(57)【要約】本発明は、配列番号：１で開示する、チモシー草（Phleum pratense）花粉からの新規なアレルゲンＰｈｌ  ｐ１１、および試薬としての、および診断キットにおける、ならびに免疫療法のためのその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１のアミノ酸配列を含む試薬Ｐｈｌ  ｐ１１、または抗体結合に関して同等または同様な機能を持つその変種または誘導体または断片。
【請求項２】
組換えにより生産されたか、または化学的に合成された請求項１記載の試薬。
【請求項３】
請求項１記載の試薬を含む診断キット。
【請求項４】
Ｐｈｌ  ｐ１、Ｐｈｌ  ｐ２、Ｐｈｌ  ｐ４、Ｐｈｌ  ｐ５ａ、Ｐｈｌ  ｐ５ｂ、Ｐｈｌ  ｐ６、Ｐｈｌ  ｐ７、Ｐｈｌ  ｐ１２およびＰｈｌ  ｐ１３のごとき他の公知のＰｈｌアレルゲンの１種以上も含む請求項３記載の診断キット。
【請求項５】
ａ）疑われる草花粉アレルギーを持つ患者から血液試料を得；
ｂ）該血液試料に由来する血清または血漿を、固相に固定化した、または溶液中の請求項１記載のアレルゲン試薬と接触させ；
ｃ）酵素−結合抗−ＩｇＥ抗体のごとき特異的検出試薬を用いて該アレルゲン試薬に結合した抗体を検出する；
工程を含むイムノアッセイ方法。
【請求項６】
該アレルゲンが組換えにより生産されたか、または化学的に合成された請求項５記載のイムノアッセイ方法。
【請求項７】
Ｐｈｌ  ｐ１１に対するＩｇＥ抗体反応性を示す草花粉アレルギー患者の免疫療法（「アレルギーワクチン接種」）用の薬物を製造するための請求項１または２記載の試薬の使用。
【請求項８】
Ｐｈｌ  ｐ１１に対するＩｇＥ抗体反応性を示すチモシー草花粉アレルギー患者の免疫療法（「アレルギーワクチン接種」）用の薬物を製造するための請求項７記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、チモシー草（Phleum pratense）花粉からの新規なアレルゲンＰｈｌ  ｐ１１、および試薬としての、および診断キットにおける、ならびに免疫療法用のその使用に関する。
【０００２】
発明の背景
アトピー性アレルギーのホールマークは、感作性生体物質に存在する蛋白質に対するＩｇＥ抗体の形成である。アレルゲン源との接触に際し、これらの蛋白質は肥満細胞の表面に存在するＩｇＥ抗体を架橋させるように作用し、それにより、ヒスタミンのごとき炎症メディエーターの放出を誘導する。その結果、アレルギー反応が生じる（１）。
【０００３】
工業化された世界においては、人類の人口の１０％までが草花粉に対するアレルギー感作を示し、これを、最も重要な風媒アレルゲン源の１つとする（２）。生化学的および免疫学的方法を用いて種々の草種からの花粉アレルゲンの特徴付けに対して多大な努力が払われてきた。かくして、種間で保存された構造的および血清学的交差反応性を呈する多数のＩｇＥ結合蛋白質が同定されている。これらの基準に基づき、そのような免疫学的に関連する草花粉アレルゲンは、数字によって命名された群に帰属されてきた。これらは、ほとんどの草種の花粉において代表される群１、群２／３、群４、および群５のアレルゲンを含む。
【０００４】
今日まで、チモシー草（Phleum pratense）花粉からの６つの異なるアレルゲンがクローン化されている：Ｐｈｌ  ｐ（４，５）、Ｐｈｌ  ｐ２（６）、Ｐｈｌ  ｐ５（７−９）、Ｐｈｌ  ｐ６（１０，１１）、Ｐｈｌ  ｐ７（１２）、Ｐｈｌ  ｐ１２（プロフィリン(profilin)）（１３）、およびＰｈｌ  ｐ１３（１４）。これらのアレルゲンは、全て、異なるイン・ビトロおよびイン・ビボ活性アッセイによって、それらの天然対応物と免疫学的およびアレルゲン的特性を共有することが示されている組換え蛋白質として生産された。
【０００５】
血清学的および皮膚テスト手法において４種の組換えアレルゲン（ｒＰｈｌ  ｐ１、ｒＰｈｌ  ｐ２、ｒＰｈｌ  ｐ５、およびプロフィリン）のパネルを用い、陽性の結果が、草花粉−アレルギー個体の大きな集団の９５％で得られた（１５）。Ｐｈｌ  ｐ７（カルシウム結合性２−ＥＦ−ハンド蛋白質）およびＰｈｌ  ｐ１２のごときアレルゲンに対する感作が草花粉アレルギーの小さな割合で起こるが、それらは、樹木および雑草の花粉に存在する相同蛋白質とＩｇＥエピトープを共有し、従って、これらの無関係なアレルゲン源との接触に際して、感作個体において即時型症状を引き起こし得る（１２，１６，１７）。
【０００６】
発明の概要
本発明は、チモシー草（Phleum pratense）花粉からの新規なアレルゲンＰｈｌ  ｐ１１に関する。草花粉アレルギーの絶対的に大部分は、チモシー草花粉の場合には、群１および群５の草花粉アレルゲン−Ｐｈｌ  ｐ１およびＰｈｌ  ｐ５に結合するＩｇＥ抗体を生じるが、該患者のサブセットもまたプロフィリン、Ｐｈｌ  ｐ７またはＰｈｌ  ｐ１１のごとき種々の他の蛋白質成分に対するＩｇＥ抗体を作成する。これらの患者はそのアレルギー病においてより広い免疫学的活性を有し、（雑草および樹木花粉、ネコおよびイヌの鱗屑、ダニ等のごとき）増大する数のアレルゲン源に対して化学反応性を生じる大きな危険性を有するようになると考えられる。
【０００７】
プロフィリンおよびＰｈｌ  ｐ７は高度に交差反応性であり（野菜、果実、および雑草および樹木の花粉）、草花粉蛋白質に対する感作を特異的に示すのではない。他方、Ｐｈｌ  ｐ１１に存在する抗体結合性構造は草花粉に対して特異的なようであり、従って、この特定のアレルゲン源に対する多価感作のマーカー、すなわち、環境物質に対してＩｇＥ抗体を生じる増強された総じての性質のマーカーと見なすことができる。組換えＰｈｌ  ｐ１１を用いて、他の草種の花粉におけるＰｈｌ  ｐ１１およびそのホモログのペプチド構造に感作する患者のサブセットを同定することができる。この花粉蛋白質に対してＩｇＥ反応性を示す全ての患者の約半分は、報告されているところによると、群１１アレルゲンに存在するグリカン構造に向けられたその抗体を有する。これらのグリカン構造は天然では交差反応性であり、それらに結合する抗体は、草花粉−特異的感作に関して情報を与えず／診断にも使えないであろう。ｒＰｈｌ  ｐ１１に対するＩｇＥ反応性は、かくして、他のアレルゲン源とは独立して、草花粉に対する患者のアレルギー感作の免疫学的多様性の状態に関して情報を与えるであろう。
【０００８】
定義された免疫療法試薬として、組換えＰｈｌ  ｐ１１を用いて、保護を誘導し、または免疫応答を減衰させることによって、感作患者を特異的に治療することができる。該活性な物質は、天然の（「野生型」）ポリペプチド配列、または改良された安全性または有効性特質を持つ誘導体いずれかよりなる蛋白質であり得る。
【０００９】
