(57)【要約】この発明は、広範囲の分子量を有するタンパク質およびタンパク質複合体の正確な構造かつダイナミックなデータを得るために使用しうる、タンパク質およびタンパク質／リガンド複合体の双方のエントロピーおよびエンタルピー・データを得るためのＮＭＲ法を提供するものである。この発明の実施形態は、ダイナミックスが測定されることになっており、かつＮＭＲ不活性核で囲まれた少なくとも1つの結合ベクトルを含むタンパク質と、化学的手段あるいは生物学的イクスプレッションで前記タンパク質の合成するためのアミノ酸と、を提供する。分析のために特に標識化されたタンパク質を用いたＮＭＲ法によると、ＮＭＲ実験の感度および分解能が最大化され、かつ拡散による信号の損失が最小化される。
2005528915.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸であって、該アミノ酸の側鎖における少なくとも1つの結合ベクトルが、互いに結合した２つのＮＭＲ活性核からなり、かつ実質的に他のすべての核がＮＭＲ不活性である。
【請求項２】
アミノ酸であって、該アミノ酸の側鎖における少なくとも１つの結合ベクトルが、互いに結合した２つのＮＭＲ不性核からなり、かつ本質的に他のすべての結合ベクトルがＮＭＲ不活性である。
【請求項３】
前記２つのＮＭＲ活性核が１３Ｃおよび１Ｈであり、前記アミノ酸における炭素原子の残りは実質的に１２Ｃであり、前記アミノ酸における窒素原子は実質的に１４Ｎであり、かつ前記アミノ酸における水素原子の残りは実質的に２Ｈである、請求項１または２に記載のアミノ酸。
【請求項４】
前記２つのＮＭＲ活性核は、１３Ｃおよび１Ｈであり、前記アミノ酸における炭素原子の残りは実質的に１２Ｃであり、前記アミノ酸における窒素原子は実質的に１４Ｎであり、かつ前記アミノ酸における水素原子の残りは自然存在比である、請求項１または２に記載のアミノ酸。
【請求項５】
前記２つのＮＭＲ活性核が１５Ｎおよび１Ｈであり、前記アミノ酸における窒素原子の残りは実質的に１４Ｎであり、前記アミノ酸における炭素原子は実質的に１２Ｃであり、前記アミノ酸における水素原子の残りは実質的に２Ｈである、請求項１または２に記載のアミノ酸。
【請求項６】
前記２つのＮＭＲ活性核は、１５Ｎおよび１Ｈであり、前記アミノ酸における窒素原子の残りは実質的に１４Ｎであり、前記アミノ酸における炭素原子の残りは実質的に１２Ｃであり、かつ前記アミノ酸における水素原子の残りは自然存在比である、請求項１または２に記載のアミノ酸。
【請求項７】
請求項１または２に記載のアミノ酸を含む培養液。
【請求項８】
請求項１または２に記載の少なくとも1つのアミノ酸を含むタンパク質。
【請求項９】
タンパク質の結合ベクトルのダイナミックスを分析する方法であって、請求項１または２に記載のアミノ酸を含むフォームで前記タンパク質を生産すること、および前記タンパク質をＮＭＲスペクトロスコピー(spectroscopy)に供すること、を含む。
【請求項１０】
リガンドに対するタンパク質境界の結合ベクトルの均質寄与を測定する方法であって、請求項１または２に記載のアミノ酸を含むフォームで前記タンパク質を生産すること、および前記のタンパク質を、前記リガンドが存在する状態および存在しない状態でＮＭＲスペクトロスコピー（spectroscopy）に供すること、を含む。
【請求項１１】
アイソトーピカリーに代替されたタンパク質を準備する方法であって、請求項１または２に記載の少なくとも１つのアミノ酸を含む媒質で前記タンパク質を表す細胞を培養すること、および前記細胞培養から前記タンパク質を再生することを含む。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の表示】
【０００１】
この出願は、２００２年６月１０日付出願に係る米国仮出願第６０／３８６，７３９号に基づくものであり、かつその優先権の利益を主張するものであって、その内容はそっくりそのままレファレンスとしてここに組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本願は、医薬分子設計の分野に関するものであって、特に広範囲の分子量に亘ってタンパク質およびタンパク質／リガンド複合体の特定の位置からダイナミックおよびエントロピーのデータを得る方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
２つの分子の相互の親和性は、ギブズ・フリー・エナジー方程式（Gibbs'  Free  Energy  Equation）と称される方程式によって表される:
△Ｇ＝△Ｈ−Ｔ△Ｓ
ここに、Ｇはギブズ・フリー・エナジー（Gibbs'  free  energy)、Ｈはエンタルピック（構造的）コンポーネント、Ｓはエントロピーック(ダイナミック)コンポーネントである。もしギブズ・フリー・エナジーの変化がネガティブであれば、分子はおのずと拘束するであろう。逆に、ギブズ・フリー・エナジーが拘束についてポジティブであれば、分子は、直ちに分離するであろう。
【０００４】
ギブズ・フリー・エナジー、２つのコンポーネントパーツを有する。構造的あるいはダイナミックなコンポーネントは、２つの分子の結合自由エネルギーが支配的になりえる。換言すると、２つの分子間の良好な構造的フィットは、伴うエントロピーのペナルティーによるオフセット以上であり得る。あるいは、これとは対照的に、フィット不良の影響は、結合のエントロピーの好ましい変化によって著しく増強されうる。例えば、図１は、２９８Ｋでマウス尿蛋白(ＭＵＰ)に対するリガンドのパネルの相対的結合親和性、およびギブズ・フリー・エナジーのエンタルピおよびエントロピー・コンポーネントの相対的寄与率を示す。現在、多くの分野における科学者は、自由エネルギーを拘束する捉えがたいエントロピー・コンポーネントの測定を得ることに興味を持っており、等温滴定熱量測定および分子動力学シミュレーションを含む様々な生物物理学的方法を使用してそうすることを試みている。例えば、以下の非特許文献参照。
【非特許文献１】ショーエン（Schoen）(生化学  ２８):５０１９−５０２４、１９８９年
【非特許文献２】チェルベナック（Chervenak）およびトーン・ジェイ（Toone、J）、アメリカン・ケミストリー・ソサエティ(Am.Chem. Soc.)１１６：１０５３３−１０５３９、１９９４年
【非特許文献３】ダム他 (Dam et al.)、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリ(J.Biol. Chem.)２７３：３２８１２-３２８１７、１９９８年
【非特許文献４】バンドル他(Bundle et al.)、１２０:５３１７-５３１８、１９９８年
【非特許文献５】ウイリアムズ（Williams）およびバーズリー（Bardsley）、パースペクト・ドラッグ・ディスカバリ・デザイン(PerspectDrug Discov. Design)１７：４３-５９、１９９９年
【非特許文献６】シェファ他(Shafter et al.)、１１３:７８０９-７８１７、２０００年
【非特許文献７】カルデソーン(Caldesone)およびウイリアムズ(Williams)、ジャーナル・アメリカン・ケミストリー・ソサエティ(Am.Chem. Soc.)１２３:６２６２-６２６７、２００１年
【非特許文献８】ハリス他(Harris et al.)、ジャーナル・アメリカン・ケミストリー・ソサエティ(Am.Chem. Soc.)１２３:１２６５８-１２６６３、２００１年
【非特許文献９】クラーク他(Clark et al.)、ジャーナル・アメリカン・ケミストリー・ソサエティ(Am.Chem. Soc.)１２３：１２２３８-１２６６３、２００１年
【非特許文献１０】シャファー他(Schafer et al)、４３:４５-５６、２００１年
【０００５】
これらの現象は、ドラッグデザインに関して重要なインパクトを有する。薬は、人間あるいは病原体生体分子組織の一部に結合する単なる化学物質であり、それによって生物学的機能を阻害したり模倣したりするものである。新医薬品分子のデザインは特別に困難である。というのは、その分子は、有効であるためには、所要の特定の分子ターゲットにしっかりとまだ結合しなければならず、身体の他の莫大な分子のうちのいずれにも結合してはならないからである。したがって、結合時のエントロピー変化を知らないと、興味のあるターゲットに特にしっかりと結合する分子を発見する際において多大なハンディキャップになる。
【０００６】
製薬産業は、望ましい治療効果を持つと分かった、プラント抽出物を分離し濃縮する歴史的に用いられた方法でドラッグデザインの効率を改善することを主に試みており、また試行錯誤化学的改良によって活性成分を改善することを試みている。言うまでもなく、これら前者のプロセスは非常に遅く非能率的であった。新しい方法には、ゲノミクス(人体の全ての構成分子のパーツを識別する)、プロテオミクス(所定の疾病条件に含まれるバイオ分子組織のそれらのパーツを識別する)、コンビナトリアル・ケミストリー(高生産性スクリーニングを使用して、所要の特性に関して急速にテストできる膨大な数の化合物の合成)、およびレイショナル・ドラッグデザイン(興味のある分子ターゲットの高解像度構造データに基づく医薬品の設計)が含まれる。
