(57)【要約】本発明は、概して、標的生物学的分子（「ＴＢＭ」）の改変体、ならびにこの作製方法およびこれを使用してＴＢＭのリガンドを同定する方法に関する。より詳細には、本発明は、個々の改変体ＴＢＭおよび改変体ＴＢＭのセットに関し、その各々は、チオールが目的の部位または目的の部位の近傍に導入されている、目的のタンパク質の改変版を表す。ＴＢＭのリガンドは、部分的に、潜在的リガンドとＴＢＭ上の反応性チオールとの間での共有結合の形成によって同定される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
方法であって、以下の工程：
ａ）ｎ個の残基を有するタンパク質ＴＢＭの三次元構造の座標セットを得る工程；
ｂ）該ＴＢＭの該三次元構造上で候補残基ｉを選択する工程であって、ここで、該候補残基ｉはｉ番目の残基であり、ｉは１とｎとの間の数字であり、そして残基ｉはシステインではない、工程；
ｃ）残基ｊを選択する工程であって、ここで、残基ｊは配列上、残基ｉに隣接する、工程；
ｄ）候補参照値を決定する工程であって、ここで、該候補参照値は残基ｉと残基ｊとの間の空間的関係である、工程；
ｅ）ジスルフィド含有タンパク質フラグメントの座標セットを含むデータベースを得る工程であって、ここで、各フラグメントは、少なくとも１つのジスルフィド結合したシステインおよび第一隣接残基を含み、ここで、該ジスルフィド結合したシステインおよび該第一隣接残基は、残基ｉおよび残基ｊと同じ順序関係を共有する、工程；
ｆ）各フラグメントについて比較参照値を決定する工程であって、ここで、該比較参照値は、該候補参照値が残基ｉと残基ｊとの間であるような、該ジスルフィド結合したシステインと該第一隣接残基との間での対応する空間的関係である、工程；ならびに
ｇ）スコアを決定する工程であって、ここで、該スコアは、該データベース中での、該候補参照値と同じであるかまたは類似する比較参照値を保有するフラグメント数の尺度である、工程
を包含する、方法。
【請求項２】
残基ｋを選択する工程であって、ここで、残基ｋが、配列上、残基ｉに隣接しており、ｋはｊではない、工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法であって、
ここで
前記候補参照値が、残基ｉ、残基ｊ、および残基ｋの間の空間的関係であり；
各フラグメントは、少なくとも１つのジスルフィド結合したシステイン、第一隣接残基、および第二隣接残基を含み、ここで該ジスルフィド結合したシステインならびに該第一隣接残基および該第二隣接残基は、残基ｉ、残基ｊ、および残基ｋと同じ順序関係を共有し；そして
前記比較参照値は、該候補参照値が残基ｉ、残基ｊ、および残基ｋの間にあるのと対応した、該ジスルフィド結合したシステイン、該第一隣接残基、および該第二隣接残基の間での空間的関係である、方法。
【請求項３】
方法であって、以下の工程：
ａ）ｎ個の残基を有するタンパク質ＴＢＭの三次元構造の座標セットを得る工程；
ｂ）該ＴＢＭの該三次元構造上の候補残基ｉを選択する工程であって、ここで、該候補残基ｉはｉ番目の残基であり、ｉは１とｎとの間の数字であり、残基ｉはシステインではない、工程；
ｃ）残基ｊおよび残基ｋを選択する工程であって、ここで、残基ｊおよび残基ｋは、両方とも、配列上、残基ｉに隣接する、工程；
ｄ）候補参照値を決定する工程であって、ここで、該候補参照値は、残基ｉ、残基ｊ、および残基ｋの各々由来の少なくとも１つの骨格原子の空間的関係である、工程；
ｅ）ジスルフィド含有タンパク質フラグメントの座標セットを含むデータベースを得る工程であって、ここで、各フラグメントは、少なくとも１つのジスルフィド結合したシステイン、第一隣接残基、および第二隣接残基を含み、ここで、該ジスルフィド結合したシステイン、該第一隣接残基、および該第二隣接残基は、残基ｉ、残基ｊ、および残基ｋと同じ順序関係を共有する、工程；
ｆ）各フラグメントについて比較参照値を決定する工程であって、ここで、該比較参照値は、該候補参照値が、残基ｉ、残基ｊ、および残基ｋの間であるのと対応した、該ジスルフィド結合したシステイン、該第一隣接残基、および該第二隣接残基の間での空間的関係である、工程；ならびに
ｇ）スコアを決定する工程であって、ここで、該スコアは、該データベース中での、該候補参照値と同じであるかまたは類似する比較参照値を保有するフラグメント数の尺度である、工程
を包含する、方法。
【請求項４】
前記空間的関係が、二面角を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記空間的関係が、一対のφψ角を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記空間的関係が、２つの残基の原子の間での複数の距離を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
残基ｉが、少なくとも部分的に表面アクセス可能である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
残基ｉが、少なくとも約２０Å２のアクセス可能な表面積を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
残基ｉが、前記ＴＢＭの骨格原子との水素結合相互作用に関与しない、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
方法であって、以下の工程：
ａ）ｎ個の残基および目的の部位を有するＴＢＭの三次元構造を得る工程；
ｂ）該目的の部位にあるかまたは該目的の部位近傍にある候補残基ｉを選択する工程であって、ここで、該候補残基ｉはｉ番目の残基であり、ｉは１とｎとの間の数字であり、そして残基ｉはシステインではない、工程；
ｃ）変異したＴＢＭ構造体のセットを作製する工程であって、ここで、各変異したＴＢＭ構造体は、残基ｉの代わりにシステイン残基を保有し、そしてここで、該システイン残基は、標準的な回転異性体コンホメーションで配置される、工程；ならびに
ｄ）該変異したＴＢＭ構造体のセットを評価する工程
を包含する、方法。
【請求項１１】
前記システイン残基が、Ｓ−メチル基でキャップされている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
システインについての前記標準的回転異性体コンホメーションが、以下：
約６０°、約１８０°、および約３００°からなる群より選択される、χ１角；ならびに
約６０°、約１２０°、約１８０°、約２７０°、および約３００からなる群より選択されるχ２角
を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
評価工程が、各回転異性体コンホメーションによって前記ＴＢＭとの好ましくない立体接触が生じるか否かを決定することを包含する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記評価工程が、力場計算を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記評価工程が、各回転異性体コンホメーションによって前記Ｓ−メチル基のメチル炭素がＣβよりも前記目的の部位に近くに配置されるか否かを決定することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
改変体タンパク質セットであって、該タンパク質は各々、ＴＢＭの変異版であり、ここで、該ＴＢＭの天然に存在する非システイン残基は、システインへと変異している、セット。
【請求項１７】
少なくとも３個のシステイン変異体を含む、請求項１６に記載のセット。
【請求項１８】
前記ＴＢＭの１以上の天然に存在するシステインが、非システイン残基へと変異している、請求項１６に記載のセット。
【請求項１９】
前記ＴＢＭが、細胞表面レセプターまたは可溶性レセプターである、請求項１６に記載のセット。
【請求項２０】
前記ＴＢＭが、サイトカインである、請求項１６に記載のセット。
【請求項２１】
前記ＴＢＭが、酵素である、請求項１６に記載のセット。
【請求項２２】
前記ＴＢＭが、ＩＬ−２；ＩＬ−４；ＴＮＦ−α；ＩＬ−１レセプター；カスパーゼ−３；ＰＴＰ−１Ｂ；ＨＩＶインテグラーゼ；ＢＡＣＥ１；ＭＥＫ−１；Ｃａｔ−Ｓ；カスパーゼ−１；ＩＬ−１３；ＣＤ４０Ｌ；ＢＡＦＦ；Ｐ５３；ｍｄｍ２；ｂｃｌ−ｘ；ｂａｘ；ＣＤＣ２５Ａ；ＣＤ２８；Ｂ７；Ｃ５Ａ；ＡＫＴ；ＣＤ４５；ＨＥＲ２；ＧＳＫ−３；α−Ｅ／β−７；組織因子；および第ＶＩＩ因子からなる群より選択される、請求項１６に記載のセット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（背景）
薬物の発見プロセスは通常、その後の医薬品化学の最適化のための中程度の親和性のリード（Ｋｄが約１〜１０μＭ）を同定するために、化合物ライブラリーの大量の機能的スクリーニングで始まる。しかし、全ての目的の標的についてこのようなスクリーニングが実行可能なわけではない。いくつかの場合、ハイスループットスクリーニングが実行可能なアッセイは利用可能でない。他の場合には、この標的は、このようなスクリーニングの結果が曖昧であって解釈が困難である、複数の結合形態を有し得る。さらに他の場合には、ハイスループットスクリーニングに関するアッセイ条件は、これらがアーチファクトを生じやすいようなものである。その結果、機能的アッセイを必ずしも頼りとしない、リガンドの発見に関する代替方法が必要とされている。本発明は、このような方法を提供する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００２】
（要旨）
本発明は、概して、標的生物学的分子（「ＴＢＭ」）の改変体、ならびにこの作製方法およびこれを使用してＴＢＭのリガンドを同定する方法に関する。より詳細には、本発明は、個々の改変体ＴＢＭおよび改変体ＴＢＭのセットに関し、その各々は、チオールが目的の部位または目的の部位の近傍に導入されている、目的のタンパク質の改変版を表す。ＴＢＭのリガンドは、部分的に、潜在的リガンドとＴＢＭ上の反応性チオールとの間での共有結合の形成によって同定される。
【０００３】
（好ましい実施形態の説明）
本発明は、概して、標的生物学的分子（「ＴＢＭ」）の改変体、ならびにこの作製方法およびこれを使用してＴＢＭのリガンドを同定する方法に関する。
【０００４】
そうではないと定義しない限り、本明細書中で用いられる専門用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解される意味と同じ意味を有する。参考文献（例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  １９９４）、およびＭａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、第４版，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  １９９２））は、本願において用いられる用語の多くに対する一般的ガイドを当業者に提供する。
【０００５】
（定義）
本明細書中で用いられる用語の定義は以下を含む：
用語「脂肪族」または「非置換の脂肪族」とは、直鎖状、分枝鎖状、環状、または多環式の炭化水素をいい、そしてアルキル部分、アルケニル部分、アルキニル部分、シクロアルキル部分、シクロアルケニル部分、およびシクロアルキニル部分を包含する。
【０００６】
用語「アルキル」または「非置換アルキル」とは、飽和炭化水素をいう。
【０００７】
用語「アルケニル」または「非置換アルケニル」とは、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する炭化水素をいう。
【０００８】
用語「アルキニル」または「非置換アルキニル」とは、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する炭化水素をいう。
【０００９】
用語「アリール」または「非置換アリール」とは、少なくとも１つの芳香族環を有する、単環式または多環式の不飽和部分をいう。この用語は、この少なくとも１つの芳香族環内に１以上のヘテロ原子を含むヘテロアリールを包含する。アリールの例示的な例としては、以下が挙げられる：フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニル、インデニル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、チオフェニル、フラニル、キノリニル、イソキノリニルなど。
【００１０】
用語「置換された」とは、部分を修飾するために用いられる場合、少なくとも１つの水素原子が、以下を含むがそれらに限定されない別の基で置換されている、置換バージョンの部分をいう：脂肪族；アリール、アルキルアリール、Ｆ、Ｃｌ、Ｉ、Ｂｒ、−ＯＨ；−ＮＯ２；−ＣＮ；−ＣＦ３；−ＣＨ２ＣＦ３；−ＣＨ２Ｃｌ；−ＣＨ２ＯＨ；−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ；−ＣＨ２ＮＨ２；−ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ３；−ＯＲＸ；−Ｃ（Ｏ）ＲＸ；−ＣＯＯＲＸ；−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＸ）２；−ＯＣ（Ｏ）ＲＸ；−ＯＣＯＯＲＸ；−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＸ）２；−Ｎ（ＲＸ）２；−Ｓ（Ｏ）２ＲＸ；および−ＮＲＸＣ（Ｏ）ＲＸであって、ここで、ＲＸの各出現箇所は、独立して、水素、置換脂肪族、非置換脂肪族、置換アリールまたは非置換アリールである。さらに、部分上の隣接する基での置換は、一緒になって、環状基を形成する。
【００１１】
用語「アンタゴニスト」は、その最も広い意味で用いられ、そして標的（例えば、ＴＢＭ）によって示される生物学的活性を部分的または完全にブロック、阻害または中和する任意のリガンドを包含する。同様の様式で、用語「アゴニスト」は、その最も広い意味で用いられ、そして例えば、このようなＴＢＭの機能もしくは発現、またはこのようなＴＢＭを通じてのシグナル伝達の効率を特異的に変化させ、それによって、既に存在する生物学的活性を変更（増大もしくは阻害）するかまたは新たな生物学的活性を誘発することによって、標的（例えば、ＴＢＭ）によって示される生物学的活性を模倣する任意のリガンドを包含する。
【００１２】
用語「リガンド」とは、標的についての測定可能な結合親和性を保有する存在をいう。一般に、リガンドは、約１００ｍＭ未満（好ましくは約１０ｍＭ未満、そしてより好ましくは約１ｍＭ未満）のＫｄまたはＫｉで標的に結合する場合、測定可能な親和性を有するといわれる。好ましい実施形態では、このリガンドは、ペプチドではなく、低分子である。リガンドは、サイズが約２０００ダルトン未満（通常、サイズが約１５００ダルトン未満）であれば、低分子である。より好ましい実施形態では、この低分子リガンドは、サイズが約１０００ダルトン未満であり、通常、サイズが約７５０ダルトン未満であり、そしてより通常はサイズが約５００ダルトン未満である。