かくして、第１の態様において、本発明は、添付の配列リストの配列番号：１のアミノ酸配列を含む、組換えにより生産されるか、あるいは化学的に合成されたＰｈｌ  ｐ１１であり得る試薬、ならびにその実質的に相同な（７５％）および交差反応性の変種および誘導体に関する。これらの変種は、抗体結合に関して同等または同様な機能を有する。また、本発明は、該アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列に関する。
【００１０】
第２の態様において、本発明は前記試薬を含む診断キットに関する。該診断キットは、Ｐｈｌ  ｐ１、Ｐｈｌ  ｐ２、Ｐｈｌ  ｐ４、Ｐｈｌ  ｐ５ａ、Ｐｈｌ  ｐ５ｂ、Ｐｈｌ  ｐ６、Ｐｈｌ  ｐ７、Ｐｈｌ  ｐ１２およびＰｈｌ  ｐ１３のごとき１以上の他の公知のＰｈｌアレルゲンも含むことができる。
【００１１】
第３の態様において、本発明は、
ａ）疑われる草花粉アレルギーを持つ患者から血液試料を得；
ｂ）該血液試料に由来する血清または血漿を、固相に固定化した、または溶液中の請求項１記載のアレルゲン試薬と接触させ；
ｃ）酵素−結合抗−ＩｇＥ抗体のごとき特異的検出試薬を用いて該アレルゲン試薬に結合した抗体を検出する；
工程を含む免疫アッセイに関する。
【００１２】
該免疫アッセイは、天然、または組換えにより生産された、または化学的に合成された試薬Ｐｈｌ  ｐ１１を含むことができる。該免疫アッセイはＥＬＩＳＡのごときいずれの所望の様式であってもよい。
【００１３】
第４の態様において、本発明は、Ｐｈｌ  ｐ１１に対するＩｇＥ抗体反応性を示す草花粉アレルギー患者の免疫療法（「アレルギーワクチン接種」）用の薬物を製造するための前記試薬またはその誘導体の使用に関する。好ましくは、該使用は、Ｐｈｌ  ｐ１１に対するＩｇＥ抗体反応性を示すチモシー草花粉アレルギー患者の免疫療法（「アレルギーワクチン接種」）用である。
【００１４】
発明の詳細な記載
材料および方法
一般的な試薬、プラスミド、オリゴヌクレオチド、細菌株および抗体
塩および緩衝液はSigma（St.Louis,MO）およびFluka（Buchs，スイス国）から購入した。チモシー草（Phleum pratense）からの花粉はPharmacia Allergon AB（Valinge，スウェーデン国）から入手した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる蛋白質分析は、４ないし２０％トリス−グリシンゲル（Novex, San Diego, CA）を用いて行い、エレクトロブロッキングのためには、Hybond-C Extra膜（America Life Science, Amersham, UK）を用いた。ＩｇＥ結合のイムノブロック分析のためには、ウサギ抗−ＩｇＥ抗血清（ＭＩＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，スウェーデン国）およびホースラディッシュペルオキシダーゼ−結合ロバ抗−ウサギＩｇＧ（Amersham Life Science）を用い、引き続いて、ＥＣＬ検出を行った（Amersham Life Science）。
【００１５】
全ＲＮＡからのポリアデニル化ＲＮＡの調製、およびRT-PCRのためのｃＤＮＡの引き続いての合成は、共にAmersham Pharmacia Biotech (Uppsala, スウェーデン国）からのmRNA精製キットおよび第１ストランドｃＤＮＡ合成キットを用いて行った。プラスミドｐＥＴ−２３ａ（＋）およびｐＭＡＬ−ｃ２は、各々、Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）およびNew England Biolabos (Beverly MA）から購入した。制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ、ならびにＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシヌクレオチドはAmersham Pharmacia Biotechからのものであった。Pfu DNAポリメラーゼはＳtratagene (La Jolla, CA)から購入した。PCRおよび他の酵素反応からのＤＮＡは、Promega(Madison, WI)からの適当なWizardキットを用いて精製した。ビオチン化ＰＣＲ産物の固相捕獲のためには、Ｄｙｎａｌ  ＡＳ(Skoeyen,ノルウェー国)からのストレプトアビジン−修飾磁性ビーズ（ｎ−２８０）を用いた。大規模のプラスミド調製のためには、Qiegen（デュッセルドルフ、ドイツ国）からのＰｌａｓｍｉｄ  Ｎａｘｉキットを用いた。オリゴヌクレオチドはScandinavian Gene Synthesis (Koeping, スウェーデン国）から入手した。ＤＮＡ配列決定は、Amersham Pharmacia BiotechからのT7配列決定キットおよびAmersham life Scienceからの［α−３５Ｓ］ｄＡＴＰを用いて行った。クローニング目的では、E.coli株はXL１−BlueMR（Stratagene）であり、発現用には、プラスミドpT7POL23を保有するＢＬ２１（Novagen）（１８）であった。固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）のためには、ＨｉＴＲＡＴキレート化カラム（Amersham Pharmacia Biotech）を用いた。緩衝液の交換およびせ蛋白質調製物のサイズ排除クロマトグラフィーは、ＦＰＬＣシステム、およびSephadex G-25およびSuperdex75(Amersham Pharmacia Biotech)を充填したカラムを用いて行った。組換えアレルゲンについての定量的な血清学は、供給業者によって推奨された試薬および手法を使用し、Pharmacia CAP System(Pharmacia Diganostics)を用いて確立した。免疫ブロット阻害実験におけるＩｇＥ検出のためのPharmacia Diagnosticsからの１２５Ｉ−標識抗−ヒトＩｇＥ抗体を用いた。アレルギーおよび健康個体の単離された顆粒球からのヒスタミン放出は、ラジオイムノアッセイ（Immunotech, Narseille,フランス国）によって測定した。細胞のヒスタミン放出能力についての陽性対照として、モノクローナル抗−ＩｇＥ抗体Ｅ１２４．２．８ＤΕ２(Immunitech）を用いた。皮膚刺傷テストのためのヒスタミンおよび塩化ナトリウム溶液は、ＡＬＫ（Hoersholm,デンマーク国）から入手した。
【００１６】
患者試料
１８８人の草花粉−アレルギー対象または血清試料の全てをこの実験で調べた。１５０の血清試料は、P.pratenseに対するＩｇＥ感作に基づいて選択されたPharmacia Diganosticsにおける社内収集からのものであった。３８人の対象はViennaクリニックからのものであり、草花粉アレルギーを示すケース履歴、チモシー草花粉についての陽性ＲＡＳＴ結果、および草花粉抽出物に対する陽性皮膚刺傷テストによって特徴付けた。
