(57)【要約】  本明細書において、発現が膀胱癌においてアップレギュレート又はダウンレギュレートされる遺伝子を記載する。また、発現が薬物耐性膀胱癌細胞において更にアップレギュレート又はダウンレギュレートされるそのような遺伝子も記載する。膀胱癌の診断、予後判定、及び治療に使用され得る関連方法及び組成物が開示される。また、本明細書において、膀胱癌のモジュレーターを同定するために使用され得る方法を記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者からの細胞における膀胱癌-関連転写産物の検出法であって、患者からの生物学的試料を、表1A-13に示された配列と少なくとも80％同一である配列と選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドと接触する工程を含む、方法。
【請求項２】
生物学的試料が単離された核酸を含有する、請求項1記載の方法。
【請求項３】
a)核酸がmRNAであるか；又は
b)更に、生物学的試料をポリヌクレオチドと接触する工程の前に、核酸を増幅する工程を含む、請求項2記載の方法。
【請求項４】
ポリヌクレオチドが：
a)表1A-13に示された配列を含むか；又は
b)固体表面に固定されている、請求項1記載の方法。
【請求項５】
患者は：
a)膀胱癌を治療するために治療的投薬計画を受けているか；又は
b)膀胱癌であると疑われる、請求項1記載の方法。
【請求項６】
表1A-13に示されたポリヌクレオチド配列からなる単離された核酸分子。
【請求項７】
標識されている、請求項6記載の核酸分子。
【請求項８】
請求項7記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項９】
請求項8記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１０】
表1A-13に示されたポリヌクレオチド配列を有する核酸分子によりコードされている、単離されたポリペプチド。
【請求項１１】
請求項10記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項１２】
更にエフェクター成分に複合されている、請求項11記載の抗体。
【請求項１３】
エフェクター成分が、蛍光標識である、請求項12記載の抗体。
【請求項１４】
エフェクター成分が、放射性同位元素又は細胞傷害性化学物質である、請求項12記載の抗体。
【請求項１５】
a)抗体断片；又は
b)ヒト化された抗体である、請求項11記載の抗体。
【請求項１６】
患者からの生物学的試料中の膀胱癌細胞の検出法であって、生物学的試料を、請求項11記載の抗体と接触する工程を含む、方法。
【請求項１７】
抗体が更に、エフェクター成分と複合されている、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
エフェクター成分が蛍光標識である、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
膀胱癌-関連ポリペプチドを変調する化合物を同定する方法であって：
a)化合物を、表1A-13に示された配列と少なくとも80％同一である配列に選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされている、膀胱癌-関連ポリペプチドと接触する工程；及び
b)この化合物の該ポリペプチドに対する機能的作用を決定する工程を含む、方法。
【請求項２０】
a)被験化合物を、膀胱癌を有する哺乳類又はそれから単離された細胞に投与する工程；
b)処理した細胞又は哺乳類における、表1A-13に示された配列と少なくとも80％同一である配列に選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドの遺伝子発現レベルを、対照細胞又は哺乳類におけるポリヌクレオチドの遺伝子発現レベルと比較する工程を含む薬物スクリーニングアッセイであって、ポリヌクレオチドの発現レベルを変調する被験化合物が膀胱癌治療の候補となる、薬物スクリーニングアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2001年7月3日に出願された米国特許出願第60/302,814号；2001年8月3日に出願された米国特許出願第60/310,099号；2001年11月8日に出願された米国特許出願第60/343,705号；2001年11月13日に出願された米国特許出願第60/350,666号；及び、2001年4月12日に出願された米国特許出願第60/372,246号に関連しており、これら各々は、本願明細書に引用によって組入れられている。
【０００２】
発明の分野
本発明は、膀胱癌に関連している核酸及びタンパク質の発現プロファイル、並びに核酸、産物、及びそれに対する抗体を同定すること；並びに、このような発現プロファイル及び組成物の、膀胱癌の診断、予後判定、及び治療における使用に関する。本発明は更に、膀胱癌を阻害する物質及び／又は標的を同定及び使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
米国において、毎年50,000例を超える新規膀胱癌症例が診断されており、10,000を超える死亡例が膀胱癌に起因している。現在膀胱癌は、米国男性における最も一般的な癌の第4位であり、米国女性における最も一般的な癌の第9位である。これは、男性の方が女性の3倍の頻度で発生し、白人男性の頻度の方が黒人男性に比べほぼ2倍高い。
【０００４】
膀胱癌は稀に、40歳未満の人にも発生するが、主として高齢男性の疾患である。それにもかかわらず、膀胱癌は、米国における疾病及び死亡の重大な原因である。膀胱癌のリスクは年齢と共に急激に上昇し、膀胱癌による全死亡例の半分以上が70歳以上である。65歳以上の白人男性において、年間の膀胱癌有病率は、1,000名当りほぼ2例であり；これは65未満の1,000名当り0.1例とは対照的である。
【０００５】
米国において、膀胱癌の割合は、南部州の人々に比べ北部州の人々の間で高く、都市部の住人の方が農村部の住人よりも高い。この差異は、遺伝的要因に加え環境的要因が本疾患の発症及び進行に寄与し得ることを示唆しているが、別の研究は、ある種の遺伝子が膀胱癌において役割を果たしていることを確認している。例えば、腫瘍抑制遺伝子p53の発現は、浸潤性膀胱癌患者にとって有害な予後に関連している。根治的膀胱切除術を受けた243名の患者に関する遡及的試験から、核p53の存在は、中期から後期腫瘍の患者間で再発に関する独立した予測値であることが分かった。Esrigら、N.E.J. Med.、331:1259-64 (1994)。
【０００６】
膀胱癌は、下記3種の一般的範疇にグループ分けすることができる疾患範囲を示している：表在性、浸潤性、及び転移性。治療予後は、腫瘍が最初に診断された病期に大きく左右される。膀胱癌治療特有の局面は、外科的生検の繰返しが、日々の患者管理の不可欠な部分であることである。これは、本疾患の特定の病期から腫瘍の分子遺伝学的試験を行うことを可能にしている。これらの試験結果は、膀胱癌が、浸潤及び転移の可能性の差異を説明することができる、少なくとも2種の個別の経路に沿って発症及び進行することを示唆している。診断及び治療に関する現在の範例への分子遺伝子的要因の組込みは、治癒の可能性を最適化し、かつ膀胱癌患者の生活の質(QOL)の維持をもたらすであろう。
【０００７】
早期検出及び治療は、本疾患の再発及び治癒不能な病期への進行を防止することができる。従って新規診断マーカー及び治療標的の同定は、膀胱癌患者の現行の治療を改善するであろう。産業界及び学界は新規配列を同定したが、病態におけるこれらの新規配列の機能を同定するためには同等の努力が払われてはいない。診断マーカー及び治療標的を同定するために病態における新規タンパク質及び化合物の役割を解明することは、膀胱癌患者の現行の治療を改善するために必須である。従って、膀胱癌の診断及び予後判定に使用することができる方法が本願明細書において提供される。加えて、膀胱癌及び他の関連した膀胱疾患の治療的介入のための分子標的が提供される。更に、膀胱癌を変調する能力について候補生体活性物質をスクリーニングするために使用することができる方法が提供される。
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
従って本発明は、膀胱癌細胞においてアップ及びダウンレギュレーションされる遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。このような遺伝子は、診断目的で、及び膀胱癌を変調する治療的化合物、例えばホルモン又は抗体のスクリーニングのための標的としても有用である。本発明のその他の局面は、下記の本発明の説明により、当業者には明らかになるであろう。
【０００９】
ひとつの局面において、本発明は、患者からの細胞において膀胱癌に関連した転写産物を検出する方法を提供し、この方法は、患者からの生物学的試料を、表1A-13に示された配列と少なくとも80％同一である配列と選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドと接触することを含む。
【００１０】
ひとつの態様において、本発明は、患者からの細胞において膀胱癌に関連した転写産物のレベルを決定する方法を提供する。
【００１１】
ひとつの態様において、本発明は、患者からの細胞において膀胱癌-関連転写産物を検出する方法を提供し、この方法は、患者からの生物学的試料を、表1A-13に示された配列と少なくとも80％同一である配列と選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドと接触することを含む。
【００１２】
ひとつの態様において、このポリヌクレオチドは、表1A-13に示された配列と少なくとも95％同一である配列と選択的にハイブリダイズする。
【００１３】
ひとつの態様において、この生物学的試料は組織試料である。別の態様において、この生物学的試料は、単離された核酸、例えばmRNAを含む。
【００１４】
ひとつの態様において、このポリヌクレオチドは、例えば蛍光標識により標識されている。
【００１５】
ひとつの態様において、このポリヌクレオチドは、固体表面に固定されている。
【００１６】
ひとつの態様において、この患者は、膀胱癌を治療するための治療的投薬計画を受けている。別の態様において、この患者は、転移性膀胱癌を有する疑いがある。
【００１７】
ひとつの態様において、この患者はヒトである。
【００１８】
ひとつの態様において、この膀胱癌関連した転写産物は、mRNAである。
【００１９】
ひとつの態様において、この方法は更に、生物学的試料をポリヌクレオチドと接触する工程の前に、核酸を増幅する工程を含む。
【００２０】
別の局面において、本発明は、膀胱癌の治療的処置の効能をモニタリングする方法を提供し、この方法は、(i)治療的処置を受けている患者から生物学的試料を調達する工程；及び、(ii)生物学的試料を、表1A-13に示された配列と少なくとも80％同一である配列と選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドと接触し、生物学的試料中の膀胱癌-関連転写産物のレベルを決定しこれによりその療法の効能をモニタリングする工程を含む。更なる態様において、患者は、転移性膀胱癌を有する。更なる態様において、患者は膀胱癌の薬物抵抗型を有する。
【００２１】
ひとつの態様において、この方法は更に、(iii)この膀胱癌-関連転写産物のレベルを、治療的処置の前又は初期の患者からの生物学的試料中の膀胱癌-関連転写産物のレベルと比較する工程を含む。
【００２２】
加えて本願明細書において、薬剤を患者に投与すること、及び患者から細胞試料を採取することを含む、候補膀胱癌用薬剤の作用を評価する方法が提供される。その後この細胞の発現プロファイルが決定される。この方法は更に、この発現プロファイルを、健常者の発現プロファイルと比較することを含むことがある。好ましい態様において、該発現プロファイルは、表1A-13の遺伝子を含む。
【００２３】
ひとつの局面において、本発明は、表1A-13に示されたポリヌクレオチド配列からなる単離された核酸分子を提供する。
【００２４】
ひとつの態様において、発現ベクター又は細胞は、単離された核酸を含む。
【００２５】
ひとつの局面において、本発明は、表1A-13に示されたポリヌクレオチド配列を有する核酸分子によりコードされた単離されたポリペプチドを提供する。
【００２６】
別の局面において、本発明は、表1A-13に示されたポリヌクレオチド配列を有する核酸分子によりコードされた単離されたポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。
【００２７】
ひとつの態様において、抗体は、エフェクター成分、例えば蛍光標識、放射性同位元素、又は細胞傷害性化学物質と複合される。
【００２８】
ひとつの態様において、抗体は、抗体断片である。別の態様において、抗体は、ヒト化されている。
【００２９】
ひとつの局面において、本発明は、患者からの生物学的試料中の膀胱癌細胞を検出する方法を提供し、この方法は、生物学的試料を、本願明細書に説明した抗体と接触する工程を含む。
【００３０】
別の局面において、本発明は、患者の膀胱癌に特異的な抗体を検出する方法を提供し、この方法は、患者からの生物学的試料を、表1A-13からの配列を含む核酸によりコードされたポリペプチドと接触することを含む。
【００３１】
別の局面において、本発明は、膀胱癌-関連ポリペプチドを変調する化合物を同定する方法を提供し、この方法は、(i)化合物を、膀胱癌-関連ポリペプチドと接触する工程であり、ここでこのポリペプチドは、表1A-13に示された配列と少なくとも80％同一である配列に選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされている工程；及び、(ii)このポリペプチドに対する化合物の機能的作用を決定する工程を含む。
【００３２】
ひとつの態様において、機能的作用は、物理的作用、酵素的作用又は化学的作用である。
【００３３】
ひとつの態様において、ポリペプチドは、真核宿主細胞又は細胞膜において発現される。別の態様において、ポリペプチドは組換え体である。
【００３４】
ひとつの態様において、機能的作用は、このポリペプチドに結合するリガンドを測定することにより決定される。
【００３５】
別の局面において、本発明は、患者における膀胱癌を治療するために、膀胱癌-関連細胞の増殖を阻害する方法を提供し、この方法は、本願明細書において説明されたように同定された化合物を治療的有効量、対象に投与する工程を含む。
【００３６】
ひとつの態様において、化合物は抗体である。
【００３７】
別の局面において、本発明は、(i)被験化合物を、膀胱癌を有する哺乳類又はそこから単離された細胞試料へ投与する工程；(ii)処置した細胞又は哺乳類における表1A-13に示された配列と少なくとも80％同一である配列に選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドの遺伝子発現レベルを、対照細胞試料又は哺乳類におけるこのポリヌクレオチドの遺伝子発現レベルと比較する工程を含む、薬剤スクリーニングアッセイを提供し、ここでポリヌクレオチド発現レベルを変調する被験化合物が、膀胱癌治療の候補である。
【００３８】
ひとつの態様において、対照は、被験化合物で処置されていない、膀胱癌である哺乳類又はそれ由来の細胞試料である。別の態様において、対照は、正常な細胞又は哺乳類である。
【００３９】
ひとつの態様において、被験化合物は、変動する量又は濃度で投与される。別の態様において、被験化合物は、変動する期間投与される。別の態様において、薬剤候補の添加又は除去後に、比較を行うことができる。
【００４０】
ひとつの態様において、表1A-13に示された配列と少なくとも80％同一である配列に選択的にハイブリダイズする複数のポリヌクレオチドのレベルは、対照細胞試料又は哺乳類におけるそれらの各々のレベルと個別に比較される。好ましい態様において、複数のポリヌクレオチドは、3〜10個である。
【００４１】
別の局面において、本発明は、本願明細書に説明されたアッセイにより同定された化合物を投与することを含む、膀胱癌を有する哺乳類を治療する方法を提供する。
【００４２】
別の局面において、本発明は、膀胱癌を有する哺乳類を治療するための医薬組成物、本願明細書に説明されたアッセイにより同定された化合物及び生理的に許容できる賦形剤を含有する組成物を提供する。
【００４３】
ひとつの局面において、膀胱癌のようにアップ及びダウンレギュレーションされている遺伝子を発現している細胞を提供することによる、薬剤候補をスクリーニングする方法を提供する。ひとつの態様において、遺伝子は、表1A-13から選択される。この方法は更に、薬剤候補を細胞へ添加し、及び薬剤候補の発現プロファイル遺伝子の発現に対する作用を決定することを含む。
【００４４】
ひとつの態様において、薬剤候補をスクリーニングする方法は、薬剤候補の非存在下での発現レベルを、薬剤候補の存在下での発現レベルと比較することを含み、ここで薬剤候補の濃度は、存在する場合には変動することができ、ここで比較は、薬剤候補の添加又は除去後に行うことができる。好ましい態様において、細胞は、少なくとも2種の発現プロファイル遺伝子を発現する。これらのプロファイル遺伝子は、増加又は減少を示すことがある。
【００４５】
膀胱癌変調タンパク質を発現又は過剰発現しているトランスジェニック動物、又は例えば遺伝子ノックアウトの結果として膀胱癌変調タンパク質を欠いている動物に、この薬剤を投与することを含む、候補膀胱癌用薬剤の作用を評価する方法も提供される。
【００４６】
更に、表1A-l3の1種又は複数の核酸セグメントを含むバイオチップも本願明細書において提供され、ここでこのバイオチップは、1000種よりも少ない核酸プローブを含む。好ましくは、少なくとも2種の核酸セグメントが含まれる。より好ましくは、少なくとも3種の核酸セグメントが含まれる。
【００４７】
更に、膀胱癌に関連した疾患を診断する方法が提供される。この方法は、第一の個人の第一の組織型における表1A-13の遺伝子の発現を決定すること、並びに第一の個人又は第二の罹患していない個人からの第二の正常組織型からの遺伝子発現と分布を比較することを含む。発現の差異は、第一の個人が膀胱癌に関連した疾患を有することを示している。
【００４８】
更なる態様において、バイオチップは、膀胱癌においてアップ及びダウンレギュレーションされていない遺伝子のポリヌクレオチド配列も含む。
【００４９】
ひとつの態様において、膀胱癌を変調するタンパク質(膀胱癌変調タンパク質)又はそれらの断片の結合を妨害することが可能な生体活性物質並びに該膀胱癌変調タンパク質に結合する抗体又はそれらの断片のスクリーニング法である。好ましい態様において、この方法は、膀胱癌変調タンパク質又はそれらの断片、候補生体活性物質並びに該膀胱癌変調タンパク質に結合する抗体又はそれらの断片を組合せることを含む。この方法は更に、該膀胱癌変調タンパク質又はそれらの断片及び該抗体の結合を決定することを含む。結合が変化する場合、物質は、妨害物質として同定される。この妨害物質は、アゴニスト又はアンタゴニストであることができる。この物質は膀胱癌を阻害することが好ましい。
【００５０】
本願明細書において、個体における免疫応答を誘起する方法も提供される。ひとつの態様において、本願明細書において提供された方法は、膀胱癌変調性タンパク質、又はそれらの断片を含有する組成物を、個体へ投与することを含む。別の態様において、このタンパク質は、表1A-13のものから選択された核酸によりコードされている。
【００５１】
更に本願明細書において、個体において免疫応答を誘起することが可能な組成物が提供される。ひとつの態様において、本願明細書において提供された組成物は、好ましくは表1A-13の核酸又はそれらの断片によりコードされた、膀胱癌変調性タンパク質、及び医薬として許容できる担体を含有する。別の態様において、該組成物は、好ましくは表1A-13の核酸から選択された、膀胱癌変調性タンパク質をコードしている配列を含む核酸、及び医薬として許容できる担体を含有している。
【００５２】
更に該タンパク質に特異的な物質を、中和作用に十分な量で、該タンパク質と接触することを含む、膀胱癌タンパク質、又はそれらの断片の作用を中和する方法も提供される。別の態様において、このタンパク質は、表1A-13のものから選択された核酸によりコードされている。
【００５３】
別の本発明の局面において、膀胱癌の個体を治療する方法が提供される。ひとつの態様において、この方法は、該個体へ、膀胱癌変調性タンパク質の阻害剤を投与することを含む。別の態様において、この方法は、膀胱癌を有する患者へ、治療的部分に複合された膀胱癌変調性タンパク質に対する抗体を投与することを含む。このような治療的部分は、細胞傷害性物質又は放射性同位元素であることができる。
【００５４】
発明の詳細な説明
先に概説した目的に従い、本発明は、膀胱疾患(BD)、例えば転移性膀胱癌を含む癌の診断及び予後判定のための新規方法、更には膀胱疾患を変調する組成物のスクリーニング法を提供する。膀胱疾患を治療するための方法及び組成物も提供される。同じくこれらのマーカーが有用であり得る様々な関連した状態は、例えば上皮内癌(CIS)、乳頭型癌の様々な病期；及び、様々な病期、層、構造部分でのそのような状態も含む。
【００５５】
概して分子医学の最近の進歩は、診断マーカーもしくは予後判定マーカーとして、又は様々な免疫療法的戦略もしくは小分子戦略の標的として利用することができる腫瘍-特異性細胞表面抗原についての関心が増している。免疫療法的戦略に適した抗原は、癌組織において高度に発現され、理想的には他の組織、例えば正常、成体組織においては発現されないはずである。しかし生命に不要な組織における発現は、そのような発現の生理的帰結は限定的であるので、容認される。膀胱癌以外の癌におけるこのような抗原の例は、Her2/neu及びB-細胞抗原CD20を含む。Her2/neuに対するヒト化されたモノクローナル抗体(Herceptin(登録商標)/trastuzumab)は、現在転移性乳癌の治療に使用されている。Ross及びFletcher、Stem Cells、6:413-428 (1998)。同様に、抗-CD20モノクローナル抗体(Rituxin(登録商標))/rituximab)は、非-ホジキン性リンパ腫の効果的治療に使用されている。Maloneyら、Blood、90:2188-2195 (1997)；及び、Leget及びCzuczman、Curr Opin. Oncol.、10:548-551 (1998)。
【００５６】
定義
用語「膀胱癌タンパク質」又は「膀胱癌ポリヌクレオチド」又は「膀胱癌-関連転写産物」は：(1)表1A-13の又はその遺伝子に関連したヌクレオチド配列に対して、好ましくは少なくとも約25、50、100、200、500、1000又はそれよりも多いヌクレオチドの領域を超える領域において、約60％より多いヌクレオチド配列同一性、65％、70％、75％、80％、85％、90％、好ましくは91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％もしくはそれ以上のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を有し；(2)表1A-13のヌクレオチド配列によりコードされた、又は遺伝子に関連したアミノ酸配列、及び保存的に修飾されたそれらの変種を含む免疫原に対し生じた抗体、例えばポリクローナル抗体に結合し；(3)ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、表1A-13の核酸配列、又はそれらの相補体及びそれらの保存的に修飾された変種に、特異的にハイブリダイズし；あるいは、(4)表1A-13の又はその遺伝子に関連したヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列に対して、好ましくは少なくとも約25、50、100、200、500、1000又はそれよりも多いアミノ酸を超える領域において、約60％より大きいアミノ酸配列同一性、65％、70％、75％、80％、85％、90％、好ましくは91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％又はそれ以上のアミノ配列同一性を有する、アミノ酸配列を有する核酸及びポリペプチドの多型変種、アレル、突然変異体、及び種間相同体を意味する。ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列は、典型的には、霊長類、例えばヒト；齧歯類、例えば、ラット、マウス、ハムスター；ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、又は他の哺乳類を含むが、これらに限定されるものではない哺乳類に由来する。「膀胱癌ポリペプチド」及び「膀胱癌ポリヌクレオチド」は、天然又は組換えの両型を含む。
【００５７】
「完全長」膀胱癌タンパク質又は核酸は、1種又は複数の天然の野生型膀胱癌ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列に通常含まれるエレメント全てを含む、膀胱癌ポリペプチドもしくはポリヌクレオチド配列、又はそれらの変種を意味する。「完全長」は、選択的スプライシングを含むスプライシング、又は翻訳後プロセシングの前、又は後の様々な段階であることができる。
【００５８】
本願明細書において使用される「生物学的試料」は、例えば膀胱癌タンパク質、ポリヌクレオチド、又は転写産物の核酸又はポリペプチドを含むような、生物学的組織又は液体の試料である。このような試料は、例えばヒト又は齧歯類、例えばマウス及びラットから単離された組織を含むが、これらに限定されるものではない。生物学的試料は、生検及び剖検試料のような組織切片、組織学的目的のために採取した凍結切片、血液、血漿、血清、喀痰、糞便、尿、涙液、粘液、毛髪、皮膚なども含むことができる。生物学的試料は、同じく患者組織由来の外植片並びに初代及び／又は形質転換された細胞培養物も含む。生物学的試料は、典型的には真核生物、最も好ましくは哺乳類、例えばチンパンジー又はヒトのような霊長類；ウシ；イヌ；ネコ；齧歯類、例えばモルモット、ラット又はマウス；ウサギ；又は、鳥類；爬虫類；又は魚類から得られる。
【００５９】
「生物学的試料の調達」は、本発明において説明された方法において用いるための生物学的試料を得ることを意味する。最も頻繁には、これは、動物から細胞試料を取り出すことにより行われるが、予め単離された(例えば、別のヒトから、別の時点で、及び／又は別の目的で単離された)細胞を用いるか、又は本発明の方法をin vivoにおいて行うことによっても実現することができる。治療歴又は転帰を備えた保管された組織は、特に有用であろう。
【００６０】
2種又はそれよりも多い核酸又はポリペプチド配列に関して、用語「同一」又はパーセント「同一性」は、2種又はそれよりも多い配列又は部分配列が、同じであるか、もしくは以下に説明したデフォルトのパラメータによるBLAST又はBLAST 2.0配列比較アルゴリズムを用いて測定したか、又は手作業の並置及び肉眼による検査により、同じアミノ酸残基又はヌクレオチドを特定の割合(例えば、比較ウインドウ又は指定された領域について最大の対応になるように比較又は並置した場合に、特定の領域について、約60％同一性、好ましくは70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又はより高い同一性)有することを意味する(例えば、NCBIウェブサイト、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/などを参照のこと)。従ってこのような配列は、「実質的に同一」と言われる。この定義は、被験配列の相補性(compliment)を意味するか、又はこれに適用することができる。この定義は、欠失及び／又は付加、置換、天然の変種、例えば多型性又はアレル変種、並びに人工の変種を含む配列も含む。以下に説明するように、好ましいアルゴリズムは、ギャップなどを説明することができる。好ましくは、同一性は、長さが少なくとも約25個のアミノ酸又はヌクレオチドである領域を超えて、より好ましくは長さ50〜100個のアミノ酸又はヌクレオチド領域を超えて存在する。
【００６１】
配列比較について、典型的には、ひとつの配列は、それに対して被験配列が比較される参照配列として作用する。配列比較コンピューターアルゴリズムを使用する場合、典型的には被験配列及び参照配列、部分配列座標、及び配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。デフォルト又は代替のプログラムパラメータを選択することができる。その後配列比較アルゴリズムを、プログラムパラメータを基に、被験配列の参照配列に対する配列同一性％について計算する。
【００６２】
本願明細書において使用される「比較ウインドウ」は、ふたつの配列が最適に並置された後に、その中の配列を同じ数の隣接位置の参照配列と比較することができるような、典型的には約20〜600個、通常約50〜200個、より一般的には約100〜150個からなる群から選択された多くの隣接位置のひとつのセグメントを参照することを含む。比較のための配列並置法は当該技術分野において周知である。比較のための配列の最適並置は、例えば、Smith及びWatennanのローカルホモロジーアルゴリズム(Adv. Appl. Math.、2:482 (1981))、Needleman及びWunschのホモロジーアラインメントアルゴリズム(J. Mol. Biol.、48:443-453 (1970))、Pearson及びLipmanの類似性検索法(Proc. Natl Acad. Sci. USA、85:2444-448 (1988))により行うことができ、これらのアルゴリズムはコンピュータにより実行されるか(GAP、BESTFIT、FASTA、及びTFASTA、Wisconsin Genetics Software Package、Genetics Computer Group、575 Science、Dr., Madison、WI)、又は手作業による並置及び肉眼により検査される(例えば、Ausubelら、(1995年、補遺)、Current Protocols in Molecular Biology、Lippincott社を参照のこと)。
【００６３】
配列同一性及び配列類似性の％決定に適した好ましいアルゴリズムは、BLAST及びBLAST 2.0 アルゴリズムを含む。Altachulら、Nuc. Acids Res.、25:3389-3402 (1977)；及び、Altschulら、J. Mol. Biol.、215:403-410 (1990)参照。BLAST及びBLAST 2.0を、本願明細書に説明したパラメータと共に使用し、本発明の核酸及びタンパク質の配列同一性％を決定する。BLAST解析を実行するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)により公に入手可能である。このアルゴリズムは、最初にクエリー配列中の長さWの短いワードを同定することにより、高スコア配列対(HSP)を同定することに関し、これは、データベース配列中の同じ長さのワードと並置した場合に、いくつかの正値閾値スコアTにマッチするか又はこれを満足するかのいずれかである。Tは隣接ワードスコア閾値と称される(Altschulら、前掲)。これらの最初の隣接ワードのヒットは、それらを含むより長いHSPを発見するための検索を開始するための種として働く。ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加し得る限りは、各配列に沿って両方向へと伸びる。累積スコアは、例えば、ヌクレオチド配列については、パラメータM(マッチした残基対に関する報償(reward)スコア；常に＞0)及びN(ミスマッチ残基に関するペナルティースコア；常に＜0)を用いて算出される。アミノ酸配列に関して、累積スコアを計算するために、スコア行列が使用される。累積アラインメントスコアが、その最大到達値から量Xだけ減少した場合；1個又は複数の負のスコア化残基アラインメントの蓄積により、累積スコアがゼロ又はそれ以下になった場合；又は、いずれかの配列の末端に到達した場合には、各方向のワードヒットの伸長は停止される。BLASTアルゴリズムパラメータであるW、T及びXは、アラインメントの感度及びスピードを決定する。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列について)は、デフォルトとしてワード長(W)11、期待値(E)10、M=5、N=-4、並びに両鎖についての比較を用いる。アミノ酸配列については、BLASTPプログラムは、デフォルトとしてワード長(W)3、期待値(E)10、並びにBLOSUM62スコア化マトリックス(Henikoff及びHenikoff、Proc. Natl Acad. Sci USA、89:10915-919 (1989)参照)アラインメント(B)50、期待値(E)10、M=5、N=-4、及び両鎖の比較を用いる。
【００６４】
BLASTアルゴリズムは、ふたつの配列間の類似性の統計解析も行う(例えば、Karlin及びAltschul、Proc. Natl Acad. Sci. USA、90:5873-5787 (1993)参照)。BLASTアルゴリズムにより提供された類似性のひとつの測定値は、最小和確率(P(N))であり、これはふたつのヌクレオチド又はアミノ酸配列間のマッチが偶然発生する確率の指標を提供する。例えば、被験核酸を参照核酸と比較し最小和確率が約0.2未満、より好ましくは約0.01未満、及び最も好ましくは約0.001未満であるならば、核酸は、参照配列と類似していると見なされる。対数値は、例えば、5、10、20、30、40、40、70、90、110、150、170など大きい負数であっても良い。
【００６５】
ふたつの核酸配列又はポリペプチドが実質的に同じであることの指標は、以下に説明するように、第一の核酸によりコードされたポリペプチドが、第二の核酸によりコードされたポリペプチドに対して生じた抗体と免疫学的に交差反応することである。従って、例えば、ふたつのポリペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合、ポリペプチドは、典型的には第二のポリペプチドと実質的に同じである。ふたつの核酸配列が実質的に同じであることの別の指標は、以下に説明するように、ふたつの分子又はそれらの相補体が、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。ふたつの核酸配列が実質的に同じであることの更に別の指標は、同じプライマーを使用し、これらの配列を増幅することができることである。
【００６６】
「宿主細胞」は、天然の細胞、又は発現ベクターを含み及び発現ベクターの複製もしくは発現を支援する形質転換された細胞である。宿主細胞は、培養された細胞、外植片、in vivoの細胞などであることができる。宿主細胞は、E. coliのような原核細胞、又は酵母、昆虫、両生類又は哺乳類細胞のような真核細胞、例えばCHO、HeLaなどであることができる(例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)カタログ又はウェブサイトwww.atcc.org参照)。
