(57)【要約】  インビトロ毒性分析であって、ａ）選択されたある濃度の分析されるべき化合物にスフェロイドサンプルをさらすこと、ｂ）適当な時間、スフェロイドサンプルをインキュベートすること、ｃ）スフェロイド細胞増殖阻害が起こるかどうか観察すること、を含む分析。
2005514042.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロ毒性分析であって、
ａ）選択されたある濃度の分析されるべき化合物にスフェロイド(spheroid)サンプルをさらすこと、
ｂ）適当な時間、スフェロイドサンプルをインキュベートすること、
ｃ）スフェロイド細胞増殖阻害が起こるかどうか観察すること、
を含む分析。
【請求項２】
スフェロイド細胞増殖阻害が、前記化合物が選択された濃度でスフェロイド細胞に毒性であることを示す、請求項１記載のインビトロ毒性分析。
【請求項３】
スフェロイド細胞増殖阻害が、神経細胞、肝臓細胞及び網膜細胞からなる群から選択される細胞に由来する、請求項１または２記載のインビトロ毒性分析。
【請求項４】
前記スフェロイドサンプルが哺乳類の細胞に由来する、請求項１から３のいずれか一項に記載のインビトロ分析。
【請求項５】
前記哺乳類細胞が、ヒト、齧歯類、豚の細胞である、請求項４記載のインビトロ毒性分析。
【請求項６】
前記哺乳類細胞が、ヒト以外の霊長類または犬の細胞である請求項４記載のインビトロ毒性分析。
【請求項７】
前記スフェロイドサンプルが魚の細胞に由来する、請求項１から３のいずれか一項に記載のインビトロ毒性分析。
【請求項８】
前記スフェロイド細胞が、培養された細胞系に由来する、請求項１から７のいずれか一項に記載のインビトロ毒性分析。
【請求項９】
前記スフェロイドサンプルが１以上の細胞タイプを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載のインビトロ毒性分析。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スフェロイドを使用したインビトロ毒性分析に関する。
【背景技術】
【０００２】
スフェロイドはさまざまな濃度の化合物の毒性を試験するために、インビトロモデルとして使用される重要な可能性を持つ。繰り返すことができ、信頼できる毒性の指標としてのインビトロモデルにおけるスフェロイドの使用は、生きている動物を使用することの望ましい代替法である。
【特許文献１】ＷＯ９８／３５０２１
【非特許文献１】Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell.,Biol.13,29-38 and modified by Lazar, A.
【非特許文献２】Peshwa, M.V.,Wu, F.J.,Chi,C.M.,Cerra,F.B.,and Hu,W.S(1995).
【非特許文献３】Extended liver-specific functions of procine hepatocyte spheroids entrapped in collagen gel. In virto Cell Biol Anim.31,340-346
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明者は、スフェロイドが適当な面の上で及び静置状態、即ち、揺動のない状態で成長したとき、観察されたスフェロイド細胞の増殖あるいは、スフェロイドにおける細胞の「増殖（spreading）」に基づく増殖阻害試験を開発した。図１で示すとおり、前記細胞はスフェロイドの表面から成長する。スフェロイドがある濃度の毒物にさらされたとき、細胞の増殖は阻害される。この細胞増殖の阻害は、毒性による阻害を示している。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の最初の態様では、
ａ）選択されたある濃度の化合物に分析されるべきスフェロイドサンプルをさらすこと、
ｂ）適当な時間、スフェロイドサンプルをインキュベートすること、
ｃ）スフェロイド細胞増殖阻害が起こるかどうか観察すること
を含む、インビトロ毒性分析が提供される。
選択された濃度において、分析される化合物にさらされていない対照スフェロイドに対して、もしサンプルのすべてのスフェロイドにおいて全く細胞が増殖しないのであれば、または、非常に増殖が限られているのであれば、これは増殖阻害陽性（+）という結果であるとみなされる。しかしながら、サンプル中で１以上のスフェロイドから細胞増殖が見られるのであれば、これは細胞増殖阻害が陰性（-）であるという結果を示している。
【０００５】
部分的な増殖が見られる、即ちサンプル中にいくらかの細胞増殖が見られ、対照中にはあまり細胞増殖が見られなかった場合には、次に、確実な結果、すなわち、増殖阻害の陽性（+）の結果が得られるように高濃度の化合物の配合を繰り返すべきである。
【０００６】
スフェロイド細胞の増殖阻害が起こった場合には、このことは、選択された濃度において、スフェロイドサンプルが由来する細胞のタイプにおいて毒性効果を有することを示していることになる。
