(57)【要約】  ヒト第XIII因子タンパクの２のサブユニットのいずれかの存在及び量についての血清サンプルの分析が、血清及び血漿の試験中におこるエラーの重要な根源を除去する手段として使用される。血清サンプルについては、サブユニットａの存在についての分析の陰性の結果は、サンプルが本当に血清であることを立証する手段であり、一方、サブユニットａについての陰性又は陽性の結果は、血清（陰性）を血漿（陽性）から識別するために役立つ。サブユニットｂの存在についての陽性の結果は、サンプルが血清又は血漿のいずれかであり、他の生物学的液体のいずれでもないことの立証手段である。サブユニットｂの定量的分析は、サンプルが不適切なサンプリングによって容量が減少したよりもむしろ、意図した容量であることの立証手段である。サブユニットbの定量的分析はまた、血清又は血漿のいずれかのサンプルの希釈度の立証手段でもある。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的状態の存否について分析される分析テストサンプルがヒト血清で、且つ、ヒト血漿を含まないサンプルであることを立証するための方法であって、その中のヒト第XIII因子タンパクのａサブユニットの存在について前記サンプルを分析することを含み、こうして検出されたａサブユニットが前記サンプル中のヒト血漿の存在の指標である、前記方法。
【請求項２】
前記ａサブユニットの上記存在がイムノアッセイによって決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、ここで、前記イムノアッセイが以下のステップ：
前記サンプルを、前記ａサブユニットに対する特異的な結合親和性を有し、且つヒト第XIII因子タンパクのｂサブユニットに対する結合親和性を実質的に有さない捕捉抗体と接触させること；及び
こうして捕捉された前記ａサブユニットを検出すること、
を含む、前記方法。
【請求項４】
請求項２に記載の方法であって、ここで、前記イムノアッセイが以下のステップ：
（ｉ）前記サンプルを、固相であって、前記ａサブユニットに対する特異的な結合親和性を有し、且つ前記ヒト第XIII因子タンパクの上記ｂサブユニットに対する結合親和性を実質的に有さない捕捉抗体がそこへ結合された、前記固相と接触させること；
（ｉｉ）前記ａサブユニットの、前記捕捉抗体を介した前記固相への結合が起こったか否かを決定すること、
を含む、前記方法。
【請求項５】
前記固相が粒子の集団であり、且つステップ（ｉｉ）がフローサイトメトリーによって前記粒子を検出することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
請求項２に記載の方法であって、ここで、前記イムノアッセイが以下のステップ：
前記サンプルを、前記ａサブユニットに対する結合親和性を有する捕捉抗体と接触させること；及び
こうして捕捉された前記ａサブユニットを、前記ａサブユニットに対する特異的な結合親和性を有し、且つ前記ヒト第XIII因子タンパクのｂサブユニットに対する結合親和性を実質的に有さない検出抗体で検出すること、
を含む、前記方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、ここで、前記イムノアッセイが以下のステップ：
（ｉ）前記サンプルを、前記ａサブユニットに対する結合親和性を有する捕捉抗体がそこへ結合された固相と接触させること；及び
（ｉｉ）前記ａサブユニットに対する特異的な結合親和性を有し、且つ前記ヒト第XIII因子タンパクの上記ｂサブユニットに対する結合親和性を実質的に有さない検出抗体とこうして結合したａサブユニットを検出することによって、前記ａサブユニットの前記捕捉抗体を介した前記固相への結合が起こったか否かを決定すること、
を含む、前記方法。
【請求項８】
前記固相が粒子の集団であり、且つ、ステップ（ｉｉ）がフローサイトメトリーによって前記粒子を検出することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
生物学的状態の存否について分析される分析テストサンプルが血清又は血漿サンプルで、且つ、脳脊髄液、尿、又は非ヒト血清のいずれでもないことを立証するための方法であって、前記サンプル中のヒト第XIII因子タンパクの上記ｂサブユニットの存在について前記サンプルを分析することを含み、前記ｂサブユニットの上記存在が、前記サンプルがヒト血清又は血漿サンプルであることを立証する、前記方法。
【請求項１０】
前記ｂサブユニットの上記存在がイムノアッセイによって決定される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、ここで、前記イムノアッセイが、以下のステップ：
前記サンプルを、前記ｂサブユニットに対する特異的な結合親和性を有する捕捉抗体と接触させること；及び
こうして捕捉された前記ｂサブユニットを検出すること、
を含む、前記方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の方法であって、ここで、前記イムノアッセイが以下のステップ：
（ｉ）前記サンプルを、前記ｂサブユニットに特異的な結合親和性を有する捕捉抗体がそこへ結合された固相と接触させること；及び
（ｉｉ）前記ｂサブユニットの前記捕捉抗体を介した前記固相への結合が起こったか否かを決定すること、
を含む、前記方法。
【請求項１３】
前記固相が粒子の集団であって、且つステップ（ｉｉ）がフローサイトメトリーによって前記粒子を検出することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
血清又は血漿のいずれかのサンプルの希釈度を決定するための方法であって、以下のステップ：
前記サンプルを、前記サンプル中のヒト第XIII因子タンパクの上記ｂサブユニットの量について分析すること；及び
前記量を、既知の希釈度のヒト血清又は血漿サンプル中のｂサブユニットの上記量と比較すること
を含む、前記方法。
【請求項１５】
前記サンプル中の前記ｂサブユニットの上記量が、イムノアッセイによって決定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、ここで、前記イムノアッセイが以下のステップ：
