(57)【要約】本発明は、予防、診断、及び／又は治療に有用である、モラクセラ（ブランハメラ）カタラーリスのポリペプチドに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号２又は４に示す配列か、又はそれらの断片か若しくは類似体から選択された配列からなる２次(secondary)ポリペプチドと、少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号２又は４に示す配列か、又はそれらの断片か若しくは類似体から選択された配列からなる２次ポリペプチドと、少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号２又は４に示す配列か、又はそれらの断片か若しくは類似体から選択された配列からなる２次ポリペプチドと、少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号２又は４に示す配列か、又はそれらの断片か若しくは類似体から選択された配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号２又は４に示す配列か、又はそれらの断片か若しくは類似体から選択された配列からなるポリペプチドに対して、結合特異性を有する抗体を生成することが可能なポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号２又は４に示す配列か、又はそれらの断片か若しくは類似体から選択された配列からなるポリペプチドの一部を有するエピトープをコードするポリヌクレオチド、
（ｇ）配列番号１又は３に示す配列か、又はそれらの断片か若しくは類似体から選択された配列からなるポリヌクレオチド、及び
（ｈ）上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド；
から選択されたポリヌクレオチドからなる、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
下記のポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号２又は４から選択された配列からなる２次ポリペプチドと、少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号２又は４から選択された配列からなる２次ポリペプチドと、少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号２又は４から選択された配列からなる２次ポリペプチドと、少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号２又は４から選択された配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号２又は４から選択された配列からなるポリペプチドに対して、結合特異性を有する抗体を生成することが可能なポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号２又は４から選択された配列からなるポリペプチドの一部を有するエピトープをコードするポリヌクレオチド、
（ｇ）配列番号１又は３から選択された配列からなるポリヌクレオチド、及び
（ｈ）上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド；
から選択されたポリヌクレオチドからなる、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
厳しい条件下において、
（ａ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、又は
（ｂ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の相補鎖
（ここで、前記ポリペプチドは、配列番号第２又は４に示す配列か、又はそれらの断片か若しくは類似体から選択された配列からなる）；
のいずれかにハイブリダイズする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８】
厳しい条件下において、
（ａ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、又は
（ｂ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の相補鎖
（ここで、前記ポリペプチドは、配列番号第２又は４に示す配列か、又はそれらの断片か若しくは類似体から選択された配列からなる）；
のいずれかにハイブリダイズする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
厳しい条件下において、
（ａ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、又は
（ｂ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の相補鎖
（ここで、前記ポリペプチドは、配列番号２又は４から選択された配列からなる）；
のいずれかにハイブリダイズする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
厳しい条件下において、
（ａ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、又は
（ｂ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の相補鎖
（ここで、前記ポリペプチドは、配列番号２又は４に示す配列か、又はそれらの断片か若しくは類似体から選択された配列からなるポリペプチドに由来する、少なくとも１０の連続するアミノ酸残基からなる）；
のいずれかにハイブリダイズする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
厳しい条件下において、
（ａ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、又は
（ｂ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の相補鎖
（ここで、前記ポリペプチドは、配列番号２又は４から選択された配列からなるポリペプチドに由来する、少なくとも１０の連続するアミノ酸残基からなる）；
のいずれかにハイブリダイズする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記ＤＮＡは発現制御部位と機能が発現するように連結されている、請求項１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１３】
前記ＤＮＡは発現制御部位と機能が発現するように連結されている、請求項２に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１４】
請求項１２に記載のベクターによりトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１３に記載のベクターによりトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項１６】
前記ポリペプチドの発現に適した条件下で、請求項１４に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、ポリペプチドの生成方法。
【請求項１７】
前記ポリペプチドの発現に適した条件下で、請求項１５に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、ポリペプチドの生成方法。
【請求項１８】
下記のポリペプチド：
（ａ）配列番号２、４に示す配列か、又はそれらの断片か若しくは類似体から選択された配列からなる２次ポリペプチドと、少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチド
（ｂ）配列番号２、４に示す配列か、又はそれらの断片か若しくは類似体から選択された配列からなる２次ポリペプチドと、少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号２、４に示す配列か、又はそれらの断片か若しくは類似体から選択された配列からなる２次ポリペプチドと、少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド、
（ｄ）配列番号２、４に示す配列か、又はそれらの断片か若しくは類似体から選択された配列からなるポリペプチド、
（ｅ）配列番号２、４に示す配列か、又はそれらの断片か若しくは類似体から選択された配列からなるポリペプチドに対して、結合特異性を有する抗原を生成することが可能なポリペプチド、
（ｆ）配列番号２、４に示す配列か、又はそれらの断片か若しくは類似体から選択された配列からなるポリペプチドの一部を有するエピトープ、
（ｇ）Ｎ末端のメチオニン残基が欠失した上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）に記載のポリペプチド、及び
（ｈ）分泌アミノ酸配列が欠失した上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）に記載のポリペプチド；
から選択されたポリペプチドからなる、単離されたポリペプチド。
【請求項１９】
下記のポリペプチド：
（ａ）配列番号２又は４から選択された配列からなる２次ポリペプチドと、少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号２又は４から選択された配列からなる２次ポリペプチドと、少なくとも8０％の同一性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号２又は４から選択された配列からなる２次ポリペプチドと、少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド、
（ｄ）配列番号２又は４から選択された配列からなるポリペプチド、
（ｅ）配列番号２又は４から選択された配列からなるポリペプチドに対して、結合特異性を有する抗原を生成することが可能なポリペプチド、
（ｆ）配列番号２又は４から選択された配列からなるポリペプチドの一部を有するエピトープ、
（ｇ）Ｎ末端のメチオニン残基が欠失した上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）に記載のポリペプチド、及び
（ｈ）分泌アミノ酸配列が欠失した上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）に記載のポリペプチド；
から選択されたポリペプチドからなる、単離されたポリペプチド。
【請求項２０】
配列番号２、４に示す配列、又はそれらの断片か若しくは類似体から選択された配列を有するポリペプチドを２又はそれ以上含み、キメラポリペプチドを形成するように該ポリペプチドを連結して提供された、キメラポリペプチド。
