(57)【要約】本発明は、概ね、抗CA IXモノクローナル抗体の作製および特性決定に関する。本発明はさらに、CA IXの活性上昇を伴う疾患、詳しくは、結腸直腸癌、腎細胞癌(RCC)、子宮頸癌およびその他の上皮起源の癌などの腫瘍の診断および治療におけるかかる抗CA IX抗体の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、21、22、24、25、26、27、28、29、30、71、72、73、75、77、79、90、92、94、96、98、100、102、125、128、130、133、136、137、142、146、150、153、169、171、172および246からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖アミノ酸を含む単離されたモノクローナル抗体であって、前記モノクローナル抗体がCA IXと特異的に結合する抗体。
【請求項２】
前記抗体が完全ヒト抗体である、請求項1に記載の抗体。
【請求項３】
抗体がさらに、配列番号32、33、34、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、60、61、62、63、64、66、67、68、69、81、82、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、162、168、175、177、179および245からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖アミノ酸を含む、請求項1に記載の抗体。
【請求項４】
治療上許容される担体を伴う、請求項1に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
治療薬または細胞障害性薬と結合している、請求項1に記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
さらなる治療薬が毒素である、請求項5に記載のコンジュゲート。
【請求項７】
さらなる治療薬が放射性同位元素である、請求項5に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
CA IX腫瘍抗原の発現と関連している細胞増殖を阻害する方法であって、CA IXを発現する細胞を有効量の請求項1に記載の抗体で処理することを含む方法。
【請求項９】
患者においてCA IXの発現を伴う疾病を治療する方法であって、患者に有効量の請求項1に記載の抗体を投与することを含む方法。
【請求項１０】
患者が哺乳類の患者である、請求項9に記載の治療法。
【請求項１１】
哺乳類の患者がヒトである、請求項10に記載の治療法。
【請求項１２】
疾病が腫瘍である、請求項11に記載の治療法。
【請求項１３】
腫瘍が結腸直腸新生物、結腸直腸腫瘍、腎細胞癌(RCC)、子宮頸癌、子宮頸部上皮内扁平上皮および腺管腫瘍、食道腫瘍および乳癌からなる群から選択される、請求項12に記載の治療法。
【請求項１４】
モノクローナル抗体の重鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子であって、前記ヌクレオチド配列が配列番号104、106、108、110、112、114、116、118、170、172、174、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211および212からなる群から選択される、核酸分子。
【請求項１５】
モノクローナル抗体の軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子であって、前記ヌクレオチド配列が配列番号105、107、109、111、113、115、117、119、176、178、180、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243および244からなる群から選択される、核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態は、炭酸脱水酵素IX(CA IX)腫瘍抗原と結合する抗体ならびにかかる抗体を作製および使用する方法および手段に関する。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体(mAb)の治療的有用性(G. KohlerおよびC. Milstein、Nature 256:495〜497頁(1975))は理解されている。モノクローナル抗体は今では、移植術、癌、感染症、循環器病および炎症において治療法として認められている。異なるアイソタイプは異なるエフェクター機能を有する。かかる機能の相違は、種々の免疫グロブリンアイソタイプの異なった3次元構造に反映される(P. M.Alzariら、Annual Rev. Immunol、6:555〜580頁(1988))。
【０００３】
マウスは免疫化に好都合であり、ほとんどのヒト抗原を外来のものと認識するので、通常、治療的可能性を有する、ヒト標的に対するmAbはマウス起源のものであった。しかし、ヒト治療薬としてのマウスmAbには、特有の欠点がある。mAbはヒトにおける循環半減期が、ヒト抗体よりも短いために、より頻回の投与が必要となる。より決定的には、ヒト免疫系へのマウス抗体の反復投与は、ヒト免疫系にマウスタンパク質を外来のものと認識することによって応答させ、ヒト抗マウス抗体(HAMA)応答を生じさせる。かかるHAMA応答は、アレルギー反応および系からのマウス抗体の迅速な排除をもたらし、これによってマウス抗体による治療が使い物にならなくなることがある。かかる影響を避けるために、マウス内にヒト免疫系を作製する試みが企てられてきた。
【０００４】
最初の試みでは、ヒト配列を有する抗体で抗原に対して応答し得るトランスジェニックマウスを作製しようとした(Bruggemannら、Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 86:6709〜6713頁(1989)参照)が、これは、利用できるクローニング媒体によって安定に維持され得るDNA量によって制限された。酵母人工染色体(YAC)クローニングベクターの使用により、ヒトIg遺伝子座の大きな生殖系列断片をトランスジェニック哺乳類に導入する方法がもたらされた。基本的に、ヒトゲノムで見られる同一スペーシングで配置されたヒトV、DおよびJ領域遺伝子の大部分とヒト定常領域を、YACを用いてマウスに導入した。1種のこのようなトランスジェニックマウス系統は、ゼノマウス(XenoMouse(登録商標))マウスとして知られ、アブジェニックス社(Abgenix, Inc.)(フリーモント、カリフォルニア州)から市販されている。
【０００５】
ゼノマウスマウスは、不活化マウスIgHおよびIgK遺伝子座を有し、機能的なメガベースサイズのヒトIgHおよびIgKトランスジーンについてトランスジェニックであるマウスの系統である。さらに、ゼノマウスマウスは、実質的にどんな所望の抗原での免疫化にも応じて、高親和性の、所望のアイソタイプの完全ヒト抗体(すなわち、IgG1)を産生し得るトランスジェニックマウスである。かかるmAbは、標的細胞に対する相補依存性細胞障害または抗体依存性細胞障害を導くために使用できる。
【０００６】
CA IXは、ほとんどの子宮頸癌(Brewerら、Gynecol. Oncol、63 (3):337〜44 (1996))およびいくつかの腫瘍、特に腎細胞癌(Beasleyら、Cancer Res.、61 (13):5262〜7頁(2001))食道癌(Kaluzら、J. Biol. Chem.、274946):32588〜32595頁(1999))および乳癌において過剰発現されていることがわかっているバイオマーカーであるために、腫瘍細胞の進行および増殖におけるCA IXの役割は極めて注目されている。Chiaら、J.Clin. Oncol.、19 (16):3660〜8頁(2001)によれば、MNとも呼ばれるCA IXは、癌腫において低酸素のマーカーとしての役割を有する可能性がある。さらに、CA IXの過剰発現は、細胞内pHの維持を助け(Beasleyら、Cancer Res. 61 (13):5262〜7頁(2001)、腫瘍細胞に延命効果を与え、放射線治療および化学療法に対する耐性を増強する可能性がある。したがって、CA IXは、かかる腫瘍に対する治療にとって理想的な潜在的に可能な標的であり得る。
【０００７】
CA IXに特異的なモノクローナル抗体は作製されている(Zavadaら、Br. J. Cancer、82(11):1808〜13(2000))。これらの抗体は、特異的に接着ドメインを対象とし、CA IXの腫瘍細胞に付着する能力に影響を及ぼす。接着ドメインはプロテオグリカンドメイン中に位置し、アミノ酸6個の配列GEEDLPの6部よりなるタンデムリピートを含む(Brewerら、Gynecol Oncol.、63(3);337〜44(1996)。ランダムへプタペプチドのファージディスプレイライブラリーから、CA IXの接着エピトープと競合し、細胞のCA IXとの接着を阻害する能力を有するいくつかのヘプタペプチドが同定されている。
【０００８】
最初の抗MN抗体は、Oosterwijkら(Am J Pathol 1986年5月;123(2):301〜9頁、OosterwijkらInt J Cancer 1986年10月15日;38(4):489〜94頁)によって作製されたG250抗体であったと考えられており、これは腎細胞癌において優先的に発現される抗原と結合する抗体であった。G250抗体は、その後、MN抗原と結合することが確認された(Uemuraら Br J Cancer 1999年10月;81(4):741〜6頁)。
【０００９】
CA IXと特異的に結合するモノクローナル抗体は同定されているが、その生物活性、例えば、腫瘍進行に必須であり得る細胞増殖および生存を特異的に阻害する抗体が必要である。CA IXを細胞表面に発現する腫瘍細胞の増殖および/または生存に影響を及ぼす能力は、腫瘍に苦しむ多数の患者に対して広範な用途を有する治療であるとわかり得る。
【非特許文献１】G. KohlerおよびC. Milstein、Nature 256:495〜497頁(1975)
【非特許文献２】P. M.Alzariら、Annual Rev. Immunol、6:555〜580頁(1988)
【非特許文献３】Bruggemannら、Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 86:6709〜6713頁(1989)
【非特許文献４】Brewerら、Gynecol. Oncol、63 (3):337〜44頁(1996)
【非特許文献５】Beasleyら、Cancer Res.、61 (13):5262〜7頁(2001)
【非特許文献６】Kaluzら、Biol. Chem.、274946):32588〜32595頁(1999)
【非特許文献７】Chiaら、J.Clin. Oncol.、19 (16):3660〜8頁(2001)
【非特許文献８】Zavadaら、Br. J. Cancer、82(11):1808〜13(2000)
【非特許文献９】Oosterwijkら(Am J Pathol 1986年5月;123(2):301〜9頁
【非特許文献１０】OosterwijkらInt J Cancer 1986年10月15日;38(4):489〜94頁
【非特許文献１１】Uemuraら Br J Cancer 1999年10月;81(4):741〜6頁
【非特許文献１２】Singletonら、Dictionary cf Microbiology and Molecular Biology第2版、J. Wiley & Sons (New York、NY 1994)
【非特許文献１３】Sambrookら、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor、NY 1989)
【特許文献１】米国特許第4,683,195号
【非特許文献１４】Mullisら、 Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263(1987)、Erlich編、PCR Technology (Stockton Pres、NY、1989)
【非特許文献１５】ChothiaらJ. Mol. Biol. 186:651(1985、NovotnyおよびHaber、Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.82:4592(1985)
【非特許文献１６】Chothiaら、Nature 342:877〜883頁(1989)
【非特許文献１７】Kohlerら、Nature、256:495(1975)
【特許文献２】米国特許第4,816,567号
【非特許文献１８】Clacksonら、Nature、352:624〜628頁(1991)およびMarksら、J. Mol. Biol.、222:581〜597頁(1991)
【非特許文献１９】RavetchおよびKinet、Annu. Rev. Immunol 9:457〜92頁(1991)
【特許文献３】米国特許第5,500,362号
【特許文献４】米国特許第5,821,337号
【非特許文献２０】Clynesら PNAS (USA) 95: 652〜656頁(1988)
【非特許文献２１】Kabatら、Sequences cf Proteins cf Immunological Interest、第5版、Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、MD.(1991)
【非特許文献２２】ChothiaおよびLesk J. Mol.Biol 196:901〜917(1987)
【非特許文献２３】Bruce Albertsら、Molecular Biology cf the Cell, Garland Publishing, Inc.、New York (第3版1994)
【非特許文献２４】Goding、Monoclonal Antibodies:Principles and Practice、59〜103頁、[Academic Press、1996]
【非特許文献２５】Kozbor,J. Immunol. 133:3001(1984)
【非特許文献２６】Brodeurら、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications、51〜63頁、Marcel Dekker, Inc.、New York、[1987]
【非特許文献２７】Munsonら、Anal. Biochem. 107:220 (1980)
【非特許文献２８】JamesおよびBell、J. Immunol. Methods 100: 5〜40頁[1987]
【非特許文献２９】Hahnら、Nature 400:464〜468頁[1999]
【非特許文献３０】Jakobovitsら、Nature 362:255〜258頁[1993]
【非特許文献３１】LonbergおよびHuszar、Int. Rev. Immunol. 13:65〜93頁[1995]
【非特許文献３２】Fishwildら、Nat. Biotechnol. 14:845〜851頁[1996]
【非特許文献３３】Mendezら、Nat. Genet. 15:146〜156頁[1997]
【非特許文献３４】Green、J. Immunol. Methods 231:11〜23頁[1999]
【非特許文献３５】Tomizukaら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722〜727頁[2000]
【非特許文献３６】Littleら、Immunol. Today 21:364〜370頁[2000]
【非特許文献３７】Jakobovitsら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551〜2555頁[1993]
【非特許文献３８】Antibodies:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、HarlowおよびDavid Lane編(1988)
【非特許文献３９】Remington:The Science and Practice cf Pharmacy、第19版、Alfonso, R.編、Mack Publishing Co. (イーストン、ペンシルバニア:1995)
【特許文献５】U.S.3,773,919
【特許文献６】EP58,481
【非特許文献４０】Sidmanら、Biopolymers、22:547〜556頁(1983)
【非特許文献４１】Langerら、J. Biomed. Mater. Res.、15:167〜277頁(1981)
【非特許文献４２】Langer、Chem. Tech.、12:98〜105頁(1982)
【特許文献７】EP133,988
【特許文献８】DE3,218,121
【非特許文献４３】Epsteinら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、82:3688〜3692頁(1985)
【非特許文献４４】Hwangら、Proc.Natl. Acad. Sci. USA、77:4030〜4034頁(1980)
【特許文献９】EP52,322
【特許文献１０】EP36,676
【特許文献１１】EP88,046
【特許文献１２】EP143,949
【特許文献１３】EP142,641
【特許文献１４】特許出願83-118008
【特許文献１５】U.S.4,485,045
【特許文献１６】U.S.4,544,545
【特許文献１７】EP102,324
【非特許文献４５】Proc. Natl. Acad. Sci USA 93:8618、1996
【非特許文献４６】J. Ntl Cancer Inst. 92:1573、2000
【非特許文献４７】Cancer Res. 60: 6089、2000
【非特許文献４８】Pastorekら(Oncogene 9:2877〜2888頁(1994)
【非特許文献４９】Kearneyら、J. Immunol.、123:1548〜1550頁(1979)
【非特許文献５０】Cancer Res 48(16):4469〜76頁(1998)
【非特許文献５１】Hazraら、Cell Biophys、24〜25:1〜7(1994)
【非特許文献５２】Witzig,T. E、Cancer Chemother Pharmacol、48 付録1:S91〜5頁(2001)
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の実施形態は、CA IXと結合し、CA IX機能に影響を及ぼすことがわかっているモノクローナル抗体の開発に基づいている。
【００１１】
一態様では、本発明は、少なくともヒトCA IXと結合し、その生物活性を中和する抗ヒトCA IXモノクローナル抗体を提供する。本抗体は、問題のヒトCA IXの生物活性を大幅に低下または消失させ得る。
【００１２】
主題ヒトCA IXの生物活性は、ストレス条件下での細胞増殖または生存にとって重要であると思われる。
【００１３】
一実施形態では、本発明は、配列番号2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、21、22、24、25、26、27、28、29、30、71、72、73、75、77、79、90、92、94、96、98、100、102、125、128、130、133、136、137、142、146、150、153、169、171、172および246からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖アミノ酸を含む単離されたモノクローナル抗体を提供し、ここで、前記モノクローナル抗体はCA IXと特異的に結合する。この抗体は完全ヒト抗体であることが好ましい。さらなる実施形態では、抗体はさらに、配列番号32、33、34、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、60、61、62、63、64、66、67、68、69、81、82、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、162、168、175、177、179および245からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖アミノ酸を含む。モノクローナル抗体はさらに治療上許容される担体を伴うこともでき、治療薬または細胞障害性薬と結合することもでき、ここで、さらなる治療薬は毒素、例えば、触媒作用性毒素、リシン、シュードモナス外毒素、または薬物様毒素、マイタンシノイド(maytansinoid)、オーリスタチン(auristatin)Eまたはゲルダナマイシン(geldanamycin)または放射性同位元素である。かかる抗体は、腫瘍などの疾病の治療に使用できることが好ましい。
【００１４】
もう1つの態様では、本発明は、CA IXを発現する細胞を、有効量のCA IXモノクローナル抗体で処理することを含む、CA IX腫瘍抗原の発現を伴う細胞増殖を阻害する方法を提供する。
【００１５】
もう1つの態様では、本発明は、患者に有効量のCA IXモノクローナル抗体を投与することを含む、患者においてCA IXの発現を伴う疾病を治療する方法を提供する。患者はヒト哺乳類患者であることが好ましく、疾病は結腸直腸新生物、結腸直腸腫瘍、腎細胞癌(RCC)、子宮頸癌、子宮頸部上皮内扁平上皮および腺管腫瘍、食道腫瘍および乳癌からなる群から選択される腫瘍であることが好ましい。
【００１６】
本明細書に記載した抗体のいずれかをコードする単離された核酸分子、単離された核酸分子を含むベクター、この核酸分子で形質転換された宿主細胞、ならびに核酸分子が発現され、抗体が産生される条件下で宿主細胞を培養すること、および場合によっては宿主細胞から抗体を回収することを含む、抗体を生産する方法も提供される。抗体はIgGクラスのものであり得る。単離された核酸分子は、モノクローナル抗体の重鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列(ここで、前記ヌクレオチド配列は配列番号104、106、108、110、112、114、116、118、170、172、174、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211および212からなる群から選択される)またはモノクローナル抗体の軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列(ここで、前記ヌクレオチド配列は配列番号105、107、109、111、113、115、117、119、176、178、180、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243および244からなる群から選択される)を含むことが好ましい。
【００１７】
さらにもう1つの態様では、本発明は放射性同位元素と結合している本発明の抗体を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
A.定義
特に断りのない限り、本明細書に用いた技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているものと同一の意味を有する。例えば、Singletonら、Dictionary of Microbiology and Molecular Biology第2版、J. Wiley & Sons (New York、NY 1994)、Sambrookら、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor、NY 1989)参照。本発明の目的上、以下の用語を下記に定義する。
【００１９】
本明細書において用語「CA IX」および「AX014」とは、本明細書中で用いられる場合には、炭酸脱水酵素(CA)ファミリーに属する酵素でもある腫瘍関連抗原を表す。CA IXはまた、当技術分野では「MN」とも呼ばれる。本発明の目的上、以後「CA IX」は、CA IXとMNの双方を指す。より詳しくは、CA IXは、活性な細胞外酵素部位を有する膜貫通糖タンパク質である。さらに、「AX014H」は本明細書中に用いられる場合には、ヒトAX014を指す。
