(57)【要約】保護カルボニル基を形成するためのポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)およびアルコールまたはフェノールとの間の反応によって形成されたポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)の誘導体を含むポリマー抗菌性物質を投与することによる胃腸疾患の治療方法。また本発明は、胃腸疾患の治療に使用するための組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
保護カルボニル基を形成するためのポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)および１つ以上の水酸基を含む有機化合物との間の反応によって形成された、ポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)の誘導体を含む有効量のポリマーの動物（ヒトを含む）への胃腸投与を特徴とする、動物における胃腸疾患の治療または予防方法。
【請求項２】
ポリマーが、経口投与される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
動物が、胃腸炎、潰瘍、下痢および胃腸ガンから選ばれる少なくとも１つの胃腸疾患ならびに赤痢促進性不十分な体重獲得に苦しんでいる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
動物が、下痢、胃腸炎および赤痢の少なくとも１つに苦しんでいる請求項１に記載の方法。
【請求項５】
動物が、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、ウシ、ネコ、家禽、カモ、七面鳥およびウズラから選ばれる請求項１に記載の方法。
【請求項６】
動物が、反芻動物から選ばれ、ポリマーが直腸投与される請求項１に記載の方法。
【請求項７】
動物が、家禽およびブタから選ばれる請求項１に記載の方法。
【請求項８】
動物が、不十分に成長したブタである請求項１に記載の方法。
【請求項９】
抗菌的有効量の請求項１のポリマーを離乳後の幼若ブタに経口投与することを特徴とする、ブタ離乳後大腸菌症の治療または予防方法。
【請求項１０】
請求項１の抗菌剤が、0.05〜5000mg/kg/日の用量で投与される請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１の抗菌剤が、0.5〜500mg/kg/日の用量で投与される請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１の抗菌剤が、0.05〜50mg/kg/日の用量で投与される請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
胃腸疾患が、大腸菌群（Coliforms）、サルモネラ菌（Salmonella）、緑膿菌（P.aeruginosa）、ヘリコバクター属（Helicobacter）、腸内細菌（Enterobacteria）、酵母（Yeasts）、原虫（Protozoa）、クロストリジウム属（Clostridia）、赤痢菌（Shigella）およびコクシジウム属（Coccidia）から選ばれる１種以上の微生物に起因する請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
保護カルボニル基を形成するために、ポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)とアルカノール、フェノール、ポリオールおよびその混合物から選ばれる水酸基を含有する有機化合物との反応によって形成されたポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)の誘導体を含む治療量のポリマーの胃腸内投与を特徴とする、ヘリコバクター感染によって引き起こされた胃腸管疾患の治療または予防方法。
【請求項１５】
胃腸疾患が、大腸菌（E.coli）およびβ−溶血性大腸菌の少なくとも１種に起因する請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
家禽に有効量の請求項１の抗菌剤を投与することを特徴とする、家禽における壊死性腸炎の治療または予防方法。
【請求項１７】
抗菌剤に吸着されることによってその膜貫通が減少する、さらなる化学療法剤と組み合わせて抗菌剤が投与される請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
家禽に抗菌的有効量の請求項１の抗菌剤を投与することを特徴とする、家禽におけるコクシジウム症の治療または予防方法。
【請求項１９】
誘導体が、少なくとも１つのヘミアセタールおよびアセタール基から選ばれる多数の保護カルボニル基を含む請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
保護カルボニル基が、アセタールを含む請求項２０に記載の方法。
【請求項２１】
アルコールが、アルカノール、フェノール、ポリオールおよびその混合物から選ばれる請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
アルコールが、少なくとも１つのポリオールから選ばれる請求項２２に記載の方法。
【請求項２３】
ポリオールが、ポリアルキレングリコールを含む請求項２３に記載の方法。
【請求項２４】
ポリオールが、ポリエチレングリコールを含む請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ポリオールが、分子量200〜2000のポリエチレングリコールである請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
保護カルボニル基を形成するためのポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)および１つ以上の水酸基を含む有機化合物との間の反応によって形成された、ポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)の誘導体を含む抗菌組成物を含む、胃腸投与によって投与される、動物における胃腸疾患の治療または予防用抗菌剤。
【請求項２７】
胃腸投与のための担体が、水、制御放出ポリマー、オリーブ油、ピーナッツ油、ごま油、ひまわり油、ラッカセイ油、ココナツ油、液体パラフィン、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、グリセロール、脂肪アルコール、トリグリセリド、ポリビニルアルコール、一部加水分解酢酸ポリビニルおよびその混合物から選ばれる請求項２６に記載の胃腸疾患の治療または予防用抗菌剤。
【請求項２８】
0.1から70重量％の請求項１の抗菌剤を含む飼料添加物または飲料水添加物の形態における請求項２７記載の抗菌組成物。
【請求項２９】
飼料材料または水および抗菌的有効量の請求項１の抗菌剤を含む、動物（ヒトを含む）の飼料または飲料水組成物。
【請求項３０】
抗菌剤が、飼料または水組成物の総量の0.001〜25重量％の量で存在する請求項３０に記載の動物飼料組成物。
【請求項３１】
請求項１の抗菌剤ならびに抗菌剤および化学療法剤から選ばれるさらなる活性作用剤を含む抗菌剤組成物。
【請求項３２】
さらなる抗菌剤が、組成物の重量に基づいて、
（ａ）0.1〜10％の量のフェノール；
（ｂ）0.001〜1％の量のイソチアゾリノン；
（ｃ）0.02〜2％の量のアルキルパラベン；および
（ｄ）0.1〜10％の量の低級アルカノール；
の少なくとも１つを含む請求項３１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胃腸疾患の治療または予防および動物の成長の促進ならびにこのような処置に使用するための抗菌組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗菌剤は、細菌などの微生物を殺す化合物である。抗生物質は、通常、他の微生物から得られる抗菌剤の一部であり、標的微生物における特定のメカニズムを妨害することによって作用する。抗生物質は、１９４０年代および１９５０年代に初めて用いられ、その使用は、その後ずっと増加している。抗生物質耐性の発達が、世界的に、重大で潜在的に生命を脅かす事象になっている。ブドウ球菌の菌株には、ほとんどすべての抗生物質に耐性を示し、病院で発生する致死性の感染症を起こしたものもある。他の薬物耐性微生物として、肺炎を引き起こす肺炎球菌ならびに下痢を引き起こすクリプトスポリジウムおよび大腸菌が挙げられる。
【０００３】
動物飼料における抗生物質の使用が、耐性の発達の促進の原因であると広く考えられており、その結果として、多くの国々がその使用を制限している。このことは、疾患の制御および最適成長速度の獲得に困難さをもたらす、動物農場経営における問題の原因となっている。このことは、ブタおよび家禽の農場経営において特に問題である。たとえば、ブタにおける大腸菌症などの胃腸疾患および家禽におけるコクシジウム症は、壊滅的な影響を与える。
【０００４】
Melroseら(International Patent Publication No. 96/38186)が、胃腸疾患の治療に使用するためのアクロレインポリマーの製造を最初に記載した。
これらのポリマーは、式(Ｉ)：
【化１】
2005521656.tif 000002
で示される繰り返しユニット、または式：
【化２】
2005521656.tif 000003
【化３】
2005521656.tif 000004
［式中、Ｒは水素であり、ｎは１以上の整数である］
で示されるその水和ヘミアセタールもしくはアセタール体を有することがこれまでに記載されている。これに先立って、消毒処理におけるアクロレインポリマーの殺生物特性が、Melroseら（International Application No. WO88/04671）によって記載された。ドイツ特許出願P4404404およびその対応出願EP667358およびAU 11686/95(現在、失効)は、水性水酸化ナトリウム媒体中でアクロレインが重合されるプロセスを開示している。この開示は、得られるポリアクロレインが、40〜50℃にて多価アルコールに可溶性であり、多価アルコール中でポリアクロレインの溶液を形成することを述べている。以下に説明するように、ドイツ出願の譲受人は、続いて、このようなポリマーが問題があり、水性媒体には溶解度が低いことを見出した。
【０００５】