【０００７】
Ｘ線結晶学は、タンパク質の構造の評価を得るために広く使用され、結晶化したタンパク質のバックボーンの完全な三次構造(グローバルな折り目)を提供することができる。しかしながら、この方法にはいくつかの不都合がある。例えば、結晶化されうるタンパク質だけがＸ線結晶学を使用して研究され得る。いくつかのタンパク質は結晶化が非常に困難であるかあるいは不可能である。さらに、結晶化は、非常に時間がかかり割高でもある。この方法の別の主な不都合は、得られた構造情報が、溶液におけるタンパク質の構造ではなくタンパク質の結晶構造にのみ関係があるかもしれないということである。結晶構造中に見られる結合角は、アクティブなコンホーメーションにある場合には、タンパク質のものと同じではないかもしれず、したがって、興味のある生物学あるいは生理的システムに関する情報を提供しないかも知れない。また、この方法も、リガンドのタンパク質の折畳あるいは結合のエントロピー・コンポーネントに関するどんな情報も提供することができないかも知れない。
【０００８】
鮮明度による標的分子結合のためのドラッグ候補化合物の高生産性スクリーニングは、ターゲットに結合することについて好ましいギブズ・エネルギー変化を有する化合物を検知する。しかし、スクリーニングは、ギブズの自由エネルギー変化のエンタルピあるいはエントロピーのコンポーネントに関する情報を提供できない。反対に、Ｘ線の結晶学的構造データは、結晶化したタンパク質に関係するエンタルピー・データを提供できるが、ダイナミックなデータは得られない。なぜなら、その材料は作動するための技術のために結晶化（硬くなる）しなければならないからである。したがって、製薬産業は、いずれもドラッグデザインの成功に必要とされる完全なデータを供給することができない多数のリサーチプロジェクトに依存することを強いられる。さらにより重要なことは、合理的なドラッグデザインで使用するのに利用可能な技術は、タンパク質へのリガンドの結合のためのギブズの自由エネルギーの変化に対する、タンパク質あるいはリガンドの個々の官能基の寄与についての情報を提供しないことである。事実、ドラッグデザイナーは、現在研究中の医薬品の結合に影響を与える、バイオ分子システムの多くのコンポーネントについての情報なしで進めなければならない。したがって、タンパク質に関する完全なエンタルピおよびエントロピーのデータの双方を確実かつ急速に提供できる技術は、高度に有益である。
【０００９】
高解像度多核のＮＭＲによる蛋白質構造定量もまた有名になった。ＮＭＲスペクトロスコピーでは、強力磁界におけるある原子核（通常、陽子）の磁化は、電波の吸収によって検知される。ＮＭＲは、小さな（＜１ｋＤ）分子の研究および分析の主たるツールになった。タンパク質のようなより大きな分子の分析のためには、それぞれの検知されたＮＭＲ信号の割り当てが信頼性のあるものとなるように、殆どのアプリケーションにおいて、炭素および窒素(１２Ｃおよび１４Ｎ)全般の自然存在比原子をＮＭＲ活性安定同位体１３Ｃおよび１５Ｎで置き換えることが不可欠である。
【非特許文献１１】イクラ他（Ikura et al.）、アブストラクト・アメリカン・ケミストリ・ソサエティ（Abstr.Pap. Am. Chem. Soc.） １９９: ９７−ＰＯＬＹ (１９９０)
【非特許文献１２】イクラ他（Ikura et al.）、アブストラクト・アメリカン・ケミストリ・ソサエティ（Abstr.Pap. Am. Chem. Soc.） １９９: １０７−ＩＮＯＲ (１９９０)
【非特許文献１３】バックス（Bax）、クアー（ Curr）、Opin. Struct. Biol. ４:７３８−７４４ (１９９４)
【００１０】
このタイプの同位体標識(isotopic label)を使用して、ＮＭＲはいくつかのタンパク質の構造を決定するために使用された。
【非特許文献１４】イクラ他（Ikura et al.）、 生化学（Biochemistry）３０: ９２１６-９２２８ (１９９１)
【非特許文献１５】クロアー（Clore）およびグロネンボーン（Gronenborn）、NatureStruct. Biol. ４: ８４９-８５３ (１９９７)
【００１１】
さらに、溶液におけるタンパク質についてＮＭＲを実行できるので、Ｘ線結晶学（それは結晶質を要求する)とは対照的に、ＮＭＲ研究は動的パラメーターを測定できる。
【非特許文献１６】ケイ他（Kay et al.）、生化学（Biochemistry）２８:８９７２-８９７９ (１９８９)
【００１２】
したがって原則として、ＮＭＲは、タンパク質のようなドラッグターゲットに関するエンタルビおよびエントロピーの双方のデータを提供できる。しかしながら、これらの目的のためのＮＭＲの実際の使用は、単に比較的小さな分子に関する研究に制限されている。タンパク質における核（１Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ）の磁化は、増加する分子量でより容易に拡散する傾向があるので、信号対雑音比は研究されている分子のサイズとともに減少し、タンパク質サイズが増加するにつれてデータを解釈することがより困難にしている。したがって、タンパク質の構造決定は約３５ｋＤ以下のサイズに制限されており、ダイナミックス研究は約２０ｋＤ以下の分子に制限されている。実際上、これは、ＮＭＲがドラッグデザイン・プロセスに関して現在まで適度のインパクトだけを与えたことを意味する。本質的には、これは、まず第1に１３Ｃのようなタンパク質ＮＭＲ信号を割り当てるために必要とされるまさにアイソトープが磁化が拡散することを容認するからである。さらに、割り当てられている信号は、近隣のアイソトープによって多重項に分割され、かつこの分割が雑音に対する信号を低下させるからである。
【００１３】
例えばデューテリウムのような追加のアイソトープとの置換を使用して、このデグラデーションを改善する試みは、それらのスピン状態(それらはデューテリウムの場合には1と等しい)の特性に起因して複雑さを加えることができる。デューテリウムリラクゼーションの測定は、理論的な単純性の点で魅力的ではあるが、信号のエネルギーの６６％だけをデューテリウム核におよびデューテリウム核から送信できるので、ＮＭＲ研究では追加の信号の損失に帰着することになり、４３％の効率になる。
【非特許文献１７】ムハンディラム他（Muhandiram etal.）、ジャーナル・アメリカン・ケミカル・ソサエティ（ J. Am. Chem. Soc.）１１７:１１５３６-１１５４４ (１９９５)
【００１４】
これらＮＭＲ構造定量で遭遇した問題は、大部分は全般にアイソトープが豊富な研究用タンパク質の使用による。そのようなタンパク質が使用されるが、それは現在、市販されている利用可能な標識化システム(labeling system)がランダムで普遍的な濃縮のみを産出するからである。そのような普遍的な標識化は、ＮＭＲスペクトルにおける分割信号を生み出し、構造決定前に割り当てられるべきそれぞれが開始しうる。信号を分割すると、より多くのより弱い信号となる。この現象は、信号の重なりとはるかに劣った信号対雑音比を生じさせ、そのいずれも割り当て処理をより一層困難にし、またそのいずれもタンパク質サイズで大幅に増加させられる。したがって、実際上、これらの方法は、小さなタンパク質のかなり正確な構造のみを提供できる。
【００１５】
最近、これらの問題を克服し、劇的に、タンパク質の構造研究におけるＮＭＲスペクトルの分解能および感度を増加させることを試みる方法は記述された。これらの方法は、背骨のみにおけるタンパク質の特定のアイソトープの濃縮を利用するもので、それは、ＮＭＲ信号の検出および割り当て、およびタンパク質の構造の計算の双方を非常に促進する。
【非特許文献１８】コーリン他（Coughlin et al.）、ジャーナル・アメリカン・ケミカル・ソサエティ（J. Am. Chem. Soc.）１２１, １１８７１-１１８７４、１９９９）
【非特許文献１９】ギエセン他（Giesen et al.）、J. BIOMOL. ＮＭＲ１９、 ２５５−２６０、２００１
【非特許文献２０】ギエセン他（Giesen et al.）、J. Biol. ＮＭＲ、ｐｐ．１−９、２００２
【００１６】
いくつかの研究がタンパク質ダイナミックスのる研究のためのＮＭＲ方法を開発するためになされている。結合のエントロピーの寄与に関するこれらの研究はタンパク質における側鎖メチル基に注目した。これらの研究は、１３ＣＨ２Ｄまたは１３ＣＨＤ２のアイソトポマーにおいて１３Ｃあるいは２Ｈリラクゼーション手段のいずれかをそれぞれ使用している。
【非特許文献２１】リー他（Lee et al.）、Nature STR. BIOL. ７: ７２−７７。２０００
【非特許文献２２】ムハンディラム他（Muhandiram etal.）、ジャーナル・アメリカン・ケミカル・ソサエティ（J. Am. Chem. Soc.）１１７: １１５３６−１１５４４、１９５５
