(57)【要約】  本発明は、腫瘍細胞の増殖または成長の阻害および／あるいは癌細胞において細胞死を誘導する方法に関連する。この方法は、ＭＵＣ１タンパク質の膜貫通イソ型の細胞外領域中のエピトープに特的に結合する有効量のリガンドを、該リガンドを必要とする被験体に投与する工程を包含し、これによって、該哺乳動物細胞の増殖または該哺乳動物細胞の成長を選択的に阻害する。本発明は、上皮腫瘍細胞、結腸腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、胸部腫瘍細胞および卵巣腫瘍細胞、またはＭＵＣ１タンパク質を発現する他の細胞の成長または増殖を阻害し、そしてこれらの細胞の死を誘導するための抗体、ハイブリドーマ、ならびにこれを含む薬学的組成物の使用に関連する。
2005508839.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞の増殖または哺乳動物細胞の成長を阻害する方法であって、ＭＵＣ１タンパク質の膜貫通イソ型の細胞外領域中のエピトープに特的に結合する、有効量のリガンドを該リガンドを必要とする被験体に投与する工程を包含し、これによって、該哺乳動物細胞の増殖または該哺乳動物細胞の成長を選択的に阻害する、方法。
【請求項２】
哺乳動物細胞死を誘導する方法であって、ＭＵＣ１タンパク質の膜貫通イソ型の細胞外領域中のエピトープに特異的に結合する、有効量のリガンドを該リガンドを必要とする被験者体に投与する工程を包含し、これによって該哺乳動物細胞死を選択的に誘導する、方法。
【請求項３】
細胞の病的な増殖を伴う疾患を有する被験体を処置する方法であって、ＭＵＣ１タンパク質の膜貫通イソ型の細胞外領域中のエピトープに特異的に結合する、有効量のリガンドを該リガンドを必要とする被験体に投与する工程を包含し、これによって該疾患を処置する、方法。
【請求項４】
細胞増殖または細胞成長を選択的に阻害する方法であって、ＭＵＣ１タンパク質イソ型を発現する細胞を、該ＭＵＣ１タンパク質の膜貫通イソ型の細胞外領域中のエピトープに特異的に結合する有効量のリガンドと接触させる工程を包含し、これによって細胞増殖または細胞成長を選択的に阻害する、方法。
【請求項５】
細胞死を選択的に誘導する方法であって、ＭＵＣ１タンパク質イソ型を発現する細胞を、該ＭＵＣ１タンパク質の膜貫通イソ型の細胞外領域中のエプトープと特異的に結合する有効量のリガンドと接触させる工程を包含し、これによって細胞死を選択的に誘導する、方法。
【請求項６】
前記細胞が癌細胞である、請求項１〜５に記載の方法。
【請求項７】
前記癌細胞が上皮癌細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、前記上皮癌細胞が、乳癌細胞、卵巣癌細胞、肺癌細胞または結腸癌細胞である、方法。
【請求項９】
請求項１〜５に記載の方法であって、前記ＭＵＣ１イソ型がＭＵＣ１／Ｙ、ＭＵＣ１／ＲＥＰ、またはＭＵＣ１／Ｘである、方法。
【請求項１０】
請求項１〜５に記載の方法であって、前記リガンドが、抗体、ペプチド、アンタゴニストまたはアゴニストである、方法。
【請求項１１】
請求項１〜５に記載の方法であって、前記エピトープが配列番号１に示される５９個のアミノ酸配列内のアミノ酸配列である、方法。
【請求項１２】
請求項１〜５に記載の方法であって、前記リガンドが細胞傷害性薬物に結合体化される、方法。
【請求項１３】
請求項１０に記載の方法であって、前記抗体が、モノクローナル抗体、合成の抗体、ポリクローナル抗体またはキメラである、方法。
【請求項１４】
細胞の病的な増殖を伴う疾患を有する被験体を処置する方法であって、ＭＵＣ１タンパク質の膜貫通イソ型の細胞外領域に対応するアミノ酸配列を含む有効量のペプチドを、該ペプチドを必要とする被験体に投与して、該被験体における該ペプチドに特異的な抗体のレベルの増加を誘導する工程を包含し、これによって該疾患を処置する、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、前記ＭＵＣ１イソ型が、ＭＵＣ１／Ｙ、ＭＵＣ１／ＲＥＰまたはＭＵＣ１／Ｘである、方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の方法であって、前記ペプチドが配列番号１に示される５９個のアミノ酸配列内のアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項１７】
ＭＵＣ１タンパク質の膜貫通イソ型の細胞外領域中のエピトープに特異的に結合する単離された抗体。
【請求項１８】
請求項１７に記載の単離された抗体であって、前記ＭＵＣ１タンパク質のイソ型がＭＵＣ１／Ｙタンパク質、ＭＵＣ１／ＲＥＰタンパク質またはＭＵＣ１／Ｘタンパク質である、抗体。
【請求項１９】
請求項１７に記載の単離された抗体であって、該抗体がモノクローナル抗体、合成の抗体、ポリクローナル抗体またはキメラである、抗体。
【請求項２０】
請求項１７に記載の抗体であって、前記エピトープが配列番号１に示される５９個のアミノ酸配列内のアミノ酸配列である、抗体。
【請求項２１】
ＭＵＣ１タンパク質の膜貫通イソ型の細胞外領域中のエピトープに結合するモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞。
【請求項２２】
請求項２１に記載のハイブリドーマであって、前記ＭＵＣ１タンパク質のイソ型がＭＵＣ１／Ｙタンパク質、ＭＵＣ１／ＲＥＰタンパク質またはＭＵＣ１／Ｘタンパク質である、ハイブリドーマ。
【請求項２３】
ＭＵＣ１タンパク質の膜貫通イソ型内のエピトープに特異的に結合する有効量のリガンドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項２４】
請求項２３に記載の薬学的組成物であって、前記リガンドが細胞殺傷剤に結合体化される、組成物。
【請求項２５】
請求項２３に記載の薬学的組成物であって、前記ＭＵＣ１イソ型がＭＵＣ１／Ｙ、ＭＵＣ１／ＲＥＰまたはＭＵＣ１／Ｘである、組成物。
【請求項２６】
請求項２３に記載の薬学的組成物であって、前記エピトープが、配列番号１に示される５９個のアミノ酸配列内のアミノ酸配列である、組成物。
【請求項２７】
請求項２３に記載の薬学的組成物であって、前記リガンドが、抗体、ペプチド、アンタゴニストまたはアゴニストである、組成物。
【請求項２８】
請求項２７に記載の薬学的組成物であって、前記抗体が、モノクローナル抗体、合成の抗体、ポリクローナル抗体またはキメラである、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（本発明の分野）
本発明は、癌において腫瘍細胞の増殖または成長を阻害する方法および／または細胞死を誘導する方法に関する。本発明は、上皮、結腸、肺、乳房および卵巣の腫瘍細胞、またはＭＵＣ１タンパク質を発現する他の細胞において成長または増殖を抑制し、そして死滅を誘導するための、抗体、ハイブリドーマおよびその同等物を含む薬学的組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
腫瘍マーカーは、正常細胞の悪性腫瘍細胞への形質転換と関係する分子である。腫瘍マーカーは、正常細胞において発現されるタンパク質とは異なる変異したタンパク質か、または正常細胞においては発現されないかもしくはほとんど発現されないタンパク質の過剰発現のいずれかである。
【０００３】
ムチンは、高分子量の糖タンパク質であり、これらは正常な上皮細胞により産生される。ＭＵＣ１は、現在までに知られている４つのムチンのうちの１つであり、膜貫通分子であり、そして成体におけるその機能はおそらくは潤滑であるが、胎児においては、それはお互いに向かい合って位置する細胞を離して維持することによって、管の内腔を形成することに重要な機能を果たすと考えられている。ＭＵＣ１遺伝子はまた、造血組織において発現されることが示されている。ＭＵＣ１（または、Ｈ２３−Ａｇ、エピシアリン（ｅｐｉｓｉａｌｉｎ）、ＰＥＭ（多形態上皮ムチン）、ＭＣＡ（乳癌腫瘍抗原）およびＥＭＡ（上皮細胞膜抗原）と呼ばれる）の発現が、正常な休眠中の乳分泌上皮細胞と比較して、乳癌細胞において上昇している（１０〜５０倍）ことが見出される。さらに、Ｈ２３  ｍＡｂ（これはＭＵＣ１を認識する）を使用する免疫組織化学は、ＭＵＣ１が乳癌組織の９１％において、および乳癌転移のうちの１００％において発現され、一方では非悪性腫瘍組織はＨ２３  ｍＡｂ染色についてはネガティブであることを明らかにした（１）。血清および体液においてＭＵＣ１タンパク質の上昇したレベルは、ステージＩ〜ＩＶを有する乳癌患者のそれぞれ、７％、１７％、６４％および６７％において報告された。さらに、循環しているＭＵＣ１の上昇したレベルは、芳しくない予後と関係し得る。
