(57)【要約】  本発明は、動物細胞を刺激し、そしてその生理学的シグナルを記録するための装置、ならびにこの装置を作製する方法および使用する方法を提供する。本発明の目的は、動物細胞を刺激し、そしてその生理学的シグナルを記録するための、効率的で、簡便で、かつ正確な装置を提供することである。動物細胞を刺激し、そしてその生理学的シグナルを記録するための、本発明の装置は、不良導電性基板を備え、ここで、この基板の少なくとも１つの表面は、少なくとも１単位の良導性ポリマー層および少なくとも１つの導電性微小電極を備える。
2005514019.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物細胞を刺激して該動物細胞の生理学的シグナルを記録するための装置であって、該装置は、不良導電性の基板を備え、該基板の少なくとも１つの表面は、少なくとも１単位の導電性ポリマー層および少なくとも１つの良導性微小電極を備える、装置。
【請求項２】
前記基板と前記導電性ポリマー層との間に、中間層をさらに備える、請求項１に記載の動物細胞を刺激して該動物細胞の生理学的シグナルを記録するための装置。
【請求項３】
前記中間相が、金または白金である、請求項２に記載の動物細胞を刺激して該動物細胞の生理学的シグナルを記録するための装置。
【請求項４】
前記基板が、二次元の平坦な構造体である、請求項１に記載の動物細胞を刺激して該動物細胞の生理学的シグナルを記録するための装置。
【請求項５】
前記基板が、前記細胞を配置するための少なくとも１つのウェルを備える、請求項１に記載の動物細胞を刺激して該動物細胞の生理学的シグナルを記録するための装置。
【請求項６】
前記導電性ポリマー層が、断絶された接合部を備える格子様のパターンを有する、請求項１、２、３、４、または５のいずれか１項に記載の動物細胞を刺激して該動物細胞の生理学的シグナルを記録するための装置。
【請求項７】
前記導電性ポリマー層が、互いに接続され、そして１対の刺激電極を共有する、複数の単位を含む、請求項１、２、３、４、または５のいずれか１項に記載の動物細胞を刺激して該動物細胞の生理学的シグナルを記録するための装置。
【請求項８】
前記導電性ポリマー層が、互いに接続されていない複数の単位を備え、各単位が、刺激電極の対を備える、請求項１、２、３、４、または５のいずれか１項に記載の動物細胞を刺激して該動物細胞の生理学的シグナルを記録するための装置。
【請求項９】
前記導電性ポリマー層が、ポリアニリン、ポリピロール、ポリチオフェンまたはこれらの誘導体、コポリマー、あるいはこれらの混合物から作製されている、請求項１に記載の動物細胞を刺激して該動物細胞の生理学的シグナルを記録するための装置。
【請求項１０】
前記装置が、１つより多くの微小電極を備え、該微小電極が、微小電極アレイに配列されている、請求項１に記載の動物細胞を刺激して該動物細胞の生理学的シグナルを記録するための装置。
【請求項１１】
前記微小電極を作製するための材料が、金、白金、またはＩＴＯである、請求項１に記載の動物細胞を刺激して該動物細胞の生理学的シグナルを記録するための装置。
【請求項１２】
前記導電性ポリマーが、微小電極と接続されている、請求項１に記載の動物細胞を刺激して該動物細胞の生理学的シグナルを記録するための装置。
【請求項１３】
前記導電性ポリマーと前記微小電極とが、１〜５０ミクロン離れている、請求項１に記載の動物細胞を刺激して該動物細胞の生理学的シグナルを記録するための装置。
【請求項１４】
前記基板上の、前記導電性ポリマーによって覆われていない、細胞成長のためでも微小電極測定のためでもない領域が、絶縁材料層でコーティングされている、請求項１に記載の動物細胞を刺激して該動物細胞の生理学的シグナルを記録するための装置。
【請求項１５】
動物細胞を刺激して該動物細胞の生理学的シグナルを記録するための装置を作製する方法であって、以下の工程：
（ａ）良導体の微小電極および該電極の接続ワイヤを、蒸着またはスパッタによって基板上に配置する工程；
（ｂ）少なくとも１単位の導電性ポリマー層を、所望のパターンで、ＰＶＤ、ＣＶＤ、電気重合、または高分子自己集合によって、該基板上に配置する工程；ならびに
（ｃ）該導電性ポリマーを刺激電極に接続するために、該導電性ポリマー層の下にいくつかの金属ワイヤを配置する工程、
を包含する、方法。
【請求項１６】
光エッチングを使用して、前記装置上に絶縁層を配置して、所望の構造を形成する工程をさらに包含する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
