(57)【要約】野生型藻類と比較して葉緑体の硫酸取り込み能が減少したまたは除去された遺伝子改変藻類を培養することにより、持続した水素生成が得られる。硫黄を含む液体または固体培地で密閉環境において藻類を培養すると、水素が連続して生成される。または、藻類を、やはり水素を生成する細菌の存在下で培養することも可能である。生成される水素は回収され、クリーンエネルギー源として用いられ得る。
2005516629.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
正常な野生型藻類と比較して硫酸透過酵素発現が減少した藻類を、照明条件下において硫黄を含む培地中で培養する段階；
大気中の酸素から藻類培養物を密閉する段階；および
発生する水素ガスを回収する段階
を含む、水素ガスを生成させる方法。
【請求項２】
藻類が緑藻類であり、野生型藻類と比較して硫酸透過酵素発現が減少するように人工的に操作されるゲノムを含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
藻類が単細胞の光合成アノキシジェニック藻類である、請求項2記載の方法。
【請求項４】
藻類がロドバクター・スファエロイドおよび遺伝子改変されたクラミドモナス・レインハルドティから選択される、請求項1記載の方法。
【請求項５】
藻類が、プロテオバクテリア；αプロテオバクテリア；ロドバクター目；ロドバクター科の系統を有するアノキシジェニック光合成細菌であるロドバクター・スファエロイドである、請求項1記載の方法。
【請求項６】
藻類が、正常な野生型藻類と比較して50%以下の硫酸透過酵素発現である下方制御された硫酸透過酵素発現を有する単離株である、請求項1記載の方法。
【請求項７】
CrcpSulPに対するアンチセンス配列の挿入により藻類が遺伝子改変される、請求項2記載の方法。
【請求項８】
遺伝子改変藻類が、CrcpSulPのアンチセンス鎖の挿入、CrcpSulPのセンス鎖の挿入、CrcpSulPの除去、およびCrcpSulPの標的遺伝子欠失から選択される技法により改変される、請求項2記載の方法。
【請求項９】
アンチセンス配列が配列番号:2の一部にハイブリダイズする、請求項7記載の方法。
【請求項１０】
配列番号:2；配列番号:3、および配列番号:2または配列番号:3にハイブリダイズする配列から選択される、単離されたヌクレオチド配列。
【請求項１１】
配列番号:1および配列番号:1に対して90%以上の配列相同性を有する配列からなる群より選択される、単離されたアミノ酸配列。
【請求項１２】
硫酸取り込み経路が天然、野生型、未改変藻類と比較して50%以下に下方制御される、遺伝子改変藻類。
【請求項１３】
緑藻類である、請求項12記載の藻類。
【請求項１４】
藻類のゲノムへのアンチセンスCrcpSulPポリヌクレオチドの挿入により内因性CrcpSulP遺伝子の発現が下方制御される、請求項13記載の藻類。
【請求項１５】
クラミドモナス・レインハルドティである、請求項14記載の藻類。
【請求項１６】
CrcpSulP mRNA転写産物の一部にハイブリダイズするアンチセンス配列によりCrcpSulP遺伝子の発現が下方制御される、請求項12記載の藻類。
【請求項１７】
水；
藻類増殖栄養素；
硫酸透過酵素発現が未改変の野生型藻類と比較して50%以上減少するように遺伝子改変された藻類
を含む組成物。
【請求項１８】
藻類が単細胞の光合成アノキシジェニック藻類である、請求項17記載の組成物。
【請求項１９】
a. 照明した嫌気的条件下で緑藻類の遺伝子改変試料をTAP培地で培養する段階；
b. 試料の一定分割量を硫黄を含む培地に移す段階； 
c. 明条件下で分割量を培養する段階；および
d. 分割量のARS活性レベルを検出する段階
を含み、アリルスルファターゼ（ARS）活性レベルの増加が、遺伝子改変緑藻類が野生型藻類と比較して硫黄取り込みが不十分であることの正の指標である、遺伝子改変緑藻類の試料において低レベルの硫黄取り込みを検出するアッセイ法。
【請求項２０】
配列番号:2に相補的なヌクレオチド配列からなる、単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
配列番号:2のコドン118〜412に相補的な配列を含む、単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
配列番号:2のコドン118〜412に相補的なアンチセンス配列を含む発現ベクター。
【請求項２３】
クラミドモナス・レインハルドティのsulP 1株；および
嫌気的であり光合成を行うロドバクター・スファエロイド細菌
を含む組成物。
【請求項２４】
細菌；ファーミキューテ；クロストリジウム；クロストリジウム目；クロストリジウム科の系統を有するクロストリジウム属種をさらに含む、請求項23記載の組成物。
【請求項２５】
クラミドモナス・レインハルドティのsulP 1株およびロドバクター・スファエロイドとクロストリジウム属種との組み合わせを培養する段階を含む、水素生成過程。
【請求項２６】
液体培地中にクラミドモナス・レインハルドティのsulP 1株およびロドバクター・スファエロイド細菌を加える段階；
液体培地を一定期間および水素生成を可能にする条件下で太陽光に曝露する段階
を含む、水素ガスを生成する方法。
【請求項２７】
培地中にクロストリジウムを加える段階
をさらに含む、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
二酸化炭素および無機栄養素を含む硫黄含有培地中で、藻類を含むバイオマスを、一定期間ならびに藻類がオキシジェニック光合成を起こすためおよび水素を生成するための条件下で太陽光に供する段階；ならびに
培地中の嫌気性光合成細菌を、一定期間および培地中でニトロゲナーゼ/ヒドロゲナーゼ酵素系から水素を生成するための条件下で太陽光に供する段階
を含む、水素ガスを生成する方法。
【請求項２９】
クロストリジウム属種を介してクラミドモナス/ロドバクターの培養液であるバイオマスの発酵を誘導する段階
をさらに含む、請求項28記載の過程。
【請求項３０】
液体培地中にクラミドモナス・レインハルドティの遺伝子改変株を加える段階；
ロドバクター・スファエロイド光合成細菌の株を加える段階；
液体培地を一定期間およびバイオマスおよび水素の生成を可能にする条件下で太陽光に曝露する段階；
培地中の嫌気性光合成細菌を、一定期間および培地中でニトロゲナーゼ/ヒドロゲナーゼ酵素系から水素を生成するための条件下で太陽光に供する段階；
培地中にクロストリジウムの株を加える段階；ならびに
クロストリジウム属種を介して培養液中のバイオマスの発酵を誘導する段階
を含む、水素ガスを生成する方法。
【請求項３１】
遺伝子改変藻類が、硫酸透過酵素遺伝子のアンチセンス鎖の挿入、硫酸透過酵素遺伝子のセンス鎖の挿入、硫酸透過酵素遺伝子の除去、および硫酸透過酵素遺伝子の標的遺伝子欠失からなる群より選択される技法により硫酸透過酵素の活性が減少するように改変される、請求項30記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は一般に、水素ガス生成の分野、および光および硫黄を含む培地の存在下において実質的な嫌気的条件下で水素ガスを生成する遺伝子改変した藻類に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
ある種の藻類および細菌が少量の水素ガスを天然で生成することが、以前から知られている。限定要因は、ヒドロゲナーゼ（水素生成反応を触媒する酵素）が酸素の存在下で下方制御されるという事実である。酸素は光合成の副産物であるため、より多量の水素を生成するためには、嫌気的環境で藻類の光合成を停止させる必要がある。藻類は環境ストレスに応答して最初に水素を生成し、その後すぐに死滅するため、これは当然のことながら持続可能な過程ではなかった。その過程において藻類を死滅させることなく水素を生成させようとするいくつかの試みがなされた。例えば、米国特許第4,442,211号では、藻類を水相中で光に供することにより水素を生成させる過程について開示した。1回目の照射期間中に退色した藻類を色が回復するまで培地中で好気的環境下で培養する間照射を増加させ、次いでこの藻類を2回目の照射に供するが、この際水素はより速い速度で生成される。
【０００３】
増殖培地中に硫黄が存在しない場合、藻類が水素ガスを生成することが後に見出された。硫黄は、葉緑体を介して硫酸イオンとして細胞によって取り込まれる。CrcpSulPは、核内の転写部位から葉緑体に移動する硫酸透過酵素である。酵素としてのその機能は、葉緑体による硫酸の取り込み促進である。葉緑体の硫酸利用能は、オキシジェニック(oxygenic)光合成の速度に影響を及ぼす。葉緑体が十分量の硫酸を摂取できない場合には、酸素を発生する正常な光合成が低下する。藻類が光の存在下で実質的に酸素を含まない系にある場合、代わりの細胞経路を介して光合成を開始し、これにより水素生成がもたらされる。
【０００４】
オキシジェニック光合成条件下においておよび暗下での嫌気的誘導の後では、ヒドロゲナーゼの活性は天然には一過性でしかない。活性の持続は、数秒から2、3分である。これは、光合成で生じるO2が[Fe]-ヒドロゲナーゼの強力な阻害剤であり（Ghirardiら、(2000) Trends Biotechnol. 12:506-511）、ヒドロゲナーゼ遺伝子発現の正の抑制因子だからである（HappeおよびKaminski (2002) Eur. J. Biochem. 269(3):1022-1032）。
【０００５】
したがって、藻類増殖培地から硫黄を除去する必要性を除き、面倒な栄養素の除去手順または培養物への新たな藻類の添加を解決する過程が必要である。さらに、デンプンおよびタンパク質等の浪費された代謝産物を回復するために細胞が正常な光合成に逆戻りする必要性を軽減しつつ、太陽光および水からの水素の連続的かつ合理的生成を可能にする過程が必要である。さらに、太陽スペクトルのできるだけ広範な部分を利用し、水素を生成させることが必要である。したがって、緑藻類および光合成紅色細菌を用いて、閉鎖系において効率的な水素生成を提供する必要性が存在する。また、硫酸の取り込み能が低下した遺伝子組換え藻類を同定するアッセイ法が必要である。藻類を用いて商業規模で水素を生成させることは、環境、地球温暖化の影響の改善、石油等のエネルギーの有限的供給に対する依存の低減、およびほぼ無限であるエネルギー供給源の創出に明らかな利点を有する。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
藻類による持続的かつ連続的な水素生成の過程を開示する。その過程は、単細胞の光合成アノキシジェニック(anoxygenic)藻類であって、好ましくはクラミドモナス・レインハルドティ(Chlamydomonas reinhardtii)である遺伝子改変した緑藻を培養する段階を含む。照明した実質的な嫌気的条件下において、藻類を液体培地または固体培地で培養する。藻類は遺伝子改変され、葉緑体の硫黄の取り込み機構が、野生型藻類と比較して50%、より好ましくは75%またはそれ以上で下方制御される（または除去される）。培養物を大気中の酸素から密閉して明所でインキュベートするが、それにより藻類の光に誘導される酸素生成速度が呼吸速度以下になる。培養物から生成される水素ガスは、クリーンエネルギー源として使用するために、好ましくは回収され保存される。
【０００７】
本発明はさらに、持続可能でありかつ商業的に実現可能な統合的生物水素生成過程を提供する。可視太陽光を利用する藻類による光生物学的水素生成を、太陽スペクトルの近赤外領域を利用する嫌気性細菌の水素生成と連関させる。2つの生物による光合成過程におけるバイオマスの蓄積は、水素および多量の小有機酸のさらなる生成のための嫌気的発酵に利用される。有機酸は、藻類および光合成細菌によるバイオマスおよび水素生成の基質となる。
【０００８】
本発明の別の局面は、例えばゲノムへのアンチセンスヌクレオチドの挿入、遺伝子自体の除去、タンパク質の翻訳の破壊、または下方制御された活性を天然に有する変異株の選択によって硫酸透過酵素遺伝子が下方制御された藻類により、水素ガスが連続的に生成される過程である。
【０００９】
本発明の別の局面は、微生物を培養するために用いられる培地が人工的に硫黄を減少させる必要がない点である。
【００１０】
本発明の別の特徴は、CrcpSulP遺伝子の発現が下方制御されている、または好ましくは除去されている点である。
【００１１】
本発明の特徴は、CrcpSulP遺伝子の上流または下流にアンチセンスポリヌクレオチドを挿入することにより、藻類を遺伝子改変する点である。
【００１２】
本発明のさらなる局面は、CrcpSulP遺伝子が除去される点である。
【００１３】
本発明の利点は、使用する培地が、培地の栄養素欠乏を必要とする以前の過程と比較して、天然の培地とより一層一致し得る点である。
【００１４】
本発明の別の局面は、80〜100時間後の培養物において藻類の生存度を回復する必要なしに、水素が連続的に生成される点である。
【００１５】
本発明のさらなる局面は、アンチセンスポリヌクレオチドまたは硫酸透過酵素遺伝子の除去により形質転換した藻類細胞をスクリーニングするアッセイ法である。
【００１６】
配列番号:1の単離されたアミノ酸配列は新規配列であり、本発明の局面である。本明細書で用いる「単離された」という用語は、タンパク質がその天然環境から分離され、その天然物が本明細書において本発明として請求されないことを意味する。配列番号:2および配列番号:3のヌクレオチド配列に関しても同様である。
【００１７】
本発明の別の特徴は、配列番号:2のゲノムDNA、配列番号:3のcDNA、および配列番号:1のアミノ酸配列である。
【００１８】
本発明の他の局面は、配列番号:1と高度の相同性、例えば90%またはそれ以上の相同性、好ましくは95%またはそれ以上の相同性を有する新規アミノ酸配列を含む。
【００１９】
本発明のさらに他の局面は、配列番号:2または配列番号:3のどちらかにハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。
【００２０】
本発明のこれらおよび他の局面、目的、利点、および特徴は、以下に詳述する本発明の詳細を読むことによって当業者に明らかとなると考えられる。
【００２１】
好ましい態様の説明
本発明を説明する前に、本発明は、記載した特定の態様に制限されず、当然のことながらそれ自体変わり得ることが理解されねばならない。また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で使用する専門用語は特定の態様を説明するためのみに用いられ、制限する意図はないことも理解されねばならない。
【００２２】
値の範囲が提供される場合、特記されない限り下限の単位の10分の1まで、その範囲の上限値と下限値の間の各仲介値もまた具体的に開示されることが理解される。規定範囲中の任意の規定値または仲介値とその規定範囲中の任意の他の規定値または仲介値との間のより小さな範囲も、本発明内に包含される。これらの小さな範囲の上限値および下限値は、独立的にその範囲に含まれても範囲から除外されてもよく、その小さな範囲内にどちらか一方の限界値が含まれる、どちらも含まれない、または両方とも含まれるそれぞれの範囲もまた、具体的に除外される任意の限定値が規定範囲内にある限り本発明内に包含される。規定範囲が限界値の一方または両方を含む場合、それら含まれた限界値のどちらか一方または両方を除外する範囲もまた、本発明に含まれる。
【００２３】
特記されない限り、本明細書で使用する専門用語および科学用語はすべて、本発明が属する分野の当業者によって共通に理解されるものと同じ意味をもつ。本発明の実施または試験において、本明細書に記載したものと類似したまたは同等の任意の方法および材料が使用できるが、本明細書に記載した方法および材料が好ましい。本明細書で言及したすべての文献は、その文献の引用に関連する方法および/または材料を開示および説明するために、参照として本明細書に組み入れられる。
【００２４】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」とは、特記する場合を除き、その対象物の複数形も含むことに留意されたい。したがって、例えば「1つの細胞」についての言及は複数のそのような細胞を含み、「その発酵」についての言及は1つまたは複数の発酵段階および当業者に周知のその同等物を含み、以下同様である。
【００２５】
定義
藻類またはそれと同種のものとは、葉状植物門の藻類亜門に属する植物を指す。藻類は単細胞の光合成アノキシジェニック藻類であり、根、茎、または葉のない非寄生性の植物である；藻類はクロロフィルを含み、微視的なものから大きな海藻まで大きさは様々である。真核生物-緑色植物門-緑藻植物亜門-緑藻綱に属する緑藻類が本発明の好ましい態様であり、ボルボックス目-クラミドモナス科に属するクラミドモナス・レインハルドティが最も好ましい態様である。しかし、藻類が水素を生成可能である限りは、本発明において有用な藻類はラン藻類、紅藻類、または褐藻類であってもよい。
【００２６】
「ハイブリダイゼーション」とは、水素結合による2つの核酸配列の相互の会合を指す。2つの配列は、水素結合を支持する条件下で相互に接触して置かれることになる。この結合に影響を及ぼす要因には：溶媒の種類および量；反応温度；ハイブリダイゼーション時間；撹拌；液相配列の固相担体への非特異的結合を遮断する薬剤（デンハルツ試薬またはBLOTTO）；配列の濃度；配列の会合速度を増加させる化合物の使用（デキストラン硫酸またはポリエチレングリコール）；およびハイブリダイゼーション後の洗浄条件のストリンジェンシーが含まれる。Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版 (1989)、第2巻、第9章、9.47〜9.57ページを参照されたい。ハイブリダイゼーションは、本分野において従来法であると考えられる条件下であってよい。
