(57)【要約】本発明は、経口免疫寛容現象を促すための少なくとも１つの手段（ラクトバチルスパラカゼイ）を含む食品、経口免疫寛容現象を維持するための少なくとも１つの手段（ビフィドバクテリウムラクチス）を含む食品、及び経口免疫寛容現象を促進かつ維持するための手段（ラクトバチルス及びビフィドバクテリアの組合せ）を含む食品に関する。この食品は、乳幼児、新生児、小児、及びペットを対象とする。本発明は、アレルギー体質の人々を対象としない食品に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
経口免疫寛容を維持するための少なくとも１つの手段を含む食品であって、該手段がビフィドバクテリウム菌株に存する食品。
【請求項２】
前記ビフィドバクテリウムがビフィドバクテリウムラクチス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）である請求項１に記載の食品。
【請求項３】
前記ビフィドバクテリウムがビフィドバクテリウムラクチス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）ＡＴＣＣ  ２７５３６である請求項１又は請求項２に記載の食品。
【請求項４】
前記添加細菌が不活性化されているか、又は死菌である請求項１から３までの一項に記載の食品。
【請求項５】
前記食品がアレルギー体質の人々を対象としない請求項１から４までの一項に記載の食品。
【請求項６】
前記食品が乳幼児用調合乳である請求項１から５までの一項に記載の食品。
【請求項７】
前記細菌が前記食品中に、１０５〜１０８、好ましくは１０５〜１０７、及び最も好ましい実施形態では１０６ｃｆｕ／ｍＬ（再構成された調合乳に対して）又はｃｆｕ／ｇ（食品に対して）の量で存在する請求項１から６までの一項に記載の食品。
【請求項８】
ペットフードである請求項１から５までの一項に記載の食品。
【請求項９】
前記細菌が、湿気の無い製品では１０４〜１０８ｃｆｕ／ｇ、湿気のある製品では１０５〜１０８ｃｆｕ／ｇ、及び液体製品では１０５〜１０８ｃｆｕ／ｇの量で存在する請求項８に記載の食品。
【請求項１０】
経口免疫寛容を促すための少なくとも１つの手段及び経口免疫寛容を維持するための少なくとも１つの手段を含む食品であって、経口免疫寛容を促すための該手段がラクトバチルスである乳酸菌に存し、かつ経口免疫寛容を維持するための該手段がビフィドバクテリアである乳酸菌に存する上記食品。
【請求項１１】
前記ラクトバチルスがラクトバチルスパラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）であり、前記ビフィドバクテリウムがビフィドバクテリウムラクチス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）である請求項１０に記載の食品。
【請求項１２】
前記ラクトバチルスパラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）がラクトバチルスパラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＮＣＭ  Ｉ−２１１６であり、前記ビフィドバクテリウムラクチス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）がビフィドバクテリウムラクチス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）ＡＴＣＣ  ２７５３６である請求項１１に記載の食品。
【請求項１３】
前記食品がアレルギー体質の人々を対象としない請求項１０から１２までの一項に記載の食品。
【請求項１４】
前記食品が乳幼児用調合乳である請求項１０から１３までの一項に記載の食品。
【請求項１５】
前記ラクトバチルス：ビフィドバクテリアの比が、新たな個々の食品抗原に触れたことの無い乳幼児では、１０：１と１：１との間に含まれる請求項１４に記載の食品。
【請求項１６】
前記ラクトバチルス：ビフィドバクテリアの比が、食品抗原に触れたことのある乳幼児、新生児又は小児では、１：１０と１：１との間に含まれる請求項１４に記載の食品。
【請求項１７】
ペットフードである請求項１０から１３までの一項に記載の食品。
【請求項１８】
本発明による食品中の微生物の量が、好ましくは、湿気のある又は液体製品の場合、１０４と１０８ｃｆｕ／ｇ（食品に対して）又はｃｆｕ／ｍＬ（再構成された製品に対して）の間に含まれ、湿気の無い又は湿気の少ない製品の場合、食品に対して１０４〜１０９ｃｆｕ／ｇに含まれる請求項１０から１７までの一項に記載の食品。
【請求項１９】
アレルギーを防ぐため、及び／又は移植片を拒絶する危険性を減少させるためにプロバイオティクスを含む食品。
【請求項２０】
経口免疫寛容を誘導するための前記乳酸菌ファミリーの少なくとも１種、及び／又は予め誘導された経口免疫寛容を維持するための前記乳酸菌ファミリーの少なくとも１種を含む請求項１９に記載の食品。
【請求項２１】
経口免疫寛容を誘導する前記乳酸菌が前記ラクトバチルス属に属し、好ましくはラクトバチルスパラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）であり、好ましい実施形態ではラクトバチルスパラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＮＣＭ  Ｉ−２１１６である請求項２０に記載の食品。
【請求項２２】
経口免疫寛容を維持する前記乳酸菌が前記ビフィドバクテリア属に属し、好ましくはビフィドバクテリウムラクチス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）であり、好ましい実施形態ではＢｂ１２株ＡＴＣＣ  ２７５３６である請求項２１に記載の食品。
【請求項２３】
前記アレルギーが食品アレルギーである請求項１９から２２までの一項に記載の食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
牛乳アレルギー又はミルク過敏症は、乳児に非常によく起こり、２歳又は３歳までにたいてい消失するが、時折一生続くこともある。乳幼児に最も多い疾病であり、満期出産乳幼児の０．５から３％、及び早産児の３から５％の頻度で発生する。このアレルギーにより、発疹、じんま疹、口の周りの発赤、鼻水、くしゃみ、仙痛、下痢、嘔吐、アナフィラキシー、又はより一般的には消化不良を起こすことがある。乳幼児突然死に関連する場合もあり得る。
【背景技術】
【０００２】
ミルク過敏症は、乳糖酵素の先天的な欠乏によりミルクに対して不耐性を示す乳糖不耐性と区別されるべきである。
【０００３】
牛乳アレルギーは、多くの場合、α−ラクトグロブリンアレルゲン及びβ−ラクトグロブリンアレルゲンにより引き起こされる。牛乳にも存在する潜在的アレルゲン性のラクトプロテインであるカゼイン及び／又はアルブミンにより引き起こされることもある。このアレルギーは、前述のタンパク質に対する免疫系の過敏性反応により発症する。このプロセスの第１の段階（感作）では、免疫系が、タンパク質が体内に入ってきた時、そのタンパク質を抗原として認識し、特異的な抗体又は具体的には感作Ｔリンパ球で構成される免疫反応を起こす。第２の段階では、その抗体がＩｇＥ抗体である場合、炎症反応を起こすことによりアレルゲンの存在に反応する。これがアレルギーである。
【０００４】