【００２０】
「ポリメラーゼ連鎖反応」または「PCR」は、1987年7月28日に発行された米国特許第4,683,195号に記載されたような、微量の特定の部分の核酸、RNAおよび/またはDNAを増幅する手順または技術を指す。一般に、オリゴヌクレオチドプライマーを設計できるように、注目する領域の末端またはそれを超えた部分から配列情報が入手可能である必要がある。これらのプライマーは、増幅される鋳型の反対側の鎖と同一または類似の配列である。2つのプライマーの5'末端ヌクレオチドは、増幅される物質の末端と一致し得る。PCRは、総ゲノムDNAおよび総細胞RNAから転写されたcDNA、バクテリオファージまたはプラスミド配列などから、特定のRNA配列、特定のDNA配列を増幅するために使用できる。一般に、Mullisら、Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263(1987)、Erlich編、PCR Technology (Stockton Pres、NY、1989)参照。本明細書において、PCRは、既知の核酸のプライマーとしての使用および特定の部分の核酸を増幅または作製するための核酸ポリメラーゼ使用を含む、核酸試験サンプルを増幅するための核酸ポリメラーゼ反応法の唯一ではない一例であると考えられる。
【００２１】
「腫瘍」とは本明細書において、悪性であるか良性であるかにかかわらない、すべての新生物細胞の成長および増殖、ならびに前癌性および癌性細胞および組織を指す。
【００２２】
用語「癌」および「癌性」とは、通常、未制御の細胞成長を特徴とする、哺乳類における生理学的状態を指すか、記載する。癌の例としては、それだけには限らないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病またはリンパ性悪性疾患が挙げられる。かかる癌のより詳しい例としては、扁平上皮癌(squamous cell cancer)(例えば、扁平上皮癌(epithelial squamous celle cancer))、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌および肺の扁平上皮癌(squamous carcinomaを含む肺癌、腹膜の癌、肝細胞癌(hepatocellular cancer)、消化管癌を含む胃癌(gastric or stomach cancer)、膵臓癌、グリア芽種、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌(liver cancer)、膀胱癌、ヘパトーマ(hepatoma)、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌(kidney or renal cancer)、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌(hepatic carcinoma)、肛門癌腫、陰茎癌腫、ならびに頭頸部癌が挙げられる。
【００２３】
「抗体」(Ab)および「免疫グロブリン」(Ig)は、同一の構造的特徴を有する糖タンパク質である。抗体が特定の抗原に対して結合特異性を示すのに対し、免疫グロブリンには抗体と抗原特異性を欠く他の抗体様分子の双方が含まれる。後者の種類のポリペプチドは、例えば、リンパ系によって低レベルで、および骨髄腫によって高レベルで産生される。
【００２４】
「未変性の抗体および免疫グロブリン」は、通常、2つの同一の軽(L)鎖と2つの同一の重(H)鎖からなる約150,000ダルトンのヘテロ四量体の糖タンパク質である。各軽鎖は重鎖と1つの共有結合によるジスルフィド結合によって結合しているが、ジスルフィド結合の数は、種々の免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。各重鎖および軽鎖はまた、規則正しく間隔のあいた鎖内ジスルフィド橋も含む。各重鎖は一方の末端に可変ドメイン(VH)とそれに続くいくつかの定常ドメインを含む。各軽鎖は一方の末端に可変ドメイン(VL)ともう一方の末端に定常ドメインとを含み、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第1定常ドメインとアラインされ、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインとアラインされている。特定のアミノ酸残基が、軽鎖と重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている(ChothiaらJ. Mol. Biol. 186:651(1985、NovotnyおよびHaber、Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.82:4592(1985)、Chothiaら、Nature 342:877〜883(1989))。
【００２５】
本明細書において用語「抗体」は、広い意味で用いられ、具体的には、インタクトなモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも2種のインタクトな抗体から形成される多特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)および所望の生物活性を示す限りは抗体断片を対象とする。
【００２６】
いずれかの脊椎動物の種由来の抗体(免疫グロブリン)の「軽鎖」は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、κおよびλと呼ばれる2つの明確に異なる種類のうちの一方に割り当てられる。
【００２７】
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、インタクトな抗体を異なる「クラス」に割り当てることができる。インタクトな抗体には5つの主要なクラス、IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMがあり、またこれらのうちのいくつかは、「サブクラス」(アイソタイプ)、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgAおよびIgA2にさらに細分することができる。異なるクラスの抗体に対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。種々のクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体配置は、十分に公知である。
【００２８】
用語「抗体」は、すべてのクラスおよびサブクラスのインタクトな免疫グロブリンを含む。用語「抗体」はまた、抗体断片も対象とする。用語「抗体」は具体的には、抗体断片クローンを含めてモノクローナル抗体を対象とする。
【００２９】
本明細書において用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質な抗体集団から得た抗体を指す。すなわち、集団を構成する個々の抗体は、微量で存在し得るあり得る天然突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。さらに、種々の決定基(エピトープ)に対する種々の抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原の単一の決定基に対するものである。モノクローナル抗体は、その特異性に加え、その他の抗体が混入していないものを合成できる点が有利である。修飾語句「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体集団から得られているという抗体の特徴を示し、何らかの特定の方法による抗体の作製を必要とすることと解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って用いられるモノクローナル抗体は、Kohlerら、Nature、256:495(1975)によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製することができ、また組換えDNA法によって作製することもできる(例えば、米国特許第4,816,567号参照)。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Clacksonら、Nature、352:624〜628(1991)およびMarksら、J. Mol. Biol.、222:581〜597(1991)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【００３０】
「単離された」抗体とは、その天然環境の構成成分から同定、分離および/または回収されているものである。その天然環境の混入構成成分とは、抗体の診断的使用または治療的使用を干渉する可能性がある物質であり、これらとしては、酵素、ホルモンおよび他のタンパク性または非タンパク性溶質が挙げられる。好ましい実施形態では、抗体を、(1)末端または内部アミノ酸配列をスピニングカップシークエネーター(spinning cup sequenator)を用いて、抗体の重量で95%より高いことがローリー法によって測定されるまで、または(3)クマシーブルー、または好ましくは銀染色を用いる還元または非還元条件下でのSDS-PAGEによる均一性まで精製する。単離された抗体には、抗体の天然環境の少なくとも1種の構成成分は存在しないので、組換え細胞内のin situの抗体が含まれる。しかし、通常、単離された抗体は、少なくとも1つの精製ステップによって調製する。
【００３１】
「中和抗体」とは、標的抗原の、結合するものに対するエフェクター機能を消失させるかまたは大幅に減少させることができる抗体分子を意味する。したがって、「中和」抗CA IX抗体は、CA IX酵素活性などのエフェクター機能を消失させるかまたは大幅に減少させることができる。
【００３２】
「抗体依存性細胞媒介性細胞障害」および「ADCC」は、Fc受容体(FcR)を発現する非特異的細胞障害性細胞(例えば、ナチュラルキラー(NK)細胞、好中球およびマクロファージ)が、標的細胞に結合している抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介性反応を指す。ADCCを媒介する一次細胞、NK細胞はFcγRIIIのみを発現し、単球はFcγRI、FcγRIIおよびFcγRIIIを発現する。RavetchおよびKinet、Annu. Rev. Immunol 9:457〜92頁(1991)の464頁の表3に肝細胞でのFc発現がまとめられている。注目する分子のADCC活性を評価するには、in vitro ADCCアッセイ、例えば、米国特許第5,500,362号または同5,821,337号に記載されたものを実施することができる。かかるアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞(PBMC)およびナチュラルキラー(NK)細胞が挙げられる。あるいは、またはさらに、注目する分子のADCC活性は、in vivoで、例えば、Clynesら PNAS (USA) 95: 652〜656頁(1988)に開示されたものなどの動物モデルで評価することができる。
【００３３】
用語「可変」とは、可変ドメインのある部分が抗体間で配列において広範囲に異なっており、各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合および特異性に用いられるという事実を指す。しかし、可変性は、抗体の可変ドメイン中に均一に分布しているわけではない。軽鎖および重鎖可変ドメイン双方にある相補性決定領域(CDR)または超可変領域と呼ばれる3つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク(FR)と呼ばれている。未変性重鎖および軽鎖の可変ドメインは、各々4つのFR領域を含み、大部分はβシート立体配置を取り、ループ接続を形成し、またβシート構造の一部を形成することもある3つのCDRによって接続されている。各鎖中のCDRはFR領域によって極めて接近してまとまっており、他の鎖のCDRとともに抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabatら(1991)参照)。定常ドメインは、抗体と抗原の結合には直接的には関与しないが、種々のエフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞毒性における抗体の関与を示す。
【００３４】
「Fv」は、完全な抗原認識部位および結合部位を含む最小の抗体断片である。二本鎖Fv種では、この領域は、堅く、非共有結合によって会合した、1つの重鎖と1つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。一本鎖Fv種では、1つの重鎖と1つの軽鎖可変ドメインが、フレキシブルペプチドリンカーによって共有結合によって連結され、その結果、軽鎖と重鎖は、二本鎖Fv種におけるものと類似の「二量体」構造で会合できる。この立体配置では、各可変ドメインの3つのCDRが相互作用してVH-VL二量体の表面の抗原結合部位を規定する。合わせて、6個のCDRが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(すなわち抗原に対して特異的な3つのCDRのみを含む半分のFv)であっても、全結合部位よりも低い親和性ではあるが、抗原を認識し、結合する能力を有する。
【００３５】
本明細書中で用いられる場合には用語「超可変領域」は、抗原結合に与かる抗体のアミノ酸残基を指す。一般に、超可変領域は、「相補性決定領域」または「CDR」のアミノ酸残基(例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基24〜34(L1)、50〜62(L2)および89〜97(L3)ならびに重鎖可変ドメイン中の31〜55(H1)、50〜65(H2)および95〜102(H3);Kabatら、Sequences cf Proteins cf Immunological Interest、第5版、Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、MD.(1991))ならびに/または「超可変ループ」の残基(例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基26〜32(L1)、50〜52(L2)および91〜96(L3)ならびに重鎖可変ドメイン中の26〜32(H1)、53〜55(H2)および96〜101(H3);ChothiaおよびLesk J. Mol.Biol 196:901〜917(1987))を含む。「フレームワーク領域」または「FR」残基は、本明細書で定義された超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００３６】
本明細書中で用いられる場合、用語「相補性決定領域」または「CDR」は、特異的リガンドと接触し、その特異性を調べる免疫学的受容体の部分を指す。免疫学的受容体のCDRは、受容体に多様性を付与する、受容体タンパク質の最も可変性の部分であり、受容体の可変ドメインの末端の、3つのループが受容体の2つの可変ドメインの各々に由来する6個のループ上にある。
【００３７】
用語「エピトープ」は、(モノクローナルまたはポリクローナル)抗体に対する、タンパク質抗原上の結合部位を指すよう用いられる。
【００３８】
本明細書において、用語アミノ酸またはアミノ酸残基とは、変異体に関してさらに以下に記載したように、天然Lアミノ酸またはDアミノ酸を指す。本明細書では通常用いられるアミノ酸の一文字および三文字略語を用いている(Bruce Albertsら、Molecular Biology of the Cell, Garland Publishing, Inc.、New York (第3版1994))。
【００３９】
用語「病状」とは、細胞または身体機能、系、または器官の妨害、休止または疾患が起こっている細胞または哺乳類全体の生理学的状態を指す。
【００４０】
用語「治療する」または「治療」とは、治療的処置および予防的または防止的措置の双方を指し、目的は望ましくない生理学的変化または疾患、例えば、癌の発生または拡散を防ぐまたは減速させる(減少させる)ことである。本発明の目的上、有益なまたは所望の臨床結果としては、それだけには限らないが、検出可能または検出不可能にかかわらず、症候の軽減、疾病の範囲の縮小、安定化(すなわち、悪化しない)状態の疾病、疾病進行の遅延または減速化、病状の寛解または緩和、および緩解(部分的または全体的にかかわらず)が挙げられる。「治療」はまた、治療を受けない場合に予想される生存と比較した延命を意味することもある。治療を必要とするものとしては、すでに症状または疾患のあるものならびに症状または疾患にかかる傾向のあるものまたは症状または疾患が予防されるべきものが挙げられる。
【００４１】
「疾患」とは、本発明の治療から利益を得る可能性がある何らかの状態である。これには、哺乳類を問題の疾患にかかりやすくする病的状態を含めた慢性および急性疾患または疾病が含まれる。本明細書において治療されるべき疾患の例としては、それだけには限らないが、良性および悪性の腫瘍、白血病およびリンパ性悪性疾患、詳しくは、乳癌、結腸癌、卵巣癌、腎癌(renal cancer)、膵臓癌、胃癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓癌(kidney cancer)、結腸癌、甲状腺癌、膵臓癌、前立腺癌または膀胱癌が挙げられる。本発明にしたがって治療されるべき好ましい疾患としては、悪性腫瘍、例えば、子宮頸癌および子宮頸部扁平上皮内および腺管腫瘍、腎細胞癌(RCC)、食道腫瘍および上皮起源の癌腫がある。
【００４２】
治療目的上「哺乳類」とは、ヒト、家畜および動物園の動物、競技用動物または愛玩動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなどをはじめとする、哺乳類として分類されるいずれかの動物を指す。哺乳類はヒトであることが好ましい。
【００４３】
「リポフェクション」とは、遺伝子情報を標的組織に導入するための実用的な非ウイルス法を指す。非ウイルス法には、化学的方法または物理的方法の双方が含まれる。リポフェクションは、正に荷電している脂質と負に荷電しているDNAからなる静電気的に結合している複合体を、ベクターとして用い、これが細胞膜と融合し、DNAを細胞質に送達する。リポフェクションは、リポフェクションによる遺伝子情報のトランスファー効率がウイルスベクターによるよりも低いという点、および遺伝子の発現が一過性であるという点でウイルス法とは異なる。その代わりとして、脂質とDNAの複合体は、ウイルスベクターと比較すると、より安定で操作がより容易である。
【００４４】
「プラークアッセイ」は具体的には、単一の抗体産生性形質細胞の、標的細胞の死滅を惹起する能力を指す。例えば、B細胞は、T細胞の助けを借りて標的赤血球の表面に存在する抗原決定基に対してIgM抗体を分泌し、抗体赤血球結合をもたらす。適切な補体供給源の存在により、抗体で覆われた赤血球の適切な補体媒介性溶解が可能となり、その結果、寒天中に透明な領域すなわち「プラーク」の形成される。単一の抗体産生性形質細胞が各プラークの中心内に位置する。
【００４５】
B. 本発明を実施する方法
本発明の実施形態は、CA IX腫瘍抗原に対する抗体ならびにかかる抗体を作製および使用する方法および手段に関する。本発明は、腫瘍細胞マーカー、CA IX/MNの、腫瘍細胞進行において機能する能力に影響を及ぼす抗体を提供する。
【００４６】
一実施形態では、CA IXに対する抗体は、具体的には、CA IXの触媒ドメインに対するものである。CA IXの他の領域、例えば、接着ドメインに特異的ないくつかの抗体(Zavadaら、Br. J. Cancer、82(11):1808〜13(2000))は、CA IXに対して異なる影響を及ぼすので、かかる抗体をCA IXの触媒ドメインと特に結合するものと区別する方法を本明細書に記載する。一態様では、本発明は、かかる特異的にCA IXの触媒ドメインに対する抗体をスクリーニングする方法を含む。例えば、実施例2において以下に記載した実験は、CA IXの触媒ドメインに対するこのような特定の抗体をスクリーニングするために使用できる。具体的には、抗体の、CA IXの触媒機能をブロックするか、何らかの方法で、例えば、CA IXの細胞へのインターナリゼーションを促進し、その結果、CA IXが腫瘍細胞などの細胞表面でその触媒機能をもはや発揮できなくなることによってCA IXがその触媒機能を発揮するのを阻害する能力を測定するアッセイを含む。かかるアッセイは、触媒ドメインと結合し、CA IXの触媒活性に影響を及ぼす抗体を、異なる様式で機能する抗体と区別するために有用であり得る。さらなる態様では、CA IXの触媒ドメインと結合する抗体の結合のスクリーニングを、実施例2にさらに記載したELISAスクリーニングにおいてCA IXの触媒ドメイン(CD)を標的として用いて実施できる。
【００４７】
もう1つの特定の実施形態では、本発明の抗体は、疾病に対するヒト治療における使用を対象とする。疾病としては、腫瘍などの異常な細胞増殖を伴う疾病が挙げられる。より具体的には、疾病としては、生存および進行のためにCA IXの触媒活性に依存する疾病が挙げられる。本発明の特定の態様では、細胞増殖および進行、より具体的には、腫瘍細胞増殖、生存および進行におけるCA IX/MNの役割を阻害できる抗体に、異常な細胞増殖を特徴とするかかる疾病、詳しくは、腫瘍、腎細胞癌および子宮頸癌などの癌腫および癌の治療における用途がある。
【００４８】
1. 抗CA IX抗体の作製
本発明に従って用いる抗体を作製するための技術を例示するために記載を続ける。
【００４９】
(a)モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Kohlerら、Nature 256:495(1975)によって最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、または組換えDNA法(米国特許第4,816,567号)によって作製できる。
【００５０】
ハイブリドーマ法では、マウスまたは他の適当な宿主動物、例えば、ハムスターまたはマカク属のサルを、本明細書において先に記載したように免疫化して、免疫化に用いたタンパク質と特異的に結合する抗体を産生させるか、または産生可能なリンパ球を誘発する。あるいは、in vitroでリンパ球を免疫化することもできる。次いで、リンパ球、またはより好ましくは、B細胞に富むリンパ球を、電気的細胞融合法によって、または適した融合剤、例えば、ポリエチレングリコールを用いることによって骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を形成する(Goding、Monoclonal Antibodies:Principles and Practice、59〜103頁、[Academic Press、1996])。
【００５１】
このように調製したハイブリドーマ細胞を、融合していない、親骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する1種または複数の物質を含むことが好ましい、適した培養培地に播種し、増殖させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRTまたはHPRT)を欠く場合には、ハイブリドーマの培養培地は、通常、ヒポキサンチン、アミノプテリンンおよびチミジンを含み(HAT培地)、これらの物質がHGPRT欠損細胞の増殖を防ぐ。