これらの対象のアレルゲン感作プロフィールは、記載された天然および組換えチモシー草花粉アレルギーで確立された（１９）。二人の非−アレルギー個体からの血清試料を対照目的で含めた。
【００１７】
蛋白質抽出物、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノブロット分析
Phleun pratense花粉を室温にて、花粉１ｇ当たり５ｍｌの蒸留水中に２時間抽出した。１３０００×ｇにおける５分間の遠心の後に、透明な上澄みを小さなアリコットに分け、用いるまで−２０℃で保存した。花粉抽出物を還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、クーマシーブリリアントブルーで染色するか、あるいはニトロセルロース膜に電気ブロットした。蛋白質ブロットは、ＰＢＳ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、４．３ｍＭＮａ２ＨＰＯ４、１．４ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４）中の１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０またはＰＢＳ中の５％（ｗ／ｖ）脱脂乳いずれかを用いて室温にて１時間ブロックし、次いで、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ中に５倍希釈した患者血清と共に一晩インキュベートした。同緩衝液中での洗浄の後に、ウサギ抗−ＩｇＥ抗血清、続いて、ホースラディッシュペルオキシダーゼ−結合ロバ抗−ウサギＩｇＧおよびＥＣＬ検出を用いて結合したＩｇＥを可視化した。
【００１８】
蛋白質配列決定
Ｐｈｌ  ｐ１１に対応するＩｇＥ−結合蛋白質バンドは、実施例にモノ反応性の血清試料を用いるイムノブロッティング分析によって同定した。バンドをクーマシーブリリアントブルー−染色ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから切り出し、ホモゲナイズし、６Ｍ塩酸グアニジニルに抽出した。遠心によるポリアクリルアミド断片の除去の後、抽出された蛋白質を、Hewlett-Packard G10000A機器を用いるＮ−末端からの２０サイクルの配列決定に付した。
【００１９】
Ｐｈｌ  ｐ１１  ｃＤＮＡのクローニングおよび特徴
ポリアデニル化ＲＮＡは、Chirgwinら（２０）のイソチオシアン酸グアニジウム方法によって調製したPhleun pratense花粉の全ＲＮＡから単離した。Ｐｈｌ  ｐ１１ｃＤＮＡは、実験を通じてクローン化Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを用い、Frohman（２１）、およびＲＴ−ＰＣＲに実質的に従って行った３’−ＲＡＣＥによって生じさせた。全ての熱サイクル反応は以下の試薬条件で行った：２０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．８、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、０．１％トリトンＸ−１００、１０％ＤＭＳＯ、０．４ｍＭ  ｄＮＴＰおよび各々０．５μＭのプライマー。
【００２０】
第１ストランドｃＤＮＡは、プライマー5'-CCA GTG AGC AGA GTG ACG AGG ACT CGA GCT CAA GC(T)18-3'(QT)を用い、精製されたポリ−Ａ＋ＲＮＡから合成した。３’−ＲＡＣＥのためには、２つのネステッドユニバーサル逆方向プライマーＱＯ（５’−ＣＣＡ  ＧＴＧ  ＡＧＣ  ＡＧＡ  ＧＴＧ  ＡＣＧ−３’）およびＱＩ（５’−ＧＡＧ  ＧＡＣ  ＴＣＧ  ＡＧＣ  ＴＣＡ  ＡＧＣ−３’）と共に、２つのネステッド特異的順方向プライマーＧＳＰ−１（５’−ＣＡＴ  ＴＡＣ  ＡＴＡ  ＴＧＧ  ＡＣＡ  ＡＧＧ  ＧＣＣ  ＣＳＧ  ＧＣＴ  ＴＣＧ  ＴＳＧ  ＴＳＡ  Ｃ−３’）およびＧＳＰ−２（５’−ＣＡＴ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＧＧＡ  ＣＧＣ  ＧＴＣ  ＴＡＣ  ＴＧＣ  ＧＡＣ−３’）を用いた。プライマーＧＳＰ−１およびＧＳＰ−２は、Ｐｈｌ  ｐ１１蛋白質のＮ−末端アミノ酸配列から設計し、他方、プライマーＱＯおよびＱＩはｃＤＮＡ合成プライマーＱＴの隣接部分と同一であった。
【００２１】
３’−ＲＡＣＥ用のＰｈｌ  ｐ１１−豊富化鋳型を生じさせるために、第一ストランドｃＤＮＡを鋳型として用いる４０サイクルのビオチニル化ＧＳＰ−１のプライマー伸長によって、第二ストランドｃＤＮＡを合成した。サイクリングプロフィールは：９５℃／５分、続いての４０サイクルの９５℃／６０秒、５８℃／６０秒、７２℃／９０秒であった。次いで、この反応の産物をストレプトアビジン−修飾磁性ビーズに固定化させ、０．１Ｍ  ＮａＯＨおよびＴＥ（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）で洗浄した。３’−ＲＡＣＥの第一ラウンドにおいて、固定化された第二ストランドｃＤＮＡおよびプライマーＧＳＰ−１およびＱＯの試料をサイクリングプロフィール：９５℃／５分、続いての４０サイクルの９５℃／１分、７２℃／２分で用いた。この反応の２０倍希釈１μｌを、サイクリングプロフィール：９５℃／５分、続いての３０サイクルの９５℃／６０秒、５８℃／６０秒、７２℃／９０秒にて、３’−ＲＡＣＥの第二ラウンドにてプライマーＧＳＰ−２およびＱＩと共に、鋳型として用いた。ＧＳＰ−２およびＱＩプライマーは、増幅産物の末端において、各々、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位に取り込まれるように設計した。精製およびこれらの酵素での切断の後、産物をｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位の間でクローン化した（２２）。５つの候補クローンをＤＮＡ配列決定に付し、Ｐｈｌ  ｐ１１に対応する単一のオープンリーディングフレームを明らかとした。
【００２２】
固定化第２ストランドｃＤＮＡからの全長Ｐｈｌ  ｐ１１コーディング配列の増幅は、ＧＳＰ−プライマーおよびＰｈｌ  ｐ１１オープンリーディングフレームの３’末端に基づく、逆方向プライマーPP11/R-X (5'-AGT CAC TCG AGT GGC GTC TCG GGG GCG TC-3')を用いて行った。これらの２つのプライマーはＰＣＲ産物において各々、末端ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ部位を取り込むように設計した。この反応で用いた熱サイクリングプロフィールは３’ＲＡＣＥ実験の第２ラウンドにおけるものと同一であった。精製し、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで設計した増幅産物を、E.coliのマルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）に対する融合としての注目する遺伝子の発現用に設計したＰＥＴ−２３ａ（＋）−誘導体のおよびＸｈｏＩの間にクローン化した。発現のための得られた全長構築体を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