この種のアレルギーのメカニズムを以下のように説明することができる。ＩｇＥ抗体が、循環している好塩基球などの細胞の表面に出現する。アレルゲン／ＩｇＥの相互作用が起こると、ＩｇＥ／アレルゲン対を持つ細胞がヒスタミンなどの化学伝達物質を産生し、放出する。この現象により、血管拡張などの局所的又は全身的な病的影響に至る。
【０００５】
通常、このミルク過敏症は、乳幼児が最初に牛乳を与えられた時、食品の多様化の最初の試みで発症する。
【０００６】
オイアボアテクＡＢ（Ｏｙ  ａｂｏａｔｅｃｈ  ＡＢ）によるＷＯ０１／９７８２２は、アトピー性疾患の危険性の高い乳幼児におけるアトピー性疾患の第一次予防に有効な組成物を調製するために、ラクトバチルスカゼイ亜種ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  ｓｓｐ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）などのプロバイオティク細菌を使用することを開示している。これはアレルギー体質の危険性の高い特定の人々におけるアレルギー予防の試みである。
【０００７】
ジェルヴェダノン社（Ｃｏｍｐａｇｎｉｅ  Ｇｅｒｖａｉｓ  Ｄａｎｏｎｅ）によるＷＯ０１／８９５４１は、病原性微生物に特異的な免疫性を増強させる経口投与用組成物にラクトバチルスカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）を使用することを開示している。これは、特に呼吸器系に影響を与える病原体を対象としており、この組成物は食品又は補助食品であり得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、自分自身で、又は前述の手段の助けにより、牛乳アレルギーなどのアトピー性疾患を予防し、かつ／又は乳幼児により得られる経口免疫寛容を維持する手段に対する必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
従って、本発明は経口免疫寛容現象を維持するための少なくとも１つの手段を含む食品、及び経口免疫寛容現象を促進かつ維持するための手段を含む食品に関する。
【００１０】
本発明は、アレルギー体質の人々を対象としない食品に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の文脈において、「食品」という語は、任意の消費可能な物質を含むことが意図される。従って、人間による消費の対象となる製品であり得るが、この用語は、動物、例えばイヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ネズミ、ラット、鳥（例えばオウム）、爬虫類及び魚（例えば金魚）などのペットにより消費される製品もまた含む。しかし、この用語は、家畜、例えば牛、馬、豚、羊、ヤギ、水牛、ラクダなどの他の飼育動物により消費される食品も含む。この用語は、任意の乳幼児用調合乳、新生児用調合乳、乳幼児及び新生児用フォローアップ調合乳などを含むことも意図される。
【００１２】
牛乳アレルギー又は牛乳過敏症について言う場合、任意の食品アレルギー又は過敏症を指し、より一般的には任意のアトピー性疾患を指すことを理解しなければならない。本発明者らは、牛乳が、多くの場合、乳幼児が出会う最初の食品であるために、このアレルギーに関して最も論証を進めているが、この疾患に対する本発明の適用範囲を限定するわけではない。
【００１３】
驚くべきことに、本発明者らはプロバイオティクスを食品に添加することで、経口免疫寛容の促進及びその維持のための補助剤として使用できることを発見した。
【００１４】
本発明の第１の態様では、牛乳タンパク質に対する経口免疫寛容現象を促すための少なくとも１つの手段を含む食品が提供される。驚くべきことに、本発明者らは、ラクトバチルス属の乳酸菌株、とりわけラクトバチルスパラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）株が経口免疫寛容の誘導を促すことが可能であり、特に牛乳タンパク質に対する経口免疫寛容を促すのに適することを発見した。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態では、使用されるラクトバチルスがラクトバチルスパラカゼイＣＮＣＭ  Ｉ−２１１６である。この微生物はとりわけ以下の特性を示すことがわかっている。グラム陽性、カタラーゼ陰性、アルギニンからのアンモニア産生が陰性、及び二酸化炭素生成が陰性である。Ｌ（＋）乳酸を産生し、０．４％までの濃度の胆汁酸塩の存在下で増殖することが可能である。
【００１６】
本発明によれば、使用される乳酸菌を、補助剤又は補助食品として、とりわけ誕生から栄養補給に抗原（例えば牛乳の抗原）が導入されるまで使用される乳幼児用調合乳に、前記抗原に対する経口免疫寛容を促すために添加することができる。この乳酸菌は、乳幼児の腸の優性フローラではないので、大量にその調合乳に混合されるべきである。例えば１０５〜１０８ｃｆｕ／ｍＬ（再構成された調合乳に対して）又はｃｆｕ／ｇ（食品に対して）、より好ましくは１０５〜１０７、並びに好ましい実施形態では再構成された調合乳に対して１０６ｃｆｕ／ｍＬである。従って、この乳酸菌を１日に数回摂取すれば、腸のミクロフローラ中のこの微生物の量が、本発明の目的に効果を成すのに常に十分なものになる。
【００１７】
前述の乳酸菌は、ラクトバチルス属に属し、とりわけラクトバチルスパラカゼイであり、好ましい実施形態ではラクトバチルスパラカゼイＣＮＣＭ  Ｉ−２１１６であるが、経口免疫寛容を促すためにペットフードに混合することも可能である。好ましくは塊の製品又はコロッケに混合することもできるが、例えば缶詰などの湿った製品に混合することも可能である。特に、子猫又は子犬用のミルクなどのペット用液体製剤に添加することもでき、同様にペット用の噛み付き製品（ｃｈｅｗ  ｐｒｏｄｕｃｔ）に添加することもできる。
【００１８】
この微生物によるペットフードの添加は、例えば、湿気の無い製品では１０４と１０８ｃｆｕ／ｇとの間、湿気のある製品では１０５〜１０８ｃｆｕ／ｇ、並びに液体製品では１０５〜１０８ｃｆｕ／ｇに含まれることが可能であり、これらの量は制限されるものではない。
【００１９】
本発明者らは、ラクトバチルスパラカゼイＣＮＣＭ  Ｉ−２１１６のタンパク質分解活性、及びミルクの最も重要なアレルゲンであるβ−ラクトグロブリンを分解する上でのその潜在的な役割についてさらに調査した。
【００２０】
乳酸菌のタンパク質分解系は、その機能に基づき、３つのグループ：
ｉ）タンパク質全体をペプチドに破壊するプロテイナーゼ、
ｉｉ）ペプチドを分解するペプチダーゼ、及び
ｉｉｉ）細胞膜を越えて破壊生成物を移動させる移送系、
に分けることができる。
【００２１】
プロテイナーゼは細菌細胞の外側に存在し、一方、大部分のペプチダーゼは細胞質に存在する。この研究では、細胞質抽出液由来のペプチダーゼが天然のベータ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）及びそのトリプシン−キモトリプシン（ＴＣ）ペプチドを分解するのに使用された。Ｌ．パラカゼイ（Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ）が関連する酵素は、主に酸性ＴＣペプチドを加水分解するが、一方、塩基性ペプチドはわずかに分解され、ＢＬＧは全く分解されない。ＢＬＧのＴＣ加水分解産物が主に酸性ペプチド（６２％）で構成されることが示されたので、Ｌ．パラカゼイの酵素によるそれらの分解は大変興味深い。しかし、サイズ排除クロマトグラフィーで観察されるように、Ｌ．パラカゼイによる分解により、より低い５００Ｄａの分子量を有するペプチドが主に放出されるため、そのタンパク質分解活性は、アミノ−又はジ−ペプチダーゼに確実に限定される。
