(57)【要約】本発明は、Ｇ蛋白結合質量類似の受容体活性を刺激または低下させる化合物を  同定する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇ蛋白共役受容体GPR45様／GPR63の活性を修飾する化合物を同定する方法であって、
ａ）Ｇ蛋白共役受容体GPR45様／GPR63を含有する生物学的材料または生物学的材料のプレパレーションおよびこの受容体の天然のリガンドを用意し、
ｂ）化学的化合物を用意し、
ｃ）ａ）からの生物学的材料または生物学的プレパレーションをｂ）からの化学的化合物と接触させ、
ｄ） Ｇ蛋白共役受容体GPR45様／GPR63の活性を測定する
ことからなる上記方法。
【請求項２】
受容体は以下の群：
ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる受容体、
ｂ）配列番号２のアミノ酸配列に関して１または２以上のアミノ酸を欠く受容体、
ｃ）１または２以上のアミノ酸が、配列番号２のアミノ酸配列に関して付加された受容体、
ｄ）１または２以上のアミノ酸が配列番号２のアミノ酸配列に関して他のアミノ酸によって置換された受容体
から選択される請求項１記載の方法。
【請求項３】
受容体は以下の群：
ａ）配列番号１に示されるポリヌクレオチド配列、
ｂ）遺伝子コードの縮重のために、１または２以上のヌクレオチド位置が異なるヌクレオチドを含有する配列番号１に示されるポリヌクレオチド配列、
ｃ）配列番号１から構成されるポリヌクレオチド配列と、緊縮条件下にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列
から選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされる請求項１記載の方法。
【請求項４】
受容体は配列番号１に示されるポリヌクレオチド配列からなる外的DNA配列の原核生物または真核生物発現によって製造される請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
各場合、Ｇ蛋白共役受容体GPR45様／GPR63からなる生物学的材料または生物学的材料のプレパレーションが用意されたのちに、外部から天然のリガンドを添加する請求項５記載の方法。
【請求項６】
天然のリガンドはスフィンゴシン１−ホスフェートまたはリゾホスファチジン酸である請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
天然のリガンドは放射性ラベルまたは蛍光法で検出できるラベルからなる請求項６記載の方法。
【請求項８】
Ｇ蛋白共役受容体GPR45様／GPR63の活性を修飾する化合物は天然のリガンドのアゴニストまたはアンタゴニストとして働く請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８に記載の方法によって同定された、Ｇ蛋白共役受容体GPR45様／GPR63の活性を修飾する化合物。
【請求項１０】
質量は０.１〜５０kDaである請求項９記載の化合物。
【請求項１１】
質量は０.１〜５kDaである請求項９または１０記載の化合物。
【請求項１２】
質量は０.１〜３kDaである請求項９〜１１のいずれかに記載の化合物。
【請求項１３】
化合物は、蛋白質、アミノ酸、ポリサッカライド、シュガー、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド、脂肪酸含有化合物、脂肪、脂肪酸、脂肪酸誘導体または芳香族炭化水素化合物である請求項９〜１２のいずれかに記載の化合物。
【請求項１４】
請求項９〜１３に記載の化合物少なくとも1種とともに医薬を処方するための賦形剤および／または心脈管系障害の処置のための更なる添加物からなる医薬。
【請求項１５】
心脈管系障害の治療用医薬を製造するための請求項９〜１３のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項１６】
請求項１〜５記載のいずれかの方法によって同定された化合物で、受容体GPR45様／GPR63の複合体を製造するための該化合物の使用。
【請求項１７】
化合物はスフィンゴシン１−ホスフェートまたはリゾホスファチジン酸である請求項１６記載の化合物の使用。
【請求項１８】
受容体GPR45様／GPR63とスフィンゴシン１−ホスフェートおよび／またはリゾホスファチジン酸の複合体からなる蛋白質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｇ蛋白共役受容体GPR45様／GPR63の活性を修飾する化合物を同定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｇ蛋白共役受容体は、たとえばホルモン、神経伝達物質、光もしくは有臭物質からＧ蛋白を介する細胞内部への細胞外シグナルを仲介し、また細胞内シグナルカスケードを介して様々な作用を開始させることができる。Ｇ蛋白は通常３つの異なるサブユニット（α、β、γ）から構成される。受容体特異性および作用が異なる様々なヘテロダイマーＧ蛋白が既に知られている。Ｇ蛋白はGTPにより活性化される。よく知られたＧ蛋白は視覚過程からの変換体（transduction）である。
