(57)【要約】本出願は、液体二相系における酵素法によるR-フェニルアセチルカルビノールの新規な製造方法に関する。
2005501560.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（I）：
【化１】
2005501560.tif 000007
のフェニルアセチルカルビノールを、ピルビン酸デカルボキシラーゼの存在下で、アセトアルデヒドまたはピルベートおよび一般式（II）：
【化２】
2005501560.tif 000008
の芳香族アルデヒドから製造する方法であって、この反応が、少なくとも1つの水相を含む液体二相系において行われることを特徴とする上記方法。
【請求項２】
一方の液相が水相であり、他方の液相がその水相と不混和性の有機相である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
有機相がオクタノールである、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
2つの液相が、その2つの相からエマルジョンが形成されるように機械的に撹拌される、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
ピルビン酸デカルボキシラーゼがザイモモナス（Zymomonas）またはC.ユチリス（C. utilis）に由来する、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
芳香族アセトアルデヒド（II）がR＝Hである、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
アセトアルデヒドが、反応の間に、アセトアルデヒド濃度が水相中で20〜50mMol/lとなるように定量供給される、請求項1に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、液体二相系における酵素法によるR-フェニルアセチルカルビノールの新規な製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
R-フェニルアセチルカルビノール（R-PAC）は、エフェドリンおよびプソイドエフェドリンの化学合成の前駆体である。ベンズアルデヒドおよび糖蜜の存在下での発酵酵母（サッカロミセス・セレビシエ）（Saccharomyces cerevisiae）によるR-PACの製造方法は、19世紀に既に確立されていた（Hildebrandt & Klavehn 1932, DE-PS 548 459）。
【０００３】
また、つい先ごろ、微生物内でのR-PACの合成に関与する触媒が、酵素ピルビン酸デカルボキシラーゼ（PDC）であることが知られるようになった。この酵素は、ピルビン酸およびベンズアルデヒドに由来するC2部分の立体選択的なカルボライゲーション（carboligation）を触媒する。また、この触媒は、多くの他のカルボニル化合物のカルボライゲーションも行う。特定の酵素、例えばザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis ）に由来する酵素を用いると、このプロセスの基質として、ピルビン酸の代わりにアセトアルデヒドも使用可能になる。
【０００４】
ピルビン酸デカルボキシラーゼ（PDC）は、サッカロミセス・セレビシエおよびザイモモナス・モビリス以外にも、別の生物においても同定され特性決定された。R-フェニルアセチルカルビノールのPDCによる酵素的合成は、従来、水系の一相系でのものしか記載されていない。ピルビン酸デカルボキシラーゼが有機溶剤中または有機溶剤と水とのエマルジョン中でも活性である、という情報はない。
【０００５】
WO 96/37620では、ザイモモナス・モビリス由来のピルビン酸デカルボキシラーゼの存在下で、ベンズアルデヒドおよびアセトアルデヒドまたはピルベート（pyrvate）からアシロイン、特にR-フェニルアセチルカルビノールを製造するための方法が開示されている。
【発明の開示】
【０００６】
本発明の主題は、液体二相系におけるピルビン酸デカルボキシラーゼ（PDC）によるベンズアルデヒドおよびピルベートの生体内変換（biotransformation）の方法であり、これは、反応が、互いに不混和性である2つの液相中で行われることを意味する。この液相の一方は水相であり、第2の液相は、その水相と不混和性で、反応物の一つではない相である。
