(57)【要約】本発明は、カスパーゼ−８相互作用ポリペプチド（Cari）、その製造方法、およびその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロカスパーゼ、またはそのムテインもしくは断片と相互作用することができ、配列番号：３のアミノ酸配列を含む細胞内ポリペプチド（Cari）、もしくはそのアイソフォーム、DF5182_3以外のムテイン、対立変異体、断片、融合タンパク質、またはそれらの誘導体。
【請求項２】
配列番号：２によりコードされる請求項１記載のポリペプチド、またはそのスプライス変異体。
【請求項３】
カスパーゼによりインビトロで切断される請求項１または２記載のポリペプチド。
【請求項４】
カスパーゼによりインビボで切断される請求項１、２または３記載のポリペプチド。
【請求項５】
カスパーゼが、カスパーゼ−８である請求項１、２、３または４記載のポリペプチド。
【請求項６】
内因性Cariポリペプチドの活性にドミナントネガティブ効果を有する請求項１記載の断片。
【請求項７】
カスパーゼのアポトーシス効果を阻害することができる請求項６記載の断片、もしくはそのムテイン、融合タンパク質、またはそれらの誘導体。
【請求項８】
Cariとカスパーゼの相互作用を阻害することができる請求項１記載の断片、もしくはムテイン、融合タンパク質、またはそれらの誘導体。
【請求項９】
配列番号：４のアミノ酸配列を含む請求項８記載の断片。
【請求項１０】
配列番号：５のアミノ酸配列を含む請求項８記載の断片。
【請求項１１】
カスパーゼのアポトーシス効果を増大させることができる請求項１記載のポリペプチド、もしくはそのアイソフォーム、ムテイン、対立変異体、断片、融合タンパク質、またはそれらの誘導体。
【請求項１２】
Cari D600Eである請求項１１記載のムテイン。
【請求項１３】
カスパーゼが、カスパーゼ−８である請求項６、７、８、９、１０、１１または１２記載のポリペプチド、またはムテインもしくはその断片。
【請求項１４】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３記載のポリペプチドをコードするDNA配列、またはそのアイソフォーム、ムテイン、対立変異体、断片、および融合タンパク質。
【請求項１５】
請求項１４記載のDNA配列に、または配列番号：２に対応するDNA配列に対する中程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるDNA配列。
【請求項１６】
配列番号：３のポリペプチドをコードする請求項１４記載のDNA配列。
【請求項１７】
配列番号：２のDNAを含む請求項１４記載のDNA配列。
【請求項１８】
ムテインが、Cari D600E変異体である請求項１４記載のDNA配列。
【請求項１９】
配列番号：４をコードする配列を含む請求項１４記載のDNA配列。
【請求項２０】
配列番号：５をコードする配列を含む請求項１４記載のDNA配列。
【請求項２１】
請求項１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０記載のDNA配列に特異的なリボザイム。
【請求項２２】
少なくとも９個のヌクレオチドを含む請求項１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０記載のDNAに対するアンチセンス配列をコードするDNA配列。
【請求項２３】
配列番号：６および／または配列番号：７にある配列を含む請求項２２記載のDNA配列。
【請求項２４】
請求項１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３記載のDNA配列を含むベクター。
【請求項２５】
前記ベクターが、発現ベクターである請求項２４記載のベクター。
【請求項２６】
前記ベクターが、ウイルス性ベクターである請求項２４記載のベクター。
【請求項２７】
Cariまたは内因性Cariインヒビターの内因性遺伝子活性化を可能にするための、細胞内の機能上のDNA調節配列を有するベクター。
【請求項２８】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３記載のポリペプチド断片またはムテインを使用して調製される、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、キメラ抗体、充分にヒト化された抗体、抗−抗−Id抗体またはその断片。
【請求項２９】
生物学的流動物中のCari検出用の免疫アッセイの開発のための請求項２８記載の抗体の使用。
【請求項３０】
診断目的のための請求項２９記載の抗体の使用。
【請求項３１】
請求項２５または２６記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３２】
請求項３１記載の宿主細胞の育成、および産生されたタンパク質の単離を含む、Cari、もしくはそのアイソフォーム、ムテイン、対立変異体、断片、融合タンパク質、またはそれらの誘導体を生成する方法。
【請求項３３】
前記細胞が、真核細胞である請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記真核細胞が、哺乳類、昆虫、または酵母細胞である請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞が、HeLa、293T HEKおよびCHO細胞である請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞が、原核細胞である請求項３２記載の方法。
【請求項３７】
トランスジェニック動物の作製、およびその動物の体液からの産生されたタンパク質の単離を含む、Cari、もしくはそのアイソフォーム、ムテイン、対立変異体、断片、融合タンパク質、またはそれらの誘導体を生成する方法。
【請求項３８】
一次的乏突起膠細胞疾患を伴う多発性硬化症、自己免疫ブドウ膜炎、糖尿病、狼瘡、自己免疫心筋炎Ｉ、HCV仲介慢性肝炎、慢性胃炎、たとえば、Ａ型胃炎、混合性結合組織病（MCTD）、クローン病、または潰瘍性大腸炎から選択される炎症疾患の治療のための遺伝子治療方法であって、該治療を必要とするヒト患者の所望の部位で、Cari、またはそのムテイン、断片、アンチセンスおよびリボザイムの発現を誘導することを含む方法。
【請求項３９】
前記ムテインが、Cari D600Eである請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
前記断片が、Cariの414〜437までのアミノ酸残基（配列番号：４）を含む請求項３８記載の方法。
【請求項４１】
前記断片が、Cariの422〜437までのアミノ酸残基（配列番号：５）を含む請求項３８記載の方法。
【請求項４２】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号：６における配列および／または配列番号：７にある配列を含む請求項３８記載の方法。
【請求項４３】
一次的乏突起膠細胞疾患を伴う多発性硬化症、自己免疫ブドウ膜炎、糖尿病、狼瘡、自己免疫心筋炎Ｉ、HCV仲介慢性肝炎、慢性胃炎、たとえば、Ａ型胃炎、混合性結合組織病（MCTD）、クローン病、または潰瘍性大腸炎から選択される炎症疾患の治療方法であって、該治療を必要とするヒト患者の所望の部位で、請求項２７記載のベクターを標的にすることによって、内因性CariまたはCariインヒビターの調節することを含む方法。
【請求項４４】
Cariの内因性遺伝子活性化のための請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
Cariインヒビターの内因性遺伝子活性化のための請求項４３記載の方法。
【請求項４６】
アポトーシスによる過剰の細胞死が起こる状況で、カスパーゼのダウンレギュレーションのための請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３記載のCariポリペプチド、そのムテイン、アイソフォーム、対立変異体、断片、融合タンパク質、またはそれらの誘導体の使用。
【請求項４７】
前記断片が、Cariの414〜437までのアミノ酸残基（配列番号：４）を含む請求項46記載の使用。
【請求項４８】
前記断片が、Cariの422〜437までのアミノ酸残基（配列番号：５）を含む請求項４６記載の使用。
【請求項４９】
アポトーシスによる過剰の細胞死が起こる状況で、カスパーゼのダウンレギュレーションのための請求項１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３記載のDNAの使用。
【請求項５０】
前記DNAが、配列番号：６および／または配列番号：７を含む請求項４９記載の使用。
【請求項５１】
アポトーシスによる過剰の細胞死が起こる状況で、カスパーゼのダウンレギュレーションのための請求項２４、２５、２６または２７記載のベクターの使用。
【請求項５２】
アポトーシスによる過剰の細胞死が起こる状況で、カスパーゼのダウンレギュレーションのための請求項２８記載の抗体の使用。
【請求項５３】
前記カスパーゼが、カスパーゼ−８である請求項４６、４７、４８、４９、５０、５１または５２記載の使用。
【請求項５４】
アポトーシスが、TNF受容体シグナル伝達経路により誘導される請求項４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４または５５記載の使用。
【請求項５５】
過剰の細胞死が要求される状況での、カスパーゼ活性のアップレギュレーションおよびアポトーシスの増大のための請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３記載のCariポリペプチド、もしくはそのムテイン、アイソフォーム、対立変異体、断片、融合タンパク質、またはそれらの誘導体の使用。
【請求項５６】
前記ムテインが、Cari D600Eである請求項５３記載の使用。
【請求項５７】
過剰の細胞死が要求される状況での、カスパーゼ活性のアップレギュレーションおよびアポトーシスの増大のための請求項１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３記載のDNAの使用。
【請求項５８】
過剰の細胞死が要求される状況でのカスパーゼ活性のアップレギュレーションおよびアポトーシスの増大のための請求項２４、２５、２６または２７記載のベクターの使用。
【請求項５９】
過剰の細胞死が要求される状況でのカスパーゼ活性のアップレギュレーションおよびアポトーシスの増大のための請求項２８記載の抗体の使用。
【請求項６０】
前記カスパーゼが、カスパーゼ−８である請求項５４、５５、５６、５７、５８または５９記載の使用。
【請求項６１】
治療的に有効量の請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３記載のCariポリペプチド、もしくはそのムテイン、アイソフォーム、対立変異体、断片、融合タンパク質、またはそれらの誘導体を含有する医薬組成物。
【請求項６２】
一次的乏突起膠細胞疾患を伴う多発性硬化症、自己免疫ブドウ膜炎、糖尿病、狼瘡、自己免疫心筋炎Ｉ、HCV仲介慢性肝炎、慢性胃炎、たとえば、Ａ型胃炎、混合性結合組織病（MCTD）、クローン病、または潰瘍性大腸炎から選択される炎症疾患の治療のための請求項６１記載の医薬組成物。
【請求項６３】
前記ムテインが、Cari D600E変異体である請求項６１または６２記載の医薬組成物。
【請求項６４】
前記断片が、Cariの414〜437までのアミノ酸残基（配列番号：４）を含む請求項６１または６２記載の医薬組成物。
【請求項６５】
前記断片が、Cariの422〜437までのアミノ酸残基（配列番号：５）を含む請求項６０または６１記載の医薬組成物。
【請求項６６】
治療的に有効量の請求項１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３記載のDNAを含有する医薬組成物。
【請求項６７】
一次的乏突起膠細胞疾患を伴う多発性硬化症、自己免疫ブドウ膜炎、糖尿病、狼瘡、自己免疫心筋炎Ｉ、HCV仲介慢性肝炎、慢性胃炎、たとえば、Ａ型胃炎、混合性結合組織病（MCTD）、クローン病、または潰瘍性大腸炎から選択される炎症疾患の治療のための請求項６６記載の医薬組成物。
【請求項６８】
治療的に有効量の請求項２４、２５、２６または２７記載のベクターを含有する医薬組成物。
【請求項６９】
一次的乏突起膠細胞疾患を伴う多発性硬化症、自己免疫ブドウ膜炎、糖尿病、狼瘡、自己免疫心筋炎Ｉ、HCV仲介慢性肝炎、慢性胃炎、たとえば、Ａ型胃炎、混合性結合組織病（MCTD）、クローン病、または潰瘍性大腸炎から選択される炎症疾患の治療のための請求項６８記載の医薬組成物。
【請求項７０】
治療的に有効量の請求項２８記載の抗体を含有する医薬組成物。
【請求項７１】
一次的乏突起膠細胞疾患を伴う多発性硬化症、自己免疫ブドウ膜炎、糖尿病、狼瘡、自己免疫心筋炎Ｉ、HCV仲介慢性肝炎、慢性胃炎、たとえば、Ａ型胃炎、混合性結合組織病（MCTD）、クローン病、または潰瘍性大腸炎から選択される炎症疾患の治療のための請求項７０記載の医薬組成物。
【請求項７２】
治療的に有効量の請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３記載のCariポリペプチド、もしくはそのムテイン、アイソフォーム、対立変異体、断片、融合タンパク質、またはそれらの誘導体を含有する癌の治療用医薬組成物。
【請求項７３】
前記ムテインが、Cari D600Eである請求項７２記載の医薬組成物。
【請求項７４】
治療的に有効量の請求項１４または１８記載のDNAを含有する癌治療用医薬組成物。
【請求項７５】
治療的に有効量の請求項２４または２６記載のベクターを含有する癌治療用医薬組成物。
【請求項７６】
治療的に有効量の請求項２８記載の抗体を含有する癌治療用医薬組成物。
【請求項７７】
Cariの活性が関与する疾患の治療または予防のための、治療的に有効量のCariインヒビターを含有する医薬組成物。
【請求項７８】
DNAライブラリーをスクリーニングするための請求項１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３記載のDNAの使用を含む、Cariと同じクラスのほかのポリペプチドを単離、同定およびクローニングする方法。
【請求項７９】
体液、細胞抽出物およびDNA発現ライブラリーから選択されるサンプルから、Cariと同じクラスのほかのポリペプチドを単離、同定およびクローニングする方法であって、カスパーゼ特異的抗体を使用して、カスパーゼと該ポリペプチドを共免疫沈降させることを含む方法。
【請求項８０】
Cariと同じクラスのほかのポリペプチドを単離、同定およびクローニングする方法であって、請求項２８記載の抗体を使用して、サンプル中のこのようなポリペプチドをアフィニティー精製することを含む方法。
【請求項８１】
前記サンプルが、体液、細胞抽出物およびDNA発現ライブラリーから選択される請求項８０記載の方法。
【請求項８２】
酵母２−ハイブリッド法で、獲物または餌として請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３記載のCariポリペプチド、もしくはそのムテイン、アイソフォーム、対立変異体、断片、融合タンパク質、またはそれらの誘導体を使用することを含む、細胞内シグナル伝達過程に関与したポリペプチドまたは因子を単離する方法。
【請求項８３】
前記ムテインが、Cari D600E変異体である請求項８２記載の方法。
【請求項８４】
前記断片が、Cariの414〜437までのアミノ酸残基（配列番号：４）を含む請求項８２記載の方法。
【請求項８５】
前記断片が、Cariの422〜437までのアミノ酸残基（配列番号：５）を含む請求項８２記載の方法。
【請求項８６】
請求項２８記載の抗体を使用して、Cariと細胞内シグナル伝達に関与するポリペプチドまたは因子を共免疫沈降させることを含む、細胞抽出物、ヒト体液および発現ライブラリーから選択されるサンプルから、細胞内のシグナル伝達過程に関与するポリペプチドまたは因子を単離する方法。
【請求項８７】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３記載のプロカスパーゼ−８、もしくはそのムテイン、アイソフォーム、対立変異体、断片、融合タンパク質、またはそれらの誘導体に対するCariの相互作用を阻害できるような分子のハイスループットスクリーニングおよび選択を含む、Cariに対するペプチドまたは小型分子のアンタゴニストをスクリーニングする方法。
【請求項８８】
前記ムテインが、Cari D600Eである請求項８７記載の方法。
【請求項８９】
前記断片が、Cariの414〜437までのアミノ酸残基（配列番号：４）を含む請求項８７記載の方法。
【請求項９０】
前記断片が、Cariの422〜437までのアミノ酸残基（配列番号：５）を含む請求項８７記載の方法。
【請求項９１】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３記載のCari、もしくはそのムテイン、アイソフォーム、対立変異体、断片、融合タンパク質、またはそれらの誘導体により増強されるアポトーシスを阻害できるような分子のハイスループットスクリーニングおよび選択を含む、Cariに対するペプチドまたは小型分子のアンタゴニストをスクリーニングする方法。
【請求項９２】
前記ムテインが、Cari D600Eである請求項９１記載の方法。
【請求項９３】
一次的乏突起膠細胞疾患を伴う多発性硬化症、自己免疫ブドウ膜炎、糖尿病、狼瘡、自己免疫心筋炎Ｉ、HCV仲介慢性肝炎、慢性胃炎、たとえば、Ａ型胃炎、混合性結合組織病（MCTD）、クローン病、潰瘍性大腸炎および癌から選択される疾患の治療および／または予防方法であって、医薬的に有効量の請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３記載のCariポリペプチド、もしくはそのムテイン、アイソフォーム、対立変異体、断片、融合タンパク質、またはそれらの誘導体を、該治療を必要とする患者に投与すること含む方法。
【請求項９４】
前記ムテインが、Cari D600E変異体である請求項９３記載の方法。
【請求項９５】
前記断片が、Cariの414〜437までのアミノ酸残基（配列番号：４）を含む請求項９３記載の方法。
【請求項９６】
前記断片が、Cariの422〜437までのアミノ酸残基（配列番号：５）を含む請求項９３記載の方法。
【請求項９７】
一次的乏突起膠細胞疾患を伴う多発性硬化症、自己免疫ブドウ膜炎、糖尿病、狼瘡、自己免疫心筋炎Ｉ、HCV仲介慢性肝炎、慢性胃炎、たとえば、Ａ型胃炎、混合性結合組織病（MCTD）、クローン病、潰瘍性大腸炎および癌から選択される疾患の治療および／または予防方法であって、医薬的に有効量の請求項１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２３記載のDNAを、該治療を必要とする患者に投与することを特徴とする方法。
【請求項９８】
一次的乏突起膠細胞疾患を伴う多発性硬化症、自己免疫ブドウ膜炎、糖尿病、狼瘡、自己免疫心筋炎Ｉ、HCV仲介慢性肝炎、慢性胃炎、たとえば、Ａ型胃炎、混合性結合組織病（MCTD）、クローン病、潰瘍性大腸炎および癌から選択される疾患の治療および／または予防方法であって、医薬的に有効量の請求項２４、２５、２６または２７記載のベクターを、該治療を必要とする患者に投与することを含む方法。
【請求項９９】
一次的乏突起膠細胞疾患を伴う多発性硬化症、自己免疫ブドウ膜炎、糖尿病、狼瘡、自己免疫心筋炎Ｉ、HCV仲介慢性肝炎、慢性胃炎、たとえば、Ａ型胃炎、混合性結合組織病（MCTD）、クローン病、潰瘍性大腸炎および癌から選択される疾患の治療および／または予防方法であって、医薬的に有効量の請求項28記載の抗体を、該治療を必要とする患者に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カスパーゼ−８相互作用ポリペプチド（Cari）、その製造方法、およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍壊死因子（TNF−アルファ）およびリンホトキシン（TNF−ベータ）は、主に単核白血球により形成される多機能性前炎症性サイトカインであり、細胞に多くの効果を示す（Wallach,D.（1986年）：「インターフェロン ７」（Ion Gresser編）83−122頁、アカデミック・プレス、ロンドン（Academic Press,London）で；およびBeutlerおよびCerami（1987年））。TNF−アルファおよびTNF−ベータはいずれも、特異的な細胞表面の受容体に結合することによって、それらの効果を開始させる。その効果のいくつかは、生物に有益である可能性がある：それらは、たとえば、腫瘍細胞またはウイルス感染細胞を破壊し、顆粒球の抗細菌活性を増大し得る。この方法で、TNFは、腫瘍および感染性因子に対する生物の防御に寄与し、かつ外傷からの回復に寄与する。したがって、TNFは、その使用で、腫瘍細胞の表面のその受容体に結合することによって腫瘍細胞の死に至る事象を開始させる、抗腫瘍剤として使用され得る。TNFは、抗感染薬剤としても使用され得る。
【０００３】
しかし、TNF−アルファは、有害効果を示す。TNF−アルファの過剰生成が、数種の疾患において主要な病原性の役割を果たす可能性があるという証拠がある。たとえば、第一に血管でのTNF−アルファの効果は、敗血症性ショックの兆候の主な原因であることが知られている（Traceyら、1994年）。ある種の疾患では、TNFは、含脂肪細胞の活性を抑制することにより、および食欲不振を引起こすことにより、過剰な体重の減少（悪液質）を引起こす可能性があるので、TNF−アルファは、カケクチンと呼ばれた。それは、リウマチ性疾患における組織に対する損傷のメディエーター（BeutlerおよびCerami、1987年）、および移植片対宿主反応で観察される損傷の主要なメディエーター（Grau GEら、1989年）とも評された。さらに、TNFは、炎症の過程に、および多くの他の疾患に関与することが知られている。
【０００４】
２つの固有で、独立に発現した受容体である、TNF−アルファとTNF−ベータのいずれとも特異的に結合するp55（CD120a）およびp75（CD120b）TNF−受容体は、TNFの前記生物学的効果を開始および／または仲介する。これらの２つの受容体は、構造的に類似しない細胞内ドメインを有することから、それらは異なってシグナルを出すことが示唆された（Hohmannら、1989年；Engelmannら、1990年；Brockhausら、1990年；Loetscherら、1990年；Schallら、1990年；Nopharら、1990年；Smithら、1990年を参照）。しかし、CD120aおよびCD120bの細胞内シグナル伝達に関与する、細胞の機構、たとえば、種々のタンパク質および可能性のある他の因子は、まだ解明されていない。それは、TNFに対する細胞の最終的に観察される反応となる反応のカスケードの開始の原因である受容体にリガンド、すなわちTNF（アルファまたはベータ）が結合したのちに通常に起こる細胞内のシグナル伝達である。
【０００５】
TNFの前記細胞破壊性効果を考慮すると、これまで研究されたほとんどの細胞で、この効果は、おもにCD120aによって誘発される。CD120aの細胞外ドメインに対する抗体（リガンド結合ドメイン）は、それら自身、抗体による受容体架橋の効率と相互に関連する細胞破壊効果（欧州特許第412486号を参照）を誘発し、細胞内のシグナル伝達過程の発生での第一段階であると思われる。さらに、突然変異の研究（Brakebuschら、1992年；Tartagliaら、1993年）は、CD120aの生物学的機能が、その細胞内ドメインの完全性に依存することを示し、したがって、TNFの細胞破壊効果に至る細胞内のシグナル伝達の開始が、CD120aの２つまたはそれ以上の細胞内ドメインの結合の結果として起こることを示唆した。さらに、TNF（アルファおよびベータ）は、ホモ三量体として生じ、そしてそれ自体、受容体分子に結合および架橋する、すなわち、受容体凝集を引起こす方法で、CD120aを介して細胞内シグナル伝達を誘導することが示唆された（Engelmann H.ら、1990年）。
【０００６】
受容体のTNF／NGFスーパーファミリーのほかのメンバーは、FAS／AP01受容体（CD95）である。CD95は、アポトーシスの形態で細胞死を仲介し（Itohら、1991年）、自己反応性Ｔ細胞の陰性セレクターとして役割を果たすように見え、すなわち、Ｔ細胞の突然変異の間、CD95は、自己抗原を認識するＴ細胞のアポトーシス死を仲介する。CD95遺伝子（lpr）における突然変異は、ヒト自己免疫疾患、全身性紅斑性狼瘡（SLB）に類似するマウスでのリンパ球増殖疾患を引起こすことも分かった（Watanabe-Fukunagaら、1992年）。CD95のリガンドは、中でも、キラーＴ細胞（または細胞傷害性Tリンパ球−CTL）により担持した細胞表面に結合した分子であるので、このようなCTLがCD95を担持する細胞と接触した際、それらは、CD95担持細胞のアポトーシス性の細胞死を誘導する能力がある。さらに、CD95に特異的であるモノクローナル抗体が調製され、これらのモノクローナル抗体は、ヒトCD95をコードするcDNAにより形質転換されたマウス細胞を含めCD95を担持する細胞におけるアポトーシス性の細胞死を誘導する能力があった（たとえば、Itohら、1991年）。
【０００７】
様々な受容体からなるTNF受容体およびFasシグナル伝達機構、それらの調節、および同定された下流のシグナル伝達分子は、Wallachら（1999年）により詳細に検討される。
