(57)【要約】虚血組織において血管新生反応を誘導することが見出された骨形成タンパク質の混合物のような増殖因子を可溶化するのに適当な液体担体溶剤を提供する。当該液体溶剤はポリビニルピロリドンの水溶液を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＧＦ−βスーパーファミリーのポリペプチド；ならびに
約２．５ｋＤから約２０ｋＤまでの分子量を有するビニルピロリドン重合体と、水および水性緩衝溶液より成る群から選択される溶媒とを含む担体；を含む増殖因子組成物。
【請求項２】
前記ビニルピロリドン重合体がＮ−ビニル−２−ピロリドンの重合体であることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記ビニルピロリドン重合体がＮ−ビニル−２−ピロリドンのホモ重合体であることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項４】
前記ビニルピロリドン重合体がポビドンであることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項５】
前記ビニルピロリドン重合体が前記増殖因子を可溶化することを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項６】
前記ビニルピロリドン重合体が水溶性であることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項７】
前記ビニルピロリドン重合体が、約０．１ｗ／ｖ％から約７０ｗ／ｖ％までの濃度で提供されることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項８】
前記ビニルピロリドン重合体が、約０．１ｗ／ｖ％から約５０ｗ／ｖ％までの濃度で提供されることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項９】
前記ビニルピロリドン重合体が、約０．１ｗ／ｖ％から約５５ｗ／ｖ％までの濃度で提供されることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項１０】
前記ビニルピロリドン重合体が、約０．５ｗ／ｖ％から約２．５ｗ／ｖ％までの濃度で提供されることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項１１】
前記ビニルピロリドン重合体が、約１ｗ／ｖ％の濃度で提供されることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項１２】
前記ＴＧＦ−βスーパーファミリーのポリペプチドが骨形成タンパク質を含むことを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項１３】
ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３およびＦＧＦ−１より成る群から選択される少なくとも２つの増殖因子を含むことを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項１４】
ＩＧＦ−１、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＴＧＦ−αおよびＰＤＧＦより成る群から選択される増殖因子を含むことを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項１５】
ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＦＧＦを含むことを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項１６】
ＴＧＦ−βスーパーファミリーのポリペプチド、ならびに約２．５ｋＤから約２０ｋＤまでの分子量を有するビニルピロリドン重合体と水および水性緩衝溶液より成る群から選択される溶媒とを含む担体を含む増殖因子組成物を提供し；さらに
前記増殖因子組成物を、血管新生を必要とする患者に投与する；工程を含む、血管新生を患者において誘導する方法。
【請求項１７】
前記患者がヒトであることを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記投与工程が、前記組成物を患者の体内に注射することを含む請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
前記投与工程が、前記組成物を患者の心臓に注射することを含む請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
前記投与工程が、前記組成物を皮下に投与することを含む請求項１６記載の方法。
【請求項２１】
前記投与工程が、前記組成物を筋肉内投与することを含む請求項１６記載の方法。
【請求項２２】
前記投与工程が、前記組成物を静脈内投与することを含む請求項１６記載の方法。
【請求項２３】
ＴＧＦ−βスーパーファミリーのポリペプチド、ならびに約２．５ｋＤから約２０ｋＤまでの分子量を有するビニルピロリドン重合体と水および水性緩衝溶液より成る群から選択される溶媒とを含む担体を含む増殖因子組成物を提供し；さらに
前記増殖因子組成物を虚血組織に投与する；工程を含む、虚血組織を治療する方法。
【請求項２４】
前記虚血組織が心筋組織であることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記投与工程が、前記組成物を心筋組織に注射することを含む請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記組成物が、約３ｃＰ未満の粘度を有する液体であることを特徴とする請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記組成物が、約２．５ｃＰ未満の粘度を有する液体であることを特徴とする請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
前記組成物が、約２ｃＰ未満の粘度を有する液体であることを特徴とする請求項２５記載の方法。
【請求項２９】
前記組成物が、約１．５ｃＰ未満の粘度を有する液体であることを特徴とする請求項２５記載の方法。
【請求項３０】
ＴＧＦ−βスーパーファミリーのポリペプチド、ならびに約２．５ｋＤから約２０ｋＤまでの分子量を有するビニルピロリドン重合体と水および水性緩衝溶液より成る群から選択される溶媒とを含む担体を含む増殖因子組成物を提供し；さらに
