(57)【要約】セメント混合物および孔形成剤を含む骨前駆体組成物は、骨移植片に対して提供される。好ましくは、孔形成剤は、２０〜２５０μｍの粒子サイズを有する。好ましくは、孔形成剤の割合は、７〜４０％（ｗ／ｗ）である。この組成物は、さらに生物活性因子、好ましくは骨形態形成タンパク質またはＢＭＰをコードする核酸を孔形成剤中にカプセル化されて含み得る。組成物の成形能力は、結合剤の添加によって調整され得る。本発明は、骨前駆体組成物を含むキットおよび移植片デバイスを提供する。本発明はまた、表面領域およびその表面領域に配置される骨前駆体物質を有する補綴デバイスを含む移植可能な補綴移植片を提供する。このキットおよびデバイスは、さらに生物活性因子および結合剤を含む１つ以上の追加の構成要素を含み得る。骨形成誘導方法および生物活性因子送達方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
セメント混合物および孔形成剤を含む骨前駆体組成物であって、該孔形成剤は、２０〜５００μｍの粒子サイズを有し；ただし、該孔形成剤がＰＬＧＡのとき、該粒子サイズが２０〜１４０μｍまたは３１０〜５００μｍであり、そして該孔形成剤が硫酸カルシウムであるとき、該粒子サイズは２０〜１４０μｍまたは２６０〜５００μｍである、骨前駆体組成物。
【請求項２】
前記孔形成剤が２０〜１４０μｍの粒子サイズを有する、セメント混合物および孔形成剤を含む、骨前駆体組成物。
【請求項３】
前記孔形成剤が７５〜１４０μｍの粒子サイズを有する、セメント混合物および孔形成剤を含む、骨前駆体組成物。
【請求項４】
前記孔形成剤の割合が７〜４０％（ｗ／ｗ）である、請求項１〜３のいずれか一項に記載される、骨前駆体組成物。
【請求項５】
前記孔形成剤の割合が７〜２５％（ｗ／ｗ）である、請求項１〜３のいずれか一項に記載される、骨前駆体組成物。
【請求項６】
前記孔形成剤の割合が７〜１４％（ｗ／ｗ）であり、そして該孔形成剤がＰＬＧＡである、請求項１〜３のいずれか一項に記載される、骨前駆体組成物。
【請求項７】
前記セメント混合物がカルシウムホスフェートセメント混合物およびカルシウムスルフェートセメント混合物からなる群から選択される混合物を含む、請求項１〜３のいずれかに一項に記載される、骨前駆体組成物。
【請求項８】
前記セメント混合物が以下からなる群から選択される混合物を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載される、骨前駆体組成物：
（ａ）脱炭酸されたアモルファスのカルシウムホスフェートおよび第２のカルシウムホスフェートの混合物；
（ｂ）テトラカルシウムホスフェートおよび第２のカルシウムホスフェートの混合物；
（ｃ）モノカルシウムホスフェート、テトラカルシウムホスフェートおよびカルシウムカーボネートの混合物；
（ｄ）β−トリカルシウムホスフェートおよびカルシウムホスフェート一水和物の混合物、ならびに必要に応じてカルシウムピロホスフェート、硫酸カルシウム二水和物、および硫酸カルシウム半水和物を含む混合物；
（ｅ）β−テトラカルシウムホスフェート、ジカルシウムホスフェート二水和物およびカルシウムカーボネートの混合物；および
（ｆ）硫酸カルシウム半水和物。
【請求項９】
前記第２のカルシウムホスフェートが、モノカルシウムホスフェート、無水ジカルシウムホスフェート、ジカルシウムホスフェート二水和物カルシウムメタホスフェート、ヘプタカルシウムホスフェート、カルシウムピロホスフェート、α−トリカルシウムホスフェート、β−トリカルシウムホスフェート、オクタカルシウムホスフェートならびにアモルファスのカルシウムホスフェートからなる群から選択される、請求項８に記載される、骨前駆体組成物。
【請求項１０】
前記孔形成剤が天然の生物分解性の重合体または合成的な生物分解性の重合体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載される、骨前駆体組成物。
【請求項１１】
前記孔形成剤がエチレンビニルアセテート、天然コラーゲンおよび合成コラーゲン、ポリ（グルキサノン）、ポリ（ファスファゼン）、ポリグラクチン、ポリグラクチン酸、ポリアルドン酸、ポリアクリル酸、ポリアクカノエート、ポリオルトエステル、ポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＤＬＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ζ−カプロラクトン）、ポリ（トリメチレンカーボネート）、ポリ（ｐ−ジオキサノン）、ポリ（ζ−カプロラクトン−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（グリコリド−ｃｏ−トリメチレンカーボネート）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−トリメチレンカーボネート）、ポリアリーレート、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、ポリ無水物、ポリ（無水物−ｃｏ−イミド）ならびにそれらの共重合体、アミノ酸重合体、プロピレン−ｃｏ−フマレート、１個以上のα−ヒドロキシ−カルボン酸モノマーの重合体、硫酸カルシウム、生物活性ガラス組成物、それらの混合物およびそれらの任意の誘導体ならびに改変体からなる群から選択される；ただし、前記セメント混合物が硫酸カルシウム半水和物であるとき、該孔形成剤が硫酸カルシウムでない、請求項１〜３のいずれか一項に記載される、骨前駆体組成物。
【請求項１２】
前記ＰＬＧＡが５ｋＤ〜１００ｋＤの分子量を有する、請求項１１に記載される、骨前駆体組成物。
【請求項１３】
前記ＰＬＧＡが１０ｋＤ〜３０ｋＤの分子量を有する、請求項１１に記載される、骨前駆体組成物。
【請求項１４】
前記セメント混合物がテトラカルシウムホスフェートおよび無水ジカルシウムホスフェートの混合物を含み；そして、前記孔形成剤がＰＬＧＡおよび硫酸カルシウムからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載される、骨前駆体組成物。
【請求項１５】
前記セメント混合物が硫酸カルシウム半水和物を含み、そして前記孔形成剤がＰＬＧＡである、請求項１〜３のいずれか一項に記載される、骨前駆体組成物。
【請求項１６】
さらに生物活性因子を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載される、骨前駆体組成物。
【請求項１７】
前記生物活性因子が骨形態形成タンパク質である、請求項１６に記載される、骨前駆体組成物。
【請求項１８】
前記生物活性因子が骨形態形成タンパク質をコードする配列を含む核酸分子である、請求項１６に記載される、骨前駆体組成物。
【請求項１９】
前記骨形態形成タンパク質がＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＣＯＰ−１、ＣＯＰ−３、ＣＯＰ−４、ＣＯＰ−５、ＣＯＰ−７、ＣＯＰ−１６、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−３ｂ、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＭＰ１２１、ドーサリン−１、ＤＰＰ、Ｖｇ−１、Ｖｇｒ−１、６０Ａタンパク質、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、ＴＧＦ−βおよび骨形成活性を有するそれらの保存性アミノ酸配列改変体からなる群から選択される、請求項１７に記載される骨前駆体組成物。
【請求項２０】
前記生物活性がヒトＯＰ−１のＣ末端の１０２〜１０６のアミノ酸と、少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む骨形成タンパク質である、請求項１６に記載される骨前駆体組成物。
【請求項２１】
前記生物活性が前記孔形成剤中にカプセル化される、請求項１６に記載される骨前駆体組成物。
【請求項２２】
さらに結合剤を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載される骨前駆体組成物。
【請求項２３】
前記結合剤がアルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、ゼラチン、ペプチド、ムチン、硫酸コンドロイチン、キトサン、ポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）、グリコサミノグリカン、多糖類、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、ヒドロキエチルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、マンニトール、白色ワセリン、マンニトール／デキストランの組み合わせ、マンニトール／白色ワセリンの組み合わせ、ゴマ油、フィブリン接着剤、血液およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項２２に記載される、骨前駆体組成物。
【請求項２４】
移植可能な請求項１〜３のいずれか一項に記載される骨前駆体組成物。
【請求項２５】
固形セメントおよび孔形成剤を含む組成物であって、該孔形成剤が２０〜５００μｍの粒子サイズを有し；ただし、該孔形成剤がＰＬＧＡであるとき、該粒子サイズが２０〜１４０μｍまたは３１０〜５００μｍであり、そして該孔形成剤が硫酸カルシウムであるとき、該粒子サイズが２０〜１４０μｍまたは２６０〜５００μｍである、組成物。
【請求項２６】
孔形成剤が２０〜１４０μｍの粒子サイズを有する、固形セメントおよび孔形成剤を含む組成物。
【請求項２７】
孔形成剤が７５〜１４０μｍの粒子サイズを有する、固形セメントおよび孔形成剤を含む組成物。
【請求項２８】
前記孔形成剤の割合が７〜４０％（ｗ／ｗ）である、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載される組成物。
【請求項２９】
前記孔形成剤の割合が７〜２５％（ｗ／ｗ）である、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載される組成物。
【請求項３０】
前記孔形成剤がＰＬＧＡであり、そしてその割合が７〜１４％である（ｗ／ｗ）、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載される組成物。
【請求項３１】
前記固形セメントがカルシウムホスフェートセメントおよびカルシウムスルフェートセメントからなる群から選択されるセメントを含む、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載される組成物。
【請求項３２】
前記孔形成剤が天然の生物分解性の重合体または合成的な生物分解性の重合体である、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載される組成物。
【請求項３３】
前記孔形成剤がエチレンビニルアセテート、天然コラーゲンおよび合成コラーゲン、ポリ（グラキサノン）、ポリ（フォスファゼン）、ポリグラクチン、ポリグラクチン酸、ポリアルドン酸、ポリアクリル酸、ポリアルカノエート、ポリオルトエステル、ポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＤＬＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ζ−カプロラクトン）、ポリ（トリメチレンカーボネート）、ポリ（ｐ−ジオキサノン）、ポリ（ζ−カプロラクトン−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（グリコリド−ｃｏ−トリメチレンカーボネート）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−トリメチレンカーボネート）、ポリアリーレート、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、ポリ無水物、ポリ（無水物−ｃｏ−イミド）およびそれらの共重合体、アミノ酸重合体、プロピレン−ｃｏ−フマレート、１個以上のα−ヒドロキシ−カルボン酸モノマー重合体、硫酸カルシウム、生物活性ガラス組成物、それらの混合物およびそれらの任意の誘導体ならびに改変体からなる群から選択され；ただし、前記セメント混合物が硫酸カルシウム半水和物であり、該孔形成剤が硫酸カルシウムでない、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載される組成物。
【請求項３４】
前記ＰＬＧＡが５ｋＤ〜１００ｋＤの分子量を有する、請求項３３に記載される組成物。
【請求項３５】
前記ＰＬＧＡが１０ｋＤ〜３０ｋＤの分子量を有する、請求項３３に記載される組成物。
【請求項３６】
以下を含むキット：
（ａ）請求項１〜３のいずれか一項に記載される前記骨前駆体組成物；および
（ｂ）生物活性因子。
【請求項３７】
前記生物活性因子が骨形態形成タンパク質である、請求項３６に記載されるキット。
【請求項３８】
前記生物活性因子が骨形態形成タンパク質をコードする配列を含む核酸分子である、請求項３６に記載されるキット。
【請求項３９】
前記骨形態形成タンパク質が、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＣＯＰ−１、ＣＯＰ−３、ＣＯＰ−４、ＣＯＰ−５、ＣＯＰ−７、ＣＯＰ−１６、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−３ｂ、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＭＰ１２１、ドーサリン−１、ＤＰＰ、Ｖｇ−１、Ｖｇｒ−１、６０Ａタンパク質、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、ＴＧＦ−βおよび骨形成活性を有するそれらの保存性アミノ酸配列改変体からなる群から選択される、請求項３７に記載されるキット。
【請求項４０】
前記生物活性因子がヒトＯＰ−１のＣ末端の１０２〜１０６のアミノ酸と、少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む骨形成タンパク質である、請求項３６に記載されるキット。
【請求項４１】
以下を含むキット：
（ａ）請求項１〜３のいずれか一項に記載される骨前駆体組成物；および
（ｂ）結合剤。
【請求項４２】
前記結合剤がアルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、ゼラチン、ペプチド、ムチン、硫酸コンドロイチン、キトサン、ポロキサマー、グリコサミノグリカン、多糖類、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、マンニトール、白色ワセリン、マンニトール／デキストランの組み合わせ、マンニトール／白色ワセリンの組み合わせ、ゴマ油、フィブリン接着剤、血液およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項４１に記載されるキット。
【請求項４３】
以下を含む移植可能な補綴デバイス：
（ａ）標的組織に近接し、移植可能な表面領域を有する補綴移植片；および
（ｂ）該表面領域に配置される、請求項１〜３のいずれか一項に記載される骨前駆体組成物。
【請求項４４】
さらに、前記骨前駆体組成物中に分散される生物活性因子を含む、請求項４３に記載される補綴デバイス。
【請求項４５】
前記生物活性因子が骨形態形成タンパク質である、請求項４４に記載される補綴デバイス。
【請求項４６】
前記生物活性因子が骨形態形成タンパク質をコードする配列を含む核酸分子である、請求項４４に記載される補綴デバイス。
【請求項４７】
前記骨形態形成タンパク質がＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＣＯＰ−１、ＣＯＰ−３、ＣＯＰ−４、ＣＯＰ−５、ＣＯＰ−７、ＣＯＰ−１６、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−３ｂ、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＭＰ１２１、ドーサリン−１、ＤＰＰ、Ｖｇ−１、Ｖｇｒ−１、６０Ａタンパク質、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、ＴＧＦ−βおよび骨形成活性を有するそれらの保存性アミノ酸配列改変体からなる群から選択される、請求項４５に記載される補綴デバイス。
【請求項４８】
前記生物活性因子がヒトＯＰ−１のＣ末端の１０２〜１０６のアミノ酸と、少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む骨形成タンパク質である、請求項４４に記載される補綴デバイス。
【請求項４９】
前記デバイスが臀部デバイス、固定ケージおよび顎顔面デバイスからなる群から選択される、請求項４３に記載される補綴デバイス。
【請求項５０】
前記生物活性因子が前記孔形成剤中にカプセル化される、請求項４３に記載される補綴デバイス。
【請求項５１】
さらに結合剤を含む、請求項４３に記載される補綴デバイス。
【請求項５２】
前記結合剤がアルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、ゼラチン、ペプチド、ムチン、硫酸コンドロイチン、キトサン、ポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）、グリコサミノグリカン、多糖類、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、マンニトール、白色ワセリン、マンニトール／デキストランの組み合わせ、マンニトール／白色ワセリンの組み合わせ、ゴマ油、フィブリン接着剤、血液およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項５１に記載される補綴デバイス。
【請求項５３】
請求項１〜３のいずれか一項に記載される骨前駆体組成物を含む組成物を哺乳動物の欠損部位に移植する工程を含む、哺乳動物中での骨形成を誘導する方法。
【請求項５４】
前記組成物がさらに生物活性因子を含む、請求項５３に記載される方法。
【請求項５５】
前記生物活性因子が骨形態形成タンパク質である、請求項５４に記載される方法。
【請求項５６】
前記組成物がさらに結合剤を含む、請求項５３に記載される方法。
【請求項５７】
請求項１〜３のいずれか一項に記載される骨前駆体組成物および生物活性因子を含む組成物を哺乳動物の欠損部位に移植する工程を含む、骨形成を必要とする部位へ生物活性因子を送達する方法。
【請求項５８】
前記生物活性因子が骨形態形成タンパク質である、請求項５７に記載される方法。
【請求項５９】
前記生物活性因子が孔形成剤中でカプセル化される、請求項５７に記載される方法。
【請求項６０】
前記生物活性因子の送達が徐放性である、請求項５９に記載される方法。
【請求項６１】
前記生物活性因子が骨形態形成タンパク質をコードする配列を含む核酸分子である、請求項５７に記載される方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
ヒト体内の骨組織は、最大の割合の身体結合組織量を含む。しかし、他の結合組織とは異なり、その基質は、組織化されたコラーゲン構造中に分配されるヒドロキシアパタイトと呼ばれる基本的なカーボネート含有カルシウムホスフェートの生理学的に鉱化された小晶子からなる。この組織の修復は、骨格形成およびその欠損部の鉱化、引き続く、その本来の構造を達成するような欠損部位の再造形に指向される多数の複雑な細胞性機能に関与する複雑なプロセスである。
【０００２】
主な状況では、カルシウムホスフェートに基づく移植片は、骨修復のために適合性および伝導性であることが見出されている。ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）は、Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２の式を有し、そしてその化合物は、骨硬質および歯のエナメル質と化学量論的組成において類似する。多孔性のヒドロキシアパタイトブロックおよび粒子は、その物質が骨伝導性でありかつ骨が内に伸びそして付着することを支持するので、構造的な支柱を提供するための移植片として幅広く使用されている。しかし、これらのヒドロキシアパタイト物質は、大部分の整形外科的な手順に関して不便な取り扱い性質を有する（Ｐａｒｓｏｎら、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、５２３、１９０〜２０７頁（１９８８））。種々のカルシウムセメント処方物（すなわち、ヒドロキシアパタイトセメント）は、インサイチュでの取り扱いの特徴を改善させるために開発されている（Ｔａｙら、Ｔｈｅ  Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃ  Ｃｌｉｎｉｃｓ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ、３０、６１５〜６２３頁）。しかし、これらの処方物は、組織移植の際、それらが有意な吸収を受けないという欠点を有する。
【０００３】
このＨＡセメントの吸収を改善するために、硫酸カルシウムのような孔形成剤がこのセメントに添加されている。例えば、Ｐａｒｓｏｎら、前出を参照のこと。二次的なその孔形成剤の吸収は、多孔性のＨＡセメントを提供し、それは、骨溶解性の細胞がその孔に湿潤しそして骨の伸長を促進することを可能にする。しかし、多孔性ＨＡセメントの不適当な多孔性および孔のサイズは、骨形成プロセスを妨げ得る。
【０００４】
