(57)【要約】本発明は、ビタミンＢ１２を製造するための改良方法に関し、該方法は、シロヘム合成に関与する酵素ウロポルフィリノーゲンＩＩメチルトランスフェラーゼ及びプレコリン−２デヒドロゲナーゼの活性が少なくとも対応の内因性酵素活性と比較して増大されている微生物を含む培養物を発酵することを含むものである。
2005528094.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シロヘム合成に関与する酵素ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ及びプレコリン−２デヒドロゲナーゼの活性が少なくとも対応の内因性酵素活性と比較して増大されている微生物を含む培養物を発酵することを含む、ビタミンＢ１２を製造するための改良方法。
【請求項２】
シロヘム合成に関与する酵素ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ及びプレコリン−２デヒドロゲナーゼの活性、並びにｃｂｉＸによりコードされ、かつコバラミン合成に関与する酵素シロヒドロクロリンコバルトキレターゼの活性が少なくとも対応の内因性酵素活性と比較して増大されている微生物を含む培養物を発酵することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
シロヘム合成に関与する酵素ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ、シロヒドロクロリンフェロキレターゼ及びプレコリン−２デヒドロゲナーゼの活性が少なくとも対応の内因性酵素活性と比較して増大されている微生物を含む培養物を発酵することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１の配列番号２に示されるウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ及び１の配列番号６に示されるプレコリン−２デヒドロゲナーゼ又はそれらのイソ酵素が対応の内因性酵素活性と比較して増大されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１の配列番号２に示されるウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ、１の配列番号６に示されるプレコリン−２デヒドロゲナーゼ及びシロヒドロクロリンコバルトキレターゼ（ｃｂｉＸ）又はそれらのイソ酵素が対応の内因性酵素活性と比較して増大されている、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１の配列番号２に示されるウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ及び１の配列番号４に示されるシロヒドロクロリンフェロキレターゼ及び１の配列番号６に示されるプレコリン−２デヒドロゲナーゼ又はそれらのイソ酵素が対応の内因性酵素活性と比較して増大されている、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項７】
配列番号１のヌクレオチド１〜７８０に示されるｓｉｒＡ、及び配列番号１、３又は５のヌクレオチド１５４２〜２１５０に示されるｓｉｒＣのシロヘム合成酵素をコードする遺伝子が、強力に発現される及び／又は増加したコピー数で存在する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
配列番号１のヌクレオチド１〜７８０に示されるｓｉｒＡ、配列番号１又は３のヌクレオチド７６１〜１５６１に示されるｓｉｒＢ、及び配列番号１、３又は５のヌクレオチド１５４２〜２１５０に示されるｓｉｒＣのシロヘム合成酵素をコードする遺伝子が、強力に発現される及び／又は増加したコピー数で存在する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
配列番号１のヌクレオチド１〜７８０に示されるｓｉｒＡ、及び配列番号１、３又は５のヌクレオチド１５４２〜２１５０に示されるｓｉｒＣのシロヘム合成酵素をコードする遺伝子、並びにコバラミン合成酵素をコードする遺伝子（ｃｂｉＸ）が、強力に発現される及び／又は増加したコピー数で存在する、請求項１、２、５及び７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
バシラス属、サルモネラ属、シュードモナス属若しくはプロピオニバクテリウム属の微生物又は該微生物の混合物を含む培養物を発酵することを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
配列番号２に示されるウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ。
【請求項１２】
配列番号４に示されるシロヒドロクロリンフェロキレターゼ。
【請求項１３】
配列番号６に示されるプレコリン−２デヒドロゲナーゼ。
【請求項１４】
シロヘム合成酵素をコードする巨大菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ｓｉｒＡＢＣオペロンを含む、配列番号１に示される単離されたヌクレオチド配列。
【請求項１５】
配列番号２に示されるウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼのヌクレオチド１〜７８０（ｓｉｒＡ）をコードする、配列番号１に示される単離されたヌクレオチド配列又はその対立遺伝子。
【請求項１６】
配列番号４に示されるシロヒドロクロリンフェロキレターゼのヌクレオチド７６１〜１５６１（ｓｉｒＢ）をコードする、配列番号１若しくは３に示される単離されたヌクレオチド配列又はその対立遺伝子。
【請求項１７】
配列番号６に示されるプレコリン−２デヒドロゲナーゼのヌクレオチド１５４２〜２１５０（ｓｉｒＣ）をコードする、配列番号１、３若しくは５に示される単離されたヌクレオチド配列又はその対立遺伝子。
【請求項１８】
請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の単離されたヌクレオチド配列又はそれらの一部、及び、それらに機能的に連結され、かつ調節機能を有するヌクレオチド配列、を含む遺伝子構造物。
【請求項１９】
シロヒドロクロリンフェロキレターゼをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１８に記載の遺伝子構造物。
【請求項２０】
請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の単離されたヌクレオチド配列若しくはそれらの一部、又は請求項１８若しくは１９に記載の遺伝子構造物、並びに、選択、宿主における複製及び／又は宿主細胞ゲノムへの組込みのための追加のヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項２１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のビタミンＢ１２の製造方法に使用するための、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ及びプレコリン−２デヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列の発現の上昇及び／又はコピー数の増加を示すトランスジェニック微生物。
【請求項２２】
ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ、シロヒドロクロリンコバルトキレターゼ又はシロヒドロクロリンフェロキレターゼ及びプレコリン−２デヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列の発現の上昇及び／又はコピー数の増加を示す、請求項２１に記載のトランスジェニック微生物。
【請求項２３】
請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の単離されたヌクレオチド配列又はそれらの一部の発現の上昇及び／又はコピー数の増加を示す、請求項２１又は２２に記載のトランスジェニック微生物。
【請求項２４】
請求項１８若しくは１９に記載の遺伝子構造物又は請求項２０に記載のベクターを複製形態で含む、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載のトランスジェニック微生物。
【請求項２５】
バシラス属、サルモネラ属、シュードモナス属又はプロピオニバクテリウム属の微生物である、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載のトランスジェニック微生物。
【請求項２６】
巨大菌種に属する、請求項２１〜２５のいずれか１項に記載のトランスジェニック微生物。
【請求項２７】
ビタミンＢ１２を製造するための、酵素ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ、シロヒドロクロリンコバルトキレターゼ、シロヒドロクロリンフェロキレターゼ及びプレコリン−２デヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列の単独又は組み合わせの使用。
【請求項２８】
ビタミンＢ１２を製造するための、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列若しくはそれらの一部の単独の又はシロヒドロクロリンコバルトキレターゼと組み合わせての、又は請求項１８若しくは１９に記載の遺伝子構造物の、又は請求項２０に記載のベクターの使用。
【請求項２９】
請求項２１〜２６のいずれか１項に記載のトランスジェニック微生物を製造するための、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列若しくはそれらの一部の単独の又はシロヒドロクロリンコバルトキレターゼと組み合わせての、又は請求項１８若しくは１９に記載の遺伝子構造物の、又は請求項２０に記載のベクターの使用。
【請求項３０】
ビタミンＢ１２を製造するための、請求項２１〜２６のいずれか１項に記載のトランスジェニック微生物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも１つのシロヘム合成酵素を使用する、ビタミンＢ１２を製造するための改良方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１９３０年代というかなり前に、ビタミンＢ１２はＧｅｏｒｇｅ  Ｍｉｎｏｔ及びＷｉｌｌｉａｍ  Ｍｕｒｐｈｙ（Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．，１９８８，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），第４版  ｐｐ．５２８−５３１，Ｓｐｅｋｔｒｕｍ  Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）により人体に対するその作用から間接的に発見された。ビタミンＢ１２は１９４８年に最初に精製、単離され、その複雑な三次元結晶構造はＤｏｒｏｔｈｙ  Ｈｏｄｇｋｉｎにより解明された（Ｈｏｄｇｋｉｎ，Ｄ．Ｃ．ら，１９５６，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｂ１２．Ｎａｔｕｒｅ  １７６，３２５−３２８；及びＮａｔｕｒｅ  １７８，６４−７０）。天然に見出されるビタミンＢ１２の生合成の最終生成物は５’−デオキシアデノシルコバラミン（Ｂ１２補酵素）及びメチルコバラミン（ＭｅＣｂｌ）であり、他方ではビタミンＢ１２はシアノコバラミン（ＣＮＣｂｌ）とも呼ばれ、これは主に産業界によって製造され取り扱われている化学物質形である。本発明においては、特に断らない限り、ビタミンＢ１２は常に三つすべての類縁分子を指す。
【０００３】