【００２３】
翻訳、蛋白質特性予測および配列比較を含めたＤＮＡおよびアミノ酸配列分析は。Wisconsin Package(Genetics Computer Group, Madison,WI.)のプログラムを用いて行った。
【００２４】
ｒＰｈｌ  ｐ１１の発現および精製
P.pratenseアレルゲンはＭＢＰに対する融合としてE.coliで発現させた。１つの選択されたクローンからのプラスミドＤＮＡをストリンジェントに制御した温度−依存的方法でＲＮＡポリメラーゼを供するプラスミドpT7POL23を保有する株ＢＬ２１に導入した（１８）。
【００２５】
ＬＢ培地（１Ｍ  ＮａＯＨ）を用いてｐＨ７．０に調整した、１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、５ｇ／ＬＮａＣｌ）を一晩の培養にて１：５００接種し、まず、３０℃にて中期対数期まで増殖させた。次いで、インキュベーション温度を１時間で４２℃にて上昇させ、続いて、収穫前に４時間で３０℃とした。４℃にて１００００×ｇでの１０分間の遠心によって細胞を収集し、１ｇ新鮮な重量の細胞当たり５ｍＬの緩衝液Ａ(２０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．０，  ０．５  Ｍ  ＮａＣｌ，  １００  ｍＭ  (3-メルカプトエタノール、５ｍＭイミダゾール)に再懸濁させた。再懸濁させた細胞を氷上に保持しつつ、音波処理により破壊し、続いて遠心して固形物質を除去した。Sephadex G-25を用いる５ｍMイミダゾールを含有する緩衝液Ｂ(２０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．  ０，０．  ５  Ｍ  ＮａＣｌ，  ５  ＭＭメルカプトエタノール)への交換に続き、上澄みを、ＩＭＡＣのためのＮｉ２＋荷電５ｍＬ  ＨｉＴｒａｐキレート化カラムに負荷した。カラムを緩衝液Ｂ中の２０ｍＬイミダゾールで洗浄し、緩衝液Ｂ中のイミダゾールの２０ないし２５０ｍＭグラジエントで行った。溶出した融合蛋白質を含有する画分をプールし、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５を介するサイズ排除クロマトグラフィーの最終工程に付し、非−還元緩衝液で平衡化させ、E.coli蛋白質による可視的汚染なくして均一な凝集していない調製物を得た。機能実験で陰性対照として供するために、５ｍＭイミダゾールを細胞ホモゲナイゼーションの段階で緩衝液Ａの代わりに用いる以外は、前記したごとく精製した蛋白質およびインサートを含まない発現ベクターを保有するＢＬ２１［ｐｔ７ＰＯＬ２８］細胞からＭＢＰ単独を発現させた。最終調製物中のＭＢＰ−Ｐｈｌ  ｐ１１およびＭＢＰの濃度は、１．３０および１．４７ｍｇ／ｍＬ当たりの計算された消光計数を用い、２８０ｎｍにおけるその吸光度から決定した。
【００２６】
Pharmacia CAP Systemを用いるｒＰｈｌ  ｐ１１のＩｇＥ−結合活性の評価
精製された組換えアレルゲンのイン・ビトロＩｇＥ−結合活性のアトピー性臨床診断においてＩｇＥ−抗体検出で用いるイムノアッセイシステムであるPharmacia CAP Systemで調べた。実験的ＩｍｍｕｎｏＣＡＰテストは、０．３５ｋＵＡ／Ｌの慣用的カットオフ値未満にて、適切な直線状測定範囲および陰性血清用のバックグラウンドを達成するように選択された濃度にて、活性化セルロースへの精製アレルゲンの共重合固定化によって調製した。ＭＢＰ単独を運ぶ陰性対照テストは、固定化で同一の蛋白質濃度を用いて調製した。天然P.pratense花粉蛋白質の全補体に対する特異的ＩｇＥの決定については、正規の花粉抽出物ベースのＩｍｍｕｎｏＣＡＰテストを用いた。以前に確立された組換えアレルゲンとの比較の目的で、全ての血清アッセイは、Ｐｈｌ  ｐ２ＩｍｍｕｎｏＣＡＰテストと平行して行った。アッセイ対照および該アッセイの質を証明する統計学的パラメーターの計算は標準的アッセイシステムルーチンソフトウェア(Pharmacia Diagnostics)を用いて行った。
【００２７】
ｒＰｈｌ  ｐ１１のＩｇＥ結合特性のイムノブロット分析
ｒＰｈｌ  ｐ１１およびｒＰｈｌ  ｐ５に対して向けられたチモシー草−特異的ＩｇＥの割合はＲＡＳＴ阻害ベースの実験によって調べた。１２のｒＰｈｌ  ｐ１１−反応性対象からの血清試料を緩衝液Ｃ（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５，０．５％ｖ／ｖＴｗｅｅｎ２０、０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．０５％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３）中に１：１０希釈し、全て１０μｇ／ｍＬの最終濃度にてｒＰｈｌ  ｐ１１、ＭＳＰ（陰性対象）またはｒＰｈｌ  ｐ５（陽性対照）いずれかと共に４℃にて一晩予め吸着させた。固相で過剰な抗原の状態を確認するために、ほぼ０．２ｍｇの天然チモシー草花粉蛋白質抽出物を正確に同一なサイズ（０．６×３ｃｍ）のニトロセルロース片に固定化した。該ニトロセルロース片を緩衝液Ｃでのプレインキュベーション（１時間で１回および５分間で２回）によってブロックし、次いで、４℃にて一晩予め吸着させた血清に暴露した。翌日、ニトロセルロース片を緩衝液Ｃ中で４回洗浄し、次いで、室温にて１２５Ｉ−標識抗ヒトＩｇＥ抗体で一晩プローブした。ニトロセルロース片を緩衝液Ｃ中で再度４回洗浄し、乾燥した。ガンマカウンター(Wallac, Turku,フィンランド)を用いて、１２５Ｉ−標識抗−ヒトＩｇＥ抗体の量を測定した。ｒＰｈｌ  ｐ５またはrPhl p11の血清プレインキュベーション後におけるＩｇＥ結合のパーセント阻害を以下のごとく計算した：％阻害＝100-100×(cpm rPh1 p5/cpm MBPまたはrPhl p 11/cpm MBP)。
【００２８】
Ｐｈｌ  ｐ１１−特異的ＩｇＥ抗体に結合する組換えアレルゲンの能力は、ＩｇＥイムノブロット阻害実験によって調べた（１７）。ｒＰｈｌ  ｐ１１に対するＩｇＥ反応性を持つ２人の草花粉アレルギー対象からの血清を、１０μｇ／ｍＬ血清にて精製されたｒＰｈｌ  ｐ１１で、あるいは対照目的で、等しい濃度のＭＢＰまたはＢＳＡで予め吸着させた。予め吸着された血清を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離されたニトロセルロース−ブロッテッド・チモシー草花粉蛋白質に暴露し、結合したＩｇＥを記載されたごとく検出した（１７）。
