(57)【要約】生体分子を固相表面に接着させる方法、および接着のためにその表面を調製する組成物を開示する。この組成物は式Iおよび式IIの分子を含み、これらは次：【化１】2005528583.tif 000006のように定義され、式中、R1は生体分子、反応基または反応基を形成しうる基であり、R2はR1とは異なり、R1の少なくとも104倍モル過剰で存在し、YおよびY'は固相表面に結合できる基であり、XおよびX'は少なくとも二価の原子であり、ZおよびZ'はリンカー基である。
2005528583.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下式
【化１】
2005528583.tif 000005
［式中、
R1は生体分子、反応基または反応基を形成しうる基であり、
R2はR1とは異なり、R1の少なくとも104倍モル過剰で存在し、
YおよびY'は固相表面に結合できる基であり、
XおよびX'は少なくとも二価の原子であり、
ZおよびZ'はリンカー基である］
で定義される式Iおよび式IIの分子を含む不動基(passive group)のバックグラウンドに反応基が散在分布するように固相支持体をコーティングするための組成物。
【請求項２】
R1が-SH、-NH2、-CN、-F、-Cl、-Brおよび-Iから選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
R1が核酸である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
R1が生体分子と共有結合を形成しうる反応基を形成するのに好適な薬剤と反応しうる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
R2が、R1を活性化する薬剤で処理しても反応性のないままである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
R2が-OH、-Me、-OMe、-Phe、-F、-Cl、-SO3および-CO2から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
YおよびY'が同じである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
Yおよび／またはY'がメトキシ、エトキシおよびカルボキシから選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
Xおよび／またはX'が同じである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
Xおよび／またはX'がSiである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
ZおよびZ'が同じである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
ZおよびZ'がC、O、N、P、SおよびSiから選択された少なくとも1原子から106原子までのリンカー基である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
ZおよびZ'が親水性ポリマーを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
ZおよびZ'が少なくとも2つの単量体単位の炭水化物またはその誘導体を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
ZおよびZ'がデキストランまたはその誘導体を含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
ZおよびZ'がセルロースまたはその誘導体を含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
ZおよびZ'がポリエチレングリコール(PEG)またはその誘導体を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
式Iの分子がシランであり、好ましくは3-アミノプロピルジメトキシシラン、(3-メルカプトプロピル)トリメトキシシラン、(3-アミノプロピル)ジメチルエトキシシラン、(3-メルカプトプロピル)ジメトキシシラン、(4-アミノフェニル)トリメトキシシラン、m-アミノ-フェニルトリメトキシシランおよび(3-グリシドキシプロピル)トリメトキシシラン、(3-アミノプロピル)メチルジエトキシシラン、(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン、(3-アミノプロピル)トリメトキシシラン、(3-クロロプロピル)ジメトキシメチルシラン、(3-クロロプロピル)トリエトキシシラン、(3-シアノプロピル)トリエトキシシラン、(3-シアノプロピル)メチルジメトキシシラン、(3-グリシドキシプロピル)ジメチルメトキシシラン、(3-グリシドキシプロピル)メチルジエトキシシラン、(3-グリシドキシプロピル)トリエトキシシラン、(3-グリシドキシプロピル)メチルジメトキシシラン、(3-メルカプトプロピル)メチルジメトキシシラン、(3-メルカプトプロピル)トリエトキシシランおよび(3-メルカプトエチル)トリメトキシシランから選択される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
式IIの分子がシランであり、好ましくは[2-ビス(ヒドロキシエチル)-3-アミノプロピル]トリメトキシシラン、(4-ヒドロキシフェニル)トリメトキシシラン、(3-ヒドロキシプロピル)-トリメトキシシラン、プロピルジメトキシシラン、(3-グリシドキシ(glycodoxy)プロピル)トリメトキシシラン、(3-ヒドロキシプロピル)メチルジメトキシシラン、(4-ヒドロキシフェニル)トリメトキシシラン、(4-ヒドロキシフェニル)メチルジメトキシシラン、フェニルトリメトキシシラン、フェニルジメチルエトキシシラン、プロピルメチルジメトキシシラン、m-アミノフェニルトリメトキシシラン、4-アミノフェニルトリメトキシシラン、(3-アミノプロピル)ジメチルエトキシシラン、(3-アミノプロピル)メチルジエトキシシラン、(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン、(3-アミノプロピル)トリメトキシシラン、(3-クロロプロピル)ジメトキシメチルシラン、(3-クロロプロピル)トリエトキシシラン、(3-シアノプロピル)トリエトキシシラン、(3-シアノプロピル)メチルジメトキシシラン、(3-グリシドキシプロピル)ジメチルメトキシシラン、(3-グリシドキシプロピル)メチルジエトキシシラン、(3-グリシドキシプロピル)トリエトキシシラン、(3-グリシドキシプロピル)メチルジメトキシシラン、(3-メルカプトプロピル)メチルジメトキシシラン、(3-メルカプトプロピル)トリエトキシシランおよび(3-メルカプトエチル)トリメトキシシランから選択される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
式IおよびIIの分子がどちらもシランである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