【０００７】
ここでは、「スフェロイド」の用語は三次元構造、一般的には実質的に形状が自然界にはなく球体であり、器官の、または組織の、または細胞系の細胞（通常は103以上の細胞を含んでいる）の再集合からなるものを意味する。
【０００８】
ここで使用される「組織」という用語は、共通の機能を持つ細胞が組織化され選択されたものを意味するととられるべきである。「器官」という用語は、共通する機能を有する「組織」の体系的収集体を意味する。「細胞系」とは、形式転換を受ける一連の細胞培養物、あるいは、連続して分裂する能力を手に入れた細胞培養物を意味するととられるべきである。
【０００９】
全体の組織または器官(バイオプシーを介して得られうる)の部分は、本発明において使用されるスフェロイドを作成するため再集合する前に、個々の細胞/細胞の小さなグループに分割しうるので、「組織」または「器官」は、本発明において使用するためには、完全に無傷である必要はない。
【００１０】
本発明において使用するためのスフェロイドの産生用細胞は、感染された組織を含む、いかなる適当な組織源に由来するものであってもよい。ニューロン細胞（例えば、脳スフェロイド）を含むスフェロイドのため胎児組織が望ましい。他の細胞を含むスフェロイドとして、胚/胎児(fortal)  及び非胎児（例えば成体由来）が一般的に使用できる。肝臓細胞が肝臓のいくつかの特性（例えば、アルブミン分泌、尿素分泌、グルコース分泌）を維持するスフェロイドを産生するために使用でき、それによって、肝臓における物質の代謝をインビトロで模倣するため、また、一般的な細胞毒および特定の肝細胞毒の影響を探索するために使用することができるので、肝臓細胞が特に有用である。これは、特定の物質が肝臓による後の代謝に毒になるかどうか及び/または、肝臓細胞に直接的に毒となり、または、一般的な細胞機能を妨げるかどうかを決定するために有用である。
【００１１】
スフェロイドは、原則的には、細胞または組織のサンプルを、好ましくは、個々の細胞または小さな細胞群に分割することにより、どんな動物に由来する所望の組織または器官からであっても産生できる。たとえば、パスツールピペットによる穏やかな粉砕によるような機械的な分解は、網膜または脳組織に対して使用される。あるいは、例えば肝臓組織の分解には、酵素分解法が使用される。
【００１２】
好ましくは、本発明のスフェロイドは哺乳類の組織または器官（例えばヒト、ヒト以外の霊長類、犬、齧歯類（ラットおよびマウスを含む）または豚の組織または器官）、に由来している。あるいは、本発明のスフェロイドは魚の組織または器官に由来している。
【００１３】
細胞系由来の細胞もまた使用してもよい。より細胞を生成させるため単層培養を最初に行うことができ；トリプシン化法を、単層培養細胞の細胞分離のために使用してもよい。
【００１４】
本発明で使用するスフェロイドは、2つ以上の異なる細胞タイプを含んでいてもよい。それにより、細胞増殖阻害の観察では、スフェロイドを生成するすべての細胞タイプは試験する毒物に対して毒性効果を示すということを指し示している。
【００１５】
本発明で使用されるスフェロイドは、新たに調製し、または低温保存されたスフェロイドを解凍することにより得てもよい。スフェロイドは、ＷＯ９８／３５０２１に記載されているような方法を使用して調製してもよい。
【００１６】
本発明のインビトロ分析は、分析される化合物の選択された一連の異なる濃度を使用して行ってもよい。その結果、その化合物がスフェロイド細胞タイプに毒となる、閾値の濃度を測定することができる。
【００１７】
同じ化合物を使用して、異なるスフェロイド細胞タイプを使用して本発明の分析を行うことによって、前記化合物が一つの細胞タイプに毒となりおよび、他のタイプには毒にならない濃度を測定することができる。
【００１８】
後述の実施例において、新鮮な肝臓またはHepG2スフェロイドを使用した。各試験は繰りかえされ、同じ結果が得られ、それによりスフェロイド細胞増殖阻害試験（the spheroid cell spreading inhibition test）（SCSIT）が毒性の信頼できる指標であることが確認された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
肝臓スフェロイドの調製
肝臓スフェロイドはSeglen P.O（（1976）Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell.,Biol.13,29-38 and modified by Lazar, A.; Peshwa, M.V.,Wu, F.J.,Chi,C.M.,Cerra,F.B.,and Hu,W.S(1995). Extended liver-specific functions of procine hepatocyte spheroids entrapped in collagen gel. In virto Cell Biol Anim.31,340-346)に記載された2段階のコラゲナーゼ潅流培養方法により雄のウィスターラットの肝臓から調製された。