(57)【要約】水性試験流体中のタンパク質を測定するための、試験流体を緩衝剤及び染料と合わせることを含む検定法。緩衝剤は、シトルリン、マロン酸、シアノ酢酸、シトラコン酸、メチルホスホン酸、サルコシン、サッカリン又はそれらの組み合わせから選択される。緩衝剤は、試験流体を含む検定対象のｐＨを、約２．０〜約３．０の範囲で選択される目標ｐＨ範囲に維持するのに十分な量で加えられる。染料は、染料自身を目標ｐＨ範囲でタンパク質指示薬として働かせることを可能にするpKaを有する。染料はまた、約１５mg/dLを超えるタンパク質の存在で検出可能な応答を発して、それにより、検定法を、試験流体中の全タンパク質の検出に適したものにするようなタンパク質に対する親和力を有する。緩衝剤及び染料は、吸収性材料の試験片に吸収させることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
水性試験流体中のタンパク質を測定するための検定法であって、試験流体を、（ａ）シトルリン、マロン酸、シアノ酢酸、シトラコン酸、メチルホスホン酸、サルコシン、サッカリン又はそれらの組み合わせから選択される緩衝剤（試験流体を含む検定対象のｐＨを、約２．０〜約３．０の範囲で選択される目標ｐＨ範囲に維持するのに十分な量で加えられる）及び（ｂ）染料自身を目標ｐＨ範囲でタンパク質指示薬として働かせることを可能にするpKaを有し、かつ約１５mg/dLを超えるタンパク質の存在で検出可能な応答を発して、それにより、検定法を、試験流体中の全タンパク質の検出に適したものにするようなタンパク質に対する親和力を有する染料と合わせることを含む検定法。
【請求項２】
前記緩衝剤が、シアノ酢酸、シトラコン酸、メチルホスホン酸、サルコシン、サッカリン又はそれらの組み合わせから選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記緩衝剤を、試験流体を含む検定対象のｐＨを約２．４〜約３．０の範囲に維持するのに十分な量で加える、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記染料が、置換フェノールスルホンフタレイン、ピロガロールレッド又はそれらの組み合わせである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記染料が置換フェノールスルホンフタレインであり、この置換フェノールスルホンフタレインが、アミノ、アミド、芳香族、アルキル、ヒドロキシル、チオ、カルボキシル、アルコキシ、ケトキシ、アセチル、ハロゲン、ニトロ、シアノ又はそれらの組み合わせでオクタ置換されている、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記染料が置換フェノールスルホンフタレインであり、この置換フェノールスルホンフタレインが、５′、５″位置をニトロで置換され、３′、３″、３、４、５及び６位置をクロリド、ブロミド又はヨージドで置換されている、請求項４記載の方法。
【請求項７】
前記染料が置換フェノールスルホンフタレインであり、この置換フェノールスルホンフタレインが、５，５″−ジニトロ−３′，３″，３，４，５，６−ヘキサブロモフェノールスルホンフタレイン又は５′−ニトロ−５″−ヨード−３′，３″，３，４，５，６，−ヘキサブロモフェノールスルホンフタレインである、請求項４記載の方法。
【請求項８】
前記染料がピロガロールレッドであり、前記試験流体をモリブデン酸塩又はタングステン酸塩と合わせることをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記緩衝剤及び染料を吸収性材料の試験片に吸収させておく、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記検出可能な応答が、約１５〜約３００mg/dLのタンパク質濃度で良好な分解能を提供する、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記染料が、約２．０〜約３．０の範囲のｐＨでタンパク質の存在で色指示薬として働く、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記染料が、約２．４〜約３．０の範囲のｐＨでタンパク質の存在で色指示薬として働く、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記緩衝剤が、試験流体を含む検定対象のｐＨを目標ｐＨ±約０．２ｐＨ単位に維持する、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
