(57)【要約】本発明は、TGase活性を有するタンパク質をコードするトウモロコシ由来のDNA分子および該DNA分子を含む遺伝子発現ベクターに関する。本発明はまた、上記DNA分子またはベクターの、TGase活性を有する組換えタンパク質の発現が可能な形質転換細胞の産生およびTGase活性を有するタンパク質をコードする配列の植物細胞への導入のための使用にも関する。さらに、本発明はその結果得られるトランスジェニック植物および微生物細胞に関する。さらに上記DNA配列から発現するTGase活性を有するタンパク質は、例えば、食品の操作、加工および変換において利用できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
トウモロコシ由来であり、TGase活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
【請求項２】
配列番号1であることを特徴とする請求項１のヌクレオチド配列。
【請求項３】
配列番号3であることを特徴とする請求項１のヌクレオチド配列。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかのヌクレオチド配列に対してヌクレオチドレベルで少なくとも60%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも95%の程度の同一性を有し、かつ、TGase活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかのヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
【請求項６】
プラスミドpGEMT15およびpGEMT21からなる群に属する請求項５の発現ベクター。
【請求項７】
請求項１から４のいずれかのヌクレオチド配列によってコードされるTGase活性を有するタンパク質。
【請求項８】
配列番号2または配列番号4のいずれかである請求項７のTGase活性を有するタンパク質。
【請求項９】
請求項５または６の発現ベクターを含みTGase活性を有するタンパク質の発現を可能にする、大腸菌株「CECT」5705または5706を含む形質転換細胞。
【請求項１０】
請求項７または８のTGase活性を有する組換えタンパク質の産生方法における請求項９の形質転換細胞の使用。
【請求項１１】
食品、例えば魚、チーズ、ヨーグルト、アイスクリーム、マヨネーズおよび肉の食感、堅さ、弾力、水分または粘度を維持または向上させるため、様々な密度のゼラチンを形成させるため、そして脂肪含量が少ない加熱処理食品を調製するための、食品の操作、加工および変換における、請求項７または８のTGase活性を有するタンパク質の使用。
【請求項１２】
植物の成長および発達、形態形成、光合成および細胞死を含む、TGaseに起因する機能の操作によって生じる新規な能力を有するトランスジェニック植物の開発における、請求項５または６の発現ベクターの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、TGase活性を有する植物由来の新規タンパク質の同定およびその食品の操作、加工および変換の分野ならびに新規能力を有するトランスジェニック植物の開発における利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
トランスグルタミナーゼ(TGase; EC2.3.13) (R-グルタミニル-ペプチドアミナーゼ-γ-グルタミル-トランスフェラーゼ)は、ポリアミンまたはリジンの一級アミノ基(アミノ供与体)といくつかのタンパク質のグルタミルのγ-カルボキシアミド基(アミノ受容体)とのアミド結合を、タンパク質のグルタミル残基のγ-カルボキシアミド基と酵素の活性中心のシステイン残基のスルフィドリル基との間の反応により、酵素が基質に結合する中間反応によって触媒する(Serafini-Fracassini, D., Del Duca、S. & Beninati, S. 1995.  Plant Transglutaminases.  Phytochemistry 40: 355-365): TGase活性の結果は以下の通りである:a)タンパク質自体の立体配置の修飾およびb)高分子量の複合体を形成する、タンパク質自体の間の結合および異なるタンパク質の間の結合の結果としての立体配置のより大幅な変化。
【０００３】
ヒトおよび動物、植物、下等脊椎動物、ある種の細菌、藻類および酵母においてTGase が研究されている(Makarova, K.S. ,Aravind、L. & Koovin、E.V. 1999.  A superfamily of archaeal、bacterial and eukaryotic proteins homologouz to animal transglutaminases  Protein Science 8:1714-1719; Bergamini, C.M., Dean, M., Tanfani, F. Ferrari, C. & Scatturin.  1999.  Conformational stability of human erythrocyte transglutaminase:  Patterns of thermal unfolding at acid and alkaline pH.  Eur. J. Biochem. 