(57)【要約】本発明は、ポリウレタンコーティングの中で酵素を不可逆的に固定化する方法を提供する。この発明はまた、酵素がほぼ１００％の固定化された酵素含有コーティングを提供する。酵素の存在下で水系ポリウレタンコーティングを合成することにより、酵素は、重合体マトリックスへ不可逆的に固定される。固定化された酵素の分布と活性保持は、コーティングの内部で均一である。重合において、低疎水性のポリイソシアネート・プレポリマーを使用することにより、ＥＣＣの疎水性が低下すると、ＥＣＣの固有活性は著しく増大する。
2005516620.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリウレタンコーティングの中に酵素を不可逆的に固定化する方法であって、
ポリオール分散共反応剤と酵素の混合物を反応させて水性混合物を作る工程、
ヘキサメチレンジイソシアネートをベースとする水分散性脂肪族ポリイソシアネートを、前記水性混合物に添加し、反応させてエマルジョンを作る工程、
該エマルジョンを熱可塑性ポリオレフィンパネルに施して、酵素含有コーティングを作る工程、及び
酵素含有コーティングを硬化する工程を含んでいる方法。
【請求項２】
混合物を反応させる工程で添加するポリオール分散物の量は、水分散性脂肪族ポリイソシアネートを添加する工程での脂肪族ポリイソシアネートの量よりも約２倍以上多い請求項１の方法。
【請求項３】
混合物を反応させる工程で添加するポリオール分散物は、含水量約７０ｗ.％である請求項２の方法。
【請求項４】
混合物を反応させる工程は、ポリエチレン変性ポリジメチルシロキサン界面活性剤を添加することを含んでいる請求項３の方法。
【請求項５】
混合物を反応させる工程は、ビス-トリスプロパン緩衝液とＣａＣｌ2を添加することを含んでいる請求項４の方法。
【請求項６】
混合物を反応させる工程で添加するポリオール分散共反応剤は約２.５ｇであり、水分散性脂肪族ポリイソシアネートを添加する工程で添加する脂肪族ポリイソシアネートは約１.０ｇである請求項５の方法。
【請求項７】
混合物を反応させる工程は、約０.０２〜９ｇのジイソプロピルフルオロホスファターゼを添加することを含んでいる請求項６の方法。
【請求項８】
混合物を反応させる工程の前に、ジイソプロピルフルオロホスファターゼを、ヘキサメチレンジイソシアネートをベースとする低粘度脂肪族ポリイソシアネート樹脂と反応させて変性する工程を含んでいる請求項７の方法。
【請求項９】
ポリウレタンコーティングの中にジイソプロピルフルオロホスファターゼを不可逆的に固定化する方法であって、
含水量約７０ｗ.％のポリオール分散共反応剤、ポリエーテル変性ポリジメチルシロキサン界面活性剤、ビス-トリスプロパン緩衝液及びＣａＣｌ2からなる緩衝媒体、並びにジイソプロピルフルオロホスファターゼの混合物を反応させて水性混合物を作る工程、
ヘキサメチレンジイソシアネートをベースとする水分散性脂肪族ポリイソシアネートを、前記水性混合物に添加し、反応させてエマルジョンを作る工程、
該エマルジョンを熱可塑性ポリオレフィンパネルに施して、酵素含有コーティングを作る工程、及び
酵素含有コーティングを硬化する工程を含んでいる方法。
【請求項１０】
混合物を反応させる工程で添加するポリオール分散物の量は、水分散性脂肪族ポリイソシアネートを添加する工程での脂肪族ポリイソシアネートの量よりも約２倍以上多い請求項９の方法。
【請求項１１】
混合物を反応させる工程の前に、ジイソプロピルフルオロホスファターゼを、ヘキサメチレンジイソシアネートをベースとする低粘度脂肪族ポリイソシアネート樹脂と反応させて変性する工程を含んでいる請求項１０の方法。
【請求項１２】
酵素含有コーティングであって、ポリオール分散共反応剤と酵素の混合物を反応させて水性混合物を作り、ヘキサメチレンジイソシアネートをベースとする水分散性脂肪族ポリイソシアネートを、前記水性混合物に添加し反応させてエマルジョンを作り、該エマルジョンを熱可塑性ポリオレフィンパネルに施して、酵素含有コーティングを作り、酵素含有コーティングを硬化させる工程によって作製される酵素含有コーティング。
【請求項１３】
混合物を反応させる工程で添加するポリオール分散物の量は、水分散性脂肪族ポリイソシアネートを添加する工程での脂肪族ポリイソシアネートの量よりも約２倍以上多い請求項１２の酵素含有コーティング。
【請求項１４】
混合物を反応させる工程で添加するポリオール分散物は、含水量約７０ｗ.％である請求項１３の酵素含有コーティング。
【請求項１５】
混合物を反応させる工程は、ポリエチレン変性ポリジメチルシロキサン界面活性剤を添加することを含んでいる請求項１４の酵素含有コーティング。
【請求項１６】
混合物を反応させる工程は、ビス-トリスプロパン緩衝液とＣａＣｌ2を添加することを含んでいる請求項１５の酵素含有コーティング。
【請求項１７】
混合物を反応させる工程で添加するポリオール分散共反応剤は約２.５ｇであり、水分散性脂肪族ポリイソシアネートを添加する工程で添加する脂肪族ポリイソシアネートは約１.０ｇである請求項１６の酵素含有コーティング。
【請求項１８】
混合物を反応させる工程は、約０.０２〜９ｇのジイソプロピルフルオロホスファターゼを添加することを含んでいる請求項１７の酵素含有コーティング。
【請求項１９】
活性保持は１０％〜１００％である請求項１２の酵素含有コーティング。
【請求項２０】