【００６７】
用語「単離された」、「精製された」又は「生物学的に純粋」は、その未変性の状態で認められるような通常それに付随する成分を実質的に又は本質的に含まない物質を意味する。純度及び等質性は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィーのような分析化学技術を用いて決定される。調製物中に存在する主要な種であるタンパク質又は核酸は、実質的に精製されている。特に、単離された核酸は、天然には遺伝子の側方にあり及びこの遺伝子によりコードされたタンパク質以外のタンパク質をコードしている一部のオープンリーディングフレームから分離されている。一部の態様において用語「精製された」は、典型的には電気泳動ゲルにおいて本質的に1本のバンドを生じる核酸又はタンパク質を意味する。好ましくは、核酸又はタンパク質が、少なくとも85％、より好ましくは少なくとも純度95％、最も好ましくは少なくとも純度99％であることを意味する。別の態様における「純度」又は「精製」は、精製される組成物から少なくとも1種の夾雑物を除去することを意味する。この意味において、精製は、精製された化合物が均質、例えば純度100％であることは必要としない。
【００６８】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、本願明細書において互換性をもって使用され、アミノ酸残基のポリマーを意味する。これらの用語は、天然のアミノ酸ポリマー、修飾された残基を含む天然のアミノ酸ポリマー、及び非天然のアミノ酸ポリマーに加え、少なくとも1種のアミノ酸残基が対応する天然のアミノ酸の人工化学的擬態であるアミノ酸ポリマーに適用される。
【００６９】
用語「アミノ酸」は、天然の又は合成のアミノ酸、アミノ酸アナログ、及びアミノ酸擬態を包含している。天然のアミノ酸は、遺伝暗号によりコードされたものに加え、後に修飾されたそれらのアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸及びO-ホスホセリンなどである。アミノ酸アナログは、天然のアミノ酸と基本的化学構造、例えば、水素、カルボキシル基、アミノ基又はR基に結合したα炭素を共有する化合物、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを含む。このようなアナログは、修飾されたR基(例えば、ノルロイシン)又は修飾されたペプチド骨格を有することができるが、一部の基本的化学構造は天然のアミノ酸と共有している。アミノ酸擬態は、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有するが、天然のアミノ酸と同様に機能する化学的化合物を含む。
【００７０】
アミノ酸は、本願明細書において、一般に知られている三文字表記、又はIUPAC-IUB生化学命名委員会が推奨する一文字表記のいずれかにより表わすことができる。ヌクレオチドも同様に、通常受け入れられている一文字コードで表わすことができる。
【００７１】
「保存的に修飾された変種」は、アミノ酸配列又は核酸配列に適用される。特定の核酸配列について、保存的に修飾された変種は、同じもしくは本質的に同じアミノ酸配列をコードしている核酸、又は核酸がアミノ酸配列をコードしていない場合には、例えば天然の隣接配列のような本質的に同じ配列もしくは関連した配列を意味する。遺伝暗号の縮重のために、多数の機能的に同じ核酸が、ほとんどのタンパク質をコードしている。例えば、コドンGCA、GCC、GCG及びGCUは全て、アミノ酸アラニンをコードしている。従って、アラニンがコドンにより特定される各位置において、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、説明された対応するコドンの別のものと交換することができる。このような核酸変種は、「サイレント変種」と称され、これは保存的に修飾された変種の一種である。本願明細書においてポリペプチドをコードしている各核酸配列は、その核酸のサイレント変種も説明している。当業者は、ある状況において、核酸の各コドン(通常メチオニンの唯一のコドンであるAUG、及び通常トリプトファンの唯一のコドンであるTGGを除く)は修飾され、機能的に同一の分子を得ることができることを認めるであろう。従って、ポリペプチドをコードしている核酸のサイレント変種は、発現産物に関して説明された配列において暗示されるが、実際のプローブ配列についてではない。
【００７２】
アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされた配列内の単独のアミノ酸又は小さい割合のアミノ酸が交換、付加又は欠失された核酸、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質配列の個々の置換、欠失又は付加は、その変更が化学的に類似したアミノ酸によるアミノ酸置換を生じるような「保存的に修飾された変種」であることを認めるであろう。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当該技術分野において周知である。このような保存的に修飾された変種は、本発明の多型変種、種間相同体、及びアレルに加えられ、これらを排除するものではない。典型的保存的置換は、互いに、以下のものである：1)アラニン(A)、グリシン(G)；2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)；3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q)；4)アルギニン(R)、リシン(K)；5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V)；6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)；7)セリン(S)、トレオニン(T)；及び、8)システイン(C)、メチオニン(M)。例えば、Creightonの「タンパク質：構造及び分子特性」Freeman(1984)を参照のこと。
【００７３】
ポリペプチド構造のような巨大分子構造は、様々なレベルの組織化について説明することができる。例えば、Albertsらの「分子細胞生物学」(2001)(第4版)、Garland；及び、Cantor及びSchimmelの「生物物理化学I：生物学的巨大分子のコンホメーション」(1980) Freemanを参照のこと。「一次構造」は、特定のペプチドのアミノ酸配列を意味する。「二次構造」は、ポリペプチド内に局所的に並べられた三次元構造を意味する。これらの構造は、ドメインとして一般に知られており、これはポリペプチドの小型のユニットを形成することが多いポリペプチドの部分であり、かつ典型的には約25〜500個のアミノ酸長である。典型的ドメインは、β-シート及びα-ヘリックスのひと配列のような、組織化がより少ない区域で構成される。「三次構造」は、ポリペプチドモノマーの完全な三次元構造を意味する。「四次構造」は、通常独立した三次元ユニットの非共有的会合により形成された三次元構造を意味する。異方性の用語は、エネルギー用語としても知られている。
【００７４】
本願明細書において使用される「核酸」又は「オリゴヌクレオチド」又は「ポリヌクレオチド」又は文法的同等物は、互いに共有結合された少なくとも2個のヌクレオチドを意味する。オリゴヌクレオチドは、典型的には約5、6、7、8、9、10、12、15、25、30、40、50個又はそれよりも多いヌクレオチド長で、最大約100個のヌクレオチド長である。核酸及びポリヌクレオチドは、より長い長さ、例えば200、300、500、1000、2000、3000、5000、7000、10,000個等を含む、ポリマーである。本発明の核酸は、一般にホスホジエステル結合を含むであろう。場合によっては、代わりの骨格を含み得る核酸アナログが含まれ、これは例えばホスホルアミデート(Beaucageら、Tetrahedron、49:1925-963 (1993)、及びその参考文献；Letsinger、J. Ore. Chem.、35:3800-803 (1970)；Sprinzlら、Eur. J. Biochem.、81:579-589 (1977)；Letsingerら、Nucl. Acids Res.、14:3487-499 (1986)；Sawaiら、Chem. Lett.、805 (1984)；Letsingerら、J. Am. Chem. Soc.、110:4470-471 (1988)；及び、Pauwelsら、Chemica Scripta、26:141-149 (1986))；ホスホロチオエート(Magら、Nucleic Acids Res.、19:1437-441 (1991)；及び、米国特許第5,644,048号)；ホスホロジチオエート(Brillら、J. Am. Chem. Soc、111:2321-322 (1989))；O-メチルホスホロアミダイト連結(Eckstein、「オリゴヌクレオチド及びアナログ：実践法」、Oxford Univ. Press、(1992)参照)；及び、ペプチド核酸骨格及び連結(Egholm、J. Am. Chem. Soc.、114:1895-897 (1992)；Meierら、Chem Int. Ed. Engl.、31:1008-010(1992)；Nielsen、Nature、365:566-568 (1993)；Carlssonら、Nature、380:207 (1996))がある。他のアナログ核酸は、正帯電した骨格(Denpcyら、Proc. Natl Acad. Sci. USA、92:6097-101 (1995))；非イオン性骨格(米国特許第5,386,023号；第5,637,684号；第5,602,240号；第5,216,141号；及び第4,469,863号；Kiedrowshiら、Angew. Chem. Intl. Ed. English、30:423-426 (1991)；Letsingerら、J. Am. Chem. Soc.、110:4470-471 (1988)；Jungら、Nucleoside and Nucleotide、13:1597-xxx (1994)；Sanghvi及びCook (1994)、「アンチセンス研究における糖修飾」、ACSシンポジウムシリーズ580、2-3章；Mesmaekerら、Bioorganic and Medicinal Chem. Lett.、4:395-398 (1994)；Jeffsら、J. Biomolecular NMR、34:17 (1994)；Hornら、Tetrahedron Lett.、37:743-xxx (1996))；及び、非リボース骨格(米国特許第5,235,033号及び第5,034,506号、並びにSanghvi及びCook (1994)、「アンチセンス研究における糖修飾」、ACSシンポジウムシリーズ580、6-7章参照)。1個又は複数の炭素環式糖を含む核酸も企図されている。Jenkins及びTurner、Chem. Soc. Rev.、24:169-176 (1995)参照。いくつかの核酸アナログは、Rawls(35頁、1997年6月2日)、C&E Newsに説明されている。例えばこのような分子の生理的環境における、又はバイオチップ上のプローブとしての安定性及び半減期を増大するために、リボース-リン酸骨格の修飾を行うことができる。天然の核酸及びアナログの混合物を作成することができ；あるいは、異なる核酸アナログの混合物、並びに天然の核酸及びアナログの混合物を作成してもよい。
【００７５】
特に好ましいのは、ペプチド核酸アナログを含むペプチド核酸(PNA)である。これらの骨格は、天然の核酸の高度に帯電したホスホジエステル骨格とは対照的に、中性の条件下で実質的に非-イオン性である。PNA骨格は、典型的には、改善されたハイブリダイゼーション速度論を示し、ミスマッチのために完全にマッチした塩基対に対し、融解温度(Tm)のより大きい変化を示す。DNA及びRNAは、典型的には、内部ミスマッチのために、Tmの2〜4℃の低下を示す。非-イオン性PNA骨格では、この低下は、7〜9℃に近い。それらの非-イオン性の性質のために、これらのポリマーのハイブリダイゼーションは、塩濃度に対しかなり非反応性である。加えてPNAは、細胞酵素によって容易には分解されず、より安定することができる。
【００７６】
核酸は、一本鎖又は二本鎖であるか、もしくは、二本鎖又は一本鎖化された両配列の一部を含むことができる。当業者に理解されるように、一本鎖の既述は、相補鎖の配列も定義し；従って、本願明細書に説明された配列は、その配列の相補体も提供する。核酸は、ゲノム及びcDNAの両方のDNA、RNA又はハイブリッドであることができ、ここで核酸は、デオキシリボ-及びリボ-ヌクレオチドの組合せ、並びにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニンなどを含む塩基の組合せを含むことができる。「転写産物」は、典型的には、天然のRNA、例えばプレ-mRNA、hnRNA、又はmRNAを意味する。本願明細書で使用される用語「ヌクレオシド」は、ヌクレオチド並びにヌクレオシド及びヌクレオチドのアナログを含み、かつアミノ修飾したヌクレオシドのような修飾されたヌクレオシドを含む。加えて「ヌクレオシド」は、非天然のアナログ構造を含む。従って、例えば各々塩基を含むペプチド核酸の個々のユニットは、本願明細書においてヌクレオシドと称される。
【００７７】
「標識」又は「検出可能な部分」は、分光光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、化学的手段又は他の物理的手段により検出可能な組成物である。直接的又は間接的方法が企図されている。例えば有用な標識は、32P、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素(例えば、ELISAにおいて通常使用されるものなど)、ビオチン、ジゴキシゲニン、もしくはハプテン及びタンパク質、又は例えばペプチドへの放射標識の組込みによる、もしくはペプチドに特異的に反応する抗体の検出のために使用されるような、検出可能に作成された他の実体を含む。この標識は、膀胱癌核酸、タンパク質、及び抗体に組込むことができる。抗体を標識に複合する方法は周知であり、Hunterら、Nature、144:945-946 (1962)；Davidら、Biochemistry、13:1014-021 (l9l4)；Painら、J. Immunol. Meth.、40:219-230 (1981)；及び、Nygren、J. Histochem. and Cytochem.、30:407-412 (1982)に説明された方法を含む。
【００７８】
「エフェクター」又は「エフェクター部分」又は「エフェクター成分」は、標的、例えば抗体へ、リンカーもしくは化学結合により共有的、又はイオン結合、ファンデルワールス結合、静電結合もしくは水素結合により非共有的のいずれかで結合された(又は連結、又は複合された)分子である。「エフェクター」は、様々な分子であり、これは例えば、放射性化合物；蛍光化合物；酵素又は基質；エピトープタグのようなタグ；毒素；活性化可能な部分；化学療法剤；リパーゼ；抗生物質；例えばβ線のような「硬線(hard)」を放出する放射性同位元素；又は、誘引部分を含む検出部分を含む。
【００７９】
「標識された核酸プローブ又はオリゴヌクレオチド」は、標識へ、リンカーもしくは化学結合により共有的、又はイオン結合、ファンデルワールス結合、静電結合もしくは水素結合により非共有的に結合されるものであり、その結果、プローブの存在は、プローブに結合した標識の存在を検出することにより検出することができる。あるいは、高親和性相互作用を用いる方法は、結合パートナー対の一方が、他方、例えばビオチン、ストレプトアビジンなどへ結合する場合に同じ結果を達成することができる。
【００８０】
本願明細書において使用される「核酸プローブ又はオリゴヌクレオチド」は、1種又は複数種の化学結合を介し、通常相補的塩基対形成を介し、通常水素結合形成を介し、相補的配列の標的核酸に結合することが可能な核酸として定義される。本願明細書において使用されるプローブは、天然の塩基(すなわち、A、G、C、又はT)又は修飾された塩基(7-デアザグアノシン、イノシンなど)を含むことができる。加えて、プローブ中の塩基は、ハイブリダイゼーションを機能的に妨害しない限りは、ホスホジエステル結合以外の連結により結合することができる。従って例えばプローブは、構成塩基が、ホスホジエステル連結よりもむしろペプチド結合により結合されているペプチド核酸であることができる。プローブは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに応じて、プローブ配列と完全な相補性を欠いている標的配列に結合することができる。これらのプローブは、好ましくは同位元素、発色団、発光体、色素原により直接標識されるか、もしくはそれにストレプトアビジン連結した標識が結合し得るビオチンなどにより間接的に標識される。プローブの存在又は非存在をアッセイすることにより、選択配列又は部分配列の存在又は非存在を検出することができる。診断又は予後判定は、ゲノムレベル、又はRNAもしくはタンパク質発現レベルを基にしている。
【００８１】
用語「組換え体」は、例えば、細胞、又は核酸、タンパク質、もしくはベクターに関して使用される場合、細胞、核酸、タンパク質又はベクターが、異種核酸又はタンパク質の導入もしくは未変性の核酸又はタンパク質の変更により修飾されること、もしくは細胞がそのように修飾された細胞に由来していることを意味する。従って例えば組換え細胞は、その細胞の未変性(非-組換え)型においては認められない遺伝子を発現するか、もしくはさもなければ異常に発現されるか、過小発現されるか、又は全く発現されないような未変性の遺伝子を発現する。本願明細書において用語「組換え核酸」は、概して、天然には通常認められない形の、例えばポリメラーゼ及びエンドヌクレアーゼを使用する核酸の操作により、in vitroにおいて当初形成された核酸を意味する。この方法において、異なる配列の機能可能な連結が実現される。従って線状の形の単離された核酸、又は通常は結合されないDNA分子のライゲーションによりin vitroにおいて形成された発現ベクターは、両方とも本発明の目的のための組換え体とみなされる。一旦組換え核酸が作成されかつ宿主細胞又は生物に再導入されるならば、非-組換え的に、例えばin vitro操作よりもむしろ宿主細胞のin vivo細胞機構を用いて、複製するが；しかし、一旦組換え的に作成されたが、引き続きは非-組換え的に複製されるこのような核酸も、依然本発明の目的のための組換え体と見なされることは理解される。同様に「組換えタンパク質」は、組換え技術を用い、例えば前述のような組換え核酸の発現により、作成されたタンパク質である。
【００８２】
用語「異種」は、核酸の一部に関して使用される場合、その核酸が、自然状態では互いに同じ関係では通常認められないような2種又はそれよりも多い部分配列を含むことを意味する。例えば核酸は、典型的には組換え的に作出され、例えば、新規機能性核酸を作成するために配置された無関係の遺伝子から、2種又はそれより多い配列を有し、例としてひとつの給源からプロモーターを及び別の給源からコード領域を有する。同様に、異種タンパク質は、自然において互いにそれと同じ関係では認められない2種又はそれよりも多い部分配列を意味することが多い(例えば、融合タンパク質)。
【００８３】
「プロモーター」は、核酸の転写を指示する核酸制御配列のアレイと定義される。本願明細書において使用されるように、プロモーターは、転写開始部位の近傍の必要な核酸配列、例えばポリメラーゼII型プロモーターの場合、TATAエレメントを含む。プロモーターは同じく、任意に遠位エンハンサー又はリプレッサーエレメントを含み、これらは、転写開始部位からの塩基対が数千にも達するように位置することができる。「構成的」プロモーターは、ほとんどの環境条件及び発生条件下で活性があるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、環境的又は発生的制御下で活性があるプロモーターである。用語「機能的に連結した」は、核酸発現制御配列(例えばプロモーター、又は転写因子結合部位のアレイ)と第二の核酸配列の間の機能性連結を意味し、ここでこの発現制御配列は、第二の配列に相当する核酸の転写を指示する。
【００８４】
「発現ベクター」は、宿主細胞において特定の核酸の転写を可能にする、一連の特定化された核酸エレメントを伴う、組換え的又は合成的に作成された核酸構築体である。発現ベクターは、プラスミド、ウイルス、又は核酸断片の一部であることができる。典型的には、発現ベクターは、プロモーターに機能的に連結されている転写されるべき核酸を含む。
【００８５】
語句「選択的(又は特異的)にハイブリダイズする」とは、配列が複雑な混合物(例えば、総細胞又はライブラリーDNAもしくはRNA)中に存在する場合に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、分子が特定のヌクレオチド配列へのみ結合、二重鎖化又はハイブリダイズすることを意味する。
【００８６】
語句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、その条件下でプローブが、典型的には核酸の複雑な混合物中でその標的部分配列にはハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしないような条件を意味する。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、かつ異なる環境においては異なるであろう。より長い配列は、より高温で特異的にハイブリダイズする。核酸ハイブリダイゼーションに関する広範な指針は、TijssenのHybridization with Nucleic Probes (Techniques in Biochemistry and Molecular Biology)、Elsevier社の「ハイブリダイゼーションの原理及び核酸アッセイ戦略の概観」(1993年)に見られる。一般に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度pHにおいて、特定の配列についてサーマル融解温度(Tm)よりも約5〜10℃低いように選択される。Tmは、標的に相補的なプローブの50％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度(所定のイオン強度、pH、及び核酸濃度下)である(標的配列は、Tmで過剰に存在するので、プローブの50％は平衡状態で占拠されている)。ストリンジェント条件は、塩濃度が約1.0M未満のナトリウムイオンである条件であり、典型的にはpH7.0〜8.3で約0.01〜1.0Mナトリウムイオン濃度(又は他の塩)であり、その温度は、短いプローブ(例えば、10〜50ヌクレオチド)については低くとも約30℃であり、長いプローブ(例えば、50ヌクレオチドより大きい)については低くとも約60℃である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドのような脱安定化剤の添加により実現することもできる。選択的又は特異的ハイブリダイゼーションについて、正のシグナルは、バックグラウンドの少なくとも2倍であり、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの約10倍である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、下記であることができる：50％ホルムアミド、5x SSC、及び1％SDS、42℃でのインキュベーション、又は5x SSC、1％SDS、65℃でのインキュベーション、並びに0.2x SSC、及び0.1％SDS、65℃での洗浄。PCRについては、温度約36℃が、低ストリンジェンシーでの増幅のための典型であるが、アニーリング温度は、プライマー長に応じて、約32〜48℃を変動することができる。高ストリンジェンシーでのPCR増幅について、温度約62℃が典型であるが、高ストリンジェンシーでのアニーリング温度は、プライマー長及び特異性に応じて、約5O℃〜約65℃の範囲であることができる。高及び低の両ストリンジェンシー増幅に関する典型的サイクル条件は、変性相90℃〜95℃で30秒〜120秒、アニーリング相の30秒〜120秒の維持、及び伸長相の約72℃での1〜2分間を含む。低及び高ストリンジェンシー増幅反応に関するプロトコール及び指針は、例えばInnisらのPCR Protocols, A Guide to Methods and Applications(1990年)、Achademic Press社に提供されている。
【００８７】
ストリンジェントな条件下では互いにハイブリダイズしない核酸は、これらがコードしているポリペプチドが実質的に同じである場合は、依然実質的に同じである。これは、例えば核酸コピーが遺伝暗号により許容される最大のコドン縮重を用いて作成される場合に起こる。このような場合、核酸は、典型的には中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」の例は、40％ホルムアミド、1M NaCl、1％SDSの緩衝液中、37℃でのハイブリダイゼーション、及び1x SSC、45℃での洗浄を含む。正のハイブリダイゼーションは、バックグラウンドの少なくとも約2倍である。代わりのハイブリダイゼーション及び洗浄条件を利用し、同様のストリンジェンシーの条件を提供することができる。ハイブリダイゼーションパラメータを決定するための追加のガイドラインは、多くの参考文献において提供されており、例えばAusubelらのCurrent Protocols in Molecular Biology、Lippincott社がある。
【００８８】
膀胱癌タンパク質の活性を変調する化合物を試験するアッセイに関連した語句「機能的作用」は、膀胱癌タンパク質又は核酸の間接的又は直接的影響下にあるパラメータ、例えば、膀胱癌を退縮する能力などの機能的、生理的又は化学的作用の決定を含む。これは、リガンド結合活性；軟寒天上での細胞増殖；足場依存性；成長の接触阻害及び密度限界；細胞生存度；細胞増殖；細胞の形質転換；増殖因子又は血清依存性；腫瘍特異マーカーレベル；マトリゲルへの浸潤；in vivoにおける腫瘍成長及び転移；転移を受けている細胞におけるmRNA及びタンパク質の発現、並びに膀胱癌細胞の他の特徴を含む。「機能的作用」は、in vitro、in vivo、及びex vivoの活性を含む。
【００８９】
「機能的作用の決定」は、膀胱癌タンパク質配列の間接的又は直接的影響下にあるパラメータ、例えば機能的、酵素的、生理的及び化学的作用を増加又は減少する化合物のアッセイを意味する。このような機能的作用は、当業者に公知の多くの手段により測定することができ：例えばタンパク質の分光光度学的特性(例えば、蛍光、吸光度、屈折率)、流体力学的特性(例えば、形状)、クロマトグラフィー的特性、又は溶解度特性の変化、膀胱癌タンパク質の誘導マーカーもしくは転写活性化の測定；例えば抗体又は他のリガンドへの結合のような、結合活性の測定又は結合アッセイ；並びに、細胞増殖又は代謝の測定などである。化合物の膀胱癌への機能的作用を決定することは、in vitroアッセイのような、膀胱癌アッセイを用いて行うこともでき、これは例えば軟寒天上での細胞増殖；足場依存性；成長の接触阻害及び密度限界；細胞増殖；細胞の形質転換；増殖因子又は血清依存性；腫瘍特異マーカーレベル；マトリゲルへの浸潤；in vivoにおける腫瘍成長及び転移；転移を受けている細胞におけるmRNA及びタンパク質の発現、並びに膀胱癌細胞の他の特徴である。機能的作用は、多くの手段により評価することができ、例えば、形態学的特徴の変化の定量的又は定性的測定のための鏡検、膀胱癌-関連配列に関するRNA又はタンパク質レベルの変化の測定、RNA安定性の測定、例えば、化学発光、蛍光、比色反応、抗体結合、誘導マーカー、及びリガンド結合アッセイによる、下流又はレポーター遺伝子の発現の同定(CAT、ルシフェラーゼ、β-gal、GFPなど)がある。
【００９０】
膀胱癌ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列の「インヒビター」、「アクチベーター」及び「モジュレーター」は、膀胱癌ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列のin vitro及びin vivoアッセイを用いて同定された分子又は化合物を活性化、阻害又は変調することを意味するように使用される。インヒビターは、例えば、膀胱癌タンパク質に、結合し、部分的に又は全体的に活性をブロックし、活性化を減少し、防止し、遅延し、失活し、脱感作し、又は活性もしくは発現をダウンレギュレーションする化合物、例えばアンタゴニストである。アンチセンス核酸は、タンパク質の発現及び引き続きの機能を阻害するように見えることがある。「アクチベーター」は、膀胱癌タンパク質活性を増大、開放、活性化、促進、活性化の増強、増感、作動、又はアップレギュレーションする化合物である。インヒビター、アクチベーター、又はモジュレーターは、天然の及び合成のリガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、抗体、小化学分子などに加え、例えば変更された活性を伴う型のような、膀胱癌タンパク質の遺伝的に修飾された型も含む。インヒビター及びアクチベーターのためのこのようなアッセイは、前述のような、例えば、膀胱癌タンパク質のin vitro、細胞内、又は細胞膜における発現、推定モジュレーター化合物の適用、並びにその後の活性に対する機能的作用の決定を含む。膀胱癌のアクチベーター及びインヒビターは、膀胱癌細胞を被験化合物と共にインキュベーションし、かつ1種又は複数の膀胱癌タンパク質、例えば1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50種又はそれよりも多い膀胱癌タンパク質、例えば表1A-13に示された配列によりコードされた膀胱癌タンパク質の発現の増加又は減少を決定することにより、同定することもできる。
【００９１】
可能性のあるアクチベーター、インヒビター、又はモジュレーターで処理される膀胱癌タンパク質を含有する試料又はアッセイは、阻害の程度を試験するために、インヒビター、アクチベーター、又はモジュレーターを伴わない対照試料と比較される。対照試料(インヒビターで処理されない)は、100％の相対タンパク質活性値に割当てられる。ポリペプチドの阻害は、その活性値が対照に対して約80％、好ましくは約50％、より好ましくは約25〜0％である場合に、実現される。膀胱癌ポリペプチドの活性化は、対照(アクチベーターで処理されない)に対する活性値が、約110％、より好ましくは約150％、更に好ましくは約200〜500％(すなわち、対照に対して2〜5倍高い)、より好ましくは約1000〜3000％高い場合に、実現される。
【００９２】
語句「細胞成長の変化」は、例えば細胞生存度、細胞増殖巣の形成、足場非依存性、半固形又は軟寒天成長、成長の接触阻害及び密度限度の変化、増殖因子又は血清の必要要件の喪失、細胞形態の変化、不死化の獲得又は喪失、腫瘍特異マーカーの獲得又は喪失、適当な動物宿主に注入した場合の腫瘍の形成能又は抑制能、及び／又は細胞の不死化のような、in vitro又はin vivoにおける細胞成長及び増殖の特性の変化を意味する。例えば、FreshneyのCulture of Animal Cells a Manual of Basic Technique、231-241頁(第3版、1994年)を参照のこと。
【００９３】
「腫瘍細胞」は、腫瘍内の前癌性、癌性、及び正常な細胞を意味する。
「癌細胞」、「形質転換された」細胞又は組織培養物中の「形質転換」は、新たな遺伝物質の取込みに必ずしも関与していない自然発生的又は誘導された表現型の変化を意味する。形質転換は、トランスフォーミングウイルスの感染及び新規ゲノムDNAの組込み、又は外来性DNAの取込みから生じるが、これは自然発生的に又は発癌物質への曝露後に生じることもあり、これにより内因性遺伝子が突然変異される。形質転換は、細胞の不死化、異常な成長制御、非形態学的変化、及び／又は悪性度のような、表現型の変化にも関連する。Freshney、Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique、(第4版、2000年)を参照のこと。
【００９４】
「抗体」は、抗原に特異的に結合しかつ認識する、免疫グロブリン遺伝子又はそれらの断片のフレームワーク領域を含むポリペプチドを意味する。認められた免疫グロブリン遺伝子は、κ、λ、α、γ、δ、ε、及びμ定常領域遺伝子に加え、無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖は、κ又はλのいずれかに分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ又はεに分類され、これらは次に各々、免疫グロブリンクラスであるIgG、IgM、IgA、IgD、及びIgEを定義する。典型的には、抗体の抗原-結合領域又はその機能性同等物は、結合の特異性及び親和性において最も重要であろう。PaulのFundamental Immunology、(1999年編集、第4版)、Raven社を参照のこと。
【００９５】
例証的免疫グロブリン(抗体)構造単位は、四量体を含む。各四量体は、ポリペプチド鎖のふたつの同一対で構成され、各対は、1個の「軽」鎖(約25kD)及び1個の「重」鎖(約50〜70kD)を有する。各鎖のN-末端は、抗原認識に主に寄与する約100〜110個又はそれよりも多いアミノ酸の可変領域を定義する。用語可変軽鎖(VL)及び可変重鎖(VH)は、各々、これらの軽鎖及び重鎖を意味する。
【００９６】
抗体は、例えば完全な免疫グロブリンとして、又は様々なペプチダーゼでの消化により作出された多くの良く特徴付けられた断片として存在する。従って、例えばペプシンは、ヒンジ領域のジスルフィド連結下側で抗体を消化し、F(ab')2を形成し、これはそれ自身ジスルフィド結合によりVH-CH1に結合した軽鎖であるFab二量体である。このF(ab')2は、穏やかな条件下で還元され、ヒンジ領域のジスルフィド連結を破壊し、これによりF(ab')2二量体をFab'単量体へと転換する。このFab'単量体は、本質的にヒンジ領域の一部を伴うFabである。PaulのFundamental Immunology、(1999年編集、第3版)、Raven社参照。様々な抗体断片が、完全な抗体の消化に関して定義されるが、このような断片は、化学的又は組換えDNA法の使用のいずれかによりde novo合成され得る。従って、本願明細書において使用される用語抗体は、抗体全体の修飾により作成される抗体断片か、又は組換えDNA法を使用しde novoに合成される抗体断片(例えば単鎖Fv)又はファージディスプレイライブラリーを用いて同定された抗体断片のいずれかも含む。例えば、McCaffertyら、Nature、348:552-554 (1990)参照。
【００９７】
