(57)【要約】本発明は、代謝疾患および障害の診断、研究、予防、および治療において、タンパク質を調節するエネルギー恒常性およびこれらをコードするポリヌクレオチドの新規使用法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
CG7956、aralar1、how、CG9373、cpo、Jafrac1、またはCG14440核酸分子から成る医薬品組成物
または、それによってコード化されたポリペプチドおよび(または)その機能的断片または当該核酸分子のエフェクター/修飾因子および(または)それによってコード化されたポリペプチド、望ましくは医薬用に許容できるキャリア、希釈液および(または)添加物と共に提供される医薬品組成物。
【請求項２】
核酸分子が脊椎動物または昆虫CG7956、aralar1、how、CG9373、cpo、Jafrac1、またはCG14440核酸、特に表1に記載のヒトタンパク質をコードする核酸、および(または)それに対して相補的な核分子、またはその機能的断片またはその変異型である請求項1の組成物。
【請求項３】
1または2、当該核酸分子が下記から成る群から選択される請求項の組成物:
(a)  表1に示したポリペプチドをコードする核酸分子;
(b)  表1に示した核酸分子から成る核酸分子か、または表1に示した核酸分子である核酸分子;
(c)  (a)または(b)で定義した核酸配列に対する遺伝子暗号の結果として変性する核酸分子;
(d)  50℃Cにて、1 x SSCおよび0.1％のSDS(ドデシル硫酸ナトリウム)を含んだ溶液中において、請求項2で定義した核酸分子および(または)それに対して相補的な核酸分子にハイブリダイズする核酸分子;
(e)  ポリペプチドをコード化する核酸分子であり、少なくとも85％、望ましくは少なくとも90％、より望ましくは少なくとも95％、より望ましくは少なくとも98％および最大で99,6％までの同一性を、表1に記載または請求項2において定義したヒトタンパク質に対して持つ核酸分子; および
(f)  当該突然変異がコード化されたポリペプチドにおいて改変、削除、重複または早期停止を引き起こす突然変異によって(a)〜(e)の核酸分子と異なる核酸分子。
【請求項４】
核酸分子がDNA分子、特にcDNAまたはゲノムDNAである請求項1〜3の任意の1項の組成物。
【請求項５】
当該核酸がポリペプチドをコード化し、エネルギー恒常性および(または)中性脂肪の代謝の調節に寄与する請求項1〜4の任意の1項の組成物。
【請求項６】
当該核酸分子が修飾核酸分子である請求項1〜5の任意の1項の組成物。
【請求項７】
組換え核酸分子がベクター、特に発現ベクターである請求項1〜6の任意の1項の組成物。
【請求項８】
ポリペプチドが組換えポリペプチドである請求項1〜5の任意の1項の組成物。
【請求項９】
当該修飾ポリペプチドが融合ポリペプチドである請求項8の組成物。
【請求項１０】
当該核酸分子がハイブリダイゼーションプローブ、プライマーおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドから選択される請求項1〜7に記載の任意の1項の組成物。
【請求項１１】
診断用組成物である請求項1〜10の任意の1項の組成物。
【請求項１２】
治療用組成物である請求項1〜10の任意の1項の組成物。
【請求項１３】
検出および(または)検証用、代謝症候群、肥満症、および(または)糖尿病を始めとする代謝疾患または機能障害、同様に、細胞、細胞塊、器官臓器および(または)被検体における摂食障害、悪質液、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、または胆石症のような関連障害の治療、軽減および(または)予防用の薬剤の製造のための請求項1〜12の任意の1項の組成物。
【請求項１４】
CG7956、aralar1、how、CG9373、cpo、Jafrac1、またはCG14440ポリペプチド、特に請求項3に記載のポリペプチドによって影響および(または)修飾される遺伝子および(または)遺伝子産物の機能を管理するための、CG7956、aralar1、how、CG9373、cpo、Jafrac1、またはCG14440核酸分子、特に請求項3の(a)、(b)または(c)による核酸分子、またはそれによってコード化されたポリペプチドまたは機能的断片または当該核酸分子または当該ポリペプチドの変異型、および(または)肥満症、糖尿病、および(または)代謝症候群の治療用の薬物の製造のための当該核細胞またはポリペプチドのエフェクター/修飾因子の使用法。
【請求項１５】
CG7956、aralar1、how、CG9373、cpo、Jafrac1、またはCG14440核酸分子、特に請求項3(a)、(b)または(c)による核酸分子、またはそれによってコード化されたポリペプチドまたは機能的断片または当該核酸分子または当該ポリペプチドの変異型の使用法、またはCG7956、aralar1、how、CG9373、cpo、Jafrac1、またはCG14440ポリペプチド、特に請求項3によるポリペプチドと相互作用する能力のある物質を試験管内で同定するための当該核酸分子または当該ポリペプチドのエフェクター/修飾因子の使用法。
【請求項１６】
CG7956、aralar1、how、CG9373、cpo、Jafrac1、またはCG14440ポリペプチド、特に請求項3によるポリペプチドの修飾発現を示す非ヒト遺伝子導入動物。
【請求項１７】
CG7956、aralar1、how、CG9373、cpo、Jafrac1、またはCG14440ポリペプチド、特に請求項3によるポリペプチドの発現が増加および(または)減少する請求項16の動物。
【請求項１８】
CG7956、aralar1、how、CG9373、cpo、Jafrac1、またはCG14440ポリペプチド、特に請求項3によるポリペプチドの修飾発現を示す組換え(型)の宿主細胞。
【請求項１９】
ヒト細胞である請求項18に記載の細胞。
【請求項２０】
哺乳動物におけるエネルギー恒常性および(または)中性脂肪の代謝に関与する(ポリ)ペプチドを同定する方法のステップは下記の通りである。
(a)  当該(ポリ)ペプチドの結合を可能にする条件下での、CG7956、aralar1、how、CG9373、cpo、Jafrac1、またはCG14440ポリペプチド、特に請求項3によるポリペプチド、またはその機能的断片を用いた、(ポリ)ペプチドの回収に接触するステップ;
(b)  結合しない(ポリ)ペプチドを除去するステップ、および
(c)  ポリペプチドまたはその断片に結合する(ポリ)ペプチドを同定するステップ。
【請求項２１】
CG7956、aralar1、how、CG9373、cpo、Jafrac1、またはCG14440ポリペプチド、特に請求項3によるポリペプチドの結合標的との相互作用を調節/影響する薬剤のための、下記のステップから成るスクリーニング方法
(a)  下記から成る混合物をインキュベートするステップ。
(aa)  CG7956、aralar1、how、CG9373、cpo、Jafrac1、またはCG14440ポリペプチド、特に請求項3によるポリペプチド、またはその機能的断片;
(ab)  当該ポリペプチドまたはその機能的断片の結合標的および薬剤; および
(ac)  候補薬剤
下記参照の親和性にて当該ポリペプチドまたはその機能的断片が特異的に当該結合標的と薬剤に結合する条件下;
(b)  薬剤の親和性を決定するため、当該結合標的に対する当該ポリペプチドまたはその機能的断片の結合親和性を検出する; および
(c)  薬剤の親和性と基準親和性間の差異を確定するステップ。
【請求項２２】
CG7956、aralar1、how、CG9373、cpo、Jafrac1、またはCG14440ポリペプチド、特に請求項3によるポリペプチドの活性を調節/影響する薬剤のための、下記のステップから成るスクリーニング方法
(a)  下記から成る混合物をインキュベートするステップ。
(aa)  当該ポリペプチドまたはその機能的断片および
(ab)  当該ポリペプチドまたはその機能的断片が基準活性を持つ条件下の
候補薬剤;
(b)  薬物の存在における活性を確定するための、当該ポリペプチドまたはその機能的断片の活性を検出するステップ; および
(c)  本薬剤の存在下の活性と標準活性間の差を確定するステップ。
【請求項２３】
医薬用に許容できるキャリア、希釈剤および(または)添加物を有する請求項20または22に記載の方法によって同定された(ポリ)ペプチド、または請求項21の方法によって同定された薬剤を含む組成物を作り出す方法。
【請求項２４】
当該組成物が、代謝症候群、肥満症、および(または)糖尿病を始めとする代謝疾患または機能障害、同様に、摂食障害、悪質液、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、または胆石症のような関連障害の防止、軽減または治療するための医薬品組成物である請求項23の方法。
【請求項２５】
請求項20の方法によって同定した(ポリ)ペプチドまたは、代謝症候群、肥満症、および(または)糖尿病を始めとする代謝疾患または機能障害、同様に、摂食障害、悪質液、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、または胆石症のような関連障害の治療、軽減および(または)予防のための医薬品組成物の調整のための、請求項21または22の方法によって同定した薬剤の使用法。
【請求項２６】
肥満症、糖尿病、および(または)代謝症候群を始めとする代謝疾患または機能障害、同様に、摂食障害、悪質液、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、または胆石症のような関連障害の治療、軽減および(または)予防のための薬物の調整のための請求項1〜6または10の任意の項において定義した核酸分子の使用法。
【請求項２７】
肥満症、糖尿病、および(または)代謝症候群を始めとする代謝疾患または機能障害、同様に、摂食障害、悪質液、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、または胆石症のような関連障害の治療、軽減および(または)予防のための薬物の調整のための請求項1〜6、8または9の任意の1項において定義したポリペプチドの使用法。
【請求項２８】
請求項7において定義したベクターの使用法、または肥満症、糖尿病、および(または)代謝症候群を始めとする代謝疾患または機能障害、同様に、摂食障害、悪質液、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、または胆石症のような関連障害の治療、軽減および(または)予防のための薬物の調整。
【請求項２９】
肥満症、糖尿病、および(または)代謝症候群を始めとする代謝疾患または機能障害、同様に、摂食障害、悪質液、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、または胆石症のような関連障害の治療、軽減および(または)予防のための薬物の調整のための請求項18または19において定義した宿主細胞の使用法。
【請求項３０】
CG7956、aralar1、how、CG9373、cpo、Jafrac1、またはCG14440遺伝子産物を過剰発現または低発現する非ヒト遺伝子導入動物の生成のための、CG7956、aralar1、how、CG9373、cpo、Jafrac1、またはCG14440核酸分子またはその機能的断片の使用法。
【請求項３１】
少なくとも下記の1つを備えたキット。
(a)  CG7956、aralar1、how、CG9373、cpo、Jafrac1、またはCG14440核酸分子またはその機能的断片;
(b)  CG7956、aralar1、how、CG9373、cpo、Jafrac1、またはCG14440アミノ酸分子またはその機能的断片;
(c)  (a)の核酸 から成るベクター;
(d)  (a)の核酸または(c)のベクターから成る宿主細胞;
(e)  (a)の核酸によってコード化されたポリペプチド;
(f)  (a)の核酸によってコード化された融合ポリペプチド;
(g)  (a)の核酸、または(b)、(e)、または(f)のポリペプチドに対する抗体、アプタマーまたは別のエフェクター/修飾因子、および
(h)  (a)の核酸アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、CG7956、aralar1、how (ヘルドアウトウイングス)、CG9373、cpo (カウチポテト)、Jafrac1 (チオレドキシン過酸化酵素1)、またはCG14440相同タンパク質の使用法、これらをコードするポリヌクレオチドの使用法、および肥満症および(または)糖尿病および(または)代謝症候群の診断、研究、予防、および治療におけるタンパク質およびポリヌクレオチドのエフェクター/修飾因子の使用法に関するものである。
【０００２】
エネルギー消費量に対比して摂取熱量がアンバランスというエネルギー不均衡に関連するヒトおよび動物代謝のさまざまな代謝疾患、例えば肥満症や体重の激減が存在する。肥満症は世界に最も蔓延している代謝障害の1つであり、重大な健康問題として西側諸国にとってますます問題となっているヒトの疾病であるが、その本質は依然としてほとんど理解されていない。肥満とは、理想体重の20％以上を超える体重として定義され、多くの場合著しい健康障害を結果としてもたらす。肥満は、脂肪過多症または肥満の指標である体重指数によって測定することが可能である。肥満を定義するためのさらなるパラメータは、ウエストサイズ、皮下脂肪の厚さおよびバイオインピーダンスである(特に、前掲のKopelman (1999)、を参照)。 肥満症は心血管疾病、高血圧、糖尿病、高脂血症のリスクの増大および高い死亡率に関連する。肥満症に悩む個人は、病気にかかる深刻なリスクを抱えている上に、多くの場合、社会的に孤立している。
【０００３】
肥満症は、遺伝的要因、代謝因子、生化学的要因、心理学的要因、および行動要因によって影響を受け、そして非インスリン依存型糖尿病、中性脂肪の増加、炭水化物接合エネルギーの増加および低エネルギー消費のような異なる原因に起因し得る。そのような事情から、肥満症は、好ましく持続可能な臨床結果を達成するために、さまざまな分野で取り組まなくてはならない複合障害である。肥満症は単一の障害として考慮されるべきではなく、(潜在的な)複数の原因を有する異種性の状態群であると考慮されるべきであり、また、空腹時の血漿インスリンの上昇および経口グルコース摂取に対する過度なインスリン反応も特徴とする(Koltermann J., (1980) Clin. Invest 65, 1272-1284)。2型糖尿病における肥満症の明らかな関与が確認されている(Kopelman P.G., (2000) Nature 404, 635-643)。
【０００４】
高脂血症および遊離脂肪酸の上昇は、肥満症およびインスリン耐性を始めとするさまざまな疾患間の連鎖として定義される「代謝症候群」と明確に相関する。これは多くの場合、同一患者において生じ、そして2型糖尿病および心血管疾病の発生の主要な危険因子である。脂質値および血糖値のコントロールが、2型糖尿病、心臓病、およびその他の代謝症候群を治療するために必要であることが示されている(例えば、Santomauro A. T.らの(1999)Diabetes、48(9):1836-1841およびMcCook、2002、JAMA 288:2709-2716を参照)。
【０００５】
食物摂取および体重のバランスを調節する分子因子は完全に理解されていない。たとえ、レプチンまたはペルオキシソーム増殖活性の受容体ガンマ活性化補助因子のような体重/重量を調節する恒常性システムに影響を及ぼすはずの候補遺伝子についての記述がいくつかあるとしても、肥満調節または体重/重量調節に影響を及ぼす特有の分子機構および(または)分子は知られていない。加えて、肥満症を結果としてもたらすさまざまな単一遺伝子の突然変異がマウスにおいて記載されており、肥満症の病因における遺伝要因を意味付けている(FriedmanおよびLeibel、1990、Cell 69: 217-220)。obマウス(遺伝性肥満マウス)において、単一遺伝子の突然変異(肥満)は、糖尿病を伴う深刻な肥満症を結果としてもたらす (Friedmanらの、1991、Genomics 11: 1054-1062 )。
【０００６】
以上の点から、本発明の根底にある技術的問題は、体重調節および(または)エネルギー恒常性回路に影響を及ぼす(病理学的な)代謝条件の調節のための手段と方法を提供することにあった。当該技術的問題に対する解決は、請求項において特徴付けられた実施例を提供することによって達成する。従って、本発明は、体重調節、エネルギー恒常性、代謝、および肥満症において、これらをコードするタンパク質および核酸の新規機能に関連するものである。従って、本明細書で開示するタンパク質およびこれらをコードするポリヌクレオチドは、代謝疾患および障害を調査研究するために好適である。さらに、記載のような代謝疾患および障害の診断、治療、および予後に有用である新規組成物を提供する。
【０００７】
KIAA0966は、シナプトジャニン様タンパク質、Sacドメインをもつイノシトールホスファターゼ(hSac2)に対してコード化する。シナプス小胞は、神経末端において注目すべき速度と精密度でリサイクルされる。主要なリサイクル経路には、放出部位の周囲に位置するエンドサイトーシス領域でのクラスリン仲介のエンドサイトーシスが含まれる。この経路に関連する異なる「アクセサリー」タンパク質が、脂質膜の形状および組成を改変すること、膜被覆タンパク質の相互作用を修飾すること、そしてアクチン重合に影響することが証明されている。これらには、GTPaseダイナミン、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ(転移酵素)エンドフィリン、およびイノシトールリン酸ホスファターゼシナプトジャニンが含まれる(Brodin L.らの、2000、Curr Opin Neurobiol 10(3):312-320)。シナプス小胞のエンドサイトーシ研究によって小胞形成におけるエンドフィリンおよびシナプトジャニンの重要な役割が明らかにされている(Ringstad N.らの1999, Neuron 24(1):143-154を参照)。酵母菌ゴルジおよび酵母菌アクチン機能における分泌欠陥の劣性抑制因子はこのファミリーに属する(Luo W.およびChang A.、1997、J Cell Biol138(4):731-746)。このタンパク質は、分泌経路およびアクチン細胞骨格の活性の協調に関与することが可能である。また、神経末端において被覆されたエンドサイトーシスの中間体上に局在することも可能であり、ヒトのシナプトジャニンもこのファミリーに属する(Haffner C.らの、1997、FEBS Lett 419(2-3):175-180)。シナプス小胞のエンドサイトーシ研究によって小胞形成におけるエンドフィリンおよびシナプトジャニンの重要な役割が明らかにされている(Ringstad N.らの1999, Neuron 24(1):143-154を参照)。
【０００８】
ヒトSacドメインをもつイノシトールホスファターゼ(hSac2)は偏在的に発現するが、特に脳、心臓、骨格筋、および腎臓において豊富である。hSac2タンパク質は、ホスファチジルイノシトール4、5-二リン酸エステルおよびホスファチジルイノシトール3、4、5-三リン酸エステルに特異的な5-ホスファターゼ活性を示す(Minagawa T.らの、(2001) J Biol Chem 276(25):22011-22015)。
【０００９】
