(57)【要約】  細胞、組織又は器官において、ヘミチャンネル機能を調節する組成物及び方法を本明細書に於いて開示する。本発明はまた、特にコネキシンのリン酸化を調節することができる化合物を検出するための有用なスクリーニング方法に関するものである。本発明は更に、心臓の不整脈のような哺乳動物における、ヘミチャンネルの好ましくない機能によって引き起こされる疾患症状を予防又は処置するための治療法を提供するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストレスにさらされた細胞、組織又は器官に於いて、ミチャンネルを閉じる方法であって、当該方法は、ストレスにさらされた細胞、組織又は器官を、化学式Ｉ又はＩＩで表される化合物からなる群から選ばれる少なくとも一つの化合物の治療上有効量と接触させることを含有し、その接触がストレスにさらされた細胞、組織又は器官に於いてヘミチャンネルを閉じるのに十分なものである方法。
【請求項２】
方法が、さらにコネキシン４３（Ｃｘ４３）のチロシン残基をリン酸化し、ヘミチャンネルの閉鎖を含有するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞、組織又は器官に於いて、ヘミチャンネルを開く方法であって、当該方法は、細胞、組織又は器官を、化学式Ｉ又はＩＩで表される化合物からなる群から選ばれる少なくとも一つの化合物の治療上有効量と接触させることを含有し、その接触が細胞、組織又は器官に於いてヘミチャンネルを開くのに十分なものである方法。
【請求項４】
方法が、さらにコネキシン４３（Ｃｘ４３）のセリン残基を脱リン酸化し、ヘミチャンネルの開口を含有するものである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
哺乳動物に於いて、組織又は器官ストレスを予防又は治療する方法であって、当該方法は、上述のように化学式Ｉ又はＩＩで表される化合物からなる群から選ばれる少なくとも一つの化合物の治療上有効量を投与することを含有し、その接触が組織又は器官におけるストレスを予防又は治療するのに十分なものである方法。
【請求項６】
方法が、さらにコネキシン４３（Ｃｘ４３）のチロシン残基をリン酸化し、ヘミチャンネルの閉鎖を含有するものである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
細胞、組織又は器官における細胞間情報伝達（ＧＪＩＣ）を増加させる方法であって、当該方法は、化学式Ｉ又はＩＩで表される化合物からなる群から選ばれる少なくとも一つの化合物の治療上有効量を投与することを含有し、その接触が細胞、組織又は器官におけるＧＪＩＣの増加に十分なものである方法。
【請求項８】
治療が必要な患者にコネキシンヘミチャンネルの開口を遮断する化学式Ｉ又はＩＩで表される化合物の治療上有効量を投与することを含有する、火傷の治療方法。
【請求項９】
治療が必要な患者にコネキシンヘミチャンネルの開口を遮断する化学式Ｉ又はＩＩで表される化合物の治療上有効量を投与することを含有する、血栓症の治療方法。
【請求項１０】
治療が必要な患者にコネキシンヘミチャンネルの開口を遮断する化学式Ｉ又はＩＩで表される化合物の治療上有効量を投与することを含有する、呼吸性及び代謝性アシドーシスの治療方法。
【請求項１１】
治療が必要な患者にコネキシンヘミチャンネルの開口を遮断する化学式Ｉ又はＩＩで表される化合物の治療上有効量を投与することを含有する、限局性不整脈の治療方法。
【請求項１２】
治療が必要な患者にコネキシンヘミチャンネルの開口を遮断する化学式Ｉ又はＩＩで表される化合物の治療上有効量を投与することを含有する、上昇した血中グルコースレベルに由来する細胞及び組織障害の治療及び予防方法。
【請求項１３】
治療が必要な患者にコネキシンヘミチャンネルの開口を遮断する化学式Ｉ又はＩＩで表される化合物の治療上有効量を投与することを含有する、慢性心房細動の治療方法。
【請求項１４】
治療が必要な患者にコネキシンヘミチャンネルの開口を遮断する化学式Ｉ又はＩＩで表される化合物の治療上有効量を投与することを含有する、てんかんの治療方法。
【請求項１５】
ヘミチャンネル機能を調節する候補化合物をスクリーニングする方法であって、当該方法は、コネキシン４３（Ｃｘ４３）のリン酸化を調節する条件下で、細胞を抗不整脈ペプチド及び化学式Ｉ又はＩＩで表される化合物からなる群から選ばれる少なくとも一つの化合物と接触させること、並びにＣｘ４３のリン酸化における変化を検出することを含有し、当該リン酸化における変化をヘミチャンネルを調節する化合物の指標とすることからなる方法。
【請求項１６】
試験方法が、さらに免疫学的アッセイ又はセルソーティングに基づくアッセイに於いて候補化合物を試験することを含有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
免疫学的アッセイが、Ｃｘ４３のリン酸化を増加又は減少させるのに十分な条件下で細胞を候補化合物と接触させ、細胞溶解物を取得し、ヘミチャンネルを調節する化合物の指標として当該細胞溶解物におけるＣｘ４３のリン酸化の増加又は減少を検出することを含有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
免疫学的アッセイがＥＬＩＳＡアッセイである、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＥＬＩＳＡ法がさらに以下の工程、
ａ）コネキシンに特異的に結合する第一の抗体で固相を被覆し、
ｂ）第一の抗体及びコネキシンの結合複合体を形成する条件下で固相に細胞溶解物を接触させ、
ｃ）第一の抗体とコネキシンとの結合複合体を、第二の抗体と接触させ、当該接触は第二の抗体及び第一抗体とコネキシンとの結合複合体に於いてリン酸化されたコネキシンとの特異的な結合複合体を形成するのに十分な条件下で行われ、
ｄ）第一の抗体：コネキシン：第二の抗体からなる結合複合体を、第二の抗体に結合する検出可能に標識された第三の抗体と接触させ、並びに
ｅ）化合物のさらなる指標となるように、固相上で検出可能に標識された第三の抗体の存在を検出すること、
を含有するものである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
第三の抗体が、ビオチン、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、放射活性ヨウ素又はパーオキシダーゼの少なくとも一つで検出可能なように標識されている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
第二の抗体が、抗ホスホチロシン抗体である、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
第二の抗体が、抗ホスホセリン抗体である、請求項１９乃至２１に記載の方法。
【請求項２３】
検出可能なように標識された第三の抗体が、放射シンチレーション計測により検出されるものである、請求項１９乃至２２に記載の方法。
【請求項２４】
免疫学的方法が放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
免疫学的方法が、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）であり、更なる方法は以下の工程、
ａ）細胞溶解物を産生するまえに、細胞を検出可能なように標識し、当該標識はリン酸化されたコネキシンを標識する条件下で行われ、
ｂ）細胞溶解物を、コネキシンと特異的な結合複合体を形成する抗体と接触させ、
ｃ）検出可能なように標識された細胞溶解物から結合複合体を分離し、及び
ｄ）ギャップジャンクション（ギャップ結合）を調節する化合物のさらなる指標としての標識化され、リン酸化されたコネキシンを検出すること、
を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
抗体が、抗コネキシン抗体である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
検出の工程がさらに、ウエスタンイムノブロットアッセイを行うことを含有するものである、請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項２８】
検出可能な標識が、放射活性リンである、請求項２５乃至２７に記載の方法。
【請求項２９】
方法が、高速スループット又は超高速スループットスクリーニング形態で行われるものである、請求項１５乃至２８に記載の方法。
【請求項３０】
化合物が、Ｃｘ４３の細胞内Ｃ末端領域のリン酸化を促進するものである、請求項１乃至２９に記載の方法。
【請求項３１】
化合物が、Ｃｘ４３の細胞内Ｃ末端領域の脱リン酸化を促進するものである、請求項１乃至３０に記載の方法。
【請求項３２】
リン酸化部位が、チロシン残基である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
脱リン酸化部位が、セリン残基である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
以下の（１）から（６）の工程、
１）心臓又は筋肉由来の細胞群、組織又は器官を培養し、
２）好ましくは、グルコース誘導体を加えることによる酸素枯渇又は代謝阻害により、細胞、組織又は器官へストレスをかけ、
３）公知又は化学式Ｉ若しくはＩＩで表されるヘミチャンネルを調節する候補化合物を添加し、
４）カルセイン及び関連の蛍光色素などの蛍光、化学発光又はリン光性化合物といった検出可能なレポーターを加え、
５）コントロールと比較して、細胞、組織又は器官への検出可能なレポーターの取り込みにおける変化を検出し、並びに、
６）ヘミチャンネル機能を調節する化合物の指標としての変化を測定すること、
を含有する、ヘミチャンネル機能を調節する候補化合物のスクリーニング方法。
【請求項３５】
以下の（１）から（７）の工程、
１）心臓又は筋肉に由来する細胞群、組織又は器官を培養し、
２）カルセイン及び関連の蛍光色素などの蛍光、化学発光又はリン光性化合物といった検出可能なレポーターを加え、
３）検出可能なレポーター由来のシグナルを検出定量することにより、細胞、組織又は器官の容量を測定し、
４）公知又は化学式Ｉ若しくはＩＩで表されるヘミチャンネルを調節する候補化合物を添加し、
５）好ましくは、グルコース誘導体を加えることによる酸素枯渇又は代謝阻害により、細胞、組織又は器官へストレスをかけ、
６）コントロールと比較して、細胞容積の変化を検出し、並びに、
７）ヘミチャンネル機能を調節する及び場合によってはギャップジャンクション（ギャップ結合）機能を調節する化合物の指標としての変化を測定すること、
を含有する、ヘミチャンネル機能を調節する候補化合物をスクリーニングする方法。
【請求項３６】
治療が必要な哺乳動物の組織又は器官の細胞を防御する方法であって、当該方法は、化学式Ｉ又はＩＩで表される化合物からなる群から選択される少なくともひとつの化合物の治療上有効量を投与することを含有する方法。
【請求項３７】
方法がさらに哺乳動物の組織又は器官を虚血状態にさらすことを含有する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
細胞が防御される器官が、線維性組織層又は骨に関連するものである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
器官が、心臓、腎臓、脳、脊髄又は骨髄である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
心臓が梗塞に羅患しており、虚血が心筋細胞膨張と関連するものである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
化合物が、Ａｃ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｐｒｏ−Ｄ−４Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−ＮＨ２（化合物１）又は（Ａｃ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−ＮＨ２）化合物２である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
哺乳動物における再潅流傷害を予防又は治療する方法であって、当該方法は、化学式Ｉ又はＩＩで表される化合物からなる群から選ばれる少なくとも一つの化合物の治療上有効量を投与することを含有する方法。
【請求項４３】
方法がさらに哺乳動物の心臓を梗塞状態にさらし、冠動脈潅流を形成することを含有する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
方法がさらに、血栓症治療薬の投与、又は冠動脈から梗塞した心臓への潅流を促進する冠動脈血管を形成することを含有する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
化合物がＡｃ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｐｒｏ−Ｄ−４Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−ＮＨ２（化合物１）又は（Ａｃ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−ＮＨ２）化合物２である、請求項４４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は２００２年１月２９日出願の米国特許仮出願第６０／３５２７１７号の優先権を主張するものであり、その開示は参照として本明細書に取り込まれる。
【０００２】
本発明は一般的に、コネキシンヘミチャンネルを調節する組成物及びその方法に関するものである。本発明はまた、そのような化合物を検出するための有用なスクリーニングに関するものである。
【背景技術】
【０００３】
ギャップジャンクション（ギャップ結合）は、細胞が周囲の環境とコミュニケーションすることを助ける重要な形質膜構造であると認識されている。例えば、ほとんどのギャップジャンクション（ギャップ結合）は隣接するの細胞間の小分子やイオンの通過を助けるものであると考えられている。そのような動きは細胞生理学の多くの局面に於いて重要な影響を及ぼすものであると考えられている。隣接した細胞の形質膜は、ギャップジャンクション（ギャップ結合）の形成のための「コネキシン」と呼ばれる蛋白質の多量体により形成さている「コネクソン」という、ヘミチャンネルを含んでいると考えられている。更に、ヘミチャンネルは細胞の細胞質及びペリプラズム又は細胞外空間との間の小分子量化合物の交換に於いて独自の役割を果たしている。一般的には、Bennett, Mら、(1991)、Neuron 6: 305、 Kumar N.及びGilula N.B.、(1996) Cell 84: 381、Quist A.Pら、(2000) J. Cell Biol. 148: 1063及びそれらの引用文献を参照のこと。
【０００４】
特に、多くのギャップジャンクション（ギャップ結合）は、チャンネル群が高密度に集積した細胞膜の特定の領域であるとの報告がある。そのようなギャップジャンクション（ギャップ結合）のチャンネルは、隣接した両細胞の細胞質分画（コンパートメント）を直接結合するものと考えられている。
【０００５】
ギャップジャンクション（ギャップ結合）のチャンネルは、隣接した両細胞からそれぞれ提供された二つのヘミチャンネル（コネクソン）からなっているとされている。個々のコネクソン（ヘミチャンネル）は、コネキシンと呼ばれる蛋白質の６量体からなることが示されている。個々のコネキシンは４つの膜貫通ドメイン、二つの細胞外ループ及び細胞質内ループをそれぞれ有している。電気刺激の伝搬はギャップジャンクション（ギャップ結合）を通して生じ、それによって正常な心臓内での伝達及びリズムを維持していると考えられている。一般的には、Guerrero R.B.ら、J. Clin Invest 1997 99 1991 、D.L.、Lerner K.A.ら、Circulation 1999 99 1508、S. Kirchhoff E. ら、Curr Biol 1998 8 295を参照のこと。
【０００６】
心臓におけるコネキシンの分布の殆どは、部位により非常に多様であることが知られている。Ｃｘ４３アイソフォームは主に心室でのタイプであるが、Ｃｘ４０は心房と伝達システムに最も豊富に存在するアイソフォームであることが示されている。
【０００７】
コネキシンの異常と心疾患の間の強い関連性についての報告がある。A.C.  de Carvalhoら、J Cardiovasc Electrophysiol 1994 5 686、R.R. Kaprielianら、Circulation 1998 97 651、N.S. Petersら、Circulation 1993 88 864、J. E. Saffitz R. B.ら、Cardiovasc Res 1999, 42 309を参照のこと。
【０００８】
ギャップジャンクション（ギャップ結合）の異常な発現、分布及び制御が不整脈に関与しているとの見解がある。Larsen B.らによりＰＣＴ／ＤＫ０１／００１２７（ＷＯ０１／６２７７５）に開示されている不整脈のペプチドは、脊椎動物の組織の細胞間情報伝達（ＧＪＩＣ）を増加させることが報告されている。
【０００９】
コネキシン（Ｃｘ）遺伝子ファミリーによりコードされる特有の哺乳動物のギャップジャンクション（ギャップ結合）蛋白質が報告されている。Bruzzone R.ら、(1996) 、Eur. J. Biochem. 238: 1を参照のこと。Ｃｘファミリーには、Ｃｘ２６、３０、３１、３２、３７、４０、４３、４５、４６及び５０が存在している。ギャップジャンクション（ギャップ結合）チャンネルはまた、無脊椎動物に於いても見出されており、そこに於いてはチャンネルを形成する蛋白質は「イネキシン」と呼ばれている。
【００１０】
Ｃｘ２６蛋白質を除くほとんどのコネキシンはリン酸化されているとされている。Ｃｘ４３蛋白質は広範囲の組織に発現しており、Ｃｘ４３蛋白質のリン酸化は、細胞間情報伝達（ＧＪＩＣ）を誘発すると報告されている。例えば、Ｃｘ４３のターンオーバー、運搬、リン酸化及びゲーティングは、リン酸化の影響を受けていることが確認されている。Darrow B.J.ら、(1995)、Circ Res 76: 381を参照のこと。
【００１１】
例えば、Saffizらはこの伝達を測定することにより、虚血から１５分以内にコネキシンのセリンの脱リン酸化が増加することを示した。図１（数個のリン酸化部位が同定されている哺乳動物のＣｘ４３膜貫通蛋白質を示している）を参照のこと。
【００１２】
コネキシンのリン酸化及び溶解性は研究対象として興味深いものである。特にＣｘ４３はラット乳房腺の筋上皮細胞でリン酸化されることが見出された。Wang Y. ら、(1995) J Biol Chem 270, 26581、及びYamanaka I.ら、(1997) Eur J Cell Biol 72: 166を参照のこと。
【００１３】
上述したように、ギャップジャンクション（ギャップ結合）チャンネルは、隣接する細胞の細胞質を結合する特別な細穴であると考えられている。ヘミチャンネルは細胞外環境とコミュニケートするものであり、心臓細胞の代謝の阻害は、コネキシンヘミチャンネルで構成されているとされる流入経路を活性化することができるという報告がある。代謝の阻害がヘミチャンネルを開き、カリウムの減少を促進すると同時にプロトン、ナトリウム及びカルシウムの流入を誘導し、それによって心臓の組織を損傷させると考えられている。Kondoら、J. Mol.Cell.Cardiol. 32:1859-72、2000、Liら、J.Mol.Cell.Cardiol. 33: 2145-55, 2001を参照のこと。
【００１４】
急性の心筋虚血時に於けるギャップジャンクション（ギャップ結合）に於ける電気的なアンカップリング（electrical uncoupling）は、伝達異常や再入不整脈（reentrant arrhythmias）を誘発すると考えられている。虚血時の、細胞内カルシウムイオン及び水素イオンレベルの増加並びに両親媒性の脂質代謝産物の蓄積が、アンカップリング（uncoupling）を促進するが、その他のメカニズムも関わっている。例えば、急激な虚血により誘導される脱共役は、コネキシン４３（Ｃｘ４３）のリン酸化における変化と関連している。急性の虚血時に心筋脱共役と不整脈誘導をもたらす、迅速で可逆的なＣｘ４３の脱リン酸化と一致する結果が報告されている。Beardslee MAら、Circ Res 2000; 87:656及びそこで引用された文献を参照のこと。
【００１５】
このようなヘミチャンネルの構造及び機能が、注目を集めてきている。
例えば、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）、蛍光色素取り込みアッセイ、及びレイザー共焦点免疫蛍光によるイメージングは、ヘミチャンネルが細胞外カルシウム依存性の細胞容積調節に関わっていることを示唆している。報告されているように、細胞容積の変化はコネキシン４３が発現していたか否かに依存していた。容積の変化は、ギャップジャンクション（ギャップ結合）遮断薬（たとえばオレアミド及びβグリシルヘチニン酸）で回避でき、又は細胞外カルシウムレベルを正常値に戻すことにより、元に戻ったことが報告されている。非−ギャップジャンクション（ギャップ結合）ヘミチャンネルは、細胞外の生理的カルシウムレベルの変化（等張状態ではない場合の）に応答して細胞容積を制御することが示めされた。上述のQuist A.P.らを参照のこと。
