得る。中性の緩衝化生理食塩水または血清アルブミンと混合された生理食塩水は、さらなる例示的なビヒクルである。他の例示的な薬学的組成物は、約ｐＨ７．０〜８．５のＴｒｉｓ緩衝液または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸塩緩衝液を含み、これはさらに、ソルビトールまたは適切な代用物を含み得る。本発明の１つの実施形態において、ＴＥＭ７αポリペプチド組成物は、所望の程度の純度を有する選択された組成物を、任意の処方薬剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，前出）と混合することによって、凍結乾燥ケークまたは水溶液の形態で、保存のために調製され得る。さらに、ＴＥＭ７αポリペプチド産物は、スクロースのような適切な賦形剤を使用して凍結乾燥物として処方され得る。
【０２０２】
このＴＥＭ７αポリペプチドの薬学的組成物は、非経口送達のために選択され得る。あるいは、これらの組成物は、吸入または消化管を介する送達（例えば、経口的）のために選択され得る。このような薬学的に受容可能な組成物の調製は、当該分野の技術の範囲内にある。
【０２０３】
処方成分は、投与の部位に受容可能な濃度で存在する。例えば、緩衝液は、生理学的ｐＨまたはわずかにより低いｐＨ（典型的に、約５〜約８のｐＨ範囲内）でこの組成物を維持するために使用される。
【０２０４】
非経口投与が意図される場合、本発明における使用のための治療組成物は、薬学的に受容可能なビヒクル中に所望のＴＥＭ７α分子を含む、発熱物質を含まない非経口的に受容可能な水溶液の形態であり得る。非経口注入のために特に適切なビヒクルは、滅菌蒸留水であり、ここで、ＴＥＭ７α分子は、滅菌の等張溶液として処方され、適切に保存される。なお別の調製物としては、その産物の制御性放出または持続性放出を提供する、注射可能なミクロスフェア、生分解性（ｂｉｏ−ｅｒｏｄｉｂｌｅ）粒子、ポリマー化合物（例えば、ポリ乳酸またはポリグリコール酸）、ビーズ、またはリポソームのような因子と、所望の分子との処方物が挙げられ得、これは、次いで、蓄積注射を介して送達され得る。ヒアルロン酸もまた使用され得、そしてこれは、循環中の持続時間を促進する効果を有し得る。所望の分子の導入のための他の適切な手段としては、移植可能な薬物送達デバイスが挙げられる。
【０２０５】
１つの実施形態において、薬学的組成物は、吸入のために処方され得る。例えば、ＴＥＭ７αポリペプチドは、吸入のための乾燥粉末として処方され得る。ＴＥＭ７αポリペプチドまたはＴＥＭ７α核酸分子の吸入溶液はまた、エアロゾル送達のための噴霧剤と共に処方され得る。なお別の実施形態において、溶液は、噴霧され得る。肺投与は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９４／２００６９にさらに記載され、これは、化学的に改変されたタンパク質の肺送達を記載する。
【０２０６】
特定の処方物が、経口投与され得ることもまた意図される。本発明の１つの実施形態において、この様式で投与されるＴＥＭ７αポリペプチドは、固体投薬形態（例えば、錠剤およびカプセル）の調合において慣用的に使用されるこれらのキャリアを伴うかまたは伴わず処方され得る。例えば、カプセルは、バイオアベイラビリティーが最大化されそして前全身性分解（ｐｒｅ−ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）が最小化される場合、胃腸管内にある時点でその処方物の活性部分を放出するように設計され得る。さらなる薬剤が、ＴＥＭ７αポリペプチドの吸収を容易にするために含まれ得る。希釈剤、香料、低融点ワックス、植物油、滑沢剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤、および結合剤（バインダー）もまた使用され得る。
【０２０７】
別の薬学的組成物は、錠剤の製造に適切な非毒性賦形剤との混合物中に、有効量のＴＥＭ７αポリペプチドを含み得る。錠剤を滅菌水または別の適切なビヒクルに溶解することによって、溶液が、単位用量形態で調製され得る。適切な賦形剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：不活性な希釈剤（例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムもしくは炭酸水素ナトリウム、ラクトース、またはリン酸カルシウム）；あるいは結合剤（例えば、デンプン、ゼラチンまたはアカシア）；あるいは滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルク）。
【０２０８】
さらなるＴＥＭ７αポリペプチドの薬学的組成物は、当業者に明らかであり、これらには、持続性送達処方物または制御性送達処方物中にＴＥＭ７αポリペプチドを含む処方物が挙げられる。種々の他の持続送達手段または制御送達手段（例えば、リポソームキャリア、生分解性微粒子もしくは多孔性ビーズ）の処方および蓄積注射のための技術もまた、当業者に公知である。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９（これは、薬学的組成物の送達のための多孔性ポリマー性微粒子の制御された放出を記載する）を参照のこと。
【０２０９】
持続性放出調製物のさらなる例としては、成形品の形態（例えば、フィルム、またはマイクロカプセル）の半透過性ポリマーマトリクスが挙げられる。持続性放出マトリクスとしては、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、欧州特許第０５８４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５６，（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７，（１９８１）およびＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５，（１９８２））、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら，前出）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３９８８号）が挙げられ得る。持続性放出組成物はまた、リポソームを含み得、これは、当該分野で公知のいくつかの方法のいずれかによって調製され得る。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３６８８−３６９２，（１９８５）；欧州特許第０３６６７６号；同第０８８０４６号；同第１４３９４９号を参照のこと。
【０２１０】
インビボ投与のために使用されるＴＥＭ７αの薬学的組成物は、代表的に、滅菌されていなければならない。これは、滅菌濾過膜を通す濾過によって達成され得る。組成物が凍結乾燥される場合、これらの方法を使用する滅菌は、凍結乾燥および再構成の前後のいずれかで実施され得る。非経口投与のための組成物は、凍結乾燥された形態または溶液中で保存され得る。さらに、非経口組成物は、一般に、滅菌アクセスポートを有する容器（例えば、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアル）内に配置される。
【０２１１】
一旦、薬学的組成物が処方されると、それは、滅菌バイアル中に、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体としてか、あるいは脱水粉末または凍結乾燥粉末として保存され得る。このような処方物は、すぐに使用できる形態または投与の前に再構成を必要とする形態（例えば、凍結乾燥形態）のいずれかで保存され得る。
【０２１２】
特定の実施形態において、本発明は、単回投与の投与単位を生成するためのキットに関する。これらのキットは、各々、乾燥タンパク質を有する第一の容器および水性処方物を有する第二の容器の両方を備え得る。単一チャンバおよびマルチチャンバの予め充填されたシリンジ（例えば、液体シリンジおよび分散シリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を備えるキットもまた、本発明の範囲内に含まれる。
【０２１３】
治療的に使用されるＴＥＭ７αの薬学的組成物の有効量は、例えば、治療の内容および目的に依存する。従って、処置のための適切な投薬レベルが、送達される分子、ＴＥＭ７α分子が使用される指標、投与の経路、ならびに患者のサイズ（体重、体表面、または器官のサイズ）および患者の状態（年齢および全身的な健康状態）に部分的に依存して変化することが、当業者に理解される。従って、臨床家は、最適な治療効果を得るために、投薬量を滴定（ｔｉｔｅｒ）し得、そして投与経路を改変し得る。代表的な投薬量は、上記の因子に依存して、約０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまでまたはそれを超える範囲にあり得る。他の実施形態において、投薬量は、０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまで；または１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまで；または５μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまでの範囲であり得る。
【０２１４】
投薬の頻度は、使用される処方物中でのＴＥＭ７α分子の薬物動態学的パラメーターに依存する。典型的に、臨床家は、所望の効果を達成する投薬量に達するまで組成物を投与する。従って、組成物は、単回投与として、長期にわたる２回以上の投与（これは、同じ量の所望の分子を含んでも、含まなくてもよい）として、あるいは移植デバイスまたはカテーテルを介する連続的な注入として、投与され得る。適切な投薬量のさらなる改良は、当業者によって慣用的になされ、そして当業者によって慣用的に実施される作業の範囲内にある。適切な投薬量は、適切な用量−応答データの使用を介して確認され得る。
【０２１５】
薬学的組成物の投与の経路は、公知の方法に従う：例えば、経口的にか；静脈内、腹腔内、大脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内または病巣内の経路による注射か、あるいは持続放出系もしくは移植デバイスによる。所望される場合、これらの組成物は、ボーラス注射によって投与され得るか、または注入によって連続的に投与され得るか、または移植デバイスによって投与され得る。
【０２１６】
あるいは、またはさらに、組成物は、膜、スポンジ、または所望の分子が吸収されるかもしくはカプセル化されている他の適切な材料の移植を介して局所的に投与され得る。移植デバイスが使用される場合、このデバイスは、任意の適切な組織または器官に移植され得、そして所望の分子の送達は、拡散、時限放出（ｔｉｍｅｄ−ｒｅｌｅａｓｅ）ボーラスまたは連続投与を介し得る。
【０２１７】
いくつかの場合において、エキソビボ様式において、ＴＥＭ７αポリペプチドの薬学的組成物を使用することが所望され得る。このような例において、患者から取り出された細胞、組織または器官は、ＴＥＭ７αポリペプチドの薬学的組成物に曝露され、その後これらの細胞、組織または器官は続いて患者に移植し戻される。
【０２１８】
