(57)【要約】本発明は、試料（２４）の多光子励起に関する。この場合、レーザービーム（１０）が、それぞれのビーム軸線の周りで同じ強度分布の少なくとも２本のコヒーレントな部分ビーム（１１，１２）に分割される。この場合、これらの部分ビーム（１１，１２）は、異なる方向からこれらのビーム軸線に対して横方向に延在している１つの共通の測定面に向けて指向される。その結果、これらの部分ビーム（１１，１２）が、この測定面の領域内で互いに干渉し、これらの部分ビーム（１１，１２）が、互いに傾斜角度（１４）＜１をなして互いに指向され、共通のレンズ系（２１）を通じて測定面に向けて指向される。その結果、これらの部分ビーム（１１，１２）の干渉によって引き起こされた測定面内の強度分布が、最小強度の領域に加えて最大強度の領域を有する。
2005508489.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザービームが、それぞれのビーム軸線の周りで同じ強度分布の少なくとも２本のコヒーレントな部分ビームに分割され、この場合、これらの部分ビームは、異なる方向からこれらのビーム軸線に対して横方向に延在する共通の１つの測定面に向かって指向され、その結果、これらの部分ビームが、この測定面の領域内で互いに干渉する試料の多光子励起の方法において、部分ビーム（１１，１２）は、互いに傾斜角度＜１（１４）をなして指向されること、及び、これらの部分ビーム（１１，１２）は、共通のレンズ系（２１）によって測定面に向かって指向され、その結果、部分ビーム（１１，１２）の干渉によって形成された測定面内の強度分布が、最小強度の領域に加えて最大強度（３１，３３）の領域を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
測定面内の部分ビーム（１１，１２）の横方向の移動は、この測定面内の各部分ビームの強度分布の半値幅の50％よりも小さいことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
部分ビーム（１１，１２）は、測定面内の少なくとも１つの測定点で焦点合わせされることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１本の部分ビーム（１２）の位相が、その部分ビームの波長を変えることによって変調され、その結果、測定面内の最大強度の領域が往復移動することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
部分ビーム（１１，１２）は、測定面内で相並んでいる多数の共通の測定点で同時に焦点合わせされ、この場合、これらの部分ビーム（１１，１２）は、全ての測定点の領域内で互いに干渉することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
最大強度の領域（３１，３３）と領域（３１，３３）との距離が、並んでいる測定点と測定点との距離の少なくとも半分であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
レーザービームを出力するレーザを有し、このレーザービームをそれぞれのビーム軸線の周りで同じ強度分布の少なくとも２本のコヒーレントな部分ビームに分割するビーム分割手段を有し、これらの部分ビームを異なる方向に指向させるビーム偏向手段を有し、そしてこれらの部分ビームを異なる方向からビーム軸線に対して横方向に延在している共通の１つの測定面に向けて指向された投影手段を有し、この場合、部分ビームが測定面の領域内で互いに干渉するように、このビーム偏向手段とこの投影手段とが対向して設定されている請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法を実施する装置において、部分ビーム（１１，１２）が、これらの部分ビーム（１１，１２）を測定面に向けて指向させる投影手段の共通のレンズ系（２１）を通過する前に、ビーム偏向手段（６〜９）が、これらの部分ビーム（１１，１２）を互いに傾斜角度（１４）＜１をなして指向させ、その結果、これらの部分ビーム（１１，１２）の干渉によって引き起こされた測定面内の強度分布が、最小強度の領域に加えて最大強度の領域（３１，３３）を有することを特徴とする装置。
【請求項８】
