(57)【要約】前から存在する神経損傷を有する被験体を治療するための組成物及び方法が開示される。前記組成物及び方法は、パーキンソン病等の神経変性状態の被験体の患者にグリア細胞株由来神経栄養因子（GDNF）を送達するアデノ随伴ウイルス（AAV)に基づく遺伝子送達系を用いる。
2005501127.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロモーターを含む発現制御エレメントに作動可能に連結されたグリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有した組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ビリオンを含有した組成物を、被験体の中枢神経系に、投与することによる、前から存在する神経損傷を持つ哺乳動物被験体の治療のための、該組成物の使用。
【請求項２】
被験体が、ヒトである、請求項1記載の使用。
【請求項３】
前から存在する神経損傷が、中度から広範な黒質線条体ドーパミン作動性（DA）脱神経を含有する、請求項１又は２のいずれかに記載の使用。
【請求項４】
ポリヌクレオチドが、ＧＤＮＦポリペプチドをコードする配列ととともに、５'位及びリーディングフレームに分泌配列をさらに含有する、請求項１〜３いずれかに記載の使用。
【請求項５】
ポリヌクレオチドが、ヒトＧＤＮＦをコードする、請求項１〜４いずれかに記載の使用。
【請求項６】
ポリヌクレオチドが、ヒトプレ−プロ−ＧＤＮＦをコードする、請求項５記載の使用。
【請求項７】
組成物を、被験体の線条体（Striatum）に投与する、請求項１〜６いずれかに記載の使用。
【請求項８】
プロモーターが、ウイルスのプロモーターである、請求項１〜７いずれかに記載の使用。
【請求項９】
プロモーターが、ＭＬＰプロモーター、ＣＭＶプロモーター又はＲＳＶ  ＬＴＲプロモーターである、請求項８記載の使用。
【請求項１０】
組換えＡＡＶビリオンを、被験体の線条体（Striatum）に投与する、請求項１〜９いずれかに記載の使用。
【請求項１１】
組換えＡＡＶビリオンが、コンベクションエンハンスドデリバリー（ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）（ＣＥＤ）を用いて、線条体（Striatum）に投与される、請求項１０記載の使用。
【請求項１２】
投与が、浸透圧ポンプで行なわれる、請求項１１記載の使用。
【請求項１３】
投与が、インフュージョンポンプで行なわれる、請求項１１記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、遺伝子送達のための組成物及び方法に関する。詳細には、本発明は、グリア細胞株由来神経栄養因子（GDNF）を送達して、パーキンソン病等の神経変性状態により引き起こされる既存の神経損傷を治療するためのアデノ随伴ウイルス（AAV）に基づく遺伝子送達系に関する。
【背景技術】
【０００２】
中枢神経系（CNS）障害は、大きな公衆衛生上の問題をもたらす。パーキンソン病（PD）単独でも、米国において100万人を超える人々に影響を与える。臨床上、PDは、自発運動の低下、歩行困難、姿勢不安定、硬直及び振せんにより特徴付けられる。PDは、黒質（SN）のドーパミン作動性（DA）ニューロンに主に影響する進行性の神経変性障害である。現在、多くのCNS障害が、治療剤の全身投与により治療される。しかし、全身投与は、薬物が血液脳関門を通過できないため、しばしば非効率的である。これらの化合物が、血液脳関門を浸透するのに成功しても、それらの化合物は、中枢神経系の副作用を誘発するであろう。したがって、タンパク質等の多くの潜在的に有用な化合物が、全身投与され得ない。
【０００３】
現在、利用可能なPDの治療は、線条体（striatum）においてドーパミンを置換して、運動機能を回復することを目的とする。しかし、進行中の神経変性プロセスをブロック又は遅らせる治療介入を開発することが必須である〔ダネット（Dunnett）ら、Nature（1999）399：A32〜39〕。グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF）は、DAニューロンについて、現在までに発見された最も強力な神経栄養因子であり、インビトロ及びインビボの両方でDAニューロンの生存を増すことが示されている〔ビョークランド（Bjorklund）ら、Brain Res．（2000）886：82〜98；ボーン（Bohn，M．C．），Mol．Ther．（2000）1:494〜496；オザワ（Ozawa）ら、J．Neural Transm．Suppl．（2000）58：181〜191〕。しかし、中枢神経系へのGDNFタンパク質の投与は、問題がある。GDNFは、ごく短時間しか活性を保持せず、その相対的に大きいサイズのため、GDNFは、血液脳関門を通過せず、脳への直接の投与が唯一の実現性のある送達手段となっている。これは、GDNFの脳への定位的な注射又は脳室内（ICV）送達が、必要になり、その治療的有用性を厳しく制限する。したがって、直接のインビボの遺伝子導入は、GDNF送達のより有効な方法を提供する。
【０００４】
アデノ随伴ウイルス（AAV）を用いて、遺伝子治療のための遺伝子を送達することに成功している。AAVゲノムは、約4681ヌクレオチドを含む線状一本鎖DNA分子である。AAVゲノムは、一般に、各々の末端に逆方向末端反復（ITR）が隣接した内部非反復ゲノムを含有する。当該ITRは、約145塩基対（bp）長である。前記ITRは、当該機能としては、DNAの複製起点としての機能及びウイルスゲノムのパッケージングシグナルとしての機能等の多様な機能を有する。ゲノムの内部非反復部分は、AAV複製（rep）遺伝子及びキャプシド（cap）遺伝子として公知の、2つの大きいオープンリーディングフレームを含む。前記rep遺伝子及びcap遺伝子は、ウイルスの複製及びビリオンへのパッケージングを可能にするウイルスタンパク質をコードする。詳細には、少なくとも4つのウイルスタンパク質のファミリーが、AAV rep領域、見かけの分子量による命名で、Rep 78、Rep 68、Rep 52及びRep 40から発現される。前記AAV cap領域は、少なくとも3つのタンパク質であるVPI、VP2及びVP3をコードする。
【０００５】
AAVは、AAVゲノムの内部非反復部分（すなわち、rep遺伝子及びcap遺伝子）を欠失すること及びITRの間に異種遺伝子を挿入することにより、目的の遺伝子を送達するように遺伝子操作されている。前記異種遺伝子は一般的には、適切な条件下で、患者の標的細胞における遺伝子発現を支配し得る異種プロモーター（構成的プロモーター、細胞特異的プロモーター又は誘導性プロモーター）に機能的に連結される。また、ポリアデニル化部位等の終止シグナルが含まれうる。
【０００６】
AAVは、ヘルパー依存性ウイルスである；すなわち、AAVビリオンを形成するために、ヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス又はワクシニア）との共感染を必要とする。ヘルパーウイルスとの共感染がなければ、AAVは、ウイルスゲノムを宿主細胞染色体に挿入するが、感染ビリオンは生成されない潜伏状態を確立する。その後に生じるヘルパーウイルスによる感染は、組み込まれたゲノムを「レスキュー」して、そのゲノムを複製して感染性AAVビリオンへパッケージングすることを可能にする。AAVは、異なる種由来の細胞に感染し得るが、ヘルパーウイルスは、宿主細胞と同じ種のものでなければならない。したがって、例えば、ヒトAAVは、イヌのアデノウイルスに共感染されたイヌの細胞において複製する。
【０００７】
AAV、アデノウイルス（Ad）ベクターに基づく系又はレンチウイルスベクターに基づく系を用いるGDNF遺伝子の送達は、PDのげっ歯類及び霊長類のモデルにおいて、神経毒の注入前又は直後に投与された場合、黒質DAニューロンを保護し、黒質線条体経路を再生することが研究により示されている〔チョイ−ランドバーグ（Choi−Lundberg）ら、Science(1997)275：838〜841；マンデル（Mandel）ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1997）94：14083〜14088；ビラング−ビューエル（Bilang−Bieuel）ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1997）94：8818〜8823；チョイ−ランドバーグ（Choi−Lundberg）ら、Exp．Neurol．（1998）154:261〜275；マンデル（Mandel）ら、Exp．Neurol．（1999）160：205〜214；キリク（Kirik）ら、J．Neurosci（2000）20：4686〜4700；ベンザドウン（Bensadoun）ら、Exp．Neurol．（2000）164：15〜24；及びコルドバー（Kordower）ら、Science（2000）290：767〜773〕。しかし、GDNFが、損傷後、遅効投与される場合、損傷を免れた（sparing）DAニューロンは、極わずかであり、機能回復の程度は、おそらく、依然として生存しており、かつ黒質線条体の結合を維持しているDAニューロンの数を反映することが以前の研究により示されている〔キリク（Kirik）ら、J．Neurosci．（2000）20：4686〜4700；コナー（Connor）ら、Gene Therapy（1999）6：1936〜1951；ウィンクラー（Winkler）ら、J Neurosci．（1996）16：7206〜7215；ナツメ（Natsume）ら、Exp．Neurol．（2001）169：231〜238〕。したがって、変性プロセスの後期段階におけるAAVベクターに基づく系を介する慢性的に送達されたGDNF遺伝子の有効性は、以前には証明されていない。
【０００８】
PDは、進行性DA変性により特徴付けられる障害であり、かなりの数のDAニューロンが明らかな症状の発現の前に消失している。したがって、遅らせた様式で送達されたGDNF遺伝子が、すでに存在する広範な黒質線条体DA脱神経をもつ動物モデルにおいて、DAニューロンをレスキューし、かつ行動能力を改善し得るか否かに取り組むことが、臨床上、より重要である。さらに、ベクター由来のGDNFが、SN中で軸索末端からDAニューロンの細胞体に逆行性に輸送されうるか否かは明らかではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
発明の要旨
当該分野において、前から存在する（preexsiting）神経損傷を治療するためにGDNFを送達する別の手段が必要である。本発明は、広範な黒質線条体ドーパミン作動性（DA）脱神経の被験体に対するAAVベクター介在のGDNF遺伝子送達が、黒質（SA）におけるDAニューロンの生存を促進し、チロシンヒドロキシラーゼ（TH）陽性DA線維の密度を増大させ、変性プロセスが開始した後でさえ、行動及び生化学的な欠陥を回復させるという発見に基づく。さらに、導入遺伝子由来GDNFは、SNにおいて線条体からDA細胞体へ逆行性に輸送されるが、かなりの数のDA細胞が消失した後でさえ、黒質線条体経路内の機能的な結合を維持する。
【００１０】
したがって、１つの実施態様において、本発明は、前から存在する神経損傷を有する哺乳動物被験体の治療方法に関する。本方法は、インビボで神経細胞におけるポリヌクレオチドの発現をもたらす条件下で、プロモーターを含む発現制御エレメントに作動可能に連結されたGDNFポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有した組換えAAVビリオンを、被験体の中枢神経系に投与し、治療効果を与えるステップを含む。
【００１１】
特定の実施態様において、前から存在する神経損傷は、中度の又は広範な黒質線条体ドーパミン作動性（DA）脱神経を含む。
【００１２】
さらなる実施態様において、神経細胞は、インビボで形質導入され、組換えAAVビリオンが、被験体の黒質線条体に投与される。
【００１３】
なおさらなる実施態様において、組換えAAVビリオンは、コンベクションエンハンスドデリバリー（convection−enhanced delivery）（CED)を用いて線条体に投与される。
【００１４】
特定の実施態様において、当該被験体は、ヒトである。
【００１５】
なおさらなる実施態様において、本発明は、前から存在する神経損傷をもつ哺乳動物被験体の治療方法に関する。前から存在する神経損傷は、中度〜広範な黒質線条体DA脱神経を含有し、本方法は、インビボにおける神経細胞の形質導入及びインビボにおける形質導入された神経細胞によるポリヌクレオチドの発現をもたらす条件下で、プロモーターを含む発現制御エレメントに作動可能に連結されたGDNFポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有した組換えAAVビリオンを含有した組成物を、被験体の線条体に投与し、治療効果を与えるステップを含む。
【００１６】
さらに、組換えAAVビリオンは、CEDを用いて当該被験体の線条体に投与されてもよい。
【００１７】
なおさらなる実施態様において、本発明は、前から存在する神経損傷を有する哺乳動物被験体の治療方法に関する。前から存在する神経損傷は、中度〜広範な黒質線条体DA脱神経を含有し、当該方法は、インビボにおける神経細胞の形質導入及びインビボにおける当該形質導入された神経細胞による当該ポリヌクレオチドの発現をもたらす条件下で、プロモーターを含む発現制御エレメントに作動可能に連結されたGDNFポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有した組換えAAVビリオンを含む組成物を、CEDを用いて、被験体の線条体に投与し、治療効果を与えるステップを含む。
【００１８】
上記のいずれの方法においても、プロモーターは、MLPプロモーター、CMVプロモーター又はRSV LTRプロモーター等のウイルスプロモーターであってもよい。
【００１９】
CEDを用いる場合、当該投与ステップは、浸透圧ポンプ又はインフュージョンポンプを用いて行われてもよい。
【００２０】
前記方法のいずれにおいても、ポリヌクレオチドは、5’位置及びGDNFポリペプチドをコードする配列のリーディングフレームに、分泌配列をさらに含有してよい。さらに、前記ポリヌクレオチドは、ヒトプレ−プロ−GDNF（pre-pro-GDNF）等のヒトGDNFをコードしてもよい。
【００２１】
また、本発明は、プロモーターを含む発現制御エレメントに作動可能に連結されたGDNFポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有した組換えAAVビリオンを含有し、インビボにおける神経細胞の形質導入をもたらす条件下で、治療効果を与える、上記のような疾患又は障害をもつ哺乳動物被験体の治療のための組成物を提供する。本発明の組成物は、必要に応じて薬学的に許容されうるキャリアを含む、医薬組成物であってもよい。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
したがって、本発明は、以下を提供する：
１．  プロモーターを含む発現制御エレメントに作動可能に連結されたグリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有した組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ビリオンを含有した組成物を、被験体の中枢神経系に、投与することによる、前から存在する神経損傷を持つ哺乳動物被験体の治療のための、該組成物の使用。
２．  被験体が、ヒトである、前記1項記載の使用。
３．  前から存在する神経損傷が、中度から広範な黒質線条体ドーパミン作動性（DA）脱神経を含有する、前記１又は２項のいずれかに記載の使用。
４．  ポリヌクレオチドが、ＧＤＮＦポリペプチドをコードする配列ととともに、５’位及びリーディングフレームに分泌配列をさらに含有する、前記１〜３項いずれかに記載の使用。
５．  ポリヌクレオチドが、ヒトＧＤＮＦをコードする、前記１〜４項いずれかに記載の使用。
６．  ポリヌクレオチドが、ヒトプレ−プロ−ＧＤＮＦをコードする、前記項５記載の使用。
７．  組成物を、被験体の線条体に投与する、前記１〜６項いずれかに記載の使用。
８．  プロモーターが、ウイルスのプロモーターである、前記１〜７項いずれかに記載の使用。
９．  プロモーターが、ＭＬＰプロモーター、ＣＭＶプロモーター又はＲＳＶ  ＬＴＲプロモーターである、前記８項記載の使用。
１０．  組換えＡＡＶビリオンを、被験体の線条体に投与する、前記１〜９項いずれかに記載の使用。