266:575-582.; Cariello, L. Ristoratore, F. & Zanitti, L. 1997.  A new transglutaminas-like from ascidian Ciona intestinalis.  FEBS Lett 408:171-176; Lorand, L. & Conrad. S.M. 1984.  Transglutaminases. Mol Cell Biochem 58:9-35; Serafini-Fracassini, D., Del Duca S. & Beninati S. 1995.  Plant transglutaminases.   Phytochemistry 40:355-365; Tokunaga、F., Muta,T. Iwanaga, S., Ichinose、A., Davie, EW, Kuma, K. & Miyata, T. 1993.  Limulus hemocyte transglutaminase.  cDNA cloning, amino acid sequence and tissue localization.  J Biol Chem 268:262-268)。
【０００４】
もっともよく知られたTGaseとしては、血漿のタンパク質である血液凝固因子XIIIおよび角質層形成に関与するTGase Kがある。一方、上記のTGaseのいくつかをコードする遺伝子は既にクローニングされており、TGaseの重要なプロセス、例えば細胞分化、組織安定化またはプログラムされた細胞死への関与が知られるようになっている(Ichinose, A., Bottenus, R.E. & Davie E.W. 1990.  Structure of transglutaminases.  J. of Biol. Chemistry.  265(23): 13411-13414; Bergamini, C.M., Dean, M., Tanfani, F., Ferrari, C. & Scatturin. 1999. Conformational stability of human erythrocyte transglutaminase:  patterns of thermal unfolding at acid and alkaline pH.  Eur. J. Biochem. 266:575-582; Nemes, Z., Marekov, L.N. & Steinert, P.M. 1999.  Involucrin cross-linking by transglutaminase 1. J. of Biol. Chemistry.  274(16): 11013-11021)。これらの酵素は神経変性疾患、腫瘍、腹腔疾患などにも関与しているようであり、それゆえそれらは臨床試験において非常に興味深い酵素の一群である。かかる臨床試験について、TGaseに関する様々な特許がある: 1998年にOrthogene,Inc出願の米国特許第5736132号”Method of promoting adhesion between tissue surfaces”;1998年Oklahoma Medical Research Foundation出願の米国特許第5726051号”Transglutaminas gene”。
【０００５】
植物のTGaseの機能はその存在に関する最初のデータが数年前に発表されているにもかかわらずあまり知られていない(Icekson I. & Apelbaun, A. 1987. Evidences for transglutaminase activity in plant tissue.  Plant Physiol. 84. 972-974;  Serafini-Fracassini D., Del Duca S., & D'Orazi D. 1988.  First evidence for polyamine conjugation mediate by an enzyme activity in plants. Plant Physiol. 87:757):植物についての研究は、活性、それが作用する基質およびそれが豊富な組織に関する生化学的側面に向けられてきたが、機能的役割は、−ここでその介入に関する部分的データは例えば成長及び発達、一般的形態形成、光合成および細胞死などである−いまだに研究されていない(Margosiak, S.A., Drama, A., Bruce-Carver, M.R., Gonzalez, A.P. Louie, D. & Kuehn. 1990.  Identification of the large subunit of ribulose 1,5-biphosphate carboxylase/oxygenase as a substrate for transglutaminase in Medicago sativa L. (Alfafa):  Plant Physiol. 92: 88-96; Del Ducca, S., Tidu, V., Bassi, R. Exposito, C., & Serafini-Fracassini, D. 1994, Identification of chlorophyll-a/b proteins as substrates of transglutaminase activity in isolated chloroplasts of Helianthus tuberosus L. Planta 193:283-289; Del Ducca, S., Della Mea, M., Munoz de Rueda, P. & Serafini-Fracassini, D. 2000 Factors affecting transglutaminase activity catalyzing polyamine conjugation to endogenous substrates in the entire chloroplast.  Plant Physiol Biochem 38:429-439)。