ミトコンドリア内のエネルギー伝達には、この原核細胞小器官の内膜全域にわたる多くの特異的な代謝物の輸送が必要とされる。ミトコンドリアのキャリアファミリー(MCF)は少なくとも37タンパク質から成る(KuanJ.およびSaier M.H.、1993、Crit Rev Biochem Mol Biol 28(3):209-233)。ミトコンドリアのアスパルタート/グルタマートキャリアは、尿素サイクルおよびアスパルタート/リンゴ酸塩NADHシャトルの両方における重要な段階に触媒作用を及ぼすシトリンおよびaralar1は、それらのN末端領域においてEFハンドCa2+結合モチーフを有するミトコンドリアのキャリアファミリーに属する相同タンパク質である。シトリンおよびaralar1は、ミトコンドリアにおいて刺激されたアスパルタート/グルタマート輸送体アイソフォームCa2+である。(Palmieri L.らの、2001、EMBO J 20(18):5060-9)。溶質キャリア25ファミリー、メンバー13 (SLC25A13)は、カルシウム結合ミトコンドリアのキャリアタンパク質、指定されたシトリンをコード化する。SLC25A13遺伝子における突然変異は成人発症の2型シトルリン血症につながる(Yasuda T.らの、2000、Hum Genet 107(6):537-545)。
【００１０】
ヘルドアウトウイングス(how)ショウジョウバエ遺伝子は、筋活性および心活性の制御に関与するRNA結合タンパク質をコード化する。howタンパク質は核に局在する。howは、少なくとも髄鞘形成において役割を演ずるマウスクエーキング遺伝子に高度に関連し、シグナル伝達経路をmRNA代謝の制御に結び付ける働きをし得る(Zaffran S.らの、1997、Development 124(10):2087-2098)。ショウジョウバエRNA結合タンパク質であるhowの2個のアイソフォームは、腱細胞分化を調節するために互いに反対方向に作用する(Nabel-Rosen H.らの、2002、Dev 細胞2002 Feb;2(2):183-193)。Howアイソフォームの反対行動は、標的筋mRNAのmRNA劣化の差速によって明らかにされる。この機構は、哺乳動物RNA結合クエーキングタンパク質として保存され、Krox20、シュワン細胞成熟の制御因子の水準に同様に影響を及ぼす可能性がある。
【００１１】
マウスクエーキング(qk)遺伝子は、髄鞘形成および受精後まもない初期胚形成の両方において必須である。その生成物QKIは、STARと呼ばれる成長タンパク質ファミリーに属するRNA結合タンパク質である(RNAのシグナル伝達および活性化剤) (Wu J.らの、1999、J Biol Chem 274(41):29202-29210)。クエーキングは血管発生にとって必須である(Noveroske J.K.らの、2002、Genesis 32(3):218-230)。
【００１２】
ミエリン基本的なタンパク質(MBP)遺伝子は膠細胞およびシュワン細胞において発現され、その発現は厳重に規制された発生経時変化に従う。MBP遺伝子の細胞型特異性発現および発生段階特異性発現は、転写始動部位の上流に位置する一連のシス作用性エレメントによって調節される。ミエリン遺伝子発現因子2 (Myef-2)、マウス脳から分離されたタンパク質は、MBP遺伝子の転写を抑圧する。Myef-2 mRNAは、マウス脳において発生的に調節され;そのピークの発現は、MBP発現の兆候に先行して、出世後第7日目に起こる(Haas S.らの、1995、J Biol Chem 270(21):12503-12510)。
【００１３】
MBPは、ミエリン形成中にその生成が発生的に制御される、ミエリン鞘の主成分である。MBP遺伝子のプログラム発現は転写レベルで調節される。MB1調節モチーフは、MBPプロモーターの転写において重要な役割を果たす。MB1エレメントには、リプレッサータンパク質MyEF-2 (ミエリン遺伝子発現因子2)の結合部位が含まれる。MyEF-2は、脳発生の過程中にMBP遺伝子の転写調節に関与する(Muralidharan V.らの、1997、J Cell Biochem 1997 Sep 15;66(4):524-31)。
【００１４】
キイロショウジョウバエ遺伝子のカウチポテト(cpo、GadFlyアクセッション番号CG18434)は推定細胞核RNA結合タンパク質をコード化する。本タンパク質はショウジョウバエ胚(胚の中枢神経系、胚の末梢神経系、胚/幼虫の中腸、グリア細胞およびその他の組織)において発現される(Harvieらの、1998、Genetics 149(1): 217-231)。少なくとも3タンパク質アイソフォーム(例えば、Cpo 17、Cpo 61.1およびCpo 61.2)および49の記録された変異体対立遺伝子が記載されている。幼虫腹部神経節に影響し、そしておよびare的ショウジョウバエにおいて劣性致死である突然変異が分離されている。変異体cpoハエは、異常かつ低機能な行動を示す(Bellenらの、1992、Genetics 131: 365-375、およびBellenらの、1992、Genes Dev. 6: 2125-2136)。本発明では、ショウジョウバエcpoにコードされた遺伝子産物、複数結合のRNA結合タンパク質遺伝子、および仮想タンパク質XP_091097に対するヒトホモログタンパク質として記述する。従来の技術からは、ヒトホモログタンパク質に関するさらなる情報が提供されていない。
【００１５】
大気の酸素の不完全な還元は、活性酸素種(ROS)およびそれらの毒性副生物を始めとする強力な酸化剤を作成する。ROSからの保護作用は、非酵素的な薬剤、酵素、およびチオレドキシンのような低分子量の酸素還元酵素によって仲介される。標準状態下では、チオレドキシン還元酵素は、酸化型チオレドキシンをNADPHの存在下で還元する。還元型チオレドキシンは、結果的にH2O2 to H2Oを還元するチオレドキシン過酸化酵素(ペルオキシレドキシン)のための電子ドナーとして役に立つ(Schallreuter K.U.およびWood J.M.、2001、J Photochem Photobiol B 64(2-3):179-184)。ペルオキシレドキシンファミリーのメンバーは、非病理的な状態下および炎症性疾患時に種々の組織において、抗酸化保護の役割を果たす。抗酸化剤は、NFKB (核因子kappa-B)転写因子活性化において重要な役割を果たす、細胞内の酸化還元(レドックス)状態を管理する。特定の転写因子のレドックス調節に対しては、異なる抗酸化剤を選択することができる。ペルオキシレドキシンファミリーのペルオキシダーゼは、水素ペルオキシドH2O2およびアルキルヒドロペルオキシドをチオールをもつドナー分子に由来する還元当量を用いて、水およびアルコールに対して還元する。
【００１６】
高度に保存された抗酸化酵素ファミリー,ペルオキシレドキシン(Prxs)は2つの主要なPrxサブファミリーを持っており、活性酸素種(ROS)を取り除くため、その1つのサブファミリは2個の保存されたシステイン(2-Cys)を使用し、そして他の1つは1-Cysを使用する。哺乳動物2-Cysの4メンバー(Prx I-IV)は、酸化防止のためにチオレドキシンを電子ドナーとして利用する。Prxsには、細胞をROS発作から保護する能力があり、さらに細胞成長およびアポトーシスに影響を及ぼすためにc-Abl、カスパーゼ、細胞核因子kappaB (NF-kappaB)および活性化剤 タンパク質1 (AP-1)を利用する、シグナル伝達経路を調節する能力がある。また、Prxsは、赤血球(RBC)分化にとっても必須であり、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)感染および臓器移植拒絶反応を抑制する能力がある(Butterfield L.H.らの、1999、Antioxid Redox Signal 1(4):385-402)。分散パターンは、Prxsが、アルツハイマー病およびパーキンソン病およびアテローム性動脈硬化症のようなROS毒性に関連する疾患の危険性がある組織および細胞において高度に発現されることを示す。この相関関係は、PrxsがROS毒性に対して保護性を持っているものの、一部の細胞においては酸化ストレスに圧倒されることを示唆する(Butterfield L.H.らの、1999、Antioxid Redox Signa 1(4):385-402)。Prxsには高濃度にて大きな凝集体を形成する傾向があり、その特性によって通常のPrxs保護機能が妨害される可能性があるばかりでなく、Prxsに細胞毒性が与えられる可能性さえある。また、サブタイプの発現における不均衡は、Prxsの酸化ストレスに対する感受性を潜在的に増大することもできる。以上の点から、Prxsは、アテローム性動脈硬化症から癌、神経変性疾患に至る範囲のROS関連疾患の細胞機能障害において役割を果たすことが可能である。
【００１７】
GadFlyアクセッション番号CG14440を有するショウジョウバエ遺伝子は、ヒト仮想タンパク質LOC55565 (タンパク質=GenBankアクセッション番号NP_060000.1、cDNA=NM_017530)に対して最も相同性が高いタンパク質に対してコード化する。従来の技術においては、これらのタンパク質の機能データは提供されていない。
【００１８】
これまでは、本発明のタンパク質または相同タンパク質がエネルギー恒常性および体重調節および関連障害の調節に関与することは記載されておらず、従って上記のような代謝疾患およびその他の疾患における機能は記述されていない。本発明において、本発明のタンパク質の正しい遺伝子投与量がエネルギー恒常性の維持にとって必須であることを実証する。遺伝子学的スクリーニングを用いて、本発明のタンパク質をコードする遺伝子または相同遺伝子の突然変異が、代謝、特に肥満症に関連する代謝において、主要なエネルギー貯蔵物質である中性脂肪の含有量の著しい変化を反映する変化を引き起こすことを同定した。
【００１９】
本タンパク質、ヌクレオチド配列、および方法について以下に説明するが、説明した特定の方法、プロトコル、細胞株、ベクターおよび試薬によって本発明が限定されるものではなく、改変し得ることは当然のことながら共通認識とする。また、本詳細書で使用する専門用語は特定の実施例を説明する目的で用いたものに過ぎず、特許請求の範囲にのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことも当然のことながら共通認識とする。本明細書中で用いる全ての専門用語および科学用語は、特に定義されている場合を除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有するものとする。本明細書中に記載する方法および材料に類似または等価な方法および材料は、本発明の実践または検査で用いることができるが、好適な方法、装置、および材料はここに記載する。本明細書で言及する全ての刊行物は、本発明に関連して使用され得る刊行物中で報告されている細胞株、ベクターおよび方法論について説明および開示する目的で、ここに引用することをもって本明細書の一部となす。本明細書のいかなる開示内容も、本発明がこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【００２０】
本発明は、CG7956、aralar1、how、CG9373、cpo、Jafrac1、またはCG14440相同タンパク質(本明細書中では、「本発明のタンパク質」と呼ぶ)質がエネルギー恒常性および脂肪代謝、特に中性脂肪、および本発明において開示したタンパク質を同定およびコードするポリヌクレオチドの代謝と保管を調節することを開示する。また、本発明は、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを作り出すためのベクター、宿主細胞、抗体、および組換え方法に関連するものである。また、本発明は、代謝症候群、肥満症、または糖尿病を始めとする代謝疾患および機能障害、同様に、摂食障害、悪質液、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、または胆石症のような関連障害の診断、研究、予防、および治療におけるこれらの配列の使用法に関するものである。
【００２１】
よって、GadFlyアクセッション番号CG7956、aralar1 (GadFlyアクセッション番号CG2139)、how (GadFlyアクセッション番号CG10293)、GadFlyアクセッション番号CG9373、cpo (GadFlyアクセッション番号CG31243およびCG18434)、Jafrac1 (GadFlyアクセッション番号CG1633)、またはGadFlyアクセッション番号CG14440相同タンパク質および核酸分子コーディングは、昆虫または脊椎動物種、例えば哺乳類または鳥類から入手可能である。特に好適なのは、相同核酸、特に表1に記載の本発明のヒトホモログタンパク質をコードする核酸である。
【００２２】
本発明は、特に、エネルギー恒常性および中性脂肪の代謝の調節に寄与するポリペプチドをコードする核酸分子に関連するものであり、そして当該核酸分子は下記より成るものとする。
【００２３】
(a)  CG7956、aralar1、how、CG9373、cpo、Jafrac1、またはCG14440または相同核酸、特に表1に記載のヒトタンパク質をコードする核酸、および(または)それに対して相補的な配列のヌクレオチド配列、
(b)  50℃にて、1 x SSCおよび0.1％のSDS(ドデシル硫酸ナトリウム)を含んだ溶液中で(a)の配列に対してハイブリダイズするヌクレオチド配列、
(c)  遺伝暗号の変性内における(a)または(b)の配列に対応する配列、
(d)  ポリペプチドをコード化する配列であって、少なくとも85％、望ましくは少なくとも90％、より望ましくは少なくとも95％、より望ましくは少なくとも98％および最大で99,6％までの同一性を、CG7956、aralar1、how、CG9373、cpo、Jafrac1、またはCG14440相同タンパク質、望ましくは表1に記載のヒトホモログタンパク質のアミノ酸配列に対して持つ配列。
【００２４】
(e)  突然変異によって(a)〜(d)の核酸分子と異なる配列であり、コードされたポリペプチドにおいて当該突然変異が改変、削除、複製および(または)早期停止を引き起こす配列、または
(f)  15塩基、望ましくは20塩基、より望ましくは25塩基および最も望ましくは少なくとも50塩基の長さを有する(a)〜(e)のヌクレオチド配列の任意の部分的配列。
【００２５】
本発明は、CG7956、aralar1、how、CG9373、cpo、Jafrac1、またはCG14440および(または)相同タンパク質およびこれらをコードするポリヌクレオチドが中性脂肪保管の調節に関与し、それ故、エネルギー恒常性にも関与するというと知見に基づく。 また、本発明では、代謝症候群、肥満症、または糖尿病を始めとする代謝疾患および機能障害、同様に、摂食障害、悪質液、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、または胆石症のような関連障害の診断、研究、予防、または治療におけるこれらの組成物の使用法を記述する。
【００２６】
従って、本発明は、体重調節、エネルギー恒常性、代謝、および肥満症、当該遺伝子の機能的断片、当該遺伝子またはその断片によってコード化されたポリペプチドコード、およびそのエフェクター/修飾因子、例えばアンチセンス分子、RNAi分子またはリボザイム、当該ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを認識するアプタマー、ペプチドまたは低分子量有機化合物のような抗体、生物学的に活性な核酸において新規機能を有する遺伝子に関するものである。
【００２７】
キイロショウジョウバエのようなモデル個体のゲノムを操作およびスクリーニングする能力は、遺伝子、細胞プロセス、および経路の有意な進化的保存に起因する、より複雑な脊椎動物個体に対する直接的な関連性を有する生物学的および生化学的プロセスを分析するための強力なツールを提供する(例えば、Adams M. D.らの、(2000) Science 287:2185-2195を参照)。モデル個体における新規遺伝子機能の同定は、哺乳動物(ヒト)における反応経路の解明およびそれらの調節方法の解明に直接的に貢献する。病理モデル(例: 肥満症を始めとする代謝症候群の徴候としての中性脂肪値の変化)とハエ遺伝子の修飾発現との関係によって、ヒトの相同分子種の特定のヒト疾病との関連を同定することができる。
【００２８】
一実施例では、フォーワード遺伝子スクリーニングを、既知の遺伝子の異所性発現に起因する変異表現型を示すハエにおいて実施する(Johnston Nat Rev Genet 3: 176-188 (2002); Rorth P.、(1996) Proc Natl Acad Sci U SA 93: 12418-12422を参照)。本発明では、発明者らは、遺伝子スクリーニングを用いて、中性脂肪値の著しい変化が反映される体重の変化を引き起こすCG7956、aralar1、how、CG9373、cpo、Jafrac1、またはCG14440遺伝子、または相同遺伝子の突然変異を同定した。
【００２９】
肥満した人々は、主に中性脂肪含有量の著しい増加を示す。中性脂肪は細胞における最も効果的なエネルギー貯蔵場所である。エネルギー恒常性において機能をともなう遺伝子を分離するために、数千の専売的および公的に提供されているEPラインの中性脂肪含有量を長期にわたる摂食期間後に検査した(詳細は実施例を参照)。さらなる分析のための好ましい候補として、中性脂肪含有量が顕著に変化したラインを選択した。遺伝子機能の損失に起因する中性脂肪含有量の増減により、中性脂肪として貯蔵されたエネルギー量を制御する用量依存的な様式でのエネルギー恒常性における遺伝子活性が示唆される。
【００３０】
本発明において、同一遺伝子型を有するハエの集積の中性脂肪含有率を、長期にわたる摂食後、中性脂肪測定法を使用して分析した。ショウジョウバエのラインEラインに対する雄バエのホモ接合またはヘテロ接合でのベクター統合を、これらのハエの中性脂肪含有量を測定するアッセイにおいて分析し、実施例セクションにおいてその詳細を図解した。中性脂肪含有量の分析結果を図1、5、9、13、17、21、25に示す。
【００３１】
EPまたはPXベクター統合に近接して局在するゲノムDNA配列を分離した。それら分離したゲノム配列を用いて、Berkeleyショウジョウバエゲノムプロジェクト(GadFly; FlyBase (1999) Nucleic Acids Research 27:85-88も参照)のような公共データベースをスクリーニングし、それによってベクター統合部位、および実施例の項においてより詳細に記載した対応遺伝子を同定した。遺伝子の分子構造図を2、6、10、14、18、22、26にそれぞれ示す。
【００３２】
眼の表現型の修飾を有するショウジョウバエ変異体を用いた追加スクリーニングは、肥満を調節し、肥満の原因となるか、または肥満に寄与するタンパク質である脂肪とのcpoの相互作用を同定した。また、眼の表現型の修飾を有するショウジョウバエ変異体を用いた追加スクリーニングは、cpoによるUCP活性の修飾、それによってもたらされる変性ミトコンドリア活性を同定した。これらの知見は、代謝障害の診断、治療、および予後への洞察を提供する、ヒトにおけるこれら記載の相同タンパク質の類似活性の存在を示唆するものである。
【００３３】
それによってコード化された、中性脂肪代謝の調節機能を有するショウジョウバエ遺伝子およびタンパク質は、公的に利用できる配列データベースで分析し(詳細は実施例を参照)、そして哺乳動物の相同体を同定した。
【００３４】