抗体、例えば組換え、モノクローナル又はポリクローナル抗体の調製については、多くの技術を使用することができる。例えば、Kohler及びMilstein、Nature、256:495-497 (1975)；Kozborら、Immunology Today、4:72 (1983)；Coleら、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Reisfeld and Sell、77-96頁、(1985)、Liss社；Coligan、Current Protocols in Immunology、(1991) Lippincott社；Harlow及びLane、Antibodies, A Laboratory Manual、(1988) CSH Press社；及び、Goding、Monoclonal Antibodies: Principles and Practice、(第2版、1986) Academic Press社を参照のこと。単鎖抗体の作成の技術(米国特許第4,946,778号)は、本発明のポリペプチドに対する抗体作成に適合させることができる。更にトランスジェニックマウス、又は他の哺乳類のようなその他の生物を用い、ヒト化抗体を発現することができる。あるいは、ファージディスプレイ技術を用い、選択された抗原へ特異的に結合する抗体及びヘテロマーFab断片を同定することができる。例えば、McCaffertyら、Nature、348:552-554 (1990)；Marksら、Biotechnology、10:779-783 (1992)を参照のこと。
【００９８】
「キメラ抗体」は、(a)定常領域、又はその一部が、変更、置換又は交換され、その結果この抗原結合部位(可変領域)が、異なる又は変更されたクラスの定常領域、エフェクター機能及び／もしくは種、又はキメラ抗体に新たな特性を付与する全体が異なる分子、例えば酵素、毒素、ホルモン、増殖因子、薬物などに連結されているか；又は、(b)可変領域、又はその一部が、異なる又は変更された抗原特異性を有する可変領域と変更、置換又は交換されているような、抗体分子である。
【００９９】
膀胱癌-関連配列の同定
ひとつの局面において、遺伝子の発現レベルは、発現プロファイルを提供するために、診断情報が望まれる様々な患者試料において決定される。特定の試料の発現プロファイルは、本質的にその試料の状態の「フィンガープリント」であり；ふたつの状態は、同様に発現された特定の遺伝子を有する一方で、多くの遺伝子の評価は、細胞の状態を特徴とする遺伝子発現プロファイルの同時作成を可能にする。すなわち、正常組織(例えば正常膀胱又は他の組織)は、膀胱の癌性又は転移性癌性組織から識別されるか、もしくは膀胱癌組織又は転移性膀胱癌組織は、生存している癌患者の膀胱及び他の組織の試料と比較することができる。わかっている様々な膀胱癌状態において組織の発現プロファイルを比較することにより、これらの状態の各々においてどの遺伝子が重要であるか(遺伝子のアップ-及びダウン-レギュレーションの両方を含む)に関する情報が得られる。
【０１００】
膀胱癌、対、非-膀胱癌組織において差次的に発現された配列の同定は、多くの方法でのこの情報の使用を可能にする。例えば、特定の治療投薬計画は、特定の患者において、化学治療薬は、膀胱癌をダウンレギュレーションし、その結果、腫瘍成長又は再発をダウンレギュレーションするように作用するかどうか；もしくは、化学療法又は放射線療法は、特定の標的の発現を誘導するかどうかについて評価される。同様に、診断及び治療の転帰は、患者試料を公知の発現プロファイルと比較することにより、行う又は確認することができる。転移性組織は、組織における膀胱癌の病期又は原発性腫瘍の起源を決定するために、分析することもできる。更に、これらの遺伝子発現プロファイル(又は個々の遺伝子)は、特定の発現プロファイルを模倣又は変更するような薬物候補の肉眼によるスクリーニングを可能にし；例えば、スクリーニングは、膀胱癌発現プロファイルを抑制する薬物について行うことができる。これは、重要な膀胱癌遺伝子のセットを含むバイオチップの作成により行うことができ、その後これはこれらのスクリーニングにおいて使用することができる。これらの方法は、タンパク質ベースに適用することもでき；すなわち、膀胱癌タンパク質のタンパク質発現レベルは、診断目的又は候補物質のスクリーニングのために評価することができる。加えて、膀胱癌核酸配列は、アンチセンスもしくはインヒビトリー核酸、又は治療薬として投与される膀胱癌タンパク質(それらの抗体及び他のモジュレーターを含む)の投与を含む、遺伝子治療目的で投与することができる。
【０１０１】
従って、本発明は、本願明細書においては「膀胱癌配列」と称される、膀胱疾患又は癌において、正常組織及び／又は非悪性膀胱組織と比べ、差次的に発現される核酸配列及びタンパク質配列を提供する。以下に概説するように、膀胱癌配列は、膀胱癌においてアップレギュレーションされるもの(すなわち、より高いレベルで発現されるもの)に加え、ダウンレギュレーションされるもの(すなわち、より低いレベルで発現されるもの)を含む。好ましい態様において、膀胱癌配列は、ヒトに由来するが；しかし、当業者には理解されるように、他の生物由来の膀胱癌配列が、疾患及び薬物評価の動物モデルにおいて有用であり；従って、他の膀胱癌配列が、齧歯類(ラット、マウス、ハムスター、モルモットなど)、霊長類、家畜(ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマなどを含む)及びペット(イヌ、ネコなど)を含む哺乳類を含む脊椎動物から提供される。他の生物由来の膀胱癌配列は、下記に概説した技術を用いて得ることができる。
【０１０２】
膀胱癌配列は、核酸配列及びアミノ酸配列の両方を含み得る。膀胱癌核酸配列は、天然の核酸を検出する診断適用に加え、スクリーニング適用を含む、様々な適用において有用である。核酸プローブを含むバイオチップ、又は膀胱癌配列に対する選択されたプローブを伴うPCRマイクロタイタープレートを、作成することができる。
【０１０３】
膀胱癌配列は、本願明細書に概説した膀胱癌配列に対する実質的核酸及び／又はアミノ酸の配列相同性により最初に同定することができる。このような相同性は、核酸又はアミノ酸配列全体を基にすることができ、かつ一般に相同性プログラム又はハイブリダイゼーション条件のいずれかを用い、以下に概略されるように決定される。
【０１０４】
膀胱癌-関連配列の同定に関して、膀胱癌スクリーニングは、典型的には、例えば、正常組織、非悪性組織又は癌性組織、又は転移性疾患、対、非転移性組織を有する患者からの腫瘍組織試料において同定された遺伝子を比較することを含む。他の適当な組織比較は、膀胱癌試料の、肺、膀胱、消化器癌、卵巣などの他の癌からの転移性癌試料との比較を含む。膀胱癌の異なる病期、例えば生存者組織、薬物抵抗性状態、及び転移を受けている組織の試料が、核酸プローブを含むバイオチップに適用される。これらの試料は、適用可能であれば、最初にマイクロダイセクションされ、かつmRNA調製のために処理される。適当なバイオチップは、例えばAffymetrix社から市販されている。本願明細書に説明されたような遺伝子発現プロファイルが作成され、かつデータ解析される。
【０１０５】
ひとつの態様において、正常状態と疾患状態の間で発現の変化を示している遺伝子は、好ましくは正常な膀胱であるが、肺、心臓、脳、肝臓、膀胱、腎臓、筋肉、結腸、小腸、大腸、脾臓、骨及び胎盤を含むが、これらに限定されるものではない他の正常な組織で発現されている遺伝子と比較される。好ましい態様において、他の組織で有意な量発現される膀胱癌スクリーニング時に同定されたこれらの遺伝子は、本プロファイルから除かれるが、一部の態様においては、これは必要ではない。すなわち、薬物についてスクリーニングする場合、通常標的は疾患特異的であり、例えば重要な臓器では発現されないことが好まれる。
【０１０６】
好ましい態様において、膀胱癌配列は、膀胱癌においてアップレギュレーションされたものであり；すなわち、これらの遺伝子の発現は、非-癌性組織と比べ、膀胱癌組織においてより高い。本願明細書において使用される「アップ-レギュレーション」は、少なくとも約2倍の変化、好ましくは少なくとも約3倍の変化であることが多く、少なくとも約5倍又はそれ以上の変化が好ましい。本願明細書においてUniGeneクラスター識別番号及び寄託番号は、GenBank配列データベースに関するものであり、寄託番号の配列は、表現上本願明細書に参照として組入れられている。GenBankは、当該技術分野において公知であり、例えばBenson, DAらの論文(Nuc. Acids Res.、26:1-7 (1998))、及びhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/を参照のこと。配列は、例えば、European Molecular Biology Laboratory (EMBL)及び日本DNAデータベース(DDBJ)などの、他のデータベースにおいて入手することもできる。
【０１０７】
別の好ましい態様において、膀胱癌配列は、膀胱癌においてダウンレギュレーションされるものであり；すなわち、これらの遺伝子の発現は、非-癌性組織と比べ、膀胱癌組織においてより低い(例えば、表1A-13参照)。本願明細書において使用される「ダウン-レギュレーション」は、少なくとも約2倍の変化、好ましくは少なくとも約3倍の変化であり、少なくとも約5倍又はそれ以上の変化が好ましい。
【０１０８】
インフォマティクス
膀胱癌において過剰又は過小発現された遺伝子を同定する能力は、更に診断、治療、創薬、遺伝薬理学、タンパク質構造、バイオセンサー開発、及び他の関連分野において使用することができる、高分解能、高感度のデータセットを提供することができる。例えば、発現プロファイルは、膀胱癌患者の診断又は予後の評価に使用することができる。又は別の例として、細胞下(subcellar)毒性情報を作成し、薬物構造及び活性相関をより良く指示することができる。Anderson、「Pharmaceutical Proteomics: Targets, Mechanism, and Function」、IBC Proteomics会議に提出された論文(コロナド、CA(1998年6月11-12日))を参照。細胞下毒性情報は、化学曝露に対する可能性のある毒性作用及び恐らく忍容性のある曝露閾値を推定するための、生物学的センサー装置においても使用することができる(米国特許第5,811,231号参照)。同様の利点は、他の生体分子及び生体活性物質(例えば、核酸、糖質、脂質、薬物など)に関連したデータセットから生じる。
【０１０９】
従って、別の態様において、本発明は、アッセイデータの少なくとも1セットを含むデータベースを提供する。このデータベースに含まれるデータは、例えば、単独の又はライブラリー様式のいずれかのアレイ解析を用い獲得される。このデータベースは、データが維持されかつ伝達される形であることができるが、好ましくは電子データベースである。本発明の電子データベースは、例えば、パーソナルコンピュータのようなデータベースへ保存及びアクセスが可能であるいずれかの電子装置において維持することができるが、ワールドワイドウェブ(WWW)のような、広域ネットワーク上で配布されることが好ましい。
【０１１０】
ペプチド配列データを含むデータベースへの本項目の集中は、例証を明確にするためのみである。同様のデータベースを、本発明のアッセイを使用して得られたアッセイデータについて集成することができることは、明らかであろう。
【０１１１】
膀胱癌を罹患した生物学的試料から、様々な分子及び巨大分子種の相対的及び／又は絶対的な豊富さを同定および／または定量するため、例えば、本願明細書に説明された膀胱癌-関連配列を同定するための組成物及び方法は、豊富な情報を提供し、これは病態、疾病素因、薬物試験、治療的経過観察、遺伝子疾患の因果関係、免疫及び生理的状態の相関の同定などと関連することができる。本発明のアッセイから作成されたデータは、手作業による検証及び解析に適しており、好ましい態様において、高速コンピュータを使用する事前(prior)データ処理が使用される。
【０１１２】
生体分子情報を指標化しかつ検索する方法のアレイは、当該技術分野において公知である。例えば、米国特許第6,023,659号及び第5,966,712号は、1種又は複数のタンパク質機能の階層に従い配列を便覧作成及び検索することを可能にする方法で、生体分子配列情報を保存しているリレーショナルデータベースシステムを開示している。米国特許第5,953,727号は、部分長配列の収集から完全長配列を得るために、1種又は複数の配列決定プロジェクトとの関連に従い便覧作成及び検索される部分長DNA配列の収集を可能にするフォーマットの情報を含む配列記録を有するリレーショナルデータベースを開示している。米国特許第5,706,498号は、キー配列と標的配列の間の類似性の程度を基にした遺伝子データベース中の配列データ項に類似した遺伝子配列の検索を行う、遺伝子データベース検索システムを開示している。米国特許第5,538,897号は、closeness-of-fit測定を用い推定された質量スペクトルを実験から得た質量スペクトルと比較することにより、コンピュータデータベースにおいて、アミノ酸配列を同定するための、ペプチドの質量分析フラグメンテーションパターンを用いる方法を開示している。米国特許第5,926,818号は、投影された串刺し演算(consolidation)及び1種よりも多い串刺し演算経路又は次元に従う実際のデータを必然的に伴う、オンライン解析処理(OLAP)として説明された多次元データ解析の関数を含む、多次元データベースを開示している。米国特許第5,295,261号は、各データベース記録フィールドが、ナビゲーションデータとインフォメーションデータのふたつのクラスに分割された、ハイブリッドデータベース構造を開示しており、ここでナビゲーションフィールドは、樹状構造として又は2種以上のこのような樹状構造の合体として見ることができる階層的位相的地図を保存している。
【０１１３】
更に、Mountら、Bioinformatics、(2001年)CSH Press社、NY；Biological Sequence Anatysis: Probabilistic Models of Proteins and Nucleic Acids (Durbinら編集、1999年)、Cambridge Univ. Press社；Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins (Baxevanis及びOeulletteら、第2版、1998))、Wiley-Liss社；Rashidi及びBuehler、Bioinformatics: Basic Applications in Biological Science and Medicine (1999年)、CSH Press社；Introduction to Computational Molecular Biology (Setubalら編集、1997年)、Brooks/Cole社；Bioinfomatics: Methods and Protocols (Misener及びKrawetz編集、2000年)、Oxford Univ. Press社；Bioinformatics: Sequence, Structure, and Databanks: A Practical Approach (Higgins及びTaylor編集、2000年)、Oxford Univ. Press社；Brown、Bioinfomatics: A Biologist's Guide to Biocomputing and the Internet (2001年)、Eaton Pub.社；Han及びKamber、Data Mining: Concepts and Techniques (2000年)、Kaufmann Pub.社；並びに、Waternian、Introduction to Computational Biology: Maps, Sequences, and Genomes (1995年)、Chaps and Hall社も参照のこと。
【０１１４】
本発明は、例えば、それらから各配列特異性記録が得られる標的-含有試料の給源を特定化するデータを伴うような、クロス集計されたコンピュータで検索可能な形のアッセイデータ記録を保存するためのコンピュータ及びソフトウェアを含む、コンピュータデータベースを提供する。
【０１１５】
例証的態様において、標的-含有試料の給源の少なくとも1種は、病理的疾患を伴わないことがわかっている対照組織試料に由来する。変型において、給源の少なくとも1種は、例えば新生物形成性病巣のような病原性であることが分かっている組織標本、又は膀胱癌について分析されるべき他の組織標本である。別の変型において、アッセイ記録は、試料中の各標的種に関する下記のパラメータの1種又は複数をクロス集計する：(1)独自の識別コード、これは、例えば、標的分子構造及び／又は特徴的分離座標(例えば、電気泳動座標)を含むことができる；(2)試料給源；及び、(3)試料中に存在する標的種の絶対量及び／又は相対量。
【０１１６】
本発明は更に、磁気ディスク、光学ディスク、磁気-光学ディスク、DRAM、SRAM、SGRAM、SDRAM、RDRAM、DDRRAM、磁気バブルメモリー装置、並びにCPUレジスター及びオン-CPUデータ記憶アレイを含む他のデータ記憶装置を含むことができる、コンピュータデータ記憶装置内の標的データの収集の保存及び検索を提供する。典型的には、標的データ記録は、磁気化できる媒体上の磁気ドメインアレイ内にビットパターンとして、又はDRAM装置内のセルアレイ(例えば、トランジスタ及びトランジスタ上に存在し得る電荷保存領域で構成された各セル)のような、荷電状態もしくはトランジスタゲート状態のアレイとして保存される。ひとつの態様において、本発明は、標的給源とクロス集計された少なくとも10個の標的データ記録についての独自の識別子を備える、タンパク質発現フィンガープリント記録をコードしているビットパターンを含むような、このような記憶装置、及びこれらにより構築されたコンピュータシステムを提供する。
【０１１７】
標的がペプチド又は核酸である場合、本発明は、好ましくは、コンピュータ記憶装置又はデータベースに保存された又はそこから検索されたペプチド又は核酸の配列アッセイ記録と、少なくとも1種の他の配列の間でコンピュータによる比較を行うことを含む、関連したペプチド又は核酸配列を同定する方法を提供する。この比較は、配列解析又は比較アルゴリズム又はそれらのコンピュータプログラムの態様(例えば、FASTA、TFASTA、GAP、BESTFIT)を含むことができ、及び／又はこの比較は、標本のポリペプチド又は核酸試料から決定された配列プール中のペプチド又は核酸配列の相対量であることができる。
【０１１８】
本発明は更に好ましくは、コンピュータ化した配列の解析、比較又は相対定量法において検索及び処理に適したファイルフォーマットで本発明のアッセイから得たデータをコードしているビットパターンを含む、IBM互換性(DOS、Windows、Windows95/98/2000、Windows NT、OS/2)又は他のフォーマット(例えば、Linux、SunOS、Solaris、AIX、SCO Unix、VMS、MV、Macintoshなど)のフロッピーディスケット又はハード(固定式、Winchester)ディスクドライブのような、磁気ディスクを提供する。
【０１１９】
本発明は更に、イーサーネットケーブル(coax又は10BaseT)、電話線、ISDN線、無線ネットワーク、光ケーブル、又は他の適当なシグナル転送媒体のような、データリンクを介して接続された複数のコンピュータ装置を含む、ネットワークを提供し、これにより少なくともひとつのネットワーク装置(例えば、コンピュータ、ディスクアレイなど)は、本発明のアッセイから獲得されたデータをコードしているビットパターンを構成している、磁気ドメイン(例えば、磁気ディスク)及び／又は電荷ドメイン(例えば、DRAMセルのアレイ)のパターンを備える。
【０１２０】
本発明は更に、モデム、ISDNターミナルアダプター、DSL、ケーブルモデム、ATMスイッチなどのような、電気通信装置上の電気シグナルの作成を含む、アッセイデータを転送する方法も提供し、ここでシグナルは、本発明の方法で得られた複数のアッセイ結果を含むアッセイ又はデータベースからのデータをコードしている、(ネイティブ又は暗号化したフォーマットの)ビットパターンを含む。
【０１２１】
好ましい態様において、本発明は、クエリー標的を、本発明の方法により得られたアッセイ結果のような、データ構造のアレイを含むデータベースと比較し、かつ標的データに対する同一性の程度及びギャップ重みを基にしたデータベース標的を等級化するコンピュータシステムを提供する。中央処理装置は、アレイ結果の並置及び／又は比較に関するコンピュータプログラムをロード及び実行するために初期化されることが好ましい。クエリー標的に関するデータは、I/O装置を介して中央処理装置に入力される。コンピュータプログラムの実行は、中央処理装置における、アッセイデータの、アッセイ結果のバイナリー表記を含むデータファイルからの検索を生じる。
【０１２２】
標的データ又は記録及びコンピュータプログラムは、二次メモリーに転送することができ、これは典型的にはランダムアクセスメモリー(例えば、DRAM、SRAM、SGRAM又はSDRAM)である。標的は、選択されたアッセイ特徴(例えば、選択された親和性部分に対する結合)とクエリー標的の同じ特徴の間の一致の程度に従い等級化され、かつ結果はI/O装置を介して出力される。例えば、中央処理装置は、従来型のコンピュータ(例えば、Intel Pentium、PowerPC、Alpha、PA-8000、SPARC、MIPS 4400、MIPS 10000、VAXなど)であることができ；プログラムは、市販又は公開されたドメインの分子生物学ソフトウェアパッケージ(例えば、UWGCG Sequence Analysis Software、Darwin)であることができ；データファイルは、光学又は磁気ディスク、データサーバー、メモリー装置(例えば、DRAM、SRAM、SGRAM、SDRAM、EPROM、バブルメモリー、フラッシュメモリーなど)であることができ；I/O装置は、ビデオディスプレイ及びキーボードを備える端末、モデム、ISDNターミナルアダプター、イーサーネットポート、パンチカード読取装置、磁気ストリップ読取装置、又は他の適当なI/O装置であることができる。
【０１２３】
本発明は更に、前述のように、下記を備えるコンピュータシステムの使用を提供することが好ましい：(1)コンピュータ；(2)本発明の方法で得られたペプチド配列特異性記録の収集をコードしている保存されたビットパターン、これはコンピュータ内に保存されている；(3)クエリー標的のような比較標的；及び、(4)典型的にはコンピュータ処理した類似性の値を基にした比較結果の等級序列化を伴う、並置及び比較のためのプログラム。
【０１２４】
膀胱癌-関連タンパク質の特徴
本発明の膀胱癌タンパク質は、分泌タンパク質、膜貫通タンパク質又は細胞内タンパク質として分類することができる。ひとつの態様において、膀胱癌タンパク質は、細胞内タンパク質である。細胞内タンパク質は、細胞質及び／又は核に認められる。細胞内タンパク質は、細胞の機能及び複製の全ての局面に関係し(例えばシグナル伝達経路を含む)；そのようなタンパク質の異常な発現は、細胞プロセシングの未調節又は非調節をもたらすことが多い(例えば、Molecular Biology of the Cell、Albertsら編集、第3版、1994年、Garland社参照)。例えば、多くの細胞内タンパク質が、プロテインキナーゼ活性、タンパク質リン酸化酵素活性、プロテアーゼ活性、ヌクレオチドシクラーゼ活性、ポリメラーゼ活性などの酵素活性を有する。細胞内タンパク質は、タンパク質の複合体の組織化に関連したドッキングタンパク質、又は様々な細胞下局在への標的タンパク質としても利用され、かつ細胞小器官の構造の完全性を維持することも関連している。
【０１２５】
理解が増しつつあるタンパク質の特徴決定に関する概念は、その限定された機能が寄与している1種又は複数の構造モチーフのタンパク質に存在している。タンパク質の酵素ドメインに認められた高度に保存された配列に加え、タンパク質-タンパク質相互作用に関連したタンパク質において、高度に保存された配列が同定された。例えば、Src-ホモロジー-2(SH2)ドメインは、配列依存性の方式でチロシンリン酸化標的に結合する。SH2ドメインとは区別されるPTBドメインも、チロシンリン酸化された標的に結合する。SH3ドメインは、プロリン-リッチ標的に結合する。加えて、2、3例を挙げると、PHドメイン、テトラトリコペプチド反復単位及びWDドメインが、タンパク質-タンパク質相互作用を媒介することが示されている。これらの一部は、リン脂質又は他のセカンドメッセンジャーへの結合にも関連している。当業者に理解されるように、これらのモチーフは、アミノ酸配列を基に同定することができ；従って、タンパク質配列の分析は、その分子の酵素的可能性及び／又はそれによりタンパク質が会合することができる分子の両方に関する洞察を提供することができる。ひとつの有用なデータベースはPfam(タンパク質ファミリー)であり、これは多くの共通タンパク質ドメインを対象としている複数の配列アラインメント及び隠れマルコフモデルの巨大な収集である。バージョンは、ワシントン大学(セントルイス)、Sanger Center(英国)及びKarolinska Institute(スウェーデン)からインターネットにより入手することができる。例えば、Batemanら、Nuc. Acids Res.、28:263-266 (2000)；Sonnhammerら、Proteins、28:405-420 (1997)；Batemanら、Nuc Acids Res.、27:260-262 (1999)；及びSonnhammerら、Nuc. Acids Res.、26:320-322 (1998)参照。
【０１２６】
別の態様において、膀胱癌配列は、膜貫通タンパク質である。膜貫通タンパク質は、細胞のリン脂質二重層に広がる分子である。これらは、細胞内ドメイン、細胞外ドメイン、又は両方を有することができる。このようなタンパク質の細胞内ドメインは、細胞内タンパク質について既に説明されているものを含む、多くの機能を有することができる。例えば、細胞内ドメインは、酵素活性を含み、及び／又は追加のタンパク質の結合部位として利用することができる。頻繁に膜貫通タンパク質の細胞内ドメインは両方の役割に役立つ。例えばある受容体チロシンキナーゼは、プロテインキナーゼ活性ドメイン及びSH2ドメインの両方を有する。加えて、受容体分子それ自身上のチロシンの自己リン酸化は、追加のSH2ドメイン含有タンパク質についての結合部位を生じる。
【０１２７】
膜貫通タンパク質は、1個から数個の膜貫通ドメインを含むことができる。例えば、受容体チロシンキナーゼ、ある種のサイトカイン受容体、受容体グアニリルシクラーゼ及び受容体セリン／トレオニンプロテインキナーゼは、1個の膜貫通ドメインを含む。しかし、チャネル及びアデニリルシクラーゼを含む様々な他のタンパク質は、多くの膜貫通ドメインを含む。Gタンパク質共役型受容体(GPCR)のような多くの重要な細胞表面受容体は、7個の膜に広がる領域を含むので、これらは「7回膜貫通ドメイン」タンパク質として分類される。膜貫通ドメインの特徴は、およそ17個の連続する疎水性アミノ酸を含み、これに帯電したアミノ酸が続く。従って、特定のタンパク質のアミノ酸配列の解析に際して、タンパク質内の膜貫通ドメインの局在及び数を推定することができる(例えば、PSORTウェブサイトhttp://psort.nibb.ac.jp/参照のこと)。重要な膜貫通タンパク質受容体は、インスリン受容体、インスリン様増殖因子受容体、ヒト成長ホルモン受容体、グルコース輸送体、トランスフェリン受容体、上皮増殖因子受容体、低密度リポタンパク質受容体、上皮増殖因子受容体、レプチン受容体、及びインターロイキン受容体、例えばIL-I受容体、IL-2受容体などを含むが、これらに限定されるものではない。
【０１２８】
膜貫通タンパク質の細胞外ドメインは、多様である；しかし、保存されたモチーフが、様々な細胞外ドメイン間に繰り返して認められる。保存された構造及び／又は機能は、異なる細胞外モチーフに起因している。多くの細胞外ドメインは、他の分子への結合に関連している。ひとつの局面において、細胞外ドメインは、受容体上に認められる。受容体ドメインに結合する因子は、循環血中リガンドを含み、これはペプチド、タンパク質又はアデノシンのような小分子などであることができる。例えば、EGF、FGF及びPDGFのような増殖因子は、様々な細胞反応を開始するためにそれらのコグネイト受容体に結合する循環血中増殖因子である。他の因子は、サイトカイン、分裂促進因子、神経栄養因子などを含む。細胞外ドメインは、細胞-会合した分子にも結合する。これに関して、これらは、細胞-細胞相互作用を媒介する。細胞-会合したリガンドは、例えばグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカーを介して、細胞に縛られるか、もしくはそれら自身膜貫通タンパク質であることができる。細胞外ドメインは更に、細胞外マトリックスにも会合し、かつ細胞構造の維持に寄与する。
【０１２９】
膜貫通する膀胱癌タンパク質は、本願明細書に説明されたように、免疫療法の標的に容易にアクセス可能であるので、これらは本発明において特に好ましい。加えて以下に概説したように、膜貫通タンパク質は、画像形成のモダリティにおいても有用であることができる。抗体を、in situにおいてこのような容易にアクセス可能なタンパク質を標識するために使用してもよい。あるいは、抗体は、細胞内タンパク質を標識することもでき、ここでは、症例の試料は、典型的には細胞内タンパク質へのアクセスを提供するために、透過性である。
【０１３０】
当業者には、膜貫通タンパク質は、例えば組換え法により、膜貫通配列を除去することにより、可溶性とすることができることも理解されるであろう。更に、可溶性とされた膜貫通タンパク質は、適当なシグナル配列の添加による組換え手段により、分泌型とすることもできる。
【０１３１】
別の態様において、膀胱癌タンパク質は、分泌型タンパク質であり；その分泌は、構成的又は調節されるかのいずれかであることができる。これらのタンパク質は、分子を分泌経路に標的化するシグナルペプチド又はシグナル配列を有する。分泌されたタンパク質は、多くの生理的事象に関連し；例えば、循環する場合、これらは様々な他の細胞型へのシグナル伝達に利用されることが多い。分泌されたタンパク質は、オートクリン様式(因子を分泌した細胞に作用する)、パラクリン様式(因子を分泌した細胞の近傍にある細胞に作用する)、エンドクリン様式(離れた細胞に作用する、例えば血流への分泌)、又はエクソクリン(例えば、汗腺、皮脂腺、膵管、涙腺、乳腺、耳垢腺などのような上皮表面の管路を通って又はこれに隣接した分泌)で機能する。従って分泌された分子には、多くの生理学的局面を変調又は変更することにおける用途が認められることが多い。分泌又は放出されたタンパク質である膀胱癌タンパク質は、例えば血液、血漿、血清又は尿検査に関する診断マーカーとして良好な標的として役立つので、これらは、本発明において特に好ましい。酵素であるものは、抗体又は小分子の標的であることができる。他のものは、例えばCTL機序を介したワクチン標的として有用であることができる。
【０１３２】
膀胱癌核酸の使用
前述のように、膀胱癌配列は、本願明細書に概説した膀胱癌配列への実質的核酸及び／又はアミノ酸配列の相同性又は連鎖について最初に同定される。このような相同性は、全般的核酸又はアミノ酸配列を基にすることができ、かつ一般に相同性プログラム又はハイブリダイゼーション条件のいずれかを用い、以下に概説したように決定される。典型的には、mRNA上の連結した配列が、同じ分子において認められる。
【０１３３】
本発明の膀胱癌核酸配列、例えば表1A-13の配列は、比較的大きい遺伝子の断片であることができ、すなわちこれらは核酸セグメントである。この状況での「遺伝子」は、コード領域、非-コード領域、並びにコード領域及び非-コード領域の混合物を含む。従って、当業者に理解されるように、本願明細書に提供された配列を用い、膀胱癌遺伝子のいずれかの方向に延長された配列を、より長い配列又は完全長配列のいずれかのクローニングのために当該技術分野において周知の技術を用い得ることができる；Ausubelら、前掲を参照のこと。インフォマティクスにより多くを行うことができ、かつ多くの配列を、単独遺伝子に対応する複数の配列を含む、例えばUniGeneのようなシステムにクラスター化することができる(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/を参照)。
【０１３４】
一旦膀胱癌核酸が同定されたならば、これをクローニングし、かつ必要に応じ、その構成的部分を組換え、全体の膀胱癌核酸コード領域又は総mRNA配列を作成することができる。例えばプラスミドもしくは他のベクター内に含まれたか、又は線状核酸セグメントとしてそれらから切出されるように、一旦その天然の給源から単離されたならば、組換え膀胱癌核酸は、更に他の膀胱癌核酸、例えば延長されたコード領域を同定及び単離するためのプローブとして更に使用することができる。これは、修飾された又は変種の膀胱癌核酸及びタンパク質を作成するための、「前駆体」核酸として使用することもできる。
【０１３５】
本発明の膀胱癌核酸は、いくつかの方法で使用される。第一の態様において、膀胱癌核酸への核酸プローブが作成され、かつ下記に概説したようなスクリーニング及び診断法において、又は例えば遺伝子治療、ワクチン及び／もしくはアンチセンス／阻害適用などのような投与において使用されるバイオチップに結合される。あるいは、膀胱癌タンパク質のコード領域を含む膀胱癌核酸は、膀胱癌タンパク質の発現のために、更にスクリーニング目的又は患者への投与のために、発現ベクターに入れることができる。
【０１３６】
好ましい態様において、膀胱癌核酸に対する核酸プローブ(表に概説した核酸配列及び／又はそれらの相補体の両方)が作成される。バイオチップに結合した核酸プローブは、膀胱癌核酸、例えば標的配列(例えばサンドイッチアッセイにおける、試料の標的配列又は他のプローブ配列のいずれか)に対し実質的に相補的であるようにデザインされ、その結果標的配列と本発明のプローブのハイブリダイゼーションが生じる。下記に概説したように、この相補体は完全である必要はなく；そこに、標的配列と本発明の一本鎖核酸の間のハイブリダイゼーションを妨害するであろう多くの塩基対のミスマッチが存在してもよい。しかし、変異の数が大きすぎて、最低のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下であってもハイブリダイゼーションが生じないならば、この配列は、相補的標的配列ではない。従って、本願明細書において「実質的に相補的」とは、これらのプローブが、通常の反応条件、特に以下に概説するような高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするのに十分な程に、標的配列に相補的であることを意味する。
【０１３７】
核酸プローブは、一般に一本鎖であるが、部分的に一本鎖及び部分的に二本鎖であることができる。このプローブの鎖状性(strandness)は、標的配列の構造、組成、及び特性から決定づけられる。一般に、核酸プローブは、約8〜約100個の塩基長範囲であり、約10〜約80個の塩基が好ましく、かつ約30〜約50個の塩基が特に好ましい。すなわち、一般に全遺伝子は使用されない。一部の態様において、最大数百塩基の長さの、より長い核酸を使用することができる。
