(57)【要約】  本発明は生体液のウイルス、細菌、原生動物、真菌および他の寄生虫による汚染を減少させる方法を包含する。生体液には血液、血液成分、細胞培養物または細胞培養物の一成分を含有する溶液があるが、これらに限定されない。本発明によれば、容器に入っている血液または血液製剤中の病原体を不活性にする方法であって、前記血液、血液製剤および容器のうち少なくとも１つを本発明の組成物と接触させることからなる前記方法が提供される。本発明によれば、本発明の抗病原体組成物で処理された少なくとも１つの表面を有する、または少なくとも１種の本発明の抗病原体組成物を含有する医療用具が提供される。本発明によれば、液体および生体組織、さらに液体および／または生体組織で汚染された表面を消毒するのに使用される、抗病原体を示す量の少なくとも１種の第４アンモニウム化合物を許容しうる担体と一緒に含有する抗病原体組成物が提供される。本発明の好ましい抗病原体組成物はさらにビスグアニジン化合物を含有する。本発明によれば、試験管内または生体外で生体液中のヒト免疫不全ウイルスの感染または複製を阻害する方法であって、前記生体液を、薬学的に許容しうる担体、例えばＤＭＳＯと組合せた有効に阻害する量のビス−グアニジン化合物またはその誘導体および少なくとも１種の第４アンモニウム化合物で処理することからなる前記方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第４アンモニウム化合物、ビス−グアニジン化合物、並びに第４アンモニウム化合物および表面張力−活性化合物から選択される化合物からなる抗病原体組成物を含有する、液体および生体組織、並びに液体および／または生体組織で汚染された表面の消毒に使用するための抗病原体組成物。
【請求項２】
ビス−グアニジン化合物はクロロヘキシジングルコネートである請求項１記載の抗病原体組成物。
【請求項３】
表面張力−活性化合物はＴｅｒｇｉｔｏｌ  ＮＰ−９およびリン酸トリ−ｎ−ブチルから選択される請求項１記載の抗病原体組成物。
【請求項４】
液体および生体組織は水、水性溶液、血液および血液製剤、移植用皮膚および臓器からなる群より選択される請求項１〜３の何れかに記載の抗病原体組成物。
【請求項５】
表面は容器、フィルター、チューブ、シール、クランプ、移動レッグクロージャ、医療用具、手術台および診察台からなる群より選択される請求項１〜３の何れかに記載の抗病原体組成物。
【請求項６】
容器は生体液の容器または水の容器である請求項５記載の抗病原体組成物。
【請求項７】
容器は血液または血液製剤の容器である請求項５記載の抗病原体組成物。
【請求項８】
容器は献血バッグまたはボトルである請求項５記載の抗病原体組成物。
【請求項９】
血液は全血である請求項１〜３の何れかに記載の抗病原体組成物。
【請求項１０】
血液製剤は血漿、濃縮赤血球、多血小板血漿、濃縮血小板およびクリオプレシピテートからなる群より選択される請求項１〜３の何れかに記載の抗病原体組成物。
【請求項１１】
組成物はクリーム剤、軟膏剤、ローション剤、ゲル剤、粉末、洗浄剤、石鹸、液体または固体の形態である請求項１〜３の何れかに記載の抗病原体組成物。
【請求項１２】
血液、血液製剤および容器のうち少なくとも１つを請求項１〜３の何れかに記載の組成物と接触させることからなる、容器に入っている血液または血液製剤中の病原体を不活性にする方法。
【請求項１３】
請求項１〜３の何れかに記載の抗病原体組成物で処理された少なくとも１つの表面を有する、または請求項１〜３の何れかに記載の少なくとも１種の抗病原体組成物を含有する医療用具。
【請求項１４】
医療用具は生体液の容器である請求項１３記載の医療用具。
【請求項１５】
生体液の容器は献血バッグまたはボトルである請求項１４記載の医療用具。
【請求項１６】
医療用具は個体へ送達される前に血液または血液製剤が通過するインラインフィルターである請求項１３記載の医療用具。
【請求項１７】
医療用具は個体からの採血時に血液または血液製剤が通過するインラインフィルターである請求項１３記載の医療用具。
【請求項１８】
抗病原体組成物を分配するための多孔質媒体をさらに含有する請求項１３記載の医療用具。
【請求項１９】
生体液を容器に採取し、その生体液を請求項１〜３の何れかに記載の抗病原体組成物に暴露することからなる、試験管内または生体外で生体液を処理する方法。
【請求項２０】
試験管内または生体外で生体液中のヒト免疫不全ウイルスの感染または複製を阻害する方法であって、該生体液を、薬学的に許容しうる担体と組合せた阻害有効量のビス−グアニジン化合物またはその誘導体および少なくとも１種の第４アンモニウム化合物で処理することからなる上記方法。
【請求項２１】
担体はＤＭＳＯである請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
試験管内または生体外で赤血球を消毒する方法であって、
ａ）赤血球を、消毒用組成物と、該赤血球に存在する病原体を不活性にするのに十分な時間接触させ、ここで該消毒用組成物は本質的に、消毒する濃度のビス−グアニジン化合物と等張に有効な濃度の溶質の溶液からなり、それにより該消毒用組成物は実質的に血液と等張であり、そして
ｂ）該血球を前記消毒用組成物から単離する
工程からなる上記方法。
【請求項２３】
ビス−グアニジン化合物は第４アンモニウム化合物およびその組合せからなる群より選択される請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
病原体を不活性にした後に該組成物を除去する工程をさらに包含する請求項１２記載の方法。
【請求項２５】
生体液を処理した後に該組成物を除去する工程をさらに包含する請求項１９〜２１の何れかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は血液、血液製剤および血液容器、例えば献血バッグに使用される抗病原体組成物に関する。本発明はまた、一般にヒト血液製剤を処理および消毒する方法に関する。さらに詳しくは、本発明は全血、血液細胞、血漿タンパクおよび血漿を、診断、治療または研究のために安全かつ効果的に使用することができるように、これらを消毒する方法に関する。本発明はまた、病原体、典型的にはウイルス、細菌、原生動物、真菌または寄生虫（寄生虫の寿命の何れかの段階）により引き起こされる病的状態を抑制するための血管系への適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
プラスチック製採血バッグの開発は献血された全血のその各種成分および類似製剤への分離を容易にし、それによりこれらの様々な血液製剤（例えば濃縮血小板）を輸血製剤として使用可能にした。時がたつにつれて研究および臨床データが蓄積し、輸血の方法が大きく変わった。現在の方法の一形態では全血が投与されることは滅多になく、むしろ赤血球を必要とする患者には濃縮赤血球が投与され、血小板を必要とする患者には濃縮血小板が投与され、そして血漿を必要とする患者には血漿が投与される。
【０００３】
しかしながら、血液製剤の輸血増加には被輸血者への病気感染の増加が相伴なう。したがって、病気のない血液供給を確実にすることが従来から求められ、大いに必要である。
ヒトおよび動物のドナーからの血液製剤は治療、診断および実験目的のために幅広く使用されている。ヒトおよび動物のドナーからの血液製剤の使用に伴なう根強い問題は、これらの製剤が血行性ウイルスおよび細菌のような他の微生物による汚染にさらされていることである。特に脅威なのはＢ型肝炎ウイルス、非Ａ、非Ｂ型肝炎ウイルスまたはウイルス群を含む様々な形態の肝炎を引き起こしそうなウイルスである。他に重要なのはサイトメガロウイルスおよびＥＢウイルスである。
【０００４】
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）として知られている治療不能で致命的になることの多い疾患と関係があるウイルスはレトロウイルスまたはレトロウイルス群（ＨＩＶ、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）により生じる。ＡＩＤＳの最も一般的な原因はＨＩＶ−１と考えられる。
【０００５】
輸血および血液製剤投与による肝炎、ＡＩＤＳおよび細菌感染の脅威は血液細胞に限定されず、血漿および血漿分画、例えばVIII因子濃厚液、IX因子濃厚液、ガンマグロブリンおよび坑トロンビンIIIの投与にまで及ぶ。
全血および赤血球、血漿や血漿分画を含む血液製剤をウイルス、細菌および他の微生物を有意に不活性にするのに十分な程強力な消毒剤で消毒することは、病原体を不活性にするのに十分な程強力な活性剤が典型的に細胞の血液成分を損傷する、または血漿および血漿タンパク分画を不活性にするため一般に無視されている。さらに、輸血される血液製剤中に残留する消毒剤の存在は被輸血者にとって有害である。
【０００６】
