(57)【要約】本発明は、ケラチノサイトの調製物からケラチノサイト幹細胞集団を濃縮する方法に関するものである。本方は、約５〜３０分間、特に約１０〜２０分間、有利には１２分間の、細胞外マトリックス成分、特にケラチノサイトの接着に関与している分子により、特にインテグリンファミリー受容体により認識される細胞外マトリックス成分、特にコラーゲンへの該調製物の接着、並びに接着性細胞集団を得るための、接着した幹細胞の生存率を維持することを可能にする条件の下での分離、特にトリプシン処理、特にトリプシン０．０５％及びＥＤＴＡ０．０２％を使用したトリプシン処理による、細胞外マトリックス成分に接着した幹細胞の回収による、ケラチノサイト幹細胞の予備濃縮段階を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケラチノサイトの調製物からケラチノサイト幹細胞集団を濃縮する方法であって、約５〜３０分間、特に約１０〜２０分間、有利には１２分間の、細胞外マトリックス成分、特にケラチノサイトの接着に関与する分子、特にインテグリンファミリーの受容体により認識される細胞外マトリックス成分、特にコラーゲンへの該調製物の接着、並びに接着した幹細胞の生存率の維持を可能にする条件の下での剥離、特にトリプシン処理、特に０．０５％トリプシン及び０．０２％ＥＤＴＡを使用したトリプシン処理による、前記細胞外マトリックス成分に接着した幹細胞を回収して接着性細胞集団を得ることによる、ケラチノサイト幹細胞の予備濃縮の段階を含む方法。
【請求項２】
接着性細胞集団が、約１０9以上の増幅能を有している、請求項１記載の濃縮法。
【請求項３】
接着性細胞の割合が、ケラチノサイトの調製物に含有される細胞の約５〜２０％、特に約１０％を占める、請求項１又は２に記載の濃縮法。
【請求項４】
接着性細胞の約７０％がインテグリンのα６鎖を発現している、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
接着性細胞集団が、特に接着性細胞に対して少なくとも約１％のレベルで、特に少なくとも約２％のレベルで、クローン原性細胞を含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
クローン原性細胞が、約５×１０10以上の増幅能を有している、請求項５記載の方法。
【請求項７】
予備濃縮段階の後、接着性細胞上の分裂促進性受容体の発現レベルの検出、及び最も低い分裂促進性受容体の発現レベルを有する、幹細胞の約２０〜５０％を占める接着性細胞の画分の回収による濃縮段階を含み、前記発現をフローサイトメトリーにより測定し、前記画分は「分裂促進性受容体low」画分と呼ばれる、請求項１〜６のいずれかに記載の濃縮法。
【請求項８】
分裂促進性受容体が、ケラチノサイト幹細胞の増殖を誘導し得る増殖因子の受容体、特に上皮成長因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）及びケラチノサイト増殖因子受容体（ＫＧＦ−Ｒ）を含む群より選択される、請求項１〜７のいずれか１項記載の濃縮法。
【請求項９】
最も低い分裂促進性受容体の発現レベルを有する幹細胞の割合が、ケラチノサイトの調製物に含有される細胞に対して約２〜５％である、請求項１〜８のいずれか１項記載の濃縮法。
【請求項１０】
分裂促進性受容体がＥＧＦ−Ｒである、請求項１〜９のいずれか１項記載の濃縮法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の濃縮法であって、
−  約１０〜２０分間、特に１２分間の、ケラチノサイトの調製物のコラーゲンへの接着、０．０５％トリプシン及び０．０２％ＥＤＴＡを使用したトリプシン処理を使用した剥離により実施されるコラーゲンに接着した幹細胞を回収して接着性細胞集団を得ることによるケラチノサイト幹細胞の予備濃縮の段階、
−  前段階において得られた接着性細胞上のＥＧＦ−Ｒ受容体の発現レベルの検出、及び最も低いＥＧＦ−Ｒの発現レベルを有する、接着性細胞の約２０〜５０％を占める幹細胞の画分の回収による濃縮の段階であって、前記画分がＥＧＦ−Ｒlowと呼ばれる濃縮の段階を含む、請求項１〜１０のいずれか１項記載の濃縮法。
【請求項１２】
ＥＧＦ−Ｒlow画分が、約１０10以上の増幅能を有する、請求項１１記載の濃縮法。
【請求項１３】
ＥＧＦ−Ｒlow画分が、クローン原性細胞を、ＥＧＦ−Ｒlow画分に含有されている細胞に対して、特に少なくとも約１％、特に少なくとも約２％含む、請求項１２記載の濃縮法。
【請求項１４】
クローン原性細胞が、約５×１０11以上の増幅能を有している、請求項１３記載の濃縮法。
【請求項１５】
請求項７〜１４に従って得られた「分裂促進性受容体low」画分を約２，５００〜７，０００細胞／cm2の播種密度で培養して最大約１２０，０００細胞／cm2を得た後、生存率を変えない条件下での細胞の剥離を可能にする条件下で剥離及び継代培養する段階を含み、剥離及び継代培養の連続的な段階が、細胞密度が最大約１２０，０００細胞／cm2に達した時点で行われる、ケラチノサイト幹細胞の培養の方法。
【請求項１６】
剥離の段階が、一方は例えば０．０５％トリプシン＋０．０２％ＥＤＴＡを使用する、剥離するのが最も容易ないくつかの細胞の剥離を可能にする条件下、及び他方は例えば０．２５％トリプシン＋０．０２％ＥＤＴＡを使用する、剥離するのが最も困難な細胞の剥離を可能にする条件下で行われる、請求項１５記載のケラチノサイト幹細胞の培養の方法。
【請求項１７】
約２，５００〜７，０００細胞／cm2の播種密度で請求項１１に従って得られたＥＧＦ−Ｒlow画分を培養して最大約１２０，０００細胞／cm2を得た後、０．０５％トリプシン＋０．０２％ＥＤＴＡを使用する、剥離するのが最も容易ないくつかの細胞の剥離を可能にする条件下、及び０．２５％トリプシン＋０．０２％ＥＤＴＡを使用する、最も剥離するのが困難な細胞の剥離を可能にする条件下で剥離し、その後に、得られた幹細胞を継代培養することを含む、ケラチノサイト幹細胞の培養の方法。
【請求項１８】
請求項１〜６のいずれか１項記載の方法の実行により、又は請求項７〜１７のいずれか１項記載の方法の実行により得られるような幹細胞の組成物。
【請求項１９】
約１０10以上の増幅能を有するケラチノサイト幹細胞（ＫＳＣ）を含む、ケラチノサイト幹細胞の組成物。
【請求項２０】
ＫＳＣが生存している、請求項１８又は１９に記載のＫＳＣ組成物。
【請求項２１】
表面上の分裂促進性受容体の発現レベルが弱いＫＳＣを含有する、請求項１８〜２０のいずれか１項記載の幹細胞の組成物。
【請求項２２】
ＥＧＦ受容体（ＥＧＦ−Ｒ）の発現レベルが低い、請求項２１記載の幹細胞の組成物。
【請求項２３】
皮膚の再構築のための、請求項１８〜２２のいずれか１項記載のケラチノサイト幹細胞の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の主題は、ケラチノサイト幹細胞の濃縮法である。
【０００２】
高い増幅能を有するケラチノサイト幹細胞も、本発明の主題である。
【０００３】
造血組織及び皮膚は、組織化のレベルにおける類似性を有している。これらは、個体の一生を通じて絶えず大量の成熟細胞が産生され再生されている、動的かつ階層的な生物学的系である。それらに含まれている細胞は、進化の段階によって３つのコンパートメントに大別され得る。しかしながら、これらのコンパートメントの間に明確に画定された境界は存在せず、それらは各々、実際には、様々な成熟度を有する細胞の連続体からなっており、従って極めて不均一である。
