(57)【要約】  本発明は複数の細胞培養バッチから採取した試料又は所定バッチから異なる時点で採取した試料の表面増強レーザー脱離イオン化質量スペクトルプロフィルを作成することによりターゲットポリペプチドの生産を監視する方法を提供する。本発明は更に精製工程中の種々の時点で採取した試料の表面増強レーザー脱離イオン化質量スペクトルプロフィルを作成することにより混合物からのターゲットポリペプチドの精製を監視するための方法も提供する。更に、本発明は所定精製工程の規模を拡大するのに使用可能な条件の特定方法にも関する。
2005509173.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の細胞バッチにおけるターゲットポリペプチドの生産の監視方法であって、
（ａ）各細胞培養バッチがターゲットポリペプチドを生産する条件下で複数の細胞培養バッチを培養する段階と、
（ｂ）各バッチにおける生体分子成分の表面増強レーザー脱離イオン化質量スペクトルプロフィルを作成し、表面増強レーザー脱離イオン化質量スペクトルプロフィルによりバッチにおける生体分子成分の定性的又は定量的検出を提供する段階と、
（ｃ）プロフィルを比較し、バッチにおける生体分子成分間の定性的又は定量的差異を測定することにより、ターゲットポリペプチドの生産を監視する段階を含む前記方法。
【請求項２】
（ｃ）がバッチにおけるターゲットポリペプチドの量の定量的差異を測定することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｃ）がバッチ間のターゲットポリペプチドの定性的差異を測定することを含み、定性的差異がターゲットポリペプチドとターゲットポリペプチドの分解形の差異を含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
（ｃ）がバッチにおける汚染性生体分子成分の定量的又は定性的差異を測定することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ターゲットポリペプチドが組換えポリペプチド又は天然ポリペプチドである請求項１に記載の方法。
【請求項６】
規定の量と純度レベルでターゲットポリペプチドを生産する少なくとも１個のバッチを識別する段階を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
最低量のターゲットポリペプチドの分解形を含むバッチを識別する段階を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項８】
バッチにおける少なくとも１種の汚染性生体分子を識別する段階を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項９】
比較する生体分子成分が増殖因子、誘導剤及び代謝産物から構成される群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
（ａ）がターゲットポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現させることを含み、（ｂ）のプロフィルがターゲットポリペプチド生産中の最適ターゲットポリペプチド発現段階、細胞培地に１種以上の付加成分を添加するターゲットポリペプチド生産段階、細胞培地中の非分解ターゲットポリペプチド量が最高となるターゲットポリペプチド生産段階、又はターゲットポリペプチドを回収するのに最適なターゲットポリペプチド生産段階の１種以上を識別する請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
同一条件下でバッチを培養する請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
異なる条件下でバッチを培養する請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
（ｃ）がバッチ間のターゲットポリペプチドの定性的差異を測定することを含み、定性的差異がターゲットポリペプチドとターゲットポリペプチドの修飾形の差異を含み、修飾がグリコシル化、リン酸化、脂質化、酵素分解、標識及びポリペプチド凝集から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
修飾がインビボ又はインビトロで行われる請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ターゲットポリペプチドがホルモン、サイトカイン、免疫グロブリン、酵素、受容体、抗原、調節因子及び蛋白質輸送体から構成される群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも１個の特定バッチからのターゲットポリペプチドを精製する段階を更に含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
細胞培養におけるターゲットポリペプチドの生産の監視方法であって、
（ａ）細胞培養バッチがターゲットポリペプチドを生産する条件下で細胞培養バッチを培養する段階と、
（ｂ）第１の時点の細胞培養バッチにおける生体分子成分の第１の表面増強レーザー脱離イオン化質量スペクトルプロフィルを作成し、表面増強レーザー脱離イオン化質量スペクトルプロフィルにより細胞培養バッチにおける生体分子成分の定性的又は定量的検出を提供する段階と、
（ｃ）別の第２の時点の細胞培養バッチにおける生体分子成分の第２の表面増強レーザー脱離イオン化質量スペクトルプロフィルを作成する段階と、
（ｄ）第１のプロフィルと第２のプロフィルを比較し、第１の時点と第２の時点の細胞培養バッチにおける生体分子成分間の定性的又は定量的差異を測定することにより、ターゲットポリペプチドの生産を監視する段階を含む前記方法。
【請求項１８】
（ｄ）が第１の時点と第２の時点の細胞培養バッチにおけるターゲットポリペプチドの量の定量的差異を測定することを含む請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
（ｄ）が第１の時点と第２の時点の細胞培養バッチにおけるターゲットポリペプチドの定性的差異を測定することを含み、定性的差異がターゲットポリペプチドとターゲットポリペプチドの分解形の定性的差異を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
（ｃ）が第１の時点と第２の時点の細胞培養バッチにおける汚染性生体分子成分の定量的又は定性的差異を測定することを含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
ターゲットポリペプチドが組換えポリペプチド又は天然ポリペプチドである請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
細胞培養バッチが規定の量と純度レベルでターゲットポリペプチドを生産する少なくとも１時点を識別する段階を更に含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
（ｄ）において細胞培養バッチが最低量のターゲットポリペプチドの分解形を含む時点を識別する請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
（ｄ）が細胞培養バッチにおける少なくとも１種の汚染性生体分子を識別することを含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
（ｄ）の生体分子成分が増殖因子、誘導剤及び代謝産物から構成される群から選択される請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】
（ａ）がターゲットポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現させることを含み、（ｄ）がターゲットポリペプチド生産中の最適ターゲットポリペプチド発現段階、細胞培養バッチに１種以上の付加成分を添加するターゲットポリペプチド生産段階、細胞培養バッチ中の非分解ターゲットポリペプチド量が最高であるターゲットポリペプチド生産段階、又はターゲットポリペプチドを回収するのに最適なターゲットポリペプチド生産段階の１種以上を識別する請求項１７に記載の方法。
【請求項２７】
（ｃ）が細胞培養バッチにおけるターゲットポリペプチドの定性的差異を測定することを含み、定性的差異がターゲットポリペプチドとターゲットポリペプチドの修飾形の差異を含み、修飾がグリコシル化、リン酸化、脂質化、酵素分解、標識及びポリペプチド凝集から選択される請求項１７に記載の方法。
【請求項２８】
修飾がインビボ又はインビトロで行われる請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ターゲットポリペプチドがホルモン、サイトカイン、免疫グロブリン、酵素、受容体、抗原、調節因子及び蛋白質輸送体から構成される群から選択される請求項１７に記載の方法。
【請求項３０】
特定時点の細胞培養バッチからのターゲットポリペプチドを精製する段階を更に含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
混合物からのターゲットポリペプチドの精製の監視方法であって、
（ａ）ターゲットポリペプチドと少なくとも１種の汚染性生体分子を含む混合物における生体分子成分の第１の表面増強レーザー脱離イオン化質量スペクトルプロフィルを作成し、第１のプロフィルにより混合物中の生体分子成分を定性的又は定量的検出を提供する段階と、
（ｂ）混合物からの少なくとも１種の汚染性生体分子の少なくとも一部を除去することによりターゲットポリペプチドを精製工程にかけ、ターゲットポリペプチドを含む高純度混合物を提供する段階と、
（ｃ）高純度混合物における生体分子成分の第２の表面増強レーザー脱離イオン化質量スペクトルプロフィルを作成する段階と、
（ｄ）第１のプロフィルと第２のプロフィルを比較して混合物と高純度混合物における生体分子成分間の定性的又は定量的差異を測定することにより、ターゲットポリペプチドの精製を監視する段階を含む前記方法。
【請求項３２】
（ｄ）が混合物と高純度混合物におけるターゲットポリペプチドの純度の定量的差異を測定することを含み、純度がターゲットポリペプチドと少なくとも１種の汚染性生体分子の相対量の測度である請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
（ｄ）が混合物と高純度混合物におけるターゲットポリペプチド間の定性的差異を測定することを含み、定性的差異がターゲットポリペプチドとターゲットポリペプチドの分解形の測度である請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
混合物が細胞を除去した細胞培地を含み、細胞培地がターゲットポリペプチドを含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
混合物が細胞溶解液を含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
（ｄ）が第１のプロフィルと第２のプロフィルにおける汚染性生体分子成分間の定量的又は定性的差異を測定することを含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
ターゲットポリペプチドがホルモン、サイトカイン、免疫グロブリン、酵素、受容体、抗原、調節因子及び蛋白質輸送体から構成される群から選択される請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
ターゲットポリペプチドが組換えポリペプチド又は天然ポリペプチドである請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
混合物と高純度混合物における１種以上の汚染性生体分子を識別する段階を更に含む請求項３１に記載の方法。
【請求項４０】
精製工程が電気泳動、クロマトグラフィー、沈殿、透析、濾過及び遠心から構成される群から選択される請求項３１に記載の方法。
【請求項４１】
精製工程がアフィニティークロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーから構成される群から選択されるクロマトグラフィー工程である請求項３１に記載の方法。
【請求項４２】
（ｅ）ターゲットポリペプチドを少なくとも付加精製工程にかけることにより少なくとも１種の後期混合物を提供する段階と、
（ｆ）少なくとも１種の後期混合物における生体分子成分の後期表面増強レーザー脱離イオン化質量スペクトルプロフィルを作成する段階と、
（ｇ）後期表面増強レーザー脱離イオン化質量スペクトルプロフィルを別の表面増強レーザー脱離イオン化質量スペクトルプロフィルと比較し、後期混合物と別の混合物における生体分子成分間の定性的又は定量的差異を測定する段階を更に含む請求項３１に記載の方法。
【請求項４３】
（ｄ）が混合物間のターゲットポリペプチドの定性的差異を測定することを含み、定性的差異がターゲットポリペプチドとターゲットポリペプチドの修飾形の定性的差異を含み、修飾がグリコシル化、リン酸化、脂質化、酵素分解、標識及びポリペプチド凝集から選択される請求項３１に記載の方法。
【請求項４４】
修飾がインビボ又はインビトロで行われる請求項３１に記載の方法。
【請求項４５】
ターゲットポリペプチドの精製方法であって、
（ａ）（ｉ）ターゲットポリペプチドを含む混合物を支持体に結合した複数の吸着剤と接触させ、
（ｉｉ）各吸着剤を異なる溶離剤で洗浄し、混合物中のポリペプチドを吸着剤に選択的に結合させ、
（ｉｉｉ）混合物中の生体分子成分の表面増強レーザー脱離イオン化質量スペクトルプロフィルを作成し、表面増強レーザー脱離イオン化質量スペクトルプロフィルにより混合物中の生体分子成分の定性的又は定量的検出を提供し、
（ｉｖ）（１）ターゲットポリペプチドを吸着剤に吸着させると共に汚染性ポリペプチドを吸着剤から溶出させる洗浄条件と、（２）ターゲットポリペプチドを吸着剤から溶出させる洗浄条件を識別することにより、精製条件を識別する段階と、
（ｂ）吸着剤を含むクロマトグラフィー媒体と混合物のバッチを接触させ、ターゲットポリペプチドを吸着剤に吸着させると共に汚染性ポリペプチドを吸着剤から溶出させる特定洗浄条件でクロマトグラフィー媒体を洗浄する段階と、
（ｃ）ターゲットポリペプチドを吸着剤から溶出させる特定洗浄条件でクロマトグラフィー媒体を洗浄する段階と、
（ｄ）溶出したターゲットポリペプチドを採取する段階を含む前記方法。
【請求項４６】
バッチが少なくとも約１０００リットルの容量である請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
支持体に結合した吸着剤がプローブの形態である請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
吸着剤がクロマトグラフィー吸着剤を含む請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
吸着剤が生体特異的吸着剤を含む請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
洗浄条件が塩濃度、洗浄剤濃度、ｐＨ、緩衝能、イオン強度、水構造特徴、洗浄剤型、疎水性、誘電定数、少なくとも１種の溶媒の濃度又は少なくとも１種の溶質の濃度の１種以上から選択される種々のパラメーターを含む請求項４５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（著作権申告）
３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．７１（ｅ）に従い、出願人は本開示の一部が著作権保護の対象となる内容を含んでいることを申告する。著作権者は特許文献又は特許開示が特許商標局の特許ファイル又は記録通りに複製されることに異議ないが、それ以外については如何なる著作権も留保する。
【０００２】
（関連出願とのクロスリファレンス）
３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§§１１９及び／又は１２０と他の適用可能な全法令又は規則に従い、本願は米国予備出願第６０／３３５，６０９号（発明の名称「表面増強レーザー脱離イオン化マススペクトロメトリーを使用するポリペプチド生産及び精製の監視方法（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＭＯＮＩＴＯＲＩＮＧ  ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＮ  ＵＳＩＮＧ  ＳＵＲＦＡＣＥ  ＥＮＨＡＮＣＥＤ  ＬＡＳＥＲ  ＤＥＳＯＲＰＴＩＯＮ／ＩＯＮＩＺＡＴＩＯＮ  ＭＡＳＳ  ＳＰＥＣＴＲＯＭＥＴＲＹ）」、出願日２００１年１１月１４日、出願人Ｂｏｓｃｈｅｔｔｉら）と米国出願第１０／１２４，６２６号（発明の名称「表面増強レーザー脱離イオン化マススペクトロメトリーを使用するポリペプチド生産及び精製の監視方法（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＭＯＮＩＴＯＲＩＮＧ  ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＮ  ＵＳＩＮＧ  ＳＵＲＦＡＣＥ  ＥＮＨＡＮＣＥＤ  ＬＡＳＥＲ  ＤＥＳＯＲＰＴＩＯＮ／ＩＯＮＩＺＡＴＩＯＮ  ＭＡＳＳ  ＳＰＥＣＴＲＯＭＥＴＲＹ）」、出願日２００２年４月１６日、出願人Ｂｏｓｃｈｅｔｔｉら）の優先権を主張し、その開示内容全体を全目的で参考資料として本明細書に組込む。
【０００３】
（連邦政府支援研究開発から創出された発明の権利に関する陳述）
適用外。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
バイオプロセシング工学、特に大量細胞培養技術を利用するバイオプロセシング工学は医薬、工業又は農業用途をもつポリペプチド等の生体化合物の大規模生産に益々重要になっている。例えば、ターゲットポリペプチド（例えば抗生物質、ホルモン、サイトカイン、酵素等）をコードするＤＮＡ分子を一般に哺乳動物、細菌又は真菌細胞等の適当な異種宿主細胞で発現させるのに適したベクターにクローニングする。特定宿主に応じて栄養源（例えば炭素、水素、リン、カリウム、窒素等）と電子受容体（例えば好気性生物には酸素、嫌気性生物には硝酸又は硫酸）と電子供与体（例えば炭水化物等）を含む水性培地で一般に形質転換宿主細胞を培養する。一般に、例えばバッチ、フェッドバッチ又は連続培養法で温度、栄養供給及び廃棄物除去等の特定処理条件を保持及び維持するように設計されたバイオリアクターで細胞を培養する。
【０００５】
細胞培地で発現される活性ターゲットポリペプチドは一般に非ターゲット化合物に加えてターゲットの分解形を含む多数の不純物を伴い、これらの不純物を分離して純粋状態の非分解ターゲットポリペプチドを単離する。このために、多数の分離精製技術が現在使用されている。例えば、宿主細胞がターゲット分子を周囲培地に分泌する場合には、一般に遠心又は濾過を使用して細胞をまず培地から除去するか、あるいは一般に細胞破砕法を使用して細胞溶解液を生成する。その後、一般に沈殿、クロマトグラフィー、膜分離、超遠心等の技術を使用してターゲットを更に精製する。これらの方法の多くの分離性能にも拘わらず、最終精製ターゲット生物製剤には一般に微量の不純物が混在しており、特に製剤を治療薬として使用する場合には悪影響を生じることが多い。これらの不純物の例としては小分子、非ターゲット蛋白質及びペプチド、核酸並びに内毒素が挙げられる。
【０００６】
不純物の種類と量は一般にターゲット生体物質を単離するために選択する方法によって異なる。更に、出発生体材料は一般にバッチ間で一致せず、多数の変数によって異なる不純物が混入している可能性がある。例えば、細胞培養上清は特異的又は非特異的生理的ストレスに対する反応として分泌される蛋白質が混入している可能性がある。細胞代謝は培地間で僅かに変動する可能性があり、一般にその結果、各バッチで同一宿主株を使用しても培地によって異なる不純物が混入する。
【０００７】
現行の微量不純物検出技術（例えば電気泳動、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及び所定のイムノアッセイ）はいずれも大きな欠点があり、特に選択性が不良で感度が不十分であり、スループットが低く、信頼性を欠き、及び／又は必要労働量が大きい。従って、例えば細胞培地又は他の複雑な混合物の不純物及び他の成分を定性的及び／又は定量的に検出するための改善方法が望ましいことは明らかである。本発明は精製工程の種々の段階でターゲット蛋白質の純度を監視する方法を提供する。本方法は目的蛋白質を複雑な混合物中で同定すると共に高感度で不純物から区別することができる。本発明は更にターゲットポリペプチドの存在を確認するために蛋白質生産工程で複数の細胞培養バッチを監視する方法も提供する。本発明の上記及び他の特徴は以下の説明を精査することにより理解されよう。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要約）
本発明は一般にはバイオプロセシング科学及び工学に関する。特に、本発明はターゲットポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現及び／又は細胞培地等の複雑な混合物からのこれらのターゲット分子の精製を監視する方法を提供する。本方法は例えば細胞培地又はこのような培地の精製フラクションにおける生体成分の表面増強レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）質量スペクトルプロフィルを作成することを含む。質量スペクトルプロフィルは既存技術よりも高感度で非分解ターゲットポリペプチドを同定及び／又は定量し、不純物を区別する。更に、本明細書に記載する方法は場合により大規模精製工程を最適化するために使用される。表面増強レーザー脱離イオン化マススペクトロメトリーは一般に支持体に結合した吸着剤に試料を暴露して試料から分析物分子を捕獲し、捕獲した分析物分子をレーザー脱離マススペクトロメトリーにより検出することにより実施される。支持体に結合した吸着剤はマススペクトロメーターに脱着可能なプローブとすることができ、プローブは表面と表面に結合した吸着剤を含む。未結合分子は場合により暴露後に表面から洗浄除去することができる。一般に、生体分子分析物の脱離は所定態様で「マトリックス」と呼ぶエネルギー吸収分子を介して実施される。
【０００９】
１側面では、本発明は複数の細胞バッチにおけるターゲットポリペプチドの生産の監視方法に関する。本方法は、（ａ）各細胞培養バッチがターゲットポリペプチド（例えば組換えポリペプチド、天然ポリペプチド等）を生産する条件下で複数の細胞培養バッチを培養する段階と、（ｂ）各バッチにおける生体分子成分の表面増強レーザー脱離イオン化質量スペクトルプロフィルを作成し、表面増強レーザー脱離イオン化質量スペクトルプロフィルによりバッチにおける生体分子成分の定性的又は定量的検出を提供する段階を含む。バッチは場合により同一条件又は異なる条件下で培養する。本方法は更に（ｃ）プロフィルを比較し、バッチにおける生体分子成分間の定性的又は定量的差異を測定することにより、ターゲットポリペプチドの生産を監視する段階を含む。場合により、本方法は更に少なくとも１個の特定バッチからのターゲットポリペプチドを精製する段階を含む。所定態様では、（ｃ）は場合によりバッチにおけるターゲットポリペプチドの量の定量的差異を測定することを含む。別態様では、（ｃ）はバッチ間のターゲットポリペプチドの定性的差異を測定することを含み、定性的差異がターゲットポリペプチドとターゲットポリペプチドの分解形の差異を含む。更に別態様では、（ｃ）はバッチにおける汚染性生体分子成分の定量的又は定性的差異を測定することを含む。
【００１０】
別の側面では、本発明は細胞培養におけるターゲットポリペプチドの生産の監視方法を提供する。本方法は（ａ）細胞培養バッチがターゲットポリペプチド（例えば組換えポリペプチド、天然ポリペプチド等）を生産する条件下で細胞培養バッチを培養する段階と、（ｂ）第１の時点の細胞培養バッチにおける生体分子成分の第１の表面増強レーザー脱離イオン化質量スペクトルプロフィルを作成し、表面増強レーザー脱離イオン化質量スペクトルプロフィルにより細胞培養バッチにおける生体分子成分の定性的又は定量的検出を提供する段階を含む。本方法は更に（ｃ）別の第２の時点の細胞培養バッチにおける生体分子成分の第２の表面増強レーザー脱離イオン化質量スペクトルプロフィルを作成する段階と、（ｄ）第１のプロフィルと第２のプロフィルを比較し、第１の時点と第２の時点の細胞培養バッチにおける生体分子成分間の定性的又は定量的差異を測定することにより、ターゲットポリペプチドの生産を監視する段階を含む。本方法は場合により細胞培養バッチが規定の量と純度レベルでターゲットポリペプチドを生産する少なくとも１時点を識別する段階と、特定時点の細胞培養バッチからのターゲットポリペプチドを精製する段階を更に含む。
【００１１】
更に別の側面では、本発明は混合物からのターゲットポリペプチドの精製の監視方法に関する。本方法は（ａ）ターゲットポリペプチド（例えば組換えポリペプチド、天然ポリペプチド等）と少なくとも１種の汚染性生体分子を含む混合物における生体分子成分の第１の表面増強レーザー脱離イオン化質量スペクトルプロフィルを作成し、第１のプロフィルにより混合物中の生体分子成分を定性的又は定量的検出を提供する段階を含む。所定態様では、混合物は細胞を除去した細胞培地を含み、前記細胞培地はターゲットポリペプチドを含む。別態様では、混合物は細胞溶解液を含む。検出は一般にターゲットポリペプチドと少なくとも１種の汚染性生体分子の質量を測定することを含む。本方法は更に、（ｂ）混合物からの少なくとも１種の汚染性生体分子の少なくとも一部を除去することによりターゲットポリペプチドを精製工程にかけ、ターゲットポリペプチドを含む高純度混合物を提供する段階と、（ｃ）高純度混合物における生体分子成分の第２の表面増強レーザー脱離イオン化質量スペクトルプロフィルを作成する段階を含む。更に、本方法は（ｄ）第１のプロフィルと第２のプロフィルを比較して混合物と高純度混合物における生体分子成分間の定性的又は定量的差異を測定することにより、ターゲットポリペプチドの精製を監視する段階を含む。本方法は場合により、混合物と高純度混合物における１種以上の汚染性生体分子を識別する段階を更に含む。