【００５２】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生性細胞による抗体の安定な高レベル産生を支援し、かつ、HAT培地などの培地に感受性であるものである。これらの中では、好ましい骨髄腫細胞株として、マウス骨髄腫株、例えば、Salk Institute Cell Distribution Center、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国から入手可能なMOP-21およびMC-11マウス腫瘍由来のもの、およびAmerican Type Culture Collection、ロックビル、メリーランド州、米国から入手可能なSP-2またはX63-Ag8-653細胞がある。ヒトモノクローナル抗体を生産するための、ヒト骨髄腫およびマウス-ヒトヘテロミエローマ細胞株も記載されている(Kozbor,J. Immunol. 133:3001(1984)、Brodeurら、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications、51〜63頁、Marcel Dekker, Inc.、New York、[1987])。
【００５３】
ハイブリドーマ細胞が増殖している培養培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。ハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって、またはin vitro結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ(RIA)もしくは酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって測定することが好ましい。
【００５４】
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Munsonら、Anal. Biochem. 107:220 (1980)のスキャッチャード解析によって調べることができる。
【００５５】
所望の特異性、親和性および/または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、希釈手順を制限することによって細胞をサブクローニングし、標準法によって増殖させることができる(Goding、Monoclonal Antibodies: Principles and Practice、59〜103頁、Academic Press、1996)。この目的に適した培養培地としては、例えば、DMEMまたはRPMI-1640培地が挙げられる。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物内で腹水腫瘍としてin vivoで増殖できる。
【００５６】
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体を、例えば、タンパク質A-セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順によって、培養培地、腹水液または血清から適切に分離する。
【００５７】
モノクローナル抗体をコードするDNAは、従来手順を用いて(例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって)容易に単離され、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、かかるDNAの好ましい供給源として働く。単離すると、DNAは発現ベクター中に入れることができ、次いで、これを、そうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない、大腸菌(E. coli)細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞または骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトして、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を獲得する。DNAはまた、例えば、非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列のすべてまたは一部を免疫グロブリンコード配列と共有結合によって結合させることによって修飾できる。本明細書ではそのようにして、抗CA IXモノクローナル抗体の結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」抗体を調製する。
【００５８】
通常、かかる非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインと置換するか、本発明の抗体の一方の抗原結合部位の可変ドメインと置換して、CA IXに対して特異性を有する一方の抗原結合部位と、異なる抗原に対して特異性を有するもう一方の抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作製する。
【００５９】
キメラまたはハイブリッド抗体はまた、架橋剤を含むものをはじめとする合成タンパク質化学における既知の方法を用いてin vitroで調製できる。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を用いて、またはチオエーテル結合を形成することによって構築できる。この目的に適した試薬の例としては、イミノチオレート(iminothiolate)およびメチル-4-メルカプトブチルイミデートが挙げられる。
【００６０】
(b)ヒト抗体
ヒトmAbの作製に同様の技術を用いる試みは、適したヒト骨髄腫細胞株がないことによって阻まれてきた。最良の結果は、融合パートナーとしてヘテロミエローマ(マウス×ヒトハイブリッドミエローマ)を用いて得られた(Kozbor、J. Immunol. 133:3001(1984)、Brodeurら、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications、51〜63頁、Marcel Dekker, Inc.、New York、1987)。あるいは、ヒト抗体分泌性細胞は、エプスタインバーウイルス(EBV)に感染させることによって不死化することができる。しかし、EBV感染細胞はクローニングするのが難しく、通常、比較的低収量の免疫グロブリンしか産生しない(JamesおよびBell, J. Immunol. Methods 100: 5〜40頁[1987])。将来、ヒトB細胞の不死化が、所定の組合せのトランスフォーミング遺伝子を導入することによって達成される可能性がある。かかる可能性は、テロメラーゼ触媒サブユニットの発現は、SV40大型TオンコプロテインおよびH-rasの発癌性対立遺伝子とともに、正常ヒト上皮細胞および線維芽細胞の腫瘍化変換をもたらすことが最近証明された(Hahnら、Nature 400:464〜468頁[1999])ことによって強調されている。
【００６１】
今では、免疫化すると、内因性免疫グロブリン産生の不在下でヒト抗体のレパートリーを産生可能であるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作製することが可能である(Jakobovitsら、Nature 362:255〜258頁[1993]、LonbergおよびHuszar、Int. Rev. Immunol. 13:65〜93頁[1995]、Fishwildら、Nat. Biotechnol. 14:845〜851頁[1996]、Mendezら、Nat. Genet. 15:146〜156頁[1997]、Green、J. Immunol. Methods 231:11〜23頁[1999]、Tomizukaら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722〜727頁[2000]、Littleら、Immunol. Today 21:364〜370頁[2000]に概説されたもの)。例えば、キメラおよび生殖系列突然変異マウスにおける抗体重鎖結合領域(JH)遺伝子のホモ接合性欠失は内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている(Jakobovitsら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551〜2555頁[1993])。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの、かかる生殖系列突然変異マウスへの導入は、抗原チャレンジするとヒト抗体の産生をもたらす(Jakobovitsら、Nature 362:255〜258頁[1993])。
【００６２】
Mendezら(Nature Genetics 15:146〜156頁[1997])は、抗原でチャレンジされると高親和性完全ヒト抗体を産生する「ゼノマウス(登録商標)II」と呼ばれるトランスジェニックマウスの系統を作製した。これはメガベースのヒト重鎖および軽鎖遺伝子座を、前記のように内因性JHセグメントに欠失を含むマウスに生殖系列組み込みすることによって達成された。ゼノマウス(登録商標)IIは、約66のVH遺伝子、完全DHおよびJH領域および3つの異なる定常領域(μ、δおよびγ)を含む1020kbのヒト重鎖遺伝子座を保持し、また、32のVκ遺伝子、JκセグメントおよびCκ遺伝子を含む800kbのヒトκ遺伝子座も保持する。これらのマウスで産生された抗体は、ヒトにおいて見られるものと、遺伝子再構成、アセンブリーおよびレパートリーをはじめとするすべての点で酷似している。ヒト抗体が、マウス遺伝子座の遺伝子再構成を妨げる内因性JHセグメントにおける欠失のために内因性抗体を上回って発現されることが好ましい。
【００６３】
かかるゼノマウスは、特定の注目する抗原を用いて免疫化できる。かかる免疫化動物由来の血清を、最初の抗原に対する抗体応答性についてスクリーニングすることができる。リンパ球は、リンパ節または脾細胞から単離することができ、さらに、CD138ネガティブかつCD19+細胞について選択することによってB細胞について選択することができる。一態様では、先に詳述したように、かかるB細胞培養物(BCC)を、骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを作製することができる。もう1つの態様では、かかるB細胞培養物をさらに、最初の抗原、好ましくはCA IXタンパク質に対する応答性についてスクリーニングすることができる。かかるスクリーニングとしては、CA IX-Hisタンパク質を用いるELISA、注目する抗原と結合する既知の抗体、例えば、抗体G250と、全長CA IXを発現する一過性にトランスフェクトされたCHOまたは他の細胞とのin vitro結合を用いる競合アッセイが挙げられる。かかるスクリーニングは実施例においてさらに記載する。注目する抗体を分泌する単一のB細胞を単離するためには、CA IX特異的溶血プラークアッセイを実施する。溶解の標的とされる細胞は、CA IX抗原で覆われたヒツジ赤血球(SRBC)であることが好ましい。注目する免疫グロブリンを分泌するB細胞培養物および補体の存在下では、プラークの形成が、標的細胞の特異的CA IX媒介性溶解を示す。プラークの中心にある単一の抗原特異的形質細胞を単離し、mRNAの単離に使用することできる。逆転写酵素PCRを用いることで、分泌された抗体の可変領域をコードするDNAをクローニングすることができる。次いで、このようにクローニングされたDNAを、さらに、適した発現ベクター、好ましくは、pcDNAなどのベクターカセット、より好ましくは、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の定常ドメインを含むpcDNAベクターに挿入することができる。作製したベクターは次いで、宿主細胞、好ましくは、CHO細胞にトランスフェクトし、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために、必要に応じて改変された従来の栄養培地で培養することができる。
【００６４】
トランスフェクションとは、何らかのコード配列が実際に発現されるか否かに関わらず、宿主細胞によって発現ベクターが取り込まれることを指す。当業者には多数のトランスフェクション法、例えば、CaPO4沈殿およびエレクトロポレーションが知られている。通常、トランスフェクションの成功は、宿主細胞内にこのベクターの働きについての何らかの指標が生じた時に認識される。
【００６５】
特定の一実施形態では、本発明は、以下のCDR(Kabatら、Sequences cf Proteins cf Immunological Interest、第5版、NIH Publication 91〜3242、ベテスダ、メリーランド州(1991)、第1〜3巻によって規定されたような): (a)配列番号2-6、24-29 125、130、133、142、150のアミノ酸26から35、配列番号30のアミノ酸20から29、配列番号8-19、22、128、136、137、146もしくは153のアミノ酸26から37、配列番号21のアミノ酸24から35、配列番号71-73、77もしくは79のアミノ酸31から35、または配列番号75のアミノ酸31から37の配列を有するCDR1;(b)配列番号2-6のアミノ酸50から65、配列番号8-19もしくは22のアミノ酸52から67、配列番号21のアミノ酸50から65、配列番号24-29のアミノ酸50から65、配列番号30のアミノ酸44から59、配列番号71-73、77もしくは79のアミノ酸50から65、配列番号75、128、146もしくは153のアミノ酸52から67、配列番号136のアミノ酸52から69、配列番号137のアミノ酸52から69、または配列番号125、130、133、142もしくは150のアミノ酸50から66の配列を有するCDR2、および/あるいは(c)配列番号2、4もしくは5のアミノ酸98から109、配列番号3もしくは6のアミノ酸98から111、配列番号8、11もしくは16のアミノ酸100-114、配列番号9、10、12、17、18もしくは19のアミノ酸100-112、配列番号13のアミノ酸100-109、配列番号14のアミノ酸100-116、配列番号15のアミノ酸100-111、配列番号21のアミノ酸98から104、配列番号22のアミノ酸100-106、配列番号24、25、26、29のアミノ酸98から111、配列番号27のアミノ酸98から113、配列番号28のアミノ酸98から112、配列番号30のアミノ酸92から107、配列番号71-73のアミノ酸98から111、配列番号75のアミノ酸100から113、配列番号77のアミノ酸98から105、配列番号79のアミノ酸98から107、配列番号136もしくは137のアミノ酸102から109、配列番号128のアミノ酸100から109、配列番号153のアミノ酸100から114、配列番号130のアミノ酸99から109、配列番号150のアミノ酸99から116、配列番号133のアミノ酸99から115、配列番号125のアミノ酸99から113、配列番号142のアミノ酸99から106、または配列番号146のアミノ酸100から111の配列を有するCDR3のうちの少なくとも1つを含む、ヒト抗CA IXモノクローナル抗体重鎖またはその断片を含む。本発明の範囲はまた、かかる抗CA IXモノクローナル抗体の重鎖可変ドメインに及ぶ。かかる重鎖可変ドメインは、配列番号2〜6、8〜10、21〜22、24〜30、71〜73、75、77、79、136、128、153、137、130、150、133、125、142または146の全配列を含み得る。
【００６６】
さらにもう1つの態様では、本発明は、以下のCDR: (a)配列番号32-34のアミノ酸23から39、配列番号36-46のアミノ酸24から35、配列番号48-58、60-64、66-69のアミノ酸24から34、配列番号81-83のアミノ酸24から35、または配列番号85、87、もしくは89アミノ酸24から34、または配列番号162もしくは168のアミノ酸24から39の配列を有するCDR1(b)配列番号32-34のアミノ酸55から61、配列番号36-46のアミノ酸51から57、配列番号48-58、60-64もしくは66-69のアミノ酸50から56、配列番号81-83のアミノ酸51から57、配列番号85、87もしくは89のアミノ酸50から56、または配列番号162もしくは168のアミノ酸55から61の配列を有するCDR2、および/あるいは(c)配列番号32-34のアミノ酸94から102、配列番号36、38、40、44、45のアミノ酸90から97、配列番号37、39、42、43のアミノ酸90から98、配列番号41もしくは46のアミノ酸90から99、配列番号48-58のアミノ酸88から96、配列番号60-64もしくは66-69のアミノ酸89から97、配列番号81-83のアミノ酸90から97、配列番号85、87もしくは89のアミノ酸89から96、配列番号162のアミノ酸94から103、または配列番号168のアミノ酸94から102の配列を有するCDR3を含む、抗ヒトCA IXモノクローナル抗体軽鎖またはその断片を提供する。本発明の範囲はまた、かかる抗CA IXモノクローナル抗体の軽鎖可変ドメインに及ぶ。かかる軽鎖可変ドメインは、配列番号32〜34、36〜66、48〜58、60〜64、66〜69、81〜83、85、87、89、162または168の全配列を含み得る。
【００６７】
さらなる態様では、本発明は、(A)以下のCDR: (a)配列番号2-6、24-29 125、130、133、142、150のアミノ酸26から35、配列番号30のアミノ酸20から29、配列番号8-19、22、128、136、137、146もしくは153のアミノ酸26から37、配列番号21のアミノ酸24から35、配列番号71-73、77もしくは79のアミノ酸31から35、または配列番号75のアミノ酸31から37の配列を有するCDR1;(b)配列番号2-6のアミノ酸50から65、配列番号8-19もしくは22のアミノ酸52から67、配列番号21のアミノ酸50から65、配列番号24-29のアミノ酸50から65、配列番号30のアミノ酸44から59、配列番号71-73、77もしくは79のアミノ酸50から65、配列番号75、128、146もしくは153のアミノ酸52から67、配列番号136のアミノ酸52から69、配列番号137のアミノ酸52から69、または配列番号125、130、133、142もしくは150のアミノ酸50から66の配列を有するCDR2、および/あるいは(c)配列番号2、4もしくは5のアミノ酸98から109、配列番号3もしくは6のアミノ酸98から111、配列番号8、11もしくは16のアミノ酸100-114、配列番号9、10、12、17、18もしくは19のアミノ酸100-112、配列番号13のアミノ酸100-109、配列番号14のアミノ酸100-116、配列番号15のアミノ酸100-111、配列番号21のアミノ酸98から104、配列番号22のアミノ酸100-106、配列番号24、25、26、29のアミノ酸98から111、配列番号27のアミノ酸98から113、配列番号28のアミノ酸98から112、配列番号30のアミノ酸92から107、配列番号71-73のアミノ酸98から111、配列番号75のアミノ酸100から113、配列番号77のアミノ酸98から105、配列番号79のアミノ酸98から107、配列番号136もしくは137のアミノ酸102から109、配列番号128のアミノ酸100から109、配列番号153のアミノ酸100から114、配列番号130のアミノ酸99から109、配列番号150のアミノ酸99から116、配列番号133のアミノ酸99から115、配列番号125のアミノ酸99から113、配列番号142アミノ酸99から106、または配列番号146のアミノ酸100から111の配列を有するCDR3を含む、少なくとも1つの重鎖またはその断片および/または(B)以下のCDR: (a)配列番号32-34のアミノ酸23から39、配列番号36-46のアミノ酸24から35、配列番号48-58、60-64、66-69のアミノ酸24から34、配列番号81-83のアミノ酸24から35、または配列番号85、87、もしくは89のアミノ酸24から34、または配列番号162もしくは168のアミノ酸24から39の配列を有するCDR1(b)配列番号32-34のアミノ酸55から61、配列番号36-46のアミノ酸51から57、配列番号48-58、60-64もしくは66-69のアミノ酸50から56、配列番号81-83のアミノ酸51から57、配列番号85、87もしくは89のアミノ酸50から56、または配列番号162もしくは168のアミノ酸55から61の配列を有するCDR2、および/あるいは(c)配列番号32-34のアミノ酸94から102、配列番号36、38、40、44、45のアミノ酸90から97、配列番号37、39、42、43のアミノ酸90から98、配列番号41もしくは46のアミノ酸90から99、配列番号48-58のアミノ酸88から96、配列番号60-64もしくは66-69のアミノ酸89から97、配列番号81-83のアミノ酸90から97、配列番号85、87もしくは89のアミノ酸89から96、配列番号162のアミノ酸94から103、または配列番号168のアミノ酸94から102の配列を有するCDR3を含む、少なくとも1つの軽鎖またはその断片とを含む抗ヒトCA IXモノクローナル抗体を提供する。一態様では、本発明は、AB-MN-21.5.2、AB-MN-21.6.1、AB-MN-22.7、AB-MN-22.8.1、AB-MN-21.17.1、AB-MN-21.8.1、AB-MN-22.11、AB-MN-22.19、AB-MN-22.26、AB-MN-22.27、AB-MN-22.3、AB-MN-22.4、AB-MN-22.5、AB-MN-22.9、AB-MN-21.2.1、AB-MN-21.7.1、AB-MN-22.10、AB-MN-22.14、AB-MN-22.18、AB-MN-22.20、AB-MN-22.21、AB-MN-22.24、AB-MN-22.25、AB-MN-22.28.1、AB-MN-22.30、AB-MN-21.1.1、AB-MN-21.14.1、AB-MN-22.12、AB-MN-22.17、AB-MN-22.29、AB-MN-21.9.1、AB-MN-22.15、AB-MN-22.16、AB-MN-22.23、AB-MN-22.17.1、AB-MN-21.10.1、AB-MN-22.10、AB-MN-22.14、AB-MN-22.20、AB-MN-22.24、AB-MN-22.28.1、AB-MN-22.30、AB-MN-22.7、AB-MN-21.8.1、AB-MN-22.4およびAB-MN-22.13.1(ここで、「AB-MN-21」および「AB-MN-22」表示は、抗体が、それぞれCA IX抗原を用いて免疫化したIgG1ゼノマウスまたはIgG2ゼノマウスから単離されたという事実を表す)などの生じた抗体を含む。B細胞は免疫化したゼノマウスから単離し、in vitroで培養するか骨髄腫細胞と融合した。先に記載したように、B細胞培養物の上清を、CA IX抗体について解析した。ロゼットアッセイを用いることで、所望の抗CA IX抗体を作製する一B細胞を同定し、RNAを単離した。所望の抗体をコードするmRNAをクローニングし、CHO細胞で発現させた。別法として、骨髄腫融合物由来の抗体含有上清を、ELISAアッセイを用いて直接スクリーニングした。「AB-MN-21」または「AM-MN-22」に続く数字、例えば、「AB-MN-21.5.2」中の「21.5.2」は、IgG1ゼノマウス由来のハイブリドーマ細胞から同定された配列と関連がある。表示AB-MN22_は、配列がIgG2免疫化マウス由来のハイブリドーマ由来であったことを示す。さらに、「AX014H」に続く数字、例えば、「AX014H21_5_2」中の「21_5_2」はまた、単一の細胞「21.5.2」として同定された配列と関連がある。本発明は、抗体、例えば、AB-MN-XG2-109、AB-MN-XG2-051、AB-MN-XG2-023、AB-MN-XG1-080、AB-MN-XG1-141、AB-MN-XG1-174、AB-MN-XG2-109、AB-MN-XG2-051およびAB-MN-XG2-023をさらに含む。「XG1」および「XG2」抗体は、CA IXを用いて免疫化したゼノマウスからリンパ球を採取することによって得た。先に記載したように、リンパ球を骨髄腫細胞と融合してCA IX抗体を発現するハイブリドーマを作製した。AB-MN-XG1-109およびAB-MN-XG2-109の可変領域中のCDRおよびFR領域は同一である。AB-MN-XG1-051およびAB-MN-XG2-051の可変領域中のCDRおよびFR領域は同一である。AB-MN-XG1-023およびAB-MN-XG2-023の可変領域中のCDRおよびFR領域は同一である。
