(57)【要約】新規セントロメア関連モータータンパク質、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅをコードする単離核酸を提供する。また、該核酸配列によってコードされる精製ポリペプチド、及び該ポリペプチドに免疫特異的な抗体も提供する。これらの生物学的分子は、細胞増殖のマーカーとして、特に細胞周期のＧ２期及びＭ期における細胞の特定のために有用である。生物学的液体及び組織試料において細胞増殖を評価するため、及び該タンパク質に対する自己抗体の存在を検出するために、該核酸、タンパク質及び抗体を使用する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号２のアミノ酸配列、及び
ｂ）アミノ酸残基１からアミノ酸残基３４０までのキネシンモータードメインを含む配列番号１のフラグメント
から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む精製ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２の配列を有する、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載のポリペプチドと医薬適合性の賦形剤を含有する組成物。
【請求項４】
該ポリペプチドが配列番号２の配列を有する、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
ａ）請求項１に記載のポリペプチドを含む試料を化合物に暴露すること、及び
ｂ）該試料においてアゴニスト活性を検出すること
を含む、請求項１に記載のポリペプチドのアゴニストとしての有効性に関して化合物をスクリーニングするための方法。
【請求項６】
ａ）請求項１に記載のポリペプチドを含む試料を化合物に暴露すること、及び
ｂ）該試料においてアンタゴニスト活性を検出すること
を含む、請求項１に記載のポリペプチドのアンタゴニストとしての有効性に関して化合物をスクリーニングするための方法。
【請求項７】
配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離精製ポリヌクレオチド。
【請求項８】
４２℃で２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド及び２００μｇ／ｍｌ  ｓｓＤＮＡの条件、及び６８℃で１５ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム及び０．１％ＳＤＳの洗浄条件下で、請求項７に記載のポリヌクレオチドにハイブリダイズする単離精製ポリヌクレオチド。
【請求項９】
（ａ）請求項７に記載のポリヌクレオチドを試料中の少なくとも１個の核酸にハイブリダイズさせ、それによってハイブリダイゼーション複合体を形成すること、及び
（ｂ）２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド及び２００μｇ／ｍｌ  ｓｓＤＮＡを含む溶液中４２℃で上記ハイブリダイゼーションを実施し、次に１５ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム及び０．１％ＳＤＳを含む溶液中６８℃で洗浄して、該ハイブリダイゼーション複合体を検出し、該ハイブリダイゼーション複合体の存在が該試料中の該ポリヌクレオチドの存在と相関すること
の段階を含む、ポリヌクレオチドを検出するための方法。
【請求項１０】
ハイブリダイゼーションの前に該ポリヌクレオチドを増幅することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
配列番号１のポリヌクレオチド配列を含む単離精製ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項７に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１４】
（ａ）ポリペプチドの発現に適した条件下で請求項１３に記載の宿主細胞を培養すること、及び
（ｂ）該宿主細胞培養から該ポリペプチドを回収すること
の段階を含む、ポリペプチドを生産するための方法。
【請求項１５】
細胞増殖を調節するために有効な量の、医薬適合性の賦形剤、及びＡＴＰ結合部位、モータードメイン及び配列番号２に示すアミノ酸配列を有することを特徴とするＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質を含有する医薬組成物を、その必要のある哺乳類に投与することを含む、その必要のある哺乳類において細胞増殖を調節する方法。
【請求項１６】
ａ）配列番号１に示す核酸配列内に含まれるヌクレオチド塩基配列領域に完全に相補的な少なくとも１８個の隣接ヌクレオチド塩基を含むオリゴヌクレオチドを提供すること、及び
ｂ）上記オリゴヌクレオチドが培養中の細胞内に送達されて、上記ヌクレオチド塩基配列領域とハイブリダイズするような条件下で上記細胞を上記オリゴヌクレオチドに接触させ、それによって上記細胞のＨｓＣＥＮＰ−Ｅ仲介／誘導細胞増殖を阻害すること
の段階を含む、培養中の細胞のＨｓＣＥＮＰ−Ｅ仲介／誘導細胞増殖を阻止するための方法。
【請求項１７】
（ａ）個体から生物学的試料を得ること、
（ｂ）上記生物学的試料を、配列番号１に示すヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされる遺伝子産物と免疫反応性である少なくとも１つの抗体と共にインキュベートすること、
（ｃ）段階（ｂ）のインキュベーションの結果として形成される免疫複合体を検出すること、及び
（ｄ）段階（ｃ）の免疫複合体の量を癌の存在に関係付け、上記量が閾値より大きいとき癌が存在すること
を含む、個体において癌の存在を検出する方法。
【請求項１８】
配列番号１のヌクレオチド配列によってコードされる実質的に精製された単離ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の交差参照）
本出願は、その内容全体が参照してここに組み込まれる、２００２年６月１０日に出願された米国特許仮出願第６０／３８７，４０３号の優先権を主張する。
（連邦後援研究開発の言明）
不適。
（マイクロフィッシュ付属物の参照）
不適。
【０００２】
本発明は、一般に、組換えＤＮＡテクノロジーを含む遺伝子工学、特に新規動原体関連モータータンパク質コードする核酸分子の特定、その遺伝子産物、及び癌及び神経障害の診断、治療及び予防におけるこれらの配列の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
細胞内の成分の転位は、細胞の構造と機能を維持するために決定的に重要である。タンパク質及び膜結合細胞小器官などの細胞成分は、詳しく明らかにされている経路に沿って特定細胞内区画へと輸送される。細胞内輸送機構は、分子の動きを方向付けるためのレールとして働く糸状高分子である微小管を利用する。分子輸送は、微小管依存性モータータンパク質、キネシンとダイニンによって駆動される。これらのタンパク質は、ＡＴＰの加水分解から生じるエネルギーを利用して、微小管に沿った自らの運動を単一方向的に推進し、分子の積荷を特定目的地へと輸送する。
【０００４】
有糸分裂において、哺乳類細胞は、最終的に染色体の分離を生じさせる一連の複雑な段階を開始する。有糸分裂は、紡錘体微小管への染色体の動的結合を必要とする。有糸分裂における遺伝物質の分離は紡錘体の微小管によって仲介される（例えばＭｃＩｎｔｏｓｈ，Ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅｓより、ｐ．４１３−４３４（Ｈｙａｍｓ  ＆  Ｌｌｏｙｄ編集、１９９４）参照）。染色体と紡錘体微小管の相互作用は、各々の姉妹染色分体のセントロメア領域に位置する特殊な微小管結合構造であるキネトコアによって仲介される（Ｒｉｅｄｅｒ，１９８２；Ｍｉｔｃｈｉｓｏｎ，１９８８に総説されている）。
【０００５】
紡錘体は主として微小管から成る自律形成構造物である。紡錘体は、細胞周期制御シグナルに応答して一連の著しい遷移を受ける。各々の有糸細胞分裂において、紡錘体が構築され、各々の染色体への結合物を形成して、自らを細胞内に正しく方向付け、次に、極めて高い適合度で染色体分離を実施する。その後紡錘体は解体する。
【０００６】
適切な紡錘体の構築と機能は、微小管動力学の調節及び少なくとも３つの異なる微小管個体群（キネトコア微小管、極微小管及び星状体微小管）の創造を含む多くの事象とプロセスの統合に関わる。さらに、種々の紡錘体微小管サブ個体群の間、紡錘体微小管と染色体の間、紡錘体微小管と微小管関連タンパク質及びモータータンパク質の間、及び紡錘体微小管と細胞表層の間の結びつきが確立されねばならない（ＷａｔｅｒｓとＳａｌｍｏｎ，１９９７によって総説されている）。適切な紡錘体の構築は細胞のサーベイランスシステムによって監視されており、紡錘体が正しく構築されない場合はそのサーベイランスシステムが有糸分裂チェックポイントを活性化する（Ｈａｒｄｗｉｃｋ，１９９８；ＲｕｄｎｅｒとＭｕｒｒａｙ，１９９６によって総説されている）。ひとたび紡錘体が構築されれば、注意深く編成された分子事象のセットが、染色体の極への移動（後期Ａ）と紡錘体極の分離（後期Ｂ）を生じさせる。
【０００７】
紡錘体微小管は規定された極性を有し、紡錘体極に又は極の近くに固定された、緩やかに成長するマイナス端と、染色体及び反対側の極から発する微小管と相互作用する、動的で急速に伸びるプラス端を備える（ＭｃＩｎｔｏｓｈとＥｕｔｅｎｅｕｒ，１９８４）。現在、コングレッションにおける染色体運動の責任を担うと考えられている２つの主要な反対の力は、紡錘体極付近の微小管密度の高い領域に関連する反極方向性の極斥力及び微小管依存性モーターによりキネトコアにおいて直接生じる力である。インビトロでの試験は、前中期キネトコア上でプラス端とマイナス端の両方に向かう微小管モーター活性の存在を明らかにした（ＭｉｔｃｈｉｓｏｎとＫｉｒｓｃｈｎｅｒ，１９８５；ＨｙｍａｎとＭｉｔｃｈｉｓｏｎ，１９９１）。
【０００８】
前中期の間、キネトコアは極から伸びる動的に不安定な微小管を捕獲し、安定化する（ＮｉｃｋｌａｓとＫｕｂａｉ，１９８５；Ｍｉｔｃｈｉｓｏｎら、１９８６）。ひとたび微小管に結合すれば、キネトコアと染色体は、極方向と反極方向運動の間を揺れ動き（Ｒｏｏｓ，１９７６；Ｂａｊｅｒ，１９８２；Ｒｅｉｄｅｒら、１９８６；Ｓｋｉｂｂｅｎｓら、１９９３；ＫｈｏｄｊａｋｏｖとＲｉｅｄｅｒ，１９９６：Ｗａｔｅｒｓら、１９９６）、中期板に整列して終わる振動運動を示す。これらの動きは集合的にコングレッションと称され、少なくとも一部には、キネトコアに局在する微小管モーターによって生じる力の結果であると思われる（ＲｉｅｄｅｒとＳａｌｍｏｎ，１９９４）。
【０００９】
キネトコアは細胞において少なくとも３つの機能を果たすことができる：微小管との相互作用を通しての紡錘体への染色体の結合、有糸分裂染色体運動の仲介、及び有糸分裂チェックポイントの維持。
【００１０】
自己免疫血清及び生化学的分別法を用いた、セントロメア−キネトコア複合体の多くのタンパク質の特定と分子クローニングは、該複合体の生化学的構造と機能を検討するために必要な試薬を提供した。そのうち６個（ＣＥＮＰ−ＡからＣＥＮＰ−Ｆまで）が現在既知である、セントロメア関連タンパク質の集合は、細胞周期の様々な時点におけるそれらの分布に基づいて、２つのクラスに有効に分類することができる。
【００１１】
１つのクラスであるＤＮＡ又はクロマチン結合タンパク質は、核（おそらくセントロメアクロマチン）内の別々の位置で、又は有糸分裂の間セントロメア−キネトコア複合体内に局在して、間期を通じて検出することができるので、構成的セントロメアタンパク質である。
【００１２】
哺乳類では、４個の構成的セントロメア結合タンパク質、ＣＥＮＰ−Ａ、ＣＥＮＰ−Ｂ、ＣＥＮＰ−Ｃ及びＣＥＮＰ−Ｄが様々な程度で特性付けられており、おそらくセントロメア機能において直接的な役割を有すると示唆されている。
【００１３】
外側キネトコアドメインに局在するタンパク質、ＣＥＮＰ−Ａは、ヒストンＨ３タンパク質と配列相同性を示すセントロメア特異的コアヒストンであり、クロマチン構造の最も基本的レベル−ヌクレオソームにおいてセントロメアを染色体の残りの部分から識別する働きをすると考えられる（Ｓｕｌｌｉｖａｎら、１９９４）。
【００１４】
霊長類αサテライト及びマウスマイナーサテライトＤＮＡに認められるＣＥＮＰ−Ｂボックスモチーフへの結合を通してセントロメアへテロクロマチンと結合するタンパク質、ＣＥＮＰ−Ｂは、おそらくセントロメアへテロクロマチンＤＮＡをパッケージングする上で役割を有するが、しかしながら、このタンパク質はＹ染色体上では検出されず（Ｐｌｕｔａら、１９９０）、二動原体染色体の不活性セントロメア上に認められるので（Ｅａｒｎｓｈａｗら、１９８９）、その役割は不可欠ではないと考えられる。
【００１５】
ＣＥＮＰ−Ｃは、内側キネトコア板に位置することが示されており、例えば細胞内への抗ＣＥＮＰ−Ｃ抗体の微量注入後の有糸分裂進行の阻止（Ｂｅｒｎａｔら、１９９０；Ｔｏｍｋｉｅｌら、１９９４）から、及び二動原体染色体の活性セントロメアには結合するが不活性セントロメアには結合しないこと（Ｅａｒｎｓｈａｗら、１９８９；Ｐａｇｅら、１９９５；ＳｕｌｌｉｖａｎとＳｃｈｗａｒｔｚ、１９９５）からわかるように、極めて重要であるがまだ明らかにされていないセントロメア機能を有すると主張されている。
【００１６】
最後に、ＣＥＮＰ−Ｄ（又はＲＣＣ１）は、セントロメアに特異的でなく、明らかにされていない全般的な細胞の役割を有すると思われるグアニン交換因子である（ＫｉｎｇｗｅｌｌとＲａｔｔｎｅｒ，１９８７；Ｂｉｓｃｈｏｆｆら、１９９０；Ｄａｓｓｏ，１９９３）。
【００１７】
その他のクラスは、キネトコア複合体とそれらの結合の一過性の性質のゆえに、セントロメア−キネトコアタンパク質の条件的ファミリーに属する、ＩＮＣＥＮＰ、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ、ＣＥＮＰ−Ｆ及びＣＥＮＰ−Ｇなどの広く特性付けられたタンパク質を包含する（ＥａｒｎｓｈａｗとＭａｃｋａｙ，１９９４及びＰｌｕｔａら、１９９５によって総説されている）。セントロメアにおけるその出現が一過性であり、細胞周期によって厳密に調節されるこれらのパッセンジャータンパク質は、染色体のモーター運動、紡錘体動力学の調節、核形成、核内架橋構造と機能、姉妹染色分体の付着と解離、及び細胞質分裂を含む決定的に重要な機能を提供する。
【００１８】
ヒトＣＥＮＰ−Ｅ遺伝子は１９９１年に最初に特性付けられ、８３７１塩基の長さに及ぶこと、そのオープンリーディングフレームは２６６３アミノ酸をコードすること、及びそれぞれのタンパク質は３１２ｋＤａの分子量を持つことが認められた。セントロメアを紡錘体微小管に結びつけるキネトコア冠線維の必須成分である、微小管モータータンパク質のキネシンスーパーファミリーの成員である（Ｙｅｎら、１９９２；Ｙａｏら、１９９７）。
【００１９】
ＣＥＮＰ−Ｅ分子の分子特性指摘は、それが、コイルドコイルを形成すると予想される１，５００残基のαヘリックスドメインによって分けられたアミノ末端とカルボキシ末端の球状ドメインから成る三元構造（ｔｒｉ−ｐａｒｔｉｔｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を有することを示す。そのＮ末端領域はキネシン及びキネシン様タンパク質（ＫＬＰ）の微小管モータードメインと強い配列相同性を共有し（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，１９９３）、ＡＴＰ依存的に微小管に結合する（Ｌｉａｏら、１９９４）。
【００２０】
染色体の運動と紡錘体の伸長を調節するために現われ、有糸分裂の終了時に分解するのが、有糸分裂が起こる前の細胞周期のＧ２期にキネトコアに一過性に蓄積するキネトコアモーターである。Ｇ１期及び初期のＳ期の細胞はほとんど検出可能なＣＥＮＰ−Ｅを有していないが、後期Ｓ期及びＧ２／Ｍ期の間は該タンパク質のレベルが急激に上昇する。ＣＥＮＰ−Ｅは、コングレッションの間はキネトコアと結合し、後期には紡錘体中央部に再配置されて、細胞分裂の終了時には廃棄されるか又は分解される。ＣＥＮＰ−Ｅは、形成中心として働き、微小管−キネトコア相互作用を促進すると考えられる。一貫して、特異的抗体によるＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の阻害は、中期で細胞周期の停止を引き起こす。加えて、ＣＥＮＰ−Ｅは微小管形成と有糸分裂の間の染色体の連続的な動きを調節しており、それ故他のキネシン様タンパク質と同様に、細胞分裂にとって決定的に重要であると示唆されてきた。
【００２１】
さらに、最近のデータは、ＣＥＮＰ−Ｅが染色体の移動に積極的に関与することを示唆している。前中期におけるＣＥＮＰ−Ｅモノクローナル抗体の微量注入は、後期の開始を有意に遅延させた（Ｙｅｎら、１９９１）。より最近になって、インビトロアッセイにおいて一部のＣＥＮＰ−Ｅ抗体が、微小管脱重合によって駆動される極方向への染色体移動を阻害することが示されたが（Ｌｏｍｂｉｌｌｏら、１９９５）、細胞質ダイニン（後期染色体運動において役割を果たすと考えられるもう１つのモーター；Ｓｔｅｕｅｒら、１９９０；Ｐｆａｒｒら、１９９０）に対する抗体又は紫外線が誘導する細胞質ダイニンの開裂は、インビトロでこの染色体運動に影響を及ぼさなかった。実際に、ＣＥＮＰ−Ｅに対する抗体の微量注入は、おそらく減数分裂キネトコアにおいてＣＥＮＰ−Ｅ及び／又は隣接成分の機能を破壊することにより、後期Ｉへの減数分裂の進行を遮断することが示された。［Ｄｕｅｓｂｅｒｙ  ＮＳら、「ＣＥＮＰ−Ｅ  ｉｓ  ａｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｋｉｎｅｔｏｃｈｏｒｅ  ｍｏｔｏｒ  ｉｎ  ｍａｔｕｒｉｎｇ  ｏｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｉｓ  ｍａｓｋｅｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ｍｏｓ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ａｒｒｅｓｔ  ａｔ  ｍｅｔａｐｈａｓｅ  ＩＩ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、９４：９１６５−７０（１９９７）。］
さらに、データは、哺乳類キネトコアからのＣＥＮＰ−Ｅの枯渇が、整列した染色体と未整列の染色体の混合物を伴って有糸分裂の停止を導くことを示している。抗体の微量注入によるキネトコアからのＣＥＮＰ−Ｅの枯渇が、整列した染色体においてキネトコア微小管結合を２３％低下させ、及び整列していない染色体で微小管結合を大きく低下させるという所見も同様である。事実上、ＣＥＮＰ−Ｅ機能の分断はまた、セントロメアを横切る圧力を低下させ、紡錘体極の断片化の発生率を上昇させ、及び紡錘体極の異常に近くまで接近する単一方向性染色体を生じさせる。
【００２２】
同様に、Ｋｕｌｌｍａｎｎら、「Ｋｉｎｅｓｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＣＥＮＰ−Ｅ  ｉｓ  ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ」Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ，１（１）：７１−８０（１９９９）は、慢性関節リウマチ（ＲＡ）におけるＣＥＮＰ−Ｅ遺伝子発現の上方調節を明らかにした。実際に、彼らの試験は、ＣＥＮＰ−Ｅが、おそらく薬剤とは無関係に、上方調節されるだけでなく、ＲＡの病態生理学にも関与しているという仮説を支持する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
上述したように、紡錘体タンパク質は重要な研究対象となってきている。紡錘体タンパク質の検討は、癌の化学療法において重要な適用を有する抗有糸分裂性化合物及び真菌病原体を標的する治療薬を生み出している。
【００２４】
実際に、タキソール及びビンカアルカロイド類などの化学療法剤は、キネトコア−微小管結合を混乱させ、染色体分離を分断して、それが次には、細胞周期の進行を遅らせるチェックポイント経路を活性化し、プログラムされた細胞死を誘導することが示されている（Ｐ．Ｋ．Ｓｏｒｇｅｒら（１９９７）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９（６）：８０７−１４；Ｃ．Ｍ．Ｉｒｅｌａｎｄら（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４９（１０）：１４９１−９９）。さらに、タキソールは、チューブリン重合と有糸分裂の停止、それに続くアポトーシスを誘導することが明らかにされている。
【００２５】
それ故、重要な医学適用において明らかにされたこれらの抗有糸分裂性化合物の有効性は、抗有糸分裂性化合物の開発候補物質を特定し、特性付けることの必要性を示している。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
そこで、有糸分裂における染色体運動の１又はそれ以上の局面、例えば細胞周期の停止を誘導することを推進するための卓越した候補物質が、ここで開示する新規ヒトＣＥＮＰ−Ｅタンパク質である。
【００２７】
重要な点として、新しいキネシン様モータータンパク質及びそれをコードするポリヌクレオチドの発見は、癌及び他のＣＥＮＰ−Ｅ仲介性疾患の診断、予防及び治療において有用な新しい組成物を提供することによって当技術分野における必要性を満たすものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明は、有糸分裂において微小管形成と染色体運動を調節することに関係付けられてきた重要なヒトセントロメア−キネトコアタンパク質をコードする新規核酸分子の発見に基づく。ここで開示する該核酸分子の遺伝子産物を、ここではセントロメア関連モータータンパク質、すなわちＨｓＣＥＮＰ−Ｅと称する。本発明のＨｓＣＥＮＰ−Ｅ分子は、様々な細胞プロセス、例えば細胞周期を調節するための調節因子として有用である。ここで開示する核酸分子によってコードされるタンパク質は、染色体運動と紡錘体の伸長を調節する。それ自体、本発明によって特定され、特性付けられる核酸分子及びタンパク質は、癌化学療法剤、抗真菌性化合物及び他の抗有糸分裂薬のための開発候補物質として有用である。
【００２９】
従って、１つの局面では、本発明は、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質をコードする単離核酸分子、ならびにＨｓＣＥＮＰ−Ｅをコードする核酸の検出のためのプライマー又はハイブリダイゼーションプローブとして適する核酸フラグメントを提供する。
【００３０】
１つの実施形態では、本発明の核酸分子をコードするＨｓＣＥＮＰ−Ｅは、ここで開示するヌクレオチド配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又はそれ以上同一である。好ましい実施形態では、該核酸分子は少なくとも１５個の（例えば隣接する）ヌクレオチドの長さであり、ここで開示するヌクレオチド配列にストリンジェント条件下でハイブリダイズする。
【００３１】
もう１つの実施形態では、該単離核酸分子は配列番号１に示すヌクレオチド配列を含む。ここで開示する核酸分子のスプライシング変異体も本発明に包含される。
【００３２】
もう１つの実施形態では、核酸分子は、配列番号２のアミノ酸配列と十分に同一なアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００３３】
他の好ましい実施形態では、該核酸分子は、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。
【００３４】
本発明のもう１つの実施形態は、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ核酸分子に対してアンチセンスである単離核酸分子、例えばＨｓＣＥＮＰ−Ｅ核酸分子のコード鎖を提供する。
【００３５】
本発明のもう１つの局面は、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅをコードする核酸分子を含むベクターを提供する。一部の実施形態では、該ベクターは組換え発現ベクターである。
【００３６】
もう１つの実施形態では、本発明は、本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００３７】
本発明の核酸分子によってコードされる遺伝子産物を生産する方法も提供する。
【００３８】
配列番号２の実質的に純粋なポリペプチドも考慮する。
【００３９】
その生物活性フラグメントを含む本発明のタンパク質は、非ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質（例えば異種アミノ酸配列）に作動可能に連結して、融合タンパク質を形成することができる。
【００４０】
本発明はさらに、本発明のタンパク質、好ましくはＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質に特異的に結合する、モノクローナル又はポリクローナル抗体などの抗体を取り扱う。
【００４１】
さらに、該ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質又はその生物活性部分は、場合により医薬適合性の担体を含有する、医薬組成物に組み込むことができる。
【００４２】
もう１つの局面では、本発明は、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ核酸分子、タンパク質又はポリペプチドの存在が生物学的試料において検出されるように、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ核酸分子、タンパク質又はポリペプチドを検出することができる物質に該生物学的試料を接触させることにより、生物学的試料においてＨｓＣＥＮＰ−Ｅ核酸分子、タンパク質又はポリペプチドの存在を検出するための方法を提供する。
【００４３】
もう１つの局面では、本発明は、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅを発現することができる細胞を、該細胞におけるＨｓＣＥＮＰ−Ｅ活性を調節するように、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ活性を調節する物質と接触させることを含む、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ活性を調節するための方法を提供する。１つの実施形態では、該物質はＨｓＣＥＮＰ−Ｅ活性を阻害する。もう１つの実施形態では、該物質はＨｓＣＥＮＰ−Ｅ活性を刺激する。１つの実施形態では、該物質は、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質に特異的に結合する抗体である。もう１つの実施形態では、該物質は、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ遺伝子の転写又はＨｓＣＥＮＰ−Ｅ  ｍＲＮＡの翻訳を調節することによってＨｓＣＥＮＰ−Ｅの発現を調節する。さらにもう１つの実施形態では、該物質は、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ  ｍＲＮＡ又はＨｓＣＥＮＰ−Ｅ遺伝子のコード鎖に対してアンチセンスであるヌクレオチド配列を有する核酸分子である。
【００４４】
１つの実施形態では、本発明の方法は、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質又は核酸分子の異常発現又は異常活性を特徴とする疾患を有する被験者を、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ調節因子である物質を該被験者に投与することによって治療するために使用される。１つの実施形態では、該ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ調節因子はＨｓＣＥＮＰ−Ｅ核酸分子である。さらにもう１つの実施形態では、該ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ調節因子はペプチド、ペプチドミメティック又は他の低分子である。好ましい実施形態では、該疾患は、有糸分裂にとっての必須タンパク質であるＣＥＮＰ−Ｅによって不適切に増殖し、分裂する細胞を特徴とする、癌などのＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質又は核酸分子の異常発現によって特徴付けられる細胞増殖性疾患である。
【００４５】
本発明はまた、（ｉ）ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質をコードする遺伝子の異常修飾又は突然変異；（ｉｉ）該遺伝子の調節不全；及び（ｉｉｉ）該遺伝子の野生型形態がＨｓＣＥＮＰ−Ｅ活性を備えたタンパク質をコードする、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の異常翻訳後修飾、の少なくとも１つを特徴とする遺伝子変化の存在又は不在を特定するための診断アッセイを提供する。
【００４６】
もう１つの局面では、本発明は、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ活性を有するＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質を含むインジケーター組成物を提供すること、該インジケーター組成物を被験化合物と接触させること、及び該インジケーター組成物におけるＨｓＣＥＮＰ−Ｅ活性への被験化合物の作用を測定して、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の活性を調節する化合物を特定することにより、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質に結合する又はＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の活性を調節する化合物を特定するための方法を提供する。
【００４７】
代替的実施形態は、抗有糸分裂薬のための開発候補物質として有用な組成物を考慮する。該開発候補物質は、配列番号２のアミノ酸配列又はその生物活性フラグメントを含む。
【００４８】
さらなる実施形態では、本発明は、紡錘体の形成／伸長に必須の１又はそれ以上のタンパク質を使用したスクリーニング法によって特定される抗有糸分裂薬を提供する。好ましい実施形態では、上記の１又はそれ以上のタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号１のＨｓＣＥＮＰ−Ｅ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含む。
【００４９】
さらなる局面では、本発明は、細胞における紡錘体形成を分断する方法を提供する。該方法は、紡錘体形成に必須の１又はそれ以上のタンパク質の活性を破壊する抗有糸分裂薬を細胞に投与することを含む。上記の１又はそれ以上のタンパク質は、配列番号１のＨｓＣＥＮＰ−Ｅ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列の少なくとも１つ及び配列番号２のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００５０】
本発明はさらに、
ａ）ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質に特異的に結合することができる抗体と生物学的試料中のＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の間で複合体の形成を可能にする条件下で、該試料を含む癌細胞を該抗体に接触させること；及び
ｂ）段階ａ）で形成された複合体を検出し、該複合体の存在が、試料を含む癌細胞が紡錘体阻害因子による治療に感受性であることを指示することを含む、紡錘体阻害因子による治療に対する生物学的試料の感受性を判定するための方法を提供する。
【００５１】
本発明はまた、
ａ）癌細胞を含むことが疑われる生物学的試料を、配列番号１に由来する少なくとも１５個の隣接ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドプローブに、該プローブが該試料中に存在するＲＮＡにハイブリダイズすることを可能にする条件下で接触させること；及び
ｂ）上記のハイブリダイズしたプローブの存在を検出し、陽性検出が紡錘体阻害因子による治療に対する感受性を指示すること
を含む、該試料中のＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の存在を検出することにより、癌細胞を含むことが疑われる生物学的試料が紡錘体阻害因子による治療に対して感受性であるかどうかを判定する方法を提供する。
【００５２】
本発明はさらに、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質をコードする核酸分子を、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の発現を低下させるのに有効な量で被験者に投与することを含む、被験者において過剰増殖性細胞成長疾患を抑制する方法を提供する。
【００５３】
本発明はまた、細胞膜を通過することができ、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅの発現を阻害するために有効である、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質をコードするｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズすることができる配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの、該ｍＲＮＡの翻訳を妨げるための量と、医薬適合性の担体を含有する、医薬組成物を提供する。
【００５４】
本発明はまた、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ遺伝子又は遺伝子産物を検出することができる核酸分子試薬を提供する。
【００５５】
本発明はまた、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ遺伝子又は遺伝子産物を検出することができる、適切に標識した核酸分子試薬と癌細胞を接触させることを含む、癌細胞においてＨｓＣＥＮＰ−Ｅをコードする核酸分子の存在を検出することにより、紡錘体阻害因子による治療に感受性であると考えられるＨｓＣＥＮＰ−Ｅ仲介性疾患のｉｎ  ｓｉｔｕでの特定のための方法を提供する。
【００５６】
本発明のさらにもう１つの局面は、配列番号１に示すヌクレオチド配列又はそれに由来する１２−１００ヌクレオチドの長さのフラグメントを含む精製ポリヌクレオチドと細胞を接触させる段階を含み、上記ポリヌクレオチドが、ＨｓＣＥＮＰ−ＥをコードするｍＲＮＡ内に存在する５０ヌクレオチドの核酸配列領域に実質的に相補的であり（しかしＵの代りにＴを有する）、上記オリゴヌクレオチドがインビボ又はインビトロで細胞の増殖を阻害する、細胞の疾患関連増殖を阻止する方法である。
【００５７】
（ａ）細胞の試料において、配列番号１に対応するヌクレオチドとハイブリダイズするヌクレオチド配列又はその相補物から発現される遺伝子産物の発現のレベルを測定すること
を含む、細胞の試料の発癌の潜在的可能性を予測するための診断方法。
【００５８】
（ａ）最初の時点で、（ｉ）配列番号１のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド及び（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドから成る群より選択されるパラメータのレベルを測定するために、被験者からの試料を検定すること；
（ｂ）第二の時点で、（ａ）で選択したパラメータのレベルを検定すること；及び
（ｃ）治療レジメンの効果の判定因子として、上記第二時点での上記レベルを（ａ）で測定されたレベルと比較することを含む、配列番号１に示すヌクレオチドの配列を有する単離核酸分子から発現される遺伝子産物の異常発現を特徴とする状態を緩和するために設計された治療レジメンの進行を追跡するための方法も提供する。
【００５９】
代替的実施形態は、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の異常レベル又は異常活性を特徴とする疾患を有する患者から得た試料を、配列番号１のヌクレオチド配列と実質的に相同なヌクレオチド配列を有する相補的核酸ハイブリダイゼーションプローブと共にインキュベートすること、及び上記患者における上記疾患の後退、進行又は発症の判定因子として、上記プローブと上記試料中に存在しうる相補的ｍＲＮＡの間の結合を測定することを含む、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の異常レベル又は異常活性を特徴とする疾患の後退、進行又は発症を判定するための方法を提供する。
【００６０】
あるいは、該プローブは、配列番号２のポリペプチド又はその生物学的／免疫学的に活性なフラグメントに特異的な抗体を包含しうる。従って、上記疾患を有する患者からの試料を、本発明の単離核酸分子によって発現される遺伝子産物に特異的な検出可能プローブと、プローブ／遺伝子産物複合体の形成を促進する条件下で接触させ、該複合体の存在が、上記患者における上記疾患の後退、進行又は発症を指示することを含む、後退を測定する提示方法が導かれる。
【００６１】
本発明の他の用途及び目的は、下記の詳細な説明に照らして当業者には明白である。そのような他の用途及び目的は特許請求の範囲内であるとみなされる。
【００６２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、新規ヒトキネシンモータータンパク質、ヒトＣＥＮＰ−Ｅ（ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ）の発見、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅをコードするポリヌクレオチド、及び癌、神経障害及び小胞輸送障害の診断、治療又は予防のためのこれらの組成物の使用に基づく。また、癌などの細胞増殖性疾患の治療のための物質を含む標的タンパク質、例えば天然ＣＥＮＰ−Ｅの調節因子も提供する。ここで提供する物質及び組成物は、スプレー、粉末及び他の組成物の製剤を含む様々な適用において使用できる。癌などの細胞増殖性疾患を治療する方法、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ活性に関連する疾患を治療するための方法、及びＨｓＣＥＮＰ−Ｅを阻害するための方法も提供する。
【００６３】
特に、本発明は、約４６５アミノ酸のヒトＣＥＮＰ−Ｅの新規モータードメインをコードする約１３９５ヌクレオチドの新規ＤＮＡフラグメントの発見−クローニング及び発現に基づく。そのコードされるタンパク質フラグメントは、微小管結合活性ならびにＡＴＰ結合部位とその付随するＡＴＰアーゼ活性を含むという意味で、機能性である。
【００６４】
生じるタンパク質は、プロリン（公表配列）の代わりに３００位にアラニンが存在することに基づいて、先行技術のＣＥＮＰ−Ｅと区別することができる。ここで提供する新規ＤＮＡ配列に関しては、少なくとも次の位置で公表配列とは異なる：
配列番号２のアミノ酸２９２に対応する、塩基対８７６Ｔ（公表配列）＞Ｃ、
３００位のアミノ酸に対応する、塩基対８９８Ｃ（公表配列）＞Ｇ、
公表配列に関するアミノ酸位置３１６位に対応する、塩基対９４８Ｔ（公表配列）＞Ａ。
【００６５】
重要な点として、公表配列のコードされるアミノ酸には変化をもたらさない、８７６位と９４８位の２つの変化とは異なり、８９８位の変化は、プロリン（公表配列）が同じ位置でアラニンに変化しているという点でコードされるタンパク質に変化を生じさせる。
【００６６】
ここで開示する配列の２９２位のアミノ酸は、公表配列の２９２位に対応する。
【００６７】
ここで開示する配列の３００位のアミノ酸は、公表配列の３００位に対応する。