【非特許文献２３】ヤング他（Yang et al.）、J.Mol. Biol. ２７６: ９３９−９５４、１９９８
【非特許文献２４】ミッターメイヤー他（Mittermaieret al.,）、J. BIOMOL. ＮＭＲ１３: １８１−１８５、１９９９
【非特許文献２５】リー他（Lee et al.）、 J.Am. Chem. Soc. １２１:２８９１−２９０２、１９９９
【非特許文献２６】イシマ他（Ishima et al.）、J. Am. Chem. Soc. １２１: １１５８９−１１５９０、１９９９
【非特許文献２７】イシマ他（Ishima et al.）、J.Am. Chem. Soc. １２３: ６１６４−６１７１、２００１
【非特許文献２８】スキリコブ他（Skrynnikov etal.）、J. Am. Chem. Soc. １２３: ４５５６−４５６６、２００１
【００１７】
しかしながら、構造の研究でのように、ダイナミックスとエントロピーの測定を非常に小さなタンパク質に制限したここまで試みられたすべてのアプローチに関する感度問題がある。強制的な理由が可能な場合に２Ｈリラクゼーション測定を選ぶために存在するが、実際上、１３Ｃリラクゼーション測定は相当により敏感である。
【非特許文献２９】ムハンディラム他（Muhandiram etal.）、ジャーナル・アメリカン・ケミカル・ソサエティ（J. Am. Chem. Soc.）１１７: １１５３６−１１５４４、１９９５
【非特許文献３０】リー他（Lee et al.）、ジャーナル・アメリカン・ケミカル・ソサエティ（J.Am. Chem. Soc.）１２１: ２８９１−２９０２、１９９９
【００１８】
確かに、リガンド−タンパク質相互作用の熱力学用のモデル系としてのマウス主要尿蛋白(ＭＵＰ)を用いる研究において、唯一の適度なサイズのタンパク質(〜１９ｋＤ)にもかかわらず、共振重なりおよび比較的貧弱な感度の統合効果によりメチル１３Ｃ、５０％２Ｈ−濃縮タンパク質におけるバリン・メチル基のための正確な２Ｈリラクゼーション速度を測定する際に、相当な困難が経験された。低感度は、１３ＣＨ２Ｄアイソトポマーだけが２Ｈリラクゼーション測定で検知されたという事実に由来したが、サンプルは、最適化された標識化スキームでさえ、あらゆる２Ｈアイソトポマーを含んでいた。
【非特許文献３１】イシマ他（Ishima et al.）、J.BIOMOL. ＮＭＲ２１: １６７−１７１，２００１
【００１９】
それゆえ、サンプルにおける有効なタンパク質濃度は相当に減じられた。
【００２０】
したがって、感度はより大きなタンパク質において特に重要なので、１３Ｃリラクゼーション測定はそのような分子のシステムのための唯一の可能なアプローチである。タンパク質における側鎖メチル基に関する１３Ｃリラクゼーション研究は典型的には１３ＣＨＤ２アイソトポマーを含んでいる。ここに１３Ｃリラクゼーション・メカニズムは、単一の陽子がある状態で特に真直ぐである。従来の１３Ｃが豊富で断片的に重水素を含んだメディアの使用によってバクテリアに過剰表示されたタンパク質においてそのようなアイソトポマーを得ることができる一方、再び、あらゆる２Ｈアイソトポマーはこれらのシステムで得られる。したがって、所望のアイソトポマー(１３ＣＨＤ２)は、不適当なもの(１３ＣＨ２Ｄ、１３ＣＨ３，１３ＣＤ３)によって薄められる。このため分解能と感度の両方が損なわれ、適度のサイズ・タンパク質でさえ、例えば２０ＫＤ以上のタンパク質でさえ、特に厳しくなる。
【００２１】
追加の問題は、多数のアイソトポマーを備えた部分的に重水素を含んだタンパク質における測定されたリラクゼーション速度への試みに帰着する場合がある。したがって上に引用されたＭＵＰシステム上のリラクゼーション測定がはるかに高感度であったが、選択的に１３ＣＨＤ２アイソトポマーから共振を検知するために設計された再焦点ＩＮＥＰＴにおける１３ＣＨ３アイソトポマーからの共振を汚染する存在が部分的に起因して、共振重なりは非常におおきいものであった。１３ＣＨ３アイソトポマーはデューテリウム同位体効果により、１３ＣＨＤ２アイソトポマーとは異なる化学シフトで共鳴し、そして、ＣＨ３グループにおける１３Ｃスピン３／２と１／２スピン・マニフォールドのタンパク質において異なるリラクゼーション速度の結果として再び焦点が当てられたＩＮＥＰＴ研究で不完全に抑えられる。
【００２２】
而して、このタイプの共振重なりの困難性および感度の関連する欠如を克服するために、従来利用不可能な新しい標識化の戦略は、薬候補のようなリガンドと錯体を形成したアポ-タンパク質(apo-proteins)およびタンパク質(proteins)に対するダイナミックスおよび関連エントロピー値を測定することが要求される。したがって、タンパク質、とくに薬または薬の候補のようなリガンドに結合するはタンパク質のような薬ターゲット上のエンタルピおよびエントロピーの双方のデータを提供できる技術プラットフォームの必要がある。また、ダイナミックなデータがタンパク質とそれらの薬候補との複合体のために得ることができるサイズ範囲の重要な増強を達成するＮＭＲスペクトロスコピーのための方法を提供する必要がある。ドラッグデザインの援助として官能基ベースによって官能基上でそうすることができるシステムは、特に有用であろう。
【発明の開示】
【発明が解決するための手段】
【００２３】
而して、本発明の実施形態は、膜タンパク質および多重タンパク質複合体を含む広範囲の分子量（例えば１０ｋＤないし１５０ｋＤのような）について、タンパク質およびタンパク質/リガンド複合体に関するダイナミックデータを得るために使用できる方法および材料を提供する。とくに、本発明の実施形態は、大きなタンパク質およびタンパク質システム上に関して情報が得られることを可能にし、また検査されるべき結合することに関する単一の官能基の寄与を可能にするＮＭＲスペクトロスコピーを用いて、タンパク質およびタンパク質/リガンド複合体のダイナミックスの測定の感度および分解能を著しく増強する方法を提供する。
【００２４】
本発明の１つの側面によると、ダイナミックが測定されるべき、ＮＭＲ不活性結合ベクトルで囲まれた少なくとも1つのアイソトープで標識化された(labeled)結合を含むタンパク質が提供される。このようにして、拡散に起因する信号の損失が最小限にされる一方、ＮＭＲ実験の感度および分解能が最大限にされる。
【００２５】
本発明の他の側面によると、ＮＭＲによって研究することが望まれる、タンパク質におけるアミノ酸の側鎖における位置での分離された１３Ｃ−Ｈベクトルを除いて、実質的に完全に１２Ｃ、１４Ｎおよび２Ｈ核からなるタンパク質を準備するおよび分析する方法が提供される。
【００２６】
本発明の更に別の側面によると、ＮＭＲによって研究することが望まれる、タンパク質におけるアミノ酸の側鎖における位置での分離された１５Ｎ−Ｈベクトルを除いて、実質的に完全に１２Ｃ、１４Ｎおよび２Ｈ核からなるタンパク質を準備するおよび分析する方法が提供される。
【００２７】
本発明の特に好ましい側面によると、ＮＭＲによって研究することが望まれる、タンパク質におけるアミノ酸の側鎖における位置での分離された１３Ｃ−Ｈベクトルを除いて、実質的に完全に１２Ｃ、１４Ｎおよび２Ｈ核からなるタンパク質が提供される。
【００２８】
本発明の特に好ましい他の側面によると、ＮＭＲによって研究することが望まれる、アミノ酸の側鎖における位置での分離された１３Ｃ−Ｈベクトルを除いて、完全に１２Ｃ、１４Ｎおよび２Ｈ核からなるアミノ酸の化学合成のための方法が提供される。
【００２９】
本発明の更に他の側面によると、ＮＭＲによって研究することが望まれる、アミノ酸の側鎖における位置での分離された１５Ｎ−Ｈベクトルを除いて、完全に１２Ｃ、１４Ｎおよび２Ｈ核からなるアミノ酸の化学合成のための方法が提供される。
【００３０】
本発明の更に他の側面によると、アイソトーピックスクランブリングの防止を提供する、特に標識化されたアミノ酸を含むんでいる媒体における細胞の培養のための方法が提供される。
【００３１】
本発明の実施形態は、アミノ酸の側鎖における少なくとも1つの結合ベクトルが互いに結合した２つのＮＭＲ活性核からなり、かつ実質的に他のすべての核がＮＭＲ不活性である、アミノ酸を提供する。本発明の実施形態は、アミノ酸の側鎖における少なくとも1つの結合ベクトルが互いに結合した２つのＮＭＲ活性核からなり、かつ実質的に他のすべての結合ベクトルがＮＭＲ不活性である、アミノ酸を更に提供する。
【００３２】
発明の実施形態は、２つのＮＭＲアクティブ核が１３Ｃと１Ｈであり、アミノ酸における炭素原子の残りが実質的に１２Ｃであり、アミノ酸における窒素原子が実質的に１４Ｎであり、アミノ酸における水素原子の残りが実質的に２Ｈである、上述したようなアミノ酸をさらに提供する。本発明の実施形態は、２のＮＭＲアクティブ核が１３Ｃおよび１Ｈであり、アミノ酸における炭素原子の残りが実質的に１２Ｃであり、アミノ酸における窒素原子が実質的に１４Ｎであり、アミノ酸における炭素原子が実質的に１２Ｃであり、アミノ酸における水素原子の残りが自然存在比である、上述したようなアミノ酸をも提供する。本発明の実施形態は、アミノ酸における窒素原子の残りが実質的に１４Ｎであり、アミノ酸における炭素原子が実質的に１２Ｃであり、アミノ酸における水素原子の残りが実質的に２Ｈである、上述したようなアミノ酸をさらに提供する。発明の実施形態は、２つのＮＭＲアクティブ核が１５Ｎおよび１Ｈであり、アミノ酸における窒素原子の残りが実質的に１４Ｎであり、アミノ酸における炭素原子の残りが実質的に１２Ｃであり、アミノ酸における水素原子の残りが自然存在比である、上述したようなアミノ酸をも提供する。