【００１２】
更に別の側面では、本発明はターゲットポリペプチドの精製方法を提供する。本方法は、（ａ）（ｉ）ターゲットポリペプチドを含む混合物を支持体に結合した複数の吸着剤（例えばクロマトグラフィー吸着剤、生体特異的吸着剤等）と接触させ、（ｉｉ）各吸着剤を異なる溶離剤で洗浄し、混合物中のポリペプチドを吸着剤に選択的に結合させ、（ｉｉｉ）混合物中の生体分子成分の表面増強レーザー脱離イオン化質量スペクトルプロフィルを作成し、表面増強レーザー脱離イオン化質量スペクトルプロフィルにより混合物中の生体分子成分の定性的又は定量的検出を提供し、（ｉｖ）（１）ターゲットポリペプチドを吸着剤に吸着させると共に汚染性ポリペプチドを吸着剤から溶出させる洗浄条件と、（２）ターゲットポリペプチドを吸着剤から溶出させる洗浄条件を識別することにより、精製条件を識別する段階を含む。支持体に結合した吸着剤はプローブの形態である。更に、洗浄条件は一般に例えば塩濃度、洗浄剤濃度、ｐＨ、緩衝能、イオン強度、水構造特徴、洗浄剤型、疎水性、誘電定数、少なくとも１種の溶媒（例えば有機溶媒等）の濃度、少なくとも１種の溶質の濃度等の１種以上から選択される種々のパラメーターを含む。本方法は更に、（ｂ）吸着剤を含むクロマトグラフィー媒体と混合物のバッチ（例えば少なくとも約１０００リットル等）を接触させ、ターゲットポリペプチドを吸着剤に吸着させると共に汚染性ポリペプチドを吸着剤から溶出させる特定洗浄条件でクロマトグラフィー媒体を洗浄する段階を含む。本方法は更に、（ｃ）ターゲットポリペプチドを吸着剤から溶出させる特定洗浄条件でクロマトグラフィー媒体を洗浄する段階と、（ｄ）溶出したターゲットポリペプチドを採取する段階を含む。
【００１３】
図面の簡単な説明
図１は複数の細胞培養バッチにおけるターゲットポリペプチドの生産の監視方法の１態様に含まれる段階を模式的に示すフローチャートである。
【００１４】
図２は細胞培養におけるターゲットポリペプチドの生産の監視方法の１態様に含まれる段階を模式的に示すフローチャートである。
【００１５】
図３は混合物からのターゲットポリペプチドの精製の監視方法の１態様に含まれる段階を模式的に示すフローチャートである。
【００１６】
図４はターゲットポリペプチドの精製方法の１態様に含まれる段階を模式的に示すフローチャートである。
【００１７】
図５はターゲットポリペプチドの存在を検出するための細胞培地試料の表面増強レーザー脱離イオン化アッセイを模式的に示す。
【００１８】
図６は混合物からのターゲットポリペプチドの精製を監視するための表面増強レーザー脱離イオン化アッセイを模式的に示す。
【００１９】
図７は表面増強レーザー脱離イオン化飛行時間マススペクトロメトリーシステムを模式的に示す。
【００２０】
図８は本発明の種々の側面を実施可能な情報装置又はディジタル装置の代表例を模式的に示す。
【００２１】
図９Ａ〜ＤはＨ４及びＩＭＡＣ３  ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレーを使用して細胞培地から検出された成分を示す質量スペクトルトレースである。
【００２２】
図１０Ａ〜ＥはＨ４  ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレーを使用して培地の種々のロットから検出された成分を示す質量スペクトルトレースである。
【００２３】
図１１Ａ〜ＥはＨ４  ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレーを使用して培地の種々のロットの定量分析から検出された成分を示す質量スペクトルトレースである。
【００２４】
図１２は２Ｄゲルから蛋白質を同定するための手順に含まれる段階を模式的に示すフローチャートである。
【００２５】
図１３は２Ｄゲルから蛋白質を同定するための手順に含まれる種々の段階を模式的に示すフローチャートである。
【００２６】
図１４は蛋白質プロファイリング手順に含まれる段階を模式的に示すフローチャートである。
【００２７】
図１５Ａ〜Ｃは洗浄後にＮＰ  ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレーで検出された蛋白質プロフィルを示す質量スペクトルトレースと差異マップである。
【００２８】
図１６Ａ〜Ｃは洗浄後にＮＰ  ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレーで検出された蛋白質プロフィルを示す質量スペクトルトレースと差異マップである。
【００２９】
図１７は生体試料の一般蛋白質分画を模式的に示すフローチャートである。
【００３０】
図１８はウシ血清からのターゲット蛋白質の微量精製における種々の段階を模式的に示すフローチャートである。
【００３１】
図１９Ａ〜Ｇはサイズ選択スピンカラムでウシ血清の分画アッセイから検出された蛋白質プロフィルを示す質量スペクトルトレースである。
【００３２】
図２０Ａ〜Ｊはアニオン交換スピンカラムでウシ血清の分画アッセイから検出された蛋白質プロフィルを示す質量スペクトルトレースである。
【００３３】
図２１Ａ〜Ｄはウシ血清からのターゲット蛋白質の精製の進行を示す質量スペクトルトレースである。
【００３４】
図２２Ａ〜ＣはＣ８アガローススピンカラムでのターゲット蛋白質の精製を示す質量スペクトルトレースである。
【００３５】
図２３Ａ〜ＣはＶ８（Ｇｌｕ  Ｃ）エンドペプチダーゼで消化した精製ターゲット蛋白質のフィンガープリントを示す質量スペクトルトレースである。
【００３６】
図２４はＶ８（Ｇｌｕ  Ｃ）エンドペプチダーゼで消化した精製ターゲット蛋白質を使用したＰｒｏＦｏｕｎｄデータベース検索用表示スクリーンを示す。
【００３７】
図２５Ａ〜ＣはＨＲＰ試料のＶ８エンドペプチダーゼ消化により生成され、検出されたペプチドフラグメントを示す質量スペクトルトレースである。
【００３８】
図２６Ａ及びＢは異なる条件下のターゲット蛋白質のトリプシン消化物から検出されたペプチドフラグメントを示す質量スペクトルトレースである。
【００３９】
図２７Ａ及びＢは蛋白質の選択的吸着と捕獲された蛋白質種のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析におけるＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレー表面の使用方法を模式的に詳示する。より具体的には、図２７Ａは試料ローディング用８スポット（Ｓ）アレーを模式的に示す。図２７ＢはＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析前に捕獲された蛋白質種をローディング、洗浄及び脱離する工程を模式的に示す。
【００４０】
図２８Ａ及びＢはＦａｂ抗体フラグメントを含む大腸菌の粗清澄化抽出液を添加したＷＣＸ２ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレー表面から検出された蛋白質プロフィルを示す質量スペクトルトレース（横軸−分子量（ダルトン）、縦軸−相対強度）である。特に、図２８Ａは各種ｐＨで保持された蛋白質の質量スペクトルトレースを示し、Ｆａｂフラグメントを矢印で示す。図２８Ｂは５０ｍＭ酢酸、５ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．６）中各種塩化ナトリウム濃度で保持された蛋白質の質量スペクトルトレースを示し、Ｆａｂフラグメントを矢印で示す。
【００４１】
図２９はＣＭジルコニア吸着剤で粗大腸菌抽出液を分離して得られたクロマトグラムである。５０ｍＭ酢酸、５ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．６）で予め平衡化しておいたカラム（０．３ｃｍＩＤ×１０ｃｍ）に粗材料２３ｍｌをロードした。カラムの流速は３００ｃｍ／時とした。塩化ナトリウム濃度を平衡化緩衝液中１５０ｍＭまで上げることによりＦａｂフラグメントの溶出が得られた。カラムを最終的に１Ｍ塩化ナトリウム溶液で洗浄後に１Ｍ水酸化ナトリウムで再生した。
【００４２】
図３０Ａ〜ＣはＮＰ２（順相）ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレーとＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを使用して得られた検出蛋白質プロフィルを示す質量スペクトルトレース（横軸−分子量（ダルトン）、縦軸−相対強度）である。図３０ＡはＦａｂ抗体フラグメントを含む大腸菌の粗抽出液から検出された蛋白質プロフィルを示す質量スペクトルトレースである。図３０ＢはＦａｂ抗体フラグメントを含む大腸菌の粗抽出液を流したＣＭジルコニアクロマトグラフィーカラムから得られた溶出液から検出された蛋白質プロフィルを示す質量スペクトルトレースである。図３０ＣはＦａｂ抗体フラグメントを含む大腸菌の粗抽出液を流したＱセラミックＨｙｐｅｒＤ（登録商標）Ｆクロマトグラフィーカラムから得られたフロースルーから検出された蛋白質プロフィルを示す質量スペクトルトレースである。これらの図の各々において、検出されたＦａｂフラグメントを矢印で示す。
【００４３】
図３１Ａ〜ＤはＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳとエンドスタチンを含むＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞培養上清をロードした種々のＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレー表面を使用して得られた検出蛋白質プロフィルを示す質量スペクトルトレース（横軸−分子量（ダルトン）、縦軸−相対強度）である。より具体的には、図３１Ａは５０ｍＭ酢酸／５ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）中弱カチオン交換（ＷＣＸ２  ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレー）を使用して得られた質量スペクトルトレースである。図３１Ｂは５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８）中強アニオン交換（ＳＡＸ２  ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレー）を使用して得られた質量スペクトルトレースである。図３１Ｃは５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、１０００ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）中疎水性相互作用表面（Ｈ４  ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレー）を使用して得られた質量スペクトルトレースである。図３１Ｄは２０ｍＭリン酸緩衝液、５００ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）中Ｃｕ+2をもつキレート化表面（ＩＭＡＣ３  ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレー）を使用して得られた質量スペクトルトレースである。これらの図の各々においてエンドスタチンを矢印で示す。
【００４４】
図３２Ａ及びＢはＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳとエンドスタチンを含むＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞培養上清をロードしたＷＣＸ２  ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレー）を使用して得られた検出蛋白質プロフィルを示す質量スペクトルトレース（横軸−分子量（ダルトン）、縦軸−相対強度）である。図３２Ａの４本のトレースに示す保持蛋白質は各々異なる指定ｐＨレベルで５０ｍＭ酢酸、５ｍＭクエン酸緩衝液での残留液クロマトグラフィー分析から得た。他方、図３２Ｂは５０ｍＭ酢酸／５ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５）中各種塩化ナトリウム濃度で保持された蛋白質の質量スペクトルトレースを示す。これらの図の各々においてエンドスタチンを矢印で示す。
【００４５】
図３３ＡはＣＭジルコニア吸着剤で粗Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ培養上清を分離して得られたクロマトグラムである。分離は５０ｍＭ酢酸、５ｍＭクエン酸、５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）で予め平衡化しておいたカラム（０．３ｃｍＩＤ×１０ｃｍ）に粗材料８０ｍｌをロードすることにより実施した。カラムの流速は３００ｃｍ／時とした。塩化ナトリウム濃度を２段階で上げることによりエンドスタチンの溶出が得られた。第１段階は平衡化緩衝液中２００ｍＭ塩化ナトリウムを使用して実施した（ａ）。第２段階は同一緩衝液中８００ｍＭ塩化ナトリウムを使用して実施した（ｂ）。
【００４６】
図３３Ｂは図３３Ａについて記載したクロマトグラフィー分析に含まれる各種フラクションの電気泳動分離から得られた電気泳動図である。図面に示すように、レーン１は粗上清を分離し、レーン２は非吸着フラクション（フロースルー）を分離し、レーン３は８００ｍＭ塩化ナトリウムでの溶出フラクションを分離した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
定義
特に指定しない限り、本明細書で使用する全科学技術用語は本発明が属する分野の当業者に一般に理解されている意味をもつ。以下の文献：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（第２版，１９９４）、Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ編，１９８８）、Ｔｈｅ  Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，第５版，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒら（編），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）、及びＨａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）は本発明で使用する用語の多くの一般定義を当業者に提供する。本明細書で使用する以下の用語は特に指定しない限り以下の意味をもつ。
【００４８】
「支持体」又は「プローブ支持体」とは（例えば結合、堆積等により）吸着剤を配置することができる固相を意味する。「表面フィーチャー」とは吸着剤を配置することができる支持体又はプローブ支持体の特定部分、セクション又は領域を意味する。
【００４９】
「表面」とは本体ないし支持体の外側ないし上側境界を意味する。
【００５０】
「吸着剤」とは分析物（例えばターゲットポリペプチド）を吸着することが可能な任意材料を意味する。「吸着剤」なる用語は本明細書では分析物を暴露する単一材料（「単一吸着剤」）（例えば化合物又は官能基）と、分析物を暴露する複数の異なる材料（「多重吸着剤」）の両方を表すために使用する。多重吸着剤の吸着剤を「吸着剤種」と言う。例えば、異なる結合特性をもつ多数の異なる吸着剤種（例えばイオン交換材料、金属キレート剤、抗体等）からなる多重吸着剤をプローブ支持体の表面フィーチャーに配置することができる。支持体材料自体が分析物を吸着できるようにし、「吸着剤」の一部とみなしてもよい。アフィニティー吸着剤、ポリペプチド、酵素、受容体、抗体（例えばモノクローナル抗体等）等の「生体分子相互作用吸着剤」ないし「生体特異的吸着剤」は一般に例えばアニオン吸着剤、カチオン吸着剤、疎水性相互作用吸着剤、親水性相互作用吸着剤、金属キレート化吸着剤等の「クロマトグラフィー吸着剤」よりもターゲット分析物に対する特異性が高い。
【００５１】
「吸着」、「捕獲」ないし「保持」とは溶離剤（選択性閾値調節剤）又は洗浄溶液で洗浄前又は洗浄後の吸着剤と分析物（例えばターゲットポリペプチド）間の検出可能な結合を意味する。
【００５２】
「溶離剤」、「洗浄剤」ないし「洗浄溶液」とは吸着剤への分析物の吸着を媒介するために使用可能な物質を意味する。溶離剤と洗浄溶液は「選択性閾値調節剤」とも言う。溶離剤と洗浄溶液はプローブ支持体表面から未結合ないし非捕獲材料を洗浄及び除去するために使用することができる。
【００５３】
「特異的結合」とは指定分析物（例えばターゲットポリペプチド）に対する吸着剤の吸引原理により主に媒介される結合を意味する。例えば、分析物に対するアニオン交換吸着剤の吸引原理は正電荷と負電荷間の静電吸引である。従って、アニオン交換吸着剤は負電荷種との特異的結合を行う。分析物に対する親水性吸着剤の吸引原理は水素結合である。従って、親水性吸着剤は電気的極性基等との特異的結合を行う。
【００５４】
「分解する」、「分解」ないし「分析物の分解」とは試料中の少なくとも１種の分析物の検出を意味する。分解は分離とその後の示差検出による試料中の複数の分析物の検出と識別を含む。分解は混合物中のある分析物を他の全分析物から完全に分離する必要はない。むしろ、少なくとも２種の分析物を区別できるようにする分離で十分である。
【００５５】
「プローブ」とはイオン化源（例えばレーザー脱離イオン化源）と照会可能な関係で且つ気相イオンスペクトロメーターの検出器と大気圧以下で同時連通するように配置した場合に分析物に由来するイオンをスペクトロメーターに導入するために使用することができる装置を意味する。本明細書で使用する「プローブ」は一般にプローブをイオン化源と連動可能な関係で検出器と連通するように配置するプローブ界面と可逆的に係合可能（例えば脱着可能）である。プローブは一般に分析物がイオン化源に提示される試料提示表面を含む支持体を含む。「イオン化源」とはプローブの試料提示表面にイオン化エネルギーを照射して分析物をプローブ表面から気相に脱離イオン化する装置を意味する。好適イオン化源は（レーザー脱離イオン化で使用される）レーザーであり、特に窒素レーザー、Ｎｄ−Ｙａｇレーザー及び他のパルスレーザー源である。他のイオン化源としては（高速原子衝撃で使用される）高速原子、（プラズマ脱離で使用される）プラズマエネルギー及び（二次イオンマススペクトロメトリーで使用される）二次イオンを発生する一次イオンが挙げられる。
【００５６】
「気相イオンスペクトロメーター」とは気相イオンを検出する装置を意味する。本発明の関連では、気相イオンスペクトロメーターは気相イオンを発生するために使用されるイオン化源を含む。気相イオンスペクトロメーターとしては例えばマススペクトロメーター、イオン移動度スペクトロメーター及び全イオン電流測定装置が挙げられる。
【００５７】
「気相イオンスペクトロメトリー」とはプローブの試料提示表面に提示された分析物から気相イオンを発生するためにイオン化源を利用し、気相イオンを気相イオンスペクトロメーターで検出する方法を言う。
【００５８】
「マススペクトロメーター」とは気相イオンの質量対電荷比で表すことが可能なパラメーターを測定する気相イオンスペクトロメーターを意味する。マススペクトロメーターは一般に入力システム、イオン化源、イオン光学アセンブリ、質量分析計及び検出器を含む。マススペクトロメーターの例は飛行時間、磁場セクター、四重極型フィルター、イオントラップ、イオンサイクロトロン共鳴、静電場セクター分析計及びこれらのハイブリッドである。
【００５９】
「マススペクトロメトリー」とはイオン化源を利用してプローブの試料提示表面に提示された分析物から気相イオンを発生し、マススペクトロメーターで気相イオンを検出する方法を言う。
【００６０】
「レーザー脱離マススペクトロメーター」とは分析物を脱離、揮発及びイオン化するための手段としてレーザーを使用するマススペクトロメーターを言う。
【００６１】
「脱離イオン化」とは高エネルギー粒子ビーム（例えばレーザー）により固体又は液体試料から脱離することによりイオンを発生することを言う。脱離イオン化は例えば，表面増強レーザー脱離、マトリックス支援レーザー脱離、高速原子衝撃、プラズマ脱離等の種々の技術を含む。
【００６２】
「表面増強レーザー脱離イオン化」ないし「ＳＥＬＤＩ」は分析物をエネルギー源に提示する支持体表面が脱離イオン化工程で積極的役割を果たす気相イオンスペクトロメトリーの方法である。ＳＥＬＤＩ技術は例えば米国特許第５，７１９，０６０（ＨｕｔｃｈｅｎｓとＹｉｐ）に記載されている。
【００６３】
「表面増強レーザー脱離イオン化質量スペクトルプロフィル」とは表面増強レーザー脱離イオン化マススペクトロメトリーの実施により獲得された飛行時間又は飛行時間の派生値（例えば質量）の関数としてシグナルを表すプロフィルを言う。
【００６４】
「残留液クロマトグラフィー」は固相吸着剤で生体分子を分画し、分画した分子をＳＥＬＤＩにより分析する方法である。残留液クロマトグラフィーは例えば国際公開ＷＯ９８／５９３６０（ＨｕｔｃｈｅｎｓとＹｉｐ）に記載されている。
【００６５】
「マトリックス支援レーザー脱離イオン化」ないし「ＭＡＬＤＩ」とはパルスレーザービームで固体マトリックス材料から脱離させることによりイオンを発生するイオン化源を言う。
【００６６】
「検出する」とは検出すべき対象の有無又は量を識別することを言う。
【００６７】
「生体分子」、「生体分子成分」又は「生体有機分子」とは一般に生体により産生される有機分子を言う。これは例えば、ヌクレオチド、アミノ酸、糖、脂肪酸、ステロイド、核酸、ポリペプチド、ペプチド、ペプチドフラグメント、炭水化物、脂質及びこれらの組合せ（例えば糖蛋白質、リボヌクレオ蛋白質、リポ蛋白質等）を含む分子を含む。
【００６８】
「生体材料」とは生物、臓器、組織、細胞又はウイルスに由来する任意材料を言う。これは唾液、血液、尿、リンパ液、前立腺液、精液、乳汁等の体液とこれらの任意のものの抽出液（例えば細胞培養抽出液、細胞培地、分画試料等）を含む。
【００６９】
「エネルギー吸着分子」ないし「ＥＡＭ」とはプローブ表面からターゲットポリペプチド等の分析物を脱離させるマススペクトロメーターを意味する。分析物の寸法と種類に応じてエネルギー吸着分子を場合により使用することもできる。生体有機分子のレーザー脱離では桂皮酸誘導体、シナピン酸（「ＳＰＡ」）、シアノヒドロキシ桂皮酸（「ＣＨＣＡ」）、及びジヒドロキシ安息香酸をエネルギー吸着分子として使用することが多い。エネルギー吸着分子の詳細についてはＨｕｔｃｈｅｎｓとＹｉｐの米国特許第５，７１９，０６０参照。
【００７０】
「ポリペプチド」「ペプチド」及び「蛋白質」なる用語は本明細書では同義に使用し、アミノ酸残基のポリマーを意味する。これらの用語は１個以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の類似体、誘導体又は模擬体であるアミノ酸ポリマーと天然アミノ酸ポリマーに適用される。例えば、ポリペプチドは修飾又は誘導体化してもよく、例えば炭水化物残基の付加により糖蛋白質を形成してもよい。「ポリペプチド」「ペプチド」及び「蛋白質」なる用語は糖蛋白質と非糖蛋白質を含む。
【００７１】
「ターゲットポリペプチド」ないし「ターゲット生体物質」とは同定すべき蛋白質を言う。
【００７２】
「ポリペプチド生産」とはターゲットポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏもしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現又は例えば固相合成技術もしくは当分野で公知の別のアプローチを使用したターゲットポリペプチドの合成を言う。
【００７３】
発明の詳細な説明
Ｉ．緒言
本発明は多様なバイオプロセスの種々の段階を監視、最適化及び規模拡大する方法に関する。特に、本発明は組換え生体系により発現されるターゲットポリペプチドから分離される蛋白質不純物を含む多重生体分子成分を同時に検出するための方法を提供する。蛋白質不純物は一般に本質的に任意の宿主細胞蛋白質、細胞培地由来蛋白質、遊離蛋白性アフィニティーリガンド等を含む。本方法は生体分子成分の吸着剤を結合した相互作用表面（ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレー）を使用するマススペクトロメトリーによりターゲットポリペプチド及び／又は不純物を分析する。
【００７４】
より具体的には、本方法は蛋白質又は他の生体分子の混合物を分解するためにマススペクトロメトリー分析と組合せた表面増強レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）を利用し、多数の既存技術よりも有意に改善された感度で検出及び同定する。例えば、この分析ツールを本明細書に記載の方法に従って使用し、細胞培養工程中に発現される精製生体物質に由来する宿主細胞蛋白質等の不純物を検出する。試料を添加するプローブ表面は例えば「順相」又は「逆相」ＨＰＬＣを実施するために使用する吸着剤に一般に類似するが、本方法の選択性はこのプローブ表面の化学的誘導体化の種類に少なくとも部分的に依存する。所定態様では、例えば不純物数が多いと予想される場合に結果の解釈を簡単にするために、プローブ表面に添加する前に例えば種々の分画技術（例えばクロマトグラフィー等）により試料を予備分画する。試料をプローブ表面に配置した後に、選択した生体分子が吸着剤との相互作用の結果として選択した緩衝液中で表面に吸着される。場合により洗浄して望ましくない全成分（例えば塩類）を除去した後に、エネルギー吸着分子をプローブ表面に添加する。入射レーザービームによるプローブからの脱離イオン化後に生体分子成分をマススペクトロメトリーにより分析する。混合物の成分は検出される分子量の差により示される。
