(57)【要約】本発明は、移植片対腫瘍(ＧＶＴ)反応および／または移植片対宿主病(ＧＶＨＤ)をもたらす広義の同種抗原に関する新しい概念を与えるものである。これまで未解決な技術的問題である同種抗原の新しい特定方法は、免疫療法における新しい戦略も必要とする。現在、ＨＬＡ結合タンパク質の分析は、対応するアミノ酸配列が既知である同種抗原を用いて行うことができるので、本発明によって、腫瘍細胞のみを認識する高反応性(alto−reactive)Ｔ細胞を、ＧＶＨＤを媒介するＴ細胞から分離することも可能である。新しい技術によって規定される抗原は、癌および移植関連疾患の診断およびワクチン接種に特に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
コーディング一塩基多型に関係する１個または複数のアミノ酸交換に基づいて、特定の種からの抗原ペプチドまたはタンパク質の対立遺伝子変異体のエピトープを提供する方法であって、前記方法が、
(i)目的とするタンパク質もしくはペプチド、またはそのサブセットを規定するステップと、
(ii)前記種の少なくとも２個以上のＤＮＡライブラリーであるデータベースを、前記規定されたペプチドもしくはタンパク質またはそのサブセットについてスクリーニングするステップと、
(iii)コード領域に少なくとも１個の単一核多型を含むＤＮＡ配列によってコードされた対立遺伝子ペプチド／タンパク質変異体、発現産物またはその断片のアミノ酸交換を特定し選択するステップと、
(iv)前記多型を含むアミノ酸残基を含む８量体から25量体のエピトープを作製するステップと、
(v)ＭＨＣタンパク質に結合するそのようなエピトープを選択するステップとを含む方法。
【請求項２】
前記対立遺伝子変異体に関するキメラ状態が、同種移植細胞によって生成または引き起こされ、レシピエント細胞がドナーとは異なる対立遺伝子変異体を発現し提示する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗原ペプチドまたはタンパク質が疾患または障害に関係し、前記疾患または障害が同種移植を必要とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗原ペプチドまたはタンパク質が、正常組織または臓器の細胞よりも患部組織または臓器において発現される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記疾患または障害が癌であり、前記患部組織または臓器が癌性である、請求項２または４に記載の方法。
【請求項６】
レシピエントの癌細胞がドナーの同種移植細胞のそれとは異なる対立遺伝子バージョンを発現していた、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＭＨＣタンパク質がＨＬＡ分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
請求項１のステップ(iv)によって作製される前記エピトープが、９量体から16量体のペプチドである、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記エピトープが移植片対宿主病(ＧＶＨＤ)免疫応答を誘導する、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記エピトープが移植片対腫瘍(ＧＶＴ)免疫応答を誘導する、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
目的とする前記タンパク質またはポリペプチドが、表１〜６に記載の抗原から選択される、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
(i)特定の種の個体から得られる抗原ペプチドまたはタンパク質の対立遺伝子変異体に由来し、(ii)コード領域に少なくとも１個の一塩基多型(ＳＮＰ)を含むＤＮＡ配列によってコードされ、(iii)ＭＨＣタンパク質複合体に結合して免疫原性応答を誘導し、(iv)ＧＶＨＤを誘発する配列とは同一でない
配列を含む合成ペプチドまたはポリペプチド。
【請求項１３】
前記ＧＶＨＤ配列が、表１〜６に記載の配列またはその一部である、請求項１２に記載の合成ペプチドまたはポリペプチド。
【請求項１４】
前記ペプチドまたはポリペプチドがＧＶＴ活性を誘導する、請求項１２または１３に記載の合成抗原ペプチドまたはポリペプチド。
【請求項１５】
前記ＧＶＴ活性が癌関連対立遺伝子変異体によって誘導される、請求項１４に記載の合成ペプチドまたはポリペプチド。
【請求項１６】
ＳＮＰによってコードされる前記抗原が癌細胞によって提示された、請求項１２から１５のいずれかに記載の合成ペプチドまたはポリペプチド。
【請求項１７】
医薬品としての請求項１２から１６のいずれかに記載の合成ペプチドまたはポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１または２に記載の方法によって得られる、請求項１２から１７のいずれかに記載の合成ペプチドまたはポリペプチド。
【請求項１９】
ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質、または異なるそのような分子の混合物を発現する細胞であって、請求項１２から１８に記載の合成ペプチドのいずれかの配列を含む細胞。
【請求項２０】
前記細胞が、前記アミノ酸交換を含むペプチドに結合するＭＨＣ分子を発現する、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２１】
前記細胞が増殖性ではない、請求項１９または２０に記載の細胞。
【請求項２２】
請求項１２から１８のいずれかに定義される抗原ペプチドもしくはポリペプチド、または様々なペプチドもしくはポリペプチドの混合物、あるいは、請求項１９から２１のいずれかに定義される細胞を含み、薬学的に有効な担体、希釈剤または賦形剤を含んでいてもよい医薬組成物。
【請求項２３】
さらにアジュバントを含む、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
ワクチンを製造するための、請求項１２から２３のいずれかに記載のペプチド／ポリペプチド、細胞または医薬組成物の使用。
【請求項２５】
前記ワクチンが、疾患関連細胞によって提示されるＳＮＰコードペプチドを含む抗原を対象とする、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
前記疾患関連細胞が癌細胞である、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
個体におけるＳＮＰ関連障害または疾患を治療する方法であって、請求項１２から１８のいずれかに記載の抗原ペプチドもしくはポリペプチド、および／または前記ペプチドもしくはポリペプチドをコードする核酸分子を前記個体に投与するステップを含み、前記ペプチド／ポリペプチドもしくは核酸がＨＬＡ分子による提示を選択的に高める方法。
【請求項２８】
前記個体から得られる複数のタンパク質に、請求項１に記載の方法を適用することによって、所与の種から１つまたは複数の個体のＳＮＰプロファイルを作成する方法。
【請求項２９】
前記ＳＮＰプロファイルが疾患に関係した、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記疾患が癌である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
請求項２８に記載の方法によって得られるＳＮＰ関連多型プロファイルを作成することによって、個体における疾患を診断する方法。
【請求項３２】
第１の個体から得られる特定のタンパク質の異なる対立遺伝子変異体を、同じ種の第２の個体から得られるそれと比較して特定し選択するex vivoの方法であって、前記差が前記個体の１つの特定の病状または疾患に演繹され、前記方法が以下のステップ、すなわち、
(i)第１の個体および第２の個体の選択された組織または臓器の試料を採取するステップと、
(ii)ＨＬＡタンパク質に結合し、単一ＳＮＰによってコードされる前記タンパク質の対立遺伝子変異体、またはその発現産物、またはこの発現産物の断片の少なくとも１個の単一アミノ酸不一致の各試料をスクリーニングするステップと、
(iii)前記個体の１つにおいてのみ発生するこのような不適合を選択するステップとを含む方法。
【請求項３３】
前記試料が患部組織に由来し、前記アミノ酸不一致が病気の個体において発生する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記単一アミノ酸不一致を示すペプチドまたはポリペプチドが、患者の抗原提示細胞またはＨＬＡタンパク質にのみ結合する、あるいは患者の抗原提示細胞またはＨＬＡタンパク質に好んで結合する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ペプチドまたはポリペプチドが細胞障害性Ｔリンパ球(ＣＴＬ)によって認識される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ペプチドが、請求項１２から１８のいずれかに定義されるペプチドまたはポリペプチドである、請求項３２または３５に記載の方法。
【請求項３７】
請求項３２から３６のいずれかに記載の方法を含む、ドナーからレシピエントへ造血幹細胞を移植する方法。
【請求項３８】
請求項３７に記載の方法を含む、造血幹細胞移植によって癌を治療する方法。
【請求項３９】
前記癌が白血病である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
請求項３７から３９のいずれかに記載の治療方法によって治療された疾患の進行、軽減または発症を判定するex vivoの方法であって、
(i)同種移植前および／または後に患者から試料を採取するステップと、(ii)(a)請求項３２に記載の方法によって得られる単一アミノ酸不一致を示すタンパク質、ポリペプチドまたはペプチド、(b)前記タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに選択的に結合する抗体、および(c)ＨＬＡ分子複合体に結合した前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を特異的に認識する細胞溶解性Ｔ細胞、からなる群から選択される様々なパラメータについて前記試料をモニタリングするステップと、
を含む方法。
【請求項４１】
第１および第２のパッケージを含むＳＮＰに関係する単一アミノ酸不一致対立遺伝子変異体の発現の存在を検出するのに適切なキットであって、各パッケージが前記アミノ酸不一致変異体をコードするヌクレオチド配列の断片である12〜32ヌクレオチドの単離核酸配列または合成核酸配列、およびコヌクレオチド補体(conucleotide complement)を含み、第１のパッケージの断片が第２のパッケージの断片と重複しないキット。
【請求項４２】
個体に投与されると、ＨＬＡ分子とヒト癌同種抗原であるアミノ酸不一致対立遺伝子タンパク質変異体とによって形成される複合体の存在を選択的に増加させる薬剤。
【請求項４３】
前記アミノ酸不一致対立遺伝子タンパク質変異体が、請求項１２から１８のいずれかに記載のペプチド配列またはエピトープを含む、請求項４２に記載の薬剤。
【請求項４４】
単一アミノ酸不一致対立遺伝子変異体であるペプチドと組換えＨＬＡ分子が複合化して、同種抗原ＨＬＡ複合体を形成している宿主細胞において前記薬剤が発現される、請求項４２または４３に記載の薬剤。
【請求項４５】
請求項４２から４４のいずれかに記載の薬剤と、薬学的に有効な担体、賦形剤または希釈剤とを含む医薬組成物。
【請求項４６】
請求項４２または４３に記載の薬剤を個体に投与することによって、ＨＬＡ分子とヒト癌同種抗原であるアミノ酸不一致対立遺伝子タンパク質変異体とによって形成される複合体の存在を選択的に増加させるex vivoの方法であって、単一アミノ酸不一致抗原に特異的な細胞溶解性Ｔ細胞が同種抗原／ＨＬＡ複合体への曝露によって増幅され活性化される方法。
【請求項４７】
単一アミノ酸不一致抗原に特異的な細胞溶解性Ｔ細胞が、同種抗原／ＨＬＡ複合体への曝露によって除去または不活性化される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
(i)ＨＬＡ分子と、(ii)そのＨＬＡ分子に結合して同種抗原／ＨＬＡ複合体を形成する単一アミノ酸不一致対立遺伝子変異体であるペプチドと、の複合体に選択的に結合する単離抗体であって、複合化されていないまたは結合していない形では(i)または(ii)には結合しない単離抗体。
【請求項４９】
前記抗体がモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または機能的に有効なその断片である、請求項４８に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の概要
本発明は、移植片対腫瘍(ＧＶＴ)反応および／または移植片対宿主病(ＧＶＨＤ)をもたらす広義の同種抗原に関する新しい概念を与えるものである。これまで未解決な技術的問題である同種抗原の新しい特定方法は、免疫療法における新しい戦略も必要とする。
【０００２】
現在、ＨＬＡ結合タンパク質の分析は、対応するアミノ酸配列が既知である同種抗原を用いて行うことができるので、本発明によって、腫瘍細胞のみを認識する反応性−反応性Ｔ細胞(reactive−reactive T cells)を、ＧＶＨＤを媒介するＴ細胞から分離することも可能である。新しい技術によって規定される抗原は、癌および移植関連疾患の診断およびワクチン接種に特に有用である。
【０００３】
発明の背景
大部分の腫瘍が、免疫応答の潜在的標的とみなすことができる、場合によっては変化した自己タンパク質を多量に発現することが当分野で知られている。また、免疫系細胞(cellular arm of the immune system)(Ｔリンパ球)は実験モデルおよびヒト対象中の癌細胞を認識可能であるが、それにもかかわらず腫瘍は次第に成長することが判明している。
【０００４】
このパラドックスを説明する１つの仮説は、腫瘍を有する宿主において、Ｔリンパ球が適切に機能していないというものである。別の仮説は、腫瘍が抗原提示機構をダウンレギュレートすることができ、したがって、Ｔリンパ球に認識されなくなるというものである。したがって、過剰発現されたタンパク質、または変化したタンパク質が、腫瘍反応性細胞障害性Ｔリンパ球(ＣＴＬ)を刺激し、腫瘍成長の免疫監視機構の一助となり得るかどうかは依然として不明である。また、腫瘍タンパク質のほとんどは、広範に発現されるタンパク質であり、自己Ｔ細胞レパートリーから特異的ＣＴＬを削除するのを媒介している可能性が高い。自己反応性Ｔ細胞は、通常、抗原によって誘導されるアポトーシスまたはネガティブ選択によって、成長の未成熟段階で消滅する。抗原に加えて、ネガティブ選択は、(ＡＰＣ)に由来する異なるセットの共刺激シグナルによって調整することができ(MacKinnon等、Br.J.Haematol.2000、110：12〜17)、自己抗原に対して耐性を有する免疫系が形成される。これらの好ましくない知見にもかかわらず、腫瘍ワクチン接種が有効であり、現在の治療手法の欠点を克服する治療を可能にするという興味や期待は計り知れない。
【０００５】
放射線療法および骨髄移植(ＢＭＴ)と併用される化学療法は、一部の代謝疾患および造血性疾患に対して過去20〜30年にわたって研究され、高用量の化学療法および照射を用いて白血病細胞を根絶しても、ほんの部分的な治療効果しか得られないことが判明した。多数の臨床観察によって、さらに、(ドナーＴ細胞)免疫応答が、残余の癌細胞の除去、特にＢＭＴを主体とする療法のその後の長期の成功に実質的に寄与しているという信じられない(over-convincing)証拠が提供されている。遡及的には、ＢＭＴにおける標準的な治療戦略は、さらに極めて高用量の化学療法および放射線療法の潜在的抗癌能力を過大評価し、ＢＭＴによって誘導される同種のドナーリンパ球によって媒介される免疫療法の効力を過小評価したものであった。
【０００６】
同種骨髄移植(同種ＢＭＴ)による、造血性障害(白血病)の治療後に見られる臨床成果は、治療免疫療法の基本を大いに実行したものである。
【０００７】
同種という用語は、ドナーとレシピエントが異なる個体である状況を記述するのに使用され、ドナーとレシピエントが一卵生双生児であって、それらの遺伝子構成が同じために同一の組織タイプを有する同系という用語と対比される。自家移植片は個体から取り出され、プロセスの後半に彼女または彼の自己細胞が戻される。しかし、これは、厳密に言うと、免疫性の移植障害が存在しないので移植ではない。
【０００８】
同種ドナーには２種類のタイプがある。すなわち、血縁のある、通常は同胞ドナーと、血縁のない、通常は極めて大きなボランティアプールから見つけ出され患者と同じ組織タイプに合致したドナーである。
【０００９】
同種移植は、血縁ドナーからの移植であろうと非血縁ドナーからの移植であろうと、レシピエントによって提供された幹細胞の免疫拒絶(宿主対移植片効果)およびレシピエントの組織に対するドナーの免疫細胞による免疫反応(移植片対宿主病)の恐れがある点で、同系移植とも自家移植とも異なる。
【００１０】
免疫拒絶は、通常、移植前のレシピエントの免疫系を抑制する集中治療(コンディショニング)によって防止される。コンディショニングの方式は、移植センターおよび関係する悪性腫瘍によって変わる。例えば、白血病の治療では、患者に、高用量のシクロホスファミドと放射線全身照射の併用を含む骨髄破壊的コンディショニングをＢＭＴ前に実施する。移植後には、急性発作および患者組織の損傷(injure)を防止するために、メトトレキセート、グルココルチコイドホルモン(ステロイド)、シクロスポリンまたはそのマイクロエマルジョン(ネオーラル(登録商標))、タクロリムス(プログラフ(登録商標))およびミコフェノール酸モフェチル(セルセプト(登録商標))を含めた免疫抑制薬物を限られた期間投与して免疫反応を抑える。制御された免疫抑制に加えて、支持療法を改善することによって、コンディショニングの毒性およびＢＭＴ後の免疫反応が実質的に低下した。しかし、重度の合併症が中咽頭、消化管、肝臓、肺、皮膚、腎臓、尿路および神経系において依然として発生しており、したがって、同種ＢＭＴは、医学的に適合した若年患者に限られる。
【００１１】
当分野では、血液の癌は、高用量の化学療法−照射コンディショニングのみでは必ずしも根絶できず、同種ＢＭＴも必要であることが一般に認められている。したがって、従来の同種ＢＭＴ主体の療法は、多くのヒト血液悪性腫瘍の標準的治療プロトコルとなっており、あらゆる免疫療法の基本となり、「治癒」の可能性を提供している。
【００１２】
同種ＢＭＴのドナーは、その主要組織適合複合体(ＭＨＣ)分子、すなわちヒト白血球抗原(ＨＬＡ)の発現に従って選択される。ＨＬＡのタイプは遺伝的に決まっている。したがって、個体のＨＬＡタイプは、その両親からの遺伝である。移植において特に重要と考えられるクラスターには、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−ＤＲの３種類の主要な遺伝子がある。各個体は、ＨＬＡクラスター中の遺伝子の各々の２個のコピーを持っている。また、多数の対立遺伝子バージョンが、ＨＬＡ遺伝子の各々に対応する。
【００１３】
理想的な６対６の一致を得るためには、２人が、その２個のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−ＤＲ遺伝子の各々において同じ対立遺伝子を持たねばならず、親と子供のＨＬＡが一致する確率は1/200である。
【００１４】
ＨＬＡの一致した血縁がおらず、検索を実行する時間があるときには、非血縁ドナーが通常考慮される。任意の２人の非血縁個体が６個のＨＬＡ遺伝子すべてについて一致する確率は100万分の１である。ＨＬＡシステムの多型、民族的背景、および診断年齢の中央値から、ＨＬＡ適合血縁ドナーからの移植は、現在、新たに診断された患者の15〜60％で可能である。別のドナーには、不適合度の小さい血縁、ＨＬＡ適合非血縁ボランティアなどがある。適合または一部不適合な適切な非血縁ドナーが見出される確率は、今や世界中で470万人を超えるドナーを含む登録者ネットワークが拡大し、さらに胎児臍帯血などの他のソースを利用することによって増大した。
【００１５】
骨髄移植は、骨髄、血液または胎児臍帯血から得ることができる造血幹細胞から主としてなる。造血幹細胞は、通常、骨髄から吸引される。別の手順は、顆粒球コロニー刺激因子(Ｇ−ＣＳＦ)を用いてドナーを３〜５日間治療して、幹細胞および前駆細胞を髄から血液に移すものである。次いで、適切な細胞を白血球除去輸血によってドナーから採取する。
【００１６】
新生児の胎盤および臍帯に含まれる血液は、新しい幹細胞源として登場した。臍帯血は、多数の幹細胞を含み、一部の患者ではＢＭＴまたは成人の血液幹細胞移植よりも有利であり、適合する非血縁骨髄幹細胞ドナーが見つからない場合に考慮することができる。臍帯血を利用する利点の１つは、レシピエントとの組織適合が完全である必要がないことである。
【００１７】
上述したようにあらかじめコンディショニングされた患者に、幹細胞試料を移植する。移植後２〜５週間で、提供された細胞の移植は、患者の血液中に正常な白血球が出現することによって明白になる。移植した幹細胞によって骨髄機能が回復するまで、赤血球および血小板を定期的に注入する。造血性が回復するまでの時間は、血液幹細胞を用いた方が骨髄細胞を用いた場合よりも短い。新しいキメラ免疫細胞の一部は、宿主を異物と認識し、移植片対白血病効果を引き起こす。以後、これを移植片対腫瘍(ＧＶＴ)活性と称する。これは、通常、移植片対宿主病(ＧＶＨＤ)を伴う。ＧＶＨＤ反応は、ドナーの免疫細胞、特にＴリンパ球が、宿主細胞が自己とは異なることを認識したときに生じる。
【００１８】
同種ＢＭＴによって引き起こされるＧＶＨＤは、ＧＶＴと密接に関係する免疫機能であり、移植細胞がレシピエント中に出現し始めるとすぐに起こり得る。両方のタイプの免疫応答は、遺伝的に同一でない細胞を認識するＴ細胞によって媒介される。これは、慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)の治療において、一卵生双生児間の移植が、適合同胞間の移植よりも成功しないことが多いという歴史的発見を説明することができるものである(Gale等、Ann.Intern.Med.1994、120：646〜652)。幹細胞移植の場合、ドナー細胞はレシピエントの組織の細胞に違いがないかどうか注意深く検査し、重大な変化を見つけるとその細胞を攻撃する。移植後の初期段階では、例えば、患者由来の残留ＡＰＣが存在し、多型遺伝子に基づく違いがないかどうかドナー由来のＴ細胞によって調べられる。提供されたＴ細胞が、異質な抗原を提示する宿主細胞(基本的にはすべての免疫細胞)を認識すると、細胞障害性応答が惹起される。Ｔ細胞応答が、恐るべきＧＶＨＤまたは有益なＧＶＴのどちらになるかは、遺伝的に顕在化した差が、癌組織または癌臓器に属する細胞中に存在するか、あるいはより悪いことに、皮膚、関節、肺、肝臓、腎臓などの本質的に疾患のない臓器の一部であるかによって決まる。罹患した臓器の重要性に応じて、ＧＶＨＤは、単なる小さな発疹から、生命にかかわる病気まで重篤度が変わる。一般に、同種ＢＭＴはやや粗雑な手法であり、移植に関係した罹患率および死亡率が高い。最近報告された集計によれば、死亡危険率は20〜41％であり、強力な免疫抑制薬が利用可能であるにもかかわらず、治療患者の最高70％が依然としてＧＶＨＤに罹っている。したがって、疾患促進プロセスの原因である同種抗原の広範な特定、ならびに闘病(disease-fighting option)に有用な同種抗原を規定することは本発明の中心的な態様である。
【００１９】
それでも、ＢＭＴに基づく免疫療法によって、最高70％の患者は移植後に白血病に罹らず生存している(Clift等、Haematol.1997、10：319〜336)。しかし、60％を超えるＣＭＬ患者は、疾患の状態、高齢、または適切なドナーの欠如のために同種ＢＭＴを受けていない。
【００２０】
ＢＭＴおよび／または幹細胞移植は、第一完全寛解またはその後における急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)、ＡＭＬ早期再発または寛解導入不能、第一完全寛解またはその後における急性リンパ性白血病(ＡＬＬ)、早期再発または寛解導入不能なＡＬＬ、ＣＭＬ、脊髄形成異常、再生不良性貧血、ホジキン病感受性再発および抵抗性再発、活動的なリンパ腫感受性再発および抵抗性再発、ならびに軽度のリンパ腫に対する容認された治療選択肢である。