【００６８】
ここで開示する配列の３１６位のアミノ酸は、公表配列の３１６位に対応する。
【００６９】
本発明のＣＥＮＰ−Ｅタンパク質におけるアミノ酸の番号付けは、公表されているタンパク質の番号付けに一致する。しかし、ｃＤＮＡ配列に関しては、ここで開示する塩基対１−１３９５は、公表されているＣＥＮＰ−Ｅ  ｃＤＮＡヌクレオチド配列における塩基対９１−１４８５に相当する。先行技術のＣＥＮＰ−Ｅタンパク質のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、Ｙｅｎ，Ｔ．Ｊ．ら（１９９１）「ＣＥＮＰ−Ｅ，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｍｅｔａｐｈａｓｅ  ｔｏ  ａｎａｐｈａｓｅ．」ＥＭＢＯ  Ｊ．１０（５）：１２４５−１２５４；及びＹｅｎ，Ｔ．Ｊ．ら（１９９２）「ＣＥＮＰ−Ｅ  ｉｓ  ａ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｋｉｎｅｔｏｃｈｏｒｅ  ｍｏｔｏｒ  ｔｈａｔ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｓ  ｊｕｓｔ  ｂｅｆｏｒｅ  ｍｉｔｏｓｉｓ．」Ｎａｔｕｒｅ  ３５９（６３９５）：５３６−５３９に開示されている。これらの参考文献の各々の内容は、その全体が参照してここに組み込まれる。
【００７０】
本発明のタンパク質、ヌクレオチド配列及び方法を説明する前に、機器、材料及び方法は変更しうるので、本発明は記述する特定の機器、材料及び方法に限定されないことが了解される。また、ここで使用する用語は、特定の実施形態を説明することだけを目的しており、特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図しないことが了解される。
【００７１】
下記の説明においては、組換えＤＮＡテクノロジーの分野において使用されるいくつもの用語を広汎に使用する。そのような用語に与えられる範囲を含めて、本明細書及び特許請求の範囲のより明瞭で一貫した理解を提供するために、下記の定義を与えるものとする。
【００７２】
「遺伝子」は、そのヌクレオチド配列がポリペプチド分子をコードする核酸分子を指す。遺伝子は、ヌクレオチドの解釈されていない配列を含みうる又はそのような介在セグメントをイントロン、プロモーター領域、スプライス部位及び反復配列として含みうる。遺伝子はＲＮＡ又はＤＮＡのいずれでもよい。好ましい遺伝子は、本発明のタンパク質をコードするものである。
【００７３】
「核酸」、「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」の語又はその文法的等価物は、リボ核酸（ＲＮＡ）又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、プローブ、ポリヌクレオチド、そのフラグメント又は部分、及びプライマーを意図する。ＤＮＡは、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）又はゲノムＤＮＡ、例えば本発明のタンパク質をコードする遺伝子のいずれでもよい。
【００７４】
ＤＮＡ分子又はポリヌクレオチドに関して、ヌクレオチド配列はデオキシリボヌクレオチドの配列を指し、及びＲＮＡ分子又はポリヌクレオチドに関して、規定されたデオキシリボヌクレオチド配列内の各々のチミジンデオキシリボヌクレオチド（Ｔ）がリボヌクレオチドウリジン（Ｕ）で置換されている、リボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ及びＵ）の対応する配列を指す。例えば、デオキシリボヌクレオチドの略語を用いて示される配列番号１の配列を有するＲＮＡ分子への言及は、配列番号１の各々のデオキシリボヌクレオチド、Ａ、Ｇ又はＣが対応するリボヌクレオチド、Ａ、Ｇ又はＣで置換されており、及び各々のデオキシリボヌクレオチドＴがリボヌクレオチドＵで置換されている配列を有するＲＮＡ分子を示すことが意図されている。
【００７５】
特に異なる指示がない限り、ヌクレオチドは、糖成分（ペントース）、リン酸基及び窒素複素環塩基から成るＤＮＡ又はＲＮＡの単量体単位を定義する。該塩基は、グリコシド炭素（該ペントースの１’炭素）によって糖成分に結合されており、塩基と糖のその組合せがヌクレオシドである。ヌクレオシドがペントースの３’又は５’位置に結合したリン酸基を含むとき、ヌクレオチドと称される。作動可能に連結されたヌクレオチドの配列を、ここでは典型的に「塩基配列」又は「ヌクレオチド配列」、及びそれらの文法的等価物と称し、ここでは、左から右への方向が従来の５’末端から３’末端への方向である式によって表わされる。
【００７６】
特に異なる指示がない限り、個々の核酸分子配列は、明白に指示されている配列と同様に、その保存的に修飾された変異体（例えば縮重コドン置換）及び相補的配列も暗黙のうちに包含する。詳細には、縮重コドン置換は、１又はそれ以上の選択した（又はすべての）コドンの３番目の位置が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって達成しうる（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｃａｓｓｏｌら、１９９２；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。核酸分子の語は、遺伝子、ｃＤＮＡ及び遺伝子によってコードされるｍＲＮＡと交換可能に使用される。
【００７７】
核酸分子又はヌクレオチド配列の「フラグメント」は、完全長未満である核酸の部分であり、少なくとも、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で配列番号１のヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズすることができる最小長を含む。そのようなフラグメントの長さは、好ましくは１５−１７ヌクレオチド又はそれ以上である。
【００７８】
「変異体」は、アミノ酸配列と核酸配列の両方に適用される。個々の核酸配列に関して、保存的に修飾された変異体は、同一又は基本的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、又は該核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は、基本的に同一の配列を指す。遺伝暗号の縮重の故に、多数の機能的に同一の核酸が所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＴはすべて、アミノ酸、アラニンをコードする。それ故、アラニンが１個のコドンによって規定されるすべての位置で、該コドンは、コードされるポリペプチドを変化させることなく上記の対応するコドンのいずれかに変更されうる。そのような核酸変異は、保存的に修飾された変異の１つの種である、「沈黙変異」である。ここではポリペプチドをコードするあらゆる核酸配列が、同時に該核酸のあらゆる可能な沈黙変異も表わす。当業者は、核酸内の各々の縮重コドンが、機能的に同一の分子を生成するように修飾されうることを認識する。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各々の沈黙変異は、暗黙のうちに各々の記述された配列に包含される。ＨｓＣＥＮＰ−Ｅをコードするポリヌクレオチドの特定オリゴヌクレオチドプローブを使用して容易に検出されうる又は検出できない多型、及びＨｓＣＥＮＰ−Ｅをコードするポリヌクレオチド配列についての正常な染色体遺伝子座以外の遺伝子座を有する、対立遺伝子変異体への不適切な又は予期せぬハイブリダイゼーションは、この定義に包含される。
【００７９】
野生型標的タンパク質のアミノ酸配列変異体も、本発明の標的タンパク質の定義に包含される。これらの変異体は、３つのクラス：置換、挿入又は欠失変異体の１つ又はそれ以上に分類される。これらの変異体は通常、該変異体をコードするＤＮＡを生産するために、カセット又はＰＣＲ突然変異誘発又は当技術分野で周知の他の手法を用いて、標的タンパク質をコードするＤＮＡにおけるヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発によって作製され、その後組換え細胞培養において該ＤＮＡを発現させる。約１００−１５０アミノ酸残基までを有する変異体標的タンパク質フラグメントは、確立された手法を用いてインビトロ合成によって作製しうる。アミノ酸配列変異体は、あらかじめ定められた性質の変異、すなわちそれらを、標的タンパク質アミノ酸配列の天然に生じる対立遺伝子又は種間変異と区別する特徴によって特色付けられる。該変異体は、典型的には天然に生じる類似体と同じ定性的生物活性を示すが、改変された特徴を有する変異体を選択することもできる。
【００８０】
アミノ酸置換は典型的には単一残基である；挿入は通常、約１−約２０アミノ酸程度であるが、かなり長い挿入も許容されうる。欠失は約１−約２０残基の範囲であるが、一部の場合には、欠失ははるかに長くてもよい。
【００８１】
置換、欠失及び挿入又はそれらの組み合わせを使用して最終誘導体に到達しうる。一般に、これらの変化は、分子の変化を最小限に抑えるために２〜３個のアミノ酸に関して起こる。しかし、ある種の状況ではより大きな特徴も許容されうる。
【００８２】
コードされる配列内の単一アミノ酸又は低いパーセンテージのアミノ酸を変化させる１個の核酸、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質配列への個々の置換は、その変化が化学的に類似のアミノ酸によるアミノ酸の置換を生じさせる「保存的に修飾された変異体」である。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換のリストは当技術分野において周知である（ＨｅｎｉｋｏｆｆとＨｅｎｉｋｏｆｆ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９（１９９２））。
【００８３】
交換可能に使用される「ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ」又は「ＣＥＮＰ−Ｅ」は、配列番号２に閉めすアミノ酸配列を有するセントロメア関連モータータンパク質又はその対立遺伝子又は生物活性フラグメントを指す。「Ｈｓ」は、ヒト（ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎ）を指す。ＨｓＣＥＮＰ−Ｅは、染色体を紡錘体微小管に結合する、染色体のキネトコア構造の必須成分である。ＨｓＣＥＮＰ−Ｅは、ＡＴＰアーゼ活性、微小管結合活性、及びプラス端指向性微小管モーター活性などの活性を有する。
【００８４】
「ＨｓＣＥＮＰ−Ｅポリヌクレオチド」は、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質又はその生物活性フラグメントをコードするヌクレオチド配列、又はここで開示するヌクレオチド配列に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする配列を含むポリヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を指す。そのような核酸分子は多くの方法で特性付けることができ、例えば、該核酸分子は、配列番号２に示すアミノ酸配列、又は配列番号２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に少なくとも７５％の同一性を有するヌクレオチド配列又はその対応するフラグメント、又は配列番号１に含まれるヌクレオチド配列に十分な同一性を有するヌクレオチド配列又はその対立遺伝子変異体、そのスプライシング変異体及び／又はそれらの相補物をコードしうる。
【００８５】
「本発明の核酸」及び「核酸分子」は交換可能に使用され、ここで述べる核酸分子を指す。
【００８６】
ここで使用するとき、「スプライシング変異体」は、ゲノムＤＮＡの一次転写産物のディファレンシャルプロセシングによって生産され、２種類以上のｍＲＮＡの生産をもたらす、本発明のタンパク質をコードする核酸の変異体を指す。ディファレンシャルプロセシングされた一次転写産物から誘導されるｃＤＮＡは、完全なアミノ酸同一性の領域と異なるアミノ酸配列を有する領域を含む本発明のＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質をコードする。それ故、同じゲノム配列が多数の関連ｍＲＮＡ及びタンパク質の生産を導きうる。生じるｍＲＮＡとタンパク質の両方をここでは「スプライシング変異体」と称する。
【００８７】
ここで使用するとき、「ポリヌクレオチドプローブ」は、１又はそれ以上の種類の化学結合を通して、通常は相補的塩基対合を通して、通常は水素結合形成を通して、相補的配列の標的核酸分子に結合することができるヌクレオチド配列と定義される。現在好ましいのは、プローブとより低い程度の相同性を有する配列と区別しながら、プローブと少なくとも７０％の相同性を有する配列の特定を可能にするプローブベースのスクリーニング条件である。その結果として、配列番号１に示すヌクレオチドの配列と実質的に同じヌクレオチド配列を有する核酸が得られる。
【００８８】
「ハイブリダイゼーション」は、染色体ＤＮＡにおいて天然に生じる結合に類似した、水素結合を通しての核酸の相補鎖（すなわちセンス：アンチセンス鎖又はプローブ−標的ＤＮＡ）の相互の結合を指す。
「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」の語句は、ここでは、その下でポリ核酸雑種が安定である条件を指すために使用される。当業者に既知であるように、雑種の安定性はその雑種の融解温度（Ｔｍ）に反映される。Ｔｍは次の式によって概算されうる：
８１．５℃−１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／１
［式中、１はヌクレオチド内の雑種の長さである］。配列相同性が１％低下するごとにＴｍは約１°−１．５℃低下する。一般に、雑種の安定性はナトリウムイオン濃度と温度の関数である。典型的には、ハイブリダイゼーション反応はより低いストリンジェンシーの条件下で実施し、その後様々な、但しより高いストリンジェンシーでの洗浄を行う。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーへの言及はそのような洗浄条件に関する。
【００８９】
ここで使用するとき、「中等度にストリンジェントなハイブリダイゼーション」の語句は、標的ＤＮＡが、該標的ＤＮＡに約６０％の同一性、好ましくは約７５％の同一性、より好ましくは約８５％の同一性を有する相補的核酸に結合することを許容する条件を指す；標的ＤＮＡに約９０％以上の同一性を有することが特に好ましい。好ましくは、中等度にストリンジェントな条件は、４２℃で５０％ホルムアミド、５Ｘデンハルト溶液、５ＸＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中のハイブリダイゼーション、次に６５℃で０．２ＸＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中での洗浄に等しい条件である。当業者は、必要に応じてプローブ長等のような因子を適合させるためにいかにして温度、イオン強度等を調整するかを認識する。（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）。
【００９０】
ここで定義する「高ストリンジェンシー条件」は、（１）洗浄に低いイオン強度と高い温度、例えば５０℃で０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを用いる；（２）ハイブリダイゼーションの間にホルムアミドなどの変性剤を用いる、例えば４２℃で０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／ｐＨ６．５の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を添加したホルムアミド、及び７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを用いる；又は（３）４２℃で５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハルト溶液、音波破砕サケ精子ＤＮＡ（５０Ｊｉｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ及び１０％硫酸デキストラン、及び５５℃の０．２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）及び５０％ホルムアミド中４２℃で洗浄、次に５５℃でＥＤＴＡを含む０．１ｘＳＳＣから成る高ストリンジェンシー洗浄を用いるものと特定しうる。
【００９１】
「低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション」の語句は、４２℃で１０％ホルムアミド、５Ｘデンハルト溶液、６ＸＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中のハイブリダイゼーション、次に５０℃で１ＸＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中での洗浄に等しい条件を指す。
【００９２】
デンハルト溶液及びＳＳＰＥ（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＭａｎｉａｔｉｓ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９参照）は、他の適切なハイブリダイゼーション緩衝液と同様に当業者に周知である。例えば、ＳＳＰＥは、ｐＨ７．４のリン酸緩衝０．１８Ｍ  ＮａＣｌである。ＳＳＰＥは、例えば、水８００ｍｌ中にＮａＣｌ  １７５．３ｇ、ＮａＨ２ＰＯ４  ２７．６ｇ及びＥＤＴＡ７．４ｇを溶解し、ｐＨを７．４に調整して、次に水を加えて１リットルにすることにより、２０Ｘ原液として調製することができる。デンハルト溶液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ（１９６６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３：６４１）は、例えば、フィコール５ｇ（Ｔｙｐｅ  ４００、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  Ｎ．Ｊ．）、ポリビニルピロリドン５ｇ及びウシ血清アルブミン５ｇ（Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）を混合し、次に水を加えて５００ｍｌにして、ろ過して微粒子物を除去することにより、５０Ｘ原液として調製することができる。
【００９３】
本発明のポリペプチドをコードする好ましい核酸は、中等度にストリンジェントな条件下で、好ましくは高ストリンジェンシー条件で、配列番号１に示す核酸配列（ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ）の実質的に配列全体に又は実質的な部分に（すなわち典型的には少なくとも１５−３０ヌクレオチド）ハイブリダイズする。
【００９４】
核酸配列を定義するとき、「実質的に類似のアミノ酸配列」をコードすることができるすべての対象核酸配列を、標準核酸配列、すなわちＨｓＣＥＮＰ−Ｅをコードする配列−配列番号１と実質的に類似であるとみなす、又は実質的に同一のヌクレオチドの配列を含むとみなす。
【００９５】
実際上、「実質的に同じ配列」の語は、２個のタンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡが、中等度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、及びアミノ酸の同じ配列を有するタンパク質又はそれらの構造又は機能を変化させない配列の変化を有するタンパク質をコードすることを意味する。
【００９６】
ヌクレオチド配列の「類似性」は、２個のポリヌクレオチドが、最適に整列したとき（適切なヌクレオチド挿入又は欠失と共に）それらの配列内の対応する位置に同一ヌクレオチド塩基を有する度合の基準である。配列類似性又はパーセント類似性は、例えば、ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータプログラム、バージョン６．０などの配列分析ソフトウエアを用いて配列情報を比較することによって決定できる。ＧＡＰプログラムは、ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１）によって修正された、ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０）の整列方法を利用する。
【００９７】
「同一性」は、当技術分野で知られているように、配列を比較することによって決定される、場合に応じて、２個又はそれ以上のポリペプチド配列あるいは２個又はそれ以上のポリヌクレオチドの間の関係である。「同一性」は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編集、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，第Ｉ部、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．とＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編集、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；及びＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．とＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編集、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１；及びＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．とＬｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に述べられているものを含むが、これらに限定されない、既知の方法によって容易に算定できる。同一性を決定する方法は、検討する配列の間で最大の一致を与えるように設計される。さらに、同一性を決定する方法は公的に入手可能なプログラムに集成されている。２個の配列間の同一性を決定するためのコンピュータプログラム法は、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２（１）：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ及びＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））を含むが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴ  Ｘプログラムは、ＮＣＢＩ及び他のソース（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）より公的に入手可能である。周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも同一性を決定するために使用しうる。
【００９８】
ポリペプチド配列比較のためのパラメータは次のものを含む：
１）アルゴリズム：ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３，（１９７０）
【００９９】
比較行列：ＨｅｎｔｉｋｏｆｆとＨｅｎｔｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）からのＢＬＯＳＳＵＭ６２
ギャップペナルティー：１２
ギャップ長ペナルティー：４
【０１００】
これらのパラメータに関して有用なプログラムは、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｗｉｓ．より「ｇａｐ」プログラムとして公的に入手可能である。上記パラメータはペプチド比較についての（末端ギャップについてはペナルティーを伴わない）デフォルトパラメータである。
【０１０１】
ポリヌクレオチド比較のためのパラメータは次のものを含む：
１）アルゴリズム：ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３，（１９７０）
比較行列：一致＝＋１０、不一致＝０
ギャップペナルティー：５０
ギャップ長ペナルティー：３
【０１０２】
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｗｉｓ．より「ｇａｐ」プログラムとして入手可能。これらは核酸比較についてのデフォルトパラメータである。
【０１０３】
場合に応じて、ポリヌクレオチド及びポリペプチドについての「同一性」の好ましい意味を下記の（１）及び（２）に述べる。
【０１０４】
（１）ポリヌクレオチド実施形態はさらに、配列番号１の標準配列と少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９７又は１００％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドを包含し、その場合、該ポリヌクレオチド配列は配列番号１の標準配列と同一であってもよく又は標準配列と比較して一定整数までのヌクレオチド変化を含んでもよく、その場合、該変化は少なくとも１個のヌクレオチド欠失、転位及び転換を含む置換、又は挿入から成る群より選択され、及び該変化は、標準ヌクレオチドの５’又は３’末端の位置で、あるいは標準配列内のヌクレオチドの間に個別に又は標準配列内の１又はそれ以上の隣接する群の中に点在して、それらの末端位置の間のいずれかの位置で生じてもよく、その場合、該ヌクレオチド変化の数は、配列番号１内のヌクレオチドの総数に、パーセント同一性を表わす整数を１００で割ったものを乗じて、次に配列番号１内のヌクレオチドの総数からその積を差し引くことによって決定されるか、又は
ＮｎＸｎ−（ＸｎＹ）
［式中、Ｎｎはヌクレオチド変化の数であり、Ｘｎは配列番号１内のヌクレオチドの総数であり、Ｙは、５０％の場合は０．５０、６０％の場合は０．６０、７０％の場合は０．７０、８０％の場合は０．８０、９０％の場合は０．９０、９５％の場合は０．９５、９７％の場合は０．９７又は１００％の場合は１．００であって、乗法の演算子についての記号であり、及びＸｎとＹの非整数の積は、Ｘｎからそれを差し引く前に最も近い整数に丸める］
によって決定される。配列番号２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の変化は、このコード配列内にナンセンス、ミスセンス又はフレームシフト突然変異を創造することがあり、それにより、そのような変化後に該ポリペプチドによってコードされるポリペプチドを変化させうる。
【０１０５】
（２）ポリペプチド実施形態はさらに、配列番号２のポリペプチド標準配列と少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９７又は１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含む単離ポリペプチドを包含し、その場合、該ポリペプチド配列は配列番号２の標準配列と同一であってもよく又は標準配列と比較して一定整数までのアミノ酸変化を含んでもよく、その場合、該変化は少なくとも１個のアミノ酸欠失、保存的及び非保存的置換を含む置換、又は挿入から成る群より選択され、及び該変化は、標準ポリペプチド配列のアミノ又はカルボキシ末端の位置で、あるいは標準配列内のアミノ酸の間に個別に又は標準配列内の１又はそれ以上の隣接する群の中に点在して、それらの末端位置の間のいずれかの位置で生じてもよく、その場合該アミノ酸変化の数は、配列番号２内のアミノ酸の総数に、パーセント同一性を表わす整数を１００で割ったものを乗じて、次に配列番号２内のアミノ酸の総数からその積を差し引くことによって決定されるか、又は
Ｎａ＝Ｘａ−（ＸａＹ）
［式中、Ｎａはアミノ酸変化の数であり、Ｘａは配列番号２内のアミノ酸の総数であり、Ｙは、５０％の場合は０．５０、６０％の場合は０．６０、７０％の場合は０．７０、８０％の場合は０．８０、９０％の場合は０．９０、９５％の場合は０．９５、９７％の場合は０．９７又は１００％の場合は１．００であって、乗法の演算子についての記号であり、及びＸａとＹの非整数の積は、Ｘａからそれを差し引く前に最も近い整数に丸める］
によって決定される。
【０１０６】
例えば、７０％と指定されたアミノ酸のパーセント同一性は、ここで開示する及び当業者に周知の配列比較アルゴリズムの１つを用いて又は手動整列と視覚検査によって測定される、比較ウインドウにわたって最大の一致を与えるように整列したとき、少なくとも約７０％のアミノ酸同一性を有する１又はそれ以上の配列を指す。しかし、スプライシング変異体として生じる又は保存的アミノ酸置換（又は縮重コドンの置換）によって修飾されている、上述したレベルより低い相同性を有するタンパク質（及びそのようなタンパク質をコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡ）は、本発明の範囲内であると考えられる。
【０１０７】
本発明はまた、配列番号１に示す核酸とは異なるが、同じ表現型を有する核酸を包含する。表現型上類似の核酸はまた、「機能的に等しい核酸」と称される。
【０１０８】
ここで使用するとき、「機能的に等しい核酸」の語句は、ここで開示する核酸と同じタンパク質産物を生産するように実質的に同じように機能する、わずかな且つ重要でない配列変異を特徴とする核酸を包含する。これらの変化は、タンパク質の三次構造を実質的に変化させないものとして当業者に認識されるものを含む。
【０１０９】
ここでは「タンパク質」とは、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド及びペプチドを含む、少なくとも２個の共有結合したアミノ酸を意味する。それ故、「アミノ酸」又は「ペプチド残基」は、ここで使用するとき、天然に生じるアミノ酸と合成アミノ酸の両方を意味する。その側鎖は（Ｒ）又は（Ｓ）立体配座のいずれでもよい。好ましい実施形態では、該アミノ酸は（Ｓ）又はＬ型立体配座である。非天然に生じる側鎖を使用する場合は、例えばインビボでの分解を防ぐ又は遅らせるために非アミノ酸置換基を使用しうる。
【０１１０】
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」の語は、ここではアミノ酸残基のポリマーを指すために交換可能に使用される。それらの語は、１個又はそれ以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工的化学類似体であるアミノ酸ポリマーならびに天然に生じるアミノ酸ポリマーに適用される。標的タンパク質は、少なくとも微小管刺激性ＡＴＰアーゼ活性を有することが明らかにされており、好ましくはＨｓＣＥＮＰ−Ｅと選択的に免疫反応性である抗体に結合するか又はその配列が突然変異誘発及び／又は組換えによってＨｓＣＥＮＰ−Ｅから誘導されるポリペプチドを含む。アミノ酸は、ここではそれらの一般に知られる１文字又は３文字記号によって表わされうる。ヌクレオチドは、同様に、それらの一般的に受け入れられている１文字コードによって表わされうる。該標的タンパク質はまた、「変化して」いてもよく、沈黙変化を生じ、機能的に等しいＨｓＣＥＮＰ−Ｅ（例えばＨｓＣＥＮＰ−Ｅ変異体）をもたらすアミノ酸残基の欠失、挿入又は置換を含みうる。意図的なアミノ酸置換は、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅの生物学的又は免疫学的活性が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性に基づいて実施しうる。例えば、負に荷電したアミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含み、正に荷電したアミノ酸は、リシン及びアルギニンを含み、及び類似の親水性値を有する無電荷の極性頭部を持つアミノ酸は、ロイシン、イソロイシン及びバリン：グリシンとアラニン；アスパラギンとグルタミン；セリンとトレオニン；及びフェニルアラニンとチロシンを含みうる。
【０１１１】
ここで使用する「アミノ酸配列」の語は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質配列、及びそのフラグメント又は部分、及び天然に生じる又は合成分子を指す。
【０１１２】
標準タンパク質、例えば配列番号２の「フラグメント」又は「生物活性フラグメント」は、野生型又は標準タンパク質の完全なアミノ酸配列の部分を含むタンパク質を指すことが意図されている。そのような分子は、中でも特に、それらの野生型相同ポリペプチド及びポリヌクレオチドと等価の類似生物学的機能／性質を有すると予想される。さらに、本発明の好ましいポリペプチド及びポリヌクレオチドは、少なくとも１つのＨｓＣＥＮＰ−Ｅ仲介性活性を有する。
【０１１３】
「ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ」又は「単離ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ」又は「標的タンパク質」のいずれかに関連して使用するとき「生物活性」は、例えばＡＴＰアーゼ活性において試験したとき、微小管刺激性ＡＴＰアーゼ活性を含むがそれに限定されない、１又はそれ以上のキネシンタンパク質の生物活性を有するタンパク質を指す。生物活性はまた、微小管滑走アッセイ又は微小管結合アッセイにおいても明らかにしうる。ここで使用するとき、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質に付随する生物活性は、ヒトＣＥＮＰ−Ｅに特徴的な何らかの活性を指す。上記参照。
【０１１４】
「ＡＴＰアーゼ活性」は、ＡＴＰを加水分解する能力を指す。他の活性は、重合／脱重合（微小管動力学への作用）、紡錘体の他のタンパク質への結合、細胞周期制御に関わるタンパク質への結合、あるいはキナーゼ又はプロテアーゼなどの他の酵素に対する基質として働くこと、及び染色体集合、軸索輸送等のような特異的キネシン細胞活性を含む。キネシンスーパーファミリーの成員は、有糸分裂及び減数分裂紡錘体形成、染色体分離、細胞小器官及び小胞輸送、及び微小管に基づく輸送に必要な多くの他のプロセスにとって必須であると考えられている。キネシンの一般的な特徴は、微小管結合、ＡＴＰ加水分解及び力の変換活性を有する保存された約３５０アミノ酸のモータードメインの存在である（例えばＢａｒｔｏｎら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３（５）：１７３５−１７４２及びＧｏｌｄｓｔｅｉｎ（１９９３）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２７：３１９−３５１参照）。キネシン（キネシンモーター）及びキネシン関連タンパク質の総説については、例えばＫｒｅｉｓとＶａｌｅ（１９９３）Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｔｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ及びその中の参考文献参照。キネシンの重鎖及び軽鎖は、ヒトを含む多くの種からクローン化され、配列決定されている（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｘ６５８７３）。
【０１１５】
「キネシンモーター阻害因子」又は「キネシンモーター活性の阻害」の語は、キネシン／微小管を介した化学エネルギー（例えばＡＴＰに貯蔵されているような）の力学的エネルギー（例えば力の生成又は運動）への変換の低下又は排除を指す。そのような低下は、例えば運動性アッセイにおけるように直接測定することができ、あるいはキネシンタンパク質のＡＴＰアーゼ活性の低下、及び／又はキネシンモータータンパク質−微小管結合相互作用の親和性及び／又は特異性の低下、及び／又は細胞（１又はそれ以上）の有糸分裂活性の低下のような代理マーカーの使用によって確認することができる。逆に、「キネシンモーターアゴニスト」又は「キネシンモーター活性の上方調節因子」は、キネシン／微小管を介した化学エネルギー（例えばＡＴＰに貯蔵されているような）の力学的エネルギー（例えば力の生成又は運動）への変換の上昇を指す。
【０１１６】
「被験化合物」の語は、その抗キネシンモーター活性を測定しようとする化合物を指す。そのような被験化合物は、単独又は適切な担体中の、事実上いかなる分子又は分子の混合物も包含しうる。
【０１１７】
「ＨｓＣＥＮＰ−Ｅの調節因子」は、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ活性に関するインビトロアッセイを用いて特定される調節分子（例えば阻害因子及び活性化因子又はエンハンサー）を指す。そのようなアッセイは、ＡＴＰアーゼ活性、微小管滑走、紡錘体構築、微小管脱重合活性、及び中期の停止を含む。試験濃度の少なくとも１つの候補物質で処理したアッセイを、対照濃度（ゼロでありうる）の候補物質を有する対照試料と比較して、調節の度合を検査する。対照試料には、１００の相対的ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ活性値を割り当てる。対照に比べてＨｓＣＥＮＰ−Ｅ活性値が少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、又は好ましくは少なくとも１００％上昇又は低下するとき、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅの調節が達成される。
【０１１８】
「治療」は、治療的処置と予防的措置の両方を指す。治療を必要とするものとは、既にその疾患を有するものならびにその疾患に罹患しやすいもの又はその疾患を予防すべきものを包含する。
【０１１９】
「疾患」は、本発明のタンパク質による治療から恩恵を受けるであろう状態である。これは、哺乳類に問題の疾患への素因を与える病的状態を含む、慢性及び急性障害又は疾病を包含する。疾患は、心臓血管系、神経系の疾患及び疼痛知覚に関わるものを含むが、これらに限定されない。
【０１２０】
ここで使用するとき、組換え又は異種ＨｓＣＥＮＰ−Ｅに関して「機能性」とは、本発明のタンパク質が、ここで開示する又は当業者に既知のインビトロ又はインビボアッセイによって評価したとき天然ＣＥＮＰ−Ｅに付随する活性を示すことを意味する。何らかのそのような活性を有することは、当業者に既知の、ここで提供する何らかの方法によって評価でき、１個のペプチドを機能性と称するのに十分である。そのような活性は上記のように検出しうる。
【０１２１】
Ｉ．単離核酸分子
本発明は、新規ヒトセントロメア関連モータータンパク質（ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ）の発見、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅをコードするポリヌクレオチド、及び癌、神経障害及び小胞輸送障害の診断、治療又は予防のためのこれらの組成物の使用に基づく。
【０１２２】
１つの局面では、本発明は、キネシンスーパーファミリーモータータンパク質をコードするヌクレオチドの配列を含む単離核酸分子を提供し、該モータータンパク質は次の性質を有する：（ｉ）該タンパク質の活性は、微小管刺激性ＡＴＰアーゼ活性を含む；（ｉｉ）該タンパク質は、配列比較アルゴリズムを用いて測定したとき配列番号２に７０％以上のアミノ酸配列同一性を有する配列を持つ、及び（ｉｉｉ）該タンパク質は、配列番号２に対して惹起した抗体に特異的に結合する。
【０１２３】
特定実施形態では、本発明は、本発明のＨｓＣＥＮＰ−Ｅをコードする、配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列を包含する。
【０１２４】
もう１つの実施形態では、該核酸分子は配列番号２をコードする。
【０１２５】
