(57)【要約】本発明は、ホスホジエステラーゼ４阻害剤をＨ１−受容体アンタゴニストと組み合わせて投与することによる、肺疾患、例えば慢性閉塞性肺疾患または喘息の治療に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
呼吸器疾患に付随する増悪の期間または頻度の予防、治療または減少方法であって、該予防、治療または減少を必要とする患者に有効量のＰＤＥ４阻害剤およびＨ１−受容体アンタゴニストを投与することを含む方法。
【請求項２】
ＰＤＥ４阻害剤が、ｃｉｓ［シアノ−４−（３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシフェニル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート］、ロフルミラストまたはＮ−（３，５−ジクロロピリド−４−イル）−２−［１−（４−フルオロベンジル）−５−ヒドロキシインドール−３−イル］−２−オキソアセトアミドであり、Ｈ１−阻害剤が、アステミゾール、レボカバスチンＨＣｌ、ロラタジンもしくはそのデカルボエトキシアナログ、テルフェナジンまたはフェキソフェナジン塩酸塩である請求項１記載の方法。
【請求項３】
有効量のＰＤＥ４阻害剤、有効量のＨ１−受容体アンタゴニストおよび医薬上許容される担体を含んで成る、肺疾患に付随する増悪を予防、治療または減少するための組成物。
【請求項４】
ＰＤＥ４受容体が、ｃｉｓ［シアノ−４−（３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシフェニル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート］、ロフルミラストまたはＮ−（３，５−ジクロロピリド−４−イル）−２−［１−（４−フルオロベンジル）−５−ヒドロキシインドール−３−イル］−２−オキソアセトアミドであり、Ｈ１−阻害剤が、アステミゾール、レボカバスチンＨＣｌ、ロラタジンもしくはそのデカルボエトキシアナログ、テルフェナジンまたはフェキソフェナジン塩酸塩である請求項３記載の組成物。
【請求項５】
経口用錠剤である請求項３または４記載の組成物。
【請求項６】
乾燥粉末吸入器に用いるための乾燥粉末である請求項３または４記載の組成物。
【請求項７】
鼻腔投与用の水性製剤である請求項３または４記載の組成物。
【請求項８】
ＰＤＥ４阻害剤およびＨ１−受容体アンタゴニストを噴射剤と合して形成され、定量吸入器を用いてデリバリーされる請求項３または４記載の組成物。
【請求項９】
呼吸器疾患に付随する増悪の期間または頻度を予防、治療または減少するための医薬の製造における、有効量のＰＤＥ４阻害剤および有効量のＨ１−受容体アンタゴニストの使用。
【請求項１０】
呼吸器疾患に付随する増悪の期間または頻度の予防、治療または減少における、有効量のＰＤＥ４阻害剤および有効量のＨ１−受容体アンタゴニストの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、肺疾患の兆候の発生を予防するか、または減少させるか、あるいは肺疾患の重篤度を治療するか、または減少させるための組成物および方法に関する。特に、ＰＤＥ４阻害剤およびＨ１−受容体アンタゴニストを投与することにより肺疾患を治療する組成物および方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
肺疾患を治療するための新規治療剤を同定することは、複数のメディエーターが疾患の進行の原因であるという事実により困難とされている。かくして、単一のメディエーターの影響を排除することが、特定の肺疾患の他のすべての要素に実質的に影響を及ぼすとは考えられない。「メディエーターアプローチ」に代わるものは、疾患の病態生理学的原因である細胞の活性を調節することである。本発明に示されるアプローチは、かかるレギュレーターである、ＰＤＥ４−特異的阻害剤とＨ１−受容体アンタゴニストとの２つの組み合わせを利用する。
【０００３】