【００１６】
開いたヘミチャンネルは、特に虚血又は代謝ストレス時に於いては、カルシウムイオン、プロトンの細胞への取り込み、及び細胞に両親媒性脂質代謝物の蓄積を誘導し、細胞膨張、細胞傷害又はアポトーシスをもたらすと言われている。上述のBeardslee ら及びQuist らを参照のこと。
【００１７】
Ｃｘ４３はインビトロで、活性化されたＳｒｃ蛋白質によって２４７位のチロシン（Ｙ２４７）、２６５位のチロシン（Ｙ２６５）また、おそらくその他の位置でもリン酸化されることが報告されている。特に、細胞間情報伝達（ＧＪＩＣ）はｖ−Ｓｒｃにより介在されるリン酸化による分裂に対して抵抗性であることが報告された。Ｃｘ４３のＹ２４７及びＹ２６５におけるリン酸化が重要であることが確認された。Lin Rら、(2001)、J Cell Biol 154(4):815を参照のこと。また図１も参照のこと。
【００１８】
また、多様なＧＪＩＣ調節化合物が開示されているLarsen B.D.らの、ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／ＵＳ０２／０５７７３（ＷＯ  ０２／０７７０１７）発明の名称、「細胞間コミュニケーションを促進する化合物の新規な医学的使用」、２００２年２月２２日出願、を参照のこと。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
ヘミチャンネル機能を調節する化合物の開発が望まれている。好ましい化合物はヘミチャンネルの開口又は閉鎖を助けるものである。そのような化合物を同定するための分子のスクリーニング方法の開発が特に望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
（発明の要約）
本発明は、一般にヘミチャンネル機能を調節する化合物及びその使用方法に関する。特に好ましいのはヘミチャンネルのリン酸化を調節する化合物である。本発明のさらなる化合物は、ヘミチャンネル機能を調節するものであり、例えばギャップジャンクション（ギャップ結合）チャンネルを開く又は閉じる、といった細胞間情報伝達（ＧＪＩＣ）に影響を与える。そのような化合物の検出及び特徴づけのための有用なスクリーニング方法もまた提供される。本発明は、不適切なヘミチャンネル機能に起因する様々な症状を治療する又は予防する方法を提供することを含む、多くの有用な応用方法をも有する。
【００２１】
ヘミチャンネル機能を調節（増加又は減少）する化合物の同定の必要性は急務である。「ヘミチャンネル機能」と言う用語は、ヘミチャンネルを経由する分子又はイオンの通過を増加又は減少させるために、コネキシンヘミチャンネルを開口又は閉鎖することを意味し、「ギャップジャンクション（ギャップ結合）機能」という用語は、ギャップジャンクション（ギャップ結合）を経由する分子又はイオンの通過を増加又は減少させるために、ギャップジャンクション（ギャップ結合）を開口又は閉鎖することを意味する。本発明の好ましい化合物はヘミチャンネルのリン酸化を調節し、また一般的には、ヘミチャンネルの開口又は閉鎖も補助する。ヘミチャンネル機能及びギャップジャンクション（ギャップ結合）機能は、本明細書に開示される標準のアッセイの一つ又はそれ以上により、容易に検出され、適宜定量化することができる。
【００２２】
より特異的なヘミチャンネルを調節する化合物は、認識されたコネキシンのリン酸化を調節（増加又は減少）する。リン酸化又は脱リン酸化の好ましい部位としては、コネキシンの一つ若しくはそれ以上のチロシン、セリン又はスレオニン残基が含まれる。下記において考察されるように、これらの残基の一つ又はそれ以上の位置におけるリン酸化の調節は、ヘミチャンネル機能、特にヘミチャンネルの開閉に影響を与えることが見出されている。従って、以下に記載されているように、本発明の目的はヘミチャンネル機能を調節できる能力を有する化合物を検出及び適宜特徴付ける手段として、コネキシンのリン酸化状態をモニターするに適したスクリーニング方法を提供することである。
【００２３】
たとえば、本発明の化合物はコネキシンの少なくとも一つのチロシン残基をリン酸化することができる。この態様に於いて、コネキシンのリン酸化はヘミチャンネルの閉鎖を補助するものである。ヘミチャンネルを調節するその他の適当な化合物は、コネキシンの少なくとも一つのセリン残基におけるリン酸化を減少（脱リン酸化）させる。この例に於いて、セリンの脱リン酸化はヘミチャンネルの開口を補助するものである。本発明の更なる化合物は、コネキシンの少なくとも一つのスレオニン残基のリン酸化を活性化し、一般的には、ヘミチャンネルの閉鎖を補助するものである。更に、本発明の適当な化合物は、コネキシンに於けるセリンのリン酸化の増加又は減少、チロシンのリン酸化の増加又は減少、及びスレオニンのリン酸化の増加又は減少の少なくとも一つを促進する。好ましくは一つ又はそれ以上のアミノ酸の修飾は、ヘミチャンネルの検出可能な開口又は閉鎖を助けるものである。
【００２４】
したがって、本発明は一態様に於いて、好ましくはヘミチャンネルを閉鎖することによって、ヘミチャンネルを調節する方法を提供する。一態様に於いて、その方法とは、ストレスに曝された細胞、組織又は器官を下記の化学式Ｉ又はＩＩで示される化合物の少なくとも一つの治療上有効な量と接触させることを含み、好ましくはストレスにさらされた細胞、組織又は器官に於いてヘミチャンネルを閉鎖することを含む。この方法における好ましい接触とは、適当なコントロールと較べて、ストレスに曝される前、その間、又は後にヘミチャンネルを閉鎖するのに十分なものである。そのようなストレスの例としては、後述の、代謝阻害、酸素枯渇、ｐＨ低下、又は細胞外カリウムイオンの増加のうち一つ又はそれ以上が挙げられる。
【００２５】
より特異的な態様に於いて、本発明の方法は更に、認識されているコネキシン、好ましくはコネキシン４３（Ｃｘ４３）のリン酸化をモニターすることを含む。本発明の方法は通常、Ｃｘ４３のチロシン、セリン及びスレオニン残基の少なくとも一つにおけるリン酸化の増加又は減少を、好ましくはチロシン及びスレオニン残基の少なくとも一つのリン酸化における増加を、検出及び開示するものである。この態様に於いて、本発明の方法はまた、適当なコントロールと比較することによって、ヘミチャンネルの閉鎖及び場合によってはギャップジャンクション（ギャップ結合）チャンネルの開口又は閉鎖を検出することも含む。
【００２６】
本発明はヘミチャンネル機能を調節するその他の方法を提供する。一態様に於いては、本発明は、Ｃｘ４３のチロシン、セリン及びスレオニン残基の少なくとも一つにおけるリン酸化の増加又は減少、好ましくはセリンのような残基の一つ又はそれ以上のリン酸化の減少を、コントロールと比較することによって検出するために、認識されているコネキシン、好ましくはＣｘ４３のリン酸化をモニターすることを含む。例えば、本発明の方法は、下記の化学式Ｉ又はＩＩで示される化合物の少なくとも一つの治療上有効な量に、ストレスを与えられた細胞、組織又は器官を接触させることを含む、ストレスに曝された細胞、組織又は器官に於いてヘミチャンネルを開くことに関するものである。好ましい接触とは、適当なコントロールとの比較に於いて、ヘミチャンネルを開口させるに十分なものであり、また、ギャップジャンクション（ギャップ結合）を適宜開口又は閉鎖するのに十分なものである。
【００２７】
このようなヘミチャンネルを調節する化合物を、より特異的に検出し及び特徴づけるためのスクリーニング方法が求められている。このようなスクリーニング方法、即ちコントロールとの比較に於いて、候補化合物がヘミチャンネルの閉鎖を補助する能力、例えば少なくともコントロールよりも５％高いといった能力をインビトロで試験して検出する方法を得ることは、新たなヘミチャンネル調節化合物群を同定したり、特徴づけるうえで重要な第一歩となる。このようなスクリーニング方法で同定された化合物は、下記の化学式Ｉ又はＩＩで表される化合物を含めて、例えば、細胞の構成要素が細胞外へ流出するのを抑制、減少又は防御することにより、細胞、組織及び器官における恒常性の維持を促すような療法に用いることができる。
【００２８】
本発明はまた、ヘミチャンネル機能を調節できる候補化合物をスクリーニングする特異的なインビトロの方法を提供する。本発明の方法は一般的に、適当な細胞、組織又は器官を下記の化学式Ｉ又はＩＩで表される少なくとも一つの化合物と接触させることを含む。好ましくは接触とは、認識されているコネキシン、好ましくはコネキシン４３（Ｃｘ４３）のリン酸化の変調を誘発し、また、コントロールと比較して、Ｃｘ４３のリン酸化に於ける変化を検出するといった条件下で行われる接触のことである。また好ましくは、リン酸化の変化は、ヘミチャンネルを調節する化合物の指標とされる。本発明のスクリーニング方法により検出された化合物は、本明細書に開示されているアッセイに準じてギャップジャンクション（ギャップ結合）チャンネルを適宜開口させたり閉鎖させたりする。
【００２９】
前述した各方法に於いて、殆どのすべての本発明の好ましいリン酸化の変化は、コネキシンの細胞内領域のＣ末端又はその近傍で起こる。Ｃｘ４３のリン酸化又は脱リン酸化のより好ましい部位は、図１に示されている。「コネキシンのＣ末端」とは、図１で示されるアミノ酸配列の約２４０位から２８１位にわたる領域を意味している。
【００３０】
コネキシンのリン酸化を検出するための、本発明の特定のインビトロのスクリーニングアッセイは、ヘミチャンネル機能、ギャップジャンクション（ギャップ結合）機能（又はその両方）をモニターするために設計された一つ又はそれ以上の工程を含む。そのようなアッセイには一般に少なくとも一つ、そして好ましくは全ての以下の工程、
１）心臓又は筋肉由来の細胞群、組織又は器官を培養すること
２）好ましくは酸素枯渇又は代謝阻害により、細胞、組織又は器官へストレスを与えること、
３）下記の化学式Ｉ又はＩＩで表される化合物のような、公知の又は候補となるヘミチャンネルを調節する化合物を添加すること、
４）コネキシン（好ましくはＣｘ４３）のリン酸化における変化を、適当なコントロールとの比較により検出すること、及び
５）ヘミチャンネルの機能、必要によりギャップジャンクション（ギャップ結合）の機能を調節する化合物の指標として、前記の変化を適宜測定すること、
が含まれる。
【００３１】
このアッセイによって、好ましいＣｘ４３蛋白質のセリン、チロシン及びスレオニン残基の少なくとも一つにおけるリン酸化を増加又は減少させる、ヘミチャンネルを調節する化合物の能力を効率的に測定できる。本明細書で用いる「標準のインビトロのコネキシンリン酸化アッセイ」又はそれに関連する用語は、上述の工程（１）から（５）のプロトコールについて言及するものである。アッセイは心臓又は筋肉由来の、初代、第二代、又は不死化させた細胞群の何れでも行うことができる。
【００３２】
前述した標準のインビトロアッセイは、一般的に融通性があり、たとえば工程（１）〜（５）は、目的とされるスクリーニング結果が達成できるならば、どのような順序で行われてもよい。従って、アッセイの一態様に於いては、候補化合物を、工程（２）の後のみではなく、工程（１）、工程（２）（又はその両工程）で添加してもよい。
【００３３】
本発明はヘミチャンネル機能を調節できる候補化合物をスクリーニングするための、他の方法を提供する。一態様に於いては、当該方法は、適当な細胞、組織又は器官を、下記の化学式Ｉ又はＩＩで示される群から選ばれる少なくとも一つの化合物と接触させることを含む。一般的には、細胞、組織又は器官による検出可能なレポーターの取り込みが、化合物の存在下で適当なコントロールとの比較によってモニターされる。好ましい検出可能なレポーターは、開いたヘミチャンネルを通して通過する分子サイズを有している。従って、ヘミチャンネルがアッセイで開いた場合には、検出可能なレポーターは細胞、組織又は器官へと入る。しかし、ヘミチャンネルが閉じた場合には、検出可能なレポーターはヘミチャンネルを通過することができない。接触は、適当なコントロールとの比較により、検出可能なレポーターの取り込みの変化を検出できるような条件下で行われるのが好ましい。
【００３４】
たとえば、標準のインビトロでのコネキシンのリン酸化アッセイで検出されるように、コネキシン、好ましくはＣｘ４３のＣ末端領域のチロシン残基、好ましくは２４７位又は２６５位の少なくとも一つのチロシン、より好ましくはその両方のチロシンが、リン酸化されていれば、本発明においてはヘミチャンネルは「閉鎖」しているとされる。「閉鎖」という用語はまた、コネキシンのＣ末端領域にあるスレオニン残基の少なくとも一つがリン酸化されていることを意味し、このリン酸化は単独でリン酸化されていてもよいし、又はチロシンのリン酸化に加えてリン酸化されたものであってもよい。コネキシンのＣ末端領域におけるセリン残基の少なくとも一つが脱リン酸化されている場合は、ヘミチャンネルは「開口」しているとされる。また、好ましいチロシン、スレオニン及びセリン残基は、キナーゼ部位として図１に示さされている。
【００３５】
検出可能なレポーターがヘミチャンネルを通過するのを検出する、より特異的なインビトロのスクリーニングアッセイとしては、一つ又はそれ以上の以下の工程、
１）心臓又は筋肉由来の細胞群、組織又は器官を培養すること、
２）好ましくは、グルコース誘導体を加えることによる酸素枯渇又は代謝阻害により、細胞、組織又は器官へストレスを与えること、
３）下記の化学式Ｉ又はＩＩで表される化合物のような、公知又は候補となるヘミチャンネルを調節する化合物を添加すること、
４）カルセイン及び関連の蛍光色素などの蛍光、化学発光又はリン光性化合物といった検出可能なレポーターを添加すること、
５）細胞、組織又は器官に於ける検出可能なレポーターの取り込みの変化を、適当なコントロールとの比較によって検出すること、並びに、
６）ヘミチャンネル機能を調節する化合物の指標としての変化を適宜測定すること、
を含む。
【００３６】
検出可能なレポーターを視覚化することによって顕微鏡で変化を容易に検出することが可能となり、細胞、組織又は器官のヘミチャンネルを開く又は閉じるといった候補化合物の能力を、このアッセイによって効率的に測定できる。本明細書で用いる「標準のインビトロの取り込みアッセイ」又はそれに関連する用語は、上述の工程の（１）から（６））のプロトコールについて言及するものである。本アッセイは心臓又は筋肉由来の、初代、第二代、又は不死化された細胞群の何れでも行うことができる。その他の許容されるレポーターとしては、ヘミチャンネルを通過できる大きさの適当な放射活性化合物もまた包含されている。特異的な化合物には、３Ｈ、３５Ｓ、１４Ｃという放射性核種の一つ又はそれ以上で標識された化合物が含まれる。
【００３７】
重要なのは、一般的に上述した、標準のインビトロの取り込みアッセイは、所望の結果が得られれば、特に前記の工程の順序にはとらわれない。従って、一態様に於いては、工程（３）及び（４）に記載された候補化合物及び検出可能なレポーターは各々、少なくとも一つ、当該方法の工程（２）の前に別々に又は一緒に加えられてもよい。例えば、このアッセイでは、細胞、組織又は器官に、化合物と検出可能なレポーターの存在下でストレスを与える。もしくは、ヘミチャンネルを開くことができる化合物を検出するために、工程（１）で検出可能なレポーターを細胞に取り込ませて（load）もよい。
【００３８】
本発明は、さらにヘミチャンネル機能を調節できる一つ又はそれ以上の候補化合物をスクリーニングする方法を提供する。一態様に於いては、当該方法は細胞、組織又は器官を、下記の化学式Ｉ又はＩＩで表される群から選ばれる少なくとも一つの化合物と接触させることを含む。一般的には、容量を測定するために、細胞、組織又は器官を、検出可能なレポーターで負荷しておく。本アッセイで使用する好ましい検出可能なレポーターとしては、開いたヘミチャンネルを通過するのに適当な分子サイズを有している。接触は、検出可能なレポーターでマーク（register）された細胞、組織又は器官の容積の変化を、適当なコントロールと比較することによって、検出できる条件下で行われるのが好ましい。細胞、組織又は器官にストレスをかけ、適当なコントロールと比較して、候補化合物が細胞容積を維持して又は容積の減少を更に遅延させるようにヘミチャンネルを閉鎖するのが好ましい。
【００３９】
細胞の容積の変化を検出する一つの特異的なインビトロのスクリーニングアッセイとしては、一つ又はそれ以上の下記の工程、
１）心臓又は筋肉由来の細胞群、組織又は器官を培養すること、
２）カルセイン及び関連の蛍光色素などの蛍光、化学発光又はリン光性化合物といった検出可能なレポーターを負荷すること、
３）検出可能なレポーター由来のシグナルを検出及び定量して、細胞、組織又は器官の容量を評価すること、
４）下記の化学式Ｉ又はＩＩで表される化合物のような、公知又は候補となるヘミチャンネルを調節する化合物を添加すること、
５）好ましくは、グルコース誘導体を加えることによる酸素枯渇又は代謝阻害により、細胞、組織又は器官へストレスを与えること、
６）適当なコントロールと比較して細胞容積の変化を検出すること、並びに、
７）ヘミチャンネルの機能及び場合によってはギャップジャンクション（ギャップ結合）の機能を調節する化合物の指標として、前記した変化を適宜測定すること、
を含む。
【００４０】
本アッセイは、細胞容積の変化を顕微鏡で観察することにより、細胞、組織又は器官に於いてヘミチャンネルを開く又は閉じる、ヘミチャンネルを調節する候補化合物の能力を効率的に測定することができる。本明細書で用いる「標準のインビトロの細胞容積アッセイ」又はそれに関連する用語は、上述の工程（１）から（７）のプロトコールについて言及するものである。本アッセイは、心筋細胞及び関連細胞若しくは組織といった心臓又は筋肉由来の初代又は第二代の細胞群の何れに於いても行うことができる。
【００４１】
標準のインビトロの細胞容積アッセイは、所望の結果が得られれば、特に工程の順序にはとらわれない。従って、一態様に於いては、工程（４）の候補化合物は、細胞容積を減少させる速度がより遅延させられることから、すでにストレスがかけられた細胞に於けるヘミチャンネル閉鎖能力（細胞容積を減少させる速度がより遅延させられることで示される）をモニターするために、工程（３）で細胞にストレスを与えた後に添加される。従って、本アッセイの一態様に於いては、細胞容積の減少又は増加速度の変化は、所定の時間枠でモニターする。しかし、他の態様に於いては、細胞容積の変化は、細胞、組織又は器官にストレスをかけた後、例えば約１〜１２０分間のある一定の時間にモニターしてもよい。
【００４２】
上記考察のように、本発明のインビトロアッセイは柔軟性があり、目的とするスクリーニングの使用に合うように適用することができる。例えば化学式Ｉ又はＩＩで表されるような特定のヘミチャンネルを調節する候補化合物は、活性試薬単独で、又は、試験されるその他の化合物を含む他の試薬とあわせて使用することができる。全てではないが、殆どのインビトロアッセイは、通常上述した工程と同じか又は非常に関連性のある試験条件を含んでいるが、培地には試験化合物が添加されていない、適当なコントロールアッセイと比較して行われる。そのような場合、ヘミチャンネルを調節する候補化合物は、コントロールと比較して、アッセイで少なくとも２％、より好ましくはコントロールに比較して少なくとも約５％、さらにより好ましくは少なくとも約１０％又はそれ以上、例えば約２０％から約４０％コントロールに比較して大きい活性を示すことにより同定することができる。
【００４３】
上記の考察のように、特定のヘミチャンネルを調節する化合物はまた、ギャップジャンクション（ギャップ結合）チャンネルにも影響を与える。例えば、ある化合物はヘミチャンネルの閉鎖を補助し、ギャップジャンクション（ギャップ結合）の開口を補助するが、他の化合物はギャップジャンクション（ギャップ結合）の閉鎖を補助し、ヘミチャンネルの開口を補助する。さらに他の化合物はギャップジャンクション（ギャップ結合）及びヘミチャンネルを閉じる一方、他の化合物はヘミチャンネルとギャップジャンクション（ギャップ結合）の両方を開く。
【００４４】
従って本発明はまた、細胞、組織又は器官における細胞間情報伝達（ＧＪＩＣ）を増加する方法を提供する。一態様に於いては、当該方法は、下記の化学式Ｉ又はＩＩで表される化合物から選択される化合物の少なくとも一つの治療上有効量を投与する方法を含む。当該接触は、適当なコントロールと比較して、細胞、組織又は器官におけるＧＪＩＣを増加させるのに十分なものが好ましい。
【００４５】
本発明では、化合物をヘミチャンネル及びギャップジャンクション（ギャップ結合）を調節する能力で選択するインビトロアッセイの組み合わせが提供される。一態様に於いては、標準のインビトロのコネキシンのリン酸化アッセイ、標準のインビトロ取り込みアッセイ、標準のインビトロ細胞容積アッセイの少なくとも一つが、Larsen Bらにより、「新規な抗不整脈ペプチド」という発明の名称で２００１年２月２２日に出願されたＰＣＴ出願である、ＰＣＴ／ＤＫ０１／００１２７（ＷＯ０１／６２７７５）又は、Larsen Bらにより、「細胞間コミュニケーションを促進する化合物の新規な医学的使用」という発明の名称で２００２年２月２２日に出願されたもう一つのＰＣＴ出願である、ＰＣＴ／ＵＳ０２／０５７７３（ＷＯ０２／０７７０１７）に於いて開示されたＧＪＩＣアッセイの一つ又はそれ以上と組み合わされる。適当なＧＪＩＣアッセイの例として、パッチクランプ、カルシウム波測定（calcium wave measurement）、色素輸送アッセイによる細胞伝導性の測定が含まれる。ＰＣＴ／ＤＫ０１／００１２７（ＷＯ０１／６２７７５）及びＰＣＴ／ＵＳ０２／０５７７３（ＷＯ０２／０７７０１７）の両ＰＣＴ出願の開示は、参照として本明細書に取り込まれる。