欧州公開公報No. 792895 Werleら(US 6060571に対応)は、アクロレインモノマーと多価アルコールの共重合によって製造されるアクロレイン放出ポリマーに関する。Werleらは、ドイツ出願 No.P4404404に記載されたポリアクロレインが、所望するよりも収量が少なく、ポリマーが水に実質的に不溶であるということにおいて問題があることに気が付く。欧州出願792895は、これらの問題が、アクロレインモノマーと多価アルコールモノマーの共重合によりアクロレイン放出ポリマーを形成することによって克服されることを教示する。提案されるコポリマーの構造は、以下の通りである：
【化４】
2005521656.tif 000005
【０００６】
遊離アクロレインは、抗菌剤として作用するが、眼、肺、組織および皮膚に対して刺激性がある。特に、胃腸処置における一連の適用において、安定性があり、水溶性が高く、使用時の安全性が高い抗菌剤が必要である。抗生物質における耐性発達への圧力を減じることができる胃腸疾患の治療または予防のために有効な抗菌剤がさらに必要である。
本発明の背景の論議は、本発明の状況を説明するために包含される。これは、請求項のいずれかについて、言及された物質のいずれかが、公表されたか、公知であったか、あるいは優先日における技術常識の一部であったという承認とみなされるべきではない。
【発明の要約】
【０００７】
我々は、ポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)ポリマーをアルコールまたはポリオールと反応させてアセタールおよび／またはヘミアセタール誘導体などの保護カルボニル基が形成されると、胃腸疾患の治療または予防におけるポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)ポリマーの活性および安定性が、実質的に増加することを見出した。驚いたことに、我々は、ポリマー中の遊離アクロレイン含量が非常に低いか、または無視できる量であるにもかかわらず、胃腸疾患の治療または予防におけるこれらの誘導体の活性が、実質的に増加することを見出した。水中でのポリマーの溶解度も非常に高い。
【０００８】
本発明は、保護カルボニル基を形成するためのポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)およびアルカノール、フェノール、ポリオールおよびその混合物から選ばれるのが好ましいアルコールなどの１つ以上の水酸基を含む有機化合物の間の反応によって形成された、有効量のポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)誘導体を動物（ヒトを含む）に投与することを含む、動物における胃腸疾患の治療または予防方法を提供する。
【０００９】
別の態様において、本発明は、保護カルボニル基を形成するためのポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)およびアルカノール、フェノール、ポリオールおよびその混合物から選ばれるのが好ましいアルコールなどの１つ以上の水酸基を含む有機化合物の間の反応によって形成された、有効量のポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)誘導体を含む胃腸疾患の治療のための抗菌剤を提供する。
【００１０】
本明細書で用いる用語「ポリオール」は、少なくとも２つの水酸基を有する分子を意味する。
形成された誘導体は、代表的に、ヘミアセタールおよびアセタール誘導体から選ばれる。理論的には解明されていないが、我々は、ポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)とアルコールとの反応が、少なくとも一部のペンデント（pendent）アルデヒド基からヘミアセタールおよび／またはアセタール基を形成することよって、カニッツァロ反応によるアルカリ分解に対してポリマーのカルボニル基が安定化されると考える。アセタール基の形成は、驚いたことに、得られる誘導体の活性を増加させる一方で、遊離アクロレインの放出を有意に減少または排除することが見出されている。
【００１１】
さらに別の態様において、本発明は、胃腸疾患の治療または予防のための医薬の製造用の上記抗菌剤の使用を提供する。
本明細書の詳細な説明および請求の範囲を通して、単語「を含む」および「を含んでいる」といったようなこの単語の変形は、他の添加剤または成分または完全体（integers）を排除することを意図するものではない。
【発明の詳細な記載】
【００１２】
本発明の抗菌剤は、アルコール、好ましくはポリエチレングリコールなどのポリオールの存在下、ポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)を加熱することによって製造することができる。水分は、アルコール中に常に存在し、少なくともいくらかの水分の存在が、ヘミアセタールまたはアセタールが形成される求核反応を補佐することが理解される。
溶液は、一般に４０℃〜１５０℃、好ましくは４０〜１１５℃、最も好ましくは７０〜１１５℃の温度範囲で加熱する。
本発明の抗菌剤は、ポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)ポリマーから製造される。このようなポリマーおよびその製造は、国際公開公報WO 96/38186(PCT/AU96/00328)に記載されており、これは全体を参考文献として本発明に援用される。ポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)ポリマーは、アクロレインの重合によって、好ましくは、水性溶液中、陰イオン性重合に続いての自動酸化によって、製造されるのが好ましい。ポリマーは、式(Ｉ)で示される繰り返しユニットを包含し、水和ヘミアセタールおよびアセタール体の少なくとも１つ（代表的には混合物）を包含する。
【００１３】
アクロレインの重合によって形成された水和ヘミアセタールおよびアセタール体は、アクロレインの種々の炭素−炭素および炭素−酸素重合メカニズムから生じることが知られている。たとえば、代表的に、水和体は、水和ジオール体であり、ヘミアセタールまたはアセタール体は、ジオール体とアルデヒドまたはジオール体との縮合から形成され、テトラヒドロピランまたは融合テトラヒドロピラン体は、ジオール体とアルドール−ミカエル自己縮合体との縮合から形成される。これらの形体の代表的な例を下記式(ａ)〜(ｆ)に示す：
【化５】
2005521656.tif 000006
【化６】
2005521656.tif 000007
［式中、Ｒは水素であり、ｎは１以上の整数である］。式(Ｉ)で示される繰り返しユニットの割合は、代表的には、２０％以下であり、５〜１５％であることが多い。これらのユニットの割合が相対的に低いにもかかわらず、我々は、それらがポリマーの安定性において重大な効果をもつことを見出した。
【００１４】
ポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)は、一般に、アクロレイン以外のモノマーからモノマーユニットのモル基準において１０％以下を包含し、アクロレインホモポリマー（自動酸化前）が最も好ましい。使用する場合、他のモノマーは、アクリル酸およびビニルピロリドンからなる群から選ばれる。２−プロペン酸基は、代表的には、０.１〜５モルのカルボキシル基／ｋｇの量で存在する。ポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)ポリマーは、代表的には、数平均分子量１０００以上、より好ましくは２０００以上である。代表的には、分子量が１００００以下である。
【００１５】
本発明の抗菌剤は、保護カルボニル基を形成するためのアルコールまたはフェノールとの反応によって製造されたポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)の誘導体である。保護カルボニル基は、２−プロペナール基から形成され、アルコールと反応してヘミアセタールおよびアセタール基を形成する。アルコールは、ポリオールが好ましいが、このことは、少なくとも２つの水酸基を含有するのが好ましいことを意味する。Ｃ１〜Ｃ１０などのアルカノールを用いることができる。アルコールがポリオールである場合、反応は、１つ以上のアルコール基の反応によって形成されたアセタールまたはヘミアセタールを作成する。さらに、２つのアルコール基が反応する場合、それらが、ポリマー内の同じカルボニルまたは異なるカルボニル基において反応することが可能である。
【００１６】
上記式(Ｉ)ならびにヘミアセタールおよびアセタール体に関して、本発明は、より少ない式(Ｉ)のユニットを含む誘導体を製造し、１つ以上のＲ基がアルコールからの誘導体であるグループを形成し、あるいは、アルコールがポリオールである場合、２つ以上のＲ基が一緒になって環式アセタール基などの架橋基を形成する。
ポリオールが内部環式基を生じるという傾向は、ポリオールの間隔と立体配置に従属する。好ましいアルコールは、ポリアルキレングリコールであり、より好ましいアルコールは、ポリエチレングリコールである。
ポリアルキレングリコールの分子量は、２００〜２０００であり、より好ましくは２００〜１０００である。
【００１７】
抗菌剤ポリマーの製造中に、５０〜９９重量％の量でポリエチレングリコールなどのアルコールが存在するのが、好ましい。分子間架橋の発生が希釈によって減少するので、アルコールがポリオールである場合、アクロレインポリマーの相対的に希薄な組成物が特に好ましい。
ポリマーの製造中に、６４〜９５重量％の量でポリエチレングリコールが存在するのが、より好ましい。
【００１８】
ポリマーの酸性基が中和されることによってポリマーの抗菌活性が増進されるので、加熱前および／または加熱中にポリマーに塩基またはアルカリを加え、次いで、酸性ｐＨにするのが好ましい。塩基またはアルカリの添加が最初にポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)ポリマーのｐＨを７〜９にするのが好ましい。塩基の添加による最初のｐＨが約８であるのが、さらにより好ましい。塩基が、アルカリ金属水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩またはその混合物であるのが好ましい。
本発明のさらに別の態様において、遊離アクロレインモノマーの放出が阻止されて継続的に放出されなくなり、そのことによって、ポリマーが組織または皮膚刺激の源を提供する可能性が低くなる。
【００１９】
我々は、本発明の抗菌剤が、胃腸疾患のコントロールにおいて、製造源であるポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)と比べて重大に改良された活性をもつことを見出した。本発明の超活性化誘導体は、広範囲の動物（ヒトを含む）および広範囲の微生物感染の治療に用いることができる。