【００２７】
温度および溶液イオン強度の適切な条件下で一本鎖型の核酸分子がもう一方の核酸分子にアニールできる場合に、核酸分子は、cDNA、ゲノムDNA、またはRNA等の別の核酸分子に「ハイブリダイズ可能」である（Sambrookら、前記を参照のこと）。温度およびイオン強度の条件により、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」が決まる。相同的核酸の予備的スクリーニングのためには、55℃のTm、例えば5倍のSSC、0.1% SDS、0.25%ミルク、およびホルムアミドなし；または30%ホルムアミド、5倍のSSC、0.5% SDSに相当する低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件が用いられ得る。中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、より高い温度のTm、例えば5倍または6倍のSSCを伴う40%ホルムアミドに相当する。ストリンジェンシーの高いハイブリダイゼーション条件は、最も高い温度のTm、例えば50%ホルムアミド、5倍または6倍のSSCに相当する。ハイブリダイゼーションには2つの核酸が相補的配列を含むことが必要であり、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに依存するが塩基間のミスマッチも可能である。核酸をハイブリダイズさせるために適切なストリンジェンシーは、当技術分野で周知の変量である核酸の長さおよび相補性の程度に依存する。2つの配列間の類似性および相同性が高ければ高いほど、それらの配列を有する核酸のハイブリッドのTm値は高くなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性（より高いTmに相当する）は、以下の順に低くなる：RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。長さが100ヌクレオチドを超えるハイブリッドには、Tmを計算する式が導かれている（Sambrookら、前記、9.50〜9.51を参照のこと）。より短いヌクレオチド、すなわちオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションでは、ミスマッチの位置がより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さによりその特異性が決まる（Sambrookら、前記、11.7〜11.8を参照のこと）。ハイブリダイズ可能な核酸の最低の長さは、少なくとも約10ヌクレオチド；好ましくは少なくとも約15ヌクレオチド；およびより好ましくは少なくとも約20ヌクレオチドである。
【００２８】
具体的な態様において、「標準的なハイブリダイゼーション条件」という用語は55℃のTmを指し、上記に示した条件を利用する。好ましい態様においてTmは60℃; より好ましい態様においてTmは65℃である。具体的な態様において「高いストリンジェンシー」とは、0.2倍のSSC中で68℃、50%ホルムアミド、4倍のSSC中で42℃、またはこれらの2つの条件のいずれかにおいて見られるハイブリダイゼーションレベルと同等のレベルを与える条件下でのハイブリダイゼーションおよび/または洗浄条件を指す。
【００２９】
「下方制御」とは、野生型の活性レベルと比較した活性レベルの減少を指す。活性の好ましい減少は少なくとも20%、好ましくは40%、より好ましくは50%、さらにより好ましくは70%、および最も好ましくは90%以上である。
【００３０】
本明細書で互換的に用いられる「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、およびその断片または一部、ならびにペプチド核酸（PNA）、その断片、一部、またはアンチセンス分子、およびゲノムまたは合成起源のDNAまたはRNAを指し、これらは一本鎖または二本鎖であってよく、センス鎖またはアンチセンス鎖を示してよい。特定のポリヌクレオチド配列（例えば、CrcpSulP遺伝子をコードする）を参照するために「ポリヌクレオチド」または「核酸」を用いる場合、この用語は、例えば縮重変種であるポリヌクレオチドといった引用したポリペプチドと機能的に同等であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または引用したポリペプチドの生物活性のある変種または断片をコードするポリヌクレオチドを包含することが意図されている。
【００３１】
「アンチセンスポリヌクレオチド」とは、所与のポリヌクレオチド配列の転写または翻訳と関連するポリヌクレオチド配列（例えばプロモーター）を含む所与のポリヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド配列を意味し、アンチセンスポリヌクレオチドはポリヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能である。特に関心がもたれるのは、インビトロまたはインビボにおいて転写および/または翻訳を阻害し得るアンチセンスポリヌクレオチドである。
【００３２】
本明細書で用いる「ポリペプチド」とは、オリゴペプチド、ペプチド、修飾ペプチド、またはタンパク質を指す。本明細書において天然タンパク質分子のアミノ酸配列について言及するために「ポリペプチド」を引用する場合、「ポリペプチド」および同様の用語は、引用したタンパク質分子と関連する完全に天然のアミノ酸配列にアミノ酸配列を限定することを意図してはおらず、類似体、縮重置換体等を包含することを意図している。
【００３３】
本発明の核酸はまた、例えば縮重変種、対立遺伝子変種等のヌクレオチド配列の天然変種を含む。本発明の核酸の変種は、推定上の変種の本明細書で開示するヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーション、好ましくはストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションによって同定される。例えば、適切な洗浄条件を用いることにより本発明の核酸の変種が同定され得り、その場合、対立遺伝子変種は選択した核酸プローブと比較して多くても約25〜30%塩基対のミスマッチを示す。対立遺伝子変種は一般には15〜25%の塩基対のミスマッチを含み、わずか5〜15%、または2〜5%、または1〜2%、さらに1塩基対のミスマッチを含む場合もある。
【００３４】
本明細書で用いる「単離された」という用語は、天然に存在する環境とは異なる環境に存在する、例えば天然では見出されない濃度までペプチドを濃縮するなどしてその天然環境から分離された関心対象の化合物（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）を表すことが意図される。「単離された」とは、関心対象の化合物について実質的に濃縮されている、および/または関心対象の化合物が部分的にまたは実質的に精製されている試料内の化合物を含むことが意図される。
【００３５】
「培養」という語の使用は、適切な環境条件下における、増殖をもたらす培地中での生細胞の増殖を指すことが意図される。最も一般的な培地にはブロス、ゼラチン、および寒天が含まれ、これらはすべて成分として硫黄を含むことになる。培養物は固形であっても液体であってもよい。培養は、商業規模で行っても1枚のペトリ皿で行ってもよい。
【００３６】
「調節」とは、アンチセンス鎖を添加することによる、または転写または翻訳レベルでタンパク質活性をノックアウトすることによるゲノムの遺伝的改変に特異的に応答したCrcpSulPタンパク質の活性レベルの変化を指すことが意図される。
【００３７】
本明細書内で考察する文献は、単に本出願の出願日より前にそれらが開示されているというだけの理由で提供されたものである。本明細書に記載したいかなるものも、先行発明のせいで本発明がこれら文献に先行できないことを認めると解釈されるべきではない。さらに、提供する文献の日付は実際の発行年月日と異なる可能性があり、独立して確認する必要があるかもしれない。
【００３８】
発明の概説
非連続的な緑藻の水素生成における段階の循環を図1に示す。単一のクラミドモナス・レインハルドティ培養物を2つの段階（硫黄栄養素存在下（+S）でのオキシジェニック光合成およびその非存在下での水素生成）間を循環させることにより、S除去および水素生成の一連の事象の可逆性および再現性が3回の完全な周期まで示された。周期Aにおける水素生成の最終点で、培養物に無機Sを補充した（t = 100時間）。
【００３９】
多くの種類の藻類および細菌が少量の水素を発することは、数十年前から知られている。商業上の問題は、水素を生成する酵素であるヒドロゲナーゼが酸素の非存在下においてのみ活性がある点である。酸素の存在下ではヒドロゲナーゼ経路が停止するため、光合成を行っている間は機能しない。MelisおよびHappe、Plant Physiol. 127:740-748 (2001年11月)を参照されたい。
【００４０】
クラミドモナス属は、世界中で見られる単細胞緑藻類（緑色植物）の1つの属である。クラミドモナス属では500を超える異なる種が知られているが、最も広く用いられる実験種はクラミドモナス・レインハルドティである。クラミドモナス・レインハルドティは他の光合成生物と同様に、カリウム、カルシウム、および硫黄を含む周囲の培地から得られるいくつかの多量養素を生存のために必要とする。硫黄は硫酸イオンとして葉緑体の細胞膜に吸収され、2つのアミノ酸の成分として利用され、多くの酵素およびタンパク質の成分となる。
【００４１】
緑藻類の増殖培地から硫黄を除去することにより光合成経路が変化し、光の存在下で水素ガスの生成がもたらされる。しかし、商業規模でのそのような栄養素の除去は、何千ガロンないしは何百万ガロンの培地が関与する藻類の大量培養で行うことになり扱いにくくかつ費用がかかる。さらに、硫黄除去における緑藻の水素生成は、藻類がすぐに死滅してしまうためいくらよくても非連続的な過程であり、硫黄の添加により培地を補充するか、または硫黄を欠く現存する培地に新たな藻類を添加しなくてはならない。例えば、US 2001/0053543 A1およびMelisら (2000年1月) Plant Physiol. 122:127-135を参照されたい。
【００４２】
内因性基質の異化作用の制御およびそれに付随する光合成電子伝達系への電子の供給により、本発明の局面が形成される。光合成装置による水の酸化の速度は連続的かつ正確に測定することができるが、内因性基質の異化作用およびNAD(P)H-プラストキノン酸化還元酵素活性により支持される電子伝達の測定を行うのは最も難しい。嫌気的にインキュベートしDCMUで阻害した葉緑体による水素の光生成から（Florinら (2001)、前記）、最初に水素生成の実質的速度が検出され得ることが示唆される。しかし、この過程は長い期間持続し得なかった（Zhangら (2002) Planta 214(4):552-561）。本発明は、これがNAD(P)H-プラストキノン酸化還元酵素活性に関連する電子伝達反応の能力の限界による結果であることを示す。本発明は、プラストキノンプールに電子を与え、これにより水素の光生成を導くための内因性デンプン、タンパク質、および脂質の異化作用を提供する。
【００４３】
本発明の1つの局面では、遺伝子改変して硫酸透過酵素の発現を下方制御した藻類を、太陽光を利用しニトロゲナーゼ/ヒドロゲナーゼ酵素系を介して水素を生成する嫌気性光合成細菌であるロドバクター・スファエロイド(Rhodobacter sphaeroides)と共に培養する。クロストリジウム属種を介したクラミドモナス/ロドバクターバイオマスの発酵過程により、生物水素生成の収量が増加する。
【００４４】
水素の高率生成は、ある種の単細胞緑藻類（例えばクラミドモナス）および嫌気性発酵細菌（例えばクロストリジウム）で [Fe]-ヒドロゲナーゼの触媒により起こり得る（MelisおよびHappe (2001) Plant Physiol. 127:740-748）。嫌気性光合成細菌（例えばロドバクター）は、ニトロゲナーゼ/ヒドロゲナーゼ酵素により水素を生成することができる。
【００４５】
水素ガスは、ヒドロゲナーゼ酵素を活用して藻類で生成される。ヒドロゲナーゼ酵素の単量体型は[Fe]-ヒドロゲナーゼのクラスに属し（Voordouwら (1989) J. Bacteriol. 171:3881-3889；Adams, M. (1990) Biochim. Biophys. Acta 1020:115-145；MeyerおよびGagnon (1991) Biochem. 30:9697-9704；およびHappeら (1994) Eur. J. Biochem. 222:769-774）、単細胞緑藻類の核内でコードされている。しかし、成熟タンパク質は葉緑体ストロマ内に局在し機能する。水分子の酸化、電子およびプロトンの放出、およびこれら電子のフェレドキシンへの吸エネルギー性伝達は光エネルギーにより促進されるため、分子水素の生成には光合成装置による光吸収が必須である。光合成フェレドキシン（PetF）は[Fe]-ヒドロゲナーゼへの生理的電子供与体として働き、その結果、緑藻葉緑体において可溶性[Fe]-ヒドロゲナーゼが電子伝達系に結びつけられる（Florinら (2001) J. Biol. Chem. 276:6125-6132）。CO2が存在しないと光で駆動される水素生成が増加し、これによりCO2固定と水素生成過程との間の電子の競合が示唆される（Cincoら (1993) Photosynth. Res 38:27-33）。
【００４６】
発酵細菌は、水素生成の過程において太陽エネルギーを利用しない。発酵細菌はもっぱら、増殖培地から供給されるはずの有機物の異化作用に依存している。水素はその嫌気的代謝の最終産物である。嫌気性光合成細菌は、嫌気的に増殖可能であり小有機酸から水素を生成し得る光合成従属栄養生物である（Warthmannら (1993) Appl. Microbiol. Biotechnol. 39:358-362）。これらの光合成細菌のほとんどは窒素固定微生物であり、分子N2からNH3への還元を触媒する酵素ニトロゲナーゼ/ヒドロゲナーゼを利用する。しかし、この酵素による水素の同時発生はこの過程に固有である（Hallら (1995) Photosynth. Res. 46:159-167）。N2ガスが存在しない場合、酵素は、式8H+ + 8e- + 16ATP → 4水素 + 16ADP + 16Pi (1)に従ってプロトン（H+）を水素ガスに単に還元するのみである。
【００４７】
通常これらの微生物によって吸収される赤外光は、水素生成反応を前方に駆動するのに必要とされるATP（式1）がこれらの微生物において光合成により生成される時のこの反応の触媒において重要な役割を果たす。赤外線および小有機酸を利用する嫌気性光合成細菌は、高収率の水素生成を達成し得る。しかし、4 ATP/水素（式1）の高エネルギーを必要としかつその光合成の飽和強度が非常に低いため、太陽光変換効率は低く、よって日射照度の効率的利用が妨げられる（Rochaら (2001)のBioHydrogen II. An Approach to Environmentally Acceptable Technology、Miyakiら編、Elsevier Science, New York）。
【００４８】
藻類は、光合成においてスペクトルの可視領域を利用し水分子を酸化することができるという利点を有する。この経路により、藻類は豊富な供給品から電子（e-）およびプロトン（H+）を抽出し得る。さらに、その葉緑体における光合成電子伝達を介して、これらの電子（e-）およびプロトン（H+）を組み合わせて分子水素を生成することができる。発酵細菌および嫌気性光合成細菌とは異なり、藻類は光合成によって単純な無機化合物および水からバイオマスを生成することができる。これらは、嫌気性光合成細菌よりも高い太陽光変換効率で作動し得る。より直接的な水素生成過程およびより高い太陽光変換効率がもたらされるならば、商業的水素生成の長期にわたる試みにおいて藻類はより有望となると考えられる。本発明は、遺伝子改変した藻類、嫌気性光合成細菌、および発酵細菌の長所を組み合わせて活用し、優れた収率の水素生成を達成し得る水素生成の統合的な系を提供する。
【００４９】
好ましい態様の詳細な説明
DNA挿入変異誘発およびスクリーニングを介して、クラミドモナス・レインハルドティ葉緑体包膜局在化硫酸透過酵素（CrcpSulP）を同定した。この葉緑体包膜局在化硫酸透過酵素に関して、配列番号:2の完全なゲノムDNA（塩基1〜3873）、配列番号:3のcDNA（塩基1〜1984）、および配列番号:1のタンパク質配列（アミノ酸1〜411）を提供する（Genbankアクセッション番号AF467891）。
【００５０】
クラミドモナス・レインハルドティ葉緑体包膜局在化硫酸透過酵素の遺伝子構造およびタンパク質配列を図2に示す。転写開始部位および5'UTR、5つのエキソンおよび4つのイントロン、ならびに3'UTR領域を示すCrcpSulP硫酸透過酵素遺伝子の構造を図2に提供する。完全なDNA配列（配列番号:2）を図4に示す。クラミドモナス・レインハルドティ硫酸透過酵素のアミノ酸配列（配列番号:1）を図3に示す。タンパク質のN末端領域の下線を引いたアミノ酸は、葉緑体輸送ペプチドを構成する。ペプチドをコードするcDNA（配列番号:3）を図5に提供する。