【００２１】
移植片対宿主反応は、ドナーの免疫細胞、特にＴリンパ球が、宿主細胞が自己と異なることを感知したときに生じる。この相違には、ＨＬＡタイピングでは検出されない多種多様なタンパク質が関与することもあり、あるいはこの反応を生じずには移植できないＨＬＡタイプのわずかな相違であることもある。この相違は、ＨＬＡタイピングおよび適合に使用されるコドン以外の対応するＨＬＡ分子の個々のコドンにおける多型がより限定されていることを反映している。一卵生双生児を除いて、移植が成功する十分な類似度をＨＬＡ試験が示していてさえも、ある種の不適合が存在することが知られている。ＨＬＡタイピング方法は、経験的に重要であるとスクリーニングされた多型を網羅しているに過ぎない。ＨＬＡ配列決定からより多くの情報が入手されるようになり、新しい対立遺伝子変異体が続けて発見されており、その一部は異物と認識され得る。ドナーとレシピエントの性が異なるときにも変化が歴然となる。要約すると、ＧＶＨＤなどの免疫反応の重篤度は、患者の細胞によって提示される、患者とドナー間の分子的に規定されたタンパク質の相違のタイプおよび程度によって決まる。
【００２２】
ＧＶＴ活性は、ＣＭＬ患者において最も研究されており、ドナー免疫細胞(ＣＴＬ)による残留腫瘍細胞の認識と根絶が、長期にわたる分子寛解をもたらすのに必須であると考えられる。ＣＭＬにおける免疫調節機序に対するさらなる見識は、移植片のＴ細胞枯渇後に再発のリスクが高くなるという観察から得られている。再発のリスクは、ＧＶＨＤの非存在下でも高くなる(Goldman等、Ann.Intern.Med.1988、108：806〜814；Horowitz等、Blood 1990、75：555〜562)。さらに、同系双生児のＢＭＴは、適合した同胞のＢＭＴよりも有効性がはるかに低い。総合すると、これらの知見は、腫瘍細胞のＴ細胞認識が治療効果に必須であることを示している。
【００２３】
見かけ上成功した移植後に疾患が再発するときには、完全寛解を、免疫抑制薬の中止、あるいはより強力には、追加のドナーＴリンパ球注入によって達成することができる。したがって、同種ＢＭＴに関係するＧＶＴ効果は、免疫系がヒトの癌を治癒させることができる最も決定的な証拠であり、強力な抗白血病効果がレシピエントに導入された細胞障害性Ｔ細胞によってもたらされることを重要視しなければならない。
【００２４】
ドナーＴリンパ球は、再発性の白血病細胞をＧＶＴ効果によって破壊し、おそらく、同種移植におけるＣＤ４+とＣＤ８+の両方の亜集団のＴ細胞が、この現象の一因となっている。ＣＤ４+Ｔ細胞は、抗体性免疫応答または細胞性免疫応答に対するヘルパー機能を有することが多く、ＭＨＣクラスII拘束性である。ＣＤ８+Ｔ細胞は、細胞障害性機能を有することが多く、通常はＭＨＣクラスＩ拘束性である。関連する抗原(腫瘍によって発現される抗原、レシピエントの組織適合性抗原、またはその両方)はまだ特定されておらず、関与する抗原を特定し規定することが本発明の目的である。
【００２５】
Ｔ細胞を枯渇させる移植が、ＣＭＬの再発のリスクを伴うことは注目される(Goldman等、Ann.Intern.Med.1988、108：806〜814；Horowitz等、Blood、1990,75：555〜562)。上述したように、抗白血病効果は、ドナーリンパ球注入(ＤＬＩ)を実施したときに、同種ＢＭＴによって得ることができる。この状況において、ＤＬＩは、永続性のある分子的寛解を最高70％の症例で回復させることができる。しかし、ＤＬＩは、移植片対宿主反応に起因するかなりの毒性を伴うことがある。移植片対宿主反応は、移植片対白血病効果を伴うことが多く、骨髄形成不全および／または全身的なＧＶＨＤによる死亡率は症例の50〜90％にのぼる(S.MacKinnon、Br.J.Haematol.2000,110：12〜17)。
【００２６】
「在来の」同種ＢＭＴプロトコルの毒性に関係する欠点を克服するために、ミコフェノール酸モフェチル(セルセプト(登録商標))およびシクロスポリンと最小限に毒性を抑えた低用量全身照射との併用による免疫抑制を含むコンディショニングモデルが示された。しかし、コンディショニングが厳密さに欠けたため、顕しい移植片対宿主反応が観察された。注入前に移植片からＴ細胞を枯渇させることによって、この状況においてＧＶＨＤを防止することができる。改変されたタイプの移植手順は、「ミニ移植」と呼ばれることもあり、現在、これらの観察結果に基づいて開発されている。移植片拒絶の危険および高い再発率は、ほんの一部のＴ細胞を移植片に残すことによって回避することができる。末梢血液試料由来のＣＤ34+細胞のポジティブ選択によって、Ｔ細胞が約1000分の１になる。芽細胞(committed stem cell)と多能性幹細胞を含むこれらの精製されたＣＤ34+細胞は同種移植に適している。ＣＭＬにおいては、漸増用量のＴ細胞を投与して、ＧＶＨＤ問題をある程度回避し(MacKinnon等、Blood、1995、86：1261〜1268)、同時にＧＶＴ効果を増強させている。
【００２７】
要約すると、将来の同種移植手法は、Ｔ細胞枯渇ミニ移植と、移植後の適度の免疫抑制とを併用して、移植片拒絶およびＧＶＨＤを制御するものを含むであろう。これは、同種移植の急性毒性を劇的に低下させ、したがって、同種ＢＭＴを、これまで不適当であった患者、主として外来患者に実施できると期待される。この将来の開発は、様々なヒト悪性腫瘍の治療に対する同種免疫療法に基づく戦略を容易にすると期待される。
【００２８】
自己と非自己の免疫識別に関係する研究活動の大部分は、多型性の高いＭＨＣ分子、特にヒトＨＬＡ分子およびマウスＨ−２抗原に焦点が絞られている。しかし、ＢＭＴのほとんどの症例において、ドナーは、ＨＬＡタイプがレシピエントのＨＬＡにほぼまたは完全に適合しているという基準によって選択されていることに留意しなければならない。ＨＬＡ適合ドナーにおいては、ＧＶＨＤおよびＧＶＴの原因は、ＨＬＡとは異なる多型分子に関係すると推定されている。したがって、ＢＭＴにおけるＧＶＨＤおよびＧＶＴ免疫応答の分子的原因を解明しようとする最近の研究は、特異的Ｔリンパ球による反応を利用するものであり、ＣＴＬは、レシピエントのＨＬＡクラスＩによって提示される抗原由来のペプチドを認識する。これらのＴ細胞は単離され、同種抗原を特定するのに使用される。ドナーとレシピエントのＨＬＡ以外の多型抗原の相違が、Ｔリンパ球によるＧＶＴおよびＧＶＨＤの発症に関連していると考えられることが判明した。したがって、ＧＶＨＤおよびＧＶＴ免疫応答を理解する鍵は、どの抗原が関与しているかを理解することである。同種免疫応答の分野における研究は、前述した側面を考慮して、他の重要な分子、いわゆる「副」組織適合抗原(ｍＨＡｇ)を特定する方向に向かっている。これらの極めて多様なタンパク質が多数あることが、抗原の複雑で多様な生物学的機能と組み合わさって、これまで完全な特徴づけの試みを頓挫させている。
【００２９】
定義によれば、ｍＨＡｇは、免疫応答を誘発させることができ(Lewalle等、Br.J.Haematol.1996、92：587〜594)、特異的ＨＬＡ分子に結合したペプチドとしてＴ細胞免疫系に対して提示される。したがって、Ｔ細胞のみがそれらを容易に認識することができ、ｍＨＡｇは、白血病および同種ＢＭＴ後の自己抗原に対するＣＴＬ反応性を誘導する重要な役割を果たしていると推測されている。残念ながら、これまでに特定された数少ないｍＨＡｇのほとんどは、白血病特異的ではなく、正常組織によっても同様に発現される。既知のｍＨＡｇが関連する組織発現は、利用可能な試薬がないために明らかになっていない。しかし、ＣＴＬを用いた機能分析によれば、多くのｍＨＡｇが組織限定的分布を有し、したがって、ある種の組織にのみ拒絶のリスクがあり得る。また、ＢＭＴにおいては、ｍＨＡｇによって誘導されるＧＶＨＤの臨床像は、全身性エリテマトーデス、強皮症などのいくつかの自己免疫疾患に類似しており、慢性ＧＶＨＤの症状が自己免疫様であることを示唆しているという所見は興味深い。
【００３０】
定義によれば、ｍＨＡｇは、ヒト６番染色体のＨＬＡ領域以外でコードされるが、それにもかかわらず顕著な免疫応答を誘発することができる。ＧＶＨＤの機序がまだ完全には解明されていないにもかかわらず、患者のｍＨＡｇに特異的なドナー由来のＣＴＬが、Ｔリンパ球による(皮膚、腸、肝臓、肺および関節を含めて)主要な標的臓器に対する細胞障害性反応と、その結果出現する、重度の症例においては致命的になり得るＧＶＨＤにおいて重要な役割を果たしていることは良く知られている。ＧＶＨＤの機序は相当に調査されているものの、ＧＶＴの誘導におけるｍＨＡｇの役割はさほど明確になっていない。これは、完全なｍＨＡｇスペクトルのうちごく少数の抗原しか特定され分析されておらず、現在利用可能な技術が、抗原を包括的に認識する有効な方法を欠いているためと考えられる。数値。一方、抗原は、治癒効果または有害作用を媒介する原因になるＣＴＬクローンを単離しその特徴を明らかにするために必須である。したがって、治療上のＢＭＴ手法は、関与する免疫応答の特異性に関して経験則のままである。患者および移植者(transplanteur)は、通常、上述したように大多数の患者に極めて良好に働く治療結果にもっぱら注目する。
【００３１】
ヒトにおいては、特定が厄介ではあるが、ＧＶＨＤの誘導に関係するｍＨＡｇが示唆されている。しかし、それらの総数および複雑さは依然として不明である。マウスにおいて実施された遺伝子実験によって多数のｍＨＡｇが示されたが、ほんの数個の遺伝子しか特定されていない。ヒトにおいては、特定のｍＨＡｇと反応性があるＴリンパ球クローンが、遺伝子連鎖解析と組み合わせて、単一の患者における２個の異なる遺伝子座を特定するために利用された。各遺伝子座は、ＨＬＡ−Ｂ７によってＴ細胞クローンに対して提示される抗原をコードしている。この技術は、Ｔ細胞応答をin vivoで誘発可能なヒトのｍＨＡｇの数を大雑把に数えるために提案された。これらのＴ細胞応答が臨床のＧＶＨＤと相関するかはまだ不明である(Gubarev等、Exp.Hematol.1998、10：976〜81)。
【００３２】
どのような特性がタンパク質をヒトｍＨＡｇとして適格なものにするのかより完全な像を描くために、ヒト系から入手可能な情報を、これまでにさらにｍＨＡｇが特定されているマウス系から収集されたデータで補完することは役に立つ。これらのタンパク質のヒト相同体は、ヒトの同種反応性ＣＴＬによって認識されることが判明し、マウスでも同様であった。したがって、例えば、ＧＶＨＤ患者に由来する単離ＣＴＬクローンを用いて、より多くのｍＨＡｇ(表１ＡおよびＢ)が応答標的として特定された。このクローンの助けを借りて、対応するｍＨＡｇに由来するペプチド成分(ＨＬＡ結合ペプチド)およびその認識に関与する特異的Ｔ細胞クローンを分析することが可能になった。
【００３３】
ヒトの皮膚外植モデルは、急性ＧＶＨＤの正確な指標として提案された手法であって、ｍＨＡｇのさらなる相違を検出するのに有用となり得る手法である。このモデルは、77％の症例でＧＶＨＤの結果を予測するのに使用された。宿主反応性Ｔヘルパー細胞、ＣＴＬ前駆体頻度分析などの他の分析も、ＨＬＡが同一である同胞ＢＭＴ後の急性ＧＶＨＤの発生を予測するのに役立った(Dickinson、Transplantation、1998、66：857〜63)。
【００３４】
Ｔ細胞受容体アルファ鎖可変領域レパートリーおよびＴ細胞受容体ベータ鎖可変領域レパートリーの分析によって、Ｔ細胞受容体がＢＭＴ後初期(６〜７週)において誤用されたことが明らかになり、Ｔ細胞が、ｍＨＡｇなどの同種抗原に応じて拡大し、変化したレパートリーが、子供において胸腺依存経路を介したＴ細胞の再生によって最終的に常態に戻ることが示唆された(Matsutani等、Br.J.Haematol、2000、109：759〜769)。
【００３５】
最も初期に特定されたｍＨＡｇの１つは、ＳＭＣＹ遺伝子によってコードされ、精子形成において役割を果たし得るＨ−Ｙ抗原であった(Meadows等、Immunity、1997、６：273〜281；Wang等、Science、1995、269：1588〜1590)。Ｈ−Ｙ抗原は、女性レシピエントによるＨＬＡが適合した男性の臓器および骨髄移植片の拒絶をもたらし、女性から男性への移植において、特に、女性ドナーが過去に妊娠したことがある場合にＧＶＨＤを高度に発症することがある。一方、ＤＦＦＲＹ(Vogt等、Blood、2000、95：1100〜1105)およびＵＴＹ遺伝子が別のＨ−Ｙ抗原源として特定された(国際公開第97/05168号、国際公開第0077046号)。
【００３６】
ＧＶＨＤを誘発させる別の抗原、すなわち、ＨＡ−１、ＨＡ−２、Ｈ−４、Ｈ−５およびＨ−８タンパク質ファミリーが、重度のＧＶＨＤレシピエントにおける遡及研究によって特定された(Mutis等、Nat.Med.1999、5：839〜842)。
【００３７】
ＨＡ−１抗原は、ＨＬＡ−Ａ＊0201拘束性ＣＴＬを利用して特定され、ＫＩＡＡ０２２３遺伝子の対立遺伝子に由来するノナペプチドとして化学的に特徴づけられた。ｃＤＮＡレベルでは、ＨＡ−１遺伝子座は、２個のヌクレオチドが異なる２個の対立遺伝子ＨＡ−１ＨとＨＡ−１Ｒを有し、その結果単一のアミノ酸が置換される(den Haan等、Science、1998、279：1054〜1057；Arostequi等、Tissue Antigens、2000、56：69〜76)。ＨＡ−１ペプチド配列をコードするコスミドＤＮＡを単離し配列を決定することによって、ＨＡ−１対立遺伝子が、２個のエキソンによってコードされ、両方のセットがイントロン配列を含むことが判明した。対立遺伝子特異的プライマーと共通プライマーからなる２個の異なるプライマーセットを用いたゲノムＤＮＡタイピングによって、ＣＴＬおよびＲＴ−ＰＣＲによるｍＨＡｇ分類とすべての場合で相関する24個のＨＬＡ−Ａ＊0201陽性個体からなる３つのファミリーが明らかになった。将来的には、ＨＡ−１対立遺伝子に対する前向きなゲノムタイピングは、ドナーの選択を改善し、ＨＡ−１誘導ＧＶＨＤのリスクが高いＨＬＡ−Ａ＊0201陽性レシピエントを特定するのに役立ち得る(Wilke等、Tissue-Antigens、1998、52：312〜317；国際公開第9905313号)。ヒトＨＡ−２抗原は、クラスＩミオシン由来の９量体ＨＬＡ結合ペプチドである(Goulmy等、米国特許第5770201号)。
【００３８】
ｍＨＡｇのＨＡ−１およびＨＡ−２の発現は、白血病細胞および白血病細胞前駆体を含めて、主に造血性組織に限られていることが指摘された(Mutis等、Blood、1999、93、2336〜2341)。これらは、繊維芽細胞、ケラチノサイトまたは肝臓細胞では発現されない。これは、ｍＨＡｇのＨＡ−１およびＨＡ−２に特異的なＣＴＬが、ドナー由来の造血性細胞のＨＬＡ−Ａ＊0201拘束性死滅(restricted killing)を媒介する理由を説明し得るものである。
【００３９】
ＨＢ−１は、ＨＬＡ適合ＢＭＴによる治療を受けたＢ細胞ＡＬＬ(Ｂ−ＡＬＬ)患者において、ドナー由来のＣＴＬ反応性を誘導する別のｍＨＡｇとして記述された。ＨＢ−１遺伝子によってコードされるペプチドＥＥＫＲＧＳＬＨＶＷは、ＨＬＡ−Ｂ４４に関連するＣＴＬによって認識された(Dolstra等、J.Exp.Med.1999、189：301〜308)。さらに詳細な分析によって、ＨＢ−１遺伝子の多型が、このペプチドの８位においてＨｉｓからＴｙｒへの単一アミノ酸交換を起こすことが判明した。このアミノ酸置換は、ＨＢ−１特異的ＣＴＬによる認識にとって重大な意味を持つ。Ｂ−ＡＬＬ細胞による多型ＨＢ−１抗原の限定的な発現、およびペプチドを含む樹状細胞を用いたＨＢ−１特異的ＣＴＬのin vitroでの産生能力によって、ＧＶＨＤを惹起するリスクなしにＢ−ＡＬＬ細胞に免疫系を特異的に標的とする機会をもたらすことが提案された。
【００４０】
ＧＶＨＤと相関する別の抗原はＣＤ31である。様々なＣＤ31 ｃＤＮＡの配列を直接決定することによって、タンパク質の125位における単一アミノ酸変化が存在することが判明した。これら２個の対立遺伝子のほかに多型は見られなかった(Behar等、N.Engl.J.Med.1996、334：286〜291)。対応するＨＬＡ提示エピトープは、ＣＴＬによって認識される単一アミノ酸変化と良好な相関を示した。
【００４１】
ＨＡ−１、ＨＡ−２および他のｍＨＡｇに関する上述の知見は、特異的Ｔ細胞が選択的に腫瘍細胞をin vivoで攻撃し、造血幹細胞と繊維芽細胞によって発現されるｍＨＡｇを識別でき、前者のみを死滅させることができることを示唆している。in vitroで「白血病反応性」にされたドナーＴ細胞を用いて治療を受けた患者において完全寛解を誘導できることは興味深い(Falkenburg等、Blood、1999、94：1201〜1208)。しかし、ＧＶＨＤ誘導抗原とＧＶＴ誘導抗原を識別する分子的根拠は依然として未知であり、現在、ｍＨＡｇ由来のＨＬＡ結合ペプチドを特定し、それらを生化学構造が既知であるタンパク質と相関させる直接的な手法はない。また、ｍＨＡｇと考えられるタンパク質の機能または数についてはほとんどわかっていない。ｍＨＡｇ遺伝子変異の頻度およびマウス系統間の異なるｍＨＡｇの数を調べることによって、ｍＨＡｇの総数が430〜720遺伝子と推定された。しかし、これらの試験のいくつかは、皮膚樹状細胞によってｍＨＡｇペプチドが提示されるために極めて感受性の高い皮膚移植片拒絶モデルを用いて実施されたことに留意されたい。造血系などの他の臓器に由来する樹状細胞は、抗原を違ったように提示することがあり、したがって、はるかに少ないｍＨＡｇが得られる。このタイプの手法に基づいて、80個の範囲内の異なるタンパク質が推定された。
【００４２】
Clave等(J.Immunother.1999、22：1〜6)は、白血病細胞に対するＧＶＴ反応の標的抗原を特定することを目的とした研究において、骨髄性白血病において過剰発現される原発性顆粒タンパク質であるプロテイナーゼ３の多型を検出した。この研究は、10人の血液系疾患患者およびそれらのＨＬＡ同一骨髄ドナーで実施された。この酵素は、ミエロイド系細胞において発現されるが、ＣＭＬ(Molldrem等、Blood、1997、90：2529〜2534；Dengler等、Brit．J.Haematol.1995、89：250〜257)を含めた骨髄性白血病において過剰発現され、プロテイナーゼ３由来のペプチドであるＰＲ１に特異的なＣＴＬは、ＣＭＬ細胞を効率的に溶解させる(Molldrem等、Blood、1997、90：2529〜2534)。循環ＰＲ１特異的ＣＴＬが、同種ＢＭＴによる治療を受けた患者を含めていく人かのＣＭＬ患者において検出され、それが存在すると、予後は良好である(Molldrem等、Nat.Med.2000、６：1018〜1023)。ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)一本鎖コンホメーション多型アッセイと、その後のＰＣＲ産物の配列の直接決定によって、７個の一塩基多型が発見された。そのうちの１個は、そのアミノ酸配列の119位にあるイソロイシンまたはバリンのどちらかをコードしている。アミノ酸115〜124の多型部位にまたがるペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２分子にin vitroで結合することが判明した。23人のＨＬＡ−Ａ２骨髄性白血病患者およびそれらのＨＬＡ同一ドナーを、その多型についてスクリーニングした。そのドナーには存在しない少なくとも１個の対立遺伝子を有する４人の評価患者群では再発は見られなかったのに対し、残りの15人の評価患者のうち７人が再発した。これらのデータは、プロテイナーゼ３の対立遺伝子の違いに対するＴ細胞応答が、急性および慢性骨髄性白血病における白血病特異的養子Ｔ細胞治療を設計する基礎として使用できる可能性を支持するものである。
【００４３】
要約すると、新しいｍＨＡｇ候補タンパク質を特定する現在の手法は、ＧＶＨＤに主に関係する単離ＣＴＬおよび／またはＨＬＡ溶出(ＨＬＡ−eluted)ペプチドの特定に主に基づいており、ほんのわずかであるが、これらの抗原が、対応するタンパク質によって規定されている。
【００４４】
マウスおよびヒトに対して文献から収集したｍＨＡｇのリストを表１Ａに示す。より予測可能でより速くｍＨＡｇを特定する明確な戦略がこれまでなく、したがって、利用可能な手法によって特徴づけられる新しいヒトｍＨＡｇの候補遺伝子は、徐々にしか現れていない。さらに新しいｍＨＡｇまたは候補タンパク質に、より容易に行き着くことができる技術は当該技術分野にはない。それらは、おそらく、様々な細胞のハウスキーピング機能に関与するタンパク質に由来する分子断片の多様で難解なグループであり、一般に、コードする遺伝子座の位置は未知である。ｍＨＡｇの一部は、体中の様々な組織において広範に発現されると考えられるのに対し、別のｍＨＡｇは、組織分布が限られている。これまでのところ、それらの分析は、抗白血病反応性に関係していないが、生命にかかわるＧＶＨＤとほぼ独占的に関連している。これは、現在利用可能な技術が、ＧＶＨＤに関係するｍＨＡｇを特定することに大きく偏り、疾患を予防するｍＨＡｇ、例えば、ＧＶＴ反応を誘導するｍＨＡｇは散発的にしか提案されていないためである。
【００４５】
ＧＶＨＤおよびＧＶＴ免疫応答の特徴づけのためのすべての試験で、関与する抗原が、対応するタンパク質配列における単一アミノ酸変化をもたらすまれなＤＮＡ突然変異によって生じる限定された多型のｍＨＡｇであるという驚くべき観察結果になることは興味深い。また、これらのアミノ酸変化が、ＧＶＴ反応またはＧＶＨＤを引き起こすために、ＨＬＡクラスＩによって提示されなければならないことは明白である。ＧＶＨＤに関与するいくつかの同種Ｔ細胞クローンが単離され、ＨＬＡ提示ペプチドの単一アミノ酸交換を特異的に認識することが判明した。
【００４６】
白血病、リンパ腫および骨髄腫は、骨髄およびリンパ組織において発生する癌である。これらの疾患は、造血系に由来する単一細胞のＤＮＡの後天的(遺伝ではなく)遺伝子損傷に起因し、この損傷は白血病クローンに転化され、次いで連続的に増殖する。この無制限の増殖は、体による健康な血球の産生を妨害し、それによって体は基本的な生理学的機能を発揮することができず、感染に対して体自体を保護することができなくなる。
【００４７】
米国において、1999年に推定107,900人が白血病、リンパ腫および骨髄腫と診断され、これは米国で毎年診断される癌の11％を占める。推定で合計632,000人のアメリカ人が、現在、白血病、リンパ腫および骨髄腫に罹患している。ヨーロッパでの数値も米国と極めて似ている。白血病、リンパ腫および骨髄腫により推定60,500人が毎年亡くなっている。白血病およびリンパ腫は、35歳未満の若い女性および若い男性において第１位の致死的癌である。
【００４８】
慢性初期には、ＣＭＬは、bcr-abl癌遺伝子を生成するｔ(９；22)染色体の転座(フィラデルフィア染色体、Ｐｈ)を特徴とする。キメラ遺伝子の産物は、ＳＴ1571などの合成阻害剤の標的である常時活性型チロシンキナーゼである。他のタイプの腫瘍患者と比較して、ＣＭＬ患者は、慢性期には免疫系はまだ比較的無傷である。Bcr-ablペプチドは、他の未知の疾患関連抗原とともに、ＨＬＡ分子によって提示され、Ｔ細胞によって認識されることが現在次第に明らかになってきた。融合タンパク質による患者の直接免疫化が、臨床現場において自然免疫または移植によって誘導される免疫を高める同種ＢＭＴの潜在能力を研究するのに使用された。初期の治験から、このようなワクチン接種が安全であることが判明したが、免疫抗原に対して特異的Ｔ細胞応答を示す患者もいた(Pinilla-lbarz等、Blood、2000、95：1781〜1787)。
【００４９】
急性白血病は、患者の細胞遺伝学的プロファイルから演繹的に推論されるリスクプロファイルに従って治療(化学療法、ＢＭＴおよび放射)を組むことが依然として極めて困難である。ＢＭＴは化学療法のみではうまくいかない患者に残されたものである。これらの破壊的な疾患の治癒を進めるために、臨床レベル、細胞レベルおよび分子レベルでの白血病の生物学、特に、免疫療法戦略を設計するための疾患関連抗原の分子的定義を理解することは、関連する白血病クローンを根絶するのに最も重要な目的である。
【００５０】
腎細胞癌(ＲＣＣ)はすべての癌死の約５％を占める。症状が出たときには、50％を超える患者は局所的に進行した転移性疾患をすでに発症しており、５年生存率は20％未満である。多種多様な治療様式による多数の試験でもほんのわずかしか進歩していない。単一薬剤も併用療法も20％以上の応答割合を一貫して示したものはない。インターロイキン−２およびインターフェロン−アルファを主体とする療法は、進行した疾患を治療するために最も一般的に使用され、10％〜20％の範囲で低いが再現性のある応答割合を示し、永続性のある応答は５％以下である(Nanus、Curr.Oncol.Rep.2000、２：417〜22)。