水性試験流体中のタンパク質を測定するための検定法であって、試験流体を、（ａ）シトルリン、マロン酸、シアノ酢酸、シトラコン酸、メチルホスホン酸、サルコシン、サッカリン又はそれらの組み合わせから選択される緩衝剤（試験流体を含む検定対象のｐＨを、約２．０〜約３．０の範囲で選択されるｐＨ範囲の約±０．２ｐＨの範囲に維持するのに十分な量で加えられる）及び（ｂ）染料自身を目標ｐＨ範囲でタンパク質の存在で色指示薬として働かせることを可能にするpKaを有し、かつ約２超〜約５００mg/dLのタンパク質の存在で検出可能な応答を発して、それにより、検定法を、試験流体中の全タンパク質の検出に適したものにするようなタンパク質に対する親和力を有する染料と合わせることを含む検定法。
【請求項１５】
流体試料中のタンパク質レベルの測定に使用するための乾式装置であって、（ａ）シトルリン、マロン酸、シアノ酢酸、シトラコン酸、メチルホスホン酸、サルコシン、サッカリン又はそれらの組み合わせから選択される緩衝剤（試験流体を含む検定対象のｐＨを、約２．０〜約３．０の範囲で選択される目標ｐＨ範囲に維持するのに十分な量で加えられる）及び（ｂ）染料自身を目標ｐＨ範囲でタンパク質指示薬として働かせることを可能にするpKaを有し、かつ装置と流体試料とが接触すると１５mg/dLを超えるタンパク質の存在で検出可能な応答を発して、それにより、装置を、流体試料中の全タンパク質の検出に適したものにするようなタンパク質に対する親和力を有する染料を中に吸収して有する吸収性材料を含む乾式装置。
【請求項１６】
前記緩衝剤が、シアノ酢酸、シトラコン酸、メチルホスホン酸、サルコシン、サッカリン又はそれらの組み合わせから選択される、請求項１５記載の乾式装置。
【請求項１７】
前記緩衝剤が、試験流体を含む検定対象のｐＨを約２．４〜約３．０の範囲に維持するのに十分な量で加えられる、請求項１５記載の乾式装置。
【請求項１８】
前記染料が、置換フェノールスルホンフタレイン、ピロガロールレッド又はそれらの組み合わせである、請求項１５記載の乾式装置。
【請求項１９】
前記染料が置換フェノールスルホンフタレインであり、この置換フェノールスルホンフタレインが、アミノ、アミド、芳香族、アルキル、ヒドロキシル、チオ、カルボキシル、アルコキシ、ケトキシ、アセチル、ハロゲン、ニトロ、シアノ又はそれらの組み合わせでオクタ置換されている、請求項１８記載の乾式装置。
【請求項２０】
前記染料が置換フェノールスルホンフタレインであり、この置換フェノールスルホンフタレインが、５′、５″位置をニトロで置換され、３′、３″、３、４、５及び６位置をクロリド、ブロミド又はヨージドで置換されている、請求項１８記載の乾式装置。
【請求項２１】
前記染料が置換フェノールスルホンフタレインであり、この置換フェノールスルホンフタレインが、５，５″−ジニトロ−３′，３″，３，４，５，６−ヘキサブロモフェノールスルホンフタレイン又は５′−ニトロ−５″−ヨード−３′，３″，３，４，５，６，−ヘキサブロモフェノールスルホンフタレインである、請求項１８記載の乾式装置。
【請求項２２】
前記染料がピロガロールレッドであり、試験流体をモリブデン酸塩又はタングステン酸塩と合わせることをさらに含む、請求項１５記載の乾式装置。
【請求項２３】
前記検出可能な応答が、約１５〜約３００mg/dLのタンパク質濃度で良好な分解能を提供する、請求項１５記載の乾式装置。
【請求項２４】
前記染料が、約２．０〜約３．０の範囲のｐＨでタンパク質の存在で色指示薬として働く、請求項１５記載の方法。
【請求項２５】
前記染料が、約２．４〜約３．０の範囲のｐＨでタンパク質の存在で色指示薬として働く、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記緩衝剤が、試験流体を含む検定対象のｐＨを目標ｐＨ±約０．２ｐＨ単位に維持する、請求項１５記載の方法。
【請求項２７】
