(57)【要約】甲状腺癌治療の新規のアプローチを本明細書に開示する。これらのアプローチには、甲状腺特異的遺伝子発現を増強する方法、例えば、甲状腺癌細胞におけるサイログロブリンおよび／またはＮａ＋／Ｉ−共搬体の発現を増強する方法が含まれる。甲状腺特異的遺伝子の発現の増強によって、細胞の分化が促進され、浸潤および転移のような生物学的に攻撃的な挙動が減少する。さらに、サイログロブリンおよび／またはＮａ＋／Ｉ−共搬体の発現の増加によって、甲状腺癌細胞のヨウ素またはヨウ化物濃縮能が増加して、それによって細胞は放射活性ヨウ素治療に対してより感受性となる。本明細書において、ヒストン脱アセチル酵素阻害剤の治療的有効量を投与すること、ヒストン脱アセチル酵素阻害剤の投与によって甲状腺細胞におけるその取り込みまたは濃縮が増加する検出可能な物質を投与すること、および検出可能な物質を検出することによって、被験者における甲状腺新生物を検出する方法も同様に開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒストン脱アセチル酵素を阻害する物質の有効量を甲状腺細胞に導入して、それによって甲状腺特異的遺伝子の発現を増強することを含む、甲状腺細胞における甲状腺特異的遺伝子の発現を増強する方法。
【請求項２】
甲状腺特異的遺伝子がＮａ＋／Ｉ−共搬体である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
甲状腺特異的遺伝子がサイログロブリンである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
甲状腺特異的遺伝子の発現の増強によって、甲状腺細胞のヨウ化物またはヨウ素の取り込み能および／または濃縮能が増加する、請求項１記載の方法。
【請求項５】
物質が、ＦＲ９０１２２８（デプシペプチド）、トリコスタチンＡ、トラポキシンＡ、トラポキシンＢ、ＨＣ−トキシン、クラミドシン、Ｃｌｙ−２、ＷＦ−３１６１、Ｔａｎ−１７４６、アピシジン、アピシジン類似体、ベンズアミド、ベンズアミド誘導体、ヒドロキサム酸誘導体、アゼライン酸ビスヒドロキサム酸、酪酸およびその塩、酢酸塩、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、スベリン酸ビスヒドロキサム酸、ｍ−カルボキシ−桂皮酸ビスヒドロキサム酸、オキサムフラチン、デプデシン、またはＭＳ−２７−２７５を含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
物質がＦＲ９０１２２８（デプシペプチド）を含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
物質が、ヒストン脱アセチル酵素の発現または機能を阻害するオリゴヌクレオチドを含む、請求項１記載の方法。
【請求項８】
物質が、ヒストン脱アセチル酵素のドミナントネガティブ断片または変種を含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
甲状腺特異的遺伝子の発現の増強によって、細胞によるヨウ素またはヨウ化物の取り込みが増加する、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
甲状腺細胞が甲状腺癌細胞である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
甲状腺細胞がインビトロである、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
ヒストン脱アセチル酵素を阻害する物質の治療的有効量を被験者に投与して、それによって被験者における甲状腺癌を治療することを含む、被験者における甲状腺癌を治療する方法。
【請求項１３】
ヒストン脱アセチル酵素を阻害する物質の投与によって、甲状腺癌における新生物細胞における放射活性ヨウ素の取り込みおよび／または濃度が増加する、被験者に放射活性ヨウ素の治療的有効量を投与することをさらに含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
放射活性ヨウ素が１３１Ｉである、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
放射活性ヨウ素の約５ ｍＣｉ〜約５００ ｍＣｉが被験者に投与される、請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
放射活性ヨウ素の約３０ ｍＣｉ〜約３００ ｍＣｉが被験者に投与される、請求項１２記載の方法。
【請求項１７】
甲状腺癌が、乳頭甲状腺癌もしくはその組織学変種、濾胞性甲状腺癌もしくはその組織学変種、島甲状腺癌もしくはその組織学変種、または未分化甲状腺癌もしくはその組織学変種である、請求項１２記載の方法。
【請求項１８】
被験者が甲状腺切除術を受けた、または受ける予定である、請求項１２記載の方法。
【請求項１９】
甲状腺癌が、甲状腺切除術後に残っている残留甲状腺癌である、請求項１２記載の方法。
【請求項２０】
甲状腺癌が転移性甲状腺癌である、請求項１２記載の方法。
【請求項２１】
放射活性ヨウ素が複数の用量で被験者に投与される、請求項１２記載の方法。
【請求項２２】
化学療法剤の治療的有効量を被験者に投与することをさらに含む、請求項１１記載の方法。
【請求項２３】
以下を含む、被験者における甲状腺新生物細胞を検出する方法：
ヒストン脱アセチル酵素を阻害する物質の有効量を被験者に投与する段階；
甲状腺新生物細胞における検出可能な物質の取り込みまたは濃度が、ヒストン脱アセチル酵素を阻害する物質によって増加する、甲状腺新生物細胞によって取り込まれる検出可能な物質を被験者に投与する段階；および
甲状腺新生物細胞における検出可能な物質を検出する段階。
【請求項２４】
新生物細胞が甲状腺癌における細胞である、請求項２１記載の方法。
【請求項２５】
甲状腺癌が、乳頭甲状腺癌、濾胞甲状腺癌、島甲状腺癌、または未分化甲状腺癌である、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
検出可能な物質が、Ｎａ＋／Ｉ−共搬体を通して甲状腺細胞に輸送される物質を含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
検出可能な物質が放射活性ヨウ素分子である、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
検出可能な物質が１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、放射標識過塩素酸、または放射標識ペルテクニテートである、請求項２３記載の方法。
【請求項２７】
新生物細胞が、甲状腺癌のために治療を受けた被験者における残留新生物細胞である、請求項２３記載の方法。
【請求項２８】
甲状腺癌の治療が、甲状腺切除術、１３１Ｉ治療、外部放射線照射、または抗癌化学療法剤の投与である、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
ヒストン脱アセチル酵素阻害剤を阻害する物質の治療的有効量を投与して、それによってヨウ素またはヨウ化物の取り込みを増加させることを含む、被験者の甲状腺におけるヨウ素の取り込みを増加させる方法。
【請求項３０】
ヨウ素が放射活性である、請求項２５記載の方法。
【請求項３１】
ヨウ素が放射活性ヨウ素であって、１３１Ｉである、請求項２６記載の方法。
【請求項３２】
甲状腺癌を治療するためのヒストン脱アセチル酵素を阻害する物質の使用。
【請求項３３】
甲状腺におけるヨウ素またはヨウ化物の取り込みを増加するためのヒストン脱アセチル酵素を阻害する物質の使用。
【請求項３４】
物質が、ＦＲ９０１２２８、トリコスタチンＡ、トラポキシンＡ、トラポキシンＢ、ＨＣ−トキシン、クラミドシン、Ｃｌｙ−２、ＷＦ−３１６１、Ｔａｎ−１７４６、アピシジン、アピシジン類似体、ベンズアミド、ベンズアミド誘導体、ヒドロキサム酸誘導体、アゼライン酸ビスヒドロキサム酸、酪酸およびその塩、酢酸塩、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、スベリン酸ビスヒドロキサム酸、ｍ−カルボキシ−桂皮酸ビスヒドロキサム酸、オキサムフラチン、デプデシン、またはＭＳ−２７−２７５を含む、請求項３２または３３記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
分野
本開示は、甲状腺新生物の診断および治療の分野、特に、甲状腺新生物の診断および治療にヒストン脱アセチル酵素阻害剤を用いることに関する。
【０００２】
背景
甲状腺は、哺乳類被験者の頚部に存在し、小さい中心峡部によって繋がっている二つの側葉に分けられる。葉は、線維様の中隔によって濾胞と呼ばれる球状構造からなる偽葉に分けられ、濾胞は内腔を取り巻く単層の上皮細胞（濾胞細胞）からなる（図１参照）。濾胞内腔は、甲状腺ホルモンの前駆体蛋白質分子であるサイログロブリン７５％以上からなるコロイド状の材料で満たされている。Ｌａｒｓｅｎら、Ｔｈｅ Ｔｈｙｒｏｉｄ Ｇｌａｎｄ、第１１章、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、Ｊ． Ｗｉｌｓｏｎ編、１９９８を参照されたい。
【０００３】
甲状腺濾胞細胞は、二つの活性な甲状腺ホルモン、すなわちトリヨードチロニン（Ｔ３）とチロキシン（Ｔ４）とを産生する。構造的に、甲状腺ホルモンは、ヨウ素原子３または４個を含むように改変されたチロシン残基にカップリングしている。それらは、甲状腺濾胞細胞において多段階のプロセスによって形成される。濾胞細胞は、サイログロブリン（ＴＧ）ポリペプチドを発現して、ヨウ化物陰イオンを取り込んで濃縮し、ＴＧポリペプチド鎖内のチロシル残基をヨウ素化する。ＴＧにおけるチロシルのヨウ素化によって、モノヨードチロシン（ＭＩＴ；ヨウ素原子１個）、およびジヨードチロシン（ＤＩＴ；ヨウ素原子２個）が得られる。次に、ＭＩＴおよびＤＩＴ残基は、カップリング反応と呼ばれるプロセスにおいてカップリングされる。Ｔ３およびＴ４は、ＴＧから蛋白質分解によって切断された後に血中に放出される。
【０００４】
甲状腺ホルモン生合成は、甲状腺が活動的にヨウ素を取り込んで濃縮することが必要である。この作業を行うために、甲状腺濾胞細胞は、甲状腺濾胞細胞にナトリウムおよびヨウ素を同時輸送する膜蛋白質であるヨウ化ナトリウム共搬体（Ｎａ＋／Ｉ−共搬体またはＮＩＳ）を発現する。ＮＩＳは、濾胞細胞において血漿中に認められるレベルより約１００倍以上ヨウ素を濃縮する。ＴＧは、細胞における構築されたヨウ素の貯蔵所または液だめとして作用することによって、濃縮プロセスを補助する。
【０００５】
視床下部−下垂体−甲状腺フィードバックループは、甲状腺ホルモンの産生と分泌を調節する。視床下部は甲状腺放出ホルモン（ＴＲＨ）を産生して、下垂体甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）の合成および放出を刺激する。ＴＳＨは、甲状腺ホルモンの産生および血中への放出を刺激する。逆に、甲状腺ホルモンは、ＴＲＨおよびＴＳＨの放出を減少させることによってネガティブフィードバック制御を提供する。
【０００６】
ＴＳＨは、濾胞細胞の増殖を刺激し、濾胞細胞における遺伝子発現を調節する。ＴＳＨは、サイログロブリン、ＮＩＳ、および甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）を含む甲状腺特異的遺伝子の発現をアップレギュレートする。Ｄａｉら、Ｎａｔｕｒｅ ３７９：４５８〜４６１、１９９６；Ｓｕｚｕｋｉら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ Ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ ９５：８２５１〜８２５６、１９９８；Ｕｌｉａｎｉｃｈら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：２５０９９〜２５１０７、１９９９；Ｄｅ Ｌａ Ｖｉｅｊａら、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ８０：１０８３〜１１０５、２０００。ＴＳＨによる甲状腺特異的遺伝子発現の増強は、ＴＳＨが甲状腺ホルモンの産生の増加を刺激する一方向である。
【０００７】
甲状腺癌に対する現在の治療アプローチ
甲状腺癌は、最も一般的な内分泌悪性疾患であり、内分泌癌による多数の死亡例の原因である。米国だけでも、毎年甲状腺癌の新規症例約１７，２００例が診断され、この疾患が原因の死亡例は約１５００例である。
【０００８】
現在、通常の甲状腺癌療法には、原発腫瘍を除去するための外科的切除が含まれる（甲状腺切除術）。この後に一般的に、放射活性ヨウ素（１３１Ｉ）治療を行い、これは甲状腺細胞のヨウ素濃縮能を利用している。これらの手段の後に、ＴＳＨの下垂体産生を減少させることによって、残っている如何なる甲状腺も抑制するために、経口甲状腺ホルモン補充による持続的治療を行う。通常の治療に、外部放射線照射および化学療法のような他の手段を補助として加えてもよい。ＳｃｈｌｕｍｂｅｒｇｅｒらのＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３３８：２９７〜３００６、１９９８；Ｍａｃｄｏｎａｌｄら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ 第５６章、Ｍ． Ａｂｅｌｏｆｆら編、第二版、２０００年を参照されたい。
【０００９】
甲状腺癌の予後における組織学サブタイプの役割
甲状腺癌の予後は、組織学サブタイプ、分化の程度、浸潤性、遠隔転移の存在、および他の要因に関連する。一般的により十分に分化した甲状腺癌は、より遅い増殖、より少ない組織浸潤、より少ない遠隔転移、およびよりよい予後に関連する。分化度の低い腫瘍は浸潤性で、攻撃的に転移性であり、予後不良に関連する。