ＰＤＥ４−特異的阻害剤は、ｃＡＭＰ（アデノシンサイクリック３’，５’−モノホスフェート）のレベルを上昇させることによる細胞レギュレーションに対する新規アプローチを意味する。環状ＡＭＰは、広範囲のホルモン、神経伝達物質および薬剤に対する生物学的応答を媒介する第２のメッセンジャーであることが示されている［Krebs Endocrinology Proceedings of the 4th International Congress Excerpta Medica, 17-29, 1973］。適当なアゴニストが特定の細胞表面受容体に結合した場合、アデニル酸シクラーゼが活性化され、これにより加速してＭｇ＋２−ＡＴＰがｃＡＭＰに変換される。
【０００４】
環状ＡＭＰは、外因性（アレルギー性）喘息および鼻炎の病態生理学に寄与する、すべてではないが、ほとんどの細胞の活性をモジュレートする。したがって、ｃＡＭＰの上昇により、以下の有利な効果が得られる：１）気道平滑筋弛緩、２）肥満細胞メディエーター放出の阻害、３）好中球脱顆粒の抑制、４）好塩基球脱顆粒の阻害、５）単球マクロファージ活性化の阻害。したがって、アデニル酸シクラーゼを活性化するか、またはホスホジエステラーゼを阻害する化合物は、気道平滑筋および種々の炎症細胞の不適切な活性化を抑制するのに効果的である。ｃＡＭＰの不活性化の主用な細胞機構は、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）と称されるイソ酵素の一またはそれ以上のファミリーによる３’−ホスホジエステラーゼ結合の加水分解である。
【０００５】
別個の環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）イソ酵素であるＰＤＥ４が、気道平滑筋および炎症細胞におけるｃＡＭＰ崩壊の原因であることが示されている［Torphy, New Drugs for Asthma中の「Phosphodiesterase Isozymes: Potential Targets for Novel Anti-asthmatic Agents」, Barnes, ed. IBC Technical Services Ltd., 1989］。この酵素の阻害が気道平滑筋弛緩を与えるだけでなく、単球および好中球の活性化を阻害するとともに、肥満細胞、好塩基球および好中球の脱顆粒を抑制することが、研究により示されている。さらに、ＰＤＥ４阻害剤の有益な効果は、インビボの場合であるように、標的細胞のアデニル酸シクラーゼ活性が適当なホルモンまたはオータコイドにより上昇される場合に非常に可能性がある。かくして、ＰＤＥ４阻害剤、特に、ＰＤＥ４特異的阻害剤は、プロスタグランジンＥ２およびプロスタサイクリン（アデニル酸シクラーゼのアクチベーター）のレベルが上昇する場合、気道において効果的であるだろう。
【０００６】
加えて、多くの肺疾患の病因が複数のメディエーターに関連している事実を鑑みて、治療を組み合わせることは有用であり得る。本発明において、肺疾患、特に慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息または関連する肺疾患、例えば慢性気管支炎またはアレルギー性鼻炎を治療するための、ＰＤＥ４阻害剤および単に抗ヒスタミン剤とも称させるＨ１−受容体アンタゴニストの組み合わせを提供する。気道疾患が肺疾患と区別される限りは、前者は本発明の範囲内に同様に含まれる。
【０００７】
（発明の概要）
第１の態様において、本発明は、気道または肺疾患に付随する増悪の予防、治療または減少方法であって、該予防、治療または減少を必要とする患者に有効量のＰＤＥ４阻害剤およびＨ１−受容体アンタゴニストを、単一の組み合わせ形態、別々の形態、あるいは別々に連続して投与し、ここで連続した投与が時間的に接近しているか、または離れている方法に関する。
【０００８】
第２の態様において、本発明は、有効量のＰＤＥ４阻害剤、有効量のＨ１−受容体アンタゴニストおよび医薬上許容される賦形剤を含んで成る、気道または肺疾患に付随する増悪を予防、治療または減少するための組成物に関する。
【０００９】
