(57)【要約】  本発明はポリヌクレオチドの細胞へのトランスフェクションまたは導入を向上させるための組成物の製造のための少なくとも一種のリゾ脂質の使用に関する。このような組成物は遺伝子治療、ワクチン接種、および、遺伝子に基づく生成物をinvivoで細胞に投与する任意の治療もしくは予防上の局面において有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチドを細胞へ導入するための組成物の製造のための少なくとも一種のリゾ脂質の使用（ただし、該ポリヌクレオチドは１以上の陽イオン脂質と会合していない）。
【請求項２】
リゾ脂質が、下式（Ｉ）のものである、請求項１に記載の使用：
【化１】
2005513073.tif 000007
［式中、
ｎは１〜５までの整数であり、
Ｒ１はＲ５または式（II）
【化２】
2005513073.tif 000008
もしくは
式（III）
【化３】
2005513073.tif 000009
｛式中、
Ｒ３は−ＣＨ２−または−ＣＯ−であり；
Ｒ４は−Ｈ、−ＯＨ、−Ｏ−（ＣＨ２）ｑ−ＣＨ３であり、
ここで、ｑは０〜２の整数であり、
Ｒ５はＣ８−３０脂肪族炭化水素基であり、
ｍは０〜５の整数である｝
のものであり；
Ｒ２は
−Ｈ、
−（ＣＨ２）ｐ−ＣＨＯＨ−ＣＨ２ＯＨ、
−（ＣＨ２）ｐ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−Ｎ＋Ｒ６Ｒ７Ｒ８、
−（ＣＨ２）ｐ−Ｎ＋Ｒ６Ｒ７Ｒ８、または
【化４】
2005513073.tif 000010
｛式中、
ｐは０〜１０までの整数であり、
Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は独立に水素または低級アルキルであるか、または
−Ｎ＋Ｒ６Ｒ７Ｒ８は環式アンモニオ基である｝
である］。
【請求項３】
Ｒ５がＣ１２−２２脂肪族炭化水素基である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
Ｒ５がＣ１６脂肪族炭化水素基である、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
Ｒ１が直鎖飽和Ｃ１６脂肪族炭化水素基であるＲ５であり、ｎ＝１であり、Ｒ２が−（ＣＨ２）ｐ−Ｎ＋Ｒ６Ｒ７Ｒ８（ここで、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８はメチル基であり、ｐ＝２である）である、請求項２〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
Ｒ１が、式（II）または式（III）のものであり（ここで、ｍ＝１である）、ｎ＝１であり、かつ、Ｒ２が−（ＣＨ２）ｐ−ＣＨＯＨ−ＣＨ２ＯＨ（ここで、ｐ＝１である）である、請求項２〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
Ｒ１が、式（II）または式（III）のものであり（ここで、ｍ＝１である）、ｎ＝１であり、かつ、Ｒ２が−（ＣＨ２）ｐ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−Ｎ＋Ｒ６Ｒ７Ｒ８（ここで、Ｒ６＝Ｒ７＝Ｒ８＝Ｈ、かつ、ｐ＝１である）である、請求項２〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
Ｒ１が、式（II）または式（III）のものであり（ここで、ｍ＝１である）、ｎ＝１であり、かつ、Ｒ２が−（ＣＨ２）ｐ−Ｎ＋Ｒ６Ｒ７Ｒ８（ここで、Ｒ６＝Ｒ７＝Ｒ８＝Ｈ、かつ、ｐ＝２である）である、請求項２〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
Ｒ１が、式（II）または式（III）のものであり（ここで、ｍ＝１である）、ｎ＝１であり、かつ、Ｒ２が−（ＣＨ２）ｐ−Ｎ＋Ｒ６Ｒ７Ｒ８（ここで、Ｒ６＝Ｒ７＝Ｒ８＝ＣＨ３、かつ、ｐ＝２である）である、請求項２〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
Ｒ１が、式（II）または式（III）のものであり（ここで、ｍ＝１である）、ｎ＝１であり、かつ、Ｒ２が下式である、請求項２〜４のいずれか一項に記載の使用：
【化５】
2005513073.tif 000011
【請求項１１】
組成物が約０．０１〜約５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．１〜約２０ｍｇ／ｍｌの間のリゾ脂質を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
組成物が脊椎動物標的組織への投与のためのものである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
標的組織が筋肉である、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
標的組織が腫瘍である、請求項１２に記載の使用。
【請求項１５】
リゾ脂質の投与が、少なくとも一種のポリヌクレオチドを含有する組成物を同じ標的組織へ投与することからなる第二の投与とは独立して行われる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
