(57)【要約】本発明は、フランシセラ・ツラレンシスのO-抗原の産生に関与する酵素をコードする核酸、それらのワクチンとしての若しくはワクチン製造における使用、および診断における使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一群の酵素または酵素断片をコードする核酸であって、前記酵素又は酵素断片は共に細胞内で発現された場合に前記核酸が投与された動物に免疫応答を生じさせる得る免疫原性部分を生成することができる酵素または酵素断片であり、前記免疫応答がフランシセラ・ツラレンシス感染に対する保護的応答である、配列番号３〜17記載の少なくともいくつかの酵素またはそれらの改変体をコードする前記核酸。
【請求項２】
配列番号３〜17の酵素をコードする、請求項１記載の核酸。
【請求項３】
配列番号１またはその変異種を含む、請求項１または２記載の核酸。
【請求項４】
配列番号１の核酸である、請求項３記載の核酸。
【請求項５】
コドンがバクテリア細胞における発現のために最適化されている、請求項１〜４のいずれか１項記載の核酸。
【請求項６】
バクテリア細胞が大腸菌細胞である、請求項５記載の核酸。
【請求項７】
サンプル中の配列番号１の核酸の存在を検出するために使用し得る、配列番号１記載の断片を含む核酸。
【請求項８】
増幅プライマーを含む請求項７記載の核酸。
【請求項９】
配列番号21、22、35または36から選ばれる、請求項８記載の核酸。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか１項記載の核酸を含む、生ワクチンベクター。
【請求項１１】
バクテリアベクターを含む、請求項１０記載の生ワクチンベクター。
【請求項１２】
バクテリアがサルモネラ種である、請求項１１記載の生ワクチンベクター。
【請求項１３】
請求項１０〜１２記載の生ワクチンベクターおよび製薬的に許容できる担体を含むワクチン。
【請求項１４】
宿主細胞を請求項１〜６のいずれか１項記載の核酸で宿主細胞を形質転換すること、前記宿主を培養すること、および前記宿主の培養物から保護的免疫原性部分を回収することを含む、予防用または治療用ワクチンを製造する方法。
【請求項１５】
請求項１〜６のいずれか１項記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１５記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１４記載の方法によって得ることのできるF.ツラレンシスの組換えO-抗原。
【請求項１８】
請求項１７記載の組換えO-抗原および製薬的に許容できる担体とを含むワクチン。
【請求項１９】
F.ツラレンシス感染が疑われる患者から採取したサンプル中に請求項７記載の核酸を検出することを含む、F.ツラレンシス感染による感染を診断する方法。
【請求項２０】
配列番号１記載の配列に特異的であるが、F.ツラレンシス亜種ツラレンシス以外の他の亜種の類似の配列には特異的でないプライマー若しくはプローブ、または、他の種を解析するために使用した場合に区別し得る産物を生成するプライマー若しくはプローブ、を選択すること、および、前記プライマー若しくはプローブを使用した解析を行うこと、を含む、F.ツラレンシスの株間を区別する方法。
【請求項２１】
解析がポリメラーゼ連鎖反応(PCR)およびプライマー対を使用して行われる、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
プライマーが配列番号１の開始領域に特異的である、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
プライマーが配列番号２１および配列番号２２記載のプライマーである、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
プライマーが配列番号１の末端トランスポザーゼコード領域に特異的である、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
プライマーが配列番号35および配列番号36記載のプライマーである、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
F.ツラレンシス亜種ツラレンシスから得ることのできる、F.ツラレンシスによる感染に対するワクチンとして使用するためのリポ多糖（LPS）。
【請求項２７】
F.ツラレンシス亜種ツラレンシスがSchu4株である、請求項２６記載のLPS。
【請求項２８】
請求項２６または２７記載のLPSおよび製薬的に許容できる担体を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は核酸配列、特にフランシセラ・ツラレンシス（Francisella tularensis）のO-抗原を生成する酵素をコードする遺伝子、並びにそのワクチンとしてのおよびワクチン製造における使用、および診断における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Francisella tularensisは小型のグラム陰性コッコバチルスであり、動物源性感染疾病である野兎病（Tularemia）の原因である。バージェイの系統的バクテリオロジーの手引きによれば、Francisella属は２つの種、F.ツラレンシス(tularensis)とフランシセラ・ノビシダ(Francisella novicida)を含む。しかしながら、近年、何人かの研究者はF.ノビシダはF.ツラレンシスの亜種と考えるべきであると示唆している（Hollis DG, et al., J.Clin.Micro. 27:1601-1608）。もっとも近縁のバクテリアYersinia philomiragia（エルシニア・フィロミラジア）も、DNAレベルにおける高い関連性故に現在ではフランシセラ属の一員であると考えられている。ノビシダ以外のF.ツラレンシスの幾つかの亜種が提唱されており、それらは以下のとおりである：亜種ツラレンシス、亜種ホラルクチカ(holarctica)および亜種メディアアシアチカ(mediaasiatica)。亜種ツラレンシスおよびホラルクチカは病原性、シトルリンウレイダーゼ活性およびグリセロールからの酸産生に基づいて同定することが出来る（Olsufjev NG, et al. (1959) J. Hyg. Epidemiol. Microbiol. Immunol. 3:138-149）。