前記サンプルを、前記ｂサブユニットに対して特異的な結合親和性を有する捕捉抗体と接触させること；及び
こうして捕捉されたｂサブユニットを検出すること、
を含む、前記方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の方法であって、ここで、前記イムノアッセイが以下のステップ：
（ａ）前記サンプルを、前記ｂサブユニットに特異的な結合親和性を有する捕捉抗体が結合された固相と接触させること；及び
（ｂ）前記ｂサブユニットの前記捕捉抗体を介した前記固相への結合が起こったか否かを決定すること、
を含む、前記方法。
【請求項１８】
前記固相が粒子の集団であって、且つ、ステップ（ｂ）がフローサイトメトリーによって前記粒子を検出することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
血清又は血漿のいずれかのサンプルが、選択された容量であることを立証するための方法であって、以下のステップ：
前記サンプルを、前記サンプル中のヒト第XIII因子タンパクの上記ｂサブユニットの上記量について分析すること；及び
こうして検出された前記量を、前記選択された容量であることが知られたヒト血清又は血漿サンプル中のｂサブユニットの上記量と比較すること
を含む、前記方法。
【請求項２０】
前記ｂサブユニットの上記量がイムノアッセイによって決定される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法であって、ここで、前記イムノアッセイが以下のステップ：
前記サンプルを、前記ｂサブユニットに対する特異的な結合親和性を有する捕捉抗体と接触させること；及び
こうして捕捉された前記ｂサブユニットを検出すること、
を含む、前記方法。
【請求項２２】
請求項２０に記載の方法であって、ここで、前記イムノアッセイが以下のステップ：
（ａ）前記サンプルを、前記ｂサブユニットに対する特異的な結合親和性を有する捕捉抗体が結合された固相と接触させること；及び
（ｂ）前記ｂサブユニットの前記捕捉抗体を介した前記固相への結合が起こったか否かを決定すること、
を含む、前記方法。
【請求項２３】
前記固相が、粒子の集団であって、且つ、ステップ（ｂ）がフローサイトメトリーによって前記粒子を検出することを含む、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
１．発明の分野
本発明は、臨床検査室における試験手順及び器具使用のための品質管理並びにヒト第XIII因子タンパク及びその使用の分野に属する。
【０００２】
２．従来技術の説明
開業医、研究者、及びすべてのタイプの臨床家を含む、医学社会は、類似の機能及びサービスと同様に、日常の理学的検査の一部分としての生物学的サンプルの分析試験について、そして病気の診断、並びに患者の進行及び病気の状態のモニターにおいて、臨床検査室に依存する。尿及び脳脊髄液のような他の体液がしばしば同様に使用されるにもかかわらず、これらの検査室で分析される最も共通する生物学的サンプルの中には、血清及び血漿がある。多くの分析が自動化された器具使用によって実施され、そしていくつかの場合には、多数のサンプルが同時に分析される。試験がこの方法によって実施されるか、又は臨床検査技師によって個別の基準で実施されるかによらず、偽の結果を作り出すことのできる多くのエラーの根源がある。
【０００３】
生じるエラーは、２の一般的なクラスに属する−（１）標準的な操作手順及び器具の機能不全におけるちょっとした間違いによる偽の試験結果、及び（２）分析のエラー。最初のクラスの最も共通するエラーのいくつかは、検体の希釈度の不正確な数学的補正、器具の信号解釈のエラー、及びサンプルウエル又は輸送配管中の泡或いは標準より少ない容量のサンプルを得る機能不全のような器具によるサンプリングのエラーである。第２のクラスでは、最も共通するタイプのエラーは、較正のドリフトにより引き起こされる。本発明は、最初のクラスのエラーに取り組むものである。熟練した試験においては、これらのエラーは、100万回のアッセイあたり300の間違った試験結果を引き起こすことが示されている。検査室でのエラーの原因についての総説は、Jenny, R.W. et al., "Causes of Unsatisfactory Performance in Proficiency Testing," Clin. Chem. 46(1): 89-99(2000)に報告されており、彼らは、不正確な希釈度の補正が、熟練した試験において偽の試験結果の21％を引き起こすこと、そして、気泡又はサンプルの凝固によって引き起こされるような、特定の自動化された器具におけるサンプリングのミスが、一般的な母集団からのサンプルの試験における器具の使用中に、0.016％の時間で起こったことを見出した。さらなるエラーの根源は、血清の代わりに尿、脳脊髄液、又は他の体液のような間違ったサンプルタイプを使用すること、又は凝固試験では、血清と血漿の区別における間違いである。
【発明の開示】
【０００４】
発明の要約
ヒト第XIII因子タンパクに関する生物学的サンプルの分析が上記の多様なタイプのエラーを検出する有効な方法であることがここに発見された。その分野で上記タンパクの活性化された形態として認識されている”サブユニットａ”又は”FXIIIa”、及びその機能が、担体タンパクであろうと推測されているが、一般的には不明である”サブユニットｂ”又は”FXIIIb”と称される上記タンパクの２のサブユニットは、以下において本発明の異なる側面において別々に分析され、エラーの検出において有用な異なるタイプの情報を提供する。FXIII全体は、各サブユニットを２個含む４量体であり、各サブユニットの解離した形態同様にヒト血漿中に存在する。しかしながら、ヒト血清のイムノアッセイはテトラマーも解離したサブユニットａも検出せず、替わりにサブユニットｂのみを検出する。少量の４量体がヒト血清中に存在するかも知れないが、仮にそうだとしても、その量は典型的なイムノアッセイの検出限界よりも低い。本明細書中で使用される”血清”及び”血漿”という用語は、特記されない限り、ヒト血清又は血漿を意味する。
【０００５】