エネルギー恒常性における哺乳動物相同体の機能(作用)は、異なる組織における転写物の発現の分析、および脂肪細胞分化における役割の分析によって、本発明でさらに確証した。発現プロフィール作成の研究(詳細は実施例を参照)は、本発明のタンパク質の特定の関連性を哺乳動物におけるエネルギー代謝の制御因子として確認する。さらに、本発明のタンパク質が、絶食と遺伝的に誘発された肥満によって調節されることを明らかにする。本発明では、本発明のタンパク質の発現を研究するために、レプチン経路遺伝子においてノックアウトを保有しているマウスのようなインスリン耐性および(または)糖尿病のマウスモデルを使用した(例えば、ob (レプチン)またはdb (レプチン受容体)マウス)。糖尿病の典型的な症状を呈するそのようなマウスは、肝脂質蓄積を示し、そして高い頻度で血漿脂質レベルを増加した(Bruningらの1998、Mol.Cell.2:449-569を参照)。
【００３５】
マイクロアレイは、生体分析化学において日常的に用いられる分析ツールである。マイクロアレイは、固形担体の表面上に分布され、そして該表面に安定して関連する分子を持つ。用語「マイクロアレイ」は、基質上の複数のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、またはその他の化合物の配列構成を指す。ポリペプチド、ポリヌクレオチド、および(または)抗体のマイクロアレイが作り出されており、遺伝子発現の監視、薬剤の発見、遺伝子シーケンシング、遺伝子マッピング、細菌の同定、およびコンビナトリアルケミストリーのような種々の用途において使用されている。マイクロアレイがとりわけ使用される一領域は、遺伝子発現分析の領域である(実施例6を参照)。アレイ技術を用いて、単一の多型遺伝子または多数の関連遺伝子の発現または無関係遺伝子の発現プロファイルを研究することができる。単一遺伝子の発現を検討する場合には、アレイを用いて特異的な遺伝子またはその変異体の発現を検出する。発現プロファイルを検討する場合、アレイは、組織特異的であり、毒物試験法において検査する物質によって影響を受け、シグナル伝達カスケードの一部であり、ハウスキーピング機能を実行し、または特異的特定の遺伝的な素因、状態、疾病、または障害に関連する遺伝子を同定するためのプラットフォームを提供する。
【００３６】
マイクロアレイは、本技術分野でよく知られている方法を用いて調製し、使用し、そして分析する（例えばBrennan, T.M.らの(1995)米国特許第5,474,796号: Schena, M.らの(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619: Baldeschweilerらの(1995) PCT出願第WO95/251116号: Shalon, D.らの(1995) PCT出願第WO95/35505号: Heller, R.A.らの(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 21502155; Heller, M.J.らの(1997)米国特許第5,605,662号などを参照）。各種マイクロアレイは公知であり、Schena、M.、ed. (1999; DNAマイクロアレイs: Practical Approach、Oxford University Press、London)において十分に記述されている。
【００３７】
更に別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド由来のオリゴヌクレオチドまたはより長い断片を、マイクロアレイにおけるエレメントとして用いることができる。多数の遺伝子の関連発現レベルを同時にモニターする転写イメージング技術にマイクロアレイを用いることが可能である。 これについては、以下に記載する。マイクロアレイはまた、遺伝変異体、突然変異及び多型の同定に用いることができる。この情報を用いることで、遺伝子機能を決定し、疾患の遺伝的根拠を理解し、疾患を診断し、遺伝子発現の機能としての疾病の進行／後退をモニターし、疾病治療における薬剤の活性を開発及びモニターすることができる。特に、患者にとって最もふさわしく、有効的な治療法を選択するために、この情報を用いて患者の薬理ゲノムプロフィールを開発することができる。例えば、患者の薬理ゲノムプロフィールに基づき、患者に対して高度に有効的で副作用を殆ど示さない治療薬を選択することができる。
【００３８】
マイクロアレイ分析によって判定されたように、クエーキング6 (QKI6)、RNA結合タンパク質HQK-7B、複数結合のRNA結合タンパク質(RBPMS)、ペルオキシレドキシン1 (PRDX1)、および仮想タンパク質LOC55565は、ヒトの初代脂肪細胞において発現の差異を示す。このようにクエーキング6 (QKI6)、RNA結合タンパク質HQK-7B、複数結合のRNA結合タンパク質(RBPMS)、ペルオキシレドキシン1 (PRDX1)、および仮想タンパク質LOC55565は、肥満症、糖尿病、および(または)代謝症候群のようなヒト代謝に関連する状態の治療のための医薬品組成物の製造および薬物に対する有力な候補である。
【００３９】
また、本発明には、本発明のタンパク質または相同タンパク質をコード化するポリヌクレオチドが包含される。従って、本発明のタンパク質のアミノ酸配列または相同タンパク質をコード化する任意の核酸配列を用いて、本発明または相同タンパク質のタンパク質を発現する組換え分子を作成することができる。特定の実施例においては、本発明には、本明細書中において「本発明のタンパク質」と呼ぶ、ショウジョウバエCG7956、aralar1、how、CG9373、cpo、Jafrac1、またはCG14440またはヒトCG7956、aralar1、how、CG9373、cpo、Jafrac1、またはCG14440ホモログをコードする核酸が包含される。当業者にとっては当然のことながら、遺伝暗号の縮重の結果、そのタンパク質をコードする多数のヌクレオチド配列(一部は既知であり天然の遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する)を作り出すことが可能である。従って、本発明には、可能コドン選択に基づく組合せの選択によって作り得るようなありとあらゆる可能性のあるヌクレオチド配列変異体を網羅し得る。
【００４０】
また、本発明に包含されるのは、種々のストリンジェントな条件下で、請求項に記載のヌクレオチド配列、および特にCG7956、aralar1、how、CG9373、cpo、Jafrac1、またはCG14440、または相同タンパク質、望ましくは表1に記載のヒトホモログのタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする能力のあるポリヌクレオチド配列である。ハイブリダイゼーション条件は、Wahl、G. M.およびS.L. Berger (1987:Methods Enzymol. 152:399-407)およびKimmel、A. R. (1987; Methods Enzymol. 152:507-511)で教示されたように、核酸結合複合体またはプローブの溶解温度(Tm)に基づいており、定義されたストリンジェントでの使用が可能である。望ましくは、ストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーションとは、1時間 1 x SSCおよび0.1％ SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)を用いて50℃にて、望ましくは55℃Cにて、より望ましくは62℃Cにて、および最も望ましくは68℃にて、特に1時間 0.2 x SSCおよび0.1％ SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)中で50℃にて、望ましくは55℃にて、より望ましくは62℃にて、および最も望ましくは68℃にて洗浄後、ポジティブなハイブリダイゼーションシグナルが認められることを意味する。本発明に包含されるそのタンパク質をコードする改造核酸配列には、異なるヌクレオチドの欠損、挿入、または置換が含まれ、機能的に同一または等価なタンパク質をコード化するポリヌクレオチドを結果としてもたらす。
【００４１】
コードされたタンパク質には、サイレント変化を作り出し、機能的に等価なタンパク質を結果としてもたらすアミノ酸残基の欠損、挿入、または置換も含まれる場合がある。計画的アミノ酸代替は、タンパク質の生物学的活性が保持される限りにおいて、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および(または)両親媒性特性の類似性に基づいて行うことができる。さらには、本発明は、ペプチドまたは誘導体が、通常少なくとも4、望ましくは少なくとも6、そして最大で50までのアミノ酸長を有する、環状ペプチド、レトロ(retro-inverso)ペプチドまたはペプチド擬態のようなタンパク質のペプチド断片またはそのような断片の誘導体に関するものである。
【００４２】
また、本発明の範囲内に含まれているものには、本発明のタンパク質または相同タンパク質をコードする遺伝子の対立遺伝子もある。本明細書で使用されている「対立遺伝子」または「対立遺伝子配列」は遺伝子の代替形態であり、核酸配列における少なくとも1つの突然変異から生じ得る。対立遺伝子は、構造または機能を改変し得るかどうかわからない変性mRNAまたはポリペプチドを結果としてもたらし得る。任意の遺伝子には、ゼロ、単一、または多くの対立遺伝子形態が含まれる場合がある。対立遺伝子を誘発する一般の突然変異変化は通常、ヌクレオチドの自然欠損、付加、または置換に帰する。これらの各変化は、単独、またはその他の変化と共に、所定の配列内で1回以上生じ得る。
【００４３】
本発明のタンパク質または相同タンパク質をコードする核酸配列は、部分的ヌクレオチド配列を利用したり、当分野で周知の種々の方法を用いて伸長させ、プロモーターおよび調節要素等の上流配列を検出することが可能である。例えば、使用可能な方法の１つである「制限部位PCR法」は、ユニバーサルプライマーを用いて既知の遺伝子座に対して近傍する未知の配列を読み出す方法である(Sarkar、G. (1993) PCR Methods Applic.2:318-322)。逆PCR法も、既知の領域に基づいた分岐プライマーを用いて配列を増幅または伸長するために使用することが可能である(Triglia、T.らのNucleic Acids Res. 16:8186)。また、別の使用可能な方法としては、ヒトおよび酵母菌の人工染色体DNAにおける既知の配列に近傍するDN断片のPCR増幅を伴うキャプチャPCR法があげられる(Lagerstrom、M.らのPCR Methods Applic. 1:111〜119)。未知の配列を読み出すために使用可能な別の方法としては、Parker、J. D.らの方法が挙げられる(1991; Nucleic Acids Res. 19:3055-3060)。加えて、PCR法、ネステッドプライマー、およびPROMOTERFINDERライブラリを用いて、ゲノムDNAの中に入ることができる(Clontech社, Palo Alto, Calif.)。このプロセスは、ライブラリをスクリーニングすることを回避し、イントロン接合部およびエキソン接合部を見つけるのに有用である。
【００４４】
生物学的に活性なタンパク質を発現するために、該タンパク質をコードするヌクレオチド配列を好適な発現ベクター、すなわち、挿入されたコーディング配列の転写および翻訳に必要な要素を含むベクターに挿入することが可能である。当業者に周知の方法を用いて、タンパク質をコードする配列、好適な転写および翻訳調節エレメントを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、試験管内組換えDNA技術、合成技術、および生体内遺伝子組換え技術が含まれる。そのような技術は、Sambrook, J.らの(1989)Molecular Cloning、Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.、およびAusubel, F. M.らの(1989)Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley& Sons, New York, N.Y.に記載されている。
【００４５】
本発明のさらに他の実施例によれば、本発明の配列をコードする核酸配列を異種配列に連結反応させ、融合タンパク質をコード化することが可能である。異種配列は、望ましくは融合タンパク質のN終端および(または)C終端に位置する。
【００４６】
種々の発現ベクターと宿主系を利用して、そのタンパク質をコードする配列を保持および発現することが可能である。これらには、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換させた細菌や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌や、ウイルス発現ベクター(例えばバキュロウイルス)に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター(例えばカリフラワーモザイクウイルスCaMVまたはタバコモザイクウイルスTMV)または細菌発現ベクター(例えばTiまたはpBR322プラスミド)で形質転換させた植物細胞系、または動物、例えば哺乳動物細胞系などの微生物等が含まれているが、これらに限定されるものではない。
【００４７】
本発明のタンパク質または相同タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の存在は、本発明のタンパク質または相同タンパク質をコードするポリヌクレオチドのプローブまたは部分または断片を用いて、DNA-DNAまたはDNA-RNAハイブリッド形成法、または増幅によって検出することが可能である。核酸増幅系アッセイには、対応タンパク質をコードするDNAまたはRNAを含んだ形質転換体を検出するために、その遺伝子に特異的な配列に基づいたオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーの使用が含まれる。本詳細書で使用した「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」は、少なくとも約10のヌクレオチド、そして約60もの数のヌクレオチド、望ましくは約15〜30ヌクレオチド、およびより望ましくは約20〜25ヌクレオチドの核酸配列を言及し、プローブ、プライマーまたはアンプライマーとして使用することが可能である。
【００４８】
タンパク質に固有のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらかを用いるタンパク質の発現を検出および計測のためのさまざまなプロトコルは、当分野で周知である。実施例には、酵素免疫測定(吸着)法(ELISA)、放射免疫測定(RIA)、および蛍光細胞分析分離装置(FACS)が含まれる。タンパク質上の2つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を利用する2部位モノクローナル系免疫測定法は好適ではあるが、競合結合実験を使用することも可能である。これらを含めた他のアッセイは、Hampton、R.らの(ミネソタ州セントポール市、1990; Ser ological Methods, Laboratory Manual, APS Press)およびMaddox、D. E.らの(1983; J. Exp. Med. 158:1211-1216)の諸所に記載されている。
【００４９】
多岐にわたる標識技術および抱合技術が当業者には周知であり、種々の核酸測定および免疫測定法において使用することが可能である。本発明のタンパク質または相同タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関連配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブまたはPCRプローブを作り出す方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、RNAプローブの末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いるPCR増幅が含まれる。このような手順は、市販されている種々のキット(ミシガン州カラマズーのPharmacia & Upjohn社、Promega社(ウィスコンシン州マディソン)、およびU.S. Biochemical Corp社(オハイオ州クリーブランド))を用いて実行することが可能である。
【００５０】
また、核酸アッセイおよびタンパク質アッセイに使用可能な好適レポーター分子または標識には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、または発色剤のほかに、基質、補助因子、阻害(抑制)剤、磁力粒子なども含まれる。
【００５１】
本タンパク質をコードするヌクレオチド配列を用いて形質転換した宿主細胞は、細胞培地からのタンパク質の回収および発現に適した条件下で培養することが可能である。組換え細胞によって作り出されたタンパク質は、使用する配列および(または)ベクターによるが、分泌または細胞内含有させることが可能である。タンパク質をコード化するポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜及び真核細胞膜を透過するタンパク質の分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理解されよう。その他の組換え構造を用いて、本タンパク質をコードする配列を水溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に結合することが可能である。そのような精製を促進する領域には、固定化金属上での精製を可能にするヒスチジントリプトファン分子などの金属キレートペプチド、固定化免疫グロブリン上の精製を可能にするタンパク質A領域、およびFLAG伸長/親和性の精製装置(Immunex Corp社, Seattle, Wash.)で利用される領域などが含まれるが、これらによって限定されるものではない。
【００５２】
精製ドメインと所望のタンパク質との間にあるXA 因子またはエンテロキナーゼ(腸活素)(カリフォルニア州のサンディエゴ市のInvitrogen 社)に対して特異的であるような切断可能リンカー配列の包括を用いて精製を促進することが可能である。
【００５３】
診断および治療
本発明において開示したデータは、本発明の核酸およびタンパク質およびそのエフェクター/修飾因子が、関連する診断目的および治療目的、例えば、限定するものではないが、代謝症候群、肥満症、または糖尿病を始めとする代謝疾患または機能障害、同様に、摂食障害、悪質液、真性糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎および(または)胆石症のような関連障害において有用であることを明らかにする。従って、本発明の核酸およびタンパク質の診断目的および治療目的は、例えば、これらに限定されるものではないが、次の通りである: (i)タンパク質療法、(ii)小分子薬剤標的、(iii)抗体標的(治療、診断、薬剤ターゲッティング/細胞毒性抗体)、(iv)診断および(または)予後マーカー、(v)遺伝子療法(遺伝子送達と遺伝子除去)、(vi)研究ツール、および(vii)生体外および生体内における組織再生(これらの組織に由来する組織型および細胞型を構成する全ての組織型および細胞型の再生)。