他の場合において、ＴＥＭ７αポリペプチドは、本明細書中に記載されるような方法を使用して、ＴＥＭ７αポリペプチドを発現および分泌するように遺伝子操作された特定の細胞を移植することによって送達され得る。このような細胞は、動物細胞またはヒト細胞であり得、そして自己、異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）、または異種間（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ）であり得る。必要に応じて、細胞は、不死化され得る。免疫学的応答の機会を減少するために、細胞は、周囲の組織の浸潤を回避するようにカプセル化され得る。カプセル化材料は、典型的に、生体適合性の半透性ポリマーの包囲物または膜であり、これらは、タンパク質産物の放出を可能にするが、患者の免疫系によるかまたは周囲の組織由来の他の有害な因子による細胞の破壊を防止する。
【０２１９】
本明細書中で考察されるように、単離された細胞集団（例えば、幹細胞、リンパ球、赤血球、軟骨細胞、ニューロンなど）を、１以上のＴＥＭ７αポリペプチドで処置することが所望され得る。これは、細胞膜に対して透過性の形態のポリペプチドに、単離された細胞を直接曝すことによって達成され得る。
【０２２０】
本発明のさらなる実施形態は、治療ポリペプチドのインビトロ産生と、遺伝子治療または細胞治療による治療ポリペプチドの産生および送達との両方のための、細胞および方法（例えば、相同組換えおよび／または他の組換え産生方法）に関する。相同組換えおよび他の組換えの方法を使用して、通常は転写的にサイレントなＴＥＭ７α遺伝子（すなわち、過少発現される遺伝子）を含む細胞を改変し得、これによって、治療有効量のＴＥＭ７αポリペプチドを発現する細胞を産生する。
【０２２１】
相同組換えは、転写的に活性な遺伝子における変異を誘導または矯正するように遺伝子を標的化するために元々開発された技術である（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ，Ｐｒｏｇ．ｉｎ  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．＆  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３６：３０１，１９８９）。この基本的技術は、特定の変異を、哺乳動物ゲノムの特定の領域へ導入するための方法として（Ｔｈｏｍａｓら，Ｃｅｌｌ，４４：４１９−４２８、１９８６；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ，５１：５０３−５１２，１９８７；Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５：８５８３−８５８７，１９８８）、または欠損遺伝子内の特定の変異を矯正するための方法として（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３０：５７６−５７８，１９８７）開発された。例示的な相同組換え技術は、米国特許第５，２７２，０７１号、欧州特許第９１９３０５１号、および同第５０５５００号；ＰＣＴ／ＵＳ９０／０７６４２、ならびに国際公開番号  ＷＯ  ９１／０９９５５に記載される。
【０２２２】
相同組換えを介して、ゲノム中に挿入されるべきＤＮＡ配列は、標的化ＤＮＡにこのＤＮＡ配列を結合することによって、目的の遺伝子の特定の領域に指向され得る。この標的化ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ領域に相補的である（相同である）ヌクレオチド配列である。ゲノムの特定の領域に相補的である標的化ＤＮＡの小片は、ＤＮＡ複製プロセスの間に親鎖との接触下に置かれる。共有される相同領域を介して内因性ＤＮＡの他の小片とハイブリダイズし、そして従って、組み換わることは、細胞内に挿入されたＤＮＡの一般的な特性である。この相補鎖が、変異配列もしくは異なる配列またはさらなるヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに結合された場合、これもまた、新たに合成された鎖に組換えの結果として組み込まれる。プルーフリーディング機能の結果として、この新たなＤＮＡ配列が、テンプレートとして作用することが可能である。このように、この移入されたＤＮＡは、ゲノム内に組み込まれる。
【０２２３】
ＴＥＭ７αポリペプチドと相互作用し得るかまたはＴＥＭ７αポリペプチドの発現を制御し得るＤＮＡ領域（例えば、隣接配列）が、標的化ＤＮＡのこれらの小片に結合される。例えば、プロモーター／エンハンサーエレメント、サプレッサーまたは外因性転写調節エレメントが、所望のＴＥＭ７αポリペプチドをコードするＤＮＡの転写に影響を与えるに十分に近位でかつ十分な方向で、その意図される宿主細胞のゲノムに挿入される。制御エレメントは、宿主細胞ゲノム中に存在するＤＮＡの一部を制御する。従って、所望のＴＥＭ７αポリペプチドの発現は、ＴＥＭ７α遺伝子自体をコードするＤＮＡのトランスフェクションによってではなく、むしろＤＮＡ調節セグメントと結合された標的化ＤＮＡ（その目的の内因性遺伝子と相同な領域を含む）の使用によって達成され得、この調節セグメントは、ＴＥＭ７α遺伝子の転写について認識可能なシグナルを、その内因性遺伝子配列に提供する。
【０２２４】
例示的な方法において、細胞内の所望の標的化された遺伝子（すなわち、所望の内因性の細胞遺伝子）の発現は、少なくとも調節配列、エキソンおよびスプライスドナー部位を含むＤＮＡの導入による、予め選択された部位でのその細胞ゲノムへの相同組換えを介して変更される。これらの成分は、実際には、これらの成分が、新たな転写単位の産生を生じる（ここで、そのＤＮＡ構築物中に存在する調節配列、エキソンおよびスプライスドナー部位が、内因性遺伝子に作動可能に連結される）このような様式で染色体（ゲノム）ＤＮＡ中に導入される。染色体ＤＮＡへのこれらの成分の導入の結果として、所望の内因性遺伝子の発現が変更される。
【０２２５】
本明細書中に記載されるように、変更された遺伝子発現は、得られたときの細胞において通常サイレントな（発現されない）遺伝子を活性化すること（または発現されるのを引き起こすこと）、ならびに得られたときの細胞において生理学的に有意なレベルで発現されない遺伝子の発現を増大させることを包含する。この実施形態はさらに、得られたときの細胞において生じる調節または誘導のパターンとは異なるように調節または誘導のパターンを変更すること、ならびに得られたときの細胞において発現される遺伝子の発現を減少させること（除去することを含む）を包含する。
【０２２６】
相同組換えを用いて、細胞の内因性ＴＥＭ７α遺伝子からのＴＥＭ７αポリペプチド産生を増大させ得るかまたは生じさせ得る１つの方法は、第１に、相同組換えを用いて部位特異的組換え系（例えば、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ、ＦＬＰ／ＦＲＴ）（Ｓａｕｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５：５２１−５２７，１９９４；Ｓａｕｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２２５：８９０−９００，１９９３）由来の組換え配列を、細胞の内因性ゲノムＴＥＭ７αポリペプチドコード領域の上流に（すなわち、５’側に）配置することを含む。ゲノムＴＥＭ７αポリペプチドコード領域のすぐ上流に配置された部位に相同な組換え部位を含むプラスミドは、この改変された細胞株に、適切なリコンビナーゼ酵素と共に導入される。このリコンビナーゼは、このプラスミドを、プラスミドの組換え部位を介して、その細胞株におけるゲノムＴＥＭ７αポリペプチドコード領域のすぐ上流に位置する組換え部位に組み込ませる（ＢａｕｂｏｎｉｓおよびＳａｕｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１：２０２５−２０２９，１９９３；Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：１３５１−１３５５，１９９１）。転写を増大させることが公知の任意の隣接配列（例えば、エンハンサー／プロモーター、イントロン、翻訳エンハンサー）は、このプラスミド内に適切に配置された場合に、新たな転写単位または改変された転写単位を作製するような様式で組み込み、この細胞の内因性ＴＥＭ７α遺伝子からの新規のＴＥＭ７αポリペプチド産生または増大したＴＥＭ７αポリペプチド産生を生じる。
【０２２７】
部位特異的な組換え配列がその細胞の内因性ゲノムＴＥＭ７αポリペプチドコード領域のすぐ上流に配置された細胞株を使用するためのさらなる方法は、相同組換えを使用して、第２の組換え部位を、この細胞株のゲノムの他の箇所に導入することである。次いで、適切なリコンビナーゼ酵素が、この２つの組換え部位の細胞株に導入されて、これが、組換え事象（欠失、反転、転移）を引き起こす（Ｓａｕｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５：５２１−２７，１９９４；Ｓａｕｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２２５：８９０−９００，１９９３）。この組換え事象は、新たな転写単位または改変された転写単位を作製し、この転写単位が、この細胞の内因性ＴＥＭ７α遺伝子からの新規のＴＥＭ７αポリペプチド産生または増加したＴＥＭ７αポリペプチド産生を生じる。
【０２２８】
細胞の内因性ＴＥＭ７α遺伝子からのＴＥＭ７αポリペプチドの発現を増加させるかまたは引き起こすためのさらなるアプローチは、細胞の内因性ＴＥＭ７α遺伝子からの新規のＴＥＭ７αポリペプチド産生または増加したＴＥＭ７αポリペプチド産生を生じる様式で、ある遺伝子（単数または複数）（例えば、転写因子）の発現を増加させるかもしくは引き起こすこと、および／またはある遺伝子（単数または複数）（例えば、転写リプレッサー）の発現を減少させることを包含する。この方法は、細胞の内因性ＴＥＭ７α遺伝子からの新規のＴＥＭ７αポリペプチド産生または増加したＴＥＭ７αポリペプチド産生が生じるように、天然には存在しないポリペプチド（例えば、転写因子ドメインに融合した部位特異的ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチド）をその細胞に導入することを包含する。
【０２２９】
本発明はさらに、標的遺伝子発現を変更する方法において有用なＤＮＡ構築物に関する。特定の実施形態において、例示的ＤＮＡ構築物は、以下を含む：（ａ）１つ以上の標的配列、（ｂ）調節配列、（ｃ）エキソン、および（ｄ）不対スプライシングドナー部位。ＤＮＡ構築物中の標的配列は、細胞内の標的遺伝子中に要素（ａ）〜（ｄ）の組込みを指向し、その結果、要素（ｂ）〜（ｄ）は、内因性標的遺伝子の配列に作動可能に連結される。別の実施形態において、ＤＮＡ構築物は、以下を含む：（ａ）１つ以上の標的配列、（ｂ）調節配列、（ｃ）エキソン、（ｄ）スプライシングドナー配列、（ｅ）イントロン、および（ｆ）スプライシングアクセプター部位（ここで、この標的配列は、要素（ａ）〜（ｆ）の組込みを指向し、その結果、（ｂ）〜（ｆ）の要素は、内因性遺伝子に作動可能に連結される。標的配列は、相同組換えが生じる細胞内染色体ＤＮＡにおける予め選択された部位に相同である。対照的に、エキソンは、一般に調節配列の３’であり、そしてスプライシングドナー部位は、エキソンの３’である。
【０２３０】