本発明のＨｓＣＥＮＰ−Ｅをコードする相補的ＤＮＡクローンは、提供されるそのＤＮＡから作製しうる。同様に、本発明のポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡライブラリーなどの天然ソースから入手しうるか、又は周知の市販されている手法を用いて合成できる。
【０１２６】
「単離ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ核酸分子」は、生物活性ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ又はそのフラグメントをコードするか、該ＲＮＡ又はＤＮＡに相補的であるか、又は該ＲＮＡ又はＤＮＡにハイブリダイズし、及び中等度からストリンジェントな条件下で安定に結合したままである、１６個以上、好ましくは２０個又はそれ以上の連続ヌクレオチド塩基を含むＲＮＡ又はＤＮＡである。このＲＮＡ又はＤＮＡは、それが天然ソースにおいて自然に結合している少なくとも１つの汚染ソース核酸分子を含まない、好ましくは他の哺乳類のＲＮＡ又はＤＮＡを実質的に含まない。単離ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ核酸分子の一例は、天然ＣＥＮＰ−Ｅと少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、さらに一層好ましくは９０％、最も好ましくは９５％の配列同一性を共有する生物活性ＨｓＣＥＮＰ−ＥをコードするＲＮＡ又はＤＮＡである。
【０１２７】
本発明の特に好ましい実施形態の中に、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質及びその生物活性フラグメントをコードするポリヌクレオチドがある。
【０１２８】
本発明の好ましい実施形態は、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質をコードするポリヌクレオチドに、それらの長さ全体にわたって少なくとも８０％同一であるポリヌクレオチド、及びそのようなポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドである。これに関して、それらの長さ全体にわたって上記に少なくとも８０％同一であるポリヌクレオチドが特に好ましく、少なくとも９０％同一であるものがとりわけ好ましい。あるいは、配列番号１に示す配列に少なくとも９７％の配列同一性を有するポリヌクレオチドが極めて好ましく、少なくとも９９％の配列同一性を有するものが最も好ましい。
【０１２９】
本発明はさらに、ここで上述した配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。これに関して、本発明は特に、ここで上述した配列にストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。ここで使用するとき、「ストリンジェント条件」の語は、配列間に少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％の同一性が存在する場合にのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。
【０１３０】
当業者は、遺伝暗号の縮重の結果として、その一部が、既知であり且つ天然に生じる遺伝子のポリヌクレオチド配列に最小限の類似性を有する、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅをコードする多数のポリヌクレオチドが産生されうることを認識する。それ故、本発明はまた、可能なコドン選択に基づいて組合せを選択することによって作製されうるポリヌクレオチド配列のあらゆる可能な変異を想定する。これらの組合せは、天然に生じるＨｓＣＥＮＰ−Ｅのポリヌクレオチド配列に適用される標準トリプレット遺伝子暗号に従って為され、そのようなすべての変異は特定して開示されているとみなされるべきである。
【０１３１】
ここで使用するとき、「縮重」の語は、配列番号１と少なくとも１個のヌクレオチドが異なるが、配列番号２からのヌクレオチド（ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ）を示すものと同じアミノ酸をコードするコドンを指す。
【０１３２】
例えば、トリプレット「ＵＣＵ」、「ＵＣＣ」、「ＵＣＡ」及び「ＵＣＧ」によって規定されるコドンは、これら４つのコドンすべてがアミノ酸、セリンをコードするので、互いに縮重している。
【０１３３】
それ故、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、その長さ全体にわたって配列番号１の１つに示すコード配列に同一でありうるか、又は配列番号２のポリペプチドをコードするこのヌクレオチド配列の縮重形態でありうるか、又は配列番号２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に高度に同一でありうる。
【０１３４】
ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質をコードする例示核酸分子は：
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
（ｂ）生物活性ヒトＨｓＣＥＮＰ−Ｅをコードする、中等度にストリンジェントな条件下で（ａ）のＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡ、又は
（ｃ）生物活性ヒトＨｓＣＥＮＰ−Ｅをコードする、上記（ａ）又は（ｂ）に関して縮重しているＤＮＡ
から選択されうる。
【０１３５】
本発明のもう１つの実施形態は、配列番号２に示すものと実質的に同じアミノ酸配列をコードする標準ヌクレオチド配列と実質的に同じヌクレオチド配列を有する核酸を考慮する。
【０１３６】
配列番号１に含まれるヌクレオチド配列に同一であるか又は十分に同一であるポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードする完全長ｃＤＮＡ及びゲノムクローンを単離するため、及び配列番号１に高い配列類似性を有する他の遺伝子（ヒト以外の種からのホモログ及びオーソログをコードする遺伝子を含む）のｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを単離するために、ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡのためのハイブリダイゼーションプローブとして又は核酸増幅（ＰＣＲ）反応のためのプライマーとして使用しうる。典型的にはこれらのヌクレオチド配列は、標準の配列に７０％同一、好ましくは８０％同一、より好ましくは９０％同一、最も好ましくは９５％同一である。該プローブ又はプライマーは一般に、少なくとも１５ヌクレオチド、好ましくは少なくとも３０ヌクレオチドを含み、少なくとも５０ヌクレオチドを有しうる。特に好ましいプローブは、３０−５０ヌクレオチドを有する。
【０１３７】
当業者は、多くの場合、単離ｃＤＮＡ配列が、本発明のヒトタンパク質をコードする領域が該ｃＤＮＡの５’末端で短く切断されているという意味で不完全であることを認識する。これは、１本目の鎖のｃＤＮＡ合成の間にｍＲＮＡ鋳型のＤＮＡコピーを完成することができない、固有の低い「処理能力（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）」（酵素が重合反応の間鋳型に結合したままである能力の基準）を有する酵素、逆転写酵素の結果である。
【０１３８】
ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ及びそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列は、好ましくは適切に選択されたストリンジェンシーの条件下で天然に生じるＨｓＣＥＮＰ−Ｅのヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるが、実質的に異なるコドン使用頻度を有するＨｓＣＥＮＰ−Ｅ又はその誘導体をコードするヌクレオチド配列を生成すること、例えば非天然に生じるコドンを含むことは有益であると考えられる。コドンは、特定コドンが宿主によって利用される頻度に従って特定原核生物又は真核生物宿主においてペプチドの発現が起こる割合を上昇させるように選択しうる。コードされるアミノ酸配列を変化させずにＨｓＣＥＮＰ−Ｅ及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に変化させるための他の理由は、天然に生じる配列から生成される転写産物よりも長い半減期のような、より望ましい性質を有するＲＮＡ転写産物を生産することによる。
【０１３９】
ＨｓＣＥＮＰ−Ｅをコードする核酸配列は、部分ヌクレオチド配列を使用し、プロモーター及び調節エレメントなどの、上流配列を検出するための当技術分野で既知の様々なＰＣＲベースの方法を用いて伸長しうる。上記の目的を達成するための様々なプロトコールが存在する。例えば、Ｓａｒｋａｒ，Ｇ．（１９９３）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌｉｃ．２：３１８−３２２；Ｔｒｎｇｌｉａ，Ｔ．ら（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：８１８６）；Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｍ，Ｍ．ら（１９９１）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌｉｃ．１：１１１−１１９；Ｐａｒｋｅｒ，Ｊ．Ｄ．ら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：３０５５−３０６参照。完全長ｃＤＮＡを得るため又は短いｃＤＮＡを伸長するための他の方法は周知である。例えば、Ｆｒｏｈｍａｎら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５、８９９８−９００２，１９８８）。
【０１４０】
ＤＮＡ塩基配列決定のための方法は当技術分野において周知であり、本発明の実施形態のいずれかを実施するために使用しうる。それらの方法は、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ（ＵＳ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、耐熱性Ｔ７ポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  Ｎ．Ｊ．）、又はＥＬＯＮＧＡＳＥ増幅システム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ  Ｍｄ．）に認められるようなポリメラーゼとプルーフリーディングエキソヌクレアーゼの組合せなどの酵素を使用しうる。塩基配列決定は、ＡＢＩ  ３７３又は３７７ＤＮＡ塩基配列決定システム（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）又はＭＥＧＡＢＡＣＥ１０００ＤＮＡ塩基配列決定システム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ  Ｃａｌｉｆ．）を用いて実施しうる。生じた配列を、当技術分野で周知の様々なアルゴリズムを用いて分析する。（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９７）Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｎ．Ｙ．，ｕｎｉｔ  ７．７；Ｍｅｙｅｒｓ，Ｒ．Ａ．（１９９５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｒｙ、Ｗｉｌｅｙ  ＶＣＨ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｎ．Ｙ．，ｐ．８５６−８５３参照。）
【０１４１】
ヒト以外の種からのホモログ及びオーソログを含む、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、適切なライブラリーを、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下に配列番号１の配列を有する標識プローブ又はそれから誘導されるフラグメントでスクリーニングすること；及び該ポリヌクレオチド配列を含む完全長ｃＤＮＡ及びゲノムクローンを単離すること、の段階を含む工程によって入手しうる。そのようなハイブリダイゼーション手法は当業者に周知である。哺乳類ライブラリーをスクリーニングした後、ハイブリダイゼーションシグナルを検出することによって陽性クローンを特定し、特定したクローンを制限酵素地図の作成及び／又はＤＮＡ塩基配列分析によって特徴づけ、その後、ここで示す配列と比較することによって検討して、それらが本発明のタンパク質全体をコードするＤＮＡを含むかどうかを確認する。選択したクローンが不完全である場合は、それらを使用して同じか又は異なるライブラリーを再びスクリーニングし、重複クローンを得る。所望する場合は、本発明のタンパク質全体をコードする重複クローンが得られるまで該ライブラリーを陽性クローンで再スクリーニングすることができる。該ライブラリーがｃＤＮＡライブラリーである場合は、重複クローンはオープンリーディングフレームを含む。ライブラリーがゲノムライブラリーである場合は、重複クローンはエクソンとイントロンを含む。いずれの場合も、ここで提供するＤＮＡ及びコードされるタンパク質との比較によって完全なクローンを特定しうる。
【０１４２】
そのようにして特定した核酸分子は、次に、そのような核酸を当業者に既知の種々のタンパク質発現系に組み込んだとき、該核酸分子によってコードされるＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質を生産するために使用することができる。さらに、そのような核酸分子又はそのフラグメントは、容易に検出しうる置換基で標識して、所与の試料においてヒトＨｓＣＥＮＰ−Ｅコード遺伝子又はｍＲＮＡ転写産物の存在及び／又は量を検定するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。ここで述べる核酸分子及びそのフラグメントはまた、ここで述べる本発明のタンパク質をコードする遺伝子を増幅するためのＰＣＲ反応におけるプライマー及び／又は鋳型としても有用である。
【０１４３】
完全長ｃＤＮＡをスクリーニングするとき、より大きなｃＤＮＡを含むようにサイズ選択したライブラリーを使用することが望ましい。好ましいストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン、及び変性してせん断したサケ精子ＤＮＡを含む溶液中、４２℃で一晩のインキュベーション、次に０．１ｘＳＳＣ中約６５℃でのフィルターの洗浄を含む。
【０１４４】
本発明の１つの局面はまた、適切なライブラリーを、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下に配列番号１の配列を有する標識プローブ又はそのフラグメントでスクリーニングすることによって得られるポリヌクレオチドを含む。
【０１４５】
本発明の核酸は、当技術分野で周知の様々な方法によって、例えば配列番号１の様々な領域からのオリゴヌクレオチドプライマーを使用したＰＣＲ増幅を用いる、ここで述べる方法等によって生産できる。あるいは、当技術分野で周知の化学的方法を用いてＨｓＣＥＮＰ−Ｅをコードする配列を、全体として又は部分的に、合成しうる。（例えばＣａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．ら（１９８０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２１５−２２３、及びＨｏｍ，Ｔ．ら（１９８０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２２５−２３２参照）。あるいは、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ自体又はそのフラグメントを、化学的方法を用いて合成してもよい。例えば、様々な固相手法を用いてペプチド合成を実施することができる。（例えば、Ｒｏｂｅｒｇｅ，Ｊ．Ｙ．ら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：２０２−２０４参照）。自動合成は、ＡＢＩ  ４３１Ａペプチドシンセサイザー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて実施しうる。
【０１４６】
本発明のもう１つの実施形態では、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列又はそのフラグメントを、適切な宿主細胞においてＨｓＣＥＮＰ−Ｅ又はそのフラグメント又は機能的等価物の発現を指令する組換えＤＮＡ分子中にクローン化しうる。遺伝暗号の固有の縮重の故に、実質的に同じか又は機能的に等しいアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列を生産し、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅを発現するために使用しうる。
【０１４７】
本発明のヌクレオチド配列は、遺伝子産物のクローニング、プロセシング及び／又は発現の修飾を含むがこれらに限定されない様々な目的に合わせてＨｓＣＥＮＰ−Ｅコード配列を変化させるために、当技術分野において一般的に知られる方法を用いて構築することができる。遺伝子フラグメント及び合成ポリヌクレオチドのランダムな切断とＰＣＲ再構築によるＤＮＡシャフリングを使用して該ヌクレオチド配列を構築しうる。例えば、オリゴヌクレオチドを介した部位指定突然変異誘発を用いて、新しい制限部位を創造する、グリコシル化パターンを変化させる、コドン使用頻度を変える、スプライシング変異体を生産する等の突然変異を導入しうる。
【０１４８】
本発明の核酸で形質転換した細胞を特定するために、数多くの方法が既知であり、当業者に使用可能である。例えば、特異的ポリクローナル又はモノクローナル抗体を用いてＨｓＣＥＮＰ−Ｅの発現を検出し、測定するための免疫学的方法は、当技術分野において既知である。そのような手法の例は、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、及び蛍光活性化細胞分類法（ＦＡＣＳ）を包含する。ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ上の２個の非干渉性エピトープに反応性のモノクローナル抗体を使用する、２サイト・モノクローナルベースの免疫測定法が好ましいが、競合結合測定法も使用しうる。これらや他のアッセイは当技術分野において周知である。（例えば、Ｈａｍｐｔｏｎ，Ｒ．ら（１９９０）Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＡＰＳ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓｔ  Ｐａｕｌ  Ｍｉｎｎ．，第ＩＶ章；Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．ら（１９９７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｎ．Ｙ．；及びＰｏｕｎｄ，Ｊ．Ｄ．（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ  Ｎ．Ｊ．参照）。
【０１４９】
本発明のタンパク質をコードするｍＲＮＡの翻訳を妨げるように、該ｍＲＮＡのいずれかの部分と特異的に結合することができるヌクレオチド配列を有するアンチセンスポリヌクレオチドも提供する。該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡの配列のいずれかの部分と特異的に結合することができる配列を有しうる。
【０１５０】
極めて多様な標識及び複合手法が当業者に既知であり、様々な核酸及びアミノ酸検定法において使用しうる。ＨｓＣＥＮＰ−Ｅをコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための標識ハイブリダイゼーションプローブ又はＰＣＲプローブを作製するための手段は、オリゴ標識、ニックトランスレーション、末端標識、又は標識ヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅を包含する。
【０１５１】
ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質のフラグメントは、組換え生産だけでなく、固相手法を用いた直接ペプチド合成によっても生産しうる（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，前出、ｐ．５５−６０参照）。タンパク質合成は、手動手法又は自動化法によって実施しうる。自動合成は、例えば、ＡＢＩ  ４３１Ａペプチドシンセサイザー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて実施しうる。ＨｓＣＥＮＰ−Ｅの様々なフラグメントを別々に合成し、次にそれらを結合して完全長分子を生産してもよい。
【０１５２】
ここで使用するとき、「発現」は、ポリ核酸がｍＲＮＡに転写され、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質に翻訳される過程を指す。ポリ核酸がゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、適切な真核宿主細胞又は生物を選択すれば、ｍＲＮＡのスプライシングを含みうる。
【０１５３】
ＩＩ．ベクター、宿主細胞、発現等
本発明はまた、例えば（ａ）配列番号２のアミノ酸配列又はその生物活性フラグメントをコードする、又は（ｂ）配列番号１に示す配列又はその部分を含むヌクレオチド配列を有する、本発明の核酸分子を含むベクター、好ましくは発現ベクターに関する。
【０１５４】
発現ベクターの設計が、形質転換する宿主細胞の選択、所望するタンパク質発現のレベル等のような因子に依存しうることは当業者に認識される。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入し、それによって、ここで述べるような核酸によってコードされる、融合タンパク質又はペプチドを含むタンパク質又はペプチド（例えばＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の突然変異形態、融合タンパク質等）を生産することができる。
【０１５５】
適切な発現ベクターへのクローン化ＤＮＡの組込み、プラスミドベクター又は各々が１個又はそれ以上の異なる遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡ又は線状ＤＮＡによる真核細胞のトランスフェクション、及びトランスフェクトした細胞の選択は、当技術分野において周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ参照）。本発明の核酸構築物を含む発現ベクターを宿主細胞に導入（形質導入）して、形質導入組換え細胞（すなわち組換え異種核酸を含む細胞）を生産するための適切な手段は、当技術分野において周知である。詳細な総説については、例えば、各々が全体として参照してここに組み込まれる、Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，１９８９、Ｓｃｉｃｅｎｅ，２４４：１２７５−１２８１；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，１９９３，Ｓｃｉｃｅｎｅ，２６０：９２６−９３２参照。
【０１５６】
ここで使用するとき、「形質転換」及び「トランスフェクション」の語は、異種核酸（例えばＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための当技術分野で認知されている様々な手法を指すことが意図されている。宿主細胞を形質転換する又はトランスフェクトするための適切な手法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）及び他の実験室マニュアルに認められる。
【０１５７】
本発明の組換え発現ベクターは、本発明の核酸を、宿主細胞における該核酸の発現に適した形態で含み、これは、該組換え発現ベクターが、発現すべき核酸配列に作動可能に連結された、発現のために使用される宿主細胞に基づいて選択される１又はそれ以上の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクター内で、「作動可能に連結された」とは、対象ヌクレオチド配列が、該ヌクレオチド配列の発現を可能にするように（例えばインビトロ転写／翻訳系において又はベクターが宿主細胞に導入されるときは宿主細胞において）調節配列に連結されていることを意味するものとする。「調節配列」の語は、プロモーター、エンハンサー及び他の発現制御エレメント（例えばポリアデニル化シグナル）を包含することが意図されている。そのような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に述べられている。調節配列は、多くの種類の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指令するもの及び特定宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指令するもの（例えば組織特異的調節配列）を含む。
【０１５８】
好ましくは、本発明の組換え発現ベクターは、キネシンスーパーファミリーモータータンパク質をコードする核酸分子を含み、該モータータンパク質は次の性質を有する：（ｉ）タンパク質の活性が微小管刺激性ＡＴＰアーゼ活性を含む；及び（ｉｉ）タンパク質が、配列比較アルゴリズムを用いて測定したとき配列番号２に７０％以上のアミノ酸配列同一性を有する配列を備える。
【０１５９】
生物活性ＨｓＣＥＮＰ−Ｅを発現するために、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ又はその誘導体をコードするヌクレオチド配列を適切な発現ベクター、すなわち適切な宿主細胞における挿入コード配列の転写及び翻訳制御のために必要なエレメントを含むベクターに挿入しうる。これらのエレメントは、エンハンサー、構成的及び誘導的プロモーターなどの調節配列、及びベクターにおける及びＨｓＣＥＮＰ−Ｅをコードするポリヌクレオチド配列における５’及び３’非翻訳領域を含む。そのようなエレメントは、それらの強さ及び特異性を変化させうる。特異的開始シグナルも、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅをコードする配列のより効率的な翻訳を達成するために使用しうる。そのようなシグナルは、ＡＴＧ開始コドン及び隣接配列、例えばコザック配列を含む。ＨｓＣＥＮＰ−Ｅをコードする配列及びその開始コドンと上流調節配列を適切な発現ベクターに挿入する場合、付加的な転写又は翻訳制御シグナルは必要ないと考えられる。しかし、コード配列又はそのフラグメントだけを挿入する場合は、インフレームＡＴＧ開始コドンを含む外来性翻訳制御シグナルがベクターによって提供されるべきである。外来性翻訳エレメント及び開始コドンは、天然及び合成の、様々な由来のものでありうる。使用する個々の宿主細胞系に適切なエンハンサーを含めることによって発現の効率を高めうる（例えば、Ｓｃｈａｒｆ，Ｄ．ら（１９９４）Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１２５−１６２参照）。
【０１６０】
一般に、最終的に発現されるＤＮＡ配列は、該ＤＮＡ配列と発現ベクターを１又はそれ以上の制限酵素で開裂し、次にそれらのフラグメントを連結することによって発現ベクターに結合される。
【０１６１】
制限酵素消化のための手順は当業者に周知である。異種核酸、プロモーター、ターミネーター又は他のエレメントをそれぞれ連結して、それらを複製のために必要な情報を含む適切なクローニングビヒクルに挿入するための手法は当業者に周知である（例えば、中でも特に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９参照）。
【０１６２】
形質導入の例示的方法は、例えば、ウイルスベクターを用いた感染（例えば、米国特許第４，４０５，７１２号及び同第４，６５０，７６４号参照）、リン酸カルシウムトランスフェクション（米国特許第４，３９９，２１６号及び同第４，６３４，６６５号）、硫酸デキストラントランスフェクション、電気穿孔法、リポフェクション（例えば、米国特許第４，３９４，４４８号及び同第４，６１９，７９４号参照）、サイトフェクション、パーティクルガン法等を包含する。異種核酸は、場合により、その染色体外（すなわちエピソーム）維持を可能にする配列を含みうるか、又は異種核酸は、宿主のゲノムに組み込まれる供与体核酸でありうる。組換え細胞を、その後、該ＤＮＡによってコードされる本発明のタンパク質が発現される条件下で培養することができる。好ましい細胞は、哺乳類細胞（例えばＨＥＫ２９３、ＣＨＯ及びＬｔｋ−細胞）、酵母細胞（例えばＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓなどのメチロトローフ酵母細胞）、細菌細胞（例えば大腸菌）等を包含する。
【０１６３】
ここで使用するとき、「異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ又はｆｏｒｅｉｇｎ）ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ」は交換可能に使用され、それが存在する細胞のゲノムの部分としては天然に生じないＤＮＡ又はＲＮＡ、あるいは天然に生じるものとは異なるゲノム内の位置（１又はそれ以上）に認められるＤＮＡ又はＲＮＡを指す。典型的には、異種ＤＮＡ及びＲＮＡは、宿主細胞に内因性ではなく、該細胞に人為的に導入されたＤＮＡ及びＲＮＡを指す。
【０１６４】
ＨｓＣＥＮＰ−Ｅをコードする配列と適切な転写及び翻訳制御エレメントを含む発現ベクターを構築するには、当業者に周知の方法を使用しうる。これらの方法は、インビトロ組換えＤＮＡ手法、合成手法及びインビボ遺伝子組み換えを包含する。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ  Ｎ．Ｙ．，第４、８及び１６−１７章；Ａｕｓｈｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｎ．Ｙ．，第９、１３及び１６章参照）。
【０１６５】
本発明のもう１つの局面は、本発明の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関する。「宿主細胞」及び「組換え宿主細胞」の語は、ここでは交換可能に使用される。そのような語は、特定対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫又は潜在的子孫も指すことと了解される。連続する世代においては突然変異又は環境的影響のいずれかのためにある種の修飾が起こりうるので、そのような子孫は、事実上、親細胞と同一でないことがありうるが、それでもここで使用する語の範囲内に包含される。
【０１６６】
ＨｓＣＥＮＰ−Ｅをコードする配列を含み且つ発現するために様々な発現ベクター／宿主系が使用できる。これらは、組換えバクテリオファージ、プラスミド又はコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌；酵母発現ベクターで形質転換した酵母；ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系；両生類細胞（例えばツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞）；ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ又はタバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）又は細菌発現ベクター（例えばＴｉ又はｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換した植物細胞系；又はチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）又はＣＯＳ細胞などの哺乳類細胞又は動物細胞系のような微生物を含むが、これらに限定されない。本発明は、使用する宿主細胞によって限定されない。注入したＲＮＡ転写産物を発現するための例示的細胞は、ツメガエル卵母細胞を包含する。一般に、宿主細胞においてポリヌクレオチドを維持し、増殖又は発現して、ポリペプチドを生産することができるいかなる系又はベクターも使用しうる。適切なヌクレオチド配列は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（前出）に述べられているもののような、様々な周知の常用手法のいずれかによって発現系に挿入しうる。
【０１６７】
細菌系では、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅをコードするポリヌクレオチド配列の意図されている用途に依存して、いくつものクローニング及び発現ベクターを選択しうる。例えば、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅをコードするポリヌクレオチド配列の常套的クローニング、サブクローニング及び増殖は、ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  Ｃａｌｉｆ．）又はｐＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの多機能性大腸菌ベクターを用いて達成できる。ベクターのマルチクローニングサイトへのＨｓＣＥＮＰ−Ｅをコードする配列の連結は、ｌａｃＺ遺伝子を分断し、組換え分子を含む形質転換細菌の特定のための比色スクリーニング手法を可能にする。さらに、これらのベクターは、インビトロ転写、ジデオキシ塩基配列決定、ヘルパーファージによる一本鎖レスキュー、及びクローン化配列における入れ子欠失の創造のために有用でありうる。（例えば、Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ，Ｇ．とＳ．Ｍ．Ｓｃｈｕｓｔｅｒ（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５５０３−５５０９参照）。例えば抗体の生産のために、大量のＨｓＣＥＮＰ−Ｅが必要なときは、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅの高レベル発現を指令するベクターを使用しうる。例えば、強力な誘導的Ｔ５又はＴ７バクテリオファージプロモーターを含むベクターを使用しうる。
【０１６８】
大腸菌原核細胞の形質転換のための例示的発現ベクターは、ｐＥＴ発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．，米国特許第４，９５２，４９６号参照）、例えば、Ｔ７プロモーター、Ｔ７ターミネーター、誘導的大腸菌ｌａｃオペレーター及びｌａｃリプレッサー遺伝子を含むｐＥＴＩＩａ、及びＴ７プロモーター、Ｔ７ターミネーター及び大腸菌ｏｍｐＴ分泌シグナルを含むｐＥＴ１２ａ−ｃを包含する。もう１つのそのようなベクターは、ｌｐｐプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーターオペレーター、ｏｍｐＡ分泌シグナル及びｌａｃリプレッサー遺伝子を含むｐＩＮ−ＩＩＩｏｍｐＡ２である（Ｄｕｆｆａｕｄら、Ｍｅｔｈ．ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３：４９２−５０７，１９８７参照）。
【０１６９】
原核生物におけるタンパク質の発現は、しばしば、融合又は非融合タンパク質の発現を指令する構成的又は誘導的プロモーターを含むベクターを用いて大腸菌において実施される。融合ベクターは、その中にコードされるタンパク質に、通常は組換えタンパク質のアミノ末端にいくつものアミノ酸を付加する。そのような誘導ベクターは、典型的には３つの目的：１）組換えタンパク質の発現を上昇させること；２）組換えタンパク質の溶解度を上昇させること；及び３）アフィニティー精製におけるリガンドとして働くことにより組換えタンパク質の精製を助けること、に役立つ。しばしば、融合発現ベクターにおいては、融合タンパク質の精製後に融合成分からの組換えタンパク質の分離を可能にするために、融合成分と組換えタンパク質の接合部にタンパク質分解性開裂部位を導入する。そのような酵素及びそれらのコグネイト認識配列は、第Ｘａ因子、トロンビン及びエンテロキナーゼを包含する。典型的な融合発現ベクターは、標的組換えタンパク質にそれぞれグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質又はプロテインＡを融合する、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．とＪｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を包含する。
【０１７０】
大腸菌における組換えタンパク質発現を最大化するための１つの戦略は、組換えタンパク質を分解開裂する能力に障害を有する宿主細菌において該タンパク質を発現させることである。（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｓ．，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）１１９−１２８）。もう１つの戦略は、各々のアミノ酸についての個々のコドンが大腸菌において選択的に使用されるものであるように、発現ベクターに挿入する核酸の核酸配列を変化させることである（Ｗａｄａら（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８）。本発明の核酸配列のそのような変更は標準ＤＮＡ合成手法によって実施できる。
【０１７１】
酵母又は糸状菌類（例えばアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、アカパンカビ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｓｐｐ．））を含む真菌細胞は、本発明における宿主細胞として使用しうる。
【０１７２】
例示的酵母細胞は、真核微生物の中で最も一般的に使用されるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ又は一般的なパン酵母を包含する。他の菌株も使用可能であり、パン酵母の代わりに使用しうる。ここで使用するとき「酵母」の語は、厳密な分類学的意味における酵母、すなわち単細胞生物だけでなく、酵母様多細胞真菌又は糸状菌類も包含する。
【０１７３】
酵母において作動可能な代表的ベクターは周知である。サッカロミセス属における発現のためには、例えば、プラスミドＹＲｐ７（Ｓｔｉｎｃｈｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ，２８２：３９（１９７９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎら、Ｇｅｎｅ，７：１４１（１９７９）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒら、Ｇｅｎｅ，１０：１５７（１９８０））が好ましい。酵母において機能性であり、酵母における異種核酸の発現のために必要な他の代表的プロモーターは、メタロチオネイン、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５，２０７３（１９８０）、又はエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ及びグルコキナーゼなどの他の解糖系酵素（Ｈｅｓｓら、Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｑ．７，１４９（１９６８）；及びＨｏｌｌａｎｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １７，４９００（１９７８））についてのプロモーターを包含する。