巨大菌（巨大菌；Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）は１００年以上前（１８８４年）にＤｅ  Ｂａｒｙによって初めて報告された。土壌菌として一般分類されているが、巨大菌は様々な他の生息地、例えば海水、沈殿物、コメ、乾燥肉、牛乳及び蜂蜜においても検出されることがある。巨大菌はシュードモナス菌［ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓ］及びアクチノミセス菌［ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ］と一緒に見出されることが多い。巨大菌はその近縁関係にある枯草菌［Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ］と同様グラム陽性菌であり、なかでも２×５μｍというその相対的に顕著な大きさ（これによりその名前が付けられている）、約３８％というＧ＋Ｃ含有量、及び非常に顕著な胞子形成能力を特徴としている。増殖培地に極僅かでもマンガンがあればこの種が完全なる胞子形成を行うのには十分であり、これは一部の好熱性バチルス菌の胞子形成効率にしか見られない能力である。そのサイズ及びその非常に効率的な胞子形成と発生がために、巨大菌におけるこれらのプロセスの分子的基礎に関して広範な研究が行われ、その胞子形成と発生に関係している１５０超個の巨大菌遺伝子が今までに報告されている。巨大菌についての生理学的な研究（Ｐｒｉｅｓｔ，Ｆ．Ｇ．ら，１９８８，Ａ  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｕｓ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３４，１８４７−１８８２）により、この種は、ウレアーゼ陽性及びフォゲス−プロスカウアー（Ｖｏｇｅｓ−Ｐｒｏｓｋａｕｅｒ）陰性であり、硝酸塩を還元することができない偏性好気性の胞子形成性細菌として分類された。巨大菌の最も際だった特性のうちの１つは、多くの炭素源を利用することができるという能力である。つまり巨大菌は非常に数多くの糖類を消費し、例えばコーンシロップ、食肉産業からの廃棄物、さらには石油化学産業の廃棄物の中に見られる。極めて広い範囲の炭素源を代謝できるというこの能力に関して、巨大菌は制限なしにシュードモナス菌と同じとみなすことができる（Ｖａｒｙ，Ｐ．Ｓ．，１９９４，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，４０，１００１−１０１３，Ｐｒｉｍｅ  ｔｉｍｅ  ｆｏｒ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）。種々の微生物群、例えばバチルス属、シュードモナス属又はプロピオン酸菌属の微生物は、バイオテクノロジーによりビタミンＢ１２を産生させるのに好適である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、微生物を用いるビタミンＢ１２の生物工学的製造をさらに最適化することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
この目的は、シロヘム合成に関与する酵素ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ及びプレコリン−２デヒドロゲナーゼの活性が少なくとも対応の内因性酵素活性と比較して増大されている微生物を含む培養物を発酵することを含む、ビタミンＢ１２を製造するための改良方法によって達成される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
同様に、本発明は、シロヘム合成に関与する酵素ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ、シロヒドロクロリンフェロキレターゼ及びプレコリン−２デヒドロゲナーゼの活性が少なくとも対応の内因性酵素活性と比較して増大されている微生物を含む培養物を発酵することを含む、ビタミンＢ１２を製造するための改良方法に関する。
【０００７】
さらに、本発明は、シロヘム合成に関与する酵素ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ及びプレコリン−２デヒドロゲナーゼ、並びにコバラミン合成に関与する酵素シロヒドロクロリンコバルトキレターゼの活性が少なくとも対応の内因性酵素活性と比較して増大されている微生物を含む培養物を発酵することを含む、ビタミンＢ１２を製造するための改良方法に関する。
【０００８】
発酵に続いて、生成されたビタミンＢ１２を発酵培地から回収することができる。これを行う手段は、標準的な実験室慣例の一部であるので、ここではさらに注釈しない。
【０００９】
本発明の変形は、少なくとも１の配列番号２に示されるウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ及び１の配列番号６に示されるプレコリン−２デヒドロゲナーゼ又はそれらのイソ酵素が対応の内因性酵素活性と比較して増大されている方法を包含する。
【００１０】
別の変形は、少なくとも１の配列番号２に示されるウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ及び１の配列番号４に示されるシロヒドロクロリンフェロキレターゼ及び１の配列番号６に示されるプレコリン−２デヒドロゲナーゼ、又はそれらのイソ酵素が対応の内因性酵素活性と比較して増大されている方法を包含する。
【００１１】
さらに、本発明は、少なくとも１の配列番号２に示されるウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ、１の配列番号６に示されるプレコリン−２デヒドロゲナーゼ及びシロヒドロクロリンコバルトキレターゼ（ｃｂｉＸ）、又はそれらのイソ酵素が対応の内因性酵素活性と比較して増大されている変形方法を包含する。
【００１２】
従って、本発明は、シロヘム合成に関与する酵素ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ（ｓｉｒＡ）、プレコリン−２デヒドロゲナーゼ（ｓｉｒＣ）及びシロヒドロクロリンフェロキレターゼ（ｓｉｒＢ）、並びにコバラミン合成に関与する酵素シロヒドロクロリンコバルトキレターゼ（ｃｂｉＸ）の活性が、単独で又は組み合わせて、少なくとも対応の内因性酵素活性と比較して増大されている微生物を含む培養物を発酵することを含む、ビタミンＢ１２を製造するための改良方法の変形に関する。
【００１３】
「内因性酵素活性」とは、細胞又は生物の構成（基本的遺伝子装置）から生じる（自然に存在する）ものであって、かつ外的影響又は外部からの供給の結果として生じていない活性、すなわち微生物が遺伝的に操作される前の個々の酵素活性のレベルにある活性であると理解される。
【００１４】
「イソ型」とは、同一又は同等の基質及び作用特異性を有するが、異なる一次構造を有する酵素であると理解される。
【００１５】
さらに、本発明は、上記酵素の改変形態に関する。
【００１６】
本発明によって同様に包含される「改変形態」とは、配列中に、例えばポリペプチドのＮ末端及び／若しくはＣ末端に、又は保存アミノ酸の領域内に変化が存在する酵素であるが、これが酵素の機能に影響することのないものであるであると理解される。これらの変化をアミノ酸置換の形で作製するために、自体公知の方法を用いることができる。
【００１７】
本発明の１つの特定の実施形態は、その活性が、例えばアミノ酸置換によって、個々の元のタンパク質の活性と比較して減弱又は増大されている、本発明に係るポリペプチドの変形を包含する。同じことは、細胞中の本発明に係る酵素の安定性、例えばプロテアーゼによる分解をより受けやすいか又はより受けにくい酵素の安定性にも当てはまる。
【００１８】
従って、本発明の意味の範囲内で、「内因性酵素活性」とは、微生物中に天然に存在するシロヘム合成又はコバラミン合成酵素の活性であると理解される。シロヘムは、前駆体ウロポルフィリノーゲンＩＩＩから合成される。当業者であれば、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩをシロヘムに変換するために必要な反応段階、及びこれらの段階に関与する生体触媒をよく理解している。特に、これらの生体触媒は、次の活性を有する酵素である：ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ、シロヒドロクロリンフェロキレターゼ及びプレコリン−２デヒドロゲナーゼを有する生体触媒である。コバラミン（ビタミンＢ１２）に変換するために、挙げるべき重要な生体触媒は、シロヒドロクロリンコバルトキレターゼの活性。これに関し、遺伝子ｃｂｉＸはシロヒドロクロリンコバルトキレターゼ酵素をコードする。
【００１９】
巨大菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）及びネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の野生型の、すなわち遺伝的に改変されていない株において、内因性ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ、シロヒドロクロリンフェロキレターゼ、プレコリン−２デヒドロゲナーゼ及びシロヒドロクロリンコバルトキレターゼ酵素活性は、それらを殆ど検出できないほど低い。
【００２０】
粗細胞抽出物において、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ及びプレコリン−２デヒドロゲナーゼの活性は、それぞれ０．２５単位／ｍｇ粗細胞抽出物、約０．００２単位／ｍｇ粗細胞抽出物よりも低い。一方、キレートゲン（ｃｈｅｌａｔｏｇｅｎ）の活性は、約０．０１単位／ｍｇ粗細胞抽出物である。これに関し、１単位は、それぞれ、毎時生成される１ｎＭのプレコリン−２、毎分生成される１ｎＭのシロヒドロクロリンに相当し、そしてキレターゼの場合は毎分１ｎＭのシロヒドロクロリンの消費（すなわち、消失）に相当する。
【００２１】
形質転換された菌株は、比較的に増大された活性を示す（以下参照）。
【００２２】
これに関し、上記酵素の各々は、それぞれの場合に１の遺伝子によってコードされることができるか、又は例えば、１の遺伝子は本来、上記酵素の２つ若しくは３つ全部又は任意の他の可能な組み合わせの活性の組み合わせで多機能性遺伝子産物をコードすることができる。
【００２３】
多数の微生物のうち、シロヘム及びコバラミンの合成に関与する酵素をコードする遺伝子は既に公知である。これらの遺伝子及び対応の遺伝子産物の命名は異なる。すなわち、大腸菌におけるシロヘム合成は、例えば多機能性タンパク質シロヘムシンターゼにより触媒され、その遺伝子はｃｙｓＧと呼ばれる。酵母サッカロミセス・セレビシエにおいて、２つの酵素（ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ及びデヒドロゲナーゼ／キレターゼ）がシロへム合成に特異的に関与し、それらの遺伝子はｍｅｔ１及びｍｅｔ８と呼ばれる。枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）において、その一部について、シロへム合成の上記酵素をコードする３つの遺伝子、すなわち、ｙｌｎＤ、ｙｌｎＥ及びｙｌｎＦが知られている。
【００２４】
また、多くのコバラミン合成酵素が知られている。例えば、シロへム合成及びコバラミン合成の分岐点における触媒であるシロヒドロクロリンキレターゼを挙げることができる。サルモネラ菌において、それはＣｂｉＫ又はＣｂｉＬと呼ばれる。巨大菌において、それはＣｂｉＸの名称で知られている（Ｒａｕｘ，Ｅら，１９９８，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３３５：１５９−１６６）。
【００２５】
本発明の意味の範囲内で、既に公知のシロへム合成遺伝子及びそれらをコードするシロへム合成酵素、並びに本発明に係るヌクレオチド配列及びそれらをコードする酵素、そしてまた、コバラミン合成の既に公知の遺伝子及びそれらによりコードされる酵素も、ビタミンＢ１２を合成するための本発明に係る方法に使用するのに適している。
【００２６】
さらに、本発明は、配列番号１に示され、かつシロヘム合成酵素をコードする巨大菌ｓｉｒＡＢＣオペロンを含む、単離されたヌクレオチド配列に関する。
【００２７】
本発明は、配列番号１に示され、かつｓｉｒＡＢＣオペロン全体をコードするヌクレオチド配列を包含するか、又はそのほかに、配列番号１に示されるヌクレオチド配列の一部を包含する。「一部」は、配列番号１に示される配列の個々のコード領域であって、該領域がそれぞれの場合に本発明により、個々に又は全ての考慮される組み合わせで使用できるもの、例えば、ｓｉｒＡ、ｓｉｒＢ、ｓｉｒＣ、ｓｉｒＡＢ、ｓｉｒＡＣ、ｓｉｒＢＣ又はｓｉｒＡＢＣを意味すると考えられる。これに関し、コバラミン合成遺伝子、有利にはシロヒドロクロリンキレターゼをコードする遺伝子（ｃｂｉＸ）又はその一部との全ての可能な組み合わせも考慮される。
【００２８】
本発明の１つの変形は、配列番号２に示されるウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ（ｓｉｒＡ）のヌクレオチド１〜７８０をコードする、配列番号１に示される単離されたヌクレオチド配列又はその対立遺伝子を包含する。同様に、本発明は、配列番号４に示されるシロヒドロクロリンフェロキレターゼ（ｓｉｒＢ）のヌクレオチド７６１〜１５６１をコードする、配列番号１又は３に示される単離されたヌクレオチド配列又はその対立遺伝子に関し、また、配列番号６に示されるプレコリン−２デヒドロゲナーゼ（ｓｉｒＣ）のヌクレオチド１５４２〜２１５０をコードする、配列番号１、３又は５に示される単離されたヌクレオチド配列又はその対立遺伝子に関する。
【００２９】
本発明の別の変形は、上記シロへム合成遺伝子とシロヒドロクロリンキレターゼをコードするｃｂｉＸ遺伝子との、そしてまた対応の対立遺伝子との任意の組み合わせを包含する。
【００３０】
本発明によれば、「単離された核酸又は単離された核酸断片」は、１本鎖又は２本鎖であってよく、かつ天然の、化学的に合成された、改変された、又は人工のヌクレオチドを場合により含んでいてもよい、ＲＮＡ又はＤＮＡから構成されるポリマーを意味すると理解すべきである。これに関し、用語「ＤＮＡポリマー」は、ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡ又はその混合物をも包含する。
【００３１】
本発明によれば、「対立遺伝子」は、機能的に等価である、すなわち、本質的に同一効果を有するヌクレオチド配列であると理解すべきである。機能的に等価な配列は、異なるヌクレオチド配列を有するにもかかわらず、例えば、遺伝暗号の縮重の結果として、所望の機能を依然として有している。従って、機能的等価物は、本明細書に記載される配列の天然変異体、並びに例えば、化学的合成により得られ、そして適切ならば、宿主生物のコドン用法に適合させた人工ヌクレオチド配列を含む。これに加えて、機能的に等価な配列は、脱感作又は阻害剤に対する抵抗性を酵素に与える改変ヌクレオチド配列を有する配列を含む。
