(57)【要約】  練り粉の成分に、練り粉という条件下で糖脂質及びリン脂質を加水分解することが可能であり、トリグリセリド及び／又は１−モノグリセリドを加水分解することが不可能若しくは実質的に不可能である酵素、又は該酵素を含む組成物を添加し、かかる練り粉の成分を混ぜ合わせてかかる練り粉を得ることを特徴とする練り穀粉の調製方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
練り粉の成分に、練り粉という条件下で糖脂質及びリン脂質を加水分解することが可能であり、トリグリセリド及び／又は１−モノグリセリドを加水分解することが不可能又は実質的に不可能である酵素を添加し、かかる練り粉の成分を混ぜ合わせてかかる練り粉を得ることを特徴とする練り穀粉の調製方法。
【請求項２】
酵素が、トリグリセリド及び１−モノグリセリドの両方を加水分解することが不可能又は実質的に不可能であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
酵素が、トリグリセリド及びジグリセリドを加水分解することが可能であって、１−モノグリセリドを加水分解することが不可能又は実質的に不可能であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
トリグリセリド、１−モノグリセリド、糖脂質及びリン脂質のうちの少なくとも１つが、練り粉に使用する穀粉に存在する天然の脂質成分であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の方法。
【請求項５】
リン脂質がホスファチジルコリン（ＰＣ）であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の方法。
【請求項６】
糖脂質がジガラクトシルジグリセリド（ＤＧＤＧ）であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の方法。
【請求項７】
トリグリセリド、１−モノグリセリド、糖脂質及びリン脂質のうちの少なくとも１つが、練り粉に添加されることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の方法。
【請求項８】
トリグリセリドが、植物油、植物性脂肪、動物性脂肪、ショートニング及び乳脂肪からなる群より選択されることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項９】
植物油が、オート油を含む天然に存在する穀物油であることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
添加された極性脂質が、ホスフォチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）及びホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）からなる群より選択されるリン脂質であることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項１１】
練り粉が、酵母菌で発酵させた練り粉であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか記載の方法。
【請求項１２】
添加される酵素の量が、０．１〜１０００単位（酵素）／ｋｇ（穀粉）の範囲内であることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか記載の方法。
【請求項１３】
添加される酵素の量が、１〜１００単位（酵素）／ｋｇ（穀粉）の範囲内であることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
練り粉がパン用練り粉であること、練り粉を焼いて焼成品を得る工程をさらに含むことを特徴とする請求項１〜１３のいずれか記載の方法。
【請求項１５】
練り粉が、パスタ用練り粉、ヌードル用練り粉、及びケーキ用練り粉又はバッターからなる群より選択される練り粉であることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか記載の方法。
【請求項１６】
酵素を添加しないこと以外はまったく同一の条件下で作製した焼成品と比較して、焼成品の比容積が少なくとも１０％増加する量の酵素を添加することを特徴とする請求項１〜１５のいずれか記載の方法。
【請求項１７】
練り粉に別の酵素を添加することを特徴とする請求項１〜１６のいずれか記載の方法。
【請求項１８】
別の酵素が、リパーゼ、デンプン分解酵素、ヘミセルラーゼ、セルラーゼ、リポキシゲナーゼ及びオキシドレダクターゼからなる群より選択されることを特徴とする請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
練り粉中に最初から存在している糖脂質の少なくとも２５％が加水分解されることを特徴とする請求項１〜１８のいずれか記載の方法。
【請求項２０】
練り粉中に最初から存在しているリン脂質の少なくとも２５％が加水分解されることを特徴とする請求項１〜１９のいずれか記載の方法。
【請求項２１】
酵素が、リン脂質及び糖脂質に対しては加水分解活性を有しているが、ｐＨ範囲が４．５〜６．５のトリグリセリド及び／又は１−モノグリセリドに対しては加水分解活性を有していない、又は実質的に有していないことを特徴とする請求項１〜２０のいずれか記載の方法。
【請求項２２】
練り粉、又は練り粉から調製される焼成品の調製方法であって、
（ｄ）少なくとも１つの酵素について、トリグリセリド、１−モノグリセリド、リン脂質及び糖脂質に対するその加水分解活性をテストすること；
（ｅ）リン脂質及び糖脂質に対しては加水分解活性を有しているが、トリグリセリド及び／又は１−モノグリセリドに対しては加水分解活性を有していない、又は実質的に有していない酵素を選択すること；
及び（ｆ）選択した酵素を練り粉に添加すること；
を含むことを特徴とする調製方法。
【請求項２３】
練り粉という条件下で糖脂質及びリン脂質を加水分解することが可能であり、トリグリセリド及び／又は１−モノグリセリドを加水分解することが不可能又は実質的に不可能である酵素を含み、かつ別の練り粉成分を１種類含んでいてもよいことを特徴とする練り粉改良組成物。
【請求項２４】
酵素が、トリグリセリド及び１−モノグリセリドの両方を加水分解することが不可能又は実質的に不可能であることを特徴とする請求項２３記載の組成物。
【請求項２５】
酵素が、トリグリセリド及びジグリセリドを加水分解することが可能であって、１−モノグリセリドを加水分解することが不可能又は実質的に不可能であることを特徴とする請求項２３記載の組成物。
【請求項２６】
組成物が、リパーゼ、デンプン分解酵素、ヘミセルラーゼ、セルラーゼ、リポキシゲナーゼ及びオキシドレダクターゼからなる群より選択される別の酵素を含むことを特徴とする請求項２３〜２５のいずれか記載の組成物。
【請求項２７】
別の練り粉成分が、穀物の粉末、酵母菌、化学膨張剤、練り粉強化剤、乳化剤、砂糖、アシルグリセロール、リン脂質、糖脂質及び塩からなる群より選択されることを特徴とする請求項２３〜２６のいずれか記載の組成物。
【請求項２８】
請求項１〜２２のいずれか記載の方法により得られることを特徴とする練り粉。
【請求項２９】
練り粉が、ＣＡ設備中で冷凍される又は包装されることを特徴とする請求項２８記載の練り粉。
【請求項３０】
請求項２８又は２９記載の練り粉を焼くことにより得られることを特徴とする焼成品。
【請求項３１】
請求項２８又は２９記載の練り粉より作製されることを特徴とするヌードル製品。
【請求項３２】
請求項２８又は２９記載の練り粉より作製されることを特徴とするパスタ製品。
【請求項３３】
リン脂質及び糖脂質に対しては加水分解活性を有しているが、トリグリセリド及び／又は１−モノグリセリドに対しては加水分解活性を有していない、又は実質的に有していない酵素の調製方法であって、
（ｉ）リン脂質、糖脂質、トリグリセリド及び／又は１−モノグリセリドに対して加水分解活性を有するリパーゼを選択すること；
（ii）リパーゼが修飾されて、トリグリセリド及び／又は１−モノグリセリドに対して活性を有さなくなる、又は実質的に活性を有さなくなるようにリパーゼの活性を変えるため、アミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失又は置換を行うことにより修飾を施すこと；
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３４】
少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失又は置換が、アミノ酸配列のリッド領域（the lid region）内に存在することを特徴とする請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失又は置換が、アミノ酸配列の活性部位の近辺に存在することを特徴とする請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失又は置換が、アミノ酸配列のＣ末端に存在することを特徴とする請求項３３記載の方法。
【請求項３７】
リッド領域（the lid region）が欠失していることを特徴とする請求項３４記載の方法。
【請求項３８】
酵素が、糖脂質及びリン脂質を加水分解することが可能であり、ｐＨ範囲が４．５〜６．５のトリグリセリド及び／又は１−モノグリセリドを加水分解することが不可能又は実質的に不可能であることを特徴とする請求項３３〜３７のいずれか記載の方法。
【請求項３９】
練り粉という条件下で糖脂質及びリン脂質を加水分解することが可能であり、トリグリセリド及び／又は１−モノグリセリドを加水分解することが不可能又は実質的に不可能である酵素を含み、かつ別の練り粉成分を含んでいてもよいことを特徴とする練り粉組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、練り粉産業及び練り穀粉製品、並びに、特に練り粉の強度及び機械加工性、パン及びその他の焼成品の体積、軟らかさ、内相構造の向上に関するが、これに限定されるものではない。
【背景技術】
【０００２】
食品の質を向上させるため、食品業界では添加物が広く使用されている。最も広く使用されている食品添加物の１つに、乳化剤、特にモノグリセリドがある。
【０００３】
モノグリセリドは本来、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドの混合物として生産された。しかし、その後、技術が進歩し、分子蒸留により高度に精製されたモノグリセリドが生産されるようになった。モノグリセリドは従来から、アルカリ性触媒を使用し、トリグリセリドとグリセロールを２００℃以上の高温で反応させるグリセロール分解反応によって生産されている。
【０００４】
アルカリ性触媒と高温を使用する方法の代替方法として、モノグリセリドの生産にリパーゼなどの酵素を使用するために、多くの試みがなされてきた。Bornscheuer (非特許文献１；Enzyme and Microbial Technology 17: 578-585, 1995)は文中で、溶媒の存在下又は非存在下におけるトリグリセリドの酵素的グリセロール分解に言及しており、固相での酵素的グリセロール分解によってモノグリセリドの生産は可能だと述べている。
【０００５】
モノグリセリドは乳化剤として、食品関連の多くの用途で使用できる。製パン業界においては、モノグリセリドにデンプンとの複合体を形成させ、それによってアミロペクチンの結晶化とパンの老化開始を遅らせてパンの軟らかさを向上させるためにモノグリセリドが使用されてきた。
【０００６】
リパーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）も、パンの製造に直接使用されてきた。例えば、ＥＰ第０５８５９８８号（特許文献１）には、練り粉にリパーゼを添加すると、結果的に抗老化作用が向上することがクレームに記載されている。Rhizopus arrhizusから得たリパーゼを練り粉に添加すると、ショートニング／脂肪と併用した場合に、結果としてできあがったパンの質を向上させることが可能だと示唆されている。ＷＯ９４／０４０３５号（特許文献２）には、リパーゼを練り粉に添加して、他の脂肪や油は練り粉に添加しないことにより、軟らかさを向上させることができるとの教示がある。Castello, P. ESEGP 89-10 Dec. 1999（非特許文献２）は、外因的リパーゼによりパンの体積を変えられると示している。このように、トリアシルグリセロールを加水分解するリパーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）は、製パン業界で使用すると有利であることが知られていた。
【０００７】
ＷＯ９８／４５４５３号（特許文献３）には、練り粉に添加されたリパーゼがモノグリセリドを容易にグリセロールと遊離脂肪酸に分解するため、リパーゼ処理された練り粉中のモノグリセリドのレベルはほんの少ししか増大しないことが示されている。このことは、リパーゼが活性部位内にある分子の脂肪酸部分を認識すること、及びリパーゼが活性を示す接触面に向けてモノグリセリドとジグリセリドが配置されているため、脂肪／油の乳液を含むマトリックスにリパーゼを添加している間に、モノグリセリドとジグリセリドは容易に分解されることによって説明可能である。反応生成物として２−モノグリセリドを残す１位及び３位のトリグリセリドの脂肪酸のみを加水分解する１．３特異的リパーゼについてさえ、結果として生じた２−モノグリセリドは、１．３特異的リパーゼによる加水分解が可能な１−モノグリセリドへと、容易に再転移する。
【０００８】
通常のリパーゼによるトリグリセリドの酵素的分解が行われている間に、モノグリセリド、ジグリセリド、遊離脂肪酸及びグリセロールが形成される。
【０００９】
１つ以上のリパーゼで処理された練り粉中のモノグリセリドの増加は、脂肪又は油が添加されていてもいなくても、０．１％未満（穀粉重量を基準として）であるのが一般的である。しかし、例えば、できあがったパンの軟らかさを向上させるのに必要な、練り粉中のモノグリセリドの通常使用量は、一般的に、穀粉重量を基準として約０．３〜０．８％である（非特許文献３；Krog, N. Cereal Food World, 24, 10, 1979）。このように、従来のリパーゼを練り粉に添加することによる好ましい作用はいずれも、ＥＰ第０５８５９８８号（特許文献１）及びＷＯ９４／０４０３５号（特許文献２）が示すように、モノグリセリドの含有量だけが増大した結果として生じたものではない。
【００１０】
リパーゼのなかには、トリグリセリドに対する加水分解活性に加え、例えばジガラクトシルジグリセリド（ＤＧＤＧ）などの糖脂質、及びリン脂質といった極性脂質を加水分解できるものもある（例えばＷＯ０１／３９６０２号（特許文献４）を参照のこと）。
【００１１】
小麦粉中のリパーゼの基質は、２〜３％が内因的小麦脂質であり、かかる脂質は、極性脂質と非極性脂質が複雑に混合したものである。極性脂質は糖脂質とリン脂質に分けることができる。これらの脂質は、２つの脂肪酸と１つの極性基でエステル化されたグリセロールで作られている。かかる極性基は、これらの脂質の表面活性に寄与している。これらの脂質における脂肪酸の１つを酵素的に開裂すると、脂質がもつ表面活性はかなり高くなる。ＤＡＴＥＭなどの表面活性の高い乳化剤を練り粉に添加すると非常に機能的であることは、よく知られている。
【００１２】
しかし、リパーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）を練り粉中で使用すると、ある条件下では、不快臭の発生、酵母菌の活性に対する有害な影響、及び／又はパンの体積に対するマイナス効果など、有害な結果を生じる場合がある。パンの体積に対するマイナス効果は、オーバードーシングと呼ばれることが多い。オーバードーシングはグルテンの弾性低下につながることがあり、それによって練り粉が硬くなりすぎ、体積が減少する結果となる。それに加えて、又はその代わりに、そうしたリパーゼは練り粉に添加されたショートニング、油又は乳脂肪を分解することができる。
【特許文献１】欧州特許第０５８５９８８号明細書
【特許文献２】国際公開第９４／０４０３５号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９８／４５４５３号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０１／３９６０２号パンフレット
【非特許文献１】Enzyme and Microbial Technology 17: 578-585, 1995
【非特許文献２】Castello, P. ESEGP 89-10 Dec. 1999
【非特許文献３】Krog, N. Cereal Food World, 24, 10, 1979
【発明の開示】
【００１３】
［態様の要約］
本発明の知見は影響力の大きなものであって、練り粉という条件下で糖脂質及びリン脂質を加水分解することが可能であり、トリグリセリド及び／又は１−モノグリセリドを加水分解することが不可能又は実質的に不可能である酵素を使用することは有利であり、練り粉中の非極性脂質を加水分解することができるリパーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）を使用した場合に伴う不都合な点を克服できるという、驚くべきものである。
【００１４】
［態様の詳細］
本発明は、第１の態様において、練り粉の成分に、練り粉という条件下で糖脂質及びリン脂質を加水分解することが可能であり、トリグリセリド及び／又は１−モノグリセリドを加水分解することが不可能又は実質的に不可能である酵素を添加し、かかる練り粉の成分を混ぜ合わせてかかる練り粉を得ることを特徴とする練り穀粉の調製方法を提供するものである。
【００１５】
本発明の第２の態様においては、練り粉又は練り粉から調製された焼成品の調製方法であって、
（ａ）少なくとも１つの酵素について、トリグリセリド、１−モノグリセリド、リン脂質及び糖脂質に対するその加水分解活性を調べること；
（ｂ）リン脂質及び糖脂質に対しては加水分解活性を有しているが、トリグリセリド及び／又は１−モノグリセリドに対しては加水分解活性を有していない、又は実質的に有していない酵素を選択すること；
及び（ｃ）選択した酵素を練り粉に添加すること；
を含むことを特徴とする方法を提供するものである。
【００１６】
本発明は第３の態様において、リン脂質及び糖脂質に対しては加水分解活性を有しているが、トリグリセリド及び／又は１−モノグリセリドに対しては加水分解活性を有していない、又は実質的に有していない酵素を含み、かつ別の練り粉成分を含んでいてもよいことを特徴とする練り粉改良組成物を提供するものである。
【００１７】
第４の態様において、本発明は、本発明に記載の方法により得られる練り粉を提供するものである。
【００１８】
第５の態様において、本発明は、本発明に記載の方法により得た練り粉を提供するものである。
【００１９】
第６の態様において、本発明は、本発明に記載の練り粉を焼くことにより得られる焼成品を提供するものである。
【００２０】
第７の態様において、本発明は、本発明に記載の練り粉を焼くことにより得た焼成品を提供するものである。
【００２１】
本発明はさらに、第８の態様において、本発明に記載の練り粉から作製することを特徴とするヌードル製品を提供するものである。
【００２２】
第９の態様において、本発明は、本発明に記載の練り粉から作製することを特徴とするパスタ製品を提供するものである。
【００２３】
第１０の態様において、本発明は、リン脂質及び糖脂質に対しては加水分解活性を有しているが、トリグリセリド及び／又は１−モノグリセリドに対しては加水分解活性を有していない、又は実質的に有していない酵素を、別の練り粉成分と混合してもよいことを特徴とする練り粉改良組成物の調製方法を提供するものである。
【００２４】
第１１の態様においては、本発明に記載の酵素の選択方法は、
（ａ）少なくとも１つの酵素について、トリグリセリド、１−モノグリセリド、リン脂質及び糖脂質に対するその加水分解活性を調べること；
（ｂ）リン脂質及び糖脂質に対しては加水分解活性を有しているが、トリグリセリド及び／又は１−モノグリセリドに対しては加水分解活性を有していない、又は実質的に有していない酵素を選択すること；
というステップを含んでいてもよい。
【００２５】
本発明は、その第１２の態様において、リン脂質及び糖脂質に対しては加水分解活性を有しているが、トリグリセリド及び／又は１−モノグリセリドに対しては加水分解活性を有していない、又は実質的に有していない酵素の調製方法又は開発方法であって、
（ａ）リン脂質、糖脂質及びトリグリセリド及び／又は１−モノグリセリドに対して加水分解活性を有しているリパーゼを選択すること；
（ｂ）リパーゼが修飾されて、トリグリセリド及び／又は１−モノグリセリドに対して活性を有さなくなる、又は実質的に活性を有さなくなるようにリパーゼの活性を変えるため、アミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失又は置換を行うことにより修飾を施すこと；
を含むことを特徴とする方法を提供するものである。
【００２６】
第１３の態様において、本発明は、練り粉という条件下で糖脂質及びリン脂質を加水分解することが可能であり、トリグリセリド及び／又は１−モノグリセリドを加水分解することが不可能又は実質的に不可能である酵素について、かかる酵素を用いない場合の練り粉と比較して、パンの体積及び／又はグルテン強度が増大する練り粉を提供すべく練り粉を調製する際の、かかる酵素の使用を提供するものである。
【００２７】
