(57)【要約】ＯＲＦ６遺伝子を特異的に増幅および検出するための増幅プライマーおよび方法が開示される。プライマー−ターゲット結合配列は、様々な増幅および検出反応において、肺炎マイコプラズマの増幅および検出に有用である。図（Ｉ）は、鎖置換増幅（ＳＤＡ）反応での肺炎マイコプラズマ核酸ＯＲＦ６遺伝子ターゲット配列の検出を示すものである。
2005508136.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＯＲＦ６ＬＰ１（配列番号１）、ＯＲＦ６ＬＰ２（配列番号２）、ＯＲＦ６ＬｅｆｔＰＣＲ（配列番号１２）、ＯＲＦ６ＲＰ１（配列番号３）、ＯＲＦ６ＲＰ２（配列番号４）、およびＯＲＦ６ＲｉｇｈｔＰＣＲ（配列番号１３）のターゲット結合配列からなる群から選択されたターゲット結合配列と、任意選択の増幅反応に必要な配列とからなることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前期増幅反応に必要な配列が制限エンドヌクレアーゼによってニッキング可能な制限エンドヌクレアーゼ認識部位であることを特徴とする請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
ＯＲＦ６ＬＰ１（配列番号１）、ＯＲＦ６ＬＰ２（配列番号２）、ＯＲＦ６ＲＰ１（配列番号３）、およびＯＲＦ６ＲＰ２（配列番号４）からなる群から選択されることを特徴とする請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
ＯＲＦ６ＡＤＰＴ１（配列番号９）、配列番号９に相補的な核酸、ＯＲＦ６ＡＤＰＴ２（配列番号１０）、および配列番号１０に相補的な核酸からなる群から選択されることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドが間接的に検出可能なマーカーを含むことを特徴とする請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
前記間接的に検出可能なマーカーがアダプター配列であることを特徴とする請求項５に記載の核酸。
【請求項７】
ａ）ＯＲＦ６ＬＰ１（配列番号１）、ＯＲＦ６ＬＰ２（配列番号２）、およびＯＲＦ６ＬｅｆｔＰＣＲ（配列番号１２）からなる群から選択されたターゲット結合配列、および任意選択の増幅反応に必要な配列からなる第１のプライマーと、
ｂ）ＯＲＦ６ＲＰ１（配列番号３）、ＯＲＦ６ＲＰ２（配列番号４）、およびＯＲＦ６ＲｉｇｈｔＰＣＲ（配列番号１３）のターゲット結合配列からなる群から選択されたターゲット結合配列、および任意選択の増幅反応に必要な配列からなる第２のプライマーとを含むことを特徴とする増幅プライマーの対。
【請求項８】
増幅反応に必要な配列が、制限エンドヌクレアーゼによってニッキング可能な制限エンドヌクレアーゼ認識部位であることを特徴とする請求項７に記載の増幅プライマーの対。
【請求項９】
前記第１のプライマーがＯＲＦ６ＬＰ１（配列番号１）であり、前記第２のプライマーがＯＲＦ６ＲＰ１（配列番号３）であることを特徴とする請求項８に記載の増幅プライマーの対。
【請求項１０】
前記第１のプライマーがＯＲＦ６ＬＰ２（配列番号２）であり、前記第２のプライマーがＯＲＦ６ＲＰ２（配列番号４）であることを特徴とする請求項８に記載の増幅プライマーの対。
【請求項１１】
ａ）ＯＲＦ６ＬＰ１（配列番号１）、ＯＲＦ６ＬＰ２（配列番号２）、およびＯＲＦ６ＬｅｆｔＰＣＲ（配列番号１２）からなる群から選択された１または２以上のプライマー、
ｂ）ＯＲＦ６ＲＰ１（配列番号３）、ＯＲＦ６ＲＰ２（配列番号４）、およびＯＲＦ６ＲｉｇｈｔＰＣＲ（配列番号１３）からなる群から選択された１または２以上のプライマー、
ｃ）ＯＲＦ６ＡＤＰＴ１（配列番号９）、配列番号９に相補的な核酸、ＯＲＦ６ＡＤＰＴ２（配列番号１０）、および配列番号１０に相補的な核酸からなる群から選択された１または２以上のシグナルプライマー
を含むことを特徴とするキット。
【請求項１２】
前記１または２以上のシグナルプライマーが間接的に検出可能なマーカーを含むことを特徴とする請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
前記間接的に検出可能なマーカーがアダプター配列であることを特徴とする請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
配列番号１１のレポータープローブをさらに含むことを特徴とする請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
ｅ）レジオネラ菌に特異的な核酸配列の増幅に特異的なプライマーの対、
ｆ）百日咳菌に特異的な核酸配列の増幅に特異的なプライマーの対、
ｇ）クラミジア感染の指標となる核酸配列の増幅に特異的なプライマーの対
をさらに含むことを特徴とする請求項１１に記載のキット。
【請求項１６】
サンプル中の肺炎マイコプラズマの有無を検出する方法であって、
ａ）核酸増幅反応において、前記第１のプライマーがＯＲＦ６ＬＰ１（配列番号１）であり、前記第２のプライマーがＯＲＦ６ＲＰ１（配列番号３）である核酸プライマーの対を用いて前記サンプルを処理すること、
ｂ）増幅された核酸産物があれば検出することを含む方法であり、増幅された産物は肺炎マイコプラズマ生物が存在する指標となることを特徴とする方法。
【請求項１７】
前記核酸増幅反応が鎖置換増幅（ＳＤＡ）反応であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記増幅された核酸産物とＯＲＦ６ＡＤＰＴ１（配列番号９）からなるシグナルプライマーとをハイブリダイズすることによって、前記増幅された核酸産物を間接的に検出することを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＳＤＡ反応が好熱性鎖置換増幅（ｔＳＤＡ）反応であることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記ｔＳＤＡ反応が均一系蛍光実時間ｔＳＤＡ反応であることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
サンプル中の肺炎マイコプラズマの有無を検出する方法であって、
ａ）核酸増幅反応において、第１のプライマーがＯＲＦ６ＬＰ２（配列番号２）であり、第２のプライマーがＯＲＦ６ＲＰ２（配列番号４）である核酸プライマーの対を用いて前記サンプルを処理すること、
ｂ）増幅された核酸産物があれば検出することを含む方法であり、増幅された産物の検出は肺炎マイコプラズマ生物が存在する指標となることを特徴とする方法。
【請求項２２】
前記核酸増幅反応が鎖置換増幅（ＳＤＡ）反応であることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記増幅された核酸産物とＯＲＦ６ＡＤＰＴ２（配列番号１０）からなるシグナルプライマーとをハイブリダイズすることによって、前記増幅された核酸産物を間接的に検出することを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＳＤＡ反応が好熱性鎖置換増幅（ｔＳＤＡ）反応であることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記ｔＳＤＡ反応が均一系蛍光実時間ｔＳＤＡ反応であることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
肺炎マイコプラズマのターゲット核酸配列を増幅する方法であって、
ａ）核酸に、
ｉ）ＯＲＦ６ＬＰ１（配列番号１）、ＯＲＦ６ＬＰ２（配列番号２）、およびＯＲＦ６ＬｅｆｔＰＣＲ（配列番号１２）のターゲット結合配列からなる群から選択された第１の増幅プライマー、および任意選択の増幅反応に必要な配列と、
ｉｉ）ＯＲＦ６ＲＰ１（配列番号３）、ＯＲＦ６ＲＰ２（配列番号４）、およびＯＲＦ６ＲｉｇｈｔＰＣＲ（配列番号１３）のターゲット結合配列からなる群から選択された第２の増幅プライマー、および任意選択の増幅反応に必要な配列と、をハイブリダイズさせること、ならびに
ｂ）ハイブリダイズされた第１および第２の増幅プライマーをターゲット核酸配列上で伸長させ、それによってターゲット核酸配列を増幅すること、を含むことを特徴とする方法。
【請求項２７】
シグナルプライマーとのハイブリダイゼーションによってターゲット核酸を間接的に検出することをさらに含むことを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
シグナルプライマーが、ＯＲＦ６ＡＤＰＴ１（配列番号９）およびＯＲＦ６ＡＤＰＴ２（配列番号１０）からなる群から選択されることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
