(57)【要約】分離カラムおよび分離カラムを調製する方法を提供する。分離カラムは、分離チャネルおよびチャネル中の多孔性マトリックスを含む。多孔性マトリックスは、フォトポリマーのような金属有機ポリマーを含む。多孔性マトリックスは、分析物の試料を分離するように適合された分離媒体であっても、チャネル中の分離媒体を保持するように適合されたフリットであってもよい。
2005507072.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分離チャネルと、
チャネル中にある多孔性マトリックスとを備える分離カラムであって、前記多孔性マトリックスは金属有機フォトポリマーを備え、前記多孔性マトリックスは均一であり、クロマトグラフィー粒子を含有しない分離カラム。
【請求項２】
前記多孔性マトリックスが、分離媒体を含む請求項１記載のカラム。
【請求項３】
分離チャネルがチャネル壁をもち、媒体がチャネル壁に付着し、チャネルの少なくとも１つのセクションを満たす請求項２記載のカラム。
【請求項４】
フォトポリマーの前駆体が、金属アルコキシドを含む請求項１記載のカラム。
【請求項５】
金属アルコキシドが金属を含み、金属がアルミニウム、バリウム、アンチモン、カルシウム、クロム、銅、エルビウム、ゲルマニウム、鉄、鉛、リチウム、りん、カリウム、けい素、タンタル、すず、チタン、バナジウム、亜鉛、およびジルコニウムからなる群から選択される請求項４記載のカラム。
【請求項６】
金属アルコキシドが、少なくとも１つの光活性基を含む請求項４記載のカラム。
【請求項７】
多孔性マトリックスが、分析物に対して親和性を有する請求項１記載のカラム。
【請求項８】
分離チャネルが、キャピラリー分離チャネルまたは平面構造である請求項１記載のカラム。
【請求項９】
前記多孔性マトリックスが、前記チャネル中に分離媒体を保持するように適合された少なくとも１つのフリットを備える請求項１記載のカラム。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのフリットが、制御された多孔度を有する請求項９記載のカラム。
【請求項１１】
前記フリットが、前記チャネル壁の内表面に結合される請求項９記載のカラム。
【請求項１２】
前記分離チャネルが、入口と出口との間に延在し、かつ、チャネル壁を有し、ここにおいて、前記フリットが、前記入口、前記出口またはその両方に隣接している請求項９記載のカラム。
【請求項１３】
前記分離チャネルが、約５μｍと１０００μｍとの間の範囲にある内径を有する溶融シリカキャピラリーであり、前記フリットが、前記チャネル中の前記分離媒体の充填中に高圧に耐えるのに十分な構造のフリットである請求項９記載のカラム。
【請求項１４】
前記フリットが、メタクリレート置換シリケートに由来する請求項９記載のカラム。
【請求項１５】
前記フリットが、光硬化性のメタクリレート置換シリケートに由来する請求項１４記載のカラム。
【請求項１６】
前記カラムが、分離媒体で充填される第１の部分および照射する前記第１の部分に隣接する第２の部分を有する請求項９記載のカラム。
【請求項１７】
前記第２の部分が、前記分離媒体を含まない請求項１６記載のカラム。
【請求項１８】
分離チャネルと、
チャネル中にある多孔性マトリックスとを備える分離カラムであって、前記多孔性マトリックスは金属有機ポリマーを備え、前記多孔性マトリックスは均一であり、クロマトグラフィー粒子を含有しない分離カラム。
【請求項１９】
分離チャネルと、
チャネル中にある多孔性マトリックスとを備える分離カラムであって、前記多孔性マトリックスは金属有機フォトポリマーを備える分離カラム。
【請求項２０】
分離カラムを調製する方法であって、
分離カラムを提供し、
カラム中に混合物を導入し、混合物が金属有機化合物を含むものとし、
混合物を照射し、混合物に光開始重合を経て固体の多孔性マトリックスを生成させること、
を含む分離カラムを調製する方法。
【請求項２１】
多孔性マトリックスが、クロマトグラフィー粒子を含まない請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
混合物が、少なくとも１つの金属有機モノマー、少なくとも１つの細孔形成剤、および光開始剤を含む請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
マトリックス中に細孔を生成するために制御可能に細孔形成剤が選択される請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
マトリックス中に細孔を生成するためにモノマーの細孔形成剤に対するモル比を選択することをさらに含む請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
照射することは、可視光または紫外光で混合物を照射することを含む請求項２０記載の方法。
【請求項２６】
カラム中に有機溶媒を導入し、カラムが固体の多孔性マトリックスを含むようにすることをさらに含む請求項２０記載の方法。
【請求項２７】
分離カラムを提供することは、キャピラリーまたは平面構造を提供することを含む請求項２０記載の方法。
【請求項２８】
分析物の試料を分離する方法であって、
分離チャネルおよびチャネル中の分離媒体を備え、前記媒体は多孔性マトリックスを備え、前記多孔性マトリックスは金属有機フォトポリマーを備える分離カラムを提供し、
カラムを通して溶液中に含まれる分析物の試料を導入し、媒体が分析物をカラム上に濃縮し、
カラムを通して溶液を流し、それにより分析物を分離し溶出すること、
を含む分析物の試料を分離する方法。
【請求項２９】
試料を導入することは、カラムに電圧または圧力を加えることを含む請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
試料を導入することは、カラムを通して第１の溶液中に含まれる分析物の試料を導入することを含み、溶液を流すことは第２の溶液をカラムを通して流すことを含み、第１の溶液が第２の溶液と同じ溶液である請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
試料を導入することは、カラムを通して第１の溶液中に含まれる分析物の試料を導入することを含み、第１の溶液が溶出溶媒を含み、溶液を流すことは、第２の溶液をカラムを通して流すことを含み、第２の溶液が溶出溶媒を含み、第１の溶液中の溶出溶媒の濃度が第２の溶液中の溶出溶媒の濃度より低い請求項２８記載の方法。
【請求項３２】
試料を導入することは、カラムの長さよりも大きな注入プラグ長を有する分析物の試料を導入することを含む請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
試料を導入することは、試料スタッキングを起させることを含む請求項２８記載の方法。
【請求項３４】
分離カラムを提供することは、クロマトグラフィー粒子をもたない多孔性マトリックスを備える分離媒体を提供することを含む請求項２８記載の方法。
【請求項３５】
分離カラムを提供することは、キャピラリーまたは平面構造を備える分離カラムを提供することを含む請求項２８記載の方法。
【請求項３６】
分離チャネルと、
チャネル中にあるフリットをもたない分離媒体とを備える分離カラムであって、前記分離媒体は多孔性マトリックスを備え、前記多孔性マトリックスは金属有機フォトポリマーを備える分離カラム。
【請求項３７】
分離チャネルがチャネル壁をもち、媒体がチャネル壁に付着し、チャネルの少なくとも１つのセクションを満たす請求項３６記載のカラム。
【請求項３８】
多孔性マトリックスが均一であり、クロマトグラフィー粒子を含有しない請求項３６記載のカラム。
【請求項３９】
フォトポリマーの前駆体が、金属アルコキシドを含む請求項３６記載のカラム。
【請求項４０】
金属アルコキシドが金属を含み、金属がアルミニウム、バリウム、アンチモン、カルシウム、クロム、銅、エルビウム、ゲルマニウム、鉄、鉛、リチウム、りん、カリウム、けい素、タンタル、すず、チタン、バナジウム、亜鉛、およびジルコニウムからなる群から選択される請求項３９記載のカラム。
【請求項４１】
金属アルコキシドが、少なくとも１つの光活性基を含む請求項３９記載のカラム。
【請求項４２】
多孔性マトリックスが、分析物に対して親和性を有する請求項３６記載のカラム。
【請求項４３】
分離媒体が、均一相を含む請求項３６記載のカラム。
【請求項４４】
分離チャネルが、キャピラリー分離チャネルまたは平面構造である請求項３６記載のカラム。
【請求項４５】
分離チャネルと、
チャネル中にあるフリットをもたない分離媒体とを備える分離カラムであって、前記分離媒体は多孔性マトリックスを備え、前記多孔性マトリックスは金属有機ポリマーを備える分離カラム。
【請求項４６】
分離カラム中にモノリスを調製する方法であって、
分離カラムを提供し、
カラム中に混合物を導入し、混合物が金属有機化合物を含むものとし、
混合物を照射し、混合物に光開始重合を経て固体の多孔性マトリックスを生成させ、それによりカラム中にフリットをもたない分離媒体を生成すること、
を含む分離カラム中にモノリスを調製する方法。
【請求項４７】
多孔性マトリックスが、クロマトグラフィー粒子を含まない請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
混合物が、少なくとも１つの金属有機モノマー、少なくとも１つの細孔形成剤、および光開始剤を含む請求項４６記載の方法。
【請求項４９】
マトリックス中に細孔を生成するために制御可能に細孔形成剤が選択される請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
マトリックス中に細孔を生成するためにモノマーの細孔形成剤に対するモル比を選択することをさらに含む請求項４８記載の方法。
【請求項５１】
照射することは、可視光または紫外光で混合物を照射することを含む請求項４６記載の方法。
【請求項５２】
カラム中に有機溶媒を導入し、カラムが固体の多孔性マトリックスを含むようにすることをさらに含む請求項４６記載の方法。
【請求項５３】
分離カラムを提供することは、キャピラリーまたは平面構造を提供することを含む請求項４６記載の方法。
【請求項５４】
分析物の試料を分離する方法であって、
分離チャネルおよびチャネル中のフリットをもたない分離媒体を備え、前記媒体は多孔性マトリックスを備え、前記多孔性マトリックスは金属有機フォトポリマーを備える分離カラムを提供し、
カラムを通して溶液中に含まれる分析物の試料を導入し、媒体が分析物をカラム上に濃縮し、
カラムを通して溶液を流し、それにより分析物を分離し溶出すること、
を含む分析物の試料を分離する方法。
【請求項５５】
試料を導入することは、カラムに電圧または圧力を加えることを含む請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
試料を導入することは、カラムを通して第１の溶液中に含まれる分析物の試料を導入することを含み、溶液を流すことは、第２の溶液をカラムを通して流すことを含み、第１の溶液が第２の溶液と同じ溶液である請求項５４記載の方法。
【請求項５７】
試料を導入することは、カラムを通して第１の溶液中に含まれる分析物の試料を導入することを含み、第１の溶液が溶出溶媒を含み、溶液を流すことは、第２の溶液をカラムを通して流すことを含み、第２の溶液が溶出溶媒を含み、第１の溶液中の溶出溶媒の濃度が第２の溶液中の溶出溶媒の濃度より低い請求項５４記載の方法。
【請求項５８】
試料を導入することは、カラムの長さよりも大きな注入プラグ長を有する分析物の試料を導入することを含む請求項５４記載の方法。
【請求項５９】
試料を導入することは、試料スタッキングを起させることを含む請求項５４記載の方法。
【請求項６０】
分離カラムを提供することは、クロマトグラフィー粒子をもたない多孔性マトリックスを備える分離媒体を提供することを含む請求項５４記載の方法。
【請求項６１】
分離カラムを提供することは、キャピラリーまたは平面構造を備える分離カラムを提供することを含む請求項５４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に分離カラムに関し、特に、光重合ゾルゲル成分を備える分離カラムおよび関連する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
高いピーク分離能力（すなわち、単位時間あたりに分離されるピークの数）を備えるキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）が、イオン種をその電気泳動易動度によって分離するための強力かつ広く用いられる技法へと過去１０年間にわたって発展されてきた。しかし、ＣＺＥにおいて、非荷電分析物についての選択性の欠如は、さらなる問題として残った。非荷電化合物が分離され得る偽の固定相を提供することにより、この問題を克服することを助けるミセル電気力学クロマトグラフィー（ＭＥＫＣ）のようないくつかの方法が開発された。ＭＥＫＣのような方法の適用は、この技法において使用できる偽の固定相の数が限られているせいで、限定されている。
【０００３】
クロマトグラフィーの移動機構および電気泳動の移動機構の両方を組み合わせたキャピラリーエレクトロクロマトグラフィー（ＣＥＣ）の登場とともに、非荷電分析物の混合物の分離および解析を高い分離能および高い効率で少ない試料容積を用いて達成することができる。分析的な適用に関するＣＥＣへの関心の増大は、プレート数の多さ、および達成された比較的高速の分離速度、および用いることができる幅広い固定相（高速液体クロマトグラフィーで通常用いられる期間）に起因する。
【０００４】
ＣＥＣは多くの異なる分野で利用されてきたが、充填カラム調製と低検出感度がいまだにこの技法の難点である。小さなシリカ充填物を含有するキャピラリーカラムがＣＥＣの中心であった。制御された細孔サイズ、細孔の長さ、および高度な機械的安定性を有する多孔性フリットの作製が充填カラムの欠点のひとつである。このようなキャピラリーの能力に対するフリットの効果に関する系統的な研究は報告されていないが、これらのフリットがこれらのキャピラリーカラムの有効性を低下させ得ると考えられる。
【０００５】
それにもかかわらず、分離カラムが、フリットを要する充填材料を有することが望まれる場合、フリットを作製するために簡単かつ再現可能な手順を有することが望まれる。粒子充填カラムのためのフリットの作製の従来の方法は、オクタデシルシリカ粒子（ＯＤＳ）のような充填材料のセクションの熱焼結を包含する。このアプローチには、いくつかの欠点がある。すなわち、（１）確実かつ再現可能にフリットを生成することが困難、（２）フリット自体の中の固定相の特徴の変更、（３）フリットの多孔度を制御することが困難、（４）フリットの位置でのキャピラリーの弱さ、（５）フリットによって生じるバンドの広域化、（６）泡の形成、およびフリット上の極性分析物の吸着がある。これらの問題は、カラムの性能、およびカラム間の再現性に直接影響し得る。
【０００６】