【０００３】
フランシセラ・ツラレンシス亜種メディアアシアチカは旧ソビエト連邦の中央アジア共和国に主として見られる。この亜種の株はシトルリンウレイダーゼ活性を有しており、グリセロールを醗酵することが出来るが、F.ツラレンシス亜種ツラレンシスよりもウサギにおいて病原性が低い。
野兎病は北半球に起こる疾病である；症例はヨーロッパ、北アメリカ、アジア、北ロシアおよび日本に見られる。げっ歯類はこのバクテリアの主たる保有宿主と考えられており、ダニが主たる媒介者と考えられている。
【０００４】
グラム陰性バクテリアのリポ多糖(LPS)は外膜の主要構成成分である。この分子は３つの領域、外膜に包埋されて種間で保存された構造を有する脂質-A、２つの多糖類、種間でその複雑度の異なるコアオリゴ糖、および非常に多型性のある構造を有するO-抗原からなっている（Kenne L, et al. (1983) Bacterial Polysaccharides The polysaccharides. Academic Press, pp.287-362）。LPS分子は血清殺傷に対する保護(Whitefield C, et al. (1997) Mol. Micro. 23:629-638)のため、およびカチオン性抗微生物ペプチドに対する保護（Groisman EA. (1994). Trends Microbio. 2: 444-449）のためにバクテリアにとって必要であると考えられている。
【０００５】
病原性のより低いF.ツラレンシス亜種ホラルクチカ株から単離されたLPSの構造および免疫原性はある程度研究されている（Dreishbach VC et al. (2000) Infect. Immun 68:1998-1996）。このLPSで免疫した動物は亜種ホラルクチカ株の攻撃から保護されるが（Fulop MJ, et al. (1995) Vaccine 13:1220-1225）、亜種ツラレンシス株の攻撃から保護されない（Fulop MJ, et al., (2001). Vaccine 19:4465-4472）。しかしながら亜種ホラルクチカ株のLPSは他のグラム陰性LPSよりも毒性が低いようであり、そのO-抗原はシュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）06および７型シゲラ・ジセンテリアエ（Shigella dysenteriae）に見られる糖に構造的に関連した稀な糖を含んでいる。
より病原性の高い亜種ツラレンシス株からのLPS単離の報告はない。
【０００６】
PLS構造を他の種で研究した場合、株間の構造上の相違がO-抗原の構成のみにあることがしばしば観察される。従って、診断テストのため、および組換え的に産生することを可能とするため、病原性生物の取り扱いを回避するために、病原性亜種のLPS分子のO-抗原部分の構造を明らかにすることは有用であろう。
しかしながら、O-抗原発現の遺伝的基礎は複雑である。ほとんどのバクテリアでは、完全なO-抗原の産生のために必要な遺伝子はバクテリア染色体上にクラスターとして位置している。従って、O-抗原に関与する遺伝子の同定及び単離は簡単な仕事ではない。さらに、病原性株のLPSの同定および単離は、伝統的方法を用いて染色するのが困難であるためさらに複雑である。
【発明の開示】
【０００７】
本出願人らはF.ツラレンシス亜種ツラレンシスにおけるO-抗原産生の遺伝的基礎を明らかにした。さらに、本出願人らは種々のF.ツラレンシス株からのLPSのワクチンとしての効能を明らかにした。
本発明によれば、細胞内で共に発現されたときに投与された動物に免疫応答を生じさせることの出来る一連の酵素または酵素断片をコードする核酸が提供される。この応答はフランシセラ・ツラレンシスに対する保護的な応答であり、前述の核酸は配列番号3-17の少なくとも幾つかの酵素またはその改変体をコードする核酸である。
「改変」という表現は、配列内の１以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたという点で基礎となる配列から異なっているアミノ酸の配列をいう。アミノ酸置換は、アミノ酸が広義に類似の特性を有する異なるアミノ酸で置換されている場合に「保存的」であると考えることができる。非保存的置換とは、アミノ酸が異なる型のアミノ酸で置換された場合を言う。大雑把に言えば、ポリペプチドの生物学的活性を改変しない非保存的置換は少ないであろう。適切には、置換は基礎配列に対して少なくとも60％同一、好ましくは少なくとも70％同一、より好ましくは少なくとも90％同一であろう。
【０００８】
この例における同一性は、例えばリップマン−ピアソン(Lipman-Pearson)のアルゴリズムを用い、Ktuple：２、ギャップペナルティ：４、ギャップ長ペナルティ：12、標準PAMスコアリング行列（Lipman D.J. and Pearson, W.R., Rapid and Sensitive Protein Similarity Searches, Science, 1985, vol. 227, 1435-1441）によって判定することが出来る。
特に、本発明は配列番号３〜17の酵素をコードする核酸を含む。
そのような核酸の好ましい例には配列番号１またはその変種が含まれる。特に前記核酸は配列番号１の核酸である。
【０００９】
