(57)【要約】Ｌ−ＦＭＡＵをＦＴＣと一緒に及び／または交互に且つインターフェロン（例えば、インターフェロンαまたはインターフェロンγ）と一緒に及び／または交互に投与するとヒトにおいてＢ型肝炎ウイルスに対して優れた治療が与えられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
独立して場合により医薬的に許容され得る担体中の、治療有効量のβ−Ｌ−ＦＴＣ、Ｌ−ＦＭＡＵ及びインターフェロンまたはその医薬的に許容され得る塩もしくはプロドラッグを一緒にまたは交互に投与することを含む、Ｂ型肝炎ウイルスに感染しているヒトの治療または予防方法。
【請求項２】
β−Ｌ−ＦＴＣが実質的に純粋な形態にある請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項３】
β−Ｌ−ＦＴＣが少なくとも９０重量％のβ−Ｌ−異性体である請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項４】
β−Ｌ−ＦＴＣが少なくとも９５重量％のβ−Ｌ−異性体である請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項５】
インターフェロンがインターフェロンα、ペグ化インターフェロンα、インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ｂ、ペグ化インターフェロンα−２ａ、ペグ化インターフェロンα−２ｂ、ＲＯＦＥＲＯＮ（登録商標）−Ａ（インターフェロンα−２ａ）、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）（ペグ化インターフェロンα−２ａ）、ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）Ａ（インターフェロンα−２ｂ）、ＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）（ペグ化インターフェロンα−２ｂ）、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターフェロンτ、インターフェロンω、コンセンサスインターフェロン、ＩＮＦＥＲＧＥＮ（インターフェロンアルファコン−１）、ＯＭＮＩＦＥＲＯＮ（天然インターフェロン）、ＲＥＢＩＦ（インターフェロンβ−１ａ）、ω−インターフェロン、経口インターフェロンα、インターフェロンγ−１ｂ、ＳｕｐｅｒＦｅｒｏｎ（天然ヒトマルチサブタイプＩＦＮ−α）及びＨｕＦｅｒｏｎ（ヒトＩＦＮ−β）からなる群から選択される請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項６】
インターフェロンがインターフェロンαである請求の範囲第５項に記載の方法。
【請求項７】
インターフェロンがインターフェロンγである請求の範囲第５項に記載の方法。
【請求項８】
インターフェロンがインターフェロンβである請求の範囲第５項に記載の方法。
【請求項９】
Ｂ型肝炎ウイルスに感染している宿主の治療における、独立して場合により医薬的に許容され得る担体中の、β−Ｌ−ＦＴＣ、Ｌ−ＦＭＡＵ及びインターフェロンまたはその医薬的に許容され得る塩もしくはプロドラッグの組合せの使用。
【請求項１０】
β−Ｌ−ＦＴＣが実質的に純粋な形態にある請求の範囲第９項に記載の使用。
【請求項１１】
β−Ｌ−ＦＴＣが少なくとも９０重量％のβ−Ｌ−異性体である請求の範囲第９項に記載の使用。
【請求項１２】
β−Ｌ−ＦＴＣが少なくとも９５重量％のβ−Ｌ−異性体である請求の範囲第９項に記載の使用。
【請求項１３】
インターフェロンがインターフェロンα、ペグ化インターフェロンα、インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ｂ、ペグ化インターフェロンα−２ａ、ペグ化インターフェロンα−２ｂ、ＲＯＦＥＲＯＮ（登録商標）−Ａ（インターフェロンα−２ａ）、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）（ペグ化インターフェロンα−２ａ）、ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）Ａ（インターフェロンα−２ｂ）、ＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）（ペグ化インターフェロンα−２ｂ）、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターフェロンτ、インターフェロンω、コンセンサスインターフェロン、ＩＮＦＥＲＧＥＮ（インターフェロンアルファコン−１）、ＯＭＮＩＦＥＲＯＮ（天然インターフェロン）、ＲＥＢＩＦ（インターフェロンβ−１ａ）、ω−インターフェロン、経口インターフェロンα、インターフェロンγ−１ｂ、ＳｕｐｅｒＦｅｒｏｎ（天然ヒトマルチサブタイプＩＦＮ−α）及びＨｕＦｅｒｏｎ（ヒトＩＦＮ−β）からなる群から選択される請求の範囲第９項に記載の使用。
【請求項１４】
インターフェロンがインターフェロンαである請求の範囲第１３項に記載の使用。
【請求項１５】
インターフェロンがインターフェロンγである請求の範囲第１３項に記載の使用。
【請求項１６】
インターフェロンがインターフェロンβである請求の範囲第１３項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有効量のＬＭＡＵ、ＦＴＣ及びインターフェロンを投与することを含む宿主におけるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染を治療または予防するための方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
有効なワクチンがあるにもかかわらず、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染により４００万人の慢性キャリアがいる世界的に重要な公衆衛生の問題が残っている。ＨＢＶ感染患者は肝硬変及び肝細胞癌に進行する危険にさらされている（Ｗ．Ｍ．Ｌｅｅ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３３７：１７３３−１７４５（１９９７））。現在、米国だけでも約１２５万人の慢性Ｂ型肝炎キャリアがおり、血液または体液との接触により毎年新たに２０万人が感染していると考えられている。
【０００３】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）はタバコに次ぐヒト癌の原因である。ＨＢＶが癌を誘発するメカニズムは未知であるが、ＨＢＶが直接腫瘍発生を誘発するかまたは感染に関連する慢性炎症、肝硬変または細胞再生を介して間接的に腫瘍発生を誘発すると仮定されている。
【０００４】
ＨＢＶに感染しているヒトの数は流行レベルに達している。宿主が感染に気づいていない２〜６ヶ月の潜伏期間後、ＨＢＶ感染は急性肝炎及び肝損傷を起こすことがあり、その結果腹痛、黄疸及び特定酵素の高血中濃度が生ずる。ＨＢＶは、急速に進行し、しばしば死に至る肝臓の大部分が損傷される病気である劇症肝炎を引き起こす恐れがある。患者は通常急性ウイルス感染から回復する。しかしながら、数人の患者では、高レベルのウイルス抗原が慢性感染を生ずる長期間もしくは不定期期間にわたり血液中に残っている。慢性感染から慢性持続性肝炎に至る可能性がある。慢性的に持続的にＨＢＶに感染している患者は発展途上国で最も一般的である。慢性持続性肝炎は疲労、肝硬変、及び原発生肝癌である肝細胞癌を引き起こし得る。西洋の工業国では、ＨＢＶキャリアまたはその血液サンプルに接触したヒトがＨＢＶ感染の高リスク群に入る。ＨＢＶの疫学は実際後天性免疫不全症候群の疫学と非常に類似しており、実際ＨＢＶ感染はＡＩＤＳまたはＨＩＶ関連感染を有している患者の中でよく起こっている。しかしながら、ＨＢＶはＨＩＶよりもより接触感染性である。
【０００５】
現在まで、慢性ＨＢＶ感染の治療のためにＦＤＡが承認している薬物はインターフェロンα、３ＴＣ（エピビル，ラミブジン）及びアデホビルジピボキシル（ヘプセラ（登録商標），Ｇｉｌｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の３つのみである。
【０００６】
【表１】
2005538084.tif 000002
【０００７】
インターフェロンα
製造形態のインターフェロンがＢ型肝炎を治療するために使用される。この治療はインターフェロンを注射により約４ヶ月間投与することを含む。
【０００８】
すべての患者がインターフェロンに応答せず、ときには再治療が必要である。臨床研究で、Ｂ型肝炎のためにＡ（インターフェロンα−２ｂ，組換え，Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を注射して治療した患者のうち血中にＢ型肝炎ウイルスをずっと有していないものは４５％に過ぎない。また、多くの患者はインターフェロン治療に耐え難く、重篤なインフルエンザ様症状、体重減少及びエネルギーやスタミナの欠乏を感じる。
【０００９】
３ＴＣ
３ＴＣ（エピビル，ラミブジン）としても公知のＢＣＨ−１８９（２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン）の（−）−エナンチオマーは、ＨＩＶ及びＨＢＶの両方に対して活性な抗ウイルス薬である。３ＴＣは、複製のためにＨＩＶ及びＨＢＶが必要とする逆転写酵素の産生を阻止することにより働くヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）と呼ばれる薬物の１種に属する。３ＴＣは元々ＨＩＶの治療用に開発されたが、研究者らにより３ＴＣがＢ型肝炎ウイルスに対しても働くことが発見された。１９９８年１２月に、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）はＢ型肝炎ウイルス感染の治療用にエピビルＨＢＶを承認した。
【００１０】
３ＴＣはＨＢＶ複製を効率的に抑制するが、３ＴＣ治療中のウイルス消失の遅い動態（Ｍ．Ｎｏｗａｋ，Ｓ．Ｂｏｎｈｏｅｆｆｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：４３９８−４４０２（１９９６））及び自然なウイルスゲノム変動性により逆転写酵素（ＲＴ）ドメインに影響を及ぼす変異を有する薬物耐性変異株が出現する（Ｗ．Ｓ．Ｍａｓｏｎ，Ｊ．Ｃｕｌｌｅｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２４５：１８−３２（１９９８）；Ｓ．Ｎａｆａ，Ｓ．Ａｈｍｅｄら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，３２：１０７８−１０８８（２０００）；Ｍ．Ｍｅｌｅｇａｒｉ，Ｐ．Ｐ．Ｓｃａｇｌｉｏｎｉ及びＪ．Ｒ．Ｗａｎｄｓ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２７：６２８−６３３（１９９８）；Ｂ．Ｓｅｉｇｎｅｒｅｓ，Ｃ．Ｐｉｃｈｏｕｄら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１８１：１２２１−１２３３（２０００））。治療を受けた患者の約５０％が３ＴＣによる３年間の治療後ウイルス耐性を示す（Ｎ．Ｗ．Ｌｅｕｎｇ，Ｃ．Ｌ．Ｌａｉら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，３３：１５２７−１５３２（２００１））。ヌクレオシドアナログに対する耐性は、特に触媒部位内のＹＭＤＤモチーフ中のＨＢＶ  ＲＴのアミノ酸配列を変化させるポリメラーゼ遺伝子の核酸配列の置換に関連している。最も一般的なポリメラーゼ変異体はｒｔＬ１８０Ｍ−ｐｌｕｓ−Ｍ２０４Ｖ変化（ＨＢＶ薬物耐性変異体に関する最近の遺伝子型独立命名法に従う）（Ｌ．Ｊ．Ｓｔｕｙｖｅｒ，Ｓ．Ａ．Ｌｏｃａｒｎｉｎｉら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，３３：７５１−７５７（２００１））であり、これは触媒部位（ｒｔＭ２０４Ｖ）の変異を触媒部位変異体に高い複製能力を与えるＲＴ（ｒｔＬ１８０Ｍ）のＢドメイン中の相補的変異を伴っている（Ｍ．Ｉ．Ａｌｌｅｎ，Ｍ．Ｄｅｓｌａｕｒｉｅｒｓら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２７：１６７０−１６７７（１９９８）；Ｋ．Ｃｈａｙａｍａ，Ｙ．Ｓｕｚｕｋｉら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２７：１７１１−１７１６（１９９８）；Ｍ．Ｐ．Ｍｅｌｅｇａｒｉ，Ｐ．Ｓｃａｇｌｉｏｎｉ及びＪ．Ｒ．Ｗａｎｄｓ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２７：６２８−６３３（１９９８）；Ｓ．Ｋ．Ｏｎｏ，Ｎ．Ｋａｔｏら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．，１０７：４４９−４５５（２００１）；Ｂ．Ｓｅｉｇｎｅｒｅｓ，Ｓ．Ａｇｕｅｓｓｅ−Ｇｅｒｍｏｎら，Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．，３４：１１４−１２２（２００１））。
【００１１】
アデホビルジピボキシル（ヘプセラ）
２００２年９月２０日に米国食品医薬品局は慢性Ｂ型肝炎の治療用にアデホビルジピボキシルを承認した。ヘプセラ（商品名）はアデホビルのジエステルプロドラッグであるアデホビルジピボキシルの商品名である。アデホビルは、天然基質デオキシアデノシントリホスフェートと競合し、ウイルスＤＮＡに取り込まれた後ＤＮＡ連鎖を停止させることによりＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＤＮＡポリメラーゼを阻害するアデノシンモノホスフェートの非環式ヌクレオチドアナログである。アデホビルジピボキシルの化学名は９−［２−［ビス［（ピバロイルオキシ）メトキシ］ホスフィニル］メトキシ］−エチル］アデニンである。アデホビルは、細胞キナーゼにより活性代謝物のアデホビルジホスフェートにリン酸化される。例えば、米国特許第５，６４１，７６３号明細書及び同第５，１４２，０５１号明細書（発明の名称：ピリミジン及びプリン塩基のＮ−ホスホニルメトキシアルキル誘導体及びその抗ウイルス活性を有する治療組成物）を参照されたい。
【００１２】
（−）−ＦＴＣ
β−Ｌ−ＦＴＣ（β−２−ヒドロキシメチル−５−（５−フルオロシトシン−１−イル）−１，３−オキサチオラン，エントリヴァ：エントリシタビン）はＨＩＶの治療用に承認されており、現在Ｂ型肝炎感染の治療用にヒトの臨床試験にかけられている。前記化合物はアヒルモデル（Ｓ．Ａｇｕｅｓｓｅ−Ｇｅｒｍｏｎ，Ｓ．Ｈ．Ｌｉｕら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，４２：３６９−３７６（１９９８）；Ｂ．Ｓｅｉｇｎｅｒｅｓ，Ｃ．Ｐｉｃｈｏｕｄら，（２０００））及びウッドチャックにおいてＢ型肝炎ウイルスに対して強い活性を示す。ＨＢＶのウッドチャックモデルでは、ＦＴＣがウイルス複製を抑制するがウイルス浄化を誘導しないことが知見された（Ｊ．Ｍ．Ｃｕｌｌｅｎ，Ｓ．Ｌ．Ｓｍｉｔｈら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，４１：２０７６−２０８２（１９９７）；Ｂ．Ｅ．Ｋｏｒｂａ，Ｒ．Ｆ．Ｓｃｈｉｎａｚｉら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，４４：１７５７−６０（２００４））。
【００１３】
【化１】
2005538084.tif 000003
【００１４】
Ｌ−ＦＭＡＵ
Ｌ−ＦＭＡＵ（クレブジン）は、ＨＢＶ感染のインビトロモデル（酵素アッセイ及び組織培養実験）に基づいて、アヒル（Ｓ．Ａｇｕｅｓｓｅ−Ｇｅｒｍｏｎ，Ｓ．Ｈ．Ｌｉｕら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，４２：３６９−３７６（１９９８）；Ｂ．Ｓｅｉｇｎｅｒｅｓ，Ｃ．Ｐｉｃｈｏｕｄら，（２０００））やウッドチャックのような実験的にＢ型肝炎を感染させた動物モデルにおいてＢ型肝炎ウイルス感染の治療のための別の有望な候補物質である。ウッドチャックモデルでは、Ｌ−ＦＭＡＵは感染肝細胞の数を急速に減少させることが判明した（Ｙ．Ｚｈｕ，Ｔ．Ｙａｍａｍｏｔｏら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５：３１１−２２（２００１））。Ｙｕｎｇ  Ｃｈｉ  Ｃｈｕｎｇ，Ｃｈｕｎｇ  Ｋ．Ｃｈｕらが最初に１９９４年に１−（２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｌ−アラビノフラノシル）−チミン（Ｌ−ＦＭＡＵ）がＢ型肝炎ウイルス及びエプスタイン−バーウイルスに対して優れた活性を発揮することを報告した。米国特許第５，５８７，３６２号明細書、同第５，５６７，６８８号明細書、同第５，５６５，４３８号明細書、同第５，８０８，０４０号明細書及び国際特許出願公開第９５／２０５９５パンフレットを参照されたい。国際特許出願公開第０１／７２２９４号パンフレットは、δ型肝炎感染の治療のために２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｌ−アラビノフラノシルチミン（Ｌ−ＦＭＡＵ）を使用することを開示している。
【００１５】
インターフェロン
インターフェロンは、免疫系を調節し、他の細胞機能を調節するために身体により自然に産生されるタンパク質である。インターフェロンの主なクラスはインターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターフェロンω及びインターフェロンτである。インターフェロンは、インビボで安定性を高めるために修飾され得、この修飾にはペグ化または分子の安定性を高めるための他の手段が含まれる。
【００１６】
インターフェロンのインターフェロンαクラスの例には、インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ｂ、ペグ化インターフェロンα−２ａ、ペグ化インターフェロンα−２ｂ、ＲＯＦＥＲＯＮ（登録商標）−Ａ（インターフェロンα−２ａ，Ｒｏｃｈｅ）、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）（ペグ化インターフェロンα−２ａ，Ｒｏｃｈｅ）、ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）Ａ（インターフェロンα−２ｂ，Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）（ペグ化インターフェロンα−２ｂ，Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、コンセンサスインターフェロン、ＩＮＦＥＲＧＥＮ（インターフェロンアルファコン−１，ＩｎｔｅｒＭｕｎｅ）、ＯＭＮＩＦＥＲＯＮ（天然インターフェロン，Ｖｉｒａｇｅｎ）、ＡＬＢＵＦＥＲＯＮ（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、経口インターフェロンα（Ａｍａｒｉｌｌｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＳｕｐｅｒＦｅｒｏｎ（天然ヒトマルチサブタイプＩＦＮ−α，Ｇｅｎｅｔｒｏｌ，Ｉｎｃ．）が含まれる。