【００７５】
所定態様では、本発明はターゲットポリペプチドの生産（例えば細胞培地中の宿主細胞集団におけるターゲットポリペプチドをコードする遺伝子の発現）を監視する方法を含む。例えば、この種の分析は場合により培養前後の細胞培養上清に適用される。このアプローチは培養工程中に種々の不純物が出現しているか否かを指示すると同時にターゲット蛋白質の発現レベルを指示する。本発明は更に例えば各単一宿主細胞蛋白質の不純物プロフィルと分子量を提供することにより、多重ロット又はバッチにおける宿主細胞蛋白質の有無を監視することにより生産一貫性を評価するための高精度高感度の方法も含む。
【００７６】
本発明は更にターゲット蛋白質精製の監視方法を提供する。特に、精製工程が最適化されていないために不純物プロフィル（例えば残留宿主細胞蛋白質、分解ターゲットポリペプチド等）に差異が生じる場合がある。他方、精製工程が十分に制御されている場合には、これらの差異は基礎となる細胞培地に関連すると思われる。例えば、細胞培地の種類は外来蛋白質や同様に目的生体物質から除去すべき他の生体分子も含む可能性があるので、これらの物質が最終精製物に含まれていないことを確認すべきである。他方、蛋白質を含まない細胞培地を分析する場合には、検出される非ターゲット蛋白質は表面上培養宿主細胞により生成される。更に、蛋白質汚染物質の数と量はいずれもターゲット生体物質の純度レベルを評価するのに重要なパラメーターであり、分離工程の効果と堅牢性の指標となる。
【００７７】
本発明は更にクロマトグラフィー吸着剤分解に起因する汚染物質の監視方法を提供する。これはリガンドとその水解物の放出に関する。典型例は抗体を分離することが可能な樹脂のリガンドとして使用される蛋白質Ａである。蛋白質Ａは抗体分画中にそのまま放出される場合もあれば、供給原料中の微量のプロテアーゼの存在による分解の結果としてフラグメントとして放出される場合もある。本発明は免疫グロブリンの蛋白質Ａ汚染を監視するために使用することができる。
【００７８】
特に、本発明の方法は発現系から分離した生体試料中の不純物を分析する技術として、電気泳動、ＨＰＬＣ、二次元電気泳動、キャピラリー電気泳動及びイムノアッセイ等の他の多くの分析技術にまさる多数の利点がある。これらの利点を以下に要約する。
【００７９】
一次元電気泳動との比較
本発明の方法と異なり、電気泳動システムは最良のものでも感度が低い。例えば、電気泳動図で蛋白質を検出するためには、蛋白質バンドを一般に特定色素で標識するが、色素は全蛋白質に同一の親和性をもたないので、バンドの色強度はバンド中の蛋白質の量に正比例しない場合がある。多くの場合に、電気泳動システムでは小蛋白質を検出することができない。これに対して、本発明の方法は他の化合物との相互作用能に関係なく蛋白質を検出する。検出は全蛋白質が同様に明示されるように直接実施される。更に、電気泳動は手間と時間のかかる技術であるが、本発明の方法は短時間で結果が得られ、本質的にオンラインの検出ツールを提供する。
【００８０】
二次元電気泳動との比較
この分析法は一般に個々の蛋白質の等電点に従って第１の次元で蛋白質を分離する。更に分子量差に従ってＳＤＳの存在下に第２の次元で蛋白質を分離する。一次元電気泳動と同様に、分離された蛋白質は一般に選択した色素（例えばクーマシーブルー）で染色してスポットマップを作成することにより間接的に検出される。本発明と異なり、この方法は時間がかかり（例えば、一般にマップを作成するには１日以上要する）、得られたデータの解釈が困難である。更に、この技術はローディング容量が低いため、一層感度が低くなる。特に、この技術は低濃度蛋白質又は小蛋白質及びペプチド（例えば１０〜２０ｋＤａ未満）を検出しない。等電点の非常に低い蛋白質と非常に高い蛋白質は一般に第１の次元で分離されないので、この技術の感度は更に制限される。
【００８１】
ＨＰＬＣとの比較
この方法は場合により多様な分離特性に基づく。一般には、逆相ＨＰＬＣを分析に使用する。しかし、イオン交換、モレキュラーシーブ、順相及びアフィニティー等の他の分離原理も場合により使用される。分離効率は一般にカラム内の固相中の粒子の寸法に比例する。分離効率を上げるためには、一般に非常に小さい分子を使用すると共にカラム内の圧力を上げる。高圧下にＨＰＬＣ分離を実施するには高価な器具を設計する。費用に加え、分離時間も比較的長い。更に、分離条件は一般に個別に設定するので、所定分離の時間と複雑さが増す。更に、複雑な混合物はＨＰＬＣでは一般に良好に分離されず、この技術は比較的小蛋白質に制限される。ＨＰＬＣは検出しようとする分子の種類によって感度レベルが低い場合もある。
【００８２】
キャピラリー電気泳動との比較
所定状況ではキャピラリー電気泳動は分離効率がＨＰＬＣよりも良好であるが、非常に低ロードしか処理できないので、低濃度蛋白質の検出能が低い。これは特に治療用ターゲット蛋白質調製物等のように微量不純物の検出を目的とする場合に大きな問題となる。
【００８３】
酵素免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）との比較
本明細書に記載の方法と異なり、ＥＬＩＳＡ等のイムノアッセイを使用して微量不純物を検出する場合には、各単一ターゲット不純物に対する特異抗体を一般に使用するので、ターゲット不純物は一般に予め分かっていなければならない。ＥＬＩＳＡは抗体が存在しない不純物は検出しない。従って、この方法は特に不純物が試料毎に異なる場合に多様な蛋白質不純物を検出するように適応させるのは一般に容易でない。更に、特異抗体の生産は時間と手間がかかる。更に、抗体は一般にバッチ間で厳密に同一でないので最終アッセイの感度レベルに差異が生じる。更に、フラグメントが蛋白質に対する抗体により認識される特定アミノ酸配列を含まない場合もあるので、イムノアッセイは一般に例えば蛋白分解により生成される全蛋白質フラグメントを検出するものではない。これに対して、本発明は分子量の差に基づいて生体分子成分を検出する。
【００８４】
ＩＩ．ターゲットポリペプチド源
説明を明瞭にする目的で主にターゲットポリペプチドに関する工程に関して発明の方法を記載する。しかし、本発明が属する分野の当業者に自明の通り、本発明の方法は例えば非ターゲット又は他の汚染性化合物の複雑な混合物からターゲット化学種を分解する工程として本質的に任意の生産及び／又は精製工程に適用又は応用することができる。
【００８５】
本明細書に記載の方法を使用して本質的に任意のポリペプチドを定性及び／又は定量的に検出することができる。このような蛋白質をコードする公知蛋白質配列又は核酸の一般的寄託機関としては例えばＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）、ＥＭＢＬ，ＤＤＢＪ，ＮＣＢＩ等が挙げられる。目的ターゲット配列としては一般に例えば種々の医薬、農業、工業又は他の商業的に該当する蛋白質が挙げられる。目的ターゲットポリペプチドの所定の例としては、場合により例えばホルモン、サイトカイン、免疫グロブリン、酵素、受容体、抗原、調節因子、輸送蛋白質体等が挙げられる。上記及び他の潜在的ターゲットに対応する付加配列は当分野で公知であり、公知方法により容易に獲得可能である。
【００８６】
特に、ターゲットポリペプチドは場合により天然産物でもよいし、核酸組換え、突然変異誘発又は当分野で公知の他の技術等の強制分子多様化工程の最終産物でもよい。例えば、本発明の方法により監視されるターゲットポリペプチドをコードする核酸を作製するために場合により使用される組換えプロトコール（例えば性別判定及びアセンブリＰＣＲ）に関する付加詳細は例えば，Ｃｒａｍｅｒｉら（１９９６）”Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐ
ｒｏｔｅｉｎ  ｂｙ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ”Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １
４：３１５−３１９及びＳｔｅｍｍｅｒ（１９９４）”Ｒａｐｉｄ  ｅｖｏｌｕ
ｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ”Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：３８９−３９１に記載されている。部
位特異的突然変異誘発、カセット突然変異誘発、変異性ＰＣＲ等の核酸突然変異誘発技術に関する付加詳細は例えばＤａｌｅら（１９９６）”Ｏｌｉｇｏｎｕｃ
ｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｍｅｔｈｏｄ”Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５７：３６９−３７４、Ｃａｌｄｗｅｌｌら（１９９２）”Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｂｙ  ＰＣＲ  
ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ”ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌｉｃ．２：２８−
３３、Ｓｍｉｔｈ（１９８５）”Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ”
Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１９：４２３−４６２、Ｋｕｎｋｅｌら（１９８７）”Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ
ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３６７−３８２
、及びＷｅｌｌｓら（１９８５）”Ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ
：ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｔ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｉｔｅｓ”Ｇｅｎｅ  ３４：３１５−３２３に記載されている。強制分子多様化法も
例えばＳｍｉｔｈとＪｏｎｅｓ（編），ＤＮＡ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（２０００）、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ（編），Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９１）、Ｔｒｏｗｅｒ（編），Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｖｏｌ．５７，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、及びＳａｎｋａｒａｎａｒａｙａｎａｎ，Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ，Ｖｏｌ．１，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００１）に概説されている。組換え、突然変異誘発及びライブラリー構築の他の側面に使用するキットも市販されている。例えば、キットは例えばＣｌｏｎｅｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、及びＰｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．から市販されている。
【００８７】
ライブラリー構築、形質転換、宿主生物選択（例えば真核又は原核細胞、トランスジェニック植物又は動物等）、細胞培養及び分子生物学の他の側面等の本発明で有用な付加分子生物学技術について記載している一般教科書としてはＢｅｒｇｅｒとＫｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｖｍｏｌｏｇｙ．Ｖｏｌ．１５２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｒｇｅｒ）、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版），Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２０００年補遺版）（Ａｕｓｕｂｅｌ）が挙げられる。植物及び導入細胞等の細胞に核酸を形質導入する方法はこのような核酸によりコードされる蛋白質を発現させる方法として一般に利用可能である。Ｂｅｒｇｅｒ、Ａｕｓｕｂｅｌ及びＳａｍｂｒｏｏｋ以外に動物細胞を培養するために有用な一般文献としてはＦｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第３版，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ（１９９４）（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ）、Ｈｕｍａｓｏｎ，Ａｎｉｍａｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第４版，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９７９）、及びＲｉｃｃｉａｒｄｅｌｌｉら，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２５：１０１６−１０２４（１９８９）が挙げられる。植物細胞クローニング、培養及び再生に関する文献としてはＰａｙｎｅら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９２）（Ｐａｙｎｅ）及びＧａｍｂｏｒｇとＰｈｉｌｌｉｐｓ（編），Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ；  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（１９９５）（Ｇａｍｂｏｒｇ）が挙げられる。
【００８８】
大量細胞培養技術はバイオプロセシング科学で広く知られている。特に、細胞培養、培地及び培養装置に関する付加詳細は例えばＦｉｅｃｈｔｅｒ（編），Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ−Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｉｎｃ．（１９９３）、Ｋａｒｇｉ，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ（２００１）、Ｂｕｃｋｌａｎｄ（編），Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９５）、Ｄｏｒａｎ，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９５）、Ｖｉｅｔｈ，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｋｉｎｅｔｉｃｓ，Ｍａｓｓ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ，Ｒｅａｃｔｏｒｓ，ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）、Ｂｕｔｌｅｒ，Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ  Ｂａｓｉｃｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９８）、及びＤａｖｉｓ（編），Ｂａｓｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，２  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（２００１）に記載されている。
【００８９】
本発明の方法で使用する試料は場合により他の生体材料源に由来する。試料は血液、血清、唾液、尿、前立腺液、精液、精漿、リンパ液、肺／気管支洗浄液、粘液、糞便、乳分泌液、痰、涙等の体液が挙げられる。更に、細胞溶解液等の生体試料抽出液でもよい。例えば、細胞溶解液試料は場合により例えば初代組織又は細胞、培養組織又は細胞等に由来する。生体試料は場合により静脈穿刺、生検等の任意公知技術により採取される。細菌、植物、動物（特に哺乳動物）及び古細菌由来の細胞等の細胞の培養と生産については多数の文献が入手可能である。例えばＡｕｓｕｂｅｌ，Ｂｅｒｇｅｒ，Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｄｏｙｌｅ，Ｐａｙｎｅ，ａｎｄ  Ｇａｍｂｏｒｇ，前出参照。本明細書に列挙する特定ターゲット蛋白質源の例は本発明を限定するためではなく例証するために示す。蛋白質試料の付加源は当分野で公知であり、容易に獲得可能である。
【００９０】
ＩＩＩ．ターゲットポリペプチド生産の監視方法
本発明は種々の系で発現される蛋白質を分離したものからターゲットポリペプチドと蛋白質不純物を検出、定量及び同定する方法を提供する。例えば、本発明はターゲットポリペプチド発現期間を通して細胞培養上清を分析し、ターゲット蛋白質の発現量のみならず、発現される蛋白質と蛋白質不純物（分解したターゲット蛋白質を含む）の量の比に関する情報を提供する。宿主細胞蛋白質及び発現されるターゲット蛋白質のいずれも所定細胞培養段階又は条件により一般に変化する動的現象であるのでこの情報は有意義である。例えば異種宿主での発現サイクル中にターゲット蛋白質を検出するためには、例えば目的ターゲット生体物質のみを吸着する特異的固相で分析用試料を場合により予備分画する。こうすると、微量レベルで存在する不純物は目的蛋白質によりマスクされない。発現された蛋白質の吸着は例えばターゲット蛋白質に対する固定化抗体への免疫吸着により実施することができる。吸着剤表面（例えば酸性又はアルカリ性又は疎水性プローブ）も場合により使用する。このアプローチは各単成分の分子量に加えて蛋白質不純物の所定物性に関する情報が得られる。場合により、記載の方法を使用して培養工程中の細胞培養上清の組成の変動を監視する。この場合には、例えば細胞増殖に必須の因子（例えば増殖因子）の低下を指示し、所定生産工程中で前記因子を培地に添加するのに適した時点と量を決定する。
【００９１】
図１は複数の細胞培養バッチにおけるターゲットポリペプチドの監視方法の１態様に含まれる段階を模式的に示すフローチャートである。図面に示すように、Ａ１では各バッチでターゲットポリペプチドを生産する条件下で複数の細胞培養バッチを培養する。本方法は更にＡ２では各細胞培養バッチにおける生体分子成分のＳＥＬＤＩ質量スペクトルプロフィルを作成し、生体分子成分の定性的又は定量的検出を提供する。ＳＥＬＤＩ質量スペクトルプロフィルについては以下に詳述する。その後、Ａ３では質量スペクトルプロフィルを比較し、細胞培養バッチにおける生体分子成分間の定性的又は定量的差異を測定する。本方法は場合により例えばターゲットポリペプチドが規定量もしくは閾値と純度レベルで生産されるバッチ又はターゲットポリペプチドの分解形の量が最低のバッチを識別するために使用される。本方法は更に場合によりバッチにおける汚染性生体分子（例えば非ターゲット宿主細胞蛋白質、細胞培地に由来する汚染物等）を識別するために使用される。このデータは一般に複数の細胞培養バッチから特定バッチ（例えば不純物レベルが最低で非分解ターゲット蛋白質を最高量で生産するバッチ等）を選択し、例えば低品質バッチを処理する場合に生じる費用を避けるように所定生産工程で更に処理するために使用される。
【００９２】
図２は細胞培養におけるターゲットポリペプチドの生産の監視方法の１態様に含まれる段階を模式的に示すフローチャートである。図面に示すように、Ｂ１ではターゲットポリペプチドを生産する条件下で細胞培養バッチを培養する。Ｂ２では、本方法は細胞培養バッチにおける生体分子成分の第１のＳＥＬＤＩ質量スペクトルプロフィルを作成し、第１の時点のバッチにおける生体分子成分の定性的又は定量的検出を提供する。ＳＥＬＤＩ質量スペクトルプロフィルについては以下に詳述する。本方法は更にＢ３で細胞培養バッチにおける生体分子成分の第２のＳＥＬＤＩ質量スペクトルプロフィルを作成し、第２の時点のバッチにおける生体分子成分の定性的又は定量的検出を提供する。Ｂ２及びＢ３後に、本方法はＢ４で第１のプロフィルと第２のプロフィルを比較し、第１の時点と第２の時点の細胞培養バッチにおける生体分子成分間の定性的又は定量的差異を測定する。場合により、３時点以上の異なる時点から試料をプロファイリングし、例えば特定細胞培養工程中に生体分子成分間で検出された定性的及び／又は定量的差異を更に精査する。例えば、試料を場合により均一時間間隔で採取してプロファイリングするか又はランダムに選択した間隔で採取する。
【００９３】
所定態様では、本方法は第１の時点と第２の時点の細胞培養バッチにおけるターゲットポリペプチドの量の定量的差を測定し、例えばターゲットが（例えば培地中に）最高濃度で存在する生産工程中の時点を識別する。場合により、本方法は第１の時点と第２の時点の細胞培養バッチにおけるターゲットポリペプチドの定性的差を測定する。例えば、定性的差は場合によりターゲットポリペプチドとターゲットポリペプチドの分解形の差異を含む。更に場合により、例えば細胞培養バッチに含まれるターゲットポリペプチドの分解形の量が最低となる時点を識別したり、（例えば第１の時点と第２の時点の）細胞培養バッチにおける汚染性生体分子成分を識別してもよい。これらの方法から得られたデータは一般に例えばバッチから細胞を回収するため又は他の方法でターゲットポリペプチドの精製工程を開始するために最適な時点を更に識別するために使用される。
【００９４】
より具体的に説明すると、本方法は場合により例えばバッチ間又は異なる時点の特定バッチにおけるターゲットポリペプチドの定性的差異を測定し、定性的差異はターゲットポリペプチドとターゲットポリペプチドの修飾形の差異を含む。例えば、ターゲットポリペプチドの所定ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ修飾としては例えばグリコシル化、リン酸化、脂質化、酵素分解、標識、ポリペプチド凝集等が挙げられる。例えば、種々の分析技術には関連標識化合物（例えばフルオロフォア等）によるポリペプチドの検出が含まれる。従って、標識ターゲット蛋白質と未標識ターゲット蛋白質間の少なくとも定性的差異を示すデータを作成することが望ましいと思われる。所定態様では、ターゲットポリペプチドのＳＥＬＤＩ質量スペクトルプロフィルにより、例えばターゲットポリペプチド生産中の最適ターゲットポリペプチド発現段階、付加成分（例えば誘導剤、代謝産物、増殖因子等）を細胞培地に添加するターゲットポリペプチド生産段階、細胞培地中の非分解ターゲットポリペプチド量が最高となるターゲットポリペプチド生産段階、ターゲットポリペプチドを回収するのに最適なターゲットポリペプチド生産段階を識別する。このデータは一般にポリペプチド生産工程を最適化するために使用される。
【００９５】
ＩＶ．ターゲットポリペプチドの精製の監視及び工程規模拡大方法
本発明はターゲットポリペプチドの精製を監視し、精製工程の規模を拡大するための方法も提供する。例えば、本方法は場合により精製工程に伴う不純物（例えば細胞宿主蛋白質、アフィニティーカラムから放出されるリガンド等）の除去の適正な追跡を行うために使用される。ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦに加え、プローブ表面への蛋白質の選択的吸着のない古典的ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦも場合により使用する。ＳＥＬＤＩ及びＭＡＬＤＩ分析については以下に詳述する。更に、場合により記載の方法を使用して精製工程から放出される可能性のある材料を追跡してもよく、例えば蛋白質Ａ等のクロマトグラフィーで使用される蛋白質リガンド（免疫グロブリンＧの精製）や、抗体をリガンドとして含む免疫吸着剤（抗原の分離）が挙げられる。
【００９６】