核酸配列との関係において用語「変種」とは、そのポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質配列が基礎配列によってコードされるタンパク質と類似の特性を示す限り、ポリヌクレオチド配列からの（への）１以上の核酸のいかなる置換、変種、改変、置換、欠失、または付加をもいう。従って、この用語にはアレル変種、類似のタンパク質をコードするが遺伝コードの縮重の結果としてのみ変動する縮退変種が含まれる。この用語には本発明のポリヌクレオチド配列に実質的にハイブリダイズするポリヌクレオチドが含まれる。好ましくは、そのようなハイブリダイゼーションは低ストリンジェンシー条件または高ストリンジェンシー条件、または、その間で生じる。一般的な用語では、低ストリンジェンシー条件は、室温から約55℃の温度における３ｘSSCとして定義することができ、高ストリンジェンシー条件とは約65℃における0.1ｘSSCとして定義することができる。SSCとは0.15M NaCl、0.015Mクエン酸三ナトリウムバッファーのことである。３ｘSSCはSSCの３倍濃度である。
【００１０】
典型的には変種は本発明のポリヌクレオチドの配列と65％以上を共通とし、より典型的には70％以上、好ましくは75％以上、より好ましくは80％または85％、および特に好ましくは90％、95％、98％または99％またはそれ以上の同一性を有する。
変種には、この技術分野でよく知られたように、その配列の発現が必要とされる特定の生物、例えば、大腸菌のような原核細胞のためにコドン頻度が増強され、または最適化されるように改変された基礎配列が含まれ得る。これには、標的生物において高度に発現している遺伝子に通常見られるものに適合させるために特定のヌクレオチド含量を改変すること、例えば、配列中に存在するＧおよびＣのパーセンテージを変更することが含まれ得る。加えて、配列番号１の特定の変種は合成変種であり、大腸菌のような一般的な発現宿主の高度に発現している遺伝子に稀にしか見られないコドンを除去し、O-抗原をコードする遺伝子に稀にしかみられないコドンの導入を回避するために操作された合成変種である。例えば、可能な限りアミノ酸arg、leu、ile、glyおよびproのコドンがCGTまたはCGC（arg）、CTG、CTTまたはCTC(leu)、ATCまたはATT(ile)、GGTまたはGGC（gly）およびCCG、CCAまたはCCT(pro)に改変され、稀なコドンが除去される。
【００１１】
同一性の程度を決定する目的で核酸配列を比較する場合に、BESTFITおよびGAP（どちらもWisconsin Genetics Computer Group (GCG)ソフトウエアパッケージ）のようなプログラムが使用できる。例えば、BESTFITは２つの配列を比較し最も似ているセグメントの最適アラインメントを生成する。GAPは配列をそれらの全長にわたってアラインメントすることを可能にし、いずれかの配列に適切にスペースを挿入して最適アラインメントを見つけ出す。適切には、本発明との関連において核酸の同一性について議論する場合、比較は配列の全体の長さにわたる配列のアラインメントによって行う。
【００１２】
配列番号１は図５および配列番号３〜17に示されたいくつかの酵素をコードする一群の遺伝子を含む。好ましくは、配列番号１のいかなる変種も配列番号３〜17の酵素またはそれらの改変体をコードする。アミノ酸配列との関連において使用する「断片」という表現は、任意の完全なアミノ酸配列と同じ活性を有する、そのアミノ酸配列のいかなる一部分をもいう。断片とは適切には基礎配列からの少なくとも20、好ましくは少なくとも50個の連続するアミノ酸を含む。
用語「断片」は核酸配列についても用いられる。配列番号１の断片は診断用途を有し、これらは本発明のさらなる側面を構成する。診断目的では、断片は極めて短くてもよく、例えば５〜30塩基であってもよく、プライマーまたはプローブとして使用することができる。診断目的の適切な断片を同定し得る配列番号１の特に特徴的な領域は以下で明らかにされる。治療に有用な断片は一般にはより長いことが期待され、例えば600〜17,000塩基長であると期待される。
【００１３】
配列番号１を含み、多糖を構築するために必要な酵素の組の発現に関与するF.ツラレンシス株Schu S4（亜種ツラレンシス）のゲノムの領域が明らかにされている。それは図６および配列番号41に示されている。この配列には図５中で配列番号３〜20として示された酵素をコードする一群の遺伝子を含むいくつかの遺伝子が含まれている。推定される機能は表１に示した既知の配列との比較によって割り当てた。
【００１４】
表１
2005528108.tif 000002
【００１５】
特に、配列番号３〜17に示したタンパク質はO-抗原生合成に関与していると考えられる。O-抗原自体は診断用途および予防用若しくは治療用ワクチンとしての用途を有する。
本発明の核酸が一緒に宿主細胞中で発現される場合、ヒトを含む動物において免疫応答を引き起こす抗原の構築を生じさせ、これはF.ツラレンシスによる感染に対して保護的であろう。従って、それらは診断用途および予防用又は治療用ワクチンの製造の両方に使用することが出来る。
本核酸は生ウイルスワクチン、例えばアデノウイルスベクター若しくはワクシニアのようなベクターに取り込ませてもよく、またはプラスミドに含めていわゆる「裸のDNA」ワクチンを形成してもよく、あるいは、好ましくは弱毒化サルモネラ種のようなバクテリアベクターに含めても良い。この場合、当業者に知られるように、核酸はプロモーター、シグナル配列、エンハンサーその他のような適切な制御要素の制御下に置かれるであろう。この場合、核酸はワクチンが投与される患者の細胞内で発現されても、または、バクテリアベクターの場合は、宿主細胞自体の中で発現されても良い。結果として、保護的O-抗原をin situで構築することができる一群の酵素が産生される。
【００１６】
ベクターは製薬的に許容できる担体とワクチン製剤中で適切に一緒にされる。この分野で知られるように、担体の性質は使用するベクターの型に依存する。特に、ワクチンが組換えサルモネラを含む場合は、経口投与に適した組成物の形態であることが好ましい。