ビーム偏向手段は、ルーフミラー（９）を有し、部分ビーム（１１，１２）が、このルーフミラー（９）の稜線縁部（１３）に対して傾斜角度（１４）をなして収束することを特徴とする請求項７に記載の装置。
【請求項９】
ビーム偏向手段（６〜９）は、少なくとも１つの偏向要素（８）を有し、この偏向要素（８）は、少なくとも１本の部分ビーム（１２）の波長を変えることによってこの部分ビーム（１２）の位相を変調することを特徴とする請求項７又は８に記載の装置。
【請求項１０】
ビーム分割手段及びビーム偏向手段は、一緒に１つの光学要素から構成されることを特徴とする請求項７に記載の装置。
【請求項１１】
光学要素は、能動面を有し、この能動面は、グループごとに互いに傾倒された又は傾倒可能な複数のマイクロミラーから構成されていることを特徴とする請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
光学要素は、能動的な透過領域を有し、この透過領域は、グループごとに異なるか又は異なって制御可能な遅延板上に構成されていることを特徴とする請求項１０に記載の装置。
【請求項１３】
レンズ系（２１）は、部分ビーム（１１，１２）を測定面内の少なくとも１つの共通の測定点内に焦点合わせすることを特徴とする請求項７〜１２のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１４】
部分ビーム（１１，１２）を同一平面内で相並んでいる多数の共通の測定点で同時に焦点合わせするため、レンズ系（２１）は、この平面内で相並んで配置された多数のマイクロレンズから構成されたマイクロレンズアレイ（１８）を有し、この場合、これらの部分ビーム（１１，１２）は、全ての測定点の領域内で互いに干渉することを特徴とする請求項１４に記載の装置。
【請求項１５】
傾斜角度（１４）＜λ／（Ｍ＊ＮＭ＊ｆ）であり、この場合、λは、レーザービーム（１０）と部分ビーム（１１，１２）の波長であり、Ｍは、各測定点内の部分ビーム（１１，１２）の焦点合わせ時の投影スケールであり、ＮＡは、レンズ系（２１）の開口数であり、ｆは、マイクロレンズアレイ（１８）の各マイクロレンズの焦点距離であることを特徴とする請求項１４に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、請求項１の上位概念に記載の多光子励起の方法に関する。
【０００２】
さらに本発明は、請求項１の上位概念に記載のこの方法を実施する装置に関する。
【背景技術】
【０００３】
測定点内での試料の多光子励起は、例えば走査顕微鏡内で実施される。したがって試料の２光子励起の場合、試料から放出された蛍光の強度分布が、励起光の強度分布の２乗に比例する。したがって試料の３光子励起の場合、蛍光の強度分布が、励起光の強度分布の３乗に比例する。すなわち各測定点内での励起光の強度分布の限定された最小半値幅の場合、実際の場所分解能が、多光子励起の蛍光の分析時に上昇する。
【０００４】
ドイツ連邦共和国特許出願公開第196 53 413号明細書から公知である請求項１の上位概念に記載の方法及び請求項８の上位概念に記載の装置の場合、試料の多光子励起の欠点は、試料が測定面内で相並んでいる多数の測定点で同時に励起されることによって、励起光の強度のべき乗に依存した蛍光の強度が試料の損傷を不可能にする励起光の強度のために多くの場合ほんの僅かにすぎず、それ故により長い測定時間を必要とする点にある。このことは、レーザービームがマイクロレンズアレイに入射することによって相並んでいる多数の焦点に合わせられることによって起こる。これらの焦点は、投影システムによって測定面内の測定点に投影される。このドイツ連邦特許出願公開第196 53 413号明細書中には、これに関連して方法と装置の実施形も記されている。この装置の場合、マイクロレンズアレイの個々のマイクロレンズがビーム軸線に沿って異なる位置及び／又は異なる焦点距離を有する。その結果、複数の測定点が、試料内の異なる距離に配置されて、これらの測定点をこの位置でも走査する。それぞれのビーム軸線に対して垂直に延在している１つの測定面内に相並んでいる多数の測定点に関して記載されていても、測定点が１つの幾何学面内に正確に存在しないこの別の実施の形態も、この明細書の発明に含めなくてはならない。
【０００５】