【０００７】
この第2の液相は、広く様々なものとすることができる。第2の相として好適なものは、アルカン、アルカノール、エーテルである。また、水相と接触すると第2の液相となる、ポリエチレングリコールなどの親水性高分子化合物も適する。
【０００８】
第2の相の好ましい実施形態は、アルカノール、特にC4〜C10のアルカノールであり、すなわち、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノール、デカノール、またはこれらのアルコールの混合物である。これらの中でも、n-アルカノールが好ましい。特に好ましいのは、n-オクタノールおよびn-ノナノールである。
【０００９】
反応媒体の撹拌／混合に応じて、2種の異なる二相系を評価した。二相分離形態（two-phase separated mode）とは、2つの相が2つの独立した相として撹拌されている二相系をいう。本発明のこの実施形態を「二相分離形態」と呼ぶ。
【００１０】
本発明のもう1つの実施形態は、「二相混合形態（two-phase mixed mode）」である。2つの相を強く混合することにより（特に、強く撹拌または振盪することにより）、その2つの相はもはや別々の相として存在せず、エマルジョンを形成する。この実施形態を「二相混合形態」と呼ぶ。
【００１１】
本発明のもう1つの実施形態は、一般式（I）：
【化１】
2005501560.tif 000003
［式中、RはH、F、ClまたはBを表わす］
のフェニルアセチルカルビノールを、ピルビン酸デカルボキシラーゼの存在下で、アセトアルデヒドおよび一般式（II）：
【化２】
2005501560.tif 000004
の芳香族アルデヒドから製造する方法であって、この反応が、少なくとも1つの水相を含む液体二相系において行われることを特徴とする上記方法である。
【００１２】
本発明の更に別の実施形態は、特許請求の範囲および実施例に開示されている。
【００１３】
実施例１：有機相の選択
PDCの活性を、各種の有機溶剤の存在下で測定した。
【００１４】
評価した全ての溶剤の比較を図1Aに示す。264時間にわたり暴露した後の残存カルボリガーゼ活性を、溶剤を含まない対照と比較する。溶剤MTBEは、酵素の安定性に対して正の作用を及ぼす。
【００１５】
この酵素は、溶剤に暴露されない対照と比較して、メチル-tert-ブチルエーテル（MTBE）に対して高い安定性を示した。MTBEは、有利にも、この酵素の活性中心または表面と相互作用して、安定性を向上させることができる。MTBEなどの溶剤による疎水的相互作用により、酵素の結合水分子の量を低減できる。結合水が失われると、そのタンパク質をより安定な立体構造へと折りたたまれるようにするか、あるいは、タンパク質分解などの水依存性の反応を低減させることができる。水素結合が安定性の向上に関与する可能性はない。何故ならば、MTBEは、水素結合の形成に必要な分極した水素結合を持たないからである。ピルビン酸デカルボキシラーゼは、他の溶剤に対して良好な安定性を示すが、いずれの場合も対照を超える活性化は示さない。
【００１６】
有機相の溶剤の機能としてのR-PACの生成
ピルビン酸デカルボキシラーゼの、二相系中でフェニルアセチルカルビノール（PAC）を生成する能力を、上記で選択した各溶剤を用いて評価した。一連の溶剤を用いてPACの形成を評価することにより、酵素活性に重要な溶剤の特性を同定することが可能になる。
【００１７】
PACの生成は、有機溶剤相中の1.8Mのベンズアルデヒドおよび水系MOPS相（2MのMOPS、1mMのTPP、1mMのMg2+、pH 6.5、4℃）中の1.43Mのピルベートを用いて評価した。反応は、水相に酵素を7.3U/mlのカルボリガーゼ活性で添加することにより開始した。有機溶剤相と水相との容量比は1に維持した。酵素添加の直後に、反応速度を増大させるために、反応物を高速で撹拌してエマルジョンを形成した。72時間後、ピルベート、ベンズアルデヒドおよびPACを分析するために、双方の相からサンプルを採取した。
【００１８】
