(57)【要約】本発明は、本発明にかかるＧＰＣＲペプチドであるヒトゲノム中の遺伝子によりコード化されるペプチドのアミノ酸配列を提供する。特に本発明は、単離ペプチドと核酸分子、ＧＰＣＲペプチドのオルソログとパラログを特定する方法、及びＧＰＣＲペプチドの変調剤を特定する方法を提供する。
2005503754.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる単離ペプチド。
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列。
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列の対立変異体のアミノ酸配列であり、該対立変異体が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（転写）又は３（ゲノム）に示される核酸分子の対立鎖に対して、ストリンジェント条件下でハイブリダイズされる核酸分子により、コード化されるもの。
（ｃ） ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列のオルソログアミノ酸配列であり、該オルソログが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（転写）又は３（ゲノム）に示される核酸分子の対立鎖に対して、ストリンジェント条件下でハイブリダイズされる核酸分子によりコード化されるもの。
（ｄ） ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列のフラグメントであり、該フラグメントが少なくとも１０個の隣接アミノ酸を含むもの。
【請求項２】
下記（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ペプチド。
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列。
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列の対立変異体のアミノ酸配列であり、該対立変異体が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（転写）又は３（ゲノム）に示される核酸分子の対立鎖に対して、ストリンジェント条件下でハイブリダイズされる核酸分子により、コード化されるもの。
（ｃ） ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列のオルソログアミノ酸配列であり、該オルソログが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（転写）又は３（ゲノム）に示される核酸分子の対立鎖に対して、ストリンジェント条件下でハイブリダイズされる核酸分子によりコード化されるもの。
（ｄ） ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列のフラグメントであり、該フラグメントが少なくとも１０個の隣接アミノ酸を含むもの。
【請求項３】
請求項２のペプチドに選択的に結合する単離抗体。
【請求項４】
下記（ａ）〜（ｅ）からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる単離核酸分子。
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列。
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列の対立変異体のアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列であり、該ヌクレオチド配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（転写）又は３（ゲノム）に示される核酸分子の対立鎖に対して、ストリンジェント条件下でハイブリダイズされるもの。
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列のオルソログアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列であり、該ヌクレオチド配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（転写）又は３（ゲノム）に示される核酸分子の対立鎖に対して、ストリンジェント条件下でハイブリダイズされるもの。
（ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列のフラグメントをコード化するヌクレオチド配列であり、該フラグメントが少なくとも１０個の隣接アミノ酸を含むもの。
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のヌクレオチド配列の補体であるヌクレオチド配列。
【請求項５】
下記（ａ）〜（ｅ）からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列。
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列の対立変異体のアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列であり、該ヌクレオチド配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（転写）又は３（ゲノム）に示される核酸分子の対立鎖に対して、ストリンジェント条件下でハイブリダイズされるもの。
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列のオルソログアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列であり、該ヌクレオチド配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（転写）又は３（ゲノム）に示される核酸分子の対立鎖に対して、ストリンジェント条件下でハイブリダイズされるもの。
（ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列のフラグメントをコード化するヌクレオチド配列であり、該フラグメントが少なくとも１０個の隣接アミノ酸を含むもの。
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のヌクレオチド配列の補体であるヌクレオチド配列。
【請求項６】
請求項５の核酸分子を含む遺伝子チップ。
【請求項７】
請求項５の核酸分子を含むヒト以外の遺伝子組換動物。
【請求項８】
請求項５の核酸分子を含む核酸ベクター。
【請求項９】
請求項８のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１０】
（ａ）〜（ｄ）のアミノ酸配列のいずれかをコード化するヌクレオチド配列を宿主細胞に導入し、ペプチドが該ヌクレオチド配列から発現される条件下で宿主細胞を培養することを含む、請求項１のペプチドのいずれかを製造する方法。
【請求項１１】
（ａ）〜（ｄ）のアミノ酸配列のいずれかをコード化するヌクレオチド配列を宿主細胞に導入し、ペプチドが該ヌクレオチド配列から発現される条件下で宿主細胞を培養することを含む、請求項２のペプチドのいずれかを製造する方法。
【請求項１２】
請求項２のペプチドのいずれかの存在をサンプル中に検出する方法であり、サンプル中の該ペプチドの存在を特異的に検出できる検出試薬にサンプルを接触させ、該ペプチドの存在を検出することを含む方法。
【請求項１３】
請求項５の核酸分子の存在をサンプル中に検出する方法であり、ストリンジェント条件下で該核酸分子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドにサンプルを接触させ、オリゴヌクレオチドがサンプル中の核酸分子に結合するかどうかを判断することを含む方法。
【請求項１４】
請求項２のペプチドの変調剤を特定する方法であり、該ペプチドを試薬に接触させ、該試薬が該ペプチドの機能又は活性を変調したかどうかを判断することを含む方法。
【請求項１５】
該ペプチドを発現する発現ベクターを含む宿主細胞に試薬が投与される請求項１４の方法。
【請求項１６】
請求項２のペプチドのいずれかに結合する試薬を特定する方法であり、ペプチドを該試薬に接触させ、接触混合物中にペプチドと試薬とが結合した複合体が成形されているかどうかを判断することを含む方法。
【請求項１７】
請求項１６の方法により特定される試薬、及びその薬剤的に許容できる媒体を含む薬剤組成物。
【請求項１８】
ヒトプロテアーゼにより媒介される疾患又は状態の治療方法であり、請求項１６の方法により特定される試薬を薬剤的に効果的な量、患者に投与することを含む方法。
【請求項１９】
請求項２のペプチド発現の変調剤を特定する方法であり、該ペプチドを発現する細胞を試薬に接触させ、該試薬が該ペプチドの発現を変調するかどうかを判断することを含む方法。
【請求項２０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％が相同であるアミノ酸配列を有する本発明の単離ヒトプロテアーゼペプチド。
【請求項２１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％が相同である請求項２０のペプチド。
【請求項２２】
ヒトプロテアーゼペプチドをコード化する単離核酸分子であり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（転写）又は３（ゲノム）に示される核酸分子と少なくとも８０％が相同である核酸分子。
【請求項２３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（転写）又は３（ゲノム）に示される核酸分子と少なくとも９０％が相同である請求項２２の核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０００年９月１９日付け出願のＵ．Ｓ．Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．６０／２３３，４９４（Ａｔｔｙ． Ｄｏｃｋｅｔ ＣＬ０００８５６−ＰＲＯＶ）、及び２００１年３月２６日付け出願のＵ．Ｓ．Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．０９／８１６，６８５（Ａｔｔｙ． Ｄｏｃｋｅｔ ＣＬ０００８５６）の優先権を主張するものである。
【０００２】
技術分野
本発明は、カルシウムセンシング受容体サブファミリーに関連するＧ−タンパク共役受容体（ＧＰＣＲ）、組換えＤＮＡ分子、及びタンパク生成に関する。特に本発明は、新規のＧＰＣＲペプチドとタンパク、及び該ペプチド及びタンパク分子をコード化する核酸分子を提供し、これらはヒト治療学、及び診察用組成物と診察方法の発展のために有用である。
【０００３】
背景技術
Ｇ−タンパク共役受容体
Ｇ−タンパク共役受容体（ＧＰＣＲ）は、細胞内での信号伝達を担うタンパクの主要なクラスを構成している。ＧＰＣＲは３つの構造のドメインを持っている。それはアミノ末端細胞外ドメイン；７つの貫膜セグメント・３つの細胞外ループ・３つの細胞内ループを含む貫膜ドメイン；及びカルボキシ末端細胞内ドメインである。ＧＰＣＲの細胞外部分にリガンドが結合する際に、細胞内で信号が伝達され、その結果、細胞の生物学的又は生理的な性質が変化する。ＧＰＣＲは、Ｇ−タンパク及び効果器（細胞内酵素、Ｇ−タンパクにより変調されるチャンネル）と共に、細胞内二次メッセンジャーの状態を細胞外入力へと結びつけるモジュラー信号系の要素である。
【０００４】
ＧＰＣＲ遺伝子及び遺伝子生成物は、疾患を引き起こす原因薬剤となり得る（Ｓｐｉｅｇｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９２：１１１９−１１２５ （１９９３）； ＭｃＫｕｓｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｇｅｎｅｔ． ３０：１−２６ （１９９３））。ロドプシン遺伝子及びＶ２バソプレッシン受容体遺伝子に特有の欠陥は、種々の色素性網膜炎（Ｎａｔｈａｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． ２６：４０３−４２４（１９９２））、及び腎性尿崩症（Ｈｏｌｔｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ． ２：１２０１−１２０４ （１９９３）） を引き起こすことが示されている。これらの受容体は、中枢神経系及び末梢の生理的プロセスにおいて非常に重要である。進化解析により、これらのタンパクの祖先は元来、複合体設計、神経系とともに発達してきたことが示唆される。
【０００５】
ＧＰＣＲタンパクスーパーファミリーは、ファミリーＩ：ロドプシン及びβ２−プリン作動性受容体に代表され、現在２００以上の特有のメンバーが示されている受容体ファミリー（Ｄｏｈｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６０：６５３−６８８ （１９９１））；  ファミリーＩＩ：副甲状腺ホルモン／カルシトニン／セクレチン受容体ファミリー（Ｊｕｐｐｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１０２４−１０２６ （１９９１）； Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１０２２−１０２４ （１９９１））；  ファミリーＩＩＩ：代謝性のグルタミン酸塩受容体ファミリー（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８ ５９７：６０３ （１９９２））；  ファミリーＩＶ：走化性及びＤ． ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍの発達に重要なｃＡＭＰ受容体ファミリー（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１４６７−１４７２ （１９８８））；  ファミリーＶ：ＳＴＥ２等の菌類交接フェロモン受容体ファミリー（Ｋｕｒｊａｎ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６１：１０９７−１１２９ （１９９２））、の５つのファミリーに分類することができる。
【０００６】
７つの推定疎水性セグメントを示し、ＧＰＣＲとは無関係と思われる少数の他のタンパクも存在する；これらはＧ−タンパクとの共役を示さなかった。ショウジョウバエは、光受容体に特有のタンパクであるｂｒｉｄｅ−ｏｆ−ｓｅｖｅｎｌｅｓｓ（ｂｏｓｓ）を発現し、この７つの貫膜セグメントを持つタンパクは広範囲にわたって研究されているが、ＧＰＣＲであるという証拠は示されていない（Ｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５０４７−５０５１ （１９９３））。ショウジョウバエ中のちぢれた遺伝子（ｆｚ）もまた、７つの貫膜セグメントを持つタンパクであると考えられる。ｂｏｓｓと同様に、ｆｚもＧ−タンパクとの共役を示さなかった（Ｖｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３８：２６３−２６４ （１９８９））。
【０００７】
Ｇ−タンパクは、グアニンヌクレオチドと結合するα、β、及びγサブユニットから成るヘテロ三量体タンパクファミリーを表す。これらのタンパクは、通常、例えば７つの貫膜セグメントを含む受容体等の細胞表面の受容体に結合している。リガンドのＧＰＣＲへの結合に続いて、立体配座の変化がＧ−タンパクに伝達され、これによりαサブユニットにおいてＧＤＰ分子がＧＴＰ分子と交換され、β、γサブユニットから分離される。αサブユニットのＧＴＰ結合様式は、典型的には、効果器変調部として機能し、ｃＡＭＰ（例えば、アデニルシクラーゼの活性化により）、ジアシルグリセロール、イノシトールリン酸塩等の二次メッセンジャーの生成を導く。２０種類以上の異なるαサブユニットがヒトにおいて知られている。これらのサブユニットは、β、γサブユニットの小さいプールと関連している。哺乳類のＧ−タンパクの例としては、Ｇｉ、Ｇｏ、Ｇｑ、Ｇｓ、及びＧｔが含まれる。Ｇ−タンパクは、Ｌｏｄｉｓｈ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， １９９５）に広範囲にわたって記載されており、その内容は参考文献としてここに折り込まれている。ＧＰＣＲ、Ｇ−タンパク、Ｇ−タンパク結合効果器、及び二次メッセンジャーシステムについては、Ｔｈｅ Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｎｋｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｆａｃｔ Ｂｏｏｋ， Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ （１９９４）に記述されている。
【０００８】
アミン作動性ＧＰＣＲ
ＧＰＣＲの１つのファミリーであるファミリーＩＩには、アセチルコリン、カテコールアミン、及びインドールアミンリガンド（以下、生体アミンとする）の受容体が含まれる。生体アミン受容体（アミン作動性ＧＰＣＲ）はＧＰＣＲの大きなグループであり、これらは進化における祖先を共有しており、脊椎動物（新口動物）と無脊椎動物（旧口動物）の両方に存在する。このＧＰＣＲファミリーには、５−ＨＴ類、ドーパミン類、アセチルコリン類、アドレナリン類、メラトニン類のＧＰＣＲが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０００９】
ドーパミン受容体
脳の機能、及び疾患に関するドーパミン作動性システムへの理解は、数十年前、薬物治療後の３つの異なる観察がなされたことにより発展を遂げた。これらは、パーキンソン病を改善するためのドーパミン置換療法において、ドーパミン受容体をブロックする抗うつ病薬及び抗精神病薬に由来するレセルピンによってドーパミンや他のカテコールアミンが減少することが観察されたというものである。典型的な抗精神病薬のドーパミン受容体結合親和性が、それらの臨床効果に相互に関連するという発見から、精神分裂症におけるドーパミン過活性の仮説が導かれた（Ｓｎｙｄｅｒ， Ｓ．Ｈ．， Ａｍ Ｊ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ １３３， １９７−２０２ （１９７６）； Ｓｅｅｍａｎ， Ｐ． ａｎｄ Ｌｅｅ， Ｔ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ １８８， １２１７−９ （１９７５））。今日、ドーパミン受容体は、精神分裂症、パーキンソン病、トゥレット症候群、遅行性ジスキネジア、ハンティングトン疾患の薬理療法における重要な対象である。ドーパミン作動性システムには、黒質線条体、中間皮質、及び隆起漏斗の経路が含まれる。黒質線条体系経路は線条体内モーターシステムの一部であり、その退化はパーキンソン病を引き起こす：中間皮質系経路は、増強及び感情表現において重要な役割を果たし、抗精神病性薬の作用において要求される部位である：隆起漏斗系経路は脳下垂体からのプロラクチン分泌を調節する。
【００１０】
ドーパミン受容体は、Ｇタンパク共役受容体スーパーファミリーのメンバーであり、共に７つの螺旋形膜スパニング構造を有し、ヘテロ３量体グアニンヌクレオチド結合調節タンパク（Ｇタンパク）の結合を通じて信号を変換する大きなタンパクグループである。ドーパミン受容体は、それらの異なるリガンド結合様式、信号伝達特性、配列相同性、ゲノム組織に基づいて、Ｄ１類（Ｄ１及びＤ５）、Ｄ２類（Ｄ２、Ｄ３及びＤ４）といったサブファミリーに分類される（Ｃｉｖｅｌｌｉ， Ｏ．， Ｂｕｎｚｏｗ， Ｊ．Ｒ． ａｎｄ Ｇｒａｎｄｙ， Ｄ．Ｋ．， Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ ３３， ２８１−３０７ （１９９３））。Ｄ１類受容体であるＤ１及びＤ５は、Ｇｓ類タンパクとの結合を通じてｃＡＭＰ合成を活性化し、また、それらの遺伝子はタンパクコード領域中にイントロンを含まない。他方、Ｄ２類受容体であるＤ２、Ｄ３及びＤ４は、Ｇｉ類タンパクとの相互作用を通じてｃＡＭＰ合成を阻害し、また、タンパクコード領域中にイントロンを含む類似のゲノム組織を共有している。
【００１１】
セロトニン受容体
セロトニン（５−Ｈｙｄｒｏｘｙｔｒｙｐｔａｍｉｎｅ）は、最初に血清から単離され、そこでは血管収縮を促進することが示された（Ｒａｐｐｏｒｔ， Ｍ．Ｍ．， Ｇｒｅｅｎ， Ａ．Ａ． ａｎｄ Ｐａｇｅ， Ｉ．Ｈ．， Ｊ  Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １７６， １２４３−１２５１ （１９４８）。ＬＳＤやプシロシビン等の幻覚剤が、平滑筋製造における５−ＨＴの作用を阻害することが観察され、５−ＨＴと精神的疾患との関係に対する関心が高められた（Ｇａｄｄｕｍ， Ｊ．Ｈ． ａｎｄ Ｈａｍｅｅｄ， Ｋ．Ａ．， Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ９， ２４０−２４８ （１９５４））。この観察は、精神医学的障害において脳での５−ＨＴ活性が変化され得るという仮説を導くものである（Ｗｏｏｌｅｙ， Ｄ．Ｗ． ａｎｄ Ｓｈａｗ，  Ｅ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ４０， ２２８−２３１ （１９５４）； Ｇａｄｄｕｍ， Ｊ．Ｈ． ａｎｄ Ｐｉｃａｒｅｌｌｉ， Ｚ．Ｐ．， Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １２， ３２３−３２８ （１９５７））。この仮説は、三環性抗憂鬱剤及びモノアミンオキシダーゼ阻害剤が多くのうつ症状治療へと導入され、これらの製剤のノルアドレナリン及び５−ＨＴの代謝への影響が観察されたことにより強化された。今日、セロトニン作用系に作用している薬剤は、一般に不安症状・社会恐怖症とされている鬱病、精神分裂症、強迫症状、パニック症候群、また偏頭痛、ガン化学療法により誘発する嘔吐、及び胃運動性障害等の精神病の薬物療法において、効果的であることが証明されている。