【０００８】
特定の悪性細胞およびHIV感染細胞がそれらの表面にCD95を担持し、CD95に対する抗体またはCD95リガンドは、これらの細胞でのCD95仲介細胞傷害性効果を誘発するために使用できるので、このような悪性細胞またはHIV感染細胞と戦うための手段を提供し得ることが見出された（Itohら、1991年を参照）。したがって、CD95の細胞傷害性活性を増強するさらにほかの方法を見出すことも、治療上の潜在性を有し得る。
【０００９】
TNF（アルファまたはベータ）およびCD95リガンドに対する細胞反応を調整する方法を提供する必要性が長年感じられてきた。たとえば、TNFまたはCD95リガンドが過剰発現される前記病理学的状況では、TNF−またはCD95リガンド誘導細胞破壊効果を阻害することが望ましい一方で、他の状況（たとえば、外傷適用）では、TNF効果を増強することが望ましく、またはCD95の場合には、腫瘍細胞またはHIV感染細胞で、CD95仲介効果を増強することが望ましい。
【００１０】
多数のアプローチは、TNFの破壊的効果を調節するために、抗TNF抗体を使用して、TNFのその受容体への結合を阻害することによるか、または可溶性TNF受容体（該受容体の本質的に可溶性の細胞外ドメインである）を使用して、細胞表面結合TNF−受容体（TNF-R）へのTNFの結合を拮抗させることによって、出願人ら（たとえば、欧州特許明細書番号  欧州特許第186,833号、欧州特許第308,378号、欧州特許第398,327号および欧州特許第412,486号を参照）によってなされた。さらに、その受容体へのTNF結合がTNF誘導細胞効果に必要とされることに基づいて、出願人ら（たとえば、欧州特許第568,925号参照）によるアプローチは、TNF-Rの活性を調整することにより、TNF効果を調整するためになされた。
【００１１】
欧州特許第568,925号は、TNF-Rでのシグナルトランスダクションおよび／または切断を調整する方法に関し、それによると、ペプチドまたは他の分子は、受容体自身と、または受容体と相互作用するエフェクタータンパク質とのいずれかと相互作用する可能性があるので、TNF-Rの正常な機能を調整している。欧州特許第568,925号では、その細胞外、膜貫通および細胞内ドメインに変異を有する様々な突然変異形態のCD120aの構築および特徴付けが記載されている。この方法により、CD120aの前記ドメイン内の領域は、受容体の機能、すなわち、リガンド（TNF）の結合、およびそののちのシグナルトランスダクション、ならびに最終的に細胞上で観察されるTNF効果を生じる細胞内シグナル伝達に必須であると識別された。さらに、CD120aの前記ドメインにある種々の領域に結合できるタンパク質、ペプチドまたは他の因子を単離および同定する多数のアプローチの記載があり、該タンパク質、ペプチドおよび他の因子は、TNF-Rの活性の調節または調整に関与し得るものであることが記載されている。このようなタンパク質およびペプチドをコードするDNA配列を単離およびクローニングするため；これらのタンパク質およびペプチドの産生のための発現ベクターを構築するため；ならびにCD120aと、またはCD120aの種々の領域と結合する前記タンパク質およびペプチドと相互作用する抗体またはその断片の調製のための多数のアプローチも、EPO368,925号に規定されるとおりである。しかし、欧州特許第568,925号は、TNF-Rの細胞内ドメインに結合する実際のタンパク質およびペプチドを特定していない。同様に、欧州特許第568,925号では、CD95の細胞内ドメインを結合する能力のある特定のタンパク質またはペプチドを全く開示していない。
【００１２】
したがって、TNFの、またはCD95リガンドの効果を阻害することが望まれる場合、細胞表面でのTNF-RまたはCD95の量または活性を減少することが望ましい。一方、TNF-RまたはCD95の量または活性の増加は、増強TNFまたはCD95リガンド効果が求められるときに望まれる。この目的のために、CD120aおよびCD120bはいずれのプロモーターを配列決定、および解析し、多数の重要な配列モチーフについて、種々の転写調節因子に特異的であり、これらTNF-Rの発現がそのプロモーターレベルで制御される、すなわち、受容体の数の減少に対してプロモーターからの転写の阻害、および受容体の数の増大に対してプロモーターからの転写の増強を制御され得ることが見出された（欧州特許第606,869号および国際公開第9531206号パンフレット）。
【００１３】
腫瘍壊死因子（TNF）受容体、および構造的に関連の受容体CD95は、白血球が産生するリガンドによる刺激により、細胞で誘発することが知られている。一方、それら自身の消滅に至る破壊的活動、この誘発の機構は、まだあまり理解されていない。突然変異の研究は、CD95およびCD120aでは、細胞傷害性のシグナル伝達が、それらの細胞内ドメイン内の固有の領域に関与することを示す（Brakebuschら、1992年；Tartagliaら、1993年、ItohおよびNagata、1993年）。これらの領域（「デスドメイン」）は、配列類似性を示す。CD95およびCD120aのいずれの「デスドメイン」は、自己結合する傾向にある。それらの自己結合は、シグナル伝達の阻害に必須である受容体凝集を明らかに促進し（Bigdaら、1994年；Boldinら、1995年）、高レベルの受容体発現は、リガンド依存性シグナル伝達の誘発を生じ得る（Boldinら、1995年）。
【００１４】
リンパ球の細胞傷害性効果のいくつかは、標的細胞でのCD95とリンパ球産生リガンドとの相互作用により仲介される（NagataおよびGoldstein、1995年も参照）。単核食細胞による細胞死滅は、TNFおよびその受容体CD120aに関与する（Vandenabeeleら、1995年も参照）。他の受容体誘導効果のように、TNF受容体およびCD95による細胞死誘導は、一連のタンパク質−タンパク質相互作用を介して起こり、リガンド−受容体結合から酵素的エフェクター機能の最終的な活性化に至り、そしてそれは、細胞死のためのシグナル伝達を開始する非酵素的タンパク質−タンパク質相互作用：受容体への三量体TNFまたはCD95リガンド分子の結合、自己結合に対するデスドメインモチーフの傾向（Boldinら、1995年a）により増大されたそれらの細胞内ドメインの生じた相互作用（Brakebuschら、1992年；Taitagliaら、1993年；ItohおよびNagata、1993年）、および受容体の細胞内ドメインへの２つの細胞質タンパク質（互いに結合もし得る）、-CD95へのMORT-1（またはFADD）（Boldinら、1995年b；Chinnaiyanら、1995年；Kischkelら、1995年）、およびCD120aへのTRADD（Hsuら、1996年）−の誘導された結合を包含することが示された。CD95およびCD120aへのそれらの結合は別として、MORT-1およびTRADDも、CD95とCD120aの間の機能性「クロストーク」を供するRIP（Stangerら、1995年）のようなタンパク質を含む他のデスドメインと同様に、互いに結合する能力がある。これらの結合は、保存配列モチーフ、受容体およびその付随タンパク質（associated protein）に共通の「デスドメインモジュール」を通して起こる。さらに、酵母２−ハイブリッド試験で、MORT-1は、CD95に同時に結合することが示されたが、哺乳類細胞では、この結合は、受容体の刺激後のみに起こるので、MORT-1はCD95シグナル伝達の開始事象に加わっていることが示唆される。MORT-1は、酵素的活性のあらゆる配列モチーフ特徴を含まないので、細胞死を誘発するその能力は、MORT-1自身の固有の活性を含まず、むしろ、MORT-1に結合し、シグナル伝達カスケードでさらに下流に作用するある種の他のタンパク質の活性化を含むように見える。分子のＮ末端部分を欠くMORT-1変異体の細胞の発現により、CD95またはCD120aによる細胞傷害性誘導を遮断することが示されたことから（Hsuら、1996年；Chinnaiyanら、1996年）、このＮ末端領域は、タンパク質−タンパク質相互作用を通して両方の受容体の細胞死滅効果のためのシグナル伝達を伝達することが示された。
【００１５】
最近の研究は、種々の生理学的細胞死プロセスの開始における、カエノルハブジチス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）プロテアーゼCED3に、そして哺乳類のインターロイキン−１ベータ−変換酵素（ICE）に構造的に関連する細胞質のチオールプロテアーゼの群に関係している（Kumar、1995年およびHenkart、1996年による論評）。このファミリーのプロテアーゼが、CD95およびTNF-Rにより誘導される細胞−細胞傷害性に役割を果たす証拠もある。プロテアーゼおよびそれらの機能を遮断する２つのウイルスにコードされたタンパク質の特異的なペプチド阻害剤である牛痘タンパク質crmAおよびバキュロウイルスp35タンパク質は、この細胞−細胞傷害性に対する細胞への保護を供することが分かった（Enariら、1995年；Tewariら、1995年；Xueら、1995年；Beidlerら、1995年）。CED3／ICE（カスパーゼ）ファミリーのプロテアーゼにより明らかに仲介される特定の特異的細胞性タンパク質の迅速な切断は、CD95またはTNF-Rの刺激の直後の細胞で証明されている。
【００１６】
１つのこのようなプロテアーゼおよびその種々のアイソフォーム（阻害性のものを含む）は、MORT-1結合タンパク質であるMACH（現在のカスパーゼ−８）として知られ、単離され、クローンニングされ、特徴付けられ、その潜在的な使用も、共に所有するPCT／US96／10521号、および本発明者らの出版物（Boldinら、1996年）における言及により、詳細に記載され、かつ完全にここに包含されるように、述べられている。Mch4（カスパーゼ−10とも呼ばれる）で表わされるほかのこのようなプロテアーゼおよびその種々のアイソフォーム（阻害性のものを含む）も、本発明者（未公表）および他者（Fernandes-Alnemriら、1996年；Srinivasulaら、1996年）により単離および特徴付けられた。カスパーゼ−10も、MORT-1結合タンパク質である。したがって、カスパーゼ−10の全ての局面、特性、特徴および使用に関する詳細は、前記出版物で述べられ、そしてその全ては、言及により完全にここに包含される。
【００１７】
類似のプロドメインを有するカスパーゼ、カスパーゼ−８およびカスパーゼ−10（Boldinら、1996年；Muzioら、1996年；Fernandes-Alnemriら、1996年；VincentおよびDixit、1997年を参照）が、MORT-1と、そのプロドメインを通して相互作用すること、そしてこの相互作用は、MORT-1のＮ末端部分に存在し、かつカスパーゼ−８およびカスパーゼ−10に重複して存在する「デスエフェクタードメイン」（すなわちDED）を介していることも注意すべきである（Boldinら、1995年b；Chinnalyanら、1996年参照）。
【００１８】
カスパーゼ（システイン・アスパラギン酸特異的プロテイナーゼ）は、数種の共通特性を共有するシステインプロテアーゼの成長ファリミーである。カスパーゼのほとんどは、プログラムされた細胞死あるいはアポトーシスの開始および執行に関与することが見出され、一方では、前炎症性サイトカインの産生に関与するようにも思えることが分かった（Nicholson DWら、1997年、Salvesen GSら、1997年、Cohen GM、1997年）。それらは、触媒的にほとんど不活性な前駆体として合成され、ドメイン間リンカーに存在する特異的な内部アスパラギン酸残基のうしろを切断することにより一般に活性化される。カスパーゼの切断部位は、テトラペプチド配列（X-X-X-D）により定義され、該切断は、アスパラギン酸の下流で常に起こる。結果として、特定の成熟した活性カスパーゼは、他の不活性前駆体と同様に、それら自身を処理し、活性化し得る（Fernandes-Alnemri Tら、1996年、Srinivasula SMら、1996年）。
【００１９】
プログラムされた細胞死過程の活性化は一般に特異的であり、「イニシエーター」カスパーゼと称される上流カスパーゼによる「エクセキューショナー（executioner）」カスパーゼと称される下流カスパーゼの一連のプロセシングを含む。２つのクラスのカスパーゼの機能的特徴は、それらの構造によっても反映される。実際に、「イニシエーターカスパーゼ」は、「エクセキューショナー」カスパーゼに比較して、より長いプロドメイン領域を含む（Salvesen GSら、1997年、Cohen GM 1997年）。長いプロドメインは、イニシエーターまたは「アピカル（apical）」カスパーゼを、TNF受容体ファミリーの死滅受容体の誘発により活性化させる。死滅受容体のリガンド誘導三量体化（trimerization）により、イニシエーターカスパーゼは、それらの長いＮ末端プロドメインを通して強化され、特異的アダプター分子と相互作用して、死滅誘導シグナル伝達複合体を形成する（Cohen GM 1997年、Kischkel FCら、1995年）。たとえば、カスパーゼ−８／MACHおよびおそらくカスパーゼ−10（２つのDEDを含む）は、アダプター分子FADD／MORT-1により強化され受容体複合体となるのに対して、カスパーゼ−２は、CRADD／RAIDDおよびRIPにより強化されると想定される（Nagata Sら、1997年、MacFarlane Mら、1997年、Ahmad Mら、1997年、Duan Hら、1997年）。活性化受容体複合体の三量体特性により、少なくとも２つのカスパーゼ分子は、互いにきわめて接近するようになるので、自己触媒プロセシングによりその活性化に至ると思われる（Yangら、1998年、Muzioら、1998年）。
【００２０】
カスパーゼは、３つの主要サブユニット、すなわちＮ末端プロドメインおよび２つのサブユニット（それらは、リンカーペプチドによりしばしば分離される）から構成されるプロ酵素として合成される。２つのサブユニットは、活性酵素部位の主要部分を含む「長鎖」またはサブユニット１（Sub-1）、および「短鎖」またはサブユニット２（Sub-2）と称されている。酵素の充分な活性化については、それをプロセシングして、プロドメインと２つのサブドメインを形成する。２つのサブユニットは、異種二量体を形成する。カスパーゼ−３の推定の三次元構造により、長鎖ドメインのＣ末端および短鎖サブドメインのＮ末端は自由である必要があり、そして短鎖サブユニットのＣ末端は、正しく折畳まれ、活性な酵素を生じるために、長鎖サブユニットのＮ末端ときわめて接近する必要があるように思われる（Rotondaら、1996年、Mittlら、1997年、Srinivasulaら、1998年）。
【００２１】
アポトーシスまたは壊死に至る経路は、完全に区別されるものと常に考えられてきたが、最近の発見により、アポトーシスの主要なメディエーターを表すカスパーゼは、負および正のいずれの手段でも、壊死にも関与できることが示唆されている。実際に、L929細胞でのカスパーゼ阻害剤CrmAの過剰発現は、1000の因子により、TNFの壊死活性についてのこれらの細胞の感受性を増大させることが示されたことから（Vercammenら、1998年）、TNF誘導壊死活性におけるカスパーゼの阻害役割が示された。さらに、これらのリガンドによるアポトーシス誘導に重要な役割を果たすTNFR1−およびFas関連デスドメイン（Wallachら、1999年による論評）は、壊死誘導に重要な役割を果たすことも最近示唆された（Booneら、2000年）。興味深いことに、FasL−誘導肝臓壊死は、カスパーゼ阻害剤により遮断されることが示された（Kunstleら、1997年）。
【００２２】
カスパーゼ仲介タンパク質分解は、アポトーシス過程の重要で中心的な要素であるので［Nicholson D. W.およびThornberry, N. A.（1997年）、Villaら（1997年）およびSalvesen, G. S.およびDixit, V. M.（1997年）］、これらのプロテアーゼの重要な下流の分子標的の同定は、アポトーシスシグナルトランスダクションを理解するために必要である。種々の構造およびシグナルタンパク質は、アポトーシス死の間にカスパーゼにより切断されることが示されており［Nicholson D. W. およびThornberry, N. A.（1997年）、Villa, P.ら（1997年）］、たとえば、そのようなタンパク質には、アポトーシスの執行にとってでなく、ヌクレオソーム間のDNA分解（internucleosomal DNA degradation）に必須であるICAD、すなわちカスパーゼ活性化DNAseの阻害剤が含まれる（Enari, M.ら（1998年）およびSakahiraら（1998年））。細胞質アクチンゲルゾル形質転換（gelsol transformation）を調整するアクチン調節タンパク質であるゲルゾリン（Yin, H. L.およびStossel, T. P.（1979年））は、（i）インビボでのアポトーシス中のその切断［Kothakota, S.ら（1997年）］、（ii）その過剰発現によるアポトーシスの防止［Ohtsu, M.ら（1997年）］および（iii）切断産物の１つによるアポトーシスの誘導［Kothakota, S.ら（1997年）］をもとに、アポトーシスに関係する。ゲルゾリンは、Ca＋2活性化多活性を示し、アクチンフィラメントに作用し、フィラメントの成長の早い端をキャップし、アクチン重合を凝集させたりもする［Yin, H. L.およびStossel, T. P.（1980年）、Kurth, M.およびBryan, J.（1984年）、Janmey, P. A.およびStossel, T. P.（1987年）］。
【００２３】
出願、国際公開第00/39160号パンフレットには、カスパーゼ−８のSub-1および／またはSub-2と相互作用する能力のあるカスパーゼ−８相互作用タンパク質が開示されている。該カスパーゼ相互作用タンパク質は、カスパーゼ−８の単鎖構造を使用する２−ハイブリッドスクリーニングにより見出された。
【００２４】
出願、国際公開第98/30582号パンフレット（Jacobsら）には、ヒト成人脳cDNAライブラリーから単離された、分泌または膜タンパク質DF518_3のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列が開示されている。タンパク質は、分泌タンパク質をコードするcDNAに選択的な方法を使用することによって同定され（米国特許第5,536,637号明細書）、またコードされたタンパク質のアミノ酸配列のコンピュータ解析により、分泌または膜貫通タンパク質をコードすることも確認された。本発明のタンパク質は、その配置（細胞内に対して膜／分泌されたもの）およびそのアミノ酸配列（残基230Eでの１つの非保存的アミノ酸変化を有するのに対して、残基230G）の点で、DF5182_3と異なる。国際公開公報の出願では、なんらデータによって支持されない膨大な関連のない活性が、DF518_3に起因するとされている。
【発明の開示】
【００２５】
本発明は、プロカスパーゼ、またはそのムテインもしくは断片と相互作用することができ、配列番号：３のアミノ酸配列を含む細胞内ポリペプチド（Cari）、もしくはそのアイソフォーム、DF5182_3以外のムテイン、対立変異体、断片、融合タンパク質、またはそれらの誘導体に関する。ある実施態様では、本発明のポリペプチドは、カスパーゼ、好ましくはカスパーゼ−８により、インビトロおよびインビボで切断可能である。
【００２６】
さらに、本発明は、内因性Cariポリペプチドにドミナントネガティブ効果（dominant-negative effect）を有するCariポリペプチドムテイン、およびカスパーゼ、より好ましくはカスパーゼ−８の細胞傷害性効果を阻害または増大することができるムテインを提供する。
【００２７】
ある実施態様では、本発明は、Cariポリペプチドでのアミノ酸残基D600がグルタミン酸残基で置換された、切断不可能なCari変異体（Cari D600E）ポリペプチドを提供する。このポリペプチドは、カスパーゼ−８の細胞傷害効果を増大することができる。他の実施態様では、本発明は、配列番号：４および配列番号：５にあるアミノ酸配列を含むものなどの、カスパーゼ−８への結合を担うCari由来ペプチドを提供する。
【００２８】
さらに、本発明は、Cariポリペプチド、もしくはそのアイソフォーム、対立変異体、断片、ムテイン（たとえば、Cari D600E）、融合タンパク質、またはそれらの誘導体をコードするDNA配列、Cariポリペプチド、もしくはそのアイソフォーム、対立変異体、断片、ムテイン、融合タンパク質、またはそれらの誘導体をコードするDNA配列に対して、または配列番号：２に対応するDNA配列に対して中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるDNA配列を提供する。
【００２９】
よりとくに、本発明は、配列番号：３のポリペプチドをコードするDNA配列を提供する。本発明は、切断不可能なCari変異体（たとえば、Cari D600E）のDNA、およびペプチド（たとえば、配列番号：４、配列番号：５）をコードするDNAをも提供する。さらに、本発明は、リボザイム、および前記DNA配列に対応する少なくとも９個のヌクレオチドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチド、好ましくは配列番号：６および配列番号：７のアンチセンスオリゴヌクレオチドをも提供する。
【００３０】
本発明はまた、Cariポリペプチド、もしくはそのアイソフォーム、対立変異体、断片、ムテイン、融合タンパク質、またはそれらの誘導体をコードするDNA配列を含むベクター、および原核生物または真核生物の宿主細胞（好ましくは哺乳類、昆虫または酵母細胞、より好ましくは、HeLa、293 T HEKおよびCHO細胞から選択される細胞）に前記ベクターを導入し、該細胞を育成し、産生されたタンパク質を単離することによって、Cariポリペプチド、もしくはそのアイソフォーム、対立変異体、断片、ムテイン、融合タンパク質、またはそれらの誘導体を生成する方法をも提供する。
【００３１】
さらに、本発明は、Cariポリペプチド、もしくはそのアイソフォーム、対立変異体、断片、ムテイン、融合タンパク質、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはそれらの誘導体をコードするウイルス性ベクター、および哺乳類細胞に、Cariポリペプチド、アイソフォーム、対立変異体、断片、ムテイン、融合タンパク質を導入するための該ベクターの使用を提供する。
【００３２】
さらに、本発明は、内因性CariまたはCari発現のインヒビターの活性化のための、細胞内の機能上の調節配列を標的にするのに適したベクターを提供する。
【００３３】
他の局面では、本発明は、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、キメラ抗体、充分にヒト化された抗体、抗−抗−Id抗体、またはその断片（それらは、Cariポリペプチド、もしくはそのアイソフォーム、対立異性体、断片、ムテイン、融合タンパク質、またはそれらの誘導体のエピトープで指向されている）、および診断目的、または生物学的流動物（biological fluid）中のCariポリペプチド、もしくはそのアイソフォーム、対立異性体、断片、ムテイン、融合タンパク質、またはそれらの誘導体を検出するための免疫アッセイにおける開発のためのその使用を提供する。
【００３４】
さらに、本発明は、Cariをコードするベクターを含む、原核生物または真核生物の細胞（好ましくはHeLa、293 T HEKおよびCHO細胞）から選択される宿主細胞、およびCari、もしくはそのアイソフォーム、ムテイン、対立異性体、断片、融合タンパク質、またはそれらの誘導体を生成する方法を提供する。また、本発明は、トランスジェニック動物の作製、および該動物の体液からの産生されたタンパク質の単離を含む、Cari、もしくはそのアイソフォーム、ムテイン、対立異性体、断片、融合タンパク質、またはそれらの誘導体を生成する方法を提供する。
【００３５】
ある局面では、本発明は、一次的乏突起膠細胞疾患（primary oligodendrogliopathy）を伴う多発性硬化症、自己免疫ブドウ膜炎（autoimmune uveoretinitis）、糖尿病、狼瘡、自己免疫心筋炎Ｉ、HCV仲介慢性肝炎、慢性胃炎、たとえば、Ａ型胃炎、混合性結合組織病（mixed connective tissue disease）（MCTD）、クローン病、または潰瘍性大腸炎から選択される炎症疾患の治療のための遺伝子治療方法であって、該治療を必要とするヒト患者の所望の部位で、Cariまたはムテイン（たとえば、Cari D600E）、断片（たとえば、配列番号：４、配列番号：５）、アンチセンス（好ましくは、配列番号：６および／または配列番号：７）、およびCariのリボザイムの発現を誘導させることを含む方法を提供する。
【００３６】
さらに、本発明は、一次的乏突起膠細胞疾患を伴う多発性硬化症、自己免疫ブドウ膜炎、糖尿病、狼瘡、自己免疫心筋炎Ｉ、HCV仲介慢性肝炎、慢性胃炎、たとえば、Ａ型胃炎、混合性結合組織病（MCTD）、クローン病、または潰瘍性大腸炎から選択される炎症疾患の治療方法であって、該治療を必要とするヒト患者の所望の部位で、Cariまたは内因性Cariインヒビターの内因性遺伝子活性化を可能にするために、細胞内の機能上のDNA調節配列を含むベクターを標的にすることによって、内因性CariまたはCariインヒビターの調節することを含む方法を提供する。