【００１７】
他のタイプのインターフェロンには、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターフェロンτ、インターフェロンω、ＲＥＢＩＦ（インターフェロンβ−１ａ，Ａｒｅｓ−Ｓｅｒｏｎｏ）、ω−インターフェロン（ＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ）、、インターフェロンγ−１ｂ（Ｉｎｔｅｒｍｕｎｅ）及びＨｕＦｅｒｏｎ（ヒトＩＦＮ−β，Ｇｅｎｅｔｒｏｌ，Ｉｎｃ．）が含まれる。
【００１８】
併用療法：
ウイルス複製をうまくコントロールし、ウイルス耐性変異体の出現を遅らすために、併用療法に基づいた抗ウイルス戦術を開発することは重要である（Ｆ．Ｚｏｕｌｉｍ，Ａｎｔｉｖｉｒ．Ｃｈｅｍ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，１２（補遺１）：１３１−１４２（２００１））。併用療法によれば、ヒト免疫不全ウイルスで立証されているように交差耐性変異体の選択が防止される（Ｙ．Ｋ．Ｃｈｏｗ，Ｍ．Ｓ．Ｈｉｒｓｃｈら，Ｎａｔｕｒｅ，３６１：６５０−６５４（１９９３）；Ｓ．Ｓｎｙｄｅｒ，Ｄ．Ｚ．Ｄ’Ａｒｇｅｎｉｏら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，４４：１０５１−１０５８（２０００）；Ｍ．Ｌ．Ｖｉｌｌａｈｅｒｍｏｓａら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６：１３２２３−１３２３１（１９９７））。幾つかの研究は、慢性ヘパドナウイルス感染の治療のためにポリメラーゼ阻害剤の併用の抗ウイルス効果の数個の実験モデルを用いた試験に向けられている（Ｋｏｒｂａら，Ａｎｔｉｖｉｒ．Ｒｅｓ．，４５：１９−３２（２０００）；Ｄ．Ｃｏｌｌｅｄｇｅ，Ｓ．Ｌｏｃａｒｎｉｎｉ及びＴ．Ｓｈａｗ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２６：２１６−２２５（１９９７）；Ｃｏｌｌｅｄｇｅら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，４４：５５１−５６０（２０００））。Ｂ型肝炎感染に対する併用療法の開発は、慢性Ｂ型肝炎感染の罹患率及び致死率を更に下げるために現在必要な戦術の１つである。
【００１９】
Ｓｅｉｇｎｅｒｅｓら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，４７（６）：１８４２−１８５２（２００３）は、Ｂ型肝炎ウイルス感染のアヒルモデルにおいて特定のピリミジン及びブリンヌクレオシドの組合せの効果を評価した。アンドキソビル（ＤＡＰＤ）、エントリシタビン（（−）−ＦＴＣ）及びクレブジン（Ｌ−ＦＭＡＵ）の組合せは高い抗ウイルス効果を有する。
【００２０】
インターフェロンによる治療を含めたＢ型肝炎ウイルスの治療もＬｏｋ及びＭｃＭａｈｏｎ，ＡＡＳＬＤプラクティスガイドライン(Practice Guideline)、ｐ．１２２５−１２４１（２００１）に記載されている。ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）に慢性的に感染したイースタンウッドチャックを１−（２−フルオロ−５−メチル−β−Ｌ−アラビノフラノシル）−ウラシル（Ｌ−ＦＭＡＵ）及びＷＨＶ表面抗原ワクチンの抗ウイルス効果を試験するためのＨＢＶ感染モデルとして使用した。Ｌ−ＦＭＡＵとワクチンの組合せに関連する液性及び細胞免疫は自己限定性ＷＨＶ感染で見られるものに類似していた（Ｍｅｎｎｅら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７６（１１）：５３０５−５３１４（２００２））。
【００２１】
Ｊａｃｑｕａｒｄらは、組換えインターフェロンγのアデノウイルス送達と共にＬ−ＦＭＡＵ及びＦＴＣを用いる慢性Ｂ型肝炎の多剤治療の研究を発表した（Ｊａｃｑｕａｒｄら，「ＧＢＶ感染のウッドチャックモデルにおけるインターフェロンγのアデノウイルス媒介送達とクレブジン及びエントリシタビンの評価及び組合せ(Evaluation and Combination of Clevudine and Emtricitabine with Adenovirus Mediated Delivery of Interferon Gamma in the Woodchuck Model of GBV Infection)」，２００２年１１月２〜５日にボストンで開催されたＡＡＳＬＤ会議で掲載されたポスター；２００２年９月２９日〜１０月３日に開催されたＡｓｉｌｏｍａｒ会議の「Ｂ型肝炎ウイルスの分子生物学(The Molecular Biology of Hepatitis B Virus)」も参照されたい）。この研究から、インターフェロンはＬ−ＦＭＡＵ及びＦＴＣの効果を増強させなかったことが示唆された。しかしながら、この研究はウッドチャックにおけるウッドチャック肝炎ウイルスに限定されており、ヒトにおけるヒトＢ型肝炎には向けられていない。
【００２２】
ジョージア研究財団大学及びエール大学に付与された米国特許第５，８０８，０４０号明細書は、Ｌ−ＦＭＡＵをＦＴＣ、３ＴＣ、カルボビル、アシクロビル、インターフェロン、ＡＺＴ、ＤＤＩ（２’，３’−ジデオキシイノシン）、ＤＤＣ（２’，３’−ジデオキシシチジン）、Ｌ−ＤＤＣ、Ｌ−Ｆ−ＤＤＣ及びＤ４Ｔと一緒に投与し得ることを開示している。
【００２３】
国際特許出願公開第００／２５７９７号パンフレット（国際特許出願第ＵＳ９９／２５６７３号）は、ヒトにおけるＨＢＶ感染及び関連状態を治療するための配合剤及び前記配合剤を用いる方法を開示している。特に、前記組成物は、相乗的に有効量のβ−２−ヒドロキシメチル−５−（５−フルオロシトシン−１−イル）−１，３−オキサチオラン（ＦＴＣ）とペンシクロゾル（２−アミノ−１，９−ジヒドロ−９−［４−ヒドロキシ−３−（ヒドロキシメチル）ブチル］−６Ｈ−プリン−６−オン，“ＰＣＶ”とも言う）、ファムシクロビルまたは９−［２−（ホスホノメトキシ）エチル］アデニン（ＰＭＥＡ，以下Ｂｉｓ−ＰＯＭ−ＰＭＥＡまたはＢＰ−ＰＭＥＡとも呼ばれる）の１つとを含む。或いは、前記組成物は、相乗的に有効量の２’−フルオロ−５−メチル−β−Ｌ−アラビノフラノシルウリジン（Ｌ−ＦＭＡＵ）とペンシクロビル、９−［２−（ホスホノメトキシ）エチル］アデニン（ＰＭＥＡ）またはβ−Ｄ−１，３−ジオキソランヌクレオシド（例えば、ＤＡＰＤ）の１つとを含む。或いは、前記組成物は、相乗的に有効量のβ−Ｄ−１，３−ジオキソランヌクレオシド（例えば、ＤＡＰＤ）及びＰＭＥＡを含む。
【００２４】
国際特許出願公開第９８／２３２８５号パンフレットは、ヒトまたは動物患者に対して治療または予防有効量のペンシクロビル（または、ファミシクロビルのようなその生物前駆体）及びα−インターフェロンを投与することを含む前記患者におけるＢ型肝炎ウイルス感染の治療または予防方法を開示している。
【００２５】
エモリー大学に譲渡されている米国特許第５，９９０，０９３号明細書、国際特許出願公開第９５／０７０８６号パンフレット及び国際特許出願公開第９６／４０１６４号パンフレットは、β−Ｌ−２’，３’−ジデオキシアデノシンを２−ヒドロキシメチル−５−（５−フルオロシトシン−１−イル）−１，３−オキサチオラン、２−ヒドロキシメチル−５−（シトシン−１−イル）−１，３−オキサチオラン、２’−フルオロ−５−ヨードアラビノシルウラシル（ＦＩＡＵ）、２’−フルオロ−５−エチル−アラビノシルウラシル（ＦＥＡＵ）、カルボビルまたはインターフェロンと一緒にまたは交互に投与することを含むＨＢＶの治療方法を開示している。
【００２６】
米国特許第５，７０３，０５８号明細書、同第５，９０５，０７０号明細書、同第６，２３２，３００号明細書及び国際特許出願公開第９６／２２７７８号パンフレットは、ＨＩＶ及びＨＢＶの治療のための（５−カルボキシミドまたは５−フルオロ）−（２’，３’−不飽和または３’−修飾）ピリミジンヌクレオシドを開示している。特に、前記明細書は、（５−カルボキシミドまたは５−フルオロ）−（２’，３’−不飽和または３’−修飾）ピリミジンヌクレオシドを２−ヒドロキシメチル−５−（５−フルオロシトシン−１−イル）−１，３−オキサチオラン、２−ヒドロキシメチル−５−（シトシン−１−イル）−１，３−オキサチオラン、９→４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテン−１−イル−グアニン（カルボビル）、９−（２−ヒドロキシエトキシ）メチル−グアニン（アシクロビル）、インターフェロン、３’−デオキシ−３’−アジドチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ＤＤＩ）、２’，３’−ジデオキシシチジン（ＤＤＣ）、（−）−２’−フルオロ−５−メチル−β−Ｌ−ＡＲＡウリジン（Ｌ−（−）−ＦＭＡＵ）及び２’，３’−ジデヒドロ−２’−３’−ジデオキシチミジン（Ｄ４Ｔ）の１つ以上と一緒に含むＨＩＶまたはＨＢＶ治療のための併用治療を開示している。
【００２７】
Ｂ型肝炎の治療及び併用療法は進歩しつつあるが、宿主におけるヒトＢ型肝炎ウイルス量を最適に実質的に低減または消失させるのに有効な配合剤はまだ知られていない。特定のＢ型肝炎剤及び組合せは追加治療により増強され得るが、追加治療が更なる効果を与えず、患者に対して実際有害なことがあり得ることが知見された。従って、公衆健康の担当者は患者が最適治療を受け得るように有利で有効なＢ型肝炎の併用療法についての情報を必要としている。
【００２８】
Ｂ型肝炎ウイルスが世界的に流行レベルに達しており、感染患者に対して重篤でしばしば悲壮な影響を与えるという事実にてらして、宿主に対して低毒性でウイルスに感染しているヒトを治療するための新しい有効な医薬方法、使用及び組合せを提供することが強く要望されている。
【００２９】
更に、慢性Ｂ型肝炎の治療は、感染肝細胞を浄化するためにヌクレオシドアナログを長期間投与しなければならず、こうすると薬物耐性ウイルス菌株の発生が助長される。薬物耐性変異体の選択により、慢性Ｂ型肝炎に対する新しい治療方法が必要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３０】
従って、本発明の目的は、ＨＩＶ感染しているヒト患者または他の宿主を治療するための方法及び組成物を提供することである。
【００３１】
本発明の別の目的は、ＨＢＶの薬物耐性菌株の感染を治療するための方法及び組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００３２】
Ｌ−ＦＭＡＵをＦＴＣと一緒に及び／または交互に且つインターフェロン（例えば、インターフェロンαまたはインターフェロンγ）と一緒に及び／または交互に投与すると、ヒトにおいてＢ型肝炎ウイルスに対する優れた治療を与える。１つの実施態様では、インターフェロンはタンパク質の形態で通常静脈または動脈に直接投与される。本発明の別の実施態様では、インターフェロンを宿主により発現されるその核酸、遺伝子または遺伝子断片の形態で投与される。本発明のインターフェロン核酸は宿主に対して“裸で”、すなわちベクターなしで送達され得るか、またはベクターを用いて送達され得る。前記ベクターには、アデノウイルスベクターを含めたウイルスベクターが含まれるが、これに限定されない。
【００３３】
好ましい実施態様では、β−Ｌ−ＦＴＣ及びＬ−ＦＭＡＵは反対のβ−Ｄ−エナンチオマーを含まず少なくとも９０％である。より好ましい実施態様では、β−Ｌ−ＦＴＣ及びＬ−ＦＭＡＵは独立して反対のβ−Ｄ−エナンチオマーを含まず少なくとも９５％、９８％または９９％である。
【００３４】
１実施態様では、インターフェロンは場合によりペグ化されているインターフェロンαである。別の実施態様では、インターフェロンαはインターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ｂ、ペグ化インターフェロンα−２ａ、ペグ化インターフェロンα−２ｂ、ＲＯＦＥＲＯＮ（登録商標）−Ａ（インターフェロンα−２ａ，Ｒｏｃｈｅ）、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）（ペグ化インターフェロンα−２ａ，Ｒｏｃｈｅ）、ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）Ａ（インターフェロンα−２ｂ，Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）（ペグ化インターフェロンα−２ｂ，Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、コンセンサスインターフェロン、ＩＮＦＥＲＧＥＮ（インターフェロンアルファコン−１，ＩｎｔｅｒＭｕｎｅ）、ＯＭＮＩＦＥＲＯＮ（天然インターフェロン，Ｖｉｒａｇｅｎ）、ＡＬＢＵＦＥＲＯＮ（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、経口インターフェロンα（Ａｍａｒｉｌｌｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＳｕｐｅｒＦｅｒｏｎ（天然ヒトマルチサブタイプＩＦＮ−α，Ｇｅｎｅｔｒｏｌ，Ｉｎｃ．）を含む群から選択されが、これらに限定されない。別の実施態様では、インターフェロンはインターフェロンγである。更に別の実施態様では、インターフェロンはインターフェロンβ、インターフェロンωまたはインターフェロンτである。別の実施態様では、インターフェロンはＲＥＢＩＦ（インターフェロンβ−１ａ，Ａｒｅｓ−Ｓｅｒｏｎｏ）、ω−インターフェロン（ＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ）、インターフェロンγ−１ｂ（Ｉｎｔｅｒｍｕｎｅ）及びＨｕＦｅｒｏｎ（ヒトＩＦＮ−β，Ｇｅｎｅｔｒｏｌ，Ｉｎｃ．）を含む群から選択されるが、これらに限定されない。
【００３５】
また、場合により医薬的に許容され得る担体または希釈剤中の式：
【００３６】
【化２】
2005538084.tif 000004
（式中、ＲはＨ、アルキル、アリール、アシル、（モノホスフェート、ジホスフェートまたはトリホスフェートを含めた。）ホスフェート、または（リン脂質またはエーテル脂質を含めた。）安定化ホスフェート部分である。）
を有するβ−Ｌ−ヌクレオシド、またはその医薬的に許容され得る塩またはプロドラッグの有効量を、場合により医薬的に許容され得る担体中の式：
【００３７】
【化３】
2005538084.tif 000005
（式中、Ｒ１はＨ、アルキル、アリール、アシル、（モノホスフェート、ジホスフェートまたはトリホスフェートを含めた。）ホスフェート、または（リン脂質またはエーテル脂質を含めた。）安定化ホスフェート部分であり、Ｒ２及びＲ３は独立して水素、アルキルまたはシクロアルキル（例えば、シクロプロピル）である。）
を有するβ−Ｌ−ヌクレオシド、またはその医薬的に許容され得る塩またはプロドラッグと一緒に及び／または交互に且つ免疫調節剤（例えば、ＴＨ１サイトカイン）、特に本明細書に記載されているようなインターフェロンと一緒に及び／または交互に投与することを含む宿主、好ましくは哺乳動物、更に好ましくはヒトにおけるＨＢＶ感染を治療及び／または予防するための組成物及び方法を提供する。
【００３８】
本発明の１実施態様では、インターフェロンはタンパク質の形態で送達される。別の実施態様では、インターフェロンは免疫調節剤タンパク質を発現する核酸、遺伝子または遺伝子断片の形態で送達される。本発明の１つの特定実施態様では、インターフェロンは“裸”の形態またはベクターを用いてその核酸、遺伝子または遺伝子断片の形態で送達される。
【００３９】
通常、交互治療中有効用量の各薬物が逐次投与されるのに対して、併用療法では有効用量の２つ以上の薬物が一緒に投与される。用量は、各薬物の吸収率、体内分布率、代謝率及び排泄率のような要因並びに当業者に公知の他の要因に依存する。用量は緩解しようとする状態の重篤度によっても異なることに留意されたい。更に、特定の患者に対する特定の投与レジメ及びスケジュールは各人の必要性及び組成物を投与するかまたはその投与を監督する医者の専門的判断に従って経時的に調節されなければならない。適当な用量範囲の例は科学文献及びＰｈｙｓｉｃｉａｎｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅに記載されている。本明細書に記載されている他の化合物についての適当な用量の多くの例は公表文献にも記載されているし、公知の手順を用いて同定され得る。これらの用量範囲は所望の結果が得られるように所望通りに調節され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
Ｌ−ＦＭＡＵをＦＴＣと一緒に及び／または交互に且つインターフェロン（例えば、インターフェロンαまたはインターフェロンγ）と一緒に及び／または交互に投与すると、ヒトにおいてＢ型肝炎ウイルスに対して優れた治療が与えられる。１つの実施態様では、インターフェロンはタンパク質の形態で通常は静脈または動脈に直接投与される。本発明の別の実施態様では、インターフェロンは宿主により発現されるその核酸、遺伝子または遺伝子断片の形態で投与される。インターフェロン核酸は当業界で公知の技術を用いて“裸で”またはベクターを介して送達され得る。
【００４１】
好ましい実施態様では、β−Ｌ−ＦＴＣ及びＬ−ＦＭＡＵは反対のβ−Ｄ−エナンチオマーを含まず少なくとも９０％である。より好ましい実施態様では、β−Ｌ−ＦＴＣ及びＬ−ＦＭＡＵは反対のβ−Ｄ−エナンチオマーを含まず少なくとも９５％、９８％または９９％である。
【００４２】
好ましい実施態様では、免疫調節剤はインターフェロンである。１つの実施態様では、インターフェロンはインターフェロンα、場合によりペグ化されているインターフェロンαである。別の実施態様では、インターフェロンαはインターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ｂ、ペグ化インターフェロンα−２ａ、ペグ化インターフェロンα−２ｂ、ＲＯＦＥＲＯＮ（登録商標）−Ａ（インターフェロンα−２ａ，Ｒｏｃｈｅ）、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）（ペグ化インターフェロンα−２ａ，Ｒｏｃｈｅ）、ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）Ａ（インターフェロンα−２ｂ，Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）（ペグ化インターフェロンα−２ｂ，Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、コンセンサスインターフェロン、ＩＮＦＥＲＧＥＮ（インターフェロンアルファコン−１，ＩｎｔｅｒＭｕｎｅ）、ＯＭＮＩＦＥＲＯＮ（天然インターフェロン，Ｖｉｒａｇｅｎ）、ＡＬＢＵＦＥＲＯＮ（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、経口インターフェロンα（Ａｍａｒｉｌｌｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＳｕｐｅｒＦｅｒｏｎ（天然ヒトマルチサブタイプＩＦＮ−α，Ｇｅｎｅｔｒｏｌ，Ｉｎｃ．）を含む群から選択されが、これらに限定されない。別の実施態様では、インターフェロンはインターフェロンγである。更に別の実施態様では、インターフェロンはインターフェロンβ、インターフェロンωまたはインターフェロンτである。別の実施態様では、インターフェロンαはＲＥＢＩＦ（インターフェロンβ−１ａ，Ａｒｅｓ−Ｓｅｒｏｎｏ）、ω−インターフェロン（ＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ）、インターフェロンγ−１ｂ（Ｉｎｔｅｒｍｕｎｅ）及びＨｕＦｅｒｏｎ（ヒトＩＦＮ−β，Ｇｅｎｅｔｒｏｌ，Ｉｎｃ．）を含む群から選択されるが、これらに限定されない。
