(57)【要約】本発明は、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）のルブラウイルス（Ｒｕｂｕｌａｖｉｒｕｓ）属に属する、クリプトウイルス（Ｃｒｙｐｔｏｖｉｒｕｓ）と命名された新ヒトウイルスの発見に基づく。クリプトウイルス特異的核酸、クリプトウイルス特異的核酸を含む核酸構築物、クリプトウイルス特異的タンパク質、単離クリプトウイルス粒子、単離抗クリプトウイルス抗体、並びにそれらを含む組成物が開示される。ワクチンまたは薬剤製造についての使用もまた開示される。さらに、クリプトウイルス特異的核酸を含む本発明のベクター並びに係るベクターを含む宿主細胞も開示される。クリプトウイルス単離及び増殖の方法、そしてクリプトウイルスによって急性あるいは非増殖型感染された哺乳類細胞株、並びに係る細胞も開示される。生物材料サンプル中に存在する、クリプトウイルス粒子、タンパク質、あるいは抗クリプトウイルス抗体の検出方法もまた開示される。抗ウイルス治療薬または予防薬候補を同定するためのインビトロ及びインビボスクリーニング法が開示される。哺乳類におけるクリプトウイルス感染の検出法が開示される。テンカン様疾患（例えば、テンカン、多発性硬化症、慢性疲労症候群、並びに亜急性硬化性全脳炎）を含む神経学的、神経変性、及び／または神経精神医学的疾患のようなヒト疾患のための動物モデルがまた開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置１〜１５２４６、
（Ｂ）（Ａ）に相補なヌクレオチド配列、又は
（Ｃ）少なくとも約５ヌクレオチド長である、（Ａ）又は（Ｂ）のクリプトウイルス特異的フラグメント、
を含む単離核酸。
【請求項２】
前記（Ｃ）のクリプトウイルス特異的フラグメントが、
（i）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置１５２〜１６７８、相補配列、又は縮重コード配列、
（ii）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置１８５０〜２５１５、相補配列、又は縮重コード配列、
（iii）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置１８５０〜３０２３、相補配列、又は縮重コード配列、
（iv）（配列番号１）のヌクレオチド位置２３３９と（配列番号１）のヌクレオチド位置２３４０の間にさらに挿入された２つのグアニン残基を結合した（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置１８５０〜３０２３、相補配列、又は縮重コード配列、
（v）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置３１４１〜４２７１、相補配列、又は縮重コード配列、
（vi）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置４５３０〜６１８２、相補配列、又は縮重コード配列、
（vii）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置４５８７〜６１８２、相補配列、又は縮重コード配列、
（viii）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置４５８７〜４８３５、相補配列、又は縮重コード配列、
（ix）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置４８３６〜６１８２、相補配列、又は縮重コード配列、
（x）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置４２７２〜６５１５、相補配列、又は縮重コード配列、
（xi）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置６３０３〜６４３４、相補配列、又は縮重コード配列、
（xii）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置６５８４〜８２７８、相補配列、又は縮重コード配列、並びに
（xiii）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置８４１４〜１５１７８、相補配列、又は縮重コード配列、
から成る群から選択される核酸セグメントを含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
前記クリプトウイルス特異的フラグメントを含み、前記フラグメントが約７ヌクレオチドから約５００ヌクレオチド長である、請求項１に記載の核酸。
【請求項４】
前記フラグメントが約７ヌクレオチドから約５０ヌクレオチド長である、請求項３に記載の核酸。
【請求項５】
前記フラグメントが約１５ヌクレオチドから約３５ヌクレオチド長である、請求項４に記載の核酸。
【請求項６】
前記核酸がＲＮＡである、請求項１に記載の核酸。
【請求項７】
前記核酸がｃＤＮＡである、請求項１に記載の核酸。
【請求項８】
請求項１に記載の核酸、及びキャリアを含む、組成物。
【請求項９】
請求項１に記載の核酸を含む、核酸構築物。
【請求項１０】
ワクチン製造における請求項１に記載の核酸の使用。
【請求項１１】
ワクチン製造における請求項９に記載の核酸構築物の使用。
【請求項１２】
請求項９に記載の核酸構築物を含む発現ベクター。
【請求項１３】
請求項９に記載の核酸構築物を含むクローニングベクター。
【請求項１４】
請求項１２に記載の発現ベクター又は請求項１３に記載のクローニングベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１５】
前記細胞が哺乳類細胞である、請求項１４に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
（Ａ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置１５２〜１６７８、又は縮重配列、
（Ｂ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置１８５０〜２５１５、又は縮重配列、
（Ｃ）（配列番号１）のヌクレオチド位置２３３９と（配列番号１）のヌクレオチド位置２３４０の間にさらに挿入された２つのグアニン残基を結合した（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置１８５０〜３０２３、相補配列、又は縮重コード配列、
（Ｄ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置３１４１〜４２７１、又は縮重配列、
（Ｅ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置４５３０〜６１８２、又は縮重配列、
（Ｆ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置４５８７〜６１８２、又は縮重配列、
（Ｇ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置４５８７〜４８３５、又は縮重配列、
（Ｈ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置４８３６〜６１８２、又は縮重配列、
（Ｉ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置６３０３〜６４３４、又は縮重配列、
（Ｊ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置６５８４〜８２７８、又は縮重配列、あるいは
（Ｋ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置８４１４〜１５１７８、又は縮重配列、
を含む核酸セグメントによってコードされる単離クリプトウイルスタンパク質。
【請求項１７】
前記タンパク質が（Ｅ）、（Ｆ）、（Ｇ）、（Ｈ）、（Ｉ）、又は（Ｊ）を含む核酸セグメントによってコードされるクリプトウイルスエンベロープタンパク質である、請求項１６に記載のタンパク質。
【請求項１８】
請求項１６に記載のタンパク質、及びキャリアを含む、組成物。
【請求項１９】
（Ａ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置１５２〜１６７８、又は縮重配列、
（Ｂ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置１８５０〜２５１５、又は縮重配列、
（Ｃ）（配列番号１）のヌクレオチド位置２３３９と（配列番号１）のヌクレオチド位置２３４０の間のヌクレオチド配列中にさらに挿入された２つのグアニン残基を結合した（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置１８５０〜３０２３、又は縮重配列、
（Ｄ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置３１４１〜４２７１、又は縮重配列、
（Ｅ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置４５３０〜６１８２、又は縮重配列、
（Ｆ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置４５８７〜６１８２、又は縮重配列、
（Ｇ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置４５８７〜４８３５、又は縮重配列、
（Ｈ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置４８３６〜６１８２、又は縮重配列、
（Ｉ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置６３０３〜６４３４、又は縮重配列、
（Ｊ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置６５８４〜８２７８、又は縮重配列、あるいは
（Ｋ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置８４１４〜１５１７８、又は縮重配列、
を含む核酸セグメントによってコードされるクリプトウイルスタンパク質を含むキメラタンパク質。
【請求項２０】
前記クリプトウイルスタンパク質が（Ｅ）、（Ｆ）、（Ｇ）、（Ｈ）、（Ｉ）、又は（Ｊ）を含む核酸セグメントによってコードされるクリプトウイルスエンベロープタンパク質である、請求項１９に記載のキメラタンパク質。
【請求項２１】
クリプトウイルス特異抗体産生における請求項１６又は請求項１９に記載のタンパク質の使用。
【請求項２２】
ワクチン製造における請求項１６又は請求項１９に記載のタンパク質の使用。
【請求項２３】
請求項１６に記載のタンパク質に特異的に結合する単離抗体。
【請求項２４】
請求項２３に記載の抗体、及びキャリアを含む、組成物
【請求項２５】
（Ａ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置４５３０〜６１８２、又は縮重配列、
（Ｂ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置４５８７〜６１８２、又は縮重配列、
（Ｃ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置４５８７〜４８３５、又は縮重配列、
（Ｄ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置４８３６〜６１８２、又は縮重配列、
（Ｅ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置６３０３〜６４３４、又は縮重配列、あるいは
（Ｆ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置６５８４〜８２７８、又は縮重配列、
によってコードされるクリプトウイルスエンベロープタンパク質を特異的に結合する、請求項２３に記載の抗体。
【請求項２６】
前記抗体がポリクローナル性である、請求項２３に記載の抗体。
【請求項２７】
前記抗体がモノクローナル性である、請求項２３に記載の抗体。
【請求項２８】
前記抗体がキメラである、請求項２３に記載の抗体。
【請求項２９】
クリプトウイルス感染症治療用薬剤の製造における、請求項２３に記載の抗体の使用。
【請求項３０】
請求項１に記載の核酸を含む、単離ウイルス粒子。
【請求項３１】
請求項３０に記載のビリオン、及びキャリアを含む、組成物。
【請求項３２】
請求項１７に記載のタンパク質を含む、単離ウイルス粒子。
【請求項３３】
（配列番号１）に完全相補なヌクレオチド配列を有するゲノムを含む、単離クリプトウイルス粒子。
【請求項３４】
ワクチン製造における請求項３２に記載のウイルス粒子の使用。
【請求項３５】
ワクチン製造における請求項３３に記載のクリプトウイルス粒子の使用。
【請求項３６】
前記ウイルス粒子が弱毒ビリオンである、請求項３４又は３５に記載の使用。
【請求項３７】
前記ウイルス粒子が、死菌ビリオンである、請求項３４又は３５に記載の使用。
【請求項３８】
前記クリプトウイルスがＢＢＲ株である、単離クリプトウイルス粒子。
【請求項３９】
請求項３に記載の核酸を含む、プローブ。
【請求項４０】
請求項５に記載の核酸を含む、プライマー。
【請求項４１】
生物材料サンプル中におけるクリプトウイルスタンパク質の存在の有無を検出する方法であって、前記方法が、
生物材料サンプルを、請求項２３に記載の抗体に接触する工程、及び
前記サンプルの構成要素に対する前記抗体の特異的結合を検出する工程であって、特異的結合の存在が、前記サンプル中における前記クリプトウイルスタンパク質の存在を示す工程、
を含む方法。
【請求項４２】
生物材料サンプル中におけるクリプトウイルス特異的ＲＮＡの存在の有無を検出する方法であって、前記方法が、
ＲＮＡを含む生物材料サンプルを得る工程、
少なくとも中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で前記サンプルを請求項３９に記載のプローブに接触させる工程であって、検出可能なハイブリダイゼーション産物の形成が、前記サンプル中に前記クリプトウイルス特異的ＲＮＡが存在することを示す工程、
を含む方法。
【請求項４３】
生物材料サンプル中におけるクリプトウイルス特異的ＲＮＡの存在の有無を検出する方法であって、前記方法が、
ＲＮＡを含む生物材料サンプルを得る工程、
増幅反応混合物中で、請求項４０に記載のプライマーを少なくとも一つ使用して、前記サンプル中のクリプトウイルス特異的ＲＮＡを増幅する工程、
次に、前記増幅反応混合物中におけるクリプトウイルス特異的増幅産物の存在の有無を検出する工程であって、前記反応混合物中の前記増幅産物の存在が、前記サンプル中における前記クリプトウイルスＲＮＡの存在を示す工程、
を含む方法。
【請求項４４】
前記生物材料が細胞材料である、請求項４１、４２、又は４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
前記生物材料が血液又は血清である、請求項４１、４２、又は４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
前記生物材料が脳脊髄液である、請求項４１、４２、又は４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
前記生物材料がリンパ組織である、請求項４１、４２、又は４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
前記生物材料が神経組織である、請求項４１、４２、又は４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
前記神経組織が脳組織である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
生物材料サンプル中におけるクリプトウイルス特異抗体の存在の有無を検出する方法であって、前記方法が、
前記サンプルを請求項１６に記載のタンパク質に接触する工程、
特異的タンパク質−抗体複合体の形成させる工程、
前記特異的タンパク質―抗体複合体の存在を検出する工程であって、該特異的タンパク質―抗体複合体の存在が、前記サンプル中における前記クリプトウイルス特異抗体の存在を示す工程、
を含む方法。
【請求項５１】
生物材料サンプル中におけるクリプトウイルス特異抗体の存在の有無を検出する方法であって、前記方法が、
前記サンプルを請求項１９に記載のタンパク質に接触する工程、
特異的タンパク質−抗体複合体の形成させる工程、及び
前記特異的タンパク質―抗体複合体の存在を検出する工程であって、該特異的タンパク質―抗体複合体の存在が、前記サンプル中における前記クリプトウイルス特異抗体の存在を示す工程、
を含む方法。
【請求項５２】
ヒト由来の抗体を含有する生物材料サンプル中におけるクリプトウイルスを選択的に結合する抗体の存在の有無を検出するためのアッセイ法であって、前記アッセイ法が、
クリプトウイルス感染症を罹患していると疑われる個体に由来するサンプルである、前記サンプルを、クリプトウイルスを選択的に結合する抗体が存在しているならば、抗体が結合したエンベロープタンパク質複合体を形成するように、請求項１７のエンベロープタンパク質に接触させる工程、
形成された任意の抗体結合エンベロープタンパク質複合体を、抗ヒト抗体を結合する抗体に接触して、前記抗体と前記抗体結合エンベロープタンパク質複合体との複合体を形成させる工程、及び
形成された任意の抗体結合エンベロープタンパク質複合体の存在の有無を検出する工程であって、前記複合体の存在が、クリプトウイルスを特異的に結合する抗体がサンプル中に存在することを示す工程、
を含むアッセイ法。
【請求項５３】
ヒト由来の抗体を含有する生物材料サンプル中においてクリプトウイルス抗原を選択的に結合する抗体の存在の有無を検出するためのアッセイ法であって、前記アッセイ法が、
クリプトウイルス感染症を罹患していると疑われる個体に由来するサンプルである、前記サンプルを、クリプトウイルスを選択的に結合する抗体が存在しているならば、抗体が結合したウイルス複合体を形成するように、請求項３２に記載のウイルス粒子に接触させる工程、
かくして形成された任意の抗体結合ウイルス複合体を、抗ヒト抗体を結合する抗体に接触して、前記抗ヒト抗体結合抗体と前記抗体結合ウイルス複合体との複合体を形成させる工程、及び
形成された任意の複合体の存在の有無を検出する工程であって、前記複合体の存在が、クリプトウイルスを特異的に結合する抗体がサンプル中に存在することを示す工程、
を含むアッセイ法。
【請求項５４】
哺乳類におけるクリプトウイルス感染の検出法であって、前記方法が、
前記哺乳類から生物材料サンプルを得る工程、及び
前記サンプルを用いて請求項４１，４２、４３、５０、５１、５２、又は５３のいずれかの方法を行い、これにより、前記哺乳類におけるクリプトウイルス感染を示す前記サンプル中にあるクリプトウイルスタンパク質、クリプトウイルス特異的ＲＮＡ、及び／又はクリプトウイルス特異抗体の存在を検出する工程
を含む方法。
【請求項５５】
前記哺乳類がヒトである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記ヒトが神経学的、神経変性、及び／又は神経精神医学的疾患を有する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記ヒトが、原発性気道及び／又はリンパ節腫脹関連疾患を有する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
培養哺乳類上皮細胞であって、前記細胞が、クリプトウイルスに急性感染しており、ＡＴＣＣに受託番号  として寄託されたシミアン上皮細胞株の特徴を有する細胞。
【請求項５９】
培養哺乳類羊膜細胞であって、前記細胞が、クリプトウイルスに非増殖型感染しており、ＡＴＣＣに受託番号  として寄託された細胞株ＡＶ3/ＳＳＰＥの特徴を有する細胞。
【請求項６０】
クリプトウイルスビリオン単離方法であって、前記方法が、
（ａ）クリプトウイルス感染を有するヒトから得られた複数の末梢血単核細胞を、細胞グアニリルシクラーゼ活性を増加する薬剤を含む人工水性培地中で培養する工程、
（ｂ）複数の末梢血単核細胞を複数の哺乳類羊膜細胞と共に、細胞グアニリルシクラーゼ活性を増加する薬剤を含む新鮮人工水性培地中で共培養する工程、
（ｃ）前記末梢血単核細胞を前記哺乳類羊膜細胞と共に共培養基中で継代培養する工程、
（ｄ）複数の哺乳類上皮細胞を前記末梢血単核細胞及び前記羊膜細胞と共に、細胞グアニリルシクラーゼ活性を増加する薬剤を含む新鮮人工水性培地中で共培養する工程、並びに
（ｅ）上清中にあるクリプトウイルスビリオンを得るために、前記水性培地の前記上清を、前記細胞から分離する工程、
を含む方法。
【請求項６１】
クリプトウイルスの増殖方法であって、前記方法が、
（ａ）複数の哺乳類上皮細胞を、請求項６０に記載の方法によって単離された複数の無細胞クリプトウイルスビリオンに曝露する工程、及び
（ｂ）ビリオンに曝露された、前記哺乳類上皮細胞を、細胞グアニリルシクラーゼ活性を増加する薬剤を含む人工水性培地中でさらに培養する工程、
を含む方法。
【請求項６２】
クリプトウイルスで非増殖型感染された哺乳類細胞株の産生方法であって、前記方法が、
（ａ）前記哺乳類羊膜細胞がクリプトウイルスによって非増殖型感染されるように、クリプトウイルスに感染しているヒトから得られた末梢血単核細胞を、哺乳類羊膜細胞と共に、細胞グアニリルシクラーゼを増加する薬剤を含む人工水性培地中で共培養する工程、
（ｂ）前記非増殖型感染哺乳類羊膜細胞を、前記末梢血単核細胞と共に継代培養して、前記共培養物が非増殖型感染された哺乳類羊膜細胞の単培養とする工程、
を含む方法。
【請求項６３】
前記哺乳類羊膜細胞がヒト羊膜細胞である、請求項６０又は請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記ヒト羊膜細胞がＡＶ3細胞である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記哺乳類上皮細胞が、Ｖｅｒｏ又はＣＶ-１細胞から成る群から選択されるシミアン上皮細胞である、請求項６０又は請求項６１に記載の方法。
【請求項６６】
前記ＣＶ-１細胞がＣＶ-１細胞亜株である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
細胞グアニリルシクラーゼ活性を増加する前記薬剤が、サイクリックＧＭＰ、インスリン、亜鉛ジカチオン、又はこれらのいずれかの組み合わせである、請求項６０、６１、又は６２に記載の方法。
【請求項６８】
前記人工水性培地中で前記サイクリックＧＭＰ濃度が約０.０５〜約５ｍＭである、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
細胞グアニリルシクラーゼ活性を増加する薬剤が、一酸化窒素又は、有機硝酸塩化合物、ニトロシル鉄化合物、Ｓ−ニトロソチオール化合物、シドノンイミン化合物、及びＮＯＮＯエート化合物から成る群から選択される一酸化窒素ドナーである、請求項６０、６１、又は６２に記載の方法。
【請求項７０】
前記水性培地がさらにグルタミンを含む、請求項６０、６１、又は６２に記載の方法。
【請求項７１】
請求項６１に記載の方法を含む、クリプトウイルスで急性感染された哺乳類上皮細胞株を産生する方法。
【請求項７２】
クリプトウイルスで急性感染された哺乳類上皮細胞であって、前記細胞が請求項６１の方法によって産生される、哺乳類上皮細胞。
【請求項７３】
クリプトウイルスで非増殖型感染された細胞であって、前記細胞が請求項６２に記載の方法に従って産生される、細胞。
【請求項７４】
抗ウイルス治療薬候補のインビトロスクリーニング方法であって、前記方法が、
（ａ）請求項５８又は７２に記載の細胞を培養する工程、
（ｂ）前記細胞を前記抗ウイルス治療薬候補に曝露する工程、並びに
（ｃ）クリプトウイルス複製及び／又はクリプトウイルスビリオンのアセンブリに対する前記薬剤の有効性を測定する工程であって、コントロールに比較してクリプトウイルス複製及び／又はクリプトウイルスビリオンのアセンブリが阻害されることが、前記治療薬候補の抗ウイルス活性を示す工程、
を含む方法。
【請求項７５】
抗ウイルス治療薬候補のインビボスクリーニング方法であって、前記方法が、
（ａ）請求項５９又は７３に記載の細胞を培養する工程、
（ｂ）前記細胞を前記抗ウイルス治療薬候補に曝露する工程、並びに
（ｃ）クリプトウイルス複製、クリプトウイルスゲノム複製、及び／又はクリプトウイルス特異的転写に対する前記薬剤の有効性を測定する工程であって、コントロールに比較してクリプトウイルス複製、クリプトウイルスゲノム複製、及び／又はクリプトウイルス特異的転写が阻害されることが、前記治療薬候補の抗ウイルス活性を示す工程、
を含む方法。
【請求項７６】
ヒト疾患研究のための動物モデルであって、前記モデルが、非ヒト哺乳類を含み、前記非ヒト哺乳類が、（配列番号１）に相補である一本鎖ＲＮＡを含むゲノムを有する感染性無細胞クリプトウイルスを人工的に接種されるか、あるいは前記クリプトウイルスで非増殖型感染された細胞を接種されており、これによって前記非ヒト哺乳類が、接種された後、以前に前記非ヒト哺乳類によって呈示されていなかった症状である、ヒト疾患に特徴的な症状を少なくとも一つ呈示する動物モデル。
【請求項７７】
前記非ヒト哺乳類が齧歯類又はウサギ類である、請求項７６に記載の動物モデル。
【請求項７８】
前記非ヒト哺乳類が非ヒト霊長類である、請求項７６に記載の動物モデル。
【請求項７９】
前記ヒト疾患が、神経学的、神経変性、及び／又は神経精神医学的疾患である、請求項７６に記載の動物モデル。
【請求項８０】
治療薬候補のインビボスクリーニング方法であって、前記方法が、
（ａ）請求項７６に記載の動物モデルに前記スクリーンされる治療薬候補を投与する工程であって、前記非ヒト哺乳類が、前記治療薬候補の投与前に、ヒト疾患に特徴的な症状を少なくとも一つ呈示している工程、及び
（ｂ）前記治療薬候補の有益な抗ウイルス効果の有無を検出する工程であって、有益な抗ウイルス効果の存在が前記治療薬候補の活性を示す工程、
を含む方法。
【請求項８１】
予防薬候補のインビボスクリーニング方法であって、前記方法が、
（ａ）前記スクリーニングされる予防薬候補を、以前にヒト疾患症状を有していない非ヒト哺乳類に投与する工程、
（ｂ）（配列番号１）に相補である一本鎖ＲＮＡを含むゲノムを有する感染性無細胞クリプトウイルス、あるいは前記クリプトウイルスで非増殖型感染された哺乳類細胞を接種する工程、並びに
（ｃ）前記非ヒト哺乳類において、その後の有益な抗ウイルス効果の有無を検出する工程であって、前記接種された非ヒト哺乳類における有益な抗ウイルス効果の存在が前記予防薬候補の活性を示す工程、
を含む方法。
【請求項８２】
前記予防薬候補が免疫予防薬である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記非ヒト哺乳類が齧歯類又はウサギ類である、請求項８０又は請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
前記非ヒト哺乳類が非ヒト霊長類である、請求項８０又は請求項８１に記載の方法。
【請求項８５】
前記ヒト疾患が神経学的、神経変性、及び／又は神経精神医学的疾患である、請求項８０又は請求項８１に記載の方法。
【請求項８６】
抗クリプトウイルス抗体検出キットであって、前記キットが、
請求項３３に記載のクリプトウイルス粒子、及び
標識抗ヒト抗体結合抗体、
を含むキット。
【請求項８７】
前記クリプトウイルス粒子を支持するための固体マトリックスをさらに含む、請求項８６に記載の抗クリプトウイルス抗体検出キット。
【請求項８８】
前記クリプトウイルス粒子が、受託番号  としてＡＴＣＣに寄託されている細胞株から産生される、請求項８６に記載の抗クリプトウイルス抗体検出キット。
【請求項８９】
抗クリプトウイルス抗体検出キットであって、前記キットが、
請求項１６又は請求項１９に記載のタンパク質、及び
標識抗ヒト抗体結合抗体、
を含むキット。
【請求項９０】
前記タンパク質を支持するための固体マトリックスをさらに含む、請求項８９に記載の抗クリプトウイルス抗体検出キット。
【請求項９１】
（Ｃ）の前記クリプトウイルス特異的フラグメントが、（配列番号３４）、（配列番号３５）、（配列番号３６）、（配列番号３７）、（配列番号３８）、（配列番号３９）、（配列番号４０）、（配列番号４１）、（配列番号４２）、（配列番号４３）、（配列番号４４）、（配列番号４５）、（配列番号４６）、（配列番号４７）、又は（配列番号４８）を含むか、あるいはこれらのいずれかの相補ヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の核酸。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願を通じて、種々の出版物をカッコ内に参照する。本発明が関連する最先端技術をより十分に説明するために、これらの出版物の全文を本出願に参考文献として引用する。
１．発明の分野
本発明は医療技術、また特にウイルス学分野、そして、さらに詳しくは、「クリプトウイルス」と命名された新ヒトルブラウイルスに関する。
２．背景技術
パラミクソウイルス科のルブラウイルス属（図１を参照）は、一本マイナス鎖ＲＮＡゲノムによって特徴づけられるエンベロープウイルスである。いくつかのルブラウイルスは家畜動物を感染して、神経疾患を起因し得るという実質上の証拠がある。これらの神経性ルブラウイルスは、イヌパラインフルエンザウイルスタイプ２、ブタルブラウイルス（別名、Ｌａ Ｐｉｅｄａｄ-Ｍｉｃｈｏａｃａｎ-Ｍｅｘｉｃｏ ウイルス）、並びにメナングルウイルス（Ｍｅｎａｎｇｌｅ Ｖｉｒｕｓ）を含む。これらウイルス間の強い配列同一性は、これらウイルスのそれぞれが、共通先祖であるルブラウイルス種の別々の宿主適応種を代表していることを含意する。
イヌパラインフルエンザウイルスタイプ２（ＣＰＩＶとしても公知である）は、イヌの感染性気管気管支炎に関連する。これは、（通常は）気道の非致死的疾患である（ＡｐｐｅｌとＢｉｎｎ、イヌ感染性気管気管支炎。Ｖｉｒｕｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃａｒｎｉｖｏｒｅｓ（食肉類のウイルス感染症）。Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｐｐ ２０ｌ〜２１１， １９８７）。しかしながら、このウイルスはまたイヌの後肢麻痺（Ｅｖｅｒｍａｎｎら、"Ｊ．Ａ．Ｖ．Ｍ．Ａ．" １７７：１１３２〜１１３４， １９８０）、神経機能不全（Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒら、"Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ．" ３１：１１７７〜１１８３，１９８１）、脳炎（Ｅｖｅｒｍａｎｎら、 "Ａｒｃｈ． Ｖｉｒｏｌ．" ６８：１６５〜１７２， １９８１）、並びに水頭症（Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒら、"Ｖｅｔ． Ｐａｔｈｏｌ．" １９：７９〜９２， １９８２）に関連することが発見されている。
ブタルブラウイルス（別名、Ｌａ Ｐｉｅｄａｄ-Ｍｉｃｈｏａｃａｎ-Ｍｅｘｉｃｏ ウイルスまたはＬＰＭＶ）は、ブタの青眼疾患（ＢＥＤ）に関連する。この疾患の症状は、幼若なブタにおける角膜混濁、極度な「神経質」、並びに雌ブタと雄ブタの不妊症を含む（Ｒａｍｉｒｅｚ−Ｍｅｎｄｏｚａら， "Ｊ． Ｃｏｍｐ． Ｐａｔｈｏｌ．" １１７：２３７〜２５２， １９９７）。ＢＥＤから回復後もこのウイルスはブタの中枢神経系に残存する（Ｗｉｍａｎら１９９８； Ｈｊｅｒｔｎｅｒら１９９８）。このウイルスは、そのヌクレオチド配列の９５％以上をクリプトウイルスと共有する。
メナングルウイルスは、１９９７年にオーストラリアで初めて同定された出現ルブラウイルスである（Ｐｈｉｌｂｅｙら、"Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ" ４：２６９〜２７１， １９９８）。このウイルスは、死産コブタの脳及び脊髄の重篤な退行変性に関連する（Ｐｈｉｌｂｅｙら１９９８）。これらの動物のニューロンは、メナングルウイルス封入体（ヌクレオカプシド）を含んでいた。血清検査によってさらに、ブタ、フルーツコウモリ、並びに少なくとも２人の豚飼育所作業員中にこのウイルスに対する中和抗体が発見された。
多数のヒトルブラウイルスは、ヒトにおける疾病の原因であることが公知である。これらは、（１）ムンプスウイルス（ヒト流行性耳下腺炎を起因）、（２）ヒトパラインフルエンザウイルスタイプ２（別名、ＨＰＩＶ−２、比較的軽症な上気道、インフルエンザ様疾患と関連する）、（３）ヒトパラインフルエンザウイルスタイプ４Ａと４Ｂ（別名、ＨＰＩＶ−４Ａ、ＨＰＩＶ−４Ｂ、これもまた比較的軽症な上気道、インフルエンザ様疾患と関連する）を含む。流行性耳下腺炎を罹患すると、実際のところ生命に危険は及ぼさないが、かなりの数の患者において神経系に関与するという証拠もある。
対照的に、もう一方のルブラウイルスである、シミアンウイルス５（Ｓｉｍｉａｎ Ｖｉｒｕｓ ５）（ＳＶ５）は、ヒトまたは実験的感染動物のいずれにおいても疾患を起因することを明確に実証する公表された研究はなく、重度の免疫不全症を併発するマウスにおいてさえ、実験的感染マウスに疾患を起こさないことを立証する研究発表が少なくとも一つある（Ｄｉｄｃｏｃｋら， "Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．" ７３：３１２５〜３１３３， １９９９）。
【０００２】
１９７８年に、一つの研究論文が、多発性硬化症（ＭＳ）患者の骨髄から「病原菌」が単離されたことを記述した。（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ， ＤＮら， Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ａｇｅｎｔ ｆｒｏｍ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｕｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ（多発性硬化症患者の骨髄からの病原菌の単離），  "Ｌａｎｃｅｔ" ｉｉ：３８７〜３９１ [１９７８]）。後続の論文が別々のＭＳ患者に由来する、５つの別々の「ヒトＳＶ５分離株」について記載した。（Ｇｏｓｗａｍｉ， ＫＫＡら， Ｄｏｅｓ ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ ５ ｉｎｆｅｃｔ ｈｕｍａｎｓ?（シミアンウイルス５はヒトを感染するか？ "Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ" ６５：１２９５〜１３０３ [１９８４]、 Ｇｏｓｗａｍｉ， ＫＫＡら， Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗｓ（ヒト骨髄におけるパラミクソウイルスの残存の証拠）， "Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ" ６５：１８８１〜１８８８ [１９８５]、Ｒａｎｄａｌｌ， ＲＥら， Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ ５ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅ ｉｎ ｒｅｖｅａｌｉｎｇ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｈｕｍａｎ， ｃａｎｉｎｅ ａｎｄ ｓｉｍｉａｎ ｉｓｏｌａｔｅｓ（シミアンウイルス５に対するモノクローナル性抗体の単離とキャラクタリゼーション並びにヒト、イヌ、及びシミアン分離物間の抗原的相違の解明におけるその用途）， "Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ" ６８：２７６９〜２７８０ [１９８７]）。しかしながら、ＳＶ５とＭＳの因果関係は推測に留まった。
１９８７年に、Ｇｏｓｗａｍｉらが、何人かのＭＳ患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）がＳＶ５に対する抗体を含んでいることを報告した。（Ｇｏｓｗａｍｉ ＫＫＡら， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ ＳＶ５ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄｓ ｏｆ ｓｏｍｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｐａｔｉｅｎｔｓ（何人かの多発性硬化症患者の脳脊髄液におけるパラミクソウイルスＳＶ５に対する抗体）， Ｎａｔｕｒｅ ３２７：２４４〜２４７ [１９８７]）。しかし、この報告は、他の高名なパラミクソウイルス学者によるその結果の再現が失敗に終わったために、議論の的となった。（Ｖａｎｄｖｉｋ， Ｂ． とＮｏｒｒｂｙ， Ｅ．， Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ ＳＶ５ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ（パラミクソウイルスＳＶ５と多発性硬化症）， Ｎａｔｕｒｅ ３３８：７６９〜７７１ [１９８９]、しかしＲｕｓｓｅｌｌ， ＷＣとＲａｎｄａｌｌ， ＲＥ， Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ａｎｄ ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ（多発性硬化症とパラミクソウイルス）， Ｎａｔｕｒｅ ３４０：１０４ [１９８９]を参照）。したがって、ＳＶ５とＭＳの明確な因果関係は当該分野では確立されなかった。
多発性硬化症は、最も一般的には若年及び初期中年成人（１８才から４０才）を冒す、慢性の退行変性中枢神経系疾患である。青年で診断されることは稀であり、小児ではさらに稀である。３５万人のアメリカ人を冒すＭＳは、外傷性障害を除いては神経性廃疾の最多原因の一つである。（"Ｈａｒｒｉｓｏｎ'ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｈａｒｒｉｓｏｎ、内科学の原理）"， 第１３版．， Ｋ．Ｊ． Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒら （編集）， ＭｃＧｒａｗ-Ｈｉｌｌ， ｐｐ．２２８７-９５ [１９９４]に掲載されている、Ｓ．Ｌ． Ｈａｕｓｅｒ， Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅｓ（多発性硬化症とその他の脱髄性疾患） ）。本疾患の発症、進行並びに結果は、疾患のいくつかのパターンの一つの症状を発現する患者によって高度に変化する。例えば、理由は明瞭ではないが、ＭＳは男性の２倍もの女性を冒す。ＭＳの診断、臨床的描写を包括する個々のコンポーネントはずっと以前から詳しく描写されているにも係わらず、その症状のシーケンスと重症度は、症例によって極めてばらつきが大きい。（Ｈａｌｌｐｉｋｅ Ｊ．Ｆ．， Ａｄａｍｓ Ｃ．Ｗ．Ｍ．，及びＴｏｕｒｔｅｌｌｏｔｔｅ Ｗ．Ｗ．，編集， １９８３， "Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ（多発性硬化症：病理、診断と管理）"， Ｃｈａｐｍａｎ & Ｈａｌｌ， Ｌｏｎｄｏｎ、ＭｃＡｌｐｉｎｅ Ｅ．ら， １９７２， "Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：Ａ Ｒｅａｐｐｒａｉｓａｌ（多発性硬化症：再評価）"， Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ， Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ、Ｒｏｓｅ Ａ．Ｓ．， １９７２， "Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  （多発性硬化症：免疫学、ウイルス学、超微細構造）" Ｗｏｌｆｇｒａｍ Ｆ．， Ｅｌｌｉｓｏｎ Ｇ．Ｗ．， Ｓｔｅｖｅｎｓ Ｊ．Ｇ．，とＡｎｄｒｅｗｓ Ｊ．Ｍ．， 編集，  Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ に掲載されているＭｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：  Ａ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ （多発性硬化症：臨床的解釈））。ＭＳを罹患するどの２人の患者をとっても同様ではないと言ってよく、その結果、何が定型的な臨床的病歴を構成するのかについての論議がある。
【０００３】
最も一般的には、ＭＳは最初に一連の神経系発作を示し、続いて症状が軽減するが一定の安定期後に回帰する完全または部分的緩解を示す（再発−緩解ＭＳ）。その他の患者では、この疾患は、明瞭な緩解を伴わず、しばしば短いプラトーあるいは症状の僅かな軽減を伴う漸進的な衰退によって特徴づけられる（原発−進行性ＭＳ）。さらに他の患者では、初期段階では疾患の再発と緩解の経過をたどり、その後進行性に衰退する可能性がある（二次的−進行性ＭＳ）。
一般的に、慢性進行性及び慢性再発性ＭＳの第一の症状発現にはさほど変化がない。潜行性疾患（無気力、抑鬱症、疲労、体重減少、筋肉痛）が存在したことは、最初の神経学的症状発現前の患者のカルテからしばしば明らかにすることができる。全ての確実なＭＳ症例の約５０％における第一の兆候は、肢の衰弱感、１つ以上の肢、四肢、または躯幹周囲の痺れ感、または刺痛（ｐａｒａｔｈｅｓｉａｓ）である。兆候と症状にはしばしば不一致が見られる。ＡｄａｍｓとＶｉｃｔｏｒ （"Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ （神経学の原理）" Ａｄａｍｓ Ｒ．Ｄ． とＶｉｃｔｏｒ Ｍ．， 編集，  ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに掲載されている、１９９７， Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ａｎｄ ａｌｌｉｅｄ ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ （多発性硬化症と類似脱髄性疾患 ） は、「ＭＳ患者が片側の脚に症状があり、両側に兆候（両側性バビンスキー兆候）を有することは一般的な警句である」を言及している。もう一つのよく見られる初期兆候は、一方または両側の眼を冒す球後視神経炎の短期エピソードである。多数のＭＳ患者は、視神経炎（視神経ヘッドの膨満）を呈し、これは神経ヘッドに対する脱髄斑の近位性に依存する。症例の有意なパーセントを占める視神経炎が他の疾患を構成しているのか、それともＭＳのサブクラスを構成するのかについてはかなりの議論があるが、症例の約５０％において、この疾患はＭＳに進行する（Ａｒｎａｓｏｎら， "Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ． Ｓｃｉ．" ２２：４１９， １９７４）。
診断が確実になるときには、臨床的症候群のさらに定型的な群が、進行的あるいは緩解様式に発症している。大多数の患者は、視神経、脳幹、小脳、及び脊髄に関連する混合または全身型疾患を呈示する。約三分の一が、脊髄型を呈し、約５％が小脳または橋小脳型、並びに同様な割合で黒内障型を呈する。ＡｄａｍｓとＶｉｃｔｏｒ （前出） は、彼ら自身の臨床材料が少なくとも８０％の脳脊髄及び脊髄型の疾患を含んでいたと推定している。
心理障害が頻繁に観察され、ＡｄａｍｓとＶｉｃｔｏｒ （前出）が おそらく前頭葉にある広範な白質病変に拠るであろうとする、不相応な多幸性として呈示され得る。高比率のＭＳ患者において、抑鬱症並びに過敏性が観察される。
比較的最近まで、ＭＳとテンカンは、別々の実体であると考えられていた。これらの障害間の「オーバーラップ」を実証する多数の最近の研究についての出版物がこの考え違いを訂正している。過去１０年に実施された疫学ならびに人口統計学的研究は、かなりの割合のＭＳ患者における併発テンカン様症状の重要な証拠を提供してきた。テンカン様症状の併発は、早発性ＭＳ（即ち、小児及び青年）において顕著に高く、ＭＳ患者におけるテンカンの総罹患率は、一般集団よりも何倍も高い。
ヒトテンカンは、不可解な医学的状態で、―事実、特定の疾患あるいは一つの症候ではないが―、しかし、むしろそれ自体が種々の病態プロセスに対して二次的であり得る、いくつかの障害を受けた脳機能から生じる広いカテゴリーの複合症状である。今日、多数の臨床的現象がテンカン発作として認識されており、そのいくつか（例えば、ミオクローヌス性及びアトニー性テンカン発作）は現在よく理解されておらず、事実、伝統的に「テンカン性」と考慮されていた病態生理学的プロセスとは若干異なる神経メカニズムを反映している可能性がある。おそらく、これらの疾病の不可解かつ複雑な本質の最大の反映は、この疾患の病因が、圧倒的大多数の症例において（７０％以上）、「原因不明」（即ち、不明瞭、不確かな起源による）あるいは「特発性」（即ち、未知の原因による）なことである。
【０００４】
テンカンはテンカン発作にとどまらない。テンカン患者は典型的には、テンカン発作活動がほとんどあるいは全くないものから、軽い活動（「小発作性」または「無」テンカン発作）、反復かつ難治性「大発作性」テンカン発作に至るまでの応答スペクトルを呈する（これらの出来事は、門外漢の一般大衆によって、テンカンの全ての形態を定義する症状であるとしばしば誤解される、"Ｅｐｉｌｅｐｓｙ： Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ（テンカン：総合テキストブック）"， Ｅｎｇｅｌ， Ｊｒ． Ｊ． ａｎｄ Ｐｅｄｌｅｙ， Ｔ．Ａ．， 編集 Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ-Ｒａｖｅｎ， １９９７を参照）。その状態実体は、各個人によって異なり、廃疾とクオリティ・オブ・ライフの損失の原因となる、多数の局面から成る。症状の理学的スペクトルは、極度に微妙な「小発作性」または「無」テンカン発作から、障害が著しい「大発作性」テンカン発作の範囲に渡るが、多数の患者が同じく障害と成り得るその他の共通な病的プロセス（例えば、記憶喪失、錯乱状態、嗜眠、睡眠障害、並びに臨床的な抑鬱状態）を経験する。テンカン発作のみに焦点を置く治療は、障害を軽減するためには往々にしてほとんど役に立たない。これはおそらく、テンカン発作性脳組織の外科的切除に成功した患者が、テンカン発作は消失しても社会的に孤立し失職したままであり、生活が改善された証拠がほとんどないことによって好適に説明されるであろう。治療上の介入は、テンカンを構成する複数及び相互作用性の医学的、心理学的、並びに環境的因子が対処される場合にのみ、至適となり得る。
もう一つのテンカン様疾患は、稀かつ致死的な小児と青年の退行変性中枢神経系疾患である、亜急性硬化性全脳炎（ＳＳＰＥ）である。（ＳｅｖｅｒとＺｅｍａｎ， 編集， Ｍｅａｓｌｅｓ Ｖｉｒｕｓ ａｎｄ Ｓｕｂａｃｕｔｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇ Ｐａｎｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ （麻疹ウイルスと亜急性硬化性全脳炎）。"Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ （Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １）" １８：１〜１９２， １９６８、ＰａｙｎｅとＢａｕｂｌｉｓ， "Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ" ７：１７９〜１９５， １９７１、ＪｏｈａｎｎｅｓとＳｅｖｅｒ， "Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｍｅｄ．" ２６：５８９〜６０１， １９７５、Ｍｅｕｌｅｎら， "Ｃｏｍｐ． Ｖｉｒｏｌ．" １８：１０５〜１５９， １９８３、Ｄｙｋｅｎ， "Ｎｅｕｒｏｌ． Ｃｌｉｎ．" ３：１７９〜１９６， １９８５）。初期においては、本疾患は普通は情動性あるいは行動障害を呈し、数ヶ月の間に著明なテンカン様の神経疾患に進行する。その後期は、難治性テンカン発作、除脳硬直、昏睡及び死亡によって特徴づけられる。時として、ほとんど全てのＳＳＰＥ患者がテンカンと「誤診」される。