【００３３】
発明の実施形態は、例えば上述したようなアミノ酸を含むバクテリア、酵母、哺乳動物、あるいは昆虫細胞、および上記述したような少なくとも1つのアミノ酸を含むタンパク質のような、タンパク質生産細胞の成長にふさわしい培養液をも提供する。
【００３４】
さらに、本発明の実施形態は、上述したようなアミノ酸を含む形式のタンパク質を生産し、該タンパク質をＮＭＲスペクトロスコピーにかけるという、タンパク質の結合ベクトルのダイナミックスを分析する方法をも提供する。本発明の別の実施形態は、上記述したようなアミノ酸を含む形式でタンパク質を生産すること、および該タンパク質を、リガンドがある状態および欠如する状態でＮＭＲスペクトロスコピーにさらすことからなる、リガンドへのタンパク質境界の結合ベクトルのエントロピーの寄与を決定する方法を提供する。
【００３５】
本発明の実施形態は、更に、上述したような少なくとも1つのアミノ酸を含む媒質においてタンパク質を示す細胞を培養すること、および該培養液または該細胞からタンパク質を再生することを含む、アイソトープで代用されたタンパク質を準備する方法をも提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
背骨におけるタンパク質の特定の標識化は、タンパク質の背骨信号の割り当てを促進するために高解像度および機密データを提供するのに（非特許文献３２，３３）およびグローバルフォールドの定量（非特許文献３４）に非常に有効であることが示された。
【非特許文献３２】コーリン他（Coughlin et al.）、 J Am. Chem. Soc. 121, １１８７１−１１８７４、１９９９
【非特許文献３３】ギーセン他（Giesen et al.）, J. Biomol. ＮＭＲ １９, ２５５−２６０、２００１
【非特許文献３４】ギーセン他（Giesen et al.）、J. Biol. ＮＭＲ、pp. １−９、２００２
【００３７】
同様なやり方で、本発明の実施形態は、タンパク質あるいはタンパク質/リガンド複合体におけるアミノ酸の側鎖における特定の標識化を提供し、それにより関連するアミノ酸側鎖のダイナミックを決定するＮＭＲ研究の感度および分解能を増加させる。本発明の実施形態は、さらに、純粋な１３ＣＨ２アイソトポマー、例えば、もっとも敏感なアイソトポマーである（１３Ｃγ１γ２ＨＤ２）２１２Ｃα、βＤ−Ｌバリンを含むアミノ酸を生産する方法を提供する。さらに、本発明の実施形態は、ＮＭＲ非可視性環境において含まれるべきアイソトポマーのための方法を提供し、それによって分解能を最大限にし感度をさらに増加させる。タンパク質は、所要のタンパク質を表示しあるいは過剰表示する細胞成長用の適切なバクテリア、酵母、昆虫あるいは哺乳類の増殖培地に所要のアミノ酸を、含めることにより準備される。生じるタンパク質は、例えばバリンあるいはリジン等のアミノ酸の所要の種にのみアイソトーピカリーにエンリッチされた原子を含んでおり、それによってＮＭＲ研究の分解能および感度を最大化している。
【００３８】
本発明は、ＮＭＲによって今までよりも相当に大きなサイズのタンパク質、すなわちタンパク質/薬複合体、の側鎖のダイナミックスを速やかに決定するための手段を提供する。用語「ダイナミックス」は、リガンドの結合と共に、あるいはその結合なしで、タンパク質の３次元の構造および情報に対して、タンパク質における特定の原子あるいは結合ベクトルのエントロピーのコンポーネントに言及するものである。本発明は、拡散するＮＭＲ研究におけるこれらの原子の磁化の傾向を同時に減じながら、タンパク質における１つ以上のアミノ酸における１以上ペアの原子から重要な信号の分解能を増加させることによって、この情報が得られるようにしている。これは、互いに共有結合された１対以上のＮＭＲアクティブ核（例えば、１Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ）を備えた側鎖におけるタンパク質におけるアミノ酸の１つ以上に特別に標識化することにより遂行される。アミノ酸の側鎖およびバックボーンの双方の他のすべての原子は、感度ロスを最小限にし、かつ分解能を増加させるために好ましくは選択される。好ましくは、標識化されたアミノ酸におけるＮＭＲアクティブ原子の結合したペアは、-１３ＣＨＤ２−、−１３ＣＨＤ−、−１３ＣＨグループおよび１５ＮＨグループに含まれる １Ｈおよび１３Ｃ、あるいは１Ｈおよび１５Ｎであり、また、タンパク質における他のすべての核は実質的に１２Ｃ、１４ＮおよびＤ(２Ｈ、デューテリウム)である。他のすべての結合ベクトルがＮＭＲ不活性である場合、単結合ベクトルが２つのＮＭＲ活性核からなるように、本発明の実施形態の方法および組成は、イソトーピカリーに代替されあるいはエンリッチされる。好ましくは、他のすべての原子はＮＭＲ不活性である。
【００３９】
ＮＭＲ活性核に言及するときの用語「アクティブ」は、ＮＭＲ研究の技術における一般的用法にしたがって使用される。自然存在比は、自然界に生じる原子のアイソトープに言及する。当該分野における熟練者の一人は、原子が自然界における単一のアイソトープに存在しないこと、したがって、例えば炭素のような原子は１２Ｃとして大部分が存在するであろうだけでなく、１３Ｃとしてもある度自然に存在するであろうと、認識するであろう。したがって、しかしながら標識化されない炭素を含む分子も同様に他の少量のアイソトープを含むであろう。したがって、実質的に１２Ｃである分子における炭素位置は、自然界に生じるの同じあるいは実質的に同じ比率（存在率）で１２Ｃを含む。窒素と水素のような他の原子が、異なるアイソトープとして自然に生じ、それゆえ「自然存在比」および「実質的に」の用語は、任意の原子に対して類似の方法で理解され得るであろう。当該技術における熟練者のうちの一人は、またアイソトープで代用された原子がまた定期のアイソトープの１００％ではないが定期のアイソトープにおいてやや豊かになることを認識するだろう。アイソトーピカリーに代替された原子もまた定期アイソトープの１００％でないが、定期アイソトープにおいてエンリッチされている。エンリッチという用語は、自然存在比より最大で約５〜１００％、好ましくは約５〜２０％、あるいは約１０〜２０％、あるいは最適には約１０％大きいアイソトープに言及するものである。
【００４０】
本発明の方法は、長さが３以上のアミノ酸の任意のペプチド分子のダイナミックな情報の定量にふさわしく、したがって、タンパク質とペプチドの双方を包含するが、説明の単純化のために、タンパク質のみに言及する。この出願において使用される「タンパク質」という用語は、３以上のアミノ酸の任意のペプチド分子、例えば約５ｋＤあるいはそれより大きな分子量のペプチドおよびタンパク質、に言及するものであると理解される。したがって、本発明の組成および方法は、約５ｋＤ以上の分子量があるタンパク質、あるいは約５０アミノ酸残基あるいはそれ以上のタンパク質に関して有利に使用され得る。これらの方法は、従来の方法を用いて研究することが困難であった特に２０〜３０ｋＤのタンパク質に、また５０あるいは５５ｋＤ以上のタンパク質、あるいは７５ｋＤ以上、あるいは１００ｋＤ以上のタンパク質にでさえもより好適に有用である。したがって、５０、６０、７０、８０、９０、１００以上、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０ｋＤあるいはそのようなタンパク質の複合体のどんなタンパク質も、この発明の実施形態に係る構造的およびダイナミック情報定量にふさわしい。これらの方法は、膜タンパク質を研究するためにも使用され得る。もちろん、より小さなタンパク質およびペプチドは、オリゴペプチドおよび３以上のアミノ酸の如何なるペプチドをも含む本発明の方法を使用して研究しうる。例えば、特に標識化されたアミノ酸を含むタンパク質は、スクラッチあるいは自然なアミノ酸から始まることから化学上合成されるか、あるいは細菌性、酵母、哺乳類あるいは昆虫細胞によって培養における細胞によって表示され得る。
【００４１】