【００４３】
また、場合により医薬的に許容され得る担体または希釈剤中の式：
【００４４】
【化４】
2005538084.tif 000006
（式中、ＲはＨ、アルキル、アリール、アシル、（モノホスフェート、ジホスフェートまたはトリホスフェートを含めた。）ホスフェート、または（リン脂質またはエーテル脂質を含めた。）安定化ホスフェート部分である。）
を有するβ−Ｌ−ヌクレオシド、またはその医薬的に許容され得る塩またはプロドラッグの有効量を、場合により医薬的に許容され得る担体中の式：
【００４５】
【化５】
2005538084.tif 000007
（式中、Ｒ１はＨ、アルキル、アリール、アシル、（モノホスフェート、ジホスフェートまたはトリホスフェートを含めた。）ホスフェート、または（リン脂質またはエーテル脂質を含めた。）安定化ホスフェート部分であり、Ｒ２及びＲ３は独立して水素、アルキルまたはシクロアルキル（例えば、シクロプロピル）である。）
を有するβ−Ｌ−ヌクレオシド、またはその医薬的に許容され得る塩またはプロドラッグと一緒に及び／または交互に且つ免疫調節剤（例えば、ＴＨ１サイトカイン）、特に本明細書に記載されているようなインターフェロンと一緒に及び／または交互に投与することを含む宿主、好ましくは哺乳動物、更に好ましくはヒトにおけるＨＢＶ感染を治療及び／または予防するための組成物及び方法を提供する。
【００４６】
本発明の１実施態様では、インターフェロンはタンパク質の形態で送達される。別の実施態様では、インターフェロンは前記タンパク質を発現する核酸、遺伝子または遺伝子断片の形態で送達される。本発明の１つの特定実施態様では、インターフェロンはその核酸、遺伝子または遺伝子断片の形態で送達され、その送達はウイルスベクターを介してまたは“裸”の送達により達成される。
【００４７】
通常、交互治療中有効用量の各薬物が逐次投与されるのに対して、併用療法では有効用量の２つ以上の薬物が一緒に投与される。用量は、各薬物の吸収率、体内分布率、代謝率及び排泄率のような要因及び当業者に公知の他の要因に依存する。用量は緩解しようとする状態の重篤度によっても異なることに留意されたい。更に、特定の患者に対する特定の投与レジメ及びスケジュールは各人の必要性及び組成物を投与するかまたはその投与を監督する医者の専門的判断に従って経時的に調節されなければならない。適当な用量範囲の例は科学文献及びＰｈｙｓｉｃｉａｎｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅに記載されている。本明細書に記載されている他の化合物についての適当な用量の多くの例は公表文献にも記載されているし、公知の手順を用いて同定され得る。これらの用量範囲は所望の結果が得られるように所望通りに調節され得る。
【００４８】
Ｉ．定義
本明細書中、用語「アルキル」は、特記しない限り、通常Ｃ１−１０の飽和の直鎖、分枝鎖または環状の第１級、第２級または第３級炭化水素を指し、具体的にはメチル、トリフルオロメチル、ＣＣｌ３、ＣＦＣｌ２、ＣＦ２Ｃｌ、エチル、ＣＨ２ＣＦ３、ＣＦ２ＣＦ３、プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、シクロペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、シクロヘキシル、シクロヘキシルメチル、３−メチルフェニル、２，２−ジメチルブチル及び２，３−ジメチルブチルが含まれる。この用語には置換及び未置換アルキル基が含まれる。アルキル基上の置換基は、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素またはヨウ素）、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、シアノ、スルホン酸、スルフェート、ホスホン酸、ホスフェートまたはホスホネートからなる群から選択される。これらの基は、例えば参照により本明細書に組込まれるＧｒｅｅｎら，「有機合成の保護基(Protective Groups in Organic Synthesis)」，第２版，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９１年）出版に教示されているように当業者に公知のように未保護であっても所要により保護されていてもよい。
【００４９】
本明細書中、用語「低級アルキル」は、特記しない限り、Ｃ１−４の飽和の直鎖、分枝鎖または適当ならば環状（例えば、シクロプロピル）のアルキル基を指し、未置換のものも置換されているものも含まれる。本明細書中に特記しない限り、アルキルが適当な基の場合低級アルキルが好ましい。また、アルキルまたは低級アルキルが適当な基の場合未置換のアルキルまたは低級アルキルが好ましい。
【００５０】
本明細書中、用語「アリール」は、特記しない限り、フェニル、ビフェニルまたはナフチルを指し、フェニルが好ましい。この用語には未置換アリールも置換アリールも含まれる。アリール基はハロゲン（フッ素、塩素、臭素またはヨウ素）、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、シアノ、スルホン酸、スルフェート、ホスホン酸、ホスフェートまたはホスホネートからなる群から選択される１個以上の置換基で置換され得る。これらの置換基は、例えば参照により本明細書に組込まれるＧｒｅｅｎら，「有機合成の保護基(Protective Groups in Organic Synthesis)」，第２版，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９１年）出版に教示されているように当業者に公知のように未保護であっても所要により保護されていてもよい。
【００５１】
本明細書中、用語「アシル」は、エステル基の非カルボニル部分が直鎖、分枝鎖または環状のアルキルまたは低級アルキル、アルコキシアルキル（例えば、メトキシメチル）、アルアルキル（例えば、ベンジル）、アリールオキシアルキル（例えば、フェノキシメチル）、場合によりハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩ）、Ｃ１−４アルキルまたはＣ１−４アルコキシで置換されていてもよいアリール（例えば、フェニル）、スルホネートエステル（例えば、メタンスルホニルのようなアルキルまたはアルアルキルスルホニル）、モノ−，ジ−またはトリホスフェートエステル、トリチルまたはモノメトキシトリチル、置換ベンジル、トリアルキルシリル（例えば、ジメチル−ｔ−ブチメシリル）またはジフェニルメチルシリルから選択されるカルボン酸エステルを指す。エステル中のアリール基は最適にはフェニル基である。用語「低級アシル」は非カルボニル部分が低級アルキルであるアシル基を指す。
【００５２】
用語「実質的に純粋な形態」は、本明細書中当該化合物の１つのエナンチオマーを約９０％以上、または少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上含む化合物を指すために使用される。本明細書において特定立体配置（ＤまたはＬ）のヌクレオシドを指すとき、このヌクレオシドは実質的に純粋な形態で投与されると考えられる。
【００５３】
本明細書中、用語「免疫調節剤」は、免疫応答を直接または間接的に調節するケモカインまたはサイトカインを指す。免疫調節剤の非限定例にはＴＨ１サイトカイン、特にインターフェロン、インターフェロン−α、精製インターフェロン−α、インターフェロン−α２ａ、インターフェロン−α２ｂ、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、コンセンサスインターフェロン、ペグ化インターフェロン、ペグ化インターフェロン−α、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インターロイキン、インターロイキン−２及びインターロイキン−１２が含まれる。好ましい実施態様では、免疫調節剤はインターフェロンであり、インターフェロン−γがより好ましい。
【００５４】
本明細書中、用語「宿主」は、細胞株及び動物を含めたウイルスが複製し得る単細胞または多細胞生物を指し、好ましくはヒトである。また、宿主はその複製または機能が本発明の化合物により改変され得るウイルスゲノムの一部を有し得る。用語「宿主」は具体的には感染細胞、ウイルスゲノムの全部または一部をトランスフェクトした細胞及び動物、特に（チンパンジーを含めた）霊長類及びヒトを指す。本発明の多くの動物用途において、宿主はヒト患者である。しかしながら、ある適応症では動物用途も本発明に含まれる。
【００５５】
ＩＩ．医薬的に許容され得る塩及びプロドラッグ
本明細書に開示されている化合物が安定な非毒性酸または塩基塩を形成するのに十分な塩基性または酸性の場合には、化合物を医薬的に許容され得る塩として投与することが適当な場合がある。医薬的に許容され得る塩の例は生理学的に許容され得るアニオンを形成する酸で形成される有機酸付加塩、例えばトシレート、メタンスルホネート、アセテート、サイトレート、マロネート、タータレート、スクシネート、ベンゾエート、アスコルベート、α−ケトグルタレート及びα−グリセロホスフェートである。硫酸塩、硝酸塩、重炭酸塩及び炭酸塩を含めた適当な無機塩も形成され得る。
【００５６】
医薬的に許容され得る塩は当業界で公知の一般的な手順を用いて、例えば十分に塩基性の化合物（例えば、アミン）を生理学的に許容され得るアニオンを与える適当な酸と反応させることにより製造され得る。カルボン酸のアルカリ金属（例えば、ナトリウム、カリウムまたはリチウム）塩またはアルカリ土類金属（例えば、カルシウム）塩も製造され得る。
【００５７】
「医薬的に許容され得るプロドラッグ」は、宿主において代謝（例えば、加水分解または酸化）されて本発明の化合物を形成する化合物を指す。プロドラッグの典型例には、活性化合物の機能部分上に生物学的に不安定な保護基を有する化合物が含まれる。プロドラッグには、酸化、還元、アミノ化、脱アミノ化、ヒドロキシル化、脱ヒドロキシル化、加水分解、脱加水分解、アルキル化、脱アルキル化、アシル化、脱アシル化、リン酸化、脱リン酸化されて活性化合物を生成し得る化合物が含まれる。医薬的に許容され得る塩には、医薬的に許容され得る無機もしくは有機酸及び無機もしくは有機塩基から誘導されるものが含まれる。適当な塩には、製薬業界で公知の他の酸の中でアルカリ金属（例えば、カリウム及びナトリウム）及びアルカリ土類金属（例えば、カルシウム及びマグネシウム）から誘導されるものが含まれる。本発明の化合物は抗ウイルス活性を有しているか、または抗ウイルス活性を示す化合物に代謝される。
【００５８】
本明細書に記載されているヌクレオシドは、そのヌクレオシドの活性、バイオアベイラビリティー、安定性を向上させ、または特性を改変させるためにヌクレオチドプロドラッグとして投与され得る。多数のヌクレオチドプロドラッグリガンドが公知である。通常、化合物のヒドロキシ基またはヌクレオシドのモノ−，ジ−またはトリホスフェートをアルキル化、アシル化または他の親油性修飾にかけるとヌクレオチドの安定性が向上する。ホスフェート部分上の１つ以上の水素を置換し得る置換基の例はアルキル、アリール、ステロイド、炭水化物（例えば、糖）、１，２−ジアシルグリセロール及びアルコールである。多くはＲ．Ｊｏｎｅｓ及びＮ．Ｂｉｓｃｈｏｆｂｅｒｇｅｒ，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｃｈ，２７：１−１７（１９９５）に記載されている。所望効果を達成するためにこれらを開示されているヌクレオシドと一緒に使用してもよい。
【００５９】
併用及び／または交互治療に使用するための本明細書に記載されている化合物はアシル化プロドラッグとして投与され得る。ここで、用語「アシル」は、エステル基の非カルボニル部分が直鎖、分枝鎖または環状のアルキルまたは低級アルキル、アルコキシアルキル（例えば、メトキシメチル）、アルアルキル（例えば、ベンジル）、アリールオキシアルキル（例えば、フェノキシメチル）、場合によりハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩ）、Ｃ１−４アルキルまたはＣ１−４アルコキシで置換されていてもよいアリール（例えば、フェニル）、スルホネートエステル（例えば、メタンスルホニルのようなアルキルまたはアルアルキルスルホニル）、モノ−，ジ−またはトリホスフェートエステル、トリチルまたはモノメトキシトリチル、置換ベンジル、トリアルキルシリル（例えば、ジメチル−ｔ−ブチメシリル）から選択されるカルボン酸エステルを指す。
【００６０】
活性ヌクレオシドまたは他のヒドロキシ含有化合物は、参照により本明細書に組込まれるＬ．Ｓ．Ｋｕｃｅｒａ，Ｎ．Ｉｙｅｒら，ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏ．Ｖｉｒｕｓｅｓ，６：４９１−５０１；Ｃ．Ｐｉａｎｔａｄｏｓｉ，Ｃ．Ｊ．Ｍａｒａｓｃｏら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３４：１４０８−１４１４；Ｋ．Ｙ．Ｈｏｓｔｅｌｌｅｒ，Ｄ．Ｄ．Ｒｉｃｈｍａｎら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，３６：２０２５−２０２９；Ｋ．Ｙ．Ｈｏｓｔｅｔｌｅｒ，Ｌ．Ｍ．Ｓｔｕｈｍｉｌｌｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：６１１２７に開示されているようにエーテル脂質（及び、特にヌクレオシドに対して５’−エーテル脂質または５’−ホスホエーテル脂質）としても提供され得る。
【００６１】
ヌクレオシド、または他のヒドロキシまたはアミン含有化合物に好ましくはヌクレオシドまたは親油性調製物の５’−ＯＨ位で共有的に取り込まれ得る適当な親油性置換基を開示している米国特許明細書の非限定例には、いずれも参照により本明細書に組込まれる米国特許第５，１４９，７９４号明細書（１９９２年９月２２日；Ｙａｔｖｉｎら）、同第５，１９４，６５４号明細書（１９９３年５月１６日；Ｈｏｓｔｅｔｌｅｒら）、同第５，２２３，２６３号明細書（１９９３年６月２９日；Ｈｏｓｔｅｔｌｅｒら）、同第５，２５６，６４１号明細書（１９９３年１０月２６日；Ｙａｔｖｉｎら）、同第５，４１１，９４７号明細書（１９９５年５月２日；Ｈｏｓｔｅｔｌｅｒら）、同第５，４６３，０９２号明細書（１９９５年１０月３１日；Ｈｏｓｔｅｔｌｅｒら）、同第５，５４３，３８９号明細書（１９９６年８月６日；Ｙａｔｖｉｎら）、同第５，５４３，３９０号明細書（１９９６年８月６日；Ｙａｔｖｉｎら）、同第５，５４３，３９１号明細書（１９９６年８月６日；Ｙａｔｖｉｎら）、同第５，５５４，７２８号明細書（１９９６年９月１０日；Ｂａｓａｖａら）が含まれる。本発明のヌクレオシドまたは親油性調製物に結合し得る親油性置換基を開示している外国特許文献には、国際特許出願公開第８９／０２７３３号パンフレット、同第９０／００５５５号パンフレット、同第９１／１６９２０号パンフレット、同第９１／１８９１４号パンフレット、同第９３／００９１０号パンフレット、同第９４／２６２７３号パンフレット、同第９６／１５１３２号パンフレット、欧州特許出願公開第０３０５２８７号明細書、欧州特許出願第９３９１７０５４．４号明細書及び国際特許出願公開第９１／１９７２１号パンフレットが含まれる。
【００６２】
ヌクレオチドプロドラッグの非限定例は下記文献に記載されている。
【００６３】
【表２】
2005538084.tif 000008
2005538084.tif 000009
2005538084.tif 000010
【００６４】
有用なホスフェートプロドラッグ基の例は、“ＳＡＴＥ”とも呼ばれるＳ−アシル−２−チオエチル基である。
【００６５】
ＩＩＩ．医薬組成物
ＨＢＶによる影響を被っていたりＢ型肝炎ウイルスに曝されている宿主、特にヒトは、患者に対して有効量のＬ−ＦＭＡＵ及びβ−Ｌ−ＦＴＣをそれぞれ独立してまたは一緒に医薬的に許容され得る担体または希釈剤中の本明細書に記載されているインターフェロンを含めた免疫調節剤、例えばＴＨ１サイトカイン、またはその医薬的に許容され得る塩またはエステルと一緒に及び／または交互に投与することにより治療され得る。活性成分は液体または固体形態で適当なルート、例えば経口、非経口、経腸、静脈、皮内、皮下、局所、鼻内、直腸により投与され得る。
【００６６】
活性化合物は、治療対象の患者に重大な有毒作用を生ずることなくインビボでウイルス複製、特にＨＢＶ複製を抑制すべく治療有効量の化合物を患者に送達するのに十分な量で医薬的に許容され得る担体または希釈剤中に配合される。「抑制量」は、例えば本明細書に記載されているようなアッセイにより測定した抑制効果を発揮するのに十分な量の活性成分の量を意味する。
【００６７】
上記したすべての状態に対する本発明の化合物の好ましい１日用量は患者の体重１ｋｇあたり約１〜５０ｍｇ、好ましくは１〜２０ｍｇ、より一般的には０．１〜約１００ｍｇである。医薬的に許容され得る誘導体の有効用量範囲は送達しようとする親ヌクレオシドの重量に基づいて計算され得る。誘導体がそれ自体で活性を発揮するならば、有効用量は誘導体の重量を用いて上記したようにまたは当業界で公知の他の手段により推定し得る。
【００６８】
本発明の化合物を任意の適当な１回量剤形で投与することが便利であり、その剤形には１剤形あたり７〜３０００ｍｇ、好ましくは７０〜１４００ｍｇの活性成分を含むものが含まれるが、これらに限定されない。５０〜１０００ｍｇの経口用量が通常便利である。
【００６９】
理想的には、活性成分の少なくとも１つ、好ましくは活性成分の組合せは、活性化合物のピーク血漿濃度が約０．２〜７０ｍＭ、好ましくは約１．０〜１０ｍＭに達するように投与されなければならない。これは、例えば（場合により食塩液中の）活性成分の０．１〜１０％溶液を静注することにより、または活性成分のボーラスとして投与することにより達成し得る。
【００７０】
薬物組成物中の活性成分の濃度は、薬物の吸収率、分布率、代謝率及び排泄率並びに当業者に公知の他の要因に依存する。用量は緩解しようとする状態の重篤度により異なることに留意されたい。更に、特定の患者に対して特定の投与レジメは各人の必要性及び化合物を投与するかまたはその投与を監督する医者の専門的判断に従って調節されなければならないこと、及び本明細書に記載されている濃度範囲は単なる例示であって、本発明の組成物の範囲または実施を制限する意図はないことを理解されたい。活性成分は一度に投与しても、異なる時間間隔で投与すべく複数のより少ない用量に分割してもよい。
【００７１】
ＦＴＣ及びＬ−ＦＭＡＵの好ましい投与モードは経口である。経口組成物は通常不活性希釈剤または食用担体を含む。この組成物をゼラチンカプセルに封入しても、錠剤に圧縮してもよい。治療用経口投与の目的では、活性化合物を賦形剤と一緒に配合され、錠剤、トローチ剤またはカプセル剤の形態で使用され得る。医薬的に適合し得る結合剤及び／またはアジュバントを組成物の一部として配合してもよい。
【００７２】
