(57)【要約】本発明は、ウシ属動物がその生乳中のβ−カゼインＡ２に関する遺伝子またはβ−カゼインＡ１に関する遺伝子を有するかどうかを、少なくとも１つのＤＮＡマーカー（遺伝子の配列そのものに存在するＤＮＡマーカーを除く）の存在について、そのウシ属動物のＤＮＡを検査することにより決定する方法に関する。特に当該方法は、β−カゼインＡ２遺伝子およびβ−カゼインＡ１遺伝子に関するＤＮＡマーカーとしてＳＮＰを使用する。
2005528898.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウシ属動物が、タンパク質β−カゼインＡ１をコードする遺伝子またはタンパク質β−カゼインＡ２をコードする遺伝子を有するかどうかを、これらいずれかの遺伝子中のＤＮＡマーカーの存在ではなく、これらいずれかの遺伝子に関する少なくとも１つのＤＮＡマーカーの存在について、同動物のＤＮＡを検査することにより決定する方法。
【請求項２】
少なくとも１つのＤＮＡマーカーのそれぞれが、一塩基多型（ＳＮＰ）、タンデムリピート、または挿入−欠失である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１つのＤＮＡマーカーのそれぞれがＳＮＰである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ウシ属動物が雌ウシである請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１つのＤＮＡマーカーの存在が、雌ウシにより産生される生乳の１つまたはそれ以上の身体的特徴に連関する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
生乳の１つまたはそれ以上の身体的特徴が、生乳中のβ−カゼインＡ１の存在の有無である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
生乳の１つまたはそれ以上の身体的特徴が、生乳中のβ−カゼインＡ２の存在の有無である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１つのＤＮＡマーカーの存在が、生乳の１つまたはそれ以上の付加的な身体的特徴に連関する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
１つまたはそれ以上の身体的特徴が、β−カゼインまたはκ−カゼインの変異体含有量、乳清含有量、タンパク質含有量、脂肪含有量、脂肪酸プロフィール、共役リノール酸含有量、β−ラクトグロブリン含有量、ラクトフェリン含有量、体細胞数、１日の産乳量、脂肪産出量、タンパク質産出量、ならびに生乳、脂肪およびタンパク質の高泌乳期産出量からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
１つまたはそれ以上の身体的特徴が、体細胞数、脂肪含有量、タンパク質含有量、β−カゼイン産出量、および脂肪酸プロフィールからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１つのＤＮＡマーカーが、β−カゼインＡ１をコードする遺伝子に関するマーカーである、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１つのＤＮＡマーカーが、β−カゼインＡ２をコードする遺伝子に関するマーカーである、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
動物のＤＮＡを、有核細胞を含有するまたは含有していたウシ属動物のあらゆる組織から得る、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
動物のＤＮＡを同動物の血液、精液、体毛、または生乳から得る、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも１つのＤＮＡマーカーが、Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓウシ属動物の６番染色体に由来するＳＮＰである、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも１つのＤＮＡマーカーが、ウシ属動物のβ−カゼインタンパク質に関する遺伝子の領域中の８つのＳＮＰの群である、請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
以下の工程：
ａ）１頭またはそれより多くのウシ属の雌ウシが、タンパク質β−カゼインＡ１をコードする遺伝子またはタンパク質β−カゼインＡ２をコードする遺伝子を有するかどうかを請求項１に従って決定する；
ｂ）タンパク質β−カゼインＡ１をコードする遺伝子を有していない雌ウシを選択する；そして
ｃ）選択した雌ウシから搾乳する；
ことを含むβ−カゼインＡ１を実質的に含まない生乳を産生する方法。
【請求項１８】
生乳が、実質的に全てβ−カゼインＡ２であるβ−カゼインを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１６または請求項１７に記載の方法により得られた生乳。
【請求項２０】
請求項１８に記載の生乳を含む、または同生乳から加工した、食品または食料製品。
【請求項２１】