ポリペプチドは場合により当分野で周知の多数の方法の任意のものにより細胞培養から回収精製され、このような方法としては電気泳動、クロマトグラフィー、沈殿、透析、濾過及び／又は遠心が挙げられる。より具体的に言うと、超遠心、硫安又はエタノール沈殿、酸抽出、イオン交換クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー（例えばタグ系を使用）、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー及び／又はレクチンクロマトグラフィー等の精製技術を場合により使用する。試料は固体材料（例えば細胞破片等）を除去した液体形態が好ましい。本明細書に記載する参考文献に加え、種々の精製方法が当分野で周知であり、例えばＳａｎｄａｎａ，Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９７）、Ｂｏｌｌａｇら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，第２版，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ（１９９６）、Ｗａｌｋｅｒ，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、ＨａｒｒｉｓとＡｎｇａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）、ＨａｒｒｉｓとＡｎｇａｌ（編）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，第３版，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９３）、ＪａｎｓｏｎとＲｙｄｅｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，第２版，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ（１９９８）、Ｗａｌｋｅｒ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｎ  ＣＤ−ＲＯＭ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９９８）、Ｓａｔｉｎｄｅｒ  Ａｈｕｊａ編，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（２０００）及びその引用文献に記載されている方法が挙げられる。場合によりこれらの精製技術の所定のものを利用して例えばＳＥＬＤＩ質量スペクトルプロファイリング用試料を調製する試料分画法については以下に詳述する。
【００９７】
図３は混合物からのターゲットポリペプチドの精製の監視方法の１態様に含まれる段階を模式的に示すフローチャートである。図面に示すように、Ｃ１ではターゲットポリペプチドと少なくとも１種の汚染性生体分子を含む混合物における生体分子成分の第１のＳＥＬＤＩ質量スペクトルプロフィルを作成し、混合物中の生体分子成分の定性的又は定量的検出を提供する。Ｃ２では、本方法は少なくとも１種の汚染性生体分子の少なくとも一部を混合物から除去する本明細書に記載するか又は当分野で公知の他の精製工程にターゲットポリペプチドをかけ、ターゲットポリペプチドを含む高純度混合物を生成する。更に、Ｃ３では高純度混合物中の生体分子成分の第２のＳＥＬＤＩ質量スペクトルプロフィルを作成する。最後に、Ｃ４で第１のプロフィルと第２のプロフィルを比較し、混合物と高純度混合物における生体分子成分間の定性的又は定量的差異を測定する。本明細書に記載するように、本方法は一般にターゲットポリペプチドを生産する条件下で細胞を培養し、培養細胞から混合物を採取する。所定態様では、培養細胞はターゲットポリペプチド生産中に細胞培地にターゲットポリペプチドを分泌し、例えば混合物は宿主細胞集団から分離された細胞培養上清を含む。ターゲットポリペプチドが周囲培地に分泌されない場合には、混合物を採取する前に例えば当分野で公知の本質的に任意の細胞培養回収法を使用して培養細胞を溶解させるのが一般的である。
【００９８】
所定態様では、本方法は混合物と高純度混合物におけるターゲットポリペプチドの純度の定量的差異を測定することを含み、純度がターゲットポリペプチドと少なくとも１種の汚染性生体分子の相対量の測度である。所定態様では、本方法は混合物と高純度混合物におけるターゲットポリペプチド間の定性的差異を測定することを含み、定性的差異がターゲットポリペプチドとターゲットポリペプチドの分解形の測度である。更に他の態様では、本方法は混合物間のターゲットポリペプチドの定性的差異を測定することを含み、定性的差異がターゲットポリペプチドとターゲットポリペプチドの修飾形の定性的差異を含み、修飾（例えばｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ修飾）が例えばグリコシル化、リン酸化、脂質化、酵素分解、標識、ポリペプチド凝集等から選択される。更に場合により、本方法は第１のプロフィルと第２のプロフィルにおける汚染性生体分子成分間の定量的又は定性的差異を測定することを含む。
【００９９】
所定態様では、本方法はターゲットポリペプチドを少なくとも１種の付加精製工程にかけ、少なくとも１種の後期混合物を提供する段階と、少なくとも１種の後期混合物における生体分子成分の後期ＳＥＬＤＩ質量スペクトルプロフィルを作成する段階を更に含む。これらの態様は一般に後期ＳＥＬＤＩ質量スペクトルプロフィルを別のＳＥＬＤＩ質量スペクトルプロフィル（例えば第１及び／又は第２の質量スペクトルプロフィル等）と比較し、後期混合物と別の混合物における生体分子成分間の定性的又は定量的差異を測定する段階を更に含む。
【０１００】
図４は大規模精製に合わせて精製工程を最適化するために場合により使用されるターゲットポリペプチドの精製方法の１態様に含まれる段階を模式的に示すフローチャートである。図面に示すように、Ｄ１では（ｉ）ターゲットポリペプチドを含む混合物を支持体に結合した複数の吸着剤（例えばプローブ形態の例えばクロマトグラフィー吸着剤、生体特異的吸着剤等）と接触させ、（ｉｉ）各吸着剤を異なる溶離剤で洗浄し、混合物中のポリペプチドを吸着剤に選択的に結合させ、（ｉｉｉ）混合物中の生体分子成分のＳＥＬＤＩ質量スペクトルプロフィルを作成し、混合物中の生体分子成分の定性的又は定量的検出を提供し、（ｉｖ）（１）ターゲットポリペプチドを吸着剤に吸着させると共に汚染性ポリペプチドを吸着剤から溶出させる洗浄条件と、（２）ターゲットポリペプチドを吸着剤から溶出させる洗浄条件を識別することにより、精製条件を識別する。吸着剤及びＳＥＬＤＩ質量スペクトルプロフィルの他の側面については以下に詳述する。Ｄ２において本方法は吸着剤を含むクロマトグラフィー媒体と混合物のバッチ（例えば少なくとも約１０００リットル等）を接触させ、ターゲットポリペプチドを吸着剤に吸着させると共に汚染性ポリペプチドを吸着剤から溶出させる特定洗浄条件でクロマトグラフィー媒体を洗浄する。Ｄ３において本方法はターゲットポリペプチドを吸着剤から溶出させる特定洗浄条件でクロマトグラフィー媒体を洗浄する段階を更に含む。本方法は更にＤ４において溶出したターゲットポリペプチドを採取する。洗浄条件は一般に例えば塩濃度、洗浄剤濃度、ｐＨ、緩衝能、イオン強度、水構造特徴、洗浄剤型、疎水性、誘電定数、少なくとも１種の溶媒（例えば有機溶媒等）の濃度又は少なくとも１種の溶質の濃度等の１種以上から選択される種々のパラメーターを含む。
【０１０１】
Ｖ．生体分子分画
所定態様ではターゲット蛋白質を含む試料を直接分析することができるが、本方法は質量プロファイリング前にターゲット蛋白質を含む試料フラクションを採取するために本明細書に記載の分画技術又は生体分子を分離するのに有用であることが当分野で知られている他の分画技術の１種又は組合せにより初期試料中の生体分子を分画する。分画は一般に試料中の分析物の複雑さを減らしてターゲット蛋白質又は不純物の検出及び特性決定を助長するために利用される。更に、分画プロトコールは試料中の生体分子成分の物理化学的特性に関する付加情報を提供することができる。例えば、イオン交換スピンカラムを使用して試料を分画する場合や、ターゲット蛋白質を所定ｐＨで溶出させる場合には、この溶出特性はターゲット蛋白質の結合特性に関する情報を提供する。別の例では、試料中に多量に存在するか及び／又は特定ターゲット蛋白質もしくは微量不純物の検出を妨げる蛋白質又は他の分子を除去するために試料を分画することができる。
【０１０２】
利用可能な試料分画プロトコールは当業者に自明である。場合により本明細書に記載の方法と併用される分画技術の例としてはサイズ排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、膜透析、濾過、遠心（例えば超遠心）等のサイズに基づく方法が挙げられる。場合により分析物の電荷（例えばアニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー）、分析物疎水性（例えばＣ1−Ｃ18樹脂）、分析物親和性（例えば免疫親和性、固定化金属、又は色素）等に基づいて分離してもよい。好適態様では、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して分画を行う。他の分画方法としては例えば結晶化と沈殿が挙げられる。これらの分画技術の多くは例えばＷａｌｋｅｒ（編）Ｂａｓｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３２，Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４）、Ｆａｌｌｏｎら（編）Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＨＰＬＣ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８７）、Ｍａｔｅｊｔｓｃｈｕｋ（編）Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９７）、Ｓｃｏｕｔｅｎ，Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：Ｂｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｉｎｅｒｔ  Ｍａｔｒｉｃｅｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８１）、Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ（１９９３）、Ｂｒｏｗｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．（１９９８）、ＬｏｕｇｈとＷａｉｎｅｒ（編），Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｂｌａｃｋｉｅ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  ａｎｄ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ（１９９６）、ＭａｎｔとＨｏｄｇｅｓ（編），Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）、Ｗｅｉｓｓ，Ｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，第２版，ＶＣＨ（１９９５）、Ｉｏｎ−Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ（１９９１）、Ｓｍｉｔｈ，Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｋｒｉｅｇｅｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９０）、Ｂｉｄｌｉｎｇｍｅｙｅｒ，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ＨＰＬＣ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９２）、及びＲｉｃｋｗｏｏｄら，Ｃｅｎｔｒｉｆｕ���ａｔｉｏｎ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｄａｔａ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９９４）に詳細に記載されている。これらの技術の所定のものを以下に詳述する。
【０１０３】
Ａ．サイズ排除クロマトグラフィー
１態様では、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して例えば試料中の蛋白質のサイズに従って試料を分画することができる。入手可能な試料量が少ない生体試料では、サイズ選択スピンカラムを使用すると好ましい。例えば、Ｋ−３０スピンカラム（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を使用することができる。一般に、カラムから溶出する第１のフラクション（「フラクション１」）は高分子量蛋白質の百分率が最高であり、フラクション２のほうが高分子量蛋白質の百分率が低く、フラクション３は高分子量蛋白質の百分率が更に低く、フラクション４は高分子量蛋白質の量が最低となる。その後、各フラクションを場合により気相イオンスペクトロメトリーにより分析し、生産中のターゲットポリペプチドの存在を検出する方法、微量不純物を検出する方法等の本明細書に記載の方法により特定蛋白質を検出する。サイズ排除クロマトグラフィーの使用については後記実施例に詳しく例証する。
【０１０４】
Ｂ．ゲル電気泳動による生体分子の分離
別の態様では、例えば一次元又は二次元ゲル電気泳動、ノーザンブロット等の高分解能電気泳動により試料中の生体分子（例えば蛋白質、核酸等）を分離することができる。ターゲット蛋白質を含む疑いのあるフラクションを単離し、本明細書に記載するような気相イオンスペクトロメトリーにより更に分析することができる。二次元ゲル電気泳動を使用して１種以上のターゲット蛋白質を含む生体分子のスポットの二次元アレーを作成することが好ましくい。例えば，ＪｕｎｇｂｌｕｔとＴｈｉｅｄｅ，Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒ．Ｒｅｖ．１６：１４５−１６２（１９９７）参照。
【０１０５】
二次元ゲル電気泳動は場合により当分野で公知の方法を使用して実施される。例えばＤｅｕｔｓｃｈｅｒ編，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．１８２参照。一般には、例えば等電点電気泳動により試料中の生体分子を分離し、この間に試料中の生体分子は正味電荷がゼロ（即ちその等電点）に達するまでｐＨ勾配中で分離される。この第１分離段階の結果、生体分子の一次元アレーが得られる。第１段階で使用した技術と一般に異なる技術を使用して一次元アレー内の生体分子を更に分離する。例えば、第２次元では、等電点電気泳動により分離した生体分子をドデシル硫酸ナトリウムの存在下のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のようにポリアクリルアミドゲルで更に分離する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは生体分子の分子量に基づいて更に分離することができる。一般に、二次元ゲル電気泳動は複雑な混合物内で約１０００〜約２００，０００Ｄａの分子量範囲の化学的に異なる生体分子を分離することができる。
【０１０６】
二次元アレー内の生体分子は場合により当分野で公知の任意方法を使用して検出される。例えば、ゲル内の生体分子を（例えばクーマシーブルー、銀染色、蛍光タグ、放射性標識等により）標識又は染色することができる。ゲル電気泳動により１種以上のターゲット蛋白質の分子量に対応するスポットが生じる場合には、本発明の方法に従って気相イオンスペクトロメトリーによりスポットを更に分析することができる。例えば、気相イオンスペクトロメトリー分析の前にゲルからスポットを切出し、選択したスポット内の蛋白質を例えばプロテアーゼ（例えばトリプシン）等の開裂試薬により開裂するか又は他の方法でより小さいペプチドフラグメントに断片化することができる。あるいは、電場を印加することにより、生体分子を含むゲルを不活性膜に移すことができる。その後、マーカーの分子量にほぼ対応する膜上のスポットを本明細書に記載の方法に従って分析することができる。気相イオンスペクトロメトリーでは、以下に詳述するように（例えばＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレーを使用して）ＭＡＬＤＩ又は表面増強レーザー脱離イオン化等の適当な任意技術を使用してスポットを分析することができる。
【０１０７】
Ｃ．高性能液体クロマトグラフィー
更に別の態様では、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して極性、電荷、サイズ等の種々のその物性に基づいて試料中の生体分子混合物を分離することができる。ＨＰＬＣ装置は一般に移動相レザバー、ポンプ、インジェクター、分離カラム、及び検出器から構成される。試料中の生体分子は試料のアリコートをカラムに注入することにより分離される。混合物中の種々の生体分子は液体移動相と固定相の間のその分配性の差により異なる速度でカラムを通過する。例えば１種以上のターゲット蛋白質の分子量及び／又は物性に対応するフラクションを採取することができる。次に、このフラクションを本明細書に記載の方法に従って気相イオンスペクトロメトリーにより分析し、ターゲット蛋白質を検出することができる。例えば、以下に詳述するように（例えばＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレーを使用して）ＭＡＬＤＩ又はＳＥＬＤＩによりスポットを分析することができる。
【０１０８】
ＶＩ．生体分子断片化
気相イオンスペクトロスコピーにより試料中の生体分子質量をプロファイリングする前に、本発明の試料中の蛋白質を場合により断片化又は消化する。このアプローチは例えば細胞培地の成分（例えば蛋白質不純物等）を識別しようとする場合に特に有用である。断片化は場合により試料中の蛋白質からペプチドフラグメントを生成する任意技術を使用して実施される。これらの技術の多くは一般に当分野で公知である。例えば、場合により酵素的、化学的又は物理的に蛋白質を断片化する。本発明の所定態様では、断片化により得られたターゲット蛋白質及び／又はペプチドフラグメントを場合により修飾し、検出時の分解能を改善する。他の態様では、試料の生体分子成分の断片化は試料のアリコートを吸着剤スポットに配置し、例えば蛋白分解剤をスポット上の材料に添加することによりＳＥＬＤＩ環境で「オンチップ」実施することができる。断片化による生体分子の同定に関する付加詳細は例えば参考資料としてその開示内容全体を全目的で本明細書に組込むＵＳＳＮ  ６０／２７７，６７７（発明の名称「高精度蛋白質同定（ＨＩＧＨ  ＡＣＣＵＲＡＣＹ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＩＤＥＮＴＩＦＩＣＡＴＩＯＮ）」、出願日２００１年３月２０日、出願人Ｔｈａｎｇ）に記載されている。
【０１０９】
ＶＩＩ．生体分子プロファイリング
本発明は例えばターゲットポリペプチド及び／又は不純物を定性的及び／又は定量的に検出するための細胞培地又は精製工程からの成分の質量のプロファイリングを含む。好適態様では、他の多くの検出法よりも有意に感度レベルの高いＳＥＬＤＩ質量スペクトルプロフィルを介して検出を行う。ＳＥＬＤＩ及び残留液クロマトグラフィーについて以下に詳述する。
【０１１０】
Ａ．ＳＥＬＤＩ及びＭＡＬＤＩ
ＳＥＬＤＩは試料提示表面が脱離イオン化工程に関与する点がＭＡＬＤＩと相違する。ＭＡＬＤＩでは、試料提示表面はこの工程に何ら役割を果たさず、検出された分析物はマトリックス材料と混合してその内部にトラップされたものに相当する。ＳＥＬＤＩでは、試料提示表面は所定類の分析物分子に対して所定レベルの親和性を示す吸着剤分子を含む。従って、エネルギー吸着分子（例えば「マトリックス」）を表面に添加してエネルギー源を衝突させた後に検出される特定分析物分子は吸着剤と分析物分子の相互作用にも依存する。従って、ＳＥＬＤＩとＭＡＬＤＩを実施する場合には種々の分子集団が検出される。
【０１１１】
ここでは「残留液クロマトグラフィー」、「非洗浄ＳＥＬＤＩ」及び「濃縮ＳＥＬＤＩ」の３種の異なるＳＥＬＤＩ様式について記載する。
【０１１２】
１．残留液クロマトグラフィー
残留液クロマトグラフィーは一般に次のように行われる。吸着剤を含む試料提示表面（例えばプローブ又はバイオチップの表面上のスポット）に細胞培養上清のアリコート等の生体有機分析物を含む液体試料を添加する。吸着剤は化学的特性に応じて分子分析物類に対して種々のレベルの親和性をもつ。例えば、親水性吸着剤は親水性生体分子に対して親和性をもつ。試料を吸着剤と結合平衡に到達させる。結合平衡に到達すると、分析物は吸着剤に対するその吸引レベルに応じて吸着剤と結合するか又は溶液に止まる。
【０１１３】
ある類の分子が到達する特定結合平衡は当然のことながら吸着剤に対するこれらの分子の結合定数により調節される。例えば、結合定数が小さいほど分子と吸着剤の結合は緊密になり、分子は溶液中よりも吸着剤に結合し易くなる。吸着剤に吸引されないか又は反発する分子は溶液中で遊離し易く、吸着剤に結合するとしても少数である。
【０１１４】
分子を吸着剤に結合させた後に、液体及び未結合分子を例えばピペッティングによりスポットから除去する。吸着剤に結合した分子と恐らく液体と共に完全に除去されなかった多少の未結合分子がスポットに残留する。こうして、未結合分子の大半は液体の除去と共に除去される。
【０１１５】
次に、洗浄溶液をスポットに添加する。一般に、洗浄溶液は試料を添加した液体と異なる溶出特性をもつ。例えば、洗浄溶液は元の試料と異なるｐＨ又は塩濃度をもつことができる。洗浄段階では、分析物は結合と溶液残留の間の新規平衡に到達することができる。例えば、洗浄のストリンジェンシーが試料を添加した液体のストリンジェンシーよりも高い場合には、弱く結合した分子を溶液中に放出することができる。この洗浄溶液を次に未結合分子と共にスポットから除去する。これは生体分子分析物と塩等の無機分子を含む。従って、特に洗浄溶液が試料を添加した溶液と類似特性をもつ場合には洗浄は脱塩段階として機能することができる。
【０１１６】
洗浄段階後に表面上の分析物分子集団は元の試料中の集団と有意に異なる。特に、元の試料中の分子と比較すると、吸着剤に残留している分子の比は吸着剤に対して特に親和性をもつ分子の側に著しく傾き、吸着剤に対して殆ど又は全く親和性をもたない分子は洗浄により除去されている。
【０１１７】
この時点で表面に残留している分析物を通常は乾燥させるが、この段階は省略してもよい。この時点で分析物はスポット上に層として存在する。
【０１１８】
エネルギー吸着分子（例えば桂皮酸誘導体、シナピン酸、ジヒドロキシ安息香酸）（マトリックスと言う場合もある）をプローブ表面に添加して脱離イオン化を助長する。通常、エネルギー吸着分子をスポットに添加して乾燥させる。しかし、所定態様では試料を添加する前にエネルギー吸着分子をプローブの表面に添加する。（この態様の１様式を「ＳＥＮＤ」と言う。米国特許第６，１２４，１３７号（ＨｕｔｃｈｅｎｓとＹｉｐ）参照）。こうして、気相イオンスペクトロメトリー、好ましくはレーザー脱離イオン化マススペクトロメトリーにより分析物を試験することができ、マトリックスと分析物の表面層の界面における相互作用によりこの界面で生体分子分析物を脱離イオン化させる。
【０１１９】
２．非洗浄ＳＥＬＤＩ
別法として「非洗浄ＳＥＬＤＩ」は以下の段階を含む。吸着剤を含む試料提示表面（例えばバイオチップの表面上のスポット）に生体有機分析物を含む液体試料を添加する。試料を吸着剤と結合平衡に到達させる。分子を吸着剤と結合させた後に、液体を例えばピペッティング等によりスポットから除去する。結合分子（と恐らく多少の未結合分子）が支持体に残留し、未結合分子の大半は液体と共に除去される。この方法では、スポットに洗浄溶液を添加しない。平衡に到達後に洗浄段階を行わずに過剰の試料を除去するので、吸着剤スポット上の分子集団は添加した試料中の分子集団及び残留液クロマトグラフィーでスポットに残留している集団と異なる。残留液クロマトグラフィーと同様に、吸着剤スポット上の集団は最初に添加した試料に比較して吸着剤に親和性をもつ分子の濃度が高い。他方、残留液クロマトグラフィーでは未結合分子、非特異的結合又は弱く結合した分子は洗浄除去されるが、これらの分子は試料提示表面に残留しているので、集団は残留液クロマトグラフィーで残留する集団とも異なる。これは生体分子種と無機種（例えば塩）の両者を含む。
【０１２０】
この時点で表面に残留している分析物を通常は乾燥させるが、この段階は省略してもよい。次に、エネルギー吸着分子（例えば桂皮酸誘導体、シナピン酸及びジヒドロキシ安息香酸）をスポットに添加して乾燥させる。その後、気相イオンスペクトロメトリー、好ましくはレーザー脱離イオン化マススペクトロメトリーにより分析物を試験することができる。
【０１２１】
３．濃縮ＳＥＬＤＩ
「濃縮ＳＥＬＤＩ」と呼ぶ別法では段階は次のように進行する。吸着剤を含む試料提示表面（例えばバイオチップの表面上のスポット）に生体有機分析物を含む液体試料を添加する。次に試料中の分析物を吸着剤表面で濃縮させる。濃縮は単位容量当たりの分析物の量が増加するように（例えば蒸発により）試料容量を減らすことにより行われる。非洗浄洗浄ＳＥＬＤＩ又は残留液クロマトグラフィーと異なり、試料液と未結合分析物を一緒に吸着剤表面から除去しない。試料中の分析物を本質的に乾涸まで濃縮することが好ましい。しかし、エネルギー吸着分子の添加前に少なくとも２倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、又は少なくとも１０００倍濃縮させてもよい。試料の容量は次第に減少するので、分析物は溶液中で安定な結合平衡に到達しない。吸着剤上の分析物を濃縮することにより、吸着剤への吸引に関係なく試料中の全分析物は表面に止まる。（蒸発過程で所定揮発性分析物は失われる可能性がある。）従って、分析物と吸着剤表面の特異的結合（即ち吸着剤に媒介される結合）と非特異的結合の両者が生じる、その後、エネルギー吸着分子をスポットに添加して乾燥させる。その後、気相イオンスペクトロメトリー、好ましくはレーザー脱離イオン化マススペクトロメトリーにより分析物を試験することができる。
【０１２２】