【００１２】
セロトニン受容体は、神経伝達物質受容体における非常に大きく多様なファミリーである。現在までに哺乳類において、１３のＧタンパク共役５−ＨＴ受容体タンパクと、１つのリガンドゲートイオンチャンネル受容体（５−ＨＴ３）が記述されている。この受容体の多様性は、神経伝達物質及びホルモンとしてのセロトニンの古代起源と同様に、哺乳類における５−ＨＴの多くの異なる役割を反映するものと考えられる。５−ＨＴ受容体は、それらの異なるリガンド−親和性プロフィール、分子構造、及び細胞内伝達機構によって、７つのサブファミリー又はグループに分類される（Ｈｏｙｅｒ， Ｄ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｒｅｖ． ４６， １５７−２０３ （１９９４））。
【００１３】
アドレナリン作動性ＧＰＣＲ
アドレナリン作動性受容体は、Ｇタンパク共役受容体「スーパーファミリー」において、最も大きく、最も広く特徴づけられたファミリーのうちの１つを含む。このスーパーファミリーには、アドレナリン作動性受容体だけでなく、ムスカリン系、コリン作動性、ドーパミン作動性、セロトニン作動性、ヒスタミン作動性受容体も含まれる。グルカゴン、ソマトスタチン、バソプレッシン受容体、同様に視覚（ロドプシン）、味覚、及び嗅覚のための感覚受容体といった多くのタンパク受容体もまた、このファミリーに属する。シグナリング分子の多様性にもかかわらず、Ｇ−タンパク共役受容体の全てのプロセスは、７つの推定αへリックス構造膜に特徴付けられる初期の構造体と全く同様である（Ｐｒｏｂｓｔ ｅｔ ａｌ．， １９９２）。最も基本的な理解としては、アドレナリン作動性受容体は、カテコールアミン、エピネフリン、及びノルエピネフリンの作用する生理的部位である。アドレナリン作動性受容体は、Ａｈｌｑｕｉｓｔによって最初にα又はβとして分類され、彼は２つの受容体サブタイプにおいて、生理的反応を引き起こす一連のアゴニストの効力が、両者で明らかに異なることを証明した（Ａｈｌｑｕｉｓｔ（１９４８））。機能的には、αアドレナリン作動性受容体は、血管収縮、瞳孔拡張、及び子宮の抑制を制御することが示され、一方でβアドレナリン作動性受容体は、血管弛緩、心筋刺激、及び気管支拡張に関係している（Ｒｅｇａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９０）。結局のところ、薬理学者達は、これらの反応はいくつかの異なるアドレナリン作動性受容体サブタイプの活性化により生じるものであると認識した。心臓中のβアドレナリン作動性受容体はβサブ１として定義され、肺及び脈管系中のそれらはβサブ２と呼ばれている（Ｌａｎｄｓ ｅｔ ａｌ．， １９６７）。
【００１４】
一方で、αアドレナリン作動性受容体は、最初にシナプス前後（それぞれαサブ１、αサブ２）としての解剖学的位置に基づいて分類された（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９７４）。しかしながら、この分類案は、αサブ２受容体が血小板のような明らかな非シナプス位置に存在していることによって混乱させられた。（Ｂｅｒｔｈｅｌｓｅｎ ａｎｄ Ｐｅｔｔｉｎｇｅｒ， １９７７）。放射性リガンド結合技術の開発に伴い、αアドレナリン作動性受容体は、プラゾシン又はヨヒンビンアンタゴニストとの親和性に基づいて薬理学的に識別された（Ｓｔａｒｋ， １９８１）。
【００１５】
しかしながら、アドレナリン作動性受容体サブタイプの決定的な証拠としては、アドレナリン作動性受容体サブタイプの精製、及び分子クローニングが待たれた。１９８６年に、ハムスターのβサブ２１アドレナリン作動性受容体（Ｄｉｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８６）、及び七面鳥のβサブ１アドレナリン作動性受容体（Ｙａｒｄｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９８６）の遺伝子がクローン化され、配列決定された。そして、水治療解析により、これらのタンパクが、光受容体であるロドプシンに類似した７つの疎水性ドメインを含んでいることが明らかとなった。これ以降、アドレナリン作動性受容体ファミリーは、３つのβ受容体サブタイプ（Ｅｍｏｒｉｎｅ ｅｔ ａｌ．， １９８９）、３つのαサブ１受容体サブタイプ（Ｓｃｈｗｉｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９９０）、及び３つの異なるβサブ２受容体（Ｌｏｍａｓｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， １９９０）を含むように拡大された。
【００１６】
動物組織由来のα受容体サブタイプのクローニング、配列解析及び発現から、α１受容体は、α１ｄ（以前、α１ａ又はα１ａ／１ｄとして知られていた）、α１ｂ、及びα１ａ（以前、α１ｃとして知られていた）サブタイプへと分類されるに至った。それぞれのα１受容体は、薬理学的特異性、及び組織特異性を示す。「α１ａ」という名称は、１９９５年の受容体及びイオンチャンネル命名補遺（Ｗａｔｓｏｎ ａｎｄ Ｇｉｒｄｌｅｓｔｏｎｅ， １９９５）において概説されているように、以前「α１ｃ」と命名されていたサブタイプについて、近年、ＩＵＰＨＡＲＮ命名委員会により公認された名称である（Ｗａｔｓｏｎ ａｎｄ Ｇｉｒｄｌｅｓｔｏｎｅ， １９９５）。本発明においては、α１ａという名称はこのようなサブタイプのことをいう。また、同時に、以前α１ａと称されていた受容体は、α１ｄと命名された。本発明においては新しい命名法が用いられている。これらのα１受容体サブタイプを発現している安定な細胞系がここに記述されている；しかしながら、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ）では、これらの細胞系は古い命名法の下に記載されている。α１アドレナリン作動性受容体サブタイプの分類については、Ｍａｒｔｉｎ Ｃ． Ｍｉｃｈｅｌ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｕｎｙｎ−Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇ’ｓ Ａｒｃｈ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． （１９９５） ３５２：１−１０を参照。
【００１７】
αアドレナリン作動性受容体サブタイプにおける相違は、病態生理学的な症状に関連している。良性の前立腺肥大又はＢＰＨとして知られている良性前立腺過形成は、典型的には５０歳以上の男性に発症し、年齢が増すに連れ病状は深刻なものとなる。症状の兆候としては、これに限られるものではないが、排尿の困難性増加や性的機能不全がある。これらの徴候は、前立腺の肥大又は過形成によって引き起こされる。前立腺が肥大すると、男性の尿道における自由な流れを阻害する。これに付随して、肥大した前立腺のノルアドレナリン作動性神経刺激伝達が増大することにより、膀胱口及び尿道におけるアドレナリン作用が増大し、さらには尿道を通じての尿の流れが制限されるに至る。
【００１８】
αサブ２受容体は、β及びαサブ１受容体の両者よりも早く開散されると考えられる。αサブ２受容体は、その染色体位置に基づいて、αサブ２Ｃ２、αサブ２Ｃ４、αサブ２Ｃ１０と呼ばれる３つの異なる分子のサブタイプに分解される。これらのサブタイプはそれぞれ、薬理学的に定義されるαサブ２Ｂ、αサブ２Ｃ、αサブ２Ａサブタイプに対応していると考えられる（Ｂｙｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．， １９９２）。
【００１９】
全てのアドレナリン作動性受容体がエピネフリンにより認識されるとはいえ、それらは薬理学的に異なるものであり、個別の遺伝子によってコード化されているものである。これらの受容体は、一般的にＧ−タンパクを通じ結合される、異なる二次メッセンジャー経路に結合される。アドレナリン作動性受容体において、βサブ１及びβサブ２受容体はアデニレートシクラーゼを活性化し、αサブ２受容体はアデニレートシクラーゼを阻害し、αサブ１受容体はホスホリパーゼＣ経路を活性化し、ポリホスホイノシチド分解を促進する（Ｃｈｕｎｇ， Ｆ． Ｚ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６３：４０５２ （１９８８））。αサブ１及びαサブ２アドレナリン作動性受容体は、それらの薬剤としての細胞活性において相違する。
【００２０】
このタンパクファミリーのメンバーの有用性を開示している米国の特許としては、６，０６３，７８５号（良性前立腺過形成の治療に有用なフタルイミドアリールピペラジン）、６，０６０，４９２号（選択的β３アドレナリン作動性アゴニスト）、６，０５７，３５０号（α１ａアドレナリン作動性受容体アンタゴニスト）、６，０４６，１９２号（フェニルエタノールアミノテトラリンカルボキサミド誘導体）、６，０４６，１８３号（良性前立腺過形成の共同治療方法）、６，０４３，２５３号（β３アゴニストとしてのアリールスルホンアミド置換融合ピペリジン）、６，０４３，２２４号（神経病的障害及び神経変性疾患の治療のための組成物及び方法）、６，０３７，３５４号（α１ａアドレナリン作動性受容体アンタゴニスト）、６，０３４，１０６号（糖尿病及び肥満の処置のための選択的βサブ３ アゴニストとしてのオキサジアゾールベンゼンスルホンアミド）、６，０１１，０４８号（糖尿病及び肥満の処置のための選択的βサブ３アゴニストとしてのチアゾールベンゼンスルホンアミド）、６，００８，３６１号及び５，９９４，５０６号（アドレナリン作動性受容体）、５，９９４，２９４号（ニトロソ化、及びニトロシル化αアドレナリン作動性受容体アンタゴニスト化合物、組成物及びその使用）、５，９９０，１２８号（良性前立腺過形成の治療のためのαサブ１Ｃの特定化合物）、５，９７７，１５４号（選択的β３アドレナリン作動性アゴニスト）、５，９７７，１１５号（α１ａアドレナリン作動性受容体アンタゴニスト）、５，９３９，４４３号（選択的β３アドレナリン作動性アゴニスト）、５，９３２，５３８号（ニトロソ化、及びニトロシル化αアドレナリン作動性受容体アンタゴニスト化合物、組成物及びその使用）、５，９２２，７２２号（α１ａアドレナリン作動性受容体アンタゴニスト２６）、５，９０８，８３０号及び５，８６１，３０９号（ヒトα１アドレナリン作動性受容体をコード化するＤＮＡ）が挙げられるが、これらに限られるものではない。
【００２１】
プリン作動性ＧＰＣＲ
プリン受容体Ｐ２Ｙ１
Ｐ２プリン受容体は、ＡＴＰゲートチャンネルであるＰ２Ｘ受容体、Ｇ−タンパク共役受容体のファミリーであるＰ２Ｙ受容体、及びマスト細胞中で非選択的に細孔を媒介するＰ２Ｚ受容体に大きく分類されてきた。それぞれのＰ２受容体において、多くのサブクラスが特定されている。Ｐ２Ｙ受容体は、ＡＴＰ及びその類似体に対する選択的な応答性によって特徴づけられる。これらのうちのいくつかは、ＵＴＰに対しても応答する。Ｐ２プリン受容体命名法の推奨に基づき、Ｐ２Ｙプリン受容体はクローニングの順序により番号付けられる。Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ２、及びＰ２Ｙ３は、様々な種からクローン化された。Ｐ２Ｙ１は、ＡＤＰとＡＴＰに対して応答する。ヒトの骨及び２つの骨芽細胞系におけるＰ２Ｙ受容体サブタイプの発現についてＲＴ−ＰＣＲにより分析したところ、全ての公知のヒトＰ２Ｙ受容体サブタイプ、すなわちＰ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、Ｐ２Ｙ６、及びＰ２Ｙ７が発現していることが示された（Ｍａｉｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９７）。対照的に、脳由来の細胞系における分析では、脳組織においてはＰ２Ｙ受容体サブタイプの選択的な発現が起こっていることが示唆された。
【００２２】
Ｌｅｏｎらは、Ｐ２Ｙ１受容体の生理学的な役割を調べるためにＰ２Ｙ１−ヌルマウスを生成した（Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １０４： １７３１−１７３７（１９９９））。これらのマウスは、発達、寿命、再生、血小板の形状等に影響する異常を生じることなく成長することができ、これらの血小板の計測数は野生型マウスと同等だった。しかしながら、Ｐ２Ｙ１不足マウスから取り出した血小板は、通常のＡＤＰ濃度では凝集することができず、他のアゴニストへの凝集も減少したが、高濃度のＡＤＰでは形状変化なしに凝集する。さらに、アデニリルシクラーゼのＡＤＰ由来の阻害が未だ生じており、Ｐ２Ｙ１とは別のＡＤＰ受容体の存在が示された。Ｐ２Ｙ１−ヌルマウスは、自発的な出血傾向は持たないが、ＡＤＰ又はコラーゲンとアドレナリンの静脈注射により引き起こされる血栓塞栓症に対する抵抗力があった。したがって、Ｐ２Ｙ１受容体は、血栓症状において重要な役割を果たし、抗血栓性薬剤を代表する。Ｓｏｍｅｒｓらは、短腕の染色体３上の末端マーカーから、１７３〜１７４ｃＭの位置のフランキングマーカーＤ３Ｓ１２７９とＤ３Ｓ１２８の間の、Ｐ２ＲＹ１遺伝子をマップした（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４４： １２７−１３０ （１９９７）。
【００２３】
プリン受容体Ｐ２Ｙ２
嚢胞性線維症（ＣＦ）に欠けている塩化物イオン分泌経路は、細胞外ヌクレオチドにより活性化される塩化物イオンの代替となる輸送経路によってバイパスされる。従って、この効果を媒介するＰ２受容体は、ＣＦ患者の塩化物イオン分泌を改善するための治療対象である。Ｐａｒｒらは、タンパクをコード化するヒト気道上皮細胞からクローンされたｃＤＮＡの配列及び機能発現を、Ｐ２Ｙヌクレオチド受容体の特性とともに報告した（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９１： ３２７５−３２７９ （１９９４））。ヒトＰ２ＲＹ２遺伝子は、染色体１１上のｑ１３．５〜ｑ１４．１にマップされた。
【００２４】
プリン受容体Ｐ２Ｙ４
Ｐ２ＲＹ４受容体は、ＵＴＰ及びＵＤＰにより特異的に活性化され、ＡＴＰ及びＡＤＰでは活性化しないと考えられる。このウリジンヌクレオチド受容体の活性化により、イノシトールリン酸形成向上、及びカルシウム移動を生じる。ＵＮＲ遺伝子は染色体Ｘｑ１３上に位置する。
【００２５】
プリン受容体Ｐ２Ｙ６
Ｓｏｍｅｒｓらは、Ｐ２ＲＹ６遺伝子を、多型マーカーＤ１１Ｓ１３１４及びＤ１１Ｓ９１６との間の１１ｑ１３．５にマップし、Ｐ２ＲＹ２は４ｃＭ以下のＰ２ＲＹ６内に位置する（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４４： １２７−１３０ （１９９７）。これは、この遺伝子ファミリーの染色体群化について最初に記述したものである。
【００２６】
アデニン、ウリジンヌクレオチドは、細胞内エネルギー代謝、リン酸化、及び核酸合成における既定の役割に加えて、重要な細胞外信号分子でもある。Ｐ２Ｙ代謝性受容体は、種々の生理的プロセスを調節している細胞外ヌクレオチドの影響を媒介するＧＰＣＲである。少なくとも１０のＰ２Ｙ受容体サブファミリーが確認されている。これらの受容体サブファミリーは、配列、及びヌクレオチドアゴニストの選択性及び有効性において大きく異なっている。
【００２７】
脳においては、Ｐ２Ｙ１受容体が強く発現されることが証明されているが、Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、及びＰ２Ｙ６受容体も存在している。神経細胞、神経膠細胞、脳脈管又は脳室上衣細胞における、これらのサブタイプの局在化は、ｉｎ ｓｉｔｕ  ｍＲＮＡハイブリダイゼーション、及びこれらの培養細胞の研究において発見された。Ｐ２Ｙ１受容体は神経細胞に顕著に存在する。あるＰ２Ｙ受容体サブタイプの、Ｎ型Ｃａ２＋チャンネル又は特定のＫ＋チャンネルへの共役が実証された。
【００２８】
また、いくつかのＰ２Ｙ受容体が、細胞内経路を刺激して、平滑筋細胞の生育促進効果を媒介することが示された。この細胞内経路はＧｑタンパク、タンパクキナーゼＣ、及びチロシンリン酸化に関連し、即時の初期遺伝子発現、細胞数、ＤＮＡ及びタンパク合成を引き起こしている。さらにＰ２Ｙ調節が、動脈硬化症の発症に応答し、分裂促進の役割を果たすことが証明された。
【００２９】
さらにＰ２Ｙ受容体が、嚢胞性線維症において重要な役割を果たすことが示された。気道表面の液体の体積及び組成は、気道上皮を透過するイオンの能動輸送により調整されている。これは、基底外受容体に作用する自律神経のアゴニスト、及び発光性受容体に作用するアゴニストの両者によって次々に調節される。特に、気道表面の液体中に存在する細胞外ヌクレオチドは、発光性Ｐ２Ｙ受容体において、Ｃｌ−分泌、及びＮａ＋吸収を制御するよう作用する。ヌクレオチドは気道上皮細胞から調節されて放出されるので、気道上イオン輸送の調節は、気道上皮の発光性表面に局在したオートクリン調節系の一部をなしていることが好ましい。この生理学的な役割に加えて、Ｐ２Ｙ受容体アゴニストは、上皮のイオン輸送障害であるＣＦの治療において有益である可能性がある。ＣＦを有するヒトの気道では、不完全なＣｌ−分泌及び異常に高率なＮａ＋吸収が生じている。Ｐ２Ｙ受容体アゴニストは、これらのイオン輸送経路の両方を調節し、ＣＦにおけるイオン輸送欠陥に対する薬理学的なバイパスとなる可能性を持つ。
【００３０】
カルシウムセンシング受容体
カルシウムセンシング受容体（ＣａＲ）はＧタンパク共役受容体、またはＧＰＣＲのファミリーである。カルシウムセンシング受容体は、香料受容体と広範囲の配列類似を有する。両方のＧＰＣＲタイプが上皮において発現される。ＣａＲは、ジスルフィドリンクにより一緒に保持された二量体を成形する。モノマー間の相互分子の相互作用はＣａＲの活性に重要であると考えられる。
【００３１】
ＣａＲのスプライス型は、ケラチン細胞において発現される；ＣａＲは上皮の分化に関係する。ノックアウトマウスのＣａＲ欠損は、結果として表皮の可視変化、及びｌｏｒｉｃｉｎの低下、（ケラチン細胞分化マーカー）となる。
ＣａＲは繊維芽細胞にも発現される；これらは、細胞外カルシウムに呼応して、Ｓｒｃのカルシウム依存性活性化及びマイトジェン作動性キナーゼに関連する。ＣａＲは繊維芽細胞の増殖を刺激しうる。甲状腺におけるＣａＲの存在は、高カルシウム血症障害及び低カルシウム血症障害の病因学での意義を強調する。ＣａＲの自然に起こる変異は、家族性低カルシウム血症、高カルシウム血症及び新生児の重い副甲状腺機能亢進症を含むいくつかの遺伝状態と関連する。
【００３２】
表皮再生は、皮膚に加えて腸、腎臓ダクト及び甲状腺の内側の置換に必要な連続工程である。この工程のスピードは、規定因子でしっかり制御されるが、規定因子の多くは未知である。本発明のＣａＲはケラチン細胞分裂と分化に必要であるケラチン細胞に発現されうる。急速な分裂皮膚細胞、例えば角化腫と胸腫瘍において、ＣａＲのレベルが高くなることがある。このタンパクに対する抗体は腫瘍を検出できる。ＧＰＣＲと結合し、そのカルシウム検出能力を妨げる合成ペプチド阻害剤は、制がん性薬剤として使われうる。ＣａＲ二量体化ドメインを擬態する短いペプチドにより、機能的なＣａＲ受容体の集合が防止できる。
【００３３】
ＣａＲＣａＲ関連の論評としては、Ｏｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２０００ Ｊａｎ １４；２７５（２）：１１８３−９０；  Ｂｉｋｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９９６ Ｆｅｂ １５；９７（４）：１０８５−９３； ＭｃＮｅｉｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９８ Ｊａｎ ９；２７３（２）：１１１４−２０；  Ｂａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １９９９ Ｍａｒ １６；９６（６）：２８３４−９； Ｅｍａｎｕｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １９９６ Ｍａｙ；１０（５）：５５５−６５を参照。
【００３４】
ＧＰＣＲ、特にカルシウムセンシング受容体サブファミリーのメンバーは、薬剤作用と開発のための主要な対象である。従ってそれは、未知のＧＰＣＲを識別し特徴付ける調剤開発の分野において貴重である。本発明は、未確認のヒトＧＰＣＲを提供することにより、技術レベルを向上する。
【００３５】
発明の概要
本発明は、カルシウムセンシング受容体サブファミリーやその対立変異体、その他の哺乳動物のオルソログに関連するヒトキナーゼペプチド及びタンパクのアミノ酸配列の特定に一部基づく。これら独特なペプチド配列及びこれらのペプチドをコード化する核酸配列は、ヒト治療対象の開発のモデルとして使用でき、治癒力のあるタンパクの同定に役立ち、ヒト治療薬剤の開発のための対象として役立つ。