タンパク質のアミノ酸は、スペクトルにおいて目に見えることが要求される原子だけが検知されるように、ＮＭＲ関連アイソトープ２Ｈ、１３Ｃおよび(または)１５Ｎの任意のコンビネーションを備えた特定の位置で標識付けされる。当該技術の熟練者達は、ＮＭＲによってタンパク質ダイナミックスの解明において要求される重要なステップは、例えばＣ−Ｈ、Ｎ−Ｈ結合ベクトルのような、結合ベクトルからの磁化の崩壊速度の測定である、と認識するであろう。測定されるベクトルは、分析されることが望まれるアミノ酸あるいは酸における１３Ｃ−Ｈあるいは１５Ｎ−Ｈ結合ベクトルを形成するために１３Ｃまたは１５Ｎで標識付けされる。如何なる結合ベクトルは、特に、ＮＭＲアクティブなアイソトープ１Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏあるいは他の必要なアイソトープのような、適切なアイソトープで標識付けできるが、結合ベクトルの残りは、ＮＭＲ不活性であり、２Ｈ（Ｄ）、１２Ｃ、１４Ｎ、１６Ｏ等からなる。これは、アイソトープ・タイプによって例えば市販の１５Ｎ２−リジン(ケンブリッジ・アイソトープ研究所)で全般にどちらかと分類されたアミノ酸、あるいは、タンパク質合成中に部分的であるがランダムに標識化されたアミノ酸の場合の初期の方法と対照的である（非特許文献３５〜３７参照）。
【非特許文献３５】ローゼン、エム．ケイ．(Rosen, M. K.) 、ガードナー、ケイ．エイチ．（Gardner, K. H.）、 ウイリアムズ、アール．シー．（Willis, R. C.）、パリス、ダブリュ．イー．（Parris, W. E.）、パウソン、ティー（Pawson, T.）、およびケイ、エル．イー．（Kay, L. E.） (１９９６) R Mol. Biol. ２６３、６２７−６３６
【非特許文献３６】ガードナー、ケイ．エイチ．（Gardner, K. H.）、ローズン、エム．ケイ．（Rosen, M. K.）、およびケイ、エル．イー．（Kay, L. E.）(１９９７) Biochemistry ３６、１３８９−１４０１
【非特許文献３７】ガードナー、ケイ．エイチ．（Gardner, K. H.）、およびケイ、エル．イー．（Kay, L. E.） (１９９７) J. Am. Chem. Soc. １１９、７５９９−７６００)
【００４２】
磁化の崩壊速度は、結合ベクトルのダイナミックエネルギーの逆関数である。ＮＭＲによって分析のために標識付けされる結合ベクトルは、タンパク質における重要な任意の結合ベクトルであっても良い。しかしながら、適宜、選択の結合ベクトルはしばしば近くになり、好ましくは、タンパク質のリガンド結合領域が研究されるときに最大の感度用のアミノ酸側鎖の終点になるであろう。
【００４３】
当該分野における熟練した者によって、アミノ酸の側鎖の多くは(ＣＨ３)−、および−(ＣＨ２)−グループからなる、ということが評価されるであろう。したがってそのようなグループにおける特別のＣ−Ｈ結合ベクトルの最大感度のために、そのグループで共有結合された他の陽子は、関心のあるＣ−Ｈ結合ベクトルが分離されてその磁化の保持が増強されるように、好ましくは重水素と置き換えられる。したがって、研究されることが望まれるＣ−Ｈ結合ベクトルは以下のように標識付けされることが特に好ましい:１３ＣＨＤ２、−１３ＣＨＤ−、および−１３ＣＨ−。好ましくは、タンパク質のアミノ酸の他のすべての炭素、窒素および水素原子は、ＮＭＲ不活性である（例えば、１２Ｃ、１４Ｎ、およびＤ（デューテリウム））。本発明の他の特に好ましい実施形態においては、研究のための分離された結合ベクトルは、上述した戦略と類似して、１５ＮＨまたは１７ＯＨであり、タンパク質ＮＭＲ不活性のアミノ酸の他のすべての原子を備えている。
【００４４】
アミノ酸は、様々な手段によって標識化されない形式で化学上合成されており、またいくらかはアイソトーピカリーに標識化された形式で合成されている（非特許文献３８参照）
【非特許文献３８】マーチン（Martin）、 Isotopes Environ. Health STUD., ３２、１５、１９９６,  シュミット（Schmidt）、IsotopesEnviron. Health STUD.,３１、１９９５、１６１1
【００４５】
而して、ラグナルソン他（Ragnarsson et al.）（J. Chem. Soc. Perkin Trans 1: ２５０３、１９９４)は、１，２−１３Ｃ２、１５Ｎ  Ala、Phe、Leu、Tyr、１，２−１３Ｃ２、３’、３’、３’−２Ｈ３、１５Ｎ Alaおよび１、２−１３Ｃ２、３’、３’−２Ｈ２、１５Ｎ Pheおよび３’、３’、３’−２Ｈ３を合成した。またラグナルソン（１７）（Ragnarsson）は、１、２−１３Ｃ２、２−２Ｈ、１５Ｎ Ala, LeuおよびPheおよび１、２−１３Ｃ２、２，２−２Ｈ２、１５Ｎ  Ｇlyを合成した、これらは、ペンタペプチドに関するCONFORMATIONAL研究、Leu‐エンケファリンに部分的に使用された。これらは、ペンタペプチド、レウ‐エンケファリン（Leu-enkephalin）の確認研究のために部分的に使用された。ウンケファー（Unkefer）は、１５Ｎと符号付されたAla, Val, Leu, Pheおよび１−１３Ｃ、１５Ｎ Val.を合成した。より最近には、アミノ酸と分類されたバックボーンの準備のための方法が開発されている。また、これらはバックボーン信号の割り当てに使用され、またタンパク質のバックボーングローバルフォールドを決定するためにも用いられている。これらのすべての場合に、適切なアミノ酸側鎖のステレオ選択的な追加は、キラルの複合体において誘導体になったグリシンに加えられた。
【００４６】
細胞培養中のタンパク質における特定の１３Ｃと標識化されたアミノ酸の選択的な陽子の付加のためのアミノ酸プレカーサーが記述された。これらの材料、１３Ｃ４−３、３−２Ｈ２−α-イソブチレートおよび１３Ｃ５−３−２Ｈ−α―イソケトバレレイト（isoketovalerate）は、バクテリアに表わされた、プリジュウテリウム化（perdeuterated）されたタンパク質における、１３ＣＨ３−メチル・ロイシン、イソロイシン(isoleucine)およびバリン(valine)残留物を生産するために使用された。
【非特許文献３９】ローゼン他（Rosen et al.）、 J. Mol. Biol. ２６３、 ６２７−６３６、１９９６
【非特許文献４０】ガードナー他（Gardner et al.）、 Biochemistry ３６、 １３８９-１４０１、 １９９７
【非特許文献４１】ガードナー他（Gardner et al.）、 J. Am. Chem. Soc. １１９、７５９９−７６００、１９９７
【００４７】
ごく最近では、ターミナル１３ＣＨ３グループを含む標識化されていないα―イソブチレート（isobutyrate）およびα―イソケトバレレイト（isoketovalerate）も、ほとんど同じ目的のために記述された。
【非特許文献４２】ハジュク他（Hajduk et al.）、J. Am. Chem. Soc. １２２、 ７８９８−７９０４、２０００
【００４８】
これらの方法および材料はすべて、ＮＲＭによるタンパク質の分析の範囲を増加させた。しかしながら、これらのラベリング法およびそれらが許容するＮＭＲ分析操作法は、ＮＭＲ分析の最大可能感度を提供しないし、また、それらはあらゆるタンパク質タイプに適用可能でない。さらに、すべての標識化パターンは、すべてのアミノ酸タイプには適用可能とは限らない。例えば、パージュウテリウム化（perdeuterated）環境における、１３ＣＨ３−メチル・ロイシン、イソロイシンおよびバリン残留物は、それらの残留物タイプあるいはそれらに近いものを含む研究に対してのみ価値のあるものである。結合する研究に潜在的に興味のあるフェニルアラニンのような他の疎水性の種を含む他の残留物は、このように研究できない。
【００４９】
したがって、本発明の特に好ましい側面は、（１３ＣＨＤ２）−および/または―（１３ＣＨＤ）−および/または−（１３ＣＨ）−および/または−（１５ＮＨ）−部分を備えた側鎖において特に標識化された２０のアミノ酸すべての合成のための方法であり、該タンパク質のアミノ酸の他のすべての部分は、実質的に１２Ｃ、１４Ｎおよびデューテリウムのフォームである。特にこのように標識化されたアミノ酸は、アイソトーピカリーに標識化された側鎖プレカーサーを使用した上で引用されたようなグリシンからの不斉合成によって合成され得る。１３ＣＨＤ２に標識化されたヨウ化メチルのようなプレカーサーは商業上利用可能である。好ましくは、したがって、アミノ酸は、１３ＣＨＤ２標識化されたヨウ化メチルのような特に標識化されたプレカーサーから準備されて、側鎖プレカーサー自体を使用して、グリシンから合成される。
【００５０】
上述のように、グリシンからのアミノ酸の合成のための多くの方法が記述されている。
【非特許文献４３】デサラー（Duthaler）, Tetrahedron ５０、１５３９、１９９４
【非特許文献４４】ショルコフ（Schollkoph）、Topics Curr. Chem., １０９ (６５): １９８３
【非特許文献４５】オポルツアー（Oppolzer）、Tett. Letts., ３０: ６００９、１９８９
【非特許文献４６】ヘルベチカ  チミカ  アクタ（Helvetica Chimica Acta）、７７: ２３６３、１９９４
【非特許文献４７】ヘルベチカ  チミカ  アクタ（Helvetica Chimica Acta） ７５: １９６５、１９９２
【００５１】
これらは本発明に従って使用されてもよい。しかしながら、本発明の好ましい側面において、グリシンは、最初にベロコン他（Belokon et al.)の方法によるニッケルII遷移金属錯体に変換される。