【０００６】
さらに、トランスグルタミナーゼには生物工学的目的のためにさらなる価値があることが強調される。この興味深い代謝産物としての新たな補足的な面は異なるタンパク質の間での共有結合を作るその能力に起因する。この性質は、例えば、食品、例えば魚や肉の質感を維持し、塩の使用の必要を減らすため(すり身など)、様々な密度のゼラチンの生産のため、脂肪の少ない加熱処理済み食品(豆腐)の調製のためなどに用いられてきた。また、製品の堅さ、弾力、水分または粘度を様々な温度で維持することも可能である。同様にそれは、様々な乳加工食品にも使用されている:チーズ、ヨーグルト、アイスクリーム等。したがって現在それは「添加物」として多くの生物加工食品に使用されており、この目的のためには米国での推奨用量は65 ppmである。
【０００７】
これらすべてのTGaseの可能性により、その取得方法、使用などに関する様々な特許が生み出され、この物質は市販されるようになった。例えば、味の素が販売している、Activa TG（登録商標）などである。この製品を上市している会社は、東京の味の素(米国でも広く流通している)および米国のRohm Enzyme (www.skidmore-sales.com/whatsnew/newsletter/summer 2001.pdf)である:しかし、スペインではTGaseの工業製品を販売している会社はない。
【０００８】
最初、上記のように市販の目的でのTGaseの過剰発現は、方法特許を取得しており、この最初の方法の改良方法の特許も取得している(米国特許第5156956号”Transglutaminase”(1992))味の素によって細菌(Streptoverticillium sp.)によって行われた。同様に、味の素は別の類似の方法特許も取得しており、かかる方法はCrassostrea gigas の形質転換(米国特許第5736356号”Transglutaminase originating from Crassostrea gigas (1998))および枯草菌からの手段(米国特許第5948662号”Bacillus-derived transglutaminase”(1999))による。
【０００９】
最近数年間にわたり、本発明の発明者である研究グループも同様に生化学的レベルで研究してきた。例えば、トウモロコシカルスの形態形成におけるTGase の関与およびその光との関係についてなど(Bernet, E., Claparols, I., Dondini, L., Santos, M.A., Serafini-Fracassini, D. & Torne、J. Ma. 1999.  Changes in polyamine content, arginine and ornithine decarboxylases and transglutaminase activities during light/dark phases (of initial differentiation) in maize calluses and their chloroplast.  Plant Physio Biochem. 37(12): 899-909):その他にも、葉緑体の発達に伴う、この酵素の様々なトウモロコシ細胞システムにおける免疫局在性について最近報告された(Villalobos, E.Torne, J.M., Olles, C., Claparols, I. & Santos, M.A. 2001, Subcellular localization of a transglutaminase related to grana development in different cell cell types.  Protoplasma. 216: 155-163)。しかし、植物トランスグルタミナーゼの分子同定および機能活性についての結果は得られていない。したがって、該トランスグルタミナーゼに関する新たな知識が商業的に注目されている。
【００１０】
（発明の説明）
本発明は、食品の操作および変換の分野および新たな能力を有するトランスジェニック植物の開発において必要とされている植物由来のTGaseが不足しているという問題に取り組むものである。
【００１１】
本発明により提供される解決手段は、本発明者らがトウモロコシからTGase活性(TGase; EC2.3.2.13)を有するいくつかのDNA配列を同定したという事実に基づく。該DNA配列によってコードされるタンパク質のTGase活性が、かかるタンパク質抽出物を用いた実験において明らかになった。
【００１２】
それゆえ、本発明の目的の１つは該DNA分子である。
【００１３】
