(57)【要約】本発明は、赤血球生成を調節する分子標的の新規パネルを提供する。本発明の新規パネルは、例えば、赤血球生成の疾患および／または障害のための治療的処置、治療的薬剤スクリーニングにおいて、ならびに診断方法において用いられ得る。本発明は、赤血球生成の間に差次的に発現して同定された、新規の遺伝子および／またはコード遺伝子産物に関する。本発明は、赤血球生成の間に差次的に発現して同定された、遺伝子群から成る分子標的の新規のパネルおよび／またはコード遺伝子産物にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
赤血球生成障害のための候補治療薬を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）表Ｉから選択される少なくとも１つの遺伝子を含むパネルと化合物とを接触させる工程、および
（ｂ）該化合物が赤血球生成障害のための候補治療薬であるか否かを評価する工程、
を包含し、該化合物と該遺伝子との間の相互作用を測定することによってか、または該化合物により引き起こされる該遺伝子の変化を測定することによって、該評価工程を実施する、方法。
【請求項２】
前記化合物が、以下の種類の化合物：アンチセンス核酸、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、遺伝子によってコードされるポリペプチドのドミナントネガティブ変異体、低分子、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド模倣物および核酸アナログから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記赤血球生成障害が貧血である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記赤血球生成障害が多血症である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記化合物が化合物のライブラリー中にある、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ライブラリーが組み合わせ合成方法を用いて作製される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記評価工程が、インビトロアッセイを用いて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記評価工程が、インビボアッセイを用いて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
赤血球生成障害のための候補治療薬を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）表Ｉから選択される少なくとも１つの遺伝子産物を含むパネルと化合物とを接触させる工程、および
（ｂ）該化合物が赤血球生成障害のための候補治療薬であるか否かを評価する工程、
を包含し、該化合物と該遺伝子産物との間の相互作用を測定することによってか、または該化合物により引き起こされる該遺伝子産物の変化を測定することによって、該評価工程を実施する、方法。
【請求項１０】
前記ライブラリーの化合物が、以下の種類の化合物：タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、低分子、サイトカインまたはホルモンから選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記赤血球生成障害が貧血である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記赤血球生成障害が多血症である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記化合物が、化合物のライブラリー中にある、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記ライブラリーが、組み合わせ合成方法を用いて作製される、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記評価工程が、インビトロアッセイを用いて行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記評価工程が、インビボアッセイを用いて行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
赤血球生成障害のための候補治療薬を同定する方法であって、該方法は、その活性が赤血球生成を促進する表Ｉの遺伝子によってコードされるタンパク質と化合物とを接触させる工程を包含し、タンパク質の活性を阻害する能力により候補治療薬を示す、方法。
【請求項１８】
前記障害が貧血である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記障害が多血症である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
赤血球生成障害のための薬剤としての候補治療薬の有効性を確定する方法であって、該方法は、赤血球生成障害に罹患している被検体の赤血球系細胞における赤血球生成に関連する１つ以上の遺伝子の発現レベルを、健常な赤血球系細胞における該１つ以上の遺伝子の発現レベルと比較する工程を包含する、方法。
【請求項２１】
前記遺伝子の発現レベルがマイクロアレイを用いて決定される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記遺伝子の発現レベルがＲＮＡ定量方法を用いて決定される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
赤血球生成の間に差次的に発現される遺伝子の複数の検出剤に結合され、そして該遺伝子の発現または該遺伝子によりコードされるポリペプチドを検出することが可能な、固体表面。
【請求項２４】
前記検出剤が、赤血球生成の間に差次的に発現される前記遺伝子に対応する核酸と特異的にハイブリダイズする単離された核酸である、請求項２３に記載の固体表面。
【請求項２５】
表Ｉの遺伝子と特異的にハイブリダイズする単離された核酸を含む、請求項２４に記載の固体表面。
【請求項２６】
表ＩＩの遺伝子と特異的にハイブリダイズする単離された核酸を含む、請求項２４に記載の固体表面。
【請求項２７】
表ＩＩＩの遺伝子と特異的にハイブリダイズする単離された核酸を含む、請求項２４に記載の固体表面。
【請求項２８】
赤血球生成の間に差次的に発現される遺伝子に対応する少なくとも１０個異なる核酸と特異的にハイブリダイズする単離された核酸を含む、請求項２５に記載の固体表面。
【請求項２９】
赤血球生成の間に差次的に発現される遺伝子に対応する少なくとも１００個異なる核酸と特異的にハイブリダイズする核酸を含む、請求項２５に記載の固体表面。
【請求項３０】
表Ｉの遺伝子のほぼ全てとハイブリダイズする単離された核酸を含む、請求項２５に記載の固体表面。
【請求項３１】
前記検出剤が、赤血球生成の間に差次的に発現される前記遺伝子によってコードされるポリペプチドを検出する、請求項２３に記載の固体表面。
【請求項３２】
前記検出剤が、前記ポリペプチドと特異的に反応する抗体である、請求項３１に記載の固体表面。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
赤血球生成は、赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ）が生成し、骨髄中の多能性幹細胞から分化するプロセスである。このプロセスは、標的細胞上で膜結合レセプターを介して作用する、ポリペプチド成長因子（サイトカインやホルモン）の複合的相互作用を含む。サイトカイン作用は、ステージ特異的であることが多い特定のサイトカインに反応して、細胞の増殖や分化をもたらす。赤血球生成を調節する最も著名な２つのサイトカインは、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）および幹細胞因子（ＳＣＦ；肥満細胞成長因子［ＭＧＦ］、幹細胞増殖因子［ＳＬＦ］またはキットリガンド［ＫＬ］とも称される）である。エリスロポエチン（Ｅｐｏ）は、ＳＣＦ等の他の成長因子と呼応して作用し、反応性骨髄赤血球前駆細胞の増殖および成熟を刺激するタンパク質ホルモンである。
【０００２】
貧血は赤血球生成の共通の障害であり、不十分な赤血球数の結果である。貧血は、身体活動障害、臓器不全または死を導くこと可能性のある酸素輸送能の減少をもたらす。毎年２７００万人を超える患者が、何らかの形態の貧血を示す。慢性進行性貧血は、腎臓疾患、ＡＩＤＳ、鉄輸送欠損症、慢性炎症および細胞減少癌療法の副作用に起因する。他の慢性貧血は、赤血球生成そのものの先天的障害に起因するか、または遺伝的障害に起因して赤血球生成を刺激するのに必要な因子が欠落しているために起こる。急性貧血は、急速または大量の血液損失をもたらす手術または外傷に起因する。貧血の治療は、いったんヘマトクリット（赤血球から成る血液質量の％）が３０％を下回ると必要とされる。
【０００３】
一方、多血症（すなわち赤血球増加症）は、過剰な赤血球生成により引き起こされる障害である。多血症は、ヘマトクリットレベルが男性では５５％、女性では５０％を超える上昇として定義される。多血症は、血栓症（凝固；卒中、心臓発作および塞栓症の原因）、息切れ、脈管炎症、頭痛および眩暈の危険増加をもたらす。多血症には以下の異なる３つの分類がある。１）相対的多血症：患者は、脱水症、利尿薬、火傷、ストレスおよび高血圧に起因して血液の液体成分である血漿の量が損失するために過剰な赤血球を有するように見えるもの；２）真性赤血球増加症：赤血球刺激ホルモンであるＥｐｏにより刺激されることなく赤血球数が増加する骨髄増殖性障害；および３）二次性多血症：赤血球数の増加が赤血球刺激ホルモンであるＥｐｏの増加に起因するもの。
【０００４】
現在、赤血球レベルに関係する障害は、必要に応じて、以下の主な３つの方法で治療される。１）栄養不足または疾患等の障害の根本的原因の治療；２）貧血の場合は鉄サプリメントによる治療、あるいは極端な場合は罹患した人への赤血球の輸血、あるいは多血症の場合は脱血や他の方法による患者の赤血球の低粘稠化；および３）赤血球レベルに影響を与える赤血球生成レベルの変更。
【０００５】
伝統的に、根本的障害を効果的に治療することができない貧血の場合、患者の状態が悪化する時に定期的な輸血を必要とする。輸血には以下の２つの型がある。１）相同輸血法：患者と同一型の血液をドナーから回収し、患者に与える方法；および２）自己輸血法：患者自身の血液を提供して保存し、その後患者に戻す方法。いずれの方法も、輸血の代わりを探すことにより克服できる問題を提起する。例えば相同輸血法は、ドナーから適切な量の血液を得る能力に頼り、血液の安全性を確保するために疾患の大規模なスクリーニングを行わなければならず、非効率的で費用がかかる。自己輸血法に伴う主な問題は、そのプロセスにより貧血が誘導されるために、各人から必要な量の血液を回収することができないことである。赤血球拡張技法は、輸血用に採血される場合に貧血が誘導されるのを防止するか、または輸血の必要性を完全に除去するのに用いることができる。
【０００６】
根本的障害の治療に効果を示さない多血症の治療において、身体的に赤血球数を減少させるために以下の幾つかの方法が用いられる。１）放血、すなわちヘマトクリットが正常レベルに低下するまで毎週１パイントの血液を除去；２）過剰な赤血球を破壊するヒドロキシ尿素等の薬剤を用いた化学療法；および３）血栓症を相殺する低用量アスピリン療法等の血液低粘稠化剤または抗凝固剤。放血は、コンプライアンスが悪く、治療の初めの３〜５年間は血栓症の危険増加を負うという点で問題がある。化学療法はさらに問題があり、免疫抑制、脱毛症、悪心等の副作用を伴う。特異的に赤血球生成を調節することにより赤血球の過剰産生を阻害することができる治療は、患者の健康により優しいと考えられる。
【０００７】
赤血球生成は、細胞培養技法および分子生物学がこの研究を促進するのに十分進歩したのはつい最近であるため、理解され始めたばかりである。最近は、組み換え型ヒトエリスロポエチンの産生および使用による、赤血球生成を増強するための限られた能力が開発された。しかしながら、組み換え型エリスロポエチン療法は非常に費用がかかり、貧血にしか有効な治療でない。組み換え型エリスロポエチン療法を拡大または置換するいずれかの他の方法を探すことが望ましい。さらに、多血症の治療のために、赤血球生成を減少させる因子を探すことも望ましい。
【０００８】
各型の前駆細胞の均質培養の維持を困難にする、幹細胞から赤血球までの経路の複雑さのため、最近までの赤血球生成の研究は限られていた。確立された細胞株または遺伝子操作された細胞株を用いて、ＳＣＦやＥｐｏを重要な赤血球生成因子として同定し、そのシグナル伝達メカニズムを特性化する研究を行った。また、ＳＣＦやＥｐｏのシグナル伝達メカニズムの初期の研究は、初代ヒト前駆細胞を用いて行われた。これらの研究の１つの制限は、多細胞数のヒト赤血球細胞前駆体の均質集団を得ることが困難であることであった。したがって、詳細な赤血球生成の生化学的特性化および分子的特性化はまだ行われていない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、赤血球生成の間に差次的に発現して同定された、新規の遺伝子および／またはコード遺伝子産物に関する。本発明は、赤血球生成の間に差次的に発現して同定された、遺伝子群から成る分子標的の新規のパネルおよび／またはコード遺伝子産物にも関する。一実施形態においては、遺伝子のパネルは、表Ｉ（図３）に列挙したような、赤血球生成の間に差次的に調節される少なくとも１つの遺伝子から成り得る。特定の実施形態においては、遺伝子のパネルは、表ＩＩ（図４）に列挙したような、赤血球生成の間にアップレギュレートされる少なくとも１つの遺伝子から成る。他の実施形態においては、遺伝子のパネルは、表ＩＩＩ（図５）に列挙したような、赤血球生成の間にダウンレギュレートされる少なくとも１つの遺伝子から成る。また、本発明の新規パネルは、パネル遺伝子の遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡやタンパク質）から成り得る。
【００１０】
さらに、本発明は赤血球生成障害および赤血球生成に関連する疾患の治療に使用するための候補治療剤をスクリーニングする方法における、新規パネルの使用に関する。本発明の一実施形態においては、この障害は貧血である。本発明の別の実施形態においては、この障害は多血症である。幾つかの実施形態においては、候補治療剤（すなわち「治療薬」）は、標的タンパク質に結合する能力に関して評価される。候補治療薬は、例えば、以下の化合物類：タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、低分子、サイトカインまたはホルモンから選択されてもよい。他の実施形態においては、候補治療薬は、標的遺伝子に結合する能力に関して評価される。候補治療薬は、例えば、以下の化合物類：アンチセンス核酸、低分子、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド模倣物または核酸アナログから選択されてもよい。幾つかの実施形態においては、候補治療薬は、化合物のライブラリー中にあり得る。これらのライブラリーは、組み合わせ合成方法を用いて作製され得る。本発明の特定の実施形態においては、上記候補治療薬の標的タンパク質と結合する能力は、インビトロアッセイによって評価され得る。候補治療薬の標的が遺伝子である本発明の実施形態においては、候補治療薬の遺伝子と結合する能力は、インビトロアッセイによって評価され得る。いずれの実施形態においても、結合アッセイはインビボであり得る。
【００１１】
さらに本発明は、被験体の赤血球を上記候補治療剤に接触させることによって、標的遺伝子の発現を調節する能力に関して候補治療剤を評価することを検討する。特定の実施形態においては、候補治療薬は、赤血球生成の促進に関する遺伝子または遺伝子群の発現レベルを正常化する能力に関して評価される。この実施形態においては、候補治療薬が赤血球生成を促進するように遺伝子発現を正常化することができれば、貧血のための候補治療薬と見なされ得る。同様に、他の実施形態においては、候補治療薬が赤血球生成を阻害するように遺伝子発現を正常化することができれば、多血症のための候補治療薬として見なされ得る。候補治療薬は、以下の化合物類：アンチセンス核酸、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、遺伝子によってコードされるポリペプチドの優性ネガティブ変異体、低分子、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド模倣物および核酸アナログから選択されてもよい。
【００１２】
あるいは、候補治療剤は、被験体の赤血球系細胞を上記候補治療剤と接触させることによって、タンパク質の活性を阻害する能力に関して評価され得る。特定の実施形態においては、正常に赤血球生成を促進するタンパク質の活性を阻害する候補治療薬の能力に関して評価され得る。この実施形態においては、タンパク質の活性を阻害する能力を示す候補治療剤は、多血症を治療するための候補治療薬として見なされ得る。他の実施形態においては、候補治療薬は、阻害される場合、赤血球生成を正常に促進するタンパク質の活性を阻害する能力に関して評価され得る。この実施例においては、タンパク質の活性を阻害する能力を示す候補治療剤は、貧血を治療するための候補治療薬として見なされ得る。
【００１３】
さらに、候補治療薬は、本発明のパネルからの遺伝子によりコードされたタンパク質のターンオーバーレベルを正常化する能力に関して評価され得る。別の実施形態においては、候補治療薬は、本発明のパネルからの遺伝子によりコードされたタンパク質の翻訳レベルを正常化する能力に関して評価され得る。さらに別の実施形態においては、候補治療薬は、本発明のパネルからの遺伝子によりコードされたｍＲＮＡのターンオーバーレベルを正常化する能力に関して評価され得る。
【００１４】
上記の方法における使用に適切なアッセイを開発するアッセイおよび方法は、当業者には公知であり、当業者に理解されるように本発明の方法に適したように用いられ得る。
【００１５】
本発明の方法を用いて同定された候補治療薬の有効性は、例えば、ａ）被験体の赤血球を候補治療薬と接触させること、およびｂ）赤血球生成レベルの確定に関するアッセイを用いて被験体の細胞における赤血球生成レベルを正常化する能力を確定すること、によって評価され得る。候補治療薬が高レベルの赤血球生成を誘導するアッセイによって示されると、その後、この候補治療薬は赤血球生成増強薬として見なされ得る。逆に、候補治療薬が赤血球生成レベルを阻害するアッセイによって示されると、その後、この候補治療薬は赤血球生成阻害薬として見なされ得る。あるいは、候補治療薬の有効性は、赤血球生成障害に罹患している被験体の赤血球における赤血球に関連する１つまたは複数の遺伝子の発現レベルを、健常な赤血球系細胞における発現レベルと比較することによって評価され得る。一実施形態においては、遺伝子の発現レベルは、マイクロアレイまたは他のＲＮＡ定量方法を用いて、または候補治療薬で治療された赤血球の遺伝子発現プロファイルを健常な赤血球の遺伝子発現プロファイルと比較することにより確定され得る。
【００１６】
さらに本発明は、本発明により提供されたスクリーニング方法を用いて同定された治療剤から成る薬学的組成物を用いて、赤血球生成障害を治療する方法を提供する。本発明は、例えば、赤血球生成障害に罹患している患者における赤血球生成レベルを正常化するための、薬学的組成物の使用を意図する。特定の実施形態においては、本発明の薬学的組成物は、貧血に罹患している患者を治療するのに用いられる。他の実施形態においては、薬学的組成物は、多血症に罹患している患者を治療するのに用いられる。このような方法は、赤血球生成の調節に関する１つまたは複数の遺伝子またはコード遺伝子産物の薬学的有効量のアゴニストまたはアンタゴニストを、赤血球生成障害に罹患している患者へ投与することを含んでもよい。本発明の薬学的組成物を含むキットも、本発明の範囲内である。
【００１７】
さらに本発明は、その発現が赤血球生成障害に特有である遺伝子の発現を検出するための、例えば診断アッセイにおける使用のための、１つまたは複数の検出剤を含む組成物を提供する。これらの検出剤は、例えば核酸またはポリペプチドであってもよいが、溶液中にあってもよく、マイクロアレイ形態等のように固体表面に結合していてもよい。本発明のマイクロアレイは、本発明の新規パネルを含む遺伝子またはコード遺伝子産物の配列由来のプローブから成り得る。本発明の他の実施形態は、データベース、コンピュータ可読媒体、本発明の遺伝子発現プロファイル（１つまたは複数）、またはその発現が赤血球生成障害に特有である１つまたは複数の遺伝子の発現レベルを含むコンピュータを含む。
【００１８】
さらに本発明は、治療を受けたまたは受けていない被験体の赤血球生成障害の存在を検出および／またはその進行をモニタリングするための診断方法を提供する。本発明のマイクロアレイは、治療剤が赤血球生成障害を副作用として誘導するかどうか確定する方法において使用され得る。一実施形態においては、この方法は以下の工程を含む：ａ）被験体の赤血球を上記治療薬と接触させる工程、およびｂ）治療前および治療後に遺伝子発現のレベルを確定する工程であって、遺伝子発現のレベルへの影響によって候補治療薬が赤血球生成障害を誘導し得ることが示唆される工程。好ましい方法は、被験体の赤血球における赤血球生成の間に差次的に発現する、１つまたは複数の遺伝子の発現レベルを確定することを含む。他の方法は、例えばマイクロアレイ技法によって、赤血球生成の間に差次的に発現する、何十、何百または何千もの遺伝子の発現レベルを確定することを含む。その後、遺伝子の発現レベルは、健常な赤血球における同一の遺伝子の発現レベルと比較される。
【００１９】
本発明は、赤血球生成障害の原因を診断するための診断方法も提供する。一実施形態においては、この方法は以下の工程を含む：ａ）赤血球生成障害に罹患している被験体から細胞サンプルを得る工程、ｂ）被験体の細胞における遺伝子発現のレベルを確定する工程、およびｃ）被験体の細胞における遺伝子発現レベルを健常な赤血球系細胞における発現レベルと比較する工程であって、遺伝子発現のレベルの差異によって候補治療薬が赤血球生成障害の原因を示唆し得ることが示唆される工程。
【００２０】
本発明が意図する診断方法のいずれかの特定の実施形態においては、診断方法は、被験体の赤血球の遺伝子がコードするタンパク質の活性を確定すること、およびその活性を健常な赤血球におけるタンパク質の活性とを比較することを含む。他の実施形態においては、診断方法は、タンパク質もしくはｍＲＮＡのターンオーバーのレベルを確定すること、または被験体の赤血球における翻訳レベルを確定することを含んでもよい。
【００２１】
さらに本発明は、上記遺伝子の１つまたは複数の発現レベルを確定するための、遺伝子発現パターンのライブラリーおよび試薬を含むキットを提供する。一例を挙げると、適切なアッセイおよびプローブのアレイを有する適切なマイクロアレイを含むキットを提供することにより、発現レベルを確定する。別の実施形態においては、キットは、被験体の赤血球におけるタンパク質活性レベルを確定するための適切な試薬を含む。キットの構成成分は、前述の方法のマニュアル、または一部自動化もしくは全自動化された実施に対してパッケージされ得る。キットに関連する他の実施形態においては、本発明は、本発明の組成物および必要に応じてその使用のための使用説明書を含むキットを意図する。このようなキットは、例えば画像化、診断、治療および他の応用等の様々な使用を有し得る。
【００２２】
本発明のこれらの実施形態、他の実施形態、およびそれらの特性や特徴は、以下の説明、図面および特許請求の範囲から明らかになる。
【００２３】
（発明の詳細な説明）
（１．概要）
本発明のパネルを含む遺伝子群および／またはそのコード遺伝子産物は、制御された条件を用いて分化または増殖を誘導され得る赤血球前駆体の均質な細胞株を用いて発見された。このようにして、これらの赤血球生成プロセスの間に差次的に発現する遺伝子が同定され得る。これらの遺伝子またはそのコード遺伝子産物は、本発明のパネルを含む。
【００２４】
本発明のパネルは、市販のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＵ６８００およびＨｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ９５Ａｖ２（ＨＧ−Ｕ９５Ａｖ２）遺伝子チップを介して、様々な赤血球前駆体の遺伝子発現プロファイリングを用いて発見された。ＳＣＦ／Ｅｐｏ依存性ヒト赤血球前駆体（Ｅ−カドヘリン＋／Ｃｄ３６＋前駆体）、および培養において赤血球の生成を正確に繰り返す初期前駆細胞のインビトロでの成長および分化システムは、細胞源として用いられる。ＨＵ６８００チップは、細胞成長、増殖および分化において潜在的な役割を有し得る１３，０００個のヒト遺伝子由来のプローブを含み、ＨＧ−Ｕ９５Ａｖ２チップは、機能や疾患の関連性に関して予め特性化された１２，０００個の全長遺伝子を含む。新規遺伝子パネルは、様々な前駆細胞の成熟赤血球への分化または増殖の間にアップレギュレートまたはダウンレギュレートされる遺伝子から成る。例えば、新規遺伝子標的の中には、ＢＦＵ−Ｅ前駆細胞のＳＣＦ−Ｅｐｏ細胞への分化および増殖の間にアップレギュレートまたはダウンレギュレートされる遺伝子があり、これは細胞のｍＲＮＡとＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＵ６８００遺伝子チップとのハイブリダイゼーションの分析によりアッセイされる。
【００２５】
図１は本発明の新規パネルを得るのに適した一実験計画を描写し、図２は本発明の新規パネルを得るのに適した別の実験計画を描写する。
【００２６】
（２．定義）
便宜上、本発明のさらなる説明の前に、明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲において用いたいくつかの用語をここで定義する。
【００２７】
単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が他に明確に示さない限り、複数を指すことを包含する。
【００２８】
アレイ（例えば、マイクロアレイ）上の「アドレス」とは、エレメント（例えば、オリゴヌクレオチド）がそのアレイの固体表面と付着する位置を指す。本明細書で用いられる場合、アレイと付着する核酸または他の分子は「プローブ」または「捕捉プローブ」と称される。アレイが１つの遺伝子に対応する幾つかのプローブを含む場合、これらのプローブは「遺伝子−プローブセット」と称される。遺伝子−プローブセットは、例えば２〜１０個のプローブ、好ましくは２〜５個のプローブ、そして最も好ましくは約５個のプローブから成り得る。
【００２９】
「アゴニスト」とは、タンパク質（例えば、ポリペプチドＸ）の生物活性を模倣またはアップレギュレート（例えば、増強または補足）する薬剤を指す。アゴニストは、野生型タンパク質の少なくとも１つの生物活性を有する、野生型タンパク質またはその誘導体であり得る。アゴニストは、遺伝子の発現をアップレギュレートするか、またはタンパク質の少なくとも１つの生物活性を増加させる化合物でもあり得る。アゴニストは、別の分子（例えば、標的ペプチドまたは核酸）とのポリペプチドの相互作用を増加させる化合物でもあり得る。
【００３０】
「対立遺伝子」とは、本明細書中で「対立遺伝子改変体」と交換可能に用いられ、遺伝子またはその一部の代替形態を指す。対立遺伝子は、相同染色体上の同一の座または位置を占める。被検体が遺伝子の２つの同一の対立遺伝子を有する場合、この被検体は遺伝子または対立遺伝子に対して同型であると言われる。被検体が遺伝子の２つの異なる対立遺伝子を有する場合、この被検体はこの遺伝子に対して異型であると言われる。特定の遺伝子の対立遺伝子は、１つのヌクレオチドまたは幾つかのヌクレオチドにおいて互いに異なっていてもよく、ヌクレオチドの置換、欠失および挿入を含んでいてもよい。遺伝子の対立遺伝子は、変異を含む遺伝子の形態でもあり得る。
【００３１】
「増幅」とは、核酸配列のさらなるコピーの産生を指す。増幅は一般に、当該技術分野において周知の、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて行われる（Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ，Ｃ．Ｗ．およびＧ．Ｓ．Ｄｖｅｋｓｌｅｒ  （１９９５）  ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．）。
【００３２】
「貧血」とは、被検体における赤血球の産生の減少を指す。
【００３３】
「アンタゴニスト」とは、タンパク質の少なくとも１つの生物活性をダウンレギュレート（例えば、抑制または阻害）する薬剤を指す。アンタゴニストは、タンパク質と別の分子（例えば、標的ペプチドまたは酵素基質）との間の相互作用を阻害するかまたは減少させる化合物であり得る。アンタゴニストは、遺伝子の発現をダウンレギュレートするか、または存在する発現されたタンパク質の量を減少させる化合物でもあり得る。
【００３４】
「抗体」とは、全抗体、例えば任意のアイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ等）を含み、脊椎動物（例えば、哺乳動物）のタンパク質と特異的反応性でもあるその断片を含むことを意味する。抗体は従来技法を用いて断片化されてもよく、断片は上記と同様の方法で、有用性に関して全抗体に対してスクリーニングされる。したがって、この用語は、あるタンパク質と選択的に反応することができる抗体分子の、タンパク質分解により切断された部分または組み換えにより調製された部分のセグメントを含む。このようなタンパク質分解性および／または組み換え型断片の非限定的例としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、およびペプチドリンカーにより結合したＶ［Ｌ］および／またはＶ［Ｈ］ドメインを含む単鎖抗体（ｓｃＦｖ）が挙げられる。ｓｃＦｖは、２箇所以上の結合部位を有する抗体を形成するために、共有結合または非共有結合で結合してもよい。本発明は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体または他の精製された調製物の抗体、および組み換え型抗体を含む。
【００３５】
「アンチセンス」核酸とは、例えば、細胞のｍＲＮＡおよび／またはゲノムのＤＮＡレベルにおいて、細胞条件下で遺伝子配列と特異的にハイブリダイズ（例えば、結合）し、例えば、転写および／または翻訳を阻害することによって遺伝子の発現を阻害するオリゴヌクレオチドを指す。結合は、従来の塩基対によって相補的に、または、例えばＤＮＡ二重鎖と結合する場合、二重らせんの主要な溝における特異的相互作用によるものであり得る。
【００３６】
「アレイ」または「マトリクス」とは、デバイス上のアドレス可能位置または「アドレス」の配置を指す。この位置は、二次元アレイ、三次元アレイまたは他のマトリクスフォーマットにおいて配置され得る。位置の数は、数個から少なくとも数十万個に及び得る。最も重要なことは、各位置が完全に独立した反応部位を表すことである。「核酸アレイ」とは、オリゴヌクレオチドや遺伝子の大部分等の核酸プローブを含むアレイを指す。アレイ上の核酸は、好ましくは一本鎖である。プローブがオリゴヌクレオチドであるアレイは、「オリゴヌクレオチドアレイ」または「オリゴヌクレオチドチップ」または「遺伝子チップ」と称される。「マイクロアレイ」は、「チップ」、「バイオチップ」または「バイオロジカルチップ」とも称されるが、各領域が少なくとも１００／ｃｍ２、好ましくは少なくとも約１０００／ｃｍ２の密度の領域のアレイである。マイクロアレイにおけるこの領域は、約１０〜２５０ミクロンの範囲の典型的な寸法（例えば、直径）を有し、アレイにおける他の領域と同一距離だけ離れている。
【００３７】
「生体活性（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）」または「生物活性（ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ）」または「活性」または「生物学的機能」とは、交換可能に用いられるが、ポリペプチド（天然コンホメーションであるか変性コンホメーションであるかにかかわらない）によって、またはその任意の部分配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）によって、直接的または間接的に行われるエフェクターまたは抗原の機能を指す。生体活性としては、ポリペプチドとの結合、他のタンパク質または分子との結合、ＤＮＡ結合タンパク質としての活性、転写調節因子としての活性、損傷を受けたＤＮＡを結合する能力等が挙げられる。生物活性は、被検体のポリペプチドに直接影響を与えることによって変調されてもよい。あるいは生物活性は、対応する遺伝子の発現を変調すること等により、ポリペプチドのレベルを変調することにより変更されてもよい。
【００３８】
「生体サンプル」または「サンプル」とは、生物体から、または生物体の構成成分（例えば、細胞）から得られたサンプルを指す。サンプルは、任意の生体組織または流体のサンプルであってもよい。サンプルは、患者由来のサンプルである「臨床サンプル」であることが多い。このようなサンプルとしては、痰、血液、血球（例えば、白血球）、組織また細針生検サンプル、尿、腹水、および胸膜液、またはそれらからの細胞が挙げられるが、これらに限定されない。また、生体サンプルは、組織学的目的のために採取された凍結切片等の組織の切片を含んでもよい。
【００３９】
「バイオマーカー」とは、存在、濃度、活性またはリン酸化状態が検出され得、そして目的のタンパク質の活性と相関し得る生体分子を指す。
【００４０】
「細胞周期」とは、以下の２つの期から成る真核細胞において繰り返す連続の事象を指す：第一は、第一のギャップ期または成長期（Ｇ１）、ＤＮＡ合成期（Ｓ）、および第二のギャップ期または成長期（Ｇ２）を含む細胞成長期であり；第二は、有糸分裂（Ｍ）を含む細胞分裂期である。
【００４１】
罹患細胞「の対応する健常細胞」または「に対応する健常細胞」または「の正常対応細胞」とは、罹患細胞と同型の健常細胞を指す。
【００４２】
「コンビナトリアルライブラリー」または「ライブラリー」は複数の化合物であり、これは「メンバー」と呼ばれ、ライブラリーにおける各反応で同一のまたは異なる反応物質または反応条件のいずれかを用いることによって、１つまたは複数の出発材料から合成、さもなければ調製されてもよい。一般に、任意のライブラリーのメンバーは少なくとも幾つかの構造的多様性を示し、これが化学的多様性をもたらすことが多い。ライブラリーは、２個の異なるメンバーから約１０８個以上のメンバーまでのどれでも有し得る。ある実施形態においては、本発明のライブラリーは、約１２、５０および９０個より多くのメンバーを有する。本発明のある実施形態においては、出発材料およびある反応物質は同一であり、このようなライブラリーにおける化学的多様性は、ライブラリーの調製の間に少なくとも１つの反応物質または反応条件を変えることによって達成される。本発明のコンビナトリアルライブラリーは、溶液中または固相上で調製され得る。
【００４３】
「相補的」または「相補性」とは、許容塩および温度条件下における塩基対合によるポリヌクレオチドの天然結合を指す。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」は相補的配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」と結合する。２個の一本鎖分子間の相補性は「部分的」であってもよく、この場合は核酸の一部のみが結合し、または完全な相補性が一本鎖分子の間に存在する場合は完全になり得る。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度へ重大な影響を及ぼす。
【００４４】
「サイトカイン」とは、細胞間の反応を媒介する細胞によって産生され、通常は生体反応変更因子用に用いられる可溶性生化学物質を指す。
【００４５】