【０１３８】
好ましい態様において、1配列当り1種よりも多いプローブが使用され、重複プローブ又は標的の異なるセクションに対するプローブが使用される。すなわち、2、3又は4種又はそれより多いプローブが、好ましくは3種が、特定の標的について縮退を構成するために使用される。これらのプローブは、重複する(すなわちいくつかの共通配列を有する)、又は分離することができる。場合によっては、PCRプライマーを用い、より高感度のシグナルを増幅することができる。
【０１３９】
当業者に理解されるように、核酸は、多種多様な方法で、固体支持体に結合又は固定することができる。本願明細書において「固定した」及び文法的同等物は、核酸プローブと固体支持体の間の会合又は結合が、下記に概説した結合、洗浄、分析及び除去の条件下で、十分安定していることを意味する。この結合は、典型的には共有的又は非共有的であることができる。本願明細書において「非共有的結合」及び文法的同等物は、1種又は複数の静電的、親水性及び疎水性の相互作用を意味する。非共有結合に含まれるのは、分子、例えばストレプトアビジンの支持体への共有的結合、及びビオチン化されたプローブのストレプトアビジンへの非共有的結合などである。本願明細書において「共有結合」及び文法的同等物は、ふたつの部分、固体支持体及びプローブが、σ結合、π結合及び配位結合を含む、少なくとも1種の結合で結合されていることを意味する。共有結合は、プローブと固体支持体の間に直接形成することができるか、もしくは固体支持体又はプローブ又は両分子のいずれかへの架橋によるか又は特異的反応基の包含により形成することができる。固定には、共有的及び非-共有的相互作用の組合せも関与している。
【０１４０】
一般に、これらのプローブは、当業者に理解されるように、多種多様な方法でバイオチップに結合することができる。本願明細書に記されたように、核酸は、最初に合成され、引き続きバイオチップに結合されるか、もしくは直接バイチップ上に合成することができるかのいずれかである。
【０１４１】
このバイオチップは適当な固体基板を含む。本願明細書において「基板」又は「固体支持体」又は他の文法的同等物は、核酸プローブの結合又は会合に適した離れた個別の位置を含むように修飾することができ、かつ少なくともひとつの検出法に適合された材料を意味する。当業者に理解されるように、可能性のある基板の数は非常に多く、かつガラス及び改質又は機能性ガラス、プラスチック(アクリル系、ポリスチレン及びスチレンと他の材料のコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、TeflonJなどを含む)、多糖、ナイロン又はニトロセルロース、樹脂、シリカ又はシリコン及び改質シリコンを含むシリカベースの材料、炭素、金属、無機ガラス、プラスチックなどを含むが、これらに限定されるものではない。一般にこれらの基板は、光学検出ができかつ明らかに蛍光体ではない。国際公開公報第00/55627号参照のこと。
【０１４２】
一般に基板は平面であるが、しかし他の形状の基板も有用であることは、当業者には理解されるであろう。例えば、プローブは、試料容量を最小にするために、フロスルー試料分析用のチューブの内面に配置することができる。同様に、基板は、特定のプラスチックから製造された独立気泡を含む軟質フォームのように、柔軟であることができる。
【０１４３】
好ましい態様において、バイオチップ表面及びプローブは、その後のこれらふたつの結合のために、化学官能基により誘導することができる。従って例えばバイオチップは、アミノ基、カルボキシ基、オキソ基及びチオール基を含むが、これらに限定されるものではない化学官能基により誘導され、アミノ基が特に好ましい。これらの官能基を用い、プローブを、プローブ上の官能基を用い結合させることができる。例えば、アミノ基を含む核酸は、例えば、当該技術分野において公知のようにリンカーを用い、アミノ基を含む表面に結合することができ；例えば、ホモ-又はヘテロ-二官能性リンカーが周知である(1994年版のPierce Chemical社カタログ参照、架橋剤に関する技術セクション、155-200頁参照)。加えて場合によっては、アルキル基(置換された及びヘテロアルキル基を含む)のような追加のリンカーを使用してもよい。
【０１４４】
この態様において、オリゴヌクレオチドは、当該技術分野において公知のように合成され、その後固体支持体の表面に結合される。当業者に理解されるように、5'又は3'末端のいずれかを固体支持体に結合することができ、もしくは結合は内部ヌクレオシドを介することができる。
【０１４５】
別の態様において、固体支持体への固定は、非常に強力に、しかし非-共有的であることができる。例えば、ビオチン化されたオリゴヌクレオチドを作成し、これをストレプトアビジンで共有的に被覆した表面に結合させ、結合を生じることができる。
【０１４６】
あるいは、これらのオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において公知であるように、その表面で合成することができる。例えば、光重合化合物及び技術を利用する光活性化技術が使用される。好ましい態様において、核酸は、周知のフォトリソグラフ技術を用い、in situで合成することができ；これらは全て説明のために本願明細書に参照として組入れられている、国際公開公報第95/25116号；国際公開公報第95/35505号；米国特許第5,700,637号及び第5,445,934号；及び、その中に引用された参考文献に開示されており；結合のこれらの方法は、Affimetrix GeneChip(商標)技術を基礎としている。
【０１４７】
しばしば増幅-ベースのアッセイが、膀胱癌-関連配列の発現レベルを測定するために行われる。これらのアッセイは、典型的には、逆転写と組合せて行われる。このようなアッセイにおいて、膀胱癌-関連核酸配列は、増幅反応(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応又はPCR)の鋳型として作用する。定量的増幅において、増幅産物の量は、当初の試料中の鋳型の量に比例するであろう。適当な対照との比較は、膀胱癌-関連RNAの量の測定をもたらす。定量的増幅法は、当業者に周知である。定量的PCRの詳細なプロトコールは、例えば、Innisらの論文、PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications (1990)、Academic Press社に提供されている。
【０１４８】
一部の態様において、TaqManベースのアッセイが、発現の測定に使用される。TaqManベースのアッセイは、5'蛍光色素及び3'消光剤を含む蛍光原オリゴヌクレオチドプローブを使用する。このプローブは、PCR産物にハイブリダイズするが、それ自身は3'末端のブロック剤のために延長されない。PCR産物が後続のサイクルにおいて増幅される場合、例えば、AmpliTaqのようなポリメラーゼの5'ヌクレアーゼ活性は、TaqManプローブの切断をもたらす。この切断は、5'蛍光色素と3'消光剤を分離し、これにより増幅の関数としての蛍光の増加を生じる。例えば、Perkin-Elmer社により提供された文献を参照のこと、例えば、www2.perkin-elmer.com。
【０１４９】
その他の適当な増幅法は、リガーゼ鎖反応(LCR)(Wu及びWallace、Genomics、4:560 (1989)；Landegrenら、Science、241:1077 (1988)；及びBarringerら、Gene、89:117 (1990))、転写増幅(Kwohら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、86:1173 (1989))、自続式配列複製(Guatelliら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、87:1874 (1990))、dot PCR、及びリンカーアダプターPCRなどを含むが、これらに限定されるものではない。
【０１５０】
核酸からの膀胱癌タンパク質の発現
好ましい態様において、例えば膀胱癌タンパク質をコードしている膀胱癌核酸は、次に下記に説明したようなスクリーニングアッセイにおいて使用することができる膀胱癌タンパク質を発現するための様々な発現ベクターの作成に使用することができる。発現ベクター及び組換えDNA技術は、当業者に周知であり(例えば、Ausubel、前掲、及びGene Expression Systems (Fernandez及びHoeffler編集、1999年、Academic Press社)参照)、かつタンパク質発現に使用される。これらの発現ベクターは、自己複製染色体外ベクター又は宿主ゲノムに組込まれるベクターのいずれかである。一般に、これらの発現ベクターは、膀胱癌タンパク質をコードしている核酸に機能的に連結された転写及び翻訳調節核酸を含む。用語「制御配列」は、特定の宿主生物における機能的に連結されたコード配列の発現に使用されるDNA配列を意味する。原核生物に適した制御配列は、例えば、プロモーター、任意にオペレーター配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーを利用することが分かっている。
【０１５１】
核酸は、他の核酸配列と機能的関係で配置されている場合に「機能的に連結され」ている。例えば、プレ配列又は分泌リーダーのDNAは、これが、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合には、ポリペプチドのDNAに機能的に連結されており；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合には、コード配列に機能的に連結され；リボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置された場合には、コード配列に機能的に連結されており；ふたつの配列が、単独のポリヌクレオチドに物理的に連結されている場合には、これらは機能的に連結することができる。一般に、「機能的に連結された」とは、連結されているDNA配列が、隣接しており、かつ分泌リーダーである場合は、隣接しかつリーディング相内にあることを意味している。しかしエンハンサーは、隣接していない。連結は、典型的には、都合の良い制限部位でのライゲーションにより達成される。このような部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが、通常の実践に従い使用される。転写及び翻訳調節核酸は、一般に膀胱癌タンパク質を発現するために使用される宿主細胞に適しているであろう。様々な宿主細胞のための多くの種類の適当な発現ベクター、及び適当な調節配列が、当該技術分野において公知である。
【０１５２】
一般に、転写及び翻訳調節配列は、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始及び終結配列、翻訳開始及び終結配列、並びにエンハンサー又はアクチベーター配列を含むが、これらに限定されるものではない。好ましい態様において、調節配列は、プロモーター並びに転写開始及び終結配列を含む。
プロモーター配列は、構成的又は誘導的のいずれかのプロモーターをコードしている。これらのプロモーターは、天然のプロモーター又はハイブリッドプロモーターのいずれかであることができる。1種より多いプロモーターのエレメントと一緒のハイブリッドプロモーターも、当該技術分野において公知であり、かつ本発明において有用である。
【０１５３】
加えて、発現ベクターは、追加のエレメントを含むことができる。この発現ベクターは、ふたつの複製システムを有し、従って例えば、発現のための哺乳類又は昆虫細胞、並びにクローニング及び増幅のための原核宿主など、ふたつの生物において維持されることが可能である。発現ベクターの組込みのために、この発現ベクターは、宿主細胞ゲノムと相同な少なくとも1個の配列を含み、かつ好ましくはこの発現構築体の側方に位置している2個の相同配列を含む。組込みベクターは、ベクターに封入するための適当な相同配列を選択することにより、宿主細胞の特異的遺伝子座に方向付けることができる。組込みベクターの構築は、当該技術分野において周知である(例えば、Fernandez及びHoeffler、前掲)。
【０１５４】
加えて、好ましい態様において、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にする選択マーカー遺伝子を含む。選択遺伝子は、当該技術分野において周知であり、かつ使用した宿主細胞により変動するであろう。
【０１５５】
本発明の膀胱癌タンパク質は、膀胱癌タンパク質の発現を誘導又は引き起すのに適した条件下で、発現ベクターにより形質転換された宿主細胞の培養により産生される。膀胱癌タンパク質発現に適した条件は、発現ベクター及び宿主細胞の選択によって変動し、かつ当業者はこれを、慣習的実験又は最適化を通じて容易に確認するであろう。例えば、発現ベクターにおける構成的プロモーターの使用は、典型的には、宿主細胞の成長及び増殖の最適化を必要とする一方で、誘導プロモーターの使用は、典型的には、誘導に適した増殖条件を確定することを必要とするであろう。加えて一部の態様において、収穫の時期は重要である。例えば、昆虫細胞発現において使用されるたバキュロウイルスシステムは、溶解性ウイルスであり、従って収穫時期の選択は、生成物の収量にとって重要であり得る。
【０１５６】
適当な宿主細胞は、酵母、細菌、古細菌、真菌、及び昆虫、並びに哺乳類細胞を含む動物細胞である。特に興味深いのは、Saccharomyces cerevisiae及び他の酵母、E. coli、Bacillus subtilis、Sf9細胞、C129細胞、293細胞、Neurospora、BHK、CHO、COS、HeLa細胞、HUVEC(ヒト臍帯静脈内皮細胞)、THP1細胞(マクロファージ細胞株)及び様々な他のヒト細胞及び細胞株である。
【０１５７】
好ましい態様において、膀胱癌タンパク質は、哺乳類細胞において発現される。哺乳類発現システムは、レトロウイルス及びアデノウイルスシステムを含む。レトロウイルスベクターシステムは、PCT/US97/01019号及びPCT/US97/01048号に説明されている。特定の使用は、哺乳類ウイルス遺伝子からのプロモーターであり、その理由はこのウイルス遺伝子は高度に発現されることが多く、かつ広範な宿主範囲を有するからである。例として、SV40初期プロモーター、マウス乳癌ウイルスLTRプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、単純ヘルペスウイルスプロモーター、及びCMVプロモーターがある(例えば、Fernandez及びHoeffler、前掲参照)。典型的には、哺乳類細胞により認識された転写終結配列及びポリアデニル化配列が、翻訳停止コドンの3'側に位置し、従ってプロモーターエレメントと共にコード配列の側方に位置する。転写ターミネーター及びポリアデニル化シグナルの例は、SV40由来のものを含む。
【０１５８】
外来核酸の哺乳類宿主に加え他の宿主への導入法は、当該技術分野において周知であり、かつ使用した宿主細胞により変動するであろう。技術は、デキストラン-媒介したトランスフェクション、リン酸カルシウム沈降法、ポリブレン媒介したトランスフェクション、プロトプラスト融合、電気穿孔、ウイルス感染、リポソーム内へのポリヌクレオチド(複数)の被包、及びDNAの核への直接的微量注入を含む。
【０１５９】
別の態様において、膀胱癌タンパク質は、細菌システムにおいて発現される。バクテリオファージ由来のプロモーターも用いることができる。合成プロモーター及びハイブリッドプロモーターも有用である；例えば、tacプロモーターは、trp及びlacプロモーター配列のハイブリッドである。細菌プロモーターは、細菌RNAポリメラーゼに結合しかつ転写を開始する能力を有する細菌起源でない天然のプロモーターを含むことができる。効率的リボソーム結合部位が望ましいことが多い。この発現ベクターは、膀胱癌タンパク質の分泌を提供するシグナルペプチド配列も含むことがある。このタンパク質は、増殖培地に分泌される(グラム陽性菌)か、又は細胞の内膜と外膜の間に位置した細胞周辺腔へと分泌されるかの(グラム陰性菌)いずれかである。細菌発現ベクターは、形質転換された細菌株の選択を可能にする選択マーカー遺伝子を含むことができる。適当な選択遺伝子は、例えばアンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン及びテトラサイクリンなどの薬物に対して細菌を耐性とする遺伝子、又は例えば、ヒスチジン、トリプトファン及びロイシンの生合成経路におけるもののような生合成遺伝子も含む。これらの成分は、発現ベクターに集成される。細菌の発現ベクターは、とりわけBacillus subtilis、E. coli、Streptococcus cremoris、及びStreptococcus lividansのベクターを含む(例えば、Fernandez及びHoeffler、前掲)。これらの細菌発現ベクターは、塩化カルシウム処理、電気穿孔及び他の方法などを用い、細菌宿主細胞へ形質転換される。
【０１６０】
膀胱癌タンパク質は、昆虫細胞において産生される。例えば、Millerら、Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual、Oxford Books社(1997年)；ISBN:0716770172；及び、Makrides、Prot. Expr. Purif.、17:183-202 (1999)を参照のこと。
膀胱癌タンパク質は、酵母細胞において産生されてもよい。酵母発現システムは、Saccharomyces cerevisiae、Candida albicans及びC. maltosa、Hansenula polymorpha、Kluyveromyces fragilis及びK. lactis、Pichia guillerimondii及びP. pastoris、Schizosaccharomyces pombe、及びYarrowia lipolyticaの発現ベクターで存在する。例えば、Jonesら、The Molecular and Cellular Biology of the Yeast Sacchammyces: Gene Expression、(編集、1993年) CSH Press社；ISBN: 0879693657を参照のこと。
【０１６１】
膀胱癌タンパク質は、当該技術分野において周知の技術を用い、融合タンパク質として作成することもできる。従って例えば、モノクローナル抗体の作成のために、望ましいエピトープが小さいならば、膀胱癌タンパク質は、担体タンパク質に融合し免疫原を形成することができる。あるいは、膀胱癌タンパク質は、発現を増大するため、又は他の理由で、融合タンパク質として作成することができる。例えば、膀胱癌タンパク質が膀胱癌ペプチドである場合、このペプチドをコードしている核酸は、発現又は精製を目的として他の核酸に連結することができる。
【０１６２】
膀胱癌タンパク質は、典型的には発現後に精製又は単離される。膀胱癌タンパク質は、試料中に存在する他の成分に応じて、様々な適当な方法で単離又は精製することができる。標準の精製法は、電気泳動的、分子的、免疫学的及びクロマトグラフィー的技術を含み、これはイオン交換、疎水性、アフィニティー及び逆相HPLCクロマトグラフィー、及び等電点電気泳動を含む。膀胱癌タンパク質は、標準の抗-膀胱癌タンパク質抗体アフィニティーカラムを用いて精製することができる。タンパク質濃縮と組合せた、限外濾過及びダイアフィルトレーション技術も有用である。適当な精製技術の一般的指針については、ScopesのProtein Purification、(1982年)、Springer-Verlag社を参照のこと。必要な精製の程度は、膀胱癌タンパク質の用途に応じて変動するであろう。場合によっては、精製は不要であり、これは意図された用途に応じて決めることができる。
【０１６３】
必要に応じ、一旦発現されかつ精製された膀胱癌タンパク質及び核酸は、多くの適用において有用である。これらは、免疫選択試薬として、ワクチン試薬として、スクリーニング剤などとして有用であることができる。
【０１６４】
膀胱癌タンパク質の変種
ひとつの態様において、膀胱癌タンパク質は、野生型配列と比べて、膀胱癌タンパク質誘導体又は変種である。すなわちより詳細に以下に概説するように、誘導体膀胱癌ペプチドは、少なくとも1個のアミノ酸の置換、欠失又は挿入を含むことが多く、アミノ酸置換が特に好ましいであろう。アミノ酸の置換、挿入又は欠失は、膀胱癌ペプチド内のほとんどの残基において生じ得る。
【０１６５】
本発明の膀胱癌タンパク質のひとつの態様は、アミノ酸配列変種である。これらの変種は、典型的には、下記の3クラスのひとつ又は複数に収まる：置換変種、挿入変種又は欠失変種。これらの変種は通常、前述のように変種をコードしているDNAを作成し、その後組換え細胞培養においてこのDNAを発現するために、カセット又はPCR、突然変異誘発又は当該技術分野において周知の他の技術を使用する、膀胱癌タンパク質をコードしているDNAのヌクレオチドの位置指定突然変異誘発により調製される。しかし、最大約100〜150残基を有する変種膀胱癌タンパク質断片は、確立された技術を用い、in vitro合成により調製することができる。アミノ酸配列変種は、変動の予め決定された性質により特徴決定されることが多く、それらを設定する特徴は、膀胱癌タンパク質アミノ酸配列の天然のアレル又は種間変動からかけ離れている。これらの変種は、典型的には、天然のアナログと同じ定性的生物学的活性を示すが、以下により完全に概説するような修飾された特徴を有する変種を選択することもできる。
【０１６６】
アミノ酸配列変動を導入するための位置又は領域は予め決定されることが多いが、突然変異それ自身は予め決定される必要はない。例えば、所定の位置での突然変異の性能を最適化するために、ランダム突然変異誘発を、標的コドン又は領域において行い、かつ発現された膀胱癌変種を、望ましい活性の最適な組合せについてスクリーニングする。例えば、M13プライマー突然変異誘発及びPCR突然変異誘発のような、公知の配列を有するDNA内の予め決定された位置での置換突然変異の作出に関する技術が周知である。突然変異体のスクリーニングは、膀胱癌タンパク質の活性アッセイを用いて行われる。
【０１６７】
アミノ酸置換は、典型的には1個の残基であり；挿入は通常、約1〜20個の桁のアミノ酸であるが、場合によってはかなり大きい挿入も容認できる。欠失は、約1〜約20個の残基の範囲であるが、場合によってははるかに大きい欠失であってもよい。
【０１６８】
置換、欠失、挿入又はそれらの組合せは、最終誘導体に到達するために使用することができる。一般に、これらの変化は、その分子の変更を最小化するために、2、3個のアミノ酸について行われる。しかし比較的大きい変化が、特定の環境において容認される。膀胱癌タンパク質の特徴の小さい変更が望ましい場合、置換は一般に、定義の項目で提供されたアミノ酸置換関係に従い行われる。
【０１６９】
これらの変種は、典型的には、天然のアナログと同じ性質の生物学的活性を示し、かつ同じ免疫応答を誘起するが、変種は、必要ならば、膀胱癌タンパク質の特徴を修飾するように選択することもできる。あるいは、変種は、膀胱癌タンパク質の生物学的活性が変更されるようにデザインすることができる。例えば、グリコシル化部位を、変更又は除去することができる。
【０１７０】
機能的又は免疫学的同一性の置換的変化は、前述のものよりも保存性が少ない置換を選択することにより作成することができる。以下のものにより有意な影響を及ぼす置換を作成することができる：例えば、α-ヘリックス又はβ-シート構造などの、変更領域のポリペプチド骨格の構造；標的部位での分子の疎水性の変化；又は、側鎖の嵩。ポリペプチドの特徴において最大の変化を生じることが予想される置換は、(a)親水性残基、例えばセリン又はトレオニンが、疎水性残基、例えばロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン又はアラニンと(又はそれにより)置換されているもの；(b)システイン又はプロリンが、別の残基と(又はそれにより)置換されているもの；(c)正電荷側鎖を有する残基、例えば、リシン、アルギニン又はヒスチジンを、負電荷の残基、例えばグルタミン酸又はアスパラギン酸と(又はそれにより)置換されているもの；又は、(d)嵩高な側鎖を有する残基、例えばフェニルアラニンが、側鎖を有さないもの、例えばグリシンと(又はそれにより)置換されているものである。
【０１７１】
膀胱癌ポリペプチドの共有的修飾は、本発明の範囲内に含まれる。共有的修飾のひとつの型は、膀胱癌ポリペプチドの選択された側鎖又はN-もしくはC-末端残基と反応することが可能である有機誘導化剤と、膀胱癌ポリペプチドの標的化されたアミノ酸残基との反応を含む。二価性試薬による誘導は、例えば、抗-膀胱癌ポリペプチド抗体の精製のための方法又はスクリーニングアッセイ法において使用するための、水に不溶性の支持体マトリックス又は表面への膀胱癌ポリペプチドの架橋において有用である。通常使用される架橋剤は、例えば、1,1-ビス(ジアゾアセチル)-2-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、4-アジドサリチル酸エステル、3,3'-ジチオビス(スクシンイミジルプロピオン酸エステル)のようなジスクシニミジルエステルを含むホモ二官能イミドエステル、ビス-N-マレイミド-1,8-オクタンのような二官能マレイミド、及びメチル-3-((p-アジドフェニル)ジチオ)プロピオイミダートのような試薬を含む。
【０１７２】
他の修飾は、各々、対応するグルタミル及びアスパルチル残基への、グルタミニル及びアスパラギニル残基の脱アミド化、プロリン及びリシンの水酸化、セリル、セリン、トレオニン又はチロシン残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のアミノ基のメチル化(Creighton、Proteins: Structure and Molecular Properties、79-86頁(1983年)、Freeman社)、N-末端アミンのアセチル化、並びにC-末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【０１７３】
本発明の範囲に包含される膀胱癌ポリペプチドの共有的修飾の別の種類は、このポリペプチドの未変性のグリコシル化パターンの変更を含む。本願明細書の目的に関して、「未変性のグリコシル化パターンの変更」は、未変性配列膀胱癌ポリペプチドにおいて見られた1個又は複数の糖残基の欠失、及び／又は未変性配列膀胱癌ポリペプチドには存在しない1個又は複数のグリコシル化部位の付加を意味することが意図されている。グリコシル化パターンは、多くの方法で変更することができる。例えば、膀胱癌-関連配列を発現するための様々な細胞型の使用は、様々なグリコシル化パターンを生じることができる。
【０１７４】
グリコシル化部位の膀胱癌ポリペプチドへの付加は、それらのアミノ酸配列の変更によっても実現することができる。この変更は、例えば、未変性配列膀胱癌ポリペプチドへの、1個又は複数のセリン又はトレオニン残基の付加、又は置換により行うことができる(O-連結したグリコシル化部位)。この膀胱癌アミノ酸配列は、DNAレベルでの変化を通じて、特に所望のアミノ酸へ翻訳するコドンが作成されるための膀胱癌ポリペプチドをコードしているDNAの予め選択された塩基での突然変異により、任意に変更することができる。
【０１７５】
膀胱癌ポリペプチド上の糖部分の数を増大する別の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。このような方法は、当該技術分野において説明されており、例えば、国際公開公報第87/05330号、及びAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem.、259-306頁(1981)に説明されている。
【０１７６】
膀胱癌ポリペプチド上に存在する糖部分の除去は、化学的もしくは酵素的に、又は標的としてグリコシル化を利用するアミノ酸残基をコードしているコドンの突然変異性の置換により、実現することができる。化学的脱グリコシル化技術は、当該技術分野において公知である。例えばHakimuddinらの論文(Arch. Biochem. Biophys.、259:52-57 (1987))及びEdgeらの論文(Anal. Biochem.、118:131-137 (1981))を参照のこと。ポリペプチド上の糖部分の酵素的切断は、様々なエンド-及びエキソ-グリコシダーゼの使用により実現することができる。例えば、Thotakuraらの論文(Meth. Enzymol.、138:350-359 (1987))を参照のこと。
【０１７７】
別の種類の膀胱癌の共有的修飾は、米国特許第4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号又は第4,179,337号に開示されたような方法による、膀胱癌ポリペプチドの、様々な非タンパク質性ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンへの連結を含む。
【０１７８】
本発明の膀胱癌ポリペプチドは、異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合した膀胱癌ポリペプチドを含むキメラ分子を形成するように修飾することもできる。ある態様において、キメラ分子は、膀胱癌ポリペプチドの、エピトープタグとの融合を含む。このエピトープタグは一般に、膀胱癌ポリペプチドのアミノ-又はカルボキシル-末端に配置される。このような膀胱癌ポリペプチドのエピトープタグ化された形の存在は、このタグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。更に、エピトープタグの供給は、抗-タグ抗体又はこのエピトープタグに結合する他の種類のアフィニティマトリックスを使用するアフィニティー精製により、膀胱癌ポリペプチドを容易に精製することができるようにする。代わりの態様において、キメラ分子は、膀胱癌ポリペプチドの、免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含むことができる。二価型のキメラ分子については、このような融合体は、IgG分子のFc領域である。
【０１７９】
様々なタグポリペプチド及びそれらの各抗体は、当該技術分野において周知である。例として、ポリ-ヒスチジン(poly-his)タグ又はポリ-ヒスチジン-グリシン(poly-his-gly)タグ；HIS6タグ及び金属キレートタグ、flu HAタグポリペプチド及びその抗体12CA5(Fieldら、Mol. Cell. Biol.、8:2159-2165 (1988))；c-mycタグ及びそれに対する8F9、3C7、6E10、G4、B7及び9E10抗体(Evanら、Molecular and Cellular Biology、5:3610-3616 (1985))；並びに、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質D(gD)タグ及びその抗体(Paborskyら、Protein Engineering、3:547-553 (1990))がある。他のタグポリペプチドは、Flag-ペプチド(Hoppら、BioTechnology、6:1204-1210 (1988))；KT3エピトープペプチド(Martinら、Science、255:192-194 (1992))；チューブリンエピトープペプチド(Skinnerら、J. Biol. Chem.、266:15163-15166 (1991))；並びに、T7遺伝子10タンパク質ペプチドタグ(Lutz-Freyermuthら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、87:6393-6397 (1990))がある。
【０１８０】
更に他の膀胱癌ファミリーの膀胱癌タンパク質、及び他の生物に由来する膀胱癌タンパク質も含まれ、これらは以下に概説したように、クローニングされかつ発現される。従って、プローブ又は縮重ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)プライマー配列を用い、ヒト又は他の生物から、他の関連した膀胱癌タンパク質を見つけることができる。当業者に明らかであるように、特に有用なプローブ及び／又はPCRプライマーの配列は、膀胱癌核酸配列の独自の領域を含む。好ましいPCRプライマーは、長さが約15〜約35個のヌクレオチドであり、約20〜約30個が好ましく、かつ必要ならばイノシンを含むことができる。PCR反応条件は、当該技術分野において周知である。例えば、Innisの著書(PCR Protocols、前掲)を参照のこと。
【０１８１】
膀胱癌タンパク質に対する抗体
好ましい態様において、例えば免疫療法又は免疫診断のために、膀胱癌タンパク質を使用し抗体を作成する場合、この膀胱癌タンパク質は、完全長タンパク質と、少なくとも1個のエピトープ又は決定基を共有しなければならない。本願明細書において「エピトープ」又は「決定基」は、典型的には、MHCとの関係において抗体を産生し、そして／あるいはT-細胞受容体に結合するタンパク質の部分を意味する。従ってほとんどの場合、比較的小さい膀胱癌タンパク質に対して産生された抗体は、完全長タンパク質に、特に線状エピトープに結合することができるであろう。好ましい態様において、エピトープは特有であり；すなわち、独自のエピトープに対して産生された抗体は、ほとんど又は全く交差反応性を示さない。
【０１８２】
ポリクローナル抗体を調製する方法は、公知である(例えば、Coligan、前掲；及び、Harlow及びLane、前掲参照)。ポリクローナル抗体は、哺乳類において、例えば、免疫化物質及び望ましいならばアジュバントの1回又は複数回の注射により作成することができる。典型的には、この免疫化物質及び／又はアジュバントは、哺乳類において、皮下又は腹腔内反復注射により注射することができるであろう。免疫化物質は、表の核酸によりコードされたタンパク質又はそれらの断片又はそれらの融合タンパク質を含む。免疫化物質を、免疫感作される哺乳類において免疫原性であることがわかっているタンパク質に複合することは有用であり得る。このような免疫原性タンパク質は、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、及びダイズトリプシンインヒビターを含む。使用することができるアジュバントの例は、フロイントの完全アジュバント及びMPL-TDMアジュバント(モノホスホリルリピドA、合成トレハロースジコリノミコレート)を含む。免疫感作プロトコールは、適宜選択することができる。
【０１８３】