【０００４】
ＭＵＣ１が乳癌以外では上皮の癌において過剰発現されることが示された。ＭＵＣ１は、上皮卵巣癌細胞、ならびに全ての型の肺癌細胞および他の癌において過剰発現されることが示された（２）。
【０００５】
悪性腫瘍において、ＭＵＣ１オリゴサッカライド（ｏｌｉｇｏｓａｃｈａｒｉｄｅ）鎖は、正常細胞におけるＭＵＣ１と比較して、より短く、そしてより低密度である。このことは、癌関連ムチンにおいて、中心的なタンパク質の新規エピトープの解明を導く。
【０００６】
ＭＵＣ１  ｃＤＮＡの単離は、いくつかのタンパク質イソ型を明らかにした：ＭＵＣ１／ＲＥＰタンパク質、ＭＵＣ１／ＳＥＣタンパク質、ＭＵＣ１／Ｙタンパク質およびＭＵＣ１／Ｘタンパク質である。本発明と関係する４つの上述のイソ型の簡単な説明は以下に提供される：
ＭＵＣ１／ＲＥＰイソ型は、膜貫通タンパク質であり、これは、重度にグリコシル化された２０アミノ酸の反復モチーフからなる巨大な細胞外ドメイン（これらの反復の数は２０から１００まで変動し、従ってＶＮＴＲ（Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  Ｔａｎｄｅｍ  Ｒｅｐｅａｔ）と名付けられる）；膜貫通ドメイン（２８アミノ酸の疎水性配列からなる）、および７２アミノ酸の細胞質ドメインを有する。ＭＵＣ１／ＲＥＰタンパク質の生合成中に、これはタンパク質分解性の切断現象を受ける。この切断は、細胞外ドメイン内に含まれる、保存された配列ＩＫＦＲＰＧＳＶＶＶ内で起こる。興味深いことに、従来同定されたモジュールのうちのこの切断部位残基は、「ＳＥＡ」モジュールと称され（３）、ある向きまたは別向きで細胞膜に一様に結合される、多くの高度にＯ結合性グリコシル化されるタンパク質において見出される。このＳＥＡモジュールは、タンパク質性分解のための部位としてだけでなく、およびサブユニットの連続的な再会合のための部位として機能する。結論として、ＭＵＣ１／ＲＥＰタンパク質は、より小さな細胞固定サブユニット（膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインが後に続く小さな細胞外フラグメントからなる）に対する、非共有結合性でＳＤＳ感受性の結合によって結合された巨大な細胞外サブユニット（反復アレイを含む）から構成されるヘテロ二量体として、細胞膜上に提示される。この巨大な細胞外サブユニットは切断され、そして細胞固定サブユニットの小さな細胞外フラグメントと再結合し得る。
【０００７】
ＭＵＣ１／Ｙイソ型は、ＭＵＣ１／ＲＥＰタンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインと同一の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、膜貫通タンパク質である。ＭＵＣ１／ＲＥＰとは異なり、反復アレイの上流および下流に位置するスプライシング部位を利用する差異的なスプライシング現象に起因して、ＭＵＣ１／Ｙタンパク質は、タンデムリピートアレイおよびその隣接領域の両方を欠失する。ＭＵＣ１／Ｙの発現は、種々のヒトの分泌性上皮腫瘍において実証された。ＭＵＣ１／Ｙは、種々のヒト上皮腫瘍細胞の細胞表面上に発現されることを見出されたが、隣接する正常な細胞においては検出されない。
【０００８】
ＭＵＣ１／Ｘイソ型（４）は、ＭＵＣ１／ＲＥＰタンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインと同一の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、膜貫通タンパク質である。ＭＵＣ１／ＲＥＰとは異なり、反復アレイの上流および下流に位置するスプライシング部位を利用する差異的なスプライシング現象に起因して、ＭＵＣ１／Ｘタンパク質は、タンデムリピートアレイおよびその隣接領域の両方を欠失する。
【０００９】
ＭＵＣ１／ＳＥＣイソ型：このイソ型は、選択的スプライシング機構により生成される。このタンパク質は、細胞膜にこのタンパク質を結合させ得る疎水性領域を欠いているので、分泌性のタンパク質である。このＮ末端配列は、ＭＵＣ１／ＲＥＰの細胞外ドメインの配列と同一である。さらに、可溶性の分泌性ＭＵＣ１／ＳＥＣタンパク質が、ＭＵＣ１／Ｙタンパク質の細胞外ドメインに特異的に結合し得ることが示されている（５）。
【００１０】
従って、ＭＵＣ１タンパク質における特定のエピトープに対して、そしてさらに具体的には、細胞（例えば、癌細胞および特にＭＵＣ１タンパク質を過剰発現する細胞）の、増殖および成長を劇的に阻害しそして細胞死を誘導するＭＵＣ１／ＲＥＰタンパク質またはＭＵＣ／Ｙタンパク質における特定の細胞外エピトープに対して、結合するリガンドを開発することは非常に有益である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（本発明の要旨）
１つの実施形態において、本発明は、ＭＵＣ１タンパク質を発現する、癌細胞において、そして特に上皮、乳房、結腸、肺および卵巣の腫瘍細胞において、増殖または成長を阻害し、そして／または細胞死を誘導するための方法を提供する。
【００１２】
１つの実施形態において、本発明は、細胞の増殖および細胞成長を選択的に阻害する方法を提供し、ＭＵＣ１タンパク質の膜貫通イソ型の細胞外領域中のエピトープに特異的に結合する、有効量のリガンドを被験体に投与し、それによってそのような細胞の増殖または成長を選択的に阻害する工程を包含する。
【００１３】
１つの実施形態において、本発明はさらに、細胞死を誘導する方法を提供し、ＭＵＣ１タンパク質の膜貫通イソ型の細胞外領域中のエピトープに特異的に結合する、有効量のリガンドを被験体に投与し、それによって細胞死を選択的に誘導する工程を包含する。
【００１４】
１つの実施形態において、本発明は、細胞増殖および細胞成長を選択的に阻害する方法を提供し、ＭＵＣ１タンパク質の膜貫通イソ型の細胞外領域中のエピトープに特異的に結合する有効量のリガンドと、ＭＵＣ１タンパク質イソ型を発現する細胞を接触させ、それによって細胞増殖または細胞成長を選択的に阻害する工程を包含する。
【００１５】
本発明は、細胞死を誘導する方法を提供し、ＭＵＣ１タンパク質の膜貫通イソ型の細胞外領域中のエピトープに特異的に結合する有効量のリガンドと、ＭＵＣ１タンパク質イソ型を発現する細胞を接触させ、それによって細胞死を選択的に誘導する工程を包含する。
【００１６】
１つの実施形態において、本発明はさらに、細胞の病理学的な増殖に関係する疾患に羅患した被験体を処置する方法を提供し、ＭＵＣ１タンパク質の膜貫通イソ型の細胞外領域中のエピトープに特異的に結合する、有効量のリガンドを被験体に投与し、それによってその疾患を処置する工程を包含する。
【００１７】
１つの実施形態において、本発明はさらに、細胞の病理学的な増殖に関係する疾患に羅患した被験体を処置する方法を提供し、被験体においてＭＵＣ１タンパク質の膜貫通イソ型の細胞外領域に一致するアミノ酸配列を含むペプチドに対して特異的な抗体のレベルの増加を誘導するために、有効量のそのペプチドを被験体に投与し、それによって疾患を処置する工程を包含する。
【００１８】
１つの実施形態において、本発明はさらに、ＭＵＣ１タンパク質イソ型の細胞外領域中のエピトープに特異的に結合する単離された抗体を提供し、ここで、そのエピトープは、配列番号１のアミノ酸配列に従う５９アミノ酸配列中に位置付けられる。
【００１９】
１つの実施形態において、本発明はさらに、ＭＵＣ１タンパク質イソ型に特異的に結合する有効量のリガンド、および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供する。