【００５４】
本発明の核酸とタンパク質は、下記のように種々の用途に関与する診断目的および治療目的において特に有用である。例えば、限定するものではないが、本発明のタンパク質をコードするcDNAおよび特にそのヒトホモログは、遺伝子療法において有用であり、また、本発明のタンパク質および特にそのヒトホモログは、それを必要とする被検体に投与されたときに有用であり得る。例証として、本発明の組成物は、例えば、限定するものではないが、上記のような代謝障害およびその他の疾患および障害に苦しむ患者の治療に対して有効性を有するであろう。
【００５５】
また、本発明のタンパク質、または相同タンパク質、またはその機能的断片をコードする核酸配列は、核酸またはタンパク質の存在または量が評価される診断目的においてもさらに有用であり得る。これらの材料はさらに、治療法または診断法における使用のため、本発明の新規物質に対して免疫特異的に結合する抗体の作成に有用である。
【００５６】
例えば一実施態様によれば、本発明のタンパク質または相同タンパク質に特異な抗体は、アンタゴニストとして直接的に、またはタンパク質を発現する細胞または組織に薬剤をもたらすターゲッティングまたは輸送機構として間接的に用いることが可能である。その抗体は当分野で周知の方法を用いて作成することが可能である。このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖、Fab断片、およびFab発現ライブラリによって作り出された断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。中和抗体(すなわち、二量体の形成を阻害する抗体)は特に治療用に望ましい。
【００５７】
抗体を作り出すため、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒトなどを含む種々の宿主は、本ンパク質または免疫抗原性の特性を有する任意の断片またはそのオリゴペプチドを注入することによって免疫化することが可能である。 宿主の種類にもよるが、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることが可能である。本タンパク質に対する抗体を誘導するために用いるペプチド、断片またはオリゴペプチドは、少なくとも約5のアミノ酸からなり、より望ましくは少なくとも約10のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するものが望ましい。
【００５８】
本タンパク質に対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって、抗体分子を作り出す任意の技術を用いて作ることが可能である。これらには、ハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術、およびEBVハイブリドーマ技術(Kohler、G.らの(1975) Nature 256:495-497; Kozbor、D.らの(1985)J. Immunol. Methods 81:31-42; Cote、R. J.らのProc. Natl. Acad. Sci. 80:2026-2030; Cole、S.P.らの(1984)Mol. Cell Biol. 62:109-120)が含まれるが、それらに限定されるものではない。
【００５９】
加えて、「キメラ抗体」を作り出すために開発された技術である、好適な抗原特異性および生物学的活性を有する分子を得るためにマウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子に対するスプライシングを使用することが可能である(Morris on, S. L.らの(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855; Neuberger , M. S.らの(1984) Nature 312:604-608; Takeda, S.らの(1985) Nature 314:452-454)。あるいは、一本鎖抗体を作り出すために記述された技術を適用し、当分野で周知の方法を使用して、本発明のタンパク質または相同タンパク質に特異的な一本鎖抗体を作り出すことが可能である。関連特異性を有するが、固有イディオタイプ組成物の一部でもある抗体は、ランダムな組み合わせの免疫グロブリンライブラリからのチェーンシャフリングによって作成することが可能である(Burton、D. R. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88:11120-3)。抗体はまた、リンパ球集団における生体内産生を誘導することによって作り出すことが可能であり、または組換え免疫グロブリンライブラリまたは文献に開示されているような高特異結合試薬パネルのスクリーニングによっても作り出すことが可能である(Orlandi、R.らの(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86:3833-3837; Winter、G.らの(1991) Nature 349:293-299)。
【００６０】
また、タンパク質に対する特異的な結合部位を含む抗体断片も得ることができる。例えば、そのような断片には、限定されるものではないが、抗体分子のペプシン消化によって作り出すことができるF(ab')2断片、およびF(ab')2のスルフィド架橋を還元することによって作成できるFab断片が含まれる。あるいは、Fab発現ライブラリを構築して、所望の特異性を有するモノクローナルFab断片の迅速かつ容易な同定を可能にすることができる(Huse、W. D.らの(1989) Science 254:1275-1281)。
【００６１】
種々の免疫測定法をスクリーニングに対して用い、所望の特異性を有する抗体を同定することができる。既存の特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを使用する競合結合および免疫放射定量測定法のための幾多のプロトコルは、当分野では周知である。通常このような免疫学的測定法には、タンパク質とその特異性抗体との間の複合体形成の計測が関与する。2つの非干渉性タンパク質エピトープに反応するモノクローナル抗体を利用する2部位モノクローナル系免疫測定法が望ましいが、競合結合実験を用いることも可能である(前出のMaddox)。
【００６２】
本発明の別の実施例によれば、ポリヌクレオチドまたはその断片、またはアンチセンス分子のような核酸エフェクター分子、アプタマー、RNAi分子またはリボザイムを治療目的のために使用することが可能である。一実施態様によれば、組み合わせ核酸ライブラリの使用を含んだ手順のスクリーニングおよび選択によって、アプタマー、すなわち、本発明のタンパク質に対して結合し、その活性を調節する能力のある核酸分子を作成することが可能である。
【００６３】
さらなる実施態様では、mRNAの転写を阻止することが望ましいような状況において、アンチセンス分子を使用することが可能である。具体的には、本発明のタンパク質または相同タンパク質をコードするポリヌクレオチドに補遺的な配列を利用して細胞を形質転換することが可能である。このように、アンチセンス分子を用いて、タンパク質活性を調節/影響すること、または遺伝子機能を調節することができる。今このような技術は当分野では周知であり、センスまたはアンチセンスのオリゴマーまたは大きな断片を、タンパク質をコードする配列のコード領域または制御領域に沿ったさまざまな位置から設計することが可能である。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスまたはワクチニアウィルス、または種々の細菌プラスミドに由来する発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的器官、組織または細胞集団に送達することができる。当業者に公知の方法を用いて、本発明のタンパク質または相同タンパク質をコードする遺伝子のポリヌクレオチドに補遺的なアンチセンス分子を発現する組換えベクターを構築することが可能である。これらの技術は、Sambrookら(前出)およびAusubelら(前出)の両方の文献に記載されている。本発明のタンパク質または相同タンパク質をコードする遺伝子は、本発明のタンパク質または相同タンパク質またはその機能的断片をコード化する、高レベルのポリヌクレオチドを発現する発現ベクターを有する細胞または組織の形質転換によってオフにすることができる。そのような構成物を用いて、翻訳不可能なセンス配列またはアンチセンス配列を細胞に導入することができる。DNAへの組み込みが不在の場合でさえ、そのようなベクターは、RNA分子が内因性ヌクレアーゼ(核酸分解酵素)によって使用不可能になるまで継続してRNA分子を転写することが可能である。一過性の発現は、非複製ベクターによって1ヶ月以上持続することが可能であり、さらに適切な複製要素がそのベクター系の一部である場合には、より一層長く持続することが可能である。
【００６４】
上述したとおり、遺伝子発現の修飾は、アンチセンス分子、例えば、DNA、RNA、またはPNAのような核酸アナログを、本発明のタンパク質または相同タンパク質、すなわち、プロモーター、エンハンサー、およびイントロンをコードする遺伝子の制御領域に対してデザインすることによって得ることができる。転写開始部位(例えば始動部位から-10〜+10の間)由来のオリゴヌクレオチドが望ましい。同様に、「三重らせん」塩基対の形成方法を用いて抑制が可能となる。三重らせん対合が有用であるのは、三重らせん対合は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合に対して二重らせんが充分に開くような能力を阻害するためである。三重らせんDNAを用いる最近の治療における進歩は文献に記載がある(Gee, J. E.らの(1994) In; Huber , B. E. and B. I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publis hing Co., Mt. Kisco, N. Y.)。また、アンチセンスは、転写物のリボソームに対する結合を防止することによって、mRNAの翻訳を阻止する目的で設計することも可能である。
【００６５】
酵素性RNA分子であるリボザイムは、RNAの特異的切断を触媒するために使用することが可能である。リボザイム作用のメカニズムには、内ヌクレオチド結合分解性の切断に先立つ相補的標的RNAへのリボザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションが含まれる。使用することが可能な実施例には、本発明のタンパク質または相同タンパク質をコードする配列の内ヌクレオチド結合分解性の切断を特異的且つ効果的に触媒する組換え型のハンマーヘッド型リボザイム分子が含まれる。任意の潜在的RNA標的内の特異性リボザイム切断部位は、GUA、GUU、およびGUC配列を含めたリボザイム切断部位に対する標的分子を走査することによって最初に同定する。ひとたび同定すると、標的遺伝子の領域に対応し、切断部位を含む15〜20リボヌクレオチド間の短いRNA配列は、オリゴヌクレオチドを機能不全にするような二次構造的特徴に対して評価することが可能となる。また、候補標的の適合性の評価も、リボヌクレアーゼ保護試験法(ribonuclease protection assay)を用いて、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの実施容易性を検査することによって行うことができる。
【００６６】
核酸エフェクター分子、例えば本発明のアンチセンスおよびリボザイムは、核酸分子合成のために当分野で周知の任意の方法を用いて作ることが可能である。これらの方法には、固相フォスフォアミダイト化合合成のようなオリゴヌクレオチドを化学的に合成する技術が含まれる。あるいは、本発明のタンパク質または相同タンパク質をコードするDNA配列の生体外および生体内転写によって、RNA分子生成することが可能である。このようなDNA配列は、T7またはSP6のような好適なRNポリメラーゼプロモーターを用いて、種々のベクターに組み込むことができる。あるいは、アンチセンスRNAを構成的または誘導的に合成するこれらcDNA構成物は、細胞株、細胞または組織の内に導入することができる。RNA分子を修飾して、細胞内の安定性および半減期を向上することが可能である。可能な修飾には、分子の5'末端および(または)3'末端でのフランキング配列の追加、またはホスホロチオネートの使用、または分子の背骨連鎖内のホスホジエステラーゼ連鎖ではなく2'O-メチルが含まれるが、それらに限定されるものではない。この概念は、PNAの作成に固有のものであり、例えばイノシン、クエオシン、ワイブトシンのほかに、アセチル系、メチル系、チオ系、および内因性エンドヌクレアーゼによって容易には認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、およびウリジンに類似の修飾態様なども含めた非従来型塩基の抱合によって、これら全ての分子に適用することができる。
【００６７】
ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が提供されており、それらの方法は生体内、生体外および生体内外交通の使用に同程度に適している。生体内外交通治療では、ベクターは患者から採取した幹細胞内に導入し、同一患者に自家移植で戻すためにクローン増殖することが可能である。形質移入およびリポソーム注入による送達は、当分野で周知である方法を用いて達成することが可能である。上記の治療方法はいずれも、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、および最も望ましくはヒトなどの哺乳動物を始めとする好適な被検体に適用することが可能である。
【００６８】
本発明の追加実施例は、医薬用に許容できるキャリアと共に、上述の任意の治療効果のための医薬品組成物の投与に関するものである。そのような医薬品組成物は、本発明のタンパク質または相同核酸配列またはタンパク質、本発明のタンパク質または相同タンパク質に対する抗体、擬態、アゴニスト(作用薬)、アンタゴニスト、または本発明のタンパク質または相同タンパク質または核酸配列の阻害(抑制)剤から成り得る。本組成物は単独で投与することができるが、少なくとも1つの安定化化合物などの他剤と共に投与することもでき、その場合には、例えば生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロースおよび水など(これらに限定されるものではない)の滅菌した生物学的に適合な医薬品キャリアを用いて投与することが可能である。本組成物は単独で患者に投与することができるが、他剤、薬剤またはホルモンと共に投与することも可能である。本発明に用いられる医薬品組成物は、幾つもの経路によって投与することができ、その経路には経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸があるが、これらに限定されるものではない。
【００６９】
その活性成分に加えて、これらの医薬品組成物は、医薬用に使用することができる活性化合物の製剤への処理を促進する賦形剤および助剤を備えている好適な医薬用に許容できるキャリアを包含し得る。および投与に関する技術の詳細は、Remington's Pharmaceutical Sciences (ペンシルベニア州イーストンのMaack Publishing社)の最新版を参照。
【００７０】
本発明の医薬品成分は、当分野で周知であるような方法で製造することができ、それらの態様としては、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠製造、研和、乳化、カプセル化、取り込み、または凍結乾燥工程等があげられる。本医薬品成分は、塩として供給することが可能であり、多くの酸と共に形成することができる。本医薬品組成物を調製した後には、適切な容器に充填し、適応条件の治療のために標識する。本タンパク質の投与に対する標識には、投与の量、頻度、および方法が明記される。
【００７１】
本発明に好適な医薬品組成物には、活性成分が所望の目的を達成するために有効な量で含有されているような成分が含まれる。有効投与量の定量は、当業者の能力の範囲内で行うものとする。任意の化合物の場合には、細胞培養試験法、例えば前脂肪細胞の細胞株の細胞培養試験法おいて、または通常マウス、ウサギ、イヌまたはブタなどの実験動物においてのいずれかを用いて、治療に有効な投与量を初期に推定することができる。また、実験動物を好適な濃度範囲および投与経路を決定するために使用することも可能である。次にはこのような情報を用いて、ヒトに対する有益な投与量および投与経路を決定することができる。治療に有効な投与量とは、活性成分量、例えば、特異的な条件を治療するために十分な本発明のタンパク質または相同タンパク質または核酸配列またはその機能的断片、または抗体のことを参照する。治療効力および毒性は、細胞培養または実験用動物における標準調剤手順、例えばED50 (50％の集団における治療に有効な用量: 50％有効量)およびLD50 (50％の集団に対して致死的な用量: 50％致死量)によって確定し得る。治療効果と毒性効果間の投与量の比は、治療指数、すなわちLD50/ED50比率として表すことができる。高い治療指数を示す医薬品組成物が望ましい。細胞培養試験法および動物実験から得たデータは、ヒト用のさまざまな投与量の製剤に使用する。そのような組成物に含まれる投与量は、毒性を殆ど持たないED50を含む循環濃度の範囲内にあることが望ましい。投与量は、投与量の使用元、患者の感受性、および投与の経路によって、本範囲内で変わる。正確な投与量は、治療を必要とする被検体に関する要因を考慮して、現場の医師が決定することになる。投与量および投与法は、十分なレベルの活性部を提供するため、または所望の効果を維持するために調節する。配慮されるべき要因には、疾患の重症度、患者の身体全体の健康状態、患者の年齢、患者の体重および性別、食習慣、投与の時間と頻度、薬剤の組み合わせ、反応感受性、および治療に対する耐性と反応が含まれる。長時間効果のある医薬品組成物は、個別製剤の半減期およびクリアランス率にもよるが、3〜4日毎、1週間毎、または2週間毎に1回の間隔で投与することが可能である。通常の投与量は、投与経路にもよるが、約0.1〜100,000マイクログラムと異なり、合計投与量は最大で約1グラムまでとする。特定の投与量および送達の方法に関する指針は文献に記載されており、通常、当分野の実務家に提供されている。当業者であれば、タンパク質または阻害(抑制)剤とは異なったヌクレオチドの製剤を利用するであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達も、個別の細胞、状態、位置などに対して特異的なものとなる。
【００７２】
別の実施例では、本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体は、本発明のタンパク質または相同タンパク質の過剰発現または低発現に関連することを特徴とする状態または疾患の診断のため、または本発明のタンパク質または相同タンパク質、アゴニスト(作用薬)、アンタゴニストまたは阻害(抑制)剤で治療を受けている患者を監視するための測定法において使用することが可能である。診断目的に有用な抗体は、上記の治療のために記載した方法と同様の態様で調製することが可能である。診断アッセイには、抗体および標識を利用してヒトの体液、または細胞や組織の抽出物にある本タンパク質を検出する方法が含まれる。抗体は、その修飾の有無に拘わらず使用することが可能であり、その抗体を共有的または非共有的のいずれかでレポーター分子と結合することによって標識化することが可能である。当分野で周知の種々のレポーター分子を用いることが可能であり、そのさまざまなレポーター分子を上述した。