ＳＳＰＥの症例は、世界中を通して先進国及び開発途上国のいずれにおいても記述されている（ＣａｎａｌとＴｏｒｃｋ， "Ｊ． Ｎｅｕｒｏｌ． Ｓｃｉ"，  １：３８０〜３８９， １９６４、 Ｐｅｔｔａｙら， "Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ．"１２４：４３９〜４４４， １９７１、 Ｈａｄｄａｄら， "Ｌａｎｃｅｔ" ２：１０２５， １９７４、Ｓｏｆｆｅｒら， "Ｉｓｒａｅｌｉ Ｊ． Ｍｅｄ． Ｓｃｉ．" １１：１〜４， １９７５、Ｎａｒｕｓｚｅｗｉｃｚ-Ｌｅｓｉｕｋら， "Ｐｒｚｅｇ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃｚｎａ" ２３：１〜８， １９７９、Ｍｏｏｄｉｅら， "Ｓｏｕｔｈ Ａｆｒｉｃａｎ Ｍｅｄ． Ｊ．" ５８：９６４〜９６７， １９８０）。この疾患の発現頻度は大きくばらつき、英国（Ｄｉｃｋ， "Ｂｒｉｔ． Ｍｅｄ． Ｊ．" ３：３５９〜３６０， １９７３）と米国（Ｊａｂｂｏｕｒら， "Ｊ． Ａ． Ｍ． Ａ．" ２２０：９５９〜９６２， １９７２）では一年あたり１００万人の人口（ｃｐｍｐｙ）につき０．０６〜０．１０症例、イスラエル（Ｓｏｆｆｅｒら， "Ｉｓｒａｅｌｉ Ｊ． Ｍｅｄ． Ｓｃｉ．" １１：１〜４， １９７５）とニュージーランド（ＢａｇｕｌｅｙとＧｌａｓｇｏｗ， "Ｌａｎｃｅｔ" ２：７６３〜７６５， １９７３）では３．４０〜７．７０ｃｐｍｐｙに及ぶ。本疾患の究極の発生機序の原因である因子（複数でもよい）は明らかではない。
【０００５】
多くの研究が、ＳＳＰＥ患者の中枢神経系組織が麻疹ウイルスによって持続的に感染されていることを示している。本疾患が幼年期に獲得された持続性麻疹ウイルスの感染の再発に関連することを示す相当な根拠がある。この仮説を支持するＳＳＰＥ患者における特定の所見は、（１）小児麻疹の病歴、（２）血清中の麻疹ウイルス特異抗体の力価の著明な上昇、（３）脳脊髄液中における麻疹ウイルス特異抗体の存在、（４）特異的免疫蛍光法によって実証されるＣＮＳ組織中における麻疹ウイルス抗原の存在、（５）オリゴデンドログリア及び神経細胞におけるパラミクソウイルスヌクレオカプシドの細胞内封入、並びに（６）感受性細胞と共培養する場合、脳及びリンパ組織からの感染性麻疹ウイルスの単離、を含む（Ｂｏｕｔｅｉｌｌｅら， "Ｒｅｖｕｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｅ" １１３：４５４〜４５８， １９６５、Ｃｏｎｎｏｌｌｙら， "Ｌａｎｃｅｔ" １：５４２〜５４４， １９６７、 Ｌｅｇｇ， "Ｂｒｉｔ． Ｍｅｄ． Ｊ．" ３：３５０〜３５４， １９６７、Ｐａｙｎｅら， "Ｎｅｗ Ｅｎｇ． Ｊ． Ｍｅｄ．" ２８１５８５〜５８９， １９６９、Ｈｏｒｔａ-Ｂａｒｂｏｓａら， "Ｎａｔｕｒｅ" ２２１：９７４， １９６９）。最後に、そしておそらく最も説得力のある疫学的根拠は、麻疹ワクチンの接種が、本疾患の発症リスクを実質的に低下させることを示唆する（Ｍｏｄｌｉｎら， "Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ" ５９：５０５〜５１２， １９７７、Ｈａｌｓｅｙら， "Ａｍ． Ｊ． Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．" １１１：４１５〜４２４， １９８０、Ｄｙｋｅｎら， "Ｍｏｒｂ． Ｍｏｒｔａｌ． Ｗｅｅｋｌｙ Ｒｅｐｏｒｔ" ３１：５８５〜５８８， １９８２）。
これらの所見にも係わらず、麻疹ウイルスのみがこの疾患の唯一の病因であることに一貫しないいくつかの変則がある。それらは以下を含む。
第一に、神経毒性。麻疹患者由来の麻疹ウイルスの臨床分離株は、実験的に感染させた動物にＳＳＰＥ様疾患を起因することが示されていない。細胞性ＳＳＰＥ由来株は、しかしながら、ケナガイタチ、マモセット、並びにサルにおいて係る疾患を起因することが示されている（Ｋａｔｚら， "Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ．" １２１：１８８〜１９５， １９７０、Ｔｈｏｒｍａｒら， "Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ．" １２７：６７８〜６８５， １９７３、Ｕｅｄａら， "Ｂｉｋｅｎ Ｊｏｕｒｎａｌ" １８：１７９〜１８１， １９７５、Ｙａｍａｎｏｕｃｈｉら， "Ｊａｐａｎ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｓｃｉ． Ｂｉｏｌ．" ２９１７７〜１８６， １９７６、Ｔｈｏｒｍａｒら， "Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ．"１３６：２２９〜２３８， １９７７、Ａｌｂｒｅｃｈｔら， "Ｓｃｉｅｎｃｅ" １９５：６４〜６６， １９７７、Ｔｈｏｒｍａｒら， "Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．" １４８：６７４〜６９１， １９７８、Ｏｈｕｃｈｉら， "Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．" ２５：８８７〜８９３ [１９８１]）。
第二は、ウイルス封入体の分布と形態。感染細胞中の麻疹ウイルス抗原は、蛍光抗体法で検査すると大型の癒着する細胞質内封入体を形成している。ＳＳＰＥ患者血清で標識されると、ウイルス抗原は、細胞性ＳＳＰＥ由来ウイルス株中及び実験的に感染させた動物ＣＮＳ組織中では明瞭に異なるパターンを実証する。係る物質では、細胞内封入体は、「こしょう様」粒子及び／または「飛散様」分布を示す（Ｄｏｉら， "Ｊａｐａｎ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｓｃｉ． Ｂｉｏｌ．" ２５：３２１〜３３３， １９７２、ＫｉｍｏｔｏとＢａｂａ， "Ｂｉｋｅｎ Ｊｏｕｒｎａｌ" １８：１２３〜１３３， １９７５、 ｄｅ Ｆｅｌｉｃｉら， "Ａｎｎａｌｅｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅ" １２６：５２３〜５３８， １９７５、Ｏｈｕｃｈｉら， "Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．" ２３：８７７〜８８８， １９７９）。
【０００６】
第三は、ウイルスヌクレオカプシドの超微細構造形態である。麻疹ウイルス感染細胞では、細胞質ヌクレオカプシドが主として「ファジー」または「顆粒状」形態となる（Ｔａｗａｒａ， "Ｖｉｒｕｓ （Ｏｓａｋａ）" １４：８５〜８８， １９６５、Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ， Ｂｕｌｌ． "Ｙａｍａｇｕｃｈｉ Ｍｅｄ． Ｓｃｈｏｏｌ" １３： １６７〜１８９， １９６６、Ｎａｋａｉら， "Ｖｉｒｏｌｏｇｙ" ３８：５０〜６７， １９６９、ＮａｋａｉとＩｍａｇａｗａ， "Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．" ３：１８７〜１９７， １９６９）。ＳＳＰＥ由来ＣＮＳ組織では、ファジー及び平滑ヌクレオカプシドのいずれも一貫して観察されている（Ｏｙａｎａｇｉら， "Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．" ７：１７６〜１８２， １９７１、Ｄｕｂｏｉｓ-Ｄａｌｃｑら， "Ａｒｃｈ． Ｎｅｕｒｏｌ．" ３１：３５５〜３６４， １９７４）。平滑な細胞質ヌクレオカプシドはまたほとんどの細胞性ＳＳＰＥ由来細胞株において観察されており（Ｄｏｉら， Ｊａｐａｎ． "Ｊ． Ｍｅｄ． Ｓｃｉ． Ｂｉｏｌ．" ２５：３２１〜３３３， １９７２、Ｍａｋｉｎｏら， "Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．" ２１：１９３〜２０５， １９７７； Ｕｅｄａら， "Ｂｉｋｅｎ Ｊｏｕｒｎａｌ" １８：１１３〜１２２， １９７５、Ｂｕｒｎｓｔｅｉｎら， "Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ．" １０：１３７８〜１３８２， １９７４、 Ｍｉｒｃｈａｍｓｙら， "Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ" ９：１０６〜１１８， １９７８、Ｓｃｈｏｔｔら， "Ｒｅｖｕｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｅ" １３５：６５３〜６６４， １９７９）、そのいくつかは係る構造のみを含む（Ｄｏｉら， Ｊａｐａｎ． "Ｊ． Ｍｅｄ． Ｓｃｉ． Ｂｉｏｌ．" ２５：３２１〜３３３， １９７２、Ｔｈｏｒｍａｒら， "Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．" １４８：６７４〜６９１， １９７８）。
第四は、ウイルスヌクレオカプシドの免疫反応性である。ファジーなヌクレオカプシドは動物で実験的に産生されたＨＲＰ−結合麻疹ウイルス特異抗体で標識されるが、平滑なウイルスヌクレオカプシドは標識されない（Ｄｕｂｏｉｓ-Ｄａｌｃｑら， "Ｌａｂ． Ｉｎｖｅｓｔ．" ３０：２４１〜２５０， １９７４、 Ｂｒｏｗｎら， "Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ" ５０：１８１〜１８６， １９８０）。さらに興味深いことには、どちらもＳＳＰＥ血清によって容易に標識され得る（Ｂｒｏｗｎら， "Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ" ５０：１８１〜１８６， １９８０）。
そして第五は、疫学。ＳＳＰＥ発生機序の麻疹ウイルス理論の最も理解できない特色は、本疾患が極めて出現頻度が低いことである。社会経済学的、人口統計上、並びに遺伝因子の役割について多数の研究が行われているにも係わらず（ＣａｎａｌとＴｏｒｃｋ， "Ｊ． Ｎｅｕｒｏｌ． Ｓｃｉ．" １：３８０〜３８９， １９６４、Ｐｅｔｔａｙら， "Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ．" １２４：４３９〜４４４， １９７１、 Ｈａｄｄａｄら， "Ｌａｎｃｅｔ" ２：１０２５， １９７４、Ｓｏｆｆｅｒら， "Ｉｓｒａｅｌｉ Ｊ． Ｍｅｄ． Ｓｃｉ．" １１：１〜４， １９７５、Ｎａｒｕｓｚｅｗｉｃｚ-Ｌｅｓｉｕｋら， "Ｐｒｚｅｇ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃｚｎａ" ２３：１〜８， １９７９、Ｍｏｏｄｉｅら， "Ｓｏｕｔｈ Ａｆｒｉｃａｎ Ｍｅｄ． Ｊ．" ５８：９６４〜９６７， １９８０、Ｄｉｃｋ， "Ｂｒｉｔ． Ｍｅｄ． Ｊ．" ３：３５９〜３６０， １９７３、Ｊａｂｂｏｕｒら， "Ｊ． Ａ． Ｍ． Ａ．" ２２０：９５９〜９６２， １９７２、ＢａｇｕｌｅｙとＧｌａｓｇｏｗ， "Ｌａｎｃｅｔ" ２：７６３〜７６５， １９７３、Ｍｏｄｌｉｎら， "Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ" ５９：５０５〜５１２， １９７７、Ｈａｌｓｅｙら， "Ａｍ． Ｊ． Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．" １１１：４１５〜４２４， １９８０、Ｄｙｋｅｎら， "Ｍｏｒｂ． Ｍｏｒｔａｌ． Ｗｅｅｋｌｙ Ｒｅｐｏｒｔ" ３１：５８５〜５８８， １９８２）、麻疹ウイルスが実際に世界中の何百万人もの小児を感染しているのに、ＳＳＰＥが何故これほど稀であるのかは、現在に至るまで全くもって明らかにされていない。
【０００７】
５０万人のアメリカ人を冒す、さらに一般的な特発性神経学的及び／または神経精神医学的疾患は、慢性疲労症候群（ＣＦＳ）であり、テンカン様の症状の併発を頻繁に伴う。（Ｐ． Ｈ． Ｌｅｖｉｎｅ， Ｗｈａｔ ｗｅ ｋｎｏｗ ａｂｏｕｔ ｃｈｒｏｎｉｃ ｆａｔｉｇｕｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｔｏ ｔｈｅ ｐｒａｃｔｉｃｉｎｇ ｐｈｙｓｉｃｉａｎ（慢性疲労症候群について我々が知っていることと臨床医師との関連性）， "Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ．" １０５（３Ａ）：１００Ｓ〜０３Ｓ [１９９８]）。慢性疲労症候群は、少なくとも６ヶ月継続する、その他の医学または精神病状態に起因しない、持続性、衰弱性疲労およびエネルギー喪失が突然発症することによって特徴づけられ、その症状は、頭痛、認識及び行動機能障害（例えば、短期記憶喪失）、咽頭炎、リンパ節及び関節の疼痛、並びに微熱を含む。（Ｍ． Ｔｅｒｍａｎら， Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｆａｔｉｇｕｅ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ ａｎｄ Ｓｅａｓｏｎａｌ； Ａｆｆｅｃｔｉｖｅ Ｄｉｓｏｒｄｅｒ： Ｃｏｍｏｒｂｉｄｉｔｙ， Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｏｖｅｒｌａｐ， ａｎｄ Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  （慢性疲労症候群と季節；情動障害：同時罹患率， 診断上の重複と治療の意義）， "Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ．" １０５（３Ａ）：１１５Ｓ〜２４Ｓ [１９９８]）。抑鬱症と関連症状がまたよく見られ、睡眠障害、不安症、及び月経前症状またはその他の婦人科合併症の悪化を含む。（Ａ．Ｌ． ＫｏｍａｒｏｆｆとＤ． Ｂｕｃｈｗａｌｄ， Ｓｙｍｐｔｏｍｓ ａｎｄ ｓｉｇｎｓ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｆａｔｉｇｕｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ（慢性疲労症候群の症状と兆候）， "Ｒｅｖ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ．" １３：Ｓ８〜Ｓ１１ [１９９１]、Ｂ．Ｌ． Ｈａｒｌｏｗら， Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｆａｔｉｇｕｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ（慢性疲労症候群の生殖的関連性）， "Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ．" １０５（３Ａ）：９４Ｓ〜９９Ｓ [１９９８]）。神経性低血圧症、副腎皮質機能低下、及び免疫調節不全を含むその他の生理学的異常もまた、ＣＦＳに関連する。（Ｐ．Ｈ． Ｌｅｖｉｎｅ [１９９８]）。ＣＦＳ患者の亜群は、気分状態の悪化、働く気力の低下、並びに季節性情動障害を暗示する冬の月間での起床の困難を訴える。（Ｍ． Ｔｅｒｍａｎら [１９９８]）。
ＣＦＳの病因は不明であり、ＣＦＳ症状の不均一性は特定の診断用臨床検査の利用を妨げてきた。（Ｐ．Ｈ． Ｌｅｖｉｎｅ [１９９８]）。ＣＦＳとウイルスまたは細菌感染症、毒物曝露、起立性低血圧及びストレスに起因するその他の疾患状態の間に並行する症候があることが示唆されてきたが、これらのいずれもＣＦＳの原因的役割を有することが示されていない。（例えば、  Ｉ．Ｒ． Ｂｅｌｌら， Ｉｌｌｎｅｓｓ ｆｒｏｍ ｌｏｗ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ： ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｔｏ ｃｈｒｏｎｉｃ ｆａｔｉｇｕｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ａｎｄ ｆｉｂｒｏｍｙａｌｇｉａ（環境化学物質の低レベルに起因する疾患：慢性疲労症候群と線維筋痛に対する関連性）， "Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ．" １０５（３Ａ）：７４Ｓ〜８２Ｓ [１９９８]、Ｒ．Ｌ． Ｂｒｕｎｏら， Ｐａｒａｌｌｅｌｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐｏｓｔ-ｐｏｌｉｏ ｆａｔｉｇｕｅ ａｎｄ ｃｈｒｏｎｉｃ ｆａｔｉｇｕｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ： ａ ｃｏｍｍｏｎ ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ?（後ポリオ疲労と慢性疲労症候群との類似性：共通病態生理学？）， "Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ．" １０５（３Ａ）：６６Ｓ〜７３Ｓ [１９９８]、Ｒ． ＧｌａｓｅｒとＪ．Ｋ． Ｋｉｅｃｏｌｔ-Ｇｌａｓｅｒ， Ｓｔｒｅｓｓ-ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｔｏ ｖｉｒａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｃｈｒｏｎｉｃ ｆａｔｉｇｕｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ （ストレス関連免疫変調とウイルス感染及び慢性疲労症候群との関連性）， "Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ．" １０５（３Ａ）：３５Ｓ〜４２Ｓ [１９９８]、Ｐ．Ｃ． ＲｏｗｅとＨ． Ｃａｌｋｉｎｓ， Ｎｅｕｒａｌｌｙ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｈｙｐｏｔｅｎｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｈｒｏｎｉｃ ｆａｔｉｇｕｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ  （神経性低血圧と慢性疲労症候群）， "Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ．" １０５（３Ａ）：１５Ｓ〜２１Ｓ [１９９８]、Ｌ．Ａ． Ｊａｓｏｎら， Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｆａｔｉｇｕｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ａｍｏｎｇ ｎｕｒｓｅｓ  （看護士における慢性疲労症候群の罹病率の推定）， "Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ．" １０５（３Ａ）：９１Ｓ〜９３Ｓ [１９９８]）。したがって、ＣＦＳの診断及び／または治療を方向づけるための既知の原因は未だ存在しない。その結果、ＣＦＳの診断と治療は、根底にある治療可能な原因というよりはむしろ症状に目が向けられ続けている。例えば、リラキシンの用途は、不随意筋を弛緩して、その結果ＣＦＳに付随する疼痛を軽減することであると説明されている。（Ｓ．Ｋ． Ｙｕｅ， Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｔｒｅａｔｉｎｇ ｍｙｏｆａｓｃｉａｌ ｐａｉｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｗｉｔｈ ｒｅｌａｘｉｎ  （筋筋膜疼痛症候群のリラキシンによる治療法， 米国特許番号第 ５，８６３，５５２号）
多数の特発性の神経学的、神経変性、神経心理学的、並びに神経精神医学的障害及び原発性気道内及び／またはリンパ節腫脹性疾患の原因となる因子について、新しい抗ウイルス薬候補のスクリーニングを含む、診断検査、研究及び開発、そして治療法を確立する需要がある。本発明によるこの点及び他の利点を本願に説明する。
【０００８】
発明の概要
本発明は、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）のルブラウイルス（Ｒｕｂｕｌａｖｉｒｕｓ）属に属する、クリプトウイルス（Ｃｒｙｐｔｏｖｉｒｕｓ）と命名された新ヒトウイルスの発見と単離に基づく。本発明の単離クリプトウイルスのゲノムは、（配列番号１）に完全相補なヌクレオチド配列を有するマイナス鎖ＲＮＡである。
本発明は、クリプトウイルス特異的である単離された核酸に関する。本発明のクリプトウイルス特異的核酸は以下を包含する：（Ａ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置１〜１５２４６のヌクレオチド配列、即ち、限定はされないが、プラス鎖ＲＮＡ（例：ｍＲＮＡ）及びｃＤＮＡ、あるいは（Ｂ）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置１〜１５２４６に相補なヌクレオチド配列、即ち、限定はされないが、マイナス鎖ＲＮＡ（例：ゲノムまたはクローン化ＲＮＡ）及びｃＤＮＡ、あるいは（Ｃ）（Ａ）または（Ｂ）のクリプトウイルス特異的フラグメントで、少なくとも約５ヌクレオチド長であるフラグメント。本発明は、ＲＮＡ及びＤＮＡのどちらも包含し、したがって、本発明が、核酸、即ち、（配列番号１）においてウラシル残基（「Ｕ」）がチミン残基（「Ｔ」）を置換しているＲＮＡを包含することは当業者には理解されよう。本発明の核酸は、有用なクリプトウイルス特異的プローブ及びプライマーを含む。
本発明の核酸を含む、クローニングベクター及び発現ベクターを含む本発明の核酸構築物が提供される。係る本発明の組換えベクターは、本発明の宿主細胞中に含まれる。
本発明はまた、クリプトウイルス特異的核酸セグメントによってコードされる単離クリプトウイルスタンパク質に関する。本発明のクリプトウイルスタンパク質は、単離クリプトウイルスヌクレオカプシド及びエンベロープタンパク質、並びにクリプトウイルスタンパク質成分を含むキメラタンパク質を含む。
本発明は、ウイルス発現ベクターのような本発明のクリプトウイルス核酸、または本発明のシュードタイプビリオン、または本発明の単離クリプトウイルスビリオンまたはその他のクリプトウイルス粒子のような本発明のクリプトウイルスタンパク質を含む単離ビリオンまたはその他のウイルス粒子に関する。
本発明のクリプトウイルス核酸、クリプトウイルスタンパク質、または単離ビリオン及びその他のウイルス粒子を、キャリアと共に含む本発明の組成物はまた本発明に含まれる。
さらに、本発明は、クリプトウイルスビリオンの単離法を提供する。本発明の方法は、クリプトウイルス感染を有するヒトから得られた複数の末梢血単核細胞（ＰＢＭＮＣ）を培養することに関する。ＰＢＭＮＣは、限定はされないが、サイクリックＧＭＰのような細胞のグアニリルシクラーゼ活性を増加する薬剤を含む人工水性培地中で培養される。ＰＢＭＮＣは次に、この薬剤を含む新鮮水性培地中で複数の哺乳類羊膜細胞と共培養されて、この共培養物は１回以上継代培養される。継代培養に引き続いて、複数の哺乳類上皮細胞をＰＢＭＮＣと哺乳類羊膜細胞と共にこの薬剤を含む新鮮水性培地中で共培養する。この共培養の結果、水性培地中にクリプトウイルスビリオンが放出される。上清中に見いだされるクリプトウイルスビリオンを得るために、水性培地の上清を培養中の細胞から分離する。本発明の方法は、細胞材料からクリプトウイルスビリオンを多数単離することに役立つ。このようにして単離されたビリオンは、本発明が提供するクリプトウイルス増殖についての本発明の方法によって、さらに増殖することができる。
本発明によるクリプトウイルス増殖の方法は、複数の哺乳類上皮細胞を、かくして単離された、複数の無細胞クリプトウイルスビリオンに曝露し、細胞グアニリルシクラーゼ活性を増加する薬剤を含む人工水性培地中で、クリプトウイルスビリオンに曝露された哺乳類上皮細胞をさらに培養することを含む。したがって、クリプトウイルスによって急性感染された哺乳類上皮細胞が供給され、この発明による細胞は本方法によって産生される。
本発明はまた、クリプトウイルスによって非増殖型感染された哺乳類細胞株を産生する方法にも関連する。この方法は、クリプトウイルスに感染しているヒトから得られたＰＢＭＮＣを、哺乳類羊膜細胞（例えば、齧歯類または霊長類の羊膜細胞）と共に、細胞グアニリルシクラーゼを増加する薬剤を含む人工水性培地中で共培養して、これによって哺乳類羊膜細胞がクリプトウイルスによって非増殖型感染するようになることを含む。この非増殖型感染哺乳類羊膜細胞を、末梢血単核細胞と共に継代培養後、この共培養物は、非増殖型感染された哺乳類羊膜細胞の単培養となる。本発明はまた、クリプトウイルスによって非増殖型感染された細胞に関連し、この細胞は本方法に従って産生される。
【０００９】
クリプトウイルスは、原因不明かつ特発型のヒト疾患、例えばテンカン、に関連する。クリプトウイルスはまた、神経機能障害及び神経病態が明らかであり、かつテンカン様症状が常に併発（例えば、亜急性硬化性全脳炎、ＳＳＰＥ）または頻繁に併発する（例えば、多発性硬化症［ＭＳ］及び慢性疲労症候群［ＣＦＳ］）、その他のヒト神経学的、神経変性、及び／または神経精神医学的疾患に関連する。したがって、本発明の細胞株、ウイルス粒子及びビリオンは、クリプトウイルスに感染した、ヒトを含む、哺乳類の治療に有効であり得る薬剤を発見するために、抗ウイルス薬剤候補のスクリーニングに特に有用である。
特に、抗ウイルス治療薬候補をスクリーニングするために有用なインビトロ法が提供される。このインビトロスクリーニング法に基づいて、本発明のクリプトウイルス感染細胞は培養されて、次に抗ウイルス治療薬候補に曝露される。急性感染された哺乳類上皮細胞が使用されるならば、次にクリプトウイルス複製及び／またはクリプトウイルスビリオンアセンブリに対する抗ウイルス治療薬候補の効果が測定される（例えば、クリプトウイルスゲノム複製、クリプトウイルス転写、及び／または翻訳に対する効果、即ち、クリプトウイルスｍＲＮＡからのタンパク質合成、産生されるクリプトウイルスビリオンの数またはクリプトウイルス粒子の完全性）。この薬剤を投与されないコントロールと比較する、クリプトウイルス複製及び／またはクリプトウイルスビリオンのアセンブリの阻害は、治療薬候補の抗ウイルス活性を示す。一方、非増殖型感染細胞が使用される場合、抗ウイルス治療薬候補のクリプトウイルス複製、クリプトウイルスゲノム複製、及び／またはクリプトウイルス特異的転写に対する効果の測定が行われる。この薬剤を投与されないコントロールと比較する、クリプトウイルス複製、クリプトウイルスゲノム複製、及び／またはクリプトウイルス特異的転写の阻害は、治療薬候補の抗ウイルス活性を示す。これらの本発明の方法は、有望な新しい抗ウイルス薬の同定、スクリーニング、または単離に有用である。いったん、本発明の方法によって化合物の潜在能力が同定されると、次にその臨床的効用を確認するためにさらなる研究が行われ得る。したがって、化学療法薬候補をスクリーニングするための本発明の方法は、クリプトウイルス関連状態及びモノネガウイルス目に属するその他のウイルスに関連するその他の状態の治療を目的とする抗ウイルス医薬品の発見と開発にメリットがある。
本発明はまた、例えば、神経学的、神経変性、及び／または神経精神医学的疾患（例えば、テンカン、ＳＳＰＥ、ＭＳ、並びにＣＦＳのような特発性テンカン様疾患）のようなヒト疾患研究用の動物モデルを提供する。この動物モデルは、（配列番号１）に相補である一本鎖ＲＮＡを含むゲノムを有する感染性無細胞クリプトウイルスを接種された、あるいはクリプトウイルスで非増殖型感染された細胞を接種された非ヒト哺乳類を含む。接種を受けた非ヒト哺乳類の動物モデルは、接種前にはこの非ヒトの乳類によって呈示されていなかった、ヒト疾患に特徴的な症状を少なくとも一つ接種後に呈示する。
動物モデルは、抗ウイルス治療薬候補のインビボスクリーニング法に有用である。この方法は、スクリーニングを受ける治療薬候補を、本発明の動物モデルに投与することを含む。治療薬候補の投与前に、この非ヒト哺乳類は、ヒト疾患に特徴的な症状を少なくとも一つ呈示する。治療薬候補の投与後、有益な抗ウイルス効果の有無が検出され、この薬剤を投与されなかったコントロール動物と比較して、有益な抗ウイルス効果があることは、治療薬候補の活性を指示する。
本発明の動物モデルのもう一つの実施形態を利用して、抗ウイルス予防薬のインビボスクリーニング法が提供される。この方法は、スクリーニングを受ける予防薬候補を、例えば、神経学的、神経変性、及び／または神経精神医学的疾患である、ヒト疾患の症状を有さない非ヒト哺乳類に投与することを含む。この動物モデルは、前述のように、（配列番号１）に相補である一本鎖ＲＮＡを含むゲノムを有する感染性無細胞クリプトウイルス、あるいはクリプトウイルスで非増殖型感染された細胞の接種を受ける。その後、この予防薬候補の投与を受けなかったコントロールと比較して、非ヒト哺乳類における有益な抗ウイルス効果の有無が検出される。接種を受けた非ヒト哺乳類における有益な抗ウイルス効果が後に存在することは、予防薬候補の活性を指示する。
【００１０】
本発明の核酸構築物、クリプトウイルスタンパク質、及び粒子とビリオンはまた、クリプトウイルス特異抗体の産生、並びにワクチンの産生と製造に特に有用であり、その抗体とワクチンは、クリプトウイルスのヌクレオカプシドまたはエンベロープのようなクリプトウイルスタンパク質に対して特異的に産生される。これらのワクチンは、弱毒ウイルス、死菌ウイルス、組換えキメラウイルス、ウイルスのタンパク質またはその他の部分、あるいは１つ以上の単離または組換え発現されたクリプトウイルスタンパク質を含む。
本発明はまた、クリプトウイルスタンパク質を特異的に結合する単離抗体、並びにクリプトウイルス感染治療のための薬剤製造における本発明の抗体の使用に関連する。抗体とキャリアを含む組成物がまた提供される。
その他の態様では、本発明は通常、例えば、生物材料がクリプトウイルス汚染されているか否か、あるいはヒトを含む哺乳類がクリプトウイルスに感染しているか否かを決定するための方法とアッセイを導出する。
特に、本発明は、血清のような生物材料サンプル中におけるクリプトウイルスタンパク質、クリプトウイルス特異的ＲＮＡ、またはクリプトウイルス特異抗体の存在の有無を検出するための方法を提供する。
クリプトウイルスタンパク質検出方法では、生物材料サンプルを、クリプトウイルスタンパク質を特異的に結合する本発明の抗体と接触させ、サンプルの構成成分に抗体が特異的結合する場合は、サンプル中にクリプトウイルスタンパク質が存在することを指摘する。
同様にして、ＲＮＡを含む生物材料サンプル中でのクリプトウイルス特異的ＲＮＡの検出方法では、少なくとも中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件において、サンプルを本発明のクリプトウイルス特異プローブと接触させ、検出可能なハイブリダイゼーション産物の形成は、サンプル中にクリプトウイルスＲＮＡが存在することを指摘する。
一方、ＲＮＡを含むサンプルは、少なくとも１つの本発明のクリプトウイルス特異プライマーを増幅反応混合物中で使用して、サンプル中でクリプトウイルス特異的ＲＮＡの増幅を受ける。増幅反応混合物中でクリプトウイルス特異的核酸増幅産物の存在の有無を検出することによって、サンプル中におけるクリプトウイルス特異的ＲＮＡ存在の有無を決定することができ、反応混合物中にクリプトウイルス特異的増幅産物が存在することは、サンプル中にクリプトウイルス特異的ＲＮＡが存在することを指摘する。
本発明はまた、血清のような抗体含有生物材料サンプル中において、クリプトウイルス特異抗体の存在の有無を検出する方法を提供する。この方法は、生物材料サンプルを、クリプトウイルスエンベロープタンパク質、あるいは本発明のビリオンまたはウイルス粒子のような本発明のタンパク質と、それぞれ特異的タンパク質−抗体複合体、または抗体を結合したウイルス複合体を形成させるような条件下で接触することを含む。係る特異的タンパク質−抗体複合体、または抗体を結合したウイルス複合体の存在が検出されることは、サンプル中にクリプトウイルス特異抗体が存在することを指摘する。本方法の実施に便利な、本発明の抗クリプトウイルス抗体検出キットがまた提供される。
したがって、ヒトを含む哺乳類由来の生物材料サンプルについて、クリプトウイルスタンパク質、クリプトウイルス特異的ＲＮＡ、またはクリプトウイルス特異抗体の存在の有無を検出する前述した本発明による方法のいずれかを実施することによって、サンプル中にクリプトウイルスタンパク質、クリプトウイルス特異的ＲＮＡ、またはクリプトウイルス特異抗体の存在が指摘されるため、哺乳類におけるクリプトウイルス感染を検出または診断する本発明の方法が提供される。治療ストラテジーとは関わりなく、「一次」感染時（即ち、ウイルスに対する初めての曝露）あるいは出来る限りその直後（即ち、一次感染の進展中）に治療を開始することが好都合であるために、これらの診断方法は有益である。
本発明のその他の特色、目的、及び利点は、付随の図面と以下の好ましい実施形態の詳細な説明から明らかであろう。
【００１１】
図面の簡単な説明
図１は、本発明のヒトクリプトウイルスの、パラミクソウイルス科のルブラウイルス属に対する分類学的割り当てを示すチャートである。
図２は、Ｃｏｌｌｉｎらのバージョン（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  （ウイルス学）， 第三版，  Ｆｉｅｌｄｓ， Ｋｎｉｐｅ， 及びＨｏｗｌｅｙ  編集， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ-Ｒａｖｅｎ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， １９９６， 第４１章， １２０６ページ， Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓｅｓ  （パラインフルエンザウイルス））から修正した系統樹である。修正系統樹は、原型であるルブラウイルスシミアンウイルス５から区別するために、３つのルブラウイルス種（ブタルブラウイルス、イヌパラインフルエンザウイルスタイプ２、及び本発明のヒトクリプトウイルス）のクラスタリングを強調する。
図３は、パラミクソウイルス科ファミリの各属の典型的メンバーの遺伝子地図の表示である。遺伝子サイズは目盛り付きで描かれている。垂直線は、遺伝子の境界を定めている。ニューモウイルスＬ遺伝子転写は、２２Ｋ（Ｍ２）遺伝子と重複しているため、したがって互い違いなフォーマットで表示される。このオーバーラップ立体構造は、ヒト及び動物ウイルスで見られるが、その他のニューモウイルス属では見られない（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（ウイルス学），前出に掲載の、ＬａｍｂとＫｏｌａｋｏｆｓｋｙ， 第４０章， １１８１ページ， Ｔｈｅ Ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ（ウイルスとその複製））。
図４は、改訂版のルブラウイルス遺伝子地図であり、これは向神経性を示し、それらの融合タンパク質のカルボキシ末端にある付加２２アミノ酸「テール」をコードする関連ウイルスのクラスタ（即ち、ヒトクリプトウイルス、イヌパラインフルエンザタイプ２、ブタルブラウイルスの「向神経性種」）からシミアンウイルス５を区別するものである。各向神経性ウイルス種の融合（Ｆ）タンパク質は、シミアンウイルス５と融合タンパク質に対してよりも、互いにさらに密接に関連している（図１０を参照）。
図５は、還元条件下で１０％アクリルアミドＬａｅｍｍｌｉスラブゲルによるＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の勾配・精製ヒトクリプトウイルス（ＢＢＲ株）及びシミアンウイルス５（ＮＩＨ ２１００５-２ＷＲ株 ）の[35Ｓ]-メチオニン標識タンパク質の図示による比較オートラジオグラムを示す。
図６は、ローダミン・イソチオシアナート標識ヤギ抗麻疹ウイルス血清（パネルＡ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、及びＩ）とウサギ抗クリプトウイルス血清、その後でフルオレセイン・イソチオシアナート標識したヤギ抗ウサギＩｇＧ（パネルＢ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、及びＪ）で直接二重標識後に撮影した種々のＳＳＰＥ由来の非増殖型感染細胞培養物の蛍光顕微鏡写真の対応セットの組み合わせである。パネルＡとＢは、クリプトウイルスで持続感染され、これらの免疫蛍光試験のためにカバーグラス上に継代培養される前に、麻疹ウイルスエドモンストン株で感染されたＡＶ3／ＳＳＰＥ／ＭＶ 細胞を示す。パネルＣとＤは、「キタケン」（Ｕｅｄａら， "Ｂｉｋｅｎ Ｊｏｕｒｎａｌ" １８：１７９〜１８１， １９７５）と命名された非増殖型ＳＳＰＥ由来細胞株を示す。パネルＥとＦは、「ニイガタ」（Ｄｏｉら， "Ｊａｐａｎ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｓｃｉ． Ｂｉｏｌ．" ２５：３２１〜３３３， １９７２）と命名された非増殖型ＳＳＰＥ由来細胞株を示す。パネルＧとＨ及びＩとＪは、それぞれ「ビケン」（Ｙａｍａｎｏｕｃｈｉら， "Ｊａｐａｎ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｓｃｉ． Ｂｉｏｌ．" ２９：１７７~１８６， １９７６、Ｏｈｕｃｈｉら， "Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．" ２５：８８７〜９８３， １９８１）と命名された非増殖型ＳＳＰＥ由来細胞株を示す。
図７は、同腹仔として生まれ、新生児（生後２日目）時にプラーク精製クリプトウイルス（ＢＢＲ株、図７Ａ）またはシミアンウイルス５のＮＩＨ ２１００５-２ＷＲ 株（ＳＶ５、図７Ｂ）で脳内接種された２ヶ月後の２匹のオス有色マウスの写真を示す。
図８は、同腹仔として生まれ、新生児（生後２日目）時にプラーク精製クリプトウイルス（ＢＢＲ株、図８Ａ）で脳内接種された３ヶ月後、及び新生児（生後２日目）時にプラーク精製クリプトウイルスで脳内接種された６ヶ月後（図８Ｂ）の２匹のメス有色マウスの写真を示す。
【００１２】
図９は、ヒトクリプトウイルスＢＢＲ株（配列番号１）とシミアンウイルス５Ｗ３Ａ株（配列番号２）のＦＡＳＴＡフォーマット配列（即ち、ｍＲＮＡセンス５’から３’）の比較である。（配列番号２）の各ラインにおける（配列番号１）からの変異数は、右側マージンに記録されている。ＳＶ５配列と一致しないクリプトウイルス特異的ヌクレオチド位置は、太文字下線で示しており、その不一致がコード領域であるならば、コードされた該当するアミノ酸をクリプトウイルスヌクレオチド配列のコドン上に記載し、もしその不一致のクリプトウイルスヌクレオチドが、相似位置にあるＳＶ５コドンと異なるアミノ酸をコードするコドンを生じる場合、ＳＶ５アミノ酸から類似クリプトウイルスタンパク質の異なるアミノ酸に向かう矢印を示している。枠に囲まれたヌクレオチドは、既知ＳＶ５及び類似クリプトウイルスの開始または停止部位を、記載のように示す。
図１０は、ルブラウイルスＦタンパク質ヌクレオチド（図１０Ａ、ＦＡＳＴＡフォーマット、即ち、ｍＲＮＡセンス５’から３’配列）とコードされたアミノ酸（図１０Ｂ）配列の比較である。一番目のライン（最上）は、本発明のクリプトウイルスＦタンパク質（「ＣＶ」［ＢＢＲ株］）の配列の実施形態を示し、二番目のラインは、イヌパラインフルエンザウイルスタイプ２（「ＣＰＶ」［Ｔ１株］、Ｉｔｏら， "Ｊ．Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．" ８１ ７１９〜７２７， ２０００を参照）を示し、三番目のラインは、ブタルブラウイルス（「ＰＲ」、ＫｌｅｎｋとＫｌｅｎｋ， ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ データベースに直接登録， ２０００年９月、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ２７８９１６）を示し、四番目のラインは、シミアンウイルス５（「Ｗ３Ａ」［Ｗ３Ａ株］、Ｐａｔｅｒｓｏｎら， "Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ" ８１：６７０６〜６７１０， １９８４）を示し、並びに五番目（最下）のラインは、シミアンウイルス５（「ＷＲ」［ＷＲ株］、Ｉｔｏら， "Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．" ７１：９８５５〜９８５８， １９９７）を示す。太字下線体のアミノ酸は、クリプトウイルスＦタンパク質の類似配列にあるアミノ酸と不一致であるアミノ酸を指し、そして右側マージンの記録は、各配列ブロックについての不一致数である。
図１１は、クリプトウイルスタンパク質の発現を示す。図１１は、還元条件下でＳＤＳＰＡＧＥ後に急性感染されたＶｅｒｏ細胞において産生された勾配・精製[35Ｓ]-メチオニン標識クリプトウイルスビリオンのオートラジオグラムの写真である。図１２の右側に表示されているタンパク質の見かけ分子量は、分子量が既知であるマーカータンパク質（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ）に対するその移動を比較することによって計算された。Ｌ＝最大ヌクレオカプシド関連タンパク質、ビリオン関連ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの主要成分、ＨＮ＝ヘマグルチニンタンパク質、エンベロープ関連タンパク質の一つ、Ｆo = 非切断型融合タンパク質、第二のエンベロープ関連糖タンパク質、ＮＰ＝ヌクレオカプシドタンパク質、ヌクレオカプシド関連主要構造タンパク質、Ｆ1= 切断型融合タンパク質の大型フラグメント、Ｐ＝ヌクレオカプシド関連リンタンパク質、Ｍ＝ビリオン関連マトリックスまたは膜タンパク質、Ｖ＝ウイルスポリメラーゼの成分であると考えられる微量ＲＮＡ結合タンパク質、Ｆ2 =切断型融合タンパク質の小型フラグメント。注：小型エンベロープ関連タンパク質であるＳＨタンパク質（約５ｋＤ）は、ゲルを流出してしまったために図示されていない。
図１２は、亜急性硬化性全脳炎と診断された患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）（図１２Ａ）及び微生物学的スクリーニングのために採取されたＣＳＦを有する６人のランダムに選択された神経科／神経外科患者のＣＳＦ（図１２Ｂ）を用いて、[35Ｓ]-メチオニン標識ウイルス特異的タンパク質の沈降とＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離によって得られた典型的な放射線免疫検定プロファイル（ＲＩＰ）のオートラジオグラム写真を示す。図１２Ａは、年齢１１才男児であるＳＳＰＥ患者のＣＳＦによる、麻疹ウイルスエドモンストン株で急性感染された[35Ｓ]-メチオニン標識ＣＶ-１c 細胞（レーンＭＶ）、クリプトウイルスＢＢＲ株（レーンＣＶ）または両方の混合物（レーンＢ）で急性感染された同一標識ＣＶ-１c細胞の沈降結果のＲＩＰを示す。レーンＶは、[35Ｓ]-メチオニン標識勾配・精製クリプトウイルスビリオンのＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルを示す（図１１をまた参照）。図１２Ｂは、６人の神経科／神経外科患者のＣＳＦによる、クリプトウイルスＢＢＲ株で急性感染された[35Ｓ]-メチオニン標識ＣＶ-１c 細胞由来タンパク質の沈降結果のＲＩＰを示す。レーン２にＲＩＰプロファイルが見られる患者は、運動失調症、錯乱及び記憶喪失を呈したが、特定の診断が下されなかった成人男性であった。レーン４にＲＩＰプロファイルが見られる患者は、水頭症及び難治性テンカン発作を呈し、後にテンカン重積症で死亡した乳児（女性）であった。図１２Ｂの患者由来のＣＳＦはいずれも、麻疹ウイルスのどのエンベロープタンパク質も沈降しなかった（データ表示なし）。図１２Ａは、図２３（以下に説明する）と同一であるが、比較のために図１２Ｂと同一スケールに縮小されている。
【００１３】
図１３は、２つのＣＳＦ検体によって、クリプトウイルスＢＢＲ株で急性感染された[35Ｓ]-メチオニン標識ＣＶ-１C 細胞から沈降されたクリプトウイルス特異的タンパク質の放射性免疫検定プロファイル（ＲＩＰ）の高解像オートラジオグラム（図１３Ａ）、並びに、クリプトウイルスのＢＢＲ株（図１３Ｂ  レーンＣＶ）及びＳＶ５のＮＩＨ ２１００５-２ＷＲ株（図１３Ｂ  レーンＳＶ５）の勾配・精製ビリオンの主要な対応構造タンパク質の移動を図によって示している。図１３ＡのＲＩＰは、クリプトウイルス陰性であると評価された患者（レーン「−」、即ち、クリプトウイルス特異抗体を含まない）及びクリプトウイルス陽性（レーン「＋」、即ち、クリプトウイルス特異抗体を含む）であると評価された患者からのＣＳＦ沈降物を示す。図１３Ｂは、クリプトウイルスのＦ0 及びＨＮタンパク質の近接する同時移動及び、シミアンウイルス５におけるその別々の移動の図示である（図５のＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルをまた参照）。
図１４は、勾配・精製クリプトウイルスビリオンを標的として用いた、対応する血清と４人の血清陽性の神経科／神経外科患者からのＣＳＦ検体のＥＬＩＳＡを示す。コントロール血清は、偽感染されたＣＶ-１c 細胞に対して産生されたウサギ抗血清（コラム１、「−」）及び、勾配・精製クリプトウイルスビリオンに対して産生された過免疫ウサギ抗血清（コラム２、「＋」）であった。ＦＮ＝水頭症及び難治性テンカン発作と診断された女乳児、ＳＧ＝特発性頭蓋内圧亢進と診断された成人女性、ＷＫ＝急性ウイルス性髄膜炎と診断された男児、ＪＫ＝診断がつかなかった成人男性。血清希釈は１：２０（最上列）から開始し、２倍の段階希釈で下方に続行した。ＣＳＦ希釈は、最上列で１：２から開始し、同様にして続行した。血清検体は、左から右に分配し、ＣＳＦ標本は右から左に分配した。全患者がその血清中にクリプトウイルス特異抗体を有したが、テンカン発作障害を有する患者（ＦＮ）のみがＣＳＦ中に抗体を有したことを注記する。
図１５は、アルツハイマー病と診断された患者からの３セットの対応する血清（Ｓ）とＣＳＦ（Ｃ）を用いたＲＩＰアッセイの写真である。
図１６は、慢性疲労症候群（ＣＦＳ）と診断された患者からの４つのＣＳＦ検体を用いたＲＩＰ分析後のオートラジオグラム写真である。レーン１〜３は、「クリプトウイルス陽性」であると評価され、レーン４は「クリプトウイルス陰性」であると評価された。
図１７は、「コレクション１」（以下参照）として得られたＣＳＦサンプルを用いたＲＩＰ分析後のオートラジオグラム写真である。レーン２の陽性ＣＳＦ沈降物は、後に運動失調症、記憶喪失、一時的意識喪失、テンカン発作、複視、及び頭痛を呈示する５５才成人男性から得られたものであることが発見された。
図１８は、「コレクション２」（以下参照）として得られたＣＳＦサンプルを用いたＲＩＰ分析後のオートラジオグラム写真である。
図１９は、（３８サンプル中から選ばれた）５人のＭＳ患者から得られた血清サンプルについてＲＩＰアッセイを実施後のオートラジオグラム写真である。
図２０は、（３８サンプル中から選ばれた）２５人のさらなるＭＳ患者から得られた血清サンプルについてＲＩＰアッセイを実施後のオートラジオグラム写真である。
図２１は、１６人のＭＳ患者から得られた１６のＣＳＦ検体についてＲＩＰアッセイ実施後のオートラジオグラム写真である。