【００５１】
ＲＣＣは、サイトカインまたはインターフェロンを主体とする免疫療法に対して感受性が高いので、自己腫瘍細胞を排除するのに特異的Ｔ細胞が関与していると考えるのに十分な理由がある(Schendel等、J.Mol.Med.1997、75：400〜413)。最近、腫瘍特異的Ｔ細胞が、ＩＦＮ−ガンマ捕捉アッセイによって、ヒトＲＣＣを浸潤させるリンパ球から単離された(Becker等、Nat.Med.2001、７：1159〜1162)。しかし、ＲＣＣ抗原およびその対応するクラスＩ提示ペプチドに関する知識が不十分なため、ＲＣＣのインターフェロン−アルファ免疫療法におけるＴ細胞の役割はあまり理解されていない。
【００５２】
ＲＣＣの免疫療法に有用であり得る新しい抗原の特定は依然として優先度が高い。ＲＣＣにおいて関連する抗原を特定する方法は転写レベルならびにタンパク質発現レベルで記述されている。二次元ゲル電気泳動(２−ＤＥ)および銀染色による非癌性腎臓とＲＣＣのプロテアーゼの比較によって、著しく異なるタンパク質パターン(ＲＣＣの約800スポットと正常腎臓の約1400スポット)が明らかになった。２−ＤＥ免疫ブロットによって、ＲＣＣ患者から得られた血清と再現性良く反応するが健康なドナーから得られた血清とは再現性良く反応しない５個のＲＣＣ特異的スポットが明らかになった。これらの抗原のうち２個は、予備的な２−ＤＥによって単離され、平滑筋細胞において主に発現される機能が未知なアクチン結合タンパク質である平滑筋タンパク質22−アルファ(ＳＭ22−アルファ)として特定された。in situハイブリダイゼーションによって、ＳＭ22−アルファは、悪性細胞においては発現されないが、腫瘍間質の間葉細胞では発現されることが明らかになった。第２の抗原は、腎臓では通常発現されないアイソフォームの炭酸脱水酵素Ｉである。異なるアイソフォーム(ＣＡＸＩＩ)が、血清学的発現クローニングによって、一部のＲＣＣにおいて過剰発現される抗原として以前に特定されたことは興味深い。組換えＣＡＩまたはＳＭ22−アルファに対する抗体が、それぞれ11人中３人または11人中５人のＲＣＣ患者から得られた血清中に検出されたのに対し、13人の健常人から得られた血清は反応しなかった。結論として、血清学的方法はプロテオーム分析において有用なツールとなり、腎臓腫瘍関連抗原の特定の一助となり得る。しかし、関連するＲＣＣ抗原を特定することが依然として求められており、特に癌に対するワクチン接種におけるこれらの抗原の関連性は明らかにされなければならない。
【００５３】
このＲＣＣの状況は、一方で178個のエピトープに対応する合計60個の異なるタンパク質抗原が規定されている様々な他の固形腫瘍疾患の状況とよく似ている。多数のこれらの抗原、および対応するＴ細胞エピトープが、免疫応答を改善する様々なワクチン接種プロトコル、アジュバント処方および細胞ベースの提示システムに使用されている。しかし、関係するプロトコルおよび抗原とは無関係に、得られる結果は、極めて類似しており、臨床反応なしにＴ細胞が活性化される。したがって、ワクチンは、そのうち治療において重要な役割を果たすであろうが、臨床試験において認められる免疫応答は、まだ大幅な延命効果には至っていない。
【００５４】
上述したように、白血病に対する同種ＢＭＴの免疫療法としての潜在的可能性は、同時に、酵素欠損障害、ファンコニー貧血、重症型地中海貧血などの他の疾患でも調査された。これは、主に、臨床体験を積み重ねることによって可能となり、同種ＢＭＴ手法は、ＲＣＣなどの転移性固形腫瘍の免疫療法にも同様に使用できることが明白になった。最近出版された研究(Childs等、N.Engl.J.Med.2000、343：750〜758)では、非骨髄破壊的同種幹細胞移植が、従来のサイトカイン治療がうまくいかなかった患者において、転移性ＲＣＣを持続的に軽減させるために適用された。試験に参加した19人の患者のうち10人(53％)が、測定可能な応答を示し、３人の患者は完全な持続性応答を示した。これらの結果は有望であり、類似の治療戦略を他の転移性腫瘍に対して使用することを奨励するはずであるが、Childs等によって使用された手順は、一部の患者における腫瘍の軽減が重度のＧＶＨＤを伴うので、完全に満足のいくものではない。この治療を受けた後に２人の患者が死亡した。この手順は、合併症を最小限に抑え、その効力を向上させるさらなる改善が必要であるが、原理証明はすでに手許にある。すなわち、同種Ｔ細胞は、腎癌細胞を根絶させることができ、ドナーリンパ球は、非骨髄破壊的コンディショニング後、宿主内に生存することができる。しかし、この試験のより一般的な意味は、同種ＢＭＴを固形腫瘍の治療に拡張可能なことである。ＲＣＣなどの固形腫瘍の治療における将来の進展は、ＧＶＨＤ応答のない、より安全でより制御された抗腫瘍免疫療法を確立できるかどうかにかかっている。
【００５５】
骨髄移植は、腎臓、心臓、肝臓、肺などの固形臓器の移植とともに多数の態様を共有する。臓器移植(organ transfer)も、いくつかの病態では依然として最適な治療である。より優れた免疫抑制剤の開発における最近の進歩によって、同種移植の短期生存が改善されたが、免疫学的拒絶反応は、依然として長期生存に対する障害となっている。ドナー臓器と患者の不適合、すなわちｍＨＡｇ不適合が、固形臓器の生着に影響を及ぼし、ＧＶＨＤを促進することを示す証拠がかなり蓄積された。したがって、長期の移植片生着を経験する患者は、依然として予後が悪く、40％の腎臓しか10年を超えて生着しない。これらの移植片の最終的な損失におけるｍＨＡｇ不適合の役割は不明であり、考察の対象である。したがって、臓器移植、特に腎移植は、同種ＢＭＴおよび対立遺伝子特異的同種抗原の特定から利益を得ることができる別の適用例である。
【００５６】
マサチューセッツ総合病院において、Cosimi等はドナーからの骨髄をレシピエントに与えた後に移植腎臓を移植し、それによって患者にＴ細胞キメラ現象状態を作ることができることを考察している(N.Engl.J.Med. 2002、346：2089〜92)。理論的には、ドナーリンパ球は、ドナー臓器からの抗原とともに胸腺に移行し、新しい腎臓に対する寛容性をもたらす。さらに未来指向のシナリオにおいては、この寛容性誘導プロセスを、本発明によって特定され、調製され、送達される適切な腎臓同種抗原を用いたワクチン接種によって支援することができる。将来の治療の中間形態は、腎移植に加えて同種ＢＭＴ移植を含むことができ、両方の移植片は同じドナーから得られる。
【００５７】
一塩基多型(ＳＮＰ)は、２個のＤＮＡ配列間の不一致として定義され(Stoneking、Nature、2001、409：821〜822)、挿入、欠失、または優先的に、本明細書で使用される、アミノ酸変化をもたらす一塩基変化などの一塩基変化の結果として生じるある集団のゲノム中の遺伝子配列の変化を意味する。ＳＮＰは、ある遺伝子に対する異なるメンデルの対立遺伝子として現れる。遺伝子座は、分岐が起こる部位である。
【００５８】
本発明において理解されるヌクレオチド塩基変化は、ゲノムのコード部分に関係し、別のアミノ酸を対応するタンパク質中に組み込む結果となる。アミノ酸交換は、前記アミノ酸の翻訳後修飾、例えば、グリコシル化に影響を及ぼし得る。したがって、ＳＮＰは、集団において２個以上の遺伝的に決定された別の配列または対立遺伝子が出現することを意味し、集団のメンバー間で現れる核酸配列、(例えば、転写、プロセシング、翻訳、運搬、タンパク質プロセシング、輸送を含めた)遺伝子発現、ＤＮＡ合成、発現タンパク質、他の遺伝子産物、または生化学経路もしくは翻訳後修飾の産物における差として現れ、検出することができる。
【００５９】
当分野で存在するＳＮＰは、タンパク質機能の変化に関係して主に考察されている。しかし、30億のＤＮＡ塩基の中から機能的に関連するＳＮＰを見つけ出し、それらを有用な機能が知られていない数百万のＳＮＰから識別することは大変な課題であり、ポストゲノム研究の主要な難題の１つである。機能的に関連するＳＮＰ情報の作成は徐々にではあるが継続して進み、ヒトＳＮＰの総数および個々の遺伝子の割り当てに関する全体的な情報が、米国、ヨーロッパ諸国、日本および中国において樹立されたＳＮＰデータを収集し利用するｄｂＳＮＰ、ＣＧＡＰ、ＨＧＢＡＳＥ、ＪＳＴ、Ｇｏ!Ｐｏｌｙなど様々なデータベースから利用可能である。Celeraのような会社は、ＳＮＰを特定するツールを作製し販売しており、2002年の終わりまでに作成されるヒトゲノムのＳＮＰに基づく連鎖地図を手にするはずである。Celera−ＳＮＰデータベースは、40または50個体からのＤＮＡ配列に基づき、その情報を用いてＳＮＰを探し出す。これらのデータにアクセスすると、特異的遺伝子に対する割り当てが可能になり、疾患に関連するＳＮＰの予測が将来可能になるはずである。
【００６０】
抗原提示は、２個の異なる経路、すなわち外因性ＨＬＡクラスIIおよび内因性ＨＬＡクラスＩ経路に基づく。クラスＩ分子は、ＨＬＡ−Ａ、ＢおよびＣ遺伝子座によってコードされ、主にＣＤ８+細胞障害性Ｔ細胞を活性化すると考えられる。ＨＬＡクラスII分子は、ＤＲ、ＤＰおよびＤＱ遺伝子座によってコードされ、主にヘルパー細胞と細胞障害性細胞の両方のＣＤ４+Ｔ細胞を活性化する。
【００６１】
「正常」個体は、通常Ａ、ＢおよびＣの３グループの各々から２個の計６個のＨＬＡクラスＩ分子を有する。それに対応して、すべての個体は、やはりＤＰ、ＤＱおよびＤＲの３グループの各々から２個の独自のＨＬＡクラスII分子を有する。Ａ、Ｂ、ＣグループおよびＤＰ、ＤＱ、ＤＲグループの各々は、さらにいくつかのサブグループに分類される。すべての遺伝子産物は高度に多型である。したがって、様々な個体が、他の個体のＨＬＡ分子とは異なる別のＨＬＡ分子を発現する。これが、移植においてＨＬＡ適合臓器ドナーを見つけることが困難な理由である。免疫生物学におけるＨＬＡ分子の遺伝的変異の重要性は、免疫応答遺伝子としてのそれらの役割を反映したものである。それらのペプチド結合能力を通して、ある種のＨＬＡ分子の有無によって個体のペプチドエピトープ応答能力が決まる。その結果、ＨＬＡ分子によって、疾患に対する抵抗または罹病性が決定される。
【００６２】
ＨＬＡクラスII発現は、ＡＰＣに限定される。これは、病原体によって産生される抗原を内部に取り込み処理するＡＰＣ(マクロファージ、樹状細胞またはＢ細胞)に遭遇した場合には局所的に活性化されるヘルパーＴリンパ球の機能と一致している。
【００６３】
ＭＨＣ(ＨＬＡ)クラスＩ分子は、体のあらゆる有核細胞上で発現され、ウイルスおよび他の細胞内病原体に対する主要な免疫防御機構の一部である。これらは、クラスＩ鎖(ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ)と可溶性β2ミクログロブリンのヘテロダイマーとして構築され、細胞内で抗原プロセシングによって産生されるペプチドに結合し、これらのペプチドを、Ｔ細胞受容体を介してＣＴＬによって認識され得る細胞表面に運搬する。
【００６４】
クラスＩとクラスII経路はまったく別個のものではない。例えば、樹状細胞、およびある種の拡張マクロファージは、細胞外タンパク質をどん食(飲食)し、続いてそれらをＭＨＣクラスＩとして提示できることが知られている。外来性抗原もクラスＩ経路に進入できることが実証された(Rock等、Immunol.Today、1996、17：131〜137)。これは、特別な投与経路によって、例えば抗原を酸化鉄ビーズと結合させることによって実施することができ、中心的機序と考えられる。というのは、同じＡＰＣ上でＭＨＣクラスＩとクラスIIが同時に発現して３細胞タイプのクラスター形成を誘発することが重要だからである。この３細胞タイプの相互作用クラスターは、Mitchison等(Eur.J.Immunol、1987、17：1579〜83)によって提案され、その後他の著者によっても提案された。彼らは、同じＡＰＣ上でのクラスＩとクラスIIエピトープの同時提示が重要であることを示した。最近記述されたＣＴＬ活性化機序によれば(Lanzavecchia、Nature、1998、393：413〜414、Matzinger、Nat.Med.1999：616〜617)、ＭＨＣクラスIIによる専門のＡＰＣ提示抗原はＴヘルパー細胞によって認識される。これは、(Ｔヘルパー細胞上のＣＤ40リガンドとＡＰＣ上のＣＤ40の相互作用によって媒介されて)ＡＰＣを活性化させ、ＡＰＣがＣＴＬを直接刺激することが可能になり、それによって、ＣＴＬが活性化される。
【００６５】
異質なＭＨＣクラスII拘束性Ｔヘルパー細胞エピトープを自己抗原に挿入すると、非改変自己抗原に対する強い交差反応性抗体応答を誘導可能な抗原が産生されることがこれまでに実証されている(出願人の国際公開第95/05849号を参照)。自己抗体誘導は、挿入された異質なエピトープによって誘導される特異的Ｔ細胞の助けによって引き起こされることが示され、改変自己抗原は、適切なアジュバントの助けによって、ＭＨＣクラスＩ拘束性自己エピトープに対する強いＣＴＬ応答を誘導できると予想される。したがって、国際公開第95/05849号に記載された技術によって、ＭＨＣとして提示されるエピトープを有する細胞内および他の細胞関連抗原に対するワクチン接種戦略を提供するようにすることもできる。
【００６６】
最も頻繁に出現するクラスＩ対立遺伝子(ＨＬＡ−Ａ１、−Ａ２、−Ａ３、−Ａ11、−Ａ24、−Ｂ７)に対するＨＬＡ結合モチーフ、ならびにいくつかの主要なクラスII分子に対するＨＬＡ結合モチーフが報告されている(Rammensee等、Immunogenet.1995；41：178〜228；Ruppert等、Cell、1993；74：929〜937；Kubo等、J.Immunol.1994；152：3913〜3924、Kondo等、Immunogenet.1997；45：249〜258；Southwoodなど、J.Immunol.1998、160：3363〜3373；Geluk等、J.Immunol.1994；152：5742〜5748)。結合モチーフは、ペプチドの限定された位置において、あるタイプのアミノ酸、例えば大きな疎水性または正に帯電した側鎖基を有するアミノ酸を必要とする特徴を有し、その結果、ＨＬＡ結合溝のポケットに適合する範囲が狭くなる。この結果と、結合溝内のペプチド長さが８〜10アミノ酸に制限されることを考慮すると、ＨＬＡクラスＩ分子の１タイプに結合しているペプチドが、別のタイプにも結合することはまったく起こりそうにない。したがって、例えば、ともにクラスＩジェンダーに属するＨＬＡ−Ａ１とＨＬＡ−Ａ２サブグループに対するペプチド結合モチーフが、ＨＬＡ−Ａ１とＨＬＡ−Ｂ１分子に対するモチーフと同様に異なる可能性が高い。
【００６７】
同じ理由で、正確に同じアミノ酸配列が、異なるクラスII分子の結合溝内に位置する見込みはない。ＨＬＡクラスII分子の場合、ペプチドの結合配列はより長いことがあり、通常、10〜16アミノ酸を含むことが判明し、そのいくつかは、片方または両方の末端において、ＨＬＡ溝に対する結合モチーフの一部ではない。
【００６８】
いくつかのＨＬＡクラスＩおよびクラスII分子の異なるペプチド結合モチーフの重複が起こり得る。少なくとも２個の異なるＨＬＡ分子に対する結合配列に重複があるペプチドは、「ネステッド(nested)Ｔ細胞エピトープ」を含むと言われる。「ネステッドエピトープペプチド」に含まれる様々なエピトープが、ＡＰＣによるペプチドのプロセシングによって形成され、その後、異なるＨＬＡ分子を介してＴ細胞に提示され得る。ヒトにおいて個体のＨＬＡ分子は多様であることから、入れ子エピトープを含むペプチドは、１タイプのＨＬＡ分子に結合することしかできないペプチドよりも一般的なワクチンとして有用である。
【００６９】
個体の有効なワクチン接種は、患者の少なくとも１タイプのＨＬＡクラスＩおよび／またはクラスII分子が、その完全長でまたは患者自身のＡＰＣによってプロセシングを受けた後にワクチンペプチドに結合することができる場合にのみ達成され得る。
【００７０】
集団の大多数に対する一般的なワクチンとしてのペプチドの有用性は、その完全長でまたはＡＰＣによってプロセシングを受けた後に結合可能である異なるＨＬＡ分子の数とともに増加する。これらのモチーフを有し、様々なＨＬＡ分子に結合する抗原関連ペプチドセットを特定することによって、Ｔ細胞エピトープ主体の腫瘍免疫療法を開発するためにヒト集団の大多数(＞80％)を適用範囲にすることができる。
【００７１】
遺伝子の対立遺伝子バージョンによってコードされたタンパク質に由来するペプチドをワクチンまたは抗癌剤として使用して、抗腫瘍ＣＤ４+および／またはＣＤ８+Ｔ細胞を産生するために、当該突然変異体タンパク質を検討し、できればＡＰＣによってより短いペプチドにプロセシングされた後に、Ｔ細胞を刺激できるペプチドを特定する必要がある。
【００７２】
一般に、腫瘍は、腫瘍細胞中に存在する遺伝的変化に関して極めて不均質である。これは、癌ワクチンの潜在的な治療効果と予防能力の両方が、ワクチンがＴ細胞免疫を誘導することができる標的の数とともに増加することを意味する。複数標的ワクチンは、治療を逃れた原発性腫瘍の変異体によって新しい腫瘍が形成されるリスクも低下させるはずである。
【００７３】
ＨＬＡクラスＩ分子上でのＴ細胞エピトープ(ペプチド断片)の提示が、細胞認識の機能だけでなく、腫瘍細胞および同種抗原を有する他の細胞を特異的Ｔ細胞によって調べ死滅させるために必須であることは明白である。
【００７４】
より詳細に述べると、エピトープを産生するためには、対応するタンパク質を、プロテアソームによって、特異的Ｃ末端アミノ酸を有するペプチドに切断しなければならない。切断された断片は、いわゆるＴＡＰ分子(抗原プロセシングに関連するトランスポーター)によって小胞体に運搬されなければならず、そこで、断片が適切なＨＬＡ結合モチーフを含むときにはＨＬＡ結合が生成される。したがって、適切なＨＬＡ結合モチーフを含む免疫療法の標的ペプチド候補が、正しいＣ末端アミノ酸でプロテアソームによって切断されることが必要である。タンパク質候補の適切なプロテアソーム切断を実験的に測定するために、精製細胞の20Ｓプロテアソームを用いたin vitroでの切断アッセイ(４〜24時間)が開発され、質量分析法によるペプチド分析と併用された。このような実験の結果は、プロテアソーム消化と結合試験との併用が免疫療法のための標的ペプチド候補を規定するのに有用であることを示している。専門家には、疾患関連タンパク質の一般的な切断性を評価するために開発された予測アルゴリズムであるＰＡＰｒｏＣ(http://www.paproc.de)が有益なことがある。
【００７５】
始めに指摘したように、多数のＣＴＬエピトープがこれまでに特定され、それらはある位置において好ましい長さおよびアミノ酸組成を有する共通モチーフを有する。予測可能なモチーフを使用して、所与のタンパク質のアミノ酸配列をＣＴＬエピトープに翻訳するコンピュータプログラムが設計された。ＭＨＣクラスＩリガンドおよびＣＴＬエピトープの予測を研究している免疫学者には、http://syfpeithi.bmi-heidelberg.com)のＳＹＦＰＥＩＴＨＩまたはhttp://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/HLA bind/のＢＩＭＡＳを使用することが特に有用である。
【００７６】
in vivoでのＴ細胞応答調査は、極めて多量の非特異的細胞の中から抗原特異的Ｔ細胞を特定することが困難であるため限定されたものになり得る。この困難は、主として、Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)とその天然リガンド、すなわちＨＬＡ−ペプチド複合体との相互作用の親和性が低いためである。４量体技術として知られるＨＬＡ−ペプチド複合体の多量体化は、ＴＣＲ−ＨＬＡ相互作用の全親和性を、このような複合体をＴ細胞のエピトープ特異的検出用試薬として使用することができる程度に増加させることによって、これらの技術的問題を克服することができる。
【００７７】
可溶性ＨＬＡクラスII−ペプチド複合体の生成は、おそらくはクラスIIペプチド結合溝の構造がより複雑なためにそれほど十分には確立されていない。昆虫細胞におけるin vivoでの発現およびリフォールディング、ならびに共有結合ペプチドエピトープの使用は、これらの技術的問題を克服する有望な手法である。
【００７８】
４量体染色は極めてエピトープ特異的であり、極めて小さな集団でさえこの技術を用いて生体外で直接特定することができる。正確な頻度分析に加えて、これらの試薬によって、単一細胞レベルでのエピトープ特異的Ｔ細胞集団の詳細な表現型および機能の特徴づけ、例えば表面マーカーの発現、サイトカインプロファイルの決定、およびＴＣＲレパートリー分析が可能である。４量体ＨＬＡ−ペプチド複合体の結合動力学は、それらのリガンドに対するエピトープ特異的Ｔ細胞の相対的親和性を測定する有用なツールと考えられる。基本的識見および４量体によって可能となったＴ細胞性免疫応答の定量に加えて、この技術は、同種ＢＭＴにおいて、ＧＶＨＤに関与する自己反応性Ｔ細胞を排除するためにも使用することができる。
【００７９】
しかし既知の予測プログラムを利用したＣＴＬエピトープの理論的予測は既知の抗原にしか実施できない。したがって、防御Ｔ細胞によって認識されるエピトープを有するタンパク質を特定することは、ワクチン開発の中心的課題である。Ｔ細胞によって認識されるペプチドが、クラス１分子から溶出して産生される場合、ペプチド主体のワクチンのさらなる開発は時間のかかるプロジェクトになり得る。癌関連タンパク質抗原およびＧＶＨＤ関連タンパク質抗原の予測に関する前記間隙を埋めることが本発明の目的である。
【００８０】
本願の特別の目的は、ｍＨＡｇなどの同種抗原を特定し特徴づけることであり、固形臓器移植のＧＶＴ、ＧＶＨＤおよび拒絶におけるそれらの役割を明らかにすることである。
【００８１】
このために、本発明者らは、同種抗原およびそれに対する免疫応答を特定し、特徴づける新規な手法を開発する。他の関連する主題は、同種抗原およびｍＨＡｇをコードする遺伝子座および対立遺伝子の特定、ならびに関与するｍＨＡｇ抗原／ｍＨＡｇ遺伝子座および対立遺伝子の総数を決定する技術の改善などであるが、これらだけに限定されない。免疫優性ｍＨＡｇ抗原／ｍＨＡｇの特定には、抗原ペプチド、治療および疾患におけるそれらの役割、相対的存在比とのそれらの関連性、ＨＬＡに対するペプチドの親和性、ならびに細胞障害性Ｔ細胞作用の誘導の評価が含まれる。また、in vitroでのペプチド免疫機能のin vivoでの相関現象を検討して、in vitroで特定された免疫優性ペプチドが同様にin vivoで機能するかどうかを明らかにすることができる。様々な同種抗原またはｍＨＡｇの相対組織発現、およびそれらの示差的な組織分布の移植片拒絶に対する影響を、同様に検討することができる。
【００８２】
この包括的な情報を使用して、ＢＭＴ後に認められるＧＶＴ反応を促進する手法を明らかにし、移植片生着を改善する。本願を支持する研究範囲は、以下の広範な対象域および調査の具体的実施例を含むが、これらだけに限定されない。本実施例は、指示的なものではなく、依然としてさらに調査されている領域を例示したものである。
【００８３】
発明の概要
本発明は、癌患者において発現される、一部はすでに知られ、残りはまだ知られていない一塩基多型(ＳＮＰ)をコードする様々な遺伝子の驚くべき発見を含む。本発明のより一般的な態様は、これまでｍＨＡｇとして要約された、ＧＶＨＤおよびＧＶＴ免疫応答の誘導に関係する機能的に異質なタンパク質抗原グループを規定する一般化された方法を初めて記述するものである。前記ｍＨＡｇは、一般化された特定スキームにこれまで利用されていない同種抗原グループに属する。本発明によれば、同種抗原グループを、ＧＶＨＤを起こす同種抗原とＧＶＴをもたらす同種抗原とに分けるのに役立つ汎用的な方法が確立された。また、遺伝子中のコーディングＳＮＰから生じる単一アミノ酸不一致対立遺伝子変異体が癌細胞によって提示され、前記抗原が、ＨＬＡ分子として(ドナー)同種反応性Ｔ細胞によって認識されて、前記細胞が破壊されることも特許請求する。
【００８４】
遺伝子中のコーディングＳＮＰは、タンパク質における単一アミノ酸交換であり、所与の個体に受け継がれ、特有のものである。移植患者あるいは治療上の理由のために非同質遺伝子個体群(non-syngen)ドナーからの骨髄移植または幹細胞移行が予定されている患者は、ＳＮＰによってコードされた単一アミノ酸交換をもたらす遺伝子産物、および前記Ｔ細胞エピトープに特異的な同種反応性Ｔ細胞に関してキメラ状態にある。結果として、遺伝子産物は、ドナー由来の(宿主の)免疫系によって認識され、その結果、診断、モニタリングおよび治療の基礎を形成する。
【００８５】