本発明の抗菌剤は、ヒトの胃腸疾患の治療に用いることができるが、他の動物、特にイヌ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、ウシ、ネコ、家禽、カモ、七面鳥およびウズラから選ばれる動物の治療に用いるのが特に好ましい。
本発明の抗菌剤は、経口または直腸投与用に製剤することができる。直腸投与は、反芻動物において特に有用である。反芻動物用の経口製剤は、胃腸間の後部において最適活性を提供するための腸溶性コーティングを用いて製造することもできる。
【００２０】
本発明の抗菌剤は、胃腸潰瘍、下痢および胃腸ガンの治療および予防において特に有用である。本発明の抗菌剤を用いて、動物の体重を転換させるための飼料を改良することによって家畜の体重増加率を改良することができる。
我々は、本発明の抗菌剤が成長促進剤として用いることができること、および、それが現在用いられている抗生物質の代わりに用いることができることを見出した。病原菌における薬物耐性は、ヒトの医薬において大きな臨床的重要性のある問題である。この問題は、家畜、特に家禽およびブタの体重を増加させるための動物飼料に重要な抗生物質を用いることによって悪化する。実際、幾つかの欧州の国々では、動物飼料における慣例の抗生物質の使用が禁止されている。本発明の抗菌剤は、ヒトの治療における慣例の抗生物質の耐用年数を大きく延ばすために動物の治療に用いることができる。
【００２１】
我々は、本発明の抗菌剤が、原生動物、グラム陽性菌およびグラム陰性菌などの広範囲の微生物に対して有効であることを見出した。本発明のポリマーは、種々の立体配置をとる多数の構造を包含し、標的生物体の細胞壁に見出されるタンパク質との適合を見出すことができ、このことは、タンパク質の不活性化および細胞の破壊を促進する。グラム陰性菌のうち、本発明の抗菌剤が、大腸菌または腸内細菌に対して広範囲の活性を提供することにおいて特に有用であることが見出された。本発明のポリマーは、腸毒素産生性大腸菌およびβ−溶血性大腸菌などの大腸菌感染による胃腸疾患の治療において特に有用である。大腸菌症は、養豚産業における破壊的疾患である。この疾患は、一般に、離乳後の小腸におけるβ−溶血性大腸菌の増殖に関連し、若い離乳したての子ブタにおいて高死亡率および罹患率を生じる。感染した離乳したての子ブタは、正常な体重増加が得られない。
【００２２】
コクシジウム症は、動物、特に家禽の原虫症であり、放置しておくと、破壊的な影響を及ぼす。我々は、本発明の抗菌剤が、鳥類、特に家禽のコクシジウム症の治療または予防において用いることができることを見出した。ニワトリでは、代表的なコクシジウム症の臨床的徴候は、無成長、体重の急減、下痢および腸炎（dysentery）である。最も重篤な影響は、原生動物が粘膜に侵入し、上皮損傷、病変および出血を引き起こす腸で起こる。
コクシジウム症を予防しようとしてワクチンが用いられているが、体重減少および食餌効率の低下の傾向などの副作用がある。
本発明の抗菌剤は、コクシジウム症に対する活性をもつことが知られている他の薬物と組み合わせて用いてもよい。このような薬物として、ニトロカルバニリド、キノリン、ピリドン、グアジニン、キノキサリン、トルトラズラル、トルアミド、強化サルファ剤およびカルバニリドを含むイオノフォアが挙げられる。
【００２３】
クロストリディウム属の細菌は、さまざまな動物において重篤な疾患の原因となるグラム陽性菌である。たとえば、壊死性腸炎は、養鶏に影響を及ぼすことが知られている疾患である。クロストリディウム属の細菌は、すべての公知の毒素のうちで最も毒性の強いもののいくつかである外毒素を出す。壊死性腸炎は、１４〜４２日齢のブロイラーに特に発生する。その病気は、顕著な無気力症状、下痢を引き起こし、数時間のうちに死に至らしめる。
慢性胃炎、胃潰瘍および十二指腸潰瘍などの上部胃腸管疾患は、重大なヒトの健康問題である。ヘリコバクターは、潰瘍の発生および胃腸ガン、特に胃の腺ガンの発生の原因であると理解されている。我々は、本発明の抗菌剤が、動物、特にヒトの胃腸管疾患において、ヘリコバクター・ピロリなどのヘリコバクターに対して特に有用であることを見出した。ヘリコバクター・ピロリによる胃感染は、世界中で最も頻繁に起こる感染性疾患の１つである。人口の約５０％がヘリコバクター・ピロリに感染している。発展途上国では、人口の８０％以上が小児期にすでにヘリコバクター・ピロリに感染していると推測されている。
【００２４】
ヘリコバクター・ピロリは、細胞の一方の端にある鞭毛で運動するグラム陰性微好気性らせん状桿菌である。ヘリコバクター・ピロリ感染の標準的治療は、すべてがメトロニダゾールまたはクラリスロマイシンのいずれかを含む、いわゆる３重抗生物質療法である。残念なことに、両方の抗生物質に対して耐性のあるヘリコバクター・ピロリの菌株が出現している。
ヘリコバクター・ピロリは、胃において胃上皮細胞の表面とそれを覆う粘膜ゲル層の間の界面に生存する。ヘリコバクター・ピロリは、十二指腸および食道内の胃上皮の上部にさらに見出すことができる。他の動物種は、それらの胃腸管内に存在する独自のヘリコバクター種をもっており、その特性はヘリコバクター・ピロリと類似している。その胃腸ガンとの関連に加えて、ヘリコバクター・ピロリは、ヒトにおいて胃炎および消化性潰瘍の形成に直接結びついている。
【００２５】
一般にヘリコバクター種、特にヘリコバクター・ピロリは、尿素を加水分解してアンモニアと重炭酸イオンにすることよって、桿菌の周辺のｐＨを上昇させるウレアーゼを分泌することによって胃の過酷な条件下で生存する。この局所的な周囲の状況の変更が、胃酸の殺菌効果から細菌を保護する。胃の保護粘膜層の下の好ましい位置もまた生存の利点であり、その運動性により、この位置を達成するための層を通って潜伏することが可能になる。
胃の内張をしている上皮細胞は、自然には貫通するのは困難である；これは、胃酸および消化液から身体の残りの部分を保護するためのそれらの機能の不可欠な要素である。この貫通困難性はまた、身体の天然の防御が胃壁を通ってヘリコバクター・ピロリ感染部位に到達することも困難にしている。このことは、２つの結果をもたらす；身体は、白血球、Ｔ細胞および他の防御メカニズムを援助するためにより多くの栄養をこの部位に送るが、これに不随して桿菌にも供給される；次いで、防御細胞は最終的に死亡し、スーパーオキシドイオンおよび他の致死性の化学種の積荷を放出し、周囲の上皮細胞に損傷を与える。
【００２６】
この活性が胃炎をもたらし、容易に消化性潰瘍に進行することができるのは明らかである。損傷が継続すると、胃の腺ガンおよび粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）リンパ腫が出現する可能性が非常に増大する。胃の腺ガンは、粘膜において開始し、進行の第１ステージである腸上皮化生は、ヘリコバクター・ピロリ感染それ自体を取り除くための胃の応答である。また、ＵＣＬメディカルスクールで行われた実験は、ＭＡＬＴリンパ腫が、ヘリコバクター・ピロリ特異的Ｔ細胞からの補助が発達することを必要することを示している。ヘリコバクター・ピロリ感染の処置が、ＭＡＬＴリンパ腫の治療において非常に有効であることがわかっている。世界保健機関は、この病原体をグループＩの発ガン物質に分類している。
したがって、本発明はまた、治療量の作用剤（ここで、作用剤は、保護カルボニル基を形成するために、ポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)とアルカノール、フェノール、ポリオールおよびその混合物から選ばれる水酸基を含有する有機化合物との反応によって形成されたポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)の誘導体を含む）の胃腸内投与を含む、ヘリコバクター感染によって引き起こされた胃腸管疾患の治療または予防方法を提供する。本明細書で用いる用語「ポリオール」は、少なくとも２つの水酸基を有する化合物を意味する。形成された誘導体は、代表的には、ヘミアセタールおよびアセタール誘導体から選ばれる。
【００２７】
したがって、本発明方法の使用は、胃腸のガンの治療における外科手術、放射線療法または従来の化学療法の使用の別法を提供する。
さらに本発明は、保護カルボニル基を形成するためのポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)と１つ以上の水酸基を有する有機化合物との間の反応によって形成されるポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)の誘導体を含む治療量の作用剤の胃腸投与を含む、胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、胃悪性リンパ腫または胃ガンなどのヘリコバクター細菌の一種による胃腸感染の治療方法を提供する。
本発明は、一般に、すべてがメトロニダゾールまたはクラリスロマイシンのいずれかを含む、いわゆる３重抗生物質療法を含むヘリコバクター感染の標準的治療の別法を提供する。これらの抗生物質の両方に対して耐性のあるヘリコバクター・ピロリの菌株が出現しており、我々は、本発明方法がこのような抗生物質耐性細菌を効果的に利用することができることを証明している。
【００２８】
保護カルボニル基を形成するためのポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)と１つ以上の水酸基を有する有機化合物との間の反応の生成物である作用剤は、ヘリコバクター感染の治療において、対応する超活性化されていないポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)群と比べて、より有効であることが証明されている。
本発明はさらに、ヘリコバクター感染によって引き起こされる疾患の治療または予防のための医薬の製造におけるポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)の誘導体の使用を提供する。
本発明方法は、胃腸ガンの治療または予防に用いることができる。このガンには、たとえば、食道、胃、腸および結腸のガンが包含される。このようなタイプのガンの一例は、ヒト結腸ガン細胞系ＨＴ−９である。
【００２９】
本発明の抗菌剤は、動物の飼料または水に配合され、これは、常法で行うことができる。好ましい態様において、本発明の抗菌剤は、プレミックスに配合される。プレミックスは、抗菌剤、生理学的に許容しうる担体および必要に応じて飼料を含むのが好ましい。プレミックスは、一般に、相対的に高濃度であり、１種以上の他の担体、ビタミンおよびミネラルサプリメントならびに飼料などの他の物質で希釈して最終的な動物飼料にするのに適している。プレミックスが、0.1〜70重量％、好ましくは0.5〜50重量％の濃度で抗菌剤を含むのが好ましい。最適濃度は、治療が予防的であるかまたは治療的であるかどうか、および本発明の抗菌剤が唯一の有効成分であるかどうか、あるいは他の物質または抗菌剤と併用療法で用いるかどうか、によって異なる。