キャピラリーカラムの調製についての別のアプローチが報告され、これらのアプローチはスラリーおよび電気力学的充填に関連するフリットの作製およびカラム調製の技術的問題を回避する。１つのアプローチでは、結合固定相を用いる。しかし、このように調製されたキャピラリーカラムは、低い保持能力および低い試料分離能力、並びに長い調製時間を欠点としてもつ。開管キャピラリーカラムの調製のための別の方法は、モノリス形充填技術を用いる。例えば、ゾルゲル化学に基づいてクロマトグラフィー粒子を取り込んだモノリス形多孔性キャピラリーカラムの調製および特徴づけが示されている（例えば、デュレイら著，アナリティカル・ケミストリー，７０巻，（１９９８年），ｐ．５１０３〜５１０７， (Dulay et al., Anal. Chem., 70, pp. 5103-5107, 1998) （非特許文献１）を参照されたい）。モノリス形キャピラリーカラムは透過性と表面電荷の制御で得られる優位性ゆえに大いに注目されてきた。
【０００７】
ＣＥＣ技法の１つの大きな問題は、分析物を低濃度で含有する試料の検出である。低濃度での感度の欠如は、小さな試料容積とオンライン検出用の短い光路長に起因する。多くの実際の分析で必要な感度を得るために試料注入前に標的分析物を濃縮する専用の試料前処理方式がしばしば必要である。溶媒−溶媒抽出および固相抽出等の方式は、しばしば非常に煩雑で時間を浪費する。
【０００８】
これらの前処理法に代るものがオンライン予備濃縮である。ガスクロマトグラフィーでは、ガスの気流を低温カラム中に通し、後に加熱することにより目的を果す。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）では、通常、初めの溶媒中では後に続く溶媒中よりも分析物をカラム上にはるかに強く保持するグラジエントＨＰＬＣによりこの過程を行う。オンライン予備濃縮は、電気泳動分離でもある程度成功してきた。例えば、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）での予備濃縮は、等速泳動、試料スタッキング、スイーピング、およびダイナミックｐＨ接合の使用を含む。ＣＺＥでは、試料およびバックグラウンド溶液のゾーン間の電場強度の変化を用いて荷電種を濃縮（すなわち、スタック）できることを示した（例えば、エフ・イー・ピー・ミッカーズ，エフ・エム・エヴァラーツ，ピー・イー・エム・フェアヘッゲン著，ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー，１６９巻（１９７９年），ｐ．１〜１０ (F. E. P. Mikkers, F. M. Everaerts, P. E. M. Verheggen, J. Chromatogr. 169 (1979), pp. 1-10) （非特許文献２）およびアール・エル・シアン，ディー・エス・ブルギ著，アナリティカル・ケミストリー，６４巻（１９９２年）ｐ．４８９Ａ〜４９６Ａ (R. L. Chien, D. S. Burgi, Anal. Chem. 64 (1992) pp. 489A-496A)（非特許文献３）を参照されたい）。電気力学クロマトグラフィーでは、ミセルを用いて中性および荷電種を濃縮（すなわち、スイープ）できることを示した（例えば、ジェー・ピー・クイリノ，エス・テラベ著，サイエンス，２８２巻（１９９８年）ｐ．４６５〜４６８ (J. P. Quirino, S. Terabe, Science, 282 (1998) pp. 465-68) （非特許文献４）およびジェー・ピー・クイリノ，エス・テラベ著，アナリティカル・ケミストリー，７１巻８号（１９９９年）ｐ．１６３８〜１６４４ (J. P. Quirino, S. Terabe, Anal. Chem. 71(8) (1999) pp. 1638-44) （非特許文献５）を参照されたい）。
【０００９】
粒子（例えば、オクタデシルシリカ）充填カラムを用いるＣＥＣでは、グラジエント高速液体クロマトグラフィーの効果に類似の濃縮効果が報告された。これらの濃縮効果は、（１）ステップグラジエント溶出、（２）非溶出溶媒中での試料の調製、または（３）試料注入後の水プラグの注入を用いて達成された。エム・アール・テーラー，ピー・ティール，ディー・ウェストウッド，ディー・ペレット著，アナリティカル・ケミストリー，６９巻（１９９７年）ｐ．２５５４〜２５５８ (M. R. Taylor, P. Teale, D. Westwood, D. Perrett, Anal. Chem. 69 (1997) pp. 2554-58) （非特許文献６）に、ステロイド試料の予備濃縮を目的としたステップグラジエントの使用について１９９７年に最初に報告された。ディー・エー・スティード，アール・ジー・リード，アール・ビー・テーラー著，ジャーナル・オブ・クロマトグラフィーＡ，７９８巻（１９９８年）ｐ．２５９〜２６７ (D. A. Stead, R. G. Reid, R. B. Taylor, J. Chromatogr. A 798 (1998) pp. 259-67)（非特許文献７）は、非溶出試料マトリックスを用いて予備濃縮することによりステロイド混合物の検出感度において１７倍の増大を達成した。ワイ・ツァン，ジェー・ツー，エル・ツァン，ダブリュー・ツァン著，アナリティカル・ケミストリー，７２巻（２０００年）ｐ．５７４４〜５７４７ (Y. Zhang, J. Zhu, L. Zhang, W. Zhang, Anal. Chem. 72 (2000) pp. 5744-47)（非特許文献８）もベンゾインとメフェニトインのそれぞれ１３４倍および２１９倍の予備濃縮に非溶出溶媒を用いた。シー・エム・ヤン，ジー・エル・ラッシ著，エレクトロフォレシス，２０巻（１９９９年）ｐ．２３３７〜２３４２ (C. M. Yang, Z. El Rassi, Electrophoresis 20 (1999) pp. 2337-42) （非特許文献９）に、長い試料プラグの後に注入された短い水プラグを用いた殺虫剤の希薄試料の予備濃縮について報告された。エム・ジェー・ヒルホースト，ジー・ダブリュー・ソムセン，ジー・ジェー・デ・ヨング著，クロマトグラフィカ，５３巻（２００１年）ｐ．１９０〜１９６ (M. J. Hilhorst, G. W. Somsen, G. J. de Jong, Chromatographia 53 (2001) pp. 190-96)（非特許文献１０）に、非溶出マトリックスおよびステップグラジエント溶出を用いた構造的に関連するステロイド類の予備濃縮を示した。７〜９倍の感度の増大について報告された。同様に、ティー・テゲラー，ジー・エル・ラッシ著，アナリティカル・ケミストリー，７３巻１４号（２００１年）ｐ．３３６５〜３３７２ (T. Tegeler, Z. El Rassi, Anal. Chem. 73(14) (2001) pp. 3365-72) （非特許文献１１）に、非溶出マトリックスおよびステップグラジエント溶出の組合せを用いたカーバメート殺虫剤混合物中の分析物の予備濃縮について報告された。最長許容試料プラグ長は約２０ｃｍであり、カルボフランについて５００倍の感度増大を達成した。ツァンと共同研究者らは、電場促進試料注入を溶媒グラジエント溶出と組み合わせることによりさらなる検出感度の増大を達成した。彼らは、正に帯電した分析物プロパテネンについてピーク高さの１７，０００倍の増大を示した。
【００１０】
上述した方法に関して改善された特性を有し、しかも作製が容易である分離カラムを提供することが望まれている。
【非特許文献１】
デュレイら著，アナリティカル・ケミストリー，７０巻，（１９９８），ｐ．５１０３〜５１０７
【非特許文献２】
エフ・イー・ピー・ミッカーズ，エフ・エム・エヴァラーツ，ピー・イー・エム・フェアヘッゲン著，ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー，１６９巻（１９７９年），ｐ．１〜１０
【非特許文献３】
アール・エル・シアン，ディー・エス・ブルギ著，アナリティカル・ケミストリー，６４巻（１９９２年）ｐ．４８９Ａ〜４９６Ａ
【非特許文献４】
ジェー・ピー・クイリノ，エス・テラベ著，サイエンス，２８２巻（１９９８年）ｐ．４６５〜４６８
【非特許文献５】
ジェー・ピー・クイリノ，エス・テラベ著，アナリティカル・ケミストリー，７１巻８号（１９９９年）ｐ．１６３８〜１６４４
【非特許文献６】
エム・アール・テーラー，ピー・ティール，ディー・ウェストウッド，ディー・ペレット著，アナリティカル・ケミストリー，６９巻（１９９７年）ｐ．２５５４〜２５５８
【非特許文献７】
ディー・エー・スティード，アール・ジー・リード，アール・ビー・テーラー著，ジャーナル・オブ・クロマトグラフィーＡ，７９８巻（１９９８年）ｐ．２５９〜２６７
【非特許文献８】
ワイ・ツァン，ジェー・ツー，エル・ツァン，ダブリュー・ツァン著，アナリティカル・ケミストリー，７２巻（２０００年）ｐ．５７４４〜５７４７
【非特許文献９】
シー・エム・ヤン，ジー・エル・ラッシ著，エレクトロフォレシス，２０巻（１９９９年）ｐ．２３３７〜２３４２
【非特許文献１０】
エム・ジェー・ヒルホースト，ジー・ダブリュー・ソムセン，ジー・ジェー・デ・ヨング著，クロマトグラフィカ，５３巻（２００１年）ｐ．１９０〜１９６
【非特許文献１１】
ティー・テゲラー，ジー・エル・ラッシ著，アナリティカル・ケミストリー，７３巻１４号（２００１年）ｐ．３３６５〜３３７２
【非特許文献１２】
シー・ユー，エフ・スヴェク，ジェー・エム・ジェー・フレシェット著，エレクトロフォレシス，２１巻１号（２０００年）ｐ．１２０〜１２７
【非特許文献１３】
エイチ・ジー・ウー，エル・ワイ・ホン，エス・ワイ・キム，エス・エイチ・パク，エス・ジェー・ソン，エイチ・エス・ハム著，ブレティン・オブ・ザ・コリアン・ケミカル・ソサエティー，１６巻（１９９５年）ｐ．１０５６〜１０５９
【非特許文献１４】
エム・カトー，エム・デュレイ，ビー・ベネット，ジェー・クイリノ，アール・ザーレ，ジャーナル・オブ・クロマトグラフィーＡ，９２４巻（２００１年），ｐ．１８７〜１９５
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の実施形態によれば、分離カラムは、分離チャネルおよびチャネル中の多孔性マトリックスを含む。多孔性マトリックスは、金属有機フォトポリマーを含む。この実施形態において、多孔性マトリックスは、好ましくはクロマトグラフィー粒子をまったく含まず、一般に均一である。本発明の実施形態において、分離カラムは、キャピラリーカラムを含み得る。
【００１２】
本発明の別の実施形態において、多孔性マトリックスは、チャネルにおいて分離媒体を保持するように適合されたフリットを備え得る。フリットは、制御された多孔度を有し得、光硬化性のメタクリレート置換シリケートに由来し得る。光重合は、一般に照射によって開始されるので、フリットの位置は、局在化され得、多孔度は再現性をもって制御され得る。
【００１３】
本発明のさらなる別の実施形態において、多孔性マトリックスは、予備濃縮に適合された分離媒体を含み、クロマトグラフィー粒子なしで分析物を分離することができる。分離媒体は、フリットをもたなくてもよい。分離媒体はクロマトグラフィー粒子を用いる分離カラムよりも大きな容積の分析物の予備濃縮および分離を可能にしてもよいと考えられる。
【００１４】
本発明は、さらに分離カラムを調製する方法を包含する。本発明の方法による一実施形態によれば、混合物をキャピラリーカラム中へ導入する。混合物は、金属有機化合物を含む。次いで、混合物をキャピラリーカラム内で照射し、光開始重合を経て固体の多孔性マトリックスを生成させる。この実施形態においては、多孔性マトリックスは、好ましくはクロマトグラフィー粒子をまったく含まない。クロマトグラフィー粒子をもたない分離カラムの調製は、クロマトグラフィー粒子をもつ分離カラムを調製するより比較的容易である。
【００１５】
多孔性マトリックスの調製のための光化学的方法には多くの利点がある。すなわち、（１）短い調製時間、（２）細孔サイズの制御、（３）多孔性マトリックスの場所と長さの制御、（４）高い機械的強度、および（５）クラッキングにつながる高温の回避である。
【００１６】
また、本発明は、分析物の試料を分離する方法を包含する。本発明の実施形態によれば、この方法は、分離チャネルと分離チャネル内に位置する分離媒体を含む分離カラムを提供することから始まる。分離媒体は多孔性マトリックスを含み、多孔性マトリックスは金属有機ポリマーから生成され、好ましくはクロマトグラフィー粒子をまったく含まない。次に、溶液中に含まれる分析物の試料がカラム内を通過する。分離媒体は分析物をカラム内に予備濃縮する。次いで、溶液は分離カラムを通して流され、分析物を分離し溶出する。分離媒体は、分析物を予備濃縮しかつ分離する。分離媒体によって及ぼされる効果に加えて、溶媒グラジエントまたは試料スタッキングによって予備濃縮をさらに強化することができる。
【００１７】
本発明の上述した特徴および他の特徴および態様は、添付する図面とともに後述する詳細な説明を読めばより明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
説明を簡略化するために、本願における同様または類似の部分については同じ参照記号を用いる。
【００１９】
光重合ゾルゲル（ＰＳＧ）成分を有する分離カラム
図１Ａは、本発明の実施形態による調製された分離カラム１１の長手方向断面図である。分離カラム１１は、キャピラリーカラム１２中の分離チャネル１３と分離チャネル１３中の多孔性マトリックス１５を含む。本発明の異なる実施形態において、分離カラム１１には、別のタイプの管または平面チップが含まれるがこれらに限定されない異なる形態をとってもよく、さらに検出窓を含んでもよい。
【００２０】
キャピラリーカラム１２は、円形断面をもつことができるが、これに限定されない多くの異なる断面をもつことができる。別の実施形態では、キャピラリーカラム１２は長く伸びた断面をもってもよい。キャピラリーカラム１２のためにはこのような断面や他の断面も使用可能であり、本発明の範囲内である。キャピラリーカラム１２は、典型的には溶融シリカ製の円形キャピラリーであってもよい。キャピラリーの内径は、およそ１０μｍ〜およそ１０００μｍの範囲であればよく、好ましくはおよそ７５μｍ〜およそ５００μｍの範囲である可能性がより高い。上述したように、キャピラリーカラム１２は、代わりに平面チップまたは２枚のシートによって閉じ込められたカラムのような閉空間であってもよい。
【００２１】
本発明の実施形態によれば、多孔性マトリックスは、多数の異なる用途において利用され得る。図１Ｂに示す一実施形態において、多孔性マトリックス１５は、分析物を予備濃縮し、かつ／または分離するように設計された分離媒体２０として用いられ得る。この実施形態において、多孔性マトリックス１５は、一般に均一である比較的長くかつ連続的な構造を含む傾向にある。本願明細書において用いる場合、モノリスという用語は、分離媒体として機能する比較的長くかつ連続的な多孔性マトリックス１５のことをいう。
【００２２】
図１Ｃに示す別の実施形態において、多孔性マトリックス１５は、分離チャネル１３中に分離媒体を保持するように適合されたフリット２２として用いられ得る。概して、２つのフリット２２が、分離媒体を保持するように用いられ、一方は入口フリットにあり、もう一方は出口フリットにある。この実施形態における分離媒体（図１に示されていない）は、充填球状のＯＤＳ粒子、またはキラル粒子を含むが、これらに限定されない種々の材料を含んでもよい。この粒子は、図１Ｃのフリット２２の間に配置される。この実施形態において、多孔性マトリックス１５は、多孔性マトリックス１５が現実の分離媒体２０自体として用いる図１Ｂの実施形態と比較して、比較的短い構造を含む傾向にある。
【００２３】