リゾ脂質の投与が第二の投与の前に行われる、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記治療組成物が、少なくとも一種のポリヌクレオチドをさらに含んでなる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
前記ポリヌクレオチドが、遺伝子を含み、かつ、該遺伝子を細胞内で機能的に発現し得るものである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１９】
前記ポリヌクレオチドが裸の核酸である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２０】
前記ポリヌクレオチドが裸の核酸でない、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２１】
前記組成物中のポリヌクレオチド濃度が、約０．０１ｍＭ〜約１の範囲である、請求項１９〜２０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２２】
組成物が、医薬上許容される注射用担体をさらに含んでなる、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２３】
ポリヌクレオチドを細胞へ導入する方法であって、該細胞をポリヌクレオチドと接触させる前、接触させると同時、または接触させた後に、リゾ脂質を含んでなる少なくとも一種の組成物と接触させることを含んでなる、方法。
【請求項２４】
細胞をリゾ脂質およびポリヌクレオチドに同時に接触させる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ポリヌクレオチドの細胞への導入を向上させるためのリゾ脂質の使用（ただし、該ポリヌクレオチドは１以上の陽イオン脂質を会合していない）。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明はポリヌクレオチドの細胞へのトランスフェクションまたは導入を向上させるための組成物の製造のための少なくとも一種のリゾ脂質（lysolipid）の使用に関する。このような組成物は遺伝子治療、ワクチン接種、および遺伝子に基づく生成物をin vivoで細胞に投与する任意の治療的または予防的局面に有用である。
【０００２】
遺伝子治療は一般に主として、機能的遺伝子の導入により永久的治癒が果たされる得る遺伝性欠損症（嚢胞性繊維症、ジストロフィー、血友病など）に適用できると考えられてきた。しかし、もっと大きな疾病群、特に後天性疾患（癌、エイズ、多発性硬化症など）も有益なタンパク質を生産するよう宿主細胞を一時的に操作することにより治療され得る。
【０００３】
例えば筋ジストロフィーや嚢胞性繊維症の治療適用がある。デュシェーヌ／ベッカー（Duchenne/Becker）筋ジストロフィーおよび嚢胞性繊維症の遺伝子は同定されており、それぞれジストロフィン、そして嚢胞性繊維症膜貫型コンダクタンス制御因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator）（ＣＦＴＲ）と呼ばれるポリペプチドをコードしている。これらの遺伝子を患者の筋肉細胞または肺細胞で直接発現させれば、標的組織内で機能的ポリペプチドが発現することでこれらの症状の著しい緩和に寄与するはずである。さらに嚢胞性繊維症では、研究により、肺症状を著しく改善するにはわずか約５％の肺上皮細胞でＣＦＴＲ遺伝子産物の発現を達成する必要があるだけであることが示唆されている。
【０００４】
遺伝子治療のもう一つの適用がワクチン接種である。これに関しては、脊椎動物の細胞内へ導入されたポリヌクレオチドによりコードされる免疫生成物を該細胞により発現および分泌させること、または該細胞によって主要組織適合性抗原を提示させ、それにより発現した免疫原に対する免疫応答を誘発することができる。機能的ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドがプラスミド由来ポリヌクレオチドからなる場合の、目的遺伝子の一時的発現（一時的トランスフェクションと呼ばれる）、またはポリヌクレオチドがウイルス由来ポリヌクレオチドからなる場合の形質導入、またはポリヌクレオチドが宿主ゲノムに組み込まれることになる宿主細胞の永久的形質転換のいずれかをもたらす種々の技術によって細胞へ導入することができる。
【０００５】
遺伝子治療の成功は生きた生物の細胞への遺伝情報の効率的な送達およびその細胞内での遺伝子情報の効率的な発現にかかっている。これまでに用いられてきたほとんどの送達機構はウイルスベクター、特にアデノウイルスおよびレトロウイルスベクターを含んでいる。結局のところ、多様に開発されきたウイルス、および細胞膜の通過、リソソーム分解の回避、それらのゲノムの核への送達を含むこの目標を達成するために極めて緻密な機構はヒトへ適用されるワクチン接種または遺伝子治療における多くの遺伝子送達適用に用いられてきた。
【０００６】