１１．  組換えＡＡＶビリオンが、コンベクションエンハンスドデリバリー（ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）（ＣＥＤ）を用いて、線条体に投与される、前記１０項記載の使用。
１２．  投与が、浸透圧ポンプで行なわれる、前記１１項記載の使用。
１３．  投与が、インフュージョンポンプで行なわれる、前記１１項記載の使用。
本発明のこれら及び他の実施態様は、本明細書の開示を参照して、当業者には容易に行われる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明の実施は、他に示さない限り、当該分野の技術内の、ウイルス学、微生物学、分子生物学及び組換えDNAの技術の従来の方法を使用する。かかる技術は、文献中に十分に説明される。例えば、ザンブルーク（Sambrook）ら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual（現行版)；DNA Cloning：A Practical Approach，第I巻及び第II巻〔グローバー（D．Glover）編〕；Oligonucleotide Synthesis〔ガイト（N．Gait）編，現行版〕；Nucleic Acid Hybridization〔ヘイムス（B．Hames）及びヒギンズ（S．Higgins）編，現行版〕；Transcription and Translation〔ヘイムス（B．Hames）及びヒギンズ（S．Higgins）編，現行版〕；CRC Handbook of Parvoviruses，第l巻及び第II巻〔ティジッセン（P．Tijssen）編〕；Fundamental Virology，第2版，第I巻及び第II巻〔フィールズ（B．N．Fields）及びナイプ（D．M．Knipe）編〕;Freshney Culture of Animal Cells，A Manual of Basic Technique（Wiley−Liss，第3版)；並びにアウスベル（Ausubel）ら、（1991）Current Protocols in Molecular Biology（Wiley Interscience,NY)。
【００２４】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において用いる場合、単数形である、「a」、「an」及び「the」とは、内容が明確に他を示すのでない限り、複数の言及を含む。
【００２５】
A.定義
本発明を記載する際、以下の用語が使用され、以下に示されるように規定されることが意図される。
【００２６】
本明細書において用いられる「グリア細胞株由来神経栄養因子ポリペプチド」又は「GDNFポリペプチド」という用語は、任意の種々の公知のGDNFと実質的に相同であり、機能的に同等である、任意の起源の神経栄養因子をいう。3つの哺乳動物種について代表的なGDNFは、図11、12及び13に示される。ラットタンパク質（図12、配列番号：4）と、ヒトタンパク質（図11、配列番号：2）との間の相同性の程度は、約93％であり、全ての哺乳動物GDNFは、同様に高い程度の相同性を有する。かかるGDNFは、その生物学的に活性な型で、モノマー、ダイマー又は他のマルチマーとして存在してもよい。したがって、「GDNFポリペプチド（GDNF polypeptide）」という用語は、本明細書において用いる場合、活性なモノマーのGDNF、並びに活性なマルチマーのGDNF、活性なグリコシル化及び非グリコシル化型のGDNF及び当該分子の活性な切断型を包含する。
【００２７】
本明細書において用いられる「機能的に同等」とは、神経栄養の特性の一部又は全てを保持するが、必ずしもネイティブなGDNF分子と同程度である必要はないGDNFポリペプチドを意味する。
【００２８】
「相同性」とは、2つのポリヌクレオチド部分の間又は2つのポリペプチド部分の間の類似性パーセントをいう。配列が、分子の一定の長さにわたって、少なくとも約50%、好ましくは少なくとも約75%、より好ましくは少なくとも約80%〜85%、好ましくは少なくとも約90%、最も好ましくは少なくとも約95%〜99%又はそれ以上の配列類似性又は配列同一性を示す場合、2つのポリヌクレオチド又は2つのポリペプチド配列は、お互いに「実質的に相同」である。また、本明細書において用いられる、実質的に相同とは、特定のポリヌクレオチドの配列又はポリペプチドの配列に対して完全な同一性を示す配列をいう。
【００２９】
一般的に、「同一性」とは、2つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列のそれぞれ、正確なヌクレオチド対ヌクレオチドの対応又はアミノ酸対アミノ酸の対応をいう。同一性パーセントとは、配列を整列すること、２つの整列された配列の間の適合（マッチング）の正確な数をカウントすること、より短い配列の長さで割ること及び当該結果に100を乗ずることにより、2つの分子の間の配列情報の直接比較により決定されうる。
【００３０】
ペプチド解析についての、スミス（Smith）及びウォーターマン（Waterman）（Advances in Appl．Math．2：482〜489,1981）の局所相同性アルゴリズムに適合するALIGN〔デイホフ（Dayhoff，M．O．）、Atlas of Protein Sequence and Structure デイホフ（M．O．Dayhoff）編，5 Suppl．3：353〜358，National biomedical Research Foundation，Washington，DC）等の容易に利用可能なコンピュータープログラムを用いて、類似性及び同一性の解析を補助することができる。塩基配列の類似性及び同一性を決定するためのプログラムは、スミス（Smith）及びウォーターマン（Waterman）のアルゴリズムによるWisconsin Sequence Analysis Package，version 8（Genetics Computer Group，Madison，WIから入手可能）  例えば、BESTFIT、FASTA及びGAPプログラムにおいて利用可能である。これらのプログラムは、製造業者により推奨され、かつ上記のWisconsin Sequence Analysis Packageに記載されるデフォルトパラメーターを用いて容易に利用される。例えば、対照配列に対する特定の塩基配列の類似性パーセントは、スミス（Smith）及びウォーターマン（Waterman）の相同性アルゴリズムを用いて、6つのヌクレオチド位置のデフォールトスコアリングテーブル及びギャップペナルティーにより決定されうる。
【００３１】
本発明の状況におけるパーセント類似性を確立する別の方法は、エジンバラ大学に著作権があり、コリンズ（John F．Collins）及びスタロック（Shane S．Sturrok）により開発され、IntelliGenetics，Inc．（Mountain View，CA）により配布されたMPSRCHパッケージのプログラムを使用することである。この総合ソフトウェアのパッケージでは、Smith-Watermanアルゴリズムは、デフォルトパラメーターをスコアリングテーブルのために用いて（例えば、ギャップオープンペナルティーが12、ギャップ伸長ペナルティーが1、ギャップが6）使用される。作成されたデータから、「Match」値は、「配列類似性」を反映する。配列間の同一性パーセント又は類似性パーセントを算出するための他の適切なプログラムは、一般に、当該分野で公知であり、例えば、別のアラインメントプログラムは、デフォルトパラメーターで用いられるBLASTである。例えば、BLASTN及びBLASTPは、下記デフォルトパラメーター：遺伝子コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝60；expect＝10；Matrix＝BLOSUM62；Descriptions＝50配列；sort by＝HIGH SCORE；データベース＝non−redundant、GenBank＋EMBL＋DDBJ＋PDB＋GenBank CDS translations＋Swiss protein＋Spupdate＋PIRを用いて使用される。これらのプログラムの詳細は、下記インターネットアドレス：http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLASTで提供されうる。
【００３２】
あるいは、相同性は、相同性領域間に安定な二重鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションの後、一本鎖特異的ヌクレアーゼによる消化及び消化した断片のサイズ決定により決定されうる。実質的に相同なDNA配列は、例えば、特定の系について規定されるようにストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験において決定されてもよい。適切なハイブリダイゼーション条件を規定することは、当該分野の技術の範囲内である。例えば、ザンブルーク（Sambrook）ら、前出；DNA Cloning、前出；Nucleic Acid Hybridization、前出を参照のこと。
【００３３】
「GDNFバリアント」とは、対照GDNF分子の生物学的に活性な誘導体又はかかる誘導体の断片であって、本明細書に記載のアッセイにおける神経栄養活性等の所望の活性を保持するものを意味する。一般的に、「バリアント」の用語は、ネイティブなポリペプチド配列を有する化合物及び改変が、神経栄養活性を破壊しないものであれば、ネイティブな分子に対して、１以上のアミノ酸付加、置換（一般に自然に保存）及び／又は欠失を有する構造を有する化合物をいう。好ましくは、当該バリアントは、ネイティブな分子と同様の神経栄養活性を少なくとも有する。GDNFバリアントをコードするポリヌクレオチドを作製するための方法は、当該分野で公知であり、以下にさらに記載される。
【００３４】
GDNF欠失バリアントについて、欠失は、一般に、約1〜30残基、より一般には約1〜10残基、典型的には約1〜5連続する残基又は前述の範囲内の任意の整数の範囲である。N末端、C末端及び内部欠失が考えられる。欠失は、一般的には、最大の生物学的活性を保存するように、他のTGF-βスーパーファミリーのメンバーと低い相同性の領域に導入される。欠失は、代表的には、影響されたドメインにおけるGDNFタンパク質産物の三次構造、例えば、システイン架橋を保存するように選択される。欠失バリアントの非限定的な例としては、GDNFの1〜40のN末端アミノ酸を欠く切断型GDNFタンパク質産物又はGDNFのC末端残基を欠くバリアント又はそれらの組合せが挙げられる。
【００３５】
GDNF付加バリアントについては、アミノ酸配列付加としては、代表的には、1残基から100以上の残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲のN末端及び／又はC末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の内部付加が挙げられる。内部付加は、一般に、約1〜10残基、より典型的には、約1〜5残基、通常約1〜3アミノ酸残基又は前述の範囲内の任意の整数の範囲である。N末端付加バリアントの例としては、GDNFのN末端に対する異種N末端シグナル配列の融合、並びに他の神経栄養因子の配列に由来するアミノ酸配列の融合が挙げられる。
【００３６】
GDNF置換バリアントは、GDNFアミノ酸配列の少なくとも1アミノ酸残基が除去され、その位置に挿入された異なる残基を有する。かかる置換バリアントとしては、アミノ酸変化を生じてもよく、生じなくてもよい種集団で自然に生じる塩基配列の変化により特徴付けられる対立遺伝子バリアントが挙げられる。特に好ましい置換は、自然に保存的置換、すなわち、それらの側鎖に関連するアミノ酸のファミリー内で生じるこれらの置換である。詳細には、アミノ酸は、一般に4つのファミリー：（1）酸性−アスパラギン酸及びグルタミン酸；（2）塩基性−リジン、アルギニン、ヒスチジン；（3）非極性−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；及び（4）非荷電極性−グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは、時に、芳香族アミノ酸として分類される。例えば、イソロイシン又はバリンによる、ロイシンの散発的な（isolated）置換、グルタミン酸によるアスパラギン酸の置換、セリンによるスレオニンの置換又は構造的に関連したアミノ酸によるアミノ酸の同様の保存的置換は、生物学的活性に大きな影響を有さないであろうことが合理的に予測できる。
【００３７】
例えば、GDNF分子は、当該分子の所望の機能がインタクトで維持されるものであれば、約5〜10までの保存的若しくは非保存的アミノ酸置換又は約15〜25までの保存的若しくは非保存的アミノ酸置換又は5〜25の間の任意の整数を含んでもよい。当業者は、当該分野で周知の技術を用いて、変化に耐え得る目的の分子の領域を容易に決定することができる。
【００３８】
GDNFアミノ酸配列の特定の変異は、グリコシル化部位（例えば、セリン、スレオニン又はアスパラギン）に対する改変を含んでもよい。グリコシル化がないこと又は部分的でしかないグリコシル化は、任意のアスパラギン結合型グリコシル化認識部位で又はＯ結合炭水化物の付加により改変される分子の任意の部位において、アミノ酸の置換又は欠失が生じる。アスパラギン結合型グリコシル化認識部位は、適切な細胞のグリコシル化酵素により特異的に認識されるトリペプチド配列を含む。これらのトリペプチド配列は、Asn−Xaa−Thr又はAsn−Xaa−Serのいずれかであり、ここでXaaは、Pro以外の任意のアミノ酸であり得る。グリコシル化認識部位の１位又は３位のアミノ酸位置の一方又は両方における種々のアミノ酸置換又は欠失（及び／又は２位のアミノ酸欠失）は、改変されたトリペプチド配列における非グリコシル化をもたらす。したがって、適切に改変された塩基配列の発現は、その部位でグリコシル化されていないバリアントを生じる。あるいは、GDNFアミノ酸配列は、グリコシル化部位を付加するように改変されてもよい。
【００３９】
変異誘発についてGDNFのアミノ酸残基又は領域の同定方法は、当該分野で周知である。かかる方法の1つは、「アラニンスキャニング変異誘発」として公知である。例えば、クニンガム（Cunningham）及びウェルズ（Wells），Science（1989）244：1081〜1085を参照のこと。この方法において、標的残基の1つのアミノ酸残基又はアミノ酸群が、同定され（例えば、Arg、Asp、His、Lys及びGlu等の荷電残基）、中性アミノ酸又は負荷電アミノ酸（最も好ましくは、アラニン又はポリアラニン）により置換されて、当該アミノ酸と、細胞の内外の周囲の水性環境との相互作用に影響する。置換に対する機能的な感受性を示すドメインは、置換の部位で、さらなる残基又は別の残基を導入することにより正確にされる。したがって、アミノ酸配列のバリエーションを導入するための標的部位を決定し、アラニンスキャニング又はランダム変異誘発を、DNA配列の対応する標的コドン又は領域で行ない、発現されたGDNFバリアントを、所望の活性及び活性の程度の最適の組合せについてスクリーニングする。
【００４０】
変異誘発について最も興味深い部位としては、種々の種由来のGDNFタンパク質において見出されるアミノ酸が、側鎖のバルク、電荷及び／又は疎水性に関して実質的に異なる部位が挙げられる。目的の他の部位は、種々の種から得られたGDNF様タンパク質の特定の残基が同一である部位である。かかる位置は、一般に、タンパク質の生物学的活性について重要である。はじめは、これらの部位は、比較的保存的な様式で置換される。かかる置換が、生物学的活性の変化を生じれば、より実質的な変化（典型的な置換）が導入され、／又は他の付加若しくは欠失が作製され得、得られた産物が、活性についてスクリーニングされる。
【００４１】
GDNF活性についてのアッセイは、当該分野で公知であり、中脳ニューロンの培養物中におけるドーパミン取り込みを増大する能力及び交感神経神経節ニューロンの生存を増大する能力を含む。例えば、米国特許第6,362，319号明細書を参照のこと。
【００４２】
「パーキンソン病様の症状」としては、パーキンソン病又は他の神経変性疾患に一般に関連する、筋肉の振せん、筋衰弱、硬直、運動緩徐（動作緩慢）、姿勢及び平衡の変化、痴呆（dimentia）及び同様の症状が挙げられる。
【００４３】
「ベクター」とは、適切な制御エレメントと関連づけられた場合、複製し得、細胞間で遺伝子配列を伝達しうる、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオン等の任意の遺伝子エレメントを意味する。したがって、前記用語は、クローニングビヒクル及び発現ビヒクル、並びにウイルスベクターを包含する。