【００７３】
ELISA、RIA、およびFACSを始めとするタンパク質を測定するための種々のプロトコルは当分野では周知であり、改変または異常レベルの遺伝子発現を診断する基準を提供する。遺伝子発現の正常値または標準値は、複合体の形成に適した条件下で、正常な哺乳動物である被検体、望ましくはヒトから採取した体液または細胞を本タンパク質に対する抗体と結合させることによって確定する。標準複合体の形成量は、種々の方法によって定量化することが可能であるが、測光的方法を用いることが望ましい。対照サンプルおよび疾患サンプル、例えば生検組織において発現したタンパク質の量を標準値と比較する。標準値と被検体値の偏差は、疾患を診断するためのパラメータを樹立する。
【００７４】
本発明の別の実施例によれば、本発明のタンパク質または相同タンパク質に特定のポリヌクレオチドを診断のために用いることも可能である。使用可能なポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、アンチセンスRNA分子とDNA分子、およびPNAが含まれる。ポリヌクレオチドを用いて、検体における遺伝子発現が疾患と相関し得るような該検体における遺伝子発現を検出および定量することが可能である。診断アッセイを用いて、遺伝子発現の不在、存在および過剰を区別すること、および治療介入中のタンパク質レベルの調節を監視することが可能である。
【００７５】
一実施形態によれば、本発明のタンパク質および相同性タンパク質または近縁の分子をコードするゲノム配列を始めとするポリヌクレオチド配列を検出する能力を持つPCRプローブを用いたハイブリダイゼーションを用いて、それぞれのタンパク質をコード化する核酸配列を同定することが可能である。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、DNAまたはRNAであってもよいし、望ましくはCG7956、aralar1、how、CG9373、cpo、Jafrac1、またはCG14440相同タンパク質、望ましくは表1に記載のヒトホモログタンパク質をコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に由来するしてもよいし、またはプロモーター、エンハンサーエレメント、および天然遺伝子のイントロンを始めとするゲノム配列に由来してもよい。本発明のタンパク質または相同タンパク質をコードするDNAに対する特異的なハイブリダイゼーションプローブを産生するための手段には、本発明のタンパク質または相同タンパク質に特異的な核酸配列のmRNAプローブを生成するためのベクターへのクローンニングが含まれる。当分野で周知であり、かつ市販されている該ベクターを用いて、適切なRNポリメラーゼと適切に標識されたヌクレオチドを追加することによって、試験管内RNAプローブを合成することができる。ハイブリダイゼーションプローブは、種々のレポーター集団によって標識することができ、その例としては32Pまたは35S等の放射性核種、またはアビジン結合系やビオチン結合系を介してプローブと共役したアルカリホスファターゼ等の酵素標識等が挙げられる。
【００７６】
本発明のタンパク質または相同核酸に特異的なポリヌクレオチド配列は、タンパク質の発現に関連する状態または疾患の診断のために使用することが可能である。そのような状態または疾患の例には、肥満症および糖尿病を始めとする代謝疾患および障害が含まれるが、それらに限定されるものではない。本発明のタンパク質または相同タンパク質に特異的なポリヌクレオチド配列を用いて、肥満症および糖尿病を始めとする代謝の疾患と障害に対して治療を受けている患者の進渉状況を監視することができる。ポリヌクレオチド配列は、変性遺伝子発現を検出するために患者の生検から採取した体液または組織を利用して、サザン法、ノーザン法、ドットブロット法またはその他の膜系の技術、およびPCR法、またはディップスティック法、ピンELISA法またはチップアッセイにおいて使用することが可能である。このような定性的または定量的方法は当分野で周知である。
【００７７】
特定の実施形態では、本発明のタンパク質または相同核酸に特異的なヌクレオチド配列は、代謝症候群、肥満症、または糖尿病を始めとする種々の代謝疾患または機能障害の活性化または誘発を検出するアッセイにおいて有用であり得る。ヌクレオチド配列は、標準法で標識化されることが可能であり、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件下で、患者から採取した体液または組織の試料に添加することが可能である。好適なインキュベーション期間の後には、その試料を洗浄し、そしてそのシグナルを定量化して標準値と比較する。関連疾病の存在。また、このようなアッセイを用いて、動物実験、臨床試験、または個々の患者の治療監視において、特定の治療上療法の有効性を評価することも可能である。
【００７８】
本発明のタンパク質または相同タンパク質の発現に関連する疾患の診断基準を提供するため、発現に対する正常プロファイルまたは標準プロファイルを樹立する。これは、ハイブリダイゼーションまたは増幅に好適な条件下で、動物またはヒトの正常な被検体から抽出した体液または細胞を、本発明のタンパク質または相同核酸をコードする核酸に特異的な配列またはその断片と結合させることによって達成し得る。標準ハイブリダイゼーションの定量化は、正常な被検体から得た値を、既知量の十分に精製したポリヌクレオチドを使用する実験から得た値に対して比較することによって行なうことができる。正常試料から得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得た試料から得た値と比較することが可能である。標準値と被検者値間の偏差を用いて疾病の存在を確定する。ひとたび疾患の存在を樹立して、治療プロトコルを開始した時点では、患者の発現レベルが正常患者において観察されるレベルに近づき始めるかどうかを評価するために、ハイブリダイゼーションアッセイを定期的に繰り返すことが可能である。連続アッセイから得た結果を用いて、数日〜数ヶ月の期間にわたる治療効果を明らかにすることができる。
【００７９】
代謝疾患または代謝症候群、肥満症、または糖尿病を始めとする機能障害に関しては、個体から取り出した生検組織における比較的に多量の転写物の存在によって、疾患の発生に対する素因を示され得るか、または実際に臨床的症状が現れる前に疾患を検知する手段が提供され得る。この種のより一層信頼のおける診断により、医療の専門家が予防措置または積極的な早期治療を施し、膵臓の疾病および障害の発生またはさらなる進行を防止することが可能となる。本発明のタンパク質または相同タンパク質をコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドの診断上のさらなる用途は、PCR法の使用に関与し得る。このオリゴマーは、化学的に合成しても良いし、酵素的に作成するか、または組換えソースから作り出しても良い。オリゴマーは望ましくは2つのヌクレオチド配列から成り、1つはセンス方向(5prime.fwdarw.3prime)を有し、別の1つアンチセンス方向(3prime.rarw.5prime)を有し、特定の遺伝子または条件を同定するために最適化された条件下で用いられる。オリゴマーのネスト化したセット、または縮重オリゴマーの集積である2つの同一オリゴマーを、あまりストリンジェントでない条件下で用いて、緊密に関連したDNA配列またはRNA配列の検出あるいは(または)定量化を行なうことができる。
【００８０】
本発明のタンパク質または相同タンパク質の発現を定量化するために使用可能な方法には、放射標識またはビオチンヌクレオチド、調節核酸の相互増幅、および実験結果が補間された標準曲線等が含まれる(Melby, P.C.らの(1993) J. Immunol Methods, 159:235-244; Duplaa, C.らの(1993) Anal. Biochem. 212:229-236)。複数試料の定量化速度は、目的のオリゴマーが種々の希釈液中に存在し、そして分光光度法または非色応答が迅速な定量に関与するような状態にあるELSA形態のアッセイを実行することによって加速し得る。
【００８１】
本発明の別の実施例によれば、本発明のタンパク質または相同タンパク質に特異的な核酸配列を用いて、天然のゲノム配列をマッピングするのに有効なハイブリダイゼーションプローブを作成することも可能である。その配列は、特定の染色体にマッピングするか、または周知の方法を用いて染色体の特異的な領域にマッピングすることが可能である。そのような技術には、Price, C. M. (1993) Blood Rev. 7:127-134、およびTrask, B. J. (1991) Trends Genet. 7:149-154においてレビューされているように、FISH、FACS、または、酵母菌人工染色体、細菌人工染色体、細菌P1構造または単一染色体含有cDNAライブラリのような人工染色体構造が含まれる。FISH (Vermaらの(1988) Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York, N.Y.に記載)は、他の物理的染色体マッピング技術および遺伝子地図データと相関し得る。遺伝地図データの例は、1994 Genome issue of Science (265:1981f)にある。物理的染色体地図上の本発明のタンパク質または相同タンパク質をコードする遺伝子の位置と、特異的な疾患または特異的な疾患に対する素因との間にある相関性は、遺伝子病に関連するDNAの領域を画定するのに役立ち得る。
【００８２】
本発明のヌクレオチド配列を用いて、健常者、保有者、または感染者の三者間における遺伝子配列の相違を検出することが可能である。遺伝子多型、例えば単一ヌクレオチド遺伝子多型の分析を行うことが可能である。さらに、樹立した染色体マーカーを用いた染色体標本および結合分析などの物理的マッピング技術の原位置ハイブリッド形成法を用いて、遺伝地図を拡張することも可能である。マウスのような別の哺乳動物種の染色体上への遺伝子の配置は、多くの場合、特定のヒト染色体の数またはアームが未知の場合でさえも、関連するマーカーを明らかにすることが可能である。新配列は、物理的マッピングによって、染色体アーム、またはその部分に指定することができる。これによって、位置クローニングまたは他の遺伝子発見技術を用いて疾病遺伝子を探索する研究者にとって貴重な情報が提供される。一旦疾患または症候群が、特定のゲノム領域への遺伝子連鎖、例えばAT〜11q22-23 (Gatti, R.A.らの(1988) Nature 336:577-580)によって大まかに位置決めがされると、その領域にマッピングする全ての配列は、さらなる研究のための関連遺伝子または調節遺伝子に相当し得る。また、本発明のヌクレオチド配列を用いて、転座、反転などに起因する、健常者、保有者、感染者の三者間における染色体位置の相違を検出することもできる。
【００８３】
本発明の別の実施例によれば、本発明のタンパク質または相同タンパク質、それらの触媒断片または免疫抗原断片またはそのオリゴペプチド、遺伝子組み替え細胞または動物は、例えば、ペプチドまたは低分子重量の有機化合物などの化合物スクリーニングライブラリのために、種々の薬剤スクリーニング技術において使用することができる。1つ以上の本発明のタンパク質の作用に結合、乃至は該作用を調節または模倣する修飾因子/エフェクター、例えば受容体、酵素、タンパク質、リガンドまたは基質を同定することができる。このようなスクリーニングで用いたタンパク質または断片は、溶液中に遊離していても、固体支持物に付着していても、細胞表面上にあっても、または細胞内にあっても構わない。また、本発明のタンパク質または相同タンパク質と検査する薬剤間の結合複合物の形成を測定することも可能である。また、薬剤が直接的または間接的に本発明のタンパク質の活性に影響を及ぼすことも可能である。
【００８４】
加えて、その生理的基質またはその誘導体に対する本発明のタンパク質の活性は細胞系のアッセイにおいて測定し得る。また、薬剤は、リン酸化および脱リン酸、ファルネシル化、パルミトイル化、アセチル化、アルキル化、ユビキチン結合、蛋白分解性処理、細胞内局在性および劣化のようなのような本発明のタンパク質の翻訳後の修飾を妨害する可能性もある。その上、薬剤は、本発明のタンパク質の二量体化またはオリゴマー形成に影響し、または異種様式で、他のタンパク質、例えば、限定するものではないが、ドッキングタンパク質、酵素、受容体、オンチャンネル、脱共役タンパク質、または翻訳因子を備えた本発明のタンパク質の二量体化またはオリゴマー形成に影響を及ぼし得る。また、薬剤は、タンパク質機能(作用)、例えば、限定するものではないが、下流のシグナル伝達に必要とされる他のタンパク質を備えた本発明のタンパク質の物理的相互作用に作用し得る。
【００８５】
本発明のSacドメインをもつイノシトールホスファターゼ2 (SAC2)のホスファターゼ活性は、当技術分野で周知の人工ホスファターゼ基質、すなわち、限定するものではないが、リン酸化または脱リンの際にフルオロフォアまたは発色団に変換されるDiFMUPまたはFDP (Molecular Probes社、Eugene、Oregon)を利用することによって、遺伝子組換え的に発現され精製されたSAC2またはその断片を用いて生体外(試験管内)で測定し得る。あるいは、SAC2の生理的な基質の脱リン酸は、SAC2イノシトール基質のリン酸化状態の検出に好適な、すなわち、イノシトールホスファターゼSHIP2のために記載された手順と類似の手順で任意の公知スクリーニング技術(T. Habibらのを用いることによって測定し得る(1998)、JBC 273、18605-18609)。加えて、その生理的な基質またはその誘導体に対するSAC2の活性は細胞系アッセイによって測定することができ、それによってそれらの下流のシグナル伝達レベルにてホスファターゼ活性を判定し得る。
【００８６】
タンパク質間の相互作用を判定するための方法は当分野で周知である。例えば、本発明のタンパク質に由来する蛍光標識ペプチドの結合タンパク質への結合は、分極の変化によって検出し得る(その逆の場合も同様)。結合相手は完全長タンパク質であっても、完全長タンパク質としての結合相手の1つであっても、単なるペプチドであってよいが、その両方の結合相手が共に蛍光標識される場合、その結合は、蛍光色素の他の蛍光色素への蛍光エネルギー転移(FRET)によって検出することができる。加えて、種々の市販されている、タンパク質間相互作用の検出のために好適なアッセイ原理は当分野で周知であり、例えば、限定するものではないがAlphaScreen (PerkinElmer社)またはAmersham社のシンチレーション近接測定法(SPA)が挙げられる。 あるいは、本発明のタンパク質の細胞タンパク質との相互作用は、両タンパク質が蛍光標識され、両タンパク質の相互作用が、限定するものではないが、例えばCellomics社またはEvotecOAI社の開発による細胞イメージング読取装置を用いて両タンパク質の同時転座分析によって検出される細胞系スクリーニングアッセイの基盤であり得る。すべての場合において、2つの以上の結合相手は互いに異なるタンパク質であり、その結合相手の1つは本発明のタンパク質であるか、または二量体化および(または)オリゴマー形成の場合は本発明のタンパク質自体であることができる。所定の1標的機構(唯一ではない)がそのようなタンパク質間相互作用である本発明のタンパク質は、CG7956、aralar1、how、CG9373、cpo、Jafrac1、またはCG14440相同タンパク質である。
【００８７】
本発明のタンパク質の酵素活性およびキャリア活性を判定する測定法は当分野で周知である。また、当技術分野で周知なものには、受容体リガンド結合を測定するための種々のアッセイフォーマットもある。
【００８８】
特に興味深いのは、哺乳動物の細胞に対して低毒性を有する薬剤のスクリーニングアッセイである。本明細書中で使用した用語「薬剤」は、1つ以上の本発明のタンパク質の生理機能を改変または模倣する能力を有する任意の分子、例えばタンパク質または医薬品である。候補薬剤は、典型的には有機分子であり、望ましくは50〜約2,500ドルトンの分子量を有する小有機化合物であるが、幾多の化学的クラスを包含する。候補薬剤には、タンパク質、特に水素結合との構造上の相互作用に必要な機能グループが含まれ、そして典型的には少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基、望ましくは少なくとも2つの機能化学グループが含まれる。候補薬剤には、多くの場合、炭素環式構造または複素環式構造、および(または)1つ以上の上記機能グループと置換された芳香族構造またはポリ芳香族構造が包含される。
【００８９】
候補薬剤は、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、核酸および誘導体、構造上の類似体またはその組み合わせを含んだ生体分子間に見出される。候補薬剤は、合成化合物または天然化合物のライブラリを始めとするさまざまな原料から取得する。例えば、任意に抽出されたオリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を始めとして、さまざまな有機化合物および生体分子のランダム合成および指向性合成のための多くの手段が提供されている。或いは、細菌、真菌、植物、および動物抽出物形態の天然化合物のライブラリは入手可能であるか、または容易に作り出すことができる。その上、従来の化学的、物理的、および生化学的な手段を介して、天然または合成的に作り出したライブラリおよび化合物は容易に修飾でき、それらを用いて組み合わせライブラリを作り出すことが可能である。アシル化、アルキル化、エステル化、アミジン化(amidification)などのような公知の薬剤は、構造上の類似体を作り出すために、指向性またはランダムな化学的修飾の対象となり得る。スクリーニングアッセイが結合実験である場合、1つ以上の分子が標識に結合することが可能であり、その標識は直接的または間接的に検出可能な信号を提供する。
【００９０】
使用可能な別の薬剤スクリーニング技術は、PCT出願公開番号WO84/03564に記載されているように、目的タンパク質に対して好適な結合親和性を有する化合物の高処理能力スクリーニングを提供する。この方法では、本発明のタンパク質または相同タンパク質に対して適用したように、多数の異なる小さな試験化合物を、プラスチックのピンまたはその他の表面のような固形基質上で合成した。試験化合物は、タンパク質またはその断片と反応させ、洗浄した。次に、結合したタンパク質を、当分野で周知の方法で検出した。精製したタンパク質は、前記した薬剤スクリーニング技術で使用するプレート上で直接被覆することもできる。あるいは、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持物上に固定することもできる。別の実施例によれば、タンパク質と結合可能な中和抗体がタンパク質と結合するため試験化合物と特に競合し、競合薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる。この方法では抗体を用いて、本発明のタンパク質と1つ以上の抗原決定因子を共有する全てのペプチドの存在を検出することができる。
