(57)【要約】本発明は、アデノウィルスに、水疱性口内炎ウィルス由来のＶＳＶ−Ｇエピトープを含んだ蛋白質が連結されていることを特徴とする組換えアデノウィルスに関するものである。また、本発明は、前記組換えアデノウィルスと薬剤学的に許容される担体を含む疾患治療組成物に関するものである。また、本発明は、組換えウィルスを発現する組換えプラスミド及びこれで形質転換又は形質感染された宿主細胞に関するものである。
2005503823.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノウィルスに、水疱性口内炎ウィルス由来のＶＳＶ−Ｇエピトープを含んだ蛋白質が連結されていることを特徴とする組換えアデノウィルス。
【請求項２】
前記アデノウィルスが複製能を保有することを特徴とする請求項１記載の組換えアデノウィルス。
【請求項３】
前記アデノウィルスは複製不可能であり、治療遺伝子を含有することを特徴とする請求項１記載の組換えアデノウィルス。
【請求項４】
前記アデノウィルスはＥ１Ｂ５５ｋＤａ、Ｅ１Ｂ１９ｋＤａ又はＥ１Ｂ１９ｋＤａ／Ｅ１Ｂ５５ｋＤａが消失されたものであることを特徴とする請求項１記載の組換えアデノウィルス。
【請求項５】
前記アデノウィルスのファイバーにＶＳＶ−Ｇエピトープが連結されていることを特徴とする請求項１記載の組換えアデノウィルス。
【請求項６】
前記アデノウィルスのファイバーがノブ(knob)部位であることを特徴とする請求項５記載の組換えアデノウィルス。
【請求項７】
前記アデノウィルスのファイバーノブ部位がＨＩループ、ペントンベース又はファイバー末端部位であることを特徴とする請求項６記載の組換えアデノウィルス。
【請求項８】
前記ＶＳＶ−Ｇエピトープが、序列番号３に記載されたアミノ酸序列を有することを特徴とする請求項１記載の組換えアデノウィルス。
【請求項９】
前記アデノウィルスのファイバーとＶＳＶ−Ｇエピトープとの間にリンカーが連結されていることを特徴とする請求項１記載の組換えアデノウィルス。
【請求項１０】
前記リンカーが５個〜１５個のアミノ酸から構成されることを特徴とする請求項９記載の組換えアデノウィルス。
【請求項１１】
前記アミノ酸がグリシン又はアラニンであることを特徴とする請求項１０記載の組換えアデノウィルス。
【請求項１２】
前記組換えアデノウィルスがＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧであることを特徴とする請求項１記載の組換えアデノウィルス。
【請求項１３】
（ａ）前記アデノウィルスに、水疱性口内炎ウィルス由来のＶＳＶ−Ｇエピトープを含んだ蛋白質が連結されている組換えアデノウィルスの治療学的有効量、及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物。
【請求項１４】
（ａ）Ｅ１Ａ遺伝子を含んだアデノウィルスに、水疱性口内炎ウィルス由来のＶＳＶ−Ｇエピトープを含んだ蛋白質が連結されている複製可能な組換えアデノウィルスの治療学的有効量、及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む請求項１３記載の薬剤学的組成物。
【請求項１５】
（ａ）Ｅ１Ａ遺伝子が欠失もしくは変異され治療遺伝子を含んだアデノウィルスに、水疱性口内炎ウィルス由来のＶＳＶ−Ｇエピトープを含んだ蛋白質が連結されている複製不可能な組換えアデノウィルスの治療学的有効量、及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む請求項１３記載の薬剤学的組成物。
【請求項１６】
前記組換えアデノウィルスがアデノウィルスのファイバーに水疱性口内炎ウィルス由来のＶＳＶ−Ｇエピトープが連結されている組換えアデノウィルスである請求項１３記載の薬剤学的組成物。
【請求項１７】
前記組換えアデノウィルスがＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧであることを特徴とする請求項１３記載の薬剤学的組成物。
【請求項１８】
請求項１記載の組換えアデノウィルスを発現する組換えプラスミド。
【請求項１９】
請求項１８記載の組換えプラスミドで形質転換又は形質感染された宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、治療効能が向上した組換えアデノウィルス(recombinant adenovirus)に関するものである。より詳しくは、本発明は、アデノウィルスに水疱性口内炎(vesicular stomatitis)ウィルスの感染リガンドを導入させることを特徴として、各種の疾病に対する治療効能を向上させた組換えアデノウィルス及びこれを含む薬剤学的組成物に関するものである。
【０００２】
〔背景技術〕
現在、分子生物学の目覚しい発達によって遺伝子水準で癌及び難治性疾患の治療剤の開発に大きい進歩があり、１９９０年に遺伝子治療の臨床的な試みが始められて以来、治療用遺伝物質の伝達方法に関する研究が持続的に行われてきた。疾病治療を目的とする遺伝子治療の臨床試験中の約６０％以上が癌を対象疾患としている。また、治療用遺伝子を対象細胞に伝達する媒介体としては、アデノウィルスの有する多くの長所のため、レトロウィルスに代えて使用されている。
【０００３】
遺伝子治療が常用化されて実質的な治療法となるためには、何よりも、治療用遺伝子を所望の部位に安全かつ効果的に伝達する遺伝子伝達体の開発が先行されるべきである。組換えアデノウィルスを遺伝子伝達体として用いた遺伝子伝達の可能性は、１９８４年にＧｒａｈａｍによって最初に報告された(Graham, F. L., EMBO J., 1:2917-2922, 1984)。１９９０年にＡＤＡ(adenosine deaminase)欠乏症を対象とした初遺伝子治療の臨床試験以後、１９９０年代中半まで複製不可能なアデノウィルスベクター内に特定の遺伝子を挿入させて標的細胞内で発現を誘導する遺伝子治療法に対する研究が活発に行われたが、これは、細胞の分裂状態の如何に関係なく様々な種類の細胞に対する遺伝子伝達能力に優れるうえ、高い力価のウィルスを容易に生産することができ、凍結乾燥ができるほど構造的に安定しており、薬剤化が相対的に容易であるといったアデノウィルスのいろいろの長所が浮き彫りになったためである(Yeh, P. et al., FASEB J., 11:615-622, 1997)。
【０００４】
その後、アデノウィルスの有する問題点、例えば短期的な遺伝子発現と人体内導入時の強い免疫反応の誘導などを克服するために、アデノウィルスの構造を変更させる努力が続けられてきた。１９９６年にＫｏｃｈａｎｅｋ等はアデノウィルス遺伝子を全て除去したガットレス(gutless)ウィルスを開発した。このウィルスを用いたベクターは、遺伝子挿入能が最大３０ｋｂと改善され、ウィルスの残余蛋白質が全く生産できないため(Kochanek, S., Proc. Natl. Acad. Sci. 93:5731-5736, 1996)、人体内免疫反応が誘導されないという長所がある。また、韓国特許公開第１９９９−２２９４１号は、パッケージングセルラインによるオーバーラップを有しないアデノウィルスベクターを開示しているが、これはアデノウィルスの自己複製能を除去してアデノウィルスがカプシドに包まれないようにすることにより、より効果的に免疫的な干渉を抑制することが可能な方法を提供する。
【０００５】
組換えアデノウィルスが、優れた遺伝子伝達効率を示し、高い力価で生産可能であるうえ、容易に濃縮することができて生体内伝達が容易であるという点が報告され、最近５年の間に、癌を対象とする遺伝子治療に組換えアデノウィルスを用いる頻度数が急激に増加した。癌を遺伝子療法で治療する場合、長期的且つ持続的な治療遺伝子の発現を必要とせず、ウィルスによって誘導される宿主の免疫反応が大きく問題にならないか、却って長所になる可能性もあるため、アデノウィルスが癌治療用遺伝子伝達体として脚光を浴び始めた(Pallard, F. Hum. Gene Ther., 9:283-286, 1998)。
【０００６】
癌治療用組換えアデノウィルスは殆ど第一世代ウィルスである。最近の研究動向をみると、特定の遺伝子を単独で用いた治療法よりは性質の異なる治療用遺伝子を同時に発現させるか、或いは既存の癌治療方法である抗癌剤投与又は放射線治療との併合治療による治療効果を極大化しようとする試みがある(Roth, J.A. et al., J. Nat. Cancer Ins., 89:21-39, 1997)。例えば、韓国特許第２１７４６３号には、抗癌効果を示すものと知られたｐ５３遺伝子を含むアデノウィルスを用いて抗癌治療を行う方法を提供しているが、この際、使用されるアデノウィルスとしては上述した組換えアデノウィルスを用いて増殖性変異ウィルスを生産しないため、効果的に抗癌治療を行うことができることを特徴とする。
【０００７】
ところが、前記研究結果は、殆どが増殖不可能なアデノウィルスを遺伝子伝達体として用いる場合であって、一次感染細胞又は極めて一部の周辺細胞にのみ抗癌効果を誘発することができる。よって、臨床に用いられる場合、多量のウィルスを一度に投与し或いは数回反復して投与すべきなので、これにより免疫反応が招かれるといった制約が伴ってしまう。これを克服する手段として、癌細胞で選択的に増殖して癌細胞を殺傷する腫瘍細胞、特異増殖及び細胞殺傷組換えアデノウィルスに対する研究がＭｃＣｏｒｍｉｃｋグループによって最初報告された。以後、腫瘍細胞特異殺傷ウィルスの可能性が多角度から研究されている。ＭｃＣｏｒｍｉｃｋによって開発されたＯＮＹＸ−０１５（ｄｌ１５２０）は、アデノウィルスのＥ１Ｂ５５ｋＤ遺伝子が消失されており、大部分の癌細胞、特にｐ５３遺伝子が不活性化された癌細胞でのみ選択的に活発にウィルスが増殖して細胞の死滅を誘導した(Heise, C. et al., Nature Med., 3:639-645, 1997)。実際、ＯＮＹＸ−０１５組換えアデノウィルスは、頭頸部癌患者を対象とした臨床試験においても優れた治療効果を示している一方、癌特異的遺伝子調節部位にＥ１遺伝子などを挿入してウィルスの増殖が癌組織でのみ特異的に可能であるよう組換えされたアデノウィルスも開発されている。また、ここに薬剤感受性遺伝子のＨＳＶ−ＴＫ又はＣＤを挿入させて抗癌効果を増幅させると共にウィルスの増殖を人為的に抑えることにより、安全性が改善できるということが確認され(Freytag et al., Nat. Biotech., 15:866-870, 1997)、アデノウィルスの臨床応用可能性が段々増大しつつある。特に、癌細胞特異殺傷効果を有するアデノウィルスは、脳癌におけるようにｐ５３突然変異が全体頻度の４０％を占めて既存の化学療法又は放射線治療に抵抗性を有する場合に、より効果的に利用できる(Shinoura, N. et al., Cancer Res. 59:3411-3416, 1999)。ところが、脳に多量のアデノウィルスを投与する場合には、ウィルスの毒性のため使用が制限的であるしかないという関係で、遺伝子伝達率を増加させて投与量を減少させる方法が先行されるべきである。
【０００８】