【００１３】
用語「リガンド候補」とは、標的上の相補的反応性基または適合性反応性基と共有結合を形成し得る反応性基を保有するかまたは保有するように改変されている化合物をいう。このリガンド候補またはこの標的のいずれかの上にある反応性基は、例えば、保護基でマスクされ得る。
【００１４】
用語「ポリヌクレオチド」は、単数形または複数形で用いられる場合、一般に、未改変ＲＮＡもしくは未改変ＤＮＡまたは改変ＲＮＡもしくは改変ＤＮＡであり得る、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチド（ｐｏｌｙｄｅｏｘｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）をいう。従って、例えば、ポリヌクレオチドは、本明細書中で定義される場合、以下を包含するがこれらに限定されない：１本鎖ＤＮＡおよび２本鎖ＤＮＡ、１本鎖領域および２本鎖領域を含むＤＮＡ、１本鎖ＲＮＡおよび２本鎖ＲＮＡ、ならびに１本鎖領域および２本鎖領域を含むＲＮＡ、１本鎖またはより代表的には２本鎖であり得るかもしくは１本鎖領域および２本鎖領域を含む、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子。さらに、用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書中で用いられる場合、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む３本鎖領域をいう。このような領域における鎖は、同じ分子由来であっても異なる分子由来であってもよい。これらの領域は、この分子のうちの１以上の全てを含み得るが、より代表的には、これらの分子のいくつかのうちの１つのみの領域を含み得る。三重らせん領域の分子のうちの１つは、しばしば、オリゴヌクレオチドである。用語「ポリヌクレオチド」は、特に、１以上の改変塩基を含む、ＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。従って、安定性についてまたは他の理由から改変された骨格を有する、ＤＮＡまたはＲＮＡは、その用語が本明細書中で意図するように、「ポリヌクレオチド」である。さらに、通常でない塩基（例えば、イノシン）または改変塩基（例えば、トリチル化塩基）を含む、ＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書中で定義されるような用語「ポリヌクレオチド」内に含まれる。一般に、用語「ポリヌクレオチド」は、全ての化学的、酵素学的および／または代謝的に改変された形態の未改変ポリヌクレオチド、ならびにウイルスおよび細胞（単純細胞および複合細胞を包含する）に特有の化学的形態のＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。
【００１５】
語句「保護されたチオール」とは、本明細書中で用いられる場合、基または分子と反応して、反応性をより低くさせる共有結合を形成していて、そして遊離チオールを再生するように脱保護され得る、チオールをいう。
【００１６】
語句「可逆的共有結合」とは、本明細書中で用いられる場合、（好ましくはその標的を変性させない条件下で）破壊され得る共有結合をいう。例としては以下が挙げられるがこれらに限定されない：ジスルフィド、Ｓｃｈｉｆｆ塩基、チオエステル、配位錯体、ボロン酸エステルなど。
【００１７】
語句「反応性基」は、適合性反応性基または相補的反応性基とともに存在した場合に共有結合が作製され得る部位を提供する化学基または部分である。例示的な例は、以下である：別の−ＳＨまたは−ＳＳ−と反応してジスルフィドを形成し得る、−ＳＨ；活性化−ＣＯＯＨと反応してアミドを形成し得る、−ＮＨ２；アルデヒドまたはケトンと反応してＳｃｈｉｆｆ塩基を形成し得る、−ＮＨ２など。
【００１８】
語句「反応性求核剤」とは、本明細書中で用いられる場合、標的を変性も損傷もしない条件下で別の分子上の適合性官能基と共有結合を形成し得る求核剤をいう。最も適切な求核剤は、チオール、アルコール、およびアミンである。同様に、語句「反応性求電子剤」とは、本明細書中で用いられる場合、（好ましくは、標的を変性も損傷もしない条件下で）別の分子上の適合性官能基と共有結合を形成し得る求電子剤をいう。最も適切な求電子剤は、イミン、カルボニル、エポキシド、アジリジン（ａｚｉｒｉｄｉｅ）、スルホネート、ジスルフィド、活性化エステル、活性化カルボニル、およびヘミアセタールである。
【００１９】
語句「目的の部位」とは、標的上の、リガンドが結合し得る任意の部位をいう。例えば、この標的が酵素である場合、この目的の部位は、その酵素の結合した基質、インヒビター、アクチベーター、補因子、またはアロステリックモジュレーターと接触するかまたはそれらと約１０Å以内（より好ましくは約５Å以内）に存在する、アミノ酸を含み得る。その酵素がプロテアーゼである場合、この目的の部位は、Ｓ６からＳ６’への基質結合チャネル（触媒機能に関与する残基（例えば、触媒性三つ組およびオキシアニオンホール））および任意の補因子（例えば、金属（例えば、Ｚｎ））結合部位を含む。この酵素がプロテインキナーゼである場合、この目的の部位は、ＡＴＰ結合部位に加えて、基質結合チャネルを含む。この酵素がデヒドロゲナーゼである場合、この目的の部位は、基質結合領域ならびにＮＡＤ／ＮＡＤＨによって占められる部位を含む。この酵素がヒドロラーゼ（ｈｙｄｒａｌａｓｅ）（例えば、ＰＤＥ４）である場合、この目的の部位は、ｃＡＭＰと接触した残基ならびに触媒性二価カチオンの結合に関与する残基を含む。
【００２０】
用語「標的」、「標的分子」、および「ＴＭ」は、交換可能に用いられ、そして最も広い意味で用いられ、そしてリガンドの結合がその標的の機能に対して影響を有する、化学的実体もしくは生物学的実体をいう。この標的は、分子、分子の一部分、または分子凝集物であり得る。リガンドの結合は、可逆的であっても不可逆的であってもよい。標的分子の特定の例としては、以下が挙げられる：ポリペプチドまたはタンパク質（例えば、酵素およびレセプター）、転写因子、このような増殖因子およびサイトカインのレセプターについてのリガンド、免疫グロブリン、核タンパク質、シグナル伝達成分（例えば、キナーゼ、ホスファターゼ）、ポリヌクレオチド、糖質、糖タンパク質、糖脂質、ならびに他の高分子（例えば、核酸−タンパク質複合体、クロマチンまたはリボソーム）、脂質二重層含有構造体（例えば、膜）または膜に由来する構造体（例えば、小胞）。この定義は特に、以下に定義されるとおりの標的生物学的分子（「ＴＢＭ」）を包含する。
【００２１】
「標的生物学的分子」または「ＴＢＭ」とは、本明細書中で用いられる場合、低分子アゴニストまたは低分子アンタゴニストがＴＢＭの機能に対して影響を有する、互いに生物学的に適切な複合体を形成し得る、単一の生物学的分子または複数の生物学的分子をいう。好ましい実施形態では、このＴＢＭは、タンパク質もしくはその部分であるか、または２以上のアミノ酸を含み、そして相補的反応性基を有する化合物と共有結合を形成し得る反応性基を保有するかまたは保有するように改変され得る。好ましいＴＢＭとしては、以下が挙げられる：細胞表面レセプターおよび可溶性レセプター、ならびにそれらのリガンド；ステロイドレセプター；ホルモン；免疫グロブリン；凝固因子；核タンパク質；転写因子；シグナル伝達分子；細胞接着分子、補助刺激分子、ケモカイン、アポトーシスの媒介に関与する分子、酵素、ならびにＤＮＡおよび／またはＲＮＡの合成または分解に関連したタンパク質。
【００２２】
多くのＴＢＭは、レセプター−リガンド結合相互作用に関与するＴＢＭであり、そしてレセプター−リガンド対のいずれかのメンバーであり得る。増殖因子およびそれらのそれぞれのレセプターの例示的な例としては、以下についてのものが挙げられる：エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、トロンボポイエチン（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ；ＴＰＯ）、アンジオポイエチン（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ；ＡＮＧ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ヒレグリンαおよびヒレグリンβ、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、胎盤増殖因子（ＰＬＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、およびインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）。ホルモンおよびそれらのそれぞれのレセプターの例示的な例としては、以下についてのものが挙げられる：成長ホルモン、プロラクチン、胎盤ラクトゲン（ＬＰＬ）、インスリン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、およびニューロキニン−１。サイトカインおよびそれらのそれぞれのレセプターの例示的な例としては、以下についてのものが挙げられる：毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、ＴＮＦ−α；ＣＤ４０Ｌ、幹細胞因子（ＳＣＦ）；インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−８、インターロイキン−９、インターロイキン−１３、およびインターロイキン−１８。
【００２３】
他のＴＢＭとしては、以下が挙げられる：細胞接着分子（例えば、ＣＤ２、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−５、ＶＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−５、およびＶＬＡ−４）；補助刺激分子（例えば、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＣＯＳ、およびＢ７ＲＰ−１）；ケモカイン（例えば、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ１ｂ）；アポトーシス因子（例えば、ＡＰＡＦ−１、ｐ５３、ｂａｘ、ｂａｋ、ｂａｄ、ｂｉｄ、およびｃ−ａｂｌ）；抗アポトーシス因子（例えば、ｂｃｌ２、ｂｃｌ−ｘ（Ｌ）、およびｍｄｍ２）；転写モジュレーター（例えば、ＡＰ−１およびＡＰ−２）；シグナル伝達タンパク質（例えば、ＴＲＡＦ−１、ＴＲＡＦ−２、ＴＲＡＦ−３、ＴＲＡＦ−４、ＴＲＡＦ−５、およびＴＲＡＦ−６）；ならびにアダプタータンパク質（例えば、ｇｒｂ２、ｃｂｌ、ｓｈｃ、ｎｃｋ、およびｃｒｋ。
【００２４】
酵素は、別のクラスの好ましいＴＢＭであり、そして例えば以下を含む多数の方法で分類され得る：アロステリック酵素；細菌酵素（イソロイシルｔＲＮＡシンターゼ、ペプチドデフォルミラーゼ、ＤＮＡジャイレースなど）；真菌酵素（チミジル酸シンターゼなど）；ウイルス酵素（ＨＩＶインテグラーゼ、ＨＳＶプロテアーゼ、Ｃ型肝炎ヘリカーゼ、Ｃ型肝炎プロテアーゼ、ライノウイルスプロテアーゼなど）；キナーゼ（セリン／トレオニン、チロシン、および二重特異性）；ホスファターゼ（セリン／トレオニン、チロシン、および二重特異性）；ならびにプロテアーゼ（アスパルチルプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、およびセリンプロテアーゼ）。酵素の顕著なサブクラスとしては、以下が挙げられる：キナーゼ（例えば、Ｌｃｋ、Ｓｙｋ、Ｚａｐ−７０、ＪＡＫ、ＦＡＫ、ＩＴＫ、ＢＴＫ、ＭＥＫ、ＭＥＫＫ、ＧＳＫ−３、Ｒａｆ、ｔｇｆ−β−活性化キナーゼ−１（ＴＡＫ−１）、ＰＡＫ−１、ｃｄｋ４、Ａｋｔ、ＰＫＣθ、ＩＫＫβ、ＩＫＫ−２、ＰＤＫ、ａｓｋ、ｎｉｋ、ＭＡＰＫＡＰＫ、ｐ９０ｒｓｋ、ｐ７０ｓ６ｋ、およびＰＩ３−Ｋ（ｐ８５サブユニットおよびｐ１１０サブユニット））；ホスファターゼ（例えば、ＣＤ４５、ＬＡＲ、ＲＰＴＰ−α、ＲＰＴＰ−μ、Ｃｄｃ２５Ａ、キナーゼ関連ホスファターゼ、ｍａｐキナーゼホスファターゼ−１、ＰＴＰ−１Ｂ、ＴＣ−ＰＴＰ、ＰＴＰ−ＰＥＳＴ、ＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２）；カスパーゼ（例えば、カスパーゼ−１、カスパーゼ−３、カスパーゼ−７、カスパーゼ−８、カスパーゼ−９、およびカスパーゼ−１１）；ならびにカテプシン（ｃａｔｈｅｓｐｉｎ）（例えば、カテプシンＢ、カテプシンＦ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カテプシンＳ、およびカテプシンＶ）。他の酵素的標的としては、以下が挙げられる：ＢＡＣＥ、ＴＡＣＥ、細胞質ゾルホスホリパーゼＡ２（ｃＰＬＡ２）、ＰＡＲＰ、ＰＤＥ  Ｉ〜ＰＤＥ  ＶＩＩ、Ｒａｃ−２、ＣＤ２６、イノシン１リン酸デヒドロゲナーゼ、１５−リポキシゲナーゼ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ、アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ、ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ、ロイコトリエンＡ４ヒドロラーゼ、および一酸化窒素シンターゼ。
【００２５】
（ＴＢＭの改変体）
本発明は概して、標的生物学的分子（「ＴＢＭ」）の改変体、ならびにこの作製方法およびこれを使用してＴＢＭのリガンドを同定する方法に関する。好ましい実施形態では、これらのＴＢＭはタンパク質であり、そしてこれらの改変体はそれらのシステイン変異体であり、ここで、ＴＢＭの天然に存在する非システイン残基が、システイン残基に変異している。このネイティブでないシステインは、このＴＢＭに対して、係留に使用するための反応性基を提供する。
【００２６】
係留は、標的上の反応性基と潜在的リガンド上の相補的反応性基との間での共有結合の形成を頼りとするリガンド同定方法であり、そして以下に記載される：米国特許第６，３３５，１５５号、ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ００／００８２３およびＰＣＴ公開番号ＷＯ  ０２／４２７７３、Ｅｒｌａｎｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：９３６７−９３７２（２０００）、ならびに米国出願第１０／１２１，２１６号（発明の名称：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＬＩＧＡＮＤ  ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ、発明者Ｄａｎｉｅｌ  Ｅｒｌａｎｓｏｎ，Ａｎｄｒｅｗ  Ｂｒａｉｓｔｅｄ、およびＪａｍｅｓ  Ｗｅｌｌｓによる（対応するＰＣＴ出願第ＵＳ０２／１３０６１号））。得られる共有結合複合体は、標的−リガンド結合体と称される。この共有結合は、標的上の所定の部位（例えば、ネイティブなシステインまたはネイティブでないシステイン）で形成されるので、化学量論および結合位置は、この方法によって同定されるリガンドについて既知である。