【００３７】
さらに、本発明は、アポトーシスによる過剰の細胞死が起こる状況（たとえば、TNF受容体シグナル伝達経路の誘導による過剰な細胞死）で、カスパーゼのダウンレギュレーションのための、Cariポリペプチド、そのムテイン、アイソフォーム、対立変異体、断片（たとえば、配列番号：４、配列番号：５）、融合タンパク質、またはその誘導体、アンチセンス（たとえば、配列番号：６および／または配列番号：７）、Cariおよびその断片をコードするベクター、ならびにCariに対する抗体の使用を提供する。
【００３８】
本発明は、さらに、過剰の細胞死が要求される状況でのカスパーゼ活性のアップレギュレーションおよびアポトーシスの増大のための、Cariポリペプチド、もしくはそのムテイン（たとえば、Cari 600E）、アイソフォーム、対立変異体、または断片、融合タンパク質、またはそれらの誘導体；Cariおよびその断片をコードするベクター；Cari、または断片およびムテインをコードするDNA；Cari、または断片もしくはムテインをコードするDNAを含むベクター；内因性Cari活性化のためのベクター；およびCariの抗イディオタイプ抗体の使用を提供する。
【００３９】
他の局面では、本発明は、一次的乏突起膠細胞疾患を伴う多発性硬化症、自己免疫ブドウ膜炎、糖尿病、狼瘡、自己免疫心筋炎Ｉ、HCV仲介慢性肝炎、慢性胃炎、たとえば、Ａ型胃炎、混合性結合組織病（MCTD）、クローン病、または潰瘍性大腸炎から選択される炎症疾患の治療のための、治療的に有効量のCariポリペプチド、もしくはそのムテイン（たとえば、Cari D600E）、アイソフォーム、対立変異体、断片（たとえば、配列番号：４、配列番号：５）融合タンパク質、またはそれらの誘導体；Cariまたはムテインもしくは断片をコードするDNA；Cariまたはそのインヒビターの内因性活性化のためのベクター；アンチセンス；リボザイム；またはCariに特異的な抗体を含有する医薬組成物を提供する。
【００４０】
さらに、本発明は、癌の治療のための、治療的に有効量のCariポリペプチド、もしくはそのムテイン（たとえば、Cari D600E）、アイソフォーム、対立変異体、断片、融合タンパク質、またはそれらの誘導体；Cari、またはムテインもしくは断片をコードするDNAまたはベクター；Cariの内因性活性化のためのベクター；またはCariに特異的な抗イディオタイプ抗体を含有する医薬組成物を提供する。
【００４１】
他の実施態様では、本発明は、Cariの活性が関与する疾患の治療または予防のための、治療的に有効量のCariインヒビターを含有する医薬組成物を提供する。
【００４２】
本発明は、さらに、DNAライブラリーをスクリーニングするためのCari、またはそのムテインもしくは断片をコードするDNAの使用；あるいはカスパーゼおよび結合ポリペプチドの共免疫沈降に適したカスパーゼ特異的抗体の使用；あるいは体液、細胞抽出物およびDNA発現ライブラリーから選択されるサンプルからの、Cari特異的抗体でのこのようなポリペプチドのアフィニティー精製；あるいは獲物（prey）または餌（bait）として、Cariポリペプチド、もしくはそのムテイン、アイソフォーム、対立変異体、断片、融合タンパク質、またはそれらの誘導体の使用する酵母２−ハイブリッド手法を含む、Cariと同じクラスの他のポリペプチドを単離、同定およびクローニングするための方法を提供する。
【００４３】
本発明は、また、Cariを認識する抗体を使用して、Cariと細胞内のシグナル伝達に関与するポリペプチドまたは因子を共免疫沈降させることを含む、細胞抽出物、ヒト体液および発現ライブラリーから選択されるサンプルから、細胞内のシグナル伝達過程に関与するポリペプチドまたは因子を単離する方法にも関する。
【００４４】
さらに、本発明は、プロカスパーゼ−８、もしくはそのムテイン（たとえば、Cari D600E）、アイソフォーム、対立変異体、断片（たとえば、配列番号：４または配列番号：５）、融合タンパク質、またはそれらの誘導体に対するCariの相互作用を阻害できるような分子のハイスループットスクリーニングおよび選択；あるいはCari、またはそのムテイン、アイソフォーム、対立変異体、断片、融合タンパク質もしく誘導体により増強されるアポトーシスを阻害できる分子の選択を含む、Cariに対するペプチドまたは小型分子のアンタゴニストをスクリーニングする方法を提供する。
【００４５】
さらに、本発明は、一次的乏突起膠細胞疾患を伴う多発性硬化症、自己免疫ブドウ膜炎、糖尿病、狼瘡、自己免疫心筋炎Ｉ、HCV仲介慢性肝炎、慢性胃炎、たとえば、Ａ型胃炎、混合性結合組織病（MCTD）、クローン病、潰瘍性大腸炎および癌から選択される疾患の治療および／または予防の方法であって、該治療を必要とする患者に、医薬的に有効量のCariポリペプチド、もしくはそのムテイン（たとえば、Cari D600E）、アイソフォーム、対立変異体、断片（たとえば、配列番号：４、配列番号：５）、融合タンパク質、またはそれらの誘導体；あるいはCariまたはそのムテインもしくは断片をコードするDNAまたはベクター；あるいはCariまたはCariインヒビターの内因性遺伝子活性化のためのベクター；あるいはCariに対する特異的抗体を投与することを含む方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
本発明は、細胞内カスパーゼ結合ポリペプチドp72（またはCari）、またはそのアイソフォーム、ムテイン、対立変異体もしくは断片に関する。
【００４７】
一方では、Cariは、プロカスパーゼ−８に結合し、プロカスパーゼ−８の活性カスパーゼ−８への変換を増強し、そして他方では、活性カスパーゼ−８は、Cariを切断するので、Cariの活性をは、活性カスパーゼ−８によりダウンレギュレーションされる。
【００４８】
Cariは、プロカスパーゼ−８に加えて、様々なカスパーゼ、またはそのムテインもしくは断片にも結合でき、このようなカスパーゼと同様の活性に影響を及ぼし得る。
【００４９】
さらに、本発明は、Cariの断片、または内因性Cariポリペプチドの活性にドミナントネガティブ効果を有するムテイン、およびカスパーゼ（好ましくは、カスパーゼ−８）の細胞傷害効果を増大できるCariポリペプチド、またはそのムテインもしくは断片に関する。
【００５０】
たとえば、アスパラギン酸600が、グルタミン酸に置換された、切断不可能なCari変異体（Cari D600E）ポリペプチドを作製した。このポリペプチドは、野生型バージョンより高い細胞傷害を誘導する。また、カスパーゼ−８の結合を担うことが示されたCari中のドメインを含むCari（それぞれ２４および１６個のアミノ酸残基、配列番号：４および配列番号：５）から誘導される小型ペプチドを、作製した。このようなペプチドは、プロカスパーゼ−８へのCariの結合を阻害するので、カスパーゼ−８の細胞傷害効果を阻害し得る。
【００５１】
カスパーゼ結合ポリペプチド（たとえば、Cari）の同定のために、リガンド刺激（たとえば、Fasリガンド）の前後に細胞を溶解させ、適切なカスパーゼ特異的抗体による免疫沈降に供され得る。
【００５２】
免疫沈降のための適切なモノクローナル抗体を、カスパーゼ−８  Sub-1のＣ末端ドメイン由来ペプチドに対して調製した。この抗体は、カスパーゼ−８結合タンパク質（たとえば、Cari）とともにプロカスパーゼ−８を免疫沈降でき、カスパーゼ−８およびカスパーゼ結合タンパク質のいずれも、免疫複合体から充分に溶出され、当初抗体調製のために使用されたカスパーゼ由来ペプチドと拮抗させることによって、上清中に回復させた。
【００５３】
したがって、カスパーゼ結合ポリペプチドは、静止または刺激された細胞の細胞溶解物、発現cDNAライブラリー、およびゲノムまたはコンビナトリアルペプチドライブラリーから選択されるサンプルから、このようなカスパーゼ特異的適性抗体で、本発明によって共免疫沈降され得る。
【００５４】
細胞の刺激は、リンホカイン（たとえば、Fasリガンド、TNF）、環境因子（飢餓、熱ショックなど）により作用されることができる。
【００５５】
抗体は、本発明により見出されたカスパーゼ結合タンパク質（たとえば、Cari）に対して展開され得る。Cari（その断片を含む）に特異的な抗体は、サンプル中のCariを定量的または定性的に検出するため、またはCariを発現する細胞の存在を検出するためにも使用され得る。これは、光学顕微鏡、フローサイトメトリー、または蛍光測定検出と結びつけて、蛍光標識抗体（以下参照）を使用する免疫蛍光技術により達成され得る。
【００５６】
ポリペプチドに対するポリクローナル抗体の調製は、「免疫学における最新プロトコール」、ウイリー・アンド・サンズ・インク．の第2章に記載されている。ペプチドに対する抗体の調製は、ポリペプチドと比較した場合、一般的にペプチドの抗原性が低いため、プロトコールにおける、ある程度の変化を必要とし得る。ペプチドに対するポリクローナル抗体の調製は、前記「免疫学における最新プロトコール」、第9章に記載される。
【００５７】
Cariに対して調製された抗体は、細胞を、Cariに対する細胞内で発現された抗体、すなわち細胞内発現抗体（intrabody）で形質導入させることを含む、たとえば、細胞上のCariを選択的に標的にすることにより、細胞内のタンパク質の活性を改変させるために使用され得る。細胞内発現抗体の調製は、国際公開第99/14353号パンフレットに開示されている。
【００５８】
モノクローナル抗体は、ハイブリッド細胞の成長を支持する条件下で、免疫化Ｂ細胞との融合により、免疫化動物（特にラットまたはマウス）の脾臓またはリンパ節から取出されたＢ細胞から調製され得る。マウスＢ細胞の融合については、細胞系Ag−8が好ましい。
【００５９】
モノクローナル抗体を調製する技術は、「免疫学における最新プロトコール」、ウイリー・アンド・サンズ・インク．第２章などの、多くの記事および教科書に記載されている。その第９章には、ペプチド、または動物を用いた免疫化が記載されている。これらの動物の脾臓またはリンパ節細胞は、その第２章に記載されているように、モノクローナル抗体の調製のために、ポリペプチド免疫化動物の脾臓またはリンパ節細胞と同じ方法で使用され得る。
【００６０】
モノクローナル抗体を調製するのに使用される技術は、さらに、KohlerおよびMilstein（1975年）および米国特許第4,376,110号明細書に記載されている。
【００６１】
そこの超可変領域がほとんどの任意の配列に置換される、ヒト抗体のジーンバンクからの抗体の調製について、米国特許第5,840,479号明細書に記載されている。このような抗体は、所定のペプチドまたはポリペプチドを用いて動物を免疫化することが困難である場合に好ましい。ある種の構造は、免疫原性に乏しく、アジュバントを添加しても、および融合構築物で他のポリペプチドに結合しても、そのままの状態に維持され得る。たとえば、ヒトでの低免疫原性を有する抗体が望まれる際、ヒト抗体に類似の構造を有する抗体を使用することが望ましい場合には、米国特許第5,840,479号明細書に記載される抗体がさらに好ましい。
【００６２】
いったん適切な抗体が同定されると、その特性を変化することが所望され得る。たとえば、キメラ抗体は、高い収率の産生を達成し得る。定常領域が、ヒト抗体の定常領域で置換されたキメラ抗体は、抗体が、ヒトにおいて低免疫原性であることが望まれる場合に、さらに望ましい。キメラ抗体の調製は、Cabillyら、1984年、Morrisonら、1984年、Boulianneら、1984年、欧州特許第125023号明細書、欧州特許第171496号明細書、欧州特許第173494号明細書、欧州特許第184187号明細書、国際公開第86/01533号パンフレット、国際公開第87/02671号パンフレット、およびHarlowおよびLane、「抗体：実験室マニュアル」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、1988年などの多数の出版物に記載されている。
【００６３】
「充分にヒト化された抗体」は、ヒト免疫グロブリンの可変および定常領域のいずれも含む分子である。充分にヒト化された抗体は、自己免疫疾患などの慢性および再発疾患のために、反復治療が要求される治療用途のために強力に使用され得る。充分なヒト抗体の製造のためのある方法は、マウスのヒト化免疫系の「ヒト化」、すなわち、内因性Ig遺伝子が不活性化されたマウスへのヒト免疫グロブリン（Ig）遺伝子座の導入による、ヒトIgを産生できるマウス株（異種マウス（Xenomice））の作製からなる。Ig遺伝子座は、それらの物理的構造、および最終的に広範な免疫応答を生じるのに必要とされる遺伝子再編成および発現プロセスの両方の点で、非常に複雑である。抗体多様性は、まず、Ig遺伝子座に存在する様々なＶ、ＤおよびＪ遺伝子間のコンビナトリアルな再編成により調製される。これらの遺伝子座は、抗体発現、対立遺伝子の排除、クラススイッチングおよび親和性の成熟を制御する、様々に散らばる（interspersed）調節要素をも含む。マウスへの再編成されていないヒトIg移入遺伝子の導入は、マウス組換え機構が、ヒト遺伝子に適合性があることを証明した。さらに、種々のアイソフォームの抗原特異的hu-mAbを分泌するハイブリドーマは、抗原による異種マウスの免疫化により得られ得る。
【００６４】
充分にヒト化された抗体およびその調製方法は、当技術分野に周知である（Mendezら、Nature Genetics 15巻：146−156頁（1997年）；Buggemannら、Eur. J. Immunol. 21巻：1323−1326頁（1991年）；Tomizukaら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97巻：722−727頁（2000年）、国際公開第98/24893号パンフレット）。
【００６５】
他の型の抗体は、抗イディオタイプの抗体である。抗イディオタイプ（抗−Id）抗体は、一般的に抗体の抗原結合部位と関連する独特の決定基を認識する抗体である。Id抗体は、抗−Idが調製されるMabの源と同じ種および遺伝子型の動物（たとえば、マウス株）を免疫化することによって調製され得る。免疫化動物は、これらのイディオタイプの決定基に対する抗体（抗−Id抗体）を産生させることによって、免疫化する抗体のイディオタイプの決定基を認識し、応答する。たとえば、米国特許第4,699,880号明細書を参照（なお、この言及により完全に本明細書に包含される）。
【００６６】
抗−Id抗体は、さらに他の動物での免疫応答を誘導する「免疫原」としても使用され、いわゆる抗−抗−Id抗体を産生し得る。抗−抗−Idは、抗−Idを誘導する元来のmAbとエピトープ的に一致し得る。したがって、mAbのイディオタイプの決定基に対する抗体を使用することによって、同一の特異性の抗体を発現する他のクローンを同定することが可能である。
【００６７】
用語「抗体」には、インタクトな分子、ならびにたとえば、抗原と結合できるFabおよびF（ab'）2などのその断片のいずれも包含されることも意味される。FabおよびF（ab'）2断片は、インタクトな抗体のFc断片を欠き、その流通（circulation）からいっそう迅速に明瞭になり、インタクトな抗体に比べ非特異的な組織とあまり結合し得ない（Wahlら、1983年）。
【００６８】
FabおよびF（ab'）2および本発明に有用な抗体の他の断片は、インタクトな抗体分子について本明細書に開示された方法にしたがって、Cariの検出および定量のために使用され得ることが理解されるだろう。このような断片は、通常、（Fab断片を産生するための）パパインまたは（F（ab'）2断片を産生するための）ペプシンなどの酵素を使用して、タンパク質分解性切断により作製される。
【００６９】
抗体は、それが、分子と特異的に反応することにより分子を抗体に結合できる場合、その分子と「結合できる」とされる。用語「エピトープ」は、抗体により結合されることができるあらゆる分子の一部を言うことを意味し、それは、抗体によって認識もされ得る。エピトープまたは「抗原性決定基」は、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表層基から構成され、特異的三次元構造特性および特異的電荷特性を示す。
【００７０】
本発明に有用な抗体（またはその断片）は、Cariのインサイチュ検出に対して、免疫蛍光または免疫電子顕微鏡法でのように組織学的に使用され得る。インサイチュ検出は、組織学的試験片を患者から取出し、そのような試験片に本発明の標識抗体を供することによって達成され得る。抗体（または断片）は、生物学的サンプルに標識抗体（または断片）を適用することによるか、または塗布することによって供されるのが好ましい。このような手段の使用を通して、Cariポリペプチドの存在のみならず、試験組織におけるその分布も決定することが可能である。当業者であれば、本発明を使用して、どんな広範な組織学的方法（染色手法など）をも、このようなインサイチュ検出を達成するために改変され得ることは容易に理解できるだろう。
【００７１】
本発明のCariポリペプチドについてのこのようなアッセイは、通常、Cariポリペプチドを同定できる検出可能に標識された抗体の存在下で、生物学的流動物、組織抽出物、新たに収集した細胞（リンパ球または白血球など）、または組織培養でインキュベーションされた細胞などの生物学的サンプルをインキュベーションすること、および当技術分野に周知の多数のあらゆる技術により、抗体を検出することを包含する。
【００７２】
「生物学的流動物」または生物学的サンプルは、細胞、細胞構成要素または細胞産物に由来するか、またはそれらを含むあらゆる流動体を意味する。生物学的流動物としては、細胞培養上清、細胞溶解物、透明細胞溶解物、細胞抽出物、組織抽出物、血液、血漿、血清、ミルク、およびそれらの分画があげられるが、それらに限定されるものではない。
【００７３】
生物学的サンプルは、ニトロセルロースなどの固相支持体もしくは担体で、または細胞、細胞粒子もしくは可溶性ポリペプチドを固定できるその他の固相支持体もしくは担体で処理され得る。支持体または担体は、そののち、前記したように、本発明にしたがって、適切な緩衝液で洗浄し、続いて検出可能に標識された抗体で処理され得る。ついで、固相支持体または担体を、二回緩衝液で洗浄して、未結合の抗体を除去し得る。該固相支持体または担体に結合した標識の量は、ついで、従来の手段により検出され得る。
【００７４】
「固相支持体」、「固相担体」、「固形支持体」、「固形担体」、「支持体」または「担体」により、抗原または抗体を結合できるあらゆる支持体または担体が意図される。周知の支持体または担体には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および改質セルロース、ポリアクリルアミド、斑レイ岩および磁鉄鉱が含まれる。担体の性質は、ある程度まで可溶性であるか、または本発明の目的のために不溶性であるかのいずれかであり得る。支持体材料は、結合分子が抗原または抗体に結合できる限り、仮想的には、あらゆる可能性のある構造形態を有し得る。したがって、支持体または担体の形態は、ビーズのような球状、試験管の内側表面またはロッド（rod）の外側表面のような円筒状であり得る。また、表面は、シート、試験細片などのような平面であり得る。好ましい支持体または担体としては、ポリスチレンビーズがあげられる。当業者であれば、抗体または抗原を結合するための他の適切な担体を知っているだろうし、日常的な実験を用いて該担体を確かめることもできるだろう。
【００７５】
前記のように本発明の所定の多くの抗体の結合活性は、周知の方法にしたがって測定され得る。当業者は、日常的な実験を適用して、各測定についての操作的および最適アッセイの条件を決定できるだろう。
【００７６】
洗浄、攪拌、振とう、濾過などのその他の工程が、特定の状況のために通例であるか、または必要である場合は、アッセイに加えられ得る。
【００７７】
本発明による抗体が、検出可能に標識され得る１つの方法は、酵素に該抗体を連結させ、酵素免疫アッセイ（EIA）で使用されるものである。この酵素は、順に、後に適切な基質にさらされる際、たとえば、分光光度計、蛍光測定によるか、または可視手段により検出できる化学的部分の生成についての手段で基質と反応するだろう。抗体を検出可能に標識するために使用できる酵素としては、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカスのヌクレアーゼ、デルタ−5−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼがあげられるが、それらに限定されるものではない。検出は、酵素について発色基質を使用する比色法によって達成され得る。また、検出は、同様に作製された照準と比較して、基質の酵素的反応の範囲の目視比較によって達成され得る。
【００７８】
検出は、多様な他のあらゆる免疫アッセイを使用して達成され得る。たとえば、抗体または抗体断片を放射性標識することにより、放射性免疫アッセイ（RIA）の使用を通してR−PTPaseを検出することが可能である。RIAについての優れた説明は、Work, T. S.らによる「分子生物学における実験室技術および生化学」、ノース・ホーランド・パブリシング・カンパニー、ニューヨーク（NY）（1978年）に、特にChard, T.による「放射性免疫アッセイおよび関連技術への導入」と題される章に見出すことができ、該言及により本明細書に包含される。放射活性アイソトープは、g計測器もしくはシンチレーション計測器の使用のような手段によって、またはオートラジオグラフィーによって検出できる。
【００７９】
本発明による抗体を、蛍光化合物を用いて標識することも可能である。蛍光標識抗体を、適切な波長の光にさらした場合、その存在は蛍光により検出できる。最も一般的に使用される蛍光標識化合物の中でも、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、ピコシアニン（pycocyanin）、アロピコシアニン（allophycocyanin）、o−フタルアルデヒドおよびフルオレサミンである。
【００８０】
抗体は、152Eまたは他のランタニド系列などの蛍光放出金属を使用して検出可能に標識することもできる。これらの金属は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ETPA）のような金属キレート基を使用して、抗体に付着され得る。
【００８１】
抗体は、化学発光化合物に連結することによって検出可能に標識することもできる。ついで、化学発光タグ付抗体の存在は、化学反応の過程中に生じる発光団の存在を検出することによって決定される。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、セロマチックアクリジニウムエステル（theromatic acridinium ester）、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルである。
【００８２】
同様に、生物発光化合物も、本発明の抗体を標識するために使用され得る。生物発光は、触媒タンパク質が、化学発光反応の効力を増大する生物系に見られる一種の化学発光である。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することによって測定される。標識目的用の重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンである。
【００８３】
本発明の抗体分子は、「２つの部位」または「サンドイッチ」アッセイとしても知られる免疫測定アッセイでの利用に適合され得る。典型的な免疫測定アッセイでは、多量の未標識の抗体（または抗体の断片）は、固形支持体または担体に結合され、多量の検出可能に標識された可溶性抗体は、固相抗体、抗原および標識抗体との間に形成された三重複合体の検出および／または定量を可能にするために添加される。
【００８４】
典型的で、好ましい免疫測定アッセイとしては、固相に結合した抗体が、まず試験されるべきサンプルと接触され、二成分の固相の抗体−抗原複合体の形成により、サンプルから抗原を抽出される「順行」アッセイがあげられる。適切なインキュベーション期間ののち、必要であれば、固形支持体または担体を洗浄し、未反応抗原を含む流動体サンプルの残渣を除去し、ついで、未知量の標識抗体（「レポーター分子」として機能する）を含む溶液と接触させる。標識抗体に、未標識抗体を通して固形支持体または担体に結合した抗原と複合体化させる二次インキュベーション期間ののち、固形支持体または担体を二回洗浄して、未反応標識抗体を除去する。
【００８５】
本発明の抗原でも有用であり得る他の型の「サンドイッチ」アッセイでは、いわゆる「同時」および「逆行」アッセイが使用される。同時アッセイは、固形支持体または担体に結合した抗体、および標識抗体を、いずれも同時に試験されるサンプルに加えるような単一のインキュベーション工程を含む。インキュベーションを完了したのち、固形支持体または担体を洗浄し、流動体サンプルの残渣および未複合化標識抗体を除去する。固形支持体または担体と結合した標識抗体の存在は、従来の「順行」サンドイッチアッセイにあるとおりに測定される。
【００８６】
「逆行」アッセイでは、流動体サンプルへの標識抗体の溶液を添加したのち、適切なインキュベーション期間後の固形支持体または担体に結合した未標識抗体を添加する工程を利用する。二次インキュベーション後、固相を従来の形態で洗浄し、試験されるサンプルの残基および未反応標識抗体の溶液を遊離する。固形支持体または担体と結合した標識抗体の測定は、ついで、「同時」および「順行」アッセイと同様に測定される。
【００８７】