アデノウィルスが細胞内に入るメカニズムは、目的細胞の受容体としてのＣＡＲ(Coxsackievirus and Adenovirus Receptor)を介して主に感染される(Tomko, R.P. et al., Proc. Natl. Sci. USA 94:3352-3356, 1997)。一般に、大部分の細胞では、ＣＡＲの発現が十分行われているが、成熟した骨組織の筋細胞、リンプ細胞、繊維細胞、肺マクロファージ、その他一部腫瘍細胞などはＣＡＲの発現が行われないか或いは極めて微弱であると知られているので、これらの組織細胞に対するアデノウィルス遺伝子の伝達効率は低い。最近のアデノウィルスを用いた臨床試験において、いろいろの腫瘍細胞への低い遺伝子伝達効率の重要な原因がＣＡＲ発現の欠損であると明かされている。また、ＣＡＲ受容体によるアデノウィルスの感染は、ＣＡＲ発現の相対的に多い正常細胞にアデノウィルスを集中させ、ＣＡＲ発現の低い対象細胞（腫瘍細胞）への感染率を低下させる結果をもたらすこともある。このような対象細胞への低い形質導入率を克服するために、臨床試験において高力価のアデノウィルスを用いなければならないが、これは、アデノウィルス伝達体自体に対する毒性と宿主の免疫反応を増加させ、安全且つ効果的な臨床治療を脅かす要因として作用する。
【０００９】
このようなＣＡＲ受容体に依存したアデノウィルスの遺伝子伝達の制限点を克服するため、ＣＡＲ受容体を介せずに細胞を感染させることが可能な方案が研究されている。実際、アデノウィルスタイプ２のファイバー(fiber)をアデノウィルスタイプ１７のファイバーで置き換えて表皮細胞に対する遺伝子伝達効率を増加させ、アデノウィルスタイプ５のノブドメイン(knob domain)をアデノウィルスサブグループ(subgroup)Ｂのノブドメインで置き換えたキメラ(chimeric)アデノウィルスがアデノウィルスタイプ５によってよく感染されない造血細胞を効果的に感染させることができた。Ｗｉｃｋｈａｍは、アデノウィルスファイバーのカルボキシル基の末端部位にポリリシン(polylysine)基又はＲＧＤモチーフを付けて、それぞれのアデノウィルスがヘパリン(heparin)を含む細胞膜受容体とインテグリン(integrin)を特異的に認識し接合して細胞内に成功的に挿入されることができることを報告した(Wickham, T. J. J. Virol., 71:8221-8229, 1997)。また、Ｋｒａｎｓｎｙｋｈ等は、目的細胞の特異的受容体を認知し結合することが可能な標的化基をアデノウィルスファイバーのカルボキシル基の末端部位の代りにファイバーのＨＩループ(loop)に導入してウィルスを効果的に再標的化することができることを報告した(Kransnykh, V. et al., J. Virol., 72:1884-1852, 1998; Yoshida, Y. et al., Hum. Gene. Ther. 9:2503-2515, 1998;及びShinoura, N. et al., Cancer Res. 59:3411-3416, 1999)。ところが、このような方法も、低い伝達効率を向上させるにはあまり効果を提供していないので、伝達効率を向上させることが可能な方法を開発しようとする努力が続けられている実情である。
【００１０】
本明細書全体にわたって多数の特許文献及び論文が参照され、その引用が表示されている。引用された特許文献及び論文の開示内容がそっくりそのまま本明細書に参照として挿入され、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容をより明確にする。
【００１１】
〔発明の開示〕
本発明の目的は、腫瘍殺傷能効果を含んで各種疾病の治療効能が向上した組換えアデノウィルスを提供することにある。
【００１２】
本発明の他の目的は、前記組換えアデノウィルスを含む薬剤学的組成物を提供することにある。
【００１３】
本発明者は、アデノウィルスにＶＳＶ−Ｇエピトープを含んだ蛋白質を導入して製造された組換えアデノウィルスが、細胞内への形質導入率を大きく増加させて各種疾病の治療効能を向上させ、特に腫瘍細胞をより高い効率で殺傷するうえ、ＣＡＲ受容体に依存せず腫瘍細胞を殺傷することができることを確認することにより、上記目的を達成した。
【００１４】
本発明の一観点は、アデノウィルスに水疱性口内炎ウィルス由来のＶＳＶ−Ｇエピトープを含んだ蛋白質が連結されていることを特徴とし、改善された疾病治療効果を有する組換えアデノウィルスを提供する。
【００１５】
本発明の他の観点は、（ａ）アデノウィルスに、水疱性口内炎ウィルス由来のＶＳＶ−Ｇエピトープを含んだ蛋白質が連結されている組換えアデノウィルスの治療学的有効量、及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物を提供する。
【００１６】
〔発明を実施するための最良の形態〕
本発明は、アデノウィルスに、水疱性口内炎ウィルス由来のＶＳＶ−Ｇエピトープを含んだ蛋白質が連結された組換えアデノウィルスに関するものである。
【００１７】
本発明の組換えアデノウィルスに用いられるアデノウィルスは、様々なタイプ、例えばタイプ１、タイプ２、タイプ３、タイプ４及びタイプ５などがあるが、最も好ましくはタイプ５である。本発明で用いられるアデノウィルスのいずれのタイプも、複製可能なものと複製不可能なものを両方とも含む。アデノウィルスはＥ１Ａ遺伝子が複製に必須的な要素であると知られている。これにより、本発明で作製される複製可能な組換えアデノウィルスはＥ１Ａ遺伝子を含むが、本発明で作製される複製不可能な組換えアデノウィルスは、Ｅ１Ａ遺伝子が欠失されるか、或いは複製できないようにＥ１Ａ遺伝子が変異されたものである。本発明によってＶＳＶ−Ｇエピトープを含んだ蛋白質が連結された複製可能な組換えアデノウィルスは、ＣＡＲ受容体に依存せず、高度の形質導入率で腫瘍細胞内に流入された後複製することにより、腫瘍細胞を高効率で殺傷する。一方、本発明によってＶＳＶ−Ｇエピトープを含んだ蛋白質が連結された複製不可能な組換えアデノウィルスは、一般に治療遺伝子を含むことにより、ＣＡＲ受容体に依存せず、高度の形質導入率で標的細胞内に流入された後その治療遺伝子を発現することにより、腫瘍を含んだ各種疾患を改善された効能で治療する。
【００１８】
非小細胞肺癌、大腸癌、乳房癌、頭頸部癌及び卵巣癌を含んだヒト癌の約５０％ではｐ５３腫瘍抑制遺伝子が突然変異する(Brennan J.A. et al., N. Engl. J. Med., 332, 429-435, 1995; Bergh et al., Nature Med., 1, 1029-1034, 1995;及びPerkins, AS. and Steern, D.F., Lippincott-Raven, 5th edition, Philadelphia, p79-102, 1997)。しかも、野生型ｐ５３をコーディングする多くの他のヒト癌において、ｐ５３はｍｄｍ２の過多発現(Leach F.S. et al., Cancer Res., 53, 2231-2234, 1993;及びMarchetti A. et al., Dign. mol. Pathol., 4, 93-97, 1995)、ヒト乳頭腫ウィルス(human papilloma virus)感染(Scheffner M. et al., Cell., 63, 1129-1136, 1990; Joseph, R.N. and Vogt, P.K., Lippincott-Raven, 3rd edition, New York, p301-343, 1996)又は他の知られていないメカニズム(Chang, F., et al., J. Clin. Oncol., 13, 1009-1022, 1995)によって不活性化されている。ｐ５３の機能喪失は大部分のヒト癌の後期状態、例えば通常の癌療法に対する良くない予後及び耐性と相関関係がある(Harris, C.C. and Holstein, M., N. Engl. J. Med., 329, 1318-1327, 1993;及びKirsch, D.G. and Kastan, M.B., J. Clin. Oncol., 16, 3158-3168, 1998)。アデノウィルス初期遺伝子の一つであるＥ１遺伝子は、ウィルスの複製に必須的な要素であり、多数のオープンリーディングフレームをコーディングし、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ１９ｋＤａ及びＥ１Ｂ５５ｋＤａを含む(Graham F. L. et al., J. Gen. Virol., 36, 59-72, 1987;及びShenk, T. Lippincott-Raven, 3rd edition, p2111-2148, New York, 1996)。Ｅ１Ａ遺伝子産物は転写因子であって、ｐＲＢ、ｐ３００及びその他の蛋白質と結合し、感染細胞をＳ段階に転換させてウィルスゲノムを合成するようにする役割を主に担当している(前記Shenk, 1996; 及び Shenk, T. and Flint, S. J., Adv. Cancer Res., 57, 47-85, 1991)。Ｅ１Ａ発現及び予期されてない外来ＤＮＡの合成は、腫瘍抑制遺伝子としてよく知られているｐ５３の発現／活性化を誘導する(Lowe, S.W. and Ruley, H.E., Genes Develop., 7, 535-545, 1993;及びNakajima T. et al., JBC., 273, 20036-20045, 1998)。逆に、Ｅ１Ｂ５５ｋＤａは、ｐ５３と物理的に結合してｐ５３を不活性化させる(Yew, P.R. and Berk, A.J., Nature, 357, 82-85, 1992;及びJoseph and Vogt, 1996)。このようなメカニズムを利用することにより、野生型アデノウィルスは宿主細胞を調節して効果的なウィルスの複製及び増殖に最適な条件を提供することができる。したがって、アデノウィルスＥ１Ｂ遺伝子のＥ１Ｂ５５ｋＤａ蛋白質がｐ５３と結合してその機能を抑制し、アデノウィルスの増殖による感染細胞の殺傷を誘導するので、本発明で用いられるアデノウィルスにはＥ１Ｂ５５ｋＤａが弱毒化或いは欠失されたものが含まれる。Ｅ１Ｂ５５ｋＤａ−弱毒化された組換えアデノウィルスはＢｉｓｃｈｏｆｆ等によって製造され、殆どのヒト癌細胞を含んでｐ５３の機能が喪失された細胞で優先的に複製されてそれらの細胞を殺傷するものと報告されている(Bischoff J., et al., Science, 274, 373-376, 1996)。このようなＥ１Ｂ５５ｋＤａ−弱毒化された組換えアデノウィルスは、試験管内及び生体内で効果的な抗腫瘍剤であると立証されたことがある(Heise C., et al., Nature Med., 3, 639-645, 1997)。しかも、再発性頭頸部癌患者の腫瘍に直接注入して得た鼓舞的な臨床データもある(Kirn D. et al., Nature Med., 4, 1341-1342, 1998)。本発明者 は、また、Ｅ１Ｂ５５ｋＤａ遺伝子の突然変異されたアデノウィルスＹＫＬ−１を開発し、これらがｐ５３遺伝子の変形が起こった癌細胞で増殖してそれらの癌細胞を��択的に殺傷すると報告した(Lee H. et al., Int J Cancer 2000;88:454-463;及びKim J. S. et al., J. Korean Cancer Assoc 2000;32(1):200-209)。
【００１９】