前記増殖因子組成物を軟組織に投与する；工程を含む、生体被験者において軟組織再生を促進する方法。
【請求項３１】
水および水性緩衝液より成る群から選択される溶媒を含む水性溶剤中に入れられたＴＧＦ−βスーパーファミリーのポリペプチドを含む増殖因子を提供し；さらに
ビニルピロリドン重合体を溶剤に加える；工程を含む、増殖因子のバイオアベイラビリティを高める方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本出願は、米国特許出願第０９／７４８，０３８号（その全体が引用によって開示に含まれる）の一部継続出願であり、それは１９９８年１０月１６日出願の米国特許出願第０９／１７３，９８９号の一部継続出願であり、それは現在米国特許第６，２１１，１５７号（ベネディクトら（Ｂｅｎｅｄｉｃｔ ｅｔ ａｌ．））として公開されており『治療的血管新生を誘導するタンパク質混合物』と題する（同じく全体が引用によって開示に含まれる）。
【０００２】
連邦予算研究または開発に関する陳述
適用なし。
【０００３】
発明の分野
本発明は、ポリビニルピロリドン（以後「ポビドン」）の、タンパク質およびポリペプチド、特に血管新生増殖因子として機能するもののための液体溶剤における用途に関する。
【背景技術】
【０００４】
生組織への血液の供給の増加が示唆される多くの医療状況が存在する。これらは以下を含む：やけどおよび創傷治癒では、血管新生因子の人工皮膚への組み込みが、治癒しつつある創部の血管形成を促進し、また感染の危険を低下させうる；心臓血管疾患では、狭心または虚血性心臓組織の修復が、新しい血管の内殖によって効果を現す；卒中では、脳への血液供給増加が、一過性虚血発作および／または脳動脈不全の危険性を減少させることができる；さらに、末梢血管疾患では、四肢への血流が減少する。それぞれの場合で、新しい血管の増殖が問題の組織を通じて循環する血液の量を増加させ、相応してその組織に利用可能となる酸素および栄養の量を増加させると考えられている。
【０００５】
血流減少の共通原因の１つがアテローム性動脈硬化である。アテローム性動脈硬化は、心臓の血管を含む血管を冒し、心臓血管疾患、卒中、および末梢血管疾患の主因である。この疾患は人生の早い段階で始まる可能性があり、最初は動脈壁の肥厚化によって特徴づけられる。この肥厚化は典型的には脂肪、フィブリン、細胞の破片、およびカルシウムの蓄積を含む。その結果生じる罹患血管腔の狭小化を狭窄という。狭窄は血流を妨げ減少させる。高血圧、および血流不足の影響を受ける器官または身体の範囲の機能不全が結果として生じうる。血管の内壁上の蓄積が厚くなるにつれ、血管壁は拡張および収縮する能力を失う。また、血管は生存力を失って、動脈瘤の名でも知られる膨張を生じやすくなる。高血圧すなわち血圧の上昇の存在下では、動脈瘤はしばしば裂け目を生じ最終的に破裂する。
【０００６】
心臓、脚、腸、および身体の他の部分に血液を供給する動脈のような小血管は、特にアテローム硬化性狭小化を生じやすい。脚または腸の動脈が冒されると、その結果起こる脚または腸の一部への血液供給の損失は、壊疽を生じうる。１つ以上の冠動脈のアテローム硬化性狭小化は、心筋の一部への血流を制限し、一部の場合には完全に妨げる。閉塞の重症度および冠循環系の中でのその位置によっては、心機能障害または死亡という結果となる。動脈閉塞の結果がそれほど重大であるため、信頼性の高い治療は非常に望ましい。
【０００７】
多くの場合に、合成移植片またはパッチ材料を必要としない形成再建を用いて主要な動脈の動脈瘤および狭窄を修正することが可能である。疾患が広範囲で血管の能力が失われている場合のような別の事例では、血管の塞がれたかまたは弱くなった部分を通常は移植片と置換する。そのような場合には、患部の血管は切開して取り除かれ、合成パッチ、導管または移植片が定位置に縫合される。これらの型の手順は、冠動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）および経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）を含み、虚血を緩和する目的で通常行われる。
【０００８】
にもかかわらず、冠状動脈疾患単独で米国の毎年約５５０，０００名の死亡の原因となっている。末梢血管疾患の結果として毎年約１５０，０００名の患者の下肢切断が行われ、その後切断の２年以内の死亡率は４０％である。動脈閉塞の治療における困難の一部は、前記の外科的手順のそれぞれが再狭窄のある程度の発生率を伴い、また一部の場合には適当でないことである。患者が高齢であるかまたは以前にＣＡＢＧまたはＰＴＣＡ処置を受けている場合、このことは特に正しい。したがって、そのような事例では侵襲性のより低い方法が好ましい。特に、周囲の組織が自ら、閉塞した血流の量に対応ししたがって閉塞した血管の補償となる新しい血管を生じるよう刺激することができれば好都合である
血管新生性の、すなわち「血管を増殖させる」ポリペプチド増殖因子は一般的に多くの研究の主題となっている。そのような組成物は、上記を含むさまざまな状況における動脈閉塞の、非侵襲的で非外科的な治療の展望をもたらすが、しかし、これらの材料に基づく生理学的治療の開発に対する主要な問題の１つは、生きた患者へ増殖因子を投与するための適当な溶媒または担体が無いことである。
【０００９】
いくつかの溶媒が医薬分野内の特定の用途のために担体として利用されている。したがって、たとえば、特許文献１（スティーブンソンら（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．））はペプチドの非水性プロトン性処方のいくつかを開示する。そこに記載の溶媒の中には、ポリエチレングリコール類（ＰＥＧｓ）、プロピレングリコール（ＰＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、メトキシプロピレングリコール（ＭＰＥＧ）、グリセロール、およびグリコフロールがある。
【００１０】
しかし、一部の医薬処方物および生物材料を適当に可溶化する多数の溶媒は、ポリペプチド増殖因子を適当に可溶化しない。したがって、そのような溶媒を利用する治療は、使用している特定の増殖因子が患者の体内に適当に送達されればそのような反応を誘導することができる場合でさえ、血管新生反応を誘導しない。他の溶媒は、ポリペプチド増殖因子と相互作用し、変性させ、架橋を誘導し、または他の望ましくない反応を生じる傾向があり、したがってポリペプチド増殖因子を凝集または沈澱させる原因となるかまたは、でなければそれらを医薬として不活性かまたは不適当にする。溶媒がポリペプチド増殖因子にとって受容可能なｐＨを与えられない場合（たとえば、塩基性が強すぎる場合）、このことは特に正しい。さらに他の有用である可能性のある溶媒は、増殖因子と安定した溶液を形成せず、したがって受容しうる保存安定性を有する製剤を作製するのに用いることはできない。