米国で使用されている典型的な成分分離法であるクエン酸−リン酸−デキストロース−アデニン（CPDA−１）システムは、献血された血液を各成分が実質的な治療的および経済的価値を有する３つの成分に分離する一連の工程を採用している。本法は典型的にフレキシブルチューブを通して少なくとも１個、好ましくは２個またはそれ以上のサテライトバッグと一体化して結合している採血バッグを使用している。遠心法を使用して、全血を差別沈降により血漿、濃縮赤血球（PRC）、きれいな血漿中に懸濁した血小板（多血小板血漿またはPRP）、濃縮血小板（PC）およびクリオプレシピテート（追加処理を必要とする）のような有用な血液成分に分離することができる。
【０００７】
ＣＰＤＡ−１の他に、一般に使用されているシステムにはＡｄｓｏｌ、ＮｕｔｒｉｃｅｌｌおよびＳＡＧ−Ｍがある。これらのシステムにおいて、採血バッグは坑凝血剤だけを含有し、栄養溶液を予めサテライトバッグに入れておくことができる。この栄養溶液はＰＲＰがＰＲＣから分離された後にＰＲＣに移され、それにより高収率の血漿および長いＰＲＣ保存寿命が達成される。現在行なわれているウイルスマーカースクリーニングおよびドナーの自己排除における改良は血液供給の安全性を継続して高めている。しかしながら、これらの方法であるにも関わらず、現在のスクリーニング試験はめったに存在しない、またはまだ知られていない輸血感染可能な病原体を選別しないため、血液の細胞成分の輸血には病原体感染のリスクが依然としてある（Dodd, R. Y.のNew Engl. J. Med., 327, 419〜421 (1992年)；Soland, E. M.らのJ. Am. Med. Assoc.,274, 1368〜1373 (1995年)；Schreiber, G. B.らのNew Engl. J. Med., 334, 1685〜1690 (1996年))。
【０００８】
スクリーニング法に関連する欠点を克服するには、血液、濃縮赤血球（RBCC）および他の血液由来の成分を滅菌する方法の使用により病原体感染の排除が期待できる。これに関して、血液細胞を滅菌するために様々なアプローチが使用されており、今までのところ光化学反応の使用が最も有効である（Ben−Hur, E.およびB. HorowitzのPhotochem. Photobiol. 62, 383〜388 (1995年)；Ben−Hur, E.およびB. Horowitzの“AIDS”, 10, 1183〜1190 (1996年))。最も有望な光化学反応はRBCCを滅菌するためにフタロシアニン（遠赤外線(660〜700nm)により活性化される）を使用している(Horowitz, B.らの“Transfusion”, 31, 102〜108 (1991年)；Ben−Hur, E.らのJ. Photochem. Photobiol. B：Biol. 13, 145〜152 (1992年))。
【０００９】
低温殺菌法および他の物理化学的方法を使用して血液成分を除去したり、または不活性にしたりするが、これらの方法の殆んどは新鮮血漿または新鮮凍結血漿に限定されている。今までのところ、これらの方法は全血の細胞成分を処理するのに適していない。
血液製剤に使用される消毒剤の１つはβ−プロピオラクトンである。しかしながら、β−プロピオラクトンは知られているカルシノーゲンであり、そのため潜在的に非常に危険である。この物質が有意な残留量で実際に輸血される血液製剤中に残存する限り、プロピオラクトンの使用は潜在的に危険である。
【００１０】
米国特許第4,833,165号（1989年5月23日にAllan Louderbackの名前で発行された）には、僅か０.１％のホルムアルデヒドおよび／またはフェノールを使用して血液中のHTLV−IIIを不活性にすることが開示されている。しかしながら、最近入手されるデータおよび情報は、僅か０.０２％のホルムアルデヒドおよび０.０１％のフェノールで処理された赤血球が生存不可能であり、輸血に適していないことを示唆している。
【００１１】
厳しい滅菌法によるウイルス不活性化は、この方法が典型的に赤血球、血小板および不安定な血漿タンパク、例えば凝固因子VIIIを破壊するため容認されていない。生存可能なＲＢＣは次の事柄の１つまたはそれ以上を特徴とする：ＡＴＰを合成する能力；細胞形態；Ｐ50値；ろ過性または変形性；オキシヘモグロビン、メテモグロビンおよびヘモクロム値；ＭＣＶ、ＭＣＨおよびＭＣＨＣ値；細胞酵素活性；並びに生体内での生存。したがって、ウイルス不活性化細胞がＡＴＰを代謝または合成することができない程度に損傷している、あるいは細胞循環が損なわれている場合、輸血医療におけるそれらの使用は危うい。
【００１２】
厳しい蒸気滅菌法によるウイルス不活性化は上記の理由のため容認されていない。湿り蒸気と同様に乾熱滅菌法もまた、ウイルス感染力を減少させるのに必要なレベルでは血液細胞および血中タンパクにとって有害である。炭水化物のような安定剤の使用は高い温度
および圧力への暴露による一般的な影響から傷つきやすい血液細胞および血中タンパクを十分に保護しない。
【００１３】
その後にタンパク質製剤の凍結乾燥が続くことが多い、精製血漿タンパク分画について現在使用されている方法は、有機溶剤での処理および被膜ウイルスの脂質膜を破壊する界面活性剤を用いた加熱または抽出を包含する。凍結乾燥（フリーズ・ドライ）だけではウイルスを不活性にするのに、または血中タンパクを加熱滅菌の効果に対して十分安定にするのに十分でないことがわかっている。精製血中タンパクについて使用される有機溶剤または界面活性剤法は、これらの化学物質が細胞を取り囲む脂質膜を破壊するため血液細胞では使用することができない。
【００１４】
１９５８年に最初に証明された血漿タンパクのウイルス不活性化に関する他のアプローチは紫外線（ＵＶ）照射と共に化合物β−プロピオラクトンの使用を包含している。本法は幾らかの明らかなウイルス不活性化を達成するのに使用される量でのβ−プロピオラクトンの毒性に対する懸念のため、また化学物質により引き起こされるタンパク質の損傷が許容されないレベルであるため米国では容認されていない。同様に、β−プロピオラクトンの爆発の可能性に対する懸念もまた生じている。
【００１５】
光線感作物質および照明を使用してウイルス除染物質を不活性にする試みもまた幾つかの非プソラレン光線感作物質を使用して開発された。使用されている光線感作物質は典型的に色素である。例としてはジヘマトポルフィリンエーテル（ＤＨＥ）、メロシアニン５４０（ＭＣ５４０）およびメチレンブルーが挙げられる。
【００１６】
血液および血液製剤、並びに血液容器、例えば献血バッグに使用される抗病原体組成物を提供することが非常に望まれる。
ヒト血液製剤を処理および消毒する方法を提供することが非常に望まれる。
全血、血液細胞、血漿タンパクおよび血漿を、診断、治療または研究のために安全かつ効果的に使用することができるように、これらを消毒する方法を提供することが非常に望まれる。
病原体、典型的にはウイルス、細菌、原生動物、真菌または寄生虫により引き起こされる病的状態を抑制するための血管系への適用法を提供することが非常に望まれる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の目的は血液、血液製剤および血液容器、例えば献血バッグに使用される抗病原体組成物を提供することである。
本発明の他の目的はヒト血液製剤を処理および消毒する方法を提供することである。
本発明の他の目的は全血、血液細胞、血漿タンパクおよび血漿を、診断、治療または研究のために安全かつ効果的に使用することができるように、これらを消毒する方法を提供することである。
本発明の他の目的は病原体、典型的にはウイルス、細菌、原生動物、真菌または寄生虫により引き起こされる病的状態を抑制するための血管系への適用法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明によれば、液体および生体組織、さらに液体および／または生体組織で汚染された表面を消毒するのに使用される、抗病原性を示す量の少なくとも１種の第４アンモニウム化合物を許容しうる担体と一緒に含有する抗病原体組成物が提供される。
本発明の好ましい抗病原体組成物はさらにビスグアニジン化合物を含有する。
本発明の好ましい抗病原体組成物において、第４アンモニウム化合物は２種またはそれ以上の第４アンモニウム化合物の混合物からなる。
【００１９】
液体および生体組織は水、水性溶液、血液（すなわち全血）および血液製剤、移植用皮膚および臓器からなる群より選択され得る。
表面は容器、フィルター、チューブ、シール、クランプ、移動レッグクロージャ、医療用具、手術台および診察台からなる群より選択される。
容器は生体液の容器または水の容器であってよい。
容器は血液または血液製剤の容器、例えば献血バッグまたはボトルである。
血液製剤は血漿、濃縮赤血球、多血小板血漿、濃縮血小板およびクリオプレシピテートからなる群より選択される。
本組成物はクリーム剤、軟膏剤、ローション剤、ゲル剤、粉末、洗浄剤、石鹸、液体または固体の形態である。
【００２０】
本発明によれば、容器に入っている血液または血液製剤中の病原体を不活性にする方法であって、前記血液、血液製剤および容器のうち少なくとも１つを本発明の組成物と接触させることからなる前記方法が提供される。
【００２１】
本発明によれば、本発明の抗病原体組成物で処理された少なくとも１つの表面を有する、または少なくとも１種の本発明の抗病原体組成物を含有する医療用具が提供される。