【０００４】
第一のコンパートメントは、増殖能（proliteration potential）が極めて限定されているか又は存在しない分化した成熟細胞（リンパ球、マクロファージ、巨核球、赤血球；表皮の基底層上層（suprabasal layerのケラチノサイト）からなる。
【０００５】
第二のコンパートメントは、分化へと方向付けられることにより次第に失われる、可変性ではあるが限定された増殖能を有する細胞集団（造血系の祖先細胞及び前駆細胞；一過性の増幅期にあるケラチノサイト）を含む。
【０００６】
第三のコンパートメントは、これらの系の階層の上流に位置する希少な細胞からなっている。それは、主に休止状態に維持されているが、極めて長期の増幅能を有するという事実によって特に特徴付けられるのみならず、その自己再生能によっても特に特徴付けられる幹細胞（造血幹細胞；ケラチノサイト幹細胞）を含む。
【０００７】
ケラチノサイト幹細胞の表現型は、従来、不完全にしか特徴決定されておらず、これらの細胞は、現在のところ、依然として精製するのが困難で、選択するのが困難であり、従って、現在のところ、ケラチノサイト幹細胞の濃縮のための効率的な方法は利用可能ではない。
【０００８】
本発明の目的の一つは、高度の長期増幅能（expansion potential）を有するケラチノサイト幹細胞集団を得ることを可能にする効率的な方法を提唱することである。
【０００９】
本発明の目的の一つは、標準的な方法により得られるケラチノサイト幹細胞の増殖能より少なくとも約１００倍大きい増殖能を有するケラチノサイト幹細胞集団を提供することである。
【００１０】
本発明の主題は、より具体的には、約５〜３０分間、特に約１０〜２０分間、有利には１２分間の、細胞外マトリックス成分、特にケラチノサイトの接着に関与する分子、特にインテグリンファミリーの受容体により認識される細胞外マトリックス成分、特にコラーゲンへの該調製物の接着によるケラチノサイト幹細胞を予備濃縮し、並びに接着した幹細胞の生存率の維持を可能にする条件下での剥離、特にトリプシン処理、特に０．０５％トリプシン及び０．０２％ＥＤＴＡを使用したトリプシン処理により、前記細胞外マトリックス成分に接着した幹細胞を回収して接着性細胞集団を得る段階を含む、ケラチノサイトの調製物からケラチノサイト幹細胞集団を濃縮する方法である。
【００１１】
「ケラチノサイト幹細胞集団」とは、クローン原性細胞を含み、かつ表皮を再構築し得る、高度の長期増幅能を有するケラチノサイト集団を意味する。
【００１２】
「ケラチノサイトの調製物」とは、皮膚試料、又は皮膚を生成させ得るその他の可能性のある幹細胞源（例えば、毛包）から得られた全てのケラチノサイトを意味する。
【００１３】
接着は、ケラチノサイトの調製物を、細胞外マトリックス成分が吸着している接着基質に適用することにより実施される。
【００１４】
接着基質に接着しなかった細胞は、洗浄により取り除かれる。
【００１５】
「細胞外マトリックス成分」とは、特に、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカンのような分子を意味する（１〜７）。
【００１６】
細胞の接着は、特に、標準的な条件下で接着基質の洗浄を実施することにより確認され得る。選択された接着性細胞は、この手段によって剥離されない。
【００１７】
接着期間が５分未満である場合、回収率は低く、例えば、ケラチノサイトの調製物に含有される全細胞に対して１％未満である。
【００１８】
接着期間が３０分超である場合、分離は比較的無差別的であり、例えばケラチノサイトの調製物に含有される細胞の少なくとも３０％が回収される。
【００１９】
剥離は、細胞の良好な生存率を維持すること、即ち全ての生細胞を保存することを可能にする条件下で行われる（剥離後、＞９７％の生細胞）。
【００２０】
細胞の生存率は、特にトリパンブルー排除法（８）により決定され得る。
【００２１】
本発明の方法は、有利には、約１０9以上の増幅能を有する接着性細胞集団を得ることを可能にする。
【００２２】
「約１０9以上の増幅能を有する接着性細胞集団」という表現は、問題とする集団が、約１０9超の率で増幅され、従って培養を開始するために使用された細胞より約１０9倍多い細胞を生成させ得ることを意味する。
【００２３】
増幅能は、累積増幅曲線を確立することを可能にする培養物の長期使用（１００日超）により推定される（実施例に後述される培養手順を参照のこと）。
【００２４】
本発明に係る濃縮法における有利な実施態様によると、接着性細胞の割合は、ケラチノサイトの調製物に含有される細胞の約５〜２０％、特に約１０％を占める。
【００２５】
もう一つの有利な実施態様は、約５〜３０分間、特に約１０〜２０分間、有利には１２分間の、細胞外マトリックス成分、特にケラチノサイトの接着に関与する分子、特にインテグリンファミリーの受容体により認識される細胞外マトリックス成分、特にコラーゲンへの該調製物の接着、並びに接着した幹細胞の生存率の維持を可能にする条件下での剥離、特にトリプシン処理、特に０．０５％トリプシン及び０．０２％ＥＤＴＡを使用したトリプシン処理により、前記細胞外マトリックス成分に接着した幹細胞を回収して接着性細胞集団（接着性細胞の約７０％がインテグリンのα６鎖を発現している）を得ることによる、ケラチノサイト幹細胞の予備濃縮の段階を含む、ケラチノサイトの調製物からケラチノサイト幹細胞集団を濃縮する方法に関する。
【００２６】
インテグリンのα６鎖の発現は、特に免疫表現型標識化により決定され、フローサイトメトリーにより分析される。
【００２７】
本発明の実施態様によると、接着性細胞はインテグリンのα６鎖を強く発現する。
【００２８】
「インテグリンのα６鎖を強く発現する」という表現は、ベクトンディッキンソン（Becton Dickinson）Ｆ．Ａ．Ｃ．Ｓ．バンテージ（VANTAGE）からのデータにより、１日目に平均蛍光強度が５５超であることを意味する。
【００２９】
もう一つの有利な実施態様によると、本発明に係る方法において、接着性細胞集団は、接着性細胞に対して、特に少なくとも約１％のレベルで、特に少なくとも２％のレベルで、クローン原性細胞を含む。
【００３０】
「クローン原性細胞」とは、細胞クローンを産生する能力を有する細胞を意味する。
【００３１】
細胞のクローン原性という特質は、短期培養テスト（６〜１２日）の実行により確認され得る（実施例に後述される培養手順を参照のこと）。
【００３２】
本発明の方法の予備濃縮段階は、約５×１０10以上の増幅能を有するクローン原性細胞を得ることを可能にする。
【００３３】
「約５×１０10以上の増幅能を有するクローン原性細胞」という表現は、接着性細胞集団に含有されるクローン原性細胞が、平均して、少なくとも約５×１０10個のケラチノサイトを派生させる能力を有することを意味する。
【００３４】
クローン原性細胞のみが、効率的に増幅に参加する。前述のように、接着性集団の細胞の約１〜２％がクローン原性であるとすれば、結果として、これらのクローン原性細胞の増幅能は、細胞集団スケールで推定されるものより約５０〜１００倍大きい。
【００３５】
もう一つの有利な実施態様によると、本発明に係る濃縮法は、接着性細胞上の分裂促進性受容体の発現レベルの検出、及び最も低い分裂促進性受容体の発現レベルを有する、幹細胞の約２０〜５０％を占める接着性細胞の画分の回収による濃縮の段階であって、前記発現がフローサイトメトリーにより測定され、前記画分が「分裂促進性受容体low」画分と呼ばれる、濃縮の段階を予備濃縮段階の後に含む
【００３６】