光エッチングによって、絶縁層を所望のパターンで配置する工程をさらに包含し、ここで、該工程が、前記導電性ポリマー層を配置する工程の前に行われる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
動物細胞を刺激して該動物細胞の生理学的シグナルを記録するための装置を使用する方法であって、以下の工程：
（ａ）導電性ポリマーに、連続的にかまたは断続的にかのいずれかで、電流を通す工程であって、ここで、該電気刺激が、直流または交流であり、ここで、該電流の強度が、ｐＡ〜ｍＡのスケールの強度であり、そして交流の刺激については、該刺激の周波数が、１〜１０６Ｈｚである、工程；および
（ｂ）微小電極を介して、該電流、電位、またはインピーダンス電気シグナルを測定することによって、試験されている細胞から発生する生理学的シグナルを記録する工程、
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、動物細胞を刺激（特に電気的に刺激）し、そしてその生理学的シグナルを記録するための装置、ならびにこのような装置の作成および使用の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
神経の成長および分化を制御する能力は、神経系の基本的機構の研究、ニューロン疾患の処置、および神経組織に対する損傷の有効な修復のために有用である。従って、これは、長年にわたって、科学的研究の焦点であった。
【０００３】
長年の研究後、電気刺激が、インビトロでの神経突起の成長を増強し得、そしてインビボで神経細胞再生を増強し得ることが明らかになった。他の研究者らによる研究は、神経突起の成長が、圧電性物質の表面上で増強されることを示した（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら、Ｐｉｅｚｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｃｈａｎｎｅｌｓ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｓｃｉａｔｉｃ  ｎｅｒｖｅ  ａｆｔｅｒ  ａｘｏｔｏｍｙ，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９８７，４３６（１），１６５−１６８）。この影響は、この物質に対する微小な機械的ストレスから生じる表面結合電荷の存在に起因した。この観察の正確な機構は、いまだ明白でない。１つの理論は、神経突起伸長に重要な特定のタンパク質または他の分子が電場中に再分配される、というものである。あるいは、これらのタンパク質は、神経突起の伸長に有利なコンフォメーション変化を受け得る。
【０００４】
導電性ポリマーは、その電気的特性および光学特性が、しばしば、可逆的な様式で、広い範囲にわたって制御可能に変動し得る、新規クラスの物質を示す。導電性ポリマーは、安定であり、生理学的細胞培養培地または体液中で長期にわたって使用され得、そしてニューロンと良好な適合性を有する（Ｃ．Ｅ．Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｖ．Ｒ．Ｓｈａｓｔｒｉ，Ｊ．Ｐ．Ｖａｃａｎｔｉ，Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒｉｔｅ  ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｌｙ  ｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇ  ｐｏｌｙｍｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９７，９４，８９４８−８９５３）。最近、導電性ポリマーを導電性媒体として使用するニューロンの電気刺激が、神経突起の成長を増強することもまた、示された（Ａ．Ｋｏｔｗａｌ，Ｃ．Ｅ．Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｌｔｅｒｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｎｅｒｖｅ  ｃｅｌｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｌｙ  ｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇ  ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２００１，２２，１０５５−１０６４；Ｃ．