【００５１】
成熟タンパク質のヒドロパシープロットに基づくと、7つの推定膜貫通ヘリックスおよび2つの伸長した親水性ループが存在する。配列解析、およびマルカンティア・ポリモルファ(Marchantia polymorpha)（Ohyamaら (1986) Nature 322:572-574）、クロレラ・ヴルガリス(Chlorella vulgaris)（Wakasugiら (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:5967-5972）、シネコッカス属種(Synechococcus sp.)PCC 7942（LaudenbachおよびGrossmann (1991) J. Bacteriol. 173:2739-2750）、およびシネコシスティス属種(Synechocystis sp.)PCC6803（KohnおよびSchumann (1993) Plant Mol. Biol. 21:409-412；およびkanekoら (1996) DNA Res. 3:109-136）由来の硫酸透過酵素との相同性から、クラミドモナス・レインハルドティの葉緑体による硫黄の取り込みにおけるCrSulPの役割が示唆される。CrSulPの機能は、この緑藻の葉緑体による硫酸取り込みの制御である。上記のように、葉緑体の硫酸の利用能によりオキシジェニック光合成の速度が制御される。CrSulP発現を下方制御するためにクラミドモナス・レインハルドティにおいてアンチセンス技術を適用することにより、光合成能が細胞呼吸能よりも低い形質転換体が提供されることになる。そのようなアンチセンス形質転換体は、酢酸塩の存在下（TAP培地）で増殖する。そのような株の密閉培養物は、呼吸能が光合成能と同等かまたはそれ以上である時に明所で嫌気的になる。密閉培養物では、そのような株は「ヒドロゲナーゼ経路」 を示し、増殖培地中に硫酸塩が豊富である時でさえ照明により水素を生成する。そのようなクラミドモナス・レインハルドティの操作により、明所での連続的な水素生成過程が可能になり、緑藻類の水素生成活性を誘導するための栄養素置換（S欠乏）または栄養素検定（S滴定）の必要性が軽減する。
【００５２】
図6は、緑藻クラミドモナス・レインハルドティの葉緑体への硫酸の輸送における硫酸透過酵素（SulP）の機能の略図である。硫黄栄養素は葉緑体包膜局在化硫酸透過酵素（SulP）を介してサイトゾルから緑藻類の葉緑体に輸送され、そこでアミノ酸であるシステインに同化される。システインおよびその誘導体であるメチオニンはタンパク質合成に必要とされ、これにより正常なオキシジェニック光合成、炭素蓄積、およびバイオマスの増加が可能になる。
【００５３】
硫酸透過酵素の機能は、葉緑体による硫酸の取り込みを導くことである。藻類の形質転換により硫酸透過酵素遺伝子を操作し（アンチセンス技術、ノックアウト、転写減衰等）、葉緑体による硫酸栄養素の取り込みを調節することが可能である。緑藻類のそのようなアンチセンス形質転換により、増殖培地から硫酸栄養物を除去する必要なしに明所で水素が生成される。
【００５４】
PSIIのクロロフィルD1/32 kD反応中心タンパク質が全チラコイド膜タンパク質に占める割合は、1%未満である。しかし、その生合成速度は葉緑体中のルビスコ（Rubisco）の豊富な大サブユニットの速度に匹敵するか、またはそれを上回る（Bottomleyら (1974) Arch. Biochem. Biophys. 164:106-117；EagleshamおよびEllis (1974) Biochim. Biophys. Acta 335:396-407；MattooおよびEdelman (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:1497-1501）。新規D1生合成が高率である理由はこのタンパク質の代謝回転が高頻度であるためであり、これは葉緑体における光酸化障害の結果である（Melis, A. (1999) Trends Plant Sci. 4:130-135）。PSII障害および修復サイクルの研究から（GuentherおよびMelis (1990) Photosynth. Res. 23:105-109）、D1生合成および光酸化障害からのPSIIの回復を維持するためには葉緑体への硫酸栄養素の一定供給が必要であることが明らかとなった（Ohadら (1984) J. Cell Biol. 99:481-485；VasilikiotisおよびMelis (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7222-7226；Wykoffら (1998) Plant Physiol. 117:129-139）。S欠乏において、D1生合成は遅くなり、PSII修復過程は妨げられる。PSII活性が徐々に失われ酸素発生が減少し、その後葉緑体チラコイドにおいて光損傷したPSII中心の蓄積が起こる（Wykoffら (1998)、前記）。緑藻類において光合成による酸素発生の速度はミトコンドリアで呼吸の速度を下回り（Melisら (2000) Plant Physiol. 122:127-135）、密閉培養での嫌気生活がもたらされる（Ghirardiら (2000) Trends Biotechnol. 18:506-511）。この条件は緑藻類の[Fe]-ヒドロゲナーゼ経路の誘導に必要かつ十分であり（MelisおよびHappe (2001) Plant Physiol. 127:740-748）、これにより培養による水素光生成の速度が維持されることになる。この点において、CrcpSulP遺伝子発現の変化によりクラミドモナス・レインハルドティの葉緑体による硫酸栄養素の取り込みを下方制御し、この緑藻の硫酸が十分な培地において水素光生成の速度を維持することができる。これは、細胞の硫酸取り込み能を低下させるCrcpSulP遺伝子のアンチセンス技術により達成することができる。この点において、アリルスルファターゼ（ARS）活性の誘導は細胞の硫酸制限状態の有用な指標であり、それ自体、硫酸透過酵素形質転換体のハイスループットスクリーニングでのアッセイに使用され得る。5%またはそれ以上のARS活性の増加は、細胞における硫酸摂取の低下を示す。
【００５５】
遺伝子発現を制御する方法は、当技術分野において周知である。一般に2つの主要な方法が用いられるが、これらは大まかに「センス」および「アンチセンス」制御として見なされる。アンチセンス制御では、遺伝子構築物を構築するが、これは細胞のゲノムに挿入された際に、標的遺伝子により最初に転写されるメッセンジャーRNAに相補的な配列であるメッセンジャーRNAを発現する。相補的RNA配列が二本鎖を形成することにより、タンパク質への翻訳を阻害するという理論である。相補的配列は標的遺伝子の全配列と同等の長さであってもよいが、通常は断片で十分であり、取り扱いもより簡便である。
【００５６】
センス制御では、標的遺伝子の1つまたは複数のコピーをゲノムに挿入する。この場合もやはり、全長であっても部分的配列であってもよい。標的遺伝子によってコードされるタンパク質の発現が阻害される細胞から、一連の表現型が得られる。次に、当技術分野で周知の技法により、関心対象の活性を示すこれらの細胞を同定および単離することができる。部分的配列を用いたセンス制御が、阻害に有利に働く傾向がある。センス制御の機構はよくわかっていない。どちらもアンチセンス制御に関連する欧州特許出願第140,308号および米国特許第5,107,065号、ならびにセンス制御について記載した国際公開公報第90/12084号を参照されたい。
【００５７】
CrcpSulP遺伝子へのアンチセンス技術の適用により、水素生成過程を誘導するために藻類の増殖培地から硫黄栄養素を物理的に除去する必要性がなくなるため、緑藻の水素生成における先行技術である硫黄欠乏法はもはや使用されなくなる。さらに、CrcpSulP遺伝子にそのような遺伝子技術を適用することにより、現在実行できる非連続的過程とは対照的に、緑藻類で連続的水素生成が可能となる。遺伝子改変した藻類はまた、水素生成のために細菌と共に同時培養してもよい。
【００５８】
転写開始部位、5'UTR、5つのエキソン、4つのイントロン、および3'UTR領域を含むCrcpSulPの遺伝子構造を図2に示し、完全なDNA配列（配列番号:2）を図4に提供する。411アミノ酸前駆タンパク質のアミノ酸配列を配列番号:1として提供する。成熟タンパク質のヒドロパシープロットに基づくと、7つの膜貫通ヘリックスおよび2つの伸長した親水性ループが存在する。配列解析、およびマルカンティア・ポリモルファ（Ohyamaら (1986) Nature 322:572-574）、クロレラ・ヴルガリス（Wakasugi (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:5967-5972）、シネコッカス属種PCC 7942（LaudenbachおよびGrossmann (1991) J. Bacteriol. 173:2739-275）、およびシネコシスティス属種PCC6803（KohnおよびSchumann (1993) Plant Mol. Biol. 21:409-412；およびKaneko (1996) DNA Res. 3:109-136）由来の硫酸透過酵素との相同性から、CrcpSulPタンパク質がクラミドモナス・レインハルドティの葉緑体による硫酸の取り込みを制御することが示唆された。
【００５９】
アンチセンス技術
アンチセンス分子を用いて、細胞内においてCrcpSulPポリペプチド遺伝子の発現を下方制御することができる。アンチセンス試薬は、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ODN）、特に天然核酸に化学修飾を施した合成ODN、またはRNAのようなアンチセンス分子を発現する核酸構築物であってよい。アンチセンス配列は標的遺伝子のmRNAに対して相補的であり、標的遺伝子産物の発現を阻害する。アンチセンス分子は様々な機構により、例えばRNAse Hの活性化または立体障害を介して翻訳に利用されるmRNAの量を減らすことにより、遺伝子発現を阻害する。1つまたは1組のアンチセンス分子を投与することが可能であり、組み合わせは2つまたはそれ以上の異なる配列を含んでよい。
【００６０】
アンチセンス分子は適切なベクター内のすべてまたは一部の標的遺伝子配列の発現により産生され得るが、転写開始はアンチセンス鎖がRNA分子として産生されるような方向に合わせる。または、アンチセンス分子は合成オリゴヌクレオチドである。好ましい配列長は10〜3000ヌクレオチドである。より好ましい配列長は100〜2000ヌクレオチドである。さらにより好ましい配列長は600〜1200ヌクレオチドである。最も好ましい配列長は800〜1000ヌクレオチドである。長さは、阻害の効率、交差反応性の欠如を含む特異性等によって決まる。しかし、7〜8塩基長の短いオリゴヌクレオチドが、遺伝子発現の強力かつ選択的な阻害剤になり得ることも見出されている（Wagnerら (1996) Nature Biotechnol. 14:840-844を参照のこと）。
【００６１】
内因性センス鎖mRNA配列の特異的領域を、アンチセンス配列の相補部分に選択する。オリゴヌクレオチドにする特異的配列の選択は経験的方法を用いてよく、その方法ではいくつかの候補配列をインビボモデルにおいて標的遺伝子の発現阻害についてアッセイする。1組の配列を用いてもよく、その場合mRNAのいくつかの領域をアンチセンス相補に選択する。
【００６２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、当技術分野で周知の方法により化学的に合成してもよい（Wagnerら (1993)、前記を参照のこと）。好ましいオリゴヌクレオチドは、細胞内安定性およ
び結合親和性を増すために天然ホスホジエステル構造を化学修飾したものである。CrcpSulPポリペプチドが発現される葉緑体での制御を規定するプロモーターエレメントに、5'隣接領域の配列を利用してもよい。組織特異的発現は、発現パターンを決定するのに、および天然の発現パターンを模倣するプロモーターを提供するのに有用である。プロモーター領域において自然に生じる多型は、発現の天然変化を決定するのに有用である。
【００６３】
または、実験的に確定した系において発現を変化させる効果を判定するために、プロモーター領域に変異を導入してもよい。転写因子の結合に関与する特異的DNAモチーフを同定する方法は、例えば既知の結合モチーフとの配列類似性、ゲルシフト研究等、当技術分野で周知である。例えば、Blackwellら (1995) Mol. Med. 1:194-205；Mortlockら (1996) Genome Res. 6:327-333；およびJoulinおよびRichard-Foy (1995) Eur. J. Biochem. 232:620-626を参照されたい。
【００６４】
制御配列を用いて、発現の転写または翻訳制御に必要とされるシス作動性の配列を同定すること、および発現を制御または仲介するシス作動性配列およびトランス作動性因子を同定することが可能である。アンチセンスCrcpSulPポリペプチドの発現を促進するため、そのような転写または翻訳調節領域を対象遺伝子の1つに機能的に結合してよい。
【００６５】
本発明の核酸組成物は、本発明のCrcpSulPポリペプチドのすべてまたは一部をコードしてよい。DNA配列の二本鎖または一本鎖断片は、従来法に従ったオリゴヌクレオチドの化学的合成、制限酵素消化、PCR増幅等により得られ得る。通例、DNA断片は少なくとも25 ntであり、通常は少なくとも50 ntないしは75 ntないしは100 ntであるが、200 nt、240 nt、270 nt、300 ntほどの長さでも、さらに400 ntほどの長さでもよい。小さなDNA断片は、PCRのプライマー、ハイブリダイゼーションスクリーニングプローブ等として有用である。PCR等の増幅反応での使用には、一対のプライマーが用いられることになる。プライマー配列の正確な組成は本発明には重要ではないが、当技術分野で周知のように、ほとんどの適用ではプライマーはストリンジェントな条件下で対象配列にハイブリダイズすることになる。少なくとも約50 nt、好ましくは少なくとも約100 ntの増幅産物を産生する一対のプライマーを選択することが好ましい。プライマー配列を選択するためのアルゴリズムが一般に周知であり、市販のソフトウェアパッケージで入手可能である。増幅プライマーはDNAの相補鎖にハイブリダイズし、相互に向かってプライミングすることになる。
【００６６】
DNAを用いて生物試料中の遺伝子の発現を同定することも可能である。ゲノムDNAまたはRNAとしての特定のヌクレオチド配列の存在について細胞を探索する様式は文献で十分に確立されており、ここでは詳細を必要としない。DNAまたはmRNAは細胞試料から単離される。mRNAは、相補DNA鎖を形成するために逆転写酵素を使用し、その後対象DNA配列に特異的なプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行うRT-PCR法により増幅され得る。または、mRNA試料をゲル電気泳動により分離し、ニトロセルロース、ナイロン等の適切な担体に転写し、その後プローブとしての対象DNAの断片でプロービングする。オリゴヌクレオチド連結アッセイ法、インサイチューハイブリダイゼーション法および固相チップ上に配列したDNAプローブへのハイブリダイゼーション等の他の技法もまた使用され得る。対象配列にハイブリダイズするmRNAの検出により、試料中のCrcpSulp遺伝子の発現が示される。
【００６７】
任意の隣接プロモーター領域およびコード領域を含むCrcpSulP核酸または遺伝子の配列に、当技術分野で周知の様々な方法で変異を起こし、プロモーターの強度、コードされるタンパク質の配列等に標的変化を生じることも可能である。そのような変異によるDNA配列またはタンパク質産物は、本明細書に提供した配列と通常は実質的に類似することになり、すなわち少なくとも1アミノ酸異なることになり、少なくとも1つまたは2つ異なる可能性もあるが約11個以上のアミノ酸が異なる可能性はない。配列変化は、置換、挿入、または欠失であってよい。欠失にはさらに、ドメインまたはエキソンの欠失等の大きな変化が含まれ得る。細胞内局在性の研究には、緑色蛍光タンパク質（GFP）との融合タンパク質が用いられ得る。
【００６８】
クローニングした遺伝子のインビトロ突然変異誘発の技法は周知である。部位特異的突然変異誘発の手順の例は、Gustinら、Biotechniques 14:22 (1993)；Barany, Gene 37:111-23 (1985)；Colicelliら、Mol Gen Genet 199:537-539 (1985)；およびPrentkiら、Gene 29:303-313 (1984)に見出され得る。部位特異的突然変異誘発の方法は、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press 1989, 15.3〜15.108ページ；Weinerら、Gene 126:35-41 (1993)；Sayersら、Biotechniques 13:592-569 (1992)；JonesおよびWinistorfer、Biotecniques 12:528-530 (1992)；Bartonら、Nucl. Acids Res. 18:7349-7355 (1990)；MarottiおよびTomich、Gene Anal Tech 6:67-70 (1989)；およびZhu, Anal. Biochem. 177:120-124 (1989)に見出され得る。そのように変異させた遺伝子を用いて、CrcpSulPファミリーポリペプチドの構造-機能の関連性を研究すること、またはその機能または制御に影響を及ぼすタンパク質の特性を変化させることが可能である。さらに、米国特許第5,464,764号および5,487,992号に記載されているような「ノックアウト」技術を用いて、硫酸透過酵素を発現する遺伝子を除去することができ、そのどちらも参照として完全に本明細書に組み入れられ、特に内因性遺伝子を除去する方法を開示および説明するために組み入れられる。