分裂促進性受容体の発現レベルの検出による濃縮の段階は、接着性細胞を２つの画分、即ち１つは分裂促進性受容体を最も強く発現する「分裂促進性受容体high」画分と呼ばれる画分、及び分裂促進性受容体を最も弱く発現する、接着性細胞の２０〜５０％を含有する「分裂促進性受容体low」画分と呼ばれる他方の画分に分離することを可能にする。
【００３７】
得られた結果は、最も大きい増幅能を有する最も原始的なケラチノサイトが、分裂促進性受容体low画分に有意に濃縮されることを再現可能に証明した。
【００３８】
「分裂促進性受容体」とは、分裂への移行を誘導し、従って細胞増殖を刺激し得る受容体を意味する。
【００３９】
本発明に係る濃縮法におけるもう一つの有利な実施態様によると、分裂促進性受容体は、ケラチノサイト幹細胞の増殖を誘導し得る増殖因子の受容体、特に上皮成長因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）及びケラチノサイト増殖因子受容体（ＫＧＦ−Ｒ）を含む群より選択される。
【００４０】
「ケラチノサイト幹細胞の増殖を誘導し得る増殖因子の受容体」とは、そのリガンドが分裂への移行及びケラチノサイト幹細胞の増殖を刺激し得る成長因子であるような任意の受容体を意味する。
【００４１】
本発明に係る濃縮法におけるもう一つの実施態様によると、最も低い分裂促進性受容体の発現レベルを有している幹細胞の割合は、ケラチノサイトの調製物に含有される細胞に対して約２〜５％である
【００４２】
本発明に係る濃縮法におけるもう一つの実施態様によると、分裂促進性受容体はＥＧＦ−Ｒである。
【００４３】
もう一つの実施態様によると、本発明に係る濃縮法は、
−  約１０〜２０分間、特に１２分間のコラーゲンへの接着、接着性細胞集団を得るための、０．０５％トリプシン及び０．０２％ＥＤＴＡを使用したトリプシン処理を使用した剥離により実施されるコラーゲンに接着した細胞の回収によるケラチノサイト幹細胞の予備濃縮の段階、
−  前段階において得られた接着性細胞におけるＥＧＦ−Ｒ受容体の発現レベルの検出、及び最も低いＥＧＦ−Ｒの発現レベルを有している接着性細胞の約２０〜５０％を占める幹細胞の画分（この画分はＥＧＦ−Ｒlowと名付けられる）の回収による濃縮の段階を含む。
【００４４】
もう一つの実施態様によると、本発明に係る濃縮法は、
−  約１０〜２０分間、特に１２分間のコラーゲンへの接着、接着性細胞集団（該接着性細胞の約７０％がインテグリンのα６鎖を発現している）を得るための、０．０５％トリプシン及び０．０２％ＥＤＴＡを使用したトリプシン処理を使用した剥離により実施されるコラーゲンに接着した細胞の回収によるケラチノサイト幹細胞の予備濃縮の段階、
−  前段階において得られた接着性細胞におけるＥＧＦ−Ｒ受容体の発現レベルの検出、及び最も低いＥＧＦ−Ｒの発現レベルを有している接着性細胞の約２０〜５０％を占める幹細胞の画分（この画分はＥＧＦ−Ｒlowと名付けられる）の回収による濃縮の段階を含む。
【００４５】
もう一つの実施態様によると、本発明に係る濃縮法は、
−  約１０〜２０分間、特に１２分間の、細胞外マトリックス成分、特にケラチノサイトの接着に関与している分子により、特にインテグリンファミリーの受容体により認識される細胞外マトリックス成分、特にコラーゲンへのケラチノサイトの調製物の接着、接着性細胞集団（該接着性細胞の約７０％がインテグリンのα６鎖を発現している）を得るための、０．０５％トリプシン及び０．０２％ＥＤＴＡを使用したトリプシン処理を使用した剥離により実施されるコラーゲンに接着した細胞の回収によるケラチノサイト幹細胞の予備濃縮の段階、
−  前段階において得られた接着性細胞におけるＥＧＦ−Ｒ受容体の発現レベルの検出、及び最も低いＥＧＦ−Ｒの発現レベルを有している接着性細胞の約２０〜５０％を占める幹細胞の画分（この画分はＥＧＦ−Ｒlowと名付けられる）の回収による濃縮の段階を含む。
【００４６】
本発明に係る濃縮法において、ＥＧＦ−Ｒlow画分は、約１０10以上の増幅能を有する。
【００４７】
「ＥＧＦ−Ｒlow画分は、約１０10以上の増幅能を有する」という表現は、接着性細胞集団が、約１０10超の率で増幅され、従って培養を開始するために使用された細胞より約１０10倍多い細胞を生成させ得ることを意味する。
【００４８】
増幅能は、累積増幅曲線を確立することを可能にする長期培養物の使用により推定される（実施例に後述される培養手順を参照のこと）。
【００４９】
本発明に係る濃縮法における有利な実施態様によると、ＥＧＦ−Ｒlow画分は、ＥＧＦ−Ｒlow画分に含有される細胞に対して、特に少なくとも約１％、特に少なくとも約２％のクローン原性細胞を含む。
【００５０】
本発明に係る方法は、約５×１０11以上の増幅能を有するクローン原性細胞を得ることを可能にする。
【００５１】
「約５×１０11以上の増幅能を有するクローン原性細胞」という表現は、接着性細胞のＥＧＦ−Ｒlow集団に含有されるクローン原性細胞が、平均して、少なくとも約５×１０11個のケラチノサイトを派生させる能力を有することを意味する。
【００５２】
ＥＧＦ−Ｒlow画分の細胞の約１〜２％がクローン原性であり、従って、これらの細胞の増幅能は、細胞画分スケールで推定されるものより約５０〜１００倍大きい。
【００５３】
本発明は、最大約１２０，０００細胞／cm2を得るための約２，５００〜７，０００細胞／cm2の播種密度による前記定義の方法に従い得られた「分裂促進性受容体low」画分の培養、それに続く、生存率を改変しない条件の下での細胞の剥離を可能に許容する条件下での剥離及び継代培養の段階を含み、剥離及び継代培養の連続的な段階が細胞密度が最大約１２０，０００細胞／cm2に達した時点で行われる、ケラチノサイト幹細胞の培養の方法にも関する。
【００５４】
播種密度は、２つの連続した継代培養の間で得られる細胞増幅が可能な限り高くなるようなもの、即ち、ケラチノサイトが対数増殖期にある場合、細胞の数が例えば少なくとも約１５倍に増加し得るようなもの（約１５超の細胞増幅）でなければならない。
【００５５】
播種密度が２，５００細胞／cm2未満であるか、又は７，０００細胞／cm2超である場合、２つの連続した継代培養の間で得られる細胞増幅（細胞が対数増殖期にある場合）は、１５未満であり、従って最適でない。
【００５６】
培養物がコンフルエンス状態（そのような状態は、細胞の分化への方向付けをもたらし、増殖の停止をもたらす）に達するのを回避するため、得られた細胞の数が約１２０，０００細胞／cm2になった時点で、細胞を剥離する。
【００５７】
剥離後、約２，５００〜７，０００細胞／cm2の密度で再播種される培養物の継代培養が実施される。
【００５８】
細胞密度が最大約１２０，０００細胞／cm2に達した時点で、剥離及び継代培養の連続的な段階が実施される。
【００５９】
テストされた細胞集団の増幅能が消耗し、培養物が休止状態へと移行し自発的に増殖を中止した時点で、培養工程を終了する。
【００６０】
本発明に係るケラチノサイト幹細胞の培養の方法における有利な実施態様によると、剥離の段階は、一方は例えば０．０５％トリプシン＋０．０２％ＥＤＴＡを使用する、剥離するのが最も容易な細胞の剥離を可能にする条件、及び他方は例えば０．２５％トリプシン＋０．０２％ＥＤＴＡを使用する、剥離するのが最も困難な細胞の剥離を可能にする条件の下で行われる。
【００６１】