これらの抗体は、モノクローナル抗体であることができる。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein、Nature、256:495 (1975)に説明されたもののような、ハイブリドーマ法を用いて調製される。ハイブリドーマ法において、マウス、ハムスター又は他の適当な宿主動物は、典型的には、免疫化物質により免疫感作され、免疫化物質に特異的に結合するであろう抗体を産生する又は産生することが可能であるようなリンパ球を誘起する。あるいは、リンパ球は、in vitroにおいて免疫感作することができる。この免疫化物質は、典型的には、表1A-13の核酸でコードされたポリペプチド、又はそれらの断片、又はそれらの融合タンパク質を含むであろう。一般に、ヒト起源の細胞が望ましい場合、末梢血リンパ球(「PBL」)が使用され、もしくは非ヒト哺乳類給源が望ましい場合は、脾細胞又はリンパ節細胞が使用される。その後リンパ球は、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用い、不死化された細胞株と融合され、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding、Monoclonal Antibodies: Principles and Practice、59-103頁(1986年)、Academic Press社)。不死化された細胞株は、通常形質転換された哺乳類細胞であり、特に齧歯類、ウシ及びヒト起源のミエローマ細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫細胞株が使用される。これらのハイブリドーマ細胞は、好ましくは融合していない不死化された細胞の増殖又は生存を阻害する1種又は複数の物質を含有する適当な培養培地において培養することができる。例えば、親細胞が、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠損しているならば、そのハイブリドーマに対する培養培地は典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含有し(「HAT培地」)、これらの物質は、HGPRT-欠損細胞の増殖を阻害する。
【０１８４】
ある態様において、抗体は、二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、典型的には、少なくとも2種の異なる抗原に対する結合特異性を有する、又は同じ抗原上のふたつのエピトープに対する結合特異性を有するか、モノクローナル性の、好ましくはヒト又はヒト化抗体である。ひとつの態様において、結合特異性のひとつは、表1A-13の核酸又はそれらの断片によりコードされたタンパク質に関し、他方は、他の抗原、及び好ましくは細胞-表面タンパク質又は受容体もしくは受容体サブユニット、好ましくは腫瘍特異性のものに関する。あるいは、四量体型技術は、多価試薬を作成することができる。
【０１８５】
好ましい態様において、膀胱癌タンパク質に対する抗体は、以下に説明するように、膀胱癌タンパク質の生物学的機能を低下又は排除することが可能である。すなわち、抗-膀胱癌タンパク質抗体(ポリクローナル性又は好ましくはモノクローナル性のいずれか)を膀胱癌組織(又は膀胱癌を含む細胞)へ添加することは、膀胱癌を軽減又は消失する。一般に、活性、成長、サイズなどの少なくとも25％の減少が好ましく、少なくとも約50％が特に好ましく、及び約95〜100％の減少が特に好ましい。
【０１８６】
好ましい態様において、膀胱癌タンパク質に対する抗体は、ヒト化抗体である(例えば、Xenerex Biosciences社、Mederex社、Abgenix社、Protein Design Labs社)。非-ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化型は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含む免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、又はそれらの断片(例えばFv、Fab、Fab'、F(ab')2、又は抗体の他の抗原-結合部分配列)のキメラ分子である。ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域(CDR)からの残基が、望ましい特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット又はウサギのような非ヒト種のCDRからの残基(ドナー抗体)で置き換わっているような、ヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。一部の例においては、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基は、対応する非-ヒト残基と交換される。ヒト化抗体は更に、レシピエント抗体においても移入されたCDR又はフレームワーク配列においても認められない残基を含むこともできる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも1種、及び典型的には2種の可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで全て又は実質的に全てのCDR領域は、非ヒト免疫グロブリンのそれに相当し、かつ全て又は実質的に全てのフレームワーク(FR)領域は、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。最適にヒト化抗体は、典型的にはヒト免疫グロブリンの、免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部を含むであろう。Jonesら、Nature、321:522-525 (1986)；Riechmannら、Nature、332:323-329 (1988)；及び、Presta、Curr. Op. Struct Biol.、2:593-596 (1992)を参照のこと。ヒト化は、齧歯類CDR又はヒト抗体の対応する配列のCDR配列との置換により、Winterとその同僚の方法に従い行うことができる(Jonesら、Nature、321:522-525 (1986)；Riechmannら、Nature、332:323-327 (1988)；Verhoeyenら、Science、239:1534-1536 (1988)参照)。従って、このようなヒト化抗体は、キメラ抗体(米国特許第4,816,567号)であり、ここでは完全なヒト可変ドメインよりも実質的に少ないものが、非ヒト種由来の対応する配列で置換されている。
【０１８７】
ファージディスプレイライブラリーを含む、ヒト-抗体(Hoogenboom及びWinter、J. Mol. Biol.、227:381-388 (1991)；Marksら、J Mol. Biol.、222:581-597 (1991))、又はヒトモノクローナル抗体(例えば、Coleら、Reisfield及びSell、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、77頁(1985)Liss社；及び、Boenrerら、J. Immunol、147:86-95 (1991))も、当該技術分野において公知の様々な技術を用い作成することができる。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の、例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的又は完全に失活されているマウスのような、トランスジェニック動物へ導入することにより作成することができる。チャレンジ時に、ヒト抗体産生が認められ、これは、遺伝子再構成、集成及び抗体レパトアを含む、事実上全ての点に関してヒトにおいて認められるものと密に類似している。この方法は、例えば、米国特許第5,545,807号；第5,545,806号；第5,569,825号；第5,625,126号；第5,633,425号；第5,661,016号、並びにMarksら、Bio/Technology、10:779-783 (1992)；Lonbergら、Nature、368:856-859 (1994)；Morrison、Nature、368:812-13 (1994)；Neuberger、Nature Biotechnology、14:826 (1996)；Fishwildら、Nature Biotechnology、14:845-51 (1996)； Lonberg及びHuszar、Intern. Rev. Immunol.、13:65-93 (1995)に説明されている。
【０１８８】
免疫療法は、膀胱癌タンパク質に対して生じた抗体による、膀胱癌の治療を意味する。本願明細書において使用されるように、免疫療法は、受動又は能動であることができる。本願明細書に定義された、受動免疫療法は、レシピエント(患者)への抗体の受動的導入であり、標識又は毒素を標的化するように使用することができる。能動免疫は、レシピエント(患者)における抗体及び／又はT-細胞反応の誘導である。免疫応答の誘導は、それに対し抗体が生じるような抗原のレシピエントへの提供の結果である。当業者に理解されるように、この抗原は、それに対する抗体が生じることが望ましいポリペプチドのレシピエントへの注射、又は抗原を発現することが可能な核酸とレシピエントの及び抗原の発現のための条件下での接触により提供され、免疫応答につながる。
【０１８９】
好ましい態様において、それに対して抗体が生じる膀胱癌タンパク質は、先に説明したように分泌タンパク質である。理論的裏付けはないが、治療に使用される抗体は、分泌タンパク質に結合し、これがその受容体に結合することを妨害し、これにより、分泌される膀胱癌タンパク質を失活させる。
【０１９０】
別の好ましい態様において、それに対して抗体が生じる膀胱癌タンパク質は、膜貫通タンパク質である。理論的裏付けはないが、この治療に使用される抗体は、膀胱癌タンパク質の細胞外ドメインに結合し、これが、循環血中リガンド又は細胞-会合分子のような他のタンパク質と結合することを妨害する。この抗体は、膜貫通膀胱癌タンパク質のダウン-レギュレーションを引き起すことがある。当業者には理解されるように、この抗体は、膀胱癌タンパク質の細胞外ドメインへのタンパク質結合の競合的、非-競合的又は未競合的インヒビターであることができる。この抗体は、膀胱癌タンパク質のアンタゴニストでもある。更には、この抗体は、膜貫通膀胱癌タンパク質の活性化を妨害することができる。ひとつの局面において、抗体が他の分子の膀胱癌タンパク質への結合を妨害する場合、この抗体は、細胞の増殖を妨害する。この抗体は、細胞を、TNF-α、TNF-β、IL-1、IFN-γ及びIL-2を含むが、これらに限定されるものではないような細胞傷害性物質、又は5FU、ビンブラスチン、アクチノマイシンD、シスプラチン、メトトレキセートなどの化学療法剤に対して標的化又は増感するために使用することもできる。場合によっては、この抗体は、膜貫通タンパク質と複合体化された場合に、血清補体を活性化し、これにより細胞傷害性又は抗原依存性細胞傷害作用(ADCC)を媒介する亜型に属する。従って、膀胱癌は、患者への、膜貫通膀胱癌タンパク質に対する抗体の投与により治療される。抗体-標識は、共毒素(co-toxin)を活性化し、毒素搭載(payload)を局在化し、さもなければ局所的に細胞を除去する手段を提供する。
【０１９１】
別の好ましい態様において、抗体は、エフェクター部分に複合される。エフェクター部分は、放射性標識又は蛍光標識のような標識部分を含む多くの分子であることができ、もしくは治療的部分であることができる。ひとつの局面において、治療的部分は、膀胱癌タンパク質の活性を変調する小分子である。別の局面において、治療的部分は、膀胱癌タンパク質に会合した又はこれと非常に近傍にある分子の活性を変調する。治療的部分は、膀胱癌に関連したプロテアーゼ又はコラゲナーゼ又はプロテインキナーゼ活性のような、酵素活性を阻害してもよい。
【０１９２】
好ましい態様において、治療的部分は、細胞傷害性物質であることもできる。この方法において、細胞傷害性物質の膀胱癌組織又は細胞への標的化は、罹患細胞数の減少を生じ、これにより膀胱癌に関連した症状が軽減される。細胞傷害性物質は多数でありかつ変動し、及び細胞傷害性薬物又は毒素又はこのような毒素の活性断片を含むが、これらに限定されるものではない。適当な毒素及びそれらに対応する断片は、ジフテリアA鎖、外毒素A鎖、リシンA鎖、アルビンA鎖、クルシン、クロチン、フェノマイシン、エノマイシンなどである。細胞傷害性物質は更に、膀胱癌タンパク質に対して生じた抗体への放射性同位元素の複合、又は抗体に共有結合されたキレート剤への放射性核種の結合により作成される放射性化学物質も含む。膜貫通膀胱癌タンパク質への治療的部分の標的化は、膀胱癌の患部における治療的部分の局所的濃度の増加を利用するのみではなく、治療的部分に関連し得る有害な副作用の低減も利用する。
【０１９３】
別の好ましい態様において、それに対し抗体が生じる膀胱癌タンパク質は、細胞内タンパク質である。この場合、抗体は、細胞への侵入を促進するタンパク質に複合することができる。ひとつの場合において、抗体は、エンドサイトーシスにより細胞へ侵入する。別の態様において、抗体をコードしている核酸が、個体又は細胞へ投与される。更に、膀胱癌タンパク質が、細胞内、例えば核内に標的化され得る場合、それに対する抗体は、標的の局在化に関するシグナル、すなわち核局在化シグナルを含む。
【０１９４】
本発明の膀胱癌抗体は、膀胱癌タンパク質に特異的に結合する。本願明細書において「特異的結合」とは、抗体がタンパク質へ、少なくとも約0.1mMのKdで、より一般的には少なくとも約1μM、好ましくは少なくとも約0.1μM又はそれより良く、及び最も好ましくは0.01μM又はそれより良く結合することを意味する。結合の選択性も重要である。
【０１９５】
診断及び治療適用での膀胱癌配列の検出
ひとつの局面において、遺伝子のRNA発現レベルが、膀胱癌表現型の様々な細胞状態について決定される。正常組織(例えば、膀胱癌を経験していない)及び膀胱癌組織(場合によっては、以下に概略したように予後に関連している膀胱癌の重症度を変動するため)又は非悪性疾患における遺伝子の発現レベルが評価され、発現プロファイルを提供する。特定の細胞状態又は発症の時点での発現プロファイルは、本質的にその状態の「フィンガープリント」である。ふたつの状態が、同様に発現された特定の遺伝子を有する一方で、多くの遺伝子の評価は、同時に細胞の状態を反映している遺伝子発現プロファイルの作成を可能にする。様々な状態での細胞における発現プロファイルを比較することにより、これらの状態の各々においてどの遺伝子が重要であるか(遺伝子のアップ-及びダウン-レギュレーションの両方を含む)に関する情報が得られる。その後、診断が行われるか又は確認され、組織試料が正常なもしくは癌性組織の遺伝子発現プロファイルを有するかどうかが決定される。これは関連した状態の分子診断を提供するであろう。
【０１９６】
本願明細書において使用される「差次的発現」又は文法上の同等物は、細胞及び組織内及びそれらの間における、一時的及び／又は細胞性の遺伝子発現パターンにおける定性的又は定量的差異を意味する。従って、差次的に発現された遺伝子は、例えば、正常組織、対、膀胱癌組織における、活性化又は失活を含む、変更されたその発現を定性的に有することができる。遺伝子は、特定の状態でオン又はオフ(turned on or turned off)されることができ、従って別の状態と関連して、2種以上の状態の比較が可能である。定性的に調節された遺伝子は、標準技術で検出可能な状態又は細胞型内の発現パターンを示すであろう。いくつかの遺伝子は、一方の状態又は細胞型においては発現されるが、両方では発現されないであろう。あるいは発現の差異は、定量的であることができ、例えば、その発現は、増加又は減少され；例えば、遺伝子発現は、アップレギュレーションされ、増加した量の転写産物を生じるか、もしくはダウンレギュレーションされ、減少した量の転写産物を生じるかのいずれかである。発現が異なる程度は、以下に概説するような標準の特徴決定技術、例えばAffymetrix GeneChip(商標)発現アレイの使用により定量するために十分な大きさのみが必要である。Lockhart、Nature Biotechnology、14:1675-1680 (1996)参照のこと。他の技術は、定量的逆転写酵素PCR、ノーザン分析及びRNaseプロテクションを含むが、これらに限定されるものではない。先に概説したように、好ましくは発現の変化(例えば、アップレギュレーション又はダウンレギュレーション)は、少なくとも約50％、より好ましくは少なくとも約100％、更に好ましくは少なくとも約150％、更により好ましくは少なくとも約200％であり、約300〜1000％であることが特に好ましい。
【０１９７】
評価は、遺伝子転写産物、又はタンパク質レベルであることができる。遺伝子発現の量は、遺伝子転写産物のDNA又はRNA同等物への核酸プローブ、及び遺伝子発現レベルの定量を用いてモニタリングすることができ、あるいは最終遺伝子産物それ自身(タンパク質)を、例えば、膀胱癌タンパク質に対する抗体及び標準のイムノアッセイ(ELISAなど)又は質量分析アッセイ、2Dゲル電気泳動アッセイなどを含む他の技術により、モニタリングすることができる。膀胱癌遺伝子に対応するタンパク質、すなわち、膀胱癌又は疾患の表現型において重要であることが同定されたものは、膀胱癌診断試験において評価することができる。
【０１９８】
好ましい態様において、遺伝子発現のモニタリングは、多くの遺伝子において同時に行われる。更に複数のタンパク質発現モニタリングを行うことができる。同様に、これらのアッセイは、更に個体について行っても良い。
この態様において、膀胱癌核酸プローブが、特定の細胞において膀胱癌配列を検出及び定量するために、本願明細書において概説したようなバイオチップに結合されている。これらのアッセイは、更に下記実施例において説明されている。PCR技術を用い、より大きい感度をもたらすことができる。
【０１９９】
好ましい態様において、膀胱癌タンパク質をコードしている核酸が検出される。膀胱癌タンパク質をコードしているDNA又はRNAは検出することができるが、特に興味深いのは、膀胱癌タンパク質をコードしているmRNAが検出される方法である。mRNAを検出するためのプローブは、mRNAと相補的でありかつハイブリダイズするようなヌクレオチド／デオキシヌクレオチドプローブであることができ、かつオリゴヌクレオチド、cDNA又はRNAを含むが、これらに限定されるものではない。プローブは、本願明細書において定義されたような、検出可能な標識も含むこととする。ひとつの方法において、mRNAは、ナイロン膜のような固体支持体上への試験される核酸の固定、及びこのプローブの試料とのハイブリダイゼーションの後に、検出される。非特異的に結合したプローブを除去するために洗浄した後、標識が検出される。別の方法において、mRNAの検出は、in situにおいて行われる。この方法において、透過性とされた細胞又は組織試料は、検出できるように標識された核酸プローブと、このプローブが標的mRNAとハイブリダイズするのに十分な時間、接触させられる。非特異的に結合したプローブを除去するために洗浄した後、標識が検出される。例えば、膀胱癌タンパク質をコードしているmRNAに相補的であるジゴキシゲニン標識したリボプローブ(RNAプローブ)は、ジゴキシゲニンの、抗-ジゴキシゲニン二次抗体との結合、並びにニトロブルーテトラゾリウム及び5-ブロモ-4-クロロ-3-インドイルリン酸による発色により検出される。
【０２００】
好ましい態様において、本願明細書に説明されたようなタンパク質の3種のクラス(分泌型、膜貫通型又は細胞内型タンパク質)の様々なタンパク質が、診断アッセイにおいて使用される。膀胱癌配列を含む膀胱癌タンパク質、抗体、核酸、修飾されたタンパク質及び細胞は、診断アッセイにおいて使用される。これは、個々の遺伝子又は対応するポリペプチドレベルについて行うことができる。好ましい態様において、発現プロファイルは、好ましくはハイスループットスクリーニング技術と組合せて使用され、遺伝子及び／又は対応するポリペプチドの発現プロファイルのモニタリングを可能にする。
【０２０１】
本願明細書において説明されかつ定義されたように、細胞内型、膜貫通型又は分泌型タンパク質を含む膀胱癌タンパク質は、膀胱癌の診断又は予後判定用マーカーとしての用途が認められるか、又は発現プロファイル及び保存データを基にした療法の選択を補助する。膀胱癌と推定される組織におけるこれらのタンパク質の検出は、膀胱癌の検出又は診断を可能にする。ひとつの態様において、抗体が、膀胱癌タンパク質の検出に使用される。好ましい方法は、ゲル(典型的には、変性及び還元型タンパク質ゲルであるが、等電点ゲルなどのような、他の種類のゲルであることもできる)上での電気泳動により、試料からタンパク質を分離する。タンパク質の分離後、膀胱癌タンパク質は、例えば、膀胱癌タンパク質に対して生じた抗体によるイムノブロッティングにより検出される。イムノブロッティング法は、当業者に周知である。
【０２０２】
別の好ましい方法において、膀胱癌タンパク質に対する抗体は、例えば、組織学(例えば、Methods in Cell Bology: Antibodies in Cell Biology、第37巻(Asai編集、1993年))において、in situ画像形成技術における用途が分かっている。この方法において、細胞は、膀胱癌タンパク質(複数)に対する1種から多種までの抗体と接触される。非特異的に結合した抗体を除去するために洗浄した後、1種又は複数の抗体の存在が検出される。ひとつの態様において、この抗体は、検出可能な標識を含む二次抗体と共にインベーションすることにより検出される。別の方法において、膀胱癌タンパク質(複数)に対する一次抗体は、検出可能な標識、例えば、基質に作用することができる酵素マーカーを含む。別の好ましい態様において、複数の一次抗体の各々は、識別できかつ検出可能な標識を含む。この方法は、複数の膀胱癌タンパク質に関する同時スクリーニングにおける特定の用途を見いだす。多くの他の組織学的画像形成技術も、本発明により提供されることは、当業者に理解されるであろう。
【０２０３】
好ましい態様において、標識は、異なる波長の放出を検出及び識別する能力を有する蛍光光度計により検出される。加えて、蛍光標示式細胞分取器(FACS)を、この方法において使用することができる。
【０２０４】
別の好ましい態様において、抗体は、血液、血清、血漿、糞便、尿及び他の試料中の膀胱癌の診断における用途を認めている。従ってこのような試料は、膀胱癌タンパク質の存在について探索又は試験される試料として有用である。抗体は、ELISA、イムノブロッティング(ウェスタンブロット)、免疫沈降、BIACORE技術などを含む、先に説明したイムノアッセイ技術により、膀胱癌タンパク質を検出するために使用することができる。逆に抗体の存在は、内在性膀胱癌タンパク質に対する免疫応答を示すことができる。
【０２０５】
好ましい態様において、標識された膀胱癌核酸プローブの組織アレイへのin situハイブリダイゼーションが行われる。例えば、膀胱癌組織及び／又は正常組織を含む組織試料のアレイが作成される。その後in situハイブリダイゼーション(例えば、Ausubel、前掲参照)が行われる。個体と標準の間でフィンガープリントを比較する場合に、当業者は、その所見を基に診断、予後判定又は推定を行うことができる。更に、診断を示す遺伝子は、予後を示すものとは異なることがあり、及び細胞の状態の分子プロファイリングは、反応性又は難治性の状態の識別につながり、もしくは転帰を推定することができることが理解される。
【０２０６】
好ましい態様において、膀胱癌配列を含む膀胱癌タンパク質、抗体、核酸、修飾されたタンパク質及び細胞は、予後判定アッセイにおいて使用することができる。前記のように、例えば長期予後判定に関して、膀胱癌、臨床、病理、又は他の情報と相関する遺伝子発現プロファイルを作成することができる。再度これは、タンパク質又は遺伝子レベルのいずれかについて行うことができ、遺伝子の使用が好ましい。単独又は複数の遺伝子が、様々な組合せにおいて有用であることができる。前記のように、膀胱癌プローブは、組織又は患者における膀胱癌配列の検出及び定量のために、バイオチップに結合することができる。これらのアッセイは、診断に関して先に概説したように進行される。PCR法は、より感度の良い正確な定量を提供することができる。
【０２０７】
治療的化合物のアッセイ
好ましい態様において、本願明細書に説明されたタンパク質、核酸及び抗体の一員が、薬物スクリーニングアッセイにおいて使用される。膀胱癌配列を含む膀胱癌タンパク質、抗体、核酸、修飾されたタンパク質及び細胞は、薬物スクリーニングアッセイにおいて、又は「遺伝子発現プロファイル」もしくはポリペプチドの発現プロファイルに対する薬物候補の作用の評価により使用される。好ましい態様において、発現プロファイルが使用され、好ましくは候補物質による処理後、発現プロファイル遺伝子についてモニタリングすることができるハイスループットスクリーニング技術と組合せて、使用される。例えば、Zlokarnikら、Science、279:84-8 (1998)；Heid、Genome Res、6:986-94 (1996)参照のこと。
【０２０８】
好ましい態様において、未変性の又は修飾された膀胱癌タンパク質を含む膀胱癌タンパク質、抗体、核酸、修飾されたタンパク質及び細胞が、スクリーニングアッセイにおいて使用される。すなわち、本発明は、膀胱癌表現型又は同定された膀胱癌タンパク質の生理的機能を変調する組成物についてスクリーニングするための新規方法を提供する。前述のように、これは個々の遺伝子レベルについて又は薬物候補の「遺伝子発現プロファイル」に対する作用の評価により行うことができる。好ましい態様において、発現プロファイルが使用され、好ましくは候補物質による処理後、発現プロファイル遺伝子についてモニタリングすることができるハイスループットスクリーニング技術と組合せて使用され、これについては前掲のZlokarnikらの論文を参照のこと。
【０２０９】
ここで差次的に発現された遺伝子が同定され、様々なアッセイが実行される。好ましい態様において、アッセイは、個々の遺伝子又はタンパク質レベルについて試行することができる。すなわち、膀胱癌においてアップレギュレーションされたような特定の遺伝子を同定し、被験化合物を、遺伝子発現を変調する能力又は膀胱癌タンパク質への結合についてスクリーニングすることができる。従って「変調」は、遺伝子発現の増加又は減少の両方を含む。変調の好ましい量は、正常組織、対、膀胱癌罹患した組織における遺伝子発現の当初の変化によって決まり、この変化は、少なくとも10％、好ましくは50％、より好ましくは100〜300％、及び一部の態様においては300〜1000％又はそれよりも多いであろう。従って、遺伝子が正常組織と比べ膀胱癌組織において4倍の増加を示す場合は、約4-倍の減少が望ましいことが多く；同様に、正常組織と比べ膀胱癌組織における10倍の減少は、被験化合物により誘導される発現の10-倍の増加の目標値を提供することが多い。
【０２１０】
遺伝子発現の量は、核酸プローブ及び遺伝子発現レベルの定量を用いてモニタリングするか、あるいは、遺伝子産物それ自身を、例えば膀胱癌タンパク質に対する抗体の使用及び標準のイムノアッセイにより、モニタリングすることができる。プロテオミクス及び分離技術も、発現の定量が可能である。
【０２１１】
好ましい態様において、多くの実体の遺伝子発現又はタンパク質モニタリングすなわち、発現プロファイルは、同時にモニタリングされる。このようなプロファイルは、典型的には本願明細書において説明された複数のこのような実体に関連するであろう。
【０２１２】
この態様において、特定の細胞における膀胱癌配列の検出及び定量のために、本願明細書に概説したように、膀胱癌核酸プローブは、バイオチップに結合することができる。あるいは、PCRを使用することができる。従って、望ましいウェル中の分配されたプライマーを伴う一連のもの、例えばマイクロタイタープレートを使用することができる。次にPCR反応を、各ウェルについて行いかつ分析することができる。
【０２１３】
発現のモニタリングは、1種又は複数の膀胱癌-関連配列、例えば、表1A-13に示したポリヌクレオチド配列の発現を修飾する化合物を同定するために行うことができる。一般に好ましい態様において、被験モジュレーターは、分析前に細胞に添加される。更に、膀胱癌を変調するか、膀胱癌タンパク質を変調するか、膀胱癌タンパク質に結合するか、もしくは膀胱癌タンパク質と抗体又は他の結合パートナーとの結合を妨害するような物質を同定するためのスクリーニングも提供される。
【０２１４】
本願明細書において使用される用語「被験化合物」又は「薬物候補」又は「モジュレーター」又は文法上の同等物は、膀胱癌表現型、又は例えば、核酸もしくはタンパク質配列のような膀胱癌配列の発現を直接的又は間接的に変更する能力について試験される、分子、例えば、タンパク質、オリゴペプチド、小有機分子、多糖、ポリヌクレオチド等を説明する。好ましい態様において、モジュレーターは、本願明細書に提供された核酸又はタンパク質の発現プロファイルを変更する。ひとつの態様において、モジュレーターは、例えば正常な組織又は非悪性のフィンガープリントへと、膀胱癌の表現型を抑制する。別の態様において、モジュレーターは、膀胱癌の表現型を誘導する。一般に、複数のアッセイ混合物が、異なる物質濃度で平行して試行され、様々な濃度に対する差次的反応が得られる。典型的には、これらの濃度のひとつは陰性対照、例えばゼロ濃度又は検出レベル未満として利用する。
【０２１５】
薬物候補は、多くの化学物質の種類を包含しているが、典型的にはこれらは有機分子、好ましくは約100ダルトンより大きく約2,500ダルトン未満の分子量を有する小有機化合物である。好ましい小分子は、約2000未満、又は約1500未満もしくは約1000未満もしくは約500D未満である。候補物質は、タンパク質、特に水素結合との構造的相互作用に必要な官能基を含み、並びに典型的には、少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシル又はカルボキシル基を含み、好ましくは少なくとも2個の官能化学基を含む。これらの候補物質は、1個又は複数の前記官能基で置換された環式炭素又はヘテロ環式構造及び／又は芳香族又はポリ芳香族(polyaromatic)構造を含むことが多い。同じく候補物質は、ペプチド、糖質、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、それらの誘導体、構造アナログ又は組合せを含む、生体分子間で認められる。特にペプチドが好ましい。
【０２１６】
ひとつの局面において、モジュレーターは、膀胱癌タンパク質の作用を中和するであろう。「中和」は、タンパク質の活性及び結果としての細胞に対する作用が阻害又は阻止されることを意味する。
【０２１７】
ある態様において、可能性のあるモジュレーターのコンビナトリアルライブラリーが、膀胱癌ポリペプチドに結合する能力又は活性を変調する能力についてスクリーニングされるであろう。慣習的に、有用な特性を有する新規化学実体は、例えば阻害活性のような、いくつかの望ましい特性又は活性を伴う、化学化合物(「リード化合物」と称される)の同定、このリード化合物の変種の作成、並びにこれらの変種化合物の特性及び活性の評価によりもたらされる。ハイスループットスクリーニング(HTS)法が、このような分析に使用されることが多い。
【０２１８】
ひとつの好ましい態様において、ハイスループットスクリーニング法は、多数の可能性のある治療的化合物(候補化合物)を含むライブラリーを提供することに関する。その後このような「コンビナトリアルケミカルライブラリー」は、1種又は複数のアッセイにおいてスクリーニングされ、望ましい特徴的活性を展示するそのようなライブラリーメンバー(特定の化学種又はサブクラス)を同定する。こうして同定された化合物は、従来型の「リード化合物」として利用するか、もしくはこれらを可能性のある治療又は実際の治療として使用することができる。
【０２１９】
コンビナトリアルケミカルライブラリーは、試薬のような多くのケミカル「ビルディングブロック」を組合せることによる化学合成又は生物学的合成のいずれかにより作成された、多様な化学化合物の収集である。例えば、ポリペプチド(例えばムテイン)ライブラリーのような、線形(linear)コンビナトリアルケミカルライブラリーは、所定の化合物長(例えば、ポリペプチド化合物中のアミノ酸の数)について全ての可能性のある方法で、アミノ酸と称されるケミカルビルディングブロックのセットを組合せることにより作成される。数百万の化学化合物を、ケミカルビルディングブロックのこのようなコンビナトリアル混合により合成することができる。例えば、Gallopら、J. Med. Chem.、37:1233-1251 (1994)参照のこと。
【０２２０】
コンビナトリアルケミカルライブラリーの調製及びスクリーニングは、当業者に周知である。このようなコンビナトリアルケミカルライブラリーは、ペプチドライブラリー(例えば、米国特許第5,010,175号、Furka、Pept. Prot. Res.、37:487-493 (1991)、Houghtonら、Nature、354:84-88 (1991)参照)；ペプトイド(PCT公開国際公開公報第91/19735号)；コードされたペプチド(PCT公開国際公開公報第93/20242号)；ランダム生体-オリゴマー(PCT公開国際公開公報第92/00091号)；ベンゾジアゼピン(米国特許第5,288,514号)；ヒダントイン、ベンゾジアゼピン及びジペプチドのようなダイバーソマー(diversomer) (Hobbsら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90:6909-6913 (1993))；ビニル性ポリペプチド(Hagiharaら、J. Amer. Chem. Soc.、114:6568-6570 (1992))；β-D-グルコース足場を伴う非ペプチド擬態(Hirschmannら、J. Amer. Chem. Soc.、114:9217-9218 (1992))；小化合物ライブラリーのアナログ性有機合成(Chenら、J. Amer. Chem. Soc.、116:2661-2662 (1994))；オリゴカルバメート(Choら、Science、261:1303-1305 (1993))；及び／又はペプチジルホスホネート(Campbellら、J. Org. Chem.、59:658-xxx (1994))を含むが、これらに限定されるものではない。一般的には、Gordonらの論文(J. Med. Chem.、37:1385 (1994))、核酸ライブラリー(例えば、Strategene社参照)；ペプチド核酸ライブラリー(例えば、米国特許第5,539,083号参照)；抗体ライブラリー(例えば、Vaughnら、Nature Biotechnology、14:309-314 (1996)、及びPCT/US96/10287号参照)；糖質ライブラリー(例えば、Liangら、Science、274:1520-1522 (1996)；及び米国特許第5,593,853号参照)；並びに小有機分子ライブラリー(例えば、ベンゾジアゼピン、Baum、C&E News、1993年1月18日、33頁；イソプレノイド(米国特許第5,569,588号)；チアゾリジノン及びメタチアザノン(米国特許第5,549,974号)；ピロリジン(米国特許第5,525,735号及び第5,519,134号)；モルホリノ化合物(米国特許第5,506,337号)；ベンゾジアゼピン(米国特許第5,288,514号)などを参照のこと。
【０２２１】