第３の態様において、本発明は、気道または肺疾患に付随する増悪を予防、治療または減少するのに効果的な組成物の製造方法であって、有効量のＰＤＥ４阻害剤およびＨ１−受容体アンタゴニストを医薬上許容される担体と混合することを含む方法に関する。
【００１０】
第４の態様において、気道または肺疾患に付随する増悪を予防、治療または減少するための医薬または医薬パックの製造における、単一の組み合わせ形態、別々の形態で、あるいは接近するか、または離れた時間で別々に連続して投与する、有効量のＰＤＥ４阻害剤およびＨ１−受容体アンタゴニストの使用を提供する。
【００１１】
第５の態様において、気道または肺疾患に付随する増悪を予防、治療または減少するための医薬の製造における有効量のＰＤＥ４阻害剤、有効量のＨ１−受容体アンタゴニストおよび医薬上許容される賦形剤を含んで成る組成物の使用を提供する。
【００１２】
（発明の詳細な記載）
本発明による組み合わせ治療は、気道または肺疾患の発生を予防するか、既存の症状を治療するか、季節性、発作性または慢性の気道または肺疾患を患っている患者にしばしば生じる増悪の頻度または重篤度を減少させるために、ＰＤＥ４阻害剤またはＰＤＥ３／４混合阻害剤をＨ１−受容体アンタゴニストと投与することを含む。化合物は単回投与形態で一緒に投与することができる。または化合物は異なる投与形態で投与することもできる。化合物は同時に投与することができる。または化合物は接近した、または離れた時間のいずれかで投与することができ、例えば１つの薬剤を朝に投与するか、または第２の薬剤を夕方に投与する。この組み合わせは、予防的または兆候が生じた後に用いることができる。ある場合には、組み合わせ（複数でも可）は、疾患の進行を防止するか、または肺機能のような機能の減少を停止させるために用いることができる。加えて、この組み合わせは、ＣＯＰＤのようないくつかの肺疾患の増悪の発生率および／または重篤度を減少させるのに有用である。ＣＯＰＤ患者における増悪の頻度および重篤度におけるこの組み合わせの作用を測定および評価するための試験方法に関する、２０００年７月２７日に出願された同時係属の米国仮出願第６０／２２１，２７５号を参照のこと。その方法論、およびその出願のすべての開示を出典明示して本明細書に組み入れる。
【００１３】
本発明において有用なＰＤＥ４阻害剤は、ＰＤＥ４酵素を阻害することが知られているか、またはＰＤＥ４阻害剤として作用することが見出されたいずれの化合物であってもよく、それは、ある程度の治療作用を示すまで、ＰＤＥファミリーの他のメンバーならびにＰＤＥ４を阻害する化合物ではなく、単にまたは本質的にＰＤＥ４阻害剤であるだけでよい。一般的に、高アフィニティーでロリプラム（rolipram）に結合するＰＤＥ４触媒形態のＩＣ５０を低アフィニティーでロリプラムに結合する形態のＩＣ５０で除したものと見なされる、約０．１またはそれ以上のＩＣ５０比を有するＰＤＥ４アンタゴニストを用いることが好ましい。
【００１４】
炎症の治療に用いられ、気管支拡張剤としてのＰＤＥ阻害剤、テオフィリンおよびペントキシフィリン様薬剤は、すべての組織中のＰＤＥイソ酵素を無差別に阻害する。これらの化合物は、明らかにすべての組織において５つすべてのＰＤＥイソ酵素群を非選択的に阻害するので副作用を示す。標的病態は、かかる化合物により効果的に治療されうるが、望ましくない副作用を示し、これらを回避するか、または最小限にできる場合、ある種の病態を治療するためのこのアプローチの全体的な治療効果が増加するだろう。例えば、抗打つ剤として開発された選択的ＰＤＥ４阻害剤ロリプラムを用いる臨床研究により、これは向精神活性を有し、胃腸作用、例えば胸焼け、悪心および嘔吐を生じることが示されている。
【００１５】
結合剤が結合する場合にヒト単球組み換えＰＤＥ４（ｈＰＤＥ４）においては少なくとも２種の結合形態が存在することが知られている。これらの所見の１つの説明は、ｈＰＤＥ４が２つの別個の形態で存在することである。１つはロリプラムおよびデンブフィリンの類に高アフィニティーで結合し、他方はこれらの化合物に低アフィニティーで結合する。本発明で用いるための好ましいＰＤＥ４阻害剤は、有益な治療率を有する化合物、すなわち、酵素がロリプラムに低アフィニティーで結合する形態である場合、ｃＡＭＰ触媒活性を優先的に阻害する化合物であり、したがって、ロリプラムに高アフィニティーで結合する形態を阻害することに明らかに関係がある副作用を減少させる。これを別の方法で述べると、好ましい化合物は、
