(57)【要約】本発明は、プロリル特異的及び／又はアラニン特異的エンドプロテアーゼの添加による飲料中の濁りの防止又は低減方法及び本発明の方法で得られる新規飲料に関する。本発明は、新規なエンドプロテアーゼにも関する。本発明は、補助的酵素を特異的エンドプロテアーゼと併用する上記方法にも関する。ゲノムDNA、cDNAの配列情報及びタンパク質配列を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
飲料中の濁りの防止又は低減方法であって、プロリン特異的及び／又はヒドロキシ-プロリル特異的及び／又はアラニン特異的エンドプロテアーゼを前記飲料に添加する方法。
【請求項２】
前記エンドプロテアーゼが、本質的に単離した形態である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
エンドプロテアーゼを添加する前記飲料のｐＨに対応するｐＨで最大の特異的活性を有するエンドプロテアーゼを添加する、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記飲料がタンパク質を含有する、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記飲料がポリフェノールを含有する、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記飲料が、7.0、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0、3.5又は3.0以下のｐＨ値を有する、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
基質としてZ-Gly-Pro-pNA、Z-Gly-ヒドロキシ-Pro-pNA又はZ-Gly-Ala-pNAを用いる活性測定によって決定した場合、前記飲料中のタンパク質１グラム当たり少なくとも150ミリ単位の特異的エンドプロテアーゼ活性を前記飲料に添加する、請求項４〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
基質としてZ-Gly-Pro-pNA、Z-Gly-ヒドロキシ-Pro-pNA又はZ-Gly-Ala-pNAを用いる活性測定によって決定した場合、前記飲料中のタンパク質１グラム当たり少なくとも500ミリ単位の特異的エンドプロテアーゼ活性を前記飲料に添加する、請求項４〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
基質としてZ-Gly-Pro-pNA、Z-Gly-ヒドロキシ-Pro-pNA又はZ-Gly-Ala-pNAを用いる活性測定によって決定した場合、前記飲料中のタンパク質１グラム当たり少なくとも１単位の特異的エンドプロテアーゼ活性を前記飲料に添加する、請求項４〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記飲料が、ビールの製造で使用する液体である、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
前記飲料が、ワインの製造で使用する液体である、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
前記飲料が、果実ジュースの製造で使用する液体である、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
プロリル特異的エンドプロテアーゼをマッシュに添加する、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
プロリル特異的エンドプロテアーゼを、濁りが形成される前のビールに添加する、請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
プロリル特異的エンドプロテアーゼを、濁りが形成された後の発酵ビールに添加する、請求項１０記載の方法。
【請求項１６】
プロリル特異的エンドプロテアーゼを発酵ワインに添加する、請求項１１記載の方法。
【請求項１７】
濁り形成をさらに低減又は防止するため、前記飲料に補助的酵素を添加する、請求項１〜１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
前記補助的酵素が、精製したエキソプロテアーゼ又はエンドプロテアーゼである、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記エキソプロテアーゼがプロリン特異的カルボキシペプチダーゼである、請求項１７又は１８記載の方法。
【請求項２０】
前記プロリン特異的カルボキシペプチダーゼがザントモナスから得られる、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記補助的エンドプロテアーゼが、グリシン特異的エンドプロテアーゼ及び／又はアスパラギン酸プロテアーゼである、請求項１７又は１８記載の方法。
【請求項２２】
前記アスパラギン酸プロテアーゼが、Fromase(登録商標)である、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
酸性のｐＨ最適値を有する、プロリル特異的及び／又はヒドロキシプロリル特異的及び／又はアラニン特異的エンドプロテアーゼ活性を有する単離したポリペプチド。
【請求項２４】
前記ｐＨ最適値が、ｐＨ5.5又は約ｐＨ5.5である、請求項２３記載のポリペプチド。
【請求項２５】
請求項２３又は２４記載の特異的エンドプロテアーゼの、飲料の製造での使用。
【請求項２６】
精製したプロリル特異的及び／又はヒドロキシプロリル特異的及び／又はアラニン特異的エンドプロテアーゼの、ビール、ワイン又は果実ジュースの製造での使用。
【請求項２７】
請求項１〜２２及び／又は２５〜２６のいずれか１項記載の方法で得られる飲料。
【請求項２８】
請求項１０記載の方法で得られるビール。
【請求項２９】
請求項１１記載の方法で得られるワイン。
【請求項３０】
請求項１２記載の方法で得られる果実ジュース。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、エンドプロテアーゼの添加による飲料中の濁り防止又は低減の方法、及び本発明の方法によって得られる新規飲料に関する。本発明は、新規なエンドプロテアーゼにも関する。
【０００２】
飲料産業において、濁りは周知の現象である。濁りは、例えばビール、ワイン及び果実ジュース中に存在しうる。濁り形成は、醸造プロセス中の種々の段階で生じうる。T. Nagodawithana及びG. Reed編集,“食品加工における酵素(Enzymes in food processing)”,第３版,Academic press Inc., San Diego, Chapter V, p.448-449には、ビールタンパク質とポリフェノールプロシアニジン(procyanidins)との間の相互作用の結果であると提案されている。ビールでは、ビールの冷却時に濁りが形成されることが多いと説明されている。ビールは、発酵させてから多くの場合冷却条件下で熟成させる。清澄性を達成するため、ビールは冷却しながらろ過することが多い。ろ過したにもかかわらず、ビールは充填かつ消費者に配送され、出す前に再冷却されると曇ってくることが多い。結局のところ、冷却しないか又はもはや冷却しないときでさえビール中に濁りが形成され、沈降が発生しうる。濁り形成によって引き起こされる曇りは、微生物の腐敗によって生成される曇りに似ているので、濁り形成は望ましくなく、特にブライトビールでは望ましくない。
【０００３】
“Indsutry Enzymology”, 第２版, Chapter 2.6, p.124-145には、ビール中の濁りは、高率の疎水性アミノ酸を含有する、麦芽の高分子量ホルデインフラクションが、主にプロアントシアニジンとカテキン（フラボノイド）から成るポリフェノールと結合する架橋に起因しうると記載されている。ポリフェノールの重合で重要な役割を果たして不可逆的な濁りを生成すると述べられている酸化のみならず、小量の炭水化物と微量の無機イオンも濁り形成に関与すると記載されている。冷却されると、ポリフェノールがゆっくりタンパク質と結合して冷濁り（chill haze）を形成するが、暖められると再溶解すると提案されている。しかし、最終的には、ポリフェノールが重合し、サイズが増大するにつれ、それらは室温で不溶性となり、不可逆的又は永久的な濁りを形成する。
【０００４】
いくつかの他の出版物では、例えばビール、ワインや果実ジュース、コーヒーや紅茶中の濁り形成は、タンパク質とポリフェノールとの相互作用の結果であると提案されている（K.J. Siebertら, J. Agric. Food Chem. 44 (1996) 1997-2005及びK.J. Siebertら, J. Agric. Food Chem. 44 (1996) 80-85, K.J.Siebert, J. Agric. Food Chem. 47 (1999) 353-362）。1911年のL. Wallersteinによるその発見以来、ビール中の冷濁り形成の低減方法がビールへのパパインの添加であることは周知である。パパインは、タンパク質分解活性を有するパパイアの抽出物である。T. Nagodawithana及びG. Reed編集の“食品加工における酵素(Enzymes in food processing)”,第３版, Academic press Inc., San Diego, Chapter V, p.448-449には、パパインがビール中の冷濁りの防止にはどの他の酵素よりもはるかに優れていると記載されている。しかし、パパインが働く正確なメカニズムは解決されていない（T. Nagodawithana及びG. Reed編集“食品加工における酵素(Enzymes in food processing)”,第３版, Academic press Inc., San Diego, Chapter V, p.448-449）。
しかし、パパイン利用の欠点は、パパインは泡に負の効果を及ぼすことである。ビール上に安定な泡を形成するためにはタンパク質が必要である。しかし、そのタンパク質分解活性によって、パパインは先端の泡安定性に逆効果を及ぼす。
【０００５】
ワイン中の濁り形成については、例えば、T. Nagodawithana及びG. Reed編集の“食品加工における酵素”,第３版, Academic press Inc., San Diego, Chapter 16, p.425に、ブドウタンパク質がワインの貯蔵中の濁り形成の原因を握っていると記載されている。瓶詰め後に沈殿がワイン中に形成されると、ワインは消費者にとって魅力が減少し、販売に影響するだろう。沈殿を防止するため、例えばベントナイトが用いられる。ベントナイト及び他の吸着剤は、うまくタンパク質を除去するが、それは選択的でなく、他の望ましい化合物をワインから除去し、ワインの感覚器官を刺激する性質に影響することが多い。さらに、ベントナイトの使用は、ワインのかなりの損失をもたらし、かつベントナイト含有廃棄物のダンピングが困難をもたらす。
【０００６】
メカニズムはよく分からないが、パパインの添加が、タンパク質-ポリフェノール濁りが形成されず、或いは形成される程度を小さくするように、ビール中のタンパク質を加水分解すると考えられる。同様の理由でワイン中ではベントナイトが使用され：タンパク質を吸着することで、タンパク質-ポリフェノール濁り及び沈殿の形成を防止する。しかし、タンパク質を除去する代わりに、ポリフェノールを除去して濁り形成を低減又は防止しうる。飲料からポリフェノールを除去するために用いる典型的な例はポリビニルポリピロリドン（PVPP）である。最近、ポリフェノールが重要な抗酸化剤であることが分かった。抗酸化剤に起因するすべての有益な効果のため、飲料からポリフェノールを除去するという選択は濁りの形成を防止するための最も魅力的な方法ではない。
【０００７】
濁り防止又は除去のためのすべての既知技術は欠点があるので、飲料中の濁り形成の防止又は低減のための新規方法が未だに要望されている。
本発明の目的は、飲料中の濁りの防止又は低減方法を提供することである。
【０００８】
驚くべきことに、この目的は、飲料中の濁りの防止又は低減方法であって、飲料に酸性のｐＨ最適値を有するエンドプロテアーゼを添加する方法を提供することで達成される。好ましくは、このエンドプロテアーゼは、プロリル特異的エンドプロテアーゼ活性及び／又はヒドロキシプロリル特異的活性及び／又はアラニン特異的活性を有する単離したエンドプロテアーゼである。
【０００９】
この発明の枠組みでは、用語“飲料”は、その製造の全段階の飲料を包含する。従って、飲料は即座に消費できる飲料のみならず、飲料を製造するために使用するいずれの組成物でもある。例えば、ビール製造で使用するウワート(wort)は、本明細書で使用する用語“飲料”に包含される。また、飲料の製造中、液体でないか或いは完全には液体でない組成物へのプロリル特異的エンドプロテアーゼの添加は、本発明の方法の範囲内であることを意図している。このような組成物の例は、ビール醸造の開始と同時にマッシュに添加するプロリル特異的エンドプロテアーゼである。
【００１０】
プロリル特異的エンドプロテアーゼ（Endo-Pro）は、好ましくは、タンパク質又はペプチドがその鎖中にプロリル残基を含む場所又はその近傍でタンパク質又はペプチドを切断する、好ましくは精製したエンドプロテアーゼとして定義される。好ましくは、本発明の方法では、タンパク質又はペプチドがプロリル残基を含む場所でタンパク質又はペプチドを切断するプロリル特異的エンドプロテアーゼを使用する。
用語Endo-Pro、プロリル特異的エンドプロテアーゼ、プロリン特異的エンドプロテアーゼ、プロリン特異的エンドペプチダーゼ及びプロリル特異的活性を有するペプチド又は同様の表現は、相互交換可能に用いられる。
【００１１】
ヒドロキシ-プロリル特異的エンドプロテアーゼ（Endo-Hydroxy-Pro）は、タンパク質又はペプチドがその鎖中にヒドロキシ-プロリル残基を含む場所又はその近傍でタンパク質又はペプチドを切断する、好ましくは精製したエンドプロテアーゼとして定義される。好ましくは、本発明の方法では、タンパク質又はペプチドがヒドロキシ-プロリル残基を含む場所でタンパク質又はペプチドを切断するヒドロキシ-プロリル特異的エンドプロテアーゼを使用する。
【００１２】
アラニン特異的エンドプロテアーゼ（Endo-Ala）は、タンパク質又はペプチドがその鎖中にアラニン残基を含む場所又はその近傍でタンパク質又はペプチドを切断する、好ましくは精製したエンドプロテアーゼとして定義される。好ましくは、本発明の方法では、タンパク質又はペプチドがアラニン残基を含む場所でタンパク質又はペプチドを切断するアラニン特異的エンドプロテアーゼを使用する。
【００１３】
プロリル特異的活性を有するエンドプロテアーゼは公知である（E.C.3.4.21.26）。しかし、プロリル特異的エンドプロテアーゼ又はヒドロキシ-プロリル特異的エンドプロテアーゼ又はアラニン特異的エンドプロテアーゼの飲料中の濁りの防止又は低減のための使用については、記載又は示唆されていない。
用語ペプチド及びタンパク質は、本明細書では相互交換可能に用いられる。
また、用語“濁り(haze)”、“曇り(cloudiness)”及び“混濁(turbidity)”は、相互交換可能に使用される。
【００１４】
本発明のなおさらに好ましい方法では、そのＣ末端でプロリル残基を切断するプロリル特異的エンドプロテアーゼを使用する。そのＮＨ2末端でプロリル残基を切断するプロリル特異的エンドプロテアーゼは、例えば1998年1月15日発行のNature, Vol.391, p.301-304に記載されている。
飲料中のさらなる濁り低減は、プロリル特異的及び／又はヒドロキシプロリル特異的及び／又はアラニン特異的エンドプロテアーゼを補助的酵素と併用して処理することで達成できる。
【００１５】
特定条件下及び特定飲料中では、Endo-Pro、Endo-Hydroxy-Pro及び／又はEndo-Ala処理だけで達成可能な濁り低減レベルより高い濁りの低減が望ましいことがある。このような場合、Endo-Pro、Endo-Hydroxy-Pro及び／又はEndo-Ala処理の前、その間又は後に補助的なタンパク質分解酵素を添加することが有益だろう。このような補助的酵素は、トリペプチジルペプチダーゼ及び／又はカルボキシペプチダーゼ及び／又はペプチジル-ジペプチダーゼのようなエンドプロテアーゼ又はエキソプロテアーゼでよい。
【００１６】
この添加処理の目的は、Endo-Pro、Endo-Hydroxy-Pro及び／又はEndo-Ala処理後に残存するペプチドの溶解性をさらに高め、及び／又は該残存ポリペプチドとポリフェノールとの相互作用をさらに低減することである。
この目的は、トリペプチジルペプチダーゼ及び／又はカルボキシペプチダーゼ及び／又はペプチジル-ジペプチダーゼのようなエキソプロテアーゼを飲料に添加することで果たされ、Endo-Pro処理後に残存するペプチドからカルボキシ末端プロリン残基を除去することができる。代わりに、又は該エキソペプチダーゼと併用して、Endo-Pro処理後に残存するペプチドをさらにエンドプロテアーゼによる処理で可溶化することができる。当該目的には、グリシン、アラニン、セリン、アスパラギン及びグルタミン残基のＮ又Ｃ末端位のいすれかでペプチド結合を切断できる酵素が特に好適である。
【００１７】
合成色素生産性ペプチドFA-Pro又はFA Pro-Proに対する活性を有するカルボキシペプチダーゼが補助的酵素として非常に有用であることが分かった。