【００４６】
上述の標準のインビトロのコネキシンのリン酸化アッセイは、一つ又はそれ以上のヘミチャンネルを調節する化合物を選択するために、一例として用いられるもので、それに限定されるものではない。一つ又はそれ以上の化合物は次いで、ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／ＵＳ０２／０５７７３（ＷＯ０２／０７７０１７）に記載の心筋細胞パッチクランプアッセイを用いてスクリーニングすることができる。両方のアッセイに於いて適当な活性を提供すれば、その化合物はヘミチャンネル及びギャップジャンクション（ギャップ結合）を調節する能力があるといえる。
【００４７】
本発明は更に、心臓不整脈を調節する治療上の有効性を検出及び適宜定量することを助けるヘミチャンネルを調節する候補化合物のインビボの試験方法を提供する。上記考察のように、ほとんどの心臓不整脈は、本発明の化合物を一つ又は組み合わせて使用することによって予防、軽減又は治療することができると考えられる。「標準のインビトロのマウス不整脈アッセイ」又は関連の表現で本明細書で言及される好ましいインビボの試験モデルは、ＰＣＴ／ＵＳ０２／０５７７３（ＷＯ０２／０７７０１７）に開示されているのと同様に、ＰＣＴ／ＤＫ０１／００１２７（ＷＯ０１／６２７７５）にも開示されている。本発明のある化合物はアッセイに於いて、誘導された房室（ＡＶ）ブロックの始まりまでの時間を、望ましくは少なくとも約２０％（少なくともスコア２）延長させる。他の化合物は当該アッセイに於いて、誘導されたＡＶブロック（少なくともスコア３）の始まりまでの時間を少なくとも約６０％延長させる。大まかには、当該アッセイは適当なマウスに一つ又はそれ以上の化合物を投与し、不整脈を誘導するために塩化カルシウムを注入し、不整脈（好ましくは第二度のＡＶブロック）の始まりの時間を適当なコントロールに比較して検出することを含む。
【００４８】
重要なことに、多様な検出形態（すなわち、本明細書で開示されている標準のインビトロのアッセイの少なくとも一つとインビボの不整脈アッセイの組み合わせ）の使用は、効率的に複合的な分析を行うことができ、それによって優れた治療上の有効性を有するヘミチャンネルを調節する化合物（例えば化学式Ｉ及びＩＩで表されるような）を高精度で高確率で同定することができる。このような本発明の特徴は、特に多くの化合物が試験される際に有用である。例えば、化学式Ｉ又はＩＩで表される化合物のいくつか又はほとんど全ての化合物を試験することができる。もしくは、又は加えて、適当な化合物はコンビナトリアルタイプの化学操作法を含む標準の合成法で合成することができ、本発明にしたがって試験することができる。
【００４９】
多様な検出形態が実施されるいくつかの態様に於いて、本明細書に記載されているアッセイによって測定されたインビトロ及びインビボの活性が、ヘミチャンネルを調節する化合物として要求される特徴でないことがあることに留意することが重要である。即ち、本明細書に記載されているある化合物は、本明細書に記載されている標準のインビトロのアッセイの少なくとも一つに於いては良好な活性を示すかもしれないが、標準のインビボの不整脈アッセイに於いては顕著な活性を示さないかもしれない。又は、他の化合物は、インビボの不整脈アッセイに於いては顕著な活性を示すが、一つ又はそれ以上の標準のインビトロアッセイに於いて良好な活性を示さないかもしれない。しかしながら、ヘミチャンネルを調節する好ましい化合物は、本明細書に記載されている少なくとも一つのインビトロ及びインビボアッセイに於いては、良好な活性を示すことができる。
【００５０】
標準のインビボの不整脈アッセイに於いて良好な活性を示す化合物は、アッセイにおける不整脈までの時間を延長する能力を表すために、「不整脈用化合物」又はそのような表現で呼ばれることもある。
【００５１】
以下に於いて更に詳細に考察されるが、本発明の化合物は、細胞膜を通過する分子及び／又はイオンの望ましくない若しくは異常な通過に伴う、又は関連していると思われる多様な病状を予防若しくは治療するために使用することができる。例えば、ＰＣＴ／ＤＫ０１／００１２７（ＷＯ０１／６２７７５）及びＰＣＴ／ＵＳ０２／０５７７３（ＷＯ０２／０７７０１７）に開示されるほとんど全ての医学的兆候に、本発明の方法で対応できる。そのいくつかの医学的兆候は、本明細書に開示されている。医学的兆候は、本出願に於いて開示されている化合物、及び特に本明細書で提供されるインビトロ及びインビボのアッセイの少なくとも一つに於いて良好な活性を示す化合物を一つ又は組み合わせて使用することにより、予防、軽減又は治療することができる。
【００５２】
本発明の試験方法と使用に適する更なる化合物は、Larsen B.D.らによるＰＣＴ／ＵＳ０２／０５７７３（ＷＯ０２／０７７０１７）に開示されている。
【００５３】
他の態様では、本発明は哺乳動物の組織又は器官に於けるストレスを予防又は治療する方法を提供する。一態様に於いては、その方法は、上述の化学式Ｉ及びＩＩで表される化合物の群から選ばれる少なくとも一つの化合物の治療上有効な量を投与することを含む。接触は、組織又は器官に於いてストレスを予防又は治療するのに十分なものであることが好ましい。
【００５４】
本発明はまた、コネキシンのヘミチャンネルの開口を阻害する化合物の治療上有効な量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、やけどの治療の方法を提供する。
【００５５】
また血栓症の治療方法も提供される。一態様に於いては、この方法にはコネキシンヘミチャンネルが開くことを阻害する化合物の治療上有効な量を処置、治療を必要とする患者に投与することが含まれる。
【００５６】
他の態様では、本発明はまた、呼吸性及び代謝性アシドーシスの治療方法であることを特徴とする。一態様に於いて、当該方法にはコネキシンヘミチャンネルを開くことを阻害する化合物の治療上有効な量を、治療を必要とする患者に投与することが含まれる。
【００５７】
本発明はまた限局性不整脈（focal arrhythmia）の治療方法を提供する。当該方法の一例として、コネキシンヘミチャンネルを開くことを阻害する化合物の治療上有効な量を、治療が必要な患者に投与することが含まれる。
【００５８】
さらに本発明によって、血中グルコースのレベル上昇に伴う細胞及び組織障害の治療及び予防方法が提供される。一態様に於いて、当該方法にはコネキシンヘミチャンネルを開くことを阻害する化合物の治療上有効な量を、治療が必要な患者に投与することが含まれる。
【００５９】
本発明はまた、慢性心房細動の治療方法を特徴とする。一態様に於いて、当該方法にはコネキシンヘミチャンネルを開くことを阻害する化合物の治療上有効な量を、治療が必要な患者に投与することが含まれる。
【００６０】
また、てんかんの治療方法も提供される。一般的には、当該方法にはコネキシンヘミチャンネルを開くことを阻害する化合物の治療上有効な量を、治療が必要な患者に投与することが含まれる。
【００６１】
さらにそのような治療を必要とする哺乳動物の組織又は器官の細胞防御をする方法が提供され、その方法には化学式Ｉ又はＩＩで表される化合物からなる群から選ばれる少なくとも一つの化合物の治療上有効な量を投与することが含まれる。
【００６２】
本発明はまた哺乳動物に於いて再潅流傷害を予防又は治療する方法が提供するもので、その方法には化学式Ｉ又はＩＩで表される化合物からなる群から選ばれる少なくとも一つの化合物の治療上有効な量を投与することが含まれる。
【００６３】
前述の各々の治療方法に於いて、本発明の化合物は、標準のインビトロマウス不整脈アッセイで測定されるように良好な抗不整脈活性（即ち、少なくともスコア２）を特徴とする。そのような化合物は「抗不整脈」化合物又は関連する表現で本明細書で用いられる場合もある。
【００６４】
本発明の更なる使用と利点は、以下の考察及び実施例から明らかとなるだろう。本発明のほかの局面もまた以下で考察される。
【００６５】
（発明の詳細な説明）
以上の考察のように、本発明はヘミチャンネル機能を調節する化合物とその使用方法を提供する。より詳細には、化合物はヘミチャンネルの開口又は閉鎖を助けるヘミチャンネルのリン酸化を調節する。そのような化合物の検出および特徴づけのための有用なスクリーニング方法もまた提供され、そのようなスクリーニング方法にはインビトロのアッセイ、インビボのアッセイ又はその組み合わせが包含される。さらに不適切なヘミチャンネル機能の影響による症状の治療又は予防に有用な方法が提供される。
【００６６】
本発明の目的は、細胞、組織及び器官のストレスが、ヘミチャンネルの閉鎖又は開口に伴う悪影響によることをはじめて明示することである。理論と結び付けることを望むものではないが、虚血の間の酸素欠乏、グルコース枯渇、ＨＣＮによる酸化的リン酸化の脱共役、又はクエン酸経路の脱共役のような代謝ストレスは全て、細胞間情報伝達（intercelluar gap junctional communication（ＧＪＩＣ））のアンカップリング（uncoupling）を助成すると思われる。さらに当該アンカップリングは、コネキシンのリン酸化の調節、特にギャップジャンクション（ギャップ結合）チャンネルでの、コネキシンのチロシン残基、及び／又はコネキシンのセリン残基、及び／又はスレオニン残基の脱リン酸化の調節と関係があると考えられる。例えば、心房細動の間に、心房細胞では高頻度のペーシング（pacing）で代謝要求性が増加し、これがへミチャンネルを開き、ギャップジャンクション（ギャップ結合）をアンカップリングさせるラクトースアシドーシスを導くと考えられている。
【００６７】
本発明の目的はまた、ヘミチャンネル機能を調節する方法、及び必要に応じて細胞、組織又は器官を、ヘミチャンネル機能調節活性を有する化合物の一つ又はそれらを組み合わせた治療上有効な量と接触させることを含む細胞間情報伝達（ＧＪＩＣ）を提供することである。好ましい化合物は、ＰＣＴ／ＤＫ０１／００１２７（ＷＯ０１／６２７７５）及びＰＣＴ／ＵＳ０２／０５７７３（ＷＯ０２／０７７０１７）に於いてB.Larsenらによりに開示されている。
【００６８】
本発明での使用に適する化合物は、下記の化学式Ｉ、
【００６９】
【化１】
2005516054.tif 000002
【００７０】
式中、
Ｒ１は、Ｈ又はアセチル基（Ａｃ）であり、
Ｒ２は、Ｇ，Ｙ，Ｄ−Ｙ、Ｆ及びＤ−Ｆからなるアミノ酸の一つの側鎖であり、
Ｒ３は、いかなるアミノ酸の側鎖でもよく、
Ｒ４は、Ｇ，Ｙ，Ｄ−Ｙ、Ｆ及びＤ−Ｆからなるアミノ酸の一つの側鎖であり、
Ｒ５は、ＯＨ又はＮＨ２であり、及び、
ａ、Ｓ，Ｔ、Ｐ、Ｑは整数であり、それぞれ独立して０又は１、
で表される化合物、及びその塩を包含する。
【００７１】
より特異的な化合物は、下記の化学式ＩＩ、
【００７２】
Ｒ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｒ２    （ＩＩ）
【００７３】
式中、
Ｘ１は０、Ａｌａ、Ｇｌｙ，β−Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｄ−Ｔｙｒ、又はＡｓｐ
Ｘ２は０、Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔ４ｃ−Ｐｒｏ、Ａｌａ−Ｓａｒ−Ｈｙｐ−Ｐｒｏ、Ａｌａ−Ａｓｎ、Ｄ−Ａｓｎ−Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、β−Ａｌａ、又はＡｓｎ、又は、
Ｘ３はＴｙｒ、Ｄ−Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、又はＰｈｅであり、及び、
Ｒ１はＨ又はＡｃ、ただしＸ１とＸ２の両方が０である場合を除く、
で表される化合並びにその塩を包含し、
Ｒ２はＯＨ又はＮＨ２である。
【００７４】
上述の化学式Ｉ又はＩＩで表されるより特異的な化合物は下記、
Ｇ−（ＤＢＦ）−Ｙ−ＮＨ２、
Ｈ−ＧＡ−Ｓａｒ−Ｈｙｐ−ＰＹ−ＮＨ２、
Ｈ−ＧＡＧ−Ｔ４ｃ−ＰＹ−ＮＨ２、
Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ、
Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｓｎ−Ｄ−Ａｌａ−Ｇｌｙ、
Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ、
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ、
Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｔｙｒ、
Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｌａ−Ｇｌｙ、
Ｇｌｙ−Ｄ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ、
Ｇｌｙ−β−Ａｌａ−Ｔｙｒ、
β−Ａｌａ−β−Ａｌａ−Ｔｙｒ、
Ｇｌｙ−β−Ａｌａ−Ｐｈｅ、
Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ、
Ａｓｎ−Ｔｙｒ、
Ａｃ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ、
Ａｃ−Ａｌａ−Ｔｙｒ、
還元されたＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（Ｈ２Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−Ｔｙｒ）、
【００７５】
【化２】
2005516054.tif 000003
及びその塩を包含する。
【００７６】
加えて本発明の好ましい候補化合物は、許容される経口生物学的利用性アッセイにより測定されるように、約５％以上の経口生物学的利用性を特徴とする。一般に、好ましいアッセイとしては、適当な試験媒体に候補成分を経十二指腸投与することを含む。次いで、生物サンプル、好ましくは血液サンプルにおける化合物の利用可能性を検出、及び好ましくは定量する。
【００７７】
さらに好ましい候補化合物は一般にリピンスキの５つの法則（Lipinski's rule of 5)を満たす。それを適用して、生物学的利用性を定義する。この法則によれば、下記の一つ又はそれ以上の特徴が、特有の化合物を特徴づける際には、満足な吸着よりも少ないことがより適当である。１）５以上の水素結合の供与体（ＯＨとＮＨの合計として表される。）、２）５００より大きい分子量、３）ＬｏｇＰが５より大きい、４）１０以上の水素結合の受容体（ＮとＯの合計として表される。）、及び５）。二つのパラメータが範囲外である場合には、多くの発明の態様に於いては避けた方がよい。
【００７８】
本発明のさらに好ましい化合物は血漿中で比較的安定である。許容できるアッセイは、好ましい候補化合物を血漿（たとえば、げっ歯類、ウサギ、又は霊長類の血清）と接触させ、化合物を血漿と共にインキュベートし、次いで、時間をかけて化合物の安定性を検出及び好ましくは定量することを含む。好ましい血漿の由来は、ラット、イヌ、ネコ、マウス、ブタ、ウシ、ウマ及びヒトである。本明細書で「標準の血漿安定性のアッセイ」として参照される好ましいアッセイは、ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／ＵＳ０２／０５７７３（ＷＯ０２／０７７０１７）に開示されている。アッセイに於いて良好な活性を示す一般的な化合物は、Ｃ末端のアミド化又はエステル化、並びにＤ−アミノ酸、天然アミノ酸の誘導体、Ｎ末端修飾、環構造の使用を特徴とする。そのような修飾の一つ又はそれらの組み合わせは、実質的な生物学的活性を維持しながら、安定性を増すものである。
【００７９】
本発明で用いられるヘミチャンネルを調節する特に好ましい化合物は、Ａｃ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｐｒｏ−Ｄ−４Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−ＮＨ２（化合物１）及びＡｃ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−ＮＨ２（化合物２）並びにそれらの塩を含む。
【００８０】
ヘミチャンネルを調節する好ましい化合物は、本明細書で開示されている標準のインビトロ及びインビボのアッセイの一つ又は組み合わせに於いて顕著な活性を表す。そのような化合物はまた、ヘミチャンネルを閉じる又は開くことができ、必要に応じてＧＪＩＣを調節することができる。適当な化合物は、好ましくは標準のインビトロのコネキシンのリン酸化アッセイによって測定され、コネキシン４３（Ｃｘ４３）のリン酸化を増加又は減少させる。より特異的なアッセイは、図１に示されるチロシン、セリン及びスレオニンのアミノ酸残基の一つ又はそれ以上のリン酸化、及び／又は、脱リン酸化をモニターすることである。特定のアッセイの形態は以下のとおりである。
１）コンフルエント又はセミコンフルエントなラット心筋細胞又はＨ９ｃ２細胞のような培地での約１０５の細胞群の培養。
２）細胞を洗浄し、次いで約１時間又はそれ以下の間グルコースの不足した培地で培養することにより、細胞にストレスをかける。
３）化合物１を約１０分から８時間かけて培地へ添加し、濃度を０．１から２００ｎＭとする。
４）細胞を溶解し、Ｃｘ４３のチロシン、セリン、及び／又はスレオニンのリン酸化を適当なコントロールと比較することによって検出し、そして
５）ヘミチャンネル機能を調節する化合物の指標としてリン酸化の変化を測定する。
【００８１】
当該方法の一態様に於いては、検出工程（４）はさらに免疫学的又はセルソーティングに基づくアッセイに於いて候補化合物を試験することを含む。免疫学的アッセイに於いては、当該アッセイは通常、コネキシンのリン酸化を増加又は減少させるのに十分な条件下で候補化合物と細胞を接触させることを含む。好ましくは、当該方法は更に、細胞の溶解物の調製、及び細胞溶解物におけるコネキシンのリン酸化の増加又は減少の検出を含む。その増加又は減少は、さらにヘミチャンネルを調節する化合物の指標とされる。
【００８２】
当該方法で使用するのに好ましい免疫学的アッセイは、すでに開示されており、免疫沈降アッセイ、抗体捕獲アッセイ、二つの抗体によるサンドイッチアッセイ、抗原捕獲アッセイ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）等が含まれる。一般的には、多くの標準の免疫学的手法に関する考察としてE.Harlow及びD.LaneによるAntibodies：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)、及びAusubelらの (1989) Current Protocols in Molecular Biology、J.Wiley & Sons、New Yorkを参照のこと、またそれらの開示は本明細書に参照として取り込まれる。
【００８３】
好ましい免疫学的アッセイはＥＬＩＳＡアッセイである。一態様に於いては、当該方法は更に、以下の工程の少なくとも一つ、好ましくは全てを含む。
ａ）固体支持体をコネキシン、好ましくはコネキシン４３（Ｃｘ４３）に特異的に結合する第一の抗体で被覆する。
ｂ）細胞溶解物を、第一の抗体とコネキシンが結合複合体を形成できるような条件下で固体支持体に接触させる。
ｃ）第一の抗体とコネキシンとの結合複合体を、第二の抗体と接触させ、その接触は、第二の抗体、及び第一の抗体とコネキシンとの結合複合体におけるリン酸化されたコネキシンが特異的に結合できる十分な条件下で行われる。
ｄ）第一の抗体：コネキシン：第二の抗体の結合複合体を、第二の抗体に結合する検出可能に標識された第三の抗体と接触させる。
ｅ）化合物の指標として、検出可能に標識された第三の抗体の存在を当該固体上で検出する。
【００８４】
当該方法の一態様に於いては、当該方法の第三の抗体は、ビオチン、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、放射活性ヨウ素又はパーオキシダーゼの少なくとも一つで検出可能に標識されたものである。他の態様では、第二の抗体は抗ホスホチロシン抗体である。さらに他の態様では、第二の抗体は抗ホスホセリン抗体である。いくつかの例に於いて、検出可能に標識された第三の抗体の検出は、放射性又はガンマシンチレーション計測により行われる。
【００８５】
他の態様では、検出工程で採用される免疫学的方法はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）である。好ましくはそのようなＲＩＡには以下の工程の少なくとも一つ、好ましくは全てが含まれる。
ａ）細胞溶解物を調製する前に細胞を検出可能に標識するが、当該標識はリン酸化されたコネキシン、好ましくはコネキシン４３（Ｃｘ４３）を標識する条件下で行われる。
ｂ）細胞溶解物を、コネキシンと特異的に結合複合体を形成する抗体を接触させる。
ｃ）検出可能に標識された細胞溶解物から結合複合体を分離する。及び、