増幅反応に必要な配列が、鎖置換増幅の際に制限エンドヌクレアーゼによってニッキングされる、制限エンドヌクレアーゼに対する認識部位であることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
ポリメラーゼ連鎖反応によってターゲット核酸を増幅することを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＳＤＡ反応が好熱性鎖置換増幅（ｔＳＤＡ）反応であることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記ｔＳＤＡ反応が均一系蛍光実時間ｔＳＤＡ反応であることを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、呼吸器サンプルもしくは他の患者検体、または培養物サンプル中の肺炎マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の有無を判定する方法に関する。この方法は、好ましくは、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、好熱性鎖置換増幅（ｔＳＤＡ）、または蛍光実時間ｔＳＤＡのうちの１つの技術を使用し、核酸プライマ−を用いて、ＯＲＦ６遺伝子内のターゲット配列を特異的に増幅させるものである。
【背景技術】
【０００２】
肺炎マイコプラズマは、大部分がヒトの気道にいる病原であり、気管支炎、咽頭炎、および非定型肺炎を引き起こし得る。この細菌は、年長児童および若年成人に最もよく感染する。肺炎マイコプラズマを診断するための標準的臨床検査法には、培養法および血清学的方法が含まれる。両方の方法は欠点を有し、肺炎マイコプラズマは選好性であり、培養に１〜３週間を要する一方で、血清学的方法は感度が鈍く、非特異的である。肺炎マイコプラズマを検出するための核酸増幅法は、速さと感度および特異性の向上という利点をもたらす可能性を秘めている。
【０００３】
非特許文献１に記載されているような物理的地図の作成、および非特許文献２に記載されているような完全なゲノムの配列決定が、肺炎マイコプラズマについて行われている。肺炎マイコプラズマの宿主細胞への接着に数種のマイコプラズマ膜タンパク質が関与することは知られている。これらには、Ｐ１、ＨＭＷ１、およびＨＭＷ３タンパク質、ならびにＯＲＦ６遺伝子の４０ｋＤａおよび９０ｋＤａの発現産物が含まれ、これらのすべてが互いに会合して膜貫通型のタンパク質複合体になっている（非特許文献３、４、５、６）。ＯＲＦ６遺伝子は、Ｐ１接着タンパク質遺伝子の両側に位置する２つのオープンリーディングフレームの一方である。肺炎マイコプラズマゲノムのこの領域については、ＯＲＦ４−ＯＲＦ５／Ｐ１−ＯＲＦ６の順をなすオペロン様機構が提唱されている（非特許文献７）。３９５０ｂｐのＯＲＦ６遺伝子は、肺炎マイコプラズマゲノム全体で合計８回繰り返される１９００ｂｐの反復性要素（ＲｅｐＭＰ５）を含んでいる（非特許文献８）。ＯＲＦ６遺伝子はこの生物において重要であるので、肺炎マイコプラズマの病原性に特異的な診断用試験を開発するために潜在的に有用なターゲットになる。またこのようなアッセイ用のターゲットとしてＯＲＦ６遺伝子内のＲｅｐＭＰ５要素を選択することにも、肺炎マイコプラズマゲノム内の一つの複製配列をターゲットにして実現できるものより感度を高められるという利点を有する。
【０００４】
【特許文献１】
米国特許第５，５４７，８６１号
【特許文献２】
米国特許第５，６４８，２１１号
【特許文献３】
米国特許第５，８４６，７２６号
【特許文献４】
米国特許第５，９１９，６３０号
【特許文献５】
米国特許第５，９２８，８６９号
【特許文献６】
米国特許第５，９５８，７００号
【特許文献７】
米国特許第５，９３５，７９１号
【特許文献８】
米国特許第６，０５４，２７９号
【特許文献９】
米国特許第６，１３０，０４７号
【特許文献１０】
米国特許出願第０９／５９０，０６１号
【特許文献１１】
米国特許出願第０９／６０２，９９６号
【特許文献１２】
ＥＰ０  ６７８  ５８２
【特許文献１３】
米国特許第５，４７０，７２３号
【特許文献１４】
米国特許出願第０９／６２６，８５５号
【特許文献１５】
米国特許出願第０９／６２６，３５４号
【特許文献１６】
米国特許出願第０９／７０８，２０８号
【特許文献１７】
ＥＰ０  ６８４  ３１５
【特許文献１８】
米国特許出願第０９／５７３，２４２号
【特許文献１９】
ＥＰ０  ６２４  ６４３
【特許文献２０】
米国特許第５，２７０，１８４号
【特許文献２１】
ヨーロッパ特許出願公開番号０  ８６９  １８７  Ａ２
【特許文献２２】
米国特許第５，９２８，９０７号
【特許文献２３】
米国特許出願第０９／１９６，１２３号
【特許文献２４】
米国特許出願第０９／５７４，０３１号
【非特許文献１】
Wenzel, et al., 1988, Nucl. Acids Res. 16: 8323-8336
【非特許文献２】
Himmelreich, et al., 1996, Nucl. Acids Res. 24: 4420-4449
【非特許文献３】
Sperker, et al., 1991, Mol. Microbiol. 5: 299-306
【非特許文献４】
Layh-Schmitt, 1993, Zentralbl Bakteriol 278: 287-295
【非特許文献５】
Layh-Schmitt, et al., 1999, FEMS Microbiol. Lett. 174: 143-149
【非特許文献６】
Layh-Schmitt, et al., 2000, Microbiol. 146: 741-747
【非特許文献７】
Su, et al., 1987, Infect. Immun. 55: 3023-3029
【非特許文献８】
Ruland, et al., 1994, J. Bacteriol. 176: 5202-5209
【非特許文献９】
G. Walker, et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:392-396
【非特許文献１０】
G. Walker, et al., 1992, Nucl. Acids Res. 20:1691-1696
【非特許文献１１】
1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2267-2268
【非特許文献１２】
1990, J. Mol. Biol. 215:403-410
【非特許文献１３】
1993, Nature Genetics 3:266-272
【非特許文献１４】
1997, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402
【非特許文献１５】
1992, Science 256:1443-1445; 1993, Proteins 17:49-61
【非特許文献１６】
1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2267-2268
【発明の開示】
【０００５】
核酸の増幅は、特定のターゲット配列の迅速な検出を可能にする有力な技術であり、したがって、肺炎マイコプラズマを迅速に検出し、同定するための有望な技術である。本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、核酸の増幅および肺炎マイコプラズマの検出に適用できる。
【０００６】