【非特許文献４８】R Chem. Soc. Perkin. Trans. １: １５２５-１５２９、１９９２
【００５２】
その後、誘導体化されたグリシンは、水酸化ナトリウム、あるいはナトリウムメトキシド、あるいは好ましくは、カリウムt-ブトオキサイド（butoxide）のような、ベースでの処理によってアルキル化され、続いて適切な側鎖プレカーサーが追加される。プレカーサーは、必要に応じて１３Ｃ−１Ｈおよび／または１５Ｎ−Ｈ標識、および、適切な位置で、臭化物、ヨウ化物、４-ナイトロベンゼンスフォネイト（nitrobenzenesufonate）などのような化学の脱離基に結合した他のすべての位置の１２Ｃ、１４Ｎおよび２Ｈを含む、アルキル基の鎖である。
【００５３】
このタイプのプレカーサーは、商業上利用可能な材料から容易に合成することできる。したがって、(１３ＣＨＤ２)２-ＣＤ−ヨウ化物、特に標識化されたバリン用の所要のプレカーサーは、マグネシウムおよび重水素を含んだギ酸エチルを用いたグリニャール反応を介して、１３ＣＨＤ２に標識化されたヨウ化メチル、および特に標識化されたイソプロピルアルコールのハロゲン化から準備できる。図２参照。その後、この特に標識化された側鎖は、酸加水分解によって得られる、所要の特に標識化されたバリンを備えたキラルの複合体として誘導体になったグリシンに加えることができる。図３参照。
【００５４】
あるいは、特に標識化されたイソプロパノールは、特に標識化されたロイシン用の必要なプレカーサーを産出するために、ディメチルオクソサルノニウム・メチライド（dimethyloxosufonium methylide）のようなメチレン基を含むドナーでの処理によって拡張された、相応して標識化されたアセトンおよび炭素連鎖に酸化できる。図４参照。上述のようなグリシン複合体のヨウ化物を追加すると、特に１３ＣＨＤ２に標識化されたロイシンが生成される。
【００５５】
あるいは、１３ＣＨＤ２ヨウ化物は、図５において示される、保護されたベータ・メルカプト・エタノールで反応させることができる。グリシン複合体およびその後の酸加水分解で特に１３ＣＨＤ２に標識化されたチオ・エーテルの反応は、メチオニンを生成する。このようにして、すべてのアルキル基のアミノ酸の特に標識化された側鎖を構築することができる。
【００５６】
次の実施例は、例示するためのものであって、ここにクレームされた発明を制限するものではない。
【実施例１】
【００５７】
Ｌ−（１３Ｃγ１γ２ＨＤ２）２１２Ｃα、βＤ−Ｌ−バリンの合成
マグネシウム・ダライ粉（６．０８ｇ、２５０．００ ｍｍｏｌ（２．５０と同等なもの））および無水エーテル（１００ mL）を、コンデンサ、機械的撹拌機および加熱マントルを装備した３首５００ｍｌの丸底フラスコへ加えた。その混合物を静かな還流液のもとで撹拌し加熱した。無水エーテル（５０ｍＬ）における１３ＣＨＤ２−Ｉ(ケンブリッジ・アイソトープ研究所、２８．９９ｇ、２００．００ ｍｍｏｌ（２．００と同等なもの))を３０分間に亘ってＭｇ/エーテル混合液中に滴下的に加え、還流が加熱マントルでさらに２時間続けてグリニャール試薬を形成した。その後、反応物を氷浴で冷却した。
【００５８】
無水エーテル（５０ｍｌ）におけるＤ−ＣＯ−ＯＣＨ３(ケンブリッジ・アイソトープ研究所)、６．１１g、１００．００ ｍｍｏｌ、１．００と同等なもの)を１５分間グリニャール試薬へゆっくり加えた。氷浴を取り除き、反応液をさらに４時間撹拌した。その後、その反応液を再び氷浴で冷却し、飽和した水性のＮＨ４Ｃｌ溶液（３５ｍＬ）を、グリニャール反応を消すために１５分間ゆっくり加えた。反応液をろ過し、固体をエーテル（２×１００ｍＬ）ですすいだ。組み合わせたエーテル溶液を乾かして（ＭｇＳＯ４）、ろ過した。濾液を、グラス螺旋を含む１０インチのカラムによってゆっくり注意深く蒸留した。蒸留液の温度が４０℃に達した時、残りの液体を、１５ｍＬの洋ナシ形フラスコへ移し、1-インチビグロウカラムによって蒸留して（１３ＣＨＤ２）１２ＣＤ−ヨウ化物（１．４６ｇ、２１．７６  ｍｍｏｌ、２１．７６％産出、Ｆ.Ｗ＝６７．１１; ｂｐ ７８-８２°C）。
【００５９】
ベルコン他（Belokon et al.）の方法によって実質的に準備されたＢＰＢ−Ｎｉ(II)-Ｇｌｙ赤複合体(７．２２ｇ、１４．４９ ｍｍｏｌ（１．００と同等なもの))を、室温で無水のＣＨ３ＣＮ(２００ mL)中にサスペンドした。無水ＣＨ３ＣＮ(１０ｍＬ)中の(１３ＣＨＤ２)１２ＣＤヨウ化物（２．８３ｇ、１５．９９ ｍｍｏｌ（１．１０と同等なもの））を、赤反応サスペンションに加え、ＮａＯｔＢｕ（（１．５４ｇ、１６．０２ ｍｍｏｌ（１．１１と同等なもの））で５分後について行った。４時間後、薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、アセトン/ＣＨＣｌ３=１／５）は、反応しない出発物質の跡の存在およびより高いＲｆ値を備えた主なスポットの存在を明らかにした。したがって、したがって、氷酢酸（３．８４ｇ、３．６６ｍＬ、ｄ＝１．０４９、６３．９５ ｍｍｏｌ(４．４１と同等なもの))を反応を消すために付け加えた。
【００６０】
反応液を減圧下で凝縮し、Ｈ２Ｏ（１Ｌ）を含む２Ｌのエルレメンメイヤー（Erlenmeyer）フラスコへ注いだ。混合物をＣＨ２Ｃｌ２（３×２００ｍＬ）で抽出し、組み合わせた有機質層をＨ２Ｏ（２×２００ｍＬ)そして次に塩水溶液（２００ｍＬ）で洗浄した。器官活動相が乾燥し（ＭｇＳＯ４）蒸発して、赤い天然の泡状グラスが提供された。天然のままの産物を溶離剤としてのアセトンであるクロロホルムを使用して、シリカゲル上のフラッシュ・カラムクロマトグラフィーによって更に浄化した。適切なフラクションを組み合わせて蒸発させて乾燥させた。残留物は１：１、トルエン：ＭｅＯＤ（Isotec、１００ｍＬ）に溶かして、ナトリウム金属（２００ｍｇ）で処理し、全体を加熱して一晩還流させた。冷却においては、反応混合物を、ディウテロ（deutero）-酢酸（ケンブリッジ・アイソトープ研究所、１ｍＬ）で処理し、減圧下で凝縮した。混合物をＣＨ２Ｃｌ２（３×２００ｍＬ）で抽出し、組み合わせた有機質層を、Ｈ２Ｏ（２×２００ｍＬ）そして次に塩水溶液（２００ｍＬ）で洗浄した。器官活動相は乾燥し（ＭｇＳＯ４）、蒸発した。生じた赤い泡状のグラスを、塩化メチレン(１０ｍＬ)に溶かし、撹拌されたヘキサン（２Ｌ）に滴下的に加えた。そのサスペンションを一晩撹拌し、ろ過して、集めた固体を乾かして（１３Ｃγ１γ２ＨＤ２）２−１２Ｃα、βＤ−Ｌ−バリン−Ｎｉ（ＩＩ）−ＢＰＢ（４．３２ｇ、７．８９ｍｍｏｌ、５４．４５％生成）。
【００６１】
この複合体（４．３２ｇ、７．８９  ｍｍｏｌ（１．００と均等））、ＣＨ３ＯＨ（６０ｍＬ）、および２ＭのＨＣＬ（６０ｍＬ）を１０分間還流液で加熱した。青白い緑の溶液を回転蒸発装置で蒸発させて乾燥させた。Ｈ２Ｏ（５０ｍＬ）を乾いた固体に加えた。混合物を数時間氷浴で冷却し、その後濾過した。濾液の薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、ＢｕＯＨ/酢酸/水=２／１／１）は、（１３Ｃγ１γ２ＨＤ２）２−１２Ｃα、βＤ−Ｌ−バリンのタイトル化合物の存在を示した。濾液を乾燥させて、そのタイトル化合物をイオン交換クロマトグラフィーによって分離し、水性エタノール（０．７４ｇ、５．９１ ｍｍｏｌ、Ｆ．Ｗ．＝１２５．１６、ＢＰＢ−Ｎｉ（ＩＩ）からの７５％の産出- グリシン)から晶出させた。図６参照。
【実施例２】
【００６２】
Ｌ-バリン-α-Ｄ-１２ＣＤ（１３ＣＨＤ２）２を含むネズミ科の尿蛋白（ＭＵＰ）の式および浄化
ベクトルｐｑｅ３０ＭＵＰで変形されたＭ１５細胞の２０ｍＬ保存培養は、５００ｍｇのアラニン、４００ｍｇのアルギニン、４００ｍｇのアスパラギン酸、５０ｍｇのシステイン、４００ｍｇのグルタミン、６５０ｍｇのグルタミン酸、５５０ｍｇのグリシン、１００ｍｇのヒスチジン、２３０ｍｇのイソロイシン、２３０ｍｇのロイシン、４２０ｍｇのリジンＨＣｌ、２５０ｍｇのメチオニン、１３０ｍｇのフェニルアラニン、１００ｍｇのプロリン、２．１ｇgのセリン、２３０ｍｇのトレオニン、１７０ｍｇのチロシン、２３０ｍｇのバリン、５００ｍｇのアデニン、６５０ｍｇのグアノシン、２００ｍｇのチミン、５００ｍｇのウラシル、２００ｍｇのシトシン、１．５ｇの酢酸ナトリウム、１．５ｇのコハク酸、７５０ｍｇのＮＨ４Ｃｌ、８５０ｍｇのＮａＯＨ、１０．５ｇgのＫ２ＨＰＯ４、２ｍｇのＣａＣｌ２２Ｈ２Ｏ、２ｍｇのＺｎＳＯ４、５０ｍｇのトリプトファン、５０ｍｇのチアミン、５０ｍｇのナイアシン、１ｍｇのビオチン、２０ｇのグルコース、４ｍＬ １ＭのＭｇＳＯ４、１ｍＬ ０．０１ＭのＦeＣｌ３、１５ｍｇのアンピシリンおよび５０ｍｇのカナマイシンを含む１Ｌの媒質に接種のために使用された。
【００６３】