【００３６】
本発明のタンパクは、これらのタンパクを発現する細胞において、カルシウムセンシング受容体サブファミリーにより媒介された経路をシグナリングすることに関与するＧＰＣＲである。図１における実験データはヒトの腎臓及び混合組織での発現を示している。ここで、「信号経路」とは、リガンドのＧＰＣＲタンパクへの結合における細胞の機能／活性の変調（例えば、刺激又は抑制）を表す。そのような機能の例としては、ホスファチジルイノシトール４，５−ビスリン酸 （ＰＩＰ２）、イノシトール１，４，５−三リン酸 （ＩＰ３）、及びアデニル酸シクラーゼ等の信号形質導入経路に関与する細胞内分子の動員 ； 原形質膜の分極 ； 分子の産生又は分泌 ； 細胞成分の構造変化 ； ＤＮＡの合成等の細胞増殖 ； 細胞移動 ； 細胞分化 ； 及び細胞生存等を含む。
【００３７】
受容体タンパクにより媒介された反応は、発現する細胞のタイプに依存する。本発明のＧＰＣＲサブファミリーの他のメンバーを発現する細胞のタイプについては、当技術においていくらかの情報がある （背景において引用された引例、及び図２に提供された近似の相同タンパクについての情報、及び図１における実験データによるヒトの腎臓及び混合組織での発現を示している情報を参照）。例えばある細胞においては、受容体タンパクへのリガンドの結合は、化合物の解放、チャンネルのゲーティング、細胞付着、遊走、分化等の活性を刺激し、ホスファチジルイノシトール又は他の細胞のサイクリックＡＭＰ代謝と代謝回転を通じて、異なる結果を引き起こす。本発明の特定のＧＰＣＲにより調整された細胞の活性／応答にかかわらず、受容タンパクは、ＧＰＣＲであり、ＧＰＣＲを表現する細胞又は組織における生物学的工程に関与する細胞において、ホスファチジルイノシトール又はサイクリックＡＭＰ代謝と代謝回転等の様々な細胞内信号形質導入経路を通じて、１つ以上の二次信号を生成するために、Ｇ−タンパクと相互作用することが、当技術の研究者には明確にわかるであろう。図１における実験データは、本発明のＧＰＣＲがヒトの腎臓で発現することを示している。特に仮想ノーザンブロットはヒトの腎臓での発現を示している。加えてＰＣＲ−組織スクリーニングパネルは混合組織での発現を示している（図１の組織発現を参照）。
【００３８】
ここで、「ホスファチジルイノシトール代謝回転と代謝」とは、これら分子の活性だけでなく、ホスファチジルイノシトール４，５−ビスリン酸（ＰＩＰ２）の代謝回転と代謝に関係する分子を意味する。ＰＩＰ２は、原形質膜のサイトゾルリーフレットに発見されたリン脂質である。いくつかの細胞において、受容体へのリガンドの結合は、ＰＩＰ２を加水分解し、１，２−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）及びイノシトール１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）を生成する原形質膜酵素ホスホリパーゼＣを活性化する。一度成形されたＩＰ３は、例えばＩＰ３結合サイトを含むカルシウムチャンネルタンパク等のＩＰ３受容体を結合できるところで、小胞体表面に放出されるかもしれない。ＩＰ３結合は、チャンネルの開放を引き起こし、カルシウムイオンの細胞質への解放を可能にする。ＩＰ３は特有なキナーゼによってリン酸化され、細胞外媒体から細胞質へのカルシウム導入を起こしうる分子であるイノシトール１，３，４，５−四リン酸（ＩＰ４）を形成する。ＩＰ３ 及びＩＰ４は後に、非常に急速に加水分解され、それぞれ不活性なイノシトール１，４−二リン酸（ＩＰ２）及びイノシトール１，３，４−三リン酸になる。これらの不活性な生成物は、ＰＩＰ２を合成するために、細胞によりリサイクルされる。ＰＩＰ２の加水分解により生成された他の二次メッセンジャー、すなわち１，２−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ） は、細胞膜にとどまり、ここで酵素タンパクキナーゼＣを活性化させるのに役立つ。細胞の細胞質において、タンパクキナーゼＣは通常可溶性であることがわかるが、細胞内のカルシウム濃縮度の上昇によって、この酵素は原形質膜に動き、ここでＤＡＧにより活性化されることができる。種々の細胞でのタンパクキナーゼＣの活性化は、グリコーゲンシンターゼのリン酸化、又はＮＦ―ｋＢ等の様々な転写因子のリン酸化等の様々な細胞の反応を生じる。ここで、「ホスファチジルイノシトール活性」という語は、ＰＩＰ２又はその代謝産物の１つの活性を表す。
【００３９】
受容体が関与しうる別の信号経路は、ｃＡＭＰ代謝回転経路である。ここで、「サイクリックＡＭＰ代謝回転と代謝」とは、これら分子の活性だけでなく、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）の代謝回転と代謝に関連する分子をも含む。サイクリックＡＭＰは、一定のＧ−タンパク共役受容体のリガンド誘導の刺激に反応して生み出された二次メッセンジャーである。ｃＡＭＰ信号経路において、ＧＰＣＲへのリガンドの結合は、酵素アデニルシクラーゼの活性化を引き起こし、これはｃＡＭＰの合成を触媒する。新しく合成されたｃＡＭＰは、ｃＡＭＰ依存タンパクキナーゼを次々に活性化する。この活性化したキナーゼは、電圧ゲートカリウムチャンネルタンパク又は関連したタンパクをリン酸化し、活動電位間においてカリウムチャンネルを開かなくする。カリウムチャンネルが開かないと、カリウムの外への流れが減少し、これは通常神経膜を再分極し、延長された膜分極を導く。
【００４０】
ＧＰＣＲを調整する薬剤を対象とすることによって、受容体により媒介された信号活性及び生物学的工程は、具体的な細胞及び組織において、活性化又は阻害される。図１における実験データはヒトの腎臓及び混合組織での発現を示している。そのような活性化作用及び阻害作用は、治療分野（哺乳動物療法）又は毒物分野（抗細胞療法、例えば制ガン剤）において生物学的活性を調整するための基礎として役立つ。
【００４１】
発明の詳細な説明
一般説明
本発明はヒトゲノム配列決定に基づく。ヒトゲノムの配列解析及び構築において、配列情報を分析することにより、当該分野においてＧＰＣＲタンパク又はＧＰＣＲタンパクの一部であると特定されるタンパク／ペプチド／ドメインに、構造及び／又は配列の相同性を有するペプチドをコード化し、カルシウムセンシング受容体サブファミリーに関連するヒトゲノムの未知のフラグメントが明らかとなった。これらの配列を利用することにより、付加的なゲノム配列が組み立てられ、転写及び／又はｃＤＮＡ配列は単離され特徴付けられた。この分析に基づき、本発明は、カルシウムセンシング受容体サブファミリーと関連するヒトＧＰＣＲペプチド及びタンパクのアミノ酸配列、転写配列型の核酸配列、これらのＧＰＣＲペプチド及びタンパクをコード化するｃＤＮＡ配列及び／又はゲノム配列、核酸変異（対立変異体情報）、発現の組織分布、及び本発明のＧＰＣＲと構造又は配列の相同性を有する近似の公知タンパク／ペプチド／ドメインに関する情報を提供する。
【００４２】
本発明において提供されるペプチドは、未知なだけでなく、商業的に重要な製品及びサービスの開発において有用であるかどうかに基づいて選択される。特に、本発明のぺプチドは、カルシウムセンシング受容体サブファミリーの公知のＧＰＣＲタンパクとの相同性及び／又は構造上の相関、及び観察される発現パターンに基づき選択される。図１における実験データはヒトの腎臓及び混合組織での発現を示している。この技術は、このタンパクファミリーのメンバー、及び本遺伝子と同様な発現型を持つタンパクのメンバーの、商業的な重要性を明確に確立した。本発明のペプチドのより具体的な機能及びその用途は、本明細書、特に発明の背景、及び図の注釈に説明されており、及び／又は公知のカルシウムセンシング受容体ファミリー又はＧＰＣＲタンパクのサブファミリーの技術において知られている。
【００４３】
具体的な実施例
ペプチド分子
本発明は、タンパクのＧＰＣＲファミリーメンバーであり、カルシウムセンシング受容体サブファミリーであると特定され、タンパク分子をコード化する核酸配列を提供する。（タンパク配列は図２、転写／ｃＤＮＡ配列は図１、ゲノム配列は図３に提供される）。ここに示した明らかな変異体と同様に、図２に提供されたペプチド配列、例えば対立遺伝子変異は、本発明のＧＰＣＲペプチド、ＧＰＣＲペプチド、あるいは本発明のペプチド／タンパクとしてここに参照される。
【００４４】
本発明は、当技術の製造と用途におけるこれらペプチドのすべての明らかな変異だけでなく、図２に示されるＧＰＣＲペプチドのアミノ酸配列（図１の転写／ｃＤＮＡ配列、あるいは図３のゲノム配列の核酸分子よってコード化される）から成っているか、実質的に成っているか、又はそれを含む単離ペプチド及びタンパク分子を提供する。これらの変異は以下に詳細に説明される。
【００４５】
ここでペプチドは、細胞物質、又は化学前駆体や他の化学物質を実質的に含まない場合に、「単離」又は「精製」されたという。本発明のペプチドは均一に、又はある程度の純度に精製され得る。精製のレベルは使用目的に基づく。重要な特徴は、調製物中に相当量の他成分が存在していたとしても、調製物がペプチドの所望の機能を発揮できるということである（単離核酸分子の特徴については以下に記述される）。
【００４６】
ここで、「細胞物質を実質的に含まない」とは、少なくとも約３０％（乾燥重量）以下の他のタンパク（即ち汚染タンパク）、２０％以下の他のタンパク、１０％以下の他のタンパク、又は５％以下の他のタンパクを有するペプチド組成物を含む。ペプチドが組替えにより生産される場合、タンパク調製物の容量に対して培地が約２０％以下の場合、培地を実質的に含まないとすることができる。
【００４７】
「化学前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない」とは、合成時において関与する化学前駆体又は他の化学物質から分離されたペプチド調製物を含む。ある例においては、「化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない」とは、約３０％（乾燥重量）以下の化学前駆体又は他の化学物質、２０％以下の化学前駆体又は他の化学物質、１０％以下の化学前駆体又は他の化学物質、又は５％以下の化学前駆体又は他の化学物質を有するＧＰＣＲペプチド調製物を含む。
【００４８】
単離ＧＰＣＲペプチドは、天然にそれを発現する細胞から精製でき、それを発現するよう変異した細胞（組換体）から精製でき、或いは公知のタンパク合成手法を用いて合成できる。図１における実験データはヒトの腎臓及び混合組織での発現を示している。例えば、ＧＰＣＲペプチドをコード化する核酸分子は、発現ベクターへクローンされ、該発現ベクターは宿主細胞へ導入され、タンパクが該宿主細胞で発現する。該タンパクはその後、標準的なタンパク精製技術を用いて適当な精製過程により細胞から単離され得る。これらの技術の多くは以下に記述される。
【００４９】
したがって、本発明は、図２で与えられたアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）からなるタンパクを提供する。例えば、図１に示された転写／ｃＤＮＡ核酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、及び図３に示されたゲノム配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）によってコード化されたタンパクである。このようなタンパクのアミノ酸配列は図２に提供される。このアミノ酸配列がタンパクの最終的なアミノ酸配列である場合、タンパクはそのアミノ酸配列からなる。
【００５０】
本発明はさらに、図２で与えられたアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）から実質的になるタンパクを提供する。例えば、図１に示された転写／ｃＤＮＡ核酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、及び図３に示されたゲノム配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）によってコード化されたタンパクである。アミノ酸配列が、例えば最終タンパク中に約１〜１００の付加的な残基、典型的には約１〜２０の付加的残基のように少ない付加的アミノ酸残基のみが存在する場合、タンパクは実質的にそのアミノ酸配列からなる。
【００５１】
本発明はさらに、図２に与えられるアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を含むタンパクを提供する。例えば、図１に示された転写／ｃＤＮＡ核酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、及び図３に示されたゲノム配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）によってコード化されたタンパクである。アミノ酸配列が該タンパクの最終的なアミノ酸配列の少なくとも一部分である場合、タンパクはこのアミノ酸配列を含む。このように、タンパクは該ペプチドのみからなることができ、又は通常そのタンパクに関連する又は非相同アミノ酸残基／ペプチド配列であるアミノ酸残基（隣接コード化配列）のような、付加的アミノ酸分子を有することもできる。このようなタンパクは、わずかな付加的アミノ酸残基を有することができ、又は数百或いはそれ以上の付加的アミノ酸を有することもできる。本発明のＧＰＣＲペプチドを含む好ましいタンパクは、成熟タンパクに自然に生じる。これらの各種タンパクを調製／単離する方法を、以下に簡潔に説明する。
【００５２】
本発明のＧＰＣＲペプチドは、キメラ又は融合タンパクを形成するために非相同配列と接合することができる。このようなキメラ又は融合タンパクは、ＧＰＣＲペプチドと実質的に相同でないアミノ酸配列を有する非相同タンパクに作用的に結合されたＧＰＣＲペプチドを含む。「作用的に結合された」とは、ＧＰＣＲペプチドと非相同タンパクとがフレーム内に融合することを示す。非相同タンパクは、ＧＰＣＲペプチドのＮ末端又はＣ末端に融合されることができる。
【００５３】
ここで、融合タンパクはＧＰＣＲペプチドの活性に本質的に影響しない。例えば、融合タンパクは、例えばベータガラクトシダーゼ融合体、酵母ツーハイブリッドＧＡＬ融合体、ポリ−Ｈｉｓ融合体、ＭＹＣ付加体、ＨＩ付加体、及びＩｇ融合体等の酵素融合タンパクを含むがこれらに限定されない。このような融合タンパク、特にポリ−Ｈｉｓ融合体は、本発明の組替えＧＰＣＲペプチドの精製を容易にすることができる。ある宿主細胞（例えば哺乳類の宿主細胞）では、タンパクの発現及び／又は分泌が非相同信号配列を用いることで増加する。
【００５４】
キメラ又は融合タンパクは、標準の組替えＤＮＡ技術により生産することができる。例えば、異なるタンパク配列をコードするＤＮＡフラグメントは、従来技術により互いにフレーム内に配置される。他の例では、融合遺伝子は自動ＤＮＡ合成を含む従来技術により合成され得る。あるいは、二つの連続した遺伝子フラグメントの間に相補的な突出を生じるアンカープライマーを用い、その後アニールし、キメラ遺伝子配列を再増幅することにより、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を行うことができる（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９２を参照）。さらに、既に融合部分をコード化した多くの発現ベクターが、商業的に入手可能である（例えばＧＳＴタンパク）。ＧＰＣＲペプチドコード化核酸は、発現ベクター等へクローニングすることができるので、融合部分はＧＰＣＲペプチドにフレーム内で結合される。
【００５５】
上述のように、本発明は、ペプチドの天然由来の成熟型、ペプチドの対立遺伝子／配列変異体、天然由来でない組換えによるペプチドの変異体、及びペプチドのオルソログとパラログ等の本発明のタンパクのアミノ酸配列の明らかな変異体も提供し、使用可能にする。このような変異体は、組換え核酸技術及びタンパク生化学の分野における公知の技術を用い、容易に生成することができる。しかしながら、変異体は、本発明以前に公開されたいずれのアミノ酸配列をも含まない。
【００５６】
このような変異体は、分子技術とここに開示された配列情報を用いて、容易に特定／製造できる。さらに、このような変異体は、本発明のＧＰＣＲペプチドに相同である配列及び／又は構造に基づき、他のペプチドと容易に区別できる。相同性／同一性の程度は、第一にペプチドが機能的変異体であるか非機能的変異体であるか、パラロググループに存在する分化量、及びオルトログ間の進化的相違に基づき判断される。
【００５７】
２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列の同一性％を決定するために、配列は最適な比較をするように並べられる（例えば、最適配列のため、ギャップは第一及び第二アミノ酸又は核酸配列の一方あるいは両方に導入され、非相同配列は比較のため無視し得る）。好ましい例においては、参照配列の長さの３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％以上が比較のため並べられる。対応するアミノ酸配置あるいはヌクレオチド配置に対応したアミノ酸残基あるいはヌクレオチドが比較される。第一配列の配置が、第二配列の対応した配置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドに占められている場合、分子はその位置で同一である（ここで、アミノ酸又は核酸の「同一性」は、アミノ酸又は核酸の「相同性」と同等である）。２つの配列間の同一性％は、配列において共有される同一位置の数に相関があり、ギャップ数と各ギャップの長さを考慮し、ギャップは２つの配列の最適配置に導入される必要がある。
【００５８】
２つの配列間の配列比較と、同一性％と類似性の定量は、数学的アルゴリズムを使って遂行できる。（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｌｅｓｋ， Ａ．Ｍ．， ｅｄ．， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８８； Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ， Ｓｍｉｔｈ， Ｄ．Ｗ．， ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９３； Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ， Ｐａｒｔ １， Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ａ．Ｍ．， ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ｈ．Ｇ．， ｅｄｓ．， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， １９９４； Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ， Ｇ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８７； ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ， Ｇｒｉｂｓｋｏｖ， Ｍ． ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．， ｅｄｓ．， Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９１）．好ましい例において、２つのアミノ酸配列の同一性％は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムに装着されたＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４−４５３ （１９７０））アルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍより入手可）を用い、Ｂｌｏｓｓｏｍ  ６２  ｍａｔｒｉｘ又はＰＡＭ２５０  ｍａｔｒｉｘ、及び１６，１４，１２，１０，８，６，４のギャップ重量、及び１，２，３，４，５又は６の長さ重量の両者を用いて決定される。さらに別の好ましい例において、２つのヌクレオチド配列の同一性％は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２（１）：３８７（１９８４）（ｈｔｔｐ：／／ｇｃｇ．ｃｏｍより入手可））を用い、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス及び４０，５０，６０，７０又は８０のギャップ重量、及び１，２，３，４，５，又は６の長さ重量を用いて決定される。異なる例において、２つのアミノ酸あるいはヌクレオチド配列の同一性％は、ＡＬＩＧＮプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）に装着されたＥ．Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７（１９８９））アルゴリズムを用い、ＰＡＭ１２０重量残基テーブル、１２のギャップ長ペナルティー及び４のギャップペナルティーを用いて決定される。
【００５９】