コンビナトリアルライブラリー調製のための装置は、市販されている。例えば、357MPS、390MPS、Advanced Chem Tech社(ルイスビル、KY)、Symphony、Rainin社(ウォバーン、MA)、433A、Applied Biosystems社(フォスターシティ、CA)、9050 Plus、Millipore社(ベッドフォード、MA)など参照。
【０２２２】
多くの周知のロボットシステムも、液相化学のために開発されている。これらのシステムは、武田化学工業社(大阪、日本)により開発された自動合成装置、並びに化学者により行われる手作業による合成操作を模倣する、ロボットアームを利用する多くのロボットシステム(Zymate II、Zymark社(ホプキントン、MA)；Orca、Hewlett-Packard社(パロアルト、CA))のような、自動化されたワークステーションを備えている。前述の装置は、本発明での使用に適している。これらの装置の特徴並びに本願明細書において説明されたように操作することができるようにする改良の履行(あるとすれば)は、当業者には明らかであろう。加えて多くのコンビナトリアルライブラリーが、それら自身市販されている(例えば、ComGenex社(プリンストン、NJ)、Asinex社(モスクワ、ロシア)、Tripos社(セントルイス、MO)、ChemStar社(モスクワ、ロシア)、3D Pharmaceuticals社(エキソン、PA)、Martek Biosciences社(コロンビア、MD)など参照)。
【０２２３】
モジュレーターを同定するためのアッセイは、ハイスループットスクリーニングに順応させやすい。従って好ましいアッセイは、膀胱癌遺伝子転写、ポリペプチド発現の阻害又は増強、及びポリペプチド活性の阻害又は増強を検出する。
【０２２４】
特定の核酸又はタンパク質産物の存在、非存在、定量又は他の特性を評価するためのハイスループットアッセイは、当業者に周知である。同じく結合アッセイ及びレポーター遺伝子アッセイも、同様に周知である。従って、例えば、米国特許第5,559,410号は、タンパク質のハイスループットスクリーニング法を開示し、米国特許第5,585,639号は、核酸結合(例えば、アレイ内)のハイスループットスクリーニング法を開示する一方で、米国特許第5,576,220号及び第5,541,061号は、リガンド／抗体結合スクリーニングのハイスループット法を開示している。
【０２２５】
加えて、ハイスループットスクリーニングシステムが市販されている(例えば、Zymark社(ホプキントン、MA)；Air Technical Industries社(メントール、OH)；Beckman Instruments社(フラートン、CA)；Precision Systems社(ナチック、MA)など参照)。これらのシステムは、典型的には、試料及び試薬のピペッティング、液体分注、時間を区切ったインキュベーション、及びアッセイに適した検出装置(複数)内のマイクロプレートの最終判読を含む手順が自動化されている。これらの構成可能なシステムは、高処理量及び迅速な開始、更には高度の柔軟性及び特別注文を提供する。このようなシステムの製造業者は、様々なハイスループットシステムに関する詳細なプロトコールを提供している。従って、例えばZymark社は、遺伝子転写、リガンド結合などの変調を検出するための、スクリーニングシステムを説明している技術会報を提供している。
【０２２６】
ひとつの態様において、モジュレーターは、タンパク質であり、天然のタンパク質又は天然のタンパク質の断片であることが多い。従って、例えば、タンパク質を含有する細胞抽出物、又はタンパク質性細胞抽出物のランダムもしくは指定された消化産物も使用することができる。この方法において、タンパク質ライブラリーを、本発明の方法のスクリーニングにより作成することができる。この態様において特に好ましいのは、細菌、真菌、ウイルス、及び哺乳類のタンパク質のライブラリーであり、後者が好ましく、かつヒトタンパク質が特に好ましい。特に有用な被験化合物は、標的が属するタンパク質のクラス、例えば酵素の基質又はリガンド及び受容体に対し示されるであろう。
【０２２７】
好ましい態様において、モジュレーターは、約5〜約30個のアミノ酸のペプチドであるが、ここで約5〜約20個のアミノ酸が好ましく、かつ約7〜約15個が特に好ましい。これらのペプチドは、先に概説したように天然のタンパク質の消化産物、ランダムペプチド、又は「バイアスがかかった(biased)」ランダムペプチドである。本願明細書において「ランダム化された」又は文法上の同等物は、核酸及びペプチドが、各々、本質的にランダムヌクレオチド及びアミノ酸からなることを意味する。概してこれらのランダムペプチド(又は以下に考察される核酸)は、化学的に合成されるので、これらは、ヌクレオチド又はアミノ酸置換に取込むことができる。この合成法は、配列の長さにわたる可能性のある組合せの全て又はほとんどの形成が可能であるように、ランダム化されたタンパク質又は核酸を作成するためにデザインすることができ、従ってランダム化された候補生体活性タンパク質性物質のライブラリーを形成することができる。
【０２２８】
ひとつの態様において、このライブラリーは、完全にランダム化されており、配列の優先又は一定のものはない。好ましい態様において、このライブラリーはバイアスがかかっている。すなわち、この配列内のいくつかの位置が、一定に保たれるか、又は限定数の可能性から選択される。例えば好ましい態様において、ヌクレオチド又はアミノ酸残基は、核酸結合ドメインの形成、架橋のためのシステイン、SH-3ドメインのためのプロリン、リン酸化部位のためのセリン、トレオニン、チロシン又はヒスチジンの形成などに対して、又はプリンなどに対して、例えば、疎水性アミノ酸、親水性残基、立体的にバイアスのかかった(小又は大のいずれかの)残基のような定義されたクラス内で無作為化されている。
【０２２９】
膀胱癌のモジュレーターは、先に定義したように、核酸であることもできる。
先に全般的にタンパク質について説明したように、核酸変調物質は、天然の核酸、ランダム核酸、又は「バイアスがかかった」ランダム核酸であることができる。原核又は真核ゲノムの消化産物を、タンパク質について先に概説したように使用することができる。
好ましい態様において、候補化合物は、有機化学物質の部分であり、多種多様なそれを、文献から入手することができる。
【０２３０】
候補物質を添加しかつ細胞をある程度の期間インキュベーションした後、分析されるべき標的配列を含有する試料をバイチップに添加する。必要ならば、標的配列は、公知の技術を用いて調製される。例えば、試料は、公知の溶解緩衝液、電気穿孔などを用い、細胞を溶解するように処理し、精製及び／又はPCRのような増幅で適宜行われる。例えば、ヌクレオチドに共有結合した標識によるin vitro 転写が行われる。一般に、核酸は、ビオチン-FITCもしくはPEにより、又はcy3もしくはcy5により標識される。
【０２３１】
好ましい態様において、標的配列は、例えば、蛍光的、化学発光的、化学的、又は放射性シグナルにより標識され、プローブに対する標的配列に特異的な結合を検出する手段を提供する。この標識は更に、アルカリホスファターゼ又はホースラディッシュペルオキシダーゼのような酵素であることもでき、これらは適当な基質と共に提供された場合、検出することができる生成物を生じる。あるいは、標識は、酵素と結合するが、酵素により触媒も変更もされない酵素インヒビターのような、標識された化合物又は小分子であることができる。この標識は、エピトープタグ又はストレプトアビジンに特異的に結合するビオチンのような、部分又は化合物であることもできる。ビオチンの例について、ストレプトアビジンは、前述のように標識され、これにより、結合した標的配列について検出可能なシグナルを提供する。未結合の標識されたストレプトアビジンは、典型的には、分析の前に取り除かれる。
【０２３２】
当業者に理解されるように、これらのアッセイは、直接ハイブリダイゼーションアッセイであるか、又は複数のプローブの使用を含む「サンドイッチアッセイ」を含むことができ、これらは一般に米国特許第5,681,702号、第5,597,909号、第5,545,730号、第5,594,117号、第5,591,584号、第5,571,670号、第5,580,731号、第5,571,670号、第5,591,584号、第5,624,802号、第5,635,352号、第5,594,118号、第5,359,100号、第5,124,246号及び第5,681,697号に開示されており、これらは全て本願明細書に参照として組入れられている。この態様において、一般に、標的核酸は、先に概説したように調製され、かつ次にハイブリダイゼーション複合体の形成を可能にするような条件下で、複数の核酸プローブを含むバイオチップに添加される。
【０２３３】
様々なハイブリダイゼーション条件を、本発明において使用することができ、これは、先に概説したような、高、中及び低ストリンジェンシー条件を含む。これらのアッセイは、一般に標的の存在下でのみ、標識プローブハイブリダイゼーション複合体の形成を可能にするようなストリンジェンシー条件下で行われる。ストリンジェンシーは、温度、ホルムアミド濃度、塩濃度、カオトロピック塩濃度、pH、有機溶媒濃度などを含むが、これらに限定されるものではない、熱力学的に変動可能な工程パラメータの変更により制御することができる。
これらのパラメータは、非特異的結合を制御するためにも使用することができ、これは米国特許第5,681,697号に開示されている。従って非特異的結合を低下するために、高ストリンジェンシー条件である工程を行うことが望ましいことがある。
【０２３４】
本願明細書に概説した反応は、様々な方法で実現することができる。この反応の成分は、以下に概説した好ましい態様において、同時、又は異なる順番で逐次添加することができる。加えて、この反応は、様々な他の試薬を含有することができる。これらは、塩、緩衝液、中性タンパク質、例えばアルブミンなど、界面活性剤などを含み、これらは、最適なハイブリダイゼーション及び検出を促進し、並びに／又は非特異的又はバックグラウンド相互作用を低下するために使用される。さもなければアッセイ効率を改善する試薬、例えばプロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗微生物剤なども、試料調製法及び標的の純度に応じて、適宜使用することができる。
【０２３５】
このアッセイデータは、個々の遺伝子の発現レベル、及びそれらの状態間で発現レベルの変化を決定するために分析され、遺伝子発現プロファイルを作成する。
【０２３６】
スクリーニングは、膀胱癌表現型のモジュレーターを同定するために行われる。ひとつの態様において、スクリーニングは、特定の発現プロファイルを誘導又は抑制することができるモジュレーターを同定する、従って好ましくは関連した表現型を作成するために行われる。別の態様において、例えば、特定の状態において重要な差次的に発現されている遺伝子が同定される診断適用に関して、スクリーニングは、個々の遺伝子の発現を変更するモジュレーターを同定するために行うことができる。別の態様において、スクリーニングは、差次的に発現された遺伝子の発現産物の生物学的機能を変更するモジュレーターを同定するために行われる。再度、特定の状態の遺伝子の重要性を同定するために、遺伝子産物に結合し及び／又はその生物学的活性を変調する物質を同定し、又は遺伝子多型を評価するスクリーニングが行われる。
【０２３７】
加えて、候補物質に反応して誘導される遺伝子についてスクリーニングすることができる。正常な発現パターンにつながる膀胱癌発現パターンを抑制する能力、又は正常な組織由来の遺伝子の発現を模倣するように単独の膀胱癌遺伝子発現プロファイルを変調するその能力を基にモジュレーターを同定した後、前述のスクリーニングを行い、該物質に反応して特異的に変調されている遺伝子を同定することができる。正常な組織と物質で処理した膀胱癌組織の間の発現プロファイルの比較は、正常な組織又は膀胱癌組織においては発現されないが、物質処理した組織において発現される遺伝子を明らかにする。これらの物質-特異的配列は、膀胱癌遺伝子又はタンパク質について本願明細書に説明された方法により同定しかつ使用することができる。特にこれらの配列及びタンパク質において、これらは、物質処理した細胞の作成又は同定における用途が見つかる。加えて、抗体は、この物質が誘導したタンパク質に対して生じ、かつ治療した膀胱癌組織試料に対する新規療法を標的化するために使用することができる。
【０２３８】
従ってひとつの態様において、被験化合物は、膀胱癌発現プロファイルに関連している膀胱癌細胞の集団に投与される。本願明細書において「投与」又は「接触」は、取込み及び細胞内作用によるか、もしくは細胞表面での作用のいずれかにより、候補物質が細胞に作用することができるような方法で、候補物質が、細胞に添加されることを意味する。一部の態様において、タンパク質性候補物質(例えば、ペプチド)をコードしている核酸は、アデノウイルス又はレトロウイルス構築体のようなウイルス構築体に組込み、並びに細胞に添加することができ、その結果そのペプチド物質の発現が実現され、これは例えば、PCT US97/01019号に開示されている。調節可能な遺伝子治療システムも使用され得る。
【０２３９】
一旦被験化合物が細胞へ投与されたならば、これらの細胞は、望ましいならば洗浄され、かつ好ましくは生理的条件下で一定期間インキュベーションすることができる。その後、以下に概説したように、これらの細胞は、収集され、かつ新規遺伝子発現プロファイルが作成される。
【０２４０】
従って、例えば膀胱癌又は非悪性の組織は、膀胱癌表現型を変調、例えば、誘導又は抑制する物質についてスクリーニングすることができる。発現プロファイルの少なくとも1種の、好ましくは多くの遺伝子の変化は、その物質が、膀胱癌活性に対する作用を有することを示している。膀胱癌表現型に関するこのようなサイン(signature)を同定することにより、その表現型を変更する新規薬物のスクリーニングを考案することができる。この方法により、薬物標的を知る必要はなく、かつ当初の発現スクリーニングプラットフォームにおいて表わされる必要もなく、更に標的タンパク質の転写産物レベルが変化する必要もない。
【０２４１】
好ましい態様において、前述のように、個別の遺伝子及び遺伝子産物(タンパク質)に対しスクリーニングを行うことができる。すなわち、特定の状態において重要なものとして特定の差次的に発現された遺伝子が同定され、遺伝子又はそれ自身の遺伝子産物のいずれかの発現の変調のスクリーニングを行うことができる。差次的に発現された遺伝子の遺伝子産物は、本願明細書において、「膀胱癌タンパク質」又は「膀胱癌変調タンパク質」と称される。この膀胱癌変調タンパク質は、表1A-13の核酸によりコードされた断片であるか、あるいは断片に対する完全長タンパク質であることができる。好ましくは、膀胱癌変調タンパク質は、断片である。好ましい態様において、配列同一性又は類似性を決定するために使用される膀胱癌アミノ酸配列は、表1A-13の核酸によりコードされている。別の態様において、配列は、表1A-13の核酸によりコードされたタンパク質の天然のアレル変種である、別の態様において、配列は、更に本願明細書に説明された配列変種である。
【０２４２】
好ましくは、膀胱癌変調タンパク質は、およそ14〜24個のアミノ酸長の断片である。より好ましくは、断片は、可溶性断片である。好ましくは、この断片は、非膜貫通領域を含む。好ましい態様において、この断片は、可溶性を補助するために、N-末端Cysを有する。ひとつの態様において、この断片のC-末端は、遊離酸として維持され、及びN-末端は、遊離アミンであり、例えば、システインへの結合を補助する。
ひとつの態様において、膀胱癌タンパク質は、本願明細書において考察されたように、免疫原性物質と複合される。ひとつの態様において、膀胱癌タンパク質は、BSAへ複合される。
【０２４３】
膀胱癌ポリペプチド活性、又は膀胱癌もしくは膀胱癌表現型の測定は、様々なアッセイを用いて行うことができる。例えば、膀胱癌ポリペプチドの機能に対する被験化合物の作用は、先に説明したパラメータを試験することにより測定することができる。活性に影響を及ぼす適当な生理的変化は、被験化合物の本発明のポリペプチドに対する影響を評価するために使用することができる。未変性の細胞又は動物を用いて機能的結果が決定される場合、腫瘍に関連した膀胱癌の症例における、腫瘍成長、腫瘍転移、新血管形成、ホルモン放出、公知の及び特徴未決定の両遺伝子マーカーの転写変化(例えば、ノーザンブロット)、細胞増殖又はpH変化のような細胞代謝の変化、並びにcGMPのような細胞内セカンドメッセンジャーの変化などの、様々な作用を測定することもできる。本発明のアッセイにおいて、哺乳類の、例えば、マウス、好ましくはヒトの膀胱癌ポリペプチドが、典型的には使用される。
【０２４４】
活性を変調する化合物を同定するアッセイは、in vitroにおいて行うことができる。例えば、膀胱癌ポリペプチドは、最初に可能性のあるモジュレーターと接触され、かつ適当な時間、例えば、0.5〜48時間インキュベーションされる。ひとつの態様において、膀胱癌ポリペプチドレベルは、タンパク質又はmRNAのレベルの測定により、in vitroにおいて決定される。タンパク質のレベルは、膀胱癌ポリペプチド又はそれらの断片に選択的に結合する抗体による、ウェスタンブロット、ELISAなどのような、イムノアッセイを用いて決定される。mRNAの測定に関し、例えばPCR、LCRを使用する増幅、又は例えばノーザンハイブリダイゼーション、RNAse保護、ドットブロットのようなハイブリダイゼーションアッセイが好ましい。本願明細書に説明されたように、タンパク質又はmRNAのレベルは、直接的又は間接的に標識された検出物質、例えば蛍光又は放射性標識された核酸、放射性又は酵素的に標識された抗体などを用いて検出される。
【０２４５】
あるいは、レポーター遺伝子システムは、ルシフェラーゼ、グリーン蛍光タンパク質、CAT、又はβ-galのような、レポーター遺伝子に機能的に連結された膀胱癌タンパク質プロモーターを用いて考案することができる。このレポーター構築体は、典型的には細胞へトランスフェクションされる。可能性のあるモジュレーターによる処理後、レポーター遺伝子の転写、翻訳又は活性の量が、当業者に公知の標準技法に従い測定される。
【０２４６】
好ましい態様において、先に概説したように、スクリーニングは、個々の遺伝子及び遺伝子産物(タンパク質)について行うことができる。すなわち、特定の差次的に発現された遺伝子が特定の状態において重要であると同定されたならば、その遺伝子又はそれ自身の遺伝子産物の発現モジュレーターのスクリーニングを行うことができる。差次的に発現された遺伝子の遺伝子産物は、本願明細書において時には「膀胱癌タンパク質」と称されることがある。この膀胱癌タンパク質は、断片であるか、あるいは本願明細書に示された断片に対する完全長タンパク質であることができる。
【０２４７】
ひとつの態様において、特異的遺伝子の発現のモジュレーターのスクリーニングが行われる。典型的には、わずかにひとつの又は2、3種の遺伝子の発現が評価される。別の態様において、スクリーニングは、最初に差次的に発現されたタンパク質に結合する化合物を見つけるようにデザインされる。次にこれらの化合物は、差次的に発現された活性を変調する能力について評価される。更に、一旦最初の候補化合物が同定されたならば、構造活性相関のより良い評価のために変種を更にスクリーニングすることができる。
【０２４８】
好ましい態様において、結合アッセイが行われる。一般に、精製又は単離された遺伝子産物が使用され；すなわち、1種又は複数の差次的に発現された核酸の遺伝子産物が作成される。例えば、抗体は、タンパク質遺伝子産物に対して作成され、かつ標準のイムノアッセイが、存在するタンパク質の量を決定するために試行される。あるいは、膀胱癌タンパク質を含有する細胞を、これらのアッセイにおいて使用することができる。
【０２４９】
従って、好ましい態様において、これらの方法は、膀胱癌タンパク質及び候補化合物を一緒にし、かつ化合物の膀胱癌タンパク質への結合を決定することを含む。好ましい態様は、ヒト膀胱癌タンパク質を利用するが、例えばヒト疾患の動物モデルの開発のために、他の哺乳類タンパク質も使用することができる。一部の態様において、本願明細書に概略されるように、変種又は誘導体の膀胱癌タンパク質を使用してもよい。
【０２５０】
一般に、本願明細書の方法の好ましい態様において、膀胱癌タンパク質又は候補物質は、単離された試料受け取り領域(例えば、マイクロタイタープレート、アレイなど)を有する不溶性支持体に非-拡散性に結合される。これらの不溶性支持体は、それに組成物が結合することができ、可溶性材料から容易に分離することができ、さもなければスクリーニングの全体的方法と適合性があるような組成物を製造することができる。このような支持体の表面は、固形又は多孔質であり、かついずれか好都合な形状であることができる。適当な不溶性支持体の例は、マイクロタイタープレート、アレイ、膜及びビーズを含む。これらは、典型的にはガラス、プラスチック(例えば、ポリスチレン)、多糖、ナイロン又はニトロセルロース、テフロン(商標)などで製造される。マイクロタイタープレート及びアレイは、少量の試薬及び試料を用い、非常に多くのアッセイを同時に行うことができるので、特に都合が良い。この組成物の結合の具体的方法は、本発明の試薬及び全体的方法と適合性があり、この組成物の活性を維持しかつ非拡散性である限りは重要ではない。結合の好ましい方法は、抗体(タンパク質が支持体に結合した場合に、リガンド結合部位又は活性化配列のいずれも立体的にブロックしない)の使用、「粘着性」又はイオン性支持体への直接結合、化学架橋、その表面上でのタンパク質又は物質の合成などを含む。タンパク質又は物質の結合後、過剰な未結合の材料は、洗浄により除去される。その後試料を受け取る領域は、ウシ血清アルブミン(BSA)、カゼイン又は他の無害なタンパク質又は他の部分と一緒のインキュベーションを通じて、ブロックされ得る。
【０２５１】
好ましい態様において、膀胱癌タンパク質は、支持体に結合され、かつ被験化合物がこのアッセイに添加される。あるいは、この候補物質が、支持体に結合され、かつ膀胱癌タンパク質が添加される。新規結合物質は、特異的抗体、ケミカルライブラリーのスクリーニングにより同定された非天然の結合物質、ペプチドアナログなどを含む。特に関心があるのは、ヒト細胞に対し毒性が低い物質のスクリーニングアッセイである。多種多様なアッセイを、この目的に使用することができ、これは標識されたin vitroタンパク質-タンパク質結合アッセイ、電気泳動移動度シフトアッセイ、タンパク質結合のイムノアッセイ、機能アッセイ(リン酸化アッセイ、など)などを含む。
【０２５２】
被験変調化合物の膀胱癌タンパク質への結合の決定は、多くの方法で行うことができる。好ましい態様において、この化合物は標識され、かつ例えば、膀胱癌タンパク質の全て又は一部の固体支持体への結合、標識された候補物質(例えば、蛍光標識物)の添加、過剰な試薬の洗浄除去、並びに標識物が固相支持体に存在するかどうかの決定により、結合が直接決定される。様々なブロック及び洗浄工程を、適宜利用することができる。
【０２５３】
一部の態様において、ひとつの成分のみが標識され、例えば、タンパク質(又はタンパク質性候補化合物)が標識され得る。あるいは、1種よりも多い成分が、異なる標識、例えばタンパク質のための125I及び化合物のための発蛍光団などにより標識される。近接試薬、例えば消光剤又はエネルギー転移試薬も、有用である。
【０２５４】
ひとつの態様において、被験化合物の結合は、競合的結合アッセイにより決定される。競合相手は、標的分子(例えば、膀胱癌タンパク質)に結合することが分かっている結合部分、例えば、抗体、ペプチド、結合パートナー、リガンドなどである。ある状況下において、化合物とその結合部分の間に競合的結合が存在することがあり、この結合部分はその化合物と置き換わる。ひとつの態様において、被験化合物は標識されている。化合物、又は競合相手のいずれか、もしくは両方が、最初にタンパク質に、存在する場合に結合するのに十分な時間かけて、添加される。インキュベーションは、最適活性を促進する温度で行うことができ、典型的には4〜40℃である。インキュベーション期間は、典型的には、例えば迅速なハイスループットスクリーニングを促進するために、最適化される。典型的には、0.1〜1時間で十分であろう。過剰な試薬は、一般に除去又は洗浄除去される。その後第二の成分が添加され、かつ結合を示すために、標識された成分の存在又は非存在が追跡される。
【０２５５】
好ましい態様において、競合相手が、最初に添加され、引き続き被験化合物が添加される。競合相手の置換えは、被験化合物が膀胱癌タンパク質に結合したことの、従って膀胱癌タンパク質に結合することが可能であるか、又はこれの活性を変調する可能性があることの指標である。この態様において、いずれかの成分が標識され得る。従って、例えば、競合相手が標識される場合、洗浄液中の標識物の存在は、該物質による置換えを示す。あるいは、被験化合物が標識される場合、支持体上の標識の存在は、置換えを示す。
【０２５６】
代わりの態様において、被験化合物が最初に添加され、インキュベーション及び洗浄され、その後競合相手が添加される。競合相手による結合が存在しないことは、この被験化合物は、膀胱癌タンパク質に高親和性で結合されることを示すことができる。従って、被験化合物が標識される場合、競合相手の結合の欠落と組合せられた、支持体上の標識の存在は、この被験化合物が、膀胱癌タンパク質と結合可能であることを示すことができる。
【０２５７】
好ましい態様において、これらの方法は、膀胱癌タンパク質の活性を変調することが可能である物質を同定するための差次的スクリーニングを含む。この態様において、これらの方法は、第一の試料中の膀胱癌タンパク質及び競合相手を一緒にすることを含む。第二の試料は、被験化合物、膀胱癌タンパク質、及び競合相手を含む。この競合相手の結合が、両試料について決定され、かつこれらふたつの試料間の結合の変化又は差異は、膀胱癌タンパク質に結合可能な物質及びその活性を変調する可能性のある物質の存在を示している。すなわち、競合相手の結合が第二の試料と第一の試料とで異なるならば、この物質は、膀胱癌タンパク質に結合することが可能である。
【０２５８】
あるいは、差次的スクリーニングを使用し、未変性の膀胱癌タンパク質に結合するが、修飾された膀胱癌タンパク質には結合することができない薬物候補が同定される。膀胱癌タンパク質の構造は、モデル化することができ、かつその部位と相互作用する物質を合成するための理論的ドラッグデザインにおいて使用される。膀胱癌タンパク質の活性に影響する薬物候補も、該タンパク質の活性を増強又は減少するいずれかの能力についての薬物のスクリーニングにより同定される。
【０２５９】
陽性対照及び陰性対照を、これらのアッセイにおいて使用することができる。好ましい対照及び被験試料は、統計学的に有意な結果を得るために、少なくとも3つ組で行われる。全ての試料のインキュベーションには、物質のタンパク質への結合に十分な時間をかける。インキュベーション後、特異的に結合していない物質を含まないように、試料を洗浄し、かつ一般には標識された物質の、結合量を決定する。例えば、放射標識が使用される場合、これらの試料は、シンチレーションカウンターで測定し、結合した化合物の量を決定することができる。
【０２６０】
様々な他の試薬を、スクリーニングアッセイに含むことができる。これらは、最適なタンパク質-タンパク質結合を促進し及び／又は非-特異的もしくはバックグラウンド相互作用を減少するために使用することができるような、塩、中性タンパク質、例えばアルブミン、界面活性剤などの試薬を含む。プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗微生物剤などの、さもなければアッセイ効率を改善する試薬も、使用することができる。これらの成分の混合物は、必要な結合を提供する順番で添加することができる。
【０２６１】
好ましい態様において、本発明は、膀胱癌タンパク質の活性を変調することが可能な化合物をスクリーニングする方法を提供する。これらの方法は、先に定義したように、被験化合物の、膀胱癌タンパク質を含有する細胞への添加を含む。多くの異なる細胞型を、膀胱癌タンパク質をコードしている組換え核酸を含むように、トランスフェクションすることができる。好ましい態様において、候補物質のライブラリーは、複数の細胞において試験される。
【０２６２】
ひとつの局面において、アッセイは、存在もしくは非存在について、例えばホルモン、抗体、ペプチド、抗原、サイトカイン、増殖因子、活動電位、例えば化学療法剤を含む薬理学的物質、放射線、発癌性物質、又は他の細胞(すなわち、細胞-細胞接触)などの生理的シグナルへの曝露前にもしくは曝露後に評価される。別の例において、これらの決定は、細胞周期プロセスの異なる段階で決定される。
【０２６３】
この方法において、膀胱癌物質を変調する化合物が、同定される。薬理学的活性を伴う化合物は、膀胱癌タンパク質の活性を増強又は妨害することができる。一旦同定されると、同様の構造が評価され、その化合物の重要な構造的特徴が同定される。
【０２６４】
ひとつの態様において、膀胱癌細胞の分裂を阻害する方法が提供される。この方法は、膀胱癌インヒビターを投与することを含む。別の態様において、膀胱癌を阻害する方法が提供される。この方法は、膀胱癌インヒビターを投与することを含む。更なる態様において、膀胱癌の細胞又は個体を治療する方法が提供される。この方法は、膀胱癌インヒビターを投与することを含む。ひとつの態様において、膀胱癌インヒビターは、先に考察したような抗体である。別の態様において、膀胱癌インヒビターは、アンチセンス分子である。
以下に説明したような、様々な細胞成長、増殖、及び転移アッセイが、当業者には公知である。
【０２６５】
軟寒天増殖又は懸濁液中コロニー形成
正常な細胞は、接着及び増殖のために、固体基板を必要とする。細胞が形質転換された場合、これらはこの表現型を失い、基板から離れて成長する。例えば、形質転換された細胞は、攪拌した懸濁培養液中又は半固形もしくは軟寒天のような懸濁した半固形培地で増殖することができる。形質転換された細胞は、癌抑制遺伝子によりトランスフェクションされた場合、正常な表現型を再生し、かつ接着及び増殖するために固体基板を必要とする。軟寒天増殖及び懸濁アッセイにおけるコロニー形成を用い、宿主細胞において発現された場合に、異常な細胞増殖及び形質転換を阻害するような膀胱癌配列のモジュレーターを同定することができる。治療的化合物は、攪拌した懸濁培養液中又は半固形もしくは軟質のような懸濁した半固形培地中で増殖する宿主細胞の能力を低下又は排除するであろう。
【０２６６】
軟寒天増殖又は懸濁アッセイにおけるコロニー形成の技術は、Freshneyの、Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique (第3版、1994年)Wiley Liss社に説明されており、これは本願明細書に参照として組入れられている。同じく、前掲のGarkavtsevらの論文(1996)の方法の項も参照し、これは本願明細書に参照として組入れられている。
【０２６７】
増殖の接触阻害及び密度限界
正常細胞は、典型的にはペトリ皿において、それらが他の細胞に接触するまで、平坦及び組織化されたパターンで増殖する。これらの細胞が互いに接触する場合、これらは接触阻害され、かつ増殖停止される。しかし細胞が形質転換されている場合、これらの細胞は接触阻害されず、かつ組織化されていない増殖巣において高密度まで増殖し続ける。従って、形質転換された細胞は、正常細胞よりもより高い飽和密度まで増殖する。これは、正常な周辺細胞の通常のパターン内の増殖巣における細胞又は円形細胞の方向のない単層の形成により、形態学的に検出することができる。あるいは、飽和密度での(3H)-チミジンによる標識指標を用い、増殖の密度限界を測定することができる。前掲のFreshneyの論文(1994)を参照のこと。形質転換された細胞は、癌抑制遺伝子でトランスフェクションされた場合に、正常な表現型を再生し、かつ接触阻害されるようになり、かつより低い密度まで増殖するであろう。
【０２６８】
このアッセイにおいて、飽和密度での(3H)-チミジンによる標識指標は、増殖の密度限界を測定する好ましい方法である。形質転換された宿主細胞は、膀胱癌-関連配列によりトランスフェクションされ、かつ非制限的培地条件において、飽和密度で、24時間増殖される。(3H)-チミジンにより標識された細胞の割合は、オートラジオグラフィーにより決定される。前掲のFreshneyの論文(1994)を参照のこと。
【０２６９】
増殖因子又は血清依存性
形質転換された細胞は、それらの正常な相対物よりもより低い血清依存性を有する(例えば、Temin、J. Natl. Cancer Insti.、37:167-175 (1966)；Eagleら、J. Exp. Med.、131:836-879 (1970)；前掲のFreshneyの論文参照)。これは、一部、形質転換された細胞による様々な増殖因子の放出に起因している。形質転換された宿主細胞の増殖因子又は血清依存性は、対照のそれと比較することができる。
【０２７０】
腫瘍特異マーカーレベル
腫瘍細胞は、それらの正常な相対物よりも増大した量のある種の因子(以後「腫瘍特異マーカー」と称す)を放出する。例えば、プラスミノーゲン活性化因子(PA)は、ヒト神経膠腫から、正常な脳細胞よりも高いレベルで放出される。例えば、「Angiogenesis, tumor vascularization, and potential interference with tumor growth」、Biological Responses in Cancer、178-184頁(Mihich(編集)、1985年、Plenum社)を参照のこと。同様に腫瘍脈管形成因子(TAP)は、それらの正常な相対物よりも高いレベルで腫瘍細胞において放出される。例えば、Folkman、Sem Cancer Biol.、3:89-96 (1992)参照のこと。
【０２７１】
これらの因子の放出を測定する様々な技術が、前掲のFreshneyの論文(1994)に説明されている。同じく、Unklessら、J. Biol. Chem.、249:4295-4305 (1974)；Strickland及びBeers、J. Biol. Chem.、251:5694-5702 (1976)；Whaurら、Br. J. Cancer、42:305-312 (1980)；Gullino、「Angiogenesis, tumor vascularization, and potential interference with tumor growth」、Biological Responses in Cancer、178-184頁 (Mihich(編集) 1985)Plenum社；Freshney、Anticancer Res.、5:111-130(1985)を参照のこと。
【０２７２】
マトリゲルへの浸潤
マトリゲル又はいくつかの他の細胞外マトリックス構成体への浸潤の程度は、膀胱癌-関連配列を変調する化合物を同定するためのアッセイとして使用することができる。腫瘍細胞は、悪性度と、マトリゲル又はいくつかの他の細胞外マトリックス構成体への細胞の浸潤性の間に、良好な相関関係を示している。このアッセイにおいて、腫瘍形成性の細胞が、典型的には、宿主細胞として使用される。これらの宿主細胞における癌抑制遺伝子の発現は、宿主細胞の浸潤性を低下するであろう。
【０２７３】