細胞密度が１．２のＯＤに達した時、細胞を遠心分離によって収穫し、ＰＢＳですすぎ、再び遠心分離して、上記配合の媒体であるが、Ｌ-バリン−α−Ｄ−１２ＣＤ（１３ＣＨＤ２）２が標識化されていないバリンの代わりに用いられた媒体で再びサスペンドした。３０分後、タンパク質エクスプレッションが、０．１  ｍｍｏｌの終濃度のＩＰＴＧの追加によって引き起こされた。６時間後、培養細胞をソルバック（Sorvall） ＲＣ−３Ｂ遠心機で２０分間毎分４０００回転で遠心分離した。そして細胞ペレットを一晩−２０℃で保管した。これら細胞を、３０ｍｌの音波処理バッファー(５０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ＝８．０）で溶解し、再サスペンドした。これら細胞は、２０，０００ｐｓｉで４回フレンチプレスを通して壊された。壊れた細胞を、オークリッジ（Oakridge）チューブ内で２０分間１５，０００xｇで沈降分離した。
【００６４】
５ｍＬのＮｉ-ＮＴＡ固定金属アフィニティカムは、５ｍＬ／ｍｉｎ．で音波処理バッファーにおいて平衡に保たれた。上澄み(細胞溶解物)をペレットを妨害せずに、オークリッジ（Oakridge）チューブから取り除いた。透明溶解液を５ｍｌ／分でカラムに載せた。カラムフロースルーは、後の分析のために保存された。その後、流出液の吸光度が０．０２０未満となるまで、カラムの材料境界を２０分間音波処理バッファーで洗浄した。境界タンパク質を、シングル・ステップを使用して、溶出バッファー(５０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭＮａＣｌ、５００ｍＭ イミディゾール（imidizole）、ｐＨ＝８．０）でカラムに溶出させた。ピーク・フラクションは手動で収集した。溶出のサンプルは分析のために保存した。
【００６５】
セファデックス(Sephadex)Ｇ−２５細繊度排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）樹脂が詰められた３００ｍＬ ＸＫ−５０カラムは、陰イオン交換バッファーＡ（２０ｍＭ  トリスＨＣｌ、ｐＨ＝７．５）で平衡に保たれた。Ｎｉ−ＮＴＡ溶出液は１５ｍｌ／ｍｉｎ．でＳＥＣカラムにロードされた。タンパク質ピークは手動で収集された。現在、陰イオン交換バッファーＡにある、タンパク質サンプルは、次のステップの準備の間に４℃で保管された。１０ｍｌのリソースＱ陰イオン交換カラムを、バッファーＡにおいて平衡に保った。部分的に浄化されたタンパク質を、１０ｍＬ/ｍｉｎ．でカラムにロードした。サンプルを３分間バッファーＡで洗浄した。サンプルは、７分間、バッファーＢ（２０ｍＭトリスＨＣｌ、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝７．５）へ直線濃度勾配で溶出された。フラクションは３０秒のインターバルで収集された。各フラクションのサンプルは分析のためにわきに置かれた。
【００６６】
材料は、一定の２００ボルトで４５分間、１２％のトリス/グリシン・ゲルを使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された。結果は図７に示されている。純粋なフラクション(レーン７−８)は、３０００ＭＷＣＯ  スライダリザー（Slidalyzer）ＴＭ  透析カセットにロードされた。タンパク質は４℃で透析されて５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０にされた。２つのバッファー変化が、トリス緩衝液の完全な除去を保証した。最終のタンパク質濃度は２８０ｎｍのＵＶ吸光度を使用して決定され、それをそれを、ＭＵＰ（１ｍｇ/ｍＬの０．５０３)のための吸光係数と比較した。純粋なネズミ科の尿蛋白の終濃度は１．９ｍＬ中の４８ｍｇ／ｍＬであった。合計収率は９０ｍｇであった。最終ＭＵＰサンプルはＮＭＲ分析に先立って４℃で保管された。
【実施例３】
【００６７】
Ｌ-バリン-α-Ｄ-１２ＣＤ（１３ＣＨＤ２）２を含むネズミ科の尿蛋白（ＭＵＰ）のＮＭＲ分析
ＭＵＰと標識化された１５ｍｇのＬ-バリン-α-Ｄ-１２ＣＤ(１３ＣＨＤ２)２ のサンプルは、５０μＬの酸化ジウテリウムが添加された６５０μLの燐酸塩緩衝食塩水（１０ｍＭのリン酸カリウム;  ２００ｍＭ塩化ナトリウム）に溶かされた。１３ＣＨＤ２グループの１３Ｃ緩和速度（Ｒ２およびＲ１）は、非特許文献４９に記述されるようなパルス系列を使用して決定された。
【非特許文献４９】イシマ他（Ishima et al.）, J. Am. Chem. Soc. １２１: １１５８９-１１５９０ (１９９９)
【００６８】
スペクトルのパラメーターは以下のとおりであった。１３Ｃディメンションでのスペクトル幅、９００Ｈｚ；１Ｈディメンジョンでのスペクトル幅、５２００Ｈｚ；１３Ｃディメンションでの実際のデータポイントの数字、１２８；１Ｈディメンジョンでの実際のデータポイントの数字、１４０８；t1インクリメント毎の過渡現象の数字、８; プローブ温度、２９８Ｋ。二次元フーリエ変換に先立って、自由誘導減衰は、既知の方法によるコサイン−ベル・ウインドイング機能でアポダイズされた。
【００６９】
そしてＮＭＲ分析を繰り返し、１μＬのイソブチル・ピラジンあるいは１μＬのイソプロピル・ピラジンの小さな分子リガンドを追加してＭＵＰの溶液を分離した。表１および２の下、および図８に示されるデータが得られた。これらは、これら小さな分子リガンドの追加で得たＴ１とＴ２の値の変化を明白に示している。リガンド２-メトキシ-３-イソプロピルピラジンおよび２-メトキシ-３-イソブチルピラジンがある状態で得られたリラクゼーション・データは、バリン側鎖が結合のエントロピーに著しく寄与しないことを示している。
【００７０】
【表１】
2005528915.tif 000003
【００７１】
【表２】
2005528915.tif 000004
【実施例４】
【００７２】
［１３Ｃγ１，γ２ＨＤ２］−Ｕ−２ＨバリンのＮＭＲリラクゼーション測定
［１３Ｃγ１，γ２ＨＤ２］−Ｕ−２Ｈバリンが濃縮された、２-メトキシ-３-イソプロピルピラジンおよび２-メトキシ-３-イソブチルピラジンを備えたＭＵＰ単独および合成物が、ｐＨ７．０の単一のサンプルおよび１ｍＭのタンパク質濃度から準備された。メチル-１３Ｃ、２Ｈ濃縮ＭＵＰの更なるサンプルがｐＨ７．０および０．５ｍＭのタンパク質濃度で準備された。縦（Ｒ１）および横（Ｒ２）１３Ｃ緩和速度が、Ishima
et al., J. AM. CHEM. SOC. 121: 11589-11590, 1999.によって記述されるように実質的に決定された。スペクトルはすべて、６００ＭＨｚの陽子周波数および３０℃のプローブ温度で記録された。Ｒ１率は、１６、６４、１２８、２４０、４００、７２０、１１２０、１６００、２２４０および２８８０ミリセカンドのリラクゼーション遅延時間で決定された。Ｒ２率は、１６，３２，４８、６４，９６、１６０，１９２、２４０および２８８ミリセカンドのリラクゼーション遅延時間および２ｋＨｚの有効磁界強度で決定された。リラクゼーション・データは、単一の指数関数形崩壊関数Ｉ＝Ｉ０ｅｘｐ（−ｔＲ）に適合した。ここに、Ｉｏは最初の共振強度、ｔはリラクゼーション遅延時間、Ｒは緩和速度(Ｒ１またはＲ２)である。リラクゼーション・データは、以下の式のリパリ−ザボ・モデル（Lipari-Szabo
model）のフリースペクトル密度に適合した:Ｊ（ω）＝Ｓ２τｍ／（１＋ω２τｍ２）＋（１−Ｓ２）τｉ／（１＋ω２τｉ２）。ただし、τｉ−１＝τＭ−１＋τｅ−１、τＭは全体的な分子タンブリング相関時間、τｅは有効な内部相関時間である（非特許文献５０参照）
【非特許文献５０】リパリおよびザボ（Lipariand Szabo）、J. Am. Chem. Soc. １０４: ４５４６-４５５９、１９８２
【００７３】
この方程式は速い内部運動τｅ＜＜τＭで有効であり、その条件下で、メチルＣＨ二極性リラクゼーションのオーダーパラメーターがＳ２＝Ｓａｘｉｓ２［Ｐ２（ｃｏｓθＨ）］２で与えられる。Ｓａｘｉｓ２は、メチル回転軸のオーダーパラメーターであり、θＨは、軸およびＣＨ結合ベクトルによって作られた角度である。８：５７ナノセカンドのグローバル回転相関時間は、以前に報告された値にしたがってこれらの計算に使用された（非特許文献５１参照）。
【非特許文献５１】ジデック他（Zideket al.）、 Nature Str. Biol. ６: １１１８-１１２１、１９９９
【００７４】
バリン残留物は非メチル位置でのパージュウテリウム化だったが、そうでなければタンパク質が加えられた。また、これらの「外部の」陽子による二極性リラクゼーションは１３Ｃリラクゼーションには無視できない。したがって、Ishima他のJ. Am. Chem. Soc. 123: 6164-6171,2001作業でのアナロジーによって、これらの外部陽子の１３ＣＲ２値に対する寄与はＭＵＰのＸ線の座標から２５％と見積もられた。従って、測定された１３ＣＲ２率がこれらの外部の二極性のリラクゼーション過程を説明するために０．７５倍された。  
【００７５】
図９Ａは、バリンＣγ１−Ｈγ１およびＣγ２−Ｈγ２相関性を含む、メチル１３Ｃ、２Ｈをエンリッチしたマウス主要尿タンパクの１３Ｃ−１Ｈ
ＨＳＱＣスペクトルからの領域を示す。