あるいは、核酸は宿主細胞を形質転換するために使用する発現ベクター中に含めても良い。適切な宿主細胞は原核細胞または真核細胞であるが、大腸菌のような原核細胞が好ましい。特に、使用する核酸は配列番号１の合成変種であって、特定の宿主細胞における発現のために最適化された核酸である。保護的O-抗原はこれらの細胞の培養後、細胞から回収することが出来る。
従って、さらなる側面において、予防用または治療用ワクチンを調製する方法が提供される。この方法は宿主細胞を本発明の核酸で形質転換すること、前記宿主細胞を培養すること、およびF.ツラレンシスに対する保護的免疫応答を生成する部分を回収することを含む。
【００１７】
本方法に使用する発現ベクターおよび宿主細胞は、それらの産物と共に本発明のさらなる側面を形成する。
この分野で知られるように、この型のワクチンは適切には抗原が製薬的に許容できる担体と一緒になった医薬組成物の形態であろう。
本発明の組成物は、経口使用に適した形態、吸入による投与に適した形態（例えば、細かく細分化された粉末または液体エアロゾル）、吸気による投与に適した形態（例えば、細かく細分化された粉末）または非経口投与に適した形態（例えば、静脈投与、皮下投与、筋肉内投与に適した滅菌水性又は油性溶液、または直腸投与のための坐薬）であって良い。
本発明の組成物はこの分野でよく知られた通常の製薬用賦形剤を用いて通常の方法によって得ることが出来る。
製剤化に関するさらなる情報についてはComprehensive Medicinal Chemistry, (Corwin Hansch; Chairman of Editorial Board), Pergamon Press 1990の第５巻第25.2章を参照されたし。
【００１８】
単一用量を作製するために１以上の賦形剤と合わされる活性成分の量は治療される宿主および特定の投与経路に依存して必然的に変わるであろう。例えば、ヒトに対する経口投与を意図した製剤は一般に、例えば、総組成物量の約５〜約98％の間で変動し得る適切かつ都合のよい量の賦形剤と混合された0.5mg〜２gの活性薬剤を含むであろう。用量単位形態は通常１mg〜約500mgの活性成分を含むであろう。投与経路および投与計画に関するさらなる情報については、Comprehensive Medicinal Chemistry（Corwin Hansch; Chairman of Editorial Board), Pergamon Press 1990の第５巻第25.3章を参照されたし。
本発明の部分の治療または予防目的の用量のサイズは、よく知られた医学的原理に従って、動物又は患者の年齢および性別、および投与経路に従って自然に変動するであろう。
【００１９】
従って、さらなる側面において、本発明は、配列番号３〜17のタンパク質又はそれらの改変体を発現する宿主細胞から得ることのできるF.ツラレンシスの組換えO-抗原を提供する。
さらに、本出願人らによりO-抗原配列の配列が認識されたことにより、この配列は患者がF.ツラレンシス感染を起こしているかどうかを決定する診断テストの基礎を形成し得るという可能性が提供される。このような場合、血液または唾液のようなサンプルを患者から採取し、配列番号１またはそれらの変種の存在をテストすることができる。
具体的な検出方法はこの分野でよく知られており、それらにはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のような増幅方法、および／または他の検出方法、たとえば標的配列、特に配列番号１にハイブリダイズする標識プローブを用いた方法が含まれる。この種のプライマーおよびプローブは本発明のさらなる側面を形成する。
特定のプライマーおよびプローブを選択することにより、F.ツラレンシス感染の株間の区別が可能となるかも知れない。例えば、出願人は、配列番号21と22、35と36を含むプライマーはF.ツラレンシス亜種ツラレンシスおよびF.ツラレンシス亜種ホラルクチカ間を区別することが出来ることを見出した。前者の場合、この可能性は下流配列における違いによって生じ、後者の場合は、フランキングトランスポザーゼ配列における欠失の相違によって生じる。従って、これらの領域に基づいたプライマーまたはプローブを使用して、どの特定の株がF.ツラレンシス亜種ツラレンシスか別の株であるかを決定することが出来る。
【００２０】
亜種ツラレンシス株のLPSが亜種ホラルクチカ株のLPSと類似の構造を有しているかを見出すため、F.ツラレンシス株Schu S4（亜種ツラレンシス）のLPSを抽出した。
F.ツラレンシス株Schu S4から抽出したLPSはゲル電気泳動により特徴的なラダーパターンを有することが示された。しかしながら、LPSは染色するのが難しく、O-抗原バンドを視覚化するためには更なる酸化が必要であった。このことは、F.ツラレンシス株Schu S4のO-抗原中の糖は大部分の他のバクテリアで見られるO-抗原糖と同じようには酸化されていないことを示唆するかも知れない。
F.ツラレンシス株Schu S4のO-抗原遺伝子クラスターには15の遺伝子が含まれ、それらの推定される機能はBLASTの結果およびO-抗原中に含まれる糖に関する構造的情報に基づいて帰属させた（上述の表１参照）。このクラスター中の遺伝子はO-抗原分子の産生およびこの分子のバクテリア細胞外への輸送に関与する可能性が高い。
【００２１】
２つの主要なO-抗原合成様式、すなわち、O-抗原ポリメラーゼ(wzy)-依存性およびwzy-非依存性様式がある。wzy-依存性の系では、ポリメラーゼ（wzy）、フリッパーゼ（wzx）および鎖長決定因子（wzz）がLPS分子の重合および輸送を容易にする細胞壁中の複合体の一部であると考えられている。wzy-非依存性の系では、別のタンパク質の組がLPS分子の重合及び輸送に関与している。この輸送体はATP駆動され、ABC−輸送因子ファミリーに属するwztおよびwzmという２つのタンパク質から構成されている。
F.ツラレンシスO-抗原遺伝子クラスターにおいて、wzyおよびwzxに高い同一性を有するタンパク質が存在し、このことはO-抗原の輸送および重合はwzy-依存性経路を介したものであることを示唆する。