請求項１に記載の方法に従って各雌ウシのＤＮＡを検査し、そしてβ−カゼインＡ２をコードする遺伝子を有していてβ−カゼインＡ２をコードする遺伝子を有していない雌ウシを選択することにより、ウシ属の雌ウシの集団を形成する方法。
【請求項２２】
請求項１に記載の方法に従って検査したウシ属の雌ウシから得られた生乳。
【請求項２３】
請求項２１に記載の生乳を含む、または同生乳から加工した、食品または食料製品。
【請求項２４】
請求項１に記載の方法に従って検査したウシ属動物由来の精液または胚。
【請求項２５】
いずれかの人工的繁殖技術を用いて産仔を産生させるために使用する、請求項２３に記載の精液または胚。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、身体的特徴の変異を決定する遺伝子の領域中の遺伝子型を決定し、動物が遺伝子の特定の変異型を有するかどうかを、同遺伝子そのものの遺伝子型を決定することよりむしろ同遺伝子の該領域中のＤＮＡを参照して決定することにより、同動物の身体的特徴を同定する方法に関する。特に本発明は、ウシ属動物がβ−カゼインＡ１タンパク質に関する遺伝子またはβ−カゼインＡ２タンパク質に関する遺伝子を有するかどうかを決定し、それによりそれらの生乳にβカゼインＡ１またはβ−カゼインＡ２を産生するウシ属の雌ウシの能力を決定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
消費者は、乳製品および食肉製品のような商品を購入する時は、高品質および低価格を要求する。しかし多くの消費者はまた、その産生物および産生システムがヒトの健康へのリスクを最小とし有益性を最大とするように管理されており、一方また環境および動物の福祉に有害ではないという保障を求めている。
【０００３】
動物の遺伝的性質が、産生および産生物の品質、および健康、環境および動物の福祉の問題に、かなりの影響を及ぼすことはよく知られている。遺伝子検査を用いて動物の表現型を決定する能力は、有益な特徴を持つ動物および動物の産生物のすばやい同定を行い、そして、産生および/または産生物の品質を増強した動物の群を形成するための重要な手段である。経済的利潤のある動物または動物の産生物の特徴に関連する遺伝子の差異に基づいて、動物を分類することができる。乳製品産業の場合、重要な特徴として生乳の産生、乳タンパク質含有量、脂肪の産生、および健康に関与する生乳の特異的な成分、例えばβカゼインＡ１タンパク質を含まないことまたは飽和脂肪率が挙げられる。
【０００４】
典型的な遺伝子検査では、目的の身体的特徴に関連するタンパク質またはタンパク質の群をコードする遺伝子のＤＮＡ配列を調べることになる。ＤＮＡサンプルは動物から採集し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅、ＤＮＡフラグメントの分析、およびデータ処理を組み合わせて使用して、動物のゲノム中の同遺伝子の公知の位置に存在するＤＮＡを同定する。高度に自動化された検査により、遺伝子または遺伝子変異型の存在、およびそれによる身体的特徴を示す能力を明らかにすることができ、比較的速やかにそして効率的に多数の動物について決定することができる。
【０００５】
動物の特定の身体的特徴の原因となる遺伝子は、一塩基多型（ＳＮＰ）により同定可能となり得る。ＳＮＰは、ただ１つのヌクレオチドのみにて、別の動物のゲノム中の同じ位置のＤＮＡ配列と異なる、ある動物のゲノム中のある位置の１つのＤＮＡ配列である。この程度の小さな差異であっても、別の動物は示さないようなある特定の身体的特徴を示す動物を生じ得る。
【０００６】
ＳＮＰの重要性の一例が、その生乳中にβ−カゼインタンパク質を産生することのできるウシ属の雌ウシの遺伝的体質である。典型的には雌ウシはその生乳中にβ−カゼインを産生する。しかしＡ１、Ａ２、Ａ３、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＦを含むいくつかのβ−カゼイン変異型が知られている。一方のＡ２、Ａ３、Ｄ、Ｅ、およびＦ変異型、および他方のＡ１、Ｂ、Ｃ変異型との間の１つの差異は、前者の群がβ−カゼインタンパク質の６７番の位置にプロリン残基を有するのに対して、後者の群は６７番の位置にヒスチジン残基を有することである。この差異は、ベータ−カゼイン遺伝子のコード領域の２００番の位置のヌクレオチドアデニンがヌクレオチドシトシンで置換されることにより決定される。したがってβ−カゼイン変異型の２群間を識別するには、動物のβ−カゼインタンパク質をコードするＳＮＰについて同定し、検査することにより可能となる。
【０００７】