高アフィニティーでロリプラムに結合するＰＤＥ４触媒形態のＩＣ５０を低アフィニティーでロリプラムに結合する形態のＩＣ５０で除したものと見なされる、約０．１またはそれ以上のＩＣ５０比を有するだろう。
【００１６】
より詳細な方法を記載している米国特許第５，９９８，４２８号を参照のこと。これは出典明示して本明細書に組み入れる。
０．５よりも大きいＩＣ５０比を有するこれらのＰＤＥ４阻害剤、特に１．０よりも大きい比を有する化合物が最も好ましい。
【００１７】
好ましい化合物は、シロミラスト（cilomilast）またはアリフロ（Afirlo）（登録商標）として知られているｃｉｓ［シアノ−４−（３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシフェニル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート］、２−カルボメトキシ−４−シアノ−４−（３−シクロプロピルメトキシ−４−ジフルオロメトキシフェニル）シクロヘキサン−１−オンおよびｃｉｓ［４−シアノ−４−（３−シクロプロピルメトキシ−４−ジフルオロメトキシフェニル）シクロヘキサン−１−オール］である。本発明において用いることができる、特異的阻害剤である他のＰＤＥ４阻害剤は、Astra (Hofgen, N. et al. 15th EFMC Int Symp Med Chem (Sept 6-10, Edinburgh) 1998, Abst P.98)からのＡＷＤ−１２−２８１［Ｎ−（３，５−ジクロロピリド−４−イル）−２−［１−（４−フルオロベンジル）−５−ヒドロキシインドール−３−イル］−２−オキソアセトアミド］；ＮＣＳ−６１３（ＩＮＳＥＲＭ）と称される９−ベンジルアデニン誘導体；Chiroscience and Schering-PloughからのＤ−４４１８；ＣＩ−１０１８として同定されれたベンゾジアゼピンＰＤＥ４阻害剤（PD-168787; Parke-Davis/Warner-Lambert）；ＷＯ９９１６７６６に開示されているKyowa Hakkoのベンゾジオキソール；Ｎａｐｐ（Landells, L.J. et al. Eur Resp J [Annu Cong Eur Resp Soc (Sept 19-23, Geneva) 1998] 1998, 12(Suppl. 28): Abst P2393）からのＶ−１１２９４Ａ；Byk-Guldenからのロフルミラスト（ＣＡＳ参照番号１６２４０１−３２−３）およびフタラジノン（pthalazinone）（ＷＯ９９４７５０５）；またはＴ−４４０として同定されている化合物（Tanabe Seiyaku; Fuji, K. et al. J Pharmacol Exp Ther,1998, 284(1): 162）である。また、Ｂａｙｅｒ１９−８００４、Ｚａｍｂｏｎ’ｓ化合物Ｚ１５３７０ＡおよびＡｓｔａ Ｍｅｄｉｃａ’ｓＡＷＤ１２−２８１およびＡＷＤ１２−３４３として文献中で同定されているＰＤＥ４阻害剤も本発明に用いることができる。いずれか１つまたはすべてのこれらの化合物は、本明細書に記載の方法により恩恵を受けることができる。
【００１８】
一般的に「抗ヒスタミン剤」と称させるＨ１−受容体アンタゴニストは、bovet and Staubが１９３７年に最初にフェノールエステルを用いてヒスタミン−遮断活性を同定してから開発されてきた、多数のアンタゴニストのいずれか１つまたはそれ以上であってもよい。それ以降から現在に至る多くの研究により、ヒトに用いるのに安全であり、Ｈ１−受容体を阻害することが知られている多くの化合物が存在する。そのすべては、Ｈ１−受容体を有するヒスタミンの相互作用の可逆的競合阻害剤である。これら阻害剤の多く、主に第１世代のアンタゴニストは、下記式：
【化１】