【０００３】
Ｇ蛋白共役受容体（GPCR）は大多数の生理学的過程中で重要な役割を演じている。それらは既知の最も大きな蛋白質ファミリーの一つである。最近ではヒトゲノム中で約１千個の遺伝子がこのクラスの受容体をコードしていると評価されている。GPCRは７トランスメンブランα−ヘリックスを有する膜蛋白質である。多くの医薬品は、その効果を、GPCRを介して発揮する。
【０００４】
GPCRはとくにシグナルプロセッシングおよび生体の制御に関与し、したがって、そこなわれていない健康な生体の機能の維持において上位的役割を果たしている。
【０００５】
細胞外リガンドの結合は、関連GPCRのコンフォーメーションの変化を導く。コンフォーメーション変化は各関連Ｇ蛋白との相互作用のための予備条件を作り出す。続いて、Ｇ蛋白は関連する細胞型に特徴的な細胞内シグナルカスケードを開始させる。
いわゆるセカンドメッセンジャーは細胞内シグナルカスケードに特徴的である。
これらは、たとえばcAMP（環状アデノシンモノホスフェート）、cGMP（環状グアノジンモノホスフェート）またはCa2+のような低分子量化合物を意味する意図である。細胞内シグナリングはセカンドメッセンジャーの濃度の変化によってコントロールされる。Ｇ蛋白およびそれらのサブユニットはこの目的で、アデニレートサイクラーゼ、ホスフォリパーゼＣまたはイオンチャンネルのような蛋白質と相互作用する。セカンドメッセンジャーの濃度変化は、続いて他の蛋白質、とくにキナーゼおよびホスファターゼの活性化または不活性化をもたらす。シグナルは、特定細胞のアッセンブリーの典型的応答たとえば蛋白質の発現で最終的に終結する。
【０００６】
ヘテロトリマーＧ蛋白は形質膜内部に存在する。活性化された受容体はＧ蛋白ヘテロトリマーと接触し、ついでそれはαサブユニットおよびβγ複合体に解離する。活性化されたαサブユニットおよびβγ複合体はいずれも細胞内エフェクター蛋白質に影響することができる。Ｇ蛋白αサブユニットファミリーは様々なクラスに分割することができる。既知の例にはGαs、Gαi、GαqおよびGα12のクラスがある。GPCRは活性化されるＧ蛋白によって分類される。
【０００７】
GsクラスのGPCRはGαsの活性化を介しアデニレートサイクラーゼの刺激を誘導し、細胞内cAMP濃度を上昇させる。GiクラスのCPCRはGαIの活性化を介してアデニレートサイクラーゼの阻害を招き、細胞内cAMPを低下させる。
【０００８】
一方、GqクラスのGPCRはGαqの活性化により様々なPLCβアイソフォームの刺激を達成
し、膜結合ホスファチジルイノシトール4,5−ビホスフェートの加水分解を介し、ジアシルグリセロールおよびイノシトールトリホスフェート（IP3）をもたらす。IP3は細胞内ストアからCa2+を放出させる。大部分のGPCRはただ１種のＧ蛋白βサブユニットファミリーとのみ接触することが可能であり、すなわち、それらは特定のシグナルトラスダクション経路に対する選択性を有する。
【０００９】
異なる受容体特異性、およびシグナルトランスダクション経路への異なる結合を有するＧ蛋白は、異なるＧ蛋白からの成分を互いに連結させることによって構築され、分子生物学および生化学の方法によってハイブリッドＧ蛋白を与えることができる。
【００１０】
ハイブリッドＧ蛋白は、１つの蛋白質配列中に異なるGαサブユニットが合体された融合構築体である。したがって、たとえばGαiの受容体認識部位をGαqのエフェクター活性化領域と融合させてGαq／iハイブリッドを生成させると、Gi共役受容体のシグナルを受容するが、Gαq PLCβシグナルトランスダクション経路にスイッチオンすることが可能になる。GαqのＣ−末端５−アミノ酸が相当するGαi配列（Gαiq5）によって置換されたこのようなハイブリッドはConklinらによって最初に報告された（Nature 363, 274-276, 1993）。受容体のこの「レルーティング」はアッセイの終点（アデニレートサイクラーゼの阻害と比較した細胞内Ca2+濃度の上昇）に、測定技術によってより容易に近づくことを可能にし、高いスループットスクリーニングに使用できるという利点がある。
【００１１】
スフィンゴシン１−ホスフェート（S1P）およびリゾホスファチジン酸（LPA）は膜ホスフォリピドから形成されるシグナルリピド分子である。S1PおよびLPAは主に細胞内シグナル分子として知られている。一部のGPCRの場合には、S1PまたはLPAは天然のリガンドとして機能する。リガンドはＧ蛋白共役受容体に可逆的に結合し、この結合を介して受容体への作用（安定化、不活性化、刺激）を発揮する分子を意味する。この作用は一般的に、下流細胞内カスケードに関し、シグナルカスケードに対する作用から検出することが可能である。リガンドは、それが生物学的システムによって産生されれば天然のものである。
【００１２】