本明細書では次のように以下の用語を定義する。増幅プライマーとは、ターゲット配列とのハイブリダイゼーション後にプライマーを伸長させることによってターゲット配列を増幅するためのプライマーである。増幅プライマーとは、通常約１０〜７５ヌクレオチド長、好ましくは約１５〜５０ヌクレオチド長である。ＳＤＡ用増幅プライマーの全長は、通常約２５〜５０ヌクレオチドである。ＳＤＡ増幅プライマー（ターゲット結合配列）の３’末端が、ターゲット配列の３’末端でハイブリダイズされる。ターゲット結合配列とは、約１０〜２５ヌクレオチド長であり、増幅プライマーにハイブリダイゼーション特異性を与える。ＳＤＡ増幅プライマーは、ターゲット結合配列の５’側に制限エンドヌクレアーゼに対する認識部位をさらに含む。非特許文献９および非特許文献１０に記載されているように、この認識部位は、この認識部位が半修飾（ｈｅｍｉｍｏｄｉｆｙ）されている場合にＤＮＡ二鎖の一本鎖にニックを入れる制限エンドヌクレアーゼに対するものである。制限エンドヌクレアーゼ認識部位の５’側のヌクレオチド（「テール」）は、ＳＤＡの際に増幅プライマーの残りにニックが入り、入れ替えられるときにポリメラーゼ再プライミング（ｒｅｐｒｉｍｉｎｇ）部位として機能する。テールヌクレオチドのこの再プライム機能は、ＳＤＡ反応を維持し、一つのターゲット分子からの多数のアンプリコンの合成を可能にする。テールは、通常約約１０〜２５ヌクレオチド長である。その長さおよび配列は、遺伝的には重要ではなく、ごく普通に選択し、改変することができる。ターゲットの末端に特殊配列を必要としない増幅方法では、ターゲット結合配列は、そのターゲット特異性を決定するプライマー部分であるので、増幅プライマーは一般に、本質的にターゲット結合配列からなる。たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用する本発明によるターゲット配列の増幅では、ここで述べた増幅プライマーのターゲット結合配列からなる増幅プライマーを使用する。ニッキング可能な制限エンドヌクレアーゼ部位およびＳＤＡテールのほかに、ターゲットに付加されている特殊配列を必要とする増幅方法（たとえば、自己持続型配列複製（Ｓｅｌｆ−Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、３ＳＲ）、核酸配列に基づく増幅（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＮＡＳＢＡ）、転写に基づく増幅系（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＴＡＳ）、またはローリングサークル増幅（Ｒｏｌｌｉｎｇ  Ｃｉｒｃｌｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＲＣＡ）用のＲＮＡポリメラーゼプロモーター）では、プライマーのハイブリダイゼーション特異性を変更せずにオリゴヌクレオチドを調製する慣例の方法を使用して、必要となる特殊配列をターゲット結合配列に連結すればよい。
【０００７】
バンパープライマーまたは外部プライマーとは、等温増幅反応でプライマー伸長産物を置換するのに使用されるプライマーである。バンパープライマーは増幅プライマーより上流でターゲット配列にアニールして、バンパープライマーの伸張が下流の増幅プライマーおよびその伸長産物に置き換わるようにする。
【０００８】
用語「ターゲット」または「ターゲット配列」とは、増幅しようとする核酸配列を指す。このような用語には、増幅しようとする元の核酸配列、増幅しようとする元の核酸配列の相補的な第二鎖、および増幅反応によって生成された、元の配列のどちらかの鎖のコピーが含まれる。これらのコピーは、増幅プライマーがハイブリッドする配列のコピーを含んでいるので、増幅可能なターゲットとして働く。
【０００９】
増幅反応の際に生成されたターゲット配列のコピーは、増幅産物、増幅体（ａｍｐｌｉｍｅｒ）、またはアンプリコンと呼ぶ。
【００１０】
用語「伸長産物」とは、ターゲット配列を鋳型として使用して、プライマーをハイブリダイズし、ポリメラーゼでプライマーを伸長させて生成したターゲット配列のコピーを指す。
【００１１】
用語「種特異的」とは、生物体の１つの種または関連する種の群に対しての検出、増幅、またはオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを指し、同属の他の種または異なる属の種に対しての実質的な検出、増幅、またはオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを除く。
【００１２】
用語「アッセイプローブ」とは、核酸を検出または同定しやすくするのに使用する任意のオリゴヌクレオチドを指す。以下で述べる検出プローブ、検出用プライマー、捕捉プローブ、シグナルプライマー、およびレポータープローブは、アッセイプローブの例である。
【００１３】
シグナルプライマーは、ターゲット中の相補配列とハイブリダイズする３’ターゲット結合配列を含み、ターゲットに対して相補性でない５’テール配列（アダプター配列）をさらに含む。アダプター配列は、その相補配列が以下で述べるレポータープローブの３’末端とハイブリダイズするように選択された、間接的に検出可能なマーカーである。シグナルプライマーは、その少なくとも一部分が、増幅プライマーのハイブリダイゼーション部位より下流のターゲット配列とハイブリダイズされる。シグナルプライマーは、ポリメラーゼによって増幅プライマーの伸長と同様の方法で伸長される。増幅プライマーの伸長によって、ターゲットの増幅に依存した方法でシグナルプライマーの伸長産物は置換され、５’アダプター配列、下流のターゲット結合配列、および隣接する（ｆｌａｎｋｉｎｇ）ＳＤＡ増幅プライマーとのハイブリダイゼーションに特異的な３’結合配列を含む１本鎖産物が生成する。この隣接する増幅プライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長、ならびにその後のニッキングおよび伸長によって、ターゲットが増幅された指標として検出できるアダプター配列の相補物を含む増幅産物が生成する。
【００１４】
本発明によるレポータープローブは、検出用オリゴヌクレオチドとして機能し、好ましくは少なくとも１つの供与体／消光剤の色素対、すなわち、蛍光供与色素と供与体フルオロフォア用消光剤の標識を含む。この標識は、ターゲット配列と直接にハイブリダイズされないレポータープローブ中の配列または構造（レポーター部分）に結合している。レポーター部分の３’側のレポータープローブ配列が選択され、シグナルプライマーアダプター配列の相補物とハイブリダイズされる。一般に、レポータープローブの３’末端は、ターゲット配列に対して有意な相補性をもつ配列を含まない。上述のアダプター配列の相補物を含む増幅産物が存在すれば、この増幅産物がそこでレポータープローブの３’末端とハイブリダイズされる。アダプター相補配列の３’末端からプライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ）および伸長を行うと、レポーター部位相補物の形成が可能になる。この形成がレポーター部分を２本鎖にし、それによってレポータープローブの標識を検出できるようになり、ターゲットの増幅があったことが示される。
【００１５】
用語「アンプリコン」とは、増幅プライマー対の片方または両方の伸長を通して生成された増幅反応産物を指す。使用された両方のプライマーがターゲット配列とハイブリダイズされれば、アンプリコンは、指数関数的に増幅された核酸を含む。あるいは、使用されたプライマーの片方がターゲット配列とハイブリダイズされなければ、アンプリコンは、直線的な増幅によって生成される。したがって、この用語は、本明細書では総称として使用し、指数関数的に増幅された核酸の存在を暗示しない。
【００１６】
本発明は、肺炎マイコプラズマ中に見られるターゲット配列の増幅に使用できるオリゴヌクレオチドプライマーを提供する。より詳細には、このターゲット配列は、ＯＲＦ６遺伝子区域を含む。この増幅プライマーは、ｔＳＤＡやＰＣＲなどでの高められた温度で効率よく特異性の高い増幅を行うために設計しているが、通常のＳＤＡ、３ＳＲ、ＴＡＳ、ＮＡＳＢＡ、またはＲＣＡなど、それより低い温度の増幅反応でも有用である。増幅産物を検出するには、ターゲットに特異的なシグナルプライマーの相補物とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドレポータープローブを使用する。
【００１７】
本発明のオリゴヌクレオチドは、培養した生物体の同一性を確認するための手段として培養後に使用できる。あるいは、本発明のヌクレオチドは、知られている増幅法を用いて、ヒトまたは動物の臨床検体中の肺炎マイコプラズマを検出および同定するのに使用することもできる。どちらの例でも、本発明のオリゴヌクレオチドおよびアッセイ法によって、肺炎マイコプラズマと他の微生物を迅速に識別する手段が提供され、実施者は、習慣的に利用している以前からの手順に頼ることなく、この微生物を迅速に確認できるようになる。感染に関与する特定の病原体をこのように迅速に確認することによって、適切な処置の決定に使用できる情報が短時間で得られる。
【００１８】
配列の概要
配列番号１〜２は、ＯＲＦ６遺伝子内配列の増幅用に上流プライマーとして使用するオリゴヌクレオチド配列である。配列番号３〜４は、ＯＲＦ６遺伝子内配列の増幅用に下流プライマーとして使用するオリゴヌクレオチド配列である。配列番号５〜６は、ＳＤＡ増幅用に上流バンパープライマーとして使用するオリゴヌクレオチド配列である。配列番号７〜８は、ＳＤＡ増幅用に下流バンパープライマーとして使用するオリゴヌクレオチド配列である。配列番号９〜１０は、ＯＲＦ６遺伝子内配列の増幅および検出用のシグナルプライマー配列である。配列番号１１は、前記シグナルプライマーのいずれかと共に使用した場合、ＯＲＦ６遺伝子内配列の検出用に設計されたレポータープローブ用の配列となる。配列番号１２は、ＯＲＦ６遺伝子内配列のＰＣＲ増幅用に上流プライマーとして使用するオリゴヌクレオチド配列である。配列番号１３は、ＯＲＦ６遺伝子内配列のＰＣＲ増幅用に下流プライマーとして使用するオリゴヌクレオチド配列である。