【００３２】
また、「機能的等価物」は、特に、所望の機能を示し続ける、最初に単離した配列の天然変異体又は人工変異体を意味すると理解すべきである。変異は、１以上のヌクレオチド残基の置換、付加、欠失、交換又は挿入を含む。また、それらは、例えばタンパク質レベルで保存アミノ酸の置換を生じ得るが、タンパク質の活性を根本的に変化させず、従って機能的に中性である、センス突然変異と呼ばれるものを包含する。また、これは、タンパク質レベルではタンパク質のＮ末端又はＣ末端に影響を及ぼすが、タンパク質の機能を有意に損なうことのないヌクレオチド配列の変化を包含する。これらの変化は、タンパク質の構造に対して安定化作用を発揮することさえできる。
【００３３】
加えて、本発明はまた、例えば、ヌクレオチド配列の改変により得られ、結果として対応の誘導体となるヌクレオチド配列を包含する。このような改変の目的は、例えば、配列中に存在するコード配列のさらなる制限部位の除去であってよく、又は、例えば追加の制限酵素切断部位の挿入であってもよい。その機能が元の遺伝子又は遺伝子断片と比較して減弱又は増大されている変異体もまた、機能的等価物である。
【００３４】
加えて、本発明はまた、上記のように所望の特性を担っている限り、人工ＤＮＡ配列にも関する。これらの人工ＤＮＡ配列は、例えば、コンピュータ補助プログラム（分子モデリング）を用いて作成されたタンパク質の戻し翻訳、又はインビトロ選択により同定することができる。宿主生物に特異的であるコドン用法に従ってポリペプチド配列の戻し翻訳により得られたコードＤＮＡ配列が特に適している。分子遺伝学的方法に精通する当業者は、形質転換しようとする生物に由来する他の既に公知の遺伝子のコンピュータ分析を行うことによって、特定のコドン用法を容易に決定することができる。
【００３５】
本発明によれば、「相同配列」とは、本発明に係るヌクレオチド配列に相補的であり、そして／又はこれらの配列とハイブリダイズする配列であると理解すべきである。本発明の意味の範囲内で、「ハイブリダイズするヌクレオチド配列」とは、標準的ハイブリダイゼーション条件下で本発明に係る対応のヌクレオチド配列に結合するオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドであると理解される。用語「標準的ハイブリダイゼーション条件」は広く理解すべきであり、そしてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件又はより低いストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を意味する。これらの条件は、とりわけ、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）に記載されている。本発明によれば、ハイブリダイズする配列という用語は、実質的に類似し、そして自体公知の標準的ハイブリダイゼーション条件下で本発明に係るヌクレオチド配列との特異的な相互作用（結合）を行うＤＮＡ又はＲＮＡ群からのヌクレオチド配列を包含する。また、ハイブリダイズする配列は、例えば、１０〜３０、好ましくは１２〜１５のヌクレオチド長を有する短いヌクレオチド配列を包含する。本発明によれば、これはまた、とりわけ、プライマー又はブローブと呼ばれるものを包含する。
【００３６】
また、本発明は、コード領域（構造遺伝子）の前（５’−又は上流）及び／又は後（３’−又は下流）の配列領域を包含する。これは、特に、調節機能を有する配列領域を包含する。それらは、転写、ＲＮＡ安定性又はＲＮＡプロセッシング、及び翻訳に対して効果を発揮することができる。調節配列の例は、とりわけ、プロモーター、エンハンサー、オペレーター、ターミネーター又は翻訳アンプリファイアーである。
【００３７】
さらに、本発明は、シロヘム合成酵素をコードする、配列番号１のヌクレオチド１〜７８０に示される遺伝子ｓｉｒＡ、及び配列番号１、３又は５のヌクレオチド１５４２〜２１５０に示されるｓｉｒＣが、強力に発現される及び／又は増加したコピー数で存在する、上述したタイプの方法に関する。
【００３８】
本発明に係る方法の好ましい変形において、シロヘム合成酵素をコードする、配列番号１のヌクレオチド１〜７８０に示される遺伝子ｓｉｒＡ、配列番号１又は３のヌクレオチド７６１〜１５６１に示されるｓｉｒＢ、及び配列番号１、３又は５のヌクレオチド１５４２〜２１５０に示されるｓｉｒＣが、強力に発現さる及び／又は増加したコピー数で存在する。
【００３９】
本発明の特に有利な変形は、シロヘム合成酵素をコードする、配列番号１のヌクレオチド１〜７８０に示される遺伝子ｓｉｒＡ、及び配列番号１、３又は５のヌクレオチド１５４２〜２１５０に示されるｓｉｒＣ、並びにコバラミン合成酵素をコードする遺伝子ｃｂｉＸが、強力に発現される及び／又は増加したコピー数で存在する方法を包含する。
【００４０】
上記の変形は、巨大菌を含む培養物を発酵することによって好ましく実施される。
【００４１】
また、本発明は、巨大菌ｓｉｒＡＢＣオペロン又はその一部によりコードされる酵素、配列番号２に示されるウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ、配列番号４に示されるシロヒドロクロリンフェロキレターゼ及び配列番号６に示されるプレコリン−２デヒドロゲナーゼに関する。
【００４２】
さらに、本発明は、上記酵素の改変形態に関する。
【００４３】
本発明により同様に包含される「改変形態」とは、配列中に、例えばポリペプチドのＮ末端及び／若しくはＣ末端に、又は保存アミノ酸領域中に変化があるが、これが酵素の機能を損なうことのない酵素であると理解すべきである。これらの変化をアミノ酸置換の形で行うために、自体公知の方法を用いることができる。
【００４４】
本発明の特定の実施形態は、その活性が、例えばアミノ酸置換によって、個々の元のタンパク質の活性と比較して減弱又は増大されている、本発明に係るポリペプチドの変異体を包含する。同じことは、細胞中の本発明に係る酵素の安定性、例えばプロテアーゼによる分解をより受けやすいか又はより受けにくい酵素の安定性にも当てはまる。
【００４５】
本発明に係る配列番号４に示されるシロヒドロクロリンフェロキレターゼは、コバルトキレターゼ活性を追加的に有するという事実によってさらに区別される。
【００４６】
鉄及びコバルトに加えて、本発明に係るキレターゼ活性を有する配列番号４に示される酵素は、ニッケルイオン、亜鉛イオン及び銅イオンをも受容する。
【００４７】
これらの金属イオンを含む反応混合物について行った適切な分光光度分析は、ＳｉｒＢが鉄キレターゼとして、またインビトロでコバルトキレターゼとして作用でき、そして、これに加えて、多数の他の金属イソ型細菌性クロリンを合成できることを示した。
【００４８】
ＳｉｒＢ及びＣｂｉＸのアミノ酸配列を比較すると、広範囲の一致性が認められる。ＳｉｒＢ及びＣｂｉＸの活性は同様である。しかしながら、ＳｉｒＢと比較して、ＣｂｉＸはＣ末端でヒスチジン残基の異常な蓄積を示す。さらに、システイン栄養要求変異体を用いた補完の研究によって、巨大菌に由来することが既知であり、かつ遺伝子ｃｂｉＸによりコードされるシロヒドロクロリンキレターゼが鉄よりもコバルトに対して高い親和性を有することを示された。
【００４９】
本発明によれば、生物工学的方法によりビタミンＢ１２を製造するために、シロヒドロクロリンフェロキレターゼ及び／又はシロヒドロクロリンコバルトキレターゼと、好適な生物においてシロヘム合成又はコバラミン合成に関与する他の酵素との組み合わせの使用を考慮することが少なくとも可能であり、コバラミンのために代謝回転に導く好適な発酵条件の使用を可能にする。
【００５０】
発酵条件は、好気的、半嫌気的又は嫌気的条件下での微生物の培養を含むことができる。加えて、本発明は、好気的条件から嫌気的条件へのシフト又はその逆の全ての考慮し得る変形を包含する。
【００５１】
本発明に係る方法において、ビタミンＢ１２を生物工学的に製造するために、バシラス属、サルモネラ属、シュードモナス属、エシェリヒア属又はプロピオニバクテリウム属の微生物又はこれらの微生物の混合物を含む培養物を発酵する。例えば、プロピオニバクテリウム属として、プロピオニバクテリウム・シェルマニイ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｇｅｒｉｕｍ  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ）種を使用することが可能である。
【００５２】
本発明によれば、ビタミンＢ１２を製造するための上述したタイプの方法において、ネズミチフス菌又は大腸菌又は巨大菌を含む培養物を発酵することが好ましい。
【００５３】
巨大菌の使用は、この生物が工業的に興味深い種々の生成物の生物工学的製造に使用するための多くの利点を有するので、経済的に極めて興味深い。
【００５４】
例えば、巨大菌はアルカリプロテアーゼを有さず、これは、異種タンパク質が産生されたときに分解が殆ど観察されないことを意味する。さらに、巨大菌は、商業的に興味深い生成物を効率的に分泌することが知られており、この特徴は例えば、α−アミラーゼ及びβ−アミラーゼの製造に利用される。加えて、巨大菌を用いると、生物の大きさの結果として、集団密度が高すぎることに起因して死滅する前に、高いバイオマスを蓄積させることが可能である。加えて、この種が、価値の高い生成物、並びに廃棄材料及び低級物質から最高品質の生成物を生成することができるという好ましい状況は、巨大菌を用いる工業的製造に関して実に最も有意義であることが分かる。また、著しく広範囲の物質を代謝するこの可能性は、シアン化物、除草剤及び持続性殺虫剤をも分解できる土壌解毒剤としての巨大菌の使用に反映される。最後に、巨大菌は完全に病原性がなく、かつ毒素を生成しないという事実は、特に食品及び化粧品の製造において最も重要である。これら種々の利点のため、巨大菌は、現在では、多数の工業的用途、例えばα−アミラーゼ及びβ−アミラーゼ並びにペニシリンアミダーゼの製造、毒性廃棄物の再生、並びにビタミンＢ１２の好気的製造に既に使用されている（概要について、Ｖａｒｙ，Ｐ．Ｓ．，１９９４，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，４０，１００１−１０１３，Ｐｒｉｍｅ  ｔｉｍｅ  ｆｏｒ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍに記載されている）。
【００５５】
原則として、少なくともシロヘム合成及び適切ならばコバラミン合成の酵素の活性が対応の野生型と比較して増大されているバシラス属、サルモネラ属、シュードモナス属、エシェリヒア属又はプロピオニバクテリウム属の菌株又はその混合物は、本発明の目的に使用することができる。これらの菌株は、特に、少なくともシロヘム合成及び適切ならばコバラミン合成の酵素をコードするヌクレオチド配列の発現の上昇及び／又はコピー数の増加を示す、遺伝的に改変された微生物を包含する。
【００５６】
ビタミンＢ１２を生成する菌株の使用が好ましい。特に好ましいサルモネラ種は、（遺伝的に改変された）ＡＲ３６１２株である（Ｒａｕｘら，１９９６；Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７８，（３）：７５３−７６７）。プロピオニバクテリウム・シェルマニイ種は、プロピオニバクテリウム属の微生物の場合に特に適することが分かった。巨大菌ＤＳＭＺ５０９株、及びビタミンＢ１２を生成する菌株としての使用に適する全ての通常の巨大菌株が非常に特に好ましい。
【００５７】
本発明の意味の範囲内で、「ビタミンＢ１２を生成する菌株」は、好ましくは、それらの代謝回転がビタミンＢ１２又はその誘導体の生合成の方向に増大して進行するように、古典的及び／又は分子遺伝学的方法を用いて改変されている微生物株（代謝工学）を意味すると理解すべきである。例えば、これらの生成株において、重要な位置（ボトルネック）に存在し、代謝経路において決定的であり、従って複合的に調節される１以上の遺伝子及び／又は対応の酵素の調節は、変更されるか、あるいはこれらの遺伝子及び／又は酵素は脱調節さえされる。これに関し、本発明において使用できる微生物は、全ての既に公知のビタミンＢ１２生成株、好ましくはバシラス属又は相同生物の株を包含する。本発明によれば、有利に使用される株は、特に、巨大菌ＤＳＭＺ５０９株及びＤＳＭＺ２８９４株を包含する。
【００５８】
しかしながら、ビタミンＢ１２を生成するために、本発明なくしてはビタミンＢ１２を生成し得ない株、例えば大腸菌ＥＲ１８５株又はＥＲ１７１株を用いることもできる（以下の表１参照）。大腸菌は、例えばサルモネラ属又はバシラス属に存在するが進化の過程で失われてしまった若干の酵素を欠いているので、ビタミンＢ１２を新規合成することができない。しかしながら、これらの欠損する遺伝子を含む好適なプラスミドで形質転換することにより、これらの酵素を再導入することができる。また、これに関して、ｃｙｓＧ株を用いる場合には、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩをコビンアミド（ｃｏｂｉｎａｍｉｄｅ）に変換するための酵素も大腸菌に存在する。本発明によれば、酵素ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ、シロヒドロクロリンフェロキレターゼ及びプレコリン−２デヒドロゲナーゼの酵素活性を増大させるか又はこの場合には導入することにより、大腸菌におけるビタミンＢ１２の合成をそれぞれ改善する又は可能にすることを実証することができた（以下及び表４参照）。