【００９１】
本発明のタンパク質をコードする核酸を用いて遺伝子導入細胞株および動物を作成することができる。これらの遺伝子導入非ヒト動物は、本発明のタンパク質の試験管内の機能および調節の研究において有用である。遺伝子導入動物、特に哺乳動物の遺伝子導入動物は、ヒトに共通する多くの発生プロセスおよび細胞プロセスの検討のためのモデル系として役立つことができる。代謝障害を有する種々の非ヒトモデルを用いて、本発明のタンパク質の修飾因子を検査することができる。本発明のタンパク質の異所性発現(例えば過剰発現または発現の欠如)、特定の摂食条件、および(または)生物学的活性化合物の投与により、代謝障害のモデルを作ることができる。
【００９２】
本発明の一実施例によれば、そのようなアッセイでは、レプチン経路遺伝子においてノックアウトを保有しているマウスのようなインスリン耐性および(または)糖尿病のマウスモデルが使用される(例えば、ob (レプチン)またはdb (レプチン受容体)マウス)。糖尿病の典型的な症状を呈するそのようなマウスは、肝脂質蓄積を示し、そして高い頻度で血漿脂質値を増加した(Bruningらの1998、Mol.Cell.2:449-569を参照)。感受性の野生型マウス(例えばC57Bl/6)は、高脂肪食を与えた場合、類似の症状を示す。そのようなマウス菌株における本発明のタンパク質の発現の検査に加えて(実施例セクションを参照)、これらのマウス用いて、候補修飾因子の投与が、例えば肝臓、血漿、または脂肪組織における脂質蓄積を改変するかどうかを、FPLC、比色法、血糖検査、インスリン耐性検査などのようなおよびその他のような当技術分野で周知の標準アッセイを用いて検査することもできる。
【００９３】
遺伝子導入動物は、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の正常な遺伝子座が突然変異する場合、非ヒト胚幹細胞における相同組換えを介して作ることが可能である。別法としては、タンパク質をコードする核酸構成物を卵母細胞に注入し、ゲノムにランダムに統合する。また、本発明の遺伝子またはその変異体を、通常には発現されないか、または異常発生するような場所に発現することもあり得る。さらには、アンチセンス分子を発現する特異的な構成物または本発明のタンパク質の発現を阻止または改変する優性阻害突然変異の発現のような本発明の遺伝子の変異体は、ランダムにゲノムに統合することが可能である。本発明の遺伝子発現の上方制御が表現型の容易に検出可能な変化を結果としてもたらすlac Zまたはルシフェラーゼのような検出可能なマーカーは、本発明遺伝子の遺伝子座に導入することが可能である。安定した統合のベクターには、プラスミド、レトロウィルスおよびその他の動物ウィルス、酵母菌人工染色体(YACs)などが含まれる。
【００９４】
相同組換えDNA構成物には、少なくとも所望の遺伝子組換えをした本発明の遺伝子の一部が含まれ、そして標的遺伝子座に対する相同領域が含まれるであろう。都合よく、ポジティブ選択およびネガティブ選択用のマーカーを含む。ランダム統合のためのDNA構成物には、組換えを仲介するための相同領域が含まれる必要はない。ランダム統合のためのDNA構成物には、本発明のタンパク質、調節エレメント(プロモーター)、イントロンおよびポリアデニル化信号をコードする核酸から成る。相同組換えを通して標的遺伝子修飾を有する細胞を作成する方法は本分野で周知である。非ヒト胚幹(ES)細胞は、ES細胞株を用いても良いし、または胚細胞を宿主、例えばマウス、ラット、モルモットなどから新たに取得しても良い。そのような細胞は、適切な線維芽細胞-支持細胞層の上で増殖さしめてから、白血病抑制因子(LIF)の存在下で増殖する。
【００９５】
非ヒトESまたは非ヒト胚細胞または体細胞の多能性ヒト幹細胞を形質転換する場合、それらの細胞を用いて遺伝子導入動物を作り出すことが可能である。形質転換後、細胞を適切な培地の支持細胞層にプレーティングする。その構成物を含んでいる細胞は、選択培地を用いることによって選択することが可能である。コロニーを十分な時間をかけて増殖した後、コロニーを摘出し、相同性組換えまたは構成物の統合の発生率を分析する。陽性反応を示すコロニーは、胚操作および胚盤胞注入に用いることが可能である。胚盤胞は、4〜6週間の過排卵雌から取得する。ES細胞をトリプシン処理し、そして修飾細胞を胚盤胞の胞胚腔に注入する。注入後、胚盤胞を偽妊娠雌の各子宮角へ戻す。次に、雌に出産させ、結果として得られた子孫をその構成物に対してスクリーニングした。胚盤胞の異なる表現型および遺伝子操作された細胞を提供することで、キメラ子孫を容易に検出することができる。キメラ動物を修飾遺伝子の存在に対してスクリーニングし、修飾を有する雄と雌を交尾させ、ホモ接合性の子孫を産生する。その遺伝子改変が成長の過程における死亡率の原因となる場合には、組織または器官は、同種間移植用または類遺伝子性移植用、または移植、または体外培養用として維持することができる。遺伝子導入動物は、実験動物、家畜などのような任意の非ヒト哺乳動物である。遺伝子導入動物は、機能研究、薬物スクリーニングなどにおいて使用することが可能である。
【００９６】
また、最終的に、本発明は少なくとも下記の1つから成るキットに関するものである。
【００９７】
(a)  CG7956、aralar1、how、CG9373、cpo、Jafrac1、またはCG14440相同核酸分子またはその機能的断片;
(b)  CG7956、aralar1、how、CG9373、cpo、Jafrac1、またはCG14440相同アミノ酸分子または機能的断片またはそのアイソフォーム;
(c)  (a)の核酸 から成るベクター;
(d)  (a)の核酸または(c)のベクターから成る宿主細胞;
(e)  (a)の核酸によってコード化されたポリペプチド;
(f)  (a)の核酸によってコード化された融合ポリペプチド;
(g)  (a)の核酸、または(b)、(e)、または(f)のポリペプチドに対する抗体、アプタマーまたは別のエフェクター/修飾因子、および
(h)  (a)の核酸アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【００９８】
本キットは、上述のように、診断用または治療用またはスクリーニング用に使用することが可能である。本キットには、さらに取扱説明書が含まれる場合がある。
【００９９】
各図が示すのは下記のとおりである:
図1は、ショウジョウバエGadflyアクセッション番号CG7956変異体の中性脂肪含有量を示す。ここに示したのは、EPコレクションの全ハエを含有する対照(「EP対照」と呼ぶ、コラム1)と比較した、CG7956転写単位のPベクター3の塩基対5'の統合(「HD-EP31805」と呼ばれる、コラム2)によって引き起こされるHD-EP(3)31805ハエの中性脂肪含有量の変化である。
【０１００】
図2は、変異型CG7956 (Gadfly アクセッション番号)遺伝子座の分子構造を示す。
【０１０１】
図3は、Gadflyアクセッション番号CG7956遺伝子産物(Query:クエリ)のBLASTP検索結果を、最も一致するヒトホモログ(Sbjct: 参照)と共に示す。
【０１０２】
図4は、哺乳動物組織におけるCG7956ホモログの発現を示す。
【０１０３】
図4Aは、野生型マウス組織におけるSacドメインをもつイノシトールホスファターゼ 2 (SAC2)発現のリアルタイムPCR分析を示す。
【０１０４】
図4Bは、異なるマウスモデルにおけるSAC2発現のリアルタイムPCR分析を示す。
【０１０５】
図5は、ショウジョウバエaralar 1 (Gadflyアクセッション番号CG2139)変異体の中性脂肪含有量を示す。ここに示したのは、EPコレクションの全ハエを含有する対照(「EP対照」と呼ぶ、コラム1)と比較した、CG2139遺伝子のイントロンへのPベクター統合(「EP(3)3675」と呼ぶ、コラム2)によって引き起こされるEP(3)3675ハエの中性脂肪含有量の変化である。
【０１０６】
図6は、変異型aralar 1 (Gadflyアクセッション番号CG2139)遺伝子座の分子構造を示す。
【０１０７】
図7は、ヒト溶質キャリア25ファミリー、メンバー11および12に対するショウジョウバエaralar 1の相同性を示す。
【０１０８】
図7Aは、aralar 1遺伝子産物(クエリ)のBLASTP検索結果を2つの最もよくマッチするヒトホモログ(参照)と共を示す。
【０１０９】
図7Bは、ヒトタンパク質とショウジョウバエタンパク質との比較を示す。「aralar1 Dm」はaralar 1によってコード化されたショウジョウバエタンパク質を参照し、「SLC25A12 Hs」はヒト溶質キャリア25ファミリー、メンバー12を参照し、そして「SLC25A13 Hs」はヒト溶質キャリア25ファミリー、メンバー13を参照する。
【０１１０】
図8は、哺乳動物組織におけるaralar 1ホモログの発現を示す。
【０１１１】
図8Aは、野生型マウス組織における溶質キャリア25ファミリー、メンバー12 (Slc25a12)発現のリアルタイムPCR分析を示す。
【０１１２】
図8Bは、異なるマウスモデルにおけるSlc25a12発現のリアルタイムPCR分析を示す。
【０１１３】
図8Cは、野生型マウス組織における溶質キャリア25ファミリー、メンバー13 (Slc25a13)発現のリアルタイムPCR分析を示す。
【０１１４】
図8Dは、異なるマウスモデルにおけるSlc25a13発現のリアルタイムPCR分析を示す。
【０１１５】
図9は、ショウジョウバエhow (Gadflyアクセッション番号CG10293)変異体の中性脂肪含有量を示す。ここに示したのは、HD-EPコレクションの全ハエを含有する対照(「EP対照」と呼ぶ、コラム1)と比較した、how遺伝子プロモーターへのPベクター統合(「HD-EP30815」と呼ぶ、コラム2)によって引き起こされるHD-EP(3)30815ハエの中性脂肪含有量の変化である。
【０１１６】
図10は、変異型how (Gadflyアクセッション番号CG10293)遺伝子座の分子構造を示す。
【０１１７】
図11は、ヒトのクエーキングアイソフォームに対するショウジョウバエhow (GadFlyアクセッション番号CG10293)の相同性を示す。
【０１１８】
図11Aは、how遺伝子産物(クエリ)のBLASTP検索結果を、12の最もよくマッチするヒトホモログ(参照)と共を示す。
【０１１９】
図11Bは、ヒトタンパク質とショウジョウバエタンパク質との比較を示す。「CG10293 Dm」はCG10293によってコード化されたショウジョウバエタンパク質を参照し、「QKI-6 Hs」はヒトクエーキングアイソフォーム6を参照し、「QKI-2 Hs」はヒトクエーキングアイソフォーム2を参照し、「QKI-3 Hs」はヒトクエーキングアイソフォーム3を参照し、および「HQK-7B Hs」はヒトRNA結合タンパク質HQK-7Bを参照する。
【０１２０】
図12は、哺乳動物の(ヒト)組織におけるhowホモログの発現を示す。
【０１２１】
図12Aは、前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のヒト腹部脂肪細胞におけるクエーキング6発現の定量分析を示す。
【０１２２】
図12Bは、前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のヒト腹部脂肪細胞におけるRNA結合タンパク質HQK-7B発現の定量分析を示す。
【０１２３】
図13は、ショウジョウバエGadflyアクセッション番号CG9373変異体の中性脂肪含有量を示す。ここに示したのは、このベクター統合を有する対照(「ランダムEP/elav」と呼ぶ、コラム1)と比較した、主にこれらのハエの神経細胞におけるCG9373遺伝子の異所性発現(「HD-EP3646/elav」と呼ぶ、コラム2)によって引き起こされるHD-EP(3)31646ハエの中性脂肪含有量の変化である。
【０１２４】
図14は、変異型CG9373 (Gadflyアクセッション番号)遺伝子座の分子構造を示す。
【０１２５】
図15は、ヒトKIAA1443タンパク質、無名タンパク質製品、およびミエリン遺伝子発現因子2に対するショウジョウバエGadFlyアクセッション番号CG9373の相同性を示す。
【０１２６】
図15Aは、CG9373遺伝子産物(クエリ)のBLASTP検索結果を、3つの最もよくマッチするヒトホモログ(参照)と共にを示す。
【０１２７】
図15Bは、ヒトタンパク質とショウジョウバエタンパク質との比較を示す。「CG9373 Dm」はCG9373によってコード化されたショウジョウバエタンパク質を参照し、「KIAA1341 Hs」はヒトKIAA1341タンパク質を参照し、「MyEF-2 Hs」はヒトミエリン遺伝子発現因子2を参照し、および「FLJ13071 Hs」はヒト不特定のタンパク質製品FLJ13071を参照する。
【０１２８】
図16は、哺乳動物組織におけるCG9373ホモログの発現を示す。
【０１２９】
図16Aは、野生型マウス組織におけるミエリン遺伝子発現因子2 (MEF-2)発現のリアルタイムPCR分析を示す。
【０１３０】
図16Bは、異なるマウスモデルにおけるMEF-2発現のリアルタイムPCR分析を示す。
【０１３１】
図16Cは、高脂肪食を与えたマウスにおけるMEF-2発現のリアルタイムPCR分析を、標準食を与えたマウスと比較して示す。
【０１３２】
図17は、ショウジョウバエcpo (Gadflyアクセッション番号CG18434)変異体の中性脂肪含有量を示す。ここに示したのは、EPコレクションの全ハエを含有する対照(「EP対照」と呼ぶ、コラム1)と比較した、CG18434遺伝子プロモーターへのPベクター統合(「EP(3)0661/Tm3,Sb」と呼ぶ、コラム2)によって引き起こされるHD-EP(3)0661ハエの中性脂肪含有量の変化である。
【０１３３】
図18は、変異型cpo (Gadflyアクセッション番号CG18434)遺伝子座の分子構造を示す。
【０１３４】
図19は、複数結合のヒトRNA結合タンパク質に対するショウジョウバエcpoの相同性を示す。
【０１３５】
図19Aは、ヒトタンパク質とショウジョウバエタンパク質との比較を示す。「cpo Dm」はcpoによってコード化されたショウジョウバエタンパク質を参照し、「NP_006858 Hs」はヒト複数結合のRNA結合タンパク質(RBPMS)を参照し、および「IPI001611」は複数結合のヒトRNA結合(RBPMS)ファミリーメンバーを参照する。
【０１３６】
図19Bは、ショウジョウバエcpo遺伝子によってコード化されたアミノ酸配列を示す(GadFlyアクセッション番号CG31243、配列識別番号1)。
【０１３７】
図20は、前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のヒト腹部脂肪細胞における、複数結合のRNA結合タンパク質(RBPMS)発現の定量分析を示す。
【０１３８】
図21は、ショウジョウバエJafrac1 (Gadflyアクセッション番号CG1633)変異体の中性脂肪含有量を示す。ここに示したのは、このベクター統合を持たない対照(本明細書中では「PX対照」と呼ぶ、コラム1)と比較した、Jafrac1遺伝子のリーダーへのPベクター統合(「PX 9430.2」と呼ぶ、コラム2)によって引き起こされるPX9430.2ハエの中性脂肪含有量の変化である。
【０１３９】
図22は、変異型Jafrac1 (Gadfly アクセッション番号CG1633)遺伝子座の分子構造を示す。
【０１４０】
図23は、ヒトのペルオキシレドキシン1および2に対するショウジョウバエJafrac1 (GadFlyアクセッション番号CG1633)の相同性を示す。
【０１４１】
図23Aは、Jafrac1遺伝子産物(クエリ)のBLASTP検索結果を、2つの最もよくマッチするヒトホモログ(参照)と共に示す。
【０１４２】
図23Bは、ヒトタンパク質とショウジョウバエタンパク質との比較を示す。「Jafrac1 Dm」はJafrac1によってコード化されたショウジョウバエタンパク質を参照し、「PRDX1 Hs」はヒトのペルオキシレドキシン1を参照し、および「PRDX2 Hs」はヒトのペルオキシレドキシン2を参照する。
【０１４３】
図24は、前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のヒト腹部脂肪細胞におけるペルオキシレドキシン1 (PRDX1)発現の定量分析を示す。
【０１４４】
図25は、ショウジョウバエGadflyアクセッション番号CG14440変異体の中性脂肪含有量を示す。ここに示したのは、このベクター統合を持たない対照(本明細書中では「PX10162対照」と呼ぶ、コラム1)と比較した、CG14440遺伝子のPベクター上流の統合(「PX10162.1」と呼ぶ、コラム2)によって引き起こされるPX10162.1ハエの中性脂肪含有量の変化である。
【０１４５】
図26は、変異型CG14440 (Gadflyアクセッション番号)遺伝子座の分子構造を示す。
【０１４６】
図27は、CG14440遺伝子産物(クエリ)のBLASTP検索結果を、最も一致するヒトホモログ(参照)と共に示す。
【０１４７】
図28は、前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のヒト腹部脂肪細胞における仮想タンパク質LOC55565発現の定量分析を示す。
【０１４８】
各実施例は本発明を図解するものである。
【０１４９】
実施例1:ショウジョウバエにおける中性脂肪含有量の測定
変異体ハエは専売のおよび公的に利用できるハエ突然変異在庫コレクションから取得する。ハエは当業者であれば公知の標準条件下で増殖する。実験の過程で、追加給餌をパン酵母(サッカロミセスセレビジエ)とともに与えた。ホモ接合またはヘテロ接合での生存可能な結合におけるEPベクターを含むショウジョウバエの中性脂肪含有量の平均変化量を対照ハエと比較して検討した(図1、5、9、13、および17、21、および25を参照)。中性脂肪を定量するため、ハエを5分間、90℃C (PX9430.2およびPX10162.1の場合は70℃C)にて、水溶性の緩衝剤中で水浴を用いてインキュベートし、継いで、熱抽出を行った。さらに5分間の90℃C (PX9430.2およびPX10162.1の場合は70℃C)にてインキュベーションを行い、マイルドな遠心分離を行った後、Sigma社の中性脂肪(INT 336-10または-20)測定法を用いて、製造者のプロトコルに従って光学密度の変化を測定することによって、ハエ抽出物の中性脂肪含有量を定量した。基準として、同一抽出物のタンパク質含有量を、BIO-RAD DCタンパク質アッセイを用いて、EPラインのための製造者プロトコルに従って測定した。本アッセイを何度か繰り返した。
【０１５０】
EPコレクション(「EP対照」と呼ぶ)の全ハエの平均中性脂肪値を100％として、図1、5、9、および25の第1コラムにそれぞれ示す。PXコレクション(「PX対照」と呼ぶ)の約50ラインの平均中性脂肪値を100％として図21および図25の第1コラムに示した(ハエ毎の中性脂肪相対量)。elav- Gal4ベクターを含有する全ハエ(「ランダムEP/elav」と呼ぶ)の平均中性脂肪値を100％として図13の第1コラムに示した。測定値の標準偏差は、細いバーとして示した。
【０１５１】
HD-EP(3)31805ホモ接合性ハエ(図1のコラム2)、EP(3)0661ヘテロ接合ハエ(図17のコラム2、「EP(3)0661/TM3,Sb」と呼ぶ)、PX9430.2ホモ接合性ハエ(図21のコラム2)、およびPX10162.1ホモ接合性ハエ(図25のコラム2)は、対照よりも常に高い中性脂肪含有量を示す。EP(3)3675ホモ接合性ハエ(図5のコラム2)およびHD-EP(3)30815ホモ接合性ハエ(図9のコラム2)は、対照よりも常に低い中性脂肪含有量を示す。以上の点から、EPベクターまたはPXベクターが生存的に統合する座位における遺伝子活性の損失が、エネルギー貯蔵中性脂肪の代謝における変化の原因である。