医療用具は生体液の容器、例えば献血バッグまたはボトル；個体への送達前に血液または血液製剤が通過するインラインフィルター；および個体からの採血時に血液または血液製剤が通過するインラインフィルターである。
本発明の好ましい医療用具はさらに前記抗病原体組成物を分配するための多孔質媒体を含有する。
【００２２】
本発明によれば、生体液を容器に採取し、その生体液を本発明の抗病原体組成物に暴露することからなる試験管内または生体外で生体液を処理する方法が提供される。
本発明によれば、試験管内または生体外で生体液中のヒト免疫不全ウイルスの感染または複製を阻害する方法であって、前記生体液を薬学的に許容しうる担体、例えばＤＭＳＯと組合せた有効に阻害する量のビス−グアニジン化合物またはその誘導体および少なくとも１種の第４アンモニウム化合物で処理することからなる前記方法が提供される。
【００２３】
本発明によれば、試験管内または生体外で赤血球を消毒する方法であって、
ａ）前記赤血球を、消毒用組成物と、前記赤血球に存在する病原体を不活性にするのに十分な時間接触させ、ここで前記消毒用組成物は本質的に、消毒する濃度のビス−グアニジン化合物と、等張に有効な濃度の溶質の溶液からなり、それにより前記消毒用組成物は実質的に血液と等張であり、そして
ｂ）前記血液細胞を前記消毒用組成物から単離する
工程からなる前記方法が提供される。
【００２４】
本発明の好ましい方法において、ビス−グアニジン化合物は第４アンモニウム化合物およびその組合せからなる群より選択される。
本発明の好ましい方法はさらに病原体を不活性にした後に本組成物を除去すること、または生体液を処理した後に本組成物を除去することを包含する。
本発明は血液成分の治療的輸血のために献血を処理するシステム、特に病原体のない、または病原体を不活性にした血液または血液成分を作成するための改良された方法および装置に関する。本発明はまた処理された生体液をその種々の成分に分離する生体液分離システムに関する。
【００２５】
本発明は赤血球組成物に含まれる病原体、例えば感染性のウイルスおよび／または細菌
のレベルを減少させる組成物および方法に関する。特に、本発明者らは赤血球組成物を第４アンモニウム化合物のような１種またはそれ以上の張力活性な界面活性剤を有する組成物中の、またはそれと一緒のビスグアニジン化合物に暴露することは、赤血球または他の血液成分に損傷を与えることなく、血液または血液製剤を輸血するべく十分に病原体を不活性にすることを見出した。
【００２６】
引用された文献はすべて全体として参照により本明細書に加入される。
本発明は全血および血液製剤の効果的および安全な消毒を包含する。本発明は輸血用全血、血液細胞、血漿および血漿タンパクのようなすべての血液製剤に幅広く適用される。全血はめったに使用されないため、本発明は特に赤血球および／または血漿を含有する組成物を消毒する方法に関する。
【００２７】
本発明は活性剤として第４アンモニウム化合物のような１種またはそれ以上の張力活性な界面活性剤を含有し、血液または血液製剤を消毒するために使用するのに適した組成物である。
本発明はまた、血液または血液製剤を本発明の１種またはそれ以上の化合物または活性剤を含有する組成物と接触させることを包含する血液または血液製剤を処理する方法であり、前記化合物は血液中の１種またはそれ以上の病原体を不活性にするのに十分で、そして本化合物による病原体の不活性化を可能にする量で存在する。本法はさらに血液または血液製剤から本化合物を除去することを包含することができる。
本発明はまた、移植に使用される組織および臓器のウイルス不活性化に応用することができ、皮膚または上皮疾患の治療あるいは局所的汚染除去のために局所用クリーム剤、軟膏剤、ローション剤、ゲル剤、粉末、液体、固体、洗浄剤または石鹸として使用することができる。
本発明はまた、特に生の、自力で生きられない、または弱毒化されたウイルス性ワクチンを産生する人間または動物に使用されるウイルス性ワクチンの製造において使用することができる。
【００２８】
本発明は生体液のウイルス、細菌、原生動物、真菌および他の寄生虫による汚染を減少させる方法を包含する。生体液には血液、血液成分、細胞培養物または細胞培養物の一成分を含有する溶液があるが、これらに限定されない。本法は液体状態の組成物をウイルス、細菌、原生動物、真菌または寄生虫と結合することができる本発明の組成物と混合することからなる。
【００２９】
本発明はまた、医療用具を本発明の１種またはそれ以上の化合物または活性剤を含有する組成物と接触させることを包含する、医者、看護士、血液または血液製剤を採取する医療技術者、あるいは歯医者により使用されるような医療用具のウイルス、細菌、原生動物、真菌および他の寄生虫による汚染を減少させる方法であり、前記化合物は医療用具の中または上にいる１種またはそれ以上の病原体を不活性にするのに十分で、そして本化合物による病原体(複数可)の不活性化を可能にする量で存在する。本法はさらに医療用具から本化合物を除去することを包含することができる。
【００３０】
「医療用具」なる用語は動物または人体の検査、清浄、体液採取または医療介入に使用される何れかの道具を意味する。このような道具にはプローブ、外科用メス、クランプ、鉗子、注射針、唾液または血液を除去するための吸引装置（該装置にはあらゆるノズル、シール、チューブ、フィルター、容器および貯蔵所が含まれる）、内視鏡、光ファイバー、変換器、ワイヤー、外科用ループ、並びに個体への送達前および／または個体からの採血時にそれを通して血液または血液製剤が通過するインラインおよびアウトラインのチューブおよびフィルターのような外科手術用器具があるが、これらに限定されない。
【００３１】
本発明はまた、スイミングプール、ホットタブ、ジャグジー、バス、ジェット噴流バス、エアコンおよび加湿器で見られるような水または水の容器を本発明の１種またはそれ以上の化合物または活性剤を含有する組成物と接触させることを包含するウイルス、細菌、原生動物、真菌および他の寄生虫による水または水の容器の汚染を減少させる方法であり、前記化合物は水中または水の容器の上にいる１種またはそれ以上の病原体を不活性にするのに十分で、そして本化合物による病原体の不活性化を可能にする量で存在する。本法はさらに水または水の容器から本化合物を除去することを包含することができる。このような水および水の容器は家庭、ホテル、スパ、リゾート、オフィスまたは貯蔵庫で見られるようなものである。
【００３２】
本発明はまた、特定の血液型に特異的な１種またはそれ以上の組成物を包含する。
本発明はまた、本発明の１種またはそれ以上の化合物を含有する血液の容器など、例えば血液または血液製剤の輸血バッグである。
本発明の最も好ましい態様において、活性剤として第４アンモニウム化合物を単独または混合物で含有する組成物は血液または血液製剤と混合され、血液を消毒するために使用される。本組成物は血液、血液製剤、生体組織および他の生体液を処理するのに効果的である。活性剤はウイルス、細菌、原生動物、寄生虫、真菌および他の病原体を含むがこれらに限定されない広範囲の病原体に対して有用である。最も好ましい組成物は１種またはそれ以上の第４アンモニウム化合物および場合によりビス−グアニジン化合物を含有する。
【００３３】
血液製剤を消毒するための好ましい方法によれば、全血および血液製剤中でＨＩＶウイルスを含むウイルスおよび細菌が不活性にされる方法が提供される。一度消毒された血液および血液製剤は治療または診断のために安全かつ有効に使用することができる。本発明は本化合物が赤血球を溶解しない、または血液製剤に害を及ぼさないため、血液または血液製剤から病原体を除去するための消毒剤として有用であるという予想外の発見に基づいている。さらに、血液と等張でなく、今まで血液製剤での使用が考慮されていなかったこれらの化合物を含有する消毒剤組成物はタンパク質を変性させることなく、または生理活性の実質的な損失を引き起こすことなく血漿および血漿タンパクを消毒するために使用することができる。
【００３４】
本発明によれば、消毒する濃度の活性剤または化合物および希釈剤からなる消毒剤組成物を用意し、次に全血または血液製剤を、消毒用組成物と、血液または血液製剤中に存在する病原体を不活性にするのに十分な時間混合する工程を包含する全血または血液製剤を消毒する方法が提供される。混合工程は血液を組成物の各成分と別々に混合することにより、または全組成物と直接混合することにより、または組成物の１種またはそれ以上の成分を加える時間を調節することにより行なうことができる。血液または血液製剤を消毒した後、活性剤または化合物を場合により消毒用組成物から分離することができ、それにより治療または診断で使用するための安全かつ有効な血液または血液製剤が得られる。
【００３５】
「薬学的に許容しうる担体」なる用語は、前記第４アンモニウム化合物を抗病原性を示す有効濃度で可溶化および／または希釈するために使用することができる担体を意味し、例えば塩水、緩衝剤、ＤＭＳＯおよびデキストロースがあるが、これらに限定されない。
【００３６】
「ビス−グアニジン化合物」および「第４アンモニウム化合物」なる用語は、すべての第４アンモニウム化合物およびそれらの誘導体を意味し、例えば塩化ジデシルジメチルアンモニウム、すべてのジアミノプロピルラウリルアミン化合物、ノノキシノール−９化合物、ビス−グアニジン化合物およびそれらの誘導体があるが、これらに限定されない。