この他、受容体媒介機構に基づくもの(Perales et al., Eur. J. Biochem. 226 (1994), 255-266; Wagner et al., Advanced Drug Delivery Reviews 14 (1994), 113-135)、ポリアミドアミン(Haensler and Szoka, Bioconjugate Chem. 4 (1993), 372-379)、樹枝状ポリマー（ＷＯ９５／２４２２１）、ポリエチレンイミンもしくはポリプロピレンイミン（ＷＯ９６／０２６５５）、ポリリシン（ＵＳ−Ａ−５５９５８９７またはＦＲ２７１９３１６）などのポリマー媒介トランスフェクションに基づくもの、またはＤＯＴＭＡ(Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7413-7417)、ＤＯＧＳもしくはトランスフェクタム（商標）(Behr et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 6982-6986)、ＤＭＲＩＥもしくはＤＯＲＩＥ(Felgner et al., Methods 5 (1993), 67-75)、ＤＣ−ＣＨＯＬ(Gao and Huang, BBRC 179 (1991), 280-285)、ＤＯＴＡＰ（商標）(McLachlan et al., Gene Therapy 2 (1995), 674-622)もしくはリポフェクタミン（商標）などの脂質媒介トランスフェクションに基づくもの(Felgner et al., Nature 337 (1989), 387-388)など非ウイルス送達系も開発されている。これらの系は大規模生産、安全性、トランスフェクト可能な細胞のターゲッティング、低い免疫原性、および大きなＤＮＡ断片を送達できる能力の点で潜在的な利点を提供する。しかしながらやはりそれらのin vivo効率は依然として限られている。
【０００７】
１９９０年、ついに、Wolff et al. (Science 247 (1990), 1465-1468)は、裸のＲＮＡまたはＤＮＡ、すなわち、特別な送達系を用いずに裸のＲＮＡまたはＤＮＡをマウスの骨格筋へ直接注入すると筋細胞内でリポーター遺伝子が発現することを示した。細胞をトランスフェクトするためのこの技術は単純であるという利点をもたらし、肺（Tsan et al., Am. J. Physiol. 268 (1995), L1052-L1056; Meyer et al., Gene Therapy 2 (1995), 450-460）、脳（Schwartz et al., Gene Therapy 3 (1996), 405-411）、関節（Evans and Roddins, Gene Therapy for arthritis; In Wolff (ed) Gene Therapeutics: Methods and Applications of direct Gene Transfer. Birkhaiser. Boston (1990), 320-343）、甲状腺（Sikes et al., Human Gen. Ther. 5 (1994), 837-844）、皮膚（Raz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994), 9519-9523）および肝臓（Hickman et al., Hum. Gene Therapy 5 (1994), 1477-1483）への送達のためのこの系の有用性を支持する実験が行われてきた。
【０００８】
しかしながら、Davis et al. (Human Gene Therapy 4 (1993), 151-159およびHuman Mol. Genet. 4 (1993), 733-740)は、骨格筋へとin vivo注入された裸のＤＮＡの発現には大きな変動があって、これは例えば原発性筋障害の治療には十分でないことを見出した。この筆者らは、筋肉の再生を刺激するために筋肉に比較的多量の高張スクロースまたは例えばヘビから単離された心臓毒などの毒素を予め注射することにより遺伝子導入の効率の改善を得るための溶液を提案している。しかしながら、これらの方法は有望ではあるが、ヒトの治療には適用できない。
【０００９】
このように利用できる送達法はin vivo遺伝子治療で実施するには、安全性または効率の点で満足のいくものではない。
【発明の概要】
【００１０】
従って、本発明の基礎にある技術的課題は、裸の、または特別な送達促進剤と組み合わせた核酸分子を送達する改良法および手段を提供することである。
【００１１】
Felgner et al. （ＥＰ０５２３１８９Ｂ１）は陽イオン脂質とポリヌクレオチドを含んでなる組成物のトランスフェクション効率を促進するリゾ脂質の使用を提案した。Felgner et al.によれば、リゾ脂質の有益な作用は安定性を好み、陽イオン脂質小胞の凝集を阻害する能力によるものである。このような使用への関心は、最終的に、陽イオン脂質、ポリヌクレオチドを中性脂質の存在下または不在下でさらに含んでなる複合体へリゾ脂質を添加してもこのような複合体の活性を有意に高めることはできないことを別の刊行物(J. Biol. Chem, 1994, 269, 2550-2561)に開示した同じチームにより否定されている。
【００１２】
驚くべきことに、１以上の陽イオン脂質と会合していないポリヌクレオチドを脊椎動物細胞、特に脊椎動物組織へ導入する場合、リゾ脂質の特定の添加は、その遺伝子導入効率の劇的な向上をもたらすことがわかった。よって、本発明は好ましくは、ポリヌクレオチドの細胞への導入を向上させるための組成物の製造のための少なくとも一種のリゾ脂質の使用に関する（ただし、該ポリヌクレオチドは１以上の陽イオン脂質と会合していない）。
【発明の具体的説明】
【００１３】