別の実施形態において、多孔性マトリックス１５は、固相抽出材料として用いてもよい。このタイプの使用の一例では、多孔性マトリックス１５は、生物学的材料の試料において塩からタンパク質を分離するように機能し得る。塩は、試料中のタンパク質を測定または解析するために用いる装置に対してしばしばダメージを与えるので、このことは有益である。さらなる別の実施形態において、多孔性マトリックス１５は、化学的反応物として用いられ得る。例えば、タンパク質が多孔性マトリックス１５上に保持され得、次いで酵素が多孔性マトリックス１５に加えられて、タンパク質と反応し得る。得られたペプチドは、後に多孔性マトリックス１５によって分離され得る。
【００２４】
多孔性マトリックス１５は、分離チャネル１３の少なくとも一部を満たして、分離チャネル１３のチャネル壁１７に付着され得る。好ましくは、多孔性マトリックス１５は、チャネル壁１７に共有結合される。既知の分離媒体とは異なり、多孔性マトリックス１５は、均一であり、クロマトグラフィー粒子をまったく含まない。いくつかの既知の用途では、クロマトグラフィー粒子を使用すると好ましくない広がり（すなわち、分離能の欠如）を招くので、均一な分離媒体の使用は有利である。本発明の他の実施形態において、多孔性マトリックス１５は、異なる細孔サイズまたは表面電荷を有するモノリスのような別のセクションで隔てられる２つのセクションに分割してもよい。
【００２５】
本発明の実施形態によれば、多孔性マトリックスは金属有機ポリマーを用いて生成される。このフォトポリマーの前駆体は、金属アルコキシドであり得る。金属は、アルミニウム、バリウム、アンチモン、カルシウム、クロム、銅、エルビウム、ゲルマニウム、鉄、鉛、リチウム、りん、カリウム、けい素、タンタル、すず、チタン、バナジウム、亜鉛、およびジルコニウムを含むが、これらに限定されない任意の多数の金属であってもよい。例えば、選択される金属がけい素ならば、対応する金属アルコキシドはシランである。本発明の実施形態によれば、前駆体は、メタクリレートのような光活性基をさらに含むことができる。例えば、前駆体は、トリメタクリロキシプロピルトリメトキシシランとしても知られるメタクリル酸トリメトキシシリプロピルであってもよい。他の実施形態においては、光活性基は異なるアクリレートであっても、任意の他の適切な他の光活性基であってもよい。
【００２６】
種々の官能基化または誘導化モノマーを多孔性マトリックス１５の生成において用いることができる。モノマーの選択は、細孔サイズ、細孔の形状、ポリマー荷電密度、および疎水等の多孔性マトリックス１５の物理的特性に影響する。種々の細孔形成剤を用いて細孔のサイズおよび形状を制御して細孔サイズの広い分布（すなわち、細孔サイズグラジエント）をもつ多孔性マトリックス１５を得ることができる。
【００２７】
光重合ゾルゲル（ＰＳＧ）分離媒体
本発明の実施形態によれば、多孔性マトリックス１５は、分離媒体を含み得る。概して、多孔性マトリックス１５が分離媒体として用いられる場合、分離媒体を適所に保持するための分離チャネル１３中のフリットの必要性はない。分離媒体として多孔性マトリックス１５が分析物に対する親和性をもつ傾向があり、分析物の試料を予備濃縮するためと分離するための両方に用いることができる。分析物に対する親和性は、分析物の保持因子ｋによって記述することができる。保持因子ｋは、次式により表すことができる。
ｋ  ＝  固定相中の成分の量／移動相中の成分の量    （１）
保持因子ｋは、また、次のように表すこともできる。
ｋ  ＝  （ｔR −ｔ0 ）／ｔ0                       （２）
ここで、ｔR は分析物の移動時間、ｔ0 は「保持されない」分析物の移動時間である。保持因子は、溶媒の性質、分析物の性質、カラムの長さ、多孔性マトリックスの透過性、多孔性マトリックスの疎水性、および多孔性マトリックスの詳細な形態によって影響を受ける。
【００２８】
分離カラム１１は、分析的に用いたり、半調製的に用いることを含む多くの異なる目的のために用いることができる。分離カラム１１上の予備濃縮によりサブミリグラムからミリグラム量の分析物の分離が可能となる。例えば、分析物の濃度がｍＭレベルにある試料溶液の約１００ｎＬよりも多い量を明らかなオーバーロードをすることなくカラム中に注入することができる。
【００２９】
上述したように、種々の細孔形成剤を用いて細孔サイズおよび形状を制御して細孔サイズグラジエントをもつ多孔性マトリックス１５を得ることができる。細孔サイズグラジエントをもつ多孔性マトリックス１５から生成された分離媒体は、キャピラリー電気泳動およびキャピラリーエレクトロクロマトグラフィーにおいて「分子ソーター」として機能することができる。このような分離媒体は、サイズ構造または化学組成（例えば、ＤＮＡ断片）が異なり得る大きな分子の混合物を分離することができる。加えて、分離カラム１１は、逆相、サイズ排除、親和性、イオン交換クロマトグラフィー等を目的として設計することができる。代わりに、多孔性マトリックス１５から生成された分離媒体は、モノマーの混合物から調製した混合相多孔性マトリックスであり得る。例えば、モノマーは、メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、ビス（トリエトキシシリル）エタンおよびビス（トリエトキシシリル）オクタンを含み得る。混合相多孔性マトリックスは、疎水性等の種々の性質を有し得る。
【００３０】
光重合ゾルゲルフリット
本発明の別の実施形態によれば、多孔性マトリックス１５は、キャピラリーカラムにおいてフォトポリマーフリットを生成するために用いられ得る。このフォトポリマーの方法は、既存の焼結されたシリカ法を上回るいくつかの利点を有する。すなわち、（ｉ）容易かつ迅速な調製、（ｉｉ）室温での短い反応時間、（ｉｉｉ）フォトポリマーのＵＶ透過性、（ｉｖ）細孔サイズの精密な制御、および（ｖ）フリットの長さおよびフリットの位置の制御である。
【００３１】
本発明の実施形態において、フォトポリマーフリットは、メタクリレート置換シリケートを光硬化することによって調製される。適切に光硬化されたゾルゲルは、当該分野において既知であり、また本発明のこの態様を実施するために有用である。要するに、３−（トリメトキシシリル）プロピルメタクリレート（ＭＡＰＴＭＳ）のようなモノマーを照射して、ゾルゲルマトリックスを生成する。別の実施形態では、他の適切なモノマーとして、金属アルコキシドのような金属有機モノマーが挙げられるがこれに限定されない。ゲルが硬化されるとき、硬性の多孔性ガラスが得られる。
【００３２】
フリットとして使用するために多孔性マトリックス１５を作製する場合、細孔形成剤を用いることができる。異なる実施形態では、細孔形成剤は、溶媒（例えば、トルエンまたはヘキサンとトルエンとの１：１混合物）、ポリマーまたは無機塩（例えば、塩化ナトリウム粉末または硫酸ナトリウム）であってもよい。ポリマー性細孔形成剤の例として、ポリ（メチルメタクリレート）またはポリスチレンが挙げられる。他の細孔形成剤として、ベンゼン、アセトニトリル、イソオクタン、ヘキサン、アルコール、テトラヒドロフランおよびアセトンが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の実施形態によれば、イソオクタンおよびトルエンの混合物は、メタクリレートに基づく多孔性ポリマーの調製のための細孔形成剤溶媒として用いることができる。
【００３３】
多孔性マトリックス１５における細孔サイズは、異なる細孔形成剤溶媒の使用を通して、さらにモノマーおよび細孔形成剤のモル比の変動によって制御され得る。５．０ミクロン程度の大きさの細孔サイズおよび可能な限り大きい細孔サイズが、本発明の方法を用いて生成され得る。
【００３４】
分離カラムを調製する方法
本発明は、さらに分離カラム１１用の調製方法を包含する。本発明の実施形態において、この方法は、典型的には溶融シリカで作製した円形のキャピラリーコラム１２を用いて、分離カラム１１を生成する。キャピラリーコラム１２の内径は、およそ１０μｍ〜およそ１０００μｍの範囲にすることができ、好ましくはおよそ７５μｍ〜およそ５００μｍであればよい。
【００３５】
本発明方法の一実施形態によれば、多孔性マトリックス１５は、金属有機モノマー、細孔形成剤、および光開始剤を一般に含む混合物を用いてキャピラリーカラム１２内で生成される。混合物を分離カラム１１を生成するために用いるキャピラリーカラム１２中に導入し、またキャピラリーカラム１２中に混合物を流すように注射器を用いることにより導入することができる。分離カラムの両端をシールすることもできる。
【００３６】
混合物は、光開始重合が行われた後、固体、多孔性マトリックスを生成する。混合物中に用いた金属有機モノマーは、シランのような金属アルコキシド、または金属アルコキシドの混合物であればよい。金属は、アルミニウム、バリウム、アンチモン、カルシウム、クロム、銅、エルビウム、ゲルマニウム、鉄、鉛、リチウム、りん、カリウム、けい素、タンタル、すず、チタン、バナジウム、亜鉛、またはジルコニウムのいずれかを含んでもよいが、これらには限定されない。金属アルコキシドは、メタクリレートのような光活性基を含んでもよい。一実施形態において、前駆体（ここでは、金属アルコキシドおよび光活性基）は、メタクリロキシプロピルトリメトキシシランとしても知られるメタクリル酸トリメトキシシリプロピルを含んでもよい。別の実施形態において、前駆体は、メタクリロキシプロピルトリメトキシシランとビス（トリエトキシシリル）エタンまたはビス（トリエトキシシリル）オクタンのような別の前駆体の混合物であってもよい。
【００３７】
本発明の実施形態において、前駆体の加水分解のために金属アルコキシドを酸または塩基触媒に加えることができる。触媒は、アルコキシ基をヒドロキシル基へ変換する。例えば、シランは次の加水分解反応をして完全に加水分解したシランを生成することができる。
Ｓｉ（ＯＲ）4 ＋４Ｈ2 Ｏ→Ｓｉ（ＯＨ）4 ＋４ＲＯＨ    （３）
【００３８】
加水分解反応は、部分的に加水分解したシラン（Ｓｉ（ＯＲ）4-n （ＯＨ）n ）で停止することができる。金属有機モノマーおよび触媒は、しばしば２秒から２４時間のいずれかの範囲にある時間の間撹拌され得る。
【００３９】
上述したように、混合物は、細孔形成剤または細孔形成剤の混合物も含む。細孔形成剤は、金属有機モノマーおよび触媒と混合することができ、混合物はこれも数秒から２４時間のいずれかの範囲にある時間の間攪拌されてもよい。この時間の間、金属有機モノマーは縮合反応をしてダイマー、トリマー、および他のオリゴマーを生成する傾向にある。例えば、部分的に加水分解したシランは、次の縮合反応を行うことができる。
２（ＲＯ）3 ＳｉＯＨ→（ＲＯ）3 Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ（ＯＲ）3 ＋Ｈ2 Ｏ    （４）
反応の温度を上げることによりさらに大きなオリゴマーを生成することができる。
【００４０】
細孔形成剤は、多孔性マトリックス１５中に細孔を生成するための分子鋳型を提供する。例えば、上述したように、細孔形成剤は、溶媒、ポリマー、または無機塩であり得る。トルエンまたはヘキサンとトルエンとの１：１混合物のような溶媒、ポリ（メチルメタクリレート）またはポリスチレンのようなポリマー、塩化ナトリウム粉末または硫酸ナトリウムのような無機塩を用いることができる。多孔性マトリックス１５の多孔度（すなわち、細孔サイズおよび細孔の形状）は、用いる細孔形成剤のタイプおよび反応溶液中のその容積または濃度によって制御することができる。例えば、混合物中に細孔を生成するために細孔形成剤に対するモノマーのモル比または容積比を選択することができる。モノマーと細孔形成剤のモル比を調整することにより、多孔性マトリックスの物理的性質（例えば、細孔サイズ）を制御することができる。
【００４１】
混合物が照射され、モノマー上の光開始剤または光活性基が放射源からの放射を吸収するとき、重合プロセスを開始する。これによって、金属有機化合物の重合を触媒する光化学反応を開始し、キャピラリーカラム１２中に均一な多孔性マトリックス１５を生成する。キャピラリーカラム１２は、およそ５分間のような短時間の放射に曝露され得る。放射は可視光または紫外光を含むことができ、放射の波長は反応中に用いる光開始剤または光活性基のタイプに依存する。分離カラムを生成するために用いるキャピラリーカラム１２が光源に対して透明でない外側の被膜を有するならば、被膜を最初に除去して照射窓をつくる。被膜の長さが分離カラム内に生成する多孔性マトリックス１５の長さを決定する。
【００４２】
光活性基メタクリレートは、シー・ユー，エフ・スヴェク，ジェー・エム・ジェー・フレシェット著，エレクトロフォレシス，２１巻１号（２０００年）ｐ．１２０〜１２７ (C. Yu, F. Svec, J. M. J. Frechet, Electrophoresis 21(1) (2000) pp. 120-27)（非特許文献１２）およびエイチ・ジー・ウー，エル・ワイ・ホン，エス・ワイ・キム，エス・エイチ・パク，エス・ジェー・ソン，エイチ・エス・ハム著，ブレティン・オブ・ザ・コリアン・ケミカル・ソサイエティー，１６巻（１９９５年）ｐ．１０５６〜１０５９ (H. G. Woo, L. Y. Hong, S. Y. Kim, S. H. Park, S. J. Song, H.-S. Ham, Bull. Korean Chem. Soc. 16 (1995) pp. 1056-59) （非特許文献１３）にそれぞれ報告されているように約３００ｎｍまたは３６５ｎｍの波長で光重合させることができる。他の実施形態において、用いる光開始剤は、約３６５ｎｍの波長で光重合されるイルガキュア (Irgacure) １８００であってもよい。イルガキュア１８００は、ニューヨーク州タリータウンのチバ・ガイギー (Ciba Geigy) から入手できる。
【００４３】
多孔性マトリックスの調製のための光化学的方法にはマトリックスを生成する他の既知の方法を上回る多くの利点がある。すなわち、短い調製時間、マトリックスの細孔サイズの精密な制御、多孔性マトリックス１５の場所と長さの制御、高い機械的強度、およびキャピラリーカラム１２またはマトリックスのクラッキングにつながる高温の回避である。さらに、本発明の方法によって生成された多孔性マトリックス１５は、フリットまたはクロマトグラフィー粒子を必要とせず、それゆえ分離カラム１１の調製はフリットまたはクロマトグラフィー粒子を用いる既知の分離媒体の調製よりも容易である。
【００４４】
本発明方法の実施形態において、あらゆる未反応材料、細孔形成剤、および光開始剤を除去するために多孔性マトリックス１５が生成された後、有機溶媒は分離カラム１１を通過することができる。用いられ得るこのような有機溶媒の１つは、エタノールである。溶媒は、注射器または他の手段を用いて分離カラム１１中に流すことができる。
【００４５】
分析物の分離のために分離カラム１１を使用する前に分離カラム１１を分離溶液でコンディショニングすることもできる。分離溶液は、酢酸アンモニウム水溶液のような緩衝液、およびアセトニトリルのような溶出溶媒を含み得る。
【００４６】
分析物の試料を分離する方法
本発明は、分析物の試料を分離するための方法も包含する。第１に、分析物は、分離カラム１１上で予備濃縮される。予備濃縮は、分離カラム１１を通して試料溶液中に含まれる分析物の試料を通過させることによって行なわれる。分析物は、多環芳香族炭化水素類、アルキルベンゼン類、アルキルフェニルケトン類、およびステロイド類のような中性化学種およびペプチド類のような荷電化学種を含み得る。試料溶液は、酢酸アンモニウム水溶液のような緩衝液、およびアセトニトリルのような溶出溶媒を含み得る。
【００４７】