第１４の態様において、本発明は、糖脂質及びリン脂質を加水分解することが可能であり、トリグリセリド及び／又は１−モノグリセリドを加水分解することが不可能又は実質的に不可能である酵素を食用油に添加することを含む、極性脂質を食用油から除去する方法を提供するものである。
【００２８】
第１５の態様において、本発明は、本発明に記載の方法により得られる又は得た大豆油又は菜種油などの食用油を提供するものである。
【００２９】
第１６の態様において、本発明は、練り粉という条件下で下記の、
ｉ）糖脂質及びリン脂質を加水分解することが可能であり、前記酵素が、トリグリセリド及び／又は１−モノグリセリドを加水分解することが不可能又は実質的に不可能であること；
ii）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で確認した分子量が約５７ｋＤａ及び／又は約８７ｋＤａであること；
という特質を１つ以上有するタンパク質であって、Vigna unguiculataから得ることができるタンパク質を提供するものである。
【００３０】
第１７の態様において、本発明は、練り粉の成分に、配列番号１２に示されるアミノ酸配列、又はその変異体、ホモログ若しくは誘導体を含む酵素を添加し、かかる練り粉の成分を混ぜ合わせてかかる練り粉を得ることを特徴とする練り穀粉の調製方法を提供するものである。
【００３１】
参照のため、本発明のこれらの態様及びその他の態様について、これよりセクションごとに適切な見出しをつけて論じていく。しかし、各セクションにおける教示は、必ずしも各特定のセクションに限定されるものではない。
【００３２】
［好ましい態様］
糖脂質及びリン脂質を加水分解することが可能であり、トリグリセリド及び／又は１−モノグリセリドを加水分解することが不可能又は実質的に不可能である酵素は、脂肪分解性アシルヒロラーゼ（ＬＡＨ）（Ｅ．Ｃ．３．１．１．２６）であるのが好ましい。
【００３３】
国際生化学・分子生物学連合（ＩＵＢＭＢ）推奨の酵素命名法（１９９２）によると、酵素番号Ｅ．Ｃ．３．１．１．２６は、２，３−ジ−Ｏ−アシル−１−Ｏ−（６−Ｏ−α−Ｄ−ガラクトシル−β−Ｄ−ガラクトシル）−Ｄ−グリセロール、ホスファチジルコリン及び他のリン脂質にも作用する「ガラクトリパーゼ」であることに留意すべきである。文献（例えば、Biochemica et Biophysica Acta 1215 (1994) 66-73）には、酵素番号Ｅ．Ｃ．３．１．１．２６に該当する酵素は、脂肪分解性アシルヒドロラーゼ（ＬＡＨ）及びそれに類似する名前で言及されている。ここで使用するガラクトリパーゼ及び脂肪分解性アシルヒドロラーゼ（ＬＡＨ）との用語は、同一の酵素、すなわち、Ｅ．Ｃ．分類の３．１．１．２６に該当し、ガラクト脂質とリン脂質の両方に対して活性を有するものを指す同義語と考えられる。
【００３４】
糖脂質及びリン脂質を加水分解することが可能であり、トリグリセリド及び／又は１−モノグリセリドを加水分解することが不可能又は実質的に不可能である酵素は、ササゲの葉の可溶性抽出物及び／又は小麦の葉のチラコイドから単離されることが好ましい。
【００３５】
適切には、糖脂質及びリン脂質を加水分解することが可能であり、トリグリセリド及び／又は１−モノグリセリドを加水分解することが不可能又は実質的に不可能である酵素は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有していてもよく、又はその変異体、ホモログ若しくは誘導体であってもよい。
【００３６】
適切には、糖脂質及びリン脂質を加水分解することが可能であり、トリグリセリド及び／又は１−モノグリセリドを加水分解することが不可能又は実質的に不可能である酵素は、配列番号１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１に対して少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を有していてもよい。
【００３７】
適切には、糖脂質及びリン脂質を加水分解することが可能であり、トリグリセリド及び／又は１−モノグリセリドを加水分解することが不可能又は実質的に不可能である酵素は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列にコードされていてもよく、又はその変異体、ホモログ若しくは誘導体であってもよい。
【００３８】
適切には、糖脂質及びリン脂質を加水分解することが可能であり、トリグリセリド及び／又は１−モノグリセリドを加水分解することが不可能又は実質的に不可能である酵素は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列、又は配列番号２に対して少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％の相同性を有するヌクレオチド配列にコードされていてもよい。
【００３９】
適切には、糖脂質及びリン脂質を加水分解することが可能であり、トリグリセリド及び／又は１−モノグリセリドを加水分解することが不可能又は実質的に不可能である酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で確認した分子量が約５７ｋＤａ及び／又は約８７ｋＤａのタンパク質であって、Vigna unguiculataから得ることができるタンパク質であってもよい。
【００４０】
分子量が約５７ｋＤａ及び／又は約８７ｋＤａのかかるタンパク質を、ここに詳述する方法と同じ方法で単離するのが好ましい。
【００４１】
「練り粉という条件下で、糖脂質及びリン脂質を加水分解することが可能であり、トリグリセリド及び／又は１−モノグリセリドを加水分解することが不可能又は実質的に不可能である酵素」という語句には、練り粉という条件下で、糖脂質及びリン脂質は加水分解するが、トリグリセリド及び／又は１−モノグリセリドは加水分解しない又は実質的に加水分解しない酵素が含まれる。
【００４２】
実施形態によっては、かかる酵素を含む組成物という形で、かかる酵素を添加する場合がある。
【００４３】
練り粉という条件下又はデガミング条件下で、酵素が、糖脂質及びリン脂質を加水分解することが可能であり、トリグリセリド及び／又は１−モノグリセリドを加水分解することが不可能又は実質的に不可能であるように、有効量の酵素を添加しなくてはならない。その代わり又はそれに加えて、かかる酵素を含む有効量の組成物を、すでに混ぜ合わせた練り粉に直接添加するか、１つ以上ある練り粉成分のうちの１つという形で練り粉に添加してもよい。
【００４４】
ここで「有効量」とは、練り粉という条件下又はデガミング条件下で、効果を示すのに充分であり、練り粉中に存在する１つ以上の糖脂質又は１つ以上のリン脂質の加水分解を検出でき、その一方で、添加した酵素がトリグリセリド及び／又は１−モノグリセリドのレベルに影響を与えない又は大きな影響を与えないような、酵素添加量を意味する。より具体的には、かかる語句は、結果として糖脂質及びリン脂質の加水分解を検出できる一方トリグリセリド及び／又は１−モノグリセリドのレベルには実質的に影響を与えないだけでなく、それに加えて、練り粉の質が向上する程度に、又は練り粉を焼く場合には、パンの体積増大、軟らかさの増大若しくは内相構造の向上など、焼成品の質が向上する程度に、又は食用油から極性脂質が除去される程度に、糖脂質及びリン脂質を加水分解することで酵素による最終生成物が形成されるような酵素の添加量、又は、トリグリセリド及び／又は１−モノグリセリドに対する作用の欠如若しくは実質的な作用の欠如のために酵素による最終生成物が形成されないような酵素の添加量に関係している場合がある。
【００４５】
ここで使用する「トリグリセリド及び／又は１−モノグリセリドを加水分解することが実質的に不可能」及び「トリグリセリド及び／又は１−モノグリセリドに対して実質的に加水分解活性をもたない」とは、かかる酵素は、トリグリセリド及び／又は１−モノグリセリドを、微々たる程度及び／又は検出不可能な程度にしか加水分解しないことを意味する。
【００４６】
練り粉中のトリグリセリド、１−モノグリセリド、糖脂質及びリン脂質のうちの少なくとも１つが、練り粉に使用する穀粉に存在する天然の脂質成分であると有利である。
【００４７】
適切には、リン脂質はホスファチジルコリン（ＰＣ）であり、及び／又は、糖脂質はジガラクトシルジグリセリド（ＤＧＤＧ）である。
【００４８】
極性脂質が添加された場合、かかる極性脂質は、適切には、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）及びホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）からなる群より選択される１つ以上のリン脂質であってもよい。
【００４９】
かかる練り粉は酵母発酵させた練り粉であることが好ましい。ローフ状のパン、ロールパン、又はトースト用パンなど酵母発酵させたパン製品を製造するために本発明の方法を用いるのが好ましいわけだが、本発明の酵素の添加により品質が向上する可能性のある、他の種類の練り粉、及びヌードル製品、パスタ製品、ケーキなど練り粉を基材とする製品についてかかる方法を使用することも考慮されている。
【００５０】
かかる酵素の添加量は、０．１〜１０００単位（酵素）／ｋｇ（穀粉）の範囲内であるのが好ましい。かかる酵素の添加量は、１〜１００単位（酵素）／ｋｇ（穀粉）の範囲内であるのがより好ましい。
【００５１】
練り粉がパン生地である場合、かかる方法には、練り粉を焼いて焼成品を得るというステップもさらに含まれる。焼きパン製品として特に望ましい性質の１つは、実施例に示したとおり、比容積の高さである。したがって、本発明の酵素を添加した場合の焼成品の比容積が、酵素を添加しないことを除いてはまったく同一の条件下で作製した焼成品のものと比べて、少なくとも１０％は増大していることが好ましい。かかる比容積の増大が、例えば、少なくとも３０％、少なくとも４０％など、少なくとも２０％であることがさらに好ましい。別の場合には、練り粉は、パスタ用練り粉、ヌードル用練り粉、及びケーキ用練り粉又はバッターからなる群より選択される練り粉である。
【００５２】
かかる酵素は、添加した場合の焼成品の比容積が、酵素を添加しないことを除いてはまったく同一の条件下で作製した焼成品のものと比べて、少なくとも１０％は増大するような量で添加することが好ましい。
【００５３】
本発明の酵素を添加することによって、酵素を添加しなかった練り粉と比較して、Glutomatic 2200装置を用いて計測した練り粉中のグルテン指数（gluten index）が少なくとも５％は増大することが好ましい。
【００５４】
グルテン指数は、下記の方法を用いてPerten Instruments社（スウェーデン国）のGlutomatic 2200で測定してもよい。寝かせて発酵させた直後に１５ｇの練り粉を計って取り分け、Glutomatic 2200に入れ、５００ｍｌの２％ＮａＣｌ溶液で１０分間洗浄する。洗浄した練り粉をGluten Index Centrifuge 2015に移し、２つのグルテン画分を計って取り分け、下記の式にしたがってグルテン指数を計算する：
グルテン指数＝（篩に残ったグルテンの重量×１００）／グルテンの総重量。
【００５５】
本発明の酵素は、例えば、効果的な界面活性剤であるジガラクトモノグリセリド（ＤＧＭＧ）に変換されるジガラクトジグリセリド（ＤＧＤＧ）をはじめとするガラクト脂質など、ある種の糖脂質に特に活性を示す場合があることがわかっている。最初から練り粉中に存在していた糖脂質の少なくとも２５％、少なくとも３５％が加水分解されるのが好ましく、糖脂質の少なくとも５０％、少なくとも６０％、又は少なくとも７５％が加水分解されるのがより好ましい。
【００５６】
その代わりに、又はそれに加えて、本発明の酵素は、リソリン脂質に変換されるある種のリン脂質に作用を示す場合があることがわかっている。最初から練り粉中に存在していたリン脂質の少なくとも２５％、少なくとも３５％が加水分解されるのが好ましく、リン脂質の少なくとも５０％、少なくとも６０％、又は少なくとも７５％が加水分解されるのがより好ましい。
【００５７】
トリグリセリドに対するリパーゼの作用は、基質のｐＨに依存する場合がある。かかる酵素は、リン脂質及び糖脂質に対しては加水分解活性を有しているが、ｐＨ範囲が４．５〜６．５でトリグリセリド及び／又は１−モノグリセリドに対しては加水分解活性を有していない、又は実質的に有していないことが好ましい。
【００５８】
ここに定義した酵素は、トリグリセリド及び／又は１−モノグリセリドを加水分解することが不可能であることが好ましい。
【００５９】
かかる酵素は、トリグリセリド及び／又は１−モノグリセリドの両方を加水分解することが不可能又は実質的に不可能であることが好ましい。かかる酵素は、トリグリセリド及び／又は１−モノグリセリドの両方を加水分解することが不可能であることが好ましい。あるいは、かかる酵素は、トリグリセリド及びジグリセリドを加水分解することは可能かもしれないが、１−モノグリセリドを加水分解することは不可能又は実質的に不可能かもしれない。適切には、かかる酵素は、１−モノグリセリドを加水分解することが不可能である。
【００６０】
リパーゼ以外の酵素が、練り粉の性質及び焼成品の品質の向上に寄与する場合があることは、当該分野では周知である。本発明の酵素に加えて、別の酵素を少なくとも１つ練り粉に添加する場合があること、又は練り粉の質を向上させる組成物中に別の酵素が少なくとも１つ存在する場合があることは、本発明の範囲内である。そうした別の酵素には、エンドアミラーゼ、エキソアミラーゼなどのデンプン分解酵素、プルラナーゼ、デンプン分解酵素、脱分岐酵素、及びキシラナーゼ、セルラーゼ、リポキシゲナーゼを含むヘミセルラーゼ、及びグルコースオキシダーゼ、ホスホリパーゼ、ヘキソースオキシダーゼなどのオキシドレダクターゼがある。
【００６１】
組成物中の別の練り粉成分について、存在しているのが１個の場合は、穀物の粉末、酵母菌、化学膨張剤、練り粉強化剤、乳化剤、砂糖、アシルグリセロール、リン脂質、糖脂質及び塩からなる群より選択されることが好ましい。
【００６２】
適切には、かかる練り粉は生の練り粉であり、ＣＡ設備中で包装されていてもよい。かかる練り粉は、冷凍されていてもよい。
【００６３】
適切には、本発明の１つ以上の酵素は、練り粉に添加されてもよく、及び／又は練り粉改良組成物中に存在していてもよく、及び／又は食用油に添加されてもよい。適切には、本発明の２つ以上、３つ以上、又は４つ以上の酵素は、練り粉に添加されてもよく、及び／又は練り粉改良組成物中に存在していてもよく、及び／又は食用油に添加されてもよい。
【００６４】
本発明の酵素を選択する方法は、ガラクト脂質、リン脂質、トリグリセリド又は１−モノグリセリドのいずれかを基質としてそれぞれ含む寒天プレート上での酵素活性のスクリーニングを含むのが好ましい。リン脂質及び糖脂質に対しては活性を有しているが、トリグリセリド及び／又は１−モノグリセリドに対しては活性を有していない若しくは実質的に有していない酵素を選択する。
【００６５】
適切には、本発明の酵素を選択する方法のステップ（ａ）及び／又は（ｂ）は、ｐＨ４．５〜６．５にて行われる。
【００６６】
本発明の酵素を選択する方法でテストされる酵素は、リパーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）又は脂質アシルヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．２６）であることが好ましい。
【００６７】
本発明の酵素の調製方法又は開発方法において、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失、又は置換がリッド領域（the lid region）及び／又は活性部位近辺及び／又はアミノ酸配列のＣ末端に存在することが好ましい。
【００６８】
かかるリッド領域（the lid region）が欠失していることが好ましい。
【００６９】
リパーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）及び脂質分解性アシルヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．２６）を修飾して、リン脂質及び糖脂質に対しては活性を有しているが、トリグリセリド及び／又は１−モノグリセリドに対しては活性を有していない、又は実質的に有していない酵素を作製することにより、適切な酵素を調製してもよい。
【００７０】
適切なアミノ酸置換として、活性部位周辺の親水性を変化させる活性部位内又はその近辺のアミノ酸の置換が挙げられる。ほんの一例として、かかるアミノ酸置換により、活性部位内又はその近辺の極性アミノ酸の数が増大する場合がある。
【００７１】
本発明にしたがって酵素を調製し、かかる酵素が、糖脂質及びリン脂質を加水分解することは可能であるが、ｐＨ範囲が４．５〜６．５でトリグリセリド及び／又は１−モノグリセリドを加水分解することは不可能又は実質的に不可能であることが好ましい。
【００７２】
適切には、本発明の酵素は、リン脂質に対してよりも糖脂質に対して強い活性を有していてもよい。適切には、最初から練り粉に存在していた糖脂質（すなわち、ＤＧＤＧ）の加水分解率（％）：最初から練り粉に存在していたリン脂質（すなわち、ホスファチジルコリン）の加水分解率（％）の比が、１０：１以上、例えば、１５：１以上、２０：１以上、３０：１以上、又は４０：１以上である。
【００７３】
あるいは、本発明の酵素は、糖脂質に対してよりもリン脂質に対して強い活性を有していてもよい。例えば、最初から練り粉に存在していた糖脂質（すなわち、ＤＧＤＧ）の加水分解率（％）：最初から練り粉に存在していたリン脂質（すなわち、ホスファチジルコリン）の加水分解率（％）の比が、例えば、１：３以上、例えば、１：５以上、１：８以上、１：１０以上、又は１：１５以上であってもよい。
【００７４】
大半の穀粉には、トリグリセリドなどの非極性脂質、並びにリン脂質及び糖脂質などの極性脂質が含まれている。かかる極性脂質は、本発明の酵素の基質として役に立つ。したがって、かかる方法の１つの実施形態においては、ジガラクトシルジグリセリド（ＤＧＤＧ）をはじめとするガラクト脂質など、少なくとも１つの糖脂質、及び、ホスファチジルコリン（ＰＣ）など、少なくとも１つのリン脂質は、練り粉に使用する穀粉に存在する天然の（又は内因的）脂質成分である。
【００７５】
しかし、練り穀粉には、本発明の酵素の基質として充分な量のこうした脂質が含まれていない場合がある。そのため、練り粉に少なくとも１つの糖脂質及びリン脂質を補充して、かかる酵素用に充分な基質を提供するのは、本発明の範囲に含まれる。当然のことながら、「充分な基質」という表現は、これらの脂質基質のいずれについても、その用途を上記の練り粉改良作用又は焼成品改良作用を得ることに限定するものではないことを意味している。
【００７６】
それに加えて、又はその代わりに、アシルグリセロールなど補助的な非極性脂質を添加してもよい。本発明にしたがい、そうした各種脂質を、植物油、植物性脂肪、動物油、例えばバター脂肪などの動物性脂肪、及びショートニングとして使用できる。これに関連して、特に有用な脂質は、オート油など、植物に由来する油又は脂肪である。オート油は一般的に、トリグリセリドに加えて５〜２５％のリン脂質、及び５〜１２％の糖脂質を含んでいる。オート油を分画して、極性脂質を多く含む画分を作製することができる（E. G. Hammond in Lipid in Cereal Technology edited by P. J. Barnes, Academic Press）。
【００７７】
したがって、本発明の方法の１つの態様は、１つ以上のリン脂質を練り粉に添加できることである。これに関連して、有用なリン脂質として、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、レシチン及びホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）が挙げられる。
【００７８】
トリグリセリド、１−モノグリセリド、糖脂質、リン脂質のうち、少なくとも１つを練り粉に添加してもよい。
【００７９】
驚いたことに、糖脂質及びリン脂質を加水分解することが可能であり、トリグリセリド及び／又は１−モノグリセリドを加水分解することが不可能又は実質的に不可能である酵素を、糖脂質、特にジガラクトシルジグリセリド（ＤＧＤＧ）とともに添加すると、パン体積及び／又は内相構造にプラスの効果があることを見い出した。かかる酵素と糖脂質とを使用した場合に観察されたプラス効果は、酵素のみの場合に観察されたものよりも大きい。したがって、適切には、ここに定義した特異的性質を有する酵素を、糖脂質と組み合わせて使用してもよい。
【００８０】
例えば大豆油、菜種油といった植物油など食用油は、トリグリセリドと、それより少量のリン脂質や糖脂質など極性脂質を含んでいるのが一般的である。透明度と品質の高い油製品を提供するために、植物油からの極性脂質の除去が求められる場合が多い。極性脂質を除去するプロセスは、普通、デガミングと称される。したがって、本発明の第１５の態様に応じて、例えば植物油など食用油のデガミングを、本発明の酵素を用いて行ってもよい。デガミングは、リン脂質などの極性脂質を粗製油から除去する食用油精製プロセスの第一段階である。通常、デガミングは水処理又は湿式処理によって行われる。例えば、ホスファチドは、酵素が触媒となる加水分解によって水溶性リソホスファチドに変換され、かかる水溶性リソホスファチドはその後遠心分離により油から分離される。酵素によるデガミング後の油に残ったリン酸の含有量は、リン２ｐｐｍという低い量にすることができる。
【００８１】
本発明の第１４及び第１５の態様の食用油は、植物油であることが好ましい。
【００８２】
［本発明の利点］