本発明の別の目的は、少なくとも１つの該DNA分子を含むベクターである。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、該DNA分子または該ベクターの、TGase活性を有する組換えタンパク質を発現することが出来る形質転換細胞の作成のための使用であり、即ち、TGase活性を有するタンパク質の該コード配列を植物細胞に導入することを含む。微生物細胞および結果として得られるトランスジェニック植物も本発明の目的に含まれる。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、該DNA配列から発現したTGase活性を有するタンパク質およびその食品の操作および変換における使用である。
【００１６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、以下から選択されるヌクレオチド配列を含む植物由来のTGase活性を有するタンパク質をコードするDNA分子（以下、本発明のDNA分子と称する）を提供する:
a) 配列番号1、配列番号3のヌクレオチド配列またはその断片;および、
b) a)の配列と類似するヌクレオチド配列。
【００１７】
本明細書において使用する場合、「類似」なる語は、配列番号1または配列番号3に示すヌクレオチド配列に基づいて、例えば以下のようにして単離または作成することが出来るあらゆるDNA配列を含む：保存的または非-保存的ヌクレオチド置換の導入、例えば、１または複数のヌクレオチドの挿入、１または複数のヌクレオチドの該分子のいずれかの末端への付加、または該配列のいずれかの末端あるいは内部における１または複数のヌクレオチドの欠失。
【００１８】
一般に、類似のDNA分子は配列番号1または配列番号3のヌクレオチド配列と有意に相同的なものである。本明細書において使用する場合、「有意に相同的」なる語は、問題のヌクレオチド配列が有するヌクレオチドレベルでの同一性の程度が、少なくとも60%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも95%であることをいう。
【００１９】
本発明のDNA分子はトウモロコシ由来であるが、その他の高等植物種、特にイネ、コムギ、シロイヌナズナなどにおいて類似の形態にて見いだすことが出来、ここでそれらは天然の形態でもよいし、あるいは遺伝子形質転換プロセスの結果得られたものでもよく、ここで形質転換生物は該DNA分子を複製するものである。本発明のDNA分子はそれを含むあらゆる植物のDNAから常套技術によって単離することが出来る。例えば、本発明において提供される該DNA分子のヌクレオチド配列情報に基づいて調製されるプローブまたはオリゴヌクレオチドを用いるとよい。
【００２０】
本発明のDNA分子には、該TGase活性を有するその断片も含まれる。
【００２１】
特定の態様において本発明のDNA分子は、配列番号1または配列番号3のトウモロコシのDNA分子である。
【００２２】
本発明のDNA分子は一般に、広範な宿主細胞においてTGase活性を有するタンパク質の発現を可能とする発現ベクター（以下、本発明の発現ベクターと称する）の作成に利用することが出来る。一般に、本発明の発現ベクターは、少なくとも１つの本発明のDNA配列および少なくともそれに操作可能に結合した目的の遺伝子の転写を促すプロモーター、および、時間と場所において好適に調整された目的の遺伝子の転写に必要または好適なその他の配列、例えば、開始および終止サイン、切断部位、ポリアデニル化サイン、複製起点、転写エンハンサー、転写サイレンサーなどを含んでいてもよい。好適な発現ベクターの例は、各個別の場合の条件および必要性にしたがって例えば以下から選択すればよい：プラスミド、酵母人工染色体(YAC)、細菌人工染色体(BAC)、P1バクテリオファージに基づく人工染色体(PAC)、コスミドまたはウイルス（細菌起点または酵母複製起点を細菌または酵母における増幅のために含んでいてもよく、目的の１または複数の遺伝子以外に、形質導入細胞を選抜するのに有用なマーカーを含んでいてもよい）。それゆえ、本発明はまた、本発明のDNA分子を含むベクターにも関する。ベクターの選択は、後でベクターが導入される宿主細胞に依存する。例えば、DNA配列が導入されるベクターは、宿主細胞に導入された場合に該細胞のゲノムに組み込まれ、宿主細胞の染色体と共に複製されるプラスミドとすればよい。
【００２３】
本発明のベクターは当業者に公知の常套方法によって得られる(Kovesdi et al.- 1997.  Curr Opin Biotech 8:583-589 Transgenic Res. 10:83-103; Coffin et al. 1998. Retroviruses、CSHLP; Robbins et al. 1998.  Trends Biotech. 16:35-40; Anderson. 1998. Nature 392:25-30; Schindelhauer.  1999.  BioEssays 21:76-83)。本発明の特定の目的は、それぞれ配列番号1および配列番号3を含むプラスミド、pGEMT15およびpGEMT21を含む。
【００２４】
本発明はまた、本発明のDNA分子または発現ベクターを含む細胞も提供する。該発現ベクターで形質転換されうる宿主細胞は、例えば、GRAS細菌細胞および酵母である。本発明の発現ベクターを含む細胞は、本発明のDNA分子によってコードされるTGase活性を有するタンパク質の過剰産生に利用できる。本発明の特定の目的は、特に配列番号2および配列番号4に示すアミノ酸配列を有するTGase活性を有するタンパク質からなる。