【００２２】
推定されるO-抗原フリッパーゼ(Wzx)およびポリメラーゼ(Wzy)タンパク質のTMHMM解析は配列類似性に基づいて帰属されたそれらの機能を支持した。F.ツラレンシスタンパク質について予測された膜貫通ヘリックスの数（WzxおよびWzyについて、それぞれ11および14）は他のバクテリアについて予測された数（これらの細胞質膜タンパク質はおよそ10〜12の膜貫通ヘリックスを有していると予測されている）と類似している。F.ツラレンシスWzyタンパク質について２つの大きなペリプラズム領域が予測されることは、シゲラ・フレクスネリ（Shigella flexneri）Wzyタンパク質の２つの大きなペリプラズム領域の存在と一致する。
Wzzホモログをコードし得る遺伝子は同定されておらず、このことはF.ツラレンシスゲノム中にはこの遺伝子は存在しないことを意味するのかも知れない。
【００２３】
遺伝子WbtAのWbtLに対する密接な近接性または重複はそれらが一つのオペロンとして転写されることを示唆している。
およそ0.5kb下流はwbtMであり、これは推定される自身のプロモーターを有している。第２のトランスポザーゼの下流はmanCおよびmanBであり、これらも自身の推定されるプロモーターを有し、F.ツラレンシスO-抗原の構造の一部としてマンノースは見出されず、その合成に必要な中間体産物の一つでもないので、おそらくO-抗原の生合成には関与していない。
manCおよびmanBの２つの遺伝子はF.ツラレンシスの祖先においてO-抗原の生合成にかつては関与していたのかも知れない。O-抗原生合成遺伝子クラスターwbtAからwbtMをフランキングするトランスポザーゼが存在することは、このクラスターが水平的に獲得されたもの、おそらく祖先多糖遺伝子クラスターを置換したものであることを示唆する。
【００２４】
O-抗原クラスターは全ての亜種ツラレンシスおよびスクリーングしたＢ株に存在しているようである。しかしながら、亜種ツラレンシスとＢ株の間にはトランスポザーゼを含む領域内に少なくとも一つの相違が存在する。部分的に欠失したトランスポザーゼを用いたBLAST解析により、F.ツラレンシスSchu S4ゲノム中におそらく50を越えるそのコピーが明らかになった。F.ツラレンシスゲノム中のこの挿入配列はS.ニューモニア（S.pneumonia）に由来し、ゲノム中でランダムにコピーされた可能性がある。この挿入配列をフランキングするオープンリーディングフレームはＦ．ツラレンシスゲノム中に有意な相同性を全く有しておらず、このことはこれらの遺伝子は挿入を伴ってこの位置に取り込まれたのではないことを示唆する。
【００２５】
亜種ツラレンシス株においては、この挿入は欠失してトランスポザーゼの断片および下流配列のみが残された。亜種ツラレンシスおよび亜種ホラルクチカクラスター間の全体的な類似性は、この挿入はF.ツラレンシスにおいて亜種の枝分れ前に起こったことを示しているようだ。亜種ツラレンシストランスポザーゼの部分欠失はDNAのこの領域の安定化という効果を有するのかも知れない。なぜなら、この酵素は挿入事象が起こるために必要であることが見出されているからである。
このことが亜種ツラレンシスまたはＢ株のいずれかにおいてクラスターの発現に影響を与えることは考えにくい。亜種ツラレンシス株においてトランスポザーゼの一部はゲノムの縮小化のために失われたのであろう。しかしながら、異なる亜種のDNAを増幅した場合に、この領域を含んで生成されるPCR産物のサイズ上の大きな相違は診断方法に利用できるであろう。
【００２６】
出願人は、F.ツラレンシス株Schu S4に見られるのと類似のO-抗原遺伝子クラスターがF.ツラレンシスの他の株に存在することを見出した。これらには、亜種ホラルクチカ株が含まれる。従って、保護的免疫応答を生じさせるためにO-抗原を利用するワクチンはF.ツラレンシスのいくつかの病原性株による感染に対する保護を与えると思われる。
出願人はF.ツラレンシス亜種ツラレンシス株のLPSが保護的であることを証明した。特に、これはF. ツラレンシス亜種ツラレンシス株以外の株の攻撃、特に、F.ツラレンシス亜種ホラルクチカによる攻撃に対して保護的であるように見える。この発見は、F.ツラレンシス亜種ホラルクチカのLPSが他のF.ツラレンシス種による感染に対して保護的でないことを示唆する上記で報告した結果に照らして予想外である。従って、上述した組換えワクチンは特に有用であろう。
【００２７】
このように、さらなる側面において、本発明は、F.ツラレンシスによる感染に対するワクチンとして使用するための、F.ツラレンシス亜種ツラレンシスから得ることの出来るLPSを提供する。F.ツラレンシス亜種ツラレンシスのLPSを含むワクチン組成物も新規であり、本発明のさらなる側面を構成する。これらの組成物は上述した製薬的に許容できる担体を含むであろう。
本発明を模式的な図を参照しつつ実施例によって具体的に記載する。
【００２８】
実施例１
方法
バクテリア株および増殖条件
本研究で使用したバクテリア株を表２に示す。これらをBCGA寒天上で37℃にて48時間培養した。
【００２９】
2005528108.tif 000003
【００３０】
LPS精製
F.ツラレンシス株Schu S4から熱フェノールおよび水抽出法（Westphal O, et al. 1965, Methods in Carbohydrate Chemistry 5:83-91）を用いてLPSを精製した。
ゲル電気泳動および銀染色
グリシンゲル電気泳動をLemmliの方法（Laemmli Uk. (1970). Nature 227: 680-685）に従って行った。12.5％分離ゲルを4.5％スタッキングゲルと共に使用した。各サンプル10μlを100mV、約２時間、Mini-proteanIIスラブシステム(Biorad)中で電気泳動した。ゲルをChartの方法（Chart H. (1994) LPS: Isolation and Characterisation. Raton B, Arbor A（編集）、Methods in Practical Laboratory Bacteriology. CRC Press, London, Tokyo, pp.11-20）に従って銀染色した。しかしながら、酸化工程を10分間に延長した。