RIAまたはELISAなどの免疫アッセイの創作は、多くの記事、教科書、およびその他の出版物に記載されている。国際公開第97/03998号パンフレット、４８頁４行から５２頁２７行までに言及される。本発明の免疫アッセイは、一般型の２つのうちにあり得る：第一に、固定Cariポリペプチド、または同等のペプチドを使用する免疫アッセイは、Cariの定量化で使用され得る。第二に、Cariポリペプチドのエピトープに対して指向された固定抗体を使用する免疫アッセイは、Cariポリペプチドを定量するために使用され得る。
【００８８】
このようなアッセイは、アポトーシス経路に関与するCari、および他のポリペプチドのレベルが、このような経路の関与の可能性のある多数の疾患または兆候で評価される必要があり得る場合に、診断での利用が見出され得る。
【００８９】
本明細書において、用語タンパク質およびポリペプチドは、相互に交換可能である。
【００９０】
本発明のポリペプチド72kDaポリペプチドは、プロカスパーゼ−８を特異的に結合することが分かった。ついで、部分的配列決定および質量分析により、該ポリペプチドをさらに分析した。ついで、そのように得られた配列を、データベース検索プログラムに入力し、オーバーラップしている配列およびESTを、コンピュータ検索により同定した。使用されるプログラムは、全ての当業者に周知であり、例えば、GCG（遺伝子コンピュータ・グループ）パッケージなどがあげられる。好ましくは、EMBLサーバー（例えば、http://dove.embl-heidelberg.de/Blast2/）から利用できるBasic Local Aligment Search Tool（BLAST）などの検索ユーティリティーが使用される。Blastnコマンドは、同定されたクローンとオーバーラップするか、または類似するヌクレオチド配列について検索するために使用され得る。
【００９１】
また、データベースを調査する前記の方法に加えて、ゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーなどのライブラリーは、完全なクローンを同定するためにスクリーニングされ得る。このようなスクリーニング法は、前記Sambrookら、およびAusubelらに記載される。または、さらに、cDNA末端の高速増幅（5'および3'RACE、Graham et al., 1991、および本明細書での言及）などのPCRに基づくクローニング技術が、使用され得る。
【００９２】
本実施態様では、見出されたEST配列を、TIGR Human gene indexで検索し、THCレポートを得た。これらの配列THC510568に適合する全ESTのコンセンサスを得た（配列番号：１）。コンセンサス配列は、ヒトESTに対して高い類似性（約90％の同一性）を示すマウスESTから判断したところ、Cariの最初のメチオニンとそれに続く６個のアミノ酸をコードするヌクレオチドを欠く。マウスESTで失われていなかった、マウスの対応タンパク質の最初のメチオニンとそれに続く６個のアミノ酸を、欠損ヒト配列の完成のために、ヒトゲノムの作業中の仮の配列と比較した。ホモサピエンスの１９番染色体の配列（クローンLLNLR−232E12）に対応する該当物を得た。このクローンについて、p72の欠損する7個のアミノ酸が確認された。図８での略図で表されるPCRにより、p72タンパク質の全長cDNAを得た。p72をコードする全DNAを回収し、配列決定し（配列番号：２）、ついでアミノ酸配列を推定した（配列番号：３）。
【００９３】
P72ポリペプチドは、３つの保存モチーフ（図７）を含むことが分かった：Ｃモチーフ（コイルドコイルモチーフ）、ポリペプチドのＮ末端付近の２つの縦列配置した「SURP」（「SWAPのモチーフ」とも称され、図７ではＳとして示す）（Denhez F and Lafyatis R 1994）、および１つのＣ末端に配置される「Ｇ−パッチ（G-patch）」（図７では、Ｇとして示す）（Aracind L and Koonin EV 1999）。SURPおよびＧ−パッチモチーフはいずれも、RNA結合に寄与すると考えられるので、p72の標的は、RNA分子であることが示唆され得る。したがって、p72は、Cariと改名された（その名称は、RNA結合モチーフを有するカスパーゼ−８付随ポリペプチドに基づく）。したがって、本明細書中の用語Cariおよびp72は、相互に交換可能である。
【００９４】
全Cariポリペプチドに対応するバンドは、細胞の刺激後に消滅し、代わりに低分子量の新たなポリペプチドが出現する。cariが、活性化カスパーゼ−８により切断され得る可能性は、組換え体が産生するカスパーゼ−８とCari標識ポリペプチドをインキュベーションすることを含むインビトロアッセイによって調査された。Cariは、そのコーディング配列を、強力なプロモーターを含む発現ベクターに導入すること、および哺乳類細胞にトランスフェクションすることによって作製され得る。また、Cariは、インビトロ翻訳系を使用して、インビトロで作製され得る。インビトロ翻訳の技術は、当業者に周知であり、試薬および詳細なプロトコールは、例えば、ストラタジーン（Stratagene）（米国ラホーラ（La Jolla, USA））より入手可能である。
【００９５】
本実施態様では、放射性アイソトープを使用してCariを標識した。有利には、アイソトープ標識を使用した場合、試験されるポリペプチドをインビトロで発現させ、アイソトープで標識されたアミノ酸（好ましくは、アイソトープは、S35であり）を、未標識アミノ酸とともに、インビトロ翻訳反応中に添加する。さらに好ましくは、標識アミノ酸は、S35メチオニンであり、標識および未標識アミノ酸の比は、１：１〜約１：1000である。
【００９６】
放射性アイソトープ標識Cariポリペプチドおよび組換え体が産生するカスパーゼ−８活性酵素を、ついで、適切な緩衝液中で切断を起こさせるのに充分な期間混合した。アッセイの好ましい緩衝液およびその他好ましいパラメーターは、出版物（Boldin et al. 1996）に記載される。好ましい期間は、一般に、10分から数時間の間であり、好ましくは30分から１時間の間である。
【００９７】
切断を起こさせた後、反応物を、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分離させた。ゲルを乾燥し、ついでアイソトープを写真フィルムにより、またはホスホイメージング（phoshoimaging）により検出した。また、試験されるべきポリペプチドをタグ付けし、ウエスタンブロットでタグ特異的抗体を使用することによっても検出され得る。
【００９８】
カスパーゼ−８なしのコントロール反応との比較により、カスパーゼ−８が添加される反応におけるさらなる低分子量バンドの出現により、カスパーゼ−８によるCariの切断が示される。切断後検出された該低分子量バンドの算出されたサイズは、切断部位のおよその位置の手がかりとなる。
【００９９】
Cariでの正確な残基標的を見出すために変異分析研究を行なった。残基６００でのＤからＥへの変異を有する変異体Cariが、カスパーゼ−８により切断されないことから（p72／Cari D600E変異体）、残基D−600は、切断のための標的であることが分かった。
【０１００】
本発明は、CariをコードするDNA配列にも関する。さらに、本発明は、さらに、Cariの生物学的に活性なアイソフォーム、ムテイン、対立変異体、断片または融合タンパク質をコードするDNA配列に関する。このようなムテインおよび断片ならびに誘導体の調製は、CariをコードするDNA配列で、１つまたはそれ以上のコドンが、欠失、添加、または他のものに置換されて、本来のポリペプチドに関して少なくとも１つのアミノ酸残基の変化を有するムテインを生じる標準的な手法による（例えば、Sambrook et al., 1989参照）（ただし、国際公開第9830582号パンフレットに記載のポリペプチドDF5182_3のようにグルタミン酸の代わりにアミノ酸残基230にグリシンを示すムテインを除く）。
【０１０１】
本発明のDNA配列は、Cari、アイソフォーム、対立変異体、断片、ムテイン、または誘導体をコードするDNA配列であって、該DNA配列は、本来のCariポリペプチドのコーディング領域に由来するcDNA配列とハイブリダイズすることができ（このようなハイブリダイゼーションは、中程度にストリンジェントな条件下で行なわる）、該ハイブリダイズできるDNA配列が、生物学的に活性なCariをコードするものであるDNA配列である。したがって、これらのハイブリダイズできるDNA配列は、本来のCari cDNA配列と比較的高い類似性を示すDNA配列、および、例えば、種々のCariアイソフォームをコードする天然由来の配列、またはCariの活性を有するポリペプチドをコードするCari様配列に属するポリペプチドをコードする天然に出現した配列であり得るCari様配列を表すDNA配列などを含む。さらに、これらの配列は、例えば、本来のCari cDNA配列に類似するが、多数の望ましい修飾を組み込んだ、天然に生じるものでなく、合成で作製される配列をも包含し得る。したがって、そのような合成配列は、Cariのムテイン、断片および誘導体をコードする可能性のある全ての配列であって、Cariの活性を示すものを包含する。
【０１０２】
本明細書で使用される場合、ストリンジェントな条件は、ハイブリダイゼーション実験で使用される温度、一価陽イオンのモル数、およびハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの含有率の関数である。あらゆる所定の条件に関与するストリンジェントの程度を決定するために、第一には、100％同一性のハイブリッドの安定性を決定するために、DNA-DNAハイブリッドの融点Tmで表わすMeinkothら（1984）の方程式を使用する。
【０１０３】
Tm＝81.5℃＋16.6（LogM）＋0.41（％GC）−0.61（％ホルム）−500／L
（ここでMは、一価陽イオンのモル数であり、％GCは、DNA中のＧおよびＣヌクレオチドの割合であり、％ホルムは、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの割合であり、Lは、塩基対中のハイブリッドの長さである）。100％同一性のハイブリッドが算出されるTmが減少する１℃毎に、許されたミスマッチの量は、約１％ずつ増大された。
【０１０４】
したがって、特定の塩およびホルムアミド濃度で、あらゆる所定のハイブリダイゼーション実験で使用されるTmが、Meinkothの方程式により100％のハイブリッドとして算出されるTmより10℃低い場合、約10％までのミスマッチがある場合でもハイブリダイゼーションが起こる。
【０１０５】
「中程度にストリンジェントな条件」は、前記式で算出されるとおりか、または実際に測定されるとおりのいずれかで、標的配列を有する完全二重鎖として存在するTmより20℃以内で低いTmで提供されるものである。制限がない場合、中程度にストリンジェントな条件（ハイブリッドにより算出または測定されたTmより15〜20℃低い）では、ハイブリッドの算出Tm以下の適切な温度で、2×SSC（標準クエン酸生理食塩水）および0.5％SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）の洗浄溶液を使用する。条件の最終的ストリンジェンシーは、特に使用されるハイブリダイゼーションの条件が、安定性の低いハイブリッドに、安定なハイブリッドとともに形成させる場合、主に洗浄条件による。ついで、より高いストリンジェンシーでの洗浄条件は、安定性の低いハイブリッドを除去する。前記中程度にストリンジェントな洗浄条件とともに使用され得る共通のハイブリダイゼーション条件は、Tmよりおよそ20℃から25℃低い温度で、６×SSC（または６×SSPE）（標準生理食塩水−リン酸−EDTA）、５×デンハルト試薬、0.5％SDS、100μg／mlの変性された断片化サケ精子DNAの溶液でのハイブリダイゼーションである。混合プローブを使用する場合、SSCの代わりに塩化テトラメチルアンモニウム（TMAC）を使用するのが好ましい（Ausubel, 1987, 1999）。
【０１０６】
前記種々の天然に生じたCari様配列を得るために、種々の組織からの天然由来のDNAまたはRNAサンプルのスクリーニングおよび単離の標準手段は、プローブとして天然のCari cDNAまたはその部分を用いて使用され得る（例えば、Sambrook et al., 1989に規定される標準手段を参照）。
【０１０７】
本発明のカスパーゼ結合ポリペプチドは、カスパーゼ−８のSub-1のＣ末端ドメインに特異的なMab179を用いる前記免疫沈降により同定できる。しかし、前記免疫沈降アッセイでは、カスパーゼ−８に代えて、様々のカスパーゼのSub-1のＣ末端ドメインに特異的な抗体を使用できる。本発明は、Cariに実質的に対応するポリペプチドまたはタンパク質にも関する。用語「実質的に対応する」は、Cariポリペプチドのみならず、それのムテインであるポリペプチドまたはタンパク質をも包含する。それらは、対応の「融合タンパク質」、すなわち、他のタンパク質と融合し、体液中でより長い半減期を有するCariまたはその変異体を包含し得る。したがって、CARIは、例えば、免疫グロブリンなどの他のタンパク質、ポリエチレングリコール（PEG）などの高分子ポリマーと融合できる。
【０１０８】
Cariポリペプチドに実質的に対応するムテインは、得られるポリペプチドが、それが対応するCariと実質的に同じまたはより高い生物学的活性を示すという条件で、カスパーゼ−８相互作用タンパク質のアミノ酸配列のうちの１つまたはそれ以上のアミノ酸が、他のアミノ酸で置換され、欠失および／または挿入されたポリペプチドである（ただし、グルタミン酸の代わりにアミノ酸残基230にグリシンを示すムテインは除く）。
【０１０９】
Cariに実質的に対応するために、アイソフォームなどのCariの配列における変化は、一般に比較的小さい。変化の数が10個より多いことがあるけれども、好ましくは、10個未満の変化であり、より好ましくは５個未満の変化、最も好ましくは３個未満の変化がある。あらゆる技術が、ポリペプチドCariに実質的に対応する、潜在的に生物学的に活性なポリペプチドを見出すために使用できる一方で、１つのそのような技術は、ポリペプチドをコードするDNAでの従来の突然変異誘発技術の使用であるので、少数の修飾が生じる。このようなクローンにより発現されるポリペプチドは、ついで、前記細胞内経路の調整／仲介において、カスパーゼ−８に結合、および／またはカスパーゼ−８活性を調整する能力についてスクリーニングされ得る。
【０１１０】
「保存的」変化は、ポリペプチドの活性を変化させることが予測されないであろう変化であり、それらがポリペプチドのサイズ、電荷または形態を実質的に変化させることが予測されないであろうから、生物学的特性を変化させることが予測されないものであろう場合、通常最初にスクリーニングされる。Cariポリペプチドの保存的置換は、ポリペプチド中の少なくとも１つのアミノ酸残基が、異なるアミノ酸と保存的に置換されたムテインを含む。このような置換は、好ましくは、表ＩＡで表される以下のリストにしたがって行なわれ、該置換は、Cariポリペプチドの生物学的活性特性を維持しつつ、合成ポリペプチド分子の修飾構造および機能特性を提供するための日常的な実験によって決定され得る。
【０１１１】
表ＩＡ
本来の残基 模範的な置換
Ala            Gly;Ser
Arg            Lys
Asn            Gln;His
Asp            Glu
Cys            Ser
Gln            Asn
Glu            Asp
Gly            Ala;Pro
His            Asn;Gln
Ile            Leu;Val
Leu            Ile;Val
Lys            Arg;Gln:Glu
Met            Leu;Tyr;Ile
Phe            Met;Leu;Tyr
Ser            Tyr
Thr            Ser
Trp            Tyr
Tyr            Trp;Phe
Val            Ile;Leu
【０１１２】
また、Cariの他の基の置換は、ポリペプチド中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、以下の表IBにしたがってその位置に異なる残基が挿入される。ポリペプチドでなされ得る置換の型は、Schulz et al., G. E., Principles of Protein Structure Springer-Verlag, New York., NY, 1798の表１〜２、およびCreighton, T. E., Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, CA. 1983の図３−９で表されるものなどの、異なる種の相同なポリペプチド間のアミノ酸変化の頻度の分析に基づき得る。このような分析に基づいて、本明細書では、代替的な保存的置換は、以下の５つの基の１つの中での変化として定義される。
表ＩＢ
1.   小型の脂肪族（small aliphatic）で、無極性またはわずかに極性の残基：Ala, Ser, Thr(Pro, Gly);
2.   極性で、マイナスに帯電した残基およびそのアミド：Asp, Asn, Glu, Gln;
3.   極性で、プラスに帯電した残基：His, Arg, Lys;
4.   大型の脂肪族（large aliphatic）で、無極性の残基：Met, Leu, Ile, Val(Cys);
5.   大型の芳香族の残基（Large aromatic residues）：Phe, Tyr, trp
【０１１３】
前記括弧書きの３つのアミノ酸残基は、タンパク質構造で特別の役割を有する。Glyは、あらゆる側鎖を欠く唯一の残基であるので、鎖に柔軟性を付与する。しかし、これは、a−へリックス以外の二次構造の形成を促進する傾向にある。Proは、その通常でない幾何学のため、鎖をきちんと固まらせ、一般に、ベータ−ターン様構造（beta-turn-like structure）を促進する傾向にあるが、ある種の場合、Cysは、タンパク質の折畳みに重要であるジスルフィド結合形成に関与することができる。Schulz et al., supraでは、前記グループ１および２は１つにまとめられていることに注目されたい。また、Tyrは、その水素結合能力のために、SerおよびThrなどと明らかに共通性を有することにも注目されたい。
【０１１４】
例えば、上に表される本発明による保存アミノ酸置換は、当技術分野で周知であり、アミノ酸置換ののち、ポリペプチドの生物学的および構造的な特性を維持することが予想されるだろう。本発明によるほとんどの欠失および置換は、タンパク質またはポリペプチド分子の特徴に根本的な変化を生じないものである。「特徴」は、二次構造（例えば、a‐へリックスまたはベータ−シート）における変化、ならびに生物学的活性（例えば、カスパーゼ−８への結合および／または細胞死でのカスパーゼ−８の効果の仲介）における変化のいずれも定義する非包括的手段で定義される。
【０１１５】
本発明で使用するためのカスパーゼ−８相互作用ポリペプチドCariのムテインを得るために使用できるタンパク質中のアミノ酸置換の生成の例としては、Markらによる米国特許第RE33,653号、第4,959,314号、第4,588,585号および第4,737,462号；Kothsらによる第5,116,943号；Namenらによる第4,965,195号；Chongらによる第4,879,111号；およびLeeらによる第5,017,691号に表されるようなあらゆる周知の方法工程；および米国特許第4,904,584号明細書（Shaw et al）に表されるリジン置換タンパク質があげられる。
【０１１６】
ポリペプチドCariの活性を明らかには変化させないだろう前述の検討された保存的置換に加え、Cariポリペプチドのムテインの生物学的活性の増大に至る保存的置換、または保存性が低くかつランダムな変化のいずれかは、本発明の範囲内にあると意図される。
【０１１７】
置換または欠失の正確な効果が確認しようとする場合、当業者は、置換、欠失などの効果が、日常的の結合および細胞死アッセイで評価されることは理解するだろう。このような標準試験を使用するスクリーニングは、過度な実験を要しない。
【０１１８】
許容し得るCariムテインは、プロカスパーゼ−８と相互作用する能力を少なくとも保持し、それにより細胞内の経路におけるカスパーゼ−８の活性を調節するものである。ある実施態様では、Cariは、おそらくプロカスパーゼ−８の活性カスパーゼ−８への変換の速度を増大させることにより、Fasにより仲介される細胞死を増大させることが分かった。いったんカスパーゼ−８が形成されると、それは、Cariを切断し、そののちおそらくその不活化を引起こす。切断不可能なCariのムテイン（Cari D600E変異体）が作製され、細胞死誘導について野生型ポリペプチドより強力であることが分かった。切断不可能な変異体、および好ましくはp72 D600E変異体は、カスパーゼ−８活性の増大が望まれ得るある特定の状況で使用できる。いわゆるドミナントネガティブ効果を有するムテインポリペプチド、すなわち、カスパーゼ−８への結合、またはそののちのシグナル伝達、またはこのような結合ののちの他の活性のいずれかに欠陥のあるポリペプチドを作製できる。ムテインは、細胞死または細胞生存の増大が望まれるかどうかに依存して、およびこれらの活性が、Cariとカスパーゼ−８の相互作用により調整される主要なものであることに依存して（前記参照）、およびこのようなムテインが、カスパーゼ−８に結合、またはカスパーゼ−８と相互作用するための天然のCariポリペプチドと競合することによって、例えば、カスパーゼ−８の細胞傷害性効果を阻害するために、またはそれを増大するために使用できる。
【０１１９】
遺伝子レベルで、ムテインは、一般に、CariポリペプチドをコードするDNAにおけるヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発によって作製され、それにより、ムテインをコードするDNAを生成し、そして以降に、組換え細胞培養においてDNAを合成させ、ポリペプチドを発現させる。ムテインは、全般的に、天然に生じるポリペプチドと同じか、または量的に増大した生物学的活性を示す、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publications and Wiley Interscience, New York, NY, 1987-1995; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989。
【０１２０】
本明細書によるCariの調製、または同等のポリペプチドをコードするが、遺伝子コードの公知の縮重に許される変化で天然の配列と異なる代替的ヌクレオチド配列は、早期に調製されたムテインまたは本来のバージョンのCariポリペプチドのいずれかをコードするDNAの部位特異的突然変異誘発により達成できる。部位特異的突然変異誘発は、望ましい突然変異のDNA配列をコードする特異的オリゴヌクレオチド配列の使用を通してムテインを作製し、充分な数の隣接するヌクレオチドは、充分なサイズのプライマー配列と配列コンプレクシティ（sequence complexity）を提供し、横断している欠失連結部の両側に安定な二重螺旋を形成させる。典型的には、プライマーの長さは約20から25個のヌクレオチドが好ましく、配列の各側の約5から10個の相補ヌクレオチドは修飾されていることが好ましい。一般に、部位特異的突然変異誘発の技術は、Adelmanら（1983年）などの出版物によって例示されるとおり当技術分野に周知であり、該開示は、言及により本明細書に包含される。
【０１２１】
予測されるとおり、部位特異的突然変異誘発技術は、一般に、一本鎖および二本鎖型のいずれでも存在するファージベクターを使用する。部位指向性突然変異誘発に有用な典型的ベクターとしては、例えば、Messing et al., Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, Editor A. Walton, Elsevier, Amsterdam (1981)に開示されるとおり、M13ファージなｄのベクターがあげられ、そして該開示は、言及により本明細書に包含される。これらのファージは、充分に商業的に利用可能であり、そしてそれらの使用法は、一般に、当業者に周知である。また、複製の一本鎖ファージのオリジンを含むプラスミドベクター（Veira et al., Meth. Enzymol. 153: 3, 1987）は、一本鎖DNAを得るために使用され得る。
【０１２２】
一般に、本明細書による部位指向性突然変異誘発は、それの配列の中に、関連性のあるポリペプチドをコードするDNA配列を含む一本鎖ベクターを最初に得ることにより行なわれる。望まれる変異配列を担持するオリゴヌクレオチドプライマーは、自動DNA／オリゴヌクレオチド合成により合成的に作製される。その後、このプライマーを、一本鎖タンパク質配列含有ベクターをアニーリングし、大腸菌（イー．コリ、E. coli）ポリメラーゼI  Klenow断片などのDNA重合酵素に供し、変異担持鎖の合成を完了する。したがって、変異配列および第二の鎖は、所望の突然変異を担持する。その後、このヘテロ二重螺旋ベクターは、イー．コリJM101細胞などの適切な細胞を形質転換させるために使用し、そして変異配列編成を担持する組換えベクターを含むクローンを選択する。
【０１２３】