特定の遺伝子の配列が公知の場合、例えば、本明細書中に示されるＴＥＭ７αポリペプチドの核酸配列（その遺伝子の選択された領域に相補的なＤＮＡ小片）は、合成され得るか、またはさもなくば、例えば、目的の領域に結合する特定の認識部位でネイティブなＤＮＡの適切な制限によって取得され得る。この小片は、細胞内での挿入の際に標的配列として働き得、そしてゲノム内のその相同領域内にハイブリダイズする。このハイブリダイゼーションがＤＮＡ複製中に生じる場合、このＤＮＡ小片、およびそれに結合した任意のさらなる配列は、岡崎フラグメントとして働き、そして新たに合成されたＤＮＡ娘鎖に組み込まれる。よって、本発明は、標的配列として使用され得る、ＴＥＭ７αポリペプチドをコードするヌクレオチドを含む。
【０２３１】
ＴＥＭ７αポリペプチド細胞治療（例えば、ＴＥＭ７αポリペプチドを産生する細胞の移植）もまた企図される。この実施形態は、ＴＥＭ７αポリペプチドの生物学的活性型を合成および分泌し得る細胞を移植する工程を包含する。このようなＴＥＭ７αポリペプチド産生細胞は、ＴＥＭ７αポリペプチドの天然の生産者である細胞であり得るか、または所望のＴＥＭ７αポリペプチドをコードする遺伝子またはＴＥＭ７αポリペプチドの発現を増加させる遺伝子での形質転換によってＴＥＭ７αポリペプチドを産生する能力が増加された組換え細胞であり得る。このような改変は、遺伝子の送達ならびにその発現および分泌の促進に適切なベクターによって達成され得る。ＴＥＭ７αポリペプチドを投与された患者において潜在的免疫学的反応を最小化するために、外来種のポリペプチドの投与で生じ得るように、ＴＥＭ７αポリペプチドを産生する天然の細胞がヒト起源でありかつヒトＴＥＭ７αポリペプチドを産生することが、好ましい。同様に、ＴＥＭ７αポリペプチドを産生する組換え細胞が、ヒトＴＥＭ７αポリペプチドをコードする遺伝子を含む発現ベクターで形質転換されていることが、好ましい。
【０２３２】
移植された細胞は、周囲の組織の浸潤を避けるためにカプセル化され得る。ヒト細胞または非ヒト動物細胞は、ＴＥＭ７αポリペプチドの放出を可能にするが患者の免疫系または周辺組織からの他の有害因子による細胞の崩壊を防ぐ生体適合性、半透過性のポリマー性封入物または膜中で患者に移植され得る。あるいは、形質転換されてＴＥＭ７αポリペプチドをエキソビボで産生する患者自身の細胞は、このようなカプセル化なしで患者に直接移植され得る。
【０２３３】
生細胞のカプセル化のための技術は、当該分野において公知であり、そしてカプセル化された細胞の調製および患者におけるその移植は、慣用的に達成され得る。例えば、Ｂａｅｔｇｅら（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／０５４５２およびＰＣＴ／ＵＳ９４／０９２９９）は、生物学的活性分子の効果的な送達のために遺伝子操作された細胞を含む膜カプセルを記載する。このカプセルは、生体適合性であり、容易に回収可能である。このカプセルは、哺乳動物宿主への移植の際にインビボでのダウンレギュレーションに供されないプロモーターに作動可能に連結された生物学的活性分子をコードするＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子でトランスフェクトされた細胞をカプセル化する。このデバイスは、生細胞からレシピエント内の特定部位への分子送達を提供する。さらに、米国特許第４，８９２，５３８号；同第５，０１１，４７２号；および同５，１０６，６２７号を参照のこと。生細胞をカプセル化するための系は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１０４２５（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら）に記載される。また、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１０４７０（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら）；Ｗｉｎｎら、１９９１、Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．１１３：３２２−２９；Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら、１９９１、Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．１１１：２６９−７５；およびＴｒｅｓｃｏら、１９９２、ＡＳＡＩＯ  ３８：１７−２３を参照のこと。
【０２３４】
インビボおよびインビトロでのＴＥＭ７αポリペプチドの遺伝子治療送達がまた想定される。遺伝子治療技術の１例は、「遺伝子治療ＤＮＡ構築物」を形成するように構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターに作動可能に連結され得る、ＴＥＭ７αポリペプチドをコードするＴＥＭ７α遺伝子（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、および／または合成ＤＮＡのいずれか）を使用することである。このプロモーターは、この構築物が挿入される細胞型または組織型中で活性である限り、内因性ＴＥＭ７α遺伝子に相同であっても非相同であってもよい。遺伝子治療ＤＮＡ構築物の他の成分は、必要に応じて、部位特異的組込みのために設計されたＤＮＡ分子（例えば、相同組換えに有用な内因性配列）、組織特異的プロモーター、エンハンサーまたはサイレンサー、親細胞を超える選択的利点を提供し得るＤＮＡ分子、形質転換された細胞を同定するための標識として有用なＤＮＡ分子、ネガティブ選択系、細胞特異的結合因子（例えば、細胞標的化のための）、細胞特異的内部移行因子、ベクターからの発現を増強する転写因子、ならびにベクター産生を可能にする因子を含み得る。
【０２３５】
次いで、遺伝子治療ＤＮＡ構築物は、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを使用して（エキソビボまたはインビボのいずれかで）細胞に導入され得る。遺伝子治療ＤＮＡ構築物を導入するための１つの手段は、本明細書中に記載されるようなウイルスベクターによる。特定のベクター（例えば、レトロウイルスベクター）は、ＤＮＡ送達物を細胞の染色体ＤＮＡに送達し、そしてその遺伝子は、染色体ＤＮＡに組み込まれ得る。他のベクターは、エピソームとして機能し、そして遺伝子治療ＤＮＡ構築物は、細胞質内に残存する。
【０２３６】
なお他の実施形態において、調節エレメントは、標的細胞中でのＴＥＭ７α遺伝子の制御された発現のために含まれ得る。このようなエレメントは、適切なエフェクターに応じてオンにされる。この様式において、所望される場合、治療的ポリペプチドが発現され得る。１つの慣用的制御手段としては、低分子結合ドメインおよび生物学的プロセスを開始し得るドメインを含むキメラタンパク質（例えば、ＤＮＡ結合タンパク質または転写活性化タンパク質）を二量体化するための低分子二量体化因子（ｄｉｍｅｒｉｚｅｒ）またはラパログ（ｒａｐａｌｏｇ）の使用を含む（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／４１８６５、ＷＯ９７／３１８９８およびＷＯ９７／３１８９９を参照のこと）。タンパク質の二量体化を使用して、導入遺伝子の転写を開始し得る。
【０２３７】
代替の調節技術は、目的の遺伝子から発現されたタンパク質を凝集体またはクラスターとして細胞内で貯蔵する方法を使用する。目的の遺伝子は、小胞体内で凝集したタンパク質の残留を生じる条件付き凝集ドメインを含む融合タンパク質として発現される。この貯蔵されたタンパク質は、細胞内で安定かつ不活性である。しかし、タンパク質は、この条件付き凝集ドメインを除去しこれにより凝集体またはクラスターを特異的に分離する薬物（例えば、低分子リガンド）の投与によって放出され得、その結果このタンパク質は細胞から放出される。Ａｒｉｄｏｒら、２０００、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：８１６−１７、およびＲｉｖｅｒａら、２０００、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：８２６−３０を参照のこと。
【０２３８】
他の適切な制御手段または遺伝子スイッチとしては、本明細書中に記載される系が挙げられるがこれらに限定されない。Ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅ（ＲＵ４８６）は、プロゲステロンアンタゴニストとして使用される。改変されたプロゲステロンレセプターリガンド結合ドメインのプロゲステロンアンタゴニストに対する結合は、２つの転写因子のダイマーの形成によって転写を活性化し、次いで、ＤＮＡを結合するために核内に入る。リガンド結合ドメインは、天然のリガンドに結合するためのレセプターの能力を排除するように改変される。改変されたステロイドホルモンレセプター系はさらに、米国特許第５，３６４，７９１号ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／４０９１１およびＷＯ９７／１０３３７に記載される。
【０２３９】
なお別の制御系は、エクジソンレセプター（細胞質レセプター）に結合しそしてこれを活性化するエクジソン（ショウジョウバエステロイドホルモン）を使用する。次いで、このレセプターは、核内へ移行して特定のＤＮＡ応答エレメント（エクジソン応答性遺伝子由来のプロモーター）を結合する。エクジソンレセプターは、転写を開始するために、トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、およびリガンド結合ドメインを含む。エクジソン系はさらに、米国特許第５，５１４，５７８号ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／３８１１７、ＷＯ９６／３７６０９およびＷＯ９３／０３１６２に記載される。
【０２４０】
別の制御手段は、ポジティブにテトラサイクリン制御可能なトランスアクチベーターを使用する。この系は、転写を活性化するポリペプチドに連結された変異されたｔｅｔレプレッサータンパク質ＤＮＡ結合ドメイン（逆テトラサイクリン調節トランスアクチベータータンパク質（すなわち、これは、テトラサイクリンの存在下でｔｅｔオペレーターに結合する）を生じる変異されたｔｅｔ  Ｒ−４アミノ酸変化）を含む。このような系は、米国特許第５，４６４，７５８号、同第５，６５０，２９８号、同第５，６５４，１６８号に記載される。
【０２４１】
さらなる発現制御系および核酸構築物は、Ｉｎｎｏｖｉｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．に対する米国特許第５，７４１，６７９号および同５，８３４，１８６号に記載される。
【０２４２】
インビボでの遺伝子治療は、ＴＥＭ７α核酸の局所注射を介してか、あるいは他の適切なウイルス性送達ベクターまたは非ウイルス性送達ベクターによってＴＥＭ７αポリペプチドをコードする遺伝子を細胞内に導入することによって、達成され得る。Ｈｅｆｔｉ  １９９４，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２５：１４１８−３５。例えば、ＴＥＭ７αポリペプチドをコードする核酸分子は、標的細胞への送達のためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに含まれ得る（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／３４６７０；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０７１７８を参照のこと）。組換えＡＡＶゲノムは、典型的には、機能的プロモーター配列およびポリアデニル化配列に作動可能に連結された、ＴＥＭ７αポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に隣接するＡＡＶ逆（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）終末反復を含む。