【００１０】
一般的に、比較的よく分化した二つのタイプの甲状腺癌が存在すると考えられている。乳頭甲状腺癌（ＰＴＣ）は、乳頭および濾胞構造を示し、明確な核特徴を有する非被包化腫瘍である（丸いガラス状の外観と縦方向の溝を有する重なり合う細胞核）。濾胞甲状腺癌（ＦＴＣ）は、濾胞が分化しているがＰＴＣの核特徴を欠損する被包化腫瘍である。それぞれについて多様な組織学的サブタイプが記述されており、ＳｃｈｌｕｍｂｅｒｇｅｒらのＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３３８：２９７〜３０６、１９９８において考察されている。
【００１１】
分化度の低い、または未分化の甲状腺癌についても同様に二つの組織学的タイプが記述されている。島状の癌は、一般的に分化度の低いＦＴＣの形であると考えられている。これは、丸い核と乏しい細胞質とを有する小さい細胞の楕円形の巣状構造（島）を特徴とする。増殖は浸潤性であり、血管浸潤が一般的である。疾患は攻撃的でしばしば致死的である。未分化甲状腺癌（ＡＴＣ）は、甲状腺癌の５〜１０％を占め、未分化の異型紡錘状の多核巨細胞で構成される。これは非常に悪性であり、隣接する構造に急速に浸潤して全身に転移する。
【００１２】
治療に対する耐性の問題
疾患の組織学サブタイプと程度に応じて、甲状腺癌はしばしば、甲状腺切除術と１３１Ｉ治療とによって治癒可能である。しかし、甲状腺癌の多くの組織学サブタイプは、本質的に１３１Ｉ治療に対して耐性である。これは、未分化および島甲状腺癌には特に当てはまるが、ＰＴＣおよびＦＴＣにおいても認められる。さらに、１３１Ｉに対する耐性はまた、最初から比較的よく分化しており、放射活性ヨウ素に対して比較的感受性がある甲状腺癌においても発生する可能性がある。
【００１３】
通常の手段はしばしば有効であるが、甲状腺癌被験者の１５％までもが最終的に疾患のために死亡する。このように、甲状腺癌に対する新規治療アプローチが必要である。
【００１４】
開示の概要
ヒストン脱アセチル酵素阻害剤の有効量を投与することによって、甲状腺におけるヨウ化物、ヨウ素、またはヨウ素化合物の取り込みを増強する方法を開示する。いくつかの例において、ヨウ素またはヨウ化物は、甲状腺腫瘍を治療するために投与されうる放射活性化合物である。甲状腺腫瘍の治療に対する新規アプローチを本明細書において開示する。特に、甲状腺新生物を治療するためにヒストン脱アセチル酵素阻害剤を用いることを開示する。もう一つの例において、ヒストン脱アセチル酵素阻害剤は、放射線曝露後の放射線予防のためにヨウ化物の取り込みを増強するために用いられる。一つの態様において、甲状腺特異的遺伝子発現を増強する方法が提供される。
【００１５】
被験者における甲状腺新生物を検出する方法を開示する。方法には、ヒストン脱アセチル酵素阻害剤の有効量を投与すること、および甲状腺細胞におけるその取り込みまたは濃縮がヒストン脱アセチル酵素阻害剤の投与によって増加する検出可能な物質を投与することが含まれる。次に、甲状腺における検出可能な物質の存在を検出する。
【００１６】
詳細な説明
本明細書に開示のように、ヒストン脱アセチル酵素阻害剤は、甲状腺癌細胞における遺伝子発現に影響を及ぼす。ヒストン脱アセチル酵素阻害剤の作用は、甲状腺癌の診断および治療に対する新規アプローチとして利用することができる。
【００１７】
使用した省略語
ＤＩＴ  ジヨードチロシン
ＭＩＴ  モノヨードチロシン
ＮＩＳ  Ｎａ＋／Ｉ−共搬体
Ｔ３  トリヨードチロニン、甲状腺ホルモン
Ｔ４  チロキシン、甲状腺ホルモン
ＴＧ  サイログロブリン
ＴＰＯ  甲状腺ペルオキシダーゼ
【００１８】
使用する用語の説明
アンチセンス、センス、およびアンチジーン：
二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）は二つの鎖、すなわちプラス鎖と呼ばれる５’−＞３’鎖と、マイナス鎖と呼ばれる３’−＞５’鎖（逆相補鎖）を有する。ＲＮＡポリメラーゼは５’−＞３’方向に核酸を付加するため、ＤＮＡのマイナス鎖は転写の際にＲＮＡの鋳型として作用する。このように、形成されたＲＮＡは、マイナス鎖と相補的で、プラス鎖と同一である（ＵがＴに置換されていることを除く）配列を有する。
【００１９】
アンチセンス分子は、ＲＮＡまたはＤＮＡのプラス鎖のいずれかと特にハイブリダイズ可能であるか、または特に相補的である分子である。センス分子は、ＤＮＡのマイナス鎖と特にハイブリダイズ可能または特に相補的である分子である。アンチジーン分子は、ｄｓＤＮＡ標的に向けられるアンチセンスまたはセンス分子のいずれかである。
【００２０】
癌：
分化の喪失、増殖速度の増加、周辺組織の浸潤という特徴的な退形成を受けて、転移することができる悪性新生物。甲状腺癌は、甲状腺組織において、または甲状腺組織から発生する悪性新生物である。残留甲状腺癌は、甲状腺癌を減少または撲滅するために被験者に行われた如何なる形の処置後も被験者に残っている甲状腺癌である。転移性甲状腺癌は、そこから転移性甲状腺癌が由来する当初の（原発性）甲状腺癌の発生部位以外の体内の一つまたはそれ以上の部位に存在する甲状腺癌である。
【００２１】
化学療法、化学療法剤：
本明細書において用いられるように、異常な細胞増殖を特徴とする疾患の治療において治療的有用性を有する如何なる化学物質。そのような疾患には、腫瘍、新生物、および癌と共に、乾癬のような過形成増殖を特徴とする疾患が含まれる。一つの態様において、化学療法剤は、甲状腺新生物を治療するために用いられる物質である。一つの態様において、化学治療物質は放射活性ヨウ素である。当業者は、用いられる化学療法剤を容易に同定することができる（例えば、ＳｌａｐａｋとＫｕｆｅ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、第８６章、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１４版；Ｐｅｒｒｙら、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、第１７章、Ａｂｅｌｏｆｆ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｅｏｌｏｇｙ、第２版、著作権２０００年、チャーチルリビングストンインク（Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ Ｉｎｃ）；Ｂａｌｔｚｅｒ Ｌ．， Ｂｅｒｋｅｒｙ Ｒ．編：Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｐｏｃｋｅｔ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、第２版、セントルイス、モスビーイヤーブック、１９９５；Ｆｉｓｃｈｅｒ ＤＳ、Ｋｎｏｂｆ ＭＦ、Ｄｕｒｉｖａｇｅ ＨＪ（編）：Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、第４版、セントルイス、モスビーイヤーブック、１９９３を参照されたい）。
【００２２】
化合物の有効量：
治療すべき被験者において所望の作用を得るために十分な化合物の量。例えば、化合物の治療的有効量は、被験者の細胞において一つまたはそれ以上のヒストン脱アセチル酵素イソ型を阻害するために必要な量、または被験者における新生物を検出するために投与される検出可能な物質の量である。
【００２３】
化合物の治療的有効量は、１回量、または数回量で投与してもよく、例えば、治療のあいだ毎日投与してもよい。しかし、化合物の治療的有効量は、適用した化合物、治療される被験者、罹患の重症度とタイプ、および化合物の投与様式に依存すると思われる。
【００２４】
「被験者に投与する」という用語には、甲状腺新生物を有するまたは発症する可能性がある全ての動物（例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシ）に対する如何なる経路の投与も含まれると理解される。
【００２５】
経腸投与：
消化管に関係する。薬剤および／または治療物質を投与する場合、経腸とは消化管を通しての投与、例えば、口、直腸、経鼻胃管、胃そう等による投与を意味する。
【００２６】
ポリペプチドの断片および変種：
この用語には、親ポリペプチドの一つまたはそれ以上の生物機能を維持する断片および変種が含まれる。ポリペプチドをコードする遺伝子またはｃＤＮＡは、一つまたはそれ以上のポリペプチドの生物機能を物質的に変化させることなくかなり変異する可能性があると認識される。遺伝子コードは、縮重することが周知であり、このように、異なるコドンが同じアミノ酸をコードする。アミノ酸置換が導入されている場合においても、変異は保存的であり、蛋白質の本質的な機能に物質的な影響を及ぼさない可能性がある（Ｓｔｒｙｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３版、著作権、１９８８）。さらに、機能を障害または消失させずに、ポリペプチド鎖の一部を欠失することができ、および／または機能を障害または消失させずに、ポリペプチド鎖に挿入または付加（例えば、エピトープタグを付加する）を行うことができる（Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９８を参照されたい）。
【００２７】
ポリペプチドの一つまたはそれ以上の機能に物質的な影響を及ぼすことなく行うことができる他の改変には、例えば、インビボもしくはインビトロの化学および生化学的改変またはまれなアミノ酸を組み入れる改変が含まれる。そのような改変には、例えば、アセチル化、カルボキシル化、燐酸化、グリコシル化、ユビキチン化、標識、例えば、放射性核種による標識、および様々な酵素的改変が含まれる。ポリペプチドを標識する多様な方法、およびそのような目的にとって有用な多様な置換基または標識は、当技術分野で周知であり、それらには、３２Ｐのような放射活性同位元素、標識アンチリガンド（例えば、抗体）に結合するリガンド、蛍光体、化学発光物質、酵素、およびアンチリガンドが含まれる。
【００２８】
機能的な断片および変種は多様な長さであってもよい。例えば、いくつかの断片は、アミノ酸残基少なくとも約５、１０、２５、５０、７５、１００、２００、５００、７５０、または９００個を有する。そのような断片はまた、免疫原性活性を有してもよく、抗体のような特異的結合物質を産生するために用いてもよい。
【００２９】
ポリペプチド、またはポリペプチドの断片をコードする核酸配列は、それらが真核細胞、細菌、昆虫、および／または植物において蛋白質を発現させることができるように操作することができる。この発現を行うために、関係する調節配列を核酸配列に機能的に結合させる。ポリペプチドをコードする核酸配列に機能的に結合した調節配列をベクターに含めることができる。次に、このベクターを宿主細胞に導入することができる。宿主細胞には、真核細胞、細菌細胞、昆虫細胞、および植物細胞が含まれるがこれらに限定されない。
【００３０】
当業者は、ポリペプチドをコードする核酸がコードされる蛋白質の生物活性に影響を及ぼすことなく様々な方法で変化させることができることを認識すると思われる。例えば、核酸配列の変化を得るために、ＰＣＲを用いてもよい。そのような変種は、蛋白質を発現するために用いられる宿主細胞におけるコドンの選択性に関して最適にした変種、または発現を容易にする他の配列変化であってもよい。
【００３１】
二つのタイプのｃＤＮＡ配列変種を作製してもよい。上記のように、ｃＤＮＡ配列の変種は、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列の変化として現れない。これらのサイレント変種は遺伝子コードの縮重性の単なる反映である。第二のタイプでは、ｃＤＮＡ配列の変化によって、コードされる蛋白質のアミノ酸配列の変化が起こる。そのような場合では、変種ｃＤＮＡ配列は、変種ポリペプチド配列を生成する。コードされるポリペプチドの機能的および免疫学的同一性を保存するために、そのような如何なるアミノ酸置換も保存的であることが好ましい。保存的置換は、一つのアミノ酸を大きさ、疎水性等が類似であるもう一つのアミノ酸に置換する。保存的置換の例を下記の表１に示す。
【００３２】
【表１】
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【００３３】
アミノ酸変化が起こるｃＤＮＡ配列の変化は、保存的であるか否かによらず、コードされる蛋白質の機能的および免疫学的同一性を保存するために、理想的には最小限である。如何なるｃＤＮＡ配列変種も、好ましくはコードされるポリペプチドにわずかに２０個、好ましくは１０個または５個未満のアミノ酸置換を導入すると思われる。変種アミノ酸配列は、例えば、本来のアミノ酸配列と８０％、９０％、または９５％同一であってもよい。
【００３４】
一つの態様において、ポリペプチド変種は、ヒストン脱アセチル酵素ドミナントネガティブ断片または変種のような「ドミナントネガティブ断片または変種」である。ヒストン脱アセチル酵素断片または変種ドミナントネガティブ変種は、一つまたはそれ以上のヒストン脱アセチル酵素基質に結合することができるが、一つまたはそれ以上のヒストン脱アセチル酵素基質の脱アセチル化能を欠損する、または脱アセチル能が損なわれているヒストン脱アセチル酵素ポリペプチドである。例えば、ヒストン脱アセチル酵素断片または変種は、変種が、部分的または実質的に一つまたはそれ以上のヒストンに対する結合親和性を保持しているが、一つまたはそれ以上のヒストンの脱アセチル化能が欠損しているまたは損なわれているように、組換えＤＮＡ技術を用いて構築することができる。その結果、ドミナントネガティブヒストン脱アセチル酵素断片または変種は、細胞におけるヒストン脱アセチル酵素活性の競合的阻害剤として作用する。一つの態様において、ドミナントネガティブヒストン脱アセチル酵素断片または変種は融合ポリペプチドである。