【０１７４】
酵母、例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現のためのベクターの例は、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら、ＥＭＢＯ  Ｊ．６：２２９−２３４（１９８７））、ｐＭＦａ（Ｋｕｉｊａｎら、Ｃｅｌｌ  ３０：９３３−９４３（１９８２））、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら、Ｇｅｎｅ  ５４：１１３−１２３（１９８７））、及びｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）を包含する。酵母において組換えタンパク質を発現することができる多くの他のベクターが既知である。代表的な例は、ＹＥＰ２４、ＹＩＰ５、ＹＥＰ５１、ＹＥＰ５２及びＹＲＰ１７を包含し、それらのすべてがＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅへの遺伝子構築物の導入において有用な、適切なクローニング及び発現ビヒクルである。参照してここに組み込まれる、Ｂｒｏａｃｈら（１９８３）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎより、Ｍ．Ｉｎｏｕｙｅ編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐ．８３参照。
【０１７５】
酵母における本発明のＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の発現に使用するためのさらなるベクター、プロモーター及びターミネーターは当業者に周知であり、例えば、参照してここに組み込まれる、Ｅｍｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：２３１−２７９（１９９０）によって総説されている。本発明のＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質はアスペルギルス属において発現されうる（ＭｃＫｎｉｇｈｔとＵｐｓｈａｌｌ、参照してここに組み込まれる、米国特許第４，９３５，３４９号に述べられている）。有用なプロモーターは、ＡＤＨ３プロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔら、ＥＭＢＯ  Ｊ．４：２０９３−２０９９，１９８５）及びｔｐｉＡプロモーターなどの、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ解糖系遺伝子から誘導されるものを包含する。適切なターミネーターの一例はＡＤＨ３ターミネーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔら、同上）である。真菌を形質転換するための手法は文献において周知であり、例えば、各々が参照してここに組み込まれる、Ｂｅｇｇｓ（同上）、Ｈｉｎｎｅｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：１９２９−１９３３，１９７８）、Ｙｅｌｔｏｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：１７４０−１７４７，１９８４）及びＲｕｓｓｅｌｌ（Ｎａｔｕｒｅ  ３０１：１６７−１６９，１９８３）によって記述されている。
【０１７６】
あるいは、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質は、バキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞において発現することができる。培養昆虫細胞（例えばＳｆ９細胞）におけるタンパク質の発現に使用できるバキュロウイルスベクターは、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）及びｐＶＬシリーズ（ＬｕｃｋｌｏｗとＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１−３９）を包含する。
【０１７７】
ＤＮＡ又はＲＮＡを導入しうる真核細胞は、そのようなＤＮＡ又はＲＮＡによってトランスフェクト可能な細胞又はそのようなＤＮＡ又はＲＮＡを注入しうる細胞を包含する。好ましい細胞は、一過性に又は安定にトランスフェクトされて、ＤＮＡ及びＲＮＡを発現することができるものである。現在最も好ましい細胞は、本発明の核酸分子によってコードされる組換え又は異種ＨｓＣＥＮＰ−Ｅを発現することができるものである。そのような細胞は、経験的に特定しうるかあるいは容易にトランスフェクトされる又は注入されることが知られているものの中から選択しうる。
【０１７８】
ＨｓＣＥＮＰ−Ｅをコードするヌクレオチド配列で形質転換した宿主細胞は、細胞培養からのタンパク質の発現と回収に適した条件下で培養しうる。形質転換細胞によって生産されたタンパク質は、使用する配列及び／又はベクターに依存して分泌されるか又は細胞内に保持されうる。当業者に了解されるように、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、分泌を指令するシグナル配列を含むように設計しうる。
【０１７９】
本発明のタンパク質は、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿法、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法によって組換え細胞培養から回収し、精製することができる。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィーを精製のために用いる。ポリペプチドが単離及び／又は精製の間に変性しているときは、タンパク質リフォールディングのための周知の手法を使用して活性コンフォメーションに再生しうる。タンパク質精製の方法は当技術分野において既知であり（一般に、参照してここに組み込まれる、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｒ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）参照）、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の精製、特にここで述べる組換え生産したＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の精製に適用しうる。
【０１８０】
本発明の核酸分子は、当技術分野において既知の方法を用いて細胞に安定に組み込むか又は一過性に導入しうる。安定にトランスフェクトされた哺乳類細胞は、本発明のタンパク質、すなわちヒトＨｓＣＥＮＰ−Ｅをコードするヌクレオチドの配列を、選択マーカー遺伝子（例えばチミジンキナーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ネオマイシン耐性等についての遺伝子など）と共に含む発現ベクターで細胞をトランスフェクトし、トランスフェクトした細胞を、該マーカー遺伝子を発現する細胞に選択的な条件下で増殖させることによって作製しうる。導入核酸で安定にトランスフェクトされた細胞は、薬剤選択によって特定できる（例えば選択マーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生存するが、その他の細胞は死滅する）。
【０１８１】
一過性トランスフェクタントを作製するためには、哺乳類細胞をレポーター遺伝子（大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子など）でトランスフェクトして、トランスフェクション効率を監視する。本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの正確な量と割合は経験的に決定でき、個々の細胞及び検定条件について最適化しうる。トランスフェクタントは、典型的には選択条件下で増殖させずに、通常はトランスフェクション後数日以内に分析するので、典型的には選択マーカー遺伝子は一過性トランスフェクションには含まれない。
【０１８２】
「細胞」、「細胞系」及び「細胞培養」はここでは交換可能に使用され、そのような名称は、細胞又は細胞系のすべての子孫を包含する。それ故、例えば、「形質転換体」及び「形質転換細胞」のような語は、転移の数に関わりなく、一次対象細胞及びそれに由来する培養物を包含する。故意又は偶然の突然変異により、すべての子孫がＤＮＡ内容物において正確に同一でない場合がありうることも了解される。最初に形質転換した細胞においてスクリーニングしたときと同じ機能又は生物活性を有する突然変異体子孫は包含される。異なる名称が与えられる場合は、文脈から明らかである。
【０１８３】
他の実施形態では、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡのインビトロ転写によってｍＲＮＡを生産しうる。このｍＲＮＡを、次に、ツメガエル卵母細胞に注入することができ、そこで該ＲＮＡは本発明のタンパク質の合成を指令する。あるいは、機能的な本発明のタンパク質の発現のために、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを直接卵母細胞に注入することができる。その後、トランスフェクトした哺乳類細胞又は注入した卵母細胞をここで提供する薬剤スクリーニングの方法において使用しうる。
【０１８４】
ここで使用するとき、「ベクター」の語は、それが連結されているもう１つ別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。１つの種類のベクターは、付加的なＤＮＡセグメントを連結することができる環状二本鎖ＤＮＡループを指す、「プラスミド」である。もう１つの種類のベクターは、付加的なＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに連結することができる、ウイルスベクターである。一部のベクターは、それらが導入された宿主細胞において自律複製することができる（例えば細菌複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって宿主ゲノムと共に複製される。さらに、一部のベクターは、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指令することができる。そのようなベクターをここでは「発現ベクター」と称する。一般に、組換えＤＮＡ手法において有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。本明細書においては、プラスミドがベクターの最も一般的に使用される形態であるので、「プラスミド」と「ベクター」は交換可能に使用できる。しかし、本発明は、等価機能を果たす、ウイルスベクター（例えば複製欠損レトロウイウルス、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルス）などの他の形態の発現ベクターを包含することが意図されている。必ずしも常に明瞭に言明されているわけではないが、これらの発現ベクターは、エピソームとして又は染色体ＤＮＡの必須部分として宿主生物において複製可能でなければならないことは了解されている。明らかに、複製能の欠如によってそれらは有効に作動可能ではなくなる。
【０１８５】
つまり、「発現ベクター」は機能的定義を与えられており、ここで規定する特定ＤＮＡ暗号の発現を生じさせうるＤＮＡ配列は、規定された配列に適用されるときこの語に包含される。一般に、組換えＤＮＡ手法において有用な発現ベクターは、しばしば、それらのベクター形態では染色体に結合していない、環状二本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」の形態である。
【０１８６】
ここで使用するとき、「発現」の語は、核酸分子がＲＮＡに転写され、（場合により）ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質に翻訳される過程を含む多くの段階を指す。ポリ核酸がゲノムＤＮＡ由来である場合、発現は、適切な真核宿主細胞又は生物を選択すれば、ＲＮＡのスプライシングを含みうる。
【０１８７】
そこで、発現ベクターは、適切な宿主細胞に導入したとき、挿入ＤＮＡの発現を生じさせる、プラスミド、ファージ、組換えウイルス又は他のベクターなどの組換えＤＮＡ又はＲＮＡ構築物を指す。適切な発現ベクターは当業者に周知であり、真核細胞及び／又は原核細胞において複製可能であるもの及びエピソームのままであるもの又は宿主細胞ゲノムに組み込まれるものを包含する。
【０１８８】
ベクターは染色体外エレメントとして宿主細胞内に維持することができ、そこで複製して、核酸分子の付加的なコピーを生産する。あるいは、ベクターは宿主細胞ゲノムに組み込まれて、宿主細胞が複製するときに核酸分子の付加的なコピーを生産しうる。
【０１８９】
ＤＮＡベクターにおける改善も為されており、おそらくすべての非ウイルス送達系に適用しうる。これらは、ＲＰＲ  Ｇｅｎｃｅｌｌによって報告された超らせんミニサークル（細菌複製起点も抗生物質耐性遺伝子も持たず、それ故それらは高レベルの生物学的封じ込めを示すので、潜在的により安全である）、Ｃｏｐｅｒｎｉｃｕｓ  Ｇｅｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃによって開発されたようなエピソーム発現ベクター（プラスミドが核内では増幅するが、染色体外では増幅せず、それ故ゲノム組込み事象を回避するエピソーム発現系を複製する）及びＰｒｏｇｅｎｉｔｏｒによって開発されたようなＴ７系（厳密には、ベクター自体がファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現し、その治療遺伝子が、第一プロモーターによって生成されるポリメラーゼを使用して、第二Ｔ７プロモーターから駆動される細胞質発現ベクター）の使用を含む。ＤＮＡベクターテクノロジーへの他のより一般的な改善は、高レベルの発現を生じさせるシス作用性エレメント（Ｖｉｃａｌ）、細胞周期当り１回の複製を供給するアルフォイド反復ＤＮＡから誘導される配列及び核標的配列（ＥＢＮＡ−１遺伝子より（ＳｔａｎｆｏｒｄのＣａｌｏｓ，及びＭｅｇａｂｉｏｓ）；ＳＶ４０初期プロモーター／エンハンサー又は該ＤＮＡに結合したペプチド配列）の使用を含む。
【０１９０】
高等真核生物による、対象標的タンパク質又は遺伝子産物をコードする異種核酸分子（配列番号２のアミノ酸配列）の転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することによって上昇させうることは特筆すべきである。エンハンサーは、ＤＮＡの転写を上昇させるようにプロモーターに作用する、通常約１０−３００ｂｐのＤＮＡのシス作用性エレメントである。その例は、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（１００−２７０ｂｐ）、サイトメガロウイルス初期プロモータエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーを包含する。
【０１９１】
特異的ポリクローナル又はモノクローナル抗体を使用して本発明のＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の発現を検出し、測定するための免疫学的方法は、当技術分野において既知である。そのような手法の例は、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、及び蛍光活性化細胞分類法（ＦＡＣＳ）を包含する。ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ上の２個の非干渉性エピトープに反応性のモノクローナル抗体を使用する、２サイト・モノクローナルベースの免疫測定法が好ましいが、競合結合測定法も使用しうる。これらや他のアッセイは当技術分野において周知である。（例えば、Ｈａｍｐｔｏｎ，Ｒ．ら（１９９０）Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＡＰＳ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓｔ  Ｐａｕｌ  Ｍｉｎｎ．，第ＩＶ章；Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．ら（１９９７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｎ．Ｙ．；及びＰｏｕｎｄ，Ｊ．Ｄ．（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ  Ｎ．Ｊ．参照）。
【０１９２】
極めて多様な標識及び複合手法が当業者に既知であり、様々な核酸及びアミノ酸検定法において使用しうる。ＣＥＮＰ−Ｅをコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための標識ハイブリダイゼーションプローブ又はＰＣＲプローブを作製するための手段は、オリゴ標識、ニックトランスレーション、末端標識、又は標識ヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅を包含する。あるいは、本発明のＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質をコードする配列又はそのフラグメントを、ｍＲＮＡプローブの作製のためにベクターにクローン化してもよい。そのようなベクターは当技術分野において既知であり、市販されており、Ｔ７、Ｔ３又はＳＰ６などの適切なＲＮＡポリメラーゼと標識ヌクレオチドの添加によってインビトロでＲＮＡプローブを合成するために使用しうる。これらの手順は、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｗｉｓ．）及びＵＳ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌによって提供されるような様々な市販のキットを用いて実施しうる。検出を容易にするために使用しうる適切なレポーター分子又は標識は、放射性核種、酵素、蛍光、化学発光又は色素形成物質、ならびに基質、補因子、阻害因子、磁気ビーズ等を包含する。
【０１９３】
トランスフェクトした宿主細胞は数多くの方法で特定できる。例えば、異種核酸分子、例えば配列番号２のアミノ酸又はその部分をコードするＤＮＡ分子の存在を、中等度にストリンジェントな条件下で該異種ＤＮＡ配列の部分と複合体（雑種）を形成するために、該異種ＤＮＡのヌクレオチド配列の部分に十分に相補的な標識オリゴヌクレオチドプローブを導入することによって判定しうる。トランスフェクト細胞の特定は、雑種／複合体の特定によって達成される。
【０１９４】
ＩＩＩ．実質的に純粋なＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質／ポリペプチド及び抗体
本発明の１つの局面は、実質的に純粋なＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質及びその生物活性フラグメント、ならびに抗ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ抗体を惹起するための免疫原としての使用に適するポリペプチドフラグメントに関する。
【０１９５】
「抗ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ」抗体は、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ遺伝子によってコードされるポリペプチド、そのｃＤＮＡ又はサブ配列に特異的に結合する抗体又は抗体フラグメントである。
【０１９６】
本発明のＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質は、ここでは、天然に生じるポリペプチド、例えば野生型ＨｓＣＥＮＰ−Ｅの少なくとも１つの生物学的性質（下記で定義する）を有するポリペプチド配列と定義される。この定義は、天然ＣＥＮＰ−Ｅソースから単離されるポリペプチドだけでなく、組換え又は合成法によって作製されるポリペプチドも包含する。また、その機能的誘導体、対立遺伝子、アイソフォーム及び類似体を含む変異形態も包含する。
【０１９７】
１つの局面では、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅは、下記の機能的及び構造的特徴の少なくとも１つ又は好ましくは２つ以上を有することによって定義される。機能的には、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅは、微小管刺激性ＡＴＰアーゼ活性及びＡＴＰ依存性の微小管モーター活性を有する。ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ活性はまた、微小管に結合するその能力によって表わすこともできる。同様に、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅは、天然ＣＥＮＰ−Ｅのモータードメイン、尾部ドメイン又は他のフラグメントに対して産生されるポリクローナル抗体に結合するその能力によって定義できる。
【０１９８】
もう１つの局面では、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列又はそのフラグメント、より特定すると配列番号２のアミノ酸配列のモータードメイン又はそのフラグメントを含む実質的に純粋なポリペプチドを取り扱う。
【０１９９】
１つの実施形態では、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質は、標準タンパク質精製手法を用いて適切な精製スキームによって細胞又は組織ソースから単離することができる。もう１つの実施形態では、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質は組換えＤＮＡ手法によって生産される。組換え発現の代りに、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質又はポリペプチドは、標準ペプチド合成手法を用いて化学合成することができる。
【０２００】
「単離」又は「精製」タンパク質又はその生物活性フラグメントは、該ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質が由来する細胞又は組織ソースからの細胞物質又は他の汚染タンパク質を実質的に含まない、あるいは化学合成するときには化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない。「細胞物質を実質的に含まない」との語法は、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質が単離される又は組換え生産される細胞の細胞成分から分離されている、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の試料を包含する。従って、ポリペプチド又はタンパク質の修飾因子としてここで用いる「単離」及び／又は「精製」の語の使用は、そのように称されるポリペプチド又はタンパク質が人の手によってそのような形態で生産されたこと、及びそれ故、それらの天然のインビボ細胞環境から切り離されていることを意味する。その結果として、本発明の組換えポリペプチド及びタンパク質は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド又はタンパク質が、それらが天然で生じるときには有用でない、ここで述べる方法において有用である。
【０２０１】
ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の「生物活性フラグメント」は、天然に生じる成熟完全長ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ配列の部分又は１個又はそれ以上のアミノ酸残基が欠失している配列番号２のタンパク質である。それ自体で、フラグメントは、完全長ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質より少ないアミノ酸を含み、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の少なくとも１つの活性を示す、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質のアミノ酸配列に十分に同一であるか又はそれから誘導されるアミノ酸配列、例えば配列番号２に示すアミノ酸配列を含むペプチドを包含する。アミノ酸残基の欠失は、Ｎ末端又はＣ末端又は内部を含む、ポリペプチドのいずれの場所で起こってもよい。典型的には、生物活性フラグメントは、ヒト又は野生型ＨｓＣＥＮＰ−Ｅと共通する少なくとも１つの生物学的性質、例えばＡＴＰ結合ドメイン等を有する。ＨｓＣＥＮＰ−Ｅフラグメントは、典型的には、哺乳類から単離されたＨｓＣＥＮＰ−Ｅの配列と同一である少なくとも１０、１５、２０、２５、３０又は４０アミノ酸残基の連続配列を有する。それ故、「ＨｓＣＥＮＰ−Ｅフラグメント」は、１個又はそれ以上のアミノ酸残基又は糖鎖単位の欠失を有する、天然に生じる成熟完全長ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ配列の部分である。
【０２０２】
１つの実施形態では、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の生物活性フラグメント（配列番号２の本発明のタンパク質）は、少なくとも１つのＡＴＰ結合ドメインを含む。もう１つの実施形態では、本発明のＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の生物活性フラグメントは、少なくとも１つのモータードメインを含む。
【０２０３】
好ましいフラグメントは、アミノ末端を含む連続的な一連の残基の欠失、又はカルボキシ末端を含む連続的な一連の残基の欠失、又は１つがアミノ末端を含み、もう１つがカルボキシ末端を含む２つの連続的なシリーズの残基の欠失を除いて、ここで開示するＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質のアミノ酸配列を有するトランケーションポリペプチドを包含する。好ましい生物活性フラグメントがＡＴＰ結合ドメイン及びモータードメインを含むことは明白である。該タンパク質の他の領域が欠失している他の生物活性フラグメントは、組換え手法によって作製することができ、天然ＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の機能的活性の１つ又はそれ以上に関して評価することができる。
【０２０４】
もう１つの実施形態では、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質は配列番号２に示すアミノ酸配列を有する。
【０２０５】
本発明はまた、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の変異体を包含する。ここで使用するとき、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の「変異体」は、本発明のタンパク質の配列と比較して１又はそれ以上のアミノ酸置換、挿入及び／又は欠失を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。一般に、相違は、標準（本発明のタンパク質）配列と変異体の配列が全体的として緊密に類似し、多くの領域において同一であるように制限される。そのような変異体は一般に生物活性であり、必ず対象ポリペプチドと１００％未満の配列同一性を有する。
【０２０６】
本発明のもう１つの局面は、配列番号２のアミノ酸配列と十分に同一であるアミノ酸配列を有する、又は配列番号１と十分に同一であるヌクレオチド配列によってコードされるＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質を提示する。
【０２０７】
ここで使用するとき、「十分に同一」とは、第一と第二のアミノ酸又はヌクレオチド配列が共通の構造ドメイン又はモチーフ及び／又は共通の機能的活性を共有するように、第二アミノ酸又はヌクレオチド配列と十分な又は最小限の数の同一又は等価（例えば類似側鎖を有するアミノ酸残基）アミノ酸残基又はヌクレオチドを含む第一アミノ酸又はヌクレオチド配列を指す。例えば、共通の構造ドメイン又は生物学的機能を共有するアミノ酸又はヌクレオチド配列は、該ドメインのアミノ酸配列を越えて又は該ポリペプチド又はポリヌクレオチドの長さ全体にわたって少なくとも７０−８０％、さらに一層好ましくは９０−９５％の同一性を有し、ここで十分に同一であると定義される少なくとも１つ、好ましくは２つの構造ドメインを含む。
【０２０８】
アミノ酸置換は、好ましくは単一アミノ酸残基の置換である。好ましい変異体は、保存的アミノ酸置換、すなわち１個の残基が同様の特徴を有するもう１つ別の残基で置換されているものによって標準から変化しているものである。典型的なそのような置換は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅの中で；Ｓｅｒ及びＴｈｒの中で；酸性残基Ａｓｐ及びＧｌｕ；Ａｓｎ及びＧｌｎの中で；及び塩基性残基Ｌｙｓ及びＡｒｇの中で；又は芳香族残基Ｐｈｅ及びＴｙｒの中での置換である。特に好ましいのは、数個、５−１０個、１−５個又は１−２個のアミノ酸が何らかの組合せで置換、欠失又は付加されている変異体である。
【０２０９】
上記によれば、好ましいタンパク質は、少なくとも１つのＡＴＰ結合ドメイン及び好ましくは少なくとも１つの他のＨｓＣＥＮＰ−Ｅ活性を有するＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質である。他の好ましいタンパク質は、少なくとも１つのＡＴＰ結合ドメインを有するＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質であり、該タンパク質は、好ましくはストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる。
【０２１０】
他の実施形態では、該ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質は配列番号２に実質的に相同であり、配列番号２のタンパク質の機能的活性を保持するが、ここで述べるような天然の対立遺伝子変異又は突然変異誘発のためにアミノ酸配列が異なる。
【０２１１】
配列番号２のポリペプチドに少なくとも８０％の同一性を有する、より好ましくは配列番号２に少なくとも８５％の同一性、さらに好ましくは少なくとも９０％の同一性、さらに一層好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するＨｓＣＥＮＰ−Ｅの変異体も本発明に包含される。好ましくは、これらのポリペプチドはすべて、抗原性を含む、ここで開示するタンパク質（配列番号２）の生物活性を保持する。
【０２１２】
他の実施形態では、該ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質は配列番号２に実質的に相同であり、配列番号２のタンパク質の機能的活性を保持するが、ここで述べるような天然の対立遺伝子変異又は突然変異誘発のためにアミノ酸配列が異なる。
【０２１３】
２個のアミノ酸配列又は２個の核酸配列のパーセント同一性を決定するには、それらの配列を最適比較のために整列する（例えば、最適整列のために第一と第二のアミノ酸又は核酸配列の一方又は両方にギャップを導入することができ、及び比較目的では非相同配列を無視することができる）。好ましい実施形態では、比較のために整列する標準配列の長さは、標準配列の長さの少なくとも７０％、又は８０％、又は９０％である。次に、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置のアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第一配列内の１つの位置が第二配列内の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドで占められているとき、それらの分子はその位置において同一である（ここで使用するときアミノ酸又は核酸の「同一性」はアミノ酸又は核酸の「相同性」と等価である）。２つの配列間のパーセント同一性は、２つの配列の最適整列のために導入する必要のある、ギャップの数及び各々のギャップの長さを考慮に入れた、それらの配列によって共有される同一位置の数の関数である。
【０２１４】
２つの配列の間での配列の比較及びパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて実施できる。好ましい実施形態では、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、Ｂｌｏｓｕｍ  ６２行列又はＰＡＭ２５０行列、及びギャップの重み１６、１４、１２、１０、８、６又は４及び長さの重み１、２、３、４、５又は６を用いて、ＧＣＧソフトウエアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍにおいて入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４−４５３（１９７０））のアルゴリズムを使用して決定される。さらにもう１つの好ましい実施形態では、２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＮＥＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰ行列及びギャップの重み４０、５０、６０、７０又は８０及び長さの重み１、２、３、４、５又は６を用いて、ＧＣＧソフトウエアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍにおいて入手可能）のＧＡＰプログラムを使用して決定される。
【０２１５】
もう１つの実施形態では、２つのアミノ酸又はヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＰＡＭ１２０重量残基表（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、ギャップ長ペナルティー１２及びギャップペナルティー４を用いて、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたＥ．ＭｅｙｅｒｓとＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７（１９８９））のアルゴリズムを使用して決定される。
【０２１６】
本発明の核酸及びタンパク質配列はさらに、例えば他のファミリー成員又は関連配列を特定するために、公的データベースに対する検索を実施するための「問い合わせ配列」として使用することができる。そのような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて実施できる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明のＨｓＣＥＮＰ−Ｅ核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で実施することができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で実施することができる。比較のためのギャップを考慮した整列を得るには、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２に述べられているようにＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴが利用できる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用するときには、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ（例えばＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）が使用できる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．参照。
【０２１７】
本発明はまた、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅキメラ又は融合タンパク質を提供する。ここで使用するとき、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ「キメラタンパク質」又は「融合タンパク質」は、非ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質に作動可能に連結されたＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質を包含する。「ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質」は上記のように定義され、一方「非ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質」は、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質と実質的に相同でないタンパク質、例えばＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質とは異なり、及び同じか又は異なる生物に由来するタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ融合タンパク質においては、該ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質はＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の全部又は一部に対応しうる。
【０２１８】
好ましい実施形態では、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ融合タンパク質は、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の少なくとも１つの生物活性部分を含む。もう１つの好ましい実施形態では、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ融合タンパク質は、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の少なくとも２つの生物活性部分を含む。
【０２１９】
該融合タンパク質において、「作動可能に連結された」の語は、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質と非ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質が互いにインフレーム融合していることを示すことが意図されている。該非ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質は該ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質のＮ末端又はＣ末端に融合しうる。
【０２２０】
もう１つの実施形態では、該融合タンパク質は、そのＮ末端に異種シグナル配列を含むＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質である。一部の宿主細胞（例えば哺乳類宿主細胞）では、異種シグナル配列の使用を通してＨｓＣＥＮＰ−Ｅの発現及び／又は分泌を高めることができる。
【０２２１】
ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ融合タンパク質の使用は、癌などのＨｓＣＥＮＰ−Ｅ関連疾患の治療のために治療上有用でありうる。
【０２２２】
さらに、本発明のＨｓＣＥＮＰ−Ｅ融合タンパク質は、被験者において抗ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ抗体を生産するための免疫原として、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅリガンドを精製するため、及びＨｓＣＥＮＰ−ＥとＨｓＣＥＮＰ−Ｅ結合パートナー又は基質との相互作用を阻害する分子を測定するためのスクリーニングアッセイにおいて使用することができる。
【０２２３】
好ましくは、本発明のＨｓＣＥＮＰ−Ｅキメラ又は融合タンパク質は標準組換えＤＮＡ手法によって生産される。１つのそのような手法は、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ａｕｓｕｂｅｌら編集、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９２）に述べられている。
【０２２４】
本発明はまた、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅアゴニスト（ミメティック）又はＨｓＣＥＮＰ−Ｅアンタゴニストとして機能する、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の変異体に関する。ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の変異体は、突然変異誘発、例えば不連続な点突然変異又はＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質のトランケーションによって作製することができる。
【０２２５】
ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質のアゴニストは、天然に生じる形態のＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質と実質的に同じ生物活性を保持するか又は生物活性のサブセットを保持しうる。ＨｓＣＥＮＰ−Ｅアンタゴニストは、天然に生じる形態のＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の活性の１つ又はそれ以上を阻害することができる。
【０２２６】
上記をさらに進めて、本発明の１つの実施形態は、天然に生じる形態の該タンパク質の生物活性のサブセットを有し、及び天然に生じる形態のＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質による治療に比べて被験者における副作用がより少ない変異体ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質で被験者を治療することを考慮する。
【０２２７】
ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ変異体の多様化ライブラリー（ｖａｒｉｅｇａｔｅｄ  ｌｉｂｒａｒｙ）は、核酸レベルでのコンビナトリアル突然変異誘発によって作製され、多様化遺伝子ライブラリーによってコードされる。ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ変異体の多様化ライブラリーは、例えば、潜在的ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ配列の縮重セットが、個々のポリペプチドとして、あるいはその中にＨｓＣＥＮＰ−Ｅ配列のセットを含むより大きな融合タンパク質のセットとして（例えばファージディスプレイのための）発現されうるように、合成ポリヌクレオチドの混合物を遺伝子配列内に酵素的に連結することによって作製することができる。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ変異体のライブラリーを作製するために使用できる様々な方法が存在する。縮重ポリヌクレオチドを合成するための方法は当技術分野において既知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ，Ｓ．Ａ．（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６；Ｉｋｅら（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１１：４７７参照）。
【０２２８】
さらに、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質コード配列のフラグメントのライブラリーを使用して、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の変異体のスクリーニング及びその後の選択のためのＨｓＣＥＮＰ−Ｅフラグメントの多様化個体群を生成することができる。
【０２２９】
例えば、コード配列フラグメントのライブラリーは、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅコード配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントを、ニッキングが１分子に付き約１回だけ起こる条件下でヌクレアーゼによって処理し、二本鎖ＤＮＡを変性して、異なるニッキング産物からのセンス／アンチセンス対を含みうる二本鎖ＤＮＡを形成するように該ＤＮＡを復元再生し、Ｓ１ヌクレアーゼでの処理によって再形成された二本鎖から一本鎖部分を除去して、生じたフラグメントライブラリーを発現ベクターに連結することによって作製することができる。この方法により、様々な大きさのＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質のＮ末端、Ｃ末端及び内部フラグメントをコードする発現ライブラリーを誘導することができる。
【０２３０】
点突然変異又はトランケーションによって作製したコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、及び選択特性を有する遺伝子産物に関してｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのいくつかの手法が当技術分野において知られている。そのような手法は、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質のコンビナトリアル突然変異誘発によって作製した遺伝子ライブラリーの高速スクリーニングに適合させうる。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための、ハイスループット分析に適合させやすい、最も広く使用されている手法は、典型的には、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローン化すること、生じたベクターのライブラリーで適切な細胞を形質転換すること、及び所望活性の検出が、その産物を検出すべき遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件下でコンビナトリアル遺伝子を発現させることを含む。ライブラリーにおける突然変異体の発生率を高める新しい手法、リクルーシブ・アンサンブル突然変異誘発（ｒｅｃｒｕｓｉｖｅ  ｅｎｓｅｍｂｌｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，ＲＥＭ）は、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ変異体を特定するためのスクリーニングアッセイと組み合わせて使用することができる（ＡｒｋｉｎとＹｏｕｒｖａｎ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７８１１−７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅら（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６（３）：３２７−３３１）。米国特許願公開第２００２／０００６６６４Ａ１（「逆トランスフェクション」）も参照のこと。あるいは、各々が又はその集合が様々なＨｓＣＥＮＰ−Ｅ突然変異体をコードする、複数の核酸分子を使用して、Ｍｅｒｃｋ  ＆  ＣＯ．，Ｉｎｃに譲渡された、２００２年４月１６日出願、番号不明の特許仮出願に開示されているＭＡＧＥＣ法に従って複数の細胞をトランスフェクトすることができる。
【０２３１】
代表的実施形態では、多様化ＨｓＣＥＮＰ−Ｅライブラリーを分析するために細胞ベースのアッセイを利用することができる。例えば、発現ベクターのライブラリーを、通常ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ仲介活性を有する細胞系統にトランスフェクトすることができる。次に、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ仲介活性へのＨｓＣＥＮＰ−Ｅ突然変異体の作用、例えば細胞増殖を、多くの慣例的アッセイのいずれかによって検出することができる。その後細胞からプラスミドＤＮＡを回収して、阻害に関して評価し、個々のクローンをさらに特徴付けることができる。
【０２３２】
もう１つの局面では、本発明の実質的に純粋なＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質（配列番号２）又はそのフラグメントを、ポリクローナル及びモノクローナル抗体作製のための標準手法を用いてＨｓＣＥＮＰ−Ｅに結合する抗体を生成するための免疫原として使用することができる。完全長ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質が使用でき、あるいは本発明は、免疫原として使用するためのＨｓＣＥＮＰ−Ｅの抗原性ペプチドフラグメントを提供する。
【０２３３】
ここで開示するＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の抗原性ペプチドフラグメントは、配列番号２に示すアミノ酸配列の少なくとも８アミノ酸残基を含み、及び該ペプチドに対して惹起した抗体がＨｓＣＥＮＰ−Ｅと特異的免疫複合体を形成するようにＨｓＣＥＮＰ−Ｅのエピトープを含む。好ましくは、該抗原性ペプチドは、少なくとも１０アミノ酸残基、より好ましくは少なくとも１５アミノ酸残基、さらに一層好ましくは少なくとも２０アミノ酸残基、最も好ましくは少なくとも３０アミノ酸残基を含む。
【０２３４】
該抗原性ペプチドに含まれる好ましいエピトープは、該タンパク質の表面に位置するＨｓＣＥＮＰ−Ｅの領域、例えば親水性領域、ならびに高い抗原性を有する領域である。
【０２３５】
従って、本発明の１つの局面は抗ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ抗体に関する。「抗体」の語は最も広い意味で使用され、特に単一モノクローナル抗体（アゴニスト及びアンタゴニスト抗体を含む）及びポリエピトープ特異性を有する抗体組成物をカバーする。一般に、この語は、免疫グロブリン分子、及び抗原として活性な又は免疫学的に活性な免疫グロブリン分子のフラグメント、すなわちＨｓＣＥＮＰ−Ｅなどの抗原に特異的に結合する（抗原と免疫反応する）抗原結合部位を含む分子を指す。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性なフラグメントの代表的な例は、抗体をペプシンなどの酵素で処理することによって作製できるＦ（ａｂ）及びＦ（ａｂ’）２フラグメントを包含する。
【０２３６】
抗体を作製する方法は周知である。ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒトその他を含む様々な宿主を、抗体を産生するためにＨｓＣＥＮＰ−Ｅ又はその「免疫学的に活性なフラグメント」で注射することによって免疫しうる。ＨｓＣＥＮＰ−Ｅの「免疫学的に活性なフラグメント」とは、免疫応答を誘発することができ、また本発明のＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質に免疫特異的な抗体を産生するための免疫原としても使用できるフラグメントを指す。そのようなフラグメントは、標的免疫系（例えばマウス又はウサギ）においてＨｓＣＥＮＰ−Ｅ特異的抗体を惹起することができる又はＨｓＣＥＮＰ−Ｅ特異的抗体への結合に関して天然ＣＥＮＰ−Ｅと競合することができるタンパク質であり、それ故生物学的試料におけるＨｓＣＥＮＰ−Ｅペプチドの存在についての免疫測定法において有用である。そのような免疫学的に活性なフラグメントは、典型的には８−１１個の連続アミノ酸の最小サイズを有する。同様に、免疫学的に活性なフラグメントは、天然ヒトＣＥＮＰ−Ｅタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であること及び天然に生じる低分子のアミノ酸配列全体を含むことが好ましい。あるいは、短い長さのＨｓＣＥＮＰ−Ｅアミノ酸をもう１つ別のタンパク質に融合してキメラ成分を形成してもよく、その後該キメラ成分に対する抗体を作製しうる。
【０２３７】
宿主の種に依存して、免疫応答を高めるために様々なアジュバントを使用しうる。そのようなアジュバントは、フロイント、水酸化アルミニウムなどの無機物ゲル、及びリソレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、ＫＬＨ及びジニトロフェノールなどの表面活性物質を含むが、これらに限定されない。ヒトにおいて使用しうるアジュバントの中で、ＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌）及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍが特に好ましい。
【０２３８】
適切な免疫原性製剤は、例えば、組換え発現ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質又は化学合成ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質を含みうる。該製剤は、フロイント完全又は不完全アジュバント、又は同様の免疫刺激性物質をさらに含みうる。免疫原性ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ製剤による適切な被験者の免疫は、ポリクローナル抗ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ抗体応答を誘導する。
【０２３９】
ポリクローナル抗ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ抗体は、適切な被験者をＨｓＣＥＮＰ−Ｅ免疫原で免疫することによって上述したように作製できる。免疫後適切な時点で、例えば抗ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ抗体力価が最も高いときに、該被験者から抗体産生細胞を入手し、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７によって最初に記述されたハイブリドーマ手法（Ｂｒｏｗｎら（１９８１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７：５３９−４６；Ｂｒｏｗｎら（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：４９８０−８３；Ｙｅｈら（１９７６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：２９２７−３１；及びＹｅｈら（１９８２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２９：２６９−７５も参照のこと）、より最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ手法（Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ手法（Ｃｏｌｅら（１９８５），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐ．７７−９６）又はトリオーマ手法などの標準手法によってモノクローナル抗体を作製するために使用できる。一般的な手法は、不朽化細胞系（典型的には骨髄腫）を、上述したようにＨｓＣＥＮＰ−Ｅ免疫原で免疫した哺乳類からのリンパ球（典型的には脾細胞）に融合すること、次に、生じたハイブリドーマ細胞の培養上清をスクリーニングして、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを特定することを含む。
【０２４０】
ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ抗原に対するヒトモノクローナル抗体の作製は従来の手法では困難な場合があるので、その重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種に由来する又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体中の対応配列に同一であるか又は相同であり、一方、鎖の残りの部分はもう１つ別の種に由来する又はもう１つ別の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体中の対応配列に同一であるか又は相同である「キメラ抗体」、ならびに、それらが所望生物活性を示す限り、そのような抗体のフラグメントを創造することが望ましいと考えられる（Ｃａｂｉｌｌｙら、前出；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５，１９８４）。一般に、マウス抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子にスプライシングして、適切な抗原特異性と生物活性を有する分子を得る。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８；及びＴａｋｅｄａ，Ｓ．ら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２−４５４参照。
【０２４１】
他の「キメラ」抗体は、由来種又は免疫グロブリンのクラス又はサブクラスの指定に関わりなく、抗ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ抗体の可変（超可変を含む）ドメインを定常ドメイン（例えば「ヒト化」抗体）でスプライシングするか、又は軽鎖を重鎖で、又は１つの種からの鎖をもう１つ別の種からの鎖で、又は融合物を異種タンパク質でスプライシングすることによって作製される雑種及び組換え抗体、ならびに、それらが所望生物活性を示す限り、抗体フラグメント（例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ）を包含する。例えば、Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍａｇｅ  ＆  Ｌａｍｏｙｉ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓより、ｐ．７９−９７（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）参照。
【０２４２】
ヒト及び非ヒト部分の両方を含む、ヒト化モノクローナル抗体も本発明に包含される。そのようなキメラ及びヒト化モノクローナル抗体は、当技術分野において既知の組換えＤＮＡ手法によって、例えばＲｏｂｉｎｓｏｎら、国際公開公報第ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９号；Ａｋｉｒａら、欧州特許願第１８４，１８７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．，欧州特許願第１７１，４９６号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、欧州特許願第１７３，４９４号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＰＣＴ国際公開公報第ＷＯ８６／０１５３３号；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙら、欧州特許願第１２５，０２３号；Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３；Ｌｉｕら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：３４３９−３４４３；Ｌｉｕら（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−３５２６；Ｓｕｎら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：２１４−２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら（１９８７）Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４４６−４４９；及びＳｈａｗら（１９８８）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−１５５９；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２−１２０７；Ｏｉら（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４；Ｗｉｎｔｅｒ，米国特許第５，２２５，５３９号；Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５５２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４；及びＢｅｉｄｌｅｒら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０に述べられている方法を用いて生産することができる。
【０２４３】
ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ特異的一本鎖抗体を有効に生産する、一本鎖抗体の生産のための手法も、当技術分野で既知の方法を用いて適合させうる。関連する特異性を有するが、異なるイディオタイプ組成物である抗体も、ランダムなコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーから鎖のシャフリングによって作製することができる（例えば、Ｂｕｒｔｏｎ  Ｄ．Ｒ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１０１３４−１０１３７参照）。
【０２４４】
従来の免疫測定法を用いて所望特異性を有する抗体を特定しうる。そのようなプロトコールは、各々が参照してここに組み込まれる、米国特許第４，６４２，２８５号；同第４，３７６，１１０号；同第４，０１６，０４３号；同第３，８７９，２６２号；同第３，８５２，１５７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，８３９，１５３号；同第３，７９１，９３２号；及びＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８８）に述べられているものを含むが、これらに限定されない。
【０２４５】
試料中のＨｓＣＥＮＰ−Ｅのインビトロ検出のために有用な免疫学的手順は周知である。実際に、確立された特異性を有するポリクローナル又はモノクローナル抗体を使用した競合結合又は放射免疫測定法についての数多くのプロトコールが当業者に既知である。そのような免疫測定法は、例えば、当技術分野において周知である、ＥＬＩＳＡ、Ｐａｎｄｅｘ微小蛍光測定法、凝集反応アッセイ、フローサイトメトリー、血清診断アッセイ及び免疫組織化学染色法を包含する。典型的な免疫測定法は、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅとその特異的抗体の間の複合体形成の測定を含む。２個の非干渉性ＨｓＣＥＮＰ−Ｅエピトープに反応性のモノクローナル抗体を使用する、２サイト・モノクローナルベースの免疫測定法が好ましいが、競合結合測定法も使用しうる。
【０２４６】
抗体は、当技術分野で周知の様々な手段によって検出可能にすることができる。例えば、検出可能なマーカーを直接又は間接的に抗体に結合することができる。有用なマーカーは、例えば、放射性核種、酵素、蛍光物質、色素形成物質及び化学発光標識を包含する。
【０２４７】
ＨｓＣＥＮＰ−Ｅに対する抗体の親和性を評価するための方法も周知である。例えば、放射免疫測定法と組み合わせたＳｃａｔｃｈａｒｄ分析を使用して、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅに対する抗体の親和性を評価しうる。親和性は、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ−抗体複合体のモル濃度を平衡条件下での遊離抗原と遊離抗体のモル濃度で除したものと定義される、会合定数Ｋａとして表わされる。多数のＨｓＣＥＮＰ−Ｅエピトープに対する親和性において不均質な、ポリクローナル抗体の試料について決定したＫａは、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅに対する抗体の平均親和性又はアビディティーを表わす。特定ＨｓＣＥＮＰ−Ｅエピトープに関して単一特異性である、モノクローナル抗体の試料について決定したＫａは、親和性の正確な測定値を表わす。ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ−抗体複合体が厳格な操作に耐えなければならない免疫測定法における使用のためには、約１０９−１０１２ｌ／モルの範囲のＫａを有する高親和性抗体試料が好ましい。最終的に抗体からのＨｓＣＥＮＰ−Ｅの解離、好ましくは活性形態のＨｓＣＥＮＰ−Ｅの解離を必要とする免疫精製及び類似の手順における使用のためには、約１０６−１０７ｌ／モルの範囲のＫａを有する低親和性抗体試料が好ましい（Ｃａｔｔｙ，Ｄ。（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，第Ｉ巻：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．；Ｌｉｄｄｅｌｌ，Ｊ．Ｅ．とＣｒｙｅｒ，Ａ．（１９９１）Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｊｏｈｎｅ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｎ．Ｙ．）。
【０２４８】
ファージディスプレイライブラリーを作製し、スクリーニングするためのキットは市販されている（例えば、ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ，カタログ番号２７−９４００−０１；及びｔｈｅ  Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＳｕｒｆＺＡＰ，ＴＭ．Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｋｉｔ，カタログ番号２４０６１２）。Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第５，２２３，４０９号；Ｋａｎｇら、ＰＣＴ国際公開公報第ＷＯ９２／１８６１９号；Ｄｏｗｅｒら、ＰＣＴ国際公開公報第ＷＯ９２／２０７９１号；Ｍａｒｋｌａｎｄら、ＰＣＴ国際公開公報第ＷＯ９２／１５６７９号；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら、ＰＣＴ国際公開公報第ＷＯ９３／０１２８８号；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、ＰＣＴ国際公開公報第ＷＯ９２／０１０４７号；Ｇａｒｒａｒｄら、ＰＣＴ国際公開公報第ＷＯ９２／０９６９０号；Ｌａｎｄｅｒら、ＰＣＴ国際公開公報第ＷＯ９０／０２８０９号；Ｆｕｃｈｓら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙら（１９９２）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５；Ｈｕｓｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：７２５−７３４；Ｈａｗｋｉｎｓら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６；Ｃｌａｒｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８；Ｇｒａｍら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：３５７６−３５８０；Ｇａｒｒａｄら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７３−１３７７；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：４１３３−４１３７；Ｂａｒｂａｓら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：７９７８−７９８２；及びＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：５５２−５５４も参照のこと。
【０２４９】
ＩＶ．本発明の使用及び方法
ここで述べる核酸分子、タンパク質、タンパク質相同体及び抗体は、次の方法：ａ）スクリーニングアッセイ；ｂ）予測医学、例えば診断アッセイ及び薬理遺伝学；及びｃ）癌を含む過度の細胞増殖を特徴とする疾患の治療方法、の１つ又はそれ以上において使用することができる。
【０２５０】
主として、本発明のポリペプチドは、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ又はそのフラグメントの活性又は発現を調節する薬剤又は化合物をスクリーニングするため、ならびにＨｓＣＥＮＰ−Ｅの過度の産生又は野生型タンパク質と比較して高い又は異常な活性を有する形態のＨｓＣＥＮＰ−Ｅの産生をスクリーニングするために使用できる。ここで開示する核酸分子又はそれらに由来する配列は、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ仲介性疾患を治療するため、ヒトＣＥＮＰ−ＥをコードするｍＲＮＡ又はＨｓＣＥＮＰ−Ｅをコードする遺伝子における突然変異を検出するために遺伝子治療において使用することができる。
【０２５１】
Ａ．スクリーニングアッセイ
１つの局面では、本発明は、調節因子、すなわち、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質に結合し、例えばＨｓＣＥＮＰ−Ｅの発現又は活性に阻害作用を及ぼす候補又は試験化合物又は作用物質（例えばペプチド、ペプチドミメティック、低分子又は他の薬剤）を特定するためのスクリーニングアッセイを提供する。
【０２５２】
一般に、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ（標的タンパク質）の調節因子に関して試験するために使用できるアッセイは、様々なインビトロ又はインビボアッセイ、例えば微小管滑走アッセイ、微小管結合アッセイなどの結合アッセイ、微小管解重合アッセイ及びＡＴＰアーゼアッセイを包含する（Ｋｏｄａｍａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９９：１４６５−１４７２（１９８６）；Ｓｔｅｗａｒｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５２０９−５２１３（１９９３）；Ｌｏｍｂｉｌｌｏら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２８：１０７−１１５（１９９５）；Ｖａｌｅら、Ｃｅｌｌ  ４２：３９−５０（１９８５））。
【０２５３】
上記に従って、本発明の１つの実施形態は、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ活性を有するＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質を含むインジケーター組成物を提供すること、該インジケーター組成物を被験化合物と接触させること、及び該インジケーター組成物におけるＨｓＣＥＮＰ−Ｅ活性への被験化合物の作用を測定して、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の活性を調節する化合物を特定することにより、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質に結合する又はＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の活性を調節する化合物を特定するための方法を提供する。
【０２５４】
さらにもう１つの局面では、本発明は、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質又はその生物活性部分を被験化合物と接触させること、及び該被験化合物がＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質又はその生物活性部分に結合する能力を測定することを含む、潜在的ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ調節因子を特定するための無細胞アッセイを提供する。ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質への被験化合物の結合は、既知の方法によって直接又は間接的に測定できる。
【０２５５】
もう１つの局面では、本発明は、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質又はその生物活性部分を該ポリペプチドに結合する既知の化合物と接触させてアッセイ混合物を形成すること、そのアッセイ混合物を被験化合物に接触させること、及び該被験化合物がＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質と相互作用する能力を測定することを提供し、その場合、該被験化合物がＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質と相互作用する能力を測定することは、該被験化合物が、上記の既知の化合物と比較して、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質又はその生物活性部分に選択的に結合する能力を測定することを含む。
【０２５６】
あるいは、化合物が標的タンパク質、例えばＨｓＣＥＮＰ−Ｅの活性を調節する能力は、該標的タンパク質の活性を調節することができる候補物質をスクリーニングすることによって試験される。アッセイ様式の一例は、標的タンパク質と候補物質を混合すること及び該標的タンパク質の生物活性の変化を測定することの段階を含む。この実施形態によれば、該候補物質は該標的タンパク質に結合する可能性があり、その結果として、その生物活性又は生化学的活性を変化させうる。該方法は、インビトロスクリーニング法、及び細胞周期分布、細胞生存度の変化に関する又は紡錘体の存在、形態、活性、分布又は量に関する細胞のインビボスクリーニングの両方を包含する。
【０２５７】
ここで述べるアッセイにおいて使用するための試験化合物は、生物学的ライブラリー、空間可定位平行固相（ｓｐａｔｉａｌｌｙ  ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ）又は液相ライブラリー；デコンボルーションを必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ・１化合物」ライブラリー法；及びアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法を含む、当技術分野で既知のコンビナトリアルライブラリー法における数多くのアプローチのいずれかを用いて入手できる。生物学的ライブラリーアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、その他の４つのアプローチは化合物のペプチド、非ペプチドオリゴマー又は低分子ライブラリーに適用できる（Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１２：１４５）。
【０２５８】
ＡＤＰを基質として使用する当技術分野で既知の多くの酵素アッセイが存在する。例えば、ピルビン酸キナーゼなどのキナーゼ反応が知られている。Ｎａｔｕｒｅ  ７８：６３２（１９５６）及びＭｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６：３１（１９７０）参照。これは、ＡＴＰの再生を可能にするという点で好ましい方法である。
【０２５９】
従って、１つの実施形態では、酵素反応の活性のレベルを直接測定する。あるいは、ＡＤＰを基質として利用する酵素反応の活性のレベルを、もう１つ別の反応と共役させることによって間接的に測定する。共役によって酵素反応を測定することは当技術分野において既知である。さらに、リン酸を利用する他のプロトコールも使用できる。例示的な反応は、直接又は間接的に測定できる、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ反応を包含する。
【０２６０】
本発明の１つの例示的実施形態は、例えばＡＤＰ又はリン酸を検出可能な化合物に結合する又は反応させることにより、ＡＤＰ又はリン酸を非酵素的に検出することを提案する。適切な例は、遊離リン酸のリンモリブデン酸複合体への変換を含むリンモリブデン酸ベースのアッセイを包含する。リンモリブデン酸を定量する１つの方法は、マラカイトグリーンを用いる。あるいは、大腸菌リン酸結合タンパク質などのリン酸結合タンパク質の蛍光標識形態を使用して、その蛍光のシフトによってリン酸を測定することができる。
【０２６１】
さらにもう１つの実施形態では、本発明は、候補物質を標的タンパク質、例えばＨｓＣＥＮＰ−Ｅの活性の調節因子として特定する方法を提供する。該方法は、通常ＡＤＰ又はリン酸の生産を可能にする条件下で、ＡＤＰ又はリン酸を直接又は間接的に生産する標的タンパク質を含む混合物に候補物質を添加することを含む。該方法はさらに、該混合物を、通常ＡＤＰ又はリン酸が利用されるのを可能にする条件下で上記ＡＤＰ又はリン酸を基質として利用する反応に供すること、及びＡＤＰ又はリン酸の濃度の測定として該反応の活性のレベルを測定することを含む。候補物質の存在下と不在下でのレベルの変化は、標的タンパク質の調節因子を指示する。標的タンパク質とは、選択ポリペプチド、例えばＨｓＣＥＮＰ−Ｅが本来結合する又は相互作用する分子を指す。一部の場合、標的タンパク質はＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質でありうる。
【０２６２】
「ＡＤＰ又はリン酸を利用する」の語句は、ＡＤＰ又はリン酸が検出試薬によって直接作用を受けることを意味する。１つの場合には、ＡＤＰが、例えば、加水分解されるか又はリン酸化されうる。もう１つの例として、リン酸がもう１つの化合物に付加されうる。ここで使用するとき、これらの各々の場合において、ＡＤＰ又はリン酸は基質として作用している。
【０２６３】
好ましくは、標的タンパク質は、直接又は間接的にＡＤＰ又はリン酸を生産し、及びモータードメインを含む。より好ましくは、標的タンパク質は上述したようなキネシンスーパーファミリーモータータンパク質を含み、最も好ましくは、標的タンパク質はＨｓＣＥＮＰ−Ｅ又はそのフラグメントを含む。
【０２６４】