2005501023.tif 000002
により示すことができる核構造を有している。
【００１９】
この一般的構造は、一般的に入手することができる３つの型の抗ヒスタミン剤、エタノールアミン、エチレンジアミンおよびアルキルアミンを意味する。加えて、他の第１世代の抗ヒスタミン剤は、ピペリジンおよびフェノチアジンに基づくものと特徴付けることができるものを含む。非鎮静剤である第２世代のアンタゴニストは、これらが核のエチレン基（アルキルアミン）を保持しているか、またはピペラジンまたはピペリジンを有する三級アミン基に模倣するものに関して同様の構造活性を有する。アンタゴニストの例としては下記のものが挙げられる：
エタノールアミン：マレイン酸カルビノキサミン、フマル酸クレマスチン、塩酸ジフェンヒドラミンおよびジメンヒドリネート、
エチレンジアミン：マレイン酸ピリルアミン。塩酸トリペレナミンおよびクエン酸トリペレナミン、
アルキルアミン：クロロフェニルアミンおよびマレイン酸塩のようなその塩、ならびにアクリバスチン（acrivastine)、
ピペラジン：塩酸ヒドロキシジン、パモ酸ヒドロキシジン、塩酸シクリジン、乳酸シクリジン、塩酸メクリジンおよび塩酸セチリジン、
ピペリジン：アステミゾール（Astemizole）、塩酸レボカバスチン、ロラタジンまたはそのデカルボエトキシアナログ、ならびにテルフェナミンおよび塩酸フェキソフェナジンまたは他の医薬上許容される誘導体。
アゼラスチン塩酸塩は、ＰＤＥ４阻害剤と組み合わせて用いることができるさらに別のＨ１−受容体アンタゴニストである。
【００２０】
これらの化合物は市販されている。加えて、Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ninth Ed, 1996, McGraw-Hillの５８６〜５９１頁に、およびより完全には、The Physicians Desk Reference（Vol. 54, 2000, Medical Economic Co., Montvale, NJ, USA）に詳細に記載されている。両方の文献は、各々の化合物、投与量および投与経路を典型的な処方データと一緒に提供する。
【００２１】
１つまたはそれ以上の抗ヒスタミン剤は、予防または治療用の１つまたはそれ以上のＰＤＥ４阻害剤と組み合わせて用いることができる。
好ましい組み合わせ療法は、ロラタジンおよびシロミラストまたはロフルミラストの組み合わせである。
上記したすべての化合物は、要すれば、別の医薬上許容される誘導体、例えばその塩およびエステルの形態で用いることができる。
通常、これらの薬剤は、経口製剤または鼻腔スプレーもしくはエアロゾールとして、あるいは吸入粉末として投与される。本発明は、吸入のような一のデリバリー形態の薬剤を共投与すること、同じ吸入に薬剤を置くことを意図する。別法として、１つは、ＰＤＥ４阻害剤をピル中に入れ、抗ヒスタミンを含有する吸入剤と一緒に、または逆の場合も同様に包装する。
経口投与された場合に活性である本発明の化合物および医薬上許容される塩は、シロップ、錠剤、カプセル、制御放出製剤もしくはロゼンジとして、または吸入可能な製剤として処方することができる。
【００２２】
シロップ処方は、一般的には、フレーバーまたは着色剤を含有する液体担体、例えばエタノール、ピーナッツ油、オリーブ油、グリセリンまたは水中の化合物または塩の懸濁液または溶液で構成されるだろう。組成物が錠剤形態である場合、一般的に固体処方に用いられるいずれの医薬担体を用いることができる。かかる単体の例としては、ステアリン酸マグネシウム、テラアルバ、タルク、ゼラチン、アカシア、ステアリン酸、スターチ、ラクトースおよびシュークロースが挙げられる。組成物がカプセル形態である場合、いずれの一般的なカプセル化法が適当であり、例えば上記した担体をハードゼラチンカプセル殻において用いる。組成物がソフトゼラチン殻カプセルの形態である場合、分散液または懸濁液を調製するのに用いられるいずれの一般的な医薬担体は、例えば水性ガム、セルロース、シリケートまたは油が考えられ、ソフトゼラチンカプセル殻中に組み入れられる。
【００２３】