１の側面において、本発明は、サブユニットｂが血漿及び血清中で狭い生理学的範囲を有し、ごくまれにのみ欠乏するという事実を利用することに属する。加えて、病気の状態がこのサブユニットの濃度に対して有する効果は、十分に僅かである。したがって、本発明のこの側面は、そのサンプルの量又は容量の指標としての、血清又は血漿のサンプル中のサブユニットｂの量的決定に属する。検出されたサブユニットｂの量が、サンプルが意図した容量であったときにサンプル中に存在するであろう量よりも顕著に少ない場合、定量はサンプリング容量のエラー、すなわち、意図したサンプル容量に対する不足、の指標として役立つ。
【０００６】
他の側面においては、本発明は、血漿がサンプル成分のすべてでないとしても、少なくとも一部分を構成するということの指標として、その存在が役立つサブユニットａについてサンプルを分析することによって、サンプルが血清又は血漿のいずれであるかを決定するため、又はサンプルが血漿であるよりも本当は血清であることを立証するための方法に属する。
【０００７】
第３の側面においては、本発明は、血清又は血漿であると考えられるサンプルが、脳脊髄液又は尿或いは非−ヒト血清のような他の生物学的液体であるよりも実際はこれら２のうちの１であることを立証するための方法に属する。この決定は、サンプルをサブユニットｂの存在について分析することにより達成され、サブユニットｂは血清及び血漿の両方に存在し、非ヒト血清又は他の生物学的液体中には存在しないため、陽性の結果はサンプルが実際は血清又は血漿であることを示す。
【０００８】
本発明のなおさらなる側面は、サンプルの希釈度を決定又は立証するための、そのサンプル中のサブユニットｂの量又は濃度についての血清又は血漿サンプルの分析に属する。これは、検出された量又は濃度を、その希釈度が既知である、同じタイプの体液のサンプルのものと比較することによって達成される。
【０００９】
本発明のこれら及び他の特徴及び側面は、以下の説明からより容易に理解されるであろう。
【００１０】
発明の詳細な説明及び特異的な実施態様
ヒト血液凝固第XIII因子（FXIII)は、トランスグルタミナーゼであり、且つ、血液凝固カスケードの最後の酵素である。フィブリン安定化因子、Laki-Lorand因子、フィブリナーゼ、架橋酵素、としても知られ、FXIIIはグルタミン及びリジン側鎖間のイソペプチド結合の形成を触媒することにより、血餅の架橋を引き起こす。この架橋は主に柔らかい血餅中のフィブリン分子間で起こるが、フィブリンとアンチプラスミン間でも起こる。因子自体は、上記の４量体として正常に存在し、トロンビンとCa++によって活性化された上でのみ、その酵素機能を果たす酵素前駆体である。活性化は、ａサブユニットのアミノ末端の近くのArg37-Gly38ペプチド結合のトロンビンによる開裂を通じて起こる。Ca++の存在下、ｂサブユニットはその後４量体から解離し、ａサブユニットを露出する。したがって、活性型は、遊離されたaサブユニット、FXIIIaである。ｂサブユニット、FXIIIbは、４量体中のａサブユニットを安定化し、又は血漿中で４量体の活性化を制御すると考えられる。いったん活性化されると、ａサブユニットは、フィブリンに結合されたままで、ｂサブユニットが血清中に放出される。４量体、個々のサブユニットのいずれもが、診断又はモニタリングのための分析サンプルとして使用されることができる尿、又は脳脊髄液或いは非ヒト体液中には存在しない。
【００１１】
したがって、慣用のイムノアッセイ技術の検出限界内において、遊離のFXIIIa及び４量体（FXIIIa及びFXIIIbのそれぞれを２鎖含む）が血漿中にのみ存在する一方、遊離のFXIIIbは血清及び血漿の両方に存在する、すなわち：
血漿：FXIIIa、FXIIIb、及び４量体
血清：FXIIIbのみ
【００１２】
血清中のFXIIIbの典型的な濃度は、21μg/mLであり、先天的なFXIII欠乏症に罹っていない患者でのいかなる変動も約10-40μg/mLの範囲内である。濃度は、体の病理学的状態に依存せず、凝固過程によって影響されない。
【００１３】
４量体又は２のサブユニットのいずれかを検出及び／又は定量するために多様な方法が使用され得る一方、好ましい検出方法はイムノアッセイである。特別に簡便なクラスのイムノアッセイでは、テストサンプルが固相に固定化された結合試薬と接触させられ、そして分析物の存在及び／又は量を検出するために実施されるステップの１が、結合せずに残っている種から、固相に結合した試薬に結合した反応混合物中の種を分離することである。固相は、多様な形態のいずれをとることもでき、その最も卓越した例は、マルチ・ウエル・プレートの個々のウエルのような反応容器の壁であり、そしてアッセイ混合物中に分散された固体粒子である。
【００１４】
粒子が使用された場合、それらは好ましくは、顕微鏡的サイズであり、したがって微粒子と呼ばれる。微粒子は、一般的にはイムノアッセイにおいてそれを有用なものとする一定の特徴を持つポリマー材料で形成される。そのような１の特徴は、そのマトリックスが生物学的サンプルの成分及び微粒子に加えられたアッセイ試薬以外のアッセイ試薬に対して不活性であることである。他の特徴は、そのマトリックスが、固体で、サンプル及びアッセイ中で使用されるいかなる他の溶媒又は担体にも不溶であり、アッセイ試薬を微粒子に加えることができることである。蛍光が検出手段として使用されるようにイムノアッセイが設計される場合、ポリマー材料は、好ましくは最小の自己蛍光を示すものである。好適なポリマーの例は、ポリスチレン、ポリエステル、ポリエーテル、ポリオレフィン、ポリアルキレンオキサイド、ポリアミド、ポリウレタン、ポリサッカライド、セルロース、及びポリイソプレンである。架橋は、多くのポリマーに構造的な完全性及び剛性を与えるのに有用である。これらの要件は、微粒子以外の固相にも適用可能である。
【００１５】
粒子の使用は、器具使用によって識別可能な群に粒子を分類する可能性をさらに提供する。したがって、別々のアッセイ結果が粒子の各群について独立に決定される、多重アッセイが同時に実施されることができる。このやり方による粒子の分類は、各粒子の主要部の中に、蛍光色素又は染料のような同定物質を埋め込み、異なるそのような作用物質、そのような作用物質の異なる強度、又はそのような作用物質の異なる比率での組み合わせを、異なる粒子群間において用いることによって達成されることができる。これらに基づいて粒子を識別することのできるフローサイトメーターは、本分野において知られており、商業的な提供者より入手可能である。