【００４４】
「AAVベクター」とは、AAV−1、AAV−2、AAV−3、AAV−4、AAV−5、AAV−6、AAV−7及びAAV−8等、限定はされず、アデノ随伴ウイルス抗原型由来のベクターを意味する。AAVベクターは、全体又は部分が欠失した1以上のAAV野生型遺伝子、好ましくは、rep遺伝子及び／又はcap遺伝子を有し得るが、機能的な隣接ITR配列を保持する。機能的なITR配列は、AAVビリオンのレスキュー、複製及びパッケージングに必要である。したがって、AAVベクターは、ウイルスの複製及びパッケージングのためのシス(cis)に必要とされる配列（例えば、機能的なITR）を少なくとも含むと、本明細書において規定される。ITRは、野生型塩基配列である必要はなく、当該配列が機能的なレスキュー、複製及びパッケージングを与えるものであれば、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失又は置換により改変されてもよい。
【００４５】
「AAVヘルパー機能」とは、発現して、生産的なAAV複製のためにトランス(trans)で順に機能するAAV遺伝子産物を与えることができるAAV由来コード配列をいう。したがって、AAVヘルパー機能は、主なAAVオープンリーディングフレーム（ORF）、rep及びcapの両方を含む。Rep発現産物は、多くの機能、とりわけ、AAVのDNA複製起点の認識、結合及びニック作製；DNAヘリカーゼ活性；並びにAAV（又は他の異種）プロモーターからの転写の調節等を有することが示されている。Cap発現産物は、必要なパッケージング機能を与える。AAVヘルパー機能がここで用いられ、AAVベクターから失われているAAV機能をトランスで補なう。
【００４６】
「AAVヘルパー構築物」とは、一般に、AAVベクターから欠失されたAAV機能を与える塩基配列を含み、目的の塩基配列の送達のための形質導入ベクターを作製するために用いられる核酸分子をいう。AAVへルパー構築物は、通常、AAVのrep遺伝子及び／又はcap遺伝子の一過性の発現を与えて、溶解性のAAV複製に必要である失われたAAV機能を補なうために用いられる；しかし、へルパー構築物は、AAV ITRを欠き、それ自体、複製することもパッケージングすることもできない。AAVヘルパー構築物は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルス又はビリオンの形態でありうる。Rep及びCap発現産物の両方をコードする通常用いられるプラスミドpAAV/Ad及びpIM29＋45等の多数のAAVヘルパー構築物が記載されている。例えば、サムルスキー（Samulski）ら、（1989）J．Virol．63：3822〜3828；及びマッカーティ（McCarty）ら、（1991)J．Virol．65：2936〜2945を参照のこと。Rep発現産物及び／又はCap発現産物をコードする、多数の他のベクターが記載されている。例えば、米国特許第5,139，941号明細書及び米国特許第6,376，237号明細書を参照のこと。
【００４７】
「アクセサリ機能」の用語は、AAVがその複製について依存する非AAV由来ウイルス機能及び／又は細胞機能をいう。したがって、この用語は、AAV遺伝子転写の活性化、段階特異的AAV mRNAスプライシング、AAV DNA複製、Cap発現産物の合成及びAAVキャプシドの構築に関与する部分等のAAV複製において必要であるタンパク質及びRNAと理解する。ウイルスに基づくアクセサリ機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス1型以外）、ワクシニアウイルス等の任意の公知のヘルパーウイルスに由来しうる。
【００４８】
「アクセサリ機能ベクター」の用語は、一般に、アクセサリ機能を与える塩基配列を含む核酸分子をいう。アクセサリ機能ベクターは、適切な宿主細胞中にトランスフェクトされ得、次に、宿主細胞におけるAAVビリオン産生を支持し得るものである。感染性ウイルス粒子は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス又はワクシニアウイルス粒子のように自然に存在するので、前記用語から明確に排除される。したがって、アクセサリ機能ベクターは、プラスミド、ファージ、トランスポゾン又はコスミドの形態でありうる。
【００４９】
詳細には、アデノウイルス遺伝子の完全な相補体は、アクセサリヘルパー機能に必要ではないことが示されている。詳細には、DNA複製及び後期遺伝子合成ができないアデノウイルス変異体は、AAV複製を許容することが示されている。イトウ（Ito）ら、（1970）J．Gen．Virol．9：243；イシバシ（Ishibashi）ら、（1971）Virology 45：317。同様に、E2B及びE3領域内の変異体は、AAV複製を支持することが示されており、E2B及びE3領域は、おそらく、アクセサリ機能の提供には関与しないことを示す。カーター（Carter）ら、（1983）Virology 126：505。しかし、E1領域に欠陥があるか又は欠失E4領域を有するアデノウイルスは、AAV複製を支持できない。したがって、E1A及びE4領域は、直接又は間接的に、AAV複製に必要であると考えられる。ラウリン（Laughlin）ら、（1982）J．Virol．41：868；ヤニク（Janik）ら、（1981）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 78：1925；カーター（Carter）ら、（1983）Virology 126：505。他の特徴付けられたAd変異体としては、:E1B〔ラウリン（Laughlin）ら、（1982）（前出）；Janikら、（1981）（前出）；オストローブ（Ostrove）ら、（1980）Virology 104：502）；E2A〔ハンダ（Handa）ら、(1975)J．Gen．Virol．29：239；シュトラウス（Strauss）ら、（1976）J．Virol．17：140；マイヤーズ（Myers）ら、(1980)J．Virol．35：665；ジェイ（Jay）ら、（1981）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 78：2927；マイヤーズ（Myers）ら、（1981）J．Biol．Chem．256:567)；E2B〔カーター（Carter），Adeno−Associated Virus Helper Functions，I CRC Handbook of Parvoviruses〔ティジッセン（P．Tijssen）編，1990〕〕；E3〔カーター（Carter）ら、（1983）、前出〕並びにE4〔カーター（Carter）ら、(1983)、前出；カーター（Carter）（1995）〕。 E1Bコード領域において変異を有するアデノウイルスにより提供されるアクセサリ機能の研究は、矛盾する結果を生じているが、サムルスキー（Samulski）ら、（1988）J．Virol．62：206〜210は、ElB55kは、最近、AAVビリオン産生に必要であり、ElB19kは必要でないことを報告した。また、国際公開第97／17458号パンフレット及びマツシタ（Matshushita）ら、（1998）Gene Therapy 5：938〜945は、種々のAd遺伝子をコードするアクセサリ機能ベクターを記載する。
【００５０】
特に好ましいアクセサリ機能ベクターは、アデノウイルスVA RNAコード領域、アデノウイルスE4 ORF6コード領域、アデノウイルスE2A 72kDコード領域、アデノウイルスE1Aコード領域及びインタクトなE1B55kコード領域を欠くアデノウイルスE1B領域を含有する。かかるベクターは、国際公開第01／83797号パンフレットに記載されている。
【００５１】
「効率的なrAAVビリオン産生を支持し得る」とは、アデノウイルスヘルパーウイルスによる宿主細胞の感染の際に得られうるレベルに実質的に等しいか又はそれより大きいレベルで、特定の宿主細胞において、rAAVビリオン産生を補なうに十分なアクセサリ機能を与える、アクセサリ機能ベクター又は系の能力を意味する。したがって、アクセサリ機能ベクター又は系が、効率的なrAAVビリオン産生を支持する能力は、当該アクセサリ機能ベクター又は系を用いて得られたrAAVビリオンの力価と、感染性アデノウイルスによる感染を用いて得られた力価とを比較することにより決定されうる。より詳細には、アクセサリ機能ベクター又は系は、同等な数の宿主細胞から得られたビリオンの量が、アデノウイルス感染を用いて得られた量よりも約200倍以下少ない、より好ましくは約100倍以下少ない、最も好ましくは、アデノウイルス感染を用いて得られた量に等しいか又はそれより大きい場合、感染性アデノウイルスを用いて得られた産生と実質的に同等又はそれより大きい効率的なrAAVビリオン産生を支持する。
【００５２】
「組換えウイルス」とは、例えば、粒子中への異種核酸構築物の付加又は挿入によって、遺伝的に改変されたウイルスを意味する。
【００５３】
「AAVビリオン」とは、野生型（wt）AAVウイルス粒子（AAVキャプシドタンパク質被覆と会合した線状一本鎖AAV核酸ゲノムを含有する）等の完全なウイルス粒子を意味する。これに関して、相補的なセンス鎖のいずれか、例えば、「センス」鎖又は「アンチセンス」鎖の一本鎖AAV核酸分子は、AAVビリオンのいずれか1つにパッケージングされ得、当該両方の鎖とも、等しく感染性である。
【００５４】
本明細書において、「組換えAAVビリオン」又は「rAAVビリオン」とは、AAVタンパク質シェルを含み、両側にAAV ITRが隣接する目的の異種塩基配列をキャプシド形成する感染性、複製欠陥ウイルスとして規定される。rAAVビリオンは、導入されたAAVベクター、AAVヘルパー機能及びアクセサリ機能を有する適切な宿主細胞中で生成される。この様式では、宿主細胞は、引き続く遺伝子送達のために、感染性組換えビリオン粒子中にAAVベクター（目的の組換え塩基配列を含む）をパッケージングするのに必要であるAAVポリペプチドをコードできるようにされる。
【００５５】
「トランスフェクション」という用語は、細胞による外来DNAの取り込みに用いられ、細胞は、外因性DNAが、細胞膜の内側へ導入された場合、「トランスフェクト」されたことになる。多数のトランスフェクション技術が一般に当該分野で公知である。例えば、グラハム（Graham）ら、（1973） Virology,52：456，ザンブルーク（Sambrook）ら、（1989） Molecular Cloning，a laboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratories，New York， デイビス（Davis）ら、（1986）Basic Methods in Molecular Biology，Elsevier，及びチュ（Chu）ら、（1981）Gene 13：197を参照のこと。かかる技術は、ヌクレオチド組み込みベクター及び他の核酸分子等の1又はそれ以上の外因性DNA部分を適切な宿主細胞中に導入するために用いられ得る。
【００５６】
「宿主細胞」の用語は、AAVヘルパー構築物、AAVベクタープラスミド、アクセサリ機能ベクター又は他のトランスファーDNAのレシピエントとして用いられ得るか又は用いられている、例えば、微生物、酵母細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞を意味する。当該用語は、トランスフェクトされている元の細胞の子孫を含む。したがって、「宿主細胞」とは、本明細書において用いる場合、一般に、外因性DNA配列によりトランスフェクトされた細胞をいう。単一の親細胞の子孫は、自然変異、偶発的変異又は意図的な変異により、元の親と、形態的に又はゲノム若しくは全てのDNA相補体が完全に同一である必要はないであろう。
【００５７】
本明細書において用いる場合、「細胞株（cell line）」という用語は、インビトロにおける連続的な又は長期の増殖及び分裂が可能である細胞の集団をいう。しばしば、細胞株は、単一の前駆細胞に由来するクローン集団である。さらに、自然な変化又は誘導された変化が、かかるクローン集団の貯蔵又は移動の間に核型において生じ得ることは当該分野において公知である。したがって、当該細胞株由来の細胞は、祖先の細胞又は培養物に正確に同一でなくてもよく、細胞株は、かかるバリアントを含むとされる。
【００５８】
「異種」の用語は、コード配列、制御配列等の核酸配列に関して、普通では一緒に連結されない配列及び／又は普通では特定の細胞と関連しない配列を意味する。したがって、核酸構築物又はベクターの「異種」領域は、自然では、他の分子との関連が見出されない別の核酸分子内の核酸のセグメント又は別の核酸分子に結合された、核酸のセグメントである。例えば、核酸構築物の異種領域は、コード配列であって、当該コード配列との関連が自然には見出されない配列に隣接されるコード配列を含みうるであろう。異種コード配列の別の例は、コード配列自体が自然には見出されない構築物（例えば、ネイティブな遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）である。同様に、普通で細胞に存在しない構築物を用いて形質転換された細胞は、本発明の目的について異種であるとみなされる。対立遺伝子のバリエーション又は自然に存在する変異事象は、本明細書において用いられるように、異種DNAを生じない。
【００５９】
「コード配列」又は特定のタンパク質を「コードする」配列とは、適切な調節配列の制御下に配置された場合、インビトロ又はインビボで転写されて（DNAの場合）、ポリペプチドに翻訳される（mRNAの場合）核酸配列である。コード配列の境界は、5’（アミノ）末端の開始コドン及び3’（カルボキシ）末端の終止コドンにより決定される。コード配列としては、原核生物又は真核生物のmRNA由来のcDNA、限定されないが、原核生物又は真核生物のDNA由来のゲノムDNA配列及び合成DNA配列をも挙げることができる。転写終止配列は、通常、コード配列に対して3’側に位置する。
【００６０】
「核酸」配列とは、DNA配列又はRNA配列をいう。当該用語は、限定されないが、4−アセチルシトシン、8−ヒドロキシ−N6−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、プソイドイソシトシン、5−(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル、5−フルオロウラシル、5−ブロモウラシル、5−カルボキシメチルアミノメチル−2−チオウラシル、5カルボキシメチル−アミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、N6−イソペンテニルアデニン、1−メチルアデニン、1−メチルプソイドウラシル、1−メチルグアニン、1−メチルイノシン、2,2−ジメチルグアニン、2−メチルアデニン、2−メチルグアニン、3−メチルシトシン、5−メチルシトシン、N6−メチルアデニン、7−メチルグアニン、5−メチルアミノメチルウラシル、5−メトキシアミノメチル−2−チオウラシル、β−D−マンノシルキューオシン、5’−メトキシカルボニルメチルウラシル、5−メトキシウラシル、2−メチルチオ−N6−イソペンテニルアデニン、ウラシル−5−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−5−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、2−チオシトシン、5−メチル−2−チオウラシル、2−チオウラシル、4−チオウラシル、5−メチルウラシル、ウラシル−5−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−5−オキシ酢酸、プソイドウラシル、キューオシン、2−チオシトシン及び2、6−ジアミノプリン等のDNA及びRNAの任意の公知の塩基アナログを含む配列と理解する。
【００６１】
DNA「制御配列」という用語は、総称的に、プロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終止配列、上流調節ドメイン、複製起点、internal ribosome entry site（「IRES」）エンハンサー等をいい、これらは集合的に、レシピエント細胞におけるコード配列の複製、転写及び翻訳を与える。選択されたコード配列が、適切な宿主細胞中で複製、転写及び翻訳できるものであれば、これらの制御配列の全てが常に存在する必要はない。
【００６２】