ジイソプロピルフルオロホスファターゼの固定度はほぼ１００％である請求項１２の酵素含有コーティング。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、発明の名称「ジイソプロピルフルオロホスファターゼのポリウレタンコーティングへの不可逆的固定化」として２００１年７月２４日出願された同時係属仮出願第６０／３０７,４５０号のＵ.Ｓ.Ｃ.§１１９(ｃ)に関する利益を主張し、該出願についてはその引用を以て本願に組み入れるものとする。
【背景技術】
【０００２】
発明の分野
本発明は、ポリウレタンコーティングの中での酵素の不可逆的固定化(irreversible immobilization)に関する。
【０００３】
従来技術の説明
固定化は、工業的プロセスにおいて、酵素を触媒として適用することを可能にし、またその適用を拡大するために、広く利用されている。ポリウレタンフォームは、この十年間、様々な酵素とのバイオプラスチック合成のための高分子担体として使用されている。ポリウレタンのスポンジ様ポリマーは、親水性のトルエン・ジイソシアネート(TDI)又はメチレン・ビス(p-フェニルイソチオシアネート)(MDI)をベースとするポリイソシアネート・プレポリマーと水から合成される。モノリシック・ポリウレタンフォームに酵素が含まれると、固定化の程度はほぼ１００％となり、高活性が維持される。ポリウレタンフォームの固定化によって熱安定性が向上することも報告されている。
【０００４】
コーティングや薄膜の中に生物学的分子を挿入すると、適用範囲は拡大する可能性がある。例えば、電位差測定バイオセンサーは、電極の検出面に隣接する内側フィルムに酵素を共有結合したり、その後、酵素層を外側フィルムで保護することがしばしばある。アンペロメトリックバイオセンサーを製造する他の方法は、ゲル層の中に酵素を取り込んで、外側の保護フィルムによってさらにコートするものである。そのようなシステムの寿命と使用は、外側メンブレンへの酵素拡散によってしばしば制限される。これらの不都合を解消するには、酵素を、コーティングの中で直接且つ共有結合によって固定化せねばならない。コーティングの中で生体触媒を共有結合することは、生体触媒の分離及び濾過、マイクロチップ、防汚作用(antifouling)のような他のバイオプロセスにも有益である。
【０００５】
高活性酵素をコーティングやフィルムの中で直接共有結合して固定化するという目標は、依然として達成されておらず、最も成功した方法でも活性の最大は０.５％程度に過ぎない。水性(waterborne)ポリウレタンコーティングは、水性ポリエステルをベースとするポリオール分散性脂肪族ポリイソシアネートから生じる。フィルムを室温で硬化すると、水が蒸発し、ヒドロキシル基とイソシアネート官能基の間で凝縮し、これにより架橋結合が起こる。２成分の水性ポリウレタンは、溶媒性ポリウレタンコーティングと同様な特性を示すから、産業上の利用可能性が高められる。水性ポリウレタンコーティングは、酵素を多地点で共有結合させるための理想的な重合体マトリックスとなる。
【０００６】
前述の如く、当該技術分野では、重合化の前に、２成分系の水相へ酵素を直接添加できる方法が要請されている。固定化プロセスでは、プレポリマーに対するヒドロキシル基の場合よりも速い速度でイソシアネート官能基と反応させるために、固定化プロセスは酵素表面でのアミンの能力に依存する。
【発明の開示】
【０００７】
発明の要旨
本発明は、ポリウレタンコーティングの中に酵素を不可逆的に固定化する方法を含んでおり、該方法は、ポリオール分散共反応剤(polyol dispersion coreactant)と酵素の混合物を反応させて水性混合物を作る工程、ヘキサメチレン・ジイソシアネートをベースとする水分散性(water-dispersible)脂肪族ポリイソシアネートを、前記水性混合物に添加し反応させてエマルジョンを作る工程、該エマルジョンを熱可塑性ポリオレフィンパネルに施して、酵素含有コーティングを作る工程、及び酵素含有コーティングを硬化する工程を含んでいる。
【０００８】
また、本発明は、ポリウレタンコーティングの中にジイソプロピルフルオロホスファターゼを不可逆的に固定化する方法を含んでおり、該方法は、含水量が約７０ｗ.％のポリオール分散共反応剤、ポリエーテル変性ポリジメチルシロキサン界面活性剤、ビス-トリスプロパン緩衝液及びＣａＣｌ2からなる緩衝媒体、並びにジイソプロピルフルオロホスファターゼの混合物を反応させて水性混合物を作る工程、ヘキサメチレン・ジイソシアネートをベースとする水分散性脂肪族ポリイソシアネートを、前記水性混合物に添加し反応させてエマルジョンを作る工程、該エマルジョンを熱可塑性ポリオレフィンパネルに施して、酵素含有コーティングを作る工程、及び酵素含有コーティングを硬化する工程を含んでいる。
【０００９】
さらにまた、本発明は、酵素含有コーティングを含んでおり、該コーティングは、ポリオール分散共反応剤と酵素の混合物を反応させて水性混合物を作る工程、ヘキサメチレン・ジイソシアネートをベースとする水分散性脂肪族ポリイソシアネートを、前記水性混合物に添加し反応させてエマルジョンを作る工程、該エマルジョンを熱可塑性ポリオレフィンパネルに施して、酵素含有コーティングを作る工程、及び酵素含有コーティングを周囲条件下で約１２時間硬化させる工程を含むプロセスによって作られる。
【００１０】
本発明のこれら及びその他の利点及び利益は、以下の望ましい実施例の詳細な説明から明らかとなるであろう。
本発明を容易に理解し実施するために、添付の図面を参照して説明する。なお、図面は、本発明の例示であって、限定するものではない。
【００１１】
望ましい実施例の詳細な説明