【００１６】
固相の表面は、典型的には分析物に結合する抗体である結合メンバーの付着のための官能基を好ましくは含むであろう。これらの官能基は、官能基を含む単独のモノマー又はコモノマーのいずれかのモノマーからポリマーを形成するような、慣用の手段でポリマー構造中へ取り込まれることができる。好適な官能基の例は、アミン基（−NH2）、アンモニウム基（−NH3+又はRがアルキル又はアリール基である−NR3+）、ヒドロキシル基（−OH）、カルボン酸基（−COOH)、及びイソシアネート基（−NCO)である。ポリスチレンにカルボン酸基を導入するための有用なモノマーは、例えば、アクリル酸及びメタクリル酸である。
【００１７】
結合メンバーの固相表面への付着は、静電気の引力、特異的親和性相互作用、疎水性相互作用、又は共有結合によって達成されることができる。共有結合が好ましい。結合基は、固相表面上の反応基の密度を増加させるため、及びアッセイの最大の範囲と感度を達成するように立体障害を減少させるための手段、又は固相に添加されることができるアッセイ試薬のタイプの範囲を広げるように特異的なタイプの反応基を固相表面へ付加するための手段として使用されることができる。好適な有用な結合基の例は、ポリリジン、ポリアルパラギン酸、ポリグルタミン酸、及びポリアルギニンである。
【００１８】
粒子が固相として使用され、検出がフローサイトメトリーによって実施される実施態様においては、高い自己蛍光を発する粒子の使用を避けるように気をつけなければならない。なぜなら、高い自己蛍光は、粒子をフローサイトメトリーに適さないものとするからである。自己蛍光の低い粒子は、広く多様な出発モノマーから標準的なエマルジョンポリメライゼーション技術によって作り出されることができる。ジビニルベンゼンモノマーのパーセンテージの高い粒子と同様に、空隙率及び表面積の高い粒子（すなわち、”マクロ多孔質”粒子）は、それらが高い自己蛍光を示す傾向があるために避けるべきである。しかしながら、一般的には、本発明において使用される好適な微粒子はそのサイズにおいて広く可変であり、サイズは本発明にとって決定的なものではない。ほとんどの場合、最良の結果は、その粒子が直径で約0.3マイクロメーター〜約100マイクロメーター、好ましくは約0.5マイクロメーター〜約20マイクロメーターの範囲である微粒子集団によって得られる。
【００１９】
粒子が固相として使用される場合、結合種を非結合種から分離する１の手段は、磁力反応性材料で作られた、又はそれを含む粒子を使用することである。そのような材料は磁場に反応するものである。本発明の実施において使用されることができる磁力反応性材料は、常磁性体材料、強磁性体材料、フェリ磁性体材料、及びメタ磁性体材料を含む。常磁性体材料が好ましい。例は、鉄、ニッケル、及びコバルト並びにFe3O4、BaFe12O19、CoO、NiO、Mn2O3、Cr2O3及びCoMnPのような金属酸化物である。磁力反応性材料は粒子全体を構成することができるが、好ましくは、粒子の単なる１の成分であり、残りの部分は、磁力反応性材料がそこへ添加され、分析物結合メンバーの付着を許容するために上記のように化学的に誘導されたポリマー材料である。
【００２０】
磁力反応性の材料を含む粒子が使用された場合、粒子中のそのような材料の量は、決定的ではなく、広い範囲で可変である。その量は、粒子の密度に影響を及ぼすことができるが、その量及び粒子サイズの両方が懸濁液中に粒子を保持する容易性に影響を及ぼすことができる。懸濁液の保持は、液体と固相間の最大の接触を促進し、フローサイトメトリーを容易にすることに貢献する。蛍光が検出に役割を果たすアッセイにおいては、粒子中の過剰量の磁力反応性材料はまた、アッセイ結果を妨害するのに十分に高レベルの自己蛍光を生じるであろう。したがって、磁力反応性の材料の濃度は上記材料から発する自己蛍光を最小化するのに十分に低いことが好ましい。これらを考慮すると、本発明による粒子中の磁力反応性材料は、好ましくは、重量で粒子全体の約１％〜約75％である。より好ましい重量パーセントの範囲は、約2％〜約50％、さらにより好ましい重量パーセントは、約5％〜約15％である。磁力反応性材料はポリマー表面にコーティングとして、又は表面上の２以上のコーティングのうちの１として加えられて、或いはポリマーマトリックス中に上記材料を固定するいずれかの他のやり方で取り込まれ又は付着されてポリマー全体に分散されることができる。
【００２１】
競合型又はサンドイッチ型の両方のイムノアッセイが使用可能である。競合アッセイは例えば、分析物に特異的な結合タンパク分子（抗体のような）が結合した固相を使用することによって実施可能である。アッセイの間、サンプル及び一定量の標識分析物が同時又は経時的に固相に接触させられる。限られた数の結合部位を使用することによって、アッセイは、利用可能な結合部位に関して標識分析物とサンプル中の分析物との間に競合を引き起こす。好適なインキュベーション時間の後、液体と固体の混合物は分離される。磁力反応性材料を含む粒子が固相として使用される場合、分離は、粒子を磁場中に置き、粒子を反応容器の壁に付着させることによって達成される。そうでなければ、分離は、遠心分離又はイムノアッセイの使用及び設計の分野の当業者に周知の他の慣用方法によって達成されることができる。いったん分離された粒子は、残存する非結合の分析物及び標識を除去するために洗浄される。粒子はその後、標識が検出されるところのフローサイトメーター中へ導入するためにキャリアー液体中に再懸濁されることができる。
【００２２】