上述したように特異性のある補助的Endo-タンパク質分解酵素は、商業的に入手可能であり、或いは代わりに技術的に公知の方法、例えば、下記式
Ｚ-Ａ-Ａ-Ａ-pNA
（式中、
pNA＝パラニトロアニリン、
Ｚ＝ベンジルオキシカルボニル、
Ａ＝アミノ酸グリシン、アラニン、セリン、アスパラギン又はグルタミン）
のような合成色素生産性ペプチドの助けによって選択することができる。
【００１８】
FA-Leu-Pro又はFA-Phe-Pro（式中、FA＝フリルアクリルオキシ）のような合成色素生産性ペプチドに対する活性を有する補助的ペプチジル-ジペプチダーゼが非常に有用であることが分かった。
補助的酵素による処理は、好ましくは飲料の味、テクスチャー又は食感に逆効果を及ぼすべきでない。これら補助的酵素は、酸性のｐＨ最適値を有し、或いは酸性、好ましくはｐＨ6.0、5.0、4.5若しくは4.0以下又はほぼその程度、或いはさらに好ましくはｐＨ3.0以下又はほぼその程度の条件下で活性であることが好ましい。
【００１９】
ほとんどのビールの生産では、タンパク質分解酵素を（補助的に）添加するとき、ビールが泡を形成する能力を殺さないように特別の注意が必要である。
従来のビール醸造プロセスでは、穀物を粉砕かつマッシュにし、その結果のマッシュをろ過してウワートを得る。ウワートを煮沸してすべての残存酵素活性を不活性化し、引き続きそれを用いて酵母成長を維持する。酵母成長及びろ過後、ビールを貯蔵熟成する(lagered)。この貯蔵熟成段階で、濁り形成を防止するため飲料にパパイン（コルプリン(collupuline)）を添加しうることが述べられている。しかし、パパインはビールの泡形成能力を殺す。
【００２０】
ビール泡の原因であるLTP1（脂質伝達タンパク質(Lipid Transfer Protein)）と呼ばれるタンパク質、すなわち10kDa大麦タンパク質は非常に頑強な３次元構造を有するので、マッシュ段階中に通常存在するプロテアーゼはこの分子を加水分解できない。しかし、ウワート煮沸段階時にLTP1が開くと、それは酵素的切断に感受性になる。泡形成で活性なため、LTP1は特定の最小サイズを必要とする。今や、貯蔵熟成中（すなわち、ウワート煮沸後）のコルプリンとのインキュベーションはLTP1を破壊し、ひいてはビールの泡形成能力を殺すと考えられる。
マッシュ又は貯蔵熟成段階時のどちらかで、酸性エンドプロテアーゼ、特にEndo-Pro、Endo-Hydroxy-Pro及び／又はEndo-Alaを使用すると、濁り形成を低減するが、LTP1を殺さず、或いはLTP1に重大には作用しないので、このような酵素の使用は、泡形成に負の効果を及ぼさない。
【００２１】
さらに、Endo-Proによる消化によって生じたペプチドからのカルボキシ末端プロリン残基の除去は、ビール中の濁りのさらなる減少をもたらした。この観点の顕著に良い結果は、ザントモナス(Xanthomonas)から単離したプロリン特異的カルボキシペプチダーゼをEndo-Proと併用した場合に得られた。また、ペプチジル-ジペプチダーゼＡ（EC3.4.15.1）を用いてうまく当該効果を達成した。
Fromase(登録商標)のような凝乳酵素もEndo-Proと併用すると、濁りの低減又は防止における補助的酵素として非常に好適である。Fromase(登録商標)は、LTP1に作用せず、ビールの泡形成能力を保護するので、この目的に好適である。
Fromase(登録商標)は、Rhizomucor mieheiから得られる、チーズ生産で使用される市販製品（DSM Food Specialities）である。Fromaseは、いわゆるアスパラギン酸プロテアーゼ（EC3.4.23）である。これら酵素は、非常に低いｐＨ最適値と、Phe-Phe、Phe-Try及びLeu-Tryのような嵩高い疎水性アミノ酸残基間のペプチド結合の切断に対する率直な優先とを特徴とする。
【００２２】
Endo-Pro、Endo-Hydroxy-Pro及び／又はEndo-Ala加水分解と組み合わせた補助的酵素による添加処理によって、ワイン中のさらなる濁り低減も達成することもできる。
キチナーゼと呼ばれるタンパク質がワイン中の濁り問題の主要な原因であることが分かっている。このキチナーゼはブドウ由来で、グリシン、アラニン及びセリン残基に富む。ワインは非常に低いｐＨを有するので、我々はこのキチナーゼを酸性エンドプロテアーゼの複合混合物で加水分解しようと試みた。日本国、Shin NihonのAP 50.000と呼ばれる製品を高濃度で添加しても、ワイン中の濁り形成に何ら効果を及ぼさなかった。この知見は、ワインタンパク質のタンパク質分解に基づくすべての戦略は、実用ではうまくいかないことが判り、おそらく徒労だろうと述べているFerreiraら（Trends in Food Science & Technology 12 (2002) 230-239）の結論と一致する。
【００２３】
実施例７では、ワイン（白及び赤）の本発明の酵素製剤とのインキュベーションについて述べる。ワイン中の濁りのさらなる低減は、カルボキシ末端プロリン残基及び／又はグリシンに対して特異性のエンドプロテアーゼを除去するエキソペプチダーゼのような補助的酵素を使用することで得られるだろう。
ワイン中で（又は非常に低いｐＨを有する他のいずれの飲料中でも）Endo-Proを使用することのさらなる利点は、実施例７の実験で使用したEndo-Proが、酸性条件下でヒドロキシ-プロリン残基のところのみならず、アラニン残基後のペプチド結合も切断できることである（実施例13）。
【００２４】
飲料中の濁りの量を数量化するため、濁度計を使用することが多い。濁度計では、入射光束の方向に対して所定角度で散乱する光の量を測定する。濁度測定は、タンパク質-ポリフェノール相互作用の結果として形成される濁りの測定に非常に好適である。
ポリフェノールは、少なくとも１個のヒドロキシル基で置換された少なくとも２個の芳香環を含む化学構造を有する化合物、又は少なくとも２個のヒドロキシル基で置換された少なくとも１個の芳香環を含む化学構造を有する化合物として定義される。
ポリフェノールの例は、タンニン及びフラボノイドであり、例えば、カテキン、フラボノール及びアントシアニンが挙げられる。
【００２５】
酵素活性の典型であるように、プロリル特異的エンドプロテアーゼの活性はｐＨに依存する。本発明の方法の好ましい実施形態では、それを添加する飲料のｐＨに相当するｐＨで最大のプロリル特異的活性を有するエンドプロテアーゼを飲料に添加する。好ましい飲料は、タンパク質を含有する飲料である。別の好ましい実施形態では、飲料はタンパク質とポリフェノールを含有する。好ましい飲料は、７未満のｐＨ値を有する飲料である。
【００２６】
本発明の方法は、ビール、ワイン及び果実ジュースに有利に適用される。本方法は、ビールとワイン以外のアルコール飲料にも有利に適用しうる。
本出願で使用する場合、用語“ビール”は、麦芽処理穀物から調製されるマッシュ、及び麦芽処理穀物と非麦芽処理穀物の混合物から調製されるすべてのマッシュのみならず、非麦芽処理穀物から調製されるマッシュから調製される少なくともビールを包含することを意図する。用語“ビール”は、添加物と共に調製されるビール、及びすべての可能なアルコール含量を有するビールをも包含する。
果実ジュースは、例えばレッドベリー、イチゴ、リンゴ、西洋ナシ、トマト、柑橘類果実、野菜等から得られるジュースでよい。
【００２７】
本発明の方法で飲料に添加するプロリン特異的エンドプロテアーゼの量は、広範囲に変えうる。本発明の好ましい実施形態では、飲料中のタンパク質１ｇ当たり少なくとも150ミリ単位のプロリル特異的エンドプロテアーゼ活性（基質としてＺ-Gly-Pro-pNAを用いる活性測定によって活性が決定した）を添加する。
さらに好ましくは、少なくとも500ミリ単位のプロリル特異的エンドプロテアーゼを飲料に添加し、さらに好ましくは少なくとも１単位のプロリル特異的エンドプロテアーゼを添加する。
プロリル特異的エンドプロテアーゼ活性の最大量は特定できない。最大量は、例えば、濁り低減又は防止の所望量、飲料の組成、飲料のｐＨ及びエンドプロテアーゼがその最大活性を有するｐＨによって決まる。
プロリル特異的エンドプロテアーゼは、飲料製造中の様々な段階で添加することができる。
【００２８】
ビールの製造プロセス中、有利にはマッシュにプロリル特異的エンドプロテアーゼを添加する。別の実施形態では、有利には発酵ビールにプロリル特異的エンドプロテアーゼを添加する。有利には、ビールの製造プロセスのマッシュ又は熟成工程でプロリル特異的エンドプロテアーゼを添加することができる。最も好ましくは、煮沸工程後のウワートに該酵素を添加する。
【００２９】
ワインの製造中、有利には、発酵ワインにプロリル特異的エンドプロテアーゼを添加する。有利には、ワインの製造プロセスのアルコール発酵後又はリンゴ酸の酪酸変化発酵後にプロリル特異的エンドプロテアーゼを添加する。しかし、清澄なブドウジュースに、すなわちアルコール発酵前に該酵素を添加してもよい。
果実ジュースの製造プロセスでは、好ましくは、解離又は脱凝膠の間にプロリル特異的エンドプロテアーゼを添加する。
【００３０】
濁り形成は、例えばビール、ワイン及び果実ジュースのような酸性飲料中で生じることが多いので、好ましくは７未満のｐＨ値でプロリル特異的活性を有するプロリル特異的エンドプロテアーゼを使用する。さらに好ましくは、本発明の方法では、7.0又は6.0未満のｐＨ値で最大のプロリル特異的活性を有するプロリル特異的エンドプロテアーゼを使用する。最も好ましくは、ｐＨ5.0以下のｐＨ最適値を有するエンドプロテアーゼである。
本発明は、約ｐＨ5.0、又は4.0〜5.0のｐＨ最適値を有するプロリン特異的エンドプロテアーゼを有するようなペプチドを提供する。
【００３１】
本発明は、さらに、以下のポリペプチド：
（ａ）配列番号:４、配列番号:５、若しくは配列番号:７又はその断片と少なくとも40％の全アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｂ）（ｉ）60個の、好ましくは100個のヌクレオチドに渡って少なくとも80％又は90％の同一性、さらに好ましくは200個のヌクレオチドに渡って少なくとも90％の同一性である配列番号:１、配列番号:２、配列番号:３若しくは配列番号:６又はその断片の核酸配列、又は（ii）（ｉ）の核酸配列に相補的な核酸配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；
から成る群から選択されるプロリン特異的エンドプロテアーゼ活性を有する単離したポリペプチドを提供する。
【００３２】
本発明は、プロリル特異的エンドプロテアーゼEndo-Proをコードする核酸分子をも提供する。
本発明は、プロリル特異的エンドプロテアーゼ活性を有する精製又は単離したポリペプチドにも関する。７未満のｐＨ値で最大活性を有する精製したプロリル特異的エンドプロテアーゼが好ましい。
本発明は、配列番号:４、配列番号:５若しくは配列番号:７のアミノ酸配列、又は適切な宿主内で配列番号:１、配列番号:２、配列番号:３、若しくは配列番号:６のポリヌクレオチド配列を発現させることによって得られるアミノ酸配列を有する単離したポリペプチドを提供する。また、上記ポリペプチドの機能等価物を含むペプチド又はポリペプチドも本発明内に包含される。上記ポリペプチドは、集合的に用語“本発明のポリペプチド”に包含される。
【００３３】
用語“ペプチド”及び“オリゴペプチド”は同義語とみなされ（普通に認識されているように）、文脈がペプチジルリンケージによって結合している少なくとも２個のアミノ酸の鎖を示す必要がある場合、各用語は相互交換可能に使用できる。語“ポリペプチド”は、本明細書では７個より多いアミノ酸残基を含有する鎖について用いる。本明細書では、すべてのオリゴペプチド及びポリペプチドの式又は配列は、左から右かつアミノ末端からカルボキシ末端の方向で書かれる。本明細書で使用するアミノ酸の１文字コードは本技術で普通に知られており、かつSambrookら(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd,ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)で見つけられる。
【００３４】
“単離した”又は“精製した”ポリペプチド又はタンパク質は、その天然の環境から除去したポリペプチド又はタンパク質を意図する。例えば、組換え的に生成したポリペプチド及び宿主細胞内で発現したタンパク質は、例えば、細胞集団から該酵素を分離するための簡単な限外ろ過工程又はSmith及びJohnson, Gene 67:31-40(1988)で開示されている単工程精製法のようないずれかの適切な方法で実質的に精製した天然又は組換えポリペプチドである場合、本発明の目的で単離したとみなされる。
【００３５】
本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウム若しくはエタノール沈殿法、酸抽出法、アニオン若しくはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法で組換え細胞培養から回収かつ精製することができる。最も好ましくは、精製には高速液体クロマトグラフィー（“HPLC”）を利用する。
【００３６】
本発明のポリペプチドは、精製した天然の産物、化学合成手順の生成物、及び例えば、細菌、酵母菌、高等植物、昆虫及び哺乳類細胞を含む原核生物又は真核生物宿主から組換え技術で生成した産物を包含する。組換え生産手順で利用する宿主によって、本発明のポリペプチドはグリコシル化してもグリコシル化しなくてもよい。さらに、本発明のポリペプチドは、ある場合には宿主媒介プロセスの結果として、初期変化したメチオニン残基をも包含する。
【００３７】
本発明の有利な実施形態は、Endo-Pro活性を有する精製又は単離したポリペプチドに関する。このような精製又は単離したポリペプチドは、本発明のポリヌクレオチドを保有するA.ニガー株のような、本発明に従って生物を培養した発酵ブロスから得られる。本技術の当業者はこのような培養の上清から少なくとも部分的に精製した酵素を得る方法を知っている。その最も基本的な形態では、産生性細胞を遠心分離で発酵ブロスから分離する。結果の液体をろ過助剤でろ過し、次いで限界ろ過工程により１ミリリットル当たり１〜50酵素単位を含有する酵素溶液が得られる。理想条件下では該酵素はそのまま、すなわちさらに精製せずに使用できる。酵素の貯蔵安定性が必要な場合、噴霧乾燥するか、或いは例えばポリオール又は保存剤を添加することによって、酵素溶液の水分活性を下げて安定化することで改善することができる。
【００３８】
特に有利な精製方法は以下のとおりである。適切な発酵ブロス内で細胞を培養後、遠心分離で細胞を培養上清から分離した。上清は濁って見えた。引き続き、上清中に残存している大きい粒子を0.5％Dicalite又は好ましくは1.0％Dicaliteでろ過して、次工程で適用するフィルターの目詰りを防止した。次に、胚減少ろ過を適用して溶液中の胚の量を減らした。まだ、ろ液は澄んでいなかった。引き続き、10kダルトンの分子量分離限界値を有するミリポアフィルターを用いてさらに溶液の水分、塩及び糖含量を減らした。１バールの圧力をフィルターに掛けた。得られる典型的な収率は、発酵ブロス中に存在する単位対限外ろ過した精製ろ液中で得られる単位に基づいて50〜92％だった。限外ろ過したろ液中の酵素の典型的な濃度は、１ml当たり４〜10単位の範囲のプロリル特異的エンドプロテアーゼ活性となる。
【００３９】
さらなる精製は、以下の方法のとぢらかを適用することで得た。
24mlのＱ-セファロース(sepharose)FFカラム(床高12cm／直径1.6cm)上Akta Explorerを用いて実験室規模の精製を行った。10mlのＵＦ-濃縮物を緩衝液Ａ中10倍に希釈し、カラムに適用した。勾配：20ＣＶ中０〜50％Ｂでタンパク質を溶出した。緩衝液Ａは、20mM NaAc ｐＨ5.1だった。緩衝液Ｂは、20mM NaAc＋1M NaCl ｐＨ5.1だった。流れは５ml/分だった。
500mlのＱ-セファロース(sepharose)FFカラム(床高23.5cm／直径５cm)上で作業指示W-0894に従うAkta精製装置を用いて精製を行った。200mlのＵＦ-濃縮物を緩衝液Ａ中10倍に希釈し、カラムに適用した。勾配：20ＣＶ中０〜40％Ｂでタンパク質を溶出した。緩衝液Ａは、20mM NaAc ｐＨ5.1だった。緩衝液Ｂは、20mM NaAc＋1M NaCl ｐＨ5.1だった。流れは10ml/分だった。フラクションを手動で収集した。
得られた生成物は、HPSEC上で単一のピークを示し、SDS PAGE及びIEF中で単一バンドとして現れた。従って、プロリル特異的エンドプロテアーゼはＱ-セファロースFFを用いて均質性に精製しうると結論した。推定純度は90％を超え、Ｚ-gly-Pro-pNAに関する特異的活性は少なくとも0.094Ｕ/mgだった。
【００４０】
本発明のポリペプチドは、単離した形態でよい。ポリペプチドは、該ポリペプチドの意図した目的を妨げない担体又は希釈剤と混合してよく、かつそれでも単離した形態とみなされることが理解されるだろう。本発明のポリペプチドは、さらに実質的に精製した形態でもよく、この場合、通常それは製剤中に本ポリペプチドを含み、該製剤中70％を超え、例えば、80％、90％、95％、98％又は99％を超えるタンパク質が本発明のポリペプチドである。
本発明のポリペプチドは、その天然の細胞環境外であるような形態で提供することができる。従って、それらは、上述したように、実質的に単離又は精製され、或いは天然には存在しない細胞、例えば他の真菌種、動物、植物又は細菌の細胞中でよい。
有利には、本発明の方法では単離又は精製したプロリル特異的エンドプロテアーゼを用いる。