それぞれの異なる溶剤を用いた酵素生成PACを評価した。各溶剤についての有機溶剤相中および水相中のPACの濃度を図1Bに示す。最大量のPACが生成されたのは、有機相としてオクタノールおよびノナノールを用いた場合であった。オクタノールの場合、有機相で100.6g/lのPACが測定され、水相で更に16.9g/lが測定され、ノナノールの場合、有機相で90.8g/lが測定され、水相で19.6g/lが測定された。
【００１９】
2つの相の間のPACの分配は、それぞれの溶剤ごとに異なる。図1Bは、オクタノールおよびノナノールを用いた場合、PACが有機溶剤相の方へ強く分配されることを示す。ペンタノールおよびベンズアルデヒドもまた、PACを主に酵素から遠い方に分配させる。logPだけでなく、溶剤の化学的性質もまた、PACの有機溶剤相と水相との分配に或る役割を担っている。log Pが3.5であるヘキサンは、PACを主に水相に分配するが、log Pが3.4であるノナノールは、PACを有機溶剤相に強く分配する。そうしたlog pの僅かな差が、そのように大きな分配の差の原因になるとは考え難い。アルコールは、PACの溶解性および酵素合成後の水相からの抽出に関してより良好な媒体となり得る。
【００２０】
実施例2：二相分離形態において酵素活性を様々に変えた場合のPACおよびアセトインの生成
二相分離形態における酵素濃度の変化を、同一条件下で二相混合系と直接比較する。
【００２１】
容積対表面積の比を1.9cmとして、1.08mlのオクタノール中1.5Mベンズアルデヒドを、様々なレベルのカンジダ・ユチリス（Candida utilis）由来のピルビン酸デカルボキシラーゼおよび1.4Mのピルベートを含有する1.08mlのMOPS緩衝液（2.5MのMops、1mMのTPP、1mMのMg2+、pH 6.5、4℃）と混合した。反応物を、相分離を維持しながら4℃でゆっくり撹拌した。全てのピルベートが消費された時点で、反応を停止させた。
【００２２】
395時間操作した後に達成されたPACレベルを、図2に示す。
【００２３】
図2に、4℃にて395時間にわたり酵素活性の機能として生成されたPACを示す。
【００２４】
PACの生成は、3.8U/mlの酵素で最大になり、オクタノール相では167.3g/l、水相では27.8g/lに達する。これは、精製PDCの比活性が17U/mgタンパク質であるとの仮定に基づけば、880g PAC／g PDCに相当する。ベンズアルデヒドに対するPACの収率は98％であり、ピルベートに対するPACの収率は92.9％であった。収率は、十分に撹拌した系で達成されるものよりも高い。酵素を含まない対照では、十分な撹拌操作の場合と比較して、ピルベートおよびベンズアルデヒドの喪失が少ないことが注目される。基質の喪失が少なければ、これらの喪失分が収率の算出に組み込まれるので、収率の向上に繋がる可能性がある。
【００２５】
全てのフラスコで最終pHを8まで上げた。これは、有意に酵素不活性化の一因となろう。pHの上昇および基質の制限は、プロセスをスケールアップして、pHの調節および基質の供給を可能にすることによって克服できると思われる。
【００２６】
表1から、酵素量当たりのPACの特異的生成が2388g PAC／g PDC（0.9U/mlの活性で起こる）まで増大していることが示される。この酵素レベルにおいて、PACは、上相では112 g/l、下相では15.6 g/l生成する。
【表１】
2005501560.tif 000005
【００２７】
図3に、十分な撹拌操作をした場合と相分離操作をした場合の特異的なPAC生成の比較を示す。相分離操作をした場合、酵素量当たりの生成物の量は有意に増大する。
【００２８】
この低い酵素レベルにおいて、ベンズアルデヒドに対する生成物の収率は高いが、ピルベートに対する生成物の収率は60.8％と低い。ピルベートの二量体化による喪失は、この酵素レベルでは反応速度が遅く、そのため、ピルベートがゆっくり利用されることに起因すると考えられる。消費されなかったピルベートは分解されると思われる。
【００２９】
図3に、相分離操作した場合と十分な撹拌操作をした場合の酵素量当たりのPACの生成量の比較を示す。両者の系とも、1.5Mのベンズアルデヒドおよび1.4Mのピルベートを用いて出発し、4℃でインキュベートした。相分離操作の場合の反応時間は395時間とし、十分な撹拌操作の場合は40時間とした。
【００３０】
実施例3：十分に撹拌した二相系（混合形態）で生成されるPACおよびアセトイン