錠剤、ピル剤、カプセル剤、トローチ剤等は以下の成分または類似の性質を有する化合物を含有し得る：結合剤、例えば微晶質セルロース、トラガカントガムまたはゼラチン；賦形剤、例えばスターチまたはラクトース；崩壊剤、例えばアルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌまたはコーンスターチ；滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓ；グリダント、例えばコロイド状二酸化ケイ素；甘味剤、例えばスクロースまたはサッカリン；または矯臭剤、例えばペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジフレーバー。１回量剤形がカプセル剤の場合、上記したタイプの材料に加えて脂肪油のような液体担体を含有し得る。加えて、１回量剤形はその剤形の物理的形態を修飾する他の材料、例えば糖、シェラックまたは他の腸溶性物質のコーティングを含有し得る。
【００７３】
本発明の化合物はエリキシル、懸濁液、シロップ、ウェハー、チューイングガム等の１成分として投与され得る。シロップは活性化合物に加えて甘味剤としてスクロース、特定の保存剤、染料、着色剤及び矯臭剤を含有し得る。
【００７４】
本発明の化合物、またはその医薬的に許容され得る誘導体または塩は、以下に詳記する所望作用を害さない他の活性物質または所望作用を補う物質、例えば抗生物質、抗菌剤、消炎剤、プロテアーゼ阻害剤、或いは他のヌクレオシドまたは非ヌクレオシド抗ウイルス剤と混合してもよい。非経口、皮内、皮下または局所投与のために使用される溶液または懸濁液は下記成分を含み得る：無菌希釈剤、例えば注射用水、食塩液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸または硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミンテトラ酢酸；緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩；及び張性調節剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロース。非経口製剤はアンプル、使い捨て注射器、またはガラス製もしくはプラスチック製多人数用バイアルに収容し得る。
【００７５】
静脈内投与する場合の好ましい担体は生理食塩液またはリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）である。
【００７６】
点鼻エアゾールまたは吸入により投与する場合、組成物は製薬業界で公知の技術に従って製造され、ベンジルアルコールまたは他の適当な保存剤、バイオアベイラビリティーを高めるための吸収促進剤、フルオロカーボン及び／または当業界で公知の他の可溶化剤または分散剤を用いて食塩液中溶液として製造され得る。
【００７７】
座薬の形態で直腸投与する場合、組成物は常温で固体であるが直腸腔で液化及び／または溶解して薬物を放出する適当な非刺激性賦形剤、例えばカカオ脂、ポリエチレングリコールの合成グリセリドエステルと薬物を混合することにより製造し得る。
【００７８】
１実施態様では、１つ以上の活性化合物はインプラントやマイクロカブセル化送達システムを含めた徐放性組成物のように身体からの急速消失から化合物を保護する担体と一緒に製造され得る。エチレン−酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリアクチン酸のような生分解性生物適合性ポリマーが使用可能である。前記組成物の製造方法は当業者に自明である。上記材料はＡｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販もされている。
【００７９】
（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染細胞に標的化するリポソームを含めた）リポソーム懸濁液も医薬的に許容され得る担体である。リポソーム懸濁液は、例えば参照により本明細書に組込まれる米国特許第４，５２２，８１１号明細書に記載されているように当業者に公知の方法に従って製造し得る。例えば、リポソーム組成物は適当な脂質（例えば、ステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ステアロイルホスファチジルコリン、アラキドイルホスファチジルコリン及びコレステロール）を無機溶媒中に溶解し、その後容器の表面上の乾燥脂質の薄膜が残るように溶媒を蒸発させることにより製造し得る。その後、活性化合物またはそのモノホスフェート、ジホスフェート及び／またはトリホスフェート誘導体の水溶液を容器に導入する。その後、容器を手で撹拌して、容器の内側から脂質材料を遊離させ、脂質凝集物を分散させるとリポソーム懸濁液が形成される。
【００８０】
本発明の組成物は、本発明の他の化合物を含めた１つ以上の他の抗ウイルス剤、抗−ＨＩＶ剤、抗−ＨＢＶ剤、抗−ＨＣＶ剤、抗ヘルペス剤、インターフェロン、抗ガン剤、抗増殖剤または抗菌剤と一緒に及び／または交互に投与され得る。本発明の特定化合物は、他の化合物の代謝、異化または不活化を抑えることにより本発明の特定物質の生物活性を高めるために有効であり得、よって所期効果のために共投与する。
【００８１】
通常、交互治療では有効用量の各物質を逐次投与するが、併用治療では有効量の２種以上の物質を一緒に投与する。用量は各薬物の吸収率、体内分布率、代謝率及び排泄率のような要因並びに当業者に公知の他の要因に依存する。用量は緩解させようとする状態の重篤度により異なることに留意されたい。更に特定の患者に対して特定の投与レジメ及びスケジュールは各人の必要性及び化合物を投与するかまたはその投与を監督する医者の専門的判断に従って経時的に調節されなければならない。適当な用量範囲の例は、科学文献及びＰｈｙｓｉｃａｌ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ中に見つけることができる。本明細書に記載されている他の化合物についての適当な用量範囲の多くの例は公表文献に記載されており、または公知の手順により同定し得る。
【００８２】
ＩＶ．遺伝子治療
本発明の別の態様は、ＨＢＶを治療すべく免疫調節剤を２つ以上の抗−ＨＢＶ剤と一緒に及び／または交互に異なる作用方法及び／または相乗効果で送達するためにインビボ遺伝子治療方法を使用することである。遺伝子治療方法は、標的組織による発現のために必要なプロモーター及び／または他の遺伝因子に作動的に連結し得る免疫調節剤の発現を高めるための宿主（例えば、動物、特にヒト）への核酸（ＤＮＡ、ＲＡＮ、及びアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ）配列の導入に関する。前記した遺伝子治療並びに送達方法及び技術は当業界で公知である。例えば、国際特許出願公開第９０／１１０９２号パンフレット；同第９８／１１７７９号パンフレット；米国特許第５，６９３，６２２号明細書；同第５，７０５，１５１号明細書；同第５，５８０，８５９号明細書；Ｈ．Ｔａｂａｔａら，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．，３５（３）：４７０−４７９（１９９７）；Ｊ．Ｃｈａｏら，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．，３５（６）：５１７−５２２（１９９７）；Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ，Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．，７（５）；３１４−３１８（１９９７）；Ｂ．Ｓｃｈｗａｒｔｚら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，３（５）：４０５−４１１（１９９６）；Ｙ．Ｔｓｕｒｕｍｉら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９４（１２）：３２８１−３２９０（１９９６）を参照されたい。
【００８３】
遺伝子治療方法に使用されるポリペプチドベクター構築物としては、宿主ゲノムに組み込まれず、複製できる配列を含まない構築物が好ましい。当業者に公知の強プロモーターはＤＮＡを発現させるために使用され得る。
【００８４】
ポリペプチド構築物は、動物細胞に注射可能な材料を送達する任意の方法、例えば組織（心臓、筋肉、皮膚、肺、肝臓、腸等）の間質腔への注射により送達され得る。ポリペプチド構築物は医薬的に許容され得る液体または水性担体の形態を用いて送達され得る。
【００８５】
ポリペプチド構築物は、筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺及び結合組織を含めた動物内の組織の間質腔に送達され得る。組織の間質腔は、細胞間流体、臓器組織の細網線維間のムコ多糖マトリックス、管壁または小室壁の弾性線維、線維組織のコラーゲン繊維、または筋肉細胞を包む結合組織内または骨小腔中の同一マトリックスを含む。また、血行の血漿及びリンパ路のリンパ液により占められている空間である。ポリペプチド構築物は細胞を含む組織に注射することにより便利に送達され得る。好ましくは、ポリペプチド構築物は、分化する持続性の非分裂細胞に送達され、発現されるが、送達及び発現は、全くまたは少ししか分化しない細胞、例えば血液の幹細胞または皮膚線維芽細胞においても達成され得る。
【００８６】
本発明の更なる実施態様では、免疫調製剤を発現するように遺伝子操作した細胞をインビボで患者に投与する。前記細胞は患者またはＭＨＣ適合性ドナーから入手可能であり、その中には線維芽細胞、骨髄細胞、血液細胞（例えば、リンパ球）、脂肪細胞、筋肉細胞、内皮細胞等が含まれるが、これらに限定されない。前記細胞は、免疫調節剤のポリペプチドのコード配列を導入すべく組換えＤＮＡ技術を用いて、または（ウイルスベクター、好ましくは細胞ゲノムに導入遺伝子を組み込むベクターを用いる）トランスダクションまたはトランスフェクション手順によりインビトロで遺伝子操作される。トランスフェクションでは、プラスミド、コスミド、ＹＡＣ、裸ＤＮＡ、エレクトロポレーション、リポソーム等の使用が含まれるが、これらに限定されない。免疫調節剤のコード配列は、免疫調節剤を発現、好ましくは分泌するために強構成または誘導プロモーターの制御下に置かれ得る。免疫調節剤を発現、好ましくは分泌する遺伝子操作した細胞は患者の全身に（すなわち、血行に）または腹腔内に導入し得る。
【００８７】
また、細胞は身体のマトリックスに組み込まれ、移植され得る。例えば、遺伝子操作した内皮細胞はリンパまたは血管グラフトの一部として移植され得る（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎらの米国特許第５，３９９，３４９号明細書、Ｍｕｌｌｉｇａｎ及びＷｉｌｓｏｎの米国特許第５，４６０，９５９号明細書参照）。
【００８８】
投与しようとする細胞が非自己細胞または非−ＭＨＣ適合細胞のときには、導入細胞に対する宿主免疫応答の発生を防止する公知の技術を用いて投与し得る。例えば、細胞は、成分を隣接の細胞外環境と交換しながらも導入細胞が宿主免疫系により認識され得ないカプセル化形態で導入し得る。
【００８９】
免疫調節剤の発現のためにその核酸、遺伝子または遺伝子断片を含む感染性ウイルス粒子が導入され得る真核細胞には、初代細胞、例えば白血球、顆粒球、単球、マクロファージ、リンパ球（Ｔリンパ球やＢリンパ球を含む）、分化全能性幹細胞や腫瘍組織浸潤リンパ球（ＴＩＬ細胞）のような一次有核血液細胞；骨髄細胞；内皮細胞；上皮細胞；ケラチノサイト；幹細胞；肝細胞前駆細胞を含めた肝細胞；繊維芽細胞；間充織細胞；中皮細胞；及び実質細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【００９０】
１実施態様において、細胞は特定部位に標的化され得、これにより細胞は該部位で治療薬として機能する。或いは、細胞は特定部位に標的化されない細胞であってもよく、その細胞は全身治療薬として機能する。
【００９１】
導入細胞は、例えばＨＢＶ治療において患者から取り出し、培養により増殖させた血液細胞のような宿主細胞に本発明に従って免疫調節剤をコードする遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を導入することにより使用され得る。前記細胞は所望遺伝子を含有する感染性ウイルス粒子を導入する前またはその後に増殖され得る。従って、患者に注入時に導入細胞が患者の身体で免疫調節剤を産生するように実施される。
【００９２】
導入細胞が担持する遺伝子または核酸は具体的には免疫調節剤の配列を含むが、細胞の治療効果を直接または間接的に増強する配列をも含み得る。導入細胞が担持する遺伝子は、導入遺伝子が通常持たない治療効果を発揮し得る配列、例えば血友病の治療において有用な凝固因子をコードする遺伝子をも含み得る。前記遺伝子は治療効果を有する１つ以上の産物をコードし得る。適当な遺伝子または核酸の例には、ＴＮＦ、インターロイキン（インターロイキン１〜１４）、インターフェロン（α−、β−、γ−インターフェロン）、Ｔ−細胞受容体タンパク質、及び免疫グロブリンのような抗体の抗原結合ドメインに対すＦｃ受容体をコードするものが含まれる。適当な遺伝子の別の例には、細胞が通常標的化しない身体の部位を標的化し、よって当該部位で細胞の治療特性が使用され得るように細胞を修飾する遺伝子が含まれる。例えば、ＴＩＬ細胞のような血液細胞は、細胞が特定抗原を認識できるようにその細胞にモノクローナル抗体のＦａｂ部分を導入するようにして修飾され得る。
【００９３】
通常“ベクター”として公知の担体を用いて細胞に核酸を送達するが、これは必須ではない。遺伝子治療において使用される最も一般的なタイプのベクターはウイルスである。ウイルスが細胞ＤＮＡに進入する独自の能力を有しているので科学者はウイルスを使用する。遺伝子治療においてベクターとして使用されるウイルスは遺伝的に無能力にされている。これらのウイルスはそれ自体複製できない。多くの遺伝子治療の臨床トライアルは所望遺伝子を送達するためにマウスレテロウイルスを用いている。ベクターとして使用される他のウイルスには、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルス及びヘルペスウイルスが含まれる。
【００９４】
例えば、患者から細胞を採取し、実験室で増殖させる。この細胞を所望遺伝子を有するウイルスに接触させる。ウイルスが細胞に進入し、所望遺伝子が細胞ＤＮＡの一部となる。細胞を実験室で増殖したら患者に戻す。このタイプの遺伝子治療は“体外”を意味するエキソビボと呼ばれる。細胞を患者の体外に置きながら、遺伝子を患者の細胞に移入させる。他の研究では、所望遺伝子を患者の体内の細胞に送達するためにベクターまたはリポソーム（脂肪粒子）を使用する。このタイプの遺伝子治療は、遺伝子を患者の体内の細胞に移入させるのでインビボと呼ばれる。
【００９５】
ウイルスベクターを遺伝子を体内に運ぶために使用するとき、このベクターは所期細胞よりも多く改変する。別の危険は、新しい遺伝子がＤＮＡ中の間違った場所に挿入され、ガンまたは他の損傷が生ずることがあることである。加えて、ＤＮＡを直接注入するかまたはリポソーム送達系を使用するときには、ＤＮＡが生殖細胞に導入されて遺伝的変化を生ずる恐れがあることである。
【００９６】
他の問題は、導入遺伝子が過剰発現して有害となるくらい多くのミッシングタンパク質が産生される恐れがあること；ウイルスベクターが炎症または免疫反応を引き起こす恐れがあること：及びウイルスが患者から他の患者または環境に伝播する恐れがあるという可能性を含む。
【００９７】
当業界には多くのベクターが公知である。任意の公知のベクターが本発明で使用され得る。本発明の好ましい実施態様では、ベクターは特定遺伝子送達のために特定細胞型を標的とし得る。
【００９８】
（アデノウイルスベクター）
免疫調節剤を発現及び／または分泌させるべく細胞及び／または細胞株をトランスフェクトするために任意のアデノウイルスベクターを使用し得る。アデノウイルスは線状二本鎖ＤＮＡゲノムを含む非エンベロープウイルスである。多くはヒトにおいて良性呼吸器感染を生じさせる４０血清型以上のアデノウイルス株があるが、サブ群Ｃ血清型２また５が主にベクターとして使用される。ライフサイクルは通常宿主ゲノムへの組み込みを含まず、むしろ宿主細胞の核においてエピソーム因子として複製するので挿入突然変異の危険はない。野生型アデノウイルスゲノムは約３５ｋｂであり、そのうちの最高３０ｋｂが外来ＤＮＡにより置換され得る（Ｓｍｉｔｈ（１９９５）；Ｖｅｒｍａ及びＳｏｍｉａ（１９９７））。調節機能を有する初期転写単位は４個あり（Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３及びＥ４）、構造タンパク質をコードする後期転写物がある。先祖ベクターは不活化されたＥ１またはＥ３遺伝子を有し、ミッシング遺伝子はヘルパーウイルス、プラスミドによりトランスに供給されるかまたはヘルパー細胞ゲノムに組み込まれる（ヒト胎児腎臓細胞、株２９３，Ｆ．Ｌ．Ｇｒａｈａｍ．Ｊ．Ｓｍｉｌｅｙ，Ｗ．Ｌ．Ｒｕｓｓｅｌ及びＲ．Ｎａｉｒｎ，Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３６：５９−７２（１９９７））。第２世代ベクターは更にＥ２ａ温度感受性変異株（Ｊ．Ｆ．Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ，Ｌ．Ｌｉｔｓｋｙ及びＪ．Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，５：１２１７−１２２９（１９９４））またはＥ４欠失（Ｄ．Ａｒｍｅｎｔａｎｏ．Ｊ．Ｚａｂｎｅｒら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７１：２４０８−２４１６（１９９７））を用いている。最も最近の“ガットレス”ベクターは逆方向末端反復（ＩＴＲ）及び導入遺伝子の周りにパッケージング配列のみを含み、必要なウイルス遺伝子はすべてヘルパーウイルスによりトランスに与えられる（Ｈ．Ｃｈｅｎ，Ｌ．Ｍ．Ｍａｃｋ，Ｒ．Ｋｅｌｌｙら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，９４：１６４５−１６５０（１９９７））。
【００９９】