ｄ）標識されたリン酸化コネキシンをギャップジャンクション（ギャップ結合）を調節する化合物の指標として検出する。
【００８６】
当該方法の一態様に於いては、抗体は抗コネキシン抗体である。他の態様では、検出工程にはさらにウエスタンブロッティングアッセイを行うことが含まれる。ＲＩＡ方法は様々な検出可能な標識に適合するが、多くの適用に於いては放射活性無機リンの投与が好ましい。
【００８７】
前述の発明の方法で使用される、抗ホスホチロシン、抗ホスホセリン及び抗Ｃ４３抗体を含む抗体は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）、シグマケミカル、St.Louis, MO、ジメッドラボラトリー Inc.、California、及びアマシャムバイオサイエンス、英国のような、様々なところから商業的に入手可能である。
【００８８】
前述の標準のインビトロの試験方法により同定される好ましいヘミチャンネルを調節する化合物は、Ｃｘ４３のリン酸化、特に図１に示されるチロシン、セリン及びスレオニン残基の一つ又はそれ以上でのリン酸化を調節する優れた能力を示す。より好ましい化合物は、化合物が約０．１ｎＭから約２００ｎＭの濃度で存在しているストレスがかけられた細胞と比較して、少なくとも５％、好ましくは少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも約５０％のリン酸化における変化（Ｃｘ４３のホスホチロシン、ホスホセリン、及び／又は、ホスホスレオニンの一つ又はそれ以上の存在下における増加又は減少として測定される）を示す。
【００８９】
標準のインビトロのコネキシンのリン酸化アッセイの特定の具体例としては、以下の実施例２〜５を参照のこと。
【００９０】
以上の考察のように、本発明はまた、ヘミチャンネルを調節する化合物の検出、及び場合によってはその特徴づけに使用できる標準のインビトロ取り込みアッセイを提示する。アッセイは単独で又は標準のインビトロのコネキシンのリン酸化アッセイと組み合わせて使用できる。標準のインビトロ取り込みアッセイの特定の態様は、以下に記載される通りである。
１）約１０５のコンフルエントなラットの心室筋細胞群を培地で培養する。
２）培地を、グルコースが少ない培地に、約２時間より短い時間、好ましくは約３０分置換することにより、細胞にストレスをかける。
３）化合物１を培地に添加し、濃度を約０．０１ｐＭから１００ｎＭとする。
４）カルセイン色素を約２時間より短い時間、好ましくは約３０分かけて培地に添加して、濃度を約１０から５００μＭとする。
５）カルセインの細胞への取り込みにおける変化を検出する。及び
６）ヘミチャンネル機能を調節する化合物の指標としてその変化を測定する。
【００９１】
カルセインの取り込みにおける変化を検出する工程は、蛍光顕微鏡、及び／または関連したセルソーティング法を含む標準の方法の一つ又はその組み合わせにより遂行できる。標準のインビトロ取り込みアッセイの特定の具体例として、実施例６を参照のこと。
【００９２】
前述の標準のインビトロ取り込みアッセイにより検出される好ましい化合物は、約０．０１ｐＭ乃至１００ｎＭの試験される化合物の存在下に於いて、少なくとも約５％、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約５０％、ストレスをかけられた細胞に比較して色素の取り込みの減少（細胞ヘミチャンネルの閉鎖）を示す。
【００９３】
また考察のように、本発明は、インビトロでの細胞容量のアッセイを提供するもので当該アッセイは、単独で行ってもよいし、又は標準のインビトロのコネキシンのリン酸化及び標準のインビトロ取り込みアッセイの一方若しくは両方と組み合わせて行ってもよい。標準のインビトロの細胞容積のアッセイの特定の態様は以下の通りである。
１）約１０５のコンフルエントなラットの心室筋細胞群を培地で培養する。
２）細胞に、約０．５から約１００μＭ、好ましくは約５μＭのカルセイン−ＡＭを、約２時間より短い時間、好ましくは約１５分間、細胞に負荷する。
３）カルセイン−ＡＭ由来のシグナルを検出、好ましくは定量することにより、細胞容量を測定する。
４）培地に化合物１を添加して、濃度を約０．０１ｎＭから約１００ｎＭとする。
５）グルコースの少ない培地で培養することにより、細胞にストレスをかける。
６）細胞容積の変化を適当なコントロールと比較して検出する。
７）ヘミチャンネル機能を調節する化合物の指標としてその変化を測定する。
【００９４】
細胞容積における変化を検出する工程は、レーザー共焦点顕微鏡、及び／又は、関連の細胞分類（セルソーティング）法を含む標準の方法の一つ又はその組み合わせにより遂行できる。実施例７は標準のインビトロ細胞容積アッセイの特定の具体例を示すものである。
【００９５】
前述の標準のインビトロの細胞容積のアッセイにより検出される好ましい化合物は、約０．０１ｐＭ乃至１００ｎＭの試験される化合物の存在下に於いて、少なくとも約５％、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約５０％、ストレスをかけられた細胞に比較して細胞容積の減少（ヘミチャンネルの閉鎖）を示す。このアッセイで選択された化合物は、ヘミチャンネルを通過するオスモライト（osmolyte）の流れを阻害し、細胞性膨張を生じる条件下で正常な細胞容積を維持することを助ける。重要なことは、細胞の膨張は線維性組織層（fibrous capsule）により囲まれた器官（例えば心臓、腎臓、骨格筋肉）又は骨（脳、脊髄）に於ける潅流の悪化と関連しており、それゆえヘミチャンネルを遮断する能力を有する化合物は、細胞性膨張に関連する疾患の治療に有効であるということである。
【００９６】
適当な対照実験は、通常、特定のアッセイ形態で使用されるように調整されている。たとえば、ほとんどの対照実験は、試験サンプル（例えば培養されたラット心筋細胞群）を培地でのインキュベーションのようなストレスのかからない条件下で用いる。通常は試験される化合物の代わりに、水、緩衝液若しくはリン酸緩衝生理食塩水等を用いた同様な試験方法が並行して又は別々にアッセイに添加されて行われる。望ましいアッセイは次いで、当該方法に従って行われる。適当なコントロールの具体例は、実施例の項に示されている。
【００９７】
本発明の方法は、多様な慣用の検出アッセイと互換性がある。この様なアッセイは、手作業で、半手作業で又は必要に応じて自動化されて行われる。迅速な又はスケールの大きなスクリーニング戦略が必要とされる場合は、本発明に於いては更に、標準の「高速スループット」及び／または「超高速スループット」スクリーニング方法を用いてもよい。この様な方法の例としては、本明細書で示される免疫学的及びセルソーティングタイプのアッセイが含まれる。
【００９８】
考察のように、本発明は広範囲の試験戦略と互換性がある。従って、ある態様に於いては、候補化合物の更なる試験は、ヘミチャンネルを調節する活性を試験又は好ましくは確認するためにインビボで行われてもよい。例えば、本明細書に記載の標準のインビトロの方法を一つ又は組み合わせたものは、ヘミチャンネル調節の活性化に関して化合物を試験するために、標準のインビボの不整脈モデルに於いて使用してもよい。標準のインビボのマウス不整脈のアッセイは、以下に参照例１として示され、またB.LarsenらによりＰＣＴ／ＤＫ０１／００１２７（ＷＯ０１／６２７７５）及びＰＣＴ／ＵＳ０２／０５７７３（ＷＯ０２／０７７０１７）にて開示されている。
【００９９】
本発明の一つ又はそれ以上の方法により同定された候補化合物は、ギャップジャンクション（ギャップ結合）及び、特に多様な細胞、組織及び器官のヘミチャンネルの同定のためのプローブとしての使用を含む重要で広範囲の応用に適している。当該化合物は、多様な発生段階及び疾病状態のギャップジャンクション（ギャップ結合）及びヘミチャンネルの検出のためのプローブとして、並びに特定の糖鎖及び／又はリン酸化のパターンによる構造を検出するためのプローブとして使用できる。当該化合物はさらに標準のクロマトグラフィーによりギャップジャンクション（ギャップ結合）の構成要素を精製するための固体の支持体としても使用される。
【０１００】
本明細書に記載されているインビトロ及び／またはインビボの試験方法により選択される化合物は、ヘミチャンネルの開口が増加したこと（細胞外分画への増加した細胞膜透過性）、例えばやけどのような傷、血栓症、呼吸性及び代謝性アシドーシス、たとえばバクテリア又は環境毒による組織膨張及び限局性不整脈（focal arrhythmia）に影響される症状の予防又は治療のための薬剤として使用することができる。本発明の他の薬剤としては、破壊的な細胞容量の変化から細胞を保護するために使用される。この様な変化は、過剰な熱、虚血、毒、炎症、浮腫、電解質の混乱、グルコースレベルの上昇、糖尿病の後期合併症を含む、要因の一つ又は組み合わせにより促進される。増加したセリンのリン酸化に伴う慢性の心房細動の治療にも応用される。本発明の更なる化合物は下記の症状の重篤度を予防、治療、緩和又は減じるための薬剤として使用することができる。ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／ＤＫ０１／００１２７（ＷＯ０１／６２７７５）及びＰＣＴ／ＵＳ０２／０５７７３（ＷＯ０２／０７７０１７）も参照のこと。
【０１０１】
本発明の治療方法は一般的に、本明細書に開示されているヘミチャンネルを調節する化合物の一つ又はそれらの組み合わせの治療上有効な量を当該治療が必要な対象生物、例えば哺乳動物、特にヒトのような霊長類に投与することを含む。本発明の治療方法はまた、上に定義された化学式Ｉ又はＩＩの化合物の有効量を、対象生物、特に本明細書に開示されているような兆候のための治療が必要なヒトのような哺乳動物に投与することを含む。
【０１０２】
一般的な対象生物としては、下記セクションＡ〜Ｒに記載されている症状を含む、本明細書で提供される疾患の一つ又はそれらを組み合わせものに羅患している哺乳動物が含まれる。
【０１０３】
Ａ．神経組織
小グリアは中枢神経系（ＣＮＳ）の主要な免疫エフェクターであり、頭傷害、虚血、神経変性疾患、自己免疫疾患、感染症、プリオン、脳腫瘍を含む、脳炎症応答を引き起こす様々な疾病に応答して活性化されることはよく知られている。活性化された小グリアは傷害を受けたＣＮＳ領域に移動し、そこでそれらは増殖して徐々に細胞の破片を除去する。Eugeninらは、小グリアは炎症サイトカインにより誘導されるギャップジャンクション（ギャップ結合）を通じてお互いコミュニケートできることを示した（Eugenin E Aら、Proc Natl Acad Sci USA, Vol.98, 4190-4195, 2001）。これは以下の実験で証明された。脳の刺し傷による損傷では、小グリアは数日間で徐々に蓄積し、細胞間のインターフェースでのＣｘ４３免疫反応性を頻繁に示した凝集物を形成した。初代培養に於いて、小グリアはウェスタンブロッティング、拡散細胞内Ｃｘ４３免疫活性、及び色素カップリングの低発生率により測定された低レベルのＣｘ４３を示した。１回の治療に免疫刺激性バクテリアのリポポリサッカライド（ＬＰＳ）若しくはサイトカインインターフェロンガンマ（ＩＮＦ−ガンマ）又は腫瘍ネクローシス因子α（ＴＮＦ−α）を一つずつ用いた治療於いては、色素カップリング率は増加しなかった。しかしながら、ＩＦＮ−ガンマに加えてＬＰＳで処置された小グリアは、抗ＴＮＦ−α抗体を同時に適用したときに阻害されていた色素カップリング率の劇的な増加を示したが、これはＴＮＦ−αの放出及び自己分泌を示唆するものである。ＩＦＮ−ガンマに加えてＴＮＦ−αでの処置はまた、色素カップリング率及び、細胞間接触に向けてＣｘ４３の転座（translocation）により、Ｃｘ４３レベルを大幅に増加させた。サイトカイン誘導性色素カップリングは、ギャップジャンクション（ギャップ結合）阻害剤である１８−グリシルヘチニン酸により可逆的に阻害された。培養されたマウス小グリアもまたＣｘ４３を発現し、サイトカインで処置されて染色カップリングを生じたが、ホモ接合のＣｘ４３欠損マウス由来のミクログリアは、ＩＦＮ−ガンマとＬＰＳ若しくはＩＮＦ−ガンマとＴＮＦ−αのいずれで処置しても顕著な色素カップリングを生じなかった。
【０１０４】
ギャップジャンクション（ギャップ結合）蛋白質である、コネキシンを強制的に発現させることは、ギャップジャンクション（ギャップ結合）が欠損している細胞株に於いて細胞内カルシウム波（calcium wave）の伝搬を可能にする。Cotrinaらは、ほとんどカップリングしていない細胞株、Ｃ６グリオーマ、ＨｅＬａ及びＵ３７３グリオブラストーマからのＡＴＰ分泌の可能性が、コネキシンの発現により５〜１５倍増強されたことを実証した。これらの知見は、コネキシン発現に関連する細胞間のシグナリングはコネキシンへミチャンネルを通して介在されるＡＴＰ放出を結果的に増進させることを明らかにした（Cotrina MLら、Proc Natl Acad Sci USA 1998 Dec 22; 95(26): 15735-40、Cotria ら、J,Neurosci 2000 Apr 15; 20(8): 2835-44）。さらに代謝ストレス（たとえば虚血）状態に於いては、ヘミチャンネル介在性の星状細胞からのＡＴＰ放出は、近傍のニューロンに影響を及ぼして細胞内カルシウムレベルを上昇させ、アポトーシス及び神経死へと導く。
【０１０５】
例えば、化合物１及び化合物２によってＣｘ４３チロシンがリン酸化されるので、これら化合物を投与により、ヘミチャンネルが閉じるの助け、小グリアの細胞間コミュニケーションを促進し、それによって上述した疾患（脳傷害及び虚血を含む脳炎症応答、神経変性疾患、自己免疫疾患、感染症、プリオン及び脳腫瘍）を「治癒」させるプロセスを増強又は迅速化する。さらにヘミチャンネルの閉鎖は、ＡＴＰの放出を防止し、それにより初期傷害の拡張を抑制することが期待される。
【０１０６】
Ｂ．肺組織：肺胞細胞
肺胞細胞のギャップジャンクション（ギャップ結合）を介した肺胞細胞間コミュニケーションは、イオン輸送、メカノケミカルシグナル伝達、細胞成長制御及び界面活性因子の分泌の促進に於いて重要なことである（Ashino Yら、(Am J Physiol Lung Mol Physiol 2000; 279: L5-L13)）。肺の肺胞領域に於ける急性及び慢性の炎症性損傷後のインビボでの修復には、細胞外マトリックスとしてのフィブロネクチンの形成を伴う（Charash WEら、(Am Rev Respir Dis 1993; 148: 467-476)、及びTorikata Cら、(Lab Invest 1985; 52: 399-408)）。肺胞上皮細胞培養の研究によって、細胞外フィブロネクチン濃度の増加に伴ってギャップジャンクション（ギャップ結合）数の増加が示された（Alford AI及びRannels  DE(Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2001; 280: L680-688)）。二酸化窒素により誘発された重篤な肺の炎症に継いで、肺胞組織である末端細気管支壁、肺胞管及び細気管支周囲肺胞で、ギャップジャンクション（ギャップ結合）の数が減少することが、インビボ動物実験によって見出された。これらの知見は用量依存的であったが、タウリンで前処理した場合、炎症反応の鎮静化に伴い、ギャップジャンクション（ギャップ結合）の減少も抑制された。ラットの肺へ放射線照射した後、及び化学療法化合物であるブレオマイシンで処理した後にも同様の知見が見られた。
【０１０７】
このように肺組織における細胞間情報伝達を維持することは肺線維症の予防に重要であるが、炎症過程及び、ガス吸入、空気によって運ばれる破壊物質並びに放射線照射といった様々な毒性刺激に対する反応として、コネキシン量の減少が見られる。Ｃｘ４３のチロシン残基をリン酸化する本発明の化合物で前処理し、ヘミチャンネルの閉鎖及び／若しくはギャップジャンクション（ギャップ結合）を開くこと又は細胞間情報伝達を促進することが、例えば肺ガンで肺が治療用の放射線に曝されるといったような、また胸ガン、甲状腺及び食道ガンの治療用放射線照射に先立って必要とされるだろう。
【０１０８】
ヘミチャンネルの閉鎖及び／若しくはギャップジャンクション（ギャップ結合）の開口を促進又は仲介する化合物による治療は、気腫、石綿病、珪拝承、肺線維症、肺炎、薬剤誘導性肺線維症及び二酸化窒素のような肺の毒性ガスにさらされた患者の肺機能が更に悪化するのを予防できる。治療方法としては、このような症状に対する慣用的な治療に加えて行われるのが好ましい。化合物は、経口、非経口、経鼻、又は肺吸入で投与されてもよい。
【０１０９】
Ｃ．平滑筋
１．血管のシステム
ギャップジャンクション（ギャップ結合）チャンネルを通した細胞間情報伝達は、血管系図（tree）を介した血管筋肉細胞の緊張の制御及び調節に基本的な役割を果たす（Christ GJら、Circ Res 1996; 79: 631-646）。細胞間情報伝達のその他の重要な役割は、血管弛緩応答に伴う平滑筋細胞間の過分極である（Benny JLら、Physiol Heart Circ Physiol 1994; 266: H1465-1472）。
【０１１０】
血管内皮の特異的な機能は、単層内での内皮細胞間、及び、内皮細胞と血管壁に存在するその他の細胞の間での細胞間情報伝達（ＧＪＩＣ）を必要とする。ほかの全ての血管と同様に、冠動脈毛細管においても、ギャップジャンクション（ギャップ結合）を通じた異なる細胞間での情報伝達が、いくつかの研究で実証されている。適応する動脈新生においても関与が立証されている（Cai W-Jら、J Mol Cell Cardiol 2001; 33: 957-967、Wang H-Z Amら、J Physiol Cell Physiol 2001; 281: C75-88、Schuster Aら、Am J Physiol Heart Circ Physiol 2001; 280: H1088-1096）。
【０１１１】
食事で誘導されたハイパーコレステロール障害と同様に、内皮単層が破壊される様々な血管の病気生理学的状況では、血管平滑筋における細胞間情報伝達（ＧＪＩＣ）が減少している（Polacek Dら、J Vasc Res 1997; 34: 19-30）。内皮細胞層の傷害は、静脈うっ血状態及び血栓静脈炎に羅患したときにみられる。Kwak BRら、Molec Biol Cell 2001; 12:831-845は、細胞間情報伝達（ＧＪＩＣ）が上皮細胞修復時の細胞移動を調整する働きをし、また、血管新生時の毛細管萌芽にとって重要な役割を果たすことを明確に立証している。
【０１１２】
ヘミチャンネルを閉じる及び／又は、細胞間情報伝達（ＧＪＩＣ）を促進する本発明の化合物による治療は、病気による血管領域の細胞間コミュニケーションの悪化を改善し、たとえば特に、間欠性跛行や心筋梗塞といった器官虚血に有用なものである。
【０１１３】
しかしながら、ラット頚動脈におけるバルーンカテーテル傷害の血管治癒のプロセスには、ギャップジャンクション（ギャップ結合）コミュニケーションの増加が見られるという特徴がある（Yeh HIら、Arterioscle Thromb Vasc Biol 1997; 17: 3174-3184）。本発明の適当な化合物は、バルーンを挿入する前に投与されたほうがよく、このような症状の慣用的な療法に付随する治療として用いられるのが好ましい。化合物の投与は、非経口が好ましい。その効果は、バルーンカテーテルによる傷害の前、及び後の異なった時間に採取された組織を用いて試験できる。内皮表面の急速なな治癒は慣用的な顕微鏡を用いて観察できる。ギャップジャンクション（ギャップ結合）コミュニケーションにも改善が見出される。Arterioscle Thromb Vasc boil 1997; 17: 3174-3184も参照のこと。
【０１１４】
２．勃起性の機能低下
海綿体には、ギャップジャンクション（ギャップ結合）を通じて合胞体のネットワークが確立されており、それは勃起機能にとって重要であり、陰茎の海綿体（corporal）及び動脈の平滑筋細胞の均一で連携した応答を確保するものである（Chtist GJ. (Int J Impot Res 2000; 12 suppl. 4: S15-25)。Melman A, Christ JC(Urolog Clin North America 2001; 28:217-31)）。糖尿病、動脈硬化、種々の神経疾患及び多くの慢性疾患には、勃起機能の阻害が見られる。糖尿病の研究によると、ギャップジャンクション（ギャップ結合）を経由する機能的な細胞間コミュニケーションは確立されていないが、神経感応と細胞間カップリリングの相反する関係が、身体環境における可塑性機能の可能性を示していると言える。
【０１１５】
ヘミチャンネルの閉鎖及び／又はギャップジャンクション（ギャップ結合）の開口を促進する化合物での治療は、、ギャップジャンクション（ギャップ結合）を経由するコミュニケーションを改善し、海綿体及び血管の平滑筋細胞間の複合的な連携を正常化する。
【０１１６】
化合物の勃起機能のインビボの薬学的試験は、Rehman Jら、(Am J Physiol 1997; 272: H1960-71）に記載されているように、ラット（８週）に、ストレプトゾトシン（３５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）で糖尿病を誘発してから１０週後に試験することができる。陰茎の反射と海綿体圧は、ヘミチャンネルを調節する多様な化合物が種々の濃度で、局所及び全身投与時に、同研究グループの文献に記載されている測定法及び技術を用いて測定される。陰茎反射及び海綿体圧に２５％又はそれ以上の増加がみられる。