本発明の核酸及びタンパクの配列は、例えば他のファミリーメンバー又は関連配列を特定するために配列データペースに対する調査を行う「クエリー配列」として用いることができる。このような調査は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０（１９９０））のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）を用いて行われる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド調査は、ＮＢＬＡＳＴプログラムにより行われ、スコア＝１００、ワードレングス＝１２で、本発明の核酸分子に相同であるヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク調査は、ＸＢＬＡＳＴプログラムを用い、スコア＝５０、ワードレングス＝３で、本発明のタンパクに相同であるアミノ酸配列性を得ることができる。比較目的のためのギャップ配列を得るため、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２（１９９７））に記載されているＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを用いることができる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合、対応プログラム（例えばＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）の規定パラメーターを用いることができる。
【００６０】
成熟処理型（ｍａｔｕｒｅ ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ ｆｏｒｍｓ）と同様、本発明のペプチドの一つを含むタンパクの全長処理前型（ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ｐｒｅ−ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ ｆｏｒｍｓ）は、ここで提供される本発明のＧＰＣＲペプチドと同じ遺伝子位置によってコード化されるだけでなく、本発明のＧＰＣＲペプチドの一つと完全配列同一性を有するものとして、容易に特定できる。図３のデータに示されるように、ｅＰＣＲにより、マップ位置は染色体６にあることが決定された。
【００６１】
本発明のＧＰＣＲペプチドの対立変異体は、ここで提供されるＧＰＣＲペプチドと同じ遺伝子位置でコード化されたものと同様、少なくともＧＰＣＲペプチドの部位で配列相同性／同一性の高い程度（重大な）を有するヒトタンパクとして容易に確認される。遺伝子位置は、対象となるヒトに対してマップされたゲノム配列のように、図３で提供される遺伝子情報に基づき容易に決定される。図３のデータに示されるように、ｅＰＣＲにより、マップ位置は染色体６にあることが決定された。ここで、２つのタンパク（あるいはタンパクの領域）は、アミノ酸配列が典型的には少なくとも約７０〜８０％、８０〜９０％、及びより典型的には少なくとも約９０〜９５％あるいはそれ以上の相同性を有するとき、強い相同性を有するとする。強い相同性を有するアミノ酸配列は、本発明によれば、より詳細には以下に示されるストリンジェント条件下で、核酸分子をコード化するＧＰＣＲペプチドに対してハイブリダイズされる核酸配列によりコード化される。
【００６２】
図３は、本発明の受容体タンパクをコード化する遺伝子において特定されたＳＮＰについての情報を提供する。３つのｉｎｄｅｌｓ（「−」により示される）及びエキソンの４つのＳＮＰを含む２３のＳＮＰ変異体が見つけられ、これらのうち２つがアミノ酸配列の変化（すなわち、非同義のＳＮＰ）の原因となっている。これらのＳＮＰが原因となるアミノ酸配列の変化は、図３に示されており、一般的な遺伝暗号及び図２に参照として提供されたタンパク配列を使ってすぐに決定できる。
【００６３】
ＧＰＣＲペプチドのパラログは、少なくともＧＰＣＲペプチドの領域に対し、強い配列相同性／同一性の程度を有し、ヒト遺伝子によりコード化される、また同様の活性又は機能を有することが容易に確認できる。アミノ酸配列が典型的には少なくとも約６０％以上、より典型的には約７０％以上、与えられた領域あるいはドメインに相同性を有する場合、２つのタンパクは典型的にはパラログであると考えられる。このようなパラログは、より詳細には以下に述べられるストリンジェント条件で変調された核酸分子をコード化するＧＰＣＲペプチドにハイブリダイズする核酸配列によりコード化される。
【００６４】
ＧＰＣＲペプチドのオルトログは、少なくともＧＰＣＲペプチドの領域に対し、強い配列相同性／同一性の程度を有し、他の生物の遺伝子にコード化されることが容易に確認できる。好ましいオルトログは、哺乳類、好ましくは霊長類から単離され、ヒト治療対象及び薬剤として開発される。このようなオルトログは、詳細には以下に述べられるストリンジェント条件で変調された、核酸分子をコード化するＧＰＣＲペプチドにハイブリダイズする核酸配列によりコード化され、タンパクを産生する２つの生物の相関性の程度に依存する。
【００６５】
本発明のＧＰＣＲペプチドの天然由来でない変異体は、組換え技術を用いて容易に調製することができる。このような変異体は、ＧＰＣＲペプチドのアミノ酸配列の削除、付加、置換を含むがこれに限られない。例えば、置換の１種として、維持アミノ酸置換が挙げられる。これらの置換は、近似した性質を有する他のアミノ酸によりＧＰＣＲペプチドのアミノ酸を置換するものである。維持置換は、脂肪族アミノ酸Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ及びＩｌｅ間の一方から他方への置換；ヒドロキシル残基Ｓｅｒ及びＴｈｒの交換；酸性残基Ａｓｐ及びＧｌｕの交換、アミド残基Ａｓｎ及びＧｌｎ間の置換；塩基性残基Ｌｙｓ及びＡｒｇの交換；及び芳香族残基Ｐｈｅ及びＴｙｒ間の置換に典型的に認められる。いずれのアミノ酸置換が表現型的に能動的でないかに関する指針は、Ｂｏｗｉｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）に記載されている。
【００６６】
変異体ＧＰＣＲペプチドは完全に機能することもあり、あるいは例えばリガンド結合能、Ｇタンパク結合能、信号調整能等の１つ以上の活性において機能を失うこともある。完全に機能する変異体は、典型的には維持変異あるいは非致命的残基又は非致命的領域の変異を含む。図２はタンパク分析の結果を提供し、致命的ドメイン／領域の特定に用いることができる。機能的変異体は、変化のない、あるいは変化が機能上重要ではない近似アミノ酸の置換を含む。あるいは、このような置換はある程度、プラス又はマイナスに作用する。
【００６７】
非機能的変異体は、典型的には、１つ以上の非維持的アミノ酸置換、欠失、挿入、転化、移動、又は致命的残基あるいは致命的領域における置換、挿入、転化又は欠失を含む。
【００６８】
機能に必須なアミノ酸は、特定部位の変異誘発あるいはアラニンスキャニング変異誘発（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５（１９８９））等の当該分野で公知の方法によって特定され、特に図２に示す結果が用いられる。後者の手法は分子のすべての残基において１つのアラニン変異を導入するものである。得られた変異分子は、リガンド／効果基分子結合等の生物学的活性あるいはｉｎ ｖｉｔｒｏの延命活性等の活性について試験される。リガンド受容体結合に重要な位置は、また、結晶化、核磁気共鳴又は光学親和性標識（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４（１９９２））； ｄｅ Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６−３１２（１９９２）） 等の構造分析により決定できる。
【００６９】
本発明はさらに、ＧＰＣＲペプチドのフラグメントを提供し、このフラグメントを含む及びこのフラグメントからなるタンパク及びペプチドに加えて、特に図２に特定される残基を含むフラグメントが含まれる。しかしながら、本発明が関連するフラグメントは、本発明以前に公知のフラグメントを含まない。
【００７０】
ここで、フラグメントは、ＧＰＣＲペプチドの少なくとも８，１０，１２，１４，１６あるいはそれ以上の隣接アミノ酸残基を含む。このようなフラグメントは、ＧＰＣＲペプチドの生物学的活性の一つ以上を有する能力に基づき選択され、あるいは、例えばリガンドや効果基に結合する能力又は抗原として働く能力などにより選択される。特に重要なフラグメントは生物学的に活性なフラグメントであり、ペプチドは、例えば８あるいはそれ以上のアミノ酸長を有する。このようなフラグメントは、典型的には活性部位、Ｇタンパク結合部位、貫膜ドメイン、あるいはリガンド結合ドメイン等の、ＧＰＣＲペプチドのドメインあるいはモチーフを有する。さらに、可能なフラグメントは、フラグメントを含むドメインあるいはモチーフ、可溶性ペプチドフラグメント、及び抗原構造を有するフラグメントを含むが、これに限定されない。予想されるドメイン及び機能性部位は、当業者に容易に利用可能な、よく知られたコンピュータプログラム（例えばＰＲＯＳＩＴＥ ａｎａｌｙｓｉｓ）により容易に特定可能である。このような分析の一つの結果は図２に示されている。
【００７１】
ポリペプチドは、２０天然由来アミノ酸と通常呼ばれる２０個のアミノ酸以外のアミノ酸をしばしば含む。さらに、末端アミノ酸を含む多くのアミノ酸は、加工や翻訳後修飾等の天然の過程、又は従来技術としてよく知られている化学修飾技術により修飾される。ＧＰＣＲペプチドに天然に起こる典型的な修飾は、基本テキスト、詳細な専攻論文、及び研究文献に記述されており、当業者によく知られている （図２において、これらの機能のいくつかが特定される）。
【００７２】
知られている修飾は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、フラビンの共有結合、ヘム半部の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスホチジリノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、ジメチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミンの形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水和化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク分解加工、ホスホリル化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のようなアミノ酸のタンパクへの転移ＲＮＡ媒介付加、及びユビキチン化を含むがこれに限定されない。
【００７３】
従って、本発明のＧＰＣＲペプチドは、置換アミノ酸残基が、遺伝コードによってコード化されたものではない誘導体又は類似体、置換基が含まれる誘導体又は類似体、成熟ＧＰＣＲペプチドが、ＧＰＣＲペプチドの半減期を増加させる化合物（例えばポリエチレングリコール）等の別の化合物により融合されている誘導体又は類似体、あるいは付加的なアミノ酸が、リーダー又は分泌性の配列、成熟ＧＰＣＲペプチド又はプロタンパクの精製のための配列等の成熟ＧＰＣＲペプチドに融合した誘導体又は類似体も含む。
【００７４】
このような修飾は当業者によく知られており、科学文献に非常に詳細に記述されている。いくつかの汎用されている修飾として、例えばグリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマカルボキシル化、水和化、及びＡＤＰリボシル化はほとんどの基本書に記述されている。このような基本書としては、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ＡＮＤ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ２ｎｄＥｄ．， Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）が挙げられる。この主題についての多くの詳細な評論が入手でき、例えば Ｗｏｌｄ， Ｆ．， Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｂ．Ｃ． Ｊｏｈｎｓｔｏｎ， Ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １−１２（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２：６２６−６４６（１９９０）） ＡＮＤ Ｒａｔｔａｎ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ６６３：４８−６２（１９９２））が挙げられる。
【００７５】
タンパク／ペプチドの使用
本発明のタンパクは、抗体を引き起こす又は別の免疫反応を誘発するため；生物的液体のタンパク（又はその結合相手又は受容体）のレベルを定量的に決定するために設計されたアッセイにおける試薬（ラベル試薬を含む）として；対応したタンパクが優先的に発現される組織（形成的に、組織の分化又は発達の特別な段階において、あるいは病気の状態において）のマーカーとして；図及び背景に提供された機能的な情報と関連した実質的及び特異的なアッセイにおいて使われうる。タンパクが、別のタンパクに結合する又は潜在的に結合する所（例えば、受容体リガンド相互作用等において）では、タンパクを、結合相手を特定するために使用し、結合相互作用の阻害剤を特定するシステムを発達させることができる。これらの一部又は全ての用途を調査することにより、商業製品としての商用化のための試薬グレード又はキットフォーマットへと発展させることができる。
【００７６】
上記の使用を達成するための方法は、当業者によく知られている。このような方法を示す文献には、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， ２ｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｅ． Ｆ． Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｄｓ．， １９８９， や ”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ： Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｅｒｇｅｒ， Ｓ． Ｌ． ａｎｄ Ａ． Ｒ． Ｋｉｍｍｅｌ ｅｄｓ．， １９８７ 等がある。
【００７７】
本発明のペプチドの潜在的な用途は、第一に、タンパクの種類／作用と同様にタンパク源に基づく。例えば、ヒトから単離されたＧＰＣＲ及びそれらのヒト／哺乳動物オルソログは、特にＧＰＣＲを発現する細胞又は組織における生物学的又は病理学的反応を調整するための哺乳動物の治療剤、例えばヒトの薬剤に使用する特定試薬の対象として役立つ。図１の実験データにより、腎臓において本発明のＧＰＣＲタンパクが発現されることが示される。特に、仮想ノーザンブロットによりヒトの腎臓での発現が示された。加えて、ＰＣＲ−ベースの組織スクリーニングパネルは、混合組織での発現を示す（図１、組織発現を参照）。すべての薬剤の約７０％が、ＧＰＣＲ活性を調整する。無脊椎動物と哺乳動物オルソログの組合せは、無脊椎動物に特異的な薬剤を発見する選択的なスクリーニング方法において使用できる。背景や図における構造及び機能的な情報により、特に図１の発現情報との組み合わせにおいて、本発明の分子の明確で現実的な用途が提供される。図１の実験データにより、ヒトの腎臓及び混合組織での発現が示される。このような用途は、当技術及び規定の実験において知られたここに提供された情報を使ってすぐに決定できる。
【００７８】
本発明のタンパク（本発明より先に明らかにされた変異とフラグメントを含む）は、カルシウムセンシング受容体サブファミリーのメンバーと関連するＧＰＣＲと関連した生物学的アッセイに有益である。このようなアッセイは、公知のＧＰＣＲ機能又は活性、あるいは、特にこの受容体を発現する細胞及び組織において、本発明の一つが属しているＧＰＣＲサブファミリーに特異的であるＧＰＣＲ関連症状の診断と治療に有用な特性のいずれかに関係する。図１における実験データは、本発明のＧＰＣＲがヒトの腎臓で発現することを示している。特に仮想ノーザンブロットはヒトの腎臓での発現を示している。加えてＰＣＲ−組織スクリーニングパネルは混合組織での発現を示している（図１の組織発現を参照）。
本発明のカルシウムセンシング受容体は、ケラチン細胞分裂と分化に必要であり、ケラチン細胞において発現される。例えば角化腫と胸腫瘍における、急速な皮膚細胞分裂においてそのレベルが高くなることがありうる。このタンパクに対する抗体により腫瘍が検出される。このＧＰＣＲに結合し、そのカルシウム検出能力を妨げる合成ペプチド阻害剤は、制がん薬剤として使われる。ＣａＲ二量体化ドメインに似た短いペプチドにより機能的なＣａＲ受容体の集合を防止できる。
【００７９】
本発明のタンパクは、細胞系、又は無細胞系の薬剤スクリーニングアッセイにおいても有益である。細胞系は、天然型、すなわち受容体タンパクを正常に発現する細胞であり、生体組織検査、又は細胞培地中で増殖する。図１における実験データはヒトの腎臓及び混合組織での発現を示している。他の実施例では、細胞ベースアッセイは受容タンパクを発現する組換えの宿主細胞を含む。
【００８０】
ポリペプチドは、自然状態でタンパクの受容体活性を変調する化合物、又は受容体に関連する特定の疾患又は症状を引き起こす変異型を特定するために用いることができる。本発明のＧＰＣＲと、適切な変異体及びフラグメントは、受容体への結合能力を持つ候補化合物をアッセイするためのハイスループットスクリーンにおいて使用することができる。
【００８１】
これらの化合物は、これらの受容体活性に対する化合物の影響を判定するために、機能性受容体に対してさらにスクリーニングを行うことができる。さらにこれらの化合物は、動物又は無脊椎動物系における、活性／効果を判定する試験することができる。化合物は、受容体を望ましい程度までに活性化（アゴニスト）又は不活性化（アンタゴニスト）すると特定される。
【００８２】
さらに、本発明のタンパクは、受容体タンパクと、通常受容体タンパクと相互作用する分子（例えば、Ｇタンパク、あるいはｃＡＭＰ又はホスファチジルイノシトール代謝回転及び／又はアデニル酸シクラーゼ、又はホスホリパーゼＣ活性化に関連する他の相互作用分子）との相互作用を促進又は抑制する能力により、化合物をスクリーンするために使用できる。このようなアッセイは一般的には、受容体タンパク又はフラグメントが対象分子と相互作用する条件下で、受容体タンパクと候補化合物とを結合する工程を含み、タンパクと対象との複合物の構成を検出する、あるいはＧタンパクリン酸化、ｃＡＭＰ又はホスファチジルイノシトール代謝回転、アデニル酸シクラーゼ又はホスホリパーゼＣ活性化等の信号伝達関連の効果等の受容体タンパクと対象と相互作用の生化学的結果を検出する。
【００８３】
候補化合物には、例えば、１）最後部がＩｇの融合ペプチド、及びランダムペプチドライブラリー（例えばＬａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４（１９９１）； Ｈｏｕｇｈｔｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８４−８６（１９９１））や、Ｄ型及び／又はＬ型アミノ酸の組み合わせからできている化学誘導分子ライブラリーのメンバーを含む可溶性ペプチドのようなペプチド；２）ホスホペプチド（例えばランダムあるいは部分的変質したホスホペプチドライブラリー（例えばＳｏｎｇｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ７２：７６７−７７８（１９９３） 参照）のメンバー）； ３）抗体（例えば、Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ発現ライブラリーフラグメント、抗体のエピトープ結合フラグメントだけでなく、ポリクロナール、モノクロナール、ヒューマナイズド、抗イディオティピック、キメラ、及び単一鎖抗体）；及び４）小有機及び無機分子（例えば組み合わせ及び天然産物ライブラリーから得られる分子）等が例示的に含まれる。
【００８４】
ある候補化合物は、リガンド結合と競合する受容体の可溶性フラグメントである。他の候補化合物には、変異受容体、又は受容体機能に影響を及ぼすキナーゼを含む適切なフラグメントがあり、このためにリガンドとの競合が起こる。従って、発明にはリガンドに競合するフラグメントは、例えばより高い親和性を持ち、又はリガンドを結合するが解放しないフラグメントが含まれる。
【００８５】
本発明はさらに、受容体活性を変調（促進又は阻害）する化合物を同定するための、他の末端アッセイを含む。このアッセイは、一般的に受容体活性を示す信号伝達経路における挙動のアッセイに関連している。このため、増殖等の細胞工程、及び受容体タンパク依存信号カスケードに応答して上向き又は下向き調整される遺伝子発現の変化がアッセイされる。１実施例においては、このような遺伝子の規定領域は、発光酵素等の容易に発見できるマーカーに操作可能に接続できる。
【００８６】
受容体により調整された生物学又は生化学の機能のうちのいずれもが、末端アッセイとして使われうる。これらは、ここに記載され、ここに文献が参照され、これら末端アッセイの対象に関する文献に参照され、及び当業者が知る他の機能あるいは図、特に図２に提供される情報により容易に特定される機能による生化学的、あるいは生化学／生物学的挙動のすべてを含む。特に、キナーゼを発現する細胞又は組織の生物学的機能が試験できる。図１における実験データは、本発明のＧＰＣＲがヒトの腎臓で発現することを示している。特に仮想ノーザンブロットはヒトの腎臓での発現を示している。加えてＰＣＲ−組織スクリーニングパネルは混合組織での発現を示している（図１の組織発現を参照）。