【００６９】
上記に基づき、葉緑体による硫酸の取り込みを減少させるまたは除去することにより、水素生成が増加することが理解されると考えられる。具体的には、その活性レベルにおいて硫酸透過酵素を破壊することにより、mRNAへの遺伝子の転写を破壊することにより、またはmRNAからタンパク質への翻訳を破壊することにより、硫酸の取り込みが減少するまたは除去される。硫酸透過酵素活性および/またはその合成は多くの様々な機構により破壊され得り、それらは単独でもまたは相互に組み合わせて使用してもよい。例えば、アンチセンスポリヌクレオチドを細胞培養物に添加し、CrcpSulP遺伝子のmRNA転写産物にハイブリダイズさせることが可能である。または、クラミドモナス・レインハルドティにおいて硫酸透過酵素を発現する遺伝子をアンチセンス技術の適用により破壊し、CrcpSulP発現を下方制御することが可能である。その結果、細胞の呼吸能よりも低い光合成能を有する形質転換体が生じる。そのようなアンチセンス形質転換体は、酢酸塩の存在下（TAP培地）で増殖する。そのような株の密閉培養物は、呼吸能が光合成能と同等かまたはそれ以上になった時に、明所で嫌気的となる。
【００７０】
水素ガス生成
密閉し照射した培養において、上記の遺伝子改変した藻類株は「水素経路」を示し、増殖培地中に硫酸栄養素が豊富な場合でさえ連続して水素を生成する。例えばクラミドモナス・レインハルドティといったそのような藻類株の遺伝子操作により、藻類で水素生成活性を誘導するために栄養素置換（S欠如）または栄養素検定（S滴定）を行う必要性がなくなりつつ、明所において連続的な水素生成が可能になる。商業的に実現可能な量で生成される場合、水素は無公害かつ再生可能な燃料となり得る。
【００７１】
本発明で用いる藻類は、水素生成可能な任意の藻類であってよい。好ましくは緑藻、さらにより好ましくはクラミドモナス・レインハルドティが用いられる。ラン藻（シネコッカス属種）もまた本発明において好ましい。米国特許第4,532,210号を参照されたい。しかし、水素生成可能な任意の藻類が本発明において有用である。
【００７２】
水素の生成は明条件で行われる。日中は供給源として太陽光を使用し、および夜間および曇った条件では人工照明を使用し、好ましくは照明は連続的である。夜間に別に照明を提供することなく太陽光のみを用いてもよいが、この場合水素の収量が減少する可能性がある。
【００７３】
水素生成は、実質的な嫌気的環境で行われる。例えばヘリウムガスの添加により、系から酸素を強制的に外に出してもよい。または、より好ましくは、酸素を除去することなく最初に系を外部環境から閉鎖してもよい。藻類の光合成を欠くことにより系に存在する酸素量が自然に減少し、環境が実質的に嫌気的になり、結果として効率的な水素の生成がもたらされ得る。
【００７４】
本発明で用いる培地は、藻類を培養するために用いられる硫黄も含む任意の標準的な市販の調製品であってよい。好ましくはTAP培地を用いる。藻類は液体培地または固形培地で培養してよいが、液体培地が好ましい。
【００７５】
硫黄の非存在下では、光合成によるO2発生の速度は呼吸によるO2消費の速度を下回る。その結果、藻類の密閉培養は明所で実質的に嫌気的になる。これにより電子伝達の「Fe-ヒドロゲナーゼ」経路が誘導され、その後藻類が光合成的に水素ガスを生成するようになる。そのような水素生成の過程では、藻類細胞はかなりの量の内部デンプンおよびタンパク質を消費する。そのような異化反応により、直接的または間接的に水素生成過程が維持され得る。選択した光合成タンパク質の特性解析により、S欠如における時間に応じたルビスコ量の急激な減少、光化学系（PS）IIおよびPSIタンパク質レベルのより緩やかな減少、およびLHC-IIの組成の変化が示された。酵素Fe-ヒドロゲナーゼのレベルの増加はS欠如の最初の段階中に（0〜72時間）顕著であり、その後この酵素のレベルはより長いS欠如期間中に（t > 72時間）減少した。S欠如条件下では、残りのPSII水-酸化活性に由来する電子がFe-ヒドロゲナーゼ経路に流れ込み、それが藻類での水素生成過程に寄与する。オキシジェニック光合成、ミトコンドリア呼吸、内因性基質の異化作用、およびFe-ヒドロゲナーゼ経路を介した電子伝達間の相互作用が、この光を介した水素生成過程に必須である。
【００７６】
いくつかの異なる細胞機構のうちの任意の1つが妨げられることにより正常な光合成が破壊されることは、当業者に理解されると考えられる。正常なオキシジェニック光合成の破壊により、嫌気的環境で水素生成が誘導される。限定されない例として、アンチセンスCrcpSulP遺伝子技術の適用に起因する葉緑体からの硫黄の除去により、藻類葉緑体において光合成が破壊され水素生成が誘導される。
【００７７】
多くの非光合成嫌気性細菌は、様々な有機基質の発酵により水素を生成することができる。例えば、Enterobacter aerogenesおよびクロストリジウム・ベイジェリンキィ(Clostridium beijerinckii)は、グルコースおよびデンプンから水素を生成することができる（Taguchiら (1995) Enzyme Microb. Technol. 17:147-150；Taguchiら (1996) J. Ferment. Bioeng. 82:80-83；およびPeregoら (1998) Bioproc. Eng. 19:205-211）。クロストリジウム属種は、セルロース分解性物質を水素に変換することで知られている。そのような嫌気的発酵および水素生成の過程で、小有機酸（グリコール酸、酢酸、乳酸、リンゴ酸等）が必然的副産物として増殖培地中に蓄積する（Majizatら (1997) Wat. Sci. Tech. 36:279-286）。小有機酸の蓄積は代謝発酵および増殖の速度の阻害を引き起こすため、よって水素生成が停止する。
【００７８】
本発明の系は、非光合成嫌気性細菌による水素生成の基質として、ハイブリッドクラミドモナス/ロドバクター系によって蓄積される過剰なバイオマスを使用する。本発明は、緑藻および光合成細菌バイオマスに支持されるそのような発酵系の工程を確立する。ハイブリッドクラミドモナス/ロドバクター系から産生されるセルロースおよび他の多糖類の嫌気的発酵には、クロストリジウム属種株no.2が最も適していることが見出された。
【００７９】
順に、クロストリジウム発酵の副産物である小有機酸は、クラミドモナス/ロドバクターハイブリッド系の増殖および水素生成を維持するために必要とされる有機炭素源として利用される（図20）。
【００８０】
水に由来する電子による光合成的水素生成の過程は「バイオフォトリシス（biophotolysis）」とも称され（Miura (1995) Process Biochem. 30:1-7；およびBenemann, J.R. (1996) Nature Biotechnol. 14:1101-1103）、これは水の酸化および [Fe]-ヒドロゲナーゼへの電子の光依存的伝達を必要とし、結果として分子水素の合成をもたらす。PSIIによる水の光化学的酸化により電子が生じる。これはチラコイド膜電子伝達系を介して伝達され、PSIおよびフェレドキシンを介して[Fe]-ヒドロゲナーゼのHCクラスターに供与される（Florinら (2001)、前記）。葉緑体において、この光合成で生じた電子の最終受容体はプロトン（H+）である。この過程は、CO2固定も細胞代謝産物へのエネルギー貯蔵も含まない。この過程により、H2:O2 = 2:1比でO2およびH2の同時生成がもたらされる（Spruit, C.P. (1958) Landbouwhogeschool Wageningen 58:1-17；およびGreenbaumら (1983) Photochem. Photobiol. 37:649-655）。この機構により、光合成装置の太陽光変換能を介して、水素が連続的かつ効率的に生成される。
【００８１】
上記した生物の代謝および水素生成特性から、オキシジェニックおよびアノキシジェニック光合成を並行して利用し、太陽の可視および赤外エネルギーを収集し、この太陽エネルギーを水素エネルギーに変換する統合系の設計が示される。水素が回収され、それと同時にこのハイブリッド過程から抽出されるバイオマスが産業用酵素を用いてポリグルコースおよびタンパク質の加水分解産物からなるセルロース分解性物質に変換され得り、これは嫌気性細菌の発酵に直接供給され得る。そのような非光合成嫌気性細菌の発酵により、水素および様々な有機酸が生成される。後者は、アノキシジェニック光合成細菌の水素生成反応にフィードバックされ得る（図20）。そのような統合系は、高収率であり、持続可能であり、かつ実行可能な水素生成過程を構成する。
【００８２】
CrcpSulP遺伝子の単離および特徴づけ
光合成変異体rep55は当初、PSII修復異常株を単離するためにクラミドモナス・レインハルドティのDNA挿入形質転換体のライブラリーをスクリーニングすることにより単離された。修復異常株を単離するスクリーニング手順は、以前に報告されている（Zhangら (1997) Photosyn. Res. 53:173-184）。この形質転換体は、インビボにおける可変Chl蛍光収率の低下、光飽和した光合成速度の低下、およびチラコイド膜におけるD1タンパク質の定常状態レベルの低下を示した。rep55においてARG7挿入により影響を受ける遺伝子を同定するため、挿入部位および挿入部位に隣接するクローニングしたゲノムDNA領域の分子特徴づけを行った。逆（inverted）PCR（iPCR）法を用いて、まず最初にrep55の挿入部位の上流隣接領域をクローニングした。KpnＩ消化したrep55ゲノムDNAを鋳型として使用し、iPCRを行った（図7の略図を参照のこと）。自己連結させてから連結したDNAを線状化した後、図7Aに示すように、2セットのプライマーを用いて（iPCR5'/ iPCR3'およびNested5'/ Nested 3'）特異的iPCR産物を増幅した。配列解析から、iPCR産物はクラミドモナス・レインハルドティゲノムDNAの126 bp断片を含むことが示された。次に、この126 bp隣接領域DNA断片を、クラミドモナス・レインハルドティBACゲノムライブラリー（Incyte Genomics, Inc）をスクリーニングするためのプローブとして用いた。126 bpプローブに強力にハイブリダイズする2つのBACクローン（20g15および9b18）が同定された。制限酵素消化によりおよび126 bp断片をプローブとして使用してこれらのBACクローンを解析したところ、共通の制限酵素断片および同一のハイブリダイゼーションパターンが示された。これにより、これらのBACクローンはそれぞれ126 bp配列を含むクラミドモナス・レインハルドティゲノムDNAの同じ領域を有することが示された。さらに、プローブとして126 bp断片を用いた2つのBACクローンおよび野生型ゲノムDNAのサザンハイブリダイゼーション解析から同じハイブリダイゼーションパターンが得られ、この領域がクラミドモナス・レインハルドティゲノムにおいてユニークであることが示された（図1Bに示す制限酵素地図）。
【００８３】
クラミドモナス・レインハルドティゲノムDNAの制限マッピング解析により、126 bp DNA断片は約7 kbのSacI断片上に位置づけられた。SacI断片を配列決定した後、126 bp配列に隣接する領域にORFが同定された。このORFのヌクレオチド配列の解析から、他の既知DNA配列との類似性は示されなかった。しかし、このORFによる推定アミノ酸から、多様な細菌および藻類の硫酸透過酵素との類似性が示された（Altschulら (1997) Nucl. Acids Res. 25:3389-3402）。特に、メソスティグマ・ヴァリデ(Mesostigma viride)（Lemieuxら (2000) Nature 403:649-652）、ネフロセルミス・オリヴァセア(Nephroselmis olivacea)（Turmelら (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:10248-10253）、クロレラ・ヴルガリス（Wakasugiら (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:5967-5972）等の緑藻類、無色藻類プロトセカ・ウイッケルハミイ（KnaufおよびHachtel (1999) Genbankアクセッション番号AJ245645）、およびゼニゴケ マルカンティア・ポリモルファ（Ohymaら (1986) Nature 322:572-574）の葉緑体硫酸透過酵素の推定アミノ酸配列との高い類似性が認められた。またラン藻シネコッカス属種PCC7942（LaudenbachおよびGrossman (1991) J. Bacteriol. 173:2739-2750）、シネコシスティス属種PCC6803（Kanekoら (1986) DNA Res. 3:109-136；およびKohnおよびSchumann (1993) Plant Mol. Biol. 21:409-412）の硫酸透過酵素、および様々な細菌の硫酸ABCトランスポーター透過酵素（Sirkoら (1990) J. Bacteriol. 172:3351-3357、およびTakamiら (2000) Nucl. Acids Res. 28:4317-4331）との高い類似性も認められることから、この種の硫酸透過酵素は原核生物起源である。したがって、このクラミドモナス・レインハルドティORFは原核生物起源の硫酸透過酵素をコードすることが明らかとなった。
【００８４】
DNAヌクレオチド配列レベルでは顕著な類似性は認められないものの、遺伝子の推定アミノ酸配列はその緑藻対応物とほぼ60%の同一性（80%類似性）を示した。クラミドモナス・レインハルドティ、ならびにシネコッカス属種PCC7942、バシラス・ハロジュランス(Bacillus halodurans)（Takamiら (1999) Extremophiles 3:21-28）、およびマルカンティア・ポリモルファを含む様々な緑藻類の硫酸透過酵素の推定アミノ酸配列のClustalWアラインメントを図8に示す。クラミドモナス・レインハルドティのタンパク質で注目すべきことはN末端がかなり伸長している点であり、これは明らかな輸送ペプチドおよびこの緑藻硫酸透過酵素に独特の他の特徴を含む。またこのタンパク質の系統樹を示す（図8B）。この解析から、クラミドモナス・レインハルドティの硫酸透過酵素遺伝子は葉緑体から核ゲノムに移動したものの、そのタンパク質のアミノ酸配列はクロレラ・ヴルガリスの葉緑体にコードされる相同体よりもむしろ祖先の緑藻（メソスティグマ・ヴァリデ）のものに近いままであることが明らかになった。前者は、明らかにその祖先配列からさらに分岐している。
【００８５】
葉緑体硫酸透過酵素遺伝子（CrcpSulP）の構造
藻類の既知である葉緑体硫酸透過酵素遺伝子は葉緑体遺伝子にコードされており、これらの遺伝子のどれもがコード領域にイントロンを含まない。この点で、クラミドモナス・レインハルドティの硫酸透過酵素遺伝子の構造はコード領域に4つのイントロンが存在することから注目される（Genbankアクセッション番号AF467891、図9）。4つのイントロンの位置は、始めにイントロンのない他の相同遺伝子配列との配列比較により、および「Berkeleyショウジョウバエゲノムプロジェクト」ウェブサイト（http://www.fruitfly.org/）によるスプライス部位予測解析により同定した。次に、特異的プライマーセットを用いたRT-PCRにより作製した硫酸透過酵素のcDNA配列（Genbankアクセッション番号AF482818、図9）と比較し、イントロンの位置を確認した。それぞれ5'および3'RACE法（cDNA末端迅速増幅法）により、cDNAの5'および3'UTR配列を決定した。この解析から、転写産物の5'および3'UTRはそれぞれ157 bpおよび575 bpであることが明らかになった。遺伝子の推定アミノ酸配列を解析したところ、N末端領域に、ChloroPおよびTargetP解析（Emanuelssonら (1999) Protein Sci. 8:978-984）によって予測される54アミノ酸の推定葉緑体輸送ペプチドの存在が示された（図3）。TMperdによるタンパク質のヒドロパシー解析により（HofmannおよびStoffel (1993) Biol. Chem. Hoppe-Seyler 374:166）、7回膜貫通ヘリックスの存在が明らかになった。ヘリックスDとEの間に著しく大きな親水性ループが同定されたが、これはABC（ATP結合カセット）トランスポーターファミリーに属する透過酵素の典型的特徴である。N末端における推定葉緑体輸送ペプチドに加え、成熟クラミドモナス・レインハルドティタンパク質のN末端配列の独特な構造特徴が認められた。それは、葉緑体にコードされる相当物には存在しない短いさらなる膜貫通ドメインを含み、その後に長い親水性領域が続いていた。そのような構造特徴は、タンパク質の葉緑体包膜への折りたたみに関連している可能性がある。
【００８６】
CrcpSulPタンパク質の葉緑体への局在