【００３７】
「化合物」なる用語はまた、単独の、あるいは他の化学薬品または物質と化合させた、
例えばＤＭＳＯを含むがこれに限定されない混合液中の上記化学薬品を包含する。好ましい活性剤はアルキルトリメチル第４アンモニウムクロルヘキシドリン（およびそれらのハロゲン化物）；ジアルキルジメチルベンジル第４アンモニウムクロルヘキシドリンである。典型的な第４アンモニウム化合物はMarchisioらのJ. Biomater. Sci. Polymer Edn. 6, 533〜539 (1994年)およびCadwalladerらのJ. Pharm. Sci., 7, 1010〜1012 (1965年)に記載されており、これらは全体として参照により本明細書に加入される。
【００３８】
活性剤を含有する組成物はまた、所望により１種またはそれ以上の追加化合物を含有することができる。これらの化合物にはＤＭＳＯ、あるいは細胞表面の極性を変化させる他の物質；１種またはそれ以上のアミノ酸；希釈剤；１種またはそれ以上の塩化物、例えば塩化銀；および／またはＥＤＴＡが含まれる。
【００３９】
下記で説明されるように、上記で特定された化合物は生理活性の実質的な損失なしに血液および血液製剤を効果的に消毒する。血液または血液製剤をウイルス、細菌、原生動物、真菌および寄生虫のような病原体を不活性にするのに十分な酸化作用を有する酸化化合物で消毒することもまた本発明の教示の範囲内であると考えられる。
【００４０】
「液体」なる用語は水、水性溶液および生体液を意味する。
「生体組織」なる用語は移植に使用される皮膚および臓器を意味する。
本明細書で使用される「生体液」とは患者または患者の循環系に直接注入することができる液体を意味する。典型的な生体液には全血；抗凝固処理全血(AWB)；AWBから得られる濃縮赤血球；AWBから得られる多血小板血漿(PRP)；AWBまたはPRPから得られる濃縮血小板(PC)；AWBまたはPRPから得られる血漿；血漿から分離し、生体液中で再懸濁した赤血球；および血漿から分離し、生体液中で再懸濁した血小板があるが、これらに限定されない。血液製剤または生体液には生体と関係がある何れかの処理または未処理液体、特に全血、温血、冷血、保存血液または新鮮血を含む血液；例えば塩水、栄養液および／または抗凝血剤溶液を含むがこれらに限定されない生理溶液で希釈された血液を含む処理血液；１種またはそれ以上の血液成分、例えば濃縮血小板(PC)、多血小板血漿(PRP)、血小板を含まない血漿、血小板の少ない血漿、血漿または濃縮赤血球(PRC)；血液または血液成分由来、あるいは骨髄由来の類似血液製剤もまた含まれる。生体液は白血球を含有してもよく、または白血球を除去するために処理してもよい。本明細書で使用される「血液製剤または生体液」とは上記成分、さらに他の手段により得られる類似の特性を有する類似の血液製剤または生体液を意味する。本発明によれば、これらの血液製剤または生体液はそれぞれ本明細書で開示した方法で処理することができる。
【００４１】
本明細書で使用される「病原体」とは感染を引き起こす１種またはそれ以上の微生物などを意味する。典型的な病原体にはウイルス、細菌、寄生虫、原生動物または真菌があるが、これらに限定されない。典型的なウイルスには単純ヘルペスウイルス、ＨＩＶ、肝炎、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、呼吸器合胞体ウイルス、ブルータングウイルスおよびウシ下痢症ウイルスがあるが、これらに限定されない。ウイルスはまた、サイトメガロウイルス、ＥＢウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型およびII型、血中を自由に循環する他のウイルス、並びに細胞関連ウイルスを包含する。典型的な細菌にはヘリコバクター・ピロリ、大腸菌、シュードモナス属、例えば緑膿菌、ブドウ球菌、プロテウス・ブルガリスおよびカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）があるが、これらに限定されない。典型的な真菌にはアスペルギルス属の真菌があるが、これらに限定されない。典型的な寄生虫にはアメーバ（Ameoba）、マラリヤ病原虫（Plasmodium）、リーシュマニア（Leishmania）、深在性マイコサス（Mycosus profundus）、トリパノソーマ（Trypanosoma）、スピロヘータ（Spirochete）およびアルボウイルスがあるが、これらに限定されない。
【００４２】
本発明の好ましい態様において、処理される病原体は血液または血液製剤中で不活性に
するのに適しているものである。感染性病原体の量を減少させることは換言すれば全てまたは実質的に全ての感染性病原体を破壊および／または不活性化することを意味する。本発明の好ましい態様において、感染性病原体の量を減少させることは血液または血液製剤を輸血できるように、または他の形で使用できるように病原体を十分に破壊または不活性化することを意味する。
【００４３】
本発明によれば、適当な希釈剤は等張液の製造で使用される化合物の何れかである。典型的な溶質にはデキストロースおよびグルコースのような糖、デキストランのような多糖、アルブミン、並びに塩化ナトリウム、塩化カリウムおよび臭化カリウムを含むアルカリ土類金属の塩があるが、これらに限定されない。生理的細胞および組織を保存するのに使用できることが知られている溶質の組合せもまた好適であり、クエン酸塩−リン酸塩−デキストロース、クエン酸塩−リン酸塩−デキストロース−アデニンおよび塩水−マンニトール−デキストロース−アデニンのような組合せがある。下記でより詳細に説明されるように、糖は消毒工程中に生成するメテモグロビン(酸化ヘモグロビン)の減少に寄与するため、希釈剤中に少なくとも１種の溶質が糖形態で存在することが好ましい。
【００４４】
等張性があるため本発明の実施に使用可能な希釈剤を組合せることができる。希釈剤を組合せることは商業的な集合単位の赤血球がACID（酸−クエン酸塩−デキストロース）、CPD（クエン酸塩−リン酸塩−デキストロース）、CPD−A（CPD−アデニン）のような坑凝血剤を含有する等張液中で保存されることが多いため、赤血球を消毒する場合に特に好適である。したがって、坑凝血剤の等張液中で保存された集合単位の赤血球を消毒する場合、消毒剤組成物は異なる等張性希釈剤、例えば生理食塩水中で調製し、坑凝血剤溶液と混合することができる。
【００４５】
さらに、本発明によれば、血漿または血漿製剤、例えば血漿タンパク分画を消毒する方法は、溶質を含まず、希釈剤が滅菌水、水、蒸留水または滅菌蒸留水である消毒用組成物を場合により利用する。血漿および血漿製剤は組織または他の形態の細胞物質を含有しないため、細胞の浸透圧を維持するための等張性媒質を必ずしも有する必要がない。
消毒剤組成物を血液または血液製剤と混合することは、血液または血液製剤および消毒剤組成物を適当な容器中で簡単に混ぜ合わせて、血液と消毒剤組成物の十分な相互作用を確実にするために軽く攪拌することにより行なうことができる。適当な容器には血液採取バッグおよび血液保存用具があるが、これらに限定されない。しかしながら、当該技術分野で知られている自動細胞洗浄装置を使用することが好ましく、それらはＣｏｂｅ社などのいろいろなメーカーから入手できる。
【００４６】
本発明によれば、第４アンモニウム化合物、好ましくはビス−グアニジン化合物と関連する第４アンモニウム化合物の消毒するのに有効な濃度、並びに血液および血液製剤を消毒するのに十分な時間は主に化合物の選択に依存する。本組成物の各成分の有効濃度および消毒時間は相互に依存し合うこともまた理解されよう。したがって、化合物濃度は変動し、血液または血液製剤と長時間混合する場合は１種またはそれ以上の活性剤について比較的低い濃度が消毒するのに有効な濃度となる。反対に、比較的高い濃度の活性剤が消毒剤組成物で使用される場合、血液または血液製剤を消毒するのに十分な時間は短い。
【００４７】
血液または血液製剤を消毒するための典型的な方法は最初に血液をＤＭＳＯと混合し、攪拌し、第４アンモニウム化合物またはビス−グアニジン化合物のような界面活性剤を活性剤が沈殿しないような量で加え、そして攪拌することを包含する。本法は場合により活性剤を血液組成物から除去する工程をさらに包含する。
本発明はまた、血液または血液製剤を容器に採取し、場合により血液製剤、例えば血漿を除去または分離し、そして血液または血液製剤を血液または血液製剤中の病原体を不活性にするのに十分な量の活性剤を含有する組成物と接触させることからなる血液を採取お
よび処理する方法を包含する。
【００４８】
生体液処理装置で使用される容器は生体液、例えば全血または血液成分と適合し、遠心分離および滅菌条件に耐えられる材料で構成される。これらの容器はすでに幅広く当該技術分野で知られている。例えば、採血およびサテライトバッグは典型的に可塑化ポリ塩化ビニル、例えばジオクチルフタレート、ジエチルヘキシルフタレートまたはトリオクチルトリメリテートで可塑化されたＰＶＣから製造される。バッグはポリオレフィン、ポリウレタン、ポリエステルおよびポリカーボネートから製造することもできる。