GPR45様／GPR63受容体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は既知である（Genbank：NM_030784; TREMBL:Q9b2i6）。GPR45様／GPR63受容体のヌクレオチド配列は配列番号１に記載し、そのアミノ酸配列は配列番号２に記載する。GPR45様／GPR63受容体に対する天然の受容体は以前には知られていなかった。したがって、この受容体機能に対するアゴニストまたはアンタゴニストを同定することは不可能である。アゴニストまたはアンタゴニストは通常、正確な構造および再現できる製造方法を有する特定の有機分子である。このような化合物の援助によってのみ、様々な組織、発育段階および異なる外的影響におけるこの受容体の機能を研究することができる。正常な組織ならびに病的に変化した組織におけるこの受容体の役割を明らかにする支援がその際に提供される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、本発明の目的は、GPR45様／GPR63に対してアゴニストまたはアンタゴニスト作用を有する化合物を同定するための方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明はＧ蛋白共役受容体GPR45様／GPR63の活性を修飾する化合物を同定する方法に関し、
ａ）Ｇ蛋白共役受容体GPR45様／GPR63を含有する生物学的材料または生物学的材料のプレパレーションおよびこの受容体の天然のリガンドを用意し、
ｂ）化学的化合物を用意し、
ｃ）ａ）からの生物学的材料または生物学的プレパレーションをｂ）からの化学的化合
物と接触させ、
ｄ）Ｇ蛋白共役受容体GPR45様／GPR63の活性を測定する、ものである。
【００１５】
Ｇ蛋白共役受容体GPR45様／GPR63の活性の修飾は、とくに、その安定化、スウイッチオン、スウイッチオフ、上昇または低下から構成される。
【００１６】
化学的化合物と生物学的材料またはそれらのプレパレーションの接触は相互作用が可能なように行われる。この関連では、とくに温度（室温〜約37℃）およびpH（pH６〜８、好ましくはpH約7.0）が重要である。
【００１７】
本発明の方法の好ましい実施態様においては、Ｇ蛋白共役受容体GPR45様／GPR63は以下の群の一つから選択される：
ａ）配列番号２に示すようなアミノ酸配列からなる受容体、
ｂ）配列番号２のアミノ酸配列に関して１または２以上のアミノ酸を欠失した受容体、
ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に関して１または２以上のアミノ酸が付加された受容体、
ｄ）配列番号２のアミノ酸配列に関して１または２以上のアミノ酸が他のアミノ酸によって置換された受容体。
【００１８】
上述の方法を実施するためのＧ蛋白共役受容体GPR45様／GPR63は、好ましくは以下の群の一つからコードされる：
ａ）配列番号１に示すようなポリヌクレオチド配列、
ｂ）遺伝子コードの縮重のために、１または２以上のヌクレオチド位置が異なるヌクレオチドを含有する配列番号１に示すようなポリヌクレオチド配列、
ｃ）配列番号１から構成されるポリヌクレオチド配列と、緊縮条件下にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列。
【００１９】
本発明の方法を実施するためのＧ蛋白共役受容体GPR45様／GPR63は、原核生物または真核生物における外的DNA配列の発現により製造することができる。蛋白質を製造するためには、任意の原核生物または真核生物プラスミドベクター、バクテリオファージベクターまたは、酵母プラスミドベクターが原理的に適当である。このようなベクターの例には、pBR322、pUC18,19、pBluescript、pcDNA 3.1等がある。
【００２０】
天然のリガンドは既に、生物学的材料または生物学的材料のプレパレーション中に存在しうる。しかしながら、このようなリガンドはまた外部から加えることもできる。この目的のためには、リガンドは、受容体へのその結合ならびに受容体シグナルがもたらされるような量、濃度および純度で存在しなければならない。
【００２１】
天然のリガンドの添加は、それぞれＧ蛋白共役受容体GPR45様／GPR63を含む生物学的材料または生物学的材料のプレパレーションが適当な方法（プレパレーション／量）で利用可能とされたのちに行われる。
【００２２】
このような天然のリガンドは好ましくはスフィンゴシン１−ホスフェートまたはリゾホスファチジン酸である。天然のリガンド、およびとくにスフィンゴシン１−ホスフェートまたはリゾホスファチジン酸は、本発明の方法における使用のためには、適当な検出方法によって検出できる標識を含んでいる。このような標識はたとえば、放射性標識または蛍光法で検出できる標識である。
【００２３】
本発明の方法では、好ましくは、同定される化合物が天然のリガンドに対してアゴニストまたはアンタゴニスト的に働くような方法で使用される。
【００２４】
本発明はまた、上述の方法によって同定されたＧ蛋白共役受容体GPR45様／GPR63の活性を修飾する化合物に関する。
【００２５】
このような化合物は、好ましくは0.1〜50kDaまたはとくに好ましくは0.1〜５kDaまたはきわめて好ましくは0.1〜３kDaの質量を有することによって識別される。