【００２７】
一旦形成されると、この標的−リガンド結合体のリガンド部分は、多数の方法を用いて同定され得る。好ましい実施形態では、質量分析法が用いられる。この標的−リガンドは、質量分析計において直接的に検出され得るか、または検出前に断片化され得る。あるいは、このリガンドは、質量分光光度計内で標的−リガンド結合体から遊離され得、続いて同定され得る。他の実施形態では、以下を含むがこれらに限定されない代替の検出方法が用いられる：クロマトグラフィー、標識されたプローブ（蛍光、放射性など）、核磁気共鳴（「ＮＭＲ」）、表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）、キャピラリー電気泳動、Ｘ線結晶学など。なお他の実施形態では、結合が、アッセイの測定に必須の領域に生じる場合、機能的アッセイもまた用いられ得る。
【００２８】
標的がタンパク質であって共有結合がジスルフィドである係留方法の１つの実施形態の模式図を図１に示す。チオール含有タンパク質は、複数のリガンド候補と反応させられる。この実施形態では、このリガンド候補は、式−ＳＳＲ１（ここで、Ｒ１は、非置換のＣ１−Ｃ１０アルキル、置換されたＣ１−Ｃ１０アルキル、非置換アリールまたは置換されたアリールである）のジスルフィドの形態で、マスクされたチオールを保有する。特定の実施形態では、Ｒ１は、潜在的リガンド候補の溶解度を増強するように選択される。示されるように、その標的に対して固有の結合親和性を保有するリガンド候補が同定され、そしてジスルフィド部分を含まず、同定された結合決定基（丸で表される）を含む対応するリガンドが作製される。
【００２９】
図２は、標的酵素であるＥ．ｃｏｌｉチミジル酸シンターゼを、以下の式のリガンド候補と接触させる２つの代表的な係留実験を図示する：
【００３０】
【化１】
2005503380.tif 000002
ここで、Ｒｃは、このプールのライブラリーメンバーの間で可変の部分であり、そして非置換脂肪族、置換脂肪族、非置換アリール、または置換アリールである。全てのＴＳ酵素と同様に、Ｅ．ｃｏｌｉのＴＳは、係留のために用いられ得る活性部位システイン（Ｃｙｓ１４６）を有する。Ｅ．ｃｏｌｉのＴＳはまた、４つの他のシステインを含むが、これらのシステインは、埋没しており、そして係留実験において反応性ではないことが見出された。例えば、最初の実験では、Ｅ．ｃｏｌｉの野生型ＴＳおよびＣ１４６Ｓ変異体（ここで、１４６位のシステインがセリンに変異している）を、シスタミンＨ２ＮＣＨ２ＣＨ２ＳＳＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２と接触させた。野生型ＴＳ酵素は、１当量のシスタミンとクリーンに（ｃｌｅａｎｌｙ）反応したが、一方、変異体ＴＳは、反応しなかった。このことは、このシスタミンがＣｙｓ１４６と反応し、そしてＣｙｓ１４６について選択的であることを示す。
【００３１】
図２Ａは、ＴＳとの結合親和性がほとんどまたは全くない１０個の異なるリガンド候補のプールを用いたＴＳの反応の逆重畳された質量スペクトルである。何の結合相互作用もないと、ＴＳと個々のリガンド候補との間のジスルフィド交換反応の平衡は、未改変の酵素へと向かう。これは、以下の方程式によって図示される。
【００３２】
【化２】
2005503380.tif 000003
予想されるように、未改変の酵素に対応するピークは、スペクトルが最も顕著な２つのピークのうちの１つである。他方の顕著なピークは、Ｃｙｓ１４６のチオールがシステアミンで改変されているＴＳである。この種は、あらゆる個々のライブラリーメンバーについて顕著な程度までは形成されないが、このピークは、ライブラリープールの各メンバーについての平衡反応の累積効果に起因する。この反応をチオール含有還元剤（例えば、２−メルカプトエタノール）の存在下で行った場合、活性部位のシステインもまた、この還元剤によって改変され得る。システアミンおよび２−メルカプトエタノールは同様の分子量を有するので、それらのジスルフィド結合したそれぞれのＴＳ酵素は、この実験において用いられる条件下では区別できない。右側の小さなピークは、別個のライブラリーメンバーに対応する。明白なことに、これらのピークはいずれも、それほど顕著ではない。図２Ａは、リガンド候補がいずれもその標的についての固有の結合親和性を保有しないスペクトルに特有である。
【００３３】
図２Ｂは、リガンド候補のうちの１つが、この酵素に対する固有の結合親和性を有する、１０個の異なるリガンド候補のプールを用いたＴＳの反応の逆重畳した質量スペクトルである。わかり得るように、最も顕著なピークは、Ｃｙｓ１４６のチオールがＮ−トシル−Ｄ−プロリン化合物で改変されているＴＳに対応するピークである。このピークは、未改変の酵素に対応するピークおよびＣｙｓ１４６のチオールがシステアミンで改変されているＴＳに対応するピークを含め、全ての他のピークを小さくする。図２Ｂは、係留によって、所望の部位についての強固な固有の結合親和性を保有する部分が捕らえられた、質量スペクトルの一例である。
【００３４】
図２の代表的係留実験を、天然に存在するシステインを目的の部位（Ｅ．ｃｏｌｉのＴＳ酵素の活性部位に位置するＣｙｓ１４６）に既に保有するＴＢＭで実施した。しかし、ＴＢＭは、天然に存在するシステインを目的の部位またはその近傍に常に保有するというわけではないので、本発明は、ＴＢＭのシステイン変異体改変体、ならびにそれを作製するための方法を提供する。
【００３５】
従って、本発明の１つの局面では、タンパク質ＴＢＭの少なくとも１つのシステイン変異体を含むセットが提供され、ここで、目的の部位またはその近傍の天然に存在する非システイン残基は、システイン残基に変異している。１つの実施形態では、このセットは、タンパク質ＴＢＭの複数のシステイン変異体を含み、ここで、各変異体は、システイン残基に変異している、天然に存在する異なる非システイン残基を有する。別の実施形態では、このセットは、タンパク質ＴＢＭの少なくとも３つのシステイン変異体を含み、ここで、各変異体は、システイン残基に変異している、天然に存在する異なる非システイン残基を有する。なお別の実施形態では、このセットは、タンパク質ＴＢＭの少なくとも５つのシステイン変異体を含み、ここで、各変異体は、システイン残基に変異している、天然に存在する異なる非システイン残基を有する。さらになお別の実施形態では、このセットは、タンパク質ＴＢＭの少なくとも１０のシステイン変異体を含み、ここで、各変異体は、システイン残基に変異している、天然に存在する異なる非システイン残基を有する。
【００３６】
本発明の別の局面では、システインへと変異させることが適切である残基を同定するための方法が提供される。好ましい実施形態では、ＴＢＭの三次元構造モデルまたは実験によって導き出された三次元構造（例えば、Ｘ線または３Ｄ  ＮＭＲ）を用いて、システインへと変異させることが適切である残基を同定するのを補助する。目的のＴＢＭの構造が利用可能でない場合、関連のＴＢＭまたは相同のＴＢＭの三次元構造が、代役として用いられ得る。代役の構造を用いて適切な残基が一旦同定されたら、当該分野で公知の方法（例えば、配列アラインメント）を用いて、目的のＴＢＭ中の対応する残基を同定する。一般に、以下に記載される、システインへと変異させるのに適切な残基を同定するための方法は、単独で、または互いに任意の組合せで用いられ得る。
【００３７】
１つの方法では、候補残基の局所骨格コンホメーションが決定され、そして実験によって解かれた構造のデータベースが、この候補残基と同じかまたは類似の局所骨格コンホメーションを有する、ジスルフィド結合したシステインの例について検索される。残基の骨格原子（Ｎ、Ｃα、ＣおよびＯ）の任意の組合せを用いて、局所コンホメーションを決定し得る。ＴＢＭがシステイン変異を受け入れる確率は、同じかまたは類似の局所骨格コンホメーション中の既知のジスルフィド結合したシステインのデータベースにおいて見出される例が多いほど改善される。実験によって解かれた構造は、以下を含む多くのソースから入手可能である：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｎｋ（「ＰＤＢ」）（これは、Ｉｎｔｅｒｎｅｔにおいてｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒに見出され得る）およびＰｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（これは、Ｉｎｔｅｒｎｅｔにおいてｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｃｓ．ｃｏｍに見出され得る）。実験によって解かれた構造のデータベースを編集するために用いられ得る独特な高解像度タンパク質鎖（特定の解像度よびＲ因子を有する構造によってグループ分けされる）のリストは、Ｉｎｔｅｒｎｅｔにおいてｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｃｃｃ．ｅｄｕ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｌａｂｓ／ｄｕｎｂｒａｃｋ／ｃｕｌｌｅｄｐｄｂ．ｈｔｍｌに見出される。一般に、候補残基の局所環境は、候補残基自体および配列上、その候補残基の前または後ろの少なくとも１つの残基を含む。コンホメーションは、比較される原子の平方自乗平均の偏差（「ＲＭＳＤ」）が、約１．０Å２以下、より好ましくは約０．７５Å２以下、そしてさらにより好ましくは約０．５Å２以下であるならば、同じかまたは類似であると考えられる。
【００３８】
１つの実施形態では、この方法は、以下の工程：
ａ）ｎ個の残基を有するタンパク質ＴＢＭの三次元構造の座標セットを得る工程；
ｂ）このＴＢＭの三次元構造上で候補残基ｉを選択する工程であって、ここで、この候補残基ｉはｉ番目の残基であり、ｉは１とｎとの間の数字であり、そして残基ｉはシステインではない、工程；
ｃ）残基ｊを選択する工程であって、ここで、残基ｊは配列上、残基ｉに隣接する、工程；
ｄ）候補参照値を決定する工程であって、ここで、この候補参照値は残基ｉと残基ｊとの間の空間的関係である、工程；
ｅ）ジスルフィド含有タンパク質フラグメントの座標セットを含むデータベースを得る工程であって、ここで、各フラグメントは、少なくとも１つのジスルフィド結合したシステインおよび第一隣接残基を含み、ここで、このジスルフィド結合したシステインおよびこの第一隣接残基は、残基ｉおよび残基ｊと同じ順序関係を共有する、工程；
ｆ）各フラグメントについて比較参照値を決定する工程であって、ここで、この比較参照値は、該候補参照値が残基ｉと残基ｊとの間であるような、このジスルフィド結合したシステインとこの第一隣接残基との間での対応する空間的関係である、工程；ならびに
ｇ）スコアを決定する工程であって、ここで、このスコアは、このデータベース中での、この候補参照値と同じであるかまたは類似する比較参照値を保有するフラグメント数の尺度である、工程
を包含する。
【００３９】
別の実施形態では、この方法は、残基ｋを選択する工程であって、ここで、残基ｋが、配列上、残基ｉに隣接しており、ｋはｊではない、工程をさらに包含し、ここで
この候補参照値は、残基ｉ、残基ｊ、および残基ｋの間の空間的関係であり；
各フラグメントは、少なくとも１つのジスルフィド結合したシステイン、第一隣接残基、および第二隣接残基を含み、ここで該ジスルフィド結合したシステインならびにこの第一隣接残基およびこの第二隣接残基は、残基ｉ、残基ｊ、および残基ｋと同じ順序関係を共有し；そして
この比較参照値は、この候補参照値が残基ｉ、残基ｊ、および残基ｋの間にあるように、このジスルフィド結合したシステイン、この第一隣接残基、およびこの第二隣接残基の間の対応する空間的関係である。
【００４０】
別の実施形態では、この方法は、以下の工程：
ａ）ｎ個の残基を有するタンパク質ＴＢＭの三次元構造の座標セットを得る工程；
ｂ）このＴＢＭの三次元構造上の候補残基ｉを選択する工程であって、ここで、この候補残基ｉはｉ番目の残基であり、ｉは１とｎとの間の数字であり、残基ｉはシステインではない、工程；
ｃ）残基ｊおよび残基ｋを選択する工程であって、ここで、残基ｊおよび残基ｋは、両方とも、配列上、残基ｉに隣接する、工程；
ｄ）候補参照値を決定する工程であって、ここで、この候補参照値は、残基ｉ、残基ｊ、および残基ｋの各々由来の少なくとも１つの骨格原子の空間的関係である、工程；
ｅ）ジスルフィド含有タンパク質フラグメントの座標セットを含むデータベースを得る工程であって、ここで、各フラグメントは、少なくとも１つのジスルフィド結合したシステイン、第一隣接残基、および第二隣接残基を含み、ここで、このジスルフィド結合したシステイン、この第一隣接残基、およびこの第二隣接残基は、残基ｉ、残基ｊ、および残基ｋと同じ順序関係を共有する、工程；
ｆ）各フラグメントについて比較参照値を決定する工程であって、ここで、この比較参照値は、この候補参照値が、残基ｉ、残基ｊ、および残基ｋの間であるように、このジスルフィド結合したシステイン、この第一隣接残基、およびこの第二隣接残基の間の対応する空間的関係である、工程；ならびに
ｇ）スコアを決定する工程であって、ここで、このスコアは、このデータベース中での、この候補参照値と同じであるかまたは類似する比較参照値を保有するフラグメント数の尺度である、工程
を包含する。
【００４１】
別の実施形態では、この空間的関係は、二面角を含む。なお別の実施形態では、この空間的関係は、一対のφψ角を含む。別の実施形態では、この空間的関係は、２つの残基の原子の間の距離を含む。データベース（例えば、ＰＤＢ）中でジスルフィド結合した対を同定し、そしてこれらを、システイン変異についての候補である残基と一致させるためのコンピュータアルゴリズムの例示的な例は、実施例１に記載される。
【００４２】
別の方法では、目的の部位はＴＢＭ上に規定され、そしてシステイン変異について適切な残基は、この目的の部位からの残基の位置に基づいて同定される。１つの実施形態では、適切な残基は、この目的の部位内に位置する非システイン残基である。別の実施形態では、適切な残基は、この目的の部位から約５Å以内に位置する非システイン残基である。なお別の実施形態では、適切な残基は、この目的の部位から約１０Å以内に位置する非システイン残基である。これらの測定の目的のために、この目的の部位内のアミノ酸の任意の原子からそれぞれ、約５Å以内または約１０Å以内に入る少なくとも１つの原子を有する任意の非システイン残基は、システインへと変異させるために適切な残基である。ＴＢＭは、１つまたは複数の目的の部位を有し得る。いくつかの場合、ＴＢＭは、１つの目的の部位を有し、そして各々がシステインへと変異している残基のセットは、この目的の部位の周囲にクラスターを形成している。他の場合、ＴＢＭは、少なくとも２つの異なる目的の部位を有し、そして各々システインへと変異している残基のセットは、この少なくとも２つの異なる目的の部位の周辺にクラスターを形成している。なお他の場合には、ＴＢＭは、明確な目的の部位を１つも保有しないかまたは複数の目的の部位を保有するかのいずれかであり、その結果、システインへと変異している残基のセットは、タンパク質の表面全体に分布している。図３は、各々システインへと変異している残基の分布パターンの３つの例示的な例を示す。