試料溶液は、圧力または電圧を加えることによって分離カラム１１を通過することができる。圧力を用いる場合、加える圧力は、通常、ほとんどの分離カラム１１において０ｐ．ｓ．ｉ．〜２０ｐ．ｓ．ｉ．程度の範囲である。また、必要な場合、特に比較的大きい内径を有する分離カラム１１が用いられる場合、かなり大きい圧力が分離カラム１１とともに用いられ得る。圧力を１秒〜３０分以上の範囲にある種々の時間の間加えることができる。電圧を用いる場合、約４０Ｖ／ｃｍの電場強度をほとんどの分離カラム１１に一定の時間加えることができる。用いる特定の圧力または電圧が、用いられる分離カラムの設計を含む多数の要因に基づいて変わるであろうことに留意すべきである。また、注入プラグ長は変えることもでき、２ｃｍを超えるプラグ長を分離カラム１１に注入することもできる。
【００４８】
試料溶液が分離カラム１１を通過するとき、多孔性マトリックス１５はカラムにおいて分析物を予備濃縮する。予備濃縮の度合いは、保持因子ｋだけに依存する。保持因子は、溶媒の性質、分析物の性質、および分離媒体の詳細な形態を含む種々の要因によって影響を受ける。流速は予備濃縮の程度にほとんど影響しなかった。
【００４９】
多孔性マトリックス１５の高度な多孔性の性質によって分析物の物質移動速度が高くなり、予備濃縮効果が機能する。高い物質移動速度は、多孔性構造の結合サイトへの分析物の接近のしやすさが強まることによって生じる。高い物質移動速度ゆえに、分析物−多孔性マトリックス相互作用（すなわち、移動相と固定相との間の分析物の分配）の速度は分離における律速段階ではない。高い物質移動速度は、この分離法を従来の形のクロマトグラフィー的な分離から区別する。この分離法を用いれば、高い物質移動速度ゆえに、通常のクロマトグラフィー的な材料を含むカラム中におけるよりも大量の試料溶液を注入し濃縮することが可能である。
【００５０】
予備濃縮の全体的効果は保持因子ｋに直接比例し、より長い注入プラグ長（例えば、２５ｍｍより大きい）は低いｋ値を有する分析物の深刻なピーク幅の広がりに通じる。この挙動は、ピーク形状が悪化する前に、各分析物の試料プラグの最大長が存在することを意味する。
【００５１】
オンライン予備濃縮の一大利点は、与えられた分析物の検出限界を低くすることである。もう１つの利点は、多孔性マトリックス１５が、固相抽出に用いられる場合、試料マトリックス中に見いだされる干渉可能化学種から分析物を洗浄するために予備濃縮を用いることができることである。
【００５２】
予備濃縮相後に、分離溶液が分離カラム１１を通過し、分析物を分離し溶出する。試料溶液について上述したのと同じ技法を用いて、すなわち、圧力または電圧を加えることによって、分離溶液が分離カラム１１を通過することができる。ここでも、加えた圧力は、通常１秒〜３０分以上の範囲にある時間の間のほとんどの分離カラムにおいて約０．５ｐ．ｓ．ｉ．〜約２０ｐ．ｓ．ｉ．の範囲であり得る。電圧を用いる場合、約４０Ｖ／ｃｍの電場強度をほとんどの分離カラム１１に一定の時間加えることができる。上述したように、用いる特定の圧力または電圧は、用いられる分離カラムの設計を含む多数の要因に基づいて変わるであろう。
【００５３】
分離溶液は、酢酸アンモニウム水溶液のような緩衝液、およびアセトニトリルのような溶出溶媒を含み得る。一実施形態において、分離溶液は、試料溶液と同じである。
【００５４】
多孔性マトリックス１５は、溶液から分析物を抽出するように作用するとともに、分析物のクロマトグラフィー的な分離のために固定相を提供する。既知の方法を上回る利点を得るこの方法にこのような効力を生じさせるのはこの抽出体−分離体の組合せである。例えば、試料溶液と同じである分離溶液を用いておよそ２ｃｍを超えるプラグ長の試料溶液を分離カラム１１中に取り込み予備濃縮することができる。
【００５５】
一実施形態において、多孔性マトリックス１５により及ぼされる効果に加えて、分析物の予備濃縮をさらに高めるために溶媒グラジエントを用いることができる。この実施形態において、試料は分離溶液中におけるよりも高い濃度の緩衝液（すなわち、水）を有する溶液中に溶解することができる。試料溶液中の緩衝液の濃度の方が高いため固定相に対する試料の親和性が増す。溶媒グラジエントを用いると、プラグ長を分離カラム１１の長さより長くできる。例えば、キャピラリー全長の３倍を超える９１．２ｃｍプラグの注入がわずかな分離能の低下だけで可能であったことが本発明を用いて見いだされた。グラジエント条件下で得られるピーク高さの改善は一千倍を超え得る。
【００５６】
中性の分析物に対して、多孔性マトリックス１５上でグラジエントを用いる２つのアプローチがある。第１のアプローチは、分離溶液と試料溶液の間の有機溶媒比を増すことである。第２のアプローチは、分離溶液と試料溶液の間の有機溶媒の妥当な百分率を維持しつつ、分離溶液中の水の百分率を増すことにより分離における保持因子ｋを増すことである。第１のアプローチを用いると分析がより迅速で、第２のアプローチを用いると分離能がよりよい。
【００５７】
本発明の別の実施形態において、多孔性マトリックスにより及ぼされる効果に加えて、分析物の予備濃縮をさらに高めるために試料スタッキングを用いることができる。試料スタッキングとは、高電場強度区域と低電場強度区域を隔てる濃度境界を分析物が通過するときに起きる荷電分析物の濃縮である。高電場区域とはより多くの溶出溶媒を含む伝導率のより低い試料溶液であり、それに対して低電場区域とは伝導率のより高い分離溶液である。アセトニトリルのような溶出溶媒は、酢酸アンモニウム水溶液のような緩衝液より低い伝導率を有する。かくして、より高い濃度の溶出溶媒は、試料マトリックス伝導率を低下させる。
【００５８】
試料スタッキングにおいて、分離カラム１１は、分離溶液を用いて調製する。分析物が分離カラム中に導入され、電圧が加えられると、カラムの入口における試料溶液中の分析物は、すでにカラム中にある分離溶液（低電場強度）に向って迅速に加速し、試料溶液と分離溶液の間の境界を通過すると分析物は速度を落して界面における狭い区域中にスタックする。
【００５９】
試料スタッキングは、基本的に濃度境界における電気泳動速度の変化により起きる。電気泳動速度は電気泳動易動度と電場強度の積である。濃度境界において電気泳動速度が低下するとき、濃縮が起きる（試料スタッキング）。試料スタッキングは、等速泳動とコールラウシュ(Kohlrausch)則の基本を用いても説明される。
【００６０】
多孔性マトリックス１５上で試料スタッキングを行う２つのアプローチがある。第１のアプローチは、アセトニトリルのような有機溶媒の百分率を増すことである。第２は、試料溶液中の緩衝成分の濃度を減らすことである。アセトニトリルまたは他の適当な有機溶媒の百分率を増すことは、高濃度の塩を含有する現実の試料には特に有用である。例えば、注入用に低伝導率溶液をつくるために透析によって脱塩する必要はない。脱蛋白質が試料調製の一部であるときには、有機溶媒の使用もまた生体試料用に有用である。
【００６１】
分析物の大容量試料の分離
大容量の試料における分析物の分離に取り組む場合、既知の分離技法は、多くの関連する問題を有する。例えば、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）に関連する小さい内径のキャピラリーの使用において固有である小さな試料容積および短い検出経路長ゆえに、ＣＥは調製的分離ツールとして広くは用いられていない。ナノモル量の分析物の取り込みは、画分の収集および束ねられたキャピラリーによる多重注入のようなストラテジーを用いることによってＣＥにおいてのみ実現されている。より大きい内径のキャピラリー（内径２００μｍ以上）を用いることに伴う主な欠点の１つは、Ｊｏｕｌｅ加熱の発生である。
【００６２】
ＣＥＣは、小さい直径のクロマトグラフィー粒子を充填された大きい内径のキャピラリーを用いて大容量の試料において分析物を分離するために用いることができる。例えば、５００μｍの内径を有し、かつ１μｍの球状シリカ粒子を充填されたキャピラリーを用いることができる。シリカ粒子は、高電圧の印加の際にカラム中で発生したＪｏｕｌｅ加熱を散逸させる少なくともいくつかの場合において有効である。残念ながら、粒子を充填されたカラムの大きい背圧は、しばしば試料の高い取り込みを妨げる。
【００６３】
より大きい内径のキャピラリーと組み合わせた本発明の使用は、半調製的適用において有用であることが示されている。本発明の一実施形態において、分離カラム１１は、比較的大きい内径（例えば、＞５００μｍ）を有するキャピラリーを用いて構築される。大容積の試料を分離するために、分析物をこの実施形態の分離カラム１１上で最初に予備濃縮する。この技法によって、多孔性マトリックス１５を充填した５４０μｍの内径のキャピラリーにおいて、少なくとも８ナノグラムの分析物（例えば、プロピオフェノン）までの取り込みが可能になることが示された。
【００６４】
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明する。以下の実施例は本発明をさらに説明し開示する目的のためにのみ提示するものであり、本発明を制限するものとして解釈されるべきものではない。実施例１〜１７はＰＳＧ分離媒体について考察し、実施例１８はＰＳＧフリットについて考察し、実施例１９はより大きい内径のキャピラリーカラムを用いるＰＳＧ分離媒体について考察する。
【実施例１】
【００６５】
材料および化学薬品。溶融シリカキャピラリー（内径７５μｍ×外径３６５μｍ）は、アリゾナ州フェニックスのポリマイクロ  テクノロジーズ (Polymicro Technologies) から購入した。メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＴＭＳ）は、ペンシルベニア州タリータウンのジェレスト(Gelest)とウィスコンシン州ミルウォーキーのシグマ−アルドリッチ (Sigma-Aldrich)から購入し精製することなく使用した。ＨＰＬＣグレードのトルエン、フェナントレン、ピレン、アルキルベンゼン類、アルキルフェニルケトン類、およびステロイド類は、ウィスコンシン州ミルウォーキーのシグマ−アルドリッチから購入した。イルガキュア１８００は、ニューヨーク州タリータウンのチバから受け取った。
【００６６】
装置類。ＵＶ吸光度検出器を有するベックマン (Beckman)Ｐ／ＡＣＥ２０００キャピラリー電気泳動装置を用いてすべてのＣＥＣ実験を行った。ニューヨーク州ウェストベリーのスペクトロニクス  コーポレイション (Spectronics Corporation)から入手できる主に３６５ｎｍ波長の１５Ｗブラックライト管６個を備えたＸＬ−１５００紫外線架橋装置を用いて反応溶液を照射した。走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）分析はオランダのアイントホーフェンから入手できるフィリップス (Philips)ＳＥＭ５０５走査形電子顕微鏡上で行った。
【００６７】
重合手順。使用直前に１００μＬの０．１２ＮＨＣｌに３７５μＬのＭＰＴＭＳを加えることによりモノマー原料溶液を調製した。この溶液を室温で約３０分間撹拌して透明な単相溶液を得た。下の表１に示すように適正な量のトルエン（細孔形成剤）をモノマー原料溶液に加えた。
【表１】
2005507072.tif 000003
【００６８】
最初に光開始剤イルガキュア１８００をトルエン／モノマー原料溶液の全重量の５％となるようにトルエンに加えた。それからこの光開始剤溶液を対応する量のモノマー原料溶液に加え、室温で３０分間撹拌して黄色の単相溶液を得た。トルエンの蒸発を最小限にするために、溶液はポリシリコンキャップをしたバイアル中で調製し、溶液で充填するときにはキャピラリーをポリシリコンキャップに挿入した。
【００６９】
キャピラリー表面に４５°の角度であてた剃刀の刃を用いて３０ｃｍ長のキャピラリーのポリイミド被覆から長さ１５ｃｍの筋を除去した。ポリイミド被覆の筋の除去にもかかわらず、キャピラリーの機械的安定性は非常によかった。照射光はこの１５ｃｍ筋を通してのみキャピラリーに入射した。ポリイミド被覆（「マスク」）が無傷で残っている場所ではキャピラリー中にモノリスは生成しなかった。
【００７０】
キャピラリーを溶液で満たす前に、０．５ｍｌ使い捨て注射器を用いて約０．２ｍｌの反応溶液をキャピラリー中に洗い流して壁の表面を十分に濡らした。これによりモノリスはキャピラリーの壁に結合した。モノリスを壁に結合するために、キャピラリー壁の特別な前処理は何も必要なかった。満たしたキャピラリーを紫外線架橋装置中で３６５ｎｍ光を用いて５分間照射（９００ｍＪ／ｃｍ2 ）して多孔性マトリックスを作製した。
【００７１】
照射後、携帯用の注射器を用いてキャピラリーをエタノールで洗浄して未反応試薬または細孔形成剤を除去した。モノリスは高度に透過性であったので、キャピラリーを通して液体を流すために高い圧力は必要ではなかった。未反応試薬を除去すると、モノリスは不透明になり顕微鏡の助けを借りなくてもキャピラリーを通して明瞭に見ることができた。
【００７２】
１００倍の倍率で多孔性マトリックスの均一性を確認した。モノリスのセクションの直後のポリイミド被覆を発煙硫酸で焼き取って検出窓をつくった。
【００７３】
作製したキャピラリーは損傷なくカートリッジ中に首尾よく格納することができた。注射器と手持ち万力を用いて分離緩衝液で約５分間キャピラリーをコンディショニングした。装置中に格納したキャピラリーはさらに分離緩衝液で加圧（２０ｐ．ｓ．ｉ．）すすぎ洗いするか、５ｋＶまたは１０ｋＶで３０分間電気力学的にコンディショニングした。
【００７４】
キャラクタリゼーション。ＳＥＭを用いて分離カラムの形態を調べた。キャピラリーを注意深く切り分けてモノリスを露出した。切り分けたキャピラリーの部分をＳＥＭ解析に先立って金でスパッタした。
【００７５】
分析物分離。ＣＥＣ実験時にはグラジエント効果を防止するために移動相中で分析物を調製した。移動相は、種々の比（容積／容積）の５０ｍＭ酢酸アンモニウム、水、およびアセトニトリルからなっていた。試料溶液と移動相のアセトニトリルの濃度を同一に維持するために注入のたびに新しい試料溶液を用いた。
【００７６】
図２Ａは、カラムＢについて吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。分離は、５０ｍＭ酢酸アンモニウム／水／アセトニトリル（１／３／６）溶液で行った。０．５ｐ．ｓ．ｉ．の圧力で３秒間試料溶液を注入し、２０℃の温度で１ｋＶの電圧を加え、２１４ｎｍで検出して分離を行った。分離の溶出順序は、（１）チオ尿素、（２）テトラヒドロフラン、（３）ナフタレン、（４）フェナントレン、（５）フルオランテン、（６）ピレン、（７）１，２−ベンゾアントラセン、および（８）１，２，５，６−ベンゾアントラセンであった。
【００７７】
図２Ｂは、カラムＤについて吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。分離は、５０ｍＭ酢酸アンモニウム／水／アセトニトリル（１／４／５）溶液で行った。０．５ｐ．ｓ．ｉ．の圧力で３秒間試料溶液を注入し、２０℃の温度で１５ｋＶの電圧を加え２００ｎｍで検出して分離を行った。分離の溶出順序は、（１）ベンゼン、（２）トルエン、（３）エチルベンゼン、（４）プロピルベンゼン、（５）ブチルベンゼン、および（６）ヘキシルベンゼンであった。
【００７８】
カラムの溶出順序は、より大きな分子量またはより疎水性の大きい分析物がより小さな分子量またはより親水性の大きい分析物より遅れて溶出する逆相クロマトグラフィーの溶出順序に類似していた。どちらの図でも分析物の溶出は７分以内に起った。ＣＥＣ実験時の典型的な操作電流は３と１０μＡの間であって泡の生成は問題ではなかった。