単離された肝臓細胞の実施可能性は等量のトリパンブルー染料（等張食塩水中1.0％）W/Vで混合し、最小の5分間室温でインキュベートした。80％を超える生存度を持つ唯一の単離肝臓細胞調製物が、肝臓スフェロイドを調製するために使用された。細胞懸濁液は培養媒体（肝細胞の培養媒体は５％FCS, 200mM L-グルタミン、2ng/ml  インスリン、100U/mlペニシリン及び100μg/mlストレプトマイシンサルファートを追加された）で希釈し、5×105細胞/mlの細胞密度にした。希釈した細胞懸濁液は、3ml/ウェルで6ウェルプレートに分散した。プレートは、37℃で、5％C02インキュベーターを用いて、最初の2４時間あたり85回転及びその後毎分77回転の速度でgyrotatory 揺動機（New Brunswick）でインキュベートした。プレートは、この研究の期間中、この速度で回転した（45日間、但し一般的には2-10日）。1.5mlの古い媒体は一日おきにそれぞれのウェルについて新鮮な媒体2.0ｍｌと交換した。媒体交換はこの研究期間中行われた（45日間、但し一般的には2-10日）。
【００２０】
この手順を使用して調製されたスフェロイドは、一般的には、170μｍの均一なサイズを持っており、80％より多くのものが160-180μｍの範囲内のサイズを持つ。
【００２１】
HepG2スフェロイドの調製
HepG2細胞系（Human Caucasian Hepatocyte Crimomal cells, from ECACC）は,75cm2フラスコで初期密度は102細胞/cm2で、10％FBS、200nM L-グルタミン、100U/mlペニシリン及び100μg/mlストレプトマイシン（GibcoBril）を追加したＭＥＭ（Sigma）を含む媒体中で、単層で培養した。フラスコの融合したHepG2細胞をトリプシンで分離してまとめてプールし、トリパンブルー染料排出により計数した。細胞懸濁液は媒体で希釈し（5％FCS, 200nM L-グルタミン、100U/mlペニシリン及び100μg/mlストレプトマイシンを追加したＭＥＭ）で１ml細胞懸濁液あたり1×106細胞とした。細胞懸濁液は6つのウェルプレートにウェルあたり3mlずつ入れた。そのプレートはgyrotatory揺動機（New Brunsrik）においた。最初の24時間は37℃CO2インキュベーターで、83rpm、その後77rpmに速度を減少した。6DIV培養の後、スフェロイドの使用準備が整った。
【００２２】
（実施例１）
3から5の新鮮な調製したスフェロイドは、24のウェルプレートにそれぞれ移して、表１及び表２に詳述したとおりさまざまな濃度のガラクトサミンにさらした。2つのウェルは、各濃度のガラクトサミンに使用した。スフェロイドは10-15％FCS, 200nM L-グルタミン、100U/mlペニシリン及び100μg/mlストレプトマイシンサルファートを追加した肝細胞媒体で培養した。37℃で5％のCO2インキュベーターに置いて、スフェロイド細胞の増殖阻害の影響を、ガラクトサミンに細胞をさらして、48時間後観察した。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
【表２】
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【００２５】
図２Ａは、回転停止48時間後の、対照の肝臓スフェロイド（ガラクトサミンにはさらしていない）を示している。スフェロイド細胞増殖の阻害は観察されていない。図２Ｂは、16mMの濃度でのガラクトサミンにさらされたあとの肝臓スフェロイドの48時間後を示しており、スフェロイド細胞の増殖阻害は観察されていない。しかしながら、図２Ｃは40mMの濃度のガラクトサミンに肝臓スフェロイドをさらした後の48時間後を示しており、スフェロイド細胞の増殖は阻害された。
【００２６】
表１からは、ガラクトサミン濃度20mM以上で、肝臓スフェロイド細胞の増殖をガラクトサミンが阻害することがわかる。
【００２７】
表２からは、ガラクトサミン濃度16mM以上で、HegG2スフェロイド細胞の増殖をガラクトサミンが阻害することがわかる。
【００２８】
（実施例２）
新鮮な調製されたスフェロイドを表３および表４で見られるとおりさまざまな濃度のプロプラノロールにさらし、スフェロイド細胞増殖阻害の影響が観察された。
【００２９】
【表３】
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【００３０】
【表４】
2005514042.tif 000006
【００３１】
図３Aは、125μMの濃度のプロプラノロールに肝臓スフェロイドをさらして48時間後を示しており、スフェロイド細胞増殖阻害が観察されていない。
【００３２】
しかしながら図３Bでは、250μMの濃度のプロプラノロールに肝臓スフェロイドをさらして48時間後を示しており、スフェロイド細胞増殖は阻害された。
【００３３】
表３からは、プロプラノロール250μM以上で、肝臓スフェロイド細胞の増殖をプロプラノロールが阻害することがわかる。