(4-アミノフェニル)トリメトキシシランと(4-ヒドロキシフェニル)トリメトキシルシラン、または3-アミノプロピルジメトキシシランと[2-ビス(ヒドロキシエチル)-3-アミノプロピル]トリメトキシシランから選択される混合物を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
XおよびX'がSi、ZおよびZ'がポリエチレングリコールであり、R1が-SHであり、R2が-OMeである、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
XおよびX'がSiであり、ZおよびZ'がデキストランであり、R1が-SHまたは-NH2のいずれかであり、R2が-OH、-SO3および-CO2から選択される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
表面に請求項１〜２３のいずれか一項に記載の組成物を有する固相支持体。
【請求項２５】
固相支持体がガラスである、請求項２４に記載の固相支持体。
【請求項２６】
式Iの分子が表面上に0.1〜100平方ミクロン当たり1分子、好ましくは0.1〜10平方ミクロン当たり1分子、最も好ましくは1〜10平方ミクロン当たり1分子の密度で分布している、請求項２４または請求項２５に記載の固相支持体。
【請求項２７】
R1に接着した生体分子をさらに含む、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の固相支持体。
【請求項２８】
生体分子がポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、タンパク質およびポリペプチドから選択される、請求項２７に記載の固相支持体。
【請求項２９】
式Iの分子を式IIの分子で希釈することにより請求項１〜２３のいずれか一項に記載の組成物を形成し、固相支持体を組成物とともにインキュベートし、固相支持体を乾燥させることを含む、コーティングされた固相支持体を製造する方法。
【請求項３０】
生体分子を固相支持体に固定化する方法であって、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の組成物を調製し、その組成物を固相支持体にコーティングし、反応が起こる条件下でR1と反応する基を含む生体分子を提供することを含む方法。
【請求項３１】
生体分子がポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、タンパク質およびポリペプチドからなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は固相表面上への分子の固定化に関する。特に本発明は生体分子、特にポリペプチドおよび核酸(オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを含む)を含むタンパク質の固定化に関する。
【０００２】
固定化分子は一般に分析のための方法に用いられる。例えば、固定化ポリペプチドは免疫アッセイおよびELISAアッセイで使用でき、固定化核酸はDNAおよびRNAの研究で使用でき、de novoシーケンシング、ハイブリダイゼーション結果の研究、および標的核酸の比較のために使用できる。
【０００３】
核酸の研究における最近の改良は固定化核酸の組立てアレイの開発に注力されている。これらのアレイは一般に固相支持体材料の個々の指定領域に固定化された多数のポリヌクレオチド(鋳型など)の高密度マトリックスからなる。
【０００４】
固相支持体上で分子を指定配列するためのいくつかの異なる方法が記載されている。例えば、Fodor et al. (Trends in Biotechnology (1994) 12, 19-26)は、マスクで保護されているが、所定の領域において適宜修飾されたヌクレオチドを接着させるために所定の領域では露出している化学感受性のあるガラス面を用いた核酸アレイを構築する方法を記載している。その他の方法は、ロボットマイクロピペット技術によってスライドグラスなどの固相支持体上の所定の位置にサンプルをスポットすることを含む(例えば、Schena et al. Science (1995) 270: 467-470)。このような方法は通常、所定の位置のいずれか1つに複数の分子を接着させることとなる。
【０００５】
固相表面に分子を接着させる方法の1つとして、シラン化により表面を修飾するというものがある。例えば米国特許第5,622,826号では、ガラス面に5'-アミノ修飾オリゴヌクレオチドを接着させることが記載され、まず(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン(APTES)でシラン化してアミノ基を含む表面を作製する。次に、シラン化された表面上の末端アミノ基を1,4-ジフェニレンジイソチオシアネート(DPC)と反応させて、アミノ基をフェニレンイソチオシアネート基へ変換する。次にこれを5'-アミノ修飾オリゴヌクレオチドと反応させて表面に結合したオリゴヌクレオチドを得る。表面結合シランに対するオリゴヌクレオチドの結合は図1aに模式的に示されている。図1bは生体分子を固相表面へ接着させるのに用いることができる、表面に結合した他の好適なシランの例を示している。
【０００６】
しかし、単一分子の検出方法における最近の進展(例えば、Nie and Zare, Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 26, 567-96, 1997に記載)により、個々のオリゴヌクレオチド対合などの結果を検出することが可能となる(Trabesinger, W., et al., Anal Chem., 1999. 71(1); p. 279-83)。単一分子のレベルでの結果を追跡することで、例えば、支持体の所定の領域に接着した多数の分子からの共通のシグナルから情報が導き出される従来の核酸シーケンシングアプローチに付随するいくつかの問題が克服される(例えば、Automation Technologies for Genome Characterisation, Wiley-Interscience (1997), ed. T.J. Beugelsdijk, Chapter 10:205-225)。
【０００７】
単一分子の大きな指定アレイを作製するということは必須ではないし、単一分子の検出を含むアプローチに実用的というわけでもない。これは一つには、単一分子レベルでの結果の検出には、分子が、例えば光学顕微鏡法により各分子が個々に分離できるように分子間に十分な分離をもって固相支持体に分布している必要があるからである。
【０００８】
さらに、また、各サンプルの存在およびデータを追跡するためにサンプルの空間分布が不可欠である従来のアッセイで用いられるアレイとは対照的に、単一分子検出では個々の各分子の同定および固相支持体上でのその位置の決定が可能となる。よって、位置の参照がなくとも各分子の位置が決定でき、単一分子の指定アレイの必要がなくなる。
【０００９】