【００８７】
結合及び／又は活性化化合物は、キメラキナーゼタンパクを用いスクリーニングすることができ、アミノ末端細胞外ドメイン又はその一部、貫膜ドメイン全体又は一部（例えば７種の貫膜セグメントあるいは細胞内又は細胞外ループ）、及びカルボキシ末端細胞内ドメイン又はその一部は、非相同ドメイン又はサブレジオンに置換されうる。例えば、Ｇタンパク結合領域は、異なるＧタンパクと相互作用し、天然受容体により認識されるものとして用いることができる。従って、信号転換要素の異なる組は活性化のエンドポイントアッセイに有用である。あるいは、全体の貫膜部分又はサブ領域（貫膜セグメントあるいは細胞内又は細胞外ループ等の）は、アミノの末端細胞外ドメイン及び／又はＧタンパク結合領域が誘導される宿主細胞とは異なる宿主細胞に特有な全体の貫膜部分又はサブ領域と交換できる。これは、受容体が誘導される特定宿主細胞以外で行われるアッセイを可能とする。あるいは、アミノの末端細胞外ドメイン（及び／又は他のリガンド結合領域）は、異なるリガンドに結合するドメイン（及び／又は、他の結合領域）に交換可能であり、これにより、非相同アミノ末端細胞外ドメイン（又は領域）と相互作用するが、信号形質導入を起こすテスト化合物にアッセイを提供する。最後に、活性化は、天然の信号形質導入経路の一部である転写規定配列と操作可能に結び付けられた容易に発見できるコード化領域を含むレポーター遺伝子により検出できる。
【００８８】
本発明のタンパクは、受容体と相互作用する化合物を発見するために設計された方法である競合結合アッセイに有用でもある。従って、ポリペプチドに結合又は相互作用することができる条件下で、化合物は受容体ポリペプチドに接触する（Ｈｏｄｇｓｏｎ， Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １９９２， Ｓｅｐｔ １０（９）；９７３−８０）。可溶性受容体ポリペプチドも混合物に加えられる。被検化合物が可溶性受容体ポリペプチドと相互作用する場合には、受容体対象から形成される複合物の量、あるいは活性が減少する。この種のアッセイは、特に受容体の特定領域に相互作用する化合物を探索する場合に有用である。そして、本発明の対象受容体領域と競合する可溶性ポリペプチドは、対象の領域に対応するペプチド配列を含むよう設計される。
【００８９】
無細胞薬剤のスクリーニングアッセイを行うため、受容体タンパク又はフラグメント、あるいはその対象分子を免疫化することが好ましい場合があり、アッセイの自動化を可能とするだけでなく、タンパクの１つあるいは両方の非複合化形態からの複合化形態の分離を効率化する。
基質上のタンパクを免疫化する技術は、薬剤スクリーニングアッセイに用いられる。ある例において、融合タンパクは、タンパクが基質に結合することを可能にするドメインを付加するものである。例えば、グルタチオン−Ｓ−トラスフェラーゼ融合タンパクは、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、又はグルタチオン誘導マイクロタイタープレート上に吸着され、細胞ライセート（ｌｙｓａｔｅｓ）（例えば３５Ｓ−ｌａｂｅｌｅｄ）、対象化合物、又は複合物形成条件（例えば、塩及びｐＨの生理学的条件）下で培養された混合物と結合する。培養に続いて、ビーズは、結合していない標識を除くため洗浄され、基質は免疫化され、放射性ラベルが直接測定され、あるいは複合物を解離した後上澄みを測定する。あるいは、複合体は基質から解離され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離され、ビーズ断片中に見出される受容体結合タンパクのレベルを、標準的な電気泳動技術によりゲルから定量する。例えば、ポリペプチドあるいはその対象分子のいずれかは、周知の方法により、ビオチン及びストレプトアビジンの共役を用いて免疫化する。あるいは、タンパクと反応するが該タンパクが対象分子と結合することを妨げない抗体をプレートのウェルに誘導し、抗体結合によりタンパクをウェルに取り付ける。受容体結合タンパク及び候補化合物の組成物は、受容体タンパク存在ウェル中で培養され、ウェルに取り付けられた複合物の量を定量することができる。このような複合体の検出方法としては、ＧＳＴ固定複合体による前述の方法に加えて、受容体タンパク対象分子に反応性のある抗体、又は、キナーゼタンパクに反応性があり対象分子と競合する抗体を用いた複合体の免疫検出法、及び対象分子と関連する酵素活性の検出に基づく酵素結合アッセイが含まれる。
【００９０】
本発明のＧＰＣＲの一つを調整する薬剤は、上記アッセイの１つ以上を単独あるいは組み合わせて用いることで特定することができる。一般的には最初に細胞系又は無細胞系を用い、その後動物又は他のモデル系で活性を確認することが好ましい。このようなモデル系は当技術において周知であり、この記載において容易に用いることができる。
【００９１】
このような薬剤スクリーニングアッセイよって特定される受容体タンパク活性の変調剤は、受容体を発現する細胞又は組織を扱うことにより、受容体経路の異常制御の患者を治療するのに用いることができる。図１における実験データはヒトの腎臓及び混合組織での発現を示している。これらの治療方法は、医薬組成物中のＧＰＣＲ活性の変調剤を治療に必要な量、患者に投与する工程を含み、変調剤はここに記載されたように特定されたものである。
【００９２】
本発明の他の形態において、ＧＰＣＲタンパクは、ツーハイブリッドアッセイあるいはスリーハイブリッドアッセイにおいて「バイトタンパク」として用いることができ（例えばＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，２８３，３１７；Ｚｅｒｖｏｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｃｅｌｌ ７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：９２０−９２４； Ｉｗａｂｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：１６９３−１６９６； 及びＢｒｅｎｔ ＷＯ９４／１０３００参照）、ＧＰＣＲと結合あるいは相互作用しＧＰＣＲ活性に関与する他のタンパクを特定する。このようなＧＰＣＲ結合タンパクは、ＧＰＣＲタンパク、又はＧＰＣＲ媒介信号経路の下流因子等のＧＰＣＲ対象による信号伝達に関与している。このようなＧＰＣＲ結合タンパクは、ＧＰＣＲ阻害剤であることがある。
【００９３】
ツーハイブリッド系は、分離可能なＤＮＡ−結合及び活性化ドメインからなる多くの転写因子の変調性に依存する。簡潔に言えば、このアッセイは２つの異なるＤＮＡ構造を利用する。１つの構造においては、ＧＰＣＲタンパクをコードする遺伝子は、公知の転写因子（例えばＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコード化する遺伝子に融合されている。他方の構造においては、ＤＮＡ配列ライブラリーから得られ、未知のタンパク（「ｐｒｅｙ」又は「ｓａｍｐｌｅ」）をコード化しているＤＮＡ配列が、公知の転写因子の活性化ドメインをコード化している遺伝子に融合される。 「ｂａｉｔ」及び「ｐｒｅｙ」タンパクは相互作用が可能であり、ｉｎ ｖｉｖｏでＧＰＣＲ依存複合体を形成し、転写因子のＤＮＡ−結合及び活性化ドメインは近接する。この近接は、転写因子に応答する転写制御サイトへ動作可能に結合するリポーター遺伝子（例えばＬａｃＺ）の転写を許容する。レポーター遺伝子の発現は検出可能であり、機能性転写因子を含む細胞コロニーが単離され、ＧＰＣＲタンパクと相互作用するタンパクをコード化するクローン化遺伝子を得るのに用いることができる。
【００９４】
本発明はさらに前記スクリーニングアッセイにより特定される新規薬剤に関する。従って、ここで記述された特定薬剤を適当な動物モデルで使用することも本発明の範囲内である。例えば、ここで記述された特定薬剤（例えば、ＧＰＣＲ調整薬剤、アンチセンスＧＰＣＲ核酸分子、ＧＰＣＲ特異的抗体、あるいはＧＰＣＲ結合対象）は、動物あるいは他のモデルにおいて、それらの薬剤で処理した場合の有効性、毒性、あるいは副作用を判定するために用いることができる。あるいは、ここで記述された特定薬剤は、動物あるいは他のモデルにおいて、それらの薬剤の挙動機構を判定するために用いることができる。さらに本発明は、ここに記載される治療のためのスクリーニングアッセイにより同定された新規な薬剤の使用に関する。
【００９５】
本発明のＧＰＣＲタンパクは、また、ペプチドにより調整される疾患又は疾患の傾向を診断する対象を提供するのに有効である。従って本発明は、細胞、組織、又は生体中でのタンパク（あるいはコード化したｍＲＮＡ）の存在又は程度を検出する方法を提供する。図１における実験データはヒトの腎臓及び混合組織での発現を示している。この方法は、生物サンプルと、受容体タンパクとの相互作用能力を有する化合物との接触に関係しており、相互作用が検出される。このようなアッセイは、シングルディテクション形態、又は抗体チップアレイのようなマルチディテクション形態で提供される。
【００９６】
サンプル中のタンパクを検出するある薬剤は、タンパクと選択的に結合することのできる抗体である。生物サンプルは、患者から単離した組織、細胞、及び生物的液体、同様に患者中の組織、細胞及び生物的液体を含む。
【００９７】
本発明にかかるペプチドは、また、変異ペプチドを有する患者の活性タンパクの活性度、疾患、疾患の傾向、特に本発明のタンパクが属するタンパクグループの他のものにおいて知られている活性及び状態を診断する対象を提供する。そして、生物サンプルからペプチドを単離することができ、変異ペプチドを生じる遺伝子変異の存在をアッセイすることができる。これはアミノ酸置換、欠失、挿入、再配置（異常組織挙動の結果）、及び適当でない転写後変異を含む。分析方法は、変更された電気泳動、変更されたトリプティックペプチド消化、細胞系あるいは無細胞における変更された受容体活性のアッセイ、リガンドあるいは抗体結合パターンの変化、変化した当電点、直接アミノ酸配列、及びその他のタンパク中の変異を検出するのに有用な公知のアッセイ技術を含む。このようなアッセイは、シングル検出形態、あるいは抗体チップアレイのようなマルチ検出形態に適用できる。
【００９８】
ペプチドのＩｎ ｖｉｔｒｏ検出技術としては、酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡｓ）ウェスタンブロット、抗体、又はタンパク結合剤のような検出試薬を用いた免疫沈降、免疫蛍光検査法を含む。あるいは、ペプチドは、ラベルされた抗ペプチド抗体あるいは他種の検出薬剤を対象中に導入し、対象中でｉｎ ｖｉｔｒｏで検出することができる。例えば、抗体は放射性のマーカーによりラベルすることができ、その対象中における存在及び分布は標準的なイメージ化技術により検出することができる。対象中に発現されたペプチドの対立変異体の検出方法、及びサンプル中のペプチドのフラグメントの検出方法は、特に有用である。
【００９９】
ペプチドはまた、薬理学的分析に有用である。薬理学では、変更された薬剤位置による薬剤への反応、及び影響されたヒトの異常挙動において、臨床的に重要な遺伝変異態を扱う。例えばＥｉｃｈｅｌｂａｕｍ，Ｍ．（Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２３（１０−１１）：９８３−９８５（１９９６））、及びＬｉｄｅｒ， Ｍ．Ｗ．（Ｃｌｉｎ．Ｃｅｍ．４３（２）：２５４−２６６（１９９７））を参照。これらの変異体から生じる臨床結果は、個人の代謝の変動により、ある個人に対しては治療用薬剤の重篤な毒性となり、又はある個人に対しては治療の失敗となる。そして、個人の遺伝子型は、体への治療薬剤の作用、あるいは薬剤の体内代謝を決定する。さらに、薬剤代謝酵素の活性は、薬剤挙動の強度と存続期間の両方に影響を与える。そして、個人の薬理学は、個人の遺伝子型に応じて、予防あるいは治療処置に効果的な薬剤及び効果的な薬剤の投与量の選択を可能とする。ある薬剤代謝酵素における遺伝子多型の発見は、なぜある患者に対しては期待された薬剤効果が得られず、または過大な薬剤効果を示し、あるいは標準的な薬剤投与量において重大な毒性を示すのかを明らかにするものである。多型は、強い代謝表現型と弱い代謝表現型とで表現される。従って、遺伝子多型は、ある集団に見られる受容体機能の１つ以上が他の集団のものとは異なり、受容体タンパクの対立タンパク変異体を導き出すものと思われる。よってペプチドは、治療方法に影響を与える遺伝子配置を確かめる対象となる。よってリガンドベース治療において、多型は、リガンド結合で多少能動的であるアミノ末端細胞外ドメイン及び／又は他のリガンド結合領域に起こり受容体を活性化する。従って、リガンド投与量は、多型を含む集団に対する治療効果を最大とするように調整されることが必要である。遺伝子型の代わりに特定の多型ペプチドを特定することもできる。
【０１００】
ペプチドはまた、タンパクの発現の欠如、不適切あるいは不必要な発現により特徴づけられる異常を治療するためにも有用である。図１における実験データはヒトの腎臓及び混合組織での発現を示している。従って治療方法は、ＧＰＣＲタンパクあるいはフラグメントの使用も含むものである。
【０１０１】
抗体
本発明はまた、その変異やフラグメントだけでなく、本発明のペプチド及び該ペプチドのフラグメントを含むタンパクの一つに、選択的に結合する抗体を提供する。ここで抗体は、対象ペプチドと結合し、関連しないタンパクとは有意に結合しない場合、選択的に対象ペプチドと結合する。抗体は、それが対象ペプチドと実質的に同種ではない他のタンパクとも結合する場合であっても、そのタンパクが抗体の対象ペプチドのフラグメント又はドメインと同一性を共有する限り、選択的にペプチドと結合するとみなされる。この場合、ペプチドに結合している抗体は、ある程度の交差反応性を持つにも関わらず、選択的であると理解される。
【０１０２】
ここで抗体は、当技術において認識されるものと一致する用語で定義される：それらは、抗原の攻撃に応答して哺乳類生物により生産された、マルチサブユニットタンパクである。本発明の抗体は、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）２、及びＦｖフラグメント等の抗体のフラグメントだけでなく、ポリクロナール抗体及びモノクロナール抗体も含むがこれに限定されない。
【０１０３】
与えられた対象ペプチドに対する抗体を生成及び／又は特定する多くの方法が知られている。このような方法の幾つかは、Ｈａｒｌｏｗ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）に記述されている。
【０１０４】
一般的に、抗体を生成するには、単離されたペプチドを免疫原として用い、これを哺乳動物、例えばラット、ウサギあるいはマウスに投与する。全長タンパク、抗原ペプチドフラグメント又は融合タンパクを使用することができる。特に重要なフラグメントは、図２に特定されるような機能性ドメインをカバーするものであり、また相同配列又はグループの中での分化配列のドメインであり、これらはタンパク配置方法を使用して容易に確認することができ、図に示される。
【０１０５】
抗体は、好ましくはＧＰＣＲタンパクの領域又は離散的なフラグメントから調製される。抗体は、ここに示されるペプチドのいかなる領域においても調製され得る。しかしながら、好ましい領域は機能／活性、及び／又は受容体／結合相手相互作用を伴う領域を含む。配列整列により維持された特有の配列フラグメントを特定できるので、図２により特に重要な領域を特定することができる。
【０１０６】
抗原性フラグメントは通常、少なくとも８個の隣接アミノ酸残基を含む。しかしながら、該抗原性ペプチドは、少なくとも１０、１２、１４、１６又はそれ以上のアミノ酸残基を含むことができる。このようなフラグメントは、例えば疎水性領域のようなタンパクの表面に位置する領域に相当するフラグメントのような、物理的性質により選択され得る、又は特有の配列に基づき選択され得る（図２を参照）。
【０１０７】
本発明の抗体の検出は、抗体を検知可能な物質へ共役（即ち、物理的な結合）させることにより行うことができる。検知可能な物質の例としては、様々な酵素、補綴基、蛍光物質、発光物質、バイオ発光物質、及び放射性物質が含まれる。適当な酵素の例としては、ホルセラディッシュパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが含まれる；適当な補綴基複合物の例としては、ストレプタビジン／ビオチン、及びアビジン／ビオチンが含まれる；適当な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナーゼ、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、又はフィコエリスリンが含まれる；発光物質の例としては、ルミノールが含まれる；バイオ発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びアエクオリンが含まれ、適当な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、又は３Ｈが含まれる。
【０１０８】
抗体の使用
抗体は、アフィニティークロマトグラフィー又は免疫沈降のような標準的な技術により、本発明のタンパクの一つを単離するために使用することができる。抗体は、細胞及び、宿主細胞で発現し組替え的に生産されたタンパクからの、天然タンパクの精製を容易にすることができる。さらにこの抗体は、通常の発達の進行に渡って、生物の様々な組織間におけるタンパクの発現のパターンを決定するため、細胞又は組織中における該タンパクの存在を検知するのに有用である。図１における実験データは、本発明のＧＰＣＲがヒトの腎臓で発現することを示している。特に仮想ノーザンブロットはヒトの腎臓での発現を示している。加えてＰＣＲ−組織スクリーニングパネルは混合組織での発現を示している（図１の組織発現を参照）。さらにこの抗体は、発現の豊富さ及びパターンを評価するために、ｉｎ ｓｉｔｕ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、又は細胞溶解液あるいは上澄み中におけるタンパクを検知するために使用することができる。また、このような抗体は、生物学的状態の発展又は進行間における、異常な組織分布又は異常な発現を評価するのに用いることができる。全長タンパクの循環フラグメントにおける抗体検出は、代謝回転を特定するために使用することができる。
【０１０９】
さらに抗体は、タンパク機能に関連した疾患の活性段階、又は該疾患素因を持つ個人等の、疾患の症状発現を評価するのに用いることができる。変調が不適切な組織分布、成長的な発現、タンパクの発現レベル、又は発現／加工された型により引き起こされる場合、抗体は通常のタンパクに対して調製することができる。図１における実験データはヒトの腎臓及び混合組織での発現を示している。もし変調がタンパクの特異的な変異により特徴付けられる場合には、この変異タンパクに特異的な抗体を、特異的な変異タンパクの存在のアッセイに使用することができる。
【０１１０】
この抗体は、生物の様々な組織中の細胞の、通常及び異常型の遺伝子局在を評価するためにも使用することができる。図１における実験データはヒトの腎臓及び混合組織での発現を示している。診断的な使用は、遺伝子試験だけでなく、治療法をモニターするためにも適用できる。したがって、治療が終局的に発現レベル、又は異常型配列の存在及び異常型組織分布、又は成長的な発現を直すことを意図している場合には、そのタンパク又は関連するフラグメントに直接的に対する抗体を、治療効率をモニターするために使用することができる。
【０１１１】
さらに、抗体は薬理ゲノム分析に有用である。例えば、多型タンパクに対して調製された抗体は、修正した治療法が求められる個人を特定するために使用することができる。この抗体は、電気伝導度、等電点、トリプシンペプチド消化、そして従来技術において知られている他の物理的アッセイにより分析される異常タンパクのための免疫的マーカーとしての診断にも有用である。
【０１１２】
この抗体は、組織分類のためにも有用である。図１における実験データはヒトの腎臓及び混合組織での発現を示している。従って、特異的なタンパクが特異的な組織の発現と関係している場合、このタンパクに特異的な抗体は、組織タイプを特定するために使用できる。
【０１１３】
抗体は、タンパク機能の阻害、例えば、リガンド等の結合相手へのＧＰＣＲタンパクの結合の阻害にも有用である。これらの使用は、タンパクの機能阻害に関連する治療法における、治療環境において適用されることができる。抗体は、例えば結合を阻害し、これによりペプチドの活性を変調（作動又は拮抗）するために使用することができる。抗体は、機能が要求されるサイトを含む特別なフラグメントに対して、又は細胞あるいは細胞膜と関連する完全なタンパクに対して調製することができる。構造の情報としては、本発明のタンパクと関連する図２を参照。
【０１１４】
本発明は、生物学的サンプル中のタンパクの存在を検知するための抗体を使用するためのキットも包む。このキットは、ラベル化又はラベル可能な抗体の等の抗体、及び生物サンプル中のタンパクを検知するための化合物又は試薬；サンプル中のタンパクの量を決定する手段；サンプル中のタンパクの量を基準と比較する手段；及び使用のための手引きを含むことができる。このようなキットは、単一のタンパク又はエピトープを検出するために供給される、あるいは抗体検出アレイ等において多数のエピトープのうちの１つを検出するために設定される。核酸アレイについてのアレイが以下に詳細に記述されるが、同様な方法が抗体アレイにも開発されている。