【００１１】
増殖因子にとって有用である可能性のある溶媒の多数はまた、生理学的に不適当である。たとえば、研究者は塩酸の希薄溶液を（１〜１０ｍＭ）、ある種の増殖因子を可溶化するために使用している。たとえば、非特許文献１；非特許文献２を参照。しかし、臨床用途には、希鉱酸のような酸性溶媒は、その使用が投与部位の近傍で細胞損傷または細胞死を引き起こす傾向があるため不適当である。一方、塩溶液および中性緩衝塩溶液は、鉱酸よりも生物学的に適合性が高くまた一部の医薬処方で溶媒として用いられているものであるが、多数の増殖因子タンパク質が沈澱するかまたは変性する原因となり、したがって増殖因子の組織におけるバイオアベイラビリティまたは有効性を低下させる。
【００１２】
増殖因子のための適当な溶媒の選択は、別の検討材料によってさらに複雑となる。たとえば、溶媒が増殖因子を適当に可溶化し、増殖因子を変性させあるいは悪影響を生じさせることがない場合でさえ、溶媒は増殖因子の溶媒からの溶出に干渉し、それによって増殖因子の有効性を低下させる。たとえば、溶媒の粘度が高すぎる場合、または増殖因子との結合（たとえば、水素結合または双極子間相互作用を通じて）が強すぎる場合、これに該当するであろう。
【特許文献１】米国特許第５，９３１，４８９号明細書
【特許文献２】米国特許出願第０９／７４８，０３８号明細書
【特許文献３】米国特許第６，２１１，１５７号明細書
【特許文献４】米国特許第５，２９０，７６３号明細書
【特許文献５】米国特許第５，３７１，１９１号明細書
【特許文献６】米国特許第６，１２０，７６０号明細書
【特許文献７】米国特許第６，１９７，５５０号明細書
【特許文献８】米国特許第５，９９４，０９４号明細書
【非特許文献１】Ｒ．Ｊ．ラハム，Ｍ．レザイー，Ｍ．ポスト，Ｄ．ノビスキー，Ｆ．Ｗ．サルケ，Ｊ．Ｄ．パールマン，Ｍ．シモンズ，Ｄ．ハン，『繊維芽細胞増殖因子−２の腹腔内投与は慢性心筋虚血のブタモデルで新血管形成を誘導する』（Ｒ．Ｊ． Ｌａｈａｍ， Ｍ． Ｒｅｚａｅｅ， Ｍ． Ｐｏｓｔ， Ｄ． Ｎｏｖｉｃｋｉ， Ｆ．Ｗ． Ｓａｌｌｋｅ， Ｊ．Ｄ． Ｐｅａｒｌｍａｎ， Ｍ． Ｓｉｍｍｏｎｓ ａｎｄ Ｄ． Ｈｕｎｇ， "Ｉｎｔｒａｐｅｒｉｃａｒｄｉａｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−２ Ｉｎｄｉｃｅｓ Ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｐｒｏｃｉｎｅ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ Ｉｓｃｈｅｍｉａ"）， Ｊ． Ｐｈａｒｍｏｃｏｌｏ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ． ２９２（２）． ７９５−８０２ （２０００）
【非特許文献２】Ｎ．ヤマモト，Ｔ．コウモト，Ｖｖ．ロクシー，Ａ，グー，Ｃ．デ・ローサ，Ｌ．Ｅ．ラバニ，Ｃ．Ｒ．スミス，Ｄ．バークホフ，『塩基性繊維芽細胞増殖因子−２が経心筋的レーザー血行再建術の血管新生作用を促進する組織学的証拠』（Ｎ． Ｙａｍａｍｏｔｏ， Ｔ． Ｋｏｈｍｏｔｏ， Ｖｖ． Ｒｏｃｔｈｙ， Ａ， Ｇｕ， Ｃ． ＤｅＲｏｓａ， Ｌ．Ｅ． Ｒａｂｂａｎｉ， Ｃ．Ｒ． Ｓｍｉｔｈ， ａｎｄ Ｄ． Ｂｕｒｋｈｏｆｆ，"Ｈｉｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｖｉｄｅｎｃｅ Ｔｈａｔ Ｂａｓｉｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−２ Ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｔｒａｎｓｍｙｏｃａｒｄｉａｌ Ｌａｓｅｒ Ｒｅｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ"）， Ｊ． Ｐｈａｒｍｏｃｏｌｏ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ． ９５（１ ）． ５５−６３ （２０００）
【非特許文献３】『ＰＶＰ：ポリビニルピロリドン（ポビドン）の動力学および毒性学の批評的総説』，ロビンソン，サリバン，ボーゼレカ，シュワルツ（"ＰＶＰ： Ａ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ （Ｐｏｖｉｄｏｎｅ），"） Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， Ｓｕｌｌｉｖａｎ， Ｂｏｒｚｅｌｌｅｃａ， ａｎｄ Ｓｃｈｗａｒｔｚ， Ｌｅｗｉｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ．， １２１ Ｓ． Ｍａｉｎ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｐ．Ｏ． Ｄｒａｗｅｒ ５１９， Ｃｈｅｌｓｅａ， ＭＩ
【非特許文献４】『ＰＶＰポリビニルピロリドン重合体』，ＧＡＦ（ＩＳＰ）技術パンフレット（"ＰＶＰ Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ"，ＧＡＦ（ＩＳＰ） Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ， ２３０２−２０３ ＳＭ−１２９０）
【非特許文献５】Ｈ． Ｆｉｋｅｎｔｓｃｈｅｒ， Ｃｅｌｌｕｓｏｃｈｅｍｉｅ， １９３２， １３， ５８−６４ ａｎｄ ７１−７４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって本分野では、ポリペプチド増殖因子を効率的に可溶化して医薬的に有用にし、凝集したり変性したり、または架橋または医薬活性に悪影響を与える他の反応を受ける原因とならず、良好な保存安定性を示し、投与部位の細胞に顕著な傷害または損傷を起こさず、そして生組織への投与後に増殖因子を溶媒から適当に溶出させる、溶媒または担体の必要性がある。以降で説明する通り、これらおよび他の必要に本発明は対応している。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