【００３１】
ヌクレオチド配列解析
O-抗原生合成クラスターをコードする配列を同定し、他のバクテリアのO-抗原の生合成に関与する既知のタンパク質配列（GenBankから入手）を用いてF.ツラレンシスSchu S4部分ゲノム配列（Prior RG, et al. (2001) Journal of applied microbiology 91:614-620）（http://artedi.ebc.uu.se/Projects/Francisella/で入手可能）をTBLASTN（Altschul SF. et al. (1997) Nucleic acids research 25: 3389-3402）を用いてプロービングして抽出した。推定されるO-抗原遺伝子クラスターを含むコンティグを抽出し、アノテーションツールArtemis（http://www.sanger.ac.uk/Software/Artemis）を用いて解析した。これにより、BLASTN、BLASTXおよびBLASTP検索の結果、GC含量およびこの配列に対して行った他の解析の結果、および予測されるタンパク質の視覚化が可能となった。
推定されるO-抗原フリッパーゼ遺伝子（wzx）およびO-抗原ポリメラーゼ遺伝子（wzy）によってコードされるタンパク質配列をTMHMM（Sonnhameer ELL, et al. (1998), Glasgow JU, Littlejohn T, et al.（編集）、The sixth international conference on intelligent systems for molecular biology. AAAI Press, Menlo Park, CA, pp.175-182）を用いて膜貫通ヘリックスについて解析した。
【００３２】
推定されるO-抗原遺伝子クラスターのPCR解析
表１に示したF.ツラレンシス株からKarlsson et al. 2000(Microb. Comp. Genom. 5: 25-39)に記載されたようにフェノール抽出によりDNAを抽出した。重複するPCRプライマーの10組の対を設計し、DNAstarプログラムPrimerSelectを用いて、およそ２kbにわたるセグメントとして推定されるO-抗原遺伝子クラスター全体を増幅した。これらのプライマーはアニーリング温度が42℃〜59℃になるように設計したがこの全てを49℃にて成功裡に使用できた。
これらのプライマー対の構造を表３にまとめた。
【００３３】
表３
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【００３４】
各鋳型DNAと各プライマー対を用いてPCR増幅を以下の混合物中で行った：１xPCRバッファー（1.5mM MgCl2を含む）、0.2mMデオキシヌクレオシド三リン酸（dNTP）、2.5mMフォワードプライマー、2.5mMリバースプライマー、2.0μl鋳型DNA、0.5U Taqポリメラーゼおよびフィルターを通した滅菌水、最終体積20μl。反応混合物を90℃にて１分間インキュベーションし、90℃にて１分間、49℃にて１分間および72℃にて２分25秒、30サイクル行い、最後に72℃にて10分間インキュベーションした。PCR産物を0.5％アガロースゲル、エチジウムブロミド染色により視覚化した。PCRバッファー、dNTPおよびポリメラーゼはロシュから購入した。PCRプライマーはMWG-Biotechが合成した。
【００３５】
PCR産物のクローニング
プライマー対８を用いて増幅したSchu S4、HN63、およびLVS DNAから増幅したPCR産物をpGEM-T easy(Promega)に配列解析のためにクローニングした。化学的に処理した大腸菌JM109コンピテント細胞をライゲーションしたDNAで形質転換し、推定されるクローンをコロニーPCRおよび制限エンドヌクレアーゼによる消化の両方を用いてスクリーニングした。ライゲーション、トランスフォーメーション、コロニーPCR、制限エンドヌクレアーゼ消化およびアガロースゲル電気泳動を含む全てのDNA操作はSambrookら(1987)Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor, New York）に従って行った。
アガロースゲルからのPCR産物の精製はQIAquick Gel Extractionキット（Qiagen）を用いて、業者の指示書に従って行った。
【００３６】
３つの構築物をジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法（Sanger F, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74:5463-5467）によってOswelにてユニバーサルプライマーを用いて配列決定した。各配列を比較し、手元に保存されたGenBankデータベース中でホモロジー検索のためARTEMISソフトウエアパッケージのBLAST機能（Altshcul SF, et al. (1990) Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215: 403-410）を使用してDNAの種々の領域の機能を同定した。
【００３７】
O-抗原分子の質量分析解析
結果
LPS精製
熱フェノール−水抽出法を使用して2.2gの凍結乾燥したF.ツラレンシス株Schu S4からLPSを精製した。これにより7mgのLPSが得られ、収率0.3％であった。LPSはSDS-PAGEおよび銀染色後視覚化は困難であった。酸化工程を５分から10分間に延ばし、ラダーパターンを視覚化した（図１）。
【００３８】
F.ツラレンシスO-抗原生合成遺伝子クラスター