「プロモーター」という用語は、本明細書において、その通常の意味で用いられ、RNAポリメラーゼと結合し、かつ下流（3’方向）コード配列の転写を開始しうる遺伝子から得られるDNA調節配列を含むヌクレオチド領域をいう。転写プロモーターとしては、「誘導プロモーター」（ここで、該プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドの配列の発現は、分析物、補因子、調節タンパク質等により誘導される）、「抑制プロモーター」（ここで、当該プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドの配列の発現は、分析物、補因子、調節タンパク質等により誘導される）及び「構成的プロモーター」を挙げることができる。
【００６３】
「作動可能に連結された」とは、記載された成分が、それの通常の機能を発揮するように形成されるエレメントの配列（arrangement）をいう。したがって、コード配列に作動可能に連結された制御配列は、コード配列の発現を発揮し得る。当該制御配列は、コード配列の発現を指向するように機能するものであれば、コード配列と連続的である必要はない。したがって、例えば、介在する、未翻訳だが、転写された配列は、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得、プロモーター配列は、コード配列に対して「作動可能に連結される」と依然としてみなすことができる。
【００６４】
「単離された（isolated）」とは、塩基配列をいう場合、示された分子が、同じタイプの他の生物学的高分子の実質的な非存在下で存在することを意味する。したがって、「特定のポリペプチドをコードする単離された核酸分子」とは、対象のポリペプチドをコードしない他の核酸分子を実質的に含まない核酸分子をいう；しかし、前記分子は、組成の基本的特徴に有害に影響しない、いくつかのさらなる塩基又は部分(moiety)を含んでもよい。
【００６５】
本出願を通して、特定の核酸分子における塩基配列の相対的位置を記載する目的のために、例えば、特定の塩基配列が、別の配列に対して、「上流」、「下流」、「3’」又は「5’」であると記載される場合、それは、当該分野で従来いわれているとおり、DNA分子の「センス」鎖又は「コード」鎖における配列の位置であることが理解されるべきである。
【００６６】
所定のAAVポリペプチドの「機能的ホモログ」又は「機能的同等物」としては、対照AAV分子と同様の方法で所望の結果を達成するように機能する組換え的に生成されるか又は化学的に合成されたポリペプチドのようなネイティブなポリペプチド配列由来の分子が挙げられる。したがって、AAV Rep68又はRep78の機能的ホモログは、組み込み活性が残るものであれば、これらのポリペプチドの誘導体及びアナログ（その内部又はアミノ末端若しくはカルボキシ末端に存在する、任意の単一又は複数のアミノ酸付加、置換及び／又は欠失を含む）を包含する。
【００６７】
所定のアデノウイルスヌクレオチド領域の「機能的なホモログ」又は「機能的同等物」としては、異種アデノウイルス抗原型由来の類似の領域、別のウイルス又は細胞供給源に由来するヌクレオチド領域、並びに対照ヌクレオチド領域と同様の様式で、所望の結果を達成するように機能する組換え的に生成されるか又は化学的に合成されたポリヌクレオチドが挙げられる。したがって、アデノウイルスVA RNA遺伝子領域又はアデノウイルスE2a遺伝子領域の機能的ホモログは、当該ホモログがバックグラウンドを超える検出可能なレベルでAAVビリオン産生を支持する固有のアクセサリ機能を与える能力を保持するものであれば、領域内に存在する、任意の１又は複数のヌクレオチド塩基の付加、置換及び／又は欠失を含むかかる遺伝子領域の誘導体及びアナログを包含する。
【００６８】
「コンベクションエンハンスドデリバリー（convection−enhanced delivery）」とは、薬剤のマニュアルでない送達をいう。本発明の状況において、AAVのコンベクションエンハンスドデリバリー（CED）は、インフュージョンポンプ又は浸透圧ポンプにより達成されうる。CEDのより詳細な記載は以下に見出される。
【００６９】
「中枢神経系」又は「CNS」という用語は、脊椎動物の脳及び脊髄の全ての細胞及び組織を含む。したがって、当該用語は、限定されないが、神経細胞、グリア細胞、星状細胞、脳脊髄液（CSF）、間質腔、骨、軟骨等を包含する。CNSの領域は、種々の行動及び／又は機能に関連している。例えば、脳の基底核は、運動機能、特に随意運動に関連している。基底核は、6対の核：尾状核、被殻、淡蒼球、側坐核、視床下核及び黒質から構成される。尾状核及び被殻は内包により隔てられるが、細胞構築上の化学的及び物理的特性を共有し、しばしば、線条体（corpus striatum）又は単に「線条体（striatum）」と呼ばれる。パーキンソン病患者で変性する黒質は、基底核への主要なドーパミン作動性インプットを提供する。
【００７０】
「被験体（subject）」、「個体」又は「患者」の用語は、本明細書において互換可能に用いられて、脊椎動物、好ましくは哺乳動物をいう。哺乳動物としては、限定されないが、マウス、サル、ヒト、家畜、競技用動物及びペットが挙げられる。
【００７１】
「有効量」とは、有利な又は所望の結果をもたらすために十分な量である。有効量は、1回以上の投与、適用又は投薬において投与されうる。
【００７２】
B．一般的方法
本発明は、AAVベクター介在GDNF遺伝子送達が、遅効様式で、ドーパミン作動性（DA）ニューロンの進行性の変性を逆転させ、機能的な黒質線条体経路を保持しているという驚くべき発見に基づく。詳細には、実施例に詳述されるように、適切なパーキンソン病動物モデルは、FLAGペプチド（AAV-GDNFflag）又はβガラクトシダーゼ（AAV-LacZ）でタグ化されたGDNFを発現するAAVベクターの注入を病変の線条体に受けた。FLAGの免疫染色は、黒質（SN）へのGDNFflagの逆行性輸送を示した。線条体におけるチロシンヒドロキシラーゼ（TH）陽性DA線維の密度及びTH陽性ニューロン又はコレラ毒素サブユニットB（CTB、ニューロントレーサー）で標識したニューロンのSNにおける数は、AAV-LacZ群においてよりもAAV-GDNFflag群において有意に多かった。線条体におけるドーパミンレベル及びその代謝物のレベルは、対照群に比べて、AAV−GDNFflag群において顕著に高かった。解剖学的変化及び生化学的変化と一致して、AAV-GDNFflag注入後に、有意な行動回復が観察された。これらのデータは、予期せぬことに、AAVに基づく送達系を用いるGDNF遺伝子の遅延型送達が、進行性変性の発現後でさえ、有効であることを示す。
【００７３】
したがって、本発明は、神経損傷が既に発生した後における神経変性疾患及び他の神経障害の治療方法を提供する。好ましい実施態様において、神経損傷は、パーキンソン病又は損傷されるか若しくは機能不全のドーパミン作動性神経細胞による。
【００７４】
したがって、本発明は、GDNFポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、限定されないが、パーキンソン病（PD）、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、てんかん、アルツハイマー病等の任意のいくつかの神経変性障害に罹患した患者に送達するために用いられ得る。さらに、本発明は、脳卒中における神経系の一部に対する血流の一時的若しくは持続的な停止による神経損傷又は癌化学療法剤であるタキソール、シスプラチン又はビンクリスチン及びAIDS化学療法剤であるddI又はddC等の神経毒に対する曝露による神経損傷に罹患した患者、並びに糖尿病又は腎機能不全等の慢性の代謝性疾患による神経損傷を被る患者に対してGDNFを送達することができる。
【００７５】
上記で説明したとおり、GDNFは、グリア細胞で同定されるか又はグリア細胞から得られてもよく、神経栄養活性を示すタンパク質である。より詳細には、GDNFは、黒質のドーパミン作動性ニューロンの胚性前駆体におけるドーパミン取り込みを増大する能力により、さらに副交感神経及び交感神経細胞の生存を促進する能力により、一部が特徴付けられるドーパミン作動性神経栄養タンパク質である。
【００７６】
GDNFは、ネイティブな形態でホモダイマーとして存在する約39kDのグリコシル化タンパク質である。GDNFは、最初は、プレ−プロ−GDNFポリペプチドとして翻訳され、シグナル配列及び当該分子の「プロ（pro）」部分のタンパク質分解プロセシングにより、結果として、成熟型のGDNFの生成をもたらす。ヒト及びげっ歯類において、単一の遺伝子が、選択的スプライシング型を生じる。例えば、米国特許第6,362，319号明細書を参照のこと。両方の形態とも、コンセンサスなシグナルペプチド配列及びタンパク質分解プロセシングのコンセンサス配列を含む。タンパク質分解切断は、同一の成熟の134アミノ酸残基型を生じる。したがって、本発明のAAVベクターでの用途のためのGDNFポリヌクレオチドは、これらの形態のいずれか又は両方をコードしてもよく、上記に規定されるような、全プレ−プロ−分子全体、プレ−分子、プロ−分子、成熟GDNFポリペプチド又はこれらの形態の生物学的に活性なバリアントをコードしてもよい。
【００７７】
多数のGDNFポリヌクレオチド及びアミノ酸配列が公知である。3つの代表的な哺乳動物GDNF配列が、本明細書において図11、12及び13に示される。詳細には、ヒトGDNFヌクレオチド及びアミノ酸配列は、図11（配列番号：1及び2）に示される。ラットGDNFヌクレオチド及びアミノ酸配列は、図12（配列番号：3及び4）に示され、マウスGDNFヌクレオチド及びアミノ酸配列は、図13（配列番号：6及び7）に示される。ラットタンパク質と、ヒトタンパク質との間の相同性の程度は、約93%であり、哺乳動物GDNFの全てが、同様の高い程度の相同性を有する。さらなるGDNFヌクレオチド及びアミノ酸配列が当該分野で公知である。例えば、以下を参照のこと：ラット及びヒトの配列については、米国特許第6,221，376号明細書及び米国特許第6,363，319号明細書、並びにリン（Lin）ら、Science（1993）260：1130〜1132、並びにヒトの配列については、NCBIアクセッション番号AY052832、AJ001896、AF053748、AF063586及びL19063；ラットの配列については、NCBIアクセッション番号AF184922、AF497634、X92495、NM019139；ジャイアントパンダの配列については、NCBIアクセッション番号AF516767；マウスの配列については、NCBIアクセッション番号XM122804、NM010275、D88351S1、D49921、U36449、U37459、U66195；トキ（Nipponia nippon）の配列については、NCBIアクセッション番号AF469665；アカゲザル（Macaca mulatta）の配列については、NCBIアクセッション番号AF106678；ゼブラフィッシュの配列については、NCBIアクセッション番号 NM131732及びAF329853を参照のこと。上記で説明したように、これらの任意の配列及びそれらのバリアント（例えば、これらの配列の実質的に相同であり、かつ機能的に同等な配列等）は、本発明の方法において用途を提供するであろう。
【００７８】
AAVから得られたGDNFポリヌクレオチドの有効性は、当該分野で公知の上記の疾患の任意の多数の動物モデルにおいて試験されうる。例えば、最も広範に用いられるパーキンソン病動物モデルは、通常、毒素の投与により、ドーパミン作動性ニューロンの神経変性を再現する。マウス又はラットの黒質への6−ヒドロキシドーパミン（6−OHDA）の片側の注入により、対側の半球におけるわずかな変化を伴って、同側性の線条体及び黒質緻密部におけるニューロンの消失をもたらす。同様に、メタンフェタミン誘導神経毒性は、ドーパミン作動性及びセロトニン作動性のニューロンの神経変性をもたらし、当業者により、ヒトとほぼ同様の状態と、当業者によりみなされる。治療剤の有効性は、アポモルフィン誘導性の回転行動を用いる行動結果により評価されうる。
【００７９】
別のパーキンソン病モデルは、神経毒であるN−メチル−4−フェニル−1,2,3,6，−テトラヒドロピリジン（MPTP）を用いて構築される。MPTPは、マウス、ラット及びサル等の哺乳動物に投与される。サルへのMPTPの投与は、黒質緻密部及び線条体におけるドーパミン作動性ニューロン及びセロトニン作動性ニューロンの損失だけでなく、ヒトパーキンソン病患者においてみられるのと同様の、アキネジア、硬直した姿勢等の行動の症候を生じさせる。例えば、米国特許第6,362，319号明細書を参照のこと。
【００８０】
パーキンソン病の上記動物モデルとは対照的に、ドーパミン作動性細胞数の漸進的な低下を示す、多数の近交系のマウスが利用可能である。例えば、行動特徴が、パーキンソン病に罹患した患者の行動特徴と似ているD2レセプター欠損マウスは、相同性組換えにより生成された。フィッツジェラルド（Fitzgerald）ら、（1993）Brain Res．608：247〜258。第二の例は、経時的に40％まで中脳のドーパミン作動性ニューロン数の漸進的な低下を示すウィーバー（weaver）変異体マウスである。ヴェリーナ（Verina）ら、（1997)  Exp．Brain Res．113：5−12；エーデルブレッヒトAdelbrechtら、（1996）Mol．Brain Res．43：291〜300；ミツモト（Mitsumoto）ら、（1994）Science 265：1107〜1110。
【００８１】
本実施例では、ザワー（Sauer）及びイェーテル（Oertel）の部分PDモデル（ザワー（Sauer）及びイェーテル（Oertel），Neuroscience（1994）59：401〜415）を用いた。本モデルでは、6−OHDAの線条体内注入が、障害後1〜2週間の間にはじまり、8〜16週間にわたって継続するDAニューロンの進行性逆行変性を誘導する。当該モデルでは、DAニューロンが継続的に消失していくので、内側前脳束を破壊することでDAニューロンのより急速な変性を生じる完全モデルよりも、治療研究用動物モデルとして、PDの疾患プロセスにより類似し、かつより適切でありうる。以下に詳述される実験において、ラットは、ベクター注入の前に一貫した行動の欠陥を示していた。アポモルフィン誘導回転の出現は、一般に、線条体のドーパミン含量の≧90％の枯渇を示すと仮定される〔ハドソン（Hudson）ら、Brain Res．（1993）626：167〜174〕。しかし、PD患者及び動物モデルでの研究により、示唆されたドーパミンのレベルよりも、生存するDAニューロンが多いであろうことが示された〔ヤボイ−アジド（Javoy-Agid）ら、Neuroscience（1990）38：245〜253;フェーンレイ（Fearnley）及びリーズ（Lees），Brain（1991）114：2283〜2301；シュルツァー（Schulzer）ら、Brain（1994)117：509〜516）。ここで用いられるモデルでは、SNの病変側のCTB陽性ニューロンの数は、病変後4週間で、対側の値の28.9％であった。これは、病変のSNにおいて28.8％（病変後35日）〔コズロウスキー（Kozlowski）ら、Exp．Neurol．（2000）166：1〜15）又は34%（病変後4週）〔ザワー（Sauer）及びイェーテル（Oertel），Neuroscience（1994）59：401〜415〕のFG−陽性細胞が示したフルオロ金（FG）−逆行性標識を用いる以前の研究と一致する。さらに、ほとんどのCTB−標識されたニューロンは、TH−陽性であり、黒質線条体投射部分が、AAVベクター注入の時点でインタクトなままであったことを示唆した。特定の理論により拘束されることはないが、インタクトな黒質線条体投射及びDAニューロンの残りの部分は、GDNF遺伝子送達後の再生及び機能回復のための基層（substrate）として働くであろう。
【００８２】
他の神経変性疾患の動物モデルが記載されており、PDに加えて、神経変性障害の治療におけるAAV送達GDNFポリヌクレオチドの治療有効性を評価するために有用である。例えば、マーチン（Martin）ら（1995）Brain Res．683：172〜178は、てんかんの動物モデルを記載しており、マテソン（Matheson）ら、（1997）NeuroReport 8：1739〜1742及びオッペンハイム（Oppenheim）ら、(1995）Nature 373：344〜346は、物理的外傷から生じる神経変性のモデルを記載しており、サゴット（Sagot）ら、（1996）J．Neurosci．16:2335〜2341は、動物における運動ニューロン変性のモデルを記載する。
【００８３】