前掲のFreshneyの論文(1994)に説明された技術を使用することができる。簡単に述べると、宿主細胞の浸潤のレベルは、マトリゲル又はいくつかの他の細胞外マトリックス構成体で被覆されたフィルターを用いて測定することができる。このゲルへの、又はフィルターの遠位側を通った浸透は、浸潤性として等級化することができ、かつ移動した細胞の数及び距離により組織学的に等級化するか、もしくは125Iによる細胞の予備標識及びフィルターの遠位側又は皿の底部での放射能の計測により等級化することができる。例えば、前掲のFreshneyの論文(2000)を参照のこと。
【０２７４】
In vivoにおける腫瘍成長
膀胱癌-関連配列の細胞増殖に対する作用は、トランスジェニック又は免疫抑制したマウスにおいて試験することができる。膀胱癌遺伝子が破壊されたか、もしくは膀胱癌遺伝子が挿入された、ノックアウトトランスジェニックマウスを、作出することができる。ノックアウトトランスジェニックマウスは、相同組換えによる、マウスゲノムの内因性膀胱癌遺伝子部位への、マーカー遺伝子又は他の異種遺伝子の挿入により作出することができる。このようなマウスは、内因性膀胱癌遺伝子の、膀胱癌遺伝子の変異された変種との置換によって、又は例えば発癌物質への曝露による、内因性膀胱癌遺伝子の突然変異によっても作出することができる。
【０２７５】
DNA構築体は、胚性幹細胞の核へ導入される。新たに遺伝子操作された遺伝的病変を含む細胞は、宿主マウス胚へと注入され、これはレシピエント雌に再移植される。これらの胚の一部は、突然変異体細胞株に一部由来した生殖細胞を有するキメラマウスへと発達する。従って、このキメラマウスの繁殖により、導入された遺伝的病変を含むマウスの新規系統を得ることが可能である。例えば、Capecchiら、Science、244:1288-1292 (1989)を参照のこと。キメラ的に標的化されたマウスを作出することができる。例えば、Hoganらの、Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual、CSH Press社(1988)、及びTeratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach、Robertson編集、IRL. Press社、ワシントンD.C.(1987)に従い誘導することができる。
【０２７６】
あるいは、様々な免疫抑制された又は免疫欠損した宿主動物を使用することができる。例えば、遺伝的胸腺欠損「ヌード」マウス(例えば、Giovanellaら、J. Natl. Cancer Inst.、52:921-930 (1974)参照)、SCIDマウス、胸腺摘出マウス、又は放射線照射したマウス(例えば、Bradleyら、Br. J. Cancer、38:263-272 (1978)；Selbyら、Br. J. Cancer、41:52-61 (1980)参照)を、宿主として使用することができる。同系宿主に注入された移植可能な腫瘍細胞(典型的には約106個細胞)は、高割合の事例において浸潤性腫瘍を形成するが、同様の起源の正常細胞は生じないであろう。浸潤性腫瘍を発達した宿主において、膀胱癌-関連配列を発現している細胞が、皮下に注射される。適当な時間の後、好ましくは約4〜8週間の後、腫瘍成長が測定され(例えば、容積によるか又はふたつの最大寸法により)及び対照と比較される。統計学的に有意な(例えば、スチューデントT検定使用)退縮を有する腫瘍は成長が阻害されたと称される。
【０２７７】
膀胱癌のポリヌクレオチドモジュレーター
アンチセンス及びRNAiポリヌクレオチド
ある態様において、膀胱癌-関連タンパク質の活性は、アンチセンスポリヌクレオチド、例えば膀胱癌タンパク質mRNAのような、コーディングmRNA核酸配列に相補的な核酸及びこれに優先して特異的にハイブリダイズすることができるような核酸、もしくはそれらの部分配列の使用により、ダウンレギュレーションされるか、もしくは完全に阻害される。アンチセンスポリヌクレオチドのmRNAへの結合は、このmRNAの翻訳及び／又は安定化を低下する。
【０２７８】
本発明との関連において、アンチセンスポリヌクレオチドは、天然のヌクレオチド、又は天然のサブユニットから形成された合成種もしくはそれらの近接したホモログを含むことができる。アンチセンスポリヌクレオチドは、糖鎖部分又は糖間の連結を変更することもできる。これらの例は、当該技術分野における用途が公知であるホスホロチオエート及び他のイオウ含有種である。アナログは、膀胱癌タンパク質mRNAと効率的にハイブリダイズするように機能する限りは、本発明に包含される。例えば、Isis Pharmaceuticals社、カールスパッド、CA；Sequitor社、ナチック、MAを参照のこと。
【０２７９】
このようなアンチセンスポリヌクレオチドは、組換え手段を用い、容易に合成することができるか、もしくはin vitroにおいて合成することができる。このような合成のための装置は、Applied Biosystems社を含む、いくつかの供給業者から販売されている。ホスホロチオエート及びアルキル化された誘導体のような他のオリゴヌクレオチドの調製も周知である。
【０２８０】
本願明細書において使用されるアンチセンス分子は、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを含む。センスオリゴヌクレオチドは、例えば、アンチセンス鎖への結合により転写をブロックするために使用することができる。アンチセンス及びセンスオリゴヌクレオチドは、膀胱癌分子について標的mRNA(センス)又はDNA(アンチセンス)配列に結合することが可能な一本鎖核酸配列(RNA又はDNAのいずれか)を含む。アンチセンス分子は、表1A-13の膀胱癌配列について、もしくはそれらのリガンド又はアクチベーターについてが好ましい。本発明のアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、一般に少なくとも約14個のヌクレオチド、好ましくは約14〜30個のヌクレオチドである断片を含む。所定のタンパク質をコードしているcDNA配列を基に、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを誘導する能力は、例えばStein及びCohenの論文(Cancer Res.、48:2659-2668 (1988))及びvan der Krolらの論文(BioTechniques、6:958-976 (1988))に説明されている。
【０２８１】
RNA干渉は、配列特異的方法で遺伝子発現を抑制する機序である。例えば、Brumelkampら、Sciencexpress、(2002年3月21日)；Sharp、Genes Dev.、13:139-141 (1999)；及び、Cathew、Curr. Op. Cell Biol.、13:244-248 (2001)を参照のこと。哺乳類細胞において、短い、例えば21ntの二本鎖の小さく干渉するRNA(siRNA)は、効果的にRNAi反応を誘導することが示されている。例えば、Elbashirら、Nature、411:494-498 (2001)参照のこと。この機序は、同定された遺伝子の発現レベルをダウンレギュレーション、例えば疾患の治療又は疾患への関与のバリデーションのために使用することができる。
【０２８２】
リボザイム
アンチセンスポリヌクレオチドに加え、リボザイムを膀胱癌-関連ヌクレオチド配列の標的化及び転写の阻害に使用することができる。リボザイムは、他のRNA分子を触媒的に切断するRNA分子である。様々な種類のリボザイムが説明されており、これはグループIリボザイム、ハンマーヘッド型リボザイム、ヘアピン型リボザイム、RNaseP、及び斧ヘッド型リボザイムを含む。例えば、異なるリボザイムの特性の一般的検証については、Castanottoら、Adv. in Pharmacology、25:289-317 (1994)を参照のこと。
【０２８３】
ヘアピン型リボザイムの一般的特徴は、例えば、Hampelら、Nucl. Acids Res.、18:299-304 (1990)；欧州特許公開第0360 257号；米国特許第5,254,678号に開示されている。それらの調製法は周知である。例えば、国際公開公報第94/26877号；Ojwangら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90:6340-6344 (1993)；Yamadaら、Human Gene Therapy、1:39-45 (1994)；Leavittら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、92:699-703 (1995)；Leavittら、Human Gene Therapy、5:1151-120 (1994)；及び、Yamadaら、Virology、205:121-126 (1994)を参照のこと。
【０２８４】
膀胱癌のポリヌクレオチドモジュレーターは、国際公開公報第91/04753号に開示されているような、リガンド結合分子との複合体の形成による、標的ヌクレオチド配列を含む細胞への導入であることができる。適当なリガンド結合分子は、細胞表面受容体、増殖因子、他のサイトカイン類、又は細胞表面受容体に結合する他のリガンドを含むが、これらに限定されるものではない。好ましくは、リガンド結合分子の複合は、リガンド結合分子の、その対応する分子もしくは受容体へ結合する能力、又はセンスもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその複合された変種の細胞への侵入をブロックする能力を実質的に妨害しない。あるいは、膀胱癌のポリヌクレオチドモジュレーターは、例えば国際公開公報第90/10448号に開示されたような、ポリヌクレオチド-脂質複合体の形成により、標的核酸配列を含む細胞へ導入することができる。アンチセンス分子又はノックアウト及びノックインモデルの使用は、前述のスクリーニングアッセイに加え治療法において使用することができることが理解される。
【０２８５】
従って、ひとつの態様において、細胞又は生物において膀胱癌を変調する方法が提供される。ひとつの態様において、これらの方法は、内因性膀胱癌タンパク質の生物学的活性を低下又は排除する抗-膀胱癌抗体を、細胞へ投与することを含む。あるいは、これらの方法は、膀胱癌タンパク質をコードしている組換え核酸を、細胞又は生物へ投与することを含む。これは、多くの方法で実現することができる。好ましい態様において、例えば、膀胱癌配列が膀胱癌においてダウンレギュレーションされる場合、このような状態は、細胞における膀胱癌遺伝子産物の量の増加により逆行されるであろう。これは例えば、公知の遺伝子治療技術を用いる、内因性膀胱癌遺伝子の過剰発現、又は膀胱癌配列をコードしている遺伝子の投与により、実現することができる。好ましい態様において、遺伝子治療技術は、例えばその全体が本願明細書に参照として組入れられているPCT/US93/03868号に開示されたような、増強された相同組換え(EHR)を用いる、外因性遺伝子の組込みを含む。あるいは、例えば膀胱癌配列が膀胱癌においてアップレギュレーションされる場合、内因性膀胱癌遺伝子の活性は、例えば膀胱癌アンチセンス核酸の投与により、低下される。
【０２８６】
ひとつの態様において、本発明の膀胱癌タンパク質を使用し、膀胱癌タンパク質に対するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を作出することができる。同様に、膀胱癌タンパク質は、標準技術を用い、アフィニティークロマトグラフィーカラムに結合することができる。その後これらのカラムを用い、製造、診断又は治療目的に有用な膀胱癌抗体を精製することができる。好ましい態様において、抗体は、膀胱癌タンパク質に独特なエピトープに対して作出され；すなわち、これらの抗体は、他のタンパク質に対する交差反応性をほとんど又は全く示さない。これらの膀胱癌抗体は、標準のアフィニティークロマトグラフィーカラムに結合することができ、かつ膀胱癌タンパク質を精製するために使用される。これらの抗体は、膀胱癌タンパク質に特異的に結合するので、先に概説したように、これらはブロッキングポリペプチドとしても使用することができる。
【０２８７】
変種膀胱癌-関連配列の同定法
理論に縛られるものではないが、様々な膀胱癌配列の発現は、膀胱癌と相関されている。従って、突然変異体又は変種の膀胱癌遺伝子を基にした障害は、決定することができる。ひとつの態様において、本発明は、例えば、細胞内の少なくとも1種の内因性膀胱癌遺伝子の配列の全て又は一部を決定する、変種の膀胱癌遺伝子を含む細胞を同定する方法を提供する。これは、多くの配列決定法を用いて実現することができる。好ましい態様において、本発明は、例えば、個体の少なくとも1種の膀胱癌遺伝子の配列の全て又は一部を決定する、個体の膀胱癌遺伝子型を同定する方法を提供する。これは、一般に個体の少なくともひとつの組織において行われ、かつ多くの組織又は同じ組織の異なる試料の評価を含むことができる。この方法は、配列決定された膀胱癌遺伝子の配列の、公知の膀胱癌遺伝子、すなわち野生型遺伝子の配列との比較を含むことができる。
【０２８８】
その後膀胱癌遺伝子の全ての又は一部の配列を、公知の膀胱癌遺伝子の配列と比較し、何らかの差異が存在するかどうかを決定することができる。これは、Bestfitなどのような多くの公知のホモロジープログラムを用いて行うことができる。好ましい態様において、本願明細書に概略するように、患者の膀胱癌遺伝子と公知の膀胱癌遺伝子の間の配列の差異の存在は、病態又は病態の性向に相関している。
【０２８９】
好ましい態様において、膀胱癌遺伝子は、ゲノム内の膀胱癌遺伝子のコピー数を決定するためのプローブとして使用される。
別の好ましい態様において、膀胱癌遺伝子は、膀胱癌遺伝子の染色体局在を決定するためのプローブとして使用される。染色体局在のような情報は、特に転座などのような染色体異常が膀胱癌遺伝子座において同定された場合の、診断又は予後判定を提供する上での用途を見いだす。
【０２９０】
医薬組成物及びワクチン組成物の投与
ひとつの態様において、膀胱癌タンパク質又はそれらのモジュレーターの治療的有効量が、患者に投与される。本願明細書において「治療的有効量」は、そのためにそれが投与された作用を生じる用量を意味する。正確な用量は、治療の目的に応じて決まり、かつ公知の技術を用い当業者により確認されるであろう。例えば、Anselら、Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery；Lieberman、Pharmaceutical Dosage Forms (第1-3巻、1992)、Dekker社、ISBN0824770846、082476918X、0824712692、0824716981；Lloyd、The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding、(1999)Amer Pharm Assn社；及び、Pickar、Dosage Calculations、(1999)Thomson社など参照のこと。当該技術分野において公知であるように、膀胱癌の縮退の調節、全身対局所の送達、及び新規プロテアーゼ合成速度、更には年齢、体重、全身の健康状態、性別、食事、投与時間、薬物相互作用及び状態の重症度が必要であり、かつこれは当業者により慣習的実験により確認されるであろう。米国特許出願第09/687,576号は、膀胱癌の診断及び治療のための組成物及び方法の使用を開示しており、かつこれは本願明細書に参照として組入れられている。
【０２９１】
本発明の目的のための「患者」は、ヒト及び他の動物、特に哺乳類の両方を含む。従って、これらの方法は、臨床治療及び獣医学的適用の両方に適用可能である。好ましい態様において、患者は、哺乳類、好ましくは霊長類であり、最も好ましい態様において、患者はヒトである。
【０２９２】
本発明の膀胱癌タンパク質及びそれらのモジュレーターの投与は、前述のような様々な方法で行うことができ、経口、皮下、静脈内、鼻腔内、経皮的、腹腔内、筋肉内、肺内、膣内、直腸内、又は眼内を含むが、これらに限定されるものではない。例えば、創傷及び炎症の治療のように、場合によっては、膀胱癌タンパク質及びモジュレーターは、液剤又はスプレー剤として直接塗布することができる。
【０２９３】
本発明の医薬組成物は、患者へ投与するのに適した剤形中に、膀胱癌タンパク質を含有している。好ましい態様において、この医薬組成物は、水溶性の形であり、例えば医薬として許容できる塩として存在し、これは酸及び塩基の両付加塩を含むことを意味する。「医薬として許容できる酸付加塩」は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などのような無機酸、及び酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、コハク酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、サリチル酸などのような有機酸により形成された、遊離塩基の生物学的有効性を保持する塩及び生物学的でない又はさもなければ望ましくない塩を意味する。「医薬として許容できる塩基付加塩」は、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウム塩などのような無機塩基から誘導されたものを含む。特に好ましいのは、アンモニウム、カリウム、ナトリウム、カルシウム及びマグネシウム塩である。医薬として許容できる有機の無毒の塩基に由来した塩は、第一級、第二級、及び第三級アミン、天然に置換されたアミンを含む置換されたアミン、環状アミン及び塩基性イオン交換樹脂、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、及びエタノールアミンを含む。
【０２９４】
医薬組成物は、更に下記の中の1種又は複数を含むことができる：血清アルブミンのような担体タンパク質；緩衝剤；微晶質セルロース、乳糖、コーンスターチ及び他のデンプンのような充填剤；結合剤；甘味剤及び他の矯味矯臭剤；着色剤；及びポリエチレングリコール。
【０２９５】
医薬組成物は、投与法に応じて、様々な単位剤形で投与することができる。例えば、経口投与に適した単位剤形は、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤及びトローチ剤を含むが、これらに限定されるものではない。膀胱癌タンパク質モジュレーター(例えば、抗体、アンチセンス構築体、リボザイム、小有機分子など)は、経口投与される場合、消化から保護されなければならないことが認められる。これは典型的には、酸及び酵素による加水分解に対して抵抗性とするための分子(複数)と組成物との複合化によるか、又はリポソームもしくは保護障壁などの適当な抵抗性担体中への分子(複数)の封入により実現される。消化から物質を保護する手段は、当該技術分野において周知である。
【０２９６】
投与するための組成物は、医薬として許容できる担体、好ましくは水性担体に溶解された、膀胱癌タンパク質モジュレーターを通常含有するであろう。様々な水性担体、例えば緩衝した生理食塩水などを使用することができる。これらの溶液は無菌であり、かつ一般に望ましくない物質は含まない。これらの組成物は、通常の周知の滅菌技術により滅菌することができる。この組成物は、pH調節剤及び緩衝剤、毒性調節剤など、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどのような、ほぼ生理的な条件が必要とするような、医薬として許容できる賦形剤を含有することができる。これらの処方中の活性物質の濃度は、広範囲に変動することができ、かつ選択された投与の具体的様式及び患者の必要性に従い、主に液体の容量、粘度、体重などを基に選択されるであろう。例えば、レミントンの薬科学(15版、1980年)及びGoodman & Gillman、The Pharmacologial Basis of Therapeutics (Hardmanら編集、1996年、McGraw-Hill社)を参照のこと。
【０２９７】
従って、静脈内投与のための典型的医薬組成物は、約0.1〜10mg／患者／日であろう。用量約0.1〜100mg／患者／日も使用することができ、特にこの薬物が、血流ではなく隔離された部位へ投与される場合、例えば体腔又は臓器管腔に投与される場合にこれを使用することができる。実質的により高い用量が、局所投与において可能である。非経口投与可能な組成物調製の実際の方法は、例えば前掲の「レミントン薬科学」及びGoodman and Gillman、The Pharmacologial Basis of Therapeuticsにおいて、当業者には公知であるかもしくは自明である。
【０２９８】
膀胱癌タンパク質のモジュレーターを含有する組成物は、治療的又は予防的処置のために投与することができる。治療的適用において、組成物は、疾患(例えば、癌)に罹患した患者へ、疾患及びその合併症が治癒又は少なくとも部分的に停止するのに十分な量で投与される。これを達成するのに適切な量は、「治療的有効量」と定義される。この用途のための有効量は、疾患の重症度及び患者の全身の健康状態によって左右される。この組成物の単回又は反復投与は、必要とされる用量及び頻度並びに患者の忍容性によって決まる。この組成物は、本発明の物質を患者を効果的に治療するのに十分な量提供することとする。哺乳類において癌の発生を予防又は遅延することが可能なモジュレーターの量は、「予防的有効量」と称される。予防的処置に必要な具体的用量は、哺乳類の医学的状態及び病歴、予防される具体的癌、更には他の要因、例えば年齢、体重、性別、投与経路、効能などによって決まるであろう。このような予防的処置は、例えば、癌の既往のある哺乳類において癌の再発を防止するために、又は少なくとも一部は遺伝子発現プロファイルを基にし癌発症の重大な可能性があると疑われる哺乳類において使用することができる。ワクチン戦略を、DNAワクチン型、又はタンパク質ワクチンのいずれかで使用することができる。
【０２９９】
本膀胱癌タンパク質を変調する化合物は、単独で、又は追加の膀胱癌を変調する化合物もしくは他の治療的物質、例えば他の抗癌剤又は治療と併用して投与することができることは理解されるであろう。
【０３００】
多くの態様において、1種又は複数の核酸、例えば、表1A-13に示した核酸配列を含むポリヌクレオチド、例えば、アンチセンスポリヌクレオチド又はリボザイムは、in vitro又はin vivoにおいて細胞に導入されるであろう。本発明は、in vitro(細胞-非含有)、ex vivo又はin vivo(細胞又は生物-ベース)の組換え発現システムを用いる、膀胱癌-関連ポリペプチド及び核酸の発現に有用な方法、試薬、ベクター、及び細胞を提供する。
【０３０１】
核酸をタンパク質又は核酸の発現のために宿主細胞へ導入するために使用される具体的手法は、適用に特異的である。外来ヌクレオチド配列を宿主へ導入する多くの手法を使用することができる。これらは、リン酸カルシウムトランスフェクション、スフェロプラスト、電気穿孔、リポソーム、微量注入、プラズマベクター、ウイルスベクター、並びにクローニングされたゲノムDNA、cDNA、合成DNA又は他の外来遺伝的物質を宿主細胞へ導入するための他の方法の使用を含む。例えば、Berger及びKimmel、Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology、第152巻(Academic Press社)；Ausubelら編集、Current Protocols in Molecular Biology(1999年まで補遺、Lippincott社)；及びSambrookら、Molecular Cloning - A Laboratory Manual (第2版、第1-3巻、1989年、CSH Prss社)を参照のこと。
【０３０２】
好ましい態様において、膀胱癌タンパク質及びモジュレーターは、治療的物質として投与され、かつ先に概説したように処方することができる。同様に、膀胱癌遺伝子(膀胱癌コード領域の完全長配列、部分配列、又は調節配列のいずれも含む)は、遺伝子治療の適用において投与することができる。これらの膀胱癌遺伝子は、当業者に理解されるように、遺伝子治療として(すなわち、ゲノムへの組込み)又はアンチセンス組成物としてのいずれかでのアンチセンス適用を含むことができる。
【０３０３】
膀胱癌ポリペプチド及びポリヌクレオチドは、HTL、CTL及び抗体反応を刺激するために、ワクチン組成物としても投与することができる。このようなワクチン組成物は、例えば、リピド化されたペプチド(例えば、Vitielloら、J. Clin. Invest.、95:341-349 (1995)；ポリ(DL-ラクチド-コ-グリコシド)("PLG")ミクロスフェア中に被包されたペプチド組成物(例えば、Eldridgeら、Molec. Immunol.、28:287-294 (1991)；Alonsoら、Vaccine、12:299-306 (1994)；Jonesら、Vaccine、13:675-681 (1995)参照)；免疫賦活複合体(ISCOMS)に含まれたペプチド組成物(例えば、Takahashiら、Nature、344:873-875 (1990)；Huら、Clin Exp Immunol.、113:235-243 (1998)参照)；多重抗原ペプチドシステム(MAP)(例えば、Tam、Proc. Natl. Acad. Sci. USA.、85:5409-5413 (1988)；Tam、J. Immunol. Methods、196:17-32 (1996)参照)；多価ペプチドとして処方されたペプチド；射出(ballistic)送達システムにおいて使用するためのペプチド、典型的には結晶化されたペプチド、ウイルス送達ベクター(Perkusら、Concepts in vaccine development (Kaufmann編集、1996年、de Gruyter社)；Chakrabartiら、Nature、320:535-537 (1986)；Huら、Nature、320:537-547 (1986)；Kienyら、AIDS Bio/Technology、4:790 (1986)；Topら、J. Infect. Dis.、124:148-154 (1971)；Chandaら、Virology、175:535-547 (1990))；ウイルス又は合成起源の粒子(例えば、Koflerら、J. Immunol. Methods.、192:25-35 (1996)；Eldridgeら、Sem. Hematol.、30:16-24 (1993)；Faloら、Nature Med.、7:649-653 (1995)参照)；アジュバント(Warrenら、Annu. Rev. Immunol.、4:369-388 (1986)；Guptaら、Vaccine、11:293-306 (1993)参照)；リポソーム(Reddyら、J. Immunol.、148:1585-1589 (1992)；Rock、Immunol. Today、17:131-137 (1996))、又は裸のもしくは粒子吸着したcDNA(Ulmerら、Science、259:1745-1749 (1993)；Robinsonら、Vaccine、11:957-960 (1993)；Shiverら、Concepts in vaccine development (Kaufmann編集、1996年、de Gruyter社)；Cease及びBerzofsky、Annu. Rev. Immunol.、12:923-989 (1994)、及びEldridgeら、Sem. Hematol.、30:16-24 (1993))を含有することができる。Avant Immunotherapeutics社(ニードハム、MA)の製品のような、受容体媒介型ターゲティングとしても公知である毒素-標的化した送達技術も、使用することができる。
【０３０４】
ワクチン組成物は、アジュバントを含有することが多い。多くのアジュバントは、抗原を迅速な異化作用から保護するようにデザインされた物質、例えば水酸化アルミニウム又は鉱油、並びに免疫応答賦活剤、例えばリピドA、Bortadella pertussis又はMycobacterium tuberculosis由来のタンパク質を含む。ある種のアジュバントは、市販されており、例えばフロイントの不完全アジュバント及び完全アジュバント(Difco Laboratories社、デトロイト、MI)；メルクアジュバント65(Merck社、ラーウェイ、NJ)；AS-2(SmithKline Beecham社、フィラデルフィア、PA)；水酸化アルミニウムゲル(ミョウバン)又はリン酸アルミニウムのようなアルミニウム塩；カルシウム、鉄又は亜鉛の塩；アシル化したチロシンの不溶性懸濁液；アシル化した糖質；カチオン性又はアニオン性に誘導された多糖；ポリホスファゼン；生分解性ミクロスフェア；モノホルホリルリピドA及びキルAがある。GM-CSF、インターロイキン-2、-7、-12のようなサイトカイン及び他の同様の増殖因子も、アジュバントとして使用することができる。
【０３０５】
ワクチンは、核酸組成物として投与することができ、ここでは1種又は複数のポリペプチド又はそれらの断片をコードしているDNA又はRNAが、患者へ投与される。この方法は、例えば、Wolffら、Science、247:1465-1468 (1990)に加え、米国特許第5,580,859号；第5,589,466号；第5,804,566号；第5,739,118号；第5,736,524号；第5,679,647号；国際公開公報第98/04720号に開示されており；並びに、以下により詳細に説明されている。DNA-ベースの送達技術の例は、「裸のDNA」、促進型(ブピバカイン、ポリマー、ペプチド-媒介型)送達、カチオン性脂質複合体、及び粒子-媒介型(「遺伝子銃」)又は圧力-媒介型送達(例えば、米国特許第5,922,687号参照)を含む。
【０３０６】
治療的又は予防的免疫感作を目的として、本発明のペプチドは、ウイルス又は細菌ベクターにより発現することができる。発現ベクターの例は、ワクシニア又は家禽ポックスのような、弱毒化したウイルス宿主を含む。この方法は、例えば、膀胱癌ポリペプチド又はポリペプチド断片をコードしているヌクレオチド配列を発現するためのベクターとしての、ワクシニアウイルスの使用に関連している。宿主への導入時に、この組換えワクシニアウイルスは、免疫原性ペプチドを発現し、かつこれにより免疫応答を誘起する。免疫感作プロトコールにおいて有用なワクシニアベクター及び方法は、例えば、米国特許第4,722,848号に開示されている。別のベクターはBCG(Bacille Calmette Guerin)である。BCGベクターは、Stoverら、Narure、351:456-460 (1991)に説明されている。治療的投与又は免疫感作に有用な多種多様な他のベクターは、例えば、アデノ及びアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、Salmonella typhiベクター、解毒した炭疽毒素ベクターなどがある。例えば、Shataら、Mol Med Today、6:66-71 (2000)；Shedlockら、J. Leukoc Biol、68:793-806 (2000)；Hippら、In Vivo、14:571-85 (2000)を参照のこと。
【０３０７】
DNAワクチンとしての遺伝子の使用法は、よく知られており、かつ膀胱癌遺伝子又は膀胱癌遺伝子の一部を、膀胱癌患者における発現のために、調節プロモーター又は組織-特異的プロモーターの制御下に配置することを含む。DNAワクチンに使用した膀胱癌遺伝子は、完全長膀胱癌タンパク質をコードすることができるが、より好ましくは膀胱癌タンパク質由来のペプチドを含む膀胱癌タンパク質の一部をコードしている。ひとつの態様において、患者は、膀胱癌遺伝子に由来した複数のヌクレオチド配列を含有するDNAワクチンにより免疫処置される。例えば、膀胱癌タンパク質の小断片をコードしている膀胱癌-関連遺伝子又は配列は、発現ベクターに導入され、かつクラスI MHCの状況においてそれらの免疫原性について及び細胞傷害性T細胞反応を生じる能力について試験される。この手法は、細胞内エピトープを含む、抗原を提示している細胞に対する細胞傷害性T細胞反応を生じることを提供する。
【０３０８】
好ましい態様において、DNAワクチンは、DNAワクチンと共にアジュバント分子をコードしている遺伝子を含む。このようなアジュバント分子は、DNAワクチンによりコードされた膀胱癌ポリペプチドに対する免疫原性反応を増強するサイトカインを含んでいる。追加の又は代替のアジュバントも利用可能である。
【０３０９】
別の好ましい態様において、膀胱癌遺伝子は、膀胱癌の動物モデルの作成における用途を見いだしている。同定された膀胱癌遺伝子が、癌組織において抑制又は縮小された場合は、例えばアンチセンスRNAが膀胱癌遺伝子に対するような遺伝子治療技術も、この遺伝子の発現を縮小又は抑制するであろう。膀胱癌の動物モデルは、膀胱癌-関連配列のモジュレーター又は膀胱癌のモジュレーターのスクリーニングにおける用途を見いだしている。同様に、例えば適当な遺伝子標的化ベクターによる相同組換えの結果としての、遺伝子ノックアウト技術を含むトランスジェニック動物技術は、膀胱癌タンパク質の発現の欠損又は増大を生じるであろう。望ましい場合は、膀胱癌タンパク質の組織特異的発現又はノックアウトが必要となる。
【０３１０】
膀胱癌タンパク質は、膀胱癌において過剰発現されることも可能である。従って、膀胱癌タンパク質を過剰発現するトランスジェニック動物を作出することができる。望ましい発現レベルに応じて、様々な強度のプロモーターを、導入遺伝子を発現するために使用することができる。更に、組込まれた導入遺伝子のコピー数を決定し、その導入遺伝子の発現レベルを決定するために比較することができる。このような方法で作出された動物は、膀胱癌の動物モデルとしての用途を見いだしており、加えて膀胱癌を治療するためのモジュレーターのスクリーニングにおいて有用である。
【０３１１】
診断及び／又は予後判定適用における使用のためのキット
本発明により、先に示された診断、研究、及び治療的適用における使用のためのキットも提供される。診断及び研究の適用において、このようなキットは、以下の1種又は複数を備えることができる：アッセイ試薬、緩衝液、膀胱癌に特異的な核酸又は抗体、ハイブリダイゼーションプローブ及び／又はプライマー、アンチセンス又はインヒビトリーポリヌクレオチド、リボザイム、ドミナントネガティブ膀胱癌ポリペプチド又はポリヌクレオチド、膀胱癌-関連配列の小分子インヒビターなど。治療用製品は、滅菌生理食塩水又は他の医薬として許容できる乳剤及び懸濁剤基剤を備えることができる。
【０３１２】
加えてこれらのキットは、本発明の方法の実践のための指示(すなわち、プロトコール)を含む使用説明書を備えることもできる。使用説明書は典型的には記載されているか又は印刷物であるが、このようなものには限定されない。最終使用者へのこのような使用説明の保存及びそれらの通達が可能である媒体は、本発明により企図されている。このような媒体は、電子記録媒体(例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ)、光学媒体(例えば、CD ROM)などを含むが、これらに限定されるものではない。このような媒体は、そのような使用説明書を提供するインターネットサイトのアドレスを含んでも良い。
【０３１３】
