(57)【要約】Ｖｐｒ／ＡＩＦの相互作用及び移動阻害剤を同定するためのアッセイが開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
工程：
ｉ）ａ）ＨＩＶのＶｐｒ又はＡＩＦと相互作用することが知られているＶｐｒの断片と、ｂ）ＡＩＦ又はＶｐｒの相互作用することが知られているＡＩＦの断片を、ｃ）試験化合物の存在下で接触させ、
ｉｉ）ＡＩＦに結合するＨＩＶのＶｐｒのレベルを、上記試験化合物の不在下でのＡＩＦに結合するＨＩＶのＶｐｒのレベルと比較すること
を含む試験アッセイを含む、ＡＩＦに結合するＨＩＶのＶｐｒを阻害する化合物を同定する方法。
【請求項２】
ａ）ＨＩＶのＶｐｒと、ｂ）ＡＩＦ又はＶｐｒに結合することが知られているＡＩＦの断片を、ｃ）試験化合物の存在下で接触させる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ａ）ＨＩＶのＶｐｒ又はＡＩＦと相互作用することが知られているＶｐｒの断片と、ｂ）ＡＩＦを、ｃ）試験化合物の存在下で接触させる、請求項１記載の方法。
【請求項４】
ａ）ＨＩＶのＶｐｒと、ｂ）ＡＩＦを、ｃ）試験化合物の存在下で接触させる、請求項１記載の方法。
【請求項５】
工程：
ｉ）ａ）ＨＩＶのＶｐｒ又はＡＩＦと相互作用することが知られているＶｐｒの断片と、ｂ）ＡＩＦ又はＶｐｒの相互作用することが知られているＡＩＦの断片を、ｃ）ＡＩＦに関してＶｐｒに競合して結合する抗−Ｖｐｒ抗体及び／又はＶｐｒに関してＡＩＦに競合して結合する抗−ＡＩＦ抗体の存在下で接触させること
をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
試験化合物の濃度が１μＭから５００μＭの間である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
試験化合物の濃度が１０μＭから１００μＭの間である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
試験化合物の連続希釈を用いて一連の試験アッセイを実施する、請求項１記載の方法。
【請求項９】
ａ）ＨＩＶのＶｐｒ又はＡＩＦと相互作用することが知られているＶｐｒの断片を含む第１コンテナー；及び
ｂ）ｃ）ＡＩＦ又は試験化合物の存在下でＶｐｒと相互作用するＡＩＦの断片を含む第２コンテナー；及び任意に
ｃ）試験アッセイを実施するための指示書
を含む、請求項１記載の方法を実施するためのキット。
【請求項１０】
ＡＩＦに関してＶｐｒに競合して結合する抗Ｖｐｒ抗体及び／又はＶｐｒに関してＡＩＦに競合して結合する抗ＡＩＦ抗体のような陽性対照を含む第４のコンテナーをさらに含む、請求項９記載のキット。
【請求項１１】
工程：
ｉ）試験化合物の存在下で、ＨＩＶのＶｐｒ又はＡＩＦと相互作用することが知られているＶｐｒの断片及びＡＩＦ又はＶｐｒと相互作用することが知られているＡＩＦの断片をＡＩＦの存在下で接触させ；そして
ｉｉ）核内のＶｐｒ／ＡＩＦレベルを試験化合物不在下の郭内のＶｐｒ／ＡＩＦのレベルと比較するか、及び／又は、細胞質内のＶｐｒ／ＡＩＦのレベルを、試験化合物不在下のＶｐｒ／ＡＩＦのレベルと比較すること
を含む試験アッセイを含む、ＨＩＶのＶｐｒ／ＡＩＦの核移動を阻害する化合物を同定する方法。
【請求項１２】
細胞が、ａ）ＨＩＶのＶｐｒ及びｂ）ＡＩＦ又はＶｐｒと相互作用するＡＩＦの断片を含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
細胞が、ａ）ＨＩＶのＶｐｒ又はＡＩＦと相互作用することが知られているＶｐｒの断片及びｂ）ＡＩＦを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
細胞が、ａ）ＨＩＶのＶｐｒ及びｂ）ＡＩＦを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
試験化合物の濃度が１μＭから５００μＭの間である、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
試験化合物の濃度が１０μＭから１００μＭの間である、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