「輸送複合体」とは、標的化手段（例えば、標的細胞表面への遺伝子、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのアフィニティ結合の上昇および／または標的細胞による細胞または核の取り込みの増加をもたらす分子）を指す。標的化手段の例としては、ステロール（例えば、コレステロール）、脂質（例えば、陽イオン性脂質、ビロゾームまたはリポソーム）、ウィルス（例えば、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルスおよびレトロウィルス）、または標的細胞特異性結合剤（例えば、標的細胞特異的レセプターにより認識されるリガンド）が挙げられる。好ましい複合体は、ｉｎ  ｖｉｖｏで標的細胞による内在化の前の重大な脱共役を防止するのに十分に安定である。しかしながら複合体は、遺伝子、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドが機能的形態で放出されるような、適切な細胞内条件下で切断可能である。
【００４６】
本明細書において用いられる「〜由来の」という語句は、所定の配列内から選択されたペプチドまたはヌクレオチド配列を示唆する。指定配列由来のペプチドまたはヌクレオチド配列は、親配列に対して小数の変更を有してもよく、ほとんどの場合においては約１５％未満、好ましくは１０％未満、多くの場合においては約５％未満の、親配列中に存在するアミノ酸残基または塩基対の欠失、置換または挿入を示す。ＤＮＡの場合、２つのＤＮＡ分子が選択的に互いにハイブリダイズすることが可能であれば、一方のＤＮＡ分子はもう一方のＤＮＡ分子由来であるとも考えられる。
【００４７】
「誘導体」とは、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列の化学的変更を指す。ポリヌクレオチド配列の化学的変更の例としては、アルキル基、アシル基またなアミノ基による水素の置換が挙げられる。誘導体ポリヌクレオチドは、天然分子の少なくとも１つの生体機能または免疫機能を保持するポリペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドとは、由来するポリペプチドの少なくとも１つの生体機能または免疫機能を保持する、グリコシル化、ペグ化または任意の類似プロセスによって変更されるものである。
【００４８】
「遺伝子の検出剤」とは、遺伝子またはそれに関連する他の生体分子（例えば、遺伝子および遺伝子によりコードされたポリペプチドから転写されたＲＮＡ）を特異的に検出するのに用いられ得る薬剤を指す。典型的な検出剤は、遺伝子および抗体に対応する核酸とハイブリダイズする核酸プローブである。
【００４９】
「分化」とは、ある遺伝子の選択的遺伝子発現および他の遺伝子の選択的抑制によって、特定の構造または機能に対して細胞が特殊化されるプロセスを指す。
【００５０】
「差次的発現」とは、遺伝子の時間的（ｔｅｍｐｏｒａｌ）および／または組織発現パターンの量的差異および質的差異の双方を指す。差次的に発現する遺伝子は、「標的遺伝子」となり得る。
【００５１】
細胞Ａと細胞Ｂとの間の「差次的遺伝子発現パターン」とは、細胞Ａと細胞Ｂとの間の遺伝子発現の差異を反映するパターンを指す。差次的遺伝子発現パターンは、ある時点における細胞と別の時点における細胞の間に、あるいは化合物と共にインキュベートしたまたは化合物と接触させた細胞と、化合物と共にインキュベートしなかったまたは化合物と接触させなかった細胞との間にも得られ得る。
【００５２】
「等価物」とは、機能的に等価なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を指す。等価なヌクレオチド配列は、対立遺伝子の改変体等の、１つ以上のヌクレオチドの置換、付加または欠失により異なる配列を含み、したがって、遺伝子コードの縮重が原因で表中に記載した核酸のヌクレオチド配列とは異なる配列を含む。
【００５３】
「赤血球」とは、末梢血の主要な細胞要素を指し、これはヘモグロビンを含み、酸素を運搬するよう特殊化されている。ヒトにおいては、成熟形態は通常、その形状やヘモグロビン含量によって酸素を運搬するのに適した無核で黄色がかった両凹の円盤である。「赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）」に対する代替的用語は、「赤血球（ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）」である。
【００５４】
「赤血球生成」とは、幹細胞からの赤血球または赤血球の産生を指す。
【００５５】
「赤血球前駆細胞」または「赤血球系細胞」は、赤血球への幹細胞成熟経路または赤血球生成経路に沿う任意の細胞である。
【００５６】
「発現プロファイル」とは、本明細書においては細胞の「遺伝子発現プロファイル」や「指紋」と交換可能に用いられるが、細胞における２０個以上の遺伝子のｍＲＮＡレベルを表す一組の値を指す。発現プロファイルは、少なくとも約３０個の遺伝子、好ましくは少なくとも約５０個、１００個、２００個以上の遺伝子の発現レベルを表す値を含むことが好ましい。発現プロファイルは、複数の細胞や条件において類似のレベルで発現する遺伝子（例えば、ＧＡＰＤＨ）のｍＲＮＡレベルを含むことが好ましい。例えば、疾患Ｄの罹患細胞の発現プロファイルは、罹患細胞における２０個以上の遺伝子のｍＲＮＡレベルを表す一組の値を指す。
【００５７】
「細胞における遺伝子の発現レベル」または「遺伝子発現レベル」とは、細胞における遺伝子によりコードされたｍＲＮＡ、ならびにｍＲＮＡ前駆体新生転写物（単数または複数）、転写物プロセッシング中間体、成熟ｍＲＮＡ（単数または複数）および分解産物のレベルも指す。
【００５８】
「遺伝子」または「組み換え型遺伝子」とは、オープンリーディングフレームを含み、少なくとも１つのエキソン配列および（必要に応じて）イントロン配列を含む核酸分子を指す。「イントロン」とは、ｍＲＮＡ成熟の間にスプライシングされる、所定の遺伝子に存在するＤＮＡ配列を指す。
【００５９】
「遺伝子構築物」とは、ポリペプチドに対する「コード配列」を含むか、またはさもなければ生体活性であるＲＮＡ（例えば、アンチセンス、デコイ、リボザイム等）に転写可能なベクター、プラスミド、ウィルスゲノム等を指し、これは細胞、ある実施形態においては哺乳動物細胞にトランスフェクトしてもよく、構築物でトランスフェクトした細胞におけるコード配列の発現を引き起こし得る。遺伝子構築物は、コード配列と動作可能に結合した１つまたは複数の調整エレメントのほかに、イントロン配列、ポリアデニル化部位、複製起点、マーカー遺伝子等も含んでもよい。
【００６０】
「異型接合体」とは、相同染色体上の対応する座において異なる対立遺伝子を有する個体を指す。したがって、「異型接合型」とは、相同染色体上の１つまたは複数の対の座において異なる対立遺伝子を有する個体または菌株を表す。
【００６１】
「同型接合体」とは、相同染色体上の対応する座において同一の対立遺伝子を有する個体を指す。したがって、「同型接合型」とは、相同染色体上の１つまたは複数の対の座において同一の対立遺伝子を有する個体または菌株を表す。
【００６２】
「相同性」あるいは「同一性」とは、２つのペプチド間の配列類似性または２つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、比較のために整列され得る各配列における１つの位置を比較することによって確定され得る。比較した配列における１つの位置が同一の塩基またはアミノ酸に占められる場合、分子はその位置において相同である。配列間の相同性の程度は、配列により共有される適合する位置または相同な位置の数の関数（ｆｕｎｃｔｉｏｎ）である。「同一度」という用語は、２つのアミノ酸配列間、または２つのヌクレオチド配列間の配列の同一性を指す。同一性はそれぞれ、比較のために整列され得る各配列における１つの位置を比較することによって確定され得る。比較した配列における１つの等価の位置が同一の塩基またはアミノ酸に占められる場合、分子はその位置において同一である。等価の部位が同一または類似（例えば、立体的および／または電子的性質が類似）のアミノ酸残基に占められる場合、分子はその位置において相同（類似）と称され得る。相同性、類似性または同一性の割合としての式は、比較した配列により共有される位置における同一または類似のアミノ酸数の関数を指す。ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＥＮＴＲＥＺ等の様々なアライメントアルゴリズムおよび／またはプログラムを用いてもよい。ＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴは、ＧＣＧ配列解析パッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）の一部として入手可能であり、例えばデフォルト設定して用いられ得る。ＥＮＴＲＥＺは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．から入手可能である。一実施形態においては、２つの配列の同一度は、ＧＣＧプログラムによって重量格差１と確定され得るが、例えば、各アミノ酸格差は、２つの配列間の１つのアミノ酸またはヌクレオチドの誤対合であるかのように重み付けされる。
【００６３】
整列化の他の技法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２６６：Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  （１９９６），ｅｄ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ａ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈａｒｃｏｕｒｔ  Ｂｒａｃｅ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡに記載されている。好ましくは、配列中の格差を許容するアライメントプログラムが配列を整列するのに用いられる。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎは、配列の整列化における格差を許容するアルゴリズムの１つの型である。Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０：１７３−１８７  （１９９７）参照。また、ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈの整列化方法を用いたＧＡＰプログラムは、配列を整列するのに用いられ得る。代替的検索ストラテジーは、ＭＡＳＰＡＲコンピュータ上で実行されるＭＰＳＲＣＨソフトを用いる。ＭＰＳＲＣＨは、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いて超並列コンピュータで配列をスコアリングする。このアプローチは、遠く関連した対号をピックアップする能力を改良し、特に、小さな格差やヌクレオチド誤差に対して寛容である。核酸にコードされたアミノ酸配列は、タンパク質データベースおよびＤＮＡデータベースの双方を検索するのに用いられ得る。
【００６４】
個体の配列を有するデータベースは、上記Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅに記載されている。データベースとしては、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＥＭＢＬ、およびＤＮＡ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）が挙げられる。
【００６５】
「ホルモン」とは、ある細胞または組織によって産生され、体内の他の場所に位置する別の細胞または組織で起こる特異的な生体変化または生体活性を引き起こす、多数の生化学物質の１つを指す。
【００６６】
「宿主細胞」とは、規定の伝達ベクターで形質導入した細胞を指す。必要に応じて、細胞は、細胞培養由来の細胞等のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞、生物体由来の細胞等のｅｘ  ｖｉｖｏ細胞、および生物体中の細胞等のｉｎ  ｖｉｖｏ細胞から選択される。「組み換え型宿主細胞」とは、組み換え型ＤＮＡ技法を用いて構築されたベクターで形質転換またはトランスフェクトされた細胞を指す。「宿主細胞」と「組み換え型宿主細胞」は、本明細書において交換可能に用いられる用語である。このような用語は特定の被検体の細胞のみを指すのではなく、このような細胞の子孫や潜在的子孫も指すことが理解される。突然変異または環境的影響によって、引き続いて起こる生成においてある変更が起こることがあるため、実際にこのような子孫は親細胞と同一ではないこともあるが、それでも本明細書において用いられる用語の範囲内に含まれる。
【００６７】
「ハイブリダイゼーション」とは、核酸鎖が塩基対合によって相補鎖と結合する任意のプロセスを指す。
【００６８】
テンプレートである核酸の標的部位へのプローブの「特異的ハイブリダイゼーション」とは、主に標的へのプローブのハイブリダイゼーションを指し、その結果、ハイブリダイゼーションシグナルがはっきりと解明される。本明細書においてさらに記載されるように、特異的ハイブリダイゼーションをもたらすこのような条件は、相同領域の長さ、その領域のＧＣ含量、ハイブリッドの融解温度「Ｔｍ」によって変化する。このため、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション溶液や洗浄液の塩含量、酸性度および温度で変化する。
【００６９】
「相互作用」とは、例えばハイブリダイゼーションアッセイを用いて検出され得る分子間の検出可能な相互作用を含むことを意味する。相互作用はまた、分子間の「結合」相互作用も含む。例えば、相互作用は事実上、タンパク質−タンパク質、タンパク質−核酸、タンパク質−低分子または低分子−核酸であり得る。
【００７０】
ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸に関して「単離された」とは、高分子の天然供給源に存在する、他のＤＮＡまたはＲＮＡそれぞれと分離された分子を指す。単離されたとは、組み換え型ＤＮＡ技法によって産生された場合に細胞物質、ウイルス物質もしくは培養培地を実質的に含有しないか、または化学的に合成された場合に化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含有しない、核酸またはペプチドも指す。さらに、「単離された核酸」とは、断片として天然に存在せず、天然状態で見つけられない核酸断片を含むことを意味する。「単離された」とは、他の細胞タンパク質から単離されたポリペプチドも指し、精製されたポリペプチドおよび組み換え型ポリペプチド両方を含むことを意味する。
【００７１】
「ラベル」および「検出可能ラベル」とは検出可能な分子を指し、放射性同位体、蛍光体、化学発光部分、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、染料、金属イオン、リガンド（例えば、ビオチンやハプテン）などが挙げられるが、これらに限定されない。「発蛍光団」とは、検出可能な範囲の蛍光を示すことが可能な物質またはその一部を指す。本発明の下で用いられ得るラベルの特定の例としては、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、ウンベリフェロン、テキサスレッド、ルミノール、ＮＡＤＰＨ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼおよび西洋わさびペルオキシダーゼが挙げられる。
【００７２】
「分子標的」または「標的」とは、目的の別の赤血球に対して示差的発現を示すような本発明の方法を用いて同定された遺伝子の分子構造または遺伝子由来の分子構造を指す。このような標的の例としては、ポリペプチド、ホルモン、レセプター、ｄｓＤＮＡ断片、炭水化物または酵素が挙げられる。このような標的はまた、「標的遺伝子」、「標的ペプチド」、「標的タンパク質」などとも称される。
【００７３】
「変調」とは、応答のアップレギュレーション（すなわち、活性化または刺激）、ダウンレギュレーション（すなわち、阻害または抑制）、またはこの２つの組み合わせもしくはそれぞれを指す。
【００７４】
罹患細胞における「遺伝子発現の正常化」とは、罹患細胞における遺伝子発現を、対応する非罹患細胞と同じレベルで実質的に発現するように変更するよう、補う手段を指す。例えば、遺伝子が罹患細胞において過剰発現する場合、罹患細胞における発現の正常化とは、発現が対応する正常な細胞における発現と実質的に同じになるように罹患細胞を処置することを指す。「正常化」は、発現レベルを約５０％以内の発現の差異に、より好ましくは約２５％以内に、さらにより好ましくは１０％の発現の差異にすることが好ましい。必要な発現レベルの近似は特定の遺伝子に依存し、本明細書において記載されたように決定され得る。
【００７５】
「罹患した赤血球の遺伝子発現の正常化」とは、罹患した赤血球の実質的に全ての遺伝子の発現を正常化する手段を指す。
【００７６】
「核酸」とはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）や、適切なリボ核酸（ＲＮＡ）などのポリヌクレオチドを指す。またこの用語は当然のことながら、等価物として、ヌクレオチドアナログから生成されたＲＮＡまたはＤＮＡいずれかのアナログ、および記載されている実施形態に適用されるように、一本鎖（センスまたはアンチセンス）および二本鎖ポリヌクレオチドを含む。ＥＳＴ、染色体、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびｒＲＮＡは、核酸と称され得る分子の代表的な例である。
【００７７】
「遺伝子に対応する核酸」とは、遺伝子を検出するのに用いられ得る核酸（例えば、遺伝子と特異的にハイブリダイズすることが可能な核酸）を指す。
【００７８】
「ＲＮＡ由来の核酸サンプル」とは、ＲＮＡから合成された１つまたは複数の核酸分子（例えば、ＤＮＡやＲＮＡ）を指し、ＰＣＲ（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）を用いた方法から得られるＤＮＡを含む。
【００７９】
本明細書において用いられる場合、「パネル」とは、赤血球生成の間に示差的に発現する、遺伝子発現プロファイルを介して同定された一群の遺伝子および／またはそのコードタンパク質を指す。
【００８０】
「非経口投与」および「非経口投与された」とは、通常は注射による経腸および局所投与以外の投与態様を意味し、静脈内、筋内、動脈内、鞘内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、クモ膜下、髄腔内および胸骨内注射および注入が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８１】
本方法により処置される「患者」、「被検体」または「宿主」とは、ヒトまたはヒト以外の動物いずれかを意味し得る。
【００８２】
「ペプチド模倣物」とは、天然の親ポリペプチドの生物学的作用を模倣することが可能なペプチド様構造エレメントを含む化合物を指す。
【００８３】
「同一性パーセント」とは、２つのアミノ酸配列間の、または２つのヌクレオチド配列間の配列の同一性を指す。同一性はそれぞれ、比較のために整列され得る各配列の１つの位置を比較することによって確定され得る。比較した配列における１つの等価の位置が同一の塩基またはアミノ酸に占められる場合、分子はその位置において同一である。その等価の部位が同一または類似（例えば、立体的および／または電気的性質が類似）のアミノ酸残基に占められる場合、分子はその位置において相同（類似）と称され得る。相同性、類似性または同一性の割合としての式は、比較した配列により共有される位置における同一または類似のアミノ酸数の関数を指す。ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＥＮＴＲＥＺを含む様々なアライメントアルゴリズムおよび／またはプログラムを用いてもよい。ＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴは、ＧＣＧ配列解析パッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓ．）の一部として入手可能であり、例えばデフォルト設定して用いられ得る。ＥＮＴＲＥＺは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．から入手可能である。一実施形態においては、２つの配列の同一性パーセントは、１のギャップウエイトを用いて、ＧＣＧプログラムによって確定され得るが、例えば、各アミノ酸ギャップは、２つの配列間の１つのアミノ酸またはヌクレオチドとして重み付けされる。アラインメントの他の技法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．  ２６６：  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  （１９９６）、Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、ａ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈａｒｃｏｕｒｔ  Ｂｒａｃｅ  ＆  Ｃｏ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡに記載されている。好ましくは、配列中のギャップを許容するアライメントプログラムが配列を整列するのに用いられる。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎは、配列のアラインメントにおけるギャップを許容するアルゴリズムの１つの型である。Ｍｅｔｈ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ７０：  １７３−１８７  （１９９７）参照。また、ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈのアラインメント方法を用いたＧＡＰプログラムは、配列を整列するのに用いられ得る。代替的検索ストラテジーは、ＭＡＳＰＡＲコンピュータ上で実行されるＭＰＳＲＣＨソフトを用いる。ＭＰＳＲＣＨは、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いて超並列コンピュータで配列を記録する。このアプローチは、遠く関連した一致をピックアップする能力を改良し、特に、小さなギャップやヌクレオチド配列の誤差に対して寛容である。核酸をコードしたアミノ酸配列は、タンパク質データベースおよびＤＮＡデータベースの両方を検索するのに用いられ得る。個体の配列を有するデータベースは、上記Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ編に記載���れている。データベースとしては、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＥＭＢＬ、およびＤＮＡ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）が挙げられる。
【００８４】
二本鎖に関して「完全に一致した」とは、各鎖における全ヌクレオチドがもう一方の鎖におけるヌクレオチドとＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋの塩基対合を受けるように、二本鎖を構成するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが他方と二本鎖構造を形成することを意味する。この用語はまた、用いられ得るヌクレオシドアナログ（デオキシイノシン、２−アミノプリン塩基を有するヌクレオシドなど）の対形成も含む。標的ポリヌクレオチドとオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとの二本鎖におけるミスマッチは、二本鎖における一対のヌクレオチドがＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ結合を受けないことを意味する。三本鎖に関して、この用語は、三本鎖が、完全に一致した二本鎖と、各ヌクレオチドが完全に一致した二本鎖の塩基対とのＨｏｏｇｓｔｅｅｎまたは逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ対合を受ける第三の鎖から成ることを意味する。
【００８５】
「薬学的に許容可能な塩」とは、比較的無毒性で、化合物の無機および有機酸付加塩を指す。
【００８６】
「薬学的に許容可能なキャリア」とは、任意のサプリメントや組成物あるいはその構成成分を、ある臓器または体の部位から別の臓器または体の部位へ運搬または輸送することに関与する、薬学的に許容可能な材料、組成物またはビヒクル（液体または固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒または封入材料など）を指す。各キャリアは、サプリメントの他の成分と適合し、患者にとって有害でないという意味で「許容可能」でなければならない。薬学的に許容可能なキャリアとして作用し得る物質の幾つかの例としては、（１）ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖類；（２）コーンスターチおよびじゃがいもデンプンなどのデンプン類；（３）カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよびセルロースアセテートなどのセルロースおよびその誘導体；（４）トラガカント粉末；（５）麦芽、（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）カカオバターおよび坐剤ワックスなどの賦形剤；（９）ピーナッツ油、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油および大豆油などの油類；（１０）プロピレングリコールなどのグリコール類；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなどのポリオール類；（１２）オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル類；（１３）寒天類；（１４）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤類；（１５）アルギン酸；（１６）発熱物質非含有水；（１７）等張食塩水；（１８）リンガー溶液；（１９）エチルアルコール；（２０）リン酸緩衝溶液；および（２１）医薬製剤に用いられる他の無毒性の適合性物質が挙げられる。
【００８７】
細胞の生体状態の「プロファイル」とは、細胞の生体状態の薬物治療および他の摂動に応答して変化することが知られる細胞の様々な構成要素のレベルを指す。細胞の構成要素としては、ＲＮＡのレベル、タンパク質存在量のレベル、またはタンパク質活性レベルが挙げられる。
【００８８】
２つのプロファイルの遺伝子の発現レベルが十分に類似し、類似性が共通の特徴（例えば、同一の型の細胞であること）を示す場合、１つの細胞における発現プロファイルは別の細胞における発現プロファイルと「類似」である。したがって、第一の細胞内で発現した遺伝子の少なくとも７５％が第一の細胞と比較して２倍以内であるレベルで第二の細胞内に発現する場合、第一の細胞と第二の細胞の発現プロファイルは類似である。
【００８９】
「多血症」とは、被検体の赤血球産生の増加を指す。
【００９０】
「増殖すること」および「増殖」とは、有糸分裂を受ける細胞を指す。「予防的」または「治療的」処置は、１つまたは複数の対象組成物の宿主への投与を指す。望ましくない状態（例えば、宿主動物の疾患または他の望ましくない状態）の臨床的徴候の前に投与される場合、この処置は予防的である（すなわち、望ましくない状態が発生しないよう宿主を保護する）。一方、望ましくない状態の臨床的徴候の後に投与される場合、この処置は治療的である（すなわち、望ましくない状態またはそれによる副作用の存在を減少、改良または維持することを目的とする）。
【００９１】
「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、例えばコード配列によってコードされ得るような遺伝子産物を指す場合、本明細書においては互換的に用いられる。「遺伝子産物」とは、遺伝子の転写の結果として産生される分子を意味する。遺伝子産物は、遺伝子から転写されるＲＮＡ分子のほかに、このような転写物から翻訳されたタンパク質を含む。
【００９２】
「組み換え型タンパク質」、「異種タンパク質」および「外因性タンパク質」は一般に、ポリペプチドをコードするＤＮＡが適切な発現ベクターに挿入され、次にこのベクターが異種タンパク質を産生するために宿主細胞を形質転換するのに用いられる、組み換え型ＤＮＡ技法によって産生されるポリペプチドを指すのに互換的に意味で用いられる。すなわち、ポリペプチドは異種核酸から発現される。
【００９３】
「低分子」とは組成物を指し、これは約１０００ｋＤａ未満の分子量である。低分子は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、炭水化物、脂質または他の有機（炭素含有）分子または無機分子であり得る。当業者には明らかなように、本発明の説明に基づき、化学的および／または生物学的混合物（多くの場合、真菌抽出物、細菌抽出物または藻類抽出物）の化学的および／または生物学的な広範な（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ）ライブラリーのライブラリーは、生物活性を調節する化合物を同定する本発明のアッセイのいずれかでスクリーニングされ得る。
【００９４】
「幹細胞」または「多能性幹細胞」とは当該技術分野で認識されており、無期限の増殖および特殊化細胞への分化の両方が可能な細胞を指し、これは新規細胞の連続的供給源として作用する。
【００９５】
「代理物（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）」とは、生体分子（例えば、核酸、ペプチド、ホルモンなど）であって、この存在または濃度は検出され、疾患状態などの既知の状態と相関し得るものを指す。
【００９６】
「全身投与」、「全身投与された」、「末梢投与」および「末梢投与された」とは、対象のサプリメント、組成物、治療薬または他の物質の中枢神経系への直接投与以外の投与を指し、これにより患者の器官系（ｓｙｓｔｅｍ）に入り、代謝および例えば皮下投与のような他の類似プロセスに付される。
【００９７】
「治療剤」または「治療薬」は、宿主への所望の生物学的効果を有することが可能な薬剤を指す。化学療法剤および遺伝毒性薬は、一般に生体起源ではなく化学物質起源であること、または特定の作用メカニズムにより治療効果を引き起こすことがそれぞれ知られる治療剤の例である。生体起源の治療剤の例としては、成長因子、ホルモンおよびサイトカインが挙げられる。様々な治療剤が当該技術分野において知られており、その効果によって同定され得る。特定の治療剤は、赤血球の増殖および分化を調節することが可能である。例としては、化学療法のヌクレオチド、薬剤、ホルモン、非特異的（非抗体）タンパク質、オリゴヌクレオチド（例えば、標的核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ配列）に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド）、ペプチドおよびペプチド模倣物が挙げられる。
【００９８】
「治療効果」とは、薬理活性物質によって引き起こされる、動物、特に哺乳動物、さらに特にヒトにおける局所的または全身的影響を指す。したがって、この用語は疾患の診断、治癒、緩和、治療または予防において、または動物またはヒトにおける望ましい肉体的または精神的な発達あるいは状態の強化において使用するための任意の物質を意味する。「治療有効量」という語句は、任意の処置に適用可能な妥当な利得／危険の比で、ある望ましい局所的または全身的効果をもたらすこのような物質の量を意味する。ある実施形態においては、治療有効量の化合物は、その治療指数、溶解度などによって決まると考えられる。例えば、本発明の方法により発見されたある化合物は、このような治療に適用可能な妥当な利得／危険の比で、望ましい効果をもたらすのに十分な量で投与され得る。
【００９９】
被検体の疾患を「処置すること」または疾患を有する被検体を「処置すること」とは、被検体を医薬治療（例えば、薬物の投与）に付し、その結果少なくとも１つの疾患の症状が軽減または予防されることを指す。
【０１００】
ポリヌクレオチド配列の文脈において用いられる場合、「改変体」は遺伝子Ｘのポリヌクレオチド配列、またはそのコード配列に関連するポリヌクレオチド配列を含み得る。この定義は、例えば「対立遺伝子」改変体、「スプライシング」改変体、「種」改変体または「多型」改変体も含み得る。スプライシング改変体は、参照分子に対して有意な同一性を有し得るが、一般に、ｍＲＮＡのプロセッシングの間のエキソンの代替的スプライシングが原因で、より多数またはより少数のポリヌクレオチドを有すると考えられる。対応するポリペプチドは、付加的な機能ドメインまたはドメインの欠如を有し得る。種改変体は、ある種から別の種へ変化するポリヌクレオチド配列である。得られるポリペプチドは一般に、互いに比較して有意なアミノ酸同一性を有する。多型改変体は、所定の種の個体間の特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列における改変体である。また、多型改変体は、ポリヌクレオチド配列が１塩基だけ変化する「一塩基多型」（ＳＮＰ）を含み得る。ＳＮＰの存在は、例えば、特定の集団、疾患状態または疾患状態の傾向を示し得る。
【０１０１】
ポリペプチドＸの「改変体」とは、１つまたは複数のアミノ酸残基において変更されたペプチドＸのアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。改変体は「保存的」変化を有することがあり、この場合、置換されたアミノ酸は類似の構造的性質または化学的性質を有する（例えば、ロイシンのイソロイシンへの置換）。ほとんどないことだが、改変体は「非保存的」変化を有することがある（例えば、グリシンのトリプトファンへの置換）。類似の少数の改変体は、アミノ酸の欠失または挿入、あるいはその両方も含み得る。生体活性または免疫活性を失うことなくアミノ酸残基が置換、挿入または欠失し得ることを確定する際の手引きは、当該技術分野で既知のコンピュータプログラム（例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ））を用いて見出され得る。
【０１０２】
「ベクター」とは、ベクターに結合した別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。好ましいベクターの１つの型は、エピソーム（すなわち染色体外複製が可能な核酸）である。好ましいベクターは、ベクターが結合する核酸の自発的複製および／または発現が可能なベクターである。ベクターに動作可能に結合された遺伝子の発現を導くことが可能なそのベクターは、本明細書において「発現ベクター」と称される。一般に、組み換え型ＤＮＡ技法において実用的な発現ベクターは、ベクター形態では染色体に結合しない、一般に円形の二本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」の形態であることが多い。本明細書においては、プラスミドが最も広く用いられる形態のベクターであるため、「プラスミド」および「ベクター」は互換的に用いられる。しかしながら、当業者には理解されるように、本発明は、等価な機能を果たし、かつ本明細書に続いて当該技術分野において知られるようになるこのような他の形態の発現ベクターを含むことが意図される。
【０１０３】
（３．赤血球生成経路に沿った分子標的の新規パネル）
赤血球生成の間に示差的発現を示す遺伝子のパネルは、以下の生体プロセス：転写、スプライシング、複製、翻訳、タンパク質分解、接着、シグナル伝達、細胞周期、アポトーシスおよびリボゾームのプロセスに関連する遺伝子を含む。この遺伝子は、以下の遺伝子ファミリー：キナーゼ、ホスファターゼ、酵素、Ｇタンパク質、ＡＴＰアーゼ、レセプター、構造タンパク質、表面マーカーおよび熱ショックタンパク質に属する。一実施形態においては、遺伝子のパネルは、表Ｉ（図３）中の赤血球生成の間に示差的に調節される少なくとも１つの遺伝子から成り得る。ある実施形態においては、遺伝子のパネルは、赤血球生成の間にアップレギュレートされる少なくとも１つの遺伝子から成り、この幾つかの例は表ＩＩ（図４）に列挙されている。他の実施形態においては、遺伝子のパネルは、赤血球生成の間にダウンレギュレートされる少なくとも１つの遺伝子から成り、この幾つかの例は表ＩＩＩ（図５）に列挙されている。本発明の新規パネルは、パネル遺伝子の遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡやタンパク質）からも成り得る。パネルは、下記の治療方法および診断方法における使用のために企図された分子標的の組を含む。図３〜図５に示された表は、以下では単に「表Ｉ」、「表ＩＩ」または「表ＩＩＩ」と称す。