１つの態様では、本発明は、１つ以上のポリペプチド増殖因子およびそのための担体溶剤を含む組成物を提供する。担体は好ましくは水性溶剤であって、ポリペプチド増殖因子を効率的に可溶化して医薬的に有用にし、凝集したり変性したり、または架橋または医薬活性に悪影響を与える他の反応を受ける原因とならない。本発明は、良好な保存安定性を示し、投与部位の細胞に顕著な傷害または損傷を起こさず、そして生組織への投与後に増殖因子を溶媒から適当に溶出させる、混合物、溶液、および組成物を提供する。
【００１５】
担体溶剤は、少なくとも１つの化合物、ラクタムまたはピロリドン部分を含む重合体または共重合体、および好ましくは少なくとも１つの化合物、ビニルラクタムまたはビニルピロリドン部分を含む重合体または共重合体を含む。より好ましくは、液体溶剤は、水性溶剤中にたとえばＮ−ビニル−２−ピロリドンに由来する重合体のようなポリビニルピロリドンの溶液を含む。非常に好ましくは、液体溶剤は、ポビドンのようなＮ−ビニル−２−ピロリドンの水溶性ホモ重合体、および水を含む。ピロリドン部分のｐＨを水と同じかまたはその付近に維持する水性緩衝液もまた用いることができ、組成物はまたアジュバントおよび保存料を含むこともできる。
【００１６】
本発明の担体溶剤は、さまざまな増殖因子、タンパク質、ポリペプチド、および血管新生を調節するさまざまな増殖因子、マトリクスメタロプロテイナーゼ、サイトカイン、インテグリンを含む他の生体物質と組み合わせたり、またはその担体または溶媒として用いることができる。したがって、たとえば、本発明の液体溶剤は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、アンジオゲニン、ＴＮＦ−α、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、形質転換増殖因子α（ＴＧＦ−α）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、胎盤増殖因子（ＰＧＦ）、ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子（ＨＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、さまざまな骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、増殖／分化因子、血管内皮増殖因子、および前記の物質のうち任意の２つ以上の混合物と共に使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
血管新生はいくつかの異なる細胞型および分子シグナル伝達現象を含む複雑な過程である。内皮細胞は細胞−細胞および細胞−マトリクス接着を溶解するためにプロテアーゼを分泌し、遊走して増殖し新しい血管分枝を形成しなければならない。ｂＦＧＦおよびＶＥＧＦといった単独の因子が血管新生物質としての有望さを示しているが、タンパク質の混合物を含む物質の使用を通じて、より頑健な血管新生反応を得られることが見出されており、その結果は対象組織に対する組み合わせたタンパク質の相乗効果に起因している可能性がある。
【００１８】
そのようなタンパク質混合物は好ましくは、すべて全体が参照により開示に含まれる同一出願人による特許文献２、特許文献３（ベネディクトら（Ｂｅｎｅｄｉｃｔ ｅｔ ａｌ．））、特許文献４、および特許文献５に記載の骨タンパク質血管新生混合物を含む。これらの混合物は組成が異なりまた異なる方法で特徴づけられる可能性がある。しかし、好ましい組成物を特徴づける１つの方法は、約２０〜２５モルパーセントの酸性アミノ酸[ＡＳＰ（＋ＡＳＮ）およびＧＬＵ（＋ＧＬＮ）]；約１０〜１５モルパーセントのヒドロキシアミノ酸（ＳＥＲおよびＴＨＲ）；約３５〜４５モルパーセントの脂肪族アミノ酸（ＡＬＡ、ＧＬＹ、ＰＲＯ、ＭＥＴ、ＶＡＬ、ＩＬＥ、およびＬＥＵ）；約４〜１０モルパーセントの芳香族アミノ酸（ＴＹＲおよびＰＨＥ）；および約１０〜２０モルパーセントの塩基性アミノ酸（ＨＩＳ、ＡＲＧおよびＬＹＳ）を含む残基を有するタンパク質の混合物としてである。より好ましくは、血管新生タンパク質混合物は好ましくは、約２３．４モルパーセントの酸性アミノ酸[ＡＳＰ（＋ＡＳＮ）およびＧＬＵ（＋ＧＬＮ）]；約１３．５モルパーセントのヒドロキシアミノ酸（ＳＥＲおよびＴＨＲ）；約４０．０モルパーセントの脂肪族アミノ酸（ＡＬＡ、ＧＬＹ、ＰＲＯ、ＭＥＴ、ＶＡＬ、ＩＬＥ、およびＬＥＵ）；約６．８モルパーセントの芳香族アミノ酸（ＴＹＲおよびＰＨＥ）；および約１６．６モルパーセントの塩基性アミノ酸（ＨＩＳ、ＡＲＧおよびＬＹＳ）のアミノ酸組成物を有する（ＴＲＰ、ＣＹＳおよび１／２ＣＹＳは測定せず、モルパーセントの計算に含まれない）。
【００１９】
好ましいタンパク質混合物を特徴づける別の方法は、下記のポリペプチド増殖因子のうち少なくとも２つ、好ましくはすべてを含む混合物としてである：ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、およびＦＧＦ−１。好ましい混合物はまた、オステオカルシン、オステオネクチン、アルブミン、トランスフェリン、およびＡＰＯ−Ａ１−ＬＰ、ヒストン、ＲＬ−３２、ＲＳ２Ｄ、およびＳＰＰ２４といった骨および／または血清タンパク質も含みうる。これらの血管新生増殖因子混合物を用いて、血流の増加が必要な組織へ混合物を注射することによって天然のバイパスを達成することができる。したがって、たとえば、混合物を使用して、閉塞した心臓動脈が治癒するように血管増殖を誘導することや、または回復を助けるように虚血組織における血管新生を促進させるのに使用できる。
【００２０】
本発明の用途に好ましい骨由来血管新生タンパク質（ＢＤＡＰ）混合物は、好ましくは適当な担体または溶剤中で虚血組織へ投与される。これらの混合物は、たとえば、虚血組織への注射を通じて直接的に、またはたとえば、静脈注射を通じて間接的に、適用することができる。ある場合には、血管新生因子を迅速に吸収されるようにする担体または溶剤中で投与するのが望ましい一方、別の場合には血管新生因子を調節された時間放出法で適用するのが望ましい。さらに別の場合には、単回投与または他の変法が好ましい。一般に、好ましい担体または溶剤は、目的の臨床用途および／または投与部位によって異なる。
【００２１】
さまざまな物質を、増殖因子、タンパク質、ポリペプチドおよび混合物中の他の生化学物質、および本発明に従って作られた治療と組み合わせることができる。これらの物質は、そのような物質を可溶化し、安定化し、バイオアベイラビリティを増加させ、医薬的に有用にし、および／または生きた対象への投与を円滑にする。そのような物質は、たとえば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸およびその共重合体、コラーゲン、プルロニック（ＰＬＵＲＯＮＩＣ）（商標）（ポリオキシアルキレンエーテル共重合体界面活性剤）、ビニルアミド重合体および共重合体、ビニルイミド重合体および共重合体、ならびにラクタムまたはピロリドン部分を含む化合物、重合体、および共重合体を含む。