アデノウィルスの初期発現遺伝子であるＥ１Ｂ遺伝子は、上述したように、Ｅ１Ｂ１９ｋＤａとＥ１Ｂ５５ｋＤａからなっている。その中でも、Ｅ１Ｂ１９ｋＤａ蛋白質は、強力なアポトーシス(apoptosis)抑制剤であって、Ｂｃｌ−２と塩基序列及びその機能が類似している(Chiou S. K. et al., J. Virol 1994;68(10):6553-6566)。Ｅ１Ｂ１９ｋＤａ蛋白質は、アデノウィルスの初期発現遺伝子であるＥ１Ａによって誘導されるアポトーシスを抑制する物質としてよく知られており、数人の腫瘍細胞でｐ５３によって誘導されるアポトーシスも抑制させるという結果が報告された(Debbas M. et al., Genes Dev 1993;7:546-554;及びHan J. et al., Genes Dev 1996;10:461-477)。また、成長因子の除去又は放射線治療又は抗癌剤によって誘導されるアポトーシスを抑制するに際してＥ１Ｂ１９ｋＤａとＢｃｌ−２が機能的に同じ役割を果たせるということが報告された(Huang D. C., Oncogene 1997;14:405-414)。したがって、Ｅ１Ｂ１９ｋＤａ蛋白質の機能が選択的に消失された複製可能なアデノウィルスも好ましい。また、本発明者は、このようにＥ１Ｂ１９遺伝子が欠失された組換えアデノウィルスを製作し、この組換えアデノウィルスがウィルスの増殖によるアポトーシスだけでなく、感染した細胞内でアポトーシスを共に誘発して効率よく癌細胞を殺傷させ、周囲腫瘍細胞に拡散する効果も卓越していることを確認した(Kim J. S., et al., Cancer Gene Therapy 2002;9:725-736;及びKim J. S., et al., Cancer Research and Treatment 2001;33(6):500-511)。
【００２０】
また、本発明で好ましく使用できるアデノウィルスには、Ｅ１Ｂ５５ｋＤａ蛋白質とＥ１Ｂ１９ｋＤａ蛋白質の機能が全て消失されたアデノウィルスが含まれる。
【００２１】
他の本発明の様態は、アデノウィルスとして、Ｅ１／Ｅ３−欠失された複製不可能なアデノウィルスの使用を含む。このようなＥ１／Ｅ３−欠失された複製不可能なアデノウィルスは、他のベクターとは対照的に遺伝子伝達効率が相当高くて広いスペクトルの細胞類型でトランス遺伝子を発現するため、遺伝子療法に広く用いられてきた(Jolly, 1994;及びVerma and Somia, 1997)。治療遺伝子は一般にウィルスの複製に必須的なＥ１Ａ遺伝子に代えて導入される(Graham et al.,  1987;Yee and Perricaudet, 1997;及びHitt et al., 1994)。癌細胞の死滅を誘導し究極的に腫瘍を退化させる癌治療遺伝子としては、サイトカイン、免疫−補助刺激因子、自殺遺伝子及び腫瘍抑制遺伝子を含んだいろいろの抗腫瘍遺伝子が適用できる(Paillard, 1998;Roth and Cristiano, 1997;及びRunnebaum, 1997)。自殺遺伝子は、細胞が外部因子によって殺傷され易くなるよう誘導する物質を発現し、或いは細胞に毒性条件を誘発する核酸序列である。このような自殺遺伝子としてよく知られているものは、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子である（米国特許第５,６３１,２３６号及び第５,６０１,８１８号）。ＴＫ遺伝子産物を発現する細胞は、ガンシクロビル(gancyclovir)の投与によって選択的な死滅に敏感である。腫瘍抑制遺伝子は腫瘍の形成を抑えるポリペプチドを暗号化する遺伝子を指す。腫瘍抑制遺伝子は哺乳動物で自然発生する遺伝子であり、この遺伝子の欠失または不活性化は腫瘍発生に必須的な前提であると信じられている。腫瘍抑制遺伝子の例としてはＡＰＣ、ＤＰＣ４、ＮＦ−１、ＮＦ−２、ＭＴＳ１、ＷＴ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＶＨＬ、ｐ５３、ｐ１１０Ｒｂ、ｐ１６及びｐ２１を含んだ腫瘍抑制遺伝子のＩＮＫ４系列の一員及びこの治療学的に有効な断片（例、ｐ５６Ｒｂ、ｐ９４Ｒｂなど）が含まれる。当業者は、前記例示された遺伝子以外にも、その他に知られている抗腫瘍遺伝子がいずれも本発明で使用できることを理解するであろう。
【００２２】
また、各種疾患の治療に有用に使用できる多くの治療遺伝子が知られている。例えば、これらに限定するものではないが、サイトカイン（例えば、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−δ及びインターフェロン−γ）、インタールキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７及びＩＬ−１０）及びコロニー刺激因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ及びＧ−ＣＳＦ）を暗号化する遺伝子が含まれる。また、組織プラスミノゲン活性化剤（ｔＰＡ）又はウロキナーゼを発現する遺伝子(Trends in Cardiovascular Medicine, Vol. 3, No. 2, 1993, p61)及び持続的な血栓効果を提供して高脂質血症を予防するＬＡＬ生成遺伝子(Proceeding the National Academy of Science, Vol. 90, April 1993, p.2812)が含まれる。また、嚢胞性繊維症、アデノシンデアミナーゼ欠乏症及びＡＤＩＳのようなウィルス、悪性及び炎症疾患と状態を治療するための多くのポリヌクレオチドが知られており、これらの様々な遺伝子はＧｅｎＢａｎｋ又はＥＭＢＬのようなＤＮＡ序列データバンクから手に入れることができる。
【００２３】
水疱性口内炎ウィルスの膜蛋白質の一部分に相当するＶＳＶ−Ｇエピトープは、様々な宿主細胞への感染を可能にするという長所を提供するものと知られている(Ory, D. S. et al., Proc. Natl. Sci. USA, 93:11400-11406, 1996)。ＶＳＶ−Ｇエピトープは、ヒト細胞の細胞膜に広く多量発現されて存在するホスファチジルセリンと結合する。したがって、本発明はヒト細胞の細胞膜に存在するホスファチジルセリンとの結合に直接的に関与するＶＳＶ−Ｇエピトープを含んだ蛋白質をアデノウィルスに導入することを特徴とする。ＶＳＶ−Ｇエピトープを含んだ蛋白質は、序列番号９に記載されたアミノ序列を有するオリゴペプチドを含み、このペプチドを含んだ糖蛋白質及びこれから由来された全ての誘導体を含む。
【００２４】
本発明によってＶＳＶ−Ｇエピトープを含んだ蛋白質は、アデノウィルスのファイバー、カプシド、ペントンベースを含んでいずれの部位にも連結されることができる。アデノウィルスに外来リガンドを挿入する位置としては、ファイバーノブ(fiber knob)のＨＩループ、ペントンベース及びファイバー末端などが多く用いられるものと知られている(Kirby, I. et al., J. Virol., 74:2804-2813, 2000)。ファイバー末端は、アデノウィルスボディから最も遠く離れた部分であって、アデノウィルスの細胞膜に存在するＣＡＲ受容体との結合に実質的に関与する部分である。すなわち、ファイバー末端部位はＶＳＶ−Ｇエピトープが特異的に認知し結合しうる細胞膜に存在するホスファチジルセリンとの結合が最も容易な部分である。したがって、本発明によれば、ＶＳＶ−Ｇエピトープを含んだ蛋白質が連結されるアデノウィルスのファイバーはノプ部位であり、より好ましくはファイバー末端部位である。図１及び図２はＶＳＶ−Ｇエピトープをアデノウィルスのファイバー末端に結合させた本発明の一様態を示す。
【００２５】
本発明の好ましい一様態として、アデノウィルスのファイバー末端に水疱性口内炎ウィルス由来のＶＳＶ−Ｇエピトープが連結されることを特徴として、改善された腫瘍殺傷効果を有する組換えアデノウィルスが提供される。
【００２６】
アデノウィルスにＶＳＶ−Ｇエピトープを含んだ蛋白質を連結する方法は、本分野に公知になっている方法によって実施できる。アデノウィルス感染経路自体をＣＡＲを利用せず他の経路によって細胞内部へ流入させるためのいろいろの方案が提示されている。これは２つの方法に大別される。その一つは、複合体を用いた方法(conjugate-based strategy)であって、アデノウィルスを標的分子(targeting molecules)と結合させることであり、このためには多数の構成成分(multi-component system)が必要である。もう一つは、遺伝子水準で標的化をなす方法であって、ウィルスの構造を遺伝工学的な方法で変更させてウィルスの感染経路を変更させることであり、このためには単一構成成分(single-component system)のみが必要であるという利点がある。
【００２７】
ウィルスの感染経路を異にするために複合体を用いる方法として、細胞特異的受容体に対するアデノウィルスベクターの表面を二重特異性標的結合体(bispecific retargeting conjugate)でコーティングさせる方法がある。この方法は、１９９６年にＤｏｕｇｌａｓ研究チームによって最初紹介されたが、中和抗ノブ(neutralizing anti-knob)単一抗体のＦａｂ切片に葉酸塩(folate)を連結させる方法である。これにより、アデノウィルス固有の感染指向性(tropism)ではなく、全く新しい指向性を有する組換えアデノウィルスの形を備え、よって、感染経路が変わる。化学作用によって結合した二重特異性標的結合体は、アデノウィルスを組織特異的に再標的化して腫瘍選択的に治療遺伝子を伝達することができる。
【００２８】
遺伝的変形による標的化方法(Genetic targeting strategies)の場合、標的化アデノウィルスは、例えばアデノウィルスのファイバー、ペントンベース、及びヘキソンカプシド(hexon capsid)蛋白質を変形させて作ることができ、これらの中でも、ノブはアデノウィルスがＣＡＲと結合するのに必要な部位なので、ウィルス標的化は主にファイバーを変形する方法で試みられる。ＣＡＲと結合するファイバー−ノブ部位を遺伝的に変形させてアデノウィルスを標的細胞に特異的に感染させるためには、ファイバーの三量体化(trimerization)構造が保たなければならず、標的リガンドがファイバーの表面によく発現され、標的リガンドに相応する他の特定の受容体との結合がしっかり行われなければならない。ファイバー蛋白質に標的リガンドを発現させるためには、ファイバー蛋白率の遺伝子終結コドンを除去させた後、標的リガンド遺伝子を添加して挿入することにより、ファイバー蛋白質と標的リガンドが融合された形のアデノウィルスを製造することができる。これは特定のリガンドでコーティングされた新しい形のアデノウィルスであって、標的指向性、感染効率性などを増加させることができる。図３及び図４は本発明者によって例示的に施された遺伝的変形による標的化方法の様態を示す。ＶＳＶ−Ｇエピトープをアデノウィルス、好ましくはアデノウィルスファイバーの末端に挿入する際、適した空間的配置を行えるように、前記アデノウィルスのファイバーとＶＳＶ−Ｇエピトープとの間にリンカーが連結されていることが好ましい。前記リンカーは大抵アミノン約５個〜１５個が好ましく、アミノ酸は天然アミノ酸及び化学的に合成されたアミノ酸のいずれも使用可能である。また、公知のアミノン酸類似体も使用可能である。一般に、Ｒ基の小さいアミノ酸、例えばグリシン及びアラニンなどが適する。また、Ｒ基が水溶性であるアミノ酸、例えばセリンなども適する。したがって、本発明のより好適な様態によれば、前記リンカーは約５個〜１２個のグリシンから構成される。
【００２９】
本発明の特定の好ましい一様態は、組換えアデノウィルスＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧ（ＫＦＣＣ−１１２１５）を含む。この組換えアデノウィルスは、アデノウィルスのファイバー末端とＶＳＶ−Ｇのエピトープとの間に、８個のグリシン、アラニン又はセリンから構成されたリンカーを有する。
【００３０】