免疫測定アッセイとしても知られているサンドイッチアッセイは、分析物に対する抗体が結合する粒子（又はいずれかの固相）を使用することによって実施される。この抗体は”捕捉”抗体と呼ばれる。すべての分析物が結合するように、分析物の予想される量の範囲に比較して過剰の捕捉抗体が使用される。捕捉抗体が付着した固相はサンプルと接触されられ、サンプルと同時又は経時的に同じ分析物に対する第２抗体が添加される。捕捉抗体と同様に、第２抗体は分析物に比較して過剰であり、しかし捕捉抗体とは異なり、第２抗体は検出可能な標識に接合され、したがって”標識”抗体と呼ばれることができる。捕捉及び標識抗体は、分析物の異なるエピトープに結合するか、又はそうでなければ、非妨害的なやり方で同時に分析物に結合することができる。好適なインキュベーション時間の後、固体及び液体の相が分離される。固相が磁力反応性の材料で成る場合、微粒子が懸濁された液体混合物が磁場の影響下に置かれ、微粒子を反応容器の壁に付着させ、そして液相が除去される。なお容器壁に付着している微粒子は、その後固定化された分析物に結合しなかった過剰の標識抗体を除去するために洗浄され、そして微粒子はその後、間に入った分析物を介して粒子に付着した標識の量が検出されるフローサイトメーター中に導入される、キャリアー液体に再懸濁される。
【００２３】
本発明の実施におけるイムノアッセイは、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のいずれかの使用を含む。FXIIIの２のサブユニット（個別に）のいずれかに対する特異的な結合親和性を有する抗体、及び４量体に対する抗体は商業的な供給者から入手可能である。そのような供給者は、Biogenetics Inc.，Brentwood，New Hampshire，USA; U.S. Enzyme Research Laboratoriesによって配給されたAffinity Biologics；Calbiochem, San Diego, California, USA; The Binding Site, Inc., San Diego, California, USA; Biodesign International, Saco, Maine, USA; Enzyme Research Laboratories, Inc., South Bend, Indiana, USA; Fitzgerald Industries International Inc., Concord, Massachusetts, USA; 及びHematologics Inc., Seattle, Washington, USAを含む。サンドイッチアッセイにおいて、抗体は、捕捉及び標識抗体のような多様な組み合わせで使用されることができる。したがって、FXIIIaを定量するために、抗−FXIIIa抗体が捕捉抗体として、抗−FXIII抗体（すなわち、４量体に対する抗体）が標識抗体として使用可能である。同様に、抗−FXIII抗体（すなわち、４量体に対する抗体）は捕捉抗体として、抗−FXIIIa抗体が標識抗体として使用されることができる。替わりに、抗−FXIIIa抗体は、捕捉及び標識抗体がFXIIIa分子上の異なるエピトープに対して特異性を有するという条件で、捕捉抗体及び標識抗体の両方として使用されることができる。FXIIIbを定量するために、抗−FXIIIb抗体が捕捉抗体として、及び抗−FXIII抗体（すなわち、４量体に対する抗体）が標識抗体として使用されることができる。同様に、抗FXIII抗体（すなわち、４量体に対する抗体）が捕捉抗体として、及び抗−FXIIIb抗体が標識抗体として使用されることができる。そしてさらに同様に、抗−FXIIIb抗体が、捕捉及び標識抗体がFXIIIb分子上の異なるエピトープに対する特異性を有するという条件で、捕捉抗体及び標識抗体の両方として使用されることができる。他の組み合わせは、容易に当業者に明らかとなるであろう。ポリクローナル又はモノクローナルのいずれかの抗体が使用されることができる。モノクローナル抗体が使用される場合、それらは、捕捉抗体、標識抗体のいずれか、又は両方であることができる。
【００２４】
本発明の実施における分析物の検出は、免疫的アッセイにおいて使用され、又は有効であることが知られている広く多様な検出方法のいずれかによって達成されることができる。蛍光は１例であり、蛍光物質標識の使用によって容易に達成される。広く多様な蛍光物質及びイムノアッセイにおけるそれらの使用方法はイムノアッセイの分野における当業者に周知であり、広く多様な蛍光物質が商業的に入手可能である。好ましい蛍光物質は、できるだけ少量の自己蛍光に寄与するものである。その消衰係数及び量子収率が他の蛍光物質よりも優れているために、蛍光物質フィコエリトリンは、この意味で好ましい。
【００２５】
フローサイトメトリーの使用を要する本発明の実施態様については、フローサイトメトリーの方法及びそのための器具使用はその分野において周知である。文献中のフローサイトメトリーの器具使用及び方法についての記述の例は、以下の：McHugh, "Flow Microsphere Immunoassay for the Quantitative and Simultaneous Detection of Multiple Soluble Analytes,"Methods in Cell Biology 42, Part B(Academic Press, 1994); McHugh et al., "Microsphere-Based Fluorescence Immunoassays Using Flow Cytometry Instrumentation," Clinical Flow Cytometry, Bauer, K.D. et al., eds.(Baltimore, Maryland, USA: Williams and Williams, 1993),pp.535-544; Lindmo et al., "Immunometric Assay Using Mixtures of Two Particle Types of Different Affinty," J. Immunol. Meth.126:183-189(1990); McHugh, "Flow Cytometry and the Application of Microsphere-Based Fluorescence Immunoassays," Immunochemica 5:116(1991); Horan et al., "Fluid Phase Particle Fluorescence Analysis: Rheumatoid Factor Specificity Evaluated by Laser Flow