試験化合物の連続希釈を用いて一連の試験アッセイを実施する、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
発明の分野
発明は、ミトコンドリアからのＡＩＦに結合するＨＩＶのＶｐｒの発見及び相互作用の変調剤を同定するアッセイに関する。
発明の背景
ＨＩＶのアクセサリー蛋白質であるＶｐｒは、細胞サイクルの停止及びアポトーシスの誘導が可能なものとして同定された。この観察は、引用により本明細書に編入されるＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／１００２８に記載される。
【０００２】
ＨＩＶのＶｐｒとヒト細胞蛋白質ｈＶＩＰとの相互作用は、引用により本明細書に編入されるＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／２１４３２に開示された。
ミトコンドリアアポトーシス誘導因子は同定されている。
【０００３】
アポトーシスを妨害又は誘導するための薬剤発見スクリーニング及び新規薬剤及び炎症性疾患及び癌の治療に有用なそれらに関する要求が存在する。
発明の概要
本発明は、ＡＩＦに結合するＶｐｒを阻害する化合物を同定する方法に関する。
【０００４】
本発明は、ＡＩＦの存在下でＶｐｒの核移動を阻害する化合物を同定する方法に関する。
好ましい態様の詳細な説明
ＶｐｒがＡＩＦに結合することは、発見されていた。ミトコンドリアに内で通常は見いだされる、ＡＩＦに結合したＶｐｒにより形成された複合体は細胞の核に移動することは、発見されていた。
【０００５】
ＡＩＦは非カスパーゼ９経路によりアポトーシスを誘導することが知られている。Ｖｐｒはカスパーゼ９経路によりアポトーシスを誘導する。
ＶｐｒがＡＩＦに結合するという発見は、特異的阻害剤をデザイン及び発見する手段を提供する。本発明によれば、ＶｐｒとＡＩＦは特異的阻害剤に関して化合物をスクリーニングするために使用される。阻害剤は、抗ＨＩＶ剤並びに炎症性疾患及び癌を治療するための剤として有用である。生成されたＶｐｒ及びＡＩＦは、複合体を解離して複合体の形成を阻害する化合物を同定するための薬剤スクリーニングにおいて使用してよい。上記複合体が核から移動することを阻害する化合物を同定するために化合物をスクリーニングしてもよい。
【０００６】
当業者は、標準の技術及び容易に入手可能な出発物資を用いて、Ｖｐｒ及びＡＩＦをコードする核酸分子を単離して、それらを発現ベクターに挿入することができる。コーディング配列は、必要な制御配列に作動可能なように連結される。発現ベクターは、よく知られており、容易に入手可能である。発現ベクターの例は、プラスミド、ファージ、ウイルスベクター及び他の核酸分子又は宿主細胞を形質転換してコーディング配列の発現を促進するために有用な媒体を含む核酸分子を含む。発明の組換え発現ベクターは、蛋白質を発現する宿主を形質転換するのに有用である。
【０００７】
蛋白質の生産のためのよく知られた組換え発現系における使用のための宿主細胞は、よく知られており、容易に入手可能である。宿主細胞の例は、細菌細胞、例えばエシェリヒアコリ、酵母細胞、例えばサッカロミセスセレビシエ、昆虫細胞、例えば、ヨトウガ（Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ），非ヒト哺乳類組織培養細胞チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞及びヒト組織培養細胞、例えばヒーラ細胞を含む。
【０００８】