【００４３】
別の方法では、溶媒アクセス可能性は、ＴＢＭの各非システイン残基について計算され、そしてシステイン変異について適切な残基を同定するために用いられる。溶媒アクセス可能性は、標準的な数字的方法（Ｌｅｅ，Ｂ．およびＲｉｃｈａｒｄｓ，Ｆ．Ｍ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  ５５：３７９−４００（１９７１）；Ｓｈｒａｋｅ，Ａ．およびＲｕｐｌｅｙ，Ｊ．Ａ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７９：３５１−３７１（１９７３））および分析方法（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ｍ．Ｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２１：７０９−７１３（１９８３）；Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｔ．Ｊ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８：６３−８９（１９８４））を用いることを含め、多数の公知の方法を用いて計算され得る。１つの実施形態では、変異について適切な残基としては、残基の原子の組合わせた表面積が、約２０Å２以上である残基が挙げられる。別の実施形態では、変異について適切な残基としては、残基の原子の組合わせた表面積が、約３０Å２以上である残基が挙げられる。なお別の実施形態では、変異について適切な残基としては、残基の原子の組合わせた表面積が、約４０Å２以上である残基が挙げられる。
【００４４】
別の方法では、システイン変異について適切な残基は、水素結合分析によって同定される。１つの実施形態では、適切な残基は、何の水素結合相互作用にも関与しない非システイン残基である。別の実施形態では、適切な残基は、その側鎖が、何の水素結合相互作用にも関与しない非システイン残基である。なお別の実施形態では、適切な残基は、その側鎖が、骨格原子との水素結合相互作用に関与しない非システイン残基である。
【００４５】
別の方法では、システイン変異について適切な残基は、回転異性体分析によって同定される。１つの実施形態では、この方法は、以下の工程：
ａ）ｎ個の残基および１個の目的の部位を有するＴＢＭの三次元構造を得る工程；
ｂ）この目的の部位にあるかまたはこの目的の部位近傍である候補残基ｉを選択する工程であって、ここで、この候補残基ｉはｉ番目の残基であり、ｉは１とｎとの間の数字であり、そして残基ｉはシステインではない、工程；
ｃ）変異したＴＢＭ構造体のセットを作製する工程であって、ここで、各変異したＴＢＭ構造体は、残基ｉの代わりにシステイン残基を保有し、そしてここで、このシステイン残基は、標準的な回転異性体コンホメーションで配置される、工程；ならびに
ｄ）該変異したＴＢＭ構造体のセットを評価する工程
を包含する。
【００４６】
別の実施形態では、システインについての標準的な回転異性体コンホメーションは、Ｐｏｎｄｅｒ，Ｊ．Ｗ．およびＲｉｃｈａｒｄｓ，Ｆ．Ｍ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９３：７７５−７９１（１９８７）によって記載されるＰｏｎｄｅｒｓおよびＲｉｃｈａｒｄｓによって列挙されたシステイン回転異性体のセットを含む。
【００４７】
別の実施形態では、システインについての標準的な回転異性体コンホメーションは、約６０°、約１８０°、および約３００°からなる群より選択される、χ１角；ならびに約６０°、約１２０°、約１８０°、約２７０°、および約３００°からなる群より選択されるχ２角を含む。
【００４８】
別の実施形態では、この方法は、残基ｉがα−ヘリックスまたはβ−シートの一部であるか否かを決定し、次いで割り当てられた二次構造に基づいて、標準的な回転異性体コンホメーションを選択する工程をさらに包含する。図４に示されるように、異なるセットの回転異性体は、システインに割り当てられた二次構造に依存することが好ましい。残基ｉは、残基ｉ−１、残基ｉ、および残基ｉ＋１のφψ角が、それぞれ、約３００±３０°および約３１５±３０°であるならば、α−ヘリックスの一部であると考えられ、そして、残基ｉ−１、ｉ、およびｉ＋１のφψ角が、約２４０±３０°および１２０±３０°であるならば、β−シートの一部であると考えられる。残基ｉが、α−ヘリックスの一部であるならば、システインについての標準的な回転異性体コンホメーションは、約１８０°と約６０；約１８０°と約２７０°；および約３００°と約３００°からなる群より選択されるχ１χ２対を含む。残基ｉがβ−ヘリックスの一部であるならば、システインについての標準的な回転異性体コンホメーションは、約１８０°と約６０°；約１８０°と約１８０°；約１８０°と約２７０°；および約３００°と約３００°からなる群より選択されるχ１χ２対を含む。
【００４９】
別の実施形態では、変異したＴＢＭ構造体のセットは、好ましくない立体接触をするか否かに基づいて評価される。残基は、好ましくない立体接触を全くしない少なくとも１つのシステイン回転異性体で置換され得るならば、システイン変異について適切な候補であると考えられる。好ましくない立体接触は、関与する原子のファンデアワールス半径の合計の約８０％未満である原子間距離と定義される。１つのバリエーションでは、このＴＢＭの骨格原子のみが、この回転異性体がこのＴＢＭと好ましくない接触をするか否かを決定する目的のために考慮される。別のバリエーションでは、このＴＢＭのこの骨格原子およびＣβは、この回転異性体がこのＴＢＭと好ましくない接触をするか否かを決定する目的のために考慮される。
【００５０】
別の実施形態では、変異したＴＢＭ構造体のセットは、力場計算に基づいて評価される。例示的な力場方法は、例えば、以下によって記載される：Ｗｅｉｎｅｒ，Ｓ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｃｏｒｎｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．７：２３０−２５２（１９８６）；Ｎｅｍｅｔｈｙ，Ｇ．ら，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．９６：６４７２−６４８４（１９９２）；およびＢｒｏｏｋｓ，Ｂ．Ｒ．ら，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．４：１８７−２１７（１９８３）。最低のエネルギーのコンホメーションの約１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以内（より好ましくは約５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以内）の全ての最小化コンホメーションは、アクセス可能と考えられる。
【００５１】
別の実施形態では、各変異したＴＢＭ構造は、残基ｉの代わりに、Ｓ−メチル基（側鎖が−ＣＨ２ＳＳＣＨ３である）でキャップされたシステインを保有し、そしてここで、このキャップされたシステイン残基は、システインについての標準的な回転異性体コンホメーションに配置される。残基は、Ｓ−メチル基のメチル炭素をこの目的の部位をこのＣβよりも近傍に配置する少なくとも１つの回転異性体で置換され得るならば、システイン変異について適切な候補であると考えられる。
【００５２】
目的の部位に対して１以上のシステインを付加することに加えて、その目的の部位の外側に位置する、１以上の天然に存在するシステインを欠失させること（そしてこれらを例えば、アラニンで置き換えること）もまた所望され得る。これらの変異体は、１以上の天然に存在するシステインが欠失または「スクラブ（無効化）」される場合、本発明の別の局面を構成する。種々の組換え体、化学技術、合成技術および／または他の技術を用いて、標的が、係留に利用可能な所望の数の遊離のチオール基を保有するように、標的を改変するために使用され得る。このような技術としては、例えば、その標的ポリペプチドをコードする核酸配列が、異なる数のシステイン残基を有するポリペプチドをコードするようにする、その標的ポリペプチドをコードする核酸配列の部位特異的変異誘発が挙げられる。特に好ましいのは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を用いた部位特異的変異誘発である（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号（１９８７年７月２８日発行）；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１５章（Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９１）を参照のこと）。他の部位特異的変異誘発技術もまた当該分野で周知であり、そして例えば、以下の刊行物に記載される：Ａｕｓｕｂｅｌら，前出，第８章；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．，第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）；Ｚｏｌｌｅｒら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８−５００（１９８３）；ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ，ＤＮＡ  ３：４７９−４８８（１９８４）；Ｚｏｌｌｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１０：６４８７（１９８７）；Ｂｒａｋｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：４６４２−４６４６（１９８４）；Ｂｏｔｓｔｅｉｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１１９３（１９８５），Ｋｕｎｋｅｌら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−８２（１９８７），Ａｄｅｌｍａｎら，ＤＮＡ  ２：１８３（１９８３）；ならびにＣａｒｔｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３：４３３１（１９８６）。カセット変異誘発（Ｗｅｌｌｓら，Ｇｅｎｅ，３４：３１５［１９８５］）および制限選択変異誘発（Ｗｅｌｌｓら，Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ  ＳｅｒＡ，３１７：４１５［１９８６］）もまた用いられ得る。
【００５３】
１より多くのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列改変体は、いくつかの方法のうちの１つにおいて作製され得る。これらのアミノ酸が、ポリペプチド鎖中に近くに一緒に位置するならば、これらは、所望のアミノ酸置換の全てをコードする１つのオリゴヌクレオチドを用いて同時に変異され得る。しかし、これらのアミノ酸が互いにいくらか距離を置いて位置する（例えば、１０個より多くのアミノ酸によって隔てられている）ならば、所望の変化の全てをコードする単一のオリゴヌクレオチドを作製することはより困難である。その代わり、２つの代替方法のうちの１つが用いられ得る。第一方法では、置換されるべき各アミノ酸について別個のオリゴヌクレオチドが作製される。次いで、これらのオリゴヌクレオチドは、１本鎖テンプレートＤＮＡに同時にアニーリングされ、そしてこのテンプレートから合成されるＤＮＡの第二鎖は所望のアミノ酸置換の全てをコードする。この代替方法は、所望の変異体を生成するための２回以上の変異誘発を含む。
【００５４】
本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに例示される。他に示さない限り、全ての標準的な分子生物学の手順が、以下に記載されるプロトコルに従って実施される：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第１巻−第３巻，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻−第２巻，Ａｕｓｂｕｂｅｌ，Ｆ．，Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．，Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｒ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｄ．，Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｊ．Ｇ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．，およびＳｔｒｕｈｌ，Ｋ．編，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７。
【実施例】
【００５５】
（実施例１）
本実施例は、ＰＤＢから潜在的係留変異体と整列するジスルフィド対を同定するための、ＦＯＲＴＲＡＮにおいて記載される例示的コンピュータアルゴリズムを提供する。このプログラムの段階的記載およびソースコードは以下に記載される。
【００５６】
最初に、ユーザは、テンプレートタンパク質についてのＰＤＢファイルの名称、一致させるフラグメントの残基、およびそのフラグメント内でのシステインの相対位置を与える。好ましい値は、潜在的変異体部位に対して１〜２残基Ｎ末端側およびＣ末端側である。例えば、ＰＴＰ１Ｂの残基Ｇｌｕ  ２００が候補残基であるならば、ユーザは、システインを相対位置３として、残基１９８から残基２０２までのフラグメントを指定する。
【００５７】
第２に、このプログラムは、テンプレートファイルを読み込み、そのテンプレート残基についてＮ原子、Ｃα原子、Ｃ原子、Ｏ原子の座標を抽出し、そしてそのテンプレート残基の各々についてφ（Ｃ’−Ｎ−Ｃα−Ｃ回転）値およびψ（Ｎ−Ｃα−Ｃ−Ｎ’）値を決定する。
【００５８】