本発明の単離又は精製したプロリル特異的エンドプロテアーゼは、好ましくはタンパク性物質１ｇ当たり少なくとも10単位のプロリル特異的エンドプロテアーゼ活性を有する。これら単位は、方法セクションで述べたように、37℃かつｐＨ５の合成ペプチドＺ-Gly-Pro-pNAを用いて測定する。
【００４１】
プロリル特異的エンドプロテアーゼは、動物及び植物内で広く見られるが、微生物中の存在は限定されているようである。今日まで、プロリン特異的エンドプロテアーゼは、種アスペルギルス(Aspergillus)(EP 0 522 428)、フラボバクテリウム(Flavobacterium)(EP 0 967 285)及びアエロモナス(Aeromonas)(J.Biochem.113, 790-796)、ザントモナス(Xanthomonas)及びバクテロイデス(Bacteroides)で同定されている。多くのこれら生物由来のプロリン特異的酵素が、ほぼｐＨ８で活性であるのと対照的に、本発明の酵素は酸性ｐＨで最適の活性を示し、ほぼｐＨ５又はそれ未満のｐＨ最適値を有する場合さえある。本発明のプロリン特異的エンドプロテアーゼは、上述した細菌種の１つ、特にアスペルギルス種から単離することができる。好ましくは、酸性プロリン特異的エンドプロテアーゼEndo-Proは、アスペルギルス・ニガー株から単離される。さらに好ましくは、プロリン特異的エンドプロテアーゼは、プロリン特異的エンドプロテアーゼをコードする遺伝子を過剰発現するように操作したアスペルギルス・ニガー宿主から単離されるが、大腸菌のような他の宿主も適切な発現ベクターである。例えば、とりわけ大腸菌中のフラボバクテリウム誘導プロリン特異的エンドプロテアーゼのクローニング及び過剰産生は、純粋形態で入手可能な特定のプロリン特異的エンドプロテアーゼを生じさせた。このような過剰産生性構成物の例は、World Journal of Microbiology &Biotechnology, Vol 11,pp 209-212に提供されている。好ましくは、アスペルギルス・ニガー宿主を用い、A. ニガープロリン特異的エンドプロテアーゼをコードする遺伝子の発現を作動させるためのA. ニガープロモーターを利用して非組換え自己構成物を生成する。
【００４２】
第１実施形態では、本発明は、配列番号:４、配列番号:５、又は配列番号:７（すなわちポリペプチド）のアミノ酸に対して、全体的度合が少なくとも約40％、好ましくは少なくとも約50％、好ましくは少なくとも約60％、好ましくは少なくとも約65％、好ましくは少なくとも約70％、さらに好ましくは少なくとも約80％、なおさらに好ましくは少なくとも約90％、なおさらに好ましくは少なくとも約95％、最も好ましくは少なくとも約97％のアミノ酸配列同一性を有し、かつプロリン特異的エンドプロテアーゼ活性を有するアミノ酸配列を有する単離したポリペプチドを提供する。
【００４３】
本発明の目的では、２種以上のアミノ酸配列間の同一性の度合は、マトリックスBlosum 62を備えたBLAST P タンパク質データベース検索プログラム（Altschulら, 1997, Nucleic Acids Research 25: 3389-3402）及び10という予想閾値によって決定される。
【００４４】
本発明のポリペプチドは、配列番号:４、配列番号:５、若しくは配列番号:７に示されるアミノ酸配列又は実質的に相同性の配列、或いはプロリン特異的エンドプロテアーゼ活性を有するどちらかの配列の断片を含みうる。一般に、配列番号:４、配列番号:５、若しくは配列番号:７に示される天然に存在するアミノ酸配列が好ましい。
本発明のポリペプチドは、配列番号:４、配列番号:５、若しくは配列番号:７のポリペプチドの天然に存在する変異体又は種相同体をも含みうる。
変異体は、例えば、真菌、細菌、酵母菌又は植物細胞内で天然に存在するポリペプチドであり、該変異体は、プロリン特異的エンドプロテアーゼ活性及び配列番号:４、配列番号:５、若しくは配列番号:７のタンパク質と実質的に同様の配列を有する。用語“変異体”は、配列番号:４、配列番号:５、若しくは配列番号:７のプロリン特異的エンドプロテアーゼと同一の本質的特性又は基本的な生物学的機能性を有するポリペプチドを指し、かつ対立形質の変異体を包含する。好ましくは、変異体ポリペプチドは、配列番号:４、配列番号:５、若しくは配列番号:７のポリペプチドと少なくとも同レベルのプロリン特異的エンドプロテアーゼ活性を有する。変異体は、配列番号:４、配列番号:５、若しくは配列番号:７のポリペプチドと同株由来、又は同属若しくは同種の異なる株由来のどちらかの対立形質の変異体を包含する。
【００４５】
同様に、本発明のタンパク質の種相同体は、プロリン特異的エンドプロテアーゼであり、かつ別種のアスペルギルス中で天然に存在する同様の配列の等価タンパク質である。
変異体及び種相同体は、配列番号:４、配列番号:５、若しくは配列番号:７のポリペプチドを単離するために使用した本明細書で述べる手順で単離することができ、かつ該手順は、適切な細胞源、例えば細菌、酵母菌、真菌又は植物細胞上で行った。本発明のプローブを用いて、酵母菌、細菌、真菌又は植物細胞から作られるライブラリーを探査し、配列番号:４、配列番号:５、若しくは配列番号:７のポリペプチドの変異体又は種相同体を発現するクローンを得ることもできる。これらクローンを従来技術で操作して本発明のポリペプチドを生じさせ、その後それ自体公知の組換え又は合成法で生産することができる。
【００４６】
配列番号:４、配列番号:５、若しくは配列番号:７のポリペプチド及び変異体や種相同体の配列を変えて本発明のポリペプチドを与えることもできる。アミノ酸置換、例えば、１、２又は３〜10、20又は30個の置換を引き起こしうる。同数の欠失及び挿入を生じさせることもできる。これら変化は、このように変化したポリペプチドがそのプロリン特異的エンドプロテアーゼ活性を保持するように、該ポリペプチドの機能に重大な領域外で起こすことができる。
【００４７】
本発明のポリペプチドは、上述した全長ポリペプチド及びその変異体の断片を包含し、配列番号:４、配列番号:５、若しくは配列番号:７に示される配列の断片を含む。このような断片は、通常プロリン特異的エンドプロテアーゼとしての活性を保持する。断片は、少なくとも50、100又は200アミノ酸長でよく、或いはこの数の、配列番号:４、配列番号:５、若しくは配列番号:７に示される全長配列のアミノ酸ショートでよい。
本発明のポリペプチドは、必要ならば、合成手段によって生産できるが、通常、後述するように組換え的に生じさせる。合成ポリペプチドは、その同定又は精製を補助するめ、例えば、ヒスチジン残基又はTGタグの付加によって、或いは細胞からのその分泌を促すたものシグナル配列の付加によって修飾することができる。
【００４８】
従って、変異体配列は、配列番号:４、配列番号:５、若しくは配列番号:７のポリペプチドが単離した株以外のアスペルギルス株由来の配列を含みうる。プロリン特異的エンドプロテアーゼ活性を探し、かつ本明細書で述べるようにクローン化及び配列決定することによって、他のアスペルギルス株から変異体を同定することができる。変異体は、該ペプチドが配列番号:４、配列番号:５、若しくは配列番号:７のプロリン特異的エンドプロテアーゼの基本的な生物学的機能性を維持する限り、タンパク質配列内の単一のアミノ酸又はアミノ酸群の欠失、修飾又は付加を含みうる。
【００４９】
アミノ酸置換は、例えば１、２又は３〜10、20又は30個の置換を生じさせることができる。修飾したポリペプチドは、通常プロリン特異的エンドプロテアーゼとしての活性を保持する。保存的置換を引き起こすことができ；このような置換は技術的に周知である。好ましくは、置換はポリペプチドの折りたたみ(folding)又は活性に影響しない。
より短いポリペプチド配列も本発明の範囲内である。例えば、長さが少なくとも50個のアミノ酸又は60、70、80、100、150若しくは200個までのアミノ酸のペプチドは、それが配列番号:４、配列番号:５、若しくは配列番号:７のプロリン特異的エンドプロテアーゼの基礎的な生物学的機能性を示す限り、本発明の範囲内に含まれるとみなす。特に、しかし排他的ではないが、本発明のこの局面は、タンパク質がその完全なタンパク質配列の断片である状況を包含する。
【００５０】
第２実施形態では、本発明は、プロリン特異的エンドプロテアーゼ活性を有し、かつ低厳密性条件、さらに好ましくは中厳密性条件、最も好ましくは高厳密性条件下で、（ｉ）配列番号:１、配列番号:２、配列番号:３若しくは配列番号:６の核酸配列、又は配列番号:１、配列番号:２、配列番号:３若しくは配列番号:６の少なくともＣ末端部を含むが、配列番号:１、配列番号:２、配列番号:３若しくは配列番号:６の塩基すべてより少ない塩基を有するか或いは異なる塩基を有する核酸断片；又は（ii）配列番号:１、配列番号:２、配列番号:３若しくは配列番号:６相補的な核酸鎖とハイブリダイズするか或いはハイブリダイズできるポリヌクレオチドによってコードされる単離したポリペプチドを提供する。
【００５１】
用語“ハイブリダイズできる”は、本発明の目標ポリヌクレオチドが、バックグラウンドを有意に超えるレベルで、プローブとして用いる核酸（例えば、配列番号:１、配列番号:２、配列番号:３若しくは配列番号:６に示されるヌクレオチド配列、又はその断片、又は配列番号:１、配列番号:２、配列番号:３若しくは配列番号:６の補体）にハイブリダイズできることを意味する。本発明は、本発明のプロリン特異的エンドプロテアーゼ、及びそれに相補性であるヌクレオチド配列をコードするポリヌクレオチドをも包含する。ヌクレオチド配列は、ゲノムDNA、合成DNA又はcDNAを含む、RNA又はDNAでよい。好ましくは、ヌクレオチド配列はDNA、最も好ましくはゲノムDNA配列である。典型的には、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号:１、配列番号:２、配列番号:３若しくは配列番号:６のコーディング配列又はコーディング配列の補体に、選択条件下でハイブリダイズできる、ヌクレオチドの相接配列を含む。このようなヌクレオチドは、技術的に周知な方法で合成することができる。
【００５２】
本発明のポリヌクレオチドは、バックグラウンドを有意に超えるレベルで配列番号:１、配列番号:２、配列番号:３若しくは配列番号:６のコーディング配列又は該コーディング配列の補体にハイブリダイズできる。例えば、cDNAライブラリー中に存在する他のcDNAのため、バックグラウンドハイブリダイゼーションが起こりうる。本発明のポリヌクレオチドと配列番号:１、配列番号:２、配列番号:３若しくは配列番号:６のコーディング配列又は該コーディング配列の補体との間の相互作用によって生成されるシグナルレベルは、典型的に、他のポリヌクレオチドと配列番号:１、配列番号:２、配列番号:３若しくは配列番号:６のコーディング配列との間の相互作用の強度の、少なくとも10倍、好ましくは少なくとも20倍、さらに好ましくは少なくとも50倍、なおさらに好ましくは少なくとも100倍である。相互作用の強度は、例えば、プローブを例えば32Ｐで放射能標識して測定することができる。選択的ハイブリダイゼーションは、典型的に、低厳密性（約40℃で0.3Ｍ塩化ナトリウムと0.03Ｍクエン酸ナトリウム）、中厳密性（例えば、約50℃で0.3Ｍ塩化ナトリウムと0.03Ｍクエン酸ナトリウム）又は高厳密性（例えば、約60℃で0.3Ｍ塩化ナトリウムと0.03Ｍクエン酸ナトリウム）の条件を用いて達成することができる。
【００５３】
（修飾）
本発明のポリヌクレオチドは、DNA又はRNAを含みうる。それらは一本鎖又は二本鎖でよい。それらは、その中に、ペプチド核酸を含む合成又は修飾したヌクレオチドを包含するポリヌクレオチドでもよい。ポリヌクレオチドに対する多数の異なるタイプの修飾が技術的に知られている。これには、メチルホスホネート及びホスホロチオエート骨格、及び該分子の３'及び／又は５'末端におけるアクリジン又はポリリジン鎖の付加が挙げられる。本発明の目的では、本明細書で述べるポリヌクレオチドは、技術的に利用可能ないずれの方法によっても修飾しうることを理解すべきである。
当業者は、日常的な方法を用いて、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響しないヌクレオチド置換を生じさせ、本発明のポリペプチドが発現される予定のいずれの特定宿主生物のコドン使用法をも反映することができる。
【００５４】
配列番号:１、配列番号:２、配列番号:３若しくは配列番号:６のコーディング配列は、ヌクレオチド置換、例えば１、２又は３〜10、25、50又は100個の置換によって修飾することができる。二者択一的に又は追加的に１つ以上の挿入及び／又は欠失によって或いはどちらか又は両方の末端での伸長によって配列番号:１、配列番号:２、配列番号:３若しくは配列番号:６のポリヌクレオチドを修飾することができる。縮重置換を引き起こし、及び／又は修飾した配列が、例えば後でポリペプチドについて述べるように翻訳されるとき、保存的アミノ酸置換となるであろう置換を引き起こすことができる。
【００５５】
（相同体）
配列番号:１、配列番号:２、配列番号:３若しくは配列番号:６のDNAコーディング配列の補体に選択的にハイブリダイズできるヌクレオチド配列は本発明に包含され、かつ通常、配列番号:１、配列番号:２、配列番号:３若しくは配列番号:６の少なくとも60、好ましくは少なくとも100、さらに好ましくは200個の相接ヌクレオチドの領域にわたって、最も好ましくは全長にわたって、配列番号:１、配列番号:２、配列番号:３若しくは配列番号:６のコーディング配列に対して少なくとも50％若しくは60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％又は少なくとも99％の配列同一性を有する。同様に、活性なプロリン特異的エンドプロテアーゼをコードし、かつ配列番号:１、配列番号:２、配列番号:３若しくは配列番号:６のDNAコーディング配列の補体の断片に選択的にハイブリダイズできるヌクレオチドも本発明に包含される。好ましくは100ヌクレオチドにわたって少なくとも80％若しくは90％同一性である、さらに好ましくは200ヌクレオチドにわたって少なくとも90％同一性である、配列番号:１、配列番号:２、配列番号:３若しくは配列番号:６の核酸配列のＣ末端断片も本発明に包含される。
【００５６】
上述した度合の同一性と最小サイズのいずれの組合せを用いても本発明のポリヌクレオチドを定義でき、さらに厳密な組合せ（すなわち、より長い長さにわたるより高い同一性）が好ましい。従って、例えば、60、好ましくは100ヌクレオチドにわたって少なくとも80％又は90％同一性であるポリヌクレオチドは本発明の一局面を形成し、同様に200ヌクレオチドにわたって少なくとも90％同一性であるポリヌクレオチドは本発明の一局面を形成する。
【００５７】
UWGCGパッケージは、同一性を計算するために使用（例えば、そのデフォルトセッティングについて使用）可能なBESTFITプログラムを提供する。
PILEUP及びBLAST Nアルゴリズムを用いても配列同一性を計算し、或いは配列を一列に並べることができる（例えば、そのデフォルトセッティングについて等価な配列又は対応する配列を同定するように）。
【００５８】
BLAST解析を実行するソフトウェアは、National Center for Biotechnology Informationを通じて公に入手可能である（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。このアルゴリズムは、まず、データベース配列中の同一長さの語で並べたとき、いくつかの正の値の許容限界スコアＴと調和し或いは満たす照会配列中の短い語長Ｗを同定することによって、高得点配列対（HSPs）を同定することを含む。Ｔは、隣接語スコア閾値と呼ばれる。これら最初の隣接語ヒットが、それらを含有するHSPsを見つけるための検索を開始する発生源として働く。語ヒットは、その累積的アラインメントスコアが増加しうる限り、各配列に沿って両方向に拡張される。各方向の語ヒットの拡張は、累積的アラインメントスコアがその達成される最大値からの値から量Ｘだけ減少するか；１以上の負のスコアリング残基アラインメントの蓄積のため、蓄積的スコアがゼロ以下になるか；又はどちらかの配列末端に到達したとき停止する。BLASTアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ及びＸは、アラインメントの感度と速度を決める。BLASTプログラムはデフォルトとして語長（Ｗ）11、BLOSUM62スコアリングマトリックスアルゴリズム（Ｂ）50、期待値（Ｅ）10、Ｍ＝５、Ｎ＝４及び両鎖の比較を用いる。
【００５９】
BLASTアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計解析を実行する。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間で一致が偶発するであろう確率の指標を与える最小総確率（Ｐ(Ｎ)）である。例えば、第１配列の第２配列と比較した最小総確率が約１未満、好ましくは約0.1未満、さらに好ましくは約0.01未満、最も好ましくは約0.001未満であれば、ある配列は一方の配列と同様とみなされる。
【００６０】
（プライマーとプローブ）
本発明のポリヌクレオチドはプライマーを包含し、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）プライマーとして、二者択一的増幅反応用プライマーとして、又はプローブ、例えば放射性若しくは非放射性標識を用いる従来手段による暴露的標識で標識化したプローブとして使用でき、或いは該ポリヌクレオチドをベクター中にクローン化することができる。このようなプライマー、プローブ及び他の断片は、少なくとも15、例えば少なくとも20、25、30又は40ヌクレオチド長だろう。これらは、典型的に長さ40、50、60、70、100、150、200又は300個までのヌクレオチド長であり、或いは配列番号:１、配列番号:２、配列番号:３若しくは配列番号:６のコーディング配列の数ヌクレオチド（５又は10ヌクレオチドのような）までの短さでさえある。