【請求項２１】
配列番号２又は４に示す配列から選択された配列を有するポリペプチドを２又はそれ以上含み、キメラポリペプチドを形成するように該ポリペプチドを連結して提供された、キメラポリペプチド。
【請求項２２】
請求項１８から２１のいずれか１つの請求項に記載のポリペプチドと、薬学的に受容可能な担体、希釈液、又はアジュバントを含む薬剤組成物。
【請求項２３】
モラクセラ（Moraxella）感染を受けやすい宿主に、請求項２２に記載の組成物を予防又は治療に必要な量を投与する工程を含む、モラクセラ感染の予防又は治療方法。
【請求項２４】
前記宿主が新生児、幼児、又は子供である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記宿主が免疫不全宿主である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記宿主が成人である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記宿主に請求項２２に記載の組成物を予防又は治療に必要な量を投与する工程を含む、中耳炎、副鼻腔炎、慢性咳、急性喉頭炎、化膿性角膜炎、新生児（neonatorum）の結膜炎、侵入性疾病の予防又は治療方法。
【請求項２８】
下記の工程；
（ａ）宿主から生体サンプルを得る工程、
（ｂ）請求項１８から２１のいずれか１つの請求項に記載のポリペプチドに反応性を示す抗体又はその断片を、生体サンプルと共にインキュベートして、混合物を生成する工程、及び
（ｃ）モラクセラの存在を示す混合物中で、特異的に結合した抗体又は結合した断片を検出する工程；
からなる、モラクセラ感染を受けやすい宿主における、モラクセラ感染の診断方法。
【請求項２９】
下記の工程；
（ａ）宿主から生体サンプルを得る工程、
（ｂ）請求項１８から２１のいずれか１つの請求項に記載のポリペプチド又はその断片を一つ又はそれ以上、生体サンプルと共にインキュベートして、混合物を生成する工程、及び
（ｃ）モラクセラに特異的な抗体の存在を示す混合物中で、特異的に結合した抗原又は結合した断片を検出する工程；
からなる、前記抗体を含むか又は含むと思われる生体サンプルにおける、モラクセラ抗原に特異的な抗体の検出方法。
【請求項３０】
モラクセラ感染の予防又は治療処理用の薬剤を製造において、請求項２２に記載の薬剤組成物を使用する方法。
【請求項３１】
請求項１８から２１のいずれか１つの請求項に記載のポリペプチドを含む、モラクセラ感染の検出又は診断用のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はポリペプチドに、より特異的には、モラクセラ（ブランハメラ）カタラーリス感染の予防、診断及び/又は治療に使用可能なモラクセラ（ブランハメラ）カタラハリス（Moraxella (Branhamella) catarrhalis）のSMC-1及びSMC-2ポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
モラクセラ（ブランハメラ）カタラーリスはヒトにおいて気道感染を引き起こすグラム陰性双球菌である。M. カタラーリスは、肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）及びインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）に次ぐ、現在幼児や子供において中耳炎を引き起こす第３の最も代表的な起炎菌であるとして受け入れられている。M. カタラーリスはまた、副鼻腔炎、しつこい咳、急性喉頭炎、化膿性角膜炎および新生児（neonatorum）結膜炎を含む、他の何種類かの感染症にも関連している。
【０００３】
モラクセラ・カタラハリス株のおよそ90％は抗生物質（βラクタマーゼ陽性）に耐性を有し、再発性中耳炎は高死亡率に結びついているから、宿主をM. カタラーリス感染から防御することができるワクチンの開発の必要性がある。M. カタラーリスによる感染は細菌細胞の表面において見出される抗原に対して免疫反応を引き起こす。しかし、これらの表面蛋白質の多くはいまだ特性解析されておらず、他の株による感染から防御する結果となる免疫反応もまた判っていない。
【０００４】
M. カタラーリスの宿主への感染を予防するワクチンの開発するために、主に、偏在性表面タンパク質Ａ（ＵｓｐＡ）という名の高分子・質量タンパクのような外膜タンパク質に主として努力がなされてきた。このタンパク質は、マウスの肺-クリアランスモデルにおいて、モノクローナル抗体とポリクローナル抗体の両方が殺菌及び防御作用を示したため、ワクチンとして有望視された。しかしながら、このタンパク質は、他のM. カタラーリスの株との間での変動性が非常に高かった。このタンパク質の他にも、別のM. カタラーリスタンパク質もワクチンの候補として関心を集めており、保存エピトープを有するトランスフェリン結合タンパクは、細菌表面に晒されているものであった。しかしながら、ある株から他の株への、同タンパク質による抗体交叉反応の程度には開きがあった。他の研究者もまた、45KDaのタンパク質CD（OMP CD）に焦点を当てていた。このタンパク質は、M. カタラーリスの株の中での保存性が非常に高いが、慢性閉塞性肺疾患の成人においては、このOMP CDに対する免疫反応には変動性が見られる。
【０００５】
それ故に、モラクセラ（ブランハメラ）カタラーリス感染の予防、診断及び／又は治療に使用可能なM. カタラーリスポリペプチドの解明が、依然必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
一つの観点において、本発明は、配列番号２、４からなる配列か、又はそれらの断片か若しくは類似体から選択された配列からなる２次（second）ポリペプチドに対して、少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０００７】
一つの観点において、本発明は、配列番号２、４なる配列か、又はそれらの断片か若しくは類似体から選択された配列からなるポリペプチドに関する。
【０００８】
他の観点においては、本発明のポリヌクレオチドにコードされたポリペプチド、薬剤組成物、発現制御部位を機能が発現するように連結した本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、及び前記ベクターを用いてトランスフェクトされた宿主細胞が提供され、また、前記宿主細胞を発現に適した条件下において培養する工程を含むポリペプチドの作成方法を提供する。
【０００９】
本発明は、モラクセラ感染の予防、診断及び／又は治療に利用可能な、モラクセラのポリペプチドをコードする、精製および単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１０】
一観点において、本発明は、配列番号２、４に示す配列か、又はそれらの断片か若しくは類似体から選択された配列からなる２次（second）ポリペプチドと、少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１１】
一観点において、本発明は、配列番号２、４に示す配列か、又はそれらの断片か若しくは類似体から選択された配列からなる２次ポリペプチドと、少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１２】
一観点において、本発明は、配列番号２、４に示す配列か、又はそれらの断片か若しくは類似体からなる２次ポリペプチドと、少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１３】
一観点において、本発明は、配列番号２、４に示す配列か、又はそれらの断片か若しくは類似体からなる２次ポリペプチドと、少なくとも９８％の同一性を有するポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１４】
一観点において、本発明は、配列番号２又は４からなる２次ポリペプチドと、少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１５】
一観点において、本発明は、配列番号２又は４からなる２次ポリペプチドに対して、少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１６】
一観点において、本発明は、配列番号２又は４からなる２次ポリペプチドに対して、少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１７】
一観点において、本発明は、配列番号２又は４からなる２次ポリペプチドに対して、少なくとも９８％の同一性を有するポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１８】
一観点において、本発明は、配列番号２、４に示す配列か、又はそれらの断片か若しくは類似体から選択されたアミノ酸配列からなるポリペプチドに関する。
【００１９】
一観点において、本発明は、配列番号２又は４から選択されたアミノ酸配列からなるポリペプチドに関する。
【００２０】
一観点において、本発明は、配列番号２、４に示す配列か、又はそれらの断片か若しくは類似体からなるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
【００２１】
一観点において、本発明は、配列番号２又は４からなるアミノ酸配列により特徴づけられるポリペプチドに関する。
【００２２】
一観点において、本発明は、配列番号２、４に示す配列か、又はそれらの断片か若しくは類似体から選択された配列からなるポリペプチドの一部を有するエピトープをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００２３】
一観点において、本発明は、配列番号２又は４から選択された配列からなるポリペプチドの一部を有するエピトープをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００２４】
一観点において、本発明は、配列番号２、４に示す配列か、又はそれらの断片か若しくは類似体から選択された配列からなるポリペプチドの一部を有するエピトープに関する。
【００２５】
一観点において、本発明は、配列番号２又は４から選択された配列からなるポリペプチドの一部を有するエピトープに関する。
【００２６】