【０１０４】
（４．赤血球生成を調節するための治療薬）
（４．１．治療剤スクリーニング）
本発明はさらに、赤血球生成の疾患および／または障害の処置における使用のための治療剤候補をスクリーニングする方法における、新規分子標的の使用に関する。本発明の一実施形態においては、この障害は貧血である。本発明の別の実施形態においては、この障害は多血症である。幾つかの実施形態においては、治療剤（すなわち「治療薬」）候補は、標的タンパク質を結合する能力に関して評価される。候補治療薬は、以下の化合物類：タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、低分子、サイトカインまたはホルモンから選択されてもよい。他の実施形態においては、候補治療薬は、標的遺伝子を結合する能力に関して評価される。候補治療薬は、以下の化合物類：アンチセンス核酸、低分子、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド模倣物または核酸アナログから選択されてもよい。幾つかの実施形態においては、候補治療薬は、化合物のライブラリー中にあり得る。これらのライブラリーは、コンビナトリアル合成方法を用いて作製され得る。本発明のある実施形態においては、上記候補治療薬が標的タンパク質を結合する能力は、インビトロアッセイによって評価され得る。候補治療薬の標的が遺伝子である本発明の実施形態においては、候補治療薬が遺伝子を結合する能力は、インビトロアッセイによって評価され得る。いずれの実施形態においても、結合アッセイはインビボでもあり得る。
【０１０５】
さらに本発明は、被検体の赤血球を治療剤候補に接触させることによって、治療剤候補が標的遺伝子の発現を変調する能力に関して治療剤候補を評価する方法を提供する。ある
実施形態においては、候補治療薬は、赤血球生成の促進に関与する遺伝子または遺伝子群の発現レベルを正常化する能力に関して評価される。この実施形態においては、候補治療薬は、赤血球生成を促進するように遺伝子発現を正常化することができれば、貧血のための候補治療薬と見なされ得る。同様に、他の実施形態においては、候補治療薬は、赤血球生成を阻害するように遺伝子発現を正常化することができれば、多血症のための候補治療薬として見なされ得る。候補治療薬は、以下の化合物類：アンチセンス核酸、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、この遺伝子によってコードされるポリペプチドのドミナントネガティブ変異体、低分子、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド模倣物および核酸アナログから選択されてもよい。
【０１０６】
あるいは、治療剤候補は、被検体の赤血球を上記治療剤候補と接触させることによって、タンパク質の活性を阻害する能力に関して評価され得る。ある実施形態においては、候補治療薬は、正常には赤血球生成を促進するタンパク質の活性を阻害する能力に関して評価され得る。この実施形態においては、タンパク質の活性を阻害する能力を示す治療剤候補は、多血症を処置するための候補治療薬として見なされ得る。他の実施形態においては、候補治療薬は、正常には、阻害される場合に赤血球生成を促進するタンパク質の活性を阻害する能力に関して評価され得る。この実施形態においては、タンパク質の活性を阻害する能力を示す治療剤候補は、貧血を処置するための候補治療薬として見なされ得る。
【０１０７】
さらに、候補治療薬は、本発明のパネルからの遺伝子によりコードされたタンパク質のターンオーバーレベルを正常化する能力に関して評価され得る。別の実施形態においては、候補治療薬は、本発明のパネルからの遺伝子によりコードされたタンパク質の翻訳レベルを正常化する能力に関して評価され得る。さらに別の実施形態においては、候補治療薬は、本発明のパネルからの遺伝子によりコードされたｍＲＮＡのターンオーバーレベルを正常化する能力に関して評価され得る。
【０１０８】
（４．２．治療剤スクリーニングアッセイ）
上記の方法における使用に適切なアッセイおよびこのアッセイを開発する方法は当業者に公知であり、本発明の方法に適切な使用のために企図される。上記治療薬の、本発明のパネル上の標的分子を結合する能力は、当業者に知られる様々な適切なアッセイを用いて確定され得る。本発明のある実施形態においては、候補治療薬が標的タンパク質または標的遺伝子を結合する能力は、インビトロアッセイによって評価され得る。いずれの実施形態においても、結合アッセイはインビボアッセイでもあり得る。アッセイは、遺伝子の発現または活性を変調する分子を同定するために行われ得る。あるいは、アッセイは、遺伝子によりコードされたタンパク質の活性を変調する分子を同定するために行われ得る。
【０１０９】
当業者は、あるスクリーニングアッセイにおいては１つの遺伝子の発現レベルを評価することが十分であり、他のスクリーニングアッセイにおいては２つ以上の発現レベルの評価が好ましく、これに対してさらに他のスクリーニングアッセイにおいては赤血球生成に関与する実質的に全ての遺伝子の発現が評価されるのが好ましいと認識するであろう。同様に、幾つかのスクリーニングアッセイにおいては、１つのタンパク質の活性を評価することが十分であり、これに対して他のスクリーニングアッセイにおいては、複数のタンパク質の活性を評価してもよい。本発明における使用のために企図されたアッセイの例としては、競合結合アッセイ、直接結合アッセイ、ツーハイブリッドアッセイ、細胞増殖アッセイ、キナーゼアッセイ、ホスファターゼアッセイ、核ホルモン輸送体アッセイ、蛍光活性細胞スクリーニング（ＦＡＣＳ）アッセイ、コロニー形成／プラークアッセイおよびポリメラーゼ連鎖反応アッセイが挙げられるが、これらに限定されない。このようなアッセイは当業者に周知であり、ルーチン的実験だけで本発明の方法に適応し得る。
【０１１０】
上記スクリーニング方法は全て、様々なアッセイ形式を用いて達成され得る。本開示を考慮して、本明細書において明確に記載されていないことは、それにもかかわらず当業者に知られ、理解されるであろう。このアッセイは、目的の標的遺伝子発現の、または目的の標的のタンパク質：タンパク質相互作用またはタンパク質−基質相互作用の、または正常細胞もしくは異常細胞の生理機能、増殖および／または分化ならびにこれらに関連する障害の病原における標的遺伝子産物の役割の、例えば、アゴニストまたはアンタゴニストのいずれかである薬物を同定し得る。タンパク質複合体またはタンパク質−核酸複合体の形成、酵素活性、さらに特異的シグナル伝達経路のような条件を近似するアッセイ形式は、多くの異なる形態で作製されてもよく、無細胞系（例えば、精製タンパク質または細胞溶解物）に基づいたアッセイ、ならびにインタクトな細胞を利用する細胞系アッセイが挙げられるが、これに限定されない。
【０１１１】
当業者は、タンパク質−タンパク質相互作用またはタンパク質−核酸相互作用の結合あるいはこのような複合体または各タンパク質もしくは核酸の基質への引き続く結合を破壊することによって、所定の相互作用から生じるシグナル伝達または他の効果を阻害し得る薬剤を検出するのに単純な結合アッセイが用いられ得ることを、本発明の説明に基づいて理解するであろう。例えば、１つのポリペプチドが別のポリペプチドと結合すると、第二のポリペプチド（本明細書においては「結合パートナー」または「結合パートナー」と称される）へのその結合を変調することにより、第一のポリペプチドの活性を変調する薬物が開発され得る。無細胞アッセイは、ポリペプチドまたは結合パートナーと相互作用することによりポリペプチドまたは結合パートナーの活性を変化させることが可能な化合物を同定するのに用いられ得る。このような化合物は、例えばポリペプチドまたは結合パートナーの構造を変化させることにより、その活性に影響を与え得る。無細胞アッセイは、ポリペプチドと結合パートナーの間の相互作用を変調させる化合物を同定するのにも用いられ得る。好ましい実施形態においては、このような化合物を同定するための無細胞アッセイは、本質的に、結合パートナーの存在下または非存在下でポリペプチドおよび試験化合物または試験化合物のライブラリーを含む反応混合物にある。試験化合物は、例えば、結合パートナーとの誘導体（例えば、生体非活性ペプチドまたは低分子）であり得る。相互作用阻害因子として作用する能力に関して試験される薬剤は、例えば、細菌、酵母または他の生物体によって産生されたもの（例えば、天然産物）、化学的に産生されたもの（例えば、ペプチド模倣物を含む低分子）、または組み換えにより産生されたものであり得る。好ましい実施形態においては、治療剤候補は、例えばペプチドまたはオリゴヌクレオチド以外の、約１，０００ダルトン未満の分子量を有する有機低分子である。
【０１１２】
化合物および天然抽出物のライブラリーを試験する多くの薬物スクリーニングプログラムにおいては、所定の期間に調べる化合物の数を最大にするために、高スループットアッセイが望ましい。無細胞系（例えば、精製もしくは半精製されたタンパク質または溶解物を用いて得られ得る）で行われる本発明のアッセイは、試験化合物により媒介される分子標的における変化の迅速な発生および比較的容易な検出を可能にするためにそれらが作製され得るという点で、「一次」スクリーニングとして好ましい場合が多い。さらに、試験化合物の細胞毒性および／またはバイオアベイラビリティの影響は、インビトロ系では一般に無視されてもよく、アッセイはその代わりに、他のタンパク質との結合アフィニティにおける変化または分子標的の酵素特性の変更において顕著であり得るような、分子標的に対する薬剤の影響に主に注目する。したがって、潜在的な変更因子（例えば、目的のタンパク質−基質、タンパク質−タンパク質相互作用または核酸：タンパク質相互作用の活性化因子または阻害因子）は、細胞溶解物における目的の機能相互作用の構成（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）によって作製された無細胞アッセイにおいて検出され得る。代替的形式においては、このアッセイは、下記のような溶解物ベースのアッセイを超える多数の利得を提供する、再構成タンパク質混合物として得られてもよい。
【０１１３】
一局面においては、本発明は、タンパク質−タンパク質相互作用、核酸−タンパク質相互作用またはタンパク質−基質相互作用を変調する薬剤をスクリーニングするのに用いられ得るアッセイを提供する。例えば、本発明の薬物スクリーニングアッセイは、タンパク質−タンパク質相互作用の結合部分の結合を破壊する薬剤を検出するために設計され得る。他の実施形態においては、対象のアッセイは、タンパク質またはタンパク質−タンパク質相互作用複合体の酵素活性の阻害因子を同定する。好ましい実施形態においては、化合物は、タンパク質−タンパク質相互作用の１つのメンバーまたはタンパク質の１つの化学基を化学的に変える、そのメンバーの特異的阻害因子である（例えば、相同なタンパク質と比較して１０倍、１００倍、より好ましくは１０００倍異なる阻害定数を有する）、メカニズムに基づく（ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｂａｓｅｄ）阻害因子である。
【０１１４】
本発明の一実施形態においては、所定のタンパク質−基質相互作用、タンパク質−タンパク質相互作用または核酸−タンパク質相互作用の構成成分の結合を妨げる能力に基づいて、阻害因子を検出する薬剤スクリーニングアッセイを作製してもよい。例示的な結合アッセイにおいては、タンパク質−タンパク質相互作用の構成成分ポリペプチドから作製された混合物と、目的の化合物を接触させる。所定のタンパク質−タンパク質相互作用から予想される活性を検出および定量することにより、２つのポリペプチド間の複合体形成を阻害する（または増強する）際の化合物の有効性を確定するための手段が提供される。化合物の有効性は、様々な濃度の試験化合物を用いて得られたデータから用量応答曲線を作製することによって評価され得る。さらに、比較用のベースラインを提供するため、対照アッセイも行われ得る。対照アッセイにおいては、複合体の形成を試験化合物の非存在下で定量する。
【０１１５】
構成成分ポリペプチド、ポリペプチドと遺伝子との間の、または構成成分ポリペプチドと基質との間の複合体形成は、様々な技法によって検出され得るが、事実上これらの技法の多くは上に記載されている。例えば、複合体の形成の変調は、例えば、検出可能に標識（例えば、放射性同位体標識、蛍光標識または酵素標識）されたタンパク質を用いて、イムノアッセイによって、またはクロマトグラフィー検出によって定量され得る。
【０１１６】
したがって、本発明の典型的なスクリーニングアッセイの１つは、ポリペプチドまたはその機能的断片または結合パートナーを、試験化合物または試験化合物のライブラリーと接触させるステップと、複合体の形成を検出するステップとを含む。検出目的のために、分子は特異的マーカーで標識されてもよく、試験化合物または試験化合物のライブラリーは異なるマーカーで標識されてもよい。その後、ポリペプチドもしくはその断片または結合パートナーとの試験化合物の相互作用は、インキュベートステップおよび洗浄ステップ後に２つの標識のレベルを確定することによって検出され得る。洗浄ステップ後の２つの標識の存在は、相互作用を示す。
【０１１７】
分子間の相互作用はまた、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、すなわち光学現象を検出するリアルタイムＢＩＡ（Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ）によって同定され得る。検出は、生体特異的界面（ｂｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）での高分子の質量濃度の変化に依存し、相互作用物質の標識を全く必要としない。一実施形態においては、試験化合物のライブラリーは、例えば、マイクロフローセルの一方の壁を形成するセンサー表面に固定化されてもよい。その後、ポリペプチド、その機能的断片、ポリペプチドアナログまたは結合パートナーを含む溶液が、センサー表面に連続的に流される。シグナルの記録において示される共鳴角の変化は、相互作用が起こったことを示す。この技法は、例えばＰｈａｒｍａｃｉａによるＢＩＡｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋにさらに記載されている。
【０１１８】
本発明の別の典型的なスクリーニングアッセイは、以下のステップを含む：（ａ）（ｉ）ポリペプチド、（ｉｉ）結合パートナー、および（ｉｉｉ）試験化合物を含む反応混合物を形成するステップ；および（ｂ）ポリペプチドと結合パートナーとの相互作用を検出するステップ。ポリペプチドおよび結合パートナーは、本明細書において記載されたように組み換えにより産生され得るか、供給源（例えば、血漿）から精製され得るか、または化学的に合成され得る。試験化合物の非存在下における相互作用に対する、試験化合物の存在下におけるポリペプチドと結合パートナーとの相互作用の統計学的に有意な変化（増強または阻害）は、試験化合物に対するポリペプチドの生体活性の潜在的アゴニスト（類似構造物（ｍｉｍｅｔｉｃ）または増強剤）またはアンタゴニスト（阻害因子）を示す。このアッセイの化合物を同時に接触させてもよい。あるいは、初めにポリペプチドを適切な時間にわたって試験化合物に接触させ、次いで結合パートナーを反応混合物へ添加してもよい。化合物の有効性は、様々な濃度の試験化合物を用いて得られたデータから用量応答曲線を作製することにより評価され得る。さらに、比較用のベースラインを提供するため、対照アッセイも行われ得る。対照アッセイにおいては、単離および精製されたポリペプチドまたは結合パートナーを、結合パートナーまたはポリペプチドを含む組成物へ添加し、複合体の形成を試験化合物の非存在下で定量する。
【０１１９】
ポリペプチドと結合パートナーとの間の複合体形成は、様々な技法によって検出され得る。複合体の形成の変調は、例えば、検出可能に標識されたタンパク質（例えば、放射性標識、蛍光標識または酵素標識されたポリペプチドまたは結合パートナー）を用いて、イムノアッセイによって、またはクロマトグラフィー検出によって定量され得る。
【０１２０】
代表的には、非複合形態の一方または双方のタンパク質からの複合体の分離を促進するため、ならびに、アッセイの自動化を図るために、ポリペプチドまたはその結合パートナーのいずれかを固相化することが望ましい。結合パートナーへのポリペプチドの結合は、反応物質を収容するのに適した任意の容器中で達成され得る。例としては、マイクロタイタープレート、試験チューブおよびマイクロ遠心チューブが挙げられる。一実施形態においては、タンパク質のマトリクスへの結合を可能にするドメインを付加する融合タンパク質が提供され得る。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ポリペプチド（ＧＳＴ／ポリペプチド）融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはグルタチオン被覆（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ）マイクトタイタープレート上に吸着させた後、これを結合パートナー（例えば、３５Ｓ−標識結合パートナー）および試験化合物と合わせ、複合体形成を導く条件（例えば、塩やｐＨに関して生理条件）下で、少しだけよりストリンジェントな条件によって混合物をインキュベートすることが望ましくあり得る。インキュベート後、ビーズを洗浄して非結合標識を全て除去し、固定化されたマトリクスと放射性同位体標識とを直接（例えば、シンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌａｎｔ）中に入れたビーズ）、またはその後複合体が引き続いて解離した後の上清中で決定する。あるいは、複合体をマトリクスから解離させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、そしてビーズ画分において見出されるポリペプチドまたは結合パートナーのレベルを、例えば添付の実施例に記載した標準的な電気泳動技法を用いてゲルから定量してもよい。
【０１２１】
タンパク質をマトリクスへ固相化するための他の技法も、対象のアッセイにおける使用に利用可能である。例えば、ポリペプチドまたはその同源の結合パートナーのいずれかは、ビオチンとストレプトアビジンとの結合体化を利用して固相化され得る。例えば、ビオチン化ポリペプチド分子は、当該技術分野で周知の技法（例えば、ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いてビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から調製され得、ストレプトアビジン被覆９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルに固定化され得る。あるいは、ポリペプチドと反応性の抗体をプレートのウェルに被覆し、ポリペプチドを抗体結合体によってウェル中で捕捉してもよい。上記のように、結合パートナーおよび試験化合物の調製物を、プレートのポリペプチドが存在するウェル中でインキュベートし、ウェル中で捕捉された複合体量を定量してもよい。このような複合体を検出するための例示的な方法としては、ＧＳＴ固定化複合体に関して上記されたもの、ならびに結合パートナーと反応性の抗体、またはポリペプチドと反応性であり結合パートナーと競合する抗体を用いた複合体の免疫検出の他に、結合パートナーに関連する酵素活性（内因性活性または外因性活性のいずれか）を検出することによる酵素結合アッセイが挙げられる。後者の例においては、酵素は化学的に結合体化されても、あるいは結合パートナーとの融合タンパク質として提供されてもよい。例えば、結合パートナーは化学的に架橋されても、あるいは西洋わさびペルオキシダーゼと遺伝子工学によって融合されてもよく、複合体中で捕捉されたポリペプチド量は、酵素の発色基質（例えば、３，３’−ジアミノ−ベンザジンテトラヒドロクロリドまたは４−クロロ−１−ナフトール）によって評価され得る。同様に、ポリペプチドおよびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを含む融合タンパク質が提供され、１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼンを用いてＧＳＴ活性を検出することによって複合体形成を定量してもよい（Ｈａｂｉｇら（１９７４）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２４９：７１３０）。
【０１２２】
複合体中で捕捉されたタンパク質の１つを定量するための免疫検出によるプロセスのために、このタンパク質に対する抗体（抗ポリペプチド抗体等）を用いてもよい。あるいは、複合体中で検出されるタンパク質は、ポリペプチド配列の他に、抗体が（例えば市販元から）容易に入手可能な第二のポリペプチドを含む融合タンパク質の形態で「エピトープタグを付加されて」いてもよい。例えば、ＧＳＴ部分に対する抗体を用いて結合を定量するために上記のＧＳＴ融合タンパク質をまた、用いてもよい。他の有用なエピトープタグとしては、ｃ−ｍｙｃからの１０残基配列を含むｍｙｃエピトープ（例えば、Ｅｌｌｉｓｏｎら（１９９１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６６：２１１５０−２１１５７参照）、ならびにｐＦＬＡＧシステム（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）またはｐＥＺＺプロテインＡシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ＮＪ）が挙げられる。
【０１２３】
本発明のアッセイの好ましいインビトロでの実施形態においては、タンパク質、またはタンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−基質相互作用またはタンパク質−核酸相互作用に関与するタンパク質の組は、少なくとも半精製されたタンパク質の再構成タンパク質混合物を含む。半精製により、再構成混合物において利用されるタンパク質が、他の細胞タンパク質またはウィルスタンパク質から予め分離されていることを意味する。例えば、細胞溶解物と対照的に、タンパク質−基質相互作用、タンパク質−タンパク質相互作用または核酸−タンパク質相互作用に関与するタンパク質は、混合物中の他の全タンパク質に対して少なくとも純度５０％までで混合物中に存在し、より好ましくは純度９０〜９５％で存在する。対象の方法のある実施形態においては、再構成タンパク質混合物は、所定のタンパク質−基質相互作用、タンパク質−タンパク質相互作用または核酸−タンパク質相互作用から生じる活性を測定する能力を妨げるか、またはさもなければ変える他のタンパク質（細胞起源またはウィルス起源のタンパク質等）を、再構成混合物が実質的に含まないように、高度に精製されたタンパク質を混合することによって得られる。
【０１２４】
一実施形態においては、再構成タンパク質混合物を使用することにより、タンパク質−基質、タンパク質−タンパク質または核酸−タンパク質相互作用条件をより注意深く制御することが可能である。さらにこのシステムは、タンパク質−タンパク質相互作用の特定の中間状態の阻害因子の開発を助けるために得られ得る。例えば、再構成タンパク質アッセイを薬剤候補の存在下および非存在下双方で行うことにより、タンパク質−基質、タンパク質−タンパク質または核酸−タンパク質相互作用の阻害因子を検出することが可能となり得る。
【０１２５】
所定のタンパク質−基質、タンパク質−タンパク質または核酸−タンパク質相互作用に起因する生体活性を、阻害因子候補の存在下および非存在下でアッセイすることは、反応物質を収容するのに適した任意の容器中で達成され得る。例としては、マイクロタイタープレート、試験管およびマイクロ遠心チューブが挙げられる。
【０１２６】
通常、非複合形態のタンパク質の１つからの複合体の分離を促進するための他に、アッセイの自動化を図るために、ポリペプチドの１つを固相化することが望ましいと考えられる。例示的な実施形態においては、タンパク質の不溶性マトリクスへの結合を可能にするドメインを付加した融合タンパク質が提供され得る。例えば、タンパク質−タンパク質相互作用構成成分融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着された後、これを潜在相互作用タンパク質（例えば、３５Ｓ−標識ポリペプチド）および試験化合物と合わせられ、複合体形成を導く条件下でインキュベートされる。インキュベート後、ビーズを洗浄して非結合相互作用タンパク質を全て除去し、マトリクスビーズ結合放射性同位体標識を直接（例えば、シンチラント中に入れたビーズ）、または、例えばマイクロタイタープレートを用いる場合、複合体が解離した後の上清中で測定する。あるいは、非結合タンパク質を洗浄して除去した後、複合体をマトリクスから解離させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、マトリクス結合画分において見られる相互作用ポリペプチドのレベルを、標準的な電気泳動技法を用いてゲルから定量してもよい。
【０１２７】
さらに別の実施形態においては、タンパク質−タンパク質相互作用構成成分または潜在相互作用ポリペプチドを用いて２ハイブリッドまたは相互作用捕捉アッセイ（米国特許第５，２８３，３１７号、Ｚｅｒｖｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：９２０−９２４；およびＩｗａｂｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８：１６９３−１６９６も参照）を、その後に相互作用構成成分の結合を互いに妨害する薬剤を検出するために作製してもよい。
【０１２８】
特に、この方法はハイブリッドタンパク質を発現するキメラ遺伝子を利用する。例えば、転写活性化因子のＤＮＡ結合ドメインに対するコード配列を含む第一のハイブリッド遺伝子は、潜在相互作用タンパク質に結合するのに十分な長さの「おとり（ｂａｉｔ）」タンパク質（例えば、タンパク質−タンパク質相互作用構成成分ポリペプチド）に対するコード配列と、インフレームで融合され得る。第二のハイブリッドタンパク質は、「魚（ｆｉｓｈ）」タンパク質（例えば、おとり融合タンパク質のタンパク質−タンパク質相互作用構成成分ポリペプチド部分と相互作用するのに十分な長さの潜在相互作用タンパク質）をコードする遺伝子とインフレームで融合した転写活性化因子ドメインをコードする。おとりタンパク質および魚タンパク質が相互作用、例えば、タンパク質−タンパク質相互作用構成成分複合体を形成できるならば、転写活性化因子の２つのドメインが近接する。この近接により、転写活性化因子に反応する転写調節部位に作動可能に結合するレポーター遺伝子の転写が引き起こされ、レポーター遺伝子の発現が検出されておとりタンパク質および魚タンパク質の相互作用に関して記録するのに用いられ得る。
【０１２９】
本発明によれば、この方法は宿主細胞、好ましくは酵母細胞（例えば、Ｋｌｕｙｖｅｒｅｉ  ｌａｃｔｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓおよびＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）であるが、最も好ましくはＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＳ．  ｐｏｍｂｅを提供することを含む。宿主細胞はおとりタンパク質に用いられる転写活性化因子のＤＮＡ結合ドメインに対する結合部位を有するレポーター遺伝子を含むため、遺伝子が転写によって活性化されると、レポーター遺伝子は検出可能な遺伝子産物を発現する。第一のキメラ遺伝子は、宿主細胞の染色体中に存在してもよいし、発現ベクターの一部として存在してもよい。
【０１３０】
宿主細胞は、宿主細胞において発現することが可能な第一のキメラ遺伝子も含む。この遺伝子はキメラタンパク質をコードし、これは、（ｉ）宿主細胞中のレポーター遺伝子上の反応性エレメントを認識するＤＮＡ結合ドメイン、および（ｉｉ）おとりタンパク質（タンパク質−タンパク質相互作用構成成分ポリペプチド配列等）を含む。
【０１３１】
宿主細胞中で発現することが可能で、「フィッシュ（ｆｉｓｈ）」融合タンパク質をコードする第二のキメラタンパク質も提供される。一実施形態においては、第一および第二のキメラ遺伝子は、プラスミドの形態で宿主細胞に導入される。しかしながら、第一のキメラ遺伝子は宿主細胞の染色体中に存在し、第二のキメラ遺伝子はプラスミドの一部として宿主細胞に導入されることが好ましい。
【０１３２】
好ましくは、第一のハイブリッドタンパク質のＤＮＡ結合ドメインおよび第二のハイブリッドタンパク質の転写活性化ドメインは、分離可能なＤＮＡ結合および転写活性化ドメインを有する転写活性化因子から得られる。例えば、これらの分離可能なＤＮＡ結合および転写活性化ドメインは、酵母ＧＡＬ４タンパク質において見られることが公知であり、酵母ＧＣＮ４およびＡＤＲ１タンパク質において見られることが公知である。転写に関連する多くの他のタンパク質も、タンパク質を本発明にとって有用にする分離可能な結合および転写活性化ドメインを有し、例えばＬｅｘＡおよびＶＰ１６タンパク質が挙げられる。当然のことながら、他の実質的に転写不活性なＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＡＣＥ１、λｃＩ、ｌａｃレプレッサー、ｊｕｎ、またはｆｏｓのドメイン）は、対象の構築物に用いられ得る。別の実施形態においては、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインは、異なるタンパク質由来であってもよい。ＬｅｘＡ  ＤＮＡ結合ドメインの使用は、ある利点を提供する。例えば酵母において、ＬｅｘＡ部分は、活性化機能を含まず、酵母遺伝子の転写へ既知の影響を及ぼさない。さらに、ＬｅｘＡの使用により、アッセイの感度を、相互作用のレベルに制御することが可能になる（例えば、Ｂｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．ＰＣＴ公報、ＷＯ９４／１０３００参照）。
【０１３３】
好ましい実施形態においては、おとりタンパク質または魚タンパク質と関連する任意の酵素活性は不活性化され、例えば、タンパク質−タンパク質相互作用構成成分のドミナントネガティブ体または他の変異体を用いてもよい。
【０１３４】
実例を続けると、タンパク質−タンパク質相互作用構成成分媒介相互作用（もしあれば、宿主細胞中のおとり融合タンパク質と魚融合タンパク質との間の相互作用）により、活性化ドメインは、レポーター遺伝子の転写を活性化させる。この方法は、宿主細胞に第一のキメラ遺伝子と第二のキメラ遺伝子を導入し、活性化されるレポーター遺伝子に対して十分な量でおとり融合タンパク質と魚融合タンパク質が発現する条件にその細胞を付すことによって行われる。タンパク質−タンパク質相互作用構成成分／相互作用タンパク質複合体の形成は、レポーター遺伝子の発現により産生される検出可能なシグナルをもたらす。したがって、試験化合物の存在下および試験化合物の非存在下における複合体形成のレベルは、それぞれの場合におけるレポーター遺伝子の発現レベルを検出することによって評価され得る。本発明の方法に従って、様々なレポーター構築物が用いられてもよく、例えば、酵素シグナル、蛍光シグナル、リン光シグナルおよび薬物耐性からなる群から選択されるような検出可能なシグナルを産生するレポーター遺伝子が挙げられる。
【０１３５】
本発明の一局面は、再構成タンパク質調製物（例えば、タンパク質−タンパク質相互作用に関与するタンパク質の組み合わせ）を提供する。
【０１３６】
本発明のアッセイのさらなる実施形態においては、対象のアッセイを補助する細胞培養技法を利用して、目的のタンパク質−タンパク質相互作用を全細胞で引き起こす。例えば、以下に記載されるように、目的のタンパク質−タンパク質相互作用は、真核細胞培養系（哺乳動物細胞および酵母細胞等）において構成され得る。無傷細胞で対象アッセイを作製する利点は、阻害因子の治療的使用が必要とする環境により近い環境において機能的な阻害因子を検出する能力、例えば薬剤の細胞への侵入を獲得する能力が挙げられる。さらに、アッセイのｉｎ  ｖｉｖｏのある実施形態（以下に記載の実施例等）は、薬剤候補の高スループット解析を行いやすい。
【０１３７】
目的のタンパク質−タンパク質相互作用の構成成分は、アッセイを補助するために選択された細胞に対して内因性であり得る。あるいは、幾つかまたは全ての構成成分は外因性供給源由来であり得る。例えば、組み換え技法（例えば、発現ベクターの使用により）のほかに、融合タンパク質そのものまたは融合タンパク質をコードするｍＲＮＡのマイクロインジェクションにより、融合タンパク質を細胞へ導入してもよい。
【０１３８】
いずれの場合においても、タンパク質−タンパク質相互作用媒介シグナル伝達事象（例えば、リン酸化、細胞のシグナル伝達に反応した遺伝子の転写の変調等の、タンパク質−タンパク質相互作用構成成分基質の翻訳後修飾の変調）の検出を促進するために、細胞を阻害因子候補と共にインキュベートした後、最後に処理する。上記のように、再構成タンパク質混合物または溶解物において行われるアッセイのために、阻害因子候補の有効性は、タンパク質−タンパク質相互作用構成成分ポリペプチドの特徴（電気泳動手段または結合アッセイにおける検出による分子量のシフト等）を直接測定することにより評価され得る。これらの実施形態のために、通常、細胞を薬剤候補とのインキュベートの最後に溶解し、この溶解物を、例えば上記のような再構成タンパク質混合物または溶解物とほぼ同様に検出ステップにおいて処理する。
【０１３９】
また、タンパク質−タンパク質相互作用の間接的測定は、タンパク質−タンパク質相互作用媒介シグナル伝達事象によって変調されるタンパク質−タンパク質相互作用構成成分に関連する生体活性を検出することによって達成され得る。上記に示したように、タンパク質−タンパク質相互作用構成成分ポリペプチドおよび酵素活性を含む融合タンパク質の使用は、検出手段が関連酵素活性を定量することによるタンパク質−タンパク質相互作用構成成分ポリペプチドの間接的測定に依存する対象アッセイの代表的な実施形態である。
【０１４０】
他の実施形態においては、核酸−タンパク質、タンパク質−基質またはタンパク質−タンパク質相互作用構成成分ポリペプチドの生体活性は、標的細胞の表現型の変化をモニタリングすることによって評価され得る。例えば検出手段は、ある形態で相互作用構成成分または相互作用構成成分基質のレベルに依存する転写調節エレメントを含む、レポーター遺伝子構築物を含み得る。タンパク質相互作用構成成分は、レポーター遺伝子構築物のＤＮＡエレメントに結合するドメインとの融合タンパク質として提供され得る。融合タンパク質の付加ドメインは、そのＤＮＡ結合能力によってレポーター遺伝子の転写を増加または減少させるものであり得る。いずれの場合においても、ドメインは、融合タンパク質中に存在することにより、タンパク質−タンパク質相互作用媒介シグナル伝達経路に反応性になる。したがって、レポーター遺伝子の発現レベルはタンパク質相互作用構成成分の発現レベルによって変化する。
【０１４１】
レポーター遺伝子産物は、ルシフェラーゼ、βラクタマーゼまたはβガラクトシダーゼ等の検出可能な標識であり、無傷細胞で産生される。標識は、細胞のその後の溶解物中で測定され得る。しかしながら、溶解ステップは避けることが好ましく、細胞を溶解して標識を測定するステップを提供することは、通常、標識の検出が全細胞において達成できない場合にのみ採用される。
【０１４２】
さらに、対象アッセイの全細胞の実施形態において、レポーター遺伝子構築物は発現の際に選択可能なマーカーを提供し得る。レポーター遺伝子は、検出可能な遺伝子産物を発現する任意の遺伝子を含み、これはＲＮＡまたはタンパク質であり得る。好ましいレポーター遺伝子は、容易に検出可能なものである。また、レポーター遺伝子は、望ましい転写調節配列を含むまたは他の望ましい特性を示す遺伝子との融合遺伝子の形態で構築物に含まれ得る。例えば、レポーター遺伝子産物は、抗生物質または他の薬物への耐性を与える酵素、または宿主細胞における欠損を補足する酵素（すなわち、チミジンキナーゼまたはジヒドロ葉酸レダクターゼ）であり得る。例えば、細菌トランスポゾン遺伝子Ｔｎ５  ｎｅｏによってコードされるアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼを、細胞中に存在するタンパク質−タンパク質相互作用構成成分ポリペプチドのレベルに応答性であるプロモーターエレメントの転写制御下に置いてもよい。対象アッセイのこのような実施形態は、細胞の増殖が相互作用の阻害の簡便な測定を提供し得るという点で、特に高スループット解析を行いやすい。