本発明は、水性ポリウレタンコーティングの中に酵素を固定化するものである。使用可能な酵素の一例として、ジイソプロピルフルオロホスファターゼ(ＤＦＰａｓｅ, E.C. 3.8.2.1)がある。しかしながら、当該分野の専門家であれば、種々の酵素及び抗体を使用できることは理解し得るであろう。天然ＤＦＰａｓｅは、ソマン(soman)やジイソプロピルフルオロホスフェート(ＤＦＰ)のような有毒有機リン系神経剤の加水分解を触媒するものと理解されている。従来、ＤＦＰａｓｅはモノリシックポリウレタンフォームの中に共重合され、６７％活性の保持と、熱安定性の向上を図っている。酵素含有コーティング(ＥＣＣ)の親水性が変化すると、活性保持力及び安定性に影響するので、本発明の固定化プロセスでは、ポリイソシアネート・プレポリマーを使用して、様々な親水性を予め付与する。担体に不可逆的に付着する酵素の量を測定する。コーティング内の酵素分布状況は、金標識体(gold-labeling)を用いて観察した。質量移動が酵素−ポリマーの活性に及ぼす影響は、拡散細胞装置を用いて調べた。また、固定化によるＤＦＰａｓｅの熱安定性の向上についても調べた。
【００１２】
材料及び方法
｛材料｝
BAYHYDURポリイソシアネートXP-7063、XP-7007、XP-7148、BAYHYDROLポリオールXP-7093、Desdomodur N3400の他、蛋白質含有コーティングの合成及び硬化に用いられる熱可塑性ポリオレフィン(ＴＰＯ)パネルについては、Bayer Co.(ペンシルベニア州ピッツバーグ)の提供を受けた。BAYHYDURポリイソシアネートXP-7063、XP-7007、XP-7148は、ヘキサメチレン・ジイソシアネート(ＨＤＩ)をベースとする水分散性脂肪族ポリイソシアネートである。BAYHYDROLポリオールXP-7093は、ポリオール分散物である。界面活性剤BYK-345は、ポリエーテル変性ポリジメチルシロキサンであり、BYK-Chemie(コネチカット州ウォリンフォード)から入手した。ジイソプロピルフルオロホスフェート(ＤＦＰ)、ブラッドフォード試薬、ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)、ビス-トリスプロパン、トリス(ヒドロキシルメチル)アミノメタンＨＣｌ(トリス-ＨＣｌ)、ＣａＣｌ2、ＮａＣｌ、Ｋ2ＣＯ3及びイソプロパノールは、Sigma-Aldrich Chemical Co.(ミズーリ州セントルイス)から購入した。ＤＦＰａｓｅは、BioCatalytics, Inc.(カリフォルニア州パサデナ)から購入した。エポキシ樹脂であるポリベッド８１２埋込み樹脂は、Polysciences(ペンシルベニア州ウォリントン)から入手した。
【００１３】
｛方法｝
＜ＥＣＣ合成＞
ＥＣＣは、混合水の緩衝液(ビス-トリスプロパン１０ｍＭ、ｐＨ７.５、ＣａＣｌ2５ｍＭ)を使用して調製した。２成分の水性ポリウレタンは、ヘキサメチレン・ジイソシアネート(ＨＤＩ)BAYHYDURをベースとする水分散性脂肪族ポリイソシアネートと、ポリオール分散共反応剤BAYHYDROLを用いて合成した。ＥＣＣ合成では、イソシアネートとヒドロキシルの官能基の比は２であった。代表例として、BAYHYDROL XP-7093(２.５ｇ)(水分７０ｗ.％)、BYK-345界面活性剤(０.１ｇ)及び緩衝媒体(１.２ｇ)を、円筒形容器に入れて、その後、酵素ＤＦＰａｓｅ(０.０２〜９ｍｇ)を添加した。この水溶液を１分間、機械的(３００ｒｐｍ)にさらに撹拌した。ＥＣＣの合成に必要なBAYHYDUR XP-7063、XP-7007、XP-7148の量は、ポリイソシアネート等価分子量から求めた。XP-7007を用いる場合、ポリイソシアネート(１ｇ)を水溶液に添加し、その二相混合物を、２５００ｒｐｍの手持式ドリルに装着された特別仕様ヘッドを用いて２０秒間撹拌した。混合後、含水量６３ｗ％の白色エマルジョンを得た。予めイソプロパノールで洗浄し常温で乾燥した熱可塑性ポリオレフィン(ＴＰＯ)パネルに、このエマルジョンを加えた。次に、ＥＣＣを常温で１２時間硬化させ、再び重量測定した(０.２４ｇ)。
【００１４】
ビス-トリスプロパンは、ヒドロキシル基と第２級アミンを含んでおり、これらはコーティングの合成中にイソシアネートと反応する。反応混合物へ添加した緩衝塩の量は、ポリイソシアネートとポリオール分散物の反応性官能基と比べると無視できる程度である。それ故、得られた２成分の水性ポリウレタンの特性に対する影響は認められなかった。
【００１５】
＜蛋白質濃度の決定＞
蛋白質の濃度は、ブラッドフォード試薬を用いて評価した。室温で蛋白質溶液に色素を加えると、１５分以内に色素−蛋白質錯体が生成し、吸収は５９６ｎｍで最大であった。１〜１０ｍｇ／ｍｌの蛋白質濃度に対して、減衰係数０.０３４１ｍｌ／ｍｇを有する校正曲線が得られる。
【００１６】
＜酵素と金とのコンジュゲートの合成＞
直径２５〜３０ｎｍの金コロイドを調製し、水性媒体の中でＤＦＰａｓｅにコンジュゲートした。具体的には、金溶液(１００ｍｌの０.０１％ＨａｕＣｌ4.２Ｈ2Ｏ)を、ガラス製フラスコの中で沸騰するまで加熱した。クエン酸３ナトリウム(０.０１５％で５ｍｌ)を加え、混合物を更に沸騰させた。オレンジ／レッド色を持続した時がコロイド形成が完了した時である。コンジュゲートが行われる間、Ｋ2ＣＯ3を用いて、ｐＨが酵素等電点(ｐＩ５.８)より若干上になるように調整した。ｐＨはリトマス紙で測定した。例えば、３０ｍｌの金コロイド溶液(金濃度：０.０１％)を安定させるのに必要な酵素の量は０.１２ｇである。ＤＦＰａｓｅの添加後、酵素−金溶液を緩やかに撹拌し、ウシ血清アルブミン溶液(ＢＳＡ)(１０％(ｗ／ｖ))を加えて最終濃度を０.１％にした。ＢＳＡは、酵素でコートされなかったコロイド表面の領域をブロックした。得られた溶液を、１００,０００ｒｐｍで１時間、遠心分離した。沈殿物の中に回収した酵素−金コンジュゲートを、緩衝媒体(１０ｍＭのトリス-ＨＣｌ、ｐＨ７.５)の中で再溶解した。遠心分離により、金クラスターがある程度形成される。沈殿物の高密度領域内に存在するクラスターのうち最も大きなものは廃棄した。それより小さなクラスターは、コロイド状の金コンジュゲートの中に依然として存在する。酵素にコンジュゲートした２種類の異なる濃度のコロイド状の金(コーティング１ｇに対して金０.００１ｍｇと金０.０１２ｍｇ)を用いて、前述の如く、BAYHYDUR XP-7007のコーティングをさらに調製した。
