(57)【要約】調節酵素をスクリーニングするための方法を記載してある。本方法は、DNAライブラリーを発現するために設計されるトリブリッド細胞の使用を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
調節酵素のためのスクリーニング法であって、該方法は、推定上の酵素の発現ライブラリー、既知のDNA結合ドメインに融合されたベイト・タンパク質またはポリペプチド、および翻訳後に修飾されたタンパク質またはポリペプチドを認識するプレイ・タンパク質をコードする遺伝子を含むトリブリッド細胞であって、前記プレイ・タンパク質は、既知のタンパク質活性ドメインに付着されている細胞の構築を含み、これにより、使用の際に、前記発現ライブラリーに含まれる酵素による翻訳後修飾によって、前記プレイ・タンパク質もしくはポリペプチドによる前記ベイト・タンパク質もしくはポリペプチドの結合または認識により、リポーター遺伝子または前記酵素活性を認識することができる遺伝子の転写を引き起こす方法。
【請求項２】
前記細胞が真核生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が酵母細胞である、請求項１または請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記酵素が新生タンパク質またはポリペプチドの翻訳後の修飾に関与する、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
【請求項５】
前記酵素が、リン酸化、糖鎖形成、スルホン化、アセチル化、側鎖修飾、ニトロシル化、ユビキチン化、ミリストイル化、またはパルミトイル化の調節に関与する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記酵素がキナーゼまたはホスファターゼである、請求項４または請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ベイト・タンパク質が、腫瘍性タンパク質、キナーゼ、ホスファターゼ、受容体タンパク質、アダプタータンパク質、または足場タンパク質である、前述の請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項８】
プレイ・タンパク質が、細胞内で高次構造的に制約される、前述の請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項９】
プレイ・タンパク質が、カルボキシの結合およびタンパク質のアミノ末端によって高次構造的に制約される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
プレイ・タンパク質が、抗体またはSH2、PTB、14-3-3、およびWWドメインから選択されるポリペプチドである、前述の請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項１１】
プレイ・タンパク質が、融合タンパク質合成の迅速な検出を可能にするエピトープ・タグをさらに含む、前述の請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項１２】
請求項1〜11に記載の方法に使用するための、酵素または推定上の酵素のcDNAライブラリー、およびプレイ・タンパク質を発現するように設計されたトリブリッド細胞。
【請求項１３】
前記細胞が真核細胞である、請求項12に記載のトリブリッド細胞。
【請求項１４】
前記細胞が酵母細胞である、請求項12または請求項13に記載のトリブリッド細胞。
【請求項１５】
実施例に関して、および例示される、実質的に上記に記述された方法。
【請求項１６】
実施例に関して、および例示される、実質的に上記に記述された細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質またはポリペプチドのスクリーニング法に関する。より詳細には、本発明は、定義された機能を有するタンパク質またはポリペプチドを同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質またはポリペプチドは、細胞が動物、植物に由来するか、または微生物であるかどうかにかかわらず、細胞および生物体全体の両方の中の重要な化合物である。タンパク質は、両細胞の、および筋肉の収縮に細胞の構造を維持することから変動する非常に多様な機能を有し、免疫応答の調節に対するインシュリン分泌の対照からの分泌タンパク質のための体の鍵となる構成要素である。現在まで、ヒトゲノムのほとんど完全な辞書が決定されたが、我々は、まだこれらの遺伝子によってコードされるタンパク質の完全な辞書を知るには長い道のりであり、体に存在する異なる細胞種の多様な範囲のタンパク質の機能的な意義を理解するにはさらに長い道のりである。その上、ヒト以外の動物または植物の、および多くの重要な微生物のゲノムは、まだ解明されずにいる。たとえば、ヒトもしくはその他の動物のタンパク質またはポリペプチドの機能の知識は、疾患の病因を確立するために有用であろうし、同様に微生物において、このような知識は、病原体の感染機構を確立するために有用であろう。植物において、このような知識は、改善された作物植物を同定し開発する際に、または珍しいまたは絶滅の危機に瀕している種の保存のために有用である。
【０００３】
大部分のタンパク質の機能は、タンパク質に対する広範な変化によって制御されており、このような変化は、翻訳後修飾として知られている。通常、タンパク質は、その三次構造または最終的な高次構造への新生タンパク質の翻訳後修飾により、構造タンパク質または球状タンパク質（分泌性タンパク質）のいずれかになる傾向がある。これらの修飾は、一過性でまたは持続性に、短いまたは長い期限にわたってタンパク質機能を調節するであろう。タンパク質に対する修飾は、細胞の起源を問わず細胞機能の制御メカニズムの中心にある膨大な範囲の酵素（タンパク質も）によって行われてもよい。これらの酵素（特にヒト酵素）の多くは、現在ゲノムのレベルで特徴づけられているが、これらの正確な機能はまだ既知ではない。同様に、タンパク質上で生じるいくつかの修飾の細部が既知であるにもかかわらず、この調節の役目を果たしている酵素の正確な性質は明らかではない。酵母2ハイブリッド方は、10年前にわたってタンパク質-タンパク質相互作用を研究するための方法として記述されていた。本技術の最初の報告から、新規の相互作用タンパク質を同定するためにcDNAライブラリーをスクリーニングすることができるように修飾され、拡張されてきたが、より最近では、翻訳後修飾が必要なタンパク質-タンパク質相互作用の発見に間で拡張された。これは、チロシン・リン酸化依存的なタンパク質-タンパク質相互作用に対して最も広範に応用されており、相互作用は、第3の遺伝子（チロシンキナーゼ）の挿入に依存するので、これは酵母トリブリッドと呼ばれていた。また、この酵母トリブリッド・アプローチは、タンパク質-タンパク質相互作用についてcDNAライブラリーをスクリーンするために使用してもよいが、この場合、相互作用が発現された第3の遺伝子キナーゼによるチロシン・リン酸化に依存するときにのみ、相互作用するタンパク質を同定できると考えられる。