【０１４３】
レポーター遺伝子の他の例としては、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）（Ａｌｔｏｎ  ａｎｄ  Ｖａｐｎｅｋ  （１９７９），Ｎａｔｕｒｅ  ２８２：８６４−８６９）ルシフェラーゼ、および他の酵素検出系（β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ（Ｇ．  Ｚｌｏｋａｒｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７９：８４−８８）；ホタルルシフェラーゼ（ｄｅ  Ｗｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：７２５−７３７）；細菌ルシフェラーゼ（Ｅｎｇｅｂｒｅｃｈｔ  ａｎｄ  Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ（１９８４），ＰＮＡＳ  １：４１５４−４１５８；Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２３：３６６３−３６６７）；アルカリホスファターゼ（Ｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８２：２３１−２３８，Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．２：１０１）；ヒト胎盤分泌アルカリホスファターゼ（Ｃｕｌｌｅｎ  ａｎｄ  Ｍａｌｉｍ  （１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１６：３６２−３６８）等）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４４】
レポーター遺伝子からの転写量は、適切なものとして当業者に公知の任意の方法を用いて測定され得る。例えば、特異的ｍＲＮＡ発現はノーザンブロットを用いて検出され、あるいは特異的タンパク質は特徴的染色、ウェスタンブロット、または固有の活性によって同定され得る。
【０１４５】
好ましい実施形態においては、レポーター遺伝子の産物は、その産物に関連する固有の活性によって検出される。例えば、レポーター遺伝子は、色、蛍光または発光に基づいた検出シグナルを、酵素活性によって引き起こす遺伝子産物をコードし得る。
【０１４６】
次いで、レポーター遺伝子からの発現量は、試験化合物の非存在下での同一の細胞における発現量と比較され、または目的のタンパク質−タンパク質相互作用の構成成分を欠如する実質的に同一の細胞における転写量と比較されてもよい。
【０１４７】
（４．３．治療剤の有効性スクリーニング）
本発明の方法を用いて同定された候補治療薬の効果は、例えば、ａ）被検体の赤血球を候補治療薬と接触させること、およびｂ）赤血球生成レベルを確定することを、対象とするアッセイを用いて被検体の細胞中の赤血球生成レベルを正常化する能力を確定することによって評価され得る。上記候補治療薬が高レベルの赤血球生成を誘導することがアッセイによって示される場合、その候補は赤血球生成促進薬物としてみなされ得る。逆に、候補治療薬が赤血球生成レベルを阻害することがアッセイによって示される場合、その候補は赤血球生成阻害薬物としてみなされ得る。あるいは、候補治療薬の有効性は、赤血球生成障害を有する被検体の赤血球の赤血球生成に関連する１つまたは複数の遺伝子の発現レベルを、健常赤血球の発現レベルと比較することによって評価され得る。一実施形態においては、遺伝子の発現レベルは、マイクロアレイまたは他のＲＮＡ定量方法を用いて、または候補治療薬により治療された赤血球の遺伝子発現プロファイルを、健常赤血球系細胞の遺伝子発現プロファイルと比較することにより確定され得る。
【０１４８】
次いで、化合物の有効性は、さらなるｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、および腫瘍異種移植研究において試験され得る。試験化合物を試験動物に投与し、腫瘍成長の阻害をモニタリングしてもよい。また、試験化合物を動物へ投与する前および後に、赤血球生成障害に特有の１つまたは複数の遺伝子発現を測定してもよい。１つまたは複数のこの遺伝子の発現の正常化は、動物における赤血球生成障害を治療するための有効性を示す。
【０１４９】
本発明の別の実施形態においては、合理的な薬物設計により薬物を開発する。すなわち、コンピュータ可読形態で記憶され、かつアルゴリズムで解析された情報に基づき、薬物を設計または同定する。現在はより多くの発現プロファイルのデータベースが確立されており、多数のものが公的に利用可能である。罹患赤血球系細胞からの遺伝子発現プロファイルの、その罹患赤血球系細胞に対応する健常細胞に対する変化と類似の方法で、赤血球生成障害に特有の少なくとも幾つかの遺伝子の発現に影響を与える薬物の説明に関するこのようなデータベースをスクリーニングすることにより、罹患赤血球系細胞における遺伝子発現を正常化する化合物が同定され得る。次いで、このような化合物の誘導体およびアナログは、化合物の活性を最適化するために合成され、上記のように試験および最適化され得る。
【０１５０】
上記の方法によって同定された化合物は、本発明の範囲内である。また、このような化合物を含む組成物、特に、薬学的に許容可能なキャリアにおいて医薬的有効量の薬物を含む組成物が提供される。ある組成物は、赤血球生成障害を治療するための１つまたは複数の活性化合物を含む。
【０１５１】
（４．４．治療剤の薬学的組成物）
さらに本発明は、本発明により提供されたスクリーニング方法を用いて同定された治療剤から成る薬学的組成物を用いて、赤血球生成障害を治療する方法を提供する。本発明は、赤血球生成障害を罹患している患者における赤血球生成レベルを正常化する薬学的組成物を使用することを意図する。ある実施形態においては、貧血を罹患している患者を治療するために本発明の薬学的組成物を用いる。他の実施形態においては、多血症を罹患している患者を治療するためにこの薬学的組成物を用いる。このような方法は、赤血球生成の調節に関連する１つまたは複数の遺伝子またはそのコード遺伝子産物の治療的有効量のアゴニストまたはアンタゴニストを、赤血球生成障害を罹患している患者に投与することを含む。
【０１５２】
本発明の化合物は、対象とする使用に応じて、当該技術分野で周知の様々な手段で投与され得る。例えば、本発明の化合物を経口投与する場合、この化合物は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤またはシロップ剤として製剤化される。あるいは、本発明の製剤は、注射（静脈内、筋肉内または皮下）、点滴調製物または坐剤として、非経口で投与されてもよい。眼粘膜経路による適用のために、本発明の化合物は目薬または眼軟膏として製剤化されてもよい。これらの製剤は従来の手段によって調製されてもよく、必要に応じてこの化合物は、賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、矯味剤、可溶化剤、懸濁助剤（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ａｉｄ）、乳化剤または被覆剤等の、任意の従来の添加剤と混合されてもよい。
【０１５３】
本発明の製剤において、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム等の湿潤剤、乳化剤および潤滑剤の他に、着色剤、放出剤、被覆剤、甘味剤、着香料および芳香剤、保存料および抗酸化剤が、製剤化された薬剤中に存在してもよい。
【０１５４】
本発明の化合物は、経口、経鼻、局所（頬および舌下を含む）、直腸、膣、エーロゾルおよび／または非経口投与に適し得る。製剤は単位剤形で便宜上提供されてもよく、薬学技術分野で周知の任意の方法によって調製されてもよい。単一用量を製造するためにキャリア材料と組み合わせられ得る薬剤量は、治療される被検体および投与の特定の態様により変化する。
【０１５５】
これらの製剤を調製する方法は、キャリア、および必要に応じて１つまたは複数の副成分と本発明の化合物とを関連（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）させるステップを含む。一般に、薬剤を液体キャリアと、または微粉化した固体キャリアと、あるいは双方と均一かつ密接に関連させ、必要に応じて産物を成型することによって製剤を調製する。
【０１５６】
経口投与に適した製剤は、カプセル剤、カシェ剤、丸剤、錠剤、ロゼンジ（風味基剤を使用、通常はスクロースおよびアラビアゴムまたはトラガカント）、散剤、顆粒剤の形態で、あるいは水溶性または非水溶性液体中の溶液または懸濁液として、あるいは水中油型または油中水型液体エマルジョンとして、あるいはエリキシル剤またはシロップ剤として、あるいは香錠（不活性基剤を使用、ゼラチンおよびグリセリン、あるいはスクロースおよびアラビアゴム等）としてであってもよく、それぞれ活性成分としてその所定量の化合物を含む。また、本発明の化合物は、ボーラス、舐剤またはペーストとして投与されてもよい。
【０１５７】
経口投与のための固体投薬形態（カプセル剤、錠剤、丸剤、糖剤、散剤、顆粒剤等）においては、その配位錯体（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ）を、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウム等の１つまたは複数の薬学的に受容可能なキャリアおよび／または以下のいずれか：（１）デンプン類、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよび／またはケイ酸等の充填剤や増量剤；（２）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸類、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび／またはアラビアゴム等の結合剤；（３）グリセロール等の保湿剤；（４）寒天、炭酸カルシウム、じゃがいもデンプン、タピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸類および炭酸ナトリウム等の崩壊剤；（５）パラフィン等の難溶化剤（ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｒｅｔａｒｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）；（６）四級アンモニウム化合物等の吸収促進剤；（７）例えば、アセチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロール等の湿潤剤；（８）カオリンおよびベントナイトクレイ等の吸着剤；（９）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール類、ラウリル硫酸ナトリウムおよびその混合物等の滑沢剤；および（１０）着色剤と混合する。また、カプセル剤、錠剤および丸剤の場合、組成物は緩衝剤を含んでもよい。また、類似の型の固体組成物は、ラクトースや乳糖のような賦形剤、ならびに高分子量のポリエチレングリコール等の賦形剤を用いて、軟充填ゼラチンカプセル剤および硬充填ゼラチンカプセル剤中の充填剤として用いられてもよい。
【０１５８】
錠剤は、必要に応じて１つまたは複数の副成分と共に圧縮または成形することによって作製されてもよい。圧縮錠剤は、結合剤（例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、滑沢剤、不活性希釈剤、保存料、崩壊剤（例えば、グリコール酸デンプンナトリウムまたは架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤または分散剤を用いて調製されてもよい。成形錠剤は、不活性液体希釈剤で湿らせた補充物またはその構成成分の混合物を、適切な機械で成形することにより作製されてもよい。錠剤および他の固体投薬形態（糖剤、カプセル剤、丸剤および顆粒剤等）は、必要に応じて、腸溶被覆のような被覆および殻（ｓｈｅｌｌ）、ならびに医薬的製剤化技術分野において既知の他の被覆等で分割（ｓｃｏｒｅｄ）または調製されてもよい。
【０１５９】
経口投与のための液体投薬形態としては、薬学的に許容可能なエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ剤およびエリキシル剤が挙げられる。化合物の他に、液体投薬形態は、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤等（エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油類（特に、綿実油、ラッカセイ油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル類、およびその混合物等）の、当該技術分野で広く用いられる不活性希釈剤を含んでもよい。
【０１６０】
懸濁液は、化合物の他に、例えばエトキシル化イソステアリルアルコール類、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天およびトラガカント、およびその混合物等の懸濁剤を含んでもよい。
【０１６１】
直腸または膣投与のための製剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）は、坐剤として提供されてもよく、これは、本発明の配位錯体を、例えばカカオバター、ポリエチレングリコール、坐剤ワックスまたはサリチル酸塩を含む１つまたは複数の適切な非刺激性賦形剤またはキャリアと混合することによって調製されてもよく、室温で固体であるが体温で液体であるため、体腔中で溶解して活性剤を放出する。また、膣投与に適した製剤としてはまた、適切なものとして当該技術分野で公知のこのようなキャリアを含むペッサリー、タンポン、クリーム剤、ゲル、ペースト、泡またはスプレー剤製剤が挙げられる。
【０１６２】
補充物または構成成分の経皮投与のための投薬形態としては、散剤、スプレー剤、軟膏、ペースト、クリーム剤、ローション剤、ゲル、溶液、パッチおよび吸入剤が挙げられる。活性構成成分は、無菌条件下で、薬学的に受容可能なキャリアと、および必要とされ得る任意の保存料、緩衝剤または噴霧剤と混合されてもよい。遷移金属錯体の経皮投与のために、錯体は親油性基および親水性基を含んで、所望の水溶解度および輸送特性を達成してもよい。
【０１６３】
軟膏、ペースト、クリーム剤およびゲルは、補充物またはその構成成分の他に、動物性脂肪、植物性脂肪、油類、ワックス類、パラフィン類、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体類、ポリエチレングリコール類、シリコーン類、ベントナイト類、ケイ酸、タルクおよび酸化亜鉛、またはその混合物等の賦形剤を含んでもよい。
【０１６４】
散剤およびスプレー剤は、補充物またはその構成成分の他に、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド散剤、またはこれらの物質の混合物等の賦形剤を含んでもよい。スプレー剤は、クロロフルオロ炭化水素類等の通常の噴霧剤、およびブタンやプロパン等の揮発性無置換炭化水素類をさらに含んでもよい。
【０１６５】
あるいは、本発明の化合物は、エーロゾルによって投与されてもよい。これは、化合物を含む水性エーロゾル、リポソーム調製物または固体粒子を調製することによって達成される。非水性（例えば、フルオロカーボン噴霧剤）懸濁液を用いてもよい。音波ネブライザーは、薬剤の剪断への曝露を最小化し、これにより化合物の分解をもたらし得るため、用いられ得る。
【０１６６】
通常、水性エーロゾルは、化合物の水性溶液または懸濁液を従来の薬学的に受容可能なキャリアおよび安定化剤と共に製剤化することによって作製される。キャリアおよび安定化剤は、特定の化合物の要件によって変化するが、代表的には、非イオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃまたはポリエチレングリコール）、血清アルブミンのような無害性タンパク質、ソルビタンエステル類、オレイン酸、レシチン、グリシン等のアミノ酸、緩衝剤、塩類、糖類または糖アルコール類が挙げられる。一般に、エーロゾルは等張性溶液から調製される。
【０１６７】
非経口投与に適した本発明の薬学的組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容可能な無菌で等張性の水性または非水性の溶液、分散液、懸濁液またはエマルジョンと、あるいは使用直前に無菌の注射可能な溶液または分散液に再構成され得る無菌の散剤と組み合わせて、１つまたは複数の補充物の構成成分を含み、これは、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、製剤を対象レシピエントの血液と等張にする溶質、懸濁剤または増粘剤を含んでもよい。
【０１６８】
本発明の薬学的組成物において用いられ得る適切な水性または非水性キャリアの例としては、水、エタノール、ポリオール類（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、およびその適切な混合物、オリーブ油等の植物油、オレイン酸エチル等の注射可能な有機エステル類が挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチン等の被覆材料を使用すること、分散液の場合は必要な粒子サイズを維持すること、および界面活性剤を使用することにより維持され得る。
【０１６９】
（４．５．薬学的組成物を用いた処置方法）
本発明の任意の薬学的組成物の投薬量は、患者の症状、年齢および体重、処置または予防されるべき障害の性質および重篤度、投与経路、および補充物の形態によって変化する。対象の製剤はいずれも、単一用量または分割用量で投与され得る。本発明の化合物の投薬量は、当業者に公知の、または本明細書で教示されるような技法で容易に確定され得る。また、本発明は、複数の対象化合物の混合物、ならびに他の治療剤も提供する。
【０１７０】
正確な投与時間および所定の患者に最も有効な治療をもたらす任意の特定の化合物の量は、特定の化合物の活性、薬物動態学およびバイオアベイラビリティ、患者の生理条件（年齢、性別、疾患の型およびステージ、全般的な身体状態、所定の用量に対する反応性および投薬形態等）、投与経路等によって決まる。本明細書で提供される指針は、処置を最適化する（例えば、最適な時間および／または投与量を確定する）ために用いられ得、これは、被検体のモニタリングならびに用量および／またはタイミングの調節から成る慣用的な実験を必要とするだけである。
【０１７１】
被検体を治療する間、患者の健康は、２４時間、所定の時間で１つまたは複数の関連指標を測定することによってモニタリングされ得る。投与および製剤の補充物、量、時間を含む治療は、このようなモニタリングの結果に従って最適化され得る。同一のパラメータを測定することによって改善の程度を確定するために、患者を定期的に再評価してもよく、初めのこのような再評価は、代表的には、治療開始から４週間目の最後に行い、その後の再評価は治療の間４〜８週毎、その後３ヶ月毎に行う。治療は数ヶ月間あるいは数年間継続してもよく、最短でも１ヶ月が、ヒトに対する治療の代表的な長さである。投与される薬剤の量および場合によっては投与時間の調節は、これらの再評価に基づいて行われ得る。
【０１７２】
処置は、最適用量の化合物より少ない、低用量で開始され得る。その後、最適な治療効果が得られるまで少量ずつ用量を増加させ得る。
【０１７３】
本発明の幾つかの化合物あるいは他の化学療法剤を組み合わせて使用することにより、異なる構成成分の効果の発生および継続が喜ばしいものであり得るため、いずれの各構成成分に必要な投薬量も減少させることができる。このような組み合わせ治療においては、異なる活性剤が、共にまたは別々に、かつ同時にまたはその日の異なる時間に送達され得る。
【０１７４】
対象化合物の毒性および治療の有効性は、例えば、ＬＤ５０およびＥＤ５０を確定するための、細胞培養または実験動物における標準的な医薬的手順によって確定され得る。多数の治療指標を示す組成物が好ましい。毒性副作用を示す化合物を用いてもよいが、副作用を減少させるために、その化合物を望ましい部位へ向ける送達システムの設計には注意を要する。
【０１７５】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のためのある範囲の投薬量を製剤化するのに用いられ得る。任意の補充物の投薬量、あるいは補充物中の任意の構成成分の投薬量は、ほとんどまたは全く毒性のないＥＤ５０を含む循環濃度範囲内にあることが好ましい。投薬量は、用いる投薬形態および利用する投与経路によってこの範囲内で変化してもよい。本発明の薬剤の場合、治療的に有効な用量は、まず細胞培養アッセイにより概算され得る。ある用量は、動物モデルにおいて考案されて、細胞培養で確定されたようなＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の５０％を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲が達成されてもよい。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に確定するのに用いられ得る。血漿におけるレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィで測定され得る。
【０１７６】
（５．本発明の標的由来のプローブを含む組成物）
本発明は、本発明のパネルを含む、遺伝子の配列由来のプローブまたはそれにコードされるタンパク質から成る組成物を提供する。これらの組成物は、本明細書において考察されたような診断的適用における使用のために企図される。本発明による使用のために好ましい組成物は、赤血球生成の間に発現が差次的に調節される、表Ｉのパネルから選択された１つまたは複数の遺伝子のプローブを含む。ある実施形態においては、組成物のプローブは、赤血球生成の間に発現がアップレギュレートされる、表ＩＩに列挙された標的遺伝子から選択される核酸配列由来である。さらに他の実施形態においては、組成物のプローブは、赤血球生成の間に発現がダウンレギュレートされる、表ＩＩＩに列挙された標的遺伝子から選択される核酸配列由来である。組成物は、新形成に関連する少なくとも１０個、好ましくは少なくとも２０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個または少なくとも１０００個の遺伝子に対応するプローブを含み得る。組成物は、表Ｉ、表ＩＩまたは表ＩＩＩに列挙された各遺伝子、または赤血球生成の間にアップレギュレートまたはダウンレギュレートされる表Ｉ、表ＩＩまたは表ＩＩＩの遺伝子のサブセットに対応するプローブを含んでもよい。
【０１７７】
本発明の一実施形態においては、組成物はマイクロアレイである。マイクロアレイ上の各遺伝子に対応する１つまたは複数のプローブが存在し得る。例えば、マイクロアレイは、１つの遺伝子に対応する２〜２０個、好ましくは約５〜１０個のプローブを含んでもよい。プローブは、赤血球生成に関連する遺伝子の全長ＲＮＡ配列またはその相補体に対応しても、あるいはその一部と対応してもよく、この部分は特異的ハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な長さである。このようなプローブは、約５０ヌクレオチド〜約１００、２００、５００または１０００ヌクレオチド、あるいは１０００を超えるヌクレオチドを含み得る。本明細書でさらに記載されるように、マイクロアレイはオリゴヌクレオチドプローブを含んでもよく、これは約１０〜５０ヌクレオチド、好ましくは約１５〜３０ヌクレオチド、さらに好ましくは２０〜２５ヌクレオチドから成る。プローブは、一本鎖であることが好ましい。プローブは、所望のレベルの配列特異的ハイブリダイゼーション（以下参照）を提供するのに十分な、その標的に対する相補性を有する。
【０１７８】
本発明における使用に適したアレイは、任意の適切な部位密度が本発明に含まれるが、１ｃｍ２あたり異なるプローブが１００個を超える部位密度を有する。好ましくは、アレイは、５００／ｃｍ２を超える、より好ましくは約１０００／ｃｍ２を超える、最も好ましくは１０，０００／ｃｍ２を超える部位密度を有する。好ましくは、アレイは単一基板上に１００個を超える異なるプローブを有し、より好ましくは約１０００個を超える異なるプローブ、さらにより好ましくは約１０，０００個を超える異なるプローブ、最も好ましくは１００，０００個を超える異なるプローブを単一基板上に有する。
【０１７９】
マイクロアレイは、以下に記載するような当該技術分野で公知の方法で調製されてもよく、企業（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ））により受託製作されてもよい。
【０１８０】
一般に、２つの型のマイクロアレイが用いられ得る。これら２つの型は、「合成」および「送達」と称される。合成型においては、ヌクレオチドから核酸をインサイチュで合成することによるステップワイズ方式でマイクロアレイを調製する。合成の各ラウンドでは、所望の長さが達成されるまでヌクレオチドを成長鎖に付加する。送達型のマイクロアレイにおいては、様々な送達技法を用いて、予め調製された核酸を既知の場所に付着させる。多数の論文（例えば、Ｓｈｅｎａら（１９９８）Ｔｉｂｔｅｃｈ  １６：３０１；Ｄｕｇｇａｎら（１９９９）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２１：１０；Ｂｏｗｔｅｌｌら（１９９９）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２１：２５）において異なるマイクロアレイ技法が説明されている。
【０１８１】
１つの新規合成技法がＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）により開発され、これはフォトリソグラフィ技法をＤＮＡ合成化学と組み合わせており、高密度のオリゴヌクレオチドマイクロアレイ製造を可能にする。このようなチップは、約１．６ｃｍ２の面積中に４００，０００群までのオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドを３’末端で固定することにより、ハイブリダイゼーション用の一本鎖核酸の有効性を最大化する。一般に、このようなチップは「ＧｅｎｅＣｈｉｐｓ（登録商標）」と称されるが、特定の遺伝子の幾つかのオリゴヌクレオチド（例えば１５〜２０、例えば１６オリゴヌクレオチド）を含む。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）は、受託製作のマイクロアレイを販売しているため、赤血球生成の間に発現が差次的に調節される遺伝子を含むマイクロアレイを注文し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）から購入してもよい
また、マイクロアレイは、機械的マイクロスポット（例えば、Ｓｙｎｔｅｎｉ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）で市販されるもの）によって調製されてもよい。これらの方法に従って、少量の核酸を固体表面にプリントする。Ｓｙｎｔｅｎｉで調製されたマイクロスポットアレイは、約３．６ｃｍ２の面積中に１０，０００群ものｃＤＮＡを含む。
【０１８２】
マイクロアレイ技法の第三の群は、「ドロップオンデマンド」輸送アプローチにあり、このうちの最先端はインクジェット技法であり、これは核酸を小型ノズルから固体表面へ移送するための圧電および他の形態の推進力を利用するものである。インクジェット技法は、Ｉｎｃｙｔｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）およびＰｒｏｔｏｇｅｎｅ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）等の幾つかの拠点で開発されている。この技法により１ｃｍ２あたり１０，０００スポットという密度が得られる。Ｈｕｇｈｅｓら（２００１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．１９：３４２もまた参照。
【０１８３】
アレイは、好ましくは、対照核酸と参照核酸を含む。対照核酸は、ハイブリダイゼーションが有効であることを示唆する役目をする核酸である。例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）の全発現アレイは、幾つかの原核生物遺伝子用のプローブの組を含む（例えば、大腸菌のビオチン合成からのｂｉｏＢ、ｂｉｏＣおよびｂｉｏＤ、ならびにＰ１バクテリオファージからのｃｒｅ）。これらのアレイに対するハイブリダイゼーションは、これらの遺伝子またはその一部の混合物（例えば、その目的でＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）により提供されるミックス（Ｐａｒｔ  Ｎｕｍｂｅｒ  ９００２９９））の存在下で行われることにより、ハイブリダイゼーションが有効であったことが確認される。また、標的核酸と共に含まれる対照核酸は、インビトロ転写によりｃＤＮＡクローンから合成されたｍＲＮＡであってもよい。アレイに含まれ得る他の対照遺伝子は、ｄａｐ、ｌｙｓ、ｐｈｅ、ｔｈｒおよびｔｒｐ等のポリＡ対照である（これらはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのＧｅｎｅＣｈｉｐｓ（登録商標）に含まれる）。
【０１８４】
参照核酸は、ある実験から別の実験までで得られた結果を正常化し、定量レベルで複数の実験を比較することを可能にする。典型的な参照核酸としては、既知の発現レベルのハウスキーピング遺伝子（例えば、ＧＡＰＤＨ、ヘキソキナーゼおよびアクチン）が挙げられる。
【０１８５】
また、誤対合対照は、標的遺伝子に対するプローブのため、発現レベル対照のため、または正常化対照のために提供され得る。誤対合対照は、１つまたは複数の誤対合塩基の存在以外は対応する試験プローブまたは対照プローブと同一のオリゴヌクレオチドプローブまたは他の核酸プローブである。
【０１８６】
また、アレイは、遺伝子の１より多い対立遺伝子にハイブリダイズするプローブを含む。例えばアレイは、対立遺伝子１を認識するあるプローブと、特定の遺伝子の対立遺伝子２を認識する別のプローブを含んでもよい。
【０１８７】
マイクロアレイは以下のように調製され得る。一実施形態においては、オリゴヌクレオチドのアレイは、固体支持体上に合成される。例示的な固体支持体としては、ガラス、プラスチック、ポリマー、金属、半金属、セラミックス、有機物等が挙げられる。チップマスキング技法および光保護化学を用いて、核酸プローブの規則的なアレイを作製することが可能である。これらのアレイは、例えば「ＤＮＡチップ」として、あるいは非常に大規模な固相化ポリマーアレイ（「ＶＬＳＩＰＳＴＭ」アレイ）として知られており、約１ｃｍ２〜数ｃｍ２の面積を有する基板上に何百万もの規定のプローブ領域を含むことにより、数個〜何百万個のプローブの組を組み込み得る（例えば、米国特許第５，６３１，７３４号参照）。
【０１８８】
標的核酸を検出する固相核酸アレイの構成は、文献に詳細に説明されている。Ｆｏｄｅｒら、（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：７６７−７７７；Ｓｈｅｌｄｏｎら（１９９３）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９（４）：７１８−７１９；Ｋｏｚａｌら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２（７）：７５３−７５９およびＨｕｂｂｅｌｌ、米国特許第５，５７１，６３９号；ＰｉｎｋｅｌらＰＣＴ／ＵＳ９５／１６１５５（ＷＯ  ９６／１７９５８号）；米国特許第５，６７７，１９５号；５，６２４，７１１号；５，５９９，６９５号；５，４５１，６８３号；５，４２４，１８６号；５，４１２，０８７号；５，３８４，２６１号；５，２５２，７４３号および５，１４３，８５４号；ＰＣＴ特許公開第９２／１００９２号および９３／０９６６８号；およびＰＣＴ  ＷＯ  ９７／１０３６５号参照。すなわち、組み合わせストラテジーにより、最小数の合成ステップを用いて多数のプローブを含むアレイを合成することができる。例えば、たった３２回の化学合成ステップを用いて、可能なＤＮＡの８マーのオリゴヌクレオチド全て（４８、すなわち６５，５３６個の可能な組み合わせ）を合成し、付着することが可能である。一般に、ＶＬＳＩＰＳＴＭは、たった４回の合成ステップを用いて、アレイ上の４個の異なるオリゴヌクレオチドプローブを製造する方法を提供する（例えば、米国特許第５，６３１，７３４号；５，１４３，８５４号およびＰＣＴ特許公開番号ＷＯ  ９０／１５０７０号；ＷＯ  ９５／１１９９５号およびＷＯ  ９２／１００９２号参照）。
【０１８９】
ガラス表面上のオリゴヌクレオチドアレイの光定方向（ｌｉｇｈｔ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）組み合わせ合成は、コンピュータチップ業界のフォトレジスト技法と類似の自動ホスホラミダイト化学およびチップマスキング技法を用いて行われてもよい。通常ガラス表面は、官能基（例えば、光不安定（ｐｈｏｔｏｌａｂｉｌｅ）保護基によりブロックされた水酸基またはアミン基）を含むシラン試薬を用いて誘導体化される。フォトリソグラフィマスクによる光分解を選択的に用いて、生じる５’光保護ヌクレオシドホスホラミダイトとその後反応する用意のある官能基を感光させる。ホスホラミダイトは、光を当てられた部位とのみ反応する（したがって、光不安定ブロック基を除去することによって感光される）。したがって、ホスホラミダイトは、前のステップから選択的に感光された領域にのみ付加される。これらのステップは、所望の配列のアレイが固体表面上に合成されるまで繰り返される。
【０１９０】
合成サイクル数を減少させるためのマスクの設計用アルゴリズムは、Ｈｕｂｂｅｌ等によって、米国特許第５，５７１，６３９号および米国特許第５，５９３，８３９号に記載されている。コンピュータシステムは、基板上の核酸プローブを選択し、米国特許第５，５７１，６３９号に記載されているようなアレイのレイアウトを設計するのに用いられ得る。
【０１９１】
高密度アレイを合成する別の方法は、米国特許第６，０８３，６９７号に記載されている。この方法は、ポリマー配列の合成を補助する照射によって開始する触媒システムを用いた、新規の化学増幅プロセスを利用する。本発明の方法は、ポリマー配列の形成を促進する様式で合成中間体を化学的に変化させる触媒として作用する感光性化合物を使用することを含む。このような感光性化合物としては、一般に照射活性触媒（ＲＡＣ）、より具体的には光活性触媒（ＰＡＣ）と称されるものが挙げられる。ＲＡＣは、それ自体が合成中間体を化学的に変化させ得るか、あるいは合成中間体をその後のさらなる合成中間体または他の化合物と化学的に結合することができる方法で合成中間体を化学的に変化させる自己触媒化合物を活性化し得る。
【０１９２】
アレイは、機械的に抑制された流路によって支持体である細胞にモノマーを輸送することによって、組み合わせ方式でも合成され得る。Ｗｉｎｋｌｅｒら、ヨーロッパ特許第６２４，０５９号参照。アレイは、インクジェットプリンタを用いて、支持体上にモノマー試薬をスポットすることによっても合成され得る。同書およびＰｅａｓｅら、ヨーロッパ特許第７２８，５２０号参照。
【０１９３】
ｃＤＮＡプローブは、当該技術分野で既知の、本明細書でさらに説明される方法（例えば、配列特異的ポリマーを用いたＲＮＡの逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ））に従って調製され得る。オリゴヌクレオチドプローブは、化学的に合成されてもよい。遺伝子またはプローブが作製されるｃＤＮＡの配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、他の公共のデータベースまたは出版物から得られ得る。