遺伝的変形による標的化方法によって、本発明に係る組換えウィルスは、アデノウィルスの遺伝子切片とこれに連結されるＶＳＶ−Ｇエピトープを含んだ蛋白質をコーディングするＤＮＡ切片を含むシャトルベクターを作製し、このベクターをアデノウィルスを含んだベクターと遺伝子相同組換えさせ、これにより収得された組換えアデノウィルスプラスミドを適切な細胞に形質転換又は形質感染させることにより生産される。本願明細書の実施例３は、本発明の一様態として、組換えアデノウィルスＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧの製造によって遺伝的変形による標的化方法を例示する。ＶＳＶ−Ｇのエピトープを含んだ蛋白質が結合するアデノウィルスの部位を含んだＤＮＡ切片を含有するシャトルベクターを製作する際に使用されるプラスミドは、原核性であれ真核性であれ、公知又は市販されているいずれも使用可能である。また、組換えアデノウィルスを生産する組換えプラスミドの宿主細胞も当業者によく知られており、その代表的な例としてはＡｄ５のヌクレオチド１−４３４４によって形質転換されたヒト胚腎臓細胞株２９３（Ｅ１Ａ／Ｂ＋）及びＡｄ５のヌクレオチド７９−５７８９を含有したヒト胚網膜芽細胞腫細胞９１１が含まれる。
【００３１】
本発明の組換えアデノウィルスは、様々な腫瘍細胞、例えば肝癌細胞、子宮癌細胞、乳房癌細胞、脳腫瘍細胞及び肺癌細胞などに対して優れた殺傷能を示すうえ、殺傷効率も他の従来の組換えアデノウィルスより一層優れる。
【００３２】
他の観点として、本発明は、（ａ）アデノウィルスに、水疱性口内炎ウィルス由来のＶＳＶ-Ｇエピトープを含んだ蛋白質が連結された組換えアデノウィルスの治療学的有効量、及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物に関するものである。
【００３３】
薬剤学的組成物に関連した本発明の一様態は、（ａ）Ｅ１Ａ遺伝子を含んだアデノウィルスに、水疱性口内炎ウィルス由来のＶＳＶ−Ｇエピトープを含んだ蛋白質が連結された複製可能な組換えアデノウィルスの治療学的有効量、及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む抗腫瘍薬剤組成物を含む。このような本発明の薬剤組成物は、これに含まれる複製可能な組換えアデノウィルスが上述したように様々な腫瘍細胞に対して殺傷効能を示すので、腫瘍に関連した様々な疾病又は疾患、例えば胃癌、肺癌、乳房癌、卵巣癌、肝癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、膵臓癌、膀胱癌、結腸癌及び子宮頸部癌などの治療に利用できる。
【００３４】
薬剤学的組成物に関連した本発明の他の様態は、（ａ）Ｅ１Ａ遺伝子が欠失又は変異され治療遺伝子が導入されたアデノウィルスに、水疱性口内炎ウィルス由来のＶＳＶ−Ｇエピトープを含んだ蛋白質が連結された複製不可能な組換えアデノウィルスの治療学的有効量、及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物に関するものである。このような本発明の薬剤学的組成物は、これに含有された複製不可能な組換えアデノウィルスに導入された治療遺伝子が標的細胞内で発現されることにより、上述したように導入された治療遺伝子に応じて腫瘍の治療を含んだ各種疾患の治療に利用できる。例えば、本発明の薬剤学的組成物は、治療遺伝子がＨＬＡ−Ｂ７の場合には直腸癌又は黒色腫、ＩＬ−２の場合には乳房癌又は肺癌、ＩＦＮの場合には神経芽細胞腫、ＧＭ−ＣＳＦの場合には腎臓細胞腫、ＭＤＲ−１の場合には末期乳房癌及び卵巣癌、ＨＳＶの場合には脳腫瘍、頭頸部腫瘍、卵巣癌及び中皮腫を治療するに使用できる。また、治療遺伝子が上述したようにウィルス、悪性及び炎症疾患と状態の治療に関連しているポリヌクレオチドの場合、それに該当する疾患、例えばこれに限定されるのではないが、前記嚢胞性繊維症、アデノシンデアミナーゼ欠乏症及びＡＤＩＳなどの治療に本発明の薬剤学的組成物を使用することができる。このような治療遺伝子は当業者によく知られており、当業者はこれらの遺伝子が本発明に適切に利用できることを十分理解するであろう。
【００３５】
本発明の組換えアデノウィルスは、大部分の細胞で十分発現されるＣＡＲ受容体に依存せず標的細胞を感染させるので、ＣＡＲが発現されないか或いは極めて微弱な細胞にも治療遺伝子を高度に伝達することができるという利点がある。このような細胞の例としては造血細胞（例えばＴ細胞、Ｂ細胞、好酸球、好中球などといった白血球、赤血球、血小板）、リンプ細胞、繊維細胞、肺マクロファージ、成熟した骨組織の筋細胞などが含まれる。したがって、本発明の組換えアデノウィルスを含んだ薬剤学的組成物は、前記細胞の損傷に関連した疾患の治療に有用に使用できる。例えば、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＧＦ−１及びＬＩＦのような多くの造血因子及びこれら遺伝子のＤＮＡ序列がよく知られており、これらの遺伝子の少なくとも一つを含んだ本発明の組換えアデノウィルスが含有された薬剤学的組成物は、造血障害の治療に有用に使用できる。
【００３６】
本明細書において、用語「治療」は疾病又は疾患の完治、抑制及び軽減を意味する。したがって、本明細書において、用語「治療学的有効量」は前記薬理学的効果を達成するに十分な量を意味する。
【００３７】
本発明の組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギナート、ゼラチン、珪酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニールピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるのではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分以外に潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁化剤、保存剤などをさらに含むことができる。
【００３８】
本発明の薬剤学的組成物は、遺伝子療法で通常用いられる経路によって投与することができ、非経口投与が好ましく、例えば静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、又は局部投与を用いて投与することができる。例えば、腹腔内に投与する卵巣癌の場合及び門脈内に投与する肝癌の場合には注入方法で投与することができ、乳房癌の場合には腫瘤に直接注射して投与することができ、結腸癌の場合には浣腸に直接注射して投与することができ、膀胱癌の場合にはカテーテル内に直接注射して投与することができる。
【００３９】
本発明の薬剤学的組成物の適合な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、疾病症状の程度、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因によって異なり、普通熟練した医者は所望の治療に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。一般に、本発明の薬剤学的組成物は、５×１０10−５×１０11ｐｆｕ／ｍｌの組換えアデノウィルスを含み、通常組換えアデノウィルスは１×１０10ｐｆｕを２日に１回ずつ２週間注射する。
【００４０】
本発明の組換えアデノウィルスを含有した薬剤学的組成物は、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施可能な方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することにより、単位用量の形で製造するか或いは多用量の容器内に入れて製造することができる。この際、剤型はオイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形であるか、或いはエキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形であり、分散剤又は安定化剤を更に含むことができる。
【００４１】
本発明の組換えアデノウィルスを含有した薬剤学的組成物は、単独の療法で利用できるが、他の通常の化学療法又は放射療法と共に利用されることもでき、このような並行療法を実施する場合には、より効果的に癌治療を行うことができる。本発明の組成物と共に利用できる化学療法剤は、シスプラチン(cisplatin)、カルボプラチン(carboplatin)、プロカルバジン(procarbazine)、メクロレタミン(mechlorethamine)、シクロホスファミド(cyclophosphamide)、イホスファミド(ifosfamide)、メルファラン(melphalan)、クロラムブシル(chlorambucil)、ビスルファン(bisulfan)、ニトロソウレア(nitrosourea)、ダクチノマイシン(dactinomycin)、ダウノルビシン(daunorubicin)、ドキソルビシン(doxorubicin)、ブレオマイシン(bleomycin)、プリコマイシン(plicomycin)、マイトマイシン(mitomycin)、エトポシド(etoposide)、タモシキフェン(tamoxifen)、タクソール(taxol)、トランスプラチナム(transplatinum)、５−フルオロウラシル(5-fluorouracil)、ビンクリスチン(vincristin)、ビンブラスチン(vinblastin)及びメトトレキサート(methotrexate)などを含む。本発明の組成物と共に利用できる放射療法はＸ線照射及びγ線照射などである。
【００４２】
本発明の組換えアデノウィルスを含有した薬剤学的組成物は、室温における安定性を増加させ、値高い低温保管の必要性を減らし、保管期限(shelf-life)を延長するために凍結乾燥させることができる。凍結乾燥工程は、凍結、１次乾燥及び２次乾燥の連続段階で行われることができる。組成物を凍結させた後の２次乾燥工程は、圧力を降下し、水蒸気の昇華のために加熱するものである。２次乾燥段階は乾燥物から吸収された残余水分を蒸発させるものである。
【００４３】
一様態として、本発明に係るＤＮＡワクチンの凍結乾燥方法は、次の手順で行われる。（１）凍結乾燥顕微鏡分析法を用いて製剤の崩壊温度(collapse  temperature)を決定する(Pikal, M. J. et al., Int. J. Pharm. 62, 165-186, 1990)。（２）ガラス瓶(vial)を室温下の凍結−乾燥機の棚にのせた後、−１℃で約３０分間平衡を保つ。（３）棚を−５５℃に冷却させ、この温度を２時間保つ。（４）約−３２℃の生成物温度又は崩壊温度より５℃低い温度で２次乾燥を行う。（５）３５℃で２次乾燥を行う。チャンバーの圧力を５５〜１２０ｕｍＨｇに調節した後、乾燥を完成する。（６）凍結−乾燥機の真空下でガラス瓶を栓で塞ぎ、凍結乾燥されたガラス瓶をクリンプシールして２℃〜８℃に保管する。
【００４４】
凍結乾燥された製剤には賦形剤(excipients)及び凍結乾燥保護剤(lyoprotectant)が含まれることができる。賦形剤はこれらに限定されるものではないが、０.９％のＮａＣｌと１０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７.０）又は１０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７.０）の緩衝液が含まれる。凍結乾燥保護剤は凍結及び乾燥工程中に生物学的分子を保護し、最終産物に機械性(mechanical support)を与える役割を果たし、これらの例としてはＰＢＳ（ｐＨ７.０）、ＰＢＳ／４％、１２％又は１５％トレハロースなどを挙げることができる。