ヒトの食品中のβ−カゼインＡ１の存在が、ある種の疾患、特に糖尿病（Elliott, R. B., Harris, D. P., Hill, J. P., Bibby, N. J., Wasmuth, H. E., Type I (Insulin-Dependent) Diabetes Mellitus and Cow Milk: Casein Variant Consumption（Ｉ型（インスリン依存型）真性糖尿病および牛乳：カゼイン変異型の消費）, Diabetologia 1999; 42: 292-6; Wasmuth, H. E., Rosenbauer, J., Elliot, R. B., McLachlan, C., Erhardt, G., Giani, G., Kolb, H., β-Casein A1 Consumption and Incidence of Type 1 Diabetes in Germany（ドイツにおけるβ−カゼインＡ１の消費およびＩ型糖尿病の発病率）． Kongress der Europaischen Diabetesgesellschaft vom 28.-30.09, 1999 in Brussels/Belgium. Proceedings published in Diabetologia 42 (Suppl. 1): A88; 1999）および冠動脈心疾患（McLachlan, C. N. (2001) β-Casein A1, Ischaemic Heart Disease Mortality, and Other Illnesses（虚血性心疾患死亡率および他の疾病） Med. Hypotheses 56(2); 262-72）の発病率に連関することが、いくつかの文献に示されている。
【０００８】
雌ウシの生乳中に産生される特定のβ−カゼインの１つまたは複数の変異型を同定することにより同雌スウシの表現型を決定することに加えて、雌ウシの有するＳＮＰを同定することにより同雌ウシの遺伝子型を決定し、同雌ウシがある種のβ−カゼイン変異型を産生する能力を有するかどうかの知識を得ることは、周知である。このような遺伝子型の決定に基づいてウシ属の雌ウシを選択し、β−カゼインＡ１変異型を含まず、好ましくはβ−カゼインＡ２変異型のみの生乳を産生する乳牛の集団を形成する方法は、ＰＣＴ/ＮＺ９６/０００３９（ＷＯ  ９６/３６２３９として公開されている）に記載されている。
【０００９】
ＳＮＰまたはその他のＤＮＡ変異型（タンデムリピート、挿入−欠失）が、疾患、動物の産生物の品質、または産生の利点を予測する上で重要であることは、複数の研究で示されている。しかし遺伝子の選択を動物の分類、抜粋、または交配に利用する場合、ただ１つのＳＮＰまたは特徴の使用に基づいての選択計画は、最適とはいえない。というのは、ＳＮＰ、例えばβ−カゼイン遺伝子中のＳＮＰは、近傍のＤＮＡにランダムに関与してはいないからである。遺伝子型を決定するＳＮＰを取り囲むＤＮＡの領域が、身体的特徴にも影響を及ぼす１つまたはそれ以上の機能をコードし得る。したがってただ１つのＳＮＰに基づいての選択は、目的の特徴に加えて複数の特徴を偶発的に選択する可能性がある。
【００１０】
本発明者らは、ウシがβ−カゼインＡ１タンパク質に関する遺伝子またはβ−カゼインＡ２タンパク質に関する遺伝子を有するかどうかを、同遺伝子のＤＮＡを同定することによるのでなく、β−カゼインに関する遺伝子の位置する同動物のゲノム領域における複数のＳＮＰまたはハプロタイプ（ＳＮＰの組み合わせ）を同定することにより、決定することが可能であることを、今回発見した。
【００１１】
したがってβ−カゼイン遺伝子に関して動物の遺伝子型を決定する新規方法を提供すること、または少なくとも公知の方法に代わる有用な方法を提供することが、本発明の目的である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の提示）
本発明の第一の側面において、ウシ属動物がタンパク質β−カゼインＡ１をコードする遺伝子、またはタンパク質β−カゼインＡ２をコードする遺伝子を有するかどうかを、これらいずれかの遺伝子中の１つのＤＮＡマーカーの存在についてではなく、これらいずれかの遺伝子に関する少なくとも１つのＤＮＡマーカーの存在について、同動物のＤＮＡを検査することにより決定するための方法を提供する。
【００１３】
本発明の好ましい態様において、少なくとも１つのＤＮＡマーカーのそれぞれは、一塩基多型（ＳＮＰ）、タンデムリピート、または挿入−欠失を表す。好ましくは少なくとも１つのＤＮＡマーカーは、１つのＳＮＰを表す。
【００１４】
この方法を使用してウシ属の雄ウシまたは雌ウシのβ−カゼイン遺伝子型を決定することができるが、本発明のウシ属動物は好ましくは雌ウシである。
動物の身体的特徴は、同動物から産生される産生物の質または量に影響を及ぼすあらゆる特徴であってよく、あるいは同動物の疾患もしくは障害、または疾患もしくは障害の回避に関連してもよい。好ましくはその特徴は、乳タンパク質または乳脂肪の量または組成を含む、ウシ属の雌ウシからの生乳の産生に関する。１つまたはそれ以上の身体的特徴として、β−カゼインまたはκ−カゼインの変異体含有量、乳清含有量、タンパク質含有量、脂肪含有量、脂肪酸プロフィール、共役リノール酸含有量、β−ラクトグロブリン含有量、ラクトフェリン含有量、体細胞数、１日の産乳量、脂肪産出量、タンパク質産出量、ならびに生乳、脂肪およびタンパク質の高泌乳期(full-lactation)の産出量を含むが、これに限定されない。
【００１５】
本発明のさらなる好ましい態様において身体的特徴は、ウシ属の雌ウシの生乳中のβ−カゼインＡ２の存在の有無である。これに代わる態様において身体的特徴は、ウシ属の雌ウシの生乳中のβ−カゼインＡ１の存在の有無である。
【００１６】
本発明の好ましい特徴において、少なくとも１つのＤＮＡマーカーは、β−カゼインＡ１をコードする遺伝子に関するマーカーである。本発明のこれに変わる態様において少なくとも１つのＤＮＡマーカーは、β−カゼインＡ２をコードする遺伝子に関するマーカーである。
【００１７】
