(57)【要約】ＨＩＶ−１に感染した個人を治療するための一つのアプローチは、かかる個人に、ヒト細胞内でＨＩＶ−１が自身を複製する機構に直接干渉して介入する化合物を投与することである。ＨＩＶ−１ウイルスタンパク質Ｖｉｆのウイルス生活環における特定の役割が未知であっても、Ｖｉｆ遺伝子は、イン・ビボでのレンチウイルスの病原性の複製に必須である。本発明は、ＨＩＶ−１に曝され又は感染した個人を治療する方法に関係する。ＨＩＶ−１に曝され又は感染したと同定された個人は、治療上有効な量の少なくとも一種の、ＨＩＶ−１ウイルスタンパク質Ｖｉｆの複製又は他の必須の機能に、Ｖｉｆの多量体形成ドメインを相互作用的にブロックしそれによりＶｉｆタンパク質の多量体形成を防止することにより干渉することによって該ＨＩＶ−１の複製を阻害し又は防止する化合物を投与され、該多量体形成は、レンチウイルス生活環におけるＶｉｆ機能にとって重要である。好適具体例において、Ｖｉｆの多量体形成ドメインを相互作用的にブロックする化合物は、Ｖｉｆアンタゴニストである。これらの化合物を含む医薬組成物も又、開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内でＶｉｆタンパク質内の多量体形成ドメインに結合してＶｉｆタンパク質の多量体形成を阻害するＶｉｆアンタゴニスト。
【請求項２】
前記のアンタゴニストが、ペプチド又はそのペプチド模倣物である、請求項１に記載のＶｉｆアンタゴニスト。
【請求項３】
前記のペプチドが、ＰＸＰモチーフを含む、請求項２に記載のＶｉｆアンタゴニスト。
【請求項４】
前記のペプチドが、約５〜２０アミノ酸を含む、請求項３に記載のＶｉｆアンタゴニスト。
【請求項５】
前記のペプチドを、SEQ ID NO:５〜２３よりなる群から選択する、請求項４に記載のＶｉｆアンタゴニスト。
【請求項６】
前記のペプチドを、SEQ ID NO:９、SEQ ID NO:１１及びSEQ ID NO:１３よりなる群から選択する、請求項５に記載のＶｉｆアンタゴニスト。
【請求項７】
製薬上許容しうるキャリアー及び少なくとも一種のＶｉｆアンタゴニストを含む医薬組成物であって、該Ｖｉｆアンタゴニストが、細胞中でＶｉｆタンパク質の多量体形成ドメインに結合してＶｉｆタンパク質の多量体形成を阻害する、当該医薬組成物。
【請求項８】
Ｖｉｆタンパク質又はその誘導体のエピトープに特異的に結合する一本鎖抗体又はその誘導体。
【請求項９】
前記の抗体が、細胞内のものである、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
Ｖｉｆタンパク質又はその誘導体のエピトープに特異的に結合する一本鎖抗体又はその誘導体であって、前記の抗体が、分泌用配列を含まない、当該一本鎖抗体又はその誘導体。
【請求項１１】
Ｖｉｔタンパク質内の多量体形成ドメインに特異的に結合してＶｉｆタンパク質の多量体形成を阻害するＶｉｆアンタゴニストを同定する方法であって、下記を含む当該方法：
ａ）該Ｖｉｆタンパク質を複数の試験分子と、該Ｖｉｆタンパク質と該試験分子との間の結合の助けとなる条件下で接触させ；そして
ｂ）該複数の試験分子の各々の該Ｖｉｆタンパク質に対する結合能力を測定して、該複数の試験分子の内で、該Ｖｉｆタンパク質内の多量体形成ドメインに特異的に結合して該Ｖｉｆタンパク質の多量体形成を阻害する該Ｖｉｆアンタゴニストを同定する。
【請求項１２】
哺乳動物においてウイルスの複製にＶｉｆタンパク質の多量体形成が必要とされる病気を治療する方法であって、該哺乳動物に、治療上有効な量の少なくとも一種のＶｉｆアンタゴニストを投与することを含み、該ＶｉｆアンタゴニストがＶｉｆタンパク質内の多量体形成ドメインに結合してＶｉｆタンパク質の多量体形成を阻害し、それにより、Ｖｉｆ媒介のウイルス複製が阻害される、当該方法。
【請求項１３】
前記の病気が、後天性免疫不全症候群である、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全体として、分子生物学及びウイルス学の分野並びに、１型ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ−１)に曝され又は感染した個人を治療する方法に関係し、一層詳細には、ＨＩＶ−１ウイルスの感染性因子タンパク質(Ｖｉｆ)の複製及び他の必須機能を、Ｖｉｆの多量体形成ドメインの相互作用をブロックすることによって阻害又は阻止する組成物に関係する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＩＶ−１に感染した個人を治療する一つのアプローチは、かかる個人に、ＨＩＶ−１がヒト細胞内で複製する機構に直接介入し又は干渉する化合物を投与することである。レンチウイルス例えばＨＩＶ−１は、すべての複製可能なレトロウイルスにより発現される構造遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖに加えて幾つかのアクセサリー遺伝子をコードしている。これらのアクセサリー遺伝子の一つのｖｉｆ(viral infectivity factor)は、馬伝染性貧血ウイルスを除くすべての公知のレンチウイルスにより発現される。ＨＩＶ−１のＶｉｆタンパク質は、高度に塩基性であり、１９２アミノ酸よりなる２３ｋＤａのタンパク質である。ＨＩＶ−１に感染した個人に由来するウイルスＤＮＡの配列分析は、Ｖｉｆのオープンリーディングフレームが完全なままであることを明らかにした。(Sova,P.等、J.Virol.69:2557-2564, 1995；Wieland,U.等、Virology 203:43-51, 1994；Wieland,U.等、J.Gen.Virol.78:393-400, 1997)。Ｖｉｆ遺伝子の欠失は、マカークザルにおけるサル免疫不全ウイルス(ＳＩＶ)の複製及びＳＣＩＤ−ｈｕマウスにおけるＨＩＶ−１複製を劇的に減少させ(Aldrovandi,G.M.及びZack,J.A., J.Virol.70:1505-1511, 1996；Desrosiers,R.C.等、J.Virol.72:1431-1437, 1998)、これは、ｖｉｆ遺伝子が、レンチウイルスのイン・ビボでの病原性の複製に必須であることを示している。
【０００３】
細胞培養系において、ｖｉｆ欠損(ｖｉｆ-)ＨＩＶ−１は、ある種の細胞例えばＨ９Ｔ細胞、末梢血液単核細胞、及び単球由来のマクロファージにおいて感染を確立することができない。これは、これらの細胞の非許容性としての分類へと導く。しかしながら、幾つかの細胞例えばＣ８１６６、ジャーカット、ＳｕｐＴ１及びＨｅＬａ−Ｔ４細胞においては、ｖｉｆ遺伝子は、必要とされず；これらの細胞は、許容性として分類されている(Gabuzda,D.H.等、J.Virol.66(11):6489-95, 1992；von Schwedler,U.等、J.Virol.67(8):4945-55, 1993；Gabuzda,D.H.等、J.AIDS 7(9):908-15, 1994)。
【０００４】
Ｖｉｆは、ＨＩＶ−１の複製のために非許容細胞によって必要とされるが、許容細胞には必要とされないので、２つの可能性がある。許容細胞には、ウイルス産生細胞においてＶｉｆ機能に取って代わることのできるＶｉｆの細胞性同族体が存在しうる；或は、その効果を打ち消すのにＶｉｆを必要とする非許容細胞におけるウイルス複製の阻害剤が存在しうる。(Trono, D., Cell 82:189-192, 1995)。最近、Ｖｉｆタンパク質が、ウイルス産生細胞において、未知の内因性インヒビターを打ち消すのに必要とされるということが提案された。(Madani, N.,及びKabat, D., J.Virol.72:10251-10255, 1998；Simon, J.H.等、Nat.Med.4:1397-1400, 1998)。ＨＩＶ−１Ｖｉｆは、ヒトの非許容細胞において、ＨＩＶ−１ Ｖｉｆ及びＳＩＶAGM Ｖｉｆの機能を補完することができるが、サルの細胞においてＨＩＶ−１及びＳＩＶAGM Ｖｉｆの機能を補完することはできない。しかしながら、ＳＩＶAGM Ｖｉｆは、ＨＩＶ−１ Ｖｉｆ及びＳＩＶAGM Ｖｉｆの機能をサルの細胞において補完することはできるが、ＨＩＶ−１及びＳＩＶAGM Ｖｉｆの機能をヒトの細胞において補完することはできず、これは、細胞性因子がＶｉｆタンパク質の作用に関与していることを示している(Simon, J.H.等、EMBO J. 17:1259-1267, 1998)。逆に、Ｖｉｆ変異体(ＨＩＶ−１F12に由来するＶｉｆ)は、野生型ＨＩＶ−１の複製を許容細胞において阻害することができるので、これらの許容細胞中には、Ｖｉｆ同族体が存在しうる。(D'Aloja, P.等、J.Virol.72:4308-4319, 1998)。
【０００５】
Ｖｉｆは、ウイルス産生細胞又は無細胞ビリオンにおいて機能して、ウイルスアセンブリーに影響を及ぼすということが提案されている。(Blanc, D.等、Virology 193:186-192, 1993；Gabuzda, D.H.等、J.Virol.66:6489-6495, 1992；von Schwedler, U.等、J.Virol.67:4945-4955, 1993)。ｖｉｆ遺伝子の欠損は、ウイルスの転写及び翻訳又はビリオン産生に対する検出可能な効果を有しない。欠損ｖｉｆ遺伝子を有するＨＩＶ−１変異体は、標的細胞に結合して透過することはできるが、細胞内逆転写及び無細胞ビリオンにおける内因性逆転写(ＥＲＴ)を完了することができない。(Courcoul, M.等、J.Virol.69:2068-2074, 1995；Goncalves, J.等、J.Virol.70:8701-8709, 1996；Sova, P.及びVolsky, D.J., J.Virol.67:6322-6326, 1993；von Schwedler, U.等、J.Virol.67:4945-4955, 1993)。ＥＲＴが高濃度のデオキシリボヌクレオシド三リン酸(ｄＮＴＰ)の添加により駆動される場合には、プラス鎖ウイルスＤＮＡのあるレベルは、完成しうる。その上、ｖｉｆ-ウイルス(非許容細胞から生成し、ＥＲＴにより生成された多量のウイルスＤＮＡを有する)を許容細胞に感染させる場合には、それらは、部分的に、ｖｉｆ-ウイルスがデオキシヌクレオシド三リン酸処理なしでは迂回できない細胞内逆転写のブロックを迂回することができる。従って、ウイルスの感染性は、部分的に、ｖｉｆ-表現型からレスキューされうる。(Dornadula, G.等、J.Virol.74:2594-2602, 2000)。
【０００６】
ウイルス性タンパク質及び核酸を含むウイルス成分の発現は、非許容細胞から産生されたビリオンにおいて変化しない。(Fouchier, R.A.等、J.Virol.70:8263-8269, 1996；Gabuzda, D.H.等、J.Virol.66:6489-6495, 1992；von Schwedler, U.等、J.Virol.67:4945-4955, 1993)。しかしながら、ｖｉｆ遺伝子の欠失は、ビリオン形態の変化を生じる。(Borman, A.M.等、J.Virol.69:2058-2067, 1995；Bouyac, M.等、J.Virol 71:2473-2477, 1997；Hoglund, S.等、Virology 201:349-355, 1994)。慢性的に感染した細胞から生成したＨＩＶ−１ビリオンにおけるＶｉｆタンパク質の量は、ビリオン当たり７〜２８分子である。(Camaur, D.及びTrono, D., J.Virol.70:6106-6111, 1996；Fouchier, R.A.等、J.Virol.70:8263-8269, 1996；Simon, J.H.等、Virology 248:182-187, 1998)。ビリオンに会合したＶｉｆタンパク質は、ウイルス性成分の発現及びウイルス産生細胞におけるＶｉｆの量に依存しないので、Ｖｉｆタンパク質は、ビリオンに特異的には取り込まれないようである。(Camaur, D.及びTrono, D., J.Virol 70:6106-6111, 1996；Simon, J.H.等、Virology 248:182-187,1998)。
【０００７】