【００２２】
塩基性画分もアミノ−及びジ−ペプチダーゼ活性で分解され、本発明者らは、Ｌ．パラカゼイによる分解後、２０００Ｄａより高い分子量を有するペプチドがこの画分に出現することも観察している。理論に縛られるのを望まないが、塩基性ＴＣペプチドがＣ１８クロマトグラフィーで高い疎水性を示したので、ペプチド間の強い疎水的相互作用でこの観察結果を説明することが可能であった。
【００２３】
Ｌ．パラカゼイ抽出液による酸性ＴＣペプチドの分解により、免疫抑制性を有するペプチドがもたらされ、この作用が経口免疫寛容の誘導に不可欠である。免疫寛容の誘導についてよく特徴付けられているメカニズムには、クローン除去、クローンアネルギー及び制御性Ｔ細胞の誘導を介する能動的抑制がある。１型制御性Ｔ細胞（Ｔｒ−１）は増殖能力が低く、ＩＬ−１０のような免疫抑制サイトカインを高レベルに産生する能力によって、ナイーブ及び記憶Ｔヘルパー１型及び２型の反応を抑制する。ＩＬ−１０は、ＣＤ５４の発現、Ｔ細胞の活性化のために重要な共刺激分子として機能するＣＤ８０及びＣＤ８６の反応を抑制することがわかった。興味深いことに、ＩＬ−１０は、Ｌ．パラカゼイによる分解酸性ペプチドに応じて高められることがわかっており、能動的抑制のメカニズムによりＢＬＧに対する経口免疫寛容を誘導するこれらのペプチドの効果を示唆している。
【００２４】
ＢＬＧ−ナイーブマウスで示される、経口免疫寛容現象におけるＬ．パラカゼイによる分解酸性ペプチドの潜在的な有益効果は、ＢＬＧの初回抗原刺激を受けたマウス（ＢＬＧ−免疫寛容マウス）の観察結果により強調される。ＢＬＧの初回抗原刺激を受けたマウス由来の脾細胞でもリンパ球の増殖抑制が観察されており、Ｔ細胞の低応答性を誘導、維持かつ強化する分解ペプチドの実質的な能力を示唆している。
【００２５】
Ｌ．パラカゼイＣＮＣＭ  Ｉ−２１１６は、そのタンパク質分解活性及び生物活性ペプチドの遊離を介して制御性Ｔ細胞を刺激する。本発明者らは、Ｌ．パラカゼイの細胞質含有物の免疫抑制効果についても論じている。これらの結果は、Ｌ．パラカゼイＣＮＣＭ  Ｉ−２１１６などの細菌が、細胞間の相互作用を介して直接的に、又は抗原の分解及び死後の細胞質含有物の遊離を介して、免疫抑制活性を誘導することを強く示唆する。
【００２６】
本発明の第２の態様では、例えば牛乳タンパク質に対する経口免疫寛容現象を維持するための少なくとも１つの手段を含む食品が提供される。実際に、本発明者らはビフィドバクテリウム属の菌株が経口免疫寛容の維持に特有の効果を有することを発見した。従って、特に経口免疫寛容が既に誘導されている人々に対して、補助食品又は補助剤として食品にビフィドバクテリアを添加することが本発明の目的である。特に、このような人々は、母乳で育てられている乳幼児である可能性があり、実際に、母親が食べたアレルゲンの一部が母乳を介して小児に与えられている。このような人々では、授乳により経口免疫寛容が促されており、前述の性質を有する効果的な量のビフィドバクテリアを乳幼児に与えることによって、この免疫寛容を維持することができる。
【００２７】
初めて牛乳を飲んだ時に牛乳過敏症を起こさない一部の乳幼児が、それにもかかわらず、例えば８カ月で他の食品成分を食べた時に何らかの食品過敏症を起こすことがよく知られている。理論に縛られるのを望まないが、本発明者らは、維持されない、又は厳密に維持されるわけではない経口免疫寛容が誘導されていると考えている。
【００２８】
従って、本発明の目的は、その能力を持つビフィドバクテリアを栄養補給に加えることによって、予め誘導されている経口免疫寛容を維持することである。
【００２９】
このプロセスの初めにビフィズス菌を小児又は乳幼児に与えることが有用であるかもしれない。
【００３０】
本発明の好ましい実施形態では、ビフィドバクテリアがビフィドバクテリウムラクチス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）であり、実現する最良の形態では、よく知られるＢｂ１２株、つまりハンセン（Ｃｈｒ．Ｈａｎｓｅｎ  Ａ／Ｓ，１０−１２  Ｂｏｅｇｅ  Ａｌｌｅ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  ４０７，ＤＫ−２９７０  Ｈｏｅｒｓｈｏｌｍ，Ｄａｎｅｍａｒｋ）から入手可能なＡＴＣＣ  ２７５３６であり得る。学名が何度も変わっているので、Ｂｂ１２は文献及び商品においてＢ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）及びＢ．アニマリス（Ｂ．ａｎｉｍａｌｉｓ）として認められる可能性もある。
【００３１】
この微生物はとりわけ以下の特性を示すことがわかっている。グラム陽性、非運動性（ｎｏｎ  ｍｏｂｉｔｉｌｅ）及び無芽胞性桿菌、胃腸の酸及び胆汁酸塩に対して耐性である。カタラーゼ陰性であり、Ｌ（＋）乳酸のみを産生し、そのＤ（−）異性体を産生しない。以下の炭水化物（リボース、サッカロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−ラフィノース、マルトース、メリビオース、アミグダリン及びベータ−ゲントビオース（ｂｅｔａ−ｇｅｎｔｏｂｉｏｓｅ））を利用することができる。
【００３２】
これは、任意の種類の乳幼児、新生児、又は小児の食品、例えば麦芽乳、乳幼児用調合乳、フォローアップ調合乳、新生児用シリアルなどに添加することができる。時には、生後４カ月の早期に乳幼児の栄養補給の多様化が起こる可能性があり、ビフィドバクテリアを４カ月及びそれ以上の年齢の小児に与える乳幼児用食品に混合することができる。たいていの場合、２〜３歳でミルク過敏症が消えるため、経口免疫寛容を維持するためのビフィドバクテリウムによる乳幼児及び新生児の食品の補給は、４カ月から３歳の乳幼児及び新生児用のあらゆる食品に行うことができる。しかし、具体的な乳幼児又は新生児の栄養摂取を対象とせず、これにかかわらず、彼らの栄養補給の一部となる食品、例えばとりわけ、ミルク、ヨーグルト、カード、チーズ、発酵乳、ミルクを加えた発酵食品、アイスクリーム、発酵穀物を加えた製品、又はミルクを加えた製品において、補給することも理解できる。
【００３３】
乳幼児用食品、新生児用食品又は一般的な食品に添加される微生物の量は、再構成された製品に対して１０５〜１０８ｃｆｕ／ｍＬ又は食品に対して１０５〜１０８ｃｆｕ／ｇ、好ましくは１０５〜１０７、並びに最も好ましい実施形態では１０６である。しかし、これらの量は制限されるものであると考えるべきではなく、対象となる人々、例えば、乳幼児又は新生児の体重及び年齢に基づき、或いはとりわけ腸の疾患、急性下痢若しくは炎症症候群を有する乳幼児、新生児又は小児などの特有の疾患を有する人々など個別の人々に適合されるべきである。
【００３４】