本発明の範囲内で「ポリヌクレオチド」とは、裸の核酸と裸でない核酸の双方をさすものとする。「核酸」はＤＮＡであってもＲＮＡであっても、一本鎖であっても二本鎖であっても、直鎖であっても環状であっても、天然であっても合成であっても、修飾されていてもされていなくともよい(修飾の例としては米国特許第５５２５７１１号、米国特許第４７１１９５５号または欧州特許ＥＰ−Ａ３０２１７５参照）。それはとりわけゲノムＤＮＡ、ゲノムＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボゾームＲＮＡ、リボザイム、トランスファーＲＮＡまたはそのようなＲＮＡをコードするＤＮＡであり得る。この核酸はポリペプチド、リボザイム、アンチセンスＲＮＡまたは細胞送達上対照となる別の分子を生成し得る少なくとも１つの発現配列を含むプラスミドまたは直鎖核酸の形態であってもよい。この核酸は、例えばアンチセンスまたはリボザイム機能を目的に細胞へ送達されるオリゴヌクレオチド（すなわち、１００ｂｐ未満といった小さな核酸）であってもよい。本発明によれば、該核酸は裸であっても裸でなくともよい。「裸」（naked）とは、該核酸がその性質（ＤＮＡかＲＮＡか）、その大きさ、その形態（一本鎖／二本鎖、環状／直鎖など）によらず、トランスフェクションを促進するウイルス粒子、リポソーム製剤、荷電脂質またはポリマー、および沈殿剤と会合していないものと定義される（Wolff et al., Science 247 (1990), 1465-1468;欧州特許ＥＰ４６５５２９）。一方、「裸でない」（non-naked）とは、該核酸が、通常ウイルスと呼ばれるもの（アデノウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルスなど）を形成する、またはその核酸がウイルスキャプシドなどのウイルスエレメントと会合してはいるがそこに包摂されていない複合体を形成するウイルスポリペプチドと(米国特許第５，９２８，９４４号およびＷＯ９５２１２５９）、または（ii）リポソーム製剤、荷電化合物（ただし、この荷電化合物は陽イオン脂質ではない）と、または細胞への核酸の導入取り込み関わり得るいずれかの成分と(総説としてはLedley, Human Gene Therapy 6 (1995), 1129-1144参照)。好ましくはこの核酸はプラスミドＤＮＡの形態であり、ポリヌクレオチドは裸のプラスミドＤＮＡである。広範なプラスミドが市販されており、当業者に周知である。これらの利用可能のプラスミドは分子生物学的技術により容易に修飾される(Sambrook et al, 1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)。ｐＢＲ３２２(Gibco BRL)、ｐＵＣ(Gibco BRL)、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ(Stratagene)、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４(Invitrogen)、また、ｐ  Ｐｏｌｙ(Lathe et al, 1987, Gene 57, 193-201)由来プラスミドがこのような修飾の例である。
【００１４】
核酸が適切な遺伝情報を含む場合、コードされるポリペプチドの比較的多量の合成を命令する。細胞へ送達されるポリヌクレオチドが免疫ポリペプチドをコードする核酸を含む場合、本発明の使用は細胞内ウイルスを含む感染性病原体、また、腫瘍細胞に対して向上した効果的な免疫を達成するのに適用できる。標的細胞による発現に必要な遺伝情報は該ＤＮＡのｍＲＮＡへの転写およびｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳に必要な全てのエレメントを含む。種々の脊椎動物系での使用に適した転写プロモーターは広く文献に記載されている。例えば、好適なプロモーターとしては、ＲＳＶ、ＭＰＳＶ、ＳＶ４０、ＣＭＶまたは７．５ｋなどのウイルスプロモーター、ワクシニアプロモーター、誘導プロモーターなどがある。核酸はまた、イントロン配列、ターゲッティング配列、輸送配列、複製または組み込みに関与する配列を含み得る。これらの配列は文献で報告されており、当業者ならば容易に入手できる。核酸またはポリヌクレオチドはまた、スペルミンなどの特定の成分で安定化させるために修飾することもできる。
【００１５】
本発明によれば、「導入」（introduction or transfer）とは、ポリヌクレオチドが細胞へ導入され、そのプロセスの終了時に細胞内、あるいはその膜内またはその膜上に置かれることを意味する。それはまたポリヌクレオチドの性質によって「トランスフェクション」または「形質導入」とも呼ばれ、「トランスフェクション」はキャプシドまたはウイルスポリペプチドなどのウイルスエレメントを含まないポリヌクレオチドの導入を意図する場合をさし、「形質導入」はウイルスの導入をさす。これらの用語は本発明の技術分野で通常のものである。
【００１６】
これに関して本発明の範囲内で「向上した導入」（improved transfer）とは、リゾ脂質を用いずに行った導入に比べてリゾ脂質が存在する場合に細胞によるポリヌクレオチドのより効率的な導入を意味する。これはリゾ脂質を用いずに取り込まれたポリヌクレオチドの量と同じ実験条件下でリゾ脂質を用いた場合に細胞によって取り込まれた量を比較することによって判定することができる。好ましくは向上した導入は、リゾ脂質を用いない場合と比較してリゾ脂質を用いた場合に細胞へ導入されたポリヌクレオチドの発現量がより高いことによって判定することができる。
【００１７】