Cytophotometry," Immunoassays in the Clinical Laboratory, 185-189(Liss 1979); Wilson et al., "A New Microsphere-Based Immunofluorescence Assay Using Flow Cytometry," J. Immunol. Meth.107:225-230(1988); Fulwyler et al., "Flow Microsphere Immunoassay for the Quantitative and Simultaneous Detection of Multiple Soluble Analytes," Meth. Cell Biol. 33:613-629(1990); Coulter Electronics Inc., 英国特許第1,561,042号（1980年2月13日に掲載）; Steinkamp et al., Review of Scientific Instruments 44(9):1301-1310(1973); 及びChandler, V.S., et al., 1999年11月9日に交付された米国特許第5,981,180号 "Multiplexed Analysis of Clinical Specimens Apparatus and Methods,"（Luminex Corporation)である。
【００２６】
本発明は、手動の方法及び自動化された方法の両方において有用である。本発明の特別な関心事は、自動化されたイムノアッセイアナライザーの正確性を立証することにある。そのような機器の例は、Abbott Laboratories Diagnostics Division, Abbott Park, Illinois, USAのAxSYMイムノアッセイアナライザー、及びBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, California, USAのCODA（登録商標）イムノアッセイアナライザーである。
【００２７】
本発明の方法は、広く多様な生理学的及び臨床的状態の指標である分析物について、血清又は血漿サンプルについて実施されるいかなる分析方法とともに用いられることもできる。FXIIIサブユニットの分析は、サンプリング容量又は希釈度の正確性、或いは正しいサンプルが分析されているか、を立証するであろう。上記２の分析は同時又は経時的のいずれで実施されることもできる。
【００２８】
以下の実施例は、例示的な目的にのみ提供されるものであり、本発明の範囲を制限することを意図するものではない。
【実施例１】
【００２９】
この実施例は、ヒト第XIII因子タンパクの解離したサブユニットaの存在について分析することによって、血漿を血清から識別する、本発明の可能性を例示するために、微粒子上で経時的なイムノアッセイを実施した結果を提供する。
【００３０】
アッセイは、サンドイッチ型イムノアッセイであり、微粒子は、7.1μｍの磁性微粒子であった。微粒子の一部分は、抗−FXIIIa2ｂ2ポリクローナル抗体でコーティングし、第２の部分は抗−FXIIIaポリクローナル抗体（捕捉抗体として）でコーティングした。抗−FXIIIaポリクローナル抗体が、遊離及び結合したサブユニットaの両方に反応し、遊離のサブユニットｂには反応性が無かった一方、抗−FXIIIa2ｂ2ポリクローナル抗体は、４量体と特異的に反応した。異なる抗−FXIIIa2ｂ2ポリクローナル抗体を試験のために両方の部分に対して標識抗体として使用した。したがって、微粒子の第２の部分のアッセイが解離したサブユニットaのみの存在を示した一方、第１の部分のアッセイは、４量体及びいずれかの解離したサブユニットの存在を示した。
【００３１】
微粒子は、磁鉄鉱を含んでおり、ジビニルベンゼンでスチレン架橋した。粒子表面は、コーティング層でカルボキシル化した。粒子の各群に特有のスペクトルによる指定を与えるか又は粒子を色分けするために、各粒子セット中に可変量の蛍光色素を埋め込んだ。粒子のコーティングは、１-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロライド及びN-ハイドロキシスルホサクシニミドとの反応によって形成された活性エステル形態に変換した。活性エステルでコーティングされた粒子は、その後、抗体上のフリーのアミノ基で抗体に結合した。活性エステル形態への変換及び抗体の結合は、免疫学者の間で周知の慣用方法に従って実施した。
【００３２】
最初にサクシニミジル4-（N-マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボキシレートで抗体を活性化した後に、抗体をフィコエリトリンに接合させ、スルホサクシニミジル6-[3’-（2-ピリジルジチオ）-プロピオンアミド]ヘキサノエート／ジチオスレイトールでフィコエリトリンを活性化することによって標識抗体を調製した。これらの活性化及び接合は、免疫学者の間で周知の慣用方法に従って同様に実施した。
【００３３】
最初のアッセイ（抗−FXIIIa2b2ポリクローナル抗体を捕捉及び標識抗体の両方として使用する）のために、100μLの血清を粒子濃度が47μg/ｍLの洗浄緩衝液中の粒子懸濁液100μLと混合し、一方、分離懸濁液を形成するために、100μLの血漿を47μg/ｍLの粒子懸濁液100μLと混合した。すべての場合において、粒子／サンプル懸濁液を室温で15分間、振盪機上で（1,100回転／分）インキュベートした。非結合の、及び混入したタンパク並びにイムノグロブリンを磁性的に分離し、洗浄緩衝液で２回洗浄し、３分間の磁性的な分離後の洗浄の間には吸引を行った。分析のために、最終的に75μLの容量の洗浄緩衝液を各群に添加した。
【００３４】
前方への光散乱及び粒子蛍光を測定することのできるLuminex 100フローサイトメーター上で分析を実施した。機器の励起システムは、微粒子表面のフィコエリトリンの励起のための532nmのレポーターレーザー、微粒子のバルク中に埋め込まれた蛍光色素の励起のための635nmの分類レーザーを含むものであった。励起によって得られた蛍光発光を、選択的発光フィルターで識別し、機器内のデジタルシグナルプロセッサーによって、その値がいかなる特別なイムノアッセイにおいても反応の規模を示す、出力シグナルに変換した。機器の供給者によって推奨された適切な方法を用いて、機器を較正微粒子によって較正した。こうして較正された値は、蛍光強度の相対的規模の指標であり、本明細書中で”検出ユニット”を呼ばれる。