【００２９】
ヒスタミン放出実験
２人の草花粉アレルギーおよび１人の非−アレルギー個体からのヘパリン化血液試料（２３，２４）のデキストラン沈積によって顆粒球を単離した。洗浄された細胞のアリコットを、ある範囲の濃度（０．００１μｇ／ｍＬ、０．０１μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ）の精製されたｒＰｈｌ  ｐ１１、ＭＢＰ、およびモノクローナル抗−ＩｇＥ抗体と共にインキュベートした。上澄みに放出されたヒスタミンをラジオイムノアッセイによって測定した。細胞の凍結−解凍の後、全ヒスタミンを測定した。結果は三連測定の平均値で示し、全ヒスタミンのパーセンテージを表す。
【００３０】
皮膚テスト
２人の草花粉−アレルギーおよび４人の非−アレルギー個体から通知された同意書を得た後、記載されているごとく皮膚刺傷テストをその前腕で行った（２５）。個体を、異なる濃度（０．１μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ）の精製されたｒＰｈｌ  ｐ１１およびＭＢＰを含有する２０μｌアリコットの溶液で、およびチモシー草花粉抽出物、ヒスタミンおよび塩化ナトリウムで刺した。試料適用から２０分後に、写真によって、および粘着テープを用いて腫れ領域のボールペン追跡を紙に移すことによって、皮膚反応を記録した。平均腫れ直径（Ｄｍ）を以下のごとく決定した：Ｄｍ＝０．５×（Ｄ１＋Ｄ２）。ここに、Ｄ１およびＤ２は、各々、最大の長さ方向および横方向直径を表す。
【００３１】
結果
天然Ｐｈｌ  ｐ１１の免疫化学検出、単離および蛋白質配列決定
現在入手可能なP.pratense（ｒＰｈｌ  ｐ１、ｒＰｈｌ  ｐ２、ｒＰｈｌ  ｐ４、ｒＰｈｌ  ｐ５、ｒＰｈｌ  ｐ６、ｒＰｈｌ  ｐ７、およびｒＰｈｌ  ｐ１２）からの全ての精製されたまたは組換えアレルゲンに対するＩｇＥ抗体を欠く、草花粉−アレルギー対象からの血清のイムノブロット分析は、ほぼ２０ｋＤａにて単一蛋白質バンドに対する支配的ＩｇＥ−結合を明らかにした。クーマシー−染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける１つの弱いバンドはイムノブロット分析におけるＩｇＥ−反応性バンドと完全に整列したが（図１）、わずかに小さなサイズのより豊富な蛋白質は明らかには除外されなかった。双方のバンドからの蛋白質を別々に抽出し、各々の一部をドット−ブロット分析用のニトロセルロース膜に適用した。反応性血清とのインキュベーション、および引き続いてのＩｇＥ検出は、血清試料に存在するＩｇＥ抗体に対する標的としてのより高いＭＷのバンドの陽性同定を可能とした（示さず）。抽出された蛋白質をＮ−末端配列決定に付し、２０−残基の後に決定が得られた：ＤＫＧＰＧＦＶＶＴＧＲＶＹＣＤＰＣＲＡＧ。相同な配列についてのデータベースサーチは、従前に精製されたライムギ草アレルゲンＬｏｌ  ｐ１１、およびｖａｎ  Ｒｅｅら（２６）によって配列決定されたアミノ酸に対する正確なマッチが明らかとなった。
【００３２】
Ｐｈｌ  ｐ１１のｃＤＮＡクローニングおよび配列分析
P.pratense花粉に発現された他の遺伝子で観察されたコドン選択性を用い、ＤＮＡへのＮ−末端アミノ酸配列の逆翻訳の後、２つのネステッド順方向ＰＣＲプライマー（ＧＳＰ−１およびＧＳＰ−２）を、３’−ＲＡＣＥおよびＲＴ−ＰＣＲで用いるために設計した。第一ストランドｃＤＮＡは、増幅の引き続いての工程で用いるべき２つのネステッド逆方向ＰＣＲプライマーＱＯおよびＱＴについての末端標的配列を運ぶユニバーサルオリゴ−ｄＴプライマーを用い、ポリ−Ａ＋ＲＮＡ調製物から合成した第一ストランドｃＤＮＡ上でのＧＳＰ−１の４０サイクルのプライマー延長によって生じた特異的に豊富化された第２ストランドｃＤＮＡを、プライマーＧＳＰ−１およびＱＯで行われた３’−ＲＡＣＥの第一ラウンドで鋳型として用いた。第二ラウンドにおいて第一ラウンド反応物の１／１０００を、プライマーＧＳＰ−２およびＱＩと共に鋳型として用いた。アガロースゲル電気泳動によるこの反応の分析により、同様な強度の２つの区別されるバンド（サイズがほぼ７００および８００ｂｐ（示さず））が明らかとなった。上昇させたアニーリング温度の使用は、第二ラウンドの３’−ＲＡＣＥ産物の出現を変化させなかった。従って、二重−バンド産物は仮に、真性かつ特異的と考えた。産物をクローン化し、双方の断片サイズにマッチするインサートを保有する形質転換体を同定し、ＤＮＡ配列決定によって分析した。全ての５つの調べたクローンはほぼ同一の配列のインサートを含み、３’−ＲＡＣＥの第二ラウンド後に観察された２つのバンド間のサイズの差は、おそらくは、転写体ポリアデニル化の部位の不均一性の結果としての、ｃＤＮＡ合成の起点用の別の部位によるものであった（図２）。全てのクローンは、P.pratense花粉に発現された既に知られた遺伝子のそれとよく合致するコドン用法を持つ同一のオープンリーディングフレームを含んだ。観察された停止コドンを超えて、３つの順方向リーディングフレームのいずれも、この基準を満たすコドンを呈しなかった。全長ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを得るために、順方向プライマーＧＳＰ−１および逆方向プライマーＰＰ１１／Ｒ−Ｘ（後者はオープンリーディングフレームの３’末端から設計した）を用いてＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。アガロースゲル電気泳動において単一のバンドとして出現したこの反応の産物を発現ベクターにクローン化し、その配列を確認した。
【００３３】
ｃＤＮＡのオープンリーディングフレームは、４．８の計算された等電点、１５．８ｋＤａの分子質量およびＮ−結合グリコシル化のための１つの潜在的部位を持つ１４３アミノ酸残基のポリペプチドを規定した（図２）。ＮＣＢＩ（www.ncbi.nlm.nih.gov）で入手可能なデータを通じての同様性サーチにより、ｃＤＮＡ配列から推定されたポリペプチドに対する配列相同を持つある範囲の単子葉植物および双子葉植物種からの花粉蛋白質が同定された。これらはLolium perenne（ライムギ草）、Phalaris coerulescens（カナリークサヨシ）、Oryza sativa（コメ）、Zea mays（トウモロコシ）、Betula pendula（カバ）、Arabidopsis thaliana、Lycopersicon esculentum（トマト）、Olea europaea（オリーブ）、Syringa vulgaris（リラ）およびLigustrum vulgare（イボタノキ）を含んだ。花粉蛋白質のこのファミリー内のアミノ酸配列同一性のレベルは３２％ないし９５％の範囲であり、二次構造の予測および保存された特徴を呈する整列を図３に示す。配列比較から、P.pratenseアレルゲンはL.perenneアレルゲンＬｏｌ  ｐ１１の対応物であることは明らかであり、従って、Ｐｈｌ  ｐ１１と命名されるべきである。