吸入用の典型的な組成物は、乾燥粉末、溶液、懸濁液またはエマルジョンの形態である。投与は乾燥粉末吸入（例えば、米国特許第５５９０６４５号に記載の単位投与または多回数投与吸入）によるか、または噴霧によるか、あるいは加圧エアロゾルの形態であってもよい。乾燥粉末組成物は、典型的には、ラクトース、トレハソールまたはスターチを用いる。噴霧用組成物は、典型的な、ビヒクルとしての水を用いる。加圧エアロゾルは、典型的には、噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、またはより好ましくは、１，１，１，２−テトラフルオロエタン、１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロ−ｎ−プロパンまたはその混合物を用いる。加圧エアロゾル処方は、溶液（エタノールのような可溶化剤を用いる）または賦形剤が存在しなくても、または界面活性剤および／または共溶媒（例えば、エタノール）を含有する賦形剤を含有していてもよい、懸濁液の形態であってもよい。乾燥粉末組成物および懸濁エアロゾル組成物において、好ましくは、活性成分は、吸入に適当な粒度（典型的には、２０ミクロン未満、例えば１〜１０、特に１〜５ミクロンの平均粒度（mass median diameter）（ＭＭＤ）を有する）であるだろう。例えば、微粉化により、活性成分の大きさを減少させることが必要とされうる。
【００２４】
加圧エアロゾル組成物は、一般的に、バルブ、特に定量バルブを備えたキャニスターに充填されるだろう。キャニスターは、所望により、プラスチック物質、例えばＷＯ９６／３２１５０に記載のフルオロカーボン重合体でコートされていてもよい。キャニスターはバッカルデリバリーに適した作動装置に充填されるだろう。
【００２５】
鼻腔デリバリー用の典型的な組成物は、上記した吸入に関するものを含み、さらに、鼻腔ポンプにより投与することができる、慣用的な賦形剤、例えば緩衝液、抗菌剤、張力修飾剤および粘度修飾剤を組み合わせた、不活性ビヒクル、例えば水中の溶液または懸濁液の形態である非加圧組成物を含む。
【００２６】
典型的な皮膚および経皮処方は、慣用的な水性または非水性ビヒクル、例えばクリーム、軟膏、ローションまたはペーストを含み、薬用膏薬、パッチまたは膜の形態である。
【００２７】
好ましくは、組成物は単位投与形態、例えば錠剤、カプセルまたは定量エアロゾルであり、患者は単回投与量を投与することができる。
【００２８】
経口投与用の各々の単位投与量は、適当には、０．３ｍｇ〜６０ｍｇ／Ｋｇ、好ましくは１ｍｇ〜３０ｍｇ／Ｋｇの化合物またはその医薬上許容される塩を含有する。好ましい投与量は、ＣＯＰＤに対して１ｍｇ〜６０ｍｇ／Ｋｇを含有する。非経口投与用の各々の単位投与量は、適当には、０．１ｍｇ〜１００ｍｇ／Ｋｇの化合物またはその医薬上許容される塩を含有する。鼻腔内投与用に適した各々の単位投与量は、適当には、活性化あたり、１〜４００ｍｃｇ、好ましくは、１０〜２００ｍｃｇを含有する。乾燥粉末吸入投与量は、単位投与量あたり１〜１０００マイクログラムを含有することができる。局所処方は、適当には０．００１〜５．０％の本発明の化合物を含有する。
【００２９】
活性成分は、望ましい活性を示すのに十分な量で、１日に１〜６回投与することができる。好ましくは、活性成分は、１日１または２回投与される。
活性剤は、同時にまたは非常に接近した時間で投与されるだろう。別法として、１つの薬剤を朝に投与し、１つの薬剤をその日のより遅くに投与することもできる。または、別の計画において、１つの薬剤を１日２回投与して、１日２回の投与の一方を行うと同時に、または別々に、他方を１日１回投与することができる。好ましくは、両方の薬剤を同時に一緒に混合物として投与する。
【００３０】
以下の実施例は、本発明の製造および使用方法を説明するものである。これらは本発明の範囲をいかなる点においても限定するものではない。請求の範囲は特許請求の範囲を参照されたい。
【００３１】
実施例