【００６８】
(1)ハイブリドーマ由来の抗体
V、Dおよび部分J領域を含む、重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、AB-MN-21.5.2についてはそれぞれ図3A-3Bに示す配列番号9および図8に示す配列番号32、AB-MN-21.6.1についてはそれぞれ図3に示す配列番号10および図8に示す配列番号33、についてはそれぞれAB-MN-22.8.1図6に示す配列番号30および図10に示す配列番号36、AB-MN-21.17.1についてはそれぞれ図1に示す配列番号2および図10に示す配列番号37、AB-MN-22.11についてはそれぞれ図3に示す配列番号13および図10に示す配列番号39、AB-MN-22.19についてはそれぞれ図1に示す配列番号3および図10に示す配列番号40、AB-MN-21.6.1についてはそれぞれ図3に示す配列番号10および図8に示す配列番号33、AB-MN-22.26についてはそれぞれ図6に示す配列番号28および図10に示す配列番号41、AB-MN-22.27についてはそれぞれ図6に示す配列番号29および図10に示す配列番号42、AB-MN-22.3についてはそれぞれ図1に示す配列番号5および図10に示す配列番号43、AB-MN-22.5についてはそれぞれ図1に示す配列番号6および図10に示す配列番号45、ならびにAB-MN-22.9についてはそれぞれ図3に示す配列番号19 および図10に示す配列番号46で表される。
【００６９】
重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、AB-MN-21.2.1についてはそれぞれ図3A-3Bに示す配列番号8および図12に示す配列番号48、AB-MN-21.7.1についてはそれぞれ図3A-3Bに示す配列番号11および図12に示す配列番号49、AB-MN-22.18についてはそれぞれ図3A-3Bに示す配列番号16および図12に示す配列番号52、AB-MN-22.21についてはそれぞれ図3A-3Bに示す配列番号17および図12に示す配列番号54、AB-MN-22.25についてはそれぞれ図5に示す配列番号22および図12に示す配列番号56で表される。
【００７０】
重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、AB-MN-21.1.1についてはそれぞれ図6に示す配列番号24および図14に示す配列番号60、AB-MN-21.14.1についてはそれぞれ図6に示す配列番号25および図14に示す配列番号61、AB-MN-22.12についてはそれぞれ図6に示す配列番号26および図16に示す配列番号62、ならびにAB-MN-22.17についてはそれぞれ図6に示す配列番号27および図16に示す配列番号63で表される。
【００７１】
重鎖および軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、AB-MN-21.9.1についてはそれぞれ図3A-3Bに示す配列番号12および図16に示す配列番号66、AB-MN-22.15についてはそれぞれ図3A-3Bに示す配列番号14および図16に示す配列番号67、AB-MN-22.16についてはそれぞれ図3A-3Bに示す配列番号15および図16に示す配列番号68、AB-MN-22.23については図3A-3Bに示す配列番号18、AB-MN-22.29についてはそれぞれ図1に示す配列番号4および図14に示す配列番号69、AB-MN-22.17.1についてはそれぞれ配列番号102および配列番号103、AB-MN-21.10.1についてはそれぞれ図5に示す配列番号21および図28A-Bに示す配列番号162、ならびにAB-MN-22.13.1についてはそれぞれ図27A-Bに示す配列番号146および図29A-Bに示す配列番号168で表される。
【００７２】
軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、AB-MN-22.10については図12に示す配列番号50、AB-MN-22.14については図12に示す配列番号51、AB-MN-22.20については図12に示す配列番号53、AB-MN-22.24については図12に示す配列番号55、AB-MN-22.28.1については図12に示す配列番号57、AB-MN-22.30については図12に示す配列番号58、AB-MN-22.7については図8に示す配列番号34、AB-MN-21.8.1については図10に示す配列番号38、およびAB-MN-22.4については図10に示す配列番号44で表される。
【００７３】
重鎖可変領域のアミノ酸配列は、AB-MN-22.10、AB-MN-22.14、AB-MN-22.20、AB-MN-22.24、AB-MN-22.28.1、AB-MN-22.30、AB-MN-22.7、AB-MN-21.8.1およびAB-MN-22.4についてはそれぞれ図26A-Bに示す配列番号136、図26A-Bに示す配列番号128、図27A-Bに示す配列番号153、図26A-Bに示す配列番号137、図26A-Bに示す配列番号130、図27A-Bに示す配列番号150、図26A-Bに示す配列番号133、図26A-Bに示す配列番号125、図26Aに示す配列番号142で表される。
【００７４】
VH4-4、VH4-31、VH4-39およびVH4-59のVγ/D/Jの生殖系列配列の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、それぞれ図1に示す配列番号1、図3A-3Bに示す配列番号7、図5に示す配列番号20および図6に示す配列番号23で表される。VK-A19、VK-A27、VK-A30、VK-L5およびVK-O12のVκ/Jの生殖系列配列の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、それぞれ図8に示す配列番号31、図10に示す配列番号35、図12に示す配列番号47、図14に示す配列番号59および図16に示す配列番号65で表される。
【００７５】
AB-MN-22.13.1の、シグナルペプチドおよびさらなるカルボキシ末端配列を含む、重鎖可変ドメインのアミノ酸配列およびコードするヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号169および170で表されている。AB-MN-22.8.1の、さらなるカルボキシ末端配列を含む、重鎖可変ドメインのアミノ酸配列およびコードするヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号171および172で表されている。AB-MN-21.10.1の、さらなるカルボキシ末端配列を含む、重鎖可変ドメインのアミノ酸配列およびコードするヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号173および174で表されている。AB-MN-22.28.1の、さらなるカルボキシ末端配列を含む、重鎖可変ドメインのアミノ酸配列およびコードするヌクレオチド配列は、それぞれ配列番246および245で表されている。
【００７６】
AB-MN-22.13.1の、シグナルペプチドおよびさらなるカルボキシ末端配列を含む、軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列およびコードするヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号175および176で表されている。AB-MN-22.8.1の、さらなるカルボキシ末端配列を含む、軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列およびコードするヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号177および178で表されている。AB-MN-22.10.1の、シグナルペプチドおよびさらなるカルボキシ末端配列を含む、軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列およびコードするヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号179および180で表されている。AB-MN-22.28.1の、シグナルペプチドおよびさらなるカルボキシ末端配列を含む、軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列およびコードするヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号245および237で表されている。
【００７７】
重鎖および軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、AB-MN-21.14.1についてはそれぞれ配列番号181および213、AB-MN-21.17.1についてはそれぞれ配列番号182および214、AB-MN-21.1.1についてはそれぞれ配列番号183および215、AB-MN-21.2.1についてはそれぞれ配列番号184および216、AB-MN-21.5.2についてはそれぞれ配列番号185および217、AB-MN-21.6.1についてはそれぞれ配列番号186および218、AB-MN-21.7.1についてはそれぞれ配列番号187および219、AB-MN-21.8.1についてはそれぞれ配列番号188および220、AB-MN-21.9.1についてはそれぞれ配列番号189および221、AB-MN-22.10についてはそれぞれ配列番号190および222、AB-MN-22.11についてはそれぞれ配列番号191および223、AB-MN-22.12についてはそれぞれ配列番号192および224、AB-MN-22.14についてはそれぞれ配列番号193および225、AB-MN-22.15についてはそれぞれ配列番号194および226、AB-MN-22.16についてはそれぞれ配列番号195および227、AB-MN-22.17についてはそれぞれ配列番号196および228、AB-MN-22.18についてはそれぞれ配列番号197および229、AB-MN-22.19についてはそれぞれ配列番号198および230、AB-MN-22.20についてはそれぞれ配列番号199および231、AB-MN-22.21についてはそれぞれ配列番号200および232、AB-MN-22.23についてはそれぞれ配列番号201および233、AB-MN-22.24についてはそれぞれ配列番号202および234、AB-MN-22.25についてはそれぞれ配列番号203および235、AB-MN-22.26についてはそれぞれ配列番号204および236、AB-MN-22.27についてはそれぞれ配列番号116および117、AB-MN-22.28.1についてはそれぞれ配列番号205および237、AB-MN-22.29についてはそれぞれ配列番号206および238、AB-MN-22.30についてはそれぞれ配列番号207および239、AB-MN-22.3についてはそれぞれ配列番号208および240、AB-MN-22.4についてはそれぞれ配列番号209および241、AB-MN-22.5についてはそれぞれ配列番号210および242、AB-MN-22.7についてはそれぞれ配列番号211および243、AB-MN-22.9についてはそれぞれ配列番号212および244で表される。重鎖および軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、AB-MN-22.27についてはそれぞれ配列番号116および117、ならびにAB-MN-22.17.1についてはそれぞれ配列番号118および119で表される。
【００７８】
特定の生殖系列再構成を有する抗CA IX抗体、例えば、Vγ/D/J生殖系列配列のVH4-4、VH4-31およびVH4-59の階層を表す樹状図を、それぞれ図2、4、7に示し、Vκ/J生殖系列配列のVK-A19、VK-A27、VK-A30、VK-L5およびVK-O12を、それぞれ図9、11、13、15および17に示す。
【００７９】
(2)ゼノマックス(XenoMax)由来の抗体
以下のシグナル配列を有する重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、AB-MN-XG1-080についてはそれぞれ配列番号71および81、AB-MN-XG1-141についてはそれぞれ配列番号72および82、AB-MN-XG1-174についてはそれぞれ配列番号73および83、AB-MN-XG1-23についてはそれぞれ配列番号75および85、AB-MN-XG1-51についてはそれぞれ配列番号77および87、ならびにAB-MN-XG1-109についてはそれぞれ配列番号79および89で表される。Vγ/D/J生殖系列配列のVH4-59/D3-3/JH6b、VH4-30.1/D3-9/JH5b、VH3-21/D5-18/JH4bおよびVH4-04/D1-20/JH6bの重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、それぞれ、図18中の配列番号70、74、76および78で示されるように表される。Vκ/J生殖系列配列のA27/JK4、L19/JK1、A20/JK1およびO2/JK3の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、図19中の配列番号80、84、86および88で示されるように表される。
【００８０】
AB-MN-XG1-080、AB-MN-XG1-141、AB-MN-XG1-174、AB-MN-XG1-023、AB-MN-XG1-051およびAB-MN-XG1-109の全重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号90、92、94、96、98および100で表される。AB-MN-XG1-080、AB-MN-XG1-141、AB-MN-XG1-174、AB-MN-XG1-023、AB-MN-XG1-051およびAB-MN-XG1-109の全重鎖可変ドメインのヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号104、106、108、110、112および114で表される。
【００８１】
AB-MN-XG1-080、AB-MN-XG1-141、AB-MN-XG1-174、AB-MN-XG1-023、AB-MN-XG1-051およびAB-MN-XG1-109の全軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号91、93、95、97、99および101で表される。AB-MN-XG1-080、AB-MN-XG1-141、AB-MN-XG1-174、AB-MN-XG1-023、AB-MN-XG1-051およびAB-MN-XG1-109の全重鎖可変ドメインのヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号105、107、109、111、113、および115で表される。
【００８２】
2.所望の特性を有する抗体のスクリーニング
(i)CA IX抗原との結合
したがって、例えば、本発明の抗CA IX抗体は、B細胞培養物またはハイブリドーマ上清を、マイクロタイタープレートと結合している、CA IXの細胞外ドメイン(アミノ酸1〜413)由来の精製タンパク質とともにインキュベートすることによって同定できる。特異的結合は、洗浄し、HRPコンジュゲートヤギ抗ヒトFc抗体を添加し、OD492nmに設定したプレートリーダーを用いて光学濃度を測定した後に検出することができる。
【００８３】
もう1つの実施形態では、B細胞培養物またはハイブリドーマ上清を、トリプシン処理し、ディッシュに播種しておいた、全長MN、より好ましくは、MNの触媒ドメインを用いて一過性にリポフェクションされたCHO細胞とともにインキュベートすることができる。洗浄後、続いて、抗ヒトIgG Fcに特異的な二次標識抗体をインキュベートして、蛍光顕微鏡に観察よる結合の可視化を可能にする。
【００８４】
一実施形態では、結合アッセイは、候補抗体の、既知の抗CA IX抗体、例えば、G250と競合する能力を評価する競合結合アッセイである。このアッセイは、以下の実施例にも例示されるELISA形式をはじめ、種々の形式で実施することができる。
【００８５】
当技術分野で公知の適した競合結合アッセイはいずれも、候補抗CA IXモノクローナル抗体の、CA IX抗原との結合について抗G250抗体と競合する能力を特性決定するために使用できる。通常の競合アッセイは、Antibodies:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、HarlowおよびDavid Lane編(1988)に記載されている。もう1つの実施形態では、以下の実施例2に記載したCA IX結合性ELISAアッセイを、候補抗体とG250などの別の既知のCA IX結合性抗体間のCA IX結合競合を用いるよう改変することが可能であり得る。かかるアッセイは、CA IXをマイクロタイタープレート上に層状にし、層状プレートを、選択濃度の標識したG250と混合した未標識抗CA IX抗体または未標識対照抗体の段階希釈物とともにインキュベートし、G250抗体標識からのシグナルを検出および測定し、次いで、抗体の種々の希釈物によって示されたシグナル測定値を比較することによって実施することが可能であり得る。
【００８６】
(ii)CA IXの生物活性の阻害
腫瘍におけるCA IXなどの炭酸脱水酵素の重要な役割としては、腫瘍生存または進行における役割が挙げられる。CA IXの触媒活性としては、CO2とH2Oの炭酸への変換が挙げられる。対応する正常組織にはない、一次癌腫細胞株および悪性組織におけるCA IXの存在は、腫瘍進行におけるCA IXの酵素活性の潜在的に可能な役割、より具体的には、腫瘍細胞の、特徴的な細胞外アシドーシスおよび細胞内アルカローシスの維持における役割を示唆する。この低い細胞外pHは、腫瘍細胞を免疫細胞の浸潤および破壊能力から保護するよう働き得る。したがって、抗CA IX抗体によるCA IXの阻害は、腫瘍を、免疫系の正常防御特性に対して、ならびに他の標準的な化学療法または抗体ベースの腫瘍治療に対してより感受性にさせ得る。
【００８７】
一実施形態では、本発明の抗体を、CA IXの炭酸脱水酵素活性を阻害する能力を評価するために分光光度的アッセイに付す。例えば、CA IXの基質、CO2およびH2Oを、CA IXの存在下または不在下(対照)でフェノールレッドとともにインキュベートする。558nmでの溶液の吸収を、分光光度計によって測定する。CO2の完全水和および赤から黄色への溶液の変換のための時間の相違を、558nmでの吸収に付随する変化によって調べることができる。対照と対照およびCA IX酵素との間の相違により、炭酸脱水酵素の活性が示される。候補抗体の、CA IX酵素活性に対する作用を調べるには、CA IX基質を加える前に抗体をCA IXとともにインキュベートする。
【００８８】
もう1つの実施形態では、本発明の抗体を、腫瘍進行部位で正常なCA IX活性を混乱させる能力について調べる。正常なCA IX活性としては、水と二酸化炭素を炭酸に変換する酵素活性が挙げられる。本来腫瘍細胞表面に存在するCA IXのインターナリゼーションによって、酵素のその正常な機能を発揮する能力がブロックされる。したがって、インターナリゼーション後のCA IX活性の除去は、腫瘍を免疫系ならびに他の化学療法または抗体ベースの腫瘍治療に対してより感受性にさせ得る。候補抗CA IX抗体をインターナリゼーションについてスクリーニングすることは、細胞、例えば、SKRC10細胞とともにインキュベートすることによって実施することが好ましい。標識した二次抗体を加え、細胞を37℃に移すことによってインターナリゼーションが開始される。細胞表面とインターナライズされた抗CA IX抗体のレベルを、蛍光顕微鏡観察によって調べる。
【００８９】
もう1つの実施形態では、細胞の増殖の混乱が、腫瘍治療における抗CA IX細胞のもう1つの潜在的に可能な用途である。抗CA IX抗体の抗増殖性作用は、疾病進行にとって重要な、腫瘍または癌細胞の増殖を阻害するのに有用である可能性がある。本発明の抗CA IX抗体の、内因性CA IXを発現する細胞、例えば、ヒーラ(HeLa)またはMDA468の細胞増殖に対する作用を調べるために、ミトコンドリア機能の完全性についてアッセイする。適切なミトコンドリア機能を有する代謝的に活性な細胞は、基質MTSテトラゾリウム化合物(ProMega)を、組織培養培地に可溶性であり、490nmに特徴的な吸光度を有する着色産物に還元することができる。この変換は、おそらくは、代謝的に活性な細胞中でデヒドロゲナーゼ酵素によって生じたNADPHまたはNADHによって達成される。かかるCA IX発現細胞のミトコンドリア機能の低下は、ストレス性条件下での細胞生存度の低下をもたらし得る。
【００９０】
(iii)ADCCの媒介
抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ADCC)とは、抗体に覆われた標的細胞を、結合している抗体のFc領域を認識するFc受容体を含む細胞によって死滅させることである。ほとんどのADCCは、その表面にFc受容体FcγRIIIまたはCD16を有するナチュラルキラー(NK)細胞によって媒介される。本抗CA IX抗体の、ADCCを媒介する能力は、腫瘍治療として有用であり得る。一実施形態では、標的細胞、例えば、HT-29またはSK-RC-52細胞、ヒト腎細胞癌細胞株を蛍光ユーロピウム(EuDTPA)で標識する。候補抗体は希釈し、マイクロタイタープレートに等分した。標的細胞は、エフェクター末梢血単核細胞(PMBC)を加える前に抗体とともに一定期間インキュベートすることが好ましい。抗CA IX細胞の、PBMCの応答を誘導することによってかかる標的細胞の溶解を誘導する能力を、EuDTPAの上清への放出によって、マルチラベルカウンターを用いて測定する。
【００９１】
3.抗CA IX抗体の治療用組成物および投与
本発明の抗CA IX抗体の治療用製剤を、所望の精製度の抗体を、任意の生理学上許容される担体、賦形剤または安定剤(Remington:The Science and Practice cf Pharmacy、第19版、Alfonso, R.編、Mack Publishing Co. (イーストン、ペンシルバニア:1995))と混合することによって、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形で保存用に調製する。許容される担体、賦形剤または安定剤は、用いられる投与量および濃度ではレシピエントにとって非毒性であり、これには、リン酸、クエン酸および他の有機酸などのバッファー;アスコルビン酸をはじめとする抗酸化剤;低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン;ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンなどのアミノ酸;単糖、二糖およびグルコース、マンノースまたはデキストリンをはじめとする他の炭水化物;EDTAなどのキレート剤;マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール;ナトリウムなどの塩形成性対イオン;および/またはTween、プルロニクス(Pluronics)またはポリエチレングリコール(PEG)などの非イオン性界面活性剤が含まれる。
【００９２】
in vivo投与に使用される抗CA IX抗体は、無菌でなければならない。これは、凍結乾燥および再構成の前または後に、滅菌濾過膜を通して濾過することによって容易に達成される。抗CA IX抗体は、通常、凍結乾燥形または溶液で保存する。
【００９３】
治療用抗CA IX抗体組成物は通常、滅菌アクセスポートのついた容器、例えば、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針によって突き刺すことができる栓のあるバイアルに入れる。
【００９４】
抗CA IX抗体の投与経路は、既知の方法、例えば、静脈内、腹腔内、脳内、皮下、筋内、眼内、動脈内、脳脊髄内、または病巣内経路による、または以下に記載した徐放性の系による注射または注入と一致している。抗体は全身投与されることが好ましい。