【００２０】
１つの実施形態において、本発明はさらに、ＭＵＣ１タンパク質イソ型の細胞外領域中のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を提供する。１つの実施形態において、そのエピトープは、配列番号１のアミノ酸配列に従う５９アミノ酸配列中に位置付けられ、そしてこのタンパク質の膜貫通ドメインのＮ’末端に直接位置付けられる。
【００２１】
（発明の詳細な説明）
ＭＵＣ１は、正常上皮細胞よって産生される膜貫通糖タンパク質である４つのムチンのうちの１つである。先に記載されたように、ＭＵＣ１の発現は全てのヒト乳癌細胞および他の上皮癌細胞において、顕著に増加される。ＭＵＣ１の配列は、図５に示される。
【００２２】
用語「特異的な結合」または「特異的に結合する」とは、本明細書および特許請求の範囲の節において、タンパク質、ペプチド、アゴニスト、抗体またはアンタゴニストの間の相互作用をいう。この相互作用は、結合分子によって認識される、タンパク質の特定の構造（例えば、抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存する。
【００２３】
別の実施形態において、このリガンドは抗体、抗体フラグメント、アンタゴニスト、アゴニストまたはペプチドであり得る。
【００２４】
用語「細胞を接触させること」とは、本明細書および特許請求の範囲において、細胞を投与すること、または細胞をリガンドに曝露することをいい、このリガンドは、当該分野で公知である直接的な適用の方法によって、ＭＵＣ１／ＹもしくはＭＵＣ１／ＸまたはＭＵＣ１／ＲＥＰにある特定のエピトープに結合する。このリガンドは、細胞の播種前または播種後に適用され得る。
【００２５】
用語「アンタゴニスト」とは、エピトープに結合される場合、エピトープの生物学的活性または免疫学的活性の効果の量または持続期間を低減させる分子をいう。アンタゴニストとしては、細胞増殖もしくは細胞生存率に対してＭＵＣ１エピトープの効果を低減させる、タンパク質、核酸、炭水化物、抗体、アンチセンスまたは全ての他の分子が挙げられ得る。
【００２６】
「抗体フラグメント」は、全長の抗体の一部、一般的にはその抗原結合領域または可変領域を含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント；ダイアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ）；直鎖抗体；単鎖抗体分子；ならびに抗体フラグメントから形成される多種特異的抗体（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）が挙げられる。
【００２７】
用語「アゴニスト」とは、本明細書および特許請求の範囲において、エピトープを結合されるかまたは活性化する場合、エピトープの生物学的活性または免疫学的活性の効果の量または持続期間を増加させる任意の分子をいう。この分子は、ペプチド構築物または核酸構築物であり得る。
【００２８】
本明細書において実証されるように、本出願人らは、実施例２および図３において明確に例示される細胞成長および／または細胞増殖に対する抗体ＢＯＳ７Ｄ１０の効果を予期せず発見した。ＭＵＣ１／ＹまたはＭＵＣ１／ＳＥＣに対するこの抗体および他の抗体の、細胞生存率に対する効果を、当該分野で周知である、ＭＴＴアッセイおよび顕微鏡を使用することによって評価した。配列番号１に記される５９アミノ酸配列（ここで、この５９アミノ酸配列は、ＭＵＣ１／Ｙタンパク質イソ型およびＭＵＣ１／Ｘタンパク質イソ型ならびにＭＵＣ１／ＲＥＰタンパク質イソ型の膜貫通ドメインからＮ末端に直ぐに位置付けられる）中に含まれるエピトープに対するＢＯＳ７Ｄ１０の効果は、同一のタンパク質上の異なるエピトープに結合する他の抗体と比較すると著しかった。
【００２９】
用語「細胞増殖または細胞成長を選択的に阻害すること」とは、本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、死滅を意味するか、または成長（すなわち、分化）もしくは増殖（すなわち、病理学的に増殖している細胞を受容不能な死滅を導かずに生育させること、または正常細胞の成長もしくは増殖の低減なしに繁殖させること）を低減させること、あるいは成長もしくは増殖の低減を意味する。1つの実施例において、死滅、または成長（すなわち、分化）の低減もしくは増殖（すなわち、病理学的に増殖している細胞の繁殖）の低減は、少なくとも２０％である。本発明に記載された抗体は、増殖を阻害するための潜在的な薬剤として示される（図３Ａ）。
【００３０】
「細胞死を選択的に誘導すること」とは、本明細書および特許請求の範囲において、病理学的な細胞の生存率の、少なくとも２０％の低減を導くことをいう。細胞死は、細胞生存率を評価すること（例えば、形態、またはＭＴＴアッセイもしくはヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色のような異なる色素の使用）、トリパンブルーアッセイ、前細胞質性の（ｐｒｅ−ｃｙｔｏｔｉｃ）ＤＮＡフラグメント化、膜対称性の変化、アポトーシス性カスパーゼの活性化、およびミトコンドリアによるシトクロムＣの細胞質中への放出、当業者に周知であるアクチンフィラメントの分解、の方法によって実証され得る。
【００３１】
細胞死を達成する多くのプロセスが存在し得、そしてこれらのうちのいくつかはアポトーシスを誘導し得る。アポトーシス以外の他の細胞死メカニズムが存在するが、細胞が細胞死に到る方法に関係無い細胞死のいくつかの特徴が存在するという推測が存在する。これら細胞死の特徴の1つは、代謝の不在であり、そして別のものは酵素の変性である。いずれの場合においても、生存株はこれらの細胞を染色し得ない。細胞死のこれらの終末点は、長い間理解されており、そして細胞死メカニズムの現在の理解を早める。さらに、細胞が死滅される細胞毒性効果と、細胞増殖が阻害される細胞分裂停止効果との間に差異が存在する。実施例の節において示されるデータに従って、本発明の抗体は細胞毒性剤および細胞分裂停止剤として有効であり、そしてアポトーシス抗体とみなされる。
【００３２】
本発明の「細胞」とは、本明細書および特許請求の範囲の節において、本発明の別の実施形態に従ってＭＵＣ／１タンパク質を発現する癌細胞のような、病理学的に増殖している細胞をいう。別の実施形態において、ＭＵＣ１タンパク質は過剰発現される。
【００３３】
癌細胞は、ＭＵＣ１タンパク質イソ型を発現する、上皮細胞、乳癌細胞、結腸癌細胞、肺癌細胞、または全ての細胞であり得るが、これらに限定されない。ＭＵＣ１タンパク質イソ型は、ＭＵＣ１／Ｙタンパク質、ＭＵＣ１／Ｘタンパク質、ＭＵＣ１／ＲＥＰタンパク質およびＭＵＣ１／ＳＥＣタンパク質のようなタンパク質イソ型を含むが、これらに限定されない。「イソ型」は、同一遺伝子から翻訳されるが、翻訳後修飾または転写後修飾に起因して、異なる数のアミノ酸および／もしくは異なる付加基を含み得、そして／または異なる分子構造を有し得るタンパク質である。
【００３４】
ＭＵＣ１／Ｙ、ＭＵＣ１／ＸおよびＭＵＣ１／ＲＥＰは、同一の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを有する。さらに重要なことに、膜貫通ドメインからＮ’末端に位置付けられるドメインは、これらの２つのイソ型において同一である（図２中の赤い枠）。従って、本発明の抗体は、両方のタンパク質イソ型上に存在するエピトープに結合し得る。
【００３５】
用語「エピトープ」とは、特定の抗体と結合する、抗原の特定の部分をいう。本発明の実施形態に従って、エピトープの長さは４〜１２アミノ酸である。別の実施形態において、エピトープの長さは５〜１０アミノ酸であり、なお別の実施形態において、エピトープの長さは６〜８アミノ酸である。エピトープの配列は、配列番号１および以下に示される５９アミノ酸配列中に含まれる：
（Ｎ末端）  ＳＶＶ  ＶＱＬＴＬＡＦＲＥＧ  ＴＩＮＶＨＤＶＥＴＱ  ＦＮＱＹＫＴＥＡＡＳ  ＲＹＮＬＴＩＳＤＶＳ  ＶＳＤＶＰＦＰＦＳＡ  ＱＳＧＡＧＶ  （Ｃ末端）。