F.ツラレンシスO-抗原生合成遺伝子クラスターは長さ17kb、O-抗原生合成に関与するとして推定的に同定される15の遺伝子（２つのトランスポザーゼによってフランキングされている）を含んでいることが分かった（図２）。潜在的なプロモーター部位がwbtAおよびwbtM遺伝子のすぐ上流に同定された。２番目のトランスポザーゼの下流にはmanCおよびmanB遺伝子が位置しており、manCのすぐ上流に潜在的なプロモーターが位置していた。
【００３９】
図２は500塩基というウィンドウサイズを用いたこのクラスターのＧ＋Ｃ含量プロットを示した図である。ゲノムのこの領域の全体的なＧ＋Ｃ含量は31.27％であり、およそ33％というゲノムの平均よりも僅かに低い。このプロットはこのクラスターの中央領域、wzyからwbtK、は一般にかなり低いＧ＋Ｃ含量を有していることを示している。
manCの下流、反対側のストランド上には転写終結因子rhoおよびチオレドキシンが位置している。大腸菌においては、これらの遺伝子はどちらも多糖類生合成遺伝子クラスター（エンテロバクテリアの共通抗原）の一方の端に隣接して見出される。
F.ツラレンシスのO-抗原反復ユニットは、O-抗原生合成に関与する遺伝子の推定される機能と共に図３に示した。他のLPSおよび糖生合成遺伝子に対する相同性に基づき、特に類似のO-抗原反復構造を発現するP.aeruginosa血清型06（Knirel YA, et al. (1985) Eur. J. Biochem. 159: 541-550）に基づき、これらの遺伝子産物の推定される役割を帰属させた。
2-アセトアミド-2,6-ジデオキシ-D-グルコース（QuiNAc）の生合成はWbtA、デヒドラターゼ、およびUDP-Glc 4-エピメラーゼに相同性のあるWbtCが関与すると考えられる。WbtAおよびWbtCはP.aeruginosa株06のWbpMおよびWbpVと相同性を共有するが、WbpMおよびWbpVはどちらもQuiNAc生合成に関与すると考えられており、06  O-抗原合成に必須であることが示されている。
【００４０】
WbtE、WbtFおよびWbtHは2-アセトアミド-2-デオキシ-D-ガラクトウロナミド（GalNAcAN）生合成に関与すると考えられている。WbtFはWbpPおよびVipBを含むUDP-グルコース 4-エピメラーゼに対して相同性を示し、一方WbtEはWbpOおよびVipA、それぞれP.aeruginosaおよびSalmonella enterica var typhiにおいて2-アセトアミド-2-デオキシ-D-ガラクトウロン酸（GalNacA）の形成に関与するUDP-GalBAcデヒドロゲナーゼに相同性を示す。WbtHはP.aeruginosa血清型06のWbpS（GalNAcANアミド基の形成に関与すると想定されている）を含むグルタミンアミドトランスフェラーゼと有意なアラインメントを生成する。４番目の糖、4N-ホルミル-キノボサミン（Qui4NFm）の生合成はWbtI、WbtJ、WbtLおよびWbtMを含む可能性が高い。配列相同性によりWbtLは活性化糖dTDP-D-グルコースの形成に関与するかも知れず、WbtMはdTDP-D-グルコース4,6-デヒドラターゼとして機能することが示唆される。WbtIは、ペルオサミンシンセターゼRfbEに相同性を示すので、Qui4NFmアミノ化に関与すると考えられる。最後に、WbtJはホルミルトランスフェラーゼに有意な相同性を示し、N-ホルミル部分の付加に関与する可能性が高い。
【００４１】
特異的グリコシルトランスフェラーゼがO-抗原反復のオリゴ糖単位の形成に必要である。F.ツラレンシスの場合、４種のグリコシルトランスフェラーゼが各O-抗原単位の合成に必要であろう。相同性に基づき、WbtBはQuiNAcのウンデカプレニルホスフェート(Und-P)への付加を媒介してO-抗原生合成を開始させると考えられる。WbtDおよびWbtGはおそらくGalNAcANトランスフェラーゼであり、おそらく２つの連続するGalNAcAN残基のO-抗原単位への付加に関与するであろう。WbtDはP.aeruginosa06株のWbpU（2-ホルムアミド-2-デオキシ-D-ガラクトウロナミド（GalNFmAN）をQuiNAcへ移すと考えられている（Belanger M, et al. (1999) Microbiology 145: 3505-3521））と相同性を有する。WbtGはGalNAcAのGalNFmANへの付加に関与すると考えられているP.aeruginosaのWbpTに相同である。WbtKはおそらく４番目のグリコシルトランスフェラーゼであり、4,6-ジデオキシ-4-ホルムアミド-D-グルコース（QuiNA4Fm）を付加してテトラ糖Ｏ単位を完結させる。
【００４２】
WzxおよびWzy
アッセンブルされると、O-抗原反復単位は輸送因子／フリッパーゼWzxによって内膜のペリプラズム側に転位される。次にWzyがO-抗原反復単位ポリメラーゼとして作用する。TMHMMを用いて解析したところ、F.ツラレンシスWzxタンパク質は予想される14の膜貫通ヘリックスを有しており、両端は膜の細胞質側にあった。F.ツラレンシスWzyタンパク質は予想される１１の膜貫通ヘリックスを有し、アミノ末端は膜の細胞質側にあり、カルボキシ末端はペリプラズム側にあると予測された。さらに、Wzyタンパク質はアミノ酸142-178、268-327の２つの大きなペリプラズム領域を有すると予測された。
O-抗原鎖長決定因子(wzz)に相同性を有する遺伝子は現在のF.ツラレンシスSchu S4配列データセット中には同定されなかった。
【００４３】
O-抗原遺伝子クラスターのPCR解析
各鋳型DNAからのPCR産物のうち８つ（プライマー組、２、３、４、５、６、７、９および10）はアガロース電気泳動で見た場合に同じサイズであるように見えた。遺伝子クラスターの開始部をカバーするプライマー対１は、F.ツラレンシスSchu S4ゲノム中に多数回見られる挿入エレメントの存在のためにこのクラスターの上流部位に適切なプライミング部位が無いので、4.8kb領域を増幅すべく設計しなければならなかった。このプライマー対１はF.ツラレンシスSchu S4については対応する大きさの産物を生成したが、亜種ホラルクチカ株LVSについて使用したときには産物を生成しなかった。従って、このプライマー対はF.ツラレンシス亜種ツラレンシスとF.ツラレンシス亜種ホラルクチカとの区別が必要な診断においては特別な応用性を有するであろう。前者からのDNAを含むサンプルが存在する場合、プライマー対１を用いたPCRは産物を生成するであろうが、この産物は第２の場合には存在しないであろう。