このようなクローンを選択したのち、変異Cari配列を取りだし、適切なベクター（一般に、適切な宿主のトランスフェクションのために使用され得る型の移行または発現ベクター）に挿入し得る。
【０１２４】
したがって、Cariをコードする遺伝子または核酸も、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）および化学的オリゴヌクレオチド合成などの周知のDNAまたはRNA増幅技術の使用により、インビトロ、インサイチュおよび／またはインビボで検出され、得られ、および／または修飾され得る。PCRは、反復DNAポリメラーゼ反応により、特異的DNA配列を増幅（数の上で増加）させる。この反応は、クローニングのための置換として使用でき、核酸配列の知識が要求されるだけである。PCRを行なうために、プライマーは、目的の配列に相補的であるように設計される。その後、プライマーは、自動DNA合成により作製される。プライマーは、遺伝子のあらゆる部分にハイブリダイズするように設計でき、相補的な塩基対での許容できるミスマッチがあるという状況が起こる。これらのミスマッチ領域の増幅は、新たな特性（すなわち、部位指向性突然変異誘発）を有するペプチドの生成となる変異産物の合成に至る。例えば、Ausubel, supra, Ch16も参照。
【０１２５】
さらに、PCRプライマーは、新たな制限部位、または増幅されるべき遺伝子セグメントの末端に終止コドンのような他の特性を組み込むように設計できる。増幅遺伝子配列の5'および3'末端での制限部位の配置は、Cariポリペプチドまたはその断片をコードする遺伝子セグメントを、ベクター中の他の配列および／またはクローニング部位にライゲーションできるようにあつらえて設計することができる。
【０１２６】
PCR、ならびにRNAおよび／またはDNAの増幅の他の方法は、当業者によく知られており、本明細書に表される教示および指針に基づいて、過度の実験なしに、本発明によって使用できる。DNAまたはRNA増幅の周知の方法としては、以下に限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応、および関連の増幅プロセス（例えば、Mullisらによる米国特許第4,683,195号明細書、第4,683,202号、第4,800,159号、第4,965,188号；Taborらによる第4,795,699号および第4,921,794号；Innisによる第5,142,033号；Wilsonらよる第5,122,464号；Innisによる第5,091,310号；Gyllenstenらによる第5,066,584号；Gelfandらによる第4.889,818号；Silverらによる第4,994,370号；Biswasによる第4,766,067号；Ringoldによる第4,656,134号；およびInnisら編、PCR Protocols: A Guide to Method and Applications参照）、および二本鎖DNA合成用の鋳型として標的配列に対するアンチセンスRNAを使用するRNA仲介増幅（Malekらによる米国特許第5,130,238号明細書、取引名NASBA）；およびDNA増幅の使用に抗体標識を組合わせる免疫−PCR（Ruzicka et al (1993); Sano et al (1992): Sano et al (1991)）があげられ、その特許および資料の全内容は、該言及により完全に本明細書に包含される。
【０１２７】
類似の形態では、Cariの生物学的に活性な断片（例えば、Cariポリペプチドまたはそのアイソフォームのいずれかのもの）は、Cariのムテインに関する前記のとおりに製造され得る。Cariの適切な断片は、プロカスパーゼ−８結合タンパク質の能力を保持し、Cari、または直接的もしくは間接的にカスパーゼ−８と関連する他のタンパク質の生物学的活性を仲介できるものである。また、Cariの適切な断片は、プロカスパーゼ−８結合タンパク質の能力を保持し、Cari、または直接的もしくは間接的にカスパーゼ−８と関連する他のタンパク質の生物学的活性を阻害するものである。したがって、ムテインに関する前記のとおりに、ドミナントネガティブまたはドミナントポジティブ効果（dominant-positive effect）を有するCari断片が作製できる。これらの断片は、本発明の特定のクラスのムテインを表し、すなわち、全Cari配列（例えば、Cariタンパク質またはそのアイソフォームのいずれか１つ）に由来したcariの部分（このような部分または断片の各々は、あらゆる前記の望ましい活性を有する）を明示することに注意されたい。このような断片は、例えば、ペプチドであり得る。
【０１２８】
同様に、誘導体は、当技術分野で周知であるのように、Cariポリペプチド、そのムテインもしくは断片の１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の側鎖基の標準修飾により、または他の分子（例えば、抗体、酵素、受容体など）へのCariポリペプチド、そのムテインもしくは断片の接合により作製され得る。したがって、本明細書で使用される場合「誘導体」は、当技術分野で知られる手段により、残基上の側鎖、またはN−もしくはC−末端基として生じる官能基から作製され得る誘導体を網羅し、そして本発明に含まれる。このような分画が、Cariポリペプチドと同じか、またはより高い生物学的活性を示す場合、誘導体は、炭化水素またはリン酸残基などの化学的部分を有し得る。
【０１２９】
例えば、誘導体は、カルボキシル基の脂肪族エステル；アンモニア、第一級アミンもしくは第二級アミンとの反応によるカルボキシル基のアミド；Ｎ−アシル誘導体；またはアシル部分（例えば、アルカノイルまたは炭素環アロイル基）で形成されるアミノ酸残基の遊離アミノ基；またはアシル部分で形成される遊離ヒドロキシル基（例えば、セリルまたはスレオニル残基）のＯ−アシル誘導体を含み得る。
【０１３０】
用語「誘導体」は、あるアミノ酸が、通常天然に生じるその他の20個のアミノ酸に変換するものでない誘導体のみを含むことを意図される。
【０１３１】
前記のように、切断アッセイは、Cariポリペプチドおよびムテインがカスパーゼ−８によって切断されるかどうかを決定するために使用され得る。
【０１３２】
本発明の実施態様では、切断部位（D600）は、さらに、前記のとおりCariの欠失変異体または点突然変異を作製し、各欠失および点突然変異体をカスパーゼ−８による切断に対する感受性について試験することによって決定された。欠失変異体は、鋳型として、試験されるべき前記ポリペプチドをコードするクローンのDNA配列を使用して、試験されるべきポリペプチドの所望の断片のPCRクローニングによって構築され得る。その後、PCR増幅断片は、発現ベクターに挿入され、それによりATG開始コドンおよび好ましくはコザック配列（Kozak, M, 1984）が提供されるに違いない。さらに、発現ポリペプチドでの詳細は、hisタグ付きタンパク質に関連するが、一般にタンパク質発現にも関連するキアゲン（Qiagen）の前記情報に見出され得る。さらには前記Current Protocolsのタンパク質発現についての別資料、特にその第16章。
【０１３３】
したがって、試験されるべきポリペプチドの切断部位は、そこから種々の欠失変異体を作製し、カスパーゼ−８により切断される欠失が最も少ない変異体を決定することによって定義され得る。
【０１３４】
切断部位を同定するその他の方法は、試験されるクローンの推定ポリペプチド配列によって生成されるペプチドを使用する。ペプチドは、例えば、Bodanszky and Bodanszky, The practice of peptide synthesis, Springer, New York, ISBN 0-387-13471-9、およびBodanszky, The practice of peptide synthesis, Springer, New York, ISBN 0-387-12359-4に詳述されるとおり、化学的に合成され得る。あつらえのペプチド合成は、さらにいくつかの営利会社（例えば、SynPep Corp., Dublin, CA USA、およびCalifornia Peptide Research, Inc. Napa, CA USA）より入手可能である。したがって、ペプチドは、前記Current Protocolsの第１６章に詳述されるとおり、他のタンパク質との融合または非融合のいずれかとして、組換えDNAコーディングを発現することによっても生成され得る。
【０１３５】
試験されるべきポリペプチドの切断部位のマッピング用のペプチドを使用するために、前記ポリペプチドの推定アミノ酸配列の領域を分割し、各領域に対応するペプチドを合成する。さらに、１つの領域の約半分のアミノ酸を包含するペプチドと、さらに直接隣接する領域のアミノ酸の約半分を連続的に包含するペプチドを、２つの領域間の境界が重複するように合成する。その領域は、５〜100個のアミノ酸、好ましくは９〜40個のアミノ酸、最も好ましくは20〜30個のアミノ酸を含む。切断反応ののち、したがって、それらを、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法とUV検出、または染色による可視化（例えば、クマシーブルーを使用）により直接的に分析し得る。また、ペプチドは、例えばアイソトープ末端標識により、簡易検出用に標識され得る（例えば、Shevchenko A, et al. 1997参照）。
【０１３６】
前記のとおりペプチドのスクリーニング完了後、カスパーゼ−８についての切断部位を含むことが現在知られているペプチドについて、さらに同じ技術を繰返し、および同定されたペプチドの配列から選択されるより小さな領域を選択して研究され得る。
【０１３７】
ペプチドの実際の切断部位は、カスパーゼ切断配列XXXDに対して確認すべきである（Boldin et al., Cell 1996およびNicholson et al., 1997参照）。ペプチド中の各アミノ酸の寄与は、１つのアミノ酸に変異があるペプチドを作製し、カスパーゼ−８による切断感受性について、これらの変異ペプチドを試験することによって評価され得る。変異を受けるアミノ酸は、好ましくは、帯電した無極性のアミノ酸の群から選択されるアミノ酸（Lehninger, Biochemistry, Worth, NY, 1979, chapter 4参照）、最も好ましくはグリシンまたはアラニンから選択されるアミノ酸により置換される。
【０１３８】
重要なアミノ酸を変異させることにより、プロカスパーゼ−８に結合するが、それによる切断には感受性でないペプチドを作製することが可能である。結合は、アクリルゲル電気泳動法を使用する非変性条件下で、ペプチド−カスパーゼ−８のサイズ分離によるか、またはカスパーゼ−８特異的抗体との共沈により試験され得る。
【０１３９】
試験されるべきポリペプチド、またはそのペプチド断片は、さらに、哺乳類細胞に該ポリペプチドまたはペプチドを導入し、該細胞におけるアポトーシス誘導試薬の効果を測定することによって特徴付けられ得る。
【０１４０】
哺乳類細胞でのCariポリペプチドまたはペプチドの発現は、プロモーター、任意によりイントロン配列およびスプライシング供与体／アクセプターシグナルを含み、さらに任意により終止配列を含むベクターに、CariをコードするDNAを挿入することによりなされ得る。これらの技術は、一般に、前記Current Protocols, chapter16に記載される。
【０１４１】
前記プロモーター、イントロン、および終止配列は、哺乳類細胞中で操作可能である。プロモーターは、好ましくは、前記RSV、CMV、またはMPSVプロモーターなどの強力なプロモーターである。プロモーターは、SV40初期プロモーター(SV40 early promoter)（Everett et al. 1983、およびそこでの参考資料）、またはベータ−アクチンプロモーターもしくはELF-1プロモーターなどの細胞性プロモーター（Tokushige, et al., 1997）でもあり得る。さらに、ハイブリッドプロモーター（Edamatsu et al. 1997に記載されているlacオペレーターとヒトELF−1アルファプロモーターとのハイブリッド、Akagi et al (1997)に記載されるCMV−ベータ・アクチンハイブリッドプロモーター、またはtetオペレーター配列とCMVプロモーターとのハイブリッド（Furth et al., 1994、およびそこでも参考資料）など）も使用し得る。
【０１４２】
完全配列として挿入され得る、すなわち、スプライス供与体およびアクセプター部位を含むイントロン配列は、発現が望まれるポリペプチドのコーディング配列に挿入され得る。このようなイントロン配列である場合、挿入は、RNA安定性を増強し得るので、望ましいポリペプチドの産生を増強する。原則として、適切なイントロン配列は、イントロンを含むあらゆる遺伝子から選択され、好ましいイントロン配列は、ベータ−アクチンイントロン、SV40イントロン、およびp55TNF受容体イントロンである。
【０１４３】
イントロン配列は、前記プロモーターによって転写を増強し得るエンハンサー要素を含み得る。
【０１４４】
しばしば、イントロン配列は、組織特異的発現を付与する転写または翻訳制御配列を含み得る。したがって、組織特異的な手法で、本発明のポリペプチドを発現することが望まれる場合、このようなイントロン配列は、有利に使用され得る。組織特異的エンハンサー要素を含むイントロンの例は、ヒト5−アミノレブリン酸合成酵素２（5-aminolevulinate synthase 2）遺伝子のイントロン８に位置する赤血球特異的エンハンサー（Surinya et al. 1998）であり、イントロン配列を使用するタンパク質産生を増強する原理の検討は、イントロン配列の例とともにHuang et al. 1990に提供される。
【０１４５】
転写終止配列およびポリアデニル化シグナルは、発現が望まれるポリペプチドをコードするDNAの3'末端に付加され得る。このような配列は、多くのまたはほとんどの遺伝子でも見られ得る。有利には、SV40ポリアデニル化シグナルが使用できる（Schekら、1992年、およびそこでの参考資料）。
【０１４６】
哺乳類細胞でのCariの発現のためのベクターは、例えば、所望のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を起動するためのCMVプロモーターを含むpcDNA3.1ベクター（Invitrogen）、およびMPSVプロモーターを含むpMPSVEHベクターを使用できる。
【０１４７】
組換えポリペプチドは、このようなポリペプチドをコードするベクターでトランスフェクションされた細菌または真核生物（例えば、CHO）の培養宿主細胞、またはトランスジェニック動物のいずれかで産生できる。トランスジェニック動物を使用する場合、それらのミルクでの異種ポリペプチドを産生するのは特に有利である。したがって、ウシ、ヒツジおよびヤギなどの酪農動物は、好ましい宿主である。例えば、特許明細書、国際公開第88／00239号パンフレット、国際公開第90／05188号パンフレット、国際公開第91／02318号パンフレット、および国際公開第92／11757号パンフレット；および米国特許第4,873,191号；第4,873,316号；および第5,304,489号を参照し、またそれらは、該言及により完全に本明細書に包含される。
【０１４８】
試験されるべきポリペプチドの組換え発現を使用して、ポリペプチドは、ここで、カスパーゼ（例えば、カスパーゼ−８）により仲介されるアポトーシスシグナルにおけるその効果について評価される。その目的のために、アポトーシスは、p55TNFR、MORT-1タンパク質、カスパーゼ−８、もしくはその同等物などのアポトーシス誘導タンパク質の過剰発現、またはp55TNFR、CD120a、CD95、TRAMP／DR3、もしくは同等の受容体を誘発することによるアポトーシスシグナルの活性化により誘導され得る。ある実施態様では、アポトーシスは、p55TNFRの過剰発現により誘導される。
【０１４９】
受容体の活性化は、受容体を、特異的リガンドと接触させることによって、または抗体（好ましくは、ポリクローナル抗体）と受容体をクロスリンクすることによっても達成され得る（Engelmannら、1990年を参照）。ある実施態様では、Cariの過剰発現は、Fasリガンドを用いた刺激に続く。
【０１５０】
一般に、Fasリガンドによる受容体様CD95の誘発は、アポトーシスについての強力なシグナルを達成するために、シクロヘキシミドなどのタンパク質合成阻害剤の添加を必要とするが、受容体細胞内ドメインおよびタンパク質の過剰発現は、アポトーシスシグナルトランスダクションに関与しない（Boldinら、1996年を参照）。対照的に、Fasリガンド刺激が、Cariを過剰発現する細胞に与えられる場合、シクロヘキシミドは、アポトーシスのための強力なシグナルの達成に必要とされなかった。このアッセイについてのアポトーシスの検出、インキュベーション時間、および他の詳細、およびパラメーターは、前記Boldinらに記載されている。
【０１５１】
コントロール細胞に対するCariを過剰発現する細胞での細胞死は、DNA断片化、またはアポトーシス特異的抗原およびエピトープの検出に基づく方法などの多数の方法によって評価され得る。キット形態のアポトーシスの検出用の試薬およびプロトコールは、前記Boehringer Mannheimおよびその他の会社から入手可能である。
【０１５２】
細胞死は、細胞の形態学的外見を評価することによっても決定され得る。アポトーシス細胞死は、細胞溶解物の非存在下で波型の細胞膜および細胞の萎縮により特徴づけられる。
【０１５３】
有利には、レポーター遺伝子は、トランスフェクションの成功をマーカーとして提供するために、哺乳類細胞で発現される。それ自身によるトランスフェクション手段が、トランスフェクションされなかった細胞の細胞死を含めて、ある種の細胞死を生じる場合、それは、トランスフェクションされた細胞を評価するのみに有利である。この目的のための好ましいレポーター遺伝子は、GFP（緑色蛍光タンパク質）であり、発色反応を必要しない直接検出のために使用され得て、このレポーター遺伝子は、蛍光顕微鏡の使用を必要とする。しかし、他のあらゆる公知レポーター遺伝子が使用でき、好ましくはその産物が、簡易発色反応を使用して容易に検出される遺伝子（例えばlacZ遺伝子）は、Xgalまたは活性ベータ−ガラクトシダーゼを示す類似試薬でトランスフェクションされた細胞のインキュベーションにより容易に検出され、その結果は顕微鏡を使用して評価され得る。
【０１５４】
したがって、トランスフェクションされた、すなわち、レポーター遺伝子を発現する細胞を考慮することによってのみ、およびアポトーシス的形態学を示す細胞の割合を計測することにより、特定のトランスフェクションされらクローンの効果およびアポトーシスであることから発現されるポリペプチドを評価することが可能である。
【０１５５】
トランスフェクションに使用され、アポトーシスを試験される哺乳類細胞は、HeLa細胞、リンパ芽球形態のヒトカフカス人の慢性骨髄性のもの（Caucasian chronic myelogenous）（K562）、リンパ芽球形態のヒトＴ細胞のリンパ腫（Hut78）、リンパ芽球形態のヒトアフリカ系バーキットリンパ腫（Negroid Burkitt's Lymphoma）（Raji）、リンパ芽球形態のナマルワ−ヒトバーキットリンパ腫（Namalwa-human Burkitt's Lymphoma）（Nalm）、前骨髄細胞形態のヒトカフカス人の前骨髄細胞性白血病（HL-60）、リンパ芽球形態の急性リンパ芽球白血病（CEM）、およびリンパ芽球形態のヒトＴ細胞（H9）から選択され、好ましくはT抗原細胞を過剰発現するヒト胚性腎臓（HEK）293細胞である。トランスフェクションは、好ましくは、前記Current Protocolsに記載されるとおり、リン酸カルシウム法により行なわれる。細胞の形態は、トランスフェクションから１〜１５０時間後に、好ましくは４〜３５時間後、最も好ましくはトランスフェクションから24時間後に評価される。
【０１５６】
Cariの内因性産生を誘導および／または増強するためのベクター、または正常に休止状態であるCariインヒビターの使用も、本発明で考慮される。ベクターは、CariまたはCariインヒビターの発現が望まれる細胞での機能的な調節配列を含み得る。このような調節配列は、例えば、プロモーターまたはエンハンサーであり得る。その後、調節配列は、相同組換えにより、ゲノムの正しい遺伝子座に導入され、調節配列を遺伝子に操作可能に連結され、所望の発現が誘導または増強される。該技術は、通常、「内因性遺伝子活性化」（EGA）と呼ばれ、例えば、国際公開第91／09955号パンフレットで記載されている。
【０１５７】
同じ技術を使用して、すなわち、例えば、サイレインシング要素などの負の調節要素をCariの遺伝子座に導入し、Cari発現のダウンレギュレーションまたは妨害を導くことによって、Cari発現を遮断することも可能であることは、当業者に理解される。当業者は、Cari発現のこのようなダウンレギュレーションまたはサイレンシングが、疾患の予防および／または治療のために、Cariインヒビターの使用と同じ効果を有することを理解するだろう。
【０１５８】
本発明の方法により、カスパーゼ結合ポリペプチドのスクリーニングで得られたクローンは、部分的クローンであり得る。必要であれば、完全なクローンの作製は、さらに前記している。本発明のスクリーニングで最初に見出された完全なクローン、および部分的なクローンのDNA配列は、多様な用途を見出し得る。
【０１５９】
例えば、Cariの発現を操作するためには、細胞中のアンチセンスRNAの産生が望ましいかもしれない。この目的のために、Cariポリペプチドをコードする完全または部分的なcDNA、好ましくは９個のヌクレオチドは、前記のとおり、プロモーターを含む発現ベクターに挿入される。それにより、cDNAの3'末端は、プロモーターの3'末端に隣接して挿入され、cDNAの5'末端は、該cDNAにより、プロモーターの3'末端から分離される。したがって、細胞でのcDNAの発現により、ポリペプチドをコードしていないアンチセンスRNAが産生される。細胞でのアンチセンスRNAの存在は、Cariの細胞の（ゲノムの）コピーの発現を減少させる。
【０１６０】
アンチセンスRNAの産生のために、完全なcDNAを使用し得る。また、その断片を使用できる（その断片の長さは、約９〜2,000個のヌクレオチドであり、より好ましくは15〜500個のヌクレオチド、最も好ましくは20〜150個のヌクレオチドである）。
【０１６１】
合成オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用し得る。オリゴヌクレオチドは、好ましくはDNAオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは、好ましくは９〜150個の間、より好ましくは12〜60個の間、最も好ましくは20〜50個の間のヌクレオチドであり、例えば、配列番号：６および配列番号：７にある配列である。
【０１６２】
アンチセンスRNAの作用機序、およびアンチセンスツールの使用の技術の現状は、Kumarら、Microbiol Mol Rev．62巻、1415−1434頁、1998で検討されている。BMP受容体合成の阻害におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用は、Yehら、1998年に記載されている。電位依存性カリウムチャネル遺伝子Kv1.4の合成を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用は、Meiriら、1998年に記載されている。Bcl-xの合成の阻害についてのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用は、Kondoら、1998年に記載されている。
【０１６３】
アンチセンス薬剤の治療的使用は、Stix 1998年、Flanagan、1998年、GuinotおよびTemsamani、1998年、およびそこでの参考資料で検討されている。
【０１６４】
所望の特性を増強するオリゴヌクレオチドの修飾は、一般に、アンチセンスオリゴヌクレオチドを設計するときに、使用される。例えば、ホスホロチオエート結合は、主に、このようなホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが、細胞酵素による変性する傾向が低いので、DNAで天然に生じるホスホエステル結合の代わりに使用される。Pengらは、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの望まれないインビボの副作用が、混合ホスホジエステル−ホスホロチオエート骨格を使用したときに、減少され得ることを教示する。好ましくは、オリゴヌクレオチドの60％で2'−メトキシリボヌクレオチド修飾が使用される。このような修飾オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドで観察される効果に匹敵するアンチセンス効果を誘発できる。Pengらは、さらに、リボヌクレアーゼＨ活性を支持できないオリゴヌクレオチドムテインが不活性であることを教示している。
【０１６５】
したがって、本発明の好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、混合ホスホジエステル−ホスホロチオエート骨格を有する。最も好ましくは、オリゴヌクレオチドの約30％から80％、最も好ましくは約60％に2'−メトキシリボヌクレオチド修飾が使用される。
【０１６６】