流体試料中のタンパク質レベルの測定に使用するための乾式装置であって、（ａ）シトルリン、マロン酸、シアノ酢酸、シトラコン酸、メチルホスホン酸、サルコシン、サッカリン又はそれらの組み合わせから選択される緩衝剤（試験流体を含む検定対象のｐＨを、約２．０〜約３．０の範囲で選択される目標ｐＨ範囲の約±０．２ｐＨに維持するのに十分な量で加えられる）及び（ｂ）染料自身を選択された目標ｐＨ範囲でタンパク質の存在で色指示薬として働かせることを可能にするpKaを有し、かつ装置と流体試料とが接触すると約２〜約５００mg/dLのタンパク質の存在で検出可能な応答を発して、それにより、装置を、流体試料中の全タンパク質の検出に適したものにするようなタンパク質に対する親和力を有する染料を中に吸収して有する吸収性材料を含む乾式装置。
【請求項２８】
水性試験流体中のタンパクを測定するための検定法であって、試験流体を、（ａ）シトルリン、マロン酸又はそれらの組み合わせから選択される緩衝剤（試験流体を含む検定対象のｐＨを、約２．０〜約３．０の範囲で選択されるｐＨ範囲に維持するのに十分な量で加えられる）及び（ｂ）染料自身を目標ｐＨ範囲でタンパク質指示薬として働かせることを可能にするpKaを有し、かつ約１５mg/dLを超えるタンパク質の存在で検出可能な応答を発して、それにより、検定法を、試験流体中の全タンパク質の検出に適したものにするようなタンパク質に対する親和力を有する染料と合わせることを含む検定法。
【請求項２９】
前記緩衝剤がシトルリンである、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記緩衝剤がマロン酸である、請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
前記染料が、置換フェノールスルホンフタレイン、ピロガロールレッド又はそれらの組み合わせである、請求項２８記載の方法。
【請求項３２】
前記染料が、約２．０〜約３．０の範囲のｐＨでタンパク質の存在で色指示薬として働く、請求項２８記載の方法。
【請求項３３】
前記染料が、約２．４〜約３．０の範囲のｐＨでタンパク質の存在で色指示薬として働く、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
流体試料中のタンパク質レベルの測定に使用するための乾式装置であって、（ａ）シトルリン、マロン酸又はそれらの組み合わせから選択される緩衝剤（試験流体を含む検定対象のｐＨを、約２．０〜約３．０の範囲で選択される目標ｐＨ範囲に維持するのに十分な量で加えられる）及び（ｂ）染料自身を目標ｐＨ範囲でタンパク質指示薬として働かせることを可能にするpKaを有し、かつ装置と流体試料とが接触すると１５mg/dLを超えるタンパク質の存在で検出可能な応答を発して、それにより、装置を、流体試料中の全タンパク質の検出に適したものにするようなタンパク質に対する親和力を有する染料を中に吸収して有する吸収性材料を含む乾式装置。
【請求項３５】
前記緩衝剤がシトルリンである、請求項３４記載の乾式装置。
【請求項３６】
前記緩衝剤がマロン酸である、請求項３４記載の乾式装置。
【請求項３７】
前記染料が、置換フェノールスルホンフタレイン、ピロガロールレッド又はそれらの組み合わせである、請求項３４記載の乾式装置。
【請求項３８】
前記染料が、約２．０〜約３．０の範囲のｐＨでタンパク質の存在で色指示薬として働く、請求項３４記載の方法。
【請求項３９】
前記染料が、約２．４〜約３．０の範囲のｐＨでタンパク質の存在で色指示薬として働く、請求項３８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般に、タンパク質を検出する方法及び装置に関する。具体的には、本発明は、種々の緩衝剤を使用して低めのｐＨでタンパク質を検出する方法及び装置に関する。
【０００２】
発明の背景
尿タンパク質の検出方法は、アルブミンに対し、他の尿タンパク質よりも高感度であることが多い。しかし、特にベンス・ジョーンズタンパク尿の場合、アルブミン以外のタンパク質を検出することが重要である。タンパク質の検出は、判定レベル及び臨床医によって講じられる推奨措置が患者の尿中で検出されるタンパク質の濃度に依存して異なるため、広い範囲のタンパク質濃度をカバーすべきである。たとえば、５０mg/dLを超える持続的なタンパク尿は腎疾患の強い証拠を表すが、３００mg/dLを超えるタンパクレベルはネフローゼ症候群の診断と合致する。８００mg/dLを超える尿中タンパク濃度は、多大なタンパク質損失を暗示し、腎生検及び／又はステロイド治療の妥当性を保証する。したがって、尿中のタンパク質の試験が広範囲のタンパク質値にわたって効果的であるべきことは明白である。