一態様において、本発明は、下記のポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号２、４に示す配列か、又はそれらの断片か若しくは類似体から選択された配列からなる２次ポリペプチドと、少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号２、４に示す配列か、又はそれらの断片か若しくは類似体から選択された配列からなる２次ポリペプチドと、少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号２、４に示す配列か、又はそれらの断片か若しくは類似体から選択された配列からなる２次ポリペプチドと、少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号２、４に示す配列か、又はそれらの断片か若しくは類似体から選択された配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号２、４に示す配列か、又はそれらの断片か若しくは類似体から選択された配列からなるポリペプチドに対して、結合特異性を有する抗体を生成することが可能なポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号２、４に示す配列か、又はそれらの断片か若しくは類似体から選択された配列からなるポリペプチドの一部を有するエピトープをコードするポリヌクレオチド、
（ｇ）配列番号１、３に示す配列か、又はそれらの断片か若しくは類似体から選択された配列からなるポリヌクレオチド、及び
（ｈ）上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、
から選択されたポリヌクレオチドからなる、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００２７】
一態様において、本発明は、下記のポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号２又は４から選択された配列からなる２次ポリペプチドと、少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号２又は４から選択された配列からなる２次ポリペプチドと、少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号２又は４から選択された配列からなる２次ポリペプチドと、少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号２又は４から選択された配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号２又は４から選択された配列からなるポリペプチドに対して、結合特異性を有する抗体を生成することが可能なポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号２又は４から選択された配列からなるポリペプチドの一部を有するエピトープをコードするポリヌクレオチド、
（ｇ）配列番号１又は３から選択された配列からなるポリヌクレオチド、
（ｈ）上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、
から選択されたポリヌクレオチドからなる、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００２８】
一態様において、本発明は、下記のポリポリペプチド：
（ａ）配列番号２、４に示す配列か、又はそれらの断片か若しくは類似体から選択された配列からなる２次ポリペプチドと、少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号２、４に示す配列か、又はそれらの断片か若しくは類似体から選択された配列からなる２次ポリペプチドと、少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号２、４に示す配列か、又はそれらの断片か若しくは類似体から選択された配列からなる２次ポリペプチドと、少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド、
（ｄ）配列番号２、４に示す配列か、又はそれらの断片か若しくは類似体から選択された配列からなるポリペプチド、
（ｅ）配列番号２、４に示す配列か、又はそれらの断片か若しくは類似体から選択された配列からなるポリペプチドに対して、結合特異性を有する抗体を生成することが可能なポリペプチド、
（ｆ）配列番号２、４に示す配列か、又はそれらの断片か若しくは類似体から選択された配列からなるポリペプチドの一部を有するエピトープ、
（ｇ）Ｎ末端のメチオニン残基が欠失した、上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のポリペプチド、
（ｈ）分泌アミノ酸配列が欠失した、上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）に記載のポリペプチド、
から選択されたポリペプチドからなる、単離されたポリペプチドを提供する。
【００２９】
一態様において、本発明は、下記のポリポリペプチド：
（ａ）配列番号２又は４から選択された配列からなる２次ポリペプチドと、少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号２は４から選択された配列からなる２次ポリペプチドと、少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号２又は４から選択された配列からなる２次ポリペプチドと、少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド、
（ｄ）配列番号２又は４から選択された配列からなるポリペプチド、
（ｅ）配列番号２又は４から選択された配列からなるポリペプチドに対して、結合特異性を有する抗体を生成することが可能なポリペプチド、
（ｆ）配列番号２又は４から選択された配列からなるポリペプチドの一部を有するエピトープ、
（ｇ）Ｎ末端のメチオニン残基が欠失した、上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）に記載のポリペプチド、
（ｈ）分泌アミノ酸配列が欠失した、上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）に記載のポリペプチド、
から選択されたポリペプチドからなる、単離されたポリペプチドを提供する。
【００３０】
当業者であれば、本発明には、本特許出願において述べられたＤＮＡ分子、すなわちポリヌクレオチド及びそれらの相補的な配列であって、突然変異体（mutant）や、変異体（variant）や、相同物や、それらポリペプチドの誘導体のような類似体をコードするものが含まれることが理解できよう。また、本発明には、本発明のＤＮＡ分子に対応するＲＮＡ分子も含まれる。ＤＮＡやＲＮＡ分子以外にも、本発明には、対応するポリペプチドや、かかるポリペプチドに特異的に結合する単一特異性を有する抗体が含まれる。
【００３１】
さらなる一態様において、本発明のポリペプチドは抗原性を示す。
【００３２】
さらなる一態様において、本発明のポリペプチドは免疫原性を示す。
【００３３】
さらなる一態様において、本発明のポリペプチドは、宿主内で免疫反応を引き起こすことができる。
【００３４】
さらなる一態様において、本発明は、上記の本発明のポリペプチドに対して結合特異性を有する抗体を生成することが可能なポリペプチドにも関連する。
【００３５】
“結合特異性を有する”抗体は、選択されたポリペプチドを認識して結合するけれども、サンプル、例えば生体サンプル内の他の分子を実質的に認識せず結合もしない抗体である。結合特異性は、固相酵素免疫検定法を用いて測定することができるが、それにおいては、選択されたポリペプチドを抗原として使用する。
【００３６】
本発明において、生物学の研究上の“予防”とは、生存曲線や、生存率や、生存期間の顕著な増加によって規定されるものである。生存曲線を比較するためのログランクテスト（log rank test）や、生存率及び死亡までの日数を比較するためのフィッシャーの正確確率テスト（Fisher exact test）を用いた統計分析は、それぞれ、Ｐ値を算出して２グループ間に統計上の有意な相違があるかを判断するのに有用であろう。Ｐ値の０．０５は、有意ではないとみなされる。
【００３７】
本発明の他の観点においては、本発明のポリペプチドの抗原性／免疫原性を有する断片や、それらの類似体が提供される。
【００３８】
本発明の断片は、かかる抗原決定部位（epitopic region）を１又はそれ以上含むか、あるいはそれらの抗原性／免疫原性特性を維持するのに十分な程、かかる部位に類似したものでなければならない。従って、本発明の断片は、本明細書に記載のポリペプチドや類似体の特定部位と１００％の同一性を有するかもしれないので、本発明の断片に関しては、同一性の程度はおそらく無関係なものであろう。本発明はさらに、本発明のポリペプチド配列に由来する、少なくとも１０の連続するアミノ酸残基を有する断片を提供する。一態様においては、少なくとも１５の連続するアミノ酸残基である。一態様においては、少なくとも２０の連続するアミノ酸残基である。
【００３９】
当業者であれば、本発明において、本発明のポリペプチドの類似体が利用可能であること、すなわち抗原性／免疫原性を有する材料として利用可能であることが理解できよう。従って、本発明には、例えば付加、欠失、又は置換等を１又はそれ以上含むタンパク質やポリペプチドが含まれる。
【００４０】
本明細書で用いる、本発明のポリペプチドの“断片”、“類似体”、又は“誘導体”には、アミノ酸残基の１又はそれ以上が、保存されるか又は保存されていないアミノ酸残基（好ましくは保存されたもの）で置換されたポリペプチドが含まれ、それらは天然のものかもしでないし又はそうでないかもしれない。一態様においては、本発明のポリペプチドの誘導体や類似体は、図面に表示の配列か又はそれらの断片と、約７０％の同一性を有する。すなわち、残基の７０％が同一である。他のさらなる態様では、ポリペプチドは８０％以上の同一性を有するであろう。他のさらなる態様では、ポリペプチドは８５％以上の同一性を有するであろう。他のさらなる態様では、ポリペプチドは９０％以上の同一性を有するであろう。他のさらなる態様では、ポリペプチドは９５％以上の同一性を有するであろう。他のさらなる態様では、ポリペプチドは９９％以上の同一性を有するであろう。他のさらなる態様においては、本発明のペプチド類似体の、約２０個以下、より好ましくは１０以下のアミノ酸残基が置換、修飾又は欠失されている。
【００４１】
これら置換は、ペプチドの二次構造や疎水性度（hydropathic nature）に最小限の影響しか与えないものである。好ましい置換は、保存されているとして従来から知られているもの、すなわち、疎水性、大きさ、電荷、又は官能基などの物理的又は化学的特性を共有する置換残基である。前記置換基には、デイホフ.Ｍが“Atlas of Protein Sequence and Structure 5 （1978年）”中で記載した置換基、又はアルゴス.Ｐが“EMBO Ｊ.8. 第779-785頁、1989年）”中に記載した置換基などが含まれる。例えば、天然のものであろうが又はそうでなかろうが、下記グループ:
ala、pro、gly、gln、asn、ser、thr、val;
cys、ser、tyr、thr;
val、ile、leu、met、ala、phe;
lys、arg、orn、his; 及び、
phe、tyr、trp、his
の１つに属するアミノ酸は、保存的置換を代表するものである。好ましい置換基は、対応するＬ-アミノ酸のＤ-光学異性体の置換基も含む。
【００４２】