【００２２】
典型的には、本発明に記載の液体溶剤に使用される物質は、目的のタンパク質、ポリペプチド、増殖因子、または前記の混合物を、医薬的に有用にするのに十分な程度に、および／またはバイオアベイラビリティを向上させるのに十分な程度に可溶化させる（または可溶化を助ける）物質である。液体溶剤として使用される物質は、投与部位で顕著な傷害または損傷を生じず、および可溶化される物質を生組織への投与時に溶液から適当に溶出させることもまた好ましい。
【００２３】
ビニルアミド重合体および共重合体、ビニルイミド重合体および共重合体、ビニルラクタム単量体または共重合体、ならびにラクタムまたはピロリドン部分を含む化合物、重合体、および共重合体を含む液体溶剤は本発明のさまざまな用途で使用しうる。好ましくは、しかし、本発明で用いられる液体溶剤は、ビニルピロリドン単量体に由来するかまたはピロリドン部分を分子構造に有する重合体を少なくとも１つ含む。より好ましくは、これらの溶剤はＮ−ビニル−２−ピロリドンに由来する重合体を含む。非常に好ましくは、これらの溶剤は、ポビドンのようなＮ−ビニル−２−ピロリドンの水溶性ホモ重合体を含む。
【００２４】
本発明に従って調製された溶剤組成物中のポビドン（ポリビニルピロリドン）の使用は、それがさまざまな分子量を有するさまざまな医薬等級で市販されており、水性およびさまざまな有機溶剤の両方に良好な溶解性を有し、およびさまざまなタンパク質、ポリペプチド、増殖因子、および前記の混合物を、医薬的に有用にするのに十分な程度に、および／またはバイオアベイラビリティを向上させるのに十分良く可溶化することが見出されているため、特に好ましい。さらに、粘度のようなパラメータを適切に選択すると、その生組織への投与時に増殖因子の溶剤からの適当な溶出を可能にする、ポビドンを含む液体溶剤を処方することができる。一部の用途では、液体溶剤の粘度のようなパラメータを操作して、液体溶剤からの有効成分の溶出を有利に調節するかまたは、溶出の希望速度を達成することができる。
【００２５】
本発明における使用に適当なポビドンの医薬等級は、ニュージャージー州ウェインのインターナショナル・スペシャルティ・プロダクツ社（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｉｎｃ．）からプラスドン（Ｐｌａｓｄｏｎｅ）の商標で市販されている。市販のポビドンの性質は当該分野で既知であり、非特許文献３および非特許文献４を含むいくつかの参考文献から得ることができる。これらの等級のそれぞれを本発明の液体溶剤に用いることができる。
【００２６】
ポビドンは幅広い分子量および粘度で入手可能であり、異なる数の単量体単位から成る重合体を反映する。ポビドンの異なる分子量等級はしばしばそのＫ値で特徴づけられ、Ｋ値は高分子物質の平均分子量の指標であり、重合体溶液の相対粘度から得られる。重合体のＫ値はその分子量と、以下のフィケンチャー（Ｆｉｋｅｎｔｓｃｈｅｒ）方程式（方程式１）によって関係づけられる：
【数１】
2005516971.tif 000002
【００２７】
式中のｃは溶液中の重合体の濃度（ｇ／１００ｍｌ）、ηｃは溶液の粘度、η０は溶媒の粘度、およびＫ＝１０００ｋであってＫは重合体のＫ値である。フィケンチャー方程式は非特許文献５により詳細に記載されている。
【００２８】
高分子物質のＫ値は、物質を適当な量の溶媒に溶解し、希釈溶液を作製することによって得られる（たとえば、溶液の総重量に基づいて、高分子物質の重量で約１％）。溶液の粘度を次に、たとえばホプラー（Ｈｏｐｐｌｅｒ）落下球粘度計または当該分野で既知である別の方法を用いて、２５℃にて測定する。純溶媒の粘度を、同じ粘度計を用いて測定する。これらの値を方程式１に入れ、ｋについて解く（したがってＫについて）。
【００２９】
表１は本発明に使用することのできるポビドンの市販等級の一部の、Ｋ値を含む物理的性質を記載する：
【表１】
2005516971.tif 000003
【００３０】
表１に記載のＫ値の範囲は、メーカーが設定した製品規格を反映し（インターナショナル・スペシャルティ・プロダクツ社（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｉｎｃ．））、これらの製品のＫ値は指定の範囲内で製品バッチ毎に異なると理解される。括弧の値は、ここに記載の後述の実験の一部使用した特定の製品試料について測定した、試料に付属の分析証明書に記入されている、実測Ｋ値である。さまざまなＫ値のポビドンを本発明の実施に用いることができる一方、ポビドンのＫ値は好ましくは約１２から約１００の範囲内、より好ましくは約１５から約３５の範囲内、非常に好ましくは約１６から約１８の範囲内である。
【００３１】
本発明で有用なピロリドンを含む重合体は、さまざまな分子構造を有しうる。したがって、たとえば、１つ以上の末端で少なくとも１つのピロリドン部分が結合していたり、少なくとも１つの側基ピロリドン部分を持っていたり、または少なくとも１つのピロリドン部分を含む反復単位または配列を持っていたりする可能性がある。その重合体はまた、少なくとも１つのビニルピロリドン単量体，共重合単量体または共重合体を基礎とするランダム重合体、グラフト重合体、またはブロック重合体でありうる。ビニルピロリドンに由来する、本発明の液体溶剤で用いられる重合体には、親油性または親水性ラジカルを結合させ、重合体をそれぞれ、より親油性または親水性にすることができる。
【００３２】
ビニルピロリドンのさまざまな共重合体はまた、本発明の実施に使用することができる。これらはたとえば、酢酸ビニル、アクリル酸エチル、アクリル酸メチル、メタクリル酸メチル、メタクリル酸ジメチルアミノエチル、アクリルアミド、メタクリルアミド、アクリロニトリル、エチレン、スチレン、無水マレイン酸、アクリル酸、スルホン酸ビニルナトリウム、塩化ビニル、ビニルピリジン、トリメチル（シロキシ）ビニルシラン、プロピオン酸ビニル、ビニルカプロラクタム、およびメチルビニルケトンといった共重合単量体から形成された共重合体を含む。そのような共重合体は、ペルオキシまたはアゾ化合物といったフリーラジカル開始剤を含む溶液、エマルジョン、または懸濁液中での重合を通じて、遷移金属触媒の使用を通じて、光重合技術によって、または本分野で既知の他の方法によって、合成することができる。
【００３３】