Ｅ．Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｖ．Ｒ．Ｓｈａｓｔｒｉ，Ｊ．Ｐ．Ｖａｃａｎｔｉ，Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒｉｔｅ  ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｌｙ  ｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇ  ｐｏｌｙｍｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９７，９４，８９４８−８９５３）。研究者らはまた、導電性ポリマーをインビボの足場として移植し、そして電気刺激を使用して、足場のガイダンスの下で、切断された神経組織を接続してきた（Ｖ．Ｒ．Ｓｈａｓｔｒｉ，Ｃ．Ｅ．Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｒ．Ｓ．Ｌａｎｇｅｒ，Ｊ．Ｐ．Ｖａｃａｎｔｉ，米国特許第６，０９５，１４８号，２０００，Ａｕｇｕｓｔ  １）。ニューロンおよび神経ネットワークの電気生理学的シグナルを記録するための微小電極または微小電極のアレイの使用は、１９７０年代以来研究されており、近年、大きな進歩がなされている。１つの方法は、複数の微小電極を、細胞外シグナルを測定するために、生きた被験体に挿入することである。これらの電極は、スパイクの形状であり得、複数の電極が、スパイクのクラスターであるか（Ｅ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｊ．Ｍ．Ｆｅｒｒａｎｄｅｚ，Ｊ．Ａｍｍｅｒｍｕｌｌｅｒ，Ｒ．Ａ．Ｎｏｒｍａｎｎ，Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｃｏｄｉｎｇ  ｉｎ  ｓｐｉｋｅ  ｔｒａｉｎｓ  ｏｆ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ  ｒｅｃｏｒｄｅｄ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｇａｎｇｌｉｏｎ  ｃｅｌｌｓ，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０００，８８７，２２２−２２９；Ｄ．Ｊ．Ｗａｒｒｅｎ，Ｅ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｒ．Ａ．Ｎｏｒｍａｎｎ，Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｓｐａｔｉａｌ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｃａｔ  ｓｔｒｉａｔｅ  ｃｏｒｔｅｘ  ｕｓｉｎｇ  ａ  １００−ｍｉｃｒｏｅｌｅｔｒｏｄｅ  ａｒｒａｙ，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，１０５（１），１９−３１；Ｐ．Ｊ．Ｒｏｕｓｃｈｅ，Ｒ．Ｓ．Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｓ．Ｂａｔｔｉ���ｔｏｎ，Ｓ．Ｇｉａｎｎｏｔｔａ，Ｍ．Ｅ．Ｄｉａｍｏｎｄ，Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｐａｔｉａｌ  ａｎｄ  ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｎｓｏｒｙ  ｃｏｒｔｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ａ  １００−ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ  ａｒｒａｙ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９９，９０，５７−６６）、または錐体中に位置づけられ得、各電極は、錐体の底部表面上の平面的な電極である（Ｇ．Ｅｎｓｅｌｌ，Ｄ．Ｊ．Ｂａｎｋｓ，Ｐ．Ｒ．Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｗ．Ｂａｌａｃｈａｎｄｒａｎ，Ｄ．Ｊ．