【００２５】
かかる結果により、異種発現によって前記新規なTGase タンパク質を産生するために有用な、GRAS (Generally Recognized as Safe（安全と認定された）)細菌系または酵母を形質転換する新たな可能性が開かれる。前述のように、TGase活性を有するタンパク質は、異なるタンパク質間での共有結合を生じさせることが出来るその能力によって、多くの食品の操作、加工および変換プロセスに用いることが出来る。この特徴は、例えば、食品例えば魚や肉の食感を維持し、塩の使用の必要性を低減するために用いられてきた。以下の特許を参照されたい：米国特許第5928689号”Method for treating PSE meat with transglutaminase”、様々な密度のゼラチンの生産方法について、国際特許出願第WO0162888号”Improved composition of marine product”;脂肪含量が少ない加熱処理食品の生産法について(豆腐)、米国特許第6342256号”Tofu products excellent in freeze resistance and process for producing the same”、米国特許第6042851号”Process for producing packed tofu”。様々な温度にて製品の堅さ、弾力、水分または粘度を維持することも可能である。同様に、それは様々な乳加工食品にも用いられている:チーズ(米国特許第6270814号”Incorporation of whey into process cheese”、米国特許出願第20010053398号”Cheese whey protein having improved texture process for producing the same and use thereof”)、ヨーグルト、アイスクリーム、マヨネーズ、ソースおよび製麺(欧州特許第EP0948905号”Enzyme preparations comprising transglutaminase and process for producing noodles”、米国特許第6106887号”Process for obtaining a modified cereal flour”)、チョコレート(米国特許第6063408号”Process for producing chocolate”)、ジャガイモ由来の食品(米国特許出願第20020004085号”Methods for producing potato products”)、砂糖(日本特許第JP200354498号”Production of sugar from cereal flour material by transglutaminase treatment”)。様々な用途、とりわけ上記特許においてTGasesについて記載されている用途は本発明のTGasesの可能性のある用途の例である。それゆえ、本発明の特定の目的は、本発明のTGase活性を有するタンパク質、特に配列番号2および配列番号4のタンパク質またはそれを含む溶液の、食品の操作、加工および変換における使用である。総説、Chiya Kuraishi et al.、2001 (Transglutaminase:  Its utilization in the food industry Food Reviews International 17 (2):221-246)）に、本発明のTGase活性を有するタンパク質の使用例が示される。
【００２６】
最後に、上記本発明のTGase活性を有するタンパク質およびその使用の例示として記載した用途とは異なる用途も存在し、特に以下の特許に記載されている:”Method for enzymatic treatment of wool”米国特許出願第161824号(1998) MacDevitt et al., April 2000; ”Enzymatically protein encapsulating oil particles by complex coacervation”、出願番号791953 (1997).  Soper, Jon C. et al. March 2000;”Cross-linked gelatin gels and method of making them”出願番号641463 (1996) Bishop, P.D. et al. ZymoGenetics, Inc. (Seattle, EA, USA); ”Process for obtaining a modified cereal flour”出願番号977575 Ajinomoto Co. Inc. (Tokyo, Japan). Yamazaki et al. August 2000; ”Microbial transglutaminase, their production and use”出願番号294565 (1999).  NovoNordisk A/S (Bagsvaerd, DK) Bech et al. Feb. 2001。
【００２７】
さらに、本発明のDNA分子または発現ベクターは、該タンパク質の発現を変化させることにより、基礎研究および該TGaseに起因する機能の操作によって産生される新規な能力(植物成長および発達、形態形成、光合成および細胞死)を有するトランスジェニック植物の開発のための植物の遺伝子形質転換工程にも利用できる。