図２２は、６人のオーストラリア人ＳＳＰＥ患者の血清（レーン１〜６）及び６人のコントロール血清（レーン７〜１２、クリプトウイルス主要エンベロープタンパク質（Ｆ0、及びＨＮ）に対する抗体を有さない小児患者の血清）によって[35Ｓ]-メチオニン標識細胞から沈降されたクリプトウイルスＮＰタンパク質（ｐ６３）のＲＩＰプロファイルの作出後に得られたオートラジオグラムの写真である。
図２３は、ＳＳＰＥと診断された年齢１１才の男児からのＣＳＦによって、[35Ｓ]-メチオニン標識麻疹ウイルス感染ＣＶ-１c 細胞（レーンＭＶ）、クリプトウイルス感染ＣＶ-１c 細胞（レーンＣＶ）、または両方の混合物（レーンＢ）から沈降された麻疹ウイルス特異的及びクリプトウイルス特異的タンパク質のＲＩＰプロファイルのオートラジオグラム写真である。レーンＶ＝[35Ｓ]-メチオニン標識クリプトウイルス感染ＣＶ-１c 細胞からの勾配・精製クリプトウイルスビリオン。Ｌ＝最大ヌクレオカプシド関連タンパク質、ビリオン関連ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの主要成分、ＨＮ＝ヘマグルチニンタンパク質、エンベロープ関連タンパク質の一つ、Ｆo = 非切断型融合タンパク質、第二のエンベロープ性糖タンパク質、ＮＰ＝ヌクレオカプシドタンパク質、ヌクレオカプシド性主要構造タンパク質、Ｆ1 = 切断型融合タンパク質の大型フラグメント、Ｐ＝ヌクレオカプシド関連リンタンパク質、Ｍ＝ビリオン関連マトリックスまたは膜タンパク質、Ｖ＝ウイルスポリメラーゼの成分であると考えられる微量ＲＮＡ結合タンパク質、Ｆ2 =切断型融合タンパク質の小型フラグメント。注：小型エンベロープ関連タンパク質であるＳＨタンパク質（約５ｋＤ）は、ゲルを流出してしまったために図示されていない。
図２４は、クリプトウイルス感染ニューロンの顕微鏡写真を示す。図２４Ａは、２日齢時にクリプトウイルスＢＢＲ株を接種された有色マウス（接種２ヶ月後にテンカン発作を呈示後屠殺された）の脳の単ニューロンにおけるクリプトウイルス特異的免疫蛍光を示す。図２４Ｂは、ＳＳＰＥ由来細胞性ウイルスのニイガタ−１株を接種後亜急性脳症を呈示したモルモット脳からの単ニューロンにおける細胞質免疫蛍光を示す。
図２５は、持続性感染ＡＶ3／ＳＳＰＥ／ＭＶ細胞におけるクリプトウイルスと麻疹ウイルスの細胞内ヌクレオカプシドの分別ｉｍｍｕｎｏｇｏｌｄ標識の写真を示す。図２５Ａは、クリプトウイルスの約１５ｎｍ〜約１７ｎｍの「平滑」で幅の狭いヌクレオカプシドの１０ｎｍ金ビーズによる標識を示す。使用された食刻法のために平滑なヌクレオカプシドの微細構造の解像損失した結果、見えにくい杉綾模様を呈した。図２５Ｂは、麻疹ウイルスの２５ｎｍの「ファジー」で幅の広いヌクレオカプシドの１５ｎｍ金ビーズによる標識を示す。倍率は約５００，０００倍である。
【００１４】
好ましい実施形態の詳細な説明
本願に記述される新ウイルスは、培養ヒト細胞中でのその不顕性あるいは「潜在性」細胞病理学及び実験的に感染された動物における緩徐で「暗号化された」病原性に基づいて、クリプトウイルス（ＣＶ）と命名された。ウイルス中に存在するヌクレオチド配列、及びその構造的、生物学的、並びに病原的な特徴からして、クリプトウイルスはパラミクソウイルス科のルブラウイルス属に属することが最も適合する（図１）。さらに詳細には、このウイルスは、イヌパラインフルエンザウイルスタイプ２（イヌパラインフルエンザウイルス、ＣＰＩ並びにＣＰＩＶとしても知られる）及びブタルブラウイルス（Ｌａ-Ｐｉｅｄａｄ-Ｍｉｃｈｏａｃａｎ-Ｍｅｘｉｃｏウイルス及びＬＰＭＶとしても知られる）として公知のウイルスによく似ている。（図２を参照）。クリプトウイルスとこれら２つのウイルスの関連性は、その配列とその構造、生物学的、並びに病原的特徴の関連性に見ることができる（図３を参照）。ＣＰＩＶは、そのヌクレオチド配列の９５％以上をクリプトウイルスと共有する。クリプトウイルスに対するメナングルウイルスのヌクレオチド配列ホモロジーの度合いは、メナングルウイルスゲノムの配列が未だ公表されていないために現在は知られていない。
クリプトウイルスと（１）シミアンパラインフルエンザウイルスタイプ５（シミアンウイルス５及びＳＶ５として公知である。図４，図５、図９及び図１０を参照。ここで、配列とウイルスの構造並びに免疫学的特性間に関連性があるが、生物学的または病原的類似性はほとんどあるいは全くない）、（２）ヒトムンプスウイルス（ここでは、ある程度の構造、生物学的、並びに病原的関連性がある）、さらに（３）ヒト麻疹ウイルス（ここではさらにまた、ある程度の構造、生物学的、並びに病原的関連性がある）の間にはまた明らかな関連性がある。これらの関連性は、クリプトウイルスの分類並びにその新規性の確立に役立つ。
テンカンまたはテンカン様疾患、即ち、テンカン様症状を有する疾病、障害、あるいは状態（例えば、ＣＦＳ、ＭＳ、ＳＳＰＥ）の特発性並びに原因不明な形態における役割を有する他に、クリプトウイルスはまた、強迫性または反復性身体的、行動的、または心理学的症状を呈する中枢神経系（ＣＮＳ）の特発性障害スペクトルに係わりを有する。クリプトウイルス感染の結果としてのこれらの障害の症状の兆候は、完全に亜急性であるか、または本質的に緩徐進行性であり発症するのに数週間、数ヶ月または何年もかかる。クリプトウイルスに感染したヒト患者によって呈示された身体的症状スペクトルは、発熱性応答、眼科疾患（光過敏症、かすみ目、眼振、失明）、刺痛、麻痺、振戦、筋クローヌス、及び大発作性並びに小発作性（無）テンカン発作を含む。患者によって呈示された行動的または心理学的症状スペクトルは、反復運動と強迫性行動（強迫神経症の特徴）、睡眠障害、記憶喪失、並びに不快、拒食症、自閉症、精神遅滞、情動障害、情緒異常（臨床的抑鬱症）、精神分裂病、及び双極性障害を含む。
本発明の必須特性ではないが、クリプトウイルス感染の侵入経路は、咽頭の口腔粘膜（即ち、気道内上皮）であり、ウイルスのインキュベーション期間は、亜急性の持続期間（即ち、何日、何週間にも及ぶ）であり得る。新規に感染した個体は、感染性単核症のようではない、長期間の発熱性咽頭炎及びリンパ節腫脹を発症する。一方、ウイルスの侵入経路はまた、経胎盤性であり、したがってウイルスの保菌者である母親が子宮内で胎児に伝播することがあり、その結果子供が神経学的、神経変性、及び／または神経精神医学的疾患あるいはその他の発育障害（例えば、自閉症、脳性麻痺、水頭症、生まれつきの障害、半身麻痺）を発症することがある。係る子供は、しばしば「知恵遅れ」と診断かつレッテルを貼られることになる。事実、テンカン及びテンカン発作の出現度は、重症な「精神遅滞者」において顕著に高い（一般集団よりも５０倍近くも高い）。
ヒトクリプトウイルスゲノムのヌクレオチド配列（１５，２４６隣接ヌクレオチド）を、ＦＡＳＴＡフォーマット（即ち、ｍＲＮＡセンス、５'から３'）で図９に示す（配列番号１）。このウイルスの実際のゲノムは、マイナス鎖（ｍＲＮＡに対するアンチセンス）であり、（配列番号１）と完全相補なヌクレオチド配列を有する。
【００１５】
したがって、本発明は、ＦＡＳＴＡフォーマット（即ち、実際のゲノムに対してプラス鎖、ｍＲＭＡセンス、並びに相補配列）で、配列番号１を有する、単離ヒトマイナス鎖ＲＮＡウイルスを包含する。図９では、シミアンウイルス５のＷ３Ａ株のヌクレオチドから変異したヌクレオチドが取り上げられており、各株での変異数は、右マージンに記録されている。ヒトクリプトウイルスＢＢＲ株のＦＡＳＴＡフォーマット配列をシミアンウイルス５Ｗ３Ａ株（配列番号２、図９を参照）と比較した。種々のルブラウイルスＦタンパク質アミノ酸配列間の比較もまた行われた（図１０）。
クリプトウイルス「粒子」は、完全クリプトウイルスビリオンであり、ビリオン形成の中間体（例えば、ヌクレオカプシド）、またはその他の場合は一部である粒子をも包含する。クリプトウイルス粒子は、一般的には、それらに含まれるクリプトウイルス特異的核酸に関連する１つ以上のクリプトウイルスタンパク質を有する。好ましいクリプトウイルス粒子またはビリオンは、クリプトウイルスＢＢＲ株であり、ＡＴＣＣ受託番号（  ）として寄託されている。
本発明はまた、本発明のクリプトウイルス粒子とキャリアを含む組成物に関する。
本願で使用する場合、「キャリア」は、有機または無機キャリアあるいは賦形剤であってよく、水または水溶液、または油／水あるいは水／油エマルジョンのようなエマルジョン、及び様々な種類の湿潤剤であり得る。本発明のウイルス粒子、核酸構築物、タンパク質、または抗体のような活性成分は、オプションとして、例えば、注入、錠剤、ペレット、カプセル、溶液、エマルジョン、懸濁液用に非毒性、生理学的に認容性のあるキャリアと製剤化された組成物、またはインビトロまたはインビボ使用に適する任意のその他の製剤と複合されてもよい。係るキャリアはまた、グルコース、ラクトース、アカシアゴム、ゼラチン、マンニトール、スターチのり、三ケイ酸マグネシウム、タルク、コーンスターチ、ケラチン、コロイドシリカ、ポテトスターチ、尿素、中鎖長トリグリセリド、デキストラン、正常生理食塩水、リン酸緩衝食塩水、並びに固体、半流動性、液体形態の調製物の製造用途に適するその他のキャリアを含む。さらに、補助剤、安定剤、濃厚化剤、及び発色剤並びに芳香剤を適宜に使用してもよい。適切なキャリアのその他の例は、以下に記述されるが、当該分野に公知の適切なキャリアを意味する。
クリプトウイルスビリオンの本発明による単離方法は、前述のように、クリプトウイルスに感染しているヒトから得られたＰＢＭＮＣを、重要なことには、細胞グアニリルシクラーゼ活性を増加する薬剤を含む人工水性培地中で培養する。
本発明の目的では、人工水性培地は、細胞グアニリルシクラーゼ活性を増加する薬剤を、ＩＭＥＭＺＯ、ＭＥＭ、ＨＹＱＰＦ Ｖｅｒｏ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）またはＲＰＭＩのような既知の最少細胞培養用培地に添加して、ｐＨ６．８〜７．８、最も好ましくはｐＨ６．８〜７．２に（例えば、ＨＥＰＥＳで）緩衝して調製する。この薬剤は、本発明に従って、クリプトウイルスの単離及び／または増殖を可能かつ促進するために作用する。
オプションとして、ウシ胎児血清（約２％（容量／容量）〜約１０％（容量／容量）を培地に加えてもよい。従来量のペニシリンまたはストレプトマイシンのような抗生物質をまた培地に加えてもよい。
細胞グアニリルシクラーゼ活性を実際に測定することは、本発明にとって重要ではない。さらに、本発明は、この薬剤が細胞グアニリルシクラーゼ活性の増加（あるいは増加しない）に作用するメカニズム、あるいはいかなるメカニズムによって薬剤が、本発明に従ってクリプトウイルスの単離及び／または増殖を可能及び／または促進に作用するかには関係がない。
細胞グアニリルシクラーゼ活性を増加する薬剤の有用な例は、最もこのましくは、グアノシン３’，５’−環状一リン酸（「サイクリックＧＭＰ」）（遊離酸、または好ましくは、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、またはアンモニア塩などのような、それらの薬剤認容性塩）、インスリン（好ましくは、ヒトインスリン）、亜鉛ジカチオン（好ましくは、塩化物、硫酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、硝酸塩、酢酸塩またはその他の薬剤認容性塩）、あるいはこれらの任意または全ての組み合わせを含む。
サイクリックＧＭＰが人工水性培地に使用される濃度は、約０．０５〜約５ｍＭであることが好ましい。さらに好ましくは、培地中のサイクリックＧＭＰ濃度は、約０．５〜約２．５ｍＭであり、最も好ましくは、約０．７５〜約１．２５ｍＭである。濃度が約５ｍＭ以上のサイクリックＧＭＰは、クリプトウイルスの培養、増殖、または単離には至適ではない。
【００１６】
人工水性培地中のインスリンの好ましい濃度範囲は、約１〜約１０ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは約２〜約６ｍｇ／Ｌ、そして最も好ましくは約３〜約５ｍｇ／Ｌである。
人工水性培地中の亜鉛ジカチオンの好ましい濃度範囲は、約０．０５〜約０．２５ｍｇ／Ｌ  ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏに当量であり、さらに好ましくは、約０．１０〜約０．２０ｍｇ／Ｌ  ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏに当量であり、または最も好ましくは、約０．１３〜約０．１５ｍｇ／Ｌ  ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏに当量である。
他方、ある実施形態では、細胞グアニリルシクラーゼ活性を増加する薬剤は、一酸化窒素または一酸化窒素ドナーである。一酸化窒素ガスは、生物膜を介して完全に浸透性である。吸入可能な一酸化窒素ガスは、例えば、当該分野で公知の制御ガス混合物のマスクによって哺乳類に投与することができる（例えば、ＫｉｅｌｅｒＪｅｎｓｅｎ，  Ｎ．ら， Ｉｎｈａｌｅｄ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｉｎ ｔｈｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅａｒｔ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｅｌｅｖａｔｅｄ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｖａｓｃｕｌａｒ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ（肺血管抵抗性が増大した心臓移植候補患者の評価における吸入一酸化窒素）， "Ｊ Ｈｅａｒｔ Ｌｕｎｇ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．" １３（３）：３６６〜７５ [１９９４]、 Ｒａｊｅｋ， Ａ．ら， Ｉｎｈａｌｅｄ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｒｅｄｕｃｅｓ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｖａｓｃｕｌａｒ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ（１） ｄｕｒｉｎｇ ｈｅａｒｔ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（一酸化窒素の吸入は、心臓移植中にプロスタグランジンＥ（１）よりも肺血管抵抗性を低下させる）， "Ａｎｅｓｔｈ Ａｎａｌｇ．" ９０（３）：５２３〜３０ [２０００]、Ｓｏｌｉｎａ， Ａ．ら， Ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｉｎｈａｌｅｄ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ａｎｄ ｍｉｌｒｉｎｏｎｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｃａｒｄｉａｃ ｓｕｒｇｅｒｙ ｐａｔｉｅｎｔｓ（成人心臓手術患者における肺高血圧症治療向けの一酸化窒素吸入とミルリノンの比較）， "Ｊ Ｃａｒｄｉｏｔｈｏｒａｃ Ｖａｓｃ． Ａｎｅｓｔｈ．" １４（１）：１２〜１７ [２０００]、 Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，  Ｄ．Ａ．ら，  Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｖａｓｃｕｌａｒ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｗｉｔｈ ｉｎｈａｌｅｄ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ａｆｔｅｒ ｃａｒｄｉａｃ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ（心臓手術後の一酸化窒素吸入による肺血管抵抗性の有効なコントロール）， "Ｊ Ｔｈｏｒａｃ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｓｕｒｇ" １１１（４）：７５３〜６２，  ディスカッション ７６２〜３ [１９９６]）。一酸化窒素（ＮＯ）ガス混合物濃度は、好ましくは約１〜１００ｐｐｍ  ＮＯ、さらに好ましくは約４〜８０ｐｐｍ  ＮＯ、そしにて最も好ましくは約２０〜４０ｐｐｍ  ＮＯである。ガス混合物はまた、酸素、及び窒素、及び／または、二酸化炭素、ヘリウム、またはアルゴンのようなその他の不活性ガスを適当な濃度で含む。
一酸化窒素ドナーは、生物系に適用されるとＮＯ関連生理学的活性を産する化合物である。したがって、ＮＯドナーは、内因性ＮＯ関連応答を模倣したり、または内因性ＮＯ欠乏症を代償することができる。当業者は、生物系においては、種々のＮＯドナー（ＮＯ+、ＮＯ0またはＮＯ）によって遊離され得る少なくとも３つのレドックス状態があり、その全てが、本発明の目的には、用語「一酸化窒素」または「ＮＯ」によって包含されることを認識しよう。ＮＯのレドックス状態は、その他の生物分子、副産物のプロファイル、並びに生物応答に対するＮＯドナー反応性に対して有意な相違を生じる（Ｆｅｅｌｉｓｃｈ， Ｍ．， Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｄｏｎｏｒｓ ｉｎ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ（薬理学的研究における一酸化窒素ドナーの用途）， "ＮａｕｎｙｎＳｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇｓ Ａｒｃｈ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．" ３５８：１１３〜２２ [１９９８]）。ＮＯドナーのあるクラスは酵素の触媒作用を必要とし、その他は非酵素的にＮＯを産生し、あるＮＯドナーは、ＮＯを遊離するためには、例えば、チオールによる還元を、あるものは酸化を必要とする。
一酸化窒素ドナーの好ましい例は、単価及び多価アルコールの硝酸エステルである、有機硝酸塩化合物を含む。典型的には、これらは水溶解性が低く、原液はエタノールまたはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で調製される。三硝酸グリセリル（ＧＴＮ）またはニトログリセリン（ＮＴＧ）、四硝酸ペンタエリトリチル（ＰＥＴＮ）、二硝酸イソソルビド（ＩＳＤＮ）、及び５−一硝酸イソソルビド（ＩＳ−５−Ｎ）がその例である。有機硝酸塩の投与は、静脈内、腹腔内、筋肉内、経皮、またはＰＥＴＮ、ＩＳＤＮ、ＮＴＧ、並びにＩＳ５Ｎの場合は経口で行うことができる。
【００１７】
一酸化窒素ドナーのその他の好ましい例は、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−ペニシルアミン（ＳＮＡＰ）、Ｓ−ニトロソグルタチオン（ＳＮＯＧ）、Ｓ−ニトロソアルブミン、Ｓ−ニトロソシステインを含む、Ｓ−ニトロソチオール化合物である。Ｓ−ニトロソチオール化合物は特に光過敏性であり、氷上で暗所に保存した原液は数時間安定性であり、安定性を増強するために、ＥＤＴＡのようなキレート剤を原液に加えてもよい。投与は、静脈内または動脈内ルートによることが好ましい。
一酸化窒素ドナーのその他の好ましい例は、モルシドミン（Ｎ−エトキシカルボニル−３−モルホリノ−シドノンイミン）、リンシドミン（ＳＩＮ-１、３−モルホリノ−シドノンイミンまたは３−モルホリニルシドノネイミン、または５−アミノ−３モルホリニル−１，２，３−オキザジアゾリウム、例えば塩化物塩）、そしてピルシドミン（ＣＡＳ９３６）のようなシドノンイミン化合物を含む。原液は典型的にはＤＭＳＯまたはＤＭＦで調製し、遮光状態では、４℃〜室温で安定性がある。リンシドミンは、水溶解性が高く、約ｐＨ５に調整された脱酸素化蒸留水で作製された酸性溶液中で一日中安定である。生理学的ｐＨでは、ＳＩＮ−１は迅速に非酵素的に加水分解されて、暗所、ｐＨ７．４で安定性のある、より好ましい一酸化窒素ドナーである開環型ＳＩＮ−１Ａになる。投与は、静脈内または動脈内ルートによることが好ましい。
また、ニドロプルシドナトリウム（ＳＮＰ、ペンタシアノニトロシル鉄（ＩＩ）酸ナトリウム）のようなニトロシル鉄化合物は一酸化窒素ドナーとしても有用である。水性原液は、使用前に脱酸素水で新鮮に作製して暗所に保存することが好ましく、原液の安定性は、ｐＨ３〜５で増大する。グルタチオンのような生理学的許容性のあるチオールを送達緩衝液に含むと、ＮＯの遊離を増大し得る。ＳＮＰは静脈内注入によって投与され、熟達した医師は、ＮＯが遊離されると１モルのＳＮＰあたり５当量の有毒ＣＮが遊離されるために、長期使用は禁止されていることを理解しよう。
最も好ましい一酸化窒素ドナーは、所謂ＮＯＮＯエート（ＮＯＮＯａｔｅ ）化合物から選択される。ＮＯＮＯエートは、アミンまたは亜硫酸塩基のような求核性残基（Ｘ）とＮＯの付加物であり、ＮＯ二量体は、窒素原子を介して求核性残基に結合して、Ｘ[Ｎ（Ｏ）ＮＯ]構造体の官能基を形成する。ＮＯＮＯエートは典型的には、生物学的反応物質にほとんど影響されることなく予測可能な速度でＮＯを遊離し、そしてＮＯ遊離は、酸触媒による解離によると考えられ、Ｘ とＮＯの再生を伴う。
ＮＯＮＯエートは、最も好ましくは、ジエチルアミン−ＮＯＮＯエート（ＤＥＡ／ＮＯ、Ｎ−エチルエタンアミン：１，１-ジエチル−２-ヒドロキシ-２-ニトロソヒドラジン（１：１）、または１-［Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ］ジアゼン−１−イウム-１，２-ジオラート）を含む。その他の好ましいＮＯＮＯエートは、ジエチレントリアミンＮＯＮＯエート（ＤＥＴＡ／ＮＯ、２，２'−ヒドロキシニトロソヒドラジノ）ビス−エタンアミン）、スペルミン−ＮＯＮＯエート（ＳＰＥＲ／ＮＯ、Ｎ−（４−［−１−（３−アミノプロピル）−２−ヒドロキシ−２−ニトロソヒドラジノ］ブチル）−１，３−プロパンジアミン）、プロピルアミノ−プロピルアミン−ＮＯＮＯエート（ＰＡＰＡ／ＮＯ、３−（２−ヒドロキシ−２−ニトロソ−１−プロピルヒドラジノ）−１−プロパンアミンまたは（Ｚ）−１−［Ｎ−（３−アミノプロピル）−Ｎ−（ｎ−プロピル）アミノ］ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオラート）、ＭＡＨＭＡ−ＮＯＮＯエート（ＭＡＭＨＭＡ／ＮＯ、６−（２−ヒドロキシ−１−メチル−２−ニトロソヒドラジノ）−Ｎ−メチル−１−ヘキサンアミン）、ジプロピレントリアミンーＮＯＮＯエート（ＤＰＴＡ／ＮＯ、３，３'−（ヒドロキシニトロソヒドラジノ）ビス−１−プロパンアミン）、ＰＩＰＥＲＡＺＩ／ＮＯ、プロリ−ＮＯＮＯエート（ＰＲＯＬＩ／ＮＯ、１―（［２−カルボキシラト］ピロロリジン−１−ｙｌ）ジアゼン−１−イウム−１，２-ジオラート−メタノール、例えば二ナトリウム塩）、ＳＵＬＦＯ−ＮＯＮＯエート（ＳＵＬＦＯ／ＮＯ、ヒドロキシジアゼンスルホン酸  １−オキシド、例えば、二アンモニウム塩）、亜硫酸ＮＯＮＯエート（ＳＵＬＦＩ／ＮＯ）、及びアンゲルス塩（Ａｎｇｅｌｉｓ  ｓａｌｔ）を含む。
【００１８】
ほとんど全てのＮＯＮＯエート化合物は、水溶解性が高く、原液は使用直前に冷脱酸素化１〜１０ｍＭ  ＮａＯＨ（好ましくは約ｐＨ１２）で調製される。アルカリ原液は、冷暗所、氷上で保存する場合は数時間は安定である。ＮＯＮＯエートのＵＶ吸光度特性は、ＮＯＮＯエート水溶液の分光光度法による数量化に使用することができる。ＮＯＮＯエートは、静脈または動脈内投与することが好ましい。
一酸化窒素ドナーは、異なる力価を有する（Ｆｅｒｒａｒｏ，ら， Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｅｖｅｒａｌ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｄｏｎｏｒｓ ｏｎ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｃｌｉｃ ＧＭＰ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｂｏｖｉｎｅ ｃｈｒｏｍａｆｆｉｎ ｃｅｌｌｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ（ウシクロム親和性細胞の一酸化窒素産生における細胞内サイクリックＧＭＰレベルに対するいくつかの一酸化窒素ドナーの比較的影響）， "Ｂｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．" １２７（３）：７７９〜８７ [１９９９]）。例えば、ＤＥＡ／ＮＯは、その半減期が約２〜４分である、最も力価が高い一酸化窒素ドナーに含まれ、ＰＡＰＡ／ＮＯ（ｔ1/2 が約１５分）とＳＰＥＲ／ＮＯ（早くｔ1/2 が３４〜４０分）はそれよりは力価が低く、ＤＥＴＡ／ＮＯ（ｔ1/2 は約２０時間）とＳＮＡＰ（ｔ1/2 は約３３〜４１時間、グルタチオンのような生理学的還元剤が存在する場合はこの時間は短縮される）はさらに力価が低い。ＳＮＰはまた力価が高いＮＯドナーである。（Ｆｅｒｒｅｒｏら[１９９９]、Ｓａｌｏｍ， Ｊ．Ｂ．ら， Ｒｅｌａｘａｎｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｏｄｉｕｍ ｎｉｔｒｏｐｒｕｓｓｉｄｅ ａｎｄ ＮＯＮＯａｔｅｓ ｉｎ ｒａｂｂｉｔ ｂａｓｉｌａｒｙ ａｒｔｅｒｙ（ニトロプルシドナトリウムとＮＯＮＯエートのウサギ基底動脈における弛緩薬効果）， "Ｐｈａｒｍａｃｏｌ" ５７（２）：７９〜８７ [１９９８]、Ｓａｌｏｍ， Ｊ．Ｂ．ら， Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｒｅｌａｘａｎｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ＮＯ ｄｏｎｏｒｓ ｓｏｄｉｕｍ ｎｉｔｒｏｐｒｕｓｓｉｄｅ， ＤＥＡ／ＮＯ ａｎｄ ＳＰＥＲ／ＮＯ ｉｎ ｒａｂｂｉｔ ｃａｒｏｔｉｄ ａｒｔｅｒｉｅｓ， （ウサギ頸動脈における、ＮＯドナー、ニトロプルシドナトリウム、ＤＥＡ／ＮＯ及びＳＰＲ／ＮＯの比較的弛緩薬効果）、 "Ｇｅｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．" ３２（１）：７５〜７９ [１９９９]、Ｓａｌｏｍ， Ｊ．Ｂ．ら， Ｒｅｌａｘａｎｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｏｄｉｕｍ ｎｉｔｒｏｐｒｕｓｓｉｄｅ ａｎｄ ＮＯＮＯａｔｅｓ ｉｎ ｇｏａｔ ｍｉｄｄｌｅ ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｒｔｅｒｙ ｄｅｌａｙｅｄ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ ｂｙ ｇｌｏｂａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ（ヤギ中大脳動脈におけるニトロプルシドナトリウム及びＮＯＮＯエートの弛緩薬効果は、全虚血性再灌流による機能障害を遅延した）， "Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ" ３（１）：８５〜９３ [１９９９]、Ｋｉｍｕｒａ， Ｍ．らＲｅｓｐｏｎｓｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂａｓｉｌａｒ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｒｔｅｒｉｅｓ ｔｏ ｎｏｖｅｌ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｄｏｎｏｒｓ（ヒト基底及びその他の単離動脈の新規一酸化窒素ドナーに対する応答）， "Ｊ． Ｃａｒｄｉｏｖａｃ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．" ３２（５）：６９５〜７０１ [１９９８]。結局、ＮＯＮＯエートまたは他のＮＯドナーの有効濃度または投与量は可変であるが、日常的スクリーニング法によって決定できる。
有機硝酸塩はバイアルが適切に密封されている限り、数ヶ月から数年保存することができるが、ＮＯドナーの原液は、使用前に新鮮に作製し（それぞれ特定のＮＯドナーについて適切なｐＨ）、氷上で冷却し、（例えば、アルミニウムフォイルで包んだ暗色ガラスバイアルを使用することによって）遮光することが好ましい。好ましくは、被験体に投与する直前に、最終希釈液を製剤認容性の緩衝液で調製し、強酸性（例えば、塩酸塩）またはアルカリ性（例えばＮＯＮＯエート）原液を使用する場合は特に、ＮＯドナー含有緩衝液の最終ｐＨが生理学的適合性のあることがチェックされる。
ＮＯ曝露時間及びＮＯ濃度の結果は、外から供給されたＮＯに対する生物応答の質と度合いを多くの場合決定する。ＤＥＡ／ＮＯのような短命ＮＯドナーは、ＮＯの短期的バーストのみの送達を避けるために、ボーラスというよりはむしろ連続注入によって投与することが最も好ましい。
【００１９】
本発明に従って、人工水性培地は、必須ではないが、さらに約０．５〜約５ｍＭの好ましい濃度のグルタミンを含むことが好ましい。培地中のさらに好ましいグルタミン濃度は、約１〜約３ｍＭである。
本発明によるクリプトウイルスビリオンの単離とクリプトウイルスで非増殖型感染された哺乳類細胞株の産生の方法において、ＰＢＭＮＣは、前述のように人工水性培地中で哺乳類羊膜細胞と共培養される。
有用な哺乳類細胞の例は、限定はされないが、齧歯類、ウサギ、霊長類、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコまたはブタ細胞を含む。
本発明に従って、一つの好ましい実施形態は、霊長類細胞、即ち、霊長類を源とする細胞である。霊長類は、哺乳類目のメンバーで、キツネザル、メガネザル、サル（例えば、アフリカミドリザル、コロブスモンキー、及びバブーン）、類人猿（例えば、チンパンジー、ゴリラ、オランウータン、及びギボン）、並びにヒトを含む。
羊膜細胞は、羊膜または羊膜腔を起源とする培養細胞である。
好ましい霊長類羊膜細胞は、ヒト羊膜細胞、例えばＡＶ3である。
本方法によって非増殖型感染された本発明の細胞の例は、ＡＴＣＣ受託番号（）として寄託されている、ＡＶ3／ＳＳＰＥである。
これらの発明の方法では、ＰＢＭＮＣと哺乳類羊膜細胞共培養物の継代培養は１回以上行われる。培養細胞の新鮮培地（前述の培地）への継代培養は、典型的には一週間あたり２回行われる。本方法に従って、少なくとも約２〜約１２継代培養を行うことが好ましい。典型的には共培養を８〜１２継代すると、実質的に全ての哺乳類羊膜細胞がクリプトウイルスによって非増殖型感染される。一般的には、約２〜約３継代のうちに、ＰＢＭＮＣは培養基から消失して、哺乳類羊膜細胞のみが残る。
本発明に従って、哺乳類上皮細胞は、哺乳類上皮組織に起源を発する培養細胞である。一つの好ましい実施形態では、哺乳類上皮細胞は、仔ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞のような、齧歯類上皮細胞である。他の好ましい実施形態では、哺乳類上皮細胞は、例えば、ＶｅｒｏまたはＣＶ−１細胞のようなサル上皮細胞である。最も好ましくは、ＣＶ−１細胞は、ＡＴＣＣ受託番号（）として寄託されている、亜株ＣＶ−１c細胞である。
このクリプトウイルス増殖方法に従って、クリプトウイルスで急性感染された霊長類上皮細胞の例は、ＡＴＣＣ受託番号（）として寄託されている。
本発明のクリプトウイルス粒子を同定するために本願に提供された配列情報に加えて、本発明のクリプトウイルスとそのウイルスサブコンポーネントは、以下に例示するものを含む、数々のウイルス学的、生化学的、及び分子技術によって特徴づけすることが可能であり、これが実行されてきた。
プラーク滴定アッセイ：単層の哺乳類上皮細胞（例えば、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、またはＣＶ-１c）上に肉眼で可視なプラーク形成を使って、感染性クリプトウイルスの調製物を定量することができる（Ｒｏｂｂｉｎｓら， "Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓｅａｓｅ" １４３：３９６〜４０３， １９８１）。
中和滴定アッセイ：プラーク形成は、臨床血清検体及びウサギで産生したクリプトウイルス特異的抗血清の段階希釈で阻害され得る（例えば、Ｒｏｂｂｉｎｓら， "Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓｅａｓｅ" １４３：３９６〜４０３， １９８１）。中和滴定アッセイは、所定の患者がある特定のウイルスに対する中和抗体を有することを実証するために医学ウイルス学研究において日常的に使用される。中和アッセイは、クリプトウイルスに対する中和抗体の有無についての診断に使用することができる。中和アッセイの典型例では、検査対象の血清またはＣＳＦサンプルのような生物材料の段階希釈は、一般的には、最終プレーティング濃度が最終希釈液（希釈血清またはＣＳＦを含む）０．２ｍＬあたり約１００〜２００プラーク形成単位のウイルスとなるように、十分に感染性のあるウイルスを加えて４℃で約１時間インキュベートする。インキュベーション後、約０．２ｍＬの希釈ウイルス−血清（またはＣＳＦ）混合物を、典型的には単層の感受性細胞（例えば、ＶｅｒｏまたはＣＶ−１）に播種して、細胞を部分的ＣＯ2大気（例えば５％（容積／容積））中３７℃でインキュベートする（典型的には１５分ごとに接種物を撹拌する）。インキュベーション期間の終わりに、接種された単層は、典型的には、十分量の２％（重量／容量）カルボキシメチルセルローズ溶液を含有する人工水性細胞培養基（例えば、一般的にはウシ胎児血清及び約２００ユニット  ペニシリン／ｍＬ及び／または１００μｇ  ストレプトマイシン／ｍＬのような適量の抗生物質を含み、ｐＨ約６．８〜約７．４に緩衝された、ＩＭＥＭＺＯ培地）で、１０〜１２日間存続するようにオーバーレイされる（即ち、単層が乾燥しないために十分な量）。至適には、インキュベーション期間中はプレートを移動してはならない。１０〜１２日後、オーバーレイを吸引除去して、細胞をホルマリン固定液で固定して、タンパク質染色（例えば、ギムザ）を行う。各プレート上に形成されたプラーク数を次に列挙して、ＰＲＤ50を計算する（ＰＲＤ50＝プラーク減少希釈度、コントロール［ウイルスと生理食塩水のみを含む試験管］上に形成されたプラーク数を５０％減少する血清またはＣＳＦの希釈）。
【００２０】
密度勾配精製法：増殖型（例えば、Ｖｅｒｏ及びＣＶ１c）並びに非増殖型感染（例えば、ＡＶ3／ＳＳＰＥ）細胞由来のビリオン及び細胞ヌクレオカプシドをショ糖−酒石酸カリウム勾配（ビリオン）及びＣｓＣｌ勾配（ヌクレオカプシド）上で精製することができる（Ｒｏｂｂｉｎｓら， "Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓｅａｓｅ" １４３：３９６〜４０３， １９８１、ＲａｐｐとＲｏｂｂｉｎｓ， "Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ" １６：１６０〜１６７， １９８１、 Ｒｏｂｂｉｎｓ とＲａｐｐ， "Ａｒｃｈ． Ｖｉｒｏｌ．" ７１：８５〜９１， １９８２、及び ＲｏｂｂｉｎｓとＡｂｂｏｔｔ-Ｓｍｉｔｈ， "Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． Ｍｅｔｈ．" １１：２５３〜２５７， １９８５を参照）。
電子顕微鏡：トランスミッションまたは走査型電子顕微鏡のような電子顕微鏡は、本発明のクリプトウイルスビリオンの検査に有用である。電子顕微鏡で検査すると、クリプトウイルスは、パラミクソウイルス科のその他のメンバーに一貫する形態と超微細構造を有することが示された（即ち、直径約１００ｎｍ〜約１２０ｎｍ、らせん状ヌクレオカプシドを含む、エンベロープ型多形性ビリオン）。増殖型（例えば、Ｖｅｒｏ及びＣＶ-１c）並びに非増殖型感染（例えば、ＡＶ3／ＳＳＰＥ）細胞の薄切片中にあるウイルスの細胞内封入体は、パラミクソウイルス科のその他のメンバーのヌクレオカプシドに類似する寸法を有する糸状構造から成る凝集体から成ることが示されている（Ｒｏｂｂｉｎｓら， "Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓｅａｓｅ" １４３：３９６〜４０３， １９８１ 及びＲｏｂｂｉｎｓとＲａｐｐ， "Ａｒｃｈ． Ｖｉｒｏｌ．" ７１：８５〜９１， １９８２を参照）。
放射免疫沈降（ＲＩＰ）アッセイ：ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、以下参照）による、[35Ｓ]−メチオニン標識した未感染、非増殖型並びに増殖型感染、哺乳類細胞のクリプトウイルス特異的免疫沈降物の比較分析によって広範なデータが生成されている。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：精製ビリオンとウイルスの細胞質ヌクレオカプシドは、還元及び非還元条件下（図１１と図１２を参照）でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析され、これは還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に急性感染されたＶｅｒｏ細胞において産生された、勾配・精製[35Ｓ]ーメチオニン標識クリプトウイルスビリオンのオートラジオグラムである。図１１の右側に表示されているタンパク質の見かけ分子量は、分子量が既知であるマーカータンパク質（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）に対するその移動を比較することによって計算された。ＭＷが約５ｋＤである小型エンベロープ関連タンパク質である、ＳＨタンパク質は、ゲルを流出してしまったために、図１１には示されていない。
免疫−超微細構造分析（Ｉｍｍｕｎｏｇｏｌｄ分析）。非増殖型及び増殖型感染哺乳類細胞の細胞内ヌクレオカプシドは、典型的には、クリプトウイルス特異的またはクリプトウイルスヌクレオカプシド特異抗体、例えば過免疫ウサギ抗体、並びに間接的Ｉｍｍｕｎｏｇｏｌｄ標識技術（以下に説明）を用いて、電子顕微鏡下でその場所を突きとめられる。
先述は、本発明の単離クリプトウイルスビリオンを特徴づけするために典型的に有用な公知技術の、徹底的な一覧ではなく、単に例示である。その他の従来の技術、または未だ発見されていないウイルス学による技術はまた、本発明のクリプトウイルスビリオンをさらに特徴づけるために利用し得る。
クリプトウイルスのさらなる特徴は以下を含む：
〈潜伏性と持続性〉  クリプトウイルスは、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＮＣ）を潜伏かつ持続感染する。パラミクソウイルス科のその他のメンバーはいずれもこれを示さない。感染の証拠は、（１）インビトロ培養及びマイトジェン及び／またはサイクリックＧＭＰによる誘導後のＰＢＭＮＣ中での間接的免疫蛍光抗体法によるクリプトウイルス特異的タンパク質の検出、（２）哺乳類細胞で連続共培養することによるＰＢＭＮＣからのウイルスの回収（Ｒｏｂｂｉｎｓら， "Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ．" １４３：３９６〜４０３， １９８１を参照）、並びに（３）１８ヶ月の期間に渡り、ＳＳＰＥ患者から採取されたＰＢＭＮＣから反復してウイルスを回収できること、を含む。
【００２１】
〈融合活性の欠陥〉  パラミクソウイルス科の特徴である細胞融合が、クリプトウイルスの実験的インビトロ感染では欠陥性があるか、または極めて制限されている（即ち ヒト羊膜細胞（ＡＶ3） の劣性非増殖型感染及びサル腎細胞の増殖型感染）（例えば、Ｖｅｒｏ及びＣＶ-ｌc、Ｒｏｂｂｉｎｓら， "Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ．" １４３：３９６〜４０３， １９８１， 及びＲｏｂｂｉｎｓとＲａｐｐ， "Ａｒｃｈ． Ｖｉｒｏｌ" ７１：８５〜９１， １９８２を参照）。
〈潜伏感染細胞における限定発現〉  クリプトウイルス特異的タンパク質発現は、哺乳類羊膜細胞（例えば、ヒトＡＶ3 細胞）の実験的非増殖型潜伏発現では劣性である。この限定は、ウイルスによってコードされるエンベロープタンパク質（Ｆ，ＨＮ及びＳＨ）の極度な発現低下、あるいは非発現に関連する（ＲｏｂｂｉｎｓとＲａｐｐ， "Ａｒｃｈ． Ｖｉｒｏｌ．" ７１：８５〜９１， １９８２を参照）。
〈Ｂ細胞リンパ向性〉  クリプトウイルスは、Ｂ細胞向性を示し、したがって係る細胞の生体内原位置に潜伏し得る。これは、ヒトドナー由来のＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株をこのウイルスで感染させることによって（即ち、クリプトウイルス特異的免疫蛍光法によって、実験的感染されたＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株の細胞質中にクリプトウイルス特異的封入体の形成が進行することを検出することによって）、実証されている。対照的に、クリプトウイルス特異的タンパク質は、実験的に感染されたヒトＴ細胞株であるＣＣＲＦ−ＣＥＭにおいては検出されなかった。したがって、クリプトウイルスは、感染個体中ではＢ細胞に存在し得る。
〈向神経性〉  クリプトウイルスはまた、新生児動物の脳内接種後、（クリプトウイルス特異的免疫蛍光法によって検出されるように）、マウスにおいてニューロンに明らかな向性を実証する。その他の神経系組織が感染されるか否かについては不明である。パラミクソウイルス科のその他のヒトメンバー（例えば、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス）と比較、対照する場合、向神経性それ自体はクリプトウイルスに独特ではないが、ＣＮＳ組織（ニューロンを含む）のクリプトウイルス感染の神経病理学的結果のいくつかは独特であると思われる（以下参照）。
〈後肢萎縮症と麻痺〉  後肢麻痺と萎縮症は、新生児時にクリプトウイルスを脳内接種されたＱｕａｃｋｅｎｂｕｓｈマウスの約３３％において観察された。さらに、新生児時にクリプトウイルスを接種されたが、顕性症状を発症しなかった成熟メスＱｕａｃｋｅｎｂｕｓｈマウスの子孫のあるものにおいて、後肢萎縮症と麻痺が観察された。後者の場合の症状出現頻度は、係る特徴を持って生まれて、後に発症するような新生児動物を母親が共食いする傾向があるために、評価が困難であった。
〈亜急性／緩徐進行性脳症及びテンカン原性の潜在性〉  感染性クリプトウイルス調製物を接種された新生児有色マウスの約３０％が亜急性／緩徐進行性脳症及び／またはテンカン様疾患を発症した（係る動物によって呈示される特定の症状は以下に説明する）。実際に脳症及び／またはテンカン様疾患を発症した動物の数は、３０％を超えると思われる、その理由は、過去に無症状であった動物の何匹かがケージの中でクローヌス体位（難治性テンカン発作後あるいは発作中の死亡に関連する症状）で死亡していたのが発見されたからである。少なくとも２つのケースでは、前日に反復性テンカン発作を発症した動物に生じた。係る疾患を発症した動物は優先的にオスであった（約２：１，オス：メス）。
〈緩徐進行性精神病の潜在性〉  新生児時の感染性クリプトウイルス調製物の脳内接種を生存して、青年期または若年成体動物時にテンカン様疾患を発症しなかった有色マウスのうち、約３０％が成体時に著明な身体及び行動異常を発症した。これらの動物が呈示した異常性を以下に説明する。これらの動物群では突然死は観察されなかった。係る疾患を発症した動物は優先的にメスであった（約３：１，メス：オス）。
前述は、本発明のクリプトウイルスの観察可能な特性のいくつかの単なる例示であり、徹底的な一覧ではない。
【００２２】
本発明はまた、「クリプトウイルス特異的」、即ち、クリプトウイルスに独特、である単離核酸及び単離タンパク質に関する。
クリプトウイルス特異的核酸セグメントまたはタンパク質は、塩基またはアミノ酸の既知配列、例えば、その他のルブラウイルス核酸またはタンパク質配列、との配列類似性またはホモロジー（相同性）によって決定される。塩基及びアミノ酸配列ホモロジーは、ＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴ、ＱＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ、ＰＨＩ−ＢＬＡＳＴ、ｇａｐｐｅｄまたはｕｎｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、またはＢａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｓｅｒｖｅｒ（バイエル医科大学サーバ） （ｗｗｗ．ｈｇｓｃ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕ／ｓｅｑ_ｄａｔａ）を使用する「アライン」プログラムのようなコンピュータ化アルゴリズムを使用して、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（国立バイオテクノロジーインフォーメーションセンター）のＧｅｎＢａｎｋデータベース（ＮＣＢＩ； ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）のようなゲノム科学／プロテオミックスデータベースの配列類似性検索を行うことによって決定される。（例えば、 Ａｌｔｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ．，ら， Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ-ＢＬＡＳＴ： ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ（Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ とＰＳＩ-ＢＬＡＳＴ：新世代のタンパク質データベース検索プログラム）， "Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．" ２５（１７）：３３８９〜４０２ [１９９７]、Ｚｈａｎｇ， Ｊ．， & Ｍａｄｄｅｎ， Ｔ．Ｌ．， ＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴ： ａ ｎｅｗ ｎｅｔｗｏｒｋ ＢＬＡＳＴ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ ｏｒ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ（ＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴ：インタラクティブまたは自動配列分析と注釈用の新ネットワークＢＬＡＳＴアプリケーション）， "Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．" ７（６）：６４９〜５６ [１９９７]、Ｍａｄｄｅｎ， Ｔ．Ｌ．，ら， Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｎｅｔｗｏｒｋ ＢＬＡＳＴ ｓｅｒｖｅｒ（ネットワークＢＬＡＳＴサーバのアプリケーション）， "Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．" ２６６：１３１〜４１ [１９９６]、 Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ．，ら， Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ（基本ローカルアライメント検索ツール）， "Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．" ２１５（３）：４０３〜１０ [１９９０]）。
本発明の目的では、「単離」という用語は「精製」を包含する。したがって、高度に均質までさらに精製される、単離核酸、タンパク質、ウイルス粒子、または抗体は、また「単離」される。
本発明の目的では、「核酸」という用語は、任意の長さの、重合リボヌクレオチド（ＲＮＡ）または、ｃＤＮＡのような重合デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）である、ポリヌクレオチドを含む。