【００４５】
以下、実施例によって本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は本発明をより具体的に説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲を制限するものではない。これは本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者には自明なことである。
【００４６】
〔実施例１〕Ｅ１Ｂ５５ｋＤが消失された組換えアデノウィルスの製造及びウィルス生産
アデノウィルスＥ１部位のうちＥ１Ｂ５５ｋＤ遺伝子を欠失させるためにＥ１ＡとＥ１Ｂ１９ｋＤを含めさせることが可能なプライマーを製作してｐＸＣ１（Microbix, Ontario, Canada）をテンプレートＤＮＡとし、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を行ってウィルスの遺伝子塩基序列上３４３〜２２７０を含むＰＣＲ産物を獲得した（図１０）。このため、末端にＢａｍＨＩ制限酵素認識部位を挿入させた５'−ＴＴＡＴＴＧＧＡＴＣＣＴＴＴＧＴＣＴＡＧＧＧＣＣＧＣＧＧＧ−３'（序列番号１）をセンスプライマーとして、ＢａｍＨIとＢｇ１II認識部位及び２２５３（Ｃ：：Ｔ）と２２６２（Ｇ：：Ｔ）の置換で２つの終結コドンを挿入させた５'−ＴＣＴＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＴＣＴＡＴＡＣＡＧＴＴＡＡＧＣＣＡＣＣＴＡＴＡＣＡＡＣ−３'（序列番号２）をアンチセンスプライマーとして用いた。ＰＣＲで得られた１.９ｋｂ生成物をＢａｍIIで切断した後、Ｅ１が完全に消失されたｐＣＡ１４（Microbix, Ontario, Canada）のＢｇ１II部位に挿入させてシャトルベクターｐＣＡ１４−Ｅ１Ａ／Ｅ１Ｂ１９ｋＤを製作し、これをＸｍｎIで切断した後、ＢｓｔＢIで処理したＥ１及びＥ３遺伝子消失アデノウィルスベクターｖｍｄｌ３２４Ｂｓｔ（Dr. Verca, University of Fribourgh, Switzerland）と共に大腸菌ＢＪ５１８３に挿入させて遺伝子相同組換えを誘導した（図１０）。大腸菌からＤＮＡを獲得してＨｉｎｄIIIで処理してＥ１Ｂ５５ｋＤが消失されたｐＹＫＬ−１であることを確認し、獲得した。ｐＹＫＬ−１をＰａｃＩで切断して２９３細胞株に添加し、Ｅ１Ｂ５５ｋＤが消失された組換えアデノウィルスを生産した。生産された組換えアデノウィルスはＹＫＬ−１と命名され、ブタペスト協約の下にＫＣＣＭ(Korean Culture Center of Microorganisms)に２００２年９月１９日付で寄託番号ＫＣＣＭ−１０４２４で国際寄託した。
【００４７】
〔実施例２〕Ｅ１Ｂ１９ｋＤ又はＥ１Ｂ１９ｋＤ／Ｅ１Ｂ５５ｋＤａが消失された組換えアデノウィルスの製造及びウィルス生産
アデノウィルスのＥ１Ｂ１９ｋＤａとＥ１Ｂ５５ｋＤａ遺伝子が欠失された組換えアデノウィルスシャトルベクターｐΔＥ１Ｂ１９／５５を製作するために、まずＥ１Ａ遺伝子のみを含まさせることが可能なプライマーセットを製作してアデノウィルスＥ１シャトルベクターのｐＸＣ１(Microbix, Ontario, Canada)をテンプレートＤＮＡとしてＰＣＲを行い、センスプライマーとして５'−ＴＴＡＴＴＧＧＡＴＣＣＴＴＴＧＴＣＴＡＧＧＧＣＣＧＣＧＧＧ−３'（序列番号３）、アンチセンスプライマーとして５'−ＣＣＡＧＧＡＴＣＣＡＧＡＴＣＴＣＣＣＣＡＴＴＴＡＡＣＡＣＧＣＣＡＴＧＣ−３'（序列番号４）を用いた。生成されたＰＣＲ産物をＢａｍＨIで切断した後、ｐＣＡ１４ＢａｌII部位にクローニングさせてｐΔＥ１Ｂ１９／５５プラスミドを製作した。Ｅ１Ｂ１９ｋＤａ遺伝子の塩基序列のうち開始コドンが終了コドンで置き換えられたｐΔＥ１Ｂ１９ｋＤａシャトルベクターを製作するためには、まずｐＸＣ１をＸｂａIとＢａｍＨI制限酵素で切断させて得られた１.３ｋｂＤＮＡ切片をｐＳＰ７２クローニングベクター(Promega, USA)に挿入させた後、センスプライマーとして５'−ＧＴＴＡＣＡＴＣＴＧＡＣＣＴＣＣＴＧＴＡＧＧＣＴＡＧＣＧＡＧＴＧＴＴＴＧＧＡＡＧ−３'（序列番号５）、アンチセンスプライマーとして５'−ＣＴＴＣＣＡＡＡＣＡＣＴＣＧＣＴＡＧＣＣＴＡＣＡＧＧＡＧＧＴＣＡＧＡＴＧＴＡＡＣ−３'（序列番号６）を用いて部位指定突然変異誘発(site directed mutagenesis)(stratagene, La Jolla, CA, USA)を施行した。製造されたプライマー内にはＥ１Ｂ１９ｋＤａ遺伝子開始コドンを終了コドンで取り換える突然変異が誘導され、新しく生成されたｐＳＰ７２／ｐｘＣ１／１.３ｋｂ／Δ１９ｍｔプラスミドは序列分析によって突然変異誘発有無を確認した。突然変異させたｐＳＰ７２／ｐＸＣ１／１.３ｋｂ／Δ１９ｍｔプラスミドをＸｂａIとＢａｍＨIで更に切断し、ｐＸＣ１内のＸｂａIとＢａｍＨI部位に再挿入させてｐΔＥ１Ｂ１９ｋＤａシャトルベクターを製作した。製作されたｐΔＥ１Ｂ１９／５５、ｐΔＥ１Ｂ１９ｋＤａシャトルベクターは、前記実施例１で製作されたＥ１Ｂ５５ｋＤａ遺伝子が欠失されたＡｄ−ΔＥ１Ｂ５５ｋＤａシャトルベクターと同様の方法でＸｍｎI制限酵素で切断された後、ＢｓｔＢI制限酵素で単一本になったアデノウィルスｖｍｄｌ３２４Ｂｓｔ(Dr. Verca, University of Fribourgh, Switzerland)と共にそれぞれ大腸菌ＢＪ５１８３において同時形質転換させて遺伝子相同組換えを誘導した（図１１）。相同組換えされたプラスミドＤＮＡを収得し、ＨＩｎｄIII制限酵素で処理してＥ１Ｂ１９ｋＤａとＥ１Ｂ５５ｋＤａの２つの遺伝子が両方とも欠失されたＡｄ−ｐΔＥ１ＢとＥ１Ｂ１９ｋＤａ遺伝子に開始コドンが終結コドンで置き換えられたＡｄ−ΔＥ１Ｂ１９生成物を確認した。それぞれの組換えアデノウィルスプラスミドをＰａｃIで切断した後、２９３細胞株に形質転換してＡｄ−ΔＥ１Ｂ１９／５５とＡｄ−ΔＥ１Ｂ１９組換えアデノウィルスを生産した。Ｅ１Ｂ１９ｋＤが消失されて生産された組換えアデノウィルスはＹＫＣ−１と命名され、ブタペスト協約の下にＫＣＣＭ(Korean Culture Center of Microorganisms)に２００２年９月１９日付で寄託番号ＫＣＣＭ−１０４２５で国際寄託された。
【００４８】
〔実施例３〕組換えアデノウィルスの製造及び確認
Ａ．組換えアデノウィルスＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧの製造
実施例１で製造された、アデノウィルスＡｄ５のＥ１領域のうちＥ１Ｂの５５ｋＤａ蛋白質をコーディングする遺伝子が欠失されたＹＫＬ−１アデノウィルスに水疱性口内炎ウィルスの膜蛋白質をコーディングする遺伝子のうち１９個のアミノ酸からなるＶＳＶ−Ｇ蛋白質のエピトープを挿入させた形の再標的化アデノウィルスを次のように製作した（図１、図２、図３及び図４）。
【００４９】
まず、アデノウィルスのシャトルベクターを製作した。アデノウィルスタイプ５のファイバー部位を含むｖｍｄｌ３２４ＢｓｔのＤＮＡ切片５５４３ｂｐをＳａｃII及びＫｐｎIで処理し、ＳａｃII及びＫｐｎIで処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫプラスミド(Stratagene, Canada)にサブクローニングしてｐＳＫ［５５４３］組換えベクターを製造した（図１２）。
【００５０】
次に、ファイバーの３'末端部位のみを更にクローニングするためにｐＳＫ［５５４３］をテンプレートＤＮＡとし、センスプライマー５'−ＧＧＣＣＴＴＴＡＣＴＴＧＴＴＴＡＣＡＧＣ−３'（序列番号７）及びアンチセンスプライマー５'−ＧＧＧＧＡＧＣＴＣＧＧＡＴＣＣＴＣＣＴＴＣＴＴＧＧＧＣＡＡＴＧＴＡＴＧ−３'（序列番号８）を用いてＰＣＲを行った。前記アンチセンスプライマーは、ファイバーの終結コドン（ＴＴＡ）を、グリシンをコーディングする塩基序列（ＴＣＣ）と置き換えるように製作してファイバー末端の終結コドンを除去した後、連続して施されるクローニングに必要なＢａｍＨI及びＳａｃIの認識部位を挿入させた。
【００５１】
前記ＰＣＲは、テンプレートＤＮＡ１００ｎｇ及びプライマー１０ｎｇを用いて９４℃で２分間予熱段階を経た後、９４℃１分、５５℃１分及び７２℃１分を１周期として総３０回繰り返し行った後、７２℃で１０分間最終伸張反応を行って終結した。ＰＣＲで得られた約８５０ｂｐのＤＮＡ生成物をＨｉｎｄIII及びＳａｃIで切断し、これをＨｉｎｄIII及びＳａｃIで切断したクローニングベクターｐＳＰ７２(Promega, USA)に挿入させてｐＳＰ７２［８０５］を製作した（図１２）。
【００５２】
一方、水疱性口内炎ウィルスが細胞内に入るのに関与するＶＳＶ−Ｇ膜蛋白質のエピトープとして知られたアミノ酸序列１１８番から１３６番までの１９個のアミノ酸及びその塩基序列は次の通りである：
ＧＴＷＬＮＰＧＦＰＰＱＳＣＧＹＡＴＶＴ（序列番号９）、及び５'−ＧＧＡ／ＡＣＴ／ＴＧＧ／ＣＴＧ／ＡＡＴ／ＣＣＡ／ＧＧＣ／ＴＴＣ／ＣＣＴ／ＣＣＴ／ＣＡＡ／ＡＧＴ／ＴＧＴ／ＧＧＡ／ＴＡＴ／ＧＣＡ／ＡＣＴ／ＧＴＧ／ＡＣＧ−３'（序列番号１０）。
【００５３】
前記エピトープをアデノウィルスファイバーの３'−末端に挿入する際、適当な空間的配置を行えるようにグリシンアミノ酸８個が連続的に発現される連結環を付着した。このような形のＤＮＡ断片を前記ｐＳＰ７２［８０５］内に挿入させるための前段階として、前記連結環を含んだＶＳＶ−Ｇエピトープの互いに相補的な５'側及び３'側のオリゴヌクレオチドを製作した。この際、５'側にはＢａｍＨI制限酵素認識部位を、３'側にはＳａｃI認識部位を挿入して５'−ＧＡ／ＴＣＣ／ＧＧＣ／ＧＧＧ／ＧＧＣ／ＧＧＴ／ＧＧＡ／ＧＧＡ／ＧＧＧ／ＧＧＴ／ＧＧＡ／ＡＣＴ／ＴＧＧ／ＣＴＧ／ＡＡＴ／ＣＣＡ／ＧＧＣ／ＴＴＣ／ＣＣＴ／ＣＣＴ／ＣＡＡ／ＡＧＴ／ＴＧＴ／ＧＧＡ／ＴＡＴ／ＧＣＡ／ＡＣＴ／ＧＴＧ／ＡＣＧ／ＴＧＡ／ＧＣＴ−３'（序列番号１１）の序列を持たせた。
【００５４】
前記オリゴマーと相補的な塩基序列を有するオリゴマーをＤＮＡ合成機で合成した後、前記相補的なオリゴマーを３７℃で５分間放置して互いに混成化されるようにした。また、長さ２７量体に該当するセンスプライマー５'−ＧＡＡ／ＧＧＧ／ＧＧＡ／ＴＣＣ／ＧＧＣ／ＧＧＧ／ＧＧＣ／ＧＧＴ／ＧＧＡ−３'（序列番号１２）及びアンチセンスプライマー５'−ＣＣＣ／ＧＡＧ／ＣＴＣ／ＡＣＧ／ＴＣＡ／ＣＡＧ／ＴＴＧ／ＣＡＴ／ＡＴＣ−３'（序列番号１３）を製作した。
【００５５】
前記プライマー１０ｎｇ及び前記混成化されたオリゴマー１００ｎｇをテンプレートＤＮＡとして用いてＰＣＲを前記条件通りに更に行った。ＰＣＲ生成物をＢａｍＨIとＳａｃIで切断した後、１０３ｂｐに該当するＤＮＡ切片をＢａｍＨIとＳａｃIで切断された前記ｐＳＰ７２［８０５］に挿入させてクローニングベクターｐＳＰ７２［８０５＋１０３ｂｐ］を製作した（図１２）。
【００５６】
前記ｐＳＰ７２［８０５＋１０３ｂｐ］をＨｉｎｄIII及びＥｃｏＲIで切断して、ＶＳＶ−Ｇエピトープが挿入されたアデノウィルスのファイバー部位［８０５＋１０３ｂ］を得た。一方、アデノウィルスのファイバー部位を含んでいるシャトルベクターの前記ｐＳＫ［５５４３］をＨｉｎｄIII及びＭｆｅIで切断して、約８３３ｂｐに該当するＤＮＡ切片を除去した後、前記［８０５＋１０３ｂｐ］を挿入させてアデノウィルスシャトルベクターｐＳＫ［５５１０＋１０３ｂｐ］を収得した（図１２）。
【００５７】