【００３６】
別の実施形態において、エピトープは、ＭＵＣ１／Ｙタンパク質、ＭＵＣ１／Ｘタンパク質およびＭＵＣ１／ＲＥＰタンパク質の膜貫通ドメインのＮ末端に直接位置付けられる５９アミノ酸セグメントのＮ末端部分に存在する１５アミノ酸配列中に位置付けられる。エピトープは、ＭＵＣ１／Ｙタンパク質、ＭＵＣ１／Ｘタンパク質およびＭＵＣ１／ＲＥＰタンパク質の膜貫通イソ型の細胞外領域中に位置付けられる。
【００３７】
用語「細胞外領域」とは、本明細書および特許請求の範囲において、膜貫通ドメインからＮ末端に直ぐに位置付けられ、細胞外環境に存在するようである、種々の数のアミノ酸のストレッチをいう。
【００３８】
用語「膜貫通」とは、本明細書および特許請求の範囲において、主として疎水性の、膜内に位置付けられる、タンパク質の細胞質ドメインからＮ末端で、そしてタンパク質の細胞外ドメインからＣ末端の、アミノ酸のストレッチである。このドメインは、タンパク質の膜への固着を可能とする。
【００３９】
用語「抗体」とは、本明細書および特許請求の範囲において、天然に存在するか、部分的もしくは全体的に合成により作製される、免疫グロブリンをいう。抗体はヒト抗体または動物の抗体であり得る。この用語はまた、抗体の結合ドメインであるか、抗体の結合ドメインに相同性のある、結合ドメインを有する全てのポリペプチドまたはタンパク質を包含する。これら抗体は、天然供給源から由来し得るか、または部分的もしくは全体的に合成により作製され得る。抗体の例は、免疫グロブリンアイソタイプおよびそれらのアイソタイプのサブクラス；フラグメント（これはＦａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄのような抗原結合ドメインを含む）；ならびにダイアボディーであり得る。実施例２で例示されるように、抗体ＢＯＳ７Ｄ１０は、細胞増殖に対する潜在的な阻害効果、およびＭＣＦ７に対する潜在的な細胞死活性を示した。
【００４０】
モノクローナル抗体および他のポリクローナル抗体を必要とし、そして、元来の抗体の特異性を維持する他の抗体またはキメラ分子を生成するために組み換えＤＮＡ工学の技術を使用することが可能である。このような技術としては、定常領域、または定常領域＋異なる免疫グロブリンのフレームワーク領域に対する抗体の免疫グロブリンの可変領域、または、相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするＤＮＡを導入することが挙げられる。例えば、ＥＰ−Ａ−１８４１８７、ＧＥ２１８８６３８ＡまたはＥＰ−Ａ−２３９４００を参照のこと。抗体は、多数の方法によって改変され得るので、用語「抗体」は、任意の特異的結合メンバーまたは必要な特異性を有する結合ドメインを有する物質をカバーするように構築されるべきである。従って、この用語は、抗体フラグメント、この抗体の誘導体、機能的等価物およびホモログ（天然であろうと、全体的にかまたは部分的に合成的であろうと、免疫グロブリン結合ドメインを含む任意のポリペプチドを含む）をカバーする。従って、他のポリペプチドに融合された、免疫グロブリン結合ドメインを含むキメラ分子、または等価物が含まれる。キメラ抗体のクローニングおよび発現は、ＥＰ−Ａ−１２０６９４およびＥＰ−Ａ−０１２５０２３中に記載される。
【００４１】
全抗体のフラグメントは、結合抗原の機能を実行し得ることが示されている。結合フラグメントの例は、（ｉ）ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメインおよびＣＨＩドメインからなるＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ＶＨドメインおよびＣＨＩドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；（ｉｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（８）；（ｖ）単離されたＣＤＲ領域；（ｖｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントであって、２つの連結したＦａｂフラグメントを含む、二価のフラグメント（ｖｉｉ）単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（ここで、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、２つのドメインを抗原結合部位（９〜１０）を形成するために結合させるペプチドリンカーによって連結される）、（ｖｉｉｉ）二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）単鎖Ｆｖダイマー（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５）ならびに（ｉｘ）「ダイアボディー」であって、遺伝子融合によって構築された多価または多特異性（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）フラグメント（ＷＯ９４／１３８０４；（１１）である。ダイアボディーは、ポリペプチドのマルチマーであって、各ポリペプチドは、免疫グロブリン軽鎖の結合領域を含む第１のドメイン、および免疫グロブリン重鎖の結合領域を含む第２のドメインを含み、この２つのドメインは、（例えば、ペプチドリンカーによって）連結されるが、互いに会合して抗原結合部位を形成し得ず：抗原結合部位は、マルチマー内のあるポリペプチドの第１のドメインと、このマルチマー内の別のポリペプチドの第２のドメインとの結合によって形成される（ＷＯ９４／１３８０４）。
【００４２】
癌の処置に関して、モノクローナル抗体の潜在的な利点の１つは、単一の抗原を特異的に認識するそれらの能力である。いくつかの場合、癌細胞は、形質転換細胞の種に対して特異的な抗原を有することが考えられた。現在では、癌細胞は、独特の抗原をほとんど有さず、むしろ、これらの癌細胞は、正常な抗原（例えば、ＭＵＣ１タンパク質）を過剰発現するか、胎児抗原を発現する傾向があるということが、頻繁に思われている。それにもかかわらず、モノクローナル抗体を使用することで、再生可能な抗体の用量を、ポリクローナル抗体よりも良い応答率が期待される患者に送達する方法が提供される。
【００４３】
実施例３に例示されるように、驚くべき、予想外の相関が、ＭＵＣ１／ＳＥＣとＭＵＣ１／Ｙとの相互作用に対する抗体の効果と、細胞死に対するこの抗体の効果との間に見出されている。細胞死を誘導する際に可能な抗体はまた、イソ型管の相互作用を誘導する際に可能であり、そして、逆もまた同じであった（表１を参照のこと）。この驚くべき相関は、細胞死を誘導する際の抗体の作用の機構に関連され得る。
【００４４】
本発明はさらに、単離された抗体を提供し、この抗体は、記載されたエピトープに結合する。この抗体は、モノクローナル抗体、合成抗体、ポリクローナル抗体またはキメラ（例えば、ヒト定常領域に結合されるマウス可変領域）であり得る。
【００４５】
別の実施形態において、本発明は、病理学的な細胞増殖に関連する疾患を有する被験体を処置する方法を提供し、この方法は、ＭＵＣ１タンパク質の膜貫通イソ型の細胞外領域に対応するアミノ酸配列を含む、有効量のペプチドを、必要な患者に投与する工程を包含し、このペプチドは、例えば、配列番号１の５９アミノ酸配列であり、これは、ＭＵＣ１タンパク質の膜貫通ドメインのＮ’末端に、直接的に位置付けされる。本発明に従って、このペプチドは、被験体中で、このペプチドに対して特異的な抗体のレベルの増加を誘導する。用語「ペプチドに対して特異的な抗体のレベルの増加を誘導する」は、非処置の被験体におけるこの抗体の基礎量を上回る、このペプチドに対して指向された特異的抗体のレベルの増加をいう。
【００４６】
抗体のエピトープを誘導する領域のアミノ酸配列が、図６中に示される。ＢＯＳ７Ｄ１０は、登録番号ＡＴＣＣ−登録番号ＸＸＸＸに基づいて、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．ＵＳＡに預けられている。
【００４７】