本発明の利点は、練り粉に使用した場合に、糖脂質及びリン脂質に対しては活性を有するが、トリグリセリド及び／又は１−モノグリセリドを加水分解することが不可能又は実質的に不可能である本発明の酵素が、ポリ不飽和脂肪酸を生成することである。なぜなら、内因的な小麦粉の糖脂質及びリン脂質には、高いレベル（＞７０％）のリノール酸（Ｃ１８：２）及びリノレン酸（Ｃ１８：３）が含まれているからである。これらの脂肪酸は、リポキシゲナーゼの基質であり、グルテン強度及び内相の白度の向上に寄与している。
【００８３】
本発明のさらなる利点又は別の利点は、過剰な脂肪酸を生成することなく内因的極性脂質を修飾できることである。これにより、練り粉が硬くなりすぎることはなく、及び／又はできあがったパンの体積増大が可能となり、及び／又は不快臭の発生を減らすことができ、及び／又は酵母活性に対する悪影響を軽減若しくは克服することができる。その他の、本発明のさらなる利点又は別の利点として、練り粉に添加したショートニング、油又は乳脂肪が加水分解されないことが挙げられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８４】
［本発明の酵素］
ここに定義した特性を有する酵素は、植物、動物及び酵母種を含む真菌及び細菌などの微生物といった多様な供給源に由来していてもよい。本発明の酵素は、かかる酵素を自然に生成する生物に由来するものであってもよく、かかる酵素をコードする遺伝子で適切な宿主細胞の形質転換を行うことにより、組換えを通して生成するものであってもよい。かかる酵素は、それ自身がその酵素活性すべての活性部位を含んでいてもよいが、合成又は組換えＤＮＡ技術の使用によって、ここに定義した酵素活性を有するハイブリッド酵素を構築することも可能である。
【００８５】
あるいは、ここに定義した性質及び望ましい基質特異性をもつ酵素を提供するために、ここに定義した特異的性質を少なくとも最初はもたない酵素を、例えば、そのアミノ酸配列を変更することにより修飾することもできる。ランダム突然変異誘発（ＵＳ第４，８１４，３３１号、ＷＯ９３／０１２８５号及びＷＯ９５／２２６１５号）により酵素を修飾して、及び部位特異的突然変異誘発（ＷＯ９７／０４０７９号）により脂質分解酵素を修飾して、酵素の性能を改良することが当該分野では知られている。一般に使用されている概念は、問題の脂質分解酵素におけるアミノ酸鎖の構造部分内で、アミノ酸の挿入、欠失又は置換を行うというものである。修飾に適した酵素とは、エステル結合の加水分解が可能な酵素である。そうした酵素としては、例えば、トリアシルグリセロールリパーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）、リポタンパク質リパーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３４）、モノグリセリドリパーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．２３）、リソホスホリパーゼ、フェルラ酸エステラーゼ及びエステラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．１、Ｅ．Ｃ．３．１．１．２）、及び脂質分解性アシルヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．２６）、及びホスファチジルイノシトールデアシラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．５２）などのリパーゼが挙げられる。
【００８６】
修飾に適した酵素は、植物、動物及び酵母種を含む真菌及び細菌などの微生物といった多様な供給源に由来していてもよい。修飾に適した酵素の例として、例えば、P. cepacia（ＵＳ第５，２９０，６９４号）、P. glumae (Frenken N et al (1992) Appl. Envir. Microbiol. 58 3787-3791)、P. pseudoalcaligenes （ＥＰ第０３３４４６２号）、又はPseudomonas sp.ＳＤ７０５株（ＷＯ９５／０６７２０号、ＥＰ第０７２１９８１号、ＷＯ９６／２７００２号及びＥＰ第０８１２９１０号）に由来する、Pseudomonasリパーゼが挙げられる。あるいは、修飾に適した酵素は、例えば、Humicola科及びZygomycetes科の脂質分解酵素や真菌のクチナーゼなど、真菌の脂質分解酵素であってもよい。脂質分解酵素のHumicola科は、H. lanuginosaＤＳＭ４１０９株由来のリパーゼ及びこのリパーゼに５０％を越える相同性を有するリパーゼからなっている。H. lanuginosa（Thermomyces lanuginosusと同義）由来のリパーゼは、ＥＰ第０２５８０６８号及びＥＰ第０３０５２１６号に記載されており、また、ＵＳ第５，８６９，４３８号の配列番号２の１〜２６９位に示されるアミノ酸配列を有している。
【００８７】
Withers-Martinez et al (Structure 1996, 4: 1363-1374)は、ガラクト脂質及びリン脂質に対して活性を有し、トリグリセリドには低い活性を有するモルモット膵臓リパーゼ関連タンパク質２（ＧＰＬＲＰ２）を研究した。この酵素の結晶構造が示されており、トリグリセリドにのみ作用を有するヒト膵臓リパーゼ（ＨＰＬ）、及びＧＰＬＲＰ２の触媒部位とＨＰＬのＣ末端領域（ＧＰＬＲＰ２／ＨＰＬ）からなるリパーゼ関連タンパク質２（ＧＰＬＲＰ２）のキメラ変異体と比較されている。ＧＰＬＲＰ２／ＨＰＬ変異体は、リン脂質及びガラクト脂質に対して活性を有するが、トリグリセリドに対しては、ＧＰＬＲＰ２酵素が有するものよりもさらに低い活性を有している。比較のため、スズメバチの毒（ＰＬＡ１）も分析した。Withers-Martinez et al (Structure 1996, Nov 15; 4(11): 1363-74)は、モルモット膵臓リパーゼ関連タンパク質２、ヒト膵臓リパーゼ、及びスズメバチの毒に由来するホスホリパーゼＡ１の活性部位上に局在するループ構造を研究し、ループの形状とトリグリセリド及びリン脂質に対する活性との間に関連性を見い出した。
【００８８】
ＧＰＬＲＰ２においては、ＨＰＬと比較してリッド領域（the lid region）のサイズが小さくなっており、β９ループだけが保存されているため、活性部位周辺の表面疎水性が低くなっているのが観察されている。これは、トリグリセリドに対するＧＰＬＲＰ２及びＧＰＬＲＰ２／ＨＰＬの活性が、ＨＰＬに比べて低いことの説明になるかもしれない。
【００８９】
ほんの一例として、リパーゼの触媒部位内又はその周辺の特異的アミノ酸を置換することにより、モノグリセリドに対する活性をもたない変異リパーゼを得てもよい。例えば、配列番号３に示され、欧州特許公開番号第０９７７８６９号に教示されているアミノ酸配列を有し、配列番号４に示されるヌクレオチド配列にコードされるAspergillus tubigensis由来のリパーゼを変化させて、本発明にしたがって使用する変異リパーゼを提供してもよい。
【００９０】
配列番号３の３つの触媒とは、セリン１７３（Ｓｅｒ１７３）、アスパラギン酸２２８（Ａｓｐ２２８）、及びヒスチジン２８５（Ｈｉｓ２８５）である。適切には、これら３つの触媒のアミノ酸の１つ以上を置換して、３つの触媒の親水性を変えてもよい。
【００９１】
配列番号３の触媒部位内又はその周辺に存在する、下記のアミノ酸の１つ以上を置換して、活性部位周辺の親水性を変えてもよい：Ｐｈｅ１０７〜Ｐｈｅ１２３；Ｇｌｙ１７１〜Ｇｌｙ１７５；Ｔｙｒ１９８〜Ｉｌｅ２０３；Ｔｈｒ２２４〜Ｇｌｙ２３９；Ｓｅｒ２７０〜Ｌｅｕ２９７。
【００９２】
例えば、本発明にしたがい、「親」リパーゼを変異させて、基質活性が変化した変異リパーゼを提供する手順には、下記のステップが含まれていてもよい。
【００９３】
Ａ．発現ベクターの構築
誘導ベクターＧａｌｌpを構成ベクターＡＤＨpで置換することにより、例えばpYELなどのベクターを構築してもよく、S. cerevisiae中でのインビボ組換えにより、リパーゼ遺伝子（例えば、ＥＰ第０９７７８６９号に教示されているAspergillus tubigensis由来のリパーゼ遺伝子）を組み込んでもよい。図１１は、pYES2由来のそうした発現ベクターを示している。
【００９４】
Ｂ．変異性ＰＣＲ（ＥＰ−ＰＣＲ）によるランダム突然変異誘発
例えば、これよりGenemorph及びDiversifyとそれぞれ称する、GeneMorphTM PCR Mutagenesis Kit及びDiversifyTM PCR Random Mutagenesis Kitという２つのＥＰ−ＰＣＲ法を用いて、ランダム突然変異誘発ライブラリーを構築してもよい。
【００９５】
例えばＬｉｐＡ遺伝子などのリパーゼ遺伝子１個につき１〜２個のアミノ酸を置換するために、変異頻度を最適化してもよい。GenemorphＥＰ−ＰＣＲ法において鋳型ＤＮＡ（〜０．６５〜４０ｎｇ）の最初の量を変えることにより、並びにDiversifyＥＰ−ＰＣＲ法においてＭｎＳＯ4（０〜６４０μＭ）及びｄＧＴＰ（４０〜１２０μＭ）の濃度を変えることにより、変異頻度の最適化を行ってもよい。最適化したＥＰ−ＰＣＲ法には、下記のものが含まれていてもよい：GenemorphＥＰ−ＰＣＲ法では、０．６５ｎｇの鋳型ＤＮＡ、２．５ＵのMutazyme DNA Polymerase、１２５ｎｇの各プライマー、１×Mutazyme反応緩衝液及び２００μＭのｄＮＴＰ混合物を使用し、DiversifyＥＰ−ＰＣＲ法では、１ｎｇの鋳型ＤＮＡ、２ＵのTitaniumTM taq DNA Polymerase、１０μＭの各プライマー、３．５ｍＭのＭｇＣｌ2、４８０μＭのＭｎＳＯ4、２００μＭのｄＮＴＰ混合物及び４０μＭのｄＧＴＰを使用した。どちらのＥＰ−ＰＣＲ法も、総量５０μＬで行われた。
【００９６】
両方のＥＰ−ＰＣＲ用に設計したプライマーを下記の表に示す。プライマーのＪＯＭ１は、さらに３個のＡ（下線部）を開始コドンの上流に導入している。
【表ｉ】
2005508609.tif 000002
【００９７】
プログラム可能なサーマルサイクラーを下記の条件で用いて、ＥＰ−ＰＣＲを行ってもよい；GeneMorphTM PCR Mutagenesis Kit：９４℃で３０秒、次いで９４℃で３０秒、５５℃で３０秒及び７２℃で２分のサイクルを３０サイクル行い、最後に、７２℃で１０分間の伸長をさらに行う。DiversifyTM PCR Random Mutagenesis Kit：９４℃で３０秒、次いで９４℃で３０秒、６８℃で１分のサイクルを２５サイクル行う。
【００９８】
Ｃ．形質転換及び発現
形質転換を行い、被感染能力をもつ細胞を、例えば、pYES2プロトコル（米国、カリフォルニア州、Invitrogen社製、カタログ番号Ｖ８２５−２０）に記載の形質転換手順を修正した手順により、調製してもよい。Saccharomyces cerevisiaeＧＥＮ．ＰＫ１１３−５Ｄのシングルコロニーを、２０ｍＬのＹＰＤ中でインキュベーションし、２００ＲＰＭで震盪しながら、３０℃で一晩増殖させてもよい。一晩過ぎた後の培養物を、ＯＤ600値が０．２〜０．３になるまでＹＰＤで希釈し、２００ＲＰＭで３０℃にてさらに３時間インキュベーションした。２０℃にて、４７５０ｇでの遠心分離を５分間行って、細胞を回収してもよい。１ｍＬの１×ＴｒｉｓＥＤＴＡ（１×ＴＥ）、ｐＨ８．０にペレットを再懸濁して洗浄し、１００００ｇで５分間の遠心分離にかけてもよい。０．５ｍＬの１×ＴＥ及び１００ｍＭの酢酸リチウム、ｐＨ７．５を添加して、細胞に被感染能力をもたせた。
【００９９】
１００μｇのＤＮＡと５０μＬの被感染能力をもつSaccharomyces cerevisiae細胞、５μＬのYeastmaker Carrier DNAと１００ｍＭの酢酸リチウム３００μＬ、４０％のポレチレングリコール３３５０と１×ＴＥとを静かに混ぜ合わせることにより、形質転換を行ってもよい。かかる混合物を１０００ＲＰＭで震盪しながら３０℃で３０分間インキュベーションし、その後４２℃で１５分間インキュベーションしてもよい。その後で、細胞を氷に移し、１１３００ｇで５秒間のペレット化を行ってもよい。かかるペレットを１ｍＬのＹＰＤに再懸濁し、３０℃で４５分間、２００ＲＰＭにてインキュベーションしてもよい。ＳＣ−ｕｒａを含むプレートに１５０μＬの懸濁液を移し、３０℃で３日間インキュベーションした。被感染能力のあるSaccharomyces cerevisiae細胞への形質転換は、インビボでの組換えを用いたクローニングにも利用された。インビボでの組換えの際には、１００ｎｇのリパーゼ（例えば、ＬｉｐＡ）又はその変異体を、５０ｎｇのＢａｍＨＩ線状化pYEAで共形質転換してもよい。
【０１００】
Ｄ．ＤＮＡの単離
High Pure Plasmid Isolation Kitを使用したアルカリ溶解法により、大腸菌由来のプラスミドＤＮＡを単離してもよい。
【０１０１】
Saccharomyces cerevisiae由来のプラスミドＤＮＡを下記のとおり単離してもよい：１１００ｇで１５分間の遠心分離を行って細胞をペレット化し、１ｍＬのＳＴＥＴ及び１．５ｍＬのガラスビーズ（４２５〜６００μ）中で再懸濁してもよい。さらに１ｍＬのＳＴＥＴを添加し、混合液を１００℃で５分間インキュベーションした。かかる溶液をその後６５００ｇで１５分間遠心分離してもよく、上清液をエッペンドルフ管に移し、さらに１５分間２７０００ｇで遠心分離を行ってもよい。Plasmid Mini Purification KitのQiagen-tip 20を用いて、上清液からＤＮＡを抽出し精製してもよい。
【０１０２】
Ｅ．ＤＮＡシーケンシング
リパーゼ（例えば、ＬｉｐＡ）変異体のシーケンシングをジデオキシ法（Sanger et al., 1977）で行ってもよい。Plasmid Mini Purification Kitを修正したものを使用して、シーケンシング用プラスミドＤＮＡを調製してもよい。Qiagen-tip 20 aを用いる代わりに標準的なアルカリ溶解法を行ってもよい。シーケンシングにＰＣＲ増幅ＤＮＡを使用する場合は、Wizard PCR Preps DNA Purification SystemによってＤＮＡを単離した。
【０１０３】
ABI Prism BigDyeTM Terminators v3.0 Cycle Sequencing Kit（Danisco Biotechnology社製）又はABI PrismTM dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit（AAU社製）を使用し、鋳型ＤＮＡ並びに濃度がそれぞれ５００ｎｇ及び３．２ｐｍｏｌのプライマーで、シーケンシング反応を行ってもよい。プログラム可能なサーマルサイクラーを用いて、下記の条件でシーケンシング反応を行ってもよい：９６℃で３０秒、５０℃で１５秒、及び６０℃で４分間というサイクルを２５サイクル行う。エタノール沈殿によりＰＣＲ産物を精製してもよく、ペレットを１２μＬのＨＩＤＩホルムアミド（Danisco Biotechnology社製）又は１２μＬの鋳型抑制試薬（AAU社製）に再懸濁しても、仕切りのついたGenetic Analyzerのサンプル管に移してもよい。サンプルをABI Prism 3100 Genetic analyzer（Danisco Biotechnology社製）又はABI Prism 310 Genetic analyzer（AAU社製）にかけてもよい。変異体ＬｉｐＡのシーケンシングに適切なプライマーを、下記の表に提示する。これらのプライマーはＬｉｐＡ内部でアニーリングを行う。
【表ｉｉ】
2005508609.tif 000003
【０１０４】
Ｆ．リパーゼ（適切にはリパーゼ３）変異体のシーケンシング：基質特異性の変化
ＤＧＤＧ活性及びホスホリパーゼ活性は示すがトリグリセリド活性は示さない変異体を、例えば予備段階でハイスループットプレートスクリーニングを利用し、続いて増強を確認し定量化する定量スクリーニングを利用して、同定してもよい。
【０１０５】
Ｇ．改良変異体の作製及び精製
選択した変異体のシングルコロニーを、５０ｍＬのＳＣ−ｕｒａ培地に接種し、３０℃、２５０ｒｐｍで２日間インキュベーションした後、２５ｍＬを５００ｍＬのＹＰＤ培地に移して、３０℃、２００ｒｐｍでさらに２日間インキュベーションしてもよい。１５分間の遠心分離を行って、作製したリパーゼを培養物から分離してもよい。次回使用時まで上清液を−１８℃で保管してもよい。
【０１０６】
疎水性相互作用クロマトグラフィー
２５０ｍＬの上清液を（ＮＨ4）2ＳＯ4で平衡化して最終濃度１．０Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4を得てもよい。１５μｍの単分散剛性ポリスチレン／ジビニルベンゼンマトリックスと結合したフェニル疎水性リガンドを含むＳＯＵＲＣＥ１５ＰＨＥカラムに、懸濁液を注入した。最終総容積が５．１ｍＬになるようにかかるカラムをパックしてもよい。２０ｍＭのＮａＡｃ緩衝液、ｐＨ５．５、及び１．０Ｍ〜０Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4の線状下降勾配を用いて、速度５ｍＬ／分で２０分間溶出を行ってもよい。
【０１０７】
本発明のリパーゼ（例えばリパーゼ３）及びその変異体を含む画分を、適切な基質を含むプレート上のウェルに各１５μＬの画分を入れてホスホリパーゼ活性、ガラクトリパーゼ活性及びトリグリセリドヒロリシスのスクリーニングを行うことにより同定してもよい。
【０１０８】
脱塩
最終総容積が８．３ｍＬになるようにパックしたSephadex G-25マトリックスを含むＰＤ−１０脱塩カラムを用いて、選択した画分を脱塩してもよい。２０ｍＭのＴＥＡ緩衝液ｐＨ７．３でかかるカラムを事前に平衡化してもよい。平衡化の後で、２．５ｍＬのサンプルを入れた。２０ｍＭのＴＥＡ緩衝液ｐＨ７．３を３．５ｍＬ使用して、溶出を行ってもよい。
【０１０９】
アニオン交換クロマトグラフィー
１５μｍの単分散剛性ポリスチレン／ジビニルベンゼンマトリックスと結合した４個のアンモニウムリガンドを含むＳＯＵＲＣＥ１５Ｑカラムに、選択した画分を注入してもよい。最終総容積が５．１ｍＬになるようにかかるカラムをパックしてもよい。２０ｍＭのＴＥＡ緩衝液、ｐＨ７．３、及び０Ｍ〜１．０ＭのＮａＣｌの線状上昇勾配を用いて、速度２ｍＬ／分で２０分間溶出を行ってもよい。
【０１１０】
Ｈ．改良変異体の性質決定
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／未変性ゲル
Laemmli（１９７０）にしたがって調製された、１×ランニング緩衝液、１２％の分離ゲル及び４％のスタッキングゲルを用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質をサイズ別に分離した。
【０１１１】
等量のサンプル及び２−メルカプトエタノールを含むＳＤＳサンプル緩衝液を、９５℃で５分間インキュベーションしてもよい。標準物質として、０．６４μｇのホスホリラーゼｂ、０．８３μｇのウシ血清アルブミン、１．４７μｇのオボアルブミン、０．８３μｇのカルボニックアンヒドラーゼ、０．８８μｇの大豆トリプシン阻害剤及び１．２１μｇのα−ラクトアルブミンを含む、分子量の低いマーカーを使用した。Coommasie G250 Stainを用いて、タンパク質のバンドを視覚化した。
【０１１２】
未変性ＰＡＧＥについて：ＳＤＳをまったく使用しない未変性ＰＡＧＥにより、移動度に応じてタンパク質を分離してもよい。
【０１１３】
これまで、ガラクト脂質及びリン脂質に対する活性しかもたないリパーゼをパン類の製造に用いることはなかった。これらの種類のリパーゼが文献に記載されることはめったにない。しかし、Matos A. R. et al (FEBS Lett 2001 Mar 2; 491 (3): 188-92)は、旱魃の被害を受けたササゲから、バキュロウィルス系で発現した４３ＫＤａのタンパク質を単離している。この酵素は、ガラクト脂質アシルヒドロラーゼ活性を優先的に示し、ある程度のリン脂質活性を示したが、トリアシルグリセロール（トリグリセリド）に対しては活性を示さなかった。この酵素のアミノ酸配列を配列番号１に示し、この酵素をコードするヌクレオチド配列を配列番号２に示す。これらの種類の酵素は、普通のリパーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）とは異なっており、通常は、脂質分解性アシルヒドロラーゼ（ＬＡＨ）（Ｅ．Ｃ．３．１．１．２６）という語が、これらの酵素に適用されている。これまでのところ、これらの酵素は植物界でしか記載されていない。Matos et alが記載したガラクト脂質アシルヒドロラーゼは、本発明での使用に適している。
【０１１４】
本発明の酵素は、特異的な性質をもつものであれば、リパーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）であっても、脂質分解性アシルヒドロラーゼ（ＬＡＨ）（Ｅ．Ｃ．３．１．１．２６）であってもよい。
【０１１５】
Sahsah et al（Biochem Biophys Acta 1994 Nov 17; 1215 (1-2): 66-73）は、可溶性ササゲ葉抽出物から脂質分解性アシルヒドロラーゼを単離した。この酵素が異なる基質に対して示す相対的な加水分解活性は、下記のとおりである：ジガラクトシルジグリセリド＞モノガラクトシルジグリセリド＞ホスファチジルコリン＞ホスファチジルグリセロール。かかる酵素は、トリアシルグリセロール（トリグリセリド）に対しては活性を示さなかった。Sahsah et alが教示した酵素は、本発明での使用に適している。
【０１１６】
O'Sullivan et al（J. Plant Physiol. Vol. 131, pp 393-404 1987）は、小麦の葉のチラコイドと会合する膜結合性ガラクトリパーゼについて、開示している。
【０１１７】