実施例１で製造されたプラスミドｐＹＫＬ−１をＳｐｅI制限酵素で処理して単一本とした後、これをシャトルベクターの前記ｐＳＫ［５５１０＋１０３ｂｐ］と共に大腸菌ＢＪ５１８３に形質転換させて遺伝子相同組換えを誘導した。形質転換された大腸菌を１日間培養して、これからＤＮＡを収得し、前記２７量体長さのプライマーを用いてＰＣＲを行った後、前記１０３ｂｐＤＮＡ切片が生成されるか否かを確認した（図６）。
【００５８】
１０３ｂｐＤＮＡ切片が挿入されたものと確認されたＤＮＡは、ＤＮＡ収得量に優れたＤＨ５ａ(Gibco, USA)に更に形質転換させてＤＮＡを増幅した後、ＰａｃIを処理した際、２ｋｂバンドが現われるか否かとＨｉｎｄIII処理後のアガロースゲル電気泳動によって選択した。こうして得られた組換えアデノウィルスプラスミドをｐＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧと命名した。
【００５９】
前記ｐＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧをＰａｃIで処理して単一本にした後、２９３細胞株(Microbix, Canada)に形質感染させてウィルスを生産し、生産されたウィルスで１０３ｂｐのＶＳＶ−Ｇリガンドが作られるかを、ウィルスゲノムＤＮＡを抽出してＰＣＲを行って確認した（図６）。生産されたウィルスをＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧと命名し、ブタペスト協約の下にＫＣＣＭ(Korean Culture Center  of Microorganisms)に２００２年９月１９日付で寄託番号ＫＣＣＭ−１０４２３で国際寄託した。
【００６０】
Ｂ．組換えアデノウィルスｄｌ３２４−ＬａｃＺ−ＶＳＶＧの製造
ＶＳＶ−Ｇエピトープによる遺伝子形質導入率の増加有無を知ることが可能な標識ウィルスであって、ＬａｃＺを発現する増殖不能アデノウィルスは次のように製作した。まず、ｐｃＤＮＡｈｙｇｒｏＬａｃＺプラスミド(Invitrogen, ＵＳＡ)をＳｐｅIとＸｂａIで切断してＬａｃＺ断片を得た後、これをＸｂａIで切断されたアデノウィルスシャトルベクターｐＣＡ１４(Microbix, Canada)に挿入させてｐＣＡ１４ＬａｃＺプラスミドを製作した。アデノウィルスベクターとしてＥ１とＥ３が消失されたｖｍｄｌ３２４Ｂｓｔ(Heider, H. et al., Biotechniques, 28(2):260-265, 268-270, 2000)をＢｓｔＢIで切断した後、前記遺伝子相同組換え方法でｄｌ３２３／ｐＣＡ１４ＬａｃＺを得た。次に、ｄｌ３２４／ｐＣＡ１４／ＬａｃＺウィルスにＶＳＶ−Ｇエピトープをファイバーの３'末端に挿入するために、ＶＳＶ−Ｇエピトープが挿入されているシャトルベクターの前記ｐＳＫ［５５１０＋１０３ｂｐ］をＳａｃIIとＫｐｎIで切断した後、ＳｐｅIで切断したｄｌ３２４／ｐＣＡ１４ＬａｃＺと共に大腸菌ＢＪ５１８３に形質転換させて遺伝子相同組換えを誘導してウィルスを製造し、ｄｌ３２４−ＬａｃＺ−ＶＳＶＧと命名した。それぞれの組換えアデノウィルスは２９３細胞株で増幅させた後、限界希釈方法又は光学密度分析方法を用いてウィルスの力価を決定した。
【００６１】
Ｃ．組換えアデノウィルスＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧのＥ１部位遺伝子構成の分析
ヒト肝癌細胞株であるＨｅｐ３Ｂ(HB-8044, ATCC, 米国)にＡｄ−ΔＥ１（Ｅ１領域全体が欠損されたアデノウィルス）、ＹＫＬ−１、ＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧ及び野生型アデノウィルスＡｄ−ｗｔをＭＯＩ(Multiplicity of infection)１０でそれぞれ感染させ、２日経過後にゲノム分離キット(Qiagen, 米国)でウィルスゲノムを回収した。前記対照群ウィルスである増殖不能アデノウィルスＡｄ−ΔＥ１はｐＣＡ１４(Microbix)をシャトルベクターとして用いて実施例２と同一の方法で製作した。
【００６２】
次に、分離したウィルスゲノムをテンプレートとし、Ｅ１遺伝子を増幅するためにセンスプライマー５'−ＴＴＴＧＴＧＴＴＡＣＴＣＡＴＡＧＣＧＣＧＴ−３'（序列番号１４）及びアンチセンスプライマー５'−ＡＴＴＣＴＴＴＣＣＣＡＣＣＣＴＴＡＡＧＣＣ−３'（序列番号１５）を用いてＰＣＲを行った。それぞれのＰＣＲ生成物をアガロースゲルにローディングして電気泳動した（図５）。図５から確認できるように、本発明のＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧウィルスは、ＹＫＬ−１ウィルスと同一のＥ１遺伝子から構成されているので、Ｅ１Ｂ５５ｋＤ遺伝子の選択的消失によって約２ｋｂサイズのＰＣＲ産物を生成し、これに反して野生型アデノウィルスはＥ１部位のＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ１９ｋＤ、及びＥ１Ｂ５５ｋＤ遺伝子が全て内在するので、約３.２ｋｂＰＣＲ産物を確認することができた。
【００６３】
Ｄ．組換えアデノウィルスＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧのファイバー部位にＶＳＶ−Ｇエピトープが挿入されたか否かを確認
本発明の組換えアデノウィルスＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧのファイバー３'末端にＶＳＶ−Ｇエピトープが挿入されたか否かを確認するために、ＶＳＶ−Ｇエピトープを増幅し得るようにセンスプライマー５'−ＧＡＡ／ＧＧＧ／ＧＧＡ／ＴＣＣ／ＧＧＣ／ＧＧＧ／ＧＧＣ／ＧＧＴ／ＧＧＡ−３'（序列番号１６）及びアンチセンスプライマー５'−ＣＣＣ／ＧＡＧ／ＣＴＣ／ＡＣＧ／ＴＣＡ／ＣＡＧ／ＴＴＧ／ＣＡＴ／ＡＴＣ−３'（序列番号１７）と前記Ｂで用いられたウィルスゲノム（Ａｄ−ΔＥ１、ＹＫＬ−１、及びＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧ）をテンプレートとしてＰＣＲを前記条件通りに行った。ＶＳＶ−ＧエピトープＰＣＲ産物を生成することが可能な陽性対群としては、ＶＳＶ−Ｇエピトープが８個のグリシンリンカーで連結された１０３ｂｐを含むクローニングベクターｐＳＰ７２［８０５＋１０３ｂｐ］を用いた。
【００６４】
前記それぞれのＰＣＲ生成物をアガロースゲルにローディングして電気泳動した（図６）。図６から確認できるように、アデノウィルスのファイバー部位が正常的な場合のＹＫＬ−１とＡｄ−ΔＥ１の場合は、ＰＣＲ産物が全く生成されていない反面、アデノウィルスのファイバー３'末端にＶＳＶ−Ｇエピトープが挿入された本発明のＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧの場合は、約１０３ｂｐの産物が形成され、陽性対照群のｐＳＰ７２［８０５＋１０３ｂｐ］においても同一サイズのＰＣＲ産物が形成されることを確認することができた。
【００６５】
〔実施例４〕ｄｌ３２４−ＬａｃＺ−ＶＳＶＧの増加した遺伝子伝達効率の究明
アデノウィルスのファイバーにＶＳＶ−Ｇエピトープを挿入して誘導される対象細胞への増加した感染効率を究明するために、標識遺伝子としてＬａｃＺが発現されるｄｌ３２４−ＬａｃＺ−ＶＳＶＧウィルスを用いていろいろの癌細胞への遺伝子伝達効率を評価した。ヒトの脳癌細胞株であるＵ３４３、Ｕ１１８ＭＧ(HTB-15, ATCC, 米国)、Ｕ２５１Ｎ及びＵ８７ＭＧ(HTB−14, ATCC, 米国)、そしてＣＡＲの発現が低い細胞株ＣＨＯ−Ｋ１(CCL-61, ATCC)、ＭＣＦ−７（HTB-22, ATCC）、Ｐｒｏ５(CRL-1781, ATCC)及びＬｅｃ２(CRL-1736, ATCC)を対象として、対照群アデノウィルスｄｌ３２４−ＬａｃＺ、及びＶＳＶ−Ｇエピトープ付きが付着されたアデノウィルスｄｌ３２４−ＬａｃＺ−ＶＳＶＧをそれぞれいろいろの異なるＭＯＩで感染させた後、２日後にＸ−ｇａｌ染色を行った（図７ａ、図７ｂ、図７ｃ、図７ｄ、図７ｅ、図７ｆ、図７ｇ及び図７ｈ）。図７ａは細胞株がＵ３４３の場合を示す写真であり、図７ｂは細胞株がＵ１１８ＭＧの場合を示す写真であり、図７ｃは細胞株がＵ２５１Ｎの場合を示す写真、図７ｄは細胞株がＵ８７ＭＧの場合を示す写真、図７ｅは細胞株がＣＨＯ−Ｋ１の場合を示す写真、図７ｆは細胞株がＬｅｃ２の場合を示す写真、図７ｇは細胞株がＭＣＦ−７の場合を示す写真、図７ｈは細胞株がＰｒｏ５の場合を示す写真である。図７ａ〜図７ｈから確認できるように、上述した全ての細胞株において、ｄｌ３２４−ＬａｃＺ−ＶＳＶＧは増加した感染効率によるＬａｃＺ遺伝子発現効率が向上したことが分かる。特に、アデノウィルスの天然受容体であるＣＡＲの発現が低くて正常的なアデノウィルスによってよく感染されないＣＨＯ−Ｋ１、ＭＣＦ−７、Ｐｒｏ５、及びＬｅｃ２細胞株においてもＣＡＲとの結合に依存せず、細胞膜に広く発現されているホスファチジルセリンによる感染で遺伝子伝達効率が著しく増加したことが分かった。
【００６６】
このようなＶＳＶ−Ｇエピトープの挿入による遺伝子伝達効率の増加を定量化するために、Ｘ−ｇａｌ染色を行った後、これを溶出してグラフで図式化した（図８ａ、図８ｂ、図８ｃ、図８ｄ、図８ｅ、図８ｆ、図８ｇ及び図８ｈ）。図８ａは細胞株がＵ３４３の場合を示すグラフ、図８ｂは細胞株がＵ１１８ＭＧの場合を示すグラフ、図８ｃは細胞株がＵ２５１Ｎの場合を示すグラフ、図８ｄは細胞株がＵ８７ＭＧの場合を示すグラフ、図８ｅは細胞株がＣＨＯ−Ｋ１の場合を示すグラフ、図８ｆは細胞株がＬｅｃ２の場合を示すグラフ、図８ｇは細胞株がＭＣＦ−７の場合を示すグラフ、図８ｈは細胞株がＰｒｏ５の場合を示すグラフである。図８ａ〜図８ｈから確認できるように、上述した全ての細胞株において、ｄｌ３２４−ＬａｃＺ−ＶＳＶＧは増加した感染効率によるＬａｃＺ遺伝子発現効率が大きく向上してＵ２５１Ｎ（ＭＯＩ１）、Ｕ１１８ＭＧ（ＭＯＩ５０）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＭＯＩ５０）、及びＰｒｏ５（ＭＯＩ５０）などの細胞株では、遺伝子伝達効率が前記ウィルス力価で約１００％以上増加し、その他の細胞株においても遺伝子伝達効率が著しく増加した。特に、正常的なアデノウィルスの感染時に必要な受容体ＣＡＲの発現が低い細胞株ＣＨＯ−Ｋ１、Ｌｅｃ２、ＭＣＦ−７及びＰｒｏ５の場合のいずれにおいても、ＶＳＶ−Ｇエピトープが挿入されてＣＡＲに依存せず対象細胞を感染させることが可能なｄｌ３２４−ＬａｃＺ−ＶＳＶＧウィルスは、正常的なファイバーを有するｄｌ３２４−ＬａｃＺウィルスに比べて一層よく感染させることができ、感染時に加えた力価に比例してＬａｃＺ遺伝子の発現が著しく増加した。
【００６７】
〔実施例５〕ＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧの増加した腫瘍細胞殺傷能力の究明
ＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧの増加した腫瘍細胞殺傷能力を究明するために腫瘍細胞株Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈｅｐ１、ＨｅｐＧ２、Ｃ３３Ａ、Ｕ３４３、Ｕ８７ＭＧ、Ｕ２５１−Ｎ、及びＭＣＦ−７を用いた。前記細胞株を増殖不能アデノウィルスｄｌ３２４／ＬａｃＺ、ＹＫＬ−１、及びＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧにＭＯＩ１０、１又は０.１となるように感染させた後、細胞の死滅程度を観察した。殺傷能力を可視化するために感染細胞を殆ど死滅させた視点に残っている細胞を１％クリスタルバイオレット（５０％メタノール）で２０分間固定し染色した後、写真を取った（図９ａ、図９ｂ、図９ｃ、図９ｄ、図９ｅ、図９ｆ、図９ｇ及び図９ｈ）。図９ａは細胞株Ｈｅｐ３Ｂに対するＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧの増加した腫瘍特異殺傷能力を示す細胞病変分析写真、図９ｂは細胞株Ｃ３３Ａに対するＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧの増加した腫瘍特異殺傷能力を示す細胞病変分析写真、図９ｃは細胞株Ｕ３４３に対するＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧの増加した腫瘍特異殺傷能力を示す細胞病変分析写真、図９ｄは細胞株Ｕ８７ＭＧに対するＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧの増加した腫瘍特異殺傷能力を示す細胞病変分析写真、図９ｅは細胞株Ｈｅｐ１に対するＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧの増加した腫瘍特異殺傷能力を示す細胞病変分析写真、図９ｆは細胞株Ｕ２５１−Ｎに対するＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧの増加した腫瘍特異殺傷能力を示す細胞病変分析写真、図９ｇは細胞株ＨｅｐＧ２に対するＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧの増加した腫瘍特異殺傷能力を示す細胞病変分析写真、図９ｈは細胞株ＭＣＦ−７に対するＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧの増加した腫瘍特異殺傷能力を示す細胞病変分析写真である。図９ａ〜図９ｈにおいて、１番レインはアデノウィルスｄｌ３２４／ＬａｃＺの場合を示し、２番レインはアデノウィルスＹＫＬ−１の場合を示し、３番レインはアデノウィルスＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧの場合を示す。図９ａ〜図９ｈから分かるように、ＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧの殺傷能力はＨｅｐ３ＢとＵ３４３でＹＫＬ−１に比べて約１００倍程度増加し、他のいろいろの細胞株においても約１０倍程度増加した殺傷能力を示した。
【００６８】
したがって、本実施例で試験された全ての腫瘍細胞株に対し、本発明のＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧは対照群ＹＫＬ−１と比較して細胞殺傷効果がＶＳＶＧエピトープの添加によって著しく増加したことが分かる。
【００６９】
〔実施例６〕ＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧの増加した細胞殺傷効果の確認
ＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧによる癌細胞殺傷効果の増加を定量化するために、いろいろの癌細胞を複製不可能なアデノウィルスｄｌ３２４−ＬａｃＺ、複製可能なアデノウィルスＹＫＬ−１、及びＶＳＶ−Ｇエピトープが付着された複製可能なアデノウィルスＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧで感染させてから一定時間の経過後に細胞生存率(cell viability)を測定することが可能なＭＴＴ検定を行った。図１３及び図１４はヒト脳癌細胞株のＵ２５１とＵ３４３細胞株をそれぞれ５ＭＯＩのアデノウィルスで感染させた後、ＭＴＴ検定を行ったものであり、図１５はヒト子宮癌細胞株のＨｅＬａ細胞株を１０ＭＯＩのアデノウィルスで感染させた後、ＭＴＴ検定を行ったものであり、図１６はヒト乳房癌細胞株のＭＣＦ−７を１００ＭＯＩのアデノウィルスで感染させた後、ＭＴＴ検定を行ったものである。
【００７０】
図１３〜図１６から確認できるように、陰性対照群である複製不可能なアデノウィルスｄｌ３２４−ＬａｃＺによって感染された場合には、細胞殺傷が起こらない反面、ウィルスの増殖が可能なＹＫＬ−１及びＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧによって感染された場合は、時間経過に伴ってウィルスの増殖による細胞殺傷効果が増加することが分かる。特に、ＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧの場合は、ウィルスのファイバー末端に付着されたＶＳＶＧ−エピトープによって細胞感染率が増加してウィルスによる細胞殺傷脳がＹＫＬ−１より著しく優れることを確認することができた。
【００７１】
〔実施例７〕ヌードマウスをモデルとしたＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧの抗腫瘍効果の確認
本実施例はヌードマウスをモデルとして、本発明の組換えアデノウィルスＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧが生体内水準においても抗腫瘍効果に優れるかを確認するためのものである。まず、５〜６週齢のヌードマウス(Charles River Japan Inc., Japan)の腹部皮下にヒト肝癌細胞株Ｈｅｐ３Ｂ(HB-8044, ATCC, 米国)、ヒト脳癌細胞株Ｕ３４３、又はヒト脳癌細胞株Ｕ８７ＭＧ(HTB-14, ATCC, 米国)を注射して腫瘍のサイズが５×５ｍｍ程度に到達したとき、本発明の組換えアデノウィルスＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧ（超遠心分離で回収してＰＢＳで投石したウィルス）５×１０8ｐｆｕ／５０μｌを腫瘍内に注射した後、２〜３日に１回ずつカリパスで腫瘍のサイズを測定した。その結果は図１７、図１８及び図１９に示されている。
【００７２】
図１７、図１８及び図１９から分かるように、陰性対照群としてＰＢＳを注射した場合には、腫瘍のサイズが時間経過に伴い成長しつつある反面、本発明のＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧウィルスを注射した場合には、腫瘍の成長が著しく抑制された。また、ＹＫＬ−１組換えアデノウィルスを注射した場合にも、ＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧウィルスを注射した場合の如く腫瘍の成長が抑制されたが、組換えアデノウィルスＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧに比べて抗腫瘍効能が落ちることを確認することができた。
【００７３】
したがって、本発明の組換えアデノウィルスＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧは、インビボ(in vivo)水準においても優れた抗腫瘍効果を示すことが分かる。また、組換えアデノウィルスＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧのファイバー末端に付着されたＶＳＶ−Ｇエピトープを用いて細胞内に入ることが可能な特性により、ＣＡＲ発現の低い癌組織へも感染が活発に起こうるため、これによる腫瘍特異的増殖可能アデノウィルスの抗腫瘍効果が増幅できるものと思われる。
【００７４】
〔実施例８〕ＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧの増加したウィルス生産量の究明
２９３細胞株を増殖不可能なアデノウィルスｄｌ３２４−ＬａｃＺ及びＶＳＶ−Ｇエピトープが付着されたアデノウィルスｄｌ３２４−ＬａｃＺ−ＶＳＶＧをそれぞれ１０ＭＯＩで感染させた後、２４時間、４８時間、７２時間に上澄液と細胞ペレットを収穫し、これらの中にあるアデノウィルスの総生産量(viral titer)を測定した。その結果は表１に示す。また、その結果は図２０のグラフで示される。
【００７５】
【表１】
2005503823.tif 000003
【００７６】
表１及び図２０から確認できるように、ｄｌ３２４−ＬａｃＺ−ＶＳＶＧは増加した感染効率によるウィルス生産量が増加した。
【００７７】
また、ＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧの増加したウィルス生産量を究明するために、Ｕ２５１Ｎ脳癌細胞株を腫瘍特異的複製可能なアデノウィルスＹＫＬ−１及びＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧをそれぞれ１０ＭＯＩで感染させた後、２４時間、４８時間、７２時間に上澄液と細胞ペレットを収穫し、アデノウィルスの総生産量を測定した。その結果は表２に示す。また、その結果は図２１のグラフで示される。
【００７８】
【表２】
2005503823.tif 000004
【００７９】
表２及び図２１から確認できるように、ＶＳＶ−Ｇエピトープがファイバー末端に付着されたＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧのウィルス総生産量が、正常的なファイバーをもったＹＫＬ−１に比べて一層増加した。
【００８０】
〔産業上の利用可能性〕
以上説明したように、本発明は、アデノウィルスに水疱性口内炎ウィルスの感染リガンドの一部のみを導入させて治療効能を向上させた組換えアデノウィルス及びこれを含む薬剤学的組成物に関するものである。本発明によれば、低調な感染効率を有するいろいろの細胞に対する感染効率を増加させることにより、これによる遺伝子形質導入の増加と細胞内ウィルスの複製量が増加して治療効果を向上させることができるうえ、既に治療効果のある細胞では増加した感染効率によって治療に必要なウィルスの投与量を減少させて人体組織における免役反応を最少化させることにより、放射線治療と薬物治療のような既存の治療法との並行療法によって治療効果を極大化するなど、新しい治療法の開発に活用できるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】図１は本発明の組換えアデノウィルスのファイバー蛋白質のＣ−末端にＶＳＶ−Ｇエピトープとグリシン連結環が付着された模式図である。
【図２】図２はＶＳＶ−Ｇエピトープが挿入された本発明の組換えアデノウィルスＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧの再標的化感染経路を模式化した図である。
【図３】図３はＹＫＬ−１のファイバー末端にＶＳＶ−Ｇリガンドが挿入された本発明の組換えアデノウィルスＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧの模式図とウィルスの製造方法を示す概略図である。
【図４】図４はｄｌ３２４−ＬａｃＺアデノウィルスのファイバー末端にＶＳＶ−Ｇリガンドが挿入された本発明の組換えアデノウィルスｄｌ３２４−ＬａｃＺ−ＶＳＶＧの模式図とウィルスの製造方法を示す概略図である。
【図５】図５は製作された本発明の組換えアデノウィルスＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧのＥ１遺伝子構成をＰＣＲで確認する写真である。
【図６】図６は製作された本発明の組換えアデノウィルスＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧのファイバー部分にＶＳＶ−Ｇエピトープが挿入されたか否かをＰＣＲで確認する写真である。