【００１７】
＜コーティング内の金−ＤＦＰａｓｅコンジュゲートの局在化＞
透過型電子顕微鏡(ＴＥＭ)用フィルムを埋め込むために、小片を１００％エタノールの中で数回洗浄し、ポリベッド８１２埋込み樹脂の中で培養した。樹脂は１時間毎に数回交換した。数種類の埋込み用媒体を用いてもよいことは理解されるべきである。使用される埋込み用媒体の大部分は、エポキシ樹脂、変性エポキシ樹脂又はメタクリルポリマーをベースとするものである。フィルムは１ｍｍ×２ｍｍの小片にカットし、埋込み用モールドの中に入れ、ポリベッド８１２の中に埋め込んだ。ブロックを、３７℃で一晩中硬化させ、次に６５℃で２日間硬化させた。Reichart社製のウルトラカットＥミクロトームにより、超薄肉切片(６０ｍｍ)のフィルムを得た。切片は、JEOL JEM1210又は100CX透過型電子顕微鏡にて８０ＫＶで観察した。
【００１８】
＜フッ化物イオン電極を用いたＥＣＣの活性＞
重さ０.００９〜０.０１２ｇの剥離ＤＦＰａｓｅフィルムの切片を用いて、ＥＣＣを評価した。典型例として、切片を、１０ｍｌの３ｍＭ ＤＦＰ緩衝溶液(５ｍＭ ＣａＣｌ2及び１０ｍＭビス-トリス-プロパン、ｐＨ７.５)の中に入れ、電磁撹拌によって撹拌した。ＤＦＰａｓｅは、ＤＦＰの結合及び加水分解によって作用するので(下記参照)、活性の測定は、室温のフッ化物イオン電極でフッ化物を放出することにより行なった。フッ化物のバルク溶液濃度は、２０秒毎に５分間測定した。
【００１９】
コーティング中の酵素濃度は、コーティング１ｇに対して０〜２ｍｇの範囲で変動があった。ＥＣＣは、酵素濃度が高いとき、初期速度の活性が高すぎて測定することができなかった。
【化１】
2005516620.tif 000003
【００２０】
＜フッ化物イオン電極による動力学的定数の決定＞
動力学的定数(kinetic constants)は、前述のフッ化物センサーにより測定した。基質(substrate)の濃度は、０〜２０ｍＭであった。データは、非線形回帰(Sigma Plot Version 2)を用いて、ミハエリス−メンテン(Michaelis-Menten)式にフィットさせた。
【００２１】
＜拡散細胞実験＞
拡散装置は、ドナーとレセプターのコンパートメントから構成され、それらの夫々にウォータージャケットが配備されている。拡散システムは、水平に並んだ２つのチャンバーから構成される。チャンバーのコンパートメント容積は３ｍｌであり、拡散断面積はＩＤ＝９ｍｍである。ＥＣＣを２つのコンパートメント間に配備し、実験は室温(２２℃)で行なった。
【００２２】
・基質有効拡散係数Ｄeffの決定
当該分野で知られた以下の手順により、基質有効拡散係数Ｄeff(ｍ2／分)を推定した。タチナタマメ(Jack beans)のUrease Type IIIをSigma(ミズーリ州セントルイス)から購入し、ＤＦＰａｓｅの存在をシミュレートするために、コーティングの中に固定化した(コーティング１ｇに対して３.６ｍｇ)。まず最初に、３ｍｌの緩衝媒体(５ｍＭ ＣａＣｌ2及び１０ｍＭ ビス-トリス-プロパン、ｐＨ７.５)にＤＦＰ(４ｍＭ)を加え、これをドナー細胞に入れた。一方、レセプター細胞には、緩衝媒体(３ｍｌ)が充満している。各細胞は、磁気撹拌により十分に混合した。一定時間(５〜３００分)の経過後、内容物を取り出し、緩衝媒体(５ｍＭ ＣａＣｌ2及び１０ｍＭ ビス-トリス-プロパン、ｐＨ７.５)で４回希釈した。次に、各サンプルのＤＦＰ濃度を、可溶性ＤＦＰａｓｅを用いた活性アッセイにより求めた。Ｄeffは、準定常状態で計算した(式１)。
【００２３】
【数１】
2005516620.tif 000004
[ＤＦＰ]DはドナーのＤＦＰ濃度(モル／ｍ3)であり、[ＤＦＰ]Rはレセプター細胞内のＤＦＰ濃度(モル／ｍ3)である。Ｖcell(３.１０-6ｍ3)は細胞容積であり、Ａ(６.３６.-5ｍ2)は拡散断面積である。ポリウレタンフィルムの膨脹が主として厚さ方向に起こると仮定し、濡れＥＣＣの厚さδ'を、次の如く推定した。
【００２４】
【数２】
2005516620.tif 000005
乾燥コーティングの厚さδ(１０μｍ)については、走査型電子顕微鏡を用いて測定した。ε(０.７)は、濡れコーティング中に液相全体積が占める割合である。
【００２５】
・活性測定
細胞には、緩衝液(５ｍＭ ＣａＣｌ2及び１０ｍＭ ビス-トリス-プロパン、ｐＨ７.５)が充満している。まず最初に、ドナー細胞にＤＦＰ(４ｍＭ)を加えた。レセプター細胞中の初期ＤＦＰ濃度は、０又は４ｍＭのどちらかである。実験は、一定のＤＦＰａｓｅ−ＥＣＣ濃度(コーティング１ｇに対して３.６ｍｇ)を用いて行なった。基質の完全な分解は、妥当な時間範囲内で起こった。各細胞は、磁気撹拌により十分に混合した。一定時間(５〜１２０分)経過後、内容物を取り出して、緩衝液(５ｍＭ ＣａＣｌ2及び１０ｍＭ ビス-トリス-プロパン、ｐＨ７.５)で４回希釈した。次に、各サンプルのＤＦＰ濃度を、可溶性ＤＦＰａｓｅを用いた活性アッセイにより求めた。