【０１１５】
核酸分子
本発明はさらに、本発明にかかるＧＰＣＲペプチド又はタンパクをコード化する単離核酸分子を提供する（ｃＤＮＡ、転移、及びゲノム配列）。該核酸分子は、本発明のＧＰＣＲペプチドの１つ、その対立変異体、又はそのオルソログあるいはパラログをコード化するヌクレオチド配列からなるか、本質的に該ヌクレオチド配列からなるか、又は該ヌクレオチド配列を含む。
【０１１６】
ここでいう「単離」核酸分子とは、核酸の天然源に存在する他の核酸から区別されたものである。好ましくは、「単離」核酸は、その核酸の由来となる生物のゲノムＤＮＡ中で核酸のフランキング配列（すなわち、５’、及び３’末端に位置する配列）は含まない。しかしながら、例えば、約５ＫＢ、４ＫＢ、３ＫＢ、２ＫＢ又は１ＫＢ以上又はこれ以下の、フランキングヌクレオチド配列があり、特に連続的にペプチドをコード化する配列及び同一遺伝子内でペプチドをコード化する配列であるが、ゲノム配列のイントロンにより分離されている。重要な点は、核酸が離れた重要でないフランキング配列から単離されたことであり、ここで述べる組換えの発現、プローブ及びプライマーの調製、及び核酸配列に特異的な他の用途等の特殊な操作の対象となるということである。
【０１１７】
さらに、転写／ｃＤＮＡ分子等の「単離」核酸分子は、他の細胞材料、組換え技術で製造された場合には培地、化学合成された場合には化学前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない。しかしながら、核酸分子は他のコード化又は調節配列と融合することができ、これも単離したと考えられる。
【０１１８】
例えば、ベクターに含まれる組換えＤＮＡ分子は単離されていると考えられる。単離ＤＮＡ分子のさらなる例としては、非相同な宿主細胞中に維持された組換えＤＮＡ分子、又は溶液中の精製（部分的に又は実質的に）されたＤＮＡ分子が挙げられる。単離ＲＮＡ分子は、ｉｎ ｖｉｖｏ、又はｉｎ ｖｉｔｒｏでの本発明の単離ＤＮＡ分子のＲＮＡ転写を含む。さらに本発明にかかる単離核酸分子は合成的に製造された分子を含む。
【０１１９】
従って、本発明は、図１又は３に示されるヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の転移配列、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のゲノム配列）よりなる核酸分子、又は図２ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のタンパクをコード化するいくつかの核酸分子を提供する。ヌクレオチド配列が核酸分子の完全なヌクレオチド配列である場合、核酸分子はヌクレオチド配列からなっている。
【０１２０】
本発明はさらに、図１又は３に示されるヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の転移配列、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のゲノム配列）より実質的になる核酸分子、又は図２ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のタンパクをコード化するいくつかの核酸分子を提供する。このようなヌクレオチド配列が、ごくわずかの付加核酸残基とともに、最終的な核酸分子中に存在するとき、核酸分子はヌクレオチド実質的に配列から成る。
【０１２１】
本発明はさらに、図１又は３に示されるヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の転移配列、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のゲノム配列）を含む核酸分子、又は図２ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のタンパクをコード化するいくつかの核酸分子を提供する。核酸分子は、該ヌクレオチド配列が核酸分子の最終的なヌクレオチド配列の少なくとも一部である核酸配列である時、該ヌクレオチド配列を含む。このように、核酸分子はヌクレオチド配列のみ、又は付加的核酸残基を有することができ、核酸残基はヌクレオチド配列又は非相同ヌクレオチド配列と自然に関連したものである。このような核酸分子は少しの付加的ヌクレオチドを有する、あるいは数百又はそれ以上の付加的ヌクレオチドを含む。これら様々なタイプの核酸分子がどのようにして製造され／単離されたかの簡単な説明を以下に提供する。
【０１２２】
図１，３には、コード化及び非コード化配列の両方が提供されている。本発明のヒトゲノム配列（図３）、及びｃＤＮＡ／転写配列（図１）により、図中の核酸分子は、ゲノムイントロニック配列、５´及び３´非コード化配列、遺伝子規定領域、及び非コード化相互ゲノム配列を含むことがある。一般的には、このような配列特徴は図１か３のどちらかに表示されており、当技術分野で知られている計算機を使って容易に特定できる。以下に述べられるように、いくつかの非コード化領域、特にプロモーターのような遺伝子特定要素は、例えば、非相同遺伝子発現の変調、化合物を変調する遺伝子活性を特定する対象として様々な目的に有用であり、ここに与えられるゲノム配列のフラグメントとして特に要求される。
【０１２３】
単離核酸分子は、成熟タンパクと付加的アミノ酸又はカルボキシル末端アミノ酸、又は成熟ペプチド内のアミノ酸（例えば成熟形態が１つ以上のペプチド鎖を有する場合）をコード化することがある。このような配列はタンパクが前駆体から成熟体へ成長する際、タンパク搬送の促進、タンパク半減期の延長又は短縮、アッセイ又は製造の際のタンパク操作の効率化、あるいは他の事由に役割を果たす。一般にｉｎ ｓｉｔｕの場合、付加的アミノ酸は細胞酵素により成熟タンパクから切り離される。
【０１２４】
上記のように、単離核酸分子は、ＧＰＣＲペプチドのみをコード化する配列、主又は副配列（例えばｐｒｅ−ｐｒｏ 又はｐｒｏ−タンパク配列）等の、成熟ペプチド及び付加的コード配列をコード化する配列、付加的コード配列を有し又は有さない成熟ペプチドをコード化する配列、プロモーターなどのゲノム調節配列に加えて、例えばイントロン及び非コード化５´及び３´配列のような転写はされるが翻訳はされず、転写、ｍＲＮＡ処理（スプライシング及びポリアデニル化信号を含む）、リボゾーム結合及びｍＲＮＡの安定化に役割を果たす付加的非コード配列を含むが、これに制限されない。さらに、核酸分子は、例えば精製に有用なペプチドなどをコード化するマーカー配列に融合されたものでもよい。
【０１２５】
単離核酸分子は、ｍＲＮＡのようなＲＮＡ形態、あるいはｃＤＮＡ及びクローニング又は化学合成技術又はこれらの組み合わせで得られたゲノムＤＮＡを含むＤＮＡ形態でありえる。核酸、特にＤＮＡは二重鎖又は一重鎖でありえる。一重鎖核酸はコード鎖（センス鎖）又は非コード鎖（アンチセンス鎖）でありえる。
【０１２６】
本発明はさらに、先に述べた本発明のＧＰＣＲタンパクの明らかな変異をコード化する核酸分子だけでなく、本発明のペプチドのフラグメントをコード化する核酸分子を提供する。このような核酸分子は、対立変異体（同じ位置）、パラログ（異なる位置）、オルソログ（異なる生物）等の天然に由来する、又はＤＮＡ組換え法あるいは化学合成により構成される。このような天然に由来しない変異は、核酸分子、細胞、又は生物に適用されるものを含む変異誘発技術により作られる。よって、上記のように、変異はヌクレオチドの置換、欠失、転化、及び挿入を含む。変異はコード化領域、非コード化領域の一方あるいは両方に起こりうる。変異は維持又は非維持アミノ酸置換を作る。
【０１２７】
本発明はさらに図１及び３に示される核酸分子の非コード化フラグメントを提供する。好ましい非コード化フラグメントとしては、プロモーター配列、エンハンサー配列、遺伝子変調配列、遺伝子終止配列が挙げられるが、これに限定されない。このようなフラグメントは非相同遺伝子発現を調整し、遺伝子変調薬剤を特定するスクリーンを発現するのに有用である。
【０１２８】
フラグメントは、１２又はそれ以上のヌクレオチドの連続的ヌクレオチド配列を含む。さらにフラグメントは、少なくとも３０，４０，５０，１００，２５０，又は５００のヌクレオチド長であることができる。フラグメントの長さは使用目的に依存する。例えば、フラグメントはペプチドのエピトープ挙動領域をコード化し、又はＤＮＡプローブ又はプライマーとして有用である。このようなフラグメントは、オリゴヌクレオチドプローブを合成する公知のヌクレオチド配列を用い、単離することができる。ラベルされたプローブは、コード領域に対応する核酸を単離するｃＤＮＡライブラリー、ゲノムＤＮＡライブラリー、又はｍＲＮＡをスクリーニングするために用いることができる。さらにプライマーは、遺伝子の特定領域をクローンするＰＣＲ反応を用いることができる。
【０１２９】
プローブ／プライマーは、典型的には実質的に精製されたオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対を含む。オリゴヌクレオチドは典型的には、少なくとも約１２，２０，２５，４０，５０又はそれ以上の連続的なヌクレオチドとなるストリンジェント条件下で、ハイブリダイズするヌクレオチド配列領域を含む。
【０１３０】
オルソログ、ホモログ、及び対立変異体は、当技術においてよく知られている方法により特定できる。ペプチドの項で記載したように、これらの変異体はペプチドをコードする核酸配列を含み、図面に示された核酸配列あるいはこの配列のフラグメントに対し、典型的には６０〜７０％、７０〜８０％，８０〜９０％、及びより典型的には９０〜９５％あるいはそれ以上の相同性を有するものである。このような核酸分子は、図に記載されたヌクレオチド配列あるいはその配列のフラグメントに対して、ストリンジェント条件でハイブリダイズできるものとして、容易に特定することができる。対立変異体は遺伝子をコード化する遺伝子座により容易に決定することができる。図３のデータにより示されるように、ｅＰＣＲにより、マップ位置は染色体６にあることが決定された。
【０１３１】
図３は、本発明の受容体タンパクをコード化する遺伝子において特定されたＳＮＰについての情報を提供する。３つのｉｎｄｅｌｓ（「−」により示される）及びエキソンの４つのＳＮＰを含む２３のＳＮＰ変異体が見つけられ、これらのうち２つがアミノ酸配列の変化（すなわち、非同義のＳＮＰ）の原因となっている。これらのＳＮＰが原因となるアミノ酸配列の変化は、図３に示されており、一般的な遺伝暗号及び図２に参照として提供されたタンパク配列を使ってすぐに決定できる。
【０１３２】
ここで「ストリンジェント条件下でのハイブリダイズ」とは、典型的には相互にハイブリダイズして残存し、ペプチドをコード化するヌクレオチド配列が互いに少なくとも６０〜７０％の相同性を有するまでハイブリダイズ及び洗浄を行うことを意味する。前記条件は、典型的には相互にハイブリダイズして残存し、互いに配列が少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％以上の相同性を有する。このようなストリンジェント条件は、当業者に公知であり、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に記載されている。ストリンジェントハイブリダイズ条件の一例は、約４５℃において６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）でハイブリダイズし、続いて５０〜６５℃において、０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで一回以上洗浄するという条件である。低いストリンジェントハイブリダイズ条件へ加減する例は、当技術においてよく知られている。
【０１３３】
核酸分子の使用
本発明の核酸分子はプローブ、プライマー、化学的中間体、マッピング試薬、発現調整試薬及び生物学的アッセイに有用である。核酸分子は、図２に表現されたペプチドをコード化する全長ｃＤＮＡとゲノムクローンを単離するため、及び図２に示すペプチドと同じ又は関連したペプチドを生成する変異体（対立遺伝子、オルソログ等）に関連するｃＤＮＡとゲノムクローンを単離するための、ｍＲＮＡ、転写／ｃＤＮＡ、及びゲノムＤＮＡへのハイブリダイズプローブとして有益である。図３に説明されるように、挿入／欠失変異（「ｉｎｄｅｌｓ」）を含むＳＮＰは、２３の異なるヌクレオチド位置で特定された。
【０１３４】
プローブは、図に示した核酸分子の全長にわたって、いずれかの配列にも対応することができる。従って、それは５´非コード化領域、コード化領域、及び３´非コード化領域から誘導できる。しかしながら、前述したように、フラグメントは、本発明以前に公開されたフラグメントを含むものではない。
【０１３５】
核酸分子は、ＰＣＲによる核酸分子のいずれかの与えられた領域のプライマーとして有用であり、また、所望の長さ及び配列のアンチセンス分子の合成に有用である。このような分子は遺伝子分類やマッピング実験に有用であり、特にプローブ領域が、ここに表された対立変異体の１つ又はそれ以上を含む時に有用である。
【０１３６】
核酸分子はまた、組換ベクターを構成するのにも有用である。このようなベクターはペプチド配列の一部分又はすべてを発現する発現ベクターを含む。ベクターは挿入ベクターを含み、他の核酸分子配列に融合して使用され、例えば細胞ゲノム中に、遺伝子及び／又は遺伝子生成物の発現状態をｉｎ ｓｉｔｕで変えるために用いられる。例えば、内生コード化配列を、そのすべて又はその一部について１以上の特に変異を引き起こすコード化領域に相同的に組換えることができる。
【０１３７】
核酸分子はまた、タンパクの抗原部位を示すのにも有用である。
また、核酸分子は、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法により、核酸分子の染色体位置を決定するためのプローブとして有用である。図３のデータにより示されるように、ｅＰＣＲにより、マップ位置は染色体６にあると決定された。
【０１３８】
核酸分子はまた、以下に詳しく説明するように、本発明の核酸分子の遺伝子特定領域を含むベクターを作るのに有用である。
核酸分子また、ここに記述された核酸分子から、全長又は一部のｍＲＮＡに対応するリボザイムを設計するのに有用である。
【０１３９】
核酸分子はまた、核酸分子及びペプチドの一部またはすべてを発現する宿主細胞を構築するのに有用である。
核酸分子はまた、前記核酸分子及びペプチドのすべて又は一部を発現する遺伝子組換動物を構築するのに有用である。
核酸分子はまた、ペプチドの一部又は全部を発現するベクターを作るのに有用である。
【０１４０】
核酸分子はまた、核酸分子の発現の存在、レベル、形態及び分布を決定するハイブリダイズプローブとして有用である。従って、プローブは、細胞、組織及び有機体における特定核酸分子の存在を検知し、又はレベルを決定するために用いられ得る。核酸のレベルはＤＮＡ又はＲＮＡで決定される。従って、ここに記述されるペプチドに対応するプローブは、与えられた細胞、組織、又は有機体で、発現及び／又は遺伝子複製数の評価に用いることができる。これらを使用することは、正常状態に比較し、ＧＰＣＲタンパクの発現が増加又は減少することを含む異常の診断に等価である。
【０１４１】
ｍＲＮＡの検出のｉｎ ｖｉｔｒｏ技術は、ノーザンハイブリダイズ及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイズを含む。ＤＮＡ検出のｉｎ ｖｉｔｒｏ技術は、サザンハイブリダイズ及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイズを含む。
【０１４２】
プローブは、ＧＰＣＲタンパクを発現する細胞又は組織を特定するための診断検査キットの一部として用いることができ、それは対象からの細胞のサンプル中の受容体コード化核酸、例えばｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡのレベルを測定すること、又は受容体遺伝子が変異していないかを検出することで行われる。図１における実験データは、本発明のＧＰＣＲがヒトの腎臓で発現することを示している。特に仮想ノーザンブロットはヒトの腎臓での発現を示している。加えてＰＣＲ−組織スクリーニングパネルは混合組織での発現を示している（図１の組織発現を参照）。
【０１４３】
核酸発現アッセイは、特に受容体を発現する細胞又は組織でのＧＰＣＲ核酸発現を変調する化合物を特定するスクリーニング試薬として有用である。
【０１４４】
従って、本発明により、ＧＰＣＲ遺伝子の核酸発現に関連した異常、それを表現する細胞及び組織において、ＧＰＣＲにより媒介される特別な生物学的および病理学的工程を処置するために使用できる化合物の特定のための方法が提供される。．  図１の実験データにより、ヒトの腎臓及び混合組織での発現が示される。この方法は、典型的にはＧＰＣＲ核酸の発現を変調する化合物の能力をアッセイし、望ましくないＧＰＣＲ核酸の発現により特徴づけられる異常の処置にその物質が使用し得るかを判定する。これらのアッセイは細胞系及び無細胞系で行うことができる。細胞系のアッセイは、ＧＰＣＲ核酸を自然に発現している細胞、又は特定の核酸配列を発現するように遺伝的に設計された組換え細胞を含む。
【０１４５】
ＧＰＣＲ核酸発現のためのアッセイは、ｍＲＮＡレベル、又は信号経路に関係する副次的な化合物等の核酸レベルの直接的なアッセイを含むことができる。さらに、ＧＰＣＲタンパク信号経路に反応して、上昇又は下降調節される遺伝子の発現も、アッセイされる。この例において、これらの遺伝子の規定領域は、発光酵素などのレポーター遺伝子と関連付けられうる。
【０１４６】
よって、ＧＰＣＲ遺伝子発現の変調剤は、細胞を候補化合物に接触させ、決定されたｍＲＮＡを発現させるという方法で特定される。候補化合物存在下でのＧＰＣＲｍＲＮＡ発現のレベルは、候補化合物非存在下でのＧＰＣＲｍＲＮＡ発現のレベルと比較される。候補化合物は、この比較に基づいて核酸発現の変調剤として特定でき、例えば異常な核酸によって特徴付けられる異常の処置に使用できる。候補化合物存在下でのｍＲＮＡ発現が、候補化合物非存在下でのｍＲＮＡ発現と比較して顕著に大きい場合、候補化合物は核酸発現の誘発剤として特定される。候補化合物存在下でのｍＲＮＡ発現が、候補化合物非存在下でのｍＲＮＡ発現と比較して顕著に少ない場合、候補化合物は核酸発現の阻害剤として特定される。
【０１４７】
本発明はさらに、核酸を対象として、タンパクを発現する細胞又は組織において、ＧＰＣＲ核酸発現を変調する、特にタンパクを発現する細胞又は組織内で活性を変調する遺伝子変調剤として薬剤スクリーニングを通して特定された化合物を用いた処置方法を提供する。図１における実験データは、本発明のＧＰＣＲがヒトの腎臓で発現することを示している。特に仮想ノーザンブロットはヒトの腎臓での発現を示している。加えてＰＣＲ−組織スクリーニングパネルは混合組織での発現を示している（図１の組織発現を参照）。変調は、上向き調整（例えば活性化又は作動化）又は下向き調整（抑制又は拮抗）の両方の調節、又は核酸発現を含む。
【０１４８】
あるいは、薬剤又は小分子がタンパクを発現する細胞又は組織中でＧＰＣＲ核酸発現を阻害する限り、ＧＰＣＲ核酸発現の変調剤は、ここに記載されるスクリーニングアッセイを用いて特定される小分子又は薬剤であり得る。。図１の実験データにより、ヒトの腎臓及び混合組織での発現が示される。
【０１４９】
核酸分子はまた、臨床試験又は治療方法において、ＧＰＣＲ遺伝子の発現及び活性に対する変調化合物の効果をモニターするのに有用である。よって、遺伝子発現パターンは化合物による治療の連続的効果のバロメーターとなり、特に患者が耐性を示す化合物に有効である。遺伝子発現パターンは、影響された細胞の化合物への生理的反応を暗示するマーカーとしてもまた有用である。従って、このようなモニターは、化合物の投与量の増加、あるいは患者が耐性を示さない別の化合物の投与を認める。同様に、核酸発現のレベルが好ましいレベル以下に落ちたら、化合物の投与を比例して減少させることができる。
【０１５０】
核酸分子はまた、ＧＰＣＲ核酸の質的変化に対する診断アッセイに有用であり、特に病状を導き出す質的変化に有用である。核酸分子はＧＰＣＲ遺伝子及びｍＲＮＡのような遺伝子発現生成物の変異を検出するのに用いることができる。核酸分子は、ＧＰＣＲ遺伝子において自然発生した遺伝子突然変異を検出し、その変異を持つ被験者が変異により生じる障害の危険性を有しているかどうかを判定するためのハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。変異は、遺伝子中の１以上のヌクレオチドの欠如、付加、置換；転置又は転移のような染色体再配置；異常メチル化パターンのようなゲノムＤＮＡの変化；増幅のような遺伝子複写数の変化等を含む。疾患がＧＰＣＲタンパクの過剰発現、過小発現又は変異発現による場合、機能障害に関連するＧＰＣＲ遺伝子の変異体の検出により、疾患の活性又は疾患への感受性の診断ツールが提供される。
【０１５１】