【０００３】
水性流体中のタンパク質の測定のための種々の方法が文献で報告されている。これらの方法は、ケルダール法、ビウレット法、Lowery法、色素組み合わせ法、ＵＶ法及び蛍光測定法を含む。一般に、タンパク質は、染料、たとえばブロモフェノールブルー、クマシーブリリアントブルー及びエオシンならびに金属イオン、たとえば銀（Ｉ）、銅（II）、亜鉛（II）及び鉛（II）をはじめとする種々の物質と反応する。
【０００４】
尿は、個人間で異なる量の塩を含有する。診断検定が尿試料のｐＨとは異なるｐＨでの作業を要するとき、これらの塩の一部が緩衝剤として働くことができる。たとえば、炭酸水素塩、酢酸塩又はリン酸塩のような塩を含有する尿試料は、ｐＨ低下に抵抗する傾向を示す。尿に一般的な成分であるクレアチニンもまた、ｐＨ低下に抵抗する際に緩衝剤として働くことができる。この緩衝の結果は、一部の尿試料が試験片ｐＨを最適値よりも高くするということである。最適値よりも高い試験片ｐＨは、結果として、タンパク質指示薬染料の発色を生じさせて、タンパク質存在の偽りの指示を発するおそれがある。このような尿の影響を減らしながらも起こる化学作用と相互作用しない緩衝系を有することが望まれる。
【０００５】
したがって、広範囲の臨床濃度及びｐＨにわたってタンパク質を検出する方法及び装置の必要性が存在する。
【０００６】
発明の概要
一つの実施態様によると、水性試験流体中のタンパク質を測定するための検定法は、試験流体を緩衝剤及び染料と合わせることを含む。緩衝剤は、シトルリン、マロン酸、シアノ酢酸、シトラコン酸、メチルホスホン酸、サルコシン、サッカリン又はそれらの組み合わせから選択される。緩衝剤は、試験流体を含む検定対象のｐＨを、約２．０〜約３．０の範囲で選択される目標ｐＨ範囲に維持するのに十分な量で加えられる。染料は、自身を目標ｐＨ範囲でタンパク質指示薬として働かせることを可能にするpKaを有する。染料は、約１５mg/dLを超えるタンパク質の存在で検出可能な応答を発して、それにより、検定法を、試験流体中の全タンパク質の検出に適したものにするようなタンパク質に対する親和力を有する。
【０００７】
もう一つの実施態様によると、流体試料中のタンパク質レベルの測定に使用するための乾式装置は、緩衝剤及び染料を中に吸収させて有する吸収性材料を含む。緩衝剤は、シトルリン、マロン酸、シアノ酢酸、シトラコン酸、メチルホスホン酸、サルコシン、サッカリン又はそれらの組み合わせから選択される。緩衝剤は、試験流体を含む検定対象のｐＨを、約２．０〜約３．０の範囲で選択される目標ｐＨ範囲に維持するのに十分な量で加えられる。染料は、自身を目標ｐＨ範囲でタンパク質指示薬として働かせることを可能にするpKaを有する。染料は、装置と流体試料とが接触すると１５mg/dLを超えるタンパク質の存在で検出可能な応答を発して、それにより、装置を、流体試料中の全タンパク質の検出に適したものにするようなタンパク質に対する親和力を有する。
【０００８】
さらなる実施態様によると、水性試験流体中のタンパク質を測定するための検定法は、試験流体を緩衝剤及び染料と合わせることを含む。緩衝剤は、シトルリン、マロン酸又はそれらの組み合わせから選択される。緩衝剤は、試験流体を含む検定対象のｐＨを、約２．０〜約３．０の範囲で選択される目標ｐＨ範囲に維持するのに十分な量で加えられる。染料は、自身を目標ｐＨ範囲でタンパク質指示薬として働かせることを可能に有するpKaを有し、かつ約１５mg/dLを超えるタンパク質の存在で検出可能な応答を発して、それにより、検定法を、試験流体中の全タンパク質の検出に適したものにするようなタンパク質に対する親和力を有する。
【０００９】
なおもさらなる実施態様によると、流体試料中のタンパク質レベルの測定に使用するための乾式装置は、緩衝剤及び染料を中に吸収させて有する吸収性材料を含む。緩衝剤は、シトルリン、マロン酸又はそれらの組み合わせから選択される。緩衝剤は、試験流体を含む検定対象のｐＨを、約２．０〜約３．０の範囲で選択される目標ｐＨ範囲に維持するのに十分な量で加えられる。染料は、自身を目標ｐＨ範囲でタンパク質指示薬として働かせることを可能にするpKaを有し、かつ装置と流体試料とが接触すると１５mg/dLを超えるタンパク質の存在で検出可能な応答を発して、それにより、装置を、試験流体中の全タンパク質の検出に適したものにするようなタンパク質に対する親和力を有する。