【０１１７】
勃起機能低下の治療は、陰茎体に皮下注射で局所投与又は経口投与できる。治療は単独で又は当該症状の慣用的な治療に加えて行うことができる。
【０１１８】
３．失禁
膀胱の平滑筋は一過性収縮が特徴であり、自発的な一過性の収縮を示す。しかし膀胱は健康な状態では膀胱内圧の増加を示すことなく、数百ミリリットル貯尿することができる。正常な膀胱とは対照的に、不安定膀胱は、急迫性尿失禁に関連した自発的な膀胱内圧上昇を示す（Turner WH, Brading AF (Pharacol Therap 1997; 75: 77-110)）。胃腸の平滑筋に比べて、膀胱の平滑筋は自発的に調整された収縮を引き起こさない(Stevens RJら、 (Am J Physiol 199; 2777: C448-60), Hashitani Hら、(J Physiol 2001; 530: 273-286))。近年、膀胱における平滑筋細胞間のギャップジャンクション（ギャップ結合）を介した電気的及び形態的な情報伝達が明らかにされた（Hashitani Hら、(J Physiol 2001; 530: 273-286), Wang H-Zら、(Urology 2001; Suppl 6A: 111)）。これらのギャップジャンクション（ギャップ結合）の重要性は、特異的なコミュニケーションの阻害により実証された。膀胱平滑筋における自発的な興奮の高まりは、ギャップジャンクション（ギャップ結合）を介して伝搬される。
【０１１９】
従って、抑えることのできない急迫性尿失禁は、ヘミチャンネルを閉鎖する又はギャップジャンクション（ギャップ結合）を開口する化合物で治療することにより制御できる。化合物は非経口又は経口で膀胱への投与できる。投与は、膀胱の筋肉収縮を正常化させるための薬剤療法に付随して行われるのが好ましい。
【０１２０】
顎下腺、尿管、胆汁腺、すい臓腺、涙腺などにある筋上皮細胞は、ギャップジャンクションに結合しており、細胞間情報伝達は筋上皮細胞の収縮機能を同期化させるのにきわめて重要である(Taugner R, Schiller A(Cell Tissue Res 1980; 206: 65-72）。これらの腺において阻害された収縮性は、ヘミチャンネルを閉鎖する又はギャップジャンクション（ギャップ結合）を開く化合物を非経口又は経口で投与することによって正常化できる。
【０１２１】
Ｄ．治癒
化合物１及び化合物２のような、ヘミチャンネルを閉鎖する又はギャップジャンクション（ギャップ結合）を開く試薬による療法の予防効果は、、Yeh HIらの（Arterioscle Thromb Vasc Biol 1997; 17: 3174-84）に記載の実験手順に従って試験することができる。化合物１又は２は、例えば上述した塩化カルシウム誘導性不整脈モデルに於いて測定されるように、化合物の生理学的反応速度論に応じて１０−１１〜１０−８の範囲の用量を、バルーン挿入の前に投与してもよい。組織は、バルーンカテーテル傷害の前及び後の異なった時間にサンプリングされる。内皮表面の急速なな治癒は慣用的な顕微鏡を用いて観察できる。化合物は、例えば非経口で投与される。
【０１２２】
治癒は、凝集（止血）に始まる一連のオーバーラッピングフェーズに於いて進行する。治癒過程の第二フェーズは、マクロファージが傷の部位に集まり、他の構成要素である繊維芽細胞やリンパ球細胞を伴う、肉芽組織の形成が始まる炎症応答のカスケードである。上皮細胞は次いで、損傷の領域を覆うために傷の境界から移動をはじめる。正常な組織から毛細血管が、出芽するように損傷部位に伸びてくるのもまた、栄養物、酸素及び異なる細胞の供給をするためである。全ての細胞と毛細血管内皮細胞はギャップジャンクション（ギャップ結合）を介して活発に細胞間コミュニケーションをする（Abdullah KMら、(Endocrine 1999; 10:35-41)）。組織壊死を伴う傷、糖尿病、動脈硬化、手術後の傷、浮腫、感染、火傷の傷並びに静脈不良に於いてしばしば見られる低酸素供給及び／又は高濃度のフリーラジカルは、細胞間情報伝達（ＧＪＩＣ）を減少させる。（Nagy JIら、Cell Growth Diff 1996; 7: 745-51）。
【０１２３】
ヘミチャンネルを閉鎖する又はギャップジャンクション（ギャップ結合）を開く化合物を用いた治療は、複雑な修復工程に於いて重要な役割を果たすと考えられている異なった細胞間のギャップジャンクション（ギャップ結合）に於いて、最大限のコミュニケーションを確立して傷の修復を改善する。化合物は局所、全身又は経口で投与できる。
【０１２４】
Ｅ．糖尿病網膜症
糖尿病網膜症は、血流量の変化（Bursell S-Vら、(Cur Eye Res 1992; 11: 287-95)）、血液−網膜バリアにおける機能低下（Cunha-Vaz JGら、(Br J Ophthalmol 1975; 59: 649-56), Do Carmo Aら、(Exp Eye Res 1998; 67: 569-75)）、及び／又は自己制御の消失(Kohner EM, Patel V, Rassam SMB(Diabetes 1995; 44: 603-6-7))を同定することにより、羅患した最初期の段階で診断することができる。追跡子の輸送と、細胞のダブルパッチクランプ法を使用することにより、Oku Hら（Invest Opthalmol Vis Sci 2001; 42: 1915-1920）は過剰な細胞間カップリングを示した。ギャップジャンクション（ギャップ結合）経路の閉鎖は、網膜の微細血管の多細胞性機構を崩壊させ、糖尿病の網膜の血管機能低下をもたらす。Zhou ZYら（Neuroscienc 2001; 102: 959-67）はさらに活性酸素が網膜ギャップジャンクション（ギャップ結合）のアンカップリングに関与し、グルタチオンが供給されるときには、再カップリングが起こることを立証した。
【０１２５】
ヘミチャンネルを閉鎖する化合物の糖尿病網膜症への影響は、上述したようにストレプトゾトシン誘導性の糖尿病モデルラットを使用してインビトロで調べることができる。新しく単離された網膜微細血管（Sakagami Kら、J Physiol (Lond) 1999; 521: 637-50）は、Oku Hら（Invest Opthalmol Vis Sci 2001; 42: 1915-1920）に記載されているようにカバースリップへ移す。この調製に於いて、血管壁における細胞間のコミュニケーションは、色素又は追跡子を用いて測定される。１０−１０〜１０−７Ｍの範囲の異なった濃度の本発明の化合物、例えばギャップジャンクション（ギャップ結合）を開く化合物１又は化合物２が試験され、ベースラインに比較して細胞間コミュニケーションの顕著な増加が、糖尿病の網膜に於いて見られる。同様の改善は、コントロール（健常動物）との比較で見いだされる。全身的、局所的又は経口（投与）により治療される。慣用的な抗糖尿病療法と合わせて行われるのが好ましい。
【０１２６】
糖尿病網膜症だけでなく、例えば動脈硬化のような網膜における血管異常に、Ｃｘのチロシンのリン酸化を助ける化合物で処理することによるヘミチャンネルの閉鎖の増加又はギャップジャンクション（ギャップ結合）の情報伝達の改善が役立つであろう。化合物は非経口で投与される。
【０１２７】
Ｆ．心疾患
１．房室（ＡＶ）遮断
心臓の心房心室結節における細胞間コミュニケーションは、ギャップジャンクション（ギャップ結合）により維持されている。機能の減少は、伝導（conduction）の減少へとつながり、全体としてＡ−Ｖ遮断へつながる。
【０１２８】
ＡＶ遮断は、急激な心筋梗塞、虚血性心臓疾患、ジギタリス中毒、カルシウムチャンネルブロッカー中毒に見られ、ヘミチャンネルを閉鎖する化合物はＡＶ伝導を改善できる。ヘミチャンネルを閉鎖する化合物の投与は、非経口又は経口で行われる。
【０１２９】
２．心房細動
Ｎａｏら（２００１）は、慢性心房細動（ＡＦ）患者の心筋細胞におけるコネキシン４０のセリンのリン酸化の減少を見出した。コネキシンに於けるセリンのリン酸化の減少は、心房細動（ＡＦ）へとつながる細胞のアンカップリングと関連することが知られている。慢性心房細動（ＡＦ）の症状が、コネキシンに於けるチロシンのリン酸化の減少によるものであれば、本明細書に示される化合物１又は２のような化合物で治療することによって、チロシンのリン酸化を増加させてヘミチャンネルを閉じ、ギャップジャンクション（ギャップ結合）チャンネルを開くことによって心房細動（ＡＦ）の原因を取り除くことができる。
【０１３０】
３．虚血／再潅流傷害
部分的な虚血に於いて心臓は、細胞膨張の原因となる代謝ストレスにさらされ、次いで、組織の圧力を増加させて虚血限界領域組織の潅流を減少させる。虚血限界領域における潅流の減少は、梗塞が徐々に広がるのを助長し、心機能の更なる低下を招くと考えられている。実施例７及び８で示されるように、化合物１は虚血時の細胞膨張を抑制し、梗塞の規模を縮小し、心筋梗塞後の心機能の低下を防ぐ。
【０１３１】
さらに、血栓溶解剤の投与又は経皮経管腔冠動脈血管形成（ＰＴＣＡ）により心筋梗塞患者の冠動脈潅流を再び安定化させる。血流の回復が心筋の救出にとって必須であるが、再潅流そのものは「再潅流傷害」として知られる、虚血のみによる組織傷害に加えて更なる組織傷害を誘発する。酸素フリーラジカル過剰、好中球介在性心筋障害、細胞内カルシウム過剰、浸透圧環境の変化を含む多くのメカニズムが、再潅流傷害を誘発するとされている（Wangら、Cardiovasc Res 2002 Jun; 55(1): 25-37 総説）。
【０１３２】
正常な条件下では、ほとんどの細胞が浸透圧変化を生じないように、体液の浸透圧は厳格に調整されているが、虚血、敗血性ショック、糖尿病昏睡のような病態に於いては浸透圧変化が生じるという認識がある。浸透圧変化による主な影響は、細胞容積を急速に変化させることである。細胞周囲の浸透圧が減少すれば、細胞は膨張し、細胞周囲の浸透圧が増加すれば、細胞はつぶれる。浸透圧の変化を緩和するために、細胞は、細胞容積を正常化し、正常な機能を維持するために浸透圧チャレンジにより活性化される容積制御機構を獲得してきた。心臓では、浸透圧ストレスは、乳酸のような代謝物が細胞内及びある程度は細胞外に蓄積するといった心筋虚血時に生じ細胞膨張の原因となる。この膨張は、超浸透圧細胞外環境が正常浸透圧血液により置換される際に、さらに再潅流に於いて悪化され、心臓の細胞膜の破裂までも招く（Wright AR, Rees SA: Pharmacol Ther 1998 Oct; 80(1): 89-121総説）。よって、本発明によって選択された化合物は、例えば実施例７（図９Ａ）に記載される効果と同様の機序により、再潅流の間の心筋傷害を防ぐ。
【０１３３】
更に、一般に行われるＰＴＣＡの間にアテローム斑が破裂してＰＴＣＡ部位の循環末端で塞栓を生じ、これにより心不全の加速的進行及び死亡率の増加している（Henriques JPら、Eur Heart J 2002 Jul; 23(14): 1112-7）。実施例７及び８に示されるように、化合物１は虚血時に細胞膨張を防止し、梗塞の大きさを減少させ、心筋梗塞後の心機能の悪化を抑制する。化合物のこれらの性質は再潅流の間の傷害を減じるものである。
【０１３４】
したがって、本発明は治療を必要とする哺乳動物の組織又は器官の細胞を防御する方法を提供する。一態様では、当該方法は、化学式Ｉ又はＩＩで表される化合物からなる群から選ばれる少なくとも一つの化合物の治療上有効量を投与することを含む。「細胞防御」という用語は、望まれない細胞膨張と関連する兆候を減少、予防又は緩和することを意味する。当該方法により恩恵を受けるであろう特別な組織や器官には、心臓又は腎臓のような繊維組織層により被覆又は封入されたものが含まれる。また脳、脊髄、骨髄のような、骨と関連する組織も含まれる。
【０１３５】
一態様に於いては、当該方法にはさらに、哺乳動物の組織又は器官を本明細書に記載されているような虚血状態にさらすことを含む。例としては、虚血が害となる心筋細胞膨張と関連している心筋梗塞（心臓麻痺）が挙げられる。一態様に於いてはそのような膨張は哺乳動物にＡｃ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｐｒｏ−Ｄ−４Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−ＮＨ２（化合物１）及びＡｃ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−ＮＨ２（化合物２）の少なくとも一つを投与することにより、減少又は回避することができる。
【０１３６】
考察のように、哺乳動物に於いて再潅流傷害を予防又は治療する方法もまた、本発明により提供される。一態様に於いては、化学式Ｉ又はＩＩで表される化合物からなる群から選ばれる少なくとも一つを治療上有効量投与することを含む。より特異的な態様では、当該方法にはさらに梗塞状態の哺乳動物の心臓が含まれる。当該方法に従って、一般的にはできる限り迅速に冠動脈潅流を確立することが好ましい。ある態様では、当該方法にはさらに血栓溶解剤（例えば組織プラスミノーゲンアクティベーター（「ＴＰＡ」）を投与すること、又は梗塞した心臓へ冠動脈潅流を促進するために、冠動脈血管形成を提供することを含む。一態様に於いては、Ａｃ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｐｒｏ−Ｄ−４Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−ＮＨ２（化合物１）及びＡｃ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−ＮＨ２（化合物２）の少なくとも一つの化合物を含む。
【０１３７】
Ｇ．免疫：細胞成熟
細胞間相互作用は、リンパ球の成熟と活性化にとって必須である。様々な膜分子が細胞間固着を確かなものとし、細胞が移動して免疫システムが活性化される間、細胞間シグナリングを可能にする。Ｃｘ４３及び細胞間の活性ギャップジャンクション（ギャップ結合）を発現するヒトＴ、Ｂ、ＮＫリンパ球の循環が、前述したように染色法を使用して示されている。また、細胞間ギャップジャンクション（ギャップ結合）カップリングの減少が、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡの分泌を顕著に減少させることもまた実証されているが、これはギャップジャンクション（ギャップ結合）を介した細胞間シグナリングが、免疫システムにおける代謝協調の基礎をなすメカニズムの重要な要素であることを示している（Oviedo-Orta Eら、(Immunology 2000; 99: 578-90), Oviedo-Orta Eら、(FASEB 2001; 15: 768-774)）。
【０１３８】
亜慢性又は慢性炎症に於いて、イムノグロブリンの合成の局所的増加は、好ましく、エチオロジー（aethiology）と無関係である。炎症時、組織はしばしば正常な健康組織とは異なり、低酸素緊張は、細胞間情報伝達（ＧＪＩＣ）のアンカップリングを引き起こす。細胞間情報伝達（ＧＪＩＣ）のアンカップリングにおける低酸素の重要性は、いくつかの異なる細胞システムに於いて実証されているが、そのことは酸素分圧が細胞間情報伝達（ＧＪＩＣ）の共通な制御因子であることを示すものである。アンカップリングは、コネキシンのチロシン及び／又はセリン及び／又はスレオニンのリン酸化に於ける変化の結果であり、化合物１又は２のような化合物の投与はこの影響を弱め、ヘミチャンネルを閉じて細胞間情報伝達（ＧＪＩＣ）を保持するものである。
【０１３９】
Ｈ．細胞間情報伝達（ＧＪＩＣ）の改善
ギャップジャンクション（ギャップ結合）チャンネルを開いたままにする、又はヘミチャンネルのドッキングを容易にするという、細胞間情報伝達（ＧＪＩＣ）を維持するには二つの基本的な方法がある。虚血状態下で特徴付けられる症状の治療又は予防に於いて、両方の方法が好まれ又は推奨される。
【０１４０】
ラット新生児の心室心筋細胞の初代培養に於いて、酸素とグルコースの枯渇は、ホスホイノシトール（ＰＩ）ターンオーバーのノルアドレナリン誘導性刺激を、常気圧及び栄養条件下でのレベルの約５０％まで減少へ導く。ギャップジャンクション（ギャップ結合）を修飾する化合物１は、酸素及びグルコースの枯渇下、ＰＩターンオーバーを正常値の約９０％になるまで上昇させることにより、悪化されたノルアドレナリン誘導性のＰＩターンオーバー刺激を正常化させることが示されている。さらに、化合物１は、常気圧及び栄養条件下では、ＰＩターンオーバーのノルアドレナリン誘導レベルを変化させないことが示されている（Meier E, Beck MM: 2001 International Gap Junction Conference, Aug 4-9, 2001, Hawaii, USA, Abstract No.132 ）。同様に、低酸素は、培養されたヒト骨芽細胞培養物及びラット骨芽細胞骨肉種セルラインに於いて、ルシフェ−ル黄色注入後の色素の移送として測定される、細胞間カルシウム波の伝搬を減少させる。この減少は化合物１で処理することにより完全に覆される（Teilmann, SC: 2001 International Gap Junction Conference, Aug 4-9, 2001, Hawaii, USA, Abstract no.176）。
【０１４１】
例えば炎症時の細胞性アンカップリングにより、ヘミチャンネルを閉じてギャップジャンクション（ギャップ結合）を開く化合物は、炎症時に於けるイムノグロブリン合成を改善できる。
【０１４２】
Ｉ．末梢神経障害及び神経障害性の疼痛
糖尿病、透析、肝硬変及びその他の多くの症状に見られるような末梢神経障害及び疼痛は、耐性神経及び自律神経の双方を含むことが報告されている。様々な条件下での末梢神経障害の正確な機序は研究中であるが、神経末端破壊、伝導性の減少、脱骨髄及び炎症応答の増加につての記載がある。実験の様々な条件で共通なものは、フリーラジカルの増加、酸化窒素の増加、酸素ストレス及びフリーラジカルスキャベンジャーの欠如であり、ギャップジャンクション（ギャップ結合）コミュニケ−ションの減少が記録されている(Pitre DAら、(Neurosci Lett 2001; 303: 67-71)、Bolanos JP, Medina JM(J Neurochem 1996; 66: 2019-9)、Low PA, Nichander, KK(Diabetes 1991; 40: 873-7)、Levy Dら、(Neurosci Lett1999; 260: 207-9)、Bruzzone R, Ressot C(J Eur Neurosci 1997; 9: 1-6))。よって，ヘミチャンネルのリン酸化によりヘミチャンネルが閉じることを助ける本発明の化合物は、末梢神経障害の治療に有用である。投与は非経口で行われてもよい。
【０１４３】
Ｊ．難聴
騒音誘導性難聴、フリーラジカルの産生を伴うことが知られている老年性難聴は、蝸牛のコルチ器官由来のハンセン細胞とダイター細胞の間でのギャップジャンクション（ギャップ結合）のカップリングの阻害に関連している（Todt Iら、(J Membrane Biol 2001; 181: 107-114)、及びBlasits Sら、(Phlugers Arch 2000; 440: 710-712)、Lagostena Lら、(J Physiol 2001; 531: 693-707)）。蝸牛の支持組織細胞間の情報伝達は、感覚細胞の重要な恒常性、そして外側のヘア細胞の正常な神経活性を提供する（Johnstone BMら。(J Physiol 1989; 408: 77-92)）。このコミュニケーションは酸化ストレスで阻害される（Todt Iら、(J Membrane Biol 2001; 181: 107-114)）。後天性の又は年齢依存の難聴は、コネキシンヘミチャンネルのチロシン残基のリン酸化を増加させ（ヘミチャンネルを閉じ）、支持組織細胞間での情報伝達を維持できる化合物で処理することで、予防できる。本発明の適当な化合物は、非経口で投与することができる。
【０１４４】
前庭器官の暗い細胞領域のメラノサイトは、ギャップジャンクション（ギャップ結合）を通じて深くコミュニケーションしており、内リンパと外リンパ間の物質の輸送における役割を果たし、耳内部での微小環境の恒常性の維持にとって重要である（Masuda Mら、(Anat Rec 2001; 262; 137-146)）。内リンパ水腫は、目眩や聴力の減少で特徴づけられる様々な臨床症状と関連している。ギャップジャンクション（ギャップ結合）コミュニケーション能力の減少は、もともと特別なタイプのトランスポーターから分泌又は放出されるいくつかの物質の膜通過輸送制御に於いて重要である。
【０１４５】
Ｋ．年齢依存性貧血と骨髄移植
造血微小環境での、造血前駆細胞とストローマ細胞間の機能的ギャップジャンクション（ギャップ結合）の存在は、長年議論を呼んでいるが、研究によりヒトギャップジャンクション（ギャップ結合）コミュニケーションの存在が証明された（Rosendaal Mら、Tissue Cell 1991; 23: 457-470）、Durig Jら、(Brit J Haematol 2000; 111: 416-25)）。ストローマ細胞が造血前駆細胞の増殖作用を制御するが、また一方ではその機能は未成熟な造血細胞によって制御されるという仮説裏付けるように、当該コミュニケーションが双方向性であることが実証されている（Gupta Pら、(Blood 1998; 91: 3724-3733)）。