【００９５】
徐放性製剤の適した例としては、造形品の形の半透性ポリマーマトリックス、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルが挙げられる。徐放性マトリックスとしては、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド(U.S.3,773,919、EP58,481)、Lグルタミン酸とγエチル-L-グルタメートの共重合体(Sidmanら、Biopolymers、22:547〜556頁(1983))、ポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレート)(Langerら、J. Biomed. Mater. Res.、15:167〜277頁(1981)およびLanger、Chem. Tech.、12:98〜105頁(1982))、酢酸エチレンビニル(Langerら、上記)またはポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸(EP133,988)が挙げられる。徐放性抗CA IX抗体組成物はまた、リポソームに封入された抗体を含むことができる。抗体を含有するリポソームは、それ自体既知の方法によって調製する:DE3,218,121;Epsteinら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、82:3688〜3692頁(1985);Hwangら、Proc.Natl. Acad. Sci. USA、77:4030〜4034頁(1980);EP52,322;EP36,676;EP88,046;EP143,949;EP142,641;特許出願83-118008;U.S.4,485,045および同4,544,545;およびEP102,324。通常、リポソームは、脂質含量が約30モル%コレステロールよりも高い、小さな(約200〜800オングストローム)単層型であり、最適な抗体治療のために選択された割合を調節する。
【００９６】
抗CA IX抗体はまた、吸入によって投与できる。ジェット噴霧器および超音波ネブライザーをはじめとする、液体製剤用の市販の噴霧器が投与にとって有用である。液体製剤は直接噴霧することができ、凍結乾燥散剤は再構成後に噴霧できる。あるいは、抗CA IX抗体は、フルオロカーボン製剤および定量吸入器を用いてエアロゾル化することもでき、または凍結乾燥および製粉した散剤として吸入することもできる。
【００９７】
治療上用いられる抗CA IX抗体の「有効量」は、例えば、治療目的、投与経路、用いる抗CA IX抗体の種類および患者の状態に応じて変わる。したがって、治療専門家には、最適な治療作用を得るために投与量の力価を判定し、必要に応じて投与経路を改変することが必要となる。通常、臨床家は、所望の作用を達成する投与量に到達するまで抗CA IX抗体を投与する。この療法の進行は、従来のアッセイによって容易にモニターされる。
【００９８】
抗CA IXなどの腫瘍抗原に特異的な抗体は、破壊するための腫瘍細胞のターゲッティングにおいて有用である。例えば、細胞性毒素であるリシンには、特に、腫瘍および癌に対する戦いにおいて独特の用途が見出されている。リシンの使用については、腫瘍の治療において影響が発見されている。リシンは、癌性細胞に対して、正常細胞よりも高い親和性を有することが示唆されており(Montfortら 1987)、悪性腫瘍をターゲッティングするための「特効薬」と呼ばれることも多い。リシンなどの毒素は、毒素のB鎖が除去された場合でさえも活性を保持する。したがって、唯一のA鎖が腫瘍特異的抗体、例えば、抗CA IX抗体と結合する場合には、毒素は癌性細胞に対して正常細胞を上回る特異的親和性を有する(Taylorson 1996)。例えば、リシン免疫毒素は、T細胞およびB細胞悪性腫瘍に見られることが多いCD5 T細胞抗原を標的とするよう開発された(Kreitmanら 1998)。カリカエマイシン(calichaemycin)、ゲルダナマイシン(geldanamycin)およびマイタンシン(maytansine)などの他の種類の毒素も、癌性細胞を治療するのに有効であると示されており、これらの種類の分子は、抗CA IX抗体と結合することが可能である(Proc. Natl. Acad. Sci USA 93:8618、1996;J. Ntl Cancer Inst. 92:1573、2000;Cancer Res. 60: 6089、2000)。さらに、かかる抗CA IX抗体を放射性同位元素と結合することによって、腫瘍治療にとって利点が提供される。化学療法やその他の形態の癌治療とは異なり、放射免疫療法または放射性同位元素-抗体の組合せの投与は、癌細胞を直接標的とし、周囲の正常で健常な組織に最小の損傷しか与えない。この「特効薬」を用いれば、患者は、今日利用可能なその他の形態の治療よりもかなり少ない量の放射性同位元素で治療されることが可能である。
【００９９】
本発明の抗CA IX抗体で治療される患者としては、食道腫瘍、膵臓腫瘍、結腸直腸腫瘍といった腫瘍、腎細胞癌(RCC)、子宮頸癌および子宮頸部扁平上皮内および腺管腫瘍といった癌腫、結腸直腸癌、乳癌、肺癌といった癌およびその他の悪性腫瘍の患者またはそれらのあるものが挙げられる。患者は、腫瘍進行から保護されるべき健常組織が残っていないような時点までは本発明の治療の候補である。腫瘍発生のできる限り早期に抗CA IX抗体を投与し、必要な限り治療を継続することが望ましい。
【０１００】
腫瘍関連疾患の、抗CA IX抗体による治療および予防では、抗体組成物を製剤し、投薬し、良好な医療に一致した様式で投与する。これに関連して考慮する因子としては、治療される個々の疾患、治療される個々の哺乳類、個々の患者の臨床症状、疾患の原因、抗体送達部位、個々の抗体の種類、投与方法、投与計画および医師に公知のその他の因子が挙げられる。投与されるべき「治療上有効量」の抗体は、かかる考慮によって決定され、慢性自己免疫症状の治療および移植レシピエントにおける免疫抑制維持をはじめとする、疾患の予防、寛解、または治療に必要なその最小量である。かかる量は、宿主にとって毒性であるか、宿主を感染症に対して大幅により感受性にする量より少ないことが好ましい。
【０１０１】
一般的な計画では、非経口的に投与される抗体の初期の薬剤有効量は、1日当たり約0.1〜50mg/患者の体重1kgの範囲にあり、用いられる抗体の通常の初期範囲は0.3〜20mg/kg/日、より好ましくは、0.3〜15mg/kg/日である。所望の投与量を、医師が達成しようとする薬物動態学的崩壊パターンに応じて、抗体の単回ボーラス投与によって、複数回ボーラス投与によって、または連続注入投与によって送達することができる。
【０１０２】
しかし、先に記載したように、抗体のこのように示唆される量は、多量の治療上の思慮の影響下にある。適当な用量および計画の選択における重要な因子は、前記に示したように得られる結果である。例えば、抗体は、場合によって、標準または高用量化学療法および造血幹細胞移植などの、腫瘍を予防または治療するために現在用いられている1種または複数の薬剤とともに製剤することができる。有効量のかかる他の薬剤は、製剤中に存在する抗CA IX抗体の量、疾患または治療の種類、および先に論じた他の因子に応じて変わる。一般に、これらは、上文に用いたものと同一投与量および投与経路で、または従来用いられた投与量の約1〜99%で用いる。
【０１０３】
本発明のさらなる詳細は、本発明の範囲をさらに明示する以下の実施例に見ることができる。本明細書を通じて記載したすべての参照文献およびそれに記載された参照文献。
【実施例１】
【０１０４】
CA  IX腫瘍抗原の調製
本研究では、組換えCA IXタンパク質を調製した。全長CA IX cDNAを、Pastorekら(Oncogene 9:2877〜2888頁(1994))NCBI受託番号X66839の配列を基にしたプライマーを用いて逆転写酵素PCR(RT-PCR)によってヒトHT-29細胞(ATCC)からクローニングした。
【０１０５】
全長(FL)CA IXの増幅に用いたプライマーは以下の通りである:
正方向プライマー:5'-GTACACACCGTGTGCTGGGAC-3'(配列番号120)
逆方向プライマー:5'-CCTCAGATGCCTCTGGCTGG-3'(配列番号121)
【０１０６】
約1.5kbのPCR産物をpCR3.1 UNI(Invitrogen)にクローニングした。クローン15を、細胞外ドメインのPCR増幅の鋳型として用いた(正方向プライマーにSalI部位を、および逆方向プライマーにNheI部位を組み込む以下のプライマーを用いて、CA IXのaa1〜413):
正方向プライマー5'-ATATTACGTCGACGTACACACCGTGTGCTGGAC-3'(配列番号122)
逆方向プライマー5'-CAGCTTAGAGCTAGCCCAGCAGCCAGGCAGGAATTCAGC-3'(配列番号123)
【０１０７】
PCR産物を、SalIおよびNheIで消化し、SalIおよびNheIで消化したCD147HuIgG2 DHFR発現ベクター(Abgenix、フリーモント、カリフォルニア州)に連結した。CaPO4法を用いてプラスミドを293細胞にトランスフェクトした。CA IX ECD-HuIgG2融合タンパク質を、回収した培養上清からタンパク質Aクロマトグラフィーによって精製した。全長タンパク質をまた、B300.19細胞で発現させ、B300.19/CA IXを得た。
【実施例２】
【０１０８】
抗CA IX抗体
A.抗体作製
1.免疫化およびELISAによる回収するための動物の選択
CA IXに対するモノクローナル抗体を、XM3B-3およびXMG2マウスを組換えCA IX抗原で逐次免疫化することによって発生させた。詳しくは、各マウスを、後肢の足蹠にCA IX組換え抗原で免疫化し、多数の候補mAbを作製した。次いで、これらの抗体を、結合および抗CA IX活性についてスクリーニングした。まず、マウスを、107個細胞/マウスの濃度のCA IXを発現するHT-29細胞で追加免疫し、再度、3〜4日後に追加免疫した。各マウスを、各後肢の足蹠にさらに6回(3〜4日間隔で)可溶性抗原、詳しくは10μgのCA-IX-IgG2-Fcでさらに免疫化した。最後の追加免疫の4日後、免疫化したマウス由来の血清を、マイクロタイタープレートに結合している精製CA IX抗原に対する力価についてELISAによって調べた。
【０１０９】
いくつかの実験では、抗CA IX力価の測定は、プレートにコーティングしたビオチン化CA IXを用いて実施した。15〜500μgのCA IXタンパク質を、pH8.6のPBS 1mLに希釈した。室温で回転しながらの1時間のインキュベーションに向けて、1mLのCA IX-HISタンパク質溶液に10μlの10mg/mLスルホ-NHS-ビオチン(DMSO中のビオチン保存液)を加えた。1時間インキュベーションした後、反応物を100μlの飽和Trisでクエンチし、遠心分離に付し、最低4回洗浄して、遊離ビオチンをビオチン化CA IX-Hisから分離した。ビオチン化CA IX-His(1μg/mL)をSigmaストレプトアビジンプレートに、室温で1時間コーティングした。対照ストレプトアビジンプレートは、対照として用いるためにコーティングしないままとした。これらプレートを蒸留水で5回洗浄した。免疫化した動物由来の血清を、1:100の最初の希釈物から、2連の2%ミルク/PBSの1:2希釈物で滴定した。最後のウェルは、対照としてブランクのままとした。ストレプトアビジンプレートを、蒸留水で5回洗浄した。ヤギ抗ヒトIgG Fc特異的HRPコンジュゲート抗体を、1μg/mLの最終濃度で、室温で1時間加えた。蒸留水で5回洗浄した後、TMB(?)を加えてストレプトアビジンプレートを30分間発現させ、1Mのリン酸を加えることによってELISAを停止した。免疫化したマウス由来の血清のCA IXに対する特異的力価を、450nmの吸光度から測定した。
【０１１０】
【表１】
2005538682.tif 000002
【０１１１】
2.免疫化動物からのリンパ球の回収
前記の抗CA IX力価データに基づいて、ゼノマウス動物(L991-3およびL991-4)を、形質細胞の回収用に選択した。CD19+Bリンパ球を用いて合計55プレートで開始した。これらのプレートをプールした鼠径部、膝窩、傍大動脈リンパ節(50プレート)および脾臓Bリンパ球(5プレート)からに設定した。リンパ節細胞は、各500個CD19+細胞/ウェル(30プレート)または250個CD19+細胞/ウェル(20プレート)で培養し、脾臓Bリンパ球は500個細胞/ウェルで培養した。B細胞培養はまた、2500細胞/ウェル(5プレート)のカットしていない末梢血単核細胞からも設定した(5プレート)。
【０１１２】
3.抗体産生性ハイブリドーマの作製
プールした鼠径部、膝窩、傍大動脈リンパ節リンパ節および脾臓Bリンパ球から単離したB細胞をハイブリドーマ作製に用いた。B細胞の豊富なリンパ球を、電気的細胞融合によって、P3-X63-Ag8.653骨髄腫細胞と融合し、ヒポキサンチン/アザセリン(HA)(Sigma、カタログ番号A9666)選抜に付した。具体的には、融合を、洗浄した豊富なB細胞を、ATCCカタログ番号CRL1580から購入した非分泌性骨髄腫P3X63Ag8.653細胞(Kearneyら、J. Immunol.、123:1548〜1550頁(1979))とを1:1の比で混合することによって実施した。細胞混合物を800gでの遠心分離に付した。上清を完全に除去した後、細胞を、2〜4mlのプロナーゼ溶液(CalBiochem、カタログ番号53702;PBS中0.5mg/ml)で2分未満の間処理した。3〜5mlのFBSを加えて、酵素活性を停止し、懸濁液を電気的細胞融合溶液(ECFS)(0.3M スクロース、Sigma、カタログ番号S7903、0.1mM 酢酸マグネシウム、Sigma、カタログ番号M2545、0.1mM 酢酸カルシウム、Sigma、カタログ番号C4705)を用いて総容量40mlに調節した。遠心分離後、上清を除去し、細胞を40mlのECFSに再懸濁した。細胞を、ECFSでもう一度洗浄し、最後にECFSに2×106個細胞/mlの濃度に再懸濁する。電気的細胞融合は、融合ジェネレーター(fusion generator)、モデルECM2001、ジェネトロニック社(Genetronic Inc.)、サンディエゴ、カリフォルニア州を用いて実施した。用いた融合チャンバーの大きさは2.0mlであり、以下の装置設定を用いた:
アラインメント条件:電圧:50v、時間:50秒;
膜破壊時:電圧:3000v;時間:30ms;および
融合後保持時間:3秒。
【０１１３】
ハイブリドーマ培養上清を、his-V5タグ型のCA IXタンパク質を用いるELISAによってスクリーニングした。ELISAスクリーニングの結果を表6に示す。
【０１１４】
4.抗体のゼノマックス作製
別法として、免疫化および抗体作製に用いるためのB細胞の選抜後、培養したB細胞を含むウェルをいくつかのスクリーニングに付して、CA IX抗原に対する特異性を測定する。
【０１１５】
(a)ELISA
先に記載したように、培養したB細胞をhis-V5タグ型のCA IXタンパク質を用いるELISAに付す。
【０１１６】
275ng/mlのビオチン化CA IX-Hisをストレプトアビジンプレートに結合させ、4℃で18時間インキュベートした。プレートを蒸留水で5回洗浄し、250μlの2%ミルク/PBSを用いて室温で30分間ブロッキングし、蒸留水で5回洗浄し、40μlの2%ミルク/PBSおよび10μlのB細胞上清とともに室温で1時間インキュベートし、再度蒸留水で5回洗浄し、50μlの1μg/mlのGt抗ヒト(Fc)-HRPとともに室温で1時間インキュベートし、蒸留水で5回洗浄し、50μlのTMB基質とともにインキュベートし、反応を停止するために、各ウェルにおいて10μLの1Mリン酸とともにインキュベートした。プレートを450nmの波長で読み取った。
【０１１７】
最初の30プレート(500個細胞/ウェルのリンパ節Bリンパ球由来のもの)を、前記のようにCA IX-Hisタンパク質に対してスクリーニングして抗原特異的ウェルを同定した。表2のデータにより、ほとんどのウェルが抗原特異的応答性を有することが示された(OD 0.3以上で2202/2880-78%)。これは、これらのウェルは全くポリクローナルであり、その後のスクリーニングには有用ではない可能性があるということを示唆した。250個細胞/ウェルで播種したリンパ節Bリンパ球および末梢血および脾臓由来(表3)のBリンパ球も解析した。これらのデータは、これらのウェルもおそらくはポリクローナルであるということを示した(OD 0.3以上で412/1440-29%)。
【０１１８】
【表２】
2005538682.tif 000003
【０１１９】
【表３】
2005538682.tif 000004
【０１２０】
最高ODウェルの一プレートの、CA IX-Hisに対する再スクリーニング(表4)は、同一ODカットオフで67%のウェルが反復することを示した。最初のスクリーニングで得られたポジティブのパーセンテージ(29%)および反復ポジティブのパーセンテージ(67%)により、本発明者らの培養が、二項分布モデルに基づいたポリクローン性の理論上の限界(20%)に極めて接近して設定されていることが示された。
【０１２１】
【表４】
2005538682.tif 000005
【０１２２】
(b)一過性にトランスフェクトしたCHO細胞における未変性結合アッセイ
CA IXとの未変性結合を調べるためにこのアッセイを、全長MNを一過性に発現するCHO細胞で実施した。BCC上清を定性的に評価し、目測で相対的結合について順位づけた。併用ELISA、G250および未変性結合アッセイを用いてBCCウェルをビニングした(表5)。
【０１２３】
未変性結合を調べるために、CHO細胞を全長MNを用いて一過性にリポフェクトした。48時間後、細胞をトリプシン処理し、Terasakiディッシュに播種し(5000個細胞/ウェル)、37℃で一晩培養した。培養培地を除去し、細胞を、氷上で10μLのB細胞培養上清で2時間染色した。モノクローナル抗MN抗体13.15をポジティブ対照として含め、250ng/mLから1:2滴定した。このアッセイには、無関係なXG2組換え対照も含めた。一次抗体インキュベーション後、培地を除去し、細胞を1%パラホルムアルデヒド(10μL、20分)で固定した。細胞を20μLのPBSで2回洗浄した。二次抗体(ヤギ抗ヒトIgG Fc Alexa 488 2μg/mL)を、氷上で細胞とともに1時間インキュベートした。細胞を20μLのPBSで2回洗浄した。細胞を蛍光顕微鏡で観察した。
【０１２４】
抗体が同定された場合には、形質細胞を同定し、溶血プラークアッセイを用いて単離し、重鎖および軽鎖配列をレスキューするためにPCRを実施した。次いで、配列を標準的な抗体発現ベクターにクローニングし、組換えヒト抗体を作製した。次いで、組換え抗体の抗原結合を確認した。
【０１２５】
【表５】
2005538682.tif 000006
【０１２６】
B.抗体特性決定
ゼノマックス技術およびハイブリドーマから同定された抗体を、それらの、ADCCを媒介する、細胞表面CA IXをインターナライズする、および炭酸脱水酵素の酵素活性を阻害する能力を評価することによってさらに特性決定した。これらの特性決定の結果は表6にまとめられている。
【０１２７】
1.配列アラインメント
ゼノマックス技術およびハイブリドーマから得られた抗体の軽鎖および重鎖の可変領域を、生殖系列Vγ/D/J重鎖およびVκ/J軽鎖配列とのアミノ酸配列類似性について解析した。シグナル配列を含まない、VγおよびVκ配列のそれぞれの生殖系列配列との同一性および欠失を、図中では、それぞれ「-」および「#」で示す。生殖系列配列との類似性を表す樹上図も作成した。
【０１２８】
抗CA IX抗体の可変重鎖領域のアミノ酸配列、すなわちAB-MN-21.17.1(配列番号2)、AB-MN-22.19(配列番号3)、AB-MN-22.29(配列番号4)、AB-MN-22.3(配列番号5)、AB-MN-22.5(配列番号6)とVH4-4(配列番号1)のVγ/D/J生殖系配列、AB-MN-21.2.1(配列番号8)、AB-MN-21.5.2(配列番号9)、AB-MN-21.6.1(配列番号10)、AB-MN-21.7.1(配列番号11)、AB-MN-21.9.1(配列番号12)、AB-MN-22.11(配列番号13)、AB-MN-22.15(配列番号14)、AB-MN-22.16(配列番号15)、AB-MN-22.18(配列番号16)、AB-MN-22.21(配列番号17)、AB-MN-22.23(配列番号18)、AB-MN-22.9(配列番号19)とVH4-31(配列番号7)のVγ/D/J生殖系配列、ならびにAB-MN-21.10.1(配列番号21)およびAB-MN22.25(配列番号22)とVH4-39(配列番号20)のVγ/D/J生殖系配列、ならびにAB-MN-21.1.1(配列番号24)、AB-MN-21.14.1(配列番号25)、AB-MN-22.12(配列番号26)、AB-MN-22.17(配列番号27)、AB-MN-22.26(配列番号28)、AB-MN-22.27(配列番号29)、AB-MN-22.8.1(配列番号30)とVH4-59 (配列番号23)のVγ/D/J生殖系配列との配列アラインメントを、それぞれ図1、3、5および6に示す。抗CA IX抗体の可変重鎖領域の、Vγ/D/J生殖系列配列のVH4-4、VH4-31およびVH4-59とのアラインメントの樹状図を、それぞれ図2、4および7に示す。図1および2は、それぞれ、抗CA IX抗体、AB-MN-21.17.1、AB-MN-22.19、AB-MN-22.29、AB-MN-22.3およびAB-MN-22.5の可変重鎖領域の、VH4-4とのアラインメントおよび樹状図を示す。図3および4は、それぞれ、抗CA IX抗体、AB-MN-21.2.1、AB-MN-21.5.2、AB-MN-21.6.1、AB-MN-21.7.1、AB-MN-21.9.1、AB-MN-22.11、AB-MN-22.15、AB-MN-22.16、AB-MN-22.18、AB-MN-22.21、AB-MN-22.23およびAB-MN-22.9の可変重鎖領域の、VH4-31とのアラインメントおよび樹状図を示す。図5は抗CA IX抗体、AB-MN-21.10.1およびAB-MN-22.25の可変重鎖領域の、VH4-39とのアラインメントを示す。図6および7は、それぞれ、抗CA IX抗体、AB-MN-21.1.1、AB-MN-21.14.1、AB-MN-22.12、AB-MN-22.17、AB-MN-22.26、AB-MN-22.27およびAB-MN-22.8.1の可変重鎖領域の、VH4-59とのアラインメントおよび樹状図を示す。
【０１２９】
抗CA IX抗体、AB-MN-XG1-080(配列番号71)、AB-MN-XG1-141(配列番号72)およびAB-MN-XG1-174(配列番号73)の可変重鎖領域のアミノ酸配列の、Vγ/D/J生殖系列配列のVH4-59/D3-3/JH6b(配列番号70)の生殖系列配列との、AB-MN-XG1-023(配列番号75)の、Vγ/D/J生殖系列配列のVH4-30.1/D3-9/JH5b(配列番号74)の生殖系列配列との、AB-MN-XG1-051(配列番号77)の、VH3-21/D5-18/JH4b(配列番号77)との、AB-MN-XG1-109(配列番号79)の、VH4-04/D1-20/JH6b(配列番号79)との配列アラインメントを図18に示す。
【０１３０】