GDNFコード配列を含有した組換えAAVビリオンは、以下により十分に記載される当該分野で認識される種々の技術を用いて作製されてもよい。野生型AAV及びヘルパーウイルスは、rAAVビリオンを生成するために必要な複製機能を与えるのに用いられてもよい（例えば、米国特許第5,139，941号明細書を参照のこと)。あるいは、ヘルパー機能遺伝子を含むプラスミドを、周知のヘルパーウイルスの1つによる感染と組合せて、複製機能の供給源として用いることができる（例えば、米国特許第5,622,856号明細書及び米国特許第5,139,941号明細書を参照のこと）。同様に、アクセサリ機能遺伝子を含むプラスミドを、野生型AAVによる感染と組合せて、必要な複製機能に用いられうる。これらの3つのアプローチは、rAAVベクターと組合せて用いられる場合、それぞれ、rAAVビリオンを生成するのに各々が、十分である。また、当該分野で周知の他のアプローチが当業者により使用されて、rAAVビリオンを生成し得る。
【００８４】
本発明の好ましい実施態様においては、3重トランスフェクション法（米国特許第6,001,650号明細書に詳細に記載される）は、感染性ヘルパーウイルスの使用が必要ではなく、いずれの検出可能なヘルパーウイルスも存在することなしに、rAAVビリオンが生成されることを可能にするため、rAAVビリオンを生成するのに用いられる。これは、３つのrAAVビリオン生成用ベクター：AAVヘルパー機能ベクター、アクセサリ機能ベクター及びrAAV発現ベクターの使用により達成される。しかし、当業者は、これらのベクターによりコードされた核酸配列が、種々の組合せで、2以上のベクターに提供されうることを、理解する。
【００８５】
本明細書において説明されるとおり、AAVヘルパー機能ベクターは、生産的なAAV複製及びキャプシド形成のためにトランスで機能する「AAVヘルパー機能」配列（すなわち、rep及びcap）をコードする。好ましくは、AAVヘルパー機能ベクターは、いかなる検出可能なwt AAVビリオン（すなわち、機能的なrep遺伝子及びcap遺伝子を含むAAVビリオン）をも生成することなく、効率的なAAVベクター生産を支持する。かかるベクターの例であるpHLP19は、米国特許第6,001,650号明細書に記載される。AAVヘルパー機能ベクターのrep遺伝子及びcap遺伝子は、上記で説明されるように、任意の公知のAAV抗原型から得られうる。例えば、AAVヘルパー機能ベクターは、AAV-2由来のrep遺伝子及びAAV-6由来のcap遺伝子を有してもよい；当業者は、明らかな特徴が、rAAVビリオン産生を支持する能力である他のrep遺伝子及びcap遺伝子の組合せが可能であることを認識するであろう。
【００８６】
アクセサリ機能ベクターは、非AAV由来ウイルス及び／又は複製のためにAAVが依存する細胞性機能（すなわち、「アクセサリ機能」）の塩基配列をコードする。前記アクセサリ機能としては、限定されないが、AAV遺伝子転写の活性化、段階特異的なAAV mRNAスプライシング、AAV DNA複製、cap発現産物の合成及びAAVキャプシドの構築に関与する部分を含むAAV複製のために必要な機能が挙げられる。ウイルスに基づくアクセサリ機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス1型以外）及びワクシニアウイルスのような任意の周知のヘルパーウイルスに由来し得る。好ましい実施態様において、アクセサリ機能プラスミドpLadeno5（pLadeno5に関する詳細は、米国特許第6,004,797号明細書に記載される）が用いられる。当該プラスミドは、AAVベクターの生成のためのアデノウイルスアクセサリ機能の完全なセットを提供するが、複製コンピテントなアデノウイルスを形成するのに必要な成分は欠く。
【００８７】
本発明のさらなる理解のために、組換えAAV発現ベクター、AAVヘルパー及びアクセサリ機能、AAVビリオンを含有した組成物、並びにビリオンの送達に関して、より詳細な考察を以下に提供する。
【００８８】
組換えAAV発現ベクター
公知の技術を用いて、組換えAAV（rAAV）発現ベクターを構築し、転写物の方向に作動可能に連結された成分として、転写開始領域を含む制御エレメント、目的のGDNFポリヌクレオチド及び転写終止領域を少なくとも提供する。当該制御エレメントは、哺乳動物の筋細胞において機能的であるように選択される。作動可能に連結された成分を含む得られた構築物を、機能的なAAV ITR配列と結合させる（5’及び3’）。
【００８９】
AAV ITR領域の塩基配列は公知である。例えば、AAV-2配列に関しては、コチン（Kotin,R.M.）（1994）Human Gene Therapy 5:793〜801;バーンズ（Berns,K.I.）「Parvoviridae and their Replication」Fundamental Virology，第2版〔フィールズ（B．N．Fields）及びナイプ（D．M．Knipe）編〕を参照のこと。本発明のベクターにおいて用いられるAAV ITRは、野生型塩基配列を有する必要はなく、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失又は置換により変更されてもよい。さらに、AAV ITRは、限定されないが、AAV−1、AAV−2、AAV−3、AAV−4、AAV−5、AAV−6、AAV−7及びAAV−8等の任意のいくつかのAAV抗原型に由来しうる。さらに、AAV発現ベクターにおける選択された塩基配列に隣接する5’及び3’ITRは、それらが意図されるように、すなわち、宿主細胞ゲノム又はベクターから目的の配列の切除及びレスキューを可能にし、AAV Rep遺伝子産物が当該細胞に存在する場合、レシピエント細胞ゲノムへのDNA分子の組み込みを可能にするように機能するものであれば、同じAAV抗原型又は単離物と同一である必要もなく、同じAAV抗原型又は単離物由来である必要もない。
【００９０】
AAVベクターにおける使用のための適切なGDNFポリヌクレオチド分子は、約5キロベース（kb）のサイズより小さいであろう。選択されたポリヌクレオチドの配列は、インビボにおいて被験体中でそれらの転写又は発現を指向する制御エレメントに作動可能に連結される。かかる制御エレメントは、選択された遺伝子と正常に関連づけられる制御配列を含み得る。あるいは、異種制御配列が使用されうる。有用な異種制御配列は、一般に、哺乳動物又はウイルスの遺伝子をコードする配列に由来する配列を含む。例としては、限定されないが、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター、GFAPプロモーター、SV40初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスLTRプロモーター；アデノウイルス主要後期プロモーター（Ad MLP）；単純ヘルペスウイルス（HSV）プロモーター、例えば、CMV最初期プロモーター領域（CMVIE）等のサイトメガロウイルス（CMV）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（RSV）プロモーター、合成プロモーター、ハイブリッドプロモーター等が挙げられる。さらに、マウスメタロチオネイン遺伝子等の非ウイルス遺伝子由来の配列がまた、本明細書において用途が提供されるであろう。かかるプロモーター配列は、例えば、Stratagene（San Diego，CA)から市販されている。
【００９１】
AAV ITRに結合された目的のGDNFポリヌクレオチド分子を保持するAAV発現ベクターは、選択された配列をAAVゲノムに直接挿入することにより構築され得、それから切り出された主要なAAVオープンリーディングフレーム（「ORF」）を有する。また、複製及びパッケージング機能を可能にするのに十分なITRの部分が残存するものであれば、AAVゲノムの他の部分は、欠失されてもよい。かかる構築物は、当該分野で周知の技術を用いて設計されうる。例えば、：米国特許第5,173,414号明細書及び米国特許第5,139,941号明細書；国際公開第92/01070号パンフレット（1992年1月23日公開）及び国際公開第93/03769号パンフレット（1993年3月4日公開）；レブコワスキー（Lebkowski）ら、(1988) Molec．Cell．Biol．8：3988〜3996；ヴィンセント（Vincent）ら、(1990) Vaccines 90（Cold Spring Harbor Laboratory Press)；カーター（Carter）(1992) Current Opinion in Biotechnology 3：533〜539；ムジッカ（Muzyczka）(1992) Current Topics in Microbiol．and Immunol．158:97〜129；コチン（Kotin）(1994) Human Gene Therapy 5：793〜801；シェリング（Shelling）及びスミス（Smith）(1994) Gene Therapy 1：165〜169；並びにゾウ（Zhou）ら、(1994) J．Exp．Med．179:1867〜1875を参照のこと。
【００９２】
あるいは、AAV ITRは、ウイルスゲノムから切り出され得、又は同じものを含むAAVベクターから切り出され得、ザンブルーク（Sambrook）ら、前出に記載されるもの等の標準的なライゲーション技術を用いて、別のベクターに存在する選択された核酸構築物の5’及び3’に融合されうる。例えば、ライゲーションは、20mM Tris-Cl、pH7.5、10 mM MgC12、10mM DTT、33μg/ml BSA、10mM−50 mM NaClと、（「突出末端」ライゲーションについて）40μM ATP、0.01〜0.02（Weiss）単位 T4 DNAリガーゼ、0℃又は（「平滑末端」ライゲーションについて)1mM ATP、0.3〜0.6（Weiss）単位T4 DNAリガーゼ（14℃）のいずれかとの中で達成されうる。分子内の「突出末端」ライゲーションは、30〜100μg／mlの全DNA濃度（5〜100nMの総最終濃度）で通常実施される。ITRを含むAAVベクターは、例えば、米国特許第5,139，941号明細書に記載される。詳細には、いくつかのAAVベクターが、ここに記載されており、これらは、アクセッション番号53222、53223、53224、53225及び53226としてアメリカンタイプカルチャーコレクション（「ATCC」）から入手可能である。
【００９３】
さらに、キメラ遺伝子は、1つ以上の選択された核酸配列の5’及び3’に配置されたAAV ITR配列を含むように合成的に生成されうる。哺乳動物の筋細胞におけるキメラ遺伝子配列の発現に好ましいコドンが用いられ得る。完全なキメラ配列は、標準的な方法により調製された重複するオリゴヌクレオチドから構築される。例えば、エッジ（Edge）(1981) Nature 292：756；ナンベイヤー（Nambair）ら、(1984) Science 223：1299；ジェイ（Jay）ら、(1984) J．Biol．Chem．(1984) 259：6311を参照のこと。
【００９４】
本発明の目的のために、AAV発現ベクターからrAAVビリオンを生成するための適切な宿主細胞としては、異種DNA分子のレシピエントとして用いられ得、又は用いられていて、懸濁培養において増殖できる、微生物、酵母細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞が挙げられる。前記用語は、トランスフェクトされた元の細胞の子孫を含む。したがって、「宿主細胞」とは、本明細書において用いる場合、一般に、外因性DNA配列でトランスフェクトされた細胞をいう。安定なヒト細胞株由来の細胞293（例えば、アクセッション番号ATCC CRL1573としてアメリカンタイプカルチャーコレクションを通じて、容易に入手可能）が、本発明の実施において好ましい。詳細には、ヒト細胞株293は、アデノウイルス5型DNA断片で形質転換されたヒト胚性腎臓細胞株であり〔グラハム（Graham）ら、(1977) J．Gen．Virol．36：59〕、アデノウイルスのE1a遺伝子及びE1b遺伝子を発現する〔アイエロ（Aiello）ら、(1979) Virology 94：460〕。293細胞株は、容易にトランスフェクトされて、rAAVビリオンを生成するのに特に都合のよいプラットフォームを提供する。
【００９５】
AAVヘルパー機能
上記のAAV発現ベクターを含む宿主細胞は、AAV ITRに隣接した塩基配列を複製し、キャプシド化して、rAAVビリオンを生成するために、AAVヘルパー機能を与えうるようにされなければならない。AAVヘルパー機能は一般に、次に、生産的なAAV複製のためにトランスで機能するAAV遺伝子産物を提供するように発現されうるAAV由来コード配列である。ここで、AAVヘルパー機能は、AAV発現ベクターから欠失している必須のAAV機能を補完するために用いられる。したがって、AAVヘルパー機能は、主なAAV ORF、すなわち、rep及びcapコード領域の一方若しくは両方又はそれらの機能的ホモログを含む。
【００９６】
「AAV repコード領域」とは、複製タンパク質Rep78、Rep68、Rep52及びRep40をコードするAAVゲノムの当該分野で認識された領域を意味する。これらのRep発現産物は、AAVのDNA複製起点の認識、結合及びニック作製、DNAヘリカーゼ活性、AAV（又は他の異種の）プロモーターからの転写の調節等を含む多くの機能を有することが示されている。Rep発現産物は、全体として、AAVゲノムを複製するために必要である。AAV repコード領域の説明については、例えば、ムジッカ（Muzyczka，N．）(1992） Current Topics in Microbiol．and Immunol 158:97〜129；及びコチン（Kotin，R．M．）(1994） Human Gene Therapy 5：793〜801を参照のこと。AAV repコード領域の適切なホモログとしては、AAV−2 DNA複製を媒介すること〔トムソン（Thomson）ら、(1994) Virology 204：304〜311〕〕も公知であるヒトヘルペスウイルス6（HHV−6）rep遺伝子が挙げられる。
【００９７】
「AAV capコード領域」とは、キャプシドタンパク質であるVP1、VP2及びVP3又はその機能的ホモログをコードするAAVゲノムの当該分野で認識される領域を意味する。これらのCap発現産物は、ウイルスゲノムをパッケージングするために全体として必要である、パッケージング機能を供給する。AAV capコード領域の説明については、例えば、ムジッカ（Muzyczka，N．）及びコチン（Kotin，R.M.）（前出）を参照のこと。
【００９８】
AAVヘルパー機能は、AAV発現ベクターのトランスフェクションの前か又はトランスフェクションと同時に、AAVヘルパー構築物により宿主細胞をトランスフェクトすることにより宿主細胞に導入される。したがって、AAVヘルパー構築物は、AAV rep及び／又はcap遺伝子の少なくとも一過性発現を提供して、失われているAAV機能（生産的AAV感染のために必要である）を補なうために用いられる。AAVヘルパー構築物は、AAV ITRを欠き、それ自体では複製することもパッケージングすることもできない。
【００９９】
これらの構築物は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルス又はビリオンの形態でありうる。Rep及びCap発現産物の両方をコードする通常用いられるプラスミドpAAV／Ad及びpIM29+45等の多数のAAVヘルパー構築物が記載されている。例えば、サムルスキー（Samulski）ら、(1989) J.Virol.63:3822〜3828；及びマッカーティ（McCarty）ら、（1991) J.Virol.65:2936〜2945を参照のこと。Rep及び／又はCap発現産物をコードする多数の他のベクターが記載されている。例えば、米国特許第5,139,941号明細書を参照のこと。
【０１００】
AAV発現ベクター及びAAVヘルパー構築物の両方とも、1以上の任意の選択マーカーを含むように構築されうる。適切なマーカーとしては、細胞が適切な選択培地中で増殖される場合、選択マーカーを含む核酸構築物によりトランスフェクトされているこれらの細胞に対して、抗生物質耐性若しくは抗生物質感受性を付与するか、色を付与するか又は抗原性特徴を変化させる遺伝子が挙げられる。本発明の実施において有用であるいくつかの選択マーカー遺伝子としては、G418（Sigma,St.Louis,Mo.から入手可能）に対する耐性を付与することにより哺乳動物細胞における選択を可能にするハイグロマイシンB耐性遺伝子（アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（APH）をコードする）が挙げられる。他の適切なマーカーは、当業者に公知である。
【０１０１】
AAVアクセサリ機能