上記の例が示すように、リン脂質及びガラクト脂質のみに対して活性を有するリパーゼ又は脂質分解アシルヒドロラーゼは、めったに見られないようではあるが自然界に存在しており、本発明に使用してもよいものである。それに加えて又はその代わりに、リン脂質及びガラクト脂質に対しては活性を有しているが、トリグリセリド及び／又は１−モノグリセリドに対しては活性を有していないリパーゼを作製する他の手段も存在する。
【０１１８】
上記のように、Withers-Martinez（Structure 1996, 4: 1363-1374）により、モルモットのリパーゼ関連タンパク質２（ＧＰＬＲＰ２）が、リン脂質及びガラクト脂質に対して活性を有し、トリグリセリドには低い活性を有することが示された。活性部位周辺の親水性によって、トリグリセリドに対する活性を制御できることも示された。これにより、活性部位内又はその近辺でのアミノ酸の置換によって、活性部位周辺の親水性を変化させてトリグリセリドに対する活性をさらに低下させる、という可能性が拓けてくる。
【０１１９】
かかる酵素中の特定のアミノ酸を変えることによってリパーゼ活性を変化させられることは、よく知られている。Cordle et al（J. Lipid Res. 1998 Sep 39 (9): 1759-67）は、チロシンをさらに極性の強いアルパラギン酸に置換し、長鎖脂肪酸に対する活性を低下させた。
【０１２０】
Carriere et al（Biochemistry 1997 Jan 7 36 (1): 239-48）は、界面の活性化をゼロにするためにヒト膵臓リパーゼのリッド（the lid）を除去し、トリグリセリドに対するその特異的活性が劇的に低下することを見出した。この文献は、ヒト膵臓リパーゼのＣ末端が界面の安定化に重要であることも報告している。
【０１２１】
リン脂質及び糖脂質に対しては活性を有しているが、トリグリセリドに対しては活性を有していない、トリグリセリド活性に最適のｐＨを修正することによって、パン類の製造に好ましいリパーゼを得ることができる。通常条件下では、練り粉中のｐＨは４．５〜６．５の範囲内である。Ching T. Hou（Journal of Industrial Microbiology, 13 (1994) 242-248）は、種類の異なる多数のリパーゼのスクリーニングを行い、多数のリパーゼが、ｐＨ７．５ではトリグリセリド活性を有しているがｐＨ５．５では有していないことを見出した。
【０１２２】
前記ｐＨ５．５では活性を有さないリパーゼを選択すること、部位特異的突然変異誘発又は局所的なランダム突然変異誘発によって活性部位周辺の領域を修飾して、活性部位周辺の表面親水性を変えること、及び部位特異的突然変異誘発又は局所的なランダム突然変異誘発によってリッド（the lid）を修飾することにより、リン脂質及びガラクト脂質に対する活性を有し、トリグリセリドに対しても、ｐＨ７．５以上であれば活性を有したままだが、例えばｐＨ５．５などｐＨ６．５以下だと活性を有していないリパーゼを得ることができる。
【０１２３】
リパーゼは、異なる種類の特異性を有することができる（Inform Vol. 8, No. 6 640-650）。リパーゼの脂肪アシル特異性は、生成される脂肪酸の種類に影響を与える。不飽和脂肪酸に非常に特異的なリパーゼもあるが、ポリ不飽和脂肪酸は、外因的リポキシゲナーゼ又は添加されたリポキシゲナーゼの基質であるため、これは、練り粉系では好ましいことである。本発明の酵素は、不飽和脂肪酸を優先的に加水分解することが好ましい。適切には、本発明の酵素の調製方法又は開発方法においては、挿入、欠失又は置換によって、酵素が脂質部分中で優先的にポリ不飽和脂肪酸を生成するように、酵素の脂肪アシル特異性が変化する。
【０１２４】
リン脂質及び糖脂質に対しては加水分解活性を有しているが、トリグリセリド及び／又は１−モノグリセリドに対しては加水分解活性を有していない、又は実質的に有していない酵素の適切な例を、この後の実施例という見出しを掲げた部分で示す。
【０１２５】
［本発明の酵素をコードするヌクレオチド配列のクローニング］
ここに定義した特異的性質を有する酵素又は修飾に適した酵素のいずれかをコードするヌクレオチド配列は、かかる酵素を生成するすべての細胞又は生物から単離してもよい。ヌクレオチド配列を単離するさまざまな方法が、当該分野でよく知られている。
【０１２６】
例えば、かかる酵素を生成する生物由来の染色体ＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡを用いて、ゲノムＤＮＡ及び／又はｃＤＮＡライブラリーを構築してもよい。かかる酵素のアミノ酸配列が判明していれば、標識オリゴヌクレオチドプローブを合成し、かかる生物より調製されたゲノムライブラリーから、酵素をコードするクローンを同定する際に使用してもよい。あるいは、他の既知の酵素遺伝子に相同的な配列を含む標識オリゴヌクレオチドプローブを使用して、酵素をコードするクローンを同定することもできる。後者の場合、ハイブリダイゼーション及び洗浄には低ストリンジェンシー条件を使用する。
【０１２７】
あるいは、ゲノムＤＮＡ断片をプラスミドなど発現ベクターに導入し、結果としてできたゲノムＤＮＡライブラリーで酵素陰性菌を形質転換し、酵素用基質（すなわち、リン脂質又はガラクト脂質）を含む寒天上にかかる形質転換した細菌を置いて、同定する酵素をクローンが発現できるようにすることにより、酵素をコードするクローンを同定することができる場合がある。
【０１２８】
あるいは、Beucage S. L. et al (1981) Tetrahedron Letters 22, p 1859-1869記載のホスホロアミダイト法、又はMatthes et al (1984) EMBO J. 3, p 801-805記載の方法など、確立された標準的な方法で合成することにより、かかる酵素をコードするヌクレオチド配列を調製してもよい。ホスホロアミダイト法では、適切なベクター中でオリゴヌクレオチドの、例えば、自動ＤＮＡ合成機による合成、精製、アニーリング、結合及びクローニングが行われる。
【０１２９】
かかるヌクレオチド配列は、ゲノム起源配列と合成起源配列との混合物、合成起源配列とｃＤＮＡ起源配列との混合物、又はゲノム起源配列とｃＤＮＡ起源配列との混合物で、標準的技法にしたがって合成起源配列、ゲノム起源配列、及びｃＤＮＡ起源配列の断片を（適切に）結合して調製したものであってもよい。結合した各断片は、全ヌクレオチド配列のさまざまな部分に相当する。例えば、ＵＳ４，６８３，２０２号又はSaiki R K et al.（Science (1988) 239, pp 487-491）に記載の特異的プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、ＤＮＡ配列も調製してもよい。
【０１３０】
［ヌクレオチド配列］
本発明は、ここに定義した特異的性質を有する酵素をコードするヌクレオチド配列をも含むものである。ここで使用する「ヌクレオチド配列」との語は、オリゴヌクレオチド配列又はポリヌクレオチド配列、及びその変異体、ホモログ、断片及び誘導体（その部分など）を指す。かかるヌクレオチド配列は、ゲノム起源、合成起源又は組替え体起源であってもよく、センス鎖又はアンチセンス鎖を示す二本鎖又は一本鎖であってもよい。
【０１３１】
「ヌクレオチド配列」との語は、本発明との関連においては、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。この語は、好ましくはＤＮＡを意味し、より好ましくは本発明のコード配列のｃＤＮＡを意味する。
【０１３２】
好ましい実施形態においては、ここに定義した特異的性質を有する酵素をコードするヌクレオチド配列それ自体は、その自然環境中の天然（native）ヌクレオチドが自然状態で会合する配列であって、同じく自然環境中に存在する配列と結合している場合には、そうした天然ヌクレオチドを含むものではない。参照を簡略化するために、この好ましい実施形態を「非天然（non-native）ヌクレオチド配列」と称する。これに関して、「天然ヌクレオチド配列」との語は、その天然の環境にある全ヌクレオチド配列を意味し、それが自然状態で会合する全プロモーターと操作可能な状態で結合している場合には、そのプロモーターもその自然環境中に存在していることになる。したがって、本発明の酵素を、その天然生物中のヌクレオチド配列によって発現させることは可能だが、その場合、そのヌクレオチド配列が、かかる生物内において自然状態で会合するプロモーターの制御を受けることはない。
【０１３３】
かかる酵素は天然の酵素ではないことが好ましい。これに関し、「天然酵素」との語は、その自然環境中に存在し、その天然ヌクレオチド配列により発現される全酵素を意味する。
【０１３４】
一般的には、ここに定義した特異的性質を有する酵素をコードするヌクレオチド配列は、組換えＤＮＡ技術（すなわち、組換えＤＮＡ）を用いて調製される。しかし、本発明の別の実施形態においては、当該分野で周知の化学的方法を使用して、かかるヌクレオチド配列を全体的又は部分的に合成できる場合がある（Caruthers MH et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23及びHorn T et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232を参照のこと）。
【０１３５】
［アミノ酸配列］
本発明は、ここに定義した特異的性質を有する酵素のアミノ酸配列をも含むものである。
【０１３６】
ここで使用する「アミノ酸配列」という語は、「ポリペプチド」及び／又は「タンパク質」という語の同義語である。「アミノ酸配列」が「ペプチド」の同義語である場合もあれば、「アミノ酸配列」が「酵素」の同義語である場合もある。
【０１３７】
かかるアミノ酸配列を、適切な供給源から調製／単離してもよく、又は、合成により作製しても、組換えＤＮＡ技術を用いて調製してもよい。
【０１３８】
適切には、ここに教示している単離した酵素から、標準的な技法によってかかるアミノ酸配列を得てもよい。
【０１３９】
単離した酵素由来のアミノ酸配列を測定する適切な方法の１つは、下記のとおりである。
【０１４０】
精製した酵素を凍結乾燥してもよく、かかる凍結乾燥した材料１００μｇを、８Ｍの尿素と０．４Ｍの炭酸水素アンモニウムの混合液５０μｌ、ｐＨ８．４に溶解してもよい。溶解したタンパク質を変性させ、５００℃で１５分間還元させた後、窒素でオーバーレイを行い、４５ｍＭのジチオスレイトール５μｌを添加してもよい。室温まで冷却した後、１００ｍＭのヨードアセトアミド５μｌを添加して、システイン残基が室温で１５分間、窒素下で暗所にて誘導されるようにしてもよい。
【０１４１】
１３５μｌの水及び５μｇのエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃを含む５Ｈｌの水を、上記の反応混合液に添加してもよく、窒素中にて３７℃で２４時間の分解を行ってもよい。
【０１４２】
溶媒Ａ：０．１ｔのＴＦＡを含む水、及び溶媒Ｂ：０．１ｋのＴＦＡを含むアセトニトリルを用いたＶＹＤＡＣ  Ｃ１８カラム（０．４６×１５ｃｍ；１０ｙｍ；米国、カリフォルニア州、The Separation Group社製）上での逆相ＨＰＬＣによって、結果として生じたペプチドを分離してもよい。Ｎ末端シーケンシングに先だって、同じ溶媒系を用いたDevelosilＣ１８カラム上で、選択したペプチドを再びクロマトグラフィーにかけてもよい。製造者の指示（米国、カリフォルニア州、Applied Biosystems社）に準じてパルス液体高速サイクルを使用したApplied Biosystems 476A sequencerで、シーケンシングを行ってもよい。
【０１４３】
［変異体／ホモログ／誘導体］
本発明は、ここに定義した特異的性質を有する酵素のアミノ酸配列及びかかる酵素をコードするヌクレオチド配列の変異体、ホモログ及び誘導体の使用をも含むものである。ここで「ホモログ」との語は、対象アミノ酸配列及び対象ヌクレオチド配列に対してある相同性を有する存在物を意味する。ここで「相同性」との語は、「同一性」と同一視することができる。
【０１４４】
アミノ酸配列及び／又はヌクレオチド配列の変異体、ホモログ及び誘導体は、かかる酵素の機能的活性を保有する酵素及び／又は活性を高める酵素を、提供する及び／又はコードするものである。
【０１４５】
本文中では、相同配列には、対象配列に対して少なくとも７５、８５又は９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５又は９８％の同一性を有するアミノ酸配列が含まれるものとされる。一般的に、ホモログに含まれる活性部位は、対象アミノ酸配列に含まれる部位と同じである。相同性は類似性という語と同義語と考えられるが（すなわち、類似した化学特性／機能を有するアミノ酸残基）、本発明の文中では、配列の同一性を相同性と表現するのが好ましい。
【０１４６】
本文中では、相同配列には、本発明の酵素をコードするヌクレオチド配列（対象配列）に対して少なくとも７５、８５又は９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５又は９８％の同一性を有するヌクレオチド配列が含まれるものとされる。一般的に、ホモログに含まれる活性部位をコードする配列は、対象配列に含まれる配列と同じである。相同性は類似性という語と同義語と考えられるが（すなわち、類似した化学特性／機能を有するアミノ酸残基）、本発明の文中では、配列の同一性を相同性と表現するのが好ましい。
【０１４７】
相同性の比較は、目視により、又は、より一般的には、容易に利用可能な配列比較プログラムを用いて行うことができる。こうした市販のコンピュータプログラムは、２つ以上の配列間の相同性（％）を計算できる。
【０１４８】
隣接配列の相同性（％）を計算してもよい。すなわち、ある配列を別の配列と並べ、ある配列中の各アミノ酸と、別の配列中の対応するアミノ酸について、その残基を１つずつ直接比較する。これは、「ギャップなし」アラインメントと呼ばれる。一般的には、そうしたギャップなしアラインメントは、残基数が比較的少ない場合のみ行われる。
【０１４９】
これは非常に簡単で首尾一貫した方法ではあるが、例えば、他の部分は同一の配列対において、１つの挿入又は欠失によって後続のアミノ酸残基がアラインメントから外れてしまい、グローバルアラインメントを行った際に、相同性（％）が結果的に大幅に減少するという可能性を考慮に入れていない。したがって、大半の配列比較方法は、全体的な相同性スコアに不当に不利な条件を与えることなく挿入及び欠失という可能性を考慮に入れた、最適のアラインメントを作り出すように設計されている。これは、配列アラインメントに「ギャップ」を挿入して、局所的相同性の最大化を試みることにより達成される。
【０１５０】
しかし、こうしたより複雑な方法では、同一アミノ酸の数が同じ場合に、ギャップの数がなるべく少ない配列アラインメント――比較する２つの配列間における関連性の高さを反映している――が、多くのギャップを有するものより高いスコアになるように、アラインメントに生じる各ギャップに「ギャップペナルティー」が割り当てられる。ギャップの存在には比較的高いコストを与え、ギャップの後ろの各残基には少ないペナルティーを与える「アフィンギャップコスト」が一般的に使用される。これはもっとも一般的に使用されるギャップスコアリングシステムである。もちろん、ギャップペナルティーが高いと、少ないギャップを有するものが最適化アラインメントとなる。大半のアラインメントプログラムは、ギャップペナルティーを修正できるようになっている。しかし、そうした配列比較用のソフトウェアを使用する際には、デフォルト値を用いるのが好ましい。例えば、GCG Wisconsin Bestfit packageを使用する場合は、アミノ酸配列用のデフォルトギャップペナルティーは、１つのギャップにつき−１２で、各伸長については−４である。
【０１５１】
したがって、最大相同性（％）の計算には、まず、ギャップペナルティーを考慮した最適アラインメントの作製が必要となる。こうしたアラインメントを実行するのに適したコンピュータプログラムは、GCG Wisconsin Bestfit package（Devereux et al 1984 Nuc. Acids Research 12 p387）である。配列比較を行えるその他のソフトウェアには、BLAST package（Ausubel et al 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed - Chapter 18を参照のこと）、FASTA（Altschul et al 1990 J. Mol. Biol. 403-410）及び比較ツールのGENEWORKS suiteがあるが、これらに限定されるものではない。BLASTとFASTAはともにオフライン及びオンラインでの検索に利用できる（Ausubel et al 1999, 7-58から7-60ページを参照のこと）。しかし、いくつかの用途には、GCG Bestfitプログラムを使用するのが好ましい。BLAST 2 Sequenceという名前の新しいツールも、タンパク質及びヌクレオチド配列を比較する際に利用できる（FEMS Microbiol Lett 1999 174 (2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177 (1): 187-8及びtatiana@ncbi.nlm.nih.govを参照のこと）。
【０１５２】
最終的な相同性（％）は同一性の観点から測定できるが、アラインメントプロセスそれ自体は、すべてか無かの一対比較法に基づかないのが一般的である。その代わり、基準化した類似性スコアマトリックスが一般に使われる。このマトリックスは、化学的類似性又は進化的隔たりに基づいて、各ペアワイズ比較にスコアを割り当てるものである。通常使用されるそうしたマトリックスの例として、BLOSUM62マトリックス――プログラムのBLAST suite用デフォルトマトリックス――が挙げられる。GCG Wisconsinプログラムは、一般的に、公的なデフォルト値又は供給されていればカスタムシンボル比較表のいずれかを使用する（詳細はユーザー用マニュアルを参照のこと）。いくつかの用途には、GCG package用の公的なデフォルト値を使用するのが好ましく、又は、他のソフトウェアの場合には、BLOSUM62などのデフォルトマトリックスを使用するのが好ましい。
【０１５３】
いったんソフトウェアが最適アラインメントを作製すると、相同性（％）、好ましくは配列同一性（％）の計算が可能になる。一般に、ソフトウェアは、配列比較の一部としてこの作業を行い、数値で結果を出す。
【０１５４】
かかる配列は、サイレントな変化を起こすため、結果として機能的には同等の物質となるような、アミノ酸残基の欠失、挿入又は置換も有していてもよい。かかる物質の二次結合活性が保有されている限り、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性における類似性に基づいて、計画的なアミノ酸置換を行ってもよい。例えば、負の電荷を帯びたアミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸がある。正の電荷を帯びたアミノ酸には、リジンとアルギニンがある。類似した親水性値をもつ非荷電極性基を先端に備えた（with uncharged polar head groups）アミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、及びチロシンがある。
【０１５５】
例えば下記の表にしたがって、同類置換を行ってもよい。２列目で同じ欄に記載されているアミノ酸、及び好ましくは３列目で同じ行に記載されているアミノ酸は、お互いに置換してもよい。
【表ｉｉｉ】
2005508609.tif 000004
【０１５６】
本発明は、生じるかもしれない相同的置換（ここでは、置換と置き換えはともに既存のアミノ酸残基を別の残基と入れかえることを意味する）、すなわち、塩基性と塩基性、酸性と酸性、極性と極性などのように、同種類同士の置換をも含むものである。非相同的置換、すなわち、ある種類の残基から別の種類への置換、又は、オルニチン（以下、Ｚと称する）、ジアミノ酪酸オルニチン（以下、Ｂと称する）、ノルロイシンオルニチン（以下、Ｏと称する）、ピリイルアラニン（pyriylalanine）、チエニルアラニン、ナフチルアラニン及びフェニルグリシンなど非天然のアミノ酸の含有を伴うような置換も生じるかもしれない。
【０１５７】
非天然のアミノ酸による置換が生じる場合もある。かかる非天然のアミノ酸としては、アルファ*及びアルファジ置換*アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸*、乳酸*、トリフルオロチロシン*、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン*、ｐ−Ｂｒ−フェニルアラニン*、ｐ−Ｉ−フェニルアラニン*など天然アミノ酸のハロゲン誘導体、Ｌ−アリル−グリシン*、β−アラニン*、Ｌ−α−アミノ酪酸*、Ｌ−γ−アミノ酪酸*、Ｌ−α−アミノイソ酪酸*、Ｌ−ε−アミノカプロン酸#、７−アミノヘプタン酸*、Ｌ−メチオニンスルホン#*、Ｌ−ノルロイシン*、Ｌ−ノルバリン*、ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン*、Ｌ−ヒドロキシプロリン#、Ｌ−チオプロリン*、４−メチル−Ｐｈｅ*、ペンタメチル−Ｐｈｅ*などフェニルアラニン（Ｐｈｅ）のメチル誘導体、Ｌ−Ｐｈｅ（４−アミノ）#、Ｌ−Ｔｙｒ（メチル）*、Ｌ−Ｐｈｅ（４−イソプロピル）*、Ｌ−Ｔｉｃ（１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキシル酸）*、Ｌ−ジアミノプロピオン酸#及びＬ−Ｐｈｅ（４−ベンジル）*が挙げられる。*は、ここまでの説明（相同的置換又は非相同的置換に関する説明）について、誘導体が疎水性であることを示すために使用したものであり、#は、誘導体が親水性であることを示すために使用したものである。#*は、両親媒性であることを示している。