以下の５種に及ぶ８つのアッセイを、約０．１またはそれ以上のＩＣ５０比の選択を支持するデータを構築するために用いた。アッセイは以下のものを行った：ウサギ単離頭頂腺からの酸産生の刺激；ヒト好中球におけるＦＭＬＰ−誘発脱顆粒（ミエロペルオキシダーゼの放出）の阻害；モルモット好酸球におけるＦＭＬＰ−誘発Ｏ２−形成の阻害；ヒト単球におけるＬＰＳ−誘発ＴＮＦα産生の阻害；イヌにおける嘔吐の発生；モルモットにおける抗原誘発気管支収縮の阻害；マウスにおけるレセルピン誘発低体温の逆転；およびマウスの養子移入ヒト単球からのＬＰＳ−誘発ＴＮＦα産生の阻害。これらのアッセイおよびデータを以下に示す。
【００３２】
統計分析
低アフィニティー部位ＰＤＥ４の阻害がこの群の化合物の抗炎症作用と関連しており、一方で、高アフィニティー部位の阻害がある種の副作用の発生に関連しているという仮定を試験するために、インビトロおよびインビボ両方で炎症細胞機能を遮断する種々のＰＤＥ４阻害剤の能力およびインビトロおよびインビボモデルで副作用を生じさせるこれらの化合物の能力を測定した。特定の治療効果または副作用を誘発するＰＤＥ４阻害剤の能力を、ＰＤＥ４の高アフィニティー部位を阻害する能力に対する低アフィニティー結合部位を阻害する能力と比較するために、インビトロまたはインビボアッセイで、これらの化合物の能力を、単離酵素触媒活性または高アフィニティー部位に対するこれらの能力と、（ｒ２）の線形相関または順位相関（Spearman's Rho）により比較した。線形相関は、低アフィニティー部位または高アフィニティー部位のいずれかを阻害する場合の化合物の能力を、所定の抗炎症作用または副作用を誘発する能力を予測するために用いることができるかどうかを求める。順位相関は、所定の抗炎症作用または副作用を生じる順位能力が低アフィニティー部位または高アフィニティー部位を阻害する順位能力と同じであるかどうかを試験する。ｒ２およびSpearman's Rhoの両方は、マッキントッシュのＳＴＡＴ ＶｉｅｗＩＩコンピュータープログラムを用いて計算した。
【００３３】
ロリプラムに対するＰＤＥ４の高アフィニティー結合
実施例１−ホスホジエステラーゼおよびロリプラム結合アッセイ
実施例１Ａ
単離ヒト単球ＰＤＥ４およびｈｒＰＤＥ（ヒト組み換えＰＤＥ４）は、低アフィニティー形態で主に存在することが測定された。したがって、試験化合物のＰＤＥ４の低アフィニティー形態に対する活性は、基質としての１μＭの［３Ｈ］ｃＡＭＰを用いるＰＤＥ４触媒活性に対する標準的なアッセイを用いて評価することができる（Torphyら、J. of Biol. Chem., Vol. 267, No. 3 pp1798-1804, 1992）。
ラット脳高速上清を蛋白源として用いた。［３Ｈ］−ロリプラムのエナンチオマーを、特定の活性２５．６Ｃｉ／ｍｍｏｌに調製した。標準的なアッセイ条件は、公開されている方法を、最後のｃＡＭＰを除いてＰＤＥアッセイ条件と同一である方法に修飾した：５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ナノＭの［３Ｈ］−ロリプラム（Torphyら、J. of Biol. Chem., Vol. 267, No. 3 pp1798-1804, 1992）。アッセイを３０℃で１時間行った。反応を終結させ、結合リガンドをBrandel cell harvesterを用いて遊離リガンドから分離した。高アフィニティー部位に関する競合は、［３Ｈ］−ｃＡＭＰおよび［３Ｈ］５’−ＡＭＰが存在しないと予想される、低アフィニティーＰＤＥ活性を測定するために用いられる条件と同一である条件下で評価した。
【００３４】
実施例１Ｂ
ホスホジエステラーゼ活性の測定