Ｖｉｆは、特異的にはビリオンに取り込まれないが、Ｖｉｆは、ｐ５５Ｇａｇ前駆体のＮＣｐ７ドメインに、その正に帯電したアミノ酸に富んだＣ末端によって結合することができる。(Bouyac, M.等、J.Virol.71:9358-9365, 1997；Huvent, I.等、J.Gen.Virol.79:1069-1081, 1998)。Ｖｉｆタンパク質は、ＨＩＶ−１感染細胞の細胞質においてＧａｇ前駆体と一緒に配置されることが見出されている。(Simon, J.H.等、J.Virol.71:5259-5267, 1997)。ＶｉｆのＧａｇ前駆体に対するモル比は、感染細胞において、１：１．７であり、これは、Ｖｉｆが、ウイルス産生細胞において調節的役割よりも構造的役割を演じていることを示唆している。(Goncalves, J.等、J.Virol.68:704-712, 1994；Simon, J.H.等、Virology 248:182-187, 1998)。
【０００８】
Ｖｉｆは、ＲＮＡ結合性タンパク質であり且つＨＩＶ−１感染細胞の細胞質におけるウイルスＲＮＡのメッセンジャーリボヌクレオタンパク質(ｍＲＮＡ)複合体の一体化成分であることが示されてきた。感染細胞におけるＶｉｆの発現は、とても高く、ウイルス産生細胞におけるＶｉｆの大部分は、細胞質画分にあり；幾らかは、細胞膜に会合している。このｍＲＮＰ複合体中のＶｉｆタンパク質は、ウイルス性ＲＮＡを様々な内因性インヒビターから防護することができ、ウイルスＲＮＡのＨＩＶ−１Ｇａｇ前駆体との結合を媒介することができ、そうして、ゲノムＲＮＡの折り畳み及びパッケージングに関与しうるであろう。そうして、ＶｉｆとＨＩＶ−１ ＲＮＡとの相互作用は、ＨＩＶ−１の生活環の後期事象において重要な役割を演じる。ウイルスアセンブリプロセスへのＶｉｆタンパク質の直接的又は間接的関与を仮定すると、それは、抗ＨＩＶ−１治療のための理想的標的である。
【０００９】
多くのＨＩＶ−１タンパク質(Ｇａｇ、プロテアーゼ、逆転写酵素、インテグラーゼ、糖タンパク質４１(ｇｐ４１)、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｐｒ及びＮｅｆを含む)は、イン・ビトロ及びイン・ビボで二量体又は多量体を形成することが示されている。二量体又は多量体の形成は、レンチウイルスの生活環においてそれらの機能に関して重要であることが示されている。(Frankel, A.D.及びYoung, J.A., Ann.Rev.Biochem.67:1-25, 1998；Vaishnav, Y.N.及びWong-Staal, F., Annu Rev Biochem 60:577-630, 1991；Zhao, L.J.等、J Biol Chem 269(51):32131-7, 1994；Liu, L.等、J.Virol.74:5310-5319, 2000)。本発明は、Ｖｉｆタンパク質が、自己会合への強い傾向を有するということ及びＶｉｆタンパク質の多量体化がウイルス生活環においてＶｉｆ機能に重要であるということの証拠を提供する。本発明は、ＨＩＶ−１に曝された個人又は感染した個人を、Ｖｉｆの多量体化ドメインに結合し或は会合することによりＶｉｆの複製及び他の必須機能を阻害又は阻止する組成物を投与し、それによりＶｉｆの多量体化を阻止し、その結果ＨＩＶ−１の複製を阻止することによって治療する方法に向けられている。
【００１０】
略号
「ＨＩＶ−１」は、「１型ヒト免疫不全ウイルス」を意味する。
「Ｖｉｆ」は、「ビリオン感染性因子」を意味する。
「ＧＳＴ」は、「グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ」を意味する。
「ＣＡＴ」は、「クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ」を意味する。
「ＩＰ」は、「免疫沈降」を意味する。
「ＷＢ」は、「ウエスタンブロッティング」を意味する。
【００１１】
定義
用語「アンタゴニスト」は、ここで用いる場合、Ｖｉｆタンパク質に、好ましくは、Ｖｉｆタンパク質内の多量体化ドメインに結合し、それによりＶｉｆ−Ｖｉｆ相互作用及びＶｉｆタンパク質の多量体化を阻害する分子をいう。アンタゴニストは、タンパク質及びそれらのペプチド模倣物、核酸、炭水化物又は、Ｖｉｆタンパク質の多量体化を阻害する任意の他の分子を含むことができる。
【００１２】
用語「類似体」、「誘導体」又は「断片」は、交換可能に用いて、構造的及び機能的に他の物質に関連する化学物質を意味する。類似体、誘導体又は断片は、親物質(今の場合は、Ｖｉｆタンパク質)から改変された構造を含み且つ親物質の機能(今の場合、細胞及び動物モデルにおけるＶｉｆタンパク質の多量体化ドメインへの結合能)を維持している。この類似体、誘導体又は断片の生物学的活性は、改良された所望の活性又は減少した望ましくない活性を含むことができる。これらの類似体、誘導体又は断片は、当分野で公知の様々な方法(化学合成又は組換え発現を含むが、これらに限られない)によって製造することができる。本発明の類似体、誘導体又は断片は、Ｖｉｆタンパク質又はその断片(少なくともアミノ酸残基１４４〜１７１、好ましくは１５１〜１６４、一層好ましくは１６１〜１６４よりなる)と相同な合成又は組換えペプチドを含むが、これらに限られない。
【００１３】
図面の説明
図１．無細胞系におけるＶｉｆ自身の会合。
Ａ．ＧＳＴ−Ｖｉｆ(レーン２)は、イン・ビトロで翻訳された35Ｓ標識ＨＩＶ−１NL4-3Ｖｉｆタンパク質に結合できるが、ＧＳＴ(レーン３)は、結合できないことを示すオートラジオグラフ。35Ｓ標識ＨＩＶ−１NL4-3Ｖｉｆタンパク質を、ＧＳＴ−Ｖｉｆ結合体化ビーズに結合させた。結合後に、ビーズに会合した35Ｓ標識ＶｉｆをＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び直接的オートラジオグラフィーにより分析した。
Ｂ．ネイティブ又は比較的ネイティブな条件下で、35Ｓ標識ＨＩＶ−１NL4-3Ｖｉｆタンパク質が、単量体、二量体、三量体又は四量体を形成することを示すオートラジオグラフ。イン・ビトロで翻訳された35Ｓ標識ＨＩＶ−１NL4-3Ｖｉｆタンパク質を、直接、ネイティブなロード用緩衝液[６２．５ｍＭ トリス−ＨＣｌ(ｐＨ６．８)及び２０％ グリセロール]及び種々の濃度のＳＤＳを用いて、４〜２０％ トリス−ＨＣｌゲル(ＳＤＳなし)上に載せた。電気泳動を、０．０５％ ＳＤＳを含むトリス−グリセリンランニング緩衝液を用いて行ない、その後、オートラジオグラフィーを行なった。
図２．Ｖｉｆ変異体のＶｉｆ−Ｖｉｆ相互作用に対する効果。
Ａ．ＰＣＲベースの突然変異誘発及びイン・ビトロ翻訳を利用して生成したＶｉｆタンパク質に沿っての一連の欠失体を示す概略図。イン・ビトロで翻訳された35Ｓ標識ＨＩＶ−１NL4-3Ｖｉｆタンパク質及びその変異体を、アガロースビーズに結合体化させたＧＳＴ−Ｖｉｆに結合させた。ビーズに会合した35Ｓ標識されたＶｉｆタンパク質及びその変異体をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけて、直接的オートラジオグラフィーにより可視化した。結合したＶｉｆ対総投入物の比を、ＧＳＴ−Ｖｉｆ結合した35Ｓ標識された野生型Ｖｉｆタンパク質と35Ｓ標識された野生型Ｖｉｆ総投入物(１００％)との比を利用して計算した(標準偏差を有する)。これらの値は、オートラジオグラフィーのデンシトメトリーを用いる定量により得られた。殆どの場合に、このデータは、少なくとも５つの独立した実験を反映する。
Ｂ．０．１％ ＳＤＳの存在下で、35Ｓ標識されたＨＩＶ−１NL4-3Ｖｉｆタンパク質変異体Δ１５１−１９２及びΔ１５１−１６４が多量体を形成できないが、他の変異体はそうすることができることを示すオートラジオグラフ。イン・ビトロで翻訳された35Ｓ標識されたＨＩＶ−１NL4-3Ｖｉｆタンパク質及びその変異体(それぞれにつき、５０，０００ｃｐｍの計数)を、ロード用緩衝液[６２．５ｍＭ トリス−ＨＣｌ(ｐＨ６．８)及び２０％ グリセロール]及び０．１％ ＳＤＳを用いて、４〜２０％ トリス−ＨＣｌゲル(ＳＤＳなし)に直接載せた。電気泳動を、０．０５％ ＳＤＳを含むトリス−グリシンランニング緩衝液を用いて行ない、その後、オートラジオグラフィーを行なった。
図３．細胞内でのＶｉｆ−Ｖｉｆ相互作用を研究するための同時免疫沈降法。
ｃ−Ｍｙｃ又はＦｌａｇエピトープによりＣ末端で標識されたＶｉｆタンパク質の、ＣＯＳ−１トランスフェクトされた細胞における発現が、Ａ１４抗−ｃ−Ｍｙｃポリクローナル抗体及び又はＭ２抗−Ｆｌａｇモノクローナル抗体をそれぞれ利用して検出できることを示すウエスタンブロット(上側の２つのパネル)。ＣＯＳ−１細胞に、Ｆｌａｇ又はｃ−Ｍｙｃ標識Ｖｉｆを有するベクターをトランスフェクトした。５％ ＣＯ2、３７℃での５４時間のインキュベーション後に、２０μｇの全細胞溶解物を、１５％ トリス−ＨＣｌゲルにより分離した。第三のウエスタンブロットは、これらの細胞溶解物をＡ１４抗−ｃ−Ｍｙｃポリクローナル抗体を用いて免疫沈降させた場合に、Ｆｌａｇ標識したＶｉｆがＭｙｃ標識されたＶｉｆと共沈されることを示している。共沈のために、同一バッチに由来する全細胞溶解物を、Ａ１４抗−ｃ−Ｍｙｃポリクローナル抗体による免疫沈降にかけた。免疫沈降物を、１５％ トリス−ＨＣｌゲルにて分離してメンブレン上に移してから、Ｍ２抗−Ｆｌａｇ抗体を用いて検出した。
図４．Ｖｉｆ−Ｖｉｆ相互作用を研究するための哺乳動物ツーハイブリッド系。
Ａ．実験に用いたプラスミド：ｐＶｉｆ−ＶＰ、ｐＧＡＬ−Ｖｉｆ及びｐＳＧ５ＧａｌＶＰを示す図式マップ。
Ｂ．様々なベクターと結合させたプラスミドを用いてトランスフェクトしたＣＯＳ−１細胞のＣＡＴ活性を示すゲル。４８時間後に、細胞溶解物を採集して、ＣＡＴ分析にかけた。
図５．Ｖｉｆ又はＶｉｆ変異体により影響されたウイルスの感染性。
組換えウイルスが感染したＨｅｌａＣＤ４−ＣＡＴ細胞のＣＡＴ活性を描いた図。野生型ｖｉｆ遺伝子又はその変異体を含むｐＣＩ−Ｎｅｏ構築物、ｐＮＬ４−３ΔｅｎｖΔｖｉｆプラスミド及びｐＭＤ．Ｇ(ＶＳＶ ｅｎｖを含む)を、Ｈ９細胞にトランスフェクトして、シュードタイプのウイルス粒子を生成した。超遠心分離による濃縮後に、これらのウイルス粒子を、ＨＩＶ−１ ｐ２４抗原により標準化した。ポリブレン(８μｇ／ｍｌ)の存在下で、これらのウイルスを利用して、ＨｅｌａＣＤ４−ＣＡＴ細胞に感染させた。４８時間後に、それらの細胞溶解物を集めて、ＣＡＴ分析にかけた。レーン１）ｐＮＬ４−３；レーン２）ｐＮＬ４−３ΔｅｎｖΔｖｉｆ、ＶＳＶ ｅｎｖ及び野生型ｖｉｆ、レーン３）ｐＮＬ４−３ΔｅｎｖΔｖｉｆ、ＶＳＶ ｅｎｖ及びｖｉｆΔ １５１−１６４；レーン４）ｐＮＬ４−３ΔｅｎｖΔｖｉｆ、ＶＳＶ ｅｎｖ及びｖｉｆΔ１４４−１５０；レーン５）ｐＮＬ４−３ΔｅｎｖΔｖｉｆ、ＶＳＶ ｅｎｖ及びｐＣＩ−Ｎｅｏベクターのみ。野生型ｖｉｆの補完の値を１００％と設定した。他の試料の相対値を同様に計算した。数字は、３つの独立した実験を表している。値は、平均値±標準偏差である。
図６．ＰＸＰモチーフを含むペプチド間での相対的親和性の比較。
ＧＳＴ−Ｖｉｆタンパク質、Ｖｉｆ変異体(１５１〜１９２アミノ酸の欠失)及びＧＳＴのみをプレート上に置いた。Ｖｉｆ含有カラムにより分離されたファージクローンを連続的に希釈して加えた。ファージ−Ｖｉｆ結合を与えるためのインキュベーションの後に、過剰のファージを洗い去った。抗Ｍ１３ファージ抗体(ＨＲＰと結合体化したもの)を、加えて、Ｖｉｆにより捕捉されたファージと結合させた。洗浄後、基質を加えて発色させた。それ故、Ｖｉｆに捕捉されたファージが半定量された。４０５ｎｍでのＯＤが０．１５以上を陽性とみなした。ファージ試料数(ＶＭＩ)は、表１に示したものと同じであった。
【００１４】
発明の詳細な説明
ＨＩＶ−１のＶｉｆタンパク質は、イン・ビボでの及び、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)、マクロファージ及びＨ９ Ｔ細胞の生産性感染でのウイルス複製に必須である。Ｖｉｆの分子機構は、未知のままであり、更に決定されることが必要である。本発明は、ＨＩＶ−１によりコードされる他の多くのタンパク質と同様に、Ｖｉｆタンパク質は、自己会合への強い傾向を有しているということを示す。比較的ネイティブな条件下で、Ｖｉｆタンパク質は、イン・ビトロで、二量体、三量体又は四量体を含む多量体を形成する。イン・ビボ結合アッセイ例えば共免疫沈降及び哺乳動物ツーハイブリッド系は、Ｖｉｆタンパク質が、細胞内で互いに相互作用することを示しており、これは、Ｖｉｆタンパク質の多量体化が単に偶然の凝集によるものではないことを示している。
【００１５】