【０２４３】
代替の適切なウイルスベクターとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、レンチウイルスベクター、肝炎ウイルスベクター、パルボウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、コロナウイルスベクター、ラブドウイルスベクター、パラミクソウイルスベクター、およびパピローマウイルスベクター。米国特許第５，６７２，３４４号は、組換え神経栄養性ＨＳＶ−１ベクターを含むインビボでのウイルス媒介遺伝子移入系を記載する。米国特許第５，３９９，３４６号は、治療タンパク質をコードするＤＮＡセグメントを挿入するようにインビトロで処理されたヒト細胞の送達によって、治療タンパク質を有する患者を提供するためのプロセスの例を提供する。遺伝子治療技術を実施するためのさらなる方法および材料は、米国特許第５，６３１，２３６号（アデノウイルスベクターに関する）、同第５，６７２，５１０号（レトロウイルスベクターに関する）、同第５，６３５，３９９号（サイトカインを発現するレトロウイルスベクターに関する）に記載される。
【０２４４】
非ウイルス性送達法としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：リポソーム媒介移入、裸のＤＮＡ送達（直接注入）、レセプター媒介移入（リガンド−ＤＮＡ複合体）、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、および微小粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃）。遺伝子治療の材料および方法としてはまた、以下が挙げられ得る：誘導性プロモーター、組織特異的エンハンサー−プロモーター、部位特異的組込みのために設計されたＤＮＡ配列、親細胞を超える選択的利点を提供し得るＤＮＡ配列、形質転換された細胞を同定するための標識、ネガティブ選択系および発現制御系（安全手段）、細胞特異的結合因子（細胞標的化のための）、細胞特異的内部移行因子、およびベクターによる発現を増強するための転写因子、ならびにベクター製造法。遺伝子治療技術の実施のためのこのようなさらなる方法および材料は、以下に記載される：米国特許第４，９７０，１５４号（エレクトロポレーション技術に関する）、同第５，６７９，５５９号（遺伝子送達のためのリポタンパク質を含む系を記載する）、同第５，６７６，９５４号（リポソームキャリアに関する）、同第５，５９３，８７５号（リン酸カルシウムトランスフェクションのための方法を記載する）、および同第４，９４５，０５０号（プロセス（ここで、生物学的に活性な粒子が、ある速度で細胞にて推進され、これによりこの粒子が細胞の表面を貫通しそして細胞の内部へ組み込まれる）を記載する）およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／４０９５８（核リガンドに関する）。
【０２４５】
ＴＥＭ７αの遺伝子治療または細胞治療はさらに、同一または異なる細胞内への１つ以上のさらなるポリペプチドの送達を含み得ることがまた企図される。このような細胞は、患者へ別々に導入され得るか、またはこの細胞は、単一の移植可能なデバイス（例えば、上記のカプセル化膜）に含まれ得るか、またはこの細胞は、ウイルスベクターによって別々に改変され得る。
【０２４６】
遺伝子治療によって細胞内で内因性ＴＥＭ７αポリペプチド発現を増加させる手段は、ＴＥＭ７αポリペプチドプロモーター内に１つ以上のエンハンサーエレメントを挿入することであり、ここで、このエンハンサーエレメントは、ＴＥＭ７α遺伝子の転写活性を増加させるように働き得る。使用したこのエンハンサーエレメントは、遺伝子が活性化されることが望まれる組織に基いて選択され、この組織でプロモーター活性を付与することが知られているエンハンサーエレメントが選択される。例えば、ＴＥＭ７αポリペプチドをコードする遺伝子がＴ細胞内で「オンされる」場合、ｌｃｋプロモーターエンハンサーエレメントが使用され得る。ここで、添加されるべき転写エレメントの機能的部分が、標準的なクローニング技術を使用してＴＥＭ７αポリペプチドプロモーターを含むＤＮＡのフラグメントに（そして必要に応じて、ベクター、ならびに／あるいは配列の５’隣接配列および／または３’隣接配列に）挿入され得る。次いで、「相同組換え構築物」として知られるこの構築物は、エキソビボまたはインビボのいずれかで所望の細胞に導入され得る。
【０２４７】
遺伝子治療をまた使用して、内因性プロモーターのヌクレオチド配列を改変することによってＴＥＭ７αポリペプチド発現を減少し得る。このような改変は、典型的には、相同組換え法を介して達成される。例えば、活性化について選択されたＴＥＭ７α遺伝子のプロモーターの全てまたは一部を含むＤＮＡ分子は、転写を調節するプロモーターの小片を除去および／または置換するように操作され得る。例えば、ＴＡＴＡボックスおよび／またはプロモーターの転写アクチベーターの結合部位は、標準的な分子生物学的技術を使用して欠失され得る；このような欠失は、プロモーター活性を阻害し得これにより対応するＴＥＭ７α遺伝子の転写を抑制し得る。プロモーター中のＴＡＴＡボックスまたは転写アクチベーター結合部位の欠失は、（調節されるべきＴＥＭ７α遺伝子として、同一種または関連種由来の）ＴＥＭ７αポリペプチドプロモーターの全てまたは関連部分を含むＤＮＡ構築物を作製することによって達成され得、ここで、１つ以上のＴＡＴＡボックスおよび／または転写アクチベーター結合部位ヌクレオチドは、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失および／または挿入を介して変異される。結果として、ＴＡＴＡボックスおよび／またはアクチベーター結合部位は、減少した活性を有するか、または完全に不活性にされる。この構築物（これはまた、典型的には、改変されたプロモーターセグメントにネイティブな（内因性の）隣接する５’ＤＮＡ配列および３’ＤＮＡ配列に対応する少なくとも約５００塩基のＤＮＡを含む）は、（エキソビボまたはインビボのいずれかで）直接的にかまたは本明細書中に記載されるようなウイルスベクターを介してかのいずれかで適切な細胞内に導入され得る。典型的には、細胞のゲノムＤＮＡへの構築物の組込みは、相同組換えを介し、ここで、プロモーター構築物中の５’ＤＮＡ配列および３’ＤＮＡ配列は、内因性染色体ＤＮＡへのハイブリダイゼーションを介する改変されたプロモーター領域の組込みを補助するように働き得る。
【０２４８】
（治療用途）
ＴＥＭ７αの核酸分子、ポリペプチド、ならびにそれらのアゴニストおよびアンタゴニストを使用して、多くの疾患、障害または状態（本明細書中に列挙されるものを含む）を処置、診断、改善または予防し得る。
【０２４９】
ＴＥＭ７αポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストとしては、ＴＥＭ７αポリペプチド活性を調節し、そしてＴＥＭ７αポリペプチドの成熟形態の少なくとも１つの活性を増加または減少させる分子を含む。アゴニストまたはアンタゴニストは、ＴＥＭ７αポリペプチドと相互作用しそれによりその活性を調節する補因子（例えば、タンパク質、ペプチド、炭化水素、脂質、または低分子）であり得る。潜在的なポリペプチドアゴニストまたはアンタゴニストとしては、ＴＥＭ７αタンパク質の細胞外ドメインの一部または全てを含むＴＥＭ７αポリペプチドの可溶性形態または膜結合形態のいずれかと反応する抗体が挙げられる。ＴＥＭ７αポリペプチド発現を調節する分子としては、典型的には、発現のアンチセンス調節因子として働き得る、ＴＥＭ７αポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。
【０２５０】
ＴＥＭ７の発現は、結腸直腸腫瘍における血管の内皮コンパートメント中に検出された（Ｓｔ．Ｃｒｏｉｘら、２０００、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８９：１１９７−２０２）。よって、ＴＥＭ７αポリペプチドは、原発性腫瘍および転移性腫瘍における新脈管形成の調節において役割を担い得る。よって、ＴＥＭ７αの核酸分子、ポリペプチド、それらのアゴニストおよびアンタゴニスト（抗ＴＥＭ７α選択的結合因子が挙げられるが、これに限定されない）は、癌疾患の処置または診断についての代理マーカーとして有用である。このような疾患の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：結腸直腸癌、乳癌、肺癌、胃癌、前立腺癌および肝癌。他の原発性癌疾患および転移性癌疾患は、本発明の範囲内に含まれる。
【０２５１】
ＴＥＭ７αポリペプチドはまた、炎症性疾患における新脈管形成の制御において役割を担い得る。よって、ＴＥＭ７αの核酸分子、ポリペプチド、これらのアゴニストおよびアンタゴニスト（抗ＴＥＭ７α選択的結合因子を含むがこれに限定されない）は、炎症性疾患の処置または診断に有用であり得る。このような疾患の例としては、慢性関節リウマチおよび炎症性腸疾患が挙げられるがこれらに限定されない。他の炎症性疾患は、本発明の範囲内に含まれる。
【０２５２】
ＴＥＭポリペプチド（ＴＥＭ７を含む）はまた、肺において検出された（例えば、Ｓｔ．Ｃｒｏｉｘら、２０００を参照のこと）。よって、ＴＥＭ７αの核酸分子、ポリペプチド、これらのアゴニストおよびアンタゴニスト（ＴＥＭ７α選択的結合因子を含むが、これに限定されない）は、肺に関与する疾患の処置または診断に有用であり得る。このような疾患の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：喘息、気管支痙攣、および急性呼吸窮迫症候群。肺に関連する他の疾患は、本発明の範囲内に含まれる。
【０２５３】
ＴＥＭポリペプチド（ＴＥＭ７を含む）はまた、心臓において検出された（例えば、Ｓｔ．Ｃｒｏｉｘら、２０００を参照のこと）。よって、ＴＥＭ７αの核酸分子、ポリペプチド、これらのアゴニストおよびアンタゴニスト（ＴＥＭ７α選択的結合因子を含むが、これに限定されない）は、心臓に関与する疾患の処置または診断に有用であり得る。このような疾患の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：不整脈、アンギナ、高血圧、心筋梗塞およびうっ血性心不全。心臓に関連する他の疾患は、本発明の範囲内に含まれる。
【０２５４】
ＴＥＭポリペプチド（ＴＥＭ７を含む）はまた、腎臓において検出された（例えば、Ｓｔ．Ｃｒｏｉｘら、２０００を参照のこと）。よって、ＴＥＭ７αの核酸分子、ポリペプチド、これらのアゴニストおよびアンタゴニスト（ＴＥＭ７α選択的結合因子を含むが、これに限定されない）は、腎臓に関与する疾患の処置または診断に有用であり得る。このような疾患の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：多発性嚢胞腎疾患、および急性腎不全。腎臓に関連する他の疾患は、本発明の範囲内に含まれる。
【０２５５】
ＴＥＭ７αポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストは、処置されるべき状態に適切なように１つ以上のサイトカイン、増殖因子、抗生物質、抗炎症剤および／または化学療法剤と組合わせて（同時にかまたは連続して）使用され得る。