大きな孔サイズおよび高い多孔性を有するカルシウムセメントは、過剰な吸収速度およびこの物質の不十分な物理的強度を生じ、これゆえ、その基質が新たに合成された骨に骨格を提供することを妨げる。さらに、骨吸収の速度が骨伸張の速度より速い場合、炎症性応答がしばしば観察される。小さい孔サイズおよび低多孔性を有するカルシウムセメントは、低吸収速度を生じ、それは新たに形成された骨において基質粒子のカプセル化を引き起こす。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、有意な吸収を可能にし、生理学的な環境において構造的な完全性を維持し、そしてインサイチュでのセメントの操作を可能にする骨前駆体組成物および孔形成剤を含むセメント処方物を開発することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、セメント混合物および孔形成剤を含む骨前駆体組成物を同定することによってこれらの問題を解決する。本発明はまた、固形セメントおよび孔形成剤を含む組成物を提供する。好ましくは、孔形成剤の粒子サイズは、２０〜５００μｍであり、より好ましくは２０〜１４０μｍであり、最も好ましくは７５〜１４０μｍである。好ましい実施形態では、孔形成剤の割合は、１０〜７０容量％であり、より好ましくは４０〜６０容量％である。好ましい実施形態では、孔形成剤の割合は、７〜４０重量％であり、より好ましくは７〜２５重量％である。より好ましい実施形態では、ＰＬＧＡの割合は７〜１４重量％である。本発明の組成物は、その物理的強度およびその移植片の操作特性を維持しながら、細胞性因子のセメントへの浸透を改善し、それにより生体での骨組織の再生を改善する。
【０００７】
本発明はまた、骨前駆体組成物および骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）またはＢＭＰをコードする配列を含む核酸分子のような生物活性因子を含む組成物を提供する。好ましい実施形態では、その生物活性因子は、孔形成剤中にカプセル化される。骨前駆体組成物または骨前駆体組成物／生物活性因子の混合物はまた、移植部位でのその組成物の成形性を調節するために結合剤と共に使用され得る。本発明はまた、骨前駆体組成物、および生物活性因子および結合剤を含む少なくとも１つ以上の付加的な組成物を含むキットを提供する。
【０００８】
別の局面では、本発明はまた、骨前駆体組成物物質を含む移植可能なデバイス、およびＢＭＰまたは結合剤のような生物活性因子を含む１つ以上の追加の組成物を必要に応じて含む移植可能なデバイスを提供する。本発明はまた、骨前駆体組成物を含む移植可能な補綴デバイスおよびＢＭＰまたは結合剤のような生物活性因子を含む１つ以上の追加の組成物を必要に応じて含む移植可能な補綴デバイスを含む。
【０００９】
本発明は、骨前駆体組成物ならびに必要に応じて結合剤および／または生物活性因子を含む組成物をその欠損部位に移植するステップを含む、哺乳動物中での骨形成を誘導する方法を提供する。本発明はまた、骨前駆体組成物および生物活性因子を含む組成物を哺乳動物の欠損部位に移植する工程を包含する、骨形成を必要とする部位へ生物活性因子を送達する方法を提供する。
【００１０】
（発明の詳細な説明）
本明細書で記載される本発明が十分に理解され得るように、以下の詳細な説明が示される。
【００１１】
「アミノ酸配列相同性」は、アミノ酸配列の同一性および類似性の両方を含むと理解される。相同な配列は、同一および／または類似のアミノ酸残基を共有し、類似の残基とは、整列された参照配列中の対応するアミノ酸残基についての保存的置換であるか、または整列された参照配列中の対応するアミノ酸残基の「可能な点変異」である。従って、参照配列と７０％のアミノ酸相同性を共有する候補ポリペプチド配列は、整列される残基のいずれか７０％がその参照配列中の対応する残基と同一であるか、またはその参照配列中の対応する残基と保存的置換であるかのいずれかである配列である。特に好ましい形態形成のポリペプチドは、Ｃ末端の１０２〜１０６アミノ酸と少なくとも６０％、好ましくは７０％のアミノ酸配列の同一性を共有し、ヒトＯＰ−１、ＢＭＰ−２、および関連するタンパク質の保存された７システインドメインを規定する。
【００１２】
アミノ酸配列の相同性は、当該分野において周知の方法によって決定され得る。例えば、この７システインドメインの配列に対する候補アミノ酸配列の相同性のパーセントを決定するために、これら２つの配列が初めに整列される。このアライメントは、例えばＮｅｅｄｌｅｍａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８、４４３頁（１９７０）に記載されるダイナミックプログラミングアルゴリズム、およびＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃによって製造された市販のソフトウェアパッケージであるＡｌｉｇｎ  Ｐｒｏｇｒａｍによって行われる。これらの参考文献の教示は、本明細書中で参考として援用される。初めのアラインメントは、関連するタンパク質ファミリーの多配列アラインメント（ｍｕｌｔｉ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）との比較によって精製され得る。いったんアラインメントが行われそして精製されると、相同性スコアのパーセントが計算される。この２つの配列の整列されたアミノ酸残基は、続いてその類似性のために互いに比較される。類似要素は、類似したサイズ、形態および電荷を含む。アミノ酸の類似性を決定する１つの特に好ましい方法は、Ｄａｙｈｏｆｆら、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、５、３４５〜３５２頁（１９７８および前出）（本明細書中で参考として援用される）に記載されるＰＡＭ２５０マトリクスである。類似性スコアは、最初に整列された２つ１組の（ｐａｉｒ  ｗｉｓｅ）アミノ酸類似性スコアの和として計算される。挿入および欠損は、パーセント相同性および同一性の目的に関して無視される。従って、ギャップペナルティは、この計算上では使用されない。次いで、未処理（ｒａｗ）のスコアが、その未処理のスコアをその候補配列および７システインドメインのスコアの相乗平均で割ることによって標準化される。その相乗平均は、これらのスコアの積の二乗である。標準化された未処理のスコアは、パーセント相同性である。
【００１３】
「骨」とは、ヒドロキシアパタイト、コラーゲン（主にＩ型コラーゲン）および骨細胞（ｂｏｎｅ  ｃｅｌｌ）（例えば、骨芽細胞、骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｙｔｅｓ）および破骨細胞）の形態で堆積されたカルシウムおよびリン酸の複合物、ならびに真性軟骨性骨の内側に形成する骨髄組織を主に含む、石灰化された（鉱化された）結合組織である。骨組織は、他の組織（軟骨組織を含む）とは有意に異なる。詳細には、骨組織は、細胞ならびに鉱化された、無機成分（主にヒドロキシアパタイト結晶）および有機成分（主にＩ型コラーゲン）を含む二相性の媒体から構成される血管化組織である。グリコサミドグリカンは、この有機成分の２％未満およびその二相性の媒体の１％未満、または本質的に骨組織自体を構成する。そのうえ、軟骨組織に関して、骨組織に存在するコラーゲンは、高度に組織化された並行した構成で存在する。骨の欠損は、退行性の病因からであろうと、外傷性の病因からであろうと、または癌性の病因からであろうと、再建手術をする外科医に侮り難い難題を提示する：特に、哺乳動物の関節で生じるような、複数の組織の複合体の一部を含む骨格部分の再建および修復は困難である。
【００１４】
「骨形成」は、軟骨性骨の形成または膜性骨の形成をいう。ヒトにおいて、骨形成は胎児発育の最初の６〜８週間の間に始まる。間葉起源の前駆幹細胞は、予め決定された部位に移動し、それらは、：（ａ）凝縮し、増殖し、そして骨形成細胞（骨芽細胞）に分化する（頭蓋で観察されそして「膜性骨形成」と称されるプロセス）か、または（ｂ）凝縮し、増殖しそして中間体として軟骨形成細胞（軟骨芽細胞）に分化し、続いて、骨形成細胞に置換されるかのいずれかである。より詳細には、間葉幹細胞は、軟骨細胞に分化する。次いで、この軟骨細胞は、石灰化され、肥大し、そして新たに形成され、分化した骨芽細胞によって作られ、その時その部位に存在する骨に置換される。続いて、鉱化された骨は、大規模に再造形され、その後機能的な骨髄要素で満たされた小骨によって占めれる。このプロセスは、長骨において観察され、そして「軟骨性骨形成」と称される。胎児以後の生命活動において、骨は、胚の軟骨性骨の発達の細胞性プロセスを模倣することによって、骨自体を損傷から回復させる能力を有する。すなわち、骨髄、骨膜、および筋に由来する間葉前駆幹細胞が誘導され、その欠損部位に移動し、そして上記のイベントのカスケードを開始し得る。そこで、これらの細胞は蓄積し、増殖し、そして軟骨に分化し、続いて、新たに形成された骨に置換される。
【００１５】
「骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）」とは、ＤＮＡおよびアミノ酸配列相同性に基づくタンパク質であるＴＧＦ−βスーパーファミリーのＢＭＰファミリーに属するタンパク質（ＢＭＰファミリー）をいう。あるタンパク質が、このＢＭＰファミリーを特徴付ける保存されたＣ末端の、システインリッチドメイン内で、少なくとも１個の公知のＢＭＰファミリーと少なくとも５０％のアミノ酸配列の同一性を有する場合、そのタンパク質は、本発明に従いＢＭＰファミリーに属する。ＢＭＰファミリーのメンバーは、全体的に５０％未満のＤＮＡ配列同一性またはアミノ酸配列同一性を有し得る。
【００１６】
「骨前駆体組成物」とは、セメント混合物および孔形成剤を含む組成物をいう。好ましくは、骨前駆体組成物は、生体適合性および生物吸収性である。この組成物は、損傷を受けた結合組織（例えば骨組織）を形成、修復または置換するための骨移植片としてセメントマトリクスを形成するために使用され得る。
【００１７】
「結合剤」は、骨前駆体組成物および／または骨形成タンパク質と混合される場合、骨形成に有害な影響を及ぼすことなく所望の操作特性を提供する任意の生体適合性の物質をいう。本明細書で教示される場合、当業者は、慣用的な実験のみを用いて、任意の最適な結合剤を用いて使用するためのタンパク質の有効量を決定し得る。数ある好ましい結合剤の他の特徴の中には、少しの例として、そのデバイスを柔軟、成形可能（ｓｈａｐｅａｂｌｅ）、および／または柔順（ｍａｌｌｅａｂｌｅ）にし；注射可能にし；骨、軟骨、筋および他の組織に対して付着性にし、外科手術中の洗浄および／または灌注による分解に対して耐性にし；そして、外科手術中、縫合および手術後の除去に対して耐性にする能力がある。
【００１８】
「生体適合性」とは、細胞性免疫応答および体液性免疫応答（例えば、炎症性応答および異物繊維性応答（ｆｏｒｅｉｇｎ  ｂｏｄｙ  ｆｉｂｒｏｔｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ））のような体の種々な防御系に関連する有害な効果を誘発しない物質をいう。用語、生体適合性はまた、物質が患者内へ移植される場合、その物質によって非特異的な所望されない細胞障害性効果または全身性効果が引き起こされることを意味する。
【００１９】
「セメント混合物」とは、固形セメントの前駆体である混合物をいう。この混合物は、乾燥粉末または顆粒形態であり得る。液体の開始剤と混合すると、この混合物は、プラスチックのペーストを形成する。このペーストは、化学反応および／または結晶再配列を受けそして水和反応の結果として、やがて固化した固形セメント内へと硬化する。この液体の開始剤は、生理学的に受容可能な水性の開始剤（例えば、水、水性緩衝剤または水性溶液）であり得る。そのセメント混合物は、結合組織表面（例えば、骨組織）を集合させるための（それは直接には接触しないが）、かつ骨組織と金属または人工の補綴デバイスとを結合させるための結合剤、または充填剤として使用され得る。好ましくは、セメント混合物は、カルシウムセメント混合物である。より好ましくは、この混合物は、カルシウムホスフェートセメント混合物、硫酸カルシウム半水和物のようなカルシウムスルフェートセメント混合物、またはそれらの組み合わせである。
【００２０】
「カルシウムホスフェートセメント混合物」とは、カルシウムホスフェート、アモルファスカルシウムホスフェート、脱炭酸されたアモルファスカルシウムホスフェート、β−トリカルシウムホスフェート、α−トリカルシウムホスフェート、モノカルシウムホスフェート、ジカルシウムホスフェート、オクタカルシウムホスフェート、カルシウムメタホスフェート、ヘプタカルシウムホスフェート、カルシウムピロホスフェートから選択される、少なくとも２つのカルシウムホスフェート混合物を含むセメント前駆体組成物をいう。このカルシウムホスフェートセメント混合物は、水和および硬化によってカルシウムホスフェートセメントを形成する。
【００２１】
「カルシウムスルフェートセメント混合物」とは、硫酸カルシウム、硫酸カルシウム半水和物（焼石膏）および硫酸カルシウム二水和物（石膏）が挙げられるが、これらに限定されない硫酸カルシウムの形態を含むセメント前駆体組成物をいう。このカルシウムスルフェートセメント混合物は、水和および硬化によってカルシウムスルフェートセメントを形成する。
【００２２】
「セメントマトリクス」とは、本発明の骨前駆体組成物と液体の開示剤との混合後に形成する組成物をいう。セメントマトリクスは、移植のために用意された、成形可能なパテ状の形態でか、またはインビボもしくはインサイチュで予め移植された、硬化された固体形態であり得る。硬化された固体形態は、湿潤細胞が接着し、増殖しそして骨形成に達成する形態形成プロセスに関与する骨格構造を有する。このセメントマトリクスはまた、ＢＭＰのような結合剤または生物活性因子から選択される１つ以上の構成要素を含み得る。
【００２３】
「保存的置換」とは、対応する基準残基と物理的にまたは機能的に類似する残基をいう。すなわち、保存的置換およびその基準残基は、類似するサイズ、形状、電荷、共有結合または水素結合などを形成する能力を含む化学的特性を有する。好ましい保存的置換は、Ｄａｙｈｏｆｆら、前出において許容される点突然変異に対して規定される基準を満たすものである。保存的置換の例は、以下の群内の置換である：（ａ）バリン、グリシン；（ｂ）グリシン、アラニン；（ｃ）バリン、イソロイシン、ロイシン；（ｄ）アスパラギン酸、グルタミン酸；（ｅ）アスパラギン、グルタミン；（ｆ）セリン、トレオニン；（ｇ）リジン、アルギニン、メチオニン；および（ｈ）フェニルアラニン、チロシン。用語「保存的改変体」または「保存的バリエーション」はまた、その親の配列に対して特異的な抗体がまた、生じる置換ポリペプチド配列に対して特異的、すなわち、「交差反応」または「免疫反応」する場合、所定の親のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の代わりに置換アミノ酸残基の使用を含む。
【００２４】
「欠損」または「欠損部位」とは、骨、関節、軟骨または靭帯の、修復、構成、融合、再生または増強を必要とする部位をいう。その部位は、整形外科的な構造的破裂または構造的異常であり得、あるいは骨が正常に成長しない部位であり得る。その欠損は、さらに骨軟骨性の欠損を規定し得、骨および上を覆う軟骨の両方の構造的な破裂を含む。欠損は、「空隙」の配置を呈し得、これは、例えば、骨または関節の構造的な完全性における間隙、腔、孔または他の実質的な破裂のような三次元の欠損を意味することが理解される。欠損は事故、疾患、外科的操作、および／またはプロテーゼ的な失敗の結果であり得る。特定の実施形態において、欠損は、内因性の修復または自然の修復が不可能な容量を有する空隙である。長骨におけるそのような欠損は、概して前記対象の骨の直径の２倍でありそしてまた「危険（ｃｒｉｔｉｃａｌ）サイズ」の欠損と呼ばれる。例えば、イヌの尺骨欠損モデルにおいて、当該分野は、そのような欠損をおよそ３〜４ｃｍであると認識する。概して、危険（ｃｒｉｔｉｃａｌ）サイズの欠損は、およそ１．０ｃｍであり、そして自然修復が不可能である。例えば、Ｓｃｈｍｉｔｚら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０５、２９９〜３０8頁（１９８６）；およびＶｕｋｉｃｅｖｉｃら、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、６、２０７〜２２４頁（１９９３）（ＪＡＩ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．）を参照のこと。ウサギおよびサルの分節欠損モデルにおいて、間隙はそれぞれおよそ１．５ｃｍおよび２．０ｃｍである。他の実施形態において、欠損は非危険サイズの分節欠損である。概して、これらは自然修復が可能である。特定の他の実施形態において、欠損は、骨軟骨性栓のような骨軟骨性の欠損である。そのような欠損は、上を覆う軟骨全体を横断しそして少なくとも一部で、その基礎をなす骨性構造に侵入する。対照的に、軟骨の欠損または肋軟骨下の欠損は、一部または全体で、それぞれ上を覆う軟骨を横断する、しかしその基礎をなす骨を巻き込まない。本発明を使用する修復が可能な他の欠損は、非癒着性の骨折；骨孔；腫瘍切除；新たな骨折（伸延性または非伸延性）；頭蓋、顎顔面および顔面の異常（例えば、顔面骨格の再構築、特に眼窩床の再構築、顎提または歯槽洞（ａｌｖｅｏｌａｒ  ｒｉｄｇｅ）の増大、歯周欠損および抜歯ソケット）；頭蓋形成、頤形成、頤増大、口蓋再構築、および他の大部分の骨性の再構築；椎骨形成、頚椎、胸椎および腰椎における椎体間融合ならびに胸椎および腰椎における後椎部での融合；骨再生に関する骨髄炎において；付属肢融合（ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｒ  ｆｕｓｉｏｎ）、足根関節融合（ａｎｋｌｅ  ｆｕｓｉｏｎ）、全臀部融合、膝融合および関節融合または関節形成；例えば、膝の前方靭帯、後方靭帯、外側靭帯および中央靭帯の腱の矯正および／または靭帯組織欠損、膝蓋骨およびアキレス腱などならびに癌、関節炎のような疾患（変形性関節症、および離断性の骨軟骨炎のような他の骨変性疾患を含む）から生じる欠損が挙げられるが、これに限定されない。
【００２５】
「形態形成タンパク質」とは、形態形成活性を有するタンパク質をいう。好ましくは、本発明の形態形成タンパク質は、ＢＭＰタンパク質ファミリーに属する少なくとも１つのポリペプチドを含む。形態形成タンパク質は、始原細胞を増殖させおよび／または局所的な環境信号に依存して軟骨、骨、腱、靭帯、神経または他の型の組織形成に導く分化経路を開始させ得、従って、形態形成タンパク質は、異なる環境において異なって挙動し得る。例えば、骨形成タンパク質は、一つの処置部位では骨組織を誘導し得、そして異なる処置部位では神経組織を誘導し得る。
【００２６】
「骨形成タンパク質（ＯＰ）」とは、始原細胞を軟骨形成および／または骨形成させることが出来る形態形成タンパク質をいう。骨は、膜内性骨または軟骨内骨であり得る。大部分の骨形成タンパク質は、ＢＭＰタンパク質ファミリーのメンバーであり、従ってＢＭＰでもある。本明細書の他の部分で記載されるように、タンパク質の種類は、ヒト骨形成タンパク質（ｈＯＰ−１）によって類型化される。本発明の実施において有用な他の骨形成タンパク質としては、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＣＯＰ−１、ＣＯＰ−３、ＣＯＰ−４、ＣＯＰ−５、ＣＯＰ−７、ＣＯＰ−１６、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−３ｂ、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＭＰ１２１，ドーサリン−１、ＤＰＰ、Ｖｇ−１、Ｖｇｒ−１、６０Ａタンパク質、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、ＴＧＦ−βおよび骨形成活性を有するこれらの保存性アミノ酸配列改変体の骨形成に活性な形態が挙げられる。現在好ましい１つの実施形態において、骨形成タンパク質としては、以下のいずれか１つ：ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−９、ならびにこれらのアミノ酸配列改変体およびホモログが挙げられ、これらの種ホモログを含む。特に好ましい骨形成タンパク質は、ヒトＯＰ−１、ＢＭＰ−２、および関連タンパク質のＣ末端の１０２〜１０６のアミノ酸（保存された７つのシステインドメインを規定する）と、少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むものである。本発明の特定の好ましい実施形態では、骨形成タンパク質（ＯＰ−１）を含む。本明細書の他の部分でさらに記載されるように、出願人の発明との使用に適切な骨形成タンパク質は、ＲｅｄｄｉおよびＳａｍｐａｔｈによって記載される、当該分野によって認識されるバイオアッセイを使用する慣用的な実験によって同定され得る。（本明細書中で参考として援用されるＳａｍｐａｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８４、７１０９〜７，１１３頁）