【０１９４】
核酸プローブは、結合化学物質（ｌｉｎｋｉｎｇ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）と適合性の活性化水酸基を有する限り、天然核酸、例えばヌクレオチドアナログから構成される化学的に修飾された核酸であってもよい。保護基自体は光不安定性であり得る。あるいは、保護基、特定の化学的条件（例えば、酸性）下で不安定であり得る。この例においては、固体支持体表面は、光に露光すると酸を生成する組成物を含み得る。したがって、基板のある領域を光へ露光することにより、露光領域の中の保護基を除去する酸がその領域に生成される。また、合成方法は、３’保護５’−０−ホスホラミダイト活性化デオキシヌクレオシドを使用してもよい。この場合、オリゴヌクレオチドは５’から３’方向に合成され、これにより遊離の５’末端をもたらす。
【０１９５】
一実施形態においては、アレイのオリゴヌクレオチドは、何千ものオリゴヌクレオチドを作製することが可能な９６ウェル自動複合オリゴヌクレオチド合成器（Ａ．Ｍ．Ｏ．Ｓ．）を用いて合成される（Ｌａｓｈｋａｒｉら（１９９５）ＰＮＡＳ  ９３：７９１２）。
【０１９６】
オリゴヌクレオチドの設計は、意図する用途に影響されることが理解される。例えば、全プローブが類似の融解温度を有することが望ましくあり得る。従って、アレイ上の全プローブの融解温度が極めて類似するように、プローブの長さを調整する（異なるプローブの異なる長さは、異なるプローブが異なるＧＣ含量を有する特定のＴ［ｍ］に達することが必要とされ得ることが理解される）。融解温度がプローブ設計における第一の考慮事項であるが、必要に応じて、さらにプローブ構成を調整するために他の因子が用いられる（プライマーの自己相補性に対する選択等）。
【０１９７】
アレイ（例えば、マイクロアレイ）は、生産またはその後使用するための購入の後に便利に保存され得る。適切な条件下で、対象のアレイは、少なくとも約６ヶ月間保存可能であり、１年以上までの間保存され得る。一般に、アレイは、約−２０℃〜室温の温度で保存され、この場合、アレイは、好ましくは、プラスチック容器（例えば、バッグ）中に密閉され、かつ遮光される。
【０１９８】
（５．１  標的核酸のマイクロアレイへのハイブリダイゼーション）
次のステップは、プローブとアレイの標的との間の結合にとって十分な条件下で、標識核酸をアレイと接触させることである。好ましい実施形態においては、マイクロアレイ上で標識核酸とプローブの間にハイブリダイゼーションが起こるのに十分な条件下で、プローブをアレイと接触させるが、このハイブリダイゼーション条件は、所望のレベルのハイブリダイゼーション特異性を提供するために選択される。
【０１９９】
アレイとプローブの接触は、プローブを含む水性媒体とアレイを接触させること含む。接触は、アレイの特異的構成に依存して、様々な異なる方法で達成され得る。例えば、アレイが「板様」硬質基板の表面上にサイズ分割標的パターンを含むだけである場合、プローブ溶液を含む容器（例えば、ポリエチレンバッグ等）にアレイを単に収容することによって接触が達成され得る。２つの硬質板によって結合される分離媒体にアレイが捕捉される他の実施形態において、電気泳動手段を介してプローブを輸送する機会がある。あるいは、アレイが流体の入口ポートおよび出口ポートを有するバイオチップデバイスに組み込まれる場合、プローブ溶液は、標的分子のパターンが入口ポートを通ってチャンバに導入され得るが、この場合、流体の導入は手動または自動デバイスで行われ得る。マルチウェルの実施形態においては、プローブ溶液は、手動（例えば、ピペットで）または自動流体操作デバイスのいずれかで、アレイを含む反応チャンバに導入される。
【０２００】
プローブ溶液と標的との接触は、プローブと標的の間の結合が起こるのに十分な時間維持される。プローブと標的の性質に依存して、一般に、約１０分〜２４時間、通常は約３０分〜１２時間、さらに通常は、約１時間〜６時間の間、接触が維持される。
【０２０１】
市販のマイクロアレイを用いる場合、適切なハイブリダイゼーション条件は製造業者によって提供される。市販でないマイクロアレイを用いる場合、適切なハイブリダイゼーション条件は以下のハイブリダイゼーション指針、およびマイクロアレイの使用に関する多数の出版論文に記載されるハイブリダイゼーション条件に基づいて決定され得る。
【０２０２】
核酸ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、プローブが特定のアレイ部位に「特異的に結合」または「特異的にハイブリダイズ」するように、すなわち、プローブが相補的核酸配列を有する配列アレイ部位にハイブリダイズ、二重鎖化（ｄｕｐｌｅｘ）または結合するが、非相補的核酸配列を有する部位にはハイブリダイズしないように最適に選択される。本明細書において用いられる場合、短い方のポリヌクレオチドが２５塩基以下である場合に、標準的な塩基対合規則を用いた誤対合が存在しない場合、あるいは短い方のポリヌクレオチドが２５塩基より長い場合に、わずか５％の誤対合しか存在しない場合、あるポリヌクレオチド配列はもう一方のポリヌクレオチド配列と相補的であるとみなされる。好ましくは、ポリヌクレオチドは完全に相補的（誤対合なし）である。特異的ハイブリダイゼーション条件は、陰性対照を含むハイブリダイゼーションアッセイを行うことによって特異的ハイブリダイゼーションをもたらす。
【０２０３】
本質的に特異的なハイブリダイゼーションを可能にする条件で、ハイブリダイゼーションは行われる。プローブの長さおよびＧＣ含量によってハイブリッドのＴｍ、つまりテンプレート核酸に対するプローブの特異的ハイブリダイゼーションを得るのに必要なハイブリダイゼーション条件が決定される。これらの因子は当業者には既知であり、またアッセイにおいて試験され得る。核酸のハイブリダイゼーションに対する詳細なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）「核酸プローブを用いた生化学および分子生物学ハイブリダイゼーションにおける実験技法（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ−ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅｓ）」に見られる。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびｐＨにおける特異的配列のための熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低いように選択される。このＴｍは、標的配列の５０％が完全に対合したプローブとハイブリダイズする（所定のイオン強度およびｐＨ下での）温度である。高ストリンジェント条件は、特定のプローブのためのＴｍ点と等しいように選択される。「Ｔｄ」という用語は、しばしば、プローブの少なくとも半分が完全に対合した標的核酸から解離する温度として定義するのに使用される。いずれの場合においても、ＴｍまたはＴｄを概算するための様々な概算技法が利用可能であり、一般に、上記Ｔｉｊｓｓｅｎ（前出）に記載されている。通常、二重鎖におけるＧ−Ｃ塩基対は、理論的最大である約８０〜１００℃までＴｍに対して約３℃寄与すると概算される一方、Ａ−Ｔ塩基対はＴｍに対して約２℃寄与すると概算される。しかしながら、Ｇ−Ｃスタッキング相互作用、溶媒効果、所望のアッセイ温度等を考慮したＴｍおよびＴｄのより高度なモデルが利用可能であり、適切である。例えば、プローブは、以下の式：Ｔｄ＝（（（（（３×＃ＧＣ）＋（２×＃ＡＴ））×３７）−５６２）／＃ｂｐ）−５（式中、＃ＧＣ、＃ＡＴおよび＃ｂｐはそれぞれ、グアニンーシトシン塩基対数、アデニン−チミジン塩基対数および全塩基対数であり、テンプレートＤＮＡに対するプローブのアニーリングに関与する）を用いて、約６０℃の解離温度（Ｔｄ）を有するように設計され得る。
【０２０４】
完全に対合した二重鎖と誤対合した二重鎖の間の安定性の差異は、特に誤対合が１つの塩基のみである場合は非常に小さく、２つのＴｍの間の差異は０．５度もの小さな差異に相当し得る。Ｔｉｂａｎｙｅｎｄａ，Ｎ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３９：１９（１９８４）およびＥｂｅｌ，Ｓ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１：１２０８３（１９９２）参照。さらに重要なことに、相同領域の長さが増加するにつれて、１つの塩基の誤対合の二重鎖安定性全体への影響が減少することが理解される。
【０２０５】
核酸ハイブリダイゼーションの理論と実践は、例えば、Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ（編）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ  ２０；およびＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３）「核酸プローブを用いた生化学および分子生物学ハイブリダイゼーションにおける実験技法（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ−ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅｓ）に記載されており、例えば、第Ｉ部第２章「ハイブリダイゼーション原理の概要および核酸プローブアッセイのストラテジー（「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ」）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋは、核酸ハイブリダイゼーションに対する基本的なガイドを提供する。
【０２０６】
特定のマイクロアレイは、「活性な」性質であり、すなわち、各特異的微小位置（ｍｉｃｒｏｌｏｃａｔｉｏｎ）で起こるハイブリダイゼーション反応（または任意の他のアフィニティ反応）の全局面にわたり、独立した電子制御を提供する。これらのデバイスは、電子的ストリンジェンシー制御（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ）（ＥＳＣ）と呼ばれる、ハイブリダイゼーション反応に影響を与えるための新規メカニズムを提供する。本発明の活性デバイスは、各微小位置で「異なるストリンジェンシー条件」を電子的にもたらし得る。したがって、全ハイブリダイゼーションは、必要に応じて同一の大量溶液中で行われ得る。これらのアレイは、Ｓｏｓｎｏｗｓｋｉ等による米国特許第６，０５１，３８０号に記載されている。
【０２０７】
好ましい実施形態においては、バックグラウンドシグナルを、非特異的結合を減少させるためにハイブリダイゼーションの間に洗浄剤（例えば、Ｃ−ＴＡＢ）またはブロッキング試薬（例えば、精子ＤＮＡ、ｃｏｔ−１  ＤＮＡ等）を使用することによって減少させる。特に好ましい実施形態においては、約０．５ｍｇ／ｍｌのＤＮＡ（例えば、ニシン精子ＤＮＡ）の存在下でハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションにおけるブロッキング剤の使用は、当業者には既知である（例えば、生化学および分子生物学における実験技法第２４巻の第８章：核酸プローブを用いたハイブリダイゼーション（Ｃｈａｐｔｅｒ  ８  ｉｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｖｏｌ．２４：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ）、Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｎ．Ｙ．，（１９９３）参照）。
【０２０８】
この方法は、標的核酸に用いた特定の標識に応じて、検出ステップ前に非結合標識の除去ステップをさらに含んでも含まなくてもよい。例えば、あるアッセイ形式（例えば、「相同アッセイ形式」）においては、検出可能なシグナルは、標識がプローブへ特異的に結合する際にのみ生成される。したがって、これらのアッセイ形式においては、ハイブリダイゼーションパターンは、非結合標識の除去ステップなしに検出され得る。他の実施形態においては、標的がプローブと特異的に結合しようとしまいと、用いられる標識はシグナルを生成する。このような実施形態においては、非結合標識標的は支持体表面から除去される。非結合標識標的を除去する一手段は、周知の洗浄技法を行うことである。様々な洗浄溶液および非結合標識の除去におけるその使用のためのプロトコルは、当業者には既知であり、用いられ得る。あるいは、非結合標識標的は電気泳動手段によって除去され得る。
【０２０９】
全標的配列が同一の標識を用いて検出される場合、異なるアレイが各生理的供給源（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｏｕｒｃｅ）に対して用いられる（この場合、異なるアレイとは、同一のアレイを別の機会に用いることを含む）。上記の方法は、異なる標的集団のための異なる区別可能な標識（アッセイされる異なる各生理的供給源を示す）を用いることにより、複合解析のために供給するように変えられてもよい。この複合方法により、同一のアレイが異なる標的集団のそれぞれに対して同時に用いられる。
【０２１０】
別の実施形態においては、ハイブリダイゼーションは、電荷結合デバイスイメージングカメラを用いて、リアルタイムでモニタリングされる（Ｇｕｓｃｈｉｎら（１９９７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５０：２０３）。光ファイバーバンドル上のアレイの合成は、容易かつ高感度な読み取りを可能にする（Ｈｅａｌｙら（１９９７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５１：２７０）。別の実施形態においては、リアルタイムのハイブリダイゼーション検出は、表面に結合した発蛍光団のみを励起する消滅波効果を用いて洗浄をせずにマイクロアレイ上で行われる（例えば、Ｓｔｉｍｐｓｏｎら（１９９５）ＰＮＡＳ  ９２：６３７９参照）。
【０２１１】
（５．２．ハイブリダイゼーション検出および結果解析）
上記のステップは、アレイ表面上の標識標的核酸のハイブリダイゼーションパターンの産生をもたらす。標識核酸の得られるハイブリダイゼーションパターンは、様々な方法で可視化または検出されて、検出の特定の方法が標的核酸の特定の標識に基づいて選択され、代表的な検出手段はとしては、シンチレーション計数、オートラジオグラフィ、蛍光測定、比色測定、発光測定、光散乱等が挙げられる。
【０２１２】
検出の一方法はアレイスキャナであり、これはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）から市販されている（例えば、４１７ＴＭＡｒｒａｙｅｒ、４１８ＴＭＡｒｒａｙ  ＳｃａｎｎｅｒまたはＡｇｉｌｅｎｔ  ＧｅｎｅＡｒｒａｙＴＭＳｃａｎｎｅｒ）。このスキャナは、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）インターフェースおよび使いやすいソフトウェアツールを用いたシステムコンピュータにより制御される。アウトプットは、様々なソフトウェアアプリケーションに直接インポートされるか、またはそれによって直接読み込まれ得る１６ビットｔｉｆファイルである。好ましいスキャンデバイスは、米国特許第５，１４３，８５４号および第５，４２４，１８６号に記載されている。
【０２１３】
蛍光標識プローブを用いる場合、転写物アレイの各部位における蛍光発光は、好ましくは、走査型共焦点レーザ顕微鏡によって検出され得る。一実施形態においては、適切な励起ラインを用いて、使用した２つの発蛍光団のそれぞれに対して別々にスキャンを行う。あるいは、２つの発蛍光団に特異的な波長における同時の標本照射を可能にするレーザを用いてもよく、２つの発蛍光団からの発光は同時に解析され得る（Ｓｈａｌｏｎら、１９９６、２色蛍光プローブハイブリダイゼーションを用いた複合体ＤＮＡサンプル解析用ＤＮＡマイクロアレイシステム（Ａ  ＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ｓａｍｐｌｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｂｅ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：６３９−６４５（あらゆる目的のために参照によりその全体を本明細書に援用する）参照）。好ましい実施形態においては、アレイは、コンピュータ制御のＸ−Ｙステージおよび顕微鏡対物レンズを有するレーザ蛍光スキャナによりスキャンされる。２つの発蛍光団の連続的励起は、マルチラインの混合ガスレーザで達成され得、放出された光は波長毎に分割され、２つの光電子増倍管を用いて検出される。蛍光レーザスキャンデバイスは、Ｓｃｈｅｎａら、１９９６，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．６：６３９−６４５および本明細書に引用した他の参照に記載されている。あるいは、Ｆｅｒｇｕｓｏｎ等により１９９６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：１６８１−１６８４に記載の光ファイバーバンドルは、ｍＲＮＡ存在量レベルをモニタリングするのに用いられ得る。
【０２１４】
蛍光標的核酸が用いられる一実施形態においては、プローブアレイの領域にハイブリダイズされた蛍光標識標的を励起させるレーザを用いてアレイをスキャンしてもよく、これはその後、広範な領域のアレイスキャンのために電荷結合デバイス（「ＣＣＤ」）を用いてイメージ化され得る。あるいは、アレイからデータを収集するための、別の特に有用な方法は、容易に自動化されたプロセスの容易さおよび速度を高解像度検出と組み合わせるレーザ共焦点顕微鏡の使用による。
【０２１５】
データ収集操作に続いて、データは通常、データ解析操作に報告される。サンプル解析操作を促進するために、読み取り装置によってデバイスから得られたデータは通常、デジタルコンピュータを用いて解析される。通常、デバイスからのデータの受け取りおよび記憶、ならびに収集されたデータの解析および報告のためにコンピュータを適宜プログラムする（例えば、バックグラウンドの減算、デコンボルーションマルチカラーイメージ、アーチファクトのフラッギングまたは除去、制御が適切に行われたことの立証、シグナルの正常化、ハイブリダイズ標的の量を決定するための蛍光データの解明、バックグラウンドおよび一塩基誤対合ハイブリダイゼーションの標準化等）。好ましい実施形態において、システムは、特異的パターン、例えば、差次的遺伝子発現（例えば、赤血球生成障害を罹患している被験体の細胞の発現プロファイルと被験体の対応する健常細胞の発現プロファイルとの間）に関連するパターンを検索することを可能にする検索機能を含む。システムは、好ましくは、３つ以上のサンプル間の遺伝子発現パターンを検索することを可能にする。
【０２１６】
データを解析するための望ましいシステムは、遺伝子発現データの可視化、操作および解析のための、一般的で柔軟なシステムである。好ましくは、このようなシステムは、発現データによるブラウジングおよびナビゲーティングのためのグラフィカルユーザインターフェースを含み、ユーザが目的の遺伝子を選択的に見て強調表示することを可能にする。このシステムはまた、機能のソート機能および検索機能を含むことが好ましく、ＰＣ、ＭａｃまたはＵｎｉｘ（登録商標）ワークステーションを所有する一般的なユーザが利用可能であることが好ましい。また、システムに含まれるのが好ましいのは、既存のものより質的に効率的なクラスター化アルゴリズムである。このようなアルゴリズムの精度は、クラスター化の詳細レベルが要望通り組織的に正確であり得るように、階層的に調整されることが好ましい。
【０２１７】
様々なアルゴリズムが、遺伝子発現プロファイルデータ（例えば、行う比較の型）を解析するために利用可能である。特定の実施形態においては、共調節される遺伝子を集団化することが好ましい。このことにより、多数のプロファイルの比較が可能になる。このような遺伝子群を同定するための好ましい実施形態は、クラスター化アルゴリズムを含む（クラスター化アルゴリズムの総説については、例えば、Ｆｕｋｕｎａｇａ，  １９９０，  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ；  Ｅｖｅｒｉｔｔ，  １９７４，  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｌｏｎｄｏｎ：  Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ  Ｅｄｕｃ．  Ｂｏｏｋｓ；  Ｈａｒｔｉｇａｎ，  １９７５，  Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｗｉｌｅｙ；  Ｓｎｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｓｏｋａｌ，  １９７３，  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ，  Ｆｒｅｅｍａｎ；  Ａｎｄｅｒｂｅｒｇ，  １９７３，  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）。
【０２１８】
クラスター化解析は、何千もの時間曲線の複雑なパターンを、代表的クラスターのより小さな組に減少させるのを助けるのに有用である。幾つかのシステムは、配列に基づいて遺伝子のクラスター化および観察を可能にする。他のシステムは、遺伝子の他の特徴（例えば、その発現レベル）に基づいたクラスター化を可能にする（例えば、米国特許第６，２０３，９８７号参照）。他のシステムは、時間曲線のクラスター化を可能にする（例えば、米国特許第６，２６３，２８７号参照）。クラスター解析は、ｈｃｌｕｓｔルーチンを用いて行われてもよい（例えば、ソフトウェアパッケージＳ−Ｐｌｕｓ（ＭａｔｈＳｏｆｔ，  Ｉｎｃ．，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  Ｍａｓｓ．）からの「ｈｃｌｕｓｔ」ルーチン参照）。
【０２１９】
幾つかの特定の実施形態においては、米国特許第６，２０３，９８７号に記載されるように、遺伝子はその転写の共変動（恐らく、共調節）の程度によって分類される。共変動する転写物を有する遺伝子群は、「遺伝子組（ｇｅｎｅｓｅｔ）」と称される。クラスター解析または他の統計的分類方法は、例えば、疾患または薬物によって引き起こされる、様々な摂動に応答する遺伝子転写の共変動を解析するのに用いられ得る。ある特定の実施形態においては、クラスター化アルゴリズムは、示される共調節の量によって遺伝子を指す「類似ツリー」または「クラスター化ツリー」を構築する発現プロファイルに適用される。遺伝子組は、クラスター化ツリーの分岐階層の異なるレベルにまたがる（ｃｕｔ  ａｃｒｏｓｓ）ことによって、クラスター化ツリーの分枝上に定義する。
【０２２０】
幾つかの実施形態においては、遺伝子発現プロファイルを射影された（ｐｒｏｊｅｃｔｅｄ）遺伝子発現プロファイルに変換する。射影された遺伝子発現プロファイルは、遺伝子組発現値の集合である。幾つかの実施形態においては、各遺伝子組の中の遺伝子の発現レベルを平均化することによって、この変換を達成する。幾つかの実施形態においては、他の線形射影プロセスを用いてもよい。射影操作は、より小型で生物学的により重要な座標の組上のプロファイルを表し、各細胞成分の組にわたり測定誤差を平均化し、プロファイルの生物学的説明を補助することによって、測定誤差の影響を減少させる。
【０２２１】
（６．マイクロアレイを用いた潜在的治療剤の毒性試験）
多数の治療剤およびその薬学的組成物は、それらが投与される被検体において毒性であるか疾患を誘導する。例えば貧血は、多くの様々な癌を処置するのに用いられる化学療法の共通の副作用である。本発明のマイクロアレイは、疾患に対する候補治療剤がそれを投与される被検体に赤血球生成障害を誘導するかどうか確定する方法において用いられ得る。一実施形態においては、この方法は、ａ）被検体の赤血球系細胞を上記治療薬と接触させる工程、およびｂ）マイクロアレイを被検体の赤血球系細胞の単離核酸とハイブリダイズすることによって、処置前および処置後の遺伝子発現レベルを確定する工程であって、遺伝子発現レベルへの任意の効果によって、候補治療薬は赤血球生成障害を誘導し得ることが示唆される、工程を含む。
【０２２２】
（７．赤血球生成疾患の診断）
本発明は、被検体における赤血球生成障害の存在および／または進行をモニタリングする診断方法をさらに提供する。本発明のマイクロアレイは、赤血球生成障害の処置における使用を対象としていない治療剤候補が副作用として赤血球障害を誘導するかどうか確定する方法において使用され得る。一実施形態においては、この方法は、ａ）被検体の赤血球系細胞を上記治療薬と接触させる工程、およびｂ）処置前および処置後の遺伝子発現レベルを確定する工程であって、遺伝子発現レベルへの効果によって、候補治療薬は赤血球生成障害を誘導し得ることが示唆される、確定する工程を含む。好ましい方法は、被検体の赤血球系細胞における赤血球生成の間に差次的に発現した１つまたは複数の遺伝子の発現レベルを確定することを含む。他の方法は、赤血球生成の間に差次的に発現した、何十、何百または何千もの遺伝子の発現レベルを、例えば、マイクロアレイ技法を用いて確定することを含む。その後、遺伝子の発現レベルは、健常赤血球系細胞における同一遺伝子の発現レベルと比較される。
【０２２３】
本発明はまた、赤血球生成障害の原因を診断する診断方法を提供する。一実施形態においては、この方法は、ａ）赤血球生成障害を罹患している被検体から細胞サンプルを得る工程、ｂ）被検体の細胞における遺伝子発現レベルを確定する工程、およびｃ）被検体の細胞における遺伝子発現レベルを健常赤血球系細胞と比較する工程であって、遺伝子発現レベルの差異によって、候補治療薬は赤血球生成障害の原因を示唆し得ることが示唆される、工程を含む。
【０２２４】
本発明が意図する任意の診断方法のある実施形態においては、診断方法は、被検体の赤血球系細胞における遺伝子によってコードされたタンパク質の活性を確定し、そしてその活性を健常赤血球系細胞におけるタンパク質の活性と比較することを含む。他の実施形態においては、診断方法は、タンパク質またはｍＲＮＡＳのターンオーバーレベルを確定すること、または被検体の赤血球系細胞における翻訳レベルを確定することを含んでもよい。
【０２２５】
典型的な診断ツールおよびアッセイは、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）に記載され、これらのアッセイを行うための典型的な方法が続く。このアッセイは、必要に応じて本発明のマイクロアレイを利用してもよい。
（ｉ）  一実施形態においては、本発明は、被検体が赤血球生成障害を有する、または発生しやすいかどうか確定する方法を提供し、これは、被検体の細胞における赤血球生成の間にアップレギュレートまたはダウンレギュレートされる１つまたは複数の発現レベルを確定すること、およびこれらの発現レベルを赤血球生成障害を有することが知られる被検体の罹患細胞における遺伝子発現レベルと比較することであって、その結果、遺伝子発現レベルが類似であることによって、被検体が赤血球生成障害または少なくともその症状を有するまたは発生しやすいことが示唆される、比較することを含む。好ましい実施形態においては、細胞は、被検体の罹患細胞と本質的に同型である。
【０２２６】
（ｉｉ）別の実施形態においては、本発明のパネル中の遺伝子の発現プロファイルは、被検体が特定の型の赤血球生成障害を有すること、特に、被検体が関連疾患または類似の症状を有する疾患を罹患しないことを確認するために用いられ得る。特に、被検体に対する最適な処置レジメンを設計する際にこれは重要であり得る。ある型の疾患を類似の疾患と区別するのに発現プロファイルが用いられ得ることは、当該技術分野で記載されている。例えば、非ホジキンリンパ腫の２つのサブタイプ（一方は現在の処置方法に対応し、他方は対応しない）を、広汎性大型Ｂ細胞リンパ腫を罹患している患者の標本における１７，８５６個の遺伝子を調べることにより区別することができた（Ａｌｉｚａｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  （２０００）  ４０５：５０３）。同様に、皮膚のメラノーマのサブタイプは、８１５０個の遺伝子のプロファイルに基づいて予測された（Ｂｉｔｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  （２０００）  ４０６：５３６）。この場合、非常に攻撃的な転移性メラノーマの特性を認識することができた。癌細胞と健常細胞の発現プロファイルを比較する多数の他の研究が記載されており、これは、高転移性癌と低（ｌｅｓｓ）転移性癌とを区別する発現プロファイルを記載する研究、および疾患の新規サブタイプ（例えば、新規腫瘍型）を記載する研究を含む（例えば、Ｐｅｒｏｕ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  ＰＮＡＳ  ９６：  ９２１２；  Ｐｅｒｏｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｎａｔｕｒｅ  ６０６：７４７；  Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｎａｔｕｒｅ  ４０６：５３２；  Ａｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  ＰＮＡＳ  ９６：６７４５；  Ｇｏｌｕｂ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６：５３１参照）。
【０２２７】
したがって、本発明の発現プロファイルは、特定の赤血球生成障害の関連疾患との区別を可能にする。好ましい実施形態においては、発現が赤血球生成障害に特有である１つまたは複数の遺伝子の発現レベルは、被検体の細胞において確定される。さらにより好ましい実施形態においては、赤血球生成に関連する遺伝子の本質的に全ての発現レベルは、例えば、表Ｉで同定された遺伝子の全てまたは本質的に全てに対応するプローブを含むマイクロアレイを用いて、被検体の細胞において確定される。赤血球生成障害を罹患している被検体の細胞中の発現レベルと類似する、赤血球生成に関連する（関連疾患でない）１つまたは複数の遺伝子の発現レベルは、赤血球障害に関連する疾患または赤血球障害に類似の症状を有する疾患でなく、赤血球生成障害を有する患者を示唆する。
【０２２８】
被検体が赤血球生成障害または関連疾患を有するかどうか確定するこの方法を使用する前に、赤血球生成障害に類似の疾患の細胞、および伝統的な（すなわち、マイクロアレイ系ではない）方法で診断されるような肺癌を有する多数の被検体からの細胞の発現プロファイルを初めに確定することが必要であり得る。これは、本明細書においてさらに説明される方法に従って、赤血球生成の間に差次的に発現した遺伝子のパネルを含むマイクロアレイを用いて行われてもよい。
（ｉｉｉ）さらに別の実施形態においては、本発明は、被検体に赤血球生成障害を誘導する特定の療法の成功の可能性を確定する方法を提供する。一実施形態においては、被検体に対して特定の療法が開始され、例えば、発現が被検体の赤血球系細胞における赤血球生成の間に差次的に調節される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルを確定することによって、療法の有効性を確定する。これらの遺伝子の発現レベルへの影響は、すなわち、発現レベルが罹患細胞と類似するような遺伝子発現レベルの変化は、処置が被検体における赤血球生成障害を誘導し得ることを示唆する。一方、赤血球生成に関連する遺伝子の発現レベルへの影響がないことは、処置が被検体における赤血球生成障害を誘導しそうにないことを示唆する。
【０２２９】
また、被検体における赤血球生成処置の成果の予測は、インビトロで行われてもよい。一実施形態においては、処置への反応性に関して評価するために細胞を被検体から得て、治療薬物と共にインビトロでインキュベートする。その後、赤血球生成に関連する１つまたは複数の遺伝子の発現レベルを細胞内で測定し、これらの値を、罹患細胞に対応する健常細胞である細胞における１つまたは複数の遺伝子の発現レベルと比較する。また、発現レベルは健常細胞と比較されてもよい。好ましい実施形態においては、赤血球生成の間に発現が差次的に調節される本質的に全ての遺伝子（すなわち、表Ｉ、表ＩＩおよび表ＩＩＩに示される遺伝子）の発現レベルを確定する。比較解析は、罹患細胞および／または健常細胞における赤血球生成障害に特有の、少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを含むデータベースを含むコンピュータを用いて行われることが好ましい。発現が健常細胞における発現レベルと類似し、罹患細胞における発現レベルとは異なる、薬物と共にインキュベートした後の被検体の細胞における赤血球生成障害に特有である、１つまたは複数の遺伝子の発現レベルは、被検体が薬物での処置に確実に応答しそうであることを示唆する。これに対して、発現が罹患細胞における発現レベルと類似し、健常細胞における発現レベルとは異なる、薬物と共にインキュベートした後の被検体の細胞における赤血球生成障害に特有である、１つまたは複数の遺伝子の発現レベルは、被検体が薬物での処置に確実に応答しそうにないことを示唆する。
【０２３０】
赤血球生成障害を処置するための薬物が、罹患細胞に直接作用しないが例えば代謝される、あるいは、その後罹患細胞に影響を与える因子を分泌する別の細胞に作用することが起こり得るため、上記アッセイは、罹患細胞以外の細胞を含む被検体の組織サンプルにおいて行われてもよい。例えば、罹患細胞を含む組織サンプルを被検体から得て、組織サンプルを可能な薬物と共にインキュベートし、必要に応じて、１つまたは複数の罹患細胞を、例えば顕微解剖またはＬａｓｅｒ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ（ＬＣＭ、以下を参照）によって、組織サンプルから単離し、発現が赤血球生成障害に特有である１つまたは複数の遺伝子の発現レベルを調べる。
【０２３１】
（ｉｖ）本発明はまた、幾つかの異なる処置の選択から患者に対する赤血球生成障害用の療法を選択する方法を提供し得る。赤血球生成障害を有するある被検体は、別の型の療法よりも１つの型の療法により応答し得る。好ましい実施形態においては、この方法は、患者の肺癌に特有の少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを、幾つかの治療薬物の１つによりインビトロまたはインビボで処置された被検体（被検体は、治療薬物の１つに対して応答するまたは応答しない）の細胞における発現レベルと比較すること、および１つまたは複数の遺伝子の、患者の発現レベルと最も類似の発現レベルを有する細胞を同定することを含むことにより、患者のための療法を同定する。さらにこの方法は、被検体に同定された療法を投与することを含む。
【０２３２】
当業者は、ある診断および予後アッセイにおいては、赤血球生成障害に特有の１つの遺伝子の発現レベルを評価すれば十分であり、他のアッセイにおいては２つ以上の発現が好ましく、一方さらに他のアッセイにおいては赤血球生成の間に差次的に発現した本質的に全ての遺伝子の発現レベルが評価されるのが好ましいことを理解する。
【０２３３】
例えば上記方法における使用のための、赤血球生成の間に差次的に発現した１つまたは複数の遺伝子の発現レベルを確定するのに用いられ得る典型的な方法を以下に述べる。例えば、遺伝子の発現レベルは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）；ドットブロット解析；ノーザンブロット解析およびインサイチュハイブリダイゼーションによって確定され得る。好ましい実施形態においては、発現レベルは、赤血球生成の間にアップレギュレートまたはダウンレギュレートされた遺伝子のプローブを含むマイクロアレイを用いることによって確定される。別の実施形態においては、赤血球生成の間にアップレギュレートまたはダウンレギュレートされた１つまたは複数の遺伝子によりコードされたタンパク質のレベルは、罹患型の細胞において確定される。これは、様々な方法（例えば、免疫組織化学）によって行われ得る。
【０２３４】
（７．１．発現が赤血球生成障害に特有の遺伝子の発現レベルを確定するためのマイクロアレイの使用）