【００６１】
一般に、プライマーは、所望の核酸配列の一度に１つのヌクレオチドの段階的製造を含む合成手段で生産される。自動化手順を用いてこれ達成するための方法は技術的に容易に利用できる。より長いポリヌクレオチドは、一般に組換え手段、例えば、PCRクローン化技術を用いて生成されるだろう。これは、１対のプライマー（典型的に約15〜30ヌクレオチド）を生じさせ、クローン化すべきプロリン特異的エンドプロテアーゼの所望領域を増幅する工程、このプライマーを酵母菌、細菌、植物、原核生物又は好ましくはアスペルギルス株の真菌細胞から得たmRNA、cDNA又はゲノムDNAと接触させる工程、所望領域の増幅に好適な条件下でポリメラーゼ連鎖反応を行う工程、増幅した断片を単離する工程（例えば、アガロースゲル上で反応混合物を精製することによって）及び増幅したDNAを回収する工程を含む。適切な制限酵素認識部位を含有するようにプライマーを設計することができるので、増幅したDNAが適切なクローニングベクター中にクローン化しうる。
【００６２】
このような技術を用いて、本明細書で述べるプロリン特異的エンドプロテアーゼ配列をコードするポリヌクレオチドのすべて又は一部を得ることができる。イントロン、プロモーター及びトレーラー領域は本発明の範囲内であり、真菌、酵母菌、細菌、植物又は原核生物細胞由来のゲノムDNAで開始する類似の方法で（例えば、組換え手段、PCR又はクローニング法によって）得ることもできる。
【００６３】
ポリヌクレオチド又はプライマーは暴露的標識を保有しうる。好適な標識としては32Ｐ又は35Ｓのような放射性同位体、酵素標識、又はビオチンのような他のタンパク質標識が挙げられる。このような標識は、本発明のポリヌクレオチド又はプライマーに付加してよく、本技術の当業者に公知の方法で検出することができる。
標識化又は非標識化ポリヌクレオチド又はプライマー（又はその断片）は、真菌試料中のプロリン特異的エンドプロテアーゼ若しくはその変異体を検出又は配列決定するための核酸ベース試験で使用できる。このような検出試験は、通常、ハイブリダイズ条件下で、問題のDNAを含有すると疑われる真菌試料を、本発明のポリヌクレオチド又はプライマーを含むプローブと接触させる工程、及び該プローブと試料中の核酸との間で形成されるいずれかの二重鎖を検出する工程を含む。検出は、PCRのような技法を用い、又は該プローブを固体支持体上に固定し、該プローブにハイブリダイズしない、試料中のいかなる核酸をも除去してから該プローブにハイブリダイズするいずれの核酸をも検出することによって達成できる。代わりに、試料核酸を固体支持体上に固定し、いかなる非結合プローブをも除去後、ハイブリダイズしたプローブと、該支持体に結合したプローブの量を検出してもよい。
【００６４】
本発明のプローブは、適切な容器内の試験キットという形態で便利に梱包することができる。このようなキットでは、そのキットが企図する検定形式がプローブを固体支持体に結合する必要がある場合には、そのように結合させることができる。キットは、探査すべき試料を処理し、プローブを試料中の核酸にハイブリダイズさせるための適切な試薬、対照試薬、使用説明書なども含むことができる。本発明のプローブ及びポリヌクレオチドを微量検定法で使用することもできる。
【００６５】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、真菌、特にアスペルギルス属の真菌のような、ポリペプチドと同一生物から得られる。
本発明のポリヌクレオチドは、プロリン特異的エンドプロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列番号:１、配列番号:２、配列番号:３若しくは配列番号:６の配列の変異体をも包含する。変異体は、付加、置換及び／又は欠失によって形成することができる。従って、このような配列番号:１、配列番号:２、配列番号:３若しくは配列番号:６のコーディング配列の変異体は、プロリンのカルボキシ末端側でポリヌクレオチド鎖を消化する能力を有するポリヌクレオチドをコードしうる。
【００６６】
（ポリヌクレオチドの生産）
配列番号:１、配列番号:２、配列番号:３若しくは配列番号:６と100％の同一性を持たないが、本発明の範囲内であるポリヌクレオチドは、多くの手段で得ることができる。従って、本明細書で述べるプロリン特異的エンドプロテアーゼ配列の変異体は、例えば、本発明のポリヌクレオチドの起源として述べた生物のような一連の生物から作製されるゲノムDNAライブラリーを探査することで得られる。さらに、プロリン特異的エンドプロテアーゼの他の真菌、植物又は原核生物相同体が得られ、かつこのような相同体及びその断片は、一般に配列番号:１、配列番号:２、配列番号:３若しくは配列番号:６にハイブリダイズできるだろう。このような配列は、他の種由来のcDNAライブラリー又はゲノムDNAライブラリーを探査し、また低、中〜高厳密性（上述したような）条件下で配列番号:１の全部又は一部を含むプローブを有する該ライブラリーを探査することで得られる。配列番号:１、配列番号:２、配列番号:３若しくは配列番号:６の全部又は一部を含む核酸プローブを用いて、本発明のポリペプチドの起源として述べた種のような他の種由来のcDNA又はゲノムライブラリーを探査することができる。
【００６７】
種相同体は、保存的アミノ酸配列をコードする変異体及び相同体内の配列を標的にするように設計したプライマーを使用する縮重PCRで得ることもできる。プライマーは、１つ以上の縮重位置を含むことができ、かつ既知配列に対する単一配列プライマーで配列をクローン化するために用いる条件より低い厳密性条件で使用される。
【００６８】
代わりに、このようなポリヌクレオチドは、プロリン特異的エンドプロテアーゼ配列又はその変異体の部位特異的突然変異によって得られる。これは、例えば、配列に対するサイレントコドン変化が、該ポリヌクレオチド配列が発現されている特定の宿主細胞用のコドン優先を最適化することが必要な場合に有用である。制限酵素認識部位を導入するため、又は該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの特性若しくは機能を変えるために、他の配列変化を生じさせることができる。
【００６９】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドとその補体を含む二本鎖ポリヌクレオチドを包含する。
本発明は、上述した本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供する。このようなポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの組換え生産用配列として有用なので、それらは配列番号:１、配列番号:２、配列番号:３若しくは配列番号:６の配列にハイブリダイズできる必要がないが、ハイブリダイズできることが一般的に望ましい。そうでなくても所望により上述したようにこのようなポリヌクレオチドを標識し、使用し、かつ製造することができる。
【００７０】
（組換えポリヌクレオチド）
本発明は、クローニング及び発現ベクターを含め、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターをも提供し、別の局面では、例えば、本発明のポリヌクレオチドの発現が起こり、又は本発明の配列によってコードされる条件下で該ベクターを成長させ、形質転換し、又は適切な宿主細胞中に形質移入する方法が存在する。本発明のポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞も提供され、該ポリヌクレオチドは宿主細胞のゲノムに非相同的である。通常宿主細胞について使用される用語“非相同的”は、該ポリヌクレオチドが該宿主細胞のゲノム中に天然には存在しないか、又は該ポリヌクレオチドは当該細胞によって天然には産生されないことを意味する。好ましくは、宿主細胞は酵母菌細胞、例えばクライベロミセス(Kluyveromyces)若しくはサッカロミセス(Saccharomyces)属の酵母菌細胞又は例えばアスペルギルス属の糸状真菌細胞である。
【００７１】
本発明のポリヌクレオチドは、組換え複製可能ベクター、例えばクローニング又は発現ベクター中に組み込むことができる。ベクターを用いて適合性宿主細胞中の核酸を複製することができる。従って、さらなる実施形態では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを複製可能ベクター中に導入し、該ベクターを適合性宿主細胞中に導入し、かつ該宿主細胞を該ベクターの複製をもたらす条件下で成長させることによって、本発明のポリヌクレオチドを製造する方法を提供する。ベクターは、宿主細胞から回収することができる。好適な宿主細胞については、発現ベクターとからめて後述する。
【００７２】
（ベクター）
本発明の発現カセットを挿入するベクターは、組換えDNA手順に都合よく供給できるいずれのベクターでもよく、ベクターの選択は、それを導入する予定の宿主細胞によって決まる。従って、ベクターは、自己複製ベクター、すなわち染色体外エンティティーとして存在し、プラスミドのようなその複製が染色体の複製と独立しているベクターでよい。代わりに、ベクターは、宿主細胞中に導入すると、宿主細胞ゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製するベクターでよい。
【００７３】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドがベクター中にあるとき、ベクターは、宿主細胞によってコーディング配列の発現の準備をしうる調節配列に作動可能に結合している、すなわちベクターは発現ベクターである。用語“作動可能に結合”は、述べている成分がその意図した様式で機能できる関係にある近位を指す。コーディング配列に“作動可能に結合”しているプロモーター、エンハンサー又は他の発現調節シグナルのような調節配列は、該コーディング配列の発現が該調節配列と適合性の条件下で達成されるように位置づけられている。
【００７４】
例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス又はファージベクターの場合、ベクターは、複製起点を備え、任意にポリヌクレオチドの発現用プロモーターと、任意に該プロモーターのエンハンサー及び／又はレギュレーターを備える。ポリアデニル化配列である場合、終止配列が存在しうる。ベクターは、１つ以上の選択可能マーカー遺伝子、例えば細菌プラスミドの場合はアンピシリン耐性遺伝子、又は哺乳類ベクター用のネオマイシン耐性遺伝子を含みうる。ベクターは、例えばRNAの生産のためインビトロ使用することができ、或いは宿主細胞に形質移入又は形質転換するために使用することができる。
【００７５】
ポリペプチドをコードするDNA配列は、好ましくは該DNA配列が、宿主細胞内で該DNA配列の発現を方向づけできる発現シグナルに作動可能に結合している発現構成物の一部として適切な宿主中に導入される。適切な宿主の該発現構成物による形質転換のための当業者に周知の形質転換手順が利用できる。発現構成物を選択可能マーカーを運ぶベクターの一部として宿主の形質転換に使用でき、又は該発現構成物は、選択可能マーカーを運ぶベクターと一緒に別個の分子として共-形質転換される。ベクターは、１つ以上の選択可能マーカー遺伝子を含むことができる。
【００７６】
好ましい選択可能マーカーとしては、限定するものではないが、宿主細胞内の欠失を補完するか、又は薬物に対する耐性を与えるマーカーが挙げられる。選択可能マーカーとしては、例えばアセトアミダーゼ遺伝子又はcDNAs（A.ニデュランス(nidulans)、A.オリゼ(oryzae)、又はA.ニガー由来のamdS、niaD、facA遺伝子）のような多くの糸状真菌や酵母菌の形質転換のために使用できる多目的マーカー遺伝子、又はG418、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、フレオマイシン(phleomycin)若しくはベノミル耐性（benA）のような抗生物質に耐性を与える遺伝子が挙げられる。代わりに、対応する突然変異体宿主株：例えば、URA3（S.セレビジエ(cerevisiae)由来又は他の酵母菌由来の類似遺伝子）、pyrG又はpyrA(A.ニデュランス又はA.ニガー由来)、argB(A.ニデュランス又はA.ニガー由来)又はtrpCを必要とする栄養要求性マーカーのような特有の選択マーカーを使用することができる。好ましい実施形態では、発現構成物の導入後、形質転換した宿主細胞から選択マーカーを除去して、選択マーカー遺伝子のないポリペプチドを産生できる形質転換宿主細胞を得る。
【００７７】
他のマーカーとしては、ATPシンセターゼサブユニット9(oliC)、オロチジン-5'-ホスフェート-デカルボキシラーゼ(pvrA)、細菌性G418耐性遺伝子(酵母菌に有用であるが、糸状真菌では有用でない)、アンピシリン耐性遺伝子(大腸菌)、ネオマイシン耐性遺伝子(バシラス(Bacillus))及び大腸菌uidA遺伝子、グルクロニダーゼ(glucuronidase)(GUS)用コーディングが挙げられる。ベクターは、例えばRNAの生産用、又は宿主細胞の形質移入若しくは形質転換のために使用しうる。
【００７８】
多くの糸状真菌及び酵母菌では、好ましくは安定な形質転換体を得るため、発現構成物を宿主細胞のゲノム中に組み込む。しかし、特定の酵母菌では、適切なエピソームベクター系も利用でき、その中に安定かつ高レベル発現のための発現構成物を組み込むことができる。その例としては、それぞれサッカロミセス及びクライベロミセスの２μm、CEN及びpKD1プラスミドから誘導されたベクター、又はAMA配列（例えば、アスペルギルス由来のAMA1）を含有するベクターが挙げられる。発現構成物を宿主細胞ゲノム中に組み込むとき、ゲノム中のランダムな遺伝子座に組み込むか、又は相同的組換えによって所定の標的遺伝子座に発現構成物を組み込み、この場合標的遺伝子座は、好ましくは高度に発現される遺伝子を含む。高度に発現される遺伝子は、例えば誘導条件下でそのmRNAが全細胞mRNAの少なくとも0.01％(w/w)を構成しうる遺伝子であり、又は二者択一的に、その遺伝子産物が全細胞タンパク質の少なくとも0.2％(w/w)を構成しうる遺伝子であり、又は、分泌遺伝子産物の場合、少なくとも0.05g/lのレベルまで分泌されうる。
【００７９】
所定の宿主細胞用の発現構成物は、通常、第１局面のポリペプチドをコードする配列のコーディング鎖に関して５'末端から３'末端への連続的順序で相互に作動可能に結合している以下の要素を含有する：（１）該所定の宿主細胞内で該ポリペプチドをコードするDNA配列の転写を方向づけできるプロモーター配列、（２）好ましくは、５'非翻訳領域（リーダー）、（３）任意に、培地中に該所定の宿主細胞由来のポリペプチドの分泌を方向づけできるシグナル配列、（４）該ポリペプチドの成熟した、かつ好ましくは活性な形態をコードするDNA配列、また、好ましくは（５）該ポリペプチドをコードするDNA配列の転写下流を終止できる転写終止領域（ターミネーター）。
【００８０】
該ポリペプチドをコードするDNA配列の下流では、発現構成物は、好ましくは、１つ以上のターミネーターとも呼ばれる転写終止部位を含有する３'非翻訳領域を含む。ターミネーターの起源はあまり重要でない。ターミネーターは、例えば該ポリペプチドをコードするDNA配列に対して自然のままでよい。しかし、好ましくは酵母菌宿主細胞では酵母菌ターミネーターを用い、糸状真菌宿主細胞では糸状真菌ターミネーターを用いる。さらに好ましくは、ターミネーターは、該ポリペプチドをコードするDNA配列が発現される宿主細胞に内在性である。
【００８１】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現は、異種調節領域、例えば、プロモーター、シグナル配列及びターミネーター領域の選択によっても増強させることができ、発現、かつ所望により選択した発現宿主からの問題のタンパク質の分泌レベルを高め、及び／又は本発明のポリペプチドの発現の誘導性制御を準備するのに役立つ。
【００８２】
本発明のポリペプチドをコードする遺伝子に対して天然のプロモーターを別にして、他のプロモーターを用いて本発明のポリペプチドの発現を方向づけできる。所望の発現宿主内での本発明のポリペプチドの発現を方向づけるその能力でプロモーターを選択できる。
【００８３】
プロモーター／エンハンサー及び他の発現調節シグナルを選択して、発現ベクターを設計する宿主細胞と適合性にすることができる。例えば、原核生物プロモーター、特に大腸菌株用に好適なプロモーターを使用できる。本発明のポリペプチドの発現を哺乳類内で行う場合、哺乳類プロモーターを使用できる。組織特異的プロモーター、例えば、肝細胞特異的プロモーターも使用できる。ウイルスプロモーター、例えばモロニーマウス白血病ウイルスロングターミナルリピート(long terminal repeat)(MMLV LTR）、ラウス肉腫ウイルス（RSV）LTRプロモーター、SV40プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）IEプロモーター、単純性ヘルペスウイルスプロモーター又はアデノウイルスプロモーターも使用できる。
【００８４】