抗CA IX抗体、AB-MN-21.5.2(配列番号32)、AB-MN-21.6.1(配列番号33)、AB-MN-22.7(配列番号34)の可変軽鎖領域のアミノ酸配列の、Vκ/J生殖系列配列のVK-A19(配列番号31)のアミノ酸配列との、AB-MN-22.8.1(配列番号36)、AB-MN-21.17.1(配列番号37)、AB-MN-21.8.1(配列番号38)、AB-MN-22.11(配列番号39)、AB-MN-22.19(配列番号40)、AB-MN-22.26(配列番号41)、AB-MN-22.27(配列番号42)、AB-MN-22.3(配列番号43)、AB-MN-22.4(配列番号44)、AB-MN-22.5(配列番号45)、AB-MN-22.9(配列番号46)の、Vκ/J生殖系列配列のVK-A27(配列番号35)のアミノ酸配列との、AB-MN-21.2.1(配列番号48)、AB-MN-21.7.1(配列番号49)、AB-MN-22.10(配列番号50)、AB-MN-22.14(配列番号51)、AB-MN-22.18(配列番号52)、AB-MN-22.20(配列番号53)、AB-MN-22.21(配列番号54)、AB-MN-22.24(配列番号55)、AB-MN-22.25(配列番号56)、AB-MN-22.28.1(配列番号57)、AB-MN-22.30(配列番号58)の、Vκ/J生殖系列配列のVK-A30(配列番号47)のアミノ酸配列との、AB-MN-21.1.1(配列番号60)、AB-MN-21.14.1(配列番号61)、AB-MN-22.12(配列番号62)、AB-MN-22.17(配列番号63)、AB-MN-22.29(配列番号64)の、Vκ/J生殖系列配列のVK-L5(配列番号59)のアミノ酸配列との、およびAB-MN-21.9.1(配列番号66)、AB-MN-22.15(配列番号67)、AB-MN-22.16(配列番号68)、AB-MN-22.23(配列番号69)の、Vκ/J生殖系列配列のVK-012(配列番号65)のアミノ酸配列との配列アラインメントを、それぞれ図8、10、12、14および16に示す。抗CA IX抗体の可変軽鎖領域の、Vκ/J生殖系列配列のVK-A19、VK-A27、VK-A30、VK-L5およびVK-O12を含む抗CA IX抗体とのアラインメントの樹上図を、それぞれ、図9、11、13、15および17に示す。図8および9は、それぞれ、21.5.2、21.6.1および22.7という抗CA IX抗体の軽鎖可変ドメインの、VK-A19とのアラインメントおよび樹状図を示す。図10および11は、それぞれ、AB-MN-22.8.1、AB-MN-21.17.1、AB-MN-21.8.1、AB-MN-22.11、AB-MN-22.19、AB-MN-22.26、AB-MN-22.27、AB-MN-22.3、AB-MN-22.4、AB-MN-22.5およびAB-MN-22.9という抗CA IX抗体の軽鎖可変ドメインの、VK-A27とのアラインメントおよび樹状図を示す。図12および13は、それぞれ、AB-MN-21.2.1、AB-MN-21.7.1、AB-MN-22.10、AB-MN-22.14、AB-MN-22.18、AB-MN-22.20、AB-MN-22.21、AB-MN-22.24、AB-MN-22.25、AB-MN-22.28.1およびAB-MN-22.30という抗CA IX抗体の軽鎖可変ドメインの、VK-A30とのアラインメントおよび樹状図を示す。図14および15は、それぞれ、AB-MN-21.1.1、AB-MN-21.14.1、AB-MN-22.12、AB-MN-22.17およびAB-MN-22.29という抗CA IX抗体の軽鎖可変ドメインの、VK-L5とのアラインメントおよび樹状図を示す。図16および17は、それぞれ、AB-MN-21.9.1、AB-MN-22.15、AB-MN-22.16およびAB-MN-22.23という抗CA IX抗体の軽鎖可変ドメインの、VK-O12とのアラインメントおよび樹状図を示す。
【０１３１】
抗CA IX抗体の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列、すなわちAB-MN-XG1-080(配列番号81)、AB-MN-XG1-141(配列番号82)およびAB-MN-XG1-174(配列番号83)とA27/JK4のVκ/Jの生殖系列配列(配列番号80)、AB-MN-XG1-023(配列番号85)とL19/JK1(配列番号84)、AB-MN-XG1-051(配列番号88)とA20/JK1(配列番号87)、ならびにAB-MN-XG1-109(配列番号89)とO2/JK3(配列番号88)との配列アラインメントを図19に示す。
【０１３２】
図26A〜26Bは、CA IX抗体の重鎖の可変領域のアミノ酸配列の、以下のVγ/D/J生殖系列配列: VHD1-2/D7-27/JH6b(配列番号124)、VH4-4/D3-3/JH6b(配列番号126)、VH4-61/D3-10/JH4b(配列番号127)、VH3-23/D1-26/JH4b(配列番号129)、VH4-31/D4-17/JH4b(配列番号131)、VH3-30/D3-10/JH4b(配列番号132)、VH-44/D6-19/JH6b(配列番号134)、VH6-1/D1-26/JH4b(配列番号135)、VH4-31/D3-10/JH4b(配列番号138)、VH4-31/D4-11/JH4b(配列番号139)、VH4-31/D2-21/JH6b(配列番号140)、VH1-2/D1-26/JH4b(配列番号141)、VH4-59/D3-9/JH4b(配列番号143)のアミノ酸配列との配列アラインメントを示す。CA IX抗体、AX014H21_8_1NlG2(配列番号124)の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、VH1-2/D7-27/JH6bとアラインした。CA IX抗体、AX014H22_5N1G2(配列番号6)、AX014H22_19N1G2(配列番号3)およびAX014H22_3N1G2(配列番号5)の重鎖可変領域のアミノ酸配列を、VH4-4/D3-3/JH6bとアラインした。CA IX抗体、AX014H22_14N1G2(配列番号128)の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、VH4-61/D3-10/JH6bとアラインした。CA IX抗体、AX014H22_28_1NlG2(配列番号130)の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、VH3-23/Dl-26/JH6bとアラインした。CA IX抗体、AX014H22_23N1G2(配列番号18)およびAX014H22_9N1G2(配列番号19)の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、VH4-31/D4-17/JH6bとアラインした。CA IX抗体、AX014H22_7N1G2(配列番号133)の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、VH3-30/D3-10/JH6bとアラインした。CA IX抗体、AX014H21_17_1NIG2(配列番号2)およびAX014H22_29N1G2(配列番号4)の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、VH4-4/D6-19/JH6bとアラインした。CA IX抗体、AX014H22_10NIG2(配列番号136)およびAX014H22_24N1G2(配列番号137)の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、VH6-1/D1-26/JH6bとアラインした。CA IX抗体、AX014H21_5_2NlG2(配列番号9)およびAX014H21_6_1N1G2(配列番号10)の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、VH4-31/D3-10/JH6bとアラインした。CA IX抗体、AX014H22_21N1G2(配列番号17)の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、VH4-31/D4-11/JH6bとアラインした。CA IX抗体、AX014H22_16N1G2(配列番号15)の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、VH4-31/D2-21/JH6bとアラインした。CA IX抗体、AX014H22_4N1G2(配列番号142)の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、VH1-2/D1-26/JH6bとアラインした。CA IX抗体、AX014H21_1_1N1G2(配列番号24)、AX014H22_27N1G2(配列番号29)、AX014H21_14_1N1G2(配列番号25)、AX014H22_17N1G2(配列番号27)、AX014H22_26N1G2(配列番号28)とVH4-59/D3-9/JH6bの重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、VH4-59/D3-9/JH6bとアラインした。
【０１３３】
図27A〜27Bは、CA IX抗体の重鎖の可変領域のアミノ酸配列の、以下のVγ/D/J生殖系列配列: VH4-31/D5-24/JH2(配列番号144)、VH3-48/JH6b(配列番号145)、VH4-31/D3-9/JH6b(配列番号147)、VH4-39/JH4b(配列番号148)、VH3-33/D3-10/JH6b(配列番号149)、VH4-31/D3-10/JH6b(配列番号151)、VH4-31/D3-9/JH3b(配列番号152)、VH4-59/D6-13/JH6b(配列番号154)のアミノ酸配列との配列アラインメントを示す。CA IX抗体、AX014H22_11N1G2(配列番号13)の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、VH4-31/D5-24/JH2とアラインした。CA IX抗体、AX014H22_13_1N1G2(配列番号146)の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、VH3-48/JH6bとアラインした。CA IX抗体、AX014H22_15N1G2(配列番号14)の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、VH4-31/D3-9/JH6bとアラインした。CA IX抗体、AX014H22_25N1G2(配列番号22)およびAX014H21_10_1NlG2(配列番号21)の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、VH4-39/JH4bとアラインした。CA IX抗体、AX014H22_30N1G2(配列番号150)の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、VH4-33/D3-10/JH6bとアラインした。CA IX抗体、AX014H21_9_1NlG2(配列番号12)の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、VH4-31/D3-10/JH4bとアラインした。CA IX抗体、AX014H22_18NlG2(配列番号16)、AX014H21_7_1NIG2(配列番号11)、AX014H22_20N1G2(配列番号153)およびAX014H21_2_1N1G2(配列番号8)の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、VH4-31/D3-9/JH3bとアラインした。CA IX抗体、AX014H22_8_1N1G2(配列番号30)およびAX014H22_12N1G2(配列番号26)の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、VH4-59/D6-13/JH3bとアラインした。
【０１３４】
図28A〜28Bは、CA IX抗体の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列の、以下のVκ/J生殖系列配列: O12/JK4(配列番号155)、A27/JK5(配列番号156)、A3/JK4(配列番号157)、A27/JK4(配列番号80)、A30/JK4(配列番号158)、L5/JK5(配列番号159)、A30/JK3(配列番号160)、A1/JK4(配列番号161)およびA27/JK2(配列番号163)のアミノ酸配列との配列アラインメントを示す。CA IX抗体、AX014H22_15NlK(配列番号67)、AX014H22_23N1K(配列番号69)、AX014H21_9_1NlK(配列番号66)、AX014H22_16N1K(配列番号68)の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、O12/JK4とアラインした。CA IX抗体、AX014H22_3N1K(配列番号43)の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、A27/JK5とアラインした。CA IX抗体、AX014H21_6_1N1K(配列番号33)およびAX014H21_5_2N1K(配列番号32)の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、A3/JK4とアラインした。CA IX抗体、AX014H22_8_1N1K(配列番号36)、AX014H22_27N1K(配列番号42)、AX014H22_5N1K(配列番号45)、AX014H21_l7_1N1K(配列番号37)、AX014H22_11N1K(配列番号39)、AX014H21_8_1N1K(配列番号38)、AX014H22_19N1K(配列番号40)、AX014H22_4N1K(配列番号44)の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、A27/JK4とアラインした。CA IX抗体、AX014H22_30N1K(配列番号58)、AX014H22_14N1K(配列番号51)およびAX014H22_28_1N1K(配列番号57)の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、A27/JK4とアラインした。CA IX抗体、AX014H21_1_1NlK(配列番号60)、AX014H22_29NlK(配列番号64)、AX014H21_14_1NlK(配列番号61)、AX014H22_17N1K(配列番号63)の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、L5/JK5とアラインした。CA IX抗体、AX014H22_24N1K(配列番号55)およびAX014H22_10N1K(配列番号50)の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、A30/JK3とアラインした。AX014H21_10_1NlK(配列番号162)の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、A1/JK4とアラインした。CA IX抗体、AX014H22_9NlK(配列番号46)およびAX014H22_26N1K(配列番号41)の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、A27/JK2とアラインした。
【０１３５】
図29A〜29Bは、CA IX抗体の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列の、以下のVκ/J生殖系列配列:L5/JK3(配列番号164)、A3/JK2(配列番号165)、A30/JK1(配列番号166)およびA23/JK4(配列番号167)のアミノ酸配列との配列アラインメントを示す。CA IX抗体、AX014H22_12N1K(配列番号62)の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、L5/JK3とアラインした。CA IX抗体、AX014H22_7N1K(配列番号34)の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、A3/JK2とアラインした。CA IX抗体、AX014H22_18N1K(配列番号52)、AX014H21_7_1N1K(配列番号49)、AX014H22_21N1K(配列番号54)、AX014H22_20N1K(配列番号53)、AX014H22_25N1K(配列番号56)、AX014H21_2_1N1K(配列番号48)の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、A30/JK1とアラインした。CA IX抗体、AX014H22_13_1NIK(配列番号168)の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、A23/JK4とアラインした。
【０１３６】
2.HT29腫瘍細胞結合アッセイ
抗CA IX抗体の腫瘍細胞との結合を、免疫蛍光顕微鏡観察によって調べた。HT-29細胞を37℃で、10%FCSを含むマッコイ5a培地でブラックウォールの(Black Walled)96ウェルディッシュで一晩増殖させた。細胞の染色は氷上で実施した。無関係なXG2組換え対照としてAB-hIL8-XG2142を含めた。ミニリポフェクション(Mini Lipofection)上清を、10%ウシ胎児血清(FCS)を含むDMEMでニートから1:2滴定した。AB-MN-XG2-109、AB-MN-XG2-051またはAB-MN-XG2-023の一次抗体インキュベーションを、氷上で1時間実施し、続いて、100μLのPBSで2回、細胞を洗浄した。この細胞を濃度2μg/mLの二次抗体(ヤギ抗ヒトIgG Fc Alexa)とともに、氷上で1時間インキュベートした。100μLのPBSで2回、細胞をさらに洗浄した。細胞を、1% パラホルムアルデヒドで固定し、Olympusイメージングステーション(Imaging Station)で観察した。
【０１３７】
図20に示される結果は、AB-MN-XG2-109、AB-MN-XG2-023およびAB-MN-XG2-051はHT-29腫瘍細胞と結合できることを示す。
【０１３８】
3.増殖アッセイ
抗CA IX抗体を、内因性CA IX抗原を発現するヒーラ細胞およびMDA468細胞の生存度を低下させるその能力について調べた(図21Aおよび21B)。細胞生存度アッセイは、おそらくは、ストレス性条件下での細胞生存度の低下をもたらすであろう、ミトコンドリア活性の低下でミトコンドリア機能を直接測定する。
【０１３９】
Promegaの製造業者のプロトコールに記載されたとおり、CellTiter96(登録商標)水性一溶液細胞増殖アッセイ(AQueous One Solution Cell Proliferation Assay)(a)は、増殖または細胞障害性アッセイにおいて生存細胞数を測定するための比色法である。CellTiter96(登録商標)水性一溶液試薬(AQueous One Solution Reagent)には、新規テトラゾリウム化合物[3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スル-ホフェニル)-2H-テトラゾリウム、内塩;MTS]および電子カップリング試薬(フェナジンエトサルフェート;PES)が含まれていた。PESは化学的安定が増強されており、これにより、MTSと組合せて安定な溶液を形成することが可能となった。この好都合な「一溶液(One Solution)」形式が、電子カップリング試薬としてフェナジンメトサルフェート(PMS)を用い、PMS溶液とMTS溶液が個別に供給される、第1バージョンのCellTiter96(登録商標)水性アッセイ(AQueous Assay)に優る改良であった。MTSテトラゾリウム化合物(オーウェン(Owen)の試薬)は、細胞によって、組織培養培地に可溶性である着色したホルマザン産物へと生物学的に還元された。この変換はおそらくは、代謝的に活性な細胞においてデヒドロゲナーゼ酵素によって産生されたNADPHまたはNADHによって達成された。アッセイは、少量のCellTiter96(登録商標)水性一溶液試薬を培養ウェルに直接加え、1〜4時間インキュベートし、次いで、96ウェルプレートリーダーを用いて490nmの吸光度を記録することによって実施した。
【０１４０】
図21A、21Bおよび21Cに示したように、AB-MN-XG1-080、AB-MN-XG1-141、AB-MN-XG1-174、AB-MN-XG1-023、AB-MN-XG1-051は、内因性CA IX抗原を発現するヒーラ細胞およびMDA468細胞の生存度を低下させた。
【０１４１】
4.インターナリゼーションアッセイ
抗CA IX抗体を、SKRC10細胞によってインターナライズされるその能力についてさらに調べた(図22)。抗体のインターナリゼーションは、免疫蛍光顕微鏡観察によって検出した。
【０１４２】
SKRC10細胞を、8チャンバースライドに2〜5×104個細胞/ウェルで24〜48時間播種した。各ウェルに抗CA IX一次抗体(2%FBS/PBS中5μg/ml)を加え、4℃で1時間インキュベートした(総容量100μl)。ウェルを冷PBSで3回洗浄した。ウェルに二次抗体(1μlのヤギ抗ヒトAF546、Jackson)を、4℃で1時間加えた(総容量100μl、2%FBS/PBS)。冷PBSで3回洗浄した後、チャンバースライドを特定の時間の間37℃に移すことによってインターナリゼーションを開始した(細胞表面染色の間は細胞を氷上においておく)。細胞を37℃から氷上に移すことによってインターナリゼーションを停止した。細胞をホルムアルデヒド(シトフィックス(Cytofix)、ファーミンゲン(Pharmingen)は約3.7%でなくてはならない)で、氷上で10分間固定した。次いで、細胞を冷PBSで3回洗浄した。DNAを、ヘキスト(Hoechst)(PBSで1:10,000)を用いて、氷上で5分間染色した。細胞を冷PBSで3回洗浄した。チャンバーを剥がし、過剰のバッファーをスライドから吸引した。細胞を観察するために、各チャンバーに1滴のマウント媒体(ベクタシールド(Vectashield))を加えた。細胞は40×〜60×の倍率で観察した。
【０１４３】
図22に示したように、AB-MN-XG1-051およびAB-MN-XG1-023抗体は、SKRC10細胞にインターナライズされた。
【０１４４】
5.抗体依存性細胞障害性(ADCC)アッセイ
全血から、フィコール-プラークで精製した末梢血単核細胞(PBMC)を、EuDTPAで標識された、抗体に感作されたSKRC-52細胞の溶解を媒介するエフェクター細胞として用いた。
【０１４５】
MN抗原を発現するSKRC-52腎細胞癌株を標的細胞として用い、0.0001μg/mL〜10μg/mLにわたる種々の濃度の抗CA IX抗体とともにインキュベートした。細胞を、2mMのグルタミン、100ユニット/mLのペニシリン、100μg/mLのストレプトマイシンおよび10%ウシ胎児血清を添加したマッコイ5a培地で培養した。SKRC-52細胞を、HEPESバッファー(50mM Hepes、93mM NaCl、5mM KClおよび2mM MgCl2含有、pH7.4)で1回洗浄した。10×106個の標的細胞を1.0mLの600μM EuCl3、3mM DTPAおよび25μg/mL 硫酸デキストランを含有する冷標識バッファーに懸濁し、氷上で頻繁に振盪しながら20分間インキュベートした。9mLの修復バッファー(2mM CaCl2および10mM D-グルコースを含有するHepesバッファー、pH7.4)を加えて標的細胞の標識を終了し、続いて、さらに氷上で5分間インキュベートした。次いで、試験管を修復バッファーで満たし、細胞を遠沈した。標識した細胞を修復バッファーでさらに3回、アッセイ培地(10%ウシ胎児血清を含むRPMI 1640培地)で2回洗浄し、必要になるまで氷上で維持した。実験の直前に、細胞をアッセイ培地でさらに1回洗浄し、細胞ペレットを清潔な試験管に移し、105個細胞/mLに希釈した。
【０１４６】