【００１９】
本発明の様々な目的、有利点、および新規な特徴は、以下の詳細な説明を添付の図面と併せて読めば容易に理解されよう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、核酸増幅反応で肺炎マイコプラズマに対する特異性を示すオリゴヌクレオチド、すなわち増幅プライマーおよびシグナルプライマーに関する。また本発明のオリゴヌクレオチドを使用して、肺炎マイコプラズマの核酸を検出および同定する方法も提供する。好ましい方法は、ＳＤＡ、ｔＳＤＡ、または均一系実時間蛍光（homogeneous real time fluorescent）ｔＳＤＡを使用するものである。これらの方法は、特許文献１、２、３、４、５、６、７、８、９、２０００年６月８日出願の特許文献１０、および２０００年６月２３日出願の特許文献１１などの参照文献から当分野の技術者に知られており、これらの開示を特に参照により本明細書に組み込む。
【００２１】
本発明のプライマーは、Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号ＮＣ０００９１２で照会されるＭ１２９株から得たＯＲＦ６遺伝子配列データの解析に基づいて設計した。表１に示すように、ＯＲＦ６遺伝子内のいくつかのターゲット領域にかかるＰＣＲプライマーを、肺炎マイコプラズマに対する特異性について評価した。８種の肺炎マイコプラズマ基準株に由来するＰＣＲ産物の配列解析によって、選択されたターゲット領域内の配列保存を評価して、ターゲット領域の相同性を実証した。ＰＣＲで増幅されたＯＲＦ６ターゲット領域内で２種のＳＤＡ系を設計した。ｔＳＤＡでの使用向けに開発したプライマーを表１に示す。得られたアンプリコンを増幅および検出するためのシグナルプライマーおよびレポータープローブも示す。増幅プライマー中の制限エンドヌクレアーゼ認識部位の例（ＢｓｏＢＩ）を太字で示し、ターゲット結合配列をイタリック体で示す。増幅プライマーのターゲット結合配列は、そのターゲット特異性を決める。
【００２２】
【表１】
2005508136.tif 000003
【００２３】
核酸がハイブリダイズされるには完全な相補性を要しないので、ここで開示するプローブおよびプライマー配列は、肺炎マイコプラズマに特異的なプローブおよびプライマーとしての有用性を損なうことなく、ある程度改変できることが理解されよう。当技術分野で知られているように、ハイブリダイゼーション条件を調整（すなわち、ハイブリダイゼーションｐＨ、温度、または緩衝液の塩含有量の調整）して、厳密性を強くまたは緩くすることによって、相補的および部分的に相補的な核酸配列をハイブリダイズすることができる。開示する配列のこのような僅かな改変、および肺炎マイコプラズマに対する特異性を維持するために必要なハイブリダイゼーション条件の調整は、ごく普通の実験を必要とするだけであり、当業者にとって技術的範囲内のことである。
【００２４】
ここで開示するプライマーを使用して生成した増幅産物は、たとえば図２および図３に示すように、臭化エチジウムで染色したポリアクリルアミドまたはアガロースゲル上で、特有の大きさによって検出すればよい。あるいは、増幅されたターゲット配列は、検出可能な標識の付いたオリゴヌクレオチドであるアッセイプローブによって検出してもよい。一実施形態では、少なくとも１種のタグ付きアッセイプローブを使用すると、ハイブリダイゼーション（検出プローブ）、非特許文献１０に記載されているようなハイブリダイゼーションおよび伸長（検出用プライマー）、または特許文献１２に記載されているようなハイブリダイゼーション、伸長、および２本鎖形態への変換（シグナルプライマー）によって、増幅されたターゲット配列を検出することができる。
【００２５】
増幅されたターゲットを検出するために好ましい実施形態の概略図を図１に示す。この実施形態では、シグナルプライマーの５’テール配列は、ターゲットとハイブリダイズしない配列（アダプター配列）からなる。アダプター配列は、異なる３’ターゲット結合配列を有する様々なシグナルプライマーでも同じものになるように選択できる間接的に検出可能なマーカーである（すなわち、「万能」５’テール配列）。配列番号９および１０を有するオリゴヌクレオチドは、本発明の増幅プライマーと併せると、肺炎マイコプラズマ生物を検出するシグナルプライマーとして特に有用である。アッセイプローブは、本発明のシグナルプライマーのアダプター配列相補物とハイブリダイズする一つのレポータープローブ配列であることが好ましい。配列番号１１の配列を有するオリゴヌクレオチドは、本発明のシグナルプライマーと共に肺炎マイコプラズマの検出に使用する場合にレポータープローブとして特に有用である。あるいは、アッセイプローブは、増幅プライマーの間にあるターゲット中の配列とハイブリダイズするように選択することもできる。別の実施形態では、増幅プライマーまたはそのターゲット結合配列をアッセイプローブとして使用してもよい。
【００２６】
アッセイプローブの検出可能な標識は、ターゲットの核酸が存在する指標として直接または間接的に検出できる部分である。標識を直接に検出するには、当技術分野で知られているように、アッセイプローブに放射性同位体を付け、オートラジオグラフィーによって検出するか、または蛍光部分を付け、蛍光によって検出することができる。あるいは、追加の試薬を要する標識を付けて、それを検出可能にすることによって、アッセイプローブを間接的に検出してもよい。間接的に検出できる標識には、たとえば、化学発光剤、可視反応産物を生じる酵素、および標識された特定の結合相手（たとえば、抗体または抗原／ハプテン）に結合させることによって検出できるリガンド（たとえばハプテン、抗体、または抗原）が含まれる。リガンドは、リガンド−標識オリゴヌクレオチド（捕捉プローブ）を固相上に固定化して、その検出を容易にするためにも有用である。特に有用な標識には、ビオチン（標識されたアビジンまたはストレプトアビジンへの結合によって検出可能）、および西洋ワサビペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼなどの酵素（酵素の基質を加えて、着色された反応産物を生成することによって検出可能）が含まれる。このような標識をオリゴヌクレオチドに加え、またはそのような標識に含ませる方法は、当技術分野でよく知られており、そのような方法のいずれもが本発明での使用に適している。
【００２７】
使用することのできる特異的検出法の例には、特許文献１３に記載されているように、増幅した産物を、ビオチン標識捕捉プローブおよび酵素結合検出プローブを使用して検出する化学発光法が含まれる。これら２種のアッセイプローブを、（２本の増幅プライマーの結合部位間にある）ターゲット配列のアッセイ領域中の異なる部位とハイブリダイズした後、ストレプトアビジンをコートしたマイクロタイタプレート上にこの複合体を捕捉プローブによって捕捉し、化学発色シグナルを発色させ、照度計で読み取る。増幅産物を検出する別の代替法として、特許文献１２に記載されているようなシグナルプライマーをＳＤＡ反応に含めてもよい。増幅産物を検出するさらに別の代替法では、シグナルプライマーは、ターゲット配列とハイブリダイズされない配列、すなわちアダプター配列を含んでいてもよい。この実施形態では、図１に示すように、標識が結合しているレポータープローブとアダプター配列の相補物とをハイブリダイズすることができる。シグナルプライマーのどちらの実施形態でも、ＳＤＡの際に、ターゲットの増幅に応じる形で第２の増幅産物が生成するので、ターゲットが増幅された指標として検出することもできる。
【００２８】
市販する都合上、核酸の特異的検出および同定用の増幅プライマーをキットの形で包装してもよい。通常、そのようなキットは、少なくとも１組の増幅プライマーを含んでいる。ターゲットに特異性のある増幅プライマーと共に、核酸の増幅反応を実施するための試薬、たとえば緩衝液、追加のプライマー、ヌクレオチド三リン酸、酵素などが含まれていてもよい。本発明の方法の特定の実施形態を行うための説明書を任意選択で同梱して、キットの各成分を共有の容器中に一緒に包装する。他の任意選択の成分、たとえば、アッセイプローブとしての使用に適する標識付きオリゴヌクレオチド、および／または標識を検出する試薬もしくは手段がキット中に含まれてもよい。
【００２９】