【００２６】
本発明の方法によって同定されるこのような化合物は、蛋白質、アミノ酸、ポリサッカライド、シュガー、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド、脂肪酸含有化合物、脂肪、脂肪酸、脂肪酸誘導体または芳香族炭化水素化合物でありうる。
【００２７】
本発明はさらに、本発明の方法によって同定された化合物、付加的な医薬処方用賦形剤および／または他の添加物からなる医薬に関する。この医薬は、とくに心脈管系障害の処置に適当である。
【００２８】
本発明の方法によって同定された化合物は、心脈管系障害の処置のための医薬の製造に使用することができる。
【００２９】
本発明はさらに、本発明の方法によって同定された化合物の、受容体GPR45様／GPR63とこの化合物との複合体を産生させるための使用に関する。このような複合体の製造に適当な化合物は、たとえばスフィンゴシン１−ホスフェートまたはリゾホスファチジン酸である。本発明はまた、受容体GPR45様／GPR63とスフィンゴシン１−ホスフェートおよび／またはリゾホスファチジン酸の複合体に関する。この関連での複合体の語はスフィンゴシン１−ホスフェートおよび／またはリゾホスファチジン酸と少なくとも特異的に結合する受容体の１または２種以上の蛋白質および更なるリピド、膜成分または受容体もしくは受容体／リガンド複合体の安定化に必要な可能性がある界面活性剤から構成されることを意味する。結合定数が100μM未満またはそれに等しい場合、結合は特異的である。
【００３０】
Ｇ蛋白共役受容体GPR45様／GPR63は、組換えベクターの構築手段によってクローン化し、製造することができる。
【００３１】
組換えベクター構築体は、熟練者の関連する知識を用い、たとえばF. M. Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, New York (ISBN 0-471-50338-X) ； J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Mamiatis, Molecular Cloning, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (ISBN 0-87969-309-6) に記載されたようにして産生することができる。これは記述した配列情報の一つ（配列番号１）に示したようなアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドまたは
基本ベクターに導入された配列情報の一つ（配列番号２）に示したようなポリヌクレオチドを伴う。基本ベクターの語は、ポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列が分子生物学の手法による導入が可能であり、微生物、たとえば細菌、かびまたは培養細胞の細胞中にクローン化できるベクターを意味する。基本ベクターはたとえば抗生物質抵抗性マーカーを有するプラスミド、細菌または培養細胞中での複製に適した複製の起源および蛋白質の発現に適当なプロモーターから構成される。
【００３２】
基本ベクターはまたたとえばファージベクター、ファージミドベクター、ファスミドベクター、コスミドベクター、ウイルスベクター、YACベクターまたは他の型のベクターから構成されていてもよい。基本ベクターの例にはpUC18、pUC19、pBluescript、pKS、pSK等がある。導入スすべきポリペプチドの導入は、たとえばBioLabs, Roche Diagnostics, Stratagene等の会社から市販されている適当な制限酵素を用いる適当な切断部位を介して行われる。このような制限切断部位は、たとえば制限酵素BamHI、EcoRI、SaII、EcoRV等
の認識部位である。
【００３３】
組換えベクター構築物は、好ましい実施態様においては真核生物細胞および／または原核生物細胞中で使用できる発現ベクターからなる。発現ベクターは、ポリヌクレオチド配列に機能的に連結が可能であり、したがって生物学的生体内たとえば細菌、かびまたは真核生物細胞系で、このポリヌクレオチド配列によりコードされる蛋白質が合成されるプロモーターからなる。プロモーターは、たとえばトリプトファンまたは構成的活性中で誘導することができる。発現ベクターの例はpUC18、pUC19、pBluescript、pcDNA3.1等である。
【００３４】
生物学的材料は遺伝子情報を含有する任意の物質であり、それ自体を再生または生物学的システム中で再生することができる。生物学的材料の例にはたとえば、ヒトまたは動物組織または臓器、とくに脳、脂肪組織、肺、心臓、肝臓、腎臓、脾臓、筋肉等からの細胞である。生物学的材料の例にはまた、細菌またはかび、たとえば、Escherichia coliまたはSaccharomyces cerevisiaeもある。生物学的材料にはまた細胞培養液からの細胞も包含される。
【００３５】