Ｅｗｉｎｓ，Ｓｉｌｉｃｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ  ｆｏｒ  ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｅｄ  ｆｏｒｍ  ｓｉｌｉｃｏｎ−ｏｎ−ｉｎｓｕｌａｔｏｒ  ｗａｆｅｒｓ，Ｍｅｄｉｃａｌ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ＆  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，２０００，３８，１７５−１７９）；別の方法は、インビトロで培養された複数の測定された細胞を同時に測定するための、微小電極の２次元アレイを使用することである（Ｙ．Ｊｉｍｂｏ，Ａ．Ｋａｗａｎａ，Ｐ．Ｐａｒｏｄｉ，Ｖ．Ｔｏｒｒｅ，Ｔｈｅ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ａ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｏｒｔｉｃａｌ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｏｆ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｒａｔｓ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，２０００，８３，１−２０；Ｔ．Ｔａｔｅｎｏ，Ｙ．Ｊｉｍｂｏ，Ａｃｔｉｖｉｔｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ  ｓｐｉｋｅ  ｔｉｍｉｎｇｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｃｏｒｔｉｃａｌ  ｎｅｕｒｏｎｓ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，１９９９，８０，４５−５５；Ｍ．Ｐ．Ｍａｈｅｒ，Ｊ．Ｐｉｎｅ，Ｊ．Ｗｒｉｇｈｔ，Ｙ．Ｃ．Ｔａｉ，Ｔｈｅ  ｎｅｕｒｏｃｈｉｐ：ａ  ｎｅｗ  ｍｕｌｔｉｅｌｅｃｔｒｏｄｅ  ｄｅｖｉｃｅ  ｆｏｒ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｎｅｕｒｏｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９９，８７，４５−５６）；第三の方法は、胚ニューロンに沿って第二の方法の微小電極アレイを含むスパイクを作成し、生きた被験体にスパイクを挿入し、そして微小電極アレイ上の細胞と被験体中の細胞との間のシグナルの統合および連絡を観察することである（Ｊ．Ｐｉｎｅ，Ｍ．Ｍａｈｅｒ，Ｓ．Ｐｏｔｔｅｒ，Ｙ．Ｃ．Ｔａｉ，Ｓ，Ｔａｔｉｃ−Ｌｕｃｉｃ，Ｊ．Ｗｒｉｇｈｔ，Ａ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｎｅｕｒｏｎ  ｐｒｏｂｅ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ＩＥＥＥ−ＥＭＢＳ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ａｍｅｒｓｔｅｒｄａｍ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９９６，Ｎｏｖ．，論文番号４２１）。インビトロのシグナルを測定する利点は、細胞の位置付けおよび細胞培養条件を制御し、それによって、ニューロンの種々の機能を、明確かつ簡便に研究し得ることである。しかし、神経突起伸長の検出は、通常、ランダムかつ制御が困難であり、このことが、電気生理学的シグナ��の連絡を記録する目的のために、神経ネットワークを確立することを困難にしている。このことはまた、移植されたニューロンが、被験体の神経系に統合され、そして神経系と連絡することを困難にしている。幾人かの研究者が、規定されたチャネルにおいてのみ、ニューロンを機械的に成長させた。しかし、この種の機械的制限は、神経突起の正常な成長に影響を与える。他の研究者らは、金属酸化物のような物質によって形成されるパターンを使用して、神経突起に対するこれらの物質のガイダンスを研究してきた（Ｙａｓｈｉｈｉｋｏ  Ｊｉｍｂｏ，Ｐ．