【発明の開示】
【０００４】
本発明は、酵母トリブリッド・アプローチの新規の拡張である。この際に、第3の遺伝子は、cDNAライブラリーとして発現され、このライブラリーから機能的な酵素が同定される。言い換えると、本技術は、定義された酵素機能（身体的な会合よりむしろ）を有する新規の遺伝子を同定する可能性を有する。
【０００５】
従来技術では、タンパク質-タンパク質相互作用を同定するための酵母ハイブリッド・アプローチに関する方法を含む、2つのカテゴリーに分類される。一般に、どのタンパク質-タンパク質相互作用が、これらの活性が誘導することができるかを検出することによって、調節酵素を同定することに依拠する。いくつかの方法では、タンパク質-タンパク質相互作用のために翻訳後修飾が必要であるものとして、タンパク質チロシン・リン酸化が記述されている。たとえば、米国特許第6,242,183号では、第1のタンパク質が第2のタンパク質と相互作用することができるかどうかを決定する方法を記述する。該方法は、a)(i)操作可能な状態でタンパク質結合部に結合されたリポーター遺伝子;(ii)第1の融合タンパク質を発現する第1の融合遺伝子（第1の融合タンパク質は、タンパク質結合部位に特異的に結合することができる結合部分に共有結合された第1のタンパク質を含む）;および(iii)第2の融合タンパク質を発現する第2の融合遺伝子（第2の融合タンパク質は、遺伝子活性化部分に共有結合され、高次構造的に制約されている第2のタンパク質を含む）を含む宿主細胞を提供する工程と;およびb)第１と第2のタンパク質の間の相互作用の測定としてのリポーター遺伝子の発現を測定する工程とを含む。
【０００６】
FieldsおよびSong(（1989）Nature 340, 245-246.）は、タンパク質-タンパク質相互作用を研究するための最初の酵母2ハイブリッドを記述する。第2のカテゴリーは、調節酵素の基質の発現クローニングに関係する。この方法は、Fashenaeら（Gene 250（2000）1-14）による有用な総説を含むいくつかの論文に記述されている。
【０００７】
従来技術の方法における問題は、これらが上流のシグナリング酵素の同定に対応しておらず、むしろ下流の基質または相互作用タンパク質の同定に対応していることである。したがって、基質タンパク質を同定するときに、その活性および／または機能をさらに決定する必要がある。
【０００８】
したがって、本発明は、調節酵素のためのスクリーニング法であって、該方法は、推定上の酵素の発現ライブラリー、既知のDNA結合ドメインに融合されたベイト・タンパク質またはポリペプチド、および翻訳後に修飾されたタンパク質またはポリペプチドを認識するプレイ・タンパク質をコードする遺伝子を含むトリブリッド細胞であって、前記プレイ・タンパク質は、既知のタンパク質活性ドメインに付着されている細胞の構築を含み、これにより、使用の際に、前記発現ライブラリーに含まれる酵素による翻訳後修飾によって、前記プレイ・タンパク質もしくはポリペプチドによる前記ベイト・タンパク質もしくはポリペプチドの結合または認識により、リポーター遺伝子または前記酵素活性を認識することができる遺伝子の転写を引き起こす方法を提供する。
【０００９】
有利には、本発明の方法は、同定されたタンパク質またはポリペプチドを、その機能または活性についてさらにスクリーニングする必要がなくなり、実際にさらに試験する必要なくタンパク質またはポリペプチドの機能または活性を確認することが可能である。これは、従来法によって同定することができるが、全く活性または機能を有しないか、または必要とされる機能または活性を有しないタンパク質またはポリペプチドを除去する際の研究者による時間および努力が実質的に不要になることを意味する。細胞は、真核生物または原核生物であってもよい。好ましくは、真核細胞は、酵母細胞であるが、培養ほ乳細胞の使用は、本発明の範囲内に含まれることが企図される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
「トリブリッド」の用語は、本明細書に使用されるものとして、効果に対して、第3の発現タンパク質またはポリペプチドの活性に依存的な2つのタンパク質またはポリペプチドを発現するように設計された細胞を企図する。
【００１１】
「ベイト・タンパク質」の用語は、本明細書に使用されるものとして、関心対象の任意のタンパク質を記述することが企図され、および診断、治療的、または薬理学的な使用に関して重要であるか、または重要であることが判明する可能性のあることが、既知であり、疑わしくいタンパク質、および今のところまだ未知のタンパク質を含む。好ましいベイト・タンパク質は、腫瘍性タンパク質（myc、ras、src、fos、およびfosの特にオリゴマーの相互作用ドメインなど）またはたとえばキナーゼ、ホスファターゼ、もしくは受容体タンパク質の細胞質ドメインなどの細胞周期の調節に関与する他のいかなるタンパク質も含む。潜在的なベイト・タンパク質の例は、サイクリンおよびサイクリン依存性キナーゼ（たとえばCdk2）、受容体-リガンド対、神経伝達物質タンパク質対、またはその他のシグナリング・タンパク質の対を含む。いずれの場合においても、ベイト・タンパク質は、既知の核酸結合ドメインに付着される。
【００１２】