アデノウイルスベクターは、インビトロ及びインビボで標的細胞に導入する際に非常に効率的であり、高力価（＞１０１１／ｍｌ）で産生され得る。ラット脳においてＥ１欠損ベクターを用いて長期間導入遺伝子発現を示したＢ．Ｊ．Ｇｅｄｄｅｓ，Ｔ．Ｃ．Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｓ．Ｌ．Ｌｉｇｈｔｍａｎ及びＪ．Ｂ．Ｕｎｅｙ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ，３：１４０２−１４０４（１９９７）を除いて、インビボで先祖ベクターからの導入遺伝子発現は一過性である傾向にある（Ｉ．Ｍ．Ｖｅｒｍａ及びＮ．Ｓｏｍｉａ，「遺伝子治療−不安、問題及び展望(Gene therapy- promises, problems and prospects)」，Ｎａｔｕｒｅ，３８９：２３９−２４２（１９９７））。静脈注射後、投与したベクターの９０％が肝臓において非免疫媒介メカニズムにより分解される（Ｓ．Ｗｏｒｇａｌｌ，Ｇ．Ｗｏｌｆｆ，Ｅ．Ｆａｌｃｋ−Ｐｅｄｅｒｓｅｎ及びＲ．Ｇ．Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，８：３７−４４（１９９７））。その後、ウイルス感染細胞を消失させるためにＣＤ８＋ＣＴＬを用い、及びＩＦＮ−αを分泌させるためにＣＤ４−細胞を用いてＭＨＣクラスＩ制限免疫応答が生じ、その結果抗−アデノウイルス抗体が生ずる（Ｙ．Ｙａｎｇ及びＪ．Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５５：２５６４−２５６９（１９９５））。アデノウイルスベクターを改変するとＣＴＬエピトープを除去し得るが、認識されるエピトープは宿主ＮＨＣハプロタイプとは異なる（Ｔ．Ｅ．Ｓｐａｒｅｒ，Ｓ．Ｇ．Ｗｙｎｎ，Ｃｌａｒｋｅｔら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７１：２２７７−２２８４（１９９７）；Ｋ．Ｊｏｏｓｓ，Ｈ．Ｃ．Ｊ．Ｅｒｔｌ及びＪ．Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７２：２９４５−２９５４（１９９８））。上記細胞において破壊されない残りのベクターは不活化プロモーターを有し（Ｄ．Ａｒｍｅｎｔａｎｏ．Ｊ．Ｚａｂｎｅｒら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７１：２４０８−２４１６（１９９７））、持続抗体はベクターのその後の投与を妨げる。
【０１００】
一過性免疫抑制治療を含む免疫応答を避けるためのアプローチにより、導入遺伝子の発現を延長させ、続発性遺伝子導入を達成することに成功している（Ｋ．Ｊｏｏｓｓ，Ｙ．Ｙａｎｇ及びＪ．Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，７：１５５５−１５６６（１９９６）；Ｍ．Ａ．Ｋａｔ，Ｌ．Ｍｅｕｓｅら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，９４：４６８６−４６９１（１９９７））。低介入的方法は、宿主にＵＶ不活化ベクターを与えることにより経口耐性を誘発させた（Ｈ．Ｋａｇａｍｉ，Ｊ．Ｃ．Ａｔｋｉｎｓｏｎら，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，９：３０５−３１３（１９９８））。しかしながら、宿主よりもベクターを操作することが望ましい。複製欠乏ベクターのみが使用されるが、ウイルスタンパク質は非常に低レベルでしか発現せず、免疫系に提示される。最終的にウイルスコード配列を含まない“ガットレス”ベクターとなる幾つかの遺伝子しか含まないベクターの開発により、肝臓組織での長期間インビボ導入遺伝子発現が生じた（Ｇ．Ｓｃｈｉｅｄｎｅ，Ｎ．Ｍｏｒｒａｌら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１８：１８０−１８３（１９９８））。大部分が分解され、免疫系に提示されるであろうアデノウイルスタンパク質内にパッケージされた大量のＤＮＡを初期送達させることが臨床トライアルのため問題となる。更に、ヒト集団はＭＨＣハプロタイプに関して不均質であり、その集団の一部はすでにアデノウイルス株に曝されている（Ｈ．Ｇａｈｒｙ−Ｓｄａｒｄ，Ｖ．Ｍｏｌｉｎｉｅｒ−Ｆｅｒｎｋｅｌら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１００：２２１８−２２２６（１９９７））。
【０１０１】
最近まで、アデノウイルスが宿主細胞を標的とするメカニズムは十分に解明されていなかった。従って、組織特異的発現が細胞プロモーター／エンハンサー、例えばミオシン軽鎖１プロモーター（Ｑ．Ｓｈｉ，Ｙ．Ｗａｎｇ及びＲ．Ｗｏｒｔｏｎ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，８：４０３−４１０（１９９７））及び平滑筋細胞ＳＭ２２ａプロモーター（Ｓ．Ｋｉｍ，Ｈ．Ｌｉｎら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１００：１００６−１０１４（１９９７））を使用することにより、または局所域に直接送達する（Ｊ．Ｊ．Ｒｏｍｅ，Ｖ．Ｓｈａｙａｎｉら，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，５：１２４９−１２５８（１９９４））ことによってのみ可能であった。アデノウイルス粒子の摂取は、ＭＨＣクラスＩ分子（Ｓ．Ｓ．Ｈｏｎｇ，Ｌ．Ｋａｒａｙａｎら，ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１６：２２９４−２３０６（１９９７））及びコクサッキーウイルス−アデノウイルス受容体（Ｊ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ａ．Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５：１３２０−１３２３（１９９７））を含む細胞受容体とアデノウイルス中の繊維外被タンパク質の初期相互作用を含む２段階プロセスであると判明した。その後、アデノウイルス粒子のペントンベースタンパク質は、細胞表面ヘテロダイマーのインテグリンファミリーに結合して（Ｔ．Ｊ．Ｗｉｃｋｈａｍ，Ｐ．Ｍａｔｈｉａｓら，Ｃｅｌｌ，７３：３０９−３１９（１９９３））、受容体媒介エンドサイトーシスを介して内部化され得る。多くの細胞はアデノウイルス外被タンパク質に対する主要受容体を発現するが、内部化はより選択的である（Ｊ．Ｄ．Ｈａｒｒｉｓ及びＮ．Ｒ．Ｌｅｍｏｉｎｅ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２２：４００−４０４（１９９６））。ウイルス摂取を高める方法は、適切なインテグリンを発現するように標的細胞を刺激し（Ｅ．Ｄａｖｉｓｏｎ，Ｒ．Ｍ．Ｄｉａｚら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７１：６２０４−６２０７（１９９７））、標的細胞型に対して特異性を有する抗体をアデノウイルスにコンジュゲートすることを含む（Ｔ．Ｊ．Ｗｉｃｋｈａｍ，Ｇ．Ｍ．Ｌｅｅら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７１：７６６３−７６６９（１９９７ｂ）；Ｃ．Ｋ．Ｇｏｌｄｍａｎ，Ｂ．Ｅ．Ｒｏｇｅｒｓ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５７：１４４７−１４８１（１９９７））。抗体を使用すると、ベクターの作成困難さ及び補体系を活性化する潜在危険性が高まる。Ｗｉｃｋｈａｍら（Ｔ．Ｊ．Ｗｉｃｋｈａｍ，Ｅ．Ｔｚｅｎｇら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７１：８２２１−８２２９（１９９７ａ））は、繊維外被タンパク質に受容体結合モチーフを導入することにより、損傷を受けた内皮細胞または平滑筋細胞により発現するインテグリンまたは多数の細胞型により発現するヘパリンサルフェート受容体に結合するようにウイルスを再指向させ得た。
【０１０２】
いずれのアデノ随伴ウイルスベクターも免疫調節剤を発現及び／または分泌させるべく細胞及び／または細胞株をトランスフェクトするために使用し得る。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ヘルパーウイルス、通常アデノウイルスに依存して増殖するためには非病原性ヒトパルボウイルスである。これらのウイルスは分裂及び非分裂細胞の両方を感染させることができ、ヘルパーウイルスの非存在下で宿主ゲノム（１９ｑ  １３−ｑｔｅｒ）の特定ポイントに高頻度で組み込まれる（Ｒ．Ｍ．Ｋｏｔｉｎ，Ｍ．Ｓｉｎｉｓｃａｌｃｏら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，８７：２２１１−２２１５（１９９０））。野生型ゲノムは、ウイルス複製、構造遺伝子発現及び宿主ゲノムへの組み込みをコントロールするタンパク質をコードするｒｅｐ及びカプシド構造タンパク質をコードするｃａｐの２つの遺伝子から構成される一本鎖ＤＮＡ分子である。ゲノムのそれぞれの端部にプロモーターを含む１４５ｂｐ末端反復（ＴＲ）がある。
【０１０３】
ベクターとして使用するとき、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子は導入遺伝子及びその関連調節配列により置換される。インサートの全長は野生型ゲノムの長さである４．７ｋｂを大きく超え得ない（Ａ．Ｅ．Ｓｍｉｔｈ，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，４９：８０７−８３８（１９９５））。組換えベクターの産生には、ｒｅｐ及びｃａｐをヘルパーウイル遺伝子産物（アデノウイルスゲノムに由来するＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４及びＶＡ  ＲＮＡ）と共にトランスに与えられなければならない。慣用の方法は、１つはベクターに対するプラスミド、他方はｒｅｐ及びｃａｐに対するプラスミドである２つのプラスミドをアデノウイルスを感染させた２９３細胞に同時トランスフェクションすることである（Ｒ．Ｊ．Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｌ．Ｃｈａｎｇ及びＴ．Ｓｈｅｎｋ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６３：３８２２−３８２８（１９８９））。しかしながら、この方法は厄介であり、収率が低く（＜１０４粒子／ｍｌ）、アデノウイルス及び野生型ＡＡＶで汚染されやすい。低収率の原因の１つはｒｅｐ遺伝子産物のアデノウイルス複製に対する抑制効果である（Ｋ．Ａ．Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ｓ．Ｔ．Ｐｉｒａｉｎｏ及びＳ．Ｃ．Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７１：１８９７−１９０５（１９９７））。より最近のプロトコルでは、すべてのアデノウイルス構造遺伝子を除去し、ｒｅｐ耐性プラスミドを使用するか（Ｘ．Ｘｉａｏ，Ｊ．Ｌｉ及びＲ．Ｊ．Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７２：２２２４−２２３２（１９９８））、または感染前に成熟ウイルスにｒｅｐ発現プラスミドをコンジュゲートさせている（Ｋ．Ｊ．Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗ．Ｍ．Ｋｅｌｌｅｙ，Ｊ．Ｆ．Ｂｕｒｄａ及びＪ．Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，７：２０７９−２０８７（１９９６）。
【０１０４】
ｒｅｐの非存在下では、一旦末端反復が僅かに分解したらＡＡＶベクターのみがランダムに１つのプロウイルスまたは頭−尾コンカテマーとして組み込まれる（Ｅ．Ａ．Ｒｕｔｌｅｄｇｅ及びＤ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７１：８４２９−８４３６（１９９７））。宿主ゲノムへ組み込まれて長期間導入遺伝子発現するのでＡＡＶベクターが興味深い。導入遺伝子が異なる種由来でないものについて、血管内皮細胞（Ｙ．Ｍａｅｄａ，Ｕ．Ｉｋｅｄａら，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３５：５１４−５２１（１９９７））、横紋筋（Ｋ．Ｊ．Ｆｉｓｈｅｒ，Ｋ．Ｊｏｏｓｓら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３：３０６−３１６（１９９７）；Ｒ．Ｗ．Ｈｏｒｚｏｇら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，９４：５８０４−５８０９（１９９７））及び肝細胞（Ｒ．Ｏ．Ｓｎｙｄｅｒ，Ｃ．Ｈ．Ｍｉａｏら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６：２７０−２７５（１９９７））への遺伝子移入の長期間発現が報告されている。ＡＡＶキャプシドに対する中和抗体は検出可能であり得るが、ベクターの再投与を防止もせず、またプロモーター活性も遮断しない。多分ウイルスキャプシドの単純性のために免疫応答はかなり弱められるであろう。ＡＡＶ抗体はヒト集団中に存在するので、更に研究する必要がある。局在化ベクター送達以外に特定細胞型を標的するための試みはなされていない。
【０１０５】
特に、参照により本明細書に組込まれる米国特許第５，６９３，５３１号明細書に記載されているアデノ随伴ベクター、例えばＡＡＶｐ５ｎｅｏ、ｐＳＶ−β−ガラクトシダーゼ、ＴＲＦ１６９、ＬＺ１１、ｐＳＰ７２、ｐＳＰ７２ｎＬａｃＺ、ｐＡｄＲＳＶ４、ｐＡｄＲＳＶｎＬａｃＺ、ＡＡＶｒｎＬａｃ、ＳＶ４０、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ、ｐＳＶ４０ｏｒｉＡＡＶ１及びｐＫＮＴ１１が使用され得る。
【０１０６】
（レトロウイルスベクター）
免疫調節剤を発現及び／または分泌させるべく細胞及び／または細胞株をトランスフェクトするために任意のレトロウイルスベクターを使用し得る。レトロウイルスはゲノムとして一本鎖ＲＮＡ分子を含むエンベーロープウイルスの１種である。感染後、ウイルスゲノムは二本鎖ＤＮＡに逆転写され、これは宿主ゲノムに組み込まれ、タンパク質として発現する。このウイルスゲノムは少なくとも３個の遺伝子、すなわち（コアタンパク質をコードする）ｇａｇ、（逆転写酵素をコードする）ｐｏｌ及び（ウイルスエンベロープタンパク質をコードする）ｅｎｖを含む約１０ｋｂである。ゲノムの各末端に、プロモーター及びエンハンサー領域及び組み込みに関与する配列を含む長末端反復（ＬＴＲ）が存在する。更に、ウイルスＤＮＡ（ｐｓｉ）及びＲＮＡスプライス部位をｅｎｖ遺伝子に詰め込むのに必要な配列がある。ある種のレトロウイルスは、変異すると癌を引き起こす恐れがある癌原遺伝子を含むが、この癌原遺伝子はベクターの作成時に除去される。レトロウイルスは、原細胞癌遺伝子の近くに組み込み、ＬＴＲから不適切に発現することにより、または腫瘍抑制遺伝子を破壊することにより細胞を形質転換することもあり得る。挿入変異と称されるこの現象は、レトロウイルスをベクターとして使用したときに非常にまれではあるが起こり得る。
【０１０７】
レトロウイルスベクターは多くの場合、マウス細胞を感染させることができ、マウスモデルにおいてベクターを作成することができ、ヒト細胞を感染させることができ且つヒトを治療することができるアンホトロピックウイルスであるＭｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭＬＶ）に基づいている。ウイルス遺伝子（ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ）は目的の導入遺伝子で置換され、パッケージング細胞株においてプラスミド上で発現される。非必須遺伝子はパッケージング配列（ｐｓｉ）を欠いているので、これらの遺伝子はビリオン粒子に含まれない。複製コンピテントなレトロウイルスを生ずる組換えを防止するために、ベクター骨格と相同な領域はすべて除去されなければならず、非必須遺伝子は少なくとも２つの転写単位により発現されなければならない（Ｄ．Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ，Ｓ．Ｇｏｆｆ及びＡ．Ｂａｎｋ，「遺伝子移入のための安全なパッケージングライン：２つの異なるプラストミドでのウイルス遺伝子の分離(A safe packaging line for gene transfer: separating viral genes on two differential plasmids)」，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６２：１１２０−１１２４（１９８８））。それにしても、複製コンピテントなレテロウイルスが低頻度で生じる。
【０１０８】
必須領域は５’及び３’ＬＴＲに加えて、５’ＬＴＲの下流にあるパッケージング配列を含む。導入遺伝子は、５’ＬＴＲ中のプロモーター／エンハンサー領域により、或いは別のウイルス（例えば、サイトメガロウイルス、ラウス肉腫ウイルス）または細胞（例えば、β−アクチン、チロシン）プロモーターにより発現され得る。突然変異分析から、完全なｇａｇコード配列まで及びすぐ上流の領域はパッケージングまたは導入遺伝子発現に影響を与えることなく除去し得ることが分かった（Ｓ．Ｈ．Ｋｉｎ，Ｓ．Ｓ．Ｙｕら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７２：９９４−１００４（１９９８））。しかしながら、導入遺伝子開始コドンの正確な位置決め及び５’ＬＴＲの小さな改変は導入遺伝子の発現に影響を与える（Ｉ．Ｒｉｖｉｒｅ，Ｋ．Ｂｒｏｓｅ及びＲ．Ｃ．Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，９２：６７３３−６７３７（１９９５））。形質転換された細胞の同定を助けるために、ネオマイシンやβ−ガラクトシダーゼのような選択マーカーを加えることができ、内部リボソーム部位の付加で導入遺伝子の発現を改善することができる（Ｍ．Ｓａｌｅｈ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，８：９７９−９８３（１９９））。レトロウイルスベクターの有効な環境収容力は約７．５ｋｂであり（Ｉ．Ｍ．Ｖｅｒｍａ及びＮ．Ｓｏｍｉａ，Ｎａｔｕｒｅ，３８９：２３９−２４２（１９９７））、これはｃＤＮＡを使用したとしても幾つかの遺伝子にとって小さすぎる。
【０１０９】
レトロウイルスエンベロープは特定細胞タンパク質と相互作用して、標的細胞範囲を決定する。ｅｎｖ遺伝子またはその産物を改変することが細胞範囲を操作するための有効手段であることが判明した。アプローチにはエンベロープタンパク質と細胞受容体間の結合部位を直接修飾することが含まれる。しかしながら、このアプローチはその後のウイルス粒子の内部化を妨害する傾向にある（Ｊ．Ｄ．Ｈａｒｒｉｓ及びＮ．Ｒ．Ｌｅｍｏｉｎｅ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２：４００−４０４（１９９６））。ｅｎｖ遺伝子の一部をエリスロポエチンタンパク質（ＥＰＯ）由来の１５０コドンと置換することにより、Ｋａｓａｈａｒａら（Ｎ．Ｋａｓａｈａｒａ，Ａ．Ｍ．Ｄｏｚｙ及びＹ．Ｗ．Ｋａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６：１３７４−１３７６（１９９４））はＥＰＯ受容体を有する細胞を高アフィニティーで標的することができた。ストレプトバジン橋を介して抗体を第２の細胞特異的抗体に対してアフィニティーを有するウイルス粒子とカップリングさせるとウイルス摂取が改善されるが、内部化はウイルス分解を起こしがちである（Ｐ．Ｒｏｕｘ，Ｐ．Ｊｅａｎｔｅｕｒ及びＭ．Ｐｉｅｃｈａｃｚｙｋ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，８６：９０７９−９０８３（１９８９））。Ｎｅｄａら（Ｈ．Ｎｅｄａ，Ｃ．Ｈ．Ｗｕ及びＧ．Ｙ．Ｗｕ，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６６：１４１４３−１４１４６（１９９１））はウイルス粒子をラクトースで処理して、アシアロ糖タンパク質受容体を発現する細胞、主に肝細胞による摂取を生じさせた。その後、たぶんウイルスエンベロープをエンドソーム膜と融合させるエンドソームの酸性化のためにウイルス導入遺伝子が効率的に発現した。