【０１５８】
変異アミノ酸配列には、グリシン又はβ−アラニン残基などのアミノ酸スペーサーに加え、メチル基、エチル基又はプロピル基をはじめとするアルキル基などを含んでいるかかる配列の２つのアミノ酸残基の間に挿入してもよい適切なスペーサー基が含まれていてもよい。変異体の別形態では、１つ以上のアミノ酸残基がペプトイド形態で存在しているが、当業者であればそうした別形態をよく理解しているであろう。念のために記すと、「ペプトイド形態」とは、α−炭素置換基が残基のα−炭素ではなく窒素原子上にある変異アミノ酸残基に言及する際に使用される。ペプトイド形態のペプチドを調製するプロセスは、例えば、Simon RJ et al., PNAS (1992) 89 (20), 9367-9371及びHorwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13 (4), 132-134など、当該分野では周知である。
【０１５９】
ここに定義した特異的性質を有する酵素をコードするヌクレオチド配列には、合成ヌクレオチド又は修飾したヌクレオチドが含まれる。オリゴヌクレオチドに対する修飾は、異なる種類のものが多数、当該分野に知られている。そのなかには、メチルホスホン酸塩及びホスホロチオエート骨格及び／又は分子の３’末端及び／又は５’末端でのアクリジン鎖又はポリリシン鎖の添加が含まれる。本発明の目的のためには、ここに記載したヌクレオチド配列が、当該分野で利用可能なあらゆる方法で修飾されてもよいことは、承知されてしかるべきである。かかる修飾は、ヌクレオチド配列のインビボでの活性の増大又は寿命の延長を目的として行われる。
【０１６０】
本発明は、ここで論じた配列、又は誘導体、断片若しくはその誘導体に相補的なヌクレオチド配列の使用をも含むものである。配列がその断片と相補的である場合には、他の生物などにおける同様のコード配列を同定するために、その配列をプローブとして用いることができる。
【０１６１】
本発明の配列に１００％の相同性を示すわけではないけれども本発明の範囲に含まれるポリヌクレオチドは、多くの方法で入手可能である。例えば、ある範囲の個体、例えば異なる群に由来する個体から作製したＤＮＡライブラリーを検索することにより、ここに記載した配列の他の変異体を得てもよい。また、哺乳類細胞（例えば、ラット、マウス、ウシ及び霊長類の細胞）で見られる他のウィルス／細菌ホモログ又は細胞ホモログ、特に細胞ホモログを得てもよく、一般に、そうしたホモログ及びその断片は、本件の配列表に示した配列と選択的にハイブリダイズすることができる。他の動物種から作製したｃＤＮＡライブラリー又はゲノムＤＮＡライブラリーを検索することにより、及び、添付した配列表中のいずれかの配列の全部又は一部を含むプローブを用いて、高ストリンジェンシー条件又は中程度のストリンジェンシー条件下でそうしたライブラリーを検索することにより、かかる配列を得てもよい。同様の考察は、本発明のポリペプチド配列又はヌクレオチド配列の種ホモログ及びアレル変異体を得る際にも当てはまる。
【０１６２】
本発明の配列内の保存アミノ酸配列をコードする変異体及びホモログ内部にある配列を標的として設計されたプライマーを使用する縮重ＰＣＲを用いて、変異体及び株／種ホモログを得てもよい。例えば、数個の変異体／ホモログ由来のアミノ酸配列のアラインメントを行うことで、保存配列を予測できる。当該分野で周知のコンピュータソフトウェアを使用して、配列のアラインメントを行うことができる。例えば、GCG Wisconsin PileUp プログラムは、広く使用されている。
【０１６３】
縮重ＰＣＲで使用するプライマーは１つ以上の縮重位置を含み、既知の配列に対するシングル配列プライマーを用いて配列のクローニングを行う際に使用される条件よりも低いストリンジェンシー条件下で使用される。
【０１６４】
あるいは、性質決定した配列の部位特異的突然変異誘発により、かかるポリヌクレオチドを得てもよい。これは、例えば、かかるポリヌクレオチド配列が発現しているある特定の宿主細胞に対するコドンの優先性を最適化するために、サイレントなコドン配列変化が必要な場合には、有用であるかもしれない。制限酵素認識部位を導入するため、又はかかるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドの性質若しくは機能を変えるために、他の配列変化が望まれる場合もある。
【０１６５】
本発明のポリヌクレオチド（ヌクレオチド配列）を使用して、例えばＰＣＲプライマー、代替的な増幅反応用プライマーなどのプライマー、例えば放射能標識又は非放射能標識を用いて従来の手段による明らかな標識を施したプローブを作製してもよく、又は、ポリヌクレオチドをクローニングしてベクターとしてもよい。そうしたプライマー、プローブ及びその他の断片は、長さとしては少なくとも１５、好ましくは少なくとも２０、例えば、少なくとも２５、３０又は４０個のヌクレオチドからなっており、ここで使用する本発明のポリヌクレオチドという語に含まれるものである。
【０１６６】
本発明のＤＮＡポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチド及びプローブの作製は、組換え、合成又は当業者が利用可能なあらゆる方法で行ってもよい。標準的な技法によってそれらのクローニングを行ってもよい。
【０１６７】
一般に、プライマーの作製は、一度につき１つのヌクレオチドというように、望ましい核酸配列を段階的に製造する合成的手段によって行われる。自動的にこの作業を行う技法は、当該分野で容易に利用できる。
【０１６８】
より長いポリヌクレオチドは、組換え技術、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング法を用いて作製されるのが一般的である。この技法では、クローニングに望ましい脂質標的配列の領域をフランキングするプライマー対（例えば、約１５〜３０個のヌクレオチド）を作製し、かかるプライマーを動物又はヒトの細胞から得たｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡと接触させ、望ましい領域が増幅するような条件下でポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅した断片を単離し（例えば、反応混合物をアガロースゲル上で精製するという方法がある）、増幅したＤＮＡを回収する。増幅したＤＮＡをクローニングして適切なクローニングベクターとすることができるように、適切な制限酵素認識部位が含まれるようにプライマーを設計してもよい。
【０１６９】
［ハイブリダイゼーション］
本発明は、本発明の配列に相補的な配列、又は本発明の配列若しくはそれに相補的な配列のいずれかとハイブリダイズできる配列をも含むものである。
【０１７０】
ここで使用する「ハイブリダイゼーション」との語には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法において行われる増幅プロセスだけではなく、「塩基対形成を通じて核酸の鎖が相補鎖と結合するプロセス」も含まれるものとする。
【０１７１】
本発明はまた、ここで論じる対象配列に相補的な配列又は誘導体、断片若しくはその誘導体とハイブリダイズできるヌクレオチド配列の使用をも含むものである。
【０１７２】
「変異体」との語には、ここで論じるヌクレオチド配列とハイブリダイズできる配列に相補的な配列も含まれるものである。
【０１７３】
ハイブリダイゼーション条件は、Berger and Kimmel（1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA）が教示するように、ヌクレオチド結合性複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づくものであり、下記に説明するように、明確な「ストリンジェンシー」を与えるものである。
【０１７４】
最も高いストリンジェンシーは一般的に、Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍより５℃低い温度）前後で発生する。高いストリンジェンシーの場合はＴｍより約５℃〜１０℃下、中程度のストリンジェンシーはＴｍより約１０℃〜２０℃下、低いストリンジェンシーはＴｍより約２０℃〜２５℃下である。当業者であればわかることだが、最高のストリンジェンシーでのハイブリダイゼーションは、同一のヌクレオチド配列を同定又は検出する際に使用できる。一方、中程度の（又は低い）ストリンジェンシーでのハイブリダイゼーションは、類似した又は関連したポリヌクレオチド配列を同定又は検出する際に使用できる。
【０１７５】
好ましくは、「変異体」との語には、ここに定義した特異的性質を有する酵素をコードするヌクレオチド配列と高ストリンジェンシー条件又は中程度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズできる配列に相補的な配列も含まれる。
【０１７６】
より好ましくは、「変異体」との語には、ここに定義した特異的性質を有する酵素をコードするヌクレオチド配列と高ストリンジェンシー条件下（例えば、６５℃及び０．１×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０｝）でハイブリダイズできる配列に相補的な配列も含まれる。
【０１７７】
本発明はまた、ここで論じるヌクレオチド配列（ここで論じる配列の相補配列を含む）とハイブリダイズできるヌクレオチド配列に関する。
【０１７８】
本発明はまた、ここで論じるヌクレオチド配列（ここで論じる配列の相補配列を含む）とハイブリダイズできる配列に相補的なヌクレオチド配列に関する。
【０１７９】
同様に、本発明の範囲には、ここで論じるヌクレオチド配列と中程度から最も高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズできるポリヌクレオチド配列も含まれる。
【０１８０】
好ましい態様においては、本発明には、ここで論じるヌクレオチド配列又はその相補体とストリンジェントな条件下（例えば、５０℃で０．２×ＳＳＣ）でハイブリダイズできるヌクレオチド配列も含まれる。
【０１８１】
より好ましい態様においては、本発明には、ここで論じるヌクレオチド配列又はその相補体と高度にストリンジェントな条件下（例えば、６５℃で０．１×ＳＳＣ）でハイブリダイズできるヌクレオチド配列も含まれる。
【０１８２】
［部位特異的突然変異誘発］
酵素をコードするヌクレオチド配列及び／又はかかる酵素のアミノ酸配列を単離した後で、本発明の望ましい性質を有する酵素を調製するため、又はかかる酵素の天然の性質を増大させるために、かかる配列を変異させるのが望ましい場合がある。
【０１８３】
合成オリゴヌクレオチドを用いて、突然変異を導入してもよい。こうしたオリゴヌクレオチドは、望ましい突然変異部位をフランキングするヌクレオチド配列を含んでいる。
【０１８４】
Morinaga et al（Biotechnology (1984) 2, p646-649）が適切な方法を開示しており、そのなかでは、酵素遺伝子を担持しているベクター中で酵素をコードする配列である、ＤＮＡの一本鎖ギャップが作製されている。その後、望ましい突然変異を有する合成ヌクレオチドを一本鎖ＤＮＡの相同部位にアニーリングする。ついで、残存するギャップをＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ断片）で充填し、Ｔ４リガーゼを用いてかかるコンストラクトを結合する。その他の適切な方法としては、Sarkar G & Sommer S. S. (1990 Bio TechniquesI 8, 404-407)のメガプリマ突然変異誘発法（mega prima mutagenesis method）、及びPapworth et al (1985 Nucleic. Acids Res. 13: 8765-8785)のクイックチェンジ法（QuickChange method）がある。
【０１８５】
ＵＳ第４，７６０，０２５号には、多数の突然変異をコードするオリゴヌクレオチドを、カセットに小規模な変更を加えることによって導入することが開示されている。しかし、上記Morinagaの方法によると、さまざまな長さのオリゴヌクレオチドを数多く導入できるため、一度により多様な突然変異を導入できる。
【０１８６】
Nelson and Long (Analytical Biochemistry (1989), 180, p 147-151)には、酵素をコードするヌクレオチド配列に突然変異を導入する別の方法が記載されている。この方法では、ＰＣＲ反応のプライマーの１つとして化学的に合成したＤＮＡ鎖を用いて導入した望ましい突然変異を含むＰＣＲ断片を、３段階で作製している。ＰＣＲで作製された断片から、かかる突然変異を有するＤＮＡ断片を制限エンドヌクレアーゼでの開裂によって単離し、発現プラスミドに再挿入してもよい。
【０１８７】
さらに、Sierks et al（Protein Eng (1989) 2, 621-625及びProtein Eng (1990) 3, 193-198）は、Aspergillusのグルコアミラーゼにおける部位特異的突然変異誘発について記載している。
【０１８８】
適切には、リパーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）又は脂質分解性アシルヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．２６）のいずれかをコードするヌクレオチド配列は、アミノ酸配列のリッド領域（the lid region）及び／又は活性部位近辺及び／又はＣ末端に部位特異的突然変異を誘発される場合がある。
【０１８９】
好ましくは、リパーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）又は脂質分解性アシルヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．２６）のいずれかをコードするヌクレオチド配列は、活性部位周辺の表面親水性を変えるために活性部位近辺に部位特異的突然変異を誘発される場合がある。
【０１９０】
［ランダム突然変異誘発］
例えば、CLONTECH社製のDiversifyTM PCR Ramdom Mutagenesis Kitを使用して、変異性ＰＣＲを行うことができる。
【０１９１】
［局所的ランダム突然変異誘発］
突然変異を誘発されるアミノ酸コドンに対応するヌクレオチド以外の、突然変異を誘発されるＤＮＡ配列の一部に対応する変異プライマー（オリゴヌクレオチド）を合成してもよい。かかるプライマーは、３’末端及び５’末端において、突然変異を誘発される配列を取り囲む配列に対応するヌクレオチドを含んでいる。突然変異を誘発されるコドンにおいては、４つの異なるヌクレオチドが異なる比率でそれぞれの位置に存在しており、このことにより、選択された位置に異なるアミノ酸のコドンが存在するという可能性が発生している。
【０１９２】
その後、結果として生じた変異プライマーを、適切な逆プライマーとともにＰＣＲ反応で用いてもよい。結果として生じたＰＣＲ断片を、おそらくはいくらかの修飾を施した後で、クローニングして、目的とする遺伝子の残りのコード領域を含む適切なベクターとしてもよい。
【０１９３】
適切には、リパーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）又は脂質分解性アシルヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．２６）のいずれかをコードするヌクレオチド配列は、アミノ酸配列のリッド領域（the lid region）及び／又は活性部位近辺及び／又はＣ末端に局所的ランダム突然変異を誘発される場合がある。
【０１９４】
好ましくは、リパーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）又は脂質分解性アシルヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．２６）のいずれかをコードするヌクレオチド配列は、活性部位周辺の表面親水性を変えるために活性部位近辺に局所的ランダム突然変異を誘発される場合がある。
【０１９５】
［酵素の発現］
ここに定義した特異的性質を有する酵素をコードするヌクレオチド配列を、組換え型複製ベクターに組み込んでもよい。かかるベクターを使用して、適合する宿主細胞内部で、及び／又は適合する宿主細胞から、ヌクレオチド配列を酵素の形態で複製し、発現させてもよい。プロモーター／エンハンサー及びその他の発現制御シグナルを含むコントロール配列を用いて、発現をコントロールしてもよい。原核細胞プロモーター及び真核細胞で機能するプロモーターを使用してもよい。組織特異的又は刺激特異的プロモーターを使用してもよい。上に記した、２つ以上の異なるプロモーターに由来する配列要素を含むキメラプロモーターも使用してもよい。
【０１９６】
ヌクレオチド配列の発現により、宿主の組換え細胞が生成した酵素は、使用する配列及び／又はベクターに応じて、細胞内で分泌されていても、又は内包されていてもよい。かかるコード配列は、ある特定の原核細胞又は真核細胞の細胞膜を通じて物質コード配列の分泌を誘導するシグナル配列を用いて、設計できる。
【０１９７】
［発現ベクター］
「発現ベクター」との語は、インビボ又はインビトロでの発現が可能なコンストラクトを意味する。
【０１９８】
かかる発現ベクターは、生物のゲノムに組み込まれていることが好ましい。「組み込まれた」との語には、好ましくは、ゲノムへの安定的な組み込みが含まれる。
【０１９９】
本発明のベクターは、本発明のコンストラクトを含んでいることが好ましい。あるいは、ここに定義した特異的性質を有する酵素をコードするヌクレオチド配列が発現し、ベクター中に存在していて、適切な宿主生物の存在によって制御配列がヌクレオチド配列を発現できるように、かかるヌクレオチド配列が制御配列に操作可能な状態で結合していること、すなわち、かかるベクターが発現ベクターであることが好ましい。
【０２００】
本発明のベクターを下記の適切な宿主細胞に形質転換して、ポリペプチド又はここに定義した特異的性質を有する酵素を発現させてもよい。したがって、別の態様においては、本発明は、ポリペプチドをコードするコード配列のベクターによって発現が起こるような条件下で、上記の発現ベクターを用いて形質転換した又はトランスフェクトした宿主細胞を培養し、発現したポリペプチドを回収することを特徴とする、次に使用する本発明のポリペプチドの調製方法を提供するものである。
【０２０１】
ベクターは、例えば、複製起点をもつプラスミド、ウィルス又はファージベクターであってもよく、前記ポリヌクレオチドの発現促進剤及びかかる促進剤の制御因子であってもよい。ベクターを導入する宿主細胞に応じて、ベクターの選択を行う場合が多い。
【０２０２】
ベクターは、１つ以上の選択マーカー遺伝子を含んでいてもよい。工業用微生物に最適の選択系は、宿主生物の突然変異を必要としない選択マーカー群によって形成されるものである。適切な選択マーカーは、B. subtilis又はB. licheniformisに由来するｄａｌ遺伝子であってもよく、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール又はテトラサイクリン耐性など抗生物質への耐性を与えるものであってもよい。代替的選択マーカーは、ａｍｄＳ、ａｒｇＢ、ｎｉａＤ及びｓＣなどAspergillus選択マーカー、又はハイグロマイシン耐性を発生させるマーカーであってもよい。他の真菌選択マーカーの例としては、ＡＴＰシンテターゼ、サブユニット９（ｏｌｉＣ）、オロチジン−５’−リン酸−デカルボキシラーゼ（ｐｖｒＡ）、フレオマイシン及びベノミル耐性（ｂｅｎＡ）の遺伝子などがある。非真菌選択マーカーの例としては、細菌性Ｇ４１８耐性遺伝子（これは酵母菌中でも使用可能だが、糸状菌中では使用不可）、アンピシリン耐性遺伝子（大腸菌）、ネオマイシン耐性遺伝子（Bacillus）、及びβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする大腸菌ｕｉｄＡ遺伝子がある。他の適切な選択マーカーには、B. subtilis又はB. licheniformisに由来するｄａｌ遺伝子がある。あるいは、同時形質転換（ＷＯ９１／１７２４３号に記載）を行って選択してもよい。
【０２０３】
例えばＲＮＡを作製するためにベクターをインビトロで使用してもよく、宿主細胞のトランスフェクション又は形質転換を行うためにベクターを使用してもよい。
【０２０４】
したがって、ここに定義した特異的性質を有する酵素をコードするヌクレオチド配列は、例えばクローニングベクター又は発現ベクターなど組換え型ベクター（一般的には複製ベクター）に組み込むことができる。かかるベクターを使用して適合する宿主細胞中の核酸を複製してもよい。したがって別の実施形態では、本発明は、ここに定義した特異的性質を有する酵素をコードするヌクレオチド配列を複製ベクターに導入し、かかるベクターを適合する宿主細胞に導入し、かかるベクターが複製されるような条件下でかかる宿主細胞を培養することにより、ここに定義した特異的性質を有する酵素をコードするヌクレオチド配列を作製する方法を提供するものである。ベクターを宿主細胞から回収してもよい。適切な宿主細胞を、発現ベクターとの関連で以下に記載する。
【０２０５】