WO 00/06770では、分子間に十分な分離が達せられ、よって、単一分子のレベルで光学的分解が可能な固相表面への分子混合物の固定化が記載されている。そこに記載されている方法では、固定化は固相表面に結合されたマイクロスフィア(microsphere)による。このマイクロスフィアは固相表面に定着させる前に、マイクロスフィアに目的の核酸分子を接着させるに先立って100平方ミクロン当たり1マイクロスフィアの密度となるように希釈する。しかし、この方法が有効なものとなるには、接着前に分子混合物をさらに希釈して、1つのマイクロスフィアに1分子しか接着しないようにすることが望ましい。さらに、マイクロスフィアは残留蛍光がいくらかあることが分かっているので、マイクロスフィアを光漂白する付加的な調製ステップが必要となる。
【００１０】
米国特許第6,258,454号では、表面エネルギーを変化させ、表面に官能基を提供する手段が記載されている。よって、この目的は疎水性および親水性を有するシラン分子を混合することにより、表面を全体的に修飾することである。この特許に記載されている表面はそれらの分析の前段階としての単一分子の散在分布には不適であり、これは官能基の表面密度が高すぎるためである。このような高密では、表面が疎水性であるので、分子の接着 またはその後の水性条件下でのそれらの修飾を可能とするのに十分な湿潤状態が保てない。
【００１１】
米国特許第5,728,203号では、金属面を塗料やニスでコーティングできるようにする処理またはその他同様の処理を目的とする、2以上のシランおよびリン酸を含む組成物の製造が記載されている。この記載は加水分解シランの水溶液についてのものである。シランの選択基準は共重合の能力、ひいては保護コーティングを提供する能力に基づく。この明細書に開示されているシランの組合せでは、それらの間で光学的に分解可能な分離が得られる単一分子の接着は可能でない。
【００１２】
米国特許第5,866,262号では、眼鏡用の傷に強いコーティングが記載されている。この組成物は共重合して物理的損傷を防ぐ強化コーティングをガラス上に施す多反応性シランの組成物である。生成されたコーティングは不動態となるよう設計され、バルク量のシランを多官能性樹脂修飾剤と混合することから得られる。
【００１３】
分子の接着ならびにその後のそれらの修飾および分析のために修飾されたガラス面を局部的に官能基化する手段が米国特許第5,474,796号に開示されている。この方法では直径少なくとも0.1μmの化学マスクを作り出すことにより布置(feature)を形成するとしている。布置内の化学基は全て反応性であるか不動性である。これに対し、本発明の布置の寸法は直径0.1μm、好ましくは直径1μm当たり1つの反応性分子を含む布置となるよう不動基(passive group)と活性基を制御混合することにより形成され、これは米国特許第5,474,796号に記載の方法によっては達成することのできないものである。
【００１４】
米国特許第5,137,765号には特に遊離酸基と第四級アンモニウム基の混合物を含む支持体が記載されている。これを達成する手段は、シランを混合することによるものである。これらの混合物は、タンパク質の安定した定量的な接着を助ける混合イオンベッド樹脂を作り出すためにコーティング表面のバルク特性を変化させるべく製造される。
【００１５】
単一分子の検出に有用なアレイを得るその他の方法としては、適宜調製した固相表面に分子の混合物を含有する少量のサンプルを分配するか、または固相表面にサンプルの希釈液を塗布してランダムアレイを作製する方法が挙げられる。しかし、これらの方法はいずれも、少量を分配するには特殊な装置が必要であるのに対して、サンプルの希釈は経験的なもので、分析するサンプルごとの定量および希釈に依存するという欠点がある。さらに、ランダムに希釈された分子、特にタンパク質は互いに相互作用しやすいので、特定の部位で分子のクラスターが生じる可能性が高くなる。
【００１６】
よって、本発明の1つの目的は、固相表面上に生体分子を実質的にランダムに分布させ、同時に得られる分子の密度にある程度の制御を可能にする改良方法を提供することである。
【００１７】
よって、本発明の第一の態様においては、下式：
【化１】
2005528583.tif 000003
［式中、
R1は生体分子、反応基または反応基を形成しうる基であり、
R2はR1とは異なり、R1の少なくとも104倍モル過剰で存在し、
YおよびY'は固相表面に結合できる基であり、
XおよびX'は少なくとも二価の原子であり、
ZおよびZ'はリンカー基である］
で定義される式Iおよび式IIの分子を含む不動基のバックグラウンドに反応基が散在分布するように固相支持体をコーティングするための組成物が提供される。
【００１８】
反応基は本明細書では、所定の条件下で、別に選択された化学基と反応して共有結合または新たな種を形成しうる官能基として定義される。これに対して不動基は、同じ特定の条件下で、同じ選択基とは反応できない化学部分として定義される。
【００１９】
反応基の散在分布とは、式Iの分子の固相表面上における0.1〜100平方ミクロン当たり1分子、好ましくは0.1〜10平方ミクロン当たり1分子、最も好ましくは1〜10平方ミクロン当たり1分子の密度での分布を意味する。
【００２０】
R1は生体分子、反応基、または反応基を形成しうる基である。好適な生体分子としてはヌクレオチドおよびタンパク質が挙げられる。「ヌクレオチド」とは、天然ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体、またはポリヌクレオチドを含めて用い、この用語は天然または合成起源のオリゴヌクレオチドを含めて用い、ヌクレオチド類似体残基も含みうる。ポリヌクレオチドは一本鎖であっても二本鎖であってもよく、RNA、DNA、PNAまたは核酸ミミック(nucleic acid mimics)であってもよい。DNAはcDNA、ゲノムまたはその他の起源のDNA、PCR断片であっても適当であり、ヌクレオチド類似体残基も含みうる。ポリヌクレオチドの長さは重要ではないが、本発明ではオリゴヌクレオチドおよびPCR断片の固定化に着目することが多い。「タンパク質」とは、サイトカイン、レセプター、抗体およびそれらのフラグメント(FcおよびFab'フラグメントを含む)などのポリペプチド、その他のペプチド断片、およびアミノ酸(天然由来であっても合成であってもよい)が挙げられる。
【００２１】
好ましい実施形態では、R1は生体分子、好ましくは核酸である。Si含有分子を介しての表面への核酸の直接結合は、例えばKumar et al. Nucleic Acids Research, 28 (14), e71(i-vi), 2000に記載されている。反応基は生体分子に接着しうるものであり、好ましくは生体分子と共有結合を形成しうる基である。好適な基は例えばLyubchenko et. al (1992) J. Biomol. Struct & Dynamics vol 10(3)589-606, Beier M & Hoseisel J (1999) Nucleic Acids Res. Vol 27(9) p1970-1977, Joos et al. (1997) Anal. Biochem. 247 p96-101, Rogers et al. (1999) Anal. Biochem vol 266(1) p23-30およびWeetall HH (1993) Appl Biochem Biotechnol. vol 41(3) p157-188に記載されている。よって、第一の態様の好ましい実施形態では、R1は -SH、-NH2、-CN、-F、-Cl、-Br および -I から選択される。