さらなる修飾が、アンチセンスオリゴヌクレオチドに導入され得る。例えば、オリゴヌクレオチド分子は、任意に部分的に不飽和脂肪族炭化水素鎖、および１つまたはそれ以上の極性または電荷を帯びた基（カルボン酸基、エステル基、およびアルコール基など）を含む基に連結され得る。また、オリゴヌクレオチドは、ペプチド構造（好ましくは膜作用性ペプチド（membranotropic peptide）である）に連結され得る。このような修飾オリゴヌクレオチドは、膜をいっそう容易に透過し（それは、その機能に重要である）、その活性を著しく増強し得る。膜透過性は、特に、脳に達することが望まれるアンチセンス薬剤には望ましい。パルミチル連結オリゴヌクレオチドは、Gersterら、1998年に記載されている。ゲラニオール連結オリゴヌクレオチドは、Shojiら、1998年に記載されている。ペプチドに連結されたオリゴヌクレオチド、例えば膜作用性ペプチド、およびその作製は、Soukchareunら、1998年に記載されている。ある細胞に対してある分子に対して標的され、該細胞によるオリゴヌクレオチドの取り込みを増強するアンチセンス分子または他の薬剤の修飾は、Wang,J、1998年に記載されている。
【０１６７】
遺伝子の公知mRNA配列を得て、該mRNA配列に特異的に結合し、切断するRNA分子であるリボザイムを設計し得る（例えば、Chenら、1992年、ZhaoおよびPick、1993年、Shoreら、1993年、JosephおよびBurke、1993年、Shimayamaら、1993年、Cantorら、1993年）。
【０１６８】
したがって、リボザイムをコードするRNA配列は、本発明のCariポリペプチドのmRNAを切断するように設計され得る。切断点は、好ましくは、コーディング領域、または5'非翻訳領域、より好ましくはAUG翻訳開始コドン付近のコーディング領域の5'部分に配置される。
【０１６９】
本発明によるリボザイムをコードするDNAは、DNAの取り込み、修飾DNAの取り込み（以下、本明細書に記載されるとおり、増強された膜透過性に至るオリゴヌクレオチドおよびタンパク質のついての修飾を参照）、または以下、本明細書で詳述されるように、ウイルス性ベクターで仲介された遺伝子移入の方法により、細胞に導入され得る。
【０１７０】
したがって、本発明は、Cari、それに由来するペプチド、突然変異体、特異的抗体、該タンパク質をコードするDNA、リボザイム、アンチセンスDNA分子、およびオリゴヌクレオチドを提供する。これらツールによる治療的または研究に関連した使用は、生きた生物の細胞へのそれらの導入を必要とする。この目的のために、ペプチド、ポリペプチドおよびオリゴヌクレオチドの膜透過性を改善することが望まれる。親油性構造を有する誘導体化は、増強された膜透過性を有するペプチドおよびポリペプチドの作製において使用され得る。例えば、前記のとおり周知の膜作用性ペプチドの配列を、該ペプチドまたはポリペプチドの配列に付加し得る。さらに、該ペプチドまたはポリペプチドは、少なくとも１つの極性または電荷を帯びた基で置換されている前記炭化水素鎖などの部分的な親油性構造により誘導体化され得る。例えば、ペプチドのラウロイル誘導体は、Muranishiら、1991年に記載されている。ペプチドおよびポリペプチドのさらなる修飾は、Zachariaら、1991年に記載されるように、メチオニン残基の酸化を包含することにより、スルホキシド基を作り出す。Zachariaおよび共働者は、比較的疎水性のペプチド結合が、そのケトメチレンイソエステル（COCH2）で置換されているペプチドまたは誘導体についても記載している。ポリペプチドおよびペプチド化学の当業者に周知のこれらおよび他の修飾は、膜透過性を増強する。
【０１７１】
膜透過性を増強する他の方法は、ペプチドまたはポリペプチドの細胞への取り込みを誘導するための、細胞表面でのウイルス受容体などの受容体の使用である。この機構は、特定の細胞表面の分子に特異的に結合するウイルスによりしばしば使用されている。結合により、細胞は、その内側にウイルスを取込む。細胞表面の分子は、ウイルス受容体と称される。例えば、インテグリン分子CARおよびAdVは、アデノウイルスについてのウイルス受容体として記載されている（Hemmiら、1998年、およびそこでの参考資料参照）。CD4、GPR1、GPR15およびSTRL33分子は、HIVについての受容体／共受容体として同定された（Edingerら、1998年およびそこでの参考資料参照）。
【０１７２】
したがって、細胞表層受容体に結合することが知られている分子に、ペプチド、ポリペプチドまたはオリゴヌクレオチドを接合することにより、該ペプチド、ポリペプチドまたはオリゴヌクレオチドの膜透過性を増強するであろう。接合体を形成するための適切な基についての例は、糖、ビタミン、ホルモン、サイトカイン、トランスフェリン、アシアロ糖タンパク質、およびそれらの同等分子である。Lowら、米国特許第5,108,921号明細書には、ペプチド、ポリペプチドおよびオリゴヌクレオチドの膜透過性を増強する目的のこれらの分子の使用、および該接合体の作製が記載されている。
【０１７３】
Lowおよび共働者は、さらに、葉酸塩またはビオチンなどの分子が、これらの分子の受容体が豊富であること、および非特異的に発現することから、生物中の複数の細胞に対し該接合体を標的にするために使用され得ることを教示する。
【０１７４】
また、本発明のペプチド、ポリペプチドまたはオリゴヌクレオチドの膜透過性を増強するための細胞表層タンパク質の前記使用は、本発明の該ペプチド、ポリペプチドまたはオリゴヌクレオチドがその細胞のタイプまたは組織に対して標的するようにすることにより使用され得る。例えば、癌細胞を標的にすることが望まれる場合、これらの細胞表面でより豊富に発現される細胞表層タンパク質を使用することが好ましい。例としては、葉酸塩受容体、ムチン抗原（MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5B、およびMUC7）、糖タンパク質抗原KSA、癌胎児性抗原、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、HER-2／neu、およびヒト慢性ゴナンドロピン−ベータである。前記Wangら、1998年は、癌細胞を標的にする葉酸塩の使用法を教示しており、Zhangら、1998年は、種々のタイプの癌および正常な細胞で、他の前記抗原が各々相対的に豊富であることを教示している。
【０１７５】
したがって、本発明のポリペプチド、ペプチドまたはオリゴヌクレオチドは、前記接合技術を使用して、所望するように、特定の細胞型を標的し得る。例えば、リンパ球系の細胞でアポトーシスを増強することが望まれる場合、本発明のCariペプチド、その断片、突然変異体および誘導体は、例えば、これらの細胞で発現されるMHCクラスII分子を使用することにより、このような細胞を標的し得る。これは、抗体、または該MHCクラスII分子の定常領域に対して指向されたその抗原結合部位を、本発明のポリペプチドまたはペプチドと結合することにより達成され得る。さらに、種々のサイトカインおよび他の細胞伝達分子のついての膨大な細胞表層受容体が記載されており、そしてこれらの分子の多くは、多かれ少なかれ組織−または細胞−型の制限形態で発現される。したがって、Ｔ細胞のサブグループを標的にすることが望まれる場合、CD4Ｔ細胞表層分子は、本発明の接合体を産生するために使用され得る。CD4結合分子は、その表面抗原gp42が、CD4分子に特異的に結合できるHIVウイルスにより提供される。本発明のアポトーシス増強Cari、突然変異体またはペプチドは、紅斑性狼瘡患者などの、Ｔ細胞に基づく自己免疫反応を罹っている患者の治療においてＴ細胞を有利に標的し得る。
【０１７６】
本発明のポリペプチド、ペプチドおよびアンチセンス配列は、ウイルス性ベクターの使用により、細胞に導入され得る。この目的のためのワクシニアベクターの使用は、前記Current Protocols in Molecular Biologyの第16章で詳述される。アデノウイルスベクターの使用は、例えば、Teohら、1998年、Narumiら、1998年、Pedersonら、1998年、Guang-Linら、1998年、およびそこでの参考資料、Nishidaら、1998年、Schwarzenbergerら、1998年、およびCaoら、1998年に記載されている。アンチセンス配列のレトロウイルスの移入は、Danielら、1998年に記載されている。
【０１７７】
Cariが関与される疾患を治療および／または予防するために、それぞれ、Cari産生および／または作用の阻害または誘導のいずれかのために、アポトーシスの阻害が要求される場合は、Cariインヒビターの配列を含む遺伝子治療ベクター、またはアポトーシスの増強が要求される場合は、Cari配列を含む遺伝子治療ベクターを、罹っている関節に直接的に注射し、例えば、ベクターの希釈、標的細胞または組織の到達および標的化、ならびに副作用などの遺伝子治療ベクターの全身投与に関連した問題を避けることができる。
【０１７８】
ベクターとしてウイルスを使用する場合、一般に、ウイルス表層タンパク質が、ウイルスを標的にするために使用される。前記アデノウイルスなどの多くのウイルスは、細胞向性にむしろ非特異的であるので、細胞型または組織に特異的なプロモーターを使用することにより、さらに特異性を付与することが望まれ得る。Griscelliら、1998年は、アデノウイルスにより移入が仲介される遺伝子を心臓特異的に標的するために、心室特異的心臓ミオシン軽鎖２プロモーターを使用することを教示している。
【０１７９】
また、ウイルスベクターは、その表面にさらに追加のタンパク質が発現されるように操作され得るか、またはウイルスベクターの表面タンパク質を、望ましいペプチド配列を組み込むように変化され得る。このように、ウイルスベクターを、該ウイルスベクターを標的にするために使用され得る１つまたはそれ以上の追加のエピトープを発現するように操作させ得る。例えば、サイトカインエピトープ、MHCクラスII結合ペプチド、またはホーミング分子由来のエピトープは、本発明の教示にしたがってウイルスベクターを標的にするために使用され得る。
【０１８０】
したがって、Cariは、ヒト患者の望ましい部位で内因量のCariを減少または増大させることによって、遺伝子治療に使用できる。
カスパーゼ−８とのCariの相互作用は、いくつかの重大性を秘めている：
第１に、アポトーシスの調整。これは本明細書において、過剰発現したCariが、p55TNFRの過剰発現により誘導されたアポトーシスを可能にするインビボアッセイにおいて証明される。P72過剰発現、またはFasリガンドによる刺激。ある実施態様では、切断不可能な変異体p72 D600Eは、Fasリガンド細胞死の相乗作用において野生型Cariより強力であることが示された。この結果の可能性のある説明としては、Cariがプロカスパーゼ−８の活性カスパーゼ−８への変換に関与することであり得る。つまり、切断不可能なCariは、プロカスパーゼ−８の活性カスパーゼ−８への変換を連続的に誘導し、野生型Cari（活性カスパーゼ−８により漸次切断および不活性化できる）と違ってアポトーシスを増大する。Cariは、RNA結合モチーフを有し、その結果、その作用の機構は、翻訳速度および／または様々のmRNA転写産物の回転率における変化に関与する可能性があり、そしてそれらは、結果的に細胞死の調整に関与する重要なタンパク質の発現をもたらす。
【０１８１】
第２に、Cariの活性を調整し得る。これは、本明細書ではCariを切断するカスパーゼ−８の能力により証明される。Cariは切断により不活化されるようである。しかし、Cariの活性が変化されること、新規活性が誘導されること、またはCariポリペプチドが、ちょうどカスパーゼ自身のように、切断により活性化されることも可能である。
【０１８２】
よって、Cari、突然変異体、好ましくはCari／p72 D600E変異体、ペプチド、例えば、アミノ酸残基414から437まで（配列番号：４）および残基422から437まで（配列番号：５）を含むCari中のカスパーゼ−８結合ドメイン、cariアンチセンスなどのオリゴヌクレオチド、およびCariに対する特異的抗体は、カスパーゼ−８の活性およびアポトーシスを調整に有用である。
【０１８３】
カスパーゼ−８のダウンレギュレーションは、アポトーシスにより過剰の細胞死が起こる状況で望ましい。例えば、一次的乏突起膠細胞疾患を伴う多発性硬化症、自己免疫ブドウ膜炎、糖尿病、狼瘡、自己免疫心筋炎Ｉ、病因を問わず急性肝不全、HCV仲介慢性肝炎、慢性胃炎、例えば、Ａ型胃炎、混合性結合組織病（MCTD）、クローン病、および潰瘍性大腸炎などの炎症性疾患では、体組織の破壊が、アポトーシス性シグナルにより引起こされることが示唆されている。したがって、アポトーシス性細胞死により破壊された細胞においてカスパーゼ−８活性を下方調整することは、これらの疾患を患っている患者に有益であり得る。
【０１８４】
同様に、Cari414〜437およびCari422〜437などの本発明のペプチドまたはポリペプチドは、前記列挙された疾患の他、および他の疾患（体組織を観察すると、過剰のアポトーシス細胞死が損傷を仲介することが見受けられる疾患）に関与する他の細胞型を標的にし得る。
【０１８５】
カスパーゼ−８活性のアップレギュレーションおよびCariによるアポトーシスの増大は、過剰の細胞死が要求される状況で利用され得る。
【０１８６】
例えば、前記乏突起膠細胞疾患で、乏突起膠細胞でのカスパーゼ−８活性を阻害することが望まれる。細胞表面Ｇタンパク質結合リン脂質リゾホスファチジン酸受容体は、乏突起膠細胞および種々の他の脳細胞で発現されるが、体の他の組織では発現されない。TNF受容体シグナル伝達経路またはカスパーゼ−８依存性アポトーシスが、CARIの活性を要求することが実施態様の内の１つで証明されたので、Cariの小型ペプチド、例えば、２４個のアミノ酸のCariポリペプチド（Cari414〜437）は、カスパーゼ−８結合が見出され、カスパーゼ−８により仲介されたアポトーシスを阻害するために乏突起膠細胞を標的し得る。これは、該ペプチドまたはポリペプチドを、リン脂質リゾホスファチジン酸に結合させるか、またはウイルスベクターが該リン脂質リゾホスファチジン酸受容体に特異的に結合するように、該リン脂質リゾホスファチジン酸受容体を特異的に認識する抗体の配列を該ウイルスベクターに導入することにより達成し得る。
【０１８７】
また、本発明のアンチセンスRNA、ＡＡＧＡＧＧＡＴＡＡＧＧＴＡＧＡＧＣＴＣＣ（１１６９〜１１９０）（配列番号：６）などのヒトCari cDNA由来の、および／または3'−非翻訳領域ＡＡＴＧＡＣＣＡＡＣＣＧＴＣＣＣＴＧＧＡＣ（３′２６〜４７ｂｐ）（配列番号：７）由来の配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ならびに本発明のリボザイムは、前記乏突起膠細胞、または他の疾患における対応の細胞を同様に標的し得る。その場合には、Cariポリペプチドの発現は、カスパーゼ−８自身の発現というよりむしろ阻害される。Cari発現の阻害は、カスパーゼ−８のアポトーシス効果を減少し得る。しかし、特定の内因性Cariポリペプチドが、カスパーゼ−８活性のネガティブレギュレーターとして作用できる場合、Cariポリペプチド発現の減少は、実際はカスパーゼ−８の効果を増大し得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスRNAの使用ならびにリボザイムの効果は、このような薬剤が治療に考慮される以前に、例えば、前記アッセイでまず試験されなければならない。
【０１８８】
一方、カスパーゼ−８活性を増大することが望まれ得る状況がある。これは、前記した疾患と同じ症例、例えば、全身性紅斑性狼瘡での症例であり得る。しかし、標的にされるべき細胞型は異なる。例えば、狼瘡では、Ｔ細胞集団は、胸腺で破壊されない自己反応性細胞を含み得る。したがって、本発明のカスパーゼ−８アップレギュレーション剤は、Ｔ細胞を標的するべきである。カスパーゼ−８アップレギュレーション剤を自己反応性細胞に対して標的させることが好ましい。多発性硬化症などのある種の疾患では、特定のＴ細胞クローンは、疾患の発症に重要な役割を果たすと予測される。したがって、本発明によるカスパーゼ−８アップレギュレーション剤は、本発明によるCariポリペプチド、突然変異体またはペプチドであり得る、本発明のカスパーゼ−８上方調整剤を標的にするための、自己反応性Ｔ細胞クローンのＴ細胞受容体の可変領域に特異的に指向された１つまたはそれ以上の抗体を使用することによって、このような細胞に対して標的され得る。
【０１８９】
Cariによるカスパーゼ−８活性およびアポトーシスの増大は、癌を治療するためにも使用され得る。
【０１９０】
本発明は、本発明による１つまたはそれ以上のCariポリペプチド、変異体（好ましくはp72 D600E）、414から437までのアミノ酸残基（配列番号：４）、および422から437までのアミノ酸残基（配列番号：５）を含むようなペプチド、このようなCariをコードするベクター、その突然変異体、ならびに断片、cariに特異的な抗体、リボザイム、アンチセンスRNA、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドから選択される活性物質を含有する医薬組成物を包含する。
【０１９１】
活性タンパク質の治療的に有効量は、多くの変数、例えば、投与経路、患者の臨床上の症状の関数であろう。
【０１９２】
「治療的に有効量」とは、投与されるときに、Cariまたはそのアンタゴニストが、生物学的活性を示すようなものである。個人に、単回または複数回投与として投与される投与量は、薬物動態学的特性、投与経路、患者の症状および特徴（性別、年齢、体重、健康度、サイズ）、兆候の程度、同時に行なわれている治療、治療の頻度、ならびに望まれる効果を含めた多様な因子によって変化するだろう。確立された投与量範囲の調整および操作は、個人における効果を決定するインビトロおよびインビボ法と同様に、充分に当業者の能力の範囲内にある。
【０１９３】
本発明は、さらに、哺乳類細胞を感染させる能力のあるウイルス性ベクターを含有する医薬組成物を包含するものであって、該ベクターが、操作可能に連結されたプロモーターと、本発明によるCari、突然変異体（例えば、p72 D600E）、ペプチド（例えば、Cari414〜437またはCari422〜437）、リボザイム、アンチセンスRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはCari抗体をコードする本発明のDNA配列と含むものである医薬組成物を包含する。ウイルス性ベクターは、任意に、ウイルス表面に配置された、または哺乳類細胞の表層タンパク質に結合できるペプチドまたはタンパク質をコードするプロモーターに操作可能に連結されたコーディング配列を含む。表層タンパク質は、好ましくは、ウイルス性ベクターの取り込みを可能にするタンパク質であり、ウイルス性ベクターの標的化を可能にするように、組織−または細胞−型に特異的な手段で発現されるタンパク質である。
【０１９４】
本発明によるCari、その突然変異体、断片または誘導体、p72 D600E突然変異体、ペプチドCari414〜437またはCari422〜437、リボザイム、アンチセンスRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはCari抗体は、同じクラスの他のポリペプチド、すなわち、カスパーゼ−８に結合するものを単離、同定およびクローン化するために、または細胞内シグナル伝達過程に関与する、機能的に関連したプロテアーゼまたはタンパク質を単離するためにも使用され得る。
【０１９５】
この目的のために、前記免疫沈降系を使用し得るか、またはストリンジェントでないサザンハイブリダイゼーションののちPCRクローニングを使用する開発された系（Wilksら、1989年）の使用があり得る。Wilksらの出版物では、ストリンジェントでないサザンハイブリダイゼーションののちキナーゼモチーフの公知配列、着想されたキナーゼ配列に基づくPCRによる、２つの推定タンパク質−チロシンキナーゼの同定およびクローニングについての記載がある。このアプローチは、関連Cariポリペプチド配列を同定およびクローニングするために、Cariポリペプチドの配列を使用する本発明にしたがって使用され得る。
【０１９６】
本発明のCariポリペプチド、ムテイン、断片もしくはそれらの誘導体、またはCari抗体を利用する他のアプローチは、それらが、細胞内シグナル伝達過程に関与する、例えば、他のポリペプチドまたは因子に結合できる他のポリペプチドまたは因子を単離および同定するアフィニティークロマトグラフィーの方法において使用することである。Cari、そのムテイン、断片またはそれらの誘導体、Cari抗体を、アフィニティークロマトグラフィーマトリクスに個別に付着させ、その後、細胞内シグナル伝達過程に関与すると思われる細胞抽出物ヒト体液、または単離ポリペプチド、または因子と接触させた。アフィニティークロマトグラフィー手段ののち、本発明のCariポリペプチド、もしくはそのムテイン、断片、またはそれらの誘導体に結合する他のポリペプチドまたは因子を、溶出、単離および特徴付けできる。
【０１９７】
本発明は、強力な治療上の価値を示す、Cari中のカスパーゼ−８結合ドメイン（残基414〜437または残基422〜437）またはCariに対するアンタゴニスト分子の作製のためのCari抗体などのCariおよびそのペプチドの使用にも関する。これらの方法は、天然のアンタゴニスト、小型ペプチドアンタゴニストおよびペプチドでない化学的アンタゴニストの単離のための、Cariおよびその断片の使用を包含する。ハイスループットスクリーニングは、Cari標的に対する数千の化合物（例えば、コンビナトリアルケミストリーにより作製されたペプチドまたは化学的化合物）の結合活性を試験するロボットを使用する。試験された化合物は、コンビナトリアルケミストリーを通してのみならず、他のハイスループット合成法からも得られ得る。自動化技術は、スクリーニングできる分子のライブラリーの高速合成、別個の化合物の大量収集を可能にする。化合物は、CariまたはCari（414〜437）とカスパーゼ−８の相互作用の阻害に関してスクリーニングされ得る。アンタゴニスト分子は、プロカスパーゼ−８へのCariの結合を阻害する能力、またはCari、カスパーゼ−８もしくはTNF受容体ファミリーリガンドにより仲介される細胞死を阻害する能力によっても検出され得る。より広範囲でかつより多様な化合物ライブラリーの作製は、ライブラリー内の有益な薬剤を見出す可能性を増大させる。
【０１９８】
前記のとおり、Cari、そのムテイン、断片、またはそれらの誘導体は、それらに対しする特異的抗体を産生するための免疫原（抗原）としても使用され得る。これらの抗体は、細胞抽出物、またはCariポリペプチド、そのムテインもしくは断片を産生する形質転換細胞系の培地のいずれかから、Cariポリペプチドを精製する目的のためにも使用され得る。さらに、これらの抗体は、カスパーゼ−８仲介FASまたはTNF系の異常な機能化に関連した障害を認識する診断目的のために使用され得る。したがって、このような障害は、カスパーゼ−８、またはCariポリペプチドを含む機能不全の細胞内シグナル伝達系に関しているにちがいなく、このような抗体は、重要な診断道具として役割を果たす。Cariを使用して産生されるこのような抗体、特に充分にヒト化された抗体（例えば、細胞内発現抗体、前記参照）は、治療的価値も有し得る。
【０１９９】
本発明によるポリペプチドまたは同じクラスのポリペプチドの単離、同定および特徴づけは、あらゆる周知の標準スクリーニング手段を使用して行なわれ得ることにも注目すべきである。例えば、これらのスクリーニング手段の内の１つは酵母２−ハイブリッド法である（Stangerら、1995年を参照）。同様に、前記および以下に示されるとおり、当技術分野で充分に知られているとおり、アフィニティークロマトグラフィー、DNAハイブリダイゼーション手段などの他の手段を、本発明のポリペプチドを単離、同定および特徴付けするために、または本発明のポリペプチドに結合できる追加のポリペプチド、因子、受容体などを単離、同定および特徴付けするために使用し得る。
【０２００】
今や本発明は記載されているため、本発明は、説明する手段として提供され、本発明を制限することを意図するものではない以下の実施例を参考にすることによって、より容易に理解されるだろう。
【実施例】
【０２０１】
［実施例１］
カスパーゼ−８に特異的なモノクローナル抗体作製のためのマウスの免疫化
活性化ののち、カスパーゼ−８を切断し、２つのサブユニットにする（Sub-1およびSub-2）。
【０２０２】
カスパーゼ−８活性化ののち形成され、新規であり得るエピトープに特異的な抗体を作製するために、Sub-1のＣ末端、ならびにSub-1およびSub-2のＮ−末端に由来する合成ペプチドを使用してマウスを免疫した。
【０２０３】
以下のペプチドを使用して、モノクローナル抗体作製のためにマウスを免疫した。
【０２０４】
ペプチド179：カスパーゼ−８の大サブユニット（Sub-1）のＣ末端に対応するペプチドＣＱＧＤＮＹＱＫＧＩＰＶＥＴＤ（残基Cys360〜Asp374に対応するエピトープ、図１）を合成し、逆相HPLCによって精製し、その天然のシステインを通して担体KLHに結合して、担体の表面にペプチドを露出させた。
【０２０５】
ペプチド182：カスパーゼ−８の小サブユニットのＮ末端に対応するペプチドＬＳＳＰＱＴＲＹＩＰＤＥＡＤＣ（Sub-2、残基Lys385−Gly399）を合成し、逆相HPLCによって精製し、Sub-2の配列に由来しないCを通して担体KLHに結合した。
【０２０６】