幾つかの態様において、例えば、当業者は、よく知られた技術を用いて、ＤＮＡ分子をよく知られた発現系において使用される市販の発現ベクター中に挿入することができる。例えば、市販のプラスミドｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）は、エシェリヒアコリにおけるＰＡＰＡ１の生産のために使用してよい。市販のプラスミドｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）は、例えば、酵母のサッカロミセスセレビシエ株における生産のために使用してよい。市販のプラスミドＭＡＸＢＡＣTMは完全バキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を、例えば、昆虫細胞における生産のために使用してよい。市販のプラスミドｐｃＤＮＡ  Ｉ又はｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を、例えば、哺乳類細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞における生産のために使用してよい。当業者は、市販の発現ベクター及び系又はその他を用いることにより、日常的な技術及び容易に入手可能な出発物質によりＷＩＰ−１を生産することができる。（例えば、引用により本明細書に編入される、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照。）即ち、所望の蛋白質を原核系及び真核系の両方において製造することができ、当該蛋白質の加工された形態のスペクトルをもたらす。
【０００９】
当業者は、他の市販の発現ベクター及び系を使用するか又はよく知られた方法及び市販の出発物質を用いてベクターを製造することができる。必要な制御配列、例えばプロモーター及びポリアデニル化シグナル及び好ましくはエンハンサーを含む発現系は、容易に入手可能であって、様々な宿主に関して当業界において知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照。
【００１０】
Ｖｐｒ又はＡＩＦの何れかをコードするＤＮＡを含む発現ベクターを用いて、適合可能な宿主細胞を形質転換して、次に、外来ＤＮＡの発現が起こる条件下で培養されて保持される。そうして生産される本発明の蛋白質は、細胞を溶解することによるか又は培養培地からの何れかにより、当業界において適切且つ公知のとおりに、培養物から回収される。当業者は、よく知られた技術を用いて、そのような発現単離物を用いて生産されるＶｐｒ又はＡＩＦを単離することができる。上記の蛋白質に特異的に結合する抗体を用いて天然源から蛋白質を精製する方法は、組換えＤＮＡ方法論により生産される蛋白質を精製するのに等しく適用してよい。
【００１１】
組換え技術により蛋白質を製造することに加えて、自動化ペプチド合成機を用いてＶｐｒ及び／又はＡＩＦを製造してもよい。そのような技術は、当業者には知られており、ＤＮＡによりコードされる蛋白質の生成のために提供されない置換体を有する誘導体の場合は有用である。
【００１２】
ＡＩＦ又はＶｐｒに結合する抗体を生産するハイブリドーマ、及び抗体それら自身は、ＡＩＦ又はＶｐｒ、及びＡＩＦ及びＶｐｒを含む複合体の単離及び精製に有用である。さらに、抗体は、ＡＩＦ又はＶｐｒの特異的阻害剤である。上記各の蛋白質に特異的に結合する抗体は、よく知られた技術及び容易に入手可能な出発物質を用いて、天然源から蛋白質を精製するのに使用してよい。そのような抗体は、組換えＤＮＡ方法論により蛋白質を生産する場合に、存在する物質から蛋白質を精製するのにも使用してよい。
【００１３】
本明細書にて使用される、用語「抗体」は、完全な（complete）、手を付けていない（intact）抗体、及びそのＦａｂ断片及びＦ（ａｂ）2断片を指すことを意味する。完全な、手を付けていない抗体は、モノクローナル抗体、例えば、マウスモノクローナル抗体、キメラ抗体及びヒト化抗体を含む。幾つかの態様において、抗体は、ＡＩＦ又はＶｐｒのエピトープに特異的に結合する。エピトープに結合する抗体は、よく知られた技術、例えば親和性クロマトグラフィーを用いて天然源又は組換え発現系からその蛋白質を単離及び精製するのに使用される。そのような抗体は、細胞が蛋白質を発現しているなら、サンプル中でそのような蛋白質を検出するのに有用である。
【００１４】