【０２５６】
所望されないレベルのＴＥＭ７αポリペプチドによって生じるかまたは媒介される他の疾患は、本発明の範囲内に含まれる。所望されないレベルとしては、過剰レベルのＴＥＭ７αポリペプチドおよび正常未満レベルのＴＥＭ７αポリペプチドが挙げられる。
【０２５７】
（ＴＥＭ７α核酸およびＴＥＭ７αポリペプチドの使用）
本発明の核酸分子（それ自体は生物学的に活性なポリペプチドをコードしない核酸分子を含む）を使用して、ＴＥＭ７α遺伝子および関連遺伝子の染色体上の位置をマッピングし得る。マッピングは、ＰＣＲ増幅およびインサイチュハイブリダイゼーションのような、当該分野において公知の技術によって行われ得る。
【０２５８】
ＴＥＭ７α核酸分子（それ自体は生物学的に活性なポリペプチドをコードしない核酸分子を含む）は、哺乳動物組織または体液サンプル中のＴＥＭ７α核酸分子の存在について定性的または定量的のいずれかで試験するための診断アッセイにおけるハイブリダイゼーションプローブとして有用であり得る。
【０２５９】
他の方法はまた、１つ以上のＴＥＭ７αポリペプチドの活性を阻害することが好ましい場合に使用され得る。このような阻害は、発現制御配列（三重ヘリックス形成）またはＴＥＭ７α  ｍＲＮＡに相補的かつこれらにハイブリダイズする核酸分子によって影響され得る。例えば、ＴＥＭ７α遺伝子の少なくとも一部に相補的な配列を有するアンチセンスＤＮＡ分子またはアンチセンスＲＮＡ分子が、細胞内に導入され得る。アンチセンスプローブは、本明細書中に開示されるＴＥＭ７α遺伝子の配列を使用して利用可能な技術によって設計され得る。典型的には、このようなアンチセンス分子の各々は、選択されたＴＥＭ７α遺伝子の各々の開始部位（５’末端）に相補的である。次いで、アンチセンス分子が対応するＴＥＭ７α  ｍＲＮＡにハイブリダイズする場合、このｍＲＮＡの翻訳は、阻止されるかまたは減少される。アンチセンスインヒビターは、細胞または生物中のＴＥＭ７αポリペプチドの減少または非存在に関する情報を提供する。
【０２６０】
あるいは、１つ以上のＴＥＭ７αポリペプチドの優性ネガティブインヒビターを作製するために、遺伝子治療が使用され得る。この状況において、本明細書中に記載されるようなウイルス法または非ウイルス法のいずれかを使用して、選択されたＴＥＭ７αポリペプチド各々の変異ポリペプチドをコードするＤＮＡが調製され得、そして、患者の細胞中に導入され得る。このような変異の各々は、典型的には、その生物学的役割において内因性ポリペプチドと競合するように設計される。
【０２６１】
さらに、（生物学的に活性またはそうでない）ＴＥＭ７αポリペプチドは、免疫原として使用され得、すなわち、このポリペプチドは、抗体が惹起され得る少なくとも１つのエピトープを含む。（本明細書中に記載されるような）ＴＥＭ７αポリペプチドに結合する選択的結合因子が、体液または細胞サンプル中のＴＥＭ７αポリペプチドの存在を検出するために標識された形態における使用を含むが、これに限定されない、インビボ診断目的およびインビトロ診断目的のために使用され得る。抗体をまた使用して、多くの疾患および障害（本明細書中に列挙されるものを含む）を予防、処置または診断し得る。抗体は、ＴＥＭ７αポリペプチドに特徴的な活性の少なくとも１つを減少またはブロックするように、ＴＥＭ７αポリペプチドに結合し得るか、またはＴＥＭ７αポリペプチドに特徴的な活性の少なくとも１つを増加する（ＴＥＭ７αポリペプチドの薬物動態学を増加させることを含む）ようにポリペプチドに結合し得る。
【０２６２】
ＴＥＭ７αポリペプチドは、「発現クローニング」ストラテジーを使用してＴＥＭ７αリガンドをクローニングするために使用され得る。放射標識された（１２５ヨード）ＴＥＭ７αポリペプチドまたは「親和性／活性タグ化」ＴＥＭ７αポリペプチド（例えば、Ｆｃ融合物またはアルカリホスファターゼ融合物）を結合アッセイに使用して、ＴＥＭ７αリガンドを発現する細胞型、細胞株または組織を同定し得る。次いで、このような細胞または組織より単離されたＲＮＡを、ｃＤＮＡへ変換し得、哺乳動物発現ベクターにクローニングし得、そして哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳまたは２９３）にトランスフェクトして発現ライブラリーを作製し得る。次いで、放射標識されたかまたはタグ化されたＴＥＭ７αポリペプチドを親和性試薬として使用して、ＴＥＭ７αリガンドを発現するこのライブラリー中の細胞のサブセットを同定および単離し得る。次いで、ＤＮＡを、これらの細胞より単離し、そして哺乳動物細胞にトランスフェクトして二次発現ライブラリーを作製し、ここで、ＴＥＭ７αリガンドを発現する細胞の画分は、もともとのライブラリーにおいてよりも数倍高い。この富化プロセスは、ＴＥＭ７αリガンドを含む単一の組換えクローンが単離されるまで、反復性に繰り返され得る。ＴＥＭ７αリガンドの単離は、ＴＥＭ７αシグナル伝達経路の新規なアゴニストおよびアンタゴニストを同定または開発するために有用である。このようなアゴニストおよびアンタゴニストとしては、ＴＥＭ７αリガンド、抗ＴＥＭ７αリガンド抗体、低分子またはアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【０２６３】
本発明のマウスおよびヒトのＴＥＭ７α核酸はまた、対応する染色体ＴＥＭ７αポリペプチド遺伝子を単離するために有用なツールである。例えば、ＴＥＭ７α配列を含有するマウス染色体ＤＮＡを使用して、ノックアウトマウスを構築し得、これにより、ＴＥＭ７αポリペプチドについてのインビボでの役割の実験を可能にする。ヒトＴＥＭ７αゲノムＤＮＡを使用して、遺伝性の組織分解疾患を同定し得る。
【０２６４】
ヒトおよびマウスのＴＥＭ７αポリペプチドをコードするｃＤＮＡ（それぞれ、登録番号ＰＴＡ−３１９９およびＰＴＡ−３２００を有する）の寄託は、２００１年３月２３日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９になされた。
【０２６５】
以下の実施例は、例示の目的のみに意図され、本発明の範囲をいかようにも限定するようには解釈されるべきではない。
【実施例】
【０２６６】
（実施例１：マウスおよびヒトのＴＥＭ７αポリペプチド遺伝子のクローニング）
一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上述）に記載されるような材料および方法を使用して、マウスＴＥＭ７αポリペプチドをコードする遺伝子をクローニングおよび分析した。
【０２６７】
ヒトＴＥＭ７  ｃＤＮＡ配列をプローブとして使用して、私的に示された配列タグデータベースおよび公的に示された配列タグ（ＥＳＴ）データベースにおいてマウスＴＥＭ７α遺伝子に対応する配列を同定した。ヒトＴＥＭ７に対して中程度の相同性（すなわち、約６０％）を有する７つのクローンを見出した；１つのクローンは、マウスＴＥＭ７α遺伝子についての全長コード配列を含むことが見出された。マウスＴＥＭ７α  ｃＤＮＡ配列を、上記で同定されたＥＳＴクローン由来のアンプリマー（５’−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−３’（配列番号９）、および５’−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−３’（配列番号１０））を使用するＰＣＲによってマウス肺第１鎖ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）より単離した。この増幅反応において生成したＰＣＲ産物を、ｐＣＲＩＩベクターにサブクローニングし、そして配列決定した。ヒトＴＥＭ７α遺伝子についてのコンセンサス配列を、少なくとも４つのクローンについて得られた配列より導き出した。
【０２６８】
マウスＴＥＭ７αポリペプチドについての全長ｃＤＮＡの配列分析は、この遺伝子が、５３０アミノ酸のタンパク質をコードする１５９０ｂｐのオープンリーディングフレームを含むことを、示した。図１Ａ〜１Ｃは、マウスＴＥＭ７α核酸配列のヌクレオチド配列およびマウスＴＥＭ７αポリペプチドの推定のアミノ酸配列を示す。
【０２６９】
マウスＴＥＭ７α配列をプローブとして使用して、私的ヒトゲノム配列データベース中のヒトＴＥＭ７α遺伝子について全てであるが２つのエキソンに対応する配列を同定した。ヒトＴＥＭ７α  ｃＤＮＡ配列を、ヒトＴＥＭ７α遺伝子の推定のエキソン配列より得られたアンプリマー（５’−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−３’；配列番号１１、および５’−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−３’；配列番号１２）を使用するＰＣＲによってヒト心臓ｃＤＮＡライブラリーパネル（ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）より単離した。この第１のアンプリマー対を用いていくつかのポジティブｃＤＮＡプールを同定した後、ヒトＴＥＭ７α遺伝子についての全長コード配列を、第２のアンプリマー対（５’−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｃ−３’；配列番号１３、および５’−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−３’；配列番号１４）を用いて単離した。この第２の増幅反応において生成したＰＣＲ産物を、ｐＣＲＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングし、そして配列決定した。ヒトＴＥＭ７α遺伝子についてのコンセンサス配列を、少なくとも４つのクローンについて得られた配列から導き出した。
【０２７０】
ヒトＴＥＭ７αポリペプチドについての全長ｃＤＮＡの配列分析は、この遺伝子が、５２９アミノ酸のタンパク質をコードする１５８７ｂｐのオープンリーディングフレームを含むことを、示した。図２Ａ〜２Ｃは、ヒトＴＥＭ７α核酸配列のヌクレオチド配列およびヒトＴＥＭ７αポリペプチドの推定のアミノ酸配列を示す。
【０２７１】
ＴＥＭ７α遺伝子は、腫瘍内皮マーカー７（ＴＥＭ７）に関連するポリペプチドをコードする（Ｓｔ．Ｃｒｏｉｘら、２０００、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８９：１１９７−２０２）。図３Ａ〜３Ｂは、ヒトＴＥＭ７αポリペプチド（ｈｕＴＥＭ７α；配列番号４）、マウスＴＥＭ７αポリペプチド（ｍｕＴＥＭ７α；配列番号２）、ヒトＴＥＭ７ポリペプチド（ｈｕＴＥＭ７；配列番号５）およびマウスＴＥＭ７ポリペプチド（ｍｕＴＥＭ７；配列番号６）のアミノ酸配列アラインメントを示す。ヒトＴＥＭ７α遺伝子は、ヒトＴＥＭ７遺伝子と６３．５％の類似性を有し、そしてヒトＴＥＭ７αポリペプチドは、ヒトＴＥＭ７ポリペプチドと６０％の類似性を有する。ヒトおよびマウス両方のＴＥＭ７αポリペプチドの構造は、ＴＥＭ７ポリペプチドの構造を類似し、ここで、両方のポリペプチドは、Ｎ末端の推定のシグナルペプチド配列およびＣ末端付近の膜貫通ドメインを含み、このことは、ＴＥＭ７αが膜結合タンパク質であることを示す。
【０２７２】