Ｃ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ａｋｉｏ  Ｋａｗａｎａ，Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃａｌｃｉｕｍ  ａｎｄ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｆｒｏｍ  Ｐａｔｔｅｒｎｅｄ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｉｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，ＩＥＥＥ  ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎ  ｏｎ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１９９３，４０（８），８０４−８１０）。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の詳細な説明）
本発明の目的は、動物細胞を刺激し、そしてその生理学的シグナルを記録するための、有効で、簡便かつ正確な装置を提供することである。このような目的を達成するために、本発明は、動物細胞を刺激し、そしてその生理学的シグナルを記録するための装置を提供し、このような装置は、不良導電性物質を含む基材を備え、ここで、この基材のうち少なくとも１つの面は、少なくとも１単位の導電性ポリマー層および少なくとも１つの良導性微小電極を備える。
【０００６】
培養培地または体液への長時間の曝露の結果として、導電性ポリマーが基材からはがれるのを防止するために、基材と導電性ポリマー層との間に、中間層が提供され得る。このような中間層は、金または白金から作成され得る。中間層の１つの機能は、電気的重合のためのキャリアとして働くことである。別の機能は、導電性ポリマーを強固に接着させることである。
【０００７】
この基材は、２次元の平坦な構造体であり得るか；または細胞を位置付けるための１つ以上のウェルを備え得る。
【０００８】
基材を作製するために使用される材料は、剛性でも可撓性でもよく、そしてシリコン、ガラス、ポリマーまたは金属酸化物から選択され得る。
【０００９】
導電性ポリマーは、神経突起の成長をガイドするように働く。従って、導電性ポリマーは、神経細胞が接合部にある、断絶された接合部を有する、格子様のパターンを形成し得る。従って、神経突起は、導電性ポリマーのパターンに沿って成長し、そして互いに連絡する。神経突起の直径は、通常１〜２ミクロンであるので、導電性ポリマーの各バンドの幅は、通常、５ミクロン未満である。このバンドが狭すぎるかまたは広すぎる場合、導電性ポリマーが神経突起を適切にガイドする能力が影響を受ける。導電性ポリマーのパターンは、神経突起に沿った神経ネットワークの形成を容易にするように選択されるべきである。
【００１０】
本明細書中に記載される導電性ポリマーは、複数の単位を含み得る。これらの単位は、相互接続されて、一対の刺激電極を共有し得る。あるいは、これらの単位は、互いに接続されていなくてもよく、各単位は、それら独自の刺激電極対を有する。これらの単位が相互接続されていない場合、各導電性ポリマー単位についての刺激パラメータ（例えば、電流強度、持続時間、振幅および周波数）は、同じかまたは異なるかのいずれかであり得る。
【００１１】
本明細書中に記載される導電性ポリマー層の厚さは、均一でも不均一でもよい。導電性ポリマー層の厚さは、数ナノメートル〜数ミリメートルの間であり得る。細胞を、倒立顕微鏡下でインビトロで観察されるべき場合、導電性ポリマー層の厚さは、好ましくは、５００ナノメートル未満である。このことは、高い光透過性を提供し、そしてポリマーを基材に適切に接着させる。
【００１２】
導電性ポリマーが作製され得る材料としては、ポリアニリン、ポリピロール、ポリチオフェンまたはこれらの誘導体、コポリマー、あるいはこれらの混合物が挙げられる。導電性ポリマーの導電率は、空間的要件および時間的要件に従って調節され得る。電気生理学的シグナルを記録するために微小電極が使用される場合、この導電性ポリマー層は、電気生理学的シグナルの測定値が影響されない限り、非導電性に調節され得るか、または導電性のままにされ得るかのいずれかである。
【００１３】
本明細書中に記載される微小電極は、微小電極アレイへと配列され得る、１つより多い微小電極を含み得る。微小電極が作製される材料は、金、白金または酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）であり得る。
【００１４】
本明細書中に記載される導電性ポリマー層および微小電極は、互いに接続されてもされなくてもよい。接続されていない場合、導電性ポリマー層および微小電極は、約１ミクロン〜約５０ミクロン隔てられ得る。各単位における導電性ポリマーと微小電極との間の距離は、同じでも異なってもよい。