好ましい態様において、抗菌剤の高濃度組成物は、制御放出製剤である。制御放出製剤は、制御放出システムからの抗菌剤の制御放出を提供するためのポリマー物質を含み、固形飼料物質に添加するための組成物において特に有用である。制御放出製剤の結果として、抗菌剤が主として十二指腸での放出されるように遅延化することができる。制御放出ポリマーは、風味によって組成物の拒絶を最小化することもでき、あるいは直腸座剤として用いることもできる。
【００３０】
本発明の抗菌剤組成物は、ペレット、丸剤などの固体組成物の製剤であってもよい。本発明の抗菌剤を含有するペレットは、以下のステップで製造することができる：
(i)抗菌剤を水性アルカリまたは塩基性溶液に溶解し；
(ii)溶液を酸で中和し；
(iii)中和された溶液にアクリルアミドおよびアクリル酸の不溶性架橋吸着剤ポリマーを加えて、湿った膨潤性ペレットを形成し；次いで、
(iv)必要に応じて、湿った膨潤性ペレットを完全または部分的に乾燥させる。
【００３１】
このように形成された湿った膨潤性ペレットは、湿った状態、部分的に乾燥した状態または完全に乾燥した状態のいずれかで、たとえば動物飼料への添加剤として用いることができる。さらに、このシステムは、胃の酸性環境において、外側のポリマーマトリックスのカルボキシル含有基が対象ポリマーを本質的にマトリックス内に含まれたままにするように設計される。しかし、十二指腸のアルカリ性環境において、マトリックスのカルボキシル基はイオン化されて相互に反発しあうようになり、そのイオン性基間の反発によって促進されて、ペレットは急速に膨潤し、十二指腸を通る飼料の通過速度にほぼ適合しながら、拡散プロセスによって対象ポリマーが放出されるようになる。
【００３２】
本発明において、用語「制御放出システム」は、鼎ontrolled Drug Delivery  Robinson & Lee、1987)において引用されるものと同じ範囲の例を包含する同じ状況において用いられる。当業者で公知の多くの他のｐＨ感受性制御放出システム(Robinson and Lee、1987)は、アクリル酸のポリマーまたはアクリルアミドとアクリル酸のコポリマーで代用することができる。たとえば、可溶性およびアニオン性、または不溶架橋性およびアニオン性のセルロース系システム；あるいは、いずれかの一般的アクリル酸ポリマーおよび／またはその誘導体から誘導された可溶性およびアニオン性、または不溶架橋性およびアニオン性ポリマーなど。このような架橋性および不溶性ポリマーは膨潤し、また、代謝される可能性が少ないので好ましい。
湿ったときにゲルになる、制御放出システムがｐＨ感受性、架橋性、水吸収性ペレットを含むのが好ましい。
また本発明は、本発明の抗菌剤および飼料を含む動物飼料組成物を提供する。抗菌剤は、全飼料組成物の0.0001〜25%、好ましくは0.0001〜5%の量で存在するのが好ましい。
他の好ましい態様において、本発明の抗菌剤を動物の飲用水に加えてもよい。
本発明の抗菌剤を0.05〜5000mg/体重kg/日の量で投与するのが好ましく、0.05〜50mg/体重kg/日がさらに好ましい。
【００３３】
本発明の抗菌剤の投与のための組成物に用いるための適当な不活性担体として、水、オリーブ油、ピーナッツ油、ごま油、ひまわり油、サフラワー油、ラッカセイ油、ココナツ油、液体パラフィン、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、グリセロール、脂肪アルコール、トリグリセリド、ポリビニルアルコール、一部加水分解酢酸ポリビニルおよびその混合物が挙げられる。
経口または直腸投与のための固形物は、医薬的または獣医学的に許容しうる結合剤、甘味料、崩壊剤、希釈剤、香味剤、コーティング剤、保存剤、滑沢剤および／または時間遅延剤を含んでもよい。適当な結合剤として、アカシアゴム、ゼラチン、コーンスターチ、トラガカントゴム、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースまたはポリエチレングリコールが挙げられる。適当な甘味料として、スクロース、ラクトース、グルコースまたはネオヘスペリジンジヒドロカルコンなどのフラボノイドが挙げられる。適当な崩壊剤として、コーンスターチ、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、キサンチンゴム、ベントナイト、アルギニン酸または寒天が挙げられる。適当な希釈剤として、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、デキストロース、カオリン、セルロース、炭酸カルシウム、ケイ酸カルシウムまたはリン酸ジカルシウムが挙げられる。適当な香味剤として、ペパーミント油、冬緑油、サクランボウ、オレンジまたはラズベリー香味剤が挙げられる。適当なコーティング剤として、アクリル酸および／またはメタクリル酸および／またはそれらのエーテル、および／またはそれらのアミドのポリマーまたはコポリマー、ワックス、脂肪アルコール、ゼイン、シェラックまたはグルテンが挙げられる。適当な保存剤として、安息香酸ナトリウム、ビタミンＥ、α−トコフェロール、アスコルビン酸、メチルパラベン、プロピルパラベンまたは重亜硫酸ナトリウムが挙げられる。適当な滑沢剤として、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、オレイン酸ナトリウム、塩化ナトリウムまたはタルクが挙げられる。適当な時間遅延剤として、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルが挙げられる。
【００３４】
経口または直腸投与用懸濁物は、分散剤および／または懸濁剤をさらに含んでもよい。適当な懸濁剤として、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、アルギン酸ナトリウムまたはセチルアルコールが挙げられる。適当な分散剤として、レシチン、ポリオキシエチレンエステル、またはステアリン酸、モノまたはジオレイン酸、ステアリン酸もしくはラウリン酸ポリオキシエチレンソルビトール、またはステアリン酸、モノまたはジオレイン酸、ステアリン酸もしくはラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタンなどの脂肪酸が挙げられる。
抗菌剤の組成物は、一種以上の乳化剤をさらに含んでもよい。適当な乳化剤として、先に例示した分散剤またはアカシアゴムもしくはトラガカントゴムなどの天然ゴムが挙げられる。
本発明方法における投与用組成物は、混合、粉砕、均質化、懸濁、溶解、乳化、分散および必要に応じて主体ポリマーと選択された賦形剤、希釈剤、担体およびアジュバントとの混合といったような組成物の製造のための当業界（獣医学用および医薬組成物業界など）で公知手段によって製造することができる。
【００３５】
経口投与のために、医薬および獣医学用組成物は、錠剤、ロゼンジ、丸剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、凍結乾燥散剤などの散剤、溶液剤、顆粒剤、懸濁液剤、乳化剤、シロップ剤およびチンキ剤の剤形であってもよい。たとえば、被覆粒子、多層錠剤または細粒などの持続放出または遅延放出剤形で製造してもよい。
一般に、空中での固体の酸化によってポリ(２−プロペナール）からポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)が製造されるのが好ましい。最初にポリ(２−プロペナール）ポリマーを主として乾燥状態で８０〜１１０℃で加熱する。ポリマーを最初に約８５℃に加熱するのがより好ましい。アルコール中、ポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)を１〜１４００時間の範囲で加熱するのが好ましく、１〜６０時間がより好ましい。
【００３６】
さらに本発明は、本発明の抗菌剤を含む保存化合物または組成物を提供する。
さらに本発明は、本発明の抗菌剤を含む殺菌および消毒化合物または組成物を提供する。
本発明の別の態様は、上記の抗菌ポリマーおよびさらなる化学療法剤（ここで、さらなる化学療法剤は抗菌剤に吸着される）を含む胃腸疾患の治療用組成物を提供する。
吸着によって、代表的に、さらなる化学療法剤の膜貫通が減少する。この態様で用いるための適当な化学療法剤は、ポリマー抗菌剤と混合したときに膜貫通において有意な減少を示す剤である。少なくとも５０％の率で貫通が阻害されるのが好ましい。
本発明のこの態様で用いるために有用な化学療法剤として、胃腸疾患治療用抗生物質および胃腸ガン治療用抗ガン剤が挙げられる。
ポリマー抗菌剤と組み合わせての化学療法剤の使用によって、化学療法剤の膜貫通が減少し、それによって全身性副作用が減少し、より標的を絞った治療が提供される。多くの場合、臭気も減少される。
【００３７】
抗菌剤ポリマーと組み合わせて用いることができる抗生物質の例として、テトラサイクリン、ペニシリン、アミノグリコシド、サルファ剤、セファロスポリンおよびニトロフランが挙げられる。
抗生物質は、胃腸管の感染症の治療に用いられる従来の抗生物質である。
本発明のポリマー抗菌剤と組み合わせてもちいることができる抗ガン剤の例は、アルキル化剤、抗代謝剤、抗ガン性抗生物質、植物アルカロイド、ホルモンおよび他の抗ガン剤、特に炭素、水素および酸素のみを含む抗ガン剤である。
本発明の組成物は、フェノール（０.１〜１０重量％の量が好ましい）、イソチアゾリノン（０.００１〜１％の量が好ましい）、アルキルパラベン（０.０２〜２％の量が好ましい）および低級アルコール（２０〜９９％の量が好ましい）から選ばれる抗菌剤などの１種以上のさらなる抗菌剤を含んでもよい（ここで、量は、組成物の重量に基づく）。
【００３８】
本発明方法で用いたポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)の誘導体は、ポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)ポリマーの安定性と比べると有意に増強された安定性をもつことが見出された。先行技術には、ポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)の組成物の抗菌活性の減損によって実証されたいくらかの不安定性が記載されているので、我々は、温度を上昇させて（すなわち、４０℃）「エージングの促進」を行った。しかし、非常に驚くべきことに、水溶液中または水性ポリエチレングリコール溶液中で、上昇させた温度、すなわち４０℃にてポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)を加熱すると、抗菌活性が遅延化されるのみならず、ポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)の抗菌活性が増加した；実施例2(a)よび(b)を参照。温度の上昇は、「エージングの促進」、すなわち抗菌活性の減損をもたらすべきであると予測する先行技術を考慮すると、この発見は、全体として矛盾した、予期せぬものである。