【００２６】
図１は、レセプター細胞がｔ＝０秒でＤＦＰを含んでいないとき、ＤＦＰａｓｅ含有ポリウレタンコーティングの中で拡散反応と酵素反応が同時に行われたときのＤＦＰ濃度プロフィールの模式図である。ｌｓは停滞溶液層、δはコーティング厚さである。ＣDFP,D,tは時間ｔにおけるドナー細胞内のバルクＤＦＰ濃度、ＣDFP,R,tは時間ｔにおけるレセプター細胞内のバルクＤＦＰ濃度である。ＣDFP,O,tはコーティングの液相の表面でのＤＦＰ濃度であり、ＣDFP,δ,tは時間ｔにおけるコーティングの液相内のＤＦＰ濃度である。境界層の拡散抵抗とＥＣＣ膨張を無視すると、ＤＦＰａｓｅ−ＥＣＣが非定常状態のときのＤＦＰ濃度プロフィールは、式３によって与えられる。
【００２７】
【数３】
2005516620.tif 000006
[ＤＦＰ]lc(モル／ｍ3)はコーティングの液相中のＤＦＰ濃度であり、ｋcat,int(ｓ-1)及びＫM(モル／ｍ3)は、ＥＣＣに固有の動力学的定数である。なお、初期条件は次の通りである。
【数４】
2005516620.tif 000007
【数５】
2005516620.tif 000008
【００２８】
ＥＣＣとドナー細胞の界面では次の関係がある。
【数６】
2005516620.tif 000009
ここで、[ＤＦＰ]0は、ＥＣＣの表面(Ｘ＝０)における液相中のＤＦＰ濃度を表す。
Ｖsurface(モル／ｍ3.ｓ)は、コーティング表面(ｘ＝０)における加水分解速度を表す(式７)。
また、ＶRelease(モル／ｍ3.ｓ)は、酵素によって触媒された反応速度である(式８)。この酵素は、ＥＣＣの合成中に共有結合で固定化されず、ドナー細胞の中に放出された酵素である。
【００２９】
【数７】
2005516620.tif 000010
ここで、[ＤＦＰａｓｅ]Surface(モル／ｍ3)は、コーティング表面において、ドナー細胞の単位容積当たりの酵素のモル数である。
【００３０】
【数８】
2005516620.tif 000011
ここで、[ＤＦＰａｓｅ]Release(モル／ｍ3)は、ドナー細胞容積に関して計算され、ｋcat,native及びＫM,nativeは表１に示されている(実験１a*).
【００３１】
ドナー細胞とレセプター細胞のＤＦＰ濃度プロフィールが実験で求められると、式２の解は、Athena Visual Version 7.1.1により、式３〜式７を用いて得られる。次に、ＥＣＣの固有動力学的定数ｋM,intとｋcatk,intを計算した。
【００３２】
・Desmodule N3400による酵素修飾
ＤＦＰａｓａ含有溶液(１ｍｌ)(５０ｍＭ ＭＯＰＳ、５ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ７.５)を、ＨＤＩの二量体及び三量体からなるDesmodur N3400(１ｇ)へ加えた。二相性混合物(biphasic mixture)を、室温で撹拌した。修飾酵素(modified enzyme)の活性は、前述のフッ化物センサーによって測定した。
【００３３】
ＤＦＰａｓｅ修飾の程度を直接測定することはできないので、模擬的手段として、Desmodur N3400と酵素リジン残基の反応を、リジン残基を１つ含む低分子量ペプチド(１１８２.４Ｄａ)であるブラジキニン(Bradykinin)potentiator Bを用いて調べた。リジン修飾の程度については、MALDI-TOFを使用し、反応時間(１５分〜１７時間)を種々変えて調べた。
【００３４】
MALDI-MS分析は、Perseptive Biosystems製のVoyager elite MALDI-TOFを用いて行なった。加速電圧は、線形モードで２０ｋＶに設定した。ペグ化酵素(PEGylated enzyme)溶液(１〜２ｍｇ／ｍｌ)を、等量のマトリックス溶液(水０.５ｍｌ、アセトニトリル０.５ｍｌ、ＴＦＡ２μｌ、及びα-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸８ｍｇ)と混合し、最終溶液２μｌを板状ターゲットにスポットした。溶媒混合物蒸発後のスペクトルを記録し、ＦＭＲＰ及びＡＣＴＨで外的較正を行なった。
【００３５】
Desmodur N3400で修飾したＤＦＰａｓｅは、前述のポリウレタンコーティング中でさらに固定化した。
【００３６】
＜ＥＣＣの熱安定性＞
天然の固定化されたＤＦＰａｓｅを、６５℃で培養した緩衝液(１０ｍＭ ＢＴＰ、５ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ７.５)に加え、常温の上記緩衝媒体(１０ｍＭ ＢＴＰ、５ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ７.５)の中でアッセイを行なった。
【００３７】
乾燥ＥＣＣの熱安定性を、室温で測定した。周囲条件下で一定時間保存した後、ＥＣＣサンプルを、常温の上記緩衝媒体(１０ｍＭ ＢＴＰ、５ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ７.５)の中でアッセイを行なった。
【００３８】
結果及び検討
＜ＥＣＣに固定されたＤＦＰａｓｅの可逆性＞
ＤＦＰａｓｅのポリマーへの固定度を、ブラッドフォード試薬を用いて調べた。ＤＦＰａｓｅ含有ポリウレタンコーティングを、パネルから剥がし、小さな切片にカットし、蒸留水で十分に洗浄した。ＥＣＣにロードした蛋白質が洗浄排水の中で検出された量は４％(ｗ／ｗ)より少なく、これは、固定化率(immobilization efficiency)が約１００％に近いことを意味する。
【００３９】