【００１０】
例示する実施態様の詳細な説明
本発明のタンパク質の検定法は、湿式フォーマット又は乾式フォーマットのいずれでも実施することができる。これは、もっとも簡便には、（ａ）シトルリン、マロン酸、シアノ酢酸、シトラコン酸、メチルホスホン酸、サルコシン、サッカリン又はそれらの組み合わせから選択される緩衝剤及び（ｂ）染料自身を約２．０〜約３．０のｐＨでタンパク質指示薬（たとえば色指示薬）として働かせることを可能にするpKaを有する染料を含浸させた吸収性試験片の形態で実施される。
【００１１】
緩衝剤
本発明で使用される緩衝剤は、試験流体を含む検定対象のｐＨを約２．０〜約３．０の範囲に維持するのに十分な量で加えられる。緩衝剤は、酸又は塩基を緩衝薬溶液に加えて特定のｐＨを達成することによって、又は緩衝薬とその塩との、特定のｐＨを与えるように選択された割合の混合物を加えることによって一般に達成されるｐＨの事前調節を受けることもできる。緩衝剤は、好ましくは、試験流体を含む検定対象のｐＨを、選択された目標ｐＨの約±０．２ｐＨ単位内に維持するために加えられる。緩衝剤は、好ましくは、試験流体を含む検定対象のｐＨを約２．４〜約３．０の範囲に維持するのに十分な量で加えられる。
【００１２】
好ましい緩衝剤は、シトルリン、マロン酸又はそれらの組み合わせである。緩衝剤は、シトルリン、マロン酸、シアノ酢酸、シトラコン酸、メチルホスホン酸、サルコシン、サッカリン又はそれらの組み合わせから選択することができる。これらの緩衝剤は種々の濃度で使用することができるが、緩衝剤の濃度は一般に約２００〜約５００mMである。
【００１３】
シトルリンは、Ｌ−シトルリン、Ｄ−シトルリン及びＤ，Ｌ−シトルリンの形態であることができ、構造Ａによって示される。
【００１４】
【化１】
2005503542.tif 000002
【００１５】
本発明で有用であるマロン酸は、構造Ｂ
【００１６】
【化２】
2005503542.tif 000003
【００１７】
によって示される。本発明で有用であるシアノ酢酸は、構造Ｃ
【００１８】
【化３】
2005503542.tif 000004
【００１９】
によって示される。本発明で有用であるシトラコン酸は、構造Ｄによって示される。
【００２０】
【化４】
2005503542.tif 000005
【００２１】
本発明で有用であるメチルホスホン酸は、構造Ｅによって示される。
【００２２】
【化５】
2005503542.tif 000006
【００２３】
本発明で有用であるサルコシンは、構造Ｆによって示される。
【００２４】
【化６】
2005503542.tif 000007
【００２５】
本発明で有用であるサッカリンは、構造Ｇによって示される。
【００２６】
【化７】
2005503542.tif 000008
【００２７】
シトルリン、マロン酸、シアノ酢酸、シトラコン酸、メチルホスホン酸、サルコシン及び／又はサッカリンは、Aldrich Chemical Companyのような企業から商業的に入手することができると考えられる。
【００２８】
染料
本発明で使用される染料は、約２．０〜約３．０の範囲内のｐＨでタンパク質指示薬として働かせることを可能にするpKaを有する。例えば、約２．０〜約３．０のｐＨ範囲内で選択される目標ｐＨ範囲にタンパク質が存在する場合、染料は、色変化を指示するpKaを有するであろう。選択された目標ｐＨ範囲は、好ましくは選択された目標ｐＨの約±０．２ｐＨ単位内である。加えて、選択された目標ｐＨ範囲内でのタンパク質の非存在で、染料は顕著な色変化を有しないpKaを有することもできる。本発明で使用される染料は、好ましくは、約２．４〜約３．０の範囲内でのｐＨでタンパク質指示薬として働かせることを可能にするpKaを有する。理論に縛られることはないが、タンパク質と結合した場合、そのような染料は、溶液中で遊離しているときとは異なる環境に曝され、変色に不可欠である電離のための低めのpKaを効果的に発現させると、考えられる。染料が、タンパク質の非存在で、選択された目標ｐＨ範囲でｐＨ感受性色指示薬として応答するならば、加えられたタンパク質は一般に正確には検出されない。