もう一つの有利な実施態様によると、ケラチノサイト幹細胞の培養の方法は、最大約１２０，０００細胞／cm2を得るための約２，５００〜７，０００細胞／cm2の播種密度による前記定義のＥＧＦ−Ｒlow画分の培養、それに続く、０．０５％トリプシン＋０．０２％ＥＤＴＡを使用した剥離するのが最も容易な細胞の剥離を許容する条件、及び０．２５％トリプシン＋０．０２％ＥＤＴＡを使用した最も剥離するのが困難な細胞の剥離を許容する条件の下での剥離、それに続く、得られた幹細胞の継代培養を含む。
【００６２】
本発明は、前記定義のような予備濃縮段階の実行により得られるような幹細胞の組成物に関する。
【００６３】
本発明は、本発明に係る方法の実行により得られるような幹細胞の組成物にも関する。
【００６４】
本発明は、約１０10以上の増幅能を有するケラチノサイト幹細胞（ＫＳＣ）を含むケラチノサイト幹細胞の組成物にも関する。
【００６５】
本発明は、ＫＳＣが生存している、前記定義のようなＫＳＣ組成物にも関する。
【００６６】
本発明は、表面上の分裂促進性受容体の発現レベルが弱いＫＳＣを含有する、前記定義のような幹細胞組成物にも関し、「低い（ｌｏｗ）」という修飾語句は、該ＫＳＣ組成物において観察された分裂促進性受容体の発現プロファイルに対して定義される。
【００６７】
本発明は、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦ−Ｒ）の発現レベルが低い、前記定義のような幹細胞の組成物に関する。
【００６８】
本発明は、皮膚の再構築のための、前記定義のようなケラチノサイト幹細胞の組成物の使用に関する。
【００６９】
本発明の詳細な実施態様を、以下に記載する。
【００７０】
Ｉ／全ケラチノサイトの１０％を占め、ＫＳＣを本質的に含む「接着性」細胞の細胞集団の予備選択
１−「接着性」細胞集団からの細胞の選択：選択法は、ケラチノサイトの接着能に基づく。選択される接着基質は、Ｉ型コラーゲンが吸着しているプラスチック支持体である。皮膚性試料に由来するケラチノサイトの調製物を、接着基質に適用した後、３７℃で短時間インキュベートした。支持体に接着しなかった細胞を抽出し、次いで穏和なトリプシン処理により接着性細胞を剥離し、別々に回収する。１２分のインキュベーション持続時間が、インビトロで細胞増幅を開始し得る細胞が濃縮された集団の選択に適していることが決定されている。接着した細胞は、「接着性」と呼ばれる。
【００７１】
２−「接着性」細胞集団の細胞の表現型上の特徴：細胞接着に関与している表面分子の発現の分析を、未分画集団並びに接着性細胞集団及び非接着性細胞集団に対するフローサイトメトリーにより実施した（図９）。接着性細胞集団においては、インテグリンのα６鎖（ＣＤ４９ｆ）を発現（最も原始的なケラチノサイトに関連した基準）している細胞が有意に濃縮されており（細胞の約７０％が表面にα６インテグリンを有している）、非接着性細胞集団には、これが豊富でない（細胞の約３０％が表面にα６インテグリンを有している）ことが観察された。インテグリンのα２鎖及びβ１鎖の発現は、全（未分画）集団、接着性集団及び非接着性集団に由来する細胞の表面に比較的低い特異性で検出される。
【００７２】
３−「接着性」細胞集団の細胞の機能的特徴：いくつかの独立試料に対して実施された統計分析（ｎ＞５実験）は、接着性細胞集団は、全ケラチノサイトのわずか１０．４％を占めているが、クローン原性細胞の相当の濃縮を有することを示している（図１Ａ）。実際、これらの２つの細胞集団に対する短期クローン原性テスト（６日）の実現は、１２分で非接着性であった細胞集団に由来するケラチノサイトの２．３％が、プラスチック支持体上でクローン生成能を有するが、非接着性細胞集団の細胞の０．２％のみがクローン原性であることを示している（図１Ｂ）。
【００７３】
ＫＳＣの生理学的機能のより代表的な特性である強い増幅能を有するケラチノサイト中のＩ型コラーゲンへの急速な接着の方法により選択された各細胞集団の含有量を、評価した。いくつかの独立試料から得られた結果（ｎ＞５実験）は、最も強い長期増殖能を発現する最も原始的な細胞が、接着性細胞集団に濃縮されていることを示している（図２）。実際、この集団に含有される細胞は、全集団に含有されるものより大きい累積増幅を得ることを可能にする。他方、非接着性細胞集団は、より後期のケラチノサイトによって主に構成されているようであり、より低い増殖能しか発現しない。
【００７４】
II／「接着性」細胞集団の細胞の２０〜４５％を占め、従って全ケラチノサイトの２〜４．５％を占め、ＫＳＣを本質的に含む「接着性ＥＧＦ−Ｒlow」と呼ばれる細胞の画分のスクリーニング
１−ＥＧＦ−Ｒを最も弱く発現している「接着性」細胞集団の細胞の４５％からなる細胞の画分：まず、１２分間でＩ型コラーゲンに接着性であった細胞からなる集団を、表面に検出可能なＥＧＦ−Ｒの発現レベルに基づき、等しいサイズの２画分に分離した。「ＥＧＦ−Ｒlow」と称される画分は、ＥＧＦ−Ｒを最も弱く発現している接着性ケラチノサイトの４５％を含有しており、「ＥＧＦ−Ｒhigh」と称される画分は、この受容体を最も強く発現している接着性ケラチノサイトの４５％を含有している（図３）。これらの実験は、いくつかの独立試料に対して実施された（ｎ＞５）。得られた結果は、最も大きい増幅能を有する最も原始的なケラチノサイトが、ＥＧＦ−Ｒlow画分に有意に濃縮されていることを再現可能に証明している（図４）。これは、ＥＧＦ−Ｒlow画分から開始された培養物における、サイズが小さく、より長期にわたり未分化であるケラチノサイト（原始的なケラチノサイトに関連した基準（９））の産生を明らかにしている、異なる培養時間における細胞の顕微鏡観察と相関している（図５）。
【００７５】
２−ＥＧＦ−Ｒを最も弱く発現している「接着性」細胞集団の細胞の２０％からなる画分：接着性細胞集団を、最終的には、細胞の表面に検出可能なＥＧＦ−Ｒの発現レベルに基づき、等しいサイズの４つの画分に分離した。
【００７６】
この集団の細胞の２０％を各々含んでいる等しい比率の４つの画分は、「ＥＧＦ−Ｒ-/+」画分、「ＥＧＦ−Ｒ++」画分、「ＥＧＦ−Ｒ+++」画分及び「ＥＧＦ−Ｒ++++」画分と定義され（図６）：「ＥＧＦ−Ｒ-/+」及び「ＥＧＦ−Ｒ++」と呼ばれる画分は、ＥＧＦ−Ｒlow画分に含まれ、接着性集団の細胞の２０％を各々含有しており；「ＥＧＦ−Ｒ+++」及び「ＥＧＦ−Ｒ++++」と呼ばれる画分は、ＥＧＦ−Ｒhigh画分に含まれ、接着性集団の細胞の２０％を各々含有している。このようにして選択された細胞の表面におけるＥＧＦ−Ｒの発現レベルと、長期増殖能との間には、反比例が観察された（図７）。実際、最も大きい累積増幅はＥＧＦ−Ｒ-/+画分から得られ、ＥＧＦ−Ｒ++++画分から得られた値は最も低いことが判明している。ＥＧＦ−Ｒ++画分及びＥＧＦ−Ｒ+++画分は、中間的な挙動を示す（ｎ＞３の独立実験が実施された）。
【００７７】
これらの実験結果は、ＫＳＣが有意に濃縮されているケラチノサイトの画分を選択するための表現型マーカーとして、分裂促進性成長因子受容体（ＥＧＦチロシンキナーゼ受容体）を使用することが可能であることを立証している。
【００７８】
III／選択されたケラチノサイト集団の長期増幅能の最適な評価
１−連続継代培養における調節された細胞のトリプシン処理：目的は、能力の過小推定をもたらし得る問題である、長期培養物の連続的な剥離及び継代培養において細胞に対して引き起こされるストレスを制限することである。第一に、生存率を改変しうる過度に強烈なタンパク質分解処理を施すことを回避しつつ、細胞の剥離を可能にする調節されたタンパク質分解処理（０．０５％トリプシン−０．０２％ＥＤＴＡ）を実施する。次いで、穏和なタンパク質分解が無効であることが判明した剥離するのが最も困難な細胞を、最終的に集団の全てを回収することを可能にする、より強力なタンパク質分解処理（０．２５％トリプシン−０．０２％ＥＤＴＡ）に供する。異なる剥離法の細胞の生存率に対する影響の比較研究を実施した。