前述のビフィドバクテリアは、ビフィドバクテリウムラクチスであり、好ましい実施形態ではＢｂ１２  ビフィドバクテリウムラクチスＡＴＣＣ  ２７５３６であるが、経口免疫寛容を維持するためにペットの食品に混合することもできる。好ましくは塊の製品又はコロッケに混合することができるが、例えば、缶詰などの湿気のある製品に混合することも可能である。とりわけ、子猫又は子犬用のミルクなどのペット用液体製剤に添加することもでき、同様にペット用の噛み付き製品（ｃｈｅｗ  ｐｒｏｄｕｃｔ）に添加することも可能である。
【００３５】
この微生物によるペットフードの添加は、例えば湿気の無い製品では１０４と１０８ｃｆｕ／ｇとの間、湿気のある製品では１０５〜１０８ｃｆｕ／ｇ、及び液体製品では１０５〜１０８ｃｆｕ／ｇに含まれることが可能であるが、これらの量は制限されるものではない。
【００３６】
本発明者らは、Ｂ．ラクチス（Ｂ．ｌａｃｔｉｓ）Ｂｂ１２の無細胞抽出液がＢＬＧのトリプシン−キモトリプシンペプチドを加水分解し、それによりそれらのＩｇＥ認識を低下させ、Ｔｈ１細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激が高まることを示した。酸性ＴＣペプチドは塩基性ペプチドよりも良い脾細胞増殖誘導因子である。しかし、Ｂ．ラクチス無細胞抽出液でさらに加水分解すると、酸性ペプチド及び塩基性ペプチドが同様の刺激効果を示す。この刺激効果は、ＢＬＧ寛容マウスよりもナイーブマウスにおいてより多く述べられている。
【００３７】
タンパク質分解酵素に対するＢＬＧなどのタンパク質の相対抵抗により、それらの一部が消化後に残存することができ、潜在的に高い頻度でアレルギーを起こさせる。一般的に、トリプシン及び／又はキモトリプシンによるタンパク質の加水分解がアレルゲン性を弱めることが認められている。この結果と一致して、本発明者らはＢＬＧのトリプシン−キモトリプシンペプチドのＩｇＥ結合能力が、天然ＢＬＧの結合能力よりも低いことを観察した。
【００３８】
理論に縛られるのを望まないが、本発明者らは、これらの潜在的抗アレルギー性の菌株が関与するメカニズムが、Ｔｈ１細胞に関連するサイトカインであるＩＦＮ−γの産生の強化によるＴｈ１促進／抗Ｔｈ２反応の調節であるように考えている。ＩＦＮ−γは、新生児において低レベルで認められ、食品アレルギーの患者において不足が認められる有力な免疫調節性及び炎症性サイトカインである。ＩＦＮ−γは、Ｔｈ２の分化を阻害し、ＩＬ−４のレベルを減少させ、それによりＩｇＥ産生を阻害することで、食品アレルギーの予防上で重要な役割を果たす。本発明者らは、Ｂ．ラクチスＢｂ１２の無細胞抽出液だけで脾細胞によるＩＦＮ−γ産生を誘導することを観察した。これらの結果は、Ｂ．ラクチスＢｂ１２などの細菌が、直接的に、又は細胞溶解及び腸管への細胞質内容物の放出後に潜在的アレルゲン性タンパク質の分解を介して、Ｔｈ１の特徴を強化することを強く示唆する。
【００３９】
前述のＩＦＮ−γの効果に加えて、ＩＦＮ−γは、腸粘膜を越える無傷の抗原の吸収を増加させる可能性があり、ミルクタンパク質に対する過敏症を有する対象者にＢ．ラクチスＢｂ１２の好ましくない影響を与える可能性が示唆されている。しかし、パイエル板を越える抗原の移送もＩＦＮ−γにより強化される。経口的に抗原に暴露された後、パイエル板が分泌型ＩｇＡを生成する部位であるため、Ｂ．ラクチスＢｂ１２によるＩＦＮ−γ産生の局所的な刺激により、免疫的な排除のメカニズムを介して有害な潜在的食物抗原の侵入が阻害される可能性がある。この結果に一致して、Ｂ．ラクチスＢｂ１２を含むフォローアップ調合乳を与えた乳幼児で糞便のＩｇＡレベルの上昇が観察された。
【００４０】
本発明者らの結果は、Ｂ．ラクチスＢｂ１２が、Ｔｈ１促進／抗Ｔｈ２細胞反応を強化する免疫偏移のメカニズム、並びに有害な潜在的食品抗原の加水分解及び免疫的排除のメカニズムを通して、抗アレルギー性を示すことを明らかにしている。本発明者らは、Ｂｂ１２が、以前にＢＬＧの暴露を受けていない幼若マウス（「ナイーブ」マウス）でＩＦＮ−γ産生を誘導できるかどうかを調べた。Ｂ．ラクチスの分解画分に応じてＩＦＮ−γが産生されることは、ＢＬＧに富む食物を与えることで免疫寛容になったマウスの脾細胞よりもナイーブマウスの脾細胞において明白であり、Ｂ．ラクチスＢｂ１２が、ミルクで育った新生児、及びより高齢の新生児ではＴｈ１反応を維持し、新生児のＴｈ２が与える免疫性を埋め合わせていることを示唆している。
【００４１】
本発明の第３の態様では、例えば牛乳タンパク質に対する経口免疫寛容現象を促進かつ維持するための手段を含む食品が提供される。その結果、とりわけ牛乳に対する経口免疫寛容を促進かつ維持するために、食品はラクトバチルス及びビフィドバクテリアを組み合わせて含むことができる。好ましい実施形態では、食品は、所望の目的を実現するために、ラクトバチルスパラカゼイ及びビフィドバクテリウムラクチスを含んでもよい。例えば、その組合せは、ラクトバチルスパラカゼイＣＮＣＭ  Ｉ−２１１６及びビフィドバクテリウムラクチスＡＴＣＣ  ２７５３６を含んでもよい。経口免疫寛容を促進かつ維持するための手段は、１種又は数種のラクトバチルスと１種又は数種のビフィドバクテリアの組合せであってよい。例えば、ラクトバチルスパラカゼイ、ラクトバチルスラムノサス及びビフィドバクテリウムラクチスの組合せであってよい。どのような人々の集団が、微生物を添加した食品を摂取する（ｉｎｇｅｒａｔｅ）かによって、ビフィドバクテリアと比較したラクトバチルスの割合が変化するかもしれない。例えば、牛乳にまだ触れていない乳幼児では、ラクトバチルス：ビフィドバクテリアの比は１０：１と１：１との間に含まれてもよい。以前に牛乳（又は他の任意のアレルゲン若しくは抗原）を摂取している新生児又は小児では、ラクトバチルス：ビフィドバクテリアの比は１：１０と１：１との間に含まれてもよい。
【００４２】
複数のビフィドバクテリウムが食品に含まれる場合、他の成分と比較した１種のビフィドバクテリアの比は、０．０１〜９９．９％であってよく、調製中に複数のラクトバチルスが存在する場合も同様である。
【００４３】
本発明による微生物の組合せが添加される食品は、本発明の第１の態様及び第２の態様に記載される任意の食品、また、他の任意の食品、例えばチョコレート、チョコレートパウダー、スプレッド、ペストリー、ゼリー、ジャム、ビスケット、菓子、ジュース、乳製品、朝食用シリアル、及び乳幼児、新生児又は小児が食べるさらに一般的な任意の食品、並びにペットが食べる任意の食品であってよい。
【００４４】
本発明による食品中の微生物の量は、好ましくは、湿気を含む、又は液体の製品に混合される場合、食品に対して１０４と１０８ｃｆｕ／ｇとの間、又は再構成された製品に対して１０４と１０８ｃｆｕ／ｍＬとの間で含まれ、湿気の無い、又は湿気の少ない製品に混合される場合、食品に対して１０４〜１０９ｃｆｕ／ｇで含まれる。このラクトバチルス：ビフィドバクテリア（Ｂｉｆｉｄｏｃａｔｅｒｉａ）の比は、食品に添加される微生物の量に影響を与えない。
【００４５】
本発明の微生物はとりわけ、単独でも組み合わせても、摂取した抗原に対する免疫寛容を防ぎ、かつ維持するのに役立つ。特に、エビ、ザリガニ、ロブスター及びカニを含む甲殻類、ピーナッツ、卵、ツリーナッツ（例えばクルミ又はカシューナッツ）、大豆、小麦、魚に対するアレルギーなどの食品アレルギー、並びに他に知られる任意の食品アレルギーに適する。とりわけ、コナダニ、花粉又は粉塵に対するアレルギーなどの他のアレルギーにも適する。
【００４６】