「プレイ・タンパク質」の用語は、本明細書に使用されるものとして、高次構造を制約するタンパク質中に埋め込まれるか、またはタンパク質のカルボキシ末端およびアミノ末端に結合することによるかのいずれかによって、好ましくは高次構造的に制約されるタンパク質を企図する。任意に、プレイ・タンパク質は、従来の免疫学的な技術を使用する融合タンパク質合成の迅速な検出を可能にするエピトープ・タグをさらに含む。本明細書に記述されるもの以外のプレイ・タンパク質は、本発明に有用であてもよい。たとえば、cDNAは、任意のmRNA個体群から構築されてもよく、周知の商業的に入手可能なキットおよび方法を使用して適切な発現ベクターに挿入されてもよい。好ましくは、本発明のプレイ・タンパク質は、単鎖の抗体、またはその他の検出器タンパク質（detector protein）、またはSH2、PTB、14-3-3、もしくはWWドメインとして既知のポリペプチドなどのポリペプチド・モジュールである。
【００１３】
いずれの酵素を本発明に使用してもよいが、好ましくは、酵素は、新生タンパク質またはポリペプチドの翻訳後修飾に関与する酵素である。より好ましくは、酵素は、亜リン酸、糖、もしくは硫黄の付加または除去において、またはアミド化、ニトロシル化、ユビキチン結合、ミリストイル化、およびパルミトイル化を含む側鎖の延長（たとえばアセチル化）または減少または分岐において役割を有する。理想的には、本発明は、タンパク質またはポリペプチド、たとえばキナーゼまたはホスファターゼに対してリンの付加または除去に付随するか、または役割を担う酵素を同定する。これらの中で、本発明は、特にチロシンおよびセリン／スレオニンキナーゼまたはホスファターゼ、およびチロシンまたはセリン／スレオニンキナーゼまたはホスファターゼを含むカスケード系の上流または下流の酵素に関する。
【００１４】
第2の側面において、本発明は、上記した方法に使用されるトリブリッド細胞を提供する。
【００１５】
好ましくは、トリブリッド細胞は、上述された真核細胞、特に酵母細胞である。
【００１６】
好ましくは、先に定義したとおり、トリブリッド細胞は、酵素または推定上の酵素のcDNAライブラリーおよびプレイ・タンパク質を発現するように設計される。また、細胞は、先に定義したとおり、基質（substate）またはベイト・タンパク質を受けるように形質転換させることが可能であり;全ての成分（ライブラリー、プレイおよびベイト）が細胞によって発現されるときに、細胞は、上記に定義したとおりにトリブリッド細胞であって、本発明の方法に使用するために適している。
【００１７】
好ましくは、ベイト・タンパク質とプレイ・タンパク質の相互作用により、トリブリッド細胞によって発現される予め選択されたタンパク質の翻訳後修飾を誘導する。
【００１８】
この修飾されたタンパク質は、たとえばマーカー反応（比色反応など）を使用することにより、またはインジウムの使用により、検出することができる。本発明の好ましい態様において、抗体が使用される。抗体は、単鎖抗体またはモノクローナル抗体であることが望ましい。
【００１９】
以下の記述において、本発明は、酵母細胞の使用に関して記述してある。しかし、本方法は、任意のトリブリッド細胞において同等の有用性が見いだされるので、これは、本発明の範囲を限定することが企図されないことが理解される。
【００２０】
同様に、本発明は、キナーゼに関して後述するが、任意の酵素が同等の有用性で使用されてもよいので、本発明の範囲をキナーゼに限定することは企図されない。
【実施例１】
【００２１】
本発明者らは、LAT機能の上流のチロシンキナーゼ調節因子について、ヒトJurkat T-リンパ球cDNAライブラリーをスクリーニングするための新規の酵母スリー・ハイブリッド・アプローチを準備した。LAT（T細胞の活性化のためのリンカー）は、T細胞活性を調節する際に重要な役割を果たし、初期のキナーゼ活性、特にZAP70およびSykからPLCγアイソフォームの活性化にリンクしている。LATは、高度にチロシン・リン酸化され、本発明者らはチロシンキナーゼのSykファミリーのメンバーが、そのリン酸化の原因であることを知っているが、T細胞活性を調節するための重要な役割を果たしているその他のいまだ未確認のキナーゼが存在する可能性が高い。本系は、転写活性化因子を形成することができる、または転写活性化因子の形成を防止する3つのタンパク質を含む。2つのハイブリッドの融合タンパク質以外に、第3のパートナーが、Met25パートナーの制御下でJurkat cDNAライブラリーから発現される。この遺伝子は、メチオニンのない培地においてポジティブに調節される。ここで、本発明者らは、特異的なチロシンキナーゼが、アッセイ法における第3のパートナーとしてコードされる状況では、一方がDNA結合ドメインに融合され、他方が活性化因子ドメインに融合された2つのタンパク質の間の相互作用を促進することを示す。このような方法で、Jurkat cDNAライブラリーをスクリーニングして、新規のチロシンキナーゼ（キナーゼX）を同定し、その後にこれが、Jurkat T-細胞においてLATをリン酸化する役割を担うことを証明した。
【００２２】
酵母形質転換  
酵母株TAT7（MATα、ade2、ura3、leu2、trp1、his1）を三者間の形質転換のために使用した。ヒスチジン（HIS）栄養素要求性アッセイ法のために、酵母をHISを欠いた適切なドロップアウト・プレート上にスポットし、10mMの3-アミノトリアゾール（3-AT）を追加した。β-ガラクトシダーゼ・アッセイ法は、後述するように液体培養において、またはニトロセルロースフィルター上で行った。一般的な酵母での方法を前述したとおりに使用した。
【００２３】
β-ガラクトシダーゼ・アッセイ  
フィルターアッセイ法のために、二倍体をニトロセルロースフィルター上にまき、標準的な方法によってβ-ガラクトシダーゼ活性の定量的決定を行った。簡単には、二倍体（107細胞/ml）をペレットにして、ガラスビーズを添加した後に0.2mlの破壊緩衝液（100mMのトリス-HCl、pH8、1mMのDTT、20%のグリセリン）中で激しく振盪することによって破壊した。100mlの二倍体の可溶化液を28℃で0.5〜4時間（T、分で）、20mlのオルト・ニトロフェニルβ-D-ガラクトピラノシド（ONPG、1.5mg/ml）と共にインキュベートした。反応を50mlの1MのNa2CO3を添加することによって止め、OD405を測定した。透明にした可溶化液のタンパク質濃度（C、mg／mlで）をBioradタンパク質アッセイを使用して決定した。nmol/min/mgで表したβーガラクトシダーゼ活性(A)は、以下の式にしたがって算出した：A=1.7 OD405/0.045TC、式中1.7は、反応体積を補正し、0.0045は、ONPGの1nmol／mlの溶液の光学濃度ある。