本発明において、有用なタンパク質としては、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３およびＣＢＭＰ−２タンパク質のような骨形成タンパク質（本明細書で参考として援用される米国特許第５，０１１，６９１号を参照のこと）、ならびにＤＰＰ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ由来）、Ｖｇ１（Ｘｅｎｏｐｕｓ由来）、Ｖｇｒ−１（マウス由来）、ＧＤＦ−１（ヒト由来、Ｌｅｅ、ＰＮＡＳ、８８、４２５０〜４２５４頁（１９９１）を参照のこと）、６０Ａ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ由来、Ｗｈａｒｔｏｎら、ＰＮＡＳ、８８、９２１４〜９２１８頁（１９９１）を参照のこと）、ドーサリン−１（ニワトリ由来、Ｂａｓｌｅｒら、Ｃｅｌｌ、７３、６８７〜７０２頁（１９９３）およびＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ１２０３２を参照のこと）およびＧＤＦ−５（マウス由来、Ｓｔｏｒｍら、Ｎａｔｕｒｅ、３６８、６３９〜６４３頁（１９９４）を参照のこと）のようなアミノ酸配列が関連するタンパク質として同定される真核生物のタンパク質が挙げられる。前記参考文献の教示は、本明細書中で参考として援用される。ＢＭＰ−３もまた好ましい。さらなる有用なタンパク質は、本明細書中で参考として援用される、米国特許第５，０１１，６９１号に開示される生合成形態形成構築物（例えば、ＣＯＰ−１、ＣＯＰ−３、ＣＯＰ−４、ＣＯＰ−５、ＣＯＰ−７およびＣＯＰ−１６、ならびに当該分野で公知の他のタンパク質）を含む。なお他のタンパク質は、骨形成的に活性な形のＢＭＰ−３ｂを含む（Ｔａｋａｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．、２１９、６５６−６６２頁（１９９６）を参照のこと）。ＢＭＰ−９（ＷＯ９５／３３８３０を参照のこと）、ＢＭＰ−１５（ＷＯ９６／３５７１０を参照のこと）、ＢＭＰ−１２（ＷＯ９５／１６０３５を参照のこと）、ＣＤＭＰ−１（ＷＯ９４／１２８１４を参照のこと）、ＣＤＭＰ−２（ＷＯ９４／１２８１４を参照のこと）、ＢＭＰ−１０（ＷＯ９４／２６８９３を参照のこと）、ＧＤＦ−１（ＷＯ９２／００３８２を参照のこと）、ＧＤＦ−１０（ＷＯ９５／１０５３９を参照のこと）、ＧＤＦ−３（ＷＯ９４／１５９６５を参照のこと）およびＧＤＦ−７（ＷＯ９５／０１８０２を参照のこと）。前記参考文献の教示は、本明細書中で参考として援用される。
【００２７】
「修復」は、欠損部位の空隙または構造的な裂け目を少なくとも一部満たすために十分な、新しい骨形成および／または軟骨形成をいう。しかし、修復は、完全な回復のプロセスまたは欠損をその欠損前の物理的／構造的／機械的状態への修復時に１００％効果的な処置を意味しない、またはそうでなければ必要としない。
【００２８】
「固形セメント」は、セメント混合物の水和反応の結果として硬化（ｃｕｒｅ）され、硬化（ｈａｒｄｅｎ）された固体をいう。セメント混合物の組成に依存して、セメント混合物が固形セメントを形成するためには、数分から数時間掛かり得る。この固形セメントは、好ましくはカルシウムホスフェートセメントまたはカルシウムスルフェートセメントである。カルシウムホスフェートセメントは、ヒドロキシアパタイト、炭酸塩化されたヒドロキシアパタイトまたは結晶性の乏しいヒドロキシアパタイトのようなヒドロキシアパタイトの形態であり得る。この固形セメントは、インビボまたはインサイチュで、骨成長、骨組織のような損傷を受けた結合組織の修復または置換を誘導するために形成され得る。
【００２９】
（骨前駆体組成物）
本発明は、セメント混合物および孔形成剤を含む骨前駆体組成物を提供する。好ましいセメント混合物は、カルシウムセメント混合物である。より好ましくは、そのカルシウムセメント混合物は、カルシウムホスフェートセメント混合物またはカルシウムスルフェートセメント混合物である。水和の際および周囲の温度、例えば、室温または体温に設定する際に、このセメント混合物は、固形セメントを形成する。水和は、水、生理食塩水緩衝剤または水性溶液のような液体の添加によって達成され得る。これらのセメントの硬化時間は、これらの組成物および添加された液体の量に依存して、数分から数時間までに変動し得る。ナトリウムホスフェートまたはナトリウムピロホスフェートのような緩衝剤は、硬化時間を減少し得る。インサイチュでの硬化は、新たな骨によるその完全な置換まで、組織片の適切な結合力を保証し、そして孔形成剤の急速な吸着は、細胞性因子がこのセメントマトリクスに浸透することを可能にする。
【００３０】
１つの実施形態では、カルシウムホスフェートセメント混合物は、ベータ−トリカルシウムホスフェート（β−ＴＣＰ）およびモノカルシウムホスフェート一水和物（ＭＣＰＭ）の混合物；β−ＴＣＰ、ジカルシウムホスフェート二水和物（ＤＣＰＤ）およびカルシウムカーボネート（ＣＣ）の混合物；モノカルシウムホスフェート、トリカルシウムホスフェートおよびカルシウムカーボネートの混合物；脱炭酸されたアモルファスのカルシウムホスフェートおよび第２のカルシウムホスフェートの混合物；テトラカルシウムホスフェート（ＴＴＣＰ）および第２のカルシウムホスフェートの混合物からなる群から選択される。
【００３１】
１つの実施形態では、第２のカルシウムホスフェートは、モノカルシウムホスフェート、ジカルシウムホスフェート無水物、ジカルシウムホスフェート二水和物、カルシウムメタホスフェート、ヘプタカルシウムホスフェート、カルシウムピロホスフェート、α−トリカルシウムホスフェート、β−トリカルシウムホスフェート、オクタカルシウムホスフェートおよびアモルファスのカルシウムホスフェートからなる群から選択される。
【００３２】
好ましい実施形態では、カルシウムホスフェートセメント混合物は、β−トリカルシウムホスフェート（β−ＴＣＰ）およびモノカルシウムホスフェート一水和物（ＭＣＰＭ）の混合物を含む。より好ましくは、このβ−ＴＣＰ／ＭＣＰＭ混合物は、さらにカルシウムピロホスフェート（ＣＰＰ）、硫酸カルシウム二水和物（ＣＳＤ）および硫酸カルシウム半水和物（ｈｅｍｉｈｙｄｒａｔｅ）（ＣＳＨ）を含む。β−ＴＣＰとＭＣＰＭとの混合の際、ＤＣＰＤの小結晶は、そのペーストの隅から隅まで形成される。これらの結晶は、β−ＴＣＰ粒子間の架橋として作用する。ＣＰＰ、ＣＳＤおよびＣＳＨの添加は、硬化時間を３０秒から約１０分に増大させる。
【００３３】
別の好ましい実施形態において、カルシウムホスフェートセメント混合物は、β−ＴＣＰ、ジカルシウムホスフェート二水和物（ＤＣＰＤ）およびカルシウムカーボネート（ＣＣ）の混合物を含む。好ましくは、β−ＴＣＰ／ＤＣＰＤ／ＣＣ混合物は、さらにヒドロキシアパタイトを含む。水の存在下で、この混合物はヒドロキシアパタイトを生成する。β−ＴＣＰ、ＤＣＰＤおよびＣＣ混合物の硬化時間は、少量（８％(ｗ／ｗ））のヒドロキシアパタイトの添加によって、４．５時間から約２０分に減少され得る。さらに別の好ましい実施形態では、カルシウムホスフェートセメント混合物は、モノカルシウムホスフェート、トリカルシウムホスフェートおよびカルシウムカーボネートの混合物を含む。生理的条件下で、炭酸塩化されたヒドロキシアパタイトは、非発熱反応において、このセメント混合物から、数分以内に形成される。
【００３４】
最も好ましい実施形態において、カルシウムホスフェートセメント混合物は、脱炭酸されたアモルファスカルシウムホスフェートおよび第２のカルシウムホスフェートの混合物を含み、この第２のカルシウムホスフェートは、ジカルシウムホスフェート二水和物、カルシウムメタホスフェート、ヘプタカルシウムホスフェート、カルシウムピロホスフェートおよびトリカルシウムホスフェートからなる群から選択される。脱炭酸されたアモルファスカルシウムホスフェートは、カーボネート成分の一部を除去するためにアモルファスの炭酸塩化されたカルシウムホスフェートを加熱することによって、形成される。アモルファスの炭酸塩化されたカルシウムホスフェートは、約１．５５から１．７の範囲でカルシウムとリンの比を有する、カルシウムイオン、ホスフェートイオンおよびカーボネートイオンを含む水溶液から沈殿される。体温（３７°Ｃ）では、水または緩衝剤における脱炭酸されたアモルファスカルシウムホスフェートおよび第２のカルシウムホスフェートの混合は、２０分以内に形成する結晶性の乏しいヒドロキシアパタイトを生成する。結晶性の乏しいヒドロキシアパタイトは、ナノメータ−サイズの結晶を含み、そして骨と実質的に同じＸ線回折スペクトルを有する。他の結晶性のセメントと比較して、結晶性の乏しいセメントは、より溶解性でありそしてより骨伝導性の細胞媒介性吸着を提供する。この結晶性の乏しいヒドロキシアパタイトの溶解性は、Ｃａ／Ｐの比を改変させることによってさらに改善され得る。この結晶性の乏しいセメントは、その硬化反応が最小限の熱を発生させるので、ＢＰＭのような生物活性因子の結合に特に適しており、タンパク質構造の変性を最小限にする。
【００３５】
最も好ましい実施形態では、カルシウムホスフェートセメント混合物は、テトラカルシウムホスフェート（ＴＴＣＰ）および第２のカルシウムホスフェートであり；ここで、この第２のカルシウムホスフェートは、モノカルシウムホスフェート、ジカルシウムホスフェート無水物（ＤＣＰＡ）、ジカルシウムホスフェート二水和物（ＤＣＰＤ）、α−トリカルシウムホスフェート、β−トリカルシウムホスフェート、オクタカルシウムホスフェート、およびアモルファスカルシウムホスフェートからなる群から選択される。この化合物が水と共に混合される場合、等温反応が生じ、１５分から３０分以内にセメント硬化が生じる。次いでセメントは、４〜６時間内にインサイチュでヒドロキシアパタイトの固形塊（ｓｏｌｉｄ  ｍａｓｓ）に完全に転化する。テトラカルシウムホスフェートは、２：１未満のモルＣａ／Ｐ比を有することが好ましい。この比が２：１を超える場合、カルシウムオキシドは、不純物として存在し得る。これは、セメントスラリーのｐＨを実質的にｐＨ８．５以上より上に上昇させ、硬化反応を妨げる。無水の条件下でテトラカルシウムホスフェートを維持することが重大である。そうでない場合、この化合物は、セメント形成において反応性がより低い。好ましい実施形態では、第２のカルシウムホスフェートは、ジカルシウムホスフェート無水物（ＤＣＰＡ）およびジカルシウムホスフェート二水和物（ＤＣＰＤ）からなる群から選択される。比較的に大きいＴＴＣＰ粒子および小さいＤＣＰＡ粒子は、セメントにおける急速な硬化および高度な強度を達成することを助ける。セメント形成において、このＴＴＣＰ／ＤＣＰＡの比は、１：１：から１：４の範囲であり得る。好ましくは、この比は、１：１である。１：１の比は、ヒドロキシアパタイトを生成する。
【００３６】
別の最も好ましい実施形態では、本発明で使用されるカルシウムスルフェートセメント混合物は、硫酸カルシウム半水和物（ＣＳＨ、ＣａＳＯ４．１／２Ｈ２Ｏ）を含む。ＣＳＨは、石膏（ＣａＳＯ４．２Ｈ２Ｏ）の加熱によって生成され、そのため石膏はその水分の７５％を消失する。ＣＳＨが水と混合される場合、急速に凝固するペーストが形成される。ＣＳＨは、それが局所的炎症性応答または異物応答を刺激しない場合、生物学的適合性であることが示される。さらに、骨芽細胞は、ＣＳＨと接着し得、そして骨芽細胞はそれを活発に吸収し得る。均一のサイズおよび形を有する医療等級のＣＳＨは、骨前駆体組成物のために使用されることが好ましい。この医療等級のＣＳＨは、よりゆっくりとした、より予測可能な溶解性および吸収性を示す。
【００３７】
本発明はまた、セメント混合物および孔形成剤から形成される固形セメントを含む組成物を提供する。好ましくは、この固形セメントは、カルシウムホスフェートセメントまたはカルシウムスルフェートセメントである。カルシウムホスフェートセメントとしては、ヒドロキシアパタイト、結晶性の乏しいＨＡセメントまたは炭酸塩化されたヒドロキシアパタイトが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】
本発明の孔形成剤は、ビーズ形態または樹脂形態であり得る。この孔形成剤は、天然ポリマーまたは合成ポリマーの両方を含む、吸収性生体適合性ポリマーであり得る。天然ポリマーは、代表的には、体内の酵素的な退化によって吸収される、一方合成吸収性ポリマーは、代表的には加水分解的な機構によって分解される。
【００３９】
１つの実施形態では、孔形成剤は、エチレンビニルアセテート、天然コラーゲンおよび合成コラーゲン、ポリ（グラキサノン）、ポリ（ホスファゼン）、ポリグラクチン、ポリグラクチン酸、ポリアルドニン酸、ポリアクリル酸、ポリアルカノエート、ポリオルトエステル、ポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ、Ｌ−ラクチド）（ＰＤＬＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ζ−カプロラクトン）、ポリ（トリメチレンカーボネート）、ポリ（ｐ−ジオキサノン）、ポリ（ζ−カプロラクトン−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（グリコリド−ｃｏ−トリメチレンカーボネート）、ポリ（Ｄ、Ｌ−ラクチド−ｃｏ−トリメチレンカーボネート）、ポリアリーレート、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、ポリ無水物、ポリ（無水物−ｃｏ−イミド）およびそれらのコポリマー、アミノ酸のポリマー、プロピレン−ｃｏ―フマレート、１つ以上のα−ヒドロキシカルボン酸モノマーのポリマー、硫酸カルシウム、生物活性ガラス組成物、それらの混合物ならびに任意の誘導体およびこれらの改変体からなる群から選択される；ただし、セメント混合物が硫酸カルシウム半水和物である場合、孔形成剤は硫酸カルシウムでない。好ましくは、孔形成剤の改変体は、全構造の５０％未満である。
【００４０】
より好ましい実施形態では、孔形成剤は、ポリオルトエステル、ポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＤＬＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ζ−カプロラクトン）、ポリ（トリメチレンカーボネート）、ポリ（ｐ−ジオキサノン）、ポリ（ζ−カプロラクトン−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（グリコリド−ｃｏ−トリメチレンカーボネート）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−トリメチレンカーボネート）、ポリアリーレートおよびそれらのコポリマーからなる群から選択される。
【００４１】
別のより好ましい実施形態では、孔形成剤は、エチレンビニルアセテート、天然コラーゲンおよび合成コラーゲン、ポリ（グラキサノン）、ポリ（ホスファゼン）、ポリグラクチン、ポリグラクチン酸、ポリアルドン酸、ポリアクリル酸、ポリアルカノエートおよびそれらのコポリマーからなる群から選択される。
【００４２】
さらに別のより好ましい実施形態では、孔形成剤は、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、ポリ無水物、ポリ（無水物−ｃｏ−イミド）およびそれらのコポリマーを含む無水物、アミノ酸ポリマー、プロピレン−ｃｏ−フマレート、１つ以上の一ヒドロキシカルボン酸モノマーのポリマー（例えば、α−ヒドロキシ酢酸（グリコール酸）および／またはα−ヒドロキシプロピオン酸（乳酸））、硫酸カルシウムならびに生物活性ガラス組成物からなる群から選択される。α−ヒドロキシプロピオン酸は、そのｄ−もしくはｌ−の形態で使用され得る、またはラセミ混合物として使用され得る。
【００４３】
なおより好ましい実施形態では、孔形成剤は、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）および硫酸カルシウムからなる群から選択される。カルシウムセメントにおいて孔を形成するために所望される比に依存して、ラクチド、グリコリドモノマーのモル比は、調整され得る。好ましい実施形態では、このモノマーの比は、５０：５０である。概して、分子量が大きければ大きいほど、生物分解はより遅くなる。好ましくは、コポリマーの分子量範囲は、約５，０００ダルトンから１００，０００ダルトンであり、より好ましくは、１０，０００ダルトンから３０，０００ダルトンである。ＰＬＧＡは、硫酸カルシウムより急速な吸収速度を有する。ＰＬＧＡの分解は、加水分解に対して不安定な骨格の化学的な加水分解による。
【００４４】
最も好ましい実施形態では、カルシウムホスフェートセメント混合物は、テトラカルシウムホスフェートおよびジカルシウムホスフェート無水物の混合物を含む；そして、孔形成剤は、ＰＬＧＡおよび硫酸カルシウムからなる群から選択される。別の最も好ましい実施形態では、硫酸カルシウム混合物は、硫酸カルシウム半水和物を含む；そして孔形成剤は、ＰＬＧＡである。
【００４５】
孔形成剤の吸収速度は、吸収不可能なカルシウムセメントの吸収速度より急速である。結果として、孔は、カルシウムセメントにおいて形成される。孔形成剤の吸収速度は、孔形成剤の割合、ポリマーの型および粒子サイズに依存する。孔形成剤の割合が増加するにつれ、組織片の機械的強度は、減少する。過剰量の孔形成剤は、より低い機械的強度を生じるセメント体の密度の減少を導く。孔形成剤の量の不足は、セメントにおいて不十分な孔を生じ得る。好ましい実施形態では、孔形成剤の割合は、１０〜７０容量％であり、より好ましくは、４０〜６０容量％である。孔形成剤の割合は、孔形成剤がＰＬＧＡである場合、好ましくは７〜４０重量％であり、より好ましくは７〜２５重量％であり、最も好ましくは７〜１４重量％である。
【００４６】
孔形成剤の粒子サイズは、セメントにおいて生じる孔のサイズに影響を及ぼす。十分な孔サイズが、湿潤する骨溶解性細胞および骨芽細胞のための滞留空間を提供するために要求される。この孔サイズはまた、吸収の速度を調節する。吸収の速度が骨成長の速度と一致する場合、骨修復が最適である。孔形成剤が、直径２０〜５００μｍ、好ましくは２０〜１４０μｍ、より好ましくは５０〜１４０μｍ、最も好ましくは７５〜１４０μｍの孔サイズを創造することが好ましい。孔形成剤がＰＬＧＡである場合、その粒子サイズは、好ましくは２０〜１４０μｍまたは３１０〜５００μｍである。孔形成剤が硫酸カルシウムである場合、その粒子サイズは、好ましくは２０〜１４０μｍまたは２６０〜５００μｍである。
【００４７】
本発明の骨前駆体組成物はまた、１つ以上の生物活性因子と組み合わされ得る。この生物活性因子は、骨成長を高める因子であり得る。ある実施形態では、生物活性因子は、骨形態形成タンパク質である。より好ましい実施形態では、この骨形態形成タンパク質は、ＯＰ−１（ＢＭＰ−７）、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＣＯＰ−１、ＣＯＰ−３、ＣＯＰ−４、ＣＯＰ−５、ＣＯＰ−７、ＣＯＰ−１６、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−３ｂ、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＭＰ１２１、ドーサリン−１、ＤＰＰ、Ｖｇ−１、Ｖｇｒ−１、６０Ａタンパク質、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、およびＴＧＦ−βからなる群から選択される。最も好ましい実施形態では、この形態形成タンパク質は、ＯＰ−１である。
【００４８】
最も好ましい実施形態では、生物活性因子は、孔形成剤中にカプセル化される。孔形成剤は、破骨細胞によってゆっくりと吸収され、カプセル化された生物活性因子は、徐々にマトリクス内に放出される。移植部位で、（好ましくは吸収速度の異なる）異なる生物分解性因子との組み合わせによってこの生物活性因子を送達して、複数ブースト送達システムを達成し得る。別の好ましい実施形態では、生物分解性因子は、複数の層にされる。各層は、（好ましくは、吸収速度が異なる）異なる生物分解性因子を含む。この生物活性因子をカプセル化する方法としては、乳濁液−溶媒エバポレーション法（ｅｍｕｌｓｉｏｎ−ｓｏｌｖｅｎｔ  ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）（Ｇｒａｎｄｆｉｌｓら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２６，４６７〜４７９頁（１９９２））およびＨｅｒｂｅｒｔら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１５、３５７〜３６１頁（１９９８）に記載される方法が挙げられるが、これらに限定されない。上記の２つの参考文献は、本明細書中で参考として援用される。後者の方法は、特にタンパク質のカプセル化に最適である。他の方法は、米国特許第６，１１０，５０３号、同第５，６５４，００８号および同第５，２７１，９６１号に記載され、これらの特許は、本明細書中で参考として援用される。好ましい実施形態では、生物活性因子は、カプセル化のプロセスの間に乳糖を添加することにより安定化される。
【００４９】
別の好ましい実施形態では、生物活性因子は、修復細胞である。好ましい実施形態では、修復細胞は哺乳動物の細胞であり、より好ましくは修復されるか、または再構築される組織と同じ型のヒトの細胞である。修復細胞の適切な例としては、骨髄幹細胞、骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｙｔｅ）、骨芽細胞、破骨細胞および骨始原細胞のような骨細胞（ｂｏｎｅ  ｃｅｌｌ）が挙げられる。別の実施形態では、細胞は、ＢＭＰをコードする核酸分子でトランスフェクトされる。
【００５０】
さらに別の好ましい実施形態では、生物活性因子は、ＢＭＰをコードする配列（好ましくはＯＰ−１をコードする配列（配列番号１０））を含む核酸分子である。好ましい実施では、核酸分子は、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子である。ＢＭＰをコードする核酸配列は、組み換え発現ベクターに挿入され得る。ベクターの例としては、ｐＢＲ３２２、ｐＨ７１７、ｐＨ７３１、ｐＨ７５２、ｐＨ７５４およびｐＷ２４が挙げられるが、これらに限定されない。ＳＰ６ベクターは、ＲＮＡのインビトロでの転写のために使用され得る。このＢＭＰを発現させるために有効な転写プロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター、アデノウイルスプロモーター（ＡｄＭＬＰ）、マウスメタロチオネイン−Ｉプロモーター（ｍＭＴ−Ｉ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）長末端反復（ＬＴＲ）、マウス乳腺癌ウイルス長末端反復（ＭＭＴＶ−ＬＴＲ）、およびヒトサイトメガロウイルス主要中間−初期プロモーター（ｈＣＭＶ）が挙げられるが、これらに限定されない。これらのプロモーター全てのＤＮＡ配列は、当該分野において公知でありそして市販されている。このＤＮＡ配列はまた、例えば、組み換えアデノウイルス、アデノ随伴ウイルスまたはレトロウイルスのような組み換えウイルスのゲノム中に挿入され得る。次いで、修復細胞または骨始原細胞は、ＢＭＰタンパク質を発現させるためにこれらのベクターまたはウイルスでトランスフェクトまたは感染される。この核酸配列は、一過性にまたは安定してこの修復細胞または骨始原細胞をトランスフェクトし得る。