【実施例１】
【００２８】
イムノスクリーニングによるトウモロコシトランスグルタミナーゼのファミリーの２つのタンパク質をコードする２つのcDNAの単離とクローニング
発現バンク
本発明のcDNAは、ラムダ-ZAPII（登録商標）中のcDNA発現バンクから単離した。この発現バンクは、２週齡のZea mays subsp. mays plantulae（同型接合体 B73、温室条件下で栽培、Dr. Alice Barkan、of the University of Oregon, USAから提供）のメッセンジャーRNAから開始して、EcoRIおよびXhoI標的から得た。
【００２９】
Helianthus tuberosusの葉の葉緑体抽出物から精製した58 kDaの植物トランスグルタミナーゼを抗原として用いた。ポリクローナル抗体を雌鶏から得た(Villalobos、E., Torne, J.M., Olles、C., Claparols, I. & Santos、M.A. 2001.  Subcellular localization of a transglutaminase related to grana development in different maize cell types.  Protoplasma. 216:155-163)。抗体の特異性はドットブロット技術により、市販のブタ肝臓トランスグルタミナーゼを用いて、そして精製タンパク質を用いたウェスタンブロットにより調べた(Dondini, L. 1998.  "Poliammine legate e transglutaminasi nelle plante."  PhD. Thesis.  University of Bologna、Italy)。力価測定はウェスタンブロットにより行った(完全な方法は以下に詳細に記載されている:  Villalobos、E., Torne, J.M.、Olles, C.-, Claparols, I. & Santos, M.A. 2001.  Subcellular localization of a transglutaminase related to grana development in different maize cell types.  Protoplasma. 216:155-163)。
【００３０】
バンクのイムノスクリーニング
使用するバンクの力価を測定した後、XL-Blue（登録商標）株のコロニーをMgSO4および20%マルトースを含有する液体LB培地に接種した。
【００３１】
細菌をOD 2.0 (600 nm)となるまで培養した後、細菌培養混合物をライブラリーからの4.5 x 104 pfuを用いて作成し、それに10 mMのIPTGを添加した。感染およびLB培地+10 mM MgSO4を含むペトリ皿に播いた後、10 mM のIPTGで飽和したニトロセルロースディスクを上に載せた。フィルターと共にペトリ皿を４時間インキュベートした後、冷却してフィルターをPBSで洗浄した。最後に、メンブレンを１回スキンミルクまたはBSAでブロッキングし、抗体によって明らかにし、印をつけた。H. tuberosusのトランスグルタミナーゼに対する抗体と相互作用した陽性のファージがみられる溶解を検出するために、該メンブレンに対してウェスタンブロット分析を行い、それをECL試薬によって写真プレートで現像した。
【００３２】
pBluescript SK-中のファージミドのインビボエキシジョンおよび陽性コロニーの選抜
抗体と相互作用するタンパク質をそれぞれコードするcDNAを含む２つのファージを単離および精製した後、それらを”ExAssist（商標） Interference-Resistant Helper Phage (Stratagene)”によって切り出した。共感染はXL1-Blue株にて行い、感染は XLOLR（登録商標）において行った。ディッシングは使用したベクター(pBluescript)を判定する選抜培地にて行った。本発明者らの場合、形質転換コロニーを選抜する培地はアンピシリン(50μg/ml)、1 mM IPTG およびX-Gal (40μg/ml)（酵素β-ガラクトシダーゼの基質であり、その遺伝子はインサートまたはcDNAにより壊される）を追加したLB-アガーであった。
【００３３】
プラスミドの小規模単離(MINIPREP)
各切り出しのために、目的のcDNAを含むプラスミドDNAの単離を、SDSおよびNaOHを用い、酢酸カリウムで中和し、フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)の混合物で精製し、エタノールで沈降させる、細菌溶解小規模MINIPREP技術により行った。次いでそれをRNAase 酵素を追加したTE 1xバッファーに再懸濁した。
【００３４】
pBluescript ベクターにおけるcDNAの存在の確認
各場合において、pBluescript中のインサートの存在の確認は、プラスミドDNAのサンプルを、バンクを作成するのに用いたものと同じエンドヌクレアーゼ酵素(EcoRIおよびXhol)で消化することにより行った。消化は各制限酵素に要求される条件(バッファーおよび温度)で行った。消化を行うと、cDNA即ちインサートがベクターから遊離する。これは常套のTBE 1XまたはTAE 1X バッファー中での0.5%アガロースゲル電気泳動によって確認した。