好適な酵母菌プロモーターとしては、S.セレビジエGAL4及びADHプロモーター、S.ポンベ(pombe)nmt1及びadhプロモーターが挙げられる。哺乳類プロモーターとしてはカドミウムのような重金属に応答して誘導されうるメタロチオネインプロモーターが挙げられる。SV40ラージＴ抗原プロモーター又はアデノウイルスプロモーターのようなウイルスプロモーターも使用できる。すべてのこれらプロモーターは、技術的に容易に利用できる。
β-アクチンプロモーターのような哺乳類プロモーターが使用できる。組織特異的プロモーター、特に内皮又は神経細胞特異的プロモーター（例えば、DDAHI及びDDAHIIプロモーター）が特に好ましい。ウイルスプロモーター、例えばモロニーマウス白血病ウイルスロングターミナルリピート（MMLV LTR）、ラウス腫ウイルス（RSV）LTRプロモーター、SV40プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）IEプロモーター、アデノウイルス、HSVプロモーター（HSV IEプロモーターのような）、又はHPVプロモーター、特にHPV上流調節領域（URR）も使用できる。ウイルスプロモーターは、技術的に容易に利用できる。
【００８５】
本発明の宿主細胞内で転写を方向づけできる種々のプロモーターを使用可能である。好ましくは、プロモーター配列は、上で定義したように、高度に発現される遺伝子から誘導される。発現構成物の組込み用の好ましい所定の標的遺伝子座内で好ましくは誘導され、及び／又は含まれる好ましい高度に発現される遺伝子の例としては、限定するものではないが、トリオース-リン酸イソメラーゼ（TPI）、グリセルアルデヒド-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）、ホスホグリセレートキナーゼ（PGK）、ピルビン酸キナーゼ（PYK）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ADH）のような糖分解酵素をコードする遺伝子、及びアミラーゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、キシラナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、アルコール（メタノール）オキシダーゼ、伸長因子及びリボソームタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。好適な高度に発現される遺伝子の特定例としては、例えば、クライベロミセス種由来のLAC4遺伝子、それぞれハンセニューラ(Hansenula)及びピキア(Pichia)由来のメタノールオキシダーゼ遺伝子(AOX及びMOX)、A.ニガー及びA.アワモリ(awamori)由来のグルコアミラーゼ(glaA)遺伝子、A.オリゼTAKA-アミラーゼ遺伝子、A.ニデュランスgpdA遺伝子及びT.reeseiセロビオヒドロラーゼ(cellobiohydrolase)遺伝子が挙げられる。
【００８６】
真菌発現宿主内で好ましく使用される強い構成的及び／又は誘導性プロモーターの例は、真菌遺伝子から得られるキシラナーゼ（xlnA）、フィターゼ、ATP-シンセターゼサブユニット９（oliC）、トリオースリン酸イソメラーゼ（tpi）、アルコールデヒドロゲナーゼ（AdhA）、アミラーゼ（amy）、アミログルコシダーゼ（AG−glaA遺伝子由来）、アセトアミダーゼ（amdS）及びグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（gpd）用のプロモーターである。
使用可能な強い酵母菌プロモーターの例としては、アルコールデヒドロゲナーゼ、ラクターゼ、3-ホスホグリセレートキナーゼ及びトリオースリン酸イソメラーゼ用の遺伝子から得られるプロモーターが挙げられる。
使用可能な強い細菌プロモーターの例としては、アミラーゼ及びSPo2プロモーター及び細胞外プロテアーゼ遺伝子由来のプロモーターが挙げられる。
【００８７】
使用可能な植物細胞に好適なプロモーターとしては、ナパリン(napaline)シンターゼ（nos）、オクトピンシンターゼ（ocs）、マンノピン(mannopine)シンターゼ（mas）、リブロース小サブユニット（rubisco ssu）、ヒストン、ライスアクチン、ファゼオリン、カリフラワーモザイクウイルス、（CMV）35S及び19S、サーコウイルス(circovirus)プロモーターが挙げられる。ベクターは、さらに、真核生物ゲノム配列、好ましくは哺乳類ゲノム配列、又はウイルスゲノム配列由来の配列に相同性の配列を含むRNAを生じさせるポリヌクレオチドに隣接する配列を含みうる。これは、本発明のポリヌクレオチドの、相同的組換えによる真核生物細胞又はウイルスのゲノム中への導入を可能にする。特に、ウイルス配列に隣接する発現カセットを含むプラスミドベクターを用いて、本発明のポリヌクレオチドを哺乳類細胞に送達するのに好適なウイルスベクターを調製することができる。好適なウイルスベクターの他の例は、単純性ヘルペスウイルスベクター及びレトロウイルスを包含し、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス及びHPVウイルス（HPV-15又はHPV-18のような）が挙げられる。これらウイルスを用いる遺伝子移動法は当業者に周知である。例えばレトロウイルスベクターを用い、アンチセンスRNAを生じさせるポリヌクレオチドを宿主ゲノム中に安定的に組み込むことができる。対照的に、複製欠陥アデノウイルスベクターはエピソームをとどめているので、一時的な発現を可能にする。
ベクターがアンチセンス方向に配向された本発明のポリヌクレオチドを含み、アンチセンスRNAの生産を準備することができる。所望により、これを用いてポリペプチドの発現レベルを減らすことができる。
【００８８】
（宿主細胞と発現）
さらなる局面では、本発明は、本発明のポリペプチドの製造方法であって、該ポリペプチドをコードするコーディング配列のベクターによる発現に好適な条件下で、上述したように発現ベクターで形質転換又は形質移入した宿主細胞を培養する工程と、発現したポリペプチドを回収する工程を含む方法を提供する。本発明のポリヌクレオチドは、発現ベクターのような組換え複製可能ベクター中に組み込むことができる。ベクターを用いて、適合性宿主細胞中の核酸を複製することができる。従って、さらなる実施形態では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを複製可能なベクター中に導入し、該ベクターを適合性宿主細胞中に導入し、かつ該ベクターの複製をもたらす条件下で該宿主細胞を成長させることによって、本発明のポリヌクレオチドを製造する方法を提供する。ベクターは宿主細胞から回収できる。好適な宿主細胞としては、大腸菌のような細菌、酵母菌、哺乳類細胞系及び他の真核生物細胞系、例えばSf9細胞ような昆虫細胞及び（例えば、糸状）真菌細胞が挙げられる。
【００８９】
好ましくは、ポリペプチドを分泌タンパク質として生産し、この場合、発現構成物中の成熟形態のポリペプチドをコードするDNA配列は、シグナル配列をコードするDNA配列に作動可能に結合している。分泌タンパク質をコードする遺伝子が野生型株内にシグナル配列を有する場合、用いるシグナル配列は、好ましくは該ポリペプチドをコードするDNA配列に対して自然のまま（相同的）である。代わりに、シグナル配列が該ポリペプチドをコードするDNA配列に対して外来性（非相同的）である場合、シグナル配列は、好ましくはDNA配列が発現される宿主細胞に対して内因性である。酵母菌宿主細胞に好適なシグナル配列の例は、酵母菌MFアルファ遺伝子由来のシグナル配列である。同様に、糸状真菌宿主細胞に好適なシグナル配列は、例えば、糸状真菌アミログルコシダーゼ（AG）遺伝子、例えばA.ニガーglaA遺伝子由来のシグナル配列である。このシグナル配列は、アミログルコシダーゼ（（グルコ）アミラーゼとも呼ばれる）プロモーター自体と組み合わせて、及び他のプロモーターと組み合わせて使用することができる。ハイブリッドシグナル配列も本発明の文脈内で使用できる。
【００９０】
好ましい異種分泌リーダー配列は、真菌アミログルコシダーゼ（AG）遺伝子（glaA−18と24の両アミノ酸型、例えばアスペルギルス由来）、MFアルファ遺伝子（酵母菌、例えばサッカロミセス及びクライベロミセス）又はアルファ-アミラーゼ遺伝子（バシラス）を起源とする配列である。
【００９１】
ベクターを上述したような適切な宿主細胞中に形質転換又は形質移入して、本発明のポリペプチドの発現に備えることができる。このプロセスは、上述したような発現ベクターで形質転換した宿主細胞を該ポリペプチドの発現に好適な条件下で培養する工程、及び任意にその発現したポリペプチドを回収する工程を含むことができる。
従って、本発明のさらなる局面は、本発明のポリヌクレオチド若しくはベクターで形質転換又は形質移入した、或いはそれらを含む宿主細胞を提供する。好ましくは、該ポリヌクレオチドの複製と発現を可能にするベクターで該ポリヌクレオチドを運ぶ。前記ベクターと適合性の細胞を選択し、例えば、原核生物（例えば、細菌）、又は真核生物真菌、酵母菌又は植物細胞でよい。
【００９２】
本発明は、本発明のポリペプチドをコードするDNA配列の組換え発現による本発明のポリペプチドの製造方法を包含する。この目的では、遺伝子増幅及び／又はプロモーター、分泌シグナル配列のような発現シグナルの交換のために本発明のDNA配列を用いて、適切な相同的又は非相同的宿主細胞内における該ポリペプチドの実用的な生産を可能にする。本明細書では、相同的宿主細胞は、該DNA配列が得られる種と同一種の宿主細胞又は同一種内の変異体として定義される。
【００９３】
好適な宿主細胞は、好ましくは細菌のような原核微生物、さらに好ましくは真核生物、例えば、酵母菌又は糸状真菌のような真菌、又は植物細胞である。一般に、酵母菌細胞は操作が容易なので、糸状真菌細胞より好ましい。しかし、酵母菌からの分泌が乏しいタンパク質があり、或いは適切に処理されない場合もある（例えば、酵母菌中の高グルコシル化）。これらの場合、糸状真菌宿主生物を選択すべきである。
【００９４】
バシラス属由来の細菌は、その培地中にタンパク質を分泌する能力のため、非相同的宿主として非常に好適である。宿主として好適な他の細菌は、ストレプトマイセス(Streptomyces)及びシュードモナス（Pseudomonas）属由来の宿主である。ポリペプチドをコードするDNA配列の発現用の好ましい酵母菌宿主細胞は、サッカロミセス、クライベロミセス、ハンセニューラ、ピキア、ヤロウィア(Yarrowia)、又はシゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)属の細胞である。さらに好ましくは、酵母菌宿主細胞は、種サッカロミセス・セレビジエ、クライベロミセス・ラクティス(lactis)（クライベロミセス・マルシナス・バール(marcianus var.)ラクティスとしても知られる）、ハンセニューラ・ポリモルファ(polymorpha)、ピキア・パストリス(pastoris)、ヤロウィア・リポリティカ(lipolytica)、及びシゾサッカロミセス・ポンベから成る群より選択される。
【００９５】
しかし、ポリペプチドをコードするDNA配列の発現には、糸状真菌宿主細胞が最も好ましい。好ましい糸状真菌宿主細胞は、以下の属、アスペルギルス、トリコデルマ(Trichoderma)、フザリウム(Fusarium)、ジスポロトリカム(Disporotrichum)、ペニシリウム(Penicillium)、アクレモニウム(Acremonium)、ニューロスポラ(Neurospora)、サーモアスカス(Thermoascus)、ミセリオフトラ(Myceliophtora)、スポロトリカム(Sporotrichum)、チエラビア(Thielavia)、及びタラロミセス(Talaromyces)から成る群より選択される。さらに好ましくは、糸状真菌宿主細胞は、種アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ソーヤ又はアスペルギルス・ニデュランスの細胞又はアスペルギルス・ニガー群(Raper及びFennell, The Genus Aspergillus, The Williams & Wilkins Company, Baltimore, pp 293-344, 1965で定義されているような)由来の種の細胞である。これらは、限定するものではないが、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・ツビゲンシス(tubigensis)、アスペルギルス・アクレアツス(aculeatus)、アスペルギルス・ホエチダス(foetidus)、アスペルギルス・ニデュランス、アスペルギルス・ジャポニカス(japonicus)、アスペルギルス・オリゼ、及びアスペルギルス・フィキューム(ficuum)を包含し、かつ、種トリコデルマ・リーサイ(reesei)、フザリウム・グラミネアルム(graminearum)、ペニシリウム・クリソゲナム(chrysogenum)、アクレモニクムアラバメンセ(alabamense)、ニューロスポラクラッサ(crassa)、ミセリオフトラ・サーモフィラム(thermophilum)、スポロトリカム・セルロフィラム(cellulophilum)、ジスポロトリカム・ジモルホスポラム(dimorphosporum)及びチエラビア・テレストリア(terrestris)の細胞も包含する。
【００９６】
本発明の範囲内の好ましい発現宿主の例は、アスペルギルス種（特にEP-A-184,438及びEP-A-284,603に記載されているもの)及びトリコデルマ種；バシラス種のような細菌(特にEP-A-134,048及びEP-A-253,455に記載されているもの)、特にバシラス・サチリス、バシラス・リケニフォルミス(licheniformis)、デンプン液化バシラス(Bacillus amyloliquefaciens)、シュードモナス種；及びクライベロミセス種(特にクライベロミセス・ラクティスのようなEP-A-096,430に記載されているもの及びEP-A-301,670に記載されているもの)及びサッカロミセス・セレビジエのようなサッカロミセス種のような酵母菌である。
【００９７】
本発明の宿主細胞は植物細胞を包含するので、本発明は、本発明の１つ以上の細胞を含有する植物又はその一部のようなトランスジェニック生物に拡張する。本細胞は本発明のポリペプチドを非相同的に発現することができ、或いは本発明の１つ以上のポリヌクレオチドを非相同的に含みうる。従って、トランスジェニック（又は遺伝的に変化した）植物は、そのゲノム中に本発明のポリペプチドをコードする配列を（典型的には安定して）挿入することができる。植物細胞の形質転換は既知技術、例えば、アグロバクテリウム・チュメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)由来のTi又はRiプラスミドを用いて実施することができる。こうしてプラスミド（又はベクター）は、植物を感染させるために必要な配列を含むことができ、かつTi及び／又はRiプラスミドの誘導体を利用することができる。
【００９８】
宿主細胞は該ポリペプチドを過剰発現することができ、過剰発現を操作する技法は周知であり、本発明で使用可能である。こうして宿主は該ポリヌクレオチドの２つ以上のコピーを有しうる。
代わりに、葉、根又は幹のような植物の一部の直接感染を果たすことができる。この技法では、例えばレーザーで植物を切断し、針で植物に穴を開け、又は研磨剤で植物をこすることによって、感染させる植物を傷つけることができる。その傷をアグロバクテリウムで接種する。植物又は植物の一部を適切な培地上で成長させて、成熟植物に発育させることができる。形質転換した細胞の遺伝的に変化した植物への再生は、公知の方法、例えば、形質転換した新芽を抗体で選択し、該新芽を適切な栄養物、植物ホルモン等を含有する培地上でサブ培養することによって達成することができる。
【００９９】
（宿主細胞の培養と組換え生産）
本発明は、プロリン特異的エンドプロテアーゼ又はその変異体を発現するように変化した細胞を包含する。このような細胞は、一時的、又は好ましくは安定的に変化した、哺乳類又は昆虫細胞のような高等真核生物細胞系、酵母菌及び糸状真菌細胞のような下等真核生物細胞、又は細菌細胞のような原核生物細胞を包含する。
本発明のポリペプチドでは、例えば、バキュロウィルス発現系内のように、細胞系内又は膜上で一時的に発現することもありうる。本発明のタンパク質を発現するように適合させたこのような系も本発明の範囲に包含される。
【０１００】
本発明により、本発明の１つ以上のポリヌクレオチドで形質転換した微生物の発現宿主の、慣習的な栄養発酵培地内における培養によって、本発明のポリペプチドの生産を達成することができる。
本発明の組換え宿主細胞は、技術的に公知の手順で培養しうる。プロモーターと宿主細胞の各組合せで、該ポリペプチドをコードするDNA配列の発現のためになる培養条件を利用できる。ポリペプチドの所望の細胞密度又は力価に到達後、培養をやめ、既知の手順でポリペプチドを回収する。
【０１０１】
発酵培地は、炭素源（例えば、グルコース、マルトース、糖蜜など）、窒素源（例えば、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム等）、有機窒素源（例えば、酵母菌抽出物、麦芽抽出物、ペプトン等）及び無機栄養源（例えば、リン酸塩、マグネシウム、カリウム、亜鉛、鉄など）を含有する既知の培養基を含むことができる。任意に、インデューサー（使用する発現構成物によって決まる）を含んでよく、或いは後で添加してもよい。
適切な培地は、発現宿主の選択に基づき、及び／又は発現構成物の調節要求に基づいて選択することができる。好適な培地は当業者に周知である。所望により、培地は混入の可能性がある他の微生物に加えて、形質転換した発現宿主に有利な添加成分を含有しうる。