生物学的材料が動物またはヒト組織からの細胞である場合には、バイオプシー、外科的除去、シリンジもしくはカテーテルによる除去または匹敵する技術により得ることができる。この方法で採取された細胞は、低温で凍結し処理するかまたは細胞培養液中に取る。細菌または酵母細胞を微生物学における慣用技術を用いて、生育し、処理する。
【００３６】
熟練者はこのための適切な指示をCurrent Protocols in Molecular Biology：F. M. Ausubelら, 連続改訂, 2001版, John Wiley & Sonsに見出すことができる。
【００３７】
生物学的材料はまた動物細胞液の細胞から構成されていてもよい。このような細胞の例には、マウス細胞、ラット細胞またはハムスター細胞がある。培養細胞の細胞は一次細胞型または確立された細胞系である。確立された細胞系の例にはマウス3T3細胞、CHO細胞またはHela細胞がある。細胞系の維持、培養および生育は、標準的テキストたとえばBasic Cell Culture; J. M. Davis IRL Press, Oxford, 1996に記載されている。
【００３８】
生物学的材料のプレパレーションは、たとえば生物学的材料の破壊、ついで精製工程によって製造される。生物学的材料の破壊は、とくに反復する凍結および解凍、超音波処理、フレンチプレスの使用、界面活性剤および酵素の添加または類似の方法で行うことができる。
【００３９】
続く精製工程は、たとえば分画遠心、硫酸アンモニウムまたは有機溶媒による沈殿、クロマトグラフィー技術の使用等から構成される。クロマトグラフィー技術には、たとえばポリアクリルアミドゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、質量スペクトロメトリー等がある。このためにはとくに、蛋白質の精製のための詳細な指示が、たとえばとくにCurrent Protocols in Protein Science, J. E. Coliganら, 連続改訂, 2001版,
John Wiley & Sons刊のようなテキストにあり、熟練者に参考になる。
【００４０】
生物学的材料または生物学的材料のプレパレーションは、慣用の実験用の容器たとえばエッペンドルフ管、遠心分離チューブまたはガラスフラスコ中で化学的化合物と接触させることができる。下層をなす水性メジウムはたとえば緩衝物質、栄養成分、１価または２価のイオンたとえばNa+、K+、Ca2+、Cl-、SO42-、PO32-等、また蛋白質、グリセロール等からなる。たとえば、とくに特定の温度、pH, イオン条件、蛋白質の濃度、容量または他の因子のような特定の一定条件が接触させるために有利である。これは、たとえば一定の
温度に維持したインキュベーション装置中、緩衝剤または予め正確に秤量した量のイオンもしくは蛋白質の存在下に接触させ実施することにより達成される。とくに、水性溶媒もある割合の有機溶媒、たとえばジメチルスルフォキシド、メタノールまたはエタノールから構成されてもよい。しかしながらこのような溶媒の含量は、好ましくは混合物の容積の10％より大くはない。
【００４１】
化学的化合物の準備は、たとえば化学的合成により行われる。熟練者は、標準的合成方法について熟知している。化学的化合物は、閉鎖合成プログラムからの化学的化合物の貯蔵または目録（化学的ライブラリーと呼ばれる）によって製造されるような化学的化合物の収集の一部であってもよい。他の場合には、化合物は微生物とくに細菌により製造されてもよく、またかびもしくは植物により製造されてもよい（天然生成物）。
【００４２】
適当な医薬は経口的、局所的、非経口的または経直腸的形態の医薬として投与することができる。最も適当な投与様式は各個体の場合により、処置される状態の性質および重篤度により、ならびに各場合に使用される化合物のタイプに依存する。適当な活性成分濃度は約１％〜35％、好ましくは約３％〜15％である。
【実施例】
【００４３】
ヒトGPR45様／GPR63受容体のクローニング
ヒトGPR45様／GPR63受容体の配列は、Genbank and EMBLにおいて、番号AF 31765およびAB 030566の許に公衆が入手できる。ヒト遺伝子はイントロンを含まない。したがって受容体はポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いてヒトゲノミックDNAから出発して増幅した。PCR反応条件は以下の通りである：
最初のインキュベーションは94℃で10分間行い、ついで、各場合１サイクルあたり１分間の94℃でのインキュベーションを35サイクル実施し、ついで60℃で１分間インキュベートし、最後に72℃で２分間インキュベートした。この場合の反応はClontechからのGC−melt Kitを用いて実施した。配列番号３および４に示すHindIII切断部位（配列番号３）およびEcoRI切断部位（配列番号４）が得られるように設計したプライマーを使用した。上述のPCRにより形成された長さ1260塩基対のPCRフラグメントを、HindIIIおよびEcoRI切断部位を用いて真核生物発現ベクターpcDNA 3.1（+）に挿入した。このベクターは、たとえばInvitrogen, Carlsbad, Californiaから市販され、入手可能である。