【００７９】
２−ケラチノサイトの最適な増幅に適した培養フラスコの播種密度：長期培養の開始及び各連続継代培養において、いかなる播種密度がテストされた細胞の増幅能の良好な証明と適合性であるかを評価するため、７日にわたる実験を実施した。これらは、２５００〜７０００細胞／cm2の播種密度が、１５〜２０の率（factor）の細胞増幅を得ることを可能にし、それより低い播種密度及び高い播種密度はより乏しい結果を与えるため、２５００〜７０００細胞／cm2が最も適当であることを決定することを可能にした。
【００８０】
図１Ａ及び１Ｂ：「接着性」細胞及び「非接着性」細胞の細胞集団の比率及びクローン原性。
【００８１】
図１Ａ及び１Ｂは、Ｉ型コラーゲンへの接着の方法による選択の後に得られたクローン原性細胞の濃縮を示す。
【００８２】
皮膚試料から単離された全ケラチノサイトを、１２分間のＩ型コラーゲンへの接着の段階により、「接着性」と呼ばれる細胞集団及び「非接着性」と呼ばれる集団に分離した。全細胞集団に対する各画分の比率を評価し、それらのクローン原性ケラチノサイト含有率も評価した。
【００８３】
図１Ａは、全細胞に対する接着性細胞集団を構成する細胞の割合（斜線付きカラム）及び全細胞に対する非接着性細胞集団を構成する細胞の割合（黒カラム）を示す。
【００８４】
図１Ｂは、それぞれ接着性細胞集団（斜線付きカラム）及び非接着性細胞集団（黒カラム）におけるクローン原性細胞の割合を示す。
【００８５】
得られた結果は、「接着性」と呼ばれる集団は、全ケラチノサイトのわずか１０％を占めるが、「非接着性」と呼ばれる集団のものより１０倍高い割合のクローン原性細胞を含有しているため、「接着性」と呼ばれる細胞集団において、クローン原性細胞が有意に濃縮されていることを示している。
【００８６】
図２：未分画集団に含有されているケラチノサイトの増幅能の、「接着性」及び「非接着性」細胞集団との比較。
【００８７】
皮膚試料から単離された全ケラチノサイトを、１２分間のＩ型コラーゲンへの接着の段階により、「接着性」と呼ばれる細胞集団及び「非接着性」と呼ばれる集団に分離した。２つの集団に含有されていた細胞及び全未分画集団の細胞を、増幅能を比較するため、長期培養テスト（産生された細胞の累積総数）に供した。
【００８８】
ｘ軸は、（日数で表された）時間を表し、ｙ軸は累積増幅（Ｘ日目に産生された細胞の数／１日目の細胞の数）を表す。
【００８９】
黒四角を含む曲線は全集団の細胞、三角を含む曲線は接着性集団の細胞（Ｉ型コラーゲンに対して１２分間）、丸を含む曲線は非接着性集団の細胞（Ｉ型コラーゲンに対して１２分間）から得られた結果に相当する。
【００９０】
得られた結果は、「接着性」と呼ばれる細胞集団が、強い増幅能を有する原始細胞を本質的に含有しており、「非接着性」と呼ばれる細胞集団が、低下した増幅能のみを発現する、より後期のケラチノサイトから主になることを示している。
【００９１】
図３Ａ及び３Ｂ：ＥＧＦ−Ｒの発現レベルに基づく「接着性」細胞のケラチノサイト集団の２つの画分への分離。
【００９２】
Ｉ型コラーゲンへの接着の段階により原始細胞が予備濃縮された「接着性」画分のケラチノサイトを、ＥＧＦ−Ｒに対する蛍光性抗体（ＥＧＦ−Ｒ細胞外ドメインに対する抗体）により標識化した。そのシグナルを、フローサイトメトリーにより半定量的に分析した。
【００９３】
図３Ａは、接着性画分のケラチノサイトから得られたＥＧＦ−Ｒの代表的な標識プロファイル（より暗い面）及び対応するコントロールプロファイル（より明るい面）を示す。ｘ軸は、フローサイトメトリーにより測定され対数尺度で表された蛍光の強度を表す。ｙ軸は、測定された蛍光シグナルの強度の関数として分析された細胞の分布を表す。
【００９４】
図３Ｂは、接着性画分のケラチノサイトの表面におけるＥＧＦ−Ｒの発現レベルのガウス分布を可視化することを可能にする（ｘ及びｙ軸は図３Ａと同一）。得られた結果は、シグナルの分布が、ＥＧＦ−Ｒを弱く発現しているか又はこの受容体を強く発現している細胞のスクリーニングを許容するのに十分な程度に拡がっていることを示している。提示されたプロファイルは、接着性集団の２つの画分（一方は、「ＥＧＦ−Ｒlow」と呼ばれ、より低レベルのＥＧＦ−Ｒを表面に発現している接着性細胞の４５％を含有しており；他方は、「ＥＧＦ−Ｒhigh」と呼ばれ、より強いレベルのＥＧＦ−Ｒを表面に発現している接着性細胞の４５％を含有している）への分離を例示している。
【００９５】
図４：「ＥＧＦ−Ｒlow」及び「ＥＧＦ−Ｒhigh」表現型画分に含有されるケラチノサイトの長期増幅能の比較。
【００９６】
皮膚試料から単離された全ケラチノサイトにおいて、Ｉ型コラーゲンへの接着の方法により原始細胞を予備濃縮し、次いで２つの画分（一方は、「ＥＧＦ−Ｒlow」と呼ばれ、最も低レベルのＥＧＦ−Ｒを表面に発現している接着性細胞４５％を含有しており；他方は、「ＥＧＦ−Ｒhigh」と呼ばれ、最も高レベルのＥＧＦ−Ｒを表面に発現している接着性細胞４５％を含有している）に分離した。これら２つの画分の長期増幅能（産生された細胞の累積総数）を比較した。
【００９７】
ｘ軸は日数で表された培養時間、ｙ軸は既に定義された累積増幅に相当する。
【００９８】
黒四角を含む曲線は、ＥＧＦ−Ｒlow画分の細胞から得られた結果に相当し、菱角を含む曲線は、ＥＧＦ−Ｒhigh画分の細胞から得られた結果に相当する。
【００９９】
得られた結果は、「ＥＧＦ−Ｒlow」と呼ばれる細胞画分が、高い増幅能を有する原始細胞を本質的に含有しており、「ＥＧＦ−Ｒhigh」と呼ばれる細胞画分の細胞が、より低い増幅能を有していることを示している。
【０１００】
図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ及び５Ｄ：「ＥＧＦ−Ｒlow」画分及び「ＥＧＦ−Ｒhigh」画分に由来する培養物。
【０１０１】
図５Ａは、ＥＧＦ−Ｒlow画分に由来する培養物（培養３４日目）に相当する。
【０１０２】
図５Ｂは、ＥＧＦ−Ｒhigh画分に由来する培養物（培養３４日目）に相当する。
【０１０３】
図５Ｃは、ＥＧＦ−Ｒlow画分に由来する培養物（培養７０日目）に相当する。
【０１０４】
図５Ｄは、ＥＧＦ−Ｒhigh画分に由来する培養物（培養７０日目）に相当する。
【０１０５】
皮膚試料から単離された全ケラチノサイトにおいて、Ｉ型コラーゲンへの接着の方法により原始細胞を予備濃縮し、次いで２つの画分（一方は、「ＥＧＦ−Ｒlow」と呼ばれ、最も低レベルのＥＧＦ−Ｒを表面に発現している接着性細胞の４５％を含有しており；他方は、「ＥＧＦ−Ｒhigh」と呼ばれ、最も高レベルのＥＧＦ−Ｒを表面に発現している接着性細胞の４５％を含有している）に分離した。ＫＳＣに関連した基準であるサイズが小さい細胞の産生を、これら２つの画分の各々に由来する培養物において、顕微鏡観察により経時的にモニタリングした。
【０１０６】
得られた結果は、「ＥＧＦ−Ｒlow」と呼ばれる細胞画分が、「ＥＧＦ−Ｒhigh」と呼ばれる細胞画分より、サイズが小さい原始細胞の、より長期的な産生を保証することを示している。
【０１０７】
図６：ＥＧＦ−Ｒの発現レベルに基づく「接着性」ケラチノサイト集団の４つの画分への分離。
【０１０８】
Ｉ型コラーゲンへの接着の段階により原始細胞が予備濃縮された「接着性」と呼ばれる集団のケラチノサイトを、ＥＧＦ−Ｒに対する蛍光性抗体（ＥＧＦ−Ｒ細胞外ドメインに対する抗体）により標識化した。そのシグナルを、フローサイトメトリーにより半定量的に分析した。