【００３４】
表４からは、プロプラノロール125μM以上で、HepG2スフェロイド細胞の増殖をプロプラノロールが阻害することがわかる。
【００３５】
（実施例３）
新しく調製されたスフェロイドは、表３および表４で見られるとおりさまざまな濃度のジクロフェナックにさらされ、スフェロイド細胞増殖阻害の影響が観察された。
【００３６】
【表５】
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【００３７】
【表６】
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【００３８】
図４Ａは、1000μMの濃度のジクロフェナクに肝臓スフェロイドをさらして48時間後を示しており、スフェロイド細胞増殖阻害が観察されていない。
【００３９】
しかしながら、図４Ｂは、1000μMの濃度のジクロフェナクに肝臓スフェロイドをさらして48時間後を示しており、スフェロイド細胞増殖阻害が観察された。
【００４０】
表５および表６からは、ジクロフェナク1000μM以上で、ジクロフェナクは肝臓スフェロイドおよびHepG2スフェロイド双方の細胞の増殖を阻害することがわかる。
【００４１】
（実施例４）
新しく調製されたスフェロイドは、表３および表４で見られるとおりさまざまな濃度のパラセタモールにさらされ、スフェロイド細胞増殖阻害の影響が観察された。
【００４２】
【表７】
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【００４３】
【表８】
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【００４４】
図５Aは、50mMの濃度のパラセタモールに肝臓スフェロイドをさらして48時間後を示しており、スフェロイド細胞増殖阻害が観察されていない。
【００４５】
しかしながら、図５Ｂは、50mMの濃度のパラセタモールに肝臓スフェロイドをさらして48時間後を示しており、スフェロイド細胞増殖阻害が観察された。
【００４６】
表７および表８からは、パラセタモール50ｍM以上で、パラセタモールは肝臓スフェロイドおよびHepG2スフェロイド双方の細胞の増殖を阻害することがわかる。
【００４７】
上述した実施例からは、スフェロイドがある濃度の毒物にさらされた場合には、細胞増殖が阻害されることが明らかである。この影響は、新鮮な肝臓とHepG2を使用して、すべての４種の選択された毒物にさらしたことにより観察された。それゆえに、スフェロイド細胞増殖阻害は、信頼できる、繰り返すことができ、及び安定した毒性の指標である。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１Ａ】スフェロイドが静置面で成長するときのスフェロイド細胞の増殖状態を示している。
【図１Ｂ】スフェロイドが静置面で成長するときのスフェロイド細胞の増殖状態を示している。
【図１Ｃ】スフェロイドが静置面で成長するときのスフェロイド細胞の増殖状態を示している。
【図２Ａ】特定濃度のガラクトサミンの存在下と非存在下でのスフェロイドの増殖を示している。
【図２Ｂ】特定濃度のガラクトサミンの存在下と非存在下でのスフェロイドの増殖を示している。
【図２Ｃ】特定濃度のガラクトサミンの存在下と非存在下でのスフェロイドの増殖を示している。
【図３Ａ】特定濃度のプロプラノールの存在下と非存在下でのスフェロイドの増殖を示している。
【図３Ｂ】特定濃度のプロプラノールの存在下と非存在下でのスフェロイドの増殖を示している。
【図３Ｃ】特定濃度のプロプラノールの存在下と非存在下でのスフェロイドの増殖を示している。
【図４Ａ】特定濃度のジクロフェナクの存在下でのスフェロイドの増殖を示している。
【図４Ｂ】特定濃度のジクロフェナクの存在下でのスフェロイドの増殖を示している。
【図５Ａ】特定濃度のパラセタモールの存在下でのスフェロイドの増殖を示している。
【図５Ｂ】特定濃度のパラセタモールの存在下でのスフェロイドの増殖を示している。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2005514042.tif 000012
【図１Ｃ】
2005514042.tif 000013
【図２Ａ】
2005514042.tif 000014
【図２Ｂ】
2005514042.tif 000015
【図２Ｃ】
2005514042.tif 000016
【図３Ａ】
2005514042.tif 000017
【図３Ｂ】
2005514042.tif 000018
【図４Ａ】
2005514042.tif 000019
【図４Ｂ】
2005514042.tif 000020
【図５Ａ】
2005514042.tif 000021
【図５Ｂ】
2005514042.tif 000022
【国際調査報告】
2005514042.tif 000023
2005514042.tif 000024
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