本発明は、更に、Ｖｉｆの自己会合に影響を及ぼすドメインが、このタンパク質のＣ末端特にプロリンリッチな１５１〜１６４領域に位置しているということを明示する。このドメインの配列は、ＡＡＬＩＫＰＫＱＩＫＰＰＬＰ(SEQ ID NO:１)である。研究は、アミノ酸１５１〜１６４位に欠失を有するＶｉｆ変異体が、Ｈ９ Ｔ細胞から生成したｖｉｆ欠損ウイルスの感染性をレスキューできないということを示しており、これは、Ｖｉｆタンパク質の多量体化がこのウイルスの生活環におけるＶｉｆ機能に重要であることを意味している。
【００１６】
方法
プラスミド構築
感染性クローンｐＮＬ４−３をテンプレートとして用いた場合、ＨＩＶ−１ Ｖｉｆの欠失変異は、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)により媒介されて位置指定された突然変異導入法によって生成される。(Zhang, H.等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(22):12519-24, 1996)。ＰＣＲで生成した野生型ｖｉｆ遺伝子及びその変異体を、次いで、イン・ビトロ翻訳のためにｐＣＩＴＥ−４ａベクター(Novagen, ウィスコンシン、Madison在)に挿入する。このｖｉｆ遺伝子は又、ＧＳＴ−Ｖｉｆ融合タンパク質のイン・ビトロ発現及び単離のためにｐＧＥＸベクターにも挿入した。細胞内Ｖｉｆ−Ｖｉｆ相互作用の研究のために、ｖｉｆ遺伝子に、Ｆｌａｇ(ＤＹＫＤＤＤＤＫ)(SEQ ID NO:２)又はｃ−Ｍｙｃ(ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ)(SEQ ID NO:３)エピトープコード配列をそれぞれ３’末端で用いるＰＣＲによって標識を付けた。これらの標識を付けたｖｉｆ遺伝子を、次いで、ベクターｐＣＩ−Ｎｅｏに挿入したが、該ベクターは、ＣＭＶエンハンサー及び最初期プロモーターの直ぐ下流にキメライントロンを含む(Promega, ウィスコンシン、Mdison在)。その結果生成したプラスミドは、それぞれ、ｐＣＩ−ｖｉｆ−ｃ−ｍｙｃ又はｐＣＩ−ｖｉｆ−ｆｌａｇと呼ばれた。哺乳動物のツーハイブリッド分析のために、ｐＧａｌ−Ｖｉｆ又はｐＧａｌ−ＶｉｆΔ１５１−１６４を、ｐＳＧ５ＧａｌＶＰのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片(ｖｐ遺伝子を含む)をＰＣＲ増幅した完全なｖｉｆ遺伝子又はその変異体Δ１５１−１６４で置き換えることによって構築した。ｐＶｉｆ−ＶＰ又はｐＶｉｆΔ１５１−１６４−ＶＰを、ｐＳＧ５ＧａｌＶＰのＥｃｏＲＩ−ＢｆｌＩＩ断片(ｇａｌ４遺伝子を含む)を、それぞれ、ＰＣＲ増幅した完全なｖｉｆ遺伝子又はその変異体Δ１５１−１６４で置き換えることによって構築した。(Shimano, R.等、Biochem.Biophys.Res.Comm 242(2):313-6,1998)。すべての構築物の完全性を、ＤＮＡ配列決定により確認した。
【００１７】
タンパク質の発現及びイン・ビトロ結合アッセイ
ｖｉｆ遺伝子を有し又は有しないベクターｐＧＥＸを、ＢＬ２１コンピテント細胞(Novagen, ウィスコンシン、Madison在)にトランスフォームした。３７℃で約０．６Ｏ.Ｄ.まで増殖させた後に、ＧＳＴ又はＧＳＴ−Ｖｉｆタンパク質の発現を、０．４ｍＭ イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド(ＩＰＴＧ)により誘導した。これらの細菌細胞を、溶解緩衝液(１％ トリトン−Ｘ−１００、０．１ｍｇ／ｍｌ リゾチーム、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、２μｇ／ｍｌ ロイペプチン及び１μｇ／ｍｌ アプロチニン)を加えてから超音波処理することにより溶解させた。この試料を、１２，０００ｇで、１０分間、４℃で遠心分離してペレット化して、上清をグルタチオン結合体化したアガロースビーズ(Sigma, ミズーリ、St.Louis在)カラムに加えた。バッチ結合後に、このマトリクスを、３回洗った(毎回、１０床容積のリン緩衝液(ＰＢＳ)を加えることにより洗浄)。次いで、ＧＳＴ又はＧＳＴ−Ｖｉｆ結合体化アガロースビーズのアリコートを取り、−２０℃に貯蔵した。逆に、35Ｓ標識したＶｉｆ又はその変異型タンパク質を、ＳＰＴ３キット(Novagen, ウィスコンシン、Madison在)を利用して合成した。製造業者により提供されたプロトコールに従った。イン・ビトロ翻訳後に、ＲＮアーゼＡ(０．２ｍｇ／ｍｌ)を加えて反応を停止させて、ｔＲＮＡ及びイン・ビトロ転写されたｍＲＮＡを除去した。トリクロロ酢酸(ＴＣＡ)不溶性の放射性アミノ酸を、シンチレーションカクテルの存在下で定量した。
【００１８】
ＧＳＴプルダウンアッセイのために、ＧＳＴ又はＧＳＴ−Ｖｉｆ結合体化ビーズスラリーを、35Ｓ標識したＶｉｆ又はその変異体(５０，０００ｃｐｍ)と結合用緩衝液[１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、０．１％ トリトン−Ｘ−１００]中で混合した。４℃で１時間の結合の後に、この混合物を、３，０００ｇで１分間、遠心分離し、これらのビーズを結合用緩衝液で３回洗った。35Ｓ標識したＶｉｆタンパク質をこれらのビーズから、ＳＤＳ含有ローディング用緩衝液を加えて９５℃で５分間か熱することによって分離した。次いで、これらの試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル(Bio-Rad社(カリフォルニア、Hercules在)製の１５％ トリス−ＨＣｌレディゲル)中で電気泳動した。固定用緩衝液(１０％ 酢酸、１０％ メタノール)で処理してから、Ａｍｐｌｉｆｙ(Amersham-Pharmacia, ニュージャージー、Piscataway在)で処理した後に、これらのゲルを乾燥してＸ線フィルムに露出し又は蛍光体イメージ(Molecular Dynamics, カリフォルニア、Sunnyview在)を利用して定量分析した。
【００１９】
Ｖｉｆ−Ｖｉｆ結合アッセイは、ＧＳＴプルダウンアッセイと類似したが、但し、ＧＳＴ又はＧＳＴ−Ｖｉｆ結合体化ビーズスラリーを35Ｓ標識したＶｉｆ及び試験ペプチド又は分子と結合用緩衝液中で混合した。これらの結果を、ＧＳＴプルダウンアッセイからのもの(これを１００％とした)と比較した。
【００２０】
加えて、イン・ビトロ翻訳した35Ｓ標識したＶｉｆ(５０，０００ｃｐｍ)も又、直接、４〜２０％ トリス−グリシンゲル(ＳＤＳなし)に、様々な濃度でＳＤＳを含む１０％ グリセロール含有ローディング用緩衝液により載せて、ＳＤＳを含まないトリス−グリシン泳動用緩衝液を用いて電気泳動した。固定及び乾燥後に、ゲルを直接オートラジオグラフィーにかけた。
【００２１】
ウエスタンブロッティング及び共免疫沈降
ＣＯＳ−１又は２９３Ｔ細胞を、リン酸カルシウム沈殿法を利用して、５μｇｐＣＩ−ｖｉｆ−ｃ−ｍｙｃ及びｐＣＩ−ｖｉｆ−ｆｌａｇでトランスフェクトした(Zhang, H.等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(22):12519-24, 1996；Zhang, H.等、J.Virol.69(6):3929-32, 1995)。４８時間後に、これらの細胞を、細胞溶解用緩衝液[１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ(ｐＨ８．０)、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ トリトン−Ｘ−１００、１０％ グリセロール、１ｍＭ ＰＭＳＦ、２μｇ／ｍｌ アプロチニン、２μｇ／ｍｌ ロイペプチン及び２μｇ／ｍｌ ペプスタチンＡ]中で溶解させた。直接ウエスタンブロッティングのために、全細胞溶解物をアセトンと混合した(１：３)。この混合物を、氷上で２０分間インキュベートした後に、１２，０００ｇで１０分間遠心分離した。次いで、これらのペレットを、風乾して、ＳＤＳ含有試料緩衝液に再懸濁させた。これらの試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにて電気泳動してから、ナイロン／ニトロセルロース膜上に電気泳動によりトランスファーした。一次抗体のヤギ抗ｃ−Ｍｙｃ抗体(Ａ１４)(Research Antibodies, カリフォルニア、Santa Cruz在)又はマウス抗Ｆｌａｇ抗体(Ｍ２)(Stratagene, カリフォルニア、La Jolla在)を、それぞれ、試料を結合するのに用いた。西洋ワサビペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)結合体化抗ヤギＩｇＧ抗体又は抗マウスＩｇＧ抗体(Research Antibodies, カリフォルニア、Santa Cruz在)を二次抗体として利用した。化学ルミネセンスベースの系(ＥＳＬ、Amersham-Pharmacia Biotech, ニュージャージー、Piscataway在)を利用して、抗原抗体結合を可視化した。
【００２２】
共免疫沈降のために、Ｖｉｆ−Ｆｌａｇ及び／又はＶｉｆ−ｃ−Ｍｙｃを発現するＣＯＳ−１又は２９３Ｔ細胞由来の細胞溶解物を、Ａ１４抗ｃ−Ｍｙｃ抗体(Research Antibodies, カリフォルニア、Santa Cruz在)(１μｇ／ｍｌ)と１２時間４℃で混合することによりインキュベートし、その後、プロテインＡ結合したセファロースＣＬ−４Ｂ(Amersham-Pharmacia Biotech, ニュージャージー、Piscataway在)と更に２時間インキュベートした。そのペレットを、細胞溶解用緩衝液で３回洗ってから、ＳＤＳ含有緩衝液に再懸濁させ、９５℃まで加熱して、１２，０００ｇで遠心分離した。その上清を、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。ナイロン／ニトロセルロース膜上にトランスファーした後に、これらの試料を、マウスＭ２抗Ｆｌａｇ抗体により検出した。ＨＲＰ結合した抗マウスＩｇＧ(Research Antibodies, カリフォルニア、Santa Cruz在)を第二抗体として利用した。
【００２３】
哺乳動物ツーハイブリッド系アッセイ
哺乳動物のツーハイブリッド系(ＧＡＬ４ベースの酵母ツーハイブリッドアッセイを改変したもの)を利用して、イン・ビボでのＨＩＶ−１Ｖｉｆタンパク質の自己会合を研究した。(Shimano, R.等、Biochem.Biophys.Res.Comm.242(2):313-6, 1998；Bogerd, H.及びGreene, W.C., J.Virol.67(5):2496-502, 1993)。この手順は、幾らかの改変を伴って、Shimano, R.等、Biochem.Biophys.Res.Comm.242(2):313-6, 1998及びBogerd, H.及びGreene, W.C., J.Virol.67(5):2496-502, 1993に記載された。簡単にいえば、５μｇのｐＧａｌ−Ｖｉｆ及びｐＶｉｆ−ＶＰをｐＧ５ＢＣＡＴとＣＯＳ−１細胞内に、Superfectトランスフェクション試薬(Qiagen, カリフォルニア、Valencia在)を用いて同時トランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、これらの細胞を適当な溶解用緩衝液(Promega, ウィスコンシン、Madison在)中で溶解させて、以前にZhang, H.等、J.Virol.69(6):3929-32, 1995に記載されたようにして、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(ＣＡＴ)アッセイにかけた。
【００２４】
単一ラウンドウイルス感染性アッセイ