【００３５】
配列決定(IBMB配列決定装置、バルセロナの”CSIC”)
２つであることが判明した目的のcDNAを含むミニプレパレーションのサンプルを同定した後、これらをフェノール、クロロホルムおよびイソアミルアルコールの混合物および純粋なクロロホルムを用いて沈降させ、精製し、配列決定を行った。配列決定すべきサンプルを水に溶解した。
【００３６】
RACE技術による全長コード配列の決定
pBluescript SK-における２つのファージの切り出しによって２つの部分的cDNAが得られ、この全長コード配列をRACE技術によって決定した。この目的のため、トウモロコシ葉から得たトータルRNAからメッセンジャーRNAをポリdTカラムによって精製し、一本鎖DNAの合成の鋳型に用いた。これを行うために、既知のcDNA配列から推定した特異的オリゴヌクレオチド(オリゴE1,3'-5':GATTCTCCCTGATAAG、配列番号5)および逆転写酵素を用いた。末端デオキシトランスフェラーゼ酵素(TdT)により一本鎖DNAにポリTテイルを付加し、第２のDNA鎖を得た。これは以下のオリゴヌクレオチドを用いるPCR技術によって行った：ポリTテイルを有するDNAに特異的な5' RACE Abridged Anchor Primer (GIBCO BRL（登録商標）) (オリゴアンカー5'-3':GGCCAGGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG、配列番号6)および第２の既知の配列の上記部分的cDNAに特異的なオリゴヌクレオチドであってオリゴE2、3'-5':GTTCTCCAGCATCTCCAG（配列番号7)に対応するもの。
【００３７】
次のPCRサイクルにおいて、該DNAを伸長させた。サイクルは以下の通りとした:まず、2分94℃、次いで以下のサイクル34回:30秒94℃（オリゴno.1について）、30秒60℃（オリゴno.2について）、両ケースについて7秒72℃。最後に、5℃で数時間放置した。
【００３８】
PCR産物を好適なベクター(例えばpGEMT)に、リガーゼ酵素を用いてクローニングした。次いで大腸菌株DH5-αを形質転換し、選抜培地で培養した。プラスミドDNAを上記のMiniprep技術により取り出し、精製し、得られた断片を配列決定した。本発明者らの場合、両方の部分的cDNA配列についてコード配列を完成させるのに必要な断片は４つのヌクレオチドだけであることが判明した。RACE技術によって得た４つのヌクレオチドを含む全長ヌクレオチドコード配列をそれぞれ配列番号1および配列番号3に示す。配列番号1および配列番号3の配列を含む宿主細胞の形質転換に用いる発現ベクターを、それぞれプラスミドpGEMT15およびpGEMT21とした。
【００３９】
ヌクレオチド配列から得たアミノ酸配列はその他の非植物系のトランスグルタミナーゼ型活性中心のドメインと、以下のアミノ酸に対応する領域において相同性を有していた: 配列番号2のタンパク質(60.97 kDa)について431-474、そして配列番号4のタンパク質(67 kDa)について485-528。両方の場合において、酵素活性に必須なアミノ酸であるとされるシステイン(Cys) (配列番号2においてCys439、配列番号4においてCys493)がこれらの領域にみられた。参照したデータベースは:(www.ncbi.nlm.nih/)であった。さらに配列番号1および配列番号3の配列に示すように、いくつかの27ヌクレオチドの領域がタンデムに両方の配列、即ち配列番号1および配列番号3において反復していることが観察された。反復の程度は、15から21とそれぞれ異なっており、それらのなかのヌクレオチドには僅かに異なっているものもあった。上記反復領域は既知のTGaseについては報告されていないものであることに注目されたい。それゆえかかる反復は本発明のDNA分子の特徴である。
【実施例２】
【００４０】
cDNAから発現するタンパク質のトランスグルタミナーゼ活性の確認
cDNAから発現するタンパク質のTGase活性の測定
目的のcDNAを含む２つのクローンのファージのそれぞれにて、大腸菌(XL-Blue株)培養物を液体LB培地中で感染し、それに10 mMのIPTGを添加した。37℃での溶解後、抽出物の全タンパク質の濃度をLowry法によって定量し(Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr, AL & Randall RJ. 1951. Protein measurement with the Folin phenol reagent.  J. Biol. Chem. 193:265-275)、以下に説明する実験を行って、トランスグルタミナーゼ活性を測定し、目的のcDNAを含まないファージによる溶解抽出物と比較した。
【００４１】
1.- トリチウム標識プトレシンによって印をしたタンパク質の測定によるTGase活性の検出方法 