エフェドリンの化学的合成では、PACからアセトインを分離させることが必要である。アセトインは、R-フェニルアセチルカルビノールの還元アミノ化の際に負の作用を及ぼす。したがって、アセトインの生成を最低限に抑えること、およびそれに続いて、アセトインをR-PACから分離させて水相へと抽出させることが有利であろう。
【００３１】
アセトインレベルを、二相混合形態の上部オクタノール相と下部水相において測定した。結果を表2に示す。この形態の操作では、表1に示す相分離操作の場合と比較して、非常に低レベルのアセトインが生成する。これは、十分に撹拌した場合は、アセトアルデヒドが上相に急速に抽出されて、PDCがアセトイン形成を触媒しなくなるようになったためであると考えられる。もう1つの原因は、PACをもたらす酵素へのベンズアルデヒドの送達が、アセトインの形成を上回って増大したことであると考えられる。
【表２】
2005501560.tif 000006
【００３２】
図4は、各種の系におけるR-フェニルアセチルカルビノールの生成性を示す。
【００３３】
実施例4：二相系におけるアセトアルデヒドおよびベンズアルデヒドからのPACの生成
この研究の目的は、ザイモモナス・モビリス由来PDCを用いた水／有機二相系におけるPACの生成である。水相中の酵素は、有機相から受け取った基質ベンズアルデヒドおよびアセトアルデヒドを変換する。生成物であるPACは有機相に抽出される。
【００３４】
ネジ式キャップ（テフロン密閉）および12mmの磁気撹拌子を備えた4ml容ガラスビンに、以下を入れた。
【００３５】
500μl    有機相
500mMのベンズアルデヒドおよび500mMのアセトアルデヒドを含有
400μl    緩衝液（50mMのMES/KOH pH 7.0、5mMのMgSO4、1mMのTPP）
ビンを、室温（約25℃）にて30秒間にわたりエマルジョンとして十分に撹拌して、基質を水相に拡散させた。相分離させた後、次の酵素調製物を下部水相に注入し、上記のようにして高速で撹拌した。
【００３６】
100μl    上記の緩衝液中のザイモモナス・モビリス由来PDC-WMを含有する粗抽出物（水相中の最終濃度：PDC活性［アセトアルデヒド＋ベンズアルデヒド］1.58mM PAC/分；総タンパク質 5mg/ml）
対照は、400μlの緩衝液中に基質を含有し、有機相は添加しないものとした。72時間後にサンプルを採取し、有機相中および水相中のPAC濃度について分析した。水相中の初期基質濃度を測定するために、酵素を緩衝液で置き換えた。全ての実験は二連で行った。
【００３７】
図5から、多種の溶剤を用いた場合は、水相中の初期アセトアルデヒド濃度が200mMよりも高いことが示される。これらのレベルは、強い酵素の不活性化を引き起こす。これに対して、アルコールを用い、酵素を僅か54〜81mMのアセトアルデヒドに暴露した場合は、アセトアルデヒドは主に有機相に分配される。これらは、生体内変換にとってより好適な条件である。アルコールの場合、第2の基質であるベンズアルデヒドの濃度もまた、水相では低い（11〜15mM）。
【００３８】
各種の溶剤系において生成したPACの量を図6に示す。最高のPAC濃度は、1-ペンタノール、1-ヘキサノールおよびイソブタノールのアルコール類を用いた場合に達成された（有機相中で16〜16.6g/l、水相中で1〜1.7g/l）。有機溶剤を添加しなかった場合、1g/lのPACしか形成されなかった。また、図2から、試験したアルコール、イソブチルアセテート、MTBEまたはトルエンを用いると、PACは主に有機相に分配されたが、アルカンでは、生成したPACの大部分が水相に残留したことが示される。
【００３９】
図7に示すように、PDCの単位当たり生成したPACの量は、有機相として1-ペンタノール、1-ヘキサノールおよびイソブタノールを用いた場合、10.8〜11.4mg/Uに達する。
【００４０】
8種の被験アルコールでは、最良のPACの生産が起こり、水相中のアセトアルデヒド濃度は最低で、水相中のアセトアルデヒド対ベンズアルデヒドの割合も最低であった（約5モル過剰）。アセトアルデヒド対ベンズアルデヒドの割合が、ザイモモナス・モビリス由来PDC-WMによるPAC生産にとって極めて重要であることが報告されている（Iwanら. J Mol Cat B Enz 11, 2001, 387-396、およびGoetzら. Biotech Bioeng 74, 2001, 317-325）。最良の結果は、アセトアルデヒドとベンズアルデヒドが等モル濃度の場合に達成されている。したがって、本二相系は、主に望ましくない基質割合によって制限を受ける可能性がある。これは、有機相中の基質割合を調整することにより、またはアセトアルデヒドをゆっくり添加することにより克服できると思われる。また、基質濃度は、酵素活性とバランスがとれた状態にすることも必要である。他の可能性のある制限要因は、アセトアルデヒドの蒸発および酵素の不活性化もしくは阻害であろう。