Ｖｉｆ変異体の生物学的活性を、Dornadula, G.等、J.Virol.74(6):2594-602, 2000に記載された単一ラウンドウイルス感染性アッセイを幾らか改変したものを利用することにより評価した。組換えＨＩＶ−１ウイルスを生成するために、Ｈ９細胞に、５μｇのｐＮＬ４−３ΔｖｉｆΔｅｎｖ、ｐＭＤ.Ｇ[ＶＳＶ(vesicular stomatitis virus)エンベロープを含む]及び野生型ｖｉｆ遺伝子又はその変異体(ｐＣＩ−ｎｅｏ構築物)をエレクトロポレーションによりトランスフェクトした。(Dornadula, G.等、J.Virol.74(6):2594-602, 2000；Naldini, L.等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(21):11382-8, 1996)。このエレクトロポレーション(６５０Ｖ、２５０μＦ、５．１〜６．３ｍ秒)を、遺伝子パルサー装置及びキャパシタンス(Bio-Rad, カリフォルニア、Hercules在)により行なった。その後、調整培地(ＲＰＭＩ１６４０に１０％ ウシ胎児血清を加えたもの)を用いて、トランスフェクトしたＨ９細胞を維持した。トランスフェクションの２日後に、上清中のウイルス粒子を集めて、超遠心分離によりペレット化した。(Dornadula, G.等、J.Virol.74(6):2594-602, 2000)。酵素結合免疫溶媒アッセイ(ＥＬＩＳＡキット、DuPont社製)により検出したＨＩＶ−１ ｐ２４抗原レベルによる標準化の後に、これらのウイルスを、５×１０5ＨｅＬａ細胞 ＣＤ４−ＣＡＴ細胞に感染させるのに用いた。(Ciminale, V.等、AIDS Res.Hum.Retro.6(11):1281-7, 1990)。感染の４８時間後に、これらの細胞を、適当な溶解用緩衝液(Promega, ウィスコンシン、Madison在)中で溶解させて、ＣＡＴアッセイにかけた。
【００２５】
ファージディスプレーペプチドスクリーニング
Ｍ１３ファージ上にディスプレーされたＶｉｆ結合性ぺプチドを、Ｐｈ．Ｄ．−１２(商標)ファージディスプレーペプチドライブラリーキット(New England Biolabs, マサチューセッツ、Beverly在)を利用してスクリーニングした。ファージパニング手順を、キットのプロトコールを幾らか改変して行なった。グルタチオン−アガロースビーズ(Sigma, ミズーリ、St.Louis在)上に結合させたＧＳＴ−Ｖｉｆ融合タンパク質をファージパニングの標的として利用した。各ラウンドのパニングのために、１０11のファージを、６ｍｌの最終容積のＴＢＳ緩衝液(５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ)中の３ｍｌのグルタチオン−アガロースゲル上に結合された１０ｍｇ ＧＳＴに加えて、１時間振盪しながら室温でインキュベートした。この結合用溶液を、５００ｇ、１０分間の遠心分離により分離してから、上清を、３ｍｌのグルタチオン−アガロースビーズに結合させた１０ｍｇのＧＳＴ−Ｖｉｆに加えた。この混合物を、１時間室温でインキュベートしてから、ＴＢＳＴ[５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ ツイーン−２０]で６回洗った。これらのＧＳＴ−Ｖｉｆ結合ファージを、３ｍｌの５ｍＭ 還元グルタチオン(ＴＢＳ中)を加えることにより溶出した。溶出されたファージを、２．５ｍｌの溶出を２０ｍｌの大腸菌ＥＲ２７３８培養物(Ｏ.Ｄ ０．６)に加えて、激しく振盪しながら３７℃で４．５時間インキュベートすることにより増幅した。遠心分離後に、上清中のファージを、ＰＥＧ／ＮａＣｌにより沈殿させた。洗浄後に、これらのファージを、２００μｌのＴＢＳ中に懸濁させた。溶出された又は増幅されたファージの滴定を、キットのプロトコールに記載されたようにして測定した。３ラウンドのパニングの後に、ＧＳＴ又はＧＳＴ−Ｖｉｆ溶出滴定プレートに由来する個々のファージプラークを、それぞれ、増幅のために選択した。ファージＤＮＡを精製して配列決定した。
【００２６】
ＥＬＩＳＡによる結合アフィニティーの測定
ファージ酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)を行なって、ファージのＧＳＴ、ＧＳＴ−Ｖｉｆ又はＧＳＴ−アミノ酸１５１〜１９２を欠くＶｉｆに対する相対的結合親和性を測定した。１５０μｌの０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3(ｐＨ８．６)中の１００μｇ／ｍｌのＧＳＴ及びＧＳＴ−Ｖｉｆを、９６ウェルミクロ滴定プレート上にそれぞれコートして、４℃で一晩インキュベートした。これらのプレートを、室温で２時間、ブロッキング緩衝液(０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3、ｐＨ８．６、５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ)を用いてブロックした。２００μｌ ＴＢＳＴ中の個々のファージクローンを４倍連続希釈し(１０11〜１０5)、ＧＳＴ、ＧＳＴ−Ｖｉｆ又はＧＳＴ−アミノ酸１５１〜１９２を欠くＶｉｆでコートされたウェルに加えて２時間室温でインキュベートした。洗浄後に、ＨＲＰ結合した抗Ｍ１３抗体を加えてこれらのファージと結合させた。洗浄後に、基質を加えて発色を行なった。それ故、Ｖｉｆに捕捉されたファージが、半定量された。４０５ｎｍでのＯＤが０．１５以上のものを陽性とした。
【００２７】
抗体の生成
ＨＩＶ−１に曝され又は感染した個人を治療する本発明の方法は、Ｖｉｆ多量体の形成を相互作用的にブロック(即ち、阻止し又は阻害)し、それにより、レンチウイルスの生活環におけるＶｉｆ機能を阻害する化合物の投与に基づいている。この発明によれば、Ｖｉｆタンパク質、その断片又は他の誘導体(又は、その類似体)を、抗体を生成するための免疫原として利用することができる(該抗体は、かかる免疫原を認識する)。かかる抗体は、一本鎖、Ｆab断片、及びＦab発現ライブラリーを包含するが、これらに限られない。特定の具体例において、ヒトタンパク質に対する一本鎖抗体を製造する。
【００２８】
この発明により、一本鎖抗体の生成のために記載された技術(米国特許第４，９４６，７７８号)を、Ｖｉｆ特異的な一本鎖抗体を製造するために適合させることができる。一本鎖抗体の生成のための方法は、当業者に周知である。当業者は、かかる方法に関して、米国特許第５，３５９，０４６号(参考として、本明細書中に援用する)を参照する。一本鎖抗体は、重鎖及び軽鎖の可変ドメインを短いペプチドリンカーを用いて一緒に融合し、それにより、抗原結合部位を単一分子上に再構成することにより造られる。一の可変ドメインのＣ末端が他の可変ドメインのＮ末端に１５〜２５アミノ酸ペプチド又はリンカーにより係留された一本鎖抗体の可変断片(ｓｃＦｖ)が、抗原結合又は結合の特異性を有意に破壊することなく開発された(Bedzyk等、1990；Chaudhary等、1990)。このリンカーは、重鎖及び軽鎖がそれらの適当なコンホメーションの向きで一緒に結合するのを可能にするように選択される。例えば、Huston, J.S.等、Methods in Enzym.203:46-121(1991)を参照されたい(参考として、本明細書中に援用する)。これらのＦｖは、ネイティブな抗体の重鎖及び軽鎖に存在する定常領域(Ｆｃ)を欠く。
【００２９】
この発明の更なる具体例は、Ｆab発現ライブラリーの構築のために記載された技術（Huse等、Science 246：1275-1281）を利用して、Ｖｉｆタンパク質、誘導体又は類似体に対する所望の特異性を有するモノクローナルＦab断片の迅速且つ容易な同定を可能にする。
【００３０】
分子のイディオタイプを含む抗体断片を、公知の技術によって生成させることができる。例えば、かかる断片は、抗体分子のペプシン消化によって生成できるＦ(ab')2断片；Ｆ(ab')2断片のジスルフィド橋の還元により生成できるＦab'断片；及び抗体分子をパパイン及び還元剤で処理することにより生成できるＦab断片を包含するが、これらに限られない。
【００３１】
抗体の製造において、所望の抗体のスクリーニングは、当分野で公知の技術によって達成することができる。
【００３２】
細胞内発現系
一本鎖抗体を、細胞によって合成し、特定の細胞コンパートメントを標的として、高度に特異的な様式でＨＩＶ−１の複製に干渉させるために利用することができる。本発明において、この方法は、Ｖｉｆタンパク質又はその誘導体に結合できる一本鎖抗体の細胞内発現を含み、ここに、この抗体は、好ましくは、その分泌をコードする配列を含まない。かかる一本鎖抗体は、細胞内で標的に結合しない。本発明の抗体は、標的に結合できる抗体の部分をコードする十分な数のヌクレオチドを含むＤＮＡ配列から発現される。遺伝コードの固有の縮重のために、実質的に同じ又は機能的に等価な重鎖及び軽鎖アミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列は、この発明の範囲内にある。この発明に従って利用することのできる変化したＤＮＡ配列は、同じ又は機能的に等価な遺伝子産物をコードする配列を生じる種々のヌクレオチド残基の欠失、付加又は置換を含む。この遺伝子産物自体は、アミノ酸残基の欠失、付加又は置換を、重鎖又は軽鎖配列内に含むことができ、これは、サイレント変化を生じ、そうして、機能的に等価なモノクローナル抗体を生成する。
【００３３】
一本鎖抗体の遺伝子は、当分野で公知の技術を利用して調製することができる。米国特許第６，０７２，０３６号(参考として、本明細書中に援用する)を参照されたい。好ましくは、この遺伝子は、可変鎖の正常なリーダー配列をコードしない。この抗体の結合部分をコードするヌクレオチドは、好ましくは、抗体の分泌用配列をコードしない(即ち、抗体を細胞から分泌させる配列)。かかる配列を省くためのこの種のデザインは、抗体をコードするヌクレオチドの選択及び省略にて、容易に達成することができる。
【００３４】
加えて、この遺伝子は、関心ある細胞における抗体の発現を可能にするようにプロモーターに操作可能に結合される。哺乳動物細胞における発現を可能にするプロモーターは、当分野で周知であり、標的細胞に応じて、容易に選択することができる。プロモーターには、ＣＭＶ、ウイルス性ＬＴＲ例えばラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＨＩＶ−ＬＴＲ、ＨＴＬＶ−１ ＬＴＲ、ＳＶ４０初期プロモーター、大腸菌ｌａｃＵＶ５プロモーター及び単純ヘルペスｔｋウイルスプロモーターが含まれるが、これらに限られない。その上、誘導性プロモーター(やはり、当分野で周知である)の利用は、幾つかの具体例において好適である。そして、「そのプロモーターをオンにすること」により、その抗体の発現を選択的に得ることができる。一本鎖抗体の重鎖及び軽鎖並びにプロモーターをコードする完全な配列は、抗体カセットとして、ここに記載されている。このカセットは、遺伝子の細胞内送達を可能にする下記の多くの手段の何れかによって、細胞に送達される。このカセットは、この抗体の細胞内発現を生じる。発現された抗体は、標的抗原に結合することができる。
【００３５】
本発明の抗体は、標的即ちＶｉｆタンパク質又はその誘導体に、特異的に結合し、そうして、Ｖｉｆの多量体化を効果的に阻害する。本発明の硬体が他の分子と上首尾に競争することを保証するために、それらは、完全な硬体の少なくとも約７５％の、標的に対する結合効力を保持しなければならない。一層好ましくは、それは、完全な硬体の少なくとも８５％の結合効力を有する。尚一層好ましくは、それは、完全な硬体の少なくとも９０％の結合効力を有する。更に一層好ましくは、それは、少なくとも９５％の結合効力を有する。
【００３６】
遺伝子治療
この抗体カセットを、公知の手段の何れかによって細胞に送達する。例えば、Miller, A.D., Nature 357:455-460(1992)；Anderson, W.F., Science 256:808-813(1992)；Wu等、J.of Biol.Chem.263:14621-14624(1988)を参照されたい。例えば、これらの抗体遺伝子例えばｓＦｖ遺伝子を含むカセットを、本発明による遺伝子治療の多くの公知の形態によって、特定の細胞を標的として送達することができる。遺伝子治療の方法の一般的概観のためには、Goldspiel等、Clinical Pharmacy 12:488-505, 1993；Wu及びWu, Biotherapy 3:87-95, 1991；Tolstoshev, Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596, 1993；Mulligan,Science 260:926-932, 1993；並びにMorgan及びAnderson, Ann.Rev.Biochem.62:191-217,1993；1993年5月、TIBTECH 11(5):155-215を参照されたい。利用することのできる組換えＤＮＡ技術の分野で公知の方法は、Ausubel等(編), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Willey ＆ Sons, NY；及びKriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY.