【００３４】
Ｐｈｌ  ｐ１１およびＬｏｌ  ｐ１１（配列受託番号Ａ５４００２）の間で観察された一次構造の最も顕著な差は、分子質量の１．０ｋＤａの増加分と等しい、Ｐｈｌ  ｐ１１のＣ−末端における９のさらなるアミノ酸残基（−ＤＬＲＤＡＰＥＴＰ）のストレッチであった。L.perenneホモログとの比較において、Ｐｈｌ  ｐ１１配列は合計６つのアミノ酸置換を含み、そのうち４つは非−保存的であった（Ｄ４２Ｎ、Ｋ５６Ｇ、Ｄ５７Ｌ、Ｋ８３Ｔ）。Ｌｏｌ  ｐ１１の場合には決定されなかった位置１０３において、アスパラギン残基がＰｈｌ  ｐ１１配列に存在した。２つのホモログは、Ｎ−結合グリコシル化のための１つの潜在的部位（残基２４）および６つのシステイン残基の保存を示す。
【００３５】
van Reeら（２６）によって従前に示されているごとく、群１１の草花粉アレルゲンは大豆トリプシン阻害剤と構造的に関連しており、従って、このファミリーに属する蛋白質と同様な抗原構造を表す。ごく最近、英国のオオバコPlantago lanceolata、（Ｐｌａ  １１）およびアカザChenopodium album、（Che a 1）からの構造的に関連したアレルゲンが報告された（２７，２８）。
【００３６】
SDS-PAGEによる天然ｒＰｈｌ  ｐ１１アレルゲンの観察された見かけのＭＷおよび推定されたアミノ酸配列から計算されたMWの間の矛盾は、天然アレルゲンの翻訳後修飾によって推定的に説明される。これを裏付けるものとしては、Reeら(26)による報告がある。そこでは、相同なL.perenne蛋白質が、全分子質量のほぼ８％に至るＮ−結合グリコシル化    およびPhl p11のアミノ酸配列における対応するグリカン付着の保存を運ぶことが示された。
【００３７】
Escherichia coliにおける発現およびＰｈｌ  ｐ１１の精製
Ｐｈｌ  ｐ１１アレルゲンのアレルギーおよび血清学的特徴付けを目的とし、当該蛋白質をE.coliで発現させ、均一になるまで精製した。アレルゲンが唯一の作成された負荷としてＮ−末端ヘキサヒスチジンタグを伴って最初に発現させた場合の貧弱な溶解性のため、我々は、溶解性を援助する手段としてE.coliマルトース結合蛋白質への融合としてそれを製造することを選択した。融合の転写がＴ７プロモーターの制御下にある構築体を調製した後、クローニング宿主として、E.coli  Ｘｌ１−Ｂｌｕｅを用い、プラスミド、pT7POL23を保有する株ＢＬ２１に移した。この二元系においては、構築体は３０℃において静止性であり、組換え蛋白質の発現は４２℃での温度シフトによって誘導される（図４）。発現用のこの株を用い、ほぼ１０％の合計細胞蛋白質へのMBP-Ｐｈｌ  ｐ１１の蓄積がクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥから見積もって得られた（図４）。
【００３８】
分画した細胞物質の分析により融合蛋白質のほぼ半分が可溶性相に存在することが明らかとなった（示さず）。収穫するまで４２℃に維持するのと反対に、可溶性蛋白質の割合は、培養を４２℃における誘導器官の後に３０℃に戻すとより高くなる傾向があった（示さず）。可溶性蛋白質の凝集を最小化させるために、還元条件下で収穫後処理を行った。緩衝液を交換して、清澄化された細胞抽出物中の還元剤の濃度を退化させた後、蛋白質をＩＭＡＣによる精製の第１工程に付した。溶出した物質は、還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥで予測されたサイズの単一の区別されるバンドとして出現したが、分析ゲル濾過はモノマーに加えて種々の凝集形態の存在を示した。従って、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５を用いるサイズ排除クロマトグラフィーの工程を精製工程に付け加えた。最終調製物は分析ゲル濾過によるとモノマーで出現し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによると、汚染細菌蛋白質がないように見えた。それが安定なように見え、−２０℃での貯蔵に際しては、凝集物の形成は観察されなかった。精製された蛋白質の最終収率は、細菌培養１リットル当たり１２ｍｇであるか、または細胞ペレット１グラム当たり１．７ｍｇであった（新鮮な重量）。
【００３９】
ｒＰｈｌ  ｐ１１の抗体認識の分析
組換えアレルゲンのＩｇＥ抗体の結合能力を調べ、草花粉−アレルギーのうち、Ｐｈｌ  ｐ１１−特異的ＩｇＥ感作の頻度および大きさを調べるために、Pharmacia CAP Systemで用いるために血清学的テストを作成した。融合蛋白質のＭＤＰ部分に対する抗体結合の対照として、ＭＢＰ単独を運ぶテストを作成し、平行して用いた。これらのテストを用いる１８４人の草花粉−感作対象の血清試料の分析に際し、それらのうち５９人（３２％）が組換えアレルゲンに対する特異的ＩｇＥ反応性を含むことかが判明した（表ＩＩ）。特異的反応性の血清におけるＩｇＥないしｒＰｈｌ  ｐ１１の平均レベルは、P. pratense花粉の天然抽出物に対するＩｇＥの７９ｌＵＡ／Ｌと比較して、１６ｋＵＡ／Ｌであった。かくして、これらの対象間を平均すると、P. pratense花粉アレルゲンに対するＩｇＥ反応性のほぼ２０％がｒＰｈｌ  ｐ１１に向けられたようであった。
【００４０】
ｒＰｈｌ  ｐ１１テストで陽性の結果を示した血清の２つにおいて、ＭＢＰ単独に対するＩｇＥの見かけの結合もあった。これらの血清の１つでは、ＩｇＥ測定は、事実、ＭＢＰテストではより高まり、従ってこの血清はＩｇＥないしｒＰｈｌ  ｐ１１を欠くとみなされた。他の血清では、融合蛋白質によるＩｇＥ結合へのＭＢＰによる寄与は約１％にすぎず、これは有利ではないと考えられた。まとめると、全てのテストした１８４人の４つの血清のみが（２％）ＭＢＰ単独に対する検出可能なＩｇＥ結合を示した。これは、ＭＢＰが可溶性非−誘導体化Ｅ，ｃｏｌｉで効果的に生産できない場合において組換えアレルゲン生産のための適切な融合パートナーであり得ることを示す。
【００４１】
比較の目的で、１８４人の血清試料を、以前に確立された主な草花粉アレルゲンｒＰｈｌ  ｐ２に対して特異的なアッセイでテストした。このアレルゲンに向けられたＩｇＥ抗体の反応性は、全てのテストした対象のうち１０３人（５３％）で見出され、平均ＩｇＥレベルは１１．４ｋＵＡ／Ｌであった。それにより、ｒＰｈｌｐ２への結合は、血清のこのサブセットにおけるP. pratense花粉の全天然抽出物に対するＩｇＥの全レベルのほぼ１５％を占めるであろう。まとめると、血清学的分析は、E.coli−発現ｒＰｈｌ  ｐ１１が、ｒＰｈｌｐ２のそれに頻度および大きさが匹敵する、有利なかつ特異的ＩｇＥ抗体結合能力を有することを示す。