この場合には、チップの表面上の分析物集団は添加した試料中の分析物集団を反映するが、エネルギー吸着材料の添加後も分析物のフラクションはチップ表面に結合したままである。従って、エネルギー吸着材料に取込まれる分析物フラクションはエネルギー吸着材料溶液を吸着剤表面に添加する場合に存在する条件下で吸着剤表面に対して結合親和性の低い分析物フラクションに相当する。これは分析物試料をマトリックス材料と直接混合するＭＡＬＤＩとは対照的である。その結果、各場合の分析物からのシグナル強度は異なり、ＭＡＬＤＩで検出不能又は識別不能な所定分子からのシグナルを濃縮ＳＥＬＤＩで検出することができる。従って、濃縮ＳＥＬＤＩは試料中の生体有機分子の存在のアッセイとしてＭＡＬＤＩよりも高感度のアッセイを提供することができる。
【０１２３】
Ｂ．生体分子試料と気相イオンスペクトロメトリー分析用支持体の接触
１．非分画試料の分析
所定態様では、気相イオンスペクトロメトリー（例えばＭＡＬＤＩ又はＳＥＬＤＩ）による試験前に分画せずに試料を分析する。例えば、細胞培養上清の試料を場合により細胞培地から直接分析し、分泌ターゲットポリペプチドの存在を評価する。別法として、質量プロファイリング前に分画せずに精製工程の各種段階から採取した試料を分析する。
【０１２４】
ＭＡＬＤＩでは、試料を適当なマトリックスと混合し、プローブの表面に置き、レーザー脱離イオン化により試験するのが一般的である。ＭＡＬＤＩ技術は当分野で周知である。例えば米国特許第５，０４５，６９４号（Ｂｅａｖｉｓら）、米国特許第５，２０２，５６１号（Ｇｌｅｉｓｓｍａｎｎら）及び米国特許第６，１１１，２５１号（Ｈｉｌｌｅｎｋａｍｐ）参照。しかし、ＭＡＬＤＩではＳＥＬＤＩによる分析ほど良好な結果が得られないことが多い。
【０１２５】
ＳＥＬＤＩでは、第１のアリコートを固相に結合（例えば支持体に結合）した吸着剤と接触させる。支持体は一般に気相イオンスペクトロメーターに脱着可能なプローブ（例えばバイオチップ）である。本発明のＳＥＬＤＩ適用では、プローブは一般に少なくとも１個の表面フィーチャーをもつ支持体を含み、例えばターゲット蛋白質からの１個以上のペプチドフラグメントを捕獲することが可能な少なくとも１種の吸着剤が支持体に結合している。この適用に好適な吸着剤は順相又は親水性吸着剤（例えば酸化ケイ素）である。プローブについては以下に詳述する。
【０１２６】
あるいは、支持体は例えばペプチドフラグメントと結合するための官能基又は吸着剤を含むポリマー、常磁性、ラテックス又はガラスピーズ又は樹脂等の固相とすることができる。分析物の捕獲後、気相イオンスペクトロメーターに脱着可能なプローブに固相を配置する。
【０１２７】
適当な任意方法（例えば浸浴、浸漬、含浸、噴霧、洗浄、ピペッティング等）により吸着剤を含むプローブと試料を接触させる。一般に、溶媒約１μｌ〜５００μｌ中ペプチドフラグメント数アットモル〜１００ピコモルを含む試料アリコートの容量か吸着剤と結合させるのに十分である。試料アリコートはペプチドフラグメントを吸着剤と結合させるために十分な時間吸着剤を含むプローブ支持体と接触することができる。一般に、約３０秒〜約１２時間、好ましくは約３０秒〜約１５分間試料アリコートと吸着剤を含む支持体を接触させる。更に、一般に大気温度及び圧力条件下に試料アリコートをプローブ支持体と接触させる。但し、試料アリコートによっては温度（一般に４℃〜３７℃）及び圧力条件を変えたほうが望ましい場合もあり、条件は当業者により決定することができる。
【０１２８】
試料をスポット上で乾燥させるか、又は適当な時間後に過剰の試料をスポットから除去する。その後、第１のアリコートにおけるペプチドフラグメントをプローブから脱離イオン化し、気相イオンスペクトロメトリーを使用して検出し、第１組のペプチドフラグメント質量データを得る。第１組のペプチドフラグメント質量データは一般に試料アリコート中に存在する全部又は大半のペプチドフラグメントのプロフィルを提供する。
【０１２９】
２．分画試料の分析
試料の分画後に試料を場合により本発明の方法により分析する。本明細書に記載の方法による試料分画の使用については後記実施例に例証する。試料アリコートの分画は一般に特定試料中に存在する生体分子に関する総情報含量を増加する。例えば、高濃度生体分子成分のシグナルは低濃度成分のシグナルを抑制するが、分画の結果、高濃度生体分子成分のシグナルを除去することにより、非分画試料では検出できないか又は正確に検出できない微量不純物を検出することができる。更に、分画後に試料中に残っている生体分子は一般にシグナル対ノイズ比の増加の結果として改善された質量精度で検出される。分画試料と非分画試料からの試料成分に関する情報を使用すると、一般に所定ターゲット蛋白質又は不純物が正確に検出される信頼性レベルが増加する。
【０１３０】
試料フラクションを生成する分画段階は上記分画方法の任意のものにより実施することができる。例えば、特定試料中の生体分子成分質量のスペクトロメトリープロファイリングの前に、例えばＨＰＬＣを使用して試料中の生体分子をフラクションに分離する。１好適態様では、分画と分析は以下に詳述するＳＥＬＤＩ／残留液クロマトグラフィーにより実施する。
【０１３１】
１態様では、これらの分画試料を上記のような典型的ＭＡＬＤＩ法により分析し、プローブ表面からの分析物の脱離イオン化に積極的に関与しないプローブ表面に試料を添加する。
【０１３２】
他方、１好適態様では残留液クロマトグラフィーにより試料の分画と分析を実施する。残留液クロマトグラフィーはプローブの表面に結合した吸着剤とアリコートを直接接触させ、吸着剤により１種以上の生体分子成分（例えばターゲット蛋白質及び／又は不純物）を捕獲する。この態様は更に、捕獲されなかった材料を例えば気相イオンスペクトロメトリー分析前に１回以上の洗浄によりプローブから除去する。場合により、１種以上の試料成分を捕獲する支持体に結合した吸着剤と接触させた後に試料をプローブ表面と間接的に接触させる。場合により、支持体に結合した吸着剤をプローブ表面と接触させる前又は後に、捕獲されなかった材料を（例えば１回以上の洗浄により）除去する。
【０１３３】
捕獲されなかった材料を除去するための洗浄は試料を溶離剤に暴露した後に例えば支持体表面又は支持体に結合した吸着剤を浸浴、含浸、浸漬、リンス、噴霧又は洗浄することにより実施することができる。溶離剤をプローブ上の吸着剤の小スポット（例えば表面フィーチャー）に導入する場合にはマイクロフルイディクス法を使用すると好ましい。一般に、溶離剤は０℃〜１００℃、好ましくは４℃〜３７℃の温度とすることができる。適当な任意溶離剤（例えば有機又は水性）を使用して支持体表面を洗浄することができる。例えば、１回以上の洗浄の各々は場合により少なくとも１回の前段階の洗浄と同一又は異なる溶出条件とする。溶出条件は一般に例えばｐＨ、緩衝能、イオン強度、水構造特徴、洗浄剤型、洗浄剤強度、疎水性、誘電定数、少なくとも１種の溶質の濃度等により異なる。水溶液を使用すると好ましい。水溶液の例としてはＨＥＰＥＳ緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、又はリン酸緩衝食塩水等が挙げられる。緩衝液の洗浄ストリンジェンシーを増すためには、添加剤を緩衝液に添加することができる。これらの添加剤としては限定されないが、イオン相互作用調節剤（イオン強度及びｐＨの両者）、水構造調節剤、疎水性相互作用調節剤、カオトロピック試薬、親和性相互作用置換剤が挙げられる。これらの添加剤の具体例は例えばＰＣＴ公開Ｗ０９８／５９３６０（ＨｕｔｃｈｅｎｓとＹｉｐ）に記載されている。特定溶離剤又は溶離剤添加剤の選択は他の実験条件（例えば使用する吸着剤又は検出しようとするペプチドフラグメントの種類）によって異なり、当業者が決定することができる。
【０１３４】
ＩｇＭ抗体のように非常に分子量の大きい分子を読取る場合にはより小さいフラグメントを生成するように還元条件下に処理する。これは消化ではなくジスルフィド結合（が存在する場合にはその）解離により得られる。抗体分子の場合には、この結果としていずれも完全抗体よりも小さく、マススペクトロメトリーにより容易に検出される重鎖と軽鎖を生じる。
【０１３５】
本明細書に記載の方法の任意のものによりプローブ表面から生体分子を脱離イオン化する前に、通常は試料の乾燥後に支持体表面上の所定試料にエネルギー吸着分子又はマトリックス材料を添加する。エネルギー吸着分子は気相イオンスペクトロメーターからのエネルギー源からエネルギー吸着を助長し、プローブ表面から生体分子成分の脱離を助長することができる。エネルギー吸着分子の例としては桂皮酸誘導体、シナピン酸（「ＳＰＡ」）、シアノヒドロキシ桂皮酸（「ＣＨＣＡ」）、及びジヒドロキシ安息香酸が挙げられる。他の適当なエネルギー吸着分子は当業者に公知である。エネルギー吸着分子の付加記載については例えば米国特許第５，７１９，０６０号（ＨｕｔｃｈｅｎｓとＹｉｐ）参照。
【０１３６】
エネルギー吸着分子と所定試料フラクション中の生体分子成分は適当な任意方法で接触させることができる。例えば、従来のＭＡＬＤＩ法のようにエネルギー吸着分子を場合により試料フラクションと混合し、混合物を支持体表面に配置する。別例では、支持体表面を試料フラクションと接触させる前にエネルギー吸着分子を支持体表面に配置してもよい。別例では、支持体表面をエネルギー吸着分子と接触させる前に試料フラクションを支持体表面に配置してもよい。その後、試料フラクション中の生体分子成分を以下に詳述するように脱離、イオン化及び検出することができる。
【０１３７】
場合により、所定試料の複数のフラクションを平行して分析する。更に場合により、未分画試料と分画試料を平行して分析する。他方、本発明の他の態様では、これらの分析を連続して実施することができる。例えば、未分画試料アリコートをスポットに配置して平衡化させることができる。その後、試料中の残留液を吸着剤スポットに移し、残留液クロマトグラフィーにより分画することができる。
【０１３８】
３．プローブ
気相イオンスペクトロメーターで使用するのに適応させる（例えば気相イオンスペクトロメーターに脱着可能とする）限り、プローブ（例えばバイオチップ）は場合により適当な任意形状（例えば正方形、三角形、円形等）に形成される。例えば、プローブは規定の割り当て可能な位置に一連のウェルを配置したストリップ、プレート又は皿の形態でもよいし、他の表面フィーチャーをもたせてもよい。プローブは更に場合により気相イオンスペクトロメーターの入力システム及び検出器で使用するのに適した形状とする。例えば、プローブを手で配置し直す必要なしにプローブを縦、横及び／又は回転移動させる縦、横及び／又は回転方向に移動可能なキャリッジに搭載するようにプローブを適応させることができる。
【０１３９】
所定態様では、分析物と結合するようにプローブ支持体表面を調整することができる。例えば、１態様では吸着剤を表面に配置できるようにプローブ支持体の表面を（例えば粗面化等により化学的又は機械的に）調整する。吸着剤は分析物と結合するための官能基を含む。所定態様では、支持体材料自体も吸着性とし、「吸着剤」の一部とすることができる。
【０１４０】
吸着剤は連続又は不連続パターンでプローブ支持体に配置することができる。連続の場合には、１種以上の吸着剤を支持体表面に配置することができる。多重型の吸着剤を使用する場合には、１種以上の結合特性が一次元又は二次元勾配で変動するように支持体表面をコーティングすることができる。不連続の場合には、支持体表面上の（例えばマススペクトロメーターのレーザービームにより割り当て可能な）規定の割り当て可能な位置又は表面フィーチャーに複数の吸着剤を配置することができる。プローブ又はバイオチップの表面フィーチャーとしては種々の態様が挙げられる。例えば、バイオチップは場合により例えば直線、直交アレー、円又はｎ角形（ｎは３以上）に配置した複数の表面フィーチャーを含む。複数の表面フィーチャーは一般に論理又は空間アレーを含む。場合により、複数の表面フィーチャーの各々が同一又は異なる吸着剤を含むか、あるいはその１種以上の組合せを含む。例えば、複数の表面フィーチャーの少なくとも２種が場合により同一又は異なる吸着剤を含むか、あるいはその１種以上の組合せを含む。適当な吸着剤については以下に詳述する。
【０１４１】
プローブ支持体は適当な任意材料から作製することができる。プローブ支持体は吸着剤を支持することが可能な材料から作製することが好ましい。例えば、プローブ支持体材料としては限定されないが、絶縁材料（例えばプラスチック、セラミック、ガラス等）、磁性材料、半導体材料（例えばシリコンウェーハ）、導電性材料（例えばニッケル、真鍮、鋼、アルミニウム、金、メタロイド、合金等の金属又は導電性ポリマー）、ポリマー、有機ポリマー、導電性ポリマー、バイオポリマー、天然バイオポリマー，有機ポリマーをコーティングした金属、合成ポリマー、複合材料又はその任意組合せを挙げることができる。プローブ支持体材料は場合により固体又は多孔質である。
【０１４２】
プローブは場合により支持体材料及び／又は吸着剤の選択に応じて適当な任意方法を使用して作製される。例えば、金属表面を誘導体化させる材料を金属支持体の表面にコーティングすることができる。より具体的には、金属表面に酸化ケイ素、酸化チタン又は金をコーティングすることができる。その後、２官能性リンカーで表面を誘導体化することができ、リンカーの一端は表面の官能基と共有結合することができ、他端は吸着剤として機能する基で更に誘導体化することができる。別例では、結晶質シリコンから作成した多孔質シリコン表面を化学的に修飾し、分析物と結合するための吸着剤を加えることもできる。更に別の例では、例えば置換アクリルアミドモノマー、置換アクリレートモノマー又は選択された官能基を吸着剤として含むその誘導体を含むモノマー溶液をｉｎ  ｓｉｔｕ重合することにより、ヒドロゲル主鎖をもつ吸着剤を支持体表面に直接形成することができる。本発明で使用するのに適したプローブは例えば，米国特許第５，６１７，０６０号（ＨｕｔｃｈｅｎｓとＹｉｐ）及びＷＯ９８／５９３６０（ＨｕｔｃｈｅｎｓとＹｉｐ）に記載されている。
【０１４３】
４．吸着剤
所定態様では、１種以上の試料成分（例えばターゲット蛋白質、不純物等）と結合することが可能な吸着剤を含む支持体を使用して試料の複雑さを更に減らすことができる。本発明の方法では場合により複数の吸着剤を利用する。種々の吸着剤は大幅に異なる結合特性、多少異なる結合特性、又は僅かに異なる結合特性を示すことができる。例えば、吸着剤は試料からの特定特性をもつ生体分子成分と結合するのに適した結合特性をもつ限り、生体特異性（例えば特定ターゲットポリペプチドと結合する抗体等の生体分子相互作用吸着剤）である必要がない。例えば、吸着剤としては場合により疎水性相互作用吸着剤もしくは基、親水性相互作用吸着剤もしくは基、カチオン吸着剤もしくは基、アニオン吸着剤もしくは基、金属キレート化吸着剤もしくは基、（例えばニッケル、コバルト等）、レクチン、ヘパリン又はその任意組合せ等のクロマトグラフィー吸着剤が挙げられる。他の態様では、吸着剤としてはアフィニティー吸着剤、ポリペプチド、酵素、受容体，抗体等の生体分子相互作用吸着剤が挙げられる。例えば、所定態様では生体分子相互作用吸着剤は特定ターゲット蛋白質を捕獲するモノクローナル抗体を含む。
【０１４４】
大幅に異なる結合特性を示す吸着剤は一般にその吸引原理又は相互作用様式により種々のものがある。吸引原理は一般に化学又は生体分子認識によって異なる。吸着剤と分析物（例えばポリペプチド）の吸引原理としては例えば、（１）塩促進相互作用（例えば疎水性相互作用、親硫黄性相互作用及び固定化色素相互作用）、（２）水素結合及び／又はファン・デル・ワールス力相互作用及び電荷移動相互作用（例えば親水性相互作用）、（３）静電相互作用（例えばイオン電荷相互作用、特に正又は負イオン電荷相互作用）、（４）分析物が吸着剤上の金属イオンと配位共有結合を形成（即ち配位錯体を形成）する能力、又は（５）上記相互作用様式の１種以上の組合せが挙げられる。即ち、吸着剤は２種以上の吸引原理を示すことができ、従って、「混合機能性」吸着剤として知られる。
【０１４５】
ａ）塩促進相互作用吸着剤
塩促進相互作用を観察するために有用な吸着剤としては疎水性相互作用吸着剤が挙げられる。疎水性相互作用吸着剤の例としては脂肪族炭化水素（例えば，Ｃ1−Ｃ18脂肪族炭化水素）をもつマトリックスと芳香族炭化水素官能基（例えばフェニル基又は複素環）をもつマトリックスが挙げられる。塩促進相互作用を生じるために有用な別の吸着剤としては親硫黄性相互作用吸着剤が挙げられ、例えばＰｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓから市販されている１種の親硫黄性相互作用吸着剤であるＴ−ＧＥＬ（登録商標）が挙げられる。塩促進イオン相互作用と同時に疎水性相互作用を伴う第３の吸着剤としては固定化色素相互作用吸着剤が挙げられる。
【０１４６】
（ｉ）逆相吸着剤−脂肪族炭化水素
有用な逆相吸着剤の１例はＣｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）から市販されているＨ４  ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレー上に存在する疎水性吸着剤である。疎水性Ｈ４チップは支持体表面への吸着剤として酸化ケイ素（ＳｉＯ2）の頂部に固定化された脂肪族炭化水素鎖を含む。
【０１４７】
ｂ）親水性相互作用吸着剤
親水性相互作用による水素結合及び／又はファン・デル・ワールス力を観察するために有用な吸着剤としては酸化ケイ素（ＳｉＯ2）、酸化チタン、酸化アルミニウム及び酸化ジルコニウム等の順相吸着剤を含む表面が挙げられる。順相又は酸化ケイ素表面は官能基として機能することができる。更に、ポリエチレングリコール、デキストラン、アガロース、又はセルロース等の親水性ポリマーで修飾した表面を含む吸着剤も親水性相互作用吸着剤として機能することができる。大半の蛋白質は水素結合又はファン・デル・ワールス力を伴う親水性相互作用を介して結合するアミノ酸残基（即ち親水性アミノ酸残基）の群又は組合せであるため、親水性相互作用吸着剤と結合する。
【０１４８】
（ｉ）順相吸着剤−酸化ケイ素
有用な親水性吸着剤の１例はＣｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）から市販されている順相（ＮＰ）ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレーに提供されるような吸着剤である。この順相チップは支持体表面に吸着剤として酸化ケイ素を含む。酸化ケイ素は多数の周知方法の任意のものにより表面に添加することができる。これらの方法としては例えば蒸着（例えばスパッターコーティング）が挙げられる。このようなプローブに好適な厚みは約９０００オングストロームである。
【０１４９】
ｃ）静電相互作用吸着剤
静電又はイオン電荷相互作用を観察するために有用な吸着剤としては例えば硫酸アニオン（即ちＳＯ3-）のマトリックス及びカルボン酸アニオン（即ちＣＯＯ-）又はリン酸アニオン（即ちＰＯ4-）のマトリックス等のアニオン交換体が挙げられる。硫酸アニオンをもつマトリックスは永久負電荷をもつ。他方、カルボン酸アニオンをもつマトリックスはｐＨがそのｐＫａを上回る場合のみに負電荷をもつ。ｐＨがｐＫａを下回る場合には、マトリックスは実質的に中性電荷を示す。硫酸及びカルボン酸アニオンとリン酸アニオンを併有するマトリックスであるアニオン吸着剤も適切なアニオン吸着剤である。
【０１５０】
静電又はイオン電荷相互作用を観察するために有用な他の吸着剤としてはカチオン交換体が挙げられる。カチオン吸着剤の具体例としては第２級、第３級又は第４級アミンのマトリックスが挙げられる。第４級アミンは常に正電荷である。他方、第２級及び第３級アミンはｐＨに依存する電荷をもつ。ｐＨがｐＫａを下回る場合には第２級及び第３級アミンは正電荷であり、ｐＨがそのｐＫａを上回る場合には負電荷である。種々の第２級、第３級及び第４級アミンを併有するマトリックスであるカチオン吸着剤も適切なカチオン吸着剤である。
【０１５１】
イオン相互作用吸着剤（アニオン及びカチオンの両者）の場合には、アニオンとカチオンを併有する混合モードイオン吸着剤を使用することが望ましいことが多い。このような吸着剤はｐＨに応じて連続緩衝能を提供する。静電相互作用を観察するために有用な他の吸着剤としては例えば相互作用が静電性でなく、形式電荷供与体又は受容体が関与しない双極子間相互作用吸着剤が挙げられる。
【０１５２】
（ｉ）アニオン吸着剤
有用な吸着剤の１例はＣｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）から市販されているＳＡＸ１又はＳＡＸ２  ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレーに提供されるようなアニオン吸着剤である。ＳＡＸ１蛋白質チップはＳｉＯ2をコーティングしたアルミニウム基板から製造される。本方法では、第４級アンモニウムポリスチレンミクロスフェアの蒸留水懸濁液をチップの表面に塗布する（１ｍＬ／スポット、２回）。風乾（室温、５分間）後にチップを脱イオン水で濯ぎ、再び風寒する（室温、５分間）。
【０１５３】
（ｉｉ）カチオン吸着剤
有用な吸着剤の１例はＣｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）から市販されているＳＣＸ１又はＳＣＸ  ２ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレーに提供されるようなカチオン吸着剤である。ＳＣＸ１蛋白質チップはＳｉＯ2をコーティングしたアルミニウム基板から製造される。本方法では、スルホン酸ポリスチレンミクロスフェアの蒸留水懸濁液をチップの表面に塗布する（１ｍＬ／スポット、２回）。風乾（室温、５分間）後にチップを脱イオン水で濯ぎ、再び風寒する（室温、５分間）。
【０１５４】
ｄ）配位共有相互作用吸着剤
金属イオンと配位共有を結合する能力を観察するために有用な吸着剤としては例えば２価及び３価金属イオンをもつマトリックスが挙げられる。固定化金属イオンキレート剤のマトリックスは遷移金属イオンとの配位共有相互作用の基礎を形成する１種以上の電子供与基をもつ固定化合成有機分子を提供する。固定化金属イオンキレート剤として機能する一次電子供与基としては酸素、窒素及び硫黄が挙げられる。金属イオンを固定化金属イオンキレート剤に結合すると、分析物上の電子供与基との相互作用のための多少数の部位を残した金属イオン錯体が得られる。適切な金属イオンとしては一般に銅、ニッケル、コバルト、亜鉛、鉄等の遷移金属イオンと他の金属イオン（例えばアルミニウムやカルシウム）が挙げられる。
【０１５５】
（ｉ）ニッケルキレート吸着剤
別の有用な吸着剤は同様にＣｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）から市販されているＩＭＡＣ３（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃａｐｔｕｒｅ、表面にニトリロトリ酢酸を塗布した固定化金属アフィニティーキャプチャー）ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレーに提供されるような金属キレート吸着剤である。チップは次のように製造される。（−）リボフラビン（０．０２重量％）を光開始剤として使用して５−メタクリルアミド−２−（Ｎ，Ｎ−ビスカルボキシメタクリルアミノ）ペンタン酸（７．５重量％）、アクリロイルトリ（ヒドロキシメチル）メチルアミン（７．５重量％）及びＮ，Ｎ■−メチレンビスアクリルアミド（０
．４重量％）を光重合する。エッチングした粗面ガラスコーテッド基板にモノマー溶液を塗布し（０．４ｍＬ，２回）、近紫外線照射システム（水銀ショートアークランプ，２０ｍＷ／ｃｍ2，３６５ｎｍ）で５分間照射する。表面を塩化ナトリウム溶液（１Ｍ）で洗浄した後、脱イオン水で２回洗浄する。
【０１５６】
Ｎｉ（ＩＩ）をもつＩＭＡＣ３を次のように活性化する。表面をＮｉＳＯ4溶液（５０ｍＭ，１０ｍＬ／スポット）で処理し、高周波数ミキサーで１０分間混合する。ＮｉＳＯ4溶液を除去した後に処理工程を繰返す。最後に、表面を脱イオン水流（１５秒／チップ）で洗浄する。
【０１５７】
ｅ）酵素活性部位相互作用吸着剤
酵素活性部位結合相互作用を観察するために有用な吸着剤としてプロテアーゼ（例えばトリプシン）、ホスファターゼ、キナーゼ、グリコヒドロラーゼ及びヌクレアーゼが挙げられる。相互作用は分析物（一般にバイオポリマー）上の酵素結合部位と酵素上の触媒結合部位の配列特異的相互作用である。
【０１５８】
ｆ）可逆的共有相互作用吸着剤
可逆的共有相互作用を観察するために有用な吸着剤としてはジスルフィド交換相互作用吸着剤が挙げられる。ジスルフィド交換相互作用吸着剤としては固定化スルフヒドリル基（例えばメルカプトエタノール、固定化ジチオスレイトール）又はスルフヒドリル基と反応することが可能な水銀含有分子を含む吸着剤が挙げられる。相互作用は溶媒に暴露されたシステイン残基又は分析物上にＳＨ基をもつように化学的に修飾した蛋白質と吸着剤の間の共有ジスルフィド結合又は水銀硫黄結合の形成による。このような吸着剤はシステイン残基をもつ蛋白質又はペプチド及び還元硫黄化合物を含むように修飾した塩基を含む核酸と結合する。
【０１５９】
ｇ）糖蛋白質相互作用吸着剤
糖蛋白質相互作用を観察するために有用な吸着剤としては固定化レクチン（即ちオリゴ糖をもつ蛋白質）をもつ吸着剤等の糖蛋白質相互作用吸着剤が挙げられ、その１例は例えばＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から市販されているコンカナバリンＡである。このような吸着剤は高分子上の炭水化物部分の分子認識を伴う相互作用により作用する。
【０１６０】
ｈ）生体特異的相互作用吸着剤
生体特異的相互作用を観察するために有用な吸着剤は一般に「生体特異的アフィニティー吸着剤」と呼ばれる。吸着は選択的であると共に親和性（平衡解離定数，Ｋd）が少なくとも１０-3Ｍ〜（例えば１０-5Ｍ，１０-7Ｍ，１０-9Ｍ等）である場合に生体特異的であるとみなす。生体特異的アフィニティー吸着剤の例としては特定生体分子と特異的に相互作用して結合する任意吸着剤が挙げられる。生体特異的アフィニティー吸着剤としては例えば抗原（例えば特定ペプチドフラグメント、固定化受容体等）と結合する固定化抗体が挙げられる。