ここに定義した特異的性質を有する酵素をコードする本発明のＤＮＡコンストラクトを結合する際に使用する手順、制御配列、及び複製に必要な情報を含む適切なベクターにそれらを挿入することは、当業者には周知である（例えば、Sambrook et al Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2nd Ed. (1989)を参照のこと）。
【０２０６】
かかるベクターはさらに、問題の宿主細胞中でのベクターの複製を可能にするようなヌクレオチド配列を含んでいてもよい。そうした配列の例としては、プラスミドpUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1、及びpIJ702の複製起点が挙げられる。
【０２０７】
［制御配列］
用途によっては、ここに定義した特異的性質を有する酵素をコードするヌクレオチド配列を、例えば選択した宿主細胞によりヌクレオチド配列を発現させることができる制御配列に操作可能な状態で結合させてもよい。例えば、本発明は、そうした制御配列に操作可能な状態で結合した本発明のヌクレオチド配列を含むベクター、すなわち、発現ベクターを含むものである。
【０２０８】
「操作可能な状態で結合した」との語は、記載の成分がその意図のとおりに機能できるような関係にある並置状態を指す。コード配列に「操作可能な状態で結合した」制御配列は、コントロール配列と適合する条件下でコード配列が発現するような状態で結合しているのである。
【０２０９】
「制御配列」との語には、プロモーター、エンハンサー及びその他の発現制御シグナルが含まれる。
【０２１０】
「プロモーター」との語は、当該分野における通常の意味、例えば、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位の意味で使用されている。
【０２１１】
発現と、必要であれば、選択した発現宿主由来の目的とするタンパク質の分泌レベルとを増大させる機能、及び／又は、ここに定義した特異的性質を有する酵素の発現を誘導的にコントロールする機能を有する非相同的制御領域、例えば、プロモーター領域、分泌リーダー領域及びターミネーター領域を選択することによっても、ここに定義した特異的性質を有する酵素をコードするヌクレオチド配列の発現を増大させてもよい。真核細胞においては、かかる酵素をコードするヌクレオチド配列に、ポリアデニル化配列を操作可能な状態で連結させてもよい。
【０２１２】
本発明のヌクレオチド配列は、少なくともプロモーターに、操作可能な状態で結合していることが好ましい。
【０２１３】
ここに定義した特異的性質を有する酵素をコードするヌクレオチド配列をコードする遺伝子由来のプロモーター以外のプロモーターを使用して酵素の発現を誘導してもよい。望ましい発現宿主中で本発明のヌクレオチド配列の発現を誘導する効率を基準として、かかるプロモーターを選択してもよい。
【０２１４】
他の実施形態においては、構成プロモーターを選択して望ましいヌクレオチド配列の発現を誘導してもよい。誘導基質を含む培地上で発現宿主を培養する必要がないため、そうした発現コンストラクトは、さらに有利といえる。
【０２１５】
真菌の発現宿主中で好ましく使用される強力な構成プロモーター及び／又は誘導プロモーターの例としては、キシラナーゼ（ｘｌｎＡ）、フィターゼ、ＡＴＰ−シンテターゼ、サブユニット９（ｏｌｉＣ）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ｔｐｉ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡｄｈＡ）、α−アミラーゼ（ａｍｙ）、アミログルコシダーゼ（ＡＧ−ｇｌａＡ遺伝子由来）、アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）及びグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｐｄ）プロモーターの真菌遺伝子から得られるものが挙げられる。真菌の宿主中での転写に有用なプロモーターの他の例としては、A. oryzaeＴＡＫＡアミラーゼをコードする遺伝子由来のもの、S. cerevisiae由来のＴＰＩ（トリオースリン酸イソメラーゼ）プロモーター（Alber et al (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1, p419-434）、Rhizomucor mieheiアスパラギン酸プロテイナーゼ、A. niger中性α−アミラーゼ、A. niger酸性安定α−アミラーゼ、A. nigerグルコアミラーゼ、Rhizomucor mieheiリパーゼ、A. oryzaeアルカリプロテアーゼ、A. oryzaeトリオースリン酸イソメラーゼ又はA.nidulansアセトアミダーゼが挙げられる。
【０２１６】
強力な酵母プロモーターの例としては、アルコールデヒドロゲナーゼ、ラクターゼ、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ及びトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られるものが挙げられる。
【０２１７】
強力な細菌プロモーターの例としては、細胞外プロテアーゼ遺伝子由来のプロモーターに加えて、α−アミラーゼプロモーター及びＳＰ０２プロモーターが挙げられる。特に細菌宿主中でヌクレオチド配列の転写を誘導するのに適した他のプロモーターの例としては、大腸菌のｌａｃオペロンのプロモーター、Streptomyces coelicolorアガラーゼ遺伝子ｄａｇＡプロモーター、Bacillus licheniformisα−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）のプロモーター、Bacillus stearothermophilusマルトジェニックアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）のプロモーター、Bacillus amyloliquefaciensα−アミラーゼ（ａｍｙＱ）のプロモーター、Bacillus subtilisｘｙｌＡ及びｘｙｌＢ遺伝子のプロモーターが挙げられる。
【０２１８】
ハイブリッドプロモーターを使用して、発現コンストラクトの誘導的制御を強化してもよい。
【０２１９】
プロモーターは、その他に、適切な宿主において確実に発現させる又は発現を増大させるという特徴を有する場合もある。例えば、その特徴として、プリブノーボックス又はＴＡＴＡボックスなどの保存領域が挙げられることもある。かかるプロモーターは、本発明のヌクレオチド配列の発現レベルに影響する（例えば、維持する、増大させる、減少させる）他の配列をも含む場合がある。例えば、他の適切な配列としては、Ｓｈ１イントロン又はＡＤＨイントロンがある。他の配列としては、誘導因子――例えば、温度誘導因子、化学誘導因子、光誘導因子、又はストレス誘導因子が挙げられる。また、転写又は翻訳を増大させる適切な因子が存在していてもよい。後者の因子の例としては、ＴＭＶ５’シグナル配列がある（Sleat 1987 Gene 217, 217-225及びDawson 1993 Plant Mol. Biol. 23: 97を参照のこと）。
【０２２０】
［コンストラクト］
「接合体」、「カセット」、及び「ハイブリッド」の同義語である「コンストラクト」という語には、プロモーターに直接的又は間接的に付着した、ここに定義した特異的性質を有する酵素をコードするヌクレオチド配列であって、本発明にしたがって使用される配列が含まれる。間接的付着の例としては、本発明のヌクレオチド配列とプロモーターの中に立つ、Ｓｈ１イントロン又はＡＤＨイントロンといったイントロン配列などの適切なスペーサー基が供給される場合が挙げられる。本発明に関しては「融合した」という語にも同じことが当てはまり、この語には直接的又は間接的付着が含まれる。野生型遺伝子プロモーターと普通に会合するタンパク質をコードするヌクレオチド配列同士が自然に結合し、それらの配列がともに自然環境下にあるような状態は、これらの語の意味範囲に含まれない場合がある。
【０２２１】
かかるコンストラクトは、例えば、Bacillus subtilisなど好ましくはBacillus属の細菌、又はそれを移入した植物における遺伝子コンストラクトの選択が可能なマーカーをも含有又は発現する場合がある。例えば、マンノース−６−リン酸イソメラーゼをコードするもの（特に植物用）又は抗生物質耐性、例えばＧ４１８、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン及びゲンタマイシンに対する耐性を提供するマーカーなど、使用してもよいマーカーは多岐にわたっている。
【０２２２】
用途によっては、かかるコンストラクトは、少なくとも、プロモーターに操作可能な状態で結合した、ここに定義した特異的性質を有する酵素をコードするヌクレオチド配列を含んでいることが好ましい。
【０２２３】
［宿主細胞］
本発明に関して、「宿主細胞」との語には、ここに定義した特異的性質を有する酵素をコードするヌクレオチド配列又は上記の発現ベクターであって、ここに定義した特異的性質を有する酵素を組換えによって生成する際に使用される発現ベクターのいずれかを内包しているあらゆる細胞が含まれる。
【０２２４】
したがって、本発明の別の実施形態は、ここに定義した特異的性質を有する酵素を発現するヌクレオチド配列で形質転換又はトランスフェクションを行った宿主細胞を提供するものである。かかるヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の複製及び発現用のベクター中に担持されているのが好ましい。細胞を選択し、そうしたベクターと適合させる。かかる細胞は、例えば、原核細胞（例えば、細菌）、真菌細胞、酵母菌細胞又は植物細胞であってもよい。
【０２２５】
グラム陰性菌の大腸菌は異種遺伝子発現の宿主細胞として広く使用されている。しかし、大量の異種タンパク質は細胞内で蓄積する傾向がある。その後で大量の大腸菌細胞内タンパク質から目的のタンパク質を精製するのが、難しい場合もある。
【０２２６】
大腸菌とは逆に、B. subtilis、B. licheniformis、B. lentus、B. brevis、 B. stearothermophilus、B. alkalophilus、B. amyloliquefaciens、B. coagulans、B. circulans、B. lautus、B. megaterium、B. thuringiensis、などのBacillus属に由来するグラム陽性菌、Streptomyces lividans 又はS. murinusは、タンパク質を培養培地中に分泌する能力のため、異種宿主として非常に適している。宿主として適している他の細菌として、Pseudomonas属由来のものが挙げられる。
【０２２７】
ここに定義した特異的性質を有する酵素をコードするヌクレオチド配列の性質によっては、及び／又は発現したタンパク質に対するさらなる処理の必要性によっては、酵母菌又は他の真菌などの真核宿主が好ましい場合がある。一般に、操作が容易であることから、酵母菌細胞のほうが真菌細胞よりも好適である。しかし、酵母菌細胞から少ししか分泌されないタンパク質もあれば、タンパク質の処理が正常に行われない（例えば、酵母菌中での糖化過剰）場合もある。こうした例では、別の真菌宿主生物を選択しなくてはならない。
【０２２８】
Kluyveromyces種、Saccharomyces種、又はSchizosaccharomyces種、例えば、Saccharomyces cerevisiae又はHansenulaから、適切な酵母菌を選択してもよい（英国特許出願第９９２７８０１．２号に開示）。
【０２２９】
適切な糸状菌は、例えば、Aspergillus niger又はAspergillus oryzae などのAspergillus種に属する株、又はFusarium oxysporium、Fusarium graminearum（完全な状態では、Gribberella zeaeと命名されている。以前の名称はSphaeria zeaeであった。Gribberella roseum及びGribberella roseum f. sp. Cerealisの同義語である）の株、又はFusarium sulphureum（完全な状態では、Gribberella puricarisと命名されている。Fusarium trichothercioides、Fusarium bactridioides、Fusarium sambucium、Fusarium roseum及びFusarium roseum var. graminearumの同義語である）、Fusarium cerealis（Fusarium crokkwellnseの同義語である）又はFusarium venenatumの株であってもよい。
【０２３０】
一例として、Aspergillus niger、Aspergillus niger var. tubigensis、Aspergillus niger var. awamori、Aspergillus aculeatis、Aspergillus nidulans、Aspergillus oryzae、Trichoderma reesei、Bacillus subtilis、B. licheniformis、Bacillus amyloliquefaciens、Kluyveromyces lactis、Saccharomyces cerevisiae、及びHansenula polymorphaから典型的な発現宿主を選択してもよい。
【０２３１】
酵母菌、真菌及び植物宿主細胞など適切な宿主細胞の使用により、翻訳後修飾（例えば、ミリストイル化、グリコシル化、切断、ラピデーション及びチロシン、セリン又はトレオニンのリン酸化）が生じることがある。かかる翻訳後修飾は、本発明の組換え型発現産物に最適の生物活性を与えるために必要となる場合がある。
【０２３２】
宿主細胞は、プロテアーゼ欠損株又はプロテアーゼマイナス株であってもよい。例えば、「ａｌｐ」というアルカリプロテアーゼ遺伝子が欠失しているプロテアーゼ欠損株のAspergillus oryzaeＪａＬ１２５であってもよい。この株は、ＷＯ９７／３５９５６号に記載されている。
【０２３３】
［生物］
本発明に関して、「生物」との語には、ここに定義した特異的性質を有する酵素をコードするヌクレオチド配列及び／又はそれから得た産物を内包するあらゆる生物が含まれる。
【０２３４】
適切な生物として、原核生物、真菌、酵母菌又は植物が挙げられる。
【０２３５】
本発明に関して、「トランスジェニック生物」との語には、ここに定義した特異的性質を有する酵素をコードするヌクレオチド配列及び／又はそれから得た産物を内包するあらゆる生物であり、及び／又は、かかる生物の内部で、ここに定義した特異的性質を有する酵素をコードするヌクレオチド配列をプロモーターが発現できる生物が含まれる。かかる生物のゲノムにヌクレオチド配列が組み込まれていることが好ましい。
【０２３６】
「トランスジェニック生物」との語は、自然環境下の天然のヌクレオチドコード配列が、同様にその自然環境下にある天然のプロモーターの制御下にある場合には、そうした配列を含むものではない
したがって、本発明のトランスジェニック生物には、ここに定義した特異的性質を有する酵素をコードするヌクレオチド配列、ここに定義したコンストラクト、ここに定義したベクター、ここに定義したプラスミド、ここに定義した細胞、又はそれらの産物のいずれか、又はそれらの組み合わせを内包する生物が含まれる。例えば、かかるトランスジェニック生物は、異種プロモーターの制御下でここに定義した特異的性質を有する酵素をコードするヌクレオチド配列をも含んでいてもよい。
【０２３７】
［宿主細胞／生物の形質転換］
これまで示したように、宿主生物が原核生物又は真核生物である可能性がある。適切な原核宿主生物の例としては、大腸菌及びBacillus subtilisが挙げられる。原核宿主生物の形質転換に関する教示については、文書による充分な裏付けがある。例えば、Sambrook et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press)及びAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons, Inc.を参照のこと。
【０２３８】
原核宿主生物を使用する場合、形質転換に先だって、例えばイントロンの除去など、ヌクレオチド配列の適切な修飾を行うことが必要な場合がある。
【０２３９】
別の実施形態では、トランスジェニック生物が酵母菌である可能性がある。この点では、酵母菌もまた異種遺伝子発現用のビヒクルとして広範囲に使用されている。Saccharomyces cerevisiaeという種には、異種遺伝子発現を目的とした使用も含め、工業用に使用されてきた長い歴史がある。Saccharomyces cerevisiae中の異種遺伝子の発現については、Goodey et al (1987, Yeast Biotechnology, D R Berry et al, eds, pp 401-429, Allen and Unwin, London)及びKing et al (1989, Molecular and Cell Biology of Yeasts, E F Walton and G T Yarronton, eds, pp 107-133, Blackie, Glasgow)に概略が述べられている。
【０２４０】
いくつかの理由により、Saccharomyces cerevisiaeは非相同的遺伝子の発現に好適である。第一に、ヒトに対して非病原性であり、あるエンドトキシンを産生することができないことが挙げられる。第二に、数世紀にわたってさまざまな目的で商取引が行われてきたという、安全利用の長い歴史があり、このため、広く公共に受け入れられていること、第三に、広い範囲でかかる生物の商業利用及び調査を行った結果、Saccharomyces cerevisiaeの大規模発酵という特質だけではなく遺伝的及び生理学的な知識も豊富に得られたことが挙げられる。
【０２４１】
Saccharomyces cerevisiaeにおける異種遺伝子発現及び遺伝子産物の分泌に関する原則についての論評が、E Hinchcliffe E Kenny (1993, "Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes", Yeasts, Vol 5, Anthony H Rose and J Stuart Harrison, eds, 2nd edition, Academic Press Ltd.)により与えられている。
【０２４２】
自己保存のためには宿主のゲノムを組み替える必要がある組み込みベクター、及び自己複製プラスミドベクターを含め、数種類の酵母ベクターが利用可能である。
【０２４３】
トランスジェニックSaccharomycesを調製するために、酵母菌中で発現させるべく設計したコンストラクトに本発明のヌクレオチド配列を挿入することにより、発現コンストラクトを調製する。異種性発現に使用されるコンストラクトは、これまでに数種類開発されている。かかるコンストラクトには、本発明のヌクレオチド配列に融合した酵母菌中で活性を示すプロモーターが含まれ、通常は、ＧＡＬ１プロモーターなど酵母菌起源のプロモーターが使用される。ＳＵＣ２シグナルペプチドをコードする配列など酵母菌起源のシグナル配列が、通常は使用される。酵母菌中で活性を示すターミネーターが、発現系を終了させる。
【０２４４】
酵母菌を形質転換するために、いくつかの形質転換プロトコルが開発されている。例えば、下記のHinnen et al (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929)、Beggs, J D (1978, Nature, London, 275, 104)、及びIto, H et al (1983, J Bacteriology 153, 163-168)の教示により、本発明のトランスジェニックSaccharomycesを調製することができる。
【０２４５】
各種選択マーカーを使用して、形質転換した酵母菌細胞を選択する。形質転換に使用されるマーカーのなかには、ＬＥＵ２、ＨＩＳ４及びＴＲＰ１など多数の栄養素要求マーカーがあり、また、Ｇ４１８などのアミノグルコシド抗生物質マーカーといった優性抗生物質耐性マーカーもある。
【０２４６】
原形質体の形成及びかかる原形質体の形質転換、その後の、既知の方法による細胞壁の再生を含むプロセスで、糸状菌細胞を形質転換してもよい。宿主微生物としてのAspergillusの使用については、ＥＰ第０２３８０２３号に記載されている。
【０２４７】
他の宿主生物として、植物が挙げられる。遺伝子改変植物の構築に関する基本原理は、挿入した遺伝材料が安定的に維持されるように、植物のゲノムに遺伝情報を挿入することである。遺伝情報の挿入にはいくつかの技法があり、遺伝情報の直接的導入及びベクター系を使用した遺伝情報の導入が２大原理となっている。一般的技法の概説は、Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42: 205-225)及びChristou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)にて、植物の形質転換についてのさらに詳しい教示は、ＥＰ−Ａ−０４４９３７５号にて見うけられるであろう。
【０２４８】
ヌクレオチド配列で形質転換した宿主細胞を、コードされた酵素が生成され、かつかかる酵素の細胞及び／又は培養培地からの回収を促進するような条件下で培養してもよい。
【０２４９】