このアッセイに用いた抗CA IXモノクローナル抗体は、AB-MN-21.1.1、AB-MN-21.2.1、AB-MN-21.6.1、AB-MN-21.7.1、AB-MN-21.8.1、AB-MN-21.9.1、AB-MN-21.10.1、AB-MN-21.11.1、AB-MN-21.13.1、AB-MN-21.14.1、AB-MN-21.15.1、AB-MN-21.17.1、AB-MN-21.18.1、AB-MN-21.5.2(IgG1)およびAB-MN-22.1、AB-MN-22.22(IgG2)とした。抗体対照およびサンプルを、アッセイ培地で10倍希釈物に希釈し、50μL容量をU底マイクロタイタープレートにピペットで入れた。アッセイブランクは培地のみからなるものとした。サンプルを含むアッセイプレートを、氷上で30分間予め冷却した。50μL容量の前記のようにEuDTPAで標識した標的細胞(0.5×104個細胞)を加え、氷上で30分間インキュベートした。エフェクター細胞、正常なドナーからの新鮮血のフィコール-プラーク勾配(Amersham Pharmacia Biotech AB)での遠心分離で生じた界面から単離した、100μlの容量の密度1.0770g/mlの末梢血単核細胞(PBMC)を加えた(50:1のE:T比)。プレートをプレートシェーカー上で短時間振盪した。細胞を1800rpmで5分間遠心分離することよってペレットにし、続いて、加湿したCO2インキュベーター中で37℃で2時間インキュベーションした後、標的細胞のADCC媒介性溶解を誘導した。細胞を再度遠心分離し、EuDTPA放出の推定のために、20μLの上清を平底マイクロタイターイソプレート(isoplate)に回収し、これに200μLの15μM 2-ナフトイル-トリフルオロアセトン、50μM トリ-n-オクチルホスフィンオキシドおよび0.1%(v/v) TritonX-100を含有する増強溶液を加えた。EuDTPAおよび増強溶液を、シェーカー上で10分間混合した。ワラック(wallac)1420マルチラベルカウンター(Multilabel Counter)を用いて蛍光を定量した。
【０１４７】
標的細胞の溶解は、抗体の存在下(実験的放出)、抗体なし(自然発生的放出)または1% Triton X-100(総放出)中で測定した。特異的細胞溶解パーセントは、次の方程式を用いて算出した:
特異的溶解パーセント=
(実験的放出)-(自然発生的放出)×100
(総放出)-(自然発生的放出)
【０１４８】
図23A、23Bおよび23Cは、0.01mg/mL程度の低い抗CA IX IgG1抗体が、IgG2抗体によって誘導された15〜20%溶解と比較して、約25〜40%の細胞性細胞障害を誘導したことを示す。抗CA IX IgG1抗体は、SK-RC-52標的細胞を用いて、1mg/mLおよび0.1mg/mLのhIgG1アイソタイプ対照によって誘導された30%および20%溶解と比較して、それぞれ、1μg/mL抗体濃度で約55〜75%、0.1μg/mLで45〜60%の細胞性細胞障害を誘導した。
【０１４９】
6.炭酸脱水酵素分光光度的アッセイ
抗CA IX抗体が、CA IXの酵素活性に影響を及ぼすかどうかを調べるために、抗体を分光光度的アッセイで試験した。0.01mg/mLの炭酸脱水酵素またはMNタンパク質50Lを、12.5mg/Lの2.4mlのフェノールレッドに加え、その後、CA IXの基質、H2OおよびCO2と混合した。対照として、12.5mg/Lの2.4mlのフェノールレッドを、炭酸脱水酵素またはMNタンパク質の不在下で0.6mLのCO2で飽和した水と混合した。混合は、一方がフェノールレッド/炭酸脱水酵素を含み、もう一方が水/CO2を含む、2つのシリンジ間のT接合部で実施した。混合用液をUVキュベットに分配し、558nmの吸光度を記録する。この反応を、約15℃の温度でモニターした。炭酸脱水酵素活性は、自身による対照と炭酸脱水酵素またはMNタンパク質を含む対照間でのCO2の完全水和のための時間の相違によって実証された。反応の完了は、赤色から黄色への溶液変化によって示された。抗体の炭酸脱水酵素活性に対する作用を調べるために、抗体を、MN受容体とともに2〜8℃で4時間インキュベートし、その後、基質含有溶液を加えた。アッセイは前記の通りに実施した。
【０１５０】
CA IXと結合しているすべての抗体を、酵素活性を阻害するその能力について試験した。CA IX抗体、AB-MN-21.7およびAB-MN-21.17.1、AB-MN-22.8、AB-MN-22.12、AB-MN-22.13、AB-MN-22.27およびAB-MN-22.28が、炭酸脱水酵素活性CA IXを阻害する能力についてポジティブであった(表6)。
【０１５１】
7.アフィニティー測定
本発明の抗CA IX抗体を、CA  IX抗原に対する親和性についてさらに試験した。
【０１５２】
本発明のすべてのCA IX抗体を、その濃度に応じて、以下の方法を用いて、BSAおよびCM-デキストランを含む(それぞれ3g/250ml)ランニングバッファーで希釈した:0.3mg/mlよりも高い濃度については希釈1/70、0.3mg/ml以上の濃度については1/300希釈、0.6mg/ml以上の濃度については1/1500、3.0mg/ml以上の濃度については1/3000。各モノクローナル抗体は、5分接触させ、モノクローナル抗体の安定化のために6分洗浄することによって分離表面に捕獲させた。600nMのKinject CA IX抗原で1分間全表面を覆い、続いて2分間解離した。親和性を調べるために、2種の異なる抗原を用いた。一方の抗原は全細胞外ドメインからなり、もう一方は、触媒ドメインのみを含んでいた。高濃度では、触媒ドメインを含むタンパク質からは、全細胞外ドメインを含むタンパク質よりもきれいなデータが得られる。しかし、10mM DTTの添加によって、両タンパク質の結合が無効となるために、抗体のCA IXに対する抗体の親和性のスクリーニング法にはDTTを加えなかった。結合データは、抗原の注入の直前のバッファーKinjedctのベースラインドリフトを、抗原注入後にとった測定値から差し引くことによって作成した。データは各表面に捕獲されたCA IX抗体の量について標準化し、結合動力学を調べるために、さらに1:1相互作用モデルに全体的に適合させた。データを表6にまとめる。
【０１５３】
【表６】
2005538682.tif 000007
【実施例３】
【０１５４】
CA IX発現
A.癌細胞におけるCA IXの発現
癌細胞がCA IXを発現するかどうかを調べるために、96種の種々の癌細胞を、セルベースドアレイ(CBA)において、抗CA IX抗体とともにインキュベートし、続いて、抗ヒトIgG-HRPとともにインキュベートした。
【０１５５】
96種の種々の癌細胞を、それぞれの培地で増殖させ、96ウェルプレートに等分して入れ、5μg/mlのCA IX抗体、AB-MN-21.141とともに1時間インキュベートした。細胞を2回洗浄し、次いで、二次抗体、ヤギ抗ヒトIgG-HRP(Jackson Immunoresearch)とともにインキュベートした。二次抗体を洗浄した後、各ウェルにテトラメチルベンジジン(TMB)基質(Zymed)を加えた。650nmのODを測定した。
【０１５６】
図24Aおよび24Bのグラフは、CBAで試験した癌細胞株のサブセットにおけるCA IX発現結果を表す。メラノーマ細胞株、SK-mel-5、Hs936.T、LOX IMVI、M-14 SK-MEL-2、UACC-62およびUACC-257、子宮頸癌細胞株、A-431、ヒーラ、HT-3、MS751およびES2ならびに卵巣癌細胞株、IGROV1、MDAH2774、SK-OV-3、OVCAR-4、OVCAR-5およびOVCAR-8におけるヒトCA IXの発現レベルを示す結果を、図24Aに示す。膵臓癌細胞株BxPC3、HPAC、HPAF IIおよびCAPAN-1、前立腺癌細胞株、DU145、22Rvl、LNCaPおよびPC-3ならびに腎臓癌細胞株、A498、786-0、SK-RC-01、SK-RC-10、Caki-1、Caki-2、RXF-393、SK-RC-52、SN12C、TK-10、UO-31、MV522におけるヒトCA IXの発現レベルを示す結果を図24Bに示す。
【０１５７】
B.低酸素条件における、CA IX発現の誘導
細胞が低酸素条件下で増殖する場合に、CA IX発現が誘導されるかどうかを調べるために、卵巣癌(OvCar3)および子宮頸癌(ヒーラ)細胞を、好気的(A)または低酸素(H)、0.5%酸素条件下で24〜48時間培養した。細胞を回収し、ウェル当たりの細胞表面CA IX発現レベルを、5μg/ml CA IX抗体、AB-MN-21.141を用いてセルベースドアッセイ(CBA)で調べた。CA IX抗体とともに1時間インキュベーションした後、ウェルに二次ヤギ抗ヒトIgG-HRPを加えた。ウェルを2回洗浄し、テトラメチルベンジジン(TMB)基質とともにさらにインキュベートした。650nmのODを測定した。
【０１５８】
図25は、低酸素条件下で培養された細胞におけるCA IX発現の誘導を示す。
【実施例４】
【０１５９】
腫瘍治療のための抗CA IX抗体の使用
抗CA IXなどの腫瘍抗原に特異的な抗体は、消失させるための、かかる抗原を発現する腫瘍細胞のターゲッティングにおいて有用である。
【０１６０】
A.抗CA IX抗体とリシンおよびその他の毒素との結合
細胞性毒素リシンには、特に腫瘍および癌との戦いにおいて独特の用途が見出されている。リシンの使用については、腫瘍の治療において影響が発見されている。リシンは、癌性細胞に対して、正常細胞よりも高い親和性を有することが示唆されており(Montfortら 1987)、悪性腫瘍をターゲッティングするための「特効薬」と呼ばれることも多い。リシンなどの毒素は、毒素非特異的レクチン活性のために毒性の副作用をもたらす原因であるB鎖が除去された場合でさえも活性を保持する。したがって、唯一のA鎖が腫瘍特異的抗体と結合する場合には、毒素は癌性細胞に対して正常細胞を上回る特異的親和性を有する(Taylorson 1996)。例えば、リシン免疫毒素は、T細胞およびB細胞悪性腫瘍に見られることが多いCD5 T細胞抗原を標的とするために開発された(Kreitmanら 1998)。
【０１６１】
インタクトなリシン全体とモノクローナル抗体を結合する新規方法が、Pieterszら(Cancer Res 48(16):4469〜76頁(1998))に記載されており、これはリシンB鎖の非特異的結合をブロックすることを含む。リシンと本発明の抗CA IX抗体の結合は、二機能性試薬、抗体にはS-アセチルメルカプトスクシニックアンヒドリドおよびリシンにはスクシンイミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネートを用いて行うことができる。結合は、B鎖結合活性の喪失をもたらし、一方で、A鎖の毒性の可能性も抗体の活性も損なうはずである。このように生じたリシン-抗体コンジュゲート全体は、標的細胞と非特異的には結合しないはずであり、最も重要な意味は、リシンA鎖が結合し、in vivoで使用可能であるような免疫毒素はより強力であるはずであるということである。
【０１６２】
最近、極めて強力な薬剤と結合している抗体からなる免疫コンジュゲートは、腫瘍細胞に対する活性が改善されていることがわかった。これらの免疫コンジュゲートは、ゲルダナマイシン、カリカエマイシンおよびマイタンシノイドなどの毒性薬物の細胞への送達において極めて効率的であり(Proc. Natl. Acad. Sci USA 93:8618、1996;J. Ntl Cancer Inst. 92:1573、2000;Cancer Res. 60:6089、2000)、こういった薬物-免疫コンジュゲートのいくつかは臨床試験中である。それらには、小分子薬はリシンのように免疫原性でなく、そのため、免疫コンジュゲート療法を患者に複数回送達することができるという利点がある。
【０１６３】
B.放射性同位元素との結合
かかる抗CA IX抗体の、放射性同位元素との結合により、腫瘍治療にとって利点が提供される。化学療法やその他の形態の癌治療とは異なり、放射免疫療法または放射性同位元素-抗体の組合せの投与は、癌細胞を直接標的とし、周囲の正常で健常な組織に最小の損傷しか与えない。この「特効薬」を用いれば、患者は、今日利用可能なその他の形態の治療よりもかなり少ない量の放射性同位元素で治療されることが可能である。好ましい放射性同位元素としては、イットリウム90(90Y)、インジウム111(111In)、131I、99mTc、放射性銀-111、放射性銀-199、アクチニウム225およびビスマス213が挙げられる。
【０１６４】
放射性同位元素の抗体との結合は、従来の二機能性キレートを用いて実施することができる。銀は一価であるので、放射性銀-111および放射性銀-199結合には、硫黄ベースのリンカーを使用できる(Hazraら、Cell Biophys、24〜25:1〜7(1994))。銀放射性同位元素の結合は、免疫グロブリンのアスコルビン酸での還元と関連することもある。もう1つの態様では、チウキセタン(tiuxetan)が、イブリツモマブチウキセタン(ibritumomab tiuxetan)(Zevalin)を形成するためにイブリツモマブと結合しているMX-DTPAリンカーキレート剤である(Witzig,T. E、Cancer Chemother Pharmacol、48 付録1:S91〜5頁(2001))。イブリツモマブチウキセタンは、インジウム111(111In)または90Yなどのラジオアイソタイプ(radioisotype)と反応して、それぞれ、111In-イブリツモマブチウキセタンおよび90Y-イブリツモマブチウキセタンを形成することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１６５】
【図１】図1は、CA IXに対する免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン領域をコードしているアミノ酸配列、すなわちAB-MN-21.17.1_HC(配列番号2)、AB-MN-22.19_HC(配列番号3)、AB-MN-22.29_HC(配列番号4)、AB-MN-22.3_HC(配列番号5)およびAB-MN-22.5_HC(配列番号6)と、VH4-4の生殖系列Vγ/D/J配列(配列番号1)とのアラインメントを示す図である。免疫グロブリン中のCDR、CDR1、CDR2、CDR3は水平の実線で示されている。「AB-MN-21.」抗体は、IgG1マウスで作製され、「AB-MN-22.」抗体はIgG2マウスで作製されている。太字の文字は、保存的および非保存的アミノ酸変更を表す。
【図２】抗CA IX免疫グロブリン、AB-MN-21.17.1_HC、AB-MN-22.19_HC、AB-MN-22.29_HC、AB-MN-22.3_HCおよびAB-MN-22.5_HCの階層を、可変重鎖領域、VH4-4とのその類似性に基づいて表す樹状図を示す図である。
【図３Ａ】図3A-Bは、CA IXに対する免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン領域をコードしているアミノ酸配列、すなわちAB-MN-21.2.1_HC(配列番号8)、AB-MN-21.5.2_HC(配列番号9)、AB-MN-21.6.1_HC(配列番号10)、AB-MN-21.7.1_HC(配列番号11)、AB-NN-21.9.1_HC(配列番号12)、AB-MN-22.11_HC(配列番号13)、AB-MN-22.15_HC(配列番号14)、AB-MN-22.16_HC(配列番号15)、AB-MN-22.18_HC(配列番号16)、AB-MN-22.21_HC(配列番号17)、AB-MN-22.23_HC(配列番号18)およびAB-MN-22.9_HC(配列番号19)と、VH4-31の生殖系列Vγ/D/J配列(配列番号7)とのアラインメントを示す図である。免疫グロブリン中のCDR、CDR1、CDR2、CDR3は水平の実線で示されている。「AB-MN-21.」抗体は、IgG1マウスで作製され、「AB-MN-22.」抗体はIgG2マウスで作製されている。太字の文字は、保存的および非保存的アミノ酸変更を表す。
【図３Ｂ】図3A-Bは、CA IXに対する免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン領域をコードしているアミノ酸配列、すなわちAB-MN-21.2.1_HC(配列番号8)、AB-MN-21.5.2_HC(配列番号9)、AB-MN-21.6.1_HC(配列番号10)、AB-MN-21.7.1_HC(配列番号11)、AB-NN-21.9.1_HC(配列番号12)、AB-MN-22.11_HC(配列番号13)、AB-MN-22.15_HC(配列番号14)、AB-MN-22.16_HC(配列番号15)、AB-MN-22.18_HC(配列番号16)、AB-MN-22.21_HC(配列番号17)、AB-MN-22.23_HC(配列番号18)およびAB-MN-22.9_HC(配列番号19)と、VH4-31の生殖系列Vγ/D/J配列(配列番号7)とのアラインメントを示す図である。免疫グロブリン中のCDR、CDR1、CDR2、CDR3は水平の実線で示されている。「AB-MN-21.」抗体は、IgG1マウスで作製され、「AB-MN-22.」抗体はIgG2マウスで作製されている。太字の文字は、保存的および非保存的アミノ酸変更を表す。
【図４】抗CA IX免疫グロブリン、AB-MN-21.2.1_HC、AB-MN-21.5.1_HC、AB-MN-21.6.1_HC、AB-MN-21.7.1_HC、AB-MN-21.9.1_HC、AB-MN-22.11_HC、AB-MN-22.15_HC、AB-MN-22.16_HC、AB-MN-22.18_HC、AB-MN-22.21_HC、AB-MN-22.23_HCおよびAB-MN-22.9_HCの階層を、可変重鎖領域、VH4-31とのその類似性に基づいて表す樹状図を示す図である。
【図５】図5は、CA IXに対する免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン領域をコードしているアミノ酸配列、すなわちAB-MN-21.10.1_HC(配列番号21)およびAB-MN-22.25_HC(配列番号22)と、VH4-39の生殖系列Vγ/D/J配列(配列番号20)とのアラインメントを示す図である。免疫グロブリン中のCDR、CDR1、CDR2、CDR3は水平の実線で示されている。「AB-MN-21.」抗体は、IgG1マウスで作製され、「AB-MN-22.」抗体はIgG2マウスで作製されている。太字の文字は、保存的および非保存的アミノ酸変更を表す。
【図６】図6は、CA IXに対する免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン領域をコードしているアミノ酸配列、すなわちAB-MN-21.1.1_HC(配列番号24)、AB-MN-21.14.1_HC(配列番号25)、AB-MN-22.12_HC(配列番号26)、AB-MN-22.17_HC(配列番号27)、AB-MN-22.26_HC(配列番号28)、AB-MN-22.27_HC(配列番号29)およびAB-MN-22.8.1_HC(配列番号30)と、VH4-59の生殖系列Vγ/D/J配列(配列番号23)とのアラインメントを示す図である。免疫グロブリン中のCDR、CDR1、CDR2、CDR3は水平の実線で示されている。「AB-MN-21.」抗体は、IgG1マウスで作製され、「AB-MN-22.」抗体はIgG2マウスで作製されている。太字の文字は、保存的および非保存的アミノ酸変更を表す。
【図７】抗CA IX免疫グロブリン、AB-MN-21.1.1_HC、AB-MN-21.14.1_HC、AB-MN-22.12_HC、AB-MN-22.17_HC、AB-MN-22.26_HC、AB-MN-22.27_HCおよびAB-MN-22.8.1_HCの階層を、VH4-59の可変重鎖領域とのその類似性に基づいて表す樹状図を示す図である。
【図８】図8は、CA IXに対する免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン領域をコードしているアミノ酸配列、すなわちAB-MN-21.5.2_LC(配列番号32)、AB-MN-21.6.1_LC(配列番号33)およびAB-MN-22.7_LC(配列番号34)と、VK-A19の生殖系列Vκ/J配列(配列番号31)とのアラインメントを示す図である。免疫グロブリン中のCDR、CDR1、CDR2、CDR3は水平の実線で示されている。「AB-MN-21.」抗体は、IgG1マウスで作製され、「AB-MN-22.」抗体はIgG2マウスで作製されている。太字の文字は、保存的および非保存的アミノ酸変更を表す。
【図９】抗CA IX免疫グロブリン、AB-MN-21.5.2_LC、AB-MN-21.6.1_LCおよびAB-MN-22.7_LCの階層を、VK-A19の可変軽鎖領域とのその類似性に基づいて表す樹状図を示す図である。
【図１０】図10は、CA IXに対する免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン領域をコードしているアミノ酸配列、すなわちAB-MN-22.8.1_LC(配列番号36)、AB-MN-21.17.1_LC(配列番号37)、AB-MN-21.8.1_LC(配列番号38)、AB-MN-22.11_LC(配列番号39)、AB-MN-22.19_LC(配列番号40)、AB-MN-22.26_LC(配列番号41)、AB-MN-22.27_LC(配列番号42)、AB-MN-22.3_LC(配列番号43)、AB-MN-22.4_LC(配列番号44)、AB-MN-22.5_LC(配列番号45)およびAB-MN-22.9_LC(配列番号46)と、VK-A27の生殖系列Vκ/J配列(配列番号35)とのアラインメントを示す図である。免疫グロブリン中のCDR、CDR1、CDR2、CDR3は水平の実線で示されている。「AB-MN-21.」抗体は、IgG1マウスで作製され、「AB-MN-22.」抗体はIgG2マウスで作製されている。太字の文字は、保存的および非保存的アミノ酸変更を表す。
【図１１】抗CA IX免疫グロブリン、AB-MN-22.8.1_LC、AB-MN-21.17.1_LC、AB-MN-21.8.1_LC、AB-MN-22.11_LC、AB-MN-22.19_LC、AB-MN-22.26_LC、AB-MN-22.27_LC、AB-MN-22.3_LC、AB-MN-22.4_LC、AB-MN-22.5_LCおよびAB-MN-22.9_LCの階層を、VK-A27の可変軽鎖領域とのその類似性に基づいて表す樹状図を示す図である。
【図１２】図12は、CA IXに対する免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン領域をコードしているアミノ酸配列、すなわちAB-MN-21.2.1_LC(配列番号48)、AB-MN-21.7.1_LC(配列番号49)、AB-MN-22.10_LC(配列番号50)、AB-MN-22.14_LC(配列番号51)、AB-MN-22.18_LC(配列番号52)、AB-MN-22.20_LC(配列番号53)、AB-MN-22.21_LC(配列番号54)、AB-MN-22.24_LC(配列番号55)、AB-MN-22.25_LC(配列番号56)、AB-MN-22.28.1_LC(配列番号57)およびAB-MN-22.30_LC(配列番号58) と、VK-A30の生殖系列Vκ/J配列(配列番号47)とのアラインメントを示す図である。免疫グロブリン中のCDR、CDR1、CDR2、CDR3は水平の実線で示されている。「AB-MN-21.」抗体は、IgG1マウスで作製され、「AB-MN-22.」抗体はIgG2マウスで作製されている。太字の文字は、保存的および非保存的アミノ酸変更を表す。
【図１３】抗CA IX免疫グロブリン、AB-MN-21.2.1_LC、AB-MN-21.7.1_LC、AB-MN-22.10_LC、AB-MN-22.14_LC、AB-MN-22.18_LC、AB-MN-22.20_LC、AB-MN-22.21_LC、AB-MN-22.24_LC、AB-MN-22.25_LC、AB-MN-22.28.1_LCおよびAB-MN-22.30_LCの階層を、VK-A30の可変軽鎖領域とのその類似性に基づいて表す樹状図を示す図である。
【図１４】図14は、CA IXに対する免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン領域をコードしているアミノ酸配列、すなわちAB-MN-21.1.1_LC(配列番号60)、AB-MN-21.14.1_LC(配列番号61)、AB-MN-22.12_LC(配列番号62)、AB-MN-22.17_LC(配列番号63)およびAB-MN-22.29_LC(配列番号64)と、VK-L5の生殖系列Vκ/J配列(配列番号59)とのアラインメントを示す図である。免疫グロブリン中のCDR、CDR1、CDR2、CDR3は水平の実線で示されている。「AB-MN-21.」抗体は、IgG1マウスで作製され、「AB-MN-22.」抗体はIgG2マウスで作製されている。太字の文字は、保存的および非保存的アミノ酸変更を表す。