【００３９】
本明細書において、ポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)を含む主題ポリマーの新規な立体配置の形成によって抗菌活性の増強を提供する方法を「超活性化」と称し、該ポリペプチドを「超活性化ポリマー」と称する。
先行技術を考慮すると、さらに驚くべきことには、本発明者らは、水性ポリエチレングリコール溶液中での超活性化が、塩基性、次いで酸性条件によって促進されることを見出した。また、超活性化は熱および水分によって促進される。
ポリエチレングリコールまたはポリオールまたはアルカノールが存在してアセタールが形成されることによって、カニッツァロ反応によるアルカリ分解からポリマーのカルボニル基が保護され、安定するので、超活性化が促進されると考えられる。
超活性化のさらなる利点は、組織および皮膚の刺激の原因である混入アクロレインを減少または排除することである。
【００４０】
超活性化が、失効したオーストラリア特許出願AU-A-11686/95(以下、「11686/95」とする)において実証されたようなポリマーの親水性の増加の結果として水性試験媒体において利用可能であるモアポリマーからのみ得られる抗菌活性のどのような増加とも全く異なり、特別なものであることを強調する。本発明者らは、11686/95に記載の方法を正確に繰り返し、次いで、続いて起こる部分溶解性ポリマーの超活性化が、明示的に特別の実質的な抗菌活性を起こすことを見出した。最初に８０−８５℃の間で加熱することから開始する超活性化とは対照的に、超活性化でさえも11686/95のポリマーを完全に溶解性にならしめなかったことに留意すべきである。
逆に、ポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)の溶液の超活性化に達するための最適時間は、温度に左右される。室温におけるエージングでさえ、特にヒドロキシル溶媒および／または塩基の存在、次いで、酸性度で促進される場合に、超活性化に用いることができるが、しかし、これはより長い時間を必要とするので明らかに実用的でないことは、はっきりとしている。
【００４１】
本発明者らは、胃腸治療、水性製品もしくは工程中の保存剤および増強された抗菌活性という利点を有する殺菌剤もしくは消毒剤の有効成分に適した、本明細書に記載のポリマー超活性化を見出した。さらに、本発明者らは、このような殺菌剤または消毒剤の抗菌活性がそのｐＨ、たとえばｐＨ６以上に上昇することによって増加することを見出した。
本発明の一般的特徴は、抗菌活性を増強するために、ヘミアセタール/アセタール形成によるか、または吸着により、本発明の抗菌剤へ疎水性相互作用を示しうる基を結合することである。
幾つかの実施例を参照して本発明を説明するが、それらによって本発明の範囲が制限されるものと解釈するべきではない。
【実施例】
【００４２】
殺生物試験
サンプルを1重量％の水性重炭酸ナトリウムに溶解して、必要な濃度を得る（他に特記しない限り、0.125重量％のポリマー）。19.9gの希釈サンプルを滅菌広口瓶に秤量し、107-108 cfuのシュードモナス・アエルギノサ（緑膿菌）0.1 mLを植菌し、混合する。特定の時間間隔において、1 mLの植菌したサンプルを9 mLのレセーン・ブロスに移し、渦巻き混合する。10個の希釈物のうちシリアル１を取り出す。トリプチカーゼ大豆寒天に注ぐ。37℃にて3日間インキュベートする。
【００４３】
実施例１
本実施例は、固体アクロレインポリマーの空気中での酸化によるポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)の製造方法を記載する。このポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)は、本発明方法に使用するための出発物質の好ましい製造方法である。ヒューム・カップボード内で水(720 mL、周囲温度、約20℃にて)およびアクロレイン(60g ; 新たに蒸留したもの、ヒドロキノンを0.25w/w%まで加える)を開口ビーカーに入れ、激しく機械攪拌する。次いで、0.2 Mの水性水酸化ナトリウム(21.4 mL)を加えて、ｐＨを10.5-11にする。
溶液は急速にヒドロキノンアニオンに特有の黄色に変わり１分以内に色は消失し、透明な溶液は乳濁する。
【００４４】
約１分後、白色綿状ポリマーの沈殿が始まり、15-30分以内に完了するのがわかる。沈殿を濾過し、水(250 mL)で洗浄し、室温にて濾紙上で２日間乾燥し（収量25g）、次いで、ガラスペトリ皿において薄層に広げ、40℃にて8時間加熱する。この加熱は、次の段取りで続ける：50℃／15時間；65℃／4時間；75℃／18時間；84℃／24時間。
たとえば、密閉容器中でアクロレインを段階的に添加し、次いで、より急速に乾燥するといったように、この方法をスケールアップしうることが予想される（比較例１０）。
代表的には、1w/w%の水性炭酸ナトリウム溶液(100 mL)に、15-30分間攪拌しながら2g主題ポリマーを添加することによって、得られるポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)の溶液を製造し、必要に応じて希釈する。このような溶液は、別法として11686/95の実施例５からのポリマーを用いる企てられた溶解とは対照的に、完全に透明である。
【００４５】
実施例２
この実施例は、ポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)からのアセタールの形成を記載する。
(a)5gのポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)を64gのポリエチレングリコール(「PEG」)200に溶解し、31gの0.71 w/w% 炭酸ナトリウム溶液と合わせる。溶液（みかけのｐＨ＝5.8）の一部を室温に保持し、
(b)残りのサンプルを60℃にて12または25日間加熱する。
(a)および(b)からのサンプルを1w/w%の重炭酸ナトリウムで希釈し、0.125w/w%のポリマー濃度で殺生物試験に供する。驚いたことに、第１表に示されるように、「エージングの促進」を行ったサンプルは改善された抗菌活性を示した。
【表１】
2005521656.tif 000008
【００４６】
1gのポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)を200 mLの0.1w/w%のNa2C03に溶解し、一夜静置する。ラウリル硫酸ナトリウムを0.05w/w%の濃度で加え、溶液にHClを加えてpH5.9の酸性にする。溶液を室温と60℃の両方で保管する。希釈液として1w/w% NaHCO3を用いた0.125w/w% ポリマー溶液で殺生物試験を行う。第２表に示されるように、「エージングした」サンプルは、性能の点で驚くべき改善を示す。
【表２】
2005521656.tif 000009
【００４７】
(c)PEG200の代わりにPEG1000を用いる以外は実施例２(a)と同様にして、超活性化ポリマーの5w/w%溶液を製造する。この溶液の一部を濃NaOHで処理して、pH8.1にする。サンプルを60℃に加熱し、殺生物試験に供する。第３表に示されるように、より塩基性の条件に暴露したサンプルは、予期せぬことに、優れた殺生物性能を示した。
【表３】
2005521656.tif 000010
【００４８】
実施例３
本実施例は、ポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)とポリエチレングリコールとの反応によって生成された生成物を調べる。
プロトン(1H)および炭素(13C)NMR分光分析を用いて、ポリマー溶液の透析および濃縮後に残された固体残渣を調べることによって、実施例2(b)のポリマー中のアセタールの存在を決定することができる。透析は、分子量1000以下のすべての物質を除去する。第４表は、プロトン(1H)および炭素(13C)データを提供する。第４表に示されるように、残渣の核磁気共鳴分光分析により、1H核磁気共鳴スペクトルではδ 3.58および3.56、13C核磁気共鳴スペクトルではδ 71.62、69.48および60.25においてピークが示される。これらのピークは、アセタールとしてのポリエチレングリコールユニットの結合を示すものである。
【表４】
2005521656.tif 000011
【００４９】
実施例４
(a)PEG 200のパーセンテージを変える以外は実施例2(a)と同様にして、みかけのpH5.7で一連の、超活性化の程度をもつポリマーの5w/w%溶液を製造する。
サンプルを60℃に加熱し、時間を追って安定性をモニターする。物理的安定性は、沈殿またはゲル化の発生をその低下とみなす。1w/w%炭酸ナトリウム溶液中の濃度0.01w/w%のポリマーにおいて紫外線測定を行う。268 nm : 230 nmにおける吸光度比の減衰を化学的安定性の低下と同義とみなす。結果を第５表に示す。
【表５】
2005521656.tif 000012
物理的および紫外線スペクトルの両方の結果は、安定性におけるPEGの正の効果を実証する：高PEGを含むと物理的および化学的安定性が同大する。
【００５０】
(b)4gのポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)を196gの1w/w%重炭酸ナトリウムに溶解し、希HClでpHを7(A)および5.5(B)に調節することによって、次の溶液AおよびBを製造する。65−70℃にて、50gのポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)をPEG 200(640g)に溶解することによって、溶液Cを製造する。次いで、4gの炭酸ナトリウムの水溶液(306g)を加え、みかけのpHを7にし、次いで、31日間の処置期間の最後にpH5.5にする。
すべての溶液を40℃にて保管する。種々の時間間隔にて、0.125w/w%ポリマーに相当するものを含むサンプルを殺生物試験に供する。結果を第６表に示す。
【表６】
2005521656.tif 000013
【００５１】
実施例５
1gのポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)を乾燥または加湿閉鎖チェンバー内で60℃にて３日間加熱する。乾燥および加湿ポリマーの溶液をそれぞれ0.125w/w%にて調製し（水分含量補正を行う）、殺生物試験による評価に供する。