抗体の生産及び完全な、手を付けていない抗体、及びそのＦａｂ断片及びＦ（ａｂ）2断片の蛋白質の構造及びそのような分子をコードする遺伝子配列の構成は、よく知られており、そして例えば、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ  Ｄ．Ｌａｎｅ（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに記載されており、引用により本明細書に編入される。簡単に言えば、例えば、ＡＩＦ又はＶｐｒ又はその免役原性断片をマウスに注射する。マウスの脾臓を取り出して、脾臓細胞を単離して、不死のマウス細胞と融合させる。ハイブリッド細胞、又はハイブリドーマを培養し、そして抗体を分泌する細胞を選択する。抗体を分析し、そして上記蛋白質に特異的に結合することがわかったら、それらを生産するハイブリドーマを培養することにより、抗体の連続した供給を生じさせる。
【００１５】
本発明は、抗−ＨＩＶ化合物及び癌及び自己免役疾患を治療するのに有用な化合物を同定する方法に関する。この側面によれば、Ｖｐｒ又はＡＩＦに相互作用することが知られているＶｐｒの断片を、試験化合物の存在下で、ＡＩＦ又はＶｐｒに相互作用することが知られているＡＩＦの断片に接触させる。Ｖｐｒ又はその断片のＡＩＦ又はその断片に対する親和性を測定し、そして試験化合物不在下でのＶｐｒ又はその断片のＡＩＦ又はその断片に対する親和性と比較する。ＡＩＦのＶｐｒに対する結合を破壊する化合物は、抗ＨＩＶ化合物又は癌及び自己免役疾患を治療する化合物として有用であるかもしれない。この薬剤スクリーニングアッセイにおける陽性対照の例は、ＡＩＦに関してＶｐｒと競合して結合する抗−Ｖｐｒ抗体のはずである。この薬剤スクリーニングアッセイにおける陽性対照の別の例は、Ｖｐｒに関してＡＩＦと競合して結合する抗ＡＩＦ抗体のはずである。そのような抗体は、Ｖｐｒ／ＡＩＦ相互作用を破壊する公知の化合物として有用である。公知の量のＶｐｒ及びＡＩＦを、結合に関して適した条件下で化合してよい。発明の幾つかの態様において、試験化合物の好ましい濃度は、１μＭから５００μＭの間である。好ましい濃度は１０μＭと１００μＭの間である。幾つかの好ましい態様においては、試験化合物の連続希釈を使用することが望まれる。幾つかの態様において、この方法を実施するためのキットが提供される。当該キットは、ＨＩＶのＶｐｒ又はＡＩＦと相互作用することが知られているＶｐｒの断片を含む第１のコンテナー；及びＡＩＦ又はＶｐｒに相互作用することが知られているＡＩＦの断片を含む第２のコンテナーを含む。任意に、上記キットは、さらに、試験アッセイを実施するための指示書及びＡＩＦに関してＶｐｒに競合して結合する抗Ｖｐｒ抗体及び／又はＶｐｒに関してＡＩＦに競合して結合する抗ＡＩＦ抗体のような陽性対照を含む第４のコンテナーを含んでよい。
【００１６】
本発明の別の側面は、Ｖｐｒ／ＡＩＦ複合体の細胞の核への移動を阻害する化合物を同定する方法に関する。Ｖｐｒを生産することが知られているか又はＶｐｒに暴露された細胞を試験化合物に接触させる。核の中のＶｐｒ及び／又はＡＩＦのレベルを及び／又は細胞質中のＶｐｒ及び／又はＡＩＦのレベルを測定し、そして試験化合物に接触させなかった細胞からの対応するレベルと比較する。発明の幾つかの態様において、試験化合物の好ましい濃度は、１μＭから５００μＭの間である。好ましい濃度は１０μＭと１００μＭの間である。幾つかの好ましい態様においては、試験化合物の連続希釈を使用することが望まれる。
実施例
受け入れ番号及び参考文献から同定される以下の配列を、引用により本明細書に引用する。
ＶＰＲ    ＡＪ４０４３２５  vp，．gag，pol，vif，vpu，env，及びnef
ＶＰＲ    ＡＦ３１６８６２  vif，vpr（カメルーン単離物）
ＶＰＲ    ＡＦ３２５７６３  vif，vpr（南アフリカ単離物）
ＡＩＦ    ＸＭ０１０２４６  「プログラムされた細胞死８」又は「ＰＤＣＤＳ」とも呼ばれる。
ＡＩＦ  ＮＭ  ００４２０８
【国際公開パンフレット】
2005508506.tif 000002
2005508506.tif 000003
2005508506.tif 000004
2005508506.tif 000005
2005508506.tif 000006
2005508506.tif 000007
2005508506.tif 000008
2005508506.tif 000009
2005508506.tif 000010
2005508506.tif 000011
【国際調査報告】
2005508506.tif 000012