「単離核酸」という用語は、クリプトウイルスゲノムが天然に会合するポリペプチドを実質的には含まず、即ち、約５０％以下、好ましくは約７０％以下、そしてそれよりもさらに好ましくは約９０％以下含むクリプトウイルスゲノムＲＮＡを意味する。他方、本発明の「単離」核酸は、クリプトウイルス特異的「組換えポリヌクレオチド」であり、これは本願で使用する場合は、ゲノムＲＮＡ、センスＲＮＡ（即ち、ｍＲＮＡセンス）、ｃＤＮＡ、半合成、または合成起源を意味し、その起源または操作によって：（１）天然で会合するポリヌクレオチドの全てまたは一部と会合しない、（２）天然で結合するポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドと結合する、あるいは（３）天然では発生しない。本発明の核酸は、センスまたはアンチセンス方向であり得る。
本願で使用する際は、核酸の「センス鎖」は、その配列のｍＲＮＡと配列ホモロジーを有する配列を含む。「アンチセンス鎖」は、「センス鎖」配列に相補な配列を含む。本発明の核酸はまた、二本鎖及び一本鎖ＤＮＡとＲＮＡを含む。
ウイルス粒子からウイルスポリヌクレオチドを精製する技術は当該分野で公知であり、例えば、カオトロピック試薬による粒子の破壊、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、及び密度勾配沈降法による、ポリヌクレオチド（複数でもよい）及びポリペプチドの分別抽出と分離を含む。
【００２３】
本発明の核酸はまた、例えば、標識、メチル化、「キャップ」のような公知のタイプの修飾、１つ以上の天然ヌクレオチドのヌクレオチド類似体による置換、例えば、無電荷結合（例えば、メチルホスホナート、ホスホトリエステル、ホスホアミダート、カルバミン酸塩等）及び電荷結合（例えば、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート等）を有するポリヌクレオチドのようなインターヌクレオチド修飾、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジン等）のようなペンダント成分を含むもの、インターカレーター（挿入剤）（例えば、アクリジン、ソラレン等）を有するもの、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化型金属等）を含むもの、アルキル化剤を含むもの、修飾結合を有するもの（例えば、αアノマー核酸など）、並びにポリヌクレオチドの未修飾形態を包含する。
「核酸セグメント」は、大型核酸のポリヌクレオチドサブポーションである。
本発明のクリプトウイルス特異的ヌクレオチド配列に相補なヌクレオチド配列は、本願で使用する際は、クリプトウイルス特異的ヌクレオチド塩基配列と特異的に結合またはハイブリダイズする配列である。「特異的に結合する」あるいは「ハイブリダイズする」という表現は、ポリヌクレオチド配列が、相補塩基配列を認識して、相補塩基対間に水素結合を形成することによって二重らせんセグメントを形成する能力を包含する。したがって、相補配列は、例えば、センス配列またはコード配列に対するアンチセンス配列を含む。当業者には公知であるように、ハイブリッドの安定性は、そのハイブリッドの融点（Ｔm）に反映される。一般的には、ハイブリッドの安定性は、ナトリウムイオン濃度と温度の関数である。典型的に、ハイブリダイゼーション反応は、比較的低いストリンジェンシー条件下で行われるがその後、異なる、しかしより高い、ストリンジェンシーで洗浄が行われる。ハイブリダイゼーションの厳密性（ストリンジェンシー）の基準は、そのような洗浄条件に関連する。
本願で使用する際は、「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション」という表現は、標的ＲＮＡまたはＤＮＡが、その標的ＲＮＡセグメントまたはＤＮＡセグメントに対して少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、あるいは約１００％同一性を有する相補核酸と結合することを可能にする条件を意味する。好ましくは、中程度ストリンジェントな条件は、５０％ホルムアミド、５ｘ  デンハート液、５ｘ  ＳＳＰＥ、０．２％  ＳＤＳ中、４２℃でハイブリダイゼーションを行い、０．２ｘ  ＳＳＰＥ、０．２％  ＳＤＳ中、６５℃で洗浄を行う場合のストリンジェンシーにほぼ等価な条件である。
「高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション」という表現は、０．０１８Ｍ  ＮａＣｌ中、６５℃で安定なハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能とする条件を意味する（即ち、ハイブリッドが０．０１８Ｍ  ＮａＣｌ中、６５℃で安定でなければ、それは本願で意図するような高ストリンジェンシー条件下で安定ではない）。高ストリンジェンシー条件は、例えば、５０％ホルムアミド、５ｘ  デンハート液、５ｘ  ＳＳＰＥ、０．２％  ＳＤＳ中、４２℃でハイブリダイゼーションを行い、０．１ｘ  ＳＳＰＥ、０．１％  ＳＤＳ中、６５℃で洗浄を行うことによって提供され得る。
「低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション」という表現は、典型的には、１０％ホルムアミド、５ｘ  デンハート液、６ｘ  ＳＳＰＥ、０．２％  ＳＤＳ中、４２℃でハイブリダイゼーションを行い、１ｘ  ＳＳＰＥ、０．２％  ＳＤＳ中、５０℃で洗浄を行う場合に等価な条件である。デンハート液及びＳＳＰＥ（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（分子クローニング、実験マニュアル）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ [１９８９]）は、その他の適切なハイブリダイゼーション用緩衝液と同様に、当業者には公知である。
本発明の核酸は、配列番号１または相補配列の、少なくとも５隣接ヌクレオチド、そして１５２４５隣接ヌクレオチドまでの長さのクリプトウイルス特異的核酸フラグメントを含む。
【００２４】
したがって、有用なフラグメントは、クリプトウイルスゲノムまたは相補配列の翻訳領域から成る核酸セグメントを含む。「翻訳領域」（ＯＲＦ）は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の領域であり、この領域は、コード配列の一部または全コード配列に相当し得る。
「コード配列」は、適切な調節配列のコントロール下に置かれると、ｍＲＮＡに転写及び／またはポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列である。コード配列の境界は、５'末端にある翻訳開始コドンと３'末端にある翻訳終止コドンによって決定される。コード配列は、限定はされないが、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、及び組換えポリヌクレオチド配列を含み得る。
フラグメントの有用な例は、クリプトウイルスタンパク質をコードする以下のような核酸セグメントを含む：（i）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置１５２〜１６７８（[配列番号３]とも指定される）、（ii）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置１８５０〜２５１５（[配列番号５]とも指定される）、（iii）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置１８５０〜３０２３（[配列番号３３]とも指定される）、（iv）（配列番号１）のヌクレオチド位置２３３９と（配列番号１）のヌクレオチド位置２３４０の間にさらに２つのグアニン残基の挿入を結合している（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置１８５０〜３０２３（[ＧＧ]挿入を含む結合配列は[配列番号７]と指定される）、（v）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置３１４１〜４２７１（[配列番号９]とも指定される）、（vi）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置４５３０〜６１８２（[配列番号１１]とも指定される）、（vii）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置４５８７〜６１８２（[配列番号１３]とも指定される）、（viii）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置４５８７〜４８３５（[配列番号１５]とも指定される）、（ix）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置４８３６〜６１８２（[配列番号１７]とも指定される）、（x）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置４２７２〜６５１５（[配列番号３４]とも指定される）、（xi）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置６３０３〜６４３４（[配列番号１９]とも指定される）、（xii）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置６５８４〜８２７８（[配列番号２１]とも指定される）、あるいは（xiii）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置８４１４〜１５１７８（[配列番号２３]とも指定される）。（配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、３３、または３４）のいずれかに相補な配列、または（配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、３３、または３４）のいずれかの縮重コード配列はまた、核酸フラグメントによって包含される。
本願で使用する際は、「縮重コード配列」、あるいは互換性を持って使用される「縮重配列」という用語は、任意の参照核酸、例えば、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、または２３のいずれかと少なくとも一つのヌクレオチド位置が異なる少なくとも一つのコドンを有するが、参照核酸と同一アミノ酸をコードする、タンパク質コード核酸配列を意味する。例えば、「ＵＣＵ」、「ＵＣＣ」、「ＵＣＡ」、及び「ＵＣＧ」の三塩基組によって特定されるコドンは、これらのコドン４つの全てがアミノ酸セリンをコードするために、お互いについて縮重である。
ある実施形態では、クリプトウイルス特異的フラグメントは、最大約５００ヌクレオチド長である。その他の実施形態では、フラグメントは約５０ヌクレオチド長である。本発明の核酸フラグメントの他の実施形態は、約１５ヌクレオチド〜約３５ヌクレオチド長であり、例えば、これは、核酸増幅反応用のクリプトウイルス特異的オリゴヌクレオチドである、本発明のクリプトウイルス特異的プライマーの好ましい長さである。最も好ましくは、本発明のクリプトウイルス特異的プライマーは、約１７〜約２２ヌクレオチド長であるが、７隣接ヌクレオチドのような短いプライマーが、いくつかの遺伝子特異的配列には有用であり得る。（例えば、 Ｖｉｎｃｅｎｔ， Ｊ．，ら， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ ｓｈｏｒｔ ａｓ ７-ｍｅｒｓ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（７マーのように短いオリゴヌクレオヌクレオチドをＰＣＲ増幅に使用することができる）， "ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．" １３（１）：７５〜８２[１９９４]）。
【００２５】
本発明のプローブは、好ましくは約７〜約５００ヌクレオチド長であり、最も好ましくは約１５〜約１５０ヌクレオチド長であり、さらに、少なくともその長さの一部として、適切にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、このプローブがクリプトウイルス特異的一本鎖核酸とハイブリダイズするような、少なくとも７〜１５ヌクレオチド長であるクリプトウイルス特異的ヌクレオチド配列を含む。例えば、本願に説明される本発明のオリゴヌクレオチドプライマー配列を含むプローブは、核酸増幅産物を含む、クリプトウイルス特異的核酸を検出または分析するためのプローブとして使用するために標識され得る。
プライマーまたはプローブとして有用なクリプトウイルス特異的フラグメントの非限定例は、以下を含む核酸を含む：配列番号１の隣接ヌクレオチド位置１６８４〜１７０１（配列番号３５と指定）、配列番号１の隣接ヌクレオチド位置１７００〜１７１７（配列番号３６と指定）、配列番号１の隣接ヌクレオチド位置４２８３〜４３００（配列番号３７と指定）、配列番号１の隣接ヌクレオチド位置４２９９〜４３１６（配列番号３８と指定）、配列番号１の隣接ヌクレオチド位置４２８５〜４３０２（配列番号３９と指定）、配列番号１の隣接ヌクレオチド位置４３００〜４３１７（配列番号４０と指定）、配列番号１の隣接ヌクレオチド位置４５１８〜４５３５（配列番号４１と指定）、配列番号１の隣接ヌクレオチド位置４５３３〜４５５０（配列番号４２と指定）、配列番号１の隣接ヌクレオチド位置６１１６〜６１３３（配列番号４４と指定）、配列番号１の隣接ヌクレオチド位置６１９２〜６２０９（配列番号４５と指定）、配列番号１の隣接ヌクレオチド位置６１９１〜６２０８（配列番号４３と指定）、配列番号１の隣接ヌクレオチド位置７５０１〜７５１８（配列番号４６と指定）、配列番号１の隣接ヌクレオチド位置７５１７〜７５３４（配列番号４７と指定）、あるいは、前述の配列番号３５〜４７のいずれかに相補なヌクレオチド配列。特にヒト由来の生物材料サンプルまたはそれに由来する増幅産物中の核酸を探索するためにプローブとして特に有用なポリヌクレオチドは、配列番号１の隣接ヌクレオチド位置４２９２〜４５４９を含む核酸（配列番号４８と指定）または相補配列である。ヒトからの生物材料サンプル由来の核酸を探索するには、例えば、配列番号１の隣接ヌクレオチド位置４２７２〜６５１５（配列番号３４と指定）を含む核酸または相補配列のような、配列番号１のさらに大型核酸セグメントを使用することができる。
プライマーは、適切な条件下に置かれると、ポリヌクレオチド鎖の合成の開始点として作用することができる。プライマーは、コピーされるべきポリヌクレオチド鎖の領域と完全にあるいは実質的に相補である。したがって、ハイブリダイゼーションを導出する条件下では、プライマーは、アナライト鎖の相補領域にアニールする。適切な反応物（例えば、ポリメラーゼ、ヌクレオチド三リン酸等）を添加すると、プライマーは、重合剤によって伸長して、アナライト鎖のコピーを形成する。プライマーは、一本鎖、または、もう一方の選択肢として、部分的あるいは完全に二本鎖であり得る。
「アナライトポリヌクレオチド」及び「アナライト鎖」という用語は、クリプトウイルス特異的標的配列を含むと推察される、及び生物材料サンプル中に存在し得る、一本鎖または二本鎖核酸分子を意味する。
本発明のプローブは、プローブ中にある少なくとも一つのヌクレオチド配列が標的領域にある配列と相補であるために、クリプトウイルス特異的標的配列とハイブリッド構造を形成するポリヌクレオチドから成る構造体である。プローブのポリヌクレオチド領域は、ＤＮＡ、及び／またはＲＮＡ、及び／または合成ヌクレオチド類似体によって構成され得る。「標的領域」とは、増幅及び／または検出されるべき核酸の領域を意味する。「標的配列」という用語は、プローブまたはプライマーが望ましい条件下で安定なハイブリッドを形成する、クリプトウイルス特異的配列を意味する。
「捕獲プローブ」及び「標識プローブ」はプローブに含まれる。好ましくは、プローブは、核酸増幅反応を起動するために使用される配列（複数でもよい）の相補配列を含まない。
【００２６】
「捕獲プローブ」という用語は、本願で使用する際は、結合パートナーと共役する一本鎖ポリヌクレオチドから成るポリヌクレオチドを意味する。一本鎖ポリヌクレオチドは、アナライトポリヌクレオチドにおいて検出されるべき標的領域にある標的配列と相補である、ターゲティングポリヌクレオチド配列から成る。相補領域は、アナライトポリヌクレオチドを固体表面に（結合パートナーを介して）不動化するために十分に安定な二本鎖を提供するために十分な長さと標的配列に対する相補性を有する。結合パートナーは、第二結合パートナーについて特異的であり、第二結合パートナーは、固体支持体表面に結合することができるか、あるいはその他の構造体または結合パートナーを介して間接的に固体支持体に結合され得る。
「結合パートナー」という用語は、本願で使用する際は、リガンド分子を高特異性に結合可能である分子、即ち例えば、その分子に特異的な抗原及び抗体、を意味する。一般的には、特異的結合パートナーは、単離条件下で、アナライトコピー／相補の二本鎖（捕獲プローブの場合）を不動化するために、十分な親和性で結合しなければならない。特異的結合パートナーは当該分野では公知であり、例えば、ビオチン及びアビジンまたはストレプトアビジン、ＩｇＧ及びタンパク質Ａ、多数の公知の受容体リガンド結合、並びに相補ポリヌクレオチド鎖を含む。相補ポリヌクレオチド結合パートナーの場合は、パートナーは一般的には少なくとも約１５塩基長であり、また少なくとも４０塩基長であることがあり、さらにＧとＣ含量が少なくとも約２５％、最大約７５％を有する。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または合成ヌクレオチド類似体から構成され得る。
「共役」とは、本願で使用する際は、共有結合あるいは、強い非共有相互作用（例えば、疎水性相互作用、水素結合等）によって連結することを意味する。共有結合は、例えば、エステル、エーテル、ホスホエステル、アミド、ペプチド、イミド、炭素−イオウ結合、炭素−リン結合等である。
「支持体」とは、望ましい結合パートナーが固定され得る固体または半流動体表面を意味する。適切な支持体は、ガラス、プラスチック、金属、ポリマーゲルなどを含み、ビーズ、ウェル、ディップスティック、膜などの形態をとる。
本願で使用する際は、「標識プローブ」という用語は、アナライトポリヌクレオチド中に検出されるべき標的配列に相補である、ターゲティング（標的指向化）ポリヌクレオチドから成るオリゴヌクレオチドを意味する。相補領域は、「標識プローブ」及び「標的配列」から成る二本鎖が標識によって検出されることを可能にするために十分な長さと標的配列に対する相補性を有する。オリゴヌクレオチドは、互いに高特異性を有する１セットのリガンド分子を介して、直接的または間接的に標識と共役する。
「標識」は、検出可能（好ましくは定量可能）なシグナルを供給するために使用することができ、例えば、抗体のような、従来の手段によってポリヌクレオチドまたはポリペプチドに連結することのできる任意の原子または成分を含む。標識は、単独あるいは付加試薬と組み合わせて使用し得る。係る標識は当該分野で公知である。標識は、適切な放射線検出手段によって検出される、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ、3Ｈ、または15Ｏのようなラジオアイソトープであり得る。一方、標識は、有用な免疫蛍光トレーサーである蛍光色素（色素）を形成するために変性することなしに、抗体または抗原と化学的に結合する蛍光標識物質であり得る。免疫蛍光分析技術の説明は、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｓ ａ Ｔｏｏｌ（ツールとしての抗体）， Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓら， 編集、 Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ & Ｓｏｎｓ， Ｌｔｄ．， ｐｐ． １８９〜２３１ （１９８２）に掲載されている、ＤｅＬｕｃａ、"Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（免疫蛍光分析）"に見られる。その上、任意の多様な蛍光色素をオプションとして使用して、プローブまたはプライマー、あるいは増幅産物を標識して、検出及び／または分析を容易にすることができる。有用な蛍光色素は、限定はされないが、ローダミン、フルオレセイン、ＳＹＢＲグリーンＩ、Ｙ１Ｏ−ＰＲＯ−１、チアゾールオレンジ、Ｈｅｘ（即ち、６−カルボキシ−２’，４’，７’，４，７−ヘキサクロロフルオレセイン）、ピコグリーン、エダンス、フルオレセイン、ＦＡＭ（即ち、６−カルボキシフルオレセイン）、またはＴＥＴ（即ち、４，７，２’，７’―テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン）を含む。（例えば、 Ｊ． ＳｋｅｉｄｓｖｏｌｌとＰ．Ｍ． Ｕｅｌａｎｄ， Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｄｏｕｂｌｅ-ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｂｙ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｗｉｔｈ ｌａｓｅｒ-ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ｄｙｅ ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ Ｉ（単量体色素ＳＹＢＲグリーンＩを用いるレーザー誘導蛍光検出を伴うキャピラリ電気泳動による二本鎖ＤＮＡの分析）， "Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．" ２３１（２０）：３５９〜６５ [１９９５]、Ｈ． Ｉｗａｈａｎａら， Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ-ｂａｓｅｄ ＰＣＲ-ＳＳＣＰ ａｎａｌｙｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ（ＰＣＲ産物の内部蛍光標識を用いる複数の蛍光ベースＰＣＲ−ＳＳＣＰ分析）， "Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ" ２１（３０：５１０〜１４， ５１６〜１９ [１９９６]）。
【００２７】
本発明の核酸構築物は、本発明の核酸を含む組換えクローニング及び発現ベクター（プラズミド及びレトロウイルスまたはアデノウイルスベクターのようなウイルス発現ベクターを含む）を含む。「ベクター」は、連結されたセグメントの複製及び／または発現を引き起こすために、他のポリヌクレオチドセグメントが連結されたレプリコンである。「レプリコン」とは、細胞内においてポリヌクレオチド複製の自律ユニットとして振る舞い、即ち、レプリコン自体のコントロール下で複製が可能である、例えば、プラズミド、染色体、ウイルス、コスミド等のような任意の遺伝的因子である。本発明の組換え型発現ベクターは、１つ以上の本発明の核酸セグメントを含み、並びに転写ユニット中にある本発明の核酸セグメントに作動可能に連結された少なくとも一つのプロモーター領域を含む。本発明の核酸構築物の好ましい例は、クリプトウイルスタンパク質をコードする１つ以上の核酸セグメントを含む構築物であり、クリプトウイルスコード配列（複数でもよい）が、構築物内の１つ以上の転写ユニット内に適切に配置され且つ適切な調節配列に作動可能に連結されている。
「制御」または「調節」配列、エレメントまたは領域とは、それが結合したコード配列の発現を影響するために必要なポリヌクレオチド配列を意味する。係る制御配列の本質は、宿主生物によって異なるが、原核生物では、係る制御配列は一般的には、プロモーター、リボソーム結合部位、及びターミネーターを含み、真核生物では、一般的に、係る制御配列は、プロモーター、ターミネーター、及びある場合はエンハンサーを含む。「制御配列」という用語は、少なくとも、その存在が発現のために必須である全ての構成要素を含み、また、例えば、リーダー配列のように、その存在が好都合であるその他の構成要素を含むことがある。
本願で使用する際は、「発現」とは、遺伝子がｍＲＮＡに転写されて、次にペプチド、ポリペプチド、タンパク質に翻訳されるプロセスを意味する。組換え型発現ベクターに関しては、プロモーター領域は、ベクターが作動可能に連結されているコード配列の転写を制御する核酸セグメントを意味する。プロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼ認識、結合、転写開始に十分な特異的配列を含む。さらに、プロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼのこの認識、結合、並びに転写開始活性をモジュレートする配列を含む。これらの配列は、シス作用性であるか、あるいはトランス作用因子に応答性があり得る。制御の本質に拠っては、プロモーターは、構成的であるか、あるいは発生的または誘導的に制御され得る。本発明の実施において使用された代表的なプロモーターは、ＳＶ４０初期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）ステロイド誘導性プロモーター、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）プロモーター等を含む。
哺乳類細胞における外来性遺伝子（例えば、本発明のクリプトウイルス遺伝子）の至適発現のためには、発現ベクターはまたターミネーター配列並びにポリＡ付加配列を必要とすることがあり、発現を増加するエンハンサー配列、及び遺伝子の増幅を起因する配列もまた望ましい。係る配列は当該分野に公知である。
本願で使用する際は、「作動可能に連結された」という用語は、核酸と、プロモーター、エンハンサー、転写及び翻訳終止部位、並びにその他のシグナル配列のような調節（制御またはエフェクター）ヌクレオチド配列との機能的関係を意味する。例えば、プロモーターに対してＤＮＡまたはＲＮＡが作動可能な連結することとは、そのＤＮＡとＲＮＡをそれぞれ特異的に認識、結合、及び転写するＲＮＡポリメラーゼによって、そのＤＮＡまたはＲＮＡの転写がプロモーターから開始されるような、ＤＮＡまたはＲＮＡとプロモーターの間の物理的並びに機能的関係を意味する。コード配列に「作動可能に連結される」調節配列は、調節配列と適合性のある条件下で、コード配列の発現が達成されるように連結される。したがって、例えば、転写ユニット内で、プロモーター配列は、コード配列から上流（即ち、それに関して５'）に位置し、コード配列はプロモーターに対して３'にあるか、または言い換えればプロモーターに対して３'の遺伝子配列または翻訳フレーム内にあり、そして発現がそれによって協調的に制御されている。プロモーター及びコード配列のどちらも５'から３'向きに方向づけられており、したがって、転写は、全ての必須酵素、転写因子、コファクター、アクチベーター、及び反応体が存在すると、望ましい物理的条件下、例えば、適切なｐＨと温度、インビトロで起こり得る。これは、特定の細胞において、条件が転写を有利にすることを意味するわけではない。例えば、組織特異性プロモーターからの転写は、一般的には異なる組織に由来する異種細胞型ではうまくいかない。
【００２８】
クリプトウイルス特異的核酸を含む、本発明の発現ベクターは、細胞を形質転換するために用いられる。「形質転換」とは、本願で使用する際は、外来性ポリヌクレオチドの宿主細胞内への挿入を意味し、例えば、直接取り込み、トランスフェクション、形質導入、ｆ−接合、マイクロ粒子ボンバードメント、または電気穿孔法、のような挿入に使用される方法には関係ない。外来性ポリヌクレオチドは、例えば、プラズミドのような非組み込み型ベクターとして、あるいは反対に宿主ゲノムに組み込まれて維持され得る。「形質転換された」宿主細胞とは、形質転換を受けた細胞、並びに当初の外来性ポリヌクレオチドを維持するその子孫を意味する。
適切な発現ベクターは、当業者には公知であり、真核細胞及び／または原核細胞内で複製可能であり、エピソーム性のまま存続するか、あるいは宿主細胞ゲノム中に組み込まれるものを含む。
形質転換された哺乳類細胞における目的タンパク質の少なくともいくつかの発現についての重要な保証を提供する、クローン化ウシパピローマウイルスゲノム、マウスレトロウイルスのクローン化ゲノム、及びｐＳＶ−２  ｇｐｔ系（ＭｕｌｌｉｇａｎとＢｅｒｇ， １９７９， "Ｎａｔｕｒｅ" Ｖｏｌ． ２７７：１０８〜１１４に記述）、Ｏｋａｙａｍａ-Ｂｅｒｇ クローニング系（"Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．" Ｖｏｌ． ２：１６１〜１７０， １９８２）、ｐＧＡＬ４、ｐＣＩ （例えば、ｐＣＩ-ｎｅｏ）のような真核性カセット、及びＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ （遺伝研究所）（"Ｓｃｉｅｎｃｅ" Ｖｏｌ． ２２８：８１０〜８１５， １９８５）によって記述されている発現ベクターを含む、代表的な真核性発現ベクターが利用可能である。
哺乳類細胞のトランスフェクションまたは形質導入のために、本発明の核酸に結合できる調節エレメントを含むベクターが好ましい。ｐｃＤＮＡ１ （インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）のようなサイトメガロウイルス（ＣＭＶ） プロモーターベースのベクター、ｐＭＡＭＮｅｏ （クローンテク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）及びｐＭＳＧ （ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ） のようなＭＭＴＶ プロモーターベースのベクター、並びに ｐＳＶβ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）のようなＳＶ４０ プロモーターベースのベクターがその例である。本発明の一つの実施形態では、哺乳類細胞を異種クリプトウイルス特異的核酸で形質導入するために、アデノウイルスートランスフェリン／ポリリジン−ＤＮＡ（ＴｆＡｄｐｌＤＮＡ）ベクター複合体（Ｗａｇｎｅｒら， １９９２， "ＰＮＡＳ"， ＵＳＡ， ８９：６０９９〜６１０３、Ｃｕｒｉｅｌら， １９９２， "Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ"， ３：１４７〜１５４； Ｇａｏら， １９９３， "Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．"， ４：１４〜２４）が使用される。本願に記述する任意のプラズミド発現ベクターをＴｆＡｄｐｌＤＮＡ 複合体において使用してもよい。
さらに、発現ベクターは、例えば、ヒト免疫不全症ウイルスのようなレトロウイルス、レンチウイルス、ムンプスウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルスのようないくつかのウイルスビリオンによってベクターがパッケージされることを可能にして、その結果「ウイルスベクター」を形成するような適切なパッケージング・シグナルを含み得る。（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｗ．Ｆ．， Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｓｃｏｒｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｃａｎｃｅｒ（遺伝子療法がガンに勝つ）， "Ｎａｔ． Ｍｅｄ．" ６（８）：８６２〜６３ [２０００]を参照）。これらのウイルスベクターは、例えば、単純ヘルペスウイルスベクター（例えば、Ｇｅｌｌｅｒら， １９８８， "Ｓｃｉｅｎｃｅ"， ２４１：１６６７〜１６６９）、ワクシニアウイルスベクター（例えば、Ｐｉｃｃｉｎｉ ら， １９８７， "Ｍｅｔｈ． ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ"， １５３：５４５〜５６３）、サイトメガロウイルスベクター（Ｍｏｃａｒｓｋｉら、Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ（ウイルスベクター）， Ｙ． Ｇｌｕｚｍａｎ ａｎｄ Ｓ．Ｈ． Ｈｕｇｈｅｓ， 編集， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， １９８８， ｐｐ． ７８〜８４）、モロニーマウス白血病ウイルスベクター（Ｄａｎｏｓら， １９８０， "ＰＮＡＳ， ＵＳＡ"， ８５：６４６９）、アデノウイルスベクター（例えば、Ｌｏｇａｎら， １９８４， "ＰＮＡＳ， ＵＳＡ"， ８１：３６５５〜３６５９； Ｊｏｎｅｓら， １９７９， "Ｃｅｌｌ"， １７：６８３〜６８９； Ｂｅｒｋｎｅｒ， １９８８， "Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ"， ６：６１６〜６２６； Ｃｏｔｔｏｎら， １９９２， "ＰＮＡＳ， ＵＳＡ"， ８９：６０９４〜６０９８； Ｇｒａｈａｍら， １９９１， "Ｍｅｔｈ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．"， ７：１０９〜１２７）、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター（米国特許第 ５，２５２，４７９号， ＷＩＰＯ（世界知的所有権機関）公報  国際公開番号ＷＯ９２／０７５７３、 ＷＯ ９０／０６９９７、ＷＯ ８９／０５３４５、ＷＯ ９２／０５２６６、及びＷＯ ９２／１４８２９、米国特許番号第 ４，４０５，７１２号 と４，６５０，７６４号、Ｓｈａｃｋｌｅｆｏｒｄら， １９８８， "ＰＮＡＳ， ＵＳＡ"， ８５：９６５５〜９６５９を参照）等を含む。
【００２９】
好ましいウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルス及び水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）−モロニーマウス白血病ウイルスと呼ばれるモロニーウイルス由来のシュードタイプレトロウイルスベクターである。最も好ましいウイルスベクターは、ＨＩＶウイルス由来のシュードタイプ（ＶＳＶ−Ｇ）レンチウイルスベクターであり、これは哺乳類細胞の形質導入に使用される。（Ｎａｌｄｉｎｉ， Ｌ．，ら， Ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ ｓｔａｂｌｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｎｄｉｖｉｄｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ（レンチウイルスベクターによるインビボ遺伝子デリバリーと非分裂細胞の安定な形質導入）， "Ｓｃｉｅｎｃｅ" ２７２： ２６３〜２６７ [１９９６]）。この遺伝子デリバリー系は、３プラズミド発現系によって産生されたレトロウイルス粒子を利用する。この系では、パッケージング構築物は、全てのウイルスタンパク質の発現を誘導する、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）最初期プロモーターを含む。この構築物のデザインは、ウイルスのパッケージング、逆転写並びにこれらの転写物の組み込みに重要なシス作用配列を排除する。第二プラズミドは、異種エンベロープタンパク質（ｅｎｖ）、即ち、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ−Ｇ）のＧ糖タンパク質、をコードする。第三のプラズミドは、形質導入ベクター（ｐＨＲ'）であり、パッケージング、逆転写、及び組み込みに必要なヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）のシス作用配列と異種性相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）をクローニングするための固有な制限部位を含む。例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、増強緑色蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、蛍光フィコビリンタンパク質、β−ガラクトシダーゼ、及び／または他の予め選択された産物をコードする遺伝子のような遺伝的選択マーカーが、ＨＲ'ベクターのｈＣＭＶプロモーターの下流にクローン化され、そして転写ユニットを形成するように作動可能に連結される。ＶＳＶ−Ｇシュードタイプレトロウイルスベクター系は、異なる種由来の広範な細胞を感染して、ゲノム中に組み込むことが可能である。いくつかのレトロウイルス、即ちＨＩＶのようなレンチウイルス、は非分裂細胞を感染する能力を有する。レンチウイルスは、異種ＤＮＡ配列について限定された能力を有し、このベクターのサイズ制限は７〜７．５キロベースである（Ｖｅｒｍａ， Ｉ．Ｍ．とＳｏｍｉａ， Ｎ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ  ｐｒｏｍｉｓｅｓ， ｐｒｏｂｌｅｍｓ ａｎｄ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ（遺伝子療法−将来性、問題並びに展望）， "Ｎａｔｕｒｅ"  ３８９：２３９〜２４２ [１９９７]）。レンチウイルスを用いるインビボ実験は、他のレトロウイルスベクターのように発現が遮断されず、脳、筋肉、肝臓、膵島細胞におけるインビボ発現は、少なくとも６ヶ月以上持続され、これは現在までに試験された最長記録である（ＶｅｒｍａとＳｏｍｉａ [１９９７]、Ａｎｄｅｒｓｏｎ， ＷＦ．，  Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（ヒト遺伝子療法），  "Ｎａｔｕｒｅ" （Ｓｕｐｐｌ）．"３９２：２５〜３０ [１９９８]）。
前記のウイルスの全てが、非病原性または低抗原性にするために修飾を必要な可能性がある。しかしながら、その他の公知ウイルスベクター系は、また本発明の範囲内で有用である。
外来性ｃＤＮＡの発現に有用で、ワクチン調製に使用され得る、特に有用な発現ベクターは、ワクシニアウイルスである。この場合は、異種ｃＤＮＡはワクシニアゲノム中に挿入される。ワクシニアウイルスゲノム中への外来性ｃＤＮＡの挿入技術は、当該分野で公知であり、例えば、相同組換えを利用する。異種ｃＤＮＡの挿入は一般的には、天然では必須ではない、例えば、チミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）中に行われ、これはまた選択性マーカーを供給する。組換え型ウイルスの構築を著しく促進するプラズミドベクターが説明されている（例えば、Ｍａｃｋｅｔｔら（１９８４）  "ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＤＮＡクローニング）" Ｖｏｌ ＩＩ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， ｐ． １９１， Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉら（１９８５）， "Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．" ５：３４０３、Ｍｏｓｓ （１９８７） "Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（哺乳類細胞用の遺伝子転移ベクター）" （Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｃａｌｏｓ，編集， ｐ． １０）、を参照）。免疫反応性領域を含む所望のポリペプチドの発現が次に細胞、及び、生存組換え型ワクシニアウイルスで感染及び／または免疫された哺乳類内で生じる。
【００３０】
本発明の「核酸構築物」はまた、ベクターに含まれていない構築物、例えば、ホスホロチオアートオリゴデオキシヌクレオチドのような合成アンチセンスオリゴヌクレオチドも包含する。ｍＲＮＡを認識して選択的に結合するようにデザインされた合成アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはその他のアンチセンス化学構造体は、クリプトウイルスコード鎖の一部、例えば、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、または２３に示すコード配列、に相補であるように構築される。哺乳類細胞に取り込まれると、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、クリプトウイルスコード領域の少なくとも一部の翻訳発現を防止して、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、クリプトウイルスタンパク質の発現防止に有用である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡ配列に結合して、例えばＲＮＡ分解酵素Ｉ消化によって、ｍＲＮＡの変性を誘導するか、あるいは翻訳調節因子またはリボソームの結合を妨害するかあるいは、リボザイム配列または標的ｍＲＮＡを変性または化学的に修飾する反応化学基のようなその他の化学構造体の封入によって、ｍＲＮＡ標的配列の翻訳を阻害することによって、標的ｍＲＮＡの配列を不活性化する。アンチセンスオリゴヌクレオチドを利用する遺伝子に基づく療法ストラテジーは当該分野で公知である。（例えば、 Ｒａｉｔ， Ａ．ら， ３'-Ｅｎｄ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｏｆ ｍｉｎｉｍａｌｌｙ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ-ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ １-Ｏ-ｈｅｘａｄｅｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ａｎｔｉ-ｒａｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｒａｄｉａｔｉｏｎ-ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｃｅｌｌｓ（最少ホスホロチオアート保護オリゴヌクレオチドと１−Ｏ−ヘキサデチルグリセロールとの３'末端複合体：照射抵抗性細胞における合成と抗ｒａｓ活性）， "Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ．"， １１（２）：１５３〜６０ [２０００]、Ｓｔｅｎｔｏｎ， Ｇ． Ｒ．ら， Ａｅｒｏｓｏｌｉｚｅｄ ｓｙｋ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｓｙｋ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ｍｅｄｉａｔｏｒ ｒｅｌｅａｓｅ ｆｒｏｍ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ， ａｎｄ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ（エアロゾル化ｓｙｋアンチセンスはｓｙｋ発現、マクロファージから遊離されるメディテーター、ならびに肺炎症を抑制する）， "Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．"， １６４（７）：３７９０〜７ [２０００]、Ｓｕｚｕｋｉ， Ｊ．ら， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｂｃｌ-ｘ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ａｒｔｅｒｉａｌ ｎｅｏｉｎｔｉｍａｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ｃａｒｄｉａｃ ａｌｌｏｇｒａｆｔｓ（アンチセンスＢｃｌ−ｘオリゴヌクレオチドは、マウス心臓同種移植片において、アポトーシスを誘導し、そして動脈性， 新生動脈内膜形成を防止する）"Ｃａｒｄｉｏｖａｓ Ｒｅｓ．"， ４５（３）：７８３〜７ [２０００]、Ｋｉｍ， Ｊ． Ｗ．ら， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｏｆ ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ-３-ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓ�� ｇｅｎｅ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ（グリセルアルデヒドー３−リン酸脱水素酵素遺伝子は、ヒト子宮頚ガン細胞株において細胞増殖を抑制し、アポトーシスを誘導する）， "Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．"， ９（６）：５０７〜１３ [１９９９]、Ｈａｎ， Ｄ． Ｃ．ら， Ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＴＧＦ-ｂｅｔａｌ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｒｅｄｕｃｅｓ ｋｉｄｎｅｙ ｗｅｉｇｈｔ ａｎｄ ｍａｔｒｉｘ ｍＲＮＡｓ ｉｎ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｍｉｃｅ（アンチセンスＴＧＦ−ｂｅｔａｌオリゴヌクレオチドによる療法は、糖尿病マウスにおいて腎臓重量とマトリックスｍＲＮＡを低下させる）， "Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．"， ２７８（４）：Ｆ６２８〜Ｆ６３４ [ ２０００]、 Ｓｃａｌａ， Ｓ．ら， Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ-ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＨＭＧＩ （Ｙ） ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｎｅｏｐｌａｓｉａｓ（ヒト悪性新生物の治療法候補としてのＨＭＧＩ（Ｙ）タンパク質合成のアデノウイルス媒介による抑制）， "Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ．"， ９７（８）：４２５６〜４２６１ [２０００]、Ａｒｔｅａｇａ， Ｃ． Ｌ．，ら， Ｔｉｓｓｕｅ-ｔａｒｇｅｔｅｄ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｃ-ｆｏｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ ｉｎ ｎｕｄｅ ｍｉｃｅ（組織標的アンチセンスｃ−ｆｏｓレトロウイルスベクターは、ヌードマウスにおける樹立乳ガン異種移植を阻害する）， "Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．"， ５６（５）：１０９８〜１１０３ [１９９６]、Ｍｕｌｌｅｒ， Ｍ．