【００４９】
本明細書で使用される「チューブ」とは、容器間の流体通路となる導管または手段を意味し、典型的には容器で使用されるのと同じ可撓性材料、好ましくは可塑化されたＰＶＣから製造される。チューブは容器の内部に及んでよく、例えばサイフォンとして使用することができる。個々の容器との流体通路となるチューブが幾つか存在してもよく、それらのチューブは幾つかの方向に配向させることができる。例えば、採取バッグの上部またはバッグの下部に少なくとも２個のチューブが存在しても、あるいはバッグの両端に１個のチューブが存在してもよい。
【００５０】
シール、バルブ、クランプ、移動レッグクロージャ（transfer leg closure）などは典型的にチューブの中または上に位置する。本発明は容器または容器を接続する導管を構成するのに使用される材料の種類により制限されない。
幾つかの追加容器は生体液処理システムとつながっており、別の流路を定めるために使用することができる。例えば、生体液を含有する追加のサテライトバッグは生体液処理システムとつないで配置することができる。
【００５１】
本発明によれば、生体液の採取および処理装置は典型的には放射線滅菌（約２.５メガラド）、および／またはオートクレーブ処理（約１１０℃〜約１２０℃で約１５〜６０分間）、および／または遠心分離（典型的には約２５００Ｇ〜３５００Ｇで約５〜１５分間；しかしながら、生体液成分の回収率が最大になることを目的とする場合、遠心分離は約５０００Ｇで約１０〜２０分間行なってもよい）からなる厳しい滅菌および遠心分離条件に耐えられるものでなければならない。
次の実施例を参照することにより本発明はより容易に理解されるが、該実施例は本発明を詳しく説明するためのものであって、その範囲を制限するものではない。
【実施例】
【００５２】
〔実施例１〕ＨＩＶ−１ウイルス活性を阻害する試験の方法
様々な実験法を使用してHIVの阻害についてビス−グアニジンを選別することができる。ある方法はヒト末梢血単核細胞（PBM）におけるウイルス複製の阻害を包含する。発生したウイルスの量は培地に存在するウイルス−コード化逆転写酵素（レトロウイルスで見られる酵素）の量を測定することにより定量される。他には、細胞を含まない系で精製逆転写酵素活性の阻害を測定することからなる方法がある。当業者に知られているスクリーニング法の例は下記でより詳細に説明される。
【００５３】
ヒト末梢血単核細胞(PBM)におけるＨＩＶ−１の複製を阻害する坑ウイルス剤の試験法
ＨＩＶ−１およびＢウイルス血清反応陰性のドナーからの細胞をFicoll−Hypaque不連続勾配遠心法により1,000回／ｇで３０分間遠心することにより単離し、PBS中で２回洗浄し、そして１０分間300回／ｇでペレット化する。感染前に、細胞を１６.７μg／mlの濃度のフィトヘムアグルチニン(PHA)により、１５％加熱不活性化ウシ胎仔血清、１.５mMのＬ−グルタミン、ペニシリン（100Ｕ／ml）、ストレプトマイシン（100μg／ml）および４mM重炭酸ナトリウム緩衝液を補足したRPMI 1640培地中で３日間刺激する。
ＨＩＶ−１（LAV−１株）はアトランタの疾病防疫センターから入手し、ＰＨＡを含まず、７％インターロイキン−２（Advanced Biotechnologies社、シルバースプリング、メリーランド州)、７μg／mlのＤＥＡＥ−デキストラン（Pharmacia社、ウプサラ、スウェーデン）および370Ｕ／mlの抗ヒト白血球(α)インターフェロン（ICN, Lisle, III）を補足した上記のようなRPMI 1640培地を使用してＰＨＡ−刺激ヒトＰＢＭ細胞において増殖させる。ウイルスは細胞を含まない培養上清から得られ、使用するまで−７０℃で一定量に分けて保存する。
【００５４】
細胞培養に使用される培地
Ｔ細胞で行なわれている細胞毒性の試験では、その培地は１０％ウシ胎仔血清(BIO−LAB)、１％グルタミン(GIBCO)、１％抗生物質(PSN, GIBCO)を補足したRPMI 1640である。
ウイルス調製液の処理後に残留する感染強度の試験では、正常ヒトＴリンパ球の培地（完全培地）は上記培地に１０％インターロイキンII、ポリブレン（２mg／ml）およびヒト抗インターフェロン血清（1.2500 (M.A.Reyら), Biochem. Biophys. Res. Com., 121 126〜133(1984年))を加えたものである。
【００５５】
細胞
細胞毒性は未熟Ｔリンパ球系のＣＥＭ細胞クローンにおいて試験される。
感染力は、健康なヒトドナーの抹消血から得られ、Ficoll勾配法により分離されたＴリンパ球において試験される。
リンパ球は１／５００に希釈したフィトヘムアグルチニンＰ（PHA P）により３日間刺激し、完全培地で培養する。残留する感染強度を明らかにするために、芽球Ｔ細胞に、処理した、または処理していないウイルスを感染させる。
【００５６】
ＨＩＶ−１ウイルス
ウイルスはＨＩＶ−１に感染したＣＥＭ細胞の培養上清から得られる。このＨＩＶ−１に感染したＴリンパ芽球状細胞はウイルス産生に使用される。
使用される上清物質の力価はウイルスの逆転写酵素活性（ATI）の定量分析後に評価される。
次の試験では上清物質を使用し、そのＡＴＩは１.８×１０6 cpm／mlであった。
【００５７】
方法
Ｔ細胞に対する化合物の細胞毒性試験
細胞：１×１０6細胞／mlのＣＥＭクローンの細胞懸濁液。
製剤：RPMI 1640培地による様々な希釈液は化合物のＱＡＣ, バルダック２２(R)から調製される。
２４ウェルの細胞培養プレートにおいて、０.５mlの各希釈液を０.５mlのＣＥＭクローン（5×105細胞）の細胞懸濁液と一緒に培養器中、３７℃でインキュベートする。
細胞増殖は細胞懸濁液を未処理細胞からなる対照と比較してトリプタンブルー(R)でカウントした後に評価される。
【００５８】
正常ヒトＴリンパ球（MLC）に対するＨＩＶ−１ウイルスの感染能力における単独または組合せたバルダックの作用
ウイルス溶液の調製：１mlのウイルス上清（ATI 1.8×106cmp／ml）を入れた数本のチューブを超遠心分離法により濃縮する。得られる残留ウイルスを無菌の再蒸留水中に作成したＱＡＣの様々な希釈液のそれぞれに、または水（未処理の対照ウイルス）に取る。
ウイルス調製液の処理：濃縮したウイルス調製液をすべて次の手順に従って処理する：
処理したウイルス試料：超遠心分離法により濃縮した残留ウイルスを100μlの各濃度の試験製剤（QAC）中で再懸濁し、１０分間インキュベートする。
対照のウイルス試料：未処理の対照ウイルス：製剤の代わりに100μlの無菌の再蒸留水を使用する。
この１０分間のインキュベーション後、各試料中に存在するウイルスをリンスし、１２mlのRPMI 1640培地を加えて超遠心分離法により再び濃縮する。次に、残留ウイルスを１mlの完全培地に取り、正常ヒトＴリンパ球に感染させるのに使用する。
各試料の感染力の測定：４×１０6正常ヒトＴリンパ球を上記の処理した各ウイルス調製液または対照で感染させる。Ｔ細胞の感染は前記の方法（F.Barre Sinoussiらの“Science”, 220, 868〜871(1983年)）に従って行なわれる：要約すると、１mlの完全培地で４×１０6細胞の懸濁液を１mlの処理した各ウイルス調製液または対照と一緒に３７℃で１時間インキュベートする。
数ミリリットルの培地を使用して２回洗浄した後、細胞懸濁液を１×１０6細胞／mlの濃度に調整する。感染日を第０日とする。
対照細胞：すべての他の試料と同じ条件下で４×１０6Ｔリンパ球を培養し、３または４日毎に感染させる。
この対照は処理過程でのウイルス産生の陰性対照である。
時間経過中のウイルス産生は下記の方法を使用して培養上清に存在する逆転写酵素活性を測定することにより定量される。
【００５９】
対照のウイルス調製液および製剤により処理したウイルス試料の逆転写酵素活性の測定
この定量分析により初期試料中の非不活性化残留ウイルスの存在を評価することができる。それは２または３日毎に採取された１mlの培養上清および超遠心分離法に基づいて行なわれる。
酵素活性は５０mMのトリス(pH７.８)、２０mMのMgCl2、 ２０mMのKCl、２mMのジチオトレイトール、０.２５ＯＤ／mlのオリゴｄＴ、０.２５ＯＤ／mlのポリｒＡ、０.１％トリトンＸ１００および２.５μCiの３Ｈ DTTPを含有する５０μlの反応混合物中で測定される。
３７℃で１時間インキュベートした後、１０μlの０.２Ｍ EDTAを加えて反応を終了させ、試料をＤＥ８１膜に付着させる。
５％ Na2HPO4、次に蒸留水を使用して数回洗浄した後、膜を乾燥し、βシンチレーション計数器（PACKARD社）により放射能を測定する。
【００６０】
結果
表１はＨＩＶ−１ウイルスの感染力における種々の製剤によるウイルス試料の処理効果を示す。
【００６１】
【表１】
2005509654.tif 000002
【００６２】
表Ｉは明らかに低濃度（濃度0.002 + 0.002）のバルダック(R)／クロロヘキシジンジグルコネートの組合せによる相乗作用、すなわち第３０日にウイルスがいないことを示しており、実際に２種の製剤は同一濃度で単独使用される場合は殺ウイルス性ではない。