【００５１】
ある実施形態では、核酸分子は、組織部位に直接注入される。別の実施形態では、核酸分子は、孔形成剤中に、好ましくは２５〜３０ｋＤのＰＬＧＡ中にカプセル化される。好ましくは、核酸分子は、マンニトール、蔗糖、乳糖、トレハロース、リポソーム、ウイルスのエンベロープタンパク質およびポリリジン−糖タンパク質複合体を含むプロテオリポソームからなる群から選択されるキャリア中に捕らえられる。例えば、Ｌｅｄｌｅｙ、Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  １１０、１頁（１９８７）；Ｎｉｃｏｌａｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８０、１０６８頁（１９８３）を参照のこと。別の好ましい実施形態では、核酸は、体から取り出された骨始原細胞および修復細胞のような標的細胞にトランスフェクトされるか、または感染される。次いで、このトランスフェクトされた細胞は、体内へ再移植される。
【００５２】
（骨前駆体組成物および固形セメントを生成する方法）
本発明はまた、骨前駆体組成物を生成する方法を提供する。乾燥粉末形態でのセメント混合物が、骨前駆体組成物の均等に分配される混合物を形成するために孔形成剤と混ぜ合わされる。これは、セメント混合物が孔形成剤の周囲を取り囲むことを可能にし、そのため孔がセメントマトリクスにおいてインサイチュで形成される。次いで、水、緩衝剤または水性溶液が、この組成物に添加される。このペーストは、固形セメント中に分散された孔形成剤を含む組成物を形成するために硬化され（ｓｅｔ）、そして硬化される（ｈａｒｄｅｎ）。この方法は、セメント混合物が液体形態で生物分解性物質に添加される処方物を調製する方法と区別できる。そこで、この生物分解性物質は、孔形成剤の代わりにセメントの周囲のマトリクスとして作用する。
【００５３】
（結合剤）
本発明の骨前駆体組成物はさらに、生物学的適合性の結合剤と組み合わせられ得る。この結合剤は、組成物の高められた粘性および結合性を提供し、当業者が、空隙内、欠損内または新たな骨成長が所望される他の領域内で、組成物を位置づけそして成形することを可能にする。組成物の高められた結合性はまた、整形外科への適用、顎顔面への適用および歯への適用のために移植物質と関連した粒子の移動を提供する。結合剤の最小量は、組織内植の期間中に、容易に形成能力を与えそして十分な粒子の結合力および成形保持力を提供するために要求される量である。
【００５４】
本発明の結合剤は、生物分解性、生物適合性でありそして流体流動特性を有する。本明細書で有用として企図される結合剤は、当該分野で認識される懸濁剤、粘性生成剤、ゲル形成剤および乳化剤が挙げられるが、これらに限定されない。他の結合剤は、局所投与、経口投与または非経口投与のための成分を懸濁するために使用される因子を含む。さらに他の結合剤は、錠剤結合剤、崩壊剤または乳化安定剤として有用な因子である。なお他の結合剤は、美容品、化粧品および食品において使用される因子である（ＵＳＰ  ＸＸＩＩ  −ＮＦ  ＸＶＩＩ  Ｔｈｅ  Ｎｉｎｅｔｅｅｎ  Ｎｉｎｅｔｙ  Ｕ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ  ａｎｄ  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ  （１９９０）を参照のこと）。ＥＤＴＡ、クエン酸塩、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）のような抗酸化物質、ポリ（ソルベート）およびポリ（オキシエチレン）のような界面活性剤を含む他の成分は、この結合剤に添加され得る。
【００５５】
好ましい結合剤は、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）ナトリウムである。カルボキシメチルセルロースナトリウムは、９０，０００〜７００，０００ダルトンの範囲にある代表的な分子量を持つセルロースのポリカルボキシメチルエーテルのナトリウム塩である。
【００５６】
室温で流動可能な結合剤を除いて、結合剤はまた、ゼラチンのような試薬を含み、暖かいまたは熱い水性溶液において可溶化され、冷却の際非流動性のゲルに変換される。このゼラチン組成物は、移植のための哺乳動物の体温以上の温度で流動可能であるが、体温のような温度または体温よりわずかに上の温度では比較的非流動性のゲルに転移するように処方される。
【００５７】
結合剤は、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、ゼラチン、ペプチド、ムチン、コンドロイチン硫酸、キトサン、ポロキサマー、グリコサミノグリカン、多糖類、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース（ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース（ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、マンニトール、白色ワセリン、マンニトール／デキストランの組み合わせ、マンニトール／白色ワセリンの組み合わせ、ゴマ油、フィブリン接着剤、血液およびそれらの混合物からなる群から選択されることが好ましい。
【００５８】
より好ましくは、結合剤は、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース（ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース（ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）およびそれらの混合物から選択される。最も好ましくは、結合剤は、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよびカルボキシメチルセルロースカルシウムからなる群から選択される。
【００５９】
ある実施形態では、本発明の結合剤は、ヒアルロン酸ナトリウム（約５００〜３０００ｋＤ）、キトサン（約１００〜３００ｋＤ）、ポロキサマー（約７〜１８ｋＤ）、およびグリコサミノグリカン（約２０００〜３０００ｋＤ）を含む高分子量のヒドロゲルのクラスから選択される。好ましい実施形態では、グリコサミノグリカンは、Ｎ，Ｏ−カルボキシメチルキトサングルコサミンである。ヒドロゲルは、３次元の網様構造を有するゲルの形態で架橋される親水性のポリマーである。ヒドロゲルは、正味の正電荷、正味の負電荷を帯び得るか、または中性であり得る。代表的な正味の負電荷を帯びたヒドロゲルは、アルギン酸塩である。正味の正電荷を帯びるヒドロゲルは、コラーゲンおよびラミニンのような細胞外マトリクス成分によって類型化され得る。市販で入手できる細胞外マトリクス成分の例としては、ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ（５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを添加したダルベッコ変性イーグル培地）およびＶｉｔｒｏｇｅｎＴＭ（０．０１２Ｎ  ＨＣｌに溶解した、精製され、ペプシン可溶化されたウシの皮膚のコラーゲンの無菌溶液）を含む。正味の中性ヒドロゲルの例は、高度に架橋されたポリエチレン酸化物およびポリビニルアルコールである。
【００６０】
別の好ましい実施形態では、結合剤は、ポリエチレングリコールである。低分子量のポリエチレングリコールおよび高分子量のポリエチレングリコールの混合物は、適当な粘性を有するペーストを生成する。例えば、適当な比での、分子量４００〜６００ダルトンのポリエチレングリコールおよび分子量１５００ダルトンのポリエチレングリコールとの混合物は、本発明による結合剤を形成する際に有効である。
【００６１】
さらに別の実施形態では、結合剤は、デキストラン、硫酸デキストラン、ジエチルアミノエチルデキストラン、デキストランホスフェートまたはそれらの混合物からなる、平均分子量が約２００，０００〜５，０００，０００ダルトンである多糖類のクラスから選択される。より低い分子量の多糖類は、より急速なデキストランの吸収速度を有し、これは、多孔性の骨前駆体組成物物質のより早期の露呈を生ずる。デキストランが長期間その部位に残存することが所望される場合、比較的高分子量のデキストランが使用され得る。他の好ましい多糖類は、デンプン、分別デンプン（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ  ｓｔａｒｃｈ）、アミロペクチン、寒天、アラビアゴム、プルラン、アガロース、カラゲナン、デキストラン、フルクタン、イヌリン、マンナン、キシラン、アラビナン（ａｒａｂｉｎａｎｓ）、グリコゲン、グルカン、キサンタンゴム、グアーゴム、ローカスト豆ゴム、トラガカントゴム、カラヤゴム、およびそれらの誘導体もしくは混合物を含む。
【００６２】
別の好ましい実施形態では、結合剤は、マンニトール、白色ワセリン、マンニトール／デキストランの組み合わせ、マンニトール／白色ワセリンの組み合わせ、ゴマ油、フィブリン接着剤およびそれらの混合物からなる群から選択される。さらに好ましい実施形態では、結合剤はフィブリン接着剤である。フィブリン接着剤は、哺乳動物のフィブリノゲンおよびトロンビンの混合物を含む。ヒトのフィブリノゲンは、Ｔｉｓｓｕｃｏｌ（登録商標）（Ｉｍｍｕｎｏ  ＡＧ、Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ）、Ｂｅｒｉｐｌａｓｔ（登録商標）（Ｂｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ、Ｍａｒｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｂｉｏｃｏｌｌ（登録商標）（Ｃｅｎｔｒｅ  ｄｅ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｓａｎｇｕｉｎｅ  ｄｅ  Ｌｉｌｌｅ、Ｐｏｕｒｓ、Ｆｒａｎｃｅ）およびＴｒａｎｓｇｌｕｔｉｎｅ（登録商標）（ＣＮＴＳ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｒｅ、Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ、Ｆｒａｎｃｅ）のような製品として市販に入手できるが、これらに限定されない。フィブリン接着剤はまた、例えばウシおよびマウスを供給源とするというような、他の哺乳動物の供給源由来のフィブリノゲンおよびトロンビンから生成され得る。
【００６３】
さらに別の好ましい実施形態では、結合剤はヒトの血液であり、好ましくは自原性の血液である。この種類の結合剤は、タンパク質隔離物質として作用する。ＢＭＰを含む本発明の骨前駆体組成物物質に添加される場合、血液は可鍛性の複合物を形成するように凝固する。これにより、ＢＭＰが、そうでなければこのタンパク質が湿潤する哺乳動物の始原細胞の骨形成活性の本来の速度を増加させるのに十分な時間の間、セメントマトリクス内に隔離される。
【００６４】
本発明はまた、本発明の骨前駆体組成物物質および骨形態形成タンパク質のような生物活性因子を含む、骨移植のためのキットに関連がある。１つの実施形態では、キットはさらに結合剤を含む。別の実施形態では、キットは本発明の骨前駆体組成物物質および結合剤を含む。
【００６５】
（骨形態形成タンパク質ファミリー）
典型的な骨形態形成／骨形成タンパク質ファミリーメンバーにちなんで命名される、ＢＭＰファミリーは、ＴＧＦ−βタンパク質スーパーファミリーに属する。報告される「ＢＭＰ」（ＢＭＰ−１〜ＢＭＰ−１８）（主に配列相同性を基にして分離される）のうち、ＢＭＰ−１を除く全ては、形態形成タンパク質のＢＭＰファミリーのメンバーとして分類されたままである（Ｏｚｋａｙｎａｋら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，９，２０８５〜９３頁（１９９０））。
【００６６】
ＢＭＰファミリーは、形態形成タンパク質である、他の構造的に関連するメンバーを含み、ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ遺伝子複合体（ＤＰＰ）生成物、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓのＶｇ１生成物およびそのマウスホモログであるＶｇｒ−１（例えば、本明細書中で参考として援用される、Ｍａｓｓａｇｕｅ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，６，５９７〜６４１頁（１９９０）を参照のこと）を含む。
【００６７】
ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、およびＯＰ−１（ＢＭＰ−７）のＣ末端ドメインは、ＢＭＰ−２のＣ末端ドメインと約６０％同一であり、そしてＢＭＰ−６およびＯＰ−１のＣ末端ドメインは、８７％同一である。ＢＭＰ−６は、おそらくマウスＶｇｒ−１のヒトホモログである（Ｌｙｏｎｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８６，４５５４〜５９頁（１９８９））；この２つのタンパク質は、アミノ酸配列レベルで、端から端まで９２％同一である（本明細書で参考として援用される、米国特許第５，４５９，０４７号）。ＢＭＰ−６は、Ｘｅｎｏｐｕｓ  Ｖｇ−１生成物と５８％同一である。
【００６８】
（骨形態形成タンパク質の生化学的特性、構造的特性および機能的特性）
天然に生じる骨モルフォゲン（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎ）は、そのＣ末端領域（ドメイン）において実質的なアミノ酸配列相同性を共有する。代表的には、上述される天然に生じる骨形成タンパク質は、前駆体として翻訳され、この前駆体は、代表的に約３０残基未満のＮ末端シグナルペプチド配列を有し、およそ１００〜１４０アミノ酸の成熟したＣ末端ドメインを生じるために分裂される「プロ」ドメインが引き続く。このシグナルペプチドは、Ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１４，４６８３〜４６９１頁（１９８６）の方法を使用することで所定の配列において予測され得る分裂部位で、翻訳時に急速に分裂される。このプロドメインは、代表的には、完全にプロセシングされた成熟Ｃ末端ドメインよりも約３倍大きい。
【００６９】
ＢＭＰタンパク質ファミリーメンバーの別の特徴は、二量体を形成する明白な能力である。いくつかの骨由来の骨形成タンパク質（ＯＰ）およびＢＭＰは、それらの活性な形態でホモ二量体およびヘテロ二量体として見出される。ＯＰおよびＢＭＰがヘテロ二量体を形成する能力は、さらなる形態形成誘導能力または変化した形態形成誘導能力を形態形成タンパク質に付与する。ヘテロ二量体は、ホモ二量体とは質的または量的に異なる結合親和性をＯＰレセプター分子およびＢＭＰレセプター分子に対して示す。変化した結合親和性は、異なるシグナル伝達経路を媒介するレセプターの差次的活性化を次々と導き得、結局異なる生物学的活性または結果を導き得る。変化した結合親和性はまた、組織型または細胞型に特異的な方法で明示され得、その結果特定の始原細胞のみが増殖および／または分化するのを誘導する。
【００７０】
好ましい実施形態では、形態形成ポリペプチドの対は、参照のモルフォゲンのアミノ酸配列と、規定される類縁性を共有する配列をそれぞれ含むアミノ酸配列を有する。本明細書中で、好ましい骨形成ポリペプチドは、骨形成的に活性なヒトＯＰ−１（配列番号１）中に存在する配列と規定された類縁性を共有する。しかしながら、本明細書中で開示される天然に生じる配列または生合成配列のうちのいずれか１つ以上が同様に、参照配列として使用され得る。好ましい骨形成ポリペプチドは、少なくともヒトＯＰ−１のＣ末端の６システインドメイン（配列番号１の残基３３５〜４３１）と規定される類縁性を共有する。好ましくは、骨形成ポリペプチドは、少なくともヒトＯＰ−１のＣ末端の７システインドメイン（配列番号１の残基３３０〜４３１）と規定される類縁性を共有する。すなわち、骨形態形成活性を有するダイマーのタンパク質における好ましいポリペプチドは、それぞれ参照配列と一致するかまたは機能的にそれと同等な、配列を含む。
【００７１】
機能的に同等な配列は、参照配列内に配列されるシステイン残基と機能的に同等な配列を含み、これらのシステインの鎖状配列を変えるがこのダイマーのモルフォゲンタンパク質の折たたみ構造における類縁性を著しくは損なわない、アミノ酸の挿入または欠損を含み、形態形成活性に必要であり得るような鎖内のジスルフィド結合または鎖間のジスルフィド結合を形成する能力を含む。機能的に同等な配列はさらに、１つ以上のアミノ酸残基が参照配列の対応する残基と異なっているもの（例えば、ヒトＯＰ−１のＣ末端の７システインドメイン（本明細書中で保存的７システイン骨格（ｓｋｅｌｅｔｏｎ）とも称される））を含むが、骨形態形成活性を無効にしない場合に限る。それゆえ、参照配列において対応するアミノ酸の保存的置換が好ましい。参照配列において対応する残基に対して保存的置換であるアミノ酸残基は、対応する参照残基と物理的にまたは機能的に類似するもの（例えば、類似するサイズ、形、電荷、共有結合または水素結合を形成する能力を含む化学的特性など）である。特に好ましい保存的置換は、Ｄａｙｈｏｆｆら（前出）（その教示は、本明細書中で参考として援用される）において受容される点突然変異に対して規定される基準を満たすものである。
【００７２】
骨形成タンパク質ＯＰ−１は、記載されている（例えば、本明細書中で参考として援用されるＯｐｐｅｒｍａｎｎら，米国特許第５，３５４，５５７号を参照のこと）。その成熟したネイティブの形態である天然の供給源とされる骨形成タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定される場合、代表的には約３０〜３６ｋＤａの見かけの分子量を有するグリコシル化された二量体である。還元された場合、この３０ｋＤａのタンパク質は、約１６ｋＤａおよび１８ｋＤａの見かけの分子量を有する２つのグリコシル化されたペプチドサブユニットを生じさせる。グリコシル化されていないタンパク質（骨形成活性も有する）は、約２７ｋＤａの見かけの分子量を有する。還元された場合、この２７ｋＤａのタンパク質は、グリコシル化されていない２つのポリペプチド（約１４ｋＤａおよび１６ｋＤａの分子量を有し、哺乳動物において軟骨内の骨形成を誘導し得る）を生じさせる。骨形成タンパク質は、ネイティブのタンパク質の様々なグリコシル化の型を有する形態、様々なＮ末端形態、および活性な短縮形態または変異した形態を含み得る。上述されるように、特に有用な配列としては、ＤＰＰ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ由来）、Ｖｇ１（Ｘｅｎｏｐｕｓ由来）、Ｖｇｒ−１（マウス由来）、ＯＰ−１タンパク質およびＯＰ−２タンパク質（本明細書中で参考として援用される米国特許第５，０１１，６９１号およびＯｐｐｅｒｍａｎｎら参照のこと）、ならびにＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４と呼ばれるタンパク質（本明細書中で参考として援用されるＷＯ８８／００２０５、米国特許第５，０１３，６４９およびＷＯ９１／１８０９８を参照のこと）、ＢＭＰ−５およびＢＭＰ−６と呼ばれるタンパク質（本明細書中で参考として援用されるＷＯ９０／１１３６６、ＰＣＴ／ＵＳ９０／０１６３０を参照のこと）、ＢＭＰ−８およびＢＭＰ−９と呼ばれるタンパク質のＣ末端の９６アミノ酸配列または１０２アミノ酸配列を含むものが挙げられる。
【００７３】
本発明の好ましい形態形成タンパク質および骨形成タンパク質は、ＯＰ−１（ＢＭＰ−７）、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＣＯＰ−１、ＣＯＰ−３、ＣＯＰ−４、ＣＯＰ−５、ＣＯＰ−７、ＣＯＰ−１６、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−３ｂ、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＭＰ１２１、ドーサリン−１、ＤＰＰ、Ｖｇ−１、Ｖｇｒ−１、６０Ａタンパク質、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、ＴＧＦ−βおよびアミノ酸配列改変体ならびにそれらのホモログからなる群から選択される、少なくとも１つのポリペプチドを包含し、それらの種ホモログを含む。好ましくは、この形態形成タンパク質は、ＯＰ−１（ＢＭＰ−７）、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５およびＢＭＰ−６からなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドを含む；さらに好ましくは、ＯＰ−１（ＢＭＰ−７）およびＢＭＰ−２である；そして最も好ましくはＯＰ−１（ＢＭＰ−７）である。
【００７４】