【００３５】
融合蛋白質またはポリペプチド：
自然界において互いに結合して認められない二つまたはそれ以上のアミノ酸配列を含む組換え型核酸によってコードされる蛋白質またはポリペプチド。融合蛋白質またはポリペプチドには、蛋白質またはポリペプチドの機能的断片または変種が含まれうる。一つの態様において、アミノ酸配列の一つがエピトープタグである。一つの特定の非制限的な例において、融合蛋白質は、緑色蛍光蛋白質、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓタグ、または当技術分野で既知の如何なる数のエピトープタグのようなエピトープタグに融合したヒストン脱アセチル酵素のドミナントネガティブ断片である。そのような融合蛋白質を操作するために簡便なクローニングベクター（例えば、クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社およびプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社によって製造されたベクター）が容易に入手可能であり、宿主細胞において融合蛋白質を発現するために用いることができる。理論に拘束されることなく、エピトープタグは、蛋白質蛋白質相互作用のような、融合蛋白質に含まれる他のポリペプチドの生物機能にほとんど影響を及ぼさない。しかし、エピトープタグは融合蛋白質の細胞内位置特定のために、融合蛋白質を精製するために、融合蛋白質の結合パートナーを精製するために、または免疫学的検出のために有用である。
【００３６】
ヒストン：
ヌクレオソームのコア蛋白質の一部である蛋白質。ヒストンのアセチル化および脱アセチル化は、ヌクレオソームおよび染色質の構造に影響を及ぼすことによって遺伝子発現の調節において何らかの役割を有する。ヒストン蛋白質には、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４が含まれるがこれらに限定されない。ヒストンは、二つの型、すなわちアセチル化型と脱アセチル化型となりうる。ヒストンアセチルトランスフェラーゼはヒストンのアセチル化を引き起こすが、ヒストン脱アセチル酵素はこのプロセスを逆転させる。ヒストンの脱アセチル化は、加水分解によるヒストンのリジン側鎖のε−アミノ基からのアセチル基の除去を含む。
【００３７】
ヒストン脱アセチル酵素：
蛋白質脱アセチル酵素とも呼ばれ、ヒストンまたは他の蛋白質（例えば、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、またはＨ４）におけるリジン側鎖のイプシロン−アミノ基からのアセチル基の除去を触媒して、それによってリジン側鎖上に陽性荷電を再構築するクラスの酵素（ＮｇとＢｉｒｄ、Ｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｌ． Ｓｃｉ． ２５：１２１〜１３６、２０００、参照として本明細書に組み入れられる）。同様に、Ｅｍｉｌｉａｎｉら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：２７９５〜２８００、１９９８；Ｆｉｓｃｈｌｅら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：１１７１３〜１１７２０、１９９０；Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１２８４５〜１２８５０、１９９６；Ｔａｕｎｔｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２、４０８〜４１１、１９９６を参照されたい。ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、およびＲＰＤ３を含むがこれらに限定されないいくつかのヒストン脱アセチル酵素が同定されている。ヒストン脱アセチル酵素の特定の非制限的な例には、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ０５８２７７、ＮＭ１５４０１、ＡＦ４０７２７３、ＸＭ００４３７９、およびＡＦ４２６１６０、ＡＦ００６６０３、ＡＦ００６６０２、およびＡＦ０７４８８２が含まれるがこれらに限定されず、同様に、米国特許第６，２８７，８４３号も参照されたい。ヒストン脱アセチル酵素が阻害されると、反対の酵素であるヒストンアセチルトランスフェラーゼの活性は、比較的過剰量存在し、ヒストンまたは他の蛋白質の超アセチル化が起こる。理論に拘束されることなく、ヒストン脱アセチル酵素の阻害によって、ヒストンのリジンテールの中和が起こり、ヒストン構造が破壊され、ＤＮＡの変性が起こる。ヒストンが変性状態となることによって、転写因子はＤＮＡに近づくことができる。
【００３８】
ヒストン脱アセチル酵素阻害剤：
一つまたはそれ以上のヒストン脱アセチル酵素の機能を例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、８０％、９５％、またはそれ以上阻害する物質。そのような物質は、薬剤または薬物、治療的に有効なオリゴヌクレオチド、特異的結合物質、またはヒストン脱アセチル酵素の断片もしくは変種の形であってもよい。いくつかの構造クラスのヒストン脱アセチル酵素阻害剤が同定されている。これらには、（１）短鎖脂肪酸（例えば、ブチレート）、（２）ヒドロキサム酸（例えば、スベリン酸ビスヒドロキサム酸、スベロリルアニリドヒドロキサム酸、プロキサミド、ｍ−カルボキシ桂皮酸ビスヒドロキサム酸）、（３）２−アミノ−８−オキソ−９，１０−エポキシ−デカノイル部分を含む環状テトラペプチド、および（４）ベンズアミドが含まれる。ヒストン脱アセチル酵素阻害剤の特定の非制限的な例には、ＦＲ９０１２２８（デシペプチド）、スクリプタイド、Ｎ−アセチルジナリン（ＣＩ−９９４）、スクリプタイド、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、トリコスタチンＡ、トラポキシンＡ、トラポキシンＢ、ＨＣ−トキシン、クラミドシン、Ｃｌｙ−２、ＷＦ−３１６１、Ｔａｎ−１７４６、アピシジン、アピシジン類似体、ベンズアミド、ベンズアミド誘導体、ヒドロキサム酸誘導体、アゼライン酸ビスヒドロキサム酸、酪酸およびその塩、酢酸塩、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、スベリン酸ビスヒドロキサム酸、ｍ−カルボキシ−桂皮酸ビスヒドロキサム酸、オキサムフラチン、デプデシン、またはＭＳ−２７５（Ｍａｒｋｓら、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｏｎｃｏｌ． １３：４７７、２００１、その全文が参照として本明細書に組み入れられる）が含まれる。または、物質は、アンチセンス分子またはリボザイムのようなヒストン脱アセチル酵素の発現または機能を阻害する治療的に有効なオリゴヌクレオチドであってもよい。または、ヒストン脱アセチル酵素阻害剤は、ヒストン脱アセチル酵素のドミナントネガティブ断片または変種となりうる。
【００３９】
注射可能組成物：
少なくとも一つの活性成分、例えば二特異的融合蛋白質を含む薬学的に許容される液体組成物。活性成分は、通常、生理的に許容される担体に溶解または懸濁して、組成物はさらに、乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝剤等のような一つまたはそれ以上の非毒性補助物質の少量を含みうる。本発明の融合蛋白質に関して用いるために有用なそのような注射可能組成物は通常のものであり；適当な製剤は当技術分野で周知である。
【００４０】
新生物：
良性および悪性腫瘍と共に他の増殖性障害を含む異常な細胞増殖。
【００４１】
オープンリーディングフレーム：
如何なる内部停止コドンも含まないアミノ酸をコードする一連のヌクレオチドトリプレット（コドン）。これらの配列は通常、ペプチドに翻訳可能である。
【００４２】
機能的に結合する：
第一の核酸配列は、第一の核酸配列が第二の核酸配列に対して機能的な関係に存在する場合に、第二の核酸配列と機能的に結合している。例えば、プロモーターは、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、コード配列に機能的に結合している。一般的に、機能的に結合したＤＮＡ配列は連続しており、二つの蛋白質コード領域を結合する必要がある場合、同じ読み取り枠に存在する。
【００４３】
Ｎａ＋／Ｉ−共搬体（ナトリウム／ヨウ素共搬体、ＮＩＳ）：
ヨウ化物陰イオンの甲状腺への能動的輸送を媒介する膜蛋白質。例えば、Ｄｅ ｌａ Ｖｉｅｊａら、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ８０：１０８３〜１１０５、２０００；Ｄａｉら、Ｎａｔｕｒｅ ３７９：４５８〜４６０、１９６６を参照されたい。本明細書では、ナトリウム−ヨウ化物共搬体とも呼ぶ。
【００４４】
非経口：
腸以外の部分への投与、例えば消化管を経由しない投与。一般的に、非経口製剤は、摂取を除く如何なる可能な様式によっても投与される製剤である。この用語は特に、静脈内、髄腔内、筋肉内、腹腔内、または皮下注射、ならびに例えば鼻腔内、皮内、および局所投与を含む様々な表面適用を意味する。
【００４５】
薬剤または薬物：
特定の用量を被験者に投与した場合に所望の治療的または予防的効果を誘導することができる化学化合物または組成物。
【００４６】
薬学的に許容される担体：
本発明において有用な薬学的に許容される担体は通常通りである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｅ．Ｗ． Ｍａｒｔｉｎ、マック出版社（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．）、ペンシルバニア州、イーストン、第１５版（１９７５）は、本明細書に開示の融合蛋白質の薬学的輸送に適した組成物および製剤を記述している。
【００４７】
一般的に、担体の特性は、用いる特定の投与様式に依存すると思われる。例えば、非経口製剤は通常、媒体として水、生理食塩液、緩衝塩溶液、水性デキストロース、グリセロール等のような薬学的および生理学的に許容される液体を含む注射可能な液体を含む。固体組成物の場合（例えば、粉剤、丸剤、錠剤、またはカプセル剤）、通常の非毒性固体担体には、例えば、薬学等級のマンニトール、乳糖、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムが含まれうる。生物学的に中性の担体の他に、投与される薬学的組成物は、湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝剤等、例えば酢酸ナトリウムまたはモノラウリル酸ソルビタンのような非毒性の補助物質の少量を含みうる。
【００４８】
プロモーター：
プロモーターは、核酸の転写を指示する核酸制御配列のアレイである。プロモーターには、ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合のＴＡＴＡエレメントのような、転写の開始部位近傍の必要な核酸配列が含まれる。プロモーターにはまた、選択的に、転写開始部位から数千塩基対もの位置に存在しうるエンハンサーまたはリプレッサーエレメントが含まれる。
【００４９】
精製された：
「精製された」という用語は、絶対的な純度を必要とせず、むしろ相対的な用語であると解釈される。このように、例えば、精製蛋白質調製物は、言及した蛋白質が細胞内でのその天然の環境における蛋白質より純粋である調製物である。
【００５０】
組換え型：
組換え型核酸は、天然に存在しない配列を有する、またはそうでなければ離れている配列の二つのセグメントの人為的な組み合わせによって作製される配列を有する核酸である。この人為的な組み合わせは、化学合成によって、またはより一般的には、単離された核酸セグメントの人為的な操作、例えば、遺伝子操作技術によって行うことができる。
【００５１】
特異的結合物質：
既定の標的のみに特異的に結合する物質。このように、ヒストン脱アセチル酵素特異的結合物質は、実質的にヒストン脱アセチル酵素イソ型のみに結合する。本明細書において用いられるように、「ヒストン脱アセチル酵素特異的結合物質」という用語には、ヒストン脱アセチル酵素蛋白質抗体および実質的にヒストン脱アセチル酵素に限って結合する他の物質が含まれる。
【００５２】
抗ヒストン脱アセチル酵素蛋白質抗体は、ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＣＳＨＬ、ニューヨーク、１９８８）を含む多くのテキストに記載される標準的な技術を用いて産生してもよい。特定の物質が実質的にヒストン脱アセチル酵素に限って結合するか否かの決定は、一般的な技術を用いて、またはそれらを合うように改変して容易に行われると思われる。一つの適したインビトロアッセイ法は、ウェスタンブロッティング法を利用する（ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＣＳＨＬ、ニューヨーク州、１９８８；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＣＳＨＬ、ニューヨーク州、１９９８を含む多くのテキストに記載される）。
【００５３】