＜ＥＣＣ内の酵素分布＞
酵素をフィルムの中に入れる際、重要な問題は、酵素がフィルムの中に均等に分布しているかどうかである。従来、ポリウレタンのモノリシックフォーム(monolith foam)の中に固定酵素を局在化する(localize)のに金の標識体が用いられていた。それ故、本発明では、コロイド状金粒子にコンジュゲートすることにより、ＤＦＰａｓｅをＥＣＣの中で局在化させた。
【００４０】
図２は、ポリウレタンコーティング内の酵素分布を示している。金／ＤＦＰａｓｅを含有するコーティングは、暗視野(Ａ；コーティング１ｇに対して金０.０００７ｍｇ)を用いて分析し、光学顕微鏡(Ｂ；コーティング１ｇに対して金０.０１１６ｍｇ)を用いて逆像(ネガ像)を得た。ここでネガ像を用いたのは、コーティングが厚く、金粒子の濃度が高いため、集束像を得ることが困難だからである。コーティングの断面は、透過型電子顕微鏡を用いて得た(Ｃ及びＤ)。黒矢印は金／酵素粒子を示しており、白抜き矢印は金／酵素のコンジュゲートクラスターを示している。矢尻は、埋め込まれた樹脂の中にあるコーティングサンプルの先端を示している。星印は、金粒子の濃度が高く、表面が不均一であるために、集束されていない領域を表している。コーティングの中の泡は、文字ｈによって示されている。Ｂの中に示されるサイズバーは、パネルＡとパネルＢを表している。Ｃ及びＤ中に示されるサイズバーは、それらパネルにおける寸法を示している。
【００４１】
図２Ａは、暗視野顕微鏡検査(コーティング１ｇに対して金０.００１ｍｇ)によって得られた金／ＤＦＰａｓｅコンジュゲート含有コーティングの顕微鏡写真であり、図２Ｂは、逆像光学顕微鏡検査(コーティング１ｇに対して金０.０１２ｍｇ)によって得られた、金／ＤＦＰａｓｅコンジュゲート含有コーティングの顕微鏡写真である。固定化されたコロイド状金／酵素コンジュゲートの濃度が１２倍増加すると、固定化された金／酵素錯体は、コーティング内で均一に分散する。金／酵素含有コーティング(コーティング１ｇに対して０.０１２ｍｇ)の断面のＴＥＭは、図２Ｃ(２５００倍拡大)及び図２Ｄ(１００００倍拡大)に示されている。光学顕微鏡検査の場合と同様、ＴＥＭもまた、金／ＤＦＰａｓｅ粒子とクラスターは、微小規模レベルではランダムに分配されていることを示している。これは、金／ＤＦＰａｓｅコンジュゲート含有コーティングの合成により、金／ＤＦＰａｓｅ錯体が重合体マトリックスの中で一様に固定されることを意味している。外挿法(extrapolation)により、フィルム中のＤＦＰａｓｅの局部濃度は位置依存性でないことを予測することができる。
【００４２】
＜ＥＣＣの活性＞
ＥＣＣは、ポリイソシアネート・プレポリマーXP-7007、XP-7148及びXP-7063を用いて調製した。図３は、各ＥＣＣの活性を、ＤＦＰａｓｅの初期ローディングの関数として示している。活性は、酵素濃度と正比例しており、これは、物質移動について実質的制限がないことを意味する。図２に示されるフィルムは無孔であるから、この結果は、フィルムの外側の薄層内の酵素だけが基質にアクセス可能(accessible)であることを意味する。
【００４３】
ポリイソシアネートの親水性は、XP-7148＞XP-7063＞XP-7007の順序で低下する。ＥＣＣの見かけの活性保持(apparent activity retention)は、ポリイソシアネートの親水性が低下するにつれて増加することは興味深いことである(図３参照)。脱水した有機溶媒中の酵素活性を調べると、酵素は疎水環境の方をより好むことがわかった。親水性の低いポリイソシアネートが、ＥＣＣ用材料としてすぐれていることは、偶然の一致でないかもしれない。図３のコーティングは、ｐＨ７.５の緩衝溶液(１０ｍＭ ビス-トリス-プロパン、５ｍＭ ＣａＣｌ2)の中で、ポリオールXP-7093と、ポリイソシアネートXP-7007(黒菱形)、XP-7063(黒丸)及びXP-7148(黒四角)で合成したものである。黒三角は、DesmodurN3400で修飾されたＤＦＰａｓｅ、ポリオールXP-7093及びポリイソシアネートXP-7007を出発物質として合成したコーティングの見かけの活性である。ＤＦＰ濃度が３ｍＭ濃度のときバイオプラスチックの活性が報告されている。
【００４４】
ポリイソシアネートXP-7007を用いて生成したＥＣＣは、見かけの活性保持レベルが非常に高く、その後で行なう予備成形には、XP7007含有ＥＣＣを用いた。見かけの動力学的特性を、ロードされた全ての酵素が利用可能であると仮定して計算すると(表１、実験１b*)、内在性保持(intrinsic retention)ではなく、活性保持(１１％)が観察可能となる。
【００４５】
＜ＥＣＣ中のＤＦＰの有効拡散率Ｄeff＞
ＥＣＣ中の活性保持力を理解するために、フィルム中の基質の拡散率(diffusivity)を調べた。式１を用いて求めたＤeffは、(５＋／−１)×１０-10ｍ2／分である。図４のコーティングは、ポリオールXP-7093とポリイソシアネートXP-7007を用いて合成したもので、実験は、細胞拡散装置を用いて、ｐＨ７.５の緩衝媒体(１０ｍＭ ビス-トリス-プロパン、５ｍＭ ＣａＣｌ2)の中で行なった。Ｄeffは、気体から液体への拡散係数又は有機溶質からヒドロゲルへの拡散係数よりも、２〜３桁少ないということが知られている。同様に、従来より、２成分の水性ポリウレタンコーティングは塩化物イオンの拡散に対する抵抗性が高いことが観察されている。コーティング中に存在する酵素の基質に対するアクセス性(accessibility)は、コーティング透過性が低いときは明らかに制限されている。この結果もまた、ＥＣＣの活性保持を求める上で、ＤＦＰのコーティングへの侵入度を考慮せねばならないことを示している。