【００６３】
〔実施例２〕ＨＢＶウイルスにおける本発明の組成物の殺ウイルス作用
Ｂ型肝炎ウイルスのＢ型肝炎ウイルス抗原(AgHB)の試験管内分解における作用：殺ウイルス剤＋Ｂ型肝炎の患者から採取したヒト血清（１／1000)
【００６４】
【表２】
2005509654.tif 000003
【００６５】
【表３】
2005509654.tif 000004
【００６６】
０.１％バルダック(R)および０.１％ＣＨＧを含有する混合物は０.２％バルダック(R)を単独で使用した場合と比べてその投与量が５０％少ないにもかかわらず興味深い活性を示す。
【００６７】
試験した様々な混合物における一般的な結論
残留Ｂ型肝炎ウイルスの抗原だけが試験したバルダック(R)−ＣＨＧ混合物の識別を可能にする。
０.０２５％ＣＨＧと組合せた０.０２％バルダック(R)は０.１％バルダック(R)と同程度の有効性があると考えられる。バルダック(R)は特にエラストマーに対して毒性であるため、この５分の１への減少は特にエラストマー材料に関連する本発明の組成物の使用において有意かつ重要である。
【００６８】
〔実施例３〕単純ヘルペスウイルス（HSV）に対する本発明の組成物の殺ウイルス作用
試験管内試験
実施した試験
ウイルス株：これはヘルペスウイルスホミニス１型の株、Ｂｅｙ株（HSV1）であり、ヒト線維芽細胞またはＫＢ細胞で生かされており、どちらかのタイプの細胞で幾つかの重要な変化が生じている。
接種材料から殆んどの細胞残屑を除去する前遠心処理なしに、少なくとも８０％の細胞が達した細胞変性効果が得られた後−８０℃で凍結されたウイルスバッチが使用される；実際にウイルスの感染力は細胞外で非常に急速に消失し、その結果ウイルス粒子がまだ細胞残屑に存在しうるウイルスバッチを使用する場合は生体内感染の実態により近いものであると考えられる。
【００６９】
このバッチをヒト線維芽細胞において−８０℃に維持した０.５mlのアリコート部分に分配した後に滴定した：
・１０倍に希釈し、８個の培養管に希釈：１０6mlにより接種し、そして
・ペトリ皿（３５mm）に培養物を接種し、液体培地中に放出されるウイルス粒子を中和するために抗−ＨＳＶ１血清をその上澄みに加えることにより、ゾーンのカウントを可能にする（１０-4に希釈した０.５mlのウイルス溶液を接種した皿１個あたり１００〜１５０単位を形成するゾーン）。
細胞毒性のチェックは試験で使用される細胞培養物、すなわちヒト線維芽細胞に対する製剤に関して行なわれる。
細胞は１０％ウシ胎仔血清を補足したダルベッコ培地で培養する；使用時に、細胞を洗浄し、同じ培地であるがウシ胎仔血清を含まない培地を使用する。
各試験製剤または各組成物について、１０個の細胞培養管を使用し、製剤の接種後に培養管を３日間観察し続けた。
【００７０】
種々の製剤を単独で使用して観察された作用
各製剤をそのままで、および１０-1、１０-2、１０-3に希釈して連続的に使用し、１mlの栄養培地を含有する培養管に０.１mlの容量で加えた。
【００７１】
結果
・バルダック(R)の０.０４％溶液：１０-3の希釈度では非毒性
・クロロヘキシジンジグルコネートの０.０５％溶液：非毒性
【００７２】
観察された即時の殺ウイルス作用
活性の測定：０.２mlのウイルス懸濁液を０.２mlの試験化合物の何れかの希釈液と混合する。次に、製剤の活性を停止する１０-4の割合で０.２mlの混合物を希釈する。この希釈した混合物を直径６cmのペトリ皿で培養したベロ細胞の層に１mlの容量で付着させる。
１時間吸着させた後、その上澄み液を取り除き、動物血清を含まないが、それに１％の１型ポリクローナルウサギ血清、抗ヘルペス型を加えた５mlの培地に代える。
これは細胞間ウイルスの増殖を妨げないが、感染した細胞の破壊中に液相に入る粒子を
中和する；第４〜５日の終わりに、油のスポットのように広がる細胞溶解ゾーンを肉眼で観察することが可能であり、それぞれ理論上、培養物に付着させたウイルス希釈液に存在する“ゾーン形成単位”(UFP)の増幅に相当する。ゾーン形成単位は感染する粒子またはウイルス粒子とおおよそ同等であると評価することができる。
【００７３】
【表４】
2005509654.tif 000005
【００７４】
活性の発現期間
０.２mlの非希釈ウイルス懸濁液を０.２mlの２種の次の混合物とそれぞれ混合する：
・０.０４％バルダック(R)＋０.０５％ＣＨＧ（ジグルコネート）
・０.０２％バルダック(R)＋０.０２５％ＣＨＧ
１、５および１５分間のインキュベーション後、一滴の混合物を５個の培養管に接種し、５日間観察し続ける。
対照として、混合物の代わりに希釈したウイルスを同様に培地に接種する。
【００７５】
【表５】
2005509654.tif 000006
【００７６】
生体内試験
ウイルス懸濁液に浸した針で筋肉注射した、または感染した（すなわちウイルス懸濁液に浸した）針が下記（実施例８、試料１）のようなラテックスで被覆されたマイクロカプセルを通過した後に注射したヌードマウスで試験を行なった。針がマイクロカプセルを通過する注射の場合に極めて有意で即効性の動物感染が可能であることがわかった。
操作手順はヘルペスウイルスに適した培地を使用することを除けば実施例８と同様である。
【００７７】
〔実施例４〕組成物の殺菌作用
試験１
材料
試験した微生物
・参照菌株：
・緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）CIP A22 
・大腸菌（Escherichia coli）CIP 54127 
・黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）CIP 5314 オックスフォード株
・院内感染菌：
・緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）
・大腸菌（Escherichia coli）
・黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）
・プロテウス ブルガリス（Proteus vulgaris）
・カンジダ アルビカンス（Candida albicans）
ミリポア膜：HAE P047SO(0.45μm)
ミューラー ヒントン２ゲロース：4 3301（Biomerieux社） 
無菌のアピロジェニック（apyrogenic）蒸留水（biosedra）
【００７８】
手順
菌株の維持
各菌株を使用前にミューラーヒントンゲロースで二次培養を２４時間毎に３回行なった。
接種菌の調製
・初期細菌懸濁液：Ａ
細菌単離に基づいて調製した。それはMcFarlandスケールにおいてポイント１と同等の
不透明度に相当する。それは最終試験で使用される。
・対照および予備試験に使用される懸濁液：Ｂ
それは懸濁液Ａを１０-6まで連続希釈することにより調製される。
対照グループ
１mlの懸濁液Ｂを“全体として”ミューラーヒントンゲロースに接種する。
対照ろ過カウント
１mlの懸濁液Ｂをミリポア膜上でろ過し、５０mlの蒸留水で洗浄する。
３７℃で２４時間後にコロニーの計数。
【００７９】
予備試験
４種の各殺菌混合物および各菌株について、次の試験を行なった：
・１mlの殺菌混合物のろ過
・洗浄（５０mlの蒸留水で２回）
・１mlの懸濁液Ｂのろ過
・５０mlの蒸留水を使用してリンス
・３７℃で２４時間後に膜上のコロニーの計数
最終試験
２倍濃度の各殺菌混合物を１、５および１０分間、１mlの懸濁液Ａと接触させ、次にろ過する。
予備試験で定義された洗浄工程後、膜を３７℃で２５時間放置する。
結果の解釈
採用した方法では、殺菌を目的とする混合物は所定の接触時間後に接種菌を少なくとも５対数まで減少させた場合、殺菌性があるとみなされる。
この効果は最終試験膜についてコロニーの数を同じ菌株および同じ混合物に対応する予備試験で観察されたものと比較してカウントすることにより確認される。
【００８０】
結果
【表６】
2005509654.tif 000007
【００８１】
【表７】
2005509654.tif 000008
【００８２】
【表８】
2005509654.tif 000009
【００８３】
結果
１分間の接触では、試験したすべての菌株について有効な混合物はなかった。しかしながら、混合物Ｎｏ.２はプロテウスブルガリス（Proteus vulgaris）だけが不感受性であると考えられるため最も有効である。
５分間の接触では、混合物Ｎｏ.２は有効であるとみなされるが、製剤に抵抗する同一株のプロテウスブルガリス（Proteus vulgaris）に対しては、５分後でさえ有効ではない。
１０分間の接触では、混合物Ｎｏ.１および２は試験したすべての菌株について満足のいく結果を与える。
【００８４】
試験２
次の溶液に基づいて別の試験を行なった。
・１００mlの０.１％クロロヘキシジンジグルコネート溶液(pH６)；および
・１００mlの０.１％バルダック２２(R)溶液
単独の、または組合せたこれらの溶液の活性は特に黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 6538、大腸菌（Escherichia coli）ATCC 11229およびカンジダアルビカンス（Candida albicans）ATCC 10231に関して試験した。