ら， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｏｗｎ-ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｓｕｌｉｎ-ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ Ｉ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ（卵巣ガン細胞におけるインスリン様成長因子Ｉ受容体のアンチセンスホスホロチオアートオリゴデオキシヌクレオチドによるダウンレギュレーション）， "Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ"， ７７（４）：５６７〜７１ [１９９８]、Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ， Ｈ． Ｈ．， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｕｓｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｂｒａｉｎ Ｔｕｍｏｒｓ（アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドテクノロジー：悪性脳腫瘍治療用途の展望）， "Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｎｔｒｏｌ"， ５（２）：１６３〜１７０ [１９９８]、Ａｌｖａｒｅｚ-Ｓａｌａｓ， Ｌ． Ｍ．ら， Ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｈｕ��ａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １６ Ｅ６ ｇｅｎｅ（ヒトパピローマウイルスタイプ１６  Ｅ６  遺伝子に指示されたアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドによる子宮頚部腫瘍細胞の成長抑制）， "Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．"， ９（５）：４４１〜５０ [１９９９]、Ｉｍ， Ｓ． Ａ．，ら， Ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆｏｒ ｇｌｉｏｍａｓ： ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ-ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ ｖｉｖｏ（神経膠腫の抗血管形成療法：アンチセンス−血管内皮成長因子の転送はインビボ腫瘍成長を抑制する）， "Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．"， ５９（４）：８９５〜９００ [１９９９]、Ｍａｅｓｈｉｍａ， Ｙ．ら， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｔｏ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｔｉｇｅｎ ａｎｄ Ｋｉ-６７ ｉｎｈｉｂｉｔ ｈｕｍａｎ ｍｅｓａｎｇｉａｌ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ（増殖細胞核抗原及びＫｉ−６７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトメサンギウム細胞増殖を抑制する）， "Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｎｅｐｈｒｏｌ．"， ７（１０）：２２１９〜２９ [１９９６]； Ｃｈｅｎ， Ｄ． Ｓ．らＲｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ-ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｃｙｃｌｉｎ Ｇ１ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ ｎｕｄｅ ｍｉｃｅ（アンチセンスサイクリンＧ１構築物のレトロウイルスバクター媒介伝達は、ヌードマウスにおける骨肉腫の成長を抑制する）， "Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．"， ８（１４）：１６６７〜７４ [１９９７]、Ｈｉｒａｏ， Ｔ．ら， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｂｌｏｃｋｓ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ（アデノウイルスベクターによって送達されたアンチセンス上皮成長因子受容体は、ヒト胃ガンにおいて腫瘍成長をブロックする）， "Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．" ６（５）：４２３〜７[１９９９]、Ｗａｎｇ， Ｘ． Ｙ．ら， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃａｌｐｈａ ｒｅｖｅｒｓｅｓ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ（タンパク質キナーゼカルファのアンチセンス抑制は、ヒト肺ガン細胞における表現型を逆転する）， "Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．"， ２５０（１）：２５３〜６３ [１９９９]、Ｓａｃｃｏ， Ｍ．Ｇ．ら， Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ-ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍａｍｍａｒｙ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｆｒｏｍ ＭＭＴＶ-ｎｅｕ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ（ＭＭＴＶ−ｎｅｕトランスジェニックマウス由来の乳房腺ガンのインビトロ及びインビボアンチセンス媒介による成長抑制）， "Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．"， ５（３）；３８８〜９３ [１９９８]、Ｌｅｏｎｅｔｔｉ， Ｃ．ら， Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃ-ｍｙｃ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｏｎ ｈｕｍａｎ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｍｉｃｅ（インビトロヒト悪性黒色種細胞及びマウスにおけるｃ−ｍｙｃアンチセンスホスホロチオアートオリゴデオキシヌクレオチドの抗腫瘍効果）， "Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．"， ８８（７）：４１９〜２９ [１９９６]、Ｌａｉｒｄ， Ａ． Ｄ．ら， Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ ｌｉｖｅｒ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ａｌｐｈａ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｇｅｎｅ（トランスフォーミング成長因子αアンチセンス遺伝子でトランスフェクトされた肝臓上皮細胞における腫瘍成長の抑制）， "Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．" ５４（１５）：４２２４〜３２ （Ａｕｇ １， １９９４）、Ｙａｚａｋｉ， Ｔ．ら， Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ Ｕ-８７ ｂｙ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ-ａｌｐｈａ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（アンチセンスタンパク質キナーゼＣ−αホスホロチオアートオリゴデオキシヌクレオチドの全身投与によるグリア芽細胞種の治療法）， "Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．"， ５０（２）：２３６〜４２ [１９９６]、Ｈｏ， Ｐ． Ｔ．ら， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｆｏｒ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅｓ（悪性疾患のための治療としてのアンチセンスオリゴヌクレオチド）， "Ｓｅｍｉｎ． Ｏｎｃｏｌ．"， ２４（２）：１８７〜２０２ [１９９７]、Ｍｕｌｌｅｒ， Ｍ．ら， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｏｗｎ-ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｓｕｌｉｎ-ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ Ｉ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ（卵巣ガン細胞におけるアンチセンスホスホロチオアートオリゴデオキシヌクレオチドによるインスリン様成長因子Ｉ受容体のダウンレギュレーション）， "Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ"， ７７（４）：５６７〜７１ [１９９８]、Ｅｌｅｚ， Ｒ．ら， Ｐｏｌｏ-ｌｉｋｅ ｋｉｎａｓｅｌ， ａ ｎｅｗ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｔｕｍｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ（ポロ様キナーゼ１、アンチセンス腫瘍治療の新ターゲット）， "Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．"， ２６９（２）：３５２〜６ [２０００]、Ｍｏｎｉａ， Ｂ． Ｐ．ら， Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔａｒｇｅｔｅｄ ａｇａｉｎｓｔ Ｃ-ｒａｆ ｋｉｎａｓｅ（Ｃ−ｒａｆキナーゼを標的化するホスホロチオアートアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの抗腫瘍活性）， "Ｎａｔ． Ｍｅｄ．"， ２（６）：６６８〜７５ [１９９６]）。
【００３１】
本発明は、単離クリプトウイルスタンパク質に関する。「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸の重合体、即ち、ポリペプチド、を意味し、特定の長さの産物を意味するわけではなく、したがって、「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「オリゴペプチド」は、「タンパク質」の定義に含まれ、係る用語は本願では「タンパク質」と互換性を持って使用される。「タンパク質」という用語はまた、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化等のような、ポリペプチドの発現後修飾を含む。「タンパク質」の定義には、例えば、１つ以上のアミノ酸類似体（例えば、不飽和アミノ酸等を含む）を含むポリペプチド、置換結合、並びに当該分野で公知の、天然及び非天然のその他の修飾を有するポリペプチドが含まれる。ペプチド配列中にアミノ酸類似体を挿入する方法は、当該分野で公知である。
「単離クリプトウイルスタンパク質」という表現は、インビボ環境で通常在来タンパク質に関連する細胞成分及び／または混入物を実質的に含まない、即ち、約５０％以下、好ましくは約７０％以下、そしてさらに好ましくは約９０％以下含む、クリプトウイルスタンパク質を意味する。本発明の単離クリプトウイルスタンパク質はまた、１つ以上のクリプトウイルス粒子のその他の成分、例えば、その他のクリプトウイルスタンパク質種、ウイルスエンベロープのリン脂質成分、またはウイルスゲノム、であり得る。いくつかの有用な実施形態では、本発明の単離クリプトウイルスタンパク質は、既知のウイルス学的及び生化学的方法によって均一になるまで精製される。
本発明のタンパク質は、クリプトウイルス特異的核酸セグメントによってコードされ、その核酸セグメントは、以下を含む：
（i）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置１５２〜１６７８（配列番号３とも指定される）、またはクリプトウイルスヌクレオカプシド（ＮＰ）タンパク質をコードする縮重コード配列、
（ii）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置１８５０〜２５１５（配列番号５とも指定される）、またはウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと考えられるクリプトウイルスＲＮＡ結合（Ｖ）タンパク質をコードする、縮重コード配列、
（iii）（配列番号１）のヌクレオチド位置２３３９と（配列番号１）のヌクレオチド位置２３４０の間にさらに２つのグアニン残基の挿入を連合している、（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置１８５０〜３０２３（配列番号３３とも指定される）（[ＧＧ]挿入を含む連合コード配列は［配列番号７］と指定される）、またはその縮重コード配列、クリプトウイルス核カプシド関連リンタンパク質（Ｐタンパク質）をコードするｍＲＮＡ中へのこのフレイムシフトを生起する挿入は、ｍＲＮＡのプロセシング中に起こり、クリプトウイルスマイナス鎖ＲＮＡゲノム配列によって鋳型されたわけではない、
（iv）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置３１４１〜４２７１（配列番号９とも指定される）、またはクリプトウイルスビリオン関連マトリックスまたは膜（Ｍ）タンパク質をコードする、縮重コード配列、
（v）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置４５３０〜６１８２（配列番号１１とも指定される）または、主要エンベロープ関連糖タンパク質のプロペプチド形であり、そのアミノ末端に１９アミノ酸シグナル領域を含む、クリプトウイルス（非切断型）融合（Ｆ）タンパク質ををコードする縮重コード配列、
（vi）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置４５８７〜６１８２（配列番号１３とも指定される）または、主要エンベロープ関連糖タンパク質のプロペプチド形であり、そのアミノ末端に１９アミノ酸シグナル領域を欠いている、クリプトウイルス（非切断型）融合（Ｆ0）タンパク質ををコードする縮重コード配列、
（vii）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置４５８７〜４８３５（配列番号１５とも指定される）、または切断型Ｆ2 タンパク質をコードする、縮重コード配列、
（viii）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置４８３６〜６１８２（配列番号１７とも指定される）、または、クリプトウイルス感染性に重要であると考えられる２２アミノ酸カルボキシ末端ペプチドセグメントを含む、切断型Ｆ1 タンパク質をコードする、縮重コード配列、
（ix）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置６３０３〜６４３４（配列番号１９とも指定される）、または、小型エンベロープ関連タンパク質である、クリプトウイルスＳＨタンパク質をコードする、縮重コード配列、
（x）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置６５８４〜８２７８（配列番号２１とも指定される）、または、もう一方の主要エンベロープタンパク質である、クリプトウイルスヘマグルチニン（ＨＮ）タンパク質をコードする、縮重コード配列、あるいは
（xi）（配列番号１）の隣接ヌクレオチド位置８４１４〜１５１７８（配列番号２３とも指定される）、またはクリプトウイルスの最大ヌクレオカプシド関連タンパク質（Ｌタンパク質）をコードする、縮重コード配列。
【００３２】
これらは、先述の本発明のタンパク質に対応するアミノ酸配列を同一順序で示す。
（i）ＮＰは以下のアミノ酸配列（配列番号４）を有し、
配列
2005503766.tif 000002
2005503766.tif 000003
2005503766.tif 000004
【００３３】
（ii）Ｖは以下のアミノ酸配列（配列番号６）を有し、
配列
2005503766.tif 000005
【００３４】
（iii）Ｐは以下のアミノ酸配列（配列番号８）を有し、
配列
2005503766.tif 000006
2005503766.tif 000007
【００３５】
（iv）Ｍは以下のアミノ酸配列（配列番号１０）を有し、
配列
2005503766.tif 000008
2005503766.tif 000009
【００３６】
（v）Ｆは以下のアミノ酸配列（配列番号１２）を有し、
配列
2005503766.tif 000010
2005503766.tif 000011
2005503766.tif 000012
【００３７】
（vi）Ｆ0は以下のアミノ酸配列（配列番号１４）を有し、
配列
2005503766.tif 000013
2005503766.tif 000014
2005503766.tif 000015
【００３８】
（vii）Ｆ2は以下のアミノ酸配列（配列番号１６）を有し、
配列
2005503766.tif 000016
【００３９】
（viii）Ｆ1は以下のアミノ酸配列（配列番号１８）を有し、
配列
2005503766.tif 000017
2005503766.tif 000018
【００４０】
（ix）ＳＨは以下のアミノ酸配列（配列番号２０）を有し、
配列
2005503766.tif 000019
【００４１】
（x）ＨＮは以下のアミノ酸配列（配列番号２２）を有し、
配列
2005503766.tif 000020
2005503766.tif 000021
2005503766.tif 000022
また
【００４２】
（xi）Ｌは以下のアミノ酸配列（配列番号２４）を有する、
配列
2005503766.tif 000023
2005503766.tif 000024
2005503766.tif 000025
2005503766.tif 000026
2005503766.tif 000027
2005503766.tif 000028
2005503766.tif 000029
2005503766.tif 000030
2005503766.tif 000031
2005503766.tif 000032
【００４３】
本発明のタンパク質はまた、（配列番号４）、（配列番号６）、（配列番号８）、（配列番号１０）、（配列番号１２）、（配列番号１４）、（配列番号１６）、（配列番号１８）、（配列番号２０）、（配列番号２２）、または（配列番号２４）と実質的に同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含する。本願で使用する際は、「実質的に同一アミノ酸配列」という用語は、参照アミノ酸配列に関して、少なくとも約８０％、さらに好ましくは約９０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を意味し、約９５％以上の配列同一性が特に好ましい。しかしながら、スプライス変異体として生じる、記述レベルより低い配列同一性を含むポリペプチドまたは保存アミノ酸置換によって修飾されるポリペプチドはまた、本発明の範囲内に包含されることが認識される。配列ホモロジーの度合いは、ＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴ、ＱＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ、ＰＨＩ−ＢＬＡＳＴ、ｇａｐｐｅｄまたはｕｎｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、またはＢａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｓｅｒｖｅｒ（バイエル医科大学サーバ） （ｗｗｗ．ｈｇｓｃ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕ／ｓｅｑ_ｄａｔａ）を使用する「アライン」プログラムのようなコンピュータ化アルゴリズムを使用して、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（国立バイオテクノロジーインフォーメーションセンター）のＧｅｎＢａｎｋデータベース（ＮＣＢＩ； ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）のデータベースのようなタンパク質データベースのアミノ酸配列類似性検索を行うことによって決定される。（例えば、 Ａｌｔｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ．，ら， Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ-ＢＬＡＳＴ： ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ（Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ とＰＳＩ-ＢＬＡＳＴ：新世代のタンパク質データベース検索プログラム）， "Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．" ２５（１７）：３３８９〜４０２ [１９９７]、Ｚｈａｎｇ， Ｊ．， & Ｍａｄｄｅｎ， Ｔ．Ｌ．， ＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴ： ａ ｎｅｗ ｎｅｔｗｏｒｋ ＢＬＡＳＴ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ ｏｒ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ（ＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴ：相互作用または自動配列分析と注釈用の新ネットワークＢＬＡＳＴアプリケーション）， "Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．" ７（６）：６４９〜５６ [１９９７]、Ｍａｄｄｅｎ， Ｔ．Ｌ．，ら， Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｎｅｔｗｏｒｋ ＢＬＡＳＴ ｓｅｒｖｅｒ（ネットワークＢＬＡＳＴサーバのアプリケーション）， "Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．" ２６６：１３１〜４１ [１９９６]、 Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ．，ら， Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ（基本ローカルアライメント検索ツール）， "Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．" ２１５（３）：４０３〜１０ [１９９０]）。
生物学上機能的または活性ペプチド類似体もまた、クリプトウイルスタンパク質という用語に包含される。ペプチド「類似体」という用語は、１つ以上の残基が機能的に類似な残基で保存的に置換されて、天然クリプトウイルスタンパク質の生物活性を模倣する能力を呈示する、本願に特に示された配列と実質的に同一なアミノ酸残基配列を有する任意のポリペプチドを含む。
保存的置換の例は、イソロイシン、バリン、ロイシン、またはメチオニンのような一つの無極性（疎水性）残基の別の残基への置換、アルギニンとリジン間、グルタミンとアスパラギンの間、グリシンとセリンの間のような一つの極性（親水性）残基の別の残基への置換、リジン、アルギニン、またはヒスチジンのような１つの塩基性残基の別の残基への置換、あるいは、アスパラギン酸またはグルタミン酸のような一つの酸性残基の別の残基への置換を含む。
「保存的置換」という表現はまた、係るポリペプチドが必要な生物活性を呈示するならば、非誘導体化残基の代わりに化学的に誘導体化した残基の使用を含む。
【００４４】
「化学的誘導体」とは、側鎖官能基の反応によって化学的に誘導体化されている１つ以上の残基を有する対象ポリペプチドを意味する。係る誘導体化分子は、例えば、遊離アミノ基が誘導体化されて、アミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾオキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成するような分子を含む。遊離カルボキシル基は、誘導体化されて、塩、メチル及びエチルエステル、またはその他の種類のエステル類またはヒドラジド類を形成し得る。遊離ヒドロキシ基は、誘導体化されてＯ−アシルまたはＯ−アルキル誘導体を形成し得る。ヒスチジンのイミダゾール窒素は、誘導体化されてＮ−ｉｍ−ベンジルヒスチジンを形成する。２０の標準アミノ酸の天然アミノ酸誘導体を一つ以上含むペプチドも化学的誘導体に含まれる。例えば、４−ヒドロキシプロリンは、プロリンに置換され、５−ヒドロキシリジンは、リジンに置換され、３−メチルヒスチジンは、ヒスチジンに置換され、ホモセリンは、セリンに置換され、そしてオルニチンは、リジンに置換され得る。本発明のポリペプチドはまた、本願にその配列を表示する本発明のポリペプチド配列を基準にして、必要な生物活性が維持される限りは、１つ以上の残基の付加及び／または欠失を有する任意のポリペプチドを含む。
本発明はまた、（配列番号４）、（配列番号６）、（配列番号８）、（配列番号１０）、（配列番号１２）、（配列番号１４）、（配列番号１６）、（配列番号１８）、（配列番号２０）、（配列番号２２）、または（配列番号２４）によって指定されるクリプトウイルスタンパク質の変異体も包含する。「変異体」とは、指定のクリプトウイルスタンパク質のアミノ酸配列が、配列中にある１つ以上のアミノ酸の欠失、置換、付加、または転位によって修飾されているポリペプチドを意味する。変異体が生じる（例えば、組換えによる）または作成される（例えば、部位特異的突然変異誘発による）方法は、当該分野で公知である。
クリプトウイルスタンパク質はまた、当業者に公知である、１つ以上の標識を含むことができる。
本発明のタンパク質は、例えば、本願に記述の組換え発現系、沈降法、ゲル濾過、イオン交換、逆相及びアフィニティークロマトグラフィー、電気泳動等を含む、種々の公知の生化学的手段によって単離または精製される。その他のよく知られた方法は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒら， Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ． １８２（酵素学におけるタンパク質精製方法ガイド  第１８２巻）， （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， [１９９０]）に記述されている。
本発明の単離クリプトウイルスタンパク質はまた、化学的に合成することができる。例えば、合成ポリペプチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．（アプライドバイオシステム社） モデル４３０Ａまたは４３１Ａ 自動ペプチドシンセサイザー （Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ） を、製造元提供の化学と本願に提供されているアミノ酸配列を用いて産生することができる。一方、クリプトウイルスタンパク質は、天然細胞ソースから単離または精製され得る。他方、クリプトウイルスタンパク質は、適切なプロテアーゼを使用することによって、本発明のキメラタンパク質から単離することができる。
他方、クリプトウイルスタンパク質は、本願に記述するように本発明の方法に従って、クリプトウイルスタンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現するように遺伝的に修飾された真核または原核細胞によって産生され、組換えによって得ることができる。組換え法は公知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， 前述， １９８９）に記述されている。本発明のクリプトウイルスタンパク質を調製する手段の例は、目的のクリプトウイルスタンパク質をコードする核酸を、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、両生類細胞（即ち、卵母細胞）、または哺乳類細胞のような、本発明の発現ベクターを含む適切な宿主細胞中で、当該分野に公知の方法を用いて発現し、公知な方法を再度用いて、発現されたポリペプチドを回収することである。
【００４５】
「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞株」及び単細胞または単層実体として培養される原核または真核細胞株を指すその他の用語は、組換体発現ベクターまたはＤＮＡまたはＲＮＡのようなその他の外来核酸のレシピエントとして使用し得るか、あるいは使用された細胞を意味し、またトランスフェクトされた起源細胞の子孫を含む。天然、偶発性、作為突然変異のために、一つの親細胞は、その形態、ゲノムまたは全ＤＮＡ成分が元の親と完全に同一であるとは限らないことが理解されている。
本発明は、キメラタンパク質を含む。「キメラタンパク質」という用語は、天然では連鎖しない２つ以上の別々のタンパク質から抜き出されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを意味する。本発明では、「キメラタンパク質」は、非クリプトウイルスタンパク質またはポリペプチド部分に融合された、クリプトウイルスタンパク質、または修飾アミノ酸配列を有するその分岐型またはポリペプチド変異株を含むポリペプチドを示すために用いられる。キメラタンパク質は、大変便利なことには、一つのポリペプチド部分を５'末端そして別のポリペプチドを３'末端にコードし、この別々な部分が適切な宿主細胞中で発現され得る一つの翻訳領域内で結合される、融合遺伝子の発現によって産生される。ある実施形態では、クリプトウイルスタンパク質は、キメラタンパク質のカルボキシ末端に位置する。他の実施形態では、クリプトウイルスタンパク質は、キメラタンパク質のアミノ末端に位置する。
本発明のキメラタンパク質の、非クリプトウイルスタンパク質部分、あるいは「キメラパートナー」は、機能的酵素フラグメントであり得る。適切な機能的酵素フラグメントは、クリプトウイルスタンパク質に融合発現されると、定量可能な活性を呈示するポリペプチドである。代表的な酵素は、限定はされないが、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）、β−ラクタマーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、グルコースオキシダーゼ（ＧＯ）、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ（ｈＳＯＤ）、ウレアーゼ等を含む。これらの酵素は、簡単な比色分析の手段によって産生されたキメラタンパク質量を定量化することができるために便利である。他方、例えば、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ（ｈＳＯＤ）のような抗原タンパク質またはフラグメントを利用して、非クリプトウイルスタンパク質キメラパートナーに特異的な抗体を用いてキメラタンパク質を簡単に検出及び定量することが可能である。キメラタンパク質において、有用なキメラパートナーは、組換え宿主からの分泌を供給し、クリプトウイルスタンパク質のエピトープ（複数でもよい）の免疫反応性を増強し、あるいはクリプトウイルスポリペプチドの支持体またはワクチンキャリアへの共役を促進するアミノ酸配列を含む。（例えば、ヨーロッパ特許公報第１１６，２０１号、米国特許第４，７２２，８４０号、ヨーロッパ特許公報第 ２５９，１４９号、米国特許第４，６２９，７８３号を参照）。
本発明のクリプトウイルスタンパク質の実施形態は、免疫反応性ポリペプチドとして有用であり、クリプトウイルス特異抗体の産生のための使用を含む。「免疫反応性」とは、抗体または受容体がポリペプチド中に含まれる特異的なエピトープを認識するために、抗体及び／またはリンパ球抗原受容体と免疫学的に結合するポリペプチドの能力、あるいはペプチドが免疫原性であるための能力を意味する。「免疫原性」タンパク質は、アジュバントの有無に係わらず単独でまたはキャリアに結合して、細胞及び／または液性免疫応答を惹起するポリペプチドである。目的とする種々の単離クリプトウイルスタンパク質、またはクリプトウイルスタンパク質フラグメントの免疫原性は、一般的なスクリーニング法によって決定される。免疫反応性は、抗体結合、さらに詳しくは、抗体結合の動態、及び／または抗体が誘導されるエピトープを含む競合（複数でもよい）既知ポリペプチド（複数でもよい）を用いる結合の競合によって決定し得る。ポリペプチドが抗体と免疫反応性を有するか否かの決定方法は当該分野で公知である。免疫原性クリプトウイルスタンパク質の特に有用な例は、エンベロープタンパク質、即ち、Ｆ、Ｆ0、Ｆ2、Ｆ1、ＨＮ、並びに ＳＨタンパク質である。
本願に使用する際は、「エピトープ」とは、ポリペプチドの抗原決定基を言及する。エピトープは、エピトープに特有の空間配座にある３個のアミノ酸を含むことができる。エピトープは典型的には、少なくとも約５個のアミノ酸、さらに普通は少なくとも約８個のアミノ酸から約１０個、あるいはそれ以上のアミノ酸を含むようにマップされる。アミノ酸の空間配座を決定する方法は当該分野に公知であり、例えば、Ｘ線結晶学並びに二次元核磁気共鳴法を含む。
【００４６】
免疫原性クリプトウイルスタンパク質は、ワクチンの生産または製造に有用である。前述のように、クリプトウイルスはウイルスのパラミクソウイルス科ファミリーに属する。多数のワクチンが、このウイルスファミリーのウイルスに対してヒト及び家畜動物向けに開発されてきた。例えば、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、イヌジステンパーウイルス、イヌパラインフルエンザウイルスタイプ２、及びニューカッスル病（家禽）に対する有効なワクチンがある。これらのウイルスは、種向性が狭く（即ち、そのウイルスは一種のみあるいは数種のみを感染する）、唯一または一つの優先的な血清型として存在し（そのウイルスに対して普遍的保護性を有するワクチンを作製する）、宿主において有意な罹患率の原因となる（即ち、そのウイルスがヒト疾患の明らかな原因である）、並びにそれらのウイルスは汎発性である（即ち、世界的な懸念である）ために、有効なワクチン開発の対象となった。
クリプトウイルスは、他のファミリーメンバーと同様な理由でワクチン開発に適する。このウイルスの別々のソースに対して作製された過免疫ウサギ抗血清の交差中和能力が実証されており、このウイルスゲノムの極めて類似するヌクレオチド配列がウイルスの２つのソースから得られている（ＢＢＲ株及びニイガタ細胞関連株）。
本発明に従って、多価または単価ワクチンが、１つ以上のクリプトウイルスタンパク質に対して調製され得る。特に、限定はされないが、エンベロープタンパク質Ｆ、Ｆ0、Ｆ2、Ｆ1、ＨＮ、並びにＳＨタンパク質のような１つ以上のクリプトウイルスタンパク質を含むワクチンが考案されている。免疫原性ポリペプチドを活性成分として含有するワクチンの製造方法は、当業者には公知である。典型的には、係るワクチンは、クリプトウイルスタンパク質（複数でもよい）を液状溶液または懸濁液のいずれかとして含む注射可能な組成物として調製され、注射前に液体で溶液とするかあるいは懸濁液とするために適する固形形態で調製されてもよい。調製物はまたエマルジョン、あるいはリポソーム中にカプセル化したタンパク質でもよい。活性免疫原性成分は典型的には、薬剤として認容性があり、活性成分と適合性がある賦形剤と混合される。適切な賦形剤またはキャリアは、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等及びそれらの組み合わせである。さらに、所望するならば、ワクチンは湿潤剤または乳化剤のような補助物質、ｐＨ緩衝剤、及び／またはワクチンの有効性を増強するアジュバントを少量含んでもよい。
有効であり得るアジュバントの例は、限定はされないが、以下を含む：水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−テロニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ  １１６３７、ｎｏｒ−ＭＤＰと呼ぶ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１−２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ  １９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと呼ぶ）、並びに細菌から抽出された３つの成分である、モノホスホリルリピドＡ、トレハローズジミコラート、及び細胞壁骨格（ＭＰＬ+ＴＤＭ+ＣＷＳ）を含むＲＩＢＩ含有２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ８０エマルジョン。特定のアジュバントの有効性は、免疫原性クリプトウイルスタンパク質をアジュバントと共に含むワクチンを投与する結果として、本タンパク質に対して誘導される抗体量を測定することによって決定され得る。
タンパク質は、中性または塩の形状でワクチン中に製剤化され得る。薬剤認容性塩は、酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基で形成される）、及び、例えば、塩酸またはリン酸のような無機酸、あるいは、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸等のような有機酸によって形成されるものを含む。遊離カルボキシル基で形成される塩はまた、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化第二鉄のような無機塩基、及び、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基に由来し得る。
【００４７】
ワクチンは従来は非経口的に注射、例えば、皮下または筋肉内によって投与されるが、鼻内、腸内、あるいは任意のその他の送達ルートによっても送達されてもよい。投与にアジュバント使用の有無は問わない。その他の非注射投与モードに適するワクチン組成物のその他の製剤は、坐薬及びある場合は経口製剤を含む。坐薬用の、従来の結合剤及びキャリアは、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドを含んでもよく、係る坐薬は、活性成分を０．５％〜１０％、好ましくは１％〜２％の範囲で含有する混合物から形成され得る。経口製剤は、例えば、製薬グレードのマンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような通常利用される賦形剤を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸薬、カプセル、カプレット、徐放性製剤または粉末の形態をとってよく、典型的には活性成分を１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％含有する。
上記の他に、弱毒化微生物、例えば、突然変異型クリプトウイルス粒子を含む弱毒化または非病原性ウイルス粒子、及び１つ以上のクリプトウイルスタンパク質をコードする本発明の組換え核酸を含むその他の弱毒化ウイルス粒子、または本願に記述するような、本発明の発現ベクターによってコードされた組換え型クリプトウイルスタンパク質を発現する宿主細胞から成る生ワクチンを製造することが可能である。適切な弱毒化微生物は当該分野で公知であり、例えば、ウイルス（例えば、ワクチニアウイルス）並びに細菌を含む。
他方、死菌クリプトウイルス粒子またはビリオン、またはクリプトウイルスエンベロープタンパク質を担う死菌シュードタイプウイルス粒子またはビリオンは、ワクチンの製造に有用である。ビリオンは、公知方法によって、ワクチン目的に死菌される。
ワクチンは、投与量処方に適合し、予防及び／治療的に有効であるような量が投与される。投与量は、一般的には一用量あたり約５μｇ〜約２５０μｇの範囲であるが、ワクチン接種される対象、抗体を合成するための対象の免疫力、及び所望する保護の度合いに基づく。投与されるべき活性成分の正確な量は医者の判断に拠り、ワクチンを受ける各動物またはヒトに特有であり得る。齧歯類、ウサギ類、ヤギ、ブタ、ウシ、ヒツジ、及び霊長類を含む、特に哺乳類種のメンバーである、任意の適切な脊椎動物はワクチン接種され得る。
ワクチンは、単一投与スケジュール、あるいは好ましくは複数回投与スケジュールで接種され得る。複数回投与スケジュールは、ワクチン接種の主要な経過が、１〜１０の別々の用量によるものであり、免疫応答を維持及び／または強化するために必要とされる時間間隔で、例えば、第二投与は１〜４ヶ月目、必要であれば、数ヶ月後に後続投与（複数でもよい）を行うものである。用法はまた、少なくとも部分的には、ワクチン接種を受ける個々の動物またはヒトの免疫学的特徴並びにニーズによって決定されるのもであり、医師の判断に拠らなければならない。
さらに、前述のクリプトウイルスタンパク質を含有するワクチンは、例えば、免疫グロブリンのような、その他の免疫調節剤と併用して投与してもよい。
本発明の組成物は、その後多数の適応に使用することのできる、ポリクローナル抗体（従来の方法を用いて血清から精製または単離される）を生成するために、個々の動物またはヒトに投与し得る。例えば、ポリクローナル抗体は、動物またはヒトを受動免疫するため、または以下に説明するように、免疫化学用試薬として使用することができる。
本発明はまた、クリプトウイルスＮＰ、Ｖ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、Ｆ0、Ｆ2、Ｆ1、ＳＨ、ＨＮ、またはＬ タンパク質のような、クリプトウイルスタンパク質を特異的に結合する単離抗体に関連する。「抗体」という用語は、少なくとも一つの抗体結合ドメインから成るポリペプチドまたはポリペプチド群を意味する。「結合ドメイン」は、抗体分子の可変ドメインの折り畳みによって形成され、抗原のエピトープの特徴に相補性のある内部表面形態と電荷分布を有する三次元結合空間を形成し、これが抗原との免疫反応を可能にする。抗体結合ドメインは、抗原結合の原因となる超可変ループを形成する、Ｈ鎖及び／またはＬ鎖ドメイン（それぞれＶHとＶL）から形成され得る。典型的な脊椎動物の抗体はテトラマーであるか、その凝集体であり、典型的にＹ型立体配置に凝集され、鎖間に共有結合を有していることもあれば、有していないこともある、Ｌ鎖とＨ鎖を含む。脊椎動物の抗体では、ある特定の抗体の全鎖のアミノ酸配列は、インビボまたはインビトロでその抗体を産生するリンパ球（例えば、ハイブリドーマ）によって産生された一つの抗体中に発見される鎖と相同である。
【００４８】
「単離された」抗体は、例えば、ポリクローナル抗体であり、それを産生する動物またはヒトの身体から取り出された抗体である。本発明のポリクローナル抗体は、例えば、血液、リンパ、または乳のような細胞材料からさらに精製することができる。好ましい実施形態は、１つ以上のクリプトウイルスタンパク質に対して誘導された抗血清の形態である。他方、本発明の「単離」抗体は、その産生が、例えば、モノクローナル抗体またはキメラ抗体のように、操作またはヒトの介入を伴う抗体を含む。
本発明の「抗体」は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ、あるいは特定のクリプトウイルスエピトープを結合する抗体フラグメントを含む、任意の免疫グロブリンを含む。係る抗体はまた、当該分野に公知のハイブリドーマ、化学合成、または組換え法によって産生され得る。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （第二版）（分子クローニング：実験マニュアル）（第二版）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＵＳＡ [１９８９]）、Ｈａｒｌｏｗ と Ｌａｎｅ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （抗体：実験マニュアル）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ [１９８８]）。抗クリプトウイルスタンパク質及び抗キメラタンパク質抗体のどちらも本発明の範囲において有用であり得る。（Ｂａｈｏｕｔｈら， "Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｓｃｉ．" １２：３３８ [１９９１]、ＡｕｓｕｂｅｌらＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ  （分子生物学における現代のプロトコル） （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， ＮＹ [１９８９]）。キメラ抗体の例は、米国特許番号４，８１６，３９７号及び第４，８１６，５６７号に説明されている。蛍光標識抗体、酵素結合抗体、あるいは、当該分野で公知であるように、別の方法で検出機能が標識されている抗体が、「抗体」にまた含まれる。
「抗体」はまた「キメラ抗体」も含む。キメラ抗体は、Ｈ鎖及び／またはＬ鎖がキメラタンパク質である抗体である。典型的には、この鎖の定常ドメインは一つの特定の種及び／またはクラスに由来し、そして可変ドメインは別の種及び／またはクラスに由来する。Ｈ鎖またはＬ鎖のいずれかまたは両方が、そのソースが異なるクラス、あるいは起源の異なる種であろうが、融合点が可変／定常境界である如何に関わらず、異なるソースの抗体配列を模倣する配列の組み合わせによって構成される。したがって、定常及び可変領域のいずれも既知抗体配列を模倣しない抗体を産生する可能性がある。そこで、例えば、その可変領域がある特定の抗原に高特異的親和性を有するか、あるいはその定常領域が、補体固定の増強を誘導できる抗体を構築すること、または特定の定常領域が所有する特性のその他の改善を行うことが可能になる。
抗体のＦａｂ及びＦ（ａｂ’）2フラグメントもまた「抗体」の定義に含まれる。「Ｆａｂ」領域は、Ｈ及びＬ鎖の枝分かれ部分を含む配列に対して、おおよそ等価、または類似である、そして特定の抗原に対する免疫結合を呈示しているが、エフェクターＦc部分を欠如する、Ｈ及びＬ鎖の部分を意味する。「Ｆａｂ」フラグメントは、一本のＨ鎖と一本のＬ鎖の凝集体である。同様にエフェクターＦc部分を欠如するＦ（ａｂ'）2フラグメントは、指定された抗原または抗原ファミリーと選択的に反応することができる、二本のＨ鎖と二本のＬ鎖を含むテトラマー（四量体）である。抗体の「Ｆａｂ」及びＦ（ａｂ’）2フラグメントを産生する方法は、当該分野で公知であり、例えば、タンパク質分解、及び組換え法による合成を含む。したがって、本発明の抗クリプトウイルス抗体はまた、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）2フラグメントでもあり得る。
ＶHドメインから構成される抗体であり、クリプトウイルス抗原と免疫反応する「単ドメイン抗体（ｄＡｂ）」もまた有用である。ｄＡＢは、ＶLドメインを含まないが、例えば、カッパ及びラムダドメインのような抗体に存在することが公知のその他の抗原結合ドメインを含み得る。ｄＡＢの調製方法は、当該分野で公知である（例えば、Ｗａｒｄら， "Ｎａｔｕｒｅ" ３４１： ５４４ [１９８９]を参照）。