請求項１の上位概念に記載の方法及び請求項８の上位概念に記載の装置に相当するドイツ連邦特許出願公開第196 53 413号明細書中の実施形は、レーザービームがマイクロレンズアレイに入射し、相並んでいる多数の焦点に分割された後に、このレーザービームをそれぞれのビーム軸線に対して同じ強度分布の２つの部分ビームに分割する。次いでこれらの部分ビームは、２つのレンズ系によって正反対の方向から、すなわち試料に対して前方からと後方とから測定面内の測定点で焦点合わせされる。これらの部分ビームがコヒーレントであるために、干渉パターンがこれらの測定点内でそれぞれ発生する。この干渉パターンの場合、最大強度の領域及び最小強度の領域が、ビーム軸線の方向の順序を有する。具体的には、主最大値(Hauptmaximum)が測定面内で測定点の周りに直接発生する。試料が、この主最大値内で特に励起する。測定面の前方又は後方にある隣の最大値(Nebenmaxima) は、測定面内の各部分ビームの強度分布だけが原因なので付随的に重要である。その結果、これらの隣の最大値は、試料の多光子励起に寄与しない。こうして、距離分解能が、試料の多光子励起時に改善される。しかし、同じ強度分布の２つの部分ビームに分岐したレーザービームの分割部分が試料まで及んでいるので、これに対して必要な構成は比較的経費がかかる。しかも、各部分ビームを両側から試料に入射させる必要がある。
【０００６】
マイクロレンズアレイの個々のマイクロレンズが可能な限り直に接し合って隣接することによって、このドイツ連邦特許出願公開第196 53 413号明細書は、レーザによって任意に処理されるレーザービームの光出力の可能な限り良好な利用の課題に対応している。その結果、レーザービームの割合が徐々に小さくならない。試料がその都度ほぼ同一の強度で多光子処理にわたって励起される状態では、測定面内に相並んでいる多数の測定点が公知の方法と公知の装置でも常に問題ない。励起光に対して非常に異なる感度を呈する試料が存在する。すなわち、いろいろな測定点に対して強度が同じ場合でも、これらの試料は、その若干の測定点内で励起光によって損傷を受ける。その一方でその他の測定点内では、蛍光の評価可能な強度がまだ存在しない。
【０００７】
多光子励起による蛍光顕微鏡が、ドイツ連邦共和国特許発明第198 51 240号明細書から公知である。この蛍光顕微鏡の場合、照射光のいろいろな成分が複数の照射方向で１つの共通の焦点に入射されることによって、多光子励起が空間的に限定される。これらの照射方向は、より大きい角度で切断する。その結果、それぞれ照射方向に伸びる個々の照射量に比べて明らかに小さく、かつ多光子励起が切断面に向かって有効に限定される切断面(Schnittvolumen)が得られる。照射光のこれらの成分は干渉しない。これらの成分は、異なる波長を有する。複数の照射方向を切断する角度は、90°の範囲内にある。この公知の蛍光顕微鏡の特定の実施形の場合、２つの照射方向が焦点方向に互いに逆に延在することが、追加の手段として提唱されている。その結果、照射光が、これらの両照射方向に沿って干渉する。このことは、請求項１の上位概念を構成するために引用されたドイツ連邦特許出願公開第196 53 413号明細書の説明に一致する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
この課題は、レーザービームの任意に使用できる強度が試料の多光子励起のために最適に利用される請求項１の上位概念に記載の方法及び請求項８の上位概念に記載の装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この課題は、本発明により、請求項１の特徴を備えた試料の多光子励起の方法によって解決される。この方法の好適な実施形は、従属請求項２〜７中に記載されている。
【００１０】
この新規の方法の場合、部分ビームが、正反対の方向から来ないで測定面の領域内で干渉する。と言うよりもむしろ、部分ビームがほぼ同じ方向から来る。これらの部分ビームの数は、２本より多くてもよい。これらの部分ビームがそれぞれなす小さい傾斜角度は、１よりも遥かに小さい。したがって、干渉パターンが生じる。この干渉パターンの場合、最大強度の領域と最小強度の領域が、試料の奥で相次いで発生するのではなくて、測定面内でつまり傾斜角度の方向に沿って発生する。この干渉パターン内の最大強度と最大強度との距離が、傾斜角度のほかにレンズ系の光学データにも依存する。この間隔は、必要に応じて設定され得る。