【０１１０】
ウイルスはその向性の点で異なる。従って、ｅｎｖ遺伝子を別のウイルスのｅｎｖ遺伝子で置換することにより宿主範囲はシュードタイピングとして公知の技術で拡大し得る。小水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質がＭｏ−ＭＬＶ誘導ベクターに導入され（Ｊ．Ｃ．Ｂｕｒｎｓ，Ｔ．Ｍａｔｓｕｂａｒａら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１６５：２８５−２８９（１９９４））、これは超遠心により精製するとより安定である。最近、Ｑｉｎｇ（Ｋ．Ｑｉｎｇ，Ｔ．Ｂａｃｈｅｌｏｔ，Ｐ．Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７１：５６６３−５６６７（１９９７））は、まずレシピエント細胞をレトロウイルスエンベロープタンパク質に対する細胞受容体を発現するアデノ随伴ベクター（以下に記載する）で処理することにより多数の細胞株への形質導入を改善した。
【０１１１】
レトロウイルスの組み込み及びウイルス遺伝子の発現に関する要件は標的細胞が分裂しなければならないことである。このため、遺伝子治療はインビトロまたはエキソビボで増殖細胞に限定される。この場合、細胞を身体から取り出し、複製を刺激するように処理し、レトロウイルスベクターを導入した後患者に戻す。エキソビボ細胞はより効率的に導入される。なぜならば、より高いウイルス力価及び成長因子に曝されるからである（Ｈ．Ｇｌｉｍｍ，Ｈ．Ｐ．Ｋｉｅｍら，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，８：２０７９−２０８６（１９９７））。更に、エキソビボ処理した腫瘍細胞は腫瘍塊に結合し、殺腫瘍効果を発揮し得る（Ｅ．Ｈ．Ｏｌｄｆｉｅｌｄ及びＺ．Ｒａｍ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，６：５５−８５（１９９５）；Ｚ．Ａｂｄｅｌ−Ｗａｈａｂ，Ｃ．Ｗｅｌｔｚら，Ｃａｎｃｅｒ．８０：４０１−４１２（１９９７））。
【０１１２】
レンチウイルスは増殖及び非増殖細胞の両方を感染させることができるレトロウイルスのサブクラスである。これらのウイルスは単純レトロウイルスよりもかなり複雑であり、更に６個のタンパク質ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｎｅｆ及びｖｉｆを含んでいる。現在のパッケージング細胞子株はシュードタイプｅｎｖ遺伝子、導入遺伝子構築物、及び構造及び調節遺伝子をトランスに供給するパッケージング構築物に対して別々のプラスミドを有する（Ｌ．Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｕ．Ｂｌｍｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７２：２６３−２６７（１９９６））。筋肉、肝臓及びニューロン組織で長期間インビボ発現を示すマーカー遺伝子を用いた初期の結果は有望である（Ｕ．Ｂｌｍｅｒ，Ｌ．Ｎａｌｄｉｎｉら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７１：６６４１−６６４９（１９９７）；Ｈ．Ｍｉｙｏｓｈｉ，Ｍ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｆ．Ｈ．Ｇａｇｅ及びＩ．Ｍ．Ｖｅｒｍａ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，９４：１０３１９−１０３２３（１９９７）；Ｔ．Ｋａｆｒｉ，Ｕ．Ｂｌｍｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１７：３１４−３１７（１９９７））。興味深いことに、導入遺伝子は、ＭｏＭＬＶベクター中とは異なり不活化されない内部を工学操作したサイトメガロウイルスプロモーターにより駆動される。これは、たぶん食塩水コントロールと同程度であるベクター注射に対する限られた炎症応答のためであろう（Ｕ．Ｂｌｍｅｒ，Ｌ．Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｔ．ｋａｆｒｉ，Ｄ．Ｔｒｏｎｏ．Ｉ．Ｍ．Ｖｅｒｍａ及びＦ．Ｈ．Ｇａｇｅ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７１：６６４１−６６４９（１９９７））。
【０１１３】
使用するレンチウイルスベクターはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）から誘導され、非必須調節遺伝子の幾つかの除去にてらして安全性について評価されている。ｖｐｒ及びｖｉｆの突然変異体は低い効率でニューロンを感染させることができるが、筋肉または肝細胞を感染させることはできない（Ｕ．Ｂｌｍｅｒ．Ｌ．Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｔ．Ｋａｆｒｉ，Ｄ．Ｔｒｏｎｏ，Ｉ．Ｍ．Ｖｅｒｍａ及びＦ．Ｈ．Ｇａｇｅ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７１：６６４１−６６４９（１９９７）；Ｔ．Ｋａｆｒｉ，Ｕ．Ｂｌｕｍｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１７：３１４−３１７（１９９７））。
【０１１４】
特定実施態様では、レトロウイルスベクターｐＬＸＩＮ、ｐＳＩＲ、ｐＬＸＳＨ、ｐＬＮＣＸ、ｐＬＡＰＳＮ、ｐＦＢ及びｐＦＢ−Ｎｅｏを使用する。
【０１１５】
（単純ヘルペスウイルスベクター）
免疫調節剤を発現及び／または分泌させるべく細胞及び／または細胞株をトランスフェクトするために任意の単純ヘルペスウイルスベクターを使用し得る。単純ヘルペスウイルスタイプ１（ＨＳＶ−１）はヒト向神経性ウイルスであり、神経系に遺伝子移入するためのベクターとしてＨＳＶ−１を用いることに現在興味が集中している。野生型ＨＳＶ−１ウイルスはニューロンを感染させ、溶解性生活サイクルに進むかまたは潜伏状態で核内エピソームとして生き残ることができる。潜伏感染したニューロンは正常に機能し、免疫系により拒絶されない。潜伏ウイルスは転写的にほぼ沈黙しているが、潜伏中に機能し得るニューロン特異的プロモーターを有している。ＨＳＶ−１に対する抗体はヒト集団において一般的であるが、ヘルペス感染に起因する脳炎のような合併症は非常にまれである。
【０１１６】
ウイルスゲノムは１５２ｋｂの線状二本鎖ＤＮＡ分子である。内部反復配列（ＩＲＬ及びＩＲＳ）によりいずれかの方向で連結する２つのユニーク領域、すなわち長領域及び短領域（ＵＬ及びＵＳと称される）がある。ユニーク領域の非リンカー末端に末端反復（ＴＲＬ及びＴＲＳ）がある。最高８１個の遺伝子が存在し（Ｐ．Ｍａｒｃｏｎｉ，Ｄ．Ｋｒｉｓｋｙら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，９３：１１３１９−１１３２０（１９９６））、その内の約半分は細胞培養での増殖に必須でない。これらの非必須遺伝子を欠失させると、外来ＤＮＡの４０〜５０ｋｂをウイルス内に収容し得る（Ｊ．Ｇ．Ｇｌｏｒｉｏｓｏ，Ｎ．Ａ．ＤｅＬｕｃａ及びＤ．Ｊ．Ｆｉｎｋ，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，４９：６７５−７１０（１９９５））。ＨＳＶ−１遺伝子の３つの主なクラス、すなわち前初期（ＩＥまたはα）遺伝子、初期（Ｅまたはβ）遺伝子及び後期（Ｌまたはγ）遺伝子が同定された。
【０１１７】
感受性細胞の感染後、溶解性複製が遺伝子転写の一時的に配位された配列により調節される。Ｖｍｗ６５（テグメント構造タンパク質）は、初期遺伝子を産生し得るトランス活性化因子である前初期遺伝子（ＩＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７及びＩＣＰ４７７）を活性化する。初期遺伝子は、ヌクレオチド代謝及びＤＮＡ複製のための遺伝子をコードする。後期遺伝子は初期遺伝子により活性化され、構造タンパク質をコードする。全サイクルは１０時間未満しかかからず、間違いなく細胞死に至る。
【０１１８】
潜伏の確立につながる分子事象は十分に解明されていない。潜伏中の遺伝子発現はゲノムのＩＲＬ領域中に位置する潜伏関連転写物（ＬＡＴ）により進められる。２つのＬＡＴ（２．０及び１．５ｋｂ）はＩＥＩ遺伝子ＩＣＰ０の反対方向に転写される。ＬＡＴは潜伏からのＨＳＶ−１再活性化（Ｉ．Ｓｔｅｉｎｅｒ，Ｊ．Ｇ．Ｓｐｉｖａｃｋら，ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，８：５０５−５１１（１９８９））及び潜伏の確立（Ｎ．Ｍ．Ｓａｗｔｅｌｌ及びＲ．Ｌ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６６：２１５７−２１６９（１９９２））において役割を有する。ＬＡＴの発現を進める２つの潜伏活性プロモーターが同定されており（Ｐ．Ｍａｒｃｏｎｉ，Ｄ．Ｋｒｉｓｋｙら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，９３：１１３１９−１１３２０（１９９６））、ベクター導入遺伝子発現のために有用であり得る。
【０１１９】
ＨＳＶ−１ベクターを作成するために２つの基本的アプローチ、すなわち単位複製配列及び組換えＨＳＶ−１ウイルスが使用されてきた。単位複製配列は、ｃｏｌ  Ｅ１  ｏｒｉ（大腸菌複製起源）、Ｏｒｉｓ（ＨＳＶ−１複製起源）、ＨＳＶ−１パッケージング配列、前初期プロモータの制御下の導入遺伝子及び選択マーカーを含む細菌産生されるプラスミドである（Ｈ．Ｊ．Ｆｅｄｅｒｏｆｆ，Ｍ．Ｄ．Ｇｅｓｃｈｗｉｎｄ，Ａ．Ｉ．Ｇｅｌｌｅｒ及びＪ．Ａ．Ｋｅｓｓｌｅｒ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９：１６３６−１６４０（１９９２））。単位複製配列はヘルパーウイルス（温度感受性変異体）を含む細胞株にトランスフェクトされ、すべてのミッシング構造及び制御遺伝子をトランスに与える。ヘルパー及び単位複製配列含有ウイルス粒子はレシピエントに送達される。より最近の単位複製配列はプラスミドエピソーム維持のためにエプスタインバルウイルス誘導配列を含む（Ｓ．Ｗａｎｄ及びＪ．Ｖｏｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７０：８４２２−８４３０（１９９６））。
【０１２０】
組換えウイルスは、トランスで与えられる前初期遺伝子の１つ（例えば、ＩＣＰ４）を欠失させることにより複製欠乏とされる。このウイルスは低病原性であり、脳組織において導入遺伝子を発現し得るが、培養中のニューロンに対しては毒性である（Ｐ．Ｍａｒｃｏｎｉ，Ｄ．Ｋｒｉｓｋｙら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，９３：１１３１９−１１３２０（１９９６））。多数の前初期遺伝子を欠失させると、細胞毒性は実質的に低下し、野生株潜伏ウイルスにおいて沈黙しているプロモーターから発現させ得る。前記プロモーターは長期間遺伝子発現させる際に有用であり得る。
【０１２１】
複製条件付き変異体は特定の細胞株においてのみ複製できる。許容細胞株はいずれも増殖性であり、ウイルス欠乏を補うために細胞酵素を与える。変異体はチミジンキナーゼ（Ｍ．Ｊ．Ｄｕｒｉｎｇ．Ｊ．Ｒ．Ｎａｅｇｅｌｅ，Ｋ．Ｌ．ＯＭａｌｌｅｙ及びＡ．Ｉ．Ｇｅｌｌｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６：１３９９−１４０３（１９９４））、リボヌクレアーゼ還元酵素（Ｃ．Ｍ．Ｋｒａｍｍ，Ｍ．Ｃｈａｓら，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，８：２０５７−２０６８（１９９７））、ＵＴＰａｓｅまたは神経毒性因子ｇ３４．５（Ｓ．Ｋｅｓａｒｉ，Ｂ．Ｐ．Ｒａｎｄａｚｚｏら，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，７３：６３６−６４８（１９９５））を含む。
【０１２２】
（非ウイルスベクター）
ウイルスベクターはいずれもある程度免疫応答を誘導し、安全性のリスク（例えば、挿入突然変異及び毒性の問題）を有し得る。更に、その能力は限られており、大規模産生することは困難なことがある。従って、本発明の１実施態様では遺伝子移入の非ウイルス方法が使用される。この方法は少数のタンパク質のみを必要とし得、実質的に無限の能力を有し、感染または突然変異可能性を持たず、大規模産生が製薬技術を用いて可能である。非ウイルスＤＮＡ移入には３つの方法、すなわち裸ＤＮＡ、リポソーム及び分子コンジュゲートがある。
【０１２３】
裸核酸：
免疫調節剤を宿主に送達するために裸ＤＮＡまたは核酸が使用され得る。これは、例えば筋細胞に直接注入し得る（Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ，Ｒ．Ｗ．Ｍａｌｏｎｅ，Ｐ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｗ．Ｃｈｏｎｇ，Ｇ．Ａｃｓａｄｉ，Ａ．Ｊａｎｉ及びＰ．Ｌ．Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１４６５−１４６８（１９９０））または組織に衝撃される金粒子に結合した（Ｌ．Ｃｈｅｎｇ，Ｐ．Ｒ．Ｚｉｅｇｅｌｈｏｆｆｅｒ及びＮ．Ｓ．Ｙａｎｇ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，９０：４４５５−４４５９（１９９３））プラスミドの形態で送達し得る。用語「裸」核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡは、ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチン、沈殿剤等のような細胞への進入を援助、助長または促進するように作用する送達ビヒクルを含まない配列を指す。余り効率的ではないが、これによりインビボで低レベルの発現が長期間生じ得る。他の遺伝子治療方法とは異なり、標的細胞に裸核酸配列を導入することの１つの大きな利点は細胞における免疫調節剤の合成が一時的なことである。研究により、非複製ＤＮＡ配列を細胞に導入すると所望の免疫調節剤が６ヶ月までの期間産生され得ることが判明した。この方法の単純さ及び持続的発現により、ＤＮＡワクチンが開発された。従来の弱毒化及びタンパク質を主成分とするワクチンと比較して、例えば母性抗体に起因する既存の免疫により影響を受けず、比較的安価であり、１つのプラスミドで多数の病原性抗原を送達できる（Ｅ．Ｍａｎｉｃｋａｎ，Ｋ．Ｌ．Ｋａｒｅｍ及びＢ．Ｔ．Ｒｏｕｓｅ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１７：１３９−１５４（１９９７））。ＨＩＶのような既存のワクチンがないか（Ｃ．Ｌｅｋｕｔｉｓ．Ｊ．Ｗ．Ｓｃｈｉｖｅｒ，Ｍ．Ａ．Ｌｉｕ及びＬ．Ｎ．Ｌｅｔｖｉｎ，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：４４７１−４４７７（１９９７））またはインフルエンザのように現在のワクチンは十分に有効でない（Ｍ．Ｄ．Ｍａｃｋｌｉｎ，Ｄ．ＭｃＣａｂｅら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７２：１４９１−１４９６（１９９８））病原体に対してＤＮＡワクチンが開発されている。高保存遺伝子を用いて、Ｕｌｔｅｒら（Ｊ．Ｂ．Ｕｌｍｅｒ，Ｊ．Ｊ．Ｄｏｎｎｅｌｌｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１７４５−１７４９（１９９３））は、２つの血清学的に異なるインフルエンザウイルス株に対してマウスを免疫化し得た。しかしながら、多くの場合、ＤＮＡワクチンは既存のワクチンよりも有効ではないことが判明した（Ｍ．Ｄ．Ｍａｃｋｌｉｎ，Ｄ．ＭｃＣａｂｅら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７２：１４９１−１４９６（１９９８））。免疫応答の実際のタイプは、適当なサイトカインをコードする遺伝子を同時形質転換することによりコントロールし得（Ｚ．Ｘｉａｎｇ及びＨ．Ｃ．Ｅｒｔｌ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２：１２９−１３５（１９９５））、この方法は不適切な免疫応答を転送させるのに有用であり得る（Ｅ．Ｍａｎｉｃｋａｎ，Ｋ．Ｌ．Ｋａｒｅｍ及びＢ．Ｔ．Ｒｏｕｓｅ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒ��ｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１７：１３９−１５４（１９９７））。裸ＤＭＡの他の用途には、ガンの免疫強化（以下に記載する、Ｍ．Ｃｏｒｒ，Ｈ．Ｔｉｇｈｅ，Ｄ．Ｌｅｅ，Ｊ．Ｄｕｄｌｅｒら，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１５９：４９９９−５００４（１９９７））、膵臓インスリン機能の修復（Ｉ．Ｄ．Ｇｏｌｄｆｉｎｅ，Ｍ．Ｓ．Ｇｅｒｍａｎ，Ｈ．Ｔｓｅｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５：１３７８−１３８２（１９９７））及び副行血管発生の刺激（Ｓ．Ｔａｋｅｓｈｉｔａ，Ｙ．Ｔｓｕｒｕｍｉら，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，７５：４８７−５０１（１９９６））が含まれる。筋組織での遺伝子産物の発現はコラゲナーゼ、パパベリン及び虚血性状態の同時投与により改善され得る（Ｖ．Ｂｕｄｋｅｒ，Ｇ．Ｚｈａｎｇ．Ｉ．Ｄａｎｋｏ，Ｐ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ及びＪ．Ｗｏｌｆｆ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，５：２７２−２７６（１９９８））。筋特異的プロモーター（Ｍ．Ｓｋａｒｌｉ，Ａ．Ｋｉｒｉら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，５：５１４−５２０（１９９８））及びポリＡや転写停止配列のような他の遺伝子内調節配列（Ｊ．Ｈａｒｔｉｋｋａ，Ｍ．Ｓａｗｄｅｙら，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，７：１２０５−１２１７（１９９６））を用いても導入遺伝子発現が改善される。
【０１２４】
裸ポリペプチドを注入する場合、ＤＮＡまたはＲＮＡの有効用量は体重１ｋｇあたり約０．０５ｇ〜約５０ｍｇの範囲である。用量は、好ましくは約０．００５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．０５〜約５ｍｇ／ｋｇである。勿論、当業者が認識しているように、この用量は組織の注入部位に応じて異なる。核酸配列の適切な有効用量は当業者により容易に決定され得、治療対象の状態及び投与ルートに依存し得る。投与は組織の間質腔への非経口ルートにより注入されるが、例えば特に肺または気管支組織、のどまたは鼻の粘膜への送達のためのエアゾール処方物の吸入のような他の非経口ルートも使用し得る。加えて、裸ポリペプチド構築物は血管形成術で使用されるカテーテルによりその施術中に動脈に送達し得る。