【００４４】
プライマー対８を用いたPCRにより亜種ツラレンシス株と亜種ホラルクチカおよび亜種メディアアシアチカの間でサイズの相違が明らかになった。亜種ツラレンシス株は亜種ホラルクチカ株（LVSを含む）および亜種メディアアシアチカと比較した場合303ヌクレオチドの欠失を示した。亜種ツラレンシスSchu S4、亜種ホラルクチカ株HN63およびLVSのこの領域のクローニングおよび配列解析により、Schu S4の欠失は、ストレプトコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)のIS630-spn１トランスポザーゼORF １に類似した推定的ランスポザーゼの開始部に生じていることが示された。
従って、プライマー対８はF.ツラレンシス株間を区別するためにも特に有用であろう。DNAを含むサンプルについて、これらのプライマーを用いてPCR反応を行えば、大きさ、例えばゲル上での大きさに基づいて産物を分離することによりそれらの間で区別し得る相違が明らかになる筈である。
【００４５】
実施例２
保護的効果
LPS精製
F.ツラレンシス株Schu S4またはLVS株から、実施例１で述べた熱フェノールおよび水抽出法を用いてLPSを精製した。
LPSによる免疫感作および保護作用研究
F.ツラレンシスLVS株またはSchu S4株のLPSがBALB/cマウスをF.ツラレンシスから保護する能力を、精製LPSによってi.p.経路で免疫した６匹のメスBALB/cマウスの免疫感作グループによって決定した。各投与において、マウスに50μgのLPSをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で与えた。マウスは７日間の間隔をおいて３回免疫した。
最後の免疫から21日後、マウスをF.ツラレンシスLVS（１ｘ105CFU）でi.p.攻撃した。全ての対照動物は攻撃後死亡した。LVS株から単離したLPSで免疫したマウスは死亡から保護された。Schu S4またはLVS株で免疫したマウスは死亡までの時間が延長された。10cfuという用量の攻撃ではSch S4で免疫した動物は64時間（99％信頼度）という平均時間生存し、これは免疫していない対照よりも長かった。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】大腸菌K325株（1.25μg、トラック１）およびF.ツラレンシス株Schu S4（50μg、トラック２）から単離したLPSのSDS-PAGE分析。
【図２】F.ツラレンシス株Schu S4におけるO-抗原遺伝子クラスターの遺伝的構成。O-抗原クラスターのG+C含量は上部パネルに示してある。
【図３】F.ツラレンシス株Schu S4のO-抗原サブユニットの模式的構造およびO-抗原遺伝子クラスターの遺伝子に帰属させた推定される機能。単一のO-単位を糖残基およびグリコシド結合と共に示した。
【図４】図４は、図５に示した全てのタンパク質をコードする、F.ツラレンシスゲノムの核酸配列領域を示した図である。
【図５】図５は、配列番号１によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列およびフランキング遺伝子配列の数を示した図である。
【図６】図６はO-抗原産生に必要な酵素をコードする核酸配列（配列番号１）を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図４】
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【図４】
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【図４】
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【図４】
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【図４】
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【図４】
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【図５】
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【図５】
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【図５】
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【図５】
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【図６】
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【図６】
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【図６】
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【図６】
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【図６】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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