より短い抗体断片もまた、特異的結合物質として作用しうる。例えば、ヒストン脱アセチル酵素に結合するＦａｂｓ、Ｆｖｓ、および一本鎖Ｆｖｓ（ＳＣＦｖｓ）は、ヒストン脱アセチル酵素特異的結合物質であると考えられる。これらの抗体断片は以下のように定義される：（１）Ｆａｂ、全抗体を酵素パパインによって消化して、無傷の軽鎖と一つの重鎖の一部とを生じることによって産生された抗体分子の一価抗原結合断片を含む断片；（２）Ｆａｂ’、全抗体をペプシンによって処置した後に還元して、無傷の軽鎖と重鎖の一部とを生じることによって得られた抗体分子の断片；抗体１分子あたりＦａｂ’断片２個が得られ；（３）（Ｆａｂ’）２、全抗体を酵素ペプシンによって処置した後還元せずに得られた抗体断片；（４）Ｆ（ａｂ’）２、二つのジスルフィド結合によって互いに結合した二つのＦａｂ’断片の二量体；（５）Ｆｖ、二つの鎖として発現される軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含む遺伝子操作された断片；および（６）一本鎖抗体（「ＳＣＡ」）、遺伝子融合された一本鎖分子として適したポリペプチドリンカーによって結合した軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含む遺伝子操作された分子。
【００５４】
治療的有効量：
疾患の進行を予防する、もしくは寛解を引き起こすために十分な用量、または発熱、疼痛、食欲減退、もしくは悪性疾患に関連したカヘキシアのような、疾患によって引き起こされた症状を軽減することができる用量。
【００５５】
治療的に有効なオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体：
治療的に有効なオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体は、例えば、蛋白質の発現の阻害による蛋白質機能の阻害能を特徴とする。阻害は、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の非存在下において標的蛋白質活性または発現と比較した場合に認められる標的蛋白質活性または発現の如何なる減少となりうる。さらに、いくつかのオリゴヌクレオチドは、標的蛋白質の活性または発現を少なくとも１５％、３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％またはそれ以上阻害することができると思われる。
【００５６】
いくつかの治療的に有効なオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体はさらに、標的蛋白質をコードする核酸配列と十分に相補的であることを特徴とする。本明細書に記載するように、十分な相補性は、治療的に有効なオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が標的蛋白質の発現を特異的に破壊することができるが、他の標的核酸配列の遺伝子発現を有意に変化させないことを意味する。
【００５７】
例えば、治療的に有効なオリゴヌクレオチドは、細胞におけるヒストン脱アセチル酵素活性を少なくとも１５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％またはそれ以上減少させる可能性がある。
【００５８】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、リボ核酸またはデオキシリボ核酸のオリゴマーまたはポリマーを意味する。この用語には、天然に存在するヌクレオベース、糖、および共有結合した糖間（骨格）結合からなるオリゴヌクレオチドと共に、類似のように機能する天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。そのような改変または置換オリゴヌクレオチドは、例えば細胞取り込みの増強、標的に対する結合の増加、およびヌクレアーゼの存在下での安定性の増加のような所望の特性のために、しばしば本来の型より好ましい。
【００５９】
サイログロブリン：
甲状腺組織において特異的に発現され、甲状腺ホルモンであるチロキシンとトリヨードチロニンを合成するための基質である大きい（アミノ酸残基約２７５０個）ヨウ化糖蛋白質。Ｍａｌｔｈｉｅｒｙら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ７１：１９５〜２０９、１９８９；Ｖａｓｓａｒｔら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ３０：８９〜９７、１９８５；ｖａｎ ｄｅ Ｇｒａａｆら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３６：５０８〜５１５、１９９７を参照されたい。
【００６０】
甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）：
濾胞細胞におけるヨウ化物陰イオンの酸化およびヨード有機化を触媒する甲状腺特異的酵素。Ｏｈｔａｋｉら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ４３：１〜１４、１９９６を参照されたい。
【００６１】
甲状腺特異的遺伝子発現：
非甲状腺細胞タイプと比較して甲状腺濾胞細胞において高レベルで（例えば、非甲状腺細胞タイプの場合より少なくとも５倍高く）発現される遺伝子。これらには、例えば、サイログロブリン、Ｎａ＋／Ｉ−共搬体、および甲状腺ペルオキシダーゼが含まれる。「甲状腺特異的」、「特異的に発現される」等という用語は、これらの遺伝子が他の細胞タイプには発現されないことを意味しない。例えば、Ｎａ＋／Ｉ−共搬体は、授乳期の乳腺細胞、唾液腺細胞、および胃粘膜において発現されることが知られている。甲状腺特異的遺伝子の特定の非制限的な例は、甲状腺癌細胞におけるサイログロブリンおよび／またはＮａ＋／Ｉ−共搬体である。理論に拘束されることなく、甲状腺特異的遺伝子の発現が増加することによって、細胞の分化が促進され、浸潤および転移のような生物学的に攻撃的な挙動が減少する。さらに、理論に拘束されることなく、サイログロブリンおよび／またはＮａ＋／Ｉ−共搬体の発現が増加すれば、甲状腺癌細胞のヨウ素濃縮能が増加して、それによって細胞は放射活性ヨウ素治療に対してより感受性となる。
【００６２】
腫瘍：
悪性（癌様）または非悪性のいずれかである可能性がある新生物。
【００６３】
特に説明していない限り、全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本発明の実践または試験にあたって、本明細書に記載の方法および材料と類似または同等の方法および材料を用いることができるが、適した方法および材料を下記に説明する。一致しない場合は、定義を含む本明細書が優先する。さらに、材料、方法、および実施例は説明のために限られ、制限すると解釈されない。
【００６４】
いくつかの開示の方法の概要
本明細書において、甲状腺癌細胞の増殖を阻害する方法を提供する。方法には、ヒストン脱アセチル酵素阻害剤の治療的有効量を投与することが含まれる。本明細書に開示のように、ヒストン脱アセチル酵素を阻害すると、甲状腺特異的サイログロブリンプロモーター−エンハンサーエレメントの転写活性が増加して、同様に、甲状腺特異的遺伝子の転写が活性化する。発現の増加を示す遺伝子の特定の非制限的な例には、Ｎａ＋／Ｉ−共搬体（ＮＩＳ）およびサイログロブリンが含まれ、二つの蛋白質は、甲状腺細胞におけるヨウ化物の輸送、ヨウ素の濃縮、および甲状腺ホルモン産生に関与する。理論に拘束されることなく、ヒストン脱アセチル酵素阻害剤によって誘導される甲状腺特異的遺伝子の発現の増加によって、甲状腺癌細胞の分化が促進して、それによって浸潤および転移のような生物学的に攻撃的な挙動が減少すると考えられる。さらに、甲状腺特異的遺伝子の発現の増加によって、ヨウ化物の濃縮能が増強または回復して、それによって甲状腺癌細胞は放射活性ヨウ素治療による治療に対して感受性となる。
【００６５】
少なくとも一つのヒストン脱アセチル酵素を阻害する物質を甲状腺癌細胞に導入することによって、甲状腺癌細胞における甲状腺特異的遺伝子の発現を増強する方法を本明細書において開示する。一つの態様において、サイログロブリンコード配列を含むサイログロブリン遺伝子を含むサイログロブリンプロモーター−エンハンサーエレメントを含む遺伝子、または異種核酸配列に機能的に結合したサイログロブリンプロモーターを含む遺伝子の発現を増強する方法を提供する。もう一つの態様において、Ｎａ＋／Ｉ−共搬体または異種核酸配列に機能的に結合したＮａ＋／Ｉ−共搬体プロモーターを含む遺伝子の発現を増強する方法が提供される。さらなる態様において、甲状腺癌細胞のヨウ化物またはヨウ素の取り込み能または濃縮能を増強する方法が提供される。さらにもう一つの態様において、甲状腺細胞のＫＩのようなヨウ化物またはヨウ素の取り込み能を増強する方法が提供される。
【００６６】
ヒストン脱アセチル酵素を阻害する物質は、例えば、ＦＲ９０１２２８（デプシペプチド）、トリコスタチンＡ、トラポキシンＡ、トラポキシンＢ、ＨＣ−トキシン、クラミドシン、Ｃｌｙ−２、ＷＦ−３１６１、Ｔａｎ−１７４６、アピシジン、アピシジン類似体、ベンズアミド、ベンズアミド誘導体、ヒドロキサム酸誘導体、アゼライン酸ビスヒドロキサム酸、酪酸およびその塩、酢酸塩、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、スベリン酸ビスヒドロキサム酸、ｍ−カルボキシ−桂皮酸ビスヒドロキサム酸、オキサムフラチン、デプデシン、またはＭＳ−２７−２７５の治療的有効量となりうる。または、物質は、ヒストン脱アセチル酵素の発現または機能を阻害する治療的有効量のオリゴヌクレオチド、またはヒストン脱アセチル酵素のドミナントネガティブ断片もしくは変種となりうる。ヒストン脱アセチル酵素を阻害する物質はまた、国際公開公報第００７１７０３Ａ２号、国際公開公報第０１７６７５Ａ２号、および国際公開公報第０００８０４８Ａ２号にも記載されている。
【００６７】
甲状腺癌細胞は、被験者における甲状腺癌細胞となりえて、方法は、放射活性ヨウ素、例えば、１３１Ｉの治療的有効量を被験者に投与することによって甲状腺癌を治療する方法となりうる。１３１Ｉの治療的有効量は、例えば、約１ ｍＣｉ〜約５００ ｍＣｉ、または約３０ ｍＣｉ〜約３００ ｍＣｉとなりうる。特定の態様において、被験者における甲状腺癌細胞は、乳頭甲状腺癌、濾胞甲状腺癌、島甲状腺癌、未分化甲状腺癌、または甲状腺癌の如何なる組織学的変種に由来しうる。
【００６８】
他の特定の例において、放射活性ヨウ素による治療は、甲状腺切除術、外部放射線照射、または抗癌化学療法剤の治療的有効量の被験者への投与を伴うことができる。なお他の特定の態様において、放射活性ヨウ素は、被験者に複数回、例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回またはそれ以上被験者に投与することができる。これらの回数は、一定期間、例えば、約１２時間を超える、約２４時間を超える、約４８時間を超える、約７２時間を超える、約１週間を超える、約２週間を超える、約４週間を超える、約８週間を超える、約１２週間を超える、約６ヶ月を超える、約１年を超える、または約２年を超える間隔をあけることができる。これらの如何なる一つまたはそれ以上の回数において、ヒストン脱アセチル酵素阻害剤および／または放射活性ヨウ素の投与は、甲状腺刺激ホルモンの治療的有効量の投与を伴うことができる。
【００６９】
同様に、ヒストン脱アセチル酵素阻害剤の治療的有効量を被験者に投与すること；甲状腺癌におけるその濃度がヒストン脱アセチル酵素阻害剤の投与によって増加する検出可能な物質を被験者に投与すること；および検出可能な物質を検出することによって、被験者における甲状腺新生物を検出する方法が開示される。方法には、甲状腺新生物細胞におけるその濃度がヒストン脱アセチル酵素阻害剤の投与によって増加する物質を検出することによって、甲状腺新生物を検出することが含まれる。物質は、Ｎａ＋／Ｉ−共搬体によって甲状腺細胞に輸送される物質となりうる。物質は、例えば、放射活性ヨウ化物分子、例えば、１２３Ｉ、１２５Ｉ、もしくは１３１Ｉ；または放射標識過塩素酸塩もしくはペルテクニテートとなりうる。
【００７０】
特定の態様において、方法は、乳頭、濾胞、島、または未分化甲状腺癌を検出する方法となりうる。他の特定の態様において、方法は、甲状腺癌を治療するために一つまたはそれ以上の治療を受けた被験者における残留甲状腺癌を検出する方法となりうる。例えば、方法は、甲状腺切除術、１３１Ｉ外部照射を受けたことがある、または抗癌化学療法を受けたことがある被験者における残留甲状腺癌を検出する方法となりうる。
【００７１】
さらに他の態様において、甲状腺癌の発生に対する放射線予防の有効性を増強するために、放射線曝露後に（例えば、核施設の事故、または核兵器への曝露後）ヨウ化物またはヨウ素化合物を予防的に投与する。
【００７２】
ヒストン脱アセチル酵素阻害剤の例
参照として本明細書に組み入れられる、Ｍａｒｋｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ９２：１２１０〜１２１６、２０００は、ヒストン脱アセチル酵素阻害剤のタイプおよびクラスの概要を示している。Ｍａｒｋｓらに記載されるヒストン脱アセチル酵素阻害剤は全て、本開示の方法において有用である。例えば、Ｍａｒｋｓらの図３および４（頁１２１２〜１２１３）に記載されるＨＤＩｓを参照されたい。
【００７３】
国際公開公報第００／０８０４８号および国際公開公報第００／２１９７９号、ならびに米国特許第５，９２２，８３７号に記載されるような環状テトラペプチドを、本発明において用いることができる。米国特許第４，９７７，１３８号に開示されるＦＲ９０１２２８および関連化合物もまた適している。他の有用なＨＤＩｓには、酪酸ナトリウム、トリコスタチンＡ、トラポキシンＡ、トラポキシンＢ、ＨＣ−トキシン、クラミドシン、Ｃｌｙ−２、ＷＦ−３１６１、Ｔａｎ−１７４６、ならびにアピシジンおよびその類似体が含まれる。
【００７４】