細胞を培養するのに使用した培地は、問題の宿主細胞を成長させ、酵素を発現させるのに適したものであれば、どのような従来培地でもよい。適切な培地は、市販品供給業者から入手可能であり、又は、公開された製法（例えば、American Type Culture Collectionのカタログに記載されている）により調製してもよい。
【０２５０】
組換え細胞により生成されるタンパク質は、かかる細胞の表面に提示される場合がある。当業者にとっては当然のことだが、必要であれば、ある特定の原核細胞又は真核細胞の細胞膜を介してコード配列の分泌を誘導するシグナル配列を用いて、コード配列を含む発現ベクターを設計することができる。他の組換え体の構築では、可溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列とコード配列とを結合させてもよい（Kroll DJ et al (1993) DNA Cell Biol 12: 441-53）。
【０２５１】
酵素が宿主細胞から分泌される場合がある。また、遠心分離又は濾過により細胞を培地から分離し、硫酸アンモニウムなどの塩で培地のタンパク質成分を沈降させ、ついでイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー法を使用するという周知の手順により、培養培地から酵素を都合よく回収する場合もある。
【０２５２】
［分泌］
大半の場合、発現宿主から、酵素がより容易に回収される培養培地へと酵素が分泌されるのが望ましいとされている。本発明によると、分泌リーダー配列は目的の発現宿主に基づいて選択され、ハイブリッドシグナル配列も本発明に関連して使用されている。
【０２５３】
異種性分泌リーダー配列の典型例としては、真菌のアミログルコシダーゼ（ＡＧ）遺伝子（ｇｌａＡ――例えば、Aspergillus由来の、アミノ酸が１８個のものと２４個のものの両方）、ａ因子遺伝子（例えば、Saccharomyces、Kluyveromyces及びHansenulaなどの酵母菌）又はα−アミラーゼ遺伝子（Bacillus）が挙げられる。
【０２５４】
［融合タンパク質］
ここに定義した特異的性質を有する酵素は、例えば、その抽出及び精製を補助する融合タンパク質として生成されてもよい。融合タンパク質の融合相手の例として、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６ｘＨｉｓ、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合性ドメイン及び／又は転写活性ドメイン）及びβ−ガラクトシダーゼが挙げられる。融合タンパク質配列を除去できるように、融合タンパク質の融合相手と目的のタンパク質配列との間にタンパク質分解開裂部位を含んでいると便利な場合がある。かかる融合タンパク質がタンパク質配列の活性を妨げないことが好ましい。
【０２５５】
かかる融合タンパク質は、酵素と融合する抗原又は抗原決定基を含んでいてもよい。この実施形態においては、融合タンパク質は、免疫系の全身性刺激を提供するという意味で補助剤として機能する場合がある物質を含む、自然には存在しない融合タンパク質であってもよい。抗原又は抗原決定基は、酵素のアミノ末端又はカルボキシ末端のいずれかに付着してもよい。
【０２５６】
本発明の別の実施形態においては、ここに定義した特異的性質を有する酵素のアミノ酸配列は、融合タンパク質をコードするため、非相同配列と結合してもよい。
【０２５７】
［実施例］
本発明を、例示のみを目的としてこれより説明するが、その際に下記の図に言及する場合がある。
【０２５８】
図１は、未変性ＰＡＧＥゲルを示すものである。
【０２５９】
図２は、ガラクト脂質（ＤＧＤＧ）ザイモグラムを示すものである。
【０２６０】
図３は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示すものである。
【０２６１】
図４は、練り粉中のササゲＬＡＨ１の作用を示すグラフである。
【０２６２】
図５は、ササゲＬＡＨで処理した練り粉中のガラクト脂質のＨＰＬＣ分析を示すグラフである。
【０２６３】
図６は、ササゲＬＡＨで処理した練り粉中のリン脂質のＨＰＬＣ分析を示すグラフである。
【０２６４】
図７は、ササゲＬＡＨで処理した練り粉中の非極性脂質のＧＬＣ分析を示すグラフである。
【０２６５】
図８は、ミニブレッドの写真を示すものであり、写真中、ローフ１４は２％の大豆油を、ローフ１５は２％の大豆油及び１．０７単位／ｋｇのササゲＬＡＨを添加したものである。
【０２６６】
図９は、ミニブレッドの写真を示すものであり、写真中、ローフ９はコントロール、ローフ１０は１．０７単位／ｋｇのササゲＬＡＨを添加したもの、ローフ１１は１．０７単位／ｋｇのササゲＬＡＨ＋０．１％のガラクト脂質を添加したもの、ローフ１２は１．０７単位／ｋｇのササゲＬＡＨ＋０．２％のガラクト脂質を添加したもの、ローフ１３は１．０７単位／ｋｇのササゲＬＡＨ＋０．４％のガラクト脂質を添加したものである。
【０２６７】
図１０は、ミニブレッドの写真を示すものであり、写真中、ローフ１はコントロール、ローフ２は０．４％のＤＧＤＧを添加したもの、ローフ３は０．４％のＤＧＤＧ＋０．４単位／ｇのササゲＬＡＨを添加したもの、ローフ４は０．４単位／ｇのササゲＬＡＨを添加したものである。
【０２６８】
図１１は、pYES2由来の発現ベクターを示すものである。pYES2のＧａｌｌプロモーターを除去し、構造ＡＤＨプロモーターに置換した。インビボ組換えにより、ＬｉｐＡをSaccharomyces cerevisiaeに組み込んだ。略語の説明：Ａｍｐ、アンピシリン耐性遺伝子；ＡＤＨ３’、アルコールデヒドロゲナーゼ３’領域；ＡＤＨp、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター；ｂｐｓ、塩基対；ＣＹＣｌ、転写終止因子；ｆｌ  ｏｒｉ、ｆｌ起点；Ｇａｌｌｐ、ガラクトース遺伝子プロモーター；ＬｉｐＡ、Aspergillus tubigenesis由来リパーゼ遺伝子；ＭＣＳ、多重クローニング部位；pMb1  ｏｒｉ、pUC由来起点、ｕｒａ３、ウラシルをコードする遺伝子、２μ  ｏｒｉ、２μ起点。
【０２６９】
図１２は、ここに詳述した方法を用いて同定したササゲ由来脂質分解性アシルヒドロラーゼ酵素のMaldi-TOFプロフィールを示すものである。
【０２７０】
図１３は、ＶＵＰＡＴ１（Matos et al FEBS Letters 491(2001) 188-192）のペプチドプロフィールを示すものである。
【０２７１】
［材料と手法］
酵素：
精製したササゲ脂質アシルヒドロラーゼ（ＬＡＨ）
小麦チラコイド由来の単離した膜結合性ガラクトリパーゼ
粉：
デニッシュ粉「Solvmel」番号２００１０８４
基質：
スウェーデン国カールスハム、Lipid Technologies Provider社製のジガラクトシルジグリセリド、ＤＧＤＧ（純度５５％）バッチＫＧＬ０１０１３。
【０２７２】
［手順］
［ササゲ脂質分解性アシルヒドロラーゼ酵素（Ｅ．Ｃ．３．１．１．２６）］
［植物材料］
糖脂質及びリン脂質を加水分解することが可能であるが、トリグリセリド及び／又は１−モノグリセリドを加水分解することが不可能又は実質的に不可能である、脂質分解性アシルヒドロラーゼ（ＬＡＨ）をササゲから単離した。脂質分解性アシルヒドロラーゼは、Sahsah et al (Biochemica et Biophysica Acta 1215 (1994) 66-73)に記載された方法に基づいた方法により入手した。別の適切な方法としては、Matos et al (FEBS Letters 491(2001) 188-192)に記載の方法を挙げてもよい。
【０２７３】
ササゲマメは、メキシコ国モレロス州から入手した。かかる植物をルカストーン（Leca stone）上で栽培し、Ellfolk, Biochem. Biophys. Acta 192 (1969) 486-493にしたがってミネラル栄養素溶液（６ｍＭの硝酸カリウムで強化した）を与えた。栽培は、成長チャンバーにおいて、大きさが３５×５０ｃｍの鉢（各鉢につき約５０株）、温度と日照を管理した条件下（明サイクルは１６時間で２２℃、暗サイクルは８時間で１８℃、相対的大気湿度はそれぞれ７２％）で行った。栽培開始から２１日後、葉を収穫した。収穫時には、かかる植物には充分に成長した葉が４〜７枚、若葉が３〜８枚ついていた。
【０２７４】
［葉からの脂質分解性アシルヒドロラーゼ酵素の抽出］
液体窒素で凍結させた２１５ｇの生の葉を工業用ブレンダーで均質化して、工業用ブレンダーを使用して（混合時間３分）、５ｍＭのＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ７．０）５００ｍｌ中に抽出した。１５０００ｇで２０分間の遠心分離を行って、不溶性物質を除去した。結果として得られた上清液を最終的に０．４５μｍのフィルターで濾過した（６０５ｍｌの粗抽出物を回収した）。
【０２７５】
［脂質分解性アシルヒドロラーゼ酵素の精製］
ステップ１．限外濾過
このステップは、５０ｋＤａのAmicon限外濾過ユニットを用いて行われた。１２２ｍｌの濃縮粗抽出物を回収した。
【０２７６】
ステップ２．硫酸アンモニウム沈殿
固体の硫酸アンモニウム（６８．５ｇ）を粗抽出物に添加して、最終濃度を８０％飽和とした。かかる混合液を室温（２５℃）で６０分間攪拌した。１５０００ｇで２０分間の遠心分離を行って、沈殿したタンパク質を回収した。２０ｍＭのＴＥＡ緩衝液（ｐＨ７．３）３０ｍｌに、沈殿物を再び溶解させた。１５０００ｇで２０分間の遠心分離を行って、不溶性物質を除去した。
【０２７７】
ステップ３．脱塩（ＧＦＣ）
２０ｍＭのＴＥＡ（ｐＨ７．３）で平衡化したSephadex G-25カラム（５×２５ｃｍ、スウェーデン国Pharmacia社製）にて、流速１５ｍｌ／分で上清液を脱塩した。ガラクトリパーゼ活性を有するフラクション（タンパク質のピーク）をプールした（１００ｍｌ）。
【０２７８】
ステップ４．イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）
その後、２０ｍＭのＴＥＡ（ｐＨ７．３）で平衡化したQ-Sepharose Fast Flow（５×６ｃｍ、スウェーデン国Pharmacia社製）に、流速１６ｍｌ／分で脱塩サンプルを添加した。非結合タンパク質を除去するため、カラムを同緩衝液２５０ｍｌで洗浄し、同緩衝液中で、０〜０．６ＭのＮａＣｌの線状勾配で結合タンパク質を溶出した。１６ｍｌのフラクションを回収し、ガラクトリパーゼ活性を分析した。ガラクトリパーゼ活性を有するフラクションをプールした（１２８ｍｌ）。
【０２７９】
ステップ５．限外濾過
このステップは、ステップ１に記載のとおりに行った。
【０２８０】
１６ｍｌの脱塩／濃縮サンプルを回収した（Ｖmax：５．６ｍＯＤ／分、又は０．０１０Ｕ／ｍｌ）。
【０２８１】
このステップのサンプルを用いて、試験的にパンの焼成を行った。
【０２８２】
ステップ６．イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）
その後、ステップ４で使用したものと同じ緩衝液で平衡化したPoros Q10（０．５×５ｃｍ、米国、Applied Biosystem社製）に、流速１．５ｍｌ／分で脱塩／濃縮（１１ｍｌ）サンプルを添加した。同緩衝液中で、０〜０．６５ＭのＮａＣｌの線状勾配で結合タンパク質を溶出した。１．５ｍｌのフラクションを回収し、ガラクトリパーゼ活性を分析した。ガラクトリパーゼ活性を有するフラクションをプールした（６ｍｌ）。
【０２８３】
［ササゲ脂質分解性アシルヒドロラーゼ酵素の性質決定］
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、純度及び分子量の測定：
ＩＥＣ（ステップ６）から精製した脂質分解性アシルヒドロラーゼをゲル（ＮＵ−ＰＡＧＥ、４〜１２％、ＭＥＳ緩衝液、米国、Novex社製）に添加し、次いでかかるゲルをクーマシーで染色した。ゲル上に数本のバンドが現れた（図１参照）。ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、クロマトフォーカシングなど数種類のクロマトグラフィー法を用いて脂質分解性アシルヒドロラーゼをさらに精製しようとする試みたところ、脂質分解性アシルヒドロラーゼの純度が上昇することはなかった。
【０２８４】
未変性ＰＡＧＥ後の、脂質分解性アシルヒドロラーゼの分子量及び電気溶出の測定：
Sahsah et al (Biochem. Biophys. Acta 1215 (1994) 66-73)にしたがって、ササゲ（Vigna unguiculata）から脂質分解性アシルヒドロラーゼを精製した。その後、拡散溶出した脂質分解性アシルヒドロラーゼをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに添加した。かかるゲルをクーマシーで染色した。ゲル上の５７ｋＤａ及び８４ｋＤａに２本の大きなバンドが現れた（図３参照）。
【０２８５】
下記のプロトコルを使用して、この調製物のトリプシン分解を行った。
１．８Ｍの尿素５０μＬを、０．４Ｍの重炭酸アンモニウム緩衝液ｐＨ８．１（５０ｍｌｓにつき、２４．０４ｇの尿素、１．５８１ｇの重炭酸アンモニウム）に添加する。
２．窒素でオーバーレイし、５０℃で５分間インキュベーションする。
３．５０ｍＭのＤＴＴ（８ｍｇ／ｍｌ（水））を５μＬ添加する。
４．よく混ぜ合わせ、窒素でオーバーレイし、５０℃で１５分間インキュベーションする。
５．室温まで冷却する。
６．１００ｍＭのヨードアセトアミド（１９ｍｇ／ｍｌ（水））を５μＬ添加する。
７．よく混ぜ合わせ、窒素でオーバーレイし、暗所にて室温で１５分間インキュベーションする。
８．１４０μＬの水を添加し、よく混ぜ合わせ、トリプシンを１：２５で添加する（トリプシンは、−２０℃で、０．１％のＴＦＡ中に１μｇ／μＬで保管する）。
９．窒素でオーバーレイし、３７℃で一晩インキュベーションする。
１０．−２０℃で凍結させ、反応を止める。
１１．Ｃ１８カラムを用いた逆相ＨＰＬＣで、ペプチドを回収する。
【０２８６】
ZipTipTMＣ１８脱塩チップを使用した分解後のペプチドスクリーニング：
Ａ．メタノール４×１０μＬにて吸引して、チップを濡らす。
Ｂ．０．１％のＴＦＡを含む水、５×１０μＬで洗浄してチップを平衡化する。
Ｃ．タンパク質分解溶液中で２０×を吸引して、ペプチドを結合させる。
Ｄ．０．１％のＴＦＡを含む水、１０×１０μＬで洗浄して、塩を除去する。
Ｅ．０．１％のＴＦＡを含む６０％アセトニトリル／水において、１０ｍｇ／ｍｌのα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸２μＬで、ペプチドを直接Maldi-TOF標的プレートに溶出する。
Ｆ．Voyage DE Maldi-TOF質量分析計を用いて、ペプチドの分子量を確認する。
【０２８７】
Maldi-TOF分析の結果を図１２に示す。
【０２８８】
ＶＵＰＡＴ１（Matos et al. FEBS Letters 491(2001) 188-192に教示されている）の理論上のペプチドプロフィール（図１３参照）と、ここで得たササゲ由来の脂質分解性アシルヒドロラーゼの、実験で入手したペプチドプロフィールとを比較すると、ここで精製した脂質分解性アシルヒドロラーゼは、Matos et alが教示したものとは異なるタンパク質であることがわかる。このことは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した分子量によっても確認されている。本研究においては５７ｋＤａと８４ｋＤａという分子量が測定されたが、これに対し、Sahsah et alは４０ｋＤａという分子量を報告している。
【０２８９】
［小麦の葉のチラコイドに由来する膜結合性脂質分解性アシルヒドロラーゼ］
［植物材料］
小麦（Herward）は、デンマーク国、オザーのPajbjergfonden社より入手した。紙の上で２５℃にて小麦を栽培し、定期的に灌漑した。１週間後、小麦の葉を収穫した。
【０２９０】
均質化緩衝液：
５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、３５０ｍＭのソルビトール、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＭｎＣｌ2、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ８．３／ＮａＯＨ。使用前の緩衝液は、氷上に保管された。
【０２９１】
［膜結合性脂質分解性アシルヒドロラーゼの抽出］
小麦の葉２６ｇを細かく切り刻んだ（１／２ｃｍ）。氷冷した７８ｍｌの均質化緩衝液を添加した。高速Ultra Turrax Mixerで１２秒間、葉を均質化した。
【０２９２】
３層にしたクリネックスティッシューを通して濾過を行い、大型の断片を除去した。濾過物を２５０ｇで１分間の遠心分離にかけ、上清液を単離した。
【０２９３】
１０００ｇで５分間の遠心分離を行い、葉緑体を単離した。ペレット（膜結合性脂質分解性アシルヒドロラーゼを含む）を１ｍｌの均質化緩衝液に再懸濁した（顕微鏡による分析では、葉緑体がはっきりと認められた）。
【０２９４】
小麦のモデル練り粉系でのテストに、かかるペレットを使用した。
【０２９５】
［ミニ焼成テスト］
下記の成分を５０ｇのBrabenderミキシングボウルに添加し、３０℃で５分間こねた：穀粉５０ｇ、乾燥酵母１．０ｇ、砂糖０．８ｇ、塩０．８ｇ、７０ｐｐｍのアスコルビン酸及び水（練り粉が常に４００Brabender単位になるようにした）。３４℃で１０分間寝かせておいた。練り粉を１５ｇずつ計って取り分けた。次いで、練り粉を木製のプレートとプレキシガラスのフレームとの間でロール状にする特別の装置に入れた。練り粉をパン焼き用の型に入れて、３４℃で４５分間寝かせて膨らませ、Voss家庭用オーブンで８分間２２５℃にて焼成した。
【０２９６】
焼成後、パンを周辺温度まで冷却し、２０分後、パンを計って取り分け、その体積を菜種置換法で測定した。
【０２９７】
かかるパンをカットして、内相と表皮を評価した。
【０２９８】
［モデル練り粉］
１０ｇの穀粉と０．０２０ｇの塩化ナトリウムを、１０ｇのFarinographミキシングボウルで１分間、酵素を用いて又は用いないで混ぜ合わせた。その後、水（５００Brabender単位）を添加し、３０℃で５分間混ぜ合わせた。混ぜ合わせた後、練り粉を３２℃で１時間放置し、さらなる分析に先だって、冷凍して凍結乾燥させた。
【０２９９】
［焼成テスト（デニッシュロール）］
穀粉（Danish reform）１５００ｇ、圧搾酵母９０ｇ、砂糖２４ｇ、塩２４ｇ、水４００Brabender単位＋２％を、フック付きのHobartTMミキサーに入れ、低速で２分間、及び高速で９分間こねた。練り粉の温度は２６℃であった。１３５０ｇの練り粉を計って取り分けた。３０℃で１０分間寝かせておき、Fortuna社製の型に入れた。練り粉を３４℃で４５分間寝かせて膨らませ、Bagoオーブンで１８分間２２０℃で焼成し、１２秒間蒸らした。
【０３００】
冷却した後、ロールパンを計って取り分け、ロールパンの体積を菜種置換法で測定した。
【０３０１】
パンの比容積
比容積＝パンの体積（ｍｌ）／パンの重量（ｇ）
【０３０２】
練り粉の品質パラメータも評価した。
練り粉の弾性  １〜１０
粘性          １〜１０
【０３０３】
［焼成テスト（トースト用パン）］
穀粉（Danish reform）２０００ｇ、乾燥酵母３０ｇ、砂糖３０ｇ、塩３０ｇ、水４００Brabender単位＋３％を、フック付きのHobartTMミキサーに入れ、低速で２分間、及び高速で１０分間こねた。混ぜ合わせた後の練り粉の温度は２５℃であった。３０℃で１０分間寝かせた。１塊の練り粉につき７５０ｇずつ練り粉を計って取り分けた。その後、３３℃で５分間、ＲＨ８５％で再び寝かせておいた。練り粉を、Glimikの型に入れた。練り粉をパン焼き用の型に入れて３３℃で５０分間寝かせて膨らませ、Wachtelオーブンで４０分間２２０℃にて焼成し、１６秒間蒸らした。
【０３０４】
冷却した後、パンを計って取り分け、パンの体積を菜種置換法で測定した。
【０３０５】
内相も評価した。１＝均質化されていない、１０＝均質化良好というように１〜１０までの段階に分けて主観的に評価した。
【０３０６】
蓋付きの型で焼いた３つのパンを２０℃で保存し、硬さの測定に使用した。
【０３０７】
［硬さ］
コンピュータに接続したInstronTM M model 4301で、パンの硬さを測定した。
【０３０８】
パンの硬さの測定条件：
ロードセル           Ｍａｘ．１００Ｎ
ピストン直径         ５０ｍｍ
クロスヘッドスピード ２００ｍｍ／分
コンプレッション     ２５％
パン１枚の厚さ       １１ｍｍ
力はＮ／ｄｍ2に変換されている。
【０３０９】
結果は、各パンにつき１０枚のパンをスライスして測定した結果の平均値である。
【０３１０】
［脂質の抽出及び脂肪酸分析］
充分に寝かせて膨らませた練り粉１０ｇを即座に冷凍し、凍結乾燥させた。かかる凍結乾燥させた練り粉をコーヒーミルで挽き、８００μのスクリーンを通過させた。１．５ｇの凍結乾燥練り粉を計って取り分け、１５ｍｌのねじ蓋付きの遠心チューブに入れた。７．５ｍｌの水飽和ブタノール（ＷＳＢ）を添加した。かかる遠心チューブを、熱湯が入った水槽に１０分間入れておいた。チューブをRotamixに置き、周辺温度にて２０分間４５ｒｐｍで回転させ、その後、再び、熱湯が入った水槽に１０分間入れ、次いで、Rotamixでさらに３０分間、周辺温度にて回転させた。かかるチューブに対して３５００ｇで５分間の遠心分離を行った。５ｍｌの上清液をバイアルに移し、ＷＳＢを窒素蒸気下で蒸発乾固した。
【０３１１】