【００４９】
その他の好ましい実施形態は、ヒト化、ＣＤＲグラフトまたは二機能性、即ち、二価抗体、のような修飾抗体を含み、その総てをまた当該分野に公知の方法によって産生することができる。「修飾抗体」とは、脊椎動物における天然アミノ酸配列が変異されている抗体を意味する。組換えＤＮＡ技術を利用して、望ましい特性を獲得するために抗体を再設計することができる。可能な変異は多数あり、そして１つ以上のアミノ酸の変更から、例えば定常領域のような領域の完全な再設計まで及ぶ。定常領域における変化は、一般的には、所望の細胞プロセス特性、例えば、補体固定、膜との相互作用、並びにその他のエフェクター機能の変更、を得るために行われる。可変領域における変化は、抗原結合特性を修飾するために行われることがある。抗体はまた、特定の細胞または組織部位への分子または物質の特異的送達を補助するために設計され得る。望ましい修飾は、分子生物学、例えば、組換え法、部位特異的突然変異誘発等、における公知技術によって作製し得る。
本発明の抗体の好ましい実施形態は、前述のクリプトウイルスエンベロープタンパク質を特異的に結合する。本発明の抗体の他の好ましい実施形態は、クリプトウイルスヌクレオカプシドタンパク質をに特異的に結合するが、他のどのクリプトウイルスタンパク質を特異的に結合する抗体もまた有用であり好ましい。
本発明の抗体は、なかでもとりわけ、診断またはアッセイ方法及び生物材料サンプル中に存在するクリプトウイルスタンパク質を検出するために使用できる。係るポリペプチドの検出に関して、抗体は、インビトロ診断またはアッセイ方法、あるいはインビボイメージング法に使用できる。係る抗体はまた、本発明のクリプトウイルスタンパク質の免疫アフィニティーまたはアフィニティークロマトグラフィー精製にも使用できる。
本発明は、生物材料サンプル中におけるクリプトウイルスタンパク質の存在の有無のインビトロ検出法を含む。この方法は、特に、しかし独占的というわけではなく、診断または病理学的目的の、臨床または実験用生物材料の検査に有用である。
サンプルは、本願に記述する本発明の抗体と接触され、サンプルの構成要素に対する抗体の特異的結合を検出するために、公知の免疫学的方法が用いられる。特異的結合の存在は、サンプル中にクリプトウイルスタンパク質が存在することを指示する。
サンプル中の標的クリプトウイルスタンパク質のインビトロ検出に有用な免疫学的方法は、検出可能な形態にある本発明のクリプトウイルスタンパク質特異抗体を利用する免疫アッセイ系を含む。
係る免疫アッセイ法及び系の既知プロトコルは、例えば、競合、または直接反応、またはサンドイッチタイプアッセイに基づく。係る免疫アッセイ法及び系は、例えば、当該分野に公知である、ＥＬＩＳＡ、免疫ブロット、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）、パンデックスマイクロ蛍光定量アッセイ、凝集アッセイ、フローサイトメトリ、血清診断アッセイ及び免疫組織化学染色法を含む。
抗体は、当該分野に公知の種々の手段によって検出可能に作製することができる。一次抗体−抗原複合体からのシグナルを増幅するアッセイ系もまた知られており、その例は、ビオチンとアビジン、並びにＥＬＩＳＡアッセイのような、酵素標識と介在型免疫アッセイを利用するアッセイである。検出マーカーは、このアッセイプロトコルでは、一次または二次抗体に直接または間接的に連結することができる。有用なマーカーは、例えば、放射性核種、酵素、フルオロゲン（蛍光原）、色素原、及び化学ルミネッセント標識を含む。実施形態は、固体支持体マトリックスを利用したり、または免疫沈降法を含む。
これらの同一免疫アッセイ法と系は、抗体を含有する生物材料中におけるクリプトウイルス特異性抗体の有無を検出する本発明の方法に利用することができる。抗体を含有する生物材料は、限定はされないが、全血及び血液成分、血漿、血清、髄液、リンパ液、呼吸器、腸、及び尿生殖路の外部切片、涙、唾液、乳、白血球、及び骨髄腫を含む。プロセスされた抗体含有画分またはこれらのいずれかの希釈液はまた、抗体を含有する生物材料と見なされる。
【００５０】
クリプトウイルス特異抗体の存在の有無を検出する方法の一つの好ましい実施形態は、クリプトウイルスに感染していると疑われる個体由来のサンプルを、本願に説明するように、ウイルスビリオンまたは１つ以上のクリプトウイルスエンベロープタンパク質を含むウイルス粒子に接触させて、クリプトウイルス抗原を選択的に結合する抗体が存在する場合は、抗体結合複合体が形成することを含む。次に、かくして形成された任意の抗体が結合したクリプトウイルス抗原複合体は、抗ヒト抗体を結合する免疫グロブリンまたは、例えば、Ｆａｂ及び／またはＦ（ａｂ’）2フラグメントのような、抗ヒト抗体を結合するフラグメントに接触され、そして免疫グロブリンまたはそのフラグメントと抗体が結合したクリプトウイルス複合体との複合体形成が可能となる。複合体が形成されたか否かは、本願に記述のような公知の免疫検出手段のいずれかを用いて検出される。係る複合体の存在は、サンプル中にクリプトウイルス抗原を選択的に結合する抗体が存在することを示す。
他のさらに好ましい実施形態は、クリプトウイルスに感染していると疑われる個体由来のサンプルを、本発明のクリプトウイルスエンベロープタンパク質に接触させ、クリプトウイルスを選択的に結合する抗体が存在する場合には、抗体が結合したエンベロープタンパク質複合体が形成される。かくして形成された任意の抗体が結合されたエンベロープタンパク質複合体は、次に抗ヒト抗体を結合する免疫グロブリンまたはＦａｂ と Ｆ（ａｂ'）2フラグメントのような抗ヒト抗体を結合するフラグメントと接触される。免疫グロブリンまたはそのＦａｂ及びＦ（ａｂ’）2フラグメントと抗体が結合したエンベロープタンパク質複合体との複合体の形成が可能となり、かくして形成された抗体結合エンベロープタンパク質複合体の存在の有無が検出される。係る複合体の存在は、クリプトウイルスを選択的に結合する抗体がサンプル中に存在することを示す。
クリプトウイルスタンパク質またはクリプトウイルス抗原に対する抗体の「選択的」または「特異的」な結合という用語は、ＳＶ５のような密接に関連するルブラウイルスとの非対称性交差反応性結合を含むが、非関連性抗原または表面に対する非特異的結合は含まない。当業者は、非特異抗体結合を決定するための免疫アッセイ系に含まれることが好ましい重要なコントロールについて認識している。典型的には、例えばＥＬＩＳＡにおいては、非特異的結合のバックグラウンドレベルが決定され、基線として用いられる。
「複合体形成」とは、抗体のようなタンパク質が、複合体−即ちその他の構成要素間の化学的結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）または結合（ｂｏｎｄｉｎｇ）の結果生じる混合物または付加物−の構成要素またはメンバーであることを意味する。化学的結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）または結合（ｂｏｎｄｉｎｇ）は、共有結合、イオン結合、水素結合、疎水結合である性質、または、種々なタイプからなる成分を一つまたは多数を有する可能性のある、複合体の構成要素を任意の部分または成分で結合するこれらの結合タイプの任意の組み合わせを有することができる。抗体−抗原結合は典型的には非共有結合である。複合体の全ての構成要素が全てのその他の構成要素と結合する必要はないが、各構成要素は少なくとも複合体の一つの構成要素と少なくとも一つの化学的結合を有する。例えば、アッセイ系における二次抗体は、クリプトウイルス抗原、またはウイルス粒子またはビリオンに直接的に結合しないこともあるが、それと複合体を形成している。
ヒト患者におけるクリプトウイルス感染を検出するための臨床診断用実施形態のさらなる非限定例として、患者からの血清検体を、クリプトウイルス特異抗体について、ＥＬＩＳＡ、放射性免疫沈降法、免役ブロット法、または任意のその他の免疫学的方法（例えば、直接または関節蛍光抗体法、免役ビーズ等）によって、ウイルスの主要エンベロープタンパク質（Ｆ0とＨＮ）に対してスクリーンする。オプションとして、他の血液サンプルを任意の血清陽性の個体から得る。ウイルスは、細胞を適切な勾配培地上で単離し、サイクリックＧＭＰの存在下で細胞を培養し、次に（１）クリプトウイルス特異的蛍光抗体を伴う細胞内クリプトウイルス特異的封入体について細胞をスクリーニングすること、または（２）クリプトウイルス特異的ヌクレオチドプライマーを用いて誘導されたＰＢＭＮＣのＰＣＲ増幅を行うこと、のいずれかによって、係るサンプルのＰＢＭＮＣ中に検出することができる。
【００５１】
クリプトウイルス特異抗体は、血清陽性個体の血清中に発見され、現在あるいは過去のクリプトウイルス感染を指摘するが、これらの抗体は必ずしもテンカン様または脳疾患の兆候ではない。クリプトウイルスは、必ずしも脳疾患を起因することなく、かなりの割合の個体のＰＢＭＮＣ中に感染または存在していると思われる。これらの個体は、明白に無症候性であると考えられる。ウイルスの神経病理学的（例えば、テンカン様、脳性、及びその他の神経学的、神経変性、及び／または神経精神医学的疾患）潜在能力は、ウイルスが神経系組織を感染した個体においてのみ顕在化するように思われる。結局、脳脊髄液（ＣＳＦ）中に発見されたクリプトウイルス特異抗体のみ（即ち、ウイルスの主要エンベロープタンパク質、ＦとＨＮに対して誘導されたもの）が、神経学的、神経変性、及び／または神経精神医学的疾患の完全な兆候であり、したがって、それらは実質的に常に兆候である。さらなる例として、顕著な短期記憶喪失を伴う慢性疲労症候群であることが過去に診断され、ＣＳＦサンプルを得ることのできた１０人のヒト患者は、その全員がＣＳＦ中にクリプトウイルス特異抗体、並びに欠神テンカン（即ち小発作性テンカン）の診断と一貫する脳波プロファイルを有することが見いだされている。
本発明はまた、特に抗体を含有する生物材料において、生物サンプルの検査またはアッセイに有用である、抗クリプトウイルス抗体検出キットに関する。したがって、本発明のキットは、ヒト血液、血清、血小板、血漿、組織及び臓器である臨床用サプライを、輸血または移植目的でその安全性を判定するためのスクリーニングに有益である。本発明のキットの診断への適用もまた有用である。
本発明のキットは、クリプトウイルス及びその抗原を選択的に結合する抗体を検出するための本発明のアッセイ法及びクリプトウイルス特異抗体の存在の有無についての本発明による検出方法を実施するために特に有用である。いくつかの好ましい実施形態では、このキットは、（配列番号１）と完全相補なヌクレオチド配列を有するゲノムを含む、単離クリプトウイルス粒子を含む。キットは、標識抗ヒト抗体を結合する抗体、好ましくは抗ヒト免疫グロブリン、または、Ｆａｂ及び／またはＦ（ａｂ’）2のような、標識抗ヒト抗体を結合する抗体フラグメントを含む。キットの好ましい実施形態は、さらにクリプトウイルス粒子（複数でもよい）を支持するための固体マトリックスを含む。好ましい実施形態では、抗クリプトウイルス抗体検出キットにおけるクリプトウイルス粒子は、クリプトウイルスビリオンであり、好ましい実施形態では、クリプトウイルスビリオンは、急性感染仔ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞由来細胞株、Ｖｅｒｏ由来細胞株、またはＣＶ−１−由来細胞株（例えば、ＣＶ−１c由来細胞株、以下に説明、ＡＴＣＣ受託番号（）として寄託）のような急性クリプトウイルス感染細胞株から産生される。
一方、クリプトウイルス粒子を含まない本発明の抗クリプトウイルス抗体検出キットの最も好ましい実施形態では、キットは、前述のように、複数の一つ以上の種類の単離クリプトウイルスタンパク質及び／またはクリプトウイルスタンパク質成分を含むキメラタンパク質を含む。いくつかの好ましい実施形態では、クリプトウイルスタンパク質またはタンパク質成分は、本願に説明するように、エンベロープタンパク質である。係る実施形態はまた、抗ヒト免疫グロブリンのような、標識抗ヒト抗体を結合する抗体または、Ｆａｂ及び／またはＦ（ａｂ’）2フラグメントのような、標識抗ヒト抗体を結合する抗体フラグメントを含む。係るキットの好ましい実施形態は、さらにクリプトウイルスタンパク質を支持するための固体マトリックスを含む。
固体マトリックス、または支持体、並びに固体マトリックスにウイルス粒子及びタンパク質を付着または吸収する方法は当該分野で公知である。本発明のキットに従って、「固体マトリックス」という用語は、ウイルス粒子またはタンパク質が固定または接着することができる任意の固体または半流動体支持体または表面を含む。適切な支持体は、ガラス、プラスチック、金属、ポリマーゲルなどを含み、ビーズ、ウェル（単一、複数ウェル血清プレート）スライド、ディップスティック、膜などの形態をとる。
【００５２】
例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、またはサンドイッチタイプアッセイのようなキットを使用する当業者には公知であるように、至適に可溶化または懸濁の上、至適に希釈した生物サンプルは、典型的には固体マトリックス（例えば、血清プレートのウェル）表面に支持されたウイルス粒子またはタンパク質と接触され、そして適切な洗浄とインキュベーションの後、さらに標識抗ヒト抗体と結合する免疫グロブリンまたは標識抗ヒト抗体と結合するフラグメントに接触される。さらなる洗浄後、クリプトウイルス粒子またはタンパク質と結合したヒト抗体に結合された抗ヒト抗体複合体の形成を検出するために、市販のプレートリーダー及び／またはその他の付属検出機器を、典型的には本発明のキットと併用する。
使用説明書はキットに含まれる。「使用説明書」は、典型的には、本願に説明するような特定の本発明のアッセイ方法における、試薬濃度または、混合されるべき試薬とサンプルの相対量、試薬／サンプル混合物の維持期間、温度、バッファー条件、インキュベーション、洗浄などのような少なくとも一つのアッセイ方法パラメーター、典型的には用途を説明する具体的な表現を含む。
オプションとして、キットはまた、希釈剤、緩衝液、またはその他の認容性のあるキャリア、検体容器、シリンジ、ピペットまたは計量ツール、濃縮、沈降、または分画サンプル用装置、またはコントロールに使用するための本発明の抗体のようなその他の有用な成分を含む。
キットにアセンブルされた材料と成分は、操作性と有用性を保つ便利で適切な方法で格納されて、医師に提供され得る。例えば、成分は、溶解、脱水、または凍結乾燥形態で、室温、冷蔵、または冷凍温度で提供され得る。
成分は典型的には、適切な包装材（複数でもよい）中に含まれる。本願で使用する際は、「包装材」という表現は、キットの内容物を収納するために使用される１つ以上の物理的構造物を意味する。包装材は公知の方法によって構築され、好ましくは滅菌、不純物を含まない環境を提供する。
キットで使用される包装材は、ウイルス及びペプチド系で通常利用されるものである。本願で使用する際は、「包装」という用語は、ガラス、プラスチック、紙、フォイル等のような、個々のキット成分を保持することが可能である、適切な固体マトリックスまたは材料を意味する。したがって、例えば、包装はウイルスまたはペプチド成分を含む本発明の組成物の適量を収容するために用いられるガラス製バイアルであり得る。包装材は一般的には内容物、容量、及び／またはキットの目的及び／またはその成分を表示する外部ラベルを有する。
したがって、本発明は、研究、臨床診断、及び輸血または移植を目的とする血液、血液成分または製品、並びに組織と臓器のスクリーニングに有用な免疫アッセイ法とキットを提供する。これらの使用は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＮＣ）がクリプトウイルスを潜伏し、係る汚染血液、血液製品、組織、または細胞を投与された患者において感染して疾患を起こす可能性があるために、極めて価値と有用性がある。
本願に先述する、生物材料サンプル中におけるクリプトウイルス特異的ＲＮＡの存在の有無を検出するための本発明の方法はまた、これら並びにその他の目的に特に有用である。本方法の最も好ましい実施形態に従って、クリプトウイルスＲＮＡは、核酸セグメントを増幅する数多くの既知方法のいずれかによってＲＮＡまたはｃＤＮＡの形態に増幅される。増幅前に、必須ではないが、サンプル中のＤＮＡからＲＮＡを抽出または分離し、そしてＤＮＡから分離されたサンプルのその分画に残存する核酸を増幅することが好ましい。増幅産物は、もしあるとすれば、次にクリプトウイルス特異的増幅産物が存在することを検出するために分析される。クリプトウイルス特異的増幅産物が存在する場合、その所見はサンプル中にクリプトウイルスＲＮＡが存在することの表れである。陰性（即ち、クリプトウイルス特異的増幅産物が検出されない）の解釈を信頼度を高めるため、細胞ハウスキーピング遺伝子、例えば、βアクチン、ホスホフルクトキナーゼ（ＰＦＫ）、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ、またはホスホグリセリン酸キナーゼをコードする遺伝子、に特異的なｍＲＮＡのコントロール増幅後にオプションとして分析が行われる。
【００５３】
サンプル中のＲＮＡは、適切な増幅法によって増幅される。例えば、好ましい実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ-ＰＣＲ）が、クリプトウイルス特異的核酸の増幅に利用される。簡単に言えば、増幅プロセスには、ｃＤＮＡを増幅してクリプトウイルス特異的増幅産物を産生するために、サンプル中のクリプトウイルス特異的ＲＮＡ鋳型からクリプトウイルス特異的ｃＤＮＡを転写するための逆転写酵素、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）の２つの酵素、並びにクリプトウイルス特異的プライマーが使用される。制限サイクルＰＣＲの使用は、半定量的な結果を生じる。（例えば、 Ｇｅｌｆａｎｄら， Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ-ｈｉｇｈ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ （耐熱性ＤＮＡポリメラーゼによる逆転写−高温逆転写）， 米国特許番号第 ５，３１０，６５２号、５，３２２，７７０号、Ｇｅｌｆａｎｄら， Ｕｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｉｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ＲＴ-ＰＣＲ  （温度選択性ＲＴ−ＰＣＲにおける従来とは異なるヌクレオチド置換）， 米国特許番号第 ５，６１８，７０３号）。
本発明の方法の他の好ましい実施形態では、単一酵素ＲＴ−ＰＣＲがクリプトウイルス特異的核酸の増幅に利用される。単一反応で逆転写とポリメラーゼ機能のどちらも実行する一つの酵素が今では存在する。例えば、パーキンエルマー組換え型高度好熱菌（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（ｒＴｔｈ）酵素（ロシュ分子（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ））、あるいはその他の同様な酵素が市販されており入手可能である。パーキンエルマーＡＢＩプリズム７７００（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００）、いわゆるライトサイクラー（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）のようなサイクリング機器及び／またはその他の同様な機器がＲＴ−ＰＣＲの実行に有用である。オプションとして、例えば、ｒＴｔｈ酵素を利用する単一酵素ＲＴ−ＰＣＲテクノロジーをＰＣＲ系において使用することができる。
例えば、ＲＴ−ＰＣＲ検査はウイルス検出に極めて感受性がある。例えば、ＲＴ−ＰＣＲプライミング法は、（培養、サイクリックＧＭＰ誘導、及び継代培養することなく）非増殖的にウイルスを潜伏しているＰＢＭＮＣにおける検出可能なクリプトウイルス運搬率を１：１０5  ＰＢＭＮＣの次数で確認するために使用される。さらに、クリプトウイルスゲノムの数多くのフラグメントが、クリプトウイルス特異的プライマーとＲＴ−ＰＣＲ増幅法を用いてＡＶ3／ＳＳＰＥ からクローン化されている。
好ましくは、増幅と分析は、サンプルからＲＮＡを自動的に抽出し、次にＰＣＲを実施し、そしてＴａｑＭａｎまたは分子標識プローブのようなプローブを用いて増幅産物の蛍光検出が後続する、自動化様式で実行される。典型的には、この計測手段は、さらなる増幅または分析ステップなしに、ＰＣＲ中、または直後に定量的分析結果を提供するソフトウェアを含む。
他の好ましい実施形態では、クリプトウイルス特異的核酸を増幅するためにｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ-ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ （ＴＭＡ）法（転写増幅法）が利用される。（例えば、 Ｋ． Ｋａｍｉｓａｎｇｏら， Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｂｙ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ-ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ  （転写増幅及びハイブリダイゼーション保護アッセイによるＢ型肝炎ウイルスの定量的検出）， "Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．" ３７（２）：３１０〜１４ [１９９９]、Ｍ． Ｈｉｒｏｓｅら， Ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｍｅａｓｕｒｅ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ-ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ  （転写増幅及びハイブリダイゼーション保護アッセイによるテロメラーゼ活性測定の新方法）， "Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ．" ４４（１２）２４４６〜５２ [１９９８]）。ｃＤＮＡの増幅にＲＴ−ＰＣＲを使用するよりはむしろ、ＴＭＡはクリプトウイルス特異的（標的配列）ＲＮＡを認識するプローブを使用し、後続するステップにおいては、プローブ中にビルトインされたプロモーター配列から、ＲＮＡポリメラーゼは反復してｃＤＮＡ中間体を転写し、実質的にオリジナルＲＮＡ転写物を増幅して、ＲＴ−ＰＣＲの感受性に近いレベルで新コピーが作出される。この反応は、ＰＣＲのように異なる温度を通じてサイクリングするよりはむしろ、等温（一つの温度）で行われる。
【００５４】
その他の有用な増幅法は、ＲＴ−ＰＣＲと同様な有用性を持つ、逆転写酵素介在性リガーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＬＣＲ）を含む。ＲＴ−ＬＣＲは、逆転写酵素がｍＲＮＡからｃＤＮＡを生成し、次にＤＮＡリガーゼが、標的ｃＤＮＡに結合後に隣接する合成オリゴヌクレオチドを結合する。
最も好ましくは、サンプル中にあるクリプトウイルス特異的核酸セグメントの増幅は、本願に説明するように、本発明のクリプトウイルス特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いて達成し得る。
オプションとして、ハイスループット分析は、例えば、さらなる診断情報を得るために、クリプトウイルス特異的核酸のみならず、ハウスキーピング遺伝子（コントロール）またはその他の診断マーカー候補の発現産物を増幅するように誘導されたプライマーのような複数のプライマーセットを用いて、当該分野に公知のマルチプレキシング技術によって達成し得る。（例えば、 Ｚ． Ｌｉｎら， Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ａｔ ａ ｌａｒｇｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｇｅｎｅ ｌｏｃｉ  （多数遺伝子座におけるマルチプレックス遺伝子型決定）， "Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．" ＵＳＡ ９３（６）：２５８２〜８７ [１９９６]、Ｄｅｍｅｔｒｉｏｕら， Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｐｒｏｂｅ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｌｉｖｅｒ ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ  （肝臓新生物疾患に関連する遺伝子検出のための方法並びにプローブ）， 米国特許番号第 ５，８６６，３２９号）。
ハイブリダイゼーション分析は、クリプトウイルス特異的核酸増幅産物の存在の有無を検出するための増幅産物分析の好ましい方法であり、相補ヌクレオチド配列を含む一本鎖クリプトウイルス特異的核酸増幅産物と、適切なストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする、１つ以上のクリプトウイルス特異的プローブ（複数でもよい）を用いる。増幅産物は典型的には、セルロースまたはニトロセルロース膜のような基質上に沈着され、次にオプションとして電気泳動後に、標識クリプトウイルス特異的プローブ（複数でもよい）でハイブリダイズされる。従来のドットブロット、サザン、ノーザン、または蛍光インサイツ（ＦＩＳＨ）ハイブリダイゼーションプロトコル、インリキッド・ハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション保護アッセイ、またはその他の半定量あるいは定量ハイブリダイゼーション分析法は通常は、本発明のクリプトウイルス特異的プローブと併用される。当業者には容易に理解されるように、係る分析用ハイブリダイゼーション法及びその他（例えば、ノーザンブロッティング）は、増幅ステップ（複数でもよい）を含まない、生物材料サンプル中におけるクリプトウイルス特異的ＲＮＡの存在の有無の検出するための本発明による方法のその他の実施形態に応じて有用である。これらの実施形態では、本発明のクリプトウイルス特異的プローブは、ハイブリダイゼーション分析を行うために、サンプル中でＲＮＡに直接に接触される。
【００５５】
他方、増幅産物の分析または検出用の電気泳動は、従来のスラブまたはキャピラリ電気泳動から成る様々な方法のいずれかを用いて、迅速かつ高感度で実行され、医者はオプションとして、限定はされないが、放射性核種、ＵＶ吸光度、レーザー誘導蛍光を含む核酸フラグメント検出の任意の補助手段を使用することを選択することができる。（Ｋ． Ｋｅｐａｒｎｉｋら， Ｆａｓｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ （ＣＡ）１８ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｒｅｐｅａｔ ｉｎ ｔｈｅ ＩｇＥ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ ｂｙ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｗｉｔｈ ｌａｓｅｒ-ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（レーザー誘導蛍光検出法を併用するキャピラリ電気泳動によるＩｇＥ受容体遺伝子における（ＣＡ）１８マイクロサテライト反復の迅速な検出）， "Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ" １９（２）；２４９〜５５ [１９９８]、Ｈ． Ｉｎｏｕｅら， Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｂｙ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｓｔｅｐｗｉｓｅ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｏｆ ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｉｅｌｄ ｓｔｒｅｎｇｔｈ（電場強度のステップワイズ勾配を用いるキャピラリ電気泳動によるＤＮＡ配列産物分離の増強）， "Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ａ．" ８０２（１）：１７９〜８４ [１９９８]、Ｎ．Ｊ． Ｄｏｖｉｃｈｉ， ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（キャピラリ電気泳動によるＤＮＡ配列決定）， "Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ" １８（１２-１３）：２３９３〜９９ [１９９７]、Ｈ． Ａｒａｋａｗａら， Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ-ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｂｙ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｗｉｔｈ ｌａｓｅｒ ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（レーザー誘導蛍光検出法を併用するキャピラリ電気泳動による単鎖構造多形性の分析）， "Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ａｎａｌ．" １５（９〜１０）：１５３７〜４４ [１９９７]、Ｙ． Ｂａｂａ， Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅ-ｃａｕｓｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ＤＮＡ-ｂａｓｅｄ ｄｒｕｇｓ ｂｙ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ． Ｔｏｗａｒｄｓ ＤＮＡ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｄｉｓｅａｓｅｓ（キャピラリ電気泳動による疾患起因遺伝子及びＤＮＡベース薬剤の分析。ヒト疾患のためのＤＮＡ診断及び遺伝子療法に向けて）， "Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｇｒ Ｂ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ａｐｐｌ．" ６８７（２）：２７１〜３０２ [１９９６]、Ｋ．Ｃ． Ｃｈａｎら， Ｈｉｇｈ-ｓｐｅｅｄ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｓｈｏｒｔ ｃａｐｉｌｌａｒｙ（短キャピラリを用いるＤＮＡフラグメントのハイスピード電気泳動分離法）， "Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｓｃｉ． Ａｐｐｌ．" ６９５（１）：１３〜１５ [１９９７]）。
生物材料サンプル中においてクリプトウイルス特異的タンパク質またはクリプトウイルス特異的ＲＮＡの存在の有無を検出するための本発明の方法を実施する目的にはいかなる生物材料を採取してもよい。採取のための好ましい生物材料は、血液、血清、リンパ組織、脳組織を含む神経組織を含む。しかしながら、生物材料は、脳脊髄液（ＣＦＳ）、リンパ、血漿、糞便、精液、前立腺液、涙、唾液、乳、胃液、粘液、滑液、胸水、腹膜浸出液、心嚢貯留液、皮膚、血管上皮、口腔上皮、膣上皮、子宮頚管上皮、子宮上皮、腸管上皮、気管支上皮、食道上皮、または中皮、または任意組織由来の細胞物質の生検サンプルであってもよい。細胞材料は、組織サンプル、発現組織液、組織洗浄液または組織リンス液、血液細胞（例えば、末梢血単核細胞）、腫瘍、臓器、及びインビトロ細胞培養成分（限定はされないが、細胞培養基中の細胞生長に起因する条件培地、推定ウイルス感染細胞、組換え細胞、及び細胞成分を含む）を含む、哺乳類細胞を含む任意のサンプルを含む。
採取され得る組織サンプルは、限定はされないが、脳、血液、脾臓、リンパ節、血管系、腎臓、下垂体、輸尿管、膀胱、尿道、甲状腺、耳下腺、顎下腺、舌下腺、骨、軟骨、肺、縦隔、乳房、子宮、卵巣、精巣、前立腺、子宮頚部、子宮内膜、膵臓、肝臓、副腎、食道、胃、及び／または腸を含むことができる。
【００５６】
サンプルは一方培養哺乳類細胞、無細胞抽出物、あるいは哺乳類被験体の身体に間接的に由来する検体、並びに被験体の身体から直接採取された物質に由来する。検出法（例えば、核酸増幅法及び／または分析、または免疫化学検出法）を適用する前に、急速冷凍、または例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、またはプロパンジオール−ショ糖のような凍結保護物質が存在する条件下での制御冷凍法のような、核酸またはタンパク質を検出可能及び／分析可能な状態に保存する公知の保存手段によって、サンプルを保存することができる。分析と検出のためにサンプル中のクリプトウイルス特異的核酸を増幅する目的、またはクリプトウイルスタンパク質検出目的で、保存の前後にサンプルをプールしてもよい。
サンプルは、オプションとして、一晩冷蔵または冷凍保存、希釈、フェノール−クロロホルム抽出、あるいはその他の手段によって、使用する種々の増幅反応を阻害する可能性のある因子、例えば、ヘム含有色素または尿因子、を除去するために、前処理してもよい。（例えば、 Ｊ． Ｍａｈｏｎｙら， Ｕｒｉｎｅ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ ｆｒｏｍ ｐｒｅｇｎａｎｔ ａｎｄ ｎｏｎ-ｐｒｅｇｎａｎｔ ｗｏｍｅｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｂｙ ＰＣＲ， ｌｉｇａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ， ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ-ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ： ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｒｉｎａｒｙ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ（ＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応、及び転写増幅法によりトラコーマ病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ ）核酸の増幅に阻害性のある妊娠及び非妊娠女性から採取した尿標本：阻害と阻害活性の除去に関連する尿物質の同定）， "Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．" ３６（１１）：３１２２〜２６ [１９９８]）。
本発明はまた、ヒト疾患、好ましくは、限定はされないが、神経学的、神経変性、及び／または神経精神医学的疾患研究のための動物モデルに関する。「神経学的疾患」という用語は、神経系の疾患を意味するものであり、中枢神経系及び／または末梢神経系に症状が現れる神経障害を含む。これらは、テンカン様疾患及び非テンカン様ＣＮＳ疾患（例えば、パーキンソン症）及び末梢神経系疾患（複数でもよい）（例えば、筋萎縮性側索硬化症、または「ルー・ゲリッグ疾患（Ｌｏｕ Ｇｅｈｒｉｇ'ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ）を含む。「神経変性」疾患は、典型的に振戦、脱力、及び萎縮症を呈示する、例えば、ルー・ゲリッグ疾患またはアルツハイマー病のような、消耗性または麻痺性神経学的疾患を含む。
「神経精神医学的」及び「神経心理学的」という用語は、本願では互換性を持って使用される。「神経精神医学的疾患」は、根底にある神経生理学的プロセスから派生する行動上の症状をまた含む神経学的疾患である。動物モデルは、限定はされないが、齧歯類、ウサギ類、または非ヒト霊長類のような非ヒト哺乳類である。
齧歯類は、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、リス、マーモット、ビーバー、ゴーファー、ハタネズミ、ヤマアラシ、及びアグーチのような齧歯目である任意の比較的小型の齧歯哺乳類である。ウサギ類は、ウサギ目に属する種々の草食性哺乳類であり、ウサギ、野ウサギ、ナキウサギを含む。
動物は、本発明の感染性無細胞クリプトウイルスビリオンを接種されるか、または既に接種されている。他方、動物は、ＡＶ3／ＳＳＰＥのようなクリプトウイルスで非増殖型感染されている細胞を人工的に接種されるか、または接種されている。
接種は、末梢性または脳内投与ルートのいずれであってもよい。神経学的、神経変性、及び／または神経精神医学的疾患の研究には、脳内接種が好ましいが、末梢神経系の関与を呈示する疾患については、末梢接種もまた有用であり得る。
脳内接種は任意の適切な手段によるが、脳内、好ましくは神経組織内に直接注射することが好ましく、そして当該分野に公知の定位的注射手段によるものが最も好ましい。他方、クリプトウイルスまたは非増殖型感染細胞による脳内接種は、動脈内（例えば、頸動脈内）または静脈内注射または注入により、物理的または化学的手段による血液脳関門の少なくとも一時的分断と組み合わせて、クリプトウイルスまたは非増殖型感染細胞が同時に送達される。
【００５７】
「同時」とは、血液脳関門を分断するための物理的または化学的手段が、クリプトウイルスびビリオンまたは非増殖型感染細胞と同時発生的または同時に投与されることを意味する。「同時に」はまた、分断手段がクリプトウイルスまたは非増殖型感染細胞の最終投与後約１時間以内、好ましくは、約３０分以内、そして最も好ましくは、クリプトウイルスまたは非増殖型感染細胞と同時に投与されることを包含する。他方、「同時に」は、薬剤が、クリプトウイルスまたは非増殖型感染細胞が最初に投与される約３０分前以内、そして好ましくは約１５分前以内に投与されることを意味する。
血液脳関門の物理的分断は、「機械的」損傷またはその他の物理的外傷の手段によって、脳の血管系の少なくとも一つの位置において血液脳関門が破壊されることを含む。化学的分断は、血液脳関門を一時的に透過促進にして、脳の微小血管系を通してクリプトウイルスが血流から脳に侵入することを可能にする薬剤を含む。係る透過促進剤は公知であり、例えば、ブラジキニン及びブラジキニン類似体、及びカルシウム依存性またはＡＴＰ依存性カリウムチャネルの活性化物質である。（例えば、 Ｂ． ＭａｌｆｒｏｙＣａｍｉｎｅ， Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｂｌｏｏｄｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｂｙ ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ ａ ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ ａｇｏｎｉｓｔ ｏｆ ｂｌｏｏｄｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ（血液脳関門透過性のブラジキニンアゴニストの投与により血液脳関門透過性を増加する方法）， 米国特許番号第 ５，１１２，５９６号、Ｊ．Ｗ． Ｋｏｚａｒｉｃｈら， Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｂｌｏｏｄ ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｗｉｔｈ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｒ ｐｅｐｔｉｄｅｓ（透過促進ペプチドによる血液脳関門透過性の増加）， 米国特許番号第５，２６８，１６４号、Ｉｎａｍｕｒａ， Ｔら， Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｏｐｅｎｓ ｂｌｏｏｄｔｕｍｏｒ ｂａｒｒｉｅｒ ｉｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒｓ（ブラジキニンは、実験的脳腫瘍における血液脳関門を選択的に開放する）， "Ｊ．  Ｃｅｒｅｂ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ．" １４（５）： ８６２〜７０ [１９９４]、Ｋ．Ｌ． Ｂｌａｃｋ， Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｏｐｅｎｉｎｇ ｏｆ ａｂｎｏｒｍａｌ ｂｒａｉｎ ｔｉｓｓｕｅ ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ（異常脳組織毛細管の選択的開口方法）， 米国特許番号第 ５，５２７，７７８号と５，４３４，１３７号、Ｎ．Ｇ． Ｒａｉｎｏｖ， Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｕｐｔａｋｅ ｏｆ ｖｉｒａｌ ａｎｄ ｍｏｎｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｉｎｔｒａａｒｔｅｒｉａｌｌｙ ｔｏ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｂｒａｉｎ ｎｅｏｐｌａｓｍｓ（実験的脳新生物に動脈内送達されたウイルス及び単結晶粒子の選択的取り込み）， "Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ． Ｔｈｅｒ．" ６（１２）： １５４３〜５２ [１９９５]、Ｎ．Ｇ． Ｒａｉｎｏｖら， Ｌｏｎｇｔｅｒｍ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ａ ｒｏｄｅｎｔ ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒ ｍｏｄｅｌ ｂｙ ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎｅｎｈａｎｃｅｄ ｉｎｔｒａａｒｔｅｒｉａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ（治療用単純ヘルペスウイルスベクターのブラジキニン増強動脈内投与による齧歯類脳腫瘍モデルにおける長期生存）， "Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．" ５（３）： １５８〜６２ [１９９８]、Ｆ．Ｈ． Ｂａｒｎｅｔｔら， Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｔｏ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒｓ ｕｓｉｎｇ ＲＭＰ７（ＲＭＰ−７を使用する実験的脳腫瘍へのヘルペスウイルスベクターの選択的��与）， "Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．" ６（１）： １４〜２０ [１９９９]、国際特許公開番号ＷＯ ０１／５４７７１ Ａ２及び ＷＯ ０１／５４６８０ Ａ２）。
接種された非ヒト哺乳類は、かくして接種された後に、接種前にはこの非ヒトの乳類によって呈示されていなかった、ヒト神経学的、神経変性、及び／または神経精神医学的疾患に特徴的な症状を少なくとも一つ呈示する。係る症状は、亜急性症状並びにさらに緩徐進行性症状を含む。
【００５８】
一般的には、係る実験的感染に付随する亜急性症状（接種後、約３週間から約２ヶ月して発症する）は、以下を含む：（１）悪液質／食欲不振（即ち、体重と身体サイズの消耗または減少）、（２）退行性神経消耗または麻痺、（３）肢（複数でもよい）萎縮症、（４）後肢麻痺、（５）光過敏症または反復性まばたき、（６）活動高進または知覚過敏（例えば、神経質、激越（不安興奮）、競走、せん妄、触感と音に対する過敏症）、（７）運動失調症（即ち、平衡喪失、歩調不安定）、（８）知覚減退、（９）他の動物からの離脱と孤絶、目を閉じる、「背をかがめる」姿勢、（１０）昏迷（即ち、硬直、準昏睡、夢遊歩行様無動作）、（１１）痙攣またはテンカン発作（即ち、四肢をつっぱる、意識喪失、くるくる回る、転げ回る、及び／または旋回する）、（１２）筋痙攣または筋クローヌス（例えば、振戦、筋攣縮、筋肉の反復反射）、（１３）角膜混濁（角膜の曇り）、並びに（１４）突然死。個々の動物は、一つ以上の先述の亜急性症状を呈示し得るが、一般的には２つ以上の複合症状が観察される。亜急性症状はメス動物と比べて、オス動物により頻繁に観察される。
さらに緩徐進行性症状（即ち、接種後約２ヶ月そしてある場合は、約６ヶ月あるいはそれ以上も発症しない）は以下を含む：（１）肥満、（２）知覚減退（即ち、感覚性刺激に対する感受性の減少）、（３）極度の嗜眠及び持続睡眠、（４）活動高進または知覚過敏  （即ち、感覚性刺激に対する感受性の増加）、（５）攻撃性（例えば、飛び上りまたは噛みつき行動）、（６）妄想強迫性行動（例えば、過剰かつ遷延な顔洗い行動、または頻繁なひっかき行動）、（７）自傷行為（皮膚が傷つくほどまでの極端な妄想強迫性洗浄またはひっかき行動）、（８）実験的感染メスに生まれた新生児動物における死亡胎児及び奇形（一般的には麻痺または肢萎縮症）、並びに（９）子殺し（多数の新生児または全同腹仔の共食い）。個々の動物は、一つ以上の先述の緩徐進行性症状を呈示し得るが、一般的には２つ以上の複合症状が観察される。緩徐進行性症状はオス動物と比べて、メス動物により頻繁に観察される。
本発明の動物モデルは、典型的に振戦、脱力、及び萎縮症を呈示する、神経変性、消耗または麻痺性神経学的疾患の研究の極めて優れたモデル系である。
本発明の動物モデルはまた、感染動物が、実質的にヒトのテンカン様疾患に付随する全ての症状スペクトルを呈示するために、特発性テンカン様疾患研究のための極めて優れたモデル系である。現在では、ほとんどの既存のテンカンの動物モデル（例えば、グルタミン酸受容体アゴニストであるカイナイトの接種、あるいは軽度の窒息によるテンカン発作の誘導）は、テンカン発作と、ヒト疾患の実際の症状スペクトルの病因とは無関係なテンカン発作に付随する粗雑な解剖学的病変を生じるように設計されている。これらのモデルは、テンカン発作活動に対する治療薬の開発に有用であるが、ヒトのテンカン様疾患の究極の発生機序または生じる実際の症状スペクトルに適用性があるかについてはほとんどまたは全く証拠がない。
対照的に、本発明の動物モデルは、真に相同な動物モデルであり、即ち、ヒト疾患に関連する実際の因子／症状が現存し、そして治療並びに予防ストラテジーのどちらからも特定して標的化できる動物モデルである。したがって、本願に開示された本発明の動物モデルは、抗テンカン及び抗向精神薬を含む抗ウイルス薬または薬物をスクリーンし、並びにワクチンやその他の予防薬を試験し、そして任意の、及び全治療ストラテジーを如何にして最適に連係させて至適化するかを決定するために使用することができる。
クリプトウイルスは、細胞培養では軽度に細胞変性性であるが、実験的に感染させた動物では著明な神経病理学的疾患を起因する。このウイルスの細胞変性及び神経変性のいずれの形質も、抗ウイルス治療薬及び／または予防薬候補を同定並びに試験するためにデザインされるスクリーンにおいてマーカーとして使用することができる。
したがって、本発明は、免疫予防薬を含む、抗ウイルス治療薬及び／または抗ウイルス予防薬をスクリーニングするためのインビトロ及びインビボ法を特徴として備え持つ。抗ウイルス治療または予防薬「候補」は、クリプトウイルスに対して有効な抗ウイルス特性を有することが臨床的に未だ確認（即ち、フェーズIII  臨床治験）されていない薬剤である。クリプトウイルス感染に対して臨床的に試験されていない、あるいはフェーズＩ及びフェーズIIに関してのみクリプトウイルス感染に対して臨床治験が行われた薬剤はまた、本発明の目的の抗ウイルス治療及び／または予防薬「候補」に包含される。