これらの配列、ならびにそれらの化学的特性および物理的特性を開示する刊行物としては、以下が挙げられる：ＯＰ−１およびＯＰ−２（米国特許第５，０１１，６９１号；米国特許第５，２６６，６８３号；Ｏｚｋａｙｎａｋら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，９，２０８５〜２０９３頁（１９９０）；ＯＰ−３（ＷＯ９４／１０２０３（ＰＣＴ  ＵＳ９３／１０５２０））、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、（ＷＯ８８／００２０５；Ｗｏｚｎｅｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１５２８〜１，５３４頁（１９８８））、ＢＭＰ−５およびＢＭＰ−６、（Ｃｅｌｅｓｔｅら，ＰＮＡＳ，８７，９８４３〜９８４７（１９９１））、Ｖｇｒ−１（Ｌｙｏｎｓら，ＰＮＡＳ，８６，４５５４〜４５５８（１９８９））；ＤＰＰ（Ｐａｄｇｅｔｔら，Ｎａｔｕｒｅ，３２５，８１〜８４頁（１９８７））；Ｖｇ−１（Ｗｅｅｋｓ，Ｃｅｌｌ，５１，８６１〜８６７頁（１９８７））；ＢＭＰ−９（ＷＯ９５／３３８３０（ＰＣＴ／ＵＳ９５／０７０８４）；ＢＭＰ−１０（ＷＯ９４／２６８９３（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５２９０）；ＢＭＰ−１１（ＷＯ９４／２６８９２（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５２８８）；ＢＭＰ−１２（ＷＯ９５／１６０３５（ＰＣＴ／ＵＳ９４／１４０３０）；ＢＭＰ−１３（ＷＯ９５／１６０３５（ＰＣＴ／ＵＳ９４／１４０３０）；ＧＤＦ−１（ＷＯ９２／００３８２（ＰＣＴ／ＵＳ９１／０４０９６）およびＬｅｅら，ＰＮＡＳ，８８，４２５０〜４２５４頁（１９９１）；ＧＤＦ−８（ＷＯ９４／２１６８１（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０３０１９）；ＧＤＦ−９（ＷＯ９４／１５９６６（ＰＣＴ／ＵＳ９４／００６８５）；ＧＤＦ−１０（ＷＯ９５／１０５３９（ＰＣＴ／ＵＳ９４／１１４４０）；ＧＤＦ−１１（ＷＯ９６／０１８４５（ＰＣＴ／ＵＳ９５／０８５４３）；ＢＭＰ−１５（ＷＯ９６／３６７１０（ＰＣＴ／ＵＳ９６／０６５４０）；ＭＰ−１２１（ＷＯ９６／０１３１６（ＰＣＴ／ＥＰ９５／０２５５２）；ＧＤＦ−５（ＣＤＭＰ−１、ＭＰ５２）（ＷＯ９４／１５９４９（ＰＣＴ／９４／００６５７）およびＷＯ９６／１４３３５（ＰＣＴ／ＵＳ９４／１２８１４）ならびにＷＯ９３／１６０９９（ＰＣＴ／ＥＰ９３／００３５０））；ＧＤＦ−６（ＣＤＭＰ−２、ＢＭＰ−１３）（ＷＯ９５／０１８０１（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０７７６２）およびＷＯ９６／１４３３５ならびにＷＯ９５／１０６３５（ＰＣＴ／ＵＳ９４／１４０３０））；ＧＤＦ−７（ＣＤＭＰ−３、ＢＭＰ１２）（ＷＯ９５／１０８０２（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０７７９９）およびＷＯ９５／１０６３５（ＰＣＴ／ＵＳ９４／１４０３０））。上記の刊行物は、本明細書中で参考文献として援用される。別の実施形態では、有用なタンパク質は、生物学的に活性な生合成構築物を含み、この構築物は、新しい生合成形態形成タンパク質および２つ以上の公知のモルフォゲン由来の配列を使用して設計されるキメラタンパク質を含む。
【００７５】
本発明の別の実施形態では、形態形成タンパク質は、組織形成を誘導するために合成的に調製され得る。合成的に調製された形態形成タンパク質は、ネイティブのタンパク質であり得るか、または非ネイティブタンパク質、すなわち、自然においては他では見出されないタンパク質であり得る。非ネイティブ骨形成タンパク質は、一連のコンセンサスＤＮＡ配列を使用して合成される（本明細書中で参考として援用される米国特許第５，３２４，８１９号）。これらのコンセンサス配列は、天然の骨形成生成物から得られる部分的なアミノ酸配列データ、および仮定される発生上の機能または証明された発生上の機能を有することが文献において報告される他の遺伝子との観察される相同性を基にして設計された。
【００７６】
これらの生合成コンセンサス配列（コンセンサス骨形成タンパク質または「ＣＯＰ」と呼ばれる）のうちのいくつかは、原核生物において融合タンパク質として発現されている。精製された融合タンパク質は、切断され得、再折り畳みされ得、確立された動物モデルにおいて移植され得、そして骨誘導活性または／および軟骨誘導活性を有することが示され得る。現今好ましい合成の骨形成タンパク質は、ＣＯＰ−５（配列番号２）およびＣＯＰ−７（配列番号３）と示される２つの合成アミノ酸配列を含む。
【００７７】
Ｏｐｐｅｒｍａｎｎら、米国特許第５、０１１、６９１号および同５、３２４、８１９号（本明細書中で参考として援用される）は、以下に示されるようなＣＯＰ−５およびＣＯＰ−７のアミノ酸配列を記載する。
【００７８】
【化１】
2005508217.tif 000002
これらのアミノ酸配列において、ダッシュ（−）は、関連するタンパク質において、比較可能な配列を整列させるためだけに間を満たすものとして使用される。整列されたアミノ酸配列間の違いは、強調されている。
【００７９】
これらのＢＭＰファミリーメンバーおよび他のＢＭＰファミリーメンバーのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は、公開されており、そして新たに同定されたタンパク質がＢＭＰファミリーに属するかどうかを決定するために当業者によって使用され得る。新たなＢＭＰ関連遺伝子生成物は、少なくとも１つの形態形成活性を持つことが類推によって予測され、したがってＢＭＰとして分類される。
【００８０】
本発明の１つの好ましい実施形態では、形態形成タンパク質は、ダイマー種を生じるようにジスルフィド結合した１対のサブユニットを含み、このサブユニットの少なくとも１つは、ＢＭＰタンパク質ファミリーに属する組み換えペプチドを含む。本発明の別の好ましい実施形態では、形態形成タンパク質は、非共有結合の相互作用によって形成されるダイマー種を生じる１対のサブユニットを含み、このサブユニットの少なくとも１つは、ＢＭＰタンパク質ファミリーに属する組み換えペプチドを含む。非共有結合の相互作用は、ファンデルワールス相互作用、水素結合相互作用、疎水的相互作用および静電的相互作用を含む。このダイマー種は、ホモ二量体またはヘテロ二量体であり得、そして細胞増殖および／または組織形成を誘導することが出来る。
【００８１】
特定の好ましい実施形態では、本明細書中で有用である骨形態形成タンパク質としては、アミノ酸配列が、前述の天然に生じるタンパク質から選択される参照形態形成タンパク質と少なくとも７０％のアミノ酸配列相同性または「類似性」を共有する配列を含むもの、および参照形態形成タンパク質と好ましくは８０％相同性または類似性を共有する配列を含むものが挙げられる。好ましくは、その参照タンパク質は、ヒトＯＰ−１であり、そして参照配列は、ヒトＯＰ−１の骨形成が活性な形態で存在するＣ末端の７システインドメイン（配列番号１の残基３３０〜４３１）である。特定の実施形態において、参照のモルフォゲンポリペプチドと機能的に同等であることが推測されるポリペプチドは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（前出）の方法（Ａｌｉｇｎ  ｐｒｏｇｒａｍ（ＤＮＡｓｔａｒ、Ｉｎｃ．）のようなコンピュータープログラムによって便利に実行される）を使用することによって参照のモルフォゲンポリペプチドと整列される。上述されるように、候補配列における内部のギャップおよびアミノ酸の挿入は、この候補配列と参照配列との間でのアミノ酸配列の相同性および類似性のレベルとして慣習的に表現される規定された関係を算出する目的で無視される。現今好ましい実施形態では、参照配列は、ＯＰ−１である。本明細書中で有用な骨形態形成タンパク質は、それゆえ、好ましい参照配列の対立遺伝子対応物、系統発生相対物および他の改変体（天然に生じるか、または生合成的に生成されるかに関わらない（例えば、「ムテイン」または「変異体タンパク質」を含む））、および一般的な形態形成ファミリーのタンパク質の新しいメンバーを含み、上で示されそして同定されるものを含む。特定の特に好ましい形態形成ポリペプチドは、ヒトＯＰ−１の好ましい参照配列と少なくとも６０％のアミノ酸同一性を共有し、なおより好ましくは、ヒトＯＰ−１の好ましい参照配列と少なくとも６５％のアミノ酸同一性を共有する。
【００８２】
別の実施形態では、有用な骨形成タンパク質は、保存的７システインドメインを共有するもの、および本明細書中で規定されるような、Ｃ末端の活性ドメイン内で少なくとも７０％のアミノ酸配列相同性（類似性）を共有するものを含む。なお別の実施形態では、本発明の骨形成タンパク質は、本明細書中で規定される一般配列  （ＯＰＸ（配列番号４）およびジェネリック配列７（配列番号５）およびジェネリック配列８(配列番号６）、またはジェネリック配列９（配列番号７）およびジェネリック配列１０（配列番号８）を含む）のいずれか１つを有する、骨形成的に活性なタンパク質として規定され得る。
【００８３】
本発明において有用な骨形態形成ポリペプチドのファミリー、およびそれらのメンバーは、一般的アミノ酸配列によって規定され得る。例えば、ジェネリック配列７（配列番号５）およびジェネリック配列８(配列番号６）は、それぞれ９７アミノ酸配列および１０２アミノ酸配列であり、そして現在までのところ同定された好ましいタンパク質ファミリーメンバー（少なくともＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＣＢＭＰ−２Ａ、ＣＢＭＰ−２Ｂ、ＢＭＰ−３、６０Ａ、ＤＰＰ、Ｖｇ１、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、Ｖｇｒ−１およびＧＤＦ−１を含む）の間で共有される相同性を適応する。これらのタンパク質についてアミノ酸配列は、上で要約されるように、本明細書および／または当該分野で記載されている。この一般配列は、Ｃ末端ドメインにおいてこれらの配列（６システイン骨格および７システイン骨格（それぞれ、ジェネリック配列７および８)によって規定される）によって共有されるアミノ酸配列同一性、およびこの配列内の可変の位置に対する代替残基の両方を含む。この一般配列は、分子間ジスルフィド結合または分子内ジスルフィド結合が形成し得る、適切なシステイン骨格を提供し、そして折り畳まれたタンパク質の３次構造に影響しそうな特定の重要なアミノ酸を含む。さらに、この一般配列は、３６位（ジェネリック配列７）または４１位（ジェネリック配列８）で追加のシステインを斟酌し、それによりＯＰ−２およびＯＰ−３の形態形成的に活性な配列を含む。
【００８４】
【化２】
2005508217.tif 000003
各Ｘａａは、以下のように規定される１つ以上の特定のアミノ酸の群から、独立して選択される：「ｒｅｓ．」は「残基」を意味し、残基２のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＬｙｓ）；残基３のＸａａ＝（ＶａｌまたはＩｌｅ）；残基４のＸａａ＝（Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕ）；残基６のＸａａ＝（Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、ＬｙｓまたはＡｌａ）；残基７のＸａａ＝（ＡｓｐまたはＧｌｕ）；残基８のＸａａ＝（Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＩｌｅ）；残基１１のＸａａ＝（Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、ＡｓｎまたはＳｅｒ）；残基１２のＸａａ＝（Ａｓｐ、Ａｒｇ、ＡｓｎまたはＧｌｕ）；残基１３のＸａａ＝（ＴｒｐまたはＳｅｒ）；残基１４のＸａａ＝（ＩｌｅまたはＶａｌ）；残基１５のＸａａ＝（ＩｌｅまたはＶａｌ）；残基１６のＸａａ＝（ＡｌａまたはＳｅｒ）；残基１８のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、ＰｒｏまたはＡｒｇ）；残基１９のＸａａ＝（ＧｌｙまたはＳｅｒ）；残基２０のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＰｈｅ）；残基２１のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｍｅｔ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、ＬｅｕまたはＧｌｙ）；残基２３のＸａａ＝（Ｔｙｒ、ＡｓｎまたはＰｈｅ）；残基２６のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、ＡｌａまたはＳｅｒ）；残基２８のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、ＧｌｎまたはＡｌａ）；残基３０のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、ＩｌｅまたはＡｓｎ）；残基３１のＸａａ＝（Ｐｈｅ、ＬｅｕまたはＴｙｒ）；残基３３のＸａａ＝（Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＭｅｔ）；残基３４のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｌａ、ＴｈｒまたはＰｒｏ）；残基３５のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、ＡｌａまたはＬｙｓ）；残基３６のＸａａ＝（Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、ＳｅｒまたはＩｌｅ）；残基３７のＸａａ＝（Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、ＧｌｙまたはＬｅｕ）；残基３８のＸａａ＝（Ａｓｎ、ＳｅｒまたはＬｙｓ）；残基３９のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、ＧｌｙまたはＰｒｏ）；残基４０のＸａａ＝（Ｔｈｒ、ＬｅｕまたはＳｅｒ）；残基４４のＸａａ＝（Ｉｌｅ、ＶａｌまたはＴｈｒ）；残基４５のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＭｅｔまたはＩｌｅ）；残基４６のＸａａ＝（ＧｌｎまたはＡｒｇ）；残基４７のＸａａ＝（Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＳｅｒ）；残基４８のＸａａ＝（ＬｅｕまたはＩｌｅ）；残基４９のＸａａ＝（ＶａｌまたはＭｅｔ）；残基５０のＸａａ＝（Ｈｉｓ、ＡｓｎまたはＡｒｇ）；残基５１のＸａａ＝（Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＶａｌ）；残基５２のＸａａ＝（Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＧｌｙまたはＬｅｕ）；残基５３のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、ＧｌｙまたはＰｈｅ）、残基５４のＸａａ＝（Ｐｒｏ、ＳｅｒまたはＶａｌ）；残基５５のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、ＰｒｏまたはＬｙｓ）；残基５６のＸａａ＝（Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、ＩｌｅまたはＨｉｓ）；残基５７のＸａａ＝（Ｖａｌ、ＡｌａまたはＩｌｅ）；残基５８のＸａａ＝（ＰｒｏまたはＡｓｐ）；残基５９のＸａａ＝（Ｌｙｓ、ＬｅｕまたはＧｌｕ）；残基６０のＸａａ＝（Ｐｒｏ、ＶａｌまたはＡｌａ）；残基６３のＸａａ＝（ＡｌａまたはＶａｌ）；残基６５のＸａａ＝（Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＧｌｕ）；残基６６のＸａａ＝（Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＧｌｕ）；残基６７のＸａａ＝（Ｌｅｕ、ＭｅｔまたはＶａｌ）；残基６８のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｙ）；残基６９のＸａａ＝（Ａｌａ、ＰｒｏまたはＳｅｒ）；残基７０のＸａａ＝（Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、ＶａｌまたはＬｅｕ）；残基７１のＸａａ＝（Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＰｒｏ）；残基７２のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＭｅｔまたはＩｌｅ）；残基７４のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＰｈｅ）；残基７５のＸａａ＝（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ＬｅｕまたはＨｉｓ）；残基７６のＸａａ＝（Ａｓｐ、ＡｓｎまたはＬｅｕ）残基７７のＸａａ＝（Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、ＡｒｇまたはＳｅｒ）；残基７８のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＴｙｒまたはＡｓｐ）；残基７９のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＬｙｓ）；残基８０のＸａａ＝（Ａｓｎ、ＴｈｒまたはＬｙｓ）；残基８２のＸａａ＝（Ｉｌｅ、ＶａｌまたはＡｓｎ）；残基８４のＸａａ＝（ＬｙｓまたはＡｒｇ）；残基８５のＸａａ＝（Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、ＡｒｇまたはＶａｌ）；残基８６のＸａａ＝（Ｔｙｒ、ＧｌｕまたはＨｉｓ）；残基８７のＸａａ＝（Ａｒｇ、Ｇｌｎ、ＧｌｕまたはＰｒｏ）；残基８８のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｇｌｕ、ＴｒｐまたはＡｓｐ）；残基９０のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＩｌｅ）；残基９２のＸａａ＝（Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ａｓｐ、ＧｌｎまたはＧｌｕ）；残基９３のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｇｌｙ、ＧｌｕまたはＳｅｒ）；残基９５のＸａａ＝（ＧｌｙまたはＡｌａ）；および残基９７のＸａａ＝（ＨｉｓまたはＡｒｇ）である。
【００８５】
ジェネリック配列８（配列番号６）は、ジェネリック配列７の全てを含み、そしてさらにそのＮ末端に以下の配列（配列番号９）を含む：
【００８６】
【化３】
2005508217.tif 000004
従って、残基７で始まる、ジェネリック配列８における各「Ｘａａ」は、ジェネリック配列７に関して規定され、特定のアミノ酸である（ジェネリック配列７で記載される各残基番号は、ジェネリック配列８において５つずれている点で異なる）。従って、ジェネリック配列７における「残基２のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＬｙｓ）」は、ジェネリック配列８における残基７のＸａａのことをいう。ジェネリック配列８において、残基２のＸａａ＝（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ＡｌａまたはＧｌｎ）；残基３のＸａａ＝（Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＭｅｔ）；残基４のＸａａ＝（Ｈｉｓ、ＡｒｇまたはＧｌｎ）；および残基５のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、またはＴｙｒ）である。
【００８７】
別の実施形態において、有用な骨形成タンパク質は、以下に規定されるジェネリック配列９および１０によって規定されるものを含む。
【００８８】
詳細には、ジェネリック配列９および１０は、以下のタンパク質の複合アミノ酸配列である：ヒトＯＰ−１、ヒトＯＰ−２、ヒトＯＰ−３、ヒトＢＭＰ−２、ヒトＢＭＰ−３、ヒトＢＭＰ−４、ヒトＢＭＰ−５、ヒトＢＭＰ−６、ヒトＢＭＰ−８、ヒトＢＭＰ−９、ヒトＢＭＰ−１０、ヒトＢＭＰ−１１、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ６０Ａ、Ｘｅｎｏｐｕｓ  Ｖｇ−１、ウニＵＮＩＶＩＮ、ヒトＣＤＭＰ−１（マウスＧＤＦ−５）、ヒトＣＤＭＰ−２（マウスＧＤＦ−６、ヒトＢＭＰ−１３）、ヒトＧＤＭＰ−３（マウスＧＤＦ−７、ヒトＢＭＰ−１２）、マウスＧＤＦ−３、ヒトＧＤＦ−１、マウスＧＤＦ−１、ニワトリＤＯＲＳＡＬＩＮ、ｄｐｐ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ＳＣＲＥＷ、マウスＮＯＤＡＬ、マウスＧＤＦ−８、ヒトＧＤＦ−８、マウスＧＤＦ−９、マウスＧＤＦ−１０、ヒトＧＤＦ−１１、マウスＧＤＦ−１１、ヒトＢＭＰ−１５、およびラットＢＭＰ３ｂ。ジェネリック配列７と同様に、ジェネリック配列９は、Ｃ末端６システイン骨格を有するする９７アミノ酸配列であり、そしてジェネリック配列８同様に、ジェネリック配列１０は、７システイン骨格を有する１０２アミノ酸配列である。
【００８９】
【化４】
2005508217.tif 000005
2005508217.tif 000006