【００４４】
RNAの抽出；逆転写酵素を用いるPCR（RT−PCR）
RNAは様々な細胞系から単離された。
本発明の場合、このためにGibco BRLからのTRIzol試薬を使用した。
RNAは以下の細胞系：HUVECS（ヒト臍帯静脈内皮細胞）、HPAEC（ヒト肺動脈内皮細胞）、Hek 293（ヒト胚腎臓細胞）、HCSAMC（ヒト冠状動脈平滑筋細胞）、HCAEC（ヒト冠状動脈内皮細胞）、HMVEC−L（ヒト肺の微小血管内皮細胞）、HPASMC（ヒト肺動脈平滑筋細胞）、HAOSMC（ヒト大動脈平滑筋）から単離された。
【００４５】
細胞は、組織培養ボトル内でコンフルーエンスに達する直前に収穫した。RNAはTRIzol試薬の製造業者の指示に従って細胞から単離した。RNAはゲノミックDNAを含まないように試験した。このRNA約５μgを使用し、MMLV（Moloneyマウス白血病ウイルス）逆転写酵素およびStratageneからのRT−PCRキットを用いて逆転写酵素反応を実施した。RT−PCRは50μLの容量で行い、反応は最初65℃で５分間、ついで室温で15分間、ついで37℃で１時間、ついで90℃で５分間インキュベートし、最後に氷冷して実施した。
【００４６】
これらの逆転写からのcDNAプレパレーションを以後のPCR反応に使用した。
利用できる場合には、市場から入手可能なcDNAを使用した。PCRには約５μgのcDNAを使用した。反応それ自体は、Perkin ElmerからのAmplitaq Gold Polymerase Kitにより実施
した。サイクルの反応条件は以下の通りである：
95℃で12分間インキュベートし、ついで、各場合、初期には１分間の94℃でのインキュベーションを35サイクル実施し、ついで各サイクル72℃、１分間のインキュベーションを行い、35サイクルの完了後、72℃で10分間インキュベートし、最後に氷上で冷却した。
【００４７】
この目的では、以下の２つのDNA配列をプライマーとして使用した：
5'-CCC ACT GGT TTG AGT TCC TTG ACC-3'
（配列番号５：「順行」）
5'-GGT AGC CTG GAT TGG TTG TGT ACC-3'
（配列番号６：「逆行」）
長さ561塩基対の生成物が得られた。
【００４８】
Taqmanを用いるリアルタイムでの定量的RT−PCR
定量的PCR分析は蛍光共鳴エネルギートランスファー（FRET）により実施した。熟練者はまたTaqman PCRの名称でのこのシステムに通暁している。Perkin Elmerから市販されているキットを使用してTaqman反応を実施した。Taqmanのサンプルは２種の異なる発蛍光団で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドからなる。3' 末端における発蛍光団（アクセプター）は5' 末端における発蛍光団（ドナー）の「クエンチャー」として（すなわち減衰効果により）働く。Taq DNAポリメラーゼは、その5'−エキソヌクレアーゼ活性により、連鎖伸展時に、5'−末端において発蛍光団を遊離させる。発蛍光団の発光は最早消光いないので、蛍光計により測定することができる。見出された蛍光の量は、増幅時に蓄積されるPCR生成物の量に比例する。Taqmanオリゴの融点はTaqポリメラーゼによる増幅のためのプライマーの融点より高いことに注意すべきである。
【００４９】
この場合に用いられた発蛍光団は、5' 末端のためのドナーとしてのFAM（６−カルボキシフルオレセイン）および3' 末端のアクセプター／クエンチャーとしてのTAMRA（５−カルボキシテトラメチルローダミン）である。
【００５０】
cDNAは、たとえばClontech, Heidelbergから市販品で入手できるRNAを用いて製造した。
総RNA ５μgを、ランダム配列のヘキサマープライマー2.5μL（５μg／μL）と混合した。このようなヘキサマープライマーは様々な会社から入手可能である。本例の場合、それらはInvitrogen（Life Technology）, KIarlsruheから入手した。
【００５１】
総RNAおよびヘキサマープライマーは、最初70℃に10分間加熱し、氷上で冷却した。ついで、５×緩衝液（第一スタンド緩衝液）４μL、0.1nM DTT （ジチオスレイトール）２μL、10mM dNTP １μLおよび水１μLを加え、注意深く混合したのち37℃で２分間インキュベートした。ついで、逆転写酵素５μLを添加し、混合物を37℃で60分間インキュベートした。反応は2.5mMのEDTA １μLの添加および65℃での10分間加熱により停止させた。この方法で製造されたサンプルは以後の定量的PCRにおいて鋳型として作用した。
【００５２】
各場合、逆転写されたcDNA鋳型それぞれの最終濃度50ng／μL、25ng／μL、10ng／μL、５ng／μL、2.5ng／μL、1.25ng／μLおよび0.625ng／μLで検討した。
反応は総容量50μLで行った。反応混合物はdNTPおよび通常の濃度の緩衝液ならびにTaqポリメラーゼを含有する。
プライマーの最終濃度は、各場合900mMとした。
【００５３】