しかし本発明には、測定面内の不均質な強度分布が干渉パターンによって設定されることによって、レーザービームの任意に使用できる強度の利用が、この距離に全く関係なく改善されるという利点がある。励起光の任意に使用できる光出力のここで生じるこのより良好な利用は、多光子励起時の蛍光生成量の非線形性に起因する。２光子励起に基づく場合、１に相当する中心の相対強度を２と０に相当する相対強度の領域に分割する干渉パターンによって、２2 ＝４に相当する相対励起が、２に相当する相対励起の領域内で得られる。このことは、２に相当する中心の励起に対応する。これに対して本来の強度の場合、１2 ＝１に相当する中心の励起しか得られない。この例に基づく励起光の強度分布が理論的でもある場合、この例は、本発明の可能性を確実に明らかにする。換言すれば、測定面内の干渉パターン自体が、多光子励起時の蛍光の相対的な生成量を改良する。この効果は、３光子励起やさらに多くの光子が寄与する処理ではさらに顕著に現れる。通常、試料による蛍光の観察時に、励起光の強度分布が測定面内の干渉パターンに基づいて分析されるか又はされないかに関係なく、ここまで言える事項が成立する。
【００１１】
傾斜角度に基づく測定面内の部分ビームの横方向の移動は、常に測定面内の各部分ビームの強度分布の半値幅の50％未満でなくてはならない。この半値幅の最大で25％である測定面内の部分ビームの横方向の移動がさらに好ましい。
【００１２】
蛍光の生成量に関してこの新しい方法の基本的な利点を利用するためには、試料の多光子励起時に高い場所分解能を実現する可能性を利用する必要は確かにないものの、部分ビームを測定面内の少なくとも１つの共通の測定点に焦点合わせすることに意義がある。
【００１３】
部分ビーム間の比較的小さい傾斜角度によって、各々のさらなるビーム形成の前に、すなわち特に部分ビームを例えばマイクロレンズアレイの相並んでいる多数の焦点に向けて分割する前にレーザービームを部分ビームに分割して、これらの焦点を引き続き測定点内で投影することに非常に意義がある。
【００１４】
測定面内の干渉パターンの強度分布の上述した基本的な利点に加えて、特別な利点が、最大強度の領域と領域との距離が測定点間の距離の少なくとも半分であることによって奏される。すなわち、一方では個々の測定点が蛍光の増大した相対生成量を完全に利用できる。他方では試料の異なる感度の領域を干渉パターンの強度分布の範囲内で異なる強度の励起光で励起することが可能である。
【００１５】
試料の異なる領域を励起光で異なる強さで励起することがその試料で重要でないか又は必要ない場合、少なくとも１つの部分ビームの位相がその部分ビームの波長を変えることによって変調され得る。その結果、測定面内の干渉パターンの最大強度の領域が往復移動する。この手段の意図は、試料を干渉パターンによって走査することを必須とするのではなくて、励起強度を均質に「補正する」ことである。細かい干渉パターンに関連して既に上述したように、それにもかかわらず、任意に使用できる強度、すなわちレーザービームの光出力が、多光子励起の非線形性によってより良好に利用される。
【００１６】
本発明のこの新しい方法を実施する装置は、請求項８の特徴によって示されている。この装置の好適な実施形は、請求項９〜１５中に記載されている。
【００１７】
ビーム偏向手段がルーフミラーを有する。部分ビームが、予めビームスプリッタによって分割され、次いでほぼ正反対の方向からルーフミラーに達した後に、これらの部分ビームは、このルーフミラーの稜線縁部に対して傾斜角度をなして収束される。本発明に関しては、２本の部分ビームがほぼ同じ強度分布で存在し、これらの部分ビームが小さい傾斜角度をなして互いに指向される点だけが重要である。このことは、その他の公知の光学手段によっても実現できる。
【００１８】
したがって、ビーム分割手段及びビーム偏向手段は、１つの光学要素から一緒に構成され得る。例えばこの光学要素は、グループで互いに傾倒可能な複数のマイクロミラーから構成されている能動面を有する。このような光学要素は、米国のテキサス・インスツルメント社から入手可能である。これらの光学要素は、例えば市松模様状にマイクロミラーの２つのグループに分割されて制御される。この場合、「黒い」フィールドつまりマイクロミラー及び「白い」フィールドつまりマイクロミラーがそれぞれ、一致する方向を示し、かつ共同でレーザービームの部分ビームのうちの１本の部分ビームを生成する。
【００１９】