ＨＣ−トキシンは、Ｌｉｅｓｃｈら（１９８２）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３８、４５〜４８に記載され；トラポキシンＡおよびトラポキシンＢは、Ｉｔａｚａｋｉら（１９９０）Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔ． ４３、１５２４〜１５３２および欧州特許第０４０６７２５号に記載され；ＷＦ−３１６１は、Ｕｍｅｈａｎａら（１９８３）Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔ． ３６、４７８〜４８３に記載され；Ｃｌｙ−２は、Ｈｉｒｏｔａら（１９７３）Ａｇｒｉ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ３７、９５５〜５６に記載され；クラミドシンはＣｌｏｓｓｅら（１９７４）Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ ５７、５３３〜５４５に記載され、およびＴａｎ １７４６は、武田薬品工業に対する日本国特許第７１９６６８６号に記載されている。ベンズアミドおよび誘導体は、Ｓｕｚｕｋｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２：３００１〜３００３、１９９９、および日本国特許第１１３３５３７５号に記載される。
【００７５】
ヒドロキサム酸誘導体は、本開示の方法において有用である。例には、Ｑｉｕら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ １１：２０６９〜２０８３、２０００に記載されるアゼライン酸ビスヒドロキサム酸；およびＲｉｃｈｏｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７：１００１４〜１００１９、２０００に記載されるスベロイルアニリドヒドロキサム酸が含まれる。
【００７６】
このように、ヒストン脱アセチル酵素阻害剤の特定の非制限的な例には、ＦＲ９０１２２８（デプシペプチド）、トリコスタチンＡ、トラポキシンＡ、トラポキシンＢ、ＨＣ−トキシン、クラミドシン、Ｃｌｙ−２、ＷＦ−３１６１、Ｔａｎ−１７４６、アピシジン、アピシジン類似体、ベンズアミド、ベンズアミド誘導体、ヒドロキサム酸誘導体、アゼライン酸ビスヒドロキサム酸、酪酸およびその塩、酢酸塩、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、スベリン酸ビスヒドロキサム酸、ｍ−カルボキシ−桂皮酸ビスヒドロキサム酸、オキサムフラチン、デプデシン、またはＭＳ−２７−２７５が含まれるがこれらに限定されない。
【００７７】
特異的結合物質はまた、ヒストン脱アセチル酵素阻害剤、例えばヒストン脱アセチル酵素に特異的に結合して、その機能を阻害する抗体および／または抗体断片となりうる。
【００７８】
治療的に有効なオリゴヌクレオチドも同様に、ヒストン脱アセチル酵素阻害剤として用いることができる。一つの特定の非制限的な例において、オリゴヌクレオチドは、ヒストン脱アセチル酵素の発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。治療的に有効なオリゴヌクレオチドを用いることを実施例６においてさらに説明する。
【００７９】
ヒストン脱アセチル酵素の断片および変種も同様に、ヒストン脱アセチル酵素阻害剤として用いてもよい。一つの特定の非制限的な例において、ヒストン脱アセチル酵素阻害剤は、ヒストン脱アセチル酵素のドミナントネガティブ変種である。ヒトヒストン脱アセチル酵素Ａは、アミノ酸残基約４９０位からＣ−末端アミノ酸残基９６７位までの触媒的活性ドメインを有することがわかっている（Ｆｉｓｃｈｌｅら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：１１７１３〜１１７２０、１９９９）。さらに、残基約４９５位から残基約５５０位までの領域は、ヒストン脱アセチル酵素触媒活性にとって必須であることがわかっている。このように、残基５４０位からＣ−末端残基９６７位までを含むヒトヒストン脱アセチル酵素Ａ断片は、ヒストン基質の結合能を保持するが、基質の脱アセチル化能を欠損すると思われる。このように、この断片は、ヒストン脱アセチル酵素のドミナントネガティブ断片であり、ヒストン脱アセチル酵素阻害剤として用いることができる。さらなるドミナントネガティブヒストン脱アセチル酵素断片は、配列相同性検索によって容易にデザインされ、ＡｕｓｕｂｅｌらのＳｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９８に記載されるような標準的なＤＮＡ組換え技術を用いて構築される。
【００８０】
ドミナントネガティブヒストン脱アセチル酵素断片または変種は、甲状腺細胞におけるヒストン脱アセチル酵素を阻害する。そのような断片は、多様な方法で甲状腺新生物細胞に輸送してもよい。例えば、ドミナントネガティブヒストン脱アセチル酵素断片をコードする核酸を適当な真核細胞遺伝子移入ベクターに移入して腫瘍細胞に輸送してもよい。
【００８１】
レトロウイルスベクターのようなウイルスベクターは、真核細胞遺伝子移入にとって有用であり、感染効率が高く、安定に組み込みおよび発現される（Ｏｒｋｉｎら、Ｐｒｏｇ． Ｍｅｄ． Ｇｅｎｅｔ． ７：１３０〜１４２、１９８８）。ドミナントネガティブヒストン脱アセチル酵素断片または変種をコードする核酸は、レトロウイルスベクターにクローニングして、その内因性のプロモーター、異種プロモーター（構成的または誘導型）、またはレトロウイルスＬＴＲ（長末端反復）のいずれかによって駆動される。アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６２：１９６３〜１９７３、１９８８）、ワクシニアウイルス（Ｍｏｓｓら、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ５：３０５〜３２４、１９８７）、ウシ乳頭腫ウイルス（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １３９：６４２〜６５４、１９８７）、エプスタイン−バーウイルスのようなヘルペスウイルスメンバー（Ｍａｒｇｏｌｓｋｅｅら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ８：２８３７〜２８４７、１９８８）、またはレンチウイルスおよび関連ベクター（米国特許第６，０１３，５１６号）を含む他のウイルストランスフェクション系も同様に、このタイプのアプローチのために利用してもよい。
【００８２】
非常に大きい核酸インサートをウイルス系に組み入れることができる。Ｋｏｃｈａｎｅｋら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：５７３１〜５７３９、１９９６は、遺伝子移入治療において用いるための２８．２ ｋｂ発現カセットのアデノウイルス系における効率的なパッケージングを証明した。同様に、アデノウイルスでの研究のＰａｒｋｓとＧｒａｈａｍは、１５．１〜３３．６ ｋｂの範囲の大きさのベクターのパッケージングを証明した（Ｐａｒｋｓら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１３５６５〜１３５７０、１９９６；ＰａｒｋｓとＧｒａｈａｍ、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１：３２９３〜３２９８、１９９７）。
【００８３】
一つの態様において、アデノウイルス媒介遺伝子輸送を用いて、甲状腺細胞における核酸の発現を指示する。Ｂｌａｇｏｓｋｌｏｎｎｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ８３（７）：２５１６〜２２、１９９８は、アデノウイルス媒介遺伝子移入が、未分化甲状腺癌細胞に対して機能的ｐ５３状態を回復するために非常に有効であることを示した。Ｚｅｉｇｅｒら、Ｓｕｒｇｅｒｙ １２０：９２１〜９２５、１９９６は、ガンシクロビル投与による腫瘍細胞障害の促進におけるアデノウイルス媒介チミジンキナーゼ遺伝子移入の有効性を証明した。
【００８４】
真核細胞遺伝子移入技術における最近の進歩には、Ｃｏｌｅ−Ｓｔｒａｕｓｓら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：１３８６〜１３８９、１９９６）によって記述されるように、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドオリゴヌクレオチドを利用することが含まれる。この技術によって、クローニングした配列の部位特異的組み込みを行うことができ、それによって遺伝子改変を正確にターゲティングすることができると思われる。
【００８５】
感染によらない輸送方法を用いることが可能である。例えば、様々な遺伝子をトランスフェクトするために（論評に関しては、ＴｅｍｐｌｅｔｏｎとＬａｓｉｃ、Ｍｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １１：１７５〜１８０、１９９９；ＬｅｅとＨｕａｎｇ、Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｔｈｅｒ． Ｄｒｕｇ． Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ． １４：１７３〜２０６；およびＣｏｏｐｅｒ、Ｓｅｍｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． ２３：１７２〜１８７、１９９６を参照されたい）、およびペプチドを輸送するために、脂質およびリポソーム媒介遺伝子輸送を用いることができる。例えば、陽イオンリポソームは単球白血病細胞にトランスフェクトできるか否かが分析されており、ウイルスベクターを用いることに対する実行可能な代用法であることが示されている（ｄｅ Ｌｉｍａら、Ｍｏｌ． Ｍｅｍｂｒ． Ｂｉｏｌ． １６：１０３〜１０９、１９９９）。そのような陽イオンリポソームはまた、例えば、モノクローナル抗体または他の適当なターゲティングリガンドを含めることによって特定の細胞にターゲティングすることができる（Ｋａｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ３：２５０〜２５６、１９９６）。Ｓｉｋｅｓら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：８３７〜８４４、１９９４は、甲状腺濾胞細胞を形質転換するために甲状腺にプラスミドＤＮＡの直接間質内注射を用いて成功した。
【００８６】
このように、甲状腺新生物細胞にドミナントネガティブヒストン脱アセチル酵素断片および変種を導入するために多様な技術が利用可能である。
【００８７】
ヒストン脱アセチル酵素阻害剤の治療的利用の例
ヒトまたは動物における甲状腺新生物を治療する場合、疾患が診断された後にヒストン脱アセチル酵素阻害剤（ＨＤＩ）を投与する。治療は、間欠的であっても連続的であってもよい。間欠的治療の例は、実施例５およびその中に記載される参考文献に記載されるように、１３１Ｉの投与前にＨＤＩの治療的有効量を短期間投与することである。例えば、ＨＤＩの治療的有効量は、１３１Ｉを投与する前約１２時間、約２４時間、約４８時間、約７２時間、約５日間、約１週間、約２週間、または約４週間投与することができると思われる。１日量は、約０．０１ μｇ／ｋｇ〜約５００ ｍｇ／ｋｇの範囲となると思われる。治療は、ＨＤＩの治療的有効量が投与されるまで、または最大治療的ＨＤＩ阻害が得られるまで１日１回またはそれ以上の経腸または非経口投与となりうる。または、１日量は、ほぼ連続的に、例えば静脈内注入によって投与することができる。
【００８８】
ＨＤＩは、甲状腺癌細胞の分化を促進して、それによって組織浸潤および転移のような生物学的に攻撃的な挙動に対する傾向を減少するために投与してもよい。治療は、上記のように間欠的または連続的であってもよい。甲状腺癌細胞の分化を促進するための連続的治療の一例は、好ましい治療反応が認められるまで、または被験者における全ての甲状腺癌細胞が消滅または死滅するまで、約０．０１ μｇ／ｋｇ〜約５００ ｍｇ／ｋｇの範囲の１日量を投与することであると考えられる。そのような分化促進ＨＤＩ治療は、放射活性ヨウ素または他の甲状腺癌治療も同様に行うか否かによらず行うことができる。
【００８９】
いくつかの例において、甲状腺切除術を受けた、または受ける予定である被験者にＨＤＩの治療的有効量を投与することができる。甲状腺切除術を受けた、または受ける予定である被験者にＨＤＩを投与することは、甲状腺切除術を受けなかった被験者の場合と物質的な差がない。
【００９０】
ヒストン脱アセチル酵素阻害剤は、治療を必要とする被験者に経腸または非経口投与することができる。投与される用量は、用いる特定の化合物、関係する甲状腺癌の組織学タイプ、特定の宿主、疾患の重症度および程度、宿主の身体状態、ならびに選択した投与経路に従って変更してもよい。適当な用量は、当業者によって容易に決定することができる。例えば、ヒトおよび動物における甲状腺癌の治療に関して、１日量は約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５００ ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよい。
【００９１】
本明細書に開示の組成物には、ヒストン脱アセチル酵素阻害剤と不活性な担体とが含まれる。組成物は、ヒトおよび獣医学で用いるための薬学的組成物の形、または家禽におけるコクシジウム症を制御するための飼料組成物の形となりうる。「組成物」という用語は、一つもしくはそれ以上の活性成分、および担体を構成する一つもしくはそれ以上の不活性成分と共に、如何なる二つもしくはそれ以上の成分の組み合わせ、配合、もしくは凝集に直接もしくは間接的に起因する、一つもしくはそれ以上の成分の解離に起因する、または一つもしくはそれ以上の成分の他のタイプの反応に起因する如何なる産物も含む産物を含むと解釈される。このように、組成物には、ヒストン脱アセチル酵素阻害剤と不活性担体とを混合することによって作製される組成物が含まれる。