用語「アミノ酸」または「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質配列、またはこれらの任意のフラグメントをいい、そして、天然に存在するか、または合成的な分子をいう。
【００４８】
本発明はさらに、ある量のリガンド（例えば、抗体、ペプチドまたはアンタゴニストで、ＭＵＣ１タンパク質に特異的に結合する）および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供する。
【００４９】
用語「薬学的に受容可能なキャリア」は、生物に対して顕著な刺激作用を起こさず、そして、投与される化合物の生物学的活性および特性を抑止しないキャリアまたは希釈液をいう。
【００５０】
本発明はさらに、病理学的な哺乳動物細胞の増殖（例えば癌）に関連する疾患を有する哺乳動物（特にヒト）を処置するために、拡大され得る。「処置（する）」ことは：（ｉ）疾患を予防すること（この疾患は、疾患、障害および／または状態にかかりそうであり得るが、まだそれを有すると診断されていない動物において生じる）；（ｉｉ）疾患を阻害すること（すなわち、その発生を阻止すること）；ならびに（ｉｉｉ）疾患を軽減すること（すなわち、この疾患の後退を起こすこと）をいう。
【００５１】
従って、本発明はさらに、哺乳細胞の病理学的な増殖または細胞増殖を阻害する方法を提供し、この方法は、ＭＵＣ１タンパク質の膜貫通イソ型の細胞外領域中のエピトープに特異的に結合する、有効量のリガンドを、それが必要な被験体に投与し、これによって、哺乳動物細胞の異常増殖または増殖を選択的に阻害する工程を包含する。
【００５２】
別の実施形態において、本発明は、細胞死を誘導する方法を提供し、この方法は、ＭＵＣ１タンパク質の膜貫通イソ型の細胞外領域中のエピトープに特異的に結合する、有効量のリガンドを、それが必要な被験体に投与し、これによって、細胞死を誘導する工程を包含する。
【００５３】
投与する工程は、標的細胞に標的化される薬学的に受容可能なキャリアとともに、リガンドのどちらかの直接的注射に関し得る。あるいは，異なる酵素によってか、または異なる化学的−物理学的条件によってかのいずれかで、必要とされる標的細胞中でのみ活性化されるプロドラッグが、使用され得る。
【００５４】
リポソームは、薬剤を癌患者に首尾良く投与するために使用されており、そして、抗癌剤（例えば、ドキソルビシン複合体、ダウノルビシン複合体およびシスプラチナム複合体）の送達において、臨床学的に有用であることが示されている（１２〜１４）。
【００５５】
同様に、ミセルはまた、薬剤を患者に送達するために使用されており（１５）、そして、ミセルは、薬物キャリアとして、および標的化薬物送達のために使用されており（１６〜１７）、癌薬剤を含む（１８〜１９）。
【００５６】
抗体または組成物が、経口投与に適切である場合、処方物は、活性成分に加えて、以下のような添加物を含み得る：スターチ（例えば、ポテトスターチ、トウモロコシスターチまたはコムギスターチ）またはセルロース誘導体もしくはスターチ誘導体（例えば、微晶質セルロース）；シリカ；様々な糖（例えば、ラクトース）；炭酸マグネシウムおよび／またはリン酸カルシウム。経口処方物が、投与のためである場合、これは、患者の消化器管によって良好に許容されることが、所望される。この目的を達するために、粘液形成物（ｆｏｒｍｅｒ）および樹脂を含むことが所望され得る。胃液中で不溶性であるカプセル中に、抗体または組成物を処方することによって許容性を改善することもまた、所望される。徐放性処方物中に抗体または組成物を含むこともまた、好ましくあり得る。
【００５７】
抗体または組成物が、直腸投与に適切である場合、この処方物は、結合剤および／または潤滑剤（例えば、重合体のグリコール、ゼラチン、ココアバターまたは他の植物蝋または植物性脂肪）を含み得る。
【００５８】
本発明中で利用される薬学的組成物は、以下を含むがこれらに限定されない、いくつもの経路によって投与され得る：経口手段、静脈内手段、筋肉内手段、動脈内手段、骨髄内手段、くも膜下腔内手段、脳室内手段、経皮手段、皮下手段、腹腔内手段、鼻腔内手段、経腸的手段、局所的手段、舌下手段または直腸手段。あるいは、抗体または組成物は、使用する前に、適切な滅菌液体との再構成のために、乾燥形態であり得る。
【００５９】
活性成分に加えて、これらの薬学的組成物は、賦形剤および補助剤を含む、適切な薬学的に受容可能なキャリアを含み得、これらは、活性化合物の調製物への処理を容易にし、これは、薬学的に使用され得る。処方および投与についての技術に対するさらなる詳細は、ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｍａａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｅａｓｔｏｎ  Ｐａ）の最新版中に見出され得る。
【００６０】
経口投与のための薬学的組成物は、経口投与に適切な投薬量で、当該分野で周知の薬学的に受容可能なキャリアを使用して、処方され得る。このようなキャリアは、患者による摂取のために、薬学的組成物が、錠剤、丸剤、糖剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして処方されることを可能にする。
【００６１】
経口用途のための薬学的調製物は、タブレットまたは糖剤コアを得るために、活性化合物を固体賦形剤と合わせること、および得られた顆粒の混合物を（必要に応じて、粉砕後に）加工することを介して、得られ得る。適切な補助剤が、所望される場合添加され得る。適切な賦形剤としては、炭水化物またはタンパク質充填剤（例えば、糖（ラクトース、スクロース、マンニトール、およびソルビトール）；トウモロコシ、コムギ、イネ、ポテトまたは他の植物からのスターチ；セルロース（例えば、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウム）；ゴム（アラビアゴムおよびトラガカントゴムを含む）；ならびにタンパク質（例えば、ゼラチンおよびコラーゲン）が挙げられる。所望される場合、分解剤または可溶化剤（例えば、架橋化ポリビニルピロリドン、寒天およびアルギン酸、またはそれらの塩（例えば、アルギン酸ナトリウム））が、添加され得る。
【００６２】
糖剤コアは、適切なコーティング剤（例えば、濃縮糖溶液）とともに使用され得、これはまた、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポル（ｃａｒｂｏｐｏｌ）ゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、ならびに適切な有機溶媒もしくは溶媒混合物であり得る。染料または顔料が、製品同定のために、または活性化合物の量（すなわち投薬量）を特徴付けるために、錠剤または糖剤に添加され得る。
【００６３】
薬学的調製物（経口的に使用され得る）としては、ゼラチンから作製される圧力適合（ｐｕｓｈ−ｆｉｔ）カプセル、ならびに、ゼラチンおよびコーティング剤（例えば、グリセロールまたはソルビトール）から作製される、軟らかい密封カプセルが挙げられる、圧力適合カプセルは、充填剤または結合剤（例えば、ラクトースまたはスターチ）、潤滑剤（例えば、タルク、またはステアリン酸マグネシウム）、必要に応じて安定化剤と混合された活性成分を含み得る。ソフトカプセルにおいて、活性化合物は、適切な液体（例えば、脂肪油、液体、安定化剤を含むか、または含まない液体ポリエチレングリコール）中に溶解されても、懸濁されても良い。
【００６４】
非経口投与に適切な薬学的処方物は、水性溶液中で、好ましくは、生理学的に適合可能な緩衝液（ハンクス液、リンガー液、または生理学的に緩衝化された生理食塩水）中で処方され得る。水性注射懸濁液は、この懸濁液の粘度を増加する物質（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストラン）を含み得る。さらに、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製され得る。適切な親和脂肪性の溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油（例えば、ゴマ油）、または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチル）、トリグリセリド、またはリポソームが挙げられる。非脂質ポリカチオン性アミノポリマーは、送達のために使用され得る。必要に応じて、懸濁液はまた、適切な安定剤、または，化合物の溶解度を増強させ、そして、高度に濃縮された溶液を調製することを可能にする薬剤を含み得る。