両方のファージ(f1は配列番号2のTGaseを含み、f2は配列番号4のTGaseを含む)によって得た溶解抽出物のそれぞれを用いて全タンパク質濃度600μgの酵素抽出物を調製し、酵素試験を30℃で30分間行った。酵素混合物は、タンパク質抽出物の他に、0.6 mMのプトレシン、185 kBqのトリチウム標識プトレシン(0.85 TBq/nmol)、20 mMのTris-HCl* pH 8および3 mMのCaCl2を含むものとした。反応を2mMのプトレシンを含む10%トリクロロ酢酸で終了させた。サンプルを繰り返し沈降させ、ペレットの放射能を測定した(Bernet、E., Claparols, L., Dondini、L., Santos、M.A., Serafini-Fracassini, D.- & Torne, J. Ma 1999):  Changes in polyamine content、arginine and ornithine decarboxylases and transglutaminase activities during light/dark phases (of initial differentiation) in maize calluses and their chloroplast.  Plant Physio Biochem. 37(12): 899-909)。TGase活性は１時間あたりのタンパク質１ミリグラムあたりのプトレシンのpmolとして測定した。活性はファージf1およびf2から得たタンパク質抽出物における方が、かかるTGase のcDNAを含まないファージからの抽出物より高かった。
【００４２】
2. CBZ-Gln-Glyを一次基質とし、ビオチンカダベリンを二次基質として用いたElisa 型試験によるTGase活性の検出方法
この試験は、少量の総タンパク質からのサンプルのTGase活性を市販のブタ肝臓TGaseと比較して測定する、Covalab（登録商標）から購入したキットによって行った。この方法により、ペプチドおよびポリアミン基質からサンプルのTGase活性によって形成されるグルタミル誘導体を比色定量試験によって検出した。活性はTGaseユニットとして測定し、ここで0.6 mUの市販のTGaseが450 nmの吸光度 1±0.05 ODに対応する。
【００４３】
２つの溶解産物(f1およびf2)に対応する２つのタンパク質抽出物は該活性の２つの検出方法において、該cDNAを含まないファージ由来の抽出物と比較してより高いTGase 型の活性を示した。データを図１および２に示す。 
【００４４】
さらに、図1は、TGase酵素活性に固有であるとされている、抽出物のTGase活性に対する様々な因子の効果を示す。したがって、発現したタンパク質の活性は以下の場合に有意に減少する:a]カルシウムの不在下、b]1 mMのGTPの存在下、c]1 mMのデノダンシルカダベリン（denodansylcadaverine）(MDC)の存在下およびd]目的のcDNAを有さないファージ(f3)による溶解抽出物。
【００４５】
大腸菌dH5α型由来の２つの細菌培養物、即ち、トウモロコシcDNAを含み、それぞれトウモロコシの配列番号2および配列番号4の配列のタンパク質をコードする遺伝子を含むプラスミドの担体であるプラスミド(pBlueScript)で形質転換された細菌培養物を、15TGZM02および21TGZM02と命名し、スペイン・カルチャー・タイプ・コレクション（Spanish Culture Type Collection）(”Coleccion Espanola de Cultivos Tipo(CECT)”, University of Valencia, Research Building, Burjasot Campus, 46100 Burjasot, Valencia, Spain, 7 (?) May 2002）に寄託した。”CECT”受託番号の対応は以下の通り: 5705は15TGZM02であり、5706は21TGZM02である。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１は、方法の部分で記載したファージ溶解（phagous lysis）産物のいずれかに対応するタンパク質抽出物のTGase活性(取り込まれたPut（プトレシン）のpmolとして測定)である。陽性ファージはf1およびf2(トウモロコシTGaseの異なるcDNAを含む:f1=配列番号1、f2=配列番号3)に対応し、陰性ファージはf3(TGaseのcDNAを含まない)に対応する。さらに、その他の系においてTGase酵素活性に固有であるとされている、抽出物のTGase活性に影響する様々な因子の効果を示す:カルシウム=タンパク質抽出物、カルシウムの不在下。GTP=1 mMのGTPの添加。MDC=1 mMのMDCの添加。
【図２】図２は、TGaseの２つのcDNAを含む２種類のファージ(f1 = 配列番号1; f2 = 配列番号2 )に対応する２つのタンパク質抽出物の、かかるcDNAを含まないファージ(f3)と比較した活性を、被験タンパク質の量について示す。活性は方法の部分に記載のようにビオチンカダベリンを含めることによりTGaseのミリユニット(mU)にて測定する。a=40 mg タンパク質/ml。b=60 mg タンパク質/ml。c= 80 mg タンパク質/ml。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年1月25日(2005.1.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005528104000001.app
【国際調査報告】
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2005528104.tif 000018
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