第３に、このプログラムは、テンプレートφ／ψ値に基づいて「残基フィルター」を作成する。このフィルターを用いて、このテンプレート残基の連続セグメントと粗い許容差（±６０°）以内で一致するφ／ψ値を有する、試験タンパク質の連続セグメントを同定する。このフィルターはまた、このフラグメントがシステインを適切な位置に含まなければならないことを必要とする。上記のＰＴＰ１Ｂの例では、このフィルターは、ＰＴＰ１Ｂの残基１９８〜残基２０２の骨格コンホメーションとほぼ一致し、そして３位にシステインを含む、試験タンパク質のうちの５残基のフラグメントを同定する。
【００５９】
第４に、このプログラムの残りは、シンプルテキストファイルで提供された、ユーザーが与えた試験タンパク質リストについて反復して操作する。１つの実施形態では、このファイルは、約２５００の選別されたＰＤＢ鎖を含む。各試験構造体については、以下である：
ａ）このプログラムは、これらの座標を読取り、配列および各残基についてのφ／ψ値を決定し、そして工程（３）において指定された残基フィルターと一致する任意の連続鎖を同定する。
【００６０】
ｂ）このプログラムは、チェックして、このフラグメントにおけるシステイン残基が、ジスルフィド結合に関与することを見る。これは、Ｓγ原子からの単純な距離に基づく検索および角に基づく検索によって行われる。対にならないシステインを含むフラグメントは、拒否される。
【００６１】
ｃ）各フラグメントについて、この骨格のＮ原子、Ｃα原子、Ｃ原子、Ｏ原子は、テンプレート分子由来の対応する原子（例えば、ＰＴＰ１Ｂの１９８〜２０２）上に重ねられる。この骨格が、ユーザが指定した許容差（代表的には０．５Å〜０．７５Å）内のＲＭＳＤに適合したら、そのジスルフィド結合したパートナーを伴う、このフラグメントのこの重ねられた座標は、ＰＤＢ形式でファイルに書き出される。ログファイルは、そのＲＭＳＤ値とともに、各「ヒット」について保管される。このヒットは、Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩまたはＰｙＭＯＬのようなグラフィックプログラムとともに見られる。
【００６２】
【数１】
2005503380.tif 000004
【００６３】
【数２】
2005503380.tif 000005
【００６４】
【数３】
2005503380.tif 000006
【００６５】
【数４】
2005503380.tif 000007
【００６６】
【数５】
2005503380.tif 000008
【００６７】
【数６】
2005503380.tif 000009
（実施例２）
（ヒトＩＬ−２のクローニングおよび変異誘発）
インターロイキン−２（ＩＬ−２）（登録番号ＳＷＳ  Ｐ０１５８５）は、活性化Ｔヘルパーリンパ球の増殖において顕著な役割を有するサイトカインである。マイトジェン刺激またはＴ細胞レセプター複合体の抗原提示細胞上の抗原／ＭＨＣ複合体との相互作用は、活性化Ｔ細胞によるＩＬ−２の合成および分泌を引き起こし、続いて、抗原特異的細胞のクローンの拡大が生じる。これらの効果は、オートクライン効果として公知である。さらに、ＩＬ−２は、Ｂ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖および活性に対してパラクリン効果を有し得る。これらの結果は、ＩＬ−２と、Ｔ細胞表面上のそのレセプターとの相互作用によって開始される。ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒ相互作用の破壊は、免疫機能を抑制し得、これは、以下を含む多数の臨床的適応症を有する：宿主対移植片病（ＧＶＨＤ）、移植拒絶、および自己免疫障害（例えば、乾癬、ブドウ膜炎、慢性関節リウマチ、および多発性硬化症）。Ｃ１２５Ａ変異体の利用可能な構造情報が存在する［３ＩＮＫ，Ｍｃ  Ｋａｙ，Ｄ．Ｂ．およびＢｒａｎｄｈｕｂｅｒ，Ｂ．Ｊ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：４１２（１９９２）］。
【００６８】
（ヒトＩＬ−２のクローニング）
野生型ＩＬ−２残基および変異体ＩＬ−２残基の番号付けは、成熟タンパク質の第一アミノ酸残基（Ａ）が、あらゆるプレ配列とは独立して、残基番号１であるという慣例に従う（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉが産生するタンパク質についてのｍｅｔ［Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｔ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３０２：３０５−３１０（１９８３）およびＤｅｖｏｓ，Ｒ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１：４３０７−４３２３（１９８３）を参照のこと］）。
【００６９】
ヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）をコードするＤＮＡ配列を、プラスミドｐＴＣＧＦ−１１（ＡＴＣＣ）から単離した。ＰＣＲプライマーを、ｐＲＳＥＴ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にサブクローニングするために、制限エンドヌクレアーゼ部位ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩを含むように設計した。
【００７０】
【化３】
2005503380.tif 000010
２本鎖ＩＬ−２／ｐＲＳＥＴを、以下の手順によって調製した。ＩＬ−２配列を含むＰＣＲおよびｐＲＳＥＴを、両方とも制限エンドヌクレアーゼで切断した（ＰＣＲ産物、各々１μｌのエンドヌクレアーゼ、２μＭの適切な１０×緩衝液、１５μｌの水；３７℃で２時間インキュベートした）。ヌクレアーゼ切断の産物を、アガロースゲル（１％アガロース、ＴＡＥ緩衝液）から単離し、そしてＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて一緒に連結した（８０ｎｇのＩＬ−２配列、１６０ｎｇのｐＲＳＥＴベクター、４μｌの５×リガーゼ緩衝液［３００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０％  ＰＥＧ  ８０００、５ｍＭ  ＡＴＰ、５ｍＭ  ＤＴＴ］、１μｌリガーゼ；１５℃で１時間インキュベートした）。１０μｌのリガーゼ反応混合物を、ＸＬ１  ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（１０μｌの反応混合物、１０μｌの５×ＫＣＭ［０．５Ｍ  ＫＣｌ、０．１５Ｍ  ＣａＣｌ２、０．２５Ｍ  ＭｇＣｌ２］、３０μｌの水、５０μｌのＰＥＧ−ＤＭＳＯコンピテント細胞；４℃で２０分間、２５℃で１０分間インキュベートした）に形質転換し、そして１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ／寒天プレートにプレーティングした。３７℃での一晩のインキュベーション後、シングルコロニーを、５ｍｌ  ２ＹＴ培地中で１８時間増殖させた。次いで、細胞を単離し、そして２本鎖ＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮＡミニプレップキットを用いて細胞から抽出した。
【００７１】
（ＩＬ−２  Ｃｙｓ変異の作製）
ＩＬ−２の部位特異的変異体を、１本鎖ＤＮＡ法（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：４８８−４９２（１９８５）の改変版）によって調製した。オリゴヌクレオチドを、所望の変異および１５〜２０塩基の隣接配列を含むように設計した。
【００７２】
１本鎖形態のＩＬ−２／ｐＲＳＥＴプラスミドを、ＣＪ２３６細胞株への２本鎖プラスミドの形質転換によって調製した（１μｌのＩＬ−２／ｐＲＳＥＴ２本鎖ＤＮＡ、２μｌの２×ＫＣＭ塩、７μｌ水、１０μｌのＰＥＧ−ＤＭＳＯコンピテントＣＪ２３６細胞；４℃で２０分間、そして２５℃で１０分間インキュベートした；１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ／寒天にプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートした）。次いで、ＣＪ２３６細胞のシングルコロニーを、対数中期になるまで５０ｍｌの２ＹＴ培地中で増殖させた；次いで、５μｌのＶＣＳヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を添加し、そしてその混合物を３７℃で一晩インキュベートした。１本鎖ＤＮＡを、ファージの沈降によって上清から単離した（１／５容量の２０％  ＰＥＧ  ８０００／２．５Ｍ  ＮａＣｌ；１２Ｋで１５分間遠心分離する）。次いで、１本鎖ＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ１本鎖ＤＮＡキットを用いてファージから単離した。配列決定によって、ロイシン−２５からセリンへの変異が同定され、これを、「Ｓ２５Ｌ」オリゴヌクレオチドを用いた変異誘発によって修正した。
【００７３】
【化４】
2005503380.tif 000011
Ｋ４３Ｃ単一変異体およびＬ７２Ｃ単一変異体（それぞれ、配列番号１１および配列番号１４）に対応するオリゴヌクレオチドを用いて作製した、さらなる二重変異体（Ｌ７２Ｃ  Ｋ４３Ｃ）が存在した。
【００７４】
部位特異的変異誘発を、以下の通りに達成した：変異誘発オリゴヌクレオチドを、１０ＯＤの濃度になるように溶解し、そして５’末端をリン酸化した（２μｌオリゴヌクレオチド、２μｌの１０ｍＭ  ＡＴＰ、２μｌの１０×Ｔｒｉｓ−塩化マグネシウム緩衝液、１μｌの１００ｍＭ  ＤＴＴ、１０μｌの水、１μｌのＴ４  ＰＮＫ；３７℃で４５分間インキュベートする）。次いで、リン酸化したオリゴヌクレオチドを、１本鎖ＤＮＡテンプレートに対してアニーリングした（２μｌの１本鎖プラスミド、１μｌオリゴヌクレオチド、１μｌの１０×ＴＭ緩衝液、６μｌの水；９４℃で２分間、５０℃で５分間加熱し、室温まで冷却する）。次いで、２本鎖ＤＮＡを、アニーリングしたオリゴヌクレオチド／テンプレートから調製した（２μｌの１０×ＴＭ緩衝液、２μｌの２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、１μｌの１００ｍＭ  ＤＴＴ、１．５μｌの１０ｍＭ  ＡＴＰ、４μｌの水、０．４μｌのＴ７  ＤＮＡポリメラーゼ、０．６μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼを添加する；室温で２時間インキュベートする）。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＸＬ１  ｂｌｕｅ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、２本鎖ＤＮＡで形質転換し（１μｌの２本鎖ＤＮＡ、１０μｌの５×ＫＣＭ、４０μｌの水、５０μｌのＤＭＳＯコンピテント細胞；４℃で２０分間、室温で１０分間インキュベートする）、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ／寒天にプレーティングし、そして３７℃で一晩インキュベートした。各プレート由来の約４個のコロニーを用いて、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む５ｍｌの２ＹＴに接種した；これらの培養物を、３７℃で１８〜２４時間増殖させた。次いで、プラスミドを、Ｑｉａｇｅｎミニプレップキットを用いてこれらの培養物から単離した。これらのプラスミドを配列決定して、どのＩＬ−２／ｐＲＳＥＴクローンが所望の変異を含むかを決定した。
【００７５】
【化５】
2005503380.tif 000012
（ＩＬ−２変異体の発現）
変異体タンパク質を、以下の通りに発現させた：変異を含むＩＬ−２／ｐＲＳＥＴクローンを、ＢＬ２１  ＤＥ３  ｐＬｙｓＳ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に形質転換し（１μｌの２本鎖ＤＮＡ、２μｌの５×ＫＣＭ、７μｌの水、１０μｌのＤＭＳＯコンピテント細胞；４℃で２０分間、室温で１０分間インキュベートする）、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ／寒天にプレーティングし、そして３７℃で一晩インキュベートした。１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む１０ｍｌの２ＹＴ中の１０ｍｌの培養物を、シングルコロニーから一晩増殖させた。１００ｍｌの２ＹＴ／アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）にこれらの一晩培養物を接種し、そして３７℃で３時間インキュベートした。次いで、この培養物を１．５Ｌの２ＹＴ／アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）に添加し、そして対数期後期（６００ｎｍでの吸光度が約０．８）になるまでインキュベートし、この時点で、ＩＰＴＧを１ｍＭの最終濃度になるまで添加した。培養物を、３７℃でさらに３時間インキュベートし、次いで細胞をペレット化し（１０Ｋｒｐｍ、１０分間）、そして−２０℃で一晩凍結した。
【００７６】
次いで、ＩＬ−２変異体を、凍結した細胞ペレットから精製した。最初に、細胞をマイクロフルイダイザー中で溶解し（１００ｍｌのＴｒｉｓ  ＥＤＴＡ緩衝液、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ［Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  １１０Ｓ］に３回通す）、そして封入体を、沈降（１０Ｋｒｐｍ、１０分間）によって単離した。細胞溶解後、５０μｌの細胞物質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析のためにとっておいた。全ての変異体は、ゲルによって決定したところ、発現していたが、いくつか（例えば、Ｅ６８Ｃ）は、再折り畳みで沈降した。次いで、封入体を、４５ｍｌのグアニジンＨＣｌ中に再懸濁し、そして１０Ｋｒｐｍで１０分間回転させた。この上清を再折り畳み緩衝液（４５ｍｌグアニジンＨＣｌ、３６ｍｌ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、２３１ｍｇシステアミン、４６ｍｇシスタミン、２３４ｍｌの水）に添加し、そして室温で３〜５時間インキュベートした。次いで、この混合物を１０Ｋｒｐｍで２０分間回転させ、そして上清を５容量の緩衝液（１０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ６）、２５ｍＭ  ＮａＣｌ）中で４〜５回透析した。次いで、このタンパク質溶液を、セルロースを通して濾過し、そしてＳ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｆａｓｔ  ｆｌｏｗカラム（直径２．５ｃｍ×長さ１４ｃｍ）に５ｍｌ／分で注射した。次いで、このタンパク質を、６０分間にわたる０〜７５％緩衝液Ｂの勾配（緩衝液Ａ：２５ｍＭ  ＮＨ４ＯＡｃ（ｐＨ６）、２５ｍＭ  ＮａＣｌ；緩衝液Ｂ：２５ｍＭ  ＮＨ４ＯＡｃ（ｐＨ６）、１Ｍ  ＮａＣｌ）を用いて溶出させた。次いで、精製したタンパク質を、ＴＥＴＨＥＲアッセイについて適切な緩衝液（代表的には、１００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４））中で交換した。平均収量は、０．５〜４ｍｇ／Ｌ培養物であった。