【００５９】
また、本発明は、古典的な突然変異誘発、又は選択的分子生物学的技術及び対応の選択方法を用いて作製することができる遺伝的に改変された細菌株を包含する。選択的遺伝子操作のための重要な標的点は、ビタミンＢ１２に導く生合成経路の分岐点であって、これによって、最大のビタミンＢ１２生成に向けた選択的手段で代謝回路を選択できるものを包含する。また、代謝回路の調節に関与する遺伝子の選択的改変は、構造遺伝子の上流及び下流の調節領域の調査及び変化、例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーター、リボソーム結合部位などの最適化及び／又は置換を包含する。また、本発明は、ＤＮＡ若しくはｍＲＮＡ、又はそれらによりコードされるタンパク質の安定性を、例えばヌクレアーゼ又はプロテアーゼによる分解の減少又は防止によって改善することを包含する。
【００６０】
さらに、本発明は、上述したタイプのｓｉｒオペロンに由来する単離されたヌクレオチド配列又はそれらの一部、並びに調節機能を有し、かつそれらに機能的に連結したヌクレオチド配列を含む、遺伝子構造物を包含する。本発明によれば、シロヒドロクロリンコバルトキレターゼをコードするヌクレオチド配列（ｃｂｉＸ）又はその一部が、上述したタイプの遺伝子構造物に存在することができる。
【００６１】
「機能的な連結」は、例えばプロモーター、コード配列、ターミネーター、及び、適切ならば調節配列の各々がコード配列の発現のために意図したようにその機能を発揮し得るような他の調節配列、の連続的配置を意味すると理解される。これらの調節ヌクレオチド配列は、天然起源のものであってよいし、又は化学的合成により得ることができる。原則として、対応の宿主生物において遺伝子発現を調節できる任意のプロモーターをプロモーターとしての使用に適している。これに関し、プロモーターは、本発明によれば、その制御下にある遺伝子の発現を宿主細胞において特定の時点にで調節できる化学的誘導性プロモーターであってもよい。ここで、一例として、β−ガラクトシダーゼ系又はアラビノース系を挙げることができる。
【００６２】
遺伝子構造物は、慣用の組換え及びクローニング技術を用いて、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ；  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｕｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されるように、好適なプロモーターを少なくとも１の本発明に係るヌクレオチド配列に融合させることにより調製される。
【００６３】
ＤＮＡ断片を互いに結合するために、アダプター又はリンカーをＤＮＡ断片に結合することができる。
【００６４】
また、本発明は、上述したタイプのｓｉｒオペロンに由来する単離されたヌクレオチド配列若しくはそれらの一部、又は上述したタイプの遺伝子構造物、並びに選択、宿主細胞における複製及び／又は宿主細胞ゲノムへの組込みのための追加のヌクレオチド配列を含むベクターを包含する。これら追加の配列の多数の例は文献に記載されているので、さらに注釈しない。
【００６５】
従って、本発明は、ｓｉｒオペロンに由来する上記ヌクレオチド配列又はそれらの一部に加えて、シロヒドロクロリンコバルトキレターゼ又はその一部をコードするヌクレオチド配列を含むベクターをも包含する。
【００６６】
上述した遺伝子を形質転換及び過剰発現するために適した系の例は、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）及びｐＫＫ８６６８（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＷＨ１５１０及びｐＷＨ１５２０、並びにＲｙｇｕｓ，Ｔ．ら（１９９１，Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３５，５：５９４−５９９）に記載されたプラスミド不含の過剰発現株である巨大菌ｐＷＨ３２０である。しかしながら、本発明においてはこれらの系に限定されない。
【００６７】
また、本発明は、ビタミンＢ１２を製造するための上述したタイプの方法に使用するためのトランスジェニック微生物に関し、該微生物は、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ及びプレコリン−２デヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列の発現の上昇及び／又はコピー数の増大を示すという事実によって区別されるものである。
【００６８】
同様に、本発明は、ビタミンＢ１２を製造するための上述したタイプの方法に使用するためのトランスジェニック微生物を包含し、該微生物は、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ、シロヒドロクロリンフェロキレターゼ及びプレコリン−２デヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列の発現の上昇及び／又はコピー数の増大を示すという事実によって区別されるものである。
【００６９】
同様に、本発明は、ビタミンＢ１２を製造するための上述したタイプの方法に使用するためのトランスジェニック微生物を包含し、該微生物は、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ、シロヒドロクロリンコバルトキレターゼ及びプレコリン−２デヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列の発現の上昇及び／又はコピー数の増大を示すものである。
【００７０】
これに関し、発現の上昇及び／又はコピー数の増大は、例えば、多機能性酵素をコードするヌクレオチド配列に関するものであってよい。同様に、幾つかのシロヘム合成酵素をコードするヌクレオチド配列は、それがオペロン又は遺伝子クラスターを含むので、例えば、トランスジェニック微生物において、より強力に発現される及び／又は増加したコピー数で存在するものであってよい。
【００７１】
本発明に係るトランスジェニック微生物は、巨大菌ｓｉｒＡＢＣオペロン又はその一部を含む、配列番号１に示される少なくとも１のヌクレオチド配列を含むことが好ましい。配列番号２に示されるウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ（ｓｉｒＡ）のヌクレオチド１〜７８０をコードし、配列番号４に示されるシロヒドロクロリンフェロキレターゼ（ｓｉｒＢ）のヌクレオチド７６１〜１５６１をコードし、及び／又は配列番号６に示されるプレコリン−２デヒドロゲナーゼ（ｓｉｒＣ）のヌクレオチド１５４２〜２１５０をコードする、配列番号１に示される少なくとも１の単離されたヌクレオチド配列又はその対立遺伝子の発現の上昇及び／又はコピー数の増大を示すトランスジェニック微生物も同様に好ましい。また、本発明に係るトランスジェニック微生物は、配列番号１に示される少なくとも１つの単離されたヌクレオチド配列若しくはその一部又はその対立遺伝子の発現の上昇及び／又はコピー数の増大を示すもの、そしてさらに、コバラミン生合成酵素（有利にはシロヒドロクロリンコバルトキレターゼ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列の発現の上昇及び／又はコピー数の増大を示すものが同等に有利である。
【００７２】
これは、本発明の一つの変形において、配列番号１に示されるヌクレオチド配列の一部を含むトランスジェニック微生物の使用を包含し、これらの一部は、より強力に優越して発現され、そして／又は増加したコピー数で優越して存在する。これに関し、該一部が、コードする機能を有する上記で詳細に定義したタイプの構成領域（ｓｉｒＡ、ｓｉｒＢ又はｓｉｒＣ）であることが好ましい。これに関し、構成配列は、単独で又は任意の随意の組み合わせで存在してもよいし、あるいは調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどに機能的に連結されていてもよい。同様に、本発明は、コバラミン合成経路、例えばｃｂｉＸ遺伝子又はその一部の酵素をコードするｓｉｒオペロン及び配列に由来する上記配列の組合せを包含する。
【００７３】
さらに、本発明は、本発明に係る遺伝子又は本発明に係るベクターを複製形態で含むトランスジェニック微生物に関する。バシラス属、サルモネラ属、シュードモナス属、エシェリヒア属又はプロピオニバクテリウム属のトランスジェニック微生物が有利である。巨大菌、大腸菌又はネズミチフス菌種である本発明に係るトランスジェニック微生物が好ましい。
【００７４】
本発明に係る方法の有利な変形は、そのｓｉｒＡ、ｓｉｒＢ又はｓｉｒＣ遺伝子又はそれらの一部の個々の又は組み合わせ、及び／あるいはｃｂｉＸ遺伝子又はその一部との全ての考慮し得る組み合せを、より強力に発現する巨大菌株又は大腸菌株を発酵することを含み、内因性に（天然に）存在するシロヘム合成酵素又はコバラミン合成酵素の活性と比較して増大された酵素活性が達成される。これに関して、ｓｉｒＡＢ、ｓｉｒＡＣ又はｓｉｒＡＢＣ、又はｓｉｒＡＢｃｂｉＸ、ｓｉｒＡＣｃｂｉＸ又はｓｉｒＡＢＣｃｂｉＸの遺伝子組み合わせが好ましい。遺伝子組み合わせｓｉｒＡＣｃｂｉＸが特に好ましい。
【００７５】
本発明に係る方法の同様に有利な変形は、そのｓｉｒＡ、ｓｉｒＢ若しくはｓｉｒＣ遺伝子又はそれらの一部の個々の又は組み合わせ、及び／あるいはｃｂｉＸ遺伝子又はその一部との全ての考慮し得る組み合せが、遺伝的に改変されていない生物と比較して増加したコピー数で細胞中に存在する、遺伝的に改変された巨大菌株又は大腸菌株を発酵することを伴う方法を包含する。コピー数は、２〜数百で変化することができ、そして上述したシロヘム合成遺伝子及び適切ならばコバラミン合成遺伝子を含むベクター又はプラスミドをトランスジェニック細胞に導入し、それらを複製することによって達成することができる。また、本発明は、該シロヘム合成及び適切ならばコバラミン合成遺伝子の追加のコピーをトランスジェニック生物のゲノムに挿入するための、相同組換えの使用を包含する。
【００７６】
天然（内因性）酵素活性の増大、遺伝子発現の増大、遺伝子コピー数の増大、及び本発明に係る遺伝子又はそれらの一部の個々の又は組み合わせを、微生物、好ましくはビタミンＢ１２生成株、特に好ましくは巨大菌種に導入することは、ビタミンＢ１２の生産性を増大するために有利である。
【００７７】
遺伝子発現の増大（上昇）を達成するために、対応の遺伝子のコピー数を増加することができる。さらに、構造遺伝子の上流に存在するプロモーター領域及び／又は調節領域及び／又はリボソーム結合部位を、発現が高められた割合で行われるように対応して改変することができる。構造遺伝子の上流に導入された発現カセットは、同じ効果を有する。加えて、ビタミンＢ１２生成の経過中に発現を増大するために、誘導性プロモーターを使用することが可能である。
【００７８】
同様に、発現は、ｍＲＮＡの寿命を延長する手段によって改善される。遺伝子又は遺伝子構造物は、異なるコピー数を有するプラスミドに存在していてよいか、又は染色体に組込まれ若しくは増幅されていてもよい。さらに、酵素の活性それ自体が増大されているか、又は活性が酵素タンパク質の分解の防止によって増大されていることも可能である。
【００７９】
さらに、ビタミンＢ１２の方向での代謝回転の増大は、培地の組成又は培養物の取り扱いの変化によって達成することができる。
【００８０】
加えて、ビタミンＢ１２の生成は、本発明によれば、代謝回転をビタミンＢ１２又はその対応の前駆体の方向に重要な位置で、より強力に導くことにより改善することができる。これは、本方法を発酵に関して変更すること、例えば嫌気的条件下での発酵によって達成することができる。別法として、発酵を最初は好気的条件下で、次いで嫌気的条件下で行うことができる。この目的には、バシラス属、サルモネラ属、シュードモナス属、エシェリヒア属又はプロピオニバクテリウム属の微生物の使用が好ましい。巨大菌、大腸菌又はネズミチフス菌が特に好ましい。
【００８１】
巨大菌は嫌気的に増殖することができる。加えて、ビタミンＢ１２生成は、これらの嫌気的条件下では好気的条件下でよりも高い。好気的条件下及び嫌気的増殖条件下での巨大菌によるビタミンＢ１２生成の比較は、研究した全ての株において、嫌気的ビタミンＢ１２生成が、好気的ビタミンＢ１２生成と比較して、少なくとも３〜４倍増大することを示す（図１〜３及び特に４参照）。さらなる増大は、増殖条件及び培地の組成、並びに使用する細菌株を系統的に最適化することによって達成することができる。
【００８２】
さらに、本発明の別の変形において、巨大菌を最初に好気的に発酵し、次いで嫌気的に発酵することを考慮することも可能である。有利な変形において、好気的に発酵した細胞の対数増殖期に、好気的発酵から嫌気的発酵への移行が行われる。これに関し、好気的発酵から嫌気的発酵への移行を、好気的に増殖する細胞の対数増殖期の半ば又は終りに、好ましくは終りに行う場合が好ましい。
【００８３】
巨大菌の１段階及び２段階発酵の両者において、「嫌気的条件」は、好気的増殖の後に細菌を嫌気的フラスコに移し、これらのフラスコ中で発酵する場合に起こる条件と理解すべきである。特に、２段階方法において、嫌気的フラスコに移す時期は、好気的に増殖する細菌細胞が対数増殖期になるとすぐに行われる。すなわち、細菌が嫌気的フラスコに移された後、細菌はフラスコ中に存在する酸素を消費し、酸素はさらに供給されない。これらの条件は、半好気的と説明することもできる。対応の手法は慣用の実験室的慣例であり、当業者に公知である。