【００２４】
プラスミド構築物  
ガラクトース誘導性プロモーターおよび転写開始および終結配列を含む酵母-大腸菌シャトル・プラスミドのYlexAを使用した。Lexオペレーターに結合する大腸菌タンパク質LexA（アミノ酸1〜202）の遺伝子およびその他の遺伝子をクローン化するための制限部位をインフレームでポリリンカー中に挿入する。このプラスミドを適切な制限酵素によって消化して、以下のcDNAを挿入して「プレイ」タンパク質：(i)ヒトPLCγ2タンデムSH2ドメイン（pPLCSH2）または(ii)単鎖の抗ホスホチロシン抗体（pYScFv）を形成させて、チロシン・リン酸化の複数の基質を同定するために一般的な検出器を使用した。ベイト・タンパク質基質のLAT遺伝子は、Gal4の転写活性化ドメインに融合してプラスミドpLATを形成した。
【００２５】
ヒトcDNAライブラリーのスクリーニング  
ヒトJurkatT-リンパ球cDNAライブラリー（pLib）を構築した。簡単には、ランダムおよびオリゴ（dT）プライマーを使用して、成体マウス脳のポリ(A)で選択したmRNAからcDNAを合成した。EcoRIリンカーをcDNAに付着した。cDNAのサイズを測り、500塩基対よりも長い断片を適切なベクターのEcoRI部位に挿入した。一次ライブラリーは、1,000,000の独立したコロニーから成る。ライブラリーのスクリーニングのために、pLATおよびpPLCSH2またはpYScFvを収容しているTAT7酵母を0.5mgのcDNAライブラリー・プラスミドで形質転換し、菌液から精製した、HISを欠いており、かつ10mMの3-ATを補った適切なドロップアウト・プレートにまいて、7日間30℃でインキュベートした。His+形質転換体では、上記の通りにβ-ガラクトシダーゼ活性を試験した。pLibプラスミドをβ-ガラクトシダーゼ陽性の形質転換体から単離して、挿入物を標準的なDNAシーケンシングによって決定した。
【００２６】
LATのチロシン・リン酸化に関与する新規キナーゼのスクリーニングアッセイ法を確認するために、pLibを置換するためにSyk構築物を使用した。Sykは、LATをリン酸化することが既知であり、スクリーニングアッセイ法のための陽性対照として使用した。
【００２７】
LATのインビトロ・リン酸化  
トリブリッド・ライブラリー・スクリーンから同定されたキナーゼXを昆虫SF9細胞においてHisタグと共に発現させて、標準的な手順でNi2+カラムによって精製した。LATをBL21大腸菌細菌中にGST-融合物として発現させて、グルタチオン-アガロースビーズを使用する標準的な手順によって精製した。Latが結合したビーズを20μlのキナーゼ・アッセイ緩衝液（5mMのMgCl2、5mMのMnCi2、100mMのNaCl、10μMのATP、20mMのHEPES、pH7.2で）に懸濁して、2μgのキナーゼXまたはポジティブ対照としての組換えSyk、またはネガティブ対照としての緩衝液と混合し、[γ-32P]-ATP（250μCi/ml）を添加することによって反応を開始した。25℃で15分間のインキュベーションの後、氷冷EDTA（0.5M）を添加することによって反応を終了させた。その後にビーズを洗浄し、試料緩衝液中に溶解し、タンパク質SDS-PAGEによって分離して、PVDF膜へ転写し、自己リン酸化ラベルの検出のためにオートラジオグラフィに供した。次に、ホスホチロシンの検出のために膜を免疫ブロットした（後述したとおり）。
【００２８】
ドミナントネガティブ変異体（DNM）のキナーゼXの作製  
トリブリッド・ライブラリー・スクリーンから同定された全長キナーゼXは、キナーゼ-ヌル変異体を作製するためにキナーゼドメイン内の重要な残基を変異させた。この変異体を作製するために、標準的な部位特異的変異誘発を使用した。本キナーゼは、その他の点では無傷であるが、キナーゼ活性を全く欠いており、したがってドミナントネガティブな変異体として使用するために適していた。キナーゼXおよびDNMキナーゼXの構築物を哺乳類発現ベクターpcDNA3にクローン化した。脂質に基づいたトランスフェクション系を使用して、これらの構築物のいずれかをJurkat T細胞にトランスフェクトした。次いで、LATのリン酸化を調節する際の、およびT細胞活性を調節する際のキナーゼXの役割を評価した。鑑定した。
【００２９】
LATの免疫沈降  
野生型キナーゼX、DNMキナーゼX、または対照として空のベクターをトランスフェクトしたJurkat T細胞をCD3の架橋によって刺激した。同体積の2×抽出緩衝液（2%（v/v）Triton X-100、300mMのNaCl、20mMのTris、1mMのPMSF、10mMのEDTA、2mMのNa3VO4、10g/mlロイペプチン、10μg/mlアプロチニン、1μg/mlペプスタチンA、pH7.3）で溶解することによって反応を停止し、遠心分離（13000g、5分、4℃）によって不溶性物質を除去した。次いで、上清を4℃で1時間プロテインA-セファロース（PAS）と共にインキュベーションし、続いて遠心分離（13000g、5分、4℃）することによって予め透明にした。次いで、上清をPASビーズおよび抗LAT抗体と共に4℃で120分間インキュベートした。次いで、ビーズを抽出緩衝液で1回、およびTBS-tでさらに2回洗浄した後に、Laemmliの試料処理緩衝液を添加した。次いで、沈殿したタンパク質をSDS-PAGEに供し、PVDF膜に転写して、以下の「免疫ブロッティング」に記載したとおりに適切な抗体によってプローブした。
【００３０】
免疫ブロッティング  
Jurkat細胞をCD3の架橋によって活性化して、同体積のLaemmli緩衝液（×2）を添加することによって反応を停止させた。試料を95℃で5分間加熱した。タンパク質を10％SDS-PAGEか、または5〜15％勾配のスラブゲルでのSDS-PAGEによるかのいずれかにより分離して、セミドライ転写系（60分、15V）を使用してPVDFブロッティング膜に転写した。膜を1次抗体と、続いて2次抗体と共に室温で60分間インキュベートし、ECL（Amersham、UK）によって検出した。
【実施例２】
【００３１】