【００９２】
薬学的組成物には、活性成分としてのヒストン脱アセチル酵素阻害剤が含まれ、同様に、薬学的に許容される担体および選択的に他の化学療法剤のような他の治療成分を含みうる。組成物には、経口、直腸内、局所、および非経口（皮下、筋肉内、および静脈内投与を含む）投与のために適した組成物が含まれるが、如何なる場合にも最も適した経路は、特定の宿主、ならびに活性成分が投与される病態の特性および重症度に依存すると思われる。薬学的組成物は、単位用量剤形であることが都合よく、薬学の技術分野において周知の如何なる方法によっても調製してもよい。
【００９３】
実際に用いる場合、ヒストン脱アセチル酵素阻害剤は、通常の薬学的合成技術に従って薬学的担体との密接混合における活性成分として組み合わせることができる。担体は、投与、例えば経口または非経口（静脈内を含む）投与のために望ましい調製物の形に応じて幅広い形であってもよい。
【００９４】
経口投与剤形の組成物を調製する場合、如何なる通常の薬学的媒体も用いることができる。例えば、懸濁剤、エリキシル剤、および溶液のような経口液体調製物の場合、水、グリセロール、油、アルコール、着香料、保存剤、着色剤等を用いることができる；または粉剤、カプセル剤、および錠剤のような経口固体調製物の場合、デンプン、糖、微結晶セルロース、希釈剤、造粒剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤等のような担体を含めることができる。投与しやすいことから、錠剤およびカプセル剤は、固体薬学的担体が明白に用いられる場合には、最も都合のよい経口単位投与剤形である。望ましければ、錠剤は標準的な水性または非水性技術によってコーティングすることができる。上記の一般的な投与剤形の他に、ヒストン脱アセチル酵素阻害剤はまた、徐放手段および／または輸送装置によって投与することができる。
【００９５】
経口投与に適した薬学的組成物は、それぞれが規定量の活性成分を含むカプセル剤、カシェ剤、もしくは錠剤のような個別の単位の形、粉剤もしくは顆粒剤、または水性液体、非水性液体、水中油型乳剤、もしくは油中水型乳剤における溶液もしくは懸濁液となりうる。そのような組成物は、如何なる薬学的方法によっても調製することができるが、全ての方法には、一つまたはそれ以上の必要な成分を構成する担体と活性成分とを会合させる段階が含まれる。一般的に、組成物は、活性成分を液体担体、細かく粉砕した固体担体、またはその双方と均一に密接に混合すること、および必要であれば、産物を所望の形状に成形することによって調製される。例えば、錠剤は、選択的に一つまたはそれ以上の補助成分と共に、圧縮または成型によって調製することができる。圧縮された錠剤は、適した機械において粉末または顆粒のような自由に流動する形での活性成分を、選択的に結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、界面活性剤、または分散剤と混合して圧縮することによって調製することができる。成型された錠剤は、不活性な液体希釈剤によって湿らせた粉末化合物の混合物を適した機械において成型することによって作製することができる。望ましくは、それぞれの錠剤は、活性成分約１ ｍｇ〜約５００ ｍｇを含み、それぞれのカシェ剤またはカプセル剤は、活性成分約１〜約５００ ｍｇを含む。
【００９６】
非経口投与に適した本発明の薬学的組成物は、例えば、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と適当に混合した水においてこれらの活性化合物の溶液または懸濁液として調製することができる。分散剤はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびその油中での混合物として調製することができる。通常の保存および使用条件では、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するために保存剤を含む。
【００９７】
注射での使用に適した薬学的製剤の例には、滅菌水溶液または分散剤、および滅菌注射用溶液または分散液との即時調製用滅菌粉末が含まれる。全ての場合において、剤形は無菌的で、容易なシリンジ操作性が存在する程度に流動性でなければならない。剤形は、製造および保存条件で安定でなければならず、細菌および真菌のような微生物の混入作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール）、その適した混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒体となりうる。
【００９８】
上記の担体成分の他に、上記の薬学的製剤には、適当であれば、希釈剤、緩衝材、着香料、結合剤、界面活性剤、濃化剤、潤滑剤、保存剤（抗酸化剤を含む）等のような一つまたはそれ以上のさらなる担体成分、および意図するレシピエントの血液に対して製剤を等張にする目的のために含まれる物質を含んでもよいと理解すべきである。
【００９９】
ヒストン脱アセチル酵素阻害剤の診断的使用
ヒストン脱アセチル酵素阻害剤は、甲状腺新生物を有することがわかっている、または有することが疑われる被験者に経腸または非経口投与することができる。ヒストン脱アセチル酵素阻害剤の投与は、甲状腺新生物の診断において、例えば甲状腺新生物の存在および程度の決定を可能にすることによって役立ちうる。ヒストン脱アセチル酵素阻害剤の投与はまた、甲状腺新生物に関する診断試験の感度、特異性、または予想される価値を増強しうる。
【０１００】
甲状腺または他の領域における機能的または非機能的甲状腺組織の位置は、おそらく、外部シンチスキャン技術によって特定することができる。基礎となる原理は、甲状腺組織によって異なるように蓄積される同位元素をインサイチューで検出および定量することができるという点である。データをデジタル化して視覚ディスプレイに変換することができる。そのような蓄積された同位元素は、Ｌａｒｓｅｎら、Ｔｈｅ Ｔｈｙｒｏｉｄ Ｇｌａｎｄ、第１１章、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、Ｊ． Ｗｉｌｓｏｎ編、１９９８に記載される外部シンチレーション検出器によって検出してもよい。
【０１０１】
甲状腺造影剤は一般的に、Ｎａ＋／Ｉ−共搬体のような甲状腺特異的遺伝子によって甲状腺に取り込まれる。このように、ヒストン脱アセチル酵素阻害剤が甲状腺特異的遺伝子、例えばＮａ＋／Ｉ−共搬体および／またはＴＧの発現を増加させることができることによって、甲状腺細胞のそのような造影剤の取り込みおよび／または保持能が増強される。このように、ヒストン脱アセチル酵素阻害によって、甲状腺組織は外的に、例えば外部シンチスキャンによってより容易に検出可能となる。
【０１０２】
ヒストン脱アセチル酵素阻害剤の投与は、一般的な多様な臨床状況において特に有用となりうる。例えば、分化の不十分な甲状腺癌はしばしば、それらが診断物質の濃縮能を失っているために検出することが難しい。理論に拘束されることなく、これはＮａ＋／Ｉ−共搬体および／またはサイログロブリンのような甲状腺特異的遺伝子の発現の減少に関連する可能性がある。ヒストン脱アセチル酵素阻害剤の投与は、分化の不十分な甲状腺癌における甲状腺特異的遺伝子の発現を増強し、それによって診断物質の取り込みが増強され、甲状腺癌はより容易に検出可能となる。このように、そのような試験の感度および正の予測値が改善され、それらの結果は臨床的により有用となる。Ｇｏｌｄｍａｎ、Ｑｕａｎｔｉｔｉｖｅ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅａｓｏｎｉｎｇ、第３章、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１４版、Ａ． Ｆａｕｃｉ編、著作権１９９８年を参照のこと。
【０１０３】
甲状腺癌の検出に関する問題は、例えば、甲状腺切除術、放射活性ヨウ素、抗癌化学療法剤、または外部放射線照射による処置後に起こりうる。
【０１０４】
いくつかの放射性同位元素が甲状腺の造影に用いられている。９９ｍＴｃ−ペルテクネテート（ＴｃＯ−４）は、一価の陰イオンであり、ヨウ化物と同様に、Ｎａ＋／Ｉ−共搬体によって甲状腺において能動的に濃縮される。９９ｍＴｃの物理的半減期が短いこと（６時間）およびそれが甲状腺に一過性に留まることから、標準的な用量によって甲状腺に輸送される放射線は非常に低くなる。その結果、分画の取り込みが低すぎて放射性ヨウ素によるシンチスキャンを行うことができない場合、大量（＞３７ ＭＢｑ［１ ｍＣｉ］）の投与によって高い計数率と甲状腺の適切な造影を行うことができる。ペルテクネテートは通常、１回静脈内投与として投与され、造影は約３０分後に行う。連続造影によって、甲状腺の血流と同位元素の蓄積の動力学に関して可能性がある研究を行うことができる。
【０１０５】
ヨウ素の三つの放射活性同位元素が甲状腺の造影に用いられている。１３１Ｉは、過去に一般的に用いられていたが、甲状腺癌の機能的転移を求める場合にはなおも有用である。１２５Ｉの物理的半減期（６０日）は、１３１Ｉ（８日）より長いが、その放射線エネルギーがより低いために、投与された放射活性の単位あたりの甲状腺に対する線量の輸送は放射線照射量１３１Ｉによって輸送される場合の約３分の２に過ぎない。第三の同位元素１２３Ｉは、多くの点において１２５Ｉまたは１３１Ｉよりよい。その短い半減期およびβ放射線が存在しないことによって、甲状腺に対する線量は１３１Ｉの同等の用量によって輸送された場合の約１％である。三つ全てのヨウ素同位元素は、その正常な位置で甲状腺の満足のゆく像を提供する。甲状腺に対する線量が低いことから、１２３Ｉはヒト小児科の現場において甲状腺シンチグラフィーにとって有用である。
【０１０６】
実施例１
細胞生存率に及ぼすヒストン脱アセチル酵素阻害剤の影響
本実施例は、ヒストン脱アセチル酵素阻害剤であるＦＲ９０１２２８が有意に細胞障害性ではないことを証明する。特に、１ ｎｇ／ｍｌまでのＦＲ９０１２２８に７２時間曝露しても、異なる四つの甲状腺細胞株に対して有意に細胞障害性ではなかった。
【０１０７】
方法および材料
ＦＴＣ１３３およびＦＴＣ２３６細胞は、ヒト濾胞性甲状腺癌の原発腫瘍（ＦＴＣ １３３）および結節性転移（ＦＴＣ ２３６）から得た培養物に由来した。ＦＴＣ １３３およびＦＴＣ２３６細胞は、当初ＴＳＨを含む培地において維持したが、これは、ＴＳＨが細胞の増殖速度に全く影響を及ぼさないことが判明した後に中止した。未分化甲状腺癌細胞株ＳＷ−１７３６およびＫＡＴ−４は、ヒト未分化甲状腺癌腫瘍の初代培養に由来した。
【０１０８】
これらの四つの細胞株のそれぞれに、様々な濃度のＦＲ９０１２２８（０．０１ ｎｇ／ｍｌ、０．１ ｎｇ／ｍｌ、１ ｎｇ／ｍｌ、１０ ｎｇ／ｍｌ）を７２時間曝露した後、Ｍｏｓｍａｎｎ、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ６５：５５〜６３、１９８３およびＤｅｎ Ｂｏｅｒら、Ｂｒ． Ｊ． Ｈａｅｍ． １０５：８７６〜８８２、２０００に記載されるように、３−［４，５−ジメチルチアゾル−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイ法を用いて細胞生存率を決定した。ＭＴＴアッセイ法は、細胞死に関連したミトコンドリア代謝活性の喪失に関する比色アッセイ法である。
【０１０９】
結果および結論
本実施例は、１ ｎｇ／ｍｌ濃度のＦＲ９０１２２８に対する７２時間の曝露が、調べた四つの細胞タイプ（ＦＴＣ １３３、ＦＴＣ２３６、ＳＷ−１７３６およびＫＡＴ−４）の如何なるものに関しても有意に細胞障害性ではないことを証明した。このように、細胞ＦＲ９０１２２８を評価するためのその後の方法は、ＦＲ９０１２２８誘導細胞障害性による結果と混同されないように、１ ｎｇ／ｍｌ ＦＲ９０１２２８を用いれば安全に行うことができると思われる。したがって、その後の実施例において記述した方法は、特に明記していない限り１ ｎｇ／ｍｌ ＦＲ９０１２２８で行った。
【０１１０】
実施例２
ＦＲ９０１２２８は甲状腺癌細胞株においてヒストン脱アセチル酵素を阻害する
ＦＲ９０１２２８がヒストンのアセチル化を阻害するために有効であることを証明するために、ヒストンのアセチル化の程度をＦＲ９０１２２８処置および対照処置甲状腺癌細胞において評価した。これらの免疫蛍光試験から、１ ｎｇ／ｍｌ ＦＲ９０１２２８による７２時間の処置によって、より分化した（ＦＴＣ ２３６）および分化度の低い（ＳＷ−１７３６）甲状腺癌細胞の双方においてヒストンアセチル化が顕著に増加することが示された。このように、１ ｎｇ／ｍｌ ＦＲ９０１２２８は、有意な細胞障害性を引き起こすことなく、甲状腺癌細胞においてヒストンの脱アセチル化を有効に阻害した。
【０１１１】
方法および材料
ヒストンのアセチル化は、免疫蛍光顕微鏡によって検出した。この実験アプローチにおいて、固定細胞を、アセチル化ヒストンに特異的に結合する一次抗体に曝露した後、一次抗体に結合するＦＩＴＣ標識二次抗体に曝露した。アセチル化ヒストンを含む細胞は、アセチル化ヒストンの存在を反映する核蛍光を示す。
【０１１２】
ＦＴＣ ２３６およびＳＷ−１７３６細胞を実施例１に記載するように培養して、１ ｎｇ／ｍｌ ＦＲ９０１２２８と共に７２時間処置した。対照ＦＴＣ ２３６およびＳＷ−１７３６にはＦＲ９０１２２８を処置しなかったが、それ以外はＦＲ９０１２２８曝露細胞と同じように処置した。７２時間後、それぞれの培養物をトリプシンによって処置して、回収し、低速遠心を行って細胞沈降物を形成した。それぞれの沈降物からの細胞を顕微鏡スライドガラス上に載せて、９５％エタノール／５％酢酸によって室温で１分間固定した。固定後、スライドガラスを燐酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）によって１５分間２回洗浄して、８％ウシ血清アルブミンのＰＢＳ溶液によって室温で１時間処置し、ＰＢＳによって１５分間洗浄した。