【００１５】
培養細胞が逃げるのを防止するために、導電性ポリマーによって覆われず、かつ細胞の成長または微小電極の測定のための領域ではない基材上の領域は、絶縁材料でコーティングされ得る。絶縁材料は、細胞に対して毒性でない非導電性材料（例えば、ポリイミドまたは良好な生体適合性を有する他の材料）から作製され得る。この絶縁層の厚さは、通常、５〜１００ミクロンである。
【００１６】
本発明の別の目的は、動物細胞を刺激し、そして上記の生理学的シグナルを記録するための装置を作製する単純な方法を提供することである。
【００１７】
１実施形態において、動物細胞を刺激し、そして生理学的シグナルを記録するための装置を作製する方法は、以下の工程を包含する：（ａ）良導性微小電極およびそれらの接続ワイヤを、蒸着またはスパッタによって基材上に配置する工程；（ｂ）ＰＶＤ、ＣＶＤ、電気的重合または高分子自己集合によって、少なくとも１つの単位の導電性ポリマー層を、所望のパターンで基板上に配置する工程；ならびに（ｃ）いくつかの金属ワイヤを、刺激電極に導電性ポリマーを接続するために、導電性ポリマー層の下に配置する工程。
【００１８】
本発明の別の目的は、動物細胞を刺激し、そして生理学的シグナルを記録するための装置を使用する方法を提供することである。
【００１９】
１実施形態において、動物細胞を刺激し、そして生理学的シグナルを記録するための装置を使用する方法は、以下の工程を包含する：（ａ）連続的または断続的のいずれかで、導電性ポリマーを介して電流を通過させる工程であって、ここで、この電気刺激は、直流または交流であり得、この電流の強度は、ｐＡ〜ｍＡのスケールであり得、そして交流刺激について、この刺激の周波数は、１〜１０６Ｈｚであり得る、工程；ならびに（ｂ）電流、電位またはインピーダンス電気シグナルを測定することによって、試験される細胞から生じた生理学的シグナルを、微小電極によって、記録する工程。
【００２０】
本明細書中に記載される、動物細胞を刺激し、そして生理学的シグナルを記録するための装置は、２次元の正方形、円または任意の他の不規則な形状であり得る。他の実施形態において、この装置は、３次元の中空シリンダー、球体、立方体、直方体、錐体または任意の他の不規則な形状であり得る。
【００２１】
本発明は、以下の図面および実施例の記載によって、さらに例示される。
【実施例】
【００２２】
（実施例１．本発明の装置の作製）
測定微小電極、刺激電極および所望のパターンの接続ワイヤを備える、３５０ミクロンの厚さのガラス基材の１つの表面上に、従来の光エッチング法を使用して、３００ｎｍの厚さの金の層を生成する。
【００２３】
刺激電極に電気を適用する。電気化学的重合方法を使用して、１００ｎｍの厚さのポリアニリン導電性ポリマーの層を、刺激電極に接続された金層の上部に形成して、所望のパターンを形成する。
【００２４】
スピンコーティング方法を使用して、その上部に絶縁層を生成する。光エッチング法を使用して、所望の構造を生成する。
【００２５】
動物細胞を刺激し、そしてその生理学的シグナルを記録するための装置は、上記の方法を使用して作製され得る。
【００２６】
この実施例において、基材は、それが不良導電性材料である限り、広範な材料から選択され得る。基材の厚さおよび形状は、実験の要件に従って選択され得る。空間を有効に使用するために、基材の１つより多い表面が、上記のように利用され得る。電極層は、白金、ＩＴＯまたは良導性材料である他の種のものから作製され得る。電極層の厚さは、好ましくは、３０ｎｍ〜４００ｎｍの間である。導電性ポリマーが作製される材料は、広範な種々の材料から選択され得、そして実験の要件に依存する。例えば、この材料は、ポリアニリン、ポリピロール、ポリチオフェンまたはそれらの誘導体、コポリマーあるいは混合物であり得る。コーティングまたは光エッチングの他の方法もまた、電極および導電性ポリマー層を生成し、そして所望のパターンを形成するために使用され得る。
【００２７】
（実施例２．本発明の構造）
図１、２および３に示されるように、動物細胞を刺激しそしてその生理学的シグナルを記録するための装置は、以下を備える：４００ミクロン厚の正方形のシリコン基板４；基板４の上の１００ミクロン厚のポリピロール導電性ポリマー層３であって、２つの電極（この図には示されていない）に連結されている、導電性ポリマー層；基板４の上の１６個の４０ｎｍ厚の白金微小電極２であって、各々が出力電極（この図には示されず）を有する、微小電極。この導電性ポリマー３と微小電極２との間に２５ミクロンの溝部が存在する。導電性ポリマー３によって被覆されず、かつ細胞成長または微小電極測定のための領域ではない、基板４上の領域は、ポリイミド絶縁層１によって被覆される。この絶縁層は、１０ミクロンの厚みを有し、細胞が漏れ出るのを防止する３〜７ミクロン幅のチャネルを形成する。