【００２２】
もう1つの好ましい実施形態では、R1は好適な薬剤と反応させた際に反応基を形成しうる基である。形成される反応基はタンパク質または核酸などの生体分子と共有結合を形成しうるものである。
【００２３】
例えば、R1がチオール基であるとき、それはジ-(有機)ジスルフィドと反応することができ、この有機基の一方または双方が脱離基であり、必要な官能基化表面が得られる。別の例では、R1がアミノ基であるとき、それは例えば、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド(EDC)またはO-ベンゾトリアゾール-1-イル-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HBTU)などのカップリング試薬の存在下で3,3'-ジチオプロピオン酸と反応させた後、ジチオスレイトールで還元し、ジ-(有機)ジスルフィドと反応させて必要な官能基化表面を得ることができる。あるいは、R1がアミノ基であるとき、それはEDCまたはHBTUなどのカップリング試薬の存在下で2-カルボキシエチル-2'-(脱離基)ジスルフィドとも反応しうる。
【００２４】
ジスルフィド結合は固相表面にタンパク質およびその他の生体分子を共有結合させるのに非常に広く用いられている。特に好ましい実施形態では、R1は式-S-S-Lであり、ここでLは脱離基、すなわち、適宜修飾されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドに容易に置換される基、例えばHである。
【００２５】
もう1つの実施形態では、SHまたはNH2などの反応基R1は、固相支持体のコーティングの際に混合されたシラン間の反応を少なくするよう可逆的に保護することができる。RがSHであるとき、これはジピリジルジスルフィドなどの反応試薬とのジスルフィド結合形成によって達成できる。R1がNH2であるときには、これはt-ブチルオキシカルボニル基などのアミノ保護基、または第一級アミンの保護に一般に用いられるその他の試薬と反応させることにより達成できる。固相表面が組成物でコーティングされてしまえば、反応基を保護する基は、R1をタンパク質または核酸などの生体分子と共有結合を形成できるようにするために、従来の化学を用いて除去することができる。
【００２６】
ある好ましい実施形態では、生体分子それ自体はR1と結合するように修飾することができる。
【００２７】
R2はR1とは異なる。従って、R1が生体分子である場合にはR2は生体分子でなく、R1が反応基である場合にはR2は反応基ではなく、R1が反応基を形成するよう活性化できる場合にはR2は同じ条件下では活性化しない。
【００２８】
よって、ある特に好ましい実施形態では、R2は、R1を活性化する薬剤で処理しても反応性のないままの基である。好ましくはR2は-OH、-Me、-OMe、-Phe、-F、-Cl、-SO3および-CO2から選択される。
【００２９】
適切には、R2は-OH、またはスライドグラスの表面を実質的に親水性とする他の基である。これにより式Iの接着分子上の反応基R1への、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドなどの分子の接着に好ましい環境が作られる。他の、メチルなどのような「親水性の低い」基は疎水性ポケットを作り出すことができ、隣接する反応基R1の、接着させる分子と相互作用する能力を減少させる。
【００３０】
YおよびY'は同一または異なっている。ある特に好ましい実施形態では、YおよびY'は同一である。ある実施形態では、Yはメトキシ、エトキシおよびカルボキシから選択される。
【００３１】
XおよびX'は同一または異なっている。ある特に好ましい実施形態では、XおよびX'は同一である。もう1つの好ましい実施形態では、Xおよび／またはX'はSiである。別の好ましい実施形態では、YがSiである場合、Xはポリエチレングリコール(PEG)、またはデキストランなどの多糖のような高分子である。
【００３２】
ある特に好ましい実施形態では、XがSiである場合、Yはエトキシである。
【００３３】
ZおよびZ'は同一または異なっている。ある特に好ましい実施形態では、ZおよびZ'は同一である。第一の態様の別の実施形態では、ZおよびZ'は少なくとも1原子からPEGまたはデキストランなどの高分子の大きさによって規定される長さまでのリンカー基である。好ましくはZまたはZ'は、C、O、N、P、Sおよび Siから選択される106未満の原子、より好ましくは100,000未満の原子、より好ましくは10,000未満の原子、より好ましくは1,000未満の原子、最も好ましくは100未満の原子である。このようなリンカーの性質および存在は当業者に周知であるが、本発明には向かない。ある特に好ましい実施形態では、Zは1、2または3個の炭素原子である。
【００３４】
適切には、ZおよびZ'は親水性高分子を含む。適切には、ZおよびZ'は少なくとも2つの単量体単位またはその誘導体の炭水化物を含む。好ましくは、ZおよびZ'はデキストランまたはその誘導体を含む。より好ましくは、Zおよび Z'はセルロースまたはその誘導体である。より好ましくは、ZおよびZ'はポリエチレングリコール(PEG)またはその誘導体を含む。
【００３５】
ある好ましい実施形態では、組成物はシランである式Iの分子を含む。適したシランは例えばFluorochem Ltd., UKから入手することができる。ある特に好ましい実施形態では、組成物は3-アミノプロピルジメトキシシラン、(3-メルカプトプロピル)トリメトキシシラン、(3-アミノプロピル)ジメチルエトキシシラン、(3-メルカプトプロピル)ジメトキシシラン、(4-アミノフェニル)トリメトキシシラン、m-アミノ-フェニルトリメトキシシランおよび(3-グリシドキシプロピル)トリメトキシシラン、(3-アミノプロピル)メチルジエトキシシラン、(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン、(3-アミノプロピル)トリメトキシシラン、(3-クロロプロピル)ジメトキシメチルシラン、(3-クロロプロピル)トリエトキシシラン、(3-シアノプロピル)トリエトキシシラン、(3-シアノプロピル)メチルジメトキシシラン、(3-グリシドキシプロピル)ジメチルメトキシシラン、(3-グリシドキシプロピル)メチルジエトキシシラン、(3-グリシドキシプロピル)トリエトキシシラン、(3-グリシドキシプロピル)メチルジメトキシシラン、(3-メルカプトプロピル)メチルジメトキシシラン、(3-メルカプトプロピル)トリエトキシシランおよび(3-メルカプトエチル)トリメトキシシランから選択される式Iの分子を含む。
【００３６】
式IIの好適な分子は、固相支持体と結合することができるが、R1が活性化基である式IのR1を活性化することができる薬剤で処理した後でも生体分子と接着することができないものである。よって、生体分子は式IIの分子が結合している領域の固相支持体とは接着しない。
【００３７】