もう１つの実施形態では、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の発現の調節因子は、細胞を候補化合物に接触させ、細胞中の選択ｍＲＮＡ又はタンパク質（すなわち、本発明のポリペプチド又は核酸に対応するｍＲＮＡ又はタンパク質）の発現を測定する方法において特定される。候補化合物の存在下での選択ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現のレベルを、候補化合物の不在下での選択ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現のレベルと比較する。次に、この比較に基づいて候補化合物をＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の発現の調節因子として特定することができる。例えば、候補化合物の存在下での選択ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現が候補化合物の不在下よりも高い（統計的に有意に高い）とき、その候補化合物は選択ｍＲＮＡ又はタンパク質発現の刺激因子として特定される。あるいは、候補化合物の存在下での選択ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現が候補化合物の不在下よりも低い（統計的に有意に低い）とき、その候補化合物は選択ｍＲＮＡ又はタンパク質発現の阻害因子として特定される。細胞における選択ｍＲＮＡ又はタンパク質発現のレベルは、ここで述べる方法によって測定することができる。
【０２６５】
上記で述べたように特定した化合物（物質）を適切な動物モデルにおいてさらに使用することも本発明の範囲内である。例えば、ここで述べたように特定した物質（例えばＨｓＣＥＮＰ−Ｅ調節物質、アンチセンスＨｓＣＥＮＰ−Ｅ核酸分子、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ特異的抗体又はＨｓＣＥＮＰ−Ｅ結合パートナー）は、そのような化合物による治療の効果、毒性又は副作用を調べるために動物モデルにおいて使用することができる。
【０２６６】
代替的実施形態では、本発明によって提供されるスクリーニングアッセイは、その生殖細胞及び体細胞がＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質又はその選択部分−配列番号２をコードするヌクレオチド配列を含むトランスジェニック哺乳類に関する。例えばＨｓＣＥＮＰ−Ｅをコードする配列を非ヒト哺乳類胚に導入しうるいくつかの手段が存在し、その一部は、例えば、参照してここに組み込まれる、米国特許第４，７３６，８６６号、Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１４６８−１４７４（１９８８）及びＷｅｓｔｐｈａｌら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５：１８１−１９６（１９８９）に述べられている。該動物の細胞は、次に、その受容体を発現し、それ故選択アゴニスト又はアンタゴニストを試験する又はスクリーニングするための好都合なモデルとして使用しうる。
【０２６７】
本発明はさらに、上述したスクリーニングアッセイによって特定される新規物質及びここで述べるような治療のためのその使用に関する。
【０２６８】
Ｂ．予測医学
ここで開示するポリヌクレオチド又はポリペプチドはまた、診断アッセイ及び薬理遺伝学におけるツールとして、ならびにＨｓＣＥＮＰ−Ｅ仲介性疾患に罹患した個体を治療するために使用しうる。
【０２６９】
一般に、ここで述べる方法は、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の異常発現又は活性に関連する疾患又は障害を有する又は発症する危険性の高い被験者を特定するための診断又は予後アッセイとして使用できる。例えば、ここで述べるアッセイは、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の異常発現又は活性に関連する障害を有する又は発症する危険性の高い被験者を特定するために使用できる。あるいは、該アッセイは、そのような疾患又は障害を有する又は発症する危険性の高い被験者を特定するために使用できる。
【０２７０】
上記に従って、１つの代表的実施形態は、被験者から被験試料を入手して、本発明のポリペプチド又は核酸（例えばｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出する方法を提供し、その場合、該ポリペプチド又は核酸の存在は、該ポリペプチドの異常発現又は活性に関連する疾患又は障害を有する又は発症する危険性の高い被験者についての診断である。ここで使用するとき、「被験試料」は、対象被験者から得た生物学的試料を指す。例えば、被験試料は生物学的液体（例えば血清）、細胞試料又は組織でありうる。
【０２７１】
これらや他の作用物質を下記の項でさらに詳細に説明する。
【０２７２】
１．診断アッセイ
従って、１つの局面では、本発明は、個体が上記で言及したパラメータの１つ又はそれ以上に関連する疾患又は障害に罹患しているかどうか又は障害を発症する危険性が高いかどうかを判定するために、（ｉ）ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質をコードする遺伝子の異常修飾又は突然変異；（ｉｉ）遺伝子の調節不全；又は（ｉｉｉ）ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の異常翻訳後修飾によって例示される遺伝子変化の存在又は不在を特定するための診断アッセイを提供する。
【０２７３】
例えば、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅをコードする遺伝子内の突然変異を生物学的試料において検定し、その後、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の異常発現又は活性を特徴とする又は関連する障害の発症の前に個体を予防的に治療するための予後又は予測目的に使用することができる。
【０２７４】
本発明の検出方法は、インビトロならびにインビボで生物学的試料中のｍＲＮＡ、タンパク質又はゲノムＤＮＡを検出するために使用できる。
【０２７５】
生物学的試料においてＨｓＣＥＮＰ−Ｅをコードするポリペプチド又は核酸の存在又は不在を検出するための例示的な方法は、被験対象から生物学的試料を得ること、及び生物学的試料においてポリペプチド又は核酸の存在が検出されるように、該生物学的試料中を、ポリペプチド又は核酸（例えばｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出することができる化合物又は物質と接触させることを含む。
【０２７６】
ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質をコードするｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡを検出するための好ましい物質は、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質をコードするｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡにハイブリダイズすることができる標識核酸プローブである。該核酸プローブは、例えば、配列番号１の核酸などの完全長ｃＤＮＡ、又は少なくとも１５、３０、５０、１００、２５０又は５００ヌクレオチドの長さの、中等度にストリンジェントな条件下でＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質をコードするｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドなどの、それらから誘導される部分でありうる。本発明の診断アッセイにおける使用のための他の適切なプローブをここで述べる。一部の実施形態では、ここで述べるポリヌクレオチド配列から誘導されるポリヌクレオチド又はより長いフラグメントは、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ仲介性疾患の存在を検出するための様々な診断アッセイにおいて使用しうる。診断のための核酸は、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅを発現することが知られている体液又は細胞抽出物から入手しうる。
【０２７７】
プローブは、標準方法によって標識し、ハイブリダイゼーション複合体の形成に適した条件下で患者からの体液又は組織試料に添加しうる。適切なインキュベーション期間後、該試料を洗浄し、シグナルを定量して、標準値と比較する。患者試料中のシグナルの量が対照と比較して有意に変化している場合、試料中のＨｓＣＥＮＰ−Ｅをコードするヌクレオチド配列のレベル変化の存在が関連疾患の存在を示す。そのようなアッセイはまた、動物試験、臨床治験において特定治療処置レジメンの効果を評価するため、又は個々の患者の治療を監視するためにも使用しうる。
【０２７８】
１つの局面では、ヒトＣＥＮＰ−Ｅタンパク質又は緊密に関連する分子をコードするゲノム配列を含む、ポリヌクレオチド配列を検出することができるＰＣＲプローブによるハイブリダイゼーションを使用して、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質をコードする核酸配列を特定しうる。プローブの特異性、高度に特異的な領域、例えば５’調節領域から作製されているか又はあまり特異的でない領域、例えば保存されたモチーフから作製されているかどうか、及びハイブリダイゼーション又は増幅のストリンジェンシー（最高、高、中間又は低）が、該プローブがＨｓＣＥＮＰ−Ｅをコードする天然に生じる配列、対立遺伝子変異体又は関連配列だけを特定するかどうかを決定する。
【０２７９】
プローブはまた、関連配列の検出にも使用でき、好ましくはＨｓＣＥＮＰ−Ｅコード配列のいずれかに少なくとも５０％の配列同一性を有するべきである。本発明のハイブリダイゼーションプローブはＤＮＡ又はＲＮＡのいずれでもよく、配列番号１の配列から又はＨｓＣＥＮＰ−Ｅ遺伝子のプロモーター、エンハンサー及びイントロンを含むゲノム配列から誘導されうる。
【０２８０】
ＨｓＣＥＮＰ−ＥをコードするＤＮＡについての特異的ハイブリダイゼーションプローブを作製するための手段は、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ又はＨｓＣＥＮＰ−Ｅ誘導体をコードするポリヌクレオチド配列を、ｍＲＮＡプローブの作製のためのベクターにクローン化することを含む。そのようなベクターは当技術分野において既知であって、市販されており、適切なＲＮＡポリメラーゼと適切な標識ヌクレオチドの添加によってインビトロでＲＮＡプローブを合成するために使用しうる。ハイブリダイゼーションプローブは、様々なレポーター群によって、例えば３２Ｐ又は３５Ｓなどの放射性核種によって、又はアビジン／ビオチン結合系を通してプローブに結合するアルカリホスファターゼなどの酵素標識によって標識しうる。
【０２８１】
ＨｓＣＥＮＰ−Ｅの発現に関連する疾患の診断のための根拠を提供するために、発現についての正常又は標準プロフィールを確立する。これは、動物又はヒトの正常被験者から採取した体液又は細胞抽出物を、ハイブリダイゼーション又は増幅に適した条件下で、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅをコードする配列又はそのフラグメントと混合することによって達成しうる。正常被験者から得た値を、実質的に精製されたポリヌクレオチドの既知量を使用した実験からの値と比較することによって標準ハイブリダイゼーションを数量化しうる。このようにして得た標準値を、疾患に関して症候性である患者の試料から得た値と比較しうる。標準値からの偏差を使用して疾患の存在が確立される。
【０２８２】
上記に対応する一般的な方法は、対照被験者から生物学的試料を得ること、生物学的試料においてＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質又は該タンパク質をコードするｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡの存在が検出されるように、該対照試料を、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質又はＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質をコードするｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡを検出することができる化合物又は物質と接触させること、及び対照試料における該ポリペプチド又はＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質をコードするｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡの存在を、被験試料における該タンパク質又は該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡの存在と比較することを含む。ひとたび疾患の存在が確立され、治療プロトコールが開始されれば、患者における発現のレベルが正常被験者で認められるレベルに近づき始めているかどうかを調べるために定期的なベースでハイブリダイゼーションアッセイを反復しうる。連続的なアッセイから得た結果を使用して、数日間から数ヶ月間にわたる治療の効果を明らかにすることができる。
【０２８３】
配列番号２のアミノ酸配列又はその生物学的に等価の変異体をコードするポリヌクレオチド又はそれらから誘導される配列を含む配列番号１に示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを使用して、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅの異常な又は変化した発現から生じる疾患の診断又は疾患への感受性の診断を裏付ける又は定義することができる診断ツールを最終的に提供する、機能不全に結びつくＨｓＣＥＮＰ−Ｅ遺伝子の突然変異形態を検出しうる。
【０２８４】
突然変異は、１）遺伝子からの１又はそれ以上のヌクレオチドに欠失；２）遺伝子への１又はそれ以上のヌクレオチドの付加；３）遺伝子の１又はそれ以上のヌクレオチドの置換；４）遺伝子の染色体再編成；５）遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写産物のレベルの変化；６）ゲノムＤＮＡのメチル化パターンなどの、遺伝子の異常修飾；７）遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写産物の非野生型スプライシングパターンの存在；８）遺伝子によってコードされるタンパク質の非野生型レベル；９）遺伝子の対立遺伝子の喪失；及び１０）遺伝子によってコードされるタンパク質の不適切な翻訳後修飾、の少なくとも１つの存在を確認することによって検出できる。ここで述べるように、遺伝子内の病変を検出するために使用できる、当技術分野で既知の数多くのアッセイ手法が存在する。
【０２８５】
従って、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅをコードするポリヌクレオチドを使用して、生検組織においてＨｓＣＥＮＰ−Ｅ遺伝子発現を検出し、定量することができ、その場合、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅの発現は疾患と相関しうる。該診断アッセイは、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅの不在、存在及び過剰発現を測定するため、及び治療処置の間のＨｓＣＥＮＰ−Ｅレベルの調節を監視するために使用しうる。ＨｓＣＥＮＰ−Ｅの発現を数量化するための方法は、放射標識、ヌクレオチドをビオチニル化すること、対照核酸の共増幅、及び標準曲線からの結果を補間することを包含する（例えば、Ｍｅｌｂｙ，Ｐ．Ｃ．ら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １５９：２３５−２４４；Ｄｕｐｌａａ，Ｃ．ら（１９９３）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２９−２３６参照）。対象オリゴマーを様々な希釈で提供し、分光測光又は熱量測定応答が迅速な定量を与える、ＥＬＩＳＡ方式でアッセイを実施することによって多数の試料の定量の速度を加速しうる。
【０２８６】
癌に関しては、個体からの生検組織におけるＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質をコードする転写産物の異常量の存在、好ましくは高いレベルの転写産物の存在は、該疾患の発症への素因を示しうる又は急性臨床徴候の出現の前に該疾患を検出するための手段を提供しうる。この種のより決定的な診断は、医療専門家がより早期に予防的措置又は積極的治療を使用し、それによって癌の発症又はさらなる進行を予防することを可能にすると考えられる。
【０２８７】
例えば、増幅したＤＮＡを標識ＨｓＣＥＮＰ−Ｅヌクレオチド配列にハイブリダイズすることによって点突然変異を特定することができる。ＲＮアーゼ消化によって又は融解温度の相違によって、完全に一致する配列をミスマッチ二本鎖から区別することができる。ＤＮＡ配列の相違はまた、変性剤を含む又は含まないゲル中でのＤＮＡフラグメントの電気泳動移動度の変化によって又は直接ＤＮＡ塩基配列決定によっても検出しうる。例えば、Ｍｙｅｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２３０：１２４２参照。特定位置における配列の変化も、ＲＮアーゼ及びＳ１保護などのヌクレアーゼ保護アッセイによって又は化学的開裂法によって明らかにしうる。Ｃｏｔｔｏｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８５）８５：４３９７−４４０１参照。
【０２８８】
好ましい実施形態では、該方法は、被験者からの細胞の試料において、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質をコードする遺伝子の完全性に影響を及ぼす変化又はＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質をコードする遺伝子の誤発現の少なくとも１つによって特徴付けられる突然変異の存在又は不在を検出することを含む。
【０２８９】
一部の実施形態では、突然変異の検出は、アンカーＰＣＲ又はＲＡＣＥ  ＰＣＲなどのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号及び同第４，６８３，２０２号）において、あるいは、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７−１０８０；及びＮａｋａｚａｗａら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３６０−３６４参照）においてプローブ／プライマーを使用することを含み、後者は遺伝子における点突然変異を検出するために特に有用でありうる（例えば、Ａｂｒａｖａｙａら（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：６７５−６８２参照）。この方法は、患者から細胞の試料を採集すること、該試料の細胞から核酸（例えばゲノム、ｍＲＮＡ又はその両方）を単離すること、該核酸試料を、遺伝子（もし存在する場合は）のハイブリダイゼーションと増幅が起こるような条件下で選択遺伝子に特異的にハイブリダイズする１又はそれ以上のプライマーと接触させること、及び増幅産物の存在又は不在を検出すること、又は増幅産物の大きさを検出し、その長さを対照試料と比較することの段階を含みうる。ここで述べる突然変異を検出するために使用される手法のいずれかと組み合わせて、ＰＣＲ及び／又はＬＣＲを予備増幅段階として使用することが望ましいであろうと考えられる。他の増幅方法は周知である。
【０２９０】
代替的実施形態では、選択遺伝子、例えば試料細胞からのＨｓＣＥＮＰ−Ｅコード遺伝子における突然変異は、制限酵素開裂パターンの変化によって特定できる。例えば、試料と対照のＤＮＡを単離し、増幅して（場合により）、１又はそれ以上の制限エンドヌクレアーゼで消化し、フラグメント長の大きさをゲル電気泳動によって測定して比較する。試料と対照ＤＮＡの間のフラグメントの長さの差が試料ＤＮＡにおける突然変異を示す。さらに、配列特異的リボザイム（例えば米国特許第５，４９８，５３１号参照）を使用して、リボザイム開裂部位の出現又は喪失によって特異的突然変異の存在を評価することができる。
【０２９１】
他の実施形態では、試料と対照の核酸、例えばＤＮＡ又はＲＮＡを、数百又は数千のポリヌクレオチドプローブを含む高密度アレイにハイブリダイズすることによって遺伝子突然変異を特定することができる（Ｃｒｏｎｉｎら（１９９６）Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ７：２４４−２５５；Ｋｏｚａｌら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２：７５３−７５９）。例えば、Ｃｒｏｎｉｎら、前出が述べたような発光ＤＮＡプローブを含む二次元アレイにおいて遺伝子突然変異を特定することができる。簡単に述べると、プローブの第一ハイブリダイゼーションアレイを使用して試料及び対照中のＤＮＡの長い範囲全体にわたって走査し、連続的重複プローブの線状アレイを作製することによって配列の間の塩基変化を特定することができる。この段階は点突然変異の特定を可能にする。この段階に続いて、第二ハイブリダイゼーションアレイは、検出されたすべての変異体又は突然変異に相補的な、より小さい特殊なプローブのアレイを使用することにより、特定突然変異の特性指摘を可能にする。各々の突然変異アレイは、一方は野生型遺伝子に相補的であり、他方は突然変異体遺伝子に相補的な、平行プローブセットから成る。
【０２９２】
さらにもう１つの実施形態では、当技術分野で既知の様々な配列決定反応のいずれかを使用して、選択遺伝子を直接配列決定し、試料核酸の配列を対応する野生型（対照）配列と比較することによって突然変異を検出することができる。配列決定反応の例は、ＭａｘｉｍとＧｉｌｂｅｒｔ（（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５６０）又はＳａｎｇｅｒ（（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３）によって開発された手法に基づくものを包含する。また、質量分析法による配列決定（例えば、ＰＣＴ国際公開公報第ＷＯ９４／１６１０１号；Ｃｏｈｅｎら（１９９６）Ａｄｖ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．３６：１２７−１６２；及びＧｒｉｆｆｉｎら（１９９３）Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：１４７−１５９参照）を含む、様々な自動配列決定手順のいずれかが、診断アッセイを実施するときに利用できる（（１９９５）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９：４４８）と考えられる。
【０２９３】
ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ遺伝子における突然変異を検出するための他の方法は、開裂物質からの保護を使用して、ＲＮＡ／ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡへテロ二本鎖におけるミスマッチ塩基を検出する方法を包含する（Ｍｙｅｒｓら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１２４２）。一般に、ミスマッチ開裂の手法は、野生型配列を含む（標識）ＲＮＡ又はＤＮＡを組織試料から得た潜在的突然変異型ＲＮＡ又はＤＮＡとハイブリダイズすることによって形成したヘテロ二本鎖を提供することを含む。その二本鎖を、対照と試料の鎖の塩基対ミスマッチのために存在するような二重鎖分子の一本鎖領域を開裂する物質で処理する。ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖は、ミスマッチ領域を消化するためにＲＮアーゼで処理することができ、ＤＮＡ／ＤＮＡ雑種は、Ｓ１ヌクレアーゼで処理してミスマッチ領域を消化することができる。他の実施形態では、ＤＮＡ／ＤＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖を、ミスマッチ領域を消化するためにヒドロキシルアミン又は四酸化オスミウム及びピペリジンで処理することができる。ミスマッチ領域の消化後、生じた物質を変性ポリアクリルアミドゲル上で大きさによって分離し、突然変異の部位を決定する。例えば、Ｃｏｔｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：４３９７；Ｓａｌｅｅｂａら（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２８６−２９５参照。好ましい実施形態では、対照ＤＮＡ又はＲＮＡを検出のために標識することができる。米国特許第５，４５９，０３９号も参照のこと。
【０２９４】
他の実施形態では、電気泳動移動度の変化を使用して遺伝子における突然変異を特定する。例えば、一本鎖立体配座多型（ＳＳＣＰ）を使用して、突然変異体と野生型核酸の間の電気泳動移動度の差を検出しうる（Ｏｒｉｔａら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：２７６６；Ｃｏｔｔｏｎ（１９９３）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２８５：１２５−１４４；Ｈａｙａｓｈｉ（１９９２）Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．９：７３−７９も参照のこと）。試料と対照核酸の一本鎖ＤＮＡフラグメントを変性し、復元させる。一本鎖核酸の二次構造は配列によって変化し、生じる電気泳動移動度の変化は、単一塩基変化の検出さえも可能にする。該ＤＮＡフラグメントは標識しうるか又は標識プローブで検出しうる。二次構造が配列の変化に対してより感受性であるＲＮＡ（ＤＮＡではなく）を使用することによってアッセイの感受性を高めうる。好ましい実施形態では、本発明の方法は、電気泳動移動度の変化に基づいてヘテロ二本鎖分子を分離するためのヘテロ二本鎖分析法を利用する（Ｋｅｅｎら（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．７：５）。
【０２９５】
さらにもう１つの実施形態では、変性剤の勾配を含むポリアクリルアミドゲル中での突然変異型又は野生型フラグメントの移動を、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）（Ｍｙｅｒｓら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：４９５）を用いて検定する。ＤＧＧＥを分析方法として使用するときは、例えばＰＣＲによって約４０ｂｐの高融解温度のＧＣに富むＤＮＡの’ＧＣクランプを添加することにより、ＤＮＡを、それが完全に変性しないことを保証するように修飾する。さらなる実施形態では、対照と試料ＤＮＡの移動度の差を特定するために変性勾配の代わりに温度勾配を使用する（ＲｏｓｅｎｂａｕｍとＲｅｉｓｓｎｅｒ（１９８７）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．２６５：１２７５３）。
【０２９６】
点突然変異を検出するための他の適切なプロトコールは、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択増幅、又は選択的プライマー伸長を含むが、これらに限定されない。例えば、Ｓａｉｋｉら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２４：１６３）；Ｓａｉｋｉら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６２３０参照。
【０２９７】
ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ分子及びそれに対する抗体を得ることにより、様々な診断アッセイが提供される。抗体は、治療のため又はここで述べる配列同一性特徴を有するＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の存在を特定するために使用できる。さらに、抗体を使用して、下記でさらに説明するような抗体とＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の間の相互作用の調節因子を特定することができる。
【０２９８】
下記の考察は結合アッセイの使用における抗体の使用を対象とするが、「非競合」又は「競合」アッセイについて述べられているのと同じ一般的アッセイ様式が、微小管等のようなＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質に結合する化合物に関して使用できることは了解される。免疫学的及び免疫測定法の手順の総説に関しては、Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｓｔｉｔｅｓ  ＆  Ｔｅｒｒ編集、第７版、１９９１）参照。さらに、本発明の免疫測定法は、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ｍａｇｇｉｏ編集、１９８０）；及びＨａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ、前出において広汎に総説されている、いくつかの立体配置のいずれかで実施することができる。
好ましくは、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質は、いくつもの十分に認識されている免疫学的結合アッセイのいずれかを用いて検出及び／又は定量される（例えば、米国特許第４，３６６，２４１号；同第４，３７６，１１０号；同第４，５１７，２８８号；及び同第４，８３７，１６８号参照）。一般的な免疫測定法の総説については、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  第３７巻：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｓａｉ編集、１９９３）；Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｓｔｉｔｅｓ  ＆  Ｔｅｒｒ編集、第７版、１９９１）も参照のこと。
【０２９９】
免疫学的結合アッセイ（又は免疫測定法）は、典型的には、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質又はその抗原活性フラグメントと比較して、選択タンパク質又は抗原に特異的に結合する抗体を使用する。抗体、例えば抗ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質は、当業者に周知であり、上述したような多くの手段のいずれかによって作製しうる。
【０３００】
それ故、本発明の１つの代表的な実施形態は、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅの発現を特徴とする疾患の診断のために、又はＨｓＣＥＮＰ−Ｅ又はＨｓＣＥＮＰ−Ｅのアゴニスト、アンタゴニスト又は阻害因子で治療されている患者を監視するためのアッセイにおいて、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質に特異的に結合する抗体を使用することを提案する。好ましくは、該抗体は、配列番号１の遺伝子産物又は配列番号２のポリペプチド又はその抗原活性フラグメントに対して結合特異性を有する。
【０３０１】
ＨｓＣＥＮＰ−Ｅを測定するのに適する様々なプロトコールが存在する。代表的な例は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ及びＦＡＣＳを包含し、それらの各々が変化した又は異常なレベルＨｓＣＥＮＰ−Ｅ発現を診断するための根拠を提供する。
【０３０２】
ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ発現についての正常又は標準値は、正常哺乳類被験者、好ましくはヒトから採取した体液又は細胞抽出物を、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅに対する抗体と、それらの複合体の形成を促進する条件下で混合することによって確立できる。標準複合体形成の量は、様々な方法によって定量しうる。生検組織からの被験者、対照及び疾患試料において発現されるＨｓＣＥＮＰ−Ｅの量を、その後、標準値と比較することができる。標準と被験者の数値の間の偏差が、今度は、疾患を診断するためのパラメータを提供する。
【０３０３】
１つのアッセイ様式では、高レベルのＨｓＣＥＮＰ−Ｅを発現することが知られている体組織と反応性である標識抗体、好ましくはモノクローナル抗体を使用すること及びそれに対する特異的結合を測定することによってＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質を特定及び／又は定量し、該アッセイは、典型的には免疫複合体形成を誘導する条件下で実施する。非標識一次抗体を、受容体を検出するために一次抗体と反応性の標識と組み合わせて使用することができる。
【０３０４】
免疫測定法はまた、抗体と抗原によって形成される複合体に特異的に結合してそれを標識するための標識物質をしばしば使用する。標識物質は、それ自体、抗体／抗原複合体を含む成分の１つでありうる。それ故、標識物質は、標識ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質ポリペプチド又は標識抗ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質抗体でありうる。あるいは、標識物質は、抗体／ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質複合体に特異的に結合する二次抗体などの第三の成分でありうる（二次抗体は、典型的には一次抗体が由来する種の抗体に特異的である）。プロテインＡ又はプロテインＧなどの、免疫グロブリン定常領域に特異的に結合することができる他のタンパク質も、標識物質として使用しうる。これらのタンパク質は、様々な種からの免疫グロブリン定常領域と強い非免疫原性反応性を示す（一般に、Ｋｒｏｎｖａｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１１：１４０１−１４０６（１９７３）；Ａｋｅｒｓｔｒｏｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：２５８９−２５４２（１９８５）参照）。標識物質は、ストレプトアビジンなどのもう１つ別の分子が特異的に結合しうる、ビオチンなどの検出可能な成分で修飾することができる。様々な検出可能成分が当業者に周知である。
【０３０５】
非競合アッセイ様式−試料中のＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質を検出するための免疫測定法は、競合的又は非競合的のどちらでもよい。非競合免疫測定法は、抗原の量を直接測定するアッセイである。１つの好ましい「サンドイッチ」アッセイでは、例えば、抗ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質抗体を固体基質に直接結合して、その上に固定化することができる。これらの固定化抗体が、次に、被験試料中に存在するＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質を捕獲する。このようにしてＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質を固定化し、その後、標識を担う第二ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質抗体などの標識物質に結合する。あるいは、第二抗体は標識を持たなくてもよいが、次に、第二抗体が由来する種の抗体に特異的な標識第三抗体によって結合されうる。第二又は第三抗体は、典型的には、検出可能成分を提供するために、ストレプトアビジンなどのもう１つ別の分子が特異的に結合する、ビオチンなどの検出可能な成分で修飾される。
【０３０６】
代替的様式、例えば競合アッセイ様式では、試料中に存在する未知のＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質によって抗ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質から置換された（競合排除された）、既知の添加（外因性）ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の量を測定することにより、試料中に存在するＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の量を間接的に測定する。１つの競合アッセイでは、既知量のＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質を試料に添加し、次に該試料を、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質に特異的に結合する抗体と接触させる。該抗体に結合した外因性ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の量は、試料中に存在するＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の濃度に逆比例する。特に好ましい実施形態では、該抗体を固体基質に固定化する。抗体に結合したＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の量は、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質／抗体複合体中に存在するＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の量を測定することによって、あるいは残存する非複合タンパク質の量を測定することによって決定しうる。ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の量は、標識ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質分子を提供することによって検出しうる。
【０３０７】
ハプテン阻害アッセイはもう１つの好ましい競合アッセイである。このアッセイでは、既知のＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質を固体基質上に固定化する。既知量の抗ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質抗体を試料に添加し、次に該試料をＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質と接触させる。既知の固定化ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質に結合した抗ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質抗体の量は、試料中に存在するＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の量に逆比例する。やはり、固定化抗体の量は、抗体の固定化分画又は溶液中に残存する抗体の分画のいずれかを検出することによって検出しうる。検出は、抗体が標識されている場合は直接的であるか、又は上述したような抗体に特異的に結合する標識成分のその後の添加によって間接的でありうる。