本発明では、生物体の呼吸器パネル用の必要な成分を提供する目的でこのようなキットを構成してもよい。そのような呼吸器パネルには、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、レジオネラ菌（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、肺炎マイコプラズマ、およびクラミジア科の生物に加え、呼吸器感染を引き起こし得る他の微生物が含まれる。したがって、このような呼吸器パネルキットは、その呼吸器パネルの各生物体に特異的な核酸配列を増幅するプライマーを含むことになる。百日咳菌、レジオネラ菌、およびクラミジア科生物を増幅および検出するのに有用なプライマー、バンパー、シグナルプライマー、およびレポータープローブはそれぞれ、２０００年７月２７日出願の同時係属の特許文献１４、２０００年７月２７日出願の同時係属の特許文献１５、および２０００年１１月８日出願の同時係属の特許文献１６に記載されており、これらの開示を特に参照により本明細書に組み込まれる。使用時には、このような呼吸器パネルキットでは、生物毎に別々の増幅反応、または１種または複数の複合増幅反応を行うことができ、パネルの各生物体の有無を示す結果が得られる。
【００３０】
増幅プライマーのターゲット結合配列によって、オリゴヌクレオチド上に種間ハイブリダイゼーション特異性が付与されるので、増幅反応に種特異性がもたらされる。したがって、本発明の増幅プライマーのターゲット結合配列は、ＰＣＲ、通常のＳＤＡ（本質はｔＳＤＡと同じものであるが、中温性（ｍｅｓｏｐｈｉｌｉｃ）酵素を使用してより低い温度で実施する反応スキーム）、３ＳＲ、ＮＡＳＢＡ、ＴＡＳ、およびＲＣＡなど、他の核酸増幅プロトコルでも有用である。詳細には、プライマーとターゲット配列との周期的な特異的ハイブリダイゼーション、ターゲット配列を鋳型として使用してのプライマーの伸長、およびターゲット配列に由来する増幅産物の分離もしくは置換を利用するどんな増幅プロトコルでも、本発明のターゲット結合配列を用いてよい。特殊な非ターゲット結合配列を必要としない増幅法（たとえばＰＣＲ）については、増幅プライマーは、表１に挙げた増幅プライマーのターゲット結合配列から本質的になるといえる。
【００３１】
オリゴヌクレオチドの種特異性を変更することなく、ここで開示するターゲット結合配列に、選択された増幅反応を行うために必要な他の配列を任意選択で加えてもよい。例として、特異的な増幅プライマーが、ＳＤＡ反応の際にニックが入る、制限エンドヌクレアーゼＢｓｏＢＩの認識部位を含んでいてもよい。ＢｓｏＢＩ認識部位の代わりに、それだけに限らないが特許文献１７で開示されている認識部位を含む他のニッキング可能な制限エンドヌクレアーゼ認識部位を用いてもよいことは当分野の技術者にわかるであろう。認識部位は、ｔＳＤＡの条件下で増幅反応を行ってもよいように好熱性制限エンドヌクレアーゼに対するものであることが好ましい。同様に、増幅プライマーのテール配列（制限エンドヌクレアーゼ認識部位の５’側）は一般に決定的なものではないが、ＳＤＡに使用する制限部位、ならびにそれ自体のターゲット結合配列または他のプライマーのいずれかとハイブリダイズされる配列は避けるべきである。したがって、ある種のＳＤＡ用増幅プライマーは、３’ターゲット結合配列と、そのターゲット結合配列の５’側のニッキング可能な制限エンドヌクレアーゼ認識部位と、制限エンドヌクレアーゼ認識部位の５’側の約１０〜２５ヌクレオチド長のテール配列とからなる。ニッキング可能な制限エンドヌクレアーゼ認識部位およびテール配列は、ＳＤＡ反応に必要な配列である。２０００年５月１８日出願の特許文献１８に記載されているように、ある種のＳＤＡ用増幅プライマーは、制限酵素認識部位の５’側および３’側の両方に位置するターゲット特異的配列からなっていてよい。この設計では、ターゲット特異的ハイブリダイゼーションの効率が上がることもある。他の増幅反応（たとえば３ＳＲ、ＮＡＳＢＡ、ＴＡＳ、およびＲＣＡ）については、増幅プライマーは、ターゲット結合配列と、選択された増幅反応に必要な追加の配列（たとえば、上述のようなＳＤＡに必要な配列、または３ＳＲではＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーター）とからなっていてよい。本発明のターゲット結合配列をＳＤＡ以外の増幅法に適合させるには、化学合成など、増幅プライマーを調製する型通りの方法、および選択された増幅反応向けのよく知られている構造上必要なものを用いる。したがって、本発明のターゲット結合配列は、型通りの生成、スクリーニング、および最適化法だけを使用し、様々な増幅反応の形で、肺炎マイコプラズマ生物に特異的なターゲット増幅および検出に容易に適合させることができる。
【００３２】
ＳＤＡでは、バンパープライマーは、下流の種特異的増幅プライマーに置き代わるように機能するので、種特異性にとって必須でない。バンパープライマーが、伸長したときに増幅プライマーおよびその伸長産物に置き代わるよう、増幅プライマーより上流のターゲットとハイブリダイズされることだけが必要である。したがって、バンパープライマーの特殊配列は、一般に決定的に重要ではなく、バンパープライマーが伸長して増幅プライマー伸長産物を置換できるくらいに増幅プライマーの結合部位に近いどんな上流ターゲット配列に由来していてもよい。バンパープライマー配列中のターゲットとの時折のミスマッチ、または非ターゲット配列との若干の交差ハイブリダイゼーションは、バンパープライマーを特定のターゲット配列にハイブリダイズすることができるままである限り、増幅効率にマイナスの影響を及ぼさない。
【００３３】
本発明のプライマーを使用する増幅反応では、非特許文献１０で教示されているように、チミンを組み込んでもよく、あるいは、たとえば特許文献１９で教示されているように、後続の増幅反応の相互混入を低減するために、この反応のＴＴＰを完全または部分的に２’−デオキシウリジン５’−三リン酸で代用してもよい。ｄＵ（ウリジン）は、増幅産物に組み込み、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）での処理によって切り取ることができる。このような塩基部位は、増幅産物を後続の増幅反応で増幅不能にする。ＵＤＧは、新たに生成した増幅産物中のｄＵが切り取られないよう、後続の増幅を行う前にＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）で不活化する。
【００３４】
ＳＤＡは、プライマーの伸長、半修飾制限エンドヌクレアーゼ認識／切断部位のニッキング、１本鎖伸長産物の置換、プライマーと伸長産物（または元のターゲット配列）のアニーリング、およびプライマーのその後の伸長が反応ミックス中で並行して起こる等温核酸増幅法である。これは、反応の温度サイクル特性のために反応の各ステップが別々の相またはサイクルで起こるＰＣＲとは対照的である。ＳＤＡは、１）制限エンドヌクレアーゼによってヘミホスホロチオアートの形のその２本鎖認識／切断部位の非修飾鎖にニックが入れられること、および２）ある特定のポリメラーゼによってニック箇所で複製を開始し、下流の鋳型でない鎖を置換できることに基づいている。温度を高く（約９５℃）して最初のインキュベーションを行って、２本鎖のターゲット配列を変性させプライマーのアニーリングに備えた後、後続の新たに合成された鎖の重合および置換を一定温度で行う。ターゲット配列の各新規コピーの生成は、次の５ステップ、１）元のターゲット配列または前に重合してはずされた１本鎖伸長産物に増幅プライマーを結合させる、２）α−チオデオキシヌクレオシド三リン酸（α−チオｄＮＴＰ）を組み込みながら、５’−３’エキソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼによってプライマーを伸長させる、３）半修飾２本鎖制限部位にニックを入れる、４）ニック部位から制限酵素を解離させる、および５）下流の新規合成鎖をはずしながら、５’−３’エキソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼによってニックの３’末端側から伸長させるからなる。ニックから伸長させることによって、別のニッキング可能な制限部位が再生されるので、ニッキング、重合、および置換が一定温度で並行して連続的に起こる。１組の増幅プライマーを使用し、その各々を２本鎖ターゲット配列の２本鎖の一方とハイブリダイズする場合、増幅は指数関数的になる。これは、センス鎖およびアンチセンス鎖が後続の回の増幅で逆プライマーに対する鋳型として働くからである。１本の増幅プライマーを使用する場合、１本の鎖だけがプライマー伸長用の鋳型として働くので、増幅は直線的になる。α−チオｄＮＴＰが組み込まれたときにその２本鎖認識／切断部位にニックを入れる制限エンドヌクレアーゼの例は、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｉｎｄＩＩ、ＡｖａＩ、ＮｃｉＩ、およびＦｎｕ４ＨＩである。これらの制限エンドヌクレアーゼおよび必要なニッキング活性を示す他の酵素はすべて、通常のＳＤＡでの使用に適する。しかし、これらの酵素は比較的熱不安定性であり、約４０℃で活性を失う。