図1&2は、既知の重要な鍵となる疾患に関連したタンパク質の活性を調節する可能性のある機能的に重要な遺伝子のcDNAライブラリーをスクリーニングするために行われる一般的なアプローチを示す。たとえば、タンパク質LAT（T細胞の活性化のためのリンカー）は、ホスホリパーゼCγアイソフォームの活性化、細胞のカルシウム応答、およびIL-2遺伝子の転写の誘導を含む主要なシグナリングおよび機能的なイベントに対してT細胞受容体をつなげさせるように、Tリンパ球に必要とされる足場タンパク質を高度に制御していることが知られている。LATは、T細胞の活性化によって高度にチロシン・リン酸化されること、およびこのリン酸化が、下流のシグナリングイベントに必要とされることが知られているが、どのチロシンキナーゼがリン酸化イベントの役割を担っているかは正確には明らかとなっていない。このアプローチにより、T細胞を媒介した疾患の治療に重要な新規標的を示すであろう推定上の上流のキナーゼを同定するためにヒト・キナーゼのライブラリーをスクリーニングすることができる。
【００３２】
関心対象のタンパク質（この場合はLAT）をpPREYベクターにクローン化して、GAL4活性化ドメインとの融合構築物を作製し、酵母に形質転換した。pBAITベクターは、これらが、lexA BDドメインと、選択的に翻訳後修飾を同定すると考えられるドメインとの融合物を発現するように構築してある。チロシン・リン酸化の場合、SH2またはホスホチロシン結合（PTB）ドメインを使用してもよいが、重要なことに、本発明者らは、チロシン残基のリン酸化を検出するために選択的な単鎖抗体（ScFvpY）も使用した。次いで、この構築物プラスプレイ構築物により、酵母を二重に形質転換した。次いで、活性な（または対照として不活性な）翻訳後修飾酵素をコードするcDNAライブラリーを形質転換して、3重に形質転換された酵母を形成する。マーカー遺伝子により、関心対象のタンパク質がライブラリーに発現された酵素によって修飾されたときに（この場合、LATは、チロシンがリン酸化される）選択されると考えられる。
【００３３】
以下の実験では、概念の証拠を示し、かつ検出器融合タンパク質が翻訳後修飾を検出するために作動するための最適な条件を決定するために、キナーゼ／基質パートナーの2つのセットをアッセイした。両方のセットは、チロシン・リン酸化の中心にあり：(i)上記したLAT系の使用、この場合、Sykによって、およびSrcファミリーのキナーゼのメンバーによって、LATをリン酸化することができる。チロシンがリン酸化されると、次いでLATはそのSH2ドメインを介してPLCγ2を結合することができる。したがって、この系のためには、検出器タンパク質は、PLCγ2SH2ドメイン（タンデム）および抗ホスホチロシン単鎖抗体ScFvpYである。(ii)Srcの基質として知られる上皮細胞成長因子（EGF）の受容体の細胞質末端の使用。チロシンがリン酸化されると、EGF受容体は、Shcのホスホチロシン結合ドメイン（PTB）のための結合部位として作用する。したがって、これは、一部のアッセイ法において検出器タンパク質として使用される。ScFvpYの広範な特異性のために、それはまた、この目的のために使用することができ、実際に多種多様なタンパク質基質のチロシン・リン酸化の検出のための汎用の検出器試薬として使用することができる。
【００３４】
図3において、酵母には：(i)Gal4のADドメインに融合された関心対象のタンパク質、EGF受容体細胞質末端、(ii)LexAの結合ドメインに融合された、アダプターShcのPTBドメインまたはScFvpYのいずれかの検出器タンパク質、および(iii)メチオニン抑圧可能なプロモーターの制御下のチロシンキナーゼSrcまたはCskの活性キナーゼドメインを3重に形質転換した。Cskは、チロシンキナーゼのSrcファミリーのもう一つのメンバーであり、このアッセイ法の対照として使用した。キナーゼのスクリーンでは、これらの後者の2つが、チロシンキナーゼのcDNAライブラリーの発現によって置換される。次いで、酵母をメチオニン（1mM）の存在下で培養し、これによりキナーゼの発現を抑制するように作用する。それぞれのアッセイ法について、3つのデータにするために、3つのコロニーを採集し、培養する。ヒスチジン（左側パネル）の存在下では、全てのコロニーが完全に増殖し、選択を除去したときに、全ての酵母のコロニーが増殖することができることを示している。これは、これらの酵母においてADおよびBDの融合構築物の非毒性の証拠となる。ヒスチジン（右側パネル）の非存在下では、メチオニンが必須の修飾酵素（SrcまたはCsk）の発現を抑制するので増殖は予測されない。ShcPTB-BD形質転換体では、増殖が見られなかったが、ScFvpY-BD形質転換体では、明らかに増殖した。これは、ScFvpYをLexA DNA結合ドメインと融合したときの、HIS3遺伝子の調節の漏出を示差する。
【００３５】
この問題を解決するために、ヒスチジンの競合的阻害剤の3-アミノ-1,2,4-トリアゾール（3-AT、1mM）の存在下において酵母を培養した（図4）。酵母は、EGFRt-ADおよびScFvpY-BDで二重に形質転換して、選択することができるようにヒスチジン(1mM)の存在下または非存在下のいずれかにおいて培養した。チロシンキナーゼの発現がなく、したがって、HIS3遺伝子の相互作用および発現を可能にする手段はないので、2つの融合タンパク質間の相互作用は、この実験では予想されない。ヒスチジンの存在下では、増殖が予想され、また観察され（上部左パネル）、これにより、酵母の生育性の証拠となる。ヒスチジン・アンタゴニストの3ATの毒性がないことを示すために、次いで酵母をヒスチジン（1mM）および過最大濃度の25mMの3AT（上部右パネル）の存在下で培養した。酵母の増殖は、この条件下で維持されたことから、25mMでさえも酵母生育性に対して3ATが毒作用でないことを示している。ヒスチジンの非存在下では、本発明者らがすでに示したように、3-ATの非存在下でHIS3遺伝子の漏出があり、酵母は増殖できる（底部左パネル）。しかし、この増殖は、ほんの1mMの3ATの存在下ではなくなり、したがって、これが、単鎖抗体検出器タンパク質ScFvpY-BDで形質転換された酵母のHIS3遺伝子の漏出を克服するための良好なアプローチであることを示している。
【００３６】