【０１５２】
HD-EP(3)31646雄をelav-Gal4処女と交雑せしめた。子孫はHD-EP(3)31646ベクターの複製およびelav-Gal4ベクターの複製を輸送し、主にこれらのハエの神経細胞において、HD-EP(3)31646統合遺伝子座の近接するゲノムDNA配列3primeの異所性発現をもたらす。ハエをアッセイで分析し、これらのハエの中性脂肪含有量を測定した。中性脂肪含有量分析の結果を図13に示す。HD-EP(3)31646/elavハエは、elav-Gal4 (「ランダムEP/elav」と呼ぶ、図13のコラム1)と交雑せしめた制御EPコレクションよりも常に高い中性脂肪含有量(図13のコラム2)を示す。以上の点から、HD-EP(3)31646ハエのEPベクターがCG9373遺伝子のプロモーターにおいて統合する遺伝子座における遺伝子活性の獲得は、エネルギー貯蔵中性脂肪の代謝における変化の原因である。
【０１５３】
実施例 2: 代謝調節に関連するショウジョウバエ遺伝子の同定
本発明のタンパク質をコードする核酸を、プラスミド救出技術を用いて同定した。EPベクター(本明細書中ではHD-EP(3)31805、EP(3)3675、HD-EP(3)30815、HD-EP(3)31646、EP(3)0661、PX9430.2、またはPX10162.1)統合に近接して局在するゲノムDNA配列を分離した。それらの分離したゲノム配列を用いて、Berkeleyショウジョウバエゲノムプロジェクト(GadFly)のような公共データベースをスクリーニングし、それによってそのベクター統合部位、および対応する遺伝子を同定した。これらの遺伝子座位の分子構造を図2、6、10、14、18、22、26に示す。
【０１５４】
図2、10、14、および26において、ゲノムDNA配列は、ラインHD-EP(3)31805、HD-EP(3)30815、HD-EP(3)31646、またはPX10162.1の各ラインのベクター統合部位が含まれる中央に、黒の点線としてアセンブリによって表す。番号はゲノムDNA座標を表す。図の上部はセンス鎖 「+」を表し、下部はアンチセンス鎖 「-」を表す。ショウジョウバエのラインにおけるPエレメントの挿入部位は、「Pエレメント+」、「Pエレメント-」、または中央ラインに三角形またはボックスとして示した。転写したDNA配列(EST)を「EST +」および(または)「EST -」ラインにおいて灰色バーとして示し、そして予測cDNAは、「cDNA +」および/または「cDNA -」ラインにおけるバーとして示した。cDNAの予測エキソンは濃灰色バーとして示し、そしてイントロンは薄灰色バーとして示す。
【０１５５】
図6、18、および22において、ゲノムDNA配列は、ラインEP(3)3675、EP(3)0661、またはPX9430.2の各ラインのベクター統合部位が含まれる中央に、細い縮尺した双頭の黒の矢印としてアッセンブリによって表す。数字とチェックマークはゲノムDNAの長さを表す(図6ではチェックマークにつき1000塩基対、図18および図22ではチェックマークにつき10000塩基対)。図の上部はセンス鎖を表し、下部はアンチセンス鎖を表す。図6および図22の上部にある灰色の矢印、および図18の最上部にある濃灰色ボックスはBACクローンを表し、図6および図22の最上部にある黒の矢印、および図18の中央にある薄灰色ボックスは染色体単位またはGenBank単位の切片を表す。ショウジョウバエのラインにおけるPエレメントの挿入部位は、図6および18では灰色の三角形として、および図22では黒の縦線としてそれぞれを示した。本P挿入部位を標識化する。黒線によって結び付けた灰色バーはcDNA配列を表す。予測遺伝子は、黒色バー(エキソン)として示し、黒線(図6および22)または薄灰色ギザギザ線(図18) (イントロン)によって結び付け、そして標識化した(また、図の底部にあるキーも参照)。
【０１５６】
HD-EP(3)31805ベクターをアンチセンス方向においてホモ接合でショウジョウバエ遺伝子の3塩基対5'を生存結合し、GadFlyアクセッション番号CG7956として同定する。HD-EP(3)31805のベクター統合の染色体局在部位は遺伝子座3R、93E4にある。図2では、ゲノムDNA座標は、染色体3R上の17260000位置から始まり、17270000位置で終わる)。ショウジョウバエHD-EP(3)31805ラインにおけるPエレメントの挿入部位を「Pエレメント-」ラインに示し、そして標識化する。CG7956遺伝子の予測cDNAを「cDNA +」ラインに示し、そして標識化する。
【０１５７】
EP(3)3675ベクターを、センス方向においてショウジョウバエ遺伝子のイントロンに対してホモ接合で生存結合し、aralar1 (GadFlyアクセッション番号CG2139)として同定する。EP(3)3675のベクター統合の染色体局在部位は遺伝子座3R、99F6にある。図6では、ショウジョウバエEP(3)3675ラインにおけるPエレメントの挿入部位を図の下部に三角形として示し、矢印を用いて標識する。ショウジョウバエaralar1遺伝子(GadFlyアクセッション番号CG2139の予測転写変異体は、細い黒線で結び付けられた黒色ボックスとして示す。
【０１５８】
HD-EP(3)30815ベクターを、アンチセンス方向においてショウジョウバエ遺伝子のプロモーターにホモ接合で生存結合し、how (GadFlyアクセッション番号CG10293)として同定する。HD-EP(3)30815のベクター統合の染色体局在部位は遺伝子座3R、94A1-2にある。図10では、ゲノムDNA座標は、染色体3R上の17775577位置から始まり、17775577位置で終わる)。ショウジョウバエHD-EP(3)30815ラインにおけるPエレメントの挿入部位を「Pエレメント-」ラインに示す。how遺伝子の予測cDNAを「cDNA +」ラインに示し、そして標識化する。
【０１５９】
HD-EP(3)31646ベクターをセンス方向においてショウジョウバエ遺伝子のプロモーター領域に対してホモ接合で生存結合し、GadFlyアクセッション番号CG9373として同定する。HD-EP(3)31646のベクター統合の染色体局在部位は遺伝子座3R、85D25にある。図14では、ゲノムDNA座標は、染色体3R上の5312505位置から始まり、5318755位置で終わる)。ショウジョウバエHD-EP(3)31646ラインにおけるPエレメントの挿入部位を「Pエレメント-」ラインに示す。CG9373遺伝子の予測cDNAを「cDNA -」ラインに示し、そして標識化する。
【０１６０】
EP(3)0661)ベクターを、センス方向においてRE30936.5のプロモーターにホモ接合で致死結合/ヘテロ接合で生存結合してショウジョウバエ遺伝子のESTクローンを表現し、cpo (GadFlyアクセッション番号CG18434およびCG31243)として同定する。EP(3)0661のベクター統合の染色体局在部位は遺伝子座3R、90D1にある。図18では、ショウジョウバエEP(3)0661ラインにおけるPエレメントの挿入部位は、図の上部における三角形として示し、矢印を用いて標識化する。cpo遺伝子の予測cDNAは、図の上部において示し、そして標識化する。
【０１６１】
PX9430.2ベクターをホモ接合でショウジョウバエ遺伝子のリーダー配列に生存結合し、Jafrac1 (GadFlyアクセッション番号CG1633)として同定する。PX9430.2のベクター統合の染色体局在部位は遺伝子座 X, 11E6にある。図22では、ショウジョウバエPX9430.2ラインにおけるPエレメントの挿入部位を標識化された縦線として示す。ショウジョウバエJafrac1遺伝子の予測転写物変異体は図の上部に示し、そして標識化する。
【０１６２】
PX10162.1ベクターをホモ接合でショウジョウバエ遺伝子の5'端の上流に生存結合し、GadFlyアクセッション番号CG14440として同定する。PX10162.1のベクター統合の染色体局在部位は遺伝子座 X, 6C7にある。図26では、ゲノムDNA座標は、染色体6519082R上の6494082位置から始まり、17270000位置で終わる。ショウジョウバエPX10162.1ラインにおけるPエレメントの挿入部位は中央の点線上に「+」として示す。CG14440の予測cDNAは、「cDNA -」ラインに示し、標識化して、その対応ESTは「EST -」ラインにを示して標識化する。
【０１６３】
上記の遺伝子発現は、転写単位へのベクター統合によって影響を受けることができ、エネルギー貯蔵中性脂肪量の変化をもたらす。
【０１６４】
実施例3: ヒトの相同遺伝子およびタンパク質の同定
それによってコード化された中性脂肪代謝の調節機能を有するショウジョウバエ遺伝子およびタンパク質を、BLASTアルゴリズム探索を用いて、公的に利用できる配列データベースにおいてさらに分析し、そして哺乳動物の相同体を同定した(図3、7、11、15、19、23、および27)。
【０１６５】
表1: ショウジョウバエ(Dm)遺伝子のヒトホモログ
【０１６６】
【表１】
2005524703.tif 000002
【０１６７】
よって、CG7956、aralar1、how、CG9373、cpo、Jafrac1、またはCG14440相同タンパク質および核酸分子コーディングは、昆虫または脊椎動物各種、例えば、哺乳動物または鳥から入手可能である。特に好適なのは、表1に記載の核酸である。
【０１６８】
本発明では、本発明のタンパク質のアミノ酸配列から成るポリペプチドを説明している。異なる種(マウスおよびショウジョウバエ)のそれぞれのタンパク質間の比較(Clustal W 1.83分析またはClustalW 1.82分析、例えばThompson J. D.らの(1994) Nucleic Acids Res. 22(22):4673-4680; Thompson J. D.、(1997) Nucleic Acids Res. 25(24):4876-4882; Higgins、D. G.らの(1996) Methods Enzymol. 266:383-402を参照)を行った。アライメントにおけるギャップは、「-」として表す。相同性に基づくと、本発明のショウジョウバエタンパク質および各相同タンパク質またはペプチドは、少なくともある程度の活性を共有する。
【０１６９】
図3に示したように、ショウジョウバエGadFlyアクセッション番号CG7956 の遺伝子産物は、ヒトSacドメインをもつイノシトールホスファターゼ(SAC2、KIAA0966タンパク質とも呼ぶ; タンパク質=GenBankアクセッション番号NP_055752.1、DNA: NM_014937c)に対して52％の相同を持つ。また、CG7956は、マウスタンパク質ENSMUSP00000045910 (ENSEMBLアクセッション番号)に対する相同性も示す。
【０１７０】
また、ヒト溶質キャリア25ファミリー(ミトコンドリアのキャリア、Aralar)、メンバー12は、タンパク質=GenBankアクセッション番号XP_010876.3、cDNA=XM_010876とも呼ぶ。図7Aに示したように、ショウジョウバエaralar 1の遺伝子産物は、ヒト溶質キャリア25ファミリー(ミトコンドリアのキャリア、Aralar)、メンバー12に対して74％相同であり、そしてヒト溶質キャリア25ファミリー、メンバー13 (シトリン)に対して73％の相同を持つ。また、aralar 1は、マウス溶質キャリア25ファミリー(ミトコンドリアのキャリア; アデニンヌクレオチド輸送体)、メンバー13 (GenBankアクセッション番号NP_056644.1)に対する相同性を示す。
【０１７１】
図11Aに示したように、ショウジョウバエhowの遺伝子産物は、ヒトクエーキングアイソフォーム5 (タンパク質=GenBankアクセッション番号AAF63416.1、cDNA=AF142421)に対して64％相同であり、KHドメインRNA結合タンパク質QKI-5Aと同類のヒトタンパク質(タンパク質=GenBankアクセッション番号XP_037438.2、cDNA=XM_037438)に対して64％相同であり、クエーキングアイソフォーム6 (タンパク質=GenBankアクセッション番号AAF63414.1、cDNA=AF142419)に対して64％相同であり、不特定のタンパク質製品(タンパク質=GenBankアクセッション番号BAB55032.1、cDNA=AK027309)に対して64％相同であり、クエーキングアイソフォーム2 (タンパク質=GenBankアクセッション番号AAF63413.1、cDNA=AF142418)に対して67％相同であり、クエーキングアイソフォーム3 (タンパク質=GenBankアクセッション番号AAF63417.1、cDNA=AF142422)に対して67％相同であり、クエーキングアイソフォーム4 (タンパク質=GenBankアクセッション番号AAF63415.1、cDNA=AF142420)に対して67％相同であり、クエーキングアイソフォーム3 (タンパク質=GenBankアクセッション番号AAF63417.1、cDNA=AF142422)に対して67％相同であり、RNA結合タンパク質HQK-6 (タンパク質=GenBankアクセッション番号BAB69497.1、cDNA=AB067799)に対して67％相同であり、RNA結合タンパク質HQK-7B (タンパク質=GenBankアクセッション番号BAB69499.1、cDNA=AB067801)に対して67％相同であり、RNA結合タンパク質HQK-7 (タンパク質=GenBankアクセッション番号BAB69498.1、cDNA=AB067800)に対して67％相同であり、クエーキングアイソフォーム1 (タンパク質=GenBankアクセッション番号AAF63412.1、cDNA=AF142417)に対して67％相同であり、および胃癌に関連する遺伝子(GenBankアクセッション番号BD004960.1に対して64％相同である。また、ショウジョウバエhowはマウスKHドメインRNA結合タンパク質QKI-7B (GenBankアクセッション番号AAC63042.1)に対する相同性も示す。
【０１７２】
図15Aに示したように、ショウジョウバエGadFlyアクセッション番号CG9373の遺伝子産物は、ヒトKIAA1341タンパク質(タンパク質=GenBankアクセッション番号BAA92579.1、cDNA=AB037762)に対して44％相同であり、ヒト不特定タンパク質製品(タンパク質=GenBankアクセッション番号BAB14421.1、cDNA=AK023133)に対して43％相同であり 、およびミエリン遺伝子発現因子2 (タンパク質=GenBankアクセッション番号NP_057216.1、cDNA=NM_016132)に対して43％相同である。また、CG9373はマウスミエリン遺伝子発現因子(GenBankアクセッション番号AAL90778.1)に対する相同性も示す。
【０１７３】
また、ショウジョウバエcpoは、図19Bでは配列識別番号1とも呼ぶ。また、複数結合のヒトRNA結合タンパク質遺伝子(RBPMS)は、タンパク質=GenBankアクセッション番号XP_047075.1、cDNA=XM_047075とも呼び、また、複数結合のRNA結合タンパク質と同類のヒト遺伝子はタンパク質=GenBankアクセッション番号XP_091097、cDNA=XM_091097とも呼ぶ。図19Aに示したように、ショウジョウバエCG31243の遺伝子産物は、ヒト複数結合のRNA結合タンパク質に対して62％相同であり、およびC末端部にて複数結合のRNA結合タンパク質と同類のヒトタンパク質に対しては59％相同である。
【０１７４】
図23Aに示したように、ショウジョウバエJafrac1の遺伝子産物は、ヒトのペルオキシレドキシン2 (タンパク質=GenBankアクセッション番号XP_009063.2、cDNA=XM_009062)に対して83％相同であり、およびヒトのペルオキシレドキシン1 (タンパク質=GenBankアクセッション番号NP_002565.1、cDNA=NM_002574)に対しては82％相同である。また、CG1633は、マウスチオレドキシン依存型ペルオキシド還元酵素2 (GenBankアクセッション番号NP_035164.1)およびマウスペルオキシレドキシン4 (GenBankアクセッション番号NP_048044.1)に対する相同性を示す。
【０１７５】
図27に示したように、ショウジョウバエGadFlyアクセッション番号CG14440の遺伝子産物は、ヒト仮想タンパク質LOC55565 (タンパク質=GenBankアクセッション番号NP_060000.1、cDNA=NM_017530)に対して57％相同である。また、CG14440は、仮想タンパク質LOC55565と同類のマウスタンパク質(GenBankアクセッション番号AAH23180.1)に対する相同性を示す。
【０１７６】
また、ヒトJafrac1相同タンパク質ペルオキシレドキシン1は、米国特許番号5610286-Aにおいてナチュラルキラー細胞促進 因子と呼ばれる。また、ヒトJafrac1相同タンパク質ペルオキシレドキシン2は、iフランス特許番号2798672-A1においてペルオキシレドキシンTDX1酸型のアミノ酸配列と呼ばれる。また、ヒトCG14440相同タンパク質は、国際特許番号WO200153312-A1においてはヒトポリペプチド配列識別番号3381と呼ばれる。
【０１７７】
実施例4: 遺伝的な脂肪経路スクリーニング
脂肪(adp)は、動物またはヒトにおいて肥満を調節し、肥満の原因となるか、または肥満に寄与するように記述されているタンパク質である(WO 01/96371を参照)。Gal4/UASシステムの制御下で脂肪cDNAの野生型複製を含有する遺伝子導入ハエを作成した(BrandおよびPerrimon、1993、Development 118:401-415; for adipose cDNA、 WO 01/96371を参照)。
【０１７８】
無眼Gal4ドライバーラインを有するこれらの遺伝子導入ハエの染色体組換えは、発育ショウジョウバエ眼において脂肪を過剰発現する安定した組換え(型)ハエラインを作成するために用いられてきた。これらの条件下で遺伝子導入脂肪活性を受けている動物は、眼の表現型の視認できる変化を有するハエ成体へと成長した。組換え(型)ドライバーラインの処女を、単交雑で、変異体EPラインコレクションの雄と交雑せしめ、望ましくは12〜15 日間、29℃Cにて保存した。子孫を、眼の表現型の修飾(増強または抑制)に関して点検した。眼の表現型を変える突然変異は、脂肪活性を修飾する遺伝子に影響を及ぼす。発明者らは、ハエラインHD-EP(3)35715が眼-脂肪-Gal4によって誘発される眼の表現型の抑制因子であることを見出した。この結果は、HD-EP(3)35715統合がcpo遺伝子座に位置することが見出されたので、脂肪を有するcpo遺伝子の相互作用を強く示唆している。これにより、エネルギー恒常性の調節におけるcpoおよび相同タンパク質の機能が支持される。
【０１７９】
実施例5: dUCPy 修飾因子のスクリーニング
眼(「無眼」遺伝子の眼特異性プロモーターの制御下にあるGal4)のような非重要器官におけるdショウジョウバエ脱共役タンパク質dUCPyの発現は結果として、可視に損傷した眼を有するハエを生じる。この容易に可視の眼の表現型は、UCP活性を修飾できる遺伝子産物の遺伝的スクリーニングの基盤である。
【０１８０】