本発明の使用に従って製造された組成物はin vivoまたはex vivoにおける細胞へのポリヌクレオチドのトランスフェクションに使用することができる。これに関して、ex vivoとは、ポリヌクレオチドが導入される細胞が生物体内にはなく、トランスフェクション後に生物体へ導入されることを意味する。
【００１８】
「遺伝子治療法」とは、好ましくは、in vivoにおいて細胞へポリヌクレオチドを導入するための方法として理解される。特に「遺伝子治療」は遺伝子産物が標的組織で発現する場合、ならびに遺伝子産物が特に血流中へ分泌される場合に関する。
【００１９】
本発明の「リゾ脂質」は式（Ｉ）の化合物をさす：
【化１】
2005513073.tif 000002
［式中、
ｎは１〜５までの整数であり、
Ｒ１は、Ｒ５または式（II）
【化２】
2005513073.tif 000003
もしくは
式（III）
【化３】
2005513073.tif 000004
｛式中、
Ｒ３は−ＣＨ２−または−ＣＯ−であり；
Ｒ４は−Ｈ、−ＯＨ、−Ｏ−（ＣＨ２）ｑ−ＣＨ３であり、
ここで、ｑは０〜２の整数であり、
Ｒ５はＣ８−３０脂肪族炭化水素基であり、
ｍは０〜５の整数である｝
のものであり；
Ｒ２は
−Ｈ、
−（ＣＨ２）ｐ−ＣＨＯＨ−ＣＨ２ＯＨ、
−（ＣＨ２）ｐ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−Ｎ＋Ｒ６Ｒ７Ｒ８、
−（ＣＨ２）ｐ−Ｎ＋Ｒ６Ｒ７Ｒ８、または
【化４】
2005513073.tif 000005
｛式中、ｐは０〜１０までの整数であり、
Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は独立に水素または置換されていてもよい低級アルキルであり、低級アルキル基としては、例えば、Ｃ１−５アルキル基（例えば、メチル、エチル、プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル）が挙げられ、これらの基はヒドロキシカルボニル、低級（Ｃ１−３）アルコキシカルボニル、ヒドロキシ、シアノまたは低級（Ｃ１−３）アルコキシなどの１以上の置換基をさらに有してもよいか、
または−Ｎ＋Ｒ６Ｒ７Ｒ８は環式アンモニオ基であり、例えば、ピリジニオ、オキサゾリオ、ピリダジニオ、キノリニオまたはイソキノリニオが挙げられ、これらの基はＣ１−４アルキル（例えば、メチル、エチル）、ヒドロキシ、ヒドロキシエチル、アミノエチル、アミノ（イミノ）、カルバモイルまたはウレイドなどの１以上の置換基をさらに有してもよい。上記の環式アンモニオ基としては、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のいずれか２つの基が第四級窒素原子とともに環を形成し、残りの１つの基がＣ１−４アルキル基（例えば、メチル、エチル）、例えばＮ−メチルモルホリノまたはＮ−メチルピペラジニオである場合が挙げられる。｝］
【００２０】
本発明のある好ましい実施形態では、Ｒ５はＣ１２−２２脂肪族炭化水素基である。
【００２１】
本発明のより好ましくは実施形態では、Ｒ５はＣ１６脂肪族炭化水素基である。
【００２２】
さらに好ましい実施形態では、Ｒ５で示されるＣ８−３０またはＣ１２−２２またはＣ１６脂肪族炭化水素基としては、直鎖または分枝鎖の、飽和または不飽和脂肪族炭化水素基（例えば、アルキル、アルケニル、アルキニルなど)が挙げられ、これは置換されていてもよい置換されていなくともよい。アルケニル基はＺ配置でもＥ配置でもよい。Ｒ３は、ヒドロキシ、メルカプト、アミノ、オキソ、カルバモイル、カルボキシ、ハロゲン、Ｃ３−７シクロアルキル、Ｃ３−７シクロアルケニル、アリール（例えば、フェノキシ、トリル、フェニルなど）などの１以上の置換基をさらに有してもよい。例えば、Ｃ８−３０アルキル基［例えば、ｎ−ドデシル、ｎ−トリデシル、ｎ−テトラデシル、３，７，１１−トリメチルドデシル、ｎ−ペンタデシル、ｎ−ヘプタデシル、ｎ−オクタデシル、ｎ−エイコシル、ｎ−ドコシル、３，７−ジメチルオクチル、（１−オクチル）ノニル、３，７，１１，１５−テトラメチルヘキサデシル］（とりわけ、Ｃ１０−３０アルキル基がより好ましい）、Ｃ８−３０アルケニル基［例えば、８−トリデセニル（.DELTA.8）、３，７，１１−トリメチル−２，６，１０−ドデカトリエニル、８−テトラデセニル（.DELTA.8）、８，１１−テトラデカジエニル（.DELTA.8,11）、８−ヘプタデセニル（.DELTA.8）、２−オクタデセニル、９−オクタデセニル（オレイル）、９，１５−オクタデカジエニル、９，１２，１５−オクタデカトリエニル、８，１１，１４−ヘプタデカトリエニル（.DELTA.8,11,14）、８，１１−オクタデカジエニル（.DELTA.8,11）、４，７，１０，１３−ノナデカテトラエニル（.DELTA.4,7,10,13）、フィチル、３，７，１１，１５−テトラメチル−２，６，１０，１４−ヘキサデカテトラエニル、３，７，１１，１５−テトラメチル−２，４，６，１０，１４−ヘキサデカペンタエニル、１２−（２，３−シクロペンテニル）ドデシル、１２−（２，３−シクロペンテニル）−５−ドデセニル、１１−ヒドロキシ−８−ヘプタデセニル、３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチル−１−シクロヘキセン−１−イル）−２，４，６，８−ノナテトラエニル、４，７，１０，１３−ノナデカテトラエニル］、Ｃ８−３０アルキニル基［例えば、９−オクタデシニル、９，１５−オクタデカジイニル、ヘプタデカン−８−イニル、４−デシニル］、Ｃ８−３０アラルキル［例えば、１５−（４−ｎ−ブチルフェニル）ペンタデシル、.omega.−（ｐ−トリル）ヘプタデシル、６−（４−ｎ−ペンチルフェニル）ヘキサデシル、１５−フェニルペンタデシル］、および１５−（４−ｎ−ブチルフェノキシ）ペンタデシルまたは６−（４−ｎ−ペンチルフェノキシ）ヘキサデシルが挙げられる。