【００３５】
ＳＤＡによる増幅のターゲットは、ターゲット配列を切断しないエンドヌクレアーゼで制限して、大きい核酸を断片にして調製することができる。しかし、一般に、非特許文献１０および特許文献２０（特に参照により本明細書に組み込む）に記載されているように、その制限エンドヌクレアーゼの認識／切断部位がＳＤＡ反応でのニッキング用に選択されたターゲット核酸を生成することが好ましい。簡潔に述べれば、ターゲット配列が２本鎖であれば、４つのプライマーをそれにハイブリダイズする。そのプライマーのうちの２つ（Ｓ1およびＳ2）はＳＤＡ増幅プライマーであり、もう２つ（Ｂ1およびＢ2）は外部プライマーまたはバンパープライマーである。Ｓ1およびＳ2は、ターゲット配列に隣接する２本鎖核酸の反対側の鎖に結合する。Ｂ1およびＢ2は、Ｓ1およびＳ2のターゲット配列５’側（すなわち上流）にそれぞれ結合する。次いで、３種のデオキシヌクレオシド三リン酸、および少なくとも１種の修飾デオキシヌクレオシド三リン酸（たとえば２’−デオキシアデノシン５’−Ｏ−（１−チオ酸リン酸）、「ｄＡＴＰαＳ」）の存在下、エキソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼを使用して、４つすべてのプライマーを同時に伸長させる。そのためＳ1およびＳ2の伸長産物は、Ｂ1およびＢ2が伸長することによって元のターゲット配列鋳型からはずされる。このはずされた１本鎖の増幅プライマー伸長産物は、逆の増幅プライマーおよびバンパープライマーが結合するターゲットとして働く（たとえば、Ｓ1の伸長産物は、Ｓ2およびＢ2を結合する）。伸長および置換の次の繰返しによって、半修飾制限エンドヌクレアーゼ認識／切断部位を各末端に有する２本の２本鎖核酸断片が得られる。これらの断片は、ＳＤＡによる増幅に適する基質である。ＳＤＡでは、ターゲット生成反応の個々のステップが並行して連続的に起こり、ＳＤＡの制限酵素でニックを入れるのに必要な認識／切断配列を末端に有するターゲット配列が生成される。ターゲット生成反応では、ＳＤＡ反応の構成要素がすべてすでに存在しているので、ターゲット配列は、自動的に生成し、ＳＤＡ反復反応に連続的に加わり、増幅される。
【００３６】
ＳＤＡ反応に別の反応の増幅産物が相互混入しないようにするため、増幅反応を阻害することなく、ＳＤＡ増幅されたＤＮＡに、ｄＴＴＰの代わりとしてｄＵＴＰを組み込んでもよい。次いで、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）処理によって、このウラシル修飾した核酸を特異的に認識させ、不活化することができる。したがって、前の反応中にｄＵＴＰがＳＤＡ増幅されたＤＮＡに組み込まれていれば、後続のＳＤＡ反応物はどれも、２本鎖ターゲットを増幅する前にＵＤＧ処理することができ、予め増幅された反応物からのどんなｄＵ含有ＤＮＡも増幅不可能になる。後続の反応で増幅しようとする標的ＤＮＡがｄＵを含んでいなければ、ＵＤＧ処理による影響を受けない。次いで、ターゲットを増幅する前に、ＵＧＩ処理によってＵＤＧを阻害することができる。あるいは、ＵＤＧを熱で不活化してもよい。ｔＳＤＡでは、反応そのものに高めの温度（≧５０℃）を利用して、ＵＤＧの不活化およびターゲットの増幅を並行して行うことができる。
【００３７】
ＳＤＡには、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を欠いたポリメラーゼが必要であり、このポリメラーゼによって、２本鎖核酸の１本鎖ニック箇所で重合を開始し、ニックの下流の鎖をはずしながら、ニックの入っていない鎖を鋳型として使用し新たな相補鎖を生成する。ポリメラーゼは、拘束されていない３’−ＯＨにヌクレオチドを付加して伸長を行わなければならない。ＳＤＡ反応を最適にするためには、ポリメラーゼに高いプロセッシング力をもたせ、増幅できるターゲット配列の長さを極限まで拡大することも望ましい。プロセッシング力の高い（ｈｉｇｈｌｙ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｅ）ポリメラーゼは、伸長産物の解離および合成終結の前に、新しい鎖をかなりの長さに重合させることができる。指数関数的な増幅反応では、置換活性によってターゲットを追加のコピーの合成に利用できるようになり、２回目の増幅プライマーのハイブリダイズ先となり得る１本鎖伸長産物が生成されるので、置換活性は、この増幅反応に必須である。反応を永続させ、後続の回のターゲット増幅を開始できるようにするのはニッキングであるので、制限酵素のニッキング活性も、重要性の高いものである。
【００３８】
ｔＳＤＡは、ＳＤＡで使用される酵素よりも高温で活性が保たれるポリメラーゼおよび制限エンドヌクレアーゼを代わりに用い、本質的には非特許文献９および１０に記載されている通常のＳＤＡのように行う。当然、反応温度は、代用する酵素に適するより高い温度に合わせ、ＨｉｎｃＩＩ制限エンドヌクレアーゼ認識／切断部位は、選択されたエンドヌクレアーゼに相応する制限エンドヌクレアーゼ認識／切断部位に取り替えることになる。また、Ｗａｌｋｅｒ等とは対照的に、実施者は、酵素がその変性温度で十分に安定であれば、最初の変性ステップの前に、酵素を反応混合物に含めてもよい。ｔＳＤＡでの使用に好ましいエンドヌクレアーゼは、ＢｓｒＩ、ＢｓｔＮＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｌＩ、およびＢｓｏＢＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）、ＢｓｔＯＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）である。ｔＳＤＡ用に好ましいポリメラーゼは、Ｂｃａ（Ｐａｎｖｅｒａ）およびＢｓｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）である。
【００３９】
さらに、ｇｐ３２などのＤＮＡ結合タンパク質を反応混合物中に含めて、より長い核酸ターゲット（たとえば、約１００塩基対より長い核酸分子）の増幅向けにＳＤＡおよびｔＳＤＡ反応を強化してもよい。この技術は、特許文献２１のその記述全体を通して、当分野の技術者に知られている。
【００４０】
均一系実時間蛍光ｔＳＤＡは、ｔＳＤＡの変更形態である。この形態では、蛍光をターゲット依存的に消光させて弱める検出用オリゴヌクレオチドを使用する。検出用オリゴヌクレオチドは、ターゲットが存在しない場合に蛍光が消光するように連結された供与体／受容体色素対を含む。分子内で塩基対が形成されている検出用オリゴヌクレオチドの二次構造が、ターゲット配列存在下で変性（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）または線状化すると、色素間の距離が広がり、蛍光の消光が弱まる。塩基対が形成されているこの二次構造の変性は、通常、二次構造の配列と相補鎖とが分子間で塩基対を形成して、二次構造が少なくとも部分的に崩壊するものである。この二次構造は、十分な長さの相補鎖の存在下では完全に線状になる。好ましい実施形態では、制限エンドヌクレアーゼ認識部位（ＲＥＲＳ）は、二次構造と相補鎖との分子間塩基対合によってＲＥＲＳも２本鎖になり制限エンドヌクレアーゼによる切断が可能になるように２種の色素間に存在する。制限エンドヌクレアーゼによる切断は、供与体および受容体色素を別々の核酸断片に分離し、さらに消光が弱まる一因となる。どちらの実施形態でも、蛍光パラメーター（たとえば、供与体蛍光強度の増加、受容体蛍光強度の低下、または変性前後の蛍光比率）の関連のある変化をターゲット配列が存在する指標としてモニターする。供与体蛍光強度の変化は、一般に受容体蛍光強度の変化よりも大きいので、これをモニターすることが好ましい。蛍光寿命の変化など、他の蛍光パラメーターをモニターしてもよい。オリゴヌクレオチドの切断は、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖のホスホジエステル結合が破壊されるか、または１本鎖ＤＮＡのホスホジエステル結合が破壊されることを指す。これは、二本鎖ＤＮＡの２本鎖の一方のホスホジエステル結合だけが破壊されることを指すニック切断とは対照的である。
【００４１】