本発明の実施においてまたは本発明に有用な材料の合成において有用なさまざまな単量体、重合体、および共重合体は、ピロリドン環とビニル基とが直接にまたはさまざまな中間構造または部分を通じて互いに結合しうる、ビニルピロリドン単量体に由来しうる。したがって、たとえば、それらは（ａ）共有結合；（ｂ）たとえば、メチレン、エチレン、またはプロピレン結合といったアルキレン結合；（ｃ）アリーレン結合；（ｄ）アルキルアクリレン結合、（ｅ）たとえば、酸素、窒素、硫黄といった１つ以上のヘテロ原子；（ｆ）たとえば、カルボキシル、カルボニル、またはアミノ結合といった官能基；または（ｈ）前記のうち任意の２つ以上の組み合わせによって結合しうる。好ましくは、ピロリドン環とビニル基が、ビニル炭素原子の１つとピロリドン環の窒素原子との間の共有結合で結合している。ビニル部分とピロリドン環はまた、さまざまな置換基を有しうる。そのような置換基は、たとえば、メチル基のようなアルキル基、またはたとえば、水酸基のような官能基を含みうる。これらの置換基はまた、進行または対象の体内におけるこれらの物質の生体内蓄積がもしあれば追跡するのが望ましい場合、重水素を含むことができる。
【００３４】
本発明に基づく液体溶剤中で有用なビニルピロリドン重合体および他の高分子材料は、さまざまな分子量を有しうる。これらの重合体の性質は、平均分子量に伴って変化することが分かっている。したがって、平均分子量の好ましい範囲は用途ごとに変わり、特定の増殖因子または他の処理、または可溶化する必要のある物質または材料に部分的に依存する。しかし、大部分の用途で、平均分子量は約１ｋＤから約１３０ｋＤまでとなり、物質は１２から１３５０までの単量体単位の間で構成される。好ましくは、分子量は約１ｋＤから約１００ｋＤまで、より好ましくは約２．５ｋＤから約９０ｋＤまで、非常に好ましくは約２．５ｋＤから約２０ｋＤまでである。約２０ｋＤ未満の分子量を有する組成物は、それらが容易に体内から排出されるため、特に好ましい一方、一部の高分子量組成物（特にポビドンの場合）は生体内蓄積を受けることがわかった。
【００３５】
液体溶剤の粘度は典型的には約３センチポアズ（ｃＰ）未満、好ましくは約２．５ｃＰ未満、より好ましくは約２．０ｃＰ未満、非常に好ましくは約１．５ｃＰ未満であって（６０ｒｐｍで２５℃にて測定）、これらの範囲の粘度は典型的には増殖因子および他のそのような物質の溶媒から処置対象の組織内への適当な溶出を促進することがわかったためである。さらに、これらの範囲の粘度は、静脈内経路を通じてまたは他の非侵襲的手順によって、生きた対象への増殖因子の適用を可能にする。しかし、たとえば増殖因子および他のそのような物質を局所ゲルとして適用するのが望ましい場合のように、ある状況ではより高い粘度が当然であるかまたは望ましいことは理解されるべきである。
【００３６】
本発明に従って調製された組成物は、典型的には約１から約６の範囲内のｐＨを有し、好ましくは約４から約６の範囲内、非常に好ましくは約４．５である。好ましいｐＨ範囲では、液体溶剤は、一般に酸性である増殖因子を変性または顕著にそのｉｎ ｖｉｖｏ活性に影響を与えることなく適当に可溶化し、組成物のｐＨは、特に投与部位で壊死を引き起こしたり生組織に損傷を与えたりするほど低くならない。
【００３７】
ビニルピロリドン重合体を本発明の組成物に使用する場合、それらは一部の場合には他の重合体、物質、溶媒、または共溶媒と共に使用することができる。したがって、たとえば、これらの重合体を用いて他の重合体または物質との、調整物、混合物、複合体、懸濁液または高分子ネットワークを形成することができる。
【００３８】
上記に示した通り、ビニルピロリドン重合体および本発明に有用であると上で記載された他の物質を、さまざまな増殖因子、タンパク質、ポリペプチド、および他のそのような生体物質のための液体溶剤に用いることができる。そのような生体物質は、たとえば、ここで記載されたような増殖因子の新規混合物、同様に血管新生を調節するさまざまな増殖因子、マトリクスメタロプロテイナーゼ、サイトカイン、およびインテグリンを含む。後者の群は血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ−β）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、アンジオゲニン、およびＴＮＦ−αを含む。これらの材料を一緒に使うことのできる他の増殖因子は、胎盤増殖因子（ＰＧＦ）、ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子（ＨＥＧＦ）、増殖分化因子（ＧＤＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、およびインターフェロンγを含む。
【００３９】
ビニルピロリドン重合体と上記の他の物質は、本発明に基づいて、下記を含むさまざまな他の生体物質のための液体溶剤にも用いることができる：ＢＭＰ−１のようなさまざまな骨形成タンパク質（ＢＭＰ）やタンパク質のＴＧＦ−βスーパーファミリーであって、ＢＭＰ−２−α、ＢＭＰ−２−β、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−３ｂ、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−８ｂ、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、ＢＭＰ−１５、ＴＧＦ−β−１、ＴＧＦ−β−２、ＴＧＦ−β−３、ＴＧＦ−β−４、およびＴＧＦ−β−５を含む；ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−９Ｂ、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、およびＧＤＦ−１５のような増殖／分化因子；ＶＥＧＦ−１２１、ＶＥＧＦ−１６５、ＶＥＧＦ−１８３、ＶＥＧＦ−１８９、およびＶＥＧＦ−２０６のような血管内皮増殖因子；ＭＰ−５２（別名ＧＤＦ−５）およびＭＰ−１２１のような細胞分裂促進タンパク質：および上記の物質のうち任意の２つ以上の混合物。これらの物質の多くが少なくとも部分的に当該分野で特徴づけられており、一部の場合にはこれらの物質の完全なヌクレオチド、ＤＮＡおよび／またはアミノ酸配列が得られている。したがって、たとえば、ＭＰ−５２およびＭＰ−１２１のヌクレオチド、ＤＮＡおよび／またはアミノ酸配列に関する情報は、特許文献６（ヘッテンら（Ｈｏ（ｅ）ｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．））、特許文献７（Ｈｏ（ｅ）ｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．）、および特許文献８（Ｈｏ（ｅ）ｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．）に見ることができる。