手短に述べると、本発明は、ＧＶＴおよびまたはＧＶＨＤをもたらす広義の同種抗原に関する新しい概念を与えるものである。本発明の主目的は、Ｔ細胞を刺激するのに使用することができる、癌細胞によって産生され提示される単一アミノ酸交換によるタンパク質のペプチド断片に対応するペプチドを得ることである。本発明における単一アミノ酸置換の分子的基礎は、正常タンパク質における単一の保存的アミノ酸置換を含めた対立遺伝子差に基づくことを指摘しておくことは注目に値する。ＢＭＴを必要とする個体、またはすでにＢＭＴを受けた個体が、所与のタンパク質における前記アミノ酸交換を有するかどうかを判定することは本発明の一部である。また、前記タンパク質が、癌組織または正常組織を代表する細胞において主におよびまたは選択的に発現されるかどうかを明らかにすることも本発明の一態様である。
【００８６】
本発明の別の目的は、標的細胞上に現れた前記単一アミノ酸の違いを認識するドナー由来のＴ細胞を決定し、必要に応じて単離することである。前記Ｔ細胞は、癌細胞に特異的であることが判明して治療に使用できることもあり、あるいは遍在するタンパク質抗原に特異的であることが判明し、したがってＧＶＨＤの刺激物質として特定されることもある。
【００８７】
本発明によって規定されるペプチドの一部は、広範な組織分布を有することが判明し、ＧＶＨＤの誘導物質であり、したがって、免疫寛容の誘導に使用することができる。これに対し、排他的に発現すると規定されたペプチドは、ＧＶＴ反応を刺激し、疾患の特異的免疫療法に有用である。
【００８８】
本発明の別の主目的は、Ｔ細胞免疫に基づく癌治療を開発することである。Ｔ細胞免疫は、細胞障害性Ｔ細胞応答を誘導し、免疫寛容を解消するために、患者において、同種ＢＭＴによって、かつ／またはそれ自身のＴ細胞もしくはドナーＴ細胞をin vivoもしくはin vitroで本発明によるペプチドを用いて刺激することによって誘導することができる。
【００８９】
本発明の別の主目的は、本発明のペプチドに対応するペプチドのみに、またはそれに一部基づいて、癌の発症を防止しまたは根絶させるワクチンを開発することである。これは、単一のヌクレオチドが変化した遺伝子および単一アミノ酸置換ペプチドを含む細胞に対するＴ細胞細胞障害作用を生じ活性化させることによって行われる。
【００９０】
ワクチン接種の別の態様は、本発明のＧＶＨＤ誘導ペプチドに対応するペプチドを使用して、単一のヌクレオチドが変化した遺伝子および単一アミノ酸置換ペプチドを含む細胞を認識するＴ細胞に対する寛容性を誘導することに関係する。
【００９１】
本発明の別の主目的は、本発明による少なくとも１個以上のペプチドを投与することを含む、このような治療または予防を必要とするヒト個体に特異的に適応される抗癌治療または予防を設計することである。
【００９２】
本発明によれば、単一アミノ酸置換タンパク質の正常組織発現は、ＧＶＨＤの予防および治療に関係するのに対し、選択された臓器および／または癌細胞特異的発現あるいは疾患関連発現は、治療上のＴ細胞応答に関係する。本発明のこの態様によれば、レシピエント由来の試料と比較して、ドナー由来の試料中のアミノ酸置換タンパク質に関する差を求めることが特に有用である。本発明によって分析され、正常組織発現と相関するドナー−レシピエント差は、ＢＭＴ後のＧＶＨＤの優れた指標である。一方、本発明によって分析され、癌組織、臓器および細胞における疾患関連発現と相関するドナー−レシピエント差は、同種ＢＭＴ後の有益なＧＶＴ反応性の優れた予測変数である。
【００９３】
本発明によって特定され、癌細胞中のＳＮＰをコードする遺伝子に起因する単一アミノ酸置換タンパク質の断片に対応するペプチドグループは、単離Ｔ細胞の産生に使用できるだけではない。さらに、前記ペプチドは、上述したように、患者において、ＳＮＰを有する遺伝子を含む癌細胞を死滅させるＴ細胞反応性を誘導するのに使用することができる。
【００９４】
本発明によって規定されるアミノ酸不一致ペプチドは、少なくとも８アミノ酸長であり、それらの完全長で、またはＡＰＣによるプロセシング後に、ヒト癌患者の疾患関連細胞によって産生されるＳＮＰ相関遺伝子産物またはその断片に対応する。本発明によるペプチドは、ａ)少なくとも８アミノ酸長であり、癌細胞遺伝子中の前記コーディングＳＮＰから生じる単一アミノ酸置換タンパク質の断片であり、ｂ)前記遺伝子によってコードされたタンパク質配列の一部として単一アミノ酸置換を含み、ｃ)その完全長で、またはＡＰＣによるプロセシング後に、Ｔ細胞応答を誘導することを特徴とする。
【００９５】
本発明のペプチドは、好ましくは、８〜25、９〜20、９〜16、８〜12または20〜25アミノ酸を含む。これらは、例えば、９、12、13、16または21アミノ酸を含むことができる。
【００９６】
本発明のペプチドは、少なくとも９アミノ酸長、例えば９〜18アミノ酸長であることが最も好ましいが、ＡＰＣ固有のプロセシングが起こり得るために、これよりも長いペプチドも同様に、ＨＬＡ複合ペプチドを産生するのに適している。したがって、１個または複数の単一アミノ酸置換を有するタンパク質のアミノ酸配列全体を、それが８アミノ酸以上を含む場合には、本発明によるペプチドまたはタンパク質として使用することができる。このようなポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を、本発明のペプチドを発現し提示するために同様に使用することができることは特記される。
【００９７】
本発明によって特定されるペプチドを本発明による組成物および方法に使用可能であるかどうかを判断するために、以下のステップを実施すべきである。
【００９８】
１)前記細胞において選択的に発現され、または過剰発現される癌細胞特異的遺伝子を特定する。前記遺伝子が、遺伝子産物中のアミノ酸交換をコードする対立遺伝子特異的単一ヌクレオチドに関して多型であるかどうか分析する。
【００９９】
こうして特定されたペプチドが癌の治療または予防、あるいはＧＶＨＤ予防に有用であるかどうかを、遺伝子の選択的または広範な発現プロファイルから判断する。
【０１００】
２)不一致単一アミノ酸であるペプチドの多型部分が、その完全長で、またはＨＬＡクラス１Ｔ細胞エピトープの定義に一致するより短い断片として、Ｔ細胞を刺激するために必要かどうかを判断する。
【０１０１】
場合によっては、さらなるステップを以下のとおり追加することができる。
【０１０２】
３)様々な主要ＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスII分子の入れ子(ネステッド)エピトープを含むペプチドを明らかにし、これらのペプチドを使用してＴ細胞を刺激または抑制する。
【０１０３】
要約すると、タンパク質の断片であり、Ｔ細胞エピトープまたはその誘導体であって、同種反応性に本質的に関係する機能的または免疫学的諸特性を有する、ＳＮＰによってコードされたペプチドを特定することが本発明の基本的な態様である。ここで、免疫学的差は、前記Ｔ細胞エピトープ内のＳＮＰによってコードされた１個または複数の単一アミノ酸変化によって決定される。また、専門家に既知の確立された標準方法を用いて、ｍＨＡｇ、ＧＶＨＤ抗原、ＧＶＴ抗原および宿主対移植片抗原と関連する、同種免疫応答を誘導する新しい関連同種抗原を特定することが現在可能であることが本発明の一態様である。本明細書に記載する方法およびペプチドに基づいて、タンパク質の単一アミノ酸対立遺伝子バージョンをコードする遺伝子中で、同種抗原、特にＳＮＰをスクリーニングするのに使用することができる遺伝子プローブまたはプライマーを作製することができる。また、本発明は、(a)対象から適切な核酸試料を採取し、(b)ステップ(a)で得られた核酸試料が、ＳＮＰによって規定される同種抗原をコードする核酸であるかどうか、または核酸から誘導されるかどうかを明らかにし、それによって対象が、ＳＮＰによって規定される同種抗原遺伝子の一方または他方の対立遺伝子バージョンを有するかどうかを判断することによって、多型遺伝子に対する対象の対立遺伝子状態を明らかにする方法を提供する。
【０１０４】
本発明は、単一アミノ酸交換をもたらすＳＮＰの一方の対立遺伝子バージョンをコードする核酸内に存在する一連のヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能な、少なくとも15ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド、ならびに他方の対立遺伝子をコードする核酸にハイブリダイズせずに、別のアミノ酸交換をコードする(他方の対立遺伝子バージョン)核酸内に存在する一連のヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが可能な、少なくとも15ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドも提供する。
【０１０５】
本発明は、対象が、癌治療に対して同種ＢＭＴから利益を得ることができるかどうかを判定する方法も提供する。この方法は、(a)対象から適切な核酸試料を採取するステップと、(b)ステップ(a)で得られた核酸試料が、１個および／または他の対立遺伝子タンパク質バージョンをコードする核酸であるかどうか、あるいは核酸から誘導されるかどうかを明らかにし、それによって対象がＧＶＨＤまたはＧＶＴ反応の素因を有するかどうかを判断するステップとを含む。
【０１０６】
本発明の特定の態様は、前記ＳＮＰによってコードされた対立遺伝子タンパク質変異体の選択的組織発現および分布に関係し、本明細書に記載するペプチドを使用して、癌および／またはＧＶＨＤなどの疾患と闘うのに必要な選択的治療薬を生成することができる。本発明によって特定される同種抗原を用いて患者、または実際にはドナーの免疫応答を高めることによって、免疫療法の改善に大きく寄与することができる。患者に防御免疫を与えるために、本発明に記載した有効量の１個または複数のポリペプチドをアジュバントとともに投与することが必要な場合もある。この分野の専門家は、選択した免疫化プロトコルに従ってこの免疫応答増幅剤(amplifier)を選択する。
【０１０７】
また、本発明は、少なくとも１個の本発明のポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、および生理的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。本発明は、少なくとも１個の本発明のポリペプチドおよび非特異的免疫応答増幅剤を含むワクチン、ならびにそのようなポリペプチドをコードする少なくとも１個のＤＮＡ配列および非特異的免疫応答増幅剤を含むワクチンも提供する。
【０１０８】
本発明は、さらに、一方および／または他方の対立遺伝子タンパク質バージョンをコードする単離核酸、あるいは有効量の１個および／または他の対立遺伝子タンパク質バージョンおよび薬剤的に許容される担体を導入し、それによってＧＶＨＤおよびまたは癌に罹患しやすい対象を治療する、ＧＶＨＤまたはＧＶＴ反応の素因を有する対象を治療する方法も提供する。
【０１０９】
本発明は、同種幹細胞または骨髄移植を受けた後に対象に癌が残留しているかどうかを判定する方法も提供する。この方法は、(a)患者の血球から適切な核酸試料を採取するステップと、(b)ステップ(a)で得られた核酸試料が、患者自身が受け継いだ対立遺伝子タンパク質バージョンまたはドナー対立遺伝子変異体をコードする核酸であるかどうか、あるいはその核酸に由来するかどうかを判定し、それによって対象に癌が残留しているかどうかを判定するステップとを含む。
【０１１０】
本発明は、さらに、一方および／または他方の対立遺伝子バージョン、あるいはタンパク質自体をコードする単離核酸を有効量導入することによって、癌患者を治療する方法も提供する。
【０１１１】
本発明は、さらに、対象においてそれ自体を調節することができない細胞を抑制することができる化学物質を特定する方法も提供する。この方法は、(a)タンパク質の一方および／または他方の対立遺伝子変異体と化学物質とが結合できる条件下で、タンパク質の一方および／または他方の対立遺伝子変異体を化学物質と接触させるステップと、(b)タンパク質の一方および／または他方の対立遺伝子変異体に対する化学物質の特異的結合を検出するステップと、(c)化学物質がタンパク質の一方および／または他方の対立遺伝子変異体を阻害するかどうかを判定し、それ自体を調節することができない細胞を抑制することができる化学物質を特定するステップとを含む。
【０１１２】
本発明は、さらに、癌を抑制可能な化学物質、タンパク質の一方および／または他方の対立遺伝子変異体をコードする単離核酸を阻害可能なアンチセンス分子、あるいはタンパク質の精製対立遺伝子変異体を癌治療に有効な量含み、また、有効な医薬担体を必要に応じて含む医薬組成物も提供する。
【０１１３】
本発明は、さらに、上で特定された医薬組成物の有効量を投与することを含む、癌患者を治療する方法も提供する。
【０１１４】
本発明は、さらに、タンパク質の一方および／または他方のヒト対立遺伝子バージョンをコードする単離核酸を含む遺伝子組み換え非ヒト哺乳動物も提供する。
【０１１５】
本発明の別の態様においては、ＳＮＰによって規定される患者またはドナーの同種抗原遺伝子の一方または他方の対立遺伝子バージョンを検出する方法および診断キットを提供する。第１の実施形態においては、この方法は、患者またはドナーの皮膚細胞またはリンパ球を１個または複数の上記ポリペプチドと接触させるステップと、患者の皮膚またはドナーの皮膚における免疫応答を検出するステップとを含む。増殖または細胞障害性応答の分析などのリンパ球活性化を評価するために使用される間接的な方法も同様に使用することができる。第２の実施形態においては、この方法は、生物学的試料を少なくとも１個の上記ポリペプチドと接触させるステップと、試料中のポリペプチドに結合する抗体の存在を検出し、それによって生物学的試料における同種反応性を検出するステップとを含む。適切な生物学的試料としては、全血、痰、血清、血漿、唾液、脳脊髄液、尿などがある。
【０１１６】
ポリペプチドを患者またはドナーの選択された細胞と接触させるのに十分な装置と組み合わせた、１個または複数の上記ポリペプチドを含む診断キットを提供する。本発明は、検出試薬と組み合わせた１個または複数の本発明のポリペプチドを含む診断キットも提供する。
【０１１７】
さらに別の態様においては、本発明は、ＳＮＰによって規定されたポリペプチドの個々の対立遺伝子バージョンに結合するポリクローナルおよびモノクローナルの両方の抗体、ならびに患者または健康なドナーにおける同種抗原の検出にそれを使用する方法を提供する。
【０１１８】
本発明のこれらの態様および他の態様は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照して明らかになるはずである。本明細書に開示したすべての参考文献を、各々を個々に援用したように参照によりそれら全体を援用する。
【０１１９】
発明の詳細な説明
本発明は、癌治療および移植一般に同種抗原を使用する新しい概念を導入する。同種抗原およびそれらのＴ細胞認識の定義は、共通の自己タンパク質に由来するＴ細胞エピトープによって単一アミノ酸交換を含むペプチドとして与えられ、ＳＮＰによって規定されたＴ細胞エピトープの特異的対立遺伝子変異体がドナーでは発現しないが、レシピエントでは疾患関連細胞のＨＬＡクラスＩ分子を介して発現し提示される場合、前記交換はコーディングＳＮＰによって規定される。
【０１２０】
癌細胞上の自己抗原を認識する腫瘍関連ＣＴＬが存在することは珍しいことではないので、腫瘍に対するＴ細胞免疫は、先に指摘したように、自然に起こる。しかし、ますます多くの抗原およびＴ細胞エピトープがあらゆるカテゴリーの腫瘍において標的であることが公表されるものの、治療上のＴ細胞応答は、通常、必要な最大応答が不足している。これは、感染、免疫化および腫瘍抗原に応答可能な機能的Ｔ細胞レパートリーが、自己抗原に対する免疫寛容を樹立し維持する機序によって形成されているからである。この状態を克服する１つの方法は、本願で提案するＨＬＡ適合個体のＴ細胞レパートリーを使用することである。
【０１２１】
正常組織に対する自己免疫攻撃の予防には、Ｔ細胞レパートリーの胸腺依存選択プロセス中に、自己抗原に対して高い親和性を有するＴ細胞受容体を発現するＴ細胞を除去する必要があることが一般に知られている。また、自己抗原に対する無応答性を樹立する胸腺以外の他の機序が記述され、両方のシステムが、自己に対する寛容性を誘導すると考えられる。多数の実験が、腫瘍抗原が成熟Ｔ細胞に遭遇すると、免疫学的無視(immunological ignorance)、アネルギーまたは物理的欠失(physical deletion)のために、寛容性が誘導されることが多いことを示している(Pardoll、1998、Nature Med.、４：525〜531、(Staveley等、1998)。寛容性の誘導は、腫瘍の免疫回避の原因になることさえあり、最終的に、in vitroおよびin vivoでの治療上の腫瘍特異的Ｔ細胞応答を生じさせる現在使用している方法がなぜ信頼できないように見えるかの理由となる。したがって、当分野で既知の数百個のＴ細胞エピトープに対応する60個以上の腫瘍抗原のほとんどが、ヒトにおける治療上の持続的な抗腫瘍免疫応答を誘導するのに有用でなかったことは意外ではない。
【０１２２】
自己抗原に先天的な一般的限界を克服するためには、患者の寛容性の状態を変えることが必要である。これは、現在、寛容性をもたらす機序についての知識が不十分なために不可能である。
【０１２３】
本発明では、現行の癌ワクチン接種戦略のこの一般的な弱点を、過去に患者の自己抗原に曝されたことによって欠損または寛容化されなかった細胞障害性Ｔ細胞集団を用いて克服する。このようなＴ細胞は、ＨＬＡ適合ドナーを通して利用可能であり、同種ＢＭＴ、または臍帯血もしくは動態化された(mobilized)血液幹細胞に基づく類似の治療を以前に受けたレシピエントではすでに存在する。
【０１２４】
同種ＢＭＴは、免疫寛容を無効にすることができる確立された方法ではあるが、同種ＢＭＴおよびまたは同種の幹細胞移植が、残余の疾患を一掃するのに役立つＴ細胞主体の免疫療法治療の基礎であることは別の知見である。同種応答の分子的背景が、ある程度明らかにされた。重要な知見の１つは、同種ＢＭＴを受けた患者が、この治療を利用しなかった患者よりも状態がはるかに良いことである。このＴ細胞による方法を用いた成果および治癒率は、癌の免疫療法において見られる最も印象的な結果の１つであり、本願は、この強力な機序に基づいている。
【０１２５】
臓器移植に関係するある種の条件下では、ドナーは、彼自身の免疫細胞に対する多型アミノ酸不一致Ｔ細胞エピトープを提示し、これは、血液幹細胞系を以前に交換しないことに留意されたい。
【０１２６】
同種抗原を、本発明による種の抗原性ペチズ(petides)またはタンパク質の対立遺伝子変異体として特定する一般的方法は、単一アミノ酸交換を検出する必要がある。この一般的方法は、
(i)障害に関係する組織、臓器またはそのサブセットにおいて独占的に発現または過剰発現されるタンパク質またはペプチドを規定するステップと、
(ii)前記種の１個または複数のＤＮＡライブラリーを含むデータベースを、前記規定されたペプチドもしくはタンパク質またはそのサブセットについてスクリーニングするステップと、
(iii)コード領域に少なくとも１個の単一核多型(single nucleic polymorphism)を含むＤＮＡ配列によってコードされた対立遺伝子ペプチド／タンパク質変異体、発現産物またはその断片のアミノ酸交換を特定し選択するステップと、
(iv)前記多型を含むアミノ酸残基を含むＴ細胞エピトープ(９量体〜16量体)エピトープを作製するステップと、
(v)ＭＨＣタンパク質複合体に結合する前記エピトープを特定するステップとを含む。
【０１２７】
組織、臓器、または患部組織を代表する細胞において独占的に発現または過剰発現される多型アミノ酸不一致ペプチドは、その各々が異なる疾患関連タンパク質に特異的である、タンパク質の対立遺伝子変異体を表す１個または複数の不一致アミノ酸の発現により特徴づけられる。前記複数は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも４、少なくとも６、少なくとも７、または少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも10個である。
【０１２８】
本発明によるアミノ酸不一致同種抗原は、ＡＭＬ、ＡＬＬ、ＣＭＬ、ホジキン病、リンパ腫、脊髄形成異常、再生不良性貧血、腎細胞癌、ＧＶＨＤ、宿主対移植片疾患などの複数のヒト疾患に特異的である。
【０１２９】
疾患に無関係な組織において発現され、ＨＬＡタンパク質と複合体を形成するタンパク質の対立遺伝子変異体の単一不一致アミノ酸は、ＧＶＨＤ誘導抗原と考えられる。
【０１３０】
これらのペプチドを患者にワクチンとして導入すると、レシピエントのＨＬＡ分子およびドナー由来のＡＰＣが(以前の同種ＢＭＴから生じた)ドナー由来のＴ細胞に対して抗原を提示する状態になる。ドナーＴ細胞は、ドナー血液幹細胞から増殖させ分化させても、あるいはドナーから直接採取し、レシピエントに導入してもよい(ドナーリンパ球注入(ＤＬＩ)として一般に知られている手順)。これらのＴ細胞は、患者において、ＨＬＡとして提示される抗原と遭遇すると容易に活性化される。あるいは、生体外でＴ細胞を刺激し患者に導入することも、活性化細胞障害性Ｔ細胞を産生する別の方法となり得る。一方、例えば寛容性の誘導に関係する病態は、患者の自己Ｔ細胞の適切な活性化を必要とする。
【０１３１】
本発明は、同種ＢＭＴを主体とする治療プロトコルの分子的基礎を提供し、現在適用されているが、現時点でより予測可能でより低毒性の方法で実施しているプロトコルによるものと類似した、またはそれよりも優れた治療免疫応答を誘導する抗原ペプチドおよび免疫療法プロトコルを規定する。ＨＬＡ適合ドナーのＴ細胞レパートリーを利用することによって免疫寛容を回避することが本発明の重要な要素である。同種ＢＭＴによってすでに示されたように、Ｔ細胞応答は、ＧＶＨＤおよびＧＶＴ反応の一部を形成する主要な不適合ＨＬＡタイプ以外の抗原に対するものである。
【０１３２】
疾患関連タンパク質における保存的単一アミノ酸交換の分析は、遺伝的に受け継がれた多型の一般的原理に基づき、多型タンパク質の状態に関して患者およびドナーの試験が必要である。本発明によるコーディングＳＮＰ同種抗原の定義は、各個体がメンデルの法則に従って、遺伝子の一方または他方または両方のコーディングＳＮＰ変異体を有し、タンパク質の所与の位置における一方または他方のアミノ酸を特徴とする一方または他方または両方の多型アミノ酸不一致タンパク質変異体を発現できることである。
【０１３３】
アミノ酸不一致同種抗原の対立遺伝子バージョンの診断は、変化したアミノ酸を含む発現産物、またはＨＬＡと複合化され単一アミノ酸置換を有する発現産物の断片の分析によって、あるいは対象から単離された生物学的試料をＳＮＰ改変核酸部分に特異的に結合する薬剤と接触させることによって実施することができる。ここで、ＳＮＰを含む核酸分子は、患部組織または臓器の細胞中で優先的にまたは単独で発現される。分析を実施するために、専門家は、コーディング単一核酸分子、相補的核酸、またはその断片を含む核酸分子からなる薬剤を調製し、標的遺伝子とのハイブリダイゼーション試験を実施する。あるいは、発現産物中の単一アミノ酸置換対立遺伝子変異体に結合する抗体も同様に使用することができる。ＨＬＡ分子とアミノ酸不一致対立遺伝子変異体の断片との複合体に結合する抗体薬剤も同様に使用することができる。選択した方法によれば、疾患関連組織または臓器または細胞に由来する試料を用いて、ＳＮＰ改変核酸分子の分析を実施することが特に有用である。タンパク質中の適切な治療に関係する単一不一致アミノ酸の診断および選択は、ドナーとレシピエントに対して同時に優先的に実施され、ＨＬＡタイピングなどの他の分子診断と容易に併用することができる。不適合を試験する強力なツールは、ＤＮＡアレイ形式でアッセイをアレンジすることによって作製することができる。
【０１３４】
また、本発明によれば、特定のドナーに由来する免疫細胞、すなわち前記アミノ酸における不適合ドナーからの特異的ＣＴＬは、レシピエントにおいて所与のペプチド位置にあるアミノ酸変異体を認識することができ、前記ペプチドを提示する前記細胞の標的に対して細胞障害性応答を誘導することができる。
【０１３５】