Srcキナーゼドメイン構築物で形質転換された酵母が、メチオニン依存的な様式でチロシンキナーゼ活性を発現することを証明するために、用量-反応の相関実験を行ってチロシンキナーゼ活性を検出した。図5は、Srcキナーゼドメイン構築物で単独で形質転換した酵母からの酵母全細胞可溶化液のウエスタンブロットを示す。酵母は、示したとおりの異なる濃度のメチオニンを含む培地中で培養し、試験緩衝液中に溶解した。タンパク質を10%ゲルのSDS-PAGEに流し、PVDF膜に転写して、4G10抗ホスホチロシンmAbでブロットした。メチオニンの非存在下では、Srcが発現し、いくつかの内因性の酵母タンパク質をリン酸化することができることが分かるであろう。Srcの発現は、0.2mMおよび上記のメチオニン濃度によって抑制され、メチオニンによる遺伝子発現の厳密な調節が、プロモーターを調節したことを示す。これは、酵母における活性なチロシンキナーゼの発現の明らかな証拠となる。
【００３７】
決定されたトリブリッド・アッセイ法のための最適な条件で、ScFvpY-BD形質転換酵母におけるHIS3遺伝子の漏れを防止するために必要とされる3ATの濃度に関して、およびチロシンキナーゼの発現を調節するために必要とされるメチオニンの濃度に関して、本発明者らは、完全なトリブリッド実験を行うことができた。図6では、酵母には：(i)Gal4のADドメインに融合された関心対象のタンパク質、EGF受容体細胞質末端、(ii)LexAの結合ドメインに融合された検出器タンパク質、アダプターShcまたはScFvpYのPTBドメインのいずれか、および(iii)メチオニン抑圧可能なプロモーターの制御下のチロシンキナーゼSrcの活性キナーゼドメインまたはCskによって3重に形質転換した。示したデータは、3回のものである。酵母をメチオニンおよびヒスチジン存在下または非存在下において培養した。ヒスチジンの存在下では、全ての条件に由来する酵母の完全増殖があり、ADおよびBD構築物の発現が有毒でなかったことを示している。ヒスチジンの非存在下では、メチオニンの存在下で培養した酵母では、チロシンキナーゼの発現が抑制されており、増殖を示さなかった。しかし、ヒスチジンおよびメチオニンの非存在下では、Srcで形質転換した酵母の有意な増殖があった（遠くの右パネル）。ShcPTB-BDではなく、ScFvpY-BDを検出器タンパク質として使用したときに、増殖はより顕著であった。加えて、CskよりむしろSrcで形質転換した酵母において、より優れた程度の酵母増殖があったので、CskよりもSrcについていくらかの選択作用があった。これらの全ての実験は、HIS3遺伝子の漏れを抑制するために3AT（1mM）の存在下で行った。したがって、この実験は、EGFRtおよびScFvpYパートナーについては、活性キナーゼSrcの発現により、相互作用を促進し、したがって基質のリン酸化を検出することができることを示す。選択性により、SrcがCskの上の上流キナーゼとして好ましいことが示され、基質のリン酸化を担っているキナーゼを同定するために、キナーゼのcDNAライブラリーをスクリーンするアプローチの潜在能力の証拠となる。より広い意味で、次いで、関心対象の任意の基質タンパク質のための、任意の明細書の修飾酵素（セリン／スレオニンキナーゼ、アセチラーゼ、グリコシラーゼ、その他を含む）を同定するために、翻訳後修飾の検出器としてScFvsを使用して、このアプローチをcDNAライブラリーに拡張させることができる。
【００３８】
図7は、キナーゼおよび基質の異なるセットを示す。ここでは、LATは、Gal4ADまたはLexABDのいずれかに融合された基質として使用される。検出器タンパク質は、Gal4ADもしくはLexABDに融合されたPLCg2SH2ドメインか、またはこの時Gal4ADに融合されたScFvpYのいずれかである。図に示したように、適切なパートナーの2重の形質転換体を作製した。次いで、SrcまたはSykの活性キナーゼドメインで酵母をさらに形質転換した。これらの両方のキナーゼは、インビボでLATのチロシン上をリン酸化する可能性を有する。この系において、ヒスチジンの存在下では、メチオニンの有無にかかわらず、全ての条件下で増殖があったので、これらの構築物の発現はいずれも、酵母に対して毒性ではない。しかし、ヒスチジンの非存在下では、チロシンキナーゼの発現が、メチオニンによって抑制されると、酵母の増殖はない。しかし、SykまたはSrcが発現されると、メチオニンの非存在下でもあらゆる条件で酵母の完全な増殖がある。これは、上記の図6に記載されているように、リン酸化が起こる場合にだけ、相互作用を検出するためにトリブリッド・アッセイを作動することができることを示す。
【００３９】
しかし、発現されたチロシンキナーゼが、BDおよびADの融合パートナーを結合するためのブリッジとして作用する可能性もあった。この可能性を除外するために、およびキナーゼ活性が、相互作用が生じるために必須であることを証明するために、本発明者らは、方法にて説明したように、Srcキナーゼドメインの点変異体構築物を作製した。LAT-AD（基質タンパク質として）、PLCγ2SH2-BD（検出器タンパク質として）、およびSrcの活性キナーゼドメインまたはその不活性変異体で3重に形質転換した酵母をメチオニンもしくはヒスチジンの存在下または非存在下において培養した。遺伝子発現は、増殖のHIS3調節についてだけでなく、方法にて説明したように、γ-ガラクトシダーゼ発現についてもモニターした。図8は、活性Srcキナーゼを3重に形質転換した酵母は、ヒスチジンを欠いた培地中では、Src発現のスイッチが入る場合であるメチオニンの非存在下においてのみ増殖することを示す。この結果は、その他のリポーター遺伝子β-galの発現によっても立証され、メチオニンの非存在下のみで発現される。しかし、対照的に、Srcの不活性点変異体では、ADおよびBDの融合タンパク質の相互作用を補助すること、およびリポーター遺伝子のスイッチを入れることができない。これは、キナーゼ活性が、トリブリッドを作動させるために必須であること、およびSrcがADおよびBDの融合タンパク質のための架橋タンパク質として作用するのではないことを示す。
【００４０】