均一系実時間蛍光ｔＳＤＡ用の検出用オリゴヌクレオチドは、ターゲット配列とハイブリダイズされる１本鎖の５’もしくは３’側部分（ターゲット結合配列）と、ターゲット結合配列に隣接する、分子内に塩基対が形成された２次構造とを含んでよい。好ましい実施形態では、図１に示すように、検出用オリゴヌクレオチドは、ターゲット配列とハイブリダイズしない１本鎖５’もしくは３’側部分を含むレポータープローブである。１本鎖５’もしくは３’側部分はむしろ、シグナルプライマーのアダプター配列の相補物とハイブリダイズする（アダプター相補物結合配列）。レポータープローブの別の特徴は、このハイブリダイズ部分が分子内に塩基対が形成されている二次構造に隣接していることである。本発明の検出用オリゴヌクレオチドは、二次構造の分子内に塩基対が形成されている時には供与体の蛍光が消光し、二次構造の変性または線状化によって蛍光の消光が弱まるように検出用オリゴヌクレオチドに結合させた供与体／受容体色素対をさらに含む。
【００４２】
均一系実時間蛍光ｔＳＤＡ用の本発明の検出ヌクレオチドは、プライマーの伸長またはハイブリダイゼーション向けに選択された反応条件下で、分子内に塩基対が形成された二次構造の配列を含む。一つの実施形態では、この二次構造は、ターゲット結合配列の少なくとも一部分が１本鎖３’もしくは５’テールを形成するように検出用オリゴヌクレオチドのターゲット結合配列に隣接して位置していてもよい。好ましい実施形態では、図１に示すように、二次構造が、アダプター相補物結合配列の少なくとも一部分が１本鎖３’もしくは５’テールを形成するように検出用レポータープローブオリゴヌクレオチドのアダプター相補物結合配列に隣接して位置していてもよい。本明細書で使用する用語「ターゲット結合配列に隣接する」または「アダプター相補物結合配列に隣接する」とは、ターゲット／アダプター相補物結合配列の全部または部分が、ターゲット／アダプター相補物とのハイブリダイゼーションに利用できる５’もしくは３’テールの形で１本鎖のままであることを意味する。すなわち、二次構造は、ターゲット／アダプター相補物結合配列の全部を含まない。ターゲット／アダプター相補物結合配列の一部分は、二次構造の分子内塩基対合に関与していてもよく、これには、二次構造の分子内塩基対合に関与した最初の配列の全部または部分が含まれるが、その相補配列にまでは及ばないことが好ましい。たとえば、二次構造がステムループ構造（たとえば「ヘアピン」）であり、検出用オリゴヌクレオチドのターゲット／アダプター相補物結合配列が１本鎖３’テールとして存在する場合、ターゲット／アダプター相補物結合配列は、ステムの最初のアームの全体または部分、任意選択でループの全体または部分にわたって伸長していてよい。しかし、ターゲット／アダプター相補物結合配列は、ステムの分子内塩基対合に関与する配列の２番目のアームまで伸長していないことが好ましい。すなわち、ターゲット／アダプター相補物とハイブリダイズすることのできる二次構造の分子内塩基対合に両方の配列が関与することを避けることが望ましい。検出用オリゴヌクレオチド二次構造の分子内塩基対合部分のミスマッチは、ターゲット存在下での蛍光の変化の規模を縮小し得るが、アッセイの感度を問題としなければ許容される。１本鎖テールのターゲット／アダプター相補物結合配列でのミスマッチも許容されるが、同様にアッセイの感度および／または特異性を低下させることがある。しかし、二次構造およびターゲット／アダプター相補物結合配列の両方での完全な塩基対合によって反応に支障をきたさないことが本発明の特徴である。ハイブリダイゼーションに関与する配列の完全な一致は、反応速度論にマイナスの影響を及ぼすことなく、アッセイの特異性を向上させる。
【００４３】
本発明の検出用オリゴヌクレオチドレポータープローブは、増幅反応物に加えると、図１に示すように、ハイブリダイゼーションおよび伸長によって２本鎖の形に変換される。またポリメラーゼによる鎖の置換では、二次構造が変性または線状化し、相補鎖が合成されてそれが２本鎖の形に変換される。ＲＥＲＳが存在する場合、これも２本鎖になり、制限エンドヌクレアーゼによって切断可能になる。ポリメラーゼによる鎖置換活性によって二次構造が変性または線状化するにつれて、供与体および受容体色素間の距離が拡大し、それによって供与体蛍光の消光が弱まる。供与体または受容体色素の蛍光における関連した変化は、ターゲット配列が増幅された指標としてモニターまたは検出することができる。ＲＥＲＳの切断では、２本鎖の第２の増幅産物が、それぞれに２種の色素の一方が結合している２個の別々の断片になることによって、一般に蛍光の変化の規模がさらに拡大する。これらの断片は、反応溶液中に不自由なく拡散でき、供与体／受容体色素対間の距離がさらに拡大する。供与体蛍光強度の増大または受容体蛍光強度の低下をターゲットの増幅が起こっているまたは起こった指標として検出および／またはモニターすることができるが、供与体／受容体色素対の近接に影響される他の蛍光パラメーターをモニターしてもよい。供与体または受容体の蛍光強度の変化を供与体および／または受容体の蛍光強度比率の変化として検出してもよい。たとえば、蛍光強度の変化は、ａ）二次構造の線状化もしくは変性後の供与体フルオロフォア蛍光、および線状化もしくは変性前の検出用オリゴヌクレオチドの供与体フルオロフォア蛍光の比率の増加、またはｂ）線状化もしくは変性後の受容体色素蛍光、および線状化もしくは変性前の検出用オリゴヌクレオチドの受容体色素蛍光の比率の減少として検出することができる。
【００４４】
本発明の検出用オリゴヌクレオチドは、ＳＤＡだけでなく、他のプライマー伸長増幅法（たとえば、ＰＣＲ、３ＳＲ、ＴＡＳ、またはＮＡＳＢＡ）のアンプリコンを検出する用途に適合させてもよいことは言うまでもない。たとえば、ＰＣＲ増幅プライマーと、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く鎖置換用ＤＮＡポリメラーゼ（たとえば、ＰｒｏｍｅｇａのＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｇｒａｄｅ  Ｔａｑ、またはＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓのｅｘｏ-  Ｖｅｎｔもしくはｅｘｏ-  Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ）をＰＣＲで使用することによって、これらの方法をＰＣＲでの使用に適合させることができる。シグナルプライマーは、少なくとも部分的にＰＣＲ増幅プライマーより下流にあるターゲットとハイブリダイズされ、検出用オリゴヌクレオチドレポータープローブとのハイブリダイゼーションおよびそれに続く伸長後にはずされ、２本鎖にされる。ＰＣＲでは、ＲＥＲＳの切断というよりニック切断を引き起こし得る修飾デオキシヌクレオシド三リン酸が通常は存在しないので、任意選択で任意のＲＥＲＳを選択して、検出用オリゴヌクレオチド中に使用してもよい。温度循環がＰＣＲによる増幅の特徴であるので、制限エンドヌクレアーゼは、増幅の終点検出に向けてプライマーをアニールし、伸長させる最終サイクルの後、低温で加えることが好ましい。しかし、ＰＣＲ反応の高温相を通して活性なままである好熱性制限エンドヌクレアーゼならば、増幅の間じゅう存在して、実時間アッセイが可能になるはずである。ＳＤＡ系のように、色素対の分離によって、蛍光の消光が弱まり、ターゲットが増幅された指標として働く強度などの蛍光パラメーターが変化する。
【００４５】
検出用オリゴヌクレオチドが変性または線状化した結果である蛍光の変化は、反応中の選択された終点で検出することができる。しかし、二次構造は、ハイブリダイゼーションまたはプライマーの伸長と並行して線状化するので、蛍光の変化は、反応を起こしながら、すなわち「実時間」でモニターすることもできる。この均一系実時間アッセイ形態を使用して、最初のターゲット存在量についての半定量的または定量的情報を得てもよい。たとえば、（ターゲット増幅の一部としての、または非増幅検出法での）変性または線状化反応中に蛍光強度が変化した時点の比率は、最初のターゲットレベルの指標である。その結果、ターゲット配列の最初のコピーが多く存在していればそれだけ、供与体蛍光は選択された閾値に迅速に到達する（すなわち、より短時間で陽性になる）。受容体蛍光の減少も同様に、選択された最小値に到達するのに要する時間としての陽性が検出されるまでの時間が短い。その上、反応過程の蛍光パラメーターの変化速度は、最初に含まれるターゲット量の少ないサンプルよりも、最初に含まれるターゲット量の多いサンプルの方が迅速である（すなわち、蛍光曲線の傾きが急になる）。これらの測定または他の測定は、当技術分野で知られている限りでは（たとえば特許文献２２、１９９８年１１月２０日出願の特許文献２３、および２０００年５月１９日に出願された特許文献２４、これらをすべて参照により特に本明細書に組み込む）、ターゲットが存在する指標として行っても、またはターゲットが増幅された指標として行ってもよい。最初のターゲット量は、実験結果と既知の量のターゲットでの結果とを比較することによって通常は決定される。
【００４６】