検査する動物のＤＮＡは、同動物の有核細胞、好ましくは血液、精液、体毛、または生乳を含有するまたは含有していた同動物のあらゆる組織から得ることができる。
好ましくはＳＮＰは、Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓウシ属動物の６番染色体に由来する。好ましい態様において、少なくとも１つのＤＮＡマーカーは、ウシ属動物のβ−カゼインタンパク質に関する遺伝子の領域の８つのＳＮＰの群である。
【００１８】
本発明の第二の側面において、以下のステップを含む実質的にβ−カゼインＡ１を実質的に含まない生乳を産生する方法を提供する：
ａ）１頭またはそれ以上のウシ属の雌ウシが、タンパク質β−カゼインＡ１をコードする遺伝子またはタンパク質β−カゼインＡ２をコードする遺伝子を有するかどうかを、本発明の第１の側面に従って決定する；
ｂ）タンパク質β−カゼインＡ１をコードする遺伝子を有していない雌ウシを選択する；そして
ｃ）選択された雌ウシから搾乳する。
【００１９】
好ましくはこの方法により産生される生乳は、実質的に全てβ−カゼインＡ２であるβ−カゼインを含む生乳である。
本発明のもう一つの側面において、本発明の第一の側面の方法に従って各雌ウシのＤＮＡを検査し、β−カゼインＡ２をコードする遺伝子を有していてβ−カゼインＡ１をコードする遺伝子を有していない雌ウシを選択することにより、雌ウシの集団を形成する方法を提供する。
【００２０】
もう一つの側面において、本発明の第一の側面の方法に従って検査した雌ウシから得られた生乳を提供する。
本発明のさらなる側面において、本発明の生乳を含有するまたは同生乳から加工した食品または食料製品を提供する。
【００２１】
本発明のなおさらなる側面において、本発明の方法に従って検査した動物由来の精液または胚を提供する。好ましくはこの精液または胚を使用して、あらゆる人工的繁殖技術を用いて産仔を産生させる。
【００２２】
（詳細な説明）
本発明は、遺伝的差異に基づいて、畜牛の母集団または動物由来の組織（例えば血液、精液、体毛または生乳）を、ユーザーが分別することを可能にする。本発明の好ましい態様において、これらの遺伝的差異はＳＮＰまたはＳＮＰの組み合わせである。このようなＳＮＰの使用、ならびにユーザーが動物の母集団を分類できることをまた、動物の表現型を予測するために使用することもできる。
【００２３】
生乳の産生に関連する特徴の例として、産乳量、乳タンパク質組成、乳脂肪量、ならびにより特異的な特徴、例えばβ−カゼイン変異型の存在、飽和および不飽和脂肪の比率、および生乳中に存在する体細胞数を含む。
【００２４】
変異型カゼインは、これらのタンパク質の配列全体における少数のアミノ酸の変化により識別される。ウシの場合、β−カゼインのＡ２およびＡ１変異型間の差異は、このタンパク質の６７番の位置のプロリンからヒスチジンへのアミノ酸のただ１つの変化である。これに関連するＳＮＰはBos taurusウシ属の６番染色体で起こる。
【００２５】
その他のβ−カゼイン変異型が６７番の位置のプロリンに対してヒスチジンを有する場合には、これらは通常マイナーな変異型であり、本発明を記載する目的に関しては全体にβ−カゼインＡ１として考慮するものとする。同様にβ−カゼインＡ２に加えて、６７番の位置にプロリンを有するβ−カゼイン変異型は通常マイナーな変異型であり、全体にβ−カゼインＡ２として考慮するものとする。
【００２６】
畜牛（cattle)または畜牛由来の組織が、β−カゼインのＡ１変異型のみ（Ａ１ホモ接合体）、Ａ２変異型のみ（Ａ２ホモ接合体）、またはＡ１およびＡ２変異型を混合して（Ａ１/Ａ２ヘテロ接合体）コードする遺伝子を有するかどうかについて、決定を行うことができる。このことから畜牛が、β−カゼインＡ１のみ、β−カゼインＡ２のみ、またはこれらのカゼイン変異型の双方を混合して含有する生乳を産生するかどうかを同定することが可能となる。また畜牛が、β−カゼインＡ１のみ、β−カゼインＡ２のみ、またはこれらのカゼイン変異型の双方を混合物して含有する生乳を産生する能力のある産仔を産生し得るかどうかも同定することができる。
【００２７】
このようにして、特定の身体的特徴を有する、例えばβ−カゼイン変異型のβ−カゼインＡ１タンパク質を含まない、またはβ−カゼインＡ２のみを含む生乳を産生する乳牛の集団を形成することができる。
【００２８】
本発明の付加的な特徴として、特定の遺伝子型またはハプロタイプを持つ動物を一度選択し、そしてそれらから生乳を産生させれば、牛乳またはその他の製品、例えば粉末ミルクおよび加工乳製品の由来を、選択された動物から産生されているものとして証明することができる。このことは、牛乳が所望の遺伝子型またはハプロタイプの群の動物に本当に由来することを、自信を持って消費者に提供できるという利点がある。
【００２９】
特に、β−カゼイン遺伝子の外側において、容易に同定でき、β−カゼインタンパク質のタイプを予測するＳＮＰを、本発明者らは示した。したがってこれらのＳＮＰはまた、β−カゼイン対立遺伝子に伴う健康のリスクを予測するもの、または潜在的原因もしくは部分的原因となる。８つのＳＮＰについて、畜牛の母集団の同定、分析を行った。これらのＳＮＰは、β−カゼインをコードする遺伝子を含む畜牛のカゼイン遺伝子クラスターに由来する。このＤＮＡの領域は、約２００−３００キロベースのＤＮＡからなると推測される。別々の固体において無作為に関連するこれら８つのＳＮＰの、２の８乗（２８）の可能な組み合わせ（またはハプロタイプ）の理論値が予測される。驚くことに、これらＳＮＰで観察されたハプロタイプの数、およびこれらＳＮＰのサブセットは、無作為に予測される数値よりはるかに少ない。したがってＳＮＰ間の特定の関連性が発見されたことを用いて、少数のＳＮＰのみを用いて、畜牛の母集団をハプロタイプの群に正しく分類することが可能になる。より重要なことにこれらのハプロタイプを使用して、個体または母集団における特異的な表現型、例えばα−Ｓ１、α−Ｓ２、β−カゼイン、およびκ−カゼインの乳タンパク質変異型の同定を予測することができる。