【表７】
2005521656.tif 000014
ポリマーは、I.R.1700−1730 cm-1においてカルボニルおよび／またはカルボキシル吸収を示した。カルボニル基（たとえば、シッフ試薬など）、およびMw＝約10000 and Mn＝約5000;滴定は、カルボキシル基が約5 mole %であることを示す。これらのパラメーターは、ポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)のものと類似している（しかし、同じではない）。
【００５２】
実施例６
２回繰り返し実験においては、11686/95の実施例５と正確に同様にして、ポリマーのサンプルを調製し、次いで、エタンジオールに溶解する。この物質の半分をさらに80℃で24時間加熱する（この後、水性媒体における溶解度は不完全に残っている）標準的殺生物試験を用いて、サンプルの抗菌活性を比較する。第８表に示されるように、加熱によって処理（すなわち、超活性化）した両方のサンプルは、抗菌活性が明らかに増加した。
【表８】
2005521656.tif 000015
【００５３】
実施例７
50gのポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)を60−70℃にてPEG200(640g)に溶解する。次いで、炭酸ナトリウム(4g)の水(306g)中の水性溶液を加える。サンプルを分割し、室温で静置するか、または80℃にて24時間加熱する。逆相HPLCによって、時間とともに溶液のアクロレイン含量を決定し、結果を第９表に示す。
【表９】
2005521656.tif 000016
【００５４】
実施例８
実施例７と同様にして、ポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)の溶液を製造し、40、60、80、100および115℃にて、種々の時間処理する。サンプルを標準的殺生物試験に付して、殺傷率の増加を確認し、結果を第１０表に示す。
【表１０】
2005521656.tif 000017
超活性化に必要な時間は、温度に反比例するのが認められる。超活性化プロセスから誘導されたすべての溶液は、すべての比率において水性溶媒と完全に混和する。
【００５５】
実施例９
(a)540gのポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)を2304gのPEG200に65℃にて溶解した後、712gの水中の43.2gの炭酸ナトリウムと混合する。次いで、溶液を100℃にして4時間加熱し、36gのラウリル硫酸ナトリウム、7gのECOTERIC（非イオン性界面活性剤）、2gのレモン香料を加える。pH6の製剤を硬水で1:30に希釈し、スタフィロコッカス・アウレウス（黄色ブドウ球菌）（グラム陽性菌、院内感染に関して特に重要である）およびサルモネラ・コレラエスイス（豚コレラ菌）（グラム陰性菌、調理領域における感染に関して特に重要である）に対して、それぞれ農芸化学会公定分析法(1995)991.47、991.48,(塗装面担体試験法)を用いてチャレンジさせる。結果を第１１表に示す。
【表１１】
2005521656.tif 000018
【００５６】
この製剤を高pHに調節すると、殺生物試験によってモニターされるように、抗菌活性が増強される。結果を第12(a)表および第12(b)表に示す。
【表１２】
2005521656.tif 000019
【００５７】
(b)1200gのポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)を7680gのPEG200に60℃にて溶解し、次いで、3024gの水中の96gのNa2CO3を加える。溶液を100℃にて6時間加熱する。
製剤を吸気通風冷却塔の容器に入れ、濃度300ppm(30ppm ポリマー)にする。週に３回、夕刻に投与を行い、接触時間が8-12時間になった後、操作を再開する；操作3-6時間ごとに残留濃度が半減することが予測される。再循環水は、平均して、温度27℃、pH8.5、導電率3000マイクロSである。微生物カウントを決定し、生物分散剤を毎日投与した隣接する同一のタワーと比較する。結果を第１３表に示す。
【表１３】
2005521656.tif 000020
データは、処置プログラムが、微生物カウントをAS/NZ（オーストラリア/ニュージーランド）スタンダード 3666.3(Int):1998のガイドライン内および生物分散剤（通常、非常に暑い夏期の厳しい試験条件には不適切であると考えられる）を含む隣接するタワーにおけるカウント以下に維持したことを示す。
【００５８】
実施例１０
比較例10(a)
本実施例は、本発明方法を用いないアクロレインポリマーの製造方法を説明する。
1.0  0.8w/w%水酸化ナトリウム
9.90kgの脱イオン水を10Lのステンレス漕に入れ、その水に0.08kgの水酸化ナトリウムを加え、溶解するまで攪拌する。
2.0  重合
100.1kgの脱イオン水を200Lのステンレス漕に入れ、その200L漕に0.8w/w%の水酸化ナトリウム溶液を加える。溶液を15〜20℃にて平衡にする。同時に、その200L漕に20kgのアクロレインモノマーおよび残りの0.8w/w%水酸化ナトリウム溶液を、pHが10.5〜11.0に維持され、温度が30℃以上にならないように、1時間にわたって加える。さらに90分間重合を継続する。
3.0  洗浄
重合混合物を濾過／遠心分離し、洗液のpHが7.0未満になるまでポリマーを脱イオン水で洗浄する。およその収量は、8kgである。
4.0  乾燥
ポリマーを風乾し、次いで以下のプログラムを用いてオーブンで加熱する。
ステップ          時間                温度
1              2時間                25℃
2              1時間                40℃
3              1時間                70℃
4              1時間                75℃
5              2時間                85℃
5.0  溶解
400Lの水を500Lの漕に入れ、4kgの炭酸ナトリウムを加え、溶解するまで攪拌する。8kgの乾燥、加熱ポリマーをゆっくりと加え30分間攪拌する。
得られるポリマーは、1w/w%炭酸ナトリウムへのおよその溶解度が、90〜95w/w%であることが見出される。
【００５９】
実施例10(b)
本実施例は、比較例のポリマーが本発明方法によって超活性化されるアクロレインポリマーの製造方法を説明する。
1.0  ベース製造
適当な容器内で、0.4kgの炭酸ナトリウムを30.6kgの水に溶解し、その混合容器に64kgのポリエチレングリコール200を加える。機械的撹拌器にて攪拌を開始し、PEG200を65±3℃に加熱する。そのPEG200に、5kgの実施例10aの乾燥アクロレインポリマーを加え、均質の混合物が得られるまで攪拌する。
注：この段階では、固体は完全には溶解しない。
グリコール混合物に炭酸ナトリウム溶液を、溶液のpHが3.5〜9.0の範囲に維持されるような速さでゆっくりと加える。
溶液を65±3℃にて45分間攪拌する。
注：pHは、7〜9の範囲にあるべきである。温度は65±3℃の範囲にあるべきである。
2.0  超活性化
混合容器にふたをし、100℃にて4時間加熱する。得られるポリマーは、水へのおよその溶解度が99.5〜100w/w%であることが見出される。
【００６０】
実施例１１
本実施例は、実施例10aの乾燥した通常活性化されたポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)ポリマーの抗菌活性および実施例10bの超活性化アセタール誘導体の抗菌活性を調べる。
以下の手順にしたがって、各抗菌剤で処置したニワトリをコントロールグループと比較する。
各試験において、日齢の20羽のコブ（Cob）種のニワトリ（53系）を商業的孵化場から購入する。それらを秤量し、性別を鑑別し、孤立した動物舎の室内にある隣接する檻にランダムに割り当てる。雄ドリと雌ドリの分布は同一である。水と飼料は自由に摂取できる。飼料は、抗コクシジウム剤(125 ppm ジニトルミド)を添加した市販のクランブル(Chick Starter、Milne Feeds: 18%粗タンパク質)である。
ニワトリに、0.1w/w%の実施例10aの通常活性化された抗菌剤水溶液の製剤を、静止型給水器を介して14日間投与する；用量は、30 mg/kg/日である。別の１０羽のニワトリはコントロールグループである。
両グループのニワトリを第0、4、7、11および14日に秤量する。試験の完了時に、すべてのニワトリを安楽死させ、処置ニワトリを検死解剖する。胸腔および腹腔の肉眼的検査を行う。
【００６１】
結果：
【表１４】
2005521656.tif 000021
コントロールグループと比較して、処置グループは、１４日間の期間の終わりに測定可能的に体重が増加する。
試験完了時の検死時、処置グループのニワトリにおいて、肉眼的検査では、毒性の臨床的または病理的徴候は明らかでない。
【表１５】
2005521656.tif 000022
残りのニワトリにおける試験完了時の検死時、両グループのニワトリにおいて、肉眼的検査では、毒性の臨床的または病理的徴候は明らかでない。
【００６２】
結論：
コントロールグループと比べて、処置グループの体重の増加には有意な差異があったp(χ2; P＜0.015)。試験完了時、処置グループはコントロールグループよりも23%重い。
次の実施例において、通常活性化ポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)と比較すると、コントロールと比べたときの超活性化アセタール誘導体の体重獲得における有意な改善は、アセタール誘導体が腸の抗菌活性において有意な改善をもたらすことを実証する。
【００６３】
実施例１２
本実施例は、ブタ離乳後大腸菌症（PWC）のコントロールに対する、現場条件における実施例10bのポリマー抗菌剤を評価する。
方法：
飼料または水中の超活性化抗菌剤、APRALAN（登録商標）(Elanco)の種々の製剤を経口で投与されるか、自己ワクチン接種を受けるか、あるいは無処置の146匹の子ブタ「離乳したての子ブタ」を、PWCに関する問題の長い歴史をもつ大きい市販の豚舎において離乳に関連するストレスにチャレンジさせる。
下痢の発生、体重獲得および死亡率におけるそれらの応答を評価し、第１５表に示す。
【００６４】
【表１６】
2005521656.tif 000023
注：
１．処置の符号化：
ｉ．グループ１＝飼料中の0.1w/w%の超活性化ポリマー抗菌剤
ii．グループ１＝水中の0.02w/w%の超活性化ポリマー抗菌剤