【００４０】
ビニルピロリドン重合体および上記の他の物質を含む液体溶剤を、上記のようなさまざまな増殖因子、タンパク質、ポリペプチドおよび他の生体物質または生体物質の混合物と共に使用する場合、ビニルピロリドン重合体および他のそのような物質は、溶剤中にさまざまな濃度で存在しうる。典型的には、しかし、ビニルピロリドン重合体および他のそのような物質は、ポリペプチド増殖因子を完全に可溶化する目的の範囲のｐＨを維持することができる水または水性緩衝液中で提供される。加えて、ビニルピロリドン重合体は、目的の増殖因子または他の生体物質を適当に溶解し医薬的に有効な溶液を作るのに必要な最低濃度から、最大では液体溶剤中のビニルピロリドン重合体または他のそのような物質の最大溶解度までの範囲の濃度の、水、または水性緩衝液中で提供される。 
当該分野の熟練者は、ビニルピロリドン重合体および他のそのような物質の最適濃度は変化する可能性があり、また溶液を投与される対象の状態、目的の生理学的効果、治療用溶液の望ましい粘度、および調節的制限といった因子に依存しうることを認識する。大部分の用途では、しかし、これらのビニルピロリドン重合体および他のそのような物質の濃度は約０．１質量対容量％（ｗ／ｖ％）から約７０ｗ／ｖ％までとなる。好ましくは、これらの物質の濃度は約０．１ｗ／ｖ％から約５０ｗ／ｖ％までとなる；より好ましくは、これらの物質の濃度は約０．１ｗ／ｖ％から約２５ｗ／ｖ％までとなる；さらにより好ましくは、これらの物質の濃度は約０．１ｗ／ｖ％から約１５ｗ／ｖ％までとなる；さらにより好ましくは，これらの物質の濃度は約０．５ｗ／ｖ％から約２．５ｗ／ｖ％までとなる；非常に好ましくは、これらの物質の濃度は約１．０％となる。下記の実施例では、特に記載の無い限り、ポビドンの濃度はすべてｇ／ｍｌである。ここで用いられるように、ｗ／ｖ％は溶液１００ｍｌを与えるのに十分な液体（通常は水）に溶解した表示の物質のグラム数をいう。したがって、１％ポビドン（ポリビニルピロリドン）水溶液は、溶液１００ｍｌを与えるのに十分な水（または水性緩衝液）に溶解した１ｇのポビドンから成る。
【００４１】
ビニルピロリドン重合体およびここに記載の他のそのような物質の濃度および平均分子量は、典型的には、ここに記載の混合物および治療に使用される増殖因子および他の生化学物質を可溶化するのに十分に酸性である溶剤を与えるように選択される一方、目的の経路によるこれらの物質の効果的な投与を妨げたり効果的な治療に必要な溶剤からこれらの物質が効率的に溶出するのを妨げたりするほど粘度は高くない。
【００４２】
好ましくは、本発明に従う液体溶剤に使用するためのビニルピロリドン重合体および上記の他のそのような物質は、望ましい（典型的には酸性）ｐＨ範囲を維持することができる、水との混合物または水性緩衝液としてのこれらの溶剤中に存在する。ゆえに、液体溶剤中に存在するビニルピロリドン重合体または他のそのような物質は、少なくとも部分的にはその物質の水での溶解度によってしばしば決定される。液体溶剤はまた、添加物、界面活性剤（たとえば、ツィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０のような非イオン性界面活性剤を含む）、保存料（たとえば、メチルまたはプロピルパラベンまたはベンジルアルコールのような抗菌剤を含む）、および共溶媒を含むがこれらに限定されない他の物質を含むことができる。
【００４３】
ここに開示され請求される方法および組成物は本開示に照らして必要以上の実験無しで作製し実施することができる。本発明の組成物および方法は好ましい実施例の形で説明されている一方、方法およびここに記載の方法の段階または段階の順序について本発明の概念、精神および範囲を離れることなく変形を行うことができることが、当該分野の熟練者には明らかとなる。より具体的には、化学的また生理学的の両方で関係しているある種の物質は、ここに記載の物質で交換しうる一方、同じかまたは類似の結果が達成されることが明らかとなる。当該分野の熟練者には明らかであるそのような同様の交換および改変はすべて、付属の請求項で定義される通りの本発明の精神、範囲および概念の内にあると見なされる。
【実施例】
【００４４】
下記の実施例は単に説明を意図し、請求された本特許の範囲を制限しない。
【００４５】
実施例１：イヌ心筋血管新生予備試験
本実施例は、７０％水性ポビドン（Ｋ−９０）溶液に可溶化されたＢＤＡＰの、虚血心筋組織を治療する有効性を説明する。
【００４６】
４頭の雄雌の雑種成犬、体重２１〜２６ｋｇを麻酔し、第５肋間腔を通じて左開胸術を実施した。回旋枝へのＬＡＤ動脈対角枝または右冠動脈と結合する、視認できたすべての心外膜側枝を結紮してＬＡＤ動脈領域への側流を最小化し、アメロイドコンストリクターを第一対角枝の近位側に取り付けた。手順の完了後、ＢＤＡＰを、虚血性および非虚血性の両方の左回旋（ＬＣＸ）冠状動脈領域に３種類の異なる濃度で３種類の異なる投与方法を用いて投与し、各個体の各領域に合計９ヶ所の注射を行った。このように、０、１０または１００μｇのＢＤＡＰを、１）容量０．１ｃｃの７０％ＩＳＰプラスドンポビドン、Ｋ値が約Ｋ−９０である、２）ポビドンに懸濁した重合体微小球中に封じ込めて、または３）コラーゲンゲルに溶解／懸濁して、合計９回の注射で注入した。閉胸し、動物を回復させた。
【００４７】
最初の手術後の複数の時点で細胞増殖の指標を与えるために、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ、２５ｍｇ／ｋｇ、シグマ（Ｓｉｇｍａ）、ミズーリ州セントルイス）を手術後２、４、６、８、１０、１２、１４および２１日に皮下投与した。２週間後または６週間後に、イヌを安楽死させ心臓を取り出して試料切片とした。試料は固定して、厚さ４〜５μｍの連続した切片を切り出し、マッソン・トリクローム染色して、心筋の全般的形態を評価した。姉妹切片は標準的な免疫組織化学技術で、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）、ＰＣ１０増殖細胞核抗抗原（ＰＣＮＡ）、α平滑筋アクチン（ＳＭＡ）および第ＶＩＩＩ因子に対する抗体を用いて標準技術で染色した。
【００４８】