異なるアプローチでは、類似体を、例えば効果的なタグを所望のポリペプチドに付けることによって、精製をより簡単にするための部分を組み込んだ融合ポリペプチドとすることができる。“タグ”は、取り除く必要があるかもしれないし、又は融合ポリペプチド自体が使用に十分な抗原性を維持する場合もあるかもしれない。
【００４３】
相同性のパーセンテージは、同一性のパーセンテージと、類似性のパーセンテージ又はアミノ酸タイプの保存性の合計パーセンテージとして定める。
【００４４】
一態様において、本発明のポリペプチドの類似体は、図面に記載の配列又はそれらの断片に対して、約７０％の同一性を有する。さらなる一態様において、ポリペプチドは８０％以上の同一性を有する。さらなる一態様において、ポリペプチドは８５％以上の同一性を有する。さらなる一態様において、ポリペプチドは９０％以上の同一性を有する。さらなる一態様において、ポリペプチドは９５％以上の同一性を有する。さらなる一態様において、ポリペプチドは９９％以上の同一性を有する。さらなる一態様において、本発明のポリペプチドの類似体は、約２０個以下、より好ましくは約１０個以下のアミノ酸残基が置換、修飾又は欠失されている。
【００４５】
アミノ酸配列を比較するためには、CLUTALプログラムのようなプログラムを用いることができる。このプログラムは、アミノ酸配列を比較して、必要に応じてどちらかの配列にスペースを挿入することにより、最適アラインメントを探し出すというものである。最適アラインメントについて、同一性や相同性を求めることもできる。ＢＬＡＳＴｘのようなプログラムは、類似配列を最も長くなるようにアラインし、適合値を定める。従って、それぞれ異なる値を有することが見付かったいくらかの類似する部位を比較することが可能となる。本発明では、両タイプの同一性分析の検討がなされている。
【００４６】
異なるアプローチでは、類似体又は誘導体は、例えば所望のタンパク質又はポリペプチドに効果的にタグを付けることによって、精製をより簡単にするための部分を組み込んだ融合ポリペプチドとすることができる。“タグ”は、取り除く必要があるかもしれないし、又は融合ポリペプチドが使用に十分な抗原性を維持する場合があるかもしれない。
【００４７】
抗原決定部位、すなわちポリペプチドの抗原性又は免疫原性を担う抗原決定部位を特定して抗原性ポリペプチドを選別できることは既知である。かかる選別を行なう方法は、従来から知られている。従って、本発明の断片は、かかる抗原決定部位を１又はそれ以上含むか、又はそれらの抗原性／免疫原性特性を維持できる程十分にかかる部位に類似していなければならない。
【００４８】
更なる本発明の観点において、本発明の蛋白質又はポリペプチドの抗原性／免疫原性断片、又はその類似体若しくは誘導体を提供するものである。
【００４９】
従って、類似体、誘導体、及び断片としては、それらが、少なくともそれらの誘導前のタンパク質又はポリペプチドの抗原性／免疫原性特性をある程度有することが重要である。
【００５０】
また、ポリペプチドの生物学上又は薬学上の特性を変える他の化合物、すなわち半減期を長期化するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、精製を簡略化するリーダー又は分泌アミノ酸配列、プレプロ及びプロ配列、及び（ポリ）サッカリドと融合されたポリペプチドも含まれる。
【００５１】
さらに、アミノ酸部位が多型性であると分かっている場合には、特定のアミノ酸１又はそれ以上を変えて、異なるモラクセラ株の異なるエピトープに、より効果的に似せるようにすることが望ましい。
【００５２】
さらに、本発明のポリペプチドは、末端のＮＨ2基のアシル化により（例えば、アンモニア又はメチルアミンを用いた、アセチル化、又はチオグリコール酸アミド化、末端カルボキシル基のアミド化により）修飾して、安定性を与え、かつ、担体や他の分子への結合又は連結に関する疎水性を高めることができる。
【００５３】
また、ポリペプチドの断片及び類似体の、ヘテロ及びホモポリペプチドマルチマーについても検討する。これらのポリマー型のものには、例えば、アビジン／ビオチン、グルタルアルデヒド、又はジメチルスーパーイミデイトなどの架橋剤によって架橋された、１又はそれ以上のポリペプチドが含まれる。それらポリマー型のものには、組換えＤＮＡ技術によって生み出された、マルチシストロニック（multicistronic）ｍＲＮＡから生成された２つ又はそれ以上の直列（tandem）又は反転した（inverted）隣接配列を含むポリペプチドも含まれる。
【００５４】
さらなる一態様において、本発明は、本願の図面に記載のポリペプチド、又はそれらの断片か若しくは類似体を１又はそれ以上含むキメラポリペプチドにも関連する。
【００５５】
さらなる一態様において、本発明は、配列番号２、４に示す配列、又はそれらの断片か若しくは類似体から選択された配列を有するポリペプチドを２又はそれ以上含み、キメラポリペプチドを形成するように該ポリペプチドを連結して提供された、キメラポリペプチドにも関連する。
【００５６】
さらなる一態様において、本発明は、配列番号２又は４に示す配列から選択された配列からなるポリペプチドを２又はそれ以上含み、キメラポリペプチドを形成するように該ポリペプチドを連結して提供された、キメラポリペプチドにも関連する。
【００５７】
好ましくは、本発明のポリペプチドの断片、類似体、又は誘導体は、抗原部位を少なくとも一つ、すなわち少なくとも１つのエプトープを含むであろう。
【００５８】
抗原性ポリマー（すなわち合成マルチマー）の形成を完成させるために、ポリペプチドには、ビスハロアセチル基を有するものか、又はニトロアリルハロゲン化物等を用いることができるが、ここで試薬は、チオ基に対して特異性を有するものである。従って、異なるポリペプチドの２つのメルカプト基間の連結は１重結合であるかもしれないし、又は炭素数が少なくとも２、典型的には炭素数が少なくとも４、そして炭素数が多くても１６の結合基から成るものであるかもしれないけれども、通常炭素数は１４以下である。
【００５９】
ある特定の態様においては、本発明のポリペプチド断片及び類似体は、メチオニン（Met）やバリン（Val）のような開始残基を含まない。好ましくは、ポリペプチドは、リーダー又は分泌配列（シグナル配列）を組み込まないものであろう。本発明のポリペプチドのシグナル部分は、確立された分子生物学技術に従い、判断することができる。通常は、興味のあるポリペプチドをモラクセラ培養物から単離して、続いて配列決定を行ない、成熟タンパク質の最初の残基を決定し、それによって成熟ポリペプチドの配列を決定する。
【００６０】
ポリペプチドは、組換えポリペプチドの生成や精製を助ける開始コドン（メチオニン又はバリン）を用いずに及び／又はリーダーペプチドを用いずに、生成及び／又は使用できることが分かっている。リーダーペプチドをコードする配列を有さないクローニング遺伝子は、ポリペプチドを大腸菌の細胞質に限定し、その回収を促すことが分かっている（グリック，G.R.及びパスタ−ナック，J.J.の“Manipulation of gene expression in prokaryotes” （1998年）、ワシントンDC、ASMプレスの“Molecular biotechnology：Principles and applications of recombinantDNA”（第2版、第109−143頁））。
【００６１】
本発明の他の観点によれば、（ｉ）本発明のポリペプチドを担体、希釈剤、又はアジュバントと共に含む組成物、（ii）本発明のポリペプチドと、薬学的に受容可能な担体、希釈剤、又はアジュバントを含む薬剤組成物、（iii）本発明のポリペプチドと、薬学的に受容可能な担体、希釈剤、又はアジュバントを含むワクチン、（iv）宿主に本発明のポリペプチドを免疫反応の惹起に有効な量投与することにより、宿主においてモラクセラに対する免疫反応（例えばモラクセラに対する感染防御免疫）を誘発する方法、及び、特には（V）予防又は治療量の本発明のポリペプチドを、必要とする宿主に投与することにより、モラクセラ感染を予防及び／又は治療する方法も提供する。
【００６２】
本発明の他の観点によれば、（ｉ）本発明のポリヌクレオチドを担体、希釈剤、又はアジュバントと共に含む組成物、（ii）本発明のポリヌクレオチドと、薬学的に受容可能な担体、希釈剤、又はアジュバントを含む薬剤組成物、（iii）宿主に本発明のポリヌクレオチドを免疫反応の惹起に有効な量投与することにより、宿主においてモラクセラに対する免疫反応（例えばモラクセラに対する感染防御免疫）を誘発する方法、及び、特には（iv）予防又は治療量の本発明のポリヌクレオチドを、必要とする宿主に投与することにより、モラクセラ感染を予防及び／又は治療する方法も提供する。
【００６３】
本発明のポリペプチドは、免疫化の前に、テタナス毒素、ジフテリア毒素、B型肝炎ウィルス表面抗原、ポリオウィルスVP１抗原や、他のウィルス性か細菌性の毒素、抗原、又は、任意の適当なタンパク質のような運搬体タンパク質に結合又は共役させて、より強い免疫反応を促すこともできる。この結合又は共役は、化学的に又は遺伝子学的に行なうことができる。ペプチド-担体の共役は、ヴァン・レゲンモーテル，Ｍ．Ｈ．Ｖ、ビリアンド Ｊ．Ｐ．、ミューラー Ｓ．、プラウエ Ｓによる生化学及び分子生物学の実験技術の“Synthetic Polypeptides as antigens”第１９巻（1998年、ニューヨーク、エルゼビアのバードウ Ｒ．Ｈ．及びヴァン・ニッペンベルグ Ｐ．Ｈ．出版）でより詳細な説明を得ることができる。
【００６４】
他の観点によれば、薬学的に受容可能なアジュバントの混合物中に、本発明のモラクセラポリペプチドを１又はそれ以上含む薬剤組成物が提供されている。適当なアジュバントは、（１）ＭＦ５９（登録商標）、ＳＡＦ（登録商標）、Ｒｉｂｉ（登録商標）のような水中油エマルジョン形成物、（２）フロインドの完全な又は不完全なアジュバント、（３）AlK(SO4)2、AlNa(SO4)2、AlNH4(SO4)2、Al(OH)3、AlPO4、シリカ、カオリン等の塩、（４）スティミュロン（登録商標）のようなサポニン誘導体、又はそれらから生成されたＩＳＣＯＭｓのような粒子（免疫刺激性複合体）、（５）インターロイキン、インターフェロン、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のようなサイトカイン、（６）カーボンポリヌクレオチドのような他の物質、すなわちポリＩＣやポリＡＵ、解毒コレラ毒素（ＣＴＢ）と、大腸菌の粘膜免疫の誘発のための熱不安定性毒素を含むものである。アジュバントのより詳細な説明は、M.Z.Iカーン等による総説“Pharmaceutical Research”第11巻、第１号（1994年）の第2−11頁や、グプタ等による他の総説“Vaccine”第13巻、第14号の第1263−1276頁（1995年）や、WO99／24578で得ることができる。好ましいアジュバントは、QuilA（登録商標）、QS21（登録商標）、Alhydrogel（登録商標）及びAdjuphos（登録商標）を含むものである。
【００６５】
本発明の薬剤組成物は、注射、急速輸液、鼻咽吸込、皮膚吸込により非経口で投与されるか、又は舌下錠又は経口で投与される。
【００６６】