ヒトＴＥＭ７αポリペプチド（ｈｕＴＥＭ７ａ；配列番号４）、マウスＴＥＭ７αポリペプチド（ｍｕＴＥＭ７ａ；配列番号２）、ヒトＴＥＭ７ポリペプチド（ｈｕＴＥＭ７；配列番号５）およびマウスＴＥＭ７ポリペプチド（ｍｕＴＥＭ７；配列番号６）についてのアミノ酸配列をまた、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアルゴリズム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９４、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３−８０）を使用して整列した。ヒトのＴＥＭ７α配列およびＴＥＭ７配列ならびにマウスのＴＥＭ７α配列およびＴＥＭ７配列（図４Ａ〜４Ｂ）のＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ整列は、ヒトＴＥＭ７αポリペプチドが多くの位置で非保存的アミノ酸置換を許容し、さらに保存的アミノ酸置換がヒトＴＥＭ７αアミノ酸配列中のいくつかの他の位置（例えば、位置５０、７２、８２、１７５、３８６、３９６、４０２および４７０で）で起こり得ることを示唆する。Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ（主にＳｍａｒｔデータベースおよびＰｆａｍデータベース由来の機能ドメインおよび構造ドメインの収集）に対するヒトおよびマウスのＴＥＭ７αオルソログのＢＬＡＳＴ分析は、これらのタンパク質が少なくとも１つの保存されたタンパク質ドメイン（すなわち、Ｐｌｅｘｉｎリピートドメイン（いくつかの細胞外レセプター（Ｐｌｅｘｉｎレセプター、マホガニーレセプターおよびＭｅｔレセプターを含む）中に見出されるシステインリッチドメイン）（図５））をまた有することを示した。ここで、このシステイン残基は、ジスルフィド結合の形成に関与し得る。ＢＬＡＳＴ分析はまた、マウスＴＥＭ７αアミノ酸配列がまたＮＩＤＯドメイン（ニドゲン（ｎｉｄｏｇｅｎ）（エンタクチン（ｅｎｔａｃｔｉｎ））に見られる細胞外ドメイン）を有することを示した。
【０２７３】
ヒトＴＥＭ７α遺伝子の配列を使用して、ＣＥＬＥＲＡヒトゲノムＤＮＡ配列データベースを検索した。ヒトＴＥＭ７α遺伝子は、約４６５ｋｂにわたり１４個のエキソンおよび１３個のイントロンから構成されることが、見出された。Ｆｉｃｈａｎｔの法則（Ｆｉｃｈａｎｔ、１９９２、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：２５９−６７）を使用して、推定のエキソン／イントロン連結の全てがＣＥＬＥＲＡデータベースで同定された（表ＩＩＩ）。ＴＥＭ７αに関するエキソン／イントロン連結の位置および数は、ＴＥＭ７のものと類似し、このことは、これらの２つの遺伝子が共通の祖先に由来することを示唆する。
【０２７４】
（表ＩＩＩ：ヒトＴＥＭ７α遺伝子のエキソン／イントロン境界）
【０２７５】
【表３】
2005516582.tif 000005
＊推定のエキソン／イントロン連結を、Ｆｉｃｈａｎｔ，１９９２によって記載されるように同定した；コンセンサススプライシングドナー配列およびアクセプター配列中の不変のヌクレオチドに下線を付した；エキソン配列を大文字で、そしてイントロン配列を小文字で示した。
【０２７６】
ヒトＴＥＭ７α遺伝子の染色体位置を、ＢＡＣクローンに対するヒトＴＥＭ７α遺伝子に対応する配列のハイブリダイゼーションによって決定した。ヒトＴＥＭ７αについてのエキソン配列を、ヒト第１０染色体にマッピングされたＢＡＣクローン番号３３７Ｎ１９に見出した。ヒトＴＥＭ７α配列をまた、ＣＥＬＥＲＡヒトゲノムデータベースからの大きなコンティグ配列中に同定した。このコンティグはまた、以下の遺伝子を含むことが見出された：マクロファージマンノースレセプター（ＭＲＣ１；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＭ＿１６７４１５）、ＡＦ−１０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ１３９４８）およびネブレット（ｎｅｂｕｌｅｔｔｅ）（ＮＥＢＬ；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００６３９３）。ＭＲＣ１遺伝子は、ＴＥＭ７α遺伝子から約２０００ｋｂ上流（ｄｉｓｔａｌ）に位置され、そしてＮＥＢＬ遺伝子およびＡＦ１０遺伝子は、それぞれＴＥＭ７α遺伝子から約６００ｋｂおよび１２５０ｋｂ下流（ｐｒｏｘｉｍａｌ）に位置される（図６）。これらの遺伝子の全てが、ヒト染色体１０ｐ１２−ｐ１３にマッピングされ、このことは、ヒトＴＥＭ７α遺伝子が同様にこの領域に位置されることを示す。この領域は、混合系統リンパ球（ＭＬＬ）を有する幾人かの患者における転座事象に関与することが示されたので、ヒトＴＥＭ７α遺伝子発現は、白血病の転座マーカーとして働き得る。
【０２７７】
（実施例２：ＴＥＭ７α  ｍＲＮＡ発現）
ヒトＴＥＭ７αの発現を、実施例１に記載したような推定のエキソン配列由来のアンプリマー（５’−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−３’；配列番号１１、および５’−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−３’；配列番号１２）を使用するＰＣＲによって分析した。予想したＰＣＲ産物（５２７ｂｐ）を、心臓、肺、腎臓、膵臓、胎盤、脳および骨格筋において検出した。予想したＰＣＲ産物を、肝臓には検出しなかった。肺および腎臓で検出した高発現のＴＥＭ７αは、ＴＥＭ７の発現パターン（Ｓｔ．Ｃｒｏｉｘら、２０００、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８９：１１９７−２０２）と類似する。ＴＥＭ７もまた、結腸直腸腫瘍における血管の内皮コンパートメントで上昇したことを示した。ＴＥＭ７（およびＴＥＭファミリーの他のメンバー）の発現もまた、肺、胸部、脳および膵臓の肉腫および原発性腫瘍で示した。さらに、ＴＥＭ発現を、転移性内皮組織で示した。
【０２７８】
ＴＥＭ７α  ｍＲＮＡ発現を、複数のヒト組織のノザンブロット（ＭＴＮブロット＃７７６０−１；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で分析した。ＴＥＭ７αプローブを、Ｒａｎｄｏｍ  Ｐｒｉｍｅ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＮＣ）を使用して全長ヒトＴＥＭ７α  ｃＤＮＡから作製した。このプローブを、標準的技術を使用して３２Ｐ−ｄＡＴＰで標識した。
【０２７９】
ノザンブロットを、Ｓｔａｒｋ溶液（５０％ホルムアルデヒド、５０ｍＭリン酸カリウム、５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、５×デンハルト溶液、０．０５％ザルコシル、および３００□ｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ）中にて４２℃で２時間プレハイブリダイズし、次いで、標識したプローブを含む新鮮なハイブリダイゼーション溶液中にて４２℃で一晩ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、フィルターを、６×ＳＳＣ中にて室温でリンスし、次いで、０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中にて４２℃で３０分間２度洗浄した。次いで、このブロットを、ホスホロ画像化カセット（ｐｈｏｓｐｈｏｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｃａｓｓｅｔｔｅ）(Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）中で一晩露光し、ホスホロ画像化リーダーで走査した。図７は、ノザンブロット分析によって検出した場合のＴＥＭ７α  ｍＲＮＡの発現を示す。
【０２８０】
ＴＥＭ７α  ｍＲＮＡの発現を、インサイチュハイブリダイゼーションによって位置付ける。正常な胎児および成体のマウス組織のパネルを、４％パラホルムアルデヒド中で固定し、パラフィン中で包埋し、そして５μｍで切片化する。切片化した組織を、０．２Ｍ  ＨＣｌ中で透過性にし、プロテイナーゼＫで消化し、そしてトリエタノールアミンおよび無水酢酸でアセチル化する。切片を、ハイブリダイゼーション溶液（３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１×デンハルト溶液、０．２％ＳＤＳ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．２５ｍｇ／ｍｌ  ｔＲＮＡ、２５μｇ／ｍｌポリＡ、２５μｇ／ｍｌポリＣおよび５０％ホルムアミド）中にて６０℃で１時間プレハイブリダイズし、次いで、１０％デキストランおよび２×１０４ｃｐｍ／μｌの３３Ｐ−標識したアンチセンスリボプローブ（ヒトＴＥＭ７α遺伝子に相補的）を含む同一の溶液中にて６０℃で一晩ハイブリダイズする。このリボプローブを、標準的技術を使用して、ヒトＴＥＭ７α  ｃＤＮＡ配列を含むクローンのインビトロ転写によって得る。
【０２８１】
ハイブリダイゼーション後、切片を、ハイブリダイゼーション溶液中でリンスし、ＲＮａｓｅＡで処理してハイブリダイズしていないプローブを消化し、次いで、０．１×ＳＳＣ中にて５５℃で３０分間洗浄する。次いで、切片を、ＮＴＢ−２エマルジョン（Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）中に浸漬し、４℃で３週間露光し、現像し、そしてヘマトキシリンおよびエオシンで対比染色する。組織形態およびハイブリダイゼーションシグナルを、以下について暗視野および標準的照明によって同時に分析する：脳（１つの矢状切片および２つの冠状切片）、胃腸管（食道、胃、十二指腸、空腸、回腸、上行結腸および下行結腸）、下垂体、肝臓、肺、心臓、脾臓、胸腺、リンパ節、腎臓、副腎、膀胱、膵臓、唾液腺、雄性生殖器官および雌性生殖器官（雌性において卵巣、卵管および子宮；ならびに雄性において精巣、精巣上体、前立腺、精嚢、および精管）、ＢＡＴおよびＷＡＴ（皮下、腎臓周囲（ｐｅｒｉ−ｒｅｎａｌ）、骨（大腿）、皮膚、胸部、ならびに骨格筋。
【０２８２】
（実施例３：ＴＥＭ７αポリペプチドの産生）
（Ａ．細菌でのＴＥＭ７αポリペプチド発現）
ＰＣＲを使用して、ＴＥＭ７αポリペプチドをコードするテンプレートＤＮＡ配列の５’末端および３’末端に対応するプライマーを用いてこの配列を増幅する。この増幅したＤＮＡ産物を、発現ベクターへの挿入を可能にするための制限酵素部位を含むように改変し得る。ＰＣＲ産物をゲル精製し、そして標準的組換えＤＮＡ方法論を使用して発現ベクターに挿入する。ｌｕｘプロモーター、およびカナマイシン耐性をコードする遺伝子を含む例示的ベクター（例えば、ｐＡＭＧ２１（ＡＴＣＣ番号９８１１３））を、挿入したＤＮＡの指向性クローニングのためにＢａｍＨＩおよびＮｄｅＩで消化する。連結した混合物を、エレクトロポレーションによってＥ．ｃｏｌｉ宿主株に形質転換し、そして形質転換体を、カナマイシン耐性について選択する。選択したコロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、そして挿入物の存在を確認するためにＤＮＡ配列決定に供する。
【０２８３】
形質転換した宿主細胞を、３０μｇ／ｍＬカナマイシンを含む２×ＹＴ培地中にて３０℃でインキュベートした後、誘導する。遺伝子発現を、Ｎ−（３−オキソヘキサノイル）−ｄｌ−ホモセリンラクトンを最終濃度３０ｎｇ／ｍＬで添加することによって誘導し、続いて、３０℃または３７℃のいずれかで６時間インキュベートする。ＴＥＭ７αポリペプチドの発現を、培養物の遠心分離、再懸濁および細胞性ペレットの溶解、ならびにＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による宿主細胞タンパク質の分析によって評価する。