最初の組織学データ（図１Ａ〜Ｅ）は、０．１ｃｃの７０％ＩＳＰプラスドンＫ−９０ポビドンに懸濁した１０または１００μｇのＢＤＡＰが、注射後２週間以内に血管形成を促したことを示す。対照切片は有意な血管形成を示さず、針跡が視認できた一方、ＢＤＡＰ処理切片はマッソン・トリクローム染色で証明された通り、いくつかの新しく形成された血管があった（図１Ａ）。免疫組織化学染色は、これらの血管が内皮細胞（暗く染色、図１Ｂ）で裏打ちされ、平滑筋（茶色に染色、図１Ｃ）の層で囲まれていることを実証した。さらに、ＰＣＮＡ−およびＢｒｄＵ−染色切片（図１Ｄ〜Ｅ）は、これらの血管内皮細胞および平滑筋細胞が活発に増殖していたことを示した。このように、イヌ試験の定量的結果に基づいて、ＢＤＡＰはイヌ心筋において直径が約５０〜１００μｍの新しく分化した血管の形成を促すと結論づけられた。コラーゲン担体は注射部位に軟骨形成を誘導するように見えた。これらの試験に用いた高分子量ポビドンは組織中の注射部位に蓄積するように見え、屠殺時点で代謝されていなかった。
【００４９】
実施例２：大規模イヌ心筋虚血試験
本実施例は、１％Ｃ−１５ポビドン水溶液中のさまざまな濃度のＢＤＡＰの、虚血心筋組織を治療する有効性を説明する。
【００５０】
本試験の目的は、慢性心筋虚血のイヌモデルで、ズルツァーの増殖因子混合物（ＢＤＡＰ、別名プロヴァスク（ＰｒｏＶａｓｃ）（商標））の心筋内注射の効果を測定することであった。３８頭のイヌが近位ＬＡＤにアメロイドコンストリクターの移植、およびＬＡＤ領域の側流となる視認できる心外膜血管の結紮を受けた。３週間後、２回目の手術中に、動物はプラセボ、１μｇ／ｍＬの濃度のＢＤＡＰ、または１０μｇ／ｍＬの濃度のＢＤＡＰ、のどれかを含む１％ポビドン（ＩＳＰプラスドンＣ−１５）溶液の心筋内注射を受けた。それぞれの注射は０．１５ｍＬの処置溶液から成り、注射はＬＡＤ領域上で〜１／ｃｍ２の空間密度で実施した。グループ割付は無作為で、すべての検査結果の分析後まで実験者はグループ割付について盲検とした。被験動物のそれぞれがさらに６週間生存した。局所血流の評価（着色微小球による）、血管造影および心エコー検査（安静および負荷）を処置の前後に実施した。組織学検査および剖検を屠殺後に実施した。
【００５１】
１％Ｃ−１５ポビドン溶液に可溶化したＢＤＡＰの効果のこの前向き盲検多角評価の結果は、組織学的評価および血管造影の判定基準によって、処置溶液が血管増殖に有意な効果を有することを示した。最大血管拡張負荷の間に血流に対する有意な影響は無かったが、技術的限界の結果として、最大血流の分析には少数の試験だけが含められた。高濃度群の最大ドブタミン負荷中に局所壁運動量スコアにわずかな低下がみられたが、全体的な安静時機能は処置によって影響されなかった。
【００５２】
実施例３：ブタ心筋虚血試験
本実施例は、５％Ｃ−１５ポビドン水溶液のＢＤＡＰ溶液の、虚血心筋組織を治療する有効性をブタモデルを用いて実証する。
【００５３】
ブタ１２頭（平均体重７３±４．６ｋｇ）を試験に供した。動物に、ケタミノール（１０ｍｇ／ｋｇ）およびアトロピン（２ｍｇ／ｋｇ）の前投与を筋肉注射で行った。耳静脈に静脈留置を確立した。この静脈ラインを通じて動物をチオペンタールナトリウム（５ｍ／ｋｇ）で麻酔し、挿管し、麻酔は必要に応じてチオペンタールの静脈内投与によって維持した。動物は空気で換気した。第５肋間腔を通じて左外側開胸術を実施した。心膜を切開し反転して心臓を吊すクレードルとした。すべての動物で、レーザーチャンネルの３つ組を５つ、左外側壁の中間の高さに開けた。３つ組それぞれの中で、チャンネルは１センチ離れていた。後で組織検査用にそれらを識別するため、各チャンネルの外側の開口部は吸収されない縫合で印を付けた。動物は無作為に割り付けられ、１％ポビドン（ＩＳＤプラスドンＣ−１５）０．１ｍＬ中の１００ｍｇの増殖因子かまたは等量の担体のみのどちらかの注射を３つ組内に受けた。手術の最後に、開胸部を胸腔チューブ上で閉じ、チューブは動物を人工呼吸器から外した後に除去した。１ヶ月後、動物を屠殺して組織検査のために心臓を速やかに摘出した。
【００５４】
図３に示す通り、ＴＭＲおよびＢＤＡＰの５％Ｃ−１５ポビドン溶液で処理した動物から採取した虚血心筋の切片における第ＶＩＩＩ因子に対する免疫染色は、無処理またはＴＭＲ単独処理と比較して血管内皮細胞の数の増加を示した。したがって、ＢＤＡＰの５％Ｃ−１５プラスドン溶液は被験動物において新しい血管の形成を促した。
【００５５】
実施例４：イヌ心筋虚血試験
本実施例は、１％Ｃ−１５ポビドン水溶液を用いたＧＤＦ−５溶液の、虚血組織の治療についての有効性を実証する。
【００５６】
１％ポビドン（ＩＳＤプラスドンＣ−１５）に可溶化したＧＤＦ−５の溶液を各例での処理溶液として用いて、実施例１の実験を繰り返した。実施例１でのように、平滑筋細胞のＢｒｄＵ染色切片、および動物から採取した虚血心筋の切片中のＢｒｄＵ陽性細胞は、これらの血管内皮細胞および平滑筋細胞が活発に増殖していたことを示し、したがって１％Ｃ−１５ポビドン中のＧＤＦ−５が被験体における新しく分化した細胞の形成を促したことを示す（図２）。
【００５７】
上記の実験結果を表２に要約する。結果が示すように、種々の分子量のさまざまな濃度のポリビニルピロリドンの水溶液を用いて、さまざまな増殖因子をさまざまな容量レベルで可溶化することができる。結果として得られる溶液は、血管新生反応をブタおよびイヌ被験体で誘導することが示され、ゆえにヒト対象者で同様の反応を誘導することが予想される。
【表２】
2005516971.tif 000004
【００５８】
本発明のさまざまな実施例が具体的に示され説明されているが、本発明の改変および変形は上記の教示によって包含され、本発明の精神および意図される範囲を離れることなく付属の請求項の範囲内であることが理解される。たとえば、ビニルピロリドン重合体およびここに記載の他のそうした物質を液体溶剤に組み込むのが好ましい一方、当該分野の熟練者は、一部の場合には、これらの物質はまた、たとえばゲルまたは液晶といった他の溶剤でも使用することができることを理解する。さらに、ここに記載の実施例は請求項によって包含される本発明の改変および変形を制限すると解釈すべきでなく、単にそのような可能な変形の一部についての説明のためである。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１Ａ〜Ｅは、本発明に記載のタンパク質混合物を用いた処理後の、イヌ心筋内で形成された血管の組織切片である。
【図２】図２はその処理に対応して新しく形成された血管を示す組織スライドである。
【図３】図３はその処理に対応して新しく形成された血管を示す組織スライドである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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