【００８４】
同等の条件は、細菌を最初に発酵槽中で好気的に培養し、次いで、やがて半好気的条件が起こるように酸素の供給を徐々に減少する場合にも可能である。
【００８５】
発酵の特別な変形において、例えば培地に還元剤を添加することにより、厳密に嫌気的の条件を作り出すことも可能である。
【００８６】
一般的に、細菌の好気的増殖（初期培養）は、嫌気的条件（これらが半嫌気的条件であろうと又は厳密に嫌気的条件であろうと）における発酵にとって必ずしも絶対的に必要ではない。すなわち、細菌を嫌気的条件下で増殖させ、次いで半嫌気的又は厳密に嫌気的条件下でさらに発酵することもできる。ストック培養物からの直接接種を行い、それを嫌気的条件下でのビタミンＢ１２の生成に使用することを考慮することも可能である。
【００８７】
職業的専門技術の範囲内で、対応の条件及び方法を、別の株の場合に使用することもできる。
【００８８】
さらに、例えば、巨大菌又は大腸菌によるビタミンＢ１２の生成を少なくともコバルトを培地に添加することによって増加させ得ることを考慮することが可能である。例えば、ベタイン、メチオニン、グルタメート、ジメチルベンズイミダゾール若しくはクロリン又はそれらの組み合わせの添加も、ビタミンＢ１２生成に対して有利な効果を有する。これらの化合物の単独又はそれらの組合せは、コバルトとの組み合わせにおいても有利であり得る。コバルトのような物質の添加により、コバルトが、例えば鉄イオン又はマグネシウムイオンと比較して増大した程度で、生合成経路の共通の前駆体に取り込まれることができ、こうしてコバラミン（ビタミンＢ１２）の合成が、例えば、シロヘム、ヘモグロビン又はクロロフィルの合成を超えて増大して有利になることが可能である。
【００８９】
本発明の別の変形において、少なくともコバルト及び／又は少なくともコバルト及び５−アミノピルビン酸を含む培地中で、嫌気的条件下で発酵を行うことが考慮される。
【００９０】
本発明によれば、炭素源としてグルコースを含む培地中で発酵を行うことが可能である。炭素源としてグリセロールを含む培地中で発酵を行う、本発明に係る方法の変形を考慮することも可能である。
【００９１】
一般的に、より高い細胞密度は、炭素源がグルコースである場合に達成されるよりも、炭素源としてグリセロールを用いて巨大菌を発酵する場合に達成される。これに関して、興味深いことに、好気的条件下でのコバルト及び５−アミノピルビン酸の同時添加は、何れも添加することなく対応の培地で得られるよりもビタミンＢ１２の生成が上昇する。
【００９２】
このビタミンＢ１２の改善された生成は、発酵した巨大菌細胞を好気的増殖条件から嫌気的増殖条件に移行することによって、よりいっそう増大することができる。グリセロール、コバルト及び５−アミノピルビン酸を含む培地を用いることが有利である。培養物を好気的から嫌気的増殖条件に移行することによって、高いビタミンＢ１２含有量及び高い細胞密度の組合せを達成することが可能である。
【００９３】
有利には、培養は回分式で行われる。発酵を供給−回分式で、又は連続培養で行う変形も同様に、本発明は包含される。
【００９４】
本発明は、ビタミンＢ１２を製造するための、酵素ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ、シロヒドロクロリンフェロキレターゼ、シロヒドロクロリンコバルトキレターゼ及びプレコリン−２デヒドロゲナーゼを個々に又は組み合わせてコードするヌクレオチド配列の使用に関する。
【００９５】
さらに、本発明は、ビタミンＢ１２を製造するための、シロヘム合成酵素をコードする配列番号１に示されるヌクレオチド配列又はその一部の使用に関する。同様に、本発明は、ビタミンＢ１２を製造するための、シロヘム合成酵素をコードする配列番号１に示されるヌクレオチド配列若しくはその一部の単独の又はシロヒドロクロリンコバルトキレターゼ酵素をコードするヌクレオチド配列との組み合わせての使用に関する。これに関し、本発明は、ビタミンＢ１２を製造するための、本発明に係る遺伝子構造物又は本発明に係るベクターの使用をも包含する。
また、本発明は、先に説明したトランスジェニック微生物を製造するための、配列番号１に示されるヌクレオチド配列若しくはその一部の単独の又はシロヒドロクロリンコバルトキレターゼ酵素をコードするヌクレオチド配列若しくはその一部と組み合わせての、又は本発明に係るタイプの遺伝子構造物、又は本発明に係るタイプのベクターの使用に関する。これはまた、ビタミンＢ１２生成株、好ましくはバシラス属又はエシェリヒア属、特に好ましくは巨大菌又はエシェリヒア種を製造するための、本発明に係るヌクレオチド配列、遺伝子構造物又はベクターの使用を包含する。
【００９６】
同様に、本発明は、ビタミンＢ１２を製造するための、トランスジェニック微生物、好ましくはバシラス属、特に好ましくは巨大菌種の使用を包含する。
【実施例】
【００９７】
以下の実施例は本発明を説明するためのものである。しかしながら、それらは本発明を限定するためのものではない。
【００９８】
１．化学物質及び分子生物学試薬
化学物質、試薬、抗生物質及びＤＥＡＥ ＳｅｐｈａｃｅｌｓはＡｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａより入手し、増殖培地はＯｘｏｉｄから入手した。酵素はＰｒｏｍｅｇａ、Ｂｉｏｌｉｎｅ又はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓより入手した。
【００９９】
２．細菌株、プラスミド及びプライマー
この研究で用いた細菌株、プラスミド及びプライマーのすべてを表１、２及び３に掲載する。
【０１００】
３．バッファー及び溶液
３．１．最少培地
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）最少培地
Ｋ２ＨＰＯ４            ６０．３ｍＭ
ＫＨ２ＰＯ４            ３３．１ｍＭ
（ＮＨ４）２ＳＯ４       ７．６ｍＭ
クエン酸ナトリウム    １．７ｍＭ
ＭｇＳＯ４             １．０ｍＭ
Ｄ−グルコース        １０．１ｍＭ
チアミン              ３．０μＭ
カザミノ酸            ０．０２５％（ｗ／ｖ）
固体培地にはカンテン１５ｇ／Ｌを加えた。
【０１０１】
Ｍｏｐｓｏ最少培地
Ｍｏｐｓｏ（ｐＨ７．０）      ５０．０ｍＭ
トリシン（ｐＨ７．０）        ５．０ｍＭ
ＭｇＣｌ２                     ５２０．０μＭ
Ｋ２ＳＯ４                      ２７６．０μＭ
ＦｅＳＯ４                     ５０．０μＭ
ＣａＣｌ２                     １．０ｍＭ
ＭｎＣｌ２                     １００．０μＭ
ＮａＣｌ                      ５０．０ｍＭ
ＫＣｌ                        １０．０ｍＭ
Ｋ２ＨＰＯ４                    １．３ｍＭ
（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４          ３０．０ｐＭ
Ｈ３ＢＯ３                      ４．０ｎＭ
ＣｏＣｌ２                     ３００．０ｐＭ
ＣｕＳＯ４                     １００．０ｐＭ
ＺｎＳＯ４                     １００．０ｐＭ
Ｄ−グルコース                ２０．２ｍＭ
ＮＨ４Ｃｌ                     ３７．４ｍＭ
滴定試薬はＫＯＨ溶液とした。
【０１０２】
ネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）最少培地
ＮａＣｌ          ８．６ｍＭ
Ｎａ２ＨＰＯ４     ３３．７ｍＭ
ＫＨ２ＰＯ４       ２２．０ｍＭ
ＮＨ４Ｃｌ        １８．７ｍＭ
Ｄ−グルコース   ２０．２ｍＭ
ＭｇＳＯ４        ２．０ｍＭ
ＣａＣｌ２        ０．１ｍＭ
固体培地にはカンテン１５ｇ／Ｌを加えた。
【０１０３】
３．２．巨大菌（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）のプロトプラスト形質転換用溶液
ＳＭＭＰバッファー
抗生物質培地Ｎｏ．３（Ｄｉｆｃｏ）  １７．５ｇ／Ｌ
スクロース                          ５００．０ｍＭ
マレイン酸Ｎａ（ｐＨ６．５）        ２０．０ｍＭ
ＭｇＣｌ２                           ２０．０ｍＭ
滴定試薬はＮａＯＨ溶液とした。
【０１０４】
ＰＥＧ−Ｐ溶液
ＰＥＧ６０００                ４０．０％（ｗ／ｖ）
スクロース                    ５００．０ｍＭ
マレイン酸Ｎａ（ｐＨ６．５）  ２０．０ｍＭ
ＭｇＣｌ２                     ２０．０ｍＭ
滴定試薬はＮａＯＨ溶液とした。
【０１０５】
ｃＲ５上部カンテン
スクロース                ３００．０ｍＭ
Ｍｏｐｓ（ｐＨ７．３）    ３１．１ｍＭ
ＮａＯＨ                  １５．０ｍＭ
Ｌ−プロリン              ５２．１ｍＭ
Ｄ−グルコース            ５０．５ｍＭ
Ｋ２ＳＯ４                 １．３ｍＭ
ＭｇＣｌ２×６Ｈ２Ｏ       ４５．３ｍＭ
ＫＨ２ＰＯ４               ３１３．０μＭ
ＣａＣｌ２                １３．８ｍＭ
カンテン                  ４．０ｇ／Ｌ
カザミノ酸                ０．２ｇ／Ｌ
酵母エキス                １０．０ｇ／Ｌ
滴定試薬はＮａＯＨ溶液とした。
【０１０６】
４．培地及び培地への添加物
４．１．培地
特に断らない限り、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ；ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に書かれているルリア−ベルターニブロス（ＬＢ）完全培地を用いた。
【０１０７】
４．２．添加物
炭素源、アミノ酸又は抗生物質などの添加物は、培地に加えて一緒にオートクレーブ処理するか又は水中の濃縮ストック溶液として作製し、濾過により滅菌した。各物質は、オートクレーブ処理し、５０℃未満に冷却しておいた培地に加えた。テトラサイクリンのような光に対して感受性のある物質に関しては、暗所でインキュベートするように注意した。通常用いた最終濃度は以下のとおりであった：
アンピシリン        ２９６μＭ
テトラサイクリン    ２１μＭ
ＡＬＡ              ２９８μＭ
ヘム                １５３μＭ
Ｘ−Ｇａｌ          ９８μＭ
メチオニン          ３３５μＭ
システイン          ２８５μＭ
硝酸ナトリウム      １０ｍＭ
亜硝酸ナトリウム    １０ｍＭ
フマル酸二ナトリウム１０ｍＭ
グルコース          １０ｍＭ
塩化アンモニウム    ３７ｍＭ
キシロース          ３３ｍＭ
リソザイム          １０μｇ／ｍＬ
カザミノ酸          ０．０２５％（ｗ／ｖ）
【０１０８】
５．微生物学的手法
５．１．滅菌
特に断らない限り、すべての培地及びバッファーは１２０℃及び陽圧１バールで２０分間スチーム滅菌した。熱に影響を受け易い物質は濾過により滅菌し、ガラス器具は１８０℃で少なくとも３時間熱滅菌した。
【０１０９】
５．２．共通の増殖条件
好気的細菌培養液はバッフル付フラスコ中で３７℃、最低回転数１８０ｒｐｍでインキュベートした。インキュベーション時間はその細菌培養液の所望の光学密度に応じて変えた。
【０１１０】
５．３．巨大菌の増殖用条件
好気的培養液の考えられうる最高の空気混和のためにはバッフル付フラスコ中２５０ｒｐｍで、特に断らない限り３０℃でインキュベートした。嫌気的培養液は小さな嫌気的ボトル中、容量１００ｍＬで３０℃にて１００ｒｐｍで培養した。いずれの場合も、一定品質の培地を用いること、一晩培養液に１：１００の比で接種すること、その一晩培養に同じ条件を用いることに注意した。
【０１１１】
５．４．細胞密度の決定
細菌培養液の細胞密度は５７８ｎｍで光学密度（ＯＤ）を測定することにより決定し、ＯＤ５７８が１とは１×１０９個の細胞の細胞数に相当すると仮定した。
【０１１２】
５．５．比較増殖試験
各種巨大菌株の好気的及び嫌気的増殖挙動の比較試験を行った。それらを図１、２及び３に示す。用いた菌株は、好気的条件下でのビタミンＢ１２生成に好適である巨大菌ＤＳＭＺ３２株（野生型）又は「生産菌株」ＤＳＭＺ５０９株及びＤＳＭＺ２８９４株である。しかしながら、本発明はこれらの菌株の使用に限定されるものではない。ビタミンＢ１２を製造するのに好適である他の菌株もまた考えられ、例えば古典的変異誘発法又は特定の分子生物学的手法及び適切な選抜方法により作製することができる遺伝子改変細菌株が挙げられる。
【０１１３】
５．６．ビタミンＢ１２産生の比較試験
巨大菌についての好気的及び嫌気的増殖条件下でのビタミンＢ１２産生の解析も行った。本発明で用いた例は、グルコース含有（完全ＬＢ）培地中嫌気的条件下での巨大菌ＤＳＭＺ３２株、ＤＳＭＺ５０９株及びＤＳＭＺ２８９４株であり、ｐｍｏｌ／ＯＤ５７８で表わしたビタミンＢ１２含有量を指数増殖期の終わりに測定した。これと並行して、好気的に増殖している間のビタミンＢ１２生成を指数増殖期の中央で調べた。結果を図４に示す。