一般に、マイクロアレイを用いて発現プロファイルを確定することは、以下の：（ａ）被検体からｍＲＮＡサンプルを得て、それから標識核酸を調製する工程（「標的核酸」または「標的」）；（ｂ）標的核酸がアレイ上の対応するプローブと、例えばハイブリダイゼーションまたは特異的結合によって結合するのに十分な条件下で標的核酸をアレイと接触させる工程；（ｃ）必要に応じて、非結合標的をアレイから除去する工程；および（ｄ）結合標識を検出し、例えばコンピュータベースの解析方法を用いて結果を解析する工程を含む。本明細書において用いられる場合、「核酸プローブ」または「プローブ」は、アレイに付着した核酸であるのに対して、「標的核酸」は、アレイにハイブリダイズした核酸である。これらの工程のそれぞれを以下詳細に説明する。
【０２３５】
（ｉ）被検体のｍＲＮＡサンプルの取得
核酸標本は、「侵襲的」サンプリング手段または「非侵襲的」サンプリング手段のいずれかを用いて、試験される個体から得られ得る。サンプリング手段は、動物（特に、マウス、ヒト、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、イヌまたはネコ科の動物等）の皮膚または臓器内から核酸を採取することを含む場合に「侵襲的」であると言われる。侵襲的方法の例としては、血液採取、精液採取、針生検、胸膜吸引、臍帯生検等が挙げられる。このような方法の例は、Ｋｉｍ，  Ｃ．Ｈ．等によって考察されている（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６６：３８７９−３８８２  （１９９２））；  Ｂｉｓｗａｓ，  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．  （Ａｎｎａｌｓ  ＮＹ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ５９０：５８２−５８３  （１９９０））；  Ｂｉｓｗａｓ，  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．  （Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２９：２２２８−２２３３  （１９９１））。
【０２３６】
一実施形態においては、試験される被検体から１つまたは複数の細胞を得て、細胞からＲＮＡを単離する。好ましい実施形態においては、細胞のサンプルは被検体から得られる。細胞を得る場合、主に所望の型の細胞、例えば、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、さらにより好ましくは少なくとも約７０％、８０％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％の細胞が所望の型の細胞である細胞のサンプルを含むサンプルを得るのが好ましい。このようなサンプルは明確な遺伝子発現データを提供する可能性があるため、所望の型の細胞の比率が高いことが好ましい。血液サンプルは、当該技術分野で既知の方法により得られ得る。
【０２３７】
被検体から細胞サンプルを得て、その後それを所望の細胞型に濃縮する（ｅｎｒｉｃｈ）ことも可能である。例えば、様々な技法（例えば、所望の細胞型の細胞表面上のエピトープと結合する抗体を用いた単離）を用いて細胞を他の細胞から単離してもよい。
【０２３８】
一実施形態においては、ＲＮＡは１つの細胞から得られる。被検体から細胞を得て、インビトロで細胞を培養すること、例えば、ＲＮＡが抽出され得る細胞の大型集団を得ることも可能である。非形質転換細胞の培養（すなわち、一次細胞培養）を確立する方法は、当該技術分野で知られている。
【０２３９】
ＲＮＡを組織サンプルまたは個体からの細胞から単離する場合、組織または細胞が被検体から除去された後の遺伝子発現のさらなる変化を防止することが重要であり得る。発現レベルの変化は、摂動（例えば、熱ショックまたはリポ多糖（ＬＰＳ）または他の試薬による活性化）後に急速に変化することが知られている。さらに、組織および細胞中のＲＮＡは、素早く分解状態になり得る。したがって、好ましい実施形態においては、被検体から得られた細胞をできるだけ早く急速（ｓｎａｐ）凍結する。
【０２４０】
ＲＮＡは、様々な方法に（例えば、グアニジンチオシアネート溶解した後、ＣｓＣｌ遠心すること（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７９，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １８：５２９４−５２９９））によって組織サンプルから抽出され得る。１つの細胞からのＲＮＡは、１つの細胞からｃＤＮＡライブラリーを調製する方法に記載されるように得られ得る（例えば、Ｄｕｌａｃ，  Ｃ．  （１９９８）  Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．  ３６，  ２４５およびＪｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９０：１９９に記載）。例えば、ＲＮＡｓｉｎを含有させること（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）によって、ＲＮＡの分解を回避するように注意を払わねばならない。
【０２４１】
その後、ＲＮＡサンプルは特定の種に濃縮され得る。一実施形態においては、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、ＲＮＡサンプルから単離される。一般に、このような精製は、ｍＲＮＡ上のポリ（Ａ）尾部を利用する。特に上記のように、ポリＴオリゴヌクレオチドを、個体支持体上に固相化してｍＲＮＡのためのアフィニティリガンドとして働かせてもよい。この目的のためのキットは市販されている（例えば、ＭｅｓｓａｇｅＭａｋｅｒキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，  ＮＹ））。
【０２４２】
好ましい実施形態においては、ＲＮＡ集団は目的の配列（例えば、赤血球生成の間に差次的に発現した遺伝子の配列）に濃縮される。濃縮は、例えば、プライマー特異的ｃＤＮＡ合成、またはｃＤＮＡ合成およびテンプレート誘導性インビトロ転写に基づく複数回の線形増幅によって行われてもよい（例えば、上記Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  ＰＮＡＳ  ８６，  ９７１７；  Ｄｕｌａｃ  ｅｔ  ａｌ．および上記Ｊｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．参照）。
【０２４３】
特定の種あるいは配列に濃縮されたまたはされていないＲＮＡ集団は、さらに増幅され得る。このような増幅は、１つのまたは数個の細胞からのＲＮＡを用いる場合に特に重要である。様々な増幅方法が本発明の方法における使用に適しており、例えば、ＰＣＲ；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４，５６０（１９８９），Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１，１０７７（１９９８））；自律配列複製（ＳＳＲ）（例えば、Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，１８７４（１９９０）参照）；核酸系配列増幅（ＮＡＳＢＡ）および転写増幅（例えば、Ｋｗｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６，１１７３（１９８９）参照）が挙げられる。ＰＣＲ技法に関しては、例えば、ＰＣＲ技法（ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）：ＤＮＡ増幅の原理と応用（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ編，Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．，１９９２）；ＰＣＲプロトコル（ＰＣＲ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）：方法および応用の手引き（Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）（Ｉｎｎｉｓ，ｅｔ  ａｌ．編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，１９９０）；Ｍａｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）１９，４９６７（１９９１）；Ｅｃｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＲの方法および応用（ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）１，１７（１９９１）；ＰＣＲ（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．編，ＩＲＬ  ｐｒｅｓｓ  Ｏｘｆｏｒｄ）；および米国特許第４，６８３，２０２号参照。増幅方法は、例えば、Ｏｈｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｉｏ  Ｔｈｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２９：５３０；Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５，１１７；Ｈｅｇｄｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２９：５４８；Ｋａｃｈａｒｍｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．３０３：３；Ｌｉｖｅｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１０：３０１；Ｓｐｉｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４０：３１０８；およびＳａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８７：３２に記載されている。また、ＲＮＡ増幅およびｃＤＮＡ合成は、ｉｎ  ｓｉｔｕで細胞で行われ得る（例えば、Ｅｂｅｒｗｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ＰＮＡＳ  ８９：３０１０参照）。
【０２４４】
定量的結果が望まれる場合、いかなる増幅方法を用いたとしても、定量的増幅を達成する増幅核酸の相対頻度を維持または制御する方法を使用するように注意を払わねばならないことを当業者は理解する。「定量的」増幅の方法は、当業者には周知である。例えば、定量的ＰＣＲは、同一のプライマーを用いて既知量の対照配列を同時に共増幅することを含む。これは、ＰＣＲ反応を較正するのに用いられ得る内部標準を提供する。次いで、高密度アレイは、増幅核酸の定量のための内部標準に特異的なプローブを含み得る。
【０２４５】
好ましい内部標準の１つは、合成ＡＷ１０６ｃＲＮＡである。ＡＷ１０６ＥＲＮＡは、当業者に公知の標準技法に従ってサンプルから単離されたＲＮＡと結合させる。次いで、逆転写酵素を用いてＲＮＡを転写してコピーＤＮＡを提供する。次いで、標識プライマーを用いて（例えばＰＣＲによって）ｃＤＮＡ配列を増幅する。増幅産物を、通常は電気泳動によって分離し、放射活性の量（増幅産物の量に比例）を確定する。次いで、サンプル中のｍＲＮＡの量は、既知のＡＷ１０６ＲＮＡ標準により生成されたシグナルと比較することによって算出される。定量的ＰＣＲの詳細なプロトコルは、ＰＣＲプロトコル、方法および応用の手引き（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）（Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．，（１９９０））に記載されている。
【０２４６】
好ましい実施形態においては、逆転写酵素ならびにオリゴ（ｄＴ）およびファージＴ７プロモータをコードする配列から成るプライマーとを用いて、サンプルｍＲＮＡを逆転写し、一本鎖ＤＮＡテンプレートを提供する。第二のＤＮＡ鎖は、ＤＮＡポリメラーゼを用いて重合する。二本鎖ｃＤＮＡの合成後、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを追加し、ＲＮＡをｃＤＮＡテンプレートから転写する。それぞれ１つのｃＤＮＡテンプレートからの転写を数回行うことによりにより、ＲＮＡが増幅される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ重合の方法は、当業者には周知であり（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（上記）参照）、この特定の方法は、この方法によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅が様々なＲＮＡ転写物の相対頻度を提供することを示す、Ｖａｎ  Ｇｅｌｄｅｒ等によって詳細に記載されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：１６６３−１６６７（１９９０））。さらに、Ｅｂｅｒｗｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：３０１０−３０１４は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を介した２回の増幅を用いて、最初の出発材料の１０６倍を超える増幅を達成し、生体サンプルが限定される場合でさえ発現モニタリングを可能にするプロトコルを提供する。
【０２４７】
当業者は、上記の直接転写方法によってアンチセンス（ａＲＮＡ）プールが提供されることを理解する。標的核酸としてアンチセンスＲＮＡが用いられる場合、アレイに提供されたオリゴヌクレオチドプローブは、アンチセンス核酸の部分配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）に相補的であるように選択される。逆に、標的核酸プールがセンス核酸のプールである場合、オリゴヌクレオチドプローブはセンス核酸の部分配列に相補的であるように選択される。最後に、核酸プールが二本鎖である場合、プローブは、センス鎖およびアンチセンス鎖の双方を含む標的核酸としてどちらか一方のセンスのものであり得る。
【０２４８】
（（ｉｉ）解析される核酸の標識）
一般に、標的分子を標識して標的分子のマイクロアレイへのハイブリダイゼーションの検出を可能にする。標識されることは、プローブがシグナル生成系のメンバーを含み、それにより直接またはシグナル生成系の１つまたは複数の追加メンバーとの結合作用を介して検出可能となることを意味する。直接検出可能な標識の例としては、ヌクレオチドモノマー単位（例えば、プライマーのｄＮＭＰ）またはプローブ分子の機能的部位に結合し得る検出可能な標識の光活性または化学的に活性な誘導体等の、プローブの部分に組み込まれた（通常は共有結合した）同位体および蛍光部分が挙げられる。
【０２４９】
核酸は、ＲＮＡの濃縮および／または増幅の後またはその間に標識され得る。例えば、標識ｃＤＮＡは、オリゴｄＴプライマーを用いた（ｏｌｉｇｏ  ｄＴ−ｐｒｉｍｅｄ）またはランダムプライマーを用いた（ｒａｎｄｏｍ−ｐｒｉｍｅｄ）逆転写によってｍＲＮＡから調製され、これらの双方は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｋｌｕｇ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇｅｒ，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３１６−３２５参照）。逆転写は、検出可能な標識と結合したｄＮＴＰ、最も好ましくは蛍光標識ｄＮＴＰの存在下で行われ得る。あるいは、単離ｍＲＮＡは、標識ｄＮＴＰの存在下で二本鎖ｃＤＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって合成された標識アンチセンスＲＮＡに変換され得る（Ｌｏｃｋｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，高密度オリゴヌクレオチドアレイへのハイブリダイゼーションによる発現のモニタリング（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｂｙ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｒｒａｙｓ）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：１６７５（あらゆる目的のためにその全体を本明細書に参考として援用する））。代替的実施形態においては、ｃＤＮＡまたはＲＮＡプローブを検出可能な標識の非存在下において合成した後、例えばビオチン化ｄＮＴＰまたはｒＮＴＰを組み込むことによって、または何らかの類似手段（例えば、ビオチンのソラレン誘導体のＲＮＡへの光架橋）によって標識してもよく、次いで標識ストレプトアビジン（例えば、フィコエリスリン結合ストレプトアビジン）または等価物を付加する。
【０２５０】
一実施形態においては、標識ｃＤＮＡは、逆転写酵素（例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ．（登録商標）．ＩＩ、ＬＴＩ  Ｉｎｃ．）と共に、０．５ｍＭのｄＧＴＰ、ｄＡＴＰおよびｄＣＴＰならびに０．１ｍＭｄＴＴＰおよび蛍光デオキシリボヌクレオチド（例えば、０．１ｍＭのローダミン１１０  ＵＴＰ（Ｐｅｒｋｅｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ）または０．１ｍＭのＣｙ３  ｄＵＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ））を含む混合物を４２℃で６０分間インキュベートすることによって合成される。
【０２５１】
目的の蛍光部分または標識としては、クマリンおよびその誘導体（例えば、７−アミノ−４−メチルクマリン、アミノクマリン）、ボディピー（ｂｏｄｉｐｙ）染料（Ｂｏｄｉｐｙ  ＦＬ等）、カスケードブルー、フルオレセインおよびその誘導体（例えば、フルオレセインイソチオシアネート）、オレゴングリーン、ローダミン染料（例えば、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、エオシン、およびエリスロシン）、シアニン染料（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７）、ＦｌｕｏｒＸ、ランタニドイオンの大環状キレート（例えば、クアンタム染料（登録商標））、蛍光エネルギー遷移染料（チアゾールオレンジ−エチジウムヘテロダイマー）、ＴＯＴＡＢ、ダンシル等が挙げられる。本発明の装置またはアッセイにおいて望ましく検出されるエレメントと結合する機能を有する、またはこのような機能を含むように修飾され得る各蛍光化合物は、例えば、ダンシルクロライド；３，６−ジヒドロキシ−９−フェニルキサンチドロール；ローダミンイソチオシアネート；Ｎ−フェニル１−アミノ−８−スルホナトナフタレン；Ｎ−フェニル−２−アミノ−６−スルホナトナフタレン；４−アセトアミド−４−イソチオシアナート−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸；ピレン−３−スルホン酸；２−トルイジノナフタレン−６−スルホネート；Ｎ−フェニル−Ｎ−メチル−２−アミノフタレン−６−スルホネート；臭化エチジウム；ステブリン；オーラミン−０，２−（９’−アンスロイル）パルミテート；ダンシルホスファチジルエタノールアミン；Ｎ，Ｎ’−ジオクタデシルオキサカルボシアニン：Ｎ，Ｎ’−ジヘキシルオキサカルボシアニン；メロシアニン，４−（３’−ピレニル）ステアレート；ｄ−３−アミノデソキシ−エクイレニン；１２−（９’−アンスロイル）ステアレート；２−メチルアントラセン；９−ビニルアントラセン；２，２’（ビニレン−ｐ−フェニレン）ビスベンズオキサゾール；ｐ−ビス（２−−メチル−５−フェニル−オキサゾリル））ベンゼン；６−ジメチルアミノ−１，２−ベンゾフェナジン；レチノール；ビス（３’−アミノピリジニウム）１，１０−デカンジルジヨージド；ヘリブリエニン（ｈｅｌｌｉｂｒｉｅｎｉｎ）のスルホナフチルヒドラゾン；クロロテトラサイクリン；Ｎ−（７−ジメチルアミノ−４−メチル−２−オキソ−３−クロロメチル）マレイミド；Ｎ−（ｐ−（２ベンズイミダゾリル）−フェニル）マレイミド；Ｎ−（４−フルオランチル）マレイミド；ビス（ホモバニリン酸）；レサザリン；４−クロロ−７−ニトロ−２，１，３−ベンゾオキサゾール；メロシアニン５４０；レゾルフィン；ローズベンガル；および２，４−ジフェニル−３（２Ｈ）−フラノン等のフルオレセインが挙げられる（例えば、Ｋｒｉｃｋａ，１９９２，非同位体ＤＮＡプローブ技法（Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ），  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．参照）。多数の蛍光タグは、ＳＩＧＭＡ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．），Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐ���ｌｉｓ，Ｍｉｎｎ．），Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．），ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．），Ｃｈｅｍ  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｒｏｐ．，Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓ．），Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ，Ｍｄ．），Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｃａ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｋａ  Ａｎａｌｙｔｉｋａ（Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＡＧ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ），およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）の他に、当業者に既知の他の市販元から市販されている。
【０２５２】
化学発光標識としては、ルシフェリンおよび２，３−ジヒドロフタラジンジオン類（例えば、ルミノール）が挙げられる。
【０２５３】
目的の同位体部分または標識としては、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、２Ｈ、１４Ｃ等が挙げられる（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５、高密度ｃＤＮＡフィルター解析（Ｈｉｇｈ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｃＤＮＡ  ｆｉｌｔｅｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ）：遺伝子発現の大規模かつ定量的解析の新規アプローチ（ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ，  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）、Ｇｅｎｅ  １５６：２０７；Ｐｉｅｔｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６、高密度ｃＤＮＡアレイの定量的ハイブリダイゼーションにより解明されたヒト筋肉において選択的に発現した新規遺伝子転写物（Ｎｏｖｅｌ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｍｕｓｃｌｅｓ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｉｇｈ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｃＤＮＡ  ａｒｒａｙ）、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．６：４９２参照）。しかしながら、放射活性粒子の散乱、およびその結果広く離間した結合部位が必要であることのために、放射性同位体の使用は、あまり好ましくない実施形態である。
【０２５４】
また、標識は、検出可能なシグナルを提供する同一のシステムの１つまたは複数の追加メンバーに呼応して作用する、シグナル生成システムのメンバーであり得る。このような標識の具体例は、例えば、ビオチン、フルオレセイン、ジゴキシゲニン、抗原、多価カチオン、キレーター群等のリガンド等の特異的結合ペアのメンバーであり、このメンバーはシグナル生成システムの追加メンバーと特異的に結合し、この場合、追加メンバーは直接または間接的に検出可能なシグナルを提供する（例えば、蛍光部分または基質を発色産物に変換することが可能な酵素部位と結合された抗体（例えば、アルカリホスファターゼ結合抗体等））。
【０２５５】
目的の追加標識は、関連するプローブが標的分子に特異的に結合する場合にのみシグナルを提供するものを含み、このような標識としては、Ｔｙａｇｉ  ＆  Ｋｒａｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９６）１４：３０３およびヨーロッパ特許公報第００７０６８５Ｂ１号に記載されるような、「分子ビーコン」が挙げられる。目的の他の標識としては、米国特許第５，５６３，０３７号；国際公開第９７／１７４７１号および国際公開第９７／１７０７６号に記載されるものである。
【０２５６】
幾つかの実施形態においては、ハイブリダイズした標的核酸は、ハイブリダイゼーション後に標識されてもよい。例えば、ビオチン標識ｄＮＴＰを、例えば増幅または転写に用いる場合、ストレプトアビジン結合レポーター基を、ハイブリダイズした複合体を標識するのに用いてもよい。
【０２５７】
他の実施形態においては、標的核酸は標識されない。この場合、ハイブリダイゼーションは、例えばＴｈｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６９：４９４８に記載されるように、例えばプラズモン共鳴によって確定され得る。
【０２５８】
一実施形態においては、標的核酸の複数（例えば、２、３、４、５またはそれ以上）の組を標識し、１つのハイブリダイゼーション反応に用いる（「多重」解析）。例えば、核酸の１つの組は、１つの細胞からのＲＮＡに対応し、核酸の別の組は、別の細胞からのＲＮＡに対応し得る。核酸の複数の組は、それらを区別し得るように、異なる標識（例えば、別個の発光スペクトルを有する、異なる蛍光標識）で標識されてもよい。その後、この組を混合し、１つのマイクロアレイに同時にハイブリダイズする。
【０２５９】
例えば２つの異なる細胞は、罹患赤血球系細胞および対応する健常細胞であり得る。あるいは、２つの異なる細胞は、赤血球生成障害を有する患者の罹患赤血球系細胞と赤血球生成障害を有する疑いのある患者の罹患赤血球系細胞であり得る。別の実施形態においては、１つの生体サンプルは薬物に暴露し、別の同型の生体サンプルは薬物に暴露しない。２つの細胞型のそれぞれ由来のｃＤＮＡは、それらが区別されるように異なって標識される。一実施形態においては、例えば罹患細胞からのｃＤＮＡは、蛍光標識ｄＮＴＰを用いて合成され、第二の細胞（すなわち、健常細胞）からのｃＤＮＡは、ローダミン標識ｄＮＴＰを用いて合成される。２つのｃＤＮＡを混合してマイクロアレイにハイブリダイズすると、各ｃＤＮＡ組からのシグナルの相対強度がアレイ上の各部位に対して確定され、特定のｍＲＮＡの存在量の相対的差異が検出される。
【０２６０】
上記の例において、蛍光体が刺激されると、罹患赤血球系細胞からのｃＤＮＡは蛍光緑を発し、赤血球生成障害を有する疑いのある被検体の細胞からのｃＤＮＡは蛍光赤を発する。結果として、２つの細胞が本質的に同一である場合は、特定のｍＲＮＡは双方の細胞において均等に行きわたっており、逆転写の場合は、赤標識ｃＤＮＡおよび緑標識ｃＤＮＡは均等に行きわたる。マイクロアレイにハイブリダイズされると、そのＲＮＡ種に対する結合部位（単数または複数）は、双方の蛍光体に特有の波長を放出する（そして組み合わせて茶色が現れる）。逆に、２つの細胞が異なる場合は、緑蛍光と赤蛍光との比は異なる。
【０２６１】
２色蛍光標識および遺伝子発現における変更を定義する検出スキームの使用は、例えば、Ｓｈｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５、相補的ＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子発現パターンの定量的モニタリング（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４６７−４７０、に記載されている。２つの異なる蛍光体で標識されたｃＤＮＡを用いることの利点は、２つの細胞状態における各アレイ遺伝子と対応するｍＲＮＡレベルの、直接的な内部制御（ｉｎｔｅｒｎａｌｌｙ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ）比較がなされ得ることであり、実験条件（例えば、ハイブリダイゼーション条件）の軽微な差異による変化は、次の解析に影響を与えない。
【０２６２】
複数の標的核酸を１つのアレイにハイブリダイズする場合、使用のための区別可能な標識の例は当該技術分野で周知であり、２つ以上の異なる放出波長の蛍光染料（Ｃｙ３とＣｙ５等）、蛍光タンパク質および染料の組み合わせ（フィコエリスリンとＣｙ５等）、異なる放出エネルギーを有する２つ以上の同位体（３２Ｐと３３Ｐ等）、異なる散乱スペクトルを有する金または銀粒子、異なる治療条件下（温度、ｐＨ、追加化学薬剤による治療等）でシグナルを生成する、または治療後に異なる時点でシグナルを生成する標識が挙げられる。シグナルを生成するための１つまたは複数の酵素を使用することにより、酵素（アルカリホスファターゼ／ペルオキシダーゼ）の異なる基質特異性に基づき、さらに多くの様々な区別可能な標識の使用が可能になる。
【０２６３】
さらに、実験誤差を減少させるために、２色差次的ハイブリダイゼーション実験において蛍光標識を交換し、各遺伝子またはアレイスポットの位置に特有の偏りを減少させることが好ましい。すなわち、測定される２つの細胞からのｍＲＮＡを標識（例えば、第一の細胞からの核酸を第一の蛍光色素で、および第二の細胞からの核酸を第二の蛍光色素で標識）して遺伝子発現を最初に測定し、その後、交換標識（例えば、第一の細胞からの核酸を第二の蛍光色素で、および第二の細胞からの核酸を第一の蛍光色素で標識）で２つの細胞からの遺伝子発現を測定することが好ましい。暴露レベルおよび摂動制御パラメータレベル全体を複数回測定することにより、さらなる実験誤差制御を提供する。
【０２６４】
標識核酸の質は、アレイへのハイブリダイゼーションの前に評価されてもよい。例えば、標識核酸のサンプルを、核酸サンプルに存在することが知られるまたは存在する疑いのある遺伝子の５’位、中間位置および３’位由来のプローブとハイブリダイズしてもよい。これは、標識核酸が全長核酸であるか、または標識核酸が分解しているかに関して示唆する。一実施形態においては、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｔｅｓｔ３  Ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  （Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）製）をこの目的のために用いてもよい。このアレイは、哺乳動物を含む幾つかの生物体からの特性化された遺伝子のサブセットを表すプローブを含む。したがって、標識核酸サンプルの質は、サンプルのフラクションのアレイ（例えば、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｔｅｓｔ３  Ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）製））へのハイブリダイゼーションによって確定され得る。
【０２６５】
（７．２．遺伝子発現レベルを確定する他の方法）
特定の実施形態では、何百または何千という遺伝子ではなく１つのまたはごくわずかな遺伝子の発現を確定するだけで十分である。これらの実施形態ではマイクロアレイが用いられ得るが、遺伝子発現を検出する様々な他の方法が利用可能である。このセクションでは、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡによりコードされるポリペプチドを検出および定量する幾つかの例示的な方法を説明する。これらの方法の第一のステップが細胞からのｍＲＮＡの単離を含む場合、このステップは上記のように行われ得る。１つまたは複数の核酸の標識は上記のように行われ得る。
【０２６６】
一実施形態では、サンプルから得られるｍＲＮＡを第一のｃＤＮＡ鎖に逆転写して、ＰＣＲ、例えばＲＴ−ＰＣＲに付す。ハウスキーピング遺伝子または発現が変化しない他の遺伝子を内部対照および実験全体の対照として用いることができる。ＰＣＲ反応後に、増幅産物を電気泳動により分離して検出し得る。定量的ＰＣＲを用いることにより、増幅産物レベルが、サンプル中に存在したＲＮＡのレベルと相関する。増幅サンプルもまた、アガロースまたはポリアクリルアミドゲルで分離し、フィルターに移してよく、このフィルターは目的の遺伝子に特異的なプローブとハイブリダイズされる。並行ＰＣＲ増幅により、例えばマルチプレックスＰＣＲにより、多くのサンプルを同時に解析することができる。
【０２６７】
別の実施形態では、ｍＲＮＡレベルはドットブロット解析および関連の方法により確定される（例えば、Ｇ．Ａ．Ｂｅｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１００，Ｐａｒｔ  Ｂ，Ｒ．Ｗｕ，Ｌ．Ｇｒｏｓｓｍａｍ，Ｋ．Ｍｏｌｄａｖｅ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １９，ｐｐ．２６６−３０８，１９８５参照）。一実施形態では、細胞から抽出した指定量のＲＮＡをフィルターにブロットし（すなわち非共有結合）、フィルターを目的の遺伝子のプローブとハイブリダイズする。ブロットは複数のＲＮＡスポットを含み得るため、多くのＲＮＡサンプルを同時に解析することができる。ハイブリダイゼーションは、プローブの標識のタイプに応じた方法を用いて検出される。別のドットブロット法では、赤血球生成の間に発現が差次的に調節される１つまたは複数の遺伝子の１つまたは複数のプローブを膜に結合させ、その膜を被検体の細胞または組織のＲＮＡから得られるかまたは任意に由来する標識核酸と共にインキュベートする。このようなドットブロットは本質的に、マイクロアレイよりも少ないプローブを含むアレイである。
【０２６８】
「ドットブロット」ハイブリダイゼーションは広く使用され、多くのバージョンが開発された（例えば、Ｍ．Ｌ．Ｍ．  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｂ．Ｄ．  Ｙｏｕｎｇ，  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｂ．Ｄ．  Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｓ．Ｊ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ，  Ｅｄｓ．，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ４，  ｐｐ．７３−１１１，  １９８５参照）。
【０２６９】