CrcpSulPタンパク質が他の藻類葉緑体硫酸透過酵素に対して高い類似性を有するもののこれらの酵素が葉緑体ゲノムによってコードされる点、およびこのタンパク質のN末端において推定葉緑体輸送ペプチドが存在する点から、このタンパク質が葉緑体包膜に局在する可能性が考えられる。成熟タンパク質のオリゴペプチドに対する特異的ポリクローナル抗体を作製し、硫酸透過酵素の免疫学的局在決定のため様々なクラミドモナス・レインハルドティ細胞画分でのウェスタンブロット解析に用いた。全細胞タンパク質抽出物でのウェスタンブロット解析から（図11B）、約37 kDに移動するタンパク質との単一の抗体交差反応が示されたが、これは全長硫酸透過酵素の予測される分子量（411アミノ酸＝42 kD）よりも小さい。しかし、37 kDのタンパク質は、おそらく54アミノ酸の予測葉緑体輸送ペプチドが除去された後の成熟型硫酸透過酵素に相当する（357アミノ酸＝37.8 kD）。したがって、電気泳動移動度によると、抗体はCrcpSulPタンパク質を特異的に認識したと考えられる。このタンパク質とクラミドモナス・レインハルドティの葉緑体が関連するという考えを強化するため、穏やかな細胞分画およびパーコール勾配遠心を行い無傷の葉緑体を単離した（Masonら (1991) Plant Physiol. 97:1576-1580）。図11Aは、単離した葉緑体画分（Cp）に付随するタンパク質のSDS-PAGEクマシー染色特性を示す。この画分の多くを占めるのは、ルビスコの大サブユニット（約58 kDに移動）および31〜27 kD領域に移動するLHC-IIである。葉緑体画分に存在しないのは（全細胞抽出物と比較して）、約50〜45 kDに移動する細胞タンパク質である。ウェスタンブロット解析から、この葉緑体画分に硫酸透過酵素が存在することが確認された（図11B）。さらに、単離したクラミドモナス・レインハルドティ葉緑体から葉緑体膜を調製した。図11A（Cp m）から、この画分がLHC-IIについて濃縮されルビスコが激減したことが示される。この画分はまた、葉緑体包膜タンパク質を示す分子量の大きなバンドを含んだ。ウェスタンブロット解析により、この葉緑体包膜画分に硫酸透過酵素が存在することが確認された（図11B、Cp m）。クラミドモナス・レインハルドティ可溶性画分は抗CrcpSulP抗体との交差反応を示さなかった。この結果から、クラミドモナス・レインハルドティの葉緑体包膜における硫酸透過酵素の局在が示される。
【００８７】
硫酸制御およびCrcpSulP遺伝子発現
シネコッカス属種株PCC 7942の硫酸透過酵素（CysT遺伝子にコードされる）の発現は、硫酸欠乏条件下で誘導される（LaudenbachおよびGrossmann (1991) J. Bacteriol. 173:2739-2750）。CysT遺伝子と相同的であるCrcpSulP遺伝子もまた、そのような誘導を示す。栄養素対照（400μM硫酸）および硫黄欠乏条件下で培養した細胞において、クラミドモナス・レインハルドティのCrcpSulP遺伝子転写産物のレベルを測定した。対照では、CrcpSulP遺伝子転写産物のレベルは低かった（図12A、0時間）。6時間のS欠乏では転写産物は実質的に増加し、24時間およびそれ以上の間この高レベルのまま残存した（図12A、6時間および24時間）。図12Bは、対照またはS欠乏条件下で培養した細胞由来の全細胞タンパク質抽出物の、対応するウェスタンブロット解析を示す。細胞のそのような硫黄欠乏において、CrcpSulPタンパク質レベルの増加はほとんど認められなかった。この結果から、0〜24時間の範囲では硫黄欠乏は転写レベルでCrcpSulP遺伝子の発現を上方制御するものの、タンパク質レベルでは増加をもたらさないことが示される。
【００８８】
CrcpSulPアンチセンス形質転換体の特徴づけ
CrcpSulP遺伝子の発現は増殖培地中の硫酸栄養素の量によって転写レベルで制御され（図12A）、このことからタンパク質機能と硫酸輸送が関連する可能性が示唆される。アンチセンス技術を適用し、CrcpSulP発現を下方制御してそのような障害の機能的影響について試験した。rbcS2プロモーターをCrcpSulP cDNAの部分的配列（逆方向）に融合し、その後にrbcS2 3'UTRを続けて、CrcpSulP遺伝子のアンチセンス構築物を作製した。クラミドモナス・レインハルドティアンチセンス形質転換実験の最初の系列では、抗CrcpSulP（pAntiSulP）構築物およびARG7遺伝子を含むpJD67プラスミドでの同時形質転換において、アルギニン栄養要求体CC425株（arg7-8 mt+ cw15 sr-u-2-60；クラミドモナス遺伝子センター、デューク大学）を利用した（Daviesら (1996) EMBO J. 15:2150-2159）。まずアルギニン原栄養性に基づき、形質転換体を選択した。挿入された抗CrcpSulP cDNA配列の存在について試験するためゲノムDNA PCRを行い、約120個のアルギニン原栄養形質転換体から同時形質転換体（pJD67およびpAntiSulPの両方を含む）を選択した。この二次スクリーニングから、31個の同時形質転換体が単離された。したがって、同時形質転換効率は約26%であった。
【００８９】
硫黄欠乏は、光化学系II（PSII）活性および光飽和した酸素発生速度の減少を引き起こす（Wykoffら (1998) Plant Physiol. 104:981-987）。光飽和した酸素発生速度を測定することにより、抗CrcpSulPアンチセンス形質転換体について試験を行った。解析から、これらの形質転換体の約50%が、CC425野生型のO2発生速度と比較して20%またはそれ以上低い速度を有することが示された（図13）。これらの中でもasulp17、asulp22、およびasulp29と名付けた3つの形質転換体は、野生型のそれぞれ約42%、36%、および44%に相当する低い速度を示した。そのような表現型は、これらの形質転換体においてpAntiSulP構築物が発現し、その発現により包膜における硫酸透過酵素のレベルが低下し、その結果葉緑体による硫酸の取り込み速度が低下することに起因する可能性がある。そのような筋書きにより、葉緑体におけるその後の硫黄の制限が原因で、光飽和した光合成の速度が低下すると考えられる。
【００９０】
さらなる生化学的解析のため、アンチセンス形質転換体asulp29を選択した。最初に、asulp29細胞におけるCrcpSulPタンパク質のレベルを野生型のレベルと比較した。どちらの細胞種も対数期の初期（1〜2x106細胞mL）まではTAP中で培養し、その後異なる硫酸濃度、すなわち400μM（対照）、50μM、または0μMを含む培地に移し、明所で24時間インキュベートした。これらの試料から全細胞タンパク質抽出物を単離し、特異的抗CrcpSulP抗体によるウェスタンブロット解析に供した。図14Aから、野生型におけるこのタンパク質のレベルは、対照と比較して（図14A、400μM）、S制限（図14A、50μM）またはS欠乏（図14A、0μM）条件下での細胞のインキュベーションに際してほとんど増加を示さなかったことが示される。S欠乏に際してこのタンパク質のレベルがほとんど増加しないことは、図12A〜Bの結果と一致する。そこでは、CrcpSulP遺伝子転写産物のレベルの増加は（図12A）、この時間の範囲内では対応するタンパク質のレベルの増加を伴わなかった（図12B）。
【００９１】
また図14Aから、増殖培地中の400μM硫酸において、asulp29アンチセンス形質転換体が野生型よりも低いレベルのCrcpSulPタンパク質を発現したことが示される。さらに、このタンパク質のレベルはまた、S制限（図14A、50μM）またはS欠乏（図14A、0μM）条件下でasulp29アンチセンス細胞をインキュベーションした際にさらに低下していた。これらの結果から、asulp29におけるpAntiSulP構築物の発現がクラミドモナス・レインハルドティにおいて対応するタンパク質レベルの低下をもたらしたことが示唆される。
【００９２】
硫黄欠乏は、緑藻において葉緑体タンパク質の組成および機能の変化をもたらす（Zhangら (2002) Planta 214:552-561）。ルビスコおよびD1反応中心タンパク質の生合成/安定性は主にS欠乏により影響を受けるため、この変化にはこれらタンパク質のレベルのかなりの低下が含まれる。図14Bおよび14Cから、野生型におけるRbcLおよびD1のレベルは、対照（400μM）と比較して、S制限（50μM）またはS欠乏（0μM）条件下での細胞のインキュベーションに際して低下したことが示される。asulp29株は対照条件下（400μM硫酸）でさえも異なるS欠乏表現型を示したものの、同じ傾向が明らかであった。
【００９３】
クラミドモナス・レインハルドティのLHC-II（PSIIの集光複合体）のレベルは、S欠乏の初期段階では影響を受けない。むしろ、LHC-IIの分解を誘導するためには48〜60時間を超えるS欠乏が必要である（Zhangら (2002)、前記）。これは野生型についての図14CのLHC-IIのウェスタンブロットの結果で反映されており、24時間のS制限またはS欠乏はLHC-IIのレベルの低下を誘導しないようである。しかし、asulp29株アンチセンス形質転換体ではLHC-IIタンパク質のレベルは、培地中に400μM硫酸が存在する場合でさえも、この株においてS制限を延長する概念と一致して低下していた（図14Bおよび14C）。クラミドモナス・レインハルドティの抗CrcpSulPアンチセンス形質転換により、細胞においてCrcpSulPタンパク質のレベルの低下が生じた。次にはこれにより、おそらくアンチセンス形質転換体の葉緑体において硫酸の取り込みおよびタンパク質生合成の速度が低下するため、主要な葉緑体タンパク質（ルビスコ、D1、およびLHC-II）のレベルの実質的低下が生じた。
【００９４】
機能的には、asulp29株におけるCrcpSulPタンパク質のレベルの低下は波及効果を有し、細胞の全体的な硫酸取り込みおよび同化能力を低下させることが予想される。対照およびS制限条件下における35S-硫酸の取り込みを直接測定することにより、このことを野生型およびasulp29において試験した。図15Aは、明所、35S-硫酸の存在下で細胞を90分間にわたってインキュベーションして測定した、野生型およびasulp29形質転換体によるS取り込みを示す。結果から、対照培養条件下では（400μM硫酸を添加したTAP培地）、asulp29の硫酸輸送効率は野生型株と比較してたったの約40〜50%であることが示された。野生型およびasulp29形質転換体においてタンパク質を35S-パルスラベルすることにより、上記の論点をさらに検討した（図15B）。そのような35S-パルスラベルの解析から、asulp29形質転換体では野生型と比較して、RbcL、RbcS、およびD1タンパク質生合成の速度が約40%低いことが明らかになった。asulp29形質転換体におけるルビスコおよびD1への35S取り込み速度の低下は野生型におけるS制限と一致し、アンチセンス株におけるこれらタンパク質の定常状態レベルの低下を示すと考えられる。
【００９５】
CrcpSulPアッセイ法
先に利用した同時形質転換法では、CrcpSulPアンチセンス形質転換体に対して抗生物質耐性に基づく選択マーカーの使用を避けた。CrcpSulPタンパク質はクラミドモナス・レインハルドティの生存に必須であると考えられるため、アンチセンス技術を介してこのタンパク質のレベルを低下させることは、細胞の適応度を実質的に低下させたはずである。抗生物質耐性に基づく形質転換体の選択を避けることにより、アンチセンス変異体の回復を増加させることが可能となった。
【００９６】
独立的にアンチセンス形質転換体を作製し、その抗生物質（ゼオシン）耐性に基づいて単離した。この場合には、抗CrcpSulP cDNAの上流領域に、Ble遺伝子カセット（Lumbrerasら (1998) Plant J. 14:441-448；およびStevensら (1996）Mol. Gen. Genet. 251:23-30)を挿入した。クラミドモナス・レインハルドティcw15細胞壁欠損株の形質転換に、この構築物を用いた。ゼオシン耐性に基づき、600個を超えるアンチセンス形質転換体が選択された。
【００９７】
S欠乏に対するクラミドモナス・レインハルドティのよく知られた応答は、細胞におけるアリルスルファターゼ（ARS）活性の誘導であるが、これは細胞外部で芳香族化合物から硫酸基を切断する酵素である（de Hostosら (1989) Mol. Gen. Genet. 218(2):229-233；LienおよびSchreiner (1975) Biochim. Biophys. Acta 384:168-179）。CrcpSulP 遺伝子の発現が下方制御されるCrcpSulPアンチセンス形質転換体は、ARS活性の誘導を示すことが予想される。本発明に有用なARS活性は、少なくとも5%である。CrcpSulPアンチセンス形質転換体を、そのARS活性に基づいてスクリーニングした。したがって、野生型および600個を超えるアンチセンス形質転換体の群を、様々な硫酸濃度を含む増殖培地中でインキュベートした。検定実験において、野生型（cw15）は50μM硫酸濃度で既にそのARS活性の誘導で認められるS制限の兆候を示した。培地中の150μM硫酸濃度は、野生型におけるARS活性の誘導の閾値よりもはるかに高いことが判明した。したがって、ARS活性によるCrcpSulPアンチセンス形質転換体のスクリーニングは、150μMの硫酸を含むTAPの細胞懸濁液で行った。この結果を、細胞を400μM硫酸で懸濁したレプリカプレートの株と比較した。
【００９８】
レプリカプレートでのそのようなスクリーニングの例を図16に示すが、ここでは野生型および47個のアンチセンス形質転換体でARS活性の試験を行った。図16（上）は、対照TAP（400μM硫酸）に懸濁したこれらの株を示す。このプレートでは、形質転換体2個が検出可能なARS活性の誘導を示した（形質転換体番号11および27）。図16（下）は、S制限条件下（150μM硫酸を含むTAP）で懸濁した同じ株を示す。このプレートでは、抗SulPアンチセンス形質転換体14個がARS活性の強い誘導を示したが、野生型はこれを示さなかった。図16（下）は、アンチセンス形質転換体の中でARS活性が非常に様々であったことを示す。このように表現型が様々であるのは、アンチセンス形質転換の性質と一致する。最も強いARS活性を有する変異体は、CrcpSulP遺伝子の発現においてもっとも厳しい阻害を有する可能性が考えられる。いずれにせよ、これらの結果から、クラミドモナス・レインハルドティにおけるアンチセンス技術の適用性および様々な硫酸取り込み能を有するアンチセンス変異体を単離するためのARSスクリーニング法の使用が立証された。
【００９９】
緑藻類
緑藻類における水素の光合成代謝はHans Gaffronによって発見されたが、彼は、嫌気的条件下において、緑藻類は暗所ではCO2固定過程で電子供与体として水素を用いることができ、または明所では水素を発生できることを観察した。Gaffron独自の観察は、Scenedesmus obliquus（GaffronおよびRubin (1942) J. Gen. Physiol. 26:219-240；Bishopら (1977)のBiological Solar Energy Conversion, Misuiら編、Academic Press, New York, 3〜22ページ；およびSchnackenbergら (1993) FEBS Lett. 327:21-24）、Chlorella fusca（Kessler (1973）Arch. Microbiol. 93:91-100)；およびクラミドモナス・レインハルドティ（McBrideら (1977)のBiological Solar Energy Conversion, Misuiら編、Academic Press, New York, 77〜86ページ；MaioneおよびGibbs (1986) Plant Physiol. 80:364-368；Greenbaumら (1988) Biophys. J. 54:365-368）を含む多くの緑藻類に及んだ。
【０１００】
歴史的に、緑藻類の水素生成活性は、事前に細胞を暗所で嫌気的にインキュベーションすることによって誘導された（RoesslerおよびLien (1984) Plant Physiol. 76:1086-1089）。ヒドロゲナーゼ酵素（Vignaisら (2001) FEMS Microbiol. Rev. 25:455-501）はそのようなインキュベーション下で発現され、高い比活性で光を介する水素生成を触媒した。その酵素の単量体型は[Fe]-ヒドロゲナーゼのクラスに属し（Voordouwら (1989) J. Bacteriol. 171:3881-3889；Adams, M. (1990)、前記、MeyerおよびGagnon (1991)、前記、Happeら (1994) 、前記）、単細胞緑藻類の核内にコードされている。しかし、成熟タンパク質は葉緑体ストロマ内に局在し機能する。水分子の酸化、電子およびプロトンの放出、およびこれら電子のフェレドキシンへの吸エネルギー性伝達は光エネルギーにより促進されるため、分子水素の生成には光合成装置による光吸収が必須である。光合成フェレドキシン（PetF）は[Fe]-ヒドロゲナーゼへの生理的電子供与体として働き、その結果、緑藻類葉緑体において可溶性[Fe]-ヒドロゲナーゼが電子伝達系に結びつけられる（Florinら (2001)、前記）。CO2が存在しないと光で駆動される水素生成が増加し、これによりCO2固定と水素生成過程との間の電子の競合が示唆される（Cincoら (1993) Photocynth. Res 38:27-33）。
【０１０１】