本発明の方法による、選択されたターゲット配列の有無についてのアッセイは、溶液中で行っても固相上で行ってもよい。検出用オリゴヌクレオチドがプライマーとして機能する実時間または終点均一系アッセイは、通常は溶液中で行う。本発明の検出用オリゴヌクレオチドを使用するハイブリダイゼーションアッセイは、（たとえば均一系実時間アッセイとして）溶液中で行ってもよいが、ターゲットの実時間または終点検出については固相アッセイにも特によく適合する。固相アッセイでは、当技術分野で知られている方法を利用し、内部または末端の標識を介して検出用オリゴヌクレオチドを固相（たとえばビーズ、膜、または反応容器）上に固定化すことができる。たとえば、ビオチン標識検出用オリゴヌクレオチドは、適切なハイブリダイゼーション条件下でターゲットに曝されたときに蛍光の変化が得られるアビジン改変固相上に固定化することができる。このようにしてターゲットを捕捉すると、サンプルからターゲットを分離しやすくなり、シグナルの検出またはアッセイの他の側面を妨害することのあるサンプル中の基質を除去することが可能になる。使用できる固相系の一例は、当技術分野で知られているものなどのアレイフォーマットである。
【００４７】
（実施例）
以下の実施例は、ここで記載した本発明の特定の実施形態を例示するものである。当分野の技術者には言うまでもないことであるが、様々な変更および修正が可能であり、記載した本発明の範囲内であると意図される。
【実施例１】
【００４８】
ＯＲＦ６の肺炎マイコプラズマ特異性
ＯＲＦ６遺伝子の肺炎マイコプラズマに対する特異性を判定するために、配列番号１２および配列番号１３のプライマーを用いて、数種の肺炎マイコプラズマ株から得たＤＮＡのＰＣＲ増幅を行った。簡潔に述べれば、ＰＣＲ条件は以下のとおり、配列番号１２および配列番号１３のプライマー各１０μＭ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰ各２００ｎＭ、ＡｍｐｌｉＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）５単位、１：１０希釈のＡＴＣＣの保存生物（organism stock）１μｌを、１×ＡｍｐｌｉＴＡＱ緩衝液を含む５０μｌの反応体積とした。ＰＣＲは、ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＰＴＣ−２００  Ｐｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒにおいて、９５℃で５分間の１サイクルに続いて９５℃で４５秒、５２℃で４５秒、７２℃で６０秒の３５サイクルからなる温度循環条件で行った。各ＰＣＲ産物９μｌを１μｌの添加色素と混合し、アガロースゲル電気泳動法によって分析した。１００ｂｐラダー（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）ゲルマーカーを使用して、産物の大きさを推定した。９８ボルトで約４５分間、ゲル上で泳動を行った。図２は、８種の肺炎マイコプラズマＡＴＣＣ株のＰＣＲ増幅から得た産物の１％アガロースゲル分析の結果を示している。表１は、試験した株と、図２の標識されたバンドに対応するバンドの同定を示す。
【００４９】
【表２】
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【００５０】
どの場合でも、５２９ｂｐのＰＣＲ産物（ＯＲＦ６増幅ターゲット領域）が観察され、８種すべての肺炎マイコプラズマ株にＯＲＦ６遺伝子が存在することが実証された。
【００５１】
系統が肺炎マイコプラズマと同類である種にＯＲＦ６遺伝子の相同体が存在するかを判定するために、上述の条件下で配列番号１２および配列番号１３のプライマーを使用するＰＣＲによって、４種の他のマイコプラズマ種から得たＤＮＡを増幅した。図３に示すように、１．５％アガロースゲルでの電気泳動によってＰＣＲ産物を分析した。この分析の結果を表２に要約する。肺炎マイコプラズマ陽性対照（ＡＴＣＣ２９３４２）だけが予想サイズの５２９ｂｐで得られ、配列番号１２および配列番号１３のＯＲＦ６プライマーがこの種に特有であることが示された。
【００５２】
【表３】
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【実施例２】
【００５３】
配列の整列
実施例１で得られたＰＣＲ産物の配列決定を行い、ＭｅｇＡｌｉｇｎソフトウェアプログラム（ＤＮＡＳｔａｒ）を使用して、８種のＯＲＦ６配列の整列をコンパイルした。
【００５４】
配列番号１２および配列番号１３のプライマーにより固定されたＯＲＦ６領域の２つのＳＤＡ系を設計した。図４は、ＯＲＦ６ターゲット領域に対するＳＤＡ系１オリゴヌクレオチドターゲット結合配列である配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、および配列番号９を整列させて示している。配列番号５に意図的にミスマッチを導入（ＣをＴで置換した）して、配列番号１との相互作用を回避した。図５は、ＯＲＦ６ターゲット領域に対するＳＤＡ系２オリゴヌクレオチドターゲット結合配列である配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、および配列番号１０を整列させて示している。これらのオリゴヌクレオチドのターゲット結合領域内にはミスマッチがない。
【００５５】
これらの整列物は、評価した肺炎マイコプラズマの全株に対して、両方のＯＲＦ６  ＳＤＡ系用のオリゴヌクレオチドターゲット結合配列内の相同性を示した。
【実施例３】
【００５６】
ＯＲＦ６遺伝子用に設計されたＳＤＡ系
ＯＲＦ６ターゲット配列用の前述した２つのＳＤＡ系を含むオリゴヌクレオチドの特異性を評価するために、当技術分野でよく知られている（非特許文献１１、１２、１３、１４）Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（「ＢＬＡＳＴ」）を使用して、核酸配列の相同性を評価した。ＢＬＡＳＴＮを使用して、ヌクレオチド照会配列をヌクレオチド配列データベースと対照した。ＢＬＡＳＴＮプログラムは、照会核酸配列と、好ましくは核酸配列データベースから得た試験配列とで類似する区域、すなわちここでは「高得点区域対」と呼ぶものを同定することによって相同配列を特定する。その多くが当技術分野で知られている得点行列によって高得点区域対を同定（すなわち整列）することが好ましい。使用する得点行列（scoring matrix）は、Ｂｌｏｓｕｍ６２行列（非特許文献１５）であることが好ましい。ＢＬＡＳＴＮプログラムは、同定された高得点区域対すべての統計的有意性を評価し、好ましくは、相同性百分率など、使用者が指定した有意性の閾値を満たす区域を選択する。高スコア区域対の統計的有意性は、Ｋａｒｌｉｎ（非特許文献１６）の統計的有意性の式を使用して評価することが好ましい。
【００５７】
ＢＬＡＳＴＮ分析は、ＯＲＦ６  ＳＤＡ系１（配列番号５〜配列番号７）および２（配列番号６〜配列番号８）それぞれの左右のバンパーを包含するターゲット配列を使用して、ＧｅｎＢａｎｋデータベースで行った。結果を分析すると、肺炎マイコプラズマ遺伝子由来の配列としか有意な相同性が示されなかった。このような結果は、ＯＲＦ６  ＳＤＡ系１および２を含むオリゴヌクレオチドが肺炎マイコプラズマに特異的であることを実証するものである。
【００５８】
本発明を若干詳細に述べてきたが、本発明の範囲から逸脱することなく、当分野の技術者にわかる変更を添えてもよい。本発明の様々な特徴は、以下の特許請求の範囲で述べる。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】本発明による鎖置換増幅（ＳＤＡ）反応における、肺炎マイコプラズマ核酸ＯＲＦ６遺伝子のターゲット配列の検出を示す図である。
【図２】図２（図２Ａ−２Ｄ）は、肺炎マイコプラズマ核酸ＯＲＦ６遺伝子ターゲット配列のＰＣＲ増幅に配列番号１２および１３を使用した場合に、５２９ｂｐの増幅産物が生成されたことを示す図である。
【図３】図３（図３Ａ−３Ｂ）は、系統が肺炎マイコプラズマと同類である生物体の核酸のＰＣＲ増幅に配列番号１２および１３を使用した場合に、交差反応性がなかったことを示す図である。
【図４】数種の肺炎マイコプラズマ株に由来するＯＲＦ６遺伝子のＳＤＡ増幅における、配列番号１、３、５、７、および９のターゲット結合配列を並べて示す図である。
【図５】数種の肺炎マイコプラズマ株に由来するＯＲＦ６遺伝子のＳＤＡ増幅における、配列番号２、４、６、８、および１０のターゲット結合配列を並べて示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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