【０１０９】
ｘ軸は、フローサイトメトリーにより測定され対数尺度で表された蛍光の強度を表す。ｙ軸は、測定された蛍光シグナルの強度の関数として分析された細胞の分布を表す。
【０１１０】
提示されたフローサイトメトリープロファイルは、接着性集団の４つの画分（「ＥＧＦ−Ｒ-/+」及び「ＥＧＦ−Ｒ++」と呼ばれる画分は、ＥＧＦ−Ｒlow画分に含まれ、接着性集団の細胞の２０％を各々含有しており；「ＥＧＦ−Ｒ+++」及び「ＥＧＦ−Ｒ++++」と呼ばれる画分は、ＥＧＦ−Ｒhigh画分に含まれ、接着性集団の細胞の２０％を各々含有している）への分離を例示している。
【０１１１】
図７：「ＥＧＦ−Ｒ-/+」、「ＥＧＦ−Ｒ++」、「ＥＧＦ−Ｒ+++」及び「ＥＧＦ−Ｒ++++」表現型の画分に含有されているケラチノサイトの長期増幅能の比較。
【０１１２】
皮膚試料から単離された全ケラチノサイトにおいて、Ｉ型コラーゲンへの接着の方法により原始細胞を予備濃縮し、次いで４つの画分（細胞のそれぞれ２０％を含有している２つの両端の画分、最も弱くＥＧＦ−Ｒを発現している「ＥＧＦ−Ｒ-/+」及び最も強くＥＧＦ−Ｒを発現している「ＥＧＦ−Ｒ++++」、並びに中間の「ＥＧＦ−Ｒ++」及び「ＥＧＦ−Ｒ+++」標識を有する２つの画分）に分離した。これら４つの画分の長期増幅能（産生された細胞の累積総数）を比較した。
【０１１３】
黒三角を含む曲線は、ＥＧＦ−Ｒ-/+画分の細胞、菱角を含む曲線は、ＥＧＦ−Ｒ++画分の細胞、丸を含む曲線はＥＧＦ−Ｒ+++画分の細胞、四角を含む曲線はＥＧＦ−Ｒ++++画分の細胞から得られた結果に相当する。
【０１１４】
得られた結果は、「ＥＧＦ−Ｒ-/+」と呼ばれる細胞画分において、高度の長期増幅能を有する原始細胞が最も濃縮されていることを示している。
【０１１５】
図８Ａ、８Ｂ、８Ｃ及び８Ｄ：Ａｄｈ+++ＥＧＦ−Ｒlow原始細胞のインビトロ多層化表皮生成能。
【０１１６】
使用された培養基質は、Regnierら(1981)(10)により記載された方法に従い調製された、表皮を含まない失活ヒト真皮である。異なるＡｄｈ+++ＥＧＦ−Ｒhigh亜集団に由来するケラチノサイト（４又は７回の連続継代培養）又はＡｄｈ+++ＥＧＦ−Ｒlow亜集団に由来するケラチノサイト（４又は７回の連続継代培養）を、この真皮基質に適用し、１０％ウシ胎仔血清（Invitrogen）；１０ng/mlのＥＧＦ（BD Biosciences,USA）；０．４μg/mlのヒドロコルチゾン（Sigma Chemical Co.）；１０-6Mのイソプロテレノール（Sigma Chemical Co.）；５μg/mlのトランスフェリン（Sigma Chemical Co.）；２×１０-9Mのトリヨードチロニン（Sigma Chemical Co.）；１．８×１０-4Mのアデニン（Sigma Chemical Co.）及び５μg/mlのインスリン（Sigma Chemical Co.）を含有するＤＭＥＭ／Ｈａｍ  Ｆ１２培地（Invitrogen）の中で６日間培養した。次いで、培養物を気液界面に置き、イソプロテレノール、トランスフェリン、トリヨードチロニン及びアデニンの非存在下で続行した。再構築された表皮の組織学的分析を７日後に実施した（注  Ａｄｈ+++とは、予備濃縮後の接着性集団に由来するケラチノサイトを示す）。
【０１１７】
図８Ａは、４代目のＡｄｈ+++ＥＧＦ−Ｒlowケラチノサイトから生成した表皮に相当する顕微鏡断面を示す。得られた表皮は、正確に形成され分化している。示した尺度は、最大サイズ１００μmで、１０μm毎に目盛りが付けられている。
【０１１８】
図８Ｂは、４代目のＡｄｈ+++ＥＧＦ−Ｒhighケラチノサイトから生成した表皮に相当する顕微鏡断面を示す。得られた表皮は、正確に形成され分化している。示した尺度は、最大サイズ１００μmで、１０μm毎に目盛りが付けられている。
【０１１９】
図８Ｃは、７代目のＡｄｈ+++ＥＧＦ−Ｒlowケラチノサイトから生成した表皮に相当する顕微鏡断面を示す。得られた表皮は、正確に形成され分化している。示した尺度は、最大サイズ１００μmで、１０μm毎に目盛りが付けられている。
【０１２０】
図８Ｄは、７代目のＡｄｈ+++ＥＧＦ−Ｒhighケラチノサイトから生成した表皮に相当する顕微鏡断面を示す。得られた表皮は、変性している。示した尺度は、最大サイズ１００μmで、１０μm毎に目盛りが付けられている。
【０１２１】
結果は、Ａｄｈ+++ＥＧＦ−Ｒlow亜集団の器官形成能が、Ａｄｈ+++ＥＧＦ−Ｒhigh亜集団のケラチノサイトのものよりも持続性であることを示す。
【０１２２】
図９Ａ、９Ｂ及び９Ｃ：予備濃縮後に得られた未分画ケラチノサイト集団並びに接着性画分及び非接着性画分のフローサイトメトリーによる表現型決定。
【０１２３】
細胞５０，０００個が０．２％でＰＢＳ／ＢＳＡに懸濁している試料に対して免疫表現型標識を実施する。非特異的な抗体の結合を制限するため、まず、標識化に使用される抗体と同一の種に由来する「ガンマグロブリン」（ラットγグロブリン又はマウスγグロブリン、Jackson Immuno Research Laboratories Inc., Immunotech, Marseille, France）の存在下で、４℃で１０分間、細胞をインキュベートする。次いで、ラットにおいて作製された抗ＣＤ４９ｆ−ＦＩＴＣ抗体（α６鎖インテグリン）（標識）（抗ヒトＣＤ４９ｆ−ＦＩＴＣラットＩｇＧ2a；ＧｏＨ３クローン、Pharmingen, San Diego, CA, USA）又は同アイソタイプのコントロール非特異的抗体（アイソタイプ抗体）（ラットＩｇＧ2a−ＦＩＴＣアイソタイプ抗体、Dako, Glostrup, Denmark）；マウスにおいて作製された抗ＣＤ４９ｂ−ＰＥ抗体（α２鎖インテグリン）（標識）（抗ヒトＣＤ４９ｂ−ＰＥマウスＩｇＧ2a；１２Ｆ１−Ｈ６クローン、Pharmingen, San Diego, CA, USA）又は同アイソタイプのコントロール非特異的抗体（アイソタイプ抗体）（マウスＩｇＧ2a−ＰＥアイソタイプ抗体；Ｇ１５５−１７８クローン、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）；マウスにおいて作製された抗ＣＤ２９−ＰＥ抗体（β１鎖インテグリン）（標識）（抗ヒトＣＤ２９−ＦＩＴＣマウスＩｇＧ1；４Ｂ４クローン、Coulter Corp., Miami, FL, USA）又は同アイソタイプのコントロール非特異的抗体（アイソタイプ抗体）（マウスＩｇＧ1−ＦＩＴＣアイソタイプ抗体；Becton Dickinson, San Jose, CA, USA）の存在下で、４℃で３０分間、細胞をインキュベートする。次いで、細胞をＰＢＳ／ＢＳＡで洗浄した後、フローサイトメトリーにより分析する。各試料について、統計値は、考慮された少なくとも１０，０００個のイベントに基づく。
【０１２４】
図９は、未分画集団（コラーゲンでの継代前、白カラム）、接着性集団（Ｉ型コラーゲンに対して１２分、黒カラム）及び非接着性集団（Ｉ型コラーゲンに対して１２分、灰色カラム）の、α６、α２及びβ１インテグリンの免疫学的標識化が陽性の細胞の割合（ｙ軸）を表している。これらの結果は、３回の独立実験で得られた平均値及び標準偏差である。
【０１２５】
図９Ａは、未分画集団（白カラム）、接着性集団（Ｉ型コラーゲンに対して１２分、黒カラム）及び非接着性集団（Ｉ型コラーゲンに対して１２分、灰色カラム）の、α６インテグリンの免疫学的標識化が陽性の細胞の割合（ｙ軸）を示している。