【００２９】
本発明で使用される染料は一般に、約２〜約５００mg/dLの全タンパク質の存在で検出可能な応答を発する。染料は、好ましくは、約１５〜約３００mg/dLの全タンパク質に対して検出可能な特に有用な応答を発する。染料の量は、そのような好ましい範囲の外で検出可能で有用な応答を出すように変更することもできると考えられる。
【００３０】
これらの染料の例は、置換フェノールスルホンフタレイン、ピロガロールレッド又はそれらの組み合わせを含む。約２〜約３のｐＨ範囲で、タンパク質の非存在で染料吸光度又は蛍光スペクトルにおける検出可能な指示（遷移を示すものとして）を有し、そうでなければ同じ条件で、ただしタンパク質の存在で異なる指示を有する傾向を示す他の染料を本発明に使用してもよいと考えられる。タンパク質の存在と非存在とで異なる検出可能な応答を出すためのｐＨは、本発明で使用される緩衝剤によって維持可能なｐＨ範囲にあるべきである。
【００３１】
たとえば、ブロモクロロフェノールブルー（３′，３″−ジブロモ−５′，５″−ジクロロフェノールスルホンフタレイン）；ブロモフェノールブルー（テトラブロモフェノールブルー）；塩基性フクシン（ベーシックレッド９）；ベーシックバイオレット１４；マルチウスイエロー（アシッドイエロー２４）；フロキシンＢ（アシッドレッド９２）；メチルイエロー（ソルベントイエロー２）；コンゴレッド（ダイレクトレッド２８）；メチルオレンジ（アシッドオレンジ５２）；及びエチルオレンジ（４−（４−ジエチルアミノフェニルアゾ）ベンゼンスルホン酸）のような染料が本発明に有用であると考えられる。このような染料は、フェノールスルホンフタレイン及びピロガロールレッドのような染料と組み合わせて使用することもできる。
【００３２】
本発明で特に有用なフェノールスルホンフタレイン指示薬は、以下の構造Ｈ及びＩによって示される。
【００３３】
【化８】
2005503542.tif 000009
【００３４】
構造Ｈは、プロトン性溶媒、たとえば水又はアルコール中のフェノールスルホンフタレイン誘導体の構造を示し、構造Ｉは、乾燥状態又は非プロトン性溶媒、たとえばエーテル及びアセトニトリル中で優勢である形態を示す。フェノールスルホンフタレイン「タンパク質エラー」指示薬は、タンパク質の存在がない限り特定のｐＨでプロトンが解離しないようなpKa値を有する解離性プロトンを含むｐＨ指示薬である。
【００３５】
以下に示す一般的なフェノールスルホンフタレイン指示薬、構造ＪのpKa値は、指示薬分子の数の半分が脱プロトン化Ｃ環のフェノール性ヒドロキシル基を含むｐＨである。上記で例示したフェノールスルホンフタレインタンパク質エラー指示薬の場合、二つの脱プロトン化イベントが起こって、観察しうる変色を生じさせる。第一の脱プロトン化がＡ環上のアリールスルホン酸からプロトンを除いて、構造Ｊとして以下に示すイオンを与える。
【００３６】
【化９】
2005503542.tif 000010
【００３７】
このプロトンのpKaは１未満であり、すべての有用なｐＨ値におけるこの部分の解離を生じさせる。この解離性基はまた、これらの化合物の水溶性の原因である。第二の脱プロトン化は、Ｃ環のフェノール性ヒドロキシルからプロトンを放出して、以下の構造Ｋ及びＬに示すようなジアニオンを生じさせることを含む。
【００３８】
【化１０】
2005503542.tif 000011
【００３９】
このタイプのタンパク質エラー指示薬を用いると、第二の脱プロトン化は、試験される試料中のタンパク質の存在を示す観察可能な変色を生じさせる。フェノールスルホンフタレインタンパク質エラー指示薬は通常、試験流体との接触によるｐＨ変化の結果ではなくタンパク質の存在の結果である変色によることができるよう、一定ｐＨの環境を提供するための緩衝剤とともに吸収性マトリックス材料に塗布される。
【００４０】
タンパク質の存在で、約２．０〜約３．０の範囲のｐＨで第二の脱プロトン化を起こさせる第二のpKaを有するフェノールスルホンフタレインタンパク質エラー指示薬だけが本発明で有用である。タンパク質の非存在で、維持されるｐＨの外で第二の脱プロトン化を起こさせる第二のpKaを有するフェノールスルホンフタレインタンパク質エラー指示薬が本発明で有用であることができる。好ましくは、第二のpKaは、タンパク質の非存在で、約２．４〜約３．０の範囲ではないｐＨ、もっとも好ましくは３．０を超えるｐＨで起こる。検出可能な指示（たとえば色応答）をも出す、タンパク質存在に感応する解離は、解離性置換基の異なる組み合わせを有する第一、第二などの脱プロトン化であることもできると考えられる。