【００６５】
局所投与または鼻腔内投与について、特定のバリアが浸透されるのに適切な浸透剤が、処方において使用される。このような浸透剤は、一般に、当該分野で公知である。
【００６６】
本発明の薬学的組成物は、当該分野で公知の様式（例えば、従来の混合、溶解、顆粒化、糖剤作製、糊状化、乳化、カプセル化、取り込み、または凍結乾燥プロセス処理によって）で、製造され得る。
【００６７】
薬学的組成物が調製された後、これらの組成物は、適切な容器中に配置され得、そして、示された条件の処置のためにラベルが貼られ得る。
【００６８】
本発明における使用に適切な薬学的組成物としては、活性成分が、意図される目的を達成するのに有効な量で含まれる組成物を含む。有効用量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。
【００６９】
任意の化合物について、治療有効用量は、例えば、腫瘍性細胞の細胞アッセイ、または動物モデル（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、またはブタ）における）のいずれかにおいて最初に見積もられ得る。動物モデルはまた、投与の適切な濃度範囲および経路を決定するために、使用され得る。次いで、このような情報は、ヒトにおける投与に有効な用量および経路を決定するために、使用され得る。有効用量はまた、ヒトにおける臨床試験においても、決定される。
【００７０】
本発明のリガンドは、ＭＵＣ１／ＹとＭＵＣ１／ＳＥＣとの相互作用を促進し得る。形態の変化は、図３Ｂ〜Ｄ中で観察され、そして、これらの２つのイソ型の相互作用に関与し得、ここで、ＭＵＣ１／ＳＥＣは、レセプターとして振舞うＭＵＣ１／Ｙに対するリガンドとして機能する。
【００７１】
用語「癌」は、広義に解釈される。本発明のリガンド（例えば、抗体またはアンタゴニスト）は、「抗癌剤」であり得、この用語はまた、「抗腫瘍細胞増殖剤」および「抗新生物薬剤（ａｎｔｉ−ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）」を含み得る。例えば、本発明の方法は、細胞死を誘導すること、または病理細胞の増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）／もしくは増殖（ｇｒｏｗｔｈ）を阻害することによる癌の処置に有用である。
【００７２】
本発明はさらに、ＭＵＣ１タンパク質のイソ型の細胞外領域中のエピトープに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を提供する。
【００７３】
本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，ｐ４９５（１９７５）によって記載される一般的な手順に従って、生成される。この手順において、ハイブリドーマは、体細胞雑種形成手順を使用して、抗体生成細胞（代表的には、ムチン抗原供給源で以前に免疫化されたマウスの脾臓細胞）を、不死化腫瘍とを融合することによって、調製される。薬剤は、ムチン抗原に対する抗体の生成を誘導するための動物の免疫化（「免疫原」）のために使用された。
【００７４】
抗体の生成について、様々な宿主（ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒトおよび他のものを含む）は、関連するエピトープ、または、免疫原性特性を有するそれらの任意のフラグメントまたはオリゴエピトープを注射することによって、免疫され得る。宿主の種に依存して、様々なアジュバンドが、免疫応答を増強するために使用され得る。このようなアジュバンドとしては、フロイント、ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム）および、界面活性物質（例えば、リソレクチン、プルロニックポリオール（ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ｐｏｌｙｏｌ）、ポルアニオン、ペプチド、油乳濁剤、ＫＬＨ、およびジニトロフェノール）が挙げられるが、これらに限定されない。ヒトにおいて使用されるアジュバンドの中で、ＢＣＧ（カルメットゲラン菌）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍが特に、好ましいＦｒｅｕｎｄのアジュバンドである。
【００７５】
融合プロセスから得られたハイブリドーマは、増殖させられる。その後、得られた上清は、特異的抗原に結合し得る、上清内に存在する抗体を検出するために、イムノアッセイ手順を使用してスクリーニングされる。他の場合、上清は、培養された癌細胞に結合する能力についてスクリーニングされた。
【００７６】
抗体は、患者における癌の治療的処置のために設計される。従って、抗体は、裸の抗体であり得る。別の実施形態において、この抗体は、細胞傷害性薬物に結合体化され得る。細胞毒性薬物という用語は、例えば放射性同位体に限定されないがこれらを含む細胞を死滅させる任意の薬剤をいう。抗体は、他の分子を癌細胞に標的化するために使用され得る。細胞傷害性薬物の例としては、ブロモデオキシウリジン（ＢＵｄＲ）、５−ヨードデオキシウリジン（ＩＵｄＲ）、ブロモデオキシシチジン、フルオロデオキシウリジン（ＦｕｄＲ）、ヒドロキシ尿素、シスプラチンであるが、これらに限定されない。
【００７７】
本発明が、記載されたものによって限定されないことが理解され、そして、多数の改変（これらの全ては本発明の範囲内である）が存在することが、理解される。例えば、本発明は、試験された抗体に関して記載されているが、記載されたエピトープの部分に重複する他の抗体は、類似の効果を実証し得る。
【００７８】
本発明は、本明細書中の上記で詳細に示され、そして記載されているものによって、限定されないことが、当業者によって理解される。
【実施例】
【００７９】
（実施例）
（材料および方法）
（細胞株）
ＨＢＬ−１００  −  上皮細胞株を、ヒト乳の初期の乳汁由来の細胞の初代培養物から取得した（２０）。この細胞は、タンデムに組み込まれたＳＶ４０を含む。
【００８０】
ＨＢＬ／ｎｅｏ（Ｈ／Ｎ）−適切なトランスフェクト体を、クローニングベクターｐＳＶ２ｎｅｏをＨＢＬ−１００細胞にトランスフェクトすることによって、生成した。
【００８１】
ＨＢＬ／Ｙ２（Ｈ／Ｙ２）−適切なトランスフェクト体を、ＭＵＣ１／Ｙ  ｃＤＮＡを保有する発現プラスミドと、クローニングベクターであるｐＳＶ２ｎｅｏを同時トランスフェクトすることによって、生成した。
【００８２】
（細胞培養増殖のための培地）
ＤＭＥＭ増殖培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏの改変Ｅａｇｌｅ培地）を、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｋｉｂｂｕｔｚ  Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ，Ｉｓｒａｅｌから購入した。
【００８３】
（培地補助剤：）
抗生物質：１０μｇ／ｍｌのナイスタチン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン（Ｂｉｏｌｏｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｋｉｂｂｕｔｚ  Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ，Ｉｓｒａｅｌ）。
【００８４】