【００７７】
（実施例３）
（ヒトＩＬ−４のクローニングおよび変異誘発）
ＩＬ−４（登録番号ＳＷＳ  Ｐ０５１１２）は、初期免疫応答およびアレルギー応答に重要なサイトカインである；ＩＬ−４Ｒとのその相互作用は、Ｔｈ２細胞の作製に関与する。ＩＬ−４は、ＩｇＥ（免疫グロブリンＥ）を産生するＢ細胞、好酸球、および肥満細胞を補充して活性化する。これらの細胞は次いで、タグ化し、そして皮膚および粘膜組織中の寄生生物を攻撃し、これらの寄生生物をこれらの組織から排出させる。免疫応答およびアレルギー応答におけるＩＬ−４／ＩＬ４Ｒ相互作用の役割は、この相互作用の破壊が、喘息、皮膚炎、結膜炎、および鼻炎のような状態を緩和し得ることを示唆する。孤立した状態で、およびレセプター分子と共複合体化（ｃｏ−ｃｏｍｐｌｅｘ）した状態で、ＩＬ−４の結晶構造が存在する［１ＨＩＫ，Ｍｕｌｌｅｒ，Ｔ．およびＢｕｅｈｎｅｒ，Ｍ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２４７：３６０−３７２（１９９５）；レセプターαである１ＩＡＲを伴って，Ｈａｇｅ，Ｔ．ら，Ｃｅｌｌ  ９７：２７１−２８１（１９９９）］。
【００７８】
（ヒトＩＬ−４のクローニング）
野生型ＩＬ−４残基および変異体ＩＬ−４残基の番号付けは、成熟タンパク質の第一アミノ酸残基（Ｈ）が、あらゆるプレ配列とは独立して、残基番号１であるという慣例に従う（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉが産生するタンパク質についてのｍｅｔ［Ｙｏｋｏｔａ，Ｔ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：５８９４−５８９８（１９８６）］）。分泌シグナルを欠き、さらなるＮ末端メチオニンを含むＩＬ−４を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、Ｓｕｎｅｓｉｓ  ＲＳＥＴ．ＩＬ４プラスミドから細胞内で発現させた。
【００７９】
ヒトインターロイキン−４（ＩＬ４）をコードするＤＮＡ配列を、以下のＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲによって、プラスミドｐｃＤ−ｈＩＬ−４（ＡＴＣＣ登録番号５７５９２）から単離した：
【００８０】
【化６】
2005503380.tif 000013
これらのプライマーは、このタンパク質の細胞外ドメインに対応し、これらのプライマーは、ｐＲＳＥＴベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にサブクローニングするための制限エンドヌクレアーゼ部位Ｎｄｅ  ＩおよびＸｈｏＩを含むように設計された。ＰＣＲ反応物を、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製カラム（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。ＩＬ４配列を含むＰＣＲ産物を、制限エンドヌクレアーゼで切断した（４１μｌのＰＣＲ産物、各々２μｌのエンドヌクレアーゼ、５μｌの適切な１０×緩衝液；３７℃で９０分間インキュベートした）。ｐＲＳＥＴベクターを、制限エンドヌクレアーゼで切断した（６μｇ  ＤＮＡ、各々４μｌのエンドヌクレアーゼ、１０μｌの適切な１０×緩衝液、１００μｌにするような水；３７℃で２時間インキュベートした；２μｌのＣＩＰおよびを添加し、そして３７℃で４５分間インキュベートした）。ヌクレアーゼ切断の産物を、アガロースゲル（１％アガロース、ＴＢＥ緩衝液）から単離し、そしてを用いて一緒に連結したＴ４  ＤＮＡリガーゼ（２００ｎｇ  ｐＲＳＥＴベクター、１５０ｎｇのＩＬ４  ＰＣＲ産物、４μｌの５×リガーゼ緩衝液［３００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０％  ＰＥＧ  ８０００、５ｍＭ  ＡＴＰ、５ｍＭ  ＤＴＴ］、１μｌリガーゼ；１５℃で１時間インキュベートした）。１０μｌの連結反応物を、ＸＬ１  ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に形質転換し（１０μｌ反応混合物、１０μｌの５×ＫＣＭ［０．５Ｍ  ＫＣｌ、０．１５Ｍ  ＣａＣｌ２、０．２５Ｍ  ＭｇＣｌ２］、３０μｌの水、５０μｌのＰＥＧ−ＤＭＳＯコンピテント細胞；４℃で２０分間、２５℃で１０分間インキュベートした）、そして１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ／寒天プレートにプレーティングした。３７℃で一晩のインキュベーション後、シングルコロニーを３ｍｌの２ＹＴ培地中で１８時間増殖させた。次いで、細胞を単離し、そして２本鎖ＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮＡミニプレップキットを用いてこの細胞から抽出した。
【００８１】
（ＩＬ−４システイン変異の作製）
変異を、以前［Ｋｕｎｌｃｅｌ，Ｔ．Ａ．ら，Ｍｅｔｌｚｏｄｓ＿Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−８２（１９８７）］に記載される通りに用いて作製した。用いたＤＮＡオリゴヌクレオチドを以下に示す。これらのＤＮＡオリゴヌクレオチドを、プラスミド由来のセンス鎖ＤＮＡとにハイブリダズするように設計した。配列を、配列番号１７のプライマーおよび配列番号１８のプライマーを用いて確認した。
【００８２】
【化７】
2005503380.tif 000014
（ＩＬ−４変異体の発現）
ＢＬ２１  ＤＥ３細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、記載されるシステイン変異を含むＲＳＥＴ．ＩＬ４プラスミドで形質転換し、そして１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ寒天にプレーティングした。一晩の増殖後、新鮮な個々のコロニーを用いて、３０ｍｌの２ＹＴ（５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）培地を有する、３７℃で一晩振盪したフラスコの培養物に接種した。午前中に、この一晩培養物で１．５Ｌの２ＹＴ／アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を接種し、これを４．０Ｌの底のへこんだ振盪フラスコ中で３７℃で、２００ｒｐｍにてさらに培養した。λ＝６００での培養物の光学密度が０．８に達したときに、これを１ｍＭ  ＩＰＴＧの添加によって誘導して、ＩＬ−４タンパク質を産生させた。さらに４時間のインキュベーション後、この培養物を収集し、細胞を７Ｋｒｐｍで１０分間（Ｋ−９  Ｋｏｍｐｏｓｉｔｅ  Ｒｏｔｏｒ）の遠心分離によってペレット化し、そして−２０℃で凍結させた。
【００８３】
次いで、細胞ペレットを融解し、そして１００ｍｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ８），５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡ中に再懸濁した。この溶液を冷却されたままにし、そしてマイクロフルイダイザー（モデル１１０Ｓ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｃｏｒｐ，Ｎｅｗｔｏｎ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）に２回通し、そして７Ｋｒｐｍで１５分間遠心分離した）。次いで、ＩＬ−４封入体を含むペレットを、５ＭグアニジンＨＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ還元型グルタチオン、および０．２５ｍＭ酸化型グルタチオンの５０ｍｌ溶液中に再懸濁し、そして室温で１時間、穏やかに混合しながらインキュベートした。次いで、可溶化したタンパク質溶液を、７．５Ｋｒｐｍで１５分間遠心分離し、そして上清を０．４５μｍのフィルターで濾過して不溶性破片を除去した。
【００８４】
ＩＬ−４を、濾過した溶液を９容量（４５０ｍｌ）の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ還元型グルタチオンおよび０．２５ｍＭ酸化型グルタチオンに対して３０分間かけてゆっくりと添加することによって再折り畳みさせた。得られた溶液を、ゆっくりと撹拌しながら、３時間、室温でさらにインキュベートし、次いで３０００ｍｗｃｏ透析バッグ中に配置し、そして２０Ｌの０．５×ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）に対して３回交換した。
【００８５】
次いで、再折り畳みした変異体タンパク質を、Ｈｉ−Ｓ  Ｃｏｌｕｍｎ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて精製した。遠心分離および濾過によってタンパク質溶液を透明にした後、これを、このカラムに５ｍｌ／分の流速でローディングした。次いで、このカラムを緩衝液Ａ（０．５×ＰＢＳ）で１５〜２０分間で洗浄し、そして１．５分の７．５ｍｌ画分を、緩衝液Ａと緩衝液Ｂ（ＰＢＳ、１Ｍ  ＮａＣｌ）との間での０〜１００％の勾配にわたって収集した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび２８０ｎｍでの光学密度によって決定された、ＩＬ−４タンパク質を含む画分をプールし、５Ｋｍｗｃｏフィルターで濃縮し、そしてそれらの緩衝液をＰＢＳに交換した。次いで、この溶液を０．２μＭのフィルターで濾過し、エタノールドライアイス浴中で凍結させ、そして−８０℃で保存した。
【００８６】
（実施例４）
（ヒト腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）のクローニングおよび変異誘発）
腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）（登録番号ＳＷＳ  Ｐ０１３７５）は、主に活性化マクロファージによって産生されるサイトカインであり、これは、敗血症性ショック、炎症および悪液質を含む免疫応答において重要な役割を果たす。このタンパク質は、２つのレセプター（ＴＮＦ  Ｒ１およびＴＮＦ  Ｒ２）と相互作用し得る。これらの２つのレセプターは、それらの細胞内ドメインにおいて類似性を共有せず、このことは、これらが、異なるシグナル伝達経路に関与することを示唆する。ＴＮＦ−αの構造は利用可能である［１ＴＮＦ，Ｅｃｋ，Ｍ．Ｊ．ら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６４：１７５９５−１７６０５（１９８９）］；ＴＮＦ−αは、伸長したβシートであり、これは、三量体を形成する。この三量体のサブユニット間残基のうちのいくつかの変異は、これらがこのレセプターに対する結合部位の一部分を形成することを示す。しかし、レセプターに対して結合したＴＮＦの構造は今日まで存在しない。
【００８７】
（ヒトＴＮＦ−αのクローニング）
ヒト腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）をコードするＤＮＡ配列を、以下に列挙したＰＣＲプライマーを用いてプラスミドｐＵＣ−ＲＩ−４１ａｒｇｅ（ＡＴＣＣ番号６５９４７）からＰＣＲによって単離した。これらのプライマーは、このタンパク質の細胞外ドメインに対応し、そしてｐＲＳＥＴベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へのサブクローニングのための制限エンドヌクレアーゼ部位Ｎｄｅ  ＩおよびＸｈｏＩを含むように設計された。
【００８８】
【化８】
2005503380.tif 000015
このＰＣＲ反応物を、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製カラム（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。ＴＮＦ配列を含むＰＣＲ産物を、制限エンドヌクレアーゼで切断した（４１μｌのＰＣＲ産物、各々２μｌのエンドヌクレアーゼ、５μｌの適切な１０×緩衝液；３７℃で９０分間インキュベートした）。ｐＲＳＥＴベクターを、制限エンドヌクレアーゼで切断した（６μｇのＤＮＡ、各々４μｌのエンドヌクレアーゼ、１０μｌの適切な１０×緩衝液、１００μｌにするような水；３７℃で２時間インキュベートした；２μｌのＣＩＰを添加し、そして３７℃で４５分間インキュベートした）。ヌクレアーゼ切断の産物をアガロースゲル（１％アガロース、ＴＢＥ緩衝液）から単離し、そしてＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて一緒に連結した（２００ｎｇ  ｐＲＳＥＴベクター、１５０ｎｇのＴＮＦ  ＰＣＲ産物、４μｌの５×リガーゼ緩衝液［３００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０％  ＰＥＧ  ８０００、５ｍＭ  ＡＴＰ、５ｍＭ  ＤＴＴ］、１μｌリガーゼ；１５℃で１時間インキュベートした）。１０μｌの連結反応物を、ＸＬ１  ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に形質転換した（１０μｌの反応混合物、１０μｌの５×ＫＣＭ［０．５Ｍ  ＫＣ１、０．１５Ｍ  ＣａＣｌ２、０．２５Ｍ  ＭｇＣｌ２］、３０μｌの水、５０μｌのＰＥＧ−ＤＭＳＯコンピテント細胞；４℃で２０分間、２５℃で１０分間インキュベートした）、そして１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ／寒天プレートにプレーティングした。３７℃で一晩のインキュベーション後、シングルコロニーを、３ｍｌの２ＹＴ培地中で１８時間増殖させた。次いで、細胞を単離し、そして２本鎖ＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮＡミニプレップキットを用いてこの細胞から抽出した。ＴＮＦ遺伝子の配列決定を、配列番号１７を有するプライマーおよび配列番号１８を有するプライマーを用いて達成した。