【００４２】
可溶性ｒＰｈｌ  ｐ１１による天然草花粉抽出物へのＩｇＥ結合の阻害
組換えおよび天然Ｐｈｌ  ｐ１１に特徴的なＩｇＥ結合をより直接的に比較するために、イムノブロット阻害実験を行った。この分析では、可溶性ｒＰｈｌ  ｐ１１による固定化天然アレルゲンへのＩｇＥ結合に対する競合が、組換えアレルゲンでの患者血清のプレインキュベーションの後に、固定化天然Ｐｈｌ  ｐ１１へのＩｇＥ結合の減衰として可視化されるであろう。非特異的阻害に対する対照として、用いた双方の血清試料を、ｒＰｈｌ  ｐ１１予備処理と平行して、ＢＳＡおよびＭＢＰとプレインキュベートした。対照蛋白質は、緩衝液でのプレインキュベーション（示さず）と比較して、抽出物蛋白質へのＩｇＥ結合に対して目に見える効果を有しないが、ｒＰｈｌ  ｐ１１での血清試料の予備処理は、２０ｋＤａ分子量においてオートラジオグラフィーシグナルをほとんど完全に消失させた（図５）。結果は、組換え蛋白質が、天然Ｐｈｌ  ｐ１１でのヒトＩｇＥ抗体に対するエピトープを共に有することを示した。
【００４３】
花粉蛋白質の全ＩｇＥ結合活性へのＰｈｌ  ｐ１１の寄与は、ドットブロット阻害実験によってさらに調べ、そこでは、その高いＩｇＥ結合能力で知られたアレルゲンであるｒＰｈｌ  ｐ５（７）を比較のために用いた。等しい量の花粉蛋白質抽出物をニトロセルロース膜の同一ピースにスポットし、ｒＰｈｌ  ｐ１１、ｒＰｈｌ  ｐ５またはＭＢＰいずれかと共にプレインキュベートした患者の血清に暴露した。血清学的分析から、これらの血清はＰｈｌ  ｐ１１およびＰｈｌ  ｐ５双方に対するＩｇＥを含むことが知られているが、ＭＢＰに対してはそうではない。対照として、緩衝液インキュベーションおよび１人の非−アレルギー個体からの血清を用いた。洗浄の後、膜−結合ＩｇＥをラジオメトリーで測定し、ｒＰｈｌ  ｐ１１およびｒＰｈｌ  ｐ５の阻害効果をＭＢＰ−予備処理試料に関して計算した。実験の結果を表ＩＩＩに示す。平均して、ｒＰｈｌ  ｐ１１は花粉抽出物に対するＩｇＥ結合の２５％を阻害することが判明し、これは、表ＩＩに示される定量的血清学的データに対応し、他方、ｒＰｈｌ  ｐ５は５５％の平均阻害を引き起こした。我々は、Ｐｈｌ  ｐ５よりは小さいが、Ｐｈｌ  ｐ１１は、チモシー草花粉−特異的ＩｇＥ抗体のかなりの割合を占めると結論する。
【００４４】
ｒＰｈｌ  ｐ１１は、好塩基球ヒスタミン放出および即時型皮膚反応を誘導する。
高レベルのＰｈｌ  ｐ１１−感作アレルギー個体からの好塩基球についての実験において、ｒＰｈｌ  ｐ１１はヒスタミンの用量−依存的放出を誘導し、これは、細胞表面−結合ＩｇＥ抗体を生産的に架橋させるその能力を証明する。限定されたヒスタミン放出が低グレードＰｈｌ  ｐ１１−感作対象の細胞から起こり、ｒＰｈｌ  ｐ１１とのインキュベーションに際して非−アレルギーの細胞からは起こらなかった（表１）。インビボでのｒＰｈｌ  ｐ１１の特異的生物学的活性の証拠は皮膚テスト実験から得られた。２人の感作対象において、用量−依存的腫れ反応がアレルゲンの希釈シリーズでの挑戦から生じ、他方テストした４つの非−アレルギー対照では反応は起こらなかった（表２）。ｒＰｈｌ  ｐ１１融合パートナーＭＢＰ単独では、これらの実験において反応を起こさなくなかった。よって、ｒＰｈｌ  ｐ１１は、特異性の基準を満足する生物学的活性を呈した。
【００４５】
【表１】
2005538040.tif 000002
【００４６】
【表２】
2005538040.tif 000003
【００４７】
考察
草花粉は最も頻繁に感作する優れたアレルゲン源に属する。それは多数のアレルギー原性分子を含み、そのいくつかは最近同定され、特徴付けられている（３）。本発明においては、我々は、組換え草花粉アレルゲンの成長するパネルに新しく重要なエピトープを加える新規なP.pratense花粉アレルゲンの同定、クローニングおよび組換え製造を報告する（２９）。群１１草花粉アレルゲンは糖蛋白質であり（２６）、いくつかのシステイン残基を含むという事実にもかかわらず、我々は、E.coliでの発現用の融合パートナーとしてＭＢＰを利用することによって、可溶性で、モノマーであり、かつ免疫学的に活性なｒＰｈｌ  ｐ１１アレルゲンを生産することができた。アレルゲンを活性化されたセルロースの共有結合によって固定化する定量的アッセイシステムを用い、ｒＰｈｌ  ｐ１１に対するＩｇＥ反応性の広範な血清学的特徴付けを行った。ｒＰｈｌ  ｐ１１−特異的テストを用い、我々は、分析された全ての草花粉感作対象の約１／３（ｍ＝１８４）が、ｒＰｈｌ  ｐ１１に対する血清ＩｇＥ抗体結合を含み、結合の大きさは、これらの対象における草花粉−特異的ＩｇＥ抗体のかなりの割合に対応することを見出した。
【００４８】
ｒＰｈｌ  ｐ１１によるエピトープ提示の真性を裏付ける証拠は天然草蛋白質が、固相、および流体相阻害剤として用いたｒＰｈｌ  ｐ１１に付着したイムノブロット阻害実験から得た。
【００４９】
天然アレルゲンへのＩｇＥ結合の特異的かつ広範な阻害は、調べた２人の患者の血清の双方で起こり、これはｒＰｈｌ  ｐ１１がＩｇＥ抗体結合に対して天然ｒＰｈｌ  ｐ１１と競合し得ることを示す。一緒に考えあわせると、血清学的データは、免疫反応性ｒＰｈｌ  ｐ１１がE.coli発現を用いて生じさせることができ、組換え蛋白質が天然アレルゲンとＩｇＥ抗体に対するエピトープを共有することを示す。得られた結果に基づくと、ｒＰｈｌ  ｐ１１は、草花粉アレルギーのイン・ビトロ診断で有用な組換え草花粉アレルゲンのパネルへの重要な付加を表すことは明らかである。
【００５０】
この議論に関連するのは、このアレルゲンのＩｇＥ結合特性における炭水化物構造の関与を示唆したｖａｎ  Ｒｅｅら（２６）に報告されている化学的に脱グリコシル化天然Ｌｏｌ  ｐ１１の免疫学的分析である。かくして、我々は、天然ｒＰｈｌ  ｐ１１と、本論文に記載した組換え分子との間にアレルギー特性の定量的な差が存在し、真核生物宿主を用いる、グリコシル化形態のｒＰｈｌ  ｐ１１の発現は種々のＩｇＥ結合特徴を持つ組換えアレルゲンを生じさせることを排除することができない。他方、グルカンのエピトープは、ＩｇＥ−媒体反応の有効なエリシターではなく、または臨床アレルギー発現（３０ないし３４）に関して情報を与えるものではないという最近の認識を考慮すると、E.coliで発現された未修飾組換えアレルゲンは診断目的でより有用である可能性がある。チモシー草におけるｒＰｈｌ  ｐ１１およびオリーブ樹木花粉におけるＯｌｅ  ｅ  １によって例示されるアレルゲンの広く示された（草、樹木および雑草）群のメンバーの間での有意な配列相同性にもかかわらず、ＩｇＥ抗体に対する交差反応性は、それらの間でほとんど存在しない。予備的な解析において、我々は、ｒＰｈｌ  ｐ１１およびＯｌｅ  ｅ  １(Niederberger, Valenta & Lidholm,未公表データ)の間の交差反応を検出することができず、このアレルゲンファミリーの他のメンバーに対する最近の研究の結果（２７，２８）はこの観察と合致する。