本発明によれば、いくつかの新しい抗原が検討されており、記述され、同種ＢＭＴおよびＧＶＴをさらに改良するのに使用できるだけでなく、患者を治療するのにも使用できる。レシピエント自身のＴ細胞レパートリーは、ＳＮＰによってコードされたアミノ酸である相同発現対立遺伝子バージョンに関してそれぞれ欠失して寛容であることが判明したので、ＨＬＡ適合ドナーのレパートリーは、ＨＬＡクラスＩ分子としてＴ細胞エピトープを特異的に認識し、提示細胞を死滅させるＣＴＬを異常に含む。これらのいわゆる同種拘束性ＣＴＬは、特異的ＳＮＰによって規定されたペプチドの不適合対立遺伝子バージョンを発現する腫瘍細胞を選択的に死滅させる。ＳＮＰによって規定されたＴ細胞エピトープが、限定された組織、臓器または腫瘍特異的発現パターンでタンパク質を提示する場合、腫瘍治療および他の病態一般の治療に本発明を適用することが想定される(envisible)。多数の選択的に発現される腫瘍抗原が文献に記載されているので、本発明の教示が、腫瘍または組織または臓器または細胞特異的に発現されると記述されているあらゆるタンパク質またはＤＮＡ配列に適用されることは当業者には明白である。
【０１３６】
白血病、リンパ腫および骨髄腫の造血性起源、含まれる疾患細胞のクローン起源、およびＣＤクラスタータンパク質(CD-clustered proteins)の限定された発現パターンは、新しい概念を実証するために特に有利である。白血病血球とＣＤクラスタータンパク質として知られるタンパク質の両方は、血液形成系、例えば血液幹細胞から生じる。このため、白血病、リンパ腫および骨髄腫は、本発明を利用して評価され治療される特に適切な疾患である。白血病、リンパ腫および骨髄腫治療を特に有望なものにしている別の態様は、同種ＢＭＴによって、患者の完全な骨髄幹細胞由来の造血系がドナー血液由来の幹細胞または骨髄幹細胞で置換され、次いで、関与するリンパ球を含めた将来のすべての血球が作られるという事実である。
【０１３７】
癌起源の疾患の中でも、白血病は、本発明による治療に好ましい疾患グループであり、このグループの中でも、ＣＭＬ患者は治療を受けると最も効果が期待される。一方、ＡＭＬおよびＡＬＬの治療は、第２の選択であるが、リンパ腫よりは好ましい。非血液系疾患のなかでも、ＲＣＣは第１の治療標的であり、メラノーマは本発明によって治療されるもう１つの疾患である。
【０１３８】
本発明によれば、本発明者らは、同様に、まだ未開拓な固有の抗原分子可変性を用いて、同種抗原に対する新しい一般化されたキャラクタリゼーション方式を教示し、新しい同種抗原を規定し、ＧＶＨＤの回避とＧＶＴ反応の強化に関して同種抗原に関係する免疫応答を精査する。本発明は、必要を満たし、有効な抗癌ワクチンを開発するのに不可欠であり、レシピエントにおける骨髄および固形臓器移植片の長期の移植片生着、癌の診断など関係する利点を提供する。
【０１３９】
本発明の特定の実施形態は、単一アミノ酸交換をコードする遺伝子の対立遺伝子変異体、およびより一般的な同種抗原の特定に関係する。前記方法は、
a)所与の組織、臓器または疾患を引き起こす細胞タイプにおいて選択的に発現され、または過剰発現され、正常な疾患に関係しない組織または臓器においては一般にさほどまたはまったく発現されない、関連遺伝子および対応するタンパク質のスクリーニング。
【０１４０】
b)a)によってあらかじめ選択された遺伝子を、既知のＳＮＰについてスクリーニングする。ここで、個々の遺伝子のコーディング単一ヌクレオチド変化は、パブリックドメインで現在アクセス可能であり、または市販されている１個または複数のＳＮＰデータベースから直接得ることができる。
【０１４１】
c)a)によってあらかじめ選択された、ＤＮＡデータベースに既知のＳＮＰ相関がない遺伝子を、相同ＤＮＡ配列を比較し、ＢＬＡＳＴなどのアラインメントプログラムを用いて遺伝子およびタンパク質多型に代表的な可変位置を検出することによってスクリーニングする。
【０１４２】
d)所望の遺伝子を網羅するＥＳＴ配列／タンパク質配列のアラインメントなどの間接的な方法の実施による、未知のＳＮＰを有する多型遺伝子の特定。ここで、様々なＥＳＴデータベースは、同一の配列ストレッチ、重複または部分的に同一なＤＮＡ配列ストレッチに関する配列情報の重複性をもたらし、配列アラインメント技術および対応する遺伝子の注釈(annotation)を用いてＳＮＰを特定することが可能である。
【０１４３】
e)方法a〜d)によってあらかじめスクリーニングされた遺伝子およびまたはタンパク質を有する疾患関連ＳＮＰを、それらの臓器およびまたは組織分布を測定することによって検証する。
【０１４４】
f)完全長で、またはそれよりも短いペプチド断片として特定されたペプチドが、Ｔ細胞を刺激し、異なる主要なＨＬＡクラスＩおよびまたはＨＬＡクラスII分子に対してＴ細胞エピトープまたは入れ子エピトープを含むペプチドを配置し、対応するペプチドを使用してＴ細胞を刺激または抑制することができるかどうかを判定する。
【０１４５】
本発明で想定される診断適用例は、癌およびまたはＢＭＴ、幹細胞および臓器移植であるが、これらだけに限定されない。
【０１４６】
適切なドナーまたはレシピエントを検出可能な様々な技術を、さらに詳細に示す特異的核酸配列の増幅またはタンパク質もしくはペプチドに基づいて使用することができる。
【０１４７】
一実施形態によれば、本発明は、前記対立遺伝子、特に個々の遺伝子の対立遺伝子のｃＤＮＡまたはゲノム核酸中の多型ヌクレオチドの検出を含み、試料中のＣＤクラスター抗原の対立遺伝子を分類する方法に関係する。
【０１４８】
優先的な実施形態においては、前記分類方法は、ゲノムのＤＮＡタイピング方法である。あるいは、前記方法を、ｃＤＮＡタイピング方法とすることもできる。
【０１４９】
a)試料中のゲノムポリ核酸を少なくとも一対のプライマーと接触させ、それによって前記プライマー対が、前記対立遺伝子中の多型ヌクレオチドを含むフランキング領域に特異的にハイブリダイズし、増幅反応を実施するステップ。
【０１５０】
b)前記少なくとも一対のプライマーの各々について、ステップa)で増幅産物が形成されたかどうかを検出するステップ。
【０１５１】
c)ステップb)の結果から前記試料中に存在するＳＮＰ対立遺伝子を推測するステップ。
【０１５２】
好ましい実施形態によれば、本発明は、上述した方法に関係し、さらに、ＳＮＰによって規定された同種抗原の前記対立遺伝子がドナー対立遺伝子とレシピエント対立遺伝子で異なることを特徴とする。
【０１５３】
ヒトゲノムのＳＮＰ可変性によれば、所与の個体は、彼の両親から受け継いだ所与の遺伝子の２個のコピーを有する。これらのコピーは、受け継いだ対立遺伝子の異なる対または類似の対であってもよく、したがって、専門家は、ｍＲＮＡをテンプレートとして用いたＲＴ−ＰＣＲ、またはゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いた標準ＰＣＲを常法に従って使用して、ＳＮＰによってコードされた本発明の対立遺伝子アミノ酸変異体を診断できることを理解する。
【０１５４】
正常な遺伝プログラムを有する血球、または血液癌細胞の場合に見られるような異常な発現パターンを有する血球はすべて、それらの細胞表面上に正常な白血球によって発現される一般的な様々な分子を有する。白血球細胞表面の系列マーカーおよび追加の分化マーカーは、常法に従って抗白血球モノクローナル抗体を用いて検出され、抗原は、それらを分化(ＣＤ)抗原のクラスターに割り当てることによって系統的に命名される。このシステムに関するいくつかの情報源が、インターネットで利用可能である。関係者のための好ましいウェブサイドは、
http://www.vetmed.wsu.edu/tkp/Search.asp
である。
【０１５５】
白血球表面分子の正式名称の広く受け容れられている規準、および血液幹細胞が血液癌細胞を含めたすべての血球の共通した起源を形成しているという事実によって、ＣＤ抗原は、本発明による理想的な候補抗原になっている。また、同種幹細胞移植を必要とする患者において、レシピエントの完全に独自の免疫および血球系は除去する必要があることから、異常な血球系であるすべての細胞は、新しい造血系を構築する過程全体を通してドナー由来の幹細胞系で最終的に置換される。この点で、ＣＤ抗原は、単一「器官」であり、本発明の発明概念を実施するのに極めて役に立つ。
【０１５６】
本発明は、現行のＣＤ系で利用可能な数百の既知の白血球タンパク質の中から、あるタイプの血液由来の癌に最も代表的なものを選択する方法を教示する。特異的ＣＤ抗原、および疾患とそれらとの相関は、当分野の専門家によって例として与えられ、認められ、使用されている。あらかじめ定義されたＣＤタンパク質の分析は、白血病およびリンパ腫を診断し、段階づける現在の基礎を成している。しかし、主として、本発明は、本願に記載するあらかじめ選択された白血球抗原に限定されず、さらにあらゆる組織、または選択的に発現されるタンパク質もしくはタンパク質グループも同様に想定できることを理解することは重要である。
【０１５７】
この点で、本発明は、可溶性同種抗原の多型部分を特徴づけ、コーディングＳＮＰによって分子レベルで規定される免疫原性アミノ酸交換を含むＣＤタンパク質を提供する。疾患に典型的であり、アミノ酸交換を含む同種抗原として適格な前記ＣＤタンパク質を表２にまとめた。本願で与える一般的な教示によって、当業者は、当分野で既知の同種抗原、または当分野ではまだ開示されていない、もしくは本明細書には記載されていない追加の新しい同種抗原を規定することができ、したがって、本発明は、表２〜５の選択された同種抗原およびＴ細胞エピトープに限定されない。
【０１５８】
一実施形態においては、本発明によって規定される可溶性同種抗原は、すでに同種移植された患者において免疫応答を誘導する。第２の実施形態においては、抗原は、ＨＬＡ−分子として提示されると、細胞溶解作用を引き起こす。免疫化および細胞溶解の誘導に特に有用なアミノ酸配列を、表３〜５に列挙した配列およびそれらの変異体からなる群から選択することができる。しかし、先に述べたように、同種抗原のプロセシングは、in vivoで極めて変わりやすく、交換を示すアミノ酸のＮ末端およびまたはＣ末端の伸長は、列挙した配列からかなり変わり得る。当分野の専門家は、ＨＬＡ可変性を解析し、その可変性をＨＬＡ結合ペプチドレベルおよびＨＬＡ結合ペプチド予測レベルで相関させる方法を知っている。
【０１５９】
別の実施形態においては、本発明によって規定される可溶性同種抗原は、患者において免疫寛容の誘導に必須な免疫応答を誘導する。免疫寛容の誘導は、多型として定義される、肺、肝臓、腸、関節など様々な組織および臓器で広範に発現される抗原関連ＧＶＨＤに特に有用である。免疫化および寛容性の誘導に特に有用なアミノ酸配列を、表１Ａ、Ｂに列挙したｍＨＡｇ配列および表６に列挙したＨＬＡ配列およびそれらの変異体からなる群から選択することができる。ＨＬＡ抗原は、当分野で既知であり、同種免疫反応をもたらす主要な抗原として定義される。また、分子内の抗原性ストレッチは十分に記録されており、様々な種類の検出薬剤が利用可能である。それにもかかわらず、本発明は、ＨＬＡ分子を記載している。それは、表６に列挙したエピトープは、一般にＨＬＡ分子の適合に使用される超可変抗原領域の外側のタンパク質領域から選択されたからである。したがって、これらの抗原は、本発明によって規定されるＳＮＰによってコードされたアミノ酸交換とみなされる。Ｔ細胞エピトープは、一般に、幹細胞および臓器移植に関係するＧＶＨＤを防止するのに使用される。
【０１６０】
別の実施形態においては、免疫原性アミノ酸交換を含む同種抗原は、本発明のポリペプチド、とりわけ、単離核酸分子をコードするＤＮＡ配列、これらの分子を含む発現ベクター、およびこれらの分子で形質転換された宿主細胞、またはこれらの分子を形質移入した宿主細胞を特徴とする。
【０１６１】
本発明は、単離タンパク質、ペプチド、ならびにこれらのタンパク質およびペプチドに対する抗体、ならびにこれらのタンパク質およびペプチドを認識するＣＴＬも提供する。上述の機能的断片を含めた断片および変異体も提供する。さらに上述の分子を含むキットも提供する。上述のものを、１個または複数の癌関連同種抗原の発現を特徴とする病態の診断、モニタリング、研究または治療に使用することができる。本発明以前には、ｍＨＡｇ関連遺伝子などの少数の同種抗原遺伝子しかこれまでに特定されていなかった。
【０１６２】
別の態様においては、本発明は、本発明による第１およびまたは第２のＴ細胞エピトープ、あるいは、本発明によるポリペプチドおよび既知の腫瘍抗原、または本発明のエピトープを免疫原性にする異質なエピトープを含む融合タンパク質を提供する。
【０１６３】
本発明は、単一の材料、複数の異なる材料、さらには大きなパネルの材料、および材料の組合せを使用するものである。例えば、ＳＮＰを含む単一の遺伝子、前記遺伝子によってコードされた単一のタンパク質、その単一の機能的断片、それに対する単一の抗体などを、本発明の方法および産物に使用することができる。同様に、対、グループ、さらにこれらの材料のパネル、場合によっては他の癌関連同種抗原遺伝子およびまたは遺伝子産物または従来の腫瘍抗原を、診断、モニタリングおよび治療に使用することができる。対、グループまたはパネルは、２、３、４、５もしくはそれ以上の遺伝子、遺伝子産物、その断片、またはこのような材料を認識する薬剤を含むことができる。複数のこのような材料は、ＳＮＰによってコードされた改変遺伝子産物を発現する細胞をモニタリングし、分類し、その特性を明らかにし、診断するのに有用なだけでなく、そのような材料の多くは治療に使用することもできる。
【０１６４】
この例は、そのような遺伝子を発現している、または将来発現する細胞における癌の予防または急性の予防、発症の遅延、寛解などへの複数のこのような材料の使用である。遺伝子、遺伝子産物、ならびにこれらの遺伝子および遺伝子産物を認識するあらゆる材料、およびそのすべての組合せを、本発明によって使用するために試験し、特定することができる。このようなすべての組合せを列挙することはあまりにも冗長すぎ、当業者は、特に本明細書の教示を考慮し、状況に応じて最も適切な組合せを容易に決定することができる。
【０１６５】
以下の考察から明らかなように、本発明は、治療、診断、モニタリングおよび研究目的も含めて、in vivoおよびin vitroでの用途を有する。本発明の一態様は、例えば、このような遺伝子産物の発現を定量することによって、本発明によって特定されたいくつかの遺伝子を発現する細胞をフィンガープリントする能力である。このようなフィンガープリントは、例えば、癌治療用の動物モデルにおいてＧＶＴおよびＧＶＨＤの効果を予測するために特徴的なものである。細胞をスクリーニングして、このような細胞が本発明によって特定されたＳＮＰ改変遺伝子を発現するかどうかを判定することもできる。
【０１６６】
本発明は、一態様においては、コーディングＳＮＰを含む核酸分子によってコードされた、治療に関連する同種抗原および癌関連抗原を診断する方法である。この方法は、患者から単離された生物学的試料を、コーディングＳＮＰを含む核酸分子、その発現産物、またはＭＨＣ分子、好ましくはＨＬＡ、分子と複合化されたその発現産物断片に特異的に結合する薬剤と接触させるステップを含む。ここで、コーディングＳＮＰによって規定される分子を、核酸分子の形で表１〜６に列挙された同種抗原から選択し、薬剤と、コーディングＳＮＰを含む核酸分子、その発現産物、またはその発現産物の断片との相互作用を明らかにするために使用することができる。
【０１６７】
別の態様は、コーディングＳＮＰを含む核酸分子によってコードされた、治療に関連し癌に関連する同種抗原を診断する方法である。この方法は、ＢＭＴの適切なドナーとみなされる対象から単離された生物学的試料を、コーディングＳＮＰを含む核酸分子、その発現産物、またはＭＨＣ分子、好ましくはＨＬＡ、分子と複合化されたその発現産物断片に特異的に結合する薬剤と接触させるステップと、薬剤と、コーディングＳＮＰを含む核酸分子、その発現産物、またはその発現産物の断片との相互作用が明らかにするステップを含み、ここで、コーディングＳＮＰを含む核酸分子は、核酸分子の形で表１〜６に列挙された同種抗原から選択される。別の実施形態においては、コーディングＳＮＰまたはそのペプチド断片を含む核酸分子を、抗体を用いて検出することができる。ＭＨＣ分子、好ましくはＨＬＡ、分子と複合化された単一アミノ酸改変発現産物の断片は、抗体を用いて検出することができ、あるいは、ＨＬＡ複合化ペプチドを、細胞の診断および活性化または阻害に直接使用することができる。
【０１６８】
障害は、コーディングＳＮＰ改変遺伝子を含む複数の癌関連抗原前駆体の発現を特徴とすることがある。したがって、診断方法は、(本明細書に開示された少なくとも１個の癌関連抗原前駆体を含めた)抗原前駆体を含む異なるヒト癌関連ＳＮＰにその各々が特異的である複数の薬剤の使用を含むことができる。ここで、前記複数の薬剤は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも10個のこのような薬剤である。上記実施形態の各々において、薬剤は、本明細書に開示された腎臓および血液由来の癌関連抗原前駆体を含めたヒト疾患優先的癌関連抗原前駆体に特異的であり得る。
【０１６９】
本発明は、別の態様においては、表１〜６に列挙した同種抗原から選択されるＳＮＰを含む核酸分子によってコードされるタンパク質の発現を特徴とする病気の軽減、進行または発症を判定する方法である。この方法は、その病気に罹った対象または罹患の疑いがある対象から得られた試料を、前記病気の軽減、進行または発症の判定因子(determination)として、(i)タンパク質、(ii)そのタンパク質に由来するペプチド、(iii)そのタンパク質またはペプチドに選択的に結合する抗体、および(iv)そのタンパク質に由来するペプチドとＭＨＣ／ＨＬＡ分子の複合体に特異的な細胞溶解性Ｔ細胞、からなる群から選択されるパラメータについてモニタリングするステップを含む。一実施形態においては、試料は、体液、体からの浸出液、または組織である。別の実施形態においては、モニタリングステップは、試料を、(a)(i)のタンパク質または(ii)のペプチドに選択的に結合する抗体、(b)(iii)の抗体に結合するタンパク質またはペプチド、および(c)(iv)のペプチドとＭＨＣ分子の複合体を提示する細胞、からなる群から選択される検出可能な薬剤と接触させるステップを含む。好ましい実施形態においては、抗体、タンパク質、ペプチドまたは細胞は、放射性標識、酵素などの検出可能な分子で標識されている。好ましい実施形態における試料は、ペプチドについて評価される。
【０１７０】
さらに別の実施形態においては、タンパク質は複数のタンパク質であり、パラメータは複数のパラメータであり、複数のパラメータの各々は異なる複数のタンパク質に特異的である。
【０１７１】
本発明は、別の態様においては、ヒト対象用医薬製剤である。医薬製剤は、対象に投与するとＨＬＡ分子とコーディングＳＮＰ改変ヒト癌関連同種抗原との複合体の存在を選択的に高める薬剤、および薬剤的に許容される担体を含む。ここで、ヒト癌関連同種抗原は、表１〜６に列挙した同種抗原から選択されるコーディングＳＮＰを有する核酸分子を含む核酸分子によってコードされるヒト癌関連同種抗原前駆体の断片である。
【０１７２】
一実施形態においては、核酸分子は、表１〜６に列挙した本発明の同種抗原を含む核酸分子である。一実施形態における薬剤は、対象において、ＨＬＡ分子と、異なるＳＮＰによってコードされたヒト癌関連同種抗原との複合体をその各々が選択的に富化する複数の薬剤を含む。この複数は、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個または少なくとも５個の異なるこのような薬剤であることが好ましい。別の実施形態においては、薬剤は、(１)ヒト癌関連同種抗原、またはその機能的変異体を含む単離ポリペプチド、(２)この単離ポリペプチドまたはその機能変異体を発現するためのプロモーターに作動可能に結合した単離核酸、(３)この単離ポリペプチドまたはその機能変異体を発現する宿主細胞、および(４)このポリペプチドまたはその機能変異体とＨＬＡ分子の単離複合体、からなる群から選択される。薬剤は、単離ポリペプチドを発現する細胞とすることができる。
【０１７３】
一実施形態においては、薬剤は、ヒト癌関連同種抗原またはその機能的変異体を含む単離ポリペプチドを発現する細胞である。別の実施形態においては、薬剤は、ヒト癌関連同種抗原またはその機能的変異体を含む単離ポリペプチドを発現する細胞であって、この細胞は、このポリペプチドに結合するＨＬＡ分子を発現する。この細胞は、ポリペプチドおよびＨＬＡ分子の一方または両方を組換え変異体として発現することができる。好ましい実施形態においては、この細胞は非増殖性である。
【０１７４】
さらに別の実施形態においては、薬剤は、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、または少なくとも５個の異なるポリペプチドであり、それぞれ異なるヒト癌関連同種抗原またはその機能変異体である。
【０１７５】
他の実施形態においては、薬剤は、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、または少なくとも５個の、アミノ酸変化を代表する異なるこのようなポリペプチドに選択的に結合する複数の異なる薬剤である。上述の実施形態の各々においては、薬剤は抗体とすることができる。別の態様においては、本発明は、本発明の上述の組成の薬剤と治療薬または診断薬との複合物で構成される組成物(composition of matter)である。この複合物は、この薬剤と、抗悪性腫瘍薬である治療薬または診断薬の複合物であることが好ましい。
【０１７６】
本発明は、別の態様においては、医薬組成物であり、表２〜６から選択される単離核酸分子、および薬剤的に許容される担体を含む。一実施形態においては、単離核酸分子は、表３およびまたは４から選択される１個の分子である。別の実施形態においては、単離核酸分子は、異なる癌関連同種抗原を含む２個の異なるポリペプチドをコードする少なくとも２個の単離核酸分子を含む。この医薬組成物は、単離核酸分子に作動可能に結合したプロモーターを有する発現ベクターも含むことが好ましい。別の実施形態においては、この医薬組成物は、単離された組換え核酸分子を発現する宿主細胞も含む。本発明の別の態様によれば、医薬組成物が提供される。この医薬組成物は、単一の同種抗原を表す表２〜６から選択される単離ポリペプチド、および薬剤的に許容される担体を含む。一実施形態においては、この単離ポリペプチドは、同種抗原である。別の実施形態においては、この単離ポリペプチドは、それぞれが本明細書に開示されたＳＮＰ改変遺伝子によってコードされる異なる癌関連同種抗原を含む少なくとも２個の異なるタンパク質である。ある実施形態においては、本明細書に記載される医薬組成物の各々はアジュバントも含む。
【０１７７】
別の実施形態においては、表２〜６から選択される断片は、少なくとも、８ヌクレオチド、10ヌクレオチド、12ヌクレオチド、14ヌクレオチド、16ヌクレオチド、18ヌクレオチド、20、ヌクレオチド、22ヌクレオチド、24ヌクレオチド、26ヌクレオチド、28ヌクレオチド、ヌクレオチド、50ヌクレオチド、75ヌクレオチド、100ヌクレオチド、200ヌクレオチド、1000ヌクレオチド、およびこれらの間のあらゆる整数長のサイズである。さらに別の実施形態においては、分子は、ヒトＨＬＡ受容体またはヒト抗体に結合するポリペプチドまたはその断片をコードする。本発明の別の態様は、プロモーターに作動可能に結合した上述の本発明の単離核酸分子を含む発現ベクターである。一態様によれば、本発明は、プロモーターに作動可能に結合した核酸を含む発現ベクターである。ここで、この核酸はＳＮＰ改変分子である。別の態様においては、本発明は、ＳＮＰ改変分子、およびＭＨＣ分子、好ましくはＨＬＡ分子をコードする核酸を含む発現ベクターである。さらに別の態様においては、本発明は、上述の本発明の発現ベクターで形質転換された、またはこの発現ベクターを形質移入した宿主細胞である。別の態様においては、本発明は、プロモーターに作動可能に結合した上述の本発明の単離核酸分子を含む発現ベクター、またはプロモーターに作動可能に結合した、ＳＮＰ改変分子である核酸を含み、ＨＬＡをコードする核酸をさらに含む発現ベクターで形質転換された、またはこれらの発現ベクターを形質移入した宿主細胞である。
【０１７８】