【００５９】
治療または予防薬候補の本発明によるインビトロスクリーニング法に従って、急性または増殖型感染哺乳類細胞培養物（例えば、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、またはＣＶ-１c）または非増殖型感染保菌細胞培養物（例えば、ＡＶ3／ＳＳＰＥ 細胞）を使って抗ウイルス薬候補を評価することができる。急性感染（増殖型）細胞系は、クリプトウイルスエンベロープ糖タンパク質のプロセシングとアセンブリを標的する（例えば、Ｆ0切断活性化のプロテアーゼ阻害）薬剤のスクリーニングに優先的に有用であるが、転写またはその他のポリメラーゼ阻害因子による長期治療の有効性についてのスクリーニングには、非増殖型感染細胞系（例えば、ＡＶ3／ＳＳＰＥ）が好ましい。
本発明の動物モデルは、通常は抗ウイルス治療薬候補のインビボスクリーニング法に利用される。本方法は、スクリーンの対象となる治療薬候補を、本発明の動物モデルに従って、クリプトウイルスを接種後の本発明の動物モデルに投与することを含む。
本発明の動物モデルの他の実施形態は、抗ウイルス予防薬候補のインビボスクリーニング法に利用される。この方法は、スクリーニングの対象となる予防薬候補を、限定はされないが、神経学的、神経変性、及び／または神経精神医学的疾患のようなヒト疾患（例えば、テンカン様疾患）の症状を有さない非ヒト哺乳類に投与することを含む。次に、本願に説明するように、感染性無細胞クリプトウイルスまたはクリプトウイルスで非増殖型感染された哺乳類細胞をこの動物に接種する。この方法は、特に、係る目的のみに限定はされないが、抗テンカンまたは抗向精神性抗ウイルス予防薬候補を同定するために有用である。
予防薬または治療薬候補の投与は、任意の適切な投与ルート、腸内（例えば、経口または坐薬による）または非経口（例えば、注射、輸液、経膜、経皮、または吸入投与ルート）による。
本発明に従って、評価され得る薬剤の例は、クリプトウイルス以外のウイルスに対して既知の抗ウイルス特性を有する化合物または物質、即ち、先述するような、潜在的抗ウイルス活性を有する細胞、植物または動物抽出物、及びワクチンのような、新化合物または化合物の混合物、またはこれらの任意な組み合わせを含む。
本発明のインビボスクリーニング法を用いる場合、免疫予防薬候補（即ち、ウイルス複製、アセンブリまたはウイルス増殖と蔓延に関連する任意のその他のプロセスを攻撃または阻害するために応答するように免疫系を刺激するワクチン）は、非ヒト動物に（前述のように）推定予防薬またはワクチンを接種して、次に感染性クリプトウイルスでチャレンジして、クリプトウイルス関連性疾患の発症を予防するその有効性を評価することができるために、試験に適している。本発明に従って発見された係る薬剤の使用は、麻疹及びムンプス（お多福風邪）ワクチンが多くの国家においてこれらの疾患を制御するために使用されてきたように、ヒト集団においてヒトクリプトウイルス関連疾患を制御かつ根絶するためには究極的に必要であろう。
上記に記載したものの他に、当業者は、本願に提供されるインビトロ（細胞培養）またはインビボ方法を用いて分析または評価し得る多数の抗ウイルス化学的及び分子的治療薬候補を認識しよう。これらの抗ウイルス治療及び／または予防薬は、クリプトウイルス以外のウイルスを影響することが公知である既存の抗ウイルス薬（例えば、ビラゾール（商標）としても公知であるリバビリオン（商標））及び新しい抗ウイルス薬候補を含み得る。例えば、分子治療薬（例えば、アンチセンスヌクレオチド及びリボザイム）またはプロテアーゼ阻害薬はまた、本発明のインビトロ及び／またはインビボスクリーニング法を用いて試験することができる。ウイルス融合タンパク質（Ｆ0）の切断を阻害する薬剤が探し求められており、そしてこれらは、融合タンパク質の切断及びウイルス赤血球凝集素／ノイラミニダーゼ（ＨＮ）とのその会合はその他のパラミクソウイルス科による感染の病原性を決定するに際して重要なイベントであることが証明されているために、特に有用であり得る（Ｙａｏら， "Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．" ７１ ６５０〜６５６， １９９７）。さらに、これらの抗ウイルス薬候補は、例えば、クリプトウイルス複製またはアセンブリ、あるいは、限定はされないが、Ｌタンパク質及びそのコンパニオンＰ及びＶタンパク質を含むクリプトウイルスコードＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのような、クリプトウイルス遺伝子及びタンパク質の発現または活性に対して誘導され得る。本発明のスクリーニング法はまた、クリプトウイルス以外のウイルスに有効な広域抗ウイルス薬の開発に利用することができる。
【００６０】
感染細胞またはウイルス粒子を攻撃するために免疫系を攻撃または刺激する（例えば、受動的抗体投与またはクリプトウイルス特異的モノクローナル抗体の導入による）免疫治療薬はまた、ビリオンのアセンブリ、遊離、または細胞間伝達を遮断または阻害できるために、試験に適している。しかし、ウイルスは、そのエンベロープタンパク質の産生を遮断して、免疫系によって検出不能であるように見える「潜在性」または不顕性状態になることによって、インサイツで生存すると考えられるために、これらの薬剤の投与は持続的且つ慢性クリプトウイルス感染を「治癒」するには限られた価値しかないであろう。
予防または治療薬候補の適量は変化し、常套的なスクリーニングによって決定される。
治療薬または予防薬候補をスクリーニングするための本発明によるインビボ法に従って、薬剤は、本発明の動物モデルにおいて有益な抗ウイルス効果を誘導、作出、招来、あるいはその原因となる能力について評価される。「有益な抗ウイルス効果」とは、コントロール動物の組織と比較して、アッセイを受ける動物において、クリプトウイルスによる感染の予防、またはクリプトウイルス感染に付随する少なくとも一つの症状の持続期間または重症度の軽減を含む。「有益な抗ウイルス効果」はまた、このスクリーニング法によってアッセイされる動物由来の組織サンプルにおける細胞変性効果（ＣＰＥ）の予防または低減を含む。また、「有益な抗ウイルス効果」によって包含されるものには、クリプトウイルス複製及び／またはクリプトウイルスビリオンアセンブリに対する阻害効果（例えば、クリプトウイルスゲノム複製、クリプトウイルス転写、及び／または翻訳に対する阻害効果、即ち、適切なコントロールと比較する、クリプトウイルスｍＲＮＡ由来のタンパク質合成、または産生されるクリプトウイルスビリオン数の減少、またはクリプトウイルス粒子の完全性の相対的欠如）があり、その効果は、アッセイされた動物から採取された細胞または組織において公知手段によって測定される。
スクリーニング法に使用される適切なコントロールは、当業者には自明であろう。係るコントロールは、以下を含む：（１）同じ予防または治療薬候補を投与され、そして滅菌人工水性培地のみまたはＳＶ５株を含む培地でチャレンジされた動物、（２）生理食塩水（または予防または治療薬候補投与に使用したものと同一のキャリア）で偽処理されて、クリプトウイルスでチャレンジされた動物、（３）生理食塩水（または予防薬または治療薬候補の送達に使用したものと同じキャリア）で偽処理されて、滅菌人工水性培地のみまたはＳＶ５株を含む培地でチャレンジされた動物。
本発明の実施は、特記しない限りは、当業者の技術範囲である、生化学、分子生物学、微生物学、ウイルス学、組換え核酸技術、及び免疫学に属する従来またはその他の公知テクニックを利用する。係るテクニックは、文献資料に詳細に説明されている。（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（分子クローニング：実験マニュアル）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＵＳＡ （１９８２）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＤＮＡクローニング）， 第一巻と二巻 （Ｄ． Ｎ Ｇｌｏｖｅｒ編集１９８５）、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （分子クローニング：実験マニュアル（第二版）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＵＳＡ （１９８９）、Ｄａｖｉｓら， Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学の基礎方法）， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＵＳＡ （１９８６）、またはＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ： Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ （酵素学方法：分子クローニング技術ガイド）１５２巻， Ｓ． Ｌ． ＢｅｒｇｅｒとＡ． Ｒ． Ｋｉｍｍｅｒｌ編集， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＵＳＡ （１９８７）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （オリゴヌクレオチド合成）（Ｍ． Ｊ． Ｇａｉｔ編集， １９８４）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ （核酸ハイブリダイゼーション）（Ｂ． Ｄ． ＨａｍｅｓとＳ． Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ編集１９８４）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ （転写と翻訳）（Ｂ． Ｄ． ＨａｍｅｓとＳ． Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ 編集１９８４）、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ （動物細胞培養）（Ｒ． Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ 編集 １９８６）、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ （不動化細胞と酵素）（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， １９８６）、Ｂ． Ｐｅｒｂａｌ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （分子クローニングの実用ガイド）（１９８４）、ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ （酵素学方法）（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ （哺乳類細胞用遺伝子伝達ベクター）（Ｊ． Ｈ． ＭｉｌｌｅｒとＭ． Ｐ． Ｃａｌｏｓ 編集１９８７， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ （酵素学方法）第１５４巻と１５５巻 （それぞれ、Ｗｕ ａｎｄ Ｇｒｏｓｓｍａｎと Ｗｕ編集）， ＭａｙｅｒとＷａｌｋｅｒ編集 （１９８７）， Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ��ｌｏｇｙ  （細胞における免疫化学的方法 と分子生物学）（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎ）， Ｓｃｏｐｅｓ， （１９８７）， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ Ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（タンパク質精製の原理と実際）， 第二版 （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ-Ｖｅｒｌａｇ， Ｎ．Ｙ．）， 並びにＨａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（実験免疫学ハンドブック）， Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ-ＩＶ （Ｄ． Ｍ． Ｗｅｉｒ とＣ． Ｃ． Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ 編集１９８６）。
本発明は、以下の非限定例を参照して、さらに詳細に説明されよう。
【００６１】
実施例
〈実施例１〉  感染細胞におけるクリプトウイルスの検出並びにクリプトウイルスウイルス粒子の単離と精製
本発明に従って、ＳＳＰＥを罹患する患者の末梢血から得た被膜形成細胞（末梢血単核細胞：ＰＢＭＮＣ）から、無細胞クリプトウイルス粒子を回収した。使用方法は、Ｒｏｂｂｉｎｓら（"Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ．" １４３：３９６〜４０３， １９８１）の修正方法を用いた。修正は、本発明に従って、水性培地にサイクリックＧＭＰ（最終濃度が１ｍＭになるように）を添加し、この培地はＰＢＭＮＣ初期培養及びヒト羊膜細胞（ＡＶ3）との一次共培養中に添加された。結果は、ＰＢＭＮＣと羊膜細胞との共培養ステップにおいて哺乳類上皮細胞株として、ＣＶ−１細胞のクローン化亜株（ＣＶ-ｌc）を用いることによってさらに至適化された。
ウイルスの単離に成功するためには、生存可能なＰＢＭＮＣを必要とする。係るＰＢＭＮＣは、フィコール−ハイパック（Ｆｉｃｏｌｌ-Ｈｙｐａｑｕｅ）（商標）勾配培地を使用する標準法によってその他の血液成分から分離された。遠心分離後、被膜形成細胞は培地界面にバンドを形成し、滅菌ピペットを用いて取り出した。次にこれを１〜２％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ細胞培養培地の５０容量希釈で丁寧に洗浄してから、卓上冷却遠心分離器で遠心した（１０００ｒｐｍ  ｘ  ５分）。ペレット化したＰＢＭＮＣを次に２ ｘ １０5細胞／ｍｌまで１０％ウシ胎児血清と１ｍＭサイクリックＧＭＰ（ナトリウム塩）を含むＲＰＭＩ培地で希釈して、３７℃で１２〜１８時間動かさないようにして静置インキュベートした。インキュベーション後、培養物をリヒター修正最少必須培地（ＩＭＥＭＺＯ）（インスリン、亜鉛、ＨＥＨＥＳ緩衝液  ２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、２００Ｕ  ペニシリン／ｍＬ、１００ｐｇ  ストレプトマイシン／ｍＬ、５〜１０％（容量／容量）ウシ胎児血清、ｐＨ６．８〜７．０を補充）中に十分なＡＶ3 細胞と共に、最終細胞濃度が２ ｘ １０5細胞／ｍＬ（培養中の全細胞） になるように播種し、３７℃で再インキュベートした。いったん培養がコンフルーエントに達したら（２〜３日）、単層を、０．０２％（重量／容量）ＥＤＴＡ  ＣＭＦ−ＰＢＳ（カルシウムとマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水）溶液でキレート化して、細胞を分散して、前述のようにＩＭＥＭＺＯ中で２ ｘ １０5細胞／ｍＬで継代培養した。
この培養を、次に３〜４日ごとに一回（およそ一週間に二回）コンフルーエントになったときに、同じ方法で盲目的に、２〜３週間にわたって継代培養した。２週間後、クリプトウイルス特異的間接蛍光抗体法 （過免疫ウサギ抗クリプトウイルス抗血清に曝露後、フルオレセイン抱合ヤギ抗ウサギＩｇＧで標識する）を用いて、細胞質中でのクリプトウイルス特異的封入体の存在の有無について細胞を検査するためにスライド培養を調製した。
細胞の５〜１０％がクリプトウイルス特異的封入体に陽性であった場合、培養物は、前述の許容的ＣＶ-ｌc 細胞と共培養する用意ができたことになる。これは、継代培養した一次ＰＢＭＮＣ／ＡＶ3 培養物を最終濃度が２ Ｘ １０5細胞／ｍＬになるようにリヒター修正最少必須培地で希釈したＣＶ-ｌc 細胞と１：１共培養することを含む。これらの培養物を次に、微妙な細胞変性効果の発生（ＣＰＥ：細胞の星形化と円形化、または３個以上の核を含む多核細胞）について、その後４〜５日にわたってモニタした。培養がコンフルーエントになる前にＣＰＥが発生しないときは、継代培養を行って再びモニタした。３回の係る継代培養後にＣＰＥが発生しなかった場合は、培養物は廃棄した。
いったんＣＰＥが観察されたら、全培養物を−７０℃で冷凍、解凍して、細胞を分散させて１．０ｍＬのアリコートに分配した。これらのアリコートは、推定一次単離ウイルスを意味する。ウイルスを次に、リヒター修正最少必須培地で作製した２％ウシ胎児血清を含む１％（重量／容量）カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＮａＣＭＣ）の半流動性溶液で重層した単層のＣＶ-ｌc 細胞上に滴定することによりプラーク精製した。この培養物を部分的ＣＯ2 大気（５％  容量／容量）中３７℃でインキュベートした。プラークは８〜１２日で形成され、次に前述のように選択かつ再プラーク形成させた。いったんプラークの三重精製を行ったら、ウイルスのアリコートを２５〜７５ｃｍ2 細胞培養フラスコ中のＣＶ-ｌc単層（５％ウシ胎児血清と前述のサプリメントを含むＩＭＥＭＺＯ培地中の）上で培養した。いったん、培養細胞の半数以上を含む十分なＣＰＥが発生したら、全培養物を冷凍、解凍して、溶解物を分散、再びアリコートに分割して、−７０℃で再冷凍した。ウイルスストックのサンプルを次に将来の用途のためにＲｏｂｂｉｎｓらの方法によって滴定した。（Ｒｏｂｂｉｎｓら， "Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓｅａｓｅ" １４３：３９６〜４０３， １９８１）。
密度勾配精製法：  増殖型（Ｖｅｒｏ及びＣＶ１C）並びに非増殖型（ＡＶ3／ＳＳＰＥ）感染細胞から単離されたビリオンと細胞内ヌクレオカプシドを、ショ糖−酒石酸カリウム勾配（ビリオン）及びＣｓＣｌ勾配（ヌクレオカプシド）上で、Ｒｏｂｂｉｎｓらの方法によってさらに精製した（Ｒｏｂｂｉｎｓら， "Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓｅａｓｅ" １４３：３９６〜４０３， １９８１、ＲａｐｐとＲｏｂｂｉｎｓ， "Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ" １６：１６０〜１６７， １９８１、 ＲｏｂｂｉｎｓとＲａｐｐ， "Ａｒｃｈ． Ｖｉｒｏｌ．" ７１：８５〜９１， １９８２、並びにＲｏｂｂｉｎｓとＡｂｂｏｔｔ-Ｓｍｉｔｈ， "Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． Ｍｅｔｈ．" １１：２５３〜２５７， １９８５）。
【００６２】
〈実施例２〉  クリプトウイルス増殖及びビリオンの単離と精製
いったん単離されると、無細胞ウイルスストックはを、サル上皮細胞株（例えば、ＶｅｒｏまたはＣＶ−１細胞）で増殖した。本願に説明した研究で使用したクリプトウイルス単離物は、三重精製プラークであり、ＣＶ-ｌcと命名されたＣＶ−１細胞のクローン化亜株中で増殖させた。感染ウイルスの至適産生は、インスリン、亜鉛、ＨＥＨＥＳ緩衝液、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、２００Ｕ  ペニシリン／ｍＬ、１００μｇ  ストレプトマイシン／ｍＬ、５〜１０％（容量／容量）ウシ胎児血清、ｐＨ６．８〜７．０を補充したＩＭＥＭＺＯを用いる場合に生じる。
組織培養培地中におけるインスリン、並びにオプションとしての亜鉛ジカチオンの存在は、感染性ウイルスの生存可能な力価を得るために有用である。標準培地（例えば、ＭＥＭ）を用いてＣＶ−１細胞でウイルスを増殖するための別の試みはほとんどうまく増殖しなかった。対照的に、霊長類細胞培養中のクリプトウイルスタンパク質の発現とクリプトウイルス感染の生殖力は、サイクリックＧＭＰ（１ｍＭ、ナトリウム塩）を標準培地（特にＭＥＭ）に添加することによって劇的に増強された（５０〜１００倍）。獲得された増強は、先に発表された麻疹ウイルス複製の増強に極めて類似していた（Ｒｏｂｂｉｎｓ， "Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ" ３２：２０４〜２０８， １９９１）。
ビリオンの単離と精製。  ビリオンを単離して、感染７２時間後に、急性感染されたＣＶ−１細胞の組織培養培地上清からさらに精製した。使用した方法は、分画遠心分離によるウイルス粒子の分離を含む。
感染培養物の上清培地を滅菌プラスチック５０-ｍＬファルコン遠心分離試験管中にデカントして、２０００ ｒｐｍで１０分間遠心して清澄化した。上清を次に、耐衝撃性ガラス遠心管（Ｓｏｒｖａｌｌ）に移して、さらに１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心して清澄化した。全ての遠心分離は、ＲＣ２Ｂ  Ｓｏｒｖａｌｌ遠心分離器中、４℃で行った。第二清澄化ステップで得られた上清液を、６０％（重量／容量）ショ糖クッション（１０ｍＭトリス、５ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）上に重層して、Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ-２８ローターに入れて、約１３０，０００  ｘ  Ｇ、４℃で９０分、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｌ７０超遠心機で遠心分離した。組織培養培地−ショ糖界面から物質を回収してプールし、組織培養培地で希釈してから、前述のように新たな６０％ショ糖クッション上で再遠心分離した。界面にある物質を再び取り出して、組織培養培地で希釈して、前述のトリスＥＤＴＡ緩衝液で調製した６０％（重量／容量）上に３０％（重量／容量）を重ねた不連続（即ち層状）ショ糖勾配を通して３５，０００ ｒｐｍ（２８０，０００  ｘＧ）で６０分間遠心分離した。ビリオンは、３０％：６０％ショ糖界面から回収され、冷却トリスＥＤＴＡ緩衝液で希釈して、Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ４１ローターで、４１，０００ｒｐｍ、４℃で６０分間ペレット化された。ペレット化ビリオンは、可変量の冷却トリスＥＤＴＡ緩衝液に再懸濁して、使用するまで−７０℃で冷凍した。各ビリオン調製物の総タンパク質は、Ｌｏｗｒｙら（１９５１）の方法によって決定した。
【００６３】
〈実施例３〉  抗血清の調製
抗血清は、クリプトウイルスのショ糖−酒石酸カリウム勾配・精製ビリオン、ＣｓＣｌ勾配・精製ヌクレオカプシド（感染ＣＶ-１c 細胞の細胞質に由来）、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ後ポリアクリルアミドゲルから抽出された主要ウイルスヌクレオカプシドタンパク質であるＮＰに対して、成体ニュージーランド白ウサギで作製した。ウサギ抗血清はまた、ＳＶ５のＮＩＨ２１００５−２ＷＲ株及び麻疹ウイルスのＥｄｍｏｎｓｔｏｎ（エドモンストン）株に対しても作製した。
動物は、滅菌２７ゲージ針と１．０ｍＬシリンジで、各動物に３シリーズの３つの別々な接種（背部に皮内接種  １回、腹腔内接種  １回、並びに後足蹠接種  １回）を含むピンクッション法によって接種された。接種の第一シリーズは、フロインド完全アジュバンドと１：１に混合した勾配・精製・透析ビリオン（１００μｇビリオンを含有する０．３ｍＬの１０ｍＭトリス−５ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液）を用いて行い、各接種は、約２００μＬのビリオン：アジュバンド混合物を含んだ。接種の第二シリーズは、二週間後に、各動物の反対側の同位置に行われ、フロインド不完全アジュバンドで混合された同量のビリオンから構成された。接種の第三シリーズは、二週間後に第一接種と同位置に、ビリオンのみを用いて行われた（前述のように０．６ｍＬのトリス−ＥＤＴＡ溶液で希釈）。接種の最終シリーズの二週間後に、動物の心臓内全採血によって血液を収集した。収集された血液は、遠心分離（２０００ ｒｐｍで１０分）して、氷上で凝血させた。上部血清成分を収集して、生理食塩水洗浄した凍結乾燥アセトン：メタノール抽出サル腎臓組織のペレット化成分（２０００ ｒｐｍで１０分）に吸収させた（１５分ごとに撹拌を加えながら４℃で１時間）。吸収された血清を遠心分離（２，０００で１０分）収集して、１．０ｍＬのアリコートにして、−２０℃で保存した。
抗クリプトウイルス抗血清の全ては、（１）免疫沈降法、（２）免疫蛍光法、（３）免疫ブロット法、（４）超微細構造免疫標識法（免疫ゴールド）、及び（５）勾配・精製ウイルス粒子に対して産生された抗血清の場合は、中和滴定アッセイ、によって分析された場合、対応するクリプトウイルス特異的物質に強い反応性を有する。ウサギで産生された全ての過免疫ウイルス特異的抗血清は、１２８０以上、そして通常は２５６０以上の同種中和力価を有した（ＰＲＤ50の逆希釈）。
全ての実験的に産生された抗血清は、生理食塩水洗浄、凍結乾燥された、サル腎臓細胞のアセトン：メタノール抽出物、またはＡＶ3 細胞及び／またはＣＶ-１c 細胞の同様な抽出物に対して吸収された。
臨床血清は同様に吸収されたが、ＣＳＦ検体は、通常少量しか入手できず、二重試験及び並行試験のためのアリコートを保存する必要性があるために前吸収は行わなかった。
精製ヌクレオカプシド及び精製ウイルスに対して作製された実験血清の沈降「力価」は、特に決定されなかったが、通常では、５〜１０μＬが陽性コントロール免疫沈降反応に使用され、２５μＬの陽性コントロール抗血清（１：１０または１：２０に希釈）が、ＥＬＩＳＡアッセイの陽性コントロールとして使用された。
クリプトウイルス特異的抗血清はまた、勾配・精製された感染性クリプトウイルスビリオンで実験的接種されたマウスにおいて産生された。これらの抗血清は、免疫沈降法によって分析され、全てのクリプトウイルスエンベロープタンパク質を強く沈降することが発見された。
クリプトウイルスビリオンに対して作製された抗血清と、ＳＶ５のＮＩＨ ２ＷＲ-２１００５株のビリオンに対して精製された抗血清の間には著明な非対称的交差反応性があった。この点において観察された非対称性は、常に、異種反応（即ち、クリプトウイルス特異的抗血清対ＳＶ５物質、及びＳＶＳ特異的抗血清対クリプトウイルス物質）は、同種反応（即ち、クリプトウイルス特異的抗血清対クリプトウイルス物質、及びＳＶＳ特異的抗血清対ＳＶ５物質）よりも２から４倍弱いことであった。ＳＶ５のＮＩＨ ２１００５-２ＷＲ 株に対して個別に作製され、またＰｕｒｎｅｌｌ Ｃｈｏｐｐｉｎ博士のご厚意で提供された他の抗血清は、前述のＳＶ５に対する抗血清と同様に非対称的な様式で行動した。
係る交差反応性は驚くには至らない。その他のパラミクソウイルス系を検査する場合、同様な非対称的な交差反応性が明らかに生じている（例えば、麻疹ウイルス抗体を、密接に関連するイヌジステンパー及び牛疫ウイルスと反応させたり、その逆反応を行う際、麻疹ウイルス抗体間に２〜４倍の非対称的な交差反応性がある）。クリプトウイルス特異的抗体とその他のパラミクソウイルス（例えば、麻疹ウイルス）間には限られた（即ち、ずっと弱い）交差反応性があった。
【００６４】
〈実施例４〉  単離クリプトウイルスのキャラクタリゼーション
クリプトウイルスの神経毒性及び向神経性。    図２４Ａに示すように、クリプトウイルスは、ニューロンに対して向性を示した。感染性クリプトウイルスまたは非増殖型ウイルス保菌細胞（ＡＶ3／ＳＳＰＥ）でマウスを脳内接種すると、その結果として、テンカン様、神経学的及び／または神経心理学的要素を有する、亜急性／緩徐進行性の神経病理学的症状スペクトルを生じる。これらの応答は、ニイガタ、キタケン、及びビケンのような「細胞性麻疹様」ウイルスの接種後の動物において、先に報告された「実験的ＳＳＰＥ」と類似であった（図２４Ｂ、Ｄｏｉら， "Ｊａｐａｎ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｓｃｉ． Ｂｉｏｌ．" ２５：３２１〜３３３， １９７２、Ｕｅｄａら， "Ｂｉｋｅｎ Ｊｏｕｒｎａｌ" １８：１７９〜１８１， １９７５、Ｙａｍａｎｏｕｃｈｉら， "Ｊａｐａｎ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｓｃｉ． Ｂｉｏｌ．" ２９：１７７〜１８６， １９７６、Ｏｈｕｃｈｉら， "Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．" ２５：８８７〜９８３， １９８１）。
神経毒性ＳＳＰＥ由来ウイルス保菌細胞株におけるクリプトウイルスの存在。    ＳＳＰＥ患者由来の４つのウイルス保菌細胞株を、麻疹ウイルス及び／またはクリプトウイルス特異抗原の存在の有無について免疫蛍光法で試験した。これらは、ＡＶ3／ＳＳＰＥ／ＭＶ （エドモンストン株麻疹ウイルスで実験的に感染されたＡＶ3細胞と共培養されたＳＳＰＥ患者のＰＢＭＮＣに由来するＳＳＰＥ由来細胞株、Ｒｏｂｂｉｎｓ， 未発表データ）、「キタケン」と命名された非増殖型ＳＳＰＥ由来細胞株（Ｕｅｄａら， "Ｂｉｋｅｎ Ｊｏｕｒｎａｌ" １８：１７９〜１８１， １９７５）、「ニイガタ」と命名された非増殖型ＳＳＰＥ由来細胞株（Ｄｏｉら， "Ｊａｐａｎ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｓｃｉ． Ｂｉｏｌ．" ２５：３２１〜３３３， １９７２）、「ビケン」と命名された非増殖型ＳＳＰＥ由来細胞株（Ｙａｍａｎｏｕｃｈｉら， "Ｊａｐａｎ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｓｃｉ． Ｂｉｏｌ．" ２９：１７７〜１８６， １９７６、Ｏｈｕｃｈｉら， "Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．" ２５：８８７〜９８３， １９８１）であった。ニイガタ細胞株が例外である可能性はあるが、ウイルス特異的免疫蛍光法によって試験すると（図６に示す）、これらウイルス保菌細胞株の全てが麻疹ウイルス特異的抗原とクリプトウイルス特異的抗原の両方を発現した。麻疹ウイルスの無細胞臨床単離物は未だかつて実験的感染動物においてＳＳＰＥ様疾患を起因することが示されていないことを考慮すると、これらの培養物中におけるクリプトウイルスの存在は、これらの動物に見られる亜急性／緩徐進行性神経障害は、培養物中の麻疹ウイルスではなく、クリプトウイルスの存在に拠ることを強く示唆する。
クリプトウイルス封入体（即ち、細胞質ヌクレオカプシド）は、急性感染細胞（ＣＶ-１c）及び非増殖型並びに持続感染細胞（ＡＶ3／ＳＳＰＥ）のいずれにおいても、ＣＮＳ生検及びＳＳＰＥ患者からの剖検材料及びＳＳＰＥ由来非増殖型生ウイルス保菌細胞株において以前に説明されたものと同様な「こしょう様」及び／または「飛散様」分布を呈示した（例えば、 ｄｅ Ｆｅｌｉｃｉら， "Ａｎｎａｌｅｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅ" １２６：５２３〜５３８ [１９７５]、Ｍａｋｉｎｏら， "Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ" ２１：１９３〜２０５ [１９７７]、Ｂｒｏｗｎら， "Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ" ５０：１８１〜１８６ [１９８０]）。これは、図６のパネル、Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、及びＪにおいて最も明瞭に示されている。これらの特徴は、細胞内麻疹ウイルス封入体の離散様及び「癒着状」分布と形態と鮮明なコントラストを示す（図６のパネルＡ、Ｃ、Ｅ、及びＧを参照）。
中和滴定アッセイ。    単層の哺乳類細胞（例えば、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、またはＣＶ-１c）上での肉眼で可視なプラーク形成を使って、感染性クリプトウイルスの調製物を定量することができる。プラーク形成は、臨床血清検体及びウサギで産生したクリプトウイルス特異的抗血清の段階希釈で阻害され得る（例えば、Ｒｏｂｂｉｎｓら， "Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓｅａｓｅ" １４３：３９６〜４０３， １９８１）。単離クリプトウイルスのＰＲＤ50 を決定するためにプラーク滴定アッセイを行った。
【００６５】
簡単に言えば、検査の対象である血清またはＣＳＦ検体の１０倍段階希釈に、最終希釈液（希釈血清またはＣＳＦを含む）０．２ｍＬあたり１００〜２００プラーク形成単位の最終プレーティング濃度を生じるために十分な量の感染性ウイルスを加えて４℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、０．２ｍＬの希釈ウイルス−血清（またはウイルス−ＣＳＦ）混合物を、次に単層の感受性細胞（例えば、ＶｅｒｏまたはＣＶ-１c）に播種して、細胞を部分的ＣＯ2大気（例えば５％（容積／容積））中３７℃でインキュベートした（１５分ごとに接種物をかき混ぜた）。インキュベーション期間の終わりに、接種された単層は、十分量の２％（重量／容量）カルボキシメチルセルローズ溶液で、１０〜１２日間存続するように重層した（２％ウシ胎児血清、インスリン、亜鉛、ＨＥＰＥＳ緩衝液、２ｍＭＬ−グルタミン、２００Ｕ  ペニシリン／ｍＬ及び／または１００μｇ  ストレプトマイシン／ｍＬ、ｐＨ約６．８〜約７．０を含む、ＩＭＥＭＺＯ培地で調製）（即ち、単層が乾燥しないために十分な量）。プレートはインキュベーション期間中は動かないように静置した。１０〜１２日後、上層（オーバーレイ）を吸引除去して、細胞をホルマリン固定液で固定して、タンパク質染色（例えば、ギムザ）を行った。各プレートに形成されたプラーク数を次に数え上げて、ＰＲＤ50 を計算した。
特に、各ウイルスのプラーク形成単位（ＰＦＵ）の５０％を中和する抗血清の力価の決定を含む交差中和アッセイを、各種ウイルスについて行った。クリプトウイルスのＢＢＲ株及びＳＶ５のＮＩＨ ２１００５-２ＷＲ株 のウイルスストックを無血清最少必須培地（２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、２００Ｕ  ペニシリン／ｍＬ、１００μｇ  ストレプトマイシン／ｍＬを含むイーグルＭＥＭをＮａＨＣＯ3でｐＨ６．８〜７．０に調整したもの）で１ｍＬあたり１，０００ ＰＦＵの力価になるように希釈した（希釈及びプレーティング後に１００ＰＦＵ／ウェル）。ニュージーランド白ウサギで作製された抗血清を同じ無血清ＭＥＭで１０倍の増分で段階希釈した。希釈ウイルスストックのアリコート（０．５ｍＬ）を次に抗血清の各希釈アリコート０．５ｍＬに混合して、緩やかにボーテックスで混合してから、氷上で緩やかな混合を１５分ごとに加えながら１時間インキュベートした。インキュベーション期間後、培地を６ウェルクラスタプレート（ＮＵＮＣ）中のＣＶ−１細胞単層から吸引除去して、単層を温かい生理食塩水で洗浄し、生理食塩水を吸引除去してから、０．２ｍＬの各希釈抗血清−ウイルスインキュベート物を２つの単層上に播種した。接種したクラスタプレートを次にＣＯ2インキュベーター（５％ＣＯ2  容量／容量）  内で３７℃で１時間、１５分ごとに接種物を手動でかき混ぜながらインキュベートした。この吸収期の後、各ウェルに半流動重層培地（１％  重量／容量  カルボキシメチルセルロースナトリウム含有、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、２００Ｕ  ペニシリン／ｍＬ、１００μｇ  ストレプトマイシン／ｍＬを含むイーグルＭＥＭ  （ＮａＨＣＯ3でｐＨ６．８〜７．０に調整））を１０．０ｍＬ重層して、動かさないようにして、ＣＯ2インキュベーター（５％ＣＯ2容量／容量）内で３７℃で１０〜１２日インキュベートした。このインキュベーション期間後、上層（オーバーレイ）を吸引除去して、単層を穏やかに温かい生理食塩水で洗浄してから、ホルマリン固定液（重量比３．７％ホルムアルデヒドガス含有生理食塩水）で一時間以上固定した。固定後、固定液を吸引除去して、固定された単層を穏やかに蒸留水で洗浄してから、ウェルあたり１〜２ｍＬのギムザ染色液（４２ｍＬ  温［５５℃］グリセリン、４２ｍＬ  無水メタノールに０．５ｇのギムザ粉末を溶解して、濾過後、使用の直前にホルマリン固定液で１：５に希釈して調製）で、室温で１時間染色した。染色液を次にデカントして、単層を水道水で洗浄して、室温で乾燥させた。単層上のプラークは、ライトボックス上で光を当て、ウイルスと抗血清シリーズの各希釈液について、拡大鏡を使って数を数えて記録した。各抗血清ウイルスシリーズの中和力価は、プラーク形成数を５０％減少させる抗血清希釈の逆数として計算された。
各交差中和セット（即ち、抗クリプトウイルス抗血清対クリプトウイルス及び抗クリプトウイルス抗血清対ＳＶ５、抗ＳＶ５抗血清対クリプトウイルス及び抗ＳＶ５抗血清対ＳＶ５）の計算による中和力価は、異種混合物（即ち、抗クリプトウイルス抗血清対ＳＶ５及び抗ＳＶ５抗血清対クリプトウイルス）が、同種混合物（抗クリプトウイルス抗血清対クリプトウイルス及び抗ＳＶ５抗血清対ＳＶ５）よりも一貫して２〜４倍低かった。同種対と比較して、いずれの異種混合物もその差異が２倍以下であることはなかった。
【００６６】
クリプトウイルス超微細構造と免疫微細構造上のキャラクタリゼーション。  ＡＶ3／ＳＳＰＥ／ＭＶ細胞（麻疹ウイルスエドモンストン株で持続的且つ非増殖型感染されたＡＶ3／ＳＳＰＥ細胞）、ＡＶ3／ＳＳＰＥ細胞、並びにクリプトウイルスＢＢＲ株で急性感染されたＣＶ-１c細胞は、２％ホルムアルデヒド及ピクリン酸並びに３％グルタルアルデヒド含有０．１Ｍ  カコジル酸緩衝液溶液、ｐＨ７．２で１５分、室温で（カバーグラス上で）インサイツ固定された。抗体処理を受ける検体（即ち、免疫超微細構造研究用に調製されたもの）については、四酸化オスミウム後固定は省いた。固定細胞を有するカバーグラスをカコジル酸緩衝液を３回交換して洗浄し、７０％エタノールで脱水してから、ＬＲ白レジンに包埋した。レジンを５０℃で２４時間重合した。超薄切片を作製して、非コートニッケルグリッド上にマウントした。
クリプトウイルスＢＢＲ株及びＡＶ3／ＳＳＰＥ 細胞で急性感染されたＣＶ-１c細胞の染色薄切片を電子顕微鏡で検査した。感染ＣＶ-１c細胞では、直径１００〜１２０ｎｍの多形性ビリオン粒子が急性感染細胞の表面から発芽するのが見られ、また多数の糸状構造（ラセン状ヌクレオカプシド、直径１５〜１７ｎｍ）の蓄積が細胞の細胞質中に観察された（データ表示なし）。ビリオンとヌクレオカプシドのどちらも、パラミクソウイルス科の他のメンバーについて説明するものと同様であった。ＡＶ3／ＳＳＰＥ細胞表面からビリオンが発芽するのは観察されなかったが、細胞内ヌクレオカプシドの封入体は多数観察され、これらは、急性感染細胞にに見られるものと同一であった。
非増殖型及び増殖型感染哺乳類細胞の細胞内ヌクレオカプシドは、クリプトウイルス特異的またはクリプトウイルスヌクレオカプシド特異的過免疫ウサギ抗体及び間接的免疫ゴールド標識法を用いて、電子顕微鏡下でその場所を容易に突きとめることができる。
ＡＶ3／ＳＳＰＥ／ＭＶ細胞切片の免疫標識は、ニッケルグリッドにマウントした切片（四酸化オスミウム後固定しないで説明のようにプロセスされたもの）を、密閉加湿チェンバー内で溶液の雫に浮遊することによって行った。切片は、Ｉｎｇｒａｍら（"Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ" ７４：２０８〜２１５， １９８８）の方法に従って食刻（エッチング）した。５％ウシ血清アルブミン含有修正トリス緩衝液（２０ ｍＭ トリス， ０．５ Ｍ ＮａＣｌ， ２０ ｍＭ アジ化ナトリウム 並びに０．０５% Ｔｗｅｅｎ ２０、 ｐＨ ８．２）を加えて、免疫標識前に切片を３７℃で３０分インキュベートすることによって、非特異的標識を低減させた。全ての希釈と洗浄には修正トリス緩衝液を使用した。
単一標識実験では、切片に修正トリス緩衝液で１：２０に希釈したウサギ抗血清（抗エドモンストン麻疹ウイルスまたは抗クリプトウイルスＢＢＲ株）を加えて、３７℃で２時間インキュベートし、緩衝液を３回交換して洗浄してから、ヤギ抗ウサギＩｇＧコロイド金（１０〜１５ｎｍ粒子サイズ、１：２０希釈、３７℃、１時間）を加えてインキュベートした。緩衝液を２回、次に蒸留水を２回交換して洗浄し、切片を２％酢酸ウラニルとｌｅｄ（発光素子）クエン酸塩で薄く対比染色してから、ＪＥＯＬ １２００ＥＸ 透過型電子顕微鏡で検査した。
二重標識実験では、単一標識法で説明したように、ウサギ抗エドモンストン麻疹ウイルスと１５ｎｍコロイド金粒子を用いて切片の一面を免疫標識して、切片の反対側が標識液で汚染されていないことを確認した。切片の反対面を標識する際に、抗体の交差反応が生じる可能性を減少するために、標識面を次にセロイジンの薄膜でコートした。切片の反対面の免疫標識は、第二抗血清（ウサギ抗クリプトウイルスＢＢＲ株）と１０ｎｍのコロイド金粒子を用いて、前述のように行った。これらの二重標識切片の検査によって、２つの抗血清の標識パターンの同時比較が可能になった。
これらの試験の結果は、疑いの余地がなく、図２５に示している。第一標識シーケンス（１５ｎｍ金ビーズ）は、幅の広いの「ファジー」な麻疹ウイルスヌクレオカプシド（図２５Ｂに表示）のみを標識したが、第二標識シーケンス（１０ｎｍ金ビーズ）は、幅が狭い平滑なクリプトウイルスヌクレオカプシド（図２５Ａに表示）のみを標識した。
【００６７】
〈実施例５〉    単離クリプトウイルスタンパク質のキャラクタリゼーション
放射免疫沈降（ＲＩＰ）アッセイ：  ドデシル硫酸ナトリウムゲルポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、以下参照）により、[35Ｓ]−メチオニン標識した未感染、非増殖型、並びに増殖型感染ヒト及び霊長類細胞のクリプトウイルス特異的免疫沈降物の比較分析によって広範なデータが生成されている。
ＣＶ-１cまたはＶｅｒｏ細胞単層を、他で説明されている（ＲｏｂｂｉｎｓとＲａｐｐ， "Ｖｉｒｏｌｏｇｙ" １０６：３１７〜３２６， １９８１）方法を用いて、１〜２  ＰＦＵ／細胞の多重感染度で、クリプトウイルスのＢＢＲ株、ＳＶ５のＮＩＨ ２１００５-２ＷＲ株または麻疹ウイルスエドモンストン株で感染した。
標識は、以下の方法によって感染２４時間後に達成された。組織培養培地を感染細胞単層から除去して、細胞を血清とメチオニンを含まないイーグル基礎ＭＥＭ（飢餓培地）で洗浄した。次に感染培養物に飢餓培地を補充して３７℃で６０〜９０分インキュベートした。飢餓期間後、培養物を、１００ mＣｉ／ｍＬ [35Ｓ]-メチオニン（Ａｍｅｒｓｈａｍ（アマシャム社））を含有する飢餓培地で標識した。標識は、３７℃、５％ＣＯ2 大気条件で５〜６時間行った。免疫沈降法は、Ｌａｍｂら， "Ｖｉｒｏｌｏｇｙ" ９１：６０〜７８， １９７８の方法に従って行われた。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：  ビリオンと免疫沈降物は、１０％（または極めて小さいペプチド種［例えば、ＳＨタンパク質］の存在の検出には２０％）ポリアクリルアミドスラブゲルで、変性及び還元条件で分析した（Ｌａｅｍｍｌｉ， １９７０）。電気泳動後、ゲルを蛍光溶液（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で処理し、乾燥してから、Ｘ線フィルムに曝露した。
ウイルスの精製ビリオンは、還元及び非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図１１、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に急性感染されたＶｅｒｏ細胞において産生された、勾配・精製[35Ｓ]−メチオニン標識クリプトウイルスビリオンのオートラジオグラム、を参照）。図の右側に表示されているタンパク質の見かけ分子量は、分子量が既知であるマーカータンパク質（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）に対するその移動を比較することによって計算された。注釈は、図面の簡単な説明で定義されている。ＭＷが約５ｋＤである小型エンベロープ関連タンパク質である、ＳＨタンパク質は、ゲルを流出してしまったために、図１１には示されていない（以下参照）。
ＳＨタンパク質。    明らかにＳＨタンパク質が小型であることと、相対的にメチオニン含量が低い理由で、ＳＨタンパク質は、クリプトウイルスのＢＢＲ株及びＳＶ５のＮＩＨ ２１００５-２ＷＲ株のどちらの放射標識ビリオンにおいても検出が困難であった。両ウイルスの非標識精製ビリオン調製物を、変性及び還元条件下で、低分子量マーカータンパク質（ＢｉｏＲａｄ）の傍らで２０％ポリアクリルアミドスラブゲル上を泳動して、銀染色法（ＢｉｏＲａｄ）で染色した際に、ＳＨタンパク質として同定された、約５ｋＤのＭrを有する小型タンパク質がクリプトウイルス及びＳＶ５ビリオン調製物中に発見された。クリプトウイルスのＢＢＲ株、ＳＶ５のＮＩＨ ２１００５-２ＷＲ株のＳＨタンパク質の移動に検出可能な差異はなかった。
Ｆ0及びＨＮ の異常な同時移動。    多数のルブラウイルス（例えば、ＳＶ５）の主要エンベロープタンパク質（Ｆ0及びＨＮ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の異なるバンドとして容易に識別可能であったが、大型のクリプトウイルスＦ0タンパク質（即ち、＋２２アミノ酸）は、本タンパク質（Ｍr = ６９ ｋＤ）にしては有意に低い移動度を起因した。図１３Ａ、Ｂに示すように、係るゲルの詳細な検査は、多少困難ではあるが、両タンパク質に識別を可能にした。図１３Ａと１３Ｂは、主要クリプトウイルスエンベロープタンパク質Ｆ0 及びＨＮの移動パターンの写真を示す。図１３Ａは、主要クリプトウイルスエンベロープタンパク質Ｆ0 及びＨＮの観察されたほぼ同時移動を示す。図１３ＡのＣＳＦ陽性患者（右レーン）からのＲＩＰの拡大は、クリプトウイルスＦ0 及びＨＮタンパク質のほぼ同時移動の結果生じる「弓型」または「稜型」構造を示す。クリプトウイルスＦ0 及びＨＮタンパク質のほぼ同時移動と、シミアンウイルス５類似タンパク質の離散型移動の図による解釈を図１３Ｂに示す。
【００６８】
〈実施例６〉  マウスの実験的感染：動物モデルの作製
感染性クリプトウイルスストック（ＣＶ-ｌc細胞で調製）及び生存非増殖型感染ＡＶ3／ＳＳＰＥ 細胞を使って、実験用マウス２系（Ｑｕａｃｋｅｎｂｕｓｈ及び有色、Ｃ５７ブラックの非近交種）に脳内接種した。
簡単に言えば、新生児マウス（１〜２日齢）に、５ ｘ １０4 ＰＦＵ無細胞クリプトウイルスまたは５ ｘ １０3 非増殖型感染ヒト羊膜細胞（ＡＶ3／ＳＳＰＥ）のいずれかを含む０．０２５ｍＬ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）を注射によって接種した。接種後、新生児マウスは、自由に食餌と水を供給されているその母親の元に戻した。毎日接種マウスの観察を行った。２１日後に罹患動物において初めて疾患の症状が出現し、他の動物では、６０日以上後まで症状は現れなかった。観察された症状は、悪液質、筋痙攣、振戦、強迫性行動（例えば、長時間のひっかき、擦りつけ行動、またはくるくる回る行動）、活動高進／知覚過敏、テンカン発作及び痙攣、並びに昏迷を含んだ。これらの結果は、クリプトウイルスの脳内接種が亜急性中枢神経系（ＣＮＳ）疾患を起因することを実証した。マウスにおける神経学的、神経変性、及び／または神経精神医学的疾患の呈示は、ヒトにおける呈示と実質的に識別不能である。
全ての接種動物がウイルスのヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）に対する抗体を発生したが、その全てがエンベロープタンパク質（Ｆ、ＨＮ、及び ＳＨ）に対する抗体を発生したわけではない。クリプトウイルスビリオンを接種されたマウスの９０％以上が、エンベロープタンパク質に対する抗体を発生したが、ＡＶ3／ＳＳＰＥ 細胞を接種されたマウスでは３３％のみが抗体を発生した。