各Ｘａａは、以下のように規定される１つ以上の特定のアミノ酸の群から、独立して選択される：「ｒｅｓ．」は「残基」を意味し、残基１のＸａａ＝（Ｐｈｅ、ＬｅｕまたはＧｌｕ）；残基２のＸａａ＝（Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、ＶａｌまたはＧｌｕ）；残基３のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＡｓｐ）；残基４のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＡｓｎまたはＰｈｅ）；残基５のＸａａ＝（ＰｈｅまたはＧｌｕ）；残基６のＸａａ＝（Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、ＡｌａまたはＡｓｎ）；残基７のＸａａ＝（Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、ＡｌａまたはＧｌｎ）；残基８のＸａａ＝（Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、ＩｌｅまたはＰｈｅ）；残基９のＸａａ＝（Ｇｌｙ、ＨｉｓまたはＬｙｓ）；残基１０のＸａａ＝（ＴｒｐまたはＭｅｔ）；残基１１のＸａａ＝（Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、ＳｅｒまたはＧｌｙ）；残基１２のＸａａ＝（Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ＧｌｕまたはＨｉｓ）；残基１３のＸａａ＝（ＴｒｐまたはＳｅｒ）；残基１４のＸａａ＝（ＩｌｅまたはＶａｌ）；残基１５のＸａａ＝（ＩｌｅまたはＶａｌ）；残基１６のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、ＴｙｒまたはＴｒｐ）；残基１８のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、ＨｉｓまたはＬｙｓ）；残基１９のＸａａ＝（Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、ＡｒｇまたはＰｈｅ）；残基２０のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＰｈｅ）；残基２１のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、ＬｙｓまたはＴｈｒ）；残基２２のＸａａ＝（ＡｌａまたはＰｒｏ）；残基２３のＸａａ＝（Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、ＡｌａまたはＡｒｇ）；残基２４のＸａａ＝（Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、ＰｈｅまたはＡｒｇ）；残基２６のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ＧｌｎまたはＧｌｙ）；残基２８のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＧｌｎ）；残基３０のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、ＧｌｎまたはＬｅｕ）；残基３１のＸａａ＝（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、ＧｌｙまたはＡｒｇ）；残基３２のＸａａ＝（Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＶａｌ）；残基３３のＸａａ＝（Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｇｌｕ、ＰｈｅまたはＶａｌ）；残基３４のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ａｒｇ、ＬｅｕまたはＰｒｏ）；残基３５のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、ＧｌｎまたはＨｉｓ）；残基３６のＸａａ＝（Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、ＧｌｕまたはＧｌｙ）；残基３７のＸａａ＝（Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、ＧｌｙまたはＴｙｒ）；残基３８のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、ＶａｌまたはＡｒｇ）；残基３９のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、ＰｒｏまたはＰｈｅ）；残基４０のＸａａ＝（Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、ＨｉｓまたはＭｅｔ）；残基４１のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、ＴｈｒまたはＧｌｎ）；残基４２のＸａａ＝（Ｈｉｓ、ＴｙｒまたはＬｙｓ）；残基４３のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＬｅｕまたはＴｙｒ）；残基４４のＸａａ＝（Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ＭｅｔまたはＰｒｏ）；残基４５のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、ＩｌｅまたはＨｉｓ）；残基４６のＸａａ＝（Ｇｌｎ、ＡｒｇまたはＴｈｒ）；残基４７のＸａａ＝（Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、ＡｓｎまたはＨｉｓ）；残基４８のＸａａ＝（Ｌｅｕ、ＡｓｎまたはＩｌｅ）；残基４９のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＰｒｏまたはＩｌｅ）；残基５０のＸａａ＝（Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、ＴｙｒまたはＧｌｎ）；残基５１のＸａａ＝（Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、ＧｌｙまたはＧｌｎ）；残基５２のＸａａ＝（Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、ＡｌａまたはＴｙｒ）；残基５３のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、ＬｅｕまたはＶａｌ）；残基５４のＸａａ＝（Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＶａｌまたはＡｓｐ）；残基５５のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、ＰｒｏまたはＨｉｓ）；残基５６のＸａａ＝（Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、ＧｌｙまたはＡｒｇ）；残基５７のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、ＬｅｕまたはＳｅｒ）；残基５８のＸａａ＝（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＡｌａ）；残基５９のＸａａ＝（Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、ＡｒｇまたはＧｌｙ）；残基６０のＸａａ＝（Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＴｈｒまたはＳｅｒ）；残基６１のＸａａ＝（Ｃｙｓ、ＶａｌまたはＳｅｒ）；残基６３のＸａａ＝（Ａｌａ、ＶａｌまたはＴｈｒ）；残基６５のＸａａ＝（Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、ＡｓｐまたはＴｙｒ）；残基６６のＸａａ＝（Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、ＡｒｇまたはＶａｌ）；残基６７のＸａａ＝（Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、ＴｈｒまたはＴｙｒ）；残基６８のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＬｙｓまたはＶａｌ）；残基６９のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｐｒｏ、ＧｌｙまたはＳｅｒ）；残基７０のＸａａ＝（Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、ＬｅｕまたはＶａｌ）；残基７１のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＡｓｎまたはＧｌｙ）；残基７２のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＭｅｔ）；残基７４のＸａａ＝（Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、ＴｙｒまたはＭｅｔ）；残基７５のＸａａ＝（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、ＧｌｎまたはＶａｌ）；残基７６のＸａａ＝（Ａｓｐ、Ｌｅｕ、ＡｓｎまたはＧｌｕ）；残基７７のＸａａ＝（Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、ＧｌｙまたはＰｒｏ）；残基７８のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ｍｅｔ、Ｇｌｕ、ＡｓｎまたはＬｙｓ）；残基７９のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、ＧｌｎまたはＡｒｇ）；残基８０のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、ＳｅｒまたはＧｌｎ）；残基８１のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、ＴｈｒまたはＡｌａ）；残基８２のＸａａ＝（Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、ＡｓｐまたはＡｌａ）；残基８３のＸａａ＝（Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、ＬｙｓまたはＩｌｅ）；残基８４のＸａａ＝（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、ＧｌｕまたはＧｌｙ）；残基８５のＸａａ＝（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＧｌｕまたはＶａｌ）；残基８６のＸａａ＝（Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、ＧｌｕまたはＩｌｅ）；残基８７のＸａａ＝（Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＰｒｏまたはＬｙｓ）；残基８８のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、ＧｌｙまたはＬｙｓ）；残基８９のＸａａ＝（ＭｅｔまたはＡｌａ）；残基９０のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＬｙｓ）；残基９１のＸａａ＝（ＶａｌまたはＡｌａ）；残基９２のＸａａ＝（Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｖａｌ、Ａｌａ、ＳｅｒまたはＴｈｒ）；残基９３のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、ＡｒｇまたはＴｈｒ）；残基９５のＸａａ＝（Ｇｌｙ、ＡｌａまたはＴｈｒ）；残基９７のＸａａ＝（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、ＬｅｕまたはＳｅｒ）である。さらに、ｒＢＭＰ３ｂおよびｍＧＤＦ−１０において残基５３の後に、Ｉｌｅがある；ＧＤＦ−１において残基５４の後に、Ｔがある；ＢＭＰ３において残基５４の後に、Ｖがある；ＢＭＰ−８およびドーサリンにおいて残基７８の後に、Ｇがある；ｈＧＤＦ−１において残基３７の後に、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏがある。
【００９０】
ジェネリック配列１０（配列番号８）は、ジェネリック配列９（配列番号７）の全てを含み、そしてさらにそのＮ末端に以下の配列（配列番号９）を含む：
【００９１】
【化５】
2005508217.tif 000007
従って、残基６で始まる、ジェネリック配列１０における各「Ｘａａ」は、ジェネリック配列９に関して規定され、特定のアミノ酸である（ジェネリック配列９で記載される各残基番号は、ジェネリック配列１０において５つずれている点で異なる）。従って、ジェネリック配列９における「残基１のＸａａ＝（Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、ＶａｌまたはＧｌｕ）」とは、ジェネリック配列１０における残基６のＸａａのことをいう。ジェネリック配列１０において、残基２のＸａａ＝（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、またはＣｙｓ）；残基３のＸａａ＝（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、またはＡｌａ）；残基４のＸａａ＝（Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、またはＴｙｒ）；残基５のＸａａ＝（Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、またはＬｅｕ）である。
【００９２】
上述されるように、本発明において有用な、特定の現今好ましい骨形態形成ポリペプチドは、ｈＯＰ−１の好ましい参照配列を規定するアミノ酸配列と６０％より高い同一性（好ましくは６５％より高い同一性）を有する。これらの特に好ましい配列は、ＯＰ−１およびＯＰ−２タンパク質の対立遺伝子改変体および系統発生的相対改変体（ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ  ｖａｒｉａｎｔｓ）を含み、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ６０Ａタンパク質を含む。従って、特定の特に好ましい実施形態において、有用な形態形成タンパク質は、本明細書中で「ＯＰＸ」（配列番号４）（７システイン骨格を規定し、そしてＯＰ−１およびＯＰ−２の多数の同定された改変体との間の相同性を有する）と称される特定のアミノ酸内でのポリペプチド鎖の対を含む活性タンパク質を含む。本明細書で記載されるように、所定の位置での各Ｘａａは、マウスまたはヒトＯＰ−１あるいはＯＰ−２のＣ末端配列において対応する位置で生じる残基から独立して選択される。
【００９３】
【化６】
2005508217.tif 000008
2005508217.tif 000009
残基２のＸａａ＝（ＬｙｓまたはＡｒｇ）；残基３のＸａａ＝（ＬｙｓまたはＡｒｇ）；残基１１のＸａａ＝（ＡｒｇまたはＧｌｎ）；残基１６のＸａａ＝（ＧｌｎまたはＬｅｕ）；残基１９のＸａａ＝（ＩｌｅまたはＶａｌ）；残基２３のＸａａ＝（ＧｌｕまたはＧｌｎ）；残基２６のＸａａ＝（ＡｌａまたはＳｅｒ）；残基３５のＸａａ＝（ＡｌａまたはＳｅｒ）；残基３９のＸａａ＝（ＡｓｎまたはＡｓｐ）；残基４１のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＣｙｓ）；残基５０のＸａａ＝（ＶａｌまたはＬｅｕ）；残基５２のＸａａ＝（ＳｅｒまたはＴｈｒ）；残基５６のＸａａ＝（ＰｈｅまたはＬｅｕ）；残基５７のＸａａ＝（ＩｌｅまたはＭｅｔ）；残基５８のＸａａ＝（ＡｓｎまたはＬｙｓ）；残基６０のＸａａ＝（Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＡｓｎ）；残基６１のＸａａ＝（Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＶａｌ）；残基６５のＸａａ＝（ＰｒｏまたはＡｌａ）；残基７１のＸａａ＝（ＧｌｎまたはＬｙｓ）；残基７３のＸａａ＝（ＡｓｎまたはＳｅｒ）；残基７５のＸａａ＝（ＩｌｅまたはＴｈｒ）；残基８０のＸａａ＝（ＰｈｅまたはＴｙｒ）；残基８２のＸａａ＝（ＡｓｐまたはＳｅｒ）；残基８４のＸａａ＝（ＳｅｒまたはＡｓｎ）；残基８９のＸａａ＝（ＬｙｓまたはＡｒｇ）；残基９１のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＨｉｓ）；および残基９７のＸａａ＝（ＡｒｇまたはＬｙｓ）である。
【００９４】
さらに別の好ましい実施形態では、有用な骨形成活性タンパク質は、低度、中度または高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、参照形態発生（ｍｏｐｈｏｇｅｎ）配列（例えば、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、６０Ａ、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７などの保存性７システインドメインを規定するＣ末端配列）をコードするＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズする核酸によってコードされる配列を含むアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖を有する。本明細書で使用される場合、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、公知の技術によるハイブリダイゼーション（４０％ホルムアミド、５ＸＳＳＰＥ、５ＸＤｅｎｈａｒｄｔ溶液、および０．１％ＳＤＳ中に３７°Ｃで一晩）工程、そして０．１ＸＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中で５０°Ｃで洗浄する工程を規定する。標準的なストリンジェント条件は、市販されている、標準的な分子クローニング用の教科書において、十分に記載されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ著（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：  １９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｉ巻およびＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ著、１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ著、１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ著、１９８４）およびＢ．Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）（本明細書中で参考として援用される発刊物）を参照のこと。
【００９５】
上述されるように、本発明において有用なタンパク質は、概して上記ポリペプチドの折り畳まれた対を含むダイマーのタンパク質である。そのような形態形成タンパク質は、還元状態で不活性である、しかし、酸化されたホモ二量体として、そしてヘテロ二量体を生成するために本発明の他のものとの組み合わせにおいて酸化される場合、活性である。従って、形態形成的に活性なタンパク質において形態発生ポリペプチドの折り畳まれる対のメンバーは、上で挙げられる特定のポリペプチドのいずれかから独立して選択され得る。
【００９６】
本発明の物質および方法において有用である骨形態形成タンパク質としては、上述されるポリペプチド鎖のいずれかを含むタンパク質（天然供給源から単離されるか、または組み換えＤＮＡもしくは他の合成技術によって生成される）が挙げられ、そしてこれらのタンパク質の対立遺伝子改変体および系統発生的な相対改変体、ならびにムテイン、ならびに種々の活性な切断構築物および融合構築物が挙げられる。欠損変異体または付加変異体もまた、活性であると考えられ、保存性Ｃ末端６システインドメインまたは７システインドメインを変性し得るものを含む（この変性が、折り畳まれた構造において、これらのシステインの相互作用を機能的に崩壊させない限り）。従って、そのような活性な形態は、本明細書で開示される、詳細に記載される構築物と同等であるものとみなされる。このタンパク質は、種々のグリコシル化の型、種々のＮ末端を有する形態、アミノ酸配列相同性の領域を有する関連タンパク質のファミリー、および本来のタンパク質または生合成タンパク質（宿主細胞中での組み換えＤＮＡの発現によって生成される）の活性な切断形態もしくは活性変異形態を含み得る。
【００９７】
本明細書中で企図される骨形態形成タンパク質は、未処理もしくは切断ｃＤＮＡまたは原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞において合成ＤＮＡから発現され得、そして精製され、切断され、再度折り畳まれ、そして骨形成活性な組成物を形成するために二量体化され得る。現今好ましい宿主細胞としては、Ｅ．ｃｏｌｉを含む原核生物または酵母またはＣＨＯ、ＣＯＳもしくはＢＳＣ細胞のような哺乳動物細胞を含む真核生物が挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、他の宿主細胞が有益に使用され得ることを理解する。本発明の実施において有用な骨形態形成タンパク質の詳細な説明（それらの作成方法、使用方法および骨形成活性についての分析方法を含む）は、多数の公報（米国特許第５，２６６，６８３号および同第５，０１１，６９１号、これらの開示は、本明細書中で参考として援用される）において開示される。
【００９８】
従って、本明細書の開示および当該分野において利用可能な知識に照らせば、当業者は、種々の異なる生物種のｃＤＮＡまたはゲノムライブラリー（適切なアミノ酸配列をコードする）から遺伝子を分離し得るか、またはオリゴヌクレオチドからＤＮＡを構築し得、そして次いで、哺乳動物において軟骨性骨形態形成を刺激することが可能な活性タンパク質の大量生成のために、それを種々の型の宿主細胞（原核生物および真核生物の両方を含む）において発現し得る。
【００９９】
（移植片デバイス）