【００５１】
ｒＰｈｌ  ｐ１１と、このアレルゲンファミリーの他のメンバーとの間の有意な交差反応性の明らかな欠如の１つの重要な意味が、それらが、天然抽出物、またはプロフィリン、２−ＥＰ−ハンドアレルゲンまたはＢｅｔ  ｖ  １ホモログのごとき交差反応性成分と比較して、アレルギー個体の重要な感作剤をより正確に同定するための診断マーカーとして有用であることである。かくして、Ｐｈｌ  ｐ１１の優先的なＩｇＥ認識は、このアレルゲンファミリーの他のメンバーに対して、交差反応性成分を含有するもう１つのアレルゲン源よりも草花粉による重要な感作を示唆し得る。このような選択された組換えアレルゲンの使用は、アレルゲン回避に対するアドバイス、および特異的な免疫療法処置についてのアレルゲン抽出物の適切な選択で有用な情報を提供することができる。
【００５２】
結論として、本発明は、ＩｇＥ−反応性であって、生物学的に活性な群１１の草花粉アレルゲンのｃＤＮＡクローニングおよび組換え生産に関する。組換えＰｈｌ  ｐ１１は、患者において群１１アレルゲンの感作を同定するのに、および特異的な免疫療法で用いることができる。
【００５３】
【表３】
2005538040.tif 000004
【００５４】
【表４】
2005538040.tif 000005
【００５５】
【表５】
2005538040.tif 000006
【００５６】
【表６】
2005538040.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は、P.pratense花粉抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノブロット分析を用いるＰｈｌ  ｐ１１の同定を示す。Ａ：花粉抽出物を推定し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、続いて、クーマシーブリリアントブルーで染色した。Ｐｈｌ  ｐ１１として同定されたかすかな蛋白質バンドを矢印で示す。Ｂ：二連ゲルの免疫ブロット分析であり、ここに、１人の患者の血清ＩｇＥ抗体の結合を可視化する。レーン１：分子量マーカー、レーン２：P.pratense花粉抽出物。
【図２】図２は、Ｐｈｌ  ｐ１１  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。全てのクローンと同一のオープンリーディングフレームは、全ての公表された花粉で発現されるP.pratense遺伝子に由来するコドン選択性と密接に関連した。下線を施したヌクレオチド配列はプライマーＧＳＰ−１およびＧＳＰ−２を表す。塗りつぶしていない矢印の頭は、分析したクローンの間のヌクレオチドの差を示す；標準ヌクレオチドのアンビギューイティー暗号をそれらの位置で用いる。クローンの間のホモポリマーストレッチの長さの変動は影によって示す。配列は、５つの分析したクローンの最長を表し、他方、黒色矢印の頭は、他のｃＤＮＡがポリ−Ａストレッチで終わる場合を示す。塗りつぶした下線によって示されるアミノ酸配列は、天然花粉蛋白質のＮ−末端ミクロ配列決定によって決定された２０の残基を表す。潜在的Ｎ−結合グリコシル化のための単一部位は点線の下線によって示される。
【図３】図３は、Ｐｈｌ  ｐ１１および構造的に関連する蛋白質の複数アミノ酸配列整列を表す。データベースから検索された各配列の前にはその受託番号を示す：Ａ５４００２（Lolium perenne）、１８１５７５９（Phalaris coerulescens）、Ｓ３１７１０（Oryza sativa）、Ｐ３３０５０（Zea mays）、２７６５３６６（Betula pendula）、Ｐ１３４４７（Lycopersicon esculentum）、２８３２６６４および３９８８９９（Arabidopsis thaliana）、Ｓ４３２４２およびＳ４３２４４（Syringa vulgaris）、３２５６２１２（Ligustrum vulgare）、および９２６８８５（Olea europaea）。全てのエントリーは、ここに調べた蛋白質ファミリーと整列させるドメインのみを示すように切形したA.thaliana配列２８３２６６４を除き、全てのエントリーは全長で示す。ｘで印を付けた位置は、同定されていないかまたは典型的でない残基を示す。３ないし８番目の配列は推定Ｎ−末端リーダーペプチドを含む。ハイホンは、整列させる残基の数を最小化するために導入したギャップを示す。
【図４】図４は、E.coliにおける組換えＰｈｌ  ｐ１１の発現の分析を示す。ＭＢＰ−Ｐｈｌ  ｐ１１融合蛋白質の発現用に調製されたE.coli株を中期対数期まで増殖させ、次いで、温度シフトに付して、発現系を脱抑制した。試料は、ＳＤＳおよびβ−メルカプトエタノールを含有する負荷緩衝液中でペレット化された細胞を沸騰させることによって調製した。レーン１：分子量マーカー、レーン２：プレ誘導試料、レーン３：誘導後収穫、レーン４：精製された蛋白質の試料。蛋白質は、クーマシーブリリアントブルー染色によって可視化した。
【図５】図５は、可溶性ｒＰｈｌ  ｐ１１による固定化されたP.pratense抽出物蛋白質に対するＩｇＥ結合のイムノブロット阻害を示す。花粉抽出物を推定し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜へ電気ブロットした。ＢＳＡ（レーン１）、ｒＰｈｌ  ｐ１１（レーン２）またはＭＢＰ（レーン３）いずれかとのプレインキュベーション後に、該膜を、２人のＰｈｌ  ｐ１１−感作草花粉−アレルギー対象からの血清試料と共にインキュベートした（ＡおよびＢ）。
【配列表】
2005538040.tif 000008
【図１】
2005538040.tif 000009
2005538040.tif 000010
【図２】
2005538040.tif 000011
【図３】
2005538040.tif 000012
【図４】
2005538040.tif 000013
【図５】
2005538040.tif 000014
2005538040.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】平成16年12月21日(2004.12.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005538040000001.app
【国際調査報告】
2005538040.tif 000016
2005538040.tif 000017
2005538040.tif 000018
2005538040.tif 000019
2005538040.tif 000020