【００３０】
ＳＮＰハプロタイプと産生および産生物の品質の特徴との間の関連性を調べた。ウシの生乳に特異的なこれらの特徴として、β−カゼインまたはκ−カゼインの変異型、乳清％、タンパク質％、脂肪％、脂肪酸プロフィール（Ｃ４からＣ２２）、共役リノール酸含有量（ＣＬＡ）、融点、β−ラクトグロブリン含有量、ラクトフェリン含有量、体細胞数、１日の産乳量、脂肪産出量、タンパク質産出量、生乳、脂肪およびタンパク質の高泌乳期産出量に関連する特徴を含む。
【００３１】
カゼインの領域のハプロタイプと産生および産生物の品質の特徴、例えば体細胞数、脂肪％、タンパク質％、β−カゼイン産出量、および脂肪酸プロフィールとの間に、有意な関連性があることを発見した。
【００３２】
母集団において隣接するＤＮＡマーカーおよびこれらマーカーの組み合わせ（すなわちハプロタイプ）間の無作為ではない関連性、ならびにこれらマーカーおよびハプロタイプおよび身体的特徴との間の関係についての情報は、以下の潜在的な利点を有する：
１．ただ１つのマーカーに基づいて動物を選択する選択法を修飾して、表現型における公知または未知の効果に連関する遺伝的情報を同時に選択してしまうことに起因し得る、望ましくない身体的特徴の偶発的増幅を回避または最小限に抑えることができる。
２．ゲノムの領域内のいかなる１つのＳＮＰと比較しても、産生物の品質の同程度またはより正確な予測を提供する、同領域内のＳＮＰ対立遺伝子の特定の組み合わせ（ハプロタイプ）の同定。
３．公知または未知のＳＮＰのより大きな群における変異を効率的に予測する、ＳＮＰ対立遺伝子のサブセットの同定。
４．何らかの理由でそれ自体では遺伝子型を決定することのできないＳＮＰの同定の、有用な程度の正確さでの予測。
５．ゲノムの領域内の新たな、まだ発見されていないようなＤＮＡの変異も典型的にはその中に含まれることになる、該領域内で起こる主要な関連群の同定。
【００３３】
本発明は、以下のためのＳＮＰの同定、ならびにＳＮＰおよびＳＮＰハプロタイプの使用を可能にする：
１．最小のＳＮＰ検査を用いて、特定のα−カゼインおよび/またはβ−カゼインおよび/またはκ−カゼインの変異型を産生する動物を、効率的に選択、区分、または分類するための方法を提供する。特にカゼインの変異型に関する遺伝子型および表現型は、少数の関連するＳＮＰの遺伝子型を決定することにより推測することができる。多数の遺伝子型または表現型、または検査することのできない遺伝子型に連関する関連マーカーを用いることで、経済的および技術的利点を提供することができる。
２．乳牛の性能、ならびにそれにより同畜牛の生乳の産生物の品質および健康への影響、またはその畜牛の子孫について、カゼインの領域のいかなる１つのＳＮＰとも同程度、またはそれ以上に予測する。
３．最小数のマーカーで畜牛母集団のカゼイン遺伝子の多くの変異を分類し、それにより予測される性能または産生物の品質により、畜牛を分類するための有効な手段を提供する。
４．関連のあるカゼインにおける変異型の頻度の変化を最小としつつ、特定のカゼインのタイプ（例えばβ−カゼインＡ２）を選択する有効な方法を提供する。
５．特定の集団中のβ−カゼインＡ２の動物の比率を増加させると同時に、その他のカゼイン遺伝子または関連する特徴を選択する方法を提供する。
【００３４】
ＳＮＰを発見する方法およびそれらをいかに使用することができるかを示す以下の実施例を参照することにより、本発明をさらに詳細に述べる。これらの実施例は本発明の範疇を限定するものではないことは、理解されるであろう。いかなる当業者もこれらの方法を一般的に使用して、動物のゲノム中の有用なＳＮＰを発見することができることを理解するだろう。
【実施例】
【００３５】
（実施例）
実施例１：母集団におけるＳＮＰの同定
いくつかの個々の畜牛に由来するαｓ１、αｓ２およびβ−カゼイン遺伝子中のＤＮＡ配列を決定、分析し、ＳＮＰを同定した。これらの配列の比較により、多型の配列を同定することができた。
【００３６】
オリゴヌクレオチドプライマー、配列番号１から配列番号１４をデザインし、合成した。この配列は、Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ  αｓ１（アクセション番号Ｘ５９８５６）配列およびαｓ２（アクセション番号Ｍ９４３２７）配列として公開されている配列に基づく。各プライマーのペアはまた、ＰＣＲで得られるあらゆる産物が、そのフランキング末端にＸｈｏ１およびＥｃｏＲ１制限エンドヌクレアーゼ部位を有するようにデザインした。ＰＣＲ増幅の条件は、適当なプライマーペアに対して至適化した。
【００３７】
配列番号１、配列番号２
配列番号３、配列番号４
配列番号５、配列番号６
配列番号７、配列番号８
配列番号９、配列番号１０
配列番号１１、配列番号１２
配列番号１３、配列番号１４