試験は１９８１年１月１日時点で「Tichtlinien fuer die Pruefung und Bewertung chemischer Desinfekutionsverfahren der DGHM/Guidelines for Testing and Evaluating Chemical Disinfection Processes of DGHM」の第Ｉ章／２.１および２.２に記載の手順に従って行なった。
【００８５】
表IX、ＸおよびXIはそれぞれ０.１％クロロヘキシジンジグルコネート水溶液、０.１％バルダック２２(R)水溶液および両化合物の等量混合物の殺菌および殺真菌活性を示している。これらの表にその結果が示されている方法はインキュベーションを３７℃で７２時間行い、対照として次の不活性物質を使用することからなる：
Ａ：３％ツイーン(R)８０＋０.３％レシチン＋０.１％システイン
Ｂ：３％ツイーン(R)８０＋３％サポニン＋０.１％システイン＋０.１％ヒスチジン
Ｃ：３％ツイーン(R)８０＋０.３％レシチン＋０.１％ヒスチジン＋０.５％チオ硫酸ナトリウム
これらの表において、記号の“＋”は増加を示し、記号の“−”は増殖がないことを示している。
【００８６】
０.１％クロロヘキシジンジグルコネート水溶液（１％の試験溶液は0.001％ジグルコネートに相当する）の殺菌および殺真菌活性を示している次の表IXから0.0005％の活性物質濃度に相当するクロロヘキシジンジグルコネート溶液の0.5％希釈液による黄色ブドウ球菌（S.aureus）および大腸菌（E.coli）の増殖阻害がわかる；カンジダアルビカンス（C.albicans）は前記溶液(0.001％クロロヘキシジンジグルコネート)の１％希釈液により阻害される。表Ｘにおいて、塩化ジデシルジメチルアンモニウムはグラム陽性菌の黄色ブドウ球菌（S.aureus）およびカンジダアルビカンス（C.albicans）を０.１％希釈液(＝0.0001％塩化ジデシルジメチルアンモニウム)で、また大腸菌（E.coli）(グラム陰性菌)を０.５％希釈液（＝0.0005％塩化ジデシルジメチルアンモニウム）で阻害するさらに顕著な効果を示している。
【００８７】
表XIはこれらの２種の消毒剤の組合せが非常に大きい希釈度で前記微生物の増殖阻害（0.00025％クロロヘキシジンジグルコネートおよび0.00025％塩化ジデシルジメチルアンモニウムの濃度での大腸菌（E.coli）およびカンジダアルビカンス（C.albicans）に関する作用；２種の前記消毒剤のそれぞれについて0.00005％の濃度での黄色ブドウ球菌（S.aureus）に関する作用）を可能にすることを示している。
【００８８】
【表９】
2005509654.tif 000010
【００８９】
【表１０】
2005509654.tif 000011
【００９０】
【表１１】
2005509654.tif 000012
【００９１】
その結果が表XII、XIIIおよびXIVに示されている試験は２２℃の反応温度において行い、不活性物質として３％ツイーン(R)８０＋３％サポニン＋０.１％システイン＋０.１％ヒスチジンを使用し、継代培養のインキュベーションを３７℃で７２時間行なった：これらの表はそれぞれ０.１％クロロヘキシジンジグルコネート水溶液、０.１％バルダック(R)水溶液および２種の化合物の等量混合物の殺菌および殺真菌活性を示しており、また接触時間の関数としての前記消毒剤の作用を示し、２種の化合物の組合せがそれらの濃度を有意に減少させて同じ効果を得る限りにおいて、上記と同様の組合せの相乗作用の出現をもたらす。
【００９２】
【表１２】
2005509654.tif 000013
【００９３】
【表１３】
2005509654.tif 000014
【００９４】
【表１４】
2005509654.tif 000015
【００９５】
〔実施例５〕殺精子作用
手順
種々の精子試料（１試料あたり１滴の精子）は健康なボランティアから得られる。
活力の測定
１滴の精子をエオシン−ニグロシンにより処理する。次に、塗抹標本を作製し、１００個の精子を顕微鏡で検査する。死んだ細胞を完全にまたは部分的に赤に着色する。生きている細胞は無色である。
試験した物質
試験した物質はバルダック(R)およびクロロヘキシジンジグルコネートであり、単独で本発明に従ってまたは組合せて試験した。手順のいろいろな段階を表XV〜XVIIに示す。
種々の物質および精子の最大接触時間は使用条件下で本法の有効性を保証するために３分間に限定された。精子中の活性溶液の濃度は粘膜に関して製剤の毒性のリスクを下げるために１０％に制限された。
【００９６】
【表１５】
2005509654.tif 000016
【００９７】
【表１６】
2005509654.tif 000017
【００９８】
【表１７】
2005509654.tif 000018
【００９９】
〔実施例６〕水溶液中におけるバルダック２２(R)およびクロロヘキシジンジグルコネートの混合物の試験
照明から離れた位置にあるプラスチックバイアル中、室温（２０℃±１℃）ですべての混合物を重量／重量百分率で調製した。
これらのバイアルの毎日の観察により白色沈殿物の存在が検出されるかどうかを決定した。これは（沈殿が生成する場合）多数のバイアルの残留物だけでなく、液体でぬれた内壁にも存在する。
【０１００】
様々な濃度のバルダック(R)−クロロヘキシジンの５０／５０溶液の試験
試験は第１段階において、様々な濃度の活性成分の水溶液について行なったが、２種の活性成分（バルダック(R)およびクロロヘキシジンジグルコネート）の混合物については等比（５０／５０）のものを用いた：
・活性成分の３０％溶液−２４時間で沈殿した。
・活性成分の２０％溶液−２４時間で沈殿した。
・活性成分の１０％溶液−２４時間で沈殿した。
・活性成分の５％溶液−２４時間で沈殿した。
・活性成分の１％溶液−２４時間で沈殿した。
【０１０１】
様々な割合のバルダック(R)およびクロロヘキシジンの１０および２０％溶液の試験
第２段階において、活性成分の濃度を１０％および２０％に固定したが、２種の活性成分の割合を変えた。
【０１０２】
【表１８】
2005509654.tif 000019
【０１０３】
【表１９】
2005509654.tif 000020
【０１０４】
〔実施例７〕アルコール溶液中におけるバルダック(R)およびクロロヘキシジンジグルコネートの混合物の試験
水について示した割合での溶解は２種の製剤をグリセロール中に溶解する場合と同じである。
【０１０５】
〔実施例８〕本発明の組成物を含有し、組織に針を刺した後にポリビニルクロスに含まれるマイクロカプセルの細菌および真菌に関する消毒能力
物質および方法
ポリビニルまたはラテックスクロスに含まれる２種のマイクロカプセル試料：
試料１：本発明の組成物を含有し、ＰＶＤＣに含まれるマイクロカプセル。マイクロカプセルを覆うクロスの厚さは約500μmであり、クロスの全厚は約1300μmであり、針(0.5×16mm)でクロスを引き裂いた後に得られる消毒剤の量は約1.5μgである；
試料２：試料１と同じタイプの本発明の組成物を含有し、ＥＶＡに含まれるマイクロカプセル。マイクロカプセルを覆うクロスの厚さは約500μmであり、針(0.5×16mm)でクロスを引き裂いた後に得られる消毒剤の量は約0.4μgである。
【０１０６】
試験を行なうための微生物試料は次の微生物：大腸菌（Escherichia coli）ATCC 11229、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 6538およびカンジダアルビカンス（Candida albicans）ATCC 10231を使用して調製される。
菌株をＣＳＬ培地（Merck社）において３７℃で２４時間培養し、次に１０-3〜１０-6の希釈液を０.９％塩化ナトリウム溶液で調製する。
得られる様々な培養物（希釈および非希釈）をそれぞれ１mlずつ９mlの不活性化ヒト血清プールに加える。試験溶液１mlあたりの微生物の数を次の表XXに記載する。
３種類の針を使用した：0.7×30mm（22G×1/4インチ, Terumo社)、0.5×16mm（25G×5/8インチ, Terumo社)、0.3×13mm（30G×1/2インチ, Microlance, Becton Dickinson社)。
これらの針を１mlのシリンジに取り付け 、上記のような微生物溶液に浸し（少なくとも１cmの針を溶液に浸さなければならない）、０.１mlの溶液を吸引する。それを次に上記クロスに突き刺し、この針と一緒にカソ寒天(casoagar；Merck社, ３％のツイーン(R)８０および０.３％レシチンを補足した培地)で被覆したペトリ皿に入れる。
針で寒天に接種する部位に印を付け 、培地を37℃で72時間インキュベートしてから結果を読み取る。
【０１０７】
結果
表XXは0.3×13mmの針（30G×1/2インチ, Microlance, Becton Dickinson社）による穿孔（１回の試験につき５回の穿孔）後に得られる陽性培養物の数、および上記のように補足したカソ寒天培地（Merck社）における穿孔したクロスの培養を示している。