本発明はまた、骨の形成、再生および修復を促進するための移植片デバイスに関連する。この移植片デバイスは、本発明の骨前駆体組成物質を含み、そして必要に応じて生物活性因子または結合剤から選択される少なくとも１つのさらなる因子を含む。
【０１００】
骨前駆体組成物から形成されるセメントマトリクスを含む移植片デバイスは、遊走性始原細胞の補充のための一時的な骨格および基部（ｓｕｂｓｔｒａｔｕｍ）として、ならびに続いて起こる固定および増殖のための基部（ｂａｓｅ）として働く。
【０１０１】
好ましい実施形態では、移植片デバイスは、骨前駆体組成物および生物活性因子（これは、骨前駆体組成物中に分散されるかまたは吸収される）を含む。骨前駆体組成物から形成されるセメントマトリクスは、生物活性因子のための送達系または支持系を提供し、このセメントマトリクスは、骨前駆体組成物がゆっくりと吸収される際に組織部位に時間をかけて放出される。好ましい実施形態では、生物活性因子は、孔形成剤中にカプセル化される。孔形成剤の吸収および生物活性因子の漸次的な放出は、持続放出系を提供する。生物活性因子の投薬量および送達速度は、セメントの性質、孔形成剤の性質および生物活性因子とセメントと孔形成剤との間の結合相互作用の性質に基づいて制御され得る。好ましい実施形態では、生物活性因子は、骨形態形成タンパク質か、またはＢＭＰをコードする核酸分子である。より好ましい実施形態では、ＢＭＰは、ＯＰ−１である。
【０１０２】
骨前駆体組成物によって形成されるセメントマトリクスは、非特異的なタンパク分解からＢＭＰを保護し得、そして組織発達の間の始原細胞誘導に関与する細胞性応答の各段階に順応し得る。
【０１０３】
骨前駆体組成物によって形成されるセメントマトリクスを有する好ましい骨形成デバイスにおいて、骨形成タンパクは、セメントマトリクスから移植部位へ拡散し、そして細胞の流入および流出を可能にする。骨形成タンパク質は、始原細胞を分化させそして増殖させる。始原細胞は、セメントマトリクスへと移動し得、そして分化した細胞は、セメントマトリクスから移植部位へ移動し得る。セメントマトリクス／骨形成タンパク質移植片の相互作用において続いて起こる細胞の反応は、以下を含む：フィブリンおよびフィブロネクチンの移植されたセメントマトリクスへの結合、間葉細胞の移動および増殖、始原細胞の軟骨芽細胞での分化、軟骨形成、軟骨石灰化、血管浸潤、骨形成、再造形、および骨髄分化。骨前駆体組成物を有する好ましい骨形成デバイスは、種々の整形外科的手順、歯の手順、および再構築手順において使用され得る。
【０１０４】
移植片デバイスはまた、生物活性因子および／または骨前駆体組成物質との混合物において結合剤を含み得る。この結合剤は、欠損部位に適合するかまたは新たな組織の形態をとるように、組成物の成形能力を調節するために添加される。１つの実施形態では、移植片物質は、組織欠損部位（ここに移植片物質が投与される）に依存して多様な形状に成形され得る。別の実施形態では、移植片物質は、注射され得る。例えば、新たな閉鎖骨折の癒合は、移植される物質の１回の最小侵襲性経皮注射によって促進され得る。例えば、本明細書中で参考として援用されるＢｌｏｋｈｕｉｓら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２２、７２５〜７３０頁（２００１）を参照のこと。さらに別の実施形態では、移植片物質は、欠損部位での移植を可能にする好ましい形状を有し得る。骨前駆体組成物から形成される成形可能なセメントマトリクスは、周囲の組織または噛み砕かれた筋肉によって適所に保持され得る。組織欠損に広がりそして新たな組織の所望の形態をとるために、組成物を成形することが好ましい。非癒着性の欠損の骨修復に関しては、例えば、非癒着性の欠損に広がる寸法を使用することが望ましい。ラットの研究は、新たに合成される骨は移植されたデバイスの寸法を有することを示す。従って、この物質は、皮下移植または筋内移植のために使用され得る。骨形成手順において、この物質は身体によってゆっくりと吸収され、そして移植片の形状または移植片にほぼ近い形状で、骨によって置換される。
【０１０５】
（補綴デバイス）
本発明の骨前駆体組成物質が、補綴デバイスにおいて使用され得るということもまた企図される。補綴デバイスは、哺乳動物の標的組織に近接して移植され得る表面領域、およびこの表面領域に配置される組成物を含む。補綴デバイスは、処置される哺乳動物における整形外科的な欠損、損傷または異常を修復するために有用である。好ましくは、哺乳動物は、ヒト患者である。補綴デバイスは、金属、セラミックまたはポリマーの複合物質を含む物質から作られ得る。好ましいデバイスは、Ｃｏ−Ｃｒ−Ｍｏ合金、チタン合金およびステンレス鋼から選択される耐性荷重芯（ｌｏａｄ−ｂｅａｒｉｎｇ  ｃｏｒｅ）を含む。好ましい補綴デバイスは、臀部デバイス、固定ケージ（ｆｕｓｉｏｎ  ｃａｇｅ）および顎顔面デバイスからなる群から選択される。
【０１０６】
この組成物は、本発明の骨前駆体組成物を含み、そして必要に応じて、骨前駆体組成物において拡散される生物活性因子または結合剤からなる群から選択される１つ以上の因子を含む。好ましい実施形態において、生物活性因子は孔形成剤中にカプセル化される。別の好ましい実施形態では、生物活性因子はＢＭＰ、またはＢＭＰ、より好ましくはＯＰ−１をコードする配列を含む核酸である。
【０１０７】
この組成物は、人工臀部、疾患骨の交換品、欠損の矯正品、または固定される歯のような合成的に構築される骨物質のためのコーティング剤として作用し得る。骨形成タンパク質被膜補綴デバイスは、プロテーゼと既在の骨との間の結合強度を高め得る（本明細書中で参考として援用されるＲｕｅｇｅｒら、米国特許第５，３４４，６５４号）。好ましい実施形態において、補綴デバイスは、この補綴デバイスへの本発明の組成物の組み込みを促進するために、ヒドロキシアパタイトまたはβトリカルシウムホスフェート物質で被膜される。補綴デバイス周囲で骨質量が不足している場合、この実施形態は、特に都合が良い。この組成物は、表面での組織増殖の増強を促進するために十分な量で、移植片の表面に配置される。組織増殖の増強を促進するために十分な組成物の量は、本明細書中で参考として援用される、Ｒｕｅｇｅｒら、米国特許第５，３４４，６５４に記載されるバイオアッセイを使用して、当業者によって経験的に決定され得る。好ましくは、類似の補綴デバイスがヒト患者において使用される前に、組成物の成分濃度を最も効果的にするために、動物実験が行われる。
【０１０８】
好ましい実施形態において、組成物は、靭帯および骨の統合を助成するために、前十時靭帯固定または付属肢器官における靭帯接着のような靭帯修復において使用され得る。
【０１０９】
別の好ましい実施形態では、病変したかまたは損傷を受けた自然関節が補綴関節によって置換される場合、組成物は、臀部、膝、肘および他の関節における総嚢内顎関節形成の臨床手順に適用される。例えば、総臀部関節形成において、股臼コップは、天然の寛骨臼と置換するために骨盤の股臼ソケットにおいて、この組成物とともに挿入される。このコップは、この組成物によって適所に保持され、そして固定ねじによって固定される。概して、窩またはソケットは、寛骨臼のコップの外部表面に適合する。この組成物はまた、関節補綴デバイスと骨との間の結合を強固にするために、総関節修正外科処置に適用され得る。
【０１１０】
さらに別の好ましい実施形態では、この組成物は、椎骨形成と呼ばれる臨床的手順に適用される。この組成物は、椎体内部へ注入される。この方法は、骨密度を増加させるために骨粗鬆症の処置において使用される。
【０１１１】
好ましい実施形態において、補綴デバイスは、固定ケージ、骨栓および嚢または室（例えば、本発明の組成物を含む椎体間融合）を有する他のデバイスからなる群から選択される。好ましくは、椎体間融合デバイスは、チタン、ＰＥＥＫ（ポリ（エーテルエーテルケトン）（ｐｏｌｙ（ｅｔｈｅｒｅｔｈｅｒｋｅｔｏｎｅ）））および同種移植片からなる群から選択される物質から作製される。頸部の棘突起、胸部の棘突起および腰部の棘突起における椎体間融合は、腹部または背部のアプローチを介して処置され得る。あるいは、本発明の組成物は、関連する椎体間デバイスなしで使用されて、椎体間融合を達成し得る。
【０１１２】
脊椎固定ケージは、損傷を受けた脊椎板の除去後に残された椎骨間隙に据えられ、局所運動を排除し、椎骨において椎骨の骨固定に関係する。米国特許第５，０１５，２４７号に記載されるように、固定ケージは、融合されるべき２つの近接した椎骨の間隙より大きい外径を有する円柱凹窩部材の形態である。円柱凹窩移植片内の内部隙は、本発明の組成物で満たされ得る。円柱移植片はまた、近接した椎骨において形成されるテーパ状のボア内への連続した挿入を可能にするためのねじ切りした外部（ｔｈｒｅａｄｅｄ  ｅｘｔｅｒｉｏｒ）を含む。あるいは、いくつかの融合移植片は、脊椎板内部隙へ詰め込まれるために設計される。米国特許第６，１４６，４２０号に記載されるように、この融合デバイスは、体型の中心要素を有する対向する末端部品（ｏｐｐｏｓｉｔｅ  ｅｎｄ  ｐｉｅｃｅｓ）を備える。この中心要素は、より小さい直径を有する。この融合デバイスがこの中心要素の周囲に環状のポケットを形成するように、本発明の組成物は、対向する末端部品との間の環状のポケット内へ配置され得る。
【０１１３】
好ましい実施形態において、補綴デバイスは、骨および円板靭帯の不安定性の修復のために使用される。本発明の組成物は、椎骨間の領域に適用され、優れた融合を生じそして結果として、１回の背側アプローチを介して外傷を受けた運動性分節の完全な安定化を達成する。本出願は、胸腰棘突起の骨折のための第二の手術（これは、現在しばしば必要であるが、さらなる高い危険性を伴う）を受ける必要性を排除し得る。また、この方法は、自原性の海綿質の移植に関連する問題およびその付随される高い罹患率の危険性を回避する。例えば、Ｒｕｅｇｅｒら、Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｅ、２７、７２〜７９頁（１９９８）を参照のこと。
【０１１４】
別の好ましい実施形態において、補綴デバイスは、顎顔面デバイスである。顎顔面デバイスは、癌の外科処置、事故、先天的な奇形から生じる顔面の欠損を矯正するために外面的に適用される。咀嚼欠乏症を回復させるために、骨質量を有する患者が、初めに本発明の組成物を用いて処置され、外科的部位をパックし、そして取り囲む。顎顔面固定体系および伸延体系は、米国特許第５，８９９，９４０号において図示されるように、既在の骨質を強めるために適用され得る。標準的な歯根型骨ねじおよび単純な極微点用の鋲または自動締りおよび歯根型の骨鋲ねじデバイス（米国特許第５，９７１，９８５号）のような固定デバイスが、組織移植片および合成膜を顎顔面骨移植片部位に保持するために使用される。いったんその部位が修復されると、適切な長さの骨内歯科インプラントを挿入しそして咀嚼機能を回復させるために、第二の手術が行われる。
【０１１５】
本発明はまた、本発明の移植可能な補綴デバイスのインビボでの形成を、哺乳動物の標的組織において促進し、ａ)補綴デバイスの表面上に骨前駆体組成物、必要に応じて、少なくとも１つの生物活性因子または結合剤を含む組成物を提供する工程、およびｂ)標的組織とデバイスとの間での組織増殖を可能にするのに十分な期間の間、標的組織および補綴デバイスの表面が、少なくとも一部接触して維持される位置にて、このデバイスを哺乳動物に移植する工程を包含する方法を提供する。
【０１１６】
（骨形成および送達を誘導する方法）
本発明はまた、哺乳動物における骨の形成または修復を誘導する方法を提供する。哺乳動物は、好ましくはヒト患者である。この方法は、哺乳動物の欠損部位において本発明の骨前駆体組成物を含む組成物を移植する工程を包含する。好ましい実施形態において、この組成物は、結合剤および／または生物活性因子をさらに含み得る。好ましくは、生物活性因子は、孔形成剤中にカプセル化される。欠損は、軟骨内の欠損、骨軟骨の欠損または分節の欠損であり得る。この方法はまた、他の欠損にも適用され得る。これらとしては、非癒着性の骨折；骨孔；腫瘍切除；新たな骨折（伸延性または非伸延性）；頭蓋、顎顔面および顔面の異常、（例えば、顔面骨格の再構築、特に眼窩床の再構築、顎提または歯槽洞の増大、歯周欠損および抜歯ソケット）；頭蓋形成、頤形成、頤増大、口蓋再構築、および他の大部分の骨性の再構築；椎骨形成、頚椎、胸椎および腰椎における椎体間融合ならびに胸椎および腰椎における後椎部での融合；骨再生に関する骨髄炎において；付属肢融合、足根関節融合、全臀部融合、膝融合および関節融合または関節形成；例えば、膝の前方靭帯、後方靭帯、外側靭帯および中央靭帯の腱の矯正および／または靭帯組織欠損、膝蓋骨およびアキレス腱などならびに癌、関節炎のような疾患（変形性関節症、および離断性の骨軟骨炎のような他の骨変性疾患を含む）から生じる欠損が挙げられるが、これらに限定されない）。
【０１１７】
本発明はまた、哺乳動物の欠損部位へ骨前駆体組成物および生物活性因子を移植する工程を包含する、骨形成を必要とする部位に生物活性因子を送達する方法を提供する。骨前駆体組成物を送達する方法はさらに、結合剤を含み得る。好ましい実施形態において、生物活性因子は、孔形成剤中にカプセル化される。好ましい実施形態において、生物活性因子は、骨形態形成タンパク質ファミリーに属する。別の好ましい実施形態において、生物活性因子は、ＢＭＰをコードする配列を含む核酸分子である。好ましくは、この核酸は、キャリア中に捕捉される。さらに別の実施形態において、生物活性因子は、骨細胞（ｂｏｎｅ  ｃｅｌｌ）またはＢＭＰを発現する骨細胞である。別の好ましい実施形態では、生物活性因子の送達は、持続性放出である。孔形成剤は、好ましくは生物適合性および非免疫原性のポリマーであり、より好ましくは、ＰＬＧＡである。生物活性因子は、好ましくはＯＰ−１である。生物活性因子の放出速度は、ＰＬＧＡの分子量を部分的に変えることによって制御され得る。水がセメントマトリクスに浸透して、長いポリマー鎖を短い水溶性のフラグメントに加水分解する場合、ＰＬＧＡの分解が始まる。その物理的な特性を失うことなく、ＰＬＧＡの分子量の減少が生じる。概して、ポリマーのさらなる侵食は、このポリマーの崩壊を導き、それによって生物活性因子を放出する。例えば、１０ｋＤ〜３０ｋＤのＰＬＧＡに関しては、ＯＰ−１の放出速度は、１週間〜６週間である。
【実施例】
【０１１８】
（実施例１：孔形成剤を有するヒドロキシアパタイトの形成）
ＰＬＧＡポリマーミクロスフェアは、Ａｌｋｅｒｍｅｓ、Ｉｎｃ．から供給された。硫酸カルシウム孔形成剤は硫酸カルシウム半水和物を水和する工程によって準備された。濡れた硫酸カルシウム塊（乾燥後硬化された）は、顆粒を形成するために篩に通され、そしていかなる塊も壊するために再度篩にかけられた。
【０１１９】
７５〜１５０μｍの粒子サイズを有するミクロスフェアＰＬＧＡビーズは、ＢｏｎｅＳｏｕｒｃｅ（登録商標）ヒドロキシアパタイトセメント粉末（テトラカルシウムホスフェートおよびジカルシウムホスフェート無水物を含む）と異なる比率で混合された（表１）。
【０１２０】
【表１】
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７５〜５００μｍの粒子サイズを有する硫酸カルシウム顆粒を、ＢｏｎｅＳｏｕｒｃｅ（登録商標）ヒドロキシアパタイトセメント粉末と異なる比率で混合した（表２）。
【０１２１】
【表２】
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上に記載される２つのセメント混合物を、乾燥させそして硬化させるために、３７°Ｃで高湿度インキュベーターの中で２４時間維持した。
【０１２２】
（実施例２：セメント混合物の硬度試験）
ＰＬＧＡおよびＣａＳＯ４移植片の両方において、ヒドロキシアパタイトの割合が減少するにつれて、移植片の容積密度が減少した。容積密度における減少は、硫酸カルシウム組み込み移植片（表４）においてよりもＰＬＧＡ組み込み移植片（表３）についてより明白であった。容積密度の決定を、移植片物質の質量および体積を測定することによって実行した。ＰＬＧＡ物質の軽さは、容積密度の明白な縮小を導き得る。
【０１２３】
【表３】
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【０１２４】
【表４】
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（実施例３：インビボでの吸収活性のシミュレーション）
次いで、硬化された移植片を、インビボでの吸収活性の迅速なシミュレーションを行うために、０．２Ｎ  ＨＣｌ酸で２４時間処理した。５ｍｌの０．２Ｎ  ＨＣｌを、５ｍｌのガラスバイアル中に配置した各移植片に添加した。酸性表面は、移植片を完全に覆った。バイアルには栓を付け、そして穏やかに振とうする自動振とう機に置いた。これらの移植片の外観を、定期的に観察した。
【０１２５】
７時間後、試験した全ての移植片の構造的な硬さは、そこなわれていなかった。硫酸カルシウム組み込み移植片とＰＬＧＡ組み込み移植片の両方において、増加した有孔性が、孔形成剤における増加に正比例して観察された。しかしながら、硫酸カルシウム移植片は、酸処理の２４時間後に構造的な硬さを保有するにつれて、より砕けやすくなることが観察された。１００％ヒドロキシアパタイト移植片は、どのような明確な有孔性も示さなかった。孔形成剤を有する移植片は、有孔性の程度の変化を示した。５０％の孔形成剤を含む移植片は、その構造も維持すると同時に、明白に非常に多孔性であった。硫酸カルシウム移植片は、ＰＬＧＡ移植片よりもより大きく、そしてより目に見える孔を発達させた。
【０１２６】
（実施例４：骨誘導のためのラットモデルバイオアッセイ）
このアッセイは、エーテル麻酔下でレシピエントラットの皮下部位に本発明の組成物を移植する工程からなる。雄性のＬｏｎｇ−Ｅｖａｎｓラット（２８〜３２日齢）を使用し得る。垂直切開（１ｃｍ）を、胸部領域上の皮膚において無菌的状況下で行い、そしてくぼみをブラントジセクションによって調製する。おおよそ２５ｍｇの試験サンプルをそのくぼみの中へ深く移植し、そして切開を、金属製の皮膚用クリップで閉じる。移植した日を、実験の１日目として表す。移植片を、その後様々な時間（すなわち１２日目、１８日目）で取り出す。異所性部位（ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｉｃ  ｓｉｔｅ）は、垂直部位の使用から生じる潜在的なあいまいさなしに、骨誘導の研究を可能にする。
【０１２７】
骨成長を、移植片のカルシウム含有量によって生化学的に決定する。カルシウム含有量は、移植片において形成される骨量に比例する。それゆえ、骨形成を、ラットにおける移植片のカルシウム含有量を決定することによって算定し、そして「骨形成単位」（１骨形成単位を、移植片の最大骨形成活性のうちの半分について必要とされるタンパク質量を示す）として表現する。インタクトな、鉱物質除去されたラット骨マトリクスによって示される骨誘導を、本アッセイにおける比較目的に関して、最大骨分化活性であるとみなす。
【０１２８】
（軟骨内骨形成期間の細胞性イベント）
成功した移植片は、タンパク質誘導性の軟骨内骨形成の段階を通して制御された進行を示し、以下を含む：（１）多形核白血球による一過性の浸潤；（２)間葉細胞の移動および増殖；（３)軟骨細胞の出現；（４)軟骨基質形成；（５）軟骨石灰化；（６)血管浸潤、骨芽細胞の出現、および新たな骨の形成；（７）破骨細胞の出現、骨再構築および移植されたマトリクスの分解；ならびに（８)小骨における造血性の骨髄分化。ラットにおけるこの時間経過は、添加されるＯＰ−１の量の増加によって促進され得る。新たな骨の形状は、移植されたセメントマトリクスの形状と一致する。
【０１２９】
（組織学的評価）
組織学的切片標本化および染色は、移植片における骨形成の程度を決定するために好ましい方法である。移植片を、ブワン溶液（Ｂｏｕｉｎｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で固定し、パラフィンに包埋し、そして６〜８μｍの切片に薄切する。トルイジンブルーまたはヘマトキシリン／エオシンを用いた染色は、軟骨内骨の最終的な発達をはっきりと証明する。１２日目の移植片は、移植片が新たに誘導された骨を含んでいるか否かを決定するのに通常十分である。
【０１３０】
（生物学的マーカー）
アルカリホスファターゼ（ＡＰ）活性を、骨形成のためのマーカーとして使用し得る。酵素活性を、移植片の均質化後に分光測光的に決定し得る。続いてインビボでの活性は、ピークまで上がり、そしてその後ゆっくりと低下する。組織学的に骨発達を示さない移植片は、これらのアッセイ条件下でほとんどまたは全くアルカリホスファターゼ活性を有さない。このアッセイは、定量化および移植片がラットから取り出された後に迅速に骨形成の推定値を得るために有用である。あるいは、骨形成量を、移植片のカルシウムセメントを測定することによって決定し得る。
【０１３１】
軟骨内骨または他の型の組織形成に関連する遺伝子発現パターンをまた、当業者に公知の手順（例えば、ノーザンブロット分析）を使用してｍＲＮＡのレベルを定量することによってモニタリングし得る。そのような発達性遺伝子発現マーカーを、骨形成タンパク質を用いた処置後の組織分化経路を通る進行を決定するために使用し得る。これらのマーカーとしては、プロコラーゲンα２（Ｉ）、プロコラーゲンα１（Ｉ）、プロコラーゲンα１（ＩＩＩ）、オステオネクチン、オステオポンチン、ビグリカン、および骨再生のためのアルカリホスファターゼのような骨芽細胞関連マトリクスタンパク質が挙げられる（例えば、Ｓｕｖａら，Ｊ．ＢｏｎｅＭｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，８，３７９〜８８頁（１９９３）；Ｂｅｎａｙａｈｕら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５６，６２〜７３頁（１９９４）を参照のこと）。
【０１３２】
（実施例５：骨修復のためのヒツジモデルバイオアッセイ）
骨格的に成熟した雌性ヒツジの左脛骨および右脛骨の両方について、近位骨幹端の領域において３つの孔を開けた欠損を創った。欠損は、直径６ｍｍおよび少なくとも１０ｍｍの深さであった。欠損サイズは、試験動物全てにわたって一貫した。欠損は、骨間の繊維脂肪髄（ｆｉｂｒｏｆａｔｔｙ  ｍａｒｒｏｗ）の構造を維持するように創られた。この髄は、移植片物質間のバリアとして作用し、そして試験されるマトリクス物質の骨間混合を防ぐ。この試験される異なる処方物を、表５中に列挙する。使用されるセメントは、ＢｏｎｅＳｏｕｒｃｅ（登録商標）製であった。