【０１１４】
好気的条件（２、４及び６）下で増殖した巨大菌は、多量のビタミンＢ１２を産生することを確認することができる。２〜３倍高い値が達成された。ビタミンＢ１２は当業者に公知の方法で単離することができる。
【０１１５】
５．７．定量的ビタミンＢ１２分析
ＯＤ５７８の決定の後に、指数増殖期の中央で好気的巨大菌培養液を採取し、指数増殖期の終わりで、５０００ｒｐｍにて１５分間の遠心分離（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ５４０３，Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）による嫌気的培養液を採取した。細菌を食塩水４０ｍＬで洗ったあと再度５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ５４０３，Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）した。得られた細胞沈殿物を最終的に凍結乾燥した。ネズミチフス菌ｍｅｔＥ  ｃｙｓＧ二重変異体（Ｒａｕｘ，Ｅ．ら，１９９６，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７８：７５３−７６７）をメチオニン及びシステイン含有最少培地で一晩３７℃でインキュベートし、プレートから掻きとり、等張性食塩水４０ｍＬで洗った。遠心分離のあと、細胞沈殿物を等張性食塩水中に再懸濁させた。洗った細菌培養液を慎重に４７〜４８℃のシステイン−含有最少培地カンテン４００ｍＬと混ぜた。滅菌脱イオン水中に再懸濁させ、水浴中で１５分間沸騰させた巨大菌サンプル１０μＬを冷却したプレート上に載せ、３７℃で１８時間インキュベートした。増殖するサルモネラ菌コロニーの直径は添加した巨大菌サンプル中のビタミンＢ１２含有量に比例する。調べたサンプル中のビタミンＢ１２含有量は、ビタミンＢ１２を０．０１、０．１、１、１０及び４０ｐｍｏｌ加えることにより作成した検量線と比較することにより推定した。この標準的な方法によって、生物材料中におけるビタミンＢ１２の僅かな量を迅速にかつ非常に再現性よく検出することが可能となる。
【０１１６】
５．８．酵素活性の測定
ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼの活性は、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩからプレコリン−２への変換に基づいて測定した。プレコリン−２の産生は、市販の蛍光分析装置を用いて、励起３８０ｎｍ及び発光６１０ｎｍにて蛍光をモニターすることにより測定した。測定は、既知量のプレコリン−２で較正することにより、すなわち検量線を作成することにより定量した。酵素活性１単位は１時間当たりに産生されるプレコリン−２の１ｎＭと規定される。
【０１１７】
約５０〜２００μｇの粗細胞抽出物を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファー（ｐＨ８）中の０．１ｍＭ Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニンを含有する２μＭウロポルフィリノーゲンＩＩＩ溶液１ｍｌに添加し、反応を３０分間かけて嫌気的条件下にて行った。
【０１１８】
粗細胞抽出物１ｍｇ当たり０．２単位のウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ活性が野生株においてみとめられた。これは、検出可能な値の下限にすぎない。形質転換した大腸菌及びネズミチフス菌の場合には、粗細胞抽出物１ｍｇ当たり５０単位のウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ活性が得られた。形質転換した巨大菌においては粗細胞抽出物１ｍｇ当たり２０単位のレベルが得られた。
【０１１９】
キレターゼｓｉｒＢ及びｃｂｉＸの場合には、キレターゼ反応の活性は、コバルトのシロヒドロクロリンへの導入について、減衰係数２．４×１０５Ｍ−１ｃｍ−１を用いてλｍａｘ３７６ｎｍにてシロヒドロクロリン蛍光の低減速度を測定することによって決定した。酵素活性１単位は１分当たりのシロヒドロクロリン１ｎＭの低減であると定義した。
【０１２０】
活性を測定するため、約５０〜２００μｇのタンパク質を含有する粗細胞抽出物を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファー（ｐＨ８）の存在下でシロヒドロクロリン（５０μＭ）及びコバルト（１０μＭ）と反応させた。
【０１２１】
野生株においては、粗細胞抽出物１ｍｇ当たり約０．０１単位の活性が測定された。形質転換大腸菌及び形質転換ネズミチフス菌においては、ＳｉｒＢ及びｃｂｉＸの活性はほぼ同じであり、いずれの場合にも活性は粗細胞抽出物１ｍｇ当たり３単位と決定された。
【０１２２】
プレコリン−２デヒドロゲナーゼ（ＳｙｒｏＣ）活性を測定するため、デヒドロゲナーゼ反応を、減衰係数２．４×１０５Ｍ−１ｃｍ−１を用いてλｍａｘ３７６ｎｍにおけるシロヒドロクロリンの形成により決定した。これに関して、酵素活性１単位は１分当たりシロヒドロクロリン１ｎＭの生成と定義した。
【０１２３】
酵素活性を測定するため、５０〜２００μｇのタンパク質を含有する粗細胞抽出物を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファー（ｐＨ８）を含有する１ｍｌの反応量でプレコリン−ＩＩ（５μＭ）及びＮＡＤ（１００μＭ）と反応させた。
【０１２４】
野生株においては、粗細胞抽出物１ｍｇ当たり０．００２単位の活性が測定された。形質転換された大腸菌及びネズミチフス菌株においては、プレコリン−２デヒドロゲナーゼ活性は粗細胞抽出物１ｍｇ当たり０．３単位であった。
【０１２５】
上記のことから、形質転換生物が、場合によっては野生株での測定値よりも１００倍以上も高い酵素活性を示すことが明らかである。
【０１２６】
６．分子生物学手法
ＤＮＡの調製、ＤＮＡの制限、連結、ＰＣＲ、シークエンシング、機能的補完、タンパク質発現などの一般的な手法は通常の実験室実験の一部を形成するものであり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ；ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に記載されている。
【０１２７】
６．１．巨大菌のプロトプラストの形質転換
プロトプラストの調製：
ＬＢ培地５０ｍＬに巨大菌の一晩培養液１ｍＬを接種し、３７℃でインキュベートした。ＯＤ５７８が１の時点で、細胞を１５０００ｒｐｍにて４℃で１５分間遠心分離（ＲＣ  ５Ｂ  Ｐｌｕｓ，Ｓｏｒｖａｌｌ）し、ＳＭＭＰバッファー５ｍＬ中に再懸濁させた。ＳＭＭＰバッファー中のリソザイムを加えたあと、懸濁液を３７℃で６０分間インキュベートし、顕微鏡下でプロトプラスト形成をチェックした。細胞を室温にて３０００ｒｐｍでの遠心分離（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ５４０３，Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）により回収した後、細胞沈殿物を慎重にＳＭＭＰバッファー５ｍＬ中に再懸濁させ、２回目の遠心分離工程及び洗浄工程を行った。そうして、１０％（ｗ／ｖ）グリセロールを加えたあとプロトプラスト懸濁液をアリコートに分け、それらを−８０℃で凍結させた。
【０１２８】
形質転換：
プロトプラスト懸濁液５００μＬをＳＭＭＰバッファー中のＤＮＡ０．５〜１μｇと混ぜ、ＰＥＧ−Ｐ溶液１．５ｍＬを加えた。室温で２分間インキュベートしたあと、ＳＭＭＰバッファー５ｍＬを加え、慎重に混合した後、懸濁液を室温にて３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ５４０３，Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）した。そのあと直ちに、上澄み液を取り除き、僅かに見える沈殿物をＳＭＭＰバッファー５００μＬ中に再懸濁させた。懸濁液を３７℃で優しく振盪しながら９０分間インキュベートした。次に形質転換細胞５０〜２００μＬをｃＲ５上部カンテン２．５ｍＬと混ぜ、選抜に好適な抗生物質を含有するＬＢカンテンプレート上に載せた。３７℃で２日間インキュベートした後形質転換コロニーが目に見えた。
【０１２９】
６．２．巨大菌のｓｉｒＡＢＣオペロンの同定とシークエンシング
ｓｉｒＡＢＣオペロンはＰＣＲによりクローニングした。巨大菌ゲノムＤＮＡは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９に記載のように調製し、これを使用して、以下の通り、表３に示されるプライマーを使用してｓｉｒＡ、ｓｉｒＢ及びｓｉｒＣ遺伝子を単離した：
遺伝子配列の３’末端に相補的なプライマーを、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩをプレコリン−２に変換するメチルトランスフェラーゼをコードするｃｏｂＡ遺伝子の既知配列に基づいて調製した（Ｒｏｂｉｎら，１９９１，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２（１５）：４８９３−６）。これらのプライマーは、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ  ｖｅｃｔｏｒｅｔｔｅシステムにおいて、Ｌｉｌｌｅｂｅｒｇら（１９９８，Ｇｅｎｏｓｙｓ  Ｏｒｉｇｉｎｓ  １（２））の方法を用いて未知の巨大菌ｓｉｒＡ配列を増幅するために使用した。ｓｉｒＢ及びｓｉｒＣ遺伝子も同様に増幅した。さらに、完全なｓｉｒＡＢＣオペロンをシークエンシングした。ｓｉｒＡＢＣオペロンをコードする２１５０ｂｐのＤＮＡ断片を同定した。対応する塩基配列を配列番号１に示し、これから推定されるアミノ酸配列を配列番号２、４及び６に示す。これに関し、配列番号１、３及び５に示す配列は同一であり、ＰａｔｅｎｔＩｎ配列表を作成するためにのみ作成したものである。その理由は、ＰａｔｅｎｔＩｎは重複するコード領域を許容せず、アミノ酸配列はそれ自体の塩基配列を有することを要するためである。
【０１３０】
その後、プライマーを合成し、これらのプライマーを使用して、上記遺伝子を個々に及び組み合わせて２つの別個の発現ベクターにクローニングした。
【０１３１】
補完試験のため、ｓｉｒＡ、ｓｉｒＡＢ、ｓｉｒＡＢＣ及びｓｉｒＡＣのＰＣＴ産物を調製し、ｐＫＫ８６６８（プラスミドｐＫＫ２２３．３の改変体）のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ切断部位にｔａｃプロモーターの制御下にクローニングした。ｓｉｒＣは、ｐＫＫ８６６８にＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片としてクローニングした。ｓｉｒＡ、ｓｉｒＢ及びｓｉｒＣは個々に、ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ断片としてｐＥＴ１４ｂ（Ｔ７発現ベクター）にクローニングした。これにより、対応するタンパク質がＮ末端Ｈｉｓタグを有して過剰発現されることとなった。
【０１３２】
６．３．形質転換及び発現系
巨大菌における遺伝子の形質転換と過剰発現に好適なプラスミドはｐＷＨ１５１０及びｐＷＨ１５２０ならびにプラスミドなしの過剰発現巨大菌ＷＨ３２０株である（Ｒｙｇｕｓ，Ｔ．ら，１９９１，Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３５，５：５９４−５９９）。
【０１３３】
コントロールプラスミドｐＷＨ１５１０は分断されたｘｙｌＡリーディングフレーム中にｓｐｏＶＧ−ｌａｃＺ融合体を有している。ＳｐｏＶＧ−ｌａｃＺとは、本発明においては、枯草菌胞子形成タンパク質（ｓｐｏＶＧ）の非常に強力なリボソーム結合配列と、β−ガラクトシダーゼをコードする大腸菌遺伝子（ｌａｃＺ）の融合体を意味する。このプラスミドは従って巨大菌における形質転換効率及び過剰発現条件を調べるのに極めて好適である。
【０１３４】
プラスミドｐＷＨ１５２０は、実際のクローニング及び発現ベクターとして機能する。２つのベクターはいずれもテトラサイクリン耐性及びアンピシリン耐性をもち、大腸菌及びバチルス属細菌における複製にとって重要な構成要素を有する。つまりそれらは、大腸菌においてプラスミドｐＢＲ３２２の誘導体に対して確立されているすべての手法に使用することができる。２つのベクターはいずれもその調節配列と一緒にｘｙｌオペロンの巨大菌ｘｙｌＡ及びｘｙｌＲ遺伝子を含有する（Ｒｙｇｕｓ，Ｔ．ら，１９９１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ；Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ  Ｅｎｃｏｄｅｄ  Ｒｅｇｕｌｏｎ  ｆｏｒ  Ｘｙｌｏｓｅ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５５，５３５−５４２）。ｘｙｌＡはキシロースソメラーゼをコードし、ｘｙｌＲは、ｘｙｌＡに強力な転写調節を発揮する調節タンパク質をコードする。ｘｙｌＡはキシロースの不存在下では抑制される。キシロースを加えるとｘｙｌＡの抑制解除により約２００倍の誘導が起こる。ｘｙｌＡリーディングフレーム中のポリリンカーによって、遺伝子がその時同様にＸｙｌＲの強力な転写調節の下にあるｘｙｌＡと融合する。さらに、ｘｙｌＡリーディングフレームはポリリンカーの上流においてまだ完全に無傷であるので、転写融合を生成させるか又は翻訳融合を生成させるかという選択肢の間で選択が可能である。