【００３５】
一連の血清及び血漿の個別サンプル、並びに洗浄緩衝液のみについて検出ユニットで表された結果を表Iに列挙する。
【００３６】
【表１】
2005516180.tif 000002
【００３７】
表I中のデータは、捕捉及びレポーター抗体の両方が（解離したサブユニット同様に）４量体に結合親和性を有した場合に、血漿及び血清において等価のFXIIIシグナルが得られたこと及び捕捉抗体がサブユニットａに特異的であった場合に血清中にシグナルが検出されなかったことを示す。サブユニットａの血漿に対する独自性（すなわち、血清中にサブユニットａのないこと）は、このようにして血漿を血清から識別した。
【実施例２】
【００３８】
この実施例は、血漿を血清から識別するための本発明の可能性を表すためにELISAs（酵素結合免疫測定法）の結果を提供する。ここでは、すべての場合において４量体に特異的なモノクローナル抗体を捕捉抗体として使用し、そして、検出抗体として別々のアッセイにおいてサブユニットａに特異的なポリクローナル抗体とサブユニットｂに特異的なポリクローナル抗体を使用した。
【００３９】
アッセイは、コーティングされたマイクロプレート上で実施し、実施例１のように、血清について２のアッセイ、血漿について２のアッセイを実施した。プレートをコーティングするために、捕捉抗体を50ｍM炭酸緩衝液、ｐH9.6で1/100に希釈し、１ウエルあたり100μLの容量でマイクロプレートウエルに添加し、続いてウエルあたり4℃で一夜インキュベーションした。ウエルを使用の直前に空にし、ブロッキング緩衝液を加え、続いてリン酸緩衝生理食塩水（PBS)及びTween界面活性剤で４回洗浄した。血漿及び血清サンプルをPBSで1/400に希釈し、ウエルに加えた。その後、1/1000に希釈した検出抗体を100μL/ウエルで加え、そして、マイクロプレートを室温で60分間インキュベートし、PBS-Tweenで洗浄、室温で再度60分間インキュベートし、再洗浄した。ペルオキシダーゼを接合した抗-ウサギIgG抗体の1/1000希釈液を100μL/ウエルで加えた。その後、酸性緩衝液（100μL）中のペルオキシダーゼ基質、テトラメチルベンジジンを各ウエルに加え、発色したら、100μLの停止溶液を各ウエルに加えた。
【００４０】
各ウエルの吸光度を450nmにおいてELISAリーダーを用いて測定した。結果を表IIに列挙する。
【００４１】
【表２】
2005516180.tif 000003
【００４２】
これらのデータは、サブユニットａがそのサブユニットに特異的な抗体によって血清中では検出されず、血漿中でのみ検出されたことを示し、サブユニットａの血漿に対する独自性が、血漿を血清から識別する手段であることを再度確認した。
【実施例３】
【００４３】
この実施例は、ヒト尿、ヒト脳脊髄液、及び多様な種の血清中のFXIII４量体のアッセイ結果を比較する。
【００４４】
アッセイは、実施例１のように磁性微粒子上で実施したサンドイッチ型イムノアッセイであり、捕捉抗体として抗−ヒトFXIIIa2b2モノクローナル抗体、標識抗体としてフィコエリトリンと接合した抗−ヒトFXIIIa2b2ポリクローナル抗体を使用した。実施例１に記載のやり方で8.0μmの直径の粒子を捕捉抗体でコーティングし、抗体−標識接合体を実施例１の記載と同様に調製した。粒子を47μg/ｍLの濃度となるように洗浄緩衝液に懸濁し、粒子懸濁液の100μL分割量をヒト血清、脳脊髄液、尿、ロバ血清、マウス血清、及びヤギ血清の各100μLと混合した。得られた粒子／サンプル懸濁液を室温で15分間、振盪機上で（1,100回転／分）インキュベートした。非結合の、及び混入タンパクをその後、磁性的な分離によって除去した。粒子をその後、２回洗浄し、洗浄の間で３分間の磁性的分離及び吸引を行った。その後、あらかじめ希釈した接合体（1.8μg/試験）を加え、懸濁液を再度インキュベートし（室温、15分、1,100回転/分）、続いて磁性的に分離し、吸引した。最後に、フローサイトメトリー分析のための粒子を調製するために洗浄緩衝液（75μL）を加えた。
【００４５】
その後、フローサイトメトリーを実施例１のように実施した。結果を図１中の棒グラフに示す。ここで、棒グラフは左から右へ、ヒト尿、ヒト血清、ヒト脳脊髄液、ヤギ血清、ロバ血清、及びマウス血清を表す。グラフは、FXIIIがヒト血清中でのみ検出され、他のヒト体液又はヤギ、ロバ、又はマウスの血清中では検出されなかったことを明らかに示す。
【実施例４】
【００４６】
この実施例は、不足したサンプル、すなわち、ヒト血清サンプルの容量の相違、を検出するために本発明によるFXIIIの分析がいかに使用されるかを表す。上記の実施例３と同じ型の微粒子を使用した。
【００４７】
試験の第１組において、50μL、10μL、3.2μL、2.0μL、及び1μLの容量のサンプルを、微粒子懸濁液（100μL、洗浄緩衝液中47μg/ｍL）に添加した。インキュベーション、洗浄、及び他の方法のステップは実施例３のように行い、Luminexフローサイトメーター上で検出ユニットとして読み取られた結果を表IIIに示す。
【００４８】
【表３】
2005516180.tif 000004
【００４９】
これらの結果は、サイズを欠くヒト血清サンプルがFXIII量の分析によって検出され得ることを表す。
【００５０】
試験の第2組では、同じサイズのサンプル容量を、微粒子懸濁液に添加する前に洗浄緩衝液で100μLに調節した。その他の方法は、第１組で使用したのと同じであった。結果を表IVに列挙する。
【００５１】
【表４】
2005516180.tif 000005
これらの結果は、第１組の結果を確認するものである。
【００５２】
第３組においては、17μL、13μL、11μL、9μL、7μL、5μL、及び3μLのサンプル容量を390μLの洗浄緩衝液と併合し、それぞれの100μLを微粒子懸濁液に加えた。上記方法はその他は第１、及び第２組で使用したのと同じであり、結果を表Vに列挙する。