【０１４６】
年齢とともに造血組織の機能は減少し、貧血が高齢者に於いてしばしばみられる。造血組織の能力の減退はまた、血液悪性腫瘍、化学治療処置後に見られる。ドナーからの骨髄移植は汎血球減少症を防ぐために使用される。
【０１４７】
ヘミチャンネルの閉鎖を助ける及び／又はギャップジャンクション（ギャップ結合）コミュニケーションを容易にする本発明の化合物の効果を、高濃度のシクロホスホアミドに曝して前処理したラットを用いて調査する。これらのラットの骨髄は、、成熟造血細胞の産生を停止した。シクロホスホアミドで処理した後の異なった時間間隔での網状赤血球の数の値は、１０−１０Ｍ〜約１０−８Ｍのコネキシンリン酸化化合物１、約１００μＬで前処理した動物に於いては、処理されなかった動物と比べて非常に高い値を示す。本発明の適当な化合物の投与は非経口である。
【０１４８】
Ｌ．下垂体及び視床下部の甲状腺不全
脳下垂体前葉由来のホルモンは、分、時間、日、季節における分泌のサーカディアン変化を示す。ほとんどのサーカディアンリズムを司る神経システムの一部は、超交叉核として知られる視床下部の一組の構造に局在化している。この中心では個々の細胞に固有の生物学的時計があるが、調整された電気的活性は、細胞間情報伝達（ＧＪＩＣ）を経由して近隣細胞へと仲介される（Colwell CS(J Neurobiol 2000; 43: 379-88)）。また、脳下垂体前葉は直接の神経支配を欠いていることから、前葉腺内での細胞間情報伝達（ＧＪＩＣ）は、適切な又は指定された時間のでホルモン分泌を確実なものにするといった細胞間の調整及び同期化に於いて必須である（Vitale ML(Biol Reporo 2001; 64: 625-633)）。Guerineau NC（J Biol Chem 1998; 273: 10389-95）は、自発的な活性内分泌細胞は、単一ユニット又はギャップジャンクション（ギャップ結合）のカップリングにより同期化された集団として脳下垂体前葉全体に散在していると結論付けた。自発的に活性化する細胞間での共時性は、基本的な分泌パターンの形成に助力する。脳下垂体前葉から、成長ホルモン、プロラクチン、副腎皮質ホルモン、甲状腺ホルモン、性腺刺激ホルモンが視賞下部刺激ホルモン由来の制御下で合成される。一つの軸内での複雑な視床下部―下垂体―内分泌腺の律動不整における機序の一つもまた、細胞間情報伝達（ＧＪＩＣ）を減少させることに関与している。疾病としてはは、糖尿病愚鈍、低ゴナドトロピン性機能低下症、粘液浮腫、副腎皮質機能低下、及び小人症が挙げられる。本発明の適当な化合物、好ましくはギャップジャンクション（ギャップ結合）を開く化合物での治療は、これらの兆候を改善することができる。
【０１４９】
また、視床下部の超交叉核における神経は、適当な細胞間情報伝達（ＧＪＩＣ）に依存している。上述した軸内で、当該領域で活性であるギャップジャンクション（ギャップ結合）を開く化合物はまた、サーカディアンリズムが乱れている患者にとって有益る（Shinohara Kら、(Neurosci Lett 2000; 286: 107-10)）。
【０１５０】
Ｍ．腎血管高血圧症と腎毒性
腎臓と内皮特有のギャップジャンクション（ギャップ結合）が腎臓にて広く阻害されることが、糸球体内毛細管、傍糸球体細動脈を含む糸球体、細管、及び脈管構造で見られる（Haefliger J-Aら、(Kidney Int 2001; 60: 190-201)）。その研究では、研究者らは、求心性細動脈のレニン分泌細胞を結合するギャップジャンクション（ギャップ結合）の存在を示している。ギャップジャンクション（ギャップ結合）の役割は、増加した血圧により誘導されるような、血液産生シグナルの検出及び増幅に寄与している。腎臓内では、そのようなシグナルは求心性細動脈の内皮細胞により、内分泌、傍分泌、エンドクリン分泌刺激へと変換され、レニン分泌細胞へと移動させられる必要がある。よって、細胞間情報伝達（ＧＪＩＣ）は相互に関連した傍糸球体装置を形成する重要な役割を果たしている。ギャップジャンクション（ギャップ結合）チャンネルの迅速な開閉は更に、生理学的要求によるレニン分泌はもとより、糸球体及び細管の機能に合致する必要がある持続的フィードバックを確実なものとする局所的血管変化に容易に応答することを示唆している。腎臓の細胞間情報伝達（ＧＪＩＣ）の機能障害を特徴とする疾患は、本発明の化合物、好ましくはギャップジャンクション（ギャップ結合）を開く特異的な化合物を経口又は非経口で投与するのが有益である。
【０１５１】
重金属は腎毒性であり、腎傷害の原因となる。水銀と同様に（Yoshida Mら、(Arch Toxicol 1998; 72: 192-96)）毒性金属カドミウム（Fukumoto Mら、(Life Sciences 2001; 69: 247-54)）は、ラット近位細管由来の初代細胞培養物に於いて、ギャップジャンクション（ギャップ結合）をアンカップリングするとして、両研究グループは、腎機能低下は細胞間コミュニケーションの減少が関連していることを示唆している。コネキシンのチロシンをリン酸化する化合物による重金属毒による治療は、組織傷害を軽減し、さらなる組織への損傷を予防するものである。
【０１５２】
細管由来の細胞培養物でインビトロ試験を行い、重金属にさらされた際のギャップジャンクション（ギャップ結合）のアンカップリングを、化合物（濃度約１０−１０から１０−７Ｍの化合物１又は化合物２）が抑制することを調査する。細胞間情報伝達（ＧＪＩＣ）を前述のルシフェール染色法により試験する。
【０１５３】
実験動物（ラット）に重金属を全身性投与した後、糸球体ろ過量のクリアランスマーカーとして３Ｈインシュリンを、腎血漿流のクリアランスマーカーとして１４Ｃで標識されたテトラエチルアンモニウムを、そして近位細管機能のマーカーとしてリチウムを使用して（Petersen JSら、J Pharmacol Esp Ther 1991 258: 1-7）、重金属による慢性疾患の処置の前及び後の異なる時間に於いて、腎機能を測定する。化合物１のような、本発明に特異的な化合物での慢性疾患の処置は、腎機能が定常化してから開始されるが、その処置により腎機能パラメータ（糸球体ろ過量及び血圧）の顕著な改善が見られる。本発明の適当な化合物を、非経口投与する。
【０１５４】
異なる微生物の感染と同様に、非感染性の炎症は、糸球体ろ過量の減少、電解質と水の排泄の減少及び血圧の変化を特徴とする、腎機能における非特異的で顕著な慢性変化を誘導する。これらの兆候のいくつかは、同様にコネキシンのチロシンをリン酸化する特異的な化合物での治療により抑制される。
【０１５５】
Ｎ．歯の発達と改造
Murakami S及びMuramatsu T(Anat Embryol 2001; 203: 367-374)は細胞間情報伝達（ＧＪＩＣ）が象牙芽細胞間で存在し、細胞性活性はその細胞間橋を通じて調整されるという（Iguchi Yら、(Arch Oral Biol 1984; 29: 489-497)）以前の研究を確認しているが、最近の研究に於いて彼らはまた、これらの細胞間情報伝達（ＧＪＩＣ）は若い又は古い象牙芽細胞におけるのと同様に歯の初期の発達に間（前象牙芽細胞）に存在することを示している。また象牙芽細胞の下にある髄質細胞にもギャップジャンクション（ギャップ結合）がある。これらの知見は、細胞間情報伝達（ＧＪＩＣ）が、歯の発達及び歯が改造され又は虫歯となったときの寿命於いて重要であることを示している。
【０１５６】
本明細書に記載されている象牙芽細胞アッセイに類似のアッセイで象牙芽細胞間コミュニケーションにおける効果をインビボで試験できる化合物２のような、本発明のコネキシンをリン酸化する化合物を用いた治療は、乱れた歯の発達を正常化する。治療はまた、歯の改造を容易にし、歯を虫歯に対してより抵抗性とする。
【０１５７】
Ｏ．幹細胞
Lumelsky（2001）らは、マウス胚性幹細胞からインシュリンと他のすい臓内分泌ホルモンを発現する細胞を産生した。Ndya Lumelskyら、Differentiation of Embryonic Stem Cells to Insuin-Secereting Structures Similar to Pancreatic Islets. Science, 292,1389-1394, 2001）を参照のこと。すい臓細胞型が神経と非常に関連している正常なすい臓ランゲルハンス島と、トポロジーが類似している三次元クラスターを形成するために、細胞は自己集積する。グルコースはインビボで行われるのと同様の機構によりこれらの細胞クラスターからのインシュリン放出の引き金となる。糖尿病マウスに投与されると、インシュリン産生細胞は迅速に血管新生をし、クラスター化されたランゲルハンス島様の機構を維持する。
【０１５８】
臨床の状況では、この胚性幹細胞に基づくシステムは、インシュリン分泌と、機能的な構造ユニットへのインシュリンの分泌を制御する重要な役割を果たすことが知られているほかのランゲルハンス島細胞型の、同時産生と集積を許容する。これらのユニットはインシュリン産生を最適化する物質を提供し、グルコース恒常性の精密なコントロールを分析することができる。ランゲルハンス島の発生と機能の分子生物学的原理を明らかにするために遺伝子工学的手法を用いることができるので、胚性幹細胞は、これらの研究には理想的なものである。ヒト及び非ヒト胚性幹細胞及び胚性生殖細胞を用いる細胞ベースの治療の可能性は、魅力的な目標である。成人組織はまた、機能的なすい臓細胞のための有用な供給源である。本明細書に記載されている分化システムは、糖尿病の治療に向けて機能的なすい臓細胞の供給源を提供するものである。これは内分泌すい臓のいくつかの細胞型が胚性幹細胞からインビトロに於いて産生できるとことを示す最初の報告である。死体から得られるすい臓のランゲルハンス島は、移植の後の肝臓で機能することができるが、組織拒絶反応の問題と入手性の問題がまだ残されている。移植のために免疫適合した組織の豊富な供給源を産生する胚性幹細胞の製造において、糖尿病に関連する多様な問題の克服が期待されている。
【０１５９】
心筋梗塞は、組織の減少と心臓機能の衰弱をもたらす。残っている心筋は、腎組織を再構築することができず、梗塞後の心臓を時間と共に悪化させる。標的器官への傷害は、遠くの幹細胞により感知され、それらは傷害の部位に集まり、他の幹細胞分化へとつづき、これらの事象は構造的及び機能的な修復を促す。この幹細胞の高い柔軟性は、Orlicら（Nature 410, 701-705 (2001)）に、梗塞したマウスに於いて、死亡した心筋が骨髄細胞を移植することにより回復するか否かを試験することを促した。彼らは、ｃ−キット発現に基づいて、蛍光による活性化細胞ソーティングにより、増強された緑の蛍光蛋白質を発現するトランスジェニックマウスから、骨髄リンケージ陰性（Ｌｉｎ−）を分離した。冠動脈結合後すぐに、Ｌｉｎ−  ｃ−キットＰＯＳ細胞は、梗塞の境界にある収縮壁へ注入された。骨髄細胞の移植から９日後、新規に形成された心筋が、心室の梗塞部分の６８％を占めることが見出された。発展段階の組織には、増殖した心筋と血管構造が含まれる。これらの研究は、局所的に運ばれた骨髄細胞は、新規な心筋を産生でき、冠動脈心房疾患の結果を改善することを示している。
【０１６０】
筋細胞の性質をさらに特徴付けるため、コネキシン４３の発現が測定された。この蛋白質は、細胞間結合及び筋細胞間の血漿膜チャンネルの産生を介した電子カップリングに於いて重要であり、コネキシン４３は細胞質及び密に並んだ分化細胞の表面に出現する。これらの結果は心臓筋肉フェノタイプの予期された機能的力量と一致した。
【０１６１】
機能的な細胞が胚性幹細胞から産生されること、及びコネキシンが事実、梗塞した心臓組織内のこれらの細胞に発現することから、これは胚性幹細胞から分化したほかの細胞にも当てはまるであろうと考えられている。コネキシンはこれらの組織（すい臓β細胞及び心筋細胞を含む）の機能に於いて支配的な役割を果たしている。化合物１及び化合物２のような、コネキシンのチロシンをリン酸化し、ヘミチャンネルを閉じる（結果としてまた細胞間情報伝達（ＧＪＩＣ）を増幅させる）本発明の化合物は、胚性幹細胞が、幹細胞を移植した器官に於いて機能性を有する細胞へと増殖していくことを促すものである。
【０１６２】
本発明の目的は、糖尿病メリティス（mellitus）の治療のためのすい臓、心筋梗塞の治療のための心臓、パーキンソン病の治療のための脳基底ガングリアといった、移植された器官に於ける機能的な細胞へと、幹細胞が変化していくことを促す化合物１及び化合物２のような、コネキシンのチロシンをリン酸化する化合物を提供することである。一般的に、これらの化合物は幹細胞の分化を加速し、心臓、脳、肌、骨、すい臓、肝臓又は他の内部器官に於いて、治癒工程を加速させると信じられている。Orlicらの、上述の文献に記載されている、心筋梗塞の一般的な実験設計を使用して、実験を行い、例えば増殖工程の間、化合物１及び化合物２は繰り返して投与される。これらの実験は化合物１及び化合物２による、コネキシン４３の発現の増加、又はより早い再生工程を示す。
【０１６３】
Ｐ．ガン
１．腫瘍進行
腫瘍産生の間、正常な細胞と周囲の細胞との生理学的相互作用の阻害、及び分化の特性の欠損が、腫瘍進行における共通の特徴である。細胞間情報伝達（ＧＪＩＣ）における変化は、細胞腫瘍産生に於いて最初期に起こる変化のうちの一つと言える（Wolburg H, RohlmannA, Int Rev Cytol 1995; 157: 315-73, Klaunig JE, Ruch RJ, 1990; 135-46）。
【０１６４】
Kyung-Sun Kangら(Cancer Letters 166 (2001) 147-153)は、ＧｅＯ２を添加したＴＰＡで処理したラット肝臓上皮細胞での前及び共インキュベーションに於いて、ＴＰＡによって細胞間情報伝達（ＧＪＩＣ）のダウンレギュレーションが撤廃されることを示し、細胞間情報伝達（ＧＪＩＣ）の阻害を回復する物質は、腫瘍の産生の予防又は阻害に使用できることを示唆した。Suzuki J及びNa H-Kら（Nutrition and Cancer, Vol.36, No.1 p.122-8）は、食品添加添加物のλカラギーナンは、十分立証されている発ガンプロモーターであるホルボールエステル（ＴＰＡ）と同様にラット肝臓上皮細胞での細胞間情報伝達（ＧＪＩＣ）を阻害し、発ガンプロモーターとして腫瘍産生の役割を果たすことを示した。よって本発明の化合物は、ＴＰＡやλカラギーナンのような腫瘍促進剤によって誘発されるガンの予防又は治療に使用できる。
【０１６５】
２．薬剤感受性耐性
増加した細胞間情報伝達（ＧＪＩＣ）は、腫瘍における微小環境を改善する。Chenら、Chem Biol Interac 1998 Apr 24; 111-112: 263-75を参照のこと。
【０１６６】
３．転移
細胞間情報伝達（ＧＪＩＣ）の減少は、転移の潜在性を持つすべてのガンの高い転移潜在性と関連している（Saunders MMら、Cancer Res 2001; 6: 1765-1767、Nicolson GIら、Proc Natl Acad Sci USA 1998; 85: 473-6）。転移の防止は、腫瘍における細胞間情報伝達（ＧＪＩＣ）を阻害することを助けるコネキシンのチロシンをリン酸化する化合物で処置することにより、確立される。処置は慣用的な化学療法に加えて行われる。
【０１６７】
本発明の化合物の治療上有効量（たとえば化合物１又は化合物２）を単独又は組み合わせて投与することは、ガンを予防又は治療できると考えられている。
【０１６８】
Ｑ．種々の細胞
ギャップジャンクション（ギャップ結合）はまた胃粘膜細胞における細胞間情報伝達、増殖及び分化に於いて重要な役割を果たしている。ギャップジャンクション（ギャップ結合）を開口する化合物は、誘導された傷害の再生過程を促進する（Endo Kら、(J Gastroenterol Hepatol 1995; 10: 589-94)）。
【０１６９】
半月板細胞の細胞構築は部分的に細胞間情報伝達（ＧＪＩＣ）に依存している。腱の線維軟骨構造と同様に半月板の線維軟骨部分は、細胞間情報伝達に依存している。傷害時に、ギャップジャンクション（ギャップ結合）を開く化合物は修復の速度を向上させる。
【０１７０】
Ｒ．てんかん
好ましくはギャップジャンクション（ギャップ結合）チャンネルのアンカップリングを助ける薬剤又は制御する小分子の取り込みを許容する補助的治療として、ヘミチャンネルを開く化合物により、異常に高い細胞間情報伝達（ＧＪＩＣ）で特徴付けられるてんかんのような症状の疾患を治療することが望まれる。
【０１７１】
本発明の目的は本明細書に記載されている医学的兆候又は症状の一つ又はそれ以上を治療又は予防する方法を提供することである。そのような方法には一般的に、上述の化合物の少なくとも一つ、好ましくは一つを、重篤な兆候又は症状を治療、予防又は減じるのに十分な量で投与することを含むがこれに限定されるものではない。好ましい化合物は本明細書に記載されているインビトロ及びインビボアッセイの一つ又は組み合わせにより選択される。特定の投与方法は、当業者には明白であるが、たとえば性別、体重、一般的な健康状態及び治療又は予防されるべき特別な兆候や症状によって異なる。考察のように、本明細書に開示されている化合物は、本発明の方法に於いて活性試薬として単独で用いてもよいし、従来の治療方法とあわせて使用してもよい。本発明に於いて治療又は予防される好ましい兆候又は状況は、一般的には、細胞コミュニケーションの悪化又はギャップジャンクション（ギャップ結合）機能の悪化と関連している。本発明の更なる特異的な兆候及び症状は上記考察の通りである。
【０１７２】
本発明の治療方法は本明細書に開示されている化合物の一つ又はそれ以上を活性試薬として単独で用いることができる。本発明の化合物の一つが用いられるのが好ましい。望ましくは、当該化合物は予防として、すなわち特定の兆候又は症状の重篤度を予防又は減じるために用いられるのがよい。当該化合物はまた、従来の治療法と組み合わせて用いてもよい。例えば、放射腺照射治療が行われている場合の治療方法としては、慣用の治療法と組み合わせて用いるのが好ましい。本発明の「追加」的な療法は、必要に応じて従来の療法と同時又は別々に行うことができる。様々な疾患及び医学的症状に於ける確立された治療アプローチが記載されている。一般的には、Harrison’s Principles of Internal Medicine (1991) 12ed. McGraw-Hill, Inc.、The Pharmacological Basis of Therapeutics (1996) Goodman, Louis S. 9th ed Pergammon Pressを参照のこと。これらの開示は参照として本明細書に取り込まれる。
【０１７３】
治療組成物中の一つ又はそれ以上の治療用の化合物の濃度は、投与するヘミチャンネルを調節する化合物の用量、使用する組成物の化学的特性（たとえば疎水性）並びに目的とする投与形態及び投与経路を含む多くの要因によって異なる。一般的には、ヘミチャンネルを調節する化合物の一つ又はそれ以上は、当該化合物を約０．１〜１０％ｗ／ｖ含む生理学的緩衡水溶液の非経口投与で提供される。
【０１７４】
特定の療法で使用される活性化合物の事実上好ましい量は、例えば、使用される特異的な化合物、処方される特定の組成、投与形態並びに、例えば人種、性別、体重、一般的な健康状態及び年齢等の試験媒体の特徴によって異なる。特定の投与プロトコールの最適な投与量は、前述のガイドラインに添った慣用的な用量決定試験を用いて当業者により容易に見積もられる。適当な用量範囲は、一日に体重１ｋｇあたり約１μｇ〜約１００ｍｇである（「治療上有効量」）。
【０１７５】
本発明の治療化合物は、一般的には、たとえば塩酸、硫酸、又はリン酸塩等の無機酸付加塩、又は、酢酸、マレート、フマレート、タータレート、クエン酸塩のような、有機酸付加塩のような酸付加塩であって、例えば薬学的に許容される塩として、プロトン化された水溶性形態で好適に投与される。本発明の治療用化合物の薬学的に許容される塩はまた、金属塩、特にナトリウム塩又はカリウム塩のようなアルカリ金属塩、マグネシウム又はカルシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、アンモニウム又はテトラメチルアンモニウム塩のようなアンモニウム塩、並びにリジン、グリシン又はフェニルアラニン塩のようなアミノ酸を付加した塩を含むことができる。追加の適当な塩は、以下に提供される。
【０１７６】
本発明のより特別なヘミチャンネルを調節する化合物は、アルカリエステル、アミド、アルカリアミド、ジアルキルアミド、又は線状化合物のＣ末端のカルボキシル基官能基若しくは、環状化合物にもし存在するならば、遊離のカルボキシル基官能基で形成されるヒドラジンの形態で使用される。線状化合物のアミド又は低級アルキルアミドは、本発明の好ましい化合物に含まれる。塩には、酸付加塩又は塩基性塩のような薬学的に許容される塩が含まれる。酸付加塩の例は、すでに記載されているが、塩酸塩、ナトリウム塩、カルシウム塩、カリウム塩などが含まれる。塩基性塩の例には、カチオンが、ナトリウム、カリウム、カルシウムのようなアルカリ土類金属、Ｒ３とＲ４がそれぞれ置換基を有していてもよいＣ１−６アルキル、置換基を有していてもよいＣ２−６アルケニル、置換基を有していてもよいアリール又は置換基を有していてもよいヘテロアリールであるアンモニウムイオン＋Ｎ（Ｒ３）３（Ｒ４）から選択される塩が含まれる。薬学的に許容される塩のその他の例は、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences 17ed. Alfonso R. Gennaro (Ed.), Mark Publishing Company, Easton, PA, U.S.A及びさらに最近の版、そしてEncyclopedia of Phamaceuticcal Technologyに記載されている。