オキシジェニック光合成条件下においておよび暗下での嫌気的誘導の後では、ヒドロゲナーゼの活性は天然には一過性でしかない。活性の持続は、数秒から2、3分である。これは、光合成で生じるO2が[Fe]-ヒドロゲナーゼの強力な阻害剤であり（Ghirardiら (2000) 、前記）、ヒドロゲナーゼ遺伝子発現の正の抑制因子だからである（Florinら (2001)、前記；およびHappeおよびKaminski (2002)、前記）。通常好気的光合成条件下で増殖する緑藻類での[Fe]-ヒドロゲナーゼの生理的意義および役割は、長い間謎であった。[Fe]-ヒドロゲナーゼのO2感受性および地球上の一般的な酸化環境条件を考えると、ヒドロゲナーゼは緑藻類の葉緑体の進化的過去の遺物に過ぎないのかどうかという疑問が生じた。そして、そもそもこの酵素および光合成の過程を利用し、商業目的で水素を生成することができるのであろうか（Zhangら (2002)、前記）。いずれにせよ、この過程の基礎的および実用的重要性のために、科学界の興味および関心は緑藻類が光合成的に分子水素を生成する能力に魅了されたのである（MelisおよびHappe (2001)、前記）。光合成的水素生成の性質および展望、ならびにその過程で遭遇する問題を以下に挙げる。
・緑藻類の光合成は、80%を超える光子変換効率で作動し得る（LeyおよびMauzerall (1982) Biochim. Biophys. Acta 680:95-106）。
・微細藻類は、80%を超える光子変換効率で光合成的に水素を生成し得る（Greenbaum, E. (1988)、前記）。
・分子酸素は、それによって水素生成活性が停止する強力かつ効果的なスイッチである。
・O2と水素の同時光生成が両立不能であることは、60年間の関連研究において制限要因であった。
【０１０２】
光合成の電子伝達系
水に由来する電子による光合成的水素生成の過程は（「バイオフォトリシスとも称される（Miura (1995)、前記、およびBanemann (1996)、前記）、水の酸化および [Fe]-ヒドロゲナーゼへの電子の光依存的伝達を必要とし、結果として分子水素の合成をもたらす。PSIIによる水の光化学的酸化により電子が生じる。これはチラコイド膜電子伝達系を介して伝達され、PSIおよびフェレドキシンを介して[Fe]-ヒドロゲナーゼのHCクラスターに供与される（Florinら (2001)、前記）。葉緑体において、この光合成で生じた電子の最終受容体はプロトン（H+）である。この過程は、CO2固定も細胞代謝産物へのエネルギー貯蔵も含まない。この過程により、H2:O2 = 2:1比で酸素および水素の同時生成がもたらされる（Spruit, C.P. (1958)、前記； Greenbaumら (1983)、前記）。この機構により、光合成装置の太陽光変換能を介して、水素の連続的かつ効率的生成が可能になる。
【０１０３】
分子酸素は酵素反応の強力な阻害剤であり[Fe]-ヒドロゲナーゼ遺伝子発現の正の抑制因子であるため、酸素を積極的に除去する措置がとられなければ、この機構は単に一過性でしか作動し得ない。照明下でPSIIの水の酸化反応により発生するO2に対する[Fe]-ヒドロゲナーゼの高い感受性が主に原因で、この直接的機構にはさらなる研究の手段としての限界および実用化への限界がある（Ghirardiら (2000)、前記）。O2 およびH2の同時生成の相互不適合性が克服されるとしても、さらなる問題が生じ、費用もかかり技術的にも困難な技術である2気体の分離が必要となる。
【０１０４】
しかし、反応混合液からO2を積極的に除去するように設計された条件下では、O2 およびH2の同時生成を延長することが可能である。例えばGreenbaumらは（Greenbaum, E. (1982) Science 196:879-880；Greenbaum, E. (1988) 、前記；Greenbaumら (1983)、前記）、ヘリウムで反応混合物を分散させて光合成で発生した気体産物（酸素および水素）を細胞の周辺から除去することにより、光合成的な水から水素への過程を何日間も連続して持続させた。本発明は、細胞内に存在する酸素を変化させるまたは除去する目的で、硫酸透過酵素（CrcpSulP）の発現を改変または下方制御し（Ghirardiら (2000)、前記）、それにより緑藻類において光で駆動される酸素および水素の同時生成を可能にする方法を提供する。
【０１０５】
電子源として水が関与し、CO2 非存在下で2:1化学量のH2およびO2を生成する上記のPSII依存性の水素光生成とは別に、別の電子源が文献で記載されている。緑藻類での内因性基質の異化作用およびそれに付随する酸化的炭素代謝により、光合成装置のための電子が産生される可能性がある（GfellerおよびGibbs (1984) Plant Physiol. 75:212-218）。そのような内因性基質の異化作用による電子は、2つの光化学系間のプラストキノンプールに流れ込む（StuartおよびGaffron (1972) Planta (Berlin) 106:101-112；GoddeおよびTrebst (1980) Arch. Microbiol. 127:245-252）。最近になって、電子をプラストキノンプールに供給するNAD(P)H-プラストキノン酸化還元酵素が、多くの維管束植物葉緑体で同定された（Shinozakiら (1986) EMBO J. 5:2043-2049；NeylandおよびUrbatsch (1996) Planta 200：273-277)。しかし、この研究は一般に緑藻ネフロセルミス・オリヴァセアに限定されていた（Turmelら (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:10248-10253）。PSIによる光吸収およびその後の電子伝達により、これら電子の酸化還元電位がフェレドキシンおよび[Fe]-ヒドロゲナーゼと同等の酸化還元まで高められる。この場合、プロトン（H+）が最終的な電子受容体として働き（GfellerおよびGibbs (1984)、前記；Bennoun, P. (2001) Biochim. Biophys. Acta 1506:133-142）、このようにして分子水素の生成が可能になる（Gibbsら (1986) Plant Physiol. 82:160-166）。PSIIの阻害剤であるDCMUの存在下では、この過程で2:1化学量の水素およびCO2が産生される（Bambergerら (1982) Plant Physiol. 69:1268-1273）。したがって、培養物を暗所で嫌気的にインキュベーションした後（[Fe]-ヒドロゲナーゼの誘導）、DCMUの存在下で藻類に照明を当てると、初期に実質的な速度の水素生成が検出され得る（HappeおよびNaber (1993) Eur. J. Biochem. 214:457-481；およびFlorinら (2001) J. Biol. Chem. 276:6125-6132）。
【０１０６】
内因性基質の異化作用の制御およびそれに付随する光合成電子伝達系への電子の供給により、本発明の局面が形成される。光合成装置による水の酸化速度は連続的かつ正確に測定することができるが、内因性基質の異化作用およびNAD(P)H-プラストキノン酸化還元酵素活性により支持される電子伝達の測定を行うのは最も難しい。嫌気的にインキュベートしDCMUで阻害した葉緑体による水素の光生成から（Florinら (2001、前記）、初期に実質的速度の水素生成が検出され得ることが示唆される。しかし、この過程は長い期間持続し得なかった（Zhangら (2002)、前記）。本発明は、これがNAD(P)H-プラストキノン酸化還元酵素活性に関連する電子伝達反応能力の限界に起因することを示す。本発明は、プラストキノンプールに電子を供給し、これにより水素の光生成に寄与する内因性デンプン、タンパク質、および脂質の異化作用を提供する。
【０１０７】
硫黄欠乏の効果
クラミドモナス・レインハルドティの増殖培地から硫黄栄養素を欠如させることにより、オキシジェニック光合成の速度の特異的だが可逆的な低下が起こるが（Wykoffら (1998)、前記）、ミトコンドリア呼吸の速度は影響を受けない（Melisら (2000)、前記)。密閉培養においては、S欠乏による光合成-呼吸関係の不均衡から細胞による酸素の純消費が起こり、その結果増殖培地での嫌気生活がもたらされる。これらの条件下で明所において[Fe]-ヒドロゲナーゼの発現が誘発され、自動的に藻類による水素生成が生じることが示された（Melisら (2000)、前記；およびGhirardiら (2000）、前記)。S欠乏下では、緑藻培養物から気泡として生じる大量の水素ガスを光生成し蓄積することが可能であり、これは2、3日間連続して利用され得る持続可能な過程である。すなわちいわゆる「2段階の光合成および水素生成」過程によるO2と水素の光生成反応の一次的分離を通じて、[Fe]-ヒドロゲナーゼのO2に対する感受性を回避することにより、水素生成が得られ得る（Melisら (2000)、前記）。この新規な2段階手順を適用することにより、緑藻クラミドモナス・レインハルドティのこれまで未知であった代謝、制御、および電子伝達経路の存在が明らかになった（Zhangら (2002)、前記）。
【０１０８】
この方法は、緑藻の光合成/呼吸関係を解明する手段として、および3生物による統合水素生成系の基礎として役立つ。この方法はまた、農業、化学工業、および燃料工業用の水素ガスの生成を提供する。この2段階の光合成および水素生成過程における事象の時間的順序は以下のとおりである：
a) 培養物においてmL当たり3〜6百万個細胞の密度に到達するまで、緑藻類を明所で光合成的に培養する（通常の光合成）。この増殖条件下では藻類の光合成/呼吸比（P/R比）は約4:1であり、酸素が放出され培地中に蓄積される。そのような条件下では、水素生成は起こり得ない。
b) 完全に消費されるように硫黄供給を慎重に制限することにより、または増殖チャンバー内で細胞を濃縮してから硫黄栄養素を欠く培地と培地交換することにより、増殖培地中の細胞に硫黄欠乏を課す。細胞は、生存のために光合成および細胞の代謝を基本的に変化させることにより、S欠乏に応答する（Daviesら (1996) EMBO J. 15:2150-2159；およびHell, R. (1997) Planta 202:138-148）。この点で注目すべきは、S欠乏の最初の24時間中に細胞のデンプン含有量を10倍増加させることである（Caoら (2001) J. Appl. Phycol. 13:25-34；およびZhangら (2002)、前記）。
c) S欠乏は、細胞の光合成および呼吸活性に明確に異なる効果を及ぼす（図1A）。オキシジェニック光合成能は、15〜20時間の半減時間で本来の速度の10%未満値まである程度指数関数的に低下する（Wykoffら (1998)、前記）。しかし、細胞呼吸能はS欠乏期間にわたってほとんど一定のままである（Melisら (2000)、前記）。したがって、S欠乏の約24時間後に光合成の絶対活性が呼吸レベルを下回り、P/R < 1比という結果になる（図1A）。光合成と呼吸間の交差点の後、S欠乏したクラミドモナス・レインハルドティの密閉培養物はすべての溶存酸素をすぐに消費し、連続した照明下で維持されるにもかかわらず嫌気的になる（Ghirardiら (2000)、前記）。
d) S欠乏条件下では、クラミドモナス・レインハルドティの密閉（嫌気的）培養物は[Fe]-ヒドロゲナーゼを誘導し、明所で水素ガスを生成するが暗所では生成しない（図1B）。光合成的水素生成の速度は時間当たりリットル培養物当たり約2.5 mLであり、これは24〜96時間にわたって持続した。その後、速度は徐々に低下した。
e) その様な水素ガス生成の過程において、細胞はかなりの量の内部デンプンおよびタンパク質を消費した（Zhangら (2002)、前記）。明らかにそのような異化反応により、直接または間接的に水素生成過程が支持される。
【０１０９】
藻類の増殖培地の硫黄栄養素欠乏は、選択的かつ可逆的にP/R比を低下させる代謝スイッチとして働く。したがって、S存在下では（P/R = 4:1）緑藻類は通常の光合成を行う（水の酸化、O2発生、およびバイオマスの蓄積）。Sの非存在およびO2の非存在下では（P/R < 1）、クラミドモナス・レインハルドティの光合成は水素生成型になる。スイッチの可逆的適用により（Sの存在/非存在）藻類がO2産生と水素生成を繰り返すことが可能となり（段階の周期、図2）、これによってO2および水素生成反応の両立不能であり相互排他的な性質が回避される。オキシジェニック光合成、ミトコンドリア呼吸、内因性基質の異化作用、およびヒドロゲナーゼ経路を介した電子伝達間の相互作用が、この光を介した水素生成過程に必須である。水素ガスの放出が、ATP生成のための葉緑体およびミトコンドリア電子伝達活性のベースラインレベルを維持する働きをし（図3）（Arnonら (1961) Science 134:1425）、このATPが長引く硫黄欠乏ストレス条件下で生物の生存に必要とされる。
【０１１０】
本発明は、水素生成に導く、オキシジェニック光合成、ミトコンドリア呼吸、内因性基質の異化作用、および[Fe]-ヒドロゲナーゼ経路を介した電子伝達間の4方向の相互作用に関する情報を提供する。本発明は、[Fe]-ヒドロゲナーゼのO2に対する感受性を回避する維持可能な水素生成を提供する。本発明は、細胞代謝の上記制御および統合を解明する手段を提供するが、その1つの局面は水素生成である。本発明は、無公害でありかつ再生可能な燃料を生成するため、緑藻類を活用する。しかし、水素ガス蓄積の実際の速度は、細胞の光合成能が生理的条件下でのO2発生能に基づく場合、そのせいぜい15〜20%である（Melisら (2000)、前記）。水素生成が比較的ゆっくりとした速度であることから、これが全体的な過程における律速段階であることが示唆される。
【０１１１】
藻類と同時培養する光合成細菌
アノキシジェニック光合成細菌には、水を酸化しプロトンおよび電子を抽出する能力がない。しかし、これらの細菌はスペクトルの赤外（700〜1,000 nm）領域を利用し、ATPの形で化学エネルギーを発生するための光合成的電子伝達を駆動する。ATPは、ニトロゲナーゼ/ヒドロゲナーゼ酵素の機能およびこれら生物による水素生成に重要である（式1）。このように、これらの生物が光合成のためにスペクトルの赤外領域を利用することから、水素生成の別の手段が提供される。そのような生物により太陽エネルギーのさらなる活用が可能になり、よって変換される日射照度が実質的に倍になる。ロドバクター・スファエロイドRV等の光合成細菌の吸光度スペクトルによりクラミドモナス・レインハルドティ等の緑藻類の吸光度スペクトル（400〜700 nm）が補足されることから、光合成的水素生成の速度の実質的上昇のためおよび優れた収率のために2つの生物を同時培養する可能性が高まる。実質的に低い光合成/呼吸比を有する緑藻類が最近になって単離され（P/R = 1.1:1を有する株sulP 1）、ロドバクター・スファエロイドRVと緑藻との非制限的な同時培養が可能になる。本発明のハイブリッド水素生成系は、水素生成の優れた速度および収率のためにこれらの生物それぞれの最も優れた特徴を利用する。本発明は、統合的水素生成のためのそのようなハイブリッド系を提供する。
【０１１２】
光合成細菌による水素生成の方法は、文献で十分に立証されている（Miyakiら (2001)のBioHydrogen II. An Approach to Environmentally Acceptable Technology, Pergamon Press, New York）。これらの細菌の水素生成に関与する酵素は、ニトロゲナーゼ/ヒドロゲナーゼである（Fedorovら (1999) Microbiol. 68:379-386；Elsenら (2000) J. Bacteriol. 182:2831-2837）。これは、緑藻類の[Fe]-ヒドロゲナーゼと同様に酸素感受性の高い酵素であり、その機能のためには嫌気生活が必要とされる。以前にそのような光合成細菌の水素生成研究が純粋な培養物で行われたが、初期炭素源として小有機酸が提供された。これらの系での水素生成速度は高く、典型的に時間当たりL培養物当たり40〜60 mLであった。しかし、小有機酸基質がこれらの微生物によって完全に消費されるため、この過程は60時間を越えて維持され得なかった。緑藻類が水素生成の過程で小有機酸を生じ（Winklerら (2002) Intl. J. Hydrogen Energy 27:1431-1439）、これが光合成細菌によって使用され得るため、ハイブリッド緑藻/光合成細菌培養物によりこの共依存過程を維持することが可能となり、よってより優れた連続性および高い収率が提供される。
【０１１３】
クロストリジウム属のメンバーのような非光合成嫌気性細菌は、糖および他の有機分子から、時間当たりL培養物当たり25〜55 mL水素の範囲の速度で水素を生成する。この過程を明確に示す基本的生化学を以下の式(2)に示す：グルコース ＋ 2H2O → 4H2 ＋ 2CO2 ＋ 2酢酸 (2)。
【０１１４】
用いる細菌種および条件により、リンゴ酸、乳酸、プロピオン酸、および/または酪酸等の他の小有機酸分子が生じ得る。これらの小有機酸の水素へのさらなる変換はエネルギー的に不利な反応であり、非光合成嫌気性細菌によって支持されない。それどころか、これら有機酸が増殖培地中に蓄積し、微生物の増殖および水素生成の阻害をもたらす。その結果、嫌気的発酵の最終産物である小有機酸の蓄積により、水素生成(式2)の持続時間は比較的短く、収率は限定され得る。
【０１１５】
実施例
実施例1：材料および方法