「薬剤組成物」という用語は抗体を含む意味である。本発明によれば、モラクセラ感染により仲介されたモラクセラ感染及び／又は疾病と症状の治療又は予防のために、本発明のポリペプチドに対して結合特異性を有する一つ又はそれ以上の抗体を使用する方法もまた提供される。
【００６７】
本発明の薬剤組成物は、P.R.ムライ（編集長）、E.J.バロン、M.A.ファレー、F.C.テノヴァー及びR.H.ヨルケンの“Manual of Clinical Microbiology”（ASMプレス、ワシントンD.C.）第７版（1999年）の第1773頁に記載のように、モラクセラ感染の予防及び／又はモラクセラ感染により生じた疾病及び症状に対して用いられる。一態様においては、本発明の薬剤組成物は、中耳炎、副鼻腔炎、慢性咳、急性喉頭炎、化膿性角膜炎、新生児の結膜炎及び侵襲的な疾患の治療又は予防に用いられ、宿主に本発明の組成物を予防又は治療量を投与することよりなる。一態様においては、本発明のワクチンの組成物は、モラクセラ感染の治療又は予防及び／又はモラクセラ感染により生じた疾病及び症状に対して用いられる。さらなる態様においては、モラクセラ感染はモラクセラカタラーリスである。
【００６８】
更なる態様において、本発明はモラクセラ感染に対して感受性を有する宿主において、モラクセラ感染の予防又は治療処理をする方法を提供するものであり、その方法は宿主に本発明の組成物の予防又は治療量を投与することからなる。
【００６９】
本出願において使用された様に、「宿主」という用語には哺乳動物が含まれる。更なる態様において、哺乳動物はヒトである。更なる態様において、ヒトは新生児、幼児又は子供である。更なる態様において、ヒトは大人である。
【００７０】
ある特定の態様において、薬剤の組成物は、幼児、高齢者、及び免疫不全宿主のような、モラクセラ感染の危険性のある宿主に投与される。
【００７１】
薬剤組成物は、好ましくは約０．００１〜１００μg／ｋｇ（抗原／体重）、より好ましくは、０．０１〜１０μg／ｋｇ、最も好ましくは０．１〜１μｇ／ｋｇの投薬形態を単位として、免疫化の間に約１〜６週間の間隔をおいて１〜３回投与する。
【００７２】
薬剤組成物は、好ましくは約０．１μg〜１０ｍｇ、より好ましくは１μｇ〜１ｍg、最も好ましくは１０〜１００μｇを投与形態の単位として、免疫化の間に約１〜６週間の間隔をおいて１〜３回投与する。
【００７３】
別の観点においては、配列番号２、４に示す配列か、又はそれらの断片か若しくは類似体から選択された配列からなるアミノ酸配列により特徴付けられたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。
【００７４】
一態様において、ポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードするオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を含む、配列番号第１、３に記載のものである。
【００７５】
図中に示されたポリヌクレオチド配列は、縮重コドンで変化を受けるかもしれないけれども、それでもなお、本発明のポリペプチドをコードする、ということが理解できるであろう。従って、本発明はさらに、上記のポリヌクレオチド配列（又は、それらの相補配列）とハイブリダイズするポリヌクレオチドにおいて、配列間の同一性が７０％であるものを提供する。一態様では、配列間の同一性は少なくとも８０％である。一態様では、配列間の同一性は少なくとも８５％である。一態様では、配列間の同一性は少なくとも９０％である。さらなる一態様では、ポリヌクレオチドは、厳しい条件下でハイブリダイズし、すなわち少なくとも９５％の同一性を有する。さらなる一態様では、同一性は９７％以上である。
【００７６】
ハイブリダイゼーションにとって最適の厳しい条件は、当業者であれば直ちに分かる（例えば、サンブローク等（Sambrook et al.）の“Molecular cloning : A Laboratory Manual” 第2版（1989年）：ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー;、ニューヨーク、ジョン・ウィレイ＆ソンズ出版、ニューヨーク、オースベルF.M.等編（Ausubel F.M. et al.,John Wiley & Sons, Inc. N.Y.）“Current protocols in Molecular Biology”（1999年）を参照）。
【００７７】
さらなる一態様において、本発明は、厳しい条件下において、下記のポリヌクレオチド：
（ａ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、又は
（ｂ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の相補鎖
（ここで、前記ポリペプチドは、配列番号２、４に示す配列、又はそれらの断片か若しくは類似体から選択されたものである）のいずれかとハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。
【００７８】
さらなる一態様において、本発明は、厳しい条件下において、下記のポリヌクレオチド：
（ａ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、又は
（ｂ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の相補鎖
（ここで、前記ポリペプチドは、配列番号２又は４から選択された配列からなるものである）のいずれかとハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。
【００７９】
さらなる一態様において、本発明は、厳しい条件下において、下記のポリヌクレオチド：
（ａ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、又は
（ｂ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の相補鎖
（ここで、前記ポリペプチドは、配列番号２、４に記載の配列か、又はそれらの断片か若しくは類似体から選択されたポリペプチドに由来する、少なくとも１０の連続するアミノ酸残基をからなるものである）のいずれかとハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。
【００８０】
さらなる一態様において、本発明は、厳しい条件下において、下記のポリヌクレオチド：
（ａ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、又は
（ｂ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の相補鎖
（ここで、前記ポリペプチドは、配列番号２又は４から選択されたポリペプチドに由来する、少なくとも１０の連続するアミノ酸残基をからなるものである）のいずれかとハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。
【００８１】
さらなる一態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号２、４に記載の本発明のポリペプチドをコードするものである。
【００８２】
さらなる一態様において、ポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードする、配列番号１、３に記載のものである。
【００８３】
当業者であれば直ちに分かるように、ポリヌクレオチドにはDNAとRNAの両方が含まれる。
【００８４】
本発明には、本願に記載のポリポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドも含まれる。
【００８５】
他の観点においては、宿主内で該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現させて、その発現ポリペプチド生成物を回収することによる、組換え技術を用いた本発明のポリペプチドの生成方法が提供されている。別の方法としては、ポリペプチドは、確立された合成化学技術に基づいて、すなわち液相合成法又は固相合成法により、連結させて全ポリペプチドを生成する（ブロック・ライゲーション）ことにより、生成することができる。
【００８６】
ポリヌクレオチド及びポリペプチドを入手及び鑑定するための通常の方法は、以下の参考文献：サンブローク等の“Molecular Cloning :A Laboratory Manual”第2版（1989年）、ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー；ニューヨーク、ジョン・ウィレイ＆ソンズ社、ニューヨーク、オースベルF.M.等編の“Current Protocol in Molecular Biology”；ニュージョージー、トトワ、ヒューマンプレス、ホワイト Ｂ．Ａ．出版の“PCR Cloning Protocols, from Molecular Cloning to Genetic Engineering”（1997年）の490頁；ニューヨーク、シュプリンガー、スコープス Ｒ．Ｋ．（Scopes R.K.）出版の“Protein Purification, Principles and Practices”第3版（1993年）の380頁；ニューヨーク、ジョン・ウィレイ＆ソンズ社出版、Coligan J.E等編の“Current Protocol in Immunology”に記載されたとおりである。
【００８７】
本発明は本発明のポリヌクレオチドを含むベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
本発明は、前記ポリペプチドの発現に適した条件下において、本発明の宿主細胞を培養する工程を含む、ポリペプチドの生成方法を提供する。
【００８８】