しかしこの光学要素は、異なる遅延板又は異なって制御可能な遅延板のグループから構成されている能動的な透過領域を有してもよい。電気的に制御可能な液晶遅延セグメントを有する光学要素は、例えば米国のDisplayTech 社から入手可能である。ここでも、傾斜角度をなして互いに指向された両部分ビームをレーザービームから生成するため、光学要素を市松模様状に分割することが可能である。液晶遅延セグメントを有する光学要素は現時点ではまだ比較的僅かな透過性しか呈さないが、将来的にはさらにより良好な透過値を呈する光学要素が本発明の実現で最も優れていることを示すことが予測できる。
【００２０】
部分ビームを相並んでいる多数の焦点に分割するため、レンズ系が、同一平面内に相並んで配置された多数のマイクロレンズから構成されたマイクロレンズアレイを有する。基本的には、例えば多重絞りのようなその他の可能性もこの目的のために使用可能である。しかし全ての絞りには、入射するレーザービームつまり入射する部分ビームの一部が弱まり、その結果貴重な光出力が失われるという欠点がある。
【００２１】
マイクロレンズアレイを使用する場合、傾斜角度の重要な上限に対しては、傾斜角度がλ／（Ｍ＊ＮＭ＊ｆ）よりも小さいという評価が重要である。この場合、λは、レーザービームと部分ビームの波長である。Ｍは、各測定点で部分ビームを焦点合わせする投影スケールである。ＮＡは、レンズ系の開口数である。ｆは、マイクロレンズアレイの各マイクロレンズの焦点距離である。λの一般的な値は、0.0004mmと0.0015mmとの間にある。Ｍの一般的な値は、0.05と0.001 との間にある。ＮＡの一般的な値は、0.2 と1.6 との間にある。ｆの一般的な値は、１mmと20mmとの間にある。したがって、傾斜角度は、0.25＊10-3未満が可能であり、一般的には1.0 ＊10-3以下である。
【００２２】
ビーム偏向手段は、少なくとも１つの偏向要素を有し得る。この偏向要素は、少なくとも１本の部分ビームを変えることによってこの部分ビームの位相を変調する。例えば、この偏向要素は、圧電素子によって支承されたミラーである。このミラーの位置が、圧電素子を制御することによって経路(Weg) 上で周期的にシフトする。経路≧部分ビームの波長である。この過程の周期が多光子励起に基づいて放出された蛍光の記録時の時間分解能よりも短い場合、測定面内の干渉パターンの強度分布が、多光子励起でのその強度分布の基本的な利点を保持しつつ効果的に求められる。
【００２３】
本発明は、試料から放出された蛍光の記録又は観察の新しい方式とは無関係である。しかし、当業者が適切な公知の方法ステップ又は適切な公知の装置を、蛍光を検出する装置で用意することが分かる。例えば、ＣＣＤカメラ又はＣＭＯＳカメラ又は１つ若しくは多数の光電子増倍管のような電子カメラが、この蛍光を検出する装置に属する。好適な実施形では、このような光電子増倍管が、マイクロレンズアレイの各マイクロレンズに割り当てられている。この場合、マイクロレンズの配置は、光電子増倍管に対して固定されている。そして、試料が、例えばガルバノミラーを使用することによって又は試料自体を移動させることによって走査される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下に、本発明を実施の形態に基づいて詳しく説明する。
【００２５】
図１中に示された装置１は、２つの部分配置２，３から構成される。これらの部分配置２，３の領域はそれぞれ、この図では線で囲まれている。しかしこのことは、部分配置１，２を異なる筐体内に配置する必要があるとか又は任意の別の空間的な若しくは立体的な仕切りを設ける必要があるという意味ではない。装置１を部分配置２，３に分割することは、むしろ純粋に実用本位の理由による。
【００２６】
装置１の部分配置２は、レーザ４，ビームスプリッタ５，偏向ミラー６，７，８及びルーフミラー９を有する。レーザ４は、コヒーレントなレーザービーム１０を放射する。このレーザービーム１０は、ビームスプリッタ５によって２本の部分ビーム１１，１２に分割される。これらの部分ビーム１１，１２は、互いにコヒーレントであり、光学軸線の周りで同一の強度分布を呈する。部分ビーム１１，１２は、偏向ミラー６〜８によって偏向され、異なる方向からルーフミラー９の稜線縁部１３に導かれる。部分ビーム１１，１２がこの部分ビーム１１とこの部分ビーム１２との間に存在する傾斜角度１４まで１本の共通の光学軸線１５に向かって延在しているように、これらの部分ビーム１１，１２は偏向される。