【０１０２】
発酵は、0.5〜30日間で行うことができる。発酵は、０℃〜45℃の範囲の適切な温度で、例えば、ｐＨ２〜10で、バッチ、連続又は流加培養法でよい。好ましい発酵条件としては、20℃〜37℃の範囲の温度及び／又はｐＨ３〜９が挙げられる。適切な条件は、通常、発現宿主と発現させる予定のタンパク質の選択に基づいて選択される。
発酵後、必要ならば、遠心分離又はろ過によって、細胞を発酵ブロスから除去する。発酵が停止した後、或いは細胞の除去後、本発明のポリペプチドを回収し、所望により、慣習的な手順で精製及び単離する。本発明のプロリン特異的エンドプロテアーゼは、真菌の菌糸体又は培養した真菌細胞によってプロリン特異的エンドプロテアーゼが遊離されている培養ブロスから単離することができる。
好ましい実施形態では、ポリペプチドは、真菌から、さらに好ましくはアスペルギルスから、最も好ましくはアスペルギルス・ニガーから得られる。
【０１０３】
（修飾）
本発明のポリペプチドを化学的に修飾、例えば、翻訳後修飾することができる。例えば、グリコシル化（１回以上）することができ、或いはアミノ酸残基の修飾を含む。ヒスチジン残基の添加によってポリペプチドを修飾し、その精製を助け、或いはシグナル配列の添加によって細胞からの分泌を促すことができる。ポリペプチドは、アミノ-末端メチオニン残基のようなアミノ-又はカルボキシル-末端の伸長、約20〜25個までの残基の小リンカーペプチド、又はポリ-ヒスチジン区域、抗原エピトープ又は結合ドメインのような精製を容易にする小さい伸長を有しうる。
【０１０４】
本発明のポリペプチドは、暴露的標識で標識化することができる。暴露的標識は、該ポリペプチドの検出を可能にするいずれの適切な標識でもよい。好適な標識としては、放射性同位体、例えば125Ｉ、35Ｓ、酵素、抗体、ポリヌクレオチド及びビオチンのようなリンカーが挙げられる。
ポリペプチドを修飾して天然には存在しないアミノ酸を含めることができ、或いは該ポリペプチドの安定性を高めることができる。タンパク質又はペプチドを合成手段で生産するとき、生産中にこのようなアミノ酸を導入することができる。タンパク質又はペプチドを修飾後、合成的又は組換え的に生産することもできる。
【０１０５】
Ｄ-アミノ酸を用いて本発明のポリペプチドを生産することもできる。この場合、ＣからＮの方向と逆配列でアミノ酸を連結する。これは、このようなタンパク質又はペプチド生産の技術では慣習的である。
多数の側鎖修飾が技術的に知られており、本発明のタンパク質又はペプチドの側鎖に行うことができる。このような修飾としては、例えば、アルデヒドとの反応後、NaBH4で還元する還元的アルキル化、メチルアセトイミデートでアミジノ化(amidination)又は無水酢酸でアシル化によるアミノ酸の修飾が挙げられる。
【０１０６】
本発明で提供される配列を“第２世代”酵素の構築用出発原料として使用することもできる。“第２世代”プロリン特異的プロテアーゼは、突然変異法（例えば、部位特異的突然変異）で変化したプロリン特異的プロテアーゼであり、野生型プロリン特異的プロテアーゼ又は本発明で生成されるプロテアーゼのような組換えプロリン特異的プロテアーゼとは異なる特性を有する。例えば、特定プロセス用にさらに適するように、その温度又はｐＨ最適値、特異的活性、基質アフィニティー又は熱安定性を変えることができる。
【０１０７】
本発明のプロリン特異的エンドプロテアーゼの活性に必須、かつ好ましくは置換を受けるアミノ酸は、部位特異的突然変異又はアラニン-スキャン突然変異のような技術的に公知の手順で同定することができる。後者の方法では、突然変異を分子中のあらゆる残基に導入し、結果の突然変異体分子を生物学的活性（例えば、プロリン特異的エンドプロテアーゼ活性）について試験し、該分子の活性に重大なアミノ酸残基を同定する。酵素-基質相互作用の部位は、核磁気共鳴、結晶学又は光親和性標識化のような方法で決定される結晶構造の解析によっても決定することができる。
【０１０８】
酵母菌及び糸状真菌宿主細胞の使用は、本発明の組換え発現産物に最適な生物学的活性を与えるのに必要とされるような翻訳後修飾（例えば、タンパク質分解的プロセシング、ミリスチル化(myristilation)、グリコシル化、トランケーション、及びチロシン、セリン又はスレオニンリン酸化）に供することを想定している。
【０１０９】
（製法）
本発明のポリペプチドは単離した形態でよい。ポリペプチドの意図した目的を妨げない担体又は希釈剤とポリペプチドを混合してよく、それでもまだ“単離した”とみなされることを理解すべきである。本発明のポリペプチドは、実質的に精製した形態でもよく、この場合、通常、製剤中に本ポリペプチドを含み、該製剤中の70％を超える、例えば、80％、90％、95％、98％又は99％を超えるタンパク質が本発明のポリペプチドである。
【０１１０】
本発明のポリペプチドは、その天然の細胞環境外にあるような形態で提供することができる。従って、ポリペプチドは、上述したように、実質的に単離又は精製され、或いはそれらが天然には存在しない細胞、例えば他の真菌種、動物、植物又は細菌の細胞中にあってよい。さらに、本発明のポリペプチドは、大量のタンパク質含有液体を処理できるように、固定化形態で使用することができる。適切な支持体材料及び好適な固定化法を選択する手段は、文献中、例えば“Immobilization of Enzymes and Cells”（Gordon F. Bickerstaff編集; ISBN 0-89603-386-4）に広範に記載されている。
【０１１１】
本発明は、飲料製造でのプロリル特異的エンドプロテアーゼの使用にも関する。好ましくはビール、ワイン又は果実ジュースの製造でプロリル特異的エンドプロテアーゼを使用する。本発明の方法により、プロリル特異的エンドプロテアーゼを添加して、濁りの低減又は防止が達成される。これらプロリル特異的エンドプロテアーゼを添加することによって、新規飲料が得られる。従って、本発明は、本発明の方法で得られる飲料にも関する。この飲料としては、例えば、本発明の方法で得られるビール、ワイン及び果実ジュースが挙げられる。
【０１１２】
本発明の方法で得られる飲料の利点は、これら飲料が高含量の抗酸化剤を有することである。ポリフェノールは抗酸化剤である。ビールは通常ポリフェノール除去剤で処理して濁りの形成を防止し、結果として得られるビールは抗酸化活性が低い。他のポリフェノール除去剤で処理される飲料についても同様である。本発明の方法で得られるビールは、高い内因性抗酸化活性を有する。抗酸化剤は健康増進成分と考えられるので、本発明の方法で得られる飲料は、PVPPのようなポリフェノール除去剤で調製した同種の飲料よりも健康的な飲料とみなすことができる。
【０１１３】
本発明のもう一つの利点は、本発明の方法は高比重ビールの発酵及びコンディショニング中の疎水性ポリペプチドの損失を防ぐことである。こうしてビール製造のマッシュ段階時の疎水性ポリペプチドの抽出が改善され、結果として高収率かつビールヘッド安定性が改善される(Breyら; Journal of the Institute of Brewing, Vol .108, No. 4, 424-433, 2002)。プロリン特異的エンドプロテアーゼは、ペプチドの疎水性を低減し、それによってその水溶性を向上させ、かつその苦味を減らすことが分かっている(WO 02/45523)。実際に、我々は実施例15でEndo-Pro酵素の使用によって、より高いタンパク質レベルと改良されたビールヘッド安定性を実証する。従って、本出願で特定したプロリン特異的エンドプロテアーゼの、任意に補助的プロテアーゼと組み合わせた使用は有利である。
【０１１４】
本発明のさらに別の利点は、本方法で得られる果実ジュースの色がポリフェノールの除去後に得られる果実ジュースの色よりまったく又はほとんど色あせないことである。本発明の方法で得られるワイン及び果実ジュースは、ベントナイト又は同様の化合物を用いる方法で得られる飲料に比し、改良された芳香と風味を有する。これは、ベントナイトはタンパク質のみならず芳香及び／又は風味成分をも除去するからである。
【実施例１】
【０１１５】
実施例１
（材料）
プロリン特異的エンドプロテアーゼ（Endo-Pro）
2001年9月10日にアスペルギルス・ニガーG306をCBS(CBS109712)で寄託した。ニガーG306は、本発明のプロリル特異的エンドプロテアーゼをコードする遺伝子を含む。この生物から得られる遺伝子又はcDNAは、いずれのアスペルギルス・ニガー宿主内でも公知の方法を用いてクローン化かつ発現させることができる。
【０１１６】
以下の試料を使用した：
１）“Endo-Pro A”、プロリン特異的エンドプロテアーゼをビールとの実験で用いた。試料は、プロリン特異的エンドプロテアーゼの遺伝子コーディングを含むアスペルギルス・ニガー株の発酵後に得た発酵ブロスの限外ろ過後に得た限外ろ過濃縮物だった。方法セクションで述べたように決定したEndo-Pro A試料のプロリル特異的活性は5.06Ｕ/mlだった。タンパク質濃度は、90％より高純度のプロリル特異的エンドプロテアーゼの試料の特異的活性に基づいて50g/lと推定した。
２）“Endo-Pro B”、プロリン特異的エンドプロテアーゼをワインとの実験で用いた。試料は、カラム上で精製後に得、6.0Ｕ/mlの活性だった。
【０１１７】
パパイン
コルプリン(Collupulin)、DSMから商業的に入手可能な液体パパイン製剤をパパインとの実験で使用した。活性は5280 NF/mgである。１単位のNFは、カゼインの加水分解を触媒して、ｐＨ6.0で１時間当たり１μg当量の可溶性チロシンを生成するパパイン活性の量である。パパイン試料中のタンパク質濃度を測定すると119g/l（Lowry）だった。
ポリビニルポリピロリドン(PVPP)
PVPPは、名称“Polyclar AT”で商業的に入手可能な非水溶性PVPPを使用した。
【０１１８】
ビール
ビールで行うすべての実験では、仏国、Lilleの“Les Trois Brasseurs”の麦芽ビール(ピルスナータイプ)を使用した。このビールのアルコール率は5.2％(v/v)で、ｐＨは4.4だった。他の市販ビールに比べ、冷却時にこのビールで測定される混濁量が相対的に高いので、この特定ビールを選んだ。このビールはLowry法で測定した場合、0.9g/lのタンパク質濃度を有していた。
【０１１９】
白ワイン
ソービニョン(Sauvignon)白ブドウから調製した白ワインをいかなるタンパク質除去処理もせずに使用した。ワイン調製時のアルコール発酵は、選択した酵母菌VL3（Lallemandから）で行った。このワインのぶどう酒醸造学的分析により以下の結果を得た：
糖(g/l)                        1.1
エタノール vol％              12.97
全酸性度(g H2SO4/l)             4.14
揮発分酸性度(g H2SO4/l)         0.22
PH                             3.46
遊離SO2(mg/l)                  18
全SO2(mg/l)                    96
グリセロール(g/l)               3
酒石酸(g/l)                     3
リンゴ酸(g/l)                   2.8
乳酸(g/l)                       0.1
フォリン(Folin)のレベル         7
【０１２０】
実施例２
方法
酵素活性を決定するための分光光度法
プロリン特異的エンドプロテアーゼの活性を測定するため、40％ジオキサンを含有するｐＨ5.0の0.1Ｍクエン酸/0.2Ｍリン酸２ナトリウム緩衝液中で調製したN-カルボベンゾキシ-グリシン-プロリン-p-ニトロアニリド(Z-Gly-Pro-pNA；分子量426.43；Bachem, Switserland)の２mM溶液の基質溶液を用いる。
１mLのｐＨ5.0緩衝液に、250μlの基質溶液を添加後、100μlの酵素溶液(より大容量又は小容量の酵素溶液が緩衝溶液で補填されるだろう)。反応混合物を37℃でインキュベートし、pNAの遊離後、410nmにおける吸光度の増加を測定する。
１単位は、8,800Ｍ-1のモル吸光係数(Ｅ)を用い、上記反応条件下で１分に１μmolのpNAをZ-Gly-Pro-pNAから遊離させる酵素活性として定義される。
【０１２１】
Flavourzyme 1000 L(NOVO, Denmark)から単離したグリシン特異的エンドプロテアーゼ の活性は、上述した手順でｐＨ5.0及び37℃の色素生産性合成基質Z-Gly-Gly-pNAについて測定した。１単位のグリシン特異的エンドプロテアーゼは、ｐＨ5.0及び37℃で、１分当たり１μmolのpNAをZ-Gly-Gly-pNAから遊離させる酵素の量として定義される。
ザントモナス種由来のプロリン特異的カルボキシペプチダーゼの活性は、アミノ酸アナライザーを用いて合成ペプチドZ-Pro-Pro(Bachem, Switserland)から遊離されるプロリン残基の量を測定することによって測定した。１単位は、ｐＨ7.0及び37℃で１時間当たり１μmolのプロリンをZ-Pro-Proから遊離させる酵素の量である。
【０１２２】
冷濁り測定(Lucien Chaponのアルコール/低温試験)
混濁又は濁りは、濁度計(“Tannometer”, Pfeuffer Gmbh, Kitzingen, Germany)で、操作説明書に即して測定した。冷たいビールでは、沈殿したポリフェノール-タンパク質複合体によって引き起こされる可逆的混濁が生じるうる。余分のアルコールの添加は、これら混濁の形成を加速する。“冷濁り試験”では、この現象を用いて存在するポリフェノール-タンパク質複合体を定量化する。Tannometerを較正するためホルマジン(formazine)標準溶液を記載どおりに調製した(Jean de Clerk,“Cours de Brasseries”第２版, Vol 2, 1963, pp.595-596, Universite de Louvain, Belgium)。ビールの濁り又は混濁単位は、European Brewery Conventionによって推奨されているような比濁分析の濁度単位であるECBを使用する。ビールについて述べられている冷濁り試験は、アルコールのないビール又はウワート(worts)でも実施できる(Tannometerの操作説明ガイドから適合させる)。この場合、試料中のアルコール含量が10％(v/v)に達するのに十分な量のエタノールも試料に加える。すべてのウワート試料にエタノールを加えて10％(v/v)に達したら、各試料を30分間-8℃に冷却する。こうして形成された濁り(濁度, EBC単位で)をその測定チャンバーも-8℃の濁度計で迅速に測定する。
【０１２３】
European Brewery Conventionの“熱濁り”測定
この“熱濁り試験”は、European Brewery Conventionによって番号9.30で推奨されているビールの濁り測定手順である。比較的短期間の高温におけるビールの貯蔵の結果、長期間室温で貯蔵後の同じビールで見られるのと同様の濁りレベルとなる。この“熱濁り”試験は、ビールを一晩中０℃の冷浴で冷やし、その朝の初期濁度を読むことによって実施する。次に、ビールを60℃の浴内に48時間、撹拌せずに置く。最後に、ビールを冷やし、一晩中０℃で保持後、０℃で最終的な濁度を測定する。
【０１２４】
ワイン及び果実ジュースの加熱濁り試験
K.J. Siebert(K.J. Siebertら, J. Agric. Food Chem. 44 (1996))によって述べられているように、ワイン又は果実ジュースのような飲料中の濁りは、加熱試験で誘導しうる。形成される濁りの量は、主に飲料中の濁り活性タンパク質とポリフェノールのレベルの関数である。加熱試験では、30分間80℃で加熱する前後に試料(例えば、ワイン又は果実ジュース)の濁度を濁度計で測定する。濁度の測定前、加熱した試料を、温度が22〜25℃になるまで冷却水下で冷やす。ワインの試験では（実施例７参照)、NTU-ホルマジン標準溶液で濁度計の較正を行い、果実ジュースの試験では（実施例８参照）、NTU濁度標準溶液は、Reagecon, Irelandから購入した。NTU＝比濁分析濁度単位(nephelometric turbidity units)。
【０１２５】
対照実験
１．インキュベーション時に外因性タンパク質を添加しないブランク実験を行った。   ２．インキュベーション前に大量のPVPP(1000g/hl)で処理したビールを用いた実験を行った。この実験は、ポリフェノール-タンパク質沈殿に起因する冷濁り試験によって誘導される濁りの平均量の測定を可能にした。PVPPはビールからポリフェノールを除去するので、濁りの形成を妨げるからである。
３．40℃で１時間インキュベーション後に０℃に冷却したビールに外因性タンパク質(それぞれプロリル特異的エンドプロテアーゼ又はパパイン)を添加する実験を行った。濁り測定前に０℃で15分間インキュベーションを行った。酵素及びパパインは、０℃で全く又はほとんど活性でないので、この実験は、酵素活性効果と非酵素的タンパク質効果の区別を可能にした。
【０１２６】
LC/MS解析
３種の合成ペプチドの特徴づけには、LCQイオントラップ質量分析計(ThermoquestTM, Breda, the Netherlands)を備えたP4000ポンプを用いるHPLC(ThermoquesTM, Breda, the Netherlands)を使用し、これらペプチドは、溶出用にMilli Q水中の0.1％ギ酸(Millipore, Bedford, MA, USA；溶液Ａ)とアセトニトリル中の0.1％ギ酸(溶液Ｂ)の勾配を組み合わせて150×1mmのPEPMAP C18 300A(LC Packings, Amsterdam, The Netherlands)カラムを用いて分離した。