【００８９】
（ＴＮＦ−αシステイン変異の作製）
変異を、以前［Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．ら，Ｍｅｔｈｏｄｓ＿Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−８２（１９８７）］に記載された通りに用いて作製した。用いたＤＮＡオリゴヌクレオチドを以下に示す。これらのＤＮＡオリゴヌクレオチドを、プラスミド由来のセンス鎖ＤＮＡとハイブリダイズするように設計した。これらの変異体の配列を、配列番号１７を有するプライマーおよび配列番号１８を有するプライマーを用いて確認した。
【００９０】
【化９】
2005503380.tif 000016
（ＴＮＦ−α変異体タンパク質の発現）
ＢＬ２１  ＤＥ３細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、記載されたシステイン変異を含むＲＳＥＴ  ＴＮＦ−αプラスミドで形質転換し、そして１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ寒天にプレーティングした。一晩の増殖後、新鮮な個々のコロニーを用いて、３０ｍｌの２ＹＴ（５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）培地を有する、３７℃で一晩振盪したフラスコの培養物に接種した。午前中に、この一晩培養物を１．５Ｌの２ＹＴ／アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）に接種し、これを、４．０Ｌの底がへこんだ振盪フラスコにおいて３７℃で２００ｒｐｍでさらに培養した。この培養物のλ＝５５０での光学密度が０．８に達したとき、これを１ｍＭ  ＩＰＴＧの添加によって誘導してＴＮＦ−αタンパク質を産生させた。さらに４時間のインキュベーション後、これらの培養物を収集し、細胞を７Ｋｒｐｍで１０分間（Ｋ−９  Ｋｏｍｐｏｓｉｔｅ  Ｒｏｔｏｒ）の遠心分離によってペレット化し、そして−２０℃で凍結させた。
【００９１】
次いで、細胞ペレットを融解し、そして１００ｍｌの２５ｍＭ  酢酸アンモニウム（ｐＨ６）、１ｍＭ  ＤＴＴおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡ中に再懸濁した。この溶液を冷却したままにし、そしてマイクロフルイダイザー（モデル１１０Ｓ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｃｏｒｐ，Ｎｅｗｔｏｎ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）に２回通し、９Ｋｒｐｍで１５分間遠心分離して、不溶性物質を除去し、そしてさらに０．４５μｍでの濾過によって透明にした。次いで、この溶液を、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｆｆ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）カラムに５ｍｌ／分の流速でローディングした。次いで、この流速を、以下の工程については７．５ｍＬ／分まで増大させた。次いで、このカラムを、ＯＤ２８０が０に近づくまで（１５〜２０分間）、緩衝液Ａ（０．２Ｍ  酢酸アンモニウム（ｐＨ６）、１ｍＭ  ＤＴＴ）で洗浄し、そして画分を、緩衝液Ａと緩衝液Ｂ（１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ６）、１ｍＭ  ＤＴＴ）との間での６０分間での０〜１００％勾配にわたって収集した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび２８０ｎｍでの光学密度によって決定した、ＴＮＦ−αタンパク質を含む画分をプールし、そして３０００ｍｗｃｏ透析バッグ中に入れ、そして４Ｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、および１ｍＭ  ＤＴＴに対して４℃で一晩透析した。次いで、透析したタンパク質溶液を、１３．５Ｋｒｐｍで１０分間の遠心分離および０．２μｍのフィルターでの濾過によって透明にした。
【００９２】
次いで、変異体タンパク質を、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に５ｍｌ／分の流速でローディングした。この流速を、以下の工程については、７．５ｍｌ／分まで増大させた。次に、このカラムを、ＯＤ２８０が０に近づくまで（１５〜２０分間）緩衝液Ａ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ）で洗浄し、そして画分を、緩衝液Ａと緩衝液Ｂ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ）との間のでの４０分間での０〜１００％勾配にわたって収集した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび２８０ｎｍでの光学密度によって決定した、ＴＮＦ−αタンパク質を含む画分をプールし、そして５Ｋｍｗｃｏフィルターで濃縮し、そしてそれらの緩衝液をＰＢＳに対して交換した。次いで、この溶液を０．２μｍのフィルターで濾過し、エタノールドライアイス浴中で凍結し、そして−８０℃で保存した。
【００９３】
（実施例５）
（ヒトインターロイキン−１レセプターＩ型（ＩＬ−１ＲＩ）のクローニングおよび変異誘発）
ＩＬ−１αまたはＩＬ−１βに対するＩＬ−１レセプター（登録番号ＳＷＳ  Ｐ１４７７８）の結合は、免疫応答および炎症応答の別の重要なメディエーターである。この相互作用は、少なくとも３つの機構によって制御される。第１に、タンパク質ＩＬ−Ｒ２は、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βに結合するが、シグナル伝達しない。第２に、タンパク質分解によってプロセシングされたＩＬ−１Ｒ１およびＩＬ−１Ｒ２は可溶性であり、そしてＩＬ−１に対して循環中で結合する。最後に、ＩＬ−１Ｒ１に結合し、それによってＩＬ−１αおよびＩＬ−１βのＩＬ−１Ｒ１結合をブロックすることによって機能する、ＩＬ−１ｒａと呼ばれる天然ＩＬ−１Ｒアンタゴニストが存在する。経口利用可能な低分子によるこれらの相互作用の阻害は、疾患（例えば、慢性関節リウマチ、自己免疫疾患、および虚血）の処置において望ましい。ＩＬ−１Ｒの２つの構造が解かれている［アンタゴニストペプチド１Ｇ０Ｙを伴って、Ｖｉｇｅｒｓ，Ｇ．Ｐ．Ａ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３６９２７−３６９３３（２０００）；レセプターアンタゴニスト１ＩＲＡを伴って、Ｓｃｈｒｅｕｄｅｒ，Ｈ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３８６：１９４−２００（１９９７）］。
【００９４】
（ヒトＩＬ−１レセプターＩ型のクローニング）
このＩＬ−１レセプターは、以下の３つの領域を有する：Ｎ末端細胞外領域、膜貫通領域、およびＣ末端細胞質領域。この細胞外領域自体は、３つの免疫グロビン様Ｃ２型ドメインを含む。ここで用いた構築物は、この細胞外領域のうちの２つのＮ末端ドメインを含む。野生型ＩＬ１Ｒ残基および変異体ＩＬ１Ｒ残基の番号付けは、成熟タンパク質の第一アミノ酸残基（Ｌ）が、シグナル配列のプロセシング後、残基番号１であるという慣例に従う（Ｓｉｍｓ，Ｊ．Ｅ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：８９４６−８９５０（１９８９））。この２ドメインタンパク質の配列を、配列番号６２として以下に示す。
【００９５】
【化１０】
2005503380.tif 000017
手短に述べると、システイン変異体を、ｈｉｓタグを有する２ドメインレセプターおよび２ドメインレセプターに関して作製した。さらに、これらの構築物は、グリコシル化部位に変異を保有し、そして１つの構築物は、２ドメイン領域のＣ末端残基での欠失に加えて、グリコシル化部位に変異を保有した。これらの構築物のアセンブリを以下に記載する。
【００９６】
ヒトインターロイキン−１レセプター（ＩＬ１Ｒ）をコードするＤＮＡ配列を、このタンパク質のシグナル配列および細胞外ドメインの末端に対応するＰＣＲプライマー（ＩＬ１ＲｓｉｇｉｎｔＦｏｒ  ５’；ＩＬ１ＲｉｎｔＲｅｖ  ５’）を用いて、ＨｅｐＧ２  ｃＤＮＡライブラリー（ＡＴＣＣ）からＰＣＲによって単離した。
【００９７】
【化１１】
2005503380.tif 000018
適切なサイズのバンドをアガロースゲルから単離し、そしてオリゴ（ＩＬ１ＲｓｉｇＦｏｒ；ＩＬ１Ｒ３１９Ｒｅｖ）を用いる２回目のＰＣＲについてのテンプレートとして用いた。オリゴ（ＩＬ１ＲｓｉｇＦｏｒ；ＩＬ１Ｒ３１９Ｒｅｖ）を、ｐＦＢＨＴベクターへのサブクローニングのための制限エンドヌクレアーゼ部位ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩを含むように設計した。
【００９８】
【化１２】
2005503380.tif 000019
このｐＦＢＨＴベクターは、ＴＥＶプロテアーゼ、続いて（Ｈｉｓ）６タグおよび停止シグナルについての配列をＸｈｏＩ部位およびＨｉｎＤＩＩＩ部位にクローニングすることによって、元のｐＦａｓｔＢａｃｌ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）から改変されている。ＩＬ１Ｒ配列を含むＰＣＲ産物を、制限エンドヌクレアーゼで切断した（４１μｌのＰＣＲ産物、各々２μｌのエンドヌクレアーゼ、５μｌの適切な１０×緩衝液；３７℃で９０分間インキュベートした）。このｐＦＢＨＴベクターを、制限エンドヌクレアーゼで切断した（６μｇのＤＮＡ、各々４μｌのエンドヌクレアーゼ、１０μｌの適切な１０×緩衝液、１００μｌにするような水；３７℃で２時間インキュベートした；２μｌのＣＩＰを添加し、そして３７℃で４５分間インキュベートした）。ヌクレアーゼ切断の産物を、アガロースゲル（１％アガロース、ＴＢＥ緩衝液）から単離し、そしてＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて一緒に連結した（２００ｎｇのｐＦＢＨＴベクター、１５０ｎｇのＩＬ１Ｒ  ＰＣＲ産物、４μｌの５×リガーゼ緩衝液［３００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０％  ＰＥＧ  ８０００、５ｍＭ  ＡＴＰ、５ｍＭ  ＤＴＴ］、１μｌリガーゼ；１５℃で１時間インキュベートした）。１０μｌの連結反応物を、ＸＬ１  ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に形質転換し（１０μｌの反応混合物、１０μｌの５×ＫＣＭ［０．５Ｍ  ＫＣｌ、０．１５Ｍ  ＣａＣｌ２、０．２５Ｍ  ＭｇＣｌ２］、３０μｌの水、５０μｌのＰＥＧ−ＤＭＳＯコンピテント細胞；４℃で２０分間、２５℃で１０分間インキュベートした）、そして１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ／寒天プレートにプレーティングした。３７℃で一晩のインキュベーション後、シングルコロニーを、３ｍｌの２ＹＴ培地中で１８時間増殖させた。次いで、細胞を単離し、そして２本鎖ＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮＡミニプレップキットを用いてこの細胞から抽出した。
【００９９】
２ドメイン版のＩＬ１Ｒを、３ドメインＩＬ１Ｒ−ＦＢＨＴクローンをテンプレートとして用いたＰＣＲによって作製した。ＰＣＲを、以下の２つの逆方向プライマーのうちの１つに加えて、シグナル配列に対応するプライマーＩＬ１ＲｓｉｇＦｏｒ（配列番号６５）を用いて実施した。これらの逆方向プライマーは、ＩＬ１Ｒ２Ｄｒｅｖｓｔｏｐ−Ｘｈｏ（これは、このタンパク質の第２の細胞外ドメインの末端に対応し、停止シグナルを有する）およびＩＬ１Ｒ２Ｄｒｅｖ−Ｘｈｏ（これは、このタンパク質の第２の細胞外ドメインの末端に対応しており、ＴＥＶプロテアーゼ部位およびＨｉｓタグを有する融合体を作製するために、停止シグナルを有さない）である。
【０１００】
【化１３】
2005503380.tif 000020
これらのＰＣＲプライマーは、制限部位（５’末端にＥｃｏＲＩ、そして３’末端にＸｈｏＩ）を含む。これらのＰＣＲプライマーを、２ドメイン版をｐＦＢＨＴベクター中に連結するために用いた。ＩＬ１Ｒ２Ｄ配列を含むＰＣＲ産物を、制限エンドヌクレアーゼで切断した（４１μｌのＰＣＲ産物、各々２μｌのエンドヌクレアーゼ、５μｌの適切な１０×緩衝液；３７℃で９０分間インキュベートした）。ヌクレアーゼ切断の産物をアガロースゲル（１％アガロース、ＴＢＥ緩衝液）から単離し、そしてＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて一緒に連結した（２００ｎｇのｐＦＢＨＴベクター、１５０ｎｇのＩＬ１Ｒ２Ｄ  ＰＣＲ産物、４μｌの５×リガーゼ緩衝液［３００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０％  ＰＥＧ  ８０００、５ｍＭ  ＡＴＰ、５ｍＭ  ＤＴＴ］、１μｌリガーゼ；１５℃で１時間インキュベートした）。１０μｌの連結反応物を、ＸＬ１  ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に形質転換した（１０μｌの反応混合物、１０μｌの５×ＫＣＭ［０．５Ｍ  ＫＣｌ、０．１５Ｍ  ＣａＣｌ２、０．２５Ｍ  ＭｇＣｌ２］、３０μｌの水、５０μｌのＰＥＧ−ＤＭＳＯコンピテント細胞；４℃で２０分間、２５℃で１０分間インキュベートした）、そして１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ／寒天プレートにプレーティングした。３７℃で一晩のインキュベーション後、シングルコロニーを、３ｍｌの２ＹＴ培地中で１８時間増殖させた。次いで、細胞を単離し、そして２本鎖ＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮＡミニプレップキットを用いてこの細胞から抽出した。
【０１０１】
さらに、ＩＬ１Ｒ２Ｄ、Ｎ８３およびＮ１７６内のこれらの２つのグリコシル化部位を、より均質なタンパク質を作製するために、各々、個々にヒスチジンに変異させた。これらの単一変異体の各々を、ｈｉｓタグを有さない２ドメインタンパク質（ｓＩＬ１Ｒｄ２−ＦＢ）およびｈｉｓタグを有する２ドメインタンパク質（ｓＩＬ１Ｒｄ２−ＦＢＨＴ）に関して作製した。変異を、これらの２つのフラグメントを作製する、２セットのプライマーを用いたＰＣＲ、続いて、以下の通り、外側プライマーＩＬ１ＲｓｉｇＦｏｒ（配列番号６５）と、外側プライマーＩＬ１Ｒ２Ｄｒｅｖｓｔｏｐ−Ｘｈｏ（配列番号６７）または外側プライマーＩＬ１Ｒ２Ｄｒｅｖ−Ｘｈｏ（配列番号６８）とを用いてこれらのフラグメントを一緒に合わせることによって達成した。２ドメイングリコシル化変異体およびそれらの構築の簡単な説明は以下の通りである。