また、宿主細胞（又はパッケージング細胞）は、rAAVビリオンを生成するために、非AAV由来機能、すなわち「アクセサリ機能」を与えうるようにされなければならない。アクセサリ機能は、非AAV由来のウイルスの機能及び／又は細胞の機能であって、AAVがその複製のために依存する機能である。したがって、アクセサリ機能としては、AAV遺伝子転写の活性化、段階特異的なAAV mRNAスプライシング、AAV DNA複製、cap発現産物の合成及びAAVキャプシドの構築に関与するもの等のAAV複製に必要である少なくともそれらの非AAVタンパク質及びRNAが挙げられる。ウイルスに基づくアクセサリ機能は、任意の公知のヘルパーウイルスに由来しうる。
【０１０２】
詳細には、アクセサリ機能は、当業者に公知の方法を用いて、宿主細胞に導入され、次いで宿主細胞中で発現されうる。典型的には、アクセサリ機能は、関連のないヘルパーウイルスによる宿主細胞の感染により与えられる。アデノウイルス；単純ヘルペスウイルス1型、2型等のヘルペスウイルス；並びにワクシニアウイルス等の多数の適切なヘルパーウイルスが公知である。また、非ウイルスアクセサリ機能は、本明細書において、任意の種々の公知の因子を用いる細胞同期化により提供されるもの等の用途を提供する。例えば、ブラー（Buller）ら、(1981） J.Virol.40:241〜247;マックファーソン（McPherson）ら、(1985) Virology 147:217〜222;シュレーホッファー（Schlehofer）ら.(1986) Virology152:110〜117を参照のこと。
【０１０３】
あるいは、アクセサリ機能は、上記のようなアクセサリ機能ベクターを用いて与えられうる。例えば、米国特許第6,004，797号明細書及び国際公開第01/83797号パンフレットを参照のこと。アクセサリ機能を与える核酸配列は、アデノウイルス粒子のゲノム等の自然の供給源から得られ得又は当該分野で公知の組換え法若しくは合成法を用いて構築されうる。上記で説明したように、アクセサリヘルパー機能に、完全に相補的なアデノウイルス遺伝子は必要ないことが示されている。詳細には、DNA複製及び後期遺伝子合成をできないアデノウイルス変異体は、AAV複製を許容する状態であることが示されている。イトウ（Ito）ら、(1970) J.Gen.Virol.9:243;イシバシ（Ishibashi）ら、(1971) Virology 45:317。同様に、E2B及びE3領域内の変異体は、AAV複製を支持することが示されており、E2B及びE3領域が、アクセサリ機能を与えることにおそらく関与していないということを示す。カーター（Carter）ら、(1983) Virology 126:505。しかし、E1領域を欠損するアデノウイルス又は欠失E4領域を有するアデノウイルスは、AAV複製を支持できない。したがって、E1A及びE4領域は、おそらく、直接又は間接的にAAV複製に必要であろう。ラウリン（Laughlin）ら、(1982) J.Virol.41:868;ヤニク（Janik）ら、(1981) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1925;カーター（Carter）ら、(1983) Virology 126：505。他の特徴付けられたAd変異体としては：E1B〔ラウリン（Laughlin）ら、(1982) （前出）；ヤニク（Janik）ら、(1981) （前出）；オストローブ（Ostrove）ら、(1980) Virology 104:502〕；E2A〔ハンダ（Handa）ら、(1975) J.Gen.Virol. 29:239;シュトラウス（Strauss）ら、(1976) J.Virol. 17:140;マイヤーズ（Myers）ら、(1980) J.Virol. 35:665;ジェイ（Jay）ら、(1981) Proc.Natal.Acad.Sci.USA 78:2927;マイヤーズ（Myers）ら、(1981) J.Biol.Chem. 256:567〕；E2B〔カーター（Carter）、Adeno-Associated Virus Helper Functions,I CRC Handbook of Parvoviruses〔ティジッセン(P.Tijssen）編,1990）〕；E3〔カーター（Carter）ら、(1983)、前出〕；並びにE4〔カーター（Carter）ら、(1983) 前出；カーター（Carter）（1995）〕。E1Bコード領域に変異を有するアデノウイルスにより与えられたアクセサリ機能の研究は、矛盾する結果を生じているが、サムルスキー（Samulski）ら〔(1988) J.Virol.62:206-210）〕は、近年、AAVビリオン生成にE1B55kが必要であるが、E1B19kは必要でないことを報告した。さらに、国際公開第97/17458号公報及びマツシタ（Matshushita）ら、(1998) Gene Therapy 5:938〜945は、種々のAd遺伝子をコードするアクセサリ機能を記載する。
【０１０４】
特に好ましいアクセサリ機能ベクターは、アデノウイルスVA RNAコード領域、アデノウイルスE4 ORF6コード領域、アデノウイルスE2A 72kDコード領域、アデノウイルスE1Aコード領域及びインタクトなE1B55kコード領域を欠くアデノウイルスE1B領域を含む。かかるベクターは、国際公開第01/83797号パンフレットに記載される。
【０１０５】
ヘルパーウイルスによる宿主細胞の感染又はアクセサリ機能ベクターによる宿主細胞のトランスフェクションの結果として、アクセサリ機能は、AAVヘルパー構築物にトランス作用して、AAV Repタンパク質及び／又はCapタンパク質を生成することが示される。Rep発現産物は、AAV発現ベクターから組換えDNA（目的のDNA等）を切り出す。また、Repタンパク質は、AAVゲノムを二つに分裂させるように働く。発現されたCapタンパク質は、キャプシドへ構築され、組換えAAVゲノムは、キャプシドにパッケージングされる。したがって、生産的AAV複製が結果として生じ、DNAは、rAAVビリオンにパッケージングされる。
【０１０６】
組換えAAV複製後、rAAVビリオンは、カラムクロマトグラフィー、CsCl勾配、等の種々の従来の精製方法を用いて、宿主細胞から精製されうる。例えば、陰イオン交換カラム、アフィニティーカラム及び／又は陽イオン交換カラムによる精製等の複数のカラム精製工程が用いられ得る。例えば、国際公開第02/12455号パンフレットを参照のこと。さらに、アクセサリ機能を発現するために感染を用いる場合、残りのヘルパーウイルスは公知の方法を用いて不活化されうる。例えば、アデノウイルスは、例えば、20分以上の約60℃の温度への加熱により不活化されうる。この処理はAAVは、極度に熱安定性であるが、ヘルパーアデノウイルスは熱不安定性であるので、ヘルパーウイルスのみを効果的に不活化する。
【０１０７】
次いで、目的のGDNF塩基配列を含む得られたrAAVビリオンを、以下に記載の技術を用いて遺伝子送達のために用いることができる。
【０１０８】
組成物
組成物は、目的の治療上有効な量、すなわち、問題の疾患状態の症状を軽減若しくは改善するのに十分な量又は所望の利益を付与するのに十分な量のGDNFを生成するのに十分な遺伝物質を含有するであろう。また、当該組成物は、薬学的に許容されうる賦形剤を含むであろう。かかる賦形剤としては、この組成物を投与された個体に有害な抗体の生成をそれ自体が誘導せず、過度の毒性なしに投与してもよい任意の薬剤が挙げられる。薬学的に許容されうる賦形剤としては、限定されないが、ソルビトール、任意の種々のTWEEN化合物及び水、生理食塩水、グリセロール、エタノール等の液体が挙げられる。薬学的に許容されうる塩が、そこに含まれてもよい、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩等の鉱物の酸性塩；並びに酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩等の有機酸の塩。さらに、湿潤剤又は乳化剤、pH緩衝剤等の補助物質が、かかるビヒクルに存在してもよい。薬学的に許容されうる賦形剤の詳しい考察は、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES（Mack Pub.Co.,N.J.1991)で入手可能である。
【０１０９】
特に有用な処方物の1つは、1以上の二価アルコール又は多価アルコール及び必要に応じて、ソルビタンエステル等の界面活性剤と組合せて、組換えAAVビリオンを含有する。例えば、国際公開第00/32233を参照のこと。
【０１１０】
本明細書の教示の観点から、当業者に自明であるように、添加されるべきウイルスベクターの有効量は、経験的に決定されうる。代表的な用量を、以下に詳述する。投与は、治療の経過を通じて、単回投与用量、連続的又は周期的に実施されうる。投与の最も有効な手段及び投与用量の決定方法は、当業者に周知であり、ウイルスベクター、治療の組成物、標的細胞及び治療される被験体により変化するであろう。単回及び複数回の投与は、治療を行なう医師により選択される用量レベル及びパターンにより実行されうる。
【０１１１】
送達された組換えビリオンにより、2以上の導入遺伝子が発現されうることが理解されるべきである。あるいは、各々が１つ以上の異なる導入遺伝子を発現する別々のベクターも本明細書に記載のようにCNSに送達されうる。さらに、本発明の方法により送達されたウイルスベクターは、他の適切な組成物及び治療と組み合わされることがまた意図される。例えば、パーキンソン病は、CNS（例えば、線条体の、尾状核又は被殻中に）に、GDNFを発現する組換えAAVビリオンを同時投与することにより治療され得、例えば、AADC、ドーパミン前駆体（例えば、L-ドーパ）、ドーパミン合成のインヒビター（例えば、カルビドパ）、ドーパミン異化作用のインヒビター（例えば、MaOBインヒビター）、ドーパミンアゴニスト又はアンタゴニスト等の補助因子、が、GDNFをコードする組換えビリオンの前に又はその後に又は同時に投与されうる。例えば、AADCをコードする遺伝子は、GDNFをコードする遺伝子とともにCNSに同時投与されてもよい。同様に、L-ドーパ及び必要に応じて、カルビドパが、全身投与されてもよい。当該方法では、PD患者において自然に枯渇しているドーパミンが、L-ドーパをドーパミンに転化することができるAADCにより明らかに回復される。導入遺伝子が、誘導プロモーターの制御下にある場合、ムリステロン（muristerone）、ポナステロン（ponasteron）、テトラサイクリン又はオーフィン（aufin）等の特定の全身に送達される化合物が、導入遺伝子の発現を調節するために投与されてもよい。
【０１１２】
AAVビリオンの送達
組換えAAVビリオンは、前から存在する神経損傷を治療するために、インビボ又はインビトロ（エキソビボともいう）のいずれかで形質導入技術を用いて、CNSの細胞に導入されうる。インビトロで形質導入された場合、所望のレシピエント細胞が当該被験体から取り出され、rAAVビリオンにより形質導入され、当該被験体に再導入されるであろう。あるいは、同系細胞又は異種細胞遺伝子的な細胞が（これらの細胞が、被験体中において不適切な免疫応答を生じない場合）、用いられてもよい。さらに、神経前駆細胞が、インビトロで導入され、次いでCNSに送達されうる。
【０１１３】
被験体への形質導入された細胞の送達及び導入のための適切な方法が記載されている。例えば、適切な培地中で、組換えAAVビリオンと、形質導入対象の細胞とを組合せることにより、細胞はインビトロで形質導入され得、目的のDNAを保持するそれらの細胞は、サザンブロット及び／又はPCR等の慣用の技術を用いて又は選択マーカーを用いることによりスクリーニングされうる。次いで、形質導入された細胞は、上記のような、医薬組成物中に処方され、当該組成物は下記のような種々の技術により、1回以上の用量で、被験体に導入されうる。
【０１１４】
インビボ送達のために、rAAVビリオンが、医薬組成物中に処方され、1回以上の調剤が、示された様式で直接投与してもよい。治療上有効な用量とは、約106〜1015個のrAAVビリオン、より好ましくは107〜1012個、なおより好ましくは約108〜1010個のrAAVビリオン（若しくはウイルスゲノム、「Vg」ともいう）又はこれらの範囲内の任意の値の程度で含むであろう。一般に、0.01〜1ml、好ましくは0.01〜約0.5mlの組成物が送達され、好ましくは約0.05〜約0.3ml、例えば、0.08、0.09、0.1、0.2等及びこれらの範囲内の任意の整数値の組成物が送達されるであろう。
【０１１５】
インビトロで形質導入された組換えAAVビリオン又は細胞は、定位固定注入等による、当該分野で公知の神経外科技術を用いて、ニードル、カテーテル又は関連の手段を用いる、例えば、脳室領域へ、並びに線条体へ（例えば、尾状核又は被殻）、脊髄及び神経筋接合部又は小脳小葉への注入により、CNS又は脳に直接送達されうる〔例えば、ステイン（Stein）ら、J Virol 73:3424〜3429,1999;デビッドソン（Davidson）ら、PNAS 97:3428〜3432,2000;デビッドソン（Davidson）ら、Nat.Genet. 3:219〜223,1993;並びにアリスキー（Alisky）及びデビッドソン（Davidson）, Hum.GeneTher.11:2315〜2329,2000を参照のこと〕。定位的座標が、注入部位を正確に標的するために用いることができないという事実により、小脳注入は、面倒である；小脳小葉のサイズ及びその絶対的な三次元定位には、動物間で変動がある。したがって、コレラ毒素サブユニットb（CTb）を用いて、注入の正確な位置を決定し、注入部位における形質転換可能なニューロンのプールを明らかにしてもよい。注入は、分子層、プルキンエ細胞層、顆粒細胞層及び活樹の白質を満たし得るが、深部小脳核には広がらない。
【０１１６】
CNSに対する投与の1つの様式は、コンベクションエンハンスドデリバリー（CED）システムを用いる。当該方法では、組換えビリオンは、脳の大きい領域にまたがる多くの細胞に送達されうる。さらに、送達されたベクターは、CNS細胞（例えば、ニューロン又はグリア細胞）において、導入遺伝子を効率的に発現する。任意のコンベクションエンハンスドデリバリー手段が、ウイルスベクターの送達に適切であり得る。好ましい実施態様では、当該手段は、浸透圧ポンプ又はインフュージョンポンプである。浸透圧ポンプ及びインフュージョンポンプの両方とも、様々な供給業者、例えば、Alzet Corporation、Hamilton Corporation,Alza,Inc.,Palo Alto,California)から市販で入手可能である。典型的には、ウイルスベクターは、以下のように、CED手段を介して送達される。カテーテル、カニューレ又は他の注入手段を、選択された被験体のCNS組織に挿入する。当業者は、CNSのどの一般的領域が適切な標的であるかを容易に決定することができる。例えば、PDを治療するためにAAV-GDNFを送達する場合、線条体は、標的するための脳の適切な領域である。定位マッピング及び位置決め手段は、例えば、ASI Instruments,Warren,MI.から入手可能である。また、被験体の脳のCT及び／又はMRI画像により得られた解剖学的なマップを用いることにより、位置決めを行ない、選択された標的に対して注入手段をガイドすることを補助してもよい。さらに、本明細書に記載された方法は、脳の比較的大きい領域が、ウイルスベクターを取り込むので、少ないインフュージョン（注入）カニューレしか必要とされない。外科的な合併症(complications)は、穿通の回数に関連するので、当該様式の送達は、従来の送達技術でみられる副作用を減らすように働く。CEDデリバリーに関する詳細な説明については、米国特許第6,309,634号明細書を参照のこと。
【０１１７】
PDの場合、中度〜広範な脱神経等の前から存在する黒質線条体ドーパミン作動性（DA）脱神経を示す被験体に対して送達がなされる。一般に、被験体が、PDの可視の症状を示す時点までに、中度〜広範な脱神経が生じ、前から存在するニューロンの少なくとも約60〜70%から90%より多くが失われている。したがって、「中度の」脱神経とは、ニューロンの少なくとも約60％〜70％の損失を意味し、一方「広範な（extensive）」脱神経とは、ニューロンの少なくとも約90％の損失をいう。
【０１１８】