抽出物中の遊離脂肪酸を、７１５ｎｍで測定されたイソオクタン中のＣｕ−塩として分析し、オレイン酸のキャリブレーション曲線にしたがって定量した（Kwon D. Y. and Rhee J. S. (1986), A simple and rapid Colourimetric Method for Determination of Fatty Acids for Lipase Assay, JAOCS 63: 89）。
【０３１２】
［ＨＰＬＣによる糖脂質及びリン脂質の測定］
１．クロマトグラフィーの条件
【表ｉｖ】
2005508609.tif 000005
【０３１３】
２．原液
ＩＬＰＳ*標準物質をＣＨＣｌ3／ＣＨ3ＯＨ（７５／７５）に、〜２ｍｇ／ｍｌ  ＰＣで溶解させた。
原料の希釈：０．７、０．１４、０．０２８
*ホスファチジル酸                  ＰＡ   ５．１３％
ホスファチジルエタノールアミン     ＰＥ   １２．７４％
ホスファチジルコリン               ＰＣ   １４．７６％
ホスファチジルイノシトール         ＰＩ   １０．１３％
*ＩＬＰＳ（International Lecithin and Phospholipid Society）の標準物質は、ドイツ国、ケルンのSpectral Service GmbH社より入手した。
【０３１４】
３．サンプルの調製
サンプルをＣＨＣｌ3／ＣＨ3ＯＨ（７５／７５）に溶解させ、超音波処理を行い、０．４５μｍのフィルターで濾過した。
【０３１５】
４．キャリブレーションモデル
キャリブレーションモデル：  ｌｏｇ−ｌｏｇ線状キャリブレーション
ＰＣ用キャリブレーション曲線を用いて、糖脂質及びリン脂質の量を計算した。
【０３１６】
［ガスクロマトグラフィー］
ＷＣＯＴ融合シリカカラム、１２．５ｍ×０．２５ｍｍ  ＩＤ×０．１μｍ  ５％フェニル−メチル−シリコン（CP Sil 8 CB、Crompack社製）を備えたPerkin Elmer 8420 Capillary Gas Chromatography。
担体：ヘリウム
インジェクション：１．５μｌを分注（with split）
検出器：ＦＩＤ．３８５℃
オーブンのプログラム：１           ２            ３            ４
オーブンの温度、℃   ８０          ２００        ２４０        ３６０
等温時間、分         ２            ０            ０            １０
温度速度、℃／分     ２０          １０          １２
サンプルの調製：内部標準物質のヘプタデカンを２ｍｇ／ｍｌで含む、ヘプタン：ピリジンが２：１の溶液１２ｍｌに、５０ｍｇの小麦脂質を溶解させた。５００μｌのサンプルをクリンプバイアルに移した。１００μｌのＭＳＴＦＡ（Ｎ−メチル−Ｎ−トリメチルシリル−トリフルオロアセトアミド）を添加して、反応物を１５分間９０℃でインキュベーションした。
【０３１７】
計算：モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド及び遊離脂肪酸の反応因子を、これらの成分を含む標準混合物から測定した。これらの反応因子に基づき、小麦脂質中のモノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド及び遊離脂肪酸を計算した。
【０３１８】
［ガラクト脂質（ＤＧＤＧ）ザイモグラム（スポットプレート）分析］
プレートの調製
溶液１
１１０ｍｌの水を９０〜１００℃に加熱して、２ｇのアガロースを溶解させた。
溶液２
１．２ｇのガラクト脂質を４０ｍｌの脱塩水に分散させた。０．１Ｍのリン酸緩衝液、ｐＨ７．０、５０ｍｌを添加し、次いで０．２％のローダミンＢ、０．６ｍｌも添加した。
【０３１９】
溶液１を約７０℃まで冷却して、攪拌しながら溶液２を添加した。最終的な混合液１２ｍｌを、７ｃｍのペトリ皿に移した。
【０３２０】
かかるプレートを使用時まで５℃で保管した。
【０３２１】
分析
直径１ｍｍの小さな穴をゲルに開け、１０μｌの酵素溶液をその穴に入れた。アガロースゲル中の暈輪の形成を時間の関数として追跡した。
【０３２２】
酵素を含まないブランクも、比較のために穴の１つに入れた。
【０３２３】
［酵素活性の分析］
酵素分析用基質の調製：基質のpNP−カプリン酸（Ｃ１０）をエタノールに溶解させ、それぞれの最終濃度として基質が０．１ｍｇ／ｍｌ、エタノールが３０％になるように、１００ｍＭのＮａリン酸緩衝液（ｐＨ６．３）で希釈し、室温で保管した。
【０３２４】
分析方法：酵素分析用混合液には、３０μｌのサンプル／ブランク及び２５０μｌの基質が含まれていた。ＥＬＩＳＡ読み取り（４２０ｎｍ）動態プログラムを同時に実行しながら、かかる混合液を３５℃で３０分間インキュベーションした（４２０ｎｍ）。酵素活性（Ｕ／ｍｌ）の計算に、Ｖmax値を使用した。サンプルと同様の条件下で測定したpNP溶液の標準曲線から、Ｖmaxをμｍｏｌに変換した。酵素活性を、３５℃で１分あたり１μｍｏｌのpNPを生成する酵素の量として定義した。
【０３２５】
［ランダム突然変異誘発用スクリーニング方法］
ランダム突然変異誘発又は局所的ランダム突然変異誘発から得た酵素ライブラリーを、成長培地を含む寒天プレート上の酢酸セルロースフィルターに塗り広げ、インキュベーションしてもよい。
【０３２６】
その後、酢酸セルロースフィルターを選択プレートに移し、３７℃で２〜６時間インキュベーションする。所定の条件下で活性酵素を有する細胞は、コロニー周辺に透明な領域を作り出す。その後、陽性の変異体をさらに精製してテストすることができる。
【０３２７】
［結果］
【実施例１】
【０３２８】
練り粉実験の最初のシリーズでは、練り粉中の酵素活性をテストするため、及び焼成実験に適切な投与量を見い出すために、濃度の異なる練り粉１０ｇ中で精製ササゲＬＡＨをテストした。酵素活性は、練り粉中の遊離脂肪酸のレベルを分析することにより測定した。結果を表１及び図４に示す。
【０３２９】
【表１】
2005508609.tif 000006
【０３３０】
表１及び図４に詳述した結果は、遊離脂肪酸が生成されている間に、ササゲ由来のＬＡＨが練り粉中で活性化していることを明示している。
【０３３１】
練り粉中の極性脂質に対する作用を研究するため、練り粉から抽出した脂質をＨＰＬＣでさらに分析した。
【０３３２】
練り粉の脂質のＨＰＬＣ分析結果を表２並びに図５及び６に示す。
【０３３３】
【表２】
2005508609.tif 000007
【０３３４】
非極性脂質をＧＬＣで分析した。この分析の結果を図７に示す。
【０３３５】
ＨＰＬＣ分析は、ガラクト脂質に対するササゲＬＡＨの作用、及び、酵素の投与量が高いとジガラクトシルジグリセリド（ＤＧＤＧ）がほぼ完全に加水分解されることをはっきりと示した。かかる結果は、対応するモノエステル、ＤＧＭＧの濃度がやや上昇したことも示した。しかし、ササゲＬＡＨの濃度が上昇すると、ＤＧＭＧも加水分解される。同様の図式が、ホスファチジルコリン（ＰＣ）についても観察されている。ホスファチジルコリンの加水分解後は、対応するリソホスファチジルコリンがやや増加する。ササゲＬＡＨの濃度が上昇すると、リソホスファチジルコリンも練り粉中で加水分解される。
【０３３６】
結論として、練り粉中のガラクト脂質とリン脂質の両方が、ササゲＬＡＨにより分解されることが観察されている。
【０３３７】
ＧＬＣ分析は、極性脂質及び遊離脂肪酸の形成に対して示す活性と比較して、トリグリセリドに対しては、ササゲＬＡＨが何の活性も示さないことを示唆している。
【０３３８】
練り粉中のガラクト脂質をほぼ完全に加水分解する３単位／ｋｇのササゲＬＡＨが、この強力な酵素が効果を示す最大投与量であることが、はっきりと見てとれる。
【実施例２】
【０３３９】
ミニブレッド実験にて、ササゲＬＡＨを２つの異なる濃度でテストし、コントロール（ササゲＬＡＨ無添加）と比較した。パンの内相構造及び外見を評価するとともに、パンの体積も評価した。このテストで使用した、充分に寝かせて膨らませた練り粉を冷凍し、凍結乾燥させ、練り粉の脂質を抽出した。単離した練り粉の脂質をＨＰＬＣ分析及びＧＬＣ分析により分析した。
【０３４０】
焼成テストの結果を表３に示す。
【０３４１】
【表３】
2005508609.tif 000008
【０３４２】
コントロールと比較して、ササゲＬＡＨは焼きあがったパンの体積増加に明らかに貢献している。また、酵素も、構造を一層均質化し、見た目をよくすることによって、内相の向上に貢献している。
【０３４３】
抽出した脂質の脂質分析結果を表４に示す。
【０３４４】
【表４】
2005508609.tif 000009
【０３４５】
脂質分析により、ササゲＬＡＨが非極性脂質を加水分解しないことがわかった。トリグリセリドのレベルは少々増加したようだが、これは実験誤差の範囲内である。しかし、ジガラクトリルジグリセリド（ＤＧＤＧ）を分解することによって、かかる酵素が、練り粉中の糖脂質に作用しているのは明らかである。対応するＤＧＭＧレベルの増加が観察されている。ガラクト脂質の加水分解の程度はあまり高くはないが、焼成時の品質が酵素によって向上することを説明するには充分である。
【実施例３】
【０３４６】
ササゲから単離したＬＡＨを下記のとおり焼成テストで評価した。ＬＡＨの評価は、表皮が硬いロールパンにおいて行った。
【０３４７】
ＬＡＨを使用量０、０．２５、０．５、１又は１．５単位の酵素／ｋｇ（穀粉）でテストした。最初の結果は、１．５ｍｇのＬＡＨを添加することによって、酵素を使用しないパンと比較してパンの体積が１０％以上増加し、練り粉の取扱い適性が向上したことを示している。
【実施例４】
【０３４８】
穀粉（Danish reform）を使用して、デニッシュトーストブレッド法にしたがい、ＬＡＨをパンの中でテストした。０、０．２５、０．５、１又は１．５単位の酵素／ｋｇ（穀粉）でＬＡＨをテストした。参照として、酵素を添加しない練り粉も１つ作製した。焼成後、パンを冷却し、パンの体積を測定した。蓋付きの型で焼いたパンを、周辺温度で保存し、ビニール袋を二重にして包装し、２２℃で保存したパンの内相の軟らかさを、保存開始１日後、３日後及び７日後に評価した。
【０３４９】
最初の結果は、１〜１．５単位のＬＡＨの添加により、パンの体積が増加することを示している。
【０３５０】
硬さ及び弾性に関する最初の結果は、ＬＡＨの添加により、コントロール（酵素無添加）と比較して、保存開始から７日後のパンの内相が有意に軟らかいことを示している。
【０３５１】
予備段階での結果も、ＬＡＨにより、非常に良質で内相構造が均質なパンができあがることを示している。
【実施例５】
【０３５２】
表５にしたがい、ミニブレッド中でササゲＬＡＨを異なる濃度でテストした。
【０３５３】
【表５】
2005508609.tif 000010
【０３５４】
明らかに、低濃度（最高で０．２３９単位／ｋｇ）のササゲＬＡＨは、体積の増加に貢献している。使用量が多くなると体積の増加は見られなくなるが、内相構造はより均質になる。この実験の練り粉を抽出し、練り粉の脂質を単離し、表６に示すように、ＨＰＬＣ及びＧＬＣで分析した。
【０３５５】
【表６】
2005508609.tif 000011
【０３５６】
脂質分析により、ササゲＬＡＨが非極性練り粉脂質（モノグリセリド、ジグリセリド、及びトリグリセリド）に対して活性を示さないことがはっきりと確認された。しかし、明らかに加水分解されるジカラクトシルジグリセリド（ＤＧＤＧ）のような極性脂質に対する作用により、その機能性は説明される。かかる結果は、ジグリセリド、及びトリグリセリドのレベルについていくつかのバリエーションを示してしるが、かかるバリエーションはランダムなものであり、決して酵素活性を示すものではない。
【実施例６】
【０３５７】
ササゲＬＡＨをミニブレッド分析で評価した。この実験では、酵素を単独で、又はオート麦から単離したガラクト脂質と組み合わせてテストした。焼成テストの結果及び遊離脂肪酸の測定結果を表７に示す。
【０３５８】
【表７】
2005508609.tif 000012
【０３５９】
この実験で、ササゲＬＡＨとガラクト脂質（５５％のＤＧＤＧ）の両方が、パンの体積に対してプラス効果を有することがわかった。その２成分を組み合わせることが、表７に示したような明らかな相乗効果の一因となっている。ササゲＬＡＨ及びＤＧＤＧを添加すると、パンの体積及び内相構造の両方が、有意に向上する。
【０３６０】
この焼成実験で使用した練り粉を冷凍し、凍結乾燥させ、練り粉の脂質を水飽和ブタノールで抽出した。単離した脂質をＧＬＣ分析及びＨＰＬＣ分析にかけた。これらの分析の結果を表８に示す。
【０３６１】
【表８】
2005508609.tif 000013
【０３６２】
ガラクト脂質（テスト番号２）を練り粉に添加すると、より多くのガラクト脂質（ＤＧＤＧ）がＨＰＬＣ分析でも検出される。ササゲＬＡＨはＤＧＤＧに対して強い加水分解活性をもつ。
【０３６３】
加水分解活性は、ＤＧＤＧを添加しなかった場合（テスト番号３）も特に添加した場合（テスト番号４）も、非常にはっきりとしていた。ササゲＬＡＨが添加された際には、加水分解産物、すなわちＤＧＭＧのレベルの増加も認められた。他の実験でも見られるように、ササゲＬＡＨはトリグリセリドには加水分解活性を及ぼさない。
【実施例７】
【０３６４】
ミニブレッド分析で、ササゲＬＡＨを大豆油と組み合わせて評価した（表９）。
【０３６５】
【表９】
2005508609.tif 000014
【０３６６】
この実験では、大豆油だけを使用して焼成したパンと比較して、ササゲＬＡＨはパンの体積増加に貢献しなかったが、ササゲＬＡＨは明らかに内相構造及びパンの外見を向上させていた（図８）。
【実施例８】
【０３６７】
ミニブレッド分析で、ササゲＬＡＨを異なる濃度のガラクト脂質（純度５５％）と組み合わせて評価した（表１０）。
【０３６８】
【表１０】
2005508609.tif 000015
【０３６９】
表１０は、１．０７単位／ｋｇのガラクト脂質と組み合わせてガラクト脂質を添加すると、パンの体積及び内相構造の両方が、かなり向上することを示している（図９）。
【実施例９】
【０３７０】
ミニブレッドにおいて、ササゲから精製したＬＡＨをガラクト脂質ＤＧＤＧと組み合わせて評価した。
【０３７１】
練り粉に添加した成分について、その概略を、これらの焼成実験で焼成したパンの体積とともに表１１に示す。
【０３７２】
【表１１】
2005508609.tif 000016
【０３７３】
表１１の結果には、ＤＧＤＧが焼きあがったパンの体積に対してかなりのプラス効果を有していることが、はっきりと示されている。ササゲＬＡＨもパンの体積増加に貢献している。ササゲＬＡＨとＤＧＤＧの組み合わせにより、パンの体積が増加し、内相が一層向上することが観察された（図１０）。
【実施例１０】
【０３７４】
この実験では、小麦の葉の葉緑体から単離した膜結合性ＬＡＨを、１０ｇのモデル練り粉系でテストした。練り粉を２６℃で１時間寝かせておき、その後冷凍して凍結乾燥させた。
【０３７５】
凍結乾燥させた練り粉を水飽和ブタノール（ＷＳＢ）で抽出し、単離した練り粉の脂質をＧＬＣ分析及びＨＰＬＣ分析にかけた。脂質分析の結果を表１２に示す。
【０３７６】
【表１２】
2005508609.tif 000017
【０３７７】
表１２の結果は、練り粉中の遊離脂肪酸の強烈な増加として測定された、練り粉中の小麦葉緑体に由来する膜結合性ＬＡＨ酵素の脂質分解活性を確認するものである。かかる結果はまた、小麦葉緑体に由来する膜結合性ＬＡＨ酵素が、非極性脂質に対してはほとんど作用を有さないこと、及びトリグリセリドの濃度が変わらないことも示している。また、膜結合性ＬＡＨ酵素の大量使用により完全に加水分解されるジカラクトシルジグリセリド（ＤＧＤＧ）などのガラクト脂質の加水分解に対する、小麦葉緑体に由来する膜結合性ＬＡＨ酵素の強い加水分解活性も示している。
【実施例１１】
【０３７８】
この実験においては、配列番号１２に示される配列を含む単離したＬＡＨ酵素を、１０ｇのモデル練り粉系でテストした。練り粉を２６℃で１時間寝かせておき、その後冷凍して凍結乾燥させた。
【０３７９】
予備段階での結果は、配列番号１２に示される配列を含む酵素が油中の極性脂質の量を減少させる一方で、油のトリグリセリドレベルについては有意な影響を及ぼさないことを示している。
【０３８０】
結論：
ササゲ由来のＬＡＨ酵素を単離し、性質決定し、モデル練り粉及びミニ焼成実験でテストした。練り粉中の極性ガラクト脂質及びリン脂質に対しては酵素は活性を示したが、練り粉中のトリグリセリドには何の活性も示さないことが観察された。小麦由来の葉緑体結合性ＬＡＨも単離して、モデル練り粉中でテストした。この酵素もまた、練り粉中のガラクト脂質及びリン脂質に対しては活性を示したが、トリグリセリドには何の活性も示さなかった
【実施例１２】
【０３８１】
植物油、特に菜種油を、ササゲから単離したＬＡＨで処理して、油のデガミングに作用が及ぶようにした。使用したプロセスは、ＬＡＨを使用することを除いては、基本的に、Buchold, H. (Fat Sci. Technol. 95 Jahrgang nr. 8, 1993, pp300-305)に一般的に教示されている酵素触媒による植物油のデガミングプロセスに準ずるものであった。
【０３８２】
予備段階での結果は、ＬＡＨが油中の極性脂質の量を減少させる一方で、油中のトリグリセリドレベルには有意な影響を及ぼさないことを示している。
【０３８３】
上記明細書中で述べた刊行物はすべて、ここに参考文献として組み込んである。
当業者であれば、本発明の要旨から逸脱することなく、ここに記載した本発明の方法及びシステムに多様な改良及び変更を加えるのは容易である。ここまで本発明を、特定の好ましい実施形態に関連して記述してきたが、クレーム記載の本発明がそうした特定の実施形態に不当に制限されるべきではないことは、承知されてしかるべきである。特に、ここに記述した、本発明を実施する形態に対して種々の改良を施すことは、食品化学／工学及び生化学分野の人間にとっては自明であるが、そのような改良を施したものについても、下記のクレームの範囲に含まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０３８４】
【図１】図１は、未変性ＰＡＧＥゲルを示すものである。
【図２】図２は、ガラクト脂質（ＤＧＤＧ）ザイモグラムを示すものである。
【図３】図３は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示すものである。
【図４】図４は、練り粉中のササゲＬＡＨ１の作用を示すグラフである。
【図５】図５は、ササゲＬＡＨで処理した練り粉中のガラクト脂質のＨＰＬＣ分析を示すグラフである。
【図６】図６は、ササゲＬＡＨで処理した練り粉中のリン脂質のＨＰＬＣ分析を示すグラフである。
【図７】図７は、ササゲＬＡＨで処理した練り粉中の非極性脂質のＧＬＣ分析を示すグラフである。
【図８】図８は、ミニブレッドの写真を示すものであり、写真中、ローフ１４は２％の大豆油を、ローフ１５は２％の大豆油及び１．０７単位／ｋｇのササゲＬＡＨを添加したものである。
【図９】図９は、ミニブレッドの写真を示すものであり、写真中、ローフ９はコントロール、ローフ１０は１．０７単位／ｋｇのササゲＬＡＨを添加したもの、ローフ１１は１．０７単位／ｋｇのササゲＬＡＨ＋０．１％のガラクト脂質を添加したもの、ローフ１２は１．０７単位／ｋｇのササゲＬＡＨ＋０．２％のガラクト脂質を添加したもの、ローフ１３は１．０７単位／ｋｇのササゲＬＡＨ＋０．４％のガラクト脂質を添加したものである。
【図１０】図１０は、ミニブレッドの写真を示すものであり、写真中、ローフ１はコントロール、ローフ２は０．４％のＤＧＤＧを添加したもの、ローフ３は０．４％のＤＧＤＧ＋０．４単位／ｇのササゲＬＡＨを添加したもの、ローフ４は０．４単位／ｇのササゲＬＡＨを添加したものである。
【図１１】図１１は、pYES2由来の発現ベクターを示すものである。pYES2のＧａｌｌプロモーターを除去し、構造ＡＤＨプロモーターに置換した。インビボ組換えにより、ＬｉｐＡをSaccharomyces cerevisiaeに組み込んだ。略語の説明：Ａｍｐ、アンピシリン耐性遺伝子；ＡＤＨ３’、アルコールデヒドロゲナーゼ３’領域；ＡＤＨp、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター；ｂｐｓ、塩基対；ＣＹＣｌ、転写終止因子；ｆｌ  ｏｒｉ、ｆｌ起点；Ｇａｌｌｐ、ガラクトース遺伝子プロモーター；ＬｉｐＡ、Aspergillus tubigenesis由来リパーゼ遺伝子；ＭＣＳ、多重クローニング部位；pMb1  ｏｒｉ、pUC由来起点、ｕｒａ３、ウラシルをコードする遺伝子、２μ  ｏｒｉ、２μ起点。
【図１２】図１２は、ここに詳述した方法を用いて同定したササゲ由来脂質分解性アシルヒドロラーゼ酵素のMaldi-TOFプロフィールを示すものである。
【図１３】図１３は、ＶＵＰＡＴ１（Matos et al FEBS Letters 491(2001) 188-192）のペプチドプロフィールを示すものである。
【図１】
2005508609.tif 000018
【図２】
2005508609.tif 000019
【図３】
2005508609.tif 000020
【図４】
2005508609.tif 000021
【図５】
2005508609.tif 000022
【図６】
2005508609.tif 000023
【図７】
2005508609.tif 000024
【図８】
2005508609.tif 000025
【図９】
2005508609.tif 000026
【図１０】
2005508609.tif 000027
【図１１】
2005508609.tif 000028
【図１２】
2005508609.tif 000029
【図１３】
2005508609.tif 000030
【配列表】
2005508609000001.app
【国際調査報告】
2005508609.tif 000031
2005508609.tif 000032
2005508609.tif 000033