【００７９】
典型的なキャピラリーカラムＤについて、保持性の低い化合物であるチオ尿素に対して最高１００，０００段／ｍまでの効率を達成した。３日間（ｎ＝３３）でチオ尿素（０．６５％ＲＳＤ）、ナフタレン（１．１０％ＲＳＤ）、フェナントレン（１．１４％ＲＳＤ）、およびピレン（１．１４％ＲＳＤ）について溶出時間の小さな変動を観測した。
【００８０】
図３は、カラムＤについて吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。分離は、５０ｍＭ酢酸アンモニウム／水／アセトニトリル（１／３／６）溶液で行った。０．５ｐ．ｓ．ｉ．の圧力で３秒間試料溶液を注入し、２０℃の温度で１ｋＶの電圧を加え２１４ｎｍで検出して分離を行った。わずか２０ｐ．ｓ．ｉ．（装置の最大限界）の加圧でチオ尿素、ナフタレン、フェナントレン、およびピレンの試料を１１０分間以内に分離した。ピレンの場合、多孔性マトリックスとの相互作用がもっとも強かったためピークのテーリングがもっともひどく、カラム上で低くしか保持されないチオ尿素ではテーリングは観測されなかった。
【００８１】
図４Ａは、内径７５μｍのキャピラリーカラム中に８０％（容積／容積）トルエンで作製した金属有機フォトポリマー（キャピラリーＢ）の断面の走査形電子顕微鏡像である。顕微鏡像は、１μｍの球状構造物の相互連結した網目状構造とその中に散在するマイクロメーターサイズのマクロ細孔（もっとも大きいものは５μｍ）を示した。
【００８２】
図４Ｂは、内径７５μｍのキャピラリーカラム中に５０％（容積／容積）トルエンで作製した金属有機フォトポリマーの断面の走査形電子顕微鏡像である。図４Ａに示した多孔性マトリックスとは対照的に、図４Ｂに示した構造は直径２μ以下のマクロ細孔を有する密度の高いフォトポリマーであった。したがって、図４Ｂのマトリックスは透過性がより低く、顕著な背圧を生じた。２００ｐ．ｓ．ｉ．に近い圧力でもカラム中に液体を流すことはまったくできなかった。
【００８３】
多孔性マトリックスの透過性は、ダーシー (Darcy)の法則で説明されるように透過性に比例する多孔性マトリックスの線形速度により定まる。マクロ細孔サイズの関数としての多孔性マトリックスの透過性は、フォトポリマーを調製するために用いた細孔形成剤の容積と形に強く依存した。９０％（容積／容積）トルエンでつくったカラム（カラムＡ）の線形速度は１２．３ｃｍ／分で、８０％（容積／容積）カラム（カラムＢ）は３．３ｃｍ／分の線形速度を有していたが、７３％（容積／容積）トルエンでつくったカラム（カラムＤ）は０．６ｃｍ／分の線形速度しかなかった。これらの線形速度データは、細孔形成剤濃度の減少と共にマクロ細孔が減少することを示唆した。この挙動は、文献に報告されたものと一致した。
【実施例２】
【００８４】
実施例１で説明したように分離カラムを調製した。細孔形成剤として１：１ヘキサン／トルエンの混合物を用いた。分離カラムは８０／２０のトルエン／反応溶液で作製した分離カラムと類似の分離能を有していた。チオ尿素について６８，０００段／ｍ（ＲＳＤ７．０％、ｎ＝５）のカラム効率と３．７ｃｍ／分の電気浸透流（ＥＯＦ）速度を得た。
【実施例３】
【００８５】
３７５μＬのＭＰＴＭＳと１００μＬの０．１２Ｍ塩酸の混合物を室温で３０分間撹拌した。この混合物２７部をトルエン７３部と合わせて最終溶液２００μＬを得た。最終溶液の５重量％の光開始剤イルガキュア１８００を加え、得られたゾルゲル溶液を使用前に５分間撹拌した。内径７５μｍ×外径３６５μｍの溶融シリカキャピラリーをゾルゲル溶液で満たし、光重合するために分離カラムをスペクトロリンカー (Spectrolinker)Ｘｌ−１５００中で３６５ｎｍの紫外光に露出した。５分間の照射に先立ってキャピラリーのポリイミド被覆を１５ｃｍの幅で取り除いて多孔性マトリックスの重合長さを制御した。未反応試薬をエタノールで洗い流した。キャピラリーの全長は：２５．６ｃｍ（入口から検出窓までは１８．８ｃｍ）であった。作製したカラムは使用前に分離溶液でコンディショニングした。
【００８６】
すべての電気泳動実験は、ベックマンＰ／ＡＣＥ２０００で行った。キャピラリーは、２０℃で温度制御した。圧力（すなわち０．５ｐ．ｓ．ｉ．および２０ｐ．ｓ．ｉ．）または電圧（１ｋＶ〜１０ｋＶまで）を用いて注入を行い、２秒〜１９２０秒間の間で変えた。検出は、２１４または２５４ｎｍで行った。データ解析は、ニューハンプシャー州セーラムのギャラクティック  インダストリーズ  コーポレイション (Galactic Industries Corporation)から入手できるＧＲＡＭＳ／３２バージョン４．０２で行った。
【００８７】
図５Ａと図５Ｂは、本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。図は、小さな分子のチオ尿素、３つの多環芳香族炭化水素（ＰＡＨ）、および８つのアルキルフェニルケトンを含有する混合物のＣＥＣ分離における注入プラグ長の増大にともなう検出感度の増大を示している。溶媒グラジエント効果を除くために、試料は分離溶液中で調製した。試料溶液と分離溶液は、５０ｍＭ酢酸アンモニウム／水／アセトニトリル（１／４／５）であった。図５Ａでは、プラグ長は０．１ｍｍ、６．８ｍｍ、１３．７ｍｍ、２７．４ｍｍ、および３４．２ｍｍであった。０．１ｍｍプラグ長は０．５ｐ．ｓ．ｉ．の圧力下で、他のすべてのプラグ長は２０ｐ．ｓ．ｉ．の圧力下であった。分離のために加えた電圧は２０ｋＶ、吸光度は２１４ｎｍで測定した。カラムの溶出順序は、（１）１２．５μＭチオ尿素、（２）５１．０μＭナフタレン、（３）１．０μＭフェナントレン、および（４）１２３μＭピレンであった。
【００８８】
図５Ｂにおいて、カラムを（３，３，３‐トリフルオロプロピル）トリクロロシランの連続流によって３０分間室温で後修飾し、続いてトルエンですすぎ洗いしたことを除いては先に説明したカラムと同様にカラムを調製した。プラグ長は０．７ｍｍ、７．２ｍｍ、１０．７ｍｍ、１７．９ｍｍ、および２８．６ｍｍであった。加えた電圧は１５ｋＶ、吸光度は２５４ｎｍで測定した。カラムの溶出順序は、（１）５μＭチオ尿素、（２）アセトフェノン、（３）プロピオフェノン、（４）ブチロフェノン、（５）バレロフェノン、（６）ヘキサノフェノン、（７）ヘプタノフェノン、（８）オクタノフェノン、および（９）デカノフェノンであった。アルキルフェニルケトンのそれぞれの濃度は、分離溶液中０．１μｇ／ｍＬであった。
【００８９】
図５Ａに示したＰＡＨ混合物について、典型的な０．１ｍｍプラグ長の注入ではピークはほとんど見えなかったが、プラグ長を６．８〜３４．２ｍｍへ増大するとピーク高さが増大した。すなわち、本発明の一実施形態である分離カラムは、典型的な分離カラムよりも長いプラグ長の注入を可能とする。同様に、図５Ｂに示したアルキルフェニルケトン混合物について、プラグ長を０．７ｍｍ〜５７．３ｍｍへ増大したとき、ピーク高さが増大した。プラグ長を大きくするにつれて４つのピークはすべて広がりが大きくなったが、後の方で溶出するピークほど、先に溶出するピークよりわずかではあるがより対称形になった。この挙動は、分散効果のために、後の溶出ピークが先の溶出ピークより対称性が悪くなる典型的なクロマトグラフィー分離において観測されるものとは逆である。これらの結果は注入時に分析物が多孔性マトリックスの入口で蓄積し、より保持性の高い化学種は保持性の低いものよりより効果的に局所化されることを示唆している。
【００９０】
図５Ａにおいて、典型的な０．１ｍｍ注入と比較した２７．４ｍｍ注入のピーク高さの改善は、ナフタレン、フェナントレン、およびピレンについてそれぞれ５０、１２５、および１２７倍である。２７．４ｍｍ注入における試料溶液は、典型的な０．１ｍｍ注入における試料の１０倍希釈である。
【実施例４】
【００９１】
実施例３で説明したように分離カラムを調製した。試料および分離溶液は、５０ｍＭ酢酸アンモニウム／水／アセトニトリル（１／３／６）であった。試料は、１ｋＶで注入した。加えた電圧は１５ｋＶ、吸光度は２１４ｎｍで検出した。図６は、本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。分離溶液中の３９．０ｍＭのナフタレンを５秒間注入した結果を信号ａによって表し、分離溶液中の３．９ｍＭのナフタレンを８５秒間注入した結果を信号ｂによって表した。１０倍希釈の試料の注入時間を制御することにより双方のエレクトロクロマトグラムの補正ずみピーク面積（ピーク面積／移動時間）がほとんど同じになるようにした。ラインａおよびｂのエレクトロフェログラムの補正ずみピーク面積は、それぞれ０．００２３（％ＲＳＤ＝０．０２％、ｎ＝３）および０．００２５（％ＲＳＤ＝０．００、ｎ＝３）任意単位／分であった。この比較は、注入されるナフタレン分子の量がそれぞれの測定で同じになるようにして行った。
【００９２】
異なる試料濃度にもかかわらず、希釈した試料をより長く注入した方がピーク高さが若干高かったことと補正ずみピーク幅（ピーク幅／移動時間）が両方の実験でほとんど同じであったことにより予備濃縮の証拠が得られた。信号ａとｂにおけるエレクトロクロマトグラムのピーク高さは、それぞれ０．０８６９（％ＲＳＤ＝０．３６％、ｎ＝３）および０．０９３７（％ＲＳＤ＝０．０６％、ｎ＝３）任意単位であった。信号ａとｂにおけるエレクトロクロマトグラムのピーク幅は、それぞれ０．０２５３（％ＲＳＤ＝０．０７％、ｎ＝３）および０．０２４９（％ＲＳＤ＝０．０１％、ｎ＝３）任意単位／分であった。ラインｂ上の移動時間のシフトは、より長い注入時間によって試料プラグの中心が検出窓により近くなったからである。
【実施例５】
【００９３】
５７５μＬのＭＰＴＭＳと１００μＬの０．１２Ｍ塩酸の混合物を室温で３０分間撹拌した。この混合物２０部をトルエン８０部と合わせて最終溶液２００μＬを得た。最終溶液の全容積の１０％の光開始剤を加え、得られたゾルゲル溶液を使用前に５分間撹拌した。上述した実施例３で説明したように分離カラムを調製した。未反応試薬をトルエンで洗い流した。キャピラリーを通してペンタフルオロフェニルトリクロロシランの連続流によって４５分間室温で多孔性マトリックスの表面を修飾し、続いてトルエンですすぎ洗いした。
【００９４】
図７（パネルａおよびｂ）は、本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。分離溶液は、５０ｍＭりん酸／水／アセトニトリル（１／５／４）であった。加えた電圧は１５ｋＶ、吸光度は２１４ｎｍで検出した。図７（パネルａ）は試料ペプチド類の０．１ｍｍプラグ長における０．５ｐ．ｓ．ｉ．注入を示し、図７（パネルｂ）は試料ペプチド類の１２ｍｍプラグ長における０．５ｐ．ｓ．ｉ．注入を示す。荷電分析物である試料ペプチド類は、（１）ブラジキニン、（２）アンジオテンシンＩＩ、（３）トリペプチドＩ、（４）トリペプチドＩＩ、および（５）メチオニンエンケファリンであった。ペプチド類の濃度は、１６．７μｇ／ｍｌであった。ペプチド類の正極方向速度は、電気泳動流効果と電気浸透流効果の両方によって支配された。分離溶液のｐＨ（ｐＨ＝２）においてペプチド類は正の正味電荷をもっていた。典型的な０．１ｍｍプラグ長の注入と比較したより長い注入のピーク高さの改善は、ブラジキニン、アンジオテンシンＩＩ、トリペプチドＩ、トリペプチドＩＩ、およびメチオニンエンケファリンに対してそれぞれ２１、１９、１６、１８および２２倍であった。この結果は、荷電分析物に対するこの方法の有用性を示している。
【実施例６】
【００９５】
実施例３におけるように分離カラムを調製した。図８（パネルａ、ｂ、およびｃ）は、本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。図８は、０．１ｍＭヒドロコーチゾン（ピーク１）、０．３ｍＭプロゲステロン（ピーク２）および０．２ｍＭコーチゾン（ピーク３）でスパイクした尿試料の分析を示す。スパイクまたはスパイクしていない尿の４部をアセトニトリルの６部と混合し、遠心分離して蛋白質を除去した。各上澄みの一部を５０ｍＭ酢酸アンモニウム／水／アセトニトリル（１／７／２）の一部と注入前に混合した。図８（パネルａ）は注入プラグ長０．１ｍｍ、図８（パネルｂ）は注入プラグ長２１．４ｍｍを示す。図８（パネルｃ）は、２１．４ｍｍ注入プラグ長の尿ブランクを示す。分離溶液は、５０ｍＭ酢酸アンモニウム／水／アセトニトリル（１／５／４）からなっていた。分離のために加えた電圧は１７ｋＶ、吸光度は２５４ｎｍで測定した。アセトニトリルによる蛋白質沈殿後、これらのステロイドは試料溶液の２１．４ｍｍ注入で検出し定量したが、典型的な０．１ｍｍ注入では弱く検出された。ブランク測定およびスパイク試料測定の比較によると、他の生物分子をまだ含んでいる試料マトリックスは、分離カラム上でステロイドの分析に顕著に干渉しなかった。この結果は、バイオ流体の分析に対するこの技法の有用性を示している。
【実施例７】
【００９６】
実施例３で説明したように分離カラムを調製した。図９（パネルａ、ｂ、ｃ、ｄ、およびｅ）は、本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。試料プラグ長１．１ｃｍを注入した。分離溶液は６０％アセトニトリル中の５ｍＭ酢酸アンモニウム、試料溶液は６０％アセトニトリル（パネルａ）、５０％アセトニトリル（パネルｂ）、４０％アセトニトリル（パネルｃ）、３０％アセトニトリル（パネルｄ）、および２０％アセトニトリル（パネルｅ）中の５ｍＭ酢酸アンモニウムであった。分離のために加えた電圧は１５ｋＶ、吸光度は２５４ｎｍで検出した。溶出順序は、（１）チオ尿素、（２）アセトフェノン、（３）プロピオフェノン、（４）ブチロフェノン、（５）バレロフェノン、（６）ヘキサノフェノン、（７）ヘプタノフェノン、（８）オクタノフェノン、および（９）デカノフェノンであった。各分析物の濃度は、２ｎｌ／ｍｌであった。
【００９７】
アセトフェノン（ピーク２）、プロピオフェノン（ピーク３）、ブチロフェノン（ピーク４）、バレロフェノン（ピーク５）、ヘキサノフェノン（ピーク６）、ヘプタノフェノン（ピーク７）、オクタノフェノン（ピーク８）、およびデカノフェノン（ピーク９）に対して得た保持因子ｋは、それぞれ０．１８、０．２５、０．３２、０．４１、０．５３、０．６７、０．８５、および１．３３であった。この検討では、ｋの決定のための基本的に保持されない中性溶質としてチオ尿素（ピーク１）を用いた。ｋの値と移動時間は、アルキル鎖長の増加に追随した。一般的に、水濃度が４０％から５０％、６０％、７０％、および８０％へと増大したとき、ピーク形状と分離能はそれぞれパネルａ、ｂ、ｃ、ｄ、およびｅによって証明されるように改善した。
【実施例８】
【００９８】