【０２８４】
ＴＥＭ７αポリペプチドを含む封入体を、以下のように精製する。遠心分離によって細菌細胞をペレット化し、そして水中に再懸濁する。この細胞懸濁物を、超音波処理によって溶解し、そして１９５，０００×ｇで５〜１０分間の遠心分離によってペレット化する。この上清を捨て、そしてこのペレットを洗浄し、ホモジナイザーに移す。このペレットを、５ｍＬのＰｅｒｃｏｌｌ溶液（７５％液体Ｐｅｒｃｏｌｌおよび０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）中で均一に懸濁するまでホモジナイズし、次いで、希釈し、２１，６００×ｇで３０分間遠心分離する。封入体を含む勾配画分を回収し、そしてプールする。単離した封入体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。
【０２８５】
Ｅ．ｃｏｌｉによって産生されたＴＥＭ７αポリペプチドに対応する、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上の単一のバンドを、ゲルから切り出し、そしてＮ末端アミノ酸配列を、Ｍａｔｓｕｄａｉｒａら、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１０−３５によって本質的に記載されるように決定する。
【０２８６】
（Ｂ．哺乳動物細胞でのＴＥＭ７αポリペプチドの発現）
ＰＣＲを使用して、ＴＥＭ７αポリペプチドをコードするテンプレートＤＮＡ配列の５’末端および３’末端に対応するプライマーを用いてこの配列を増幅する。この増幅したＤＮＡ産物を、発現ベクターへの挿入を可能にするための制限酵素部位を含むように改変し得る。ＰＣＲ産物をゲル精製し、そして標準的組換えＤＮＡ方法論を使用して発現ベクターに挿入する。エプスタインバーウイルス複製起点を含む例示的発現ベクター（ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、２９３−ＥＢＮＡ−１細胞でのＴＥＭ７αポリペプチドの発現のために使用し得る。増幅およびゲル精製したＰＣＲ産物を、ｐＣＥＰ４ベクターに連結し、そしてリポフェクションによって２９３−ＥＢＮＡ細胞に形質導入する。トランスフェクトした細胞を、１００μｇ／ｍＬハイグロマイシンにて選択し、そして生じた薬物耐性培養物を、コンフルエントまで増殖させる。次いで、この細胞を、無血清培地中で７２時間培養する。馴化培地を回収し、そしてＴＥＭ７αポリペプチド発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。
【０２８７】
ＴＥＭ７αポリペプチド発現を、銀染色によって検出し得る。あるいは、ＴＥＭ７αポリペプチドを、このペプチドタグに対する抗体を使用するウエスタンブロット分析によって検出し得るエピトープタグ（例えば、ＩｇＧ定常ドメインまたはＦＬＡＧエピトープ）との融合タンパク質として産生する。
【０２８８】
ＴＥＭ７αポリペプチドを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから切り出し得るか、またはＴＥＭ７α融合タンパク質を、エピトープタグに対するアフィニティクロマトグラフィーによって精製して本明細書中に記載されるようなＮ末端アミノ酸配列分析に供する。
【０２８９】
（Ｃ．哺乳動物細胞でのＴＥＭ７αポリペプチドの発現および精製）
ＴＥＭ７αポリペプチド発現構築物を、リポフェクションプロトコルまたはリン酸カルシウムプロトコルのいずれかを使用して２９３ＥＢＮＡ細胞またはＣＨＯ細胞に導入する。
【０２９０】
産生したＴＥＭ７αポリペプチドに対する機能的研究を行うために、多量の馴化培地を、ハイグロマイシン選択２９３ＥＢＮＡクローンのプールから生成する。この細胞を、５００ｃｍのＮｕｎｃ  Ｔｒｉｐｌｅ  Ｆｌａｓｋ中で８０％コンフルエントに増殖させ、その後、無血清培地に交換した１週間後に培地を回収する。馴化培地を回収し、そして精製まで−２０℃で凍結する。
【０２９１】
馴化培地を、以下に記載するようなアフィニティクロマトグラフィーによって精製する。この培地を融解し、次いで、０．２μｍフィルターを通す。プロテインＧカラムをＰＢＳ（ｐＨ７．０）で平衡化し、次いで、濾過した培地をロードする。Ａ２８０での吸光度が基底線に達するまで、このカラムをＰＢＳで洗浄する。ＴＥＭ７αポリペプチドを、０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．７）でカラムから溶出し、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で直ちに中和する。ＴＥＭ７αポリペプチドを含む画分をプールし、ＰＢＳに透析し、そして−７０℃で保存する。
【０２９２】
ヒトＴＥＭ７αポリペプチド−Ｆｃ融合ポリペプチドの第Ｘａ因子切断のために、アフィニティクロマトグラフィー精製したタンパク質を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２に透析する。制限プロテアーゼ第Ｘａ因子を、透析したタンパク質に１／１００（ｗ／ｗ）で添加し、そしてこのサンプルを室温で一晩消化する。
【０２９３】
（実施例４：抗ＴＥＭ７αポリペプチド抗体の産生）
ＴＥＭ７αポリペプチドに対する抗体を、生物学的に生成した精製タンパク質または化学合成したＴＥＭ７αペプチドで免疫することによって取得し得る。抗体生成のための適切な手順としては、ＨｕｄｓｏｎおよびＢａｙ，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第２版、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）に記載されるような手順が挙げられる。
【０２９４】
抗体生成のための１つの手順において、動物（典型的にはマウスまたはウサギ）に、ＴＥＭ７α抗原（例えば、ＴＥＭ７αポリペプチド）を注入し、ＥＬＩＳＡによって決定されるような十分な血清力価レベルを有する動物を、ハイブリドーマ産生のために選択する。免疫化した動物の脾臓を収集しそして単一細胞懸濁物として調製し、そこから脾細胞を回収する。この脾細胞を、マウス骨髄腫細胞（例えば、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４細胞）に融合し、２００Ｕ／ｍＬペニシリン、２００μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシン、および４ｍＭグルタミンを含むＤＭＥＭ中でまずインキュベートし、次いで、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン）選択培地中でインキュベートする。選択後、この組織培養上清を、各融合ウェルから取り出し、そしてＥＬＩＳＡによって抗ＴＥＭ７α抗体産生について試験する。
【０２９５】
あるいは、抗ＴＥＭ７α抗体を得るための手順（例えば、ヒト抗体の産生のためのヒトＩｇ遺伝子座を有するトランスジェニックマウスの免疫化、および合成抗体ライブラリー（例えば、抗体可変ドメインの変異誘発によって生成されるライブラリー）のスクリーニング）をまた利用し得る。
【０２９６】
（実施例５：トランスジェニックマウスでのＴＥＭ７αポリペプチドの発現）
ＴＥＭ７αポリペプチドの生物学的活性を評価するために、肝臓特異的ＡｐｏＥプロモーターの制御下でＴＥＭ７αポリペプチド／Ｆｃ融合タンパク質をコードする構築物を調製する。この構築物の送達によって、ＴＥＭ７αポリペプチドの機能についての情報となる病理学的変化を引き起こされることを予想する。同様に、βアクチンプロモーターの制御下で全長ＴＥＭ７αポリペプチドを含む構築物を調製する。この構築物の送達によって、遍在性発現を生じることを予想する。
【０２９７】
これらの構築物を生成するために、ＰＣＲを使用して、所望の配列の５’末端および３’末端に対応するプライマー（これは、増幅産物の発現ベクターへの挿入を可能にする制限酵素部位を含む）を用いてＴＥＭ７αポリペプチドをコードするテンプレートＤＮＡ配列を増幅する。増幅後、ＰＣＲ産物をゲル精製し、適切な制限酵素で消化し、そして標準的組換えＤＮＡ技術を使用して発現ベクターに連結する。例えば、増幅したＴＥＭ７αポリペプチド配列を、Ｇｒａｈａｍら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１７：２７２−７４、およびＲａｙら、１９９１、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．５：２２６５−７３に記載されるように、ヒトβ−アクチンプロモーターの制御下で発現ベクター中にクローニングし得る。
【０２９８】
連結後、反応混合物を使用して、エレクトロポレーションによってＥ．ｃｏｌｉ宿主株を形質転換し、そして形質転換体を、薬物耐性について選択する。選択したコロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、そして適切な挿入物の存在および変異の非存在を確認するためにＤＮＡ配列決定に供する。ＴＥＭ７αポリペプチド発現ベクターを、２度のＣｓＣｌ密度勾配遠心分離によって精製し、適切な制限酵素で切断し、そしてＴＥＭ７αポリペプチド導入遺伝子を含む線状化フラグメントを、ゲル電気泳動によって精製する。この精製したフラグメントを、５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）および０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ中に２ｍｇ／ｍＬの濃度で再懸濁する。
【０２９９】
ＢＤＦ１×ＢＤＦ１交配マウス由来の単細胞胚に、記載される（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／２３６１４）ように注入する。胚を、ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養し、１５〜２０個の２細胞胚を、偽妊娠ＣＤ１雌性マウスの卵管に移す。マイクロインジェクションした胚の移植から得られた子孫を、以下のように、ゲノムＤＮＡサンプル中に組み込まれた導入遺伝子をＰＣＲ増幅することによってスクリーニングする。耳片を、２０ｍＬの耳緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  （ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＳＤＳおよび５００ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ）中にて５５℃で一晩消化する。次いで、このサンプルを、２００ｍＬのＴＥで希釈し、そして耳サンプル２ｍＬを、適切なプライマーを用いるＰＣＲ反応に使用する。
【０３００】