【００５３】
【表５】
2005516180.tif 000006
【００５４】
これらの結果は、第１、及び第２組の結果を確認するものである。
【００５５】
試験の第４組においては、5μL、3μL、2μL、及び1μLの容量の23の血清サンプル（-70℃で保存された）を295μLの洗浄緩衝液と併合し、100μLのコーティングされた粒子懸濁液（0.28μg）を各チューブに加えた。得られた粒子／サンプル懸濁液を、室温、900回転／分で15分間、振盪機上でインキュベートした。非結合の、及び混入タンパク、並びにイムノグロブリンを磁性的な分離によって除去した。粒子を300μLの洗浄緩衝液で２回洗浄し、連続する洗浄の間に３分間の磁性的分離及び吸引を行った。最後の洗浄後、50μLのフィコエリトリン−標識抗-FXIII抗体（１試験あたり0.25μgのフィコエリトリン）を各チューブに添加した。チューブを室温で振盪機上でインキュベートし（15分間、900回転/分）、続いて３分間磁性的に分離し、吸引した。その後、粒子を300μLの洗浄緩衝液で２回洗浄し、洗浄の間で３分間の磁性的分離及び吸引を行った。洗浄緩衝液（75μL)をその後加え、懸濁液をフローサイトメーター上で分析した。
【００５６】
結果を、サイトメーターの検出ユニット及び多様なサンプルサイズの間でどのようにそれらが分布するかを示す図３に示す。横軸は検出ユニットであり、縦軸はサンプル数であり、縦のバーの異なる組は多様なサンプルサイズ、塗りつぶしたバーは5μLのサンプルに、白抜きのバーは1μLのサンプルに、右上がりの斜線をつけた影つきバーは3μLのサンプルに、左上がりの斜線をつけた影つきバーは2μLのサンプルに使用される。すべての1μLのサンプルは、すべての5μLのサンプルから完全に離れており、これら２の組の間に重複はない。これは、適切なサンプル容量の20％しかないサンプルの存在が一様に完全な容量のサンプルから識別され得ることを示す。
【実施例５】
【００５７】
この実施例は、本発明によるFXIIIの分析が希釈されたヒト血清サンプルの検出にいかに使用されるかを示す。上記の実施例４中に記載されたと同じ型の微粒子を使用した。
【００５８】
試験の第１組において、血清を1/10、1/20、1/40、1/80、及び1/160に洗浄緩衝液で希釈したものを使用した。先の実施例中のように、各希釈液をコーティングした微粒子懸濁液と混合した。その後、直ちに磁性的分離を行い（インキュベーションせずに）、混入タンパク及びイムノグロブリンを除去した。引き続く洗浄及び標識抗体とのインキュベーションの後、微粒子をLuminexフローサイロメーター上で分析し、結果を表VIに示す。
【００５９】
【表６】
2005516180.tif 000007
【００６０】
試験の第２組において、洗浄緩衝液で1/40、1/80、1/160、1/320、1/640、1/1280、及び1/2560に希釈した血清を使用した。各希釈液を、先の実施例におけるようにコーティングされた微粒子懸濁液と混合した。試験の第１組とは異なり、この第２組における粒子／サンプル懸濁液は分離の前にインキュベートした（室温、10分間、1,100回転／分）。その後、混入タンパク及びイムノグロブリンを磁性的な分離によって除去した。引き続く洗浄及び標識抗体とのインキュベーションの後、微粒子をLuminexフローサイトメーター上で分析し、結果を表VIIに示す。
【００６１】
【表７】
2005516180.tif 000008
【００６２】
表VI及VII中のデータは、すべての希釈度が相互に識別可能であることを示す。
【００６３】
試験の第３組では、そのままの（希釈されない）、及び洗浄緩衝液で1/10に希釈したいくつかを含む各100μLの容量の23の血清サンプルを使用した。各サンプルに、サンプルあたり0.26μgの粒子を含むコーティングした微粒子懸濁液を加え、上記サンプルを磁性プレート上で3分間分離し、その後、吸引し、300μLの洗浄緩衝液で2回洗浄した。最後の洗浄の後、標識抗体（50μL）を各サンプルに加えた。その後、上記サンプルを10分間、振盪機上で混合して（900回転/分、37℃）、その後、磁性プレート上で3分間、分離した。上清を吸引し、粒子を300μLの洗浄緩衝液で2回洗浄した。フローサイトメーターのためのサンプルを調製するために、さらに、洗浄緩衝液（75μL）を各サンプルに加えた。フローサイトメーター上で行われた分析及び結果を図４のヒストグラム中に示す。図４は、そのままの、及び希釈したサンプル間の検出ユニットの分布を示す。横軸は検出ユニットの数値、縦軸はサンプル数である。塗りつぶされたバーは希釈したサンプルに、白抜きのバーはそのままの（希釈されない)サンプルに使用する。すべての希釈したサンプルはそのままのサンプルから離れており、これら２の組の間に重複はない。これは、1/10に希釈したサンプルが、希釈しないサンプルから一様に識別され得ることを確認するものである。
【実施例６】
【００６４】
この実施例は、異なるヒト患者の血清サンプル間におけるFXIIIの低度の変動を表す。260の異なる個体からのサンプルを、実施例３と同じ方法を用いて試験した。結果の分布は、図２中の昇順の検出ユニットで示す。図２は、サンプル全体を通じて、FXIIIレベルに僅かの変動しかないことを示す。
【００６５】
上述の記載は、主として例示の目的のために提供される。説明された材料及び方法のさらなる改変並びに変更が、なお本発明の範囲内にあることは、当業者に容易に明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】図１は、ヒト血清、尿、脳脊髄液、及び非−ヒト血清中のFXIIIレベルを比較する棒グラフである。
【図２】図２は、260人のヒト患者の血清間のFXIIIレベルの分布を示す線図である。
【図３】図３は、異なるサンプルサイズの血清サンプル間のFXIIIレベルを比較するヒストグラムである。
【図４】図４は、希釈した血清サンプルと希釈しない血清サンプルとの間のFXIIIレベルを比較するヒストグラムである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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