【００２３】
特に好ましい式Ｉの化合物としては、以下の化合物がある：
−  Ｒ１が直鎖飽和Ｃ１６脂肪族炭化水素基であるＲ５であり、ｎ＝１であり、Ｒ２が−（ＣＨ２）ｐ−Ｎ＋Ｒ６Ｒ７Ｒ８（ここで、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８はメチル基であり、ｐ＝２である）である、化合物；
−  Ｒ１が、式（II）または式（III）のものであり（ここで、ｍ＝１である）、ｎ＝１であり、かつ、Ｒ２が−（ＣＨ２）ｐ−ＣＨＯＨ−ＣＨ２ＯＨ（ここで、ｐ＝１である）である、化合物；
−  Ｒ１が、式（II）または式（III）のものであり（ここで、ｍ＝１である）、ｎ＝１であり、かつ、Ｒ２が−（ＣＨ２）ｐ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−Ｎ＋Ｒ６Ｒ７Ｒ８（ここで、Ｒ６＝Ｒ７＝Ｒ８＝Ｈ、かつ、ｐ＝１である）である、化合物；
−  Ｒ１が、式（II）または式（III）のものであり（ここで、ｍ＝１である）、ｎ＝１であり、かつ、Ｒ２が−（ＣＨ２）ｐ−Ｎ＋Ｒ６Ｒ７Ｒ８（ここで、Ｒ６＝Ｒ７＝Ｒ８＝Ｈ、かつ、ｐ＝２である）である、化合物；
−  Ｒ１が、式（II）または式（III）のものであり（ここで、ｍ＝１である）、ｎ＝１であり、かつ、Ｒ２が−（ＣＨ２）ｐ−Ｎ＋Ｒ６Ｒ７Ｒ８（ここで、Ｒ６＝Ｒ７＝Ｒ８＝ＣＨ３、かつ、ｐ＝２である）である、化合物；
−  Ｒ１が、式（II）または式（III）のものであり（ここで、ｍ＝１である）、ｎ＝１であり、かつ、Ｒ２が下式である、化合物。
【化５】
2005513073.tif 000006
【００２４】
本発明のリゾ脂質は陰イオンであるので、リゾ脂質の電荷のバランスをとるには１以上の陽イオンが必要とされ得る。この目的にはいずれかの医薬上許容される陽イオンが好適である。
【００２５】
本発明によるリゾ脂質は、いずれの常法によっても製造することができ、または、その開示内容を引用することによりそのまま本明細書の一部とされる米国特許第４９３５５２０号に開示されているように製造することができる。
【００２６】
一つの好ましい形態では、本発明の用途に従って製造される組成物中のリゾ脂質の量は約０．０１〜約５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．１〜約２０ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは約０．２〜約１０ｍｇ／ｍｌの範囲である。
【００２７】
一つの好ましい形態では、本発明の用途に従って製造される組成物は、脊椎動物組織へ投与するための形態である。これらの組織としては、筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、骨、軟骨、膵臓、腎臓、膀胱、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺、結合組織、血液、腫瘍などである。外来ポリヌクレオチドの導入の向上が得られる細胞は挙げられた各標的組織に見られるものである（筋細胞、気道細胞、造血細胞など）。投与は皮内、皮下、静脈内、筋肉内、鼻内、脳内、気管内、動脈内、腹腔内、膀胱内、胸膜腔内、歯冠内、または腫瘍内経路により、シリンジまたはその他の装置を用いた注射によって行われてもよい。経皮投与も考えられ、吸入またはエアゾール投与がある。投与部位およびポリヌクレオチドの導入部位は同じ場合もあるし、異なる場合もある。一つの好ましい形態では、本発明に従って製造される治療組成物は、筋細胞への導入のためのものであり、より好ましくは筋肉内注射経路または静脈内経路による。これに関して、投与方法は輸入管および／または輸出管注射を組み合わせてその血管の浸透性を上昇させることにより有利に向上させることができる。一つの特定の形態では、このような上昇は、静水圧の上昇により（すなわち、流出および／または流入を遮断することにより）、および／または浸透圧により（高張液を用いる場合）、および／または生体活性分子の導入（例えば、投与組成物へのヒスタミンの導入）により得られる（ＷＯ９８／５８５４２）。
【００２８】
もう一つの好ましい形態では、本発明の用途に従って製造される治療組成物は、腫瘍細胞へ導入するためのものである。
【００２９】
もう一つの好ましい形態では、本発明はポリヌクレオチドの細胞への導入を向上させるための治療組成物の製造のためのリゾ脂質の使用を提供し、ここでは該治療組成物は、少なくとも一種のポリヌクレオチドを含有する組成物の投与からなる第二の投与とは独立に投与される。本発明によれば、第一の投与は第二の投与の前、第二の投与と同時、または第二の投与の後、およびその逆で行うことができる。治療組成物の投与および第二の投与は異なる送達経路によっても同じ送達経路によっても行うことができる。一つの好ましい形態では、各々は同じ標的組織へ、最も好ましくは注射により、行うべきである。
【００３０】
本発明に従う使用のさらに好ましい形態では、この組成物は少なくとも１種のポリヌクレオチドをさらに含んでなる。一つの特に好ましい形態では、組成物中に含まれるポリヌクレオチドは、その細胞内で、コード核酸配列を機能的に発現し得る。
【００３１】