【０１２５】
リポソーム：
免疫調節剤は、当業界で公知の方法により調製し得るリポソーム処方物（例えば、（Ｐ．Ｌ．Ｆｅｌｇｎｅｒら，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７７２：１２６−１３９（１９９５）及びＢ．Ａｂｄａｌｌａｈら，Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ，８５（１）：１−７（１９９５）に教示されているようなもの）の形態でも送達し得る。リポソームは水性流体の一部を捕捉する脂質二重層である。ＤＮＡは自発的に（電荷により）カチオン性リポソームの外表面に会合し、このリポソームは細胞膜と相互作用する（Ｊ．Ｈ．Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｒ．Ｋｕｍａｒら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６９：２５５０−２５６１（１９９４））。インビボでは、特定細胞株の最高９０％がトランスフェクトされ得る。カチオン性リポソームに少量のアニオン性脂質を配合することにより、ＤＮＡはリポソームの内表面に取り込まれ得、よって酵素分解から保護される（Ｓ．Ｆ．Ａｌｉｏ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，５４：９−１３（１９９７）に引用されているＣｒｅｓｐｏら（１９９６））。エンドソームとして細胞への摂取を助長するために、標的タンパク質はリポソーム、例えば抗−ＭＨＣ抗体（Ｃ．Ｗａｎｇ及びＬ．Ｈｕａｎｇ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，８４：７８５１−７８５５（１９８７））、トランスフェリン（Ｊ．Ｃ．Ｓｔａｖｒｉｄｉｓ，Ｇ．Ｄｅｌｉｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｏｓら，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６４：５６８−５７２（１９８６））及びセンダイウイルスまたはそのＦタンパク質（Ｊ．Ｖ．Ｄｚａｕ，Ｍ．Ｊ．Ｍａｎｎ，Ｒ．Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ及びＹ．Ｋａｎｅｄａ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，９３：１１４２１−１１４２５（１９９６））中に配合されていた。センダイウイルスにより、更にプラスミドＤＮＡはエンドソームから細胞質に逃げ、よって分解を避けることができる。ＤＮＡ結合タンパク質（２８ｋＤの高移動度グループ１タンパク質）を配合すると、プラスミドが核に移動することにより転写が強化される（Ｄｚａｕら，Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，８０（９Ａ）：３３１−３９１（１９９７），１９９７年１１月６日発行）。
【０１２６】
分子コンジュゲート：
分子コンジュゲートは、ＤＮＡ結合剤を結合させたタンパク質または合成リガンドから構成されている。細胞への送達は、リポソームの場合と同様の技術を用いて改善され得る。標的タンパク質には、アシアロ糖タンパク質（Ｅ．Ｗａｇｎｅｒ，Ｍ．Ｃｏｔｔｅｎ，Ｒ．Ｆｏｉｓｎｅｒ及びＭ．Ｌ．Ｂｉｒｎｓｔｉｅｌ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，８８：４２５５−４２５９（１９９１））、トランスフェリン（Ｃ．Ｈ．Ｗｕ，Ｊ．Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ及びＧ．Ｙ．Ｗｕ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６４：１６９８５−１６９８７（１９８９））、ポリマーＩｇＡ（Ｔ．Ｆｅｒｋｏｌ，Ｃ．Ｓ．Ｋａｅｔｚｅｌ及びＰ．Ｂ．Ｄａｖｉｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，９２：２３９４−２４００（１９９３））及びアデノウイルス（Ｊ．Ｍａｄｏｎ及びＨ．Ｅ．Ｂｌｕｍ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２４：４７４−４８１（１９９６））が含まれる。導入遺伝子の発現は一過性である傾向にあり、エンドソーム／リポソーム分解により制限される。
【０１２７】
以下、本発明の非限定的実施例を提示する。これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１２８】
本明細書に使用される略号は以下の意味を有する：
ＡｄＩＦＮ      ウッドチャックインターフェロンγを発現するアデノウイルスベクター；
ＡｄＲＦＰ      ウッドチャックインターフェロンγ遺伝子を持たないアデノウイルスベクター；
ＣＣＣ  ＤＮＡ  ＤＮＡの共有結合閉環ウイルス形態；
ＤＮＡ          デオキシリボ核酸；
ＦＴＣ          ５−フルオロ−１−（２Ｒ，５Ｓ）−１，３−オキサチオラン−５−イル］シトシン；
ＧＦＰ          緑色蛍光タンパク質；
ＨＢＶ          Ｂ型肝炎ウイルス；
ＩＦＮ          インターフェロン；
Ｌ−ＦＭＡＵ    １−（２−フルオロ−５−メチル−β，Ｌ−アラビノフラノシル）チミン；
Ｍ１、Ｍ２      治療開始後それぞれ１ヶ月目または２ヶ月目；
ＰＣＮＡ        増殖細胞核抗原；
ＰＣＲ          ポリメラーゼ連鎖反応；
Ｐｆｕ          プラーク形成単位；
ＲＦＰ          赤色蛍光タンパク質；
ＲＩ            複製中間体；
ＲＴ            逆転写；
ＴＵＮＥＬ      ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）媒介ｄＵＴＰニック末端標識アッセイ；
ＷＨＶ          ウッドチャックＢ型肝炎ウイルス。
【０１２９】
（実施例１）
Ｌ−ＦＭＡＵ及びβ−Ｌ−ＦＴＣの投与：
通常、β−Ｌ−ＦＴＣはＣｕｌｌｅｎら（Ｃｕｌｌｅｎら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，４１：２０７６−５０８２（１９９７）に記載されているプロトコルに従った投与した。具体的には、３０ｍｇ／ｋｇのβ−Ｌ−ＦＴＣを腹腔内投与した。
【０１３０】
Ｌ−ＦＭＡＵを用いる実験では、化合物をＰｅｅｋら（Ｐｅｅｋら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，３３：２５４−６６（２００１）及びＺｈｕら（Ｚｈｕら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５：３１１−２２（２００１）に記載されている濃度（１０ｍｇ／ｋｇ）で腹腔内投与した。
【０１３１】
動物：
ウッドチャックＢ型肝炎ウイルス感染モデルは、慢性Ｂ型肝炎を患っているヒトで見られるウイルス感染の病歴に似ているので抗ウイルス剤を評価するための有用なモデルである。幾つかの研究で、この動物モデルが新しいヌクレオシドアナログの研究において特に抗ウイルス効果及び毒性に関する研究において確実に使用されることが判明している。
【０１３２】
インビボ実験のために慢性的にＷＨＶ感染している約１才の飼育(captive-born)ウッドチャック（Ｍａｒｍｏｔｔａ ｍｏｎａｘ）１２匹を使用した。治療プロトコルを２０００年７月〜１２月の間実施した。
【０１３３】
アデノウイルスを注入したとき、アデノウイルス注入から１０日間は毎日、その後は週２回血液サンプルを集めた。これらのサンプルを下記するウイルスマーカーについて更に評価した。
【０１３４】
インターフェロン遺伝子送達システム（ドイツ国フライブルグ大学のＮａｓｓａｌ博士）：
アデノウイルスベクターは、Ｈｅら（Ｔ．Ｃ．Ｈｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９５：２５０９−１４（１９９８））に記載されている手順に従って得た。このアデノウイルスベクターは、Ｅ１及びＥ３領域を欠失しているので複製欠損である。ＳＶ４０プロモーターの制御下のｅＣＦＰ遺伝子レポーターに結合させたＣＭＶプロモーターの制御下のプレ−ＩＦＮγ遺伝子（ａａ  １−１４３）のコーディングカセットを有する組換えカセットを元のＥ１領域（４５４−３５００）に挿入した（図１）。活性ウッドチャックＩＦＮγ産生効率をウッドチャック細胞株ＷＣＨ１７のＶＳＶ感染からの保護により評価した。
【０１３５】
ｐＳＶ４０−ｅＣＦＰカセットのみを含む同一アデノベクターを対照として使用した。肝臓を標的化するためにアデノウイルスベクターを静注により投与した。このベクターはリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）で希釈して３×１０７〜３×１０１１ｐｆｕ／動物の濃度で投与した。
【０１３６】
（実施例２）
Ｌ−ＦＭＡＵ＋β−Ｌ−ＦＴＣ＋ａｄＩＦＮの評価：
実験的にＷＨＶに感染させたウッドチャック（Ｍａｒｍｏｔｔａ ｍｏｎａｘ）１８匹をニューヨーク州サウスプリマスに所在のＮｏｒｔｈｅａｓｔｅｒｎ  Ｗｉｌｄｌｉｆｅから購入した。これらのウッドチャックは慢性的に感染しており、インビボ実験のために使用した。
【０１３７】
β−Ｌ−ＦＴＣ（３０ｍｇ／ｋｇ）及びＬ−ＦＭＡＵ（１０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した。最初の１週間は毎日注射し、その後７週間は１日おきに注射した。
【０１３８】
ＳＶ４０プロモーターの制御下のｅＲＦＰｎｕｃ遺伝子レポーターに結合させたＣＭＶプロモーターの制御下のウッドチャックインターフェロンγ（ＩＦＮ）遺伝子の新しい組換えカセットをアデノウイルスベクター（Ａｄ  ＩＦＮ）の元のＥ１領域に挿入した。ｐＳＶ４０制御下ｅＧＦＰｎｕｃのみを含む同一のアデノウイルスベクターを対照（ＡｄＦＧＰ）として使用した（ドイツ国フライブルグ大学のＭｉｃｈｅａｌ  Ｎａｓｓａｌ博士より提供）。
【０１３９】
上記実験に対して、ウッドチャックインターフェロンγを発現する組換えアデノウイルスベクターを３×１０１０ｐｆｕ／動物で４週目及び８週目の２回静注した。ウイルス接種を２００１年８月に米国マサチューセッツ州アマーストで開催されたＨＢＶ会議で発表された研究で確認されていた（図２参照）。
【０１４０】
治療中、血液サンプルを２日毎に、Ａｄ  ＩＦＮを注射後毎回５日間は毎日集めた。休薬後、血液サンプルをウイルス量が増加しはじめるまでは２日毎に集め、その後は１週間に２回、その後は１月に２回集めた。
【０１４１】
（実施例３）
肝生検：
治療前（ＴＯ）、治療中２回（Ｍ１，Ｍ２）及び休薬後４ヶ月目（Ｍ３）に全身麻酔下で開腹後外科的肝生検を実施した。アデノウイルス注射後毎回４日目に治療時生検を実施した。各サンプルの一部をウイルスＤＮＡ分析のために−８０℃で保存した。別の部分は肝組織検査及び免疫染色のためにホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した。最後の部分は電子顕微鏡研究（ＴＯ及びＭ２）のために１％  四酸化オスミウムで固定した。手術中肉眼で肝臓を調べた。
【０１４２】
肝臓内ウイルスＤＮＡ合成の分析：
肝生検時に感染ウッドチャックから肝臓内ウイルスＤＮＡを抽出した。１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ中でホモジナイズ後、肝サンプルを二分し、一方は（プロテイナーゼＫ消化し、フェノール−クロロホルム抽出し、エタノール沈殿させた後）総ウイルスＤＮＡを分離するために、他方は（タンパク質結合ＤＮＡをＳＤＳ−ＫＣｌ沈殿させ、フェノール−クロロホルム抽出し、エタノール沈殿させた後）非タンパク質結合の共有結合閉環（ＣＣＣ）ウイルスＤＮＡを単離するために使用した。サザンブロット分析のために使用される各サンプル中のＤＮＡの量を正規化するために、ＤＮＡ濃度をＵＶ濃度測定分析により測定し、アガロースゲル用いる電気泳動後既に定量されているＤＮＡと比較した。その後、全ＤＮＡまたはＣＣＣ  ＤＮＡ調製物に相当する核酸５μｇを１．２％アガロースゲルを用いる電気泳動にかけ、ナイロン膜にブロットすることによりアルカリ移動させ、ウイルスＤＮＡを上記した特異的ハイブリダイゼーションにより検出した。
【０１４３】
肝組織の分析：
ホルマリン固定した肝生検組織切片をヘマトキシリン−エオシン−サフラン（ＨＥＳ）染料で染色し、光学顕微鏡下で検査した。肝細胞壊死（好酸体）の程度、門脈路及び小葉内腔の炎症レベル及び線維症段階をＭｅｔａｖｉｒスコア（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２０（１  Ｐｔ  １）：１５−２０（１９９４））を用いて半定量的に評価した。肝生検切片は脂肪変性、小管増殖、肝細胞異形成及び肝細胞癌についても評価した。
【０１４４】
肝組織検査から、Ａｄ  ＩＦＮまたはＡｄ  ＧＦＰベクターを投与された動物の両群で同等の肝炎の急性憎悪の兆候が見られたが、未治療動物では中程度の炎症作用が観察された。
【０１４５】
注射前及びポリクローナル抗−ＷＨＶ抗体を注射後５日目に得た肝生検切片で実施した免疫染色実験から、ウッドチャックＡ３７及びＡ３６における感染肝細胞の数が大きく減少していることが判明した。
【０１４６】
（実施例４）
ウイルス血症の分析：
ドットブロット分析
ウイルス血症を、ウッドチャックＢ型肝炎ウイルス（ＷＨＶ）ＤＮＡを定量的に検出することにより評価した。ＷＨＶ  ＤＮＡをＨｉｇｈＰｕｒｅ  ＰＣＲ鋳型ＤＮＡ抽出キット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて血清から抽出し、血清５０μｌに相当するサンプルを膜（Ｂｉｏｄｙｎｅ  Ｂ，０．４５μＭ，Ｍｅｒｃｋ  Ｅｕｒｏｌａｂ）上にＷＨＶ  ＤＮＡ標準物質の連続希釈物を用いてスポットした。固定手順後、フィルターを３２Ｐ標識した完全長ＷＨＶ  ＤＮＡプローブとハイブリダイズした。ホスホイメージャースキャン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）の比較分析をＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアを用いて実施した。このアッセイの検出限界は６×１０７コピー／ｍｌ（２００ｐｇ／ｍｌ）であった。
【０１４７】
内因性ポリメラーゼアッセイ（ＥＰＡ）
ウイルスプラス鎖ＤＮＡの合成に対するＡｄ  ＩＦＮの影響を内因生ポリメラーゼアッセイ（ＥＰＡ）においてＷＨＶ粒子を用いて調べた。比較のために、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤のホスホノホルム酸（ＰＦＡ）を対照として使用した。内因性ポリメラーゼ活性はリラックス環状ＤＮＡを含有する成熟粒子におけるウイルスプラス鎖ＤＮＡの完成に相当する。ＷＨＶ随伴ＤＮＡポリメラーゼ活性は、部分精製したウイルス粒子５０μｌを（ｉ）ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ（それぞれ１００μｌ）及び３Ｈ−ＤＴＴＰ（０．１７μＭ）を含有する反応緩衝液（５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），４０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，６０ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ，０．５％  ＮＰ４０，１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール）２５μｌと混合することによりアッセイした。酵素アッセイはＨａｎｔｚら（Ｑ．Ｈａｎｔｚら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｓｅｐ．，１９０（１）：１９３−２００（１９９２））に記載されているように実施した。簡単に説明すると、酵素反応物を３７℃で３時間インキュベートし、ＧＦ／Ｃファイバーガラスフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ）上にスポットし、５％  トリクロロ酢酸で十分に洗浄した。３Ｈ−ｄＴＴＰの取り込み量をＢｅｃｋｍａｎ  ＬＳ  ６０００ＳＣシンチレーションカウンターを用いて測定した。このアッセイの検出限界は１，０００ｃｐｍ／ｍｌであった。
【０１４８】
リアルタイムＰＣＲアッセイ（光サイクラー）
ウイルス力価がドットブロットハイブリダイゼーションにより簡単に検出するには低すぎる場合には、リアルタイムＰＣＲ技術を用いた（例えば、Ｄａｎｄｒｉら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，３２：１３９−４６（２０００）参照）。リアルタイムＰＣＲが１０コピーほどの少量のヒトＨＢＶ  ＤＮＡを検出することは公知である。従って、ウイルス血症を完全に分析するために、リアルタイムＰＣＲを用いて６×１０７コピー／ｍｌ（２００ｐｇ／ｍｌ）以下のＷＨＶ  ＤＮＡを検出するために使用した。同一ＷＨＶ  ＤＮＡ標準物質をドットブロットアッセイ及びリアルタイムＰＣＲアッセイのために使用した。ドットブロット陽性サンプルに対するＰＣＲアッセイで類似の定量結果が生じた。この方法の検出限界の下限は２５ＷＨＶコピー／μｌであった。
【０１４９】
リアルタイムＰＣＲで分析した３匹のウッドチャックにおけるウイルスクリアランス・リバウンドのカイネティックスの予備結果を図１０に示す。ウイルス力価は、９×１０４コピー／ｍｌの平均を表す０．３２０ｐｇ／ｍｌの低値に達することが判明した。この技術は、β−Ｌ−ＦＴＣの単独使用またはＡｄ  ＩＦＮのような免疫調節剤と併用の効果を調べるために更に動物サンプルにも適用され得る。
【０１５０】
（実施例５）
接種物力価の測定：
アデノウイルスベクター接種物の抗ウイルス効果及び耐性を調べるために、４匹の動物にＡｄ−ＩＦＮを３×１０７ｐｆｕ（Ａ３３）、３×１０９ｐｆｕ（Ａ３０）及び３×１０１１ｐｆｕ（Ａ３２及びＡ３４）の濃度で静注した。
【０１５１】
最高力価の接種物（３×１０１１ｐｆｕ）はウイルス量の著しい低下を誘発したが、２匹の動物すべてが注射後２日目及び５日目に死亡した（ＷＨＶ  ＤＮＡはＤ０〜死亡日までの間にそれぞれ１４７ｎｇ／ｍｌから７０ｎｇ／ｍｌに、１０６７ｎｇ／ｍｌから２６５ｎｇ／ｍｌに低下した）。３×１０９ｐｆｕ接種物は６日間で７０ｎｇ／ｍｌから約３０ｎｇ／ｍｌへの一時的減少を誘発した。最低力価の接種物はウイルス血症の減少を殆ど誘発しなかった（図３）。
【０１５２】
（実施例６）
有効性の研究−Ａｄ  ＩＦＮベクターの抗ウイルス効果の評価：
５匹のウッドチャック（Ａ３５、Ａ３６、Ａ３７、Ａ３８、Ａ４２）に３×１０９ｐｆｕの完全Ａｄ  ＩＦＮベクターを与えた。２匹のウッドチャック（Ａ３９、Ａ４０）からなるコントロール群には３×１０９ｐｆｕのＡｄ  ＧＦＰベクターを与え、１匹のウッドチャック（Ａ４１）は未治療であった（図４及び５）。
【０１５３】