【００２８】
図２に示されるように、細胞培養培地を保持するための、基板上の小さな細胞培養チャンバ５が存在する。このチャンバは、生体適合性材料（例えば、ポリイミド）から作製される。この培養チャンバ５の高さは、通常、１００ｍｍよりも大きく、そしてこのチャンバの面積は、微小電極アレイ中の微小電極の数および分布に依存する。
【００２９】
この実施例において、基板と導電性ポリマー層（この図には示されず）との間に、この導電性ポリマー層が、培養培地または体液に長時間曝露された結果として、この基板から脱離するのを防止するための中間層が存在する。
【００３０】
本実施例において、この装置のサイズおよび形状、ならびに導電性ポリマー層または微小電極を配置するための基板の表面（単数または複数）の選択は、実験の必要性により決定される。図５に示されるように、この装置のインビボでの使用を容易にするために、基板４の２つの側面の両方は、導電性ポリマー層３および微小電極２で被覆される。ニューロンは、この基板の両方の側面に配置され得、従って、細胞密度を増加し、かつ効率を上げる。図５に示されるように、インビボでの移植のための装置は、上部層６を備える。この層は、移植の間の細胞の損傷を防止し、そして生きた被験体中で細胞が漏れ出るのを防止するために有用である。層６が作製される材料は、好ましくは、生体適合性であり、安定であり、そして非導電性（例えば、ポリイミド）である。
【００３１】
（実施例３：インビトロで神経ネットワークを研究するための本発明の装置の使用）
ニューロン７を、図４に示される装置の上に置く。導電性ポリマーを通じて、断続的に電流を導入する。電気的刺激は、直流または交流であり得、刺激周波数は、１〜１０６Ｈｚであり得る。研究される細胞の生理学的シグナルを、微小電極２を通じて測定する。
【００３２】
断続的な電気的刺激（一定電圧１００ｍＶ）および数日間の細胞培養の後、細胞体のサイズ、神経突起の長さのようなパラメーターによって測定されるように、刺激した細胞の成長を測定し、刺激されていない細胞と比較する。さらに、細胞を、電気的シグナルまたは化学的シグナルにより刺激し、種々の刺激に対する細胞の応答を、細胞膜上の電位の変化を測定することにより、微小電極を介してモニターする。
【００３３】
（実施例４：インビボで神経ネットワークを研究するための装置の使用）
図５に示される装置を、生きた被験体に移植する。装置上のニューロンネットワークを使用して、被験体中の損傷した神経線維を接続する。この装置をまた使用して、外部刺激(電気的刺激および医薬品による刺激を含む)に対する局所的神経組織におけるニューロンの応答を測定する。さらに、この装置を使用して、局所的神経組織を電気的に刺激し、それにより、損傷した神経の修復および再生を刺激する。
【００３４】
（産業上の有用性）
本発明は、導電性ポリマーおよび微小電極製作技術を神経科学に適用し、神経突起成長の速度および方向を効率的に制御するために導電性ポリマーを介する電気的刺激を利用する。このことにより、インビトロでの神経ネットワークの電気生理学的シグナルの効率的記録が可能になり、シグナル伝達および神経系の根本をなす機構のさらなる研究が可能になる。本発明はまた、インビボでの神経細胞の移植、移植した神経細胞の主要神経系への組み込み、および損傷した神経組織の修復を可能にする移植可能な装置を提供する。従って、この装置は、重要な医療適用価値を有する。この装置が、尿失禁、網膜の傷害、または他の神経疾患の処置に有用であることもまた予測される。
【００３５】
本発明の装置は、種々の動物神経系由来の異なる種の細胞の研究について有用であるのみならず、非神経細胞由来の細胞の研究についてもまた有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、本発明の装置の小領域の構造図を提供する。
【図２】図２は、本発明の装置の概観を提供する。
【図３】図３は、微小電極アレイの拡大図を提供する。
【図４】図４は、神経ネットワークをインビトロで研究するために使用される、単一培養単位の断面図を提供する。
【図５】図５は、生きた被験体に移植するために使用される、本発明の装置の３次元の図を提供する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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