これらの結果から、αｓ１遺伝子のエキソン１−２およびエキソン３−６およびαｓ２遺伝子のエキソン１−２および１７−１８に対応するＤＮＡ領域から、期待されたサイズのＰＣＲ産物が得られることが決定された。
【００３８】
予め遺伝子型が決定されており、β−カゼインタンパク質のＡ１またはＡ２変異型のいずれかのキャリアーであることが示された畜牛から、精液のゲノムＤＮＡを精製した。ＤＮＡは、５頭のＡ１ホモ接合体（Ａ１ＤＮＡ）の動物および５頭のＡ２ホモ接合体（Ａ２ＤＮＡ）の動物からの等モル濃度で混合したゲノムＤＮＡを用いて増幅した。Ａ１ＤＮＡおよびＡ２ＤＮＡから増幅したＰＣＲ産物をHigh Pure PCR Product Purification Kitを用いて精製し、ＥｃｏＲ１およびＸｈｏ１制限エンドヌクレアーゼで消化し、その後７０℃で２０分間加熱することにより、酵素を熱により不活性化した。これら各サンプルの一部を、Ｘｈｏ１およびＥｃｏＲ１制限酵素で予め消化し、エビアルカリホスファターゼ(Amersham Pharmacia Biotech Inc.)で処理し、最後に７０℃で２０分間加熱により不活性化した、プラスミドpBluescript KS (Stratagene)中に連結させた。
【００３９】
連結したプラスミドを使用して、コンピテント大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅへの化学的形質転換を行った。Ａ１ＤＮＡまたはＡ２ＤＮＡ由来のいずれかの挿入を含む各コロニーを、コロニーＰＣＲにより分析した。αｓ１遺伝子領域については、エキソン３−６（Ａ１ＤＮＡおよびＡ２ＤＮＡから各３つ）およびエキソン１−２（Ａ１ＤＮＡに５つが由来し、そしてＡ２ＤＮＡから５つ）由来のＤＮＡを含むプラスミドの配列決定を行った。αｓ２領域については、エキソン１−２（Ａ１ＤＮＡおよびＡ２ＤＮＡから各５つ）およびエキソン１７−１８（Ａ１ＤＮＡおよびＡ２ＤＮＡから各５つ）をスパンする領域のプラスミドの配列決定を行った。これらの配列の比較により多型の配列およびヌクレオチドの同定を行うことができた。このような多型の配列の例を、配列番号１５−２８に示す。
【００４０】
実施例２：予測手段としてのＳＮＰの使用
Wisconsin Package Version 10.2, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisc.のプログラムを用いての整列により、配列の分析を行った。驚くことにこの分析から、Ａ１の動物とＡ２の動物とを識別するために、いくつかのＳＮＰを容易に使用することができることが明らかになった。Ａ１ホモ接合体およびＡ２ホモ接合体の動物のαｓ２遺伝子由来の配列の整列により、これらの配列中のいくつかのＳＮＰが、Ａ１またはＡ２の動物のいずれかと直接連関することが明らかになった。したがって図１に示したように、５頭のＡ１の動物および５頭のＡ２の動物からプールしたＤＮＡのαＳ２遺伝子に由来する挿入を含有する、合計１０種のプラスミドについて、pbluescriptプラスミドのｔ７およびｔ３プライマー部位から、二方向の配列決定を行った。
【００４１】
配列はすべてプログラムGelstart、Gelenter、GelmergeおよびGelassembleを用いて整列を行った。Gelassembleの結果を図１に示すが、ここでＰ１からＰ５−８２＿ｔ３またはｔ７までの配列はＡ１ホモ接合体の畜牛に由来し、Ｐ６からＰ１０−８２＿ｔ３またはｔ７までの配列はＡ２ホモ接合体の畜牛に由来する。コンセンサス配列もまたこの整列において与えられる。異なる個体の配列間には多数の差異または多型が生じる。これらの差異の多くは、個体間に生じる１つの欠失または１つのヌクレオチド塩基の違い（ＳＮＰ）である。配列中の、コンセンサス配列の最初の塩基から連続して読み取られる６６４、９２６および１３７７番の位置の３つのＳＮＰは、Ａ１の動物の配列のみにおいてはそれぞれグアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびＴを有する。反対にＡ２の動物の配列においては、この配列のこれらの位置に各々アデニン（Ａ）、Ｇ、およびシトシン（Ｃ）が認められる。６６４、９２６および１３７７の位置の３つのＳＮＰを太字および下線で示す。ＥｃｏＲ１（ＧＡＡＴＴＣ）およびＸｈｏ１（ＣＴＣＧＡＧ）制限エンドヌクレアーゼ認識部位もまた太字で示す。
【００４２】
これらのヌクレオチドの同定はまたシーケンシング以外の方法、特にゲノム配列の特異的な増幅技術、例えばポリメラーゼ連鎖反応（Mullis, K. et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263-273 (1986); Erlich H. et al., EP 50,424; EP 84,796, EP 258,017, EP 237,362; Mullis, K., EP 201,184; Mullis K. et al., US 4,683,202; Erlich, H., US 4,582,788; およびSaiki, R. et al., US 4,683,194）と組み合わせて使用する方法により決定することもできる。