【００４６】
図５は、ＤＦＰａｓｅ−ＥＣＣ(コーティング１ｇに対して３.６ｍｇ)を使用した例であって、ドナー細胞とレセプター細胞中のＤＦＰ濃度の時間経過による変化を示すグラフであり、両細胞のＤＦＰの初期濃度は４ｍＭである。実験は、ｐＨ７.５の緩衝媒体(１０ｍＭ ビス-トリス-プロパン、５ｍＭ ＣａＣｌ2)の中で行ない、ドナー細胞とレセプター細胞は両方共、ＤＦＰの初期濃度は４ｍＭである。ドナー細胞(黒菱形)とレセプター細胞(黒丸)について、時間経過によるＤＦＰ濃度の変化を測定した。ドナー細胞とレセプター細胞内のＤＦＰの理論的プロフィールは、対称であるため、同一である。それゆえ、実験で求めたドナー細胞とレセプター細胞の濃度曲線は、式２〜式７及びAthena Visual 7.13.1を用いてシミュレートした同じプロフィール(破線)として記載されている。ドナー細胞及びレセプター細胞内のＤＦＰ濃度低下プロフィールについても、同様な傾向を示している。固定化されたＤＦＰａｓｅがコーティングの中で一様に分布していると仮定すると、コーティングの両面では、酵素による活性保持はほぼ同じである。硬化時、ＥＣＣの上面はＴＰＯパネルに接触し、下面は空気に曝されている。ＥＣＣの外表面の活性保持に殆んど違いがないと仮定すると、空気の界面と、重合体／疎水性環境は、ＥＣＣの活性保持に影響を及ぼさない。
【００４７】
ＤＦＰａｓｓｅ−ＥＣＣ(コーティング１ｇに対して３.６ｍｇ)について、ドナー細胞とレセプター細胞内のＤＦＰ濃度プロフィールを測定した。レセプター細胞の中にＤＦＰは存在しない(図６参照)。コーティングの合成は、ポリオールXP-7093及びポリイソシアネートXP-7007と、コーティング１ｇに対して３.６ｍｇロードしたＤＦＰａｓｅを用いて行なった。実験は、ｐＨ７.５の緩衝媒体(１０ｍＭ ビス-トリス-プロパン、５ｍＭ ＣａＣｌ2)中で行ない、初期状態は、ドナー細胞内のＤＦＰは４ｍＭであり、レセプター細胞にはＤＦＰが含まれていない。
図６ａは、ドナー細胞内(黒三角)とレセプター細胞(黒丸)について、時間経過によるＤＦＰの濃度変化の測定結果を示している。ドナー細胞(点線)とレセプター細胞(破線)について、シミュレートしたＤＦＰ濃度プロフィールを、式２〜式７及びAthena Visual 7.13.1を用いて求めた。図６ｂは、ＥＣＣの基質濃度プロフィールの計算結果を示しており、０(中破線)、３０(実線)、６０(短破線)、９０(一点鎖線)、１２０(点線)、１８０(二点鎖線)、２８０(長破線)で計算したものである。式３は、実験結果をよく表している(図６ａ)。
固定化されたＤＦＰａｓｅの推定固有ミハエリス定数ＫM,int(表１、実験２b**)は、拡散装置なしで得られた定数(表１、実験１b*)と同様である。基質拡散に対するコーティングの抵抗性を考慮に入れた場合、ｋcat,int(表１、実験２b**)は、拡散装置なしで測定した見かけのｋcat,app(表１、実験１b*)よりも２.４倍高いことは興味深いことである。コーティング内の基質について、実験回数を変えてシミュレートしたプロフィールに示されるように(図６ｂ)、実験の時間的経過により、基質はコーティングの３分の１まで侵入する。見かけの動力学的パラメータ(kinetic parameters)の推定値には、コーティング表面において、固定化された酵素層におけるＤＦＰの分解だけが含まれている。それゆえ、ＤＦＰａｓｅ−ＥＣＣの見かけの酵素有効率は、固定化されたＤＦＰａｓｅのこの外層の活性保持力に依存する。ＤＦＰａｓｅ−ＥＣＣの固有動力学的定数によって与えられるように、この層内の固有活性保持率は３８％である。ｋcatの見かけと固有の比Ｒは、ｋcat,app／ｋcat,int＝０.４であり、拡散装置なしで活性測定を行なう際、ＥＣＣの中で基質が到達可能な固定ＤＦＰａｓｅの割合を表す。
【００４８】
＜Desmodur N3400で修飾されたＥＣＣ＞
ポテンシエータ(potentiator)としてブラジキニン(Bradykinin)Ｂを含有する水溶液をDesmodur N3400と激しく混合することにより、ペプチドリジン残基はＨＤＩの二量体で化学修飾された。これはMALDI-TOFを用いて観察される。反応収率は７０〜９０％であり、これは１５分の反応時間で到達するが、ペプチド溶液をDesmodur N3400相とさらに混合しても収率は向上しなかった。
【００４９】
ポリイソシアネートDesmodur N3400は、ＨＤＩのウレトジオン(uretdione)を主体としており、コーティングの硬化時にバルク(bulk)から重合体／空気の界面へ移動することが知られている。ＤＦＰａｓｅをコーティングへ固定する前にDesmodur N3400で修飾することにより、固定化酵素は、コーティング表面の外層内に主として集中する。その結果、固定化されたＤＦＰａｓｅは、基質へのアクセス性が良好となり、見かけの活性保持力が向上する。ＨＤＩの二量体のイソシアネートと、ポテンシエータのブラジキニン(Bradykinin)Ｂのリジン残基との良好な反応が迅速に行われると仮定し、ＤＦＰａｓｅを、１５分間Desmodur N3400と反応させた。酵素活性の低下は観察されなかった。図３及び表１(実験１ｂ#*)に示されるように、ＤＦＰａｓｅをDesmodur N3400で前処理することにより、ＥＣＣの見かけの効率は６４％上昇した。
【００５０】
＜ＥＣＣの熱安定性＞
前述したように、活性測定では、全ての固定化酵素が基質によって認識されるわけではない。アクセス不可能な酵素は、速度測定の妨げとならないから、拡散抵抗を特に考慮することなく、フィルムの熱安定性を求めることができる。