一般に、組成物中のポリヌクレオチドの濃度は約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌ、一つの好ましい形態では、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌである。本発明によれば、ポリヌクレオチドはそれが導入される標的細胞と同種であっても異種であってもよい。有利には該ポリヌクレオチドはポリペプチド、特に組成物に治療または予防特性を与える治療または予防ポリペプチドの全てまたは一部をコードする。ポリペプチドは大きさ、およびグリコシル化されているかされていないかに関係なく、ポリヌクレオチドの任意の翻訳産物であると理解され、ペプチドおよびタンパク質を含む。治療ポリペプチドとしては、主な例として、動物またはヒト生物体の欠陥または欠損タンパク質を補償し得るポリペプチド、あるいは身体の有害細胞を制限する、または身体から有害細胞を除去するために毒性作用を介して働くものが挙げられる。それらは内在免疫原として働いて体液性応答または細胞応答、あるいはその双方を誘発する免疫付与ポリペプチドであってもよい。ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの例としては、酵素、ホルモン、サイトカイン、膜受容体、構造ポリペプチド、輸送ポリペプチド、アドヘシン、リガンド、転写因子、輸送因子、複製因子、安定性因子、抗体、より具体的にはＣＦＴＲ、ジストロフィン、VIII因子またはIX因子、ＨＰＶ由来のＥ６またはＥ７、ＭＵＣ１、ＢＲＣＡ１、インターフェロン、インターロイキン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子））、１型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）由来ｔｋ遺伝子、ｐ５３またはＶＥＧＦがある。このポリヌクレオチドはまた抗体をコードすることもできる。これに関して、抗体はいずれのクラスの全免疫グロブリン、キメラ抗体、および二重または多重抗原またはエピトープ特異性を有するハイブリッド抗体、ならびにＦ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂなどのフラグメント（ハイブリッドフラグメントおよび抗イディオタイプを含む）を包含する（米国特許第４，６９９，８８０号）。
【００３２】
さらに好ましい形態では、組成物はクロロキン、プロトン性化合物（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロール、エタノール、１−メチルＬ−２ピロリドンまたはその誘導体など）、非プロトン性化合物（ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エチルスルホキシド、ジ−ｎ−プロピルスルホキシド、ジメチルスルホン、スルホラン、ジメチル−ホルムアミド、ジメチルアセトアミド、テトラメチル尿素、アセトニトリルまたは誘導体など）からなる群から選択される少なくとも一種の成分をさらに含んでなる。該組成物はまた、サイトカイン（特にインターロイキン−１０（ＩＬ−１０））、Ｍｇ２＋、Ｌｉ＋、および例えばアクチンＧなどのヌクレアーゼ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一種の成分を含んでなることもできる。
【００３３】
もう一つの好ましい形態では、本発明の使用に従って製造される組成物は、ヒトまたは動物の治療的処置のための方法において使用できる。この特定の場合においては、組成物はまた医薬上好適な注射用担体または希釈剤を含んでもよい（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed. 1980, Mack Publishing Co参照）。担体または希釈剤は好ましくは等張、低張、またはやや高張であり、スクロース溶液によって提供されるものなど、比較的低いイオン強度を有する。また、それは滅菌パイロジェンフリー水、分散媒、コーティング剤、および同等のもの、または希釈剤（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸、リン酸）、乳化剤、安定剤もしくはアジュバントを含む適切な溶媒、水性または部分水性液体担体を含んでよい。この医薬製剤のｐＨは適宜調整し、in vivo適用に有用とするために緩衝させる。これは液剤として調製してもよいし、あるいは投与前に溶液に懸濁させる固体状（例えば凍結乾燥状）として調製してもよい。
【００３４】
もう一つの態様では、本発明はまた、ポリヌクレオチドを細胞へ導入する方法に関する。この方法は、該細胞を、ポリヌクレオチドと接触させる前、接触させると同時、または接触させた後に、本発明の使用に従って製造された組成物と接触させることを含んでなる。この方法は、in vivoで動物の細胞へ該組成物を直接投与することによって適用されてもよい。本発明の実施によれば、標的化された「細胞」および「in vivo投与経路」は上記のように定義される。「標的化された細胞」（targeted cells）とは、ポリヌクレオチドの取り込みおよび発現が起こる細胞であり、それらは必ずしも注射された組織（投与部位）に存在しなくてもよい。ある特定の態様では、投与は血管へ行い、ポリヌクレオチドのトランスフェクションまたは感染は、例えば肺、筋肉、肝臓、腎臓、心臓などのような器官または組織の近位または遠位部位で起こる。
【００３５】