ヒト脳cDNAにおけるヒトβアクチンについてプライマーとの比較を行った。定量は異なるバッチについて、それぞれ二重に実施した。ヒトアクチン遺伝子の標準値は、様々なRNAに見出されるGPR45様／GPR63遺伝子発現の定量に際しサンプルを標準化するための内部コントロールとして使用された。発現は以前に定義された参照組織に対する比として表した。各場合における定義された参照値は、中枢神経系では小脳とし、末梢組織では脳とした。
【００５４】
第一の定量における増幅反応に使用したプライマーは以下のヌクレオチド配列を有する：
5'-CTC AAC ACC CTT CGC CAC A-3'（配列番号７）
5'-GGCC TGG CTG AGG CAT ATAC-3'（配列番号８）
このためのTaqmanオリゴサンプルは以下のヌクレオチド配列を有する：
5'-TGC CTT GAG GAT CCA TAG CTA CCC TGA A-3'（配列番号９）
【００５５】
第二の定量における増幅プライマーは以下のヌクレオチド配列を有する：
5'-TGCC TGG ACA TGA TGC CTA A-3'（配列番号10）
5'-TCC GTC GCT TTG TGT GAC C-3'（配列番号11）
このための相当するTaqmanサンプルは以下のヌクレオチド配列を有する：
5'-TCC TTC AAC TTT TTG CCG CAG CTC C-3'（配列番号12）を有する。
【００５６】
ノーザンブロッティング
様々なヒト組織からのRNAとのノーザンブロットは、Clontech, Palo Altoから購入した。このようなノーザンブロットはまた、他の供給者からも同じ品質で得られる。GPR45様／GPR63受容体のヌクレオチド配列はEcoRIおよびHindIIIならびにpcDNA 3.1から誘導した発現プラズマを用いて切断し、アガロースゲル上で分画化し、長さ1260塩基対の配列を単離し、ついで32P-dCTPで放射標識した。様々な組織からのRNAによるノーザンブロットは緊縮条件下にハイブリダイズした。放射能は、フィルムを用いて検出した。内部比較のためには、同じノーザンブロットを、GPR45様／GPR63受容体のコード配列と先にハイブリダイズしたDNA分子がもはや検出されなくなるまで洗浄した。洗浄したこれらのノーザンブロットはβアクチンcDNAサンプルを用いて再びハイブリダイズした。
【００５７】
トランスファーされた培養細胞におけるGPR45様／GPR63受容体の検出
CHO−K1細胞はさらに他の添加物とともに基本的Iscoveのメジウム中で培養した。Iscoveのメジウムは、たとえばBiochromから市販されている。組成は、Iscove, N. N., Melchers, F., Journal of Experimental Medicine 147, 923-933 (1978) に最初に記載された。Iscoveのメジウムへの更なる添加物としては、10％ウシ胎児血清、10 000U／mL〜10 000μg／mLのペニシリン−ストレプトマイシン、ゲンタマイシンおよび２mMのＬ−グルタミンを使用した。細胞は５％CO2雰囲気中37℃でインキュベートした。
【００５８】
約２×105のCHO−K1細胞は一過性トランスフェクションのために35mmの皿に接種した。約24時間さらにインキュベーションして50〜80％コンフルーエンスにし、Lipofectamine（Gibco）を用い、細胞を１μgのプラスミドDNA構築体により一過性にトランスフェクトした。
【００５９】
FLIPRアッセイ（蛍光造影プレートリーダーアッセイ）
トランスフェクションから16〜18時間後、CHO細胞を96−ウエルのプレートに、ウエルあたり約80 000の細胞量を置き、さらに18〜24時間インキュベートした。95μLのHBBS（Hankの緩衝食塩溶液）と20mM HEPES、2.5mMのプロベネシド（４−[(ジプロピルアミノ)スルホニル]安息香酸）および４μMの色素Fluo−４を細胞に加えた。
【００６０】
細胞を５％CO2中で１時間インキュベートし、１mM MgCl2、１mM MEDTA, 0.4mg／mL FAF−BSA（脂肪酸を含まないウシ血清アルブミン）および2.5mMのプロベネシッドを含有するPBS（リン酸緩衝食塩水）で３回洗浄した。
【００６１】
最後の洗浄工程後、各ウエル中の細胞に100μLを残した。試験するリピドはDMSO（ジメチルスルホオキシド）中２mMの保存溶液として使用した。60μM溶液を96−ウエルタイタープレート上に保持し準備した。保存溶液はPBSで希釈した。この６μM溶液50μL部を、100μLのPBSと細胞を含む各マイクロタイターのウエルに移した。試験すべきリピドの最終濃度20μMがこの方法で得られた。
蛍光は１秒間隔で１分間、さらに３秒間隔で２分間、装置（FLIPR, Molecular Devices）によって測定した。
【００６２】
細胞生育アッセイ
CHO細胞は８×104の量の細胞を35mmのプレート中に取った。32時間後、Lipofectamine（Gibco）を用い、細胞を１μgのプラスミド構築体でトランスフェクトした。さらに13時間後（時間０）に細胞をPBSで洗浄し、10％の透析ウシ胎児血清を含むIscoveメジウム中で48時間（時間48）、とくに１μMのS1P（スフィンゴシン１−ホスフェート）の存在下または不存在下にインキュベートした。  