【０１２６】
図９Ｂは、未分画集団（白カラム）、接着性集団（Ｉ型コラーゲンに対して１２分、黒カラム）及び非接着性集団（Ｉ型コラーゲンに対して１２分、灰色カラム）の、α２インテグリンの免疫学的標識化が陽性の細胞の割合（ｙ軸）を示している。
【０１２７】
図９Ｃは、未分画集団（白カラム）、接着性集団（Ｉ型コラーゲンに対して１２分、黒カラム）及び非接着性集団（Ｉ型コラーゲンに対して１２分、灰色カラム）の、β１インテグリンの免疫学的標識化が陽性の細胞の割合（ｙ軸）を示している。
【０１２８】
結果は、接着性細胞集団の細胞の約７０％がαインテグリンを発現しているが、未分画集団の細胞の約４０％がこのインテグリンを発現しており、非接着性集団の細胞の約３０％のみがそれを発現していることを示している。
【０１２９】
実施例
Ｉ／皮膚試料（包皮）からのケラチノサイトの単離
メスを使用して皮下組織を排除した後、皮膚試料を約５mm×５mmの断片へと切り分け、次いで抗生物質処理（ゲンタマイシン（Life Technologies Ltd., Paisley, Scotlanｄ）、３回の連続的な１０分間のＤＭＥＭ培養培地（Life Technologies Ltd., Paisley, Scotland）浴）により除染した。次いで、表皮からの真皮の分離を許容するため、試料をタンパク質分解処理（ジスパーゼ（Boehringer, Roch Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）４℃で一夜、次いで３７℃で３０分）に供した。真皮組織から分離された表皮の断片を、０．０５％トリプシン−０．０２％ＥＤＴＡ溶液（Biological Industories, Kibbutz Beit Haemek, Israel）（３７℃で１５分間）の中に置いた。その調製物を、細胞の解離を促進するため定期的に攪拌した。次いで、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, France）を含有する培養培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ）の添加により、トリプシンの効果を中和した。細胞懸濁液を均質にし、次いでケラチノサイト培養培地（ケラチノサイト成長培地、ＫＧＭ）（KGM Bullet Kit, BioWhittaker, Clontics Corp., San Diego, CA, USA）で洗浄した。細胞懸濁液をマラッセ（Malassez）セルを使用して顕微鏡により計数した。試料の生存率を、トリパンブルー（Life Technology, Cergy Pontoise Cedex, France）排除法により推定した。
【０１３０】
II／ケラチノサイトの調製物における表皮の基底層に由来する原始細胞の濃縮
表皮の基底層は、「幹細胞」と呼ばれる最も原始的なケラチノサイトを含有している。これらの細胞は、迅速な接着という特性に基づき、より成熟したケラチノサイトから分離され得る。この段階は、調製物における原始細胞の予備濃縮を可能にする。
【０１３１】
細胞懸濁物を、２００，０００細胞／cm2の密度で、Ｉ型コラーゲンで「覆われた」培養フラスコ（ＰＢＳで２倍希釈されたコラーゲンＩ（Sigma Chemical Co Ltd., Irvine, UK）の溶液を４５分にわたりフラスコに適用、続いて過剰分を排除した後、乾燥）に置いた。１２分後、接着していないケラチノサイトをＰＢＳバッファーで洗浄することにより排除した。このようにして選択された接着性細胞を、穏和なトリプシン処理（０．０５％トリプシン−０．０２％ＥＤＴＡ溶液（Biological Industories, Kibbutz Beit Haemek, Israel）３７℃で３〜５分間）により支持体から剥離した。トリプシンの中和（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ）の後、細胞を回収し、洗浄し、次いでＫＧＭ培地に再懸濁させた。この方法により選択された接着性細胞の画分は、表皮の全ケラチノサイトの約１０％を占める。
【０１３２】
III／短期クローン原性テスト
顕微鏡で容易に観察可能な、よく個別化されたクローンを得るため、低密度（１６００、３２００、及び／又は４８００細胞／cm2）でＫＧＭ培地中でケラチノサイトを培養した。実験を終了するまで（６〜１２日）、週に３回、培養培地を更新した。次いで、クローンを固定し、染色し、次いで計数し、含まれる細胞の数によって分類した。
【０１３３】
染色のため、まず、室温で３０分間、ＰＢＳバッファー（BioWhittaker Inc., Walkersville, MA, USA）で１０％に希釈されたホルマリン（ホルムアルデヒド３５％溶液）（Merck, Darmstadt, Germany）で調製物を固定し、次いで水で２回洗浄した。次いで、細胞を濾過されたヘマトキシリン（核の染色）（Sigma diagnostics, St Louis, MO, USA）と共に２分間インキュベートした。水ですすいだ後、調製物を空気乾燥させ、次いで１％エオシン（Sigma diagnostics, St Louis, MO, USA）を含むＰＢＳバッファーの中で５分間インキュベートした。それらを再び水で洗浄し、次いで乾燥させた。
【０１３４】
ＩＶ／未分画ケラチノサイト集団、予備濃縮後に得られた接着性画分及び非接着性画分のフローサイトメトリーによる表現型決定
細胞５０，０００個が０．２％でＰＢＳ／ＢＳＡに懸濁している試料に対して、免疫表現型標識化を実施した。非特異的な抗体の結合を制限するため、まず、標識化に使用される抗体と同一の種に由来する「ガンマグロブリン」（ラットγグロブリン又はマウスγグロブリン、Jackson Immuno Research Laboratories Inc., Immunotech, Marseille, France）の存在下で、４℃で１０分間、細胞をインキュベートした。次いで、ラットにおいて作製された抗ＣＤ４９ｆ−ＦＩＴＣ抗体（α６鎖インテグリン）（標識）（抗ヒトＣＤ４９ｆ−ＦＩＴＣラットＩｇＧ2a；ＧｏＨ３クローン、Pharmingen, San Diego, CA, USA）又は同アイソタイプのコントロール非特異的抗体（アイソタイプ抗体）（ラットＩｇＧ2a−ＦＩＴＣアイソタイプ抗体、Dako, Glostrup, Denmark）；マウスにおいて作製された抗ＣＤ４９ｂ−ＰＥ抗体（α２鎖インテグリン）（標識）（抗ヒトＣＤ４９ｂ−ＰＥマウスＩｇＧ2a；１２Ｆ１−Ｈ６クローン、Pharmingen, San Diego, CA, USA）又は同アイソタイプのコントロール非特異的抗体（アイソタイプ抗体）（マウスＩｇＧ2a−ＰＥアイソタイプ抗体；Ｇ１５５−１７８クローン、Pharmingen, San Diego, CA, USA）；マウスにおいて作製された抗ＣＤ２９−ＰＥ抗体（β１鎖インテグリン）（標識）（抗ヒトＣＤ２９−ＦＩＴＣマウスＩｇＧ1；４Ｂ４クローン、Coulter Corp., Miami, FL, USA）又は同アイソタイプのコントロール非特異的抗体（アイソタイプ抗体）（マウスＩｇＧ1−ＦＩＴＣアイソタイプ抗体；Becton Dickinson, San Jose, CA, USA）の存在下で、４℃で３０分間、細胞をインキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳ／ＢＳＡで洗浄した後、フローサイトメトリーにより分析した。各試料について、統計値は、考慮された少なくとも１０，０００個のイベントに基づく。