【０１３５】
６．４．補完研究
大腸菌シロヘム変異体を補完する目的で、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩをシロヘムに変換するために必要な酵素活性の全部が欠損している大腸菌ｃｙｓＧ３０２Δａ株（ＥＲ１７１）（Ｒａｕｘら，１９９７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７９（１０）：３２０２−１２）に、上記のｓｉｒ遺伝子の組み合わせを含むｐＫＫ８６６８誘導体を形質転換した。この株はシロヘムを合成できず、従ってシステインを合成することができない。形質転換した大腸菌株を、システイン含有及び非含有の最少培地で選択した。加えて、シロヘムの合成に対するコバルトの影響を、コバルト含有（１ｍｇのＣｏＣｌ２／ｌ）及びコバルト非含有の最少培地で調べた。最少培地プレートを３７℃で２４時間インキュベートした。プラスミドｐＫＫ８６６８ｓｉｒＡＢ及びｐＫＫ８６６８ｓｉｒＡＢＣは、両方とも大腸菌ＥＲ１７１を補完できる。これは、ＳｉｒＡ（ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ）及びＳｉｒＢ（シロヒドロクロリンフェロキレターゼ）がシロヘムの生成に必須であることを意味する。形質転換した大腸菌は、その時点でビタミンＢ１２を生成することができる。それらは４．２５、好ましくは７２．５ｐＭのビタミンＢ１２／ＯＤを生じる。ＳｉｒＡＢＣ遺伝子がコードする酵素の３つ全てを用いる利点を認めることができる。
【０１３６】
ＳｉｒＢが鉄キレターゼ又はコバルトキレターゼをコードするかどうかを調べるため、コバルト含有及び非含有の培地を用いた。ｐＫＫ８６６８ｓｉｒＡＢ又はｐＫＫ８６６８ｓｉｒＡＢＣによる大腸菌ＥＲ１７１の補完は、外部コバルトの添加により阻害されなかった（表４）。これは、ＳｉｒＢが特異的シロヒドロクロリンフェロキレターゼであることを示す。
【０１３７】
平行アッセイにおいて、ｓｉｒ遺伝子を個々に又は組み合わせて含むｐＫＫ８６６８誘導体を、ｃｉｂＫ（コバルトキレターゼ；Ｒａｕｘら，１９９７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７９（１０）：３２０２−１２）とは別にＢ１２を合成するためのネズミチフス菌の遺伝子全てを含む大腸菌ＥＲ１８５株に形質転換した。形質転換した株を鉱油の積層により嫌気的に増殖させた（３７℃で６時間）。ＩＰＴＧ及びＡＬＡを添加し、培養物をさらに１８時間増殖させた。次いで、細胞を超音波処理により破壊し、ネズミチフス菌ｃｙｓＧｍｅｔＥ（ＡＲ３６２１）バイオアッセイプレートを用いる標準的方法でビタミンＢ１２を定量測定するために（Ｒａｕｘら，１９９６，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７８（３）：７５３−６７）、粗製抽出物を測定した。
【０１３８】
表４から分かるように、ＳｉｒＢは、それがｃｂｉＫの不在下でビタミンＢ１２の生合成を回復するので、シロヒドロクロリンコバルトキレターゼとして作用することができる。生成するビタミンＢ１２の含有量は、ＳｉｒＣも存在する場合に増加する。
【０１３９】
従って、本発明に従って形質転換された大腸菌株は、ビタミンＢ１２を製造するために適している。
【０１４０】
大腸菌３０２Δａ（外因性システインを添加した場合に最少培地でのみ増殖する機能的シロヘムシンターゼを含まないｃｙｓＧ欠損株）をプラスミドｐＡＲ８７６６（巨大菌ｃｂｉＸ及び大腸菌ｃｙｓＧを含むｐＫＫ２２３．３誘導体；Ｐｈａｒｍａｃｉａ；Ｒａｕｘ．Ｅ．ら，１９９８，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１９９８，３３５：１６７−１７３）又はプラスミドｐＥＲ１７９（シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）ｃｏｂＡ遺伝子及び巨大菌ｃｂｉＸ遺伝子を含むｐＫＫ２２３．３誘導体；Ｐｈａｒｍａｃｉａ；Ｒａｕｘ．Ｅ．ら，１９９８，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１９９８，３３５：１６７−１７３）で補完することだけが可能であったが、ｃｙｓＧまたはｃｏｂＡ単独では不可能であった。これは、ｃｂｉＸがシロヒドロクロリンキレターゼとして作用することを示す。鉄特異性に関し、システイン栄養要求変異体である大腸菌３０２Δａは、外因性コバルト（５μＭ）を最少培地に添加した場合に補完されなかったことが示された。すなわち、鉄はコバルトで置換され、コバラミンの生合成に導く。これに関し、ＣｂｉＸは、ｓｉｒＢと同じシロヒドロクロリンキレターゼ活性を有し、このために、シロヘムの生合成及びコバラミンの生合成の両者に使用できる。しかしながら、ＣｂｉＸは鉄よりもコバルトに高い親和性を有する。
【０１４１】
６．５．ＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ及びＣｂｉＸタンパク質の過剰生成及び精製
ｓｉｒＡ、ｓｉｒＢ及びｓｉｒＣによりコードされる酵素を迅速に精製する目的で、ＩＰＴＧ誘導性Ｔ７プロモーターの制御下に、これらの遺伝子を別個にベクターｐＥＴ１４ｂにクローニングした。これらのベクターを大腸菌株ＢＬ２１  ＤＥ３  ｐＬｙｓＳに形質転換した後、対応遺伝子が過剰発現されたときに、それぞれのタンパク質にＨｉｓタグを付加した。これらのタンパク質をクロマトグラフィー（金属キレートの形成）により、標準的方法及び製造業者の指示を用いて精製した。次いで、サンプルをＳＤＳゲル電気泳動により分画した。結果を図５に示す。
【０１４２】
巨大菌ｃｂｉＸ遺伝子をＳｓｐＩ／ＳｎａＢＩ断片として、ｃｏｐオペロン全体（Ｒａｕｘ，Ｅ．ら，１９９８，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１９９８，３３５：１６７−１７３）を含むプラスミドｐＡＲ８７６６から単離し、プラスミドｐＫＫ２２３．３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にクローニングし、プラスミドｐＡＲ８８８２を得た。大腸菌３０２Δａに形質転換し、ＩＰＴＧを添加した後、ＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ及びＳｉｒＣの場合の精製と同様に発現及び精製を行った。
【０１４３】
６．６．形質転換株にｉｎ ｖｉｖｏで蓄積した生成物の分光分析
異なるｓｉｒ遺伝子の組み合わせを含むｐＫＫ８６６８誘導体を、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩをシロヘムに変換するために必要な酵素活性の全部が欠損している大腸菌ｃｙｓＧ−３０２Δａ ＥＲ１７１株（Ｒａｕｘら，１９９７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７９（１０）：３２０２−１２）に形質転換した。この株はシロヘムを合成できず、従ってシステインを合成することができない。
【０１４４】
対応の形質転換株を２００ｍｌの最少培地に接種し、コバルト含有及び非含有で培養した。培養物をＯＤが０．１となるまで増殖させ、ＩＰＴＧ及びＡＬＡを添加した後、さらに４時間増殖させた。回収した細胞を超音波処理により破壊した後、それぞれの場合に粗製抽出物をＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｃｏｌカラムに加えた。溶出物を３００〜６００ｎｍで分光光度法により分析した。結果を図６に示す。シロヒドロクロリンに相当する３７８ｎｍでの吸収極大を、大腸菌ｐＫＫ８６６８ｓｉｒＡＣの抽出物で測定した。大腸菌ｐＫＫ８６６８ｓｉｒＡのスペクトルは３５４ｎｍで極大を示し、これは、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩの過剰メチル化に起因する非生理的化合物トリメチルピロコルフィンに相当する。大腸菌ｐＫＫ８６６８ｓｉｒＡＢＣの場合には、シロヘムスペクトルを明確に検出することは不可能であった。シロヒドロクロリン及びシロヘム（３７８ｎｍに極大を有する）のＵＶ−Ｖｉｓスペクトルには多くの類似性があり、これは明確な区別が困難であることを意味する。しかしながら、４１０ｎｍ及び５９０ｎｍにおける極大では、コバルト−シロヒドロクロリンのスペクトルはシロヒドロクロリンのものとは明確に異なる。
【０１４５】
６．７．改善されたコバラミン製造のためのプレコリン−２デヒドロゲナーゼの必要性の測定
既に述べたように、大腸菌は、それがプレコリン−２をコビンアミドに変換するために必要な若干の酵素を欠くので、ビタミンＢ１２を新規合成することができない。しかしながら、この能力は、失損するコバラミン生合成遺伝子の導入に適するプラスミドの使用により、大腸菌において回復することができる。加えて、この場合にｃｙｓＧ株を用いる場合には、ウロポルフィリノーゲン−ＩＩＩをコビンアミドに変換するための全ての酵素は対応の大腸菌株に再び存在する。
【０１４６】
この知見は、コバラミン生合成において、プレコリン−２及びその酸化生成物（シロヒドロクロリン）の合成のための酵素に対する必要条件を調べるのに用いられた。以下の結果は、本発明により、ビタミンＢ１２の生成がプレコリン−２デヒドロゲナーゼの存在下で改善されることを示す。
【０１４７】
ウロポルフィリノーゲンＩＩＩをコビリン酸（ｃｏｂｙｒｉｃ  ａｃｉｄ）に変換するために必要な遺伝子を含む大腸菌株を用いて、巨大菌でのコバラミン生合成経路におけるプレコリン−２デヒドロゲナーゼの必要条件を、ます第一に調べた。大腸菌ｃｙｓＧ株（大腸菌３０２Δａ）を、巨大菌のｃｂｉＷ、−Ｈ、−Ｘ、−Ｊ、−Ｃ、−Ｄ、−ＥＴ、−Ｌ、−Ｆ、−Ｇ、−Ａ、ｃｙｓＧＡ、−Ｙ、−ｂｔｕＲ及びｃｂｉＰ遺伝子を含むプラスミドｐＥＲ２７０で形質転換することにより、これを行った。加えて、ｃｙｓＧ、ｍｅｔ８Ｐ又はｓｉｒＣの何れかを含む第二の好適なプラスミドを、大腸菌株の形質転換に用いた。ｃｙｓＧ、ｍｅｔ８Ｐ及びｓｉｒＣは全て、プレコリン−２デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする。それぞれ２つのプラスミドを共形質転換した後、コバラミン生成は、下記の表に示すように、少なくとも３０倍増大した：
2005528094.tif 000003
【０１４８】
ｃｙｓＧＧ２１Ｄで形質転換した株は、デヒドロゲナーゼ活性を有しなかった。なぜならば、ＮＡＤ結合部位が破壊的なので、該株はＮＡＤに結合できないためである。ＣｂｉＫはサルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）コバルトキレターゼである。
【０１４９】
これらの結果から、プレコリン−ＩＩデヒドロゲナーゼの存在がビタミンＢ１２の改善された製造の達成に必須であることになる。
【０１５０】
これらの結果を裏付けるために、サルモネラ・エンテリカ（ネズミチフス菌）経路内のデヒドロゲナーゼの必要条件を調べた。このために、全てのサルモネラ・エンテリカｃｂｉ遺伝子を含むが、ｃｂｉＫ遺伝子が欠損しているプラスミドであるプラスミドｐＥＲ１８５ＫＤで大腸菌ｃｙｓＧ株を形質転換した。加えて、プレコリン−ＩＩデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の必要条件の調査を行うことができるもう１つのプラスミドで大腸菌を共形質転換した。下記の結果が得られた：
2005528094.tif 000004
【０１５１】
これらの結果は、サルモネラ・エンテリカ生合成経路においてビタミンＢ１２のコリン環を生合成する際のプレコリン−ＩＩデヒドロゲナーゼの必要性又は利点を確証する。より良好なコバラミン生成の結果は、デヒドロゲナーゼ（この場合はＳｉｒＣ）が存在する場合に再現性よく得られ、達成できるコバラミン生成は検出されたコビリン酸から明らかなように、約１０倍増大する。
【０１５２】
６．８．ＳｉｒＢ及びＳｉｒＣの役割の判定
ＳｉｒＡを過剰発現する細胞は、ＵＶ光下で僅かな蛍光を示すという特徴を有する（Ｗａｒｒｅｎら，１９９４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３０２（Ｐｔ３）：８３７−４４）ので、さらなる酵素分析を行わなかった。
【０１５３】
キレターゼとしてのＳｉｒＢの役割及びデヒドロゲナーゼとしてのＳｉｒＣの役割を判定するために、タンパク質を精製し、シロヒドロクロリン及びコバルトシロヒドロクロリンの形成を検査するための、ｉｎ ｖｉｔｒｏ反応アッセイに用いた。この目的で、０．５ｍｇのＣｏｂＡ、０．１ｍｇのＨｅｍＣ、０．１５ｍｇのＨｅｍＤ、０．７５ｍｇのＳＡＭ及び０．０５ｍｇのＰＢＧを用いた。ＣｏｂＡ（ＳｉｒＡの代わり）、ＨｅｍＣ及びＨｅｍＤを、Ｒａｕｘら（１９９９、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ．Ｃｈｅｍ．，２７：１００−１１８）に記載されたように精製した。アッセイサンプルを１ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８に混合した。次いで、０．１ｍｇのＳｉｒＢ、０．１ｍｇのＳｉｒＣ、０．５ｍｇのＮＡＤ＋及び２１μＭのＣｏＣｌ２×６Ｈ２Ｏを添加した。次いで、このアッセイサンプルを３７℃で３０分間インキュベートした後、分光光度法で分析した。対照のために、ＳｉｒＢ及びＳｉｒＣを用いることなくスペクトルを測定した。