ニューロン損失の測定の1つは、CNSにおけるドーパミン活性のレベルを参照することによる。したがって、「中度の」脱神経とは、一方又は両方の線条体半球におけるドーパミン含量の少なくとも約60％〜70％の損失をいい、「広範な」脱神経とは、一方又は両方の線条体半球における少なくとも約90％の損失により反映される。ドーパミン含量を測定するために、標識されたトレーサーを、被験体に投与する。標識の検出は、ドーパミン活性の指標である。好ましくは、標識されたトレーサーは、例えば、ポジトロン放出断層撮影（PET）スキャニング又は他のCNS画像技術により、動物全体の脳においてインビボで視認されうるものである。選択されたトレーサーに適切な標識としては、分光学的方法、光化学的方法、免疫化学的方法、電気的方法、光学的方法又は化学的方法による任意の検出可能な組成物が挙げられる。本発明において有用な標識としては、放射性標識（例えば、18F、3H、125I、35S、32P等）、酵素、比色定量標識、蛍光色素等が挙げられる。好ましい実施態様において、標識18Fが、DOPAとともに用いられ、ドーパミン活性を定量する。したがって、当該実施態様では、ニューロン損失の程度は、トレーサーとして［18F]−フロロ−DOPAを用いて測定される。ドーパミン活性の別の測定は、標識されたトレーサーである6−[18F]−フルオロ−L−m−チロシン（18F−FMT)を用いる。FMTは、ドーパミンを利用する細胞に結合する。インビボにおけるドーパミン含量の測定方法については、例えば、米国特許第6,309,634号明細書を参照のこと。
【０１１９】
また、ニューロンの再生及びそれによる疾患の治療は、上記のようなドーパミンレベルを測定することによりモニターされうる。本明細書において用いられる、疾患の治療とは、目的の疾患の症状の軽減又は排除及びニューロンの再生を意味する。したがって、治療の前及び治療の後のドーパミンレベルを、ニューロン再生の指標として比較されうる。あるいは、疾患の視覚的症状を、治療の指標として用いてもよい。
【０１２０】
神経組織解析及び生化学解析
治療した被験体から組織を収集して、慣用的な手順を用いて、神経変性、再生及び分化の評価にために処理し得る。本発明において、線条及びSNの冠状断面を評価すること等、例えば、線条体及び黒質（SN）の種々の細胞を評価するのに有用である。経時的に実施した測定により、ベクター投与部位から離れた細胞の補正の向上が示されうる。
【０１２１】
ドーパミン及びその代謝物、HVA及びDOPACのレベルは、既報〔シェン（Shen,Y.）、Hum.Gene Ther.（2000）11:1509〜1519〕、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いて評価されうる。特に、当該ベクターが、GDNFの選択可能な形態をコードする場合、CSFも、タンパク質レベル又は酵素活性について収集及び評価されうる。
【０１２２】
また、被験体は、アポモルフィン−HClの腹腔内注射により、回転行動について定期的に試験されうる。
【０１２３】
C.実験
以下は、本発明の実行のための特定の実施態様の例である。本実施例は、例示の目的でのみ提供され、いかなる方法でも本発明の範囲を限定することは意図されない。
【０１２４】
用いた数値（例えば、量、温度等）に関して正確性を確保するための労力が払われているが、ある程度の実験誤差及び偏差が、当然ながら認められるべきである。
【０１２５】
材料及び方法
動物及び外科的手順
成体の雄Wistarラット（体重200〜250g）を、食物及び水に自由にアクセスできるケージ中で、12時間の明／暗サイクルで維持した。動物の取り扱いについて、自治医科大学のガイドラインにしたがって、実験を行なった。PDの部分ラットモデルは、ザワー（Sauer）及びイェーテル（Oertel），Neuroscience(1994）59：401〜415に記載のように作製した。簡単には、ラットは、4μlのアスコルビン酸−生理食塩水（0.05％）に溶解された20μgの6−ヒドロキシドーパミン（6−OHDA；遊離塩基として算出；Sigma,St.Louis MO）の定位注入を、以下の座標：前−後（anterior−posterior）（AP）＋1.0mm、内−側面（medial−lateral）(ML）3.0mm、背腹（dorso−ventral）(DV)-4.5mmで左の線条体に投与をうけた。定位座標は、ブレグマ（十字縫合）及び硬膜表面に対して算出された。4週間後、アポモルフィン誘導性回転（腹腔内に0.1mg／kg投与した）について動物を試験し、60分間の観察期間において、1分間あたり7回以上の対側性の回転を示す動物のみを、さらなる研究に含めた。黒質線条体の変性の程度を評価するため、神経トレーサーCTB（蒸留水1μl中に1％；List Biological Laboratories,Campbell,CA,USA）を、死の3日前に、線条体に両側性に注入した(n＝5、AP＝＋1mm、ML＝3.0mm、DV＝-4.5mm）。これを行ない、6−OHDA病変の4週間後に線条体に対する機能的投射を維持するSNにおいてDNAニューロンの小集団を逆行性に標識した。以下の座標：（AP＝＋1.5mm、＋1.0mm及び＋0.5mm；ML＝2.6mm、3.0mm及び3.2mm；DV＝-4.5mm)を用いて、3つの異なる部位（2μl/部位、１０13ベクターゲノムコピー/ml）において左の線条体に、AAV−GDNFflag(n＝32)、AAV−LacZ（n＝22)又はビヒクル（0．1M PBS；n＝8）をうけるように、PD動物モデルを無作為に割り当てた。注入速度を1μl／分に設定し、注入針をさらに7分間定位置において、その後ゆっくりと引き抜いた。GDNFflagタンパク質の逆行性輸送を評価するため、数匹のラット（各々の時点で：AAV−GDNFflag注入群、n＝4；AAV−LacZ注入群、n＝2）を、それぞれAAV注入の2、4及び8週間後に組織学のために、安楽殺した。ベクター注入の20週後、ラットを無作為にグループ分けして、生化学解析又は免疫組織化学解析のために安楽殺した。8匹のラットでは、CTBを死の3日前に線条体に両側性に注入した。
【０１２６】
行動試験
AAVベクター注入の後、アポモルフィン-HCl（0.1mg／kg）の腹腔内注射により、2週間ごとに回転行動についてラットを試験した。既報〔シェン（Shen,Y.）、Hum.Gene Ther.（2000）11：1509〜1519〕のように、60分以上の観察期間の間に、完全な身体ターンの総回数をカウントした。シリンダー試験法〔キリク（Kirik）ら、J.Neurosci.(2000)20:4686〜4700〕を用いて、自発的な四肢の使用を4週間ごとにスコア付けした。ラットを、自由な運動が十分な大きさの透明なガラスシリンダーに入れた。シリンダーの壁に少なくとも片足を置きながら、ラットが10回の直立を行った後、シリンダーの壁に対する両方の前足の接触の回数を少なくとも20回とカウントした。対側性の前足接触についてのデータを全体の割合として得た。
【０１２７】
生化学的解析
ペントバルビタールナトリウム麻酔下での断頭によりラットを安楽殺して、直ちに脳を解剖してドライアイス上に置いた。鋭い刃のステンレスチューブを用いて、線条体を両側に打ち抜いた。湿潤組織サンプルを秤量して、引き続く解析まで−80℃で貯蔵した。既報〔シェン（Shen,Y.）、Hum.GeneTher.(2000)11:1509〜1519〕のように、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いて、ドーパミン及びその代謝物（HVA及びDOPAC）のレベルを推定した。
【０１２８】
免疫組織化学
深い麻酔下で、PBSを用い、その後、4％氷冷PFAを用いて、ラットを還流した。脳を切開して、次いで4％ PFA中で4時間、事後固定した。線条体及びSNからの冠状断面（30μm）を、0.3% H2O2含有PBS中で30分間処理して、3％  ウシ胎仔血清（FBS）を含有するPBS／0.1％ TritonX-100を用いて1時間ブロックした。次いで、切片をTH（1:1000、マウス抗THモノクローナル抗体；Chemicon,Temecula，CA，USA)、CTB（1：10 000，CTBに対するヤギ抗血清；List Biologic,Campbell,CA,USA）又はFLAG（1：1000，抗FLAG M2抗体，Sigma，St．Louis，MO）について、一次抗体とともに4℃で一晩インキュベートした。その後、一次抗体の種に対するビオチン化二次抗体とともに、室温で1時間、インキュベーションを行なった（1：400，Santa Cruz，Santa Cruz，CA)。色素原として3,3−ジアミノベンジジン（DAB）を用いて、アビジン−ビオチン化ペルオキシダーゼ複合手順（avidin−biotinylated peroxidase complex procedure）（Vectastain ABC キット；Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA）により切片を可視化した。
【０１２９】
FLAG／TH二重免疫蛍光染色のために、切片を、順次、5％の正常なヤギ血清をPBS中に含むブロッキング溶液とともに、1時間、室温でインキュベートし、モノクローナルマウス抗FLAG抗体（1:250,Sigma）及びポリクローナルウサギ抗TH抗体（1:500）とともに4℃で一晩、ローダミン結合ヤギ抗マウスIgG（1：200;Santa Cruz,Santa Cruz,CA）及びFITC結合ヤギ抗ウサギIgG（1：200；Santa Cruz，Santa Cruz，CA）とともに室温で2時間、インキュベートした。断片を試験して、共焦点レーザー走査型顕微鏡（TCS NT；Leica，Heidelberg，Germany)のもとで観察した。CTB/TH二重免疫蛍光染色のために、抗CTB（1:5000、CTBに対するヤギ抗血清）及びマウス抗TH（1：500）抗体を用いた。
【０１３０】
TH陽性ニューロン及びCTB標識ニューロンの定量的解析のために、SNを含む300μm間隔の切片を両側でカウントした。TH-IR線維の光学密度を、NIH Image 1.59ソフトウェア〔コズロウスキー（Kozlowski）ら、Exp．Neurol．（2000)166：1〜15)を用いて、線条体全体にわたって体軸方向の300μmごとの断面で定量した。
【０１３１】
統計的解析
結果を、平均±s.e.m.として示した。反復測定分散分析（ANOVA）を用い、ついで、Tukey honestly significance difference（HSD）検定（StatView 5．0 software)を用いて、データを統計学的に解析した。
【実施例１】
【０１３２】
組換えAAVベクターの構築
FLAGタグGDNF(AAV−GDNFflag、図1a）又はβガラクトシダーゼ（AAV−LacZ、図1b）を発現する組換えAAVベクターを、以下のように構築した。6−OHDA病変又はアポモルフィンの注射は、GDNFの内因性発現を誘導するので〔オオタ（Ohta）ら、Biochem．Biophys．Res．Commun．（2000）272：18〜22；ゾウ（Zhou）ら、Neuroreport（2000）11：3289〜3293〕、内因性GDNFから、導入遺伝子由来のGDNFを識別して、遺伝子送達の効果を評価する必要がある。したがって、FLAGタグGDNFを発現するAAVベクターを構築した。
【０１３３】
AAVベクタープラスミドpAAV−GDNFflagは、既報〔ファン（Fan）ら、Neurosci．Lett．（1998）248：61〜64〕のpAAV−GDNFプラスミドに由来した。当該プラスミドは、AAV-2ゲノムの逆方向末端反復（ITR）間に、ヒト成長ホルモン第一イントロン及びシミアンウイルス40（SV40）ポリアデニル化シグナル配列とともに、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）最初期プロモーターの下に、カルボキシ末端でFLAG配列（DYKDDDDK（配列番号：5）によりタグ付けされたマウスGDNFcDNA〔マツシタ（Matsushita）ら、Gene（1997）203:149〜157を含む。
【０１３４】
AAVベクタープラスミドpAAV−LacZ、補助プラスミドpHLP19及びpladeno 1は、以前に説明された〔ファン（Fan）ら、Neurosci.Lett.（1998）248：61〜64〕。 pladeno 5は、米国特許第6,004，797号明細書に記載されている。コンフルエントに達していないヒト293細胞を、リン酸カルシウム共沈法を用いて、ベクタープラスミド及びヘルパープラスミドにより一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの72時間後、細胞を回収して3回の凍結融解サイクルにより溶解した。AAVベクター（AAV−GDNFflag及びAAV−LacZ）を、既報〔マツシタ(Matsushita）ら、Gene Therapy(1998）5：938〜945〕のように、2つの連続的CsCl勾配を用いて精製した。AAV−GDNFflagの最終粒子力価は、DNAドットブロットハイブリダイゼーション解析により評価して、1．6×10l3ベクターゲノムコピー／mlであり、AAV−LacZは、2．1×1013ベクターゲノムコピー／mlであった。
【実施例２】
【０１３５】
AAV−GDNFflagのインビトロ発現
GDNFflag融合タンパク質のインビトロ発現を検出するため、AAV−GDNFflag又はAAV−LacZ（5000ベクターゲノムコピー／細胞）により293細胞を形質導入した。形質導入の36時間後、細胞溶解物を15％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、二フッ化ポリビニリデン膜（Millipore，Bedford,MA，USA)に転写させた。残りのタンパク質結合部位を、5％脱脂粉乳含有TBSにより室温で1時間ブロックした。マウス抗FLAG M2抗体（1：1000，Sigma，St Louis，MO）又はウサギ抗−GDNF抗体（1：2000，Santa Cruz,Santa Cruz,CA)を用いて、膜を4℃で一晩インキュベートし、ついで、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗マウス又は抗ウサギ抗体（1：2500，Amersham，Arlington Heights，IL）とともに、室温で2時間インキュベーションした。化学発光シグナルをECLシステム(Amersham)により検出した。
【０１３６】
ウエスタンブロット解析において、GDNFflag融合タンパク質を、抗GDNF抗体及び抗FLAG抗体の両方により、AAV-GDNFflag形質導入293細胞の溶解物で検出した。AAV-LacZ形質導入細胞の溶解物においてシグナルは検出されなかった（図2）。
【０１３７】
AAVベクター由来GDNFflag融合タンパク質の生物学的活性をアッセイするため、ラット胎仔DAニューロンの初代培養物を調製した。簡単には、腹側の中脳を14日目のWistarラット胚から切り出して、細断し、0.25％のトリプシン含有PBSとともに、15分間インキュベートした。単離した細胞を、ポリ−L−リジンで予めコーティングされた35mmディッシュに、105細胞／ディッシュの初期細胞密度で播種して、B27（Gibco BRL）、100単位／ml  ペニシリン、100μg／ml  ストレプトマイシン、25mM KCl及び2mM  グルタミンを補充したNeurobasal−SFM培地（Gibco BRL）とともに37℃でインキュベートした。AAVベクター処理ディッシュにおいて、AAV−GDNFflag又はAAV−LacZ（5000ベクターゲノムコピー／細胞）で培養物を感染させた。陽性対照ディッシュ又は陰性対照ディッシュにおいて、組換えヒトGDNF（rhGDNF，Santa Cruz）又はBSAを、最終濃度10ng/mlで培養物に添加した。同じ濃度で維持したrhGDNF又はBSAとともに、3日間の間隔で、半分量の新鮮な培地により培養培地を補なった。9日後、4％のパラホルムアルデヒド（PFA）を用いて30分間細胞を固定し、免疫化学染色のために処理して、GDNFflag及びTHの発現を試験した。存在するTH-IR細胞の数を、記載されたように〔サワダ（Sawada）ら、J．Neurochem．（2000）74：1175〜1184〕、カウントした。
【０１３８】
チロシンヒドロキシラーゼ（TH）免疫染色は、AAV−LacZ形質導入培養物においてよりもAAV−GDNFflagで形質導入された培養物において、約2倍多くのTH免疫反応性（TH−IR）細胞が生存したことを明らかにした（図3）。これらの結果により、AAV−GDNFflagは、インビトロにおいて生理活性GDNFflag融合タンパク質の生成を支配し得、FLAGペプチドの添加が、DAニューロンに対するGDNFの神経栄養性の影響を変えず、抗FLAG抗体による外因性に発現されたGDNFflag融合タンパク質の同定が可能になることが確認された。
【実施例３】
【０１３９】
線条体におけるGDNFflagの発現及びSNに対する逆行性輸送