別の形式の、いわゆる「サンドイッチ」ハイブリダイゼーションは、オリゴヌクレオチドプローブを固体支持体に共有結合させること、および複数の核酸標的を捕捉および検出するためにそれらを用いることを含む（例えば、Ｍ．  Ｒａｎｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ，  ２１，  ｐｐ．  ７７−８５，  １９８３；  Ａ．Ｍ．  Ｐａｌｖａ，  Ｔ．Ｍ．  Ｒａｎｋｉ，  ａｎｄ  Ｈ．Ｅ．  Ｓｏｄｅｒｌｕｎｄ，  ｉｎ  ＵＫ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ＧＢ  ２１５６０７４Ａ，  Ｏｃｔ．  ２，  １９８５；  Ｔ．  Ｍ．  Ｒａｎｋｉ  ａｎｄ  Ｈ．Ｅ．  Ｓｏｄｅｒｌｕｎｄ  ｉｎ  Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ４，５６３，４１９，  Ｊａｎ．  ７，  １９８６；  Ａ．Ｄ．Ｂ．  Ｍａｌｃｏｌｍ  ａｎｄ  Ｊ．Ａ．  Ｌａｎｇｄａｌｅ，  ｉｎ  ＰＣＴ  ＷＯ  ８６／０３７８２，  Ｊｕｌ．  ３，  １９８６；  Ｙ．  Ｓｔａｂｉｎｓｋｙ，  ｉｎ  Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ４，７５１，１７７，  Ｊａｎ．  １４，  １９８８；  Ｔ．Ｈ．  Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ｉｎ  ＰＣＴ  ＷＯ  ９０／０１５６４，  Ｆｅｂ．２２，  １９９０；  Ｒ．Ｂ．  Ｗａｌｌａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．  ６  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  １１，  ｐ．  ３５４３，  １９７９；  ａｎｄ  Ｂ．Ｊ．  Ｃｏｎｎｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ８０  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ｐｐ．２７８−２８２，  １９８３参照）。これらの形式の多重バージョンは、「リバースドットブロット」と呼ばれる。
【０２７０】
ｍＲＮＡレベルは、ノーザンブロットによっても確定することができる。指定量のＲＮＡをゲル電気泳動により分離してフィルターに移し、次にこれを、目的の遺伝子に対応するプローブとハイブリダイズする。この方法は、多くのサンプルおよび遺伝子を解析する場合にはより煩わしいが、非常に正確であるという利点をもたらす。
【０２７１】
高スループットの遺伝子発現解析の好ましい方法は、ＳＡＧＥ（ｓｅｒｉａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）法であり、これはＶｅｌｃｕｌｅｓｃｕ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０，  ４８４−４８７に最初に記載された。ＳＡＧＥの利点としては、所与の細胞型で発現した全遺伝子を検出することができ、かかる遺伝子の相対的発現に関する定量的情報を提供し、２つの細胞中の遺伝子の遺伝子発現を容易に比較でき、検出された遺伝子を同定するのに用いられ得る配列情報が得られることが挙げられる。これまで、ＳＡＧＥの手法は、様々な細胞型における調節された遺伝子および調節されていない遺伝子の発現を確実に検出することがわかっている（Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕら（１９９７）Ｃｅｌｌ  ８８，２４３−２５１；Ｚｈａｎｇら（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６，１２６８−１２７２およびＶｅｌｃｕｌｅｓｃｕら（１９９９）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２３，３８７−３８８）。
【０２７２】
核酸を生成および調査する技法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）にさらに記載されている。
【０２７３】
あるいは、赤血球生成の間に差次的に発現する１つまたは複数の遺伝子の発現レベルは、インサイチュハイブリダイゼーションにより確定される。一実施形態では、被検体から組織サンプルを得て、組織サンプルをスライスし、当該技術分野で既知の方法によりインサイチュハイブリダイゼーションを行って、目的の遺伝子の発現レベルを確定する。
【０２７４】
他の方法では、遺伝子の発現レベルは、遺伝子によりコードされるタンパク質のレベルを測定することにより検出される。これは、例えば免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ、または免疫化学法により、例えば遺伝子によりコードされるタンパク質を特異的に検出する作用物質（例えば抗体）を用いて行われ得る。他の技法としては、ウェスタンブロット解析が挙げられる。イムノアッセイは、細胞サンプル中のタンパク質レベルを定量するために一般に用いられ、多くの他のイムノアッセイ法が当該技術分野で既知である。本発明は、特定のアッセイ手順に限定されないため、同一の手順および異なる手順の両方を含むことが意図される。本発明により行われ得るイムノアッセイの例としては、蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、比濁阻害イムノアッセイ（ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｒｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）（ＮＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）が挙げられる。指標部分（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ  ｍｏｉｅｔｙ）すなわち標識群は、対象抗体に結合することができ、アッセイ設備の利用可能性および対応するイムノアッセイ手順に左右されることが多い方法の様々な使用の必要性を満たすように選択される。上述の様々なイムノアッセイを行う際に用いられる一般的な技法は、当業者には既知である。
【０２７５】
細胞から分泌されるポリペプチドの場合、これらのポリペプチドの発現レベルは、生体液において測定され得る。
【０２７６】
（７．３  データ解析法）
赤血球生成の間に、差次的に発現する１つまたは複数の遺伝子の発現レベルを、参照発現レベル、例えば赤血球生成障害を有する被検体の病変赤血球系細胞または健常な対応細胞での発現レベルと比較することは、コンピュータシステムを用いて行われることが好ましい。一実施形態では、２つの細胞から発現レベルを得て、これら２組の発現レベルを、比較のためにコンピュータシステムに導入する。好ましい実施形態では、コンピュータシステム内にすでにあるか、またはその後コンピュータシステムに入力されるコンピュータ可読形態である値と比較するために、１組の発現レベルをコンピュータシステムに入力する。
【０２７７】
一実施形態では、本発明は、本発明の遺伝子発現プロファイルデータ、または罹患細胞における赤血球生成障害に関連する少なくとも１つの遺伝子の発現レベルに対応する値のコンピュータ可読形態を提供する。これらの値は、実験、例えばマイクロアレイ解析から得られるｍＲＮＡ発現レベルであり得る。これらの値は、多くの条件下で多くの細胞において発現が一定である参照遺伝子（例えばＧＡＰＤＨ）に関して正常化したｍＲＮＡレベルでもあり得る。他の実施形態では、コンピュータの値は、種々のサンプルの正常化された、または正常化されていないｍＲＮＡレベル間の比、または差異である。
【０２７８】
遺伝子発現プロファイルデータは、Ｅｘｃｅｌ表等の表の形態であり得る。データは単独であってもよく、または、例えば他の発現プロファイルを含んだより大きいデータベースの一部であってもよい。例えば、本発明の発現プロファイルデータは、公共データベースの一部であってもよい。コンピュータ可読形態は、コンピュータ内にあり得る。別の実施形態では、本発明は、遺伝子発現プロファイルデータを表示するコンピュータを提供する。
【０２７９】
一実施形態では、本発明は、第一の細胞（例えばある被検体の細胞）において赤血球生成の間に差次的に発現する１つまたは複数の遺伝子の発現レベルと、第二の細胞のそのような遺伝子の発現レベルとの類似性を確定する方法であって、第一の細胞において赤血球生成の間に差次的に発現する１つまたは複数の遺伝子の発現レベルを得ること、およびそれらの値をコンピュータに入力することを含む方法を提供する。コンピュータは、第二の細胞における、発現が赤血球生成障害に特有の１つまたは複数の遺伝子の発現レベルに対応する値からなる記録を含むデータベースと、コンピュータに記憶されているデータと比較するために１つまたは複数の値の選択を受け取ることができるプロセッサ命令（例えばユーザインタフェース）とを含む。コンピュータはさらに、比較データを表またはチャートまたは他のタイプの出力に変換する手段を含み得る。
【０２８０】
別の実施形態では、赤血球生成の間に差次的に発現する遺伝子の発現レベルを表す値が、コンピュータシステムに入力され、コンピュータシステムは、２つ以上の細胞から得られる参照発現レベルを含む１つまたは複数のデータベースを含む。例えば、コンピュータは、罹患細胞および健常細胞の発現データを含む。コンピュータに命令が供給されると、コンピュータは、入力されたデータをコンピュータ内のデータと比較して、入力されたデータが健常細胞か罹患細胞のいずれのデータにより類似しているかを判定することができる。
【０２８１】
さらに別の実施形態では、コンピュータの参照発現プロファイルは、赤血球生成障害以外の障害の治療に用いる薬物でインビボまたはインビトロで処置された細胞を有する、１つまたは複数の被検体の細胞からの発現プロファイルである。薬物でインビトロまたはインビボで処置された被検体の細胞の発現データを入力すると、コンピュータは入力されたデータをコンピュータ内のデータと比較して、コンピュータに入力された発現データが薬物の影響を受けた被検体の赤血球系細胞の発現データにより類似しているか、薬物の影響を受けていない被検体の細胞の発現データにより類似しているかを示す結果を提供するように命令される。これにより、結果は、被検体が薬物での治療により赤血球生成障害を発症する可能性が高いか、そのような障害を発症する可能性が低いかを示す。
【０２８２】
一実施形態では、本発明は、１つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現データを受け取る手段と、上記１つまたは複数の遺伝子のそれぞれからの遺伝子発現データを共通の参照フレームと比較する手段と、比較結果を提示する手段とを備えるシステムを提供する。このシステムは、データをクラスタ化する手段をさらに備え得る。
【０２８３】
別の実施形態では、本発明は、（ｉ）複数の遺伝子の遺伝子発現データを入力として受け取るコンピュータコードと、（ｉｉ）上記複数の遺伝子のそれぞれからの上記遺伝子発現データを共通の参照フレームと比較するコンピュータコードとを含む遺伝子発現データを解析するコンピュータプログラムを提供する。
【０２８４】
本発明はまた、（ｉ）照会細胞（ｑｕｅｒｙ  ｃｅｌｌ）において赤血球生成の間に差次的に発現する１つまたは複数の遺伝子の発現レベルに対応する複数の値を、１つまたは複数の参照細胞の参照発現または発現プロファイルデータおよび細胞型の注釈からなる記録を含むデータベースと比較するステップ、および（ｉｉ）発現プロファイルの類似性に基づいて、照会細胞が最も類似している細胞を示すステップ、を実行するプログラム命令を含む機械可読またはコンピュータ可読媒体を提供する。参照細胞は、特定の薬物処置に応答するかまたは応答しない、任意にその薬物でインビトロまたはインビボでインキュベートされた、被検体からの細胞であり得る。
【０２８５】
参照細胞は、赤血球生成障害のための幾つかの異なる処置に応答するかまたは応答しない被検体からの細胞であってもよく、コンピュータシステムは被検体にとって好ましい処置を示す。したがって、本発明は、患者に対する治療を選択する方法を提供する。本方法は、（ｉ）処置された被検体の病変赤血球系細胞における、赤血球生成の間に差次的に発現する１つまたは複数の遺伝子の発現レベルを提供すること、（ｉｉ）それぞれが治療に関連する複数の参照プロファイルを提供することであって、被検体の発現プロファイルおよび各参照プロファイルは複数の値を有し、各値は肺細胞の腫瘍形成（ｎｅｏｐｌａｓｉａ）に関連する遺伝子の発現レベルを示す、複数の参照プロファイルを提供すること、および（ｉｉｉ）被検体の発現プロファイルに最も類似した参照プロファイルを選択することであって、それにより上記患者に対する治療を選択すること、を含む。好ましい実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）は、コンピュータにより行われる。最も類似した参照プロファイルは、対応する発現データに関連する重み値を用いて、複数の比較値を重み付けすることにより選択され得る。
【０２８６】
２つの生体サンプルにおけるｍＲＮＡの相対存在量は、摂動およびその確定された大きさとして（すなわち、存在量が試験した２つのｍＲＮＡ源で異なる）、または摂動しないものとして（すなわち、相対存在量が同じである）記録され得る。種々の実施形態では、２つのＲＮＡ源間で、少なくとも約２５％の因子の（一方の源からのＲＮＡが他方の源よりも２５％豊富である）、より一般的には約５０％の因子の、さらに多くの場合は約２因子（２倍豊富）、３因子（３倍豊富）、または５因子（５倍豊富）の差異が摂動として記録される。摂動は、計算および発現比較のためにコンピュータにより用いられ得る。
【０２８７】
好ましくは、摂動を陽性または陰性として特定することに加えて、摂動の大きさを確定することが有利である。これは、上記のように、区別して標識するために用いられる２つの蛍光体の発光比を計算することにより、または当業者には容易に明らかとなるであろう類似の方法により、実行され得る。
【０２８８】
コンピュータ可読媒体はさらに、赤血球生成障害の処置の記述子に対するポインタを含み得る。
【０２８９】
動作の際には、本発明のシステムのコンテキストにおいて、遺伝子発現データを受け取る手段と、遺伝子発現データを比較する手段と、提示する手段と、正常化する手段と、クラスタ化する手段とは、ハードウェアまたはハードウェアおよびソフトウェアで実施される、本明細書中で説明される各機能を有するようにプログラムされたコンピュータ、コンピュータプログラムの指示を受けて本明細書中で具体的に説明される動作を実行する、プログラムされたコンピュータの論理回路または他のコンポーネント、または本明細書中で説明される特定の様式でコンピュータが機能するようにし得るコンピュータプログラムを表す実行可能な命令でコードされたコンピュータメモリ、を必要とし得る。
【０２９０】
当業者は、本発明のシステムおよび方法が、ＭＳ−ＤＯＳまたはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）を実行するＩＢＭと互換性のあるパーソナルコンピュータを含む様々なシステムに適用され得ることを理解するであろう。
【０２９１】
コンピュータは、外部コンポーネントにリンクする内部コンポーネントを有し得る。内部コンポーネントは、メインメモリと相互接続されるプロセッサ要素を含んでもよい。コンピュータシステムは、２００ＭＨｚ以上のクロック速度および３２ＭＢ以上のメインメモリを有するＩｎｔｅｌ  Ｐｅｎｔｉｕｍ（登録商標）（商品名）ベースプロセッサであってもよい。外部コンポーネントは、１つまたは複数のハードディスク（通常はプロセッサおよびメモリと共にパッケージされる）であり得る大容量記憶装置を含み得る。このようなハードディスクは、通常は１ＧＢ以上の記憶容量を有する。他の外部コンポーネントは、ユーザインタフェースデバイス（モニタであり得る）を入力デバイス（「マウス」であり得る）または他のグラフィック入力デバイスおよび／またはキーボードと共に含む。プリンティングデバイスを、コンピュータに取り付けてもよい。
【０２９２】
通常は、コンピュータシステムは、ネットワークリンクにもリンクされ、ネットワークリンクは、他のローカルコンピュータシステム、リモートコンピュータシステム、またはインターネット等の広域通信ネットワークへのイーサネット（登録商標）リンクの一部であり得る。このネットワークリンクにより、コンピュータシステムは、他のコンピュータシステムとデータおよび処理タスクを共有することができる。
【０２９３】
このシステムの動作中、幾つかのソフトウェアコンポーネントがメモリにロードされるが、これらのソフトウェアコンポーネントは、当該技術分野における標準であるとともに、本発明に特殊のものである。これらのソフトウェアコンポーネントはまとめて、本発明の方法に従ってコンピュータが機能するようにする。これらのソフトウェアコンポーネントは通常、大容量記憶装置に記憶される。ソフトウェアコンポーネントは、コンピュータシステムおよびそのネットワーク相互接続の管理を担う動作システムを表す。この動作システムは、例えば、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）ファミリー（Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）９５、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）９８、またはＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）  ＮＴ等）であり得る。ソフトウェアコンポーネントは、本発明に特有の方法を実施するプログラムを補助するようにこのシステムに便宜上存在する共通の言語および機能を表す。本発明の解析法をプログラムするために、多くの高レベルまたは低レベルのコンピュータ言語が用いられ得る。命令は、ランタイム中に解釈されるか、またはコンパイルされ得る。好ましい言語としては、Ｃ／Ｃ＋＋およびＪＡＶＡ（登録商標）（商品名）が挙げられる。最も好ましくは、本発明の方法は、数学的ソフトウェアパッケージでプログラムされ、この数学的ソフトウェアパッケージは、方程式の記号入力および用いられるアルゴリズムを含む高レベルの処理指定を可能にすることにより、ユーザが個々の方程式またはアルゴリズムを手続き上プログラムする必要をなくす。このようなパッケージとしては、Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ（Ｎａｔｉｃｋ，Ｍａｓｓ．）製のＭａｔｌａｂ、Ｗｏｌｆｒａｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｃｈａｍｐａｉｇｎ，Ｉｌｌ．）製のＭａｔｈｅｍａｔｉｃａ、またはＭａｔｈ  Ｓｏｆｔ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）製のＳ−Ｐｌｕｓが挙げられる。したがって、ソフトウェアコンポーネントは、手続き形言語または記号のパッケージにプログラムされる本発明の解析法を表す。好ましい実施形態では、コンピュータシステムは、発現が肺癌に特有の１つまたは複数の遺伝子の発現レベルを表す値を含むデータベースも含む。データベースは、種々の細胞において発現が肺癌に特有の遺伝子の１つまたは複数の発現プロファイルを含んでもよい。
【０２９４】
例示的な実施態様では、本発明の方法を実施するために、ユーザはまず発現プロファイルデータをコンピュータシステムにロードする。これらのデータは、モニタおよびキーボードから、またはネットワーク接続によりリンクされた他のコンピュータから、またはＣＤ−ＲＯＭあるいはフロッピー（登録商標）ディスク等の取り外し可能な記憶媒体に、あるいはネットワークを介して、ユーザにより直接入力され得る。次にユーザは、共変動する遺伝子を比較するステップ、および例えばそれらの遺伝子を遺伝子の群にクラスタ化するステップを行う発現プロファイル解析ソフトウェアを実行させる。
【０２９５】
別の例示的な実施態様では、発現プロファイルは、米国特許第６，２０３，９８７号に記載される方法を用いて比較される。ユーザはまず、発現プロファイルデータをコンピュータシステムにロードする。遺伝子組プロファイル定義が、記憶媒体またはリモートコンピュータから、好ましくは、動的遺伝子組データベースシステムから、ネットワークを介してメモリにロードされる。次に、ユーザは、発現プロファイルを射影発現プロファイルに変換するステップを行う射影ソフトウェアを実行させる。次に射影発現プロファイルが表示される。
【０２９６】
さらに別の例示的な実施形態では、ユーザはまず射影プロファイルをメモリにロードする。次に、ユーザは、参照プロファイルをメモリにロードさせる。次に、ユーザは、プロファイルを客観的に比較するステップを行う比較ソフトウェアを実行させる。
【０２９７】
（７．４  本発明の例示的な診断用および予後用組成物ならびにデバイス）
上記の方法で用いられるいかなる組成物およびデバイス（例えばマイクロアレイ）も、本発明の範囲内にある。
【０２９８】
一実施形態では、本発明は、表Ｉ、表ＩＩ、および表ＩＩＩの遺伝子の発現を検出するための複数の検出剤を含む組成物を提供する。好ましい実施形態では、組成物は、少なくとも２個、好ましくは少なくとも３個、５個、１０個、２０個、５０個、または１００個の異なる検出剤を含む。検出剤は、核酸プローブ、例えばＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、または、例えば表Ｉ、表ＩＩ、および表ＩＩＩに列挙する遺伝子によりコードされるポリペプチドと結合する抗体としてのポリペプチドであってもよい。プローブは、溶液中に等量または異なる量で存在し得る。
【０２９９】
核酸プローブは、少なくとも約１０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも約１５、２０、２５、３０、５０、１００ヌクレオチド長以上であり得、完全長遺伝子を含み得る。好ましいプローブは、表Ｉ、表ＩＩ、および表ＩＩＩに列挙する遺伝子と特異的にハイブリダイズされるものである。核酸が短い（すなわち、２０ヌクレオチド未満である）場合、特異的ハイブリダイゼーションが得られ得るように、配列は標的遺伝子（すなわち、赤血球生成に関連する遺伝子）と完全に相補的であることが好ましい。しかしながら、標的遺伝子と完全には相補的でない核酸は、短いものであっても、例えば陰性対照として用いるために、本発明の組成物に含まれ得る。ある特定の組成物は、ある遺伝子の対立遺伝子と相補的であり、かつそれを検出することができる核酸も含み得る。
【０３００】
好ましい実施形態では、本発明は、６５℃で０．２〜１×ＳＳＣに続いて６５℃で０．２×ＳＳＣでの洗浄という非常にストリンジェントな条件（ｈｉｇｈ  ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）下で、赤血球生成の間に差次的に発現する遺伝子とハイブリダイズする核酸を提供する。別の実施形態では、本発明は、室温で６×ＳＳＣに続いて室温で２×ＳＳＣでの洗浄というあまりストリンジェントではない条件（ｌｏｗ  ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）下でハイブリダイズする核酸を提供する。他の核酸プローブは、４０または５０℃で３×ＳＳＣで標的にハイブリダイズし、続いて２０℃、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、または６５℃で１または２×ＳＳＣで洗浄する。
【０３０１】
赤血球生成またはそのｃＤＮＡに関連する遺伝子およびその補体と、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％、最も好ましくは少なくとも約９８％同一である核酸もまた、本発明の範囲内にある。
【０３０２】
核酸プローブは、例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ（例えばＲＴ−ＰＣＲによる）、またはクローニングされた配列からの遺伝子断片のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅により得てもよい。ＰＣＲプライマーは、遺伝子またはｃＤＮＡの既知の配列に基づいて選択され、これにより独特の断片の増幅がもたらされる。要求される特異性および最適な増幅特性を有するプライマーの設計にはコンピュータプログラムが用いられ得る。例えば、Ｏｌｉｇｏバージョン５．０（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を参照されたい。増幅のためのプライマーの設計および選択に適用される因子は、例えば、Ｒｙｌｃｈｉｋ，  Ｗ．  （１９９３）  「ポリメラーゼ連鎖反応のためのプライマーの選択（Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｉｍｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）」（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  １５，  Ｗｈｉｔｅ  Ｂ．  ｅｄ．，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｔｏｔｏｗａ，  Ｎ．Ｊ．）に記載されている。配列は、ＧｅｎＢａｎｋまたは他の公共の供給源から得てもよい。
【０３０３】
本発明のオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において既知の標準的な方法により、例えば、自動ＤＮＡ合成器（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ等から市販されているもの等）の使用により、合成され得る。例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．の方法（１９８８，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６：３２０９）により合成されてもよく、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、ＣＰＧ（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）ポリマー支持体（Ｓａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８５：  ７４４８−７４５１）等の使用により調製され得る。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １５：  ６１３１−６１４８）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ２１５：  ３２７−３３０）である。
【０３０４】
表Ｉ、表ＩＩ、および表ＩＩＩに列挙する遺伝子の配列を有するプローブは、合成的に生成されてもよい。多数のオリゴデオキシリボヌクレオチドからの遺伝子の一段階構築は、Ｓｔｅｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  （Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）（１９９５）１６４（１）：４９−５３により記載されるように行われ得る。この方法では、アセンブリＰＣＲ（多数のオリゴデオキシリボヌクレオチド（オリゴ）からの長いＤＮＡ配列の合成）が記載されている。この方法は、ＤＮＡシャッフリング（Ｓｔｅｍｍｅｒ，  Ｎａｔｕｒｅ  （１９９４）  ３７０：３８９−３９１）から得られ、構築プロセス中に徐々に長くなるＤＮＡ断片を作製するために、ＤＮＡリガーゼには依存せず、その代わりＤＮＡポリメラーゼに依存する。例えば、ＴＥＭ−１  β−ラクタマーゼをコードする遺伝子（ｂｌａ）を含む１．１−ｋｂ断片は、それぞれ４０ヌクレオチド（ｎｔ）長の、合計５６のオリゴから１回の反応で構築され得る。合成遺伝子は、ＰＣＲ増幅され得、この手法を任意の遺伝子の迅速かつ費用効率的な合成の一般的な方法とする。
【０３０５】
「ｃＤＮＡ末端の迅速増幅」すなわちＲＡＣＥは、多くの異なるＲＮＡからｃＤＮＡを増幅するために用いられ得るＰＣＲ法である。ｃＤＮＡは、オリゴヌクレオチドリンカーにライゲーションして、２つのプライマーを用いてＰＣＲにより増幅され得る。１つのプライマーは、完全長配列が望ましい本核酸からの配列に基づいてよく、第二のプライマーは、ｃＤＮＡを増幅するためにオリゴヌクレオチドリンカーとハイブリダイズする配列を含み得る。この方法の説明は、ＰＣＴ公報ＷＯ９７／１９１１０号において報告されている。
【０３０６】
別の実施形態では、本発明は、赤血球生成に関連する遺伝子によりコードされるポリペプチドを検出し得る複数の薬剤を含む組成物を提供する。薬剤は例えば抗体であってもよい。本明細書中に記載されるポリペプチドに対する抗体は、市販されているものであってもよいが、当該技術分野において既知の方法により生成してもよい。
【０３０７】
プローブは、紙、膜、フィルター、チップ、ピン、あるいはスライドガラス等の固体支持体、または本明細書中でさらに説明するもの等の任意の他の好適な基板に結合され得る。例えば、赤血球生成に関連する遺伝子のプローブは、例えばドットブロットで用いるために膜に、またはアレイ（例えばマイクロアレイ）を形成する等のために固体に、共有結合されても非共有結合されてもよい。
【０３０８】
７．５  代替的な診断方法
本発明が企図する診断方法の他の実施形態においては、診断方法は、被検体の赤血球系細胞における本発明のパネルから選択される遺伝子がコードするタンパク質の活性を確定する工程、および被検体の細胞におけるタンパク質の活性を同じ型の健常な赤血球系細胞におけるタンパク質の活性と比較する工程を含む。この診断方法は、タンパク質のターンオーバーのレベル、タンパク質の翻訳レベル、または本発明のパネルから選択される遺伝子がコードするｍＲＮＡのターンオーバーレベルを確定する工程を含んでもよい。特定のタンパク質の活性、ターンオーバーレベル、および翻訳レベルを確定するためのアッセイは、当該技術分野でルーチン的に用いられ、当業者には周知であり、ルーチン的実験のみで本発明の方法に適応し得る。
８．  治療用および診断用キット
本発明は、赤血球生成障害を処置するキットを提供する。例えば、キットは、例えば赤血球生成障害を罹患している患者の処置に用いるための、赤血球形成障害に特有の１つまたは複数の遺伝子に対応する１つまたは複数の核酸も含み得る。核酸は、プラスミドまたはベクター（例えばウイルスベクター）に含まれ得る。他のキットは、赤血球生成障害に特有の遺伝子によりコードされるポリペプチドまたはポリペプチドに対する抗体を含む。さらに他のキットは、赤血球生成障害に特有の遺伝子のアゴニストまたはアンタゴニストとして本明細書中で同定される化合物を含む。組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤を含む薬学的組成物であり得る。
【０３０９】
キットは、赤血球生成の間に差次的に発現する遺伝子のプローブを含むマイクロアレイを含み得る。キットは、赤血球生成の間に差次的に発現する１つまたは複数の遺伝子の発現レベルを検出するための１つまたは複数のプローブまたはプライマー、および／またはプローブが結合され、赤血球生成の間に差次的に発現する１つまたは複数の遺伝子の発現を検出するのに用いられ得る固体支持体を含み得る。キットはさらに使用のために核酸対照、緩衝液、および取扱説明書を含み得る。
【０３１０】
さらに本発明は、遺伝子の１つまたは複数の発現レベルを確定するための、遺伝子発現パターンのライブラリーおよび試薬を含むキットを提供する。例を挙げると、適切なアッセイおよびプローブのアレイを有する適切なマイクロアレイを含むキットを提供することにより、発現レベルを確定することができる。別の実施形態においては、キットは、被検体の赤血球におけるタンパク質活性レベルを確定するための適切な試薬を含む。キットは、赤血球生成障害を発症しやすい被検体または赤血球生成障害を罹患している被検体を同定するとともに、赤血球生成障害の治療法を同定および確認するのに有用であり得る。一実施形態では、キットは、赤血球生成障害を罹患している被検体の罹患細胞の１つまたは複数の遺伝子発現プロファイル、あるいは少なくとも、赤血球生成の間に差次的に発現する１つまたは複数の遺伝子の発現レベルを表す値を記憶するコンピュータ可読媒体を含む。コンピュータ可読媒体は、対応する健常細胞の遺伝子発現プロファイル、薬物で処置された罹患細胞の遺伝子発現プロファイル、および本明細書中で説明される任意の他の遺伝子発現プロファイルも含んでもよい。キットは、コンピュータシステムのメモリにロードすることができる発現プロファイル解析ソフトウェアを含み得る。
【０３１１】
キットは、被検体の赤血球系細胞におけるタンパク質活性レベルを確定するのに適した試薬を含み得る。
【０３１２】
キットの構成成分は、前述の方法のマニュアル、または一部もしくは全自動化された実施のいずれかに対してパッケージされ得る。キットに関連する他の実施形態においては、本発明は、本発明の組成物および必要に応じてその使用のための使用説明書を含むキットを企図する。このようなキットは、例えばイメージング、診断、療法および他の応用等の様々な使用を有し得る。
【０３１３】
例証
本発明を以下の実施例によりさらに説明するが、これらの実施例は決して限定的なものと解釈されるべきではない。本願中で引用する参考文献、発行済み特許、公開または未公開の特許出願を含む、全ての引用文献の内容は、参照により本明細書に明らかに援用される。本発明の実施では、別段の指示がない限り、当該技術分野の技術範囲内にある細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組み換え型ＤＮＡ、および免疫学の従来技法を用いる。このような技法は、文献において十分に説明されている（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  ｅｄ．  ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９）；  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ  （Ｄ．Ｎ．  Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．，  １９８５）；  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  （Ｍ．Ｊ．  Ｇａｉｔ  ｅｄ．，  １９８４）；  Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ：  ４，６８３，１９５；  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  （Ｂ．Ｄ．  Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．  １９８４）；  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  （Ｂ．Ｄ．  Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．  １９８４）；  （Ｒ．Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．，  １９８７）；  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  （ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８６）；  Ｂ．  Ｐｅｒｂａｌ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  （１９８４）；  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎ．Ｙ．）；  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ  （Ｊ．Ｈ．  Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．  Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．，  １９８７，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；，  Ｖｏｌｓ．  １５４  ａｎｄ  １５５  （Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，  ｅｄｓ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｌｏｎｄｏｎ，  １９８７）；  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ  （Ｄ．Ｍ．  Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，  ｅｄｓ．，  １９８６）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．，  １９８６を参照）。