ＰＤＥ活性を、業者（Amersham Life Sciences）により記載された、［３Ｈ］−ｃＡＭＰシンチレーション近傍アッセイ（ＳＰＡ）または［３Ｈ］ｃＧＭＰ ＳＰＡ酵素アッセイを用いてアッセイした。反応を、５０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、８．３ｍＭのＭｇＣｌ２、１．７ｍＭのＥＧＴＡ、［３Ｈ］ｃＡＭＰまたは［３Ｈ］ｃＧＭＰ（約２０００ｄｐｍ／ｐｍｏｌ）、酵素および種々の濃度の阻害剤を含有する０．１ｍｌ（最終濃度）の反応緩衝液中、室温で９６ウェルプレートにおいて行った。アッセイを１時間進行させ、５０μｌの硫酸亜鉛存在下ＳＰＡケイ酸イットリウムビーズを加えて終結させた。プレートを振盪し、２０分室温で静置した。放射線標識生成物の組成を、シンチレーション分光分析により評価した。ＰＤＥ３およびＰＤＥ７の活性を、０．０５μＭの［３Ｈ］ｃＡＭＰを用いて評価し、一方で、ＰＤＥ４を基質としての１μＭの［３Ｈ］ｃＡＭＰを用いて評価した。ＰＤＥ１Ｂ、ＰＤＥ１Ｃ、ＰＤＥ２およびＰＤＥ５の活性を、基質としての１μＭの［３Ｈ］ｃＧＭＰを用いて評価した。
【００３５】
［３Ｈ］Ｒ−ロリプラム結合アッセイ
［３Ｈ］Ｒ−ロリプラム結合アッセイを、Schneiderおよび共同研究者の方法（Nicholsonら、Trends Pharmacol. Sci., Vol. 12, pp.19-27 (1991)およびMcHaleら、Mol. Pharmacol., Vol. 39, 109-113 (1991)を参照のこと）を修飾した方法により行った。Ｒ−ロリプラムはＰＤＥ４の触媒部位に結合する（Torphyら、Mol. Pharmacol., Vol. 39, pp. 376-384 (1991)を参照のこと）。その結果、［３Ｈ］Ｒ−ロリプラム結合について競合させることで、標識されていない競合剤のＰＤＥ４阻害剤の効能が独立して確認される。アッセイを、３０℃で１時間、５０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５％の牛血清アルブミン、２ｎＭの［３Ｈ］Ｒ−ロリプラム（５．７×１０４ｄｐｍ／ｐｍｐｌ）および種々の濃度の非放射標識阻害剤を含有する０．５μｌの緩衝液中で（最終濃度）行った。反応を２．５ｍｌの氷冷反応緩衝液（［３Ｈ］Ｒ−ロリプラムは含まない）を添加して停止させ、０．３％のポリエチルエミニン中に浸したＷｈａｔｍａｎ ＧＦ／Ｂフィルターを通して急速吸引濾過（Brandel Cell Harvester）を行った。フィルターをさらに７．５ｍｌの冷緩衝液で洗浄し、乾燥させ、液体シンチレーション分光分析を用いて計数した。
【００３６】
処方実施例
Ａ：定量吸入剤
【表１】
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【００３７】
微粉化活性成分（例えば１２０操作分）をアルミニウム缶に量り取り、ついで、１，１，１，２−テトラフルオロエタンを真空フラスコから加え、計量バルブを所定の位置に取りつける。
【００３８】
Ｂ：乾燥粉末吸入剤
【表２】
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【００３９】
活性成分を微粉化し、上記した比率でラクトースと大量に混合した。混合物をハードゼラチンカプセルまたはカートリッジ中に充填するか、あるいは特に、二重ホイルブラスターパックに構成され、例えば、Ｒｏｔａｈａｌｅｒ、ＤｉｓｋｈａｌｅｒまたはＤｉｓｋｕｓ吸入器（これらは各々、Glaxo Group Limitedの登録商標である）により投与される。
【００４０】
Ｃ：鼻腔投与用処方
【表３】
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【００４１】
Ｖａｌｏｉｓ ＶＰ７予備圧縮ポンプにより調剤された１００μｌの計量容量において、約１５０ｍｃｇのシロミラストおよび１００ｍｃｇのロラタジンがデリバリーされるだろう。
【００４２】
Ｄ：経口錠剤
表５は、ＰＤＥ４阻害剤およびＨ１受容体アンタゴニストの組み合わせを投与するために用いることができる錠剤処方を示す。
【表４】
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【００４３】
錠剤は、標準的な乾燥粉末混合および打錠ツールを用いて慣用的な方法により調製される。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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