【０１１３】
次に、固定細胞を５ μｇ／ｍｌ抗αアセチル化ヒストンＨ３の２％ウシ血清アルブミンＰＢＳ溶液と共に４℃で一晩インキュベートした（アップステートバイオテクノロジー（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、レークプラシッド、ニューヨーク州から得た抗体）。その後、細胞をＰＢＳによって室温で５分間２回洗浄した後、ウマ抗ウサギＦＩＴＣ結合二次抗体（ベクターラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）、バーリンガム、カリフォルニア州）と共にインキュベートした。スライドガラスをＰＢＳによって１５分間３回洗浄してから、ＤＡＰＩ含有色あせ防止化合物（ベクターラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）、バーリンガム、カリフォルニア州）によって対比染色した。
【０１１４】
結果および結論
対照細胞を調べたところ、適度の核蛍光バックグラウンドレベルを認めたが、分化したＦＴＣ ２３６細胞では未分化ＳＷ−１７３６細胞の場合より大きいことが判明した。対照的に、ＦＲ９０１２２８処置ＦＴＣ ２３６およびＳＷ−１７３６細胞は強い核蛍光を示し、このことは対照細胞と比較してヒストンアセチル化が顕著に増加していることを反映した。このように、１ ｎｇ／ｍｌ ＦＲ９０１２２８による処置によって、分化度の高いおよび分化度の低い甲状腺癌細胞株のいずれにおいてもヒストンのアセチル化は顕著に増加する。
【０１１５】
実施例３
ヒストン脱アセチル酵素は甲状腺特異的プロモーターを活性化する
サイログロブリン（ＴＧ）は、正常な完全に分化した甲状腺細胞によって産生され、他の細胞タイプでは産生されない甲状腺ホルモン結合蛋白質である。ＴＧの発現は、転写レベルで、甲状腺特異的ＴＧエンハンサー−プロモーターエレメントの活性化によって主として調節される。
【０１１６】
甲状腺癌では、甲状腺特異的遺伝子発現は障害されているか、または失われている。甲状腺特異的遺伝子発現がこのように失われることは、癌様表現型を維持するために重要な要因となる可能性がある。甲状腺特異的遺伝子発現を促進する物質は、甲状腺癌細胞の分化を促進して、それによってこれらの腫瘍の生物学的に攻撃的な挙動を減少させる可能性がある。
【０１１７】
ヒストン脱アセチル酵素阻害が甲状腺特異的遺伝子発現に及ぼす影響を調べるために、サイログロブリンプロモーター活性に及ぼすＦＲ９０１２２８の作用を示した。これは、１ ｎｇ／ｍｌ ＦＲ９０１２２８が甲状腺癌細胞におけるＴＧプロモーター−エンハンサー活性を顕著に増加することを示した。
【０１１８】
方法および材料
ＦＴＣ ２３６およびＳＷ−１７３６細胞に、ＴＧプロモーター−エンハンサーエレメントに機能的に結合したルシフェラーゼをコードするレポータープラスミドを一過性にトランスフェクトした。このレポータープラスミドをトランスフェクトした細胞は、ＴＧプロモーターエンハンサーの活性化時にルシフェラーゼを発現すると思われる。細胞溶解物におけるルシフェラーゼ活性は、細胞におけるＴＧプロモーターエンハンサー活性を正確に反映する。
【０１１９】
陽性対照として、ＦＴＣ ２３６およびＳＷ−１７３６細胞に、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターエンハンサーに機能的に結合したルシフェラーゼをコードするレポータープラスミドをトランスフェクトした。ＴＫプロモーターエンハンサーは、構成的に活性なプロモーターエレメントであり、このことはこれが甲状腺特異的でなく、全ての細胞タイプにおいて十分に活性であることを意味している。
【０１２０】
トランスフェクションに関して、ＦＴＣ ２３６およびＳＷ−１７３６細胞にプラスミドＤＮＡ ０．５ μｇ、トランスファーストトランスフェクション試薬（ＴｒａｎｓＦａｓｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社、マディソン、ウィスコンシン州）４．５ μｌ、およびＲＰＭＩ培地２００ μｌのトランスフェクション混合物に曝露した。プラスミドＤＮＡは、ＴＧ−ルシフェラーゼ（ＴＧ−ｌｕｃ）構築物またはＴＫ−ルシフェラーゼ（ＴＫ−ｌｕｃ）構築物のいずれかであった。トランスフェクションは全て１試料あたり３個ずつ行った。
【０１２１】
細胞をトランスフェクション混合物と１時間インキュベートした後、細胞を１ ｎｇ／ｍｌ ＦＲ９０１２２８の存在下または非存在下で２日間培養した。次に、細胞を回収して溶解し、細胞蛋白質の抽出物を得た。抽出物における総蛋白質濃度は、バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）蛋白質アッセイ系（バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社、リッチモンド、カリフォルニア州）を用いて決定した。ルシフェラーゼ活性は、ルシフェラーゼアッセイ系（プロメガ社、マディソン、ウィスコンシン州）を用いて決定し、総蛋白質濃度に対して標準化した。
【０１２２】
結果
結果を図２に示す。ＴＫ ｌｕｃ−トランスフェクトした細胞における標準化したルシフェラーゼ活性に１００％の値を割付して、ＴＧ ｌｕｃ−トランスフェクトした細胞における標準化したルシフェラーゼ活性を、相対的ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）としてこれと比較して表記した。
【０１２３】
ＨＤＩ処置を行わなかった場合、ＴＧ ｌｕｃ−トランスフェクトした細胞における標準化したルシフェラーゼ活性は、ＴＫ ｌｕｃトランスフェクト細胞において認められた場合より小さかった。比較的よく分化したＦＴＣ １３３およびＦＴＣ ２３６細胞では、ＴＧ ｌｕｃ−トランスフェクト細胞のＲＬＵは約５０〜８０％であった。分化度の低いＳＷ−１７３６およびＫＡＴ−４細胞では、ＴＧ ｌｕｃトランスフェクションによってＲＬＵは約３０％となった。このように、基準値ＴＧプロモーターエンハンサー活性は、分化した甲状腺癌細胞では分化度の低い未分化細胞より大きい。
【０１２４】
１ ｎｇ／ｍｌ ＦＲ９０１２２８による処置は、ＴＫ ｌｕｃトランスフェクト細胞においてルシフェラーゼ活性に影響を及ぼさなかった。しかし、ＦＲ９０１２２８処置によって、ＴＧ−ｌｕｃトランスフェクト細胞におけるＲＬＵは顕著に増加した。例えば、ＦＴＣ １３３およびＦＴＣ ２３６細胞におけるＲＬＵは約１０００％であり、未処置細胞において認められた場合よりルシフェラーゼ活性の１０倍を超える増加を示した。分化度の低いＳＷ−１７３６およびＫＡＴ−４細胞では、ＲＬＵは４００〜５００％であり、この場合も未処置細胞において認められたＲＬＵに対して１０倍を超える増強を示した。
【０１２５】
これらの結果は、ＨＤＩ処置が甲状腺癌細胞タイプにおいて甲状腺特異的ＴＧプロモーターエンハンサーの活性を顕著に増強することを証明している。
【０１２６】
実施例４
ヒストン脱アセチル酵素を阻害すると甲状腺特異的遺伝子の発現が増加する
ＴＧプロモーター活性のＨＤＩ増強は生理的に関連するため、ＨＤＩ処置はまた、ＴＧプロモーター調節遺伝子の発現も増加させる。本実施例において、ＦＲ９０１２２８処置によって、二つのＴＧプロモーター調節遺伝子の発現が顕著に増加することが証明された。
【０１２７】
材料および方法
ＲＴ ＰＣＲおよびノザンブロット分析を用いて、ＦＲ９０１２２８処置および未処置甲状腺癌細胞におけるサイログロブリンおよびＮａヨウ化物共搬体（Ｎａ＋／Ｉ−共搬体、またはＮＩＳ）発現が転写的に調節されることを証明した。ＲＴ ＰＣＲおよびノザンブロット分析は、標準的な分子生物学の参考となる多くの研究、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９８において詳細に説明されている。
【０１２８】
総ＲＮＡは、ＲＮＡ ＳＴＡＴ−６０（テルテスト社（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ， Ｉｎｃ））を用いて、ＦＲ９０１２２８処置および未処置甲状腺癌細胞から、ＦＲ９０１２２８含有または対照溶液を細胞培養物に加えた２４時間、４８時間、および７２時間後に抽出した。ＲＮＡも同様に、比較目的のために正常な甲状腺細胞から抽出した。抽出したＲＮＡは、ノザンブロットに関してはこれ以上改変せずに用いた。ＲＴ ＰＣＲの場合、抽出したＲＮＡは、標準的な技術を用いてｃＤＮＡに逆転写した。
【０１２９】
ヒトサイログロブリン発現のＰＣＲ分析のために用いられるオリゴヌクレオチドプライマーは以下の通りであった：
2005507231.tif 000003
2005507231.tif 000004
【０１３０】
これらのプライマーを用いると、ヒトサイログロブリンｃＤＮＡ鋳型が存在することは、２１９ ｂｐ ＰＣＲ産物によって反映される。
【０１３１】
ヒトＮａ＋／Ｉ−共搬体発現のＰＣＲ分析のために用いられるオリゴヌクレオチドプライマーは以下の通りであった：
2005507231.tif 000005
2005507231.tif 000006
【０１３２】
これらのプライマーを用いると、ヒトＮａ＋／Ｉ−共搬体ｃＤＮＡ鋳型が存在することは、３０３ ｂｐ ＰＣＲ産物によって反映される。
【０１３３】
結果
未処置ＡＴＣ細胞では、ＴＧもＮＩＳ発現も検出できなかった。このように、これらの遺伝子は、未処置の未分化甲状腺癌細胞では発現されない。未処置ＦＴＣ細胞では、非常にかすかなバンドがＲＴ ＰＣＲによって検出されたが、ノザンブロットでは検出されなかった。このことは、より分化した甲状腺癌細胞ではＴＧおよびＮａ＋／Ｉ−共搬体の双方が非常に低レベルで発現されることを示している。
【０１３４】
ＦＴＣ細胞において、ＴＧおよびＮａ＋／Ｉ−共搬体発現の増加は、ＦＲ９０１２２８の添加後ＲＴ ＰＣＲおよびノザンブロット分析の双方によって２４時間以内に検出され、７２時間後ではさらなる増加を認めた。ＡＴＣ細胞において、発現の増加は、ＦＲ９０１２２８の添加後４８時間に初めて認められ、ＦＲ９０１２２８の曝露後７２時間ではさらなる増加を認めた。対照処置細胞は、ＴＧまたはＮａ＋／Ｉ−共搬体の発現の増加を示さなかった。
【０１３５】
これらの実験は、ＨＤＩ処置が甲状腺癌細胞において甲状腺特異的遺伝子の発現を顕著に増加する証明を提供する。
【０１３６】
実施例５
ヒストン脱アセチル酵素を阻害するとＮａ−Ｉ共搬体の発現が増加する
遺伝子の転写が増加しても、細胞における機能的蛋白質レベルは必ずしも増加しない。ｍＲＮＡおよび蛋白質安定性のような無数の他の要因が蛋白質濃度に影響を及ぼす。本実施例は、（１）機能的Ｎａ＋／Ｉ−共搬体が甲状腺癌細胞において発現されること、および（２）Ｎａ＋／Ｉ−共搬体の発現がＨＤＩ処置によって増加しうることを証明する。
【０１３７】
これらの実験は、甲状腺癌細胞が低レベルの機能的Ｎａ＋／Ｉ−共搬体を含むが、これらの低レベルはＨＤＩ処置によって顕著に増加しうることを明らかにした。
【０１３８】
方法および材料
Ｎａ＋／Ｉ−共搬体の機能を評価するために、ヨウ素蓄積実験を行った。ＦＴＣ １３３、ＦＴＣ ２３６、ＳＷ−１７３６、およびＫＡＴ−４細胞に１ ｎｇ／ｍｌ ＦＲ９０１２２８を２日間もしくは３日間処置したか、または未処置のままとした。次に細胞を、約２ μＣｉの担体不含Ｎａ１２５Ｉ（デュポン（Ｄｕ Ｐｏｎｔ）ＮＥＮ社、ボストン、マサチューセッツ州）および３０μＭ Ｎａ１２５Ｉを含むハンクス緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ；ライフテクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ）、エッゲンスタイン、ドイツ）０．５ ｍｌ中で１０分間インキュベートした。過塩素酸研究の場合、放射標識ヨウ素を添加した直後に、ＮａＣｌＯ４を１００×ＨＢＳＳ溶液として、最終濃度３０μＭおよび１００μＭとなるように加えた。過剰量の放射標識ヨウ素を除去した後、細胞に蓄積した１２５Ｉの量をγ計数によって決定した。
【０１３９】
結果
ＦＲ９０１２２８処置を行わない場合、ＦＴＣ細胞におけるヨウ素の蓄積は、ＡＴＣ細胞より高かった。この結果は、ＲＴ ＰＣＲ研究において認められたＮａ＋／Ｉ−共搬体の発現がより高いこと（実施例４）と一致し、同様にＡＴＣ細胞と比較してＦＴＣ細胞のより分化した状態と一致する。
【０１４０】
ヨウ素の蓄積の顕著な増加は、ＦＲ９０１２２８を添加した２日後および３日後に四つの細胞株において認められた。ヨウ素の蓄積は、過塩素酸ナトリウムによって用量依存的に阻害され、ヨウ素の蓄積がＮａ＋／Ｉ−共搬体の活性の結果であったことを示している。このように、ＦＴＣおよびＡＴＣ甲状腺癌細胞の双方において、ヒストン脱アセチル酵素阻害は、Ｎａ＋／Ｉ−共搬体の転写を誘導し（実施例４）、機能的なＮａ＋／Ｉ−共搬体の発現を増加させた。
【０１４１】
実施例５
甲状腺癌の治療におけるヒストン脱アセチル酵素阻害
本明細書に含まれる開示は、ヒトおよび動物被験者における甲状腺癌の治療に対する新規アプローチを可能にする。ヒストン脱アセチル酵素阻害剤の投与は、本明細書において甲状腺癌治療において利用される可能性がある有益な作用を有することが示されている。例えば、ＨＤＩの投与によって、甲状腺癌細胞は分化誘導して、それによって急速な増殖および転移傾向のような生物学的に攻撃的な挙動が減少する。さらに、ＨＤＩ投与は、甲状腺癌細胞における機能的Ｎａ＋／Ｉ−共搬体およびＴＧのレベルを増加させる。機能的Ｎａ＋／Ｉ−共搬体を発現する細胞がより多くのヨウ素を蓄積し、したがって、放射活性ヨウ素治療に対してより感受性が高くなる。ＴＧの発現の増加はまた、甲状腺癌細胞における細胞内ヨウ素の蓄積を増強する。
【０１４２】
１３１Ｉ放射線治療と組み合わせたＨＤＩ阻害剤治療のプロトコール