４ｍＭのＬ−グルタミン（Ｂｉｏｌｏｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｋｉｂｂｕｔｚ  Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ，Ｉｓｒａｅｌ）。
【００８５】
熱不活性化（５６℃、３０分）１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｂｉｏｌｏｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｋｉｂｂｕｔｚ  Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ，Ｉｓｒａｅｌ）。
【００８６】
混合オキサロアセテート（Ｓｉｇｍａ）、ピルビン酸（Ｓｉｇｍａ）、インスリン（Ｓｉｇｍａ）（ＯＰＩ）を、ハイブリドーマの増殖培地に添加した。
【００８７】
（ハイブリドーマＳ．Ｍ（無血清）培地）−ＤＭＥＭ増殖培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏの改変Ｅａｇｌｅ培地）を、Ｆ１２培地（Ｂｉｏｌｏｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｋｉｂｂｕｔｚ  Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ，Ｉｓｒａｅｌ）で１：１に希釈し、そして、抗生物質（１０μｇ／ｍｌのナイスタチン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン）、４ｍＭのＬ−グルタミンおよび「ＢＩＯＧＲＯ−２」（合成無血清培地補助剤）を補充した。上記の材料の全ては、Ｂｉｏｌｏｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｋｉｂｂｕｔｚ  Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ，Ｉｓｒａｅｌから購入した。
【００８８】
（フローサイトメトリー媒質）−ＤＭＥＭに、上記の抗生物質、５％のＦＣＳおよび０．０１％のＮａ−Ａｚｉｄｅを補充した。
【００８９】
（抗体）
Ｈ２３−  ＭＵＣ１タンデムリピートアレイ内のエピトープを認識し、これにより、ＭＵＣ１／ＲＥＰおよびＭＵＣ１／ＳＥＣを検出し得るモノクローナル抗体。
【００９０】
ＢＯＳ６Ｅ６−  ＭＵＣ１／Ｙ特有のエピトープを認識する抗ＭＵＣ１／Ｙ特異的モノクローナル抗体。
【００９１】
ＢＯＳ７Ｄ１０、ＢＯＳ１０Ｄ２、ＢＯＳ１０Ｂ３−  ＭＵＣ１／Ｙ細胞外ドメイン内のエピトープを認識するモノクローナル抗体。
【００９２】
ＳＥＣ７Ｈ１０−  ＭＵＣ１／ＳＥＣのＣ末端の１１個のアミノ酸を認識する抗ＭＵＣ１／ＳＥＣ特異的ｍＡｂ。
【００９３】
（細胞培養）
（培養における細胞の増殖）
細胞を、それぞれ５ｍｌまたは１０ｍｌの培養培地で２５ｃｍ２または７５ｃｍ２の組織培養フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ  Ｃｏｓｔａｒ）中で培養し、そして９５％の空気と５％のＣＯ２で３７℃にてインキュベーター中で保持した。
【００９４】
（細胞の収集および接種）
単層中で増殖している細胞の収集を、０．５〜１ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡ溶液をフラスコに１〜５分間添加することによって実行した（細胞型選択）。次に、等量の１０％  ＦＣＳリッチな増殖培地を添加して、酵素活性を中和した。細胞を、増殖培地を含む組織培養フラスコ中に接種した。
【００９５】
（細胞計数）
細胞を、血球計算板を用いて計数した。死細胞を検出するために、細胞を０．０８％のトリパンブルーを含む培地中に再懸濁した。
【００９６】
（細胞のトランスフェクション）
細胞のトランスフェクションを、以下の市販のトランスフェクションキットを用いて実行した：ＤＯＴＡＰトランスフェクション試薬キット（Ｒｏｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）およびＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）。トランスフェクションプロトコルを、製造者のマニュアルに従って実行した。
【００９７】
（フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ分析））
細胞サンプル（１０６個の細胞／サンプル）を、フローサイトメトリーの媒質で洗浄し、そしてフロサイトメトリーの媒質で希釈した一次抗体と共に４℃で２時間インキュベートした。細胞を、フロサイトメトリーの媒質で洗浄し、そして二次抗マウスＩＦＴＣ結合抗体（フローサイトメトリーの媒質で１：５０に希釈した）と共に４℃で４５分間インキュベートし、続いて大量に洗浄し、そして細胞を０．０１％のＮａ−アジドを含むＰＢＳ中に再懸濁した。このサンプルを、ＦＡＣＳ分析器（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）によって分析した。このフローサイトメトリーの結果を、「Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ」ソフトウェアを用いて分析した。
【００９８】
（ＭＴＴ増殖アッセイ）
２０μｌの０．５％  ＭＴＴ（Ｓｉｇｍａ）溶液（リン酸生理食塩水緩衝液中）を、９６ウェルプレート中の２００μｌの培地中で増殖しているＨＢＬ−Ｙ細胞に添加した。細胞を、ＭＴＴ試薬で３７℃で２時間インキュベートし、培地を細胞から除去し、そしてＭＴＴ結晶を９５％エタノール中で１５分間溶解し、そしてプレートを５９２ｎｍでＥＬＩＳＡリーダーによって読み取った。
【００９９】
（ＭＵＣ１／ＳＥＣ−ＭＵＣ１／Ｙ相互作用ＥＬＩＳＡアッセイ９６マイクロタイター）
「マキシソープ（Ｍａｘｉ  Ｓｏｒｐ）」プレート（ＮＵＮＣ）を、ＭＵＣ１／ＳＥＣを含む１００μｌの順化培地を用いて室温で一晩コーティングした。以下のコーティングプレートを、０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０（０．０５％）を含むリン酸生理食塩水洗浄緩衝液（ｐＨ  ７．０（１Ｍ  ＨＣｌで中和））を用いて２回洗浄し、そして１０％  ＦＣＳを補充したリン酸生理食塩水洗浄緩衝液で３５℃で２時間ブロッキングした。１０％  ＦＣＳを補充したリン酸生理食塩水洗浄緩衝液で希釈された組換えＭＵＣ１／Ｙを３５℃で２時間プレート中でインキュベートした。インキュベーションの後に、プレートを、リン酸生理食塩水洗浄緩衝液で大量に洗浄し、そしてリン酸生理食塩水洗浄緩衝液中で１：３００に希釈されたビオチン化６Ｅ６／２  ｍＡｂと共に３５℃でさらに２時間インキュベートし、続いてリン酸生理食塩水洗浄緩衝液で大量に洗浄し、そしてストレプトアビジン−ＨＲＰ（１：１０００に希釈）と共にインキュベートした。この反応を、ＯＰＤ基質（Ｓｉｇｍａ）を用いて展開した。この反応を、３０μｌの２Ｍ  スルホン酸の添加によって停止し、そして４９０ｎｍで読み取った。
【０１００】
（ベクター）
ｐＳＶ２ｎｅｏ−  安定にトランスフェクトされた真核生物細胞をＧ４１８（２１）を用いて選択することを可能にするネオマイシン耐性遺伝子をコードしているベクター。
【０１０１】
ｐＣＬ６４２−ＭＵＣ１／Ｙ−  ＭＵＣ１／Ｙイソ型（６）をコードしているｐＣＬ６４２。
【０１０２】
（ＤＮＡライゲーション）
反応を、一晩、温度を２５℃〜４℃に徐々に減少しながら以下の混合物をインキュベートすることによって実行した。
【０１０３】
【表１】
2005508839.tif 000003
（プラスミド調製）
小スケールおよび大スケールの両方でのプラスミド調製（それぞれＭｉｎｉ  ｐｒｅｐおよびＭａｘｉ  ｐｒｅｐ）を、Ｍａｎｉａｔｉｓハンドブック（Ｓｍｂｒｏｏｋら、１９９０）に従って実行した。
【０１０４】
ＤＮＡ濃度を、以下の式に従って２６０ｎｍでの吸光度（ＯＤ）単位を変換することによって決定した：１Ｏ．Ｄ２６０ｎｍ＝４０μｇ
（実施例１）
（ＭＵＣ１／Ｙ発現細胞の確立）