【０３０８】
試料中のＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の存在を検出し、定量するために、ウエスタンブロット分析が使用できる。その手法は一般に、分子量に基づきゲル電気泳動によって試料タンパク質を分離すること、分離したタンパク質を適切な保持体（ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター又は誘導体化ナイロンフィルターなど）に移すこと、及び該試料を、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質に特異的に結合する抗体と共にインキュベートすることを含む。抗ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質抗体は、保持体上のＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質に特異的に結合する。これらの抗体は、直接標識するか、あるいはその後、抗ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質抗体に特異的に結合する標識抗体（例えば標識ヒツジ抗マウス抗体）を用いて検出しうる。他のアッセイ様式は、特定分子（例えば抗体）に結合して、被包された試薬又はマーカーを放出するように設計されたリポソームを使用する、リポソーム免疫測定法（ＬＩＡ）を包含する。放出された化学物質は、その後、標準手法に従って検出される（Ｍｏｎｒｏｅら、Ａｍｅｒ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｄ．Ｒｅｖ．５：３４−４１（１９８６）参照）。
【０３０９】
非特異的結合の低減−免疫測定法においてはしばしば非特異的結合を最小限に抑えることが望ましいことは認識されよう。特に、該測定法が固体基質に固定化された抗原又は抗体を含む場合は、基質への非特異的結合の量を最小限に抑えることが望ましい。そのような非特異的結合を低減する手段は当業者に周知である。典型的には、この手法は、基質をタンパク様組成物で被覆することを含む。特に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、脱脂粉乳及びゼラチンなどのタンパク質組成物は広く使用されており、脱脂粉乳が最も好ましい。
【０３１０】
プローブ又は抗体に関して、「標識」の語は、検出可能な物質をプローブ又は抗体に結合すること（すなわち物理的結合）によるプローブ又は抗体の直接標識、ならびに直接標識されたもう１つ別の試薬との反応性によるプローブ又は抗体の間接標識を包含することが意図されている。ここで開示するアッセイにおいて使用される特定標識又は検出可能基は、特定アッセイで使用される抗体の特異的結合に有意に干渉しない限り、決定的に重要ではない。検出可能基は、検出可能な物理的又は化学的性質を有するいかなる物質でもよい。そのような検出可能標識は免疫測定法の分野で広く開発されており、一般に、そのような方法において有用なほとんどの標識が本発明に適用できる。
【０３１１】
ここで使用する「生物学的試料」は、標的タンパク質、例えばＨｓＣＥＮＰ−Ｅ又はそのフラグメント、あるいは標的タンパク質又はそのフラグメント、例えばＨｓＣＥＮＰ−Ｅをコードする核酸を含む生物組織又は体液の試料である。生物学的試料はまた、組織学的検査のために採取された凍結切片などの組織の切片を包含する。この語は、被験者から単離された組織、細胞及び生物学的液体、ならびに被験者の体内に存在する組織、細胞及び液体を包含することが意図されている。
【０３１２】
本発明はまた、生物学的試料（被験試料）における本発明のポリペプチド又は核酸の存在を検出するためのキットを包含する。そのようなキットは、被験者が、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の異常発現に関連する疾患（例えばＨｓＣＥＮＰ−Ｅ仲介性又は関連性の癌）に罹患している又は疾患を発症する危険性が高いかどうかを判定するために使用できる。例えば、該キットは、生物学的試料において該ポリペプチド又は該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを検出することができる標識化合物又は物質、及び該試料中のＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質又はｍＲＮＡの量を測定するための手段（例えば、該ポリペプチドに結合する抗体又は該ポリペプチドをコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡに結合するオリゴヌクレオチドプローブ）を含みうる。キットはまた、該ポリペプチド又は該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの量が正常値以上又は以下である場合、試験する被験者が、該ポリペプチドの異常発現に関連する疾患に罹患している又は疾患を発症する危険性が高いことを認識するための指示書を含みうる。
【０３１３】
抗体ベースのキットに関しては、該キットは、例えば（１）ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質に結合する第一抗体（例えば保持体に結合した）；及び場合により（２）該ポリペプチド又は第一抗体のいずれかに結合し、検出可能物質に複合している第二の異なる抗体を含みうる。
【０３１４】
オリゴヌクレオチドベースのキットに関しては、該キットは、例えば（１）ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、例えば検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド又は（２）ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質をコードする核酸分子を増幅するために有用な一対のプライマーを含みうる。
【０３１５】
該キットはまた、例えば緩衝剤、防腐剤又はタンパク質安定剤も含みうる。該キットはまた、検出可能物質（例えば酵素又は基質）を検出するために必要な成分を含みうる。該キットはまた、検定して、含まれる被験試料と比較することができる対照試料又は一連の対照試料も含みうる。キットの各々の成分は、通常、個別の容器内に納められ、様々な容器全部が、試験する被験者が該ポリペプチドの異常発現に関連する疾患に罹患している又は疾患を発症する危険性が高いかどうかを認識するための指示書と共に単一包装内に納められる。
【０３１６】
他の実施形態では、例えば、診断核酸は配列番号１から誘導される。考慮される診断システムは、本発明のタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ又は転写核酸（ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡなど）において本発明のタンパク質をコードする核酸の存在又は不在を検定するために有用である。
【０３１７】
適切な診断システムは、少なくとも１個の本発明の核酸分子又はそれから誘導されるフラグメント、好ましくは２個又はそれ以上の本発明の核酸を、少なくとも１回のアッセイに十分な量で別々に包装された化学試薬として含む。典型的には、包装された試薬の使用のための指示書も含まれる。当業者は、ここで述べる本発明の方法の実施のために適切な緩衝液及び溶液と組み合わせて、本発明の核酸プライマーローブ及び／又はプライマーをキットの形態に容易に組み込むことができる。
【０３１８】
「本発明のタンパク質」は、それらすべてが配列番号２のアミノ酸配列又は生物活性ＨｓＣＥＮＰ−Ｅをコードする、配列番号１の遺伝子産物又はその変異体又はフラグメントを指す。
【０３１９】
２．薬理遺伝学
本発明はさらに、個体にとって適切な治療又は予防薬を選択するための、個体における核酸又はＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の発現又はＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の活性のための方法（ここでは「薬理遺伝学」と称する）を提供する。
【０３２０】
ここで使用するとき「薬理遺伝学」は、遺伝子の塩基配列決定、統計遺伝学及び臨床開発中及び市販されている薬剤に対する遺伝子発現分析などのゲノムテクノロジーの適用を指す。より特定すると、この語は、患者の遺伝子が薬剤に対する応答（例えば患者の「薬剤応答表現型」又は「薬剤応答遺伝子型」）をどのようにして決定するかについての試験を指す。例えば、Ｌｉｎｄｅｒ（１９９７）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４３（２）：２５４−２６６参照。
【０３２１】
それ故、本発明の１つの局面は、個体の予防又は治療処置を、その個体の薬剤応答遺伝子型に従って本発明のＨｓＣＥＮＰ−Ｅ分子又はＨｓＣＥＮＰ−Ｅ調節因子に適合させるための方法を提供する。
【０３２２】
従って、ここで述べるスクリーニングアッセイのいずれか１つによって特定されたＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の活性又は発現を阻害する調節因子を、該ポリペプチドの異常活性に関連する疾患を治療する（予防的又は治療的に）ために個体に投与することができる。そのような治療と共に、該個体の薬理遺伝学（すなわち、個体の遺伝子型とその個体の外来化合物又は薬剤に対する応答との間の関係の試験）考慮しうる。それ自体で、本発明の提示する方法は、臨床家又は医師が、患者がその治療から最も恩恵を受ける予防又は治療処置を患者に有効に標的すること、及び患者が有害な薬剤関連副作用を経験する治療を有効に回避することを可能にする。
【０３２３】
そのような薬理遺伝学はさらに、適切な用量及び治療レジメンを決定するために使用できる。その結果、個体におけるＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の活性、該ポリペプチドをコードする核酸の発現、又は該ポリペプチドをコードする遺伝子の突然変異含量を測定し、それによって該個体の治療又は予防処置のための適切な薬剤を選択することができる。
【０３２４】
例えば、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ遺伝子発現、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質レベル又はそのタンパク質活性を低下させることに関係付けられてきた、ここで特定する薬剤の有効性を、高い遺伝子発現、タンパク質レベル又はタンパク質活性を示す被験者の臨床治験において監視することができる。
【０３２５】
例えば、限定ではなく、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅポリペプチドの活性又は発現を調節する物質（例えばここで述べるスクリーニングアッセイにおいて特定されるような）（例えば化合物、薬剤又は低分子）による治療によって細胞において調節される、配列番号１に対応する又は配列番号２のタンパク質をコードする、本発明の遺伝子を含む遺伝子が特定できる。
【０３２６】
それ故、例えば臨床治験において、特定ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ仲介性又は関連性の癌、例えばタキソールに抵抗性のもの又は他の薬剤抵抗性腫瘍を含む、過剰増殖性細胞によって特徴付けられるものへの作用物質（例えば抗有糸分裂薬）の作用を検討するために、細胞を単離し、ｍＲＮＡを作製して、本発明の遺伝子及び該疾患に関係付けられる他の遺伝子の発現のレベルに関して分析することができる。遺伝子発現のレベル（すなわち遺伝子発現パターン）を、ここで述べるようなノーザンブロット分析又はＲＴ−ＰＣＲによって、あるいはここで述べる方法の１つを用いて、産生されるタンパク質の量を測定することによって、又は本発明の遺伝子又は他の遺伝子の活性のレベルを測定することによって定量することができる。このように、遺伝子発現パターンは作用物質に対する細胞の生理的応答を指示するマーカーとして使用できる。従って、この応答状態を、作用物質による個体の治療の前及び治療中の様々な時点で測定しうる。
【０３２７】
その結果、本発明の１つの例示的な実施形態は、（ｉ）作用物質の投与前に被験者から投与前試料を得ること；（ｉｉ）投与前試料において本発明のポリペプチド又は核酸のレベルを検出すること；（ｉｉｉ）被験者から１又はそれ以上の投与後試料を得ること；（ｉｖ）投与後試料において本発明のポリペプチド又は核酸のレベルを検出すること；（ｖ）投与前試料における本発明のポリペプチド又は核酸のレベルを投与後試料（１又はそれ以上）における本発明のポリペプチド又は核酸のレベルと比較すること；及び（ｉｖ）それに従って被験者への作用物質の投与を変化させること、を含む、作用物質（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチドミメティック、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子又はここで述べるスクリーニングアッセイによって特定される他の薬剤候補物質）による被験者の治療の有効性を監視するための方法を提供する。例えば、作用物質の投与量の上昇は、該ポリペプチドの発現又は活性を低下させる、すなわち作用物質の有効性を上昇させるために望ましいと考えられる。
【０３２８】
Ｃ．治療方法
本発明はまた、異常ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ発現又は活性に関連する疾患の危険性が高い（又は疾患に感受性がある）又は疾患を有する被験者を処置する、予防的及び治療的方法を提供する。処置の予防的及び治療的方法の両方に関して、そのような処置は、薬理遺伝学の分野から得られる知識に基づいて、特異的に適合させうる又は改変しうる。
【０３２９】
１．予防的方法
上記に従って、本発明は、被験者にＨｓＣＥＮＰ−Ｅ、あるいはＨｓＣＥＮＰ−Ｅの発現又は少なくとも１つのＨｓＣＥＮＰ−Ｅ活性を調節する物質を投与することにより、該被験者において異常ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ発現又は活性に関連する疾患又は状態を予防するための方法を提供する。異常ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ発現又は活性によって引き起こされる又は異常ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ発現又は活性が寄与する疾患の危険性が高い被験者は、例えば、ここで述べる診断又は予後アッセイのいずれか又はそれらの組合せによって特定することができる。予防物質の投与は、該疾患又は障害が予防されるように、あるいはその進行が遅延するように、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ異常を特徴とする症状の発現の前に実施できる。ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ異常のタイプに依存して、例えば、被験者を処置するためにＨｓＣＥＮＰ−Ｅアゴニスト又はＨｓＣＥＮＰ−Ｅアンタゴニストを使用することができる。適切な作用物質は、ここで述べるスクリーニングアッセイに基づいて決定することができる。
【０３３０】
２．治療的方法
例えば配列及びモチーフに関して、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅとキネシンのモータードメインの領域間に化学的及び構造的類似性が存在することは周知である。同様に、例えば癌のような過剰増殖細胞を伴う疾患状態にＨｓＣＥＮＰ−Ｅの発現が関与することは数多くの先行技術が教示している。それ故、高いＨｓＣＥＮＰ−Ｅ活性を特徴とする疾患状態の治療においては、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅの発現又は活性を低下させることが望ましい。あるいは、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ活性の低下を伴う病的状態の治療では、該タンパク質を提供すること又はＨｓＣＥＮＰ−Ｅの発現を上昇させることが望ましい。
【０３３１】
一般に、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ活性の阻害は、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅが異常に上方調節される及び／又は低いＨｓＣＥＮＰ−Ｅ活性が有益な作用を及ぼすと考えられる状態において望ましい。好ましくは、作用物質は１又はそれ以上のＨｓＣＥＮＰ−Ｅ活性を阻害する。そのような阻害物質の例は、アンチセンスＨｓＣＥＮＰ−Ｅ核酸分子、抗ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ抗体及びＨｓＣＥＮＰ−Ｅ阻害因子を包含する。これらの調節方法は、インビトロで（例えば細胞を作用物質と共に培養することによって）、あるいはインビボで（例えば作用物質を被験者に投与することによって）実施することができる。
【０３３２】
ＨｓＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の高発現は、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅのアンタゴニストを、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅの高い発現又は活性に関連する疾患を治療する又は予防するのに有効な量で被験者に投与することによって治療できる。そのような疾患は、上記で述べたものを含みうるが、それらに限定されない。
【０３３３】
ＨｓＣＥＮＰ−Ｅに特異的に結合する抗体は、アンタゴニストとして直接使用しうるか又はＨｓＣＥＮＰ−Ｅを発現する細胞又は組織に医薬物質を供給する標的又は送達機構として間接的に使用しうる。本発明の１つの好ましい実施形態は、治療上有効な量のＨｓＣＥＮＰ−Ｅ抗体を被験者に投与する段階を含む、疾患又は障害に関連するＨｓＣＥＮＰ−Ｅの治療のための方法を包含する。
【０３３４】
ここで定義するように、抗体の治療有効量（すなわち有効投与量）は、約０．００１−３０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．０１−２５ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．１−２０ｍｇ／ｋｇ体重、さらに一層好ましくは約１−１０ｍｇ／ｋｇ体重、２−９ｍｇ／ｋｇ、３−８ｍｇ／ｋｇ、４−７ｍｇ／ｋｇ又は５−６ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。当業者は、疾患又は障害の重症度、過去の治療、被験者の全般的健康状態及び／又は年齢、及び他の疾患の存在を含むがこれらに限定されないいくつかの因子が、被験者を有効に治療するために必要な用量に影響を及ぼしうることを認識する。さらに、治療有効量の抗体による被験者の治療は、単回治療を含みうるか、又は好ましくは、一連の治療を含みうる。好ましい一例では、被験者を約０．１−２０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内の抗体で、約１−１０週間、好ましくは２−８週間、より好ましくは約３−７週間、さらに一層好ましくは約４、５又は６週間にわたって週に１回治療する。また、治療のために使用する抗体の有効用量は、個々の治療期間中に増加又は低減させうることも認識されよう。用量の変更は、ここで述べる診断アッセイの結果によって生じうる。
【０３３５】
上述したように、内因性ヒトＣＥＮＰ−Ｅタンパク質をコードする遺伝子の発現は、発現遮断手法を用いて阻害することができる。
【０３３６】
その結果、インビボで適切な宿主細胞によって取り込まれるが、発現されず、その代わりにある種の遺伝子の発現を遮断するアンチセンス構築物−ＤＮＡ又はＲＮＡも、本発明の方法によって考慮される。
【０３３７】
既知のそのような手法は、内的に生成される又は別途に投与されるアンチセンス配列の使用を含む。例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ（１９９１）５６：５６０、Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９８８）参照。あるいは、遺伝子と三重らせんを形成するポリヌクレオチドを供給することができる。例えば、Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９７９）６：３０７３；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４１：４５６；Ｄｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５１：１３６０参照。これらのオリゴマーはそのままで投与することができ、又は関連オリゴマーをインビボで発現させることができる。
【０３３８】
先行技術には、短いアンチセンスオリゴヌクレオチドが、細胞膜によるそれらの取り込みが限られているために生じる低い細胞内濃度にもかかわらず、細胞内に輸送されて、そこで阻害因子と働くことを示す教示が豊富に存在する。（Ｚａｍｅｃｎｉｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３，４１４３−４１４６［１９８６］）。該ポリヌクレオチドは、例えばそれらの負に荷電したホスホジエステル基を無電荷の基で置換することによって、取り込みを高めるように修飾することができる。
【０３３９】
上記に従って、本発明の１つの局面は、どちらの方法もＤＮＡ又はＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に基づく、三重らせん形成あるいはアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡを通して、遺伝子発現を制御するために使用しうる、アンチセンステクノロジーの使用によって作製したアンチセンス構築物の導入を導く。
【０３４０】
本発明のために、細胞のＤＮＡに関して意図されている目的は、その複製及び転写に干渉することである。同様に、ＲＮＡに関しては、例えばタンパク質翻訳の部位へのＲＮＡの転位、ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、１又はそれ以上のｍＲＮＡ種を生成するためのＲＮＡのスプライシング、及びＲＮＡが関与しうる又はＲＮＡによって促進されうる触媒作用などの、すべての生命機能に干渉することが本発明の目的である。上記実施形態に関連して提示する作用の全体的効果は、宿主細胞における標的核酸の発現の調節である。この実施形態に関連して使用するとき、「標的核酸」は、その複製又は転写を阻害することが意図されているＤＮＡ又はＲＮＡをカバーするものとする。それ自体で、上記で言及する実施形態に関する「調節」は、「標的核酸」の発現の低下又は完全な阻害を意味する。
【０３４１】
上記実施形態のための手法は、標的とするｍＲＮＡの転写に関与する遺伝子の領域に相補的であるようにオリゴヌクレオチドを構築することを詳述する。その後、本発明の方法に従って及びその取り込みとその後の発現を促進する条件下で、アンチセンスＲＮＡポリヌクレオチドを疑わしい宿主細胞に導入し、それによって該ポリヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡにハイブリダイズして、ｍＲＮＡ分子のタンパク質への翻訳を阻止する（三重らせん−Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：４５６（１９８８）；及びＯｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９８８）参照）。
【０３４２】
それ自体で、本発明の実施形態は、上述したものを含むがそれらに限定されない、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅの高い発現又は活性に関連する疾患を治療する又は予防するために、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅをコードするポリヌクレオチドの相補物を発現するベクターを被験者に投与することを提案する。
【０３４３】
上記実施形態を実施するために、アンチセンスＤＮＡ配列は、天然ヌクレオチド又は当技術分野で既知の非天然ヌクレオチドミミックを使用しうる。
【０３４４】
本発明のもう１つの実施形態では、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅをコードするポリヌクレオチドの相補物は、ｍＲＮＡの転写を遮断することが望ましい状況において使用しうる。特に、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅをコードするポリヌクレオチドに相補的な配列で細胞を形質転換しうる。それ故、相補的分子又はフラグメントは、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ活性を調節するため又は遺伝子機能の調節を達成するために使用しうる。そのようなテクノロジーは現在当技術分野において周知であり、センス又はアンチセンスポリヌクレオチド又はより大きなフラグメントを、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅをコードする配列のコード領域又は制御領域に沿った様々な位置から設計することができる。
【０３４５】
レトロウイルス、アデノウイルス、あるいはヘルペス又はワクシニアウイルスから、又は様々な細菌プラスミドから誘導される発現ベクターは、標的器官、組織又は細胞群へのヌクレオチド配列の送達のために使用しうる。当業者に周知の方法が、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅをコードするポリヌクレオチドに相補的な核酸配列を発現するベクターを構築するために使用できる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、前出；Ａｕｓｕｂｅｌ，１９９５，前出参照）。
【０３４６】
ＨｓＣＥＮＰ−Ｅをコードする遺伝子は、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅをコードするポリヌクレオチド又はそのフラグメントの高レベルを発現する発現ベクターで細胞又は組織を形質転換することによって排除されうる。そのような構築物は、翻訳不能のセンス又はアンチセンス配列を細胞に導入するために使用しうる。ＤＮＡの組込みが存在しない場合でも、そのようなベクターは、内因性ヌクレアーゼによって無能化されるまでＲＮＡ分子を転写し続けることができる。非複製ベクターによる一過性発現は１ヶ月又はそれ以上持続することができ、適切な複製エレメントがベクター系の一部である場合はさらに長く持続しうる。
【０３４７】
上述したように、遺伝子発現の修飾は、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅをコードする遺伝子の制御、５’又は調節領域に相補的な配列又はアンチセンス分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＰＮＡ）を設計することによって実施できる。転写開始部位から、例えば開始部位より−１０の位置から＋１０の位置までの間から誘導されるポリヌクレオチドが好ましい。同様に、三重らせん塩基対合法を用いて阻害を達成することができる。三重らせん対合は、二重らせんがポリメラーゼ、転写因子又は調節分子の結合のために十分に開く能力の阻害を引き起こすので、有用である。三重鎖ＤＮＡを使用した最近の治療上の進歩が文献に記述されている（例えば、Ｇｅｅ，Ｊ．Ｅ．ら（１９９４）Ｈｕｂｅｒ，Ｂ．Ｅ．とＢ．Ｉ．Ｃａｒｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ，Ｆｕｔｕｒａ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｍｔ．Ｋｉｓｃｏ  Ｎ．Ｙ．，ｐ．１６３−１７７参照）。相補的配列又はアンチセンス分子はまた、転写産物がリボソームに結合するのを妨げることによってｍＲＮＡの翻訳を遮断するように設計することもできる。
【０３４８】
酵素的ＲＮＡ分子、リボザイムも、ＲＮＡの特異的開裂を触媒するために使用しうる。リボザイム作用の機序は、相補的な標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションとそれに続くエンドヌクレアーゼによる切断を含む。例えば、構築したハンマーヘッドモチーフリボザイム分子は、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅをコードする配列のエンドヌクレアーゼによる切断を特異的且つ効率的に触媒しうる。
【０３４９】
最初に、次の配列：ＧＵＡ、ＧＵＵ及びＧＵＣを含む、リボザイム開裂部位に関して標的分子を走査することにより、潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム開裂部位を特定する。ひとたび特定されれば、開裂部位を含む標的遺伝子の領域に対応する、１５−２０リボヌクレオチドの間の短いＲＮＡ配列を、オリゴヌクレオチドを作動不能にしうる二次構造特徴に関して評価することができる。候補標的の適合性はまた、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの容易性（アクセシビリティー）を試験することによって評価しうる。
【０３５０】
本発明の相補的リボ核酸分子及びリボザイムは、核酸分子の合成のための当技術分野で既知の何らかの方法によって作製しうる。これらは、固相ホスホルアミダイト化学合成などの、ポリヌクレオチドを化学合成するための手法を包含する。あるいは、ＲＮＡ分子は、ＨｓＣＥＮＰ−ＥをコードするＤＮＡ配列のインビトロ及びインビボ転写によって生成しうる。そのようなＤＮＡ配列を、Ｔ７又はＳＰ６などの適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターと共に多様なベクターに組み込むことができる。あるいは、構成的又は誘導的に相補的ＲＮＡを合成するこれらのｃＤＮＡ構築物を、細胞系統、細胞又は組織に導入することができる。
【０３５１】
ＲＮＡ分子は、細胞内での安定性及び半減期を高めるように修飾しうる。可能な修飾は、分子の５’及び／又は３’末端における隣接配列の付加、あるいは分子の骨格内のホスホジエステラーゼ結合に代るチオリン酸塩又は２’Ｏ−メチルの使用を含むが、これらに限定されない。この概念はＰＮＡの生産に固有であり、イノシン、クエオシン及びワイブトシンなどの非伝統的塩基、ならびに内因性エンドヌクレアーゼによって容易に認識されないアセチル、メチル、チオ及び同様の修飾形態のアデニン、シチジン、グアニン、チミン及びウリジンの含有によってこれらの分子すべてに拡大することができる。
【０３５２】
ベクターを細胞又は組織に導入するための多くの方法が使用可能であり、インビボ、インビトロ及び半ビボでの使用に等しく適する。半ビボ治療のためには、患者から採取した幹細胞にベクターを導入し、同じ患者への自家移植のためにクローン増殖させることができる。トランスフェクション、リポソーム注入又はポリカチオン型アミノポリマーによる送達は、当技術分野において周知の方法を用いて達成しうる（例えばＧｏｌｄｍａｎ，Ｃ．Ｋ．ら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５：４６２−４６６参照）。
【０３５３】
上述した治療法のいずれもが、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サルなどの哺乳類、最も好ましくはヒトを含む、そのような治療を必要とする被験者に適用しうる。
【０３５４】
あるいは、標的細胞を、二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）を発現するように構築し、宿主細胞における内因性ＲＮＡへのその作用を従来の手段によって評価することができる。ｄｓＲＮＡを導入するための手法は当業者に既知である。Ｆｉｒｅ  Ａ．（１９９９）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１５：３５８−３６３；Ｓｈａｒｐ  Ｐ  Ａ（１９９９）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １３：１３９−１４１；及びＨｕｎｔｅｒ  Ｃ．（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．９：Ｒ４４０−Ｒ４４２参照。そこで、上述したｄｓＲＮＡアプローチ（例えばＲＮＡｉ）は、クローン化遺伝子を不活性化することならびに遺伝子発現プロフィールを確立すること等において有用であることが証明されよう。Ｆｉｒｅら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：８０６８１（１）；及びＭｏｎｔｇｏｍｅｒｙら（１９９８）ＰＮＡＳ  ９５：１５５０２−１５５０７参照。代替的実施形態では、本発明の方法は、薬剤についての受容体をコードするｍＲＮＡにアンチセンスであるＤＮＡフラグメントを導入するために使用しうる。アンチセンス異種ＤＮＡは、薬剤受容体タンパク質の発現を有効に低下させ、それによってアンチセンスＤＮＡを含む細胞への薬剤結合の低下を生じさせ、潜在的標的をさらに特徴付けること等を可能にする。他の用途は当業者には明白である。
【０３５５】
本発明はまた、異種核酸が逆方向でベクター内にクローン化されているが、アンチセンスＲＮＡの転写を可能にする調節配列に作動可能に連結されているベクターを包含する。そこで、アンチセンス転写産物は、コード及び非コード領域の両方を含む標的核酸の全部又は一部を生産することができる。
【０３５６】
さらにもう１つの実施形態では、本発明の方法において使用するための、配列番号２のタンパク質又はそのフラグメントをコードする異種又は外来核酸分子を、分子の安定性、ハイブリダイゼーション又は溶解度を改善するために塩基部分、糖部分又はリン酸骨格で修飾することができる。例えば、核酸分子のデオキシリボースリン酸骨格を、ペプチド核酸を生成するように修飾することができる（Ｈｙｒｕｐ  Ｂ．ら（１９９６）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４（１）：５−２３参照）。
【０３５７】
ここで使用するとき、「ペプチド核酸」又は「ＰＮＡ」の語は、デオキシリボースリン酸骨格が偽ペプチド骨格によって置換されており、４個の天然核酸塩基だけが保持されている核酸ミミック、例えばＤＮＡミミックを指す。ＰＮＡの中性骨格は、低イオン強度の条件下でＤＮＡ及びＲＮＡへの特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、Ｈｙｒｕｐ  Ｂ．ら（１９９６）前出；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：１４６７０−６７５に述べられているような標準固相ペプチド合成プロトコールを用いて実施できる。
【０３５８】
従って、標的核酸分子のＰＮＡは治療及び診断適用において使用することができる。例えば、ＰＮＡは、例えば転写又は翻訳の停止を誘導すること又は複製を阻害することによる遺伝子発現の配列特異的修飾のためのアンチセンス物質として使用できる。
【０３５９】
Ｖ．医薬製剤及び投与方法
本発明の新規ＨｓＣＥＮＰ−Ｅをコードする核酸分子、そのアンチセンス配列、配列番号２のポリペプチド又は少なくとも１つのＨｓＣＥＮＰ−Ｅ活性を有するそのフラグメント、ここで開示するタンパク質に対する抗体、及びＨｓＣＥＮＰ−Ｅのミメティック、アゴニスト、アンタゴニスト又は阻害因子を含有する製薬上有用な組成物は、医薬適合性の担体の混合などによる既知の方法に従って製剤しうる。そのような担体及び製剤方法の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．）に見出しうる。有効な投与に適した医薬適合性の組成物を形成するために、そのような組成物は、ここで述べるタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は調節因子の有効量を含有する。
【０３６０】
治療有効用量は、ヒトＣＥＮＰ−Ｅ仲介性疾患を治療する又は診断するのに十分な量で個体に投与される本発明の組成物を指す。有効量は、個体の状態、体重、性別及び年齢などの様々な因子に従って変化しうる。他の因子は、投与方法を包含する。有効であるが非毒性の量の所望化合物をヒトＣＥＮＰ−Ｅ調節剤として使用することができる。
【０３６１】
ここで開示する方法に従って特定される化合物は、潜在的毒性を最小限に抑えながら、ＣＥＮＰ−Ｅポリペプチド又はその活性の最適調節を得るために常用試験によって定義される適切な用量で単独使用しうる。さらに、他の薬剤の同時投与又は連続投与が望ましい場合もありうる。
【０３６２】
そのような化合物の毒性と治療効果は、例えばＬＤ５０（個体群の５０％に対する致死用量）及びＥＤ５０（個体群の５０％における治療有効用量）を決定するための、細胞培養又は実験動物における標準製薬手順によって判定することができる。毒性作用と治療効果の間の用量比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比で表わすことができる。大きい治療指数を示す化合物が好ましい。これらの細胞培養アッセイ及び動物試験から得たデータは、ヒトにおける使用のための用量範囲を規定するのに使用することができる。そのような化合物の用量は、好ましくはほとんど又は全く毒性を伴わないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。用量は、使用する投与形態及び使用する投与経路に依存してこの範囲内で変化させうる。
【０３６３】
正確な製剤、投与経路及び用量は、患者の状態に鑑みて個々の医師によって選定されうる。例えば、Ｆｉｎｇｌら、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１９７５，第１章、ｐ．１参照。主治医は、どのようにして及びいつ、毒性又は臓器不全のために投与を終了する、中断する又は調節するかを認識することに留意すべきである。逆に、主治医はまた、臨床応答が十分でない場合、より高い（毒性をあらかじめ排除する）レベルに治療を調整することを認識する。対象とする疾患の管理における投与用量の程度は、治療する状態の重症度及び投与経路によって変化する。状態の重症度は、例えば、一部には、標準予後評価方法によって評価しうる。さらに、用量及びおそらくは投与頻度も、個々の患者の年齢、体重及び応答に従って変化する。獣医学においても、上記で論じたものに匹敵するプログラムが使用できる。用量は、望ましくない交差反応、アナフィラキシー反応等のような有害副作用を引き起こさない大きさにすべきである。
【０３６４】
一般に、用量は、患者の年齢、状態、性別及び疾患の程度、もし存在する場合は禁忌、及び個々の医師によって調整されるべき他のそのような変数によって異なる。用量は、本発明のアゴニスト又はアンタゴニスト０．００１ｍｇ／ｋｇ−５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ−１．０ｍｇ／ｋｇの１日１回又はそれ以上の投与を１日又は数日間で変化しうる。
【０３６５】