【０３１４】
実施例１：前駆細胞培養
ａ．ＳＣＦ／Ｅｐｏ前駆細胞
慣例的指針に従って廃棄および採取するようにスケジュールされた臍帯血細胞を、正常な満期妊娠後に得た。胎盤排出後に臍静脈にカニューレを挿入して吸引した。約３０〜４０ｍＬの臍帯血が、臍帯血１ミリリットルあたり１００Ｕのヘパリンナトリウム（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ｐｈａｒｍａ，  Ｍａｉｎｚ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を含むシリンジにルーチン的に回収および採取された。残存した血餅を７０μｍセルストレーナ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  ＣＡ）に通すことにより除去し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ遠心法（密度１．０７７ｇ／ｍＬ；Ｅｕｒｏｂｉｏ，  Ｐａｒｉｓ，  Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、密度の低い単核細胞を単離した。細胞を４×１０６細胞／ｍＬで（１日〜３日）、その後２×１０６細胞／ｍＬでプレーティングし、５％のＣＯ２雰囲気下および高湿度（９５％）で３７℃で培養した。培地の部分的な交換を毎日行った。
【０３１５】
乳癌を罹患している患者からインフォームドコンセントを得た後に、動員された末梢血単核細胞をアフェレーシスにより採取し、その後、公表されているように、ＣＤ３４＋末梢血幹細胞を濃縮するために、ＣＥＰＲＡＴＥ  ＬＣ３４（ＣｅｌｌＰｒｏ  Ｉｎｃ，  Ｂｏｔｈｅｌｌ，  ＷＡ）またはＩｓｏｌｅｘ３００装置（Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｃ，  Ｓａｎｔａ  Ａｎａ，  ＣＡ）を用いてＣＤ３４＋の選択を行った。８５％〜９９％の純度を有するＣＤ３４＋細胞（２〜１０×１０６）を実験ごとに用いて、２．５×１０６細胞／ｍＬ細胞密度で上述のように培養した。
【０３１６】
用いられる培養培地は、鶏の赤血球前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ）の成長のために以前に確立された成長培地を改良したものであった。要するに、培養培地は、１５％のウシ胎児血清（ＦＣＳ；  Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）、１％の脱イオン、脱脂、および透析したウシ血清アルブミン（フラクションＶ；Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）、１５％の蒸留水、１．９ｍｍｏｌ／Ｌの重炭酸ナトリウム、０．１ｍｍｏｌ／Ｌのメルカプトエタノール、０．１２８ｍｇ／ｍＬの鉄飽和ヒトトランスフェリン（ｉｒｏｎ−ｓａｔｕｒａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）（Ｓｉｇｍａ）、ならびに１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよびストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，  Ｐａｉｓｌｅｙ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）から構成されていた。１Ｕ／ｍＬの組み換え型ヒトＥｐｏ（ｒｈｕＥｐｏ；Ｒｅｃｏｒｍｏｎ  １０００；  １．２×１０５Ｕ／ｍｇ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）、１００ｎｇ／ｍＬの組み換え型ヒトＳＣＦ（ｒｈｕＳＣＦ；Ａｍｇｅｎ  Ｉｎｃ，  Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，  ＣＡ）、４０ｎｇ／ｍＬの長Ｒ３インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１；Ｓｉｇｍａ）、１０６ｍｏｌ／Ｌのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）、および１０６ｍｏｌ／Ｌのエストラジオール（Ｓｉｇｍａ）を培養培地に補足した。細胞増殖をモニタリングするために、細胞を電子細胞計数装置（ＣＡＳＹ１；Ｓｃｈａｅｒｆｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｒｅｕｔｌｉｎｇｅｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）で毎日計数し、累積細胞数を求めた。必要な場合、培養の確立の初期の間に、細胞をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ遠心分離に付して細胞残屑および死細胞を除去した。同様に、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ遠心法を用いて、成熟赤血球および部分的成熟赤血球ならびに培養の後期の間に蓄積した死細胞を除去した。
【０３１７】
分化を誘導するため、ヒト赤血球前駆細胞を培養９日目に回収し（上記を参照）、無血清培地で２回洗浄し、１Ｕ／ｍＬのｒｈｕＥｐｏおよび１μｇ／ｍＬの組み換え型ヒトインスリン（ｒｈｕＩｎｓ；Ａｃｔｒａｐｉｄ  ＨＭ４０；Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ｐｈａｒｍａ）を含む培養培地に４×１０６細胞／ｍＬで播種した。培地を、新鮮な培養培地および因子で毎日部分的に交換した。赤血球の分化を、細胞サイズの測定により（ＣＡＳＹ１；Ｓｃｈａｅｒｆｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、およびヘモグロビンの染色サイトスピン調製（ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｃｙｔｏｓｐｉｎ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）によりモニタリングした（以下を参照）。必要な場合、異なる分化段階の細胞をパーコール密度遠心分離により精製した。
【０３１８】
実施例２：培養された前駆細胞および赤血球の特性決定
ａ．増殖アッセイ
３Ｈチミジンの取り込みの率を測定することにより、細胞増殖を定量的に評価した。細胞（２×１０４／ウェル）を、種々の成長因子またはそれらの組み合わせを含むか、あるいは因子を含まない培養培地１００μＬで、３７℃で４８時間、マイクロタイタープレートでインキュベートした。３Ｈチミジン（０．７５μＣｉ／ウェル；特異的活性、２９Ｃｉ／ｍｍｏｌ；Ａｍｅｒｓｈａｍ，  Ｂｕｃｈｌｅｒ，  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加して、細胞を２時間インキュベートした。次に、細胞を１サイクルの凍結／融解により溶解させ、フィルタープレート（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｍｅｒｉｄｅｎ，  ＣＴ）上に回収し、液体シンチレーション計数に供した。三連のサンプルの平均値（数／分［ｃｐｍ］）を、播種した１×１０５細胞に正規化した。
【０３１９】
ｂ．コロニーアッセイ
培養前の臍帯血細胞（５×１０４）および培養６日目の１×１０３細胞を、３５ｍｍのプラスチック培養皿のメチルセルロース培地に１ｍＬずつ分取してプレーティングした。メチルセルロース培地は、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ；ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ  Ｈ４１００；Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ，  Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ，  Ｃａｎａｄａ）に０．９％のメチルセルロースを含み、１０％の熱不活性化ＦＣＳ、１％の解毒したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、２ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミン、０．１ｍｍｏｌ／Ｌのメルカプトエタノール、０．１２８ｍｇ／ｍＬの鉄飽和ヒトトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ）、２Ｕ／ｍＬのｒｈｕＥｐｏ、２００ｎｇ／ｍＬのｒｈｕＳＣＦ、２×１０６ｍｏｌ／Ｌのエストラジオール、および２×１０６ｍｏｌ／Ｌのデキサメタゾンを補充した。培養を、５％のＣＯ２および高湿度下で３７℃で１４日間インキュベートした。立体顕微鏡を用いて、３０以上の細胞を含むコロニーのプレートを二連で解析した。赤芽球バースト形成単位（ＢＦＵ−Ｅ）および赤芽球コロニー形成単位（ＣＦＵ−Ｅ）型のコロニーを、１２〜１４日目に評価した。同様に、顆粒球、赤血球、単球、マクロファージコロニー形成単位（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）のコロニーおよびマクロファージコロニー形成単位（ＣＦＵ−Ｍ）のコロニーを、形態学的に同定して評価した。
【０３２０】
ｃ．細胞形態およびヘモグロビン含量
細胞形態およびヘモグロビン含量を解析するために、上述のように、細胞をスライドガラス上で細胞遠心分離し（７００ｒｐｍで７分間；サイトスピン２；Ｓｈａｎｄｏｎ  Ｉｎｃ，  Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，  ＰＡ）、中性ベンジジンおよび組織学的染料で染色した（参照）。ＡｘｉｏｐｈｏｔＩＩ顕微鏡およびＫｏｎｔｒｏｎ  ＰｒｏｇＲｅｓ３０１２ＣＣＤカメラ（Ｚｅｉｓｓ，  Ｊｅｎａ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）で写真を撮影し、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェア（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ，  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  ＣＡ）で処理した。
【０３２１】
ｄ．表面抗原発現
赤血球系細胞の表面抗原発現を、フローサイトメトリーで解析した。これにより、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中１％のＢＳＡ（フラクションＶ；Ｓｉｇｍａ）および１％のヒトＩｇＧ（ベリグロビン；Ｂｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ，  Ｍａｒｂｕｒｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）と共に１時間プレインキュベートし、続いて特異的抗体と反応させた（１時間）。ＣＤ３（抗ＬＥＵ−４、クローンＳＫ７；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＣＤ１４（ＩＯＭ２、クローンＲＭ０５２；Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，  Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，  Ｆｒａｎｃｅ）、ＣＤ１９（ＨＤ３７；ＤＡＫＯ，  Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，  Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＣＤ２９（ＭＡＲ４；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）、ＣＤ３４（抗ＨＰＣＡ−１、クローンＭｙ１０；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＣＤ４４（ＩＭ７；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＤ４９ｄ（９Ｆ１０；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＤ７１（Ｂｅｒ−Ｔ９；ＤＡＫＯ）、ＣＤ１１７（ＹＢ５．Ｂ８；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、バンド３（ＢＩＩＩ−１３６；Ｓｉｇｍａ）、およびグリコホリンＡ／Ｂ（Ｅ３；Ｓｉｇｍａ）に対するモノクローナル抗体を使用し、続いてイソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）結合抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ特異的；４５分；Ｓｉｇｍａ）と反応させることにより、免疫表現型を調べた（Ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）。細胞を２回洗浄し、１％ＢＳＡおよびヨウ化プロピジウム（２μｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ）を含むＰＢＳに再懸濁させ、生細胞をゲーティングした（ｇａｔｉｎｇ  ｏｎ  ｖｉａｂｌｅ  ｃｅｌｌｓ）。フローサイトメトリーには、ＣＥＬＬＱｕｅｓｔソフトウェアを備えるＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ装置（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いた。
【０３２２】
実施例３：発現プロファイリング
赤血球生成の様々な段階における細胞の差次的遺伝子発現を、赤血球生成の２段階における細胞のサンプルを調製することにより検出した。例えば、ＳＣＦ−Ｅｐｏのサンプルを上記のように調製した。サンプルのそれぞれからのＲＮＡを、ＣｓＣｌ勾配により精製し、フェノールクロロフォルム抽出し、製造業者の推奨に従って、ＱｉａｇｅｎのＲＮＡｅａｓｙカラムで精製した。単離されたＲＮＡの完全性を確認するために、各サンプルの分取を１％変性アガロースゲルで電気泳動させた。無傷の２８Ｓおよび１８Ｓリボソームバンドを示したサンプルを、プローブ生成のために選択した。ＲＮＡをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘが提供する材料および方法を用いたＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのマイクロアレイ解析のために調製した（Ｍａｈａｄｅｖａｐｐａ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，  Ｊ．Ａ．，  （１９９９）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，．  １７：１１３４−１１３６）。簡潔に言えば、全ＲＮＡのｃＤＮＡを、Ｔ７−ｄＴ２４プライマーを用いて生成した。アンチセンスｃＲＮＡを、ビオチン標識リボヌクレオチドおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写キットを用いて生成した。ｃＲＮＡを断片化し、マイクロアレイと一晩ハイブリダイズさせた。ハイブリダイズしたアレイをＳＡＰＥ（ストレプトアビジン−フィコエリトリン）で染色した。ハイブリダイゼーションレベル（例えばＳＡＰＥ蛍光）を、Ｈｅｗｌｅｔｔ−ＰａｃｋａｒｄのＧｅｎｅＡｒｒａｙスキャナを用いて測定した。
【０３２３】
２つのサンプルにおけるｍＲＮＡの相対的存在量は、その確定された大きさとして（すなわち、存在量が試験した２つのｍＲＮＡ源で異なる）、または変化しないものとして（すなわち、相対存在量が同じである）記録された。本明細書中で用いる場合、非分化細胞由来のＲＮＡと分化細胞由来のＲＮＡとの間の差異は、２つの異なるサンプルにおいて少なくとも約２因子（２倍豊富）である。現在の検出方法では、約２倍〜約５倍の差異を確実に検出することができるが、より小さい大きさの摂動を区別できるより敏感な方法が開発中である。
【０３２４】
６つの赤血球データセットを評価した。セット間に少なくとも４回存在し、５０を超える値を有していた遺伝子を、表Ｉのリストに関して選択した。アップレギュレートされた遺伝子の例を表ＩＩに列挙し、ダウンレギュレートされた遺伝子の例を表ＩＩＩに列挙する。
【０３２５】
参考文献
本願中で引用する参考文献、発行済み特許、公開または未公開の特許出願、ならびに以下で列挙する文献を含む、全ての引用文献の内容は、参照により本明細書に明らかに援用される。矛盾がある場合は、本明細書中のいかなる定義も含めて本願が制御するものとする。Ｓｉｅｗｅｋｅ，  Ｍ．  Ｈ．  ａｎｄ  Ｇｒａｆ，  Ｔ．  （１９９８）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ８，  ５４５−５５１；  Ｌａｃｏｍｂｅ，  Ｃ．  ａｎｄ  Ｍａｙｅｕｘ，  Ｐ．  （１９９９）  Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  １４［ｓｕｐｐｌ  ２］，  ２２−２８；  Ｓｏｃｏｌｏｖｓｋｙ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ９５，  ６５７３−６５７５；  Ｋｒａｎｔｚ，  Ｓ．Ｂ．  （１９９１）  Ｂｌｏｏｄ  ７７，  ４１９−４３４；  Ａｌｔｅｒ，  Ｂ．Ｐ．  （１９９４）  Ａｎｎ  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ７３１，  ３６−４７；  Ｓｈｉｖｄａｓａｎｉ，  Ｒ．Ａ．  ａｎｄ  Ｏｒｋｉｎ，  Ｓ．Ｈ．  （１９９６）  Ｂｌｏｏｄ  ８７，  ４０２５−４０３９；  ａｎｄ  Ｂｒｏｕｄｙ，  Ｖ．Ｃ．，  （１９９７）  Ｂｌｏｏｄ  ９０，  １３４５−１３６４。
【０３２６】
等価物
本発明をここに詳細に説明したが、通常の実験以上のことを必要とせずに、または添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱せずに、多くの変更および改変を行い得ることは、当業者には明らかとなろう。
【０３２７】
本明細書および実施例は、添付の特許請求の範囲により示唆される本発明の真の範囲および精神により、単なる例示に過ぎないものとみなされるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０３２８】
【図１】図１は、本発明の新規パネルを得るのに適した一実験計画を描写する概略図である。
【図２】図２は、本発明の新規パネルを得るのに適した別の実験計画を描写する概略図である。
【図３−１】図３は表Ｉを含み、この表は赤血球生成の間に差次的に調節される遺伝子を列挙する。
【図３−２】図３−１の続き。
【図３−３】図３−１の続き。
【図３−４】図３−１の続き。
【図３−５】図３−１の続き。
【図３−６】図３−１の続き。
【図３−７】図３−１の続き。
【図３−８】図３−１の続き。
【図３−９】図３−１の続き。
【図３−１０】図３−１の続き。
【図３−１１】図３−１の続き。
【図３−１２】図３−１の続き。
【図３−１３】図３−１の続き。
【図３−１４】図３−１の続き。
【図３−１５】図３−１の続き。
【図３−１６】図３−１の続き。
【図３−１７】図３−１の続き。
【図３−１８】図３−１の続き。
【図３−１９】図３−１の続き。
【図３−２０】図３−１の続き。
【図３−２１】図３−１の続き。
【図３−２２】図３−１の続き。
【図３−２３】図３−１の続き。
【図３−２４】図３−１の続き。
【図３−２５】図３−１の続き。
【図３−２６】図３−１の続き。
【図３−２７】図３−１の続き。
【図３−２８】図３−１の続き。
【図３−２９】図３−１の続き。
【図３−３０】図３−１の続き。
【図３−３１】図３−１の続き。
【図３−３２】図３−１の続き。
【図３−３３】図３−１の続き。
【図３−３４】図３−１の続き。
【図３−３５】図３−１の続き。
【図３−３６】図３−１の続き。
【図３−３７】図３−１の続き。
【図３−３８】図３−１の続き。
【図３−３９】図３−１の続き。
【図３−４０】図３−１の続き。
【図３−４１】図３−１の続き。
【図３−４２】図３−１の続き。
【図３−４３】図３−１の続き。
【図３−４４】図３−１の続き。
【図３−４５】図３−１の続き。
【図３−４６】図３−１の続き。
【図３−４７】図３−１の続き。
【図３−４８】図３−１の続き。
【図３−４９】図３−１の続き。
【図３−５０】図３−１の続き。
【図３−５１】図３−１の続き。
【図３−５２】図３−１の続き。
【図３−５３】図３−１の続き。
【図３−５４】図３−１の続き。
【図３−５５】図３−１の続き。
【図３−５６】図３−１の続き。
【図３−５７】図３−１の続き。
【図３−５８】図３−１の続き。
【図３−５９】図３−１の続き。
【図３−６０】図３−１の続き。
【図３−６１】図３−１の続き。
【図３−６２】図３−１の続き。
【図３−６３】図３−１の続き。
【図３−６４】図３−１の続き。
【図３−６５】図３−１の続き。
【図３−６６】図３−１の続き。
【図３−６７】図３−１の続き。
【図３−６８】図３−１の続き。
【図３−６９】図３−１の続き。
【図３−７０】図３−１の続き。
【図３−７１】図３−１の続き。
【図３−７２】図３−１の続き。
【図３−７３】図３−１の続き。
【図３−７４】図３−１の続き。
【図３−７５】図３−１の続き。
【図３−７６】図３−１の続き。
【図３−７７】図３−１の続き。
【図３−７８】図３−１の続き。
【図３−７９】図３−１の続き。
【図３−８０】図３−１の続き。
【図３−８１】図３−１の続き。
【図３−８２】図３−１の続き。
【図３−８３】図３−１の続き。
【図３−８４】図３−１の続き。
【図３−８５】図３−１の続き。
【図３−８６】図３−１の続き。
【図３−８７】図３−１の続き。
【図３−８８】図３−１の続き。
【図３−８９】図３−１の続き。
【図３−９０】図３−１の続き。
【図３−９１】図３−１の続き。
【図３−９２】図３−１の続き。
【図３−９３】図３−１の続き。
【図３−９４】図３−１の続き。
【図３−９５】図３−１の続き。
【図３−９６】図３−１の続き。
【図３−９７】図３−１の続き。
【図３−９８】図３−１の続き。
【図３−９９】図３−１の続き。
【図３−１００】図３−１の続き。
【図３−１０１】図３−１の続き。
【図３−１０２】図３−１の続き。
【図３−１０３】図３−１の続き。
【図３−１０４】図３−１の続き。
【図３−１０５】図３−１の続き。
【図３−１０６】図３−１の続き。
【図３−１０７】図３−１の続き。
【図３−１０８】図３−１の続き。
【図３−１０９】図３−１の続き。
【図３−１１０】図３−１の続き。
【図３−１１１】図３−１の続き。
【図３−１１２】図３−１の続き。
【図３−１１３】図３−１の続き。
【図３−１１４】図３−１の続き。
【図３−１１５】図３−１の続き。
【図３−１１６】図３−１の続き。
【図３−１１７】図３−１の続き。
【図３−１１８】図３−１の続き。
【図３−１１９】図３−１の続き。
【図３−１２０】図３−１の続き。
【図３−１２１】図３−１の続き。
【図３−１２２】図３−１の続き。
【図３−１２３】図３−１の続き。
【図３−１２４】図３−１の続き。
【図３−１２５】図３−１の続き。
【図３−１２６】図３−１の続き。
【図３−１２７】図３−１の続き。
【図３−１２８】図３−１の続き。
【図３−１２９】図３−１の続き。
【図３−１３０】図３−１の続き。
【図３−１３１】図３−１の続き。
【図３−１３２】図３−１の続き。
【図３−１３３】図３−１の続き。
【図３−１３４】図３−１の続き。
【図３−１３５】図３−１の続き。
【図３−１３６】図３−１の続き。
【図３−１３７】図３−１の続き。
【図３−１３８】図３−１の続き。
【図３−１３９】図３−１の続き。
【図３−１４０】図３−１の続き。
【図３−１４１】図３−１の続き。
【図３−１４２】図３−１の続き。
【図３−１４３】図３−１の続き。
【図３−１４４】図３−１の続き。
【図３−１４５】図３−１の続き。
【図３−１４６】図３−１の続き。
【図３−１４７】図３−１の続き。
【図３−１４８】図３−１の続き。
【図３−１４９】図３−１の続き。
【図３−１５０】図３−１の続き。
【図３−１５１】図３−１の続き。
【図３−１５２】図３−１の続き。
【図３−１５３】図３−１の続き。
【図３−１５４】図３−１の続き。
【図３−１５５】図３−１の続き。
【図３−１５６】図３−１の続き。
【図３−１５７】図３−１の続き。
【図３−１５８】図３−１の続き。
【図３−１５９】図３−１の続き。
【図３−１６０】図３−１の続き。
【図３−１６１】図３−１の続き。
【図３−１６２】図３−１の続き。
【図３−１６３】図３−１の続き。
【図３−１６４】図３−１の続き。
【図３−１６５】図３−１の続き。
【図３−１６６】図３−１の続き。
【図３−１６７】図３−１の続き。
【図３−１６８】図３−１の続き。
【図３−１６９】図３−１の続き。
【図３−１７０】図３−１の続き。
【図３−１７１】図３−１の続き。
【図３−１７２】図３−１の続き。
【図３−１７３】図３−１の続き。
【図３−１７４】図３−１の続き。
【図３−１７５】図３−１の続き。
【図３−１７６】図３−１の続き。
【図３−１７７】図３−１の続き。
【図３−１７８】図３−１の続き。
【図３−１７９】図３−１の続き。
【図３−１８０】図３−１の続き。
【図３−１８１】図３−１の続き。
【図３−１８２】図３−１の続き。
【図３−１８３】図３−１の続き。
【図３−１８４】図３−１の続き。
【図３−１８５】図３−１の続き。
【図３−１８６】図３−１の続き。
【図３−１８７】図３−１の続き。
【図３−１８８】図３−１の続き。
【図３−１８９】図３−１の続き。
【図３−１９０】図３−１の続き。
【図３−１９１】図３−１の続き。
【図４】図４は表ＩＩを含み、この表は赤血球生成の間にアップレギュレートされる遺伝子を列挙する。
【図５】図５は表ＩＩＩを含み、この表は赤血球生成の間にダウンレギュレートされる遺伝子を列挙する。
【図１】
2005531280.tif 000002
【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【図３−７】
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【図３−８】
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【図３−９】
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【図３−１０】
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【図３−１１】
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【図３−１２】
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【図３−１３】
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【図３−１４】
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【図３−１５】
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【図３−１６】
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【図３−１７】
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【図３−１８】
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【図３−１９】
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【図３−２０】
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【図３−２１】
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【図３−２２】
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【図３−２３】
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【図３−２４】
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【図３−２５】
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【図３−２６】
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【図３−２７】
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【図３−２８】
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【図３−２９】
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【図３−３０】
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【図３−３１】
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【図３−３２】
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【図３−３３】
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【図３−３４】
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【図３−３５】
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【図３−３６】
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【図３−３７】
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【図３−３８】
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【図３−３９】
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【図３−４０】
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【図３−４１】
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【図３−４２】
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【図３−４３】
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【図３−４４】
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【図３−４５】
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【図３−４６】
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【図３−４７】
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【図３−４８】
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【図３−４９】
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【図３−５０】
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【図３−５１】
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【図３−５２】
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【図３−５３】
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【図３−５４】
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【図３−５５】
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【図３−５６】
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【図３−５７】
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【図３−５８】
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【図３−５９】
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【図３−６０】
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【図３−６１】
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【図３−６２】
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【図３−６３】
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【図３−６４】
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【図３−１８４】
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【図３−１８６】
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【図３−１８７】
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【図３−１８８】
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【図３−１８９】
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【図３−１９０】
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【図３−１９１】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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2005531280.tif 000198
2005531280.tif 000199
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