８週齢で、トランスジェニックファウンダー動物およびコントロール動物を、剖検および病理学的分析のために屠殺する。脾臓の一部を回収し、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してこの脾臓から総細胞ＲＮＡを単離し、そして導入遺伝子発現を、ＲＴ−ＰＣＲによって決定する。脾臓から回収したＲＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ  Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を以下のように使用してｃＤＮＡに変換する。発現ベクター配列中に位置しそしてＴＥＭ７αポリペプチド導入遺伝子の３’である適切なプライマーを使用して、導入遺伝子転写物からｃＤＮＡ合成をプライムする。トランスジェニックファウンダーおよびコントロールからの１０ｍｇの総脾臓ＲＮＡを、１ｍＭのプライマーとともに７０℃で１０分間インキュベートし、そして氷上に置く。次いで、この反応液に、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．１ｍＭ  ＤＴＴ、および２００ＵのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素を補充する。４２℃で５０分間のインキュベーション後、７２℃で１５分間加熱することによって反応を停止し、３７℃で２０分間、２ＵのＲＮａｓｅ  Ｈで消化する。次いで、サンプルを、ＴＥＭ７αポリペプチドに特異的なプライマーを用いるＰＣＲによって増幅する。
【０３０１】
（実施例６：トランスジェニックマウスでのＴＥＭ７αポリペプチドの生物学的活性）
安楽死の前に、トランスジェニック動物を秤量し、イソフルオランによって麻酔し、そして心臓穿刺によって放血させる。このサンプルを、血液学および血清化学分析に供する。放血終了（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｅｘｓａｎｇｕｉｎａｔｉｏｎ）後に、ラジオグラフィーを行う。全体的な切開の際に、主要な内臓器官を秤量分析に供する。
【０３０２】
全体的な切開後に、組織（すなわち、肝臓、脾臓、膵臓、胃、胃腸管全体、腎臓、生殖器官、皮膚および乳腺、骨、脳、心臓、肺、胸腺、気管、食道、甲状腺、副腎、膀胱、リンパ節および骨格筋）を回収し、組織学的試験のために１０％緩衝化Ｚｎ−ホルマリン中で固定する。固定後、この組織をパラフィンブロックに処理し、そして３ｍｍ切片を得る。ヘマトキシリンおよびエオシンで切片全てを染色し、次いで、組織学的分析に供する。
【０３０３】
トランスジェニックマウスおよびコントロールマウスの両方の脾臓、リンパ節およびパイアー斑を、以下のようなＢ細胞特異的抗体およびＴ細胞特異的抗体を用いる免疫組織学的分析に供する。ホルマリン固定化パラフィン包埋切片を、脱パラフィン化し、そして脱イオン水で水和させる。この切片を、３％過酸化水素水でクエンチし、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｌｏｃｋ（Ｌｉｐｓｈａｗ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）でブロックし、そしてラットモノクローナル抗マウスＢ２２０およびＣＤ３(Ｈａｒｌａｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）中でインキュベートする。抗体結合を、色素原としてＤＡＢ（ＢｉｏＴｅｋ，Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）を用いて、ビオチン化ウサギ抗ラット免疫グロブリンおよびペルオキシダーゼ複合体化ストレプトアビジン（ＢｉｏＧｅｎｅｘ，Ｓａｎ  Ｒａｍｏｎ，ＣＡ）によって検出する。切片を、ヘマトキシリンで対比染色する。
【０３０４】
剖検後、脾臓および胸腺のＭＬＮおよび切片を、トランスジェニック動物およびコントロール同腹仔から回収する。単一細胞懸濁物を、１００ｍｍのナイロンセルストレイナー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）の底に対してシリンジの平坦な末端を用いて組織を穏やかに磨りつぶすことによって調製する。細胞を２度洗浄し、計数し、次いで、各組織からの約１×１０６細胞を、２０μＬ容量中で０．５μｇ  ＣＤ１６／３２（ＦｃγＩＩＩ／ＩＩ）Ｆｃブロックとともに１０分間インキュベートする。次いで、サンプルを、１００μＬ容量のＰＢＳ（Ｃａ＋およびＭｇ＋を含まない）、０．１％ウシ血清アルブミン、および０．０１％アジ化ナトリウム中にて、ＣＤ９０．２（Ｔｈｙ−１．２）、ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）、ＣＤ１１ｂ（Ｍａｃ−１）、Ｇｒ−１、ＣＤ４またはＣＤ８(ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に対するＦＩＴＣ複合体化モノクローナル抗体またはＰＥ複合体化モノクローナル抗体（０．５μｇ）を用いて、２〜８℃で３０分間染色する。抗体結合後、細胞を洗浄し、次いで、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でのフローサイトメトリーによって分析する。
【０３０５】
本発明は好ましい実施形態に関して記載されているが、バリエーションおよび改変が当業者に思い浮かぶことが理解される。よって、添付の特許請求の範囲は請求されるような本発明の範囲内にあるこのような等価なバリエーションの全てを含むことが、意図される。
【図面の簡単な説明】
【０３０６】
【図１Ａ】図１Ａ〜図１Ｃは、マウスＴＥＭα遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）およびマウスＴＥＭαポリペプチドの推定アミノ酸配列（配列番号２）を例示する。
【図１Ｂ】図１Ａ〜図１Ｃは、マウスＴＥＭα遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）およびマウスＴＥＭαポリペプチドの推定アミノ酸配列（配列番号２）を例示する。
【図１Ｃ】図１Ａ〜図１Ｃは、マウスＴＥＭα遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）およびマウスＴＥＭαポリペプチドの推定アミノ酸配列（配列番号２）を例示する。
【図２Ａ】図２Ａ〜図２Ｃは、ヒトＴＥＭα遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号３）およびヒトＴＥＭαポリペプチドの推定アミノ酸配列（配列番号４）を例示する。
【図２Ｂ】図２Ａ〜図２Ｃは、ヒトＴＥＭα遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号３）およびヒトＴＥＭαポリペプチドの推定アミノ酸配列（配列番号４）を例示する。
【図２Ｃ】図２Ａ〜図２Ｃは、ヒトＴＥＭα遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号３）およびヒトＴＥＭαポリペプチドの推定アミノ酸配列（配列番号４）を例示する。
【図３Ａ】図３Ａ〜図３Ｂは、ヒトＴＥＭ７αポリペプチド（ｈｕＴＥＭ７α；配列番号４）、マウスＴＥＭ７αポリペプチド（ｍｕＴＥＭ７α；配列番号２）、ヒトＴＥＭ７ポリペプチド（ｈｕＴＥＭ７；配列番号５）、およびマウスＴＥＭ７ポリペプチド（ｍｕＴＥＭ７；配列番号６）のアミノ酸配列アラインメントを例示する。
【図３Ｂ】図３Ａ〜図３Ｂは、ヒトＴＥＭ７αポリペプチド（ｈｕＴＥＭ７α；配列番号４）、マウスＴＥＭ７αポリペプチド（ｍｕＴＥＭ７α；配列番号２）、ヒトＴＥＭ７ポリペプチド（ｈｕＴＥＭ７；配列番号５）、およびマウスＴＥＭ７ポリペプチド（ｍｕＴＥＭ７；配列番号６）のアミノ酸配列アラインメントを例示する。
【図４Ａ】図４Ａ〜図４Ｃは、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを用いて調製された、ヒトＴＥＭ７αポリペプチド（ｈｕＴＥＭ７α；配列番号４）、マウスＴＥＭ７αポリペプチド（ｍｕＴＥＭ７α；配列番号２）、ヒトＴＥＭ７ポリペプチド（ｈｕＴＥＭ７；配列番号５）、およびマウスＴＥＭ７ポリペプチド（ｍｕＴＥＭ７；配列番号６）のアミノ酸配列アラインメントを例示する。これらの配列は、アプリ―ケーションＭａｃＶｅｃｔｏｒ７．１．１（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ；ｈｔｔｐ／／ｗｗｗ．ａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍ）をデフォルトの設定で用いて整列された。保存された残基は四角で囲まれている。
【図４Ｂ】図４Ａ〜図４Ｃは、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを用いて調製された、ヒトＴＥＭ７αポリペプチド（ｈｕＴＥＭ７α；配列番号４）、マウスＴＥＭ７αポリペプチド（ｍｕＴＥＭ７α；配列番号２）、ヒトＴＥＭ７ポリペプチド（ｈｕＴＥＭ７；配列番号５）、およびマウスＴＥＭ７ポリペプチド（ｍｕＴＥＭ７；配列番号６）のアミノ酸配列アラインメントを例示する。これらの配列は、アプリケーションＭａｃＶｅｃｔｏｒ７．１．１（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ；ｈｔｔｐ／／ｗｗｗ．ａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍ）をデフォルトの設定で用いて整列された。保存された残基は四角で囲まれている。
【図４Ｃ】図４Ａ〜図４Ｃは、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを用いて調製された、ヒトＴＥＭ７αポリペプチド（ｈｕＴＥＭ７α；配列番号４）、マウスＴＥＭ７αポリペプチド（ｍｕＴＥＭ７α；配列番号２）、ヒトＴＥＭ７ポリペプチド（ｈｕＴＥＭ７；配列番号５）、およびマウスＴＥＭ７ポリペプチド（ｍｕＴＥＭ７；配列番号６）のアミノ酸配列アラインメントを例示する。これらの配列は、アプリケーションＭａｃＶｅｃｔｏｒ７．１．１（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ；ｈｔｔｐ／／ｗｗｗ．ａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍ）をデフォルトの設定で用いて整列された。保存された残基は四角で囲まれている。
【図５】図５は、保存されたドメインのデータベースに対するアミノ酸配列のＢＬＡＳＴ分析に従って示されるような、ヒトＴＥＭ７αポリペプチド（配列番号４）およびマウスＴＥＭ７αポリペプチド（配列番号２）により保有される複数の保存されたドメインの位置を例示する。
【図６】図６は、ヒト染色体１０ｐ１２〜ｐ１３上のＭＲＣ１遺伝子、ＴＥＭ７α遺伝子、ＮＥＢＬ遺伝子、およびＡＦ−１０遺伝子の位置および方向を示す略図を例示する。
【図７】図７は、ノーザンブロット分析により検出されるようなＴＥＭ７α  ｍＲＮＡの発現を例示する。
【配列表】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
2005516582.tif 000025
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2005516582.tif 000027
【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
2005516582.tif 000029
【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
2005516582.tif 000031
【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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