別の態様においては、本明細書に記載する核酸、およびそれによってコードされるポリペプチドを調製する方法を提供する。一部の実施形態においては、これらの方法は、宿主細胞を培養するステップと、宿主細胞または培地から核酸またはポリペプチドを単離するステップとを含む。別の実施形態においては、これらの方法は、ウサギ網状赤血球またはコムギ胚芽抽出物の無細胞転写およびまたは翻訳溶解物などの核酸の転写およびまたは翻訳用の非細胞系を用意するステップを含む。しかし、本発明によるタンパク質産生に利用可能な最も進んだ系は、Roche Diagnosticsによって供給される「細胞工場(cell factory)」システムを利用したものである。本発明の別の態様においては、これらの方法は、核酸または発現ベクターを非細胞系に導入するステップと、核酸の転写または翻訳に十分な条件下でこの系をインキュベートするステップと、非細胞系から転写された核酸または翻訳されたポリペプチドを単離するステップとを含む。本発明の別の態様によれば、上述した本発明の単離核酸分子によってコードされる単離ポリペプチドが提供される。本発明は、免疫原性である、表１〜６に列挙した分子から選択されるポリペプチドの断片も含む。一実施形態においては、この断片、またはこの断片の一部は、ＨＬＡまたはヒト抗体に結合する。本発明は、別の態様においては、ＨＬＡまたはヒト抗体に結合する、またはその一部がＨＬＡまたはヒト抗体に結合するヒト癌関連抗原前駆体の単離断片を含む。ここで、この前駆体は、表１〜６にまとめて列挙した分子から選択されるコーディングＳＮＰを含む核酸分子によってコードされる。一実施形態においては、この断片は、ＨＬＡとの複合体の一部である。別の実施形態においては、この断片は、８〜12アミノ酸長である。別の実施形態においては、本発明は、ヒトゲノムに独特な配列を表すのに十分な長さのポリペプチド断片を含み、ヒト癌関連抗原前駆体であるポリペプチドを特定する単離ポリペプチドを含む。本発明の別の態様によれば、癌関連同種抗原前駆体の発現の存在を検出するキットが提供される。このキットは、遺伝子の両方の対立遺伝子バージョンに代表的な一対の単離核酸分子を含む。
【０１７９】
本発明によって想定される別の手法においては、免疫細胞は、同種抗原の免疫原性アミノ酸交換を表す表２〜５から選択される列挙された分子から選択されるペプチドを用いたリンパ球の培養によってin vitroで産生することができる。ここで、対立遺伝子バージョンは、患者の腫瘍細胞によって発現されるバージョンに対応する。このような手順による同種抗原を使用することによって、同種反応性腫瘍特異的Ｔ細胞の集団をそのまま残して、単一アミノ酸変化を含む単一抗原を認識するドナー細胞障害性Ｔ細胞およびヘルパーＴ細胞を、予期される宿主の組織適合性抗原に対するＴ細胞の反応を防止する方法によって、in vitroで産生することができる。組織適合性同胞がいる患者にもいない患者にも使用できる別の手法は、骨髄を切除することなく、本発明によって規定されるＧＶＨＤ誘導同種抗原に対する免疫抑制を引き起こす、十分我慢のできる(well-tolerated)コンディショニング療法を含む。
【０１８０】
これらの手順は、固形腫瘍、固形臓器移植を含めた他の適応症に対して非骨髄破壊的幹細胞移植を使用した最近報告された臨床試験をかなり改善することができる。この手法を、例えば癌治療に使用するときには、レシピエントが拒絶しないＴ細胞枯渇造血幹細胞をレシピエントに与え、続いて、同種抗原認識に関して慎重に刺激されたドナーＴ細胞(または腫瘍特異的Ｔ細胞)を徐々に多量に投与する。この手法を通して、Ｔ細胞の抗腫瘍反応性を高めるために、生体外(ex vivo)またはその場(in situ)で同種抗原を表２〜５から選択したペプチドで免疫原性アミノ酸交換したＨＬＡ結合ペプチドを利用して、ドナーＴ細胞を増やすことが特に有用である。養子免疫治療目的に十分な数のＣＴＬを得ることができ、要するに、これによって、ＧＶＨＤを誘導するリスクを最小限に抑えて、ＢＭＴ後に再発した白血病を治療する新規療法が可能になる。
【０１８１】
単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子などの当分野で既知の自殺遺伝子を挿入することによって、(単一アミノ酸改変を認識する)同種抗原特異的ドナーリンパ球をin vitroで操作することも可能である。これによって、医師は、抑制されていない移植片対宿主病の患者において注入されたリンパ球を破壊することが可能になる。
【０１８２】
別の手法は、腫瘍細胞上のみで想定される単一アミノ酸改変抗原に対するドナーＴ細胞の初回抗原刺激のために、ＧＶＨＤを増悪することなくＧＶＴ活性を増加させる、レシピエント限定単一アミノ酸改変癌同種抗原ワクチンを用いた、同種ＢＭＴドナーの移植前の免疫化を含む。要約すると、本発明は、ＢＭＴおよび他の移植関連処置に関係する毒性および死亡率を回避するのに役立つ。
【０１８３】
同種抗原によるワクチン接種を必要とする状況は、腫瘍の苦しみが少ないことと、腫瘍の苦しみがより大きい場合には腫瘍特異的Ｔ細胞を用いた養子移入とによって優先的に特徴づけられる。しかし、腫瘍ＣＴＬエピトープを含むワクチンによる免疫化の結果は、エピトープ送達様式に大きく左右される。驚くべきことに、ＭＨＣクラスＩ結合ペプチドを用いたワクチン接種は、免疫ではなく、腫瘍の成長促進に関連するＣＴＬ寛容性を引き起こす恐れがある。これらの結果は、ＧＶＨＤ誘導同種抗原に対する寛容性を惹起するワクチン接種の可能性を示唆している。一方、寛容性が惹起されるのを防止するために、ＡＰＣの調節は、免疫化に対する応答性を高める有望な戦略である(Sotomayor、1999)。同種抗原を用いた有用な免疫化プロトコルの詳細な説明を、本発明の実験の部分に開示する。
【０１８４】
ＨＬＡ遺伝子型同一移植のレシピエントに関して、同種抗原の不一致は、本発明によって、ＳＮＰによってコードされたアミノ酸交換を有するものと定義される。ＳＮＰによって規定された同種抗原遺伝子座のゲノムは、対立遺伝子特異的ＰＣＲ法によって特定することができる。ドナーとレシピエントの相違は、一般に、２個の異なるプライマーセットによって分析される。各プライマーセットは、対立遺伝子特異的プライマーと共通のプライマーからなり、両方のプライマーセットはイントロン配列を含むことができる。
【０１８５】
予測される対立遺伝子特異的産物は、すべての場合で、生化学的方法、ＣＴＬによる抗体、またはＲＴ−ＰＣＲによって検出される、ＳＮＰによってコードされたアミノ酸交換と相関し得る。本発明を通して示すように、ＳＮＰによってコードされる新しい別の同種抗原の特定は、ＳＮＰによってコードされた同種抗原対立遺伝子の有望なゲノムタイピングとして使用することができ、ドナー選択を改善し、ＢＭＴレシピエントのＧＶＨＤのリスクが高いか低いかを判定し、ＧＶＴの改善されたＢＭＴレシピエントを特定する。この目的に従うＳＮＰは、配列特異的方法で、ハイブリダイゼーション、プライマー伸長法、またはＤＮＡ連結手法を用いて検出することができる。当業者は、下記適切な手法を選択し、個々の手法に特有の標準操作手順に従って抗原分析を実施する。
【０１８６】
１．ハイブリダイゼーション手法は、完全に一致するときにのみ標的配列にハイブリダイズする２個の対立遺伝子特異的プローブを基にしている。最適化されたアッセイ条件では、一塩基不一致は、対立遺伝子プローブが標的配列にアニールされるのを防止するのに十分なほどハイブリダイゼーションを不安定化する。対立遺伝子特異的プローブを固体担体に固定すると、標識標的ＤＮＡ試料が捕捉され、未結合標的の洗浄除去後に標識を検出することによって、ハイブリダイゼーション現象を可視化できる。
【０１８７】
２．プライマー伸長法は、別の極めて堅牢な対立遺伝子識別機序である。これは、極めて適応性が高く、最少のプライマー／プローブしか必要としない。プローブ設計およびアッセイの最適化は、通常極めて簡単明瞭である。テンプレートＤＮＡの配列に相補的な特定のデオキシリボヌクレオシドを取り込むＤＮＡポリメラーゼの能力に基づいたプライマー伸長手法には多数の種類があるが、２つのカテゴリーにグループ分けすることができる。
【０１８８】
より詳細には、標的ＤＮＡ中の多型塩基の同定は、対立遺伝子特異的ヌクレオチドを組み込み、その後配列を決定することによって求められる。対立遺伝子特異的ＰＣＲ手法を用いて、ＰＣＲプライマーが標的ＤＮＡ配列に対して完全に相補的である場合のみ、ＤＮＡポリメラーゼを使用して標的ＤＮＡを増幅させる。いくつかの独創的な方法が均質アッセイにおけるプライマー伸長法産物分析に考案された。これらの手法のほとんどは、新規な類似の核酸(nucleic acid analogous)と、出発試薬とプライマー伸長法産物の物理的性質の重要な差のモニタリングとの組合せである。対立遺伝子特異的ＰＣＲ手法は、その３'末端がテンプレートに対して完全に相補的であるときにのみプライマーを伸長させるＤＮＡポリメラーゼに依拠している。この条件が満たされたときに、ＰＣＲ産物が産生される。ＰＣＲ産物が産生されるかどうかを明らかにすることによって、標的ＤＮＡ上の対立遺伝子を推測することができる。いくつかの革新的手法が、ホモジニアスアッセイにおいて特異的ＰＣＲ産物の形成を検出するために利用された。一部は融解曲線分析に基づき、一部は標的特異的プローブのハイブリダイゼーションに基づく。この手法の変形手法は、対立遺伝子特異的プライマー伸長法である。ここでは、多型部位を含むＰＣＲ産物はテンプレートとして働き、プライマー伸長プローブの３'末端は、対立遺伝子塩基からなる。プライマーは、３'塩基が標的ＤＮＡ中の対立遺伝子を補完する場合にのみ伸長される。したがって、プライマー伸長現象をモニタリングすることによって、ＤＮＡ試料中の対立遺伝子を推測することができる。
【０１８９】
ＤＮＡリガーゼは、ＤＮＡ分子中のニックを極めて特異的に補修する。２個の隣接するオリゴヌクレオチドがＤＮＡテンプレートにアニールされるときには、オリゴヌクレオチドがその結合部においてテンプレートに完全に合致する場合にのみ連結される。したがって、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、多型部位における塩基の特性を調べる。標的ＤＮＡ中の対立遺伝子を、連結が起きたかどうかを確認することによって推測することができる。連結は、最も高いレベルの特異性を有し、すべての対立遺伝子識別機序の中で一番最適化が容易であるが、最も遅い反応であり、最も多い改変プローブを必要とする。しかし、一機序としての連結は、あらかじめＰＣＲによって標的を増幅することなく、遺伝子型を決定できる潜在的可能性がある。
【０１９０】
ポジティブな対立遺伝子反応産物は、産物が形成されたときに放出される光をモニターすることによって、または産物の質量を測定することによって、または電気的性質の変化を検出することによって検出される。
【０１９１】
用語解説
以下の定義は、以後頻繁に使用するある用語の理解を容易にするためのものである。
【０１９２】
同種反応性は、Ｔ細胞によって特異的に認識される、個体間で異なる多型Ｔ細胞エピトープを記述するために使用される用語である。
【０１９３】
本明細書で使用する「抗体」は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、キメラ、単鎖、およびヒト化抗体、ならびにＦａｂの産物を含めたＦａｂ断片、または他の免疫グロブリン発現ライブラリーなどである。
【０１９４】
「ＣＤタンパク質」は、細胞の正常な遺伝的プログラムによって、または異常な病的発現パターンによって産生される系列特異的細胞表面マーカーである。ＣＤタンパク質は、一般に造血性起源に由来する細胞に割り当てられる。これらの細胞マーカーは、科学的コンセンサスによって分化の群別化(ＣＤ)を規定する標準命名法に従って命名される。ＣＤタンパク質は、蛍光性標識、単一特異的免疫試薬、および細胞集団をカウントし分析するフローサイトメーターを組み合わせたプロセスによって検出される。次いで、細胞を、サイズ、マーカー反応性、クローン性および比率によって分類する。この手順は、診断、予後、残余の疾患評価、治療モニタリング、ならびに白血病、リンパ腫および関係する病態のケースマネージメントにおいて臨床的に広く使用されており、当業者には周知である。様々な組織および体液を分析することができる。解釈の質および臨床的有用性を確保するために、すべての細胞数測定データは、試料の微視的検査に照らして解釈される。
【０１９５】
癌マーカーの「免疫フェノタイピング」は、通常、２段階の染色手順を含む。第１段階では、先に列挙したステップ抗原特異的ネズミｍＡｂを細胞に添加する。ｍＡｂの結合を、ＦＩＴＣ複合抗マウスＩｇ抗血清を用いた免疫蛍光技術によって評価する。抗原の分布を、フローサイトメトリーおよびまたは光学顕微鏡によって分析する。免疫タイピングの結果は、一般に試料受け入れ後24時間以内に入手でき、細胞数測定マーカー割合が提供される。関連があるときには、形態的およびマーカー発現レベル(強度)も評価し記述することができる。抗原発現強度は、継代間で異なることがあり、細胞培養条件に影響されることがある。
【０１９６】
「単離された」とは、その自然の状態から「人の力で」変えられたこと、すなわち、自然に存在する場合、その本来の環境から変化または移動、あるいはその両方がされたことを意味する。この用語を本明細書で使用するところによると、例えば、生きている生物に自然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離されて」いないが、その自然の状態で共存する材料から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離されている」。さらに、形質転換、遺伝子操作または任意の他の組換え方法によって生物に導入されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、その生物の生死に関わらず、前記生物中に依然として存在する場合であっても「単離されて」いる。
【０１９７】
「ポリヌクレオチド」は、一般に、任意のポリリボヌクレオチド(ＲＮＡ)またはポリデオキシリボヌクレオチド(ＤＮＡ)を意味する。これらは、無修飾でも、修飾ＲＮＡまたはＤＮＡでもよい。「ポリヌクレオチド」は、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖であってもよいＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子、より典型的には、二本鎖、または一本鎖領域と二本鎖領域の混合物などであるが、これらに限定されない。また、「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡまたはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を意味する。「ポリヌクレオチド」という用語は、１個または複数の修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡ、および安定性または他の理由で改変された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡも含む。「修飾」塩基は、例えば、トリチル化塩基、およびイノシンなどの異常な塩基である。様々な修飾をＤＮＡおよびＲＮＡに施すことができる。したがって、「ポリヌクレオチド」は、一般に天然に存在する化学的、酵素的または代謝的に修飾された形のポリヌクレオチド、ならびにウイルスおよび細胞に特徴的な化学的形態のＤＮＡおよびＲＮＡを含む。「ポリヌクレオチド」は、オリゴヌクレオチドと呼ばれることが多い比較的短鎖のポリヌクレオチドも含む。
【０１９８】
「ポリペプチド」とは、ペプチド結合または改変ペプチド結合によって互いに結合した２個以上のアミノ酸、すなわち、ペプチドイソエステルを含む任意のポリペプチドを意味する。「ポリペプチド」とは、ペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴマーと一般に称する単鎖と、一般にタンパク質と称する長鎖の両方を意味する。ポリペプチドは、遺伝子によってコードされる20種類アミノ酸以外のアミノ酸も含むことができる。「ポリペプチド」は、翻訳後プロセシングなどの自然のプロセス、または当分野で周知の化学修飾技術によって修飾されたアミノ酸配列を含む。このような修飾は、基本的な教科書、より詳細なモノグラフ、ならびに膨大な研究文献に十分記載されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノ末端またはカルボキシ末端を含めたポリペプチドのあらゆる場所で起こり得る。同じタイプの修飾が、所与のポリペプチドのいくつかの部位において、程度が同じでも異なっても存在し得ることを理解されたい。また、所与のポリペプチドは、多数のタイプの修飾を含むことができる。ポリペプチドは、ユビキチン結合の結果分枝していてもよく、分枝を有しても有さなくてもよい環式であってもよい。環式、分枝および分枝環式ポリペプチドは、翻訳後の自然プロセスから得ることができ、または合成方法によって調製することができる。修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、ビオチン化、フラビンの共有結合性結合、ヘム成分の共有結合性結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合性結合、脂質または脂質誘導体の共有結合性結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合性結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル、共有結合性架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化(selenoylation)、硫酸化、アルギニル化などのタンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ媒介付加、ユビキチン結合などがある(例えば、Proteins-Structure and Molecular Properties, 2nd Ed., T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York, 1993; Wold, F., Post-translational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, 1-12, in Post-translational Covalent Modification of Proteins, B.C. Creighton, Ed., Academic Press, New York, 1983; Seifter et al., "Analysis for protein modifications and no protein cofactors", Meth Enzymol, 182, 626-646, 1990, およびRattan et al., "Protein Synthesis: Post-translational Modifications and Aging", Ann NY Acad Sci, 663, 48-62, 1992)。
【０１９９】
ポリペプチド配列の「断片」とは、基準配列よりも短いが、基準ポリペプチドと本質的に同じ生物学的機能または活性を維持しているポリペプチド配列を意味する。ポリヌクレオチド配列の「断片」とは、基準遺伝子配列よりも短いポリヌクレオチド配列を意味する。
【０２００】
「変異体」とは、基準ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるが、その基本的諸特性を維持しているポリヌクレオチドまたはポリペプチドを意味する。典型的なポリヌクレオチド変異体は、ヌクレオチド配列が基準ポリヌクレオチドとは異なる。変異体のヌクレオチド配列の変化は、基準ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列が変化したものでも変化していないものでもよい。ヌクレオチドの変化は、以下に考察するように、基準配列によってコードされるポリペプチドにおけるアミノ酸置換、付加、欠失、融合および切断をもたらし得る。典型的なポリペプチド変異体は、アミノ酸配列が基準ポリペプチドとは異なる。一般に、変化は、基準ポリペプチドと変異体の各配列が、全体として極めて類似しており、多数の領域で同一であるように限定される。変異体と基準ポリペプチドは、任意の組合せの１個または複数の置換、挿入および欠失によってアミノ酸配列が異なる。置換または挿入されたアミノ酸残基は、遺伝コードによってコードされたものでも、コードされていないものでもよい。典型的な保存的置換は、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；ならびにＰｈｅおよびＴｙｒである。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体は、対立遺伝子などの天然のものでも、天然には知られていない変異体でもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの非天然変異体は、突然変異誘発技術または直接合成によって調製することができる。変異体としては、１個または複数の翻訳後修飾、例えばグリコシル化、リン酸化、メチル化、ＡＤＰリボシル化などを有するポリペプチドも含まれる。実施形態には、Ｎ末端アミノ酸のメチル化、セリンおよびトレオニンのリン酸化、ならびにＣ末端グリシンの修飾も含まれる。
【０２０１】
「対立遺伝子」とは、ゲノム中の所与の遺伝子座にある２個以上の異なる遺伝子形態の１つを意味する。哺乳動物は二倍体生物なので、遺伝子は２個あり、染色体の対を有する。適合した姉妹染色体上の２個の遺伝子特定遺伝子座は、特徴となる１つの特定の形質を制御し、対立遺伝子と呼ばれる。ヒトにおいては、染色体対は、異なる対立遺伝子を有することができる。各遺伝子が異型接合的な状況で発現される場合、それらは共優性であると言われ、２種類の異なる遺伝子産物または同種抗原が産生される。各遺伝子が同型接合的な状況で発現される場合、産生される遺伝子産物は１種類のみである。
【０２０２】
各生物において１個または複数の遺伝子座における遺伝子の配列が同一でないとき、２つ以上の個体(または系統)は互いに同種であるとされる。同種異系は、通常、関係する遺伝子座に関して規定される。
【０２０３】
同種異系と考えられる種の各個体は、同種移植に対して免疫応答を引き起こす抗原性差を示す。これらの抗原は、しばしば同種抗原と呼ばれる。
【０２０４】
「同種抗原」は、２グループの組織適合性遺伝子産物によって表される。これらは、主要組織適合性抗原および副組織適合性抗原とされた。主要組織適合性抗原は、急性で、迅速で、激しい移植片拒絶を刺激し、ＨＬＡクラスＩおよびIIタンパク質によって表される。副組織適合性抗原は、慢性で、緩やかな、より強度の低い反応を刺激し、機能的に異質なタンパク質グループである。単一エピトープに対するモノクローナル抗体を産生することができ、血清学的組織分類を可能にする、様々なＨＬＡ抗原に特異的な異なるモノクローナル抗体のパネルが開発された。
【０２０５】
「多型」とは、集団内のゲノムの所与の位置におけるヌクレオチド配列(および、関連がある場合には、コードされたポリペプチド配列)の変化を意味する。
【０２０６】
「一塩基多型」(ＳＮＰ)は、ゲノム内の１つの塩基位置における、塩基変動の発生をいう。ＳＮＰは、遺伝子内、またはゲノムの遺伝子間領域内に存在し得る。
【０２０７】
突然変異によって導入されたＳＮＰを検出するために多数の方法が使用されている。例えば、突然変異ras遺伝子の極めて高感度なアッセイ、および急性白血病における提示遺伝子型(presentation genotype)および再発遺伝子型(relapse genotype)の研究へのその応用が記述されている(Oncogene ９、1994、553〜563)。２種類の広範に使用されている方法は、対立遺伝子特異的増幅(ＡＳＡ)および突然変異体濃縮ＰＣＲ(mutant-enriched PCR)(ＭＥ−ＰＣＲ)である。ＡＳＡプロセスの場合、少なくとも３個のプライマーが必要である。共通プライマーがアッセイされる多型に対して逆方向に相補となるように使用される。この共通プライマーは、多型な塩基から50ｂｐから1500ｂｐの間で隔たったものとできる。それ以外の２つ(またはそれ以上)のプライマーは、最後の３'塩基が、多型を構成する２つ(またはそれ以上)の対立遺伝子の１つと一致するように変化している点を除いて、互いに同一である。そして、それぞれ、共通プライマーおよび１つの対立遺伝子特異的プライマーを使用して、２つ(またはそれ以上)のＰＣＲ反応を、サンプルＤＮＡについて行う。特に白血病に関係する遺伝コーディングＳＮＰを検出する場合、癌細胞一般にそれは当てはまるので、多量の正常細胞バックグラウンド中のわずかな割合のＳＮＰ含有細胞に関する一般的な制限はない。一方、血球を分析するときには、１０4〜１０6個の不適合タイプの対立遺伝子のバックグラウンド中で１個のＳＮＰ対立遺伝子を検出することは、移植後の患者の再発性疾患を分析するときには役に立つことがある。ＳＮＰの検出に対して極めて高感度で特異的なアッセイが記述されている(Sidransky、Science、278、1997、1054〜1058、Ahrendt等、J.Natl.Cancer.Inst.91、1999、332〜339)。