ある好ましい実施形態では、組成物は、シランである式IIの分子を含む。ある特に好ましい実施形態では、組成物は[2-ビス(ヒドロキシエチル)-3-アミノプロピル]トリメトキシシラン、(4-ヒドロキシフェニル)トリメトキシシラン、(3-ヒドロキシプロピル)-トリメトキシシラン、プロピルジメトキシシラン、(3-グリシドキシ(glycodoxy)プロピル)トリメトキシシラン、(3-ヒドロキシプロピル)メチルジメトキシシラン、(4-ヒドロキシフェニル)トリメトキシシラン、(4-ヒドロキシフェニル)メチルジメトキシシラン、フェニルトリメトキシシラン、フェニルジメチルエトキシシラン、プロピルメチルジメトキシシラン、m-アミノフェニルトリメトキシシラン、4-アミノフェニルトリメトキシシラン、(3-アミノプロピル)ジメチルエトキシシラン、(3-アミノプロピル)メチルジエトキシシラン、(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン、(3-アミノプロピル)トリメトキシシラン、(3-クロロプロピル)ジメトキシメチルシラン、(3-クロロプロピル)トリエトキシシラン、(3-シアノプロピル)トリエトキシシラン、(3-シアノプロピル)メチルジメトキシシラン、(3-グリシドキシプロピル)ジメチルメトキシシラン、(3-グリシドキシプロピル)メチルジエトキシシラン、(3-グリシドキシプロピル)トリエトキシシラン、(3-グリシドキシプロピル)メチルジメトキシシラン、(3-メルカプトプロピル)メチルジメトキシシラン、(3-メルカプトプロピル)トリエトキシシランおよび(3-メルカプトエチル)トリメトキシシランから選択される式IIの分子を含む。
【００３８】
もう1つの実施形態では、式Iおよび式IIの化合物の混合物を含む組成物は固相表面に単層を形成することができる。
【００３９】
適切には式Iの「接着」分子と式IIの「非反応性」分子は実質的に同じ構造のものであり、実質的に同じ特性を有し、生体分子との接着をなしうる能力があるかないかの点だけが異なる。特に好ましい実施形態では、式Iおよび式IIの分子は実質的に均一な大きさである。もう1つの実施形態では、この二組の分子は同じ効率で固相支持体と結合し、従って、固相支持体上に実質的に均一な分子の層が得られる。さらにもう1つの実施形態では、式Iの分子と式IIの分子の間の相互作用は、式Iの分子間の相互作用および式IIの分子間の相互作用と実質的に同じであって、このことから接着分子と非反応性分子が自由に混合することができる。これらの特徴により、固相支持体上の層における分子の分布が、非反応性分子のバックグラウンドに接着分子が極めて均一に分布している状態が確保される。これにより式Iの接着分子の希釈が制御可能となり、固相支持体上に所望の密度の接着部位を得ることができる。混合物における式IおよびIIの化合物の相対的な比率は必要な接着部位の濃度に依存する。
【００４０】
適切には、式IおよびIIの分子はともにシランであり、式Iの分子はアミンまたはスルフィドリル基などの好適な反応基R1を有するシランであり、式IIの分子はこのような反応基を含まないシランである。
【００４１】
例えば、式IおよびIIの分子がともにシランであるとき、これらの分子が小さいこと、および所定の性質により、その組成物を固相支持体上で層とした場合にシランの分布が極めて均一となる状態を確保する。
【００４２】
よって、本発明の第一の態様に従う好適な組成物としては、3-アミノプロピルジメトキシシランと[2-ビス(ヒドロキシエチル)-3-アミノプロピル]トリメトキシシランの混合物、または(4-アミノフェニル)トリメトキシシランと(4-ヒドロキシフェニル)トリメトキシルシランの混合物を含む。3-アミノプロピルジメトキシシラン(すなわち、接着分子)：[2-ビス(ヒドロキシエチル)-3-アミノプロピル]トリメトキシシラン(すなわち、非接着分子)の比率を変更すれば、組成物を固相支持体に接着させる際の接着部位の密度を制御することができる。
【００４３】
ある好ましい実施形態では、XおよびX'はSiであり、ZおよびZ'はポリエチレングリコールであり、R1は-SHであり、R2は-OMeである。
【００４４】
もう1つの実施形態では、XおよびX'はSiであり、ZおよびZ'はデキストランであり、R1は-SHまたは-NH2のいずれかであり、R2は-OH、-SO3および-CO2から選択される。
【００４５】
第二の態様においては、本発明の第一の態様の組成物をその表面に有する固相支持体が提供される。
【００４６】
第二の態様のある実施形態では、支持体の表面は、Yと結合する基を有するか、またはYと結合する基を有するように修飾されることができる。ある特に好ましい実施形態では、固相支持体は表面水酸基を有するか、または水酸基を有するよう修飾されることができ、これは式IおよびIIの分子と反応することができる。適切には、表面が水酸基を有する場合、Yはメトキシ、エトキシおよびカルボキシから選択される。
【００４７】
固相支持体は塊状であっても(例えば、反応槽の表面またはマイクロタイタープレートのウェル)、粒子であってもよい。特に注目されるものとしては、多孔質であっても非多孔質であってもよい平坦な面である。支持体の材料は酸化または加水分解に安定なものでなければならず、無機系のもの(例えば、二酸化ケイ素、二酸化チタン、または水酸化アルミニウム、あるいは好ましくはガラス）であっても、有機系のもの(例えば、ポリスチレン、セルロース、ポリアミドその他)であってもよい。
【００４８】
ある特に好ましい実施形態では、固相支持体はガラスまたはシリカである。
【００４９】
もう1つの態様では、接着分子の間に非反応性分子を散在させていることを特徴とする、表面に接着分子の層を有する固相支持体が提供される。適切には、接着分子は式Iの分子であり、非接着分子は式IIの分子である。
【００５０】
好ましくは、固相支持体は式Iの分子が表面上に0.1〜100平方ミクロン当たり1分子、好ましくは0.1〜10平方ミクロン当たり1分子、最も好ましくは1〜10平方ミクロン当たり1分子の密度で分布している。
【００５１】
もう1つの実施形態では、固相支持体はR1に接着した生体分子をさらに含む。
【００５２】
本発明の第三の態様においては、式Iの分子を式IIの分子で希釈することにより第一の態様のいずれかの実施形態の組成物を形成し、固相支持体を組成物とともにインキュベートし、固相支持体を乾燥させることを含む、コーティングされた固相支持体を製造する方法が提供される。
【００５３】
好ましくは、式Iの分子は、固相表面上で0.1〜100平方ミクロン当たり式Iの分子が1分子、好ましくは0.1〜10平方ミクロン当たり1分子、最も好ましくは1〜10平方ミクロン当たり1分子の密度となる適切な比率で式IIの分子で希釈する。
【００５４】
単層におけるシランの接着の密度は既知であるか、または例えばKallury et al. (1994) Langmuir vol.10, 492-499およびMoon et al. (1996) Langmuir vol 12, 4621-24に記載のように計算することができる。生体分子の接着のための反応基を含む数種のシランの、ガラスに接着させた場合の単層密度の例は次の通りである。
【表１】
2005528583.tif 000004
a=Kallury et al. (1994) Langmuir vol.10, 492-499, 
b=Moon et al. (1996) Langmuir vol 12, 4621-24.