組換え体の生成においては、本発明のポリペプチドをコードするベクターを用いて宿主をトランスフェクトし、その後、プロモーターの活性化か、形質転換細胞の選択か、又は遺伝子の増殖に適するように改変した栄養培養液中で培養する。適したベクターは、選択された宿主内で生存と複製が可能なものであり、かつ染色体性、非染色体性、及び合成DNA配列を含み、例えば、細菌性プラスミド、ファージDNA、バキュロウィルス、イースト菌プラスミド、プラスミドとファージDNAの組み合わせから生成したベクターなどがある。ポリペプチド配列を、制限酵素を用いてベクターの適切な部位に組込むことが可能であり、該ポリペプチドはプロモーター、リボソーム結合部位（共通部位又はシャイン・ダルガルノ配列）と、必要に応じてオペレーター（制御要素）からなる発現制御部位と機能が作動するように連結されている。所定の宿主とベクターに適した発現制御部位の個々の構成成分は、確立された分子生物学の原理（サンブローク等の“Molecular Cloning :A Laboratory Manual”第2版（1989年）、ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー；ニューヨーク、ジョン・ウィレイ＆ソンズ社、ニューヨーク、オースベルF.M.等編の“Current Protocol in Molecular Biology”）に従い、選択することができる。適したプロモーターは、LTR又はSV40プロモーターと、大腸菌ラクトースと、tac又はtrpプロモーターと、ファージラムダPLプロモーターとを含むものであるが、それらに制限されない。ベクターは、好ましくは選択マーカー、すなわちアンピシリン抵抗性遺伝子だけでなく、複製起点も組込んだものである。適した細菌性ベクターは、pET、pQE70、pQE60、pQE-9、pD10、phagescript、psiX174、pbluescript SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5、と真核ベクターpBlueBacIII、pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG、pSVK3、pBPV、pMSG、及びpSVLを含むものである。宿主は細菌性のもの、すなわち大腸菌、枯草菌、ストレプトミセス；カビ、すなわちアスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・ニダランス；、酵母菌、すなわちサッカロミケス；又は真核性のもの、すなわちCHO、COSとすることができる。
【００８９】
培養液中にポリペプチドが発現すれば、細胞を通常遠心分離で回収し、その後（発現したポリペプチドが媒体中に分泌されていなければ）物理的又は化学的手法を用いて破砕し、その結果生じた粗抽出物を保持して興味の対象であるポリペプチドを単離する。培養液又は溶解液からのポリペプチドの精製は、ポリペプチドの特性に応じて確立された技術を用い、すなわち硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロース・クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイト・クロマトグラフィー、及びレクチン・クロマトグラフィーを用いて行なうことができる。最終精製は、HPLCを用いて行なうことができる。
【００９０】
ポリペプチドは、リーダー又は分泌配列の有無にかかわらず発現することができる。前者の場合においては、リーダーは翻訳後プロセシングを用いて取り除く（米国第4,431,739号、同第4,425,437号、及び同第4,338,397号）か、又は発現したポリペプチドの精製後に化学的に取り除く。
【００９１】
さらなる観点によれば、本発明のモラクセラポリペプチドは、モラクセラ感染、詳細にはモラクセラ感染の診断検査に使用することができる。
【００９２】
いくつかの診断方法が可能であるが、例えば、生体サンプルにおけるモラクセラ菌の検査において、又はモラクセラに感受性を有する宿主におけるモラクセラ感染の診断において、下記工程:
ａ）宿主から生体サンプルを得る工程、
ｂ）本発明のモラクセラポリペプチドに反応性を示す抗体又はその断片を、生体サンプルと共にインキュベートして、混合物を生成する工程、及び
ｃ）モラクセラの存在を示す混合物中で、特異的に結合した抗体又は結合した断片を検出する工程
に従った方法がある。
【００９３】
その他には、モラクセラ抗原に特異的な抗体を含むか、又は含むと思われる生体サンプル内における、前記抗体の検出方法は、下記工程：
ａ）宿主から生体サンプルを得る工程、
ｂ）本発明のモラクセラポリペプチドの１又はそれ以上、あるいはその断片を、生体サンプルと共にインキュベートして、混合物を生成する工程、及び
ｃ）モラクセラに特異的な抗体の存在を示す混合物中で、特異的に結合した抗原又は結合した断片を検出する工程、
に従い実施することができる。
【００９４】
当業者であれば、この診断検査には、酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）、放射免疫測定法、又はラテックス凝集反応法のような免疫検査を含む、本質的にはそのタンパク質に特異的な抗体が生物中に存在するか否かを調べるための、様々な方法があると分かるであろう。
【００９５】
本発明のポリペプチドをコードするDNA配列は、モラクセラを含むと思われる生体サンプル中の、同菌の存在有無の検出に用いるDNAプローブの設計にも用いることができる。本発明の検出法は、下記工程:
ａ）宿主から生体サンプルを得る工程、
ｂ）本発明のポリペプチドをコードするDNA配列を有するDNAプローブの１又はそれ以上、又はその断片を、生体サンプルと共にインキュベートして、混合物を生成する工程、及び
ｃ）モラクセラ菌の存在を示す混合物中で、特異的に結合したDNAプローブを検出する工程、を含む。
【００９６】
本発明のDNAプローブも、例えばポリメラーゼ連鎖反応を用いた、循環モラクセラ、すなわちサンプル中のモラクセラ核酸の検出に、モラクセラ感染の診断方法として用いることができる。そのプローブは、従来技術を用いて合成することができ、固相に固定するか、又は検出可能なラベルを付すことができる。本願の好ましいDNAプローブは、本発明のモラクセラペプチドの少なくとも約６個の連続するヌクレオチドに相補的な配列からなるオリゴマーである。更なる態様において好適なDNAプローブは、本発明のモラクセラペプチドの少なくとも約１５個の連続するヌクレオチドに相補的な配列からなるオリゴマーである。更なる態様において好適なDNAプローブは、本発明のモラクセラペプチドの少なくとも約３０個の連続するヌクレオチドに相補的な配列からなるオリゴマーである。更なる態様において好適なDNAプローブは、本発明のモラクセラペプチドの少なくとも約５０個の連続するヌクレオチドに相補的な配列からなるオリゴマーである。
【００９７】
宿主中のモラクセラを検出する他の診断方法は、下記工程：
ａ）本発明のポリペプチド又はその断片に反応性を示す抗体に検出可能なラベルを付す工程、
ｂ）ラベルを付した抗体又はラベルを付した断片を宿主に投与する工程、及び
ｃ）モラクセラの存在を示す宿主中で、特異的に結合したラベルを付した抗体またはラベルを付した断片を検出する工程：
を含む。
【００９８】
本発明のさらなる観点は、モラクセラ感染の診断と、特にはその治療に特有の抗体の生成に用いる免疫原として、本発明のモラクセラポリペプチドを使用する方法である。適当な抗体は、適切なスクリーニング法を用いて、例えば試験モデル内においてモラクセラ感染を受動的に防御するある特定の抗体の能力を測ることにより、測定することができる。動物モデルの一例は、本明細書の実施例に記載のマウスモデルである。前記抗体は、完全な抗体であるか、又は抗原に結合性のある断片でもよく、かつ任意の免疫グロブリンのクラスに属するものとすることができる。前記抗体又は断片は、動物由来のものとすることができ、詳細には、哺乳動物のもの、より詳細には、マウス、ラット、又はヒトのものとすることができる。天然の抗体やその断片とすることもでき、あるいは必要に応じて、組換え抗体や抗体の断片とすることもできる。組換え抗体や抗体の断片という用語は、分子生物学の技術を用いて生成された抗体又は抗体の断片を意味する。前記抗体又は抗体の断片は、ポリクローナルか、又は好ましくはモノクローナルのものとすることができる。それは、モラクセラポリペプチドと結合した多数のエピト−プに特有のものでもよいが、好ましくは、１つのものに特有のものとすることができる。
【００９９】
一観点において、本発明は、モラクセラ感染の予防及び／又は治療に用いる抗体の使用方法を提供している。
【０１００】
更なる観点において、本発明は、モラクセラ感染に感受性を有する宿主におけるモラクセラ感染の予防又は治療の処理の方法を提供するものであり、その方法は予防量又治療量の本発明の薬剤組成物を宿主に投与することからなる。
【０１０１】
更なる観点において、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又はその断片、類似体あるいは誘導体を、DNA免疫化法に使用することができる。それは、注入することによってそれらを複製及び発現可能なベクターに導入し、それによってインビボで抗原性ポリペプチドを製造することができる。例えばポリヌクレオチドを、真核細胞中で機能するCMVプロモーターの制御下でプラスミドベクター中に導入することができる。好ましくはベクターを筋肉注射する。
【０１０２】
本発明のさらなる観点は、本発明のポリペプチドに対する抗体を、受動免疫のために用いる使用方法であり、そのために本発明のポリペプチドによって誘導された抗体は宿主に、受動免疫を与えるのに十分な量で投与される。人は本出願において述べられた抗体を使用することができるであろう。適切なスクリーニング方法を用いて適切な抗体を決定することができ、その一例として、試験モデルにおいて特定の抗体がモラクセラ感染を受動的に防御する能力を測定することができる。動物モデルの一例は、この中で述べられたマウスのモデルである。その抗体は全抗体あるいはその抗原結合断片であってもよく、如何なる免疫グロブリンクラスに属しても良い。その抗体又は断片は動物由来であってもよく、特異的には哺乳動物由来、更に特異的にはマウス、ラット又はヒト由来であってもよい。それは天然の抗体又はその断片であっても良く、望むならば、組み換え抗体又は抗体断片であってもよい。組み換え抗体又は抗体断片という用語は、分子生物学の技術を用いて製造された抗体又は抗体断片を意味するものである。その抗体又は抗体断片はポリクローナルであり、又は好ましくはモノクローナルである。それはモラクセラペプチドに関連した多くのエピトープに特異的であっても良いが、好ましくは一つに対して特異的である。
【０１０３】
遺伝的な免疫法における本発明のポリヌクレオチドの使用には、好ましくは適切な送達方法又はシステムが採用され、その例には、筋肉へのプラスミドDNAの直接注射［フォルフら, H M G (1992) 1: 363; ターネスら、ワクチン (1999), 17: 2089; レーら、ワクチン (2000), 18: 1893; アルベスら、ワクチン (2001), 19: 788］、アジュバントあり又はなしでのプラスミドDNA注射［ウルマーら、ワクチン (1999), 18: 18; マックローグリンら、ジャーナル・オブ・コントロールリリース, (1998) 56: 259; ハルティッカら、ジェーンセラピー(2000) 7: 1171-82; ベンベニスティー及びレシェフ、PNAS USA (1986) 83: 9551; シングら、PNAS USA (2000) 97: 811］、特異的な担体と複合したDNAを送ることによる細胞の標的化［ワら、ジャーナル・オブ・バイオロジカルケミストリー (1989) 246: 16985; チャピンら、Infect.Immun. (1999) 67: 6434］、種々の形のリポソームに複合化された又はカプセルに包まれたプラスミドの注射［イシイら、エイズリサーチ・アンド・ヒューマンレトロウイルス (1997) 13:142; ペリエら、ワクチン (2001), 19: 3301］、種々のボンバートメント法によるDNAの投与［タンら、ネーチャー (1992) 356: 152; エイセンブラウンら., DAN Cell Biol (1993) 12: 791; チェンら、ワクチン (2001), 19: 2908］、生きている（lived）ベクターによるDNA投与［チュブレカスら、ジェーン (1997) 190: 191; プショコら、バイロロジー (1997) 23*: 389; スプレングら、FEMS (2000) 27: 299; ディエトリッチら、ワクチン (2001), 19: 2506］がある。