緑藻クラミドモナス・レインハルドティは、液体培養または1.5%アガロースプレートで、トリス-酢酸-リン酸（TAP）培地、pH 7（GormanおよびLevin (1996)）で混合栄養的に培養した。液体培養では、TAPまたは規定の改変硫酸濃度を含むTAPにより、約20μmolの光子m-2s-1の連続した照明下において平底ボトルで撹拌しながらまたはフラスコで振盪しながら25℃で培養した。培養密度は、Neubauerウルトラプレーン血球計算器およびBH-2光学顕微鏡（Olympus、東京）を用いて細胞数をカウントすることにより測定した。全光合成を計測するため、細胞を対数期初期（約1〜2 x 106細胞/ml）まで培養した。
【０１１６】
培養物の酸素発生活性は、スライド映写機ランプで照明を当てクラーク型酸素電極により測定した。CS 3-69 Corningカットオフフィルターにより、黄色光線励起が提供された。光飽和した光合成速度の測定は、酸素電極を使用し、細胞懸濁液の暗呼吸を記載することから開始しその後約1,500μmolの光子m-2s-1における酸素発生速度を測定することにより行った。酸素発生速度（勾配）の記載は、いずれの場合にも5分間記録した。
【０１１７】
挿入部位の隣接領域のクローニング
それぞれArg7遺伝子コード配列およびpBluescript部分に位置する2セットのプライマーを用いて、逆PCRを行った（図1）。PCR技法の総説に関しては、SambrookおよびRussell (2001)のMolecular Cloning, A Laboratory Manual, 第3版、Protocol 14, 8.81〜8.85ページを参照されたい。StratageneのゲノムDNA抽出キットを用いて、クラミドモナス・レインハルドティゲノムDNAを抽出した。rep55ゲノムDNA 10μgを制限酵素KpnIで消化した。消化が完了した後（一晩実施）、DNAをエタノール沈殿して水に再懸濁し、0.7%アガロースゲル電気泳動で分離した。サザンブロット解析により、pBluescriptプローブにハイブリダイズするKpnI断片のサイズが約4 kbであることをあらかじめ測定しておいた。3〜5 kbのDNA断片を含むアガロース断片を単離し、Qiagen Inc.（カリフォルニア州、バレンシア）のゲル抽出キットを用いてDNAを抽出した。ゲル精製したDNAをライゲーション反応に供し、400 uのDNAリガーゼ（DNAリガーゼ、400u/μl、New England Biolabs、Inc.、マサチューセッツ州、ビバリー）を含む100μl中で行った。ライゲーション反応は、室温で3時間行った。65℃で15分間インキュベーションしてリガーゼを失活させた後、Qiagen Inc.のPCR精製キットを用いてカラムによりライゲーション混合液を精製した。次に精製DNA溶液を、ScaIでの制限酵素消化による線状化に供した。2時間消化した後、前回と同様にカラムによりDNAを精製し、第1のプライマーセットiPCR-5'およびiPCR-3'によるPCR反応に用いた。Roboticサーマルサイクラー（Thermal Cycler）（Stratagene、カリフォルニア州、ラ・ホーヤ）を用いて、50μl容量でPCR反応を行った。装置の設定は以下の通りであった：95℃/4分、次に95℃/45秒、58℃/45秒、および72℃/1.5分の35サイクル、その後反応を終結するための72℃で10分。反応産物の一定分割量を0.8%アガロースゲル電気泳動により解析し、残りの反応混合液をPCRカラム精製キット（Qiagen Inc.）により精製した。精製PCR産物を50X希釈したうちの1μlを、Nested-5'およびNested-3'プライマーを用いるネステッドPCR反応に用いた。ネステッドPCRの設定は、アニーリング温度を60℃に上げた以外は本質的に同様であった。ネステッドPCRによるDNAバンドをゲルから精製し、pGEMTベクター（Stratagene）にクローニングし配列決定した。
【０１１８】
サザンおよびノーザンブロット解析
標準的な手順（Sanbrookら (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版、Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press）に従い、サザンブロット解析を行った。DNA 10μgを制限酵素消化し、0.7%アガロースゲル電気泳動によりサイズ分離した。20x SSC緩衝液を用いて16時間にわたってインキュベーションし、DNAをアガロースから正に荷電したナイロン膜（PALL、BiodyneB）に毛細管拡散により転写した。Amersham-Pharmaciaの非放射性標識キットAlkaPhosを使用し製造業者の説明に従って、核酸ハイブリダイゼーション反応を行った。ハイブリダイゼーション像は、KodakのBioMax-Rフィルムに記録した。ノーザンブロット解析に関しては、Qiagen Inc.の「植物全RNA抽出キット」を使用し、細胞密度1〜2x106細胞/mlの細胞培養液30 mlから全RNAを抽出した。全RNA 30μgをホルムアミド/ホルムアルデヒドゲルで電気泳動した（Sambrookら (1989)、前記）。10x SSC緩衝液を用いて毛細管転写により、RNAを正に荷電したナイロン膜（PALL、BiodyneB）に一晩転写した。放射標識プローブを用いて（ランダムプライム標識キット、La Roche）製造業者の説明に従い、RNA-DNAハイブリダイゼーション反応を行った。
【０１１９】
SDS-PAGEおよびウェスタンブロット解析
3,000xgで5分間、4℃で遠心分離し、細胞を回収した。全タンパク質を抽出するため、0.5Mトリス-HCl (pH 6.8)、7％SDS、20%グリセロース、2M尿素、および10%β-メルカプトエタノールを含む可溶化緩衝液と共に30分間インキュベーションしてペレットを溶解した。次に粗製細胞抽出液を微量遠心管中で最大速度で3分間遠心分離し、細胞残屑および他の不溶性物質を除去した。可溶化細胞10μlと80%アセトン 990μlを混合した後に短時間勢いよくボルテックスすることによって得られた色素抽出物の吸光度を測定することにより、クロロフィル濃度を測定した。次に試料を微量遠心管中で最大速度で1分間遠心分離し、非溶解物質を除去してから、Chlを決定する分光光度測定を行った（Arnon, D. (1949) Plant Physiol. 24:1-5）
【０１２０】
12.5%アクリルアミドおよび0.2%ビス-アクリルアミドを含む非連続緩衝系を用いたSDS-PAGEにより（Laemmli, U.K. (1970) Nature 227:680-685）、タンパク質を分離した。濃縮ゲルは4.5%アクリルアミドを含んだ。0.75 mm x 7 cm x 8 cmスラブゲルでの電気泳動は、10 mAの定電流で4℃で2.5時間行った。電気泳動が完了した後、ゲル上のタンパク質はクマシーで染色するか、またはニトロセルロース膜に電気転写した。特異的ポリクローナル抗体を用いて、免疫ブロット解析を行った。抗体-抗原交差反応の可視化には、化学発光（ECL、Amersham-Pharmacia）および比色（Biorad）検出法の両方を利用した、
【０１２１】
図14Aは、様々な濃度の硫酸栄養素（400、50、および0μM）を含む培地中で24時間インキュベートした野生型およびasulp29を示す。全細胞タンパク質を抽出し、ゲルに泳動した（同じ細胞数に基づく）。抗CrcpSulP特異的ポリクローナル抗体をウェスタンブロット解析に使用した。野生型におけるCrcpSulPタンパク質のレベルはほぼ同じであり（400、50、および0μM硫酸）、asulp29形質転換体ではこのタンパク質のレベルが実質的に低下していくことに留意されたい。図14B。上記のように様々な濃度の硫酸栄養素（400、50、および0μM）を含む培地中で24時間インキュベートした野生型およびasulp29の全タンパク質抽出物のクマシー染色したSDS-PAGE特性。ルビスコの大サブユニット（RbcL）およびLHC-IIに相当するタンパク質バンドを示す。タンパク質マーカーの分子量は左側に示してある。野生型およびアンチセンス形質転換体のどちらにおいても硫酸濃度の低下（400、50、および0μM硫酸）に応じてRbcLタンパク質のレベルが減少することに留意されたい。図14C。図14Bで示すSDS-PAGE分離したタンパク質のウェスタンブロット解析。RbcL（ルビスコの大サブユニット）、D1（PSII反応中心タンパク質）、およびLHC-II（PSIIの集光複合体）に対する特異的ポリクローナル抗体を用いて、野生型およびasulp29アンチセンス形質転換体の対応するタンパク質のレベルを検出した。
【０１２２】
実施例2
クラミドモナス・レインハルドティ分画研究
1〜2 x 106細胞/mlの細胞密度に到達する対数期初期まで、細胞をTAP培地中で12時間:12時間の明/暗周期で培養した。Masonら (1991) Plant Physiol. 97:1576-1580に記載される方法に従って、葉緑体を単離した。パーコール遠心勾配の45〜65%界面から、無傷の葉緑体を回収した。無傷の葉緑体を緩衝液（300 mMソルビトール、50 mM Hepes-KOH、pH 7.5、2 mM Na-EDTA、1 mM MgCl2）で2回洗浄した後、50 mM Hepes-KOH、pH 7.5、2 mM MgCl2緩衝液中で懸濁することにより低浸透圧で溶解した。勾配の底のペレットから、粗製葉緑体膜画分を回収した。膜を可溶化緩衝液中で溶解し、SDS-PAGEにより解析した。
【０１２３】
アンチセンスCrcpSulPプラスミドの構築およびアンチセンス形質転換体の作製
本研究で使用する抗SulPプラスミド（pAntiSulp）は、rbcS2プロモーターの下流にCrcpSulP cDNAの部分配列（アミノ酸118から終止コドン412まで）を逆向きに配置し、その後にrbcS2 3'UTRを配置することにより構築した。rbcS2プロモーターおよび3'UTR配列のどちらも、ベクターpSP124S（Stevensら (1996) Mol. Gen. Genet. 251:23-30）からPCR増幅した。pAntiSulPを線状化し、pBluescriptII KS+ベクター（Stratagene）中にpARG7遺伝子を保有するpJD67プラスミドと共に、クラミドモナス・レインハルドティの同時形質転換に使用した。線状化したpAntiSulPおよびpJD67を用いて、グラスビーズ法により（Kindle, 1990）アルギニン栄養要求株CC425（arg7-8 mt+ cw15 sr-u-2-60；クラミドモナス遺伝子センター、デューク大学）を同時形質転換した。まず、アルギニンを欠くTAPプレート上で形質転換体を選択した。同時形質転換体を選択するため、アルギニン原栄養形質転換体からゲノムDNAを調製し、CrcpSulP cDNAの両末端に位置するプライマーを用いるPCR解析に使用した。約900 bpのDNA断片の陽性増幅をもたらす形質転換体を、陽性同時形質転換体とみなした。
【０１２４】
クラミドモナス・レインハルドティcw15アンチセンス形質転換体も作製し、ゼオシン耐性についての選択に基づいて単離した。この場合には、RbcS2.pm-AntiSULP-RbcS2.3'カセットの上流領域に、Ble遺伝子カセット（Lumbrerasら (1998) Plant J. 14:441-448；およびStevensら (1996）Mol. Gen. Genet. 251:23-30)を挿入した。グラスビーズ法による形質転換を行い（Kindle (1990） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1228-1232）、ゼオシン使用濃度が2.5μg/mlである以外は記載されているように（Lumbrerasら (1998) Plant J. 14:441-448；Stevensら (1996) Mol. Gen. Genet. 251:23-30）ゼオシン（Invitrogen）を含むTAPアガープレート上で形質転換体を選択した。
【０１２５】
実施例3
硫酸の取り込みおよび35S-パルスラベル
硫酸取り込み実験は、以下の改変を加えて行った（Yildizら (1994) Plant Physiol. 104:981-987）。細胞を、約50μmolの光子m-2s-1の連続した照明下で、1〜2 x 106細胞/mlの密度まで培養した。細胞をペレット化し、TAP（TAP-S400）で2回洗浄した。最終的に、0.5x106細胞/mlの細胞密度で細胞を洗浄培地中に懸濁した。35S-硫酸取り込み実験の前に、試料を照明下に24時間置いた。硫酸取り込み実験の前に、細胞を遠心分離してTAP-S0（硫酸を含まないトリス-酢酸-リン酸培地）で2回洗浄し、TAP-S0培地中で2〜3 x 107細胞/mlの密度まで約10倍濃縮した。次に濃縮細胞懸濁液1.25 mlをガラスバイアルに移し、200μmolの光子m-2s-1の連続した照明下において2分間撹拌し、その後50μlの35S-Na2SO4（NEN、比放射能560μCi/μmol、1 mCi/ml、最終硫酸濃度は72μMであった）を添加した。各時点（0、15、30、45、60、および90分）で細胞懸濁液から100μ分割量を採取し、冷TAP培地1 mlを含むチューブに移した。遠心分離により細胞をペレット化し、TAP 1 mlで2回洗浄してTAP 50μlに再懸濁した後、Nano-Sepカラム（PALL）に移した。10,000 rpmで2分間遠心分離した後、細胞を含む各Nano-Sepカラムのフィルターをはずし、試料の放射能を測定した。35S-パルスラベル実験は、TAP培地で2回洗浄した後、細胞を可溶化緩衝液に懸濁してSDS-PAGE解析に供する点以外は、上記の硫酸取り込み実験と本質的に同様に行った。
【０１２６】
実施例4
プラスミドの構築
2種類のDNA構築物を作製した。フォワードSulPcDNA（5'→3'）構築物は、RbcS2プロモーターの調節下で硫酸透過酵素を過剰発現させるために用いられる。以下の図は、野生型クラミドモナス・レインハルドティを形質転換するために用いられるこの特定の構築物の構造を表す。
2005516629.tif 000003
プロモーター
【０１２７】
SulPcDNA（3'→5'）アンチセンス構築物は、内因性硫酸透過酵素遺伝子の発現レベルを低下させために用いられる。
2005516629.tif 000004
プロモーター
図中のBle：抗生物質選択マーカーが藻類にゼオシン耐性を付与する；RbcS2プロモーター：クラミドモナス・レインハルドティのRbc2遺伝子由来の強力なプロモーター；RbcS3'UTR：クラミドモナス・レインハルドティのRbcS2遺伝子由来の3'UTRは、転写ターミネーターとして働く；SulPcDNA（5'→3'）：CrcpSulP遺伝子の全長cDNAは、ATG翻訳開始コドンから始まりTGA翻訳終止コドンで終わる；SulPcDNA（3'→5'）：アンチセンス方向のCrcpSulP遺伝子の全長cDNAは、TGA翻訳終止コドンから始まりATG翻訳開始コドンで終わる。
【０１２８】
実施例5
クラミドモナス・レインハルドティにおける硫酸透過酵素遺伝子の発現レベルの操作
(i) 突然変異誘発およびスクリーニング手順：
センスまたはアンチセンス方向のCrcpSulP遺伝子を含むプラスミドDNAで野生型株を形質転換することにより、クラミドモナス・レインハルドティを作製する。形質転換体DNAの挿入は、ほぼ例外なく非相同的組換えにより起こる（Kindle (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1228-1232）。したがって、クラミドモナス核ゲノムのランダムな位置に挿入CrcpSulP DNAを保有する形質転換体が作製されることになる。形質転換体は、選択マーカーとしての抗生物質ゼオシン（5〜10μg/mL）の存在下でTAP上でコロニーとして単離されることになる（Stevensら (1996) Mol. Gen. Genet. 251:23-30）。
【０１２９】
(ii) DNAおよびRNAブロット解析：
クローニングしたDNAで形質転換された細胞のゲノムDNAを、ble遺伝子に特異的なプローブを用いる、および別にSulP DNAを用いるサザンブロット解析に供する。この相対的なサザンブロット解析により、クラミドモナス・レインハルドティゲノムにおけるプラスミド/SulP遺伝子の独立した挿入の数を可視化する方法が提供される（GumpelおよびPurton (1994) Trends Cell Biol. 4:299-301）。選択した形質転換体は、SulP遺伝子のmRNAレベルについて試験することになる。
【０１３０】
(iii) 機能解析：
クラミドモナス・レインハルドティ葉緑体が硫酸を取り込む能力およびオキシジェニック光合成のPSIIの機能を維持する能力に及ぼす形質転換の効果を評価するため、センスおよびアンチセンス株の光合成速度および呼吸速度が試験され得る。センスおよびアンチセンス株の光合成装置の解析は、PSII (QA)、シトクロムb-f複合体、およびPSI (P700)の濃度を測定することにより行われ得る（Melisら (2000) Plant Physiol. 122:127-136）。本研究室による研究において以前に記載したように、野生型および形質転換体においてルビスコの量（Zhangら (2002)、前記）および[35S]硫酸によるD1標識の相対速度（VasilikiotisおよびMelis (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7222-7226）が試験され得る。光合成速度が呼吸速度以下である系統を、Sが豊富なTAP培地に懸濁した場合のヒドロゲナーゼ経路の発現および水素生成について試験することができる。
【０１３１】