【００５５】
従って、例えばμm2当たり接着分子(4-アミノフェニル)トリメトキシシラン1分子という密度を達成するには、非反応性分子(4-ヒドロキシフェニル)トリメトキシシランで、1:6.25x106の比率でこれを希釈する必要がある。シランコーティングに関していずれの所望の密度を達成する場合でも同様の計算を行うことができる。このような希釈は固相支持体をシラン混合物でコーティングする前に行う。また、比率は実験をもとに経験的に決定してもよい。
【００５６】
シラン混合物による固相支持体のコーティング（または「シラン化」）は、蒸気相または液相のいずれかで行うことができる(例えば、Lyubchenko et. al (1992) J. Biomol. Struct & Dynamics vol 10(3)589-606参照)。
【００５７】
好ましくは、シラン混合物は液相で塗布してもよく、そのようにすると固相表面にシラン溶液がより均一に接触し得、非反応性シランの不活性なバックグラウンドに反応性シラン(すなわち、接着分子)の一様な分布が最大限得られる。
【００５８】
固相支持体上で生体分子の特定の密度を達成するための従来の方法では、生体分子を支持体に結合させる前に生体分子の濃度を決定して希釈する必要があった。本発明の第二の態様の固相支持体では、式Iの接着分子の密度、従って結合部位の密度は接着した生体分子の分布および密度を決定する。従って、生体分子は固相支持体に対して過剰量で加えればよく、予め正確に希釈しておく必要はなくなる。固相支持体の表面への生体分子の接着は所定の位置(すなわち、反応基を有する接着分子が存在するところ)で、ひいては所定の密度で可能となる。結合の確率論的性質およびこのような反応の数からして、その生体分子集団を代表する適当なものが表面に結合していることが確実となる。
【００５９】
本発明の第四の態様においては、生体分子を固相支持体に固定化する方法が提供され、この方法は本発明の第一の態様の組成物を製造し、その組成物を固相支持体にコーティングし、反応が起こる条件下でR1と反応する基を含む生体分子を提供することを含む。
【００６０】
固定化する生体分子は、官能基化された後にR1と相互作用しうる基を備えさせることにより修飾してもよい。生体分子が核酸分子であって、R1がチオール基である場合、これは5'末端または3'末端リン酸基-PO4Hをホスホロチオエート基-PO3SHで置換することによって行えばよい。この修飾ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと固相支持体の官能基化表面とを、スルフィド置換反応により両者がカップリングする条件下で接触させる。
【００６１】
適切には、生体分子は1つの一重結合または複数の一重結合によって固定化しうる。これらの結合は、生体分子の分析の際に遭遇する条件、例えば核酸ハイブリダイゼーションまたはその他の手順の際に遭遇する条件に安定であることが好ましい。
【００６２】
以下、明確にするため、本発明の特定の実施形態を実施例により説明する。
図1aは、オリゴヌクレオチドと結合する、表面に結合したシランの一例を示した図である。
図1bは、表面に結合したシランの例を示した図である。
図2a〜dは、散剤分布する反応基をグラフトした表面へのホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの固定化を示す。
図2aは、シラン化後のスライドグラスの表面を示した図である。
図2bは、シリル基のHS-PEG-SH/HS-PEG-OCH3による誘導体化を示す。
図2cは、アルドリチオールでの処理後のスライドグラスを示す。
図2dは、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのスライドグラスへの固定化を示す。
【実施例１】
【００６３】
シラン混合物を調製する。(4-アミノフェニル)トリメトキシシラン1分子/μm2の密度とするため、(4-フェニル)トリメトキシシランで1:6.25x106の比率で希釈する。（この非希釈(4-アミノフェニル)トリメトキシシランの単層密度2.5分子/nm2を基にしている。）
【００６４】
脂質層におけるシラン化は以下のようにして行う。
シラン混合物3mlを乾燥トルエン300mlに加える。スライドグラスを洗剤で洗浄した後、125℃〜130℃で1時間半焼き付け、水の痕跡を完全に除去し、その後、シラン／トルエン溶液に1〜2時間浸漬する。次に、スライドグラスを乾燥トルエン、次いでエタノール中で2回洗浄した後、100℃で1時間、さらに60℃で10時間乾燥させる。このコーティングスライドを真空デシケーターで保存する。
【００６５】
オリゴヌクレオチドの接着ためのコーティングスライドを調製するため、シランの末端アミノ基を1,4-フェニレンジ-イソチオシアネート(PDC)と反応させ、アミノ基をアミノ反応性フェニレンイソチオシアネート基に変換する。このスライドグラスをDMF/乾燥ピリジン(9:1 v/v)中2g/lのPDCに一晩浸漬する。次にスライドグラスをDMF、次いでエタノールで洗浄し、オーブンにて110℃で乾燥させる。
【００６６】
スライドグラスへ結合させるため、5'末端アミノ基を含むオリゴヌクレオチドを合成する。各10μm濃度のオリゴヌクレオチドを同量の0.1M炭酸バッファーpH9およびエチレングリコール、ならびに2倍量の蒸留水と混合する。次に、このオリゴヌクレオチドをガラス面に塗布し、21℃〜22℃にて最低4時間反応させる。次にこのスライドグラスを、17%アンモニアで処理した水ですすいだ後、さらに水で4回、イソプロパノールで1回洗浄し、乾燥させる。
【実施例２】
【００６７】
3-アミノプロピルジメトキシシラン(AMS)(Sigma, UK)および[2-ビス(ヒドロキシエチル)-3アミノプロピル]トリメトキシシラン(HAS)(Fluka, UK)の混合物を1:0、1:250、1:1000、1:2500、1:10,000、1:40,000、1:160,000、1:1000,000、1:40000,000および0:1 AMS:HMSの比率で調製した。
【００６８】
洗浄済みのスライドグラス(Elan, UK)を乾燥トルエン(Fluka, UK)中シラン混合物の2.5%(v/v)溶液とともに一晩インキュベートした。過剰なシラン混合物次のような洗浄で除去した：トルエンで1回、1:1トルエン／エタノールで1回、エタノール(Fluka, UK)で2回、水で2回。洗浄したスライドグラスを乾燥させ、デシケーターで保存した。
【００６９】
オリゴヌクレオチドを接着させる前、シランをコーティングしたこのスライドグラスを室温にて一晩、9:1乾燥ジメチルホルムアミド(Sigma, UK)／乾燥ピリジン中2g/lの1,4-ジフェニレンジイソチオシアネート(Fluka, UK)とともにインキュベートして反応基を活性化させた。スライドグラスをジメチルホルムアミド、次いでエタノールで洗浄した後、110℃で乾燥させた。
【００７０】
活性化した各スライドグラスを、マイクロアレイスライドカバーガラス(APBiotech, UK)下、室温で2時間、1%(v/v) Tween-20 (Sigma, UK)を含有す50mMリン酸バッファーpH6.0中、2μMのCy3標識オリゴヌクレオチドNH2-GTG TGG(Cy3)AG (Interactiva GmbH, Germany)溶液の40μlアリコートとともにインキュベートした。次にこのスライドグラスを、0.5% SDSを含有するリン酸バッファーで3回洗浄した後、水で3回洗浄した。洗浄は超音波水浴中、50℃で行った。スライドグラスを乾燥させた後、マイクロアレイスキャナー(Molecular Dynamics)を用いて分析した。
【実施例３】
【００７１】
厚さ70nmのSiO2をコーティングしたガラスミラー顕微鏡スライドを、Piehler et. al.の方法(Biosensors & Bioelectronics (2000): 15, 473-481に記載)に従い、ニートの3-(グリシドキシプロピル)メチルジメトキシシランでシラン化した(図2a)。
【００７２】
脱酸素した水(超音波処理、Heパージ)1mlに1mgのHS-PEG-SH(Mw.2000)を加えて10-3mg μL-1(〜5x10-10mol)とすることでHS-PEG-SH水溶液を調製した。この溶液のアリコート10μlを脱酸素水990μL中、100mgのHS-PEG-OCH3の溶液に加え、104倍希釈とした。同様に、1mgのHS-PEG-SHを10mLの脱酸素水に溶かして10-4mg mL-1(〜5x10-11mol)とした。この溶液のアリコート1μLを、脱酸素水999μL中、100mgのHS-PEG-OCH3(Mw.2000)に加え、106倍希釈とした。この希釈HS-PEG-SH/HS-PEG-OCH3溶液を凍結乾燥させて流動性の灰白色粉末とした。この粉末を顕微鏡スライドのシラン化した面に塗布し、このスライドグラスをPEG混合物が融解するまで75℃まで加熱した。図2bはHS-PEG-SH/HS-PEG-OCH3溶液で処理した後のスライドグラス表面を示している。