本発明は、膀胱癌-関連配列のモジュレーターに関するスクリーニングキットも提供する。このようなキットは、容易に入手できる材料及び試薬から調製することができる。例えば、このようなキットは、1種又は複数の下記の材料を備えることができる：膀胱癌-関連ポリペプチド又はポリヌクレオチド、陽性対照又は陰性対照の試料、反応チューブ、及び膀胱癌-関連活性を試験するための指示書。任意に、このキットは、生物学的に活性のある膀胱癌タンパク質を備えることができる。多種多様なキット及び成分を、キットの意図された使用者及び使用者の具体的必要性に応じて、本発明に従い調製することができる。診断は、典型的には、複数の遺伝子又は産物の評価に関連している。これらの遺伝子は、既往歴又は転帰のデータにおいて確認することができる疾患における重要なパラメータとの相関を基に選択されるであろう。
【実施例】
【０３１４】
実施例1：遺伝子チップ分析
様々な正常組織及び癌性組織の分子プロファイルを、遺伝子チップを用いて決定及び分析した。RNAを単離し、及び遺伝子チップ分析を、説明されたように行った(Glynneら、Nature、403:672-676 (2000)；Zhaoら、Genes Dev.、14:981-993 (2000))。
【０３１５】
表の説明
表1Aは、膀胱癌試料中において増加又は減少した発現を示す約3413個を示す。米国特許出願第60/302,814号参照。
【０３１６】
表2Aは、Affymetrix/Bos Hu03遺伝子チップアレイを用い分析した、正常組織に対し膀胱腫瘍において過剰発現された約485個の遺伝子を示す。米国特許出願第60/343,705号参照。
【０３１７】
表3Aは、正常体組織に対し膀胱腫瘍においてアップレギュレーションされ、並びに膀胱癌療法のための小分子、抗体、DNAワクチン標的としての効用が好ましい約414個の遺伝子を示す。これらの遺伝子は、Eos/Affymetrix Hu03遺伝子チップアレイ上の59680個のプローブセットから選択した。この分析から得た各プローブセットに関する遺伝子発現データは、mRNA発現の相対レベルを反映している標準化した値である平均強度(AI)として表わした。
【０３１８】
表4Aは、正常体組織に対し膀胱癌においてアップレギュレーションされ、並びに膀胱癌診断のための効用が好ましい約129個の遺伝子を示す。これらの遺伝子は、Eos/Affymetrix Hu03遺伝子チップアレイ上の59680個のプローブセットから選択した。この分析から得た各プローブセットに関する遺伝子発現データは、mRNA発現の相対レベルを反映している標準化した値である平均強度(AI)として表わした。
【０３１９】
表5Aは、正常体組織に対し膀胱癌においてアップレギュレーションされた約149個の遺伝子を示す。これらの遺伝子は、Eos/Affymetrix Hu03遺伝子チップアレイ上の59680個のプローブセットから選択した。この分析から得た各プローブセットに関する遺伝子発現データは、mRNA発現の相対レベルを反映している標準化した値である平均強度(AI)として表わした。
【０３２０】
表6Aは、正常膀胱組織に対し膀胱癌においてアップレギュレーションされた約199個の遺伝子を示す。これらの遺伝子は、Eos/Affymetrix Hu03遺伝子チップアレイ上の59680個のプローブセットから選択した。この分析から得た各プローブセットに関する遺伝子発現データは、mRNA発現の相対レベルを反映している標準化した値である平均強度(AI)として表わした。
【０３２１】
表7Aは、正常膀胱組織に対し膀胱腫瘍においてアップレギュレーションされた約63個の遺伝子を示す。これらの遺伝子は、Eos/Affymetrix Hu03遺伝子チップアレイ上の59680個のプローブセットから選択した。この分析から得た各プローブセットに関する遺伝子発現データは、mRNA発現の相対レベルを反映している標準化した値である平均強度(AI)として表わした。
【０３２２】
表8Aは、後に筋層-浸潤性膀胱腫瘍(病期T2-T4)を呈した患者からのTa又はT1膀胱腫瘍中でアップレギュレーションされた約1440個の遺伝子を示す。この分析から得た各プローブセットに関する遺伝子発現データは、平均強度(AI)、mRNA発現の相対レベルを反映している標準化した値として表わした。
【０３２３】
表9Aは、後により多くのTa腫瘍を示すか又は全く腫瘍を示さない患者からのTa又はT1腫瘍中でアップレギュレーションされた約1200個の遺伝子を示す。この分析から得た各プローブセットに関する遺伝子発現データは、mRNA発現の相対レベルを反映している標準化した値である平均強度(AI)として表わした。
【０３２４】
表10Aは、T2-T4筋層-浸潤性腫瘍に対し、非浸潤性外長性Ta膀胱腫瘍においてアップレギュレーションされた約65個の遺伝子を示す。この分析から得た各プローブセットに関する遺伝子発現データは、mRNA発現の相対レベルを反映している標準化した値である平均強度(AI)として表わした。
【０３２５】
表11Aは、非浸潤性外長性Ta膀胱腫瘍に対し、T2-T4筋層-浸潤性膀胱腫瘍においてアップレギュレーションされた約106個の遺伝子を示す。この分析から得た各プローブセットに関する遺伝子発現データは、mRNA発現の相対レベルを反映している標準化した値である平均強度(AI)として表わした。
【０３２６】
表12Aは、表13の配列の全てに関する、Pkey、ExAccn、UnigeneID、及びUnigene Titleを示している。Seq ID No.は、表12Aを表13に関連付けるために使用している。
【０３２７】
表1B-12Bは、各々、表1A-12AのUnigeneIDを欠いているPkeyの寄託番号を示す。各プローブセットについて、オリゴヌクレオチドがデザインされた遺伝子クラスター番号を列記した。遺伝子クラスターは、GenbBank EST由来の配列及びmRNAを用いて、集計した。これらの配列は、Clustering and Alignment Tools(DoubleTwist、オークランド、CA)を用い、配列類似性を基にクラスター化した。各クラスターを含む配列のGenBank寄託番号は、「Accession」欄に列記している。
【０３２８】
表1C-12Cは、各々、表1A-12AのUnigeneID及び寄託番号を欠いているPkeyのゲノム配置を示す。各予想されるエキソンについて、予想に使用したゲノム配列給源を列記した。各予想されたエキソンのヌクレオチド位置も列記した。
【０３２９】
表１Ａ
Pkey：独自のEosプローブセット識別番号
ExAccn：例証的寄託番号、GeneBank寄託番号
UnigeneID：Unigene番号
UnigeneTitle：Unigeneタイトル
R1：当初の適用に関する満足度(please)
R2：当初の適用に関する満足度
Target Type：標的が正常膀胱に対し膀胱腫瘍においてダウンレギュレーションされる場合のダウンレギュレート期、又は標的が初期(Ta)膀胱腫瘍マーカーである場合の初期、又は標的が後期(T2-T4)膀胱腫瘍マーカーである場合の後期、又はT2-T4グレード3のパピローママーカーもしくはT2-T4グレード3の固形腫瘍マーカー、又はアップレギュレート期
【表１】
2005514908.tif 000002
【表２】
2005514908.tif 000003
【表３】
2005514908.tif 000004
【表４】
2005514908.tif 000005
【表５】
2005514908.tif 000006
【表６】
2005514908.tif 000007
【表７】
2005514908.tif 000008
【表８】
2005514908.tif 000009
【表９】
2005514908.tif 000010
【表１０】
2005514908.tif 000011
【表１１】
2005514908.tif 000012
【表１２】
2005514908.tif 000013
【表１３】
2005514908.tif 000014
【表１４】
2005514908.tif 000015
【表１５】
2005514908.tif 000016
【表１６】
2005514908.tif 000017
【表１７】
2005514908.tif 000018
【表１８】
2005514908.tif 000019
【表１９】
2005514908.tif 000020
【表２０】
2005514908.tif 000021
【表２１】
2005514908.tif 000022
【表２２】
2005514908.tif 000023
【表２３】
2005514908.tif 000024
【表２４】
2005514908.tif 000025
【表２５】
2005514908.tif 000026
【表２６】
2005514908.tif 000027
【表２７】
2005514908.tif 000028
【表２８】
2005514908.tif 000029
【表２９】
2005514908.tif 000030
【表３０】
2005514908.tif 000031
【表３１】
2005514908.tif 000032
【表３２】
2005514908.tif 000033
【表３３】
2005514908.tif 000034
【表３４】
2005514908.tif 000035
【表３５】
2005514908.tif 000036
【表３６】
2005514908.tif 000037
【表３７】
2005514908.tif 000038
【表３８】
2005514908.tif 000039
【表３９】
2005514908.tif 000040
【表４０】
2005514908.tif 000041
【表４１】
2005514908.tif 000042
【表４２】
2005514908.tif 000043
【表４３】
2005514908.tif 000044
【表４４】
2005514908.tif 000045
【表４５】
2005514908.tif 000046
【０３３０】
表１Ｂ
Pkey：独自のEosプローブセット識別番号
CAT番号：遺伝子クラスター番号
Accession：GeneBank寄託番号
【表４６】
2005514908.tif 000047
【表４７】
2005514908.tif 000048
【表４８】
2005514908.tif 000049
【表４９】
2005514908.tif 000050
【表５０】
2005514908.tif 000051
【表５１】
2005514908.tif 000052
【０３３１】
表１Ｃ
Pkey：独自のEosプローブセットに対応する番号
Ref：配列給源。この欄の7桁の数は、GeneBank識別(GI)番号である。"Dunham I.ら"は、題名「ヒト22番染色体のDNA配列」の刊行物を意味している。Dunham I.ら、Nature、402:489-495 (1999)。
Strand：エキソンが推定されたDNA鎖を示す。
Nt position：推定されたエキソンのヌクレオチド位置を示す。
【表５２】
2005514908.tif 000053
【表５３】
2005514908.tif 000054
【表５４】
2005514908.tif 000055
【０３３２】
表２Ａ
膀胱癌においてアップレギュレーションされた485個の遺伝子
Pkey：独自のEosプローブセット識別番号
ExAccn：例証的寄託番号、GeneBank寄託番号
UnigeneID：Unigene番号
UnigeneTitle：Unigeneタイトル
R1：正常膀胱に対する膀胱腫瘍のmRNA発現の比
【表５５】
2005514908.tif 000056
【表５６】
2005514908.tif 000057
【表５７】
2005514908.tif 000058
【表５８】
2005514908.tif 000059
【表５９】
2005514908.tif 000060
【表６０】
2005514908.tif 000061
【表６１】
2005514908.tif 000062
【０３３３】
表２Ｂ
Pkey：独自のEosプローブセット識別番号
CAT番号：遺伝子クラスター番号
Accession：GeneBank寄託番号
【表６２】
2005514908.tif 000063
【表６３】
2005514908.tif 000064
【０３３４】
表２Ｃ
Pkey：独自のEosプローブセットに対応する番号
Ref：配列給源。この欄の7桁の数は、GeneBank識別(GI)番号である。"Dunham I.ら"は、題名「ヒト22番染色体のDNA配列」の刊行物を意味している。Dunham I.ら、Nature、402:489-495 (1999)。
Strand：エキソンが推定されたDNA鎖を示す。
Nt position：推定されたエキソンのヌクレオチド位置を示す。
【表６４】
2005514908.tif 000065
【０３３５】
表３Ａ
膀胱癌に好ましい治療標的
Pkey：独自のEosプローブセット識別番号
ExAccn：例証的寄託番号、GeneBank寄託番号
UnigeneID：Unigene番号
UnigeneTitle：Unigeneタイトル
R1：膀胱腫瘍AIの90番目のパーセンタイル／正常膀胱試料AIの90番目のパーセンタイル
R2：膀胱腫瘍AIの90番目のパーセンタイル／正常体試料AIの90番目のパーセンタイル
【表６５】
2005514908.tif 000066
【表６６】
2005514908.tif 000067
【表６７】
2005514908.tif 000068
【表６８】
2005514908.tif 000069
【表６９】
2005514908.tif 000070
【表７０】
2005514908.tif 000071
【０３３６】
表３Ｂ
Pkey：独自のEosプローブセット識別番号
CAT番号：遺伝子クラスター番号
Accession：GeneBank寄託番号
【表７１】
2005514908.tif 000072
【０３３７】
表３Ｃ
Pkey：独自のEosプローブセットに対応する番号
Ref：配列給源。この欄の7桁の数は、GeneBank識別(GI)番号である。"Dunham I.ら"は、題名「ヒト22番染色体のDNA配列」の刊行物を意味している。Dunham I.ら、Nature、402:489-495 (1999)。
Strand：エキソンが推定されたDNA鎖を示す。
Nt position：推定されたエキソンのヌクレオチド位置を示す。
【表７２】
2005514908.tif 000073
【表７３】
2005514908.tif 000074
【０３３８】
表４Ａ
膀胱癌の好ましい診断
Pkey：独自のEosプローブセット識別番号
ExAccn：例証的寄託番号、GeneBank寄託番号
UnigeneID：Unigene番号
UnigeneTitle：Unigeneタイトル
R1：筋層浸潤性膀胱腫瘍(T2-T4病期)AIの80番目のパーセンタイル／外長性非浸潤性腫瘍(Ta病期)AIの80番目のパーセンタイル
R2：(膀胱腫瘍AIの90番目のパーセンタイル−バックグラウンド)／(正常体試料AIの90番目のパーセンタイル−バックグラウンド)、ここでバックグランドは、全試料AIの15番目のパーセンタイルと等しい。
R3：膀胱腫瘍AIの90番目のパーセンタイル／正常体試料AIの90番目のパーセンタイル
【表７４】
2005514908.tif 000075
【表７５】
2005514908.tif 000076
【０３３９】
表４Ｂ
Pkey：独自のEosプローブセット識別番号
CAT番号：遺伝子クラスター番号
Accession：GeneBank寄託番号
【表７６】
2005514908.tif 000077
【０３４０】
表４Ｃ
Pkey：独自のEosプローブセットに対応する番号
Ref：配列給源。この欄の7桁の数は、GeneBank識別(GI)番号である。"Dunham I.ら"は、題名「ヒト22番染色体のDNA配列」の刊行物を意味している。Dunham I.ら、Nature、402:489-495 (1999)。
Strand：エキソンが推定されたDNA鎖を示す。
Nt position：推定されたエキソンのヌクレオチド位置を示す。
【表７７】
2005514908.tif 000078
【０３４１】
表５Ａ
膀胱癌においてアップレギュレーションされた遺伝子
Pkey：独自のEosプローブセット識別番号
ExAccn：例証的寄託番号、GeneBank寄託番号
UnigeneID：Unigene番号
UnigeneTitle：Unigeneタイトル
R1：膀胱腫瘍AIの90番目のパーセンタイル／正常体試料AIの90番目のパーセンタイル
【表７８】
2005514908.tif 000079
【表７９】
2005514908.tif 000080
【表８０】
2005514908.tif 000081
【０３４２】
表５Ｂ
Pkey：独自のEosプローブセット識別番号
CAT番号：遺伝子クラスター番号
Accession：GeneBank寄託番号
【表８１】
2005514908.tif 000082
【０３４３】
表５Ｃ
Pkey：独自のEosプローブセットに対応する番号
Ref：配列給源。この欄の7桁の数は、GeneBank識別(GI)番号である。"Dunham I.ら"は、題名「ヒト22番染色体のDNA配列」の刊行物を意味している。Dunham I.ら、Nature、402:489-495 (1999)。
Strand：エキソンが推定されたDNA鎖を示す。
Nt position：推定されたエキソンのヌクレオチド位置を示す。
【表８２】
2005514908.tif 000083
【０３４４】
表６Ａ
膀胱癌においてアップレギュレーションされた遺伝子
Pkey：独自のEosプローブセット識別番号
ExAccn：例証的寄託番号、GeneBank寄託番号
UnigeneID：Unigene番号
UnigeneTitle：Unigeneタイトル
R1：膀胱腫瘍AIの90番目のパーセンタイル／正常尿路上皮生検標本AIの90番目のパーセンタイル
R2：膀胱腫瘍AIの90番目のパーセンタイル／(正常尿路上皮生検標本AI＋正常膀胱AIの90番目のパーセンタイル)
【表８３】
2005514908.tif 000084
【表８４】
2005514908.tif 000085
【表８５】
2005514908.tif 000086
【０３４５】
表６Ｂ
Pkey：独自のEosプローブセット識別番号
CAT番号：遺伝子クラスター番号
Accession：GeneBank寄託番号
【表８６】
2005514908.tif 000087
【表８７】
2005514908.tif 000088
【０３４６】
表６Ｃ
Pkey：独自のEosプローブセットに対応する番号
Ref：配列給源。この欄の7桁の数は、GeneBank識別(GI)番号である。"Dunham I.ら"は、題名「ヒト22番染色体のDNA配列」の刊行物を意味している。Dunham I.ら、Nature、402:489-495 (1999)。
Strand：エキソンが推定されたDNA鎖を示す。
Nt position：推定されたエキソンのヌクレオチド位置を示す。
【表８８】
2005514908.tif 000089
【０３４７】
表７Ａ
膀胱癌においてダウンレギュレーションされた遺伝子
Pkey：独自のEosプローブセット識別番号
ExAccn：例証的寄託番号、GeneBank寄託番号
UnigeneID：Unigene番号
UnigeneTitle：Unigeneタイトル
R1：正常尿路上皮生検標本AIの90番目のパーセンタイル／膀胱腫瘍AIの75番目のパーセンタイル
R2：(正常尿路上皮生検標本AI＋正常膀胱AIの90番目のパーセンタイル)／膀胱腫瘍AIの90番目のパーセンタイル
【表８９】
2005514908.tif 000090
【０３４８】
表７Ｂ
Pkey：独自のEosプローブセット識別番号
CAT番号：遺伝子クラスター番号
Accession：GeneBank寄託番号
【表９０】
2005514908.tif 000091
【０３４９】
表７Ｃ
Pkey：独自のEosプローブセットに対応する番号
Ref：配列給源。この欄の7桁の数は、GeneBank識別(GI)番号である。"Dunham I.ら"は、題名「ヒト22番染色体のDNA配列」の刊行物を意味している。Dunham I.ら、Nature、402:489-495 (1999)。
Strand：エキソンが推定されたDNA鎖を示す。
Nt position：推定されたエキソンのヌクレオチド位置を示す。
【表９１】
2005514908.tif 000092
【０３５０】
表８Ａ
膀胱癌進行を予測する遺伝子
Pkey：独自のEosプローブセット識別番号
ExAccn：例証的寄託番号、GeneBank寄託番号
UnigeneID：Unigene番号
UnigeneTitle：Unigeneタイトル
R1：病期進行した患者由来のTa又はT1腫瘍AIの80番目のパーセンタイル／病期進行しない患者由来のTa又はT1腫瘍AIの80番目のパーセンタイル
R2：病期進行した患者由来のTa又はT1腫瘍AIの中央値／病期進行しない患者由来のTa又はT1腫瘍AIの中央値
【表９２】
2005514908.tif 000093
【表９３】
2005514908.tif 000094
【表９４】
2005514908.tif 000095
【表９５】
2005514908.tif 000096
【表９６】
2005514908.tif 000097
【表９７】
2005514908.tif 000098
【表９８】
2005514908.tif 000099
【表９９】
2005514908.tif 000100
【表１００】
2005514908.tif 000101
【表１０１】
2005514908.tif 000102
【表１０２】
2005514908.tif 000103
【表１０３】
2005514908.tif 000104
【表１０４】
2005514908.tif 000105
【表１０５】
2005514908.tif 000106
【表１０６】
2005514908.tif 000107
【表１０７】
2005514908.tif 000108
【表１０８】
2005514908.tif 000109
【表１０９】
2005514908.tif 000110
【表１１０】
2005514908.tif 000111
【０３５１】
表８Ｂ
Pkey：独自のEosプローブセット識別番号
CAT番号：遺伝子クラスター番号
Accession：GeneBank寄託番号
【表１１１】
2005514908.tif 000112
【表１１２】
2005514908.tif 000113
【表１１３】
2005514908.tif 000114
【表１１４】
2005514908.tif 000115
【表１１５】
2005514908.tif 000116
【０３５２】
表８Ｃ
Pkey：独自のEosプローブセットに対応する番号
Ref：配列給源。この欄の7桁の数は、GeneBank識別(GI)番号である。"Dunham I.ら"は、題名「ヒト22番染色体のDNA配列」の刊行物を意味している。Dunham I.ら、Nature、402:489-495 (1999)。
Strand：エキソンが推定されたDNA鎖を示す。
Nt position：推定されたエキソンのヌクレオチド位置を示す。
【表１１６】
2005514908.tif 000117
【表１１７】
2005514908.tif 000118
【０３５３】
表９Ａ
膀胱癌非進行を予測する遺伝子
Pkey：独自のEosプローブセット識別番号
ExAccn：例証的寄託番号、GeneBank寄託番号
UnigeneID：Unigene番号
UnigeneTitle：Unigeneタイトル
R1：病期進行しない患者由来のTa又はT1腫瘍AIの80番目のパーセンタイル／病期進行した患者由来のTa又はT1腫瘍AIの80番目のパーセンタイル
R2：病期進行しない患者由来のTa又はT1腫瘍AIの中央値／病期進行した患者由来のTa又はT1腫瘍AIの中央値
【表１１８】
2005514908.tif 000119
【表１１９】
2005514908.tif 000120
【表１２０】
2005514908.tif 000121
【表１２１】
2005514908.tif 000122
【表１２２】
2005514908.tif 000123
【表１２３】
2005514908.tif 000124
【表１２４】
2005514908.tif 000125
【表１２５】
2005514908.tif 000126
【表１２６】
2005514908.tif 000127
【表１２７】
2005514908.tif 000128
【表１２８】
2005514908.tif 000129
【表１２９】
2005514908.tif 000130
【表１３０】
2005514908.tif 000131
【表１３１】
2005514908.tif 000132
【表１３２】
2005514908.tif 000133
【表１３３】
2005514908.tif 000134
【０３５４】
表９Ｂ
Pkey：独自のEosプローブセット識別番号
CAT番号：遺伝子クラスター番号
Accession：GeneBank寄託番号
【表１３４】
2005514908.tif 000135
【表１３５】
2005514908.tif 000136
【表１３６】
2005514908.tif 000137
【０３５５】
表９Ｃ
Pkey：独自のEosプローブセットに対応する番号
Ref：配列給源。この欄の7桁の数は、GeneBank識別(GI)番号である。"Dunham I.ら"は、題名「ヒト22番染色体のDNA配列」の刊行物を意味している。Dunham I.ら、Nature、402:489-495 (1999)。
Strand：エキソンが推定されたDNA鎖を示す。
Nt position：推定されたエキソンのヌクレオチド位置を示す。
【表１３７】
2005514908.tif 000138
【表１３８】
2005514908.tif 000139
【表１３９】
2005514908.tif 000140
【０３５６】
表１０Ａ
非浸潤性膀胱腫瘍において優先的に発現された遺伝子
Pkey：独自のEosプローブセット識別番号
ExAccn：例証的寄託番号、GeneBank寄託番号
UnigeneID：Unigene番号
UnigeneTitle：Unigeneタイトル
R1：Ta腫瘍AIの80番目のパーセンタイル／T2-T4腫瘍AIの80番目のパーセンタイル
【表１４０】
2005514908.tif 000141
【０３５７】
表１０Ｂ
Pkey：独自のEosプローブセット識別番号
CAT番号：遺伝子クラスター番号
Accession：GeneBank寄託番号
【表１４１】
2005514908.tif 000142
【０３５８】
表１０Ｃ
Pkey：独自のEosプローブセットに対応する番号
Ref：配列給源。この欄の7桁の数は、GeneBank識別(GI)番号である。"Dunham I.ら"は、題名「ヒト22番染色体のDNA配列」の刊行物を意味している。Dunham I.ら、Nature、402:489-495 (1999)。
Strand：エキソンが推定されたDNA鎖を示す。
Nt position：推定されたエキソンのヌクレオチド位置を示す。
【表１４２】
2005514908.tif 000143
【０３５９】
表１１Ａ
筋層-浸潤性膀胱腫瘍において優先的に発現された遺伝子
Pkey：独自のEosプローブセット識別番号
ExAccn：例証的寄託番号、GeneBank寄託番号
UnigeneID：Unigene番号
UnigeneTitle：Unigeneタイトル
R1：T2-T4腫瘍AIの80番目のパーセンタイル／Ta腫瘍AIの80番目のパーセンタイル
【表１４３】
2005514908.tif 000144
【表１４４】
2005514908.tif 000145
【０３６０】
表１１Ｂ
Pkey：独自のEosプローブセット識別番号
CAT番号：遺伝子クラスター番号
Accession：GeneBank寄託番号
【表１４５】
2005514908.tif 000146
【表１４６】
2005514908.tif 000147
【０３６１】
表１１Ｃ
Pkey：独自のEosプローブセットに対応する番号
Ref：配列給源。この欄の7桁の数は、GeneBank識別(GI)番号である。"Dunham I.ら"は、題名「ヒト22番染色体のDNA配列」の刊行物を意味している。Dunham I.ら、Nature、402:489-495 (1999)。
Strand：エキソンが推定されたDNA鎖を示す。
Nt position：推定されたエキソンのヌクレオチド位置を示す。
【表１４７】
2005514908.tif 000148
【０３６２】
表１２Ａ
筋層-浸潤性膀胱腫瘍において優先的に発現された遺伝子
Pkey：独自のEosプローブセット識別番号
ExAccn：例証的寄託番号、GeneBank寄託番号
UnigeneID：Unigene番号
UnigeneTitle：Unigeneタイトル
Seq ID No：表12Aの情報を表13の配列に結びつける配列識別番号
【表１４８】
2005514908.tif 000149
【表１４９】
2005514908.tif 000150
【０３６３】
表１２Ｂ
Pkey：独自のEosプローブセット識別番号
CAT番号：遺伝子クラスター番号
Accession：GeneBank寄託番号
【表１５０】
2005514908.tif 000151
【０３６４】
表１２Ｃ
Pkey：独自のEosプローブセットに対応する番号
Ref：配列給源。この欄の7桁の数は、GeneBank識別(GI)番号である。"Dunham I.ら"は、題名「ヒト22番染色体のDNA配列」の刊行物を意味している。Dunham I.ら、Nature、402:489-495 (1999)。
Strand：エキソンが推定されたDNA鎖を示す。
Nt position：推定されたエキソンのヌクレオチド位置を示す。
【表１５１】
2005514908.tif 000152
【表１５２】
2005514908.tif 000153
【０３６５】
表１３
【表１５３】
2005514908.tif 000154
【表１５４】
2005514908.tif 000155
【表１５５】
2005514908.tif 000156
【表１５６】
2005514908.tif 000157
【表１５７】
2005514908.tif 000158
【表１５８】
2005514908.tif 000159
【表１５９】
2005514908.tif 000160
【表１６０】
2005514908.tif 000161
【表１６１】
2005514908.tif 000162
【表１６２】
2005514908.tif 000163
【表１６３】
2005514908.tif 000164
【表１６４】
2005514908.tif 000165
【表１６５】
2005514908.tif 000166
【表１６６】
2005514908.tif 000167
【表１６７】
2005514908.tif 000168
【表１６８】
2005514908.tif 000169
【表１６９】
2005514908.tif 000170
【表１７０】
2005514908.tif 000171
【表１７１】
2005514908.tif 000172
【表１７２】
2005514908.tif 000173
【表１７３】
2005514908.tif 000174
【表１７４】
2005514908.tif 000175
【表１７５】
2005514908.tif 000176
【表１７６】
2005514908.tif 000177
【表１７７】
2005514908.tif 000178
【表１７８】
2005514908.tif 000179
【表１７９】
2005514908.tif 000180
【表１８０】
2005514908.tif 000181
【表１８１】
2005514908.tif 000182
【表１８２】
2005514908.tif 000183
【表１８３】
2005514908.tif 000184
【表１８４】
2005514908.tif 000185
【表１８５】
2005514908.tif 000186
【表１８６】
2005514908.tif 000187
【表１８７】
2005514908.tif 000188
【表１８８】
2005514908.tif 000189
【表１８９】
2005514908.tif 000190
【表１９０】
2005514908.tif 000191
【表１９１】
2005514908.tif 000192
【表１９２】
2005514908.tif 000193
【表１９３】
2005514908.tif 000194
【表１９４】
2005514908.tif 000195
【表１９５】
2005514908.tif 000196
【表１９６】
2005514908.tif 000197
【表１９７】
2005514908.tif 000198
【表１９８】
2005514908.tif 000199
【表１９９】
2005514908.tif 000200
【表２００】
2005514908.tif 000201
【表２０１】
2005514908.tif 000202
【表２０２】
2005514908.tif 000203
【表２０３】
2005514908.tif 000204
【表２０４】
2005514908.tif 000205
【表２０５】
2005514908.tif 000206
【表２０６】
2005514908.tif 000207
【表２０７】
2005514908.tif 000208
【表２０８】
2005514908.tif 000209
【表２０９】
2005514908.tif 000210
【表２１０】
2005514908.tif 000211
【表２１１】
2005514908.tif 000212
【表２１２】
2005514908.tif 000213
【表２１３】
2005514908.tif 000214
【表２１４】
2005514908.tif 000215
【表２１５】
2005514908.tif 000216
【表２１６】
2005514908.tif 000217
【表２１７】
2005514908.tif 000218
【表２１８】
2005514908.tif 000219
【表２１９】
2005514908.tif 000220
【表２２０】
2005514908.tif 000221
【表２２１】
2005514908.tif 000222
【表２２２】
2005514908.tif 000223
【表２２３】
2005514908.tif 000224
【表２２４】
2005514908.tif 000225
【表２２５】
2005514908.tif 000226
【表２２６】
2005514908.tif 000227
【表２２７】
2005514908.tif 000228
【表２２８】
2005514908.tif 000229
【表２２９】
2005514908.tif 000230
【０３６６】
先に説明した実施例は、いかなる意味においても、本発明の真の範囲を制限するものではなく、むしろ例証を目的として提示されていることが理解される。本願明細書に引用した全ての刊行物、寄託番号の配列、及び特許明細書は、各々個別の刊行物又は特許出願が、具体的かつ個別に参照として組込まれていることが示されるように、参照として組込まれている。
【国際調査報告】
2005514908.tif 000231