このような方法の例として、エキソヌクレアーゼ耐性による方法（US 4,656,127）、ＤＮＡの多型部位を分析するためのプライマーをガイドとしたヌクレオチド取り込みの方法（Komher, J.S. et al., Nucl. Acids. Res. 17: 7779-7784(1989); Sokolov, B. P., Nucl. Acids Res. 18: 3671 (1990); Syvanen, A. -C., et al., Genomics 8: 684-692 (1990); Kuppuswamy, M. N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88: 1143-1147 (1991); Prezant. T. R. et al., Hum. Mutat. 1: 159-164 (1992); Ugozzoli, L. et al., GATA 9: 107-112 (1192); Nyren, P. et al., Anal. Biochem. 208: 171-175 (1993)）、“オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ”（”Oligonucleotide Ligation Assay” ）(“OLA”)法（Landegren, U. et al., Science 241: 1077-1080 (1988)）、ピロシークエンシング（pyrosequencing）法（Kittles et al., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2001 Sep; 10(9): 943-7）、およびＭａｓｓＡＲＲＡＹ法（Sequenom Corp.）を含む。
【００４３】
実施例３：別の遺伝子型決定法を用いて遺伝子型または表現型を予測するためのＳＮＰの使用
本実施例は、実施例２で使用したより大きな母集団において、ＳＮＰの同定をＤＮＡシーケンシング以外の方法で決定することができ、そしてこれらのＳＮＰを使用して、遺伝子型または表現型を予測することができることを示す。特に、ＰＣＲ増幅、プライマーの伸展、およびSequenom質量分析計装置によるプライマー伸展産生物の最終的な分析に基づいた方法を使用して、動物または動物由来の組織が、特異的に生乳β−カゼイン遺伝子のＡ１（または反対にＡ２）変異型をコードする遺伝子の１つまたは２つのコピーのいずれかを含有するかどうかを予測した。
【００４４】
公知のヘテロ接合体Ａ１Ａ２の動物由来の精液を使用して、雌ウシを人工的に受精させた。ＤＮＡサンプル（生乳由来）を雄親およびこれらの交配による子孫から単離した。子孫が表現型的にまたは遺伝子型的にＡ１またはＡ２であることに関するこの子孫の同定を、個体毎に決定した。合計７１頭の子孫について、ＡＣ０００６９、ＡＣ０００７０、ＡＣ０００５５、ＡＣ０００５７、ＡＣ０００５８、ＡＣ０００５９、ＡＣ０００６０、ＡＣ０００６１、ＡＣ０００６３およびＡＣ０００６４（配列表を参照）に関するＳＮＰを、Sequenom Inc.の標準的な方法により分析した。これらのＳＮＰに加えて、乳タンパク質変異型β−カゼインＡまたはＢの同定を決定するマーカーＡＣ０００６９およびＡＣ０００７０についても、遺伝子型の決定を行った。
【００４５】
完全な遺伝子型の各個体の遺伝子型を分析し、それらのハプロタイプ（すなわちマーカー同士がその染色体上で物理的に生じる、マーカーの組み合わせおよび構成）を導いた。最初にCrimapパッケージを使用して雌からおよび２つの雄からのハプロタイプがプログラムSimwalkにより導かれている変則例について、ＳＮＰをチェックした。Ａ１またはＡ２β−カゼイン生乳表現型を決定するＳＮＰを含むこれらのＳＮＰの分析から導かれたハプロタイプを、表１に示す。
【００４６】
【表１】
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【００４７】
２つの雄からのおよび３６の雌からのハプロタイプからなる合計３８のハプロタイプが導かれる。しかし、より詳細な観察によりこれらの動物に関して１８の独特のハプロタイプのみが認められた。より重要なことにこれらのＳＮＰ、より具体的にこれらのＳＮＰの小さなサブセットを用いて、Ａ１またはＡ２の遺伝子型を有する動物を区別することができる。本研究は３６頭の動物および雄親において、これらの動物の１頭を除く全てについての同定を推測可能とする（すなわち９７％の正確さ）のに、ＳＮＰのうちの１つのみ（ＡＣ０００６１）の遺伝子型を決定すればよいことを示した。さらに２つのＳＮＰ（ＡＣ０００５９およびＡＣ０００６３）の遺伝子型を決定することで、この母集団の全ての動物をＡ１またはＡ２の遺伝子型および表現型であるとの同定を行うことができる（表２参照）。
【００４８】
【表２】
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【００４９】
本発明を、実施例を通して説明してきたが、本発明の範疇から離れることなく変異および修飾を行うことができることは、理解されるべきであろう。さらに特異的な特徴と公知の均等物があれば、このような均等物も本明細書で特異的に述べたものとして含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１−１】 
【図１−２】 
【図１−３】 
【図１−４】 
【図１−５】 
【図１−６】 
【図１−７】 
【図１−８】 
【図１−９】 
【図１−１０】 
【図１−１１】 
【図１−１２】 
【図１−１３】 
【図１−１４】 
【図１−１５】 