実験条件は実施例７におけるのと同じとした。図１０は、ピーク高さ比（分離溶液に類似した水濃度の試料マトリックスから求めたピーク高さによって、より高い水の濃度の試料マトリックスから求めたピーク高さを除したもの）の対数対試料マトリックス中の水の百分率を示すプロットのグラフ表示である。データは、試料マトリックス中の緩衝液の濃度を増すことによって改善できるピークの高さにはある限界が存在することを示している。予備濃縮は、多孔性マトリックスへの分析物の引力が増すことによって改善された。ピーク高さ比の対数の値が１を下回ったとき、およそ１であったとき、または１より大きかったとき、分離溶液を試料マトリックスとして用いた類似の注入と比較すると、ピーク高さにはそれぞれ減少、無変化、または増大がみられた。すべての試験ＡＰＫに対して、水濃度が４０％〜５０％へ、また５０％〜６０％へ増大したとき、ピーク高さは改善した。水の百分率が６０％〜７０％またはさらに増大したとき、もっとも低いｋの分析物（アセトフェノンおよびプロピオフェノン）２つを除いてピーク高さは改善しなかった。８０％水マトリックス中ではより高いｋ値の分析物（ヘプタノフェノン、オクタノフェノン、およびデカノフェノン）に対するピーク高さは悪化した。ピーク高さの低下の理由は、水性度の高い試料マトリックス中における高いｋ値の分析物の溶解性が減少することにある。オクタノフェノンおよびデカノフェノンについて取り込んだ試料の量の指標である補正ピーク面積は、８０％水マトリックス中では用いた他の試料マトリックスと比較して１０〜６０％低かった。溶解性の問題を回避するために、以降の実験における試験ＡＰＫは少なくとも３０％のアセトニトリルを有するマトリックス中で調製した。
【実施例９】
【００９９】
上述した実施例３で説明したように分離カラムを調製した。図１１（パネルａ、ｂ、およびｃ）は、本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。分離溶液は、６０％アセトニトリル中の５ｍＭ酢酸アンモニウムである。プラグ長は、６０％アセトニトリル中の５ｍＭ酢酸アンモニウムの試料溶液で０．２ｃｍ（パネルａ）、パネルａで用いたのと同じ試料溶液で２．７４ｃｍ（パネルｂ）、３０％アセトニトリル中の５ｍＭ酢酸アンモニウムの試料溶液で２．７４ｃｍ（パネルｃ）であった。他の条件とピークの同定は実施例７におけると同じである。
【０１００】
図１１（パネルｃ）に示したように、グラジエント条件を用いると分離能とピーク形状が改善した。図１１（パネルｃ）に示したグラジエント条件下でのピーク高さの改善は、アセトフェノン、プロピオフェノン、ブチロフェノン、バレロフェノン、ヘキサノフェノン、ヘプタノフェノン、オクタノフェノン、およびデカノフェノンに対してそれぞれ３６、３５、３８、４１、４２、３８、３２、および２４倍であった。測定したピーク高さの％ＲＳＤ（ｎ＝５）は、０．９％〜２．５％の範囲であった。移動時間の％ＲＳＤ（ｎ＝５）は、０．３％〜０．５％の範囲であった。それゆえ、この手順は、単一カラム内で再現可能である。
【実施例１０】
【０１０１】
図１２Ａ、１２Ｂ、および１２Ｃは、本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。プラグ長は、４０％アセトニトリル中の５ｍＭ酢酸アンモニウムの試料溶液で２．７４ｃｍ（図１２Ａ）、３０％アセトニトリル中の５ｍＭ酢酸アンモニウムの試料溶液で２．７４ｃｍ（図１２Ｂ）、図１２Ｂにおけるのと同じ試料溶液で５．４８ｃｍ（図１２Ｃ）であった。分離溶液は、６０％アセトニトリル中の５ｍＭ酢酸アンモニウム（図１２Ａ）および５０％アセトニトリル中の５ｍＭ酢酸アンモニウム（図１２Ｂおよび１２Ｃ）であった。他の条件とピークの化合物は、実施例７におけるのと同じである。
【０１０２】
図１２Ｂのｋ値は、分離溶液中の水の百分率が高いため、図１２Ａよりも高かった。分析物分子は、高い水の百分率でＰＳＧ相により強くひきつけられた。ｋに直接比例する分布定数Ｋ（分離溶液中の溶質の分子数で除したＰＳＧ相中の溶質の分子数）は、分離溶液中の水の濃度の増大とともに増大した。図１２Ｂで、アセトフェノン、プロピオフェノン、ブチロフェノン、バレロフェノン、ヘキサノフェノン、ヘプタノフェノン、オクタノフェノン、およびデカノフェノンに対するｋ値は、それぞれ０．２９、０．４７、０．６５、０．９２、１．２８、１．７６、２．３７、および４．２５であった。グラジエント効果を一定に維持するために、図１２Ａと１２Ｂで分離溶液と試料マトリックスとの間の有機溶媒比の百分率を同じ値に保った。理由はわからないが、より低いｋ値を有する分析物（アセトフェノンおよびプロピオフェノン）に対して図１２Ａと比較すると、図１２Ｂの結果はピーク高さに若干の増加があることを示した。他の試験溶質については、ピーク高さにいくらか減少がある。
【０１０３】
図１２Ｃは、注入プラグを５．４８ｃｍとより長くして分離溶液中の水の百分率をより高くしたときに起きることを示している。アセトフェノン、プロピオフェノン、ブチロフェノン、バレロフェノン、ヘキサノフェノン、ヘプタノフェノン、オクタノフェノン、およびデカノフェノンに対するピーク高さの改善は、それぞれ３１、３３、５５、４４、４４、３７、２９、および１９倍であった。図１１ｃ（パネルｃ）におけるように、ピーク高さの改善は非グラジエント条件下とは異なりｋに追随しなかった。ピーク高さの改善は、分離溶液と試料マトリックスとの間の有機溶媒の百分率がより高いものを用いて得られた改善（図１１、パネルｃ）に匹敵した。図１１（パネルｃ）において、注入プラグ長が図１２Ｃにおけるよりも２倍短いことに留意されたい。
【実施例１１】
【０１０４】
図１３（パネルａおよびｂ）は、本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。プラグ長は、０．２２ｍｍ（パネルａ）および１９．５ｃｍ（パネルｂ）であった。分離溶液は、６０％アセトニトリル中の５ｍＭ酢酸アンモニウムであった。試料溶液は、６０％アセトニトリル中（パネルａ）および３６％アセトニトリル（パネルｂ）中の５ｍＭ酢酸アンモニウムであった。試料濃度は、１１〜５３μｇ／ｍｌまで（パネルａ）および１．１〜５．３μｇ／ｍｌまで（パネルｂ）であった。加えた電圧は３０ｋＶ、吸光度は２１４ｎｍで測定した。溶出順序は、チオ尿素（ピーク１）、ナフタレン（ピーク２）、フェナントレン（ピーク３）、ピレン（ピーク４）、およびベンゾ［ｅ］アセフェナンチレン（ピーク５）であった。
【０１０５】
図１３（パネルｂ）に示したように、溶媒グラジエントによって４つのＰＡＨの検出は改善した。より迅速な分析時間のために、分離溶液中のより高いアセトニトリルの百分率（６０％）、より短いＰＳＧ長（１０ｃｍ）、および高い電場強度（７８１．３Ｖ／ｃｍ）を用いた。図１３（パネルａ）は、分離溶液中に調製した試料の０．２２ｍｍの典型的な注入である。図１３（パネルｂ）は、グラジエントを用いた１９．５ｃｍ注入で、試料は３６％アセトニトリルマトリックス中にあり、試料溶液と分離溶液との間には有機溶媒の百分率が高くなるようにした。１９．５ｃｍより大きなプラグを用いるとナフタレンピークの広がりが起きる。注入長が入口から検出窓までの長さ（１８．８ｃｍ）より長いということは興味深い。実際により速く溶出するチオ尿素区域が試料注入中に観測される。チオ尿素区域は、それゆえ分離電圧の開始時に検出窓にある。
【０１０６】
ナフタレン（ピーク２）、フェナントレン（ピーク３）、ピレン（ピーク４）、およびベンゾ［ｅ］アセフェナンチレン（ピーク５）のピーク高さの改善は、それぞれ３４６、４３７、４０９、および３１５倍であった。図１３（パネルｂ）における試料濃度は、図１３（パネルａ）におけるよりも１０倍低かった。ナフタレン、フェナントレン、およびピレンに対しては、上述した値は、先に報告した非グラジエント条件におけるものよりそれぞれ６．９、３．５、および３．２倍優れていた。
【実施例１２】
【０１０７】
図１４（パネルａ、ｂ、ｃ、ｄ、およびｅ）は、本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。プラグ長は、０．２３ｍｍ（パネルａ）、７．６ｃｍ（パネルｂ）、２２．８ｃｍ（パネルｃ）、４５．６ｃｍ（パネルｄ）、および９１．２ｃｍ（パネルｅ）であった。分離溶液は、６０％アセトニトリル中の５ｍＭ酢酸アンモニウムであった。試料溶液は、６０％アセトニトリル（パネルａ）および４０％アセトニトリル（パネルｂ、ｃ、ｄ、およびｅ）中の５ｍＭ酢酸アンモニウムである。試料濃度は、９〜５０μｇ／ｍｌまで（パネルａ）、０．９〜５μｇ／ｍｌまで（パネルｂ、ｃ、ｄ、およびｅ）であった。加えた電圧は２２ｋＶ、吸光度は２５４ｎｍで検出した。溶出順序は、チオ尿素（ピーク１）、デカノフェノン（ピーク２）、およびピレン（ピーク３）であった。
【０１０８】
プラグ長が増大するとデカノフェノン（ピーク２）およびピレン（ピーク３）のピーク高さは増大した。注入は、０．２３ｍｍ（パネルａ）〜７．６ｃｍ（パネルｂ）、２２．８ｃｍ（パネルｃ）、４５．６ｃｍ（パネルｄ）、および９１．２ｃｍ（パネルｅ）に増大し、これは、全キャピラリー長の０．１％、３０％、８９％、１７８％、および３５６％に対応する。多孔性マトリックスの多孔度が高いためまたは流れに対する抵抗が低いため、試料溶液長の長いものをむしろたやすく導入することが可能であった。９１．２ｃｍよりさらに長い注入でさえ可能である。ただし、図１４（パネルｅ）にみられるような分離能の低下のため実行しない。パネルｄまたはｅのエレクトロクロマトグラムは、全キャピラリー長より長い試料注入を示すＣＥＣにおける初めての実例であると考えられる。注入された試料の容積もまた１μｌより大きい。パネルａおよびｅで得たピーク高さの比較によると、デカノフェノンおよびピレンに対してそれぞれ１１１８倍および１１０４倍のピーク高さにおける改善が示唆される。これらの値は、ＣＥＣにおける単純なオンライン予備濃縮技法を用いて中性分析物で報告された中の感度改善の最高値である。多孔性マトリックスに対する分析物の強い相互作用および多孔性マトリックス固有の迅速な物質移動特性によってこのような顕著な予備濃縮効果の観測が可能となった。
【０１０９】
内径２５０μｍのキャピラリー中のＰＳＧを用いて分離に成功した（データは示していない）。この結果は、長いプラグ注入を用いる半調製的分離を実行する可能性を開くものである。μｌ域の注入容積が容易に実行できた。
【実施例１３】
【０１１０】
図１５（パネルａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、およびｆ）は、本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。プラグ長は、０．１ｍｍ（パネルａ）および１．８ｃｍ（パネルｂ、ｃ、ｄ、ｅ、およびｆ）であった。注入長を１．８ｃｍに固定したものについては圧力で注入した。試料溶液は、分離溶液と同じ（パネルａとｂ）、２０％アセトニトリル中の１０ｍＭりん酸（パネルｃ）、７０％アセトニトリル中の１０ｍＭりん酸（パネルｄ）、４０％アセトニトリル中の５０ｍＭりん酸（パネルｅ）、４０％アセトニトリル中の０．０５ｍＭりん酸（パネルｆ）であった。分離溶液は、４０％アセトニトリル中の１０ｍＭりん酸であった。ペプチド濃度は各１６．７μｇ／ｍｌ、加えた電圧は１２ｋＶ、吸光度検出は２１４ｎｍにおいてとした。溶出順序は、ブラジキニン（ピーク１）、アンジオテンシンＩＩ（ピーク２）、トリペプチドＩ（ピーク３）、トリペプチドＩＩ（ピーク４）、およびメチオニンエンケファリン（ピーク５）であった。
【０１１１】
非グラジエント条件（図１５、パネルｂ）と比較してグラジエント条件（図１５、パネルｃ）下ではピーク形状がよりよくなると予測したが、試料マトリックス中でより高い濃度のアセトニトリル（図１５、パネルｄ）を用いた方が得られるピーク形状がよりよかった。図１５（パネルｄ）中のよりよいピーク形状は、試料スタッキングの結果観測されたものである。ひとたび電圧を加えるとカチオン性ペプチドが直ちに分離緩衝液へ移動し、かくして分離溶液が多孔性マトリックスに到達する前にペプチド区域は既に分離溶液中にあるため、より高い濃度の溶出溶媒を試料溶液中に用いたときの広がり効果（溶出溶媒のより高い濃度に起因する逆グラジエント効果）は観測されない。分離溶液と比較してより低い濃度の緩衝成分および類似の百分率のアセトニトリルを有するマトリックス中で試料を調製した図１５（パネルｆ）中にも試料スタッキングは示される。
【０１１２】
デスタッキングから生じる望ましくないピーク形状が図１５（パネルｃ）中でみられる。デスタッキングは、分析物が低い電場強度域と高い電場強度域を隔てる濃度境界を通過するときの荷電分析物の広がりである。低電場区域は、より多くの水を含む高伝導率試料マトリックスである。また、分離溶液と比較してより高い濃度の緩衝成分および類似の百分率のアセトニトリルを有するマトリックス中で試料を調製した図１５（パネルｅ）にもデスタッキングは示される。
【実施例１４】
【０１１３】
図１６（パネルａおよびｂ）は、本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。注入は、０．５ｐ．ｓ．ｉ．圧力を用いて０．１ｍｍ（パネルａ）および５ｋＶで１５秒間（パネルｂ）であった。試料溶液は、４０％アセトニトリル中の１０ｍＭりん酸（パネルａ）および４０％アセトニトリル中の０．５μＭりん酸（パネルｂ）であった。ペプチド濃度は各１６．７μｇ／ｍｌ（パネルａ）および各１６７ｎｇ／ｍｌ（パネルｂ）であった。分離電圧は、１２ｋＶであった。他の条件は実施例１３におけるものと同じである。
【０１１４】
図１６（パネルｂ）における分析物は、図１６（パネルａ）における分析物より１００倍低濃度であった。ブラジキニン（ピーク１）、アンジオテンシンＩＩ（ピーク２）、トリペプチドＩ（ピーク３）、トリペプチドＩＩ（ピーク４）、およびメチオニンエンケファリン（ピーク５）に対するピーク高さの改善は、それぞれ１０４０、８２０、８１０、９５０、および７１１倍であった。この予備濃縮手順に対するピーク高さの％ＲＳＤ（ｎ＝５）は６．２％〜１６．２％の範囲にあり、移動時間の％ＲＳＤ（ｎ＝５）は０．７％〜１．５％の範囲にあった。ピーク高さの再現性は内部標準の使用により改善されるべきものである。
【０１１５】
試料を低伝導率マトリックス（４０％アセトニトリル中の０．５μＭりん酸）中に溶解し、続いて負電極を検出器端に置いた電圧を用いる注入により、電場促進試料注入を行った。電圧が加えられたとき、低伝導率試料マトリックスは電気浸透流（ＥＯＦ）の作用によってキャピラリーに入り、カチオン性ペプチドはＥＯＦと電気泳動流の両方の作用によってカラムに入る。分離溶液の低いｐＨがＥＯＦを顕著に低下させるため試料マトリックスの非常に小さいプラグだけが導入され、キャピラリー壁におけるシラノール基の解離を妨げた。保持されない中性溶質（チオ尿素）は実際に３０分後に検出された。
【０１１６】
カラム中に導入された試料マトリックス区域中の電場は、分離区域よりはるかに高かった。この効果によりキャピラリー中に入るカチオン性ペプチド類の電気泳動速度は高くなった。流体力学的な注入とは異なり、分析物の電気泳動速度が高いため大量のペプチド類が導入され、取り込まれた試料の容量によって導入される試料の量が決まった。また、分析物の電気泳動速度が高いため試料マトリックスと分離溶液の間の濃度境界においてペプチド類は濃縮されるか予備濃縮された（試料スタッキング）。電気運動的注入前に水プラグを導入することは、電気運動的注入を用いる試料スタッキングにおいて有用であると示唆されているが、ＥＯＦと分析物の電気泳動速度の方向が同様なためピーク高さは改善されなかった。また、キャピラリーに入る低伝導率の試料マトリックスは、注入時にキャピラリーの入口端における電場の増大を維持した。
【０１１７】
図１６における条件で、５ｋＶにおける最適な電気運動的注入時間は１５秒であった。これより長い注入時間はピークの広がりをもたらした。注入後、注入におけるのと同じ極性（検出器側に負電極）で分離電圧を加えた。分析物は正極へ移動し、次に再びＰＳＧカラム上での保持に基づいて予備濃縮された。カチオンはほとんどがキャピラリー中に導入されていたので、この方法はカチオンに対して選択的と考えられた。注入された中性物は、ＥＯＦが非常に遅いため保持されない中性のマーカーおよびカチオンの後で移動した。用いたｐＨにおいて、すべての分析物は正に荷電しているか中性であった。この技法の他のカチオン性試料への適用も可能である。