本発明の第４の態様では、移植片を拒絶する危険性を防ぐためにプロバイオティクスを含む食品を提供することである。このような食品は、経口免疫寛容を誘導するために乳酸菌ファミリーの少なくとも１種及び／又は予め誘導された経口免疫寛容を維持するためにビフィドバクテリア属の少なくとも１種を含むことが可能である。ラクトバチルス属に属する乳酸菌の菌株は、特にラクトバチルスパラカゼイ、さらに具体的にはラクトバチルスパラカゼイＣＮＣＭ  Ｉ−２１１６が好ましい。使用されるビフィドバクテリアは、好ましくはビフィドバクテリウムラクチスであり、さらに具体的にはＢｂ１２株ＡＴＣＣ  ２７５３６である。
【００４７】
理論に縛られるのを望まないが、実際に本発明者らは、この２種の細菌が経口免疫寛容を促すことにより免疫系を特異的に刺激する能力を有すると考えている。その結果、単独又は組み合わせられたこれらの細菌と共に免疫系で生み出された、アレルギーを除去するメカニズムは、牛乳アレルギー又は過敏症に特異的であるわけではなく、このメカニズムは、移植を必要とする患者、又は移植が行われた患者が移植片を拒絶しないようにするのに役立つことができる。本発明の態様は、移植される抗原に対する経口免疫寛容を得ることにより、免疫学的な観点から、移植に対応する患者の役に立つために、移植の前及びその後に移植片に対する経口免疫寛容の誘導及び維持に寄与することにより対宿主性移植片疾病の発生の危険性を防ぐものである。
【００４８】
本発明による食品に添加する微生物は、生菌が好ましいが死菌でもよく、或いは、例えば凍結乾燥により不活性化されたものでもよい。実際に、死菌の外膜は、生菌と同様に、少なくとも部分的に免疫系を活性化するようである。その結果、本発明の任意の実施形態では、死菌を用いて細菌又は細菌の組合せを実現することが可能である。この場合、食品に混合する微生物の量は、上記で与えられる量に対して５％から２５０％で増加させるのが好ましい。
実施例
【００４９】
以下の実施例は、本発明の範囲内における一部の製品及びその同一のもの（ｓａｍｅ  ｆａｌｌｉｎｇ）を作成する方法を例示するものである。これらは本発明に何らかの制限を与えるものであると考えるべきではない。本発明に関して変更及び改良を行うことが可能である。すなわち、当業者は、自然発生レベルの本発明の複合物を様々な用途に合理的に適応させるための、製剤、成分、加工及び混合の広範囲にわたる、これらの実施例の多くの変形例を認めるだろう。
【実施例１】
【００５０】
経口免疫寛容の誘導
３〜５週令の無菌雌マウスＣ３Ｈ／ＨｅＪ２０匹の３群、及び３週令の通常雌マウスＢＡＬＢ／ｃの１群がこの試験で使用された。２種のプロバイオティク菌株が本研究で使用され、１種は健康な新生児の糞便から単離され、ネスレカルチャーコレクション（スイス、ローザンヌ）より得られたラクトバチルスパラカゼイＮＣＣ  ２４６１（ＣＮＣＭ  Ｉ−２１１６）であり、１種はクリスハンセン（Ｃｈｒｉｓ  Ｈａｎｓｅｎ）（フランス）より入手した、ヒト由来のビフィドバクテリウムラクチスＢｂ１２ＮＣＣ  ３６２である。
【００５１】
無菌マウスに、Ｌ．パラカゼイ又はＢ．ラクチス菌株のうちの１種を約５×１０８ｃｆｕ／ｍＬで含む２４時間細菌培養液の０．３ｍＬを、胃内チューブで経口的に接種した。経口的な誘導は、細菌を与えた後２週間行った。各群において、１０匹のマウスに、経口免疫寛容を誘導するために乳清タンパク質を３ｍｇ／ｇ体重で経口投与した。乳清タンパク質は酸ホエーの限外ろ過により得られ、タンパク質含量が８０％であり、その約６２％がβ−ラクトグロブリンであった。残りの１０匹のマウスは、ネガティブコントロール（寛容化させないマウス）として塩水だけが経口的に与えられた。
【００５２】
５日後、全てのマウスに、３度結晶化したβ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）１００μｍ及びオボアルブミングレードＶ（ＯＶＡ）１００μｇを用いて、皮下に免疫性を与えた。強制栄養後２８日又は５０日でマウスを殺処分し、それぞれの免疫寛容の誘導及び維持を評価した。殺処分毎に、乳清タンパク質を与えた５匹、及び水を与えた５匹のマウスを殺処分した。５０日で処分されたマウスは、２１日目及び３５日目にＢＬＧ及びＯＶＡの２度の追加皮下注入を受けた。
【００５３】
血清中のＢＬＧ特異的ＩｇＥ、ＢＬＧ特異的ＩｇＧ１及びＢＬＧ特異的ＩｇＧ２ａレベルの量はＥＬＩＳＡにより決定された。
【００５４】
通常マウス、無菌マウス、及び単一菌種の関連したマウスにおける経口免疫寛容の誘導は、乳清タンパク質を経口投与し、ＢＬＧで免疫性を与えた後、２８日で殺処分したマウスで評価された（図１Ａを参照）。結果により、乳清タンパク質を与えることで、通常マウス、無菌マウス及びＬ．パラカゼイ関連マウスにおいてＢＬＧ特異的ＩｇＥ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ抗体反応が顕著に抑制される（Ｐ＜０．０５）ことが明らかに示され、Ｔｈ１及びＴｈ２型体液性反応抑制が示された。Ｂ．ラクチスの関連するマウスにおいて、抗ＢＬＧのＩｇＥ反応のみが顕著に抑制されており、抗ＢＬＧのＩｇＧ１反応は抑制されていたが、顕著なものではなかった（Ｐ＜０．２）。それ故に、このマウス群においてＴｈ２型体液性反応のみが免疫寛容に敏感であった。
【００５５】
脾臓細胞の増殖及びサイトカインの産生に関して免疫寛容の誘導、つまり免疫寛容誘導がプロバイオティクスにより調節されることをさらに確認するために、脾臓細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養され、細胞増殖（表１）及び培養液の上清におけるサイトカインの概要の両方が調べられた（図２Ａ）。
【００５６】
【表１】
2005538703.tif 000002
【実施例２】
【００５７】
ラクトバチルスパラカゼイＮＣＣ  ２４６１の免疫抑制効果：ベータ−ラクトグロブリンに対する経口免疫寛容誘導における発生
Ｌ．パラカゼイ抽出液による分解前後の天然ＢＬＧ及びそのＴＣ画分の分子サイズ
Ｌ．パラカゼイ抽出液がＢＬＧ及びそのＴＣ画分を加水分解するか否かを評価するために、Ｌ．パラカゼイ抽出液による分解前後のペプチドの分子サイズが比較された。天然ＢＬＧは、Ｌ．パラカゼイ抽出液により全く分解されなかったが、酸性及び塩基性ＴＣ画分は両方とも分解された。高分子量（１０００〜５０００Ｄａ）の酸性ペプチドは極めてよく分解され、１０００Ｄａより小さな分子量の小ペプチドを放出した。小ペプチドは、分解前の３６％に比べて、分解画分の７５％を超えており、放出ペプチドの４２％が５００Ｄａより小さいものである。塩基性画分は、それより低い程度で分解された。その画分中で５００〜１０００Ｄａにわたるペプチドが減少し、５００Ｄａより小さなペプチドを生じ、分解前の３７％に比べて分解後では最終的にその画分の４３％を示した。驚くべきことに、２０００Ｄａを上回る分子量のペプチドは、分解画分中で増加した。
【００５８】
Ｌ．パラカゼイ抽出液による分解の有無条件におけるＢＬＧ及びそのＴＣ画分のリンパ球増殖への効果
天然ＢＬＧ及び塩基性ＴＣ画分は、濃度に関わらず、Ｌ．パラカゼイ抽出液による加水分解後でさえリンパ球増殖に影響を及ぼさない。対照的に、酸性ＴＣ画分は、１，０００μｇ／ｍｌを上回る濃度で使用されると、１．８を上回り、２，０００μｇ／ｍｌで２．５に達する刺激指数で示されるようにリンパ球増殖を刺激した。Ｌ．パラカゼイ抽出液による分解後、この刺激効果は顕著に抑制され（ｐ＜０．０５）、最も強い抑制が２，０００μｇ／ｍｌで観察された。さらに、Ｌ．パラカゼイ分解酸性画分の免疫抑制効果は、予めＢＬＧに曝されていないマウスの脾細胞でさらに明らかに認められ、ＢＬＧの初回抗原刺激を受けたマウスの０．４に比べ、刺激指数０．７の減少を示した。