【００７３】
第二のシラン化顕微鏡スライドを第一のスライドグラスの上にのせ、融解したPEG混合物が薄膜として両スライドのシラン化面に挟み込まれるようにした。次にこのスライド対を75℃で24時間加熱した。さらに、「対照」としてHS-PEG-OCH3単独の薄膜を含むスライド対も同じ方法で準備した。次にこのスライド対をPEGがまだ融解しているうちに剥がし、冷却する。十分な量の純水(18MΩ)ですすぐことで過剰なPEGをスライドグラスの表面から洗い流した。次にスライドグラスを乾燥窒素ガスの蒸気で乾燥させた。全てのスライドグラスをイソプロパノール中、アルドリチオールの溶液(6.4gL-1)に浸し、周囲温度で24時間浸漬した。次にこれらのスライドグラスを取り出し、イソプロパノールで3回すすぎ、デシケーター内で乾燥させた。図2cはアルドリチオールで処理した後のスライドグラスの表面を示している。全てのスライドグラスをLucidea Automated Slide Processor (Amersham Biosciences)のチャンバーにのせ、0.8M(pH4)クエン酸バッファー中、Cy5標識モノホスホロチオエートキャップオリゴヌクレオチド(5'-TA ACT CAT TAA CAG GAT-3')の溶液 2pmol/スライド(0.01pmol mL-1溶液 200μL／スライド)の濃度に曝した。Cy5はAmersham Biosciences, UKから入手できる。スライドグラスをこの溶液に室温で30分間曝した後、50mmol KCl/10mmol TRIS.HCl pH8/2%トリトンバッファーで洗浄した。さらに水、次いでイソプロパノールで洗浄を行った後、これらのスライドグラスを48℃で風乾した。図2dはスライドグラスの表面に固定化されたオリゴヌクレオチドを示している。
【００７４】
スライドグラスを、単一分子の検出のため、10倍対物レンズとLavision CCDカメラを備えたNikon顕微鏡に設置した。Cy5をヘリウム-ネオンレーザー633nmで励起し、1〜10秒間画像をとった。スライドから得られるデータの一貫性を証明するため、複数の対象視野を観察した。CCDの造画はLavision GmbH(Goettingen, Germany)が提供しているソフトウエア(Datavis 6.1)を用いて解析した。これらの画像は3倍の非線形スライド最小補正と3倍の非線形収束を受けている。
【００７５】
870μm x 660μmの視野を含む光学顕微鏡写真(示されていない)によれば、不動基に対して1:1000000希釈すると個々の接着分子が光学分解可能な分離が得られることが示された。スライドグラス表面を非反応基単独を含む分子でコーティングした場合にのみ、くず、またはcy5標識分子の意図しない非特異的な吸着が見られた。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１ａ】オリゴヌクレオチドと結合する、表面に結合したシランの一例を示す。
【図１ｂ】表面に結合したシランの例を示す。
【図２】図２ａは、シラン化後のスライドグラスの表面を示す。図２ｂは、シリル基のHS-PEG-SH/HS-PEG-OCH3による誘導体化を示す。図２ｃは、アルドリチオールでの処理後のスライドグラスを示す。図２ｄは、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのスライドグラスへの固定化を示す。
【図１ａ】
2005528583.tif 000007
【図１ｂ】
2005528583.tif 000008
【図２】
2005528583.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成16年3月4日(2004.3.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下式
【化１】
2005528583.tif 000010
［式中、
R1は生体分子と共有結合を形成しうる反応基、または該反応基を形成しうる基であり、
R2はR1とは異なり、R1の少なくとも104倍モル過剰で存在し、
YおよびY'は固相表面に結合できる基であり、
XおよびX'は少なくとも二価の原子であり、
ZおよびZ'はリンカー基である］
で定義される式Iおよび式IIの分子を含む不動基(passive group)のバックグラウンドに反応基が散在分布するように固相支持体をコーティングするための組成物。
【請求項２】
R1が-SH、-NH2、-CN、-F、-Cl、-Brおよび-Iから選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
該生体分子がオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸、タンパク質およびポリペプチドからなる群から選択される、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
R1が生体分子と共有結合を形成しうる反応基を形成するのに好適な薬剤と反応しうる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
R2が、R1を活性化する薬剤で処理しても反応性のないままである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
R2が-OH、-Me、-OMe、-Phe、-F、-Cl、-SO3および-CO2から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
YおよびY'が同じである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
Yおよび／またはY'がメトキシ、エトキシおよびカルボキシから選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
Xおよび／またはX'が同じである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
Xおよび／またはX'がSiである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
ZおよびZ'が同じである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
ZおよびZ'がC、O、N、P、SおよびSiから選択された少なくとも1原子から106原子までのリンカー基である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
ZおよびZ'が親水性ポリマーを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
ZおよびZ'が少なくとも2つの単量体単位の炭水化物またはその誘導体を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
ZおよびZ'がデキストランまたはその誘導体を含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
ZおよびZ'がセルロースまたはその誘導体を含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
ZおよびZ'がポリエチレングリコール(PEG)またはその誘導体を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
式Iの分子がシランであり、好ましくは3-アミノプロピルジメトキシシラン、(3-メルカプトプロピル)トリメトキシシラン、(3-アミノプロピル)ジメチルエトキシシラン、(3-メルカプトプロピル)ジメトキシシラン、(4-アミノフェニル)トリメトキシシラン、m-アミノ-フェニルトリメトキシシランおよび(3-グリシドキシプロピル)トリメトキシシラン、(3-アミノプロピル)メチルジエトキシシラン、(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン、(3-アミノプロピル)トリメトキシシラン、(3-クロロプロピル)ジメトキシメチルシラン、(3-クロロプロピル)トリエトキシシラン、(3-シアノプロピル)トリエトキシシラン、(3-シアノプロピル)メチルジメトキシシラン、(3-グリシドキシプロピル)ジメチルメトキシシラン、(3-グリシドキシプロピル)メチルジエトキシシラン、(3-グリシドキシプロピル)トリエトキシシラン、(3-グリシドキシプロピル)メチルジメトキシシラン、(3-メルカプトプロピル)メチルジメトキシシラン、(3-メルカプトプロピル)トリエトキシシランおよび(3-メルカプトエチル)トリメトキシシランから選択される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