ペプチド183：Sub-1のＮ末端に対応するペプチドＳＥＳＱＴＬＤＫＶＹＱＭＫＳＫＰＲＣ（残基Ser217〜Gly234）を合成し、逆相HPLCによって精製し、そしてSub-1の配列に由来しないＣを通して担体KLHに結合した。
【０２０７】
同量の抗原（ペプチド−KLH）による４回の免疫および２回の追加免疫（boost）を、以下のようにマウスに投与した。
【０２０８】
50μgのペプチド−KLHによる最初の免疫化を50μl PBSに溶解し、50μl完全フロイントアジュバントで均質化し、ついで５匹の7週齢Balb／Cの雌マウスの各々の足の裏に注射した。
【０２０９】
第１の免疫化の２週間後に行なった第２の免疫化のために、マウスを、不完全フロインドアジュバントの50％（v／v）溶液中同量のペプチドで筋肉内に追加免疫した。
【０２１０】
第２の免疫化の２週間後に行なった第３の免疫化のために、マウスを、50μl PBS中50μgのペプチド−KLHで、腹膜内注射した。
【０２１１】
注射したマウスの血清を、第２および第３の免疫化の10日後に試験した。
【０２１２】
第４の免疫化（ペプチド182および183のみで行なわれた）を、第３の免疫化と同じ方法で、１ヶ月後に行なった。
【０２１３】
第４の免疫化（またはペプチド179で促されたマウスの第３の免疫化）の１ヶ月後に、（第３および第４の免疫化と同じ方法で）２日の間隔内で、２回の追加免疫を行なった。
【０２１４】
４日後、最も高い特異的免疫反応性を示す２匹のマウスの脾臓および鼠蹊リンパ節を、ミエローマ細胞との融合のために取出した（Eshhar Zm, 1985）。
【０２１５】
［実施例２］
カスパーゼ−８に特異的なポリクローナル抗体作製のためのウサギの免疫化
特異的ポリクローナル抗体作製のために、ウサギを、179-KLHおよび183-KLHで免疫化した。
【０２１６】
100μｇのペプチド-KLH（50μlのPBSに溶解し、50μl完全フロイントアジュバントで均質化された）で第１の免疫化を行ない、皮下に注射された。同量のペプチド−KLHで２週間後に、第２の免疫化を行ない、不完全フロイントアジュバントで２週間後に筋肉内に注射した。これらの２回の免疫化ののち、PBS中に溶解された同量のペプチド−KLHによる２回の追加免疫をし、２週間の間隔で皮下に投与した。
【０２１７】
［実施例３］
ハイブリドーマ作製、抗体産生クローンの選択、および腹水からの抗体の調製
Eshhar Z、1985年におけるプロトコールにしたがって、融合プロセスおよびハイブリドーマ細胞選択を行なった。手短に言うと、２匹の反応性マウスからの脾臓およびリンパ節細胞110×106の混合物を、PEGを用いた短いインキュベーションにより、32×106のNSO／1ミエローマ変異ミエローマ細胞と融合させた。PEGを、まずDMEMで徐々に希釈し、ついで、遠心分離により完全に除去した。細胞を、DMEM−HAT培地に再懸濁し、約2.5×104細胞／ウェルの濃度で96穴プレートに分配し、37℃で８％のCO2インキュベーターでインキュベーションした。全てのハイブリドーマウェル中の培地を、10％ウマ血清（HS）で補足されたDMEMに交換した。ハイブリドーマ培養上清サンプルを、ELISA（以下実施例１２に記載）によって、融合から２週間後の特異的Mabの存在についてスクリーニングした。細胞上清中で特異的抗体の存在が検出されたウェルからの細胞を、24穴プレートに移した。陽性細胞を、２回サブクローニングした：この段階で、全サブクローンは、陽性であることが分かった。クローンを、24穴に、その後25cm2のＴフラスコに広げた。拡張培養物を、特異的Mabの分泌について監視した。陽性培養物からの細胞のアンプルを、凍結し、そして液体窒素で保存した。
【０２１８】
ペプチド179に対する特異的抗体を検出するためにスクリーニングされたおよそ700クローンの内、１つだけ陽性クローンを見出し（Mab179）、ペプチド182に対する特異的抗体を検出するためにスクリーニングされたおよそ700クローンの内、１つだけ陽性クローンを見出し（Mab182）、そしてペプチド183に対する特異的抗体を検出するためにスクリーニングされたおよそ1100クローンの内、２つだけ陽性クローンを見出した（Mab183.1および183.2）。陽性クローンを、96穴プレートでの限界希釈によりサブクローニングした。成長中のクローンから得た上清を、数回、ELISA（実施例１２に記載）により特異的抗体について試験した。
【０２１９】
陽性ハイブリドーマ・クローンを、15％ウマ血清を含むDMEM中の組織培養フラスコで生育させ、アンプルを培養物の一部から凍結させた。並行して、異なるハイブリドーマ・クローンの細胞を、２〜４匹のマウスに各々注射して、腹水液を得た。マウス免疫化のために使用される合成ペプチド（ペプチド179、182または183）に結合したBSA（Pierce Cat 77116）と架橋したアフィゲルビーズ（アフィゲル15、バイオラッド（Biorad））を使用するアフィニティー精製により、抗体を、腹水液から精製した。
【０２２０】
抗体精製については、50％硫酸アンモニウムにより沈殿された腹水を、０℃で16時間、PBSで透析した。透析ののち、分取を、０℃で、16時間、１mlアフィゲル−BSA−ペプチドビーズとインキュベーションし、そして予備インキュベーションしたビーズを使用して1mlカラムに充填した。最初に、カラムを、10ml PBSで洗浄し、続いて、1M NaClを含む10mM トリスpH7.5で洗浄し、ついでPBSで洗浄した。抗体を、100mMグリシンHCl（pH2.7）および0.5M NaClを含む溶液でカラムから溶出させた。1ml分画を、溶出剤の中和のために40μlのトリス基材を含む試験管に収集した。25ml腹水から、約5〜13.6mgの精製抗体を得た。
【０２２１】
［実施例４］
モノクローナル抗体アイソタイプ
市販のアイソタイピングキット（Southern Biotechnology Associates, INC cat 5300-05）を使用し、取扱説明書のアッセイ手段により、モノクローナル抗体のアイソタイプを決定した。Mab183および179は、IgG1と同定され、一方、Mab182は、IgMクラスのものであることが分かった。
【０２２２】
［実施例５］
Mab179、182および183を用いるカスパーゼ−８の免疫沈降
前記実施例３に記載される様々なモノクローナル抗−カスパーゼ−８抗体を、休止および活性化BjaB細胞の溶解物由来のカスパーゼ−８を免疫沈降する能力について試験した（以下、実施例１３参照）。Bjab系は、バーキットリンパ腫のアフリカ人の症例由来の継代リンパ腫細胞系である（Clements GBら、1975）。
【０２２３】
BjaB細胞を、１時間、Fasリガンドで刺激した。細胞溶解物を、刺激の前後のBjaB細胞から調製した。（実施例13に記載されるとおり）Mab179、182および183を用いる免疫沈降ののち、対応のペプチドで溶出された「消耗溶解物（depleted lysate）」およびカスパーゼ−８を、SDS-PAGEおよび銀染色、または１次抗体として抗Sub-1抗体を用いるウエスタンブロット解析（Cell Signaling Technology Caspase-8 ICI2 Cat 9746）により解析した。
【０２２４】
図２は、Mab179、183.1および183.2、ならびに182を用いる免疫沈降の後に得られた全細胞抽出物および「消耗溶解物」のウエスタンブロット解析（以下の実施例１１で記載されるとおりに行なわれる）を示す。
【０２２５】
未刺激細胞（レーン２、４、６、８および10）において、プロカスパーゼ−８アイソフォームα１およびα２（プロカスパーゼ−８  53／55 kDa）に対応するバンド二重線を、全細胞抽出物（レーン２）および抗183および抗182抗体で得られた消耗溶解物（レーン６、８および10）で検出し、対照に、プロカスパーゼ−８は、Mab179で得られた消耗溶解物では検出されなかった（レーン４）。これらの結果は、Mab179が、プロカスパーゼ−８を免疫沈降することを示す。
【０２２６】
刺激細胞では、全細胞抽出物中のプロカスパーゼ−８のレベルは、より低かった（レーン１）。活性化カスパーゼ−８断片に対応する別のより小さいバンドが、活性化において出現した、すなわち、アイソフォームα１およびα２に対応する部分的にプロセシングを受けたカスパーゼ−８（部分的にプロセシングを受けたカスパーゼ−８  p41／43、Sub-3を欠く）の二重線、およびSub-1に対応するより小さいバンド（p20）。プロカスパーゼ−８の最小量の消耗、およびMabによる活性化カスパーゼ−８断片を、Fasリガンドで刺激された細胞の溶解物で試験した（図２  レーン３、５、７、９および11）。
【０２２７】
活性化カスパーゼ−８は、Sub-2に結合したSub-1からなるため、Mab182での免疫沈降によるSub-2の除去は、結果的に、Sub-1の消耗至るはずであるので、Sub-2に特異的なMab182によるSub-1の消耗も試験した。
【０２２８】
刺激細胞溶解物からのカスパーゼ−８の免疫沈降によると、正常なマウス血清コントロール（図２  レーン11）と同様Mab182、183.1および183.2は、少量の残存するプロカスパーゼ−８または活性カスパーゼ−８の断片（それぞれ、レーン９、７、５および11）を除去しないことが示される。これらの結果とは対照的に、Mab179での細胞溶解物の処理（レーン３）は、活性カスパーゼ−８断片だけでなく、全てのポリカスパーゼ−８を有効に除去した。
【０２２９】
図３ａ（ウエスタンブロット解析）および３ｂ（銀染色によるタンパク質検出）は、Mab179、182および183.1および183.2抗体により免疫沈降したプロカスパーゼ−８および活性カスパーゼ−８の断片は、それぞれのペプチド（種々の抗体を生じさせた）との競合により上清中に有効に回収できた（実施例１３）。
【０２３０】
未刺激細胞（図３ａ、レーン２、４、６、８および10、および図３ｂ、レーン２、３、６、８、および10）では、プロカスパーゼ−８は、Mab179での免疫沈降、およびペプチド179との競合（図３ａおよび３ｂ、レーン８）により、有効に回収された。刺激細胞では、活性化の後に残存する少量のプロカスパーゼ−８の代わりに、Mab179での免疫沈降により、タンパク質を有効に回収した（図３ａおよびｂ、レーン９）。プロカスパーゼ−８のある種の回収は、Mab183.2による非活性化細胞（図３ａ、レーン６）、およびMab183.1による活性化細胞（図３ａ、レーン５）で観察でき、ここでカスパーゼ−８の活性断片は、Mab182（図３ａ、レーン３）、183.1（図３ｂ、レーン５）および183.2（図３ａ、レーン７  p20のみ）による活性化細胞の溶解物で回収できた。
【０２３１】
得られた結果は、Sub-1のＣ末端に対応するペプチド（179エピトープ）に対して展開されたMab179が、活性化カスパーゼ−８についてと同様に、微量に存在する場合でさえ、プロカスパーゼ−８の免疫沈降および精製について非常に効率的であることを示した。
【０２３２】
同じ179エピトープに特異的なポリクローナル抗体（前記実施例１に記載されるとおりに調製）を作製し、179エピトープが、プロカスパーゼ−８および活性カスパーゼ−８の有効な免疫沈降および精製のために一般に使用できる抗体を誘導する特徴的能力を有するかどうか調べた。エピトープ179に特異的なポリクローナル抗体（レーン５および６、それぞれ、活性化および非活性化細胞について）、エピトープ182に特異的なモノクローナル抗体（レーン７および８、それぞれ、活性化および非活性化細胞について）による免疫沈降で得られた「消耗溶解物」を比較した。図４での結果は、明らかに、実際に刺激細胞溶解物由来のプロカスパーゼ−８およびカスパーゼ−８の断片が、ポリクローナル抗179抗体により細胞溶解物から有効に除去されること、およびそしてモノクローナル抗182抗体によるより有効でさえあることを示す。
【０２３３】
並行して、Mab183および183エピトープに特異的なポリクローナル抗体（実施例1に記載）を用いて行なった、休止細胞溶解物由来のプロカスパーゼ−８の免疫沈降および回収を、Mab179により得られたものと比較した。図５より、Mab183およびポリ183によるプロカスパーゼ−８の免疫沈降は、効果がないのに対して、Mab179によるプロカスパーゼ−８の免疫沈降は、極めて優れていることが示される。
【０２３４】
約5.6kDaの別のカスパーゼ−８誘導断片は、Mab179で行なわれた免疫沈降でのみ観察される（レーン３）。大型カスパーゼSub-1のＣ末端に対応するカスパーゼ−８の領域に対して展開された抗体は、カスパーゼに新規態様のプロセシングを課す独特の能力を有する。
【０２３５】
上で観察された結果は、他のエピトープとは異なり、カスパーゼ−８のエピトープ179が、プロカスパーゼ−８および活性化カスパーゼ−８の免疫沈降に非常に有効であり、プロカスパーゼ−８自動プロセシングを誘導できる特異的抗体を誘導する特別な能力を有することを示す。
【０２３６】
［実施例６］
カスパーゼ−８結合ポリペプチド（Cari）の単離および同定
カスパーゼ−８を効率的に免疫沈降する能力により、Mab179を活用して、カスパーゼ−８とカスパーゼ−８結合タンパク質を共免疫沈降した。
【０２３７】
BjaB細胞（Steinitz M,Klein G.1975年）を１時間、Fasリガンドで刺激し、ついで細胞溶解物を、刺激の前後の細胞から調製した。実施例１３に記載されるとおり、免疫沈降および溶出ののち、回収されたタンパク質を、SDS-PAGEにより分離し、銀染色により検出した。マウスIgG1での免疫沈降を、ネガティブコントロールとした。図６での結果は、一見約72.5kDaの分子量のポリペプチド（本明細書では、p72と言う）は、休止細胞からの溶解物中のプロカスパーゼ−８（p53／55）とともに共沈降されるが（レーン３）、刺激細胞からの溶解物中の活性カスパーゼ−８とでは沈降されない（レーン４）ことを示す。
【０２３８】
さらに、p72ポリペプチドは、未刺激HeLa、Raji、H9、K562、HL-60、CEMおよびHut78細胞（ATCC）から調製された溶解物においても、プロカスパーゼ−８とともに共免疫沈降されることが分かった。
【０２３９】
これらの結果は、ポリペプチド、p72が、一般に、プロカスパーゼ−８と結合されるが、活性カスパーゼ−８には結合されないことを示唆する。
【０２４０】
p72に対応するSDS-PAGE中のバンドを切取り、トリプシンで消化し、そして限定配列解析および質量分析解析に供した。トリプシン消化により得られた７つのペプチドを使用して、ヌクレオチド配列（またはEST）から推定されるタンパク質データベースを検索した。該タンパク質配列は、その機能が知られていない、遺伝子バンクに見られるヒトESTクローン（配列番号：１）の推定タンパク質配列の一部に適合した（受諾番号gi／2988397／gbAAC08052.1／（AC004475）。
【０２４１】
［実施例８］
p72をコードする全長cDNAの作製
p72をコードする全長cDNAを、以下のとおりに作製した：
ESTフォーム（実施例7）を、TIGRヒト遺伝子指数をスクリーニングするために使用し、この配列に適合する全てのESTのコンセンサスを含むTHCレポート（THC510568  配列番号：１）を得た。
【０２４２】
推定ポリペプチドの一部をコードするDNAクローンを、インサイト・ゲノミックス（Incyte Genomics）（IMAGE＃2964545）から購入した。クローンは、最初のメチオニンとそれに続く６個のアミノ酸（すなわち、21個のヌクレオチド）をコードするヌクレオチド配列を欠いていた。マウスおよびヒトのこれらのタンパク質配列は、非常に類似することが分かり（約90％の同一性）、したがって、マウスESTで欠失されていないマウスのタンパク質の最初のメチオニンとそれに続く６個の連続アミノ酸をコードするヌクレオチド配列を、欠損ヒト配列を完成させるために、ヒトゲノムの作業中の仮の配列と比較した。ホモサピエンスの19番染色体、クローンLLNLR−232E12の配列に対応する該当物を得た。このクローンは、p72の欠失している７個のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を確かにした。p72の全長cDNAを２回のPCR（Takara ExTaq, Takara, cat # R001Aを使用）により得た。それは、図８に概略的に表す。
【０２４３】
第１回PCRでは、インサイト・ゲノミックスから得られたクローンを鋳型とし、p72の実存配列とともに、21個の欠失ヌクレオチドのうち15個（下線）を含むように合成されたフォワードプライマー（図８、プライマー２）：ＣＴＣＡＡＧＡＴＧＧＡＣＡＡＣＣＧＧＧＡＴＧＴＴＧＣＡＧＧＡＡＡＧＧおよび終止コドンを有する3'領域の末端を含むリバースプライマー（図８、プライマー３）：ＣＣＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＴＡＧＴＡＡＧＧＣＣＧＴＣＴＧＧＧＡＴＴとともに使用した。
【０２４４】
第２回PCRは、鋳型として第１回PCRのPCR産物、および全21個の欠失ヌクレオチドと５つの実存するヌクレオチドを含むフォワードプライマー（図８、プライマー１）：ＡＡＴＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＧＴＣＴＣＡＡＧＡＴＧＧＡＣＡＡＣＣＧＧＧＡ、および同じリバースプライマー（図８、プライマー３）からなる。p72をコードする全cDNAを回収、配列決定し（配列番号：２）、アミノ酸配列を、ヌクレオチド配列（配列番号：３）から推定した。
【０２４５】
図１３における、全ESTのコンセンサスを含むTHCレポートで得られた配列（THC510568  配列番号：１）と、作製された全長cDNA（配列番号：３）により推定されるポリペプチドとの比較により、ESTにおいて７個の最初のアミノ酸を欠失していること、ESTにおいて２５個のアミノ酸配列を欠失していること、およびアミノ酸397の誤り（ロイシンの代わりにプロリン）が見出される。
【０２４６】
p72ポリペプチドは、３つの保存モチーフ（図７）を含むことが見出された：コイルドモチーフであるＣモチーフ、ポリペプチドのＮ末端付近の２つの縦列配置した「SURP」（「SWAP」モチーフとも呼ばれ、図７でＳとして示す）（Denhez FおよびLafyatis R、1994年）、および１つのＣ末端に配置している「Ｇ−パッチ」（図７は、Ｇとして示す）（Aracind LおよびKoonin EV 1999年）。SURPおよびＧ−パッチモチーフはいずれも、RNA結合に寄与すると考えられることから、p72の標的はRNA分子であり得ると示唆される。したがって、p72は、Cariと改名された（RNA結合モチーフを有するカスパーゼ−８付随ポリペプチド）。
【０２４７】
［実施例９］
カスパーゼ−８によるCariの切断
実施例８に示されるように、Cariは、刺激から１時間後に試験されるとき、活性カスパーゼ−８にではなく、プロカスパーゼ−８にのみ結合される。ある種のプロカスパーゼ−８は、刺激から20分後も、まだ検出され得る。Cariが、より短い刺激時間で、プロカスパーゼ−８と共沈できるかどうかを決定するために、20分間のみで活性化されたBjaB細胞を溶解し、Mab179で免疫沈降した。免疫沈降と溶出ののち、カスパーゼ−８および結合ポリペプチドを、SDS-PAGEにより分離し、ポリペプチドを銀染色により検出させた。おそらくCariに対応する72.5kDaの１つのバンド（図９、レーン３）は、刺激前の細胞からの溶解物において免疫沈降されるが、刺激から20分後に、Cariに加えると、一見約68kDaの低分子量を示すポリペプチドが検出された（図９、レーン４）。BjaB細胞から免疫沈降される両ポリペプチド72.5および68kDaを、質量分析解析に供した。トリプシン処理後、両ポリペプチドは、１つの明らかな相違以外は同様のペプチドプロファイルを示し、配列FRPNPLNNPR（残基632〜641）の別のペプチドが、72.5kDa（Cari）のＣ末端に存在するが、68kDaポリペプチドには存在しなかった。
【０２４８】
この結果は、細胞刺激により、約4.5kDaの断片が、おそらく活性化カスパーゼ−８により、CariのＣ末端から除去され、その結果、一見68kDaの分子量を有する小型ポリペプチド（残存しているプロカスパーゼ−８にまだ結合される）が生じることを示唆する。
【０２４９】
このような切断から生じる推定断片が、20分間の刺激ののちインビボで検出されたCari断片と類似の分子量を示すので、CariのＣ末端に配置する残基D600（図７）は、切断のための候補残基である可能性が考えられる。
【０２５０】
示唆されるとおり、Cariがカスパーゼ−８の基質であり、D600が切断のための標的残基であるかどうかを試験するために、インビトロ転写−翻訳および放射性アイソトープ標識（S35）Cari（TnTシステム）を、組換え活性カスパーゼ−８の作用に供した。Cari cDNAを、TnT T7結合網状赤血球溶解物システムを用いて、35Sメチオニンの存在下で、網状赤血球溶解物中で、インビトロで発現させ、組換え活性カスパーゼ−８（混合された大腸菌（イー．コリ（E.coli）で別個に作製された各Sub-ユニット１および２、ならびにインビトロでともに折畳み直されたもの）による切断に供した。簡潔には、インビトロ合成35S標識Cariを、細菌で産生された活性カスパーゼ−８の存在または非存在下で、30分間、37℃で、プロテアーゼ緩衝液（25mMヘペス（pH7.5）、0.1％ CHAPS、5mM EDTAおよび2mM DTT）中でインキュベーションした。タンパク質およびそれらの断片をSDS-PAGEで分離し、その結果を、ホスホイメージングにより視覚化した。結果（図１０）は、カスパーゼ−８の非存在下では、全長Cariに対応する72.5バンドのみ（レーン１）が、検出されたことを示す。このバンドは、１時間の活性化カスパーゼ−８の添加のちに消え、68kDaに対応する新たな小断片が出現する（レーン４）。この結果は、基質として使用されるCari cDNAによりコードされるタンパク質が、カスパーゼ−８により効率的に切断されることを示す。
【０２５１】
さらに、TnT転写翻訳系を、インビトロの２つの異なるCari変異体を産生するためにも使用した：１、インビボ実験から、カスパーゼ−８の標的残基であると思われる残基Ｄ６００をＥに変異されたCari（D600E）、および２、D600の下流で残基を欠っている欠失Cari（すなわち、発現タンパク質は１〜600残基を示す）。
【０２５２】
前記２つのCari変異体の切断を、活性組換えカスパーゼ−８の存在下（図１０、それぞれ、レーン５および６）、または非存在下（それぞれ、レーン２および３）で試験した。図１０（それぞれ、レーン３および６）に示されるとおり、Cari D600E変異体の同じタンパク質プロファイルが、カスパーゼ−８の存在または非存在下で観察されたことから、カスパーゼ−８は、Cari D600E変異体を切断しないことが示される。Cari 1〜600の突然変異体は、野生型Cariの切断後に産生される68kDa断片と同時に移動し、カスパーゼ−８の添加によりさらには切断されない（レーン２および５）。これらの結果は、活性化により、カスパーゼ−８は、D600残基でCariを切断することを示す。
【０２５３】
インビトロで行なわれた研究は、カスパーゼによるCariの切断が、Fasリガンド刺激から５〜20分後（図１１）の範囲内で、細胞で急速に起こることと、切断されたCari（またはむしろ、そのより長い断片）がプロカスパーゼ−８に結合したままであることを示唆する。
【０２５４】
［実施例１０］
Cariの機能的特徴付け
TNF受容体シグナル伝達経路により誘導されるアポトーシス性細胞死におけるCariの効果を分析するために、Cari cDNAもしくはアンチセンスCari（a／s）、またはネガティブコントロールとしてp72 cDNAの挿入物なしのベクターを使用した（pc）。cDNAを、pcDNA3.1発現ベクター（インビトロゲンから入手可能）に挿入し、pcDNA3ベクター（インビトロゲン）に挿入されたp55 TNFR受容体DNAとpEGFPC1発現ベクター（クロンテック（Clontech））に挿入されたレポーター遺伝子緑色蛍光タンパク質（GFP）とで、Ｔ抗原を構成的に発現するHEK293細胞に同時トランスフェクションした。
【０２５５】
24時間後、トランスフェクションされた細胞を、蛍光顕微鏡下で検討し、細胞死を、蛍光細胞の総集合の内のアポトーシス性形態を示す細胞の数を測定することにより記録した。Cariの過剰発現は、p55 TNF受容体の過剰発現により誘導される細胞死を可能にすることが分かった（図１２ａ、p72）。対照的に、アンチセンスcDNA構築物を、同時トランスフェクションのために使用した場合（図１２ａ、p72／a／s）、細胞は、p55TNFの過剰発現により誘導される死から保護された。
【０２５６】
この結果は、Cariが、TNF受容体シグナル伝達経路により誘導されるアポトーシス性細胞死を調整することを示す。
【０２５７】
一般に、FasLによるCD120aのような受容体を誘発は、アポトーシスの強力なシグナルを達成するために、シクロヘキシミドのようなタンパク質合成阻害剤の添加を必要とする。Fasシグナル伝達経路により誘導される細胞死におけるCariの効果を分析するために、シクロヘキシミドの添加なしの、Fasリガンド仲介細胞死におけるCari過剰発現の効果を、T抗原を構成的に発現するHEK293細胞（HEK−293T）で監視した。実験では、HEK−293Ｔ細胞を、ベクターpcDNA3.1、またはCariもしくはCariアンチセンスをコードするpcDNA3.1（それぞれ、pc、p72およびp72 a／s）と、レポーター遺伝子SEAP（分泌アルカリホスファターゼ）をコードするベクターpSBC-2（Dirksetら、1983年）と同時トランスフェクションした。24時間後、トランスフェクションされた細胞を、16時間Fasリガンドで誘導し、生育培地を新鮮な生育培地に交換した。24時間中、生育培地に分泌されたSEAPの量を測定することによって、細胞死を算出した（Boldinらによる記載されるとおり酵素的反応によって検出）。図１２ｂでの結果は、Cariアンチセンスではなく、Cariの過剰発現が、Fasリガンド刺激との組合わせで死を引起こしたことを示す。該結果は、Fasリガンド刺激の非存在下でのCariの過剰発現が、細胞死に何ら効果を有さないことも示す（示されず）。