同時に、感染性クリプトウイルスストックで接種された動物の多くは、著明な神経病理学的疾患を発症したが、非増殖型感染ＡＶ3／ＳＳＰＥ 細胞を接種された動物はほとんど係る疾患を発症せず、そしてウイルスのエンベロープタンパク質に対する抗体の発生とＣＮＳ症状の発症には強い関連性があった。これは、ＣＮＳ疾患の発症は、ウイルスによる急性または亜急性ＣＮＳ感染及びある細胞または組織におけるウイルス構造タンパク質全ての発現に依存することを示唆する。
以下にさらに詳細な例を示す：
Ｑｕａｃｋｅｎｂｕｓｈマウス。  ５ ｘ １０4 ＰＦＵの クリプトウイルス（ＢＢＲ株）（１０個体）または麻疹ウイルス（エドモンストン株）（８個体）を脳内接種した二腹の１〜２日齢のＱｕａｃｋｅｎｂｕｓｈマウスを、母親の元に戻して、３ヶ月間にわたって観察した。２匹の動物（１匹はクリプトウイルス、他方は麻疹ウイルスを接種）が死亡しているのが発見され、翌朝には部分的に食べられていた。これらの死亡は、「針による外傷」及び／または母親の共食いに拠った。麻疹ウイルスを接種されたどのマウスも、試験期間を通じて神経学的、神経変性、生理学的または神経精神医学的症状を発症しなかったが、クリプトウイルスを接種された２匹のオスマウスが、接種３〜４週間後に萎縮症及び対側後肢麻痺（左後肢）を発症した。３番目（メス）マウスは、接種の約４週間後に後肢を引きずっている（非萎縮性）いるのが観察されたが、翌日殺されて半ば共食いされているのが発見された。クリプトウイルスを接種された９匹中３匹が後肢麻痺を発症（３３％）したが、どの動物も、試験期間にわたってテンカン発作、消耗または神経精神医学的な顕著な症状は示さなかった。新生児時にクリプトウイルスを接種されたが、顕性な症状を発症しなかった成熟メスＱｕａｃｋｅｎｂｕｓｈマウスのかなりの数の子孫に、後肢萎縮症と麻痺が観察された。この現象の出現頻度は、係る特徴を持って生まれて、後に発症するような新生児動物を母親が共食いする傾向があるために、評価することが困難であった。
【００６９】
有色マウス。    １〜２日齢の有色マウスの３群の同腹仔（２６個体から成る）に５ ｘ １０4 ＰＦＵのクリプトウイルス（ＢＢＲ株）、シミアンウイルス５（ＮＩＨ ２１００５-２ＷＲ株）、または麻疹ウイルス（エドモンストン株）、または偽感染細胞を脳内接種後、毎日観察した。各同腹仔の半分にクリプトウイルスを接種し（１３匹）、他の半分を３群に分けて、シミアンウイルス５（６匹）、麻疹ウイルス（４匹）、または偽感染ＣＶ-１c 溶解物（３匹）で感染した。各群は区別目的で、１つの肢の上部皮膚にフェノールレッド染色でマークした（即ち、右前肢、左前肢、右後肢、左後肢）。クリプトウイルスを接種した１匹は接種後２４〜４８時間で死亡したが、これは母親の元に戻したときに摂食を中止（あるいは拒否された）理由による、「針外傷／飢餓」に起因した。３〜４週間後に、１匹オスと１匹メスが強直間代性姿勢でケージ内で死亡しているのが発見された−どちらの動物もクリプトウイルスを接種されていた。その同腹仔と比較するとどちらも体重が低めであったことが注記された。クリプトウイルス接種２ヶ月後、３匹目のマウス（オス）が悪液質、摂食障害性消耗、振戦、及びテンカン発作を有することが観察された（図７Ａ）。次の１ヶ月にわたり（接種後約１１週）、４匹目の動物（オス）が、消耗は観察されなかったが、振戦とテンカン発作を発症した（データの表示なし）。ＳＶ５のＮＩＨ ２１００５-２ＷＲ株を接種された 図７Ａに示したクリプトウイルス感染マウスのオス同腹仔を図７Ｂに示す。マウスを麻疹ウイルスエドモンストン株、偽感染ＣＶ-ｌc 細胞、またはホモジナイズドＡＶ3／ＳＳＰＥ細胞のいずれかで接種した場合、同一の結果が観察された（即ち、全て健康のままであって、神経学的、神経変性、または神経精神医学的症状を発症したものは全くなかった。データ表示なし）。
その後の６ヶ月にわたり、（接種後９ヶ月まで観察した）、クリプトウイルスを接種された残りの動物（残り８匹のうち４匹）の有意な数が生理学的、神経学的、及び／または神経精神医学的症状を発症した。係る遅発性動物は、亜急性発症動物（即ち、接種後最初の３ヶ月に症状を発症したもの）において観察された顕性のテンカン発作とは著しく対照的である症状を呈した。これらの症状は、顕性神経学的症状というよりはむしろ生理学的、神経精神医学的並びに行動障害が優位を占めており、以下を含んだ：顕著な体重増、刺激に対する極度の攻撃的／受動的応答、強迫性行動、運動失調及び振戦。疾患動物において、攻撃性は、取り扱い時の身体的激昂または噛みつき素因によって最も頻繁に特徴づけられた。受動的動物は、過食、体重増、そして睡眠の傾向があった。反復行動がまた突発的に観察され、主として、極端なために頭部と頚部の抜け毛並びに摩擦性創傷の発症を起因するような、際限ない歩行及び／または顔洗いから成った。１匹の動物（図８Ａに示すメス）は、異常な頭蓋構造（小頭症）を有し、６ヶ月目には、肥満、チック症及び筋肉単収縮（背部と左側）並びに強迫性顔洗いとひっかき行動を含む広域な生理学的及び行動上の症状を表した。係る強迫性行動のエピソードは、１時間以上継続することが観察された。接種後初めの５ヶ月間は明らかに正常と見えた２匹目のメス動物は（図８Ｂに示す）、５ヶ月〜６ヶ月の間に顕著な運動失調、振戦及び攻撃性の呈示を開始した。この動物は正常な体重と外観を維持したが、静止時にバランスを維持するために脚を外に開き、歩行時にはつまずき、そして取り扱いまたは邪魔をすると噛みつき及びヒス音をたてたり／うなったりする傾向があった。図８に示した動物のいずれも、図７Ａに示した動物と比較すると、顕著な（大発作性）テンカン発作は発症しなかった。２匹の他の動物（１匹のオスと１匹のメス）がまた、緩徐進行性の混合症状を発症した（データ表示なし）。遅発性動物のいずれにおいても顕性テンカン発作活動は観察されず、ＳＶ５、麻疹ウイルス、または偽感染細胞を接種された動物のいずれも同様な症状は発症しなかった。
クリプトウイルスを接種された１３匹の新生児動物中、１匹は針外傷で死亡（性別不明）、２匹は、消耗症の兆候を有し強直間代姿勢で死亡（テンカン重積症による突然死の兆候）（１匹オス、１匹メス）、２匹は消耗して、大発作型テンカン発作を発症（どちらもオス）、４匹は広域遅発性神経学的／神経心理学的症状を発症（３匹メス、１匹オス）、１匹は繁殖後子殺しを犯し（メス）、そして３匹はいずれの症状も発症しなかった（２匹メス、１匹オス）。この式から針外傷死を除くと、１２匹の動物中９匹が、神経学的、神経変性、及び／または神経精神医学的症状を発症した（７５％）。２匹の間代性姿勢の死亡を除くと、１０匹の動物中７匹が症状を発症した（７０％）。これはコントロール接種マウスの併合結果と比べて極めて有意であり（クリプトウイルス接種した７／１０のマウスが神経学的症状を呈示したがコントロール群では０／１３であった、ｐ＝０．０００５、両側フィッシャー正確検定）、そしてまたＳＶ５接種マウスとのみ比較しても（７／１０に対して０／６、Ｐ＝０．０１、両側フィッシャー正確検定）、並びに麻疹接種マウスとのみ比較した場合さえ（７／１０に対して０／４、Ｐ＝０．０３５、片側フィッシャー正確検定）有意であった。この群ではマウスが少数であったために、非感染細胞溶解物で接種されたマウスと比較すると、統計学的有意さは達成されなかった（７／１０対０／３、ｐ＝０．０６９、片側フィッシャー正確検定）。しかしながら、２匹の間代性姿勢の死亡が含まれた場合でも、この少数コントロール群でさえ、有意な差があった（９／１２対０／３，ｐ＝０．０４４，両側フィッシャー正確検定）。したがって、クリプトウイルス感染に起因する疾患（複数でもよい）及び症状は明らかに有意であった。
子殺し。    新生児期にクリプトウイルスを接種されたにもかかわらず、試験の最初の９ヶ月にわたって亜急性または遅発性症状を発症しなかった４匹の有色マウスのうち、３匹はメスで、月齢９ヶ月時に未感染のオスと交配された。その結果生じた３群の同腹仔のうち２群の子孫の全ては正常に発育したが、１群の同腹仔の全て（１０匹）が殺されて、全部または部分的に母親によって共食いされた。係る子殺しは、ＳＶ５、麻疹または偽感染細胞を接種されたメスの同腹仔には起こらなかった。別の試験では（以下参照）、生存ＡＶ3／ＳＳＰＥ細胞を接種されたが、顕性な症状を発症しなかったメスの１匹は、遅発性生理学的及び行動上の症状を発症して、未感染オスと交配後同腹仔を全部子殺しした。
非増殖型感染ＡＶ3／ＳＳＰＥ細胞の接種を利用する動物モデル。    別の試験では、２群の同腹新生マウス（１８匹）を生存またはホモジナイズドＡＶ3／ＳＳＰＥ 細胞（各６匹）または生存またはホモジナイズドＡＶ3細胞（各３匹）で（生後１〜２日目に）接種した。針外傷による死亡はなかった。ホモジナイズドＡＶ3／ＳＳＰＥ 細胞、生存ＡＶ3細胞、またはホモジナイズドＡＶ3細胞（１２匹）を接種された動物のいずれも亜急性または遅発性症状を一切発生しなかったが、生存ＡＶ3／ＳＳＰＥ 細胞を接種された６匹のうちの１匹が亜急性退行変性及び神経学的症状（１匹、オス）を発症し、１匹が遅発性症状を発症した（１匹、メス）。亜急性症状を発症した動物は、脳内接種２４日後に症状を呈示した。５日間にわたって、呈示症状は悪液質、消耗症、背を丸める姿勢、チューチュー鳴いたり、クリック音を反復し、知覚過敏、尿失禁、振戦、筋痙攣、及び昏睡を含んだ。顕著なテンカン発作は観察されなかった。動物は昏睡発症時に屠殺された。遅発性症状を発症した動物（１匹メス）は、（接種後）５〜６ヶ月時に、反復性歩行、攻撃性及び進行性肥満を呈示した。６ヶ月時にこの動物を未感染オスと交配した。８匹の仔を産んだ７日後に、このマウスは全同腹仔を殺して、各仔を部分的に食べた。テンカン発作または顕性な神経学的症状の兆候は観察されなかった。ホモジナイズドＡＶ3／ＳＳＰＥ 細胞、ＡＶ3細胞、またはホモジナイズドＡＶ3細胞を接種され、交配された（計６匹）その他のメスのいずれも子殺しはしなかった。
【００７０】
〈実施例７〉  神経学的、神経変性、及び／または神経精神医学的疾患と診断されたヒト患者の血清と脳脊髄液中にクリプトウイルス特異抗体が存在する。
患者の血清とＣＳＦ中におけるウイルスの主要エンベロープタンパク質（Ｆ0とＨＮ）に対するクリプトウイルス特異抗体の存在の証拠が、急性感染ＣＶ-１c 細胞において産生された[35Ｓ]-メチオニン標識クリプトウイルス特異的タンパク質の免疫沈降法によって判別された。図１２Ａと１２Ｂは、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ （還元）後の臨床ＣＳＦ検体によって[35Ｓ]-メチオニン標識急性感染ＣＶ-１c細胞から沈降された麻疹ウイルス、またはクリプトウイルス特異的タンパク質のＲＩＰプロファイル例となるオートラジオグラム写真である。図１２Ａでは、レーン「Ｖ」は、急性感染された[35Ｓ]メチオニン標識ＣＶ-１c細胞（ＢＢＲ株）からの勾配・精製クリプトウイルスビリオンを含む。レーン「ＭＶ」は、麻疹ウイルス（エドモンストン株）で急性感染された放射標識ＣＶ-１c細胞から１１才の男児ＳＳＰＥ患者のＣＳＦによって沈降されたタンパク質を含む。レーン「Ｂ」は、麻疹ウイルスまたはクリプトウイルスで急性感染された放射標識ＣＶ-１c 細胞の１：１混合物から同一のＣＳＦ検体によって沈降されたタンパク質を含む。レーン「ＣＶ」は、クリプトウイルスで急性感染された放射標識ＣＶ-１c 細胞から同一ＣＳＦ検体によって沈降されたタンパク質を含む。図１２Ｂは、診断用スクリーニングのためにＣＳＦを採取された神経科／神経外科患者からランダムに選択された６人のＣＳＦによって沈降されたクリプトウイルス特異的タンパク質のＲＩＰプロファイルを示す。レーン２のサンプルが採取された患者は、運動失調症、錯乱及び記憶喪失を呈した成人男性であった（小脳性運動失調症と仮診断されていた）。レーン４のサンプルを採取された患者は、水頭症及び難治性テンカン発作を呈し、後にテンカン重積症で死亡した乳児（女性）であった。
【００７１】
〈実施例８〉  クリプトウイルスは、特発性ヒト神経学的、神経変性、及び／または神経精神医学的疾患であると診断された患者における疾患の発生機序に関係する
クリプトウイルスは、拒食症、多発性硬化症（ＭＳ）、テンカン、亜急性硬化性全脳炎（ＳＳＰＥ）、自閉症、精神遅滞、情動障害、情緒異常（臨床的鬱病）、精神分裂病、強迫性神経症、躁鬱病（双極性障害）、慢性疲労症候群（ＣＦＳ）、水頭症、小脳性運動失調症及び非定型ウイルス性髄膜炎を含む、特発性神経学的、神経変性、及び／または神経精神医学的疾患であると診断された患者の疾患発生機序に関連する。そのＣＳＦ中にクリプトウイルス特異抗体を有するほとんどの患者は複数の疾患を有していた。したがって、神経科または神経外科患者のＣＳＦ中におけるクリプトウイルスの主要エンベロープタンパク質（Ｆ0とＨＮ）に対する特異抗体の存在と顕著な「反復性」または強迫性要素を伴う状態の事前診断には関連性がある。
クリプトウイルス血清陽性は、必ずしもＣＳＦ陽性（即ち、ＣＳＦ中のクリプトウイルスＦ0 及びＨＮタンパク質に対する抗体の存在）あるいは任意の神経病理学的状態の診断に関連しないが、ＣＳＦ陽性は、中枢神経系の顕著な障害の事前診断と強く関連した。これらの関連性は、ある種の診断（例えば、ＳＳＰＥ、ＭＳ、ＣＦＳ、及び特発性テンカンのある形態）を受けた患者には一貫して発見され、またその他の診断（例えば、アルツハイマー病）を受けた患者からの検体にも偶然発見された。
免疫ブロット法によって分析された２つのＣＳＦ検体（データ表示なし）、または酵素結合免疫吸着アッセイ法（ＥＬＩＳＡ、図１４を参照）によって分析された血清とＣＳＦ検体で、同一サンプルで利用可能な容量が限られているためにＣＳＦ検体のほんの一部を使ってこれらのアッセイが行われたにも係わらず、同様な結果が得られた。
ある患者は、前述症状のいくつかを呈したが、ＣＳＦ検体中にウイルスに対する抗体を有さなかったが、多数の症状を呈示せず、明らかな神経病理学的または神経心理学的障害と診断されなかった患者のＣＳＦ中にクリプトウイルス特異抗体が発見された事例はなかった。
さらに、血清陽性個体（即ち、その血清中にクリプトウイルス特異抗体を有する個体）は、そのＰＢＭＮＣ中に非増殖型、不顕性、しかし誘導可能な状態にあるウイルスを潜伏している。
個々の患者のＰＢＭＮＣ中におけるウイルスの存在は、神経病理学的障害の発症と対称的に関連はしなかったが、これらの所見は、ウイルスが微小血管イベント（即ち、クリプトウイルスを担うＰＢＭＮＣのＣＮＳ中への漏入）を介して、またはその他のＣＮＳ刺激に対する免疫系応答によって（即ち、その他の感染に対する炎症性応答の一部として、クリプトウイルスを担うリンパ球のＣＮＳへの漏出、トロイの馬現象）によってＣＮＳ中への侵入を得ることができる。対称的な関連性の欠如についての参照は、ＰＢＭＮＣ検査を受け、そのＣＳＦ中にクリプトウイルス特異抗体を有する個人の全てがそれらの細胞中にウイルスを有しているが、そのＰＢＭＮＣ中にウイルスを有することが発見された全ての個人が、その時点で、神経学的、神経変性、及び／または神経精神医学的障害を罹患しているわけではないことを意味する。
以下の例がさらなる詳細を明らかにする。
（ａ）アルツハイマー病。  図１５に示すように、血清とＣＳＦの３つの対応したセット（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｐｅｃｉｍｅｎ Ｂａｎｋ （国立神経学リサーチ標本バンク）（ＮＮＲＳＢ）、ロサンゼルス、ＣＡ提供）について、放射標識した急性感染ＣＶ-１c 細胞からのクリプトウイルスＦ0とＨＮタンパク質を沈降する能力についてＲＩＰ分析によって検査した。３つの検体全てが血清中にクリプトウイルス特異抗体を有したが、患者３のみがこれらの抗体をそのＣＳＦ中に含んだ。このことは、アルツハイマー病と診断された患者３が罹患する疾患は、ＣＮＳ組織のクリプトウイルス同時感染を合併していた。あるいは、患者３は誤診されていて、実はクリプトウイルス関連神経障害を罹患していた場合もある。
サンプルのサイズは小さいにも係わらず、アルツハイマー病患者３人の全てがクリプトウイルスに曝露されていて、多分それをリンパ球に担っていたということは興味深いことである。しかしながら、患者１と２はそのＣＮＳ組織中にウイルスを有するようには思われないために、クリプトウイルスがアルツハイマー病の発症に役割を果たすとは考えにくい。
【００７２】
（ｂ）小脳性運動失調症、非定型ウイルス性髄膜炎、水頭症、特発性不規則性機能高進症及びテンカン重積症。  オーストラリア、クイーンズランド、ブリスベンにあるロイヤル・ブリスベン＆ロイヤル小児病院の臨床微生物学部によって診断スクリーンのためにＣＳＦ検体が採取された神経科または神経外科患者に由来する６６のＣＳＦ検体について盲検を行った（即ち、検体関する診断または病歴のどちらも検体スクリーニング前には提供されない）。これらのＣＳＦ検体のうち、１０検体がクリプトウイルス陽性であった（図１７参照）。１０のクリプトウイルス陽性ＣＳＦ検体のうちの１検体は、小脳性運動失調症と診断された成人男性患者のものであることが同定された。（図１２Ｂ参照）。１０のクリプトウイルス陽性ＣＳＦ検体のうちの他の１検体は、非定型ウイルス性髄膜炎と診断された成人女性患者のものであることが同定された。３番目の陽性ＣＳＦ検体は、運動失調症、記憶喪失、一時的意識喪失、テンカン発作、複視と頭痛を呈して、水頭症、慢性疲労症候群、及びテンカンの可能性があると診断された５５才男性のものであり、４番目の陽性ＣＳＦ検体は、特発性不規則性機能高進症と診断された成人男性に由来し、５番目の陽性ＣＳＦ検体は、慢性の手の運動及び難治性テンカン発作を呈して、水頭症及びテンカン重積症と診断された乳児（女性）であった（以下のｃ及びｄを参照）。残りの５つのクリプトウイルス陽性ＣＳＦ検体の診断と症状は入手できなかった。
（ｃ）慢性疲労症候群（ＣＦＳ）。  ＣＦＳの症状を呈する多数の青年及び成人患者がその血清中に高力価の抗クリプトウイルス抗体を有することが発見され、これはこのウイルスの一次感染が、慢性倦怠感及びリンパ節腫脹を付随する慢性発熱性気道内疾患として症状発現し得ることを示した。これは感染性単核症の症状（即ち咽頭炎と持続性「腺性発熱」）ではない。係る患者またはその血清またはＣＳＦ中にクリプトウイルス特異抗体を有することが発見されたその他の患者において、急性脳性（または脳症）疾患を示す証拠はなかった。「急性」とは本願では、７日以内に迅速な発症と症状の呈示することを意味する。
ＣＦＳと診断された患者からの５６の血清検体が地域の医師（ブリスベンと南西クイーンズランド）からクリプトウイルススクリーニングのために提供された。１１の対応するＣＳＦ検体が次に得られた。ＲＩＰ分析によって、血清サンプルの５４／５６（９６．４％）及びＣＳＦ検体の１０／１１（９０．９％）がクリプトウイルス特異抗体を含むことが明らかになった（図１６）。
水頭症、テンカン、及びＣＦＳと同時診断された患者を含むと（図１７及び以下のテンカンのデータを参照）、ＣＦＳ患者からの全１２のＣＳＦ検体がＲＩＰ分析されて、１１／１２（９１．７％）がその中にクリプトウイルス特異抗体を有した。
ＣＦＳと診断された患者はほとんど常に２つ以上の併発診断を受けていた。これらは：拒食症、ＭＳ、テンカン発作、情緒異常（臨床的鬱病）、精神分裂病、及び躁鬱病（双極性障害）、を含んだ。例えば、拒食症と慢性疲労症候群（ＣＦＳ）を同時診断された一人の青年女性は、ＣＳＦ中にクリプトウイルス特異抗体を有していた。実質的に全てのこれら障害の病因が特発性であることは注記に値する。
ＣＦＳ患者が呈する症状は、広域スペクトルに及ぶが、このスペクトルは、実はかなりばらばらで本疾患を代表する。これは多分以下に呈示する５人の患者の病歴を調べることによって最もよく説明されよう。
患者ＰＲは、成人男性、年齢５５才で、主として精神錯乱、嗜眠、記憶喪失、かすみ目、情緒異常、及び小発作性テンカン発作を罹患していた。ＥＥＧ結果は異常であり、これはテンカン様疾患を指示する。患者ＰＲは、進行性に悪化するＣＮＳ症状を有するが歩行可能であった。
患者ＤＦは、成人男性、年齢５２才で、主として精神錯乱、嗜眠、記憶喪失、情緒異常、及び小発作性テンカン発作を罹患していた。ＥＥＧ結果は異常で、前側半球の皮質及び皮質下機能にテンカン様応答を示した。患者ＤＦは、進行性に悪化するＣＮＳ症状を有するが歩行可能であった。
患者ＮＢは、成人女性、年齢３６才であり、主として精神錯乱、嗜眠、及び極度の疲労、記憶喪失、情緒異常、運動失調症、かすみ目、及び刺痛を罹患し、腺性発熱、長引く反復性咽頭炎、振戦、及び小発作性テンカンの病歴を有した。ＮＢの姉妹は拒食症と筋クローヌスと診断された。患者ＮＢは、進行性に悪化するＣＮＳ症状を有し、寝たきりで一部歩行可能であった。
【００７３】
患者ＫＴは、成人女性、年齢２７才であり、主として精神錯乱、集中力喪失、記憶喪失、拒食症、嗜眠及び極度の疲労、及び振戦を罹患し、反復発熱性リンパ節腫脹の病歴を有した。患者ＫＴは安定していたが寝たきりで、歩行は僅かに可能であるのみであった。
患者ＳＳは、成人女性、年齢２３才で、主として集中力喪失、記憶喪失、及び嗜眠を罹患し、年齢１４才の時から情緒異常が始まり、ＥＢＶ陰性腺性発熱の病歴を有した。直系家族メンバー（母親、父親、２姉妹、及び１兄弟）は全て血清陽性であった。さらにＳＳの母親は９年の情緒異常病歴を有し、クリプトウイルス抗原がその培養ＰＢＭＮＣ中に検出された。サンプル採取の２年後、患者ＳＳは安定かつ歩行可能となった。
（ｄ）テンカンと水頭症。  ＲＩＰ分析を使って、ＣＳＦ検体の２つの臨床コレクションにおいてクリプトウイルス特異抗体の存在を測定した。最初のコレクションは、クイーンズランド、ブリスベンにあるロイヤル・ブリスベン病院の臨床微生物学部に、神経科及び神経外科部門の医師によって提出された検体からランダムに選択された６６検体を含んだ（前記ｂを参照）。検体に関する診断または病歴のどちらも検体スクリーニング前には提供されなかった。図１７は、このコレクションからのＣＳＦで行われたＲＩＰアッセイの結果を示す。レーン２の陽性ＣＳＦ沈降物は、後に運動失調症、記憶喪失、一時的意識喪失、テンカン発作、複視、及び頭痛を呈示する５５才成人男性（ＲＷ）から得られたものであることが発見された。この患者は、水頭症状態であることが決定され、この状態を軽減するために脳室シャントを挿入する手術を受けた。この患者は、水頭症、テンカン、及び慢性疲労症候群（ＣＦＳ）と診断されていた。
コレクション１の６６のＣＳＦ検体中の１０検体が、クリプトウイルス特異抗体を含むことが発見された（１５％）。これらの患者の５人については診断が下されており、次を含んだ：（１）女乳児−水頭症及び難治性テンカン発作、後に死亡（図１２Ｂを参照）。（２）成人男性−小脳性運動失調症（図１２Ｂを参照）、（３）女児−非定型ウイルス性髄膜炎、（４）成人男性−刺痛、及び（５）図１７に関連して説明した患者−水頭症、テンカン及びＣＦＳ。
５６のクリプトウイルス陰性ＣＳＦ検体中の２検体についてのみ診断が下された。一人の患者（ＷＫ、男性）は、急性ウイルス性髄膜炎と診断され、もう一人（ＳＧ、女性）は、特発性頭蓋内圧亢進と診断された。
第二コレクション（コレクション２）は、オーストラリア、ニューサウスウェールス州、シドニーにあるキャンペルダウン小児病院において神経科医によって収集された小児（１２才以下）から得られた２０のＣＳＦ検体を含んだ。再び、検体に関する診断または病歴のどちらも検体スクリーニング前には提供されなかった。しかし、このコレクションでは、テンカン様疾患を呈した、または特発性テンカンのある形態と診断された小児からの未公開数のＣＳＦ検体を含むように要請された。
図１８は、コレクション２からのＣＳＦで行われたＲＩＰアッセイの結果を示す。レーン１で分析されたＣＳＦ沈降物は、難治性テンカン発作を発症して、テンカン重積症で死亡した新生児に由来し（患者ＣＴ、以下）、レーン２で分析された沈降物は、レノックス−ガストー／汎発性テンカンの診断を受けた小児に由来した。バンドを見るために長期間の曝露（３０日）を必要とした結果、このオートラジオグラムのバックグラウンドノイズは高かった。
コレクション２（バイアス化）で提供された２０ＣＳＦ検体のうち６検体が、クリプトウイルス特異抗体を有することが発見され、後にこのスクリーニングは、テンカンまたはその他のテンカン様疾患と診断されて、このコレクションに含まれた患者由来の７検体のうち６検体を同定したことが判明した。６つのクリプトウイルス陽性ＣＳＦ検体は以下の患者から得られた：（１）ＣＴ、難治性痙攣及びテンカン発作を有し、テンカン重積症で死亡、（２）ＬＢ、レノックス−ガトーテンカン及び汎発性テンカンと診断された、（３）ＢＭ、重度精神遅滞及びテンカンと診断された、（４）ＦＺ、難治性テンカン発作を有し、テンカン重積症で死亡した２ヶ月の小児、（５）ＣＮ、水頭症、脳性麻痺、及びテンカン様発作を有した、並びに（６）ＬＤ、原発性乳児性痙攣を有した。テンカンまたはその他のテンカン様疾患と診断された８人の患者中３人において、水頭症も同時に診断された。
【００７４】
１４のクリプトウイルス陰性ＣＳＦ検体の一つは、テンカンと診断された患者から得られたものであるが、残りの検体については診断は提供されなかった。それらの検体は、単に無症候性患者（即ち、テンカン様症状を呈示しなかったあるいはテンカン様疾患と診断されなかった患者）由来の小児神経科または神経外科検体として特徴づけられた。
（ｅ）多発性硬化症（ＭＳ）。  ＭＳ患者由来の臨床検体は、スクリーンされた物質では最も大型グループの一つを成す（３８血清サンプル及び３０ＣＳＦサンプル、このうち各３０の対応セットを含む）。血清サンプルのうち８検体は、衰弱性疾患を有し、オーストラリアの国立多発性硬化症協会によって運営されている養護施設に住んでいた、クイーンズランド、ブリスベンのＭＳ患者に由来した。これらの患者からＣＳＦ検体は得られなかった。３０の血清及びＣＳＦの対応セットは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｐｅｃｉｍｅｎ Ｂａｎｋ （国立神経学リサーチ標本バンク）（ＮＮＲＳＢ）、ロサンゼルスから提供された。
図１９は、ＮＮＲＳＢ提供の５／３０ＭＳ患者の血清サンプルについて実施したＲＩＰアッセイの結果を例示する。ＮＮＲＳＢ提供のその他の２５血清検体から得られた結果は図２０に示し、ＮＮＲＳＢ提供のＭＳ患者からのＣＳＦ検体の１６／３０から得られたＲＩＰ結果は図２１に示す。残りの８検体を用いて行われたＲＩＰの結果は同様なプロファイルを示した（データ表示なし）。図１９〜２１に示すように、これらの分析の結果は、全患者が、血清中に高レベルのクリプトウイルス特異抗体（１００％）を有し、２９／３０の患者がそのＣＳＦ中にクリプトウイルス特異抗体を有した（９６．７％）。
（ｆ）亜急性硬化性脳炎（ＳＳＰＥ）。  麻疹ウイルスのみがＳＳＰＥの単独病因であることでは説明のつかない変態（従来の技術のディスカッションを参照）が観察されたことは、ＳＳＰＥの発生機序が、麻疹及びクリプトウイルス（ＳＳＰＥ患者から単離された）によるＣＮＳの二重感染を含むことの証拠によって説明され得る。
ＳＳＰＥ患者の血清は、非増殖型感染ＡＶ3／ＳＳＰＥ 細胞からのウイルスの主要ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ、６３ ｋＤ）を沈降することが発見された（図２２参照）。図２２は、６人のオーストラリア人ＳＳＰＥ患者の血清（レーン１〜６）及び６人のコントロール血清（レーン７〜１２、クリプトウイルス主要エンベロープタンパク質（Ｆ0、ＨＮ）に対する抗体を有さない小児患者の血清）によって[35Ｓ]-メチオニン標識細胞から沈降されたクリプトウイルスＮＰタンパク質（ｐ６３）のＲＩＰプロファイルの作出後に得られたオートラジオグラム写真である。
図２３は、ＳＳＰＥと診断された年齢１１才の男児からのＣＳＦサンプルによって、[35Ｓ]-メチオニン標識麻疹ウイルス感染ＣＶ-１c 細胞（レーンＭＶ）、クリプトウイルス感染ＣＶ-１c 細胞（レーンＣＶ）、または両方の混合物（レーンＢ）から沈降された麻疹ウイルス特異的及びクリプトウイルス特異的タンパク質のＲＩＰプロファイルのオートラジオグラム写真である。レーンＶ＝[35Ｓ]-メチオニン標識クリプトウイルス感染ＣＶ-１c 細胞から勾配・精製されたクリプトウイルスビリオン。図２３は、ＳＳＰＥ患者からのＣＳＦがクリプトウイルスと麻疹ウイルスタンパク質のどちらをも沈降することを示す。このアッセイの結果は、ＳＳＰＥ  ＣＳＦは、麻疹ウイルス特異抗体及びクリプトウイルス特異抗体（即ち、麻疹ウイルスのＨＮタンパク質（レーンＭＶ）及びクリプトウイルスのＨＮ及びＦ0タンパク質（レーンＣＶ）のどちらも有し、両方がほぼ等量含まれていることを示す。クリプトウイルスタンパク質を沈降したその他のＣＳＦサンプル（例えば、ＭＳ、ＣＦＳ、またはテンカン患者由来）のいずれも、麻疹ウイルスＨＮタンパク質を沈降しなかったために、これはユニークであった。
このＣＳＦ検体によって沈降されたクリプトウイルス特異的タンパク質のＲＩＰプロファイルは、現在までに試験されたＭＳ患者、ＣＦＳ患者及び特発性テンカン患者の「クリプトウイルス陽性」ＣＳＦによって産生されるプロファイルに象徴的であった（図１２Ａと１７を比較）。Ｆ0及びＨＮタンパク質に対する抗体応答の強度にはかなりの変動があったが、一つのタンパク質またはその他に対する抗体の存在についてはほとんど変動は見られなかった。しかしながら、Ｆ1とＦ2 タンパク質に対する応答には可変性があった（即ち、多くの患者において、係る応答は存在しないと見られる）。このパラドックスは、インサイツにおけるタンパク質のタンパク質分解性切断と対応する免疫応答に関係する可能性があり（即ち、Ｆ0タンパク質は、ある患者では効率的に切断されて、Ｆ1とＦ2 フラグメントを生成し、究極的にはこれらを免疫系に曝露する）、他の患者ではこのタンパク質切断の効率が悪く（あるいは全く切断されず）、したがって、これらの患者はこれらのフラグメントに対して抗体応答をほとんど発生しないことがある）。
【００７５】
〈実施例９〉  罹患ヒト患者と実験的感染動物間の相関性
本願の例のいくつかは、その脳脊髄液（ＣＳＦ）中にクリプトウイルス特異抗体を有する患者の多数によって、あるいはこのウイルスで実験的に感染されたマウスによって、呈示されるテンカン様症状に注目している。この関連性は強いが、クリプトウイルス特異抗体をそのＣＳＦ中に有する患者の全てが顕性のテンカン発作または痙攣を呈示するわけではない。テンカン患者は典型的には、テンカン発作活動がほとんどあるいは全くないものから、軽い活動（「小発作性」または「無」テンカン発作）、反復かつ難治性「大発作性」テンカン発作に至るまでの応答スペクトルを呈する（これらの出来事は、門外漢の一般大衆によって、テンカンの全ての形態を定義する症状であるとしばしば誤解される、"Ｅｐｉｌｅｐｓｙ： Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ（テンカン：総合テキストブック）"， Ｅｎｇｅｌ， Ｊｒ． Ｊ． ａｎｄ Ｐｅｄｌｅｙ， Ｔ．Ａ．， 編集 Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ-Ｒａｖｅｎ， １９９７を参照）。
ヒトクリプトウイルス感染の症状及び兆候の発症に関して、空間的（「どこで」）、時間的（「いつ」）、並びに量子的（「他に何が」）に関与する因子を認識することが必須である：（１）どの細胞、組織、神経路、及びＣＮＳ構造がウイルスによって感染されるのか、（２）感染時点でのそれらのシステムの発生状態、及び（３）感染の発生と進行における環境及び宿主因子それぞれの役割。
例えば、ここに呈示されたデータは、テンカン様症状とこのウイルスによる初期ＣＮＳ感染（即ち、乳児期、小児初期、または青年期、及び実験的感染された新生児マウス）の間には強い相関性があることを確立し、この相関性は、成人（及びテンカン様症状を発症しない成体マウス）ではあまり強くなく、観察されたＣＮＳ兆候スペクトルははるかに広域に渡る。
一般的には、ヒトまたは実験的にこのウイルスで感染された動物によって最も頻繁に、そして一貫して呈示される特徴は、「反復性」または「強迫性」神経障害及び行動の発症である。これはおそらく、ＣＮＳ発生の異なる時点または異なるステージにおける中枢神経系（ＣＮＳ）の異なる部分のニューロン（例えば、介在ニューロン）またはニューロン路の選択的欠損（またはこれに対する免疫病理学的損傷）に起因すると思われる。
ＣＳＦ中にクリプトウイルス特異抗体を有する患者の病歴を検討すると、患者の全てが１つ以上の重度な神経障害を有すると診断されている。これらは、限定はされないが、以下を含む：
（１）亜急性硬化性脳炎（ＳＳＰＥ）：検査された４つのＣＳＦのうち４検体（１００％）、全て青年患者）、
（２）特発性／原因不明テンカン：検査された７つのＣＳＦのうち６検体（８５．７％）が、テンカン発作を呈し、特発性テンカンまたはテンカンの原因不明な形態と診断された、乳児及び小児、
（３）多発性硬化症（ＭＳ）：試験された３０のＣＳＦのうち２９検体（９６．７％）、全て成人、並びに
（４）慢性疲労症候群（ＣＦＳ）／臨床型躁鬱病：検査された１２のＣＳＦのうち１１検体（９１．７％）、全て成人。
これらの結果は、ＣＳＦ中のクリプトウイルス特異抗体とＣＮＳ疾患の狭域スペクトルの間の明らかな相関性を実証する。上記に一覧した疾患は別々の疾病特徴的実体の代表として定義されるが、現実にはこれらの患者によって呈示される症状とその診断の間にはかなりの重複がある。例えば、最終的にＳＳＰＥと診断された患者の全てが実質的には、当初はテンカンと診断されている。同様にして、初期ステージＭＳは、ＣＦＳの提示と極めて類似しており、臨床型躁鬱病はその両方の共通的特徴である。ＣＦＳの別名が「非定型多発性硬化症」であることは驚くには当たらない。（Ｂｅｌｌ、 Ｔｈｅ Ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ ａ Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｎａｍｅｓ  （千の名前を持つ疾患）， Ｐｏｌｌａｒｄ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｌｙｎｄｏｎｖｉｌｌｅ， ＮＹ [１９９１]）。
【００７６】
（１）重症テンカン様疾患を患う患者の年齢（ＳＳＰＥとテンカン、その大多数が乳児、小児、または青年）並びに（２）さらに瀰漫性または複雑な神経学的機能障害を煩う患者の年齢（例えば、ＭＳ及びＣＦＳ患者は全て成人）の間には強い相関性がある。さらに、特発性及び原因不明テンカンのある種の形態である、ＳＳＰＥ及びＭＳは、多数の共通な神経病理学的特徴を有する。これらは、離散型、限局性、または播種性硬化症領域（ＣＮＳ組織における瘢痕形成）、形成異常病巣（免疫病理学的プロセスまたはニューロン路欠失のいずれかの結果として）、及び免疫細胞の血管周囲性免疫細胞集積（病巣周辺における炎症プロセスの証拠）を含む。したがって、これらの疾患のそれぞれが、クリプトウイルス感染ＣＮＳ組織を有する空間的、時間的、量子的因子の別々の病理学的「複合体」を共有特徴として提示している可能性がある。ＳＳＰＥに関しては、本疾患には麻疹ウイルスがまた関与していることを過去のデータが確立（及び本願のデータが確証）した。ＳＳＰＥは、両ウイルスによる広域ＣＮＳ感染に起因（脳白質間に炎症性及び播種性硬化症を生起する）するが、特発性テンカンのある形態は、クリプトウイルスのみによるＣＮＳの初期感染を表す（感受性介在ニューロン及びニューロン路の欠失並びに離散性形成異常病巣の発生）。ほとんど専ら成人に発症するＭＳは、ＣＮＳの遅延性及び限局性クリプトウイルス感染の病理学的結果を代表し−完全に分化したＣＮＳ組織におけるクリプトウイルス複製の制限と成熟グリアアーキテクチャによる脳の有効な分節に拠る。
要約すると、ウイルス、あるいはウイルスで非増殖型感染された細胞によるマウスの脳内接種は、大部分の動物において亜急性神経病理学的疾患の発生を起因する。これらの疾患は、その脳脊髄液中にクリプトウイルス特異抗体を有する患者に見られるヒト神経障害の症状スペクトルと密接に類似している。
さらに、クリプトウイルス陽性ＣＳＦを有する患者は、様々な疾患を診断されており、明らかに以下の２群（１）しばしば致命的である亜急性テンカン様身体症状に優先される疾患を有する乳児、小児、及び青年、並びに（２）通常は致命的ではなく、はっきりした身体的症状は少ないが、明らかな神経心理学的要素を呈する緩徐進行性の慢性疾患を有する若年成人と成人、に分けられる。
これらの所見は、その究極的兆候が、（１）一次感染した個体の年齢、（２）ウイルスがＣＮＳ組織への侵入を獲得するメカニズム、（３）その時点での感染の度合い、（４）感染されたときのＣＮＳの発生段階、（５）感染を受けたＣＮＳの場所、（６）遺伝的因子（例えば、免疫系欠損、神経機能不全、ＣＮＳ組織上におけるウイルス受容体存在の有無等）、並びに（７）その他の環境因子（例えば、頭部外傷の存在、任意の種類の神経外科手術、その他の因子によるＣＮＳ組織の前または同時感染、薬物または毒性化学物質への曝露等）に依存する、神経学的な障害の原因であるという結論を支持する。
本発明の多数の実施形態が説明された。それにも係わらず、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく様々な変形を作製できることが理解されよう。したがって、その他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】図１は、本発明のヒトクリプトウイルスの、パラミクソウイルス科のルブラウイルス属に対する分類学的割り当てを示すチャートである。
【図２】図２は、Ｃｏｌｌｉｎらのバージョン（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  （ウイルス学）， 第三版， Ｆｉｅｌｄｓ， Ｋｎｉｐｅ， 及びＨｏｗｌｅｙ  編集， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ-Ｒａｖｅｎ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， １９９６， 第４１章， １２０６ページ， Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓｅｓ  （パラインフルエンザウイルス））から修正した系統樹である。
【図３】図３は、パラミクソウイルス科ファミリの各属の典型的メンバーの遺伝子地図の表示である。
【図４】図４は、改訂版のルブラウイルス遺伝子地図である。
【図５】図５は、還元条件下で１０％アクリルアミドＬａｅｍｍｌｉスラブゲルによるＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の勾配・精製ヒトクリプトウイルス（ＢＢＲ株）及びシミアンウイルス５（ＮＩＨ ２１００５-２ＷＲ株 ）の[35Ｓ]-メチオニン標識タンパク質の図示による比較オートラジオグラムを示す。
【図６】図６は、ローダミン・イソチオシアナート標識ヤギ抗麻疹ウイルス血清（パネルＡ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、及びＩ）とウサギ抗クリプトウイルス血清、その後でフルオレセイン・イソチオシアナート標識したヤギ抗ウサギＩｇＧ（パネルＢ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、及びＪ）で直接二重標識後に撮影した種々のＳＳＰＥ由来の非増殖型感染細胞培養物の蛍光顕微鏡写真の対応セットの組み合わせである。
【図７】図７は、同腹仔として生まれ、新生児（生後２日目）時にプラーク精製クリプトウイルス（ＢＢＲ株、図７Ａ）またはシミアンウイルス５のＮＩＨ ２１００５-２ＷＲ 株（ＳＶ５、図７Ｂ）で脳内接種された２ヶ月後の２匹のオス有色マウスの写真を示す。
【図８】図８は、同腹仔として生まれ、新生児（生後２日目）時にプラーク精製クリプトウイルス（ＢＢＲ株、図８Ａ）で脳内接種された３ヶ月後、及び新生児（生後２日目）時にプラーク精製クリプトウイルスで脳内接種された６ヶ月後（図８Ｂ）の２匹のメス有色マウスの写真を示す。
【図９】図９は、ヒトクリプトウイルスＢＢＲ株（配列番号１）とシミアンウイルス５Ｗ３Ａ株（配列番号２）のＦＡＳＴＡフォーマット配列（即ち、ｍＲＮＡセンス５’から３’）の比較である。
【図１０】図１０は、ルブラウイルスＦタンパク質ヌクレオチド（図１０Ａ、ＦＡＳＴＡフォーマット、即ち、ｍＲＮＡセンス５’から３’配列）とコードされたアミノ酸（図１０Ｂ）配列の比較である。
【図１１】図１１は、クリプトウイルスタンパク質の発現を示す。
【図１２】図１２は、亜急性硬化性全脳炎と診断された患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）（図１２Ａ）及び微生物学的スクリーニングのために採取されたＣＳＦを有する６人のランダムに選択された神経科／神経外科患者のＣＳＦ（図１２Ｂ）を用いて、[35Ｓ]-メチオニン標識ウイルス特異的タンパク質の沈降とＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離によって得られた典型的な放射線免疫検定プロファイル（ＲＩＰ）のオートラジオグラム写真を示す。
【図１３】図１３は、２つのＣＳＦ検体によって、クリプトウイルスＢＢＲ株で急性感染された[35Ｓ]-メチオニン標識ＣＶ-１C 細胞から沈降されたクリプトウイルス特異的タンパク質の放射性免疫検定プロファイル（ＲＩＰ）の高解像オートラジオグラム（図１３Ａ）、並びに、クリプトウイルスのＢＢＲ株（図１３Ｂ  レーンＣＶ）及びＳＶ５のＮＩＨ ２１００５-２ＷＲ株（図１３Ｂ  レーンＳＶ５）の勾配・精製ビリオンの主要な対応構造タンパク質の移動を図によって示している。
【図１４】図１４は、勾配・精製クリプトウイルスビリオンを標的として用いた、対応する血清と４人の血清陽性の神経科／神経外科患者からのＣＳＦ検体のＥＬＩＳＡを示す。
【図１５】図１５は、アルツハイマー病と診断された患者からの３セットの対応する血清（Ｓ）とＣＳＦ（Ｃ）を用いたＲＩＰアッセイの写真である。
【図１６】図１６は、慢性疲労症候群（ＣＦＳ）と診断された患者からの４つのＣＳＦ検体を用いたＲＩＰ分析後のオートラジオグラム写真である。
【図１７】図１７は、「コレクション１」（以下参照）として得られたＣＳＦサンプルを用いたＲＩＰ分析後のオートラジオグラム写真である。
【図１８】図１８は、「コレクション２」（以下参照）として得られたＣＳＦサンプルを用いたＲＩＰ分析後のオートラジオグラム写真である。
【図１９】図１９は、（３８サンプル中から選ばれた）５人のＭＳ患者から得られた血清サンプルについてＲＩＰアッセイを実施後のオートラジオグラム写真である。
【図２０】図２０は、（３８サンプル中から選ばれた）２５人のさらなるＭＳ患者から得られた血清サンプルについてＲＩＰアッセイを実施後のオートラジオグラム写真である。
【図２１】図２１は、１６人のＭＳ患者から得られた１６のＣＳＦ検体についてＲＩＰアッセイ実施後のオートラジオグラム写真である。
【図２２】図２２は、６人のオーストラリア人ＳＳＰＥ患者の血清（レーン１〜６）及び６人のコントロール血清（レーン７〜１２、クリプトウイルス主要エンベロープタンパク質（Ｆ0、及びＨＮ）に対する抗体を有さない小児患者の血清）によって[35Ｓ]-メチオニン標識細胞から沈降されたクリプトウイルスＮＰタンパク質（ｐ６３）のＲＩＰプロファイルの作出後に得られたオートラジオグラムの写真である。
【図２３】図２３は、ＳＳＰＥと診断された年齢１１才の男児からのＣＳＦによって、[35Ｓ]-メチオニン標識麻疹ウイルス感染ＣＶ-１c 細胞（レーンＭＶ）、クリプトウイルス感染ＣＶ-１c 細胞（レーンＣＶ）、または両方の混合物（レーンＢ）から沈降された麻疹ウイルス特異的及びクリプトウイルス特異的タンパク質のＲＩＰプロファイルのオートラジオグラム写真である。
【図２４】図２４は、クリプトウイルス感染ニューロンの顕微鏡写真を示す。
【図２５】図２５は、持続性感染ＡＶ3／ＳＳＰＥ／ＭＶ細胞におけるクリプトウイルスと麻疹ウイルスの細胞内ヌクレオカプシドの分別ｉｍｍｕｎｏｇｏｌｄ標識の写真を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図９．１】
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【図９．２】
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【図９．３】
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【図９．４】
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【図９．５】
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【図９．６】
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【図９．７】
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【図９．８】
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【図９．９】
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【図９．１０】
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【図９．１１】
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【図９．１２】
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【図９．１３】
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【図９．１４】
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【図９．１５】
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【図９．１６】
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【図９．１７】
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【図９．１８】
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【図９．１９】
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【図９．２０】
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【図９．２１】
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【図９．２２】
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【図９．２３】
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【図９．２４】
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【図９．２５】
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【図１０Ａ．１】
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【図１０Ａ．２】
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【図１０Ａ．３】
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【図１０Ａ．４】
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【図１０Ａ．５】
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【図１０Ａ．６】
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【図１０Ｂ．１】
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【図１０Ｂ．２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図２０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2005503766.tif 000337
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005503766.tif 000338
【国際調査報告】
2005503766.tif 000339
2005503766.tif 000340
2005503766.tif 000341