２．試験中にPWCで死亡したグループのパーセンテージ
３．便スコア１または２が記録される場合のグループ内の各ブタの平均日数；便スコアは下痢の強度の尺度である。
４．ブタ毎に観察されたサンプルの数で割った便スコアの総和
５．Ｆ＝フィッシャーの直接確率検定
【００６５】
結論：
この現地試験は、離乳後にβ−溶血性大腸菌にチャレンジされる場合に、商業的養豚場において子ブタで使用するためのポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)のアセタール誘導体（超活性化抗菌剤）の効能を積極的に考慮する以下の点を明らかにした。
１．死亡率
無処置、ワクチン接種またはApralan（登録商標）グループのどれよりも、超活性化ポリマー抗菌剤で処置されたどのグループにおいても死亡率は低い。
２．下痢日数：
無処置、ワクチン接種またはApralan（登録商標）グループのどれよりも、超活性化抗菌剤処置されたどのグループにおいても下痢日数は有意に少ない[F; P＜0.0001]。
３．便スコア
無処置、ワクチン接種またはApralan（登録商標）グループのどれよりも、超活性化抗菌剤処置されたどのグループにおいても平均便スコアは有意に低い[F; P<0.0001]。
【００６６】
実施例１３
本実施例は、本発明抗菌剤と特定の添加剤の使用の効果を調べる。
方法：
チャレンジ培養物の一夜ブロスを調製し、一夜培養物の総生存カウント（TVCを評価する。
滅菌標準生理食塩水(5mL)を用いてサンプルを１対１に連続的に希釈する。EDTAを含むサンプルを試験する場合、希釈液として滅菌硬水(SHW)を用いる。
１部の各一夜培養物を９部の希釈液で希釈する。得られる希釈懸濁液を接種菌液として用いる。
100マイクロＬの希釈一夜培養物を含む各サンプル希釈液を接種する。（１培養物／１試験管）。よく混合する。
37℃にて〜24時間試験管をインキュベートする（A.ニゲラは、28℃にて〜24時間インキュベートする）。
各試験管から1mLを、9mLの回復ブロスに継代培養して、よく混合する(回復ブロス：ポリマー抗菌剤およびEDTAについては、栄養ブロス＋3% Tween 80(NBT); グルタルアルデヒドについては、栄養ブロス＋3% Tween 80＋0.1% アンモニア(NBTA)；およびメチルパラベンについては、レセーン・ブロス(LB))。
サンプルを37℃にてさらに〜48時間インキュベートする（A.ニゲラは、28℃にて〜５日間）。
成長について各試験管を調べる。次いで、すべての試験管を選択的寒天上に継代培養し、37℃にて〜24時間インキュベートする（A.ニゲラは、28℃にて〜５日間）。試験微生物の成長を確認するために選択的寒天上の成長を行う。
培養物を植菌した5mLの希釈液を用いてポジティブコントロールを行い、インキュベートに付し、回収し、確認する。
非植菌の5mLの希釈液を用いてネガティブコントロールを行い、インキュベートに付し、回収し、確認する。
【００６７】
結果：結果を下記表に示す。
【表１７】
2005521656.tif 000024
凡例：
1)        ポリマー抗菌剤 0.025w/w%
2)        ポリマー抗菌剤 0.2w/w%
3)        グルタルアルデヒド 0.025w/w%
4)        ポリマー抗菌剤 0.025w/w%＋グルタルアルデヒド 0.025w/w%
5)        ポリマー抗菌剤 0.2w/w%＋グルタルアルデヒド 0.025w/w%
6)        ポリマー抗菌剤 0.2w/w%
7)        EDTA 0.1w/w%
8)        ポリマー抗菌剤 0.2w/w%＋EDTA 0.1w/w%
9)        ポリマー抗菌剤 0.2w/w%(80w/w% グリセロール中)
10)        メチルパラベン 1w/w%(80w/w% グリセロール中)
11)        ポリマー抗菌剤 0.2w/w%(80w/w% グリセロール中)＋メチルパラベン 1w/w%(80w/w% グリセロール中)。
【００６８】
【表１８】
2005521656.tif 000025
注：相乗効果＜1.0、相加的＝1.0、拮抗的＞1.0
SI＝CD/A＋CE/Bにより算出
A＝MKC ポリマー抗菌剤
B＝MKC 保存剤
C＝MKC 混合物
D＝Bに対するAの比率
E＝Aに対するBの比率
【００６９】
結論：
ポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)のアセタール誘導体が、A.ニゲラ、C.アルビカンス、E.コリ、P.アエルギノサ、S.アウレウスに対して、グルタルアルデヒド、EDTAおよびメチルパラベンそれぞれと相乗効果をもつことが明らかである。
【００７０】
実施例１４
本実施例は、「デットール（Dettol）」ブランドの抗菌剤と組み合わせた本発明抗菌剤の活性を実証する。
滅菌生理食塩水(5mL)を用いてサンプルを１対１に連続的に希釈する。
各サンプル希釈物に100マイクロＬの希釈一夜培養物を植菌する（１試験管に１培養物）。サンプルをよく混合する。試験管を37±2℃にて〜24時間インキュベートする（アスペルギルス・ニゲラを植菌した試験管は、28±2℃にて〜24時間インキュベートする）。
各試験管から、1mLを、9mLの回復ブロスに継代培養して、よく渦巻き混合する（A.ニゲラについては、NBT、またはSabouraud＋3% Tween 80(SABT）。
試験管を37±2℃にて〜48時間インキュベートする（A.ニゲラは、28±2℃℃にてさらに５日間）。
濁度（成長）について回復ブロスを調べ、選択的寒天に画線し、成長を確認する。
【００７１】
【表１９】
2005521656.tif 000026
凡例：
1)        0.1w/w% ポリマー抗菌剤
2)        0.2w/w% ポリマー抗菌剤
3)        「デットール」4.8% w/v(1:20希釈)
4)        0.1w/w% ポリマー抗菌剤＋「デットール」(1:20希釈)
5)        0.2w/w% ポリマー抗菌剤＋「デットール」(1:20希釈)
【００７２】
【表２０】
2005521656.tif 000027
注：SI＞１ならば拮抗的、SI＝１ならば相加的、SI＜１ならば相乗的
SI＝CD/A＋CE/B
A＝MKC ポリマー抗菌剤(ppm)
B＝MKC デットール(ppm)
C＝MKC of ポリマー抗菌剤／「デットール」混合物(ppm)
D＝デットールに対するポリマー抗菌剤の比率
E＝ポリマー抗菌剤に対する「デットール」の比率
注：「デットール」中の活性抗菌剤は、クロロキシレノールである。
【００７３】
結論：
本発明のポリマー抗菌剤が、E.コリ、S.アウレウス、P.アエルギノサ、C.アルビカンスおよびA.ニゲラに対して、「デットール」と相乗効果をもつことが明らかである。これは、「デットール」およびポリマー抗菌剤が、混合溶液として一緒に用いる場合にそれら単独で用いる場合よりも実質的によりよい働きをすることを示す。
【００７４】
実施例１５
ポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)［超活性化］の消毒剤としての品質
抗菌剤であるポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)［超活性化］を消毒剤品質について追跡する。抗菌剤の適用し、外科手術用手袋を着用する前後に、被験者の手の上に存在する多くの細菌を測定しする。ポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)［超活性化］の消毒効果を、通例用いられる外科用消毒剤である４％クロロヘキシジン・サージカル・スクラブ(Western Australia、Perth、Orion Laboratories製)と比較する。
ポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)［超活性化］の3w/w%水溶液は、3時間後の手袋上の細菌集団のベースラインカウントを減少させる。
ポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)［超活性化］2w/w%水溶液＋70%エタノールは、4%クロロヘキシジンと同様に、3時間後の手袋上の細菌集団のベースラインカウントにおける持続性の減少を示す。
外科手術用手袋を着用する前に手に適用された、ポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)［超活性化］の3.2w/w%水溶液＋3.1%ラウリル硫酸ナトリウム、次いで、70%エタノール中のポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)［超活性化］の4w/w%水溶液は、3時間後のベースライン細菌カウントを有意に減少させる。
結果は、ポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)［超活性化］が、外科的無菌状態において細菌数の持続性コントロールのために必要な良好な残留性抗菌活性をもつことを示す。製剤に70%エタノールを包含させると、細菌数の初期の急速な減少が補助される。
【００７５】
実施例１６
pH 7およびpH 4における、参考菌株ヘリコバクター・ピロリNCTC 11637に対する0.125w/w%および0.05w/w%超活性化ポリマーの殺生物活性
超活性化ポリマーのインビトロにおける効力を、最初にヘリコバクター・ピロリ参考菌株であるヘリコバクター・ピロリNCTC 11637に対して確立する。変数として、２つの濃度を選択する；１つは、胃での希釈を模倣する超活性化ポリマーの0.125w/w%という濃度を与える実施例２で製造した超活性化ポリマーの5%溶液の40倍希釈である；他の１つは、超活性化ポリマーの0.05w/w%という濃度を与える100倍希釈である。ベースラインとしてpH7および胃における模倣状態であるpH4という２つのpHを選択する。
【００７６】
H.ピロリNCTC 11637の培養物を、十分な成長が観察されるまで、37±2℃にて選択的寒天プレート上でミクロ好気的に成長させる。プレートから成長物を無菌的に取り外し、滅菌生理食塩水で希釈して、Vitek比色計に表示されるように、10% Tの標準化濁り懸濁液として調製する。19.9gのサンプルを秤量し、100マイクロＬの培養物懸濁液を植菌する。1mLのサンプルを失活/回復ブロス(Nutrient Broth＋3% Tween 80)に迅速に移し、次いで、連続的に希釈する。100マイクロのアリコートを選択的寒天プレートに置き、滅菌使い捨てスプレッダーを用いて広げる。5、10、15および20分の時間間隔で移動ステップを繰り返す。十分な成長が達成されるまで（およそ5〜7日間）、すべてのプレートをミクロ好気的に37±2℃にてインキュベートする。すべてのコロニーをカウントし、時間にわたる集団の下り勾配を決定する。サンプルとして滅菌生理食塩水を用いて試験を繰り返し、大気条件での天然の固体激減率を決定する。