【００３７】
特定の具体例において、この核酸は、直接、イン・ビボ投与され、それは、イン・ビボで発現されて、コードされた生成物を生成する。これは、当分野で公知の多くの方法の何れかによって、例えば、それを、適当な核酸発現ベクターの部分として構築して、それが細胞内に入るように、例えば欠損若しくは弱毒化レトロウイルス又は他のウイルスベクターを(米国特許第４，９８０，２８６号参照)(下記参照)利用する感染により、又は裸のＤＮＡの直接的投与により、又は微粒子ボンバードメント(例えば、遺伝子銃；Biolistic, Dupont)の利用により、又は脂質若しくは細胞表面レセプター若しくはトランスフェクト剤での被覆、又はリポソーム、微粒子若しくはマイクロカプセルへの封入により投与することにより、又はそれを、核に入ることが公知のペプチドに結合させて投与することにより、レセプター媒介のエンドサイトーシスのためにリガンド実体に結合させて投与することなどによって達成することができる(例えば、Wu及びWu,J.Biol.Chem.262:4429-4432, 1987を参照されたい)(これらのレセプターを特異的に発現している細胞型を標的とするために利用することができる)。他の具体例においては、リガンドが、エンドソームを破壊して核酸のリソソームでの分解を回避するfusogenicウイルスペプチドを含む、核酸−リガンド複合体を形成することができる。更に別の具体例においては、この核酸は、イン・ビボで、細胞特異的な取込み及び発現を、特異的レセプターを標的とすることによって、標的とすることができる(例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０６１８０、1992年、4月１６日(Wu等)；ＷＯ９２／２２６３５、1992年、12月23日(Wilson等)；ＷＯ９２／２０３１６、1992年11月26日(Findeis等)；ＷＯ９３／１４１８８、1993年、7月22日(Clarke等)、ＷＯ９３／２０２２１、1993年10月14日(Young)を参照されたい)。或は、この核酸は、細胞内に導入することができ且つ発現のために相同組換えによって宿主細胞ＤＮＡ中に組み込むことができる。(Koller ＆ Smithies, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:8932-8935, 1989；Zijlstra等、Nature 342:435-438, 1989)。
【００３８】
好適な面において、この治療剤は、Ｖｉｆ一本鎖抗体又はその誘導体をコードする核酸を含み、それは、適当な宿主においてＶｉｆ抗体又はその断片を発現する発現ベクターの部分である。特に、かかる核酸は、Ｖｉｆ抗体コード領域に操作可能に結合されたプロモーターを有し、このプロモーターは、誘導性であるか又は構成的であり、適宜、組織特異的である。他の特定の具体例においては、Ｖｉｆ抗体コード配列及び任意の他の所望の配列がゲノム中の所望の部位での相同組換えを促進する領域と隣接しており、そうして、Ｖｉｆ抗体核酸の染色体内発現を与える核酸分子が用いられる。(Koller及びSmithies, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:8932-8935, 1989；Zijlstra等、Nature 342:435-438, 1989)。
【００３９】
核酸の患者への送達は、直接的であり、即ち、この患者は、直接、核酸又は核酸を運ぶベクターに曝される。このアプローチは、イン・ビボ遺伝子治療として公知である。
【００４０】
タンパク質、それらの誘導体及び類似体
この発明は、更に、Ｖｉｆタンパク質及びそれらの誘導体(断片を含むが、それらに限られない)及び類似体に関係し、これらは、Ｖｉｆタンパク質の多量体化ドメインに結合し、それにより、Ｖｉｆ−Ｖｉｆ相互作用及びＶｉｆタンパク質の多量体化を阻害する。Ｖｉｆタンパク質又は誘導体を含む分子も又、提供される。
【００４１】
Ｖｉｆに関係する誘導体及び類似体の生成及び利用は、本発明の範囲内にある。特定の具体例において、この誘導体又は類似体は、相互作用によりＶｉｆに結合することができるが、完全長の野生型タンパク質と結合した機能活性を示すことのできないアンタゴニストである。かかる所望の免疫原性又は抗原性を有する誘導体又は類似体を、例えば、Ｖｉｆ活性の阻害のために利用することができる。関心ある所望のＶｉｆ特性を欠き又は阻害(例えば、感染性の阻止)する誘導体又は類似体を、かかる特性のインヒビター又はその生理的相関物として利用することができる。特定の具体例は、Ｖｉｆ自身に結合し或は会合し、それにより、Ｖｉｆの多量体化を阻止し又は該多量体化に干渉することのできるＶｉｆ断片に関係する。Ｖｉｆの誘導体又は類似体は、所望の活性について、当分野で公知の手順によって試験することができる。
【００４２】
この発明の特定の具体例においては、少なくとも本質的にアミノ酸残基１４４〜１７７(SEQ ID NO:２６)、好ましくは１５１〜１６４(SEQ ID NO:１)及び一層好ましくは１６１〜１６４(SEQ ID NO:２５)からのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列よりなるＶｉｆタンパク質よりなる(該タンパク質の断片を含む)タンパク質を提供する。アミノ酸残基１４４〜１７１、好ましくは１５１〜１６４、一層好ましくは１６１〜１６４又は本質的にそれらに対応する配列を有するＶｉｆの誘導体又は類似体は、本質的にＶｉｆ又はその断片と相同な領域(例えば、様々な具体例において、同じサイズのアミノ酸配列にわたって又は当分野で公知のコンピューター相同性プログラムにより為された整列において整列させた配列と比較した場合に、少なくとも６０％又は７０％又は８０％又は９０％又は９５％同一性)を含み又はコード核酸が、コーディングｖｉｆ配列に、ストリンジェントな条件下、中位にストリンジェントな条件下又は非ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることのできる分子を含むが、それらに限られない。
【００４３】
「ストリンジェントな条件」は、ここで用いる場合、洗浄に低イオン強度及び高温、例えば５０℃で、０．０１５Ｍ ＮａＣｌ／０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム／０．１％ ＳＤＳを使用；(Narducci, M.G.等、1997, Cancer Res, 57:5452-5456)ハイブリダイゼーション中、ホルムアミドなどの変性剤例えば５０％(ｖ／ｖ)ホルムアミド、０．１％ ウシ血清アルブミン／０．１％ フィコール／０．１％ ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤(ｐＨ６．５)、７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭ クエン酸ナトリウムを４２℃で使用し；又は(Virgilio, L.等、1998, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 95:3885-3889)５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ(０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍ ピロリン酸ナトリウム、５×デンハート溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ(５０ｇ／ｍｌ)、０．１％ ＳＤＳ及び１０％ デキストラン硫酸を４２℃で使用し、４２℃で０．２×ＳＳＣ及び０．１％ ＳＤＳ中で洗浄するハイブリダイズ条件(Virgilio, L.等、1994, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 91:12530-12534)をいう。
【００４４】
「中位にストリンジェントな条件」又は「非ストリンジェントな条件」は、Sambrook等、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989に記載されたように確認することができ、上記のものより低くストリンジェントな洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件(例えば、温度、イオン強度及びＳＤＳの％)の利用を含む。「中位にストリンジェントな条件」の例は、２０％ ホルムアミド、５×ＳＳＣ(１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸三ナトリウム)、５０ｍＭ リン酸ナトリウム(ｐＨ７．６)、５×デンハート溶液、１０％ デキストラン硫酸、及び２０μｇ／ｍＬ 変性して剪断されたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中での、３７℃で一晩のインキュベーション及びその後の１×ＳＳＣ中での約３７〜５０℃でのフィルターの洗浄である。当業者は、プローブ長などの因子を適応させるのに必要な温度、イオン強度などを如何にして調節するのかを認めるであろう。「非ストリンジェントな条件」は、５×ＳＳＣ、２５％ ホルムアミド、５×デンハート溶液、１０％ デキストラン硫酸、及び１００ｇ／ｍｌ 変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中での、３７℃で一晩のインキュベーション及びその後の５×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中での室温でのフィルターの洗浄である。
【００４５】
この発明のＶｉｆ誘導体及び類似体は、当分野で公知の様々な方法によって製造することができる。それらの生成を生じる操作は、遺伝子レベル又はタンパク質レベルで存在しうる。やはり本発明の範囲内で、他の立体的に類似の化合物(ペプチド模倣物と呼ばれる)を処方して、Ｖｉｆタンパク質、その誘導体及び類似体の構造の鍵となる部分を真似ることができる。かかる化合物は、Ｖｉｆタンパク質、その誘導体及び類似体と同様にして利用することができ、それ故、機能的同等物でもある。構造的機能的同等物の生成は、当業者に公知のモデリング及び化学的デザインの技術によって達成することができる。すべてのかかる立体的に類似の構造は、本は積め胃の範囲に入るということは理解されよう。
【００４６】
加えて、ｖｉｆをコードする核酸配列は、イン・ビトロ又はイン・ビボで成熟して、翻訳、開始、及び／又は停止配列を創生し及び／又は破壊するか、又はコード領域内に変化を創生し及び／又は新たな制限エンドヌクレアーゼ部位を形成し、又は先在するものを破壊して更なるイン・ビトロ改変を促進する。当分野で公知の突然変異誘発のための任意の技術を利用することができ、それには、化学的突然変異導入、イン・ビトロ位置指定突然変異導入(Hutchinson, C.等、J.Biol.Chem.253:6551, 1978)などが含まれるが、これらに限定されない。
【００４７】
Ｖｉｆ配列の操作は又、タンパク質レベルでも為されうる。翻訳中又は翻訳後に公知の保護基／ブロッキング基、タンパク質加水分解による開裂、抗体分子若しくは他の細胞性リガンドなどへの結合によって、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、誘導体形成によって、差次的に改変されたタンパク質断片又は他の誘導体若しくは類似体は、この発明の範囲内に含まれる。任意の多くの化学的修飾を、シアノゲンブロミド、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ4による特異的な化学的開裂；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシンの存在下での代謝的合成などを含む(これらに限られない)公知の技術によって行なうことができる。
【００４８】
加えて、Ｖｉｆの類似体及び誘導体は、化学合成することができる。例えば、所望のドメインを含む(又は、イン・ビトロで所望の活性を媒介する)Ｖｉｆタンパク質の一部に対応するペプチドを、ペプチドシンセサイザーの利用によって合成することができる。その上、所望であれば、非古典的アミノ酸又は化学的アミノ酸類似体を、Ｖｉｆ配列への置換又は付加として導入することができる。非古典的アミノ酸には、一般的アミノ酸のＤ−異性体、α−アミノイソ酪酸、４アミノ−酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、γ−Ａｂｕ、ε−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロ−アミノ酸、デザイナーアミノ酸例えばβ−メチルアミノ酸、Ｃ−α−メチルアミノ酸、Ｎ−α−メチルアミノ酸、及びアミノ酸類似体が、一般に、含まれるが、これらに限られない。その上、このアミノ酸は、Ｄ(右旋性)であっても、Ｌ(左旋性)であってもよい。
【００４９】
特定の具体例において、Ｖｉｆ誘導体は、キメラ(又は、融合)タンパク質であり、Ｖｉｆタンパク質又はその断片(少なくともアミノ酸残基１４４〜１７１好ましくは１５１〜１６４、一層好ましくは１６１〜１６４よりなる)を、そのアミノ末端又はカルボキシ末端においてペプチド結合を介して異なるタンパク質のアミノ酸配列に結合して含む。一具体例においては、かかるキメラタンパク質を、そのタンパク質をコードする核酸(Ｖｉｆコード配列を、異なるタンパク質のコード配列にイン・フレームで結合して含む)の組換え発現により製造する。かかるキメラ生成物は、所望のアミノ酸配列をコードする適当な核酸配列を、適当なコード枠で、当分野で公知の方法により互いに連結して、当分野で一般に知られた方法によりそのキメラ生成物を発現させることにより作成されうる。或は、かかるキメラ生成物は、タンパク質合成技術により(例えば、ペプチドシンセサイザーの利用により)作成することができる。任意の異質タンパク質をコードする配列に融合されたｖｉｆの部分を含むキメラ遺伝子を構築することができる。
【００５０】