個々のペプチドに関する詳細な情報は、イオントラップ質量分析計の特徴的なアルゴリズムである“スキャン依存性”MS/MSアルゴリズムを用いて得た。ヒドロキシプロリン及びアラニンのエンドプロテアーゼ特異性は、MS/MSで得た、理論的な配列情報を有する種々のペプチドの実験的ペプチド配列の比較によってチェックした。
【０１２７】
実施例３
プロリル特異的エンドプロテアーゼ添加のビール中の濁り形成に及ぼす効果
脱炭酸した麦芽ビール(Les Trois Brasseurs)、タンパク質含量：0.9g/lに、いろいろな量のプロリル特異的エンドプロテアーゼ酵素(“Endo-Pro A”原料セクション参照)を添加した。２系列の濁り測定を行った。第１系列では、ビール-Endo-Pro A組成物を40℃で１時間インキュベート後、冷濁り試験を行った。40℃でインキュベーション後、かつ冷濁り試験の直前に、アルコール含量を６％(v/v)に高めるのに十分な量のエタノールをビール-Endo-Pro A組成物に添加した。第２系列では、Endo-Pro Aのないビールを40℃で１時間インキュベートしてから０℃に冷却した。０℃で、Endo-Pro Aを添加し、結果の組成物を０℃で15分間インキュベートした。冷濁り試験の直前に、アルコール含量を６％(v/v)に高めるのに十分な量のエタノールをビール-Endo-Pro A組成物に添加した。
添加したEndo-Pro Aの量と、Endo-Pro Aを添加しない場合に測定される濁りに対する濁り低減のパーセンテージを下表１に示す。添加したEndo-Pro Aの量は、ビール中に存在するタンパク質の量に対して、１％未満の外因性添加タンパク質から10％を超える量まで広範にカバーした。
【０１２８】
【表１】
2005528906.tif 000002
【０１２９】
【表２】
2005528906.tif 000003
【０１３０】
表１は、冷却前、プロリル特異的エンドプロテアーゼが活性な温度でビールに該プロテアーゼを添加した場合、冷却時に形成される濁りが少ないことを明白に示している。表２は、プロリル特異的エンドプロテアーゼを添加するときの温度が低いので、該プロテアーゼが全く又はほとんど活性でない場合にもいくらかの効果はあるが、プロテアーゼが活性な温度で添加した場合に観察される効果に比し、非常に効果が小さいことを明白に示している。
【０１３１】
実施例４
ビール中の濁り形成に及ぼすパパイン添加の効果
脱炭酸した麦芽ビール(Les Trois Brasseur)、タンパク質含量：0.9g/lに、いろいろな量のパパイン(０〜100g/hl)を添加した。２系列の冷濁り測定を行った。第１系列では、冷濁り試験前にビール-パパイン組成物を40℃で１時間インキュベートした。インキュベートした試料にエタノールを加えて6％アルコール(v/v/)にした後、濁り測定を行った。第２系列では、ビール試料を40℃で１時間インキュベートし、引き続き０℃に冷却した。次に、パパインを添加し、試料を０℃で15分間インキュベートした。添加したパパインの量と、パパインを添加しない場合に測定される濁りに対する濁り低減のパーセンテージを下表３に示す。
【０１３２】
【表３】
2005528906.tif 000004
【０１３３】
【表４】
2005528906.tif 000005
【０１３４】
表３の結果は、冷却時にビール中に形成される濁りの量に及ぼすパパインの効果を実証する。パパインを３g/hl以上の量で添加したときに、濁りに及ぼすパパインの効果が安定することが明白である。明らかに、パパインでは、プロリル特異的エンドプロテアーゼと同量の濁り低減は達成できない。
【０１３５】
実施例５
ビール中の濁り形成に及ぼすPVPP添加の効果
ビール-プロリル特異的エンドプロテアーゼ実験とビール-パパイン実験の両実験において、インキュベーション前に大量のPVPP(1000g/hl)を添加して対照実験を行った。15分のミキシング後、PVPPをろ過で除去した(プロリル特異的エンドプロテアーゼ酵素又はパパインは添加せず)。両対照で、冷濁り試験中にはほとんど濁りが形成されなかった。PVPPはポリフェノールを飲料から除去することが知られているので、これら対照実験はポリフェノールがビール中の濁り形成に関与することを示している。ビール濁り安定性に及ぼすPVPPの効果を測定するため、異なる量のPVPPを脱炭酸したビールに添加し、15分のミキシング後にろ過で除去した。PVPPを添加前にビールを１時間40℃でインキュベートした。
下表５は、いろいろな量のPVPP添加の冷却時にビール中に存在する濁りの量に及ぼす効果を示す。Endo-Pro A又はパパインは添加しなかった。
【０１３６】
【表５】
2005528906.tif 000006
【０１３７】
表３には、３ｇのパパイン/１hlのビール(ビール業界で推奨されている最大用量である)の添加が、40℃で１時間インキュベーション後にほぼ36％の濁り低減を引き起こすことが示されている。プロリル特異的エンドプロテアーゼ添加の場合、1％(ビール中のタンパク質の量に対して)のプロリル特異的エンドプロテアーゼの添加が、40℃で１時間インキュベーション後にビールの冷濁りの38％の低減を引き起こす(表１参照)。醸造所では、通常、30g/hlを超えない量でPVPPを添加する。当該量で添加した場合、PVPPは約20％まで濁りを低減するので、パパインとプロリル特異的エンドプロテアーゼ酵素は共にPVPPより良い濁りインヒビターであると結論することができる。
【０１３８】
実施例６
100％麦芽マッシュ上へのEndo-Pro Aの添加と100％麦芽ウワートの濁り低減
この目的は、Endo-Pro Aを100％麦芽マッシュに添加した場合、最終的な麦芽ウワート中の濁りを低減できるかどうかを決定することだった。
各マッシュ工程試験は、25ｇの粉砕麦芽と100mlの水とのミキシングで開始する。次に、マッシュを50℃に加熱し、ある量の“Endo-Pro A”の添加後マッシュを４段階の逐次的高温に向けて段階的加熱手順で処理する。表６は、マッシュ工程温度プロフィルを示す。全マッシュ工程中、マッシュは200rpmで撹拌する。マッシュ工程の最後に、マッシュを室温に保ち、水を加えて水の蒸発を補填する。次いで、マッシュをろ紙上でろ過してウワート（液体）を固体から分離する。
【０１３９】
【表６】
2005528906.tif 000007
【０１４０】
それぞれ、０、200及び500μlのEndo-Pro Aをマッシュに添加した。15分間90℃に加熱して不活性化した500μlのEndo-Pro Aを使用する対照実験を行った。ウワートの混濁又は濁りは、室温と冷濁り試験後に測定した。ウワート冷試験は、Chaponのアルコール/低温試験(冷濁り試験-Pfeuffer Operating instructions)で述べられているとおりに、アルコールフリービールについてChaponによって推奨されているように試料中10％(v/v)に達するまでエタノールを添加することで行う。
【０１４１】
【表７】
2005528906.tif 000008
【０１４２】
表７の結果は、明らかにプロリル特異的エンドプロテアーゼを麦芽マッシュに添加した場合、結果のウワートはプロリル特異的エンドプロテアーゼを添加せずに調製したウワートより冷却時の混濁がずっと少ないことを示している。
Endo-Pro Aの効果を研究するため、冷濁り試験を麦芽ウワートについて行った。プロリル特異的エンドプロテアーゼの添加は麦芽ウワート冷濁りを低減することが観察された。冷濁り試験で形成された濁りの減少は、低量のプロリル特異的エンドプロテアーゼ酵素の添加でさえ観察された。この酵素をマッシュに添加する前に不活性化すると、安定化効果は完全に消失し、すなわち、形成される濁りの量はもはや減少しない。プロリル特異的エンドプロテアーゼ酵素の添加によって引き起こされる濁り低減は非常に重要である。実施例では、82％までの濁り低減が達成された。
【０１４３】
麦芽ウワート中と大麦ウワート中におけるプロリル特異的エンドプロテアーゼ酵素添加の効果を比較するため、種々の量のEndo-Pro Aを大麦マッシュに添加する実験を行った。ｐＨは、それぞれ麦芽ウワート中で5.6、大麦ウワート中で6.1だった。大麦ウワート冷濁り試験で得られた結果は、麦芽ウワートについて以前に観察されたように、大麦マッシュのプロリル特異的エンドプロテアーゼによる処理が、大麦ウワート冷濁りの重要な低減を引き起こすことを示した。プロリル特異的エンドプロテアーゼで処理した麦芽と大麦の両マッシュは、高度に安定したウワートをもたらすが、効果は、大麦ウワートよりも麦芽ウワートの方が強い。実際、200μlのEndo-Pro Aのマッシュへの添加は、大麦ウワート中では約59％の濁り低減を誘導し、麦芽ウワート中では70％を超える低減を誘導した。500μlのEndo-Pro Aで行う試験は、麦芽ウワート中では82％まで濁り低減を高めたが、大麦ウワート中では200μlのEndo-Pro A実験に比べて濁り低減を改善しなかった。驚くべきことに、Endo-Pro Aの大麦マッシュへの添加は、清澄なろ過ウワートをもたらしたが、非Endo-Pro処理マッシュは曇ったろ過ウワートをもたらした(大麦マッシュのろ過は室温で行い、ウワートの濁度はエタノールを添加せずに室温で測定した)。当該効果は大麦マッシュに添加したプロリル特異的エンドプロテアーゼの量がどんな場合でも観察される。
【０１４４】
実施例７
ワイン中の濁り低減
異なる用量（０、30、60、150μl）の、6.0Ｕ/mlの比活性を有するプロリル特異的エンドプロテアーゼ（Endo-Pro B）を、500mlの白ワイン（“原料”セクションで述べたとおりのワイン）を含有するフラスコに添加し、室温（22〜25℃）で19日間窒素雰囲気下でインキュベートした。ワインの濁り安定性を０、６、８、12及び19日後に、“方法”セクションで述べたような加熱試験によって測定した。
【０１４５】
この実験の結果を下表８に示す。表８では、ワインの混濁又は濁りがネフェロス(nephelos)濁度単位(NTU)で表される。ΔNTU＝加熱後のワイン試料について測定したNTUでの濁度−加熱前のワイン試料について測定したNTUでの濁度。ワインのタンパク質を安定化するのに必要なベントナイトの量は、下記式で計算した：（1.48×ΔNTU）＋２。知られているように、ワインが濁り形成に感受性が低い場合、ワイン中の濁り形成を防止するためには少しのベントナイトしか必要ない。
【０１４６】
【表８】
2005528906.tif 000009
【０１４７】
表８の結果は、加熱前の白ワインへのプロリル特異的エンドプロテアーゼの添加が、加熱後のワイン中に形成される濁りを低減することを示している。室温での６日のインキュベーション後、効果が観察される。実際、150μlのEndo-Pro B添加で濁り低減は39％に達し、30μl又は60μlのEndo-Pro Bで約12％に達する。12日後には、どんな量のプロリル特異的エンドプロテアーゼを使用しても濁り低減が46％に達し、19日後では70％を超えた。従って、プロリル特異的エンドプロテアーゼを用いて、濁り形成に対してワインを安定化するのに必要なベントナイトを回避し、或いはその量を非常に減らしうることが明かである。
【０１４８】
実施例８
イチゴジュース中の濁り低減
イチゴ果実ジュースは以下のように調製した：イチゴを解凍してつぶし、引き続き90℃でゆがき（加熱し）、ポリフェノールオキシダーゼのようなすべての内因性酵素を殺し、かつタンパク質を変性させた。つぶしたイチゴを50℃に冷まし、30分間50℃で、600g/tのRapidase BEスーパー(super)(DSMの市販酵素産物, France)と共にふやかし、エアプレス内で圧搾した。変性タンパク質を除去するため、結果の混合物を8000rpmの速度で遠心分離機にかけ、ろ過した。イチゴジュースを収集した。酸性アルコール試験は負であり、該ジュースにはペクチンがないことを確認した。該ジュースのｐＨ値は3.3だった。
【０１４９】
Endo-Pro A/イチゴジュースインキュベーション：種々の量(0、5、10、20μl)のEndo-Pro A(5.06Ｕ/ml)を100mlのイチゴジュースに添加し、50℃で60分間インキュベートした。２種の対照実験、（ｉ）第１は20μlの不活性化Endo-Pro Aを添加して(30分80℃でインキュベート)、及び（ii）第２対照は、200mgのPVPPを、予め１時間50℃でインキュベートした20mlのイチゴジュースに添加して行った。15分間室温で混合後、遠心分離でPVPPを除去した。
果実ジュース加熱試験：果実ジュース試料の80℃で30分間の加熱前後に該ジュースの濁度を測定した。濁度測定前、加熱したジュースを冷水で冷却した。
Reagecon(Ireland)のNTU濁度標準で予め較正した濁度計で濁度測定を行った。
【０１５０】
【表９】
2005528906.tif 000010
【０１５１】
表９の結果は、100mlのイチゴジュースへの５μlのEndo-Pro Aの添加がジュース加熱試験後に形成される濁りを25.7％まで減らしたことを示す。100mlのイチゴジュースへの10μlのEndo-Pro Aの添加は、５μl試験と比べて濁り低減効果を高めなかった。おそらく、酵素活性は５μlで最大であり、それより酵素添加が多いと、多くのタンパク質沈殿が得られるだろう。
不活性化酵素でも、形成される濁りの量を低減したが、効果は顕著に低かった。PVPPの添加後は、ほとんど何も濁りが観察されなかったが、試料の色も除去された。PVPP添加の結果が濁り形成を防止するという事実は、イチゴジュース中でも、濁りがおそらくポリフェノール-タンパク質相互作用の結果であることを示している。
【０１５２】
実施例９
ザントモナス種由来のプロリン特異的カルボキシペプチダーゼの単離
多くの科学の報告は、ペプチド鎖のカルボキシ末端でプロリン残基に作用しうるエキソペプチダーゼについて述べているが、これらカルボキシペプチダーゼのプロリン残基に向かう加水分解速度は非常に遅い。さらに、これらカルボキシペプチダーゼの多くは、ポリプロリン配列からカルボキシ末端プロリン残基を遊離できない。US 5,693,503は、驚くべきことに、ポリプロリン配列からでさえ、カルボキシ末端プロリン残基の遊離に向けて高い活性を示すザントモナス種由来のカルボキシペプチダーゼの精製について述べている。我々は、いくつかのザントモナス種からこのようなカルボキシペプチダーゼを単離してその濁り形成を防止する活性について試験した。
【０１５３】
US 5,693,503に記載されているような精製方法は我々の手ではうまくいかなかったので、ザントモナスからの所望カルボキシペプチダーゼの単離は困難な仕事であることが判明し、完全に新しい精製手順を開発しなければならなかった。試した多くの手順のうち、以下の手順が実質的に精製された酵素を与えた。
【０１５４】
１リットルのブロスから出発し、細胞を遠心分離で収集し、水で１回洗浄してから０℃で超音波処理して細胞を破壊した。細胞デブリを20000rpmで20分間遠心分離で除去し、結果の上清を同一条件下で再び遠心分離した。次いで、硫酸アンモニウムを40％飽和に達するまで上清に加えた。低速遠心分離後、上清を収集し、さらに80％飽和に達するまで硫酸アンモニウムを加えた。新しく生じた沈殿を低速遠心分離で収集し、pH7.0、４℃で広く透析し、0.05mol/lのTris-HCl pH 8.0中で平衡化しているバシトラシン-セファロース(Sepharose)カラムに適用した(J. Appl. Biochem.,1983 pp420-428)。カラムに結合した物質を１mol/lのNaClと10%(v/v)のイソプロパノールで懸濁している平衡緩衝液を用いて溶出した。原料及び方法セクションで述べたように、合成基質Z-Pro-Proとのインキュベーションによって、探している酵素活性を含有するフラクションを同定した。0.025mol/lのTris-HCl pH 8.5中で平衡化しているMonoQカラムに活性含有フラクションを適用した。これら条件下で酵素はカラムに結合し、それをNaCl濃度勾配で溶出した。活性フラクションをプールし、透析し、再び上述したようにMonoQカラム上でクロマトグラフ処理した。37℃かつpH7.0でZ-Pro-Proについて測定された最終的な濃縮物の活性は、0.5単位/mlであり、pH5.5では0.09単位/mlだった。50℃、pH5.5における２〜３時間のインキュベーション後、酵素は、その活性の約50％を保存した。この試料を実施例11で述べる試験で用いた。
ザントモナス・カンペストリス(campestris) pv カンペストリスから単離した酵素だけが酸性条件下で活性を示した。X.ルブリリネアンス(rubrilineans)から単離した同様のカルボキシペプチダーゼは、pH5.5で活性を示さなかったので、期待した用途にはあまり適さない。
【０１５５】
実施例１０
アスペルギルス・オリゼからのグリシン-切断エンドプロテアーゼの単離
グリシン残基中に富むタンパク質を切断できるエンドプロテアーゼは、パパイヤ抽出物中で同定されている（グリシルエンドプロテアーゼ, EC 3.4.22.25）。しかし、この酵素は、そのかなり高い（ほぼ中性）ｐＨ最適値と、純粋形態で生産するための高いコストのため、予想しているような用途にはいつかの欠点がある。従って、食品グレードの可能性のある微生物内における酸安定性のグリシン特異的エンドプロテアーゼ酵素の同定が多くの利点を与えるだろう。その目的のため、我々は多数の商業的に入手可能な食品グレードの酵素製剤をスクリーニングした。
【０１５６】