【００４１】
多くのフェノールスルホンフタレインタンパク質エラー指示薬は、適切な範囲の第二のpKaを有し、したがって、本発明における使用に適している。有用なフェノールスルホンフタレインは、構造Ｊ及びＬのＡ、Ｂ又はＣ環を電子求引基及び／又は電子供与基、たとえばアミノ、アミド、芳香族、アルキル、ヒドロキシル、チオ、カルボキシル、アルコキシ、ケトキシ、アセチル、ハロゲン、ニトロ及びシアノで置換されているものを含む。環の１個以上がなおも水素を含有してもよいと考えられる。具体的な置換基及びそれらの染料分子上の位置は、得られる染料が適切な範囲のpKaを示し、かつ所望の物理的性質、たとえば溶解度、タンパク質親和力及び色を保持する限り、重要ではない。非置換フェノールスルホンフタレインは、そのpKaが適切な範囲にないため、不適当である。オクタ置換されたスルホンフタレイン指示薬、すなわち３′、３″、５′、５″、３、４、５及び６位置で置換されているフェノールスルホンフタレイン誘導体が本発明における使用に特に適しているということがわかった。これらの指示薬は、好ましくは、ハロゲン及びニトロ基で置換されており、構造Ｍ
【００４２】
【化１１】
2005503542.tif 000012
【００４３】
（式中、Ｘはニトロであり、Ｙ及びＺは、塩素、臭素又はヨウ素である）
によって示すことができる。同じく有用であるものは、米国特許第５，２７９，７９０号に開示されている、Ｙがニトロであり、Ｘ及びＺが塩素、臭素又はヨウ素である、ニトロ置換ポリハロゲン化フェノールスルホンフタレインである。これらの指示薬は、流体試料中で約２〜５００mg/dLのタンパク質を検出する能力を有するといわれている。しかし、本発明の検定系の使用は、３０mg/dLを超えるタンパク尿が計測され、２mg/dLのミクロアルブミン尿が計測されない状況で望ましいであろう。
【００４４】
たとえば、子供の腎疾患を診断する場合、ミクロアルブミンを計測することは、この応答が、その可変性の性質により、偽りの疾病の指示を出すことがあるため、望ましくない。本発明で有用なフェノールスルホンフタレイン指示薬の芳香環が多様な置換基を有しうるということは明白である。このような置換基は、自身を本発明における使用に適したものにするのに適切なタンパク質エラー指示薬性質を有する安定な化合物を調製する当業者の能力のみによって限定される。
【００４５】
フェノールスルホンフタレイン染料のいくつか具体的な例は、５′、５″位置をニトロで置換され、３′、３″、３、４、５及び６位置をクロリド、ブロミド又はヨージドで置換されているものである。たとえば、使用することができるフェノールスルホンフタレイン染料は、５，５″−ジニトロ−３′，３″，３，４，５，６−ヘキサブロモフェノールスルホンフタレイン又は５′−ニトロ−５″−ヨード−３′，３″，３，４，５，６，−ヘキサブロモフェノールスルホンフタレインを含む。
【００４６】
先に論じたように、使用することができる染料はピロガロールレッドである。ピロガロールレッドは通常、濃い色を提供するのに役立つモリブデン酸塩又はタングステン酸塩の使用を含む。米国特許第５，３９９，４９８号は、タングステン酸塩が指示薬と反応して、モリブデンの場合と同様な方法でタンパク質の存在で色が変移する錯体を形成することを開示している。米国特許第５，３９９，４９８号はまた、この種の検定法のバックグラウンド干渉を減らすためのフィチン酸又はその誘導体の使用を開示している。本検定法は流体試料、たとえば尿中で低レベルのタンパク質を検出するのに非常に良好であるが、高めのタンパク質濃度、特に約１５０mg/dLを超えるタンパク質濃度でその分解能が劇的に低下する。この方法は、応答が試料中に存在するタンパク質のタイプに依存しないため、全タンパク質検定法である。したがって、１５mg/dLのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は１５mg/dLのＩｇＧと同じ応答を発する。全タンパク質検定法は一定の疾病状態の検出に有用であり、尿中にあふれる全タンパク質が多くなればなるほど潜在的な問題がより深刻になるため、高いタンパク質濃度で検出可能な応答を発する全タンパク質検定法が望ましい。しかし、モリブデン酸塩／タングステン酸塩検定法は、タンパク質に対する染料の強い親和力のせいで、高レベル、すなわち約１５０mg/dLを超えるタンパク質の検出には有効ではない。