【実施例１５】
【０１１８】
表２は、前駆体（メタクリロキシプロピルトリエトキシシラン）に対する酸触媒の比を変えて、または（混合相ＰＳＧモノリスを生成するために）前駆体を補助前駆体と反応させて、種々の前駆体原料溶液をつくるために用いた試薬の形と容積を並べて示す。
【表２】
2005507072.tif 000004
【０１１９】
反応溶液中の前駆体の濃度を変えまたは混合相生成用の補助前駆体を用いて元のＰＳＧモノリスの化学的性質を変えた。溶液ＡおよびＪから調製したＰＳＧモノリスのそれぞれＰＳＧ−ＡとＰＳＧ−Ｊは、反応に用いた前駆体の量についてＪはＡよりも高い容積の前駆体を含むということだけが異なる。より高い容積の前駆体を反応に用いるとキャピラリーカラム中の密度がより高いモノリスが得られる。ＰＳＧモノリスのＰＳＧ−Ｋは、前駆体とビス（トリエトキシシリル）エタンを補助前駆体として用いて調製した。ＰＳＧモノリスのＰＳＧ−ＭとＰＳＧ−Ｐは、前駆体と種々の量のビス（トリエトキシシリル）オクタンを補助前駆体として用いて調製した。補助前駆体は、加水分解し前駆体と縮合してハイブリッドゾル（混合相）を生成する。
【０１２０】
溶液ＡとＪについては、適当な容積の前駆体を１００μＬの酸触媒（０．１２Ｍ  ＨＣｌ）に加え、得られた溶液を室温で１５分間撹拌した（暗所で）。溶液Ｋ、ＭおよびＰについては、適当な容積の前駆体を１００μＬの０．１２Ｍ  ＨＣｌに加え、続いて適当な量のビス（トリエトキシシリル）エタンを加えた。得られた溶液を室温で１５分間撹拌した（暗所で）。これらの溶液はすべて調製後２時間以内に使用した。
【０１２１】
同様な手順に従って光開始剤を加えたトルエン／前駆体原料溶液をつくった。トルエン／前駆体原料溶液に加えた光開始剤の量は、トルエン／前駆体原料溶液１００μＬに対して光開始剤１０ｍｇであった。
【０１２２】
先に説明したのと同じようにキャピラリーを調製しコンディショニングした。ＰＳＧキャピラリーカラムコンディショニングは前と同じである。
【０１２３】
アルキルフェニルケトン類（ＡＰＫ）および多環芳香族炭化水素（ＰＡＨ）の２つの試験混合物に対するモノリスの分離因子を決定した。分離因子は、クロマトグラフィー系の分析物分離能力の指標である。分離因子αは、ｋ2 ／ｋ1 で与えられ、ここでｋは特定の分析物の保持因子、ｋ2 とｋ1 は隣り合う分析物のｋ値である。保持因子ｋ＝（ｔR −ｔ0 ）／ｔ0 は通常の方法により定め、ここでｔR は分析物の保持時間、ｔ0 は保持されないマーカーの保持時間であり、ここではマーカーとしてチオ尿素を用いた。表３は、各ＰＳＧモノリスのナフタレンおよびピレンに対する分離因子を列挙する。
【表３】
2005507072.tif 000005
【０１２４】
αの値は、ＰＳＧ−Ｋの２．４３からＰＳＧ−Ｐの２．７６まで変化し、ＰＳＧ−Ｐの分離因子は他のモノリスのそれより若干高い。１より大きい分離因子は、分析物の分離が成功したことを示す。
【０１２５】
図１７（パネルａ、ｂ、ｃ、ｄ、およびｅ）は、本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。チオ尿素（Ｔ）、ナフタレン（Ｎ）、フェナントレン（Ｐｈ）、およびピレン（Ｐｙ）の混合物をＰＳＧ−Ａ（図１７、パネルａ）、ＰＳＧ−Ｋ（図１７、パネルｂ）、ＰＳＧ−Ｊ（図１７、パネルｃ）、ＰＳＧ−Ｍ（図１７、パネルｄ）、およびＰＳＧ−Ｐ（図１７、パネルｅ）上で分離した。すべての場合において、異なる分析物のピークが良好に分かれた。
【０１２６】
分離能は、式ＲS ＝√Ｎ（α−１）ｋ／４α（ｋ＋１）によって定め、ここでＮは効率（理論段数）、αは分離因子、ｋは特定の分析物の保持因子である。ＰＳＧ−Ａはナフタレンとピレンに対して２．４３のもっとも低い分離能を有し、ＰＳＧ−Ｊは同じ２つの分析物に対して４．３５の分離能を有していた。ＰＳＧ−Ａと比較してＰＳＧ−Ｊの調製において用いたより高い容積の前駆体はモノリスの疎水性を増大させた。ＰＳＧ−Ｊ上のナフタレンおよびピレンに対する保持因子はそれぞれ０．３１および０．７９であり、これらの値はモノリスの疎水性の増大を反映していた。これらの値は、それぞれ５５％および５４％の増加を表している。
【０１２７】
補助前駆体、すなわちＰＳＧ−Ｍにおけるビス（トリエトキシシリル）オクタンおよびＰＳＧ−ＫとＰＳＧ−Ｐにおけるビス（トリエトキシシリル）エタンの使用は、ナフタレンとピレンに対してそれぞれ４．３７、４．０９、および９．０３の分離能を生じ、元であるＰＳＧ−Ａ（ＲS ＝２．４３）上での分離能と比較すると最大７３％の増大である。これらの３つのモノリスでの保持因子は、ナフタレン（０．２３）に対してもピレン（０．５６）に対してもＰＳＧ−Ａより６０％高かった。
【実施例１６】
【０１２８】
上述した実施例１５でモノリスＰＳＧ−Ｊについて説明したように分離カラムを調製した。１５ｃｍの長さを有する多孔性マトリックスでは、ナフタレンおよびピレンの保持因子（ｋN およびｋPy）は、８０％トルエンでつくった多孔性マトリックスでそれぞれ０．３１と０．７９であった。１０ｃｍの長さを有する同様な多孔性マトリックスでは、ｋN およびｋPyはそれぞれ０．１０と０．２４であった。長さとｋN （ｒ＝０．９９１）およびｋPy（ｒ＝０．９９１）との間には線形な相関があった。１５ｃｍ、１０ｃｍ、および５ｃｍの多孔性マトリックスでの分離因子は、それぞれ２．５５、２．５２、および２．４０であった。かくして、もっとも短いモノリス長さに対して、高い分離因子が維持され、分析物に対する溶出時間は顕著に短縮された。キャピラリーカラム中の多孔性マトリックスの長さを減らすことは、試験分析物の溶出時間の短縮につながった。この長さを減らすことにはナフタレンおよびピレンに対する保持因子を減らす効果があった。
【実施例１７】
【０１２９】
上述した実施例１５で説明したように分離カラムを調製した。８０％トルエンでつくったＰＳＧ−ＡではｋN は０．１４でｋPyは０．３６であったが、７３％トルエンでつくったＰＳＧ−ＡではｋN は０．３０でｋPyは０．７４であった。８０％トルエンおよび７３％トルエンでつくったＰＳＧ−Ａの分離因子は、それぞれ２．５７（０．１％ＲＳＤ）および２．４７（０．１％ＲＳＤ）であった。モノリスの調製において７３％トルエンを用いたとき、ナフタレンおよびピレンに対するｋの値は５３％および５１％増大した。
【０１３０】
同様な傾向がＰＳＧ−Ｊについて観測され、８０％トルエンでつくったモノリスでは、ｋN は０．３１でｋPyは０．７９であった。トルエンの濃度が８０％〜７３％へ低下したとき、ｋN （０．４９）およびｋPy（１．２３）値は３７％および３６％増大した。８０％トルエンおよび７３％トルエンでつくったＰＳＧ−Ｊの分離因子は、それぞれ２．５５および２．５１であった。
【０１３１】
８０％および７３％トルエンでつくったＰＳＧモノリスを比較するとき、ナフタレンおよびピレンの分離能は顕著に異なった。より低い容積のトルエンを用いることにより細孔サイズが減少するとき、ＰＳＧ表面積は増大し、その結果、同じ分離溶液条件下で保持および分離能が増大した。かくして、多孔性マトリックスの透過性は分析物の保持に影響する。
【実施例１８】
【０１３２】
材料。（Ｓ）−Ｎ−３，５−ジニトロベンゾイル−１−ナフチルグリシンを用いて改変した５μｍの球状キラル粒子は、東京大学薬学科大学院（日本、東京）および住化分析センター（日本、大阪）から提供された。Ｄアミノ酸、およびＬアミノ酸、Ｄ非タンパク質アミノ酸、およびＬ非タンパク質アミノ酸（ＮＰＡＡ）、３−メタクリル酸（トリメトキシシリル）プロピル、および４−フルオロ−７−ニトロ−２，１，３−ベンゾオキサジアゾール（ＮＢＤ−Ｆ）は、シグマ（アメリカ合衆国ミズーリ州セントルイス）またはアルドリッチ（アメリカ合衆国ウィスコンシン州ミルウォーキー）またはフルカ (Fluka)（アメリカ合衆国ニューヨーク州ロンコンコマ）から購入し、受け取ったまま使用した。イルガキュア１８００は、チバ（アメリカ合衆国ニューヨーク州タリータウン）のものであった。二重に蒸留した水を全ての試料および緩衝液の調製に用いた。ＨＰＬＣグレードのアセトニトリルをアルドリッチから購入し、さらなる精製をすることなく使用した。
【０１３３】
フリット作製およびカラム充填。エム・カトー，エム・デュレイ，ビー・ベネット，ジェー・クイリノ，アール・ザーレ，ジャーナル・オブ・クロマトグラフィーＡ，９２４巻（２００１年），ｐ．１８７〜１９５ (M. Kato, M. Dulay, B. Bennett, J. Quirino, R. Zare, Journal of Chromatography A, 924 (2001), PP. 187-195) （非特許文献１４）に記載のように、光重合手順を行った。ポリマイクロ  テクノロジィース（アメリカ合衆国アリゾナ州フェニックス）から購入した溶融シリカキャピラリー（内径７５μｍ×外径３６５μｍ）においてモノマー溶液を照射することにより、その場で（in situ)フリーラジカル重合を開始した。主に３６５ｎｍの波長のＵＶ光を生じる６個の１５Ｗの蛍光ブラックライト管を有するＸＬ−１５００の紫外線架橋装置（アメリカ合衆国ニューヨーク州ウェストベリーのスペクトロニクス  コーポレイション）によりモノマー溶液の照射を行った。
【０１３４】
ゾルゲル溶液を７５０μｌの３−メタクリル酸（トリメトキシシリル）プロピル、２２．５μｌの０．１２Ｍ塩酸および２２５μｌの水から作製して、室温下、暗所で３０分間撹拌した。１７０μｌの容積のトルエンを３０μｌのゾルゲル溶液に添加して、室温で３０分間撹拌した。８．９ｍｇの量のイルガキュア１８００をトルエン混合物に加え、室温で１時間撹拌した。この手順によって、本願発明者らが溶液Ａと呼ぶものが生成される。
【０１３５】
出口フリットをまず調製した。３ｍｍセクションのポリイミド被覆（約３０ｃｍのキャピラリーの末端から約１０ｃｍ）を剃刀を用いて除去した。次いで、キャピラリーを注射器を用いて溶液Ａで満たした。キャピラリーを５分間ＵＶ光に曝露する前に、キャピラリーの両端をパラフィンでシールした。フリットの存在を１００倍の倍率の検査で確認した。モノリス形材料は、不透明な外観を有し、かつ極めて多孔性である。
【０１３６】
キャピラリーを注射器からの圧力によってエタノールを用いてすすぎ洗いして、未反応溶液を除去した。注射器および手持ち万力を用いてキャピラリーカラム中に１０ｍｇのキラル粒子の超音波処理（５分間）されたスラリーを導入することにより、１５ｃｍ充填キラルセクションをキャピラリー中に調製した。
【０１３７】
最終的に、出口フリットと同じ方法で、カラム中に入口フリットを調製した。３ｍｍセクションのポリイミド被覆（キャピラリーの出口から約２５ｃｍおよび出口フリットから１５ｃｍ）を除去した。手持ち万力を用いて加圧した注射器によって溶液Ａをキャピラリー中に導入した。得られたフリットは、充填セクションのすぐ末端に位置する。
【０１３８】
熱した硫酸（＞１００℃）を用いることにより、出口において充填セクションの直後に検出窓を作製した。カラムを（手持ち万力を用いて約２００ｐ．ｓ．ｉ．までカラムの入口を加圧することにより）超音波処理によって脱気された泳動用緩衝液を用いて事前にコンディショニングした。次に、安定なベースラインが得られるまで、１５ｋＶの加えた電圧でキャピラリーを通して緩衝液移動相を電気運動的に押し出すことによってＣＥ装置中で、カラムをさらにコンディショニングした。この手順は、典型的には終了まで２〜３時間かかる。
【０１３９】
アミノ酸の誘導体化。各５ｍＭアミノ酸またはＮＰＡＡを含有する０．２Ｍホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）の１０μｌの容積および１０μｌの５ｍＭのＮＢＤ−Ｆを含有するアセトニトリルを混合し、６０℃で５分間加熱した。２０μｌの泳動緩衝液を加えた後、混合物を１０ｋＶで５秒間キャピラリー中に電気運動的に注入した。
【０１４０】
分離。ベックマンＰ／ＡＣＥ５０００キャピラリー電気泳動システム（アメリカ合衆国カリフォルニア州フラトン）で、全ての分離を行った。この装置は、空冷の４８８ｎｍのアルゴンイオンレーザを備えていた。１５ｃｍのキラル充填セクションを有するキャピラリーカラムをアミノ酸の分離のために用いた。誘導体化アミノ酸試料を２０℃の温度で電気運動的に（０．３３ｋＶ／ｃｍ）カラムに注入した。分離中に加えた電圧は、主に０．８３ｋＶ／ｃｍまたは０．５０ｋＶ／ｃｍである。保持されない化合物の溶出時間は、注入から第１の溶媒妨害ピークの出現までの時間であるととられる。０．８３ｋＶ／ｃｍが、カラムを通して加えられる場合、第１の妨害ピークの速度は１．２８ｍｍ／ｓである。分析物は、その蛍光強度をモニタリングすることによって観察された（励起波長は、４８８ｎｍであり、発光について５２０ｎｍの帯域通過フィルターを伴う）。エナンチオマーの分離の有効性は、分離能因子の値により測定され、この分離能因子は、
分離能＝２（ｔA −ｔB ）／（ＷA ＋ＷB ）
と表してもよく、ｔA はより保持されたエナンチオマー（Ａ）の保持時間、ｔB は保持が劣るエナンチオマー（Ｂ）の保持時間、ＷA およびＷB は種ＡおよびＢのピーク幅である。
【０１４１】
走査形電子顕微鏡（ＳＥＭ）解析。充填キャピラリーを５ｍｍのセグメントに切り分けた。これらのセグメントをＳＥＭ解析のために金でスパッタした。ＳＥＭ解析は、走査形電子顕微鏡 (オランダのアイトンホーフェンのフィリップスＳＥＭ５０５）上で行った。
【０１４２】
本願明細書の実施例１８に記載された実験において用いた充填キャピラリーは、（１）出口フリット、（２）充填セクション、（３）入口フリットの３つのセクションを有すると考えることができる。図１８に示されているように、出口フリットは、直径１μｍの球状構造を相互接続する網目状構造から作製されていると考えられる。出口フリット内に埋め込まれた粒子はない。ゾルゲルの網目状構造を通して３μｍのチャネル（暗野）が見られる。これらのチャネルによってイオンおよび液体の通過が可能となるが、キラル粒子の逃避を妨げる。
【０１４３】
しかし、図１９に示されているように、入口フリットは、いくつかの埋め込まれたキラル粒子を含む。これは溶液Ａとの粒子混合の結果ゆえに、これらの粒子は照射に先立ってキャピラリーの充填セクションに入る。出口フリットを含む相互接続している球状構造は、もはや明確ではない。代わりに、ＳＥＭ顕微鏡像（図１９）は、キラル粒子を覆ってこれに結合し、入口フリットを形成するいくつかのアモルファス構造を示す。粒子の存在下および非存在下の２つのフリットの間で観察された構造的相違は、他に報告されたものと同様である。
【０１４４】
図２０は、キャピラリーの充填セグメントのセクションの顕微鏡像である。ピリミジン被覆が、フリットの光重合中にキャピラリーのこのセクションにＵＶ光が入らないようにブロックしたので、ゾルゲル材料は充填セグメントのいずれの部分においても生成されなかった。従って、充填セグメントは、出口および入口フリットにより適所で保持されるキラル粒子だけから作製される。
【０１４５】