重要な重なりは、スペクトル中に生じており、これは、バリン以外の残留物に由来するメチル共振と共に１３ＣＨ３アイソトポマーからの共振からの干渉の併用効果から発生する。これに対して、[１３Ｃγ１γ２ＨＤ２]−Ｕ−２Ｈバリン濃縮ＭＵＰ（図９Ｂ）に記録された等価スペクトルは、共振重なりが実質的になく、また、１２のバリン・メチル基すべてが観察され割り当てられる（非特許文献５２参照）。
【非特許文献５２】アバッテ他（Abbateet al.）、J BIOMOL. NMR 15: １８７−１８８、１９９９
【００７６】
ＭＵＰは、小さな疎水性のリガンド、２-メトキシ-３-イソプロピルピラジン、および２-メトキシ-３-イソブチルピラジンに結合し、それはそれぞれ５６０ｎＭおよび８０ｎＭのＫｄでＭＵＰにそれぞれ結合する。図９Ｃは、これらのリガンドを備えた[１３Ｃγ１γ２ＨＤ２]−Ｕ−２Ｈバリン濃縮ＭＵＰの複合体の１３Ｃ−１Ｈ
ＨＳＱＣスペクトルを示す。著しい変更摂動は、Ｖａｌ８２γ１およびγ２からの相関性のために観察された。これは、Ｖａｌ８２がＭＵＰの結合ポケット内にあるので、予想されたものであった（非特許文献５３参照）。
【非特許文献５３】チム他（Timmet al）、PROT. Sci. 10: ９９７−１００４、２００１
【００７７】
両方の複合体では、相関性はすべて、メチル１３Ｃ、２Ｈ濃縮ＭＵＰを備えた複合体とは対照的に、よく解決された（データは示されていない）。これらの状況の下で、１３Ｃの縦および横リラクゼーション率（Ｒ１およびＲ２）の測定は高感度で、および共振重なりによる最小の干渉で各サンプルについて試みることができる。リラクゼーション曲線が作成された。
典型的な結果は図１０において示される。
【００７８】
【表３】
2005528915.tif 000005
【００７９】
Ｓ２軸の値は、上に与えられたモデルなしのスペクトル密度関数を使用して、各メチル基のＲ１およびＲ２のデータに由来しており、表３においてリストされている。２−メトキシ-３-イソプロピルピラジンあるいは２−メトキシ-３−イソブチルピラジンのいずれかの結合上のＭＵＰにおける６つのバリン残留物のうちのいずれにも小さな変化Ｓ軸２だけがあった。その大部分は実験誤差内である。例外はＶａｌ−７０  Ｃγ２のためのＳ軸２であり、それは、結合する２-メトキシ-３-イソブチルピラジンに関して劇的に増加するように見える。しかしながら、これは変則の結果-Ｖａｌ−７０  Ｃγ２であり、それは、結合する２-メトキシ-３-イソブチルピラジンに関して劇的に増加するように見える。しかしながら、これは変則の結果-Ｖａｌ−７０  Ｃγ１であり、また、Ｃγ2は、両方複合体において同様の変化を有し、２-メトキシ-３-イソブチルピラジン複合体においてによって３Ｈｚ異なり、その条件下で、Ｃγ１およびＣγ２は、２つの結合スカラー・カップリングを介して強力に連結されるであろう。これは、Ｖａｌ-７０  Ｃγ2(ｘ２=４９．７)のためのR2リラクゼーション・データの嵌合不良となる。
【００８０】
あるバリン残留物の２つのメチル基に対する測定されたＳ２軸値は、実験誤差内に同一ではない。一見して、これは、それらのモビリティーが実質的に同じであるという要求と一致しない。というのは、それらが同じイソプロピル基の一部を形成するからである。しかしながら、これは、必ずしも等価なＳ２軸値に反映されていない。このグループ用の有効な平均する軸がメチル３倍軸で異なる角度を作る場合、同じイソプロピル基からのメチル基のオーダーパラメーターは異なることがある。
【００８１】
この残留物が結合ポケット内にあり、境界リガンドに近位であるので、Ｖａｌ−８２のメチル基のための錯体形成中の一定のＳ２軸の値は予期しないものである。直観的に、複合体における結合ポケット内の減少したモビリティーにより関連するＳ軸２値が増加すると予想されるかもしれない。各リガンドが加えられるので、リガンド陽子によって提示された追加のリラクゼーション経路は、Ｖａｌ−８２側鎖原子の増加したモビリティーに起因して等しい反対の有効な寄与によって相殺される。対照的に、残るバリン・メチル基は、結合ポケットに遠位である。また、ＭＵＰの中の著しい構造変化が、これらの複合体(示されないデータ)の結晶構造において観察されないので、リガンド陽子はこれらの場合にリラクゼーションに無視できる貢献をするだろう。
【００８２】
カルモジュリンを結合するドメインのペプチド・モデルを備えた複合体においてカルシウム飽和カルモジュリンに関して２Ｈリラクゼーション法を使用する従来の研究は、合理的なやり方で予言できないＳ軸２値の著しい変化を強調した。Ｓ軸2値の変化は、Ｃａ2+結合部位から近位かつ遠位である位置で見つけられた。この観察は、この現象が一般的ではないかもしれないことを示唆する。確かにタンパク質ダイナミックスからの結合の支配的なエントロピーの寄与は、MUPとここで記述されたピラジン派生物と無関係な小さな分子のリガンドの間の複合体のために示唆されたように、バックボーンに由来するかもしれない（非特許文献５４参照）。
【非特許文献５４】ジデック他（Zidek et al.）、 Nature Str. BIOL. 6: １１１８-１１２１, １９９９
【００８３】
自由なタンパク質、および2-メトキシ-3-イソプロピルピラジンおよび2-メトキシ-3-イソブチルピラジンを備えた複合体におけるバリン・メチル基の各々に対するＳ軸２値の計算は、バリン側鎖は、この場合結合するエントロピーに著しく寄与しないということを示唆する。本発明の方法が高度に敏感であるので、より低い(１０〜２０％)レベルの１３Ｃ-リンリッチメントが使用されてもよい。約５ないし３０％あるいは約１０〜２０％のレベルが適切であり、最も好ましくは約１０％のレベルである。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】図１は、２９８Ｋでマウス尿蛋白に対するリガンドのパネルの相対的な結合親和性およびギブズ自由エネルギー・コンポーネントを提供する。
【図２】図２は、特に標識化されたバリンの合成において使用されるプレカーサーの準備に実施例を提供する。
【図３】図３は、特に標識化されたアミノ酸の準備に実施例を示す。
【図４】図４は特に標識化されたアミノ酸の準備の実施例である。
【図５】図５は、特に標識化されたアミノ酸の合成の中間物の準備の実施例である。
【図６】図６は、L-バリン-α-Ｄ-１２ＣＤ（１３ＣＨＤ２）２の化学合成のための合成スキームを示す。
【図７】図７は、ＳＤＳＰＡＧＥゲル（レーン１:分子量基準、レーン２:非誘導ＭＵＰ、レーン３:誘導ＭＵＰ、レーン４:不溶性細胞破損ペレット、レーン５:Ｎｉ−ＮＴＡAカラム・フロースルー、レーン６：ＮＩ−ＮＴＡカラム溶出、レーン７:陰イオン交換フラクション１、レーン８:陰イオン交換フラクション２）である。
【図８】図８は、L-バリン−α−Ｄ−１２ＣＤ（１３ＣＨＤ２）２で表示されたマウス尿蛋白のＮＭＲ結果を示す。
【図９】図９は、バリン・メチル相関性を示すメチル１３Ｃおよび５０％−２Ｈ濃縮ＭＵＰの１３Ｃ−１Ｈ  ＨＳＱＣスペクトルの領域（図９Ａ）、(１３Ｃγ1γ2ＨＤ２)２Ｄ−Ｌバリンで選択的に濃縮したＭＵＰの等価スペクトル（図９Ｂ）、および２-メトキシ-３-イソプロピルピラジン（2-methoxy-3-isopropylpyrazine）(黒い相関性)および２-メトキシ-３-イソブチルピラジン（2-methoxy-3-isobutylpyrazine）(灰色の相関性)と複合した（１３Ｃγ１γ２ＨＤ２）２１２Ｃα、βＤ−Ｌバリン濃縮MUPの１３Ｃ−１Ｈ  ＨＳＱＣスペクトラの領域のオーバーレイ（図９Ｃ）を示す。
【図１０】図１０は（１３Ｃγ１γ２ＨＤ２）２１２Ｃα、βＤ−Ｌ−バリン濃縮ＭＵＰから得られたＶａｌ−１２Ｃγ１の典型的なリラクゼーション曲線を示し、実線はフリータンパク質、点線は２−メトキシ−３−イソプロピルピラジン複合体（2-methoxy-3-isopropylpyrazine complex）、一点鎖線は２−メトキシ−３−イソブチルピラジン（2-methoxy-3-isobutylpyrazine）複合体を示す。明確にするため、フリータンパク質に対応するデータポイントだけ示した。エラーバーはこれらデータポイントに使用されたシンボルより小さくした。
【図１】
2005528915.tif 000006
【図２】
2005528915.tif 000007
【図３】
2005528915.tif 000008
【図４】
2005528915.tif 000009
【図５】
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【図６】
2005528915.tif 000011
【図７】
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【図８】
2005528915.tif 000013
【図９】
2005528915.tif 000014
【図１０】
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【国際調査報告】
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