【０１０４】
一つの観点によると、本発明は、モラクセラ感染の予防及び／又は治療のための抗体の使用方法を提供する。
【０１０５】
さらなる態様において、本発明は、モラクセラ感染の予防又は治療用の薬剤の製造における、本発明の薬剤組成物の使用方法を提供する。
【０１０６】
さらなる態様において、本発明は、本発明のポリペプチドを含む、モラクセラ感染の検出又は診断用のキットを提供している。
【０１０７】
別段の定義がない限り、本明細書で使用する技術又は科学用語の全ては、本発明が属する分野における当業者に通常理解されているものと同様の意味を有する。ここに記載の出版物、特許出願、特許、及びその他のここで言及された参考文献の全ては、参考文献としてそのまま盛りこまれる。紛争の際には、定義も含めて本明細書が支配をする。さらに、材料や方法や実施例は解説を行なうのみであり、それに制限されるものではない。
【実施例１】
【０１０８】
ＳＭＣ−１遺伝子とそれに対応するポリペプチドのクローニング及び分子特性を、以下実施例で説明する。
【０１０９】
M. カタラーリスＳＭＣ−１（配列番号：１）遺伝子のコード領域を、ＰＣＲ（カリフォルニア州サンノゼ、パーキンエルマー社のＤＮＡ熱サイクル遺伝子増幅ＰＣＲシステム２４００を使用）により、M. カタラーリス株のＥＴＳＵ  Ｃ−２のゲノムＤＮＡから増幅し、そのPCRにあたって、制限部位ＮｃｏＩ（CCATGG）及びＸｈｏＩ（CTCGAG）付加のための伸張した塩基を含む下記オリゴ:ＲＩＯＳ３０（5'- TATGTACCATGGCTGAACTCAATACCAGCCGTTCA -3'）およびＲＩＯＳ３１（5'- GGCATGCTCGAGGTAATCATGTCTCCAAGCATTTTG -3'）を用いた。ＰＣＲ産物を、QIAgen社のQIAquickゲル抽出キットを用いて、その製品使用説明書（カリフォルニア、チャッツワース）に従って、アガロースゲルから精製し、NcoI及びXhoI（カナダ、ベー・ドゥルフェ、アマシャム ファルマシア バイオテク社）により消化した。pET21b(+)ベクター（ウィスコンシン州、マディソン、ノヴァゲン）をNcoI及びXhoIにより消化し、QIAquickゲル抽出キットを用いて、アガロースゲルから精製した。NdeI−XhoI PCR産物を、NcoI−XhoI pET21b(+)発現ベクターに連結させた。その連結した産物により、シマニス（Simianis）（Hanahan.Dによる“DNAクローニング”（1985年）、D.M.グローバー出版、第109−135頁）の方法に従い、大腸菌DH5α［φ80dlacZΔM15Δ(lacZYA-argF)U169 endA1 racA1 hsdR17 (rK-mK+)deoR thi-1 supE44 λ-gyrA96 relA1］（メリーランド州、ゲーサーズバーグ、ギブコBRL）を形質転換した。SMC-1遺伝子を含む組換えpET21d(+)プラスミド（rpET21d(+)）からQIAgenキット（カリフォルニア、チャッツワース）を用いて精製し、DNA挿入物の配列決定を行なった（カリフォルニア、フォスター シティ、エー・ビー・アイ、タック・ダイ・デオキシターミネ−ター配列キット）。
【０１１０】
【表１】
2005507653.tif 000002
【０１１１】
SMC-1のポリペプチドをコードするオープン・リーディング・フレーム（ORF）は2781bpを含み、6.31の予測pIと104054.84Daの予測分子量を有するアミノ酸残基926個のポリペプチドをコードすることが分かった。スプキャン・ソフトウェア（ウィスコンシン配列分析パッケージ；ジェネティックス・コンピューター・グループ）を用いた予測アミノ酸残基配列（配列番号:２）の分析では、35個のアミノ酸残基のシグナルペプチド（MHTAHHHRSKTYLTTAIRYALFGIASLPFVIPTYA）の存在が示されたが、それは、アラニンとグルタミン残基との間に位置する開裂部位を末端としていた。
【０１１２】
ＰＣＲ増幅法によりSMC-1（配列番号：１）遺伝子の存在を確認するために、次の３種の別個のM. カタラーリス株：イースト・テネシー州立大学から提供されたM. カタラーリスETSU C-2と、ETSU T-25と、ETSU 658の臨床単離株；ラバル大学病院本部感染病研究センターから提供されたM. カタラーリス株M-12を用いた。これらの実験には、負のコントロールとして、大腸菌XL１−Blue MRF’を用いた。PCR（カリフォルニア州サンノゼ、パーキンエルマー社のＤＮＡ熱サイクル遺伝子増幅ＰＣＲシステム２４００）により、オリゴヌクレオチド・プライマーＲＩＯＳ３０及びＲＩＯＳ３１（表１）を用いて、SMC-1（配列番号：１）遺伝子を、前記３種のM. カタラーリス株のゲノムＤＮＡと、コントロールの大腸菌株から増幅させた。ＰＣＲは、９４℃で１５秒間と、４７℃で３０秒間と、６８℃で３分のサイクルを５回と、続いて９４℃で１５秒間と、６３℃で３０秒間と、６８℃で３分のサイクルを３０回と、最終伸長期間を６８℃で５分間で行なった。ＰＣＲ産物は、１％アガロースゲル中でサイズ分別し、エチジウムブロマイド染色で視覚化した。これらＰＣＲ増幅の結果は、表２に示すとおりである。増幅産物の分析から、テストした３種のM. カタラーリス株の全てのゲノム中に、SMC-1（配列番号：１）遺伝子が存在することが明らかになった。コントロールである大腸菌ＤＮＡに、前記オリゴヌクレオチド・プライマーを用いた同様のＰＣＲ増幅法を行なっても、そのような産物は検出されなかった。
【０１１３】
【表２】
2005507653.tif 000003
【実施例２】
【０１１４】
ＳＭＣ−２遺伝子とそれに対応するポリペプチドのクローニング及び分子特性を、以下実施例で説明する。
【０１１５】
M. カタラーリスのＳＭＣ−２（配列番号：３）遺伝子のコード領域を、ＰＣＲ（カリフォルニア州サンノゼ、パーキンエルマー社のＤＮＡ熱サイクル遺伝子増幅ＰＣＲシステム２４００を使用）により、M. カタラーリス株ＥＴＳＵ  Ｃ−２のゲノムＤＮＡから増幅し、そのPCRにあたって、制限部位ＮｄｅI（CATATG）及びＸｈｏＩ（CTCGAG）付加のために伸張した塩基を含む下記オリゴ: 表１に記載のＲＩＯＳ２０及びＲＩＯＳ２１を用いた。発現ベクターへのSMC-2遺伝子のクローニングとその解読には、実施例１に記載のものと同様の方法を用いた。
【０１１６】
SMC-2のポリペプチドをコードするオープン・リーディング・フレーム（ORF）は957bp を含み、5.78の予想pIと35954.10Daの予想分子量を有するアミノ酸残基318個のポリペプチドをコードすることが分かった。スプキャン・ソフトウェア（ウィスコンシン配列分析パッケージ；ジェネティックス・コンピューター・グループ）を用いた予想アミノ酸残基配列（配列番号：4）の分析では、47個のアミノ酸残基のシグナルペプチド（VGKIMSKIPMMNEKYFRRQALYWLIAAAIMAGLWLIVWLTSSVPAMI）の存在が示されたが、それは、イソロイシンとアスパラギン残基との間にある開裂部位を末端としていた。
【０１１７】
試験した３種のM.カタラーリス株（表２）について、オリゴヌクレオチド・プライマーＲＩＯＳ２０とＲＩＯＳ２１を用いてPCR増幅を行なったところ、SMC-2遺伝子の存在が示された。SMC-2遺伝子のPCR増幅には、実施例１に記載の方法と同様の方法を用いた。これらオリゴヌクレオチド・プライマーを用いた同様のPCR増幅を、コントロール大腸菌DNAについて行なったが、上記のような産物は検出されなかった。
【実施例３】
【０１１８】
CMVプラスミドpCMV-GHにおけるM.カタラーリス遺伝子のクローニングを、以下実施例で説明する。
【０１１９】
M.カタラーリスポリペプチドのDNAコード領域を、プラスミドベクターpCMV-GH中のサイトメガロウイルス（CMV）プロモーター転写調節下にあるヒト成長ホルモン（hGH）遺伝子の下流相に挿入した（タング等の“Nature”（1992年）356：152）。CMVプロモーターは、大腸菌細胞内では機能しないプラスミドであるけれども、真核細胞へのプラスミド投与により活性化する。前記ベクターは、アンピシリン耐性遺伝子も組込んだものとした。
【０１２０】
SMC-1(配列番号:１)とSMC-2(配列番号:３)の、リーダーペプチド部位を有さないコード領域を、ＰＣＲ法（カリフォルニア州サンノゼ、パーキンエルマー社、ＤＮＡ熱サイクル遺伝子増幅ＰＣＲシステム２４００）によりM. カタラーリス株のＥＴＳＵ  Ｃ−２のゲノムＤＮＡから増幅し、そのPCRにあたって、表１に記載の制限部位BamHI（GGATCC）及びBglII（AGATCT）、SalI（GTCGAC）、又はHindIII（AAGCTT）付加のための伸張した塩基を含むオリゴヌクレオチド・プライマーを用いた。PCR産物は、QIAgen社のQIAquickゲル抽出キットを用いてアガロースゲルから精製し、制限酵素（アマシャム ファルマシア バイオテク社）により消化した。pCMV-GHベクター（テキサス州、ダラス、テキサス大学、生化学部、ステファン・A・ジョンストン博士研究室）をBamHI、BglII、SalI、又はHindIIIにより消化し、QIAgen社のQIAquickゲル抽出キットを用いてアガロースゲルから精製した。消化したDNA断片を、消化したpCMV-GHベクターに連結させ、CMVポリモーターの制御下で、hGH-SMC-1とhGH- SMC-2の融合ポリペプチドを生成できるようにした。その連結産物を、シマニスの方法（ハナハン、D．DNAクローニング、1985年、D.M.グローバー出版、pp.109-135）に従って、大腸菌株DH5α［φ80dlacZΔM15Δ(lacZYA-argF)U169 endA1racA1 hsdR17 (rK-mK+)deoR thi-1 supE44 λ-gyrA96 relA1］（ギブコBRL）を形質転換した。組換えpCMVプラスミドをQIAgenキットを用いて精製し、DNA配列決定により、挿入物のDNAのヌクレオチド配列を確認した。
【実施例４】
【０１２１】
M.カタラーリスポリペプチド抗原に対して免疫反応を誘発するDNAの使用法を、以下実施例で説明する。
【０１２２】
雌のBALB／cマウス8匹（カナダ国ケベック州、セントコンスタント、チャールズリバー）のグループに、50μgの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）発現プラスミドpCMV-GH-GM-CSF（テキサス州、ダラス、テキサス大学、生化学部、ステファン・A・ジョンストン博士研究室）存在下に、SMC-1（配列番号：１）とSMC-2（配列番号：３）遺伝子をコードする組換えpCMV-GHを50μg、2〜3週間の間隔をあけて100μlを3回筋肉注射することにより、免疫化した。コントロールとしては、マウスのグループに、50μgのpCMV-GH-GM-CSF存在下に、pCMV-GH を50μg注射した。各免疫注射の実施前と三度目の注射の7日後に、眼窩洞から血液サンプルを採取して、対応するHisタグラベルを付したM.カタラーリス組換えポリペプチドを皮膜抗原として用いて、ELISA法により血清の抗体反応を調べた。これらHisタグでラベル化したM.カタラーリス組換えポリペプチドの生成及び精製法については、実施例５に示す。