ＭＵＣ１／Ｙ発現細胞を生成するために、上皮細胞株ＨＢＬ−１００を、ＭＵＣ１／Ｙ  ｃＤＮＡおよび選択プラスミドｐＳＶ２ｎｅｏを含む真核生物発現ベクターと共に同時トランスフェクトした。コントロール細胞を、ネオマイシン耐性を与えるプラスミドのみで細胞をトランスフェクトすることによって生成した。トラスフェクション後、多くのコントロールトランスフェクト体（Ｈ／Ｎ）を生成し、そして一定にＭＵＣ１／Ｙタンパク質を発現する単一のクローン（Ｈ／Ｙ２）を生成した。発現を、抗ＭＵＣ１／Ｙ  ｍＡｂを用いてフローサイトメトリー分析によって確認した（図１）。
【０１０５】
上記のフローサイトメトリー分析から観察され得るように、Ｈ／Ｙ２トランスフェクト体およびＨ／Ｎトランスフェクト体の両方が、イソ型を含む内因性ＭＵＣ１タンデムリピートアレイを発現する。
【０１０６】
（実施例２）
（上皮細胞生存性におけるＭＵＣ１／Ｙタンパク質およびＭＵＣ１／ＳＥＣタンパク質を認識するモノクローナル抗体の効果）
ＭＵＣ１タンパク質に対する多数の抗体が使用されている。ＭＵＣ１タンパク質内のその免疫反応性の領域が、規定されている（図２）。
【０１０７】
抗ＭＵＣ１／ＹおよびＭＵＣ１／ＳＥＣモノクローナル抗体がヒト上皮細胞増殖に影響する効果を評価するために、ＭＵＣ１／Ｙ発現ヒト上皮細胞トランスフェクト体（Ｈ／Ｙ２）を、抗ＭＵＣ１／Ｙ（ＭＵＣ１／Ｙ細胞外ドメイン中の異なるエピトープを認識する４つのｍＡｂ）または抗ＭＵＣ１／ＳＥＣモノクローナル抗体のいずれかを含む無血清ハイブリドーマ上清で予めコートしたウェルに播種した。
【０１０８】
細胞を、モノクローナル抗体ＢＯＳ７Ｄ１０でコートされたウェルにプレートしたとき、劇的な効果を観察した（図３Ａ、列２および２’ならびにパネルＣ）。他の３つの抗ＭＵＣ１／Ｙモノクローナル抗体は、識別可能な効果はなかった（図３Ａ、列１および１’、３および３’、４および４’、ならびにパネルＢおよびＣ）。ハイブリドーマＢＯＳ７Ｄ１０の強力な阻害効果を、無血清ハイブリドーマ上清の８倍希釈に従ってさらに観察し、そして最終の１６倍希釈で力価測定を終えた。
【０１０９】
抗体を標的細胞としてＭＣＦ７ヒト、乳癌細胞で試験した場合に類似の結果を観察した。この場合においてまた、モノクローナル抗体ＢＯＳ７Ｄ１０は、ＭＣＦ７細胞における強力な細胞死活性を発揮した。他の抗体は、細胞において顕著な効果はなかった。
【０１１０】
図３Ｄで実証されたように、顕微鏡分析は、他の抗体で処理された細胞とＢＯＳ７Ｄ１０で処理した細胞が異なる外観を有することを明らかにした（図３Ｂ、Ｃ）。実際これらは、非生存細胞の形態を示す。
【０１１１】
ウシ胎仔血清の濃度に対するＢＯＳ７Ｄ１０ハイブリドーマ上清の「ボックス（ｂｏｘ）」力価測定（図４）は、細胞が０．３％の最終的な血清濃度で増殖し、そしてより少ない程度だが１％の最終的な血清濃度で識別可能である場合、細胞増殖阻害活性が明らかに観察され得る（図４）。１％よりも高い血清濃度での細胞増殖は、ＢＯＳ７Ｄ１０抗体によって発揮される増殖阻害活性を抑止した。
【０１１２】
興味深いことに、ＭＵＣ１／ＳＥＣタンパク質の１１個のＣ末端アミノ酸に対するモノクローナル抗体ＳＥＣ７Ｈ１０もまた、増殖阻害活性を実証した（図３Ａ、列５および５’）。しかし、この増殖阻害は、ＢＯＳ７Ｄ１０によって発揮されるよりも有意に少なかった。ＢＯＳ７Ｄ１０抗体およびＳＥＣＨ１０抗体に一致したコントロールモノクローナル抗体イソ型は、いかなる効果もまかった（データは示されていない）。
【０１１３】
（実施例３）
（ＭＵＣ１／ＹおよびＭＵＣ１／ＳＥＣの結合に対する抗ＭＵＣ１／Ｙ抗体および抗ＭＵＣ１／ＳＥＣ抗体の効果）
上皮細胞増殖に対する抗ＭＵＣ１／Ｙ抗体および抗ＭＵＣ１／ＳＥＣ抗体の効果に平行して、本発明者らは、多少なりともこれらの抗体がＭＵＣ／Ｙタンパク質に対するＭＵＣ１／ＳＥＣタンパク質の結合に影響し得るか否かを分析した（アッセイの説明についての方法を参照のこと）。
【０１１４】
ＭＵＣ１／Ｙの細胞外ドメインにおけるエピトープを認識する抗体ＢＯＳ７Ｄ１０は、ＭＵＣ１／ＳＥＣタンパク質に対するＭＵＣ１／Ｙの結合を著しく増強した。抗ＭＵＣ１／ＳＥＣ抗体ＳＥＣ７Ｈ１０はまた、ＢＯＳ７Ｄ１０よりもわずかに少ないが結合を増加した（表１を参照のこと）。他の抗体は、同じ方法でＭＵＣ１／Ｙ  ＭＵＣ１／ＳＥＣ相互作用に影響しない（表１）。意外なことに、これらの結果は、細胞増殖に影響する抗体に直接相関する。最大の細胞増殖阻害を誘発するＢＯＳ７Ｄ１０はまた、ＭＵＣ１／Ｙ  ＭＵＣ１／ＳＥＣ相互作用に対する強力な効果を有する。同様の相関を、ＳＥＣ７Ｈ１０について示した。ＭＵＣ１／Ｙ−ＭＵＣ１／ＳＥＣ結合を増加する抗体がネガティブな増殖シグナルを誘発し得ることを示す。この結果は、ＭＵＣ１／Ｙに対するＭＵＣ１／ＳＥＣの結合が増殖阻害シグナルを発揮し得るということを示唆する以前のデータと良好に一致する。実際、ＭＵＣ１／Ｙタンパク質を発現する細胞へＭＵＣ１／ＳＥＣタンパク質を含む順化培地の添加は、後者の細胞の増殖速度を減少し、そしてアポトーシスのプロセスと相関するアクチンフィラメントの分解によって達成される細胞（５３）の形態学的変化を誘導した。さらに、ＭＵＣ１／Ｙタンパク質を発現するように操作された高度に腫瘍形成性のマウス哺乳動物腫瘍細胞とＭＵＣ１／ＳＥＣ発現細胞の同時接種は、注射された細胞の腫瘍増殖を著しく減少し（６７％の減少）、注射され高度に腫瘍形成性のマウス哺乳動物腫瘍細胞の微小環境内でのＭＵＣ１／ＳＥＣの存在がその腫瘍形成能力を減少することを示唆した。
【０１１５】
（表１−ＭＵＣ１／ＳＥＣ−ＭＵＣ１／Ｙ相互作用および細胞死に対する抗ＭＵＣ１  ｍＡｂの効果）
【０１１６】
【表２】
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ＭＵＣ１／ＳＥＣ−ＭＵＣ１／Ｙ相互作用に対する抗ＭＵＣ１  ｍＡｂの効果を、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ（方法に記載される）によって分析した。
【０１１７】
（参考文献）
【０１１８】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【０１１９】
本発明は、添付の図面と関連付けられる以下の詳細な記載から、より完全に理解され、そして認識される：
【図１】図１は、上皮細胞のトランスフェクト体におけるＭＵＣ１タンパク質の発現を示す。ＨＢＬ−１００細胞を、（Ａ）ＭＵＣ１／Ｙ  ｃＤＮＡを含む発現ベクター（Ｈ／Ｙ２）、または（Ｂ）選択プラスミドｐＳＶ２ｎｅｏ（Ｈ／Ｎ）のどちらかでトランスフェクションした。種々のＭＵＣ１イソ型の発現を、（Ａ１，Ｂ１）、抗ＭＵＣ１／Ｙ特異的ｍＡｂのＢＯＳ６Ｅ６／２、または（Ａ２，Ｂ２）抗タンデムリピートｍＡｂのＨ２３を使用して、異なるトランスフェクト体をインキュベーションすることによって分析した。
【図２】図２は、異なるＭＵＣ１タンパク質イソ型、およびモノクローナル特異的抗体のエピトープの位置を示す。
【図３】図３Ａ〜Ｄは、（Ａ）ＭＴＴアッセイを使用して、そして（Ｂ〜Ｄ）顕微鏡により細胞形態を評価することによって、Ｈ／Ｙ２細胞の成長に対する抗ＭＵＣ１モノクローナル抗体の効果を示す。
【図４】図４は、細胞の成長に対するＢＯＳ７Ｄ１０の効果が血清濃度に依存することを示す。Ｈ／Ｙ２細胞を、０．１％のＦＣＳ（レーン６；１２）、０．２％のＦＣＳ（レーン５；１１）；０．３％のＦＣＳ（レーン４；１０）、１％のＦＣＳ（レーン３；９）；３％のＦＣＳ（レーン２；８）；および１０％のＦＣＳ（レーン１；７）を補充した培地に曝露した。細胞増殖に対するｍＡｂの阻害効果を測定するために、Ｈ／Ｙ２細胞に対する異なるｍＡｂの効果をＭＴＴによって分析した。
【図５】図５は、ＭＵＣ１／ＲＥＰタンパク質の配列を示す。
【図６】図６は、ＢＯＳ７Ｄ１０モノクローナル抗体によって認識されるエピトープを含む５９アミノ酸配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図５−１】
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【図６】
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