【０１６１】
ｉ）タグ相互作用吸着剤
タグ付き分子を観察するために有用な吸着剤を本明細書では「タグ相互作用吸着剤」と言う。これらの例としては例えば、ｈｉｓタグ付き蛋白質と相互作用するためのキレート基、アビジン／ストレプトアビジンタグ付き蛋白質と相互作用するためのビオチン、ＧＳＴタグ付き蛋白質と相互作用するためのグルタチオン、ＭａｌＥタグ付き蛋白質と相互作用ためのアミロース及びＣＢＤタグ付き蛋白質と相互作用するためのセルロースが挙げられる。
【０１６２】
ＶＩＩＩ．気相イオンスペクトロメトリー
好適態様では、気相イオンスペクトロメトリー、より好ましくはマススペクトロメトリーを使用して試料アリコート中のターゲットポリペプチド及び／又は不純物等の生体分子成分を検出する。１態様では、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（「ＭＡＬＤＩ」）マススペクトロメトリーを使用して例えば試料中の生体分子質量をプロファイリングする。ＭＡＬＤＩでは、例えば二次元ゲル電気泳動、ＨＰＬＣ等の蛋白質分離方法を使用して本質的にターゲット蛋白質から構成されるフラクションを得るように試料を一般に準精製する。生体分子分画技術については上記に詳述した通りである。ＭＡＬＤＩに関する付加詳細は例えばＳｋｏｏｇら，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，第５版，Ｈａｒｃｏｕｒｔ  Ｂｒａｃｅ  ＆  Ｃｏ．（１９９８）及びＳｉｕｚｄａｋ，Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）に記載されている。気相イオンスペクトロメーターを含むシステムについては以下に詳述する。
【０１６３】
好適態様では、場合によりＳＥＬＤＩマススペクトロメトリーを使用してプローブ表面から生体分子を脱離イオン化する。ＳＥＬＤＩは吸着剤を含む支持体を使用してペプチドフラグメントを捕獲した後、場合によりマススペクトロメトリー中に支持体表面からペプチドフラグメントを直接脱離イオン化する。表面増強レーザー脱離イオン化における支持体表面は試料成分を捕獲するので、ＭＡＬＤＩのように試料を準精製する必要がない。しかし、試料の複雑さと使用する吸着剤の種類に応じて、例えば捕獲されなかった材料を表面増強レーザー脱離イオン化分析の前に除去することにより複雑さを少なくした試料アリコートを調製することが一般に望ましい。
【０１６４】
例えば、図５はバイオチップ５０２上にクロマトグラフィー吸着剤１０６を含む未分画試料の表面増強レーザー脱離イオン化アッセイを模式的に示す。疎水性及び親水性相互作用吸着剤等のクロマトグラフィー吸着剤については上述した通りである。更に上述したように、試料中の生体分子成分５０４は表面フィーチャー５００に結合したクロマトグラフィー吸着剤５０６に配置した後に洗浄しない。レーザー５０８からの入射光子エネルギーにより生体分子成分５０４を脱離イオン化した後、マススペクトロメーターで検出し、質量スペクトル５１０を作成する。
【０１６５】
図６は分泌されたターゲット蛋白質を含む細胞培養上清から採取した試料の表面増強レーザー脱離イオン化アッセイを模式的に示す。図面に示すように、表面フィーチャー６０６に結合したクロマトグラフィー吸着剤６０４を含むバイオチップ６０２に試料６００を添加する。上述のように、クロマトグラフィー吸着剤６０４に結合しない試料６００の成分をマススペクトロメトリー前にバイオチップ６０２から洗浄除去（例えば溶出等）する。試料６００中のターゲットポリペプチド６０８の捕獲及び洗浄後にエネルギー吸着分子６１０（図５には示さず）をバイオチップ６０２に添加し、イオン化源６１２（即ちレーザー）からのエネルギーを吸収させ、バイオチップ６０２の表面からターゲットポリペプチド６０８を脱離し易くする。脱離イオン化ターゲットポリペプチド６０８の質量スペクトル分析により質量スペクトル６１４を作成する。
【０１６６】
場合により、支持体上の生体分子成分を分解及び検出できるという条件で適切な任意気相イオンスペクトロメーターを使用する。例えば、所定態様では気相イオンスペクトロメーターはマススペクトロメーターである。典型的なマススペクトロメーターでは、その表面に生体分子成分を含むプローブをマススペクトロメーターの入力システムに導入する。次に、レーザー、高速原子衝撃、高エネルギープラズマ、エレクトロスプレーイオン化、サーモスプレーイオン化、液体二次イオンＭＳ、電界脱離等の脱離源により生体分子成分を脱離させる。発生した脱離揮発種は予め形成されたイオン又は脱離現象の直接結果としてイオン化された中性粒子から構成される。発生したイオンをイオン光学アセンブリにより収集した後、マススペクトロメーターは通過するイオンを分散及び分析する。マススペクトロメーターから排出されるイオンを検出器で検出する。その後、検出器は検出したイオンの情報を質量対電荷比に変換する。生体分子成分又は他の物質の存在の検出は一般にシグナル強度の検出により行われる。これは支持体に結合した生体分子成分の量と特徴を表すことができる。本発明の態様ではマススペクトロメーターのコンポーネントの任意のもの（例えば脱離源、質量分析計、検出器等）を本明細書に記載の他の適当なコンポーネント又は当分野で公知の他のコンポーネントと組合せることができる。
【０１６７】
好適側面では、本発明の態様ではレーザー脱離飛行時間マススペクトロメーターを使用する。レーザー脱離マススペクトロメトリーでは、生体分子成分を含む支持体又はプローブを入力システムに導入する。材料を脱離させ、イオン化源からの入射レーザーエネルギーにより気相にイオン化する。発生したイオンをイオン光学アセンブリで収集した後に飛行時間質量分析計でイオンを短時間高電圧電界に通して加速し、高減圧チャンバー内にドリフトさせる。高減圧チャンバーの遠端で、加速したイオンは別の時点で感受性検出器表面にぶつかる。飛行時間はイオンの質量の関数であるので、イオン形成からイオン検出器衝突までの経過時間を使用すると、特定質量対電荷比のペプチドフラグメントの有無を識別することができる。
【０１６８】
別の態様では、場合によりイオン移動度スペクトロメーターを使用して生体分子成分を検出する。イオン移動度スペクトロメトリーの原理はイオン移動度の差に基づく。具体的に説明すると、イオン化により生成した試料のイオンは電界の影響下に管内を例えば質量、電荷又は形状の相違により異なる速度で移動する。（一般に電流形態の）イオンを検出器で記録した後に、この記録を使用して試料中の生体分子成分を同定することができる。イオン移動度スペクトロメトリーの１つの利点は大気圧で操作できることである。
【０１６９】
更に別の態様では、場合により総イオン電流測定装置を使用して生体分子成分を検出し、特性決定することができる。この装置は場合により支持体が単一型のマーカーしかもたない場合に使用される。単一型のマーカーが支持体に存在する場合には、イオン化マーカーから発生される総電流はマーカーの量及び他の特徴を反映する。その後、マーカーにより発生される総イオン電流を対照（例えば公知化合物の総イオン電流）と比較することができる。その後、マーカーの量又は他の特徴を決定することができる。
【０１７０】
更に別の態様では、タンデムマススペクトロメトリーが可能な四重極型飛行時間（Ｑ−ＴＯＦ）マススペクトロメーターを場合により利用して本明細書に記載の方法を実施する。これらの質量分析計システムはレーザー脱離／イオン化源に連結し易く、蛋白質とペプチドの分析に日常的に使用されている。多くのＱ−ＴＯＦマススペクトロメーターはｍ／ｚ１００００を上回る質量範囲と半値全幅約１００００の分解能をもつ。
【０１７１】
ＩＸ．データ分析
生体分子成分の脱離と検出により作成されたデータは場合により例えば検出された成分を同定及び／又は定量するために適当な任意方法を使用して分析される。１態様では、例えばシステムの一部として含まれるプログラマブルディジタルコンピューター等の論理装置を使用してデータを分析する。システムについては以下に詳述する。コンピューターは一般にシステムソフトウェアの論理命令を保存するコンピューター読取り可能な媒体を含む。所定の論理命令は一般にプローブ上の各フィーチャーの位置、前記フィーチャーにおける吸着剤の種類、吸着剤を洗浄するために使用する溶出条件等を含むメモリーに充てられる。コンピューターは更に一致に入力として受信される論理命令、特定のアドレス指定可能な位置又はプローブの表面フィーチャーから受信される種々の分子量でのシグナル強度に関するデータ、及びデータをデータベースに入力するための命令を含む。このデータは一般に検出された成分の数と質量（各成分により発生されるシグナルの強度を含む）を指示する。
【０１７２】
所定態様では、生体分子成分質量データセット（例えば第１セット、第２セット等）はデータベース照会で使用するのに適したコンピューター読取り可能な形態である。例えば、データベース照会は一般にプログラマブルコンピューター又は他の論理装置を操作し、コンピューター読取り可能なデータとデータベース入力間の適合近接度を決定するアルゴリズムを実行する。データベース入力は一般に同定された蛋白質又は他の化合物の質量に対応し、特定試料で検出される成分の一致候補を得るための相関生体分子成分質量データである。本質的に任意の蛋白質又は他の生体分子データベースが場合により本発明の方法及びシステムを使用して得られる生体分子成分質量データで照会される。多くの適当なデータベースが利用可能であり、一般に当分野で公知である。所定態様では、アルゴリズムは人口知能アルゴリズム又は発見的学習アルゴリズムを含む。例えば、人口知能アルゴリズムは場合により例えばファジー論理命令セット、クラスター分析命令セット、神経回路網、遺伝アルゴリズム等の１種以上を含む。
【０１７３】
データベースに照会し、マススペクトロメトリー蛋白質同定法の速度を改善し、更に他の点でマススペクトロメトリーをバイオインフォマティクスに組込むための種々のソフトウェアパッケージが現在入手可能である。例えば、Ｍａｓｃｏｔは一次配列データベースから蛋白質を同定するためにマススペクトロメトリーデータを使用する検索エンジンである。例えばＰｅｒｋｉｎｓら（１９９９）”Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ−ｂａｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｅａｒｃｈｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｄａｔａ，”  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２０（１８）：３５５１−３５６７参照。本発明の方法を実施するために有用なソフトウェアパッケージの別の例としてはＰｒｏＦｏｕｎｄが挙げられ、蛋白質同定のためにベイズ統計と組合せて迅速データベース検索を実施する。Ｐｒｏｆｏｕｎｄは例えばＺｈａｎｇとＣｈａｉｔ（２０００）”ＰｒｏＦｏｕｎｄ−Ａｎ  ｅｘｐｅｒｔ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，”Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７２：２４８２−８２４９、ＺｈａｎｇとＣｈａｉｔ（１９９８）”ＰｒｏＦｏｕｎｄ−Ａｎ  ｅｘｐｅｒｔ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，”Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ４６ｔｈ  ＡＳＭＳ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  Ａｌｌｉｅｄ  Ｔｏｐｉｃｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ，Ｆｌｏｒｉｄａ，ｐ．９６９、及びＺｈａｎｇとＣｈａｉｔ（１９９５）”Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈｉｎｇ：ａ  Ｂａｙｅｓｉａｎａｌｇｏｒｉｔｈｍ，”Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ４３ｒｄ  ＡＳＭＳ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  Ａｌｌｉｅｄ  Ｔｏｐｉｃｓ，Ａｔｌａｎｔａ，Ｇｅｏｒｇｉａ，ｐ．６４３に詳細に記載されている。
【０１７４】
データ分析は更に一般に検出された分析物のシグナル強度（例えばビーク高）を測定する段階と、「外れ値」（規定統計分布から外れたデータ）を除去する段階を含む。観測されたピークは所定基準値に対する各ピーク高を計算する方法により標準化することができる。例えば、計器や化学物質（例えば，エネルギー吸着分子）により発生するバックグラウンドノイズをスケールのゼロに設定して基準値とすることができる。その後、各マーカー又は他の生体分子で検出されたシグナル強度を所望スケール（例えば１００）に相対強度として表示することができる。あるいは、標準（例えばウシ血清アルブミン）を試料に加え、標準からのピークを基準値として使用し、検出された各生体分子に観測されるシグナルの相対強度を計算することもできる。
【０１７５】
コンピューターは得られたデータを種々の表示用フォーマットに変換することができる。「スペクトル図又は残留液マップ」と呼ぶ１フォーマットでは、各特定分子量で検出器に到達する生体分子の量を表す標準スペクトル図を表示することができる。「ビークマップ」と呼ぶ別のフォーマットでは、ピーク高と質量情報のみをスペクトル図から維持し、より明瞭な画像を生成し、ほぼ等しい分子量をもつ分析物をより容易に観測できるようにする。「ゲル図」と呼ぶ更に別のフォーマットでは、ピーク図からの各質量を各ピーク高に基づいてグレースケール画像に変換し、電気泳動ゲル上のバンドに類似する外観を得ることができる。「３Ｄオーバーレイ」と呼ぶ更に別のフォーマットでは、数個のスペクトルをオーバーレイし、相対ピーク高の僅かな変化を調べることができる。「差異マップ図」と呼ぶ更に別のフォーマットでは、２個以上のスペクトルを比較し、ユニークな分析物と試料間でアップレギュレート又はダウンレギュレートされる分析物を簡便にハイライトすることができる。任意２個の試料からの生体分子成分質量プロフィル（スペクトル）を目視比較することができる。更に別のフォーマットではＳｐｏｔｆｉｒｅ  Ｓｃａｔｔｅｒ  Ｐｌｏｔを使用することができ、検出される生体分子をプロットのドットとしてプロットし、プロットの一方の軸は検出される成分の見掛けの分子量を表し、別の軸は検出される成分のシグナル強度を表す。試料毎に検出される生体分子と試料中に存在する生体分子の量をコンピューター読取り可能な媒体に保存することができる。その後、このデータを場合により対照（例えば対照で検出される生体分子のプロフィル又は量）と比較する。
【０１７６】
Ｘ．システム
本発明は更に本明細書に記載の方法に従って試料中の生体分子成分の質量スペクトルプロフィルを提供することが可能なシステムも提供する。本システムは１種以上の条件下で試料中の生体分子を捕獲することが可能な１種以上の吸着剤（例えばプローブ表面に結合した吸着剤、支持体に結合した吸着剤等）と、質量データを提供する条件下で捕獲した生体分子の質量をプロファイリングすることが可能な気相イオンスペクトロメーター（例えばレーザー脱離イオン化マススペクトロメーター等のマススペクトロメーター）を含む。本システムは更に気相イオンスペクトロメーターに作動的に連結した（例えばコンピューター又は他の論理装置の）プロセッサーを含む。プロセッサーは場合により気相イオンスペクトロメーターの内部に配置しても外部に配置してもよい。場合により、システムは多重プロセッサーを含む。システムソフトウェアは一般に例えば検出された生体分子を定量することや、質量データセット及びデータベース入力等で検出された１種以上の生体分子質量間の適合近接度を決定することが可能な論理命令を含む。
【０１７７】
図７は表面増強レーザー脱離イオン化飛行時間マススペクトロメトリーシステム７００を模式的に示す。図面に示すように、レーザー源７０２から発生された光子エネルギーは捕獲された生体分子と共に選択された吸着剤を含む表面フィーチャー７０６でバイオチップ７０４と衝突する。光子エネルギーは表面フィーチャー７０６で捕獲された生体分子を脱離イオン化する。その後、脱離したイオンはフライトチューブ／質量分析計７０８を通って加速される。各イオンは一方の電荷しかもたないのでイオンは図面に示すように単にイオン種の質量である質量／電荷比に従って分離される。更に図面に示すように、小さいイオンのほうが大きいイオンよりも迅速に移動するので質量に従って種を分解することができる。イオンは検出器７１０で検出可能なシグナルを発生し、前記シグナルは情報装置ないしディジタルデバイス７１２により処理され、質量スペクトル７１４を生成する。
【０１７８】
図８は本発明の種々の側面を実施可能な図７の情報装置７１２の典型的付加詳細を示す模式図である。本明細書の教示から当業者に自明の通り、本発明は場合によりハードウェア及び／又はソフトウェアで実施される。所定態様では、本発明の種々の側面はクライアント側論理又はサーバー側論理で実施される。当分野で自明の通り、本発明又はその構成要素は適切に構築された計算装置にロードした場合に装置を本発明に従って実行させる論理命令及び／又はデータを含む媒体プログラムコンポーネント（例えば固定媒体成分）で実施することができる。当分野で自明の通り、論理命令を含む固定媒体は固定媒体の視聴者に配布して視聴者のコンピューターに物理的にロードしてもよいし、論理命令を含む固定媒体は遠隔サーバーに維持し、視聴者が通信媒体を介してアクセスし、プログラムコンポーネントをダウンロードしてもよい。
【０１７９】
図８は媒体８１７及び／又はネットワークポート８１９からの命令を読取ることが可能な論理装置とみなすことができる情報装置ないしディジタルデバイス７１２を示し、前記ポートは場合により固定媒体８２２をもつサーバー８２０に接続することができる。その後、当分野で自明のように装置８１２は前記命令を使用してサーバー又はクライアント論理に本発明の側面を実施させる。本発明を実施することが可能な論理装置の１例は７１２に示すコンピューターシステムであり、ＣＰＵ８０７、光学入力装置８０９及び８１１、ディスクドライブ８１５並びにオプションモニター８０５を含む。固定媒体８１７又はポート８１９を介してロードされる固定媒体８２２はこのようなシステムをプログラムするために使用することができ、ディスク型光学又は磁気媒体、磁気テープ、ソリッドステートダイナミックもしくはスタティックメモリー等とすることができる。特定態様では、本発明はこの固定媒体に記録されたソフトウェアとして全体又は一部を実施することができる。このようなシステムをプログラムするために使用される命令を最初に受信するために通信ポート８１９を使用してもよく、任意型の通信接続とすることができる。場合により、本発明は特定用途向け集積回路（ＡＣＩＳ）又はプログラマブル論理装置（ＰＬＤ）の回路内で全体又は一部を実施することができる。このような場合には、本発明はＡＳＩＣ又はＰＬＤを作成するために使用できるコンピューター解読可能な記述言語で実施することができる。
【０１８０】
ＸＩ．実施例
以下の非限定的な実施例は単に例証を目的とする。
【０１８１】
Ａ．分泌組換えターゲット蛋白質用哺乳動物細胞培地の監視
１．概要
要約すると、本実施例は本明細書に記載の方法と装置を使用して達成可能な種々の目的を例証する。特に、本発明の方法は場合により種々のＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレーを使用して細胞により分泌されるターゲットポリペプチド（例えば組換えポリペプチド、天然ポリペプチド等）の細胞培地の数個のロット又はバッチを分析するために実施され、例えばどのロットがターゲットポリペプチドの量が多く、不純物（例えば蛋白性不純物等）の量が少ないかを調べるため、種々のロットにおけるターゲットポリペプチドの分解を監視するため、ターゲットポリペプチドの修飾（例えば翻訳後修飾）を監視するためなどに実施される。更に、本発明の方法は機能的ターゲットポリペプチドの回収を最大にするように細胞培地を回収するために理想的なターゲットポリペプチド生産工程中の時点を決定するためにも使用される。
【０１８２】
２．結果
本実施例に記載する分析はＣｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）から市販され、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）ソフトウェアを組込んだＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）リーダーと、例えば検出されたポリペプチド質量を分析するためのパーソナルコンピューターを含むＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）システム（シリーズＰＢＳ  ＩＩ）を使用して実施した。ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）システムは約１０００Ｄａ未満から約３００ｋＤ以上までの生体分子を検出することができ、飛行時間に基づいて質量を計算する。ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）リーダーは脱離イオン化飛行時間マススペクトロメーターである。ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）リーダーのイオンオプティクスは優れた質量分解能で精密正確な分子量測定が可能な４段タイムラグ集光レンズアセンブリに基づく。レーザーオプティクスは可能な最大試料面積にわたってイオン抽出効率を最大にし、分析感度と再現性を増すように改造した。
【０１８３】
これらの実験で使用したＣｉｐｈｅｒｇｅｎ  ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレーは、シラノール官能基を含み、親水性相互作用を介して蛋白質と結合するＮＰ（順相）チップと、Ｃ１６アルキル官能基を含み、疎水性相互作用を介して蛋白質と結合するＨ４チップと、キレート化金属イオン官能基を含み、配位共有結合を介して蛋白質と結合するＩＭＡＣ（固定化金属キレート）チップと、イオン官能基を含み、静電相互作用を介して蛋白質と結合するＳＡＸ（強アニオン交換）チップを含むものとした。
【０１８４】
本実施例に記載する分析で使用した一般プロトコールはまず選択した緩衝液で種々のＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレーの表面フィーチャーを平衡化した。特に、疎水性（Ｈ４）ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）Ｄアレーは水又は１０％アセトニトリルで平衡化し、アフィニティーキャプチャー（ＩＭＡＣ３−Ｃｕ）ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレーはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で平衡化し、及び／又はアニオン交換（ＳＡＸ２）ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレーはＴｒｉｓ−緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した。その後、細胞培地の５μｌ試料を表面フィーチャーに加え、アレーを１５分間インキュベートした。インキュベーション後に種々のアレー表面を夫々の平衡化緩衝液で洗浄した。水で最後に濯いだ後に、飽和シナピン酸（ＳＰＡ）を各アレー表面フィーチャーに加え、ＰＢＳＩＩシステムを使用して結合した生体分子成分を分析した。
【０１８５】
図９Ａ〜ＤはＨ４及びＩＭＡＣ３−Ｃｕ  ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレーを使用して細胞培地から検出された成分を示す質量スペクトルトレース（横軸−分子量（ダルトン）；縦軸−相対強度）である。図９Ａは対照として純ターゲット蛋白質の試料に暴露したアレーからＳＥＬＤＩを使用して得られた質量スペクトルトレースを示す。図９Ｂは平衡化し、水洗しておいたＨ４アレーからＳＥＬＤＩを使用して得られた質量スペクトルトレースを示す。図９Ｃは平衡化し、アセトニトリルで洗浄しておいたＨ４アレーからＳＥＬＤＩを使用して得られた質量スペクトルトレースを示す。図９Ｄは平衡化し、ＰＢＳで洗浄しておいたＩＭＡＣ３−ＣｕアレーからＳＥＬＤＩを使用して得られた質量スペクトルトレースを示す。
【０１８６】
図１０Ａ〜ＥはＨ４  ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレーを使用して培地の種々のロットから検出された成分を示す質量スペクトルトレース（横軸−分子量（ダルトン）；縦軸−相対強度）である。矢印は種々のロットで検出された不純物の一部を示す。図１０Ａは対照として純ターゲット蛋白質の試料に暴露したアレーからＳＥＬＤＩを使用して得られた質量スペクトルトレースを示す。図１０Ｂは比較的純粋なロットからＳＥＬＤＩを使用して得られた質量スペクトルトレースを示す。図１０Ｃは有意数の不純物を含むロットからＳＥＬＤＩを使用して得られた質量スペクトルトレースを示す。図１０Ｄは不純物が最小数のロットからＳＥＬＤＩを使用して得られた質量スペクトルトレースを示す。図１０Ｅは有意数の不純物を含むロットからＳＥＬＤＩを使用して得られた質量スペクトルトレースを示す。
【０１８７】