【００５９】
Ｌ．パラカゼイ抽出液による分解の有無条件におけるＢＬＧ及びそのＴＣ画分のサイトカイン産生への効果
低レベルのＩＦＮ−γ及びＩＬ−１０が、Ｌ．パラカゼイ抽出液による分解の有無に関わらず、天然ＢＬＧ及び塩基性ＴＣ画分に反応して脾細胞により産生された。酸性ＴＣ画分は、高レベルのＩＦＮ−γ及び低レベルのＩＬ−１０を誘導することが認められたが、Ｌ．パラカゼイ抽出液によるその分解は、その逆の反応を誘導する。ＩＬ−４は、画分に関わらず、低レベルで産生されることが認められたが、ＢＬＧ及び酸性画分の分解により、本試験の検出限界に近いレベルにまでその分泌が減少した。
【００６０】
Ｌ．パラカゼイ抽出液のリンパ球増殖及びサイトカイン産生への効果
Ｌ．パラカゼイがマウスにおいてＢＬＧに対する経口免疫寛容を誘導することができるメカニズムをさらによく理解するために、リンパ球増殖及びサイトカイン産生における細胞質抽出液単独による効果が調査された。Ｌ．パラカゼイは、低希釈（１／１０）で最大の抑制を示し、高希釈（１／１０００）では効果が無く、用量依存的にマイトジェン誘導のリンパ球増殖を抑制した。ＰＨＡ不在下で観察された細胞増殖は、高用量（１／１０希釈）でさえ、Ｌ．パラカゼイ抽出液により影響が与えられず、使用された濃度が細胞に有毒ではないことが示唆された。さらに、細胞増殖が強く抑制されると大量のＩＬ−１０が産生されたが、ＩＦＮ−γの産生は影響を受けず、非常に少量なままであった。
【実施例３】
【００６１】
経口免疫寛容の維持
本試験は、実施例１の続きである。
【００６２】
寛容化されたマウスの特異的抗体反応抑制の維持は、乳清タンパク質を与えた後、７週間で観察された（図１）。ＢＬＧ特異的ＩｇＥ反応、ＩｇＧ１反応及びＩｇＧ２ａ反応は、通常マウスで抑制が維持された（ｐ＜０．０１）。無菌及びＬ．パラカゼイ関連マウスでは、抗ＢＬＧのＩｇＧ２ａ力価の抑制は維持されなかったが、特異的ＩｇＥレベル及びＩｇＧ１レベルは両方とも維持された。Ｂ．ラクチスを接種したマウスでは、ＢＬＧ特異的ＩｇＥ反応の持続的な抑制及び抗ＢＬＧのＩｇＧ１力価の顕著な減少が観察された。結果として、通常マウスでは、Ｔｈ１−及びＴｈ２−型体液性反応の抑制が維持されたが、一方、無菌マウス、Ｂ．ラクチス及びＬ．パラカゼイ関連マウスでは、Ｔｈ１−型抗体力価のみの失効が維持された。
【００６３】
経口免疫寛容を誘導後、５０日目に殺処分されたマウスでは、脾臓細胞によるＩＦＮ−γの産生は、その減少が有意ではなかった無菌マウス及びその減少が有意なものであったＢ．ラクチス関連マウスを別にすれば、２８日後に得られたものと同様であった（図２Ｂ）。Ｔｈ１−細胞活性もまた全マウス群において抑制されたままであった（図２Ｂ）。その一方、乳清タンパク質を与えた通常マウスのみでＩＬ−１０の高い産生量が維持された（図２Ｂ）。それでもやはり、無菌マウス及びＢ．ラクチス関連マウス由来の脾臓細胞が、ＢＬＧの存在下で、それぞれ１３１、６１及び３８に達する高い刺激指数で明らかに示されるように、長期間の免疫寛容の持続に対して敏感に反応することがわかった（表１）。通常マウス及びＬ．パラカゼイ接種マウスでは、ＢＬＧの存在下で低い刺激指数が得られたが、全マウス群由来の細胞はＰＨＡによく反応していた（表１）。
【実施例４】
【００６４】
ベータ−ラクトグロブリンに対するビフィドバクテリウムラクチスＢｂ１２の抗アレルギー性
ＢＬＧのＴＣ画分の特徴−ＢＬＧ及びそのＴＣペプチドの分子サイズにおけるＢ．ラクチスによる加水分解の効果
天然ＢＬＧがＢ．ラクチス抽出液により分解されなかったのに、酸性画分及び塩基性画分の両方がＢ．ラクチス抽出液により分解された。Ｂ．ラクチスによる分解前には、酸性画分は２０００〜５０００Ｄａにわたる分子量を有するペプチドを３６％含んでいた。Ｂ．ラクチスによる分解後には、このペプチドの濃度は２１％に減少し、一方、低分子量のペプチド（＜５００Ｄａ）は１９％から４６％に増加した。小ペプチドは、塩基性画分の加水分解後にも放出された。５００〜２０００Ｄａの分子量の塩基性ペプチドは分解され、遅延保持期間を伴って小ペプチドを生じた。
【００６５】
ＢＬＧ及びそのＴＣ画分のＩｇＥ結合能力
ＢＬＧ及びその塩基性ＴＣ画分の結合能力は、Ｂ．ラクチス抽出液による分解により有意に弱まるわけではない。その一方、酸性ＴＣペプチドによる血清ＩｇＥ結合は、Ｂ．ラクチスによる加水分解によりわずかに弱まった。
【００６６】
Ｂ．ラクチス抽出液により分解されるＢＬＧ及びそのＴＣ画分のリンパ球増殖への効果
Ｂ．ラクチスによる分解前には、リンパ球増殖は、１，０００μｇｍｌ−１或いはそれ以上の濃度の酸性画分の存在下で顕著に刺激されたが、濃度に関わらずＢＬＧ及び塩基性画分の存在下では刺激されなかった。対照的に、Ｂ．ラクチス抽出液による分解後には、ＢＬＧ及びそのＴＣ画分全てが用量依存的にリンパ球増殖を刺激した。ＢＬＧ及び塩基性画分は、１，０００μｇｍｌ−１以上の濃度で顕著に細胞増殖を誘導したが、酸性画分は２，０００μｇｍｌ−１の濃度でそのような誘導を行った。さらに、２，０００μｇｍｌ−１で得られた刺激指数は、ＢＬＧ、酸性画分及び塩基性画分で同様であった。酸性ＴＣペプチド及び塩基性ＴＣペプチドが明確な刺激効果を有したが、Ｂ．ラクチス抽出液による分解は、高用量で集中的な効果をもたらした。
【００６７】
酸性画分及び塩基性画分と異なり、Ｂ．ラクチス抽出液により加水分解されるＢＬＧは、その後、ろ過して酵素を除去しないので、コントロールとして、リンパ球増殖への抽出液単独の効果を評価した。１／１００に希釈すると（ＢＬＧ加水分解のために、ウェルは２０００μｇｍｌ−１のＢＬＧ、さらに４０μｇｍｌ−１の細胞抽出タンパク質も含む。）、抽出液はリンパ球増殖を強く刺激し、ＢＬＧの刺激効果が４０μｇｍｌ−１で存在する無細胞抽出液に主に起因している可能性があることが示された。対照的に、Ｂ．ラクチス抽出液の限外ろ過で、Ｃ１８クロマトグラフィーで確認されるように、本質的にタンパク質の除かれた通過物が作り出され、ろ過後には微量の抽出物しか、酸性画分及び塩基性画分の両方に残らないことが示唆された。低濃度（１／１０００又は細胞抽出タンパク質に対して４μｇｍｌ−１）では、抽出液はリンパ球増殖を刺激しないようであり、酸性画分及び塩基性画分で観察される効果に貢献しないことが示された。
【００６８】
ナイーブマウス及び免疫寛容マウス由来リンパ球の増殖
この段落は、幼若ナイーブマウス由来リンパ球の増殖、並びにＢＬＧに富む餌を日常的に与えられたマウス由来リンパ球の増殖を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激するために使用される因子におけるＢ．ラクチス抽出液の効果について扱う。Ｂ．ラクチス抽出液による分解前では、酸性画分は、免疫寛容マウス由来のリンパ球よりもナイーブマウス由来のリンパ球を刺激したが、ＢＬＧ及び塩基性ペプチドはそうではなかった。Ｂ．ラクチス抽出液による分解後では、ＢＬＧ及びそのＴＣ画分全てが、免疫寛容マウス由来のリンパ球に比べて、指数３に対して４に達する指数で示されるように、ナイーブマウス由来のリンパ球の増殖を著しくより強く刺激した。しかし、免疫寛容マウスで前述したように、ナイーブマウスでは、Ｂ．ラクチス抽出液（希釈１／１００）が単独でリンパ球増殖を刺激することが示されており、Ｂ．ラクチス抽出液により分解される天然ＢＬＧに実質的な増殖刺激効果が無いことが示唆された。
【００６９】