【配列表】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図１−８】
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【図１−９】
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【図１−１０】
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【図１−１１】
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【図１−１２】
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【図１−１３】
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【図１−１４】
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【図１−１５】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年1月26日(2005.1.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウシ属動物が、タンパク質β−カゼインＡ1をコードする遺伝子またはタンパク質β−カゼインＡ2をコードする遺伝子を有するかどうかを、β−カゼインＡ1またはβ−カゼインＡ2遺伝子いずれかに関する少なくとも１つのＤＮＡマーカーであって、ここで、当該少なくとも１つのＤＮＡマーカーはタンパク質αｓ２−カゼインをコードする遺伝子中に位置する、当該マーカーの存在について、同動物のＤＮＡを検査することにより決定する方法。
【請求項２】
少なくとも１つのＤＮＡマーカーが、αｓ２−カゼイン遺伝子のエキソン１７またはエキソン１８に位置する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１つのＤＮＡマーカーがＳＮＰである、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＳＮＰが、配列番号２１のＡＣ００００６１である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
さらに、配列番号１９のＡＣ００００５９および配列番号２３のＡＣ００００６３のＳＮＰの存在について検査することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ウシ属動物が雌牛である、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１つのＤＮＡマーカーの存在が、その雌ウシの生産する生乳中のβ−カゼインＡ1の存在の有無に連関する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１つのＤＮＡマーカーの存在が、その雌ウシの生産する生乳中のβ−カゼインＡ2の存在の有無に連関する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つのＤＮＡマーカーが、β−カゼインＡ1をコードする遺伝子に関するマーカーである、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１つのＤＮＡマーカーが、β−カゼインＡ2をコードする遺伝子に関するマーカーである、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ウシ属動物のＤＮＡを、有核細胞を含有するまたは含有していたウシ属動物のあらゆる組織から得る、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
動物のＤＮＡを同動物の血液、精液、体毛、または生乳から得る、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
以下の工程：
ａ）１頭またはそれより多くのウシ属の雌ウシが、タンパク質β−カゼインＡ1をコードする遺伝子またはタンパク質β−カゼインＡ2をコードする遺伝子を有するかどうかを請求項１に従って決定する；
ｂ）タンパク質β−カゼインＡ1をコードする遺伝子を有していない雌ウシを選択する；そして
ｃ）選択した雌ウシから搾乳する；
ことを含む、β−カゼインＡ1を実質的に含まない生乳を産生する方法。
【請求項１４】
生乳が、実質的に全てβ−カゼインＡ2であるβ−カゼインを含有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１３または請求項１４に記載の方法により得られた生乳。
【請求項１６】
請求項１５に記載の生乳を含む、または同生乳から加工した、食品または食料製品。
【請求項１７】
請求項１に記載の方法に従って各雌ウシのＤＮＡを検査し、そしてβ−カゼインＡ2をコードする遺伝子を有していてβ−カゼインＡ1をコードする遺伝子を有していない雌ウシを選択することにより、ウシ属の雌ウシの集団を形成する方法。
【請求項１８】
請求項１に記載の方法に従って検査したウシ属動物由来の精液または胚。
【請求項１９】
いずれかの人工的繁殖技術を用いて産仔を産生させるために使用する、請求項２３に記載の精液または胚。