図１１Ａ〜ＥはＨ４  ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレーを使用して培地の種々のロットの定量分析から検出された成分を示す質量スペクトルトレース（横軸−分子量（ダルトン）；縦軸−相対強度）である。図１１Ａは対照として純ターゲット蛋白質の試料に暴露したアレーからＳＥＬＤＩを使用して得られた質量スペクトルトレースを示す。図１１Ｂはターゲット蛋白質量が比較的多いロットからＳＥＬＤＩを使用して得られた質量スペクトルトレースを示す。図１１Ｃはターゲット蛋白質量が比較的少ないロットからＳＥＬＤＩを使用して得られた質量スペクトルトレースを示す。図１１Ｄはターゲット蛋白質量が最高のロットからＳＥＬＤＩを使用して得られた質量スペクトルトレースを示す。図１１Ｅはターゲット蛋白質量が比較的少ないロットからＳＥＬＤＩを使用して得られた質量スペクトルトレースを示す。
【０１８８】
本実施例に示す結果から明らかなように、本発明の方法は他の分析技術に比較して顕著な利点がある。特に、本明細書に記載の方法により作成したＳＥＬＤＩ質量スペクトルプロフィルは粗細胞培地から直接得られた。これは他の型のマススペクトロメトリー分析では一般に実現できなかった。例えば、他の形態のマススペクトロメトリーは一般に例えば細胞培地に分泌されるターゲット蛋白質の量を検出する前にターゲット蛋白質を精製することが必要である。更に、上記に例示した方法は分析を実施するために比較的少量の試料（例えば５μｌ）しか使用せず、一般に迅速に結果を得ることができ、アッセイ全体を約３０分で実施することができる。例えば、ウェスタンブロッティング等の他の分泌技術は一般に結果が得られるまでに数日間を要する。更に、本明細書に記載のＳＥＬＤＩ法は場合により細胞培地を連続的に監視するために使用され、例えば一組の生産バッチのうちのどのバッチの処理を続け、どのバッチを工程の初期に廃棄するかを識別し、時間と資源を節約するために使用される。更に、本方法は場合により所定生産工程を最適化するためにも使用される。例えば、本発明の方法は場合により細胞培養生産工程中で細胞増殖に必須の因子（例えば代謝産物、増殖因子等）が低下した場合にどの時点でこれらの必須因子を培地に補充するか、どの時点で誘導剤を添加してターゲット遺伝子発現を誘導するか、最大量の非分解ターゲット蛋白質を得るためにどの時点で細胞培地を回収するか等を識別するために使用される。更に、本明細書に記載の方法によると、使用者はターゲット蛋白質の種々の翻訳後修飾を監視し、細胞培地からのターゲット蛋白質精製を監視できる。
【０１８９】
Ｂ．蛋白質同定のためのＳＥＬＤＩ支援蛋白質微量精製
１．現行技術
複雑な試料中の蛋白質を同定するために種々のストラテジーが存在しており、例えば２Ｄゲル電気泳動により単離した蛋白質のマススペクトロメトリーによる同定が挙げられる。マススペクトロメトリーによるストラテジーは例えばＢｕｒｌｉｎｇａｍｅとＣａｒｒ（編），Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｖ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）１７１〜２０２頁のＳｔｅｖｅｎ  Ｈａｌｌら，”Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｂｙ  Ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ”（Ｈａｌｌ）に詳細に記載されている。例えば、図１２は２Ｄ  ＰＡＧＥにより単離した細胞蛋白質を同定するためのＨａｌｌに記載の１手順における段階を模式的に示すフローチャートである。図面に示すように、細胞溶解液（Ｅ１）試料の成分を２Ｄゲルで分離し（Ｅ２）、クーマシー染色／脱色により可視化する（Ｅ３）。その後、目的蛋白質を切出し（Ｅ４）（例えば一般に蛋白質約１００ピコモル）、ポリアクリルアミドマトリックスから電気溶出させる（Ｅ５）。電気溶出した蛋白質を次にアセトン沈殿させ、ＳＤＳと染色を除去した蛋白質を生成する（Ｅ６）。蛋白質の酵素消化によりペプチドを生成（Ｅ７）した後、マイクロボアＨＰＬＣを使用してペプチドを分離する（Ｅ８）。液体二次イオンマススペクトロメトリー（ＬＳＩＭＳ）によりペプチドの分子量を測定し（Ｅ９）、高エネルギー衝突誘導解離（ＣＩＤ）によりペプチドを配列決定する（Ｅ１０）。次に、データベース検索を実施することにより蛋白質を同定する（Ｅ１１）。
【０１９０】
図１３は２Ｄゲルから蛋白質を同定するためｋＨａｌｌに記載の別の手順に含まれる種々の段階を模式的に示すフローチャートである。図面に示すように、未処理（Ｆｌ）又は処理（Ｆ２）細胞を溶解させ、細胞蛋白質を抽出する（Ｆ３）。抽出した蛋白質を次に  ２Ｄ  ＰＡＧＥを使用して分離可視化する（Ｆ４）。一般にピコモル範囲の目的蛋白質を電気溶出又はゲル内消化によりゲルから取出し（Ｆ５）、こうして取出した全蛋白質を酵素消化する（Ｆ６）。場合により、ＨＰＬＣを使用してペプチドを分離し（Ｆ７）、分離したペプチドの質量をＭＡＬＤＩ  ＭＳにより測定する（Ｆ９）か、未分離ゲル内消化蛋白質をＭＡＬＤＩにより分析する（Ｆ８）。段階Ｆ８後に、ペプチド質量を使用して例えばペプチド質量データベースを検索する（Ｆ１３）。データベース検索が確定したら蛋白質を同定し（Ｆ１６）、イムノブロット分析により同定を確認する（Ｆ１７）。データベース検索が確定しない場合には、段階Ｆ１３のペプチドを段階Ｆ９のペプチドと同一分析にかける。特に、段階Ｆ１０のペプチド質量を質量に従って区別する。質量が２０００Ｄａ以上のペプチドをエドマン分解により配列決定し（Ｆ１２）、質量が２０００Ｄａ未満のペプチドをタンデムマススペクトロメトリーにより配列決定する（Ｆ１１）。段階Ｆ１１及びＦ１２で決定したペプチド配列を使用して次に蛋白質配列データベースを検索する（Ｆ１４）。蛋白質が同定されない場合には、蛋白質配列情報からオリゴヌクレオチドを逆翻訳し、クローニング用に設計する（Ｆ１５）。蛋白質が同定される場合には（Ｆ１６）、イムノブロット分析により同定を確認する（Ｆ１７）。
【０１９１】
２．蛋白質プロファイリング及びマーカー同定
本実施例はＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）技術による例えば生体試料でアップレギュレート又はダウンレギュレートされる蛋白質の検出、蛋白質マーカーの同定等のための本明細書に記載の方法の使用を例証する。特に、本実施例はＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレーとサイズ選択スピンカラムを使用した示差発現蛋白質のマッピング、蛋白質マーカーアッセイの実施、及び表現型検証工程における本発明の有用性を実証する。本実施例は更にＣｉｐｈｅｒｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）から市販されているスピンカラムとアレーを使用した蛋白質マーカーの精製、種々のプロテアーゼを使用した精製蛋白質の酵素消化、ＰＢＳ  ＩＩシステムを使用したペプチド質量測定、蛋白質を同定するためのデータベース検索、ペプチドフラグメントの部分精製、部分精製ペプチドの配列決定、及び例えば遺伝子クローニングに使用するＤＮＡプローブの設計における本明細書に記載の方法の有用性を例証する。
【０１９２】
図１４は蛋白質プロファイリング手順に含まれる段階を模式的に示すフローチャートである。段階Ｇ３に示すように、４〜５種のＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレーを使用して生体試料Ａ（ウシ血清）（Ｇ１）及び生体試料Ｂ（ウシ血清と蛋白質Ｘ（即ちターゲット蛋白質マーカー））（Ｇ２）の蛋白質プロフィルを作成する。場合により、サイズ選択スピンカラムにより一般に約１５分間試料を精製する。蛋白質のコンピューター分析後に試料Ａ及びＢのプロフィルを比較する（Ｇ４）。このデータを処理し、その分子量によりターゲット蛋白質マーカーを検出する（Ｇ５）。前段階で収集したデータに基づき、ターゲット蛋白質マーカーのアッセイを実施する（Ｇ６）。この工程を完了するまでに要する合計時間は一般に約１日である。
【０１９３】
図１５Ａ〜Ｃは洗浄後にＮＰ  ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレーで検出された蛋白質プロフィルを示す質量スペクトルトレース（横軸−分子量（ダルトン）；縦軸−相対強度）と差異マップである。図１５Ａは洗浄液を含むＮＰアレーからの試料Ａ（ウシ血清）のＳＥＬＤＩを使用して得られた質量スペクトルトレースを示す。図１５Ｂは洗浄液を含むＮＰアレーからの試料Ｂ（ウシ血清と蛋白質Ｘ（即ちターゲット蛋白質マーカー））のＳＥＬＤＩを使用して得られた質量スペクトルトレースを示す。検出された蛋白質Ｘをトレース上に示す。図１５Ｃは図１５Ａ及びＢに示すトレース間の差異マップを示す。試料Ａ及びＢの両者に共通の蛋白質はゼロよりも上の強度値で示される。矢印は試料Ｂに固有の蛋白質Ｘを示す。
【０１９４】
図１６Ａ〜Ｃは洗浄後にＮＰ  ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレーで検出された蛋白質プロフィルを示す質量スペクトルトレース（横軸−分子量（ダルトン）；縦軸−相対強度と差異マップである。図１６Ａは洗浄液を含むＮＰアレーからの試料Ａ（ウシ血清）のＳＥＬＤＩを使用して得られた質量スペクトルトレースを示す。図１６Ｂは洗浄液を含むＮＰアレーからの試料Ｂ（ウシ血清と蛋白質Ｘ（即ちターゲット蛋白質マーカー））のＳＥＬＤＩを使用して得られた質量スペクトルトレースを示す。検出された蛋白質Ｘをトレース上に示す。図１６Ｃは図１６Ａ及びＢに示すトレース間の差異マップを示す。試料Ａ及びＢの両者に共通の蛋白質はゼロよりも上の強度値で示される。矢印は試料Ｂに固有の蛋白質Ｘを示す。
【０１９５】
図１７は生体試料の一般蛋白質分画を模式的に示すフローチャートである。図面に示すように、生体試料（例えば血清）をサイズにより分画する（Ｈ１）。試料は場合により例えばＫ−３０又はＫ−７０サイズ選択スピンカラムを使用して分画する。サイズ選択した蛋白質フラクションを例えばＱアニオン交換スピンカラムと各種ｐＨ及びイオン強度の溶出緩衝液を使用して等電点分画する（Ｈ２）。等電点選択した蛋白質フラクションを例えば疎水性スピンカラム又は疎水性（Ｈ４）ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレーを使用して疎水性分画する（Ｈ３）。疎水性により分画した蛋白質のＳＥＬＤＩマススペクトロメトリー分析は蛋白質チップリーダーを使用して実施する。段階Ｈ４では、獲得したデータを分析して蛋白質プロフィルを作成し、フラクション純度を測定する。工程を完了するには一般に約１〜２日間を要する。
【０１９６】
図１８はウシ血清からのターゲット蛋白質（蛋白質Ｘ）の微量精製における種々の段階を模式的に示すフローチャートである。図面に示すように、蛋白質Ｘ０．５％（ｗ／ｗ）を含むウシ血清試料を、例えばＫ−７０サイズ選択スピンカラムを使用して一般に約１５分間サイズ分画する（Ｉ１）。サイズ選択した蛋白質フラクションを、例えばＱアニオン交換スピンカラムを使用して一般に約３０分間等電点分画する（Ｉ２）。等電点選択した蛋白質フラクションを例えば疎水性Ｃ８スピンカラムを使用して一般に約１５分間疎水性分画する（Ｉ３）。疎水性により分画した蛋白質のＳＥＬＤＩマススペクトロメトリー分析をＮＰ及びＨ４ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレーで実施し、蛋白質プロフィルを作成する（Ｉ４）。蛋白質プロフィルデータを分析し、蛋白質Ｘを含むフラクションを選択する（Ｉ５）。データ分析を実施するには一般に約１時間を要する。
【０１９７】
図１９Ａ〜Ｇはサイズ選択スピンカラムでウシ血清の分画アッセイから検出された蛋白質プロフィルを示す質量スペクトルトレース（横軸−分子量（ダルトン）；縦軸−相対強度）である。図１９Ａはウシ血清試料のＳＥＬＤＩを直接使用して得られた質量スペクトルトレースを示す。図１９Ｂはウシ血清試料のＫ−７０サイズ選択スピンカラムを使用して生成した第１のフラクションのＳＥＬＤＩを使用して得られた質量スペクトルトレースを示す。図１９Ｃはウシ血清試料のＫ−７０サイズ選択スピンカラムを使用して生成した第２のフラクションのＳＥＬＤＩを使用して得られた質量スペクトルトレースを示す。検出された蛋白質Ｘを示す。図１９Ｄはウシ血清試料のＫ−７０サイズ選択スピンカラムを使用して生成した第３のフラクションのＳＥＬＤＩを使用して得られた質量スペクトルトレースを示す。図１９Ｅはウシ血清試料のＫ−７０サイズ選択スピンカラムを使用して生成した第４のフラクションのＳＥＬＤＩを使用して得られた質量スペクトルトレースを示す。図１９Ｆはウシ血清試料のＫ−７０サイズ選択スピンカラムを使用して生成した第５のフラクションのＳＥＬＤＩを使用して得られた質量スペクトルトレースを示す。図１９Ｇは全フラクションで検出された蛋白質を示す総合プロットである。
【０１９８】
図２０Ａ〜Ｊはアニオン交換スピンカラムでウシ血清の分画アッセイから検出された蛋白質プロフィルを示す質量スペクトルトレース（横軸−分子量（ダルトン）；縦軸−相対強度）である。図２０ＡはＫ−７０サイズ選択スピンカラムから採取したウシ血清試料のＳＥＬＤＩを使用して得られた質量スペクトルトレースを示す。図２０ＢはｐＨ９．０緩衝液で溶出したウシ血清試料のアニオン交換スピンカラムを使用して生成したフラクションのＳＥＬＤＩを使用して得られた質量スペクトルトレースを示す。図２０ＣはｐＨ８．０緩衝液で溶出したウシ血清試料のアニオン交換スピンカラムを使用して生成したフラクションのＳＥＬＤＩを使用して得られた質量スペクトルトレースを示す。図２０ＤはｐＨ７．０緩衝液で溶出したウシ血清試料のアニオン交換スピンカラムを使用して生成したフラクションのＳＥＬＤＩを使用して得られた質量スペクトルトレースを示す。図２０ＥはｐＨ６．０緩衝液で溶出したウシ血清試料のアニオン交換スピンカラムを使用して生成したフラクションのＳＥＬＤＩを使用して得られた質量スペクトルトレースを示す。図２０Ｆ  はｐＨ５．０緩衝液で溶出したウシ血清試料のアニオン交換スピンカラムを使用して生成したフラクションのＳＥＬＤＩを使用して得られた質量スペクトルトレースを示す。図２０ＧはｐＨ４．０緩衝液で溶出したウシ血清試料のアニオン交換スピンカラムを使用して生成したフラクションのＳＥＬＤＩを使用して得られた質量スペクトルトレースを示す。図２０ＨはｐＨ３．４緩衝液で溶出したウシ血清試料のアニオン交換スピンカラムを使用して生成したフラクションのＳＥＬＤＩを使用して得られた質量スペクトルトレースを示す。図２０ＩはｐＨ３．４の０．２Ｍ  ＮａＣｌ緩衝液で溶出したウシ血清試料のアニオン交換スピンカラムを使用して生成したフラクションのＳＥＬＤＩを使用して得られた質量スペクトルトレースを示す。図２０ＪはｐＨ３．４の１．０Ｍ  ＮａＣＩ緩衝液で溶出したウシ血清試料のアニオン交換スピンカラムを使用して生成したフラクションのＳＥＬＤＩを使用して得られた質量スペクトルトレースを示す。
【０１９９】
図２１Ａ〜Ｄはウシ血清からのターゲット蛋白質（蛋白質Ｘ）の精製の進行を示す質量スペクトルトレース（横軸−分子量（ダルトン）；縦軸−相対強度）である。図２１Ａはウシ血清と蛋白質Ｘを含む未精製試料のＳＥＬＤＩを使用して得られた質量スペクトルトレースを示す。図２１ＢはＫ−７０サイズ選択スピンカラムを使用して生成したウシ血清と蛋白質Ｘの試料２フラクションの合計のＳＥＬＤＩを使用して得られた質量スペクトルトレースを示す。図２１Ｃは蛋白質をｐＨ８．０緩衝液で溶出させたアニオン交換スピンカラムを使用して生成したウシ血清と蛋白質Ｘの試料のＳＥＬＤＩを使用して得られた質量スペクトルトレースを示す。図２１Ｄは１０％アセトニトリルで洗浄したウシ血清と蛋白質Ｘの試料の疎水性ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレーからＳＥＬＤＩを使用して得られた質量スペクトルトレースを示す。
【０２００】
図２２Ａ〜ＣはＣ８アガローススピンカラムでのターゲット蛋白質（蛋白質Ｘ）の精製を示す質量スペクトルトレース（横軸−分子量（ダルトン）；縦軸−相対強度）である。図２２Ａはアニオン交換スピンカラムとｐＨ８．０溶出緩衝液を使用して生成したウシ血清と蛋白質Ｘの試料のフラクション中の蛋白質のＳＥＬＤＩを使用して得られた質量スペクトルトレースを示す。図２２Ｂは疎水性Ｃ８スピンカラムと２．８Ｍ  ＮａＣｌ溶出緩衝液を使用して生成したウシ血清と蛋白質Ｘの試料のフラクション中の蛋白質のＳＥＬＤＩを使用して得られた質量スペクトルトレースを示す。精製蛋白質Ｘを示す。図２２ＣはＡｍｉｃｏｎ  Ｋ１０  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒを使用して生成したウシ血清試と蛋白質Ｘの試料のフラクション中の蛋白質のＳＥＬＤＩを使用して得られた質量スペクトルトレースを示す。図面に示すように、図２２Ａ及びＢに示す分析に比較して有意量の蛋白質が失われている。
【０２０１】
図２３Ａ〜ＣはフィンガープリントアッセイにおけるＶ８（Ｇｌｕ  Ｃ）エンドペプチダーゼで消化した精製ターゲット蛋白質（蛋白質Ｘ）の質量スペクトルトレース（横軸−分子量（ダルトン）；縦軸−相対強度）である。図２３Ａは対照としてＶ８単独のＳＥＬＤＩを使用して得られた質量スペクトルトレースを示す。図２３Ｂは精製蛋白質ＸとＶ８のＳＥＬＤＩを使用して得られた質量スペクトルトレースを示す。図２３Ｃは精製蛋白質Ｘ、Ｖ８、及び内部標準のＳＥＬＤＩを使用して得られた質量スペクトルトレースを示す。
【０２０２】
図２４はＶ８（Ｇｌｕ  Ｃ）エンドペプチダーゼで消化した精製ターゲット蛋白質を使用したＰｒｏＦｏｕｎｄデータベース検索用表示スクリーンを示す。
【０２０３】
図２５Ａ〜ＣはＨＲＰ試料のＶ８エンドペプチダーゼ消化により生成され、検出されたペプチドフラグメントを示す質量スペクトルトレース（横軸−分子量（ダルトン）；縦軸−相対強度）である。図２５Ａは高レーザー設定のＰＢＳ  ＩＩシステムでＶ８エンドペプチダーゼにより消化したＨＲＰのＳＥＬＤＩを使用して得られた質量スペクトルトレースを示す。図２５Ｂは低レーザー設定のＰＢＳ  ＩＩシステムでＶ８エンドペプチダーゼにより消化したＨＲＰのＳＥＬＤＩを使用して得られた質量スペクトルトレースを示す。図２５ＣはＰＢＳ  ＩシステムでＶ８エンドペプチダーゼにより消化したＨＲＰのＳＥＬＤＩを使用して得られた質量スペクトルトレースを示す。
【０２０４】
図２６Ａ及びＢは異なる条件下のターゲット蛋白質（蛋白質Ｘ）のトリプシン消化物から検出されたペプチドフラグメントを示す質量スペクトルトレース（横軸−分子量（ダルトン）；縦軸−相対強度）である。図２６Ａは検出前に水洗したＨ４  ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレーからＳＥＬＤＩを使用して得られた質量スペクトルトレースを示す。図２６Ｂは検出前に３０％アセトニトリルと０．１％ＴＦＡで洗浄したＨ４  ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレーからＳＥＬＤＩを使用して得られた質量スペクトルトレースを示す。
【０２０５】
本実施例は特に例えばＶ８（Ｇｌｕ  Ｃ）、トリプシン、ＬｙｓＣ等を使用して酵素により生成したターゲットのフラグメントからの精製ターゲット蛋白質（蛋白質Ｘ）のマッピングにおける本発明の方法の有用性と、蛋白質同定におけるデータベース検索の使用を例証する。これらの方法の利点としては例えばＳＥＬＤＩ支援蛋白質精製技術を使用して（例えば血清等の複雑な混合物から）ターゲット蛋白質を数日間で検出及び精製することが挙げられる。特に、２種のスピンカラムと疎水性ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）Ｓ）アレー又はＣ８アガロースカラムを使用してターゲット蛋白質が３０μｌ血清から高純度まで微量精製された。更に、蛋白質マッピングにより更に同定するために十分な蛋白質マーカー（約５ｐｍｏｌ）が血清３０μｌから精製された。本実施例は更にＰＢＳ  ＩＩシステムを使用して蛋白質を同定する効果を例証する。場合により、精製蛋白質を例えばＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析する。
【０２０６】
Ｃ．ＳＥＬＤＩ−残留液クロマトグラフィー−マススペクトロメトリーを使用するプロセスクロマトグラフィー条件の迅速設定方法
１．緒言
本実施例は例えばイオン交換及び他の表面からのターゲット蛋白質及び不純物成分の選択的保持／溶出を維持するｐＨ及びイオン強度条件を識別するために蛋白質バイオチップを使用できることを例証する。このような条件はプロセスに適合可能なクロマトグラフィー吸着剤を溶出クロマトグラフィー条件下で使用する場合に対応する挙動を与える。本実施例に記載する方法と計測によると、複数のアレー表面と関連洗浄条件を利用する種々の蛋白質バイオチップアレー実験の結果を分析することにより、分取溶出クロマトグラフィーの予測データを迅速に作成することができる。後述するように、大腸菌で発現されるＦａｂ抗体フラグメントの分離とＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ培養上清で発現される組換えエンドスタチンの分離に残留液クロマトグラフィー−マススペクトロメトリー（ＲＣ−ＭＳ）原理を適用した。イオン強度とｐＨにおいて最適のアレー結合及び溶出条件を決定し、段階溶出方式の通常のクロマトグラフィーカラムに直接適用した。フラクションを集めて分析した処、ＲＣ−ＭＳ法により予測された結果と良好な相関を示した。従って、ＲＣ−ＭＳ技術は複雑な生体混合物からの蛋白質の大規模ＬＣ精製に最適な分離条件を明確に予測しながら試料の消費を最小にする分取蛋白質分離条件を最適化するための簡単な方法を提供することにより、プロセスクロマトグラフィー実施を迅速に促進する。
【０２０７】
２．実験
ａ）化学及び生物製品
本試験で使用した強アニオン交換（ＳＡＸ２）、弱カチオン交換（ＷＣＸ２）、疎水性（Ｈ４）、固定化金属アフィニティーキャプチャー（ＩＭＡＣ）、及び順相（ＮＰ２）ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレーはＣｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ，米国）の製品を使用した。処理後のアレーはＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）システム（ＰＢＳ  ＩＩ）、レーザー脱離イオン化飛行時間マススペクトロメーター（同様にＣｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．製品）を使用して読取った。
【０２０８】
ｂ）アレーでの蛋白質分離のシミュレーション
細胞培養から発現されたターゲット蛋白質（Ｆａｂフラグメントとエンドスタチン）を含む粗抽出液をＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標））アレー表面に直接付着した。夫々その表面にカルボン酸、第４級アミン、疎水性鎖及びキレート化学基をもつ４種のアレーＷＣＸ２、ＳＡＸ２、Ｈ４及びＩＭＡＣ３を先験的に選択した。各アレーは蛋白質の吸着を実施することができる８個の不連続スポットを含むものを使用した。ＷＣＸ２表面のｐＨ範囲を調べた処、４．５〜６．０であった。まず９６ウェルバイオプロセッサー（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を使用することにより、全スポットを低イオン強度緩衝液（５０ｍＭ酢酸緩衝液又は２０ｍＭクエン酸緩衝液で５ｍＳ／ｃｍのイオン強度を得る）２００μＬで平衡化した。これらの条件下で選択的蛋白質表面吸着はターゲット蛋白質を優先的に吸着することを究極目的として表面及び溶媒和蛋白質の両者の最終電荷状態に依存すると思われる。激しい振盪下に３０分間インキュベーション後に、各スポットを適当なｐＨとイオン強度の緩衝液２００μＬで３回洗浄し、弱く吸着しているか又は吸着していない蛋白質を除去した。
【０２０９】
次に全表面を乾燥し、０．５％トリフルオロ酢酸を含有する５０％アセトニトリル中の飽和シナピン酸溶液から構成されるマトリックス溶液２×０．８μＬを添加することによりＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析に備えた。次に、ＰＢＳ  ＩＩシステムを使用して全アレーを分析した。計器は正イオンモードで使用し、加速電位２０ｋＶ、検出器利得電圧２ｋＶとした。試験した質量範囲は３〜２００ｋＤａとし、Ｆａｂ抗体フラグメントとエンドスタチンに夫々４８ｋＤａと２０ｋＤａのタイムラグ集光条件を最適化した。これは１０５５及び１５６４ｎ秒の夫々のラグタイムに対応する。レーザー強度は試験する試料に応じて２００〜２８０単位に設定した。計器はウシ血清アルブミンで校正した。
【０２１０】
ターゲット蛋白質吸着に最適なｐＨが決定されたら、緩衝液ｐＨを一定に維持しながら今度はイオン強度を変えて同一アレーを使用して第２組の実験を実施した。こうして、吸着蛋白質を減らしながらターゲット蛋白質吸着に理想的なイオン強度を決定することができた。更に、吸着ターゲット蛋白質を溶出させるために必要な最小イオン強度も同時に決定した。試験した濃度範囲は初期酢酸緩衝液中０〜１０００ｍＭ塩化ナトリウムとした。全試料を上述のようにロードした。次に、各チップ表面を適当なイオン強度の緩衝液２００μＬで３回洗浄し、乾燥した。次に０．５％トリフルオロ酢酸を含有する５０％アセトニトリル中の飽和シナピン酸溶液２×０．８μＬを添加することによりアレーをＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析に備え、上述のように分析した。