【０２５８】
おそらくCariを遮断する、短期間干渉するCari RNAの安定な発現のための系であるpSuper-Cari過剰発現の効果を、Mach a1（カスパーゼ−８）の過剰発現により、またはFAS受容体（CI*）の膜貫通および細胞内部分に融合したp55 TNFR1の細胞外部分を含むキメラにより、HeLa細胞で誘導されるアポトーシスを試験した。
【０２５９】
HeLa細胞（2×105細胞）を接種し、プラスミド（骨格プラスミド、インビトロゲンから得られるpcDNA3）および3μg pSuperベクター（Brunmmelkampら、2002年、science 296-550）またはpSuper-Cari（pSuper-Cariは、ヒトCari cDNA由来の配列ＡＡＧＡＧＧＡＴＡＡＧＧＴＡＧＡＧＣＴＣＣ（1169〜1190、配列番号：６）、または3'非翻訳領域由来のＡＡＴＧＡＣＣＡＡＣＣＧＴＣＣＣＴＧＧＡＣ（3'26-47bp、配列番号：７）、および0.5μgのレポーターGFP遺伝子含有プラスミド（骨格プラスミド、pRGFP、クロンテック）を含むpSuperプラスミドの１：１混合物である）を含む２μg Mach a1またはCI*DNAを使用して同時トランスフェクションした。トランスフェクションから27時間後、細胞を蛍光顕微鏡下で試験し、細胞死をGFP含有細胞の形態により評価した。
【０２６０】
結果を、図１６で要約する。細胞の死は、Mach a1またはCI*を過剰発現させることにより誘導される（アポトーシスは、CL*過剰発現細胞でよりMach a1でいっそう上昇する）一方で、Mach a1またはCI*とともにpSuper-Cariとトランスフェクションされた細胞は、極めて減少したアポトーシスを示すか、またはアポトーシスを示さなかった。これらの結果は、TNF受容体シグナル伝達経路を介するか、またはカスパーゼ−８によるアポトーシスを導入が、Cariの活性を必要とすることを証明する。
【０２６１】
［実施例１１］
カスパーゼ−８免疫反応性血清の検出のためのウエスタンブロット解析
組換え精製Sub-1およびSub-2の混合物を、合成ペプチドで展開された抗体のウエスタンブロット解析のために使用した。簡潔には、12％SDSポリアクリルアミドゲルに、還元条件（40mM DTT）下で100ng／レーンのSub-1およびSub-2の混合物をロードした。１つのレーンに、低分子量マーカー（LMW）をロードした。ゲルで分離されるタンパク質を、電気溶出により、PVDF高結合−P（アマシャム）膜に移した。膜を、16時間、５％低脂肪乳、0.05％ツイーン20を含むPBSでインキュベーションした。膜を、細片に切断し、各細片を、１時間室温でマウス血清（1／2000に希釈）でインキュベーションした。膜細片を、0.05％ツイーン20を含むPBSで洗浄し（３×15分）、１時間、二次抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼに接合したヤギ抗−マウス（1：100000に希釈、Jakson））で室温で１時間インキュベーションした。
【０２６２】
細片を、0.1％のツイーン20を含むPBSで洗浄した（３×15分）。陽性バンドを、高感度化学発光（ECL、アマシャム）により検出した。
【０２６３】
実施例５で行なわれたウエスタンブロットについては、Sub-1に特異的な抗体を使用した（Cell Signaling Technology Caspase-8 ICI2 Cat 9746）。
【０２６４】
［実施例１２］
ハイブリドーマクローンスクリーニングのためのELISA
特異的抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングするための直接的ELISAを、以下のとおり行なった：96穴プレートを、１時間37℃で、または16時間４℃で、結合溶液（0.1M Na2HPO4、pH9）中の2.5μg／mlの濃度で、50μl／ウェルのBSA−ペプチド（またはコントロールプレートに関してはBSAのみ）で被覆した。続いて、プレートを、３回、PBS-T（0.05％のツイーン20を伴うPBS）で洗浄し、そして37℃で１時間、200μl／ウェルの遮断溶液（PBS中の1％のヘモグロビン）をロードし、そしてPBSで３回洗浄した。50μlのハイブリドーマ培養上清または（PBS-Tを用いた）希釈標準を、ウェル毎にロードし、37℃で１時間、または22℃で4時間インキュベーションした。このインキュベーション期間の後、ウェルを、６回PBS-Tで洗浄した。二次抗体、HRPに接合した抗マウス抗体（Jackson 115-025-100）を、PBS-T中で1：5000に希釈し、37℃で１時間インキュベーションし、PBS-Tで６回洗浄することによって洗い流した。HRPに関する基質を、新たに作製し（2.2mlの0.2M Na2HPO4、pH9.2、1.4mlの0.2Mクエン酸、pH4.35、6.4ml H2O、10mg ABTSおよび1μl H2O2）、50μl／ウェルをロードし、22℃で彩色するまで（約５〜80分）インキュベーションした。50μl／ウェルに0.2Mクエン酸を添加することによって、発色反応を停止させた。プレートを、405nmで読み取った。
【０２６５】
ポジティブコントロール抗体として、1：1000に希釈した陽性マウス抗血清を使用し、そしてネガティブコントロールは培地とした。
【０２６６】
［実施例１３］
カスパーゼ−８の免疫沈降
各免疫沈降のために、108細胞を使用した。細胞を収集し、40分間０℃で、１％ NP-40溶解緩衝液および完全プロテアーゼインヒビター（Roche Molecular Biochemicalsから得られる完全プロテアーゼインヒビターカクテル錠剤）中でのインキュベーションにより溶解させた。細胞溶解物を、エッペンドルフチューブに等分し、10分間４℃で、1400rpmで遠心分離し、上清を新しいチューブに収集した。タンパク質Ｇ−セファロースに非特異的に結合するタンパク質を除去する意図で、細胞溶解物を予備洗浄工程に供した。予備洗浄のために、細胞溶解物を、PBSで予備洗浄したタンパク質Ｇ−セファロース（Pharmacia）と、マウスIgGとで４℃で２〜３時間予備インキュベーションした。このインキュベーションののち、溶解物を、30秒間1400rpmで、エッぺンドルフチューブ中で遠心分離し、タンパク質Ｇ−セファロースを捨て、予備洗浄した上清を収集した。精製モノクローナル抗体（またはネガティブコントロールについてはマウスIgG1カッパ）とPBS予備洗浄したタンパク質Ｇ−セファロースを混合し、４℃で４〜１６時間、予備洗浄した上清とともにインキュベーションした。このインキュベーション期間ののち、「消耗溶解物」と称する未結合材料を、遠心分離（1400rpmで30秒）により収集し、結合材料を溶解緩衝液で６回セファロースビーズを洗浄することにより、および22℃で２時間、免疫化のために使用される0.2％ NP-40溶解緩衝液、プロテアーゼインヒビターおよび400μg／mlのペプチドを含む「溶出溶液」（300μlの溶出溶液／100μlセファロース）とのインキュベーションによって溶出した。チューブを、５分間5,000rpmで回転させ、「カスパーゼ−８溶出液」と称される上清を、新たなチューブに移した。
【０２６７】
［実施例１４］
Fas仲介アポトーシスｈにおける切断不可能な突然変異体p72 D600Eの効果の評価
Cariが、活性カスパーゼ−８で切断され、かつその特異的切断部位が、切断不可能な突然変異体（p72 D600E）（実施例９）の作製によって証明されることが分かった。Cariの一過性の過剰発現が、Fasリガンドで処理された細胞のアポトーシス性活性を可能にすることが示された（実施例９）。Fas仲介アポトーシスにおける野生型ポリペプチドを越える切断不可能な突然変異体p72 D600Eの効果を評価するために、BjaB細胞を遺伝子操作して、変異体または野生型のcariのいずれかを構成的に産生させ、遺伝子操作した細胞におけるFasリガンドの効果を監視した。構成的産生を生じさせるために、２つのCariタンパク質の各々をコードするcDNAを、pcDNA3.1発現ベクターに挿入した。トランスフェクション体BjaB細胞を、1500μg／mlのネオマイシンで選択し、単離物を収集し、そして細胞溶解物のウエスタンブロット解析により、Cari産生について試験した。類似のレベルのCari野生型および変異体を産生する単離物を、さらに選択した。BjaB細胞の生存を、コントロール細胞（B1）、トランスフェクションされたp72を構成的に発現する細胞（B2）、およびトランスフェクションされたD600E p72を構成的に発現する細胞（B3）に対してFasリガンドを適用した後に監視した。図１４における結果は、切断不可能なCari突然変異体を発現する細胞が、野生型Cariを発現する細胞よりFasリガンド処理により効率的に死滅されれることを示す。この結果の説明としての１つの可能性は、Cariが、プロカスパーゼ−８の活性カスパーゼ−８への変換に関与し得ることである。したがって、切断不可能なCariは、プロカスパーゼ−８の活性カスパーゼ−８への変換を連続して誘導するため、活性カスパーゼ−８により切断され、おそらく不活化される野生型p72と異なり、アポトーシスの増大に至る。
【０２６８】
カスパーゼ−８の活性化におけるCariの起こり得る関与を試験するために、野生型Cariまたは切断不可能なCari突然変異体を発現するBjaB細胞におけるFasリガンド処理によりプロカスパーゼ−８の活性カスパーゼ−８への変換の速度を、プロカスパーゼ−８および活性化カスパーゼ−８の検出用抗カスパーゼ−８特異的抗体を用いるウエスタンブロット解析により観察した。得られた結果から、カスパーゼ−８活性化の速度が、突然変異体Cariを発現するBjaB細胞でより高いことが示された（示されず）。
【０２６９】
これらの結果は、p72が、カスパーゼ−８の活性化に関与すること、および突然変異体p72 D600Eを発現する細胞で得られるFasリガンドにより仲介される抗アポトーシス性活性における増大は、野生型タンパク質以上に、活性カスパーゼ−８の存在の代わりに、その前段階のタンパク質が活性を保持する（切断されない）という事実によることを示唆する。
【０２７０】
［実施例１４］
カスパーゼ−８結合に寄与するCari中のドメインの決定
欠失研究を、Cariを用いて行ない、カスパーゼ−８結合に寄与するCari中の最小アミノ酸配列を決定した。Cariを徐々に欠失させ、生じた断片を、GFPレポーター遺伝子に連結し、pcDNA3.1／HisCベクター（インビトロゲン）に導入した。Cari構築物（10μg）を、HeLa細胞に、プロカスパーゼ−８を含むベクター（10μg）［pcDNA3ベクター（インビトロゲン）に導入されたMach a1（C360S）］とともに同時トランスフェクションした。
【０２７１】
トランスフェクションの24時間後、細胞を、１％のNP-40溶解緩衝液に溶解させた。カスパーゼ−８を、２時間、抗体179とＧタンパク質とで免疫沈降した。沈降複合体を、５回、洗浄緩衝液（0.2％のNP-40緩衝液）で洗浄し、ペプチド179を含む洗浄緩衝液で溶出した。免疫沈降したタンパク質を、SDS-PAGEにより分離し、抗カスパーゼ−８抗体1C12（1：2000、Cell s Signaling Technology）およびイー．コリで産生されたHis−Cariに対するポリクローナル抗体（１：2000）を使用してウエスタンブロット解析に供した。
【０２７２】
図８は、コイルドコイルモチーフ、SURP−またはSWAPモチーフ、Ｇパッチモチーフ、NLSモチーフ、カスパーゼ−８切断部位D600および該モチーフをつなぐ対応のアミノ酸を含むCariの概略図を示す。表IIに、Cariの完全な、および欠失した構築物のカスパーゼ−８に対する結合の結果を要約する。
【０２７３】
D600E Cari突然変異体がカスパーゼ−８に結合しないので、Cari中のカスパーゼ−８の切断部位であるD600は、おそらく、その結合については必要でない。前記Cariモチーフ（コイルドコイルモチーフ、SURP−またはSWAPモチーフ、Ｇパッチモチーフ、NLSモチーフ）のいくつかを含むタンパク質のＮ末端の一部を欠くが、タンパク質のインタクトなＣ末端を含む欠失構築物393-645は、カスパーゼ−８になお結合することから、Ｃ末端とは異なるこれらのモチーフは、カスパーゼ−８結合には必要でないことが示される。Ｇパッチモチーフは、Ｇパッチモチーフを欠き、そしてなおカスパーゼを結合する欠失構築物393-437で示されるのと同様に、おそらく必要でない。タンパク質は、さらに、そのＮ末端から欠失され、カスパーゼになお結合できる24個のアミノ酸ペプチドＳＶＱＤＬＫＧＬＧＹＥＫＧＫＰＶＧＬＶＧＶＴＥＬ（構築物414-437、配列番号：４）を得た。Ｎ末端からこのようなペプチドに対する16個のアミノ酸のさらに欠失させて生じた９個のアミノ酸ペプチド（構築物429-437）は、カスパーゼ−８に結合できなかった。したがって、414-437構築物のＮ末端から７個ののみのアミノ酸を欠失させて生じた16個のアミノ酸ペプチド（構築物422-437）を試験し、カスパーゼ−８に結合することが分かった。したがって、カスパーゼ−８に結合できる最小アミノ酸は、配列ＧＹＥＫＧＫＰＶＧＬＶＧＶＴＥＬ（構築物422-437、配列番号：５、図１５）の16個のアミノ酸ペプチドであることが分かった。
【０２７４】
【表１】
2005501545.tif 000002
【０２７５】
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【図面の簡単な説明】
【０２７６】
【図１】プロ−カスパーゼ−８のアミノ酸配列を示す。Mabの調製に使用されるカスパーゼ−８のペプチド配列は、太字でかつ下線を付している。ペプチド−179：カスパーゼ−８の大サブユニット（Sub-1）のＣ末端に対応するペプチドＣＱＧＤＮＹＱＫＧＩＰＶＥＴＤ。ペプチド−182：カスパーゼ−８の小サブユニットのＮ末端に対応するペプチドＬＳＳＰＱＴＲＹＩＰＤＥＡＤ（Sub-2、残基Lys385〜Gly399）。ペプチド−183：Sub-1のＮ末端に対応するペプチドＳＥＳＱＴＬＤＫＶＹＱＭＫＳＫＰＲ（残基Ser217〜Gly234）。
【図２】エピトープ179に対するモノクローナル抗体を用いる、BJAB細胞の溶解物で見出された少量のカスパーゼ−８の有効な免疫沈降を示す。（Fas受容体刺激前（−）、後（＋）に調製された）BJAB細胞溶解物由来のカスパーゼ−８の、様々な抗体による免疫沈降による消耗は、左から右へ示される。レーン３および４、Mab179：Sub-1のＣ末端に対応するペプチド（カスパーゼ−８の大サブユニット、Cys360〜Asp374）に対して調製されたモノクローナル抗体。レーン５および６、Mab183.1：およびレーン７および８、Ｍａｂ183.2：Sub-1のＮ末端に対応するペプチド（Ser217〜Gly234）に対して調製された２つのモノクローナル抗体。レーン９および10、Mab182：Sub-2（カスパーゼ−８の小サブユニット）のＮ末端に対応するペプチド（Lys385〜Asp399）に対して調製されたモノクローナル抗体。レーン11、NMS：正常なマウス血清。この図は、指定の抗体による免疫沈降ののちの細胞溶解物中、および全細胞溶解物中に残存するカスパーゼ−８の量のウエスタンブロッティング評価を示す（レーン１および２）。
【図３ａ】ペプチド（該ペプチドに対して様々な抗体が作製された）と競合することによって、図２のように免疫沈降されたカスパーゼ−８の溶出を示す。指定の抗体で生成された免疫沈降物からの溶出液中のカスパーゼ−８を、（図２のように）ウエスタンブロット解析で検出する。
【図３ｂ】ペプチド（該ペプチドに対して様々な抗体が作製された）と競合することによって、図２のように免疫沈降されたカスパーゼ−８の溶出を示す。指定の抗体で生成された免疫沈降物からの溶出液中のカスパーゼ−８を、銀染色で検出する。
【図４】Sub-1のＣ末端に対応するペプチド（カスパーゼ−８の大サブユニット、残基Cys360〜Asp374）で免疫することにより調製されたポリクローナル血清を用いる、BJAB細胞の溶解物中に見出された少量のカスパーゼ−８の効果的な免疫沈降を示す。（Fas受容体刺激前（−）、後（＋）に調製された）BJAB細胞溶解物由来のカスパーゼ−８の、様々な抗体による免疫沈降による消耗は、左から右に示される。該溶解物中に残存するカスパーゼ−８は、以下の抗体による免疫沈降法ののちウエスタンブロット解析により検出される。レーン３および４、NMS：正常なマウス血清。レーン５および６、抗179ポリクローナル抗体：Sub-1のＣ末端（カスパーゼ−８の大サブユニット、残基Cys360〜Asp374）に対して調製されたウサギポリクローナル抗体。レーン７および８、Mab182。ＴＬ：全細胞溶解物。
【図５】未刺激BJAB細胞の溶解物から、様々な抗体を用いて免疫沈降され、溶出されたカスパーゼ−８を示す。左から右に、以下の抗体を用いて行なった免疫沈降の溶出ののち、ウエスタンブロット解析によって検出されたカスパーゼ−８のレベルを示す。レーン１、Sub-1のＮ末端に対する抗183血清（残基Ser217〜Gly234）。レーン２、Mab183.2：Sub-1のＮ末端（残基Ser217〜Gly234）に対するモノクローナル抗体。レーン３、Mab179：Sub-1のＣ末端（カスパーゼ−８の大サブユニット、残基Cys360〜Asp374）に対するモノクローナル抗体。Mab179による新規プロセシング様式によって産生された、カスパーゼ−８の小断片（5.6kDa）は、矢印で示される。
【図６】Fasリガンドによる１時間の刺激の前または後のBjab細胞の溶解物からMab179で免疫沈降され、ペプチド179により溶出されたカスパーゼ−８および結合タンパク質（P72/Cari）を示す。Mab179で免疫沈降されたカスパーゼ−８および結合タンパク質は、（図３ｂのように）溶出され、SDS-PAGEで分離され、ついで銀染色された。レーン１および２は、細胞溶解物がMIgG1（マウス免疫グロブリンIgG1）で免疫沈降されたコントロールを示す。
【図７】p72（CARI）ポリペプチドモチーフの略図を示す。コイルドコイルモチーフ（Ｃ）および２つの縦列配置した「SURPモチーフ」（Ｓ）は、ポリペプチドのＮ末端付近に配置し、１つの「Ｇ−パッチ」モチーフは、ポリペプチドのＣ末端に配置している（Ｇモチーフ）。Ｇモチーフの内側に存在するアスパラギン酸残基D600も示す。D600：ポリペプチド中の残基D600がグルタミン酸残基で置換された変異体。
【図８】p72（Cari）cDNAの全長作成に使用するアプローチの略図を示す。Incyte Genomicsから購入した、（最初の７個のアミノ酸をコードする）最初の21個のヌクレオチドの配列を欠くESTクローンIMAGE29964545は、一対のプライマーとともに最初のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）用の鋳型として使用した（フォワードプライマーP2は、5'ESTクローンとオーバーラップする核酸と、さらに21個欠失しているヌクレオチドのうち15個のヌクレオチドを含む；およびリバースプライマーＰ３は、3'ESTとオーバーラッピングする配列を含む）。得られたPCR産物は、一対のプライマーとともに第２のPCR用の鋳型として使用した（フォワードプライマーP1は、全21個欠失しているヌクレオチドと、ESTの５個の核酸を含む：リバースプライマーP3は、3'ESTとオーバーラッピングする配列を含む）。
【図９】Fasリガンドによる刺激から０時間および20分間後のBjab細胞の溶解物からの、Mab179によるカスパーゼ−８とp72（Cari）の共免疫沈降を示す。Mab179による免疫沈降ののち溶出されたポリペプチドは、SDS-PAGEゲルで分離され、銀染色により検出された。p72（Cari）に対応する、一見約72.5kDaの分子量を有するバンドは、Fasリガンド刺激の前にプロカスパーゼ−８で共沈される（レーン３）。刺激から20分後、72.5kDaのバンドのレベルは減少し、一見約68kDaの低分子量のタンパク質に対応する新しいバンドが検出される（レーン４）。レーン１および２は、MIgG1（マウス免疫グロブリンIgG1）による細胞溶解物の免疫沈降からなるネガティブコントロールを示す。
【図１０】活性カスパーゼ−８によるCariの切断を示す。p72（Cari）cDNAによってコードされるポリペプチドは、TnT T7結合網状赤血球溶解物システムを用いる35Sメチオニンの存在下で、網状赤血球の溶解物においてインビトロで発現し、組換え活性カスパーゼ−８の存在または非存在下で１時間37℃でのインキュベーションののち試験した。さらに、Cariの切断を、２つの異なるp72cDNA変異体でコードされるTnT産物を用いて研究した（一方は、Cariにおいて、カスパーゼ−８の標的残基であると思われる残基D600が、Ｅに変異されたCari［p72(D600E)］をコードしているもの：もう一方は、該遺伝子が、欠失し、得られた切断ポリペプチドが下流の残基を欠くもの［D600p72(1-600)］）。得られるポリペプチドを、SDS-PAGEで分離し、その結果をホスホイメージングにより、視覚化した。
【図１１】Fasリガンドによる刺激の前（0'）、または５、10、20、40および60分後のBjab細胞の溶解物からMab179で共免疫沈降されたカスパーゼ−８およびp72（Cari）を示す。ペプチドは溶出され、SDS-PAGEゲルにおいて分離され、銀染色により検出された。一見72.5kDaの分子量のペプチドは、刺激前（0'）に検出される。刺激から５および10分後、一見約68kDaの低分子量を有する新規タンパク質が出現した。刺激から40分後、72.5kDaのバンドが完全に消え、68kDaのみが検出される。60分に、前記ポリペプチドは、カスパーゼ−８で共沈した。
【図１２ａ】TNF受容体シグナル伝達経路により誘導されるアポトーシス細胞死におけるp72（Cari）の効果を示す。p72（Cari）cDNA（p72）またはアンチセンスp72（a/s）を、pcDNA3.1発現ベクターに挿入し、pcDNA3.1ベクターに挿入されたp55TNF受容体とpEGFPC1ベクターから発現する緑色蛍光タンパク質（GFP）とを用いて、Ｔ抗原を構成的に発現するＨＥＫ２９３細胞に同時トランスフェクションをした［ネガティブコントロールとして、p72cDNA挿入物なしのベクターを使用した（pc）］。24時間後、トランスフェクションされた細胞を蛍光顕微鏡下で観察し、細胞死を、蛍光細胞の総数のうちアポトーシスの形態を示す細胞の数を測定することによって記録した。
【図１２ｂ】Fasリガンド刺激を組み合わせた、p72（Cari）の過剰発現による細胞死の誘導を示す。Fasリガンド仲介細胞死におけるCari過剰発現の効果は、Ｔ抗原を構成的に発現するHEK293細胞で観察された。実験では、細胞を、ベクターpcDNA3.1（コントロール群）、またはCariまたはそのアンチセンスをコードするpcDNA3.1（各々、pc、p72、またはp72a/s）と、分泌アルカリホスファターゼ（SEAP）をコードするベクターpSBC-2とで、同時トランスフェクションした。24時間後、トランスフェクションされた細胞を、16時間、Fasリガンドで誘導し、ついで、生育培地を新たな生育培地と交換した。細胞死は、翌２４時間の期間に、生育培地に分泌されたSEAPの量を決定することによって測定した。
【図１３】全ESTのコンセンサスを含むTHCレポート（THC510568  配列番号：１）で得られたポリペプチド配列と、作成された全長cDNA（配列番号：３）で推定されるポリペプチドとの間の整列を示す。
【図１４】Cariで切断不可能な変異体D600Ep72による細胞死調節の動力学（kinetics）を示す。Bjab細胞の生存率を、コントロール細胞（B1）、トランスフェクションされたp72を構成的に発現する細胞（B2）、およびトランスフェクションされたD600Ep72を構成的に発現する細胞（B3）で、Fasリガンド適用後観察した。
【図１５】カスパーゼ−８結合に寄与する、Cari中のポリペプチドの最小アミノ酸配列を示す。プロカスパーゼ−８結合に寄与するCari中の最小ポリペプチドの同定は、詳細な欠失研究およびプロカスパーゼ−８との共沈により得られた。
【図１６】Cariアンチセンス分子（pSuper-Cari）の発現によるアポトーシスの阻害を示す。細胞のアポトーシスを、カスパーゼ−８（Mach a1）、またはFas受容体の膜貫通および細胞内部分に融合したp55 TNF R1の細胞外部分のキメラ（Cl*）の過剰発現を、これらのポリペプチドをコードするベクターで行われる数回の独立したトランスフェクションにより誘導し、Cariアンチセンスによる阻害を、pSuper-Cari（横縞のバー）、またはpSuper-vector（コントロール、縦縞のバー）との同時トランスフェクションにより評価した。
【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１４】
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【図１６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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