キラル分離。充填キラルカラムの能力を蛍光的に誘導体化されたアミノ酸を分離することにより研究した。次いで、この結果を同じキラル粒子を埋め込むようにゾルゲル材料を用いるモノリス形カラム上で行なった以前に報告されたアミノ酸分離と比較した。以前の報告において、１３の誘導体化アミノ酸および３つのＮＰＡＡの混合物が、５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ２．５）およびアセトニトリルの分離溶液を用いてキラル粒子を取り込んだモノリス形カラム上で分離された。アミノ酸およびＮＰＡＡの同じ混合物を以前と同じ条件下で充填カラムを用いて分離した。詳細には、分離溶液は５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ２．５）−アセトニトリル（３０：７０）の混合物、電場強度は０．５０ｋＶ／ｃｍ、温度は２０℃である。
【０１４６】
表４は、ＮＢＤアミノ酸およびＮＢＤ−ＮＰＡＡの保持時間、分離能、溶出順序およびプレート高さを列挙する。
【表４】
2005507072.tif 000006
【０１４７】
ほとんどのＮＢＤアミノ酸およびＮＢＤ−ＮＰＡＡは１０分以内に溶出されるが、ＮＢＤ−グルタミン酸（Ｇｌｕ）エナンチオマーは４０分で溶出される。充填カラムにおいて、このアミノ酸の保持時間は、粒子を取り込んだモノリス形カラムにおける同じ分離と比較して短くなっている。本願発明者らの実験条件下では、電気浸透流は非常に小さいか、または無視できるものであり、電気泳動速度はカラムを通した分析物移動のための主な押し出し力である。充填カラムおよびモノリス形カラムの分離溶液および加えた電圧は同じであったため、これらの分析物の電気泳動速度は充填カラムとモノリス形カラムとの間で同様である。２つのカラムの間の異なる保持時間は、移動相と固定相との間の異なる分配比に由来する。充填カラムとモノリス形カラムとの間の構造的相違は、この分析物の分配比において観察された相違に起因する。
【０１４８】
光重合ゾルゲルフリットを用いて作製されたキラルカラムを用いて、全てのＮＢＤ−アミノ酸およびＮＢＤ−ＮＰＡＡが十分に分解された。分離能因子は、１．２１と８．２９との間である。これらの値は、粒子を取り込んだモノリス形カラムにおける値よりも約１．５倍大きい。充填カラムでのＮＢＤ−アミノ酸の溶出順序は、モノリス形カラムでの溶出順序と同じであり、ＮＢＤ−Ｄ−アミノ酸が、ＮＢＤ−Ｐｒｏを除けば、対応するＮＢＤ−Ｌ−アミノ酸よりも速く溶出する。試料が光学的に活性なものではなくラセミ混合物で作製されたので、ＮＢＤ−ＮＰＡＡの溶出順序は確認されなかった。。
【０１４９】
ＮＢＤ−アミノ酸およびＮＢＤ−ＮＰＡＡのプレート高さは、ＮＢＤ−ＧｌｕおよびＮＢＤ−２，３−ジアミノプロピオン酸を除けば、充填カラム上で２０μｍ未満であった。モノリス形カラムにおいて、ＮＢＤ−アミノ酸およびＮＢＤ−ＮＰＡＡのプレート高さは、１４と６５μｍとの間である。これらのプレート高さは、充填カラムにおける高さよりも約２倍高い。
【０１５０】
これらのＮＢＤ−ＧｌｕおよびＮＢＤ−２，３−ジアミノプロピオン酸は、充填カラムおよびモノリス形カラムの両方において、他のＮＢＤ−アミノ酸およびＮＢＤ−ＮＰＡＡよりも劣った分離であることが示された。クロマトグラフィー的な分離において、物質移動の速度の低下をもたらしたさらなる相互作用は、分析物のプレート高さを増大する。Ｇｌｕは、アミノプロピルシリカゲルの改変されていないアミノ基とのイオン性相互作用を生成する２つのカルボキシル基を有する。２，３−ジアミノプロピオン酸の２つのアミノ基は、ＮＢＤ構造を用いて誘導体化され、これにより他のアミノ酸およびＮＰＡＡとは異なるようになる。これら２つのＮＢＤ構造は、充填粒子といくつかのさらなるπ−π相互作用を生成し得る。従って、ＮＢＤ−ＧｌｕおよびＮＢＤ−２，３−ジアミノプロピオン酸は、充填カラムおよびモノリス形カラムの両方において他よりも劣った分離であることが示された。ＮＢＤ−ＧｌｕおよびＮＢＤ−２，３−ジアミノプロピオン酸を含む全てのＮＢＤ誘導体についてのプレート高さは、モノリス形カラムよりも充填カラムについてのほうがより小さい。
【０１５１】
図２１Ａは、充填カラム上のＮＢＤ−ＤＬ−アラニン（Ａｌａ）およびＮＢＤ−ＤＬ−トレオニン（Ｔｈｒ）の試料のエレクトロクロマトグラムを示すが、図２１Ｂは、モノリス形カラム上の同じ試料のエレクトロクロマトグラムである。０．５ｋＶ／ｃｍの加えた電場を用いることによりモノリス形カラムと比較して、充填カラム上で同様の溶出時間が達成された。図２１Ｂにおいて約６分で観察されたピークは、蛍光発生試薬の加水分解から生じる。アミノ酸の間の分離は、充填カラム上で大いに改善される。図２１に示されているように、試料成分のベースライン分離は、モノリス形カラムと比較して、充填カラム内で達成された。充填カラムにおける各ＮＢＤ−アミノ酸のピーク形状は、モノリス形カラムにおけるよりもかなり先鋭である。これらの結果は、充填カラムの分離有効性が、モノリス形カラムの分離有効性よりも優れていることを示す。
【０１５２】
モノリス形カラムと比較した充填カラムにおけるアミノ酸試料の分離有効性および分離能の改善は、キラル粒子とアミノ酸との良好な相互作用から生じ得る。粒子を取り込んだモノリス形カラムにおいて、粒子は、ゾルゲルマトリックスにおける粒子のカプセル化の結果として部分的に遮断されていたかもしれない。ゾルゲルマトリックスの非存在下において、物質移動が改善される。モノリス形カラムにおける低い分離有効性の別の理由は、小さいギャップまたはクラックのようなゾルゲル構造のある程度の不均一性に由来し得る。このようなギャップまたはクラックは、埋め込まれたキラル粒子に対して用いたゾルゲルの熱重合中に反応混合物からエタノールが蒸着されるときに生じる。光重合により本願発明者らは熱の使用を回避することが可能になり、結果として、モノリス構造内のこれらのギャップまたはクラックの形成を回避することが可能になる。
【０１５３】
フリットを生成するために光重合ゾルゲルを用いることのさらなる利点は、他の光重合フリットまたはケイ酸塩フリットの調製と比較して、調製の容易さおよび速さ、ならびにフリットの長さおよび位置を制御することの容易さである。フリットは、本願発明者らの充填カラムにおいてＵＶ光に対する露光の際に５分で作製される。フリットのためのメタクリレートに基づく試薬の使用には、１〜１６時間の光重合時間が必要であった。ケイ酸塩フリットの場合、作製にはわずか２〜３秒しか必要ではないが、キャピラリー壁の事前処理が必要である。結果として、ケイ酸塩フリットを用いる充填キャピラリーの調製は、充填カラムを作製するのに１時間を要する。さらに、熱によって調製されるフリットの位置および場所を制御することはさらに困難である。
【０１５４】
ゾルゲルフリットの高い多孔度に起因して、キャピラリー中の１５ｃｍセクションのキラル粒子を充填するのに、極めて低圧（手持ち万力上の注射器から約２００ｐ．ｓ．ｉ．）でわずか３０分しか必要ではない。ケイ酸塩または光重合メタクリレートフリットに比較して、光重合ゾルゲルフリットでは背圧は極めて低い。
【０１５５】
短い充填セグメントのカラムの能力。充填カラムにおいて、ＮＢＤ−アミノ酸エナンチオマーのプレート高さは、モノリス形カラムの２分の１である。結果として、ＮＢＤ−アミノ酸は、短い充填カラムによって短い分離時間で分離されると期待される。ＮＢＤ−アミノ酸エナンチオマー（ＮＢＤ−Ｐｈｅ、ＮＢＤ−Ｖａｌ、ＮＢＤ−Ｇｌｎ、ＮＢＤ−Ｔｈｒ）の分離は、５ｃｍの充填セグメントのカラムで分離される。短い充填カラムは、わずか５分以内にＮＢＤ−Ｐｈｅエナンチオマーを分離する（図２２）。ＮＢＤ−Ｐｈｅエナンチオマーの分離因子およびＮＢＤ−Ｄ−Ｐｈｅのプレート高さは、それぞれ２．２２および８μｍである。プレート高さは短い充填カラムでは改善されるが、分離因子は短い充填セグメントのせいで低下する。
【実施例１９】
【０１５６】
ＰＳＧモノリスの調製。キャピラリーカラムにおける親のＰＳＧ構造の調製については、上述した。結合相を用いて親のＰＳＧの表面を誘導体化するために用いられる手順がまた記載されている。しかし、誘導体化反応の長さは、小さい内径のキャピラリーと比較して、大きい内径のキャピラリーのほうが通常２倍程度長い。
【０１５７】
分離。チオ尿素、アセトフェノン、プロピオフェノン、およびブチロフェノン（すべてミリモル量）の混合物を、電気運動的にＰＳＧ充填キャピラリーに注入した。最小注入時間は１５秒である。加えた電圧は、８ｋＶ〜１５ｋＶの範囲にある。
【０１５８】
ＵＶ吸光度検出器を用いて分析物のピークを検出する。キャピラリーに電圧を加えるために、高電圧の電源を用いる。他の実験の詳細の全ては、分析用（小さい内径）ＰＳＧ充填キャピラリーで既に公表したものと同様である。各分析物のストック溶液を１ｍｇのアルキルフェニルケトンを含有する１ｍＬのアセトニトリルとして調製した。チオ尿素含有水の５０ｍＭストック溶液を試料溶液の調製において用いた。
【０１５９】
結果。分析物がより疎水性であるほど疎水性の低い分析物よりも後に溶出するので、分析物の分離は同じ逆相機構に従う。注入時間（すなわち、プラグ長）が増大するにつれて、分析物の予備濃縮が観察される。
【０１６０】
図２３において、チオ尿素およびアルキルフェニルケトンの混合物を、Ｃ8 結合相と誘導体化された１０ｃｍのＰＳＧモノリス（ＰＳＧ−Ｃ8 ）を充填された内径２５０μｍのキャピラリー上で、予備濃縮し分離した。長い注入プラグ長によりカラム上でプロピオフェノンを０．７４ｎｇまで取り込むことが可能になった。取り込みが高くなるにつれて、ピークは先鋭になる。ピーク形状および高さが損なわれ、予備濃縮がもはやできなくなる前に、より多くの分析物がカラム上に取り込まれ得るということを達成できると考えられる。
【０１６１】
カラム上に取り込まれたプロピオフェノンの量は、図２４に示したのと同じＰＳＧモノリスで充填された内径３５０μｍのキャピラリーを用いることにより、７．４３ｎｇまで増量され得る。分離能にはほとんど損失はないが、ピークは広がった。
【０１６２】
図２５は、同じＰＳＧモノリスを充填された内径５４０μｍのキャピラリーにおけるチオ尿素およびプロピオフェノンの分離を示す。０．８６ｎｇのプロピオフェノンを３．７３ｍｍの短い注入長でカラム上に取り込んだ。
【０１６３】
光重合ゾルゲルフリットおよびモノリスを用いる充填カラムの調製のための簡単かつ早い方法が開発された。いずれかのクロマトグラフィーの試行の間も泡の形成は観察されない。種々の実施形態を参照することにより本発明を上述したように説明してきたが、本発明の適用範囲から外れることなく変更および修正がなされ得るものと解釈される。参照した上記のすべての参照はそれらの総体としてここに組込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１６４】
【図１Ａ】本発明の一実施形態による分離カラムの横断面図である。
【図１Ｂ】多孔性マトリックスが本発明の実施形態による分離媒体として作用する分離カラムの透視的模式図である。
【図１Ｃ】多孔性マトリックスが本発明の実施形態による分離媒体を保持するように設計された２つのフリットとして作用する分離カラムの透視的模式図である。
【図２Ａ】本発明の一実施形態を用いた（ａ）あるカラムの吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。
【図２Ｂ】本発明の一実施形態を用いた（ｂ）別のカラムの吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。
【図３】本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。
【図４Ａ】本発明の実施形態のＳＥＭ顕微鏡像である。
【図４Ｂ】本発明の実施形態のＳＥＭ顕微鏡像である。
【図５Ａ】本発明の実施形態を用いた種々の分析物の吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。
【図５Ｂ】本発明の実施形態を用いた種々の分析物の吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。
【図６】本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。
【図７】本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラム（パネルａおよびｂ）である。
【図８】本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラム（パネルａ、ｂ、およびｃ）である。
【図９】本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラム（パネルａ、ｂ、ｃ、ｄ、およびｅ）である。
【図１０】本発明の一実施形態を用いたピーク高さ比の対数対試料中の水の百分率のプロットを示すグラフ表示である。
【図１１】本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラム（パネルａ、ｂ、およびｃ）である。
【図１２Ａ】本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。
【図１２Ｂ】本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。
【図１２Ｃ】本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラムである。
【図１３】本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラム（パネルａおよびｂ）である。
【図１４】本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラム（パネルａ、ｂ、ｃ、ｄ、およびｅ）である。
【図１５】本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラム（パネルａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、およびｆ）である。
【図１６】本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラム（パネルａおよびｂ）である。
【図１７】本発明の一実施形態を用いた吸光度対保持時間のプロットを示す代表的なエレクトロクロマトグラム（パネルａ、ｂ、ｃ、ｄ、およびｅ）である。
【図１８】本発明の実施形態による調製された出口フリットのＳＥＭ顕微鏡像である。
【図１９】本発明の実施形態による調製された入口フリットのＳＥＭ顕微鏡像である。
【図２０】本発明の実施形態による調製されたキャピラリーの充填セグメントのセクションの顕微鏡像である。
【図２１】２１Ａは、充填カラムに対するＮＢＤ−ＤＬ−アラニン（Ａｌａ）およびＮＢＤ−ＤＬ−トレオニン（Ｔｈｒ）の試料のエレクトロクロマトグラムであり、２１Ｂは、モノリス形カラムに対するＮＢＤ−ＤＬ−アラニン（Ａｌａ）およびＮＢＤ−ＤＬ−トレオニン（Ｔｈｒ）の試料のエレクトロクロマトグラムである。
【図２２】充填セグメントカラムに対するＮＢＤ−ＤＬ−Ｐｈｅのエレクトロクロマトグラムである。
【図２３】大きい内径のキャピラリーを用いるチオ尿素および５つのアルキルフェニルケトンの分離のエレクトロクロマトグラムである。
【図２４】大きい内径のキャピラリーを用いるチオ尿素およびプロピオフェノンの分離のエレクトロクロマトグラムである。
【図２５】大きい内径のキャピラリーを用いるチオ尿素およびプロピオフェノンの分離の第２のエレクトロクロマトグラムである。
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【国際公開パンフレット】
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