【０２１１】
この実験系列の完了後に、同一官能基（弱カチオン交換基：カルボキシメチル）をもつ樹脂充填ＬＣカラムからのターゲット蛋白質吸着及び溶出に最良のｐＨ及びイオン強度条件を識別した。ＳＡＸ２表面についても同様に調査を行ったが、試験したｐＨ範囲はアニオン交換クロマトグラフィーに一般に使用される範囲とし、即ち５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を使用して７．５〜９とした。イオン強度は５ｍＳ／ｃｍに維持した。
【０２１２】
疎水性相互作用クロマトグラフィーの原理に従って疎水性Ｈ４アレー表面を使用した。２種の塩化ナトリウム濃度（１Ｍ及び１．５Ｍ）と４種の異なるｐＨ値（４．５、６．０、７．５及び９．０）を使用して蛋白質の吸着を促進した。各スポットを対応する緩衝液２００μＬで平衡化後、平衡ｐＨ及びイオン強度条件に予め調節しておいた粗試料５０μＬを激しい振盪下に３０分間インキュベートした。次に、イオン強度を０〜１Ｍ塩化ナトリウムで変動させながら同一ｐＨの緩衝液２００μＬで各スポットを３回洗浄した。次に全表面を脱イオン水で迅速に洗浄して塩を除去した後、乾燥し、上記のようなマトリックス溶液を添加することによりＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析に備えた。
【０２１３】
ＩＭＡＣ３アレーは銅とニッケルの２種の異なる金属イオンを使用して調査した。表面スポットにまず硫酸銅又は硫酸ニッケルの１００ｍＭ溶液５０μＬをロードした。脱イオン水２００μＬで素早く洗浄して過剰の金属イオンを除去した。次に５００又は１０００ｍＭ塩化ナトリウムを含有する２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）２００μＬを使用してスポットを平衡化した。次に、予め同一イオン強度に調節しておいた試料５０μＬを激しい撹拌下に３０分間インキュベートした。次にスポットを脱イオン水で迅速に洗浄し、乾燥し、上記ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析に備えた。
【０２１４】
ｃ）液体クロマトグラフィー
大腸菌抽出液とＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ培養上清からのターゲット蛋白質のカラムＬＣ分離はＣＭジルコニアビーズ（ＢｉｏＳｅｐｒａ，Ｃｅｒｇｙ，フランス）で実施した。この選択はアレー表面調査から得られた結果に基づいて決定した。（上記）アレーシステムを使用する予備実験により決定したイオン強度とｐＨの吸着緩衝液でまず０．３ｃｍＩ．Ｄ．ｘ１０ｃｍカラムを平衡化した。０．４５μｍ膜で濾過後に原料を直接ロードした。溶出は予備ＲＣ−ＭＳ実験から得られた情報に従って塩化ナトリウム濃度段階を使用して実施した。最後に、１Ｍ水酸化ナトリウム５カラム容量で洗浄することにより吸着剤を再生した。クロマトグラフィー分離は３００ｃｍ／時の直線流速で実施した。
【０２１５】
大腸菌抽出液からのＦａｂフラグメント分離には、５０ｍＭ酢酸、５ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．６）を使用して吸着条件を適合させ、同一緩衝液中塩化ナトリウムを使用してイオン強度を１５０ｍＳ／ｃｍまで上げることにより溶出を行った。原料ロード容量は２３ｍｌとした。Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ培養上清からの組換えエンドスタチンは、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５）中で吸着を実施し、イオン強度を８００ｍＭ塩化ナトリウムまで上げることにより溶出を実施した。原料ロード容量は８０ｍｌとした。その後、フラクションを集め、ＮＰ  ２ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレーを使用するＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ又は通常のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。
【０２１６】
ｄ）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
クロマトグラフィーフラクションの電気泳動は１２又は１８％濃度の１５ウェルプレキャストポリアクリルアミドプレートを使用して慣用条件下にＭｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ３（登録商標）システム（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｖｒｙ  ｓｕｒ  Ｓｅｉｎｅ，フランス）で実施した。試料はＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液で２倍に希釈することにより調製した。試料１２μＬ／レーンをロードし、２００ボルト電圧を４５分間使用して電気泳動を行った。染色はエタノール及び酢酸中クーマシーブルー溶液を使用して１時間〜１．５時間温和な撹拌下に実施した。脱色は水中４０％エタノールと１０％酢酸を使用して実施した。
【０２１７】
３．結果と考察
多孔質平面又は多孔質ビーズに対する蛋白質のイオン交換吸着−脱離メカニズムは本質的に同一である。蛋白質バイオチップイオン交換表面を使用して粗混合物から蛋白質を分離する基本原理を図２７Ａ及びＢに模式的に示す。従来のカラムクロマトグラフィーに従い、目的蛋白質を固体支持体に捕獲するのに適したｐＨ及びイオン強度条件下に試料をアレーの表面にロードする。次に洗浄し、アレー上にターゲット蛋白質を保持しながら不純物を除去する。望ましくない蛋白質の脱離は一般に緩衝液のイオン強度を上げるか又は緩衝液ｐＨを変化させることにより実施される。クロマトグラフィー分離では後期下流又はオフライン分析のために全蛋白質を溶出させるように移動相溶出強度を設定するが、ここでは保持された蛋白質を最終的に試験する。試料調製の最終段階中に、吸着蛋白質をアレーから脱離して成長中の結晶に連行するように機能するマトリックス溶液を添加する。結晶にレーザー光の集光パルスを照射した後、相転移させてガスイオンを生成し、ＴＯＦ  ＭＳで分析する。こうして、多くの場合には目的蛋白質が吸着されるか否かを指示すると共に不純物の存在について指示する質量スペクトルを作成することができる。不純物数が少ないほど、試験条件下のターゲット蛋白質に対するアレー表面の選択性は高い。
【０２１８】
ａ）Ｆａｂ抗体フラグメント分離
この分析は組換えＦａｂ抗体フラグメント（４７ｋＤａ）が発現された大腸菌粗抽出液で実施した。蛋白質の合計存在量は７００μｇ／ｍｌであった。ＷＣＸ２表面（弱カチオン交換体）を使用する場合には、Ｆａｂフラグメントは４．５〜４．８のｐＨ範囲で有効に吸着した。この上限値を越えると、Ｆａｂフラグメントは表面吸着種に含まれなかった。他方、主要４５ｋＤａ不純物が保持された（図２８Ａ参照）。ｐＨ５では蛋白質は全く存在せず、試料からの蛋白質は全く保持されないことが判明した。最終的に、Ｆａｂフラグメント保持に最適なｐＨは４．５〜４．７であると判断された。従って、全後期アレー実験では、緩衝液ｐＨ値を４．６に固定し、酢酸緩衝液中の塩化ナトリウム濃度を０〜１５０ｍＭで変動させることによりイオン強度の効果を試験しながら実験を進めた。
【０２１９】
ＷＣＸ  アレーからのＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳデータによると、Ｆａｂフラグメントは７５ｍＭ塩化ナトリウムではまだ存在していたが、塩化ナトリウム濃度が１５０ｍＭ以上になると消滅した（図２８Ｂ参照）。これらの結果から、ＦａｂフラグメントはｐＨ約４．６〜４．７と低イオン強度でカルボキシル含有表面に適正に吸着できることが明白に判明した。塩化ナトリウム濃度を少なくとも１５０ｍＭまで上げると、脱離が生じた。粗抽出液のイオン強度は１０ｍＳ／ｃｍであり、５０ｍＭ酢酸／５ｍＭクエン酸緩衝液中５０ｍＭの塩化ナトリウム濃度に等価であるので、Ｆａｂフラグメントを吸着させるために何も変更する必要はなかった。
【０２２０】
ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレー結果に基づき、アレーの表面の組成に類似する組成の吸着剤を使用してカラムＬＣ分離を実施した。吸着剤ＣＭジルコニアを０．３ｃｍＩ．Ｄ．ｘ１０ｃｍのクロマトグラフィーカラムに充填した。吸着及び洗浄緩衝液はイオン強度約８ｍＳ／ｃｍに等価の２５ｍＭ塩化ナトリウムを含有する５０ｍＭ酢酸／５ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．６）とし、ナトリウム濃度を１５０ｍＭまで上げながら同一ｐＨで溶出を行った。図２９はクロマトグラフィー分離プロフィルを示し、溶出ピークが明白に出現している。溶出フラクションをマススペクトロメトリーにより分析した処、主にＦａｂフラグメントを含んでおり、より低分子量の不純物が多少存在することが判明した（図３０参照）。存在する主不純物の質量は約３７ｋＤａであった。ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析によりＦａｂフラグメントの存在を更に確認した。全体として、Ｆａｂフラグメントは粗原料から適切に捕獲され、有効に１０倍に濃縮されると同時に多数の不純物が除去された。Ｆａｂフラクションを更に精製するには二次的な直交分離スキームが必要である。
【０２２１】
ＷＣＸ２アレーについて記載したと同様の種々のｐＨとイオン強度の粗抽出液の分析をＳＡＸ２アレー表面で実施した。イオン強度に関係なく、Ｆａｂフラグメントは保持されなかった。従って、ＳＡＸ２表面はカチオン交換樹脂に有用な直交分離スキームとして、ターゲット蛋白質の代わりに不純物を吸着することによりＦａｂフラクションを更に精製すると思われる。この強アニオン交換カラム精製段階は５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＱ  Ｃｅｒａｍｉｃ  ＨｙｐｅｒＤ（登録商標）Ｆ吸着剤（カラム寸法：０．６６ｃｍＩＤｘ１０ｃｍ）を使用して実施した。ＣＭジルコニアカラムからの溶出フラクション３００μＬをＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）で１０倍に希釈し、イオン強度をカラム初期条件（１５ｍＳ／ｃｍ未満）と同等の値まで下げた。これらの条件下で、Ｆａｂフラグメントはフロースルー中に有効に検出された。Ｑ樹脂分離からのフラクションを集めて分析した処、実際にＦａｂフラグメントの純度は有意に増加したが、微量の不純物がまだ存在していた（図３０参照）。本実験の結果、液体クロマトグラフィーの条件を予測するためにＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレーを使用すると有効であることが明白に実証された。
【０２２２】
ｂ）組換えエンドスタチン精製
ＲＣ−ＭＳアプローチを他の蛋白質にも応用できることを確認するために、内皮細胞培養増殖を阻害する２０．１ｋＤａ蛋白質である組換えエンドスタチンを含むＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓの培養上清を使用して第２組の実験を実施した。原料の合計蛋白質濃度は０．６ｍｇ／ｍｌであり、エンドスタチン濃度は０．０５ｍｇ／ｍｌであった。粗抽出液を上述のように４種のアレー表面、即ち弱カチオン交換、強アニオン交換、疎水性及び銅をもつキレート表面で試験した。ロード後に吸着クロマトグラフィーを模倣するのに適した緩衝液でアレー表面を洗浄した後、ＭＳ分析した。図３１Ａ〜Ｄに示すように、ＷＣＸ２アレー（図３１Ａ）は微量の不純物と共にエンドスタチンを吸着したが、ＳＡＸ２、Ｈ４及びＩＭＡＣ３アレー（夫々図３１Ｂ〜Ｃ）はターゲット組換え蛋白質と有意相互作用を示さないことが判明した。特に、ＳＡＸアレー表面は蛋白質を全く吸着せず、Ｈ４及びＩＭＡＣ３アレー表面は異なる吸着挙動を示した。Ｈ４及びＩＭＡＣ３表面はエンドスタチン以外の他の蛋白質と明らかに相互作用した。Ｈ４アレーは主に分子量約２５ｋＤａの蛋白質を吸着し、ＩＭＡＣ３表面は低分子量（１７ｋＤａ）の蛋白質と結合した。
【０２２３】
カチオン交換クロマトグラフィーを使用してエンドスタチンを精製するための条件を規定するために、５．０、５．５、６．０及び６．５の狭いｐＨ範囲を使用してアレー吸着／脱離条件を最適化した（図３２Ａ）。その後、エンドスタチン表面相互作用を全廃することが可能な塩化ナトリウム濃度を識別するために各種イオン強度を試験した（図３２Ｂ）。ｐＨ５．０は最適エンドスタチン表面相互作用を促進することが判明した。当初のイオン強度の修正は不要であった。予想通り、塩化ナトリウム濃度の増加は約２００ｍＭ  ＮａＣｌから出発してＷＣＸ２表面からのエンドスタチン脱離を明らかに促進した。ＭＳ分析によると、約４００ｍＭを上回るＮａＣｌ濃度でエンドスタチンの完全な脱離が行われることが判明した。
【０２２４】
これらの規定条件から、ＣＭジルコニアカラムを調製し、分取使用した。平衡化後、細胞培養上清８０ｍｌをｐＨ５．０に調整し、カラムにロードした。エンドスタチンの溶出はｐＨ５．０で２００ｍＭ→８００ｍＭの２段階塩化ナトリウム濃度勾配により実施した。付加詳細については上記実験セクションと図３３Ａ参照。フラクションを集めて分析した処、カラムにロードして洗浄した場合に全エンドスタチンは吸着し、本質的に塩化ナトリウム濃度の２回目の増加後にエンドスタチンの溶出が生じた。
【０２２５】
電気泳動（図３３Ｂ参照）の結果、８００ｍＭの塩化ナトリウム緩衝液濃度を使用するとエンドスタチンは完全に溶出することが判明した。溶出したフラクションを分析した処、総エンドスタチン純度はいずれの場合も初期原料組成物（レーン「１」）に比較して有意に増加していることが判明した。エンドスタチンよりも低分子量の不純物が微量存在していた。電気泳動結果によると、組換えエンドスタチンの純度は単一段階で１０％未満から少なくとも９０％まで向上した。
【０２２６】
Ｃｕ+2ＩＭＡＣアレーのみがＣＭジルコニアクロマトグラフィー後に微量で残存していた１７ｋＤａ蛋白質不純物を吸着したことからみて（図３３Ｂのレーン３）、銅と錯化したキレートビーズの高度精製カラムを使用して更にエンドスタチンフラクション純度を上げることができると思われる。逆に、Ｈ４アレー表面を使用して得られた予備結果（図３１）によると、電気泳動移動度が低い（分子量が高い）不純物は疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用する第２回目の高度精製分離段階で除去されると思われる。
【０２２７】
４．結論
本試験の結果、ＲＣ−ＭＳ法は試料の消費を最小限にしながら有効な分取分離条件を即座に迅速に予測できることが実証された。本試験の結果によると、ＲＣ−ＭＳは多数の他の体液及び組織抽出液を精製するのに適用可能であると思われる。まず第１に、この方法はターゲット蛋白質分子量が先験的にわかっているだけでよい。あるいは、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳアプローチを使用してターゲット蛋白質分子量を容易に測定することができる。シリアル多重カラム法分離スキームを設計することもできる。初期アレー操作からの複合データから一次元ＬＣ分離スキーム全体を設計するために十分なターゲット蛋白質と不純物の挙動に関する情報が得られるが、第１のカラムからの溶出フラクションの第２回目のアレー分析を開始し、不純物の種類を更に精査し、潜在的高度精製ストラテジーを提供することも有用であると思われる。更に、分離したフラクションからの不純物追跡も非常に良好な感度レベルで可能になる。実際に、フェントモル範囲で種の検出が可能である。
【０２２８】
以上、明確にすると共に理解し易くする目的で本発明を詳細に記載したが、以上の開示から当業者に自明の通り、本発明の真の範囲を逸脱することなく形態や細部に種々の変更を加えることができる。例えば、上記全技術及び装置は種々に組合せて使用することができる。本明細書に引用した全刊行物、特許、特許出願又は他の文献は全目的でその開示内容全体を参考資料として組込み、個々の刊行物、特許、特許出願又は他の文献が全目的で参考資料として組込むと記載されているものとみなす。
【図面の簡単な説明】
【０２２９】
【図１】複数の細胞培養バッチにおけるターゲットポリペプチドの生産の監視方法の１態様に含まれる段階を模式的に示すフローチャートである。
【０２３０】
【図２】細胞培養におけるターゲットポリペプチドの生産の監視方法の１態様に含まれる段階を模式的に示すフローチャートである。
【０２３１】
【図３】混合物からのターゲットポリペプチドの精製の監視方法の１態様に含まれる段階を模式的に示すフローチャートである。
【０２３２】
【図４】ターゲットポリペプチドの精製方法の１態様に含まれる段階を模式的に示すフローチャートである。
【０２３３】
【図５】ターゲットポリペプチドの存在を検出するための細胞培地試料の表面増強レーザー脱離イオン化アッセイを模式的に示す。
【０２３４】
【図６】混合物からのターゲットポリペプチドの精製を監視するための表面増強レーザー脱離イオン化アッセイを模式的に示す。
【０２３５】
【図７】表面増強レーザー脱離イオン化飛行時間マススペクトロメトリーシステムを模式的に示す。
【０２３６】
【図８】本発明の種々の側面を実施可能な情報装置又はディジタル装置の代表例を模式的に示す。
【０２３７】
【図９】図９Ａ〜ＤはＨ４及びＩＭＡＣ３  ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレーを使用して細胞培地から検出された成分を示す質量スペクトルトレースである。
【０２３８】
【図１０】図１０Ａ〜ＥはＨ４  ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレーを使用して培地の種々のロットから検出された成分を示す質量スペクトルトレースである。
【０２３９】
【図１１】図１１Ａ〜ＥはＨ４  ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレーを使用して培地の種々のロットの定量分析から検出された成分を示す質量スペクトルトレースである。
【０２４０】
【図１２】２Ｄゲルから蛋白質を同定するための手順に含まれる段階を模式的に示すフローチャートである。
【０２４１】
【図１３】２Ｄゲルから蛋白質を同定するための手順に含まれる種々の段階を模式的に示すフローチャートである。
【０２４２】
【図１４】蛋白質プロファイリング手順に含まれる段階を模式的に示すフローチャートである。
【０２４３】
【図１５】図１５Ａ〜Ｃは洗浄後にＮＰ  ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレーで検出された蛋白質プロフィルを示す質量スペクトルトレースと差異マップである。
【０２４４】
【図１６】図１６Ａ〜Ｃは洗浄後にＮＰ  ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレーで検出された蛋白質プロフィルを示す質量スペクトルトレースと差異マップである。
【０２４５】
【図１７】生体試料の一般蛋白質分画を模式的に示すフローチャートである。
【０２４６】
【図１８】ウシ血清からのターゲット蛋白質の微量精製における種々の段階を模式的に示すフローチャートである。
【０２４７】
【図１９】図１９Ａ〜Ｇはサイズ選択スピンカラムでウシ血清の分画アッセイから検出された蛋白質プロフィルを示す質量スペクトルトレースである。
【０２４８】
【図２０】図２０Ａ〜Ｊはアニオン交換スピンカラムでウシ血清の分画アッセイから検出された蛋白質プロフィルを示す質量スペクトルトレースである。
【０２４９】
【図２１】図２１Ａ〜Ｄはウシ血清からのターゲット蛋白質の精製の進行を示す質量スペクトルトレースである。
【０２５０】
【図２２】図２２Ａ〜ＣはＣ８アガローススピンカラムでのターゲット蛋白質の精製を示す質量スペクトルトレースである。
【０２５１】
【図２３】図２３Ａ〜ＣはＶ８（Ｇｌｕ  Ｃ）エンドペプチダーゼで消化した精製ターゲット蛋白質のフィンガープリントを示す質量スペクトルトレースである。
【０２５２】
【図２４】Ｖ８（Ｇｌｕ  Ｃ）エンドペプチダーゼで消化した精製ターゲット蛋白質を使用したＰｒｏＦｏｕｎｄデータベース検索用表示スクリーンを示す。
【０２５３】
【図２５】図２５Ａ〜ＣはＨＲＰ試料のＶ８エンドペプチダーゼ消化により生成され、検出されたペプチドフラグメントを示す質量スペクトルトレースである。
【０２５４】
【図２６】図２６Ａ及びＢは異なる条件下のターゲット蛋白質のトリプシン消化物から検出されたペプチドフラグメントを示す質量スペクトルトレースである。
【０２５５】
【図２７】図２７Ａ及びＢは蛋白質の選択的吸着と捕獲された蛋白質種のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析におけるＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレー表面の使用方法を模式的に詳示する。
【０２５６】
【図２８】図２８Ａ及びＢはＦａｂ抗体フラグメントを含む大腸菌の粗清澄化抽出液を添加したＷＣＸ２ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレー表面から検出された蛋白質プロフィルを示す質量スペクトルトレース（横軸−分子量（ダルトン）、縦軸−相対強度）である。
【０２５７】
【図２９】ＣＭジルコニア吸着剤で粗大腸菌抽出液を分離して得られたクロマトグラムである。
【０２５８】
【図３０】図３０Ａ〜ＣはＮＰ２（順相）ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレーとＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを使用して得られた検出蛋白質プロフィルを示す質量スペクトルトレース（横軸−分子量（ダルトン）、縦軸−相対強度）である。
【０２５９】
【図３１】図３１Ａ〜ＤはＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳとエンドスタチンを含むＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞培養上清をロードした種々のＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレー表面を使用して得られた検出蛋白質プロフィルを示す質量スペクトルトレース（横軸−分子量（ダルトン）、縦軸−相対強度）である。
【０２６０】
【図３２】図３２Ａ及びＢはＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳとエンドスタチンを含むＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞培養上清をロードしたＷＣＸ２  ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレー）を使用して得られた検出蛋白質プロフィルを示す質量スペクトルトレース（横軸−分子量（ダルトン）、縦軸−相対強度）である。
【０２６１】
【図３３】図３３ＡはＣＭジルコニア吸着剤で粗Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ培養上清を分離して得られたクロマトグラムである。
【０２６２】
図３３Ｂは図３３Ａについて記載したクロマトグラフィー分析に含まれる各種フラクションの電気泳動分離から得られた電気泳動図である。
【図１】
2005509173.tif 000003
【図２】
2005509173.tif 000004
【図３】
2005509173.tif 000005
【図４】
2005509173.tif 000006
【図５】
2005509173.tif 000007
【図６】
2005509173.tif 000008
【図７】
2005509173.tif 000009
【図８】
2005509173.tif 000010
【図９】
2005509173.tif 000011
【図１０】
2005509173.tif 000012
【図１１】
2005509173.tif 000013
【図１２】
2005509173.tif 000014
【図１３】
2005509173.tif 000015
【図１４】
2005509173.tif 000016
【図１５】
2005509173.tif 000017
【図１６】
2005509173.tif 000018
【図１７】
2005509173.tif 000019
【図１８】
2005509173.tif 000020
【図１９】
2005509173.tif 000021
【図２０】
2005509173.tif 000022
【図２１】
2005509173.tif 000023
【図２２】
2005509173.tif 000024
【図２３】
2005509173.tif 000025
【図２４】
2005509173.tif 000026
【図２５】
2005509173.tif 000027
【図２６】
2005509173.tif 000028
【図２７】
2005509173.tif 000029
【図２８】
2005509173.tif 000030
【図２９】
2005509173.tif 000031
【図３０】
2005509173.tif 000032
【図３１】
2005509173.tif 000033
【図３２】
2005509173.tif 000034
【図３３】
2005509173.tif 000035
【国際調査報告】
2005509173.tif 000036