【０２０８】
本発明に関する重要な態様は、このようなアッセイを、大規模なスクリーニングを可能にする自動化されたハイスループット形式で実行する必要性であり得る(Dong等、J.Natl.Cancer Inst.93、2001、858〜865、Ahlquist等、Gastroenterology、119、2000、1219〜1227、Ahrendt等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、96、1999、7382〜7387)。
【０２０９】
本明細書中で使用されている「スプライス変異体」は、同じゲノムＤＮＡ配列から一旦転写され、ただし、択一的なＲＮＡスプライシングを受けている、ＲＮＡ分子から作製されたｃＤＮＡ分子をいう。択一的なＲＮＡスプライシングは、一般には、イントロンを除くために、一次ＲＮＡ転写物がスプライシングを受ける際に生じ、それぞれ、異なるアミノ酸配列をコードしてもよい、１つ以上のｍＲＮＡ分子の産生を引き起こす。スプライス変異体の用語はまた、上記のｃＤＮＡ分子によってコードされるタンパク質をもいう。
【０２１０】
「同一性」および「類似度」は、２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列の間における相互関係を反映しており、非常に類似する長さの配列を比較することにより決定される。あるいは、より短い、限定された長さにわたって、決定してもよく(所謂、局所的なアラインメント)、不ぞろいな長さの配列において、より好適である。
【０２１１】
２個以上の配列の同一性および類似度を比較する方法は当分野で周知である。したがって、例えば、Wisconsin Sequence Analysis Package、バージョン9.1中の利用可能なプログラム(Devereux J等、Nuclei Acids Res、12、387〜395
好ましくは、ＢＬＯＳＵＭ６２ アミノ酸置換行列(Henikoff S and Henikoff JG、Proc.Nat.Acad.Sci.USA、89、10915〜10919、1992)を、比較の前に、ヌクレオチド配列をアミノ酸配列に予め翻訳する場合をも含み、ポリペプチド配列の比較において使用する。
【０２１２】
基準となるポリヌクレオチド配列と比較した際、0.95の同一性指標を有するポリヌクレオチド配列は、既に記載したように、基準配列内の塩基100個毎に、平均して５個までが、任意の組合せで、欠失、置換または挿入されていてもよい。同じことが、同一性指標の他の値、例えば、0.96、0.97、0.98および0.99についても、必要に応じて変更して適用される。
【０２１３】
「融合タンパク質」は、２つの、関連しない、融合された遺伝子またはそのフラグメントによってコードされるタンパク質をいう。本発明による最も一般的な意味では、２個のアミノ酸バージョンを含む少なくとも２個の同種抗原または断片を単一ポリペプチド中で融合することができる。より具体的な例では、前記同種抗原それぞれのその断片を、免疫グロブリンのＦｃ部分と融合する。米国特許第5541087号、同5726044号には例が開示されている。Ｆｃ同種抗原の場合には、融合タンパク質の一部として免疫グロブリンＦｃ領域を採用することは、治療に使用するときに、Ｆｃ同種抗原または同種抗原断片を機能的に発現させて、このような融合タンパク質の薬物動態学的諸特性を改善し、かつ免疫学的諸特性を改善するのに有利である。いくつかの症例では、２量体Ｆｃ同種抗原の産生が特に有利なことがある。Ｆｃ−ＤＮＡ構築体は、５'から３'方向に、分泌カセット、すなわち哺乳動物の細胞から、融合パートナーとしての免疫グロブリンＦｃ領域断片をコードするＤＮＡ、および同種抗原をコードするＤＮＡまたはその断片の搬出を誘発するシグナル配列を含む。いくつかの用途では、融合タンパク質の残部をそのまま残しながら機能的Ｆｃ部分を突然変異させることによって固有の機能的諸特性(補体結合、Ｆｃ受容体結合)を変えることができ、または発現後Ｆｃ部分を完全に除去できることが望ましい。
【０２１４】
(ＣＤタンパク質などの)「組織特異的」発現マーカーは、白血病およびリンパ腫の診断に日常的に使用され、また、固形腫瘍の診断において、従来の細胞学のみでは明瞭な結果が得られないときに有用であることが判明している。造血性起源に由来する細胞は、一般に系列マーカー(ＣＤタンパク質)と呼ばれる、組織特異的遺伝子を最も多く発現する細胞タイプの１つであることが当分野では知られている。系列細胞集団としては、単球、ＮＫ細胞、顆粒球(好中球、好塩基球、好酸球)、リンパ球(Ｔ細胞およびＢ細胞)、樹状細胞、それらの前駆体などがある。ほとんどのヒト癌基準細胞系、特に白血病およびリンパ腫に関係するヒト癌基準細胞系は、ＤＳＭＺから入手可能である。したがって、特性の明らかなモノクローナル抗体(ｍＡｂ)のパネルを用いて行われるすべてのヒト癌細胞系上での組織マーカーの発現に対する定型試験は一般的な技術である。一般に、これらの抗原の発現パターンは、それが由来する細胞タイプの発現パターンを反映している。しかし、個々のｍＡｂによって検出されるタンパク質発現は、長期間にわたって必ずしも安定ではない。したがって、所与の細胞系に対して報告されているすべてのマーカーが、必ずしもＤＳＭＺ基準クローン上で発現されるわけではない。また、同じ抗原に対する異なるＡｂは、常に同程度に結合して同等の染色強度をもたらすわけではない。したがって、報告された各結果は異なることがあり、そのまま細胞系の同一性を疑うことはできない。
【０２１５】
組織特異性または腫瘍特異性は、異なって使用することができる命名法であり、ある種の組織において他の組織よりも過剰発現される遺伝子または分子を意味し、あるいは１つの組織において発現されるが他の組織においては発現されない、組織に特有の遺伝子または分子を意味することができる。本発明によれば、両方の遺伝子カテゴリーは、ＳＮＰによってコードされる多型を含むので標的抗原とみなさなければならない。
【０２１６】
特許および特許出願に限らず、これらを含む、本明細書中で引用されている刊行物および参考文献の全ては、十分に述べているように、個々の刊行物または参考文献を、参照して組み込むために、明示的かつ個別的に示唆されているように、その全部を、参照することで、本明細書中に組み込まれる。本出願が優先権を主張する特許出願はいずれも、先に刊行物および参考文献に関して記載したと同様に、その全部を、参照することで、本明細書中に組み込まれる。
【０２１７】
さらなる実施例
実施例１
癌マーカー分析のための試料要件
ＣＤタンパク質および癌マーカーは、蛍光標識された単一特異的免疫学的試薬(抗体)と、細胞集団をカウントし分析するフローサイトメーターとを組み合わせた診断プロセスによって常法に従って検出される。次いで、細胞を、サイズ、マーカー反応性、クローン性および比率によって分類する。個々の抗ＣＤ抗体および白血病／リンパ腫基準細胞系は、ＡＴＣＣ、ＤＳＭＺなどの基準細胞コレクションから容易に利用可能である。所望のパネルの抗ＣＤ抗体を選択して、所望の白血病／リンパ腫免疫表現型を特徴づけ、選択し、ＤＳＭＺから入手可能な選択され標準化された白血病／リンパ腫基準細胞系と前記表現型を必要に応じて比較する。この手順は、診断、予後、残余の疾患評価、治療モニタリング、ならびに白血病、リンパ腫および関係する病態のケースマネージメントにおいて臨床的に広く使用されており、当業者には周知である。ＣＤタンパク質発現プロファイルの特徴が明らかな基準抗ＣＤ抗体それぞれ基準白血病／リンパ腫細胞系が、例えば、DSMZ-Deutsche Sammlung von Microorganism und Zellkulturen GmbH、Mascheroder Weg 1b、38124 Braunschweig、GERMANYから入手可能である。様々な組織および体液を分析することができる。解釈の質および臨床上の有用性を確保するために、すべての細胞数測定データは、試料の微視的検査に照らして解釈される。
【０２１８】
血液：
ヘパリンナトリウム処理された(緑色のふた)管中の血液５〜７ｍｌ、およびＥＤＴＡ(紫色のふた)管中の血液５〜７ｍｌ。反転させて十分混合する。最適な結果を得るために、試料は、24時間以内に受け取るべきである。試料を24時間以内に受け取ることができない場合、試料を室温で静置することができるが、血液塗沫標本は、ＥＤＴＡ血液から作製され、試料とともに送付されなければならない。あるいは、ＡＣＤ管(黄色のふた)７または10ｍｌを、ＡＣＤ管を取り出すのと同時に得られた白血球カウントおよび示差的血液カウント(differential blood count)とともに提示することができる(別の管のカウントを、ＡＣＤの希釈効果を回避するために用意しなければならない)。
【０２１９】
骨髄：
ヘパリンナトリウム処理シリンジ(試料１ｍｌ当たり約500ＵＳＰのヘパリンナトリウム)に吸引された骨髄１〜２ｍｌ。十分混合する。試料をヘパリンナトリウム処理管に移す。骨髄の細胞が少ない(hypo cellulare)場合は、さらに試料を必要とすることがある。試料は24時間以内に受け取るべきである。24時間以内に到着するように試料を発送することができない場合は、試料を運搬媒体に入れるべきである(その場合でも、最初の抜き取りには、ヘパリン処理シリンジが必要である)。
【０２２０】
組織：
組織生検を組織培地を含む無菌容器中に置く。試料は、生存度を確実に最適なものにするために24時間以内に受け取るべきである。生存度の検査は、組織から単離された細胞を分析する前に実施する。
【０２２１】
実施例２
白血病関連組織マーカーの選択
白血病およびリンパ腫の免疫フェノタイピングは、生物学的系列および分化の段階に応じて、血液、骨髄およびリンパ組織の細胞を特定し定量するために使用されるプロセスである。使用される細胞マーカーは、ＣＤタンパク質を定義する標準命名法に従って命名される。ＣＤマーカータンパク質は、造血性起源の細胞による発現のために、本発明によるＳＮＰ分析を開始するのには好適である。白血病、リンパ腫などの血液系疾患の診断に関連する細胞表面マーカーのリストを表２に示す。最終目標は、対応するタンパク質におけるアミノ酸の変化の原因になるこれらのＣＤタンパク質内の多型を特定することである。
【０２２２】
例えばＢ細胞系またはＴ細胞系に属し得る、リンパ系起源または骨髄起源の未分化白血病細胞の分類は分析の第一段階であり、系列タイプ内の白血病細胞の細分類がこれに続くことがある。細胞表面マーカー発現に関する詳細な情報の収集は当分野で知られており、実験設定を計画するのに使用される。より多くのマーカー、特に癌マーカーが、一般に、発現プロファイリングによって解明されるにつれ、本手法に適切な癌の数は次第に増加している。白血病プロファイルを規定するのに使用できる最も卓越したマーカーが本発明において試験され、リストが表２に与えられている。当分野の専門家は、血液由来の特定の疾患を診断し治療するのに最適なこれらのＣＤマーカーを容易に選択することができる。
【０２２３】
以下の項に、特定の疾患を対象とする関連ＣＤタンパク質プロファイルを要約する。特定の疾患としては、急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)、急性リンパ性白血病(ＡＬＬ)、骨髄異形成症候群(ＭＤＳ)および他の慢性の骨髄増殖性症候群、慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)、慢性リンパ芽球性白血病(ＣＬＬ)、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫を含めたリンパ腫(ホジキンまたは非ホジキン)、中程度のリンパ腫、核に切れ込みを有しない高度の小細胞型(small non-cleaved cell)リンパ腫Ｂまたは高度のＴ細胞リンパ芽球性リンパ腫、未分化大細胞型リンパ腫、外套細胞リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、結節外疾患またはＢ症状を有するホジキンリンパ腫、大きい腫瘍、重度の再生不良性貧血などであるが、これらだけに限定されない。
【０２２４】
あるプロファイルの異なるタンパク質であるいくつかのＳＮＰの組合せは、本発明を疾患の治療および診断に適用するときに特に有利である。
【０２２５】
推定上または既知の白血病細胞集団の急性白血病プロファイルは、Ｔ細胞マーカー(ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７およびＣＤ８)の分析に基づく。Ｂ細胞マーカーは、好ましくはＣＤ10、ＣＤ19、ＣＤ20、ＣＤ21、ＣＤ22およびＣＤ24、ならびに骨髄／単球マーカー(ＣＤ13、ＣＤ14、ＣＤ15およびＣＤ33)である。有用であれば、さらにＣＤ23、37、38、39、40、72、73、74、ＣＤｗ75、ＣＤｗ76、ＣＤ77、ＣＤｗ78、ＣＤ79、ＣＤ80、ＣＤ81、ＣＤ82、ＣＤ83、ＣＤｗ84、ＣＤ85、ＣＤ86などのＢ細胞マーカーを含めることができる。急性巨核芽球性白血病は、マーカーＣＤ61、ＣＤ42およびＣＤ41を使用することによって検査することができる。成熟状態(非系列)は、ＣＤ34、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ10(ＣＡＬＬＡ)を用いて評価される。正当な理由があるときには、末端トランスフェラーゼ(ＴｄＴ)も別の試験として必要になることがあり、あるいは病理医が添加することができる。
【０２２６】
慢性白血病プロファイルおよびリンパ腫プロファイルは、全Ｔ細胞集団の汎Ｔ細胞マーカー：ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ５の存在を分析することによって評価され、ＣＤ４(Ｔヘルパー)およびＣＤ８(Ｔ細胞障害性／抑制因子)亜集団の分析が規定通りに含まれる。骨髄／単球マーカーとしては、ＣＤ14、ＣＤ15などがある。全Ｂ細胞集団は、Ｂ細胞マーカーＣＤ19およびＣＤ20の発現を確認することによって絞り込むことができる。ＣＤ５とＣＤ20の同時発現は、新生物増殖と関連することが多い。ＣＤ41およびＣＤ42は、芽球発症におけるＣＭＬの分化に対するものとすることができる。ＣＤ10(ＣＡＬＬＡ)、ＣＤ22、ＣＤ23、ＣＤ38、ＣＤ45、ＦＭＣ−１およびＨＬＡ−ＤＲは、標準プロファイルに含まれる。他のマーカーを、Ｔ細胞障害(ＣＤ１、ＣＤ30)、ホジキン病(ＣＤ15、ＣＤ30)、または未分化(Ｋｉ−１)リンパ腫(ＣＤ30)を評価するために添加することができる。
【０２２７】
ヘアリー細胞白血病、前リンパ球性白血病、または外套細胞リンパ腫および白血病は、慢性の白血病プロファイルおよびリンパ腫プロファイル(上述)と、毛様細胞マーカーＣＤ11ｃ(補体受容体)、ＣＤ25(ＩＬ−２受容体)、ＣＤ103、および前リンパ球性毛様細胞マーカーＦＭＣ−７の発現とを特徴とするＢ細胞疾患である。Ｂリンパ様マーカーＣＤ23は、慢性白血病と外套細胞リンパ腫の異なる診断でのＣＤ５発現に関連して評価される。ＣＤ23は、基礎的なリンパ腫プロファイルの一部である。
【０２２８】
未分化(Ｋｉ−１)リンパ腫およびホジキン病は、マーカーＣＤ１、ＣＤ15およびＣＤ30(Ｋｉ−１)によって評価される。
【０２２９】
実施例３
ＤＮＡデータベースをスクリーニングすることによって特定された新しいＳＮＰ
ＳＮＰは、ヒトゲノムの対立遺伝子変化を表すＤＮＡデータベースをスクリーニングすることによって特定される。ここで、ＤＮＡ配列は、異なる個体に由来するものである。スクリーニングは、ＥＳＴ、ＳＮＰまたはゲノムＤＮＡデータを含めて様々なレベルで実施することができる。しかし、これは、最終的には同じ結果をもたらす。直接のＳＮＰスクリーニングに有用なデータベースは、
http://www.jbic.or.jp
http://snp.ims.u-tokyo.ac.jp
http://www.celera.com
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/
を含むデータベースグループから選択することができる。
【０２３０】
ＣＤクラスタータンパク質中のＳＮＰの特定を説明するために、多様な癌関連ＣＤタンパク質を表す様々なアミノ酸配列を、プログラムのデフォルトモード(翻訳ＤＮＡデータベースに対するタンパク質配列)を用いたｔｂｌａｓｔｎ検索に適用した。スクリーニングには、アミノ酸交換に効果のないＳＮＰ(サイレントな突然変異)を除外することができるので、ヌクレオチド配列よりもタンパク質配列が特に有用である。データバンク検索を、１個または複数の前記パブリックドメインＳＮＰデータベースを使用して実施した。
【０２３１】
特定のＣＤタンパク質配列の様々なクローン間でｃＤＮＡ配列の不一致(推定ＳＮＰ)を示す生成アラインメントを、以下の厳格な判定基準に従ってさらに処理した。
【０２３２】
(i)ゲノムＤＮＡまたはＥＳＴ(発現配列タグ)と、Ｘを含むＣＤ配列とのアラインメントは配列決定誤差であり、無視されなければならない。
【０２３３】
(ii)ゲノムＤＮＡクローンと、５'または３'末端に隣接する不一致を有するＣＤ配列とのアラインメントはエキソン／イントロン境界の指標であり、同様に無視されなければならない。
【０２３４】
(iii)ゲノムＤＮＡまたはＥＳＴ配列と、完全に適合したＤＮＡによって包囲されたＣＤ配列との間のアラインメントの単一塩基差は、推定ＳＮＰに対する厳密な指標である。
【０２３５】
ＤＮＡレベルで特定されたＳＮＰを、受託コードによって利用可能なタンパク質配列を比較することによってさらに分析した。Ｔｂｌａｓｔｎ検索によって、下記ＣＤ42の例で示されたアラインメントが得られ、対応するゲノムクローン中に存在する推定ＳＮＰが特定された。ＳＮＰ分析に適用された関連タンパク質のリストを表２に示す。
【０２３６】
実施例４
ＣＤ４２ＳＮＰ変異体の分析
実施例３に記載した手順をより詳細に説明するために、ＣＤ４２ｂタンパク質を例として選択した。受託コード第P07359号として利用可能なタンパク質配列を、ＣＤ４２ｂタンパク質中の推定ＳＮＰのスクリーニングに適用した。
【０２３７】
ｔｂｌａｓｔｎ検索によって、以下に示すアラインメントが得られ、受託番号AC032038.2のゲノムクローン中に存在する２個の推定ＳＮＰが特定された。
【０２３８】
【表１】
2005529187.tif 000002
ＣＤ４２ｂのアミノ酸配列：
【０２３９】
【表２】
2005529187.tif 000003
ＣＤ４２ｂ断片アラインメント：
対立遺伝子変異体であって、ＣＤ４２ｂタンパク質中のアミノ酸交換を含む配列を太字で示す。
【０２４０】
【表３】
2005529187.tif 000004
マイナス鎖ＨＳＰ：
【０２４１】
【表４】
2005529187.tif 000005
実施例５
癌細胞系のＨＬＡおよびＳＮＰの試験
ＣＤタンパク質発現プロファイル特性が明らかな、エプスタインバーウイルスによって形質転換された白血病／リンパ腫細胞系は、例えばＤＳＭＺから入手可能であり、あるいは患者から単離することができる。これらの細胞について、ｍＡｂ ＢＢ7.2(または、American Type Culture Collection、Manassas、VAを通して入手可能な他の抗体)を用いて免疫蛍光によってＨＬＡ−Ａ２の発現(または、他の所望のクラスＩ発現)を試験した。造血性細胞および／または癌細胞の発現およびＳＮＰ状態を、ゲノムＰＣＲによって試験した。Poly(A)＋ＲＮＡを、QickPrep Micro mRNA精製キット(Amersham Pharmacia Biotech、Piscatawa、ＮＪを用いて単離した。例えばＣＤ42遺伝子(受託番号J02940)の細胞または組織特異的発現および多型を検出する場合は、ＣＤ42のｃＤＮＡのそれぞれのＰＣＲプライマー(５'−ＣＡＡＧＡＧＡＡＣＴＣＧＣＴＧＴＡＴＡＣＡ−３'および５'−ＡＡＧＧＧＧＴＧＧＴＴＴＣＧＧＧＴＡＴＧＴ−３')対応塩基位置586〜607および塩基位置939〜960を使用して、374塩基対ＰＣＲ産物を得た。ＳＮＰ検出を、続いてABI 310キャピラリー配列決定装置を用いてＰＣＲ産物の配列を決定することによって実施した。
【０２４２】
実施例６
ＣＤ４２ｂ中のＳＮＰコードＨＬＡ結合ペプチドの特定
ＤＮＡおよびタンパク質配列中のコーディングＳＮＰの検索に加えて、適切なＨＬＡクラスＩ結合モチーフの選択は、関連ＳＮＰを規定するための別の重要なステップである。
【０２４３】
より代表的ないくつかのＨＬＡクラスＩ提示分子を選択した。ＳＹＶＰＥＩＴＨＩアルゴリズムの使用は、表４に示すＨＬＡ結合ペプチドおよびスコアを予測するのに役立った。８〜27のスコアは、ＨＬＡクラスＩ分子との結合に対する個々のペプチドの高い親和性を示している。
【０２４４】
この分析の成果は、ペプチドの９残基のうち８個が一致したヒト配列である。両方のヒトペプチドを合成し、感作活性について試験した。まれに、１つを超えるアミノ酸不一致を、９残基Ｔ細胞エピトープ内に認めることができる。
【０２４５】
実施例７
in vitro試験用ＨＬＡ結合ペプチドの選択
ＳＮＰ由来アミノ酸交換のin vitro試験の場合は、ＨＬＡ−Ａ２の既知の結合モチーフ(ＨＬＡ−Ａ＊02またはＨＬＡ−Ｂ51またはＨＬＡ−Ｂ62)を優先的に保有する９量体ペプチドを、同種抗原ＣＤ42の場合に述べたように、成熟タンパク質配列中で特定しなければならない。
【０２４６】
一般に、ＨＬＡ−Ａ２結合Ｔ細胞エピトープの選択は、in vitroでの抗原提示試験に使用することができる細胞系が当分野で存在するために、他よりも有利である。このような細胞系は、なかでも、表面にＨＬＡ−Ａ２を有するＬＣＬ.174(ＴＡＰ欠失突然変異細胞系)である。
【０２４７】
実施例８
ＨＬＡ−Ａ２結合ペプチドの単離
ＨＬＡ−Ａ２結合ペプチドを単離し、ＨＬＡ−Ａ２特異的抗体ＢＢ7.2、酸処理、限外ろ過、およびＨＰＬＣ分画を用いた標準手順に従って配列を決定した(Seeger等、Immunogenetics、49:571〜576、1999、Falk等、Nature、351：290〜296、1991)。ペプチド含有ＨＰＬＣ画分をプールし、約１０10細胞からのペプチド抽出物に対応するアリコートをナノキャピラリーＨＰＬＣ ＥＳＩ ＭＳによって分析した(Schirle等、Eur.J.Immunol.、30：2216〜2225、2000)
実施例９
ペプチド合成
ペプチドをＦ−ｍｏｃケミストリーによって合成した。Ｆ−ｍｏｃケミストリーは、G.A.Grant Synthetic Peptides：A User's Guide、W.H.Freeman and Co.(1992)に記載されている。ペプチドの同一性を、アミノ酸分析およびマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法によって確認した。
【０２４８】
凍結乾燥ペプチドをＤＭＳＯに20ｍＭで溶解し、等分して−80℃で保存した。ペプチドを無血清培地で４ｍＭに希釈し、所望の最終濃度で使用した。
【０２４９】
実施例１０
合成ＨＬＡ結合ペプチドのin vitro試験
ＨＬＡ−Ａ２分子に結合可能なＳＮＰ誘導単一アミノ酸変化を含むペプチドを、LCL.174系統のＴＡＰ欠失突然変異細胞表面でＨＬＡ−Ａ２の発現を増加させることができるかどうかの能力によって特定した。手短に述べると、LCL.174細胞を、ＲＰＭＩ 200μｌとペプチド50μＭ中２×１０6細胞/ウェルで丸底96ウェルプレート中で培養し、37℃で終夜インキュベートした。次いで、これらの細胞を、ＨＬＡ−Ａ２特異的ｍＡｂ、BB7.2(ＡＴＣＣ、Rockville、Md.)を用いて処理し、続いて、ＦＩＴＣ複合ヤギ抗マウスＩｇＧで染色した。蛍光強度をフローサイトメトリーによって分析した。インフルエンザウイルスマトリックスＭ１タンパク質ペプチド、ＦｌｕＭＰ５８は、既知のＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬエピトープであり、これを正の対照として使用した。Ｂ型肝炎ウイルスエンベロープ抗原ＨＢｅｎｖＡｇ125ペプチドはＨＬＡ−Ａ２に結合せず、これを負の対照として使用した。
【０２５０】
実施例１１
抗原反応性細胞を特定するための４量体技術
多量体ＭＨＣクラスＩ／ペプチド複合体は、通常、細菌中で組換えβ２ミクログロブリンおよび重鎖ＨＬＡ分子が発現して生成される。重鎖は、突然変異して膜貫通領域が除去され、Ｃ末端に特異的ビオチン化配列が付加される。精製されたタンパク質は、高濃度のペプチド／エピトープの存在下でin vitroで再び折り畳まれて、安定な可溶性ＨＬＡペプチド複合体を形成することができる。酵素によるビオチン化後、これらの複合体は、４個のビオチン分子を結び付けるストレプトアビジンとともに多量化される。蛍光複合ストレプトアビジンを使用することによって、フローサイトメトリーによる染色細胞の可視化が可能になる。