要約すると、本発明者らは、次いで、2つの異なる酵素／基質パートナー系を使用して、キナーゼまたはその他の翻訳後修飾酵素のライブラリーをスクリーニングするための方法を確認した。翻訳後修飾を検出するために、一連の異なる検出器タンパク質が使用されてもよい。最も一般的に有用であるものは、この場合ホスホチロシンに対して向けられた単鎖抗体である。ScFvsは、いずれの翻訳後修飾に対して作製されてもよく、この点に関しては極めて応用が利く。次いで、関心対象の任意の基質タンパク質の上流に位置し、調節するキナーゼまたはその他の修飾酵素のcDNAライブラリーをスクリーンするために、この系を使用してもよい。
【００４１】
実験法  
酵母の形質転換  
酵母（Saccharomyces cerevisiae）株TAT7(MATα、ade2、ura3、leu2、trp1、his1）を3重の形質転換のために使用した。ヒスチジン（HIS）栄養要求性をアッセイするために、酵母形質転換体を、HISを欠いた適切なドロップアウト・プレート上にスポットし、25mMの3-アミノトリアゾール（3-AT）を添加した。β-ガラクトシダーゼ・アッセイを後述するようにニトロセルロースフィルター上で行った。一般的な酵母の方法は、前述したように使用した。
【００４２】
β-ガラクトシダーゼ・アッセイ  
HISを含む適切なドロップアウト・プレート上で培養した酵母形質転換体は、ニトロセルロースフィルター上にレプリカを作製した。フィルタ（酵母コロニーを含む側を上に）を液体窒素中に10〜15秒間浸漬し、室温で融解した。次いで、フィルタ（酵母コロニー側を上に）を0.3mg/mlのX-galおよび40μMのβ-メルカプトエタノールを含むZ-緩衝液（60mMのNa2HPO4、40mMのNaH2PO4、10mMのKCl、1mMのMg2SO4、pH7.0）に浸漬したワットマン3MM濾紙上に置き、X−galの青色の生成物への変換のために37℃で3〜10時間インキュベートした。
【００４３】
プラスミド構築物  
ADHプロモーターおよび終結配列を含む酵母-大腸菌シャトル・プラスミドpLexAを使用した。Lexオペレーターに結合する大腸菌タンパク質LexA（アミノ酸1〜202）の遺伝子(BD)およびその他の遺伝子をクローン化するための制限部位をインフレームでポリリンカー中に挿入する。チロシン・リン酸化の複数の基質を同定するために一般的な検出器を使用して、このプラスミドを適切な制限酵素によって消化して、以下のcDNAを挿入して「ベイト」タンパク質を形成する：(i)ヒトPLCγ2タンデムSH2ドメイン（pPLCSH2）または、(ii)Shcホスホチロシン結合ドメイン(ShcPTB）または、(iii)単鎖の抗ホスホチロシン抗体（ScFvpY）。
【００４４】
プレイ・タンパク質基質LATまたはEGFR(EGFRt)のC末端の領域をGal4の転写活性化ドメイン（AD）に融合し、プラスミドpPreyを形成した。SRC、Syk、およびCSKのチロシン・キナーゼドメイン（TK）を、メチオニンの存在下における遺伝子発現を防止するためのMet25プロモーターを含むpRs426Metに挿入した。
【００４５】
SRCのドミナントネガティブ変異体（DNM）の作製  
キナーゼ-ヌル変異体を作製するために、SRCのキナーゼドメイン内の重要な残基を（K298R）において変異した。この変異体を作製するために、標準的な部位特異的変異誘発を使用した。本キナーゼは、その他の点では無傷であるが、キナーゼ活性を全く欠いており、したがってドミナントネガティブな変異体として使用するために適していた。DNM SRCのキナーゼドメインは、pRS426 Metにクローン化した。
【００４６】
免疫ブロット  
酵母細胞（107細胞/ml）をペレットにして、ガラスビーズを添加した後に0.2mlの破壊緩衝液（100mMのTris-HCl、pH8、1mMのDTT、20%のグリセリン）中で激しく振盪することにイオって破壊した。タンパク質をSDS-PAGEによって分離し、PVDFブロッティング膜に転写した。膜を1次抗体と、続いて2次抗体と共に室温で60分間インキュベートし、ECL（Amersham、UK）によって検出した。
【００４７】
本発明の態様は、ここでは、以下の添付図面に関して実施例のみの方法により記述される：
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】タンパク質の翻訳後修飾に関与する機能的な酵素をクローニングするための方法に含まれる工程の概要を示すダイアグラムである。LAT-Tリンパ球の活性化のためのリンカー;pPREY-翻訳後修飾を同定するための遺伝子のためのDNA結合ドメイン融合ベクター;pBAIT-関心対象の遺伝子のための転写性の活性化ドメイン融合ベクター。ホスホチロシンのためのSH2およびPTBドメインおよび広範囲の修飾のための単鎖抗体を含む、翻訳後修飾を同定するために使用される遺伝子;pLIB-核局在化配列融合タグの有する、または有さない翻訳後修飾酵素のcDNAライブラリー。
【図２】プレイとしてSc-Fv抗ホスホチロシン抗体を使用する、LATをリン酸化するキナーゼとしてSrcを同定するためのトリブリッド・アプローチを示すダイアグラムである。NLS-核局在化配列;AD-活性化ドメイン;BD-DNA結合ドメイン;LAT-T細胞の活性化のためのリンカー;Sc-Fv-単鎖抗体の可変領域;P-ホスフェート;Pro-遺伝子プロモーター領域;TK-チロシンキナーゼドメイン。
【図３】ScFvpYをLexA DNA結合ドメインと融合するときの、HIS3遺伝子の漏れやすさを示す。ShcPTB-BD-LexA DNA結合ドメインと融合されたShcのホスホチロシン結合ドメイン（PTB）;ScFvPY-BD-LexA DNA結合ドメインと融合された抗ホスホチロシン単鎖抗体;EGFRt-AD-GAL4活性化ドメインと融合されたヒトEGF受容体のC-末端領域;SrcKDom-Src活性キナーゼドメイン;CskKDom-Csk活性キナーゼドメイン。
【図４】酵母をScFvpY-BDおよびEGFRt-ADによって形質転換したときに、1mMの3-アミノ-1,2,4-トリアゾールが、HIS3遺伝子発現の漏れやすさを克服することを示す一連の写真。*は、ScFvpY-BDおよびEGFRt-ADの両方によって形質転換した酵母を接種したプレートの領域を示す。
【図５】Srcキナーゼドメイン構築物を単独で形質転換した酵母に由来する酵母の全細胞可溶化物のウエスタンブロットを示す。NTY-形質転換されていない酵母;Met-メチオニン;WCL-全細胞可溶化液。この図は、メチオニンが、met抑圧的なプロモーター下のこの構築物を形質転換した酵母における活性Srcキナーゼドメイン発現を抑制することを示す。