他の特定の具体例において、Ｖｉｆ誘導体は、Ｖｉｆタンパク質と相同な領域を含む分子である。例として、様々な具体例において、第一のタンパク質領域は、第一の領域のアミノ酸配列が、第一の領域に含まれる数と同じ数のアミノ酸の第二の領域中の任意の配列と比較したときに、又は当分野で公知のコンピューターホモロジープログラムにより整列させてある第二の領域の整列させた配列と比較したときに、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％又は９５％同一である場合には、第二のタンパク質領域と「相同である」と考えられる。例えば、一つの分子は、Ｖｉｆドメイン又はその一部分又は完全長タンパク質と相同な１つ以上の領域を含むことができる。
【００５１】
本発明により、Ｖｉｆドメイン又はその一部又は完全長タンパク質の少なくとも１つのペプチド模倣物を含む分子が、やはり与えられる。
【００５２】
ＰＸＰモチーフを含むペプチド
本発明は又、ＰＸＰモチーフを含むペプチドにも関係する。ＰＸＰモチーフを含むペプチドを含む分子も又、与えられる。
【００５３】
ＰＸＰモチーフを含むペプチドは、約５〜２０アミノ酸の長さであってよい。例として(制限するものではない)、かかるＰＸＰモチーフ含有ペプチドは、SEQ ID NO:５〜２３のアミノ酸配列を有するペプチドを包含することができる。
【００５４】
ＰＸＰモチーフ含有ペプチドの製造及び利用は、本発明の範囲内にある。特定の具体例において、これらのＰＸＰモチーフ含有ペプチドは、Ｖｉｆタンパク質の多量体化ドメインと相互作用的に結合してＶｉｆタンパク質の多量体化を阻害することのできるアンタゴニストである。やはり本発明の範囲内にある、他の立体的に類似の化合物(ペプチド模倣物という)を処方して、ＰＸＰモチーフ含有ペプチドの構造の鍵となる部分を真似ることができる。かかる化合物は、この発明のＰＸＰモチーフ含有ペプチドと同様にして利用することができ、それ故、機能的にも同等である。構造的機能的同等物の生成は、当業者に公知のモデル化及び化学的デザインの技術により達成することができる。すべてのかかる立体的に類似の構造物は、本発明の範囲内に入るということは理解されよう。
【００５５】
この発明のＰＸＰモチーフ含有ペプチドは、当分野で公知の様々な方法により製造することができる。例えば、ＰＸＰモチーフ含有ペプチドは、ペプチドシンセサイザーの利用により化学合成することができる。その上、所望であれば、非古典的アミノ酸又は化学的アミノ酸類似物を、置換又は付加として、ＰＸＰモチーフ含有ペプチドに導入することができる。非古典的アミノ酸は、一般的アミノ酸のＤ−異性体、α−アミノイソ酪酸、４アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、γ−Ａｂｕ、ε−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸例えばβ−メチルアミノ酸、Ｃ−α−メチルアミノ酸、Ｎ−α−メチルアミノ酸、及びアミノ酸類似体を一般に包含するが、これらに限られない。その上、このアミノ酸は、Ｄ(右旋性)であってもＬ(左旋性)であってもよい。
【００５６】
特定の具体例において、ＰＸＰモチーフを含むペプチドは、異なるタンパク質のアミノ酸配列にペプチド結合を介してアミノ末端又はカルボキシ末端で結合したＰＸＰモチーフ含有ペプチドを含むキメラ(又は、融合)タンパク質である。一具体例において、かかるキメラタンパク質は、このタンパク質をコードする核酸(異なるタンパク質をコードする配列にイン・フレームで結合されたＰＸＰモチーフ含有ペプチドをコードする配列を含む)の組換え発現によって製造される。かかるキメラ生成物は、所望のアミノ酸配列をコードする適当な核酸配列を当分野で公知の方法により適当なコード枠で互いに連結して、そのキメラ生成物を当分野で一般に知られている方法により発現させることによって作成することができる。或は、かかるキメラ生成物は、タンパク質合成技術(例えば、ペプチドシンセサイザーの利用)によって作成することができる。任意の異質タンパク質をコードする配列に融合されたＰＸＰモチーフ含有ペプチドのコード配列を含むキメラ遺伝子を構築することができる。
【００５７】
この発明の他の特定の具体例においては、ＰＸＰモチーフ含有ペプチドを含む分子を提供する。一つの分子は、一つ以上のＰＸＰモチーフ含有ペプチドを含むことができる。ＰＸＰモチーフ含有ペプチドは、５〜２０アミノ酸長であってよい。例として(制限ではない)、かかるＰＸＰモチーフ含有ペプチドは、SEQ ID NO:５〜２３のアミノ酸配列を有するペプチドを含むことができる。
【００５８】
ＰＸＰモチーフ含有ペプチドの一つ以上のペプチド模倣物を含む分子も又、提供される。かかるＰＸＰモチーフ含有ペプチドは、SEQ ID NO:５〜２３のアミノ酸配列を有するペプチドを包含するが、これらに限られない。
【００５９】
Ｖｉｆ多量体形成を阻害する小分子のスクリーニング
本発明は、Ｖｉｆに特異的に結合し、それにより、多量体化を阻害する分子の検出に関係する。かかる分子は、そうして、ＨＩＶ−１の生活環を阻止する。好適具体例において、アッセイを行なって、治療剤としての潜在的有用性を有する分子又は薬物開発のためのリード化合物をスクリーニングする。この発明は、Ｖｉｆに結合してＶｉｆの多量体化に拮抗し、それによりＶｉｆの活性及びその後のレンチウイルスの複製を阻害する分子を検出するためのアッセイを提供する。
【００６０】
例えば、Ｖｉｆ核酸を発現する組換え細胞を利用して、組換えによって、Ｖｉｆ又はＶｉｆ結合体を製造し、Ｖｉｆ又はＶｉｆ結合体に結合する分子をスクリーニングする。分子をＶｉｆ又はＶｉｆ結合体(又は、それらの断片)と、結合に助けとなる条件下で接触させてから、Ｖｉｆ又はＶｉｆ結合体に特異的に結合する分子を同定する。上記を実行するのに用いられる方法は、一般に、当分野で公知である。例として(制限ではない)、ファージペプチドディスプレーアッセイ又はファージ酵素結合免疫結合アッセイ(ＥＬＩＳＡ)を利用することができる。
【００６１】
本発明の他の具体例において、Ｖｉｆ又はＶｉｆ結合体に結合してＶｉｆタンパク質の多量体形成を阻害する分子を、Ｖｉｆ−Ｖｉｆ結合アッセイによって同定することができる。一層詳細には、Ｖｉｆ−Ｖｉｆ結合アッセイは、１）Ｖｉｆ又はＶｉｆ含有ペプチドをカラム又はビーズに結合させ；２）試験分子及び多量体化ドメインを含む標識したＶｉｆ(又は、その断片)を、Ｖｉｆ又はＶｉｆ含有ペプチドを結合したカラム又はビーズに加え；３）そのカラム又はビーズを洗って、標識したＶｉｆ(又は、その断片)をカラム又はビーズから分離し；そして４）カラム又はビーズに結合した標識されたＶｉｆ(又は、その断片)の量を測定し、比較して、この分子の拮抗活性を測定するステップを含む。「標識したＶｉｆ又はその断片」は、放射性標識、化学的標識又は蛍光標識したことをいうが、これらに制限はしない。
【００６２】
本発明の特定の具体例においては、Ｖｉｆ及び／又はＶｉｆを発現する細胞株を利用して、Ｖｉｆに結合してＶｉｆのアンタゴニストとして作用する抗体、ペプチド又は他の分子をスクリーニングする。本発明のアンタゴニストは、任意の細胞において機能する。本発明のＶｉｆアンタゴニストは、Ｖｉｆの多量体化ドメインに結合してＶｉｆの自己会合を阻止し、それにより、Ｖｉｆの複製その他の必須機能を阻害し又は阻止する。それ故、Ｖｉｆアンタゴニストは、レンチウイルス感染と関係する病気を阻止し又は防止する。かかる病気には、後天性免疫不全症候群が含まれるが、これに限られない。
【００６３】
Ｖｉｆアンタゴニストは、組換えにより発現されたＶｉｆを有する有機又はペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって同定される。これらのＶｉｆアンタゴニストは、Ｖｉｆの活性を改変する治療用分子として又は治療用分子の開発のためのリード化合物として有用である。合成の及び天然の生成物を、当業者に日常的と認められる多くの方法でスクリーニングする。
【００６４】
例として、多様性ライブラリー(例えば、ランダム又はコンビナトリアルペプチド又は非ペプチドライブラリー)を、Ｖｉｆに特異的に結合する分子につきスクリーニングする。多くのライブラリー例えば化学合成したライブラリー、組換え(例えば、ファージディスプレーライブラリー)、及びイン・ビトロ翻訳ベースのライブラリーが、当分野で知られ、用いられている。
【００６５】
化学合成したライブラリーの例は、(Fodor等、Science 251:767-773, 1991；Hougten等、Nature 354:84-86, 1991；Lam等、Nature 354:82-84, 1991；Medynski, Bio/Technology 12:709-710, 1994；Gallop等、J.Medicinal Chemistry 37(9):1233-1251, 1994；Ohlmeyer等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:10922-10926, 1993；Erb等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:11422-11426, 1994；Houghten等、Biotechniques 13:412,1992；Jayawickreme等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:1614-1618, 1994；Salmon等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:11708-11712, 1993；ＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ９３／２０２４２；及びBrenner及びLerner, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5381-5383, 1992)に記載されている。
【００６６】
ファージディスプレーライブラリーの例は、(Scott及びSmith, Science 249:386-390, 1990；Devlin等、Science, 249:404-406, 1990；Christian, R.B.等、J.Mol.Biol.227:711-718, 1992；Lenstra, J.Immunol.Meth.152:149-157, 1992；Kay等、Gene 128:59-65, 1993；１９９４年８月１８日付けＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ９４／１８３１８)に記載されている。
【００６７】
イン・ビトロ翻訳ベースのライブラリーは、１９９１年４月１８日付けＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ９１／０５０５；Mattheakis等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:9022-9026, 1994に記載されたものを包含するが、これらに限られない。
【００６８】
非ペプチドライブラリーの例として、ベンゾジアゼピンライブラリー(Bunin等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:4708-4712, 1994参照)を適合させて利用することができる。ペプトイドライブラリー(Simon等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:9367-9371, 1992)も又、利用することができる。ペプチド中のアミノ官能基がペルメチル化されており、化学的にトランスフォームされたコンビナトリアルライブラリーを生成するのに利用できる他のライブラリーの例は、Ostresh等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:11138-11142, 1994に記載されている。
【００６９】
これらのライブラリーのスクリーニングは、一般に知られている様々な方法の何れかによって達成することができる。例えば、ペプチドライブラリーのスクリーニングを開示している次の参考文献を参照されたい：Parmley及びSmith, Adv.Exp.Med.Biol.251:215-218, 1989；Scott及びSmith, Science 249:386-390, 1990；Fowlkes等、BioTechniques 13:422-427,1992；Oldenburg等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5393-5397, 1992；Yu等、Cell 76:933-945,1994；Staudt等、Science 241:577-580, 1988；Bock等、Nature 355:564-566, 1992； Tuerk等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6988-6992,1992；Ellington等、Nature 355:850-852, 1992；米国特許第５，０９６，８１５号、米国特許第５，２２３，４０９号及び米国特許第５，１９８，３４６号(何れもLadnerに対する特許)；Rebar及びPabo, Science 263:671-673, 1993；及びＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ９４／１８３１８。
【００７０】
特定の具体例において、スクリーニングは、ライブラリーメンバーを固相上に固定したＶｉｆ(又は、その断片)と接触させ、Ｖｉｆ(又は、その断片)に結合したライブラリーメンバーを採集することにより実施される。かかるスクリーニング法(「パニング」技術と呼ばれる)は、例えば、Parmley及びSmith, Gene 73:305-318, 1988；Fowlkes等、BioTechniques 13:422-427, 1992；ＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ９４／１８３１８及び上記の参考文献に記載されている。
【００７１】
他の具体例においては、酵母において相互作用するタンパク質を選択するためのツーハイブリッド系(Fields及びSong, Nature 340:245-246, 1989；Chien等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:9578-9582, 1991)を利用して、Ｖｉｆ(又は、その断片)と特異的に結合する分子を同定する。
【００７２】