サイトカイン産生
この段落は、Ｂ．ラクチス抽出液による加水分解の有無条件におけるＢＬＧ及びそのＴＣ画分の存在下でのナイーブマウス及び免疫寛容マウス由来の脾細胞によるサイトカインの産生について扱う。ナイーブマウス及び免疫寛容マウスの脾細胞培養において、ＩＦＮ−γが、未処理ＢＬＧ、酸性及び塩基性ＴＣ画分の存在下で少量産生され、最高産生量は酸性画分に反応して得られた４００ｐｇｍｌ−１であった。Ｂ．ラクチス抽出液で加水分解されると、ＢＬＧ及び両画分は、ナイーブマウスの脾細胞及び免疫寛容マウスの脾細胞の両方によるＩＦＮ−γ分泌を強く誘導し、ナイーブマウスでより高い産生量を示した。同様の反応がＩＬ−１０分泌で観察されたが、産生量はＩＦＮ−γより１０倍低いものであった。ＩＬ−４又はＩＬ−５は、ＢＬＧ試料又はマウスに関わらず、細胞培養液の上清で検出されず、強力なＴｈ２−型サイトカインの誘導が無いことが示唆された。リンパ球増殖で観察されたように、Ｂ．ラクチス抽出液で分解されるＢＬＧに反応したＩＦＮ−γの産生は、主に試料中に残っている抽出液に起因する。
【実施例５】
【００７０】
経口免疫寛容を促進かつ誘導する乳幼児用調合乳
本発明者らは、以下の指示割合の成分を混合することによって乳幼児用調合乳を調製する。最終製品は１００ｇに対して５１９ｋｃａｌを有し、粉末状である。
【００７１】
脂肪                              ２７．７ｇ
乳脂肪                            ０．７ｇ
各種脂肪（１５０）混合物        ２６．８ｇ
レシチン                          ０．２ｇ
リノール酸                    ４．１ｇ
α−リノール酸                ５２５ｍｇ
タンパク質                          ９．５ｇ
遊離炭水化物                      ５７．９ｇ
ラクトース                      ５７．９ｇ
ミネラル（灰分）                    １．９ｇ
ナトリウム                        １２０ｍｇ
カリウム                          ４６０ｍｇ
塩化物                            ３３０ｍｇ
カルシウム                        ３２０ｍｇ
リン                              １６０ｍｇ
マグネシウム                        ３６ｍｇ
マンガン                            ４０μｇ
セレン                              １０．４μｇ
全固形分                          ９７．０ｇ
水分                                ３．０ｇ
【００７２】
上述の調合乳に１００ｇ当たり１０６のラクトバチルスパラカゼイ及び１０２のビフィドバクテリウムラクチスを添加する。
【実施例６】
【００７３】
経口免疫寛容を促進かつ誘導するキャットフード
配合飼料は、総重量の約５８％のトウモロコシ、総重量の約６％のトウモロコシグルテン、総重量の約２３％のチキンミールから成り、残りは、塩、ビタミン及びミネラルから成る。
【００７４】
配合飼料をプレコンディショナーに送り込み、湿らせる。湿った飼料を押出調理器（ｅｘｔｒｕｄｅｒ−ｃｏｏｋｅｒ）に送り込み、ゼラチン状にする。押出機に残しているゼラチン化基質を型に通して、押し出す。押し出されたもの（ｅｘｔｒｕｄａｔｅ）を猫に与えるのに適切な断片に切り分け、約１１０℃で約２０分間乾燥し、冷却して小粒を形成させる。この時点で、この小粒に適用するために、以下の種のうちの１種又は複数種の菌株の凍結乾燥粉末が提供される：ラクトバチルスパラカゼイ及びビフィドバクテリウムラクチス。猫に対する対応食餌摂取量が約１０７〜１０９ｃｆｕ／日であるような十分な粉末がこうして提供される。粉末の一部は第１集団の小粒に混合され、袋詰めされる。第２の量の粉末は計り分けられ、脂質担体に混合され、第２集団の小粒に吹き付けられる。小粒は、その被覆物が５０〜６０℃で数分間、十分に乾燥した後に袋詰めされる。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】乳清タンパク質を経口的に給餌した後、２８日（Ａ）又は５０日（Ｂ）で殺処分したマウス（通常マウス（ＣＶ）、単一菌種の関連したマウス及び無菌マウス（ＧＦ））の血清中のＢＬＧ特異的抗体力価（ＩｇＥ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ）の減少を示す。
【図２】ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける脾臓細胞のＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、ＩＬ−５及びＩＬ−４の産生を示す。マウス（通常マウス（Ｃｏｎｖ）、単一菌種の関連したマウス、無菌マウス（ＧＦ））に乳清タンパク質（黒い棒線）又は塩水（無色の棒線）を経口的に与え、Ａｌ（ＯＨ）３中のＢＬＧ１００μｇ及びＯＶＡ１００μｇを皮下に注入し、強制栄養後、２８日（Ａ）又は５０日（Ｂ）で殺処分した。５０日で処分されたマウスは、２１日目及び３５日目に２度の追加注入を受けた。
【図１】
2005538703.tif 000003
【図２】
2005538703.tif 000004
【手続補正書】
【提出日】平成16年8月12日(2004.8.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原に対する経口免疫寛容を維持するための食品の製造におけるビフィドバクテリウム菌株の使用。
【請求項２】
前記ビフィドバクテリウムがビフィドバクテリウムラクチス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）である請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記ビフィドバクテリウムがビフィドバクテリウムラクチス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）ＡＴＣＣ  ２７５３６である請求項１又は請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記添加細菌が不活性化されているか、又は死菌である請求項１から３までの一項に記載の使用。
【請求項５】
前記食品が乳幼児用調合乳である請求項１から４までの一項に記載の使用。
【請求項６】
前記細菌が前記食品中に、１０５〜１０８、好ましくは１０５〜１０７、及び最も好ましい実施形態では１０６ｃｆｕ／ｍＬ（再構成された調合乳に対して）又はｃｆｕ／ｇ（食品に対して）の量で存在する請求項１から５までの一項に記載の使用。
【請求項７】
ペットフードである請求項１から４までの一項に記載の使用。
【請求項８】
前記細菌が、湿気の無い製品では１０４〜１０８ｃｆｕ／ｇ、湿気のある製品では１０５〜１０８ｃｆｕ／ｇ、及び液体製品では１０５〜１０８ｃｆｕ／ｇの量で存在する請求項７に記載の使用。
【請求項９】
抗原に対する経口免疫寛容を促進かつ維持するための食品の製造におけるラクトバチルス及びビフィドバクテリアの使用。
【請求項１０】
前記ラクトバチルスがラクトバチルスパラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）であり、前記ビフィドバクテリウムがビフィドバクテリウムラクチス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）である請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記ラクトバチルスパラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）がラクトバチルスパラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＮＣＭ  Ｉ−２１１６であり、前記ビフィドバクテリウムラクチス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）がビフィドバクテリウムラクチス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）ＡＴＣＣ  ２７５３６である請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記食品が乳幼児用調合乳である請求項９から１１までの一項に記載の使用。
【請求項１３】
前記乳幼児用調合乳が、抗原に触れる前に与えられ、前記ラクトバチルス：ビフィドバクテリアの比が１０：１と１：１との間に含まれる請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記乳幼児用調合乳が、抗原に触れた後に与えられ、前記ラクトバチルス：ビフィドバクテリアの比が１：１０と１：１との間に含まれる請求項１２に記載の使用。
【請求項１５】
前記食品がペットフードである請求項９から１１までの一項に記載の使用。
【請求項１６】
本発明による食品中の微生物の量が、好ましくは、湿気のある又は液体製品の場合、１０４と１０８ｃｆｕ／ｇ（食品に対して）又はｃｆｕ／ｍＬ（再構成された製品に対して）の間に含まれ、湿気の無い又は湿気の少ない製品の場合、食品に対して１０４〜１０９ｃｆｕ／ｇに含まれる請求項９から１５までの一項に記載の使用。
【請求項１７】
移植片を拒絶する危険性を減少させる食品を製造するためのプロバイオティクスの使用。
【請求項１８】
経口免疫寛容を誘導するためのラクトバチルス、及び予め誘導された経口免疫寛容を維持するためのビフィドバクテリウムを含む請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
ラクトバチルスがラクトバチルスパラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）であり、好ましくはラクトバチルスパラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＮＣＭ  Ｉ−２１１６である請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
ビフィドバクテリウムがビフィドバクテリウムラクチス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）であり、好ましくはＢｂ１２株ＡＴＣＣ  ２７５３６である請求項１９に記載の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
従って、本発明は、抗原に対する経口免疫寛容を維持するための食品の製造のためのビフィドバクテリウム菌株の使用を提供する。本発明はさらに、抗原に対する経口免疫寛容を促進かつ維持するための食品の製造のためのラクトバチルス及びビフィドバクテリアの使用を提供する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
具体的には、本発明者らは、ラクトバチルス属の乳酸菌株、とりわけラクトバチルスパラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）株が経口免疫寛容の誘導を促すことが可能であり、特に牛乳タンパク質に対する経口免疫寛容を促すのに適することを発見した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
本発明者らはビフィドバクテリウム属の菌株が経口免疫寛容の維持に特有の効果を有することを発見した。従って、特に経口免疫寛容が既に誘導されている人々に対して、補助食品又は補助剤として食品にビフィドバクテリアを添加することが本発明の目的である。特に、このような人々は、母乳で育てられている乳幼児である可能性があり、実際に、母親が食べたアレルゲンの一部が母乳を介して小児に与えられている。このような人々では、授乳により経口免疫寛容が促されており、前述の性質を有する効果的な量のビフィドバクテリアを乳幼児に与えることによって、この免疫寛容を維持することができる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
とりわけ牛乳に対する経口免疫寛容を促進かつ維持するために、ラクトバチルス及びビフィドバクテリアを組み合わせて使用することが好ましい。好ましい実施形態では、食品は、所望の目的を実現するために、ラクトバチルスパラカゼイ及びビフィドバクテリウムラクチスを含んでもよい。例えば、その組合せは、ラクトバチルスパラカゼイＣＮＣＭ  Ｉ−２１１６及びビフィドバクテリウムラクチスＡＴＣＣ  ２７５３６を含んでもよい。経口免疫寛容を促進かつ維持するための手段は、１種又は数種のラクトバチルスと１種又は数種のビフィドバクテリアの組合せであってよい。例えば、ラクトバチルスパラカゼイ、ラクトバチルスラムノサス及びビフィドバクテリウムラクチスの組合せであってよい。どのような人々の集団が、微生物を添加した食品を摂取する（ｉｎｇｅｒａｔｅ）かによって、ビフィドバクテリアと比較したラクトバチルスの割合が変化するかもしれない。例えば、牛乳にまだ触れていない乳幼児では、ラクトバチルス：ビフィドバクテリアの比は１０：１と１：１との間に含まれてもよい。以前に牛乳（又は他の任意のアレルゲン若しくは抗原）を摂取している新生児又は小児では、ラクトバチルス：ビフィドバクテリアの比は１：１０と１：１との間に含まれてもよい。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
移植片を拒絶する危険性を防ぐために食品の製造ではプロバイオティクスを使用することもできる。このような食品は、経口免疫寛容を誘導するために乳酸菌ファミリーの少なくとも１種及び／又は予め誘導された経口免疫寛容を維持するためにビフィドバクテリア属の少なくとも１種を含むことが可能である。ラクトバチルス属に属する乳酸菌の菌株は、特にラクトバチルスパラカゼイ、さらに具体的にはラクトバチルスパラカゼイＣＮＣＭ  Ｉ−２１１６が好ましい。使用されるビフィドバクテリアは、好ましくはビフィドバクテリウムラクチスであり、さらに具体的にはＢｂ１２株ＡＴＣＣ  ２７５３６である。


【国際調査報告】
2005538703.tif 000005
2005538703.tif 000006
2005538703.tif 000007
2005538703.tif 000008
2005538703.tif 000009
2005538703.tif 000010