この場合、偏向ミラー６は部分ビーム１１を偏向させるために設けられていて、偏向ミラー７，８は部分ミラー１２を偏向させるために設けられている。両部分ビームの波長は、ビームスプリッタ５とルーフミラー９との間で同じ長さである。したがって、ルーフミラー９の後方の部分ビームは、互いに干渉に適している。部分ビーム１２の波長の変化が部分ビーム１１に対する相対的な位相シフトを意味するので、そこで発生する干渉パターンが、圧電素子１６を制御することによって可変である。偏向ミラー８が、部分ビーム１２の光路内でこの圧電素子１６によって支承されている。ルーフミラー９の後方の部分ビーム１１と部分ビーム１２とのなす角度１４は、ここでは8.4 ×10-4である。
【００２７】
装置１の部分配置３内では、以下のようにレンズ系２１によって変換される。このレンズ系２１は、ここでは１つの拡大鏡１７，１つのマイクロレンズアレイ１８，多数のレンズ２２及び１つのオイル対物レンズから構成される。まず部分ビーム１１，１２がそれぞれ、拡大鏡１７によって拡大される。次いでこれらの部分ビーム１１，１２は、拡大してマイクロレンズアレイ１８に照射される。このマイクロレンズアレイ１８は、軸線１９の周りを回転するマイクロレンズ板２０から構成される。マイクロレンズアレイ１８は、部分ビーム１１，１２をそれぞれ相並んでいる多数の焦点で焦点を合わせる。このとき、これらの焦点は、レンズ２２とオイル対物レンズ２３を通じて試料２４内部の測定面内の異なる測定点に投影される。この場合、部分ビーム１１，１２がそのそれぞれの強度分布の半値幅の約20％だけ相対的にシフトするように、これらの部分ビーム１１，１２の強度分布が各測定点で重なり合う。部分ビーム１１と部分ビーム１２との間の傾斜角度１４にとって、測定面内の個々の測定点が、干渉パターンの形成を阻止する。この場合、一種の干渉、すなわち悪性の(destruktiv)干渉又は良性(konstruktiv) の干渉が、相対的な位相位置に依存する、すなわち偏向ミラー８を支承する圧電素子１６の制御に依存する。これに関しては、以下で図３に関連して詳しく説明する。部分ビーム１１，１２が良性に重なり合う場合、試料２４が、多光子励起、ここでは２光子励起中に励起されて蛍光を放出する。この蛍光は、接眼レンズ２５を通して直接観察してもよいし又は電子カメラ２６で記録してもよい。そのため、２枚のミラー２７，２８が、装置１のビーム経路内にさらに設けられている。ミラー２７は、特にカラースプリッタである。このカラースプリッタは、部分ビーム１１，１２は試料２４に向けて偏向させるものの、蛍光はこの試料から接眼レンズ２５又はカメラ２６に向けて通過させる。この場合、このカラースプリッタは、一方では部分ビーム１１，１２と他方では蛍光との異なる波長を利用する。カラースプリッタとして構成されたミラー２７のほかに、ＳＮ比を改善するため又は目を保護するため、ここでは図示しなかったフィルタをカメラ２６又は接眼レンズ２５を通過するビーム経路内に配置して試料２４から反射したレーザー光を吸収してもよい。ミラー２８は、半透過性のミラーでもよい。蛍光の強度をその都度完全に利用しながら試料を電子カメラ２６で記録するか又は接眼レンズ２５を通して目で観察するためには、特にこのミラー２８は、ビーム経路内に割込み可能な又はビーム経路方向に旋回可能な全反射ミラーである。
【００２８】
図３は、試料の場所にわたって、すなわち測定面の横断面にわたってプロットされた蛍光を放出する試料の励起量を示す。個々の測定点が、この測定面に沿って配置されている。図３中に示された測定面の横断面が、軸線１９の周りを回転するマイクロレンズアレイ１８によって走査される。図３中では、曲線２９が、２光子励起の強度分布を示す。この強度分布は、レーザービーム１０を部分ビーム１１，１２に分割することなしに得られる。これは、ガウス状の強度分布である。これに対して、曲線３０は、部分ビーム１１と部分ビーム１２との重なりの中心点内の良性の干渉を示す。相並んでいる３つの最大強度領域３１が発生する。最大強度領域３１と最大強度領域３１との間では、蛍光の励起が零に戻る。曲線３２は、両強度分布の中心点内の悪性の干渉の状況を示す。したがって、蛍光の励起が、曲線３０の領域３１内で零に戻る。この代わりに、最大強度領域３３が、領域３１と領域３１との間で発生する。曲線３０，３１つまり部分ビーム１１，１２の全ての相対位相位置が平均化されると、曲線３４が、試料２４の蛍光励起に対して得られる。曲線３４は、例えば偏向ミラー８を支承する圧電素子１６の周期振動よりも小さく時間分解能による蛍光測定に対応する。蛍光に基づく多光子励起の非線形性の結果として、曲線２４が明らかに曲線２９の上にある。すなわち、試料の多光子励起による蛍光量が、試料２４の領域内の両部分ビーム１１，１２の干渉によって改善される。２光子励起の場合、両部分ビームの干渉による蛍光量が、レーザービームを直接使用するよりも50％程度まで多くなくてはならない。３光子励起の場合、改善は150 ％までに達する。