【図７ａ】図７ａは細胞株がＵ３４３の場合に本発明の組換えアデノウィルスｄｌ３２４−ＬａｃＺ−ＶＳＶＧの増加した遺伝子伝達効率を示す写真である。
【図７ｂ】図７ｂは細胞株がＵ１１８ＭＧの場合に本発明の組換えアデノウィルスｄｌ３２４−ＬａｃＺ−ＶＳＶＧの増加した遺伝子伝達効率を示す写真である。
【図７ｃ】図７ｃは細胞株がＵ２５１Ｎの場合に本発明の組換えアデノウィルスｄｌ３２４−ＬａｃＺ−ＶＳＶＧの増加した遺伝子伝達効率を示す写真である。
【図７ｄ】図７ｄは細胞株がＵ８７ＭＧの場合に本発明の組換えアデノウィルスｄｌ３２４−ＬｃａＺ−ＶＳＶＧの増加した遺伝子伝達効率を示す写真である。
【図７ｅ】図７ｅは細胞株がＣＨＯ−Ｋ１の場合に本発明の組換えアデノウィルスｄｌ３２４−ＬａｃＺ−ＶＳＶＧの増加した遺伝子伝達効率を示す写真である。
【図７ｆ】図７ｆは細胞株がＬｅｃ２の場合に本発明の組換えアデノウィルスｄｌ３２４−ＬａｃＺ−ＶＳＶＧの増加した遺伝子伝達効率を示す写真である。
【図７ｇ】図７ｇは細胞株がＭＣＦ−７の場合に本発明の組換えアデノウィルスｄｌ３２４−ＬａｃＺ−ＶＳＶＧの増加した遺伝子伝達効率を示す写真である。
【図７ｈ】図７ｈは細胞株がＰｒｏ５の場合に本発明の組換えアデノウィルスｄｌ３２４−ＬａｃＺ−ＶＳＶＧの増加した遺伝子伝達効率を示す写真である。
【図８ａ】図８ａは細胞株がＵ３４３の場合に本発明の組換えアデノウィルスｄｌ３２４−ＬａｃＺ−ＶＳＶＧの増加した遺伝子伝達効率を定量化したグラフである。
【図８ｂ】図８ｂは細胞株がＵ１１８ＭＧの場合に本発明の組換えアデノウィルスｄｌ３２４−ＬａｃＺ−ＶＳＶＧの増加した遺伝子伝達効率を定量化したグラフである。
【図８ｃ】図８ｃは細胞株がＵ２５１Ｎの場合に本発明の組換えアデノウィルスｄｌ３２４−ＬａｃＺ−ＶＳＶＧの増加した遺伝子伝達効率を定量化したグラフである。
【図８ｄ】図８ｄは細胞株がＵ８７ＭＧの場合に本発明の組換えアデノウィルスｄｌ３２４−ＬａｃＺ−ＶＳＶＧの増加した遺伝子伝達効率を定量化したグラフである。
【図８ｅ】図８ｅは細胞株がＣＨＯ−Ｋ１の場合に本発明の組換えアデノウィルスｄｌ３２４−ＬａｃＺ−ＶＳＶＧの増加した遺伝子伝達効率を定量化したグラフである。
【図８ｆ】図８ｆは細胞株がＬｅｃ２の場合に本発明の組換えアデノウィルスｄｌ３２４−ＬａｃＺ−ＶＳＶＧの増加した遺伝子伝達効率を定量化したグラフである。
【図８ｇ】図８ｇは細胞株がＭＣＦ−７の場合に本発明の組換えアデノウィルスｄｌ３２４−ＬａｃＺ−ＶＳＶＧの増加した遺伝子伝達効率を定量化したグラフである。
【図８ｈ】図８ｈは細胞株がＰｒｏ５の場合に本発明の組換えアデノウィルスｄｌ３２４−ＬａｃＺ−ＶＳＶＧの増加した遺伝子伝達効率を定量化したグラフである。
【図９ａ】図９ａは細胞株Ｈｅｐ３Ｂに対する本発明の組換えアデノウィルスＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧの増加した腫瘍特異殺傷能力を示す細胞病変分析写真である（ここで、１＝△Ｅ１、２＝ＹＫＬ−１、３＝ＹＣｌ−Ａｄ−ＶＳＶＧ）。
【図９ｂ】図９ｂは細胞株Ｃ３３Ａに対する本発明の組換えアデノウィルスＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧの増加した腫瘍特異殺傷能力を示す細胞病変分析写真である（ここで、１＝△Ｅ１、２＝ＹＫＬ−１、３＝ＹＣｌ−Ａｄ−ＶＳＶＧ）。
【図９ｃ】図９ｃは細胞株Ｕ３４３に対する本発明の組換えアデノウィルスＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧの増加した腫瘍特異殺傷能力を示す細胞病変分析写真である（ここで、１＝△Ｅ１、２＝ＹＫＬ−１、３＝ＹＣｌ−Ａｄ−ＶＳＶＧ）。
【図９ｄ】図９ｄは細胞株Ｕ８７ＭＧに対する本発明の組換えアデノウィルスＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧの増加した腫瘍特異殺傷能力を示す細胞病変分析写真である（ここで、１＝△Ｅ１、２＝ＹＫＬ−１、３＝ＹＣｌ−Ａｄ−ＶＳＶＧ）。
【図９ｅ】図９ｅは細胞株Ｈｅｐ１に対する本発明の組換えアデノウィルスＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧの増加した腫瘍特異殺傷能力を示す細胞病変分析写真である（ここで、１＝△Ｅ１、２＝ＹＫＬ−１、３＝ＹＣｌ−Ａｄ−ＶＳＶＧ）。
【図９ｆ】図９ｆは細胞株Ｕ２５１−Ｎに対する本発明の組換えアデノウィルスＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧの増加した腫瘍特異殺傷能力を示す細胞病変分析写真である（ここで、１＝△Ｅ１、２＝ＹＫＬ−１、３＝ＹＣｌ−Ａｄ−ＶＳＶＧ）。
【図９ｇ】図９ｇは細胞株ＨｅｐＧ２に対する本発明の組換えアデノウィルスＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧの増加した腫瘍特異殺傷能力を示す細胞病変分析写真である（ここで、１＝△Ｅ１、２＝ＹＫＬ−１、３＝ＹＣｌ−Ａｄ−ＶＳＶＧ）。
【図９ｈ】図９ｈは細胞株ＭＣＦ−７に対する本発明の組換えアデノウィルスＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧの増加した腫瘍特異殺傷能力を示す細胞病変分析写真である（ここで、１＝△Ｅ１、２＝ＹＫＬ−１、３＝ＹＣｌ−Ａｄ−ＶＳＶＧ）。
【図１０】図１０は組換えアデノウィルスＹＫＬ−１の特徴を図式化したものである。
【図１１】図１１はＡｄ−ΔＥ１及びＡｄ−ＷＴと共に３つのＥ１Ｂ突然変異アデノウィルスＡｄ−ΔＥ１Ｂ１９、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ５５及びＡｄ−ΔＥ１Ｂ１９／５５を図示化したものである。
【図１２】図１２は本発明に係る組換えプラスミドｐＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧの作製過程を示す。
【図１３】図１３はヒト脳癌細胞株のＵ２５１細胞株を５ＭＯＩの本発明に係る組換えアデノウィルスＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧで感染させた後のＭＴＴ検定結果である。
【図１４】図１４はヒト脳癌細胞株のＵ３４３細胞株を５ＭＯＩの本発明に係る組換えアデノウィルスＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧで感染させた後のＭＴＴ検定結果である。
【図１５】図１５はヒト子宮癌細胞株のＨｅＬａ細胞株を１０ＭＯＩの本発明に係る組換えアデノウィルスＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧで感染させた後のＭＴＴ検定結果である。
【図１６】図１６はヒト乳房癌細胞株のＭＣＦ−７を１００ＭＯＩの本発明に係る組換えアデノウィルスＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧで感染させた後のＭＴＴ検定結果である。
【図１７】図１７は本発明の組換えアデノウィルスＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧが、ヌードマウスで形成されたＨｅｐ３Ｂ腫瘍細胞の成長を抑制させることを示すグラフである。
【図１８】図１８は本発明の組換えアデノウィルスＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧが、ヌードマウスで形成されたＵ３４３瘍細胞の成長を抑制させることを示すグラフである。
【図１９】図１９は本発明の組換えアデノウィルスＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧが、ヌードマウスで形成されたＵ８７ＭＧ腫瘍細胞の成長を抑制させることを示すグラフである。
【図２０】図２０は本発明の組換えアデノウィルスｄｌ３２４−ＬａｃＺ−ＶＳＶＧを１０ＭＯＩで２９３細胞株に感染させた後のアデノウィルスの総生産量結果を示すグラフである。
【図２１】図２１は本発明の組換えアデノウィルスＹＣＩ−Ａｄ−ＶＳＶＧを１０ＭＯＩでＵ２５１Ｎ脳癌細胞株に感染させた後のアデノウィルスの総生産量結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図８ｄ】
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【図８ｅ】
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【図８ｆ】
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【図８ｇ】
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【図８ｈ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年12月12日(2003.12.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８ａ】
2005503823.tif 000123
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８ｂ】
2005503823.tif 000124
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８ｃ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８ｃ】
2005503823.tif 000125
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８ｄ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８ｄ】
2005503823.tif 000126
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８ｅ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８ｅ】
2005503823.tif 000127
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８ｆ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８ｆ】
2005503823.tif 000128
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８ｇ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８ｇ】
2005503823.tif 000129
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８ｈ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８ｈ】
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【国際調査報告】
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