【００４１】
図5は、アセトアルデヒドおよびベンズアルデヒドからPACを生成するための二相系の水相における初期濃度を示す。
【００４２】
図6は、72時間後のPAC濃度を示す。50容量％の溶剤（500mMのアセトアルデヒドおよび500mMのベンズアルデヒドを含有）および50容量％の水相を、室温（約25℃）でエマルジョンとして撹拌した。水相は、50mMのMES/KOH（pH 7.0）、5mMのMgSO4、1mMのTPP、ザイモモナス・モビリス由来PDC-WM（カルボキシラーゼ活性：1.58mM PAC/分（アセトアルデヒド＋ベンズアルデヒド）、5mgのタンパク質/mlを含むものとした（1-デカノールおよびn.d.：溶剤がPACの分析に干渉したために測定されなかった）。
【００４３】
図7は、二相系におけるザイモモナス・モビリス由来PDC-WMを用いた特異的なPACの生成を示す。1単位のPDC活性とは、25℃およびpH 7において、アセトアルデヒドおよびベンズアルデヒドから、1分間当たり1mMのPACを生成する酵素の量として定義した。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１Ａ】評価した全ての溶剤の比較を示す図である。
【図１Ｂ】各溶剤についての有機溶剤相中および水相中のPACの濃度示す図である。
【図２】4℃にて395時間にわたり酵素活性の機能として生成されたPACを示す図である。
【図３】相分離操作した場合と十分な撹拌操作をした場合の酵素量当たりのPACの生成量の比較を示す図である。
【図４】各種の系におけるR-フェニルアセチルカルビノールの生成性を示す図である。
【図５】アセトアルデヒドおよびベンズアルデヒドからPACを生成するための二相系の水相における初期濃度を示す図である。
【図６】各種の溶剤系において72時間後に生成したPACの量を示す図である。
【図７】二相系におけるザイモモナス・モビリス由来PDC-WMを用いた特異的なPACの生成を示す図である。
【図１Ａ】
2005501560.tif 000009
【図１Ｂ】
2005501560.tif 000010
【図２】
2005501560.tif 000011
【図３】
2005501560.tif 000012
【図４】
2005501560.tif 000013
【図５】
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【図６】
2005501560.tif 000015
【図７】
2005501560.tif 000016
【国際公開パンフレット】
2005501560.tif 000017
2005501560.tif 000018
2005501560.tif 000019
2005501560.tif 000020
2005501560.tif 000021
2005501560.tif 000022
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2005501560.tif 000024
2005501560.tif 000025
2005501560.tif 000026
2005501560.tif 000027
2005501560.tif 000028
2005501560.tif 000029
2005501560.tif 000030
2005501560.tif 000031
2005501560.tif 000032
2005501560.tif 000033
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005501560.tif 000034
2005501560.tif 000035
【国際調査報告】
2005501560.tif 000036
2005501560.tif 000037
2005501560.tif 000038
2005501560.tif 000039