【図１５】抗CA IX免疫グロブリン、AB-MN-21.1.1_LC、AB-MN-21.14.1_LC、AB-MN-22.12_LC、AB-MN-22.17_LCおよびAB-MN-22.29_LCの階層を、VK-L5の可変軽鎖領域とのその類似性に基づいて表す樹状図を示す図である。
【図１６】図16は、CA IXに対する免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン領域をコードしているアミノ酸配列、すなわちAB-MN-21.9.1_LC(配列番号66)、AB-MN-22.15_LC(配列番号67)、AB-MN-22.16_LC(配列番号68)およびAB-MN-22.23_LC(配列番号69)と、VK-O12の生殖系列Vκ/J配列(配列番号65)とのアラインメントを示す図である。免疫グロブリン中のCDR、CDR1、CDR2、CDR3は水平の実線で示されている。「AB-MN-21.」抗体は、IgG1マウスで作製され、「AB-MN-22.」抗体はIgG2マウスで作製されている。太字の文字は、保存的および非保存的アミノ酸変更を表す。
【図１７】抗CA IX免疫グロブリン、AB-MN-21.9.1_LC、AB-MN-22.15_LC、AB-MN-22.16_LCおよびAB-MN-22.23_LCの階層を、VK-O12の可変軽鎖領域とのその類似性に基づいて表す樹状図を示す図である。
【図１８】図18Aおよび18Bは、CA IXに対する免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン領域をコードしているアミノ酸配列、すなわちAB-MN-XG1-080(配列番号71)、AB-MN-XG1-141(配列番号72)、AB-MN-XG1-174(配列番号73)とVH4-59(DP-71)/D3-JH4bの生殖系列Vγ/D/J配列(配列番号70)、AB-MN-XG1-023(配列番号75)とVH4-30.1(DP-65)/D3-9/JH5bの生殖系列Vγ/D/J配列(配列番号74)、AB-MN-XG1-051(配列番号77)とVH3.21(DP-77)/D5-18/JH4bの生殖系列Vγ/D/J配列(配列番号76)、およびAB-MN-XG1-109(配列番号79)とVH4.04(VIV-4)/D1-20/JH6bの生殖系列Vγ/D/J配列(配列番号78)とのアラインメントを示す図である。免疫グロブリン中のCDR、CDR1、CDR2、CDR3はそれぞれの列の見出しに示されている。これらの「AB-MN-XG1」抗体は、IgG1ゼノマウスで作製されている。
【図１９】図19Aおよび19Bは、CA IXに対する免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン領域をコードしているアミノ酸配列、すなわちAB-MN-XG1-080(配列番号81)、AB-MN-XG1-141(配列番号82)、AB-MN-XG1-174(配列番号83)とA27/JK4の生殖系列Vκ/J配列(配列番号80)、AB-MN-XG1-023(配列番号85)とL19/JK1の生殖系列Vκ/J配列(配列番号84)、AB-MN-XG1-051(配列番号87)とA20/JK1のの生殖系列Vκ/J配列(配列番号86)、およびAB-MN-XG1-109(配列番号89)とO2/JK3の生殖系列Vκ/J配列(配列番号88)とのアラインメントを示す図である。免疫グロブリン中のCDR、CDR1、CDR2、CDR3はそれぞれの列の見出しに示されている。これらの「AB-MN-XG1」抗体は、IgG1ゼノマウスで作製されている。
【図２０】抗CA IX抗体、AB-MN-XG2-109、AB-MN-XG2-051およびAB-MN-XG2-023が腫瘍細胞と結合し、IL8に対する対照抗体、AB-hIL8-XG2142がHT-29腫瘍細胞とは結合しないことを示す免疫蛍光結果を表す図である。
【図２１Ａ】抗CA IX抗体、AB-MN-XG1-023(MN23)、AB-MN-XG1-080(MN80)、AB-MN-XG1-141(MN141)、AB-MN-XG1-174(MN174)およびAB-MN-XG1-051(MN51)が、内因性CA IX抗原を発現するヒーラおよびMDA468細胞の生存度を低下させること、抗CA IX抗体の、内因性CA IXを発現するヒーラ細胞およびMDA468細胞の生存度に対する影響を示す、細胞生存度アッセイ結果を表す図である。
【図２１Ｂ】抗CA IX抗体、AB-MN-XG1-023(MN23)、AB-MN-XG1-080(MN80)、AB-MN-XG1-141(MN141)、AB-MN-XG1-174(MN174)およびAB-MN-XG1-051(MN51)が、内因性CA IX抗原を発現するヒーラおよびMDA468細胞の生存度を低下させること、抗CA IX抗体の、内因性CA IXを発現するヒーラ細胞およびMDA468細胞の生存度に対する影響を示す、細胞生存度アッセイ結果を表す図である。
【図２１Ｃ】抗CA IX抗体、AB-MN-XG1-023(MN23)、AB-MN-XG1-080(MN80)、AB-MN-XG1-141(MN141)、AB-MN-XG1-174(MN174)およびAB-MN-XG1-051(MN51)が、内因性CA IX抗原を発現するヒーラおよびMDA468細胞の生存度を低下させること、抗CA IX抗体の、内因性CA IXを発現するヒーラ細胞およびMDA468細胞の生存度に対する影響を示す、細胞生存度アッセイ結果を表す図である。
【図２２】抗CA IX抗体、AB-MN-XG1-051(MN51)およびAB-MN-XG1-023(MN23)がSKRC10細胞にインターナライズされることを示す免疫蛍光結果を表す図である。
【図２３Ａ】HT-29またはSK-RC-52、腎臓細胞癌細胞株由来の細胞、標的細胞における抗CA IX抗体による抗体依存性細胞媒介性細胞障害性(ADCC)の誘導を示す図である。
【図２３Ｂ】HT-29またはSK-RC-52、腎臓細胞癌細胞株由来の細胞、標的細胞における抗CA IX抗体による抗体依存性細胞媒介性細胞障害性(ADCC)の誘導を示す図である。
【図２３Ｃ】HT-29またはSK-RC-52、腎臓細胞癌細胞株由来の細胞、標的細胞における抗CA IX抗体による抗体依存性細胞媒介性細胞障害性(ADCC)の誘導を示す図である。
【図２４Ａ】いくつかの腫瘍細胞株におけるCA IX発現レベルを示す、セルベースドアレイ(CBA)結果を表す図である。図の上部パネルにはメラノーマ、子宮頸癌および卵巣癌細胞株におけるヒトCA IX発現を示し、下部パネルには膵臓、前立腺および腎臓癌細胞株におけるヒトCA IX発現を示す。
【図２４Ｂ】いくつかの腫瘍細胞株におけるCA IX発現レベルを示す、セルベースドアレイ(CBA)結果を表す図である。図の上部パネルにはメラノーマ、子宮頸癌および卵巣癌細胞株におけるヒトCA IX発現を示し、下部パネルには膵臓、前立腺および腎臓癌細胞株におけるヒトCA IX発現を示す。
【図２５】低酸素条件で培養した細胞におけるCA IX発現のアップレギュレーションセルベースドアレイ(CBA)結果を表す図である。
【図２６Ａ】図26A-Bは、CA IXに対する免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン領域をコードしているアミノ酸配列、すなわちAX014H21_8_1N1G2(配列番号125)とVH1-2/D7-27/JH6bの生殖系列Vγ/D/J配列(配列番号124)、AX014H22_5N1G2(配列番号6)、AX014H22_19N1G2(配列番号3)およびAX014H22_3N1G2(配列番号5)とVH4-4/D3-3/JH6bの生殖系列Vγ/D/J配列(配列番号126)、AX014H22_14N1G2(配列番号128)とVH4-61/D3-10/JH46のVγ/D/J配列(配列番号127)、AX014H22_28.1N1G(配列番号130)とVH3-23/D1-26/JH6bのVγ/D/J配列(配列番号129)、AX014H22_23N1G2(配列番号18)およびAX014h22_9N1G2(配列番号19)とVH4-31/D4-17/JH6bのVγ/D/J配列(配列番号131)、AX014H22_7N1G2(配列番号133)とVH3-30/D3-10/JH6bのVγ/D/J配列(配列番号132)、AX014H21_17_1N1G(配列番号2)およびAX014H22_29N1G2(配列番号4)とVH4-4/D6-19/JH6bのVγ/D/J配列(配列番号134)、AX014H22_10N1G2(配列番号136)およびAX014H22_24N1G2(配列番号137)とVH6-1/D1-26/JH4bのVγ/D/J配列(配列番号135)、AX014H21_5_2N1G2(配列番号9)およびAX014H21_6_1N1G2(配列番号10)とVH4-31/D3-10/JH4bのVγ/D/J配列(配列番号138)、AX014H22_21N1G2(配列番号17)とVH4-31/D4-11/JH6bのVγ/D/J配列(配列番号139)、AX014H22_16N1G2(配列番号15)とVH4-31/D2-21/JH6b(配列番号140)、AX014H22_4N1G2(配列番号142)とVH1-2/D1-26/JH4bのVγ/D/J配列(配列番号141)、AX014H21_1_1N1G2(配列番号24)、AX014H22_27N1G2(配列番号29)、AX014H21_14_1N1G2(配列番号25)、AX014H22_17N1G2(配列番号27)およびAX014H22_26N1G2(配列番号28)とVH4-59/D3-9/JH4bのVγ/D/J配列(配列番号143)とのアラインメントを示す図である。免疫グロブリン中のCDR、CDR1、CDR2、CDR3およびFR領域はそれぞれの列の見出しに示されている。これらの「AX014H21」および「AX014H22」抗体は、それぞれIgG1およびIgG2ゼノマウスで作製されている。
【図２６Ｂ】図26A-Bは、CA IXに対する免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン領域をコードしているアミノ酸配列、すなわちAX014H21_8_1N1G2(配列番号125)とVH1-2/D7-27/JH6bの生殖系列Vγ/D/J配列(配列番号124)、AX014H22_5N1G2(配列番号6)、AX014H22_19N1G2(配列番号3)およびAX014H22_3N1G2(配列番号5)とVH4-4/D3-3/JH6bの生殖系列Vγ/D/J配列(配列番号126)、AX014H22_14N1G2(配列番号128)とVH4-61/D3-10/JH46のVγ/D/J配列(配列番号127)、AX014H22_28.1N1G(配列番号130)とVH3-23/D1-26/JH6bのVγ/D/J配列(配列番号129)、AX014H22_23N1G2(配列番号18)およびAX014h22_9N1G2(配列番号19)とVH4-31/D4-17/JH6bのVγ/D/J配列(配列番号131)、AX014H22_7N1G2(配列番号133)とVH3-30/D3-10/JH6bのVγ/D/J配列(配列番号132)、AX014H21_17_1N1G(配列番号2)およびAX014H22_29N1G2(配列番号4)とVH4-4/D6-19/JH6bのVγ/D/J配列(配列番号134)、AX014H22_10N1G2(配列番号136)およびAX014H22_24N1G2(配列番号137)とVH6-1/D1-26/JH4bのVγ/D/J配列(配列番号135)、AX014H21_5_2N1G2(配列番号9)およびAX014H21_6_1N1G2(配列番号10)とVH4-31/D3-10/JH4bのVγ/D/J配列(配列番号138)、AX014H22_21N1G2(配列番号17)とVH4-31/D4-11/JH6bのVγ/D/J配列(配列番号139)、AX014H22_16N1G2(配列番号15)とVH4-31/D2-21/JH6b(配列番号140)、AX014H22_4N1G2(配列番号142)とVH1-2/D1-26/JH4bのVγ/D/J配列(配列番号141)、AX014H21_1_1N1G2(配列番号24)、AX014H22_27N1G2(配列番号29)、AX014H21_14_1N1G2(配列番号25)、AX014H22_17N1G2(配列番号27)およびAX014H22_26N1G2(配列番号28)とVH4-59/D3-9/JH4bのVγ/D/J配列(配列番号143)とのアラインメントを示す図である。免疫グロブリン中のCDR、CDR1、CDR2、CDR3およびFR領域はそれぞれの列の見出しに示されている。これらの「AX014H21」および「AX014H22」抗体は、それぞれIgG1およびIgG2ゼノマウスで作製されている。
【図２７Ａ】図27A-Bは、CA IXに対する免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン領域をコードしているアミノ酸配列、すなわちAX014H22_11N1G2(配列番号13)とVH4-31/D5-24/JH2の生殖系列Vγ/D/J配列(配列番号144)、AX014H22_13_1N1G2(配列番号146)とVH3-48/JH6bの生殖系列Vγ/D/J配列(配列番号145)、AX014H22_15N1G2(配列番号14)とVH4-31/D3-9/JH46の生殖系列Vγ/D/J配列(配列番号147)、AX014H22_25N1G2(配列番号22)およびAX014H21_10_1N1G2(配列番号21)とVH4-39/JH6bの生殖系列Vγ/D/J配列(配列番号148)、AX014H22_30N1G2(配列番号150)とVH3-33/D3-10/JH6bの生殖系列Vγ/D/J配列(配列番号149)、AX014H21_9_1N1G2(配列番号12)とVH4-31/D3-10/JH6bの生殖系列Vγ/D/J配列(配列番号151)、AX014H22_18N1G2(配列番号16)、AX014H21_7_1N1G2(配列番号11)、AX014H22_20N1G2(配列番号153)およびAX014H21_2_1N1G2(配列番号8)とVH4-31/D3-9/JH6bの生殖系列Vγ/D/J配列(配列番号152)、ならびにAX014H22_8_1N1G2(配列番号30)およびAX014H22_12N1G2(配列番号26)とVH4-59/D6-13/JH6bの生殖系列Vγ/D/J配列(配列番号154)とのアラインメントを示す図である。免疫グロブリン中のCDR、CDR1、CDR2、CDR3およびFR領域はそれぞれの列の見出しに示されている。これらの「AX014H21」および「AX014H22」抗体は、それぞれIgG1およびIgG2ゼノマウスで作製されている。
【図２７Ｂ】図27A-Bは、CA IXに対する免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン領域をコードしているアミノ酸配列、すなわちAX014H22_11N1G2(配列番号13)とVH4-31/D5-24/JH2の生殖系列Vγ/D/J配列(配列番号144)、AX014H22_13_1N1G2(配列番号146)とVH3-48/JH6bの生殖系列Vγ/D/J配列(配列番号145)、AX014H22_15N1G2(配列番号14)とVH4-31/D3-9/JH46の生殖系列Vγ/D/J配列(配列番号147)、AX014H22_25N1G2(配列番号22)およびAX014H21_10_1N1G2(配列番号21)とVH4-39/JH6bの生殖系列Vγ/D/J配列(配列番号148)、AX014H22_30N1G2(配列番号150)とVH3-33/D3-10/JH6bの生殖系列Vγ/D/J配列(配列番号149)、AX014H21_9_1N1G2(配列番号12)とVH4-31/D3-10/JH6bの生殖系列Vγ/D/J配列(配列番号151)、AX014H22_18N1G2(配列番号16)、AX014H21_7_1N1G2(配列番号11)、AX014H22_20N1G2(配列番号153)およびAX014H21_2_1N1G2(配列番号8)とVH4-31/D3-9/JH6bの生殖系列Vγ/D/J配列(配列番号152)、ならびにAX014H22_8_1N1G2(配列番号30)およびAX014H22_12N1G2(配列番号26)とVH4-59/D6-13/JH6bの生殖系列Vγ/D/J配列(配列番号154)とのアラインメントを示す図である。免疫グロブリン中のCDR、CDR1、CDR2、CDR3およびFR領域はそれぞれの列の見出しに示されている。これらの「AX014H21」および「AX014H22」抗体は、それぞれIgG1およびIgG2ゼノマウスで作製されている。
【図２８Ａ】図28A-Bは、CA IXに対する免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン領域をコードしているアミノ酸配列、すなわちAX014H22_15N1K(配列番号67)、AX014H22_23N1K(配列番号69)、AX014H21_9_1N1K(配列番号66)およびAX014H22_16N1K(配列番号68)とO12/JK4の生殖系列Vκ/J配列(配列番号155)、AX014H22_3N1K(配列番号43)とA27/JK5の生殖系列Vκ/J配列(配列番号156)、AX014H21_6_1N1K(配列番号33)およびAX014H21_5_2N1K(配列番号32)とA3/JK4の生殖系列Vκ/J配列(配列番号157)、AX014H22_8_1N1K(配列番号36)、AX014H22_27N1K(配列番号42)、AX014H22_5N1K(配列番号45)、AX014H21_17_1N1K(配列番号37)、AX014H22_11N1K(配列番号39)、AX014H21_8_1N1K(配列番号38)、AX014H22_19N1K(配列番号40)およびAX014H22_4N1K(配列番号44)とA27/JK4の生殖系列Vκ/J配列(配列番号80)、AX014H22_30N1K(配列番号58)、AX014H22_14N1K(配列番号51)およびAX014H22_28_1N1K(配列番号57)とA30/JK4の生殖系列Vκ/J配列(配列番号158)、AX014H21_1_1N1K(配列番号60)、AX014H22_29N1K(配列番号64)、AX014H21_14_1N1K(配列番号61)およびAX014H22_17N1K(配列番号63)とL5/JK5の生殖系列Vκ/J配列(配列番号159)、AX014H22_24N1K(配列番号55)およびAX014H22_10N1K(配列番号50)とA30/JK3のの生殖系列Vκ/J配列(配列番号160)、AX014H21_10_1N1K(配列番号162)とA1/JK4の生殖系列Vκ/J配列(配列番号161)、ならびにAX014H22_9N1K(配列番号46)およびAX014H22_26N1K(配列番号41)とA27/JK2の生殖系列Vκ/J配列(配列番号163)とのアラインメントを示す図である。免疫グロブリン中のCDR、CDR1、CDR2、CDR3およびFR領域はそれぞれの列の見出しに示されている。これらの「AX014H21」および「AX014H22」抗体は、それぞれIgG1およびIgG2ゼノマウスで作製されている。
【図２８Ｂ】図28A-Bは、CA IXに対する免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン領域をコードしているアミノ酸配列、すなわちAX014H22_15N1K(配列番号67)、AX014H22_23N1K(配列番号69)、AX014H21_9_1N1K(配列番号66)およびAX014H22_16N1K(配列番号68)とO12/JK4の生殖系列Vκ/J配列(配列番号155)、AX014H22_3N1K(配列番号43)とA27/JK5の生殖系列Vκ/J配列(配列番号156)、AX014H21_6_1N1K(配列番号33)およびAX014H21_5_2N1K(配列番号32)とA3/JK4の生殖系列Vκ/J配列(配列番号157)、AX014H22_8_1N1K(配列番号36)、AX014H22_27N1K(配列番号42)、AX014H22_5N1K(配列番号45)、AX014H21_17_1N1K(配列番号37)、AX014H22_11N1K(配列番号39)、AX014H21_8_1N1K(配列番号38)、AX014H22_19N1K(配列番号40)およびAX014H22_4N1K(配列番号44)とA27/JK4の生殖系列Vκ/J配列(配列番号80)、AX014H22_30N1K(配列番号58)、AX014H22_14N1K(配列番号51)およびAX014H22_28_1N1K(配列番号57)とA30/JK4の生殖系列Vκ/J配列(配列番号158)、AX014H21_1_1N1K(配列番号60)、AX014H22_29N1K(配列番号64)、AX014H21_14_1N1K(配列番号61)およびAX014H22_17N1K(配列番号63)とL5/JK5の生殖系列Vκ/J配列(配列番号159)、AX014H22_24N1K(配列番号55)およびAX014H22_10N1K(配列番号50)とA30/JK3のの生殖系列Vκ/J配列(配列番号160)、AX014H21_10_1N1K(配列番号162)とA1/JK4の生殖系列Vκ/J配列(配列番号161)、ならびにAX014H22_9N1K(配列番号46)およびAX014H22_26N1K(配列番号41)とA27/JK2の生殖系列Vκ/J配列(配列番号163)とのアラインメントを示す図である。免疫グロブリン中のCDR、CDR1、CDR2、CDR3およびFR領域はそれぞれの列の見出しに示されている。これらの「AX014H21」および「AX014H22」抗体は、それぞれIgG1およびIgG2ゼノマウスで作製されている。
【図２９Ａ】図29A-Bは、CA IXに対する免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン領域をコードしているアミノ酸配列、すなわちAX014H22_12N1K(配列番号62)とL5/JK3の生殖系列Vκ/J配列(配列番号164)、AX014H22_7N1K(配列番号34)とA3/JK2の生殖系列Vκ/J配列(配列番号165)、AX014H22_18N1K(配列番号52)、AX014H21_7_1N1K(配列番号49)、AX014H22_21N1K(配列番号54)、AX014H22_20N1K(SEQ ID NO; 53)、AX014H22_25N1K(配列番号56)およびAX014H21_2_1N1K(配列番号48)とA30/JK1の生殖系列Vκ/J配列(配列番号166)、ならびにAX014H22_13_1N1K(配列番号168)とA23/JK4の生殖系列Vκ/J配列(配列番号167)とのアラインメントを示す図である。免疫グロブリン中のCDR、CDR1、CDR2、CDR3およびFR領域はそれぞれの列の見出しに示されている。これらの「AX014H21」および「AX014H22」抗体は、それぞれIgG1およびIgG2ゼノマウスで作製されている。
【図２９Ｂ】図29A-Bは、CA IXに対する免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン領域をコードしているアミノ酸配列、すなわちAX014H22_12N1K(配列番号62)とL5/JK3の生殖系列Vκ/J配列(配列番号164)、AX014H22_7N1K(配列番号34)とA3/JK2の生殖系列Vκ/J配列(配列番号165)、AX014H22_18N1K(配列番号52)、AX014H21_7_1N1K(配列番号49)、AX014H22_21N1K(配列番号54)、AX014H22_20N1K(SEQ ID NO; 53)、AX014H22_25N1K(配列番号56)およびAX014H21_2_1N1K(配列番号48)とA30/JK1の生殖系列Vκ/J配列(配列番号166)、ならびにAX014H22_13_1N1K(配列番号168)とA23/JK4の生殖系列Vκ/J配列(配列番号167)とのアラインメントを示す図である。免疫グロブリン中のCDR、CDR1、CDR2、CDR3およびFR領域はそれぞれの列の見出しに示されている。これらの「AX014H21」および「AX014H22」抗体は、それぞれIgG1およびIgG2ゼノマウスで作製されている。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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