動物は皮膚からの直接注射によって便宜に接触できる比較的大きな筋肉塊を持っているので、いくつかの治療適用においてはポリヌクレオチドの送達および発現のための部位としては、好ましくは筋肉が用いられる。よって、一つの好ましい場合では、本発明は、ポリヌクレオチド、好ましくは裸の形態のものをin vivoで筋細胞へ導入する方法に関し、本方法は、少なくとも一種のポリヌクレオチドとリゾ脂質を、in vivoにおいて好ましくは筋肉内投与し、それによりポリヌクレオチドが組織の筋細胞へ直接投与されるか、または、血管内投与し、それによりポリヌクレオチドが輸入および／または輸出筋肉血管へ投与される工程を含んでなる。このポリヌクレオチドは筋細胞によって発現され接触工程の後に最終的に血流中へ分泌されて脊椎動物に治療法を提供する治療ポリペプチドをコードし得る。同様に、これは接触工程の後に筋細胞により発現され、免疫応答を生起し、それにより脊椎動物を免疫化する免疫ポリペプチドをコードし得る。本発明の一つの重要な態様は筋ジストロフィーの治療のための方法であって、ここでは該ポリヌクレオチドは機能し得るようにジストロフィンをコードする。好ましくは該組成物は筋肉組織へ直接投与される。
【００３６】
もう一つの好ましい実施形態によれば、治療する症状が癌である場合、ポリヌクレオチドの送達および発現部位としては腫瘍が用いられる。よって、ある好ましい場合では、本発明は、ポリヌクレオチド、好ましくは裸の形態のものをin vivoで腫瘍細胞へ導入するための方法に関し、本方法は少なくとも一種のポリヌクレオチドとリゾ脂質をin vivoにおいて好ましくは腫瘍内投与し、それによりポリヌクレオチドが腫瘍細胞へ直接投与されるか、あるいは、血管内投与し、それによりポリヌクレオチドが輸入および／または輸出腫瘍血管へ投与される。
【００３７】
最後に、本発明はin vitro（またはex vivo、上記参照）またはin vivoのいずれかでポリヌクレオチドの細胞への導入を向上させるためのリゾ脂質の使用に関する。
【００３８】
本発明を例示的に記載してきたが、用いてきた用語は限定ではなく記載の言葉の本質を意図するものであると理解される。明らかに上記の技術を鑑みて本発明の多くの変形や変更が可能である。よって、クレームの範囲内で本発明は具体的に記載されているもの以外でも実施し得ると理解される。
【００３９】
上記に挙げた特許、刊行物およびデータベースの収録内容の開示は総て、そのような個々の特許、刊行物または収録物を各々引用することにより具体的に個々に示する場合と同様にして、それらの全開示内容を引用することにより具体的に本明細書の一部とされる。
【実施例】
【００４０】
材料および方法
実施例においては以下の材料および方法を用いる。
【００４１】
１．プラスミド／ＨＰＣ組成物の腫瘍内投与
プラスミドＤＮＡ（ｐＴＧ１１２３６：ＣＭＶプロモーター、β−グロビンイントロン、ルシフェラーゼカセット、５７３９塩基対）をBischoff et al., Analytical Biochemistry254 (1997), 69-81に従って調製した。
【００４２】
ＲＥＮＣＡまたはＰ８１５細胞を８週齢の雌Ｂ６Ｄ２マウスの皮下に注射した（３．１０５細胞／動物）。細胞を注射して１１日後、触知可能な腫瘍が現れる。腫瘍内注射に先立ち、ＨＰＣをプラスミドＤＮＡ調製物と混合した。その後、種々の量のプラスミドおよびＨＰＣを３回腫瘍に直接注射した（次の注射までに３日の間隔をおいた）。
【００４３】
２．腫瘍生検およびルシフェラーゼの測定
組成物を注射して２４時間後、マウスを殺し、腫瘍を取り出し、冷凍した。
通常の測定キット(Luciferase Assay System, Promega）を用いて全腫瘍抽出物に対してルシフェラーゼ活性を定量した。要するに、腫瘍を２００μｌのリポーター溶解バッファー(Promega)に希釈した。１０μｌのサンプルを９６ウェルプレートに入れ、基質１００μｌと混合した。ルシフェラーゼ活性はＰＬＵ放出数／分／タンパク質ｍｇとして表した。
【００４４】
３．タンパク質の測定
ＶＣＡタンパク質アッセイキット(Pierce)を用い、１０μｌのサンプルに対してタンパク質を測定した。
得られた結果を図１および２に示す。これらは、ＨＰＣが注射された腫瘍のルシフェラーゼ活性に対して積極的な影響を有することを示している。ルシフェラーゼ活性は０．４または２ｍｇ／ｍｌのＨＰＣの存在下で注射された腫瘍でより高かった。  
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】ルシフェラーゼプラスミド（ｐＴＧ１１２３６）のＲＥＮＣＡ細胞への腫瘍内導入に対するヘキサデシルホスホコリン（ＨＰＣ）の作用を示す。バーはＲＬＵ／分／タンパク質ｍｇの平均値である。０．４、２または１０μｇのプラスミドと２ｍｇ／ｍｌのＨＰＣを含んでなる組成物５０μｇをＢ６Ｄ２マウスへ最後に注入して２４時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。
【図２】ルシフェラーゼプラスミド（ｐＴＧ１１２３６）のＰ８１５細胞への腫瘍内導入に対するＨＰＣの作用を示す。バーはＲＬＵ／分／タンパク質ｍｇの平均値である。１０μｇのプラスミドと０．４ｍｇ／ｍｌのＨＰＣを含んでなる組成物５０μｇをＢ６Ｄ２マウスへ最後に注入して２４時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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