【０１７７】
本発明の治療方法に於いて、治療用化合物は当該方法の何れの方法で対象生物に投与されてもよい。例えば、提供されるインビトロ及び／又はインビボアッセイの一つ又は組み合わせにより選択されたヘミチャンネルを調節する化合物は、標的となる症状の羅患を防止又は重篤度を軽減するための予防薬として投与できる。また、化合物は目的の症状が進行中に投与できる。
【０１７８】
治療用化合物は対象生物に、単独で、又は、慣用的な賦形剤、すなわち、活性化合物を悪化させるようには反応せず、患者そのものを悪化もさせない、非経口、経腸若しくは経鼻投与に適当な薬学的に許容される有機若しくは無機担体物質と混合した薬学的組成物として、一つ又はそれ以上の治療用薬剤と組み合わせて投与できる。薬学的に許容される適当な担体には、水、塩溶液、アルコール、野菜油、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳酸、アミロース、マグネシウムステアレート、タルク、珪酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸モノグリセライド並びにジグルセライド、ペトロエーテル脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が含まれるが、これらに限定されるものではない。薬学的な調製は滅菌下、並びに、望ましくは、たとえば活性化合物を悪化させるように反応しない、潤滑剤、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝剤、色素、香料、及び／又は芳香物質等の補助的試薬と混合して調製されることができる。
【０１７９】
そのような組成物は、特に溶液又は懸濁の形態での非経口投与、特に錠剤又はカプセルの形態での経口投与、特に粉、鼻用ドロップ又はエアロゾールの形態での経鼻投与、経膣投与、例えばクリームの形態での局所に、例えば座剤として直腸等で使用するために調製される。
【０１８０】
薬学的試薬は、慣用的にはユニット単位の用量形態で投与されることができ、たとえばRemington’s Pharmaceutical Science(Mack Pub. Co., Easton, Pa., 1980)に記載されるような、薬学分野に於いてよく知られた手法のいずれかにより、調製することができる。非経口投与形態では、一般の賦形剤として、滅菌された水もしくは生理食塩水、ポリエチレングリコールのようなポリアルキレングリコール、野菜由来のオイル、水素化されたナフタレンなどのようなものが含まれるだろう。特に、生物学的適合性、生分解性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコライドコポリマー、又はポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーは、本発明のあるヘミチャンネルを調節する化合物の放出を調節するための賦形剤として有用であろう。
【０１８１】
他の期待される有用な非経口輸送システムには、エチレンビニルアセテートコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、移植可能な注入システム、及びリポソームが含まれる。吸入投与のための形態には、賦形剤として例えばラクトースを含み、又はたとえばポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテルであるグリココレート及びデオキシコレートを含む水溶液であり、または経鼻ドロップの形態での投与のための油性溶液、又は経鼻で適用されるゲルであることができる。非経口投与のための形態にはまた、舌下錠投与のためのグリココレート、直腸投与のためのメトキシサリチル酸、又は膣投与のためのクエン酸が含まれるだろう。他の輸送システムは、例えばバルーン血管形成の後に手術部位に治療用試薬を直接投与する。ヘミチャンネルを調節する化合物はステントの使用により投与されてもよい。
【０１８２】
略語と化学式
発明の詳細な説明とクレームを通して、サルコシン（Ｓａｒ）、α−アミノ−イソ−ブタノイックアシド（Ａｉｂ）、１−ナフチルアラニン（１Ｎａｌ）及び２−ナフチルアラニン（２Ｎａｌ）を含むナフチルアラニン（Ｎａｌ）、フェニルグリシン（Ｐｈｅ）、２，４−ジアミノブタノイックアシド（Ｄａｂ）、２，３−ジアミノプロパノイックアシド（Ｄａｐａ）、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）のようなほかのαアミノ酸の一般的に許容されている三文字コードと同様に、天然アミノ酸の３文字コードが使用される。何も特定されていないときは、Ｈｙｐは４−ヒドロキシプロリンを表す。天然又は必須アミノ酸は、蛋白質を構成するアミノ酸である。芳香族アミノ酸は、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、１Ｎａｌ、２Ｎａｌ、Ｈｉｓである。Ｌ体又はＤ体が特定されていない場合には、問題となるアミノ酸は天然のＬ体であると理解される。Pure & Appl. Chem. Vol.56(5) pp595-624 (1984)参照。何も特定されていない場合には、発明の化合物のＣ末端アミノ酸は遊離カルボン酸であると理解されており、これらはまた「−ＯＨ」として特定されるであろう。発明の化合物のＣ末端アミノ酸は化合物の好ましい二つの形態である、遊離カルボン酸とアミド化された誘導体を意図する末端基「−ＯＨ／ＮＨ２」を有することが示されるかもしれない。
【０１８３】
特異的な以下の定義は、別段の定めのない限り適用される。ＡＳＡＬは４−アジドサリチロイル基を、ＡＢは４−アジドベンゾイル基を、Ｆｍｏｃは９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基を、Ａｃはアセチル基を表す。別段の定めのない限り本明細書の開示には以下の定義が適用される。Ａｃｍはアセトアミドメチル基を、Ｔ４ｃはＬ−チアゾリジン−４−カルボン酸基を、ＰｃはＬ−ピペコリン酸基を、ＤＮＰはジニトロフェニルを、ＤＢＦは２−アミノエチル−６−ジベンゾフランプロピオン酸を、Ａｃｍはアセトアミドメチルを、Ｓａｒはサルコシニル基を表し、ＤＮＰ機能は抗体認識のためのハプテンであり、ＤＮＰ部分を含む本発明の化合物が好ましくは研究道具として使用できる。
【０１８４】
さらなる情報に関しては、ＰＣＴ／ＤＫ０１／００１２７（ＷＯ０１／６２７７５）及びＰＣＴ／ＵＳ０２／０５７７３（ＷＯ０２／０７７０１７）も参照のこと。
本明細書に開示されている全ての参照文献は、参考としてここに挿入される。以下の実施例は発明を説明するものである。
【０１８５】
参照例１：標準のインビボマウス不整脈アッセイ
マウスのカルシウム誘導不整脈モデルにより、抗不整脈効果を試験することが可能である。
化合物の抗不整脈効果はJ. J. Lynch, R. G.らのJ. Cardiovasc. Pharmacol. 1981, 3 49-60のモデルにしたがってカルシウム誘導された不整脈のインビボモデルに於いて試験されることができる。マウス（２５−３０ｇ）は神経弛緩麻酔の組み合わせ（ハイブノーム（商標）（フェンタニルシトレート  ０．３１５ｍｇ／ｍｌと、フアニソン１０ｍｇ／ｍｌ）＋ミダゾラム（５ｍｇ／ｍｌ））により麻酔された。ハイプノームとミダゾラムの商業的な溶液は、蒸留水中で１：１に希釈され、蒸留されたハイプノーム（商標）の一部は、蒸留されたミダソラムの一部と混合された。
【０１８６】
麻酔はマウス１０ｇあたり０．０５−０．０７５μｌの容量で、皮下投与により誘導された。静脈投与カニューレは、尾の静脈へ挿入される。ステンレススチールＥＣＧ電極を右前足と左後ろ足に設置することにより、リードＩＩＥＣＧシグナルが連続して記録された。基準の電極は右後ろ足に設置された。シグナルは増幅され（ｘ５．０００−１０．０００）、ヒューゴサックエレクトロニックモデル６８９ＥＣＧモジュールを通じてボードboard（データトランジションモデルＤＴ３２１）を通じてデジタル化され、ウィンドウズＮＴ用のノトコードＨＥＭ３．１ソフトウエアを使用して１０００Ｈｚで採取された。１０分の平衡化時間の後、薬剤の試験サンプルは尾の静脈に注入された。ビヒクルで前処理されたマウスは、非処置動物のコントロールレベルの測定として試験された。注入用量は、全ての実験に於いて１００μｌであった。塩化カルシウム（３０ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｌ／分≒１００ｍｇ／ｋｇ／分（塩化カルシウム−２水和物, Riedel-de Haen, ドイツ））の注入は、薬剤又はビヒクルの静脈内投与から３分後にはじめられた。第二段階のＡＶ遮断の始まりまでのタイムラグが、最初の不整脈状況が起こるまでの塩化カルシウム注入の始まりからの時間として測定された。第二段階のＡＶ−遮断は共同ＱＲＳ複合体なしでＰ波により特徴付けられるＡＶ伝導の間欠的故障として定義された。
【０１８７】
応答は、ビヒクルで処理されたマウスに於いて第二段階のＡＶ−遮断が生じるまでの時間と比較して表された。試験された物質の個々の最大効果が要約されている。良好なギャップジャンクション（ギャップ結合）修飾活性を有する候補化合物のより特定の検出方法にはさらに、誘導された心房心室（ＡＶ）遮断の始まりまでの時間を、標準のインビボマウス不整脈アッセイに於いて少なくとも約２０％（少なくともスコア２）延長させる候補化合物を選択することが含まれる。さらに好ましい化合物は、アッセイに於いて誘導されたＡＶ遮断の始まりまでの時間の少なくとも約６０％（少なくともスコア３）の延長を表す。
【０１８８】
以下の実施例は、化合物１がラット新生心筋に於いてギャップジャンクション（ギャップ結合）チャンネルを開き、ヘミチャンネルを閉じる能力を示す機能的なアッセイを提供する。よって、ヘミチャンネル及びギャップジャンクション（ギャップ結合）チャンネルのチロシンをリン酸化することによって細胞間情報伝達（ＧＪＩＣ）の制御を差別化することができる。
【実施例１】
【０１８９】
抗不整脈化合物
本発明で使用される化合物にはＡｃ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｐｒｏ−Ｄ−４Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−ＮＨ２（化合物１）及びＡｃ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−ＮＨ２（化合物２）が含まれる。これらの化合物は、ＷＯ０１／６２７７５に開示されるように標準的な固相合成により合成される。本発明に於いて有用な化合物のさらなる例は、トランスレスベレートル（resveratrol）及びＣＡＰＥ（カフェイン酸フェネチルエステル）である。化合物の製造方法は記載されている。例えば、ＰＣＴ／ＤＫ０１／００１２７（ＷＯ０１／６２７７５）及びＰＣＴ／ＵＳ０２／０５７７３（ＷＯ０２／０７７０１７）を参照のこと。
【実施例２】
【０１９０】
グルコースの除去により誘導される代謝ストレス分析
心臓の不整脈は活性電位の形成及び伝導の阻害により引き起こされる。細胞から細胞への活性電位の増幅は、細胞間のギャップジャンクション（ギャップ結合）により仲介される。これらのギャップジャンクション（ギャップ結合）は、コネキシンと呼ばれる特別な蛋白質で作られるチャンネルからなる。減少した発現及び／又は阻害されたコネキシン分布は、正常な刺激の増幅を悪化させ、それゆえ不整脈を新生することを示すいくつかの報告がある。一つの例では虚血の間及び後に見られる変化である。急激な虚血の間には、細胞のアンカップリングは主に細胞内酸性化、増加した細胞内カルシウムイオン、減少した細胞内ＡＴＰ、及び長鎖アシルカルニチンと脂肪酸の上昇した濃度により生じると考えられている［１，２］。急性の虚血状態の後には、梗塞領域とその境界領域の構造が変化させられる再構成が起こる。この再構成はコネキシンが混乱された領域と不整脈を新生する基質として働くと信じられている電位再入循環の発展と関連している［３］。インビボ及びインビトロでの研究により、抗不整脈ペプチドの集団は不整脈の羅患を遅らせる及び阻害することができることが示されており、それに続く研究によりこれらのペプチドが細胞間での電子カップリングを増強することが示されている［２］。
【０１９１】
Ａ．方法
１．細胞培養：２０新生ラット（年齢１−２日）由来の心臓が無菌で素早く取り出される。心室が単離され、４−６片に切断され、それらはトリプシンとＤＮＡｓｅによりハンクス緩衡生理食塩水中でいくつかの工程で消化される。細胞はそれから遠心分離され、５％ＦＣＳを含むＭＥＭ中に再懸濁される。非筋肉細胞を減じるために、懸濁液はペトリ皿に３０分間３７℃で前移植される。懸濁液中の細胞はそれからコラーゲンで被覆したカバーガラスへ植え付けられる。植え付ける密度はコンフルエントな培養物を生じるように調整されるであろう。
【０１９２】
２．電気生理学：コンフルエントな心筋のあるカバーガラスは、倒立顕微鏡の台上のオープンチャンバーへとりつけられ、３７℃、１ｍｌ／分の重力によって駆動された流れのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で覆われる。溶液（ＰＢＳ）には、Ｎａ＋１５２、Ｋ＋４．２、Ｃｌ−１４１．５、ＰＯ４３−９．５、Ｃａ２＋０．９、Ｍｇ２＋０．５ｍＭが、ｐＨ７．４で含まれる。パッチクランプピペットが、１．５ｍｍガラスキャピラリー（ＧＣ１５０Ｆ−１５、ハーバードアパレータス）からシャターフラミングブラウンＰ−８７微小電流発生機に接続され、４−６ＭＷの抵抗で加熱される。ピペットは、Ｋ＋１５０、Ｎａ＋１５、Ｃｌ−５、グルコネート１５０．２、ＥＧＴＡ５、ＨＥＰＥＳ５、Ｃａ２＋２ｍＭ含むｐＨ７．２の細胞間様溶液で満たされる。
【０１９３】
パッチクランプセットアップは、シンクロナイズされた断続的増幅器（ＳＥＣ−０５ＬＸ、ＮＰＩエレクトロニクス）からなり、データはＩＮＴ−１０インターフェース（ＮＰＩエレクトロニクス）及びＰＣ１２００データ取得ボード（ナショナルインスツリュメント）を使用してデジタル化される。電流及び電圧シグナルは、増幅器の内部フィルターを使用して１ｋＨｚより短いものはカットオフされされ、１０ｋＨｚでデジタル化される。
【０１９４】
細胞はパッチマン５１７３マイクロマニピュレーター（エッペンドルフ）を用いて電極に近づけられる。細胞との接触が得られると（入力抵抗の突然の増加として見られる）、サクションはギガシール構成が確立されるまで適用される。それから、サクションの短いパルスがピペット下の膜を壊すために適用される。増幅器はそれから膜電位をモニターするために、ゼロ−電流クランプモードにおかれる。
【０１９５】
ある距離（＞＞１ｃｍ）離れて、両極性白金電極が培養物を追跡するために使用される。パッチされた細胞における刺激（stimulus artifact）と活性電位の出現までの遅延が、伝導速度として測定される。
【０１９６】
細胞は、刺激−活性化の間隔（ＳＡＩ）における安定なベースラインが確立されるまで、０．１ｇ／ｌのＢＳＡコントロール溶液で潅流された。それから潅流は１５分間グルコースを含まない溶液へと変化され、それから化合物１（１０−８Ｍ）で２０分間試験された。平行して、化合物１を添加することなく同様のタイムスケールでコントロール実験が行われた。データは培地からグルコースを除去する前のベースラインと比べた変化のパーセンテージとして表される。
【０１９７】
Ｂ．結果
図２に示されるように、グルコース除去により誘導される代謝ストレスは、グルコースの除去による伝導速度の遅延を示す刺激−活性化の間隔をわずかに増加させた。対照的に化合物１を１０ｎＭ濃度で満たすことは、刺激−活性化の間隔を減少させ、すなわち化合物１は培養された初代心筋における伝導速度を増大させた。これらのデータは化合物１が心筋に於いて細胞対細胞のカップリングを増大させることを示している。
参考文献
[１]Carmeliet E, Cardiac ionic currents and acute ischemia: from channels to 不整脈s. Physiol Rev., 1999, 79: 917-1017
[2]Dhei, s. Cardiac gap junctions. Physiology, regulation, pathophysiology and pharmacology. Karger Basel, 1998
[3]Peters, N. S. and Wit, A. L. Myocardial architecture and ventricular arrhythmogenesis. Circulation, 1998 97: 1746-1754
【実施例３】
【０１９８】
リン酸化されたコネキシンの免疫沈降と分析
本実施例で使用される化合物は、標準的な固相Ｆｍｏｃ化学を用いて製造された。前述の例を参照のこと。同定はマススペクトロメトリーを用いて行われ、純度はＲＰ−ＨＰＬＣにより決定された。インサイチュ（In situ）結合と動物における研究は、以下のペプチド（化合物１）がナノモーラー範囲に於いて受容体に結合することを示している。化合物１を１ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ用いた最初の研究は、以下の化合物３（Ｈ−ＧＡＧ−４−Ｈｙｐ−ＰＹ−ＮＨ２）と化合物４（Ｈ−ＧＮＹ−ＮＨ２）のペプチドでの研究が行われるかどうか決定するであろう。これらの研究はまた、特定のキナーゼ阻害剤を含む研究が行われるか否かをも決定するであろう。
【０１９９】
Ｈ９ｃ２細胞は密度７９００細胞／ｃｍ２（〜１５０００細胞／ウェル）で２４−マルチウウェルに移植され、１０％胎児ウシ血清（ＦＣＳ）と１０００ユニットペニシリン／１０００μｇストレプトマイシン（ペニシリン／ストレプトマイシン）を添加されたＭＥＭ内で３日間、５％二酸化炭素、１００％湿度の雰囲気下、３７℃で３日間成長させられた。
【０２００】
標識された細胞はトリトンＸ−１００溶解緩衡液（〜５*１０７細胞／ｍｌ）中で、１時間４℃でインキュベートされた。溶解物は３０分間２００００*ｇで３０分間遠心分離された。上清は２００μｌの上清あたり１０μｌセファロースを添加することによりあらかじめきれいにされた。あらかじめきれいにされた上清には、それから０．５−１μｇのホスホ−チロシン、又はホスホ−セリン抗体（シグマ）が添加され、１．５時間４℃、オービタルシェイカー内でインキュベートされた。抗体複合体はそれから５０μｌの１：１プロテインＧセファロースの懸濁液で１．５時間インキュベートされることにより捕獲された。最後に複合体は０．１％（ｗ／ｖ）トリトンＸ−１００、５０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、３００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭＥＤＴＡで十分洗浄された。
【０２０１】
複合体は１２％ＳＤＳゲルへロードされ、ＰＶＤＦ膜へとブロットされた。膜は０．１％トウイーン２０、５０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、３００ｍＭ塩化ナトリウム、５％乾燥ミルク（ＴＢＳＴ）で最低２時間ブロックされる。膜はそれからコネキシン４３特異的抗体（ジメッド）と、１．５時間室温でインキュベートされ、ＥＣＬ＋（アマシャム）で感光された。
【０２０２】
図３Ａ−Ｂは抗ホスホ−チロシン抗体が使用されたイムノブロットを示す。Ｃｘ４３断片のリン酸化は、化合物１（３Ａ−Ｂ）及び化合物２（３Ｂ）の各濃度における作用として示されている。
図４Ａ−Ｂは抗ホスホ−セリン抗体（４Ａ）又は抗ホスホ−チロシン抗体（４Ｂ）が使用された際のイムノブロットを示す。
【実施例４】
【０２０３】
コンフルエントな心筋細胞でのヘミチャンネル活性における化合物１ペプチドの効果
１．細胞培養：新生ラット（年齢１−２日）２０匹由来の心臓が、無菌で素早く切除された。心室が単離され、４−６片へ切断され、トリプシンとＤＮＡｓｅによりハンクス緩衝生理食塩水中でいくつかのステップで消化された。細胞はそれから遠心分離され、５％ＦＣＳを含むＭＥＭで再懸濁された。非筋肉細胞を減少させるために、再懸濁液はペトリ皿で、３０分間３７℃前プレートされた。懸濁液中の細胞はそれからコラーゲンで被覆されたカバーガラスへ移植された。
【０２０４】
２．色素―取り込み：心筋細胞を有するカバーガラスは、ナトリウムイオン１５２ｍＭ、カリウムイオン４．２ｍＭ、塩素イオン１４１．５ｍＭ、リン酸イオン９．５ｍＭ、カルシウムイオン０．９ｍＭ、マグネシウムイオン０．５ｍＭ、グルコース６ｍＭを含む、ｐＨ７．４のコントロール溶液（ＰＢＳ）とともに、又は虚血様（傷害）溶液（カリウムイオン８．２ｍＭ、グルコースを含まない、１０ｍＭデオキシグルコースを含む、ｐＨ６．５以外はコントロール同様）、２００μｌカルセインを含む量溶液と共に３０分間インキュベートされた。
カバーガラスは倒立顕微鏡の台上のオープンチャンバーへのせられた。１０個のランダムな領域が選ばれ、個々の領域から３つの細胞が慣用的な光顕微鏡のもとで選ばれた。それから細胞は４８０ｎｍの光で励起され、蛍光発光が５１０ｎｍで測定され、その強度が色素取り込みの測定となる。