【０１３５】
図９に提示された結果は、未分画集団（約４０％の陽性細胞）及び非接着性集団（約３０％の陽性細胞）と比べて、Ｉ型コラーゲン接着性細胞集団が、高頻度に、α６インテグリンを発現していることを示している（約７０％の陽性細胞）。従って、接着性細胞集団は、未分画集団と比べて、α６型インテグリンの有意な濃縮を有している。対照的に、α２及びβ１インテグリンは、３つの集団（未分画、接着性、非接着性）の細胞の大半がこれらのインテグリンを発現しているため、濃縮の評価に適したマーカーではない。
【０１３６】
Ｖ／フローサイトメトリーによる分析及びスクリーニングのためのＥＧＦ受容体（ＥＧＦ−Ｒ）の標識化
細胞懸濁物を遠心分離し、０．２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Sigma Chemical Co., St Louis,MO,USA）を含有するＰＢＳバッファー（ＰＢＳ／０．２％ＢＳＡ）に採取した。非特異的な抗体の結合を制限するため、まず、「ラットガンマグロブリン」（ラットγグロブリン、Jackson Immuno Research Laboratories Inc., Immunotech, Marseille, France）の存在下で、４℃で１０分間、細胞をインキュベートした。次いで、マウスにおいて作製された非結合体化抗ＥＧＦ−Ｒ抗体（細胞外ドメイン）（標識）（抗ヒトＥＧＦ−ＲマウスＩｇＧ2b；ＥＧＦＲ１クローン、Dako, Glostrup, Denmark）又は抗ＥＧＦ−Ｒ抗体と同じアイソタイプのコントロール非特異的抗体（アイソタイプ抗体）（マウスＩｇＧ2bアイソタイプコントロール、Immunotech, Marseille, France）の存在下で、４℃で３０分間、細胞をインキュベートした。ＰＢＳ／０．２％ＢＳＡでの２回の連続的な洗浄の後、マウス抗体を認識することができる、ラットにおいて作製され、フィコエリトリン（ＰＥ）とカップリングさせられた二次抗体（ラット抗マウスＩｇＧ2a+b−ＰＥ、Becton Dickinson, San Jose, CA, USA）の存在下で、細胞をインキュベートした（４℃で３０分間）。細胞を再び２回洗浄した後、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳバンテージ（Vantage）、Becton Dickinson, San Jose, CA, USA）によるスクリーニングに使用した。
【０１３７】
接着性ケラチノサイト集団を異なるＥＧＦ−Ｒ発現レベルを有する画分に分離し、それらが含有している細胞を、機能的な観点から特徴決定するためスクリーニングした。
【０１３８】
VI／フローサイトメトリーによりスクリーニングされたケラチノサイトの画分の長期増幅能の評価
フローサイトメトリーによりスクリーニングされた各亜集団の細胞を、長期増幅能（「幹細胞」と呼ばれる最も原始的な細胞に関連した特性）を評価することを可能にする機能テストに供した。
【０１３９】
トリパンブルー排除法による生存率の推定の後、各亜集団の細胞６０，０００個を、２５cm2の表面積を有する「覆われていない」培養フラスコに播種した。培養培地（ＫＧＭ）を週に３回交換した。細胞を支持体から剥離し、計数し、接触阻害現象の後に細胞が分化へと方向付けられるのを回避するため、培養物が７０〜８０％コンフルエンスに達した時点で、２５cm2フラスコ１個当たり生存細胞６０，０００個の比率で再播種した。細胞の剥離は、２回の連続的な段階で実施した。第一は、細胞の約８０％を剥離することを可能にする穏和なトリプシン処理（０．０５％トリプシン−０．０２％ＥＤＴＡ溶液（Biological Industories, Kibbutz Beit Haemek, Israel）３７℃で３〜５分間））であった。次いで、穏和なタンパク質分解が無効であることが判明した、剥離するのがより困難な細胞を、細胞集団の全てを回収することを可能にする、より強いトリプシン処理（０．２５％トリプシン−０．０２％ＥＤＴＡ溶液（Biological Industories, Kibbutz Beit Haemek, Israel）に供した。
【０１４０】
各継代時、得られた累積増幅を各培養物について計算した（Ｘ日目に産生された細胞の数／１日目に播種された細胞の数）。細胞増殖能が消耗するまで、実験を継続した。結果は、テストされた細胞亜集団の各々の全増殖能を可視化することを可能にする累積増幅曲線の形態で示した。
【０１４１】
VII／選択された表皮幹細胞の、インビトロで再構築された表皮を生成させる能力
評価されたＡｄｈ+++ＥＧＦ−Ｒlowケラチノサイトのもう一つの特徴は、器官形成能、即ちインビトロで多重層化表皮を生成させる能力である（注  Ａｄｈ+++とは、予備濃縮後の接着性集団に起因するケラチノサイトを意味する）。Ａｄｈ+++ＥＧＦ−Ｒhigh亜集団及びＡｄｈ+++ＥＧＦ−Ｒlow亜集団のケラチノサイトを７回連続的に継代培養した。各継代時に、真皮基質上に播種するため、増幅された細胞の一部を採取した。初期継代（４代）中は、Ａｄｈ+++ＥＧＦ−Ｒhigh細胞及びＡｄｈ+++ＥＧＦ−Ｒlow細胞から開始された培養物に起因するケラチノサイトは、良質な表皮を生成させる良好な能力を示した（図８Ａ、図８Ｂ）。いずれの場合にも、その組織学は、正確に形成され分化した表皮の特徴：Ｉ）真皮基質に対して垂直に方向付けられた多角形細胞を含有している基底層、II）３〜４層の有棘細胞、III）４〜６層の顆粒細胞及びＩＶ）無核角質細胞を含む緻密な角質層、であった。継代数が高くなるにつれ（７代）、Ａｄｈ+++ＥＧＦ−Ｒlow亜集団に起因するケラチノサイトのみが、表皮生成能を維持しており（図８Ｃ）、Ａｄｈ+++ＥＧＦ−Ｒhigh亜集団に起因する培養物は変性表皮しか産生しない（図８Ｄ）ことが観察された。これらの結果は、Ａｄｈ+++ＥＧＦ−Ｒhigh亜集団のケラチノサイトよりも持続性であるＡｄｈ+++ＥＧＦ−Ｒlow亜集団の器官形成能を証明している。
【０１４２】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１】「接着性」細胞及び「非接着性」細胞の細胞集団の比率及びクローン原性。
【図２】未分画集団に含有されているケラチノサイトの増幅能の、「接着性」及び「非接着性」細胞集団との比較。
【図３】ＥＧＦ−Ｒの発現レベルに基づく「接着性」細胞のケラチノサイト集団の２つの画分への分離。
【図４】「ＥＧＦ−Ｒlow」及び「ＥＧＦ−Ｒhigh」表現型画分に含有されているケラチノサイトの長期増幅能の比較。
【図５】「ＥＧＦ−Ｒlow」画分及び「ＥＧＦ−Ｒhigh」画分に起因する培養物。
【図６】ＥＧＦ−Ｒの発現レベルに基づく「接着性」ケラチノサイト集団の４つの画分への分離。
【図７】「ＥＧＦ−Ｒ-/+」、「ＥＧＦ−Ｒ++」、「ＥＧＦ−Ｒ+++」及び「ＥＧＦ−Ｒ++++」表現型の画分に含有されているケラチノサイトの長期増幅能の比較。
【図８】Ａｄｈ+++ＥＧＦ−Ｒlow原始細胞のインビトロで多重層化表皮を生成させる能力。
【図９】予備濃縮後に得られた未分画ケラチノサイト集団並びに接着性画分及び非接着性画分のフローサイトメトリーによる表現型決定。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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