治療用途
この発明は、治療用化合物の投与による様々な病気の治療又は予防を与える。かかる治療剤は、Ｖｉｆタンパク質並びにそれらの類似体及び誘導体(断片を含む)；それらに対する抗体；これらのタンパク質、類似体又は誘導体をコードする核酸；及びアンタゴニストを包含するが、これらに限られない。好適具体例においては、レンチウイルス感染に関係する疾患を、Ｖｉｆ機能を阻害する治療剤の投与により治療し又は予防する。
【００７３】
一般に、患者の種と同じ種の起源又は反応性(抗体の場合)の生成物の投与が好ましい。従って、好適具体例において、ヒトのＶｉｆタンパク質、誘導体又は類似体、又は核酸、又はヒトＶｉｆタンパク質又はヒトＶｉｆ核酸に対する抗体を、治療又は予防のために、ヒト患者に投与する。
【００７４】
ｖｉｆポリヌクレオチド及びそのタンパク質生成物を、レンチウイルス感染に関係する疾患並びにＶｉｆの多量体化に関係する他の疾患の治療／予防目的のために利用することができる。ｖｉｆポリヌクレオチド及びそのタンパク質生成物は、治療／予防目的のために、単独で又は後天性免疫不全症候群又はレンチウイルスにより引き起こされる他の疾患の治療に有用な他の治療剤と共に利用することができる。
【００７５】
特定の具体例において、Ｖｉｆ機能を阻害する治療剤を、治療(予防を含む)のために：(１)レンチウイルス特にＨＩＶ−１に関係する疾患；又は(２)イン・ビトロ(又は、イン・ビボ)アッセイがＶｉｆアンタゴニストの投与の有用性を示している疾患において投与する。ＨＩＶ−１の存在は、当分野で標準的な任意の手段によって(例えば、患者の血液試料を得て、それをイン・ビトロでＨＩＶ−１の存在につきアッセイすることによって)容易に検出することができる。
【００７６】
治療／予防方法
この発明は、患者への有功量の治療剤即ち本発明のモノクローナル(又は、ポリクローナル)抗体、レトロウイルスベクター、又はＶｉｆアンタゴニストの投与による治療及び予防方法を提供する。好適な面において、この治療剤は、実質的に純粋である。患者は、好ましくは、ウシ、ブタ、ニワトリなどの動物を含む動物であり(これらに限られない)、好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。
【００７７】
様々な送達システム例えばリポソーム内へのカプセル封入、微粒子、マイクロカプセル、組換え細胞による発現、レセプター媒介のエンドサイトーシス(例えば、Wu及びWu, J.Biol.Chem.262:4429-4432, 1987参照)、レトロウイルス又は他のベクターの部分としての治療用核酸の構築などが知られており、この発明の治療剤の投与に利用される。導入方法は、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内及び経口経路を包含するが、これらに限られない。これらの化合物を、任意の便利な経路により、例えば、点滴又はボーラス注射により、上皮又は皮膚粘膜内層からの吸収(例えば、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜など)によって投与し、他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与することができる。投与は、全身性であっても局所的であってもよい。加えて、この発明の医薬組成物を、中枢神経系に、脳室内注射及び髄腔内注射を含む任意の適当な経路により導入することは望ましいことでありうる；脳室内注射は、脳室カテーテル(例えば、オマヤレザバーなどの貯蔵器に結合したもの)により促進されうる。
【００７８】
特定の具体例において、この発明の医薬組成物を、治療を必要とする領域に局所的に投与することは望ましいことでありえて；これは、制限はしないが、例えば、外科手術中の局所的浸剤、局所適用(例えば、外科手術後に外傷用包帯と共に適用)により、注射により、カテーテルにより、坐薬により、又はインプラントによって達成することができる(インプラントは、多孔性のもの、非多孔性のもの又はゼラチン材料のものであり、シラスティック膜などの膜又は繊維を含む)。一具体例において、投与は、悪性腫瘍の部位(又は、形成部位)又は新生物又は新生物前駆体組織への直接的注射による。
【００７９】
治療剤がタンパク質治療剤をコードする核酸である特定の具体例においては、その核酸を、イン・ビボで投与してそのコードするタンパク質の発現を、それを適当な核酸発現ベクターの部分として構築し、それが細胞内となるように例えばレトロウイルスベクター(米国特許第４，９８０，２８６号参照)の利用により、又は直接的注射により、又はミクロパーティクルボンバードメント(例えば、遺伝子銃；Biolistic, Dupont)の利用、又は脂質若しくは細胞表面レセプター若しくはトランスフェクション剤での被覆により、又は核に入ることが公知のホメオボックス様ペプチド(例えば、Joliot等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:1864-1868, 1991参照)と結合させて投与することなど(前出)により投与することにより促進する。或は、核酸治療剤を、相同組換えによる発現のために細胞内に導入して、宿主細胞ＤＮＡ内に組み込むことができる(前出)。
【００８０】
医薬組成物
本発明は又、医薬組成物をも提供する。かかる組成物は、治療上有効な量の治療剤及び製薬上許容しうるキャリアー又は賦形剤を含む。かかるキャリアーには、塩溶液、緩衝塩溶液、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、及びこれらの組合せが含まれるが、これらに限られない。キャリアー及び組成物は、無菌であってよい。この配合は、投与方法に適合させる。
【００８１】
この組成物は、所望であれば、少量の湿潤剤又は乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を含むこともできる。この組成物は、液体溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、丸薬、カプセル、持続的放出用配合物又は粉末であってよい。この組成物は、伝統的結合剤及びキャリアー例えばトリグリセリドを用いて坐薬として配合することができる。経口用配合物は、標準的キャリアー例えば医薬等級のマンニトール、ラクトース、澱粉、マグネシウムステアレート、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含むことができる。
【００８２】
好適具体例において、この組成物は、日常的手順に従って、ヒトへの静脈投与に適合した医薬組成物として配合される。典型的には、静脈投与のための組成物は、無菌の等張の水性緩衝液中の溶液である。必要であれば、この組成物には又、可溶化剤及び局所麻酔剤例えばリグノカインを含ませて注射部位の痛みを和らげることもできる。一般に、これらの成分を別々に供給し又は単位投薬形態に一緒に混合して供給する(例えば、アンプルなどの密封した容器内の凍結乾燥した粉末又は無水濃縮物又は活性剤の量を示すサッシェとして)。この組成物を点滴により投与すべき場合には、それは、無菌の医薬等級の水又は塩溶液を含む点滴ボトルにて分配される。この組成物を注射により投与する場合には、注射用の無菌水又は塩溶液のアンプルを、成分が投与前に混合されるように与える。
【００８３】
この発明の治療剤は、中性の又は塩の形態として配合される。製薬上許容しうる塩は、遊離のアミノ基により形成されるもの例えば塩酸、リン酸、酢酸、蓚酸、酒石酸などから誘導されるもの及び遊離のカルボキシル基により形成されるもの例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどを含む。
【００８４】
特定の病気の治療に有効なこの発明の治療剤の量は、その病気の性質に依存し、標準的な臨床的技術により決定される。加えて、最適な投薬量の範囲を同定するのを助けるために、イン・ビトロアッセイを、適宜、使用することができる。この配合において使用すべき正確な投与量も又、投与の経路、病気の重さに依存し、開業医の判断及び各患者の事情によって決定される。しかしながら、静脈投与に適した投薬量の範囲は、一般に、体重１ｋｇ当たり約２０〜５００μｇの活性化合物である。鼻腔内投与のための適当な投薬量の範囲は、体重１ｋｇ当たり約０．０１ｐｇ〜１ｍｇである。有効な投与量は、イン・ビトロ及び動物モデル試験系から導かれた投与量−応答曲線から外挿することができる。
【００８５】
坐薬は、一般に、活性成分を０．５重量％〜１０ｋの範囲で含み;経口用配合物は、好ましくは、１０〜９５％の活性成分を含む。
【００８６】
この発明は又、この発明の医薬組成物の少なくとも一種の成分を充填した少なくとも一つの容器を含む医薬パック又はキットをも提供する。かかる容器には、医薬又は生物学的製品の製造、使用又は販売を取り締まる政府機関により規定された形式の通知が、適宜、結合されており、該通知は、ヒトへの投与のための製造、使用又は販売の機関による認可を反映する。
【００８７】
結果
Ｖｉｆタンパク質は、多量体をイン・ビトロで形成することができる
Ｖｉｆタンパク質が自己会合する傾向を有するかどうかを調べるために、ＧＳＴ−ＶｉｆをＢＬ２１細菌細胞中で発現させて、グルタチオン結合したアガロースビーズ上に分離した。これらのＧＳＴ−Ｖｉｆ結合したビーズを、次いで、イン・ビトロ翻訳した35Ｓ標識したＶｉｆタンパク質とインキュベートした。結合後に、ビーズ結合した35Ｓ標識したＶｉｆを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析してから直接オートラジオグラフィーを行なった。結合した35Ｓ標識Ｖｉｆのオートラジオグラフィーは、ＧＳＴ−Ｖｉｆ(レーン２)が、35Ｓ標識されたイン・ビトロ翻訳されたＶｉｆタンパク質に結合するが、ＧＳＴ(レーン３)は結合しないことを示し、これはＶｉｆ−Ｖｉｆ相互作用を示している(図１Ａ)。
【００８８】
Ｖｉｆタンパク質の自己会合する傾向を更に評価するために、イン・ビトロ翻訳された35Ｓ標識したＨＩＶ−１ Ｖｉｆタンパク質を、直接、トリス−グリシン−ネイティブゲル(ＳＤＳなし)に載せた(１０％グリセロールのみを含むか又は様々な濃度でＳＤＳを含むローディング緩衝液使用)。４〜１５％ トリス−グリシンランニング緩衝液を用いて行なった電気泳動は、ネイティブな又は比較的ネイティブな条件下で、35Ｓ標識したＶｉｆタンパク質が単量体(２３Ｋｄ)、二量体(４６Ｋｄ)、三量体(６９Ｋｄ)、又は四量体(９２Ｋｄ)として移動することを示している(図１Ｂ)。ローディング緩衝液中のＳＤＳの濃度の増大と共に、Ｖｉｆの主要形態は、最終的に単量体(２３Ｋｄ)になる。この試料を９５℃に５分間加熱した場合には、Ｖｉｆタンパク質のすべての多量体が消失し、これは、Ｖｉｆ−Ｖｉｆ結合が共有結合でないことを意味している。試料のローディング前に、35Ｓ標識したイン・ビトロ翻訳されたＨＩＶ−１ Ｖｉｆタンパク質をＲＮアーゼＡで処理して可能なＲＮＡ夾雑を排除したので、Ｖｉｆ−Ｖｉｆ結合は、ＲＮＡとは無関係であった。
【００８９】
Ｖｉｆ多量体形成のための結合部位は、Ｃ末端に位置している
Ｖｉｆ多量体形成のための結合部位を決定するために、Ｖｉｆタンパク質中に、ＰＣＲベースの突然変異導入とその後の35Ｓ−メチオニンの存在下でのイン・ビトロ翻訳により、一連の欠失を生成させる。これらのＶｉｆ変異体を、その後、アガロースビーズ上に結合したＧＳＴ−Ｖｉｆ融合タンパク質に結合させた。結合後に、ビーズに会合した35Ｓ標識したＶｉｆタンパク質及びその変異体をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけて、直接オートラジオグラフィーにより可視化した。図２Ａは、その結果を与えるものである。Ｖｉｆタンパク質は、Ｃ末端の欠失によりＶｉｆ−Ｖｉｆ結合活性を著しく失い、１５１〜１６４位のアミノ酸の欠失は、結合活性を有意に減じる(図２Ａ)。この結果は、ネイティブな多量体形成アッセイにより確認される。０．１％ ＳＤＳ、Ｖｉｆ変異体Δ１５１−１９２及びΔ１５１−１６４は、多量体を形成することができなかったが、他の変異体は、多量体を形成する能力を保持した(図２Ｂ)。
【００９０】
幾つかの正に帯電したアミノ酸が１５１−１６４断片中にあることは注目に値する。これらの正に帯電したアミノ酸をGoncalves等(Goncalves, J.等、J.Virol.69(11):7196-204, 1995)により生成されたように置き換えた変異体を、このＶｉｆ−Ｖｉｆ結合につき試験した。しかしながら、これらの変異体すべては、依然として、Ｖｉｆ−Ｖｉｆ結合能力を含んでいる(データは、示さない)。幾つかのプロリン(Ｐ１５６、Ｐ１６１、Ｐ１６２、Ｐ１６４)が、この断片中にあることも又、注目に値する。これらのプロリンの内で、Ｐ１６１は、ＨＩＶ−１又はＳＩＶの種々の株において高度に保存されている。更なる研究は、161ＰＰＬＰ164(Ｖｉｆタンパク質 SEQ ID NO:２５中のアミノ酸１６１〜１６４)の欠失が、Ｖｉｆタンパク質の互いに相互作用する能力を有意に減じることを示している。その上、高度に保存されたモチーフＳＬＱＹＬＡＬ(SEQ ID NO:４)(ＨＩＶ−１NL4-3の１４４〜１５０位のアミノ酸)は、このドメインに近い。
【００９１】
それ故、Ｖｉｆ多量体形成のためのドメインは、Ｃ末端に位置しており、一層詳細には、ＨＩＶNL4-3Ｖｉｆタンパク質の１４４〜１７１位のアミノ酸に位置しており、SEQ ID NO:２６のアミノ酸配列を有している。
【００９２】
細胞内でのＶｉｆのＶｉｆに対する相互作用
Ｖｉｆの自己会合が、細胞内でも起きるのかどうかを調べるために、共免疫沈降法を使用した。このＶｉｆタンパク質を、ｃ−Ｍｙｃ(SEQ ID NO:３)又はＦｌａｇエピトープ(SEQ ID NO:２)を用いてＣ末端でタグ標識して、ＣＯＳ−１細胞内で発現させた。ｃ−Ｍｙｃタグ標識したＶｉｆ及びＦｌａｇタグ標識したＶｉｆの発現を、マウス抗ｃ−Ｍｙｃエピトープ抗体又はヤギ抗Ｆｌａｇエピトープ抗体を用いるウエスタンブロッティングによりそれぞれ検出した(図３、上の２つのパネル)。Ｖｉｆ−Ｖｉｆ相互作用を研究するために、これらの細胞溶解物を、抗−Ｍｙｃ抗体を用いて免疫沈降させ、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけてから、ウエスタンブロッティングを行なった。ヤギ抗−Ｆｌａｇ抗体を用いて、Ｆｌａｇタグ標識したＶｉｆを検出した。これらの結果を図３の一番下のパネルに示す。Ｆｌａｇタグ標識したＶｉｆは、マウス抗−Ｍｙｃ抗体を免疫沈降に使用する場合には、Ｍｙｃタグ標識したＶｉｆにより共沈され、これは、細胞内のＶｉｆ−Ｖｉｆ相互作用を意味している(図３、一番下のパネル)。