眼にGal4発現を有する菌株のゲノム部分とpUAST-dUCPy構成物を保有する菌株とを、ゲノム組換え(再結合)を用いて1つの染色体上に混合した。結果として生じたハエ菌株は、dUCPy発現によって永久に損傷した眼を有する。この菌株のハエを、変異誘発したハエ菌株の大きな収集のハエと交雑種せしめた。この変異体収集において、特別発現システム(EPエレメント、参照: Rorth P, Proc Natl Acad Sci U S A 1996, 93(22):12418-22)を異なるゲノム座位でランダムに統合した。酵母菌転写因子Gal4は、EPエレメントに結合し、そしてEPエレメントの統合部位を閉じる内在性遺伝子の転写を活性化することができる。遺伝子の活性化は以上の点から、dUCPyを過剰発現する同一細胞(眼)において発生する。変異体収集は、EPエレメントの異なる統合部位を有する数千の菌株を含むので、遺伝子の発現がdUCPy活性と相互作用するかどうかを確認するために、多数の遺伝子を検査することが可能である。遺伝子が、UCP活性エンハンサーとして作用する場合には、眼欠陥は悪化され; 抑制因子として作用する場合には、その欠陥は回復される。
【０１８１】
このスクリーニングを用いて、抑制活性を備えた遺伝子を発見し、これがショウジョウバエにおけるcpo遺伝子であることが判明した。
【０１８２】
実施例6: 哺乳動物(マウス)の組織におけるポリペプチドの発現
本発明において開示した哺乳動物組織におけるポリペプチドの発現を分析するため、いくつかのマウス菌株(望ましくは、標準モデル系における肥満症および糖尿病の研究であるマウス菌株 C57Bl/6J、C57Bl/6 肥満型およびC57Bl/KS db/db)は、Harlan Winkelmann (33178 Borchen、Germany)から購入し、一定の温度下(望ましくは22℃Ｃ)にで、湿度40パーセントおよび明/暗サイクルの望ましくは14/10 時間保存維持した。マウスには標準食を与えた(例えばssniff Spezialitaten有限責任会社、製品番号niff M-Z V1126-000)。絶食実験(「絶食野生型マウス」)に関しては、野生型マウスを、食物を与えずに水のみを適時に与えるだけで48時間飢えさしめた(例えば、Schnetzlerらの(1993)J Clin Invest 92(1):272-280、Mizunoらの(1996) Proc Natl Acad Sci U S A 93(8):3434-3438を参照)。動物は6〜8週間目に達した時点で屠殺した。動物組織は、当業者であれば既知の標準手順に従って分離し、液体窒素で簡易冷凍し、必要となるまで-80℃Cにて保管した。
【０１８３】
RNAをTrizol試薬(例えば、ドイツ、KarlsruheのInvitrogen社製)を用いて、マウス組織から分離し、さらに、RNeasyキット(例えば、ドイツ、Qiagen社製)と共に、DNase-treatmentを使用し、製造者の指示に従って当業者であれば公知の方法で精製した。全RNAを逆転写(望ましくはInvitrogen社、Karlsruhe、ドイツからのSuperscriptII RNaseH- Reverse Transcriptaseを利用する)し、そして全RNAをTaqman分析の対象とし、望ましくはTaqman2xPCR Master  Mix(Applied Biosystems社、Weiterstadt、ドイツ; このミックスには、製造者によれば、例えば、AmpliTaq ゴールドDNポリメラーゼ、Amper ase UNG、dUTPを有するdNTP、受動基準Roxおよび最適化された緩衝液成分などが含まれる)をGeneAmp 5700配列検出システム(Applied Biosystems社、Weiterstadt、ドイツ)上に用いた。
【０１８４】
Taqman分析は、望ましくは下記のプライマー/プローブ ペアを用いて実施した:
Sacドメインをもつイノシトールホスファターゼ2 (sac2) (配列識別番号1)の増幅用: 5'- CCT GGA TCG CAC CAA CG -3';マウスsac2 逆プライマー(配列識別番号2): 5'- TTA AGC TGC TGT TCC ATG ACC -3'; Taqmanプローブ (配列識別番号3): (5/6-FAM) TCC AGG CTG CCAタグCGC GC (5/6-TAMRA)
マウス溶質キャリア25ファミリー(ミトコンドリアのキャリア、Aralar) メンバー12 (Slc25a12) (配列識別番号4)の増幅用: 5'- CCT GCC AAC CCT GAT CAC -3';マウスSlc25a12 逆プライマー(配列識別番号5): 5'- TTT CAA TGC CAG CGA AAG TG -3'; Taqmanプローブ (配列識別番号6): (5/6-FAM) CGG TGG CTA CAG 作用するTGC CAC GG (5/6-TAMRA)
マウス溶質キャリア25ファミリー(ミトコンドリアのキャリア;アデニンヌクレオチド輸送体)、メンバー13 (Slc25a13) (配列識別番号7)の増幅用: 5'- AGC GGT GGT TCT ATG TCG ATT T -3';マウスSlc25a13 逆プライマー(配列識別番号8): 5'- CGG GAT TTA GGA ACC GGC T -3'; Taqmanプローブ (配列識別番号9): (5/6-FAM) AGG CGT GAA GCC CGT GGG ATC T (5/6-TAMRA)
マウスミエリン遺伝子発現因子2 (mef2) (配列識別番号10)の増幅用: 5'- ACA AGG ATG GCA AGA GCA GAG -3';マウスmef2 逆プライマー(配列識別番号11): 5'- ATG GAA ATT GCT TGG 作用するGCT T -3'; Taqmanプローブ (配列識別番号12): (5/6-FAM) CAT GGG CAC TGT CAC TTT TGA GCA GG (5/6-TAMRA)
図では、相対RNA発現をX軸上に示す。図4Aおよび図4B、図8A、図8B、図8C、および図8D、および図16A、図16B、および図16Cでは、検査した組織をX軸上に示した。「WAT」は白色脂肪組織を参照し、「BAT」は茶色脂肪組織を参照する。
【０１８５】
図4Aに示したように、哺乳動物(マウス)組織におけるSacドメインをもつイノシトールホスファターゼ2 (SAC2) RNA発現のリアルタイムPCR法(Taqman)分析は、SAC2が視床下部、脳、WAT、脾臓および腎臓において高度に発現されることを明らかにした。図4Bは、SAC2が絶食させた動物、同様に、ob/obマウスのBATおよび膵臓において上方制御されることを示す。視床下部における弓状核は、摂食行動を調節する脳における領域である。視床下部およびWATにおけるSAC2の高発現レベルは、この遺伝子がエネルギー恒常性において中枢的な役割を果たすことを強く示唆する。これは、代謝障害を研究するために用いられる2実験動物のBATおよび膵臓におけるSAC2の上方制御によって支持される。
【０１８６】
図8Aに示したように、哺乳動物(マウス)組織における溶質キャリア25ファミリー、メンバー12 (Slc25a12) RNA発現のリアルタイムPCR法(Taqman)分析は、that Slc25a12が筋肉、視床下部、脳および心臓において高度に発現されることを明らかにした。図8Bに示したように、Slc25a12は、BATにおいてob/obマウスの9倍上方制御され、そして絶食させた動物のBATにおいては2倍以上も上方制御される。Slc25a12は、ob/obマウスの心臓においてほぼ3倍下方制御される。図8Cに示したように、溶質キャリア25ファミリー、メンバー13 (Slc25a13)は、野生型動物の肝臓、心臓および腎臓において高度に発現される。図8Dに示したように、Slc25a13は、ob/obマウスのBATにおいて強く上方制御され、そしてob/obマウスの心臓組織においては4倍以上も下方制御される。肥満症のための遺伝モデルのBATおよび心臓における明らかな調節と共に、Slc25a12およびSlc25a13の組織特異的な発現は、Slc25a12およびSlc25a13が代謝において中枢的な役割を果たすことを示唆する。
【０１８７】
図16Aに示したように、哺乳動物(マウス)組織におけるミエリン遺伝子発現因子2 (MEF-2) RNA発現ののリアルタイムPCR法(Taqman)分析は、MEF-2が視床下部、脳および精巣において高度に発現されること明らかにした。さらに、MEF-2は、WAT、結腸、肺臓、脾臓および腎臓において強い発現レベルを示す。図16Bは、MEF-2がob/obマウスのBATにおいて上方制御されるを示す。また、図16Cでは、MEF-2が、高脂肪(パルミタート)食事の摂食後にBATにおいて上方制御されることも示す。高脂肪食下のみならず、肥満症遺伝モデルのBATにおけるMEF-2の上方制御も、MEF-2の代謝における中枢的な役割を示唆する。
【０１８８】
実施例7. ヒト組織における本発明のタンパク質の転写物の発現差異の分析
実施例6において記載したように、ヒト初代脂肪組織からのRNA調整を行った。ハイブリダイゼーションおよび走査を製造者の説明書に記載されたように実施した( Affymetrix Technical Manual、2002、obtained from Affmetrix、Santa Clara、USAを参照)。
【０１８９】
図12Aおよび図12B、図20、図24、および図28において、X軸は時間軸であり、脂肪細胞分化.の0日目と12日目を示した。Y軸は蛍光強度を表す。クエーキング6 (QKI6)、RNA結合タンパク質HQK-7B、複数結合のRNA結合タンパク質(RBPMS)、ペルオキシレドキシン1 (PRDX1)、および初代ヒト腹部脂肪細胞分化を用いた仮想タンパク質LOC55565遺伝子の発現分析(Affymetrix GeneChips使用)は、脂肪細胞におけるヒトQKI6、HQK-7B、RBPMS、PRDX1、およびLOC55565遺伝子の発現の差異を明確に示す。さまざまな非依存性の実験を行った。本実験は、QKI6 (図12Aを参照)、HQK-7B (図12Bを参照)、およびPRDX1 (図24を参照)が、分化中には、0日目に比較して12日目に最も豊富であることを示す。さらに、本実験は、RBPMS (図20を参照)およびLOC55565 (図28を参照)転写物が、分化中には、12日目に比較して0日目に最も豊富でであることを示す。
【０１９０】
このように、前脂肪細胞が成熟脂肪細胞に分化するためには、QKI6、HQK-7B、またはPRDX1タンパク質が著しく 増加される必要がある。前脂肪細胞におけるQKI6、HQK-7B、またはPRDX1タンパク質には、きわめて初期の段階で脂肪分化を促進する能力が備わっている。このように、前脂肪細胞が成熟脂肪細胞に分化するためには、RBPMSまたはLOC55565タンパク質が著しく減少される必要がある。前脂肪細胞における以上の点から、RBPMSまたはLOC55565タンパク質には、きわめて初期の段階で脂肪分化を抑制する能力が備わっている。
【０１９１】
以上の点から、QKI6、HQK-7B、RBPMS、PRDX1、およびLOC55565タンパク質は、ヒト代謝の調節、特に脂質生成の調節において重要な役割を果たすことが可能であるので、これらのタンパク質は肥満症、糖尿病、および(または)代謝症候群において重要な役割を果たす可能性がある。
【０１９２】
本発明のために、当事者にとっては当然のことだが、本明細書の至る所で言及した任意の機能の任意の組み合わせをここに明示的に開示する。
【図面の簡単な説明】
【０１９３】
【図１】図１は、ショウジョウバエGadflyアクセッション番号CG7956変異体の中性脂肪含有量を示す
【図２】図２は、変異型CG7956 (Gadfly アクセッション番号)遺伝子座の分子構造を示す
【図３】図３は、Gadflyアクセッション番号CG7956遺伝子産物(Query:クエリ)のBLASTP検索結果を、最も一致するヒトホモログ(Sbjct: 参照)と共に示す
【図４Ａ】図４Ａは、野生型マウス組織におけるSacドメインをもつイノシトールホスファターゼ 2 (SAC2)発現のリアルタイムPCR分析を示す
【図４Ｂ】図４Ｂは、異なるマウスモデルにおけるSAC2発現のリアルタイムPCR分析を示す
【図５】図５は、ショウジョウバエaralar 1 (Gadflyアクセッション番号CG2139)変異体の中性脂肪含有量を示す
【図６】図６は、変異型aralar 1 (Gadflyアクセッション番号CG2139)遺伝子座の分子構造を示す
【図７Ａ】図７Ａは、aralar 1遺伝子産物(クエリ)のBLASTP検索結果を2つの最もよくマッチするヒトホモログ(参照)と共を示す
【図７Ｂ】図７Ｂは、ヒトタンパク質とショウジョウバエタンパク質との比較を示す
【図８Ａ】図８Ａは、野生型マウス組織における溶質キャリア25ファミリー、メンバー12 (Slc25a12)発現のリアルタイムPCR分析を示す
【図８Ｂ】図８Ｂは、異なるマウスモデルにおけるSlc25a12発現のリアルタイムPCR分析を示す
【図８Ｃ】図８Ｃは、野生型マウス組織における溶質キャリア25ファミリー、メンバー13 (Slc25a13)発現のリアルタイムPCR分析を示す
【図８Ｄ】図８Ｄは、異なるマウスモデルにおけるSlc25a13発現のリアルタイムPCR分析を示す
【図９】図９は、ショウジョウバエhow (Gadflyアクセッション番号CG10293)変異体の中性脂肪含有量を示す
【図１０】図１０は、変異型how (Gadflyアクセッション番号CG10293)遺伝子座の分子構造を示す
【図１１Ａ】図１１Ａは、how遺伝子産物(クエリ)のBLASTP検索結果を、12の最もよくマッチするヒトホモログ(参照)と共を示す
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ヒトタンパク質とショウジョウバエタンパク質との比較を示す
【図１２Ａ】図１２Ａは、前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のヒト腹部脂肪細胞におけるクエーキング6発現の定量分析を示す
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のヒト腹部脂肪細胞におけるRNA結合タンパク質HQK-7B発現の定量分析を示す
【図１３】図１３は、ショウジョウバエGadflyアクセッション番号CG9373変異体の中性脂肪含有量を示す
【図１４】図１４は、変異型CG9373 (Gadflyアクセッション番号)遺伝子座の分子構造を示す
【図１５Ａ】図１５Ａは、CG9373遺伝子産物(クエリ)のBLASTP検索結果を、3つの最もよくマッチするヒトホモログ(参照)と共にを示す
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、ヒトタンパク質とショウジョウバエタンパク質との比較を示す
【図１６Ａ】図１６Ａは、野生型マウス組織におけるミエリン遺伝子発現因子2 (MEF-2)発現のリアルタイムPCR分析を示す
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、異なるマウスモデルにおけるMEF-2発現のリアルタイムPCR分析を示す
【図１６Ｃ】図１６Ｃは、高脂肪食を与えたマウスにおけるMEF-2発現のリアルタイムPCR分析を、標準食を与えたマウスと比較して示す
【図１７】図１７は、ショウジョウバエcpo (Gadflyアクセッション番号CG18434)変異体の中性脂肪含有量を示す
【図１８】図１８は、変異型cpo (Gadflyアクセッション番号CG18434)遺伝子座の分子構造を示す
【図１９Ａ】図１９Ａは、ヒトタンパク質とショウジョウバエタンパク質との比較を示す
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、ショウジョウバエcpo遺伝子によってコード化されたアミノ酸配列を示す(GadFlyアクセッション番号CG31243、配列識別番号1)
【図２０】図２０は、前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のヒト腹部脂肪細胞における、複数結合のRNA結合タンパク質(RBPMS)発現の定量分析を示す
【図２１】図２１は、ショウジョウバエJafrac1 (Gadflyアクセッション番号CG1633)変異体の中性脂肪含有量を示す
【図２２】図２２は、変異型Jafrac1 (Gadfly アクセッション番号CG1633)遺伝子座の分子構造を示す
【図２３Ａ】図２３Ａは、Jafrac1遺伝子産物(クエリ)のBLASTP検索結果を、2つの最もよくマッチするヒトホモログ(参照)と共に示す
【図２３Ｂ】図２３Ｂは、ヒトタンパク質とショウジョウバエタンパク質との比較を示す
【図２４】図２４は、前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のヒト腹部脂肪細胞におけるペルオキシレドキシン1 (PRDX1)発現の定量分析を示す
【図２５】図２５は、ショウジョウバエGadflyアクセッション番号CG14440変異体の中性脂肪含有量を示す
【図２６】図２６は、変異型CG14440 (Gadflyアクセッション番号)遺伝子座の分子構造を示す
【図２７】図２７は、CG14440遺伝子産物(クエリ)のBLASTP検索結果を、最も一致するヒトホモログ(参照)と共に示す
【図２８】図２８は、前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のヒト腹部脂肪細胞における仮想タンパク質LOC55565発現の定量分析を示す
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ−１】
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【図７Ａ−２】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ−１】
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【図１１Ａ−２】
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【図１１Ａ−３】
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【図１１Ａ−４】
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【図１１Ａ−５】
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【図１１Ａ−６】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ−１】
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【図１５Ａ−２】
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【図１５Ａ−３】
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【図１５Ａ−４】
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【図１５Ａ−５】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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