【図６】SrcがEGF受容体の末端領域をリン酸化することを示すトリブリッド・アッセイ法の結果を示す：トラップ・プレイは、ShcPTBドメインまたは単鎖の抗ホスホチロシン抗体（ScFvpY-BD）である。
【図７】SrcまたはSykによるLATのチロシン・リン酸化を示すトリブリッド・アッセイ法の結果を示す：リン酸化は、プレイ・タンパク質PLCγ2-SH2ドメインまたは単鎖抗ホスホチロシン（ScFvPY）によって検出した。LAT-Tリンパ球の活性化のためのリンカー;PLCγ2 SH2-PLCg2のタンデムSh2ドメイン;ScFvpY-単鎖抗ホスホチロシン抗体;SrcKDom-ヒト・チロシンキナーゼSrcの活性触媒ドメイン;SykKDom-ヒト・チロシンキナーゼSykの活性触媒ドメイン。
【図８】非触媒的に活性なSrcの点変異体は、PLCγ2-SH2とLATの間の相互作用を維持することができないことを証明する酵母トリブリッド・アッセイ法の結果を示す。結果は、LATが酵母トリブリッド・アッセイ法においてSRCによるリン酸化によってPLCγ2 SH2と相互作用することを示す。pLexA-およびpGAD-の融合構築物をTAT7酵母株にpRS426-融合構築物と同時形質転換し、ヒスチジンおよびメチオニンの非存在下においてこれらが増殖し、βガラクトシダーゼを発現する能力を試験し、これをX-galの青色産物への変換をアッセイすることによって分析した。パネルは、左から右に、それぞれの形質転換体の3つのクローンが、ヒスチジン（-Hおよび+H）およびメチオニン（-Mおよび+M）を有し、および有さない固形培地において、およびフィルタ-βガラクトシダーゼ・アッセイ法(βーgal)で増殖したことを示す。Src-TK-ヒトSrcの触媒的に活性なキナーゼドメイン;Src-TK（KD）-ヒトSrcのキナーゼドメインの触媒的に不活性な点変異体。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年7月2日(2004.7.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
調節酵素のためのスクリーニング法であって、該方法は、推定上の酵素の発現ライブラリー、既知のDNA結合ドメインに融合されたベイト・タンパク質またはポリペプチド、および翻訳後に修飾されたタンパク質またはポリペプチドを認識するプレイ・タンパク質をコードする遺伝子を含むトリブリッド細胞であって、前記プレイ・タンパク質は、既知のタンパク質活性ドメインに付着されている細胞の構築を含み、これにより、使用の際に、前記発現ライブラリーに含まれる酵素による翻訳後修飾によって、前記プレイ・タンパク質もしくはポリペプチドによる前記ベイト・タンパク質もしくはポリペプチドの結合または認識が、リポーター遺伝子または前記酵素活性を認識することができる遺伝子の転写を引き起こす方法。
【請求項２】
前記細胞が真核生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が酵母細胞である、請求項１または請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記酵素が新生タンパク質またはポリペプチドの翻訳後修飾に関与する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
前記酵素が、リン酸化、糖鎖形成、スルホン化、アセチル化、側鎖修飾、ニトロシル化、ユビキチン化、ミリストイル化、またはパルミトイル化の調節に関与する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記酵素がキナーゼまたはホスファターゼである、請求項４または請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ベイト・タンパク質が、腫瘍性タンパク質、キナーゼ、ホスファターゼ、受容体タンパク質、アダプタータンパク質、または足場タンパク質である、前述の請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項８】
前記プレイ・タンパク質が、前記細胞内で高次構造的に制約される、前述の請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項９】
前記プレイ・タンパク質が、前記タンパク質のカルボキシ末端およびアミノ末端の結合によって高次構造的に制約される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記プレイ・タンパク質が、融合タンパク質合成の迅速な検出を可能にするエピトープ・タグをさらに含む、前述の請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項１１】
請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法に使用するためのトリブリッド細胞であって、前記トリブリッド細胞は、cDNAライブラリー由来の酵素または推定上の酵素、既知のDNA結合ドメインに融合されたベイト・タンパク質またはポリペプチド、および翻訳後修飾されたタンパク質またはポリペプチドを認識する抗体であるプレイ・タンパク質を発現するように操作されており、前記プレイ・タンパク質は、既知のタンパク質ドメインに結合されており、これにより、使用の際に、前記cDNAライブラリーに由来する酵素による翻訳後修飾によって、前記プレイ・タンパク質もしくはポリペプチドによるベイト・タンパク質もしくはポリペプチドの結合または認識が、前記酵素の活性を認識することができるレポーター遺伝子または遺伝子群の転写を引き起こすトリブリッド細胞。
【請求項１２】
前記細胞が真核細胞である、請求項11に記載のトリブリッド細胞。
【請求項１３】
前記細胞が酵母細胞である、請求項11または請求項12に記載のトリブリッド細胞。
【請求項１４】
実施例に関して、および例示される、実質的に上記に記述された方法。
【請求項１５】
実施例に関して、および例示される、実質的に上記に記述された細胞。
【国際調査報告】
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