【実施例５】
【０１２３】
M.カタラーリス組換えポリペプチドの生成及び精製法を、以下実施例で説明する。
【０１２４】
SMC-1（配列番号：１）とSMC-2（配列番号：３）遺伝子を組込んだ組換えpET21プラスミドを用いて、電気穿孔法（カナダ国ミシサーガ、バイオラッド研究室、ジェーンパルサーIIアパレイタス）により、大腸菌株AD494（DE3）［Δara-leu7697ΔlacX74ΔphoA PvuII phoRΔmalF3 F’[lac+(lacIq)pro] trxB::Kan(DE3)］（ノヴァゲン）を形質転換した。大腸菌のこの菌株において、組換えポリペプチドの発現を制御するT7プロモーターは、イソプロピル-β-d-チオ-ガラクトピラノシド（IPTG）によって誘導が可能であるlacプロモーターの制御下にある遺伝子であるT7 RNAポリメラーゼ（λDE３プロファージ上に存在）によって特異的に認識される。形質転換細胞AD494（DE3）／rpET21を、1mlにつき100μgのカルベニシリン（カナダ国オークビル、シグマ-アルドリッチ・カナダ社）を含むLB培養液（ペプトン10g／L、イースト菌抽出物5g／L、NaCl 10g／L）中で250rpmで攪拌しながら、A600値が0.5になるまで、37℃で培養した。Hisタグを付したM.カタラーリス組換えポリペプチドの生成を促進するために、最終濃度1mMのIPTGと共に、細胞をさらに3時間インキュベートした。500ml培養液から誘導された細胞を遠心分離でペレット化して、-70℃で凍結させた。
【０１２５】
His結合金属キレート樹脂に固定された2価のカチオン（Ni2+）へのHisタグ配列（連続する6個のヒスチジン残基）の結合特性に基づいたアフィニティー・クロマトグラフィーを用いて、IPTGに誘導されたAD494（DE3）／rpET21の可溶性細胞質画分から、組換えポリペプチドの精製を行なった。大略すると、IPTGにより誘導された500mLの培養液から得られたペレット化した細胞を、PMSFを1mM含む溶解緩衝液（20mLトリス、500mMNaCl、10mMイミダゾ-ル、pH7.9）中に再び懸濁させ、超音波処理して12000Xgで20分間遠心分離処理して、沈殿物を取り除いた。その上清をNi-NTAアガロースカラム（キアゲン）にかけた。Hisタグでラベルを付したM. カタラーリス組換えポリペプチドを、250mMのイミダゾ-ルと、500mMのNaClと、20mMのトリスpH7.9で溶出した。4℃でPBSに対して透析して、サンプルから塩とイミダゾ-ルを取り除いた。大腸菌の可溶部分から得られた組換えポリペプチド量は、MicroBCA（イリノイ州、ロックフォード、ピース）で測定した。
【実施例６】
【０１２６】
Hisタグを付したM. カタラーリス組換えポリペプチドとヒト口蓋扁桃中に存在する抗体との反応性を、以下実施例で説明する。
【０１２７】
表３に示すように、ヒト口蓋扁桃内に存在する抗体を用いた免疫ブロット法において、SMC-1とSMC-2のHisタグを付した組換えポリペプチドの存在が認められた。このことは、ヒトは普通にM. カタラーリスと接触し、そのポリペプチドに特異的な抗体を作成することを示している。これらの特別なヒトの抗体は、M. カタラーリス感染の予防に関与するかもしれない。
【０１２８】
【表３】
2005507653.tif 000004
1免疫ブロットは、実施例5に記載のように生成かつ精製されたHis標識組換えポリペプチドを用いて行なった。
2 Hisタグを付した組換えポリペプチドの分子量は、SDS-PAGE後に測定した。
3免疫ブロットを行うためにヒト口蓋扁桃からの抽出物は希釈を行わなかった。
【実施例７】
【０１２９】
M. カタラーリス株表面上にSMC-1とSMC-2ポリペプチドの抗体が接近する可能性を、以下実施例で説明する。
【０１３０】
細菌を、３７℃、８％二酸化炭素ガス中で１％デキストロースを含む脳心臓輸液（BHI）培養液中で培養して、OD490nmが０．６５０（〜１０８CFU／mｌ）となるようにした。その後、抗SMC-1又は抗SMC-2又はコントロール血清の希釈物を添加して細胞に結合させ、回転させながら4℃で2時間インキュベートした。サンプルをブロッキング緩衝液（2％ウシ血清アルブミン（BSA）含有リン酸緩衝生理食塩水（PBS））で4回洗浄し、その後、ブロッキング緩衝液で特異的に希釈したヤギ蛍光標識（FITC）-結合抗マウスIgG Fc（ガンマ）の断片1mlを加えた。さらに暗室中で回転させながら、室温で60分間インキュベートした後、サンプルをブロッキング緩衝液で4回洗浄し、0.25％ホルムアルデヒド含有PBS緩衝液で4℃で18時間固定化した。細胞を遠心し、PBS緩衝液0.5ml中に再懸濁させた。細胞は、フローサイトメトリー（ベックマン・クールター社、Epics（登録商標）XL）で分析するまで、4℃の暗室に放置した。フローサイトメトリー分析から、SMC-1とSMC-2に特異的な抗体が、試験した均質な（ETSU C-2）M. カタラーリス株上にあるそれらに対応する表面エピトープを、効率的に認識することが明らかになった（表4）。分析されたモラクセラ細胞10000個のうちの89％以上が、SMC-1とSMC-2に特異的な血清中に存在する抗体によりラベル化されていることが示された。加えて、SMC-1とSMC-2に特異的な血清のプール中に存在する抗体は、M.カタラーリスのETSU 658株の表面に結合した（表４）。この株の10000個の細胞の90％以上が特異的な抗体により標識されていることも測定された。これらの観察は、SMC-1とSMC-2ポリペプチドが、抗体に認識され易い表面に接近可能であることを明確に示している。抗M.カタラーリス抗体は、M.カタラーリス感染の予防に重要な役割を果すことが明らかになった。
【０１３１】
【表４】
2005507653.tif 000005
1精製した組換えポリペプチド20μgとQuilAアジュバント（カナダ国、ホーンビー、シーダーレーン・ラボラトリーズ社）10μgの混合物を2週間毎に5回、マウスに皮下注射した。血清を1／50に希釈した。
2免疫血清で細胞にラベルを付けた後に得られた蛍光値の中央値を、コントロールのマウス血清について得られた蛍光値で割って算出したものを、蛍光指標とした。蛍光値の1は、無傷のモラクセラ細胞の表面に結合された抗体が存在しないことを示したものとする。
3分析した10,000細胞のうちの、ラベルを付した細胞％を示す。
4この検定には、免疫化されていないマウス又は見せかけ上免疫化されたマウスから採取した血清をプールして1／50に希釈したものを、負のコントロールとして用いた。
5検定には、精製されたM. カタラーリス株ETSU-C2由来の精製された外膜ポリペプチド20μgで免疫化されたマウスから得られた血清を1／1000に希釈して、正のコントロールとして用いた。
【実施例８】
【０１３２】
抗SMC-1及びSMC-2マウス血清の殺菌活性を、以下実施例で説明する。
【０１３３】
細菌をチョコレート寒天プレートに載せ、8％二酸化炭素ガス中、37℃で18時間、インキュベートした。その後、OD490nmが0.25となるように溶菌緩衝液（10％ハンクス平衡塩類溶液（HBSS）及び１％カゼイン加水分解物、pH7.3）中に細菌細胞を再懸濁させ、8×104CFU／mlに希釈した。細菌懸濁液25μlと、熱で不活化した希釈試験用血清50μl及びHBSS15μlとを混合して、攪拌（200rpm）しながら8％二酸化炭素中、37℃で15分間インキュベートすることにより、細菌検定を行なった。その後、ウサギの捕体成分含有血清を最終濃度が10％となるように添加して、その混合物を攪拌（200rpm）しながら8％二酸化炭素中37℃で、さらに60分間インキュベートした。インキュベート終了時に、チョコレート寒天プレートに検定混合物10μlをのせ、生存細菌数を測定した。そのプレートを8％二酸化炭素中、37℃で18〜24時間インキュベートした。コントロールは、免疫化前のマウスから採取した熱不活化血清およびウサギ捕体とインキュベートした細菌を含むものとした。殺菌活性は、コントロールと比較して、50％かそれ以上の細菌を殺す結果となる最高血清希釈として測定した。M. カタラーリス株ＥＴＳＵ658を用いて血清の殺菌活性を評価した。M. カタラーリス株ＥＴＳＵ658に対する殺菌活性は、精製された組み換えSMC-1又はSMC-2ポリペプチド20μgで５回免疫したマウスから採取した血清において検出した。
【実施例９】
【０１３４】
免疫化により誘発されたM. カタラーリス感染に対するマウスの予防を、以下実施例で説明する。
【０１３５】
１０匹の雌のBALB／cマウス（チャールズリバー）のグループに、１０％のQuilAアジュバント（カナダ国、ホーンビー、シーダーレーン・ラボラトリーズ社）の存在下で、アフィニティ精製されたHisタグを付したM.カタラーリス組換えポリペプチド20μgを、2週間毎に５回、皮下に投与して免疫化するか、又は、コントロールとして、PBS中のQuilAアジュバントのみを投与した。血液サンプルは、それぞれ免疫化前の0、14、28、42及び56日目と、５度目の注射から14日後（70日目）に、眼窩洞から採取した。１週間後、M. カタラーリス株ETSU 658約1×106CFUを用いて、マウスに肺内疾患を患わせた。M.カタラーリス疾患の接種材料をチョコレート寒天にのせ、CFUを測定して、投与した量を確認した。マウスは、ペントバルビタール・ナトリウム（Euthanyl（登録商標））の腹腔内投与により感染の5時間後に屠殺した。無傷の肺を摘出して、組織ホモゲナイザーで均質化した。CFU測定のための連続希釈でプレーティングすることにより、肺ホモジェネートについて細菌クリアランスを測定した。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】図1は、M. カタラーリス株ＥＴＳＵ Ｃ-２由来のSMC-1遺伝子のDNA配列（配列番号:１）を示したものである。前記配列の下線部は、リーダーペプチドのコード領域を示す。
【図２】図2は、M. カタラーリス株ＥＴＳＵ Ｃ-２由来のSMC-1ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号:２）を示したものである。下線部の配列は、35アミノ酸残基のリーダーペプチドを示す。
【図３】図３は、M. カタラーリス株ＥＴＳＵ Ｃ-２由来のSMC-2遺伝子のDNA配列（配列番号:３）を示したものである。前記配列の下線部は、リーダーペプチドのコード領域を示す。
【図４】図４は、M. カタラーリス株ＥＴＳＵ Ｃ-２由来のSMC-2ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号:４）を示したものである。下線部の配列は、47アミノ酸残基のリーダーペプチドを示す。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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