ＧＰＣＲ遺伝子に変異を有する個人は、各種技術により遺伝子レベルで検出することができる。図３は、本発明の受容体タンパクをコード化している遺伝子において特定されたＳＮＰについての情報を提供する。３つのｉｎｄｅｌｓ（「−」により示される）及びエキソンの４つのＳＮＰを含む２３のＳＮＰ変異体が見つけられ、これらのうち２つがアミノ酸配列の変化（すなわち、非同義のＳＮＰ）の原因となっている。これらのＳＮＰが原因となるアミノ酸配列の変化は、図３に示されており、一般的な遺伝暗号及び図２に参照として提供されたタンパク配列を使ってすぐに決定できる。図３のデータにより示されるように、ｅＰＣＲにより、マップ位置は染色体６にあることが決定された。ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡは直接分析されるか、または分析に先がけて、ＰＣＲを使って拡大できる。ＲＮＡ又はｃＤＮＡも同様に使われうる。変異の検出は、ある用途では、アンカーＰＣＲ又はＲＡＣＥ  ＰＣＲのようなポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．４，６８３，１９５及び４，６８３，２０２参照）、又は異なるものではリゲーション鎖反応（ＬＣＲ）（Ｌａｎｄｅｇｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７−１０８０（１９８８）；及びＮａｋａｚａｗａ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ９１：３６０−３６４（１９９４）参照）におけるプローブ／プライマーの使用を含み、後者は特に遺伝子のポイント変異の検出に特に有効である（Ａｂｒａｖａｙａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：６７５−６８２（１９９５）参照）。この方法は、患者から細胞サンプルを収集する工程；細胞サンプルから核酸（例えばゲノム，ｍＲＮＡ又は両者）を単離する工程；核酸サンプルを遺伝子（もし存在すれば）のハイブリダイズ及び増幅が生じる条件下で、遺伝子に特にハイブリダイズした１以上のプライマーと接触させる工程；増幅生成物の存在又は不存在を検出する、又は増幅生成物の大きさを検出しコントロールサンプルの長さと対比する工程；を含む。欠失及び挿入は増幅生成物を正常遺伝子型と比較することにより、大きさの変化で検出することができる。ポイント変異は、増幅ＤＮＡを正常ＲＮＡ又はアンチセンスＤＮＡとハイブリダイズすることで特定することができる。
【０１５２】
あるいは、ＧＰＣＲ遺伝子の変異は、例えばゲル電気泳動により決定される制限酵素消化パターンの変更により、直接的に確認することができる。
さらに、配列特定リボザイム（Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，４９８，５３１）は、リボザイム開裂部位の成長又は減少により、特定の変異の存在を評点することに用いることができる。完全に一致する配列は、ヌクレアーゼ開裂消化アッセイ、又は融点の違いによって、不一致の配列から区別することができる。
【０１５３】
特定領域の配列変化は、ＲＮａｓｅ及びＳ１保護のようなヌクレアーゼ保護アッセイ又は化学開裂法により評価することができる。さらに、変異ＧＰＣＲ遺伝子と野性型遺伝子との間の配列相違は、直接ＤＮＡ配列化により決定できる。自動配列化手段の各種は、診断アッセイを実行するときに有効であり（Ｎａｅｖｅ，Ｃ．Ｗ．，（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９：４４８）、マススペクトルによる配列化を含む（ＰＣＴ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＷＯ９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．３６：１２７−１６２（１９９６）；及びＧｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３８；１４７−１５９（１９９３）参照）。
【０１５４】
遺伝子の変異を検出する他の方法には、ＲＮＡ／ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖の不適合塩基を検出するため開裂試薬から保護する方法（Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０；１２４２（１９８５））；Ｃｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ８５：４３９７（１９８８）；Ｓａｌｅｅｂａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２８６−２９５（１９９２））、変異及び野性型核酸の電気泳動量を比較する方法（Ｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ８６；２７６６（１９８９）；Ｃｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２８５：１２５−１４４（１９９３）；及びＨａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．９：７３−７９（１９９２））、及び変性剤の勾配を含んだポリアクリルアミドゲル中での変異体又は野生型フラグメントの動きを、勾配ゲル電気泳動を用いてアッセイする方法 （Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１３：４９５（１９８５））が含まれる。ポイント変異を検出する他の技術の例には、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイズ、選択的増幅、及び選択的プライマー伸長が含まれる。
【０１５５】
核酸分子は、治療方法に影響を及ぼすにも関わらず、必ずしも疾患を引き起こすわけではない遺伝子型の個人テストにおいても有用である。このため、核酸分子は、個人の遺伝子型と、治療に用いられる化合物に対する個人の応答との相関（薬理ゲノム相関）についての研究に用いることができる。したがって、治療のために適切な化合物及び投与量を選択するために、ここに記載されている核酸分子を、個人のＧＰＣＲ遺伝子の変異の評価に用いることができる。図３に説明されるように、挿入／欠失変異（「ｉｎｄｅｌｓ」）を含むＳＮＰは、２３の異なるヌクレオチド位置で特定された。
【０１５６】
そして、治療に影響を与える遺伝子変異を示す核酸分子は、個人に対するテーラー治療に用いることのできる診断対象を提供する。従って、これらの多型を有する組換細胞及び動物の製造は、治療化合物及び投与量の効果的な臨床設計を可能とする。
【０１５７】
核酸分子は、細胞、組織、及び生体におけるＧＰＣＲ遺伝子発現を制御するためのアンチセンス構成物として有用である。ＤＮＡアンチセンス核酸分子は、転写に関連する遺伝子の領域に相補的に設計され、転写及びその後のＧＰＣＲタンパクの製造を阻止する。アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ核酸分子は、ｍＲＮＡにハイブリダイズされ、ｍＲＮＡのＧＰＣＲタンパクへの翻訳を阻止する。
【０１５８】
あるいは、アンチセンス分子の一種は、ＧＰＣＲ核酸の発現を減少させ、ｍＲＮＡを不活性化するために用いられる。従って、これらの分子は、異常又は望ましくないＧＰＣＲ核酸発現により特徴づけられる異常を治療することができる。この技術は、ｍＲＮＡの１以上の部分に、ｍＲＮＡが翻訳される能力を減じるヌクレオチド配列を相補的に含むリボザイムによる開裂に関する。可能な部分はコード領域、特にリガンド結合領域のようなＧＰＣＲタンパクの触媒活性及び他の機能的活性に関連したコード領域である。
【０１５９】
核酸分子はさらに、ＧＰＣＲ遺伝子発現に異常を有する細胞を含む患者の遺伝子治療のベクターを提供する。組み換え細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏで調製され患者に戻される細胞を含み、個人の体内に導入されて、そこで細胞は個人の治療のために望ましいＧＰＣＲタンパクを生成する。
【０１６０】
本発明はまた、生物的サンプル中のＧＰＣＲ核酸の存在を検知するキットを含む。図１における実験データは、本発明のＧＰＣＲがヒトの腎臓で発現することを示している。特に仮想ノーザンブロットはヒトの腎臓での発現を示している。加えてＰＣＲ−組織スクリーニングパネルは混合組織での発現を示している（図１の組織発現を参照）。例えば、キットは、ラベル化された又はラベル化可能な核酸、あるいは生物学的サンプル中でＧＰＣＲ核酸を検出することのできる試薬；サンプル中のＧＰＣＲ核酸量を決定する手段；及び標準サンプルのＧＰＣＲ核酸量と比較する手段；を含むことができる。化合物又は薬剤は適当な容器に封入される。このキットはさらにＧＰＣＲタンパクｍＲＮＡ又はＤＮＡを検出するキットの使用に関する説明書を含む。
【０１６１】
核酸アレイ
さらに本発明により、図１及び３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１及び３）で与えられる配列情報に基づく核酸分子のアレイ又はマイクロアレイ等の核酸検出キットが提供される。
【０１６２】
ここで用いる「アレイ」又は「マイクロアレイ」とは、紙、ナイロン又は他種の膜、フィルター、チップ、スライドグラス又は他の適当な固形担体である基板上に合成された別個のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドのアレイを表す。１つの例において、マイクロアレイはＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ ５，８３７，８３２，Ｃｈｅｅ ｅｔ ａｌ．， ＰＣＴ 出願 ＷＯ９５／１１９９５（Ｃｈｅｅ ｅｔ ａｌ．），Ｌｏｃｋｈａｒｔ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９６；Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：１６７５−１６８０）及びＳｈｅｎａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９６；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：１０６１４−１０６１９）に記載された方法にしたがって調製且つ使用され、これらは参考としてここに折り込まれる。他の例では、このようなアレイはＢｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．， Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，８０７，５２２に記載される方法により製造される。
【０１６３】
マイクロアレイ又は検出キットは、好ましくは多くの特異な単鎖核酸配列を含み、通常、固形担体に固定された合成アンチセンスオリゴヌクレオチド又はｃＤＮＡのフラグメントのいずれかを含む。オリゴヌクレオチドは好ましくは約６〜６０のヌクレオチド長で、より好ましくは１５〜３０のヌクレオチド長、もっとも好ましくは約２０〜２５のヌクレオチド長である。ある種のマイクロアレイあるいは検出キットでは、好ましくはわずか７〜２０のヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを用いる。マイクロアレイあるいは検出キットは、既知の５’あるいは３’配列を包含するオリゴヌクレオチド、全長配列を包含する配列化オリゴヌクレオチド、あるいは配列の長さに沿った特定領域から選択された特異なオリゴヌクレオチドを含む。マイクロアレイあるいは検出キットに用いられるポリヌクレオチドは、遺伝子あるいは対象遺伝子グループに特異的なオリゴヌクレオチドである。
【０１６４】
マイクロアレイあるいは検出キット用に公知の配列のオリゴヌクレオチドを製造するため、対象となる遺伝子（あるいは本発明により特定されるＯＲＦ）は、典型的にはヌクレオチド配列の５’あるいは３’末端から開始する、コンピュータアルゴリズムを用いて検査される。典型的なアルゴリズムは、遺伝子に特異的な長さであり、ハイブリダイズに適した範囲にＧＣ含有量を有し、ハイブリダイズを妨害する二次構造を有さないとされたオリゴマーを特定する。ある条件下で、マイクロアレイあるいは検出キット上のオリゴヌクレオチド対を用いることが好適である。「対」は同一で、好ましくは配列の中央部に位置する一つのヌクレオチドを除く。対の第二オリゴヌクレオチド（一方とは整合しない）はコントロールとなる。オリゴヌクレオチド対の数は２から百万である。オリゴマーは、基板の特定領域に、光照射化学処理により合成される。基板は、紙、ナイロンあるいは多種の膜、フィルター、チップ、スライドグラス、あるいは他の適当な固体担体である。
【０１６５】
他の例では、オリゴヌクレオチドは基板上に化学結合処理及びインクジェット処理装置により合成され、これはＰＣＴ出願 ＷＯ９５／２５１１１６（Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒ等）に記載されており、そのすべては参考としてここに折り込まれる。他の例では、「格子化」配列は、ドット（又はスロット）がｃＤＮＡフラグメント又はオリゴヌクレオチドを、真空システム、加熱、ＵＶ、機械的又は化学的結合処理により基板の表面に配置及び結合する。上記のような配列は、手作業又は適当な装置（スロットブロット又はドットブロット装置）、材料（適当な固体担体のいずれか）及び機械（ロボット化設備）により製造され、８，２４，９６，３８４，１５３６，６１４４又はそれ以上のオリゴヌクレオチド、又は市販の設備の効率的な用途に適している２〜１００万のオリゴヌクレオチドを含む。
【０１６６】
マイクロアレイあるいは検出キットを用いたサンプル分析を行うため、生物サンプルから得られたＲＮＡあるいはＤＮＡをハイブリダイズプローブに調製する。ｍＲＮＡは単離され、ｃＤＮＡは製造され、アンチセンスＲＮＡ（ａＲＮＡ）を製造する型として使用される。ａＲＮＡは蛍光ヌクレオチドの存在下に増幅され、ラベルされたプローブはマイクロアレイあるいは検出キットとともに培養され、プローブの配列はマイクロアレイあるいは検出キットのオリゴヌクレオチドに相補的にハイブリダイズされる。完全な相補性、又は様々な程度の少ない相補性を持つようにハイブリダイズが起こるよう、培養条件が調整される。非ハイブリダイズプローブが除かれた後、蛍光レベル及びパターンを決定するためスキャナーが用いられる。スキャンされたイメージは、マイクロアレイあるいは検出キット上の各オリゴヌクレオチド配列の相補性の程度及び相対的存在度を決定する検査を行う。生物的サンプルはいずれの体液（血液、尿、唾液、たん、胃液等）、培養細胞、生体組織、あるいは他の組織調製物からも得ることができる。検出システムは、すべての区別される配列についてハイブリダイゼーションの欠如、存在、及び量を測定するのに用いられる。このデータは、配列、発現型、変異、変異体又はサンプル間の多型の大規模な相互関係研究のために使用することができる。
【０１６７】
本発明は、このようなアレイを用い、本発明のＧＰＣＲタンパク／ペプチドの発現を特定する方法を提供する。詳細には、このような方法は被検サンプルを１以上の核酸分子と共に培養し、被検サンプル中の成分への核酸分子の結合をアッセイすることを含む。このアッセイは、典型的には多くの遺伝子を含む配列を含み、少なくとも１つは本発明の遺伝子及び／又は本発明のＧＰＣＲ遺伝子の対立遺伝子である。図３は、本発明の受容体タンパクをコード化する遺伝子において特定されたＳＮＰについての情報を提供する。３つのｉｎｄｅｌｓ（「−」により示される）及びエキソンの４つのＳＮＰを含む２３のＳＮＰ変異体が見つけられ、これらのうち２つがアミノ酸配列の変化（すなわち、非同義のＳＮＰ）の原因となっている。これらのＳＮＰが原因となるアミノ酸配列の変化は、図３に示されており、一般的な遺伝暗号及び図２に参照として提供されたタンパク配列を使ってすぐに決定できる。
【０１６８】
核酸分子の培養条件は被検サンプルとともに変化する。培養条件はアッセイに用いられた形態、採用された検出方法、及びアッセイに用いられた核酸分子の型及び性質に依存する。当業者は、一般的に適用されるハイブリダイゼーション、増幅、又はアレイアッセイ形態を、ここに記述されたヒトゲノムの新規なフラグメントを用いるのに適するよう調製することができる。このようなアッセイの例は、Ｃｈａｒｄ，Ｔ，Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８６）；Ｂｕｌｌｏｃｋ，Ｇ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｒｌａｎｄｏ， ＦＬ Ｖｏｌ．１（１９８２），Ｖｏｌ．２（１９８３）， Ｖｏｌ．３ （１９８５）；Ｔｉｊｓｓｅｎ， Ｐ．， Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ： Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８５） に記載されている。
【０１６９】
本発明の披検サンプルは、細胞、タンパク、又は細胞から得られる細胞膜抽出物を含む。上記の方法により使われた披検サンプルは、アッセイフォーマット、検出方法の性質、及びアッセイされるサンプルとして使用された組織、細胞、抽出物に基づき変化する。核酸、又は細胞抽出物を用意する方法は、当業者によく知られており、利用された系と矛盾のないサンプルを得るために、容易に適応できる。
【０１７０】
本発明の他の例では、キットは本発明のアッセイを実行するために、必要な試薬を含むように規定される。
【０１７１】
特に本発明は、（ａ）核酸プローブの一つ、例えばここに記述されるヒトゲノムのフラグメントを結合することのできる核酸分子を含む第一の容器；及び（ｂ）洗浄剤又は結合核酸の存在を検出することのできる試薬の一つ以上を含む一以上の容器を含む、小さく仕切られ、コンパートメント化されたキットを提供する。
【０１７２】
詳細には、コンパートメント化されたキットは、隔離された容器に試薬が入る各キットを含む。このような容器は、小さなガラス容器、プラスチック容器、プラスチックのストライプ、ガラス又は紙、又はシリカのようなアレイ化材料を含む。このような容器は、一つのコンパートメントから他のコンパートメントに試薬を効率的に移行させ、サンプル及び試薬は相互汚染せず、各容器の試薬又は溶液は一の容器から他の容器へ定量的に添加される。このような容器は、被検サンプルを入れる容器、核酸プローブを入れる容器、洗浄液（リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液等）を入れる容器、結合プローブを検出する試薬を入れる容器を含む。当業者は、本発明の遺伝子をコード化する本発明の未特定ＧＰＣＲ遺伝子を、ここに開示された配列情報を用い、定型的に特定することができ、これを周知のキット形式、特に発現アレイに折り込んで用いることができる。
【０１７３】
ベクター／宿主細胞
本発明はまた、ここに記載の核酸分子を含むベクターを提供する。「ベクター」とは、核酸分子を輸送する媒体、好ましくは核酸分子を意味する。ベクターが核酸分子である場合、核酸分子はベクターの核酸と共有結合している。本発明のこの見地から、ベクターはプラスミド、一本鎖又は二本鎖のファージ、一本鎖又は二本鎖のＲＮＡ又はＤＮＡウイルスベクター、あるいは人工染色体を含み、例えば、ＢＡＣ、ＰＡＣ、ＹＡＣ、ＭＡＣなどが挙げられる。
【０１７４】
ベクターは、染色体外成分として宿主細胞中で維持可能であり、そこで核酸分子の別のコピーを複製、生産する。あるいは、ベクターは、宿主細胞ゲノム中に組み込まれ、宿主細胞が複製する際に核酸分子の別のコピーを生産してもよい。
【０１７５】
本発明は、維持のためのベクター（クローニングベクター）あるいは核酸分子発現のためのベクター（発現ベクター）を提供する。ベクターは、原核細胞又は真核細胞、あるいはその両者において機能することができる（シャトルベクター）。
【０１７６】
発現ベクターは、シス作用性調節領域を含み、該領域は、核酸分子の転写が宿主細胞中でできるように、ベクター中で核酸分子に作動可能に結合されている。核酸分子は、転写に作用することが可能な別の核酸分子と共に宿主細胞に導入することができる。従って、この第２の核酸分子は、ベクターからの核酸分子の転写ができるように、シス調節コントロール領域と相互作用するトランス作用性因子を与えてもよい。あるいは、トランス作用性因子は、宿主細胞により供給されてもよい。また、トランス作用性因子は、ベクター自体から生産することもできる。しかしながら、いくつかの実験において、核酸分子の転写及び／又は翻訳は無細胞系で起こり得ることが理解される。
【０１７７】
ここに記載の核酸分子が作動可能に結合している調節配列は、ｍＲＮＡ転写を指示するプロモーターを含む。これは、バクテリオファージλから残ったプロモーター、大腸菌からのｌａｃ、ＴＲＰ、及びＴＡＣプロモーター、ＳＶ４０からの初期及び後期プロモーター、ＣＭＶ即時型プロモーター、アデノウイルス初期及び後期プロモーター、ならびにレトロウイルス長末端反復を含むが、これらに限定されない。
【０１７８】
発現ベクターは、転写を促進するコントロール領域の他に、レプレッサー結合領域やエンハンサー等の転写調節領域をも含むことができる。例としては、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス即時型エンハンサー、ポリオーマエンハンサー、アデノウイルスエンハンサー、レトロウイルスＬＴＲエンハンサーを含む。
【０１７９】
発現ベクターは、転写を開始及びコントロールするための領域を含む他、転写終止に必要な配列を含むことが可能であり、また転写される領域においては、翻訳のためのリボソーム結合領域を含むことも可能である。発現のための他の調節コントロール要素は、ポリアデニル化信号だけでなく開始及び終止コドンも含む。当業者は、発現ベクターに有用な多数の調節配列を知っているであろう。このような調節配列は例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｅｒ， ＮＹ （１９８９） に記載されている。
【０１８０】