【００４７】
他の可能な成分
検定装置又は成分は、染料結合に基づくタンパク質検出法での使用に関して当該技術で公知である界面活性剤、洗剤、バックグラウンド染料、エンハンサポリマー又はキレート化剤を何種類でも含有することができる。これらの検定装置又は成分は通常、プロトン性溶媒、たとえば水／メタノール混合物を表１に示す濃度で含む。通常、溶液は、尿試料中の他の成分による干渉を抑止又は防止するため、キレート化剤、たとえばフィチン酸及び／又はシュウ酸を含有する。ペーパディップ法における酸は、水酸化ナトリウムなどの添加によって約２．４〜約３の好ましいｐＨに調節することができる。
【００４８】
【表１】
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【００４９】
例
乾式装置、たとえば診断試験片を形成する一つの例は、材料、たとえば紙を水溶液に浸漬することを含む。診断試験片は、種々の材料から製造することができるが、通常、プラスチック支持体に取り付けられた紙から製造される。適当な紙の一例はAhlstrom  204である。これらの試験片は、他の材料、たとえば天然又は合成の織物又は不織材料から製造することもできると考えられる。
【００５０】
一つの実施態様にしたがって、３種のサブミックス（サブミックス１〜３）の添加によって第一の水溶液を形成した。サブミックス１を形成するため、メタノール１０ml、１２５mM  ＴＲＩＳ（（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）／メタノール）１．７６ml及びピロガロールレッド４４．０mgを一緒に加えた。これらの成分を約２０〜約３０分間混合してサブミックス１を形成した。サブミックス２を形成するため、４０％フィチン酸４．１０g（３．２０ml）、３１〜５０Ｋの５％水性ＰＶＡ（ポリビニルアルコール）８．００ml、１Ｎ  ＮａＯＨ１１．２ml及び１００mg/mlのモリブデン酸ナトリウム０．６５４mlならびに水４５．６mlを一緒に加えた。ＮａＯＨを加えてｐＨを約２．３に調節した。これらの成分を約６０分間混合してサブミックス２を形成した。サブミックス３を形成するため、シュウ酸二ナトリウム２１７．５mg、ｐＨ２．５の５００mM  Ｌ−シトルリン１２０．０ml及びCibacronブリリアントイエロー１００．０mgを一緒に加えた。これらの成分を約３０分間混合してサブミックス３を形成した。
【００５１】
サブミックス１とサブミックス２とを約１０分間混合したのち、サブミックス３を加えた。ｐＨは２．６であり、合わせたサブミックス１〜３を４時間安定化させたのち、量を調節した。サブミックス１〜３は、約２００mlの第一の浸漬溶液を形成した。紙を第一の浸漬溶液に浸漬し、３段オーブン中、５０／５０／７０℃で、１インチの気流で乾燥させた。使用した紙はAhlstrom  204紙であった。
【００５２】
次に、この紙を１６０mlの第二の浸漬溶液に浸漬した。第二の浸漬溶液は、トルエン１４４ml、ＴＨＦ（安定化）１６ml、米国特許第５，４２４，２１５号に開示されているようなＫＯＫ（ポリプロピレングリコールカーボネート）０．４８g及びＤＮＨＢ（５，５″ジニトロ−３′，３″，３，４，５，６−ヘキサブロモフェノールスルホンフタレイン）３６．５７mgを混合することによって製造した。紙を３段オーブン中、５０／５０／５０℃で、１インチの気流で乾燥させて、診断試験片の活性パッドを形成した。診断試験片は、ポリマー試験片に付着した活性パッドを含む。
【００５３】
本発明の具体的な実施態様及び応用を例示し、開示したが、本発明は、本明細書に開示したとおりの構成及び組成に限定されず、請求の範囲で定義される本発明の本質及び範囲を逸することなく、種々の変更、変形及び改変が上記記載から明白になるであろう。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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