【００６３】
時間０および48における細胞数を計数によって測定した。これは、まず細胞をトリプシンで処理し、ついでそれらを１mLのIscoveメジウムに懸濁して実施した。これらの細胞100mLの量を10mLの緩衝液で希釈し、細胞カウンター中たとえばCasy Cellcounter TT（Cell Counter und Analysesystem, Schaerfe, Reutlingen）で計数した。
【００６４】
様々なヒト組織におけるGPR45様／GPR63受容体発現の特異性
発現はRT−PCRを用いて検討した。GPR45様／GPR63受容体の転写特異性は、大動脈、心臓、左心室、胎児心臓、脳および腎臓において検出することができる。左心房からの組織では弱いバンドのみが得られた。肺組織では、シグナルは検出できなかった。
【００６５】
様々なヒト細胞系におけるGPR45様／GPR63受容体の発現
HUVECS（ヒト臍帯静脈内皮細胞）、HCAEC（ヒト冠状動脈内皮細胞）、HMVEC−L（ヒト肺からの微小血管内皮細胞）、HPAEC（ヒト冠状動脈平滑筋細胞）、HPASMC（ヒト肺動脈平滑筋細胞）、HAOSMC（ヒト大動脈平滑筋）について検討した。
すべての細胞系においてGPR45様／GPR63受容体の転写が検出できた。
【００６６】
ヒト末梢組織におけるGPR45様／GPR63受容体の発現
受容体の発現は、TaqMan RT−PCRを用いて半定量的に測定し、脳における発現と比較した。
内部比較はβアクチンRNAとの関係で実施した。測定はそれぞれ二重に行った。以下の表は、RNA発現を脳における発現に対する倍数として示す。
〔表１〕
様々な組織におけるGPR45様／GPR63受容体発現の脳における発現と比較
脳に対する発現  
脳                    １
心臓                  ０.１
腎臓                  ０.２
肝臓                  ０.０１
肺臓                  ０.０５
脾臓                  ０.２
胸腺                  ０.６
骨格筋                ０.０５
膵臓                  ０.１５
小腸                  ０.８ 
胃                    ０.７
比較的強い発現が胸腺、小腸および胃に認められ、一方、肝臓、腎臓および骨格筋には、発現はほとんど検出されなかった。
【００６７】
脳の様々な部分におけるGPR45様／GPR63受容体の発現
受容体の発現は、TaqMan RT−PCRを用いて半定量的に測定し、小脳における発現と比較した。内部比較はβアクチンRNAとの関係で実施した。測定はそれぞれ二重に行った。以下の表は、RNA発現を小脳に対して示す。
〔表２〕
脳の様々な部分におけるGPR45様／GPR63受容体の発現の小脳との比較
小脳に対する発現  
小脳                    １
全脳                    １.２
脳梁                    ０.２
尾状核                  １.５
視床                    ２.１
扁桃核                  １.２
比較的に最も強い発現は視床に観察された。
【００６８】
GPR45様／GPR63受容体による細胞内Ca2+放出の刺激
GPR45様／GPR63受容体およびＧ蛋白αサブユニットδ ６qi4mgr（＝i49i4）を発現したCHO細胞に、物質ライブラリーからの209種の生物活性リピドを、それぞれ１μMの最終濃度で添加した。約30種の化合物が試験された。S1P（スフィンゴシン１−ホスフェート）およびDHS1P（ジヒドロスフィンゴシン１−ホスフェート）のみが測定可能なCa2+のインフラックスを招いた。S1PおよびDHS1Pは天然に産生するリピド様物質であり、他のGPCRの天然リガンドであるように思われる。αサブユニットδ 6qi4mgr（＝i49i4）は様々なGPCRに関して広い特異性を有する。
【００６９】
GPR45様／GPR63受容体による細胞生育の誘導
CHO細胞は８×104の量の細胞を35mmのプレート中に接種した。32時間後、１μgのDNA構築体でトランスフェクトした。13時間後に、細胞をPBSで１回洗浄し、10％の透析ウシ胎児血清を含むIscoveメジウム中でさらに48時間、１μMのS1Pの存在下または不存在下にインキュベートした。S1Pを含む試験混合物は、互いに独立に実施した２回の試験の平均で約20％を越える細胞を含有することを示すことができた。
【配列表】
2005528920000001.app
【国際調査報告】
2005528920.tif 000002
2005528920.tif 000003
2005528920.tif 000004
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