甲状腺癌被験者に、ヒストン脱アセチル酵素阻害剤の治療的有効量を投与する。望ましければ、ＨＤＩ治療の治療的有効性は、「トレーサー」、例えば診断用量の１３１Ｉ（例えば、ＭｃＤｏｕｇａｌｌら、Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． Ｃｏｍｍｕｎ． １８：５０５〜５１０、１９９７）を投与後に放射性ヌクレオチドスキャンによってモニターする。他の適したトレーサーには、１２３Ｉおよび９９ｍＴｃ標識ペルテクニテートが含まれる。そのような放射性核種スキャンは、トレーサーの投与後のトレーサーの蓄積の増加を追跡および定量するために、ＨＤＩ阻害剤治療の前、あいだ、および後に行うことができる。ＨＤＩ阻害剤治療は、トレーサーの蓄積を約２倍、約５倍、約１０倍、または１０倍以上増加させる。
【０１４３】
一つの態様において、被験者はこれまで治療をうけていない。もう一つの態様において、被験者は、甲状腺癌のために甲状腺切除術および／または放射活性ヨウ素治療を受けていた。いくつかの場合において、被験者は、体内の一つまたはそれ以上の部位に残留および／または転移性甲状腺癌を有するまたは有することが疑われる被験者であり、方法は、残留および／または転移性甲状腺癌を治療する方法である。
【０１４４】
ヒストン脱アセチル酵素阻害剤の治療的有効量による治療後またはそれと同時に、放射活性ヨウ素治療を行う。放射性ヨウ素治療は、甲状腺ホルモン補充を中止して、それによって臨床的甲状腺機能低下症を誘導することを伴ってもよい。甲状腺機能低下状態は、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）の下垂体分泌を誘発して、これはＮａ＋／Ｉ−共搬体活性およびＴＧ発現の増加に関してＨＤＩ治療と相加的または相乗的となり、それによって１３１Ｉの取り込みおよび細胞内蓄積の増加を誘導する。一つの代用として、ＴＳＨはまた、Ｍｅｉｅｒら、Ｊ． Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ． ７８：１８８、１９９４に記載されるように外から投与してもよい。外因性のＴＳＨもまた、Ｎａ＋／Ｉ−共搬体活性およびＴＧ発現の増加に関してＨＤＩ治療と相加的または相乗的となる。
【０１４５】
放射活性ヨウ素治療はしばしば、大量の１３１Ｉ（例えば、５０〜５００ ｍＣｉを７０ ｋｇのヒト被験者に）として投与される。細胞内放射活性ヨウ素蓄積のＨＤＩ増強によって、放射活性ヨウ素治療の有効性が増強され、または抗腫瘍作用を失うことなく低用量を投与することができる。例えば、ＨＤＩ治療が甲状腺癌細胞におけるヨウ素蓄積を５倍増加すれば、１３１Ｉの投与量を例えば、１〜５０ ｍＣｉを７０ ｋｇのヒト被験者に減少することが可能である。用量の大きさは体重、体表面積および／または種に関して調節してもよい。
【０１４６】
放射活性ヨウ素治療の他に、ＨＤＩ治療は他の如何なる治療とも組み合わせることができる。例えば、ＨＤＩ治療を受ける被験者に対して、ＨＤＩ治療とほぼ同時に、またはＨＤＩ治療の前もしくは後に外部放射線照射または抗癌化学療法を行ってもよい。ＨＤＩ治療は、これらの他の治療的様相と相化的または相乗的となりうる。
【０１４７】
放射活性ヨウ素の投与後、甲状腺細胞が放射線によって死滅したため、およびほとんどの被験者が同様に甲状腺切除術を受けるという事実のために、被験者は甲状腺機能低下症となる。したがって、甲状腺ホルモン補充療法を開始する、または再開する。
【０１４８】
特に、残留甲状腺癌が存在する場合には、この、または類似のプロトコールを一定間隔で繰り返してもよい（例えば、約２〜２４ヶ月ごと、または約６〜１２ヶ月ごとに）。
【０１４９】
実施例６
アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたＨＤＩ阻害
本実施例は、アンチセンス化合物、特にヒストン脱アセチル酵素をコードする核酸分子の機能を調節して、最終的に産生されるヒストン脱アセチル酵素の量を減少させるために用いられるオリゴヌクレオチドを用いる（参照として本明細書に組み入れられる、国際公開公報第００７１７０３Ａ２号を参照されたい）。これは、核酸と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、好ましくはヒストン脱アセチル酵素イソ型をコードするｍＲＮＡを提供することによって行われる。
【０１５０】
オリゴヌクレオチドのようなアンチセンス化合物と、それがハイブリダイズするその相補的な核酸標的とのこの関係は一般的に「アンチセンス」であると呼ばれる。オリゴヌクレオチドを選択した核酸標的に「ターゲティング」することは、通常、その機能が調節される核酸配列を同定することによって始まる。ヒストン脱アセチル酵素ｍＲＮＡは、現在好ましい標的である。ヒストン脱アセチル酵素ｍＲＮＡには、三文字遺伝子コードを用いて蛋白質をコードする情報のみならず、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、５’キャップ領域、およびイントロン／エキソン結合リボヌクレオチドとして当業者に既知の領域を形成する関連するリボヌクレオチドが含まれる。標的に対して十分に相補的である、すなわち治療的に有効なオリゴヌクレオチドとして機能するために十分にかつ十分な特異性でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを選択する。
【０１５１】
本開示の意味において、「ハイブリダイゼーション」とは、通常、反対の核酸鎖、または核酸鎖の二つの領域に存在する相補的な塩基間の、ワトソン−クリック塩基対形成としても知られる水素結合を意味する。グアニンとシトシンは、それらのあいだの三つの水素結合を形成することが知られている相補的塩基の例である。アデニンおよびチミンは、それらのあいだに二つの水素結合を形成する相補的塩基の例である。
【０１５２】
「特異的にハイブリダイズ可能」および「相補的」とは、安定で特異的な結合がＤＮＡまたはＲＮＡ標的とオリゴヌクレオチドとのあいだに起こるように、十分な相補性の程度を意味するために用いられる用語である。
【０１５３】
オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズ可能となるためにその標的核酸配列に対して１００％相補性である必要はないと理解される。オリゴヌクレオチドは、標的に対するオリゴヌクレオチドの結合が標的分子の正常な機能を妨害して、有用性を喪失し、特異的結合が望ましい条件で、すなわちインビボアッセイ法もしくは治療的治療の場合では生理的条件、またはインビトロアッセイ法の場合には、アッセイ法が行われる条件で、非標的配列に対するオリゴヌクレオチドの非特異的結合を回避するために十分な程度の相補性が存在する場合に特異的にハイブリダイズ可能である。
【０１５４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドとｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションは、ｍＲＮＡの一つまたはそれ以上の正常な機能を妨害する。妨害されるｍＲＮＡの機能には、例えば、ＲＮＡの蛋白質翻訳部位への転位、ＲＮＡからの蛋白質の翻訳、一つまたはそれ以上のｍＲＮＡ種を生じるためのＲＮＡのスプライシング、およびＲＮＡが関係する可能性がある触媒活性のような全ての重要な機能が含まれる。ＲＮＡに対する一つもしくはそれ以上の特異的蛋白質の結合もまた、ＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって妨害される可能性がある。
【０１５５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドをデザインするために、ヒストン脱アセチル酵素のような所望の分子からのｍＲＮＡ配列を調べる。ＴＴＴＴＴＴＴＴのような多数の反復配列を含む配列の領域は、それらが特異性を欠損することから望ましくない。いくつかの異なる領域を選択することができる。それらの中で、以下の特徴を有するオリゴヌクレオチドを選択する：溶液中で最善のコンフォメーションを有するオリゴヌクレオチド；ハイブリダイゼーション特徴に関して最適なオリゴヌクレオチド；および二次構造を形成する可能性が低いオリゴヌクレオチド。二次構造を形成する性向を有するアンチセンス分子はあまり望ましくない。
【０１５６】
このような調節は、当技術分野で一般的な方法、例えばヒストン脱アセチル酵素ｍＲＮＡ発現のノザンブロットアッセイ法、本出願の実施例において教示される逆転写ＰＣＲ、またはヒストン脱アセチル酵素蛋白質発現のウェスタンブロットもしくはＥＬＩＳＡアッセイ法、またはヒストン脱アセチル酵素蛋白質発現の免疫沈降アッセイ法によって測定することができる。
【０１５７】
本発明において有用なアンチセンス化合物の特定の例には、改変骨格または非天然のヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドが含まれる。本明細書において定義するように、改変骨格を有するオリゴヌクレオチドには、骨格に燐原子を保持するオリゴヌクレオチドおよび骨格に燐原子を有しないオリゴヌクレオチドが含まれる。本明細書の目的に関して、当技術分野において時に言及されているように、そのヌクレオシド間結合に燐原子を含まない改変オリゴヌクレオチドもまたオリゴヌクレオシドであると見なすことができる。
【０１５８】
改変オリゴヌクレオチド骨格には、例えば、ホスホロチオエート、カイラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネートおよびカイラルホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホラミデートおよびアミノアルキルホスホラミデートを含むホスホラミデート、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、および正常な３’−５’結合を有するボラノホスホネート、これらの２’−５’結合類似体、ならびにヌクレオシド単位の隣接する対が３’−５’から５’−３’に、または２’−５’から５’−２’に結合している、逆極性を有する類似体が含まれる。様々な塩、混合塩、および遊離の核酸型も同様に含まれる。
【０１５９】
上記の燐含有結合の調製物を教示する代表的な米国特許には、米国特許第３，６８７，８０８号、第４，４６９，８６３号、第４，４７６，３０１号、第５，０２３，２４３号、第５，１７７，１９６号、第５，１８８，８９７号、第５，２６４，４２３号、第５，２７６，０１９号、第５，２７８，３０２号、第５，２８６，７１７号、第５，３２１，１３１号、第５，３９９，６７６号、第５，４０５，９３９号、第５，４５３，４９６号、第５，４５５，２３３号、第５，４６６，６７７号、第５，４７６，９２５号、第５，５１９，１２６号、第５，５３６，８２１号、第５，５４１，３０６号、第５，５５０，１１１号、第５，５６３，２５３号、第５，５７１，７９９号、第５，５８７，３６１号、第５，６２５，０５０号、および第５，６９７，２４８号が含まれるがこれらに限定されない。
【０１６０】
本発明の原理を応用してもよい多くの可能性がある態様を考慮して、説明した態様は本発明の例であって、本発明の範囲を制限するものと解釈してはならないと認識すべきである。むしろ、本発明の範囲は、以下の請求の範囲によって定義される。したがって、われわれは、これらの請求の範囲の範囲および精神に入る全てのものをわれわれの発明であると主張する。
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒト被験者における甲状腺の図（図１Ａ）、および甲状腺ホルモンが産生されて貯蔵される（図１Ｂ）甲状腺濾胞の拡大図である（図１Ｂ）。図１Ｃは、図１Ｂに示す甲状腺濾胞の拡大図であり、甲状腺濾胞細胞の機能を示す。甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）は、甲状腺特異的遺伝子の発現を活性化して、図に示すプロセスの全てを活性化する。細胞は、Ｎａ＋／Ｉ−共搬体（ＮＩＳ）を通してヨウ化物（Ｉ−）とナトリウムとを取り込む。細胞はまた、サイログロブリン（ＴＧ）を合成して、これを濾胞内腔に輸送する。内腔表面において、ヨウ化物は酸化され、ＴＧ上のチロシン残基に酵素的に結合する。ＴＧチロシン残基は、酵素的にカップリングして、甲状腺ホルモン、図の場合ではチロキシン（Ｔ４）を形成する。改変されたサイログロブリンは、エンドサイトーシスによって内腔から濾胞細胞の先端に輸送される。エンドライソゾームにおいて、ＴＧは分解されて活性なＴ４を放出する。
【図２】甲状腺癌細胞におけるサイログロブリンプロモーターエンハンサーの活性に及ぼすヒストン脱アセチル酵素阻害剤の影響を示す棒グラフである。四つの甲状腺癌細胞株に、ルシフェラーゼレポーター遺伝子に機能的に結合したサイログロブリンプロモーターエンハンサーエレメントを含むプラスミドをトランスフェクトさせた。次に、トランスフェクトした細胞に、処置を行わないか、またはヒストン脱アセチル酵素阻害剤ＦＲ９０１２２８（デシペプチドとしても知られる）による７２時間の処置のいずれかを行った。細胞溶解物におけるルシフェラーゼ活性を決定した。ルシフェラーゼ活性に及ぼすＦＲ９０１２２８の影響を決定し、未処置細胞（白い棒）対ＦＲ９０１２２８処置細胞におけるルシフェラーゼ活性の棒グラフとしてプロットする。
【図３】甲状腺癌の放射活性ヨウ素の取り込み能に及ぼすヒストン脱アセチル酵素阻害の影響を示す棒グラフである。図３Ａは、四つの甲状腺癌細胞株における１２５Ｉ取り込みを示し、ＦＲ９０１２２８処置（表記のように２日間または３日間の処置）細胞における取り込みを未処置細胞における取り込みと比較する。図３Ｂは、ＦＲ９０１２２８処置甲状腺癌細胞における１２５Ｉ取り込みに及ぼす過塩素酸ナトリウム処置の影響を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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