この実験手順により、緑藻類における光合成と呼吸の関係を変化させる、およびヒドロゲナーゼ経路の機能を精査する遺伝的研究方法が提供される。P/R比（= 1.1:1）が野生型の比（= 4:1）よりも実質的に低い緑藻形質転換体（sulP 1）が単離された。水素生成を増加させるためのクラミドモナス/ロドバクター同時培養系においては、このsulP 1を用いる。
【０１３２】
緑藻（クラミドモナス/ロドバクター）ハイブリッド系は、緑藻類が光合成的にO2を生成する優れた能力に起因し（P/R = 4:1比）、過去に失敗した可能性がある。酸素は[Fe]-ヒドロゲナーゼおよびニトロゲナーゼ/ヒドロゲナーゼ遺伝子発現の強力な正の抑制因子であり、それぞれの酵素の機能の阻害剤である（SasikalaおよびRamana (1995) Adv. Appl. Microbiol. 41:211-295；およびOgataら (2001) Proc. JSWE 35:540)。しかし、sulP 1株（P/R = 1.1:1比）が利用可能になり、これによりオキシジェニック光合成を損なうことなく酸素生成反応の支配性が除去されるため、この問題が解決される。したがって、sulP 1の存在により嫌気的条件下で2つの生物の同時培養が可能になる。これらの生物両者において、水素生成活性を誘導するためには嫌気生活は必要かつ十分である。
【０１３３】
実施例6
確立された手順に従い（Harris (1989)のThe Chlamydomonas Sourcebook, Academic Press, Inc., San Diego, 780ページ；およびRochaら (2001)、前記）、緑藻クラミドモナス・レインハルドティおよびアノキシジェニック光合成細菌ロドバクター・スファエロイドを独立栄養的/光合成従属栄養的に培養する。最初に培養物にクラミドモナス・レインハルドティを播種し、バイオマスが顕著に蓄積されるまで（約3x106細胞/mL）光合成栄養的に培養する。その段階で、増殖培地にR. sphaeroidesの光合成従属栄養増殖に必要な有機栄養素を補充する。これらの光合成従属栄養増殖条件下で、クラミドモナス・レインハルドティはその操作可能なP/R比を低下させる（Polleら (2000) Planta 211(3):335-344；およびZhangら (2002)、前記）。sulP 1では、そのような光合成従属栄養増殖条件によりP/R比が1を下回り、結果として培養物の嫌気生活がもたらされる。増殖培地で嫌気生活が確立されたならば、同じ条件下でR. shpaeroidesの播種および同時培養が可能になる（Miuraら (1992) Bioshi. Biotech. Biochem. 56:751-754）。R. sphaeroidesの増殖培地中のクラミドモナス・レインハルドティおよびR. shpaeroidesは、R. sphaeroides がクラミドモナス・レインハルドティの発する小有機酸の利益を受ける通性過程において共存しバイオマスおよび水素を生成する（図20）。
【０１３４】
本発明は、統合培養における細胞の生理的および生化学的パラメータを測定することにより、その過程を最適化する。以下のパラメータが測定される：
a. 増殖速度；
b. ガス生成の速度；
c. 光合成および呼吸の速度；
d. 細胞当たりの吸光度スペクトルおよび密度；
e. 細胞代謝産物含有量（細胞当たりのデンプン、タンパク質、脂質）；および
f. 単一細胞培養と比較した、ハイブリッド培養の水素生成の持続時間。
【０１３５】
これらの測定値に基づき必要かつ十分な混合比が決まり、負の酸素交換比で（すなわち、呼吸速度がオキシジェニック光合成の速度を上回る）光合成および水素生成を行う2つの生物の混合が可能になる。クラミドモナス/ ロドバクター混合比を制御する手順は、本明細書に記載する手順に従い作製され得る。
【０１３６】
個々に最適条件下でおよび最新の技術に基づき、クラミドモナス・レインハルドティおよびR. sphaeroidesはそれぞれ時間当たりL培養物当たり2.5 mLおよび40〜50 mL水素を生成することになる。光合成および水素生成の過程において、R. shpaeroidesは実質的な量の小有機酸分子（グリコール酸、酢酸、乳酸、リンゴ酸等）を消費する。これらの代謝産物が使い果たされたならば、水素生成は停止する。嫌気条件下での光合成従属栄養増殖および水素生成の過程において、クラミドモナス・レインハルドティの内因性基質の異化作用により小有機酸の生成および放出が起こり、これが細胞から発せられる。
【０１３７】
この2生物ハイブリッド系の利点は、クラミドモナス・レインハルドティ（株sulP 1）が培地中にバイオマスおよび小有機酸分子を産生する点である。次に、R. sphaeroidesは長期間にわたって水素生成するためにこれらの小有機酸分子の供給の利益を受け、結果として実質的に優れた収率が得られ経費が削減される。これにより、統合過程の持続時間および収率が個々の成分のものを大きく上回る水素生成ハイブリッド系が提供される。
【０１３８】
実施例7
ARS活性アッセイ
TAPアガープレートから液体TAP培地を含む96ウェルマイクロタイタープレートに細胞を移し、明所で24時間インキュベートした。次に、一定分割量の細胞懸濁液（38μl）をウェル当たりTAP-S0培地62μlを含む別のマイクロタイタープレートに移し、培地中の硫酸最終濃度を約150μMとした。ARS活性を検出する前に、マイクロタイタープレートを連続した照明下に24時間置いた。ARS活性を検出するため、10 mMトリス-HCl、pH 7.5中の10 mM 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル硫酸カリウム塩（製品番号B1379、Sigma-Aldrich）10μlを細胞懸濁液に添加した。3〜4時間にわたって混合液の色を発色させた後、結果の像を記録するためマイクロタイタープレートをスキャンした。
【０１３９】
アッセイの結果を図16Aおよび16Bに示す。図16Aは、通常のTAP培地（400μM硫酸）に懸濁した場合の、野生型および47個のアンチセンス形質転換体をARS活性誘導について試験した結果を示す。野生型対照株は液体培養マルチウェルプレートの左上の角に示されるが、これは「・」で示してある。96ウェルプレートで青色の呈色により判断されるARS活性を示した株は、「*」で示してある。5%以上の色の変化は、硫酸取り込みの下方制御の陽性結果を示す。図16Bは、150μM硫酸を含むTAP培地に株が懸濁されている、上記のレプリカプレートを示す。他の条件は図16Aと同じである。
【０１４０】
本発明をその特定の態様に関して説明したが、本発明の精神および範囲に反することなく、様々な変更が行われ得りかつ均等物が代用され得ることは当業者に理解されねばならない。さらに、特定の状況、物質、組成物、工程、工程段階、または段階を、本発明の目的、精神、および範囲に適合化させるため、多くの改変がなされ得る。そのような修正はすべて、本明細書に添付される特許請求の範囲の範囲内に包含されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】培地への硫黄添加点を示す、天然クラミドモナス・レインハルドティによる水素生成の段階の循環を示すグラフである。
【図２】野生型クラミドモナス・レインハルドティの葉緑体硫酸透過酵素（CrcpSulP）の概略図である。
【図３】クラミドモナス・レインハルドティ硫酸透過酵素のアミノ酸配列（配列番号:1）を示し、タンパク質のN末端領域の下線を引いたアミノ酸は葉緑体輸送ペプチドを構成する。
【図４】図4Aおよび図4Bはどちらも、イントロンおよびエキソンを含む、CrcpSulPをコードする完全なヌクレオチド配列（配列番号:2）を提供する。
【図５】全長1984 bpを有する、CrcpSulPの全長cDNAのヌクレオチド配列（配列番号:3）である。
【図６】クラミドモナス・レインハルドティの細胞および葉緑体による硫酸取り込み経路を示し、酸素産生光合成の活性における硫酸を介するタンパク質合成の役割を示す概略図である。
【図７】図7Aおよび7Bは、クラミドモナス・レインハルドティにおけるpJD67挿入部位のマッピングおよび特徴づけを示す。図7Aは、rep55ゲノムDNAにおけるpJD67挿入部位および逆PCR（iPCR）による隣接ゲノムDNA領域の単離の概略図である。ベクターpBluescript II KS+（Stratagene）内にARG7遺伝子を含むプラスミドpJD67を、クラミドモナス・レインハルドティ株CC425の形質転換に用いた。ゲノムDNAの消化には、制限酵素KpnIを用いた。次の連結したKpnIゲノムDNA断片の線状化にはScaIを使用し、それからiPCR反応を行った（「方法」を参照のこと）。iPCR5'-iPCR3'およびNested5'- Nested 3'は、それぞれ1回目および2回目のiPCR反応で用いた2セットのプライマーを表す。126 bp DNA断片は、隣接領域の単離されたゲノムDNAに相当する。図7Bは、SacI 7 kbゲノムDNA断片の制限酵素地図である。ORFの位置を示す。灰色の斜線を施した四角はエキソンを表し、白四角はイントロンを表す。矢印は、オープンリーディングフレーム（ORF）転写の方向を示す。
【図８】図8Aは、様々な生物の葉緑体硫酸透過酵素遺伝子の推定アミノ酸配列アラインメントおよび系統学的比較を示す。ネフロセルミス・オリヴァセア、メソスティグマ・ヴァリデ、クラミドモナス・レインハルドティ、およびクロレラ・ヴルガリス（緑藻類）、シネコッカス属種PCC 7942（ラン藻）、マルカンティア・ポリモルファ（ゼニゴケ）、ならびにバシラス・ハロジュランス（非光合成原核生物) の推定アミノ酸配列アラインメントである。アミノ酸配列のアラインメントは、ClustalW解析に基づいた。図8Bは、上記のアミノ酸配列比較に基づいた上記硫酸透過酵素の系統樹を示す。
【図９】CrcpSulP遺伝子の構造を示す。CrcpSulP遺伝子は、コード領域に内に5つのエキソンおよび4つのイントロンを含む。エキソンは灰色の斜線を施した四角で表す。5'UTR（173 bp）、コード領域（CD：1236 bp）、および3'UTR（575 bp）の大きさについても示してある。
【図１０】CrcpSulPタンパク質のヒドロパシープロットを示す。予想される葉緑体輸送ペプチド（CpTP）を示す。成熟タンパク質の7回膜貫通ヘリックスは、InnTMおよびA〜Fとして示してある。
【図１１】図11Aおよび図11Bは、CrcpSulPタンパク質の細胞局在を示す。図11Aは、クラミドモナス・レインハルドティの全タンパク質抽出物（細胞）、無傷の単離葉緑体タンパク質（Cp）、および葉緑体膜画分（Cp m）のクマシー染色したSDS-PAGE特性を示す。Cp画分中の約66 kDの強いタンパク質バンドは、精製過程で用いたBSAに相当する。図11Bは、特異的抗CrcpSulP抗体を用いた上記細胞画分のウェスタンブロット解析である。約37 kDポリペプチドとの交差反応に留意されたい。
【図１２】図12Aおよび12Bは、CrcpSulP遺伝子の発現解析を示す。図12Aは、クラミドモナス・レインハルドティのS欠乏におけるCrcpSulP遺伝子転写産物の定常状態レベルを示す。増殖培地から硫酸栄養素を除去して、試料を0、6、または24時間インキュベートした。各試料から等量の全RNA（30マイクログラム）をアガロースゲルレーンに泳動し、ノーザンブロット解析した（上部）。下部は、rRNAのエチジウムブロマイド染色を示す。図12Bは、特異的抗CrcpSulP抗体を用いた、上記細胞画分のウェスタンブロット解析である。抗体の約37 kDポリペプチドとの交差反応に留意されたい。ゲルレーンの泳動は、同じ細胞数に基づいた。
【図１３】抗CrcpSulPアンチセンス形質転換体における、光飽和した酸素発生速度を示す。測定は、実施例に記載したように行った。どの測定にも、1,500マイクロモルの光子m-2s-1の光強度を用いた。値は、CC425の酸素発生速度（= 秒当たりモルChl当たり40マイクロモルO2）に対して標準化し、酸素発生相対速度として表してある。形質転換体31個および「野生型」2個について示す。黒棒：CC425；破線棒：CC125。灰色の斜線を施した棒は、アンチセンス形質転換体asulp29に相当する。
【図１４】図14A、14B、および14Cは、野生型およびasulp29の相対的タンパク質特性解析を示す。図14Aは、400、50、および0マイクロM硫酸を含む、CrcpSulPタンパク質および野生型のウェスタンブロット解析を示す。図14Bは、野生型およびasulp29由来の全タンパク質抽出物のクマシー染色したSDS-PAGE特性を示す。図14Cは、図14Bに示すSDS-PAGEで分離したタンパク質のウェスタンブロット解析を示す。
【図１５】図15Aおよび15Bは、クラミドモナス・レインハルドティの野生型およびasulp29アンチセンス形質転換体による硫酸取り込みの解析を示す。図15Aにおいて、硫酸取り込み実験は通常の増殖条件下（培地中に400μM硫酸を含むTAP）で培養した細胞で行った。35S-硫酸の存在下で0、15、30、45、60、および90分間インキュベーションした時点で、一定分割量を採取した。図15Bは、SDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーによって示される、クラミドモナス・レインハルドティタンパク質の放射標識（35S-硫酸）を示す。標識反応混合物から、それぞれ0、15、30、45、60、および90分の時点で一定分割量を採取した。全細胞タンパク質を抽出し、同じ細胞数に基づいて泳動し、SDS-PAGEにより解析した。風乾したポリアクリルアミドゲルをX腺フィルムに露光し、タンパク質の35S-標識のオートラジオグラフィーを記録した。RbcL、RbcS、およびD1に対応するタンパク質バンドを矢印で示す。
【図１６】クラミドモナス・レインハルドティの野生型およびアンチセンス形質転換体のアリルスルファターゼ（ARS）活性解析を示す。ARS活性を検出する前に、藻類を含むマイクロタイタープレートを連続した照明下に24時間置いた。ARS活性を検出するため、10 mMトリス-HCl、pH 7.5中の10 mM 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル硫酸（XSO4、Sigma）10μlを細胞懸濁液に添加した。3〜4時間にわたって混合液の色を発色させた後、結果の像を記録するためマイクロタイタープレートをスキャンした。（上部）通常のTAP培地（400μM硫酸）に懸濁した場合の野生型および47個のアンチセンス形質転換体を、ARS活性誘導について試験した。（下部）150μM硫酸を含むTAP培地に株が懸濁されている、上記のレプリカプレート。野生型対照株は「・」で示し、液体培養マルチウェルプレートの左上の角に示される。96ウェルプレートにおいて青色の呈色により判断されるARS活性を示した株は、「*」で示される。
【図１７】CrcpSulPタンパク質の作業仮説折りたたみモデルを示す。CpTPは、ストロマ局在ペプチダーゼによって切断される前の葉緑体輸送ペプチドを指す。InnTMはCrcpSulPタンパク質の1つ目のN末端膜貫通ドメインを表すが、これはクラミドモナス・レインハルドティに特異的である。A〜Fは、緑藻葉緑体硫酸透過酵素の6つの保存された膜貫通ドメインを表す。膜貫通ヘリックスInnTM-Aの間およびD-Eの間に生じる2つの伸長した親水性ループが、葉緑体の外側を向いていることに留意されたい。
【図１８】図18Aおよび18Bは、クラミドモナス・レインハルドティにおける硫黄欠乏に応じた光合成、呼吸、および水素生成。図18Aは、硫黄源を欠く培地に懸濁した野生型クラミドモナス・レインハルドティにおける、オキシジェニック光合成（P、白丸）および呼吸（R、黒丸）の絶対活性を示す。暗下で細胞呼吸の速度（R）を記録した後、光飽和した光合成速度（P）を測定した。0時間での培養物は、2.2x 106細胞ml-1を含んだ。図18Bは、硫黄を欠く培地に懸濁したクラミドモナス・レインハルドティ細胞による水素ガスの生成および蓄積を示す。逆さにしたビュレット内に気体を回収し、水と置換した量から測定した。
【図１９】緑藻における水素生成過程での、協調的な光合成および呼吸の電子伝達および共役したリン酸化を示す。光合成の電子伝達は水の光酸化で生じた電子をヒドロゲナーゼに送達し、それにより光リン酸化および水素生成がもたらされる。この過程で生じた酸素は、ミトコンドリア呼吸における協調した酸化的リン酸化を駆動するのに役立つ。後者の電子（[4e]）は内因性基質の異化作用に由来し、異化作用では還元体およびCO2が生じる。葉緑体による分子水素の放出によって、緑藻類でこの協調的な光合成-呼吸機能が持続して作動することが可能になり、細胞内の2つの生体エネルギー的細胞小器官によるATPの連続した産生が可能になる。
【図２０】商業的水素生成のための3生物による統合系を示す。同じ光バイオリアクター内で緑藻類および光合成細菌を同時培養することにより、設備費が最低限に抑えられる。日射照度を捕らえるための光バイオリアクターの表面積が、この段階での必要条件である。嫌気性細菌は、表面積が必要とされない従来の発酵槽で培養され得る。3つの過程を統合することにより、3過程による非常に長期間であり高収率の水素生成が期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ−１】
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【図８Ａ−２】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2005516629.tif 000028
2005516629.tif 000029