Ａｄ  ＩＦＮ治療群では、５匹の治療動物のうち３匹で一過性のＷＨＶ  ＤＮＡの減少が観察された（Ａ３５では４６ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌ；Ａ３７では７６ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌ；Ａ４２では２０ｎｇ／ｍｌから５ｎｇ／ｍｌ）。ＷＨＶ  ＤＮＡの結果をＥＰＡによっても評価した（図４及び５）。肝臓内ＷＨＶ  ＤＮＡのサザンブロットハイブリダイゼーションは、ウイルスＤＮＡの著しい減少（Ａ４２を除いて１６〜７６％）及びＣＣＣ  ＤＮＡレベルの著しい減少（２〜７６％）を示した（図６）。
【０１５４】
（実施例７）
Ｌ−ＦＭＡＵ及びβ−Ｌ−ＦＴＣの評価：
結果はウイルス血症の有意な抑制を示し、β−Ｌ−ＦＴＣ、Ｌ−ＦＭＡＵ及びＡｄ  ＩＦＮで治療したすべての動物でドットブロットアッセイの検出限界（６×１０７コピー／ｍｌ）以下のほぼ４〜５ｌｏｇ単位減少した（図７参照）。しかしながら、対照（未治療、Ａｄ  ＧＦＰ）またはＡｄ  ＩＦＮのみで治療したウッドチャックはウイルス血症の有意な変化を示さなかった（図８及び９）。
【０１５５】
治療によるウイルス量の低下は著しく急速であった。ウイルス血症は治療開始から１〜２週間以内に検出不能レベル（＜６×１０７／ｍｌ）に減少した。
【０１５６】
β−Ｌ−ＦＴＣ、Ｌ−ＦＭＡＵ及びＡｄ  ＩＦＮで治療した動物におけるウイルス血症は治療の休薬後の色々な時間にわたり抑制されたままであった。更に、治療動物のウイルス量は治療前レベルまで戻らなかった。β−Ｌ−ＦＴＣ、Ｌ−ＦＭＡＵ及びＡｄ  ＩＦＮで治療した２匹のウッドチャック（Ａ５２及びＡ４９）のウイルス血症レベルは２８週（休薬後６ヶ月）でも依然として検出不能レベル以下であった。
【０１５７】
免疫調節剤との併用治療の結果は、ウイルス血症レベルの急速で有意な減少を示した（２週間以内に平均して５ｌｏｇ１０減少）。この減少は、β−Ｌ−ＦＴＣ及びＬ−ＦＭＡＵを単独で用いて得られる結果に比して有意である。以前の研究で、血清中のウイルス力価は同一時間フレームでそれぞれ約５６倍及び１０００倍低下した。この観察から、β−Ｌ−ＦＴＣ及びＬ−ＦＭＡＵの抗ウイルス活性が免疫調節剤と組み合わせたときに改善されたことが分かる。更に、この抗ウイルス効果は長期間持続し、ウイルスリバンドは遅れた。休薬から６または７ヶ月目の２匹の動物（Ａ４９及びＡ５２）の血清サンプルでウイルス血症はドットブロットアッセイ（＜６×１０７コピー／ｍｌ）で検出不能のままであった。この持続する効果はＣＣＣ  ＤＮＡレベルの減少（それぞれ〜６９％及び〜７５％）と一致する。治療中止後ウイルス複製リバウンドが遅れることは、新しい肝細胞の再感染によるＣＣＣ  ＤＮＡプールの再確立及び／または感染細胞中のＣＣＣ  ＤＮＡの既存の細胞内プールの再増殖に必要な時間を反映している。
【０１５８】
肝臓内ＣＣＣ  ＤＮＡ：
肝臓内ウイルスＤＮＡのサザンブロット分析（図１１）は、通常ウイルス血症パターンに一致していた肝臓内ＷＨＶ複製中間体レベルの変化を示した。ウイルスＤＮＡ合成レベルの著しい減少がβ−Ｌ−ＦＴＣ及びＬ−ＦＭＡＵ治療群で観察され、治療前レベルに比して肝臓内ウイルスＤＮＡ中間体レベルは８２〜９３％減少した（図１２及び１３）。ＣＣＣ  ＤＮＡはＭ１及びＭ２で肝臓において持続していたが、他のＷＨＶ  ＤＮＡ複製中間体は劇的に減少した。
【０１５９】
更に、ＣＣＣ  ＤＮＡもＬ−ＦＭＡＵ／β−Ｌ−ＦＴＣ治療中２４〜４７％減少した。しかしながら、サザンブロット分析で立証されるように、Ｌ−ＦＭＡＵ／β−Ｌ−ＦＴＣ投与によるＷＨＶ複製の抑制の後に肝臓内ウイルスＣＣＣ  ＤＮＡのクリアランスはなかった。
【０１６０】
しかしながら、未治療のウッドチャックでは総ＤＮＡもＣＣＣ  ＤＮＡも経時的にそれぞれ＋６４％、＋７７％増加した（図１４）。
【０１６１】
Ｃｕｌｌｅｎら（Ｃｕｌｌｅｎら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，４１：２０７６−２０８２（１９９７））、Ｚｈｕら（Ｚｈｕら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５：３１１−２２（２００１））及びＰｅｅｋら（Ｐｅｅｋら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，３３：２５４−６６（２００１））の結果と比較して、β−Ｌ−ＦＴＣとＩＦＮ及びＬ−ＦＭＡＵの併用は高い抗ウイルス効果を有している。肝臓において複製中間体は治療開始から１ヶ月で検出不能レベルに低下した。対照的に、肝臓内ＣＣＣ  ＤＮＡレベルは複製ＤＮＡよりも非常にゆっくりしか減衰しなかった。β−Ｌ−ＦＴＣとＬ−ＦＭＡＵの併用はウイルスＣＣＣ  ＤＮＡを４０％減少させた（ＤＮＡ複製中間体の場合９８％の減少）。この効果は、ＣＣＣ  ＤＮＡの平均１０倍の減少を示したＰｅｅｋら（Ｐｅｅｋら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，３３：２５４−６６（２００１））が立証しているようにＬ−ＦＭＡＵ単独での抗ウイルス効果に起因するであろう。しかしながら、Ｌ−ＦＭＡＵのみによる治療の８〜９ヶ月後にはＷＨＶの薬物耐性株が出現した（Ｔ．Ｚｈｏｕら，Ｊ．Ｖｉｒｏｎ．，７４：１１７５４−６３（２０００））。Ｌ−ＦＭＡＵとβ−Ｌ−ＦＴＣを併用すると薬物耐性株の出現は避けられ得、ＣＣＣ  ＤＮＡの残留プールを減らすことができる長期間治療が可能であり得る。
【０１６２】
（実施例８）
肝臓内ＷＨＶ  ＤＮＡ合成：
併用治療の結果とは異なって、Ａｄ  ＩＦＮ単独では肝臓中の総ウイルスレベル及びＣＣＣ  ＤＮＡレベルに影響を与えなかった（Ａｄ  ＧＦＰ群の総ＤＮＡの＋４３％に比して、それぞれ＋４４％及び−６％）（図１５）。
【０１６３】
（実施例９）
組換えアデノウイルスベクターによる肝細胞形質導入の評価：
アデノウイルス感染した肝細胞の数を調べるために、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に対する市販の抗体を用いて免疫染色した。しかしながら、観察された蛍光は対照に比して特異的でなく、肝細胞の天然蛍光または多分胆汁色素に起因し得る。
【０１６４】
（実施例１０）
組織検査：
β−Ｌ−ＦＴＣ併用治療した動物の肝生検切片の検査から、肝臓中の小葉病巣炎症が明らかとなった。Ａｄ  ＩＦＮ治療群のウッドチャックはすべて高い炎症活性を示した（図１５）。この群で６つの生検でＭｅｔａｖｉｒスコアの最高炎症活性が観察された。反対に、Ｌ−ＦＭＡＵ及びβ−Ｌ−ＦＴＣ治療群は同様のプロフィールを示さなかった。この群の６匹のウッドチャックのうち３匹のみが炎症活性の増加を示した。対照群では、ＭｅｔａｖｉｒスコアはＡｄ  ＩＦＮのみで治療した群でもずっと不変であった。
【０１６５】
（実施例１１）
ウイルス血症の分析：
ウイルス血症はＷＨＶ  ＤＮＡに対するドットブロット分析を用いて分析し、ウイルス血症が治療前値に戻るまでホスホイメージャーを用いて定量し得る。
【０１６６】
ウイルスの消失を確認しようとする場合には、ＰＣＲ条件下で血清から抽出したＤＮＡはドットブロットアッセイ（ウイルス血症  ６×１０７コピー／ｍｌ以下）により検出できてはならない。更に、ＤＮＡはリアルタイムＰＣＲ（Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ）アッセイにより分析されなければならない。これらの例では、リアルタイムＰＣＲ方法を特定プライマーを用いるＷＨＶ検出ＤＮＡのために改変した。
【０１６７】
（実施例１２）
肝臓内ウイルスＤＮＡ合成の分析：
治療後５ヶ月目に採取した生検の肝切片をサザンブロットハイブリダイゼーションにかけて、肝臓内ウイルスＤＮＡ合成を分析した。
【０１６８】
（実施例１３）
ＷＨＶポリメラーゼ遺伝子配列決定：
ＰｒｅＳ及びＲＴ領域をＰＣＲ増幅後エスケープ変異体が抗ウイルスプロトコルの１つにより選択されるか否かを調べるために循環ビリオン由来のゲノム配列を分析し得る。
【０１６９】
ＷＨＡ  ＤＮＡを治療期間終了時または動物死前の最良の時点で集めた血清からＰＣＲにより増幅させた。血清由来のＤＮＡを、公開されている配列を参照して逆転写酵素遺伝子のＢ及びＣドメインに相当する特異的プライマー対の５’−ＡＧＡＴＴＧＧＴＴＧＧＴＧＣＡＣＴＴＣＴ−３（ヌクレオチド３８５〜４０３）及び５’−ＡＴＴＧＴＣＡＧＴＧＣＣＣＡＡＣＡ−３（ヌクレオチド１４６８〜１４６１）及びＴａｑポリメラーゼを用いて３５サイクル（９４℃×１分間、５０℃×１分間及び７２℃×１分間）かけて増幅させた。ウイルスＤＮＡが存在しないことを確認するために、第１回増幅で陰性であることが分かったサンプルにおいてネステッドＰＣＲのために別のプライマー対、すなわち５’−ＧＧＡＴＧＴＡＴＣＴＧＧＧＧＣＧＴＴＴ−３’（ヌクレオチド５１０〜５２８）及び５’−ＣＣＣＡＡＡＴＣＡＡＧＡＡＡＡＡＣＡＧＡＡＣＡ−３’（ヌクレオチド９５３〜９３１）を用いた。
【０１７０】
（実施例１４）
電子顕微鏡による肝ミトコンドリアの検査：
肝生検切片を１５０ｍＭ  カコジル酸ナトリウムＨＣｌ（ｐＨ７．４）中１％  四酸化オスミウムで固定し、等級エタノールを用いて脱水し、メタノール性酢酸ウラニル及びクエン酸鉛で包埋し、透過型電子顕微鏡１２００ＥＸで分析すると、併用β−Ｌ−ＦＴＣ治療のミトコンドリア毒性が妨げられる。
【０１７１】
（実施例１５）
ＧＦＰまたはＲＦＰの可視化：
アデノウイルスベクターで感染した細胞の数は、５μｍ厚の脱パラフィン化肝組織切片を適当なフィルターを用いる共焦点顕微鏡により直接観察することによりモニターし得る。
【０１７２】
（実施例１６）
ＷＨＶ感染肝細胞の数の評価：
ＷＨＶ感染細胞の数は、表面及びキャプシドタンパク質を免疫染色することによりモニターすることができる。このためには、５μｍ厚の脱パラフィン化肝組織切片をＷＨＶコアまたはｐｒｅ−Ｓタンパク質に対するポリクローナル抗体を含む家兎血清と一晩インキュベートした。その後、切片をビオチニル化ヤギ抗−家兎免疫グロブリンＧとインキュベートした。抗原−抗体複合体をストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼを用いて明らかにした。ウイルスタンパク質を発現する感染肝細胞の数を肝切片の代表的領域で定量した。
【０１７３】
（実施例１７）
肝細胞ターンオーバーの分析：
アポトーシスを受けた肝細胞の数はＴＵＮＥＬ（ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介ｄＵＴＰニック末端標識）方法（Ｊ．Ｆ．Ｒ．Ｋｅｒｒ，Ａ．Ｈ．Ｗｙｌｌｉｅ及びＡ．Ｒ．Ｃｕｒｒｉｅ，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，２６：２３９−２５７（１９７２））を用いて測定し得る。細胞分裂周期有糸分裂において進行する肝細胞の数はＰＣＮＡについて免疫染色することにより測定し得る。
【０１７４】
本発明を好ましい実施態様を参照して説明してきたが、本発明の詳細説明から本発明の変更及び修飾は当業者に自明である。これらの変更及び修飾はすべて本発明の範囲内に含まれると解される。
【図面の簡単な説明】
【０１７５】
【図１】送達のために適したウッドチャックインターフェロンγを含むアデノウイルスベンターの非限定例を示す。コード領域を示し、規定する。
【図２】代表的なウッドチャックに対して与えた、ウッドチャックインターフェロンγを発現するアデノウイルスベクター（Ａｄ  ＩＦＮ）または緑色蛍光タンパク質を発現するアデノウイルスベクター（Ａｄ  ＧＦＰ）を注射してまたは注射せずに１−（２−フルオロ−５−メチル−β−Ｌ−アラビノシル）ウラシル（Ｌ−ＦＭＡＵ）及びβ−２−ヒドロキシメチル−５−（５−フルオロシトシン−１−イル）−１，３−オキサチオラン（ＦＴＣ）の治療レジメの非限定的概略図を示す。
【図３】ウッドチャックに異なる量（ｐｆｕ）のウッドチャックインターフェロンγを発現するアデノウイルスベクター（Ａｄ  ＩＦＮ）を注射する前及びその後のウッドチャックＢ型肝炎ウイルス（ＷＨＶ）のウイルスＤＮＡ量（コピー／ｍｌ）を経時的（日数）に示す４つのグラフである。矢印は接種時間及び生検時間を示す。左のＹ軸には、実施例３に記載したように内因性ポリメラーゼアッセイ（ＥＰＡ，ｄｐｍ／ｍｌ）により測定したウイルスプラス鎖ＤＮＡの量を時間に対してプロットして示す。
【図４】ウッドチャックに３×１０９ｐｆｕのウッドチャックインターフェロンγを発現する完全アデノウイルスベクター（Ａｄ  ＩＦＮ  ＧＦＰ）を注射する前及びその後のウッドチャックＢ型肝炎ウイルス（ＷＨＶ）のウイルスＤＮＡ量（コピー／ｍｌ）を経時的（日数）に示す５つのグラフである。矢印は接種時間及び生検時間を示す。左のＹ軸には、実施例３に記載したように内因性ポリメラーゼアッセイ（ＥＰＡ，ｄｐｍ／ｍｌ）により測定したウイルスプラス鎖ＤＮＡの量を時間に対してプロットして示す。データは実施例５により詳細に記載されている。
【図５】ウッドチャックに３×１０９ｐｆｕの緑色蛍光タンパク質を発現するアデノウイルスベクター（Ａｄ  ＧＦＰ）を注射する前及びその後（上部の２つのグラフ）または未治療コントロール（下部のグラフ）のウッドチャックＢ型肝炎ウイルス（ＷＨＶ）のウイルスＤＮＡ量（コピー／ｍｌ）を経時的（日数）に示す３つのグラフである。矢印は接種時間及び生検時間を示す。左のＹ軸には、実施例３に記載したように内因性ポリメラーゼアッセイ（ＥＰＡ，ｄｐｍ／ｍｌ）により測定したウイルスプラス鎖ＤＮＡの量を時間に対してプロットして示す。データは実施例５により詳細に記載されている。
【図６】ウッドチャックインターフェロンγを発現する完全アデノウイルスベクター（Ａｄ  ＩＦＮ  ＧＦＰ）または緑色蛍光タンパク質を発現するアデノウイルスベクター（Ａｄ  ＧＦＰ）を注射したかまたは未治療のウッドチャックから治療の１ヶ月前（Ｍ−１）及び注射から５日目（Ｄ５）に採取したウッドチャックＢ型肝炎ウイルス（ＷＨＶ）に感染したウッドチャックの肝生検で認められるウイルスＤＮＡを分析したサザンブロットのコピーである。下部ブロットはＤＮＡ（ＣＣＣ）ＤＮＡの共有結合閉環ウイルス形態のものである。グラフの下の数字はＤ５／Ｍ−１でのＤＮＡの比を％で示す。
【図７】実施例６に記載されているようにウッドチャックインターフェロンγを発現するアデノウイルスベクター（Ａｄ  ＩＦＮ）を注射しまたは注射せずに動物を１−（２−フルオロ−５−メチル−β−Ｌ−アラビノシル）ウラシル（Ｌ−ＦＭＡＵ）及びβ−２−ヒドロキシメチル−５−（５−フルオロシトシン−１−イル）−１，３−オキサチオラン，エントリヴァ，エントリシタビン（ＦＴＣ）で治療している間及びその後のウッドチャックＢ型肝炎ウイルス（ＷＨＶ）のウイルス濃度（コピー／ｍｌ）を経時的（日数）に示すグラフである。結果は実施例３に記載されているドットブロットアッセイを用いて得た。
【図８】実施例６に記載されているように動物にウッドチャックインターフェロンγを発現するアデノウイルスベクター（Ａｄ  ＩＦＮ）または緑色蛍光タンパク質を発現するアデノウイルスベクター（Ａｄ  ＧＦＰ）を注射して治療している間及びその後のウッドチャックＢ型肝炎ウイルス（ＷＨＶ）のウイルス濃度（コピー／ｍｌ）を経時的（日数）に示すグラフである。結果は実施例３に記載されているドットブロットアッセイを用いて得た。Ａｄ  ＩＦＮのみで治療した対照ウッドチャックはウイルス血症に有意な変化を示さなかった。
【図９】実施例６に記載されているように未治療動物におけるウッドチャックＢ型肝炎ウイルスのウイルス濃度（コピー／ｍｌ）を経時的（日数）に示すグラフである。結果は実施例３に記載されているドットブロットアッセイを用いて得た。
【図１０】実施例３に記載されているリアルタイムＰＣＲを用いて測定した、ウッドチャックインターフェロンγを発現するアデノウイルスベクター（Ａｄ  ＩＦＮ）を注射しまたは注射せずに動物を１−（２−フルオロ−５−メチル−β−Ｌ−アラビノシル）ウラシル（Ｌ−ＦＭＡＵ）及びβ−２−ヒドロキシメチル−５−（５−フルオロシトシン−１−イル）−１，３−オキサチオラン，エントリヴァ，エントリシタビン（ＦＴＣ）で治療している間及びその後のウッドチャックＢ型肝炎ウイルス（ＷＨＶ）のウイルス量（コピー／ｍｌ）を経時的（日数）に示すグラフである。
【図１１】１−（２−フルオロ−５−メチル−β−Ｌ−アラビノシル）ウラシル（Ｌ−ＦＭＡＵ）、β−２−ヒドロキシメチル−５−（５−フルオロシトシン−１−イル）−１，３−オキサチオラン，エントリヴァ，エントリシタビン（ＦＴＣ）、ウッドチャックインターフェロンγを発現するアデノウイルスベクター（Ａｄ  ＩＦＮ）または緑色蛍光タンパク質を発現するアデノウイルスベクター（Ａｄ  ＧＦＰ）で治療したかまたは未治療のウッドチャックから治療直前（Ｔ０）、治療に入って１ヶ月目（Ｍ１）及び治療に入って２ヶ月目（Ｍ２）に採取したウッドチャックＢ型肝炎ウイルス（ＷＨＶ）に感染したウッドチャックの肝生検で認められるウイルスＤＮＡを分析したサザンブロットのコピーである。下部ブロットはＤＮＡ（ＣＣＣ）ＤＮＡの共有結合閉環ウイルス形態のものである。グラフの下の数字はＤ５／Ｍ−１でのＤＮＡの比を％で示す。
【図１２】１−（２−フルオロ−５−メチル−β−Ｌ−アラビノシル）ウラシル（Ｌ−ＦＭＡＵ）、β−２−ヒドロキシメチル−５−（５−フルオロシトシン−１−イル）−１，３−オキサチオラン，エントリヴァ，エントリシタビン（ＦＴＣ）またはウッドチャックインターフェロンγを発現するアデノウイルスベクター（Ａｄ  ＩＦＮ）で治療した動物におけるウッドチャックＢ型肝炎ウイルス（ＷＨＶ）ウイルスＤＮＡ及び共有結合閉環ウイルス形態のＤＮＡ（ＣＣＣ）ＤＮＡの％、すなわちウイルスの減少を示すグラフである。Ｍ０は治療直前に採取したサンプルを示す。Ｍ１は治療に入ってから１ヶ月目に採取したサンプルを示す。Ｍ２は治療に入ってから２ヶ月目に採取したサンプルを示す。
【図１３】１−（２−フルオロ−５−メチル−β−Ｌ−アラビノシル）ウラシル（Ｌ−ＦＭＡＵ）及びβ−２−ヒドロキシメチル−５−（５−フルオロシトシン−１−イル）−１，３−オキサチオラン，エントリヴァ，エントリシタビン（ＦＴＣ）で治療した動物におけるウッドチャックＢ型肝炎ウイルス（ＷＨＶ）ウイルスＤＮＡ及び共有結合閉環ウイルス形態のＤＮＡ（ＣＣＣ）ＤＮＡの％、すなわちウイルスの減少を示すグラフである。Ｔ０は治療直前に採取したサンプルを示す。Ｍ１は治療に入ってから１ヶ月目に採取したサンプルを示す。Ｍ２は治療に入ってから２ヶ月目に採取したサンプルを示す。
【図１４】ウッドチャックインターフェロンγを発現するアデノウイルスベクター（Ａｄ  ＩＦＮ）または緑色蛍光タンパク質を発現するアデノウイルスベクター（Ａｄ  ＧＦＰ）を注射して治療したかまたは未治療の動物におけるウッドチャックＢ型肝炎ウイルス（ＷＨＶ）ウイルスＤＮＡ及び共有結合閉環ウイルス形態のＤＮＡ（ＣＣＣ）ＤＮＡの％を示すグラフである。Ｔ０は治療直前に採取したサンプルを示す。Ｍ１は治療に入ってから１ヶ月目に採取したサンプルを示す。Ｍ２は治療に入ってから２ヶ月目に採取したサンプルを示す。
【図１５】１−（２−フルオロ−５−メチル−β−Ｌ−アラビノシル）ウラシル（Ｌ−ＦＭＡＵ）及びβ−２−ヒドロキシメチル−５−（５−フルオロシトシン−１−イル）−１，３−オキサチオランＥｍｔｒｉｖａ，エントリシタビン（ＦＴＣ）で治療、ウッドチャックインターフェロンγを発現するアデノウイルスベクター（Ａｄ  ＩＦＮ）または緑色蛍光タンパク質を発現するアデノウイルスベクター（Ａｄ  ＧＦＰ）を注射した後または未治療コントロールの実施例２に記載されている炎症活性の量（Ｍｅｔａｖｉｒスコア）を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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