【０１３３】
３〜４インチの切開を、近位脛骨骨幹端にわたって作った。皮膚およびその基底にある筋肉を、骨膜を露出させるため解剖した。骨膜を切開し、そして可能ならば外科的な閉鎖ためにインタクトな状態を維持した。３つの横径の孔を、骨幹端中に創った。第一の、そしてもっとも上位の孔を、脛骨の関節面におよそ２ｃｍ未満で創った。欠損を、骨の長軸に向く線を形成するように創った。移植片を、中心から中心で測定して１．６ｃｍ間隔で、間隔を空けておいた。
【０１３４】
物質を、処理４週後および８週後に回収した。動物を、ペントバルビタール（ｐｅｎｔｏｂａｒｂｉｔａｌ）７５〜１００ｍｇ／ｋｇで安楽死させた。最良の組織固定を可能にするために、近位脛骨を取り出して、そして切断した。標本を、１０％中性緩衝済みホルマリンで固定した。可能ならば、１つの標本において全ての移植片部位を捕獲するように、標本を切断した。固定に引き続いて、標本を脱石灰して、プラスチック中に包埋し、そしてＥｘａｃｋｔ技術を使用することで長軸方向に切片標本化し、そして組織学的分析のために適切な切片の厚さにすり減らした。
【０１３５】
全ての移植部位のＸ線撮影評価および組織学的評価を、手術の４週後および８週後で行った。全ての３つの欠損を同時に、最良に画像化し、そして円柱状の欠損を側面から見るために、前方Ｘ線写真、後方Ｘ線写真を、撮影した。定性的な組織学的描写は、新たな骨形成、残留の移植物質および病理学的応答の任意の証拠を同定した。各標本、ならびに骨形成、急性および慢性の炎症ならびに残留マトリクスのために呈されるスコアについて、写真を撮った。
【０１３６】
標本の取り扱いおよび止血特性を、移植の際に記録した。物質は、良好な粘ちゅう度を有するパテ形態であった。セメントマトリクスを、処方物および食塩水の混合に続いて移植した。
【０１３７】
【表５】
2005508217.tif 000014
（組織学の結果）
近位脛骨切片は、３つの欠損を含んだ。３つの欠損全てが１つの切片中に含まれるように、これらの切片を、グロスで大きく切断した。グロス切片観察、臨床試験およびこの切片のファキシトロンＸ線照射に基づいて、この切片を、このサンプルの典型であるとみなした。この切断方向は、欠損の上を覆う骨膜反応および試験物質の骨髄内応答の評価を可能にした。４週および８週の外植片から、標本を評価した（図１〜６）。
【０１３８】
（パラフィン組織学研究）
ヒツジモデルバイオアッセイからの組織を、パラフィン切片ならびにヘマトキシリンおよびエオシン染色を使用して骨形成について評価した。脛骨標本を、動物由来の近位部位、中間部位および遠位部位における移植部位を単離するように薄切した。これらの外植片を、脱石灰化し、パラフィンに包埋し、切片標本化してヘマトキシリンおよびエオシンを用いて染色した。
【０１３９】
切片を、光学顕微鏡を使用して観察、そして骨形成について判断した。骨形成中に層状にされた標本に関しては、皮質レベルからの応答は強くそして過度であり、そしてこの応答は、骨髄区分においては適度であった。この層状に起因して、骨内膜皮質から２〜３ｍｍの深さのレベルに広がるレベルを評価した。
【０１４０】
（実施例６：骨修復のためのネコモデルバイオアッセイ）
大腿骨の骨きり術の欠損を、外科的に調製した。さらなる介入が無い場合、擬態の骨折欠損は、一貫して非結合性に進行するだろう。創った骨欠損内へ移植した、本発明の組成物およびデバイスの効果を、以下の研究プロトコルによって評価する。
【０１４１】
簡単には、その手順は次の通りである：それぞれ重さが１０ポンド未満である１６匹の成体のネコに、外側外科的アプローチによって右大腿骨における１ｃｍの骨欠損を片側に調製する。他の実験においては、２ｃｍの骨欠損を創り得る。欠損の正確な寸法を保つために８穴プレートの外側配置によって、大腿骨を、直ちに内部に固定する。３つの異なる型の物質を、ネコ大腿骨に外科的に創った欠損中に外科的に移植し得る：群Ｉは、試験物質を有さない陰性対照群である；群ＩＩには、骨前駆体組成物から形成されたセメントマトリクスを移植する；群ＩＩＩには、骨前駆体組成物および骨形成タンパク質から形成されるセメントマトリクスを移植する。
【０１４２】
全ての動物に対して、手術後、ケージ内で自由に動くことを許す。全てのネコに、テトラサイクリン（２５ｍｇ／ｋｇ皮下に（ＳＱ）、１週間ごとに４週間）を骨標識のために注射する。
【０１４３】
軽く麻酔をかけた動物（大腿および骨切り部位の正確な前方−後方観察を一貫して行うために設計されたクッション性のあるＸ線ジグに位置づけた）の標準Ｘ線を考慮することによって、インビボでの放射線形態測定研究を、手術後４週、８週、１２週および１６週で直ちに実行した。それぞれの動物について、正確に同じ様式および正確に同じ位置において、全てのＸ線撮影をする。骨修復を、ランダム点分析によって、鉱化作用の機能として計算する。切り出した骨の最終的な標本のＸ線撮影研究を、屠殺後、２つの面において行う。
【０１４４】
切り出した試験大腿骨および正常な大腿骨を、骨デンシトメトリーによって直ちに研究し得るか、またはさらなる研究まで、２層の生理食塩水に浸したタオル中に包み、密封性プラスチックバック内に入れ、−２０°Ｃで保管する。骨修復能力、破損負荷（ｌｏａｄ−ｔｏ−ｆａｉｌｕｒｅ）、および破損仕事（ｗｏｒｋ−ｔｏ−ｆａｉｌｕｒｅ）は、特別に設計された、インストロンテスト機（Ｉｎｓｔｒｏｎ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｍａｃｈｉｎｅ）に装着した鋼４点屈曲ジグ（ｓｔｅｅｌ  ４−ｐｏｉｎｔ  ｂｅｎｄｉｎｇ  ｊｉｇ）上で、破損負荷をかけることで試験して、骨強度、剛性、吸収されたエネルギーおよび破損変形を定量する。試験大腿骨および正常大腿骨の研究は、何ポンドもの骨強度（負荷）および何ジュールもの破損仕事を生じる。正常な大腿骨は、９６（＋／−１２）ポンドの強度を示す。骨形成デバイスを移植された大腿骨強度は、（骨欠損修復の「砂時計（ｈｏｕｒｇｌａｓｓ」)形状に起因して）骨折部位での表面領域を矯正されるべきである。この矯正をもって、結果は正常な骨強度と密接に相関する。
【０１４５】
生体力学的試験に続いて、骨を、その欠損部位で２つの縦断面に直ちに分割し、重さを量り、そしてその体積を測定する。１／２は、蛍光染色液取り込み評価（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｓｔａｉｎ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）を用いて、標準的に石灰化された骨の組織学的形態測定のために固定し、そして１／２は、脱石灰化したヘマトキシリン／エオシン染色の組織学的標本のために固定する。
【０１４６】
骨修復部位から選択された標本を、冷０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．０）中で、Ｓｐｅｘ冷凍製粉機によってホモジナイズする。次いで、上清のアルカリホスファターゼ活性および酸性可溶性成分画のセグメントの総カルシウム含有量を決定する。
【０１４７】
（実施例７）：骨修復のためのウサギモデルバイオアッセイ
本アッセイは、本明細書中で参考として援用されるＯｐｐｅｒｍａｎｎら、米国特許第５、３５４、５５７号において詳細に記載される；（また、Ｃｏｏｋら、Ｊ．ｏｆ  Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇｅｒｙ、７６−Ａ、８２７〜３８頁（１９９４）参照のこと）。１．５ｃｍの非癒着性の尺骨の欠損を、成熟した（１０ポンド未満の）ニュージランドホワイト種のウサギにおいて、Ｘ線によって証明される骨端閉鎖（ｅｐｉｐｈｙｓｅａｌ  ｃｌｏｓｕｒｅ）を用いて創る。この実験は、次のとおり、１群につき少なくとも８匹のウサギ内へのデバイスの移植を含み得る：群Ｉは、試験物質を有しない陰性対照群である；群ＩＩには、骨前駆体組成物から形成されるセメントマトリクスを移植する；群ＩＩＩには、骨前駆体組成物および骨形成タンパク質から形成されるセメントマトリクスを移植する。尺骨欠損を、各群のウサギにおいて８週の研究の全経過にわたって追跡する。
【０１４８】
別の実験において、１．５ｃｍの尺骨欠損の骨髄窩を、骨前駆体組成物から形成されるセメントマトリクス中の骨形成タンパク質で満たす。骨を、介在様式で同種移植する。陰性対照尺骨は、８週までには癒着せずそして古典的な「ぞうげ」外観を示す。異なる対照において、骨形成タンパク質処置される移植片は、６〜８週までの再鉱化作用の開始を伴って、４週までにはＸ線写真的に「消滅」する。これらの同種移植片は、８週までには緩やかな増殖性骨形成を伴って、それぞれの端で癒着する。この型のデバイスは、同種移植片修復を促進するために役立つ。
【０１４９】
上で記載されるように、ウサギモデルはまた、本発明の特定の組成物が局所的な骨形成を誘導し得る条件の効力を試験しそして最も効果的にするために使用され得る。
【０１５０】
（実施例８）：骨修復のためのイヌ尺骨欠損バイオアッセイ
本アッセイは、Ｃｏｏｋら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３０１、３０２〜１１２頁（１９９４）（本明細書中で参考として援用される）に記載されるように、本質的に実行される。簡単には、尺骨分節欠損モデルを、３５〜４５ｋｇのオスイヌにおける骨癒着を評価するために使用する。５００ｍｇの骨前駆体組成物を含む実験的コンポジットを、様々な量のＯＰ−１で再構成する。任意の骨形成タンパク質が、本アッセイにおいてＯＰ−１の代わりに使用され得る。欠損部位への移植を、１つのキャリア対照および試験ＯＰ−１の実験系を用いて実行する。機械的試験を、移植後１２週間でコンポジットを受け入れる動物の尺骨で実行する。前肢のＸ線写真を、動物が手術後１２週または１６週のいずれかで安楽死されるまでに毎週撮影する。組織学的切片を、欠損部位および近接の正常骨から分析する。
【０１５１】
（実施例９）：骨修復のためのサル尺骨および脛骨欠損バイオアッセイ
アフリカミドリサルにおける、本骨癒着アッセイは、Ｃｏｏｋら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇｅｒｙ、７７Ａ、７３４〜５０頁（１９９５）（本明細書中で参考として援用される）に記載されるように、本質的に実行される。簡単には、２．０ｃｍの骨骨膜欠損を、尺骨長幹の中間において創りそしてＯＰ−１を含む骨前駆体組成物マトリクスを含む移植片で満す。様々な量のＯＰ−１の量で再構成される骨前駆体組成物マトリクスを含む実験的コンポジットを、脛骨の骨幹において創られる２．０ｃｍの骨骨膜欠損を満たすために使用する。任意の骨形成タンパク質が、本アッセイにおいてＯＰ−１の代わりに使用され得る。欠損部位への移植を、１つのキャリア対照および試験ＯＰ−１の実験系を用いて実行する。機械的試験を、コンポジットを受け入れる動物の尺骨および脛骨で実行する。Ｘ線写真および組織学的切片を、Ｃｏｏｋらにおいて記載されるように、欠損部位および近接の正常骨から分析する。
【０１５２】
（実施例１０）：ヤギモデル骨折癒着バイオアッセイ
ヒツジにおける本骨折癒着アッセイは、Ｂｌｏｋｈｉｕｓら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２２、７２５〜７３０頁（２００１）（本明細書中で参考として援用される）において記載されるように、本質的に実行される。成体メスヤギの左脛骨において、注文品の３点屈曲デバイスを用いて閉鎖性長幹中間骨折させる。骨折を、外固定器（脛骨の外側に置かれる）で安定化する。３つの異なる型の物質を、注射によってヤギ欠損内に移植する：群Ｉは、試験物質を有しない陰性対照群である；群ＩＩには、骨前駆体組成物から形成されるセメントマトリクスを移植する；および群ＩＩＩには、骨前駆体組成物および骨形成タンパク質から形成されるセメントマトリクスを移植する。注射は、無菌条件下で与えそしてＸ線透視は、注射された物質が骨折裂孔に配置されたことを確認するために使用する。機械的試験（４点非破壊性屈曲試験）を、２週および４週でコンポジットを受け入れる動物において実行する。機械的試験後、骨折裂孔の前方切片、後方切片、側方切片、および中間切片を、Ｘ線写真および組織学的切開を実行するために切り取る。
【０１５３】
（実施例１１）：ヒツジ腰椎棘突起の不安定な運動性分節の融合アッセイ
本アッセイは、骨性および円板靭帯不安定性の癒着を調査する。棘突起の運動性分節は、１つのものが他のものより上に位置する２つの椎体、および椎間円板からなる機能単位である。
【０１５４】
試行群は、１２頭のヒツジからなる。それぞれ１２頭からの２つの対照群を、使用する。下方腰椎棘突起の手術領域は、全身麻酔導入および動物を腹臥位に配置した後に用意される。下方腰椎棘突起の棘状突起より上で長さ約１２ｃｍの皮膚切開を行う。皮下組織および筋膜の離断後、背側の筋肉を側部に移動する。
【０１５５】
挿管麻酔を、１．５ｍｌキシラジン（Ｒｏｍｐｕｎ（登録商標））の筋内注射によって適用する。必要になるにつれて、さらなる用量が投与され得る。鎮静には、耳の静脈に穿刺した後、静脈留置カテーテルの配置を必要とする。麻酔は、体重１キログラムにつき３〜５ｍｇのチオペンタール（Ｔｒａｐａｎａｌ（登録商標））を提供することによって、カテーテルをとおして導入される。気管内挿入後、動物は、酸素（３０％）、亜酸化窒素（笑気ガス）およびイソフルラン（Ｉｓｏｆｌｕｒａｎ（登録商標））を使用することで通気される。全手術の間、用量０．２〜０．４ｍｇを有する鎮痛性フェンタニール二水素シトレート（Ｆｅｎｔａｎｂｙｌ（登録商標））が、投与される。同時に、弛緩は、０．５ｍｇ／体重ｋｇの用量でアトラクリウム（Ａｔｒａｃｕｒｉｕｍ（登録商標））を投与することによって達成される。
【０１５６】
腰椎椎体間の茎Ｌ４〜Ｌ６を完全に露出した後、茎Ｌ４および茎Ｌ６の両側のインストルメンテーションが起こる。これは、直径５ｍｍまたは６ｍｍ（茎中に見いだされる直径に依存して）の茎ねじを使用することによって実行される。引き続いて、上方の運動性分節Ｌ４／Ｌ５の円板の両相対茎除去を、茎鏡（Ｐｅｄｉｃｕｌｏｓｃｏｐｉｃ）制御下でＬ５の茎にわたって実行する。罹患した椎体間の終板を除皮質する。
【０１５７】
試験サンプルの身体間および身体内への応用は、試行群の全ての１２頭のヒツジにおいて相対茎のカニューレを介して起こる。試験サンプルは、様々な濃度でセメントマトリクスおよび骨形成タンパク質を含む。１２頭のヒツジからなる第一の対照群において、セメントマトリクスだけを応用する。第二の対照群において、自己海綿を、本発明の組成物の代わりに投与する。
【０１５８】
最終的に、内部固定器を完全に取り付ける。内部固定器の型および必然のインストルメンテーションは、ヒトにおいて使用されるものと同じである。従って、外科的手順は、標準化されそして熟練した実施者に周知である。廃液管を配置しそして創傷を、筋膜および皮下組織に対して吸収性縫合糸を使用し、ならびに皮膚ステープルを使用して閉鎖する。
【０１５９】
全手術の手順の間、Ｘ線イメージアンプリファイアーは、手術中のＸ線透視のために有用である。これは、上のステップの実行の間、正確な位置づけを促進する。
【０１６０】
自己海綿を投与された１２頭のヒツジの回収を、次のとおり麻酔下で実行する：左腸骨稜皮膚および筋膜を、約８ｃｍの長さの縦の切開を作ることで切開する。殿部筋肉を、骨膜下に移動しそして海綿質移植片を、骨きり術後、腸骨稜から回収する。過剰な出血を調節する血液遮断および廃液管の配置を、層における創傷の閉鎖のために実行する。回収手順は、標準的でありそして当業者に公知である。
【０１６１】
（臨床観察）
日常的な神経学的検査を、動物の歩行および手術後に生じ得る神経学的欠損を評価するために実行する。手術による創傷を、毎日きっちりと検査する。体重は、手術前および安楽死のときに測定する。
【０１６２】
（Ｘ線分析）
評価の前に、完成した腰椎棘突起を新たに切り開き、そして内部固定器を注意深く除去する。手術された棘突起分節の前後Ｘ線写真および外側の単純Ｘ線写真を、融合評価を助成するために、０週および８週で、一貫したミリアンペア、キロボルト、および秒の条件下で撮影した。融合状態を、Ｌｅｎｋｅら、Ｊ．Ｓｐｉｎａｌ  Ｄｉｓｏｒｄ、５、４３３〜４４２頁（１９９２）（本明細書中で参考として援用される）によって典拠を示される段階付け体系を用いて評価する。この体系を用いることによって、Ａは大きく、充実した肉柱両側性融合塊（明確に固形である）を示し；Ｂ、大きく、充実した一側性融合塊（小さい対側性融合塊を有する）（おそらく固形である）；Ｃ、小さく、やせた両側性融合塊（明らかな裂け目を有する）（多分固形ではない）；およびＤ、移植片または融合塊の両側性吸収（明白な両側性偽関節を有する）（明確に固形ではない）。
【０１６３】
さらに、コンピューター断層撮影スキャンを、断面および矢状面再構築における融合塊を評価するために実行する。それぞれの融合塊のために、おおよそ４０回連続したコンピューター断層撮影スキャンを、一貫した倍率およびＸ線写真条件下で、２ｍｍ薄片間隔の使用および続いて起こる矢状面における再構築をもって行う。
【０１６４】
（生体力学的試験）
各群の４つの標本を、生体力学的に評価する。Ｘ線写真分析後、靭帯構造および骨構造を維持しながら、全ての筋肉を、注意深く除去する。棘突起を、−２０°Ｃで凍結させる。これらの標本それぞれのために、運動性分節Ｌ４／Ｌ５の上部椎骨の上部半分および下部椎骨の下部半分を、ポリメチルメタクリレート（Ｔｅｃｈｎｏｖｉｔ  ３０４０；Ｈｅｒａｅｕｓ  Ｋｕｌｚｅｒ  ＧｍｂＨ、Ｗｅｈｒｈｅｉｍ／Ｔｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中に包埋すれる。次いで、各標本を、固定しそして非破壊的な試験様式において、棘突起試験器（ｓｐｉｎｅ  ｔｅｓｔｅｒ）中で前負荷なしに試験する。屈曲／伸長、軸の左右回転、および左右への側方屈曲モーメントの交互の連続を、１．７度／秒の一定速度で連続的に適用する（棘突起試験器のジンバルにおいて調節されるステッパモータによって）。２回の前サイクルは、粘性弾性応答における粘性成分の効果を最小限にするために適用し、そしてデータは、３回目のサイクルで集められる。運動の範囲、中立帯の範囲、および２つの剛性パラメーターは、結果として生じる負荷−変形曲線（ｌｏａｄ−ｄｅｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｃｕｒｖｅ）から決定する。
【０１６５】
（組織学／組織体型測定）
各群の８つの標本を、手術後２週、４週または８週後に組織学的に評価する。Ｘ線写真分析後、棘突起を１０％ホルマリン溶液中で固定する。おのおのの標本の断面を、骨性融合、細胞性反応、生物適合性、およびセメント統合／分解の兆候を評価するために得る。手術部位での融合塊の定性的組織学的評価を、巨細胞、炎症性細胞、または繊維性応答（移植される物質がカプセル化され得る場合）の存在に関して下す。さらに、肉柱融合塊内で見られる類骨および肉柱骨の量を評価する。類骨のパーセンテージ、類骨の厚み、骨表面１ミリメーターあたりの骨芽細胞の数、および骨表面１ミリメーターあたりの破骨細胞の数のような組織体型測定的変数を決定する。
【０１６６】
（蛍光色素標識）
８動物は、手術後２週目に体重１キログラムにつき９０ミリグラムのキシレノールオレンジの静脈への適用、手術後４週目に体重１キログラムにつきに１０ミリグラムのカルセリングリーンの静脈への適用、および手術後６週目に体重１キログラムにつき２５ミリグラムのドキシサイクリンヒクレートイエローの静脈への適用を被る。この養生法（ｒｅｇｉｍｅｎ）は、ＲａｈｎおよびＰｅｒｒｅｎによって発表された方法に従う。例えば、Ｒａｈｎら、Ｓｔａｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、４６、１２５〜１２９頁（１９７１）、Ｒａｈｎら、Ａｋｔ  Ｔｒａｕｍａｔｏｌ、１０、１０９〜１１５頁（１９８０）を参照のこと。次いで、定量的および定性的力学評価のために、蛍光色素連続分析を、標本についてＵＶ光下での蛍光顕微鏡検査法によって実行する。
【０１６７】
本発明者らが本発明の多数の実施形態を記載する一方で、本発明者らの基本的な構成物が、他の実施形態（本発明の生成物およびプロセスを利用する）を提供するために部分的に変化させられ得ることが明白である。それゆえ、本発明の範囲が、特定の実施形態（例として述べられる）によるよりもむしろ、添付の特許請求の範囲によって規定されるべきであるということが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１６８】
【図１】図１は、４週目での動物５３３４の右脛骨のグロス画像（上）およびファキシトロン（Ｆａｘｉｔｒｏｎ）画像（下）を示す。左から、近心部位、中間部位および遠心部位は、それぞれ処方物１、２および３を含む。
【図２】図２は、４週目での動物５３２９の左脛骨のグロス画像（上）およびファキシトロン画像（下）を示す。左から、近心部位、中間部位および遠心部位は、それぞれ処方物６、７および８を含む。
【図３】図３は、４週目での動物５３２９の右脛骨のグロス画像（上）およびファキシトロン画像（下）を示す。左から、近心部位、中間部位および遠心部位は、それぞれ処方物対照、１０および９を含む。
【図４】図４は、８週目での動物５３３９の左脛骨のグロス画像（上）およびファキシトロン画像（下）を示す。左から、近心部位、中間部位および遠心部位は、それぞれ処方物３、２および１を含む。
【図５】図５は、８週目での動物５３３８の右脛骨のグロス画像（上）およびファキシトロン画像（下）を示す。左から、近心部位、中間部位および遠心部位は、それぞれ処方物６、７および８を含む。
【図６】図６は、８週目での動物５３４０の右脛骨のグロス画像（上）およびファキシトロン画像（下）を示す。左から、近心部位、中間部位および遠心部位は、それぞれ処方物対照、１０および９を含む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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