経口投与については、該組成物は、好ましくは、治療する患者への用量を対症的に調節するために０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０及び５０．０ミリグラムの有効成分を含有する割線入り又は割線なし錠剤の形態で提供される。薬剤の有効量は、通常、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ−約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の用量レベルで供給される。その範囲は、より特定すると、約０．００１ｍｇ／ｋｇ−１０ｍｇ／ｋｇ体重／日である。さらに一層特定すると、その範囲は約０．０５ｍｇ／ｋｇ−約１ｍｇ／ｋｇである。言うまでもなく、用量レベルは個々の化合物の効力に依存して変化する。ある種の化合物は他の化合物よりも強力である。さらに、用量レベルは化合物のバイオアベイラビリティーに依存して変化する。化合物のバイオアベイラビリティーがより高く、より強力であるほど、経口送達を含むがこれに限定されない送達経路を通して投与する必要のある化合物の量はより少なくなる。所望効果を達成するために組み合わせたときには、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅの用量を調節する。他方で、これらの様々な薬剤の用量を独立して最適化し、いずれかの薬剤を単独で使用した場合よりも疾病をさらに軽減させる相乗作用を達成するように組み合わせてもよい。当業者は、ヌクレオチドに関してはタンパク質又はそれらの阻害因子とは異なる製剤を使用する。同様に、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの送達は個々の細胞及び状態に特異的である。
【０３６６】
例えば、細胞培養で決定したＩＣ５０（すなわち、ポリペプチド複合体の半最大破壊又は複合体成分の細胞レベル及び／又は活性の半最大阻害を達成する被験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するための用量を動物モデルにおいて規定することができる。そのような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えばＨＰＬＣによって測定しうる。
【０３６７】
医薬組成物は、皮下、局所、経口及び筋肉内などの様々な経路によって個体に提供されうる。医薬組成物の投与は経口的又は非経口的に実施される。非経口的送達の方法は、局所、動脈内（組織に直接的に）、筋肉内、皮下、髄内、髄腔内、心室内、静脈内、腹腔内又は鼻内投与を含む。本発明はまた、本発明の新規治療方法における使用のための適切な局所、経口、全身及び非経口的医薬製剤を提供するという目的を有する。ＨｓＣＥＮＰ−Ｅの調節における使用のために本発明に従って特定される化合物を有効成分として含有する組成物は、投与のための従来のビヒクル中の様々な治療投与形態として投与することができる。例えば、該化合物は、錠剤、カプセル（各々時限放出型及び持続放出型製剤を含む）、丸剤、散剤、可粒剤、エリキシル、チンキ剤、溶液、懸濁液、シロップ及び乳剤などの経口投与形態として又は注射によって投与することができる。同様に、それらはまた、すべて製薬技術分野における当業者に周知の形態を使用する、静脈内（ボーラス及び持続注入の両方）、腹腔内、皮下、閉鎖を伴う又は伴わない局所、又は筋肉内形態でも投与しうる。
【０３６８】
注射のためには、本発明の作用物質を水溶液中で、好ましくはハンクス溶液、リンガー溶液又は生理食塩水などの生理適合性緩衝液中で製剤しうる。そのような経粘膜的投与に関しては、透過すべき障壁に適した浸透剤を製剤中で使用する。そのような浸透剤は当技術分野で一般的に知られている。
【０３６９】
本発明の実施のためにここで開示する化合物を全身投与に適した剤型に製剤するための、医薬適合性の担体の使用は、本発明の範囲内である。適切な担体の選択と適切な製造の実施により、本発明の組成物、特に溶液として製剤した組成物は、静脈内注射などによって非経口的に投与しうる。該化合物は、当技術分野で周知の医薬適合性の担体を使用して、経口投与に適した剤型に容易に製剤することができる。そのような担体は、治療する患者による経口摂取のために、本発明の化合物を錠剤、丸剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等として製剤することを可能にする。
【０３７０】
細胞内に投与することを意図される薬剤は、当業者に周知の手法を用いて投与しうる。例えば、そのような薬剤をリポソーム内に被包し、その後上述したように投与しうる。リポソームは、水性の内部を有する球状脂質二重層である。リポソーム形成時点で水溶液中の存在するすべての分子が水性内部に組み込まれる。リポソームの内容物は、外部微小環境から保護され、またリポソームは細胞膜と融合するので、細胞質内に効率的に送達される。加えて、それらの疎水性の故に、低有機分子を細胞内に直接投与しうる。
【０３７１】
有効成分に加えて、これらの医薬組成物は、活性化合物を医薬的に使用できる製剤へと加工することを容易にする賦形剤及び補助剤を含む適切な医薬適合性の担体を含有しうる。経口投与用に製造される製剤は、錠剤、カプセル又は溶液の形態でありうる。本発明の医薬組成物は、それ自体既知である方法で、例えば従来の混合、溶解、造粒、浮揚化（ｌｅｖｉｔａｔｉｎｇ）、乳化、被包、捕捉（ｅｎｔｒａｐｐｉｎｇ）又は凍結乾燥工程によって製造しうる。
【０３７２】
非経口投与用の医薬製剤は、水溶性形態の活性化合物の水溶液を含む。加えて、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射用懸濁液として製造しうる。適切な親油性溶媒又はビヒクルは、ゴマ油などの脂肪油、又はオレイン酸エチル又はトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、又はリポソームを包含する。水性注射用懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール又はデキストランなどの、懸濁液の粘度を上昇させる物質を含有しうる。場合により、懸濁液はまた、高度濃縮溶液の製造を可能にするために化合物の溶解度を上昇させる適切な安定剤又は作用物質を含有しうる。
【０３７３】
経口投与用の医薬製剤は、活性化合物を固体賦形剤と組み合わせること、場合により生じた混合物を摩砕すること、及び所望に応じて適切な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して錠剤又は糖衣丸のコアを得ることによって入手できる。適切な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトール又はソルビトールを含む糖類；例えばトウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム及び／又はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などのセルロース製剤のような充填剤である。所望する場合は、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、あるいはアルギン酸又はアルギン酸ナトリウムなどのその塩のような崩壊剤を添加しうる。
【０３７４】
下記の実施例は本発明を例示するために提供するものであり、本発明を限定することを意図しない。
【実施例】
【０３７５】
Ｉ．ｃＤＮＡライブラリーの構築及び／又はｃＤＮＡクローンの単離
ＭＲＣ−５ヒト二倍体肺線維芽細胞ポリＡ  ＲＮＡを市販のソース（Ａｍｂｉｏｎ）から入手し、ＨｓＣＥＮＰ−ＥモータードメインｃＤＮＡフラグメントのＲＴ−ＰＣＲを介した単離のために使用した。ＨｓＣＥＮＰ−Ｅモータードメインのアミノ酸１−４６５に対応する長いモータードメインフラグメントの増幅のために、次のＲＴ−ＰＣＲプライマーを使用した：
５’増幅プライマー：５’ＧＣＣＣＡＴＧＧＣＧＧＡＧＧＡＡＧＧＡＧＣＣＧＴ３’。
【０３７６】
ＨｓＣＥＮＰ−Ｅヌクレオチド配列に加えて、このプライマーは、発現ベクターへのサブクローニングを容易にするためにＧＣ−クランプ及びそれに続くＡＴＧ開始コドン付近で入れ子にしたＮｃｏＩ制限部位を含む。
【０３７７】
３’増幅プライマー：
５’ＧＣＧＧＴＡＣＣＧＡＣＡＧＡＴＴＣＡＴＣＡＡＴＴＴＣＴＣＧ３’。
【０３７８】
ＨｓＣＥＮＰ−Ｅヌクレオチド配列に加えて、このプライマーは、発現ベクターへのサブクローニングを容易にするためにＧＣ−クランプとＫｐｎＩ制限部位を含む。
【０３７９】
Ｔｉｔａｎ  Ｏｎｅ  Ｔｕｂｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ）を製造者の指示に従って使用して、ｃＤＮＡを逆転写し、増幅した。簡単に述べると、ＭＲＣ−５ポリＡ  ＲＮＡ  ２００ｎｇに関して５０℃で３０分間逆転写酵素反応を実施した。この反応の前に、ＲＮＡ鋳型とプライマーを水中で１分間９５℃に加熱し、次に氷上で直ちに冷却してＲＮＡ鋳型の５’末端の二次構造を変性した。
【０３８０】
ｃＤＮＡへの逆転写後、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００熱サイクラー（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において試料をＰＣＲ増幅に供した。試料を最初に９４℃で２分間変性し、次に９４℃、１５秒間、５２℃、３０秒間及び６８℃、２分間の温度サイクルの３０ラウンドに供した。最後に６８℃で５分間の伸長を実施した後、保存のために試料を４℃に冷却した。
【０３８１】
ＨｓＣＥＮＰ−ＥｃＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅後、試料を過剰のプライマーとヌクレオチドから精製し、ＮｃｏＩ及びＫｐｎＩ制限酵素で消化した。モータードメインフラグメントをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのｐＴｒｃＨｉｓ２Ｃベクターにサブクローニングした。
【０３８２】
対応するプラスミドをｐＴｒｃＨｉｓ２Ｃ／ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ４６５と称した。
【０３８３】
アミノ酸１−３４０に対応するＨｓＣＥＮＰ−Ｅのより小さなモータードメインフラグメントの機能分析のために、Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈｔ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ）を製造者の指示に従って使用して、プラスミドＤＮＡ（ｐＴｒｃＨｉｓ２Ｃ／ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ４６５）からのＨｓＣＥＮＰ−Ｅモータードメインの１０２０塩基対フラグメントを増幅した。
【０３８４】
次の増幅プライマーを使用した：
５’増幅プライマー：
５’ＧＣＣＣＡＴＧＧＣＧＧＡＧＧＡＡＧＧＡＧＣＣＧＴ３’。
このプライマーは上述した５’増幅プライマーと同じである。
３’増幅プライマー：
５’ＧＣＧＴＣＧＡＣＡＧＴＴＧＡＴＡＣＣＴＣＡＴＴＡＡＣ３’。
【０３８５】
ＨｓＣＥＮＰ−Ｅヌクレオチド配列に加えて、このプライマーは、発現ベクターへのサブクローニングを容易にするためにＧＣ−クランプとＳａｌＩ制限部位を含む。簡単に述べると次の増幅条件を使用した：プラスミド鋳型ＤＮＡ５ｇを、９４℃で２分間のＰＣＲ反応の初期変性及びそれに続く９４℃、１５秒間、５５℃、３０秒間及び７２℃、１分間の温度サイクルの２５ラウンドによって増幅した。最後に７２℃で５分間の伸長を実施した後、保存のために試料を４℃に冷却した。ＰＣＲ増幅は、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００熱サイクラー（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で実施した。
【０３８６】
ＰＣＲ後、増幅した物質を過剰のプライマーとヌクレオチドから精製し、ＮｃｏＩ及びＳａｌＩ制限酵素による消化に供した。アミノ酸１−３４０に対応するＨｓＣＥＮＰ−Ｅモータードメインフラグメントを、ＮｏｖａｇｅｎからのｐＥＴ２３Ｄ細菌発現ベクターにサブクローニングした。
【０３８７】
生じたプラスミドをｐＥＴ２３Ｄ／ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ３４０と称した。ｆｐＥＴ２３Ｄベクター内に存在するヒスチジンリンカーへのＨｓＣＥＮＰ−Ｅ  ｃＤＮＡのインフレームでの挿入は、発現されたタンパク質のＣ末端に６ヒスチジン残基（６Ｘ  Ｈｉｓ  Ｔａｇ）のシリーズを創造する。この６Ｘ  Ｈｉｓ  Ｔａｇは、発現タンパク質の精製と免疫学的検出のために有用である。
【０３８８】
ＰＣＲを介した配列の誤りが存在しないことを確認するために、個々の細菌形質転換体からのプラスミドＤＮＡを配列分析に供した。
【０３８９】
ＩＩ．塩基配列決定及び分析
上記プラスミドＤＮＡを配列分析に供した。クローン化ＨｓＣＥＮＰ−Ｅモータードメインのコード鎖と非コード鎖の両方を配列確認した。ＨｓＣＥＮＰ−Ｅの公表ヌクレオチド配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録Ｚ１５００５）又はＨｓＣＥＮＰ−Ｅの翻訳アミノ酸配列（ＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚ  Ｐｒｏｔｅｉｎ［ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝Ｐｒｏｔｅｉｎ］登録：ＣＡＡ７８７２７、Ｓ２８２６１、ＮＰ００１８０４、Ｑ０２２２４、１８１９４８５Ａ）に対する整列を、ＧＣＧアラインメントパッケージを使用して実施した。各々の場合に、ここで述べるＨｓＣＥＮＰ−Ｅモータードメインフラグメントのヌクレオチド及びアミノ酸配列は、上記に列挙した登録に述べられているようにアミノ酸３００位にプロリン残基ではなくアラニン残基が存在することと一致した。
【０３９０】
ＩＩＩ．単離ｃＤＮＡクローンの部位指定突然変異誘発
アミノ酸３００位のＨｓＣＥＮＰ−Ｅにおけるアラニン残基の機能的重要性をその位置のプロリン残基と比較して検討するために、ｐＥＴ２３Ｄ／ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ３４０発現プラスミドに関して、ヌクレオチドコード配列をＨｓＣＥＮＰ−Ｅモータードメインのアミノ酸３００位のプロリンを規定する配列に変更する部位指定突然変異誘発を実施した。
【０３９１】
ＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを製造者の指示に従って使用した。簡単に述べると、ｐＥＴ２３Ｄ／ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ３４０プラスミドＤＮＡ  ５ｎｇのＰＣＲ増幅を、所望ヌクレオチド変化を含み、該プラスミドの反対側の鎖上の同じ配列にアニーリングした２個の突然変異誘発性ヌクレオチドプライマー各々１２５ｎｇの存在下で実施した。次の突然変異誘発性オリゴヌクレオチドを使用した：
Ｍｕｔ３５Ａ：５’ＣＣＴＴＧＧＧＡＧＧＡＡＡＴＣＣＡＡＡＧＡＣＡＣＧＴＡＴＴＡＴＣＴＧＣ３’
Ｍｕｔ３５Ｂ：５’ＧＣＡＧＡＴＡＡＴＡＣＧＴＧＴＣＴＴＴＧＧＡＴＴＴＣＣＴＣＣＣＡＡＧＧ３’。
【０３９２】
該プラスミドＤＮＡを、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００熱サイクラー（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において、最初に９５℃で３０秒間変性し、次に９５℃、３０秒間、５５℃、１分間及び６８℃、９分間の温度サイクルの１２ラウンドに供した。
【０３９３】
反応物を４℃に冷却した後、ＤｐｎＩ制限酵素１０単位を各々のＰＣＲ反応物５０μｌに加えて、混合し、３７℃で１時間インキュベートして親（非突然変異）超らせん二本鎖ＤＮＡを消化した。ＤｐｎＩ処理したＤＮＡ１μｌを、製造者の指示に従ってＸＬ−１  Ｂｌｕｅ  Ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｅｔｅｎｔ細胞に形質転換した。細胞をＬＢ−アンピシリン寒天平板に塗布し、３７℃で１６時間以上インキュベートした。
【０３９４】
個々の細菌形質転換体コロニーを３７℃で液体選択培地において増殖させ、ＰｒｏｍｅｇａからのＷｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いてプラスミドミニプレップＤＮＡを単離した。その後試料を配列分析に供して、所望ヌクレオチド変化の存在を確認した。
【０３９５】
所望突然変異だけがｐＥＴ２３Ｄ／ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ３４０発現ベクターに組み込まれたこと及び他のＰＣＲ誘発の誤りが存在しないことを確実にするために、正しいヌクレオチド変化を含む配列確認した発現ベクターをＨｐａＩ及びＳａｌＩ制限酵素で消化し、対象突然変異を担う１５８塩基対フラグメントを単離した。このフラグメントを、事前のＰＣＲ増幅に供していないｐＥＴ２３Ｄ／ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ３４０プラスミドに再導入した。生じたプラスミド発現ベクター、ｐＥＴ２３Ｄ／ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ３４０Ａ３００Ｐを、下記の第ＶＩＩＩ章、「ＨｓＣＥＮＰ−Ｅの発現」の中で述べる誘導条件「Ａ」の下でタンパク質発現のためにＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞に形質転換した。
【０３９６】
ＩＶ．ノーザンブロット分析
ノーザンブロット分析は、遺伝子の転写産物の存在を検出するために使用される実験室手法であり、特定細胞型又は組織からのＲＮＡが結合している膜への標識ヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを含む（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、前出、第７章；Ａｕｓｕｂｅｌ，１９９５、前出、第４及び１６章参照）。
【０３９７】
Ｖ．個々のハイブリダイゼーションプローブの標識と使用
配列番号１から誘導されるハイブリダイゼーションプローブを、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡをスクリーニングするために使用する。約２０塩基対から成るポリヌクレオチドの標識を詳細に述べるが、より大きなヌクレオチドフラグメントに関しても基本的に同じ手順を使用する。ＯＬＩＧＯ４．０６ソフトウエア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）などの技術水準のソフトウエアを使用してポリヌクレオチドを設計し、適切な量のオリゴマー、例えば各々のオリゴマー５０ｐｍｏｌ、３２Ｐ−アデノシン三リン酸２５０μＣｉ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＤｕＰｏｎｔ  ＮＥＮ，Ｂｏｓｔｏｎ  Ｍａｓｓ．）を混合することによって標識した。ＳＥＰＨＡＤＥＸ  Ｇ−２５超微細サイズ排除デキストランビーズカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて標識ポリヌクレオチドを実質的に精製する。１０７計数／分の標識プローブを含むアリコートを、次のエンドヌクレアーゼ：ＡｓｅＩ、ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、Ｘｂａｌ又はＰｃｕＩＩ（ＤｕＰｏｎｔ  ＮＥＮ）の１つで消化したヒトゲノムＤＮＡの典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション分析において使用する。
【０３９８】
各々の消化産物からのＤＮＡを０．７％アガロースゲル上で分画し、ナイロン膜（Ｎｙｔｒａｎ  Ｐｌｕｓ，Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｄｕｒｈａｍ  Ｎ．Ｈ．）に移す。ハイブリダイゼーションを４０℃で１６時間実施する。非特異的シグナルを除去するために、ブロットを、０．１ｘクエン酸ナトリウム及び０．５％ドデシル硫酸ナトリウムまでの漸増するストリンジェント条件下に室温で連続的に洗浄する。ＸＯＭＡＴ−ＡＲフィルム（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ  Ｎ．Ｙ．）をブロットに露光して数時間撮影し、ハイブリダイゼーションパターンを視覚的に比較する。
【０３９９】
ＶＩ．マイクロアレイ
一般に、化学的カップリング手順及びインクジェット装置を用いて、基質の表面上にアレイエレメントを合成することができる（例えばＢａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒ、前出参照）。ドット又はスロットブロットに類似のアレイも、熱、紫外線、化学物質又は機械的結合手法を用いて基質の表面にエレメントを配置し、結合させるために使用しうる。典型的なアレイは、手によって又は使用可能な方法と機器を用いて作製することができ、適切な数のエレメントを含みうる。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイズしていないプローブを除去し、スキャナーを使用して蛍光のレベルとパターンを測定する。マイクロアレイ上のエレメントにハイブリダイズする各々のプローブの相補性の程度と相対的存在率を、走査した画像の分析を通して評価しうる。
【０４００】
完全長ｃＤＮＡ、発現配列タグ（ＥＳＴ）又はそのフラグメントは、マイクロアレイのエレメントを含みうる。ハイブリダイゼーションに適するフラグメントは、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウエア（ＤＮＡＳＴＡＲ）などの当技術分野で周知のソフトウエアを用いて選択することができる。本発明のヌクレオチド配列の１つに対応する、あるいは本発明に関連するｃＤＮＡライブラリーからランダムに選択した完全長ｃＤＮＡ、ＥＳＴ又はそのフラグメントを、適切な基質、例えばスライドガラス上に整列する。例えば紫外線架橋とそれに続く熱及び化学的処理及びその後の乾燥を用いてｃＤＮＡをスライドガラスに固定する（例えばＳｃｈｅｎａ，Ｍ．ら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４６７−４７０；Ｓｈａｌｏｎ，Ｄ．ら（１９９６）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．６：６３９−６４５参照）。蛍光プローブを作製し、基質上のエレメントへのハイブリダイゼーションのために使用する。該基質を上述した手順によって分析する。
【０４０１】
ＶＩＩ．相補的ポリヌクレオチド
ＨｓＣＥＮＰ−Ｅコード配列に相補的な配列又はその部分は、天然に生じるＨｓＣＥＮＰ−Ｅの発現を検出する、低下させる又は阻害するために使用される。約１５−３０塩基対を含むポリヌクレオチドの使用を述べるが、より小さい又はより大きい配列フラグメントに関しても基本的に同じ手順を使用する。ＯＬＩＧＯ４．０６ソフトウエア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とＨｓＣＥＮＰ−Ｅのコード配列を使用して適切なポリヌクレオチドを設計する。転写を阻害するために、最もユニークな５’配列から相補的オリゴヌクレオチドを設計し、コード配列へのプロモーター結合を妨げるために使用する。翻訳を阻害するためには、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅコード転写産物へのリボソーム結合を妨げるように相補的オリゴヌクレオチドを設計する。
【０４０２】
ＶＩＩＩ．ＨｓＣＥＮＰ−Ｅの発現
細菌における３４０アミノ酸のＨｓＣＥＮＰ−Ｅモータードメインの発現のための最適条件を調べるために、ｐＥＴ２３Ｄ／ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ３４０構築物に関するパイロット発現試験を実施した。簡単に述べると、ｐＥＴ２３Ｄ／ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ３４０発現構築物を、条件「Ａ」、「Ｂ」及び「Ｃ」としてここで述べる３つの異なる誘導条件下で、ＮｏｖａｇｅｎからのＢＬ２１（ＤＥ３）及びＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細菌株において試験した。
【０４０３】
誘導条件Ａに関しては、該発現プラスミドを担う細菌形質転換体を、持続的に振とうしながら３７℃で液体選択培地においてＯ．Ｄ．６００が０．４になるまで増殖させた。ひとたび適切な光学密度が達成されれば、細胞培養物にＩＰＴＧを添加して最終濃度１００μＭとし、持続的に振とうしながら２５℃で１８−２０時間、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ３４０発現の誘導を進行させた。
【０４０４】
誘導条件Ｂについては、ｐＥＴ２３Ｄ／ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ３４０発現プラスミドを担う細菌形質転換体を、持続的に振とうしながら３７℃で液体選択培地においてＯ．Ｄ．６００が０．６−１．０になるまで増殖させた。その後培養物にＩＰＴＧを添加して最終濃度０．５ｍＭとし、持続的に振とうしながら２５℃で４時間、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ３４０タンパク質発現の誘導を進行させた。
【０４０５】
誘導条件Ｃについては、ｐＥＴ２３Ｄ／ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ３４０発現プラスミドを担う細菌形質転換体を、持続的に振とうしながら３７℃で液体選択培地においてＯ．Ｄ．６００が０．６になるまで増殖させた。その後培養物にＩＰＴＧを添加して最終濃度０．４ｍＭとし、３７℃で３時間、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ３４０タンパク質発現を誘導した。
【０４０６】
ＩＰＴＧの添加前と添加後の細菌試料を各々の誘導条件から採集し、免疫検出のための６Ｘ  Ｈｉｓ  Ｔａｇ抗体（Ｓｉｇｍａからのペルオキシダーゼ複合モノクローナル抗ポリヒスチジン抗体、Ｃｌｏｎｅ  ＨＩＳ−１）を使用したウエスタン分析法によってＨｓＣＥＮＰ−Ｅ３４０タンパク質の発現を評価した。簡単に述べると、細菌細胞ペレットを、ＰｉｅｒｃｅからのＢ−ＰＥＲ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔで抽出した。不溶性物質を遠心分離によってペレット化し、可溶性物質を新しい試験管に移した。不溶性物質をＲＩＰＡ緩衝液（新鮮添加したプロテアーゼ阻害因子錠剤［Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉ，ＲｏｃｈｅからのＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害因子カクテル錠剤］を含むＰＢＳ中、１％ＮＰ４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ）でさらに抽出し、分析のために使用した。
【０４０７】
可溶性及び不溶性物質の抽出物から総タンパク質濃度を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｄｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を製造者の指示に従って使用することによって測定した。各々の試料からの等量のタンパク質をウエスタン法によって分析し、可溶性の生物活性ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ３４０タンパク質の高レベルを発現するためにどの誘導条件が最良であるかを判定した。誘導条件Ａの下で細菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳの使用が、可溶性の生物活性ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ３４０タンパク質を大量に発現するための最良且つ最も好都合な手段を提供すると判定された。
【０４０８】
タンパク質発現及び精製のための方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９５、前出、第１０及び１６章）に述べられている。これらの方法によって得た精製ＨｓＣＥＮＰ−Ｅは、下記の活性測定法において直接使用することができる。
【０４０９】
ＩＸ．ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ活性の実証
ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ活性に関する微小管運動性アッセイは、モータードメインの機能を測定する。このアッセイでは、組換えＨｓＣＥＮＰ−Ｅをスライドガラス又は同様の基質上に固定化する。ＡＴＰ及び細胞質ゾル抽出物を含む溶液中のタキソール安定化ウシ脳微小管（市販されている）をスライド上に流す。ＨｓＣＥＮＰ−Ｅモーター活性によって駆動される微小管の運動を、ビデオ強化型光学顕微鏡と画像分析手法を用いて視覚化し、数量化することができる。ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ活性は微小管運動の頻度と速度に直接比例する。
【０４１０】
Ｘ．機能的アッセイ
哺乳類細胞培養系においてＨｓＣＥＮＰ−Ｅをコードする配列を生理的に高いレベルで発現することによってＨｓＣＥＮＰ−Ｅ機能を評価する。ｃＤＮＡを、高レベルのｃＤＮＡ発現を駆動する強力なプロモーターを含む哺乳類発現ベクターにサブクローニングする。選択ベクターは、いずれもサイトメガロウイルスプロモーターを含む、ｐＣＭＶ  ＳＰＯＲＴ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びｐＣＲ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ  Ｃａｌｉｆ．）を包含する。組換えベクター５−１０μｇを、リポソーム製剤又は電気穿孔法を用いてヒト細胞系統、好ましくは内皮又は造血系由来のヒト細胞系統に一過性にトランスフェクトする。マーカータンパク質をコードする配列を含む付加的なプラスミド１−２μｇをコトランスフェクトする。マーカータンパク質の発現は、トランスフェクト細胞を非トランスフェクト細胞から区別する手段を提供し、組換えベクターからのｃＤＮＡ発現の信頼しうる予測因子である。使用のマーカータンパク質は、市販のマーカー、例えばグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ＣＤ６４又はＣＤ６４−ＧＦＰ融合タンパク質のいずれかを包含する。レーザー光学に基づく自動化手法であるフローサイトメトリー（ＦＣＭ）が、ＧＦＰ又はＣＤ６４−ＧＦＰを発現するトランスフェクト細胞を特定するため、及び細胞特性、例えばそれらのアポトーシス状態を評価するために使用される。ＦＣＭは、細胞死に先立つ又は細胞死と同時に起こる事象を診断する、蛍光分子の取り込みを検出し、定量する。これらの事象は、ヨウ化プロピジウムによるＤＮＡの染色によって測定される核内ＤＮＡ含量の変化；前方光散乱と９０°側方光散乱によって測定される細胞の大きさと粒状度の変化；ブロモデオキシウリジンの取り込みの低下によって測定されるＤＮＡ合成の下方調節；特異的抗体との反応性によって測定される細胞表面及び細胞内タンパク質の発現の変化；及び細胞表面へのフルオレセイン複合アネキシンＶタンパク質の結合によって測定される形質膜組成物の変化を包含する。フローサイトメトリーにおける方法は、Ｏｒｍｅｒｏｄ，Ｍ．Ｇ．（１９９４）Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｎ．Ｙ．の中で論じられている。
【０４１１】
遺伝子発現へのＨｓＣＥＮＰ−Ｅの影響は、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅをコードする配列でトランスフェクトした細胞の高度精製個体群及びＣＤ６４又はＣＤ６４−ＧＦＰのいずれかを用いて評価することができる。ＣＤ６４及びＣＤ６４−ＧＦＰは、トランスフェクトした細胞の表面で発現され、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の保存された領域に結合する。トランスフェクト細胞は、ヒトＩｇＧ又はＣＤ６４に対する抗体（ＤＹＮＡＬ，Ｌａｋｅ  Ｓｕｃｃｅｓｓ  Ｎ．Ｙ．）のいずれかで被覆した磁気ビーズを用いて非トランスフェクト細胞から効率的に分離される。ｍＲＮＡは、当業者に周知の方法を用いて細胞から精製することができる。ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ及び他の対象遺伝子をコードするｍＲＮＡの発現は、ノーザンブロット分析又はマイクロアレイ手法によって分析することができる。
【０４１２】
ＸＩ．ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ特異的抗体の作製
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ；例えばＨａｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｍ．Ｇ．（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：４８８−４９５）又は他の精製手法を用いて実質的に精製したＨｓＣＥＮＰ−Ｅを使用してウサギを免疫し、標準プロトコールを用いて抗体を作製する。
【０４１３】
あるいは、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウエア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いてＨｓＣＥＮＰ−Ｅアミノ酸配列を分析して、高い免疫原性の領域を決定し、対応するオリゴペプチドを合成して、当業者に既知の手段によって抗体を惹起するために使用する。Ｃ末端の近く又は親水性領域内にあるものなどの、適切なエピトープの選択のための方法は当技術分野において広く記述されている（例えばＡｕｓｕｂｅｌ，１９９５，前出、第１１章参照）。
【０４１４】
典型的には、１５残基の長さのオリゴペプチドを、ＡＢＩ４３１Ａペプチドシンセサイザー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）においてｆｍｏｃ化学を用いて合成し、Ｎ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル（ＭＢＳ）との反応によってＫＬＨ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  Ｍｏ．）に結合して、免疫原性を上昇させる（例えばＡｕｓｕｂｅｌ，１９９５，前出参照）。完全フロイントアジュバント中のオリゴペプチド−ＫＬＨ複合体でウサギを免疫する。生じた抗血清を、例えば該ペプチドをプラスチックに結合し、１％ＢＳＡで遮断して、ウサギ抗血清と反応させ、洗浄して、放射性ヨウ素化ヤギ抗ウサギＩｇＧと反応させることによって、抗ペプチド活性に関して試験する。
【０４１５】
ＸＩＩ．特異的抗体を用いた天然に生じるＨｓＣＥＮＰ−Ｅの精製
天然に生じる又は組換えＨｓＣＥＮＰ−Ｅを、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅに特異的な抗体を使用した免疫アフィニティークロマトグラフィーによって実質的に精製する。ＣＮＢｒ−活性化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）などの活性化クロマトグラフィー樹脂に抗ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ抗体を共有結合することによって免疫アフィニティーを構築する。結合後、樹脂を遮断し、製造者の指示に従って洗浄する。
【０４１６】
ＨｓＣＥＮＰ−Ｅを含む媒質を免疫アフィニティーカラムに通し、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅの選択的吸着を可能にする条件下で（例えば界面活性剤の存在下での高イオン強度緩衝液）カラムを洗浄する。抗体／ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ結合を分断する条件下で（例えばｐＨ２−ｐＨ３の緩衝液、あるいは尿素又はチオシアン酸イオンなどの高濃度のカオトロープ）カラムを溶出し、ＨｓＣＥＮＰ−Ｅを収集する。
【０４１７】
ＸＩＩＩ．ＨｓＣＥＮＰ−Ｅと相互作用する物質の特定
ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ又はその生物活性フラグメントを１２５Ｉボルトン−ハンター試薬（例えば、Ｂｏｌｔｏｎら（１９７３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１３３：５２９参照）で標識する。あらかじめマルチウエル平板のウエルに整列しておいた候補分子を標識ＨｓＣＥＮＰ−Ｅと共にインキュベートし、洗浄して、標識ＨｓＣＥＮＰ−Ｅ複合体を含むウエルを検定する。種々の濃度のＨｓＣＥＮＰ−Ｅを使用して得たデータを用いて、候補分子とＨｓＣＥＮＰ−Ｅの数、親和性及び結合に関する数値を算定する。
【０４１８】
本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、上述した本発明の方法及びシステムの様々な変更及び変法が当業者には明白である。本発明を特定の好ましい実施形態に関して説明したが、特許請求される本発明がそのような特定実施形態に不当に限定されないことは了解されるべきである。実際に、分子生物学又は関連分野における当業者には明白な、本発明を実施するための上述した様式の様々な修正は、特許請求の範囲内であることが意図されている。
【０４１９】
（配列の要約）
配列番号１は、ＣＥＮＰ−Ｅ４６５と称する、ヒトＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の新規モータードメインをコードする１３９５塩基対のヌクレオチド配列を開示する。該配列の残りの部分（ｂｐ１３９６−１４８８）は、ｐＴｒｃＨｉｓ２Ｃ発現ベクターに由来するポリリンカーである。
【０４２０】
配列番号２は、配列番号１に示すヌクレオチド配列によってコードされるモータータンパク質のアミノ酸配列：１−４６５アミノ酸である。アミノ酸４６６−４９６はＣＥＮＰ−Ｅモータードメインに由来せず、ｐＴｒｃＨｉｓ２Ｃ発現ベクターによって提供されるリンカー領域プラスｍｙｃエピトープ及び６Ｘ  Ｈｉｓ  Ｔａｇであることに留意されたい。
【０４２１】
配列番号３は、ＣＥＮＰ−Ｅ３４０とも称される、３４０アミノ酸のヒトＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の新規モータードメインをコードする１０２０塩基対のヌクレオチド配列に相当する。該配列の残りの部分（ｂｐ１０２１−１０６５）は、ｐＥＴ２３Ｄ発現ベクターに由来するポリリンカーである。この発現ベクターのさらなる詳細については実施例参照。
【０４２２】
配列番号４は、配列番号３に示すヌクレオチド配列によってコードされるモータータンパク質のアミノ酸配列：３−３４０アミノ酸である。アミノ酸３４１−３５５はＣＥＮＰ−Ｅモータードメインに由来せず、ｐＥＴ２３Ｄ発現ベクターによって提供されるリンカー領域プラス６Ｘ  Ｈｉｓ  Ｔａｇであることに留意されたい。
【図面の簡単な説明】
【０４２３】
【図１】図１（配列番号１）は、ＣＥＮＰ−Ｅ４６５と称する、ヒトＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の新規モータードメインをコードする１３９５塩基対のヌクレオチド配列を開示する。
【図２】図２（配列番号２）は、配列番号１に示すヌクレオチド配列によってコードされるモータータンパク質−４６５アミノ酸のアミノ酸配列である。
【図３】図３（配列番号３）は、ＣＥＮＰ−Ｅ３４０とも称する、３４０アミノ酸のヒトＣＥＮＰ−Ｅタンパク質の新規モータードメインをコードする１０２０塩基対のヌクレオチド配列に相当する。
【図４】図４（配列番号４）は、配列番号３に示すヌクレオチドによってコードされるモータータンパク質−３４０アミノ酸のアミノ酸配列である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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