【００２９】
図３中に示されている理論値は、図４中の測定値によって立証される。これらの測定値は、図４中では曲線３０，３３，３４によって示される。曲線２９は、図４中では示されていない。しかしこの曲線２９は、同じガウス状の基本形で曲線３４の下に一定に延在している。
【００３０】
図５，６，７は、曲線３０，３３，３４に相当する測定面内の均質な試料の励起した蛍光の強度分布を示す。図７は部分ビーム１１，１２の干渉パターンの発生時の蛍光量の上昇しか示さない一方で、例えば試料の異なる感度を考慮するため、図５，６は、試料の所定の領域も干渉パターンによってその他の領域よりも強く励起され得ることを認識することができる。また、測定面内の部分ビーム１１，１２の干渉パターンは、図５，６中で見て取れるように比較的粗く省略する必要はない。多数の最大強度領域を相並べて示してもよい。この場合、試料の多光子励起に対するこの新規の方法及びそれに対応する装置の基本的な利点は維持される。異なる相対位相にわたる干渉パターンを平均化することさえも簡単に可能である。干渉パターンが各測定点内の部分ビームの強度分布よりも細かい場合、この平均化はほぼ自動的に実施される。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】新しい装置の構成を示す。
【図２】図１の装置の詳細を示す。
【図３】図１の装置による測定面の横断面にわたる励起光の強度分布を理論的な干渉結果として示す。
【図４】図３にしたがって実際に測定された強度分布を示す。
【図５】測定面内の図４による強度分布のうちの１つを示す。
【図６】測定面内の図４による第２の強度分布を示す。
【図７】測定面内の図４による第３の強度分布を示す。
【符号の説明】
【００３２】
１  装置
２  部分配置
３  部分配置
４  レーザ
５  ビームスプリッタ
６  偏向ミラー
７  偏向ミラー
８  偏向ミラー
９  ルーフミラー
１０  レーザービーム
１１  部分ビーム
１２  部分ビーム
１３  稜線縁部
１４  傾斜角度
１５  光学軸線
１６  圧電素子
１７  拡大鏡
１８  マイクロレンズアレイ
１９  軸線
２０  マイクロレンズ板
２１  レンズ系
２２  レンズ
２３  オイル対物レンズ
２４  試料
２５  接眼レンズ
２６  電子カメラ
２７  ミラー
２８  ミラー
２９  曲線
３０  曲線
３１  最大強度領域
３２  曲線
３３  最大強度領域
３４  曲線
【国際公開パンフレット】
2005508489.tif 000003
2005508489.tif 000004
2005508489.tif 000005
2005508489.tif 000006
2005508489.tif 000007
2005508489.tif 000008
2005508489.tif 000009
2005508489.tif 000010
2005508489.tif 000011
2005508489.tif 000012
2005508489.tif 000013
2005508489.tif 000014
2005508489.tif 000015
2005508489.tif 000016
2005508489.tif 000017
2005508489.tif 000018
2005508489.tif 000019
2005508489.tif 000020
2005508489.tif 000021
2005508489.tif 000022
2005508489.tif 000023
【国際調査報告】
2005508489.tif 000024
2005508489.tif 000025
2005508489.tif 000026
2005508489.tif 000027