式IIの分子がシランであり、好ましくは[2-ビス(ヒドロキシエチル)-3-アミノプロピル]トリメトキシシラン、(4-ヒドロキシフェニル)トリメトキシシラン、(3-ヒドロキシプロピル)-トリメトキシシラン、プロピルジメトキシシラン、(3-グリシドキシ(glycodoxy)プロピル)トリメトキシシラン、(3-ヒドロキシプロピル)メチルジメトキシシラン、(4-ヒドロキシフェニル)トリメトキシシラン、(4-ヒドロキシフェニル)メチルジメトキシシラン、フェニルトリメトキシシラン、フェニルジメチルエトキシシラン、プロピルメチルジメトキシシラン、m-アミノフェニルトリメトキシシラン、4-アミノフェニルトリメトキシシラン、(3-アミノプロピル)ジメチルエトキシシラン、(3-アミノプロピル)メチルジエトキシシラン、(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン、(3-アミノプロピル)トリメトキシシラン、(3-クロロプロピル)ジメトキシメチルシラン、(3-クロロプロピル)トリエトキシシラン、(3-シアノプロピル)トリエトキシシラン、(3-シアノプロピル)メチルジメトキシシラン、(3-グリシドキシプロピル)ジメチルメトキシシラン、(3-グリシドキシプロピル)メチルジエトキシシラン、(3-グリシドキシプロピル)トリエトキシシラン、(3-グリシドキシプロピル)メチルジメトキシシラン、(3-メルカプトプロピル)メチルジメトキシシラン、(3-メルカプトプロピル)トリエトキシシランおよび(3-メルカプトエチル)トリメトキシシランから選択される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
式IおよびIIの分子がどちらもシランである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
(4-アミノフェニル)トリメトキシシランと(4-ヒドロキシフェニル)トリメトキシルシラン、または3-アミノプロピルジメトキシシランと[2-ビス(ヒドロキシエチル)-3-アミノプロピル]トリメトキシシランから選択される混合物を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
XおよびX'がSi、ZおよびZ'がポリエチレングリコールであり、R1が-SHであり、R2が-OMeである、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
XおよびX'がSiであり、ZおよびZ'がデキストランであり、R1が-SHまたは-NH2のいずれかであり、R2が-OH、-SO3および-CO2から選択される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
表面に請求項１〜２３のいずれか一項に記載の組成物を有する固相支持体。
【請求項２５】
固相支持体がガラスである、請求項２４に記載の固相支持体。
【請求項２６】
式Iの分子が表面上に0.1〜100平方ミクロン当たり1分子、好ましくは0.1〜10平方ミクロン当たり1分子、最も好ましくは1〜10平方ミクロン当たり1分子の密度で分布している、請求項２４または請求項２５に記載の固相支持体。
【請求項２７】
R1に接着した生体分子をさらに含む、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の固相支持体。
【請求項２８】
生体分子がポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、タンパク質およびポリペプチドから選択される、請求項２７に記載の固相支持体。
【請求項２９】
式Iの分子を式IIの分子で希釈することにより請求項１〜２３のいずれか一項に記載の組成物を形成し、固相支持体を組成物とともにインキュベートし、固相支持体を乾燥させることを含む、コーティングされた固相支持体を製造する方法。
【請求項３０】
生体分子を固相支持体に固定化する方法であって、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の組成物を調製し、その組成物を固相支持体にコーティングし、反応が起こる条件下でR1と反応する基を含む生体分子を提供することを含む方法。
【請求項３１】
生体分子がポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、タンパク質およびポリペプチドからなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
よって、本発明の第一の態様においては、下式
【化２】
2005528583.tif 000011
［式中、
R1は生体分子と共有結合を形成しうる反応基、または反応基を形成しうる基であり、
R2はR1とは異なり、R1の少なくとも104倍モル過剰で存在し、
YおよびY'は固相表面に結合できる基であり、
XおよびX'は少なくとも二価の原子であり、
ZおよびZ'はリンカー基である］
で定義される式Iおよび式IIの分子を含む不動基のバックグラウンドに反応基が散在分布するように固相支持体をコーティングするための組成物が提供される。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
R1は生体分子と共有結合を形成しうる反応基、またはこのような反応基を形成しうる基である。好適な生体分子としてはヌクレオチドおよびタンパク質が挙げられる。「ヌクレオチド」とは、天然ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体、またはポリヌクレオチドを含めて用い、この用語は天然または合成起源のオリゴヌクレオチドを含めて用い、ヌクレオチド類似体残基も含みうる。ポリヌクレオチドは一本鎖であっても二本鎖であってもよく、RNA、DNA、PNAまたは核酸ミミック(nucleic acid mimic)であってもよい。DNAはcDNA、ゲノムまたはその他の起源のDNA、PCR断片であっても適当であり、ヌクレオチド類似体残基も含みうる。ポリヌクレオチドの長さは重要ではないが、本発明ではオリゴヌクレオチドおよびPCR断片の固定化に着目することが多い。「タンパク質」とは、サイトカイン、レセプター、抗体およびそれらのフラグメント(FcおよびFab'フラグメントを含む)などのポリペプチド、その他のペプチド断片、およびアミノ酸(天然由来であっても合成であってもよい)が挙げられる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
好ましい実施形態では、生体分子は核酸である。Si含有分子を介しての表面への核酸の直接結合は、例えばKumar et al. Nucleic Acids Research, 28 (14), e71(i-vi), 2000に記載されている。反応基は生体分子と共有結合を形成しうる基である。好適な基は例えばLyubchenko et. al (1992) J. Biomol. Struct & Dynamics vol 10(3)589-606, Beier M & Hoseisel J (1999) Nucleic Acids Res. Vol 27(9) p1970-1977, Joos et al. (1997) Anal. Biochem. 247 p96-101, Rogers et al. (1999) Anal. Biochem vol 266(1) p23-30およびWeetall HH (1993) Appl Biochem Biotechnol. vol 41(3) p157-188に記載されている。よって、第一の態様の好ましい実施形態では、R1は-SH、-NH2、-CN、-F、-Cl、-Brおよび-Iから選択される。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
R2はR1とは異なる。従って、R1が反応基である場合にはR2は反応基ではなく、R1が反応基を形成するように活性化できる場合にはR2は同じ条件下では活性化しない。


【国際調査報告】
2005528583.tif 000012
2005528583.tif 000013
2005528583.tif 000014