【００９３】
或は、このイン・ビボでのＶｉｆ対Ｖｉｆ相互作用を、哺乳動物のツーハイブリッド系により試験した。ＶＰ１６とＧａｌ４よりなる融合タンパク質は、Ｇａｌ４応答エレメント含有Ｅ１ｂプロモーターを活性化することができる。Ｇａｌ４は、ＤＮＡ結合ドメインとして機能するが、ＶＰ１６は、ＤＮＡ活性化ドメインとして機能する。ＨＩＶ−１ Ｖｉｆタンパク質で、ＶＰ１６又はＧａｌ４ドメインをそれぞれ置き換えた(図４Ａ)。もしＶｉｆタンパク質間で相互作用が起きれば、ＶＰ１６とＧａｌ４ドメインは、一緒に運ばれて、Ｅ１ｂプロモーターに含まれるＧａｌ４結合配列が活性化される。ＣＡＴ分析は、Ｒｅｖ−Ｒｅｖ相互作用と同様に、Ｖｉｆ−ＶＰ１６融合タンパク質中のＶｉｆが、Ｇａｌ４−Ｖｉｆ融合タンパク質中のＶｉｆに結合してＣＡＴの発現を活性化することを示した(レーン６)(図４Ｂ)。対照として、ｐＧａｌ−Ｖｉｆ又はＶｉｆ−ＶＰは、単独では、ＣＡＴ発現を活性化することができなかった(レーン３及び４、図４Ｂ)。図４Ｂは又、Ｖｉｆ変異体Δ１５１−１６４(他の系では、Ｖｉｆタンパク質と相互作用する能力をもたない)が、この系でＶｉｆと相互作用しないことをも示している(レーン７)。
【００９４】
Ｖｉｆ−Ｖｉｆ結合ドメインの欠失は、ウイルス生活環におけるＶｉｆ機能を著しく低下させる。
前述のように、Ｖｉｆは、ＨＩＶ−１の生活環の後期ステージにおいて機能し、「非許容」細胞例えばＰＢＭＣ、マクロファージ、及びＨ９ Ｔ細胞によりＨＩＶ−１複製のために必要とされる。(Gabuzda, D.H.等、J.Virol.66(11):6489-95, 1992；Blanc, D.等、Virology 193(1):186-92, 1993；von Schwedler, U.等、J.Virol.67(8):4945-55, 1993)。Ｖｉｆの多量体形成の生理学的意味を調べるために、Ｖｉｆ変異体Δ１５１−１６４の、ウイルス生活環においてＶｉｆ機能を補完する能力を試験した。Ｖｉｆ変異体Δ１５１−１６４を、それが、無細胞系で及び細胞内で多量体を形成することができないので利用した。この目的のために、単一ラウンドのウイルス感染性アッセイを適合させた。野生型のＶｉｆ又はその変異体を、「非許容」Ｈ９ Ｔ細胞中で発現させた。同時に、シュードタイプ(ＶＳＶエンベロープを有する)ＨＩＶ−１ウイルス(ゲノム中にｖｉｆ及びｅｎｖを有しない)を、これらの細胞から生成させた。富化のための超遠心分離の後に、これらの組換えウイルスを、標的細胞(Ｈｅｌａ ＣＤ４−ＣＡＴ)(ＨＩＶ−１ ＬＴＲプロモーター駆動されるＣＡＴ遺伝子を含む発現カセットを有する)に感染させた。このウイルス感染性を、新たに合成されたプロウイルスにより発現されるＨＩＶ−１ Ｔａｔタンパク質により駆動される標的細胞におけるＣＡＴ遺伝子発現のレベルにより測定した。図５は、野生型ｖｉｆ遺伝子がｖｉｆ欠損ＨＩＶ−１ウイルスを産生する「非許容」Ｈ９細胞において発現される場合には、そのウイルス感染性は、高レベルに達するということを示している(レーン２)。しかしながら、ＶｉｆΔ１５１−１６４がｖｉｆ欠損ＨＩＶ−１ウイルス産生「非許容」Ｈ９ Ｔ細胞において発現される場合には、そのウイルス感染性は、ｖｉｆ欠損ＨＩＶ−１ウイルス(レーン４)と比較して変化しない(レーン３)(図５)。これらのデータは、１５１−１６４欠失が、Ｖｉｆタンパク質の機能を著しく減少させ、「非許容」Ｔ細胞から生成したｖｉｆ欠損ＨＩＶ−１ウイルスの感染性をレスキューすることを不可能にすることを示している。これらの結果は、Ｖｉｆタンパク質の多量体形成がＶｉｆ機能に必要とされることを示している。
【００９５】
ＰＸＰモチーフを含むペプチドは、ＰＰＬＰドメインに結合することにより、Ｖｉｆ−Ｖｉｆ相互作用を阻害する
Ｖｉｆタンパク質多量体形成ドメインに結合し、それにより、Ｖｉｆ−Ｖｉｆ相互作用及びＨＩＶ−１のウイルス感染性を阻害するペプチドを更に同定するために、ＰＸＰモチーフを含む１２量体ペプチドの一組(表１、SEQ ID NO:５〜２０)を構築したが、その構造は、Ｖｉｆタンパク質の161ＰＰＬＰ164ドメイン(SEQ ID NO:２５)を共有している。ファージペプチドディスプレー法により、これらのペプチドは、精製されたＨＩＶ−１ Ｖｉｆタンパク質に高親和性で結合することが示された(図６)。これらのペプチドの幾つかを合成して、Ｖｉｆ−Ｖｉｆ結合のための反応系に加えた。表１に示したように、ＰＸＰモチーフを含むペプチド例えばＬＰＬＰＡＰＳＦＨＲＴＴ(ＶＭＩ９、SEQ ID NO:１３)又はＳＮＱＧＧＳＰＬＰＲＳＶ(ＶＭＩ７、SEQ ID NO:１１)は、Ｖｉｆ−Ｖｉｆ相互作用を有意に阻害することができる。
【００９６】
更なる実験は、ＰＸＰモチーフ含有ペプチドは、161ＰＰＬＰ164ドメイン欠失ＶＩＦタンパク質に結合することができず、それにより、161ＰＰＬＰ164ドメインが、Ｖｉｆの多量体形成において鍵となる役割を演じるということ及びＰＸＰモチーフ含有ペプチドが、Ｖｉｆタンパク質の161ＰＰＬＰ164ドメインに結合することによりＶｉｆの多量体形成をブロックすることが証明されることを示した。
【００９７】
合成されたＶｉｆペプチドの一組、Ｖｉｆ１５５−１６６(SEQ ID NO:２１)、Ｖｉｆ１５７−１７１(SEQ ID NO:２３)、Ｖｉｆ１６１−１７５(SEQ ID NO:２２)及びＶｉｆ１１７−１３１(SEQ ID NO:２４)を、それらのイン・ビトロでＶｉｆ−Ｖｉｆ相互作用をブロックする能力につきスクリーニングした。表１に示したように、３つのペプチド、Ｖｉｆ１５５−１６６(SEQ ID NO:２１)、Ｖｉｆ１５７−１７１(SEQ ID NO:２３)及びＶｉｆ１６１−１７５(SEQ ID NO:２２)( 161ＰＰＬＰ164ドメインを含む)は、Ｖｉｆ−Ｖｉｆ相互作用を阻害することができたが、これは、161ＰＰＬＰ164ドメインが、Ｖｉｆ多量体形成の原因であることを更に支持している。
【００９８】
【表１】
2005516885.tif 000002
【００９９】
検討
多くのＨＩＶ−１タンパク質例えばＧａｇ、プロテアーゼ、逆転写酵素、インテグラーゼ、糖タンパク質４１(ｇｐ４１)、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｐｒ及びＮｅｆによる二量体又は多量体の形成は、それらのレンチウイルス生活環における機能にとって重要であることが示されている。(Frankel, A.D.及びYoung, J.A., Ann.Rev.Biochem.67:1-25, 1998；Vaishnav, Y.N.及びWong-Staal, F., Annu Rev Biochem 60:577-630, 1991；Zhao, L.J.等、J Biol Chem 269(51):32131-7, 1994；Liu, L.等、J.Virol.74:5310-5319, 2000)。加えて、多量体形成は、多くの原核及び真核生物タンパク質の生物学的活性にとって臨界的であり、タンパク質の機能の活性化／不活性化のための一般的機構である。本発明は、ＨＩＶ−１ Ｖｉｆタンパク質が二量体又は多量体を形成すること、及びかかる多量体形成がウイルス生活環におけるＶｉｆ機能に必須であることを示す。証拠は、イン・ビトロ翻訳された35Ｓ標識したＶｉｆタンパク質がネイティブな環境で多量体を形成することができることを示す。逆に、ＧＳＴタンパク質よりむしろＧＳＴ−Ｖｉｆ融合タンパク質(細菌の発現系で生成される)が、イン・ビトロ翻訳された35Ｓ標識Ｖｉｆタンパク質に結合することができる。更に、共免疫沈降及び哺乳動物ツーハイブリッド系の結果は、細胞内のＶｉｆ−Ｖｉｆ相互作用を示している。これらのイン・ビトロ及びイン・ビボデータは、Ｖｉｆタンパク質が多量体を形成することができることを強く意味している。Ｖｉｆ−Ｖｉｆ結合に必須のドメインの欠失は、「非許容」細胞におけるＶｉｆの機能を著しく減じ、これは、Ｖｉｆの多量体形成がＨＩＶ−１生活環におけるその機能にとって重要であることを更に示している。
【０１００】
Ｖｉｆの多量体形成のためのドメインは、正に帯電したアミノ酸及びプロリンに富む断片(１４４〜１７１位のアミノ酸)内に位置して、SEQ ID NO:２６のアミノ酸配列を有する(図２)。この領域内の正に帯電したアミノ酸は、Ｖｉｆ−Ｖｉｆ相互作用の原因とはならない。しかしながら、プロリン、一層詳細には161ＰＰＬＰ164ドメインは、Ｖｉｆの多量体形成の原因となる(図６及び表１)。これに基づいて、一組のＰＸＰモチーフ含有ペプチドは、Ｖｉｆタンパク質多量体形成のインヒビターとして同定される。高度に保存されたモチーフ、ＳＬＱＹＬＡＬ(SEQ ID NO:４)(ＨＩＶ−１NL4-3の１４４〜１５０位のアミノ酸)がこのドメインに近いことは、注目に値する。セリン１６５が、Ｖｉｆの有糸分裂促進物質で活性化されたプロテインキナーゼ(ｐ４４／４２)によりリン酸化されること及びこのリン酸化がＶｉｆ機能に重要であるということも又、示されている。(Yang, X.及びGabuzda., D., J.Bio.Chem.273(45):29879-87, 1998)。これらの残基は、多量体形成のためのドメインに近いので、Ｖｉｆタンパク質の多量体形成がウイルス産生細胞におけるリン酸化により調節されるということは可能である。
【０１０１】
興味深いことに、ＶｉｆのＣ末端中の正に帯電したアミノ酸(Ｂ４及びＢ７変異体中に置換)は、イン・ビトロでのＶｉｆ−ＮＣｐ７結合の原因となる。(Bouyac, M.等、J.Virol.71(12):9358-65, 1997)。最近の研究は、ＨＩＶ−１ ＶｉｆがＲＮＡ結合タンパク質であり且つ細胞質におけるウイルスＲＮＡのｍＲＮＰ複合体の一体化成分であることだけでなく、それがウイルスＲＮＡパッケージング過程に関与しうることをも示している。(Zhang, H.等、J.Virol.74:8252-8261, 2000)。ＮＣｐ７とのＣ末端を介する相互作用と対照的に、Ｖｉｆは、ＲＮＡとＮ末端を介して結合する。ＲＮＡをＶｉｆ又はＧａｇそれぞれと混合した場合には、Ｇａｇに対するよりも一層多くのＲＮＡがＶｉｆに結合し；対照的に、Ｖｉｆタンパク質をＲＮＡ及びＮＣｐ７と一緒に混合した場合には、ＲＮＡは、Ｇａｇとのみ結合する。(Zhang, H.等、J.Virol.74:8252-8261, 2000)。この「置換」は、様々な機構によることがありうるが、Ｖｉｆ多量体形成のためのドメインとＶｉｆ−ＮＣｐ７結合のためのドメインが、極めて近い位置にあり又はおそらく重複しているので、ＶｉｆとＧａｇとの間の相互作用並びにＶｉｆ、ＲＮＡ及びＧａｇの間の相互作用がＶｉｆの多量体形成により調節されるということはありうることである。
【０１０２】
まとめると、Ｖｉｆタンパク質は、自己会合する強い傾向を有しており、二量体及び多量体を形成する。自己会合に影響を及ぼすドメインは、このタンパク質のＣ末端に、位置し、詳細には、161ＰＰＬＰ164ドメインに位置している。ＰＸＰモチーフ含有ペプチドは、Ｖｉｆタンパク質の161ＰＰＬＰ164ドメインに結合することによってＶｉｆの多量体形成をブロックする。証拠は、１５１〜１６４位のアミノ酸の欠失を有するＶｉｆ変異体がＨ９ Ｔ細胞から生成したｖｉｆ欠損ウイルスの感染性をレスキューできないことを示しており、これは、Ｖｉｆタンパク質の多量体形成がレンチウイルス生活環におけるＶｉｆ機能にとって重要であることを意味している。
【０１０３】
この発明は、特定の具体例に言及して記載したが、これらの方法及び組成物において変形を利用することができること及びこの発明をここに特に記載したのとは別の状態で実施することができることは、当業者には明らかであろう。従って、この発明は、請求の範囲に規定されたこの発明の精神及び範囲内に含まれるすべての変形物を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１ａ】ＧＳＴ−Ｖｉｆ(レーン２)は、イン・ビトロで翻訳された35Ｓ標識ＨＩＶ−１NL4-3Ｖｉｆタンパク質に結合できるが、ＧＳＴ(レーン３)は、結合できないことを示すオートラジオグラフを示した図である。
【図１ｂ】ネイティブ又は比較的ネイティブな条件下で、35Ｓ標識ＨＩＶ−１NL4-3Ｖｉｆタンパク質が、単量体、二量体、三量体又は四量体を形成することを示すオートラジオグラフを示した図である。
【図２ａ】ＰＣＲベースの突然変異誘発及びイン・ビトロ翻訳を利用して生成したＶｉｆタンパク質に沿っての一連の欠失体を示す概略図である。
【図２ｂ】０．１％ ＳＤＳの存在下で、35Ｓ標識されたＨＩＶ−１NL4-3Ｖｉｆタンパク質変異体Δ１５１−１９２及びΔ１５１−１６４が多量体を形成できないが、他の変異体はそうすることができることを示すオートラジオグラフを示した図である。
【図３】細胞内でのＶｉｆ−Ｖｉｆ相互作用を研究するための同時免疫沈降法を示した図である。
【図４ａ】実験に用いたプラスミド：ｐＶｉｆ−ＶＰ、ｐＧＡＬ−Ｖｉｆ及びｐＳＧ５ＧａｌＶＰを示す図式マップを示した図である。
【図４ｂ】様々なベクターと結合させたプラスミドを用いてトランスフェクトしたＣＯＳ−１細胞のＣＡＴ活性を示すゲルを示した図である。
【図５】Ｖｉｆ又はＶｉｆ変異体により影響されたウイルスの感染性を示した図である。
【図６】ＰＸＰモチーフを含むペプチド間での相対的親和性の比較を示した図である。
【配列表】
2005516885.tif 000003
2005516885.tif 000004
【図１ａ】
2005516885.tif 000005
【図１ｂ】
2005516885.tif 000006
【図２ａ】
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【図２ｂ】
2005516885.tif 000008
【図３】
2005516885.tif 000009
【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
2005516885.tif 000012
【図６】
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【国際調査報告】
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