基質としてｐＨ4.0の色素生産性合成ペプチドZ-Gly-Gly-pNAを用いてスクリーニングを行った。６種の酵素製剤を試験し、Flavourzyme 1000 L(HPN 00011アスペルギルス・オリゼ由来；NOVO, Denmark)だけが、使用した合成基質に対していくらかの活性を示した。この活性の原因である酵素を単離するため、多数の異なる精製手順を試した。以下の手順がうまくいくことが判った。
【０１５７】
まず、Flavourzyme原料中に存在するような過剰の小分子量成分を広範な透析によって除去した。この透析工程の間、Gly-特異的活性はその初期値の約50％まで低下した。透析した結果の液体をさらに洗浄し、Amicon PM-10限外ろ過装置を用いて濃縮した。この結果の液状濃縮物に硫酸アンモニウムを50％まで添加し、遠心分離後さらに硫酸アンモニウムを飽和レベルの75％に達するまで上清に加えた。こうして得られた沈殿を低速遠心分離で収集し、透析し、結果の液体をPM-10装置で再び濃縮した。この濃縮物をSephadex G-100ゲルろ過カラム上で処理し、活性フラクションをプールした。各フラクション中の活性は、原料及び方法セクションで述べたように、ｐＨ4.0のZ-Gly-Gly-pNAを用いて測定した。プールしたフラクションを0.05mol/lの酢酸ナトリウムｐＨ5.0中で平衡化しているHITrat Q上イオン交換クロマトグラフィーに供し、1M NaClを含有する同一緩衝液で溶出した。以前のように、しかし今回はｐＨ5.0でZ-Gly-Gly-pNAとのインキュベーションで活性フラクションを同定し、プールし、PM-10装置で濃縮した。ｐＨ5.0で測定すると、最終濃縮物は0.008単位/mlを含んでいた。この溶液を用いて実施例11で述べる実験を行った。
【０１５８】
実施例１１
選ばれた補助プロテアーゼで処理した100％麦芽ウワートの改良された濁り安定性
本実施例は、Endo-Proの抗-濁り効果が、Endo-ProA処理を選ばれた補助プロテアーゼと併用することでさらに改良できること実証する。本実施例は、ザントモナス・カンペストリス由来のプロリン特異的カルボキシペプチダーゼ（“CarboxyPro”）又はアスペルギルス・オリゼ由来のグリシン切断エンドプロテアーゼ（“EndoGly”）は、さらにEndo-ProAと併用すると、濁り形成を有意に低減することを例証する。本実施例は、100％麦芽ウワート中の濁り低減効果に焦点を当てる。
【０１５９】
麦芽ウワートを調製するため、50gの粉砕麦芽を200mlの水と混ぜ、50℃に加熱した。０又は150μlのEndo-Pro酵素濃縮物を加え、このマッシュを、下表10で指定するような段階的加熱手順に供した。この手順の間、マッシュは200rpmで撹拌した。最後に、マッシュを室温に冷まし、蒸発した水を補填するため水を添加した。最終的に、マッシュをろ紙上でろ過し、固体からウワート（液体）を分離した。こうして得られたウワートを使用し、参考としてPVPPの効果を用いて補助的酵素の効果を試験した。
【０１６０】
【表１０】
2005528906.tif 000011
【０１６１】
そのポリフェノールに対する高い親和性のため、PVPPは本業界で広範に使用され、ポリフェノール-タンパク質凝集体によって引き起こされるビールの濁りを除去する。CarboxyPro又はEndoGlyがPVPPのような濁り低減効果を有するかを決定するため、非Endo-Pro処理ウワートを100μlのCarboxyPro又は20μlのEndoGlyと共に120分間50℃でインキュベート後、その結果の濁り安定性を、原料及び方法セクションで述べた手順に従って測定した。参考として、非Endo-Pro処理マッシュをPVPPと共に15分間室温でインキュベート後ろ過して測定した。得られた結果を下表１１に示す。
【０１６２】
【表１１】
2005528906.tif 000012
【０１６３】
表１１に示される結果によれば、CarboxyProとEndoGlyの両者とのインキュベーションが、冷却時の濁りの少ないウワートをもたらす。しかし、この結果は、PVPPの添加が明らかに優れた効果を有することも示す。
マッシュ段階にEndo-Proで前処理したウワートを用いる次の実験を行った。この実験では、10mlのウワート当たり補助プロテアーゼを0、100若しくは500μlの量のEndoGly、又は0、20若しくは100μlの量のCarboxyProをウワートに添加した。 全試料を120分間50℃でインキュベート後、冷濁り試験を行った。得られた結果を下表１２に示す。
【０１６４】
【表１２】
2005528906.tif 000013
【０１６５】
表１２に示される結果によれば、Endo-Pro前処理とCarboxyPro又はEndoGlyのどちらかとの併用が、ウワートの濁り安定性に有意な効果を有する。添加する補助プロテアーゼの濃度によっては、非Endo-Pro処理ウワート中でPVPPによって得られる効果より優れた効果を得ることができる（表１１参照）。
【０１６６】
最後に、観察される酵素効果が非酵素的人工産物の結果なのか、特異的なタンパク質分解作用の結果なのかを試験する実験を行った。その目的のため、100μlのCarboxyPro又は20μlのEndoGlyをEndo-Pro-処理ウワートに添加した。補助的酵素の全酵素活性を妨げるため、これら酵素を含有するウワートを０℃で15分間保持後(すなわち、PVPPで用いたインキュベーション時間と匹敵する)、形成されたウワート冷濁りを測定した。いろいろな量のPVPPで処理してからろ過したウワートを参考として用いた。
【０１６７】
【表１３】
2005528906.tif 000014
【０１６８】
表１３に示されるデータは、CarboxyProとEndoGlyは両方とも０℃でインキュベートすると、何ら効果がないことを示しており、このことは、それらのタンパク質分解活性が、表１１及び１２で観察される濁り安定化の直接的な原因であることを暗示している。PVPPは、限定された効果しか持たない（表１１で述べた条件下で、たった17.3％の濁り低減対46.8％の濁り低減）。この観察は、ポリフェノール-タンパク質凝集体の形成を阻害することによる、存在する沈殿しうるポリフェノール-タンパク質の総量に及ぼすEndo-Proインキュベーションの効果を再確認し、PVPPの使用がほとんど不要になった。
【０１６９】
実施例１２
Endo-Pro Aは、Endo-Hydroxy-Pro及びEndo-Ala活性をも有する
Endo-Pro Aがヒドロシキプロリン及びアラニンに特異的な活性も有するかどうか調査した。従って、何らかの変化のあるαs1-カゼインＢのＣ末端を包含する３種の合成ペプチドを合成した。これらペプチドは以下のとおりである：
・0139-59, SEKTTMPLW, αs1-カゼイン本来のＣ末端                 M=1091.5
・0139-60, SEKTTMJLW, ヒドロキシプロリンであるＪで              M=1107.5
・0139-61, SEKTTMALW, プロリンの代わりにアラニンで              M=1065.5
【０１７０】
このような複合ペプチド混合物の解析のため、いわゆるスキャン依存性MS/MSを使用する。各スキャンが３つのセグメントから成るこの方法は、以下のように定義される：
１：フルスキャン解析、
２：フルスキャン質量範囲内で最強の電荷状態の決定のためのズームスキャン解析
３：アミノ酸配列情報を得るためのフルスキャン質量範囲内の最強イオンのMS/MS。
【０１７１】
すべての３種のペプチドを0.1％ギ酸に75〜100μg/lの濃度で溶かし、勾配溶出を用いるLC/MS及びLC/MS/MS様式でその純度をチェックした。すべての３種のペプチドは、全適用範囲のアミノ酸配列によるLC/MS様式及びLC/MS/MS様式で、プロトン化及び二重プロトン化分子によって同定できた。
【０１７２】
Endo-ProAで処理した合成ペプチドを50倍に希釈後解析した。処理後に形成されたペプチドのLC/MS解析では、勾配はわずかに適合させなければならない。本当にEndo-ProAがプロリン及びヒドロキシプロリン特異的な特異性を有する場合、該ペプチドは以下の部分で切断されるはずである：
SEKTTMP及びLW、それぞれm/z 793.4及び318.1のプロトン化分子で。
SEKTTMJ及びLW、それぞれm/z 809.4及び318.1のプロトン化分子で。
両予測ペプチド質量は、実際にEndo-Pro処理ペプチドのイオンクロマトグラム内で観察することができ、正確なアミノ酸配列を有するLC/MS/MS様式でチェックした。
【０１７３】
イオンクロマトグラム内でSEKTTMAのm/z 767.4及びLWのm/z 318.1を観察することで３番目の合成ペプチドも同一パターンを示した。Endo-Proは優先的にＰ、Ｊ及びＡでＣ末端を切断するが、１、２、又は３アミノ酸短いペプチドも観察され、LC/MS/MSで確実に同定できた。しかし、これらパーセンテージはすべて６％未満だった。
上記概要を表１４に示す。
【０１７４】
【表１４】
2005528906.tif 000015
【０１７５】
結論
確かに、Endo-Pro Aは、そのプロリン切断に優先であることに加え、ヒドロキシプロリン及びアラニン残基をそのカルボキシ末端側で切断することができる。
【０１７６】
実施例１３
Endo-ProのｐＨ最適値
配列番号:１及び配列番号:３のDNA配列は、アスペルギルス・ニガーiso 502内で発現された。この結果、それぞれ配列番号:５及び配列番号:４のポリペプチドとなった。これらポリペプチドは、それぞれさらにEndo-Pro RUS及びEndo-Pro GAMとも呼ばれる。両酵素は非常に似ているが、いくつかの生物学的局面で異なることも分かった。Endo-Pro RUSは、より高い特異的活性を有し、かつビール中の濁り除去でいくらか活性が高いことが分かった。
【０１７７】
１）ｐＨ最適Endo-Pro：
レゾルフィン(resorufin)標識カゼインとRocheの処方(“Universal Protease Substrate”；カタログ番号1 080 733)を用いてEndo-Proのタンパク質分解活性を測定した。プロテアーゼとの処理によってレゾルフィン標識ペプチドは遊離され、トリクロロ酢酸で沈殿しえない。それで、与えられた温度又はｐＨ値でEndo-Pro酵素の活性が高いほど、574nmでの光吸収が高い。ｐＨ4.5−4.8−5.0−5.5−6.0−7.0−8.0のｐＨ範囲内で、ｐＨ７及び８では0.1M Tris/HCl緩衝液を用いた。より低いｐＨでは0.1M Hac緩衝液を用いた。緩衝液は、0.02MのCaCl2を含んでいた。
【０１７８】
反応は30分間37℃で行い、得られたデータを下表１５に示す。Endo-ProRUS (６Ｕ/mL)とEndo-ProGAM(約４Ｕ/mL)を0.5Ｕ/mLに希釈した。10μlの試料をインキュベーション混合物に加え、インキュベーション緩衝液で容積を補填した。
表１５に示される結果によれば、酵素のｐＨ最適値は約ｐＨ5.5である。しかし、その後になって、用いたレゾルフィン標識カゼインがｐＨ5.5未満のｐＨ値では沈殿し始めるので、このｐＨ未満では信頼できない結果が得られることが明らかになった。それを補正するため、上述したが色素生産性基質としてレゾルフィン標識カゼインではなくZ-Gly-Pro-pNAを用いて種々のｐＨ条件下で実験を繰り返した。Z-Gly-Pro-pNAを用いて得られたデータと、410nmでの光吸収は(実施例２参照)、両Endo-Pro酵素についてほぼｐＨ4.5で明白な活性ピークを示した。
【０１７９】
２）Endo-Pro酵素の温度安定性
両Endo-Pro酵素をｐＨ5.0で40−50−55及び60℃に加熱して両酵素の温度安定性を測定した。0.5−1−2−5及び20時間後に試料を取り、Endo-ProRUS及びEndo-ProGAMの活性を約0.5Ｕ/mLに希釈した。次いで、10μlの試料をZ-Gly-Pro-pNA(実施例２参照)を含有するインキュベーション混合物に添加し、実施例２で述べたように残留酵素活性を測定した。参考では10μlの量をインキュベーション緩衝液で補填した。非加熱酵素のZ-Gly-Pro-pNA切断活性を100％値として使用した。
下表１６に示される結果から、両Endo-Pro酵素が優れた温度安定性を示すことは明白である。
【０１８０】
【表１５】
2005528906.tif 000016
【０１８１】
【表１６】
2005528906.tif 000017
【０１８２】
実施例１４
ビール発酵及びラガーリング(lagering)条件下における濁り低減
前記実施例で、我々は室温(実施例７参照)と高温の両者における酵素の濁り阻害効力を示した。本実施例では、我々は、プロリン特異的エンドプロテアーゼが、該酵素にとってとうてい最適でない条件下で活性でなければならない条件下でも有効に濁り形成を防止できることを示すことによって、この酵素Endo-Proアプローチの多様性を示す。その目的のため、我々は、ビール発酵前に添加するか（酵素は10日間12℃で働きうるように）、又はビールのラガーリング前に添加（酵素は10日間４℃で働きうるように）した場合、Endo-Pro酵素はビール中の濁り形成を防止できるかをどうか試験した。
【０１８３】
ビール発酵中の酵素的濁り防止効果を試験するため、我々は新たに製造し、膜ろ過したが、濁り形成成分を除去するための如何なる処理も受けていない、約４％のエタノールを含有する100％麦芽ビールを使用した。この“非安定化”ビールを脱炭酸後、種々の濃度のEndo-Proを添加した（表１７参照）。この混合物を12℃で10日間インキュベートし、産業的ビール発酵をできる限り精密に模倣した。
ラガーリング条件中の酵素的濁り防止効果を試験するため、同一の出発原料を同濃度のEndo-Pro酵素と組み合わせて使用するが、今回は混合物を10日間４℃でインキュベートした。
両実験で、参考として１ヘクトリットルのビール当たり20、30及び50グラム用量のPVPP(Polyclar AT/水不溶性)を使用した(15分間室温で撹拌後ペーパーろ過)。
両実験で、パパイン(液体DSM Collupulin；バッチ番号010604,5480 NFU/mgの最終活性)も１ヘクトリットル当たり１、２及び３グラムの用量で含めた。
全試料で、実施例２で記載したように濁り形成を測定した。
【０１８４】
【表１７】
2005528906.tif 000018
【０１８５】
【表１８】
2005528906.tif 000019
【０１８６】
得られたデータから、酵素的濁り除去は、プロセスの発酵中及びラガーリング部分に適用できることが明かである。まったく驚くべきことに、酵素Endo-Proプロセスは、パパイン又はPVPPのいずれよりも冷濁りを阻害し、熱濁りの形成を抑えるために現在使用されている１ヘクトリットル当たり30グラムという用量のPVPPと同程度に良い。
【０１８７】
実施例１５
酵素的濁り低減及びそのビール泡安定性とポリフェノール（抗酸化剤）に及ぼす影響
タンパク質分解酵素を用いてビール中の濁り形成を低減することの主張されている欠点は、そのビール泡安定性に及ぼす負の効果である。過剰なタンパク質分解のため、穀物タンパク質が安定な泡を形成し損なう。この実施例では、我々は、おそらくその高い選択性の結果として、Endo-Pro酵素がビール泡安定性に逆効果を及ぼさないことを実証する。Endo-Proインキュベーションの重要な副作用は、結果のビールが、上昇したポリフェノールレベルを示し、ひいては酸化に対して高い天然の保護を示すことである。
【０１８８】
この実験では、すべて100％麦芽を用いる４種のパイロット試験でビールを製造した。２つのパイロット試験では、Endo-Pro酵素を２種の濃度でマッシュ工程時に添加した。他の２つのパイロット試験では、酵素を添加せずに、これらビールをPVPPで処理して濁り形成成分の慣習的な除去を模倣した。
【０１８９】
以下の手順でビールを製造した。各検定で１つの醸造物を作った(6kgの麦芽、18リットルの水)。マッシュ工程は50℃で20分間、50℃〜64℃で10分間、64℃で20分間、64℃〜74℃で８分間、最後に74℃で30分間行った。ろ過はマッシュフィルターを用いて行い、その後の洗浄は熱水で行った。90分間煮沸を持続後、ホップを加えた。最初の発酵用に乾燥ラガー(lager)イースト(7.5×106細胞/１mlのウワート)を用い、12℃で発酵を行った。発酵時間は比重の減少によって決まるが、約10日間持続した。少なくとも７日間０℃でビール熟成を行った。最後にビールを膜ろ過し、ビンに詰めた。
【０１９０】
【表１９】
2005528906.tif 000020
【０１９１】
得られた結果は、明らかに本酵素的濁り低減法が、ビールの泡に絶対的な負の効果を及ぼすことなく、かつPVPPで安定化したビールに比べてビールの全ポリフェノール含量を増やすことを示す。後者の観察は、Endo-Pro酵素で処理したビールの天然の高い抗酸化能力を強く示唆する。
【図面の簡単な説明】
【０１９２】
【図１】50℃でｐＨ最適Endo-Pro RUS及びGAMの活性（574nmでの光吸収）を示すグラフである。
【図２】50℃でｐＨ最適Endo-Pro RUS及びGAMの相対的活性を示すグラフである。
【図３】ｐＨ5.0のEndo-Pro GAMの熱安定性を示すグラフである。
【図４】ｐＨ5.0のEndo-Pro RUSの熱安定性を示すグラフである。
【図１】
2005528906.tif 000021
【図２】
2005528906.tif 000022
【図３】
2005528906.tif 000023
【図４】
2005528906.tif 000024
【配列表】
2005528906000001.app
【国際調査報告】
2005528906.tif 000025
2005528906.tif 000026
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