【００７７】
凡例：
培養物1. 超活性化ポリマー、pH 7、0.125w/w%
培養物2. 超活性化ポリマー、pH 7、0.05w/w%。
培養物3. 超活性化ポリマー、pH 4、0.125w/w%。
培養物4. 超活性化ポリマー、pH 4、0.05w/w%。
培養物5. 滅菌生理食塩水、pH 7。
培養物6. 滅菌生理食塩水、pH 4。
【表２１】
2005521656.tif 000028
注：コロニー形成ユニット(cfu)におけるカウント／失活ブロスmL
参考菌株に対する結果（第２０表）は、超活性化ポリマーが、pH 7において0.125w/w%および0.05w/w%の両方の濃度で有効であり、またpH4において0.125w/w%の濃度が有効であることを示す。
【００７８】
実施例１７
実施例１６の分析に続いて、さらなる３つのH.ピロリ菌株をpH7およびpH4にて調べる：クラリスロマイシンおよびメトロニダゾール耐性があるH.ピロリ01/303；シドニーで単離された、可能な動物モデルに興味のある高いコロニー形成能力をもつ臨床菌株であるH.ピロリSS1；およびゲノムが配列決定されており、英国由来の菌株であるH.ピロリATCC 700392。
【表２２】
2005521656.tif 000029
0.125w/w%の超活性化ポリマーでpH7にて処置すると、すべての菌株が速やかに殺され、抗生物質耐性菌株は特に脆弱であり10分以内に死亡する（第２１表）。コントロール菌株は、無処置である。
【００７９】
実施例１８
すべてのH.ピロリ菌株に対する0.125w/w%超活性化ポリマー(pH4)の殺生物活性の試験において、実施例３の方法を繰り返す。
【表２３】
2005521656.tif 000030
胃を模倣しているpH4であって0.125w/w%の超活性化ポリマーの試験の結果、すべての菌株が20分以内に殺される（第２２表）。H.ピロリを殺すための時間枠が胃を通過する時間（40分〜1時間）以下なので、この結果は重要である。これは、胃内でのH.ピロリ感染の処置に一致するpH、濃度および時間枠における活性化ポリマーの有効性を実証する。コントロール菌株は、無処置である。
【００８０】
実施例１９
本実施例は、実施例10bの手順にしたがって製造されたポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)のアセタール誘導体の腸内抗菌活性を実証する。
材料および方法：
16匹の離乳したての子ブタ（日齢：18日±2日および体重：5.5kg±1.0kg）を商業的養豚場から購入する。それらを8匹からなる2つのグループ（性別分布は同じ）にランダムに割り当て、環境的にコントロールされ孤立した動物舎で飼育する。
動物舎において水および飼料は自由に摂取させ、飼料は市販の抗菌剤フリーの離乳食用ペレットである［19％粗タンパク質］。
バルビツール酸ナトリウムを静脈注射して、すべての離乳したての子ブタを安楽死させ、次いで、検死解剖する。検死において使用説明書にしたがってQiagen Dneasy 組織キットを用い、24匹の子ブタの腹部の胃および食道領域由来のDNAを抽出する。3マイクロLの抽出したDNAを用いて、生検組織サンプルにおけるヘリコバクター属の存在を試験する。各サンプルおよび各PCR実行に含まれる７つのコントロールDNAサンプルについてポリメラーゼ鎖反応（PCR）を2回行う。行ったPCRの間に矛盾はない。
【００８１】
結果：
処置の符号化：
グループ1:無処置(ネガティブコントロール)
グループ2:実施例10bにしたがって製造した超活性化ポリマー抗菌剤0.1w/v%; 30 mg/kg/日。
【表２４】
2005521656.tif 000031
グループ1（無処置）では、ヘリコバクター属に対する5つのポジティブなPCR結果(1つ−胃、4つ−食道)があるが、グループ2(0.1w/v% of ポリマー抗菌剤)では、ポジティブなPCRの結果はない。
結論：
0.1w/v%のポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)のアセタール誘導体は、離乳したての子ブタの胃および食道粘膜におけるブタヘリコバクター属の出現を有意に減少させる(χ2: P<0.025)。
【００８２】
実施例２０
比較例20(a)
本実施例は、非超活性化ポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)の製造方法を実証する。
0.8w/w%水酸化ナトリウム
9.90kgの脱イオン水を10Lのステンレス漕に入れ、その水に0.08kgの水酸化ナトリウムを加え、溶解するまで攪拌する。
重合
100.1kgの脱イオン水を200Lのステンレス漕に入れ、その200L漕に0.8w/w%の水酸化ナトリウム溶液を加える。溶液を15〜20℃にて平衡にする。同時に、その200L漕に20kgのアクロレインモノマーおよび残りの0.8w/w%水酸化ナトリウム溶液を、pHが10.5〜11.0に維持され、温度が30℃以上にならないように、1時間にわたって加える。さらに90分間重合を継続する。
洗浄
重合混合物を濾過／遠心分離し、洗液のpHが7.0未満になるまでポリマーを脱イオン水で洗浄する。およその収量は、8kgである。
乾燥
ポリマーを風乾し、次いで以下のプログラムを用いてオーブンで加熱する。
ステップ          時間                温度
1              2時間                25℃
2              1時間                40℃
3              1時間                70℃
4              1時間                75℃
5              2時間                85℃
溶解
400Lの水を500Lの漕に入れ、4kgの炭酸ナトリウムを加え、溶解するまで攪拌する。8kgの乾燥、加熱ポリマーをゆっくりと加え30分間攪拌する。
得られるポリマーは、1w/w%炭酸ナトリウムへのおよその溶解度が、90〜95w/w%であることが見出される。
【００８３】
実施例20(b)
本実施例は、比較例20(ａ)のポリマーが超活性化されるアクロレインポリマーの製造方法を説明する。
ベース製造
適当な容器内で、0.4kgの炭酸ナトリウムを30.6kgの水に溶解し、その混合容器に64kgのポリエチレングリコール200を加える。機械的撹拌器にて攪拌を開始し、PEG200を65±3℃に加熱する。そのPEG200に、5kgの実施例10aの乾燥アクロレインポリマーを加え、均質の混合物が得られるまで攪拌する。
注：この段階では、固体は完全には溶解しない。
グリコール混合物に炭酸ナトリウム溶液を、溶液のpHが3.5〜9.0の範囲に維持されるような速さでゆっくりと加える。
溶液を65±3℃にて45分間攪拌する。
注：pHは、7〜9の範囲にあるべきである。温度は65±3℃の範囲にあるべきである。
超活性化
混合容器にふたをし、100℃にて4時間加熱する。得られる超活性化ポリマーは、すべての比率において水と混和性であることが見出される。
【００８４】
実施例２１
PCT/AU9600328の実施例１４では、マウスモデルにおいて、0.5w/w%炭酸ナトリウム溶液中のポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)ポリマーが、エールリッヒ腹水細胞系に対して抗ガン活性をもつことが実証された。
超活性化ポリマー[実施例20(b)]の抗ガン活性に対するポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)ポリマー[実施例20(a)]の抗ガン活性。ヒト結腸ガン細胞系HT-29において、胃腸ガンのインビトロモデルを行う。ポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)は、濃度5w/w%で用いる。用いた試験では、IC５０を確立できるプロットを得るために、ガン細胞を種々の濃度のポリマーとインキュベートする。
【００８５】
方法論
HT-29細胞（ヒト結腸ガン細胞）を96ウエルの培養プレートに播種(100 マイクロリットルずつ)し、加湿CO２5%、空気95%雰囲気中、37℃にて一夜インキュベートする。ポリマー［比較例20(a)のポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)ポリマーおよび実施例20(b)の超活性化ポリマー］を水に溶解し、次いで、培地にて、４-logレンジにわたる10個の濃度に希釈する。次いで、100 マイクロリットルの各溶液をそれぞれ5つのウエルに入れる。プレートをさらに72時間インキュベートした後、スルホローダミンＢアッセイ(Skehanら,(1990)J. Nat. Cancer Inst. 82: 1107-1112； Monksら,(1991)J. Nat. Cancer Inst. 83: 757-766)を用いて生存細胞を測定する。次いで、4℃にて1時間、10%冷トリクロロ酢酸で細胞を固定し、プレートを蒸留水で濯ぎ、風乾し、次いで、1%酢酸中の0.4%スルホローダミンＢ(Aldrich)(v/v)で30分間染色する。蒸留水で2回、最後に1％酢酸で洗浄することによって、未結合の色素を除去する。次いで、タンパク質結合色素を10mM非緩衝トリスベースに可溶化し、自動プレートリーダーを用いて、550nmにおける吸光度を測定する。各薬物の平均吸光度を無処理のコントロールウエルの吸光度に関するパーセンテージとして表す。
【００８６】
試験結果を第２４表に示す。
比較例20(a)のポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)ポリマーの2回の試験における平均IC50は、0.030%である；割り当てられるポリ(２−プロペナール，２−プロペン酸)ポリマーは100%という値である。これは、0.0015w/w%の活性ポリマーに相当する。
実施例20(b)の超活性化ポリマーの4回の試験における平均IC50は、0.025%である。これは、0.00125w/w%の超活性化活性ポリマーに相当し、超活性化ポリマーが強力な抗ガン活性をもつことが示される。
【表２５】
2005521656.tif 000032
IC５０は、細胞成長を50%阻害するのに必要な濃度である。
最後に、当然のことながら、本明細書に概略した本発明の範囲を逸脱することなく、種々の他の修正および／または変更をなすことができる。
【国際調査報告】
2005521656.tif 000033
2005521656.tif 000034
2005521656.tif 000035