多様な発現ベクターを核酸分子の発現に用いることができる。このようなベクターは、染色体ベクター、エピソームベクター、ウイルス由来ベクターを含み、例えば、細菌プラスミド由来；バクテリオファージ由来；酵母エピソーム由来；酵母人工染色体を含む酵母染色体要素由来；バクロウイルス、ＳＶ４０等のパポーバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス等のウイルス由来；のベクターが挙げられる。ベクターはプラスミド及びバクテリオファージ遺伝要素、例えば、コスミド、ファージミドなどに由来するようなこれら起源の組み合わせに由来してもよい。原核宿主及び真核宿主のための適当なクローニングベクター及び発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｅｒ， ＮＹ （１９８９） に記載されている。
【０１８１】
調節配列は１つ以上の宿主細胞における構成性発現を与えてもよく（すなわち、組織特異的）、あるいは、温度、栄養添加剤、又はホルモンや別のリガンドのような外因性因子によるような一つ以上の細胞型での誘導性発現を与えてもよい。原核宿主及び真核宿主における構成性発現及び誘導性発現を与える様々なベクターは当業者に良く知られている。
【０１８２】
核酸分子は、周知の方法論により、ベクターの核酸に挿入することができる。一般に、最終的に発現するＤＮＡ配列は、一つ以上の制限酵素によりＤＮＡ配列と発現ベクターを切断し、その後そのフラグメントが互いに結合することにより発現ベクターに結合する。制限酵素の消化及び結合反応の手順は、当業者に良く知られている。
【０１８３】
適当な核酸分子を含むベクターは、周知の技術を用い、増殖あるいは発現に適当な宿主細胞に導入することができる。細菌細胞は、大腸菌、放線菌、及びネズミチフス菌を含むが、これらに限定されない。真核細胞は、酵母、ショウジョウバエなどの昆虫細胞、ＣＯＳやＣＨＯ細胞などの動物細胞、及び植物細胞を含むが、これらに限定されない。
【０１８４】
ここに記載のように、融合タンパクとしてペプチドを発現することが望ましいかもしれない。従って本発明は、ペプチドが生産できる融合ベクターを提供する。融合ベクターは、組換えタンパクの発現を増大し、組換えタンパクの溶解度を向上させ、そして例えばアフィニティー精製のためのリガンドとして作用することによりタンパク精製を助けることができる。タンパク加水分解の切断部位は、融合部位の接合点に導入してもよく、その結果、所望のペプチドを最終的に融合部位から分離することができる。タンパク加水分解酵素は、Ｘａ因子、トロンビン、及びエンテロキナーゼを含むが、これらに限定されない。代表的な融合発現ベクターは、対象組換えタンパクに対してグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク、あるいはタンパクＡとそれぞれ融合するｐＧＥＸ （Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０ （１９８８））、 ｐＭＡＬ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）、及びｐＲＩＴ５ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）を含む。
【０１８５】
適切な誘導性非融合大腸菌発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ （Ａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５ （１９８８）） 及び ｐＥＴ  １１ｄ （Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５：６０−８９ （１９９０））を含む。
【０１８６】
組換えタンパクの発現は、組換えタンパクをタンパク加水分解的に切断する宿主細胞の能力が減じられている遺伝的背景を提供することにより、宿主細菌において最大化することができる（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ， Ｓ．， Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ （１９９０） １１９−１２８）。あるいは、関係のある核酸分子の配列は、大腸菌等の特定の宿主細胞に優先的コドンの使用を提供するように変更することができる（Ｗａｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０：２１１１−２１１８ （１９９２））。
【０１８７】
核酸分子は、酵母において作用する発現ベクターにより発現することも可能である。酵母、例えばＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ での発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１ （Ｂａｌｄａｒｉ， ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ６：２２９−２３４ （１９８７））、 ｐＭＦａ （Ｋｕｒｊａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ３０：９３３−９４３（１９８２））、 ｐＪＲＹ８８ （Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ５４：１１３−１２３ （１９８７））、 及び ｐＹＥＳ２ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を含む。
【０１８８】
核酸分子は、また、例えばバクロウイルス発現ベクターを用い、昆虫細胞中で発現させることもできる。培養昆虫細胞（例えば、Ｓｆ ９ 細胞）中でのタンパク発現に有用なバクロウイルスベクターは、ｐＡｃ系（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ３：２１５６−２１６５ （１９８３）） 及び ｐＶＬ系 （Ｌｕｃｋｌｏｗ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９ （１９８９）） を含む。
【０１８９】
本発明のある例において、ここに記載の核酸分子は、哺乳類の発現ベクターを用い、哺乳類細胞において発現する。哺乳類発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８ （Ｓｅｅｄ， Ｂ． Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０（１９８７）） 及び ｐＭＴ２ＰＣ （Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ６：１８７−１９５ （１９８７））を含む。
【０１９０】
ここに挙げた発現ベクターは、核酸分子を発現するのに有用であり、当業者が利用可能な周知のベクターの単なる例として提供するものである。当業者は、ここに記載の核酸分子の維持、増殖あるいは発現に適した他のベクターについて知っているであろう。これらは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｈ， Ｅ． Ｆ．， ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ， ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９に認められる。
【０１９１】
本発明は、ここに記載の核酸配列が逆向きにベクター中にクローン化されてはいるが、アンチセンスＲＮＡの転写を許可する調節配列に作用可能に結合されているベクターも含む。従って、アンチセンス転写物は、コード領域及び非コード領域の両方を含むここに記載の核酸分子配列の全てあるいは一部に対して生産することができる。このアンチセンスＲＮＡの発現は、センスＲＮＡの発現に関する上記各パラメータに従う（調節配列、構成性又は誘導性発現、組織特異的発現）。
【０１９２】
本発明は、ここに記載のベクターを含む組換え宿主細胞にも関する。宿主細胞は、原核細胞、酵母等の下等真核細胞、昆虫細胞等の他の真核細胞、及び哺乳類細胞等の高等真核細胞を含む。
【０１９３】
組換え宿主細胞は、ここに記載のベクター構成物を当業者が容易に使用可能な技術により細胞に導入することにより作製される。これらは、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、リポフェクション、及びＳａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ． （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ， ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９）に認められるような他の技術を含むが、これらに限定されない。
【０１９４】
宿主細胞は、一つ以上のベクターを含むことができる。従って、異なるヌクレオチド配列を同じ細胞の異なるベクター上に導入することができる。同様に、核酸分子を単独で、あるいは発現ベクターのためのトランス作用性因子を提供する核酸分子等に無関係な他の核酸分子とともに導入することもできる。一つ以上のベクターを細胞に導入する場合、ベクターは独立して導入するか、共に導入するか、あるいは核酸分子ベクターに結合することができる。
【０１９５】
バクテリオファージ及びウイルス性ベクターの場合、これらは感染及び形質導入の標準的な方法によりパッケージ化ウイルスあるいはカプセル化ウイルスとして細胞内に導入することができる。ウイルスベクターは、複製コンピテント（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）あるいは複製欠損（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ）であることが可能である。ウイルス複製が欠損している場合、欠損を補足する機能を発揮する宿主細胞において、複製は起こる。
【０１９６】
ベクターは、一般的に、組換えベクター構成物を含む細胞亜集団の選択ができる選択可能マーカーを含む。このマーカーは、ここに記載の核酸分子を含む同一のベクター中に含まれていてもよく、あるいは別のベクター上にあってもよい。マーカーは、原核宿主細胞に関するテトラサイクリン又はアンピシリン抵抗性遺伝子、及び真核宿主細胞に関するジヒドロ葉酸レダクターゼ又はネオマイシン抵抗性遺伝子を含む。しかしながら、表現型形質を選択する何れのマーカーも効果的である。
【０１９７】
成熟タンパクは、細菌、酵母、哺乳類細胞、及び他の細胞において適当な調節配列のコントロール下に生産可能であるが、ここに記載のＤＮＡ構成物に由来するＲＮＡを用いて、これらタンパクを生産するために無細胞転写及び翻訳系を使用することも可能である。
【０１９８】
ペプチド分泌が望まれるところでは、ＧＰＣＲ等のタンパクを含むマルチ貫膜ドメインが達成しづらく、適切な分泌信号がベクターに組み入れられる。信号配列は、ペプチドに対して内因性であるか、あるいはこれらのペプチドに対して非相同であることができる。
【０１９９】
ペプチドを媒体中に分泌しないところでは、それはＧＰＣＲの場合に典型的であるが、タンパクは凍結解凍、音波処理、機械的破砕、溶菌剤の使用等を含む標準的な破砕方法により宿主細胞から単離することができる。ペプチドは、その後、硫酸アンモニウム沈降、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、あるいは高速液体クロマトグラフィー等の周知の精製方法により回収、精製することができる。
【０２００】
ここに記載のペプチドの組換え生産における宿主細胞に依存して、ペプチドは、細胞によって様々なグリコシル化パターンを有することができ、あるいは細菌中で生産する場合のようにグリコシル化されないかもしれない。さらに、宿主媒介工程の結果のような場合には、ペプチドは初期修飾メチオニンを含むかもしれない。
【０２０１】
ベクターと宿主細胞の使用
ここに記載のペプチドを発現する組換え宿主細胞は、様々な用途を有する。まず、細胞は、ＧＰＣＲタンパクの生産、あるいは、さらに精製して所望量のＧＰＣＲタンパクやフラグメントを生産することができるペプチドの生産に有用である。従って、発現ベクターを含む宿主細胞は、ペプチド生産に有用である。
【０２０２】
宿主細胞は、また、当該分野で公知のフォーマットだけでなく、前記のようなＧＰＣＲタンパクあるいはＧＰＣＲタンパクフラグメントに関連する細胞系アッセイにも有用である。従って、天然ＧＰＣＲタンパクを発現する組換え宿主細胞は、ＧＰＣＲタンパク機能を刺激あるいは抑制する物質アッセイに有用である。
【０２０３】
宿主細胞はまた、その機能に影響があるＧＰＣＲタンパク変異体の特定にも有用である。その変異体が自然に発生し、病理を起こすのであれば、その変異を含む宿主細胞は、天然ＧＰＣＲタンパクに対しては示さないかもしれない効果であり、ＧＰＣＲタンパク変異体に対しては望ましい効果（例えば、誘発機能や抑制機能）を有する化合物の分析に有用である。
【０２０４】
一般的に、設計された宿主細胞は、さらにヒト以外の形質転換動物の生産に使用することができる。形質転換動物は、好ましくは哺乳類、例えば、ラットやマウス等の齧歯類であり、その動物の細胞の一つ以上が導入遺伝子を含むものである。導入遺伝子は、形質転換動物が発育した細胞のゲノム中に組み込まれ、その形質転換動物の一つ以上の細胞型あるいは組織中の成熟動物のゲノム中に残存する外因性ＤＮＡである。これらの動物は、ＧＰＣＲタンパクの機能の研究、並びにＧＰＣＲタンパク活性の変調剤の特定及び評価に有用である。形質転換動物の他の例としては、ヒト以外の霊長目動物、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類を含む。
【０２０５】
形質転換動物は、受精卵母細胞の雄前核中に核酸を導入することにより生産することができる。例えば微量注入法、レトロウイルス感染、卵母細胞の疑似妊娠雌養育動物中での発育などにより生産できる。ＧＰＣＲタンパクヌクレオチド配列は何れも、マウスのようなヒト以外の動物のゲノム中に導入遺伝子として導入することができる。
【０２０６】
発現ベクターにおいて有用な調節配列あるいは他の配列は何れも、形質転換配列の一部を形成することができる。これは、もし既に含まれていない場合に、イントロン配列及びポリアデニル化信号を含む。組織特異的調節配列は、導入遺伝子に作用可能に結合し、特定の細胞に対してＧＰＣＲタンパクの発現を指示する。
【０２０７】
胚操作及び微量注入法による形質転換動物の生成方法は、特にマウスのような動物では、当該技術分野において通常行われており、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．４，７３６，８６６及びＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．４，８７０，００９（共にＬｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．）、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．４，８７３，１９１（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．）、並びにＨｏｇａｎ， Ｂ．， Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ， （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， １９８６）等に記載されている。同様の方法は、他の形質転換動物の生産にも使用される。形質転換の基礎動物は、そのゲノム中の導入遺伝子及び／又はその動物の組織あるいは細胞中の形質転換ｍＲＮＡの発現の存在に基づき特定することができる。形質転換の基礎動物は、その後、導入遺伝子を保有する別の動物を生むのに用いることができる。また、導入遺伝子を保有する形質転換動物は、さらに別の導入遺伝子を保有する別の形質転換動物に改良することができる。形質転換動物はまた、ここに記載の相同組換え宿主細胞を用いて完全な動物あるいはその動物の組織を生産する動物も含む。
【０２０８】
別の例において、ヒト以外の形質転換動物は、導入遺伝子発現調節ができる選択システムを含み生産することができる。このようなシステムの一例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｏｘＰリコンビナーゼシステムである。ｃｒｅ／ｏｘＰリコンビナーゼシステムに関しては、例えば、Ｌａｋｓｏ ｅｔ ａｌ． ＰＮＡＳ ８９：６２３２−６２３６ （１９９２）を参照。リコンビナーゼシステムの別の例はＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ のＦＬＰリコンビナーゼシステムである（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３５１−１３５５ （１９９１））。ｃｒｅ／ｏｘＰリコンビナーゼシステムを導入遺伝子の発現調節に使用する場合、Ｃｒｅリコンビナーゼ及び選択タンパクの両方をコード化する導入遺伝子を含む動物が必要である。このような動物は、”複”形質転換動物の構築を通じて、例えば、２つの形質転換動物、すなわち、一つは選択タンパクをコード化する導入遺伝子を含み、他方はリコンビナーゼをコード化する導入遺伝子を含む２つの形質転換動物を交配することにより、得ることができる。
【０２０９】
ここに記載の非ヒト形質転換動物のクローンは、また、Ｗｉｌｍｕｔ， Ｉ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０−８１３ （１９９７） 並びにＰＣＴ国際公開公報 ＷＯ ９７／０７６６８及びＷＯ ９７／０７６６９に記載の方法により生産することもできる。簡単に説明すれば、細胞、例えば、体細胞は、成長サイクルから脱してＧ０期に入るように、形質転換動物から単離、誘導することができる。
【０２１０】
休止細胞は、その後、例えば電気パルスを使用して、その休止細胞を単離した動物と同種の動物由来の無核卵母細胞に対して、融合することができる。この再構築卵母細胞は、その後、培養して桑実胚又は尾胞に発達し、疑似妊娠雌養育動物に転移する。この雌養育動物の子は、その細胞、例えば体細胞を単離した動物のクローンであろう。
【０２１１】
ここに記載のペプチドを発現する組換え細胞を含む形質転換動物は、ここに記載のアッセイをｉｎ ｖｉｖｏ状況下で行うのに有用である。従って、ｉｎ ｖｉｖｏに存在し、リガンド結合、ＧＰＣＲタンパク活性化、及び信号形質導入に影響する様々な生理的因子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの無細胞分析あるいは細胞系分析からは明らかでないかもしれない。従って、ヒト以外の形質転換動物の提供は、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＧＰＣＲタンパク機能、例えば、リガンド相互作用、ＧＰＣＲタンパク機能とリガンド相互作用に対する特異的変異ＧＰＣＲタンパクの影響、並びにキメラＧＰＣＲタンパクの影響を含む機能の分析に有用である。また、ヌル変異、すなわち、実質的にあるいは完全に一つ以上のＧＰＣＲタンパク機能を除去する変異の影響を評価することもできる。
【０２１２】
上記明細書に記載の全ての出版物及び特許はここに織り込まれるものである。本発明に記載の方法及びシステムの様々な修飾及び変更は本発明の範囲ならびに精神を外れない範囲で当業者に明らかである。本発明は特定の好ましい例に関連して記載しているが、クレームされた本発明はこのような特定の例に不当に限定されないことが理解されるべきである。特に、分子生物学及び関連する分野の当業者に自明な前記本発明の実施態様の様々な修飾は、以下のクレームの範囲内であることを意図する。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、本発明にかかるＧＰＣＲをコード化するｃＤＮＡ分子又は転写配列のヌクレオチド配列を提供する（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）。さらに、ＡＴＧ開始、終止、及び組織分布等の構造及び機能情報を提供し、この分子配列に基づく発明の具体的な用途を容易に決定することができる。図１の実験データは、腎臓及び混合組織（ｍｉｘｅｄ ｔｉｓｓｕｅ）での発現を示している。
【図２】
図２は、本発明にかかるＧＰＣＲの予測アミノ酸配列を提供する（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）。さらに、タンパクファミリー、機能、及び修飾部位等の構造及び機能情報を提供し、この分子配列に基づく発明の具体的な用途を容易に決定することができる。
【図３】
図３は、本発明にかかるＧＰＣＲタンパクをコード化する遺伝子をスパンするゲノム配列を提供する（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）。さらに、イントロン／エキソン構造、プロモーター位置等の構造及び機能情報を提供し、この分子配列に基づく発明の具体的な用途を容易に決定することができる。図３に示されるように、挿入／欠失変異（「ｉｎｄｅｌｓ」）を含むＳＮＰは、２３の異なるヌクレオチド位置で特定された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005503754.tif 000188
2005503754.tif 000189
【国際調査報告】
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