【０１５４】
図７ａは、ＮＡＤ＋の存在下又は不在下でインキュベートした２０分後において、ＰＢＧ、ＨｅｍＣ、ＨｅｍＤ、ＣｏｂＡ及びＳＡＭを含む共役アッセイ（coupled assay）におけるプレコリン−２の合成は、プレコリン−２特異的スペクトルと同程度のスペクトルを示す。ＳｉｒＣの添加によって、３７８ｎｍでの極大で、シロヒドロクロリンのスペクトルに対応し、かつ図６に示す大腸菌ｐＫＫ８６６８ｓｉｒＡＣ粗製抽出物のスペクトルと同程度のスペクトルが生じた。
【０１５５】
３７８ｎｍに吸収極大を有するスペクトルは、同様に、ＳｉｒＢ及びＳｉｒＣの添加により得られた（図７ｂ）。しかしながら、コバルトの添加によって、コバルト−シロヒドロクロリンのスペクトルと同等である４２０ｎｍ及び５９０ｎｍに吸収極大を有するスペクトルが生じた。これは、ＳｉｒＢがコバルトキレターゼとして作用することを意味する。
【０１５６】
加えて、硫酸銅（ＩＩ）、塩化マグネシウム６水和物、塩化亜鉛及び硫酸鉄７水和物を、硫酸コバルトニッケル（ＩＩ）６水和物の代わりに共役反応アッセイにおいて用いた。対応のスペクトルを３００〜７００ｎｍで記録した。図８は、生成したシロヒドロクロリン金属錯体の吸収極大が顕著に異なることを示す。これは、ＳｉｒＢがｉｎ ｖｉｔｒｏで鉄キレターゼ及びコバルトキレターゼとして作用でき、これに加えて、多数の他の金属イソ型細菌性クロリンを合成できることを示す。
【０１５７】
６．９．ＳｉｒＡの過剰発現：
ＳｉｒＡを含むプラスミドｐＫＫ８６６８（ｐＫＫ８６６８ｓｉｒＡ）で大腸菌ＥＲ１７１を形質転換した後、このように形質転換した微生物を実施例５．３に記載したように培養した。対照として、形質転換されていない対応の大腸菌株を同じ条件下で培養した。遺伝子発現は、１０ｍｇ／ｌの濃度のＩＰＴＧ及びＡＬＡで誘導した。次いで、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ（ＳｉｒＡ）の比活性を、形成されたプレコリン−２の測定により測定した。プレコリン−２は蛍光を発し、蛍光性プレコリン−２による明確な発光は、３４０ｎｍでのアッセイサンプルの励起後に６００ｎｍで測定することができる（消光係数：８×１０５Ｍ−１Ｌ−１）。基質ウロポルフィリノーゲンＩＩＩは蛍光を発しない。
【０１５８】
この実験において、形質転換されていない大腸菌株では、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ活性は殆ど測定できなかった。これに対して、形質転換した大腸菌株において、ｓｉｒＡでコードされる酵素ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼの過剰を測定することが可能であり、培地１Ｌ当り少なくとも１０ｍｇのタンパク質で、培地１Ｌ当り約１５０００単位を有する。１単位は毎時１ｎｍｏｌｅのプレコリン−２の生成に対応する。タンパク質を測定するために、Ｂｒａｄｆｏｒｄの方法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８９，１７８，２６３．２６８）に基づくタンパク質検出キット（ＢｉｏＲａｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた。
【０１５９】
同様に、巨大菌ＤＳＭＺ５０９株も、実施例５．３に記載したように、ｓｉｒＡを含むプラスミドｐＫＫ８６６８（ｐＫＫ８６６８ｓｉｒＡ）で形質転換し、培養した。この場合にも、対応の方法で培養した形質転換されていない対応の巨大菌を対照として使用する。
【０１６０】
ｓｉｒＡでコードされるタンパク質は、形質転換した巨大菌株においてより強力に生成され、これは、遺伝子が発現されるとすぐに赤色蛍光を発する細胞により定性的に示される。遺伝子発現は、１０ｍｇ／ｌの濃度のＩＰＴＧ及びＡＬＡで誘導された。
【０１６１】
ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼの比活性も測定した。この場合にも、形質転換されていない株において比酵素活性は殆ど測定できなかった。形質転換した巨大菌株において、約１５０００単位／ｌ培地の比活性を測定した。
【０１６２】
実施例６．５に記載したように、ｓｉｒＡでコードされるタンパク質を精製した後、形成されたウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼの比タンパク質含有量を測定した（Ｂｒａｄｆｏｒｄ；Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８９，１７８，２６３，２６８）。これにより、培地１Ｌ当り１０ｍｇのタンパク質という過剰のＳｉｒＡが生じた。
【０１６３】
６．１０．ＳｉｒＡ及びＳｉｒＣの過剰発現
プラスミドＰＫＫ８６６８ｓｉｒＡＣ（ｓｉｒＡ及びｓｉｒＣを含む）で大腸菌ＥＲ１７１を形質転換した後、このように形質転換した微生物を実施例５．３に記載したように培養した。対照として、形質転換されていない対応の大腸菌株を同じ条件下で培養した。遺伝子発現は、１０ｍｇ／ｌの濃度のＩＰＴＧ及びＡＬＡで誘導した。次いで、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ（ｓｉｒＡ）の比活性を、形成されたプレコリン−２の測定により測定した。３４０ｎｍでのアッセイサンプルの励起後に、蛍光性プレコリン−２による明確な発光を６００ｎｍで測定することができる（消光係数：８×１０５Ｍ−１Ｌ−１）。基質ウロポルフィリノーゲンＩＩＩは蛍光を発しない。この実験において、形質転換されていない大腸菌株は、測定し得る酵素活性を殆ど有しなかった。形質転換した大腸菌株において、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ（ＳｉｒＡ）の比酵素活性は、培地１Ｌ当り２５００単位のプレコリン−２と測定された一方、プレコリン−２デヒドロゲナーゼ（ＳｉｒＣ）の比酵素活性は、培地１Ｌ当り４０００単位のシロヒドロクロリンと測定された。
【０１６４】
加えて、実施例６．６に記載したように、生成物シロヒドロクロリンが培地中で測定された。
【０１６５】
６．１１．シロヒドロクロリンの役割の調査
シロヒドロクロリンは、例えば実施例６．９に記載したように、形質転換細胞中で生成される。
【０１６６】
基質としてシロヒドロクロリン又はプレコリン−２（各場合に、１ｍｌの０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８中２．５μＭの基質）を用い、かつｓｉｒＢ及びｃｂｉＸによりそれぞれコードされる精製した酵素（各場合に、２５μｇ）を用いるｉｎ ｖｉｔｒｏ試験において、中間物質としてシロヒドロクロリンは、ｓｉｒＢによりコードされるシロヘム合成酵素（シロヒドロクロリンフェロキレターゼ）及びｃｂｉＸでコードされるコバラミンキレターゼの両者の基質として機能することを見出した。これに関し、上記の２つの酵素、すなわちシロヒドロクロリンフェロキレターゼ（ｓｉｒＢ）及びコバラミンキレターゼ（ｃｂｉＸ）はそれぞれ、それらが金属イオンを還元プレコリン−２中間体に取り込む効率よりも１００倍を超えて優れた効率で、金属イオン（２０μＭ）をシロヒドロクロリンに取り込む。すなわち、シロヒドロクロリンフェロキレターゼ（ｓｉｒＢ）により触媒されると、プレコリン−２への金属イオンの取り込みは、低い効率（＜１％）でしか行われない。一方、コバラミンキレターゼ（ｃｂｉＸ）は、プレコリン−２への金属イオンの取り込みを全く支持しない。
【０１６７】
図表について
表１、２及び３に示す細菌株、プラスミド及びプライマーを用いた。
【表１】
2005528094.tif 000005
【表２】
2005528094.tif 000006
【表３】
2005528094.tif 000007
【表４】
2005528094.tif 000008
【０１６８】
図面の説明
本発明を、さらに図面を利用して以下に説明する。
【０１６９】
図１は、好気的条件下及び嫌気的条件下における３０℃での巨大菌ＤＳＭＺ３２（野生型）の増殖の比較を示す。嫌気的増殖は、添加した１０ｍＭ硝酸塩（白菱形）、１０ｍＭ亜硝酸塩（白三角）、及び１０ｍＭフマル酸塩（ばつ印）の存在下で測定した。発酵増殖（白丸）及び好気増殖（黒菱形）は、添加物なしでＬＢ培地で行った。表示した時間においてサンプルを採取し、光学密度を５７８ｎｍで測定した。
【０１７０】
図２は、好気的条件下及び嫌気的条件下における３０℃での巨大菌ＤＳＭ５０９の増殖の比較を示す。嫌気的増殖は、添加した１０ｍＭ硝酸塩（白菱形）、１０ｍＭ亜硝酸塩（白三角）、及び１０ｍＭフマル酸塩（ばつ印）の存在下で測定した。発酵増殖（白丸）及び好気増殖（黒菱形）は、添加物なしでＬＢ培地で行った。表示した時間においてサンプルを採取し、光学密度を５７８ｎｍで測定した。
【０１７１】
図３は、好気的条件下及び嫌気的条件下における３０℃での巨大菌ＤＳＭ２８９４の増殖の比較を示す。嫌気的増殖は、添加した１０ｍＭ硝酸塩（白菱形）、１０ｍＭ亜硝酸塩（白三角）、及び１０ｍＭフマル酸塩（ばつ印）の存在下で測定した。発酵増殖（白丸）及び好気増殖（黒菱形）は、添加物なしでＬＢ培地で行った。表示した時間においてサンプルを採取し、光学密度を５７８ｎｍで測定した。
【０１７２】
図４は、好気的条件下及び嫌気的条件下における巨大菌によるビタミンＢ１２の産生を示す。細胞量当たりのビタミンＢ１２量（ｐｍｏｌ／ＯＤ５７８）は、好気的増殖（１）及び嫌気的増殖（２）した巨大菌ＤＳＭ３２野生株、好気的増殖（３）及び嫌気的増殖（４）した巨大菌ＤＳＭ５０９、並びに好気的増殖（５）及び嫌気的増殖（６）した巨大菌ＤＳＭ２８９４で測定した。
【０１７３】
図５は、Ｈｉｓタグを付加した精製ＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ及びＳｉｒＣのＳＤＳポリアクリルアミドゲルを示す。分子量標準をレーン１に泳動させ、精製Ｈｉｓタグ付加タンパク質ＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ及びＳｉｒＣをそれぞれレーン２、３及び４に泳動させた。
【０１７４】
図６は、ｐＫＫ８６６８ＳｉｒＡ、ｐＫＫ８６６８ＳｉｒＡＢ、ｐＫＫ８６６８ＳｉｒＡＢＣ及びｐＫＫ８６６８ＳｉｒＡＣを過剰発現し、ＡＬＡの存在下で培養された大腸菌ＥＲ１７１細菌株から単離された蓄積色素のＵＶ−Ｖｉｓスペクトルを示す。
【０１７５】
図７は、ＳｉｒＢ及びＳｉｒＣを含有する共役プレコリン−２酵素アッセイからのｉｎ ｖｉｔｒｏ蓄積色素のＵＶ−Ｖｉｓスペクトルを示す。
【０１７６】
（７ａ）プレコリン−２（ＰＣ−２）及びＳｉｒＣ添加後のプレコリン−２（コバルトの存在下及び不在下）を含有する共役プレコリン−２アッセイのスペクトル。吸光度の最大値はシロヒドロクロリンの値と等しい。
【０１７７】
（７ｂ）ＳｉｒＢ及びＳｉｒＣと一緒のＰＣ−２のスペクトル。吸光度の最大値（４１０ｎｍ及び５９０ｎｍ）はコバルトシロヒドロクロリンの値と等しい。
【０１７８】
図８は、添加したコバルト以外の金属（すなわち、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｕ２＋及びＦｅ２＋）の存在下にてＳｉｒＢ及びＳｉｒＣを含有する共役プレコリン−２酵素アッセイからのｉｎ ｖｉｔｒｏ蓄積色素のＵＶ−Ｖｉｓスペクトルを示す。Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｕ２＋及びＦｅ２＋の吸光度の最大値は３９５ｎｍ、４０５ｎｍ及び４０２ｎｍである。
【図面の簡単な説明】
【０１７９】
【図１】好気的条件下及び嫌気的条件下における３０℃での巨大菌ＤＳＭＺ３２（野生型）の増殖の比較を示す。
【図２】好気的条件下及び嫌気的条件下における３０℃での巨大菌ＤＳＭ５０９の増殖の比較を示す。
【図３】好気的条件下及び嫌気的条件下における３０℃での巨大菌ＤＳＭ２８９４の増殖の比較を示す。
【図４】図４は、好気的条件下及び嫌気的条件下における巨大菌によるビタミンＢ１２の産生を示す。分子量標準をレーン１に泳動させ、精製Ｈｉｓタグ付加タンパク質ＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ及びＳｉｒＣをそれぞれレーン２、３及び４に泳動させた。
【図５】図５は、Ｈｉｓタグを付加した精製ＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ及びＳｉｒＣのＳＤＳポリアクリルアミドゲルを示す。
【図６】図６は、ｐＫＫ８６６８ＳｉｒＡ、ｐＫＫ８６６８ＳｉｒＡＢ、ｐＫＫ８６６８ＳｉｒＡＢＣ及びｐＫＫ８６６８ＳｉｒＡＣを過剰発現し、ＡＬＡの存在下で培養された大腸菌ＥＲ１７１細菌株から単離された蓄積色素のＵＶ−Ｖｉｓスペクトルを示す。
【図７】図７は、ＳｉｒＢ及びＳｉｒＣを含有する共役プレコリン−２酵素アッセイからのｉｎ ｖｉｔｒｏ蓄積色素のＵＶ−Ｖｉｓスペクトルを示す。
【図８】図８は、添加したコバルト以外の金属（すなわち、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｕ２＋及びＦｅ２＋）の存在下にてＳｉｒＢ及びＳｉｒＣを含有する共役プレコリン−２酵素アッセイからのｉｎ ｖｉｔｒｏ蓄積色素のＵＶ−Ｖｉｓスペクトルを示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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