【００５１】
天然ＤＦＰａｓｅとは異なり、固定化されたＤＦＰａｓｅは、６５℃で二相性の熱不活性プロフィールを有する(図７参照)。固定ＤＦＰａｓｅ(黒四角)及び天然ＤＦＰａｓｅ(黒菱形)の非活性化は、緩衝溶液(１０ｍＭ ＢＴＰ、５ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ７.５)の中で行なった。残存酵素活性は、基質にＤＦＰ(３ｍＭ)を用いた緩衝媒体(１０ｍＭ ＢＴＰ、５ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ７.５)の中で、室温での時間経過による変化を測定した。二相間挙動を４パラメータ・モデルで表し、動力学的定数α1(０.３４±０.０３)、α2(０.１０±０.０１)、ｋ1(１.３±０.１)及びｋ2(０.０４２±０.００３)を、Marquardt-Levenberg(マルカート・レーベンベルグ)のアルゴリズム(SigmaPlot Version 2.0)を用いて求めた。
酵素を不活性化する際、適当な時間範囲内で実験を行なうために６５℃の高温を利用した。この範囲の培養時間では、２成分のポリウレタンコーティングは、水相中にさほど溶解しない。ＥＣＣは、当初、天然酵素と同様な不活性傾向を示した。しかしながら、初期段階で急速な不活性化が起こると、固定化酵素が安定で且つ活性な状態となり、残存活性は６〜７％である。３５０分以上経過しても、極めて安定した状態のＤＦＰａｓｅ−ＥＣＣの活性に顕著な変化は観察されなかった。ＥＣＣの二相性非活性化動力学は、次のスキームを仮定し、４パラメータ・モデルによってモデル化した。
【００５２】
【数９】
2005516620.tif 000012
ここで、Ｅは酵素の初期状態、Ｅ1は酵素の中間状態、Ｅ2は酵素の最終状態である。α1はびＥ1の残存活性、α2はＥ2の残存活性である。また、ｋ1及びｋ2は、一次非活性化率を表す。酵素活性αの解析解は、式１０によって与えられる。
【００５３】
【数１０】
2005516620.tif 000013
ここで、ｔは、非活性化時間を表す。式１０にデータをフィットさせたものを図７に示している。
【００５４】
異なる非活性化経路を有するＥＣＣの中に異なる２種類の形態のＤＦＰａｓｅが存在すると仮定し、４つの物理的パラメータだけを必要とする別の動力学モデルでは、実験データを適切に記載することができなかった。また、少なくとも５以上のパラメータを含むようなさらに複雑な機構については考慮しなかった。
【００５５】
また、ポリウレタンフォームの中のＤＦＰａｓｅの不動化とペグ化は、一次不活性化動力学から二相性不活性化動力学への移行を引き起こした。構造的変化によって生じるＤＦＰａｓｅ−ＥＣＣの熱不活性化は、ＤＦＰａｓｅ含有ポリウレタンフォームのモノリシスの熱不活性化について前述したものと同様に変化する。
【００５６】
ＤＦＰａｓｅ−ＥＣＣは、６５℃以上の室温でさらに高い安定性を示す。実際、ＤＦＰａｓｅ−ＥＣＣは、室温で１００日間保存後の活性損失は４０％にすぎない(図８参照)。残りの酵素活性については、ＦＰを基質として使用し、緩衝媒体(１０ｍＭ ＢＴＰ、５ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ７.５)の中で時間経過による活性を測定した。安定性の高いＥＣＣが周囲条件下で乾燥状態が維持されると、得られる触媒は、有効な汚染防止剤として様々な用途に適用することができる。
【００５７】
それゆえ、本発明は、単一工程の蛋白質−重合体の合成において、ポリオールとポリイソシアネートを使用して水性ポリウレタンコーティングの中にＤＦＰａｓｅを共有結合させるものである。固定化工程において、ポリイソシアネートXP-7007と、Desmodur N3400で修飾された酵素を使用することにより、最大の固有触媒効率(活性保持率１８〜３８％)がもたらされる。高温では、ＦＤＰａｓｅ−ＥＣＣの活性の９３％は急速に損なわれるが、その後は超安定(hyper-stable)になる。
【００５８】
本発明を、望ましい実施例を参照して説明したが、当該分野の専門家であれば、実施例について多くの変更及び変形をなし得るであろう。前記の説明及び請求の範囲は、それらの変更及び変形を包含するものと解されるべきである。
【００５９】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】ＤＦＰａｓｅ含有ポリウレタンコーティングの中での同時拡散と酵素反応におけるＤＦＰ濃度プロフィールの模式図である。
【図２】ポリウレタンコーティング内での酵素分布を示す図である。
【図３】ＤＦＰａｓｅ含有コーティングに対するＤＦＰａｓｅ濃度の影響を示すグラフである。
【図４】コーティングにおけるＤＦＰの有効拡散を示すグラフである。
【図５】ポリオールXP-7096とポリイソシアネートXP-7007を用いて合成し、１ｇ当たり３.６ｍｇのＤＦＰａｓｅをローディングしたコーティングについて、拡散細胞内のＤＦＰ消費プロフィールを示すグラフである。
【図６ａ】拡散細胞におけるＤＦＰの消費プロフィールを示すグラフである。
【図６ｂ】拡散細胞におけるＤＦＰの消費プロフィールを示すグラフである。
【図７】ＤＦＰａｓｅ含有コーティングの６５℃での熱活性化を示すグラフである。
【図８】ＤＦＰａｓｅ含有コーティングの室温での熱不活性化を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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