【０２０５】
化合物１の色素取り込みにおける効果は、２つの条件下で検討された。
実験１：この一連の実験では、細胞はカルセインを含むコントロール溶液で３０分間インキュベートされ、１０分間色素なしで洗浄された。対応する実験では、３０分間インキュベートの間にペプチドが添加されて同じ実験が行われた。
実験２：コントロール溶液の代わりに傷害溶液を用いて実験１と同様に行われた。
【０２０６】
３．結果  新生ラット由来の培養された心筋細胞におけるカルセインの取り込みを利用する実験では、細胞が代謝ストレス（低いｐＨ、増加した細胞外カリウムイオン、デオキシグルコース５−１０ｍＭという形態）にさらされた際に、色素取り込みが３８％高いことが示された。この効果は、細胞が化合物１（１０ｎＭ、デオキシグルコースのみにさらされた細胞に対する対応するｔ−テストに於いてｐ＜０．０１７、ｎ＝６）と共にインキュベートされた際には、５％にまで顕著に減少することができる。これらのデータは、代謝ストレスの後に見られるコネキシンヘミチャンネルを通じた膜透過性の増加を、化合物１により阻害できることを示している。この結果は細胞機能とその生存にとって有益である。さらに培養されたＨ９ｃ２  心筋細胞でのリン酸化実験は、化合物１がコネキシン４３のチロシンリン酸化を仲介することを示している。加えて、０．１、１０、５０、１００ｎＭの化合物１に４時間さらされた心筋細胞は、コネキシン４３チロシンリン酸化を増加させる。チロシンリン酸化はギャップジャンクション（ギャップ結合）の細胞間コミュニケーションの混乱を仲介することが報告されており、カルセイン実験に於いてみられる膜透過性の減少を容易に説明できるだろう。いくつかの実験では、化合物１はセリンリン酸化を減少させることが見出された。
図５は、培養された心筋細胞における虚血誘導されたカルセインの取り込みにおける１０ｎＭの化合物１の効果を示す。
【実施例５】
【０２０７】
部位特異的コネキシンリン酸化のＥＬＩＳＡアッセイ
マルチウェルフォーマット（２４−９６ウェル）での細胞培養と同様に組織サンプルにおけるコネキシンの部位特異的なリン酸化の測定を可能にするＥＬＩＳＡサンドウィッチアッセイが、開発されている。ウェルは問題とされるコネキシンの型に対する抗体（捕獲用抗体（capture antibody））で被覆されている。細胞又は組織抽出物はそれから捕獲用抗体被覆プレートで４℃ｏ／ｎで、反応させられる。リン酸化された捕獲されたコネキシンは、特定のリン酸化部位に対する、ビオチン、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、又はペルオキシダーゼと結合した抗体で検出される。
特定のリン酸化部位に結合した抗体の量は、又は放射標識された又は酵素が結合した、検出抗体の特定のＩｇＧに対する抗体で測定されるだろう。
【０２０８】
捕獲用抗体としてマウス抗Ｃｘ４３抗体を、検出抗体として抗Ｔｙｒ−Ｐ（チロシンリン酸化部位）抗体を、抗Ｔｙｒ−Ｐ抗体への結合量を測定するために、１２５Ｉ又はＨＲＰ（ホースラディッシュパーオキシダーゼ）で標識された抗ウサギＩｇＧ抗体を使用する原理が示されている。ウサギ抗Ｃｘ４３抗体（５μｇ／ｍｌ、カタログ番号７１０７００、ジメッドラボ、インク、California、ＵＳＡ）を捕獲用抗体として、マウス抗ホスホチロシン抗体（５０μｇ／ｍｌ、カタログ番号Ｐ−３３００、クローンｐｔ６６、シグマ、ＭＯ、ＵＳＡ）を検出抗体として、１２５Ｉ（ヒツジ抗マウスＩｇ、カタログ番号ＩＭ１３１、アマシャムバイオサイエンス、Wales、ＵＫ）又はパーオキシダーゼ（ロバ抗マウスＩｇ、カタログ番号７１５−０３５−１５１）で標識された抗マウス全体抗体が抗ホスホチロシン抗体の結合量を測定するために使用される原理もまた示されるだろう。
図６Ａは、好ましいＥＬＩＳＡ検出形態をスキームで示す。図６Ｂ及び６Ｃは本実施例の結果を示す。
【０２０９】
本実施例と考察は、代謝ストレスが心臓細胞に於いてコネキシンヘミチャンネルを開き、この開くことが化合物１とのインキュベーションにより避けることができるという証拠を提供する。さらに実施例２−５は化合物１が代謝ストレスの間にヘミチャンネルを閉じることを示す。化合物１のヘミチャンネルによるカルセイン取り込みへの阻害効果、すなわちヘミチャンネルの閉鎖と一致して、実施例はまた化合物１がコネキシン４３のチロシンリン酸化部位を調節することを助けることを示している。化合物１はＷＯ０１／６２７７５を参照するように、ギャップジャンクション（ギャップ結合）を開くことが知られており、コネキシンの脱リン酸化の阻害は、ギャップジャンクション（ギャップ結合）チャンネルの閉鎖を抑制することが知られている。それゆえ、ここに提供される有益なギャップジャンクション（ギャップ結合）を開口又は化合物１の効果を調節することが示されている化合物は、すなわち、ＷＯ０１／６２７７５に開示されている全ての抗不整脈ペプチド及びＡＡＰ、ＡＡＰ１０、ＨＰ５等のような公知のペプチドは、本発明に於いてヘミチャンネル開口又は閉鎖のモジュレーターとして有用である。化合物１はＣｘ４３のチロシンリン酸化を維持又は増加させ、それゆえヘミチャンネル機能を調節していることになる。
【実施例６】
【０２１０】
心筋細胞における色素の取り込み
１．方法  心室筋細胞が新生ラットからトリプシン消化により単離され、コラーゲンで被覆されたカバーガラスへ移植された。４日後、筋細胞はコンフルエントに達し、細胞のシンクロナイズなビーティングシートを形成した。色素取り込みを測定するために，細胞は２００μＭのカルセインを含む緩衡液中、３０分間室温でインキュベートされた。それからカバーガラスはコントロール緩衡液で完全に洗浄され、オープンバズチャンバーへのせられ、コントロール緩衝液（ＲＴ）で覆われた。細胞はキセノンランプとモノクロメーターにより４８０ｎｍで励起された。５１０ｎｍの蛍光イメージが冷却したＣＣＤカメラ（センシカム）で集められた。励起のコントロールとイメージの獲得は、イメージングウオークベンチ（アクソン）を用いて調節された。
【０２１１】
光顕微鏡下（light microscopy）で、心筋細胞上の三つの領域がイメージへ供された。平均の蛍光強度が測定され、その工程は１０イメージにおける３０領域が測定されるまで繰り返された。測定の平均値は、与えられた実験条件のための値、すなわちｎ＝１として使用された。各一連に於いて、一つのコントロールインキュベーションが行われ、全ての実験値はこの値に比較して与えられる。
溶液：コントロール緩衝液は、ｍＭで、ＮａＣｌ  １３６、ＫＣｌ  ４、ＭｇＣｌ２  ０．８、ＣａＣｌ２  １．８、ＨＥＰＥＳ  ５、ＭＥＳ  ５、グルコース  ６を含み、ｐＨ７．３であり、ストレス緩衝液は、ｍＭで、ＮａＣｌ  １３６、ＫＣｌ  ８、ＭｇＣｌ２  ０．８、ＣａＣｌ２  １．８、ＨＥＰＥＳ  ５、ＭＥＳ  ５、デオキシグルコース  １０を含み、ｐＨ６．２である。
【０２１２】
２．結果  コントロール条件下での細胞とカルセインのインキュベーションは、いくつかの蛍光染色を生じ、これはほとんど局在化された粒子的な性質であった（図７Ａ−Ｃ、パネルＢ参照）。培養された筋細胞の上には、迅速にトリパンブルーで染色されるカールされた細胞がしばしば見出される。これらの細胞はカルセインでよく染色され、他の細胞での測定領域へ置かれないように常に手当てされた。細胞が代謝阻害にさらされた際には、染色パターンが変化し、サイトゾル内への色素の拡散が観測された（図７Ｃ）。ストレスの間の平均強度は、コントロールに比べて３６．２±４．１８％高かった（ｎ＝５、対応するｔ−テストでｐ＜０．００１）。
【０２１３】
代謝阻害が蛍光染色の取り込みを、おそらくコネキシンヘミチャンネルを通じて活性化するということは、心臓及び他の細胞型での知見を確かなものとする。我々は、ペプチドのＡＡＰファミリーが心臓組織に於いてそのプラスの効果を発現できるようなメカニズムの一つは、ヘミチャンネル活性化の阻害とそれによる細胞内恒常性の改善であろうと仮定した。この仮定を調べるために、細胞は０．１ｐＭから１０ｎＭの濃度のＺＰ１２３存在下でストレスにさらされた。結果は図８に示されており、個々のデータポイントは５つの実験を表している。図に於いて見られるように、ＺＰ１２３用量依存的にカルセインの取り込みが減少された。シグモイダル作用（Ｓ字形相関）を使用して、ＥＤ５０は、３．３±５．３ｐＭで、ヒル係数は２．５±１．０と見積もられた。化合物１による最大阻害の間の平均強度はコントロールより６．９±１．７％高かった。
【実施例７】
【０２１４】
心筋細胞の容量の測定
１．方法  心室筋細胞が、新生ラットからトリプシン消化により単離され、コラーゲンで被覆されたカバーガラスへ移植された。４日後、筋細胞はコンフルエントで、シンクロナイズされた細胞のビーディングシートを形成した。細胞容積をはかるために、細胞は１５分間３７℃でカルセイン−ＡＭ（コントロール緩衝液中５μＭ）でロードされ、カバーガラスがオープンバスチャンバーにのせられた。以下の実験が室温で行われた。ライカレーザー共焦点顕微鏡の使用で、光学的交差区分（optical cross-section）が実験の間を通じて２０秒ごとに行われた。
【０２１５】
光学的交差区分はメタモルフ（ユニバーサルイメージング）を用いて分析された。細胞の領域が、バックグラウンドで誘導されたばらつきを最小化するために選ばれた閾値よりも高い蛍光強度を有する画素の領域として決定された。データはコントロール条件下（代謝ストレス前の最後の測定）の平均領域で個々の値を分けることにより、相対的な容積として表される。
溶液：コントロール緩衝液は、ｍＭで、ＮａＣｌ  １３６、ＫＣｌ  ４、ＭｇＣｌ２  ０．８、ＣａＣｌ２  １．８、ＨＥＰＥＳ  ５、ＭＥＳ  ５、グルコース  ６を含み、ｐＨ７．３であり、ストレス緩衝液は、ｍＭで、ＮａＣｌ  １３６、ＫＣｌ  ８、ＭｇＣｌ２  ０．８、ＣａＣｌ２  １．８、ＨＥＰＥＳ  ５、ＭＥＳ  ５、デオキシグルコース  １０を含み、ｐＨ６．２である。
【０２１６】
２．結果  コントロール条件下、平均的な細胞は時間とともにその容量をわずかに減少させる傾向であった（図９は５回の実験の平均データを示す）。細胞が代謝阻害に晒されたとき、容量の減少はネット増加へと転じた（図９Ａの黒四角（■））。平均して、相対的な容量は１．０６±０．０２（ストレスの最後５分、ｎ＝５）であり、一方その間コントロール細胞の容量は０．９４±０．０４であった。
【０２１７】
筋細胞における色素取り込み測定は、化合物１が開いたコネキシンヘミチャンネルを阻害することを示している。ヘミチャンネルは観測された膨張に貢献すると考えられる。これを試験するために、化合物１（０．１ｎＭ）をストレス培地に添加し、インキュベートされ、容量が観測された。６回の実験に由来するデータが図９Ａに於いて開示され（白い四角（□））、そこでみられるように、ストレス誘導膨張は抑制された。化合物１存在下でのストレスの間の平均相対容量は、０．９３±０．０５であった。
【０２１８】
一方向ＡＮＯＶＡを使用して、ストレス及びストレスと化合物１を含む場合のデータを、コントロールのデータと比較すると、顕著な違いが検出された（図１０参照）。ポストホク（post.hoc.）試験（ＬＳＤ）は、ストレスの場合が、コントロール（ｐ＜０．０５）及びストレスと化合物１を含む場合（ｐ＜０．０５）と顕著に異なる一方、コントロールはストレスと化合物１を含む場合とほとんど変わらなかった（Ｐ＞０．７６）。
【実施例８】
【０２１９】
ラットにおける心筋梗塞後の梗塞サイズの減少
１．方法  オスのルイスラット（３００−３５０ｇ、Ｍ＆Ｂ、LI. Skendsved、デンマーク）が、神経弛緩麻酔組み合わせ（ハイブノーム（商標）（フェンタニルシトレート  ０．３１５ｍｇ／ｍｌと、フアニソン１０ｍｇ／ｍｌ）＋ミダゾラム（５ｍｇ／ｍｌ））により麻酔された。市販のミダゾラムの溶液を、蒸留水中で１：２に希釈した。希釈されたミダソラムの３部と、ハイプノーム（商標）の１部を混合した。麻酔はラット１００グラムあたり、この溶液の０．２ｍｌを皮下投与されることにより、誘導された。手術的な麻酔が確立された後、気管内カニューレが挿入され、ラットは手術の間心房のｐH７．３−７．５に維持するように調整されたハーバードげっ歯類人口呼吸器を用いて、人工的に通気された。
【０２２０】
化合物１が、心筋梗塞の誘導に先立って、迅速に腹腔内へ挿入された浸透圧ミニポンプ（アルゼットモデル２ＭＬ４）により輸送された。ポンプはビヒクル（等張生理食塩水）又は化合物１がみたされ、手術に先立って２４時間３７℃でプライムされた。治療血漿濃度が梗塞の時にすでに得られることを確立するために、化合物１のローディング容量（losding dose）がＬＡＤのライゲーションに先立って皮下投与された。皮下へのローディング容量で、３分後にすでに定常状態の血漿レベルに達した。
【０２２１】
化合物１の皮下へのローディング容量の投与後と、浸透圧ミニポンプの腹腔内挿入後、左の開胸が行われ、左前下行性動脈が６−０シルク縫合を用いて結合された。胸郭が層に閉じ込められ、肺を広げるために胸腔に於いて陰圧が誘導された。みせかけ飼養がなされた動物（Sham-operated animals）は、ＬＡＤの結合なしに同じ手順に供せられた。手術後、動物は次の朝まで５０％酸素３０℃で、熱した保管庫で回復されるようにされた。回復期間中の脱水症を避けるために、ラットは手術終了後すぐに５％グルコースを皮下に５ｍｌ投与され、４ｐ．ｍ．にさらに５％グルコースが５ｍｌ投与された。手術後の痛みを軽減するために、ラットはブプレノルフィン（２０μｇ／１００ｇ  皮下  一日二回）とメロキシカム（０．１ｍｇ／１００ｇ  皮下．一日一回）を心筋梗塞後３日間処置された。本研究に於いて、心筋梗塞（ＭＩ）ラットに与えられた注入用量は、血漿濃度が０（ビヒクル＝等張生理食塩水）、１．７±０．４ｎＭ（用量１）、５．７±０．４（用量２）、又は９３．７±１２．３ｎＭ（用量３）となるように調整された。化合物１の血漿濃度は、固相抽出に続くマススペクトロメトリーで測定された。使用された用量は、以下の表１に記載される。
【０２２２】
【表１】
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【０２２３】
ＬＡＤの結合から３週間後、ラットはペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注入で麻酔された。ラットは体温を３７℃に保つために、温かいブランケット上に置かれた。開胸が行われ、ラットはハーバードげっ歯類人工呼吸器を用いて酸素で通気された。人工呼吸器はｐＨ７．３５−７．４５に心房を維持するために調節された。ＰＥ５０カテーテルは大腿静脈と動脈への静脈内投与と動脈の圧力測定のために設置された。大腿静脈カテーテルの挿入後、ラットはパンクロニウム１ｍｇ／ｋｇの静脈投与により麻痺させられた。麻酔と呼吸麻痺は、等張生理食塩水（５０μｌ／ｍｌ）で輸送されたペントバルビタール（２．５ｍｇ／ｋｇ／時間）と、パンクロニウム（１ｍｇ／ｋｇ／時間）の持続的な静脈注入により維持される。タイゴン（Tygon）カテーテルが左心室終弛緩期圧の決定のために、右の頚動脈を通じて左心室へと挿入された。左心室終弛緩期圧（ＬＶＥＤＰ）の記録後、心臓が生体から、心臓から数ｍｍの静脈と冠動脈を切断することにより取り出された。心臓は注意深く等張生理食塩水で血液を洗浄され、重さをはかられ、４％の中性緩衝ホルマリン中へ置かれた。
【０２２４】
固定後、心臓に近い大脈管が切断された。それから心臓は１．５ｍｍの幅を有する平行レーザー刃からなる集合体を用いて厚さ１．５ｍｍの厚さへ平行にスライスされた。スライスは心臓の長軸に対して垂直である。
スライスは、２つの組織カプセル（histological capsule）に置かれ、例えば、ランダムに選ばれた一つ目のスライスを一方のカプセルに、二つ目のスライスは他方のカプセルに、三つ目のスライスは最初のカプセルに、のようにして置いた。これらのスライスを包まい後、そのスライスはヘマトキシリンエオシンやマッソントリクローム等により染色される４μｍの厚さの切片に切断された。
【０２２５】
前決定段階で顕微鏡を使用することにより、マッソン−トリクロムで染色されたスライドが調べられ、線維性組織（マッソン−トリクロムで青く染色された）をヒットするポイントの数と正常な組織が計測された。この顕微鏡はビデオカメラに接続され、イメージがスクリーン上で現された。使用された体系測定システムは、オリンパス、デンマークのＣａｓｔ２であった。梗塞の大きさは心臓の線維性組織の％として数えられた。
【０２２６】
２．結果
図１１に示されるように、心臓の重さ−体重比は、化合物１の二つの高い用量の場合に減少させられており、本化合物が心筋梗塞の肥大性の影響（すなわち再構築）を減少させることを示している。
【０２２７】
図１２に示されるように、化合物１での３週間の処置は、心筋梗塞にかかりビヒクルで処理されたラットにおける梗塞の大きさに比べて２０−５０％梗塞の大きさを減少させた。これは化合物１が心筋虚血の間に細胞防御活性を有することを示している。ここに記載されることと同様に、これらのデータは化合物１が細胞膨張を抑制することを含むであろう機構により心筋梗塞の大きさを減少させることを示している。細胞膨張の抑制は、周囲の健康な組織に圧力がかけられることを抑え、それゆえ周囲の健康な組織における微小環境がつぶされることを防ぐであろう。それゆえ本発明は、この原理が、いかなる器官、好ましくは閉じ込められた線維性組織層（例えば、心臓、腎臓）、又は骨で囲まれる器官（例えば脳、脊髄、骨髄）、しかしこれらに限定されることのない         器官における虚血損傷の影響を抑えることを提供するものである。
【０２２８】
図１３に示されるように、心筋梗塞にさらされたが化合物１を３週間処置されたラットでは、減少した左心室終弛緩期圧で示されるような左心室がより少なくうっ血している、改良された心臓の機能を有していた。このデータは、化合物１が心筋梗塞に続く心臓機能の悪化を抑えることを示している。
【０２２９】
本明細書に開示されている全ての引用文献は、参照として本明細書に取り込まれる。本発明はその好ましい態様に関して記載されている。しかしながら、当業者が本明細書の開示に基づいて考えて、本発明の精神と範囲内で修飾や改良を加えることができるであろう。
を示している。
【図面の簡単な説明】
【０２３０】
【図１】図１は、コネキシン（Ｃｘ４３）のリン酸化部位を示す図である。ここでみられるように、Ｃｘ４３の膜貫通蛋白質のサイトゾルドメインは、いくつかの潜在的なセリン及びチロシンのリン酸化部位を有している。
【図２】図２は、グルコースの除去により誘導される代謝ストレスを示すグラフである。グラフから見られるように、化合物１の投与は相対的な伝導の遅延の減少により証明されるように、ストレスを抑える。
【図３】図３Ａ−Ｂは、コネキシン４３（Ｃｘ４３）におけるチロシンのリン酸化の検出を示すイムノブロットを表している。図３Ａは化合物１の投与の結果を示す。図３Ｂは化合物１及び２の投与結果を示す。
【図４】図４Ａ−Ｂは、Ｃｘ４３のチロシンのリン酸化（８Ａ）及びセリンのリン酸化（８Ｂ）の検出を示すイムノブロットを表している。
【図５】図５は、培養された心筋細胞における虚血で誘導されたカルセインの取り込みにおける１０ｎＭの化合物１の効果を示すグラフである。
【図６−Ａ】図６Ａは、好ましいＥＬＩＳＡアッセイ形態を示す図である。
【図６−Ｂ】図６Ｂは、Ｈｅｌａ細胞におけるＴｙｒ−Ｐでリン酸化されたＣｘ４３のＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。
【図６−Ｃ】図６Ｃは、ＣＨＯ細胞におけるＴｙｒ−Ｐでリン酸化されたＣｘ４３のＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。
【図７】図７Ａ乃至Ｃは、培養された心筋細胞における取り込み色素を示す顕微鏡写真である。図７Ａは光顕微鏡下での心筋細胞、図７Ｂはコントロールにおける蛍光（図７Ａにおける細胞と同じ）、図７Ｃは、代謝阻害の３０分後の蛍光。
【図８】図８は、化合物１が用量依存的に、ストレスで誘導されたカルセインの取り込みを抑えることを示すグラフである。
【図９】図９Ａ及びＢは、ストレス誘導された細胞膨張における化合物１の効果を示すグラフである。図９Ａは、化合物１（０．１ｎＭ）の存在下又は欠損下に於いて阻害を阻害する間の相対容量である。図９Ｂは、コントロールデータである。
【図１０】図１０は、化合物１（０．１ｎＭ）のストレスで誘導された細胞膨張における効果を示すグラフである。
【図１１】図１１は、心筋梗塞に羅患したラットに化合物１を投与した後の体重に対する心臓の重量比率の減少を示すグラフである。
【図１２】図１２は、化合物１の投与に続くラットにおける梗塞サイズの減少を示すグラフである。
【図１３】図１３は、心筋梗塞に羅患したラットに化合物１を投与した後に改良された心機能を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−Ａ】
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【図６−Ｂ】
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【図６−Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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