【０１０８】
【表２０】
2005509654.tif 000021
【０１０９】
これらの結果は特に、低濃度の細菌または真菌（１０2／ml）がポリビニルクロスにより機械的に吸収または除去され；１mlあたり１０5の微生物の濃度が、最小の針（0.3×13mm、表XX）を使用した時に増殖がない限界とみなされ；他方で、サイズがそれぞれ0.7×30mmおよび0.5×16mmの針を使用した場合に同位の結果が得られることを示している。増殖は対照クロスを穿孔した時、高濃度の細菌（108／ml）または真菌（107／ml）の場合にだけ達成される（試料１）。
さらに、これらの結果は試料１のマイクロカプセル(PVDC)が試料２のマイクロカプセル(EVA)よりも有効であることを示している。
【０１１０】
結論
試料１を使用して行なった試験から、マイクロカプセルに組み込まれた本発明の組成物は病院で遭遇するものと近い条件下で実質的に即時の消毒効果を示すことがわかる。
【０１１１】
〔実施例９〕赤血球の溶血における化合物の効果
試験管内でのヘパリン添加全血の赤血球溶血における本化合物の効果を分光光度法により監視する。
様々な配合および濃度の試験化合物をヘパリン添加ウシ血に加え、１.５mlのマイクロ遠心管中で穏やかに混合する。試料を３７℃で１時間インキュベートする。インキュベーションの終了後、試料を培養器から取り出し、２０００rpmで５分間遠心する。２００μlのアリコートの上澄みを各試料から採取して９６ウェルのマイクロプレートに入れ、４１３nmで読取る。試験試料の吸光度をリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７.２）を含有する対照試料と比較する。吸光度の測定値が対照試料よりも高い試験試料は溶血性であると考えられる。
表XXIに試験条件下で非溶血性である試験化合物の濃度および成分をまとめる。
【０１１２】
【表２１】
2005509654.tif 000022
【０１１３】
本発明を特定の好ましい態様に関して説明したが、本発明はこれらの態様に制限されない。特に先行の教示に照らして、本発明に包含される他の態様、例および変更が当業者によりなされよう。
【手続補正書】
【提出日】平成15年6月20日(2003.6.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２種の第４アンモニウム化合物、ビス−グアニジン化合物、並びに第４アンモニウム化合物および表面張力−活性化合物から選択される化合物からなる抗病原体組成物を含有する、液体および生体組織、並びに液体および／または生体組織で汚染された表面を消毒するのに使用される抗病原体組成物。
【請求項２】
ビス−グアニジン化合物はクロロヘキシジングルコネートである請求項１記載の抗病原体組成物。
【請求項３】
表面張力−活性化合物はＴｅｒｇｉｔｏｌ  ＮＰ−９およびリン酸トリ−ｎ−ブチルから選択される請求項１記載の抗病原体組成物。
【請求項４】
液体および生体組織は水、水性溶液、血液および血液製剤、移植用皮膚および臓器からなる群より選択される請求項１〜３の何れかに記載の抗病原体組成物。
【請求項５】
表面は容器、フィルター、チューブ、シール、クランプ、移動レッグクロージャ、医療用具、手術台および診察台からなる群より選択される請求項１〜３の何れかに記載の抗病原体組成物。
【請求項６】
容器は生体液の容器または水の容器である請求項５記載の抗病原体組成物。
【請求項７】
容器は血液または血液製剤の容器である請求項５記載の抗病原体組成物。
【請求項８】
容器は献血バッグまたはボトルである請求項５記載の抗病原体組成物。
【請求項９】
血液は全血である請求項１〜３の何れかに記載の抗病原体組成物。
【請求項１０】
血液製剤は血漿、濃縮赤血球、多血小板血漿、濃縮血小板およびクリオプレシピテートからなる群より選択される請求項１〜３の何れかに記載の抗病原体組成物。
【請求項１１】
組成物はクリーム剤、軟膏剤、ローション剤、ゲル剤、粉末、洗浄剤、石鹸、液体または固体の形態である請求項１〜３の何れかに記載の抗病原体組成物。
【請求項１２】
血液、血液製剤および容器のうち少なくとも１つを請求項１〜３の何れかに記載の組成物と接触させることからなる、容器に入っている血液または血液製剤中の病原体を不活性にする方法。
【請求項１３】
請求項１〜３の何れかに記載の抗病原体組成物で処理された少なくとも１つの表面を有する、または請求項１〜３の何れかに記載の少なくとも１種の抗病原体組成物を含有する医療用具。
【請求項１４】
医療用具は生体液の容器である請求項１３記載の医療用具。
【請求項１５】
生体液の容器は献血バッグまたはボトルである請求項１４記載の医療用具。
【請求項１６】
医療用具は個体へ送達される前に血液または血液製剤が通過するインラインフィルターである請求項１３記載の医療用具。
【請求項１７】
医療用具は個体からの採血時に血液または血液製剤が通過するインラインフィルターである請求項１３記載の医療用具。
【請求項１８】
抗病原体組成物を分配するための多孔質媒体をさらに含有する請求項１３記載の医療用具。
【請求項１９】
生体液を容器に採取し、その生体液を請求項１〜３の何れかに記載の抗病原体組成物に暴露することからなる、試験管内または生体外で生体液を処理する方法。
【請求項２０】
試験管内または生体外で生体液中のヒト免疫不全ウイルスの感染または複製を阻害する方法であって、該生体液を、薬学的に許容しうる担体と組合せた阻害有効量のビス−グアニジン化合物またはその誘導体および少なくとも１種の第４アンモニウム化合物で処理することからなる上記方法。
【請求項２１】
担体はＤＭＳＯである請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
試験管内または生体外で赤血球を消毒する方法であって、
ａ）赤血球を、消毒用組成物と、該赤血球に存在する病原体を不活性にするのに十分な時間接触させ、ここで該消毒用組成物は本質的に、消毒する濃度のビス−グアニジン化合物と等張に有効な濃度の溶質の溶液からなり、それにより該消毒用組成物は実質的に血液と等張であり、そして
ｂ）該血球を前記消毒用組成物から単離する
工程からなる上記方法。
【請求項２３】
ビス−グアニジン化合物は第４アンモニウム化合物およびその組合せからなる群より選択される請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
病原体を不活性にした後に該組成物を除去する工程をさらに包含する請求項１２記載の方法。
【請求項２５】
生体液を処理した後に該組成物を除去する工程をさらに包含する請求項１９〜２１の何れかに記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成15年11月11日(2003.11.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
光線感作物質および照明を使用してウイルス除染物質を不活性にする試みもまた幾つかの非プソラレン光線感作物質を使用して開発された。使用されている光線感作物質は典型的に色素である。例としてはジヘマトポルフィリンエーテル（ＤＨＥ）、メロシアニン５４０（ＭＣ５４０）およびメチレンブルーが挙げられる。
第４アンモニウム化合物を含有する他の消毒剤組成物はウイルス、細菌などを不活性にするのに使用されており、例えば欧州特許出願ＥＰ−Ａ０５５５１１６、ＥＰ−Ａ−０３３８５１５、ＥＰ−Ａ−８８０９６５５、ＥＰ−Ａ−０４５７６５６、ＥＰ−Ａ−０７４２１７６、国際出願ＷＯ−Ａ−８８０９６５５および日本特許ＪＰ２１８４６０９に記載されている。しかしながら、これらの組成物が血液および血液製剤で有効であることは示されていない。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
本発明は全血および血液製剤の効果的および安全な消毒を包含する。本発明は輸血用全血、血液細胞、血漿および血漿タンパクのようなすべての血液製剤に幅広く適用される。全血はめったに使用されないため、本発明は特に赤血球および／または血漿を含有する組成物を消毒する方法に関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
「化合物」なる用語はまた、単独の、あるいは他の化学薬品または物質と化合させた、例えばＤＭＳＯを含むがこれに限定されない混合液中の上記化学薬品を包含する。好ましい活性剤はアルキルトリメチル第４アンモニウムクロルヘキシドリン（およびそれらのハロゲン化物）；ジアルキルジメチルベンジル第４アンモニウムクロルヘキシドリンである
。典型的な第４アンモニウム化合物はMarchisioらのJ. Biomater. Sci. Polymer Edn.6, 533〜539 (1994年) およびCadwalladerらのJ. Pharm. Sci., 7, 1010〜1012 (1965年) に記載されている。


【国際調査報告】
2005509654.tif 000023
2005509654.tif 000024
2005509654.tif 000025