AAV-GDNFflag注入の2、4、8及び20週後に、抗FLAG抗体を用いて、線条体において、GDNFflag導入遺伝子発現を検出した。FLAG免疫反応性（FLAG-IR）細胞は、線条体に注入部位の周囲で検出された。これらの細胞は、中突起ニューロン（medium spiny neurons）（MS細胞）の代表的形態を示した（図4a及び4b)。さらに、抗TH抗体と抗FLAG抗体とを用いた二重免疫蛍光染色は、AAV−GDNFflag注入の4週及び8週後に同側性のSNの緻密部において、二重陽性細胞を検出した（図4c〜4e)。AAVベクター注入の8週後、TH−IR細胞の13.1±2.4%(n＝4)が、SN全体にわたって分散したFLAG−IR細胞と重複しており、いくつかの導入遺伝子GDNFflagが、DAニューロンに対してアクセスしたことを示す。対側性の線条体又はSNにおいても、AAV−LacZ又はビヒクルを注入されたラットにおけるこれらの領域においても、FLAG-IR細胞は観察されなかった。AAV−LacZ注入されたラットでは、注入後2〜20週から線条体においてX-gal陽性細胞は検出されたが、SNにおいては、βガラクトシダーゼシグナルは検出できなかった。
【０１４０】
これらの結果により、AAV−GDNFflagは、線条体におけるGDNFflag融合タンパク質の発現を支配し得、AAVベクター自体ではなく、GDNFflag融合タンパク質が、線条体における末端からSNにおけるDAニューロン体へ逆行性に輸送されうることが示される。
【実施例４】
【０１４１】
線条体におけるDA神経支配のレスキュー
AAV−GDNFflagが、病変の線条体におけるDAニューロン神経支配をレスキューするか否かを決定するために、TH−IR線維末端の程度を、注入後20週で線条体にわたる300μm間隔のスライスで試験した。AAV−LacZ注入ラットにおいて、病変の線条体におけるTH−IR線維の密度は、インタクトな側のわずか13.5±3.0％まで顕著に低下した（図5a及び5c）。対照的に、AAV−GDNFflagを注入されたラットでは、TH−IR線維の密度は、有意により大きく、インタクトな側の48.7±7.3%近くに達した（図5b、5d及び5e)。維持されたTH−IR線維は、注入部位周辺に分布されており、TH−IR繊維の神経支配が線条体において発現されたGDNFflagによりレスキューされたことを示す。
【０１４２】
CTB後標識は、CTBが、機能的な黒質線条体投射を維持するSNニューロンのみを標識するが、抗TH免疫染色は、ニューロン体におけるTH酵素の存在を示すだけであるため、抗TH免疫染色単独よりも黒質線条体機能の評価においてより正確である。AAV−GDNFflag群においては、SNにおいてよりもCTB標識されたDAニューロンが多く存在し、線条体において発現されたGDNFflagが、DAニューロンをレスキューして、線条体に対する機能的投射を促進し得ることを示唆した。さらに、線条体内AAV−GDNFflag注入による黒質線条体系の首尾よいレスキューは、線条体において高レベルのドーパミン及びその代謝物により支持され、黒質線条体系におけるドーパミンの持続性の活性が示された。
【実施例５】
【０１４３】
黒質線条体投射の維持
コレラ毒素サブユニットB（CTB、ニューロントレーサー）〔レマン（Leman）ら、Brain Res.Brain Res.Protoc.(2000)5:298〜304〕を、線条体に両側に注入して、残りの黒質線条体系路の程度を評価した。6−OHDA注入の同じ座標を、死の3日前に利用して、線条体への投射を維持するDAニューロンの小集団を逆行性に標識した。AAVベクター処理の時点、すなわち、6−OHDA注入の4週後）に、病変のSNにおけるCTB陽性ニューロンの数は、インタクトな対側の28.9±3.7%であった（n＝5)。また、抗CTB抗体と抗TH抗体とを用いた二重免疫蛍光は、SN中のほとんどの大きいCTB陽性ニューロンがTH陽性であることを明らかにした（図6）。病変の側におけるTH−IRニューロンの割合は、インタクトな側の34.9±2.6%（n＝4）であった。これらの結果は、黒質線条体結合のいくつかの部分は、病変の4週間後に保持されていたことを示す。AAVベクター注入の20週後、TH-IR細胞（インタクトな側の19.5±2.0%）及びCTB陽性細胞（インタクトな側の17.9±1.6%）の広範な損失が、AAV−LacZを注入したラットにおいて観察された。対照的に、AAV−GDNFflagの注入は、それぞれ、対側の57.3±6.2%及び50.8±8.5%に達するTH−ＩＲニューロン及びCTB陽性細胞の有意な増大が生じた（図7及び8、P＜0．01)。
【０１４４】
これらの結果は、病変後4週間での線条体内AAV−GDNFflag注入が、SNにおけるDAニューロンの生存をレスキューして、黒質線条体投射の維持を促進したことを示す。
【実施例６】
【０１４５】
AAV−GDNFflagの線条体内注入後の行動回復
6−OHDA投与の4週間後、3つの群（AAV−GDNFflag,n＝20；AAV−LacZ，n＝16；及びビヒクル,n＝8）における全てのラットが、アポモルフィン誘導回転試験及びシリンダー試験の両方で、同様の程度の障害を示し、同等なレベルのDA枯渇を示唆した。
【０１４６】
AAV−GDNFflagをうけたラットにおいて、ベクター注入後4週間で開始する、アポモルフィン誘導性回転の低下が、観察された（図9a）。当該低下は、徐々に進行して、実験を通じて持続した（20週）。対照的に、AAV−LacZ又はビヒクル注入群におけるラットは、同じ期間中、かなり安定な回転速度を示した。
【０１４７】
シリンダー試験を用いて、病変のラットにおける自発性の前肢の使用を測定した（図9b）。AAV治療の前に、各々の群のラットは、6−OHDA病変後、当該試験において対側の脚の使用の頻度の低下（総接触の23〜25％）により示されるように、同様の顕著な同側性の偏りを示した。AAV−GDNFflagをうけているラットでは、注入の4週後から、有意な改善が観察され、徐々に進展して、20週では正常なレベル（総接触の47％）付近に到達した。対照的に、対側の使用は、AAV−LacZ又はビヒクルをうけているラットにおいて20週間にわたって同じレベルで持続した。アポモルフィン誘導性回転及びシリンダー試験の両方についての、AAV−GDNFflagを注入されたラット対、AAV−LacZ又はビヒクルを注入されたラットの統計学的解析により、有意な差異(P＜0.01)が明らかになった。
【実施例７】
【０１４８】
病変線条体におけるドーパミン含量の保存
AAV−GDNFflag注射後の行動回復が、黒質線条体ドーパミン産生のレベルに相関するか否かを試験するため、、ドーパミンレベル及び線条体におけるその代謝物ホモバニリン酸（HVA）及び3,4−ジヒドロキシフェニル酢酸（DOPAC）を、注入後20週でアッセイした。AAV−GDNFflagを注入された群（n＝8)では、線条体の病変部位におけるドーパミンレベルは、対側のインタクトな側の50．9±7.7%であったが、AAV−LacZ注入群（n＝8）では、そのレベルは、対側の11.5±4.8%残っていた（図10、P＜0.01)。さらに、HVA及びDOPACのレベルは、AAV−GDNFflag注入群において高かった。ドーパミン及びその代謝物のレベルにおける有意な差異は、2つの群間において、線条体のインタクトな側では観察されなかった。
【０１４９】
上記に詳細な実施例により、条件にあったPD動物モデルの線条体中へのGDNF遺伝子のAAVベクター介在送達は、さらなる後期変性からSNニューロンを保護し、線条体に対するそれらのニューロンの結合を維持していることが示される。
【０１５０】
本発明において、GDNFflagは、注入後4〜8週間から、AAV−GDNFflag注入側及び同側のSN細胞において検出された。これらのSN細胞は、抗FLAG抗体と抗TH抗体とを用いた二重免疫蛍光染色を用いて、DA細胞であることが確認された。FLAG−IR細胞の割合は低いようであった（TH−IR細胞の13.1%）が、FLAG−IR細胞は、AAVベクター処理後8週間で緻密部の広範な領域で観察された。GDNFは、DAニューロン上において、ピコモル範囲で非常に強力な影響を示すので、一過性に輸送され、死の時点で、免疫組織化学により検出されなかった少量のGDNFflagタンパク質は、毒素誘導性の細胞死に対して黒質DAニューロンを保護したかもしれない。対照的に、線条体にAAV−LacZを注入されたラットは、SNにおいてβガラクトシダーゼシグナルを示さなかった。以前の研究〔チャンベリン（Chamberlin）ら、Brain Res．(1998）793：169〜175〕と一致して、AAVベクター自体は、中枢神経系において逆行性に輸送されなかったが、GDNFflagタンパク質は、SNにおいて線条体からDAに逆行性に輸送された。線条体におけるGDNFflagタンパク質の実質的な発現も、注入後20週で検出された。このGDNFflag産生の持続は、単回のAAVベクター注入後、黒質線条体系の長期のレスキューを与えた。病変線条体におけるTH−IRの密度は、AAV−GDNFflag注入の後、保存された。
【０１５１】
このように、線条体におけるAAV介在GDNF遺伝子送達は、PD及び他のCNS変性疾患の神経保護的な遺伝子治療として有効である。
【０１５２】
したがって、神経変性障害の新規な治療方法が提供される。本発明の好ましい実施態様は、ある程度詳細に記載されているが、添付の特許請求の範囲により規定される本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、自明なバリエーションがなされうることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０１５３】
前から存在する神経損傷を持つ被験体の治療のための組成物及び方法が開示される。前記組成物及び方法は、パーキンソン病等の神経変性状態の被験体に対してグリア細胞株由来神経栄養因子（GDNF）を送達するためのアデノ随伴ウイルス（AAV）に基づく遺伝子送達系を用いる。
【図面の簡単な説明】
【０１５４】
【図１】図1a及び1bは、AAVベクターの模式図である。図1aでは、LacZは、CMVプロモーターの転写制御下にある。図1bでは、マウスGDNF cDNAは、C末端においてFLAGペプチドのコード配列と融合され、CMVプロモーターの転写制御下である。ITRは、逆方向末端反復；CMVは、サイトメガロウイルス最初期プロモーター；イントロンは、ヒト成長ホルモンの第１イントロン；poly Aは、SV40ポリアデニル化シグナル配列である。
【０１５５】
【図２】図2は、AAV−GDNFflagを用いた形質導入後の293細胞由来の細胞抽出物のウエスタンブロット解析の提示である。Mock（レーン1）又はAAV-LacZ（レーン2）を用いて形質導入された293細胞を、陰性対照として用いた。AAV-GDNFflag（レーン3）による形質導入の36時間後、GDNFflag融合タンパク質の発現を、それぞれ抗GDNF抗体及び抗FLAG抗体により検出した。
【０１５６】
【図３】図3は、AAV−GDNFflagを用いて形質導入した培養物におけるDAニューロンの生存の増大を示す。TH−IR（DA）ニューロンの数を、AAV−GDNFflag、AAV−LacZ又はモック（mock）を用いて形質導入した9日後に、ラットE14中脳細胞培養物中でカウントした。rhGDNF（10 ng/ml）を、陽性対照として培養物中に添加した。エラーバーは、s.e.m.（＊P＜0.01）を示す。
【０１５７】
【図４】図4a〜4eは、線条体におけるGDNFflagの発現及びSNへの逆行性輸送を示す。病変の線条体にAAV−GDNFflagを注入した4週間後、ラットを安楽殺して、免疫組織化学のために線条体及びSN間の冠状切片を作製した。抗FLAG抗体を用いて、線条体において、GDNFflag導入遺伝子発現を検出した（図4a及び4b)。同側性のSNにおけるGDNFflagの逆行性輸送が、ポリクローナル抗TH抗体（4c）とモノクローナル抗FLAG抗体（4d）とを用いた二重免疫蛍光染色により確認された。（4e）図4c及び4dの重なりにより、SNにおけるFLAG及びTH陽性ニューロンの共局在を示す。緻密層部の広範な領域で、二重に陽性のニューロンが検出された。当該図は、TH及びFLAGの最も顕著な共局在が観察された領域を示す。（a、バー＝100μm；b、バー＝25μm；c-e、バー＝50μm）。
【０１５８】
【図５】図5a〜5eは、線条体におけるTH−IR線維のAAV-GDNFflag注入の影響を示す：TH-IR線維の密度は、AAV−LacZ注入動物の病変側では顕著に低下した（図5a及び5c）。対照的に、AAV−GDNFflag注入動物は、治療された線条体においてTH−IR線維の密度の増大を示した（図5b及び5d)。図5c及び5dは、それぞれ、図5a及び5bの病変側における矢印により示される領域の高倍率の視野である。図5eは、図5bのインタクトな側において矢尻印により示される領域の高密度のTH-IR線維を示す（図5a〜5b、バー＝1mm；図5c〜5e、バー＝50μm）。
【０１５９】
【図６】図6a〜6fは、6−OHDA病変の作製の4週間後のCTBによる逆行性標識を示す。SN由来の部位をCTB（図6a及び6d）及びTH（図6b及び6e）について二重染色した。CTB陽性細胞（病変側（図6a〜6c）及び対側（図6d〜6f）の両方）におけるDAニューロンを示すTH-IR陽性であった。病変側（図6a〜6c）では、TH陽性ニューロンは、CTBにより逆行性に標識され、いくつかのDAニューロンが、病変の4週間後に線条体病変に対する結合を維持していたことを示した。図6cは、図6a及び6bのオーバーレイである。図6fは、図6d及び6eのオーバーレイである（バー＝50μm）。
【０１６０】
【図７】図7a〜7fは、SNにおけるTH陽性細胞及びCTB陽性細胞の数に対するAAV−GDNFflagの影響を示す。中脳を通る冠状断面により、AAVベクター投与20週後、TH−IR陽性（図7a〜7c）及びCTB陽性（図7d〜7f）の黒質ニューロンを示した。動物を安楽殺する3日前に、CTBを線条体に両側に注入した。それぞれ、AAV−LacZ注入動物（図7a及び7d)における病変側、並びにAAV−GDNFflag−注入動物における病変側（図7b及び7e）及びインタクト半球領域（図7c及び7f）のSNの例。（図7a〜7c、バー＝200μm；図7d〜7f、バー100μm)。
【０１６１】
【図８】図8は、AAV−LacZを注入された動物に比べて、AAV−GDNFflag注入を受けたラットの病変SNにおける、TH陽性ニューロン及びCTB陽性ニューロンの割合の有意な増大を示す（n＝8）。データを、陽性細胞の割合として表わした（病変半球領域対、非病変半球領域、＊P＜0.01）。
【０１６２】
【図９】図9a〜9bは、行動の回復に対するGDNFflagの影響を示す。AAV−GDNFflag（n＝20)、AAV−LacZ（n＝16）又はビヒクル(n＝8）の線条体内注入を行ったラットを、アポモルフィン誘導回転を、シリンダー試験で調べた。AAV−GDNFflagを投与されたラットにおいて、アポモルフィン誘導回転の有意な減少が観察された。対照的に、AAV−LacZ注入群及びビヒクル注入群におけるラットは、安定な回転を示した。回転は、60分あたりのターンとして表した（図9a）。6−OHDA病変後の自発性の前肢の使用を、シリンダー試験で評価した。AAV治療の前に、ラットは、対側の肢の使用の頻度の低下により示されるように、顕著な同側の偏りを示した（総接触の23〜25％）。AAV−GDNFflag−処理ラットは、徐々に改善して、20週でほぼ正常に達した（全体のうち47%）。対照的に、対側の肢の使用頻度の低下は、AAV−LacZ又はビヒクルを投与されたラットでは継続した。対側（右）の前肢の接触は、全体の割合として示された（＊P＜0.01)。（図9b）。
【０１６３】
【図１０】図10a及び10bは、AAV−GDNFflag（n＝8)又はAAV−LacZ（n＝8）の注入の20週後の6−OHDA病変線条体中の、ドーパミン（図10a）、並びにDOPAC及びHVA（ドーパミン代謝物）（図10b）の含量を示す。データは、インタクトな線条体の割合を示す（P＜0．01)。
【０１６４】
【図１１】図11（配列番号：1及び2）は、ヒトプレ−プロ−GDNFの塩基配列及びアミノ酸配列を示す。成熟GNDF分子は、78〜211位のアミノ酸にまたがる。
【０１６５】
【図１２】図12（配列番号：3及び4）は、ラットプレ−プロ−GDNFの塩基配列及びアミノ酸配列を示す。成熟GDNF分子は、78〜211位のアミノ酸にまたがる。
【０１６６】
【図１３】図13（配列番号：6及び7）は、マウスプレ−プロ−GDNFの塩基配列及びアミノ酸配列を示す。成熟GDNF分子は、107〜240位のアミノ酸にまたがる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005501127.tif 000091
【国際調査報告】
2005501127.tif 000092
2005501127.tif 000093
2005501127.tif 000094
2005501127.tif 000095