【０２５１】
ＭＨＣクラスＩ／ペプチド複合体を使用してＴ細胞を活性化する場合には、４量体技術をサイトカイン分泌分析と併用して免疫応答をより詳細に試験することが役立ち得る。
【０２５２】
実施例１２
ＣＴＬのin vitroでの刺激
末梢血単核球(ＰＢＭＣ)を、ヒトＨＬＡ−Ａ２+対象から得たヘパリン処理末梢血液30ｍｌから、Ficoll-Hypaque(Sigma、St.Louis、Mo.)を用いた遠心分離によって調製した。ＣＤ８+細胞は、抗ＣＤ８抗体で被覆された磁気マイクロビーズを用いて製造者の指示に従って(Milteny Biotec、Auburn、Calif.)、新たに単離されたPBMCからポジティブ選択され、あるいは場合によっては、液体窒素で凍結させたＰＢＭＣからポジティブ選択される。
【０２５３】
ＣＤ８+細胞を、無血清ＤＭＥＭに再懸濁させ、48ウェルプレートの500μｌアリコート中で３×１０6細胞/ウェルで培養した。37℃、５％ＣＯ2で２時間後、繰り返し洗浄して非接着細胞を除去し、接着単球(adherent monocytes)を50μＭペプチドおよび５μｇ/ｍｌヒトβ２ミクログロブリン(Sigma、St.Louis、Mo.)とともに４時間インキュベートした。無血清ＤＭＥＭで洗浄後、ｒｈｌＬ−７(0.5ｎｇ/ｍｌ；Ｒ＆Ｄ Systems、Minneapolis、Minn.)を補充した10％ヒト血清を含むＤＭＥＭ500μｌ中の1.5×１０6個のＣＤ８+細胞(フローサイトメトリーによる純度＞90％)を各ウェルに補充した。
【０２５４】
ｒｈｌＬ−２を２日後に25Ｕ/ｍｌで与え、その後、培地の半分を置換することによって週に２回与えた。10日目に、ＣＴＬ培養物を、照射(5000rad)自己ＬＣＬを用いて応答者／刺激物質比５で再刺激した。あるいは、本発明によって規定される50μＭ ＨＬＡ結合ペプチドとともにインキュベートしたLCL.174細胞を使用して、ＨＬＡ−Ａ２+対象から得られたＣＴＬ培養物を再刺激した。以下に記述するように、再刺激から１週間後にＣＴＬアッセイを実施した。
【０２５５】
キャラクタリゼーション後、ペプチド刺激ＣＴＬを30％ヒト血清、10％ＤＭＳＯおよび60％ＤＭＥＭからなる培地中で凍結させ保存することができ、次いで、解凍し再刺激してさらに分析することができる。(インフルエンザウイルスマトリックスＭ１タンパク質に由来する)ペプチドＦｌｕＭＰ58を、ペプチド特異的ＣＴＬのin vitroでの刺激の正の対照として使用した。
【０２５６】
実施例１３
同種抗原特異的ＣＴＬの生体外での産生
好ましい同種抗原の対立遺伝子バージョンであるＨＬＡ結合ペプチドを使用し、特異的ＣＴＬを単離することによってさらに特徴を明らかにすることができる。この手法の可能性は、未感作アミノ酸不一致対立遺伝子陰性の健康な供血者から同種抗原特異的ＣＴＬを生体外で産生することによって示された。合成ペプチドを間欠投与した樹状細胞をＡＰＣとして使用して、自己または同種未感作ＣＤ８+Ｔ細胞を刺激することができる。次いで、生体外で産生されたアミノ酸不一致特異的ＣＴＬを使用して、急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)および急性リンパ性白血病(ＡＬＬ)患者に由来する白血病細胞を効率的に溶解することができる。非造血細胞に対しては溶解反応性は検出されないはずである。十分な数のＣＴＬを養子免疫療法用に得ることができる。この技術が、本発明によって発見されたすべてのＳＮＰ規定同種抗原に制限なく適用可能であることは特記される。
【０２５７】
実施例１４
51Ｃｒ放出細胞毒性試験：
これらのエフェクター細胞の細胞溶解活性は、標識標的細胞から同位体が放出されることによって測定される。細胞溶解活性は、クロム放出アッセイによって試験されることが多いが、他の方法も利用可能である。クロム放出アッセイでは、放射性クロム(51Ｃｒ)で標識された標的細胞を、活性化されたＣＴＬと混合する。Ｎａ251ＣｒＯ4の形の放射性クロムは生細胞によって取り込まれ、細胞内でクロムが還元される。還元されたクロムが溶解細胞から放出されるときには、他の細胞がそれを再利用することができず、そのため、放出されたクロムの量は、エフェクター細胞の細胞溶解活性の良好な指標となる。原則的には、任意のタイプの細胞を、ＣＴＬ活性を測定するために標的として使用することができるが、リンパ芽球、組織培養細胞、腫瘍細胞などの活性化された細胞が最適であることが判明している。固有の死滅活性は、Ｋ562と呼ばれる基準細胞系の溶解によって測定される。この試験は、ドナーまたはレシピエント由来のＬＡＫ細胞または細胞障害性Ｔ細胞クローン(エフェクター)の活性を測定するために使用される。ＬＡＫ細胞またはＴ細胞クローンは、ＨＬＡと同種抗原ペプチドの適切な組合せを発現する標的細胞を死滅させる。
【０２５８】
選択された同種異系Ｔ細胞エピトープを間欠投与した優先的な標的細胞系は、ヒトＨＬＡ−Ａ２陽性ＥＢＶ−ＬＣＬ細胞系である。また、豊富な白血病細胞系源がＤＳＭＺを通して利用可能である。標的となる１×１０6個の細胞を５ｍｌファルコンチューブに入れる。細胞を遠心分離し、Ｎａ252ＣｒＯ4(高活性)10μｌ混合物を添加して再懸濁させ、37℃で45分間インキュベートする。標識細胞をＰＢＳ／ＦＢＳで３回洗浄し、１ｍｌ培地に再懸濁させカウントする。標識細胞を、必要になるまで氷上で保存する。試験には、濃度５〜104細胞/ｍｌの総容積５ｍｌの各標的細胞タイプが必要であり、濃度を調節する。
【０２５９】
細胞障害性リンパ球(ＣＴＬ)は、前駆体Ｔリンパ球から以下のようにして産生することができる。１)アクセサリー細胞およびヘルパーＴ細胞の存在下での、「刺激物質」細胞によって運ばれる抗原による特異的刺激、または２)インターロイキン−２とともにインキュベーションして４〜５日間にわたって誘導され、ＬＡＫ細胞と称されるポリクローナル活性化。好ましいエフェクター細胞を50ｍｌファルコンチューブに移す。細胞を洗浄し、再懸濁させ、濃度2.5×１０6細胞/ｍｌに調節する。エフェクター細胞および標的細胞は、４つの異なるエフェクター：標的比(50：１、25：１、12.5：１、６：１)で混合する必要がある。各エフェクター：標的比は、３つ組で試験すべきである。連続希釈したエフェクター細胞を、エフェクター細胞の総容積が希釈後に100μｌになるようにプレート中で調製する。次いで、標的細胞懸濁液100μｌを添加した。ウェル当たりの標的細胞数を5000とすべきである。自然に最大放出するように標的細胞のみを含む培地100μｌのウェルを含める。37℃、５％ＣＯ2で４時間プレートをインキュベートする。４時間後に回収し、細胞毒性アッセイのガンマカウンターでカウントする。
【０２６０】
実施例１４
ワクチンプロトコルＡ
多型タンパク質全体、または少なくともその多型ペプチド部分の形の選択したＳＮＰコード同種抗原を使用する。タンパク質およびペプチドの一部は免疫原性であるが、他のものは免疫原性を欠く。この欠如は、タンパク質またはペプチドを担体に結合させることによって最も容易に克服される。有用な担体は、キーホールリンペットヘモシアニン(ＫＬＨ)、ウシ血清アルブミン、ＢＳＡ)、マイコバクテリウムボビスＢＣＧまたはツベルクリンの精製タンパク質誘導体、コレラ毒素サブユニットＢなどである。結合は、任意の二官能性架橋剤を用いて実施することができる。スベリン酸ビス(スルホスクシンイミジル)、スベリン酸ジサクシミジル(Disuccimidyl Suberate)、グルタルアルデヒドなどのホモ二官能性試薬も使用することができる。タンパク質またはペプチドの一方が架橋可能な基を表面に持たないことが判明している場合、ヘテロ二官能性試薬の使用が有利なこともある。ｍ−マレイムドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、スルホ−ｍ−マレイムドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドなどのヘテロ二官能性試薬が当分野で既知の他のヘテロ二官能性試薬であり、複合化される化合物の生化学的諸性質に従って選択することができる。好ましい例における最適な抗原に複合化された担体はＫＬＨ−抗原複合体であり、免疫アジュバントＱＳ−21とともに優先的に使用することができる。さらなる抗原処方には、ＩＳＣＯＭ、ＭＤＰ、マイコバクテリアボビスＢＣＧまたは水酸化アルミニウムが含まれる。サポニンまたはＣｐＧオリゴヌクレオチドは、免疫応答を高めることができ、選択された配列または抗原複合体に有用であり得る。別の手順としては、選択した抗原を用いた繰り返しのワクチン接種などがある。
【０２６１】
十分振とうした後、静脈内、腫瘍内、皮内、皮下または経口経路によってヒト対象に投与される。投与は、好ましくは、０、７および14日にすべきである。場合によっては、Ｂ細胞エピトープペプチドも含めることができ、追加免疫用途でも同様である。
【０２６２】
ワクチンプロトコルＢ
提案されるワクチン薬剤は、目的ＳＮＰコード同種抗原ペプチドをin vivoで発現可能な、適切なＤＮＡ配列が挿入された複製プラスミドを有するネズミチフス菌の弱毒系統である。本発明者らは、ベクターとして、それを無毒にするΔｃｒｐ−１およびΔｃｙａ突然変異、および正常ａｓｄＡ遺伝子が内在プラスミド上に存在しないかぎりそれを成長できなくするΔａｓｄＡ−１突然変異を有する弱毒化ネズミチフス菌種Ｘ 4072(Schodel等、Infect.Immun.1994、62:1669〜1676)を提案する。しかし、他の安全な菌種を代わりに使用することもできる。
【０２６３】
プラスミドｐＹＡＮは、Ｎｃｏ Ｉ部位を有するように改変されたｐＹＡ292型である(Schodel等、上記)。Ｎｃｏ Ｉ部位によって、目的とする異質なタンパク質またはペプチドのＡＵＧをインフレームでプラスミドに挿入することが可能になる。ｐＹＡＮは、抗生物質耐性遺伝子を欠き、サルモネラ症状を示唆する徴候が出現した場合に抗生物質を使用することが可能になる。
【０２６４】
ｐＹＡＮは、そのプラスミドを保持する細菌のみの生存を維持する正常なａｓｄａ遺伝子を有する。ＡＵＧをコードするＤＮＡ配列とそれに続くそのペプチドをコードする配列が合成される。推奨用量は、小児では５×１０4コロニー形成単位、成人では５×１０5コロニー形成単位である。
【０２６５】
成人の場合、細菌を重炭酸ナトリウム(ＮａＨＣＯ3 ２ｇの蒸留水150ml溶液)とともに投与する。胃酸を中和する溶液120ｍｌを最初に飲むべきである。１分後、今度は細菌を含む残りの炭酸水素塩溶液30ｍｌを飲む。ワクチン接種前後90分間は飲食はできない。
【０２６６】
ワクチンプロトコルＣ
別法では、ＤＮＡを、D.Zhangなど(J.Infect.Dis.1997、176:1035〜1040)によって記載されたワクチン接種プロトコルに類似のものなどの他のＤＮＡ送達技術によって送達することができる。
【０２６７】
好ましい実施形態を上述したが、当業者は、本発明の範囲内で他の改変形態が可能であることを理解されたい。例えば、大腸菌中でＤＮＡを発現する代わりに、他の宿主用にＤＮＡを最適化し、それをこれらの宿主中で発現させることができる。
【０２６８】
また、特異的配列が特定されたが、本発明の技術を利用して、望ましいＣＴＬ活性化特性を有する所望の８〜10量体よりも長いペプチドを挿入することができると考えられる。したがって、特許請求の範囲は、本発明の全範囲を評価するために、最も広範に解釈されるべきである。
【０２６９】
ワクチンプロトコルＤ
樹状細胞(ＤＣ)は、癌に対するワクチン接種用の生きているベクター(life vectors）と考えられ、この処置の抗原を送達するのに特に有用である。
【０２７０】
より最近の臨床試験のほとんどは、ＣＤ14＋前駆体(５、６)から生体外で産生されるＤＣ(いわゆる単球由来のＤＣまたはＭｏ−ＤＣ)を用いて実施され、現在最高の標準(gold standard)と考えられている(Thurner Ｂ等、J Exp Med.190:1669、1999；Schuler-Thurner Ｂ等、J Exp Med.195:1279、2002)。Ｍｏ−ＤＣは、血液中の前駆体から数日で多量に(１回のアフェレーシス当たり３〜５億個の成熟ＤＣ)再現性良く産生することができる(Feuerstein Bなど、J Immunol Methods.245：15〜29、2000)。Ｍｏ−ＤＣの場合、成熟刺激の選択が成功の鍵であり、具体的には、ＤＣをリンパ様臓器に誘導するＣＣＬ19およびＣＣＬ21に応答して移動するＭｏ−ＤＣを発現するＣＣＲ７を得るためにＰＧＥ２が成熟刺激の一部でなければならない(Luft Tなど、blood.100：1362、2002；Scandella Eなど、Blood.100:1354、2002)。ＤＣを主成分とする対腫瘍ペプチドワクチンのＧＭＰ臨床産生を可能にするＤＣ調製方法が利用可能である。選択されたＳＮＰコード同種抗原を有するペプチドを、ＤＣのペプチドローディングに使用することができる。ＤＣに抗原を入れる別の手法は、所望の抗原をコードする裸のＲＮＡをトランスフェクションまたはエレクトロポレーションプロトコルによって取り込み(Van Tendeloo VF等、Blood.98：49、2001)、続いて患者において抗原特異的Ｔ細胞をin vitroならびにin vivoで誘導することによって実施することができる。
【０２７１】
ＤＣには、最高20個のＨＬＡクラスＩ拘束性Ｔ細胞エピトープおよび10個のＨＬＡクラスII拘束性Ｔ細胞エピトープを入れることができ、ＤＣは抗原特異的ＣＴＬ応答を誘導する天然アジュバントとして作用する。
【０２７２】
４量体技術およびＣＴＬ頻度決定に加えて、生体外で実施されるELISPOT分析(実施例15に記載する方法)を使用して、免疫応答をモニターすることができる。
【０２７３】
実施例１５
免疫原性およびワクチン接種効力の評価
癌抗原を用いる臨床試験においては、最も重要な目標はそれらの免疫原性を求めることである。これは、通常、サイトカイン、インターフェロンなどのリンパ球活性化の代理マーカー、または抗体応答などの免疫反応の終点を測定することによって実施される。
【０２７４】
当分野の専門家に知られている標準アッセイは、(アロ)抗原特異的抗体応答が誘導されるかどうかを判定する。これは、ワクチン投与前後の患者から得られた血清を用いて、細胞または抗原ベースの酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)によって実施される。自己白血病細胞、または他の病原細胞、または単離抗原、特にそのアミノ酸交換を含む同種抗原は、ELISAを設定するために好適な標的である。
【０２７５】
別の方法は、遅延型過敏(ＤＴＨ)皮膚試験による免疫原性の評価である。すべての患者は、ワクチン投与前後に、抗原、同種抗原、または照射された自己癌細胞の皮内注射を受ける。硬化、および注射後48時間存在する紅斑の程度が測定される。また、ＤＴＨ試験は、免疫系細胞の流入があるかどうかを判定する免疫組織化学的分析にかける生検試料の収集を含むことができる。
【０２７６】
癌特異的エフェクター細胞を特定する別の方法は、抗原と遭遇して産生された特異的活性化Ｔ細胞を測定するのに有用な最近開発されたアッセイに基づく。活性化細胞は、サイトカインを放出することによって応答し、それらを測定するために抗サイトカイン抗体が使用される。酵素結合イムノスポット(ELISPOT)アッセイとして知られる技術である。ELISPOTは、ドナーまたは患者のリンパ球のin vitroでの再刺激を高感度で実施し測定することができる。
【０２７７】
エフェクター細胞によって分泌されるサイトカインが定量され、それに加えてＴ細胞頻度を測定するためにフローサイトメトリー分析を実施することができる。インフルエンザウイルス(ＦＬＵ)、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)または破傷風トキソイド(ＴＴ)の基準ペプチドまたはタンパク質を、系を標準化するために使用することができる。ＩＬ−４分泌またはＩＦＮ−ガンマ分泌を検出することは、正常ＰＢＭＣ内の抗原特異的ＣＤ４+ならびにＣＤ８+Ｔ細胞の指標となる。記憶型細胞(memory-type cells)は、ＣＤ27およびＣＤ28を発現するがＣＤ57は発現しない。ＩＬ−２を用いて単離し増殖させた後、回収した細胞は抗原特異的細胞毒性を示す。抗原特異的Ｔ細胞の頻度は、ＴＴなどのまれにしか遭遇しないほんの中程度の免疫原性抗原ではより低い(10.000〜1.000.000個に１個)が、持続性のウイルスＣＭＶでははるかに高い(血清陽性ドナーの100〜10.000個のＰＢＭＣに１個)。これらの技術は、本発明によれば、癌に特異的なＴ細胞および同種抗原を分析し単離するのに貴重なツールである。
【０２７８】
実施例１６
同種活性化の測定
同種活性化Ｔ細胞の効力を列挙し測定する方法は、不活性細胞から活性細胞を区別することを臨床的に含むことができる。
【０２７９】
ＸＴＴホルマザン還元アッセイは、同種活性化細胞の活性を非刺激対照と比較するのに有益である。このアッセイは、生きている細胞がＸＴＴを赤色−オレンジホルマザン色素に還元する能力に基づいており、不活性細胞から活性細胞を区別するのにも役立つ。これは、実質的にあらゆる培地中の実質的にあらゆる細胞に使用することができる。有用な細胞の範囲は、１０5から５×１０6/ｍＬである。試薬は、96ウェルプレート、平底(ELISAプレートではない)１ｍｇ/ｍＬ ＭＴＴ(２,３−ビス(２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホ−フェニル−２Ｈ−テトラソリウム(tetrasolium)−５−カルボキシアニリニド(carboxanilinide)塩、Sigma)の(新しい)ＰＢＳ溶液1.53ｍｇ/ｍＬ ＰＭＳ(フッ化フェニルメタンスルホニル、Sigma)のＰＢＳ(凍結、保護されたロムライト(rom light))溶液である。このアッセイは、細胞を含む培地100μｌを96ウェルプレート中に２つ組または３つ組で置くことによって実施される。培地100μＬのみを対照として使用する。第１のカラムはブランクのままにする。発生させるために、使用直前にＰＭＳをＸＴＴとプレミックスし(５μｇ/ｍｌ ＸＴＴ)、ＸＴＴ 50μｌを各ウェルに添加する。プレートを軽くたたいて混合する。プレートを覆い、37℃で４時間インキュベートする。470nm(基準650ｎｍ)でプレートをカウントする。
【０２８０】
実施例１７
ＣＤ３／ＣＤ69またはＣＤ３／ＦＤＡ発現の分析のためのフローサイトメトリー
これは、同種混合リンパ球刺激後にＴリンパ球活性化を分析するアッセイである。ＣＤ69発現またはエステラーゼ活性は、サイトカイン分泌と相関し、Ｔリンパ球活性化の代理指標として使用することができる。非刺激リンパ球は、その表面でＣＤ69を発現せず、低レベルの非特異的エステラーゼしか含まない。同種抗原または非特異的分裂促進因子によって活性化された後、ＣＤ69の発現が48時間以内(24時間でピーク)に出現する。エステラーゼ活性は、刺激後まもなく増加し、数日間続く。すべての同種刺激リンパ球反応が同じ動力学で進行するわけではなく、培養１、２および３日目に活性化を測定することが好ましい。
【０２８１】
ドナーおよび患者の細胞の試験試料を、少量の培養物中で0.5×１０6細胞/ｍｌで２％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ中で混合する。これらの培養物を５％ＣＯ2インキュベーター中で37℃で試験するまで保持する。
【０２８２】
実施例１８
細胞増殖アッセイ
ＤＮＡへの[3Ｈ]−チミジン取り込みを以下のとおり測定した。応答者のリンパ球を、ＲＰＭＩ１６４０含有10％ウシ胎児血清、抗生物質(ストレプトマイシン/ペニシリン)および５×１０-5Ｍ ２−メルカプトエタノール中に100万細胞/ｍｌで懸濁させる。これらの細胞100μｌを丸底マイクロタイタープレート(Costar)の３つ組ウェルに播種する。次いで、同種抗原を含む刺激物質細胞を応答者細胞の調製と同じ方法で、ただし使用前に3000 Ｒ(137Ｃｓ源)を照射して調製する。刺激物質細胞100μｌを応答者細胞に添加し、混合リンパ球培養物を37℃、５％ＣＯ2で７日間インキュベートする。その後、[3Ｈ]−チミジン(0.5ｍＣｉ/ｍｌ、ＩＣＮ Pharmaceuticals、Costa Mesa、Calif.)10μｌを各ウェルに６時間添加する。次いで、マイクロタイタープレートをＭＡＳＨハーベスターを用いて収集し、収集したウェルを液体シンチレーションカウンターでカウントすることによって、取り込まれたチミジンの量を求める。次いで、刺激インデックス(ＳＩ)を、混合リンパ球培養物に取り込まれた[3Ｈ]−チミジンのｃｐｍを対照(非刺激)培養に取り込まれた[3Ｈ]−チミジンのｃｐｍで割った比を計算することによって求める。アクリジンオレンジ取り込みを、[3Ｈ]−チミジン取り込みの代わりに使用することができる。
【０２８３】
実施例１９
腫瘍抗原の特定技術
血清学的クローニング手法(組換えｃＤＮＡ発現クローニングによる腫瘍抗原の血清学的分析)であるＳＥＲＥＸを、Salim等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA、1995、92：11810〜11813)によって記載されたように実施することができる。また、参照により本明細書に援用する米国特許第5,698,396号を参照されたい。本願によれば、同種ＢＭＴを最近受けた患者から得られた抗血清を使用して、患者の白血病細胞ｃＤＮＡから構築された発現ライブラリーをスクリーニングすることによって、癌細胞中で発現される免疫原性タンパク質抗原を特定する。そのようにして特定された抗原をコードするクローンは、その抗血清を採取した患者において高力価の体液性免疫応答を誘発することが判明した。このような高力価のＩｇＧ応答は、検出された抗原がヘルパーＴ細胞によって認識されることを意味し、同種ＢＭＴ後の患者を評価するのに特に役立ち得る。次いで、発現された腫瘍抗原を、ＨＬＡクラスＩおよびクラスIIモチーフの有無、およびＣＴＬとの反応性についてスクリーニングすることができる。ＳＥＲＥＸは、一連の腫瘍タイプに適用され、いくつかの新規な癌関連免疫原性遺伝子産物がクローン化された(Tiireci等、Mol.Med.Today、1997、３：342〜349；Sahin等、Curr.Opin.Immunol.1997、9:709〜716;Old等、J.Exp.Med.1998、187:1163〜1167)。本願によれば、検出された抗原は、それらに対する抗体応答を欠くためにこの方法によっては通常利用できない同種抗原に特異的に関係する。
【０２８４】
【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【表２２】
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【表２３】
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【表２４】
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【表２５】
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【表２６】
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【表２７】
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【表２８】
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【表２９】
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【表３０】
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【表３１】
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【表３２】
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【表３３】
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【表３４】
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【国際調査報告】
2005529187.tif 000036
2005529187.tif 000037
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2005529187.tif 000039
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