【０１０２】
ｈｉｓタグを有さないＮ８３Ｈ変異体についての構築物を、ｓＩＬ１Ｒ２Ｄ−Ｎ８３Ｈ−ＦＢという。そしてこの構築物を、Ｎ８３ＨＦ（配列番号７０）およびＩＬ１Ｒ２Ｄｒｅｖｓｔｏｐ−Ｘｈｏ（配列番号６７）とともに、ＩＬ１ＲｓｉｇＦｏｒ（配列番号６５）およびＮ８３ＨＲ（配列番号６９）を用いて作製した。
【０１０３】
【化１４】
2005503380.tif 000021
ｈｉｓタグを有するＮ８３Ｈ変異体についての構築物を、ｓＩＬ１Ｒ２Ｄ−Ｎ８３Ｈ−ＦＢＨＴという。そしてこの構築物を、Ｎ８３ＨＦ（配列番号７０）およびＩＬ１Ｒ２Ｄｒｅｖ−Ｘｈｏ（配列番号６８）とともにＩＬ１ＲｓｉｇＦｏｒ（配列番号６５）およびＮ８３ＨＲ（配列番号６９）を用いて作製した。
【０１０４】
ｈｉｓタグを有さないＮ１７６Ｈ変異体についての構築物を、ｓＩＬ１Ｒ２Ｄ−Ｎ１７６Ｈ−ＦＢという。そして、この構築物を、ＩＬ１ＲｓｉｇＦｏｒ（配列番号６５）、Ｎ１７６ＨＲ（配列番号７１）、Ｎ１７６ＨＦ（配列番号７２）、およびＩＬ１Ｒ２Ｄｒｅｖｓｔｏｐ−Ｘｈｏ（配列番号６７）を用いて作製した。
【０１０５】
【化１５】
2005503380.tif 000022
ｈｉｓタグを有するＮ１７６Ｈ変異体についての構築物を、ｓＩＬ１Ｒ２Ｄ−Ｎ１７６Ｈ−ＦＢＨＴという。そして、この構築物を、Ｎ１７６ＨＦ（配列番号７２）、およびＩＬ１Ｒ２Ｄｒｅｖ−Ｘｈｏ（配列番号６８）とともにＩＬ１ＲｓｉｇＦｏｒ（配列番号６５）、およびＮ１７６ＨＲ（配列番号７１）を用いて作製した。
【０１０６】
これらのＰＣＲ産物をアガロースゲルから単離し、そしてＰＣＲを用いて、これらの２つのフラグメントを、ＩＬ１ＲｓｉｇＦｏｒ（配列番号６５）およびＩＬ１Ｒ２Ｄｒｅｖｓｔｏｐ−Ｘｈｏ（配列番号６７）またはＩＬ１Ｒ２Ｄｒｅｖ−Ｘｈｏプライマー（配列番号６８）を用いて一緒に合わせた。グリコシル化部位で変異したＩＬ１Ｒ２Ｄ配列を含むＰＣＲ産物を、制限エンドヌクレアーゼで切断した（４１μｌのＰＣＲ産物、各々２μｌのエンドヌクレアーゼ、５μｌの適切な１０×緩衝液；３７℃で９０分間インキュベートした）。ヌクレアーゼ切断の産物を、アガロースゲル（１％アガロース、ＴＢＥ緩衝液）から単離し、そしてＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて一緒に連結した（２００ｎｇのｐＦＢＨＴベクター、１５０ｎｇのＩＬ１Ｒ２Ｄ  ＰＣＲ産物、４μｌの５×リガーゼ緩衝液［３００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０％  ＰＥＧ  ８０００、５ｍＭ  ＡＴＰ、５ｍＭ  ＤＴＴ］、１μｌリガーゼ；１５℃で１時間インキュベートした）。連結反応物のうちの１０μｌを、ＸＬ１  ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に形質転換し（１０μｌの反応混合物、１０μｌの５×ＫＣＭ［０．５Ｍ  ＫＣｌ、０．１５Ｍ  ＣａＣｌ２、０．２５Ｍ  ＭｇＣｌ２］、３０μｌの水、５０μｌのＰＥＧ−ＤＭＳＯコンピテント細胞；４℃で２０分間、２５℃で１０分間インキュベートした）、そして１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ／寒天プレートにプレーティングした。３７℃で一晩のインキュベーション後、シングルコロニーを、３ｍｌの２ＹＴ培地中で１８時間増殖させた。次いで、細胞を単離し、そして２本鎖ＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮＡミニプレップキットを用いてこの細胞から抽出した。その後のプラスミドを、ｓＩＬ１Ｒ２Ｄ−Ｎ８３Ｈ−ＦＢまたはｓＩＬ１Ｒ２Ｄ−Ｎ８３Ｈ−ＦＢＨＴと、およびｓＩＬ１Ｒ２Ｄ−Ｎ１７６Ｈ−ＦＢと、またはｓＩＬ１Ｒ２Ｄ−Ｎ１７６Ｈ−ＦＢＨＴという。
【０１０７】
最後に、さらなる構築物を、ｓＩＬ１Ｒ２Ｄ−Ｎ８３Ｈ−ＦＢ構築物を用いて作製した。このさらなる構築物は、ｈｉｓ  ｔａｇを有さず、２つの変異（Ｎ８３Ｈグリコシル化変異およびＣ末端残基（Ｋ２０５）の欠失）を有する２ドメインＩＬ１Ｒレセプターを含む。この構築物をｓＩＬ１Ｒ２Ｄ２Ｍ−ＦＢと命名する。そしてこの構築物を、Ｋ２０５ｄｅｌオリゴヌクレオチドを用いて作製した。
【０１０８】
【化１６】
2005503380.tif 000023
（ＩＬ−１ＲＩシステイン変異の作製）
ＩＬ１Ｒ２Ｄの部位特異的変異体を、１本鎖ＤＮＡ法［Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：４８８−４９２（１９８５）の改変版］によって調製した。オリゴヌクレオチドを、所望の変異および１５〜２０塩基の隣接配列を含むように設計した。
【０１０９】
１本鎖形態のＩＬ１Ｒ２Ｄ（ｓＩＬ１Ｒ２Ｄ−ＦＢＨＴ、ｓＩＬ１Ｒ２Ｄ−Ｎ１７６Ｈ−ＦＢ／ＦＢＨＴ、ｓＩＬ１Ｒ２ＤＮ８３Ｈ−ＦＢ／ＦＢＨＴ、ｓＩＬ１Ｒ２Ｄ２Ｍ−ＦＢ）プラスミドを、ＣＪ２３６細胞株への２本鎖プラスミドの形質転換によって調製した（１μｌのＩＬ１Ｒ−ＦＢ２本鎖ＤＮＡ、２μｌの２×ＫＣＭ塩、７μｌの水、１０μｌのＰＥＧ−ＤＭＳＯコンピテントＣＪ２３６細胞；４℃で２０分間および２５℃で１０分間インキュベートした；１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ／寒天にプレーティングし、そして３７℃で一晩インキュベートした）。次いで、ＣＪ２３６細胞のシングルコロニーを、５０ｍｌの２ＹＴ培地中で対数中期になるまで増殖させた；次いで、１０μｌのＶＣＳヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を添加し、そして混合物を３７℃で一晩インキュベートした。１本鎖ＤＮＡを、ファージの沈降によって上清から単離した（１／５容量の２０％  ＰＥＧ  ８０００／２．５Ｍ  ＮａＣｌ；１２Ｋで１５分間遠心分離する）。次いで、１本鎖ＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  １本鎖ＤＮＡキットを用いてファージから単離した。
【０１１０】
部位特異的変異誘発を、以下の通りに達成した。オリゴヌクレオチドを、１０ＯＤの濃度になるように溶解し、そして５’末端をリン酸化した（２μｌのオリゴヌクレオチド、２μｌの１０ｍＭ  ＡＴＰ、２μｌの１０×Ｔｒｉｓ−塩化マグネシウム緩衝液、１μｌの１００ｍＭ  ＤＴＴ、１０μｌの水、１μｌのＴ４  ＰＮＫ；３７℃で４５分間インキュベートする）。次いで、リン酸化したオリゴヌクレオチドを、１本鎖ＤＮＡテンプレートに対してアニーリングした（２μｌの１本鎖プラスミド、１μｌのオリゴヌクレオチド、１μｌの１０×ＴＭ緩衝液、６μｌの水；９４℃で２分間、５０℃で５分間加熱し、室温になるまで冷却する）。次いで、２本鎖ＤＮＡを、アニーリングしたオリゴヌクレオチド／テンプレートから調製した（２μｌの１０×ＴＭ緩衝液、２μｌの２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、１μｌの１００ｍＭ  ＤＴＴ、１．５μｌの１０ｍＭ  ＡＴＰ、４μｌの水、０．４μｌのＴ７  ＤＮＡポリメラーゼ、０．６μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼを添加する；室温で２時間インキュベートする）。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＸＬ１  ｂｌｕｅ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、この２本鎖ＤＮＡで形質転換し（１μｌの２本鎖ＤＮＡ、１０μｌの５×ＫＣＭ、４０μｌの水、５０μｌのＤＭＳＯコンピテント細胞；４℃で２０分間、室温で１０分間インキュベートする）、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ／寒天にプレーティングし、そして３７℃で一晩インキュベートした。各プレート由来の約４個のコロニーを使用して、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む５ｍｌの２ＹＴに接種した；これらの培養物を、３７℃で１８〜２４時間増殖させた。次いで、プラスミドを、Ｑｉａｇｅｎミニプレップキットを用いてこの培養物から単離した。これらのプラスミドを配列決定して、どのＩＬ１Ｒ２Ｄ−ＦＢクローンが所望の変異を含むかを決定した。
【０１１１】
ＩＬ１Ｒ２Ｄ遺伝子の配列決定を、以下の通りに達成した。プラスミドＤＮＡの濃度を、２８０ｎｍでの吸光度によって定量した。８００ｎｇのプラスミドを、配列決定試薬と混合した（８μｌのＤＮＡ、３μｌの水、１μｌの配列決定プライマー、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ［Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ］を含む、８μｌの配列決定混合物）。用いた配列決定プライマーは、以下に示すＦＢ  ＦｏｒｗａｒｄおよびＦＢ  Ｒｅｖｅｒｓｅであった。
【０１１２】
【化１７】
2005503380.tif 000024
次いで、この混合物について、ＰＣＲサイクルを実行し（９６℃、１０秒間；５０℃、５秒間；６０℃、４分間；２５サイクル）、そしてＤＮＡ反応産物を沈澱させた（２０μｌの混合物、８０μｌの７５％イソプロパノール；室温で２０分間インキュベートし、１４Ｋｒｐｍで２０分間ペレット化した；２５０μｌの７０％エタノールで洗浄する；９４℃で１分間加熱する）。次いで、沈澱した産物をＴｅｍｐｌａｔｅ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＴＳＢ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中に懸濁し、そして配列を読取り、そしてＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３１０キャピラリーゲルシークエンサーによって分析した。概して、４つのうちの３つのプラスミドが、所望の変異を含んでいた。構築物およびそれらの変異体のリストを以下に示すが、任意のシステイン変異体が、所定の任意の状況において作製され得る。
【０１１３】
【化１８】
2005503380.tif 000025
（ＩＬ−１  Ｒ変異体タンパク質の発現）
全てのＩＬ１Ｒ−ＦＢ／ＦＢＨＴプラスミドを、このプラスミドをＤＨ１０ｂａｃ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）コンピテント細胞中に以下の通りに形質転換することによって、バキュロウイルスシャトルベクター（ｂａｃｍｉｄ）中に部位特異的に転移させた：５ｎｇ／μｌのＤＮＡを１μｌ、１０μｌの５×ＫＣＭ［０．５Ｍ  ＫＣｌ、０．１５Ｍ  ＣａＣｌ２、０．２５Ｍ  ＭｇＣｌ２］、３０μｌの水を、５０μｌのＰＥＧ−ＤＭＳＯコンピテント細胞と混合し、４℃で２０分間、２５℃で１０分間インキュベートし、９００μｌのＳＯＣを添加し、撹拌しながら３７℃で４時間インキュベートし、次いで５０μｇ／ｍｌカナマイシン、７μｇ／ｍｌゲンタマイシン、１０μｇ／ｍｌテトラサイクリン、１００μｇ／ｍｌのＢｌｕｏ−ｇａｌ、１０μｇ／ｍｌのＩＰＴＧを含むＬＢ／寒天プレートにプレーティングした。３７℃で２４時間のインキュベーション後、大きな白色コロニーを拾い、そして３ｍｌの２ＹＴ培地中で一晩増殖させた。次いで、細胞を単離し、そして２本鎖ＤＮＡを、この細胞から以下の通りに抽出した：ペレットを、２５０μｌの溶液１［１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００μｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ  Ａ］中に再懸濁した。２５０μｌの溶液２［０．２ＮのＮａＯＨ、１％  ＳＤＳ］を添加し、穏やかに混合し、そして室温で５分間インキュベートした。２５０μｌの３Ｍ酢酸カリウムを添加して混合し、そしてこのチューブを氷上に１０分間置いた。この混合物を１４，０００×ｇで１０分間遠心分離し、そして上清を、０．８  ｍｌイソプロパノールを含むチューブに移した。このチューブの内容物を混合し、そして氷上に１０分間置いた；１４，０００×ｇで１５分間遠心分離した。このペレットを７０％エタノールで洗浄し、そして風乾し、そしてＤＮＡを４０μｌのＴＥ中に再懸濁した。
【０１１４】
ｂａｃｍｉｄ  ＤＮＡを用いて、Ｓｆ９細胞をトランスフェクトした。Ｓｆ９細胞を、０．５×濃度の抗生物質−抗真菌剤を含む２ｍｌのＳｆ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地中、３５ｍＭウェルあたり９×１０５細胞播種し、そして２７℃で１時間付着させた。この間に、５μｌのｂａｃｍｉｄ  ＤＮＡを、抗生物質を含まない１００μｌの培地中に希釈し、６μｌのＣｅｌｌＦＥＣＴＩＮ試薬を、抗生物質を含まない１００μｌの培地中に希釈し、次いでこれらの２つの溶液を穏やかに混合して、室温で３０分間インキュベートさせた。これらの細胞を、抗生物質を含まない培地で１回洗浄し、この培地を吸引し、次いで０．８ｍｌの培地を脂質−ＤＮＡ複合体に添加し、そしてこれらの細胞上に重層した。これらの細胞を、２７℃で５時間インキュベートし、トランスフェクション培地を除去し、そして抗生物質を有する２ｍｌの培地を添加した。これらの細胞を、２７℃で７２時間インキュベートし、そしてウイルスを細胞培養培地から収集した。
【０１１５】
このウイルスを、０．５ｍｌのウイルスを、２×１０６細胞／ｍｌの５０ｍｌのＳｆ９細胞培養物に添加し、そして２７℃で７２時間インキュベートすることによって、増幅した。このウイルスを、細胞培養培地から収集し、そしてこのストックを用いて、種々のＩＬ１Ｒ構築物をＨｉｇｈ−Ｆｉｖｅ細胞中で発現させた。１×１０６細胞／ｍｌでの１ＬのＨｉｇｈ−Ｆｉｖｅ細胞培養物を、このウイルスに約２のＭＯＩで感染させ、そして７２時間インキュベートした。細胞を遠心分離によってペレット化し、そして上清をＩＬ１Ｒアンタゴニストカラムに１ｍｌ／分でローディングし、ＰＢＳで洗浄し、続いて緩衝液Ａ（０．２Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．０）、０．２Ｍ  ＮａＣｌ）で洗浄した。このタンパク質を、１０分間での、０〜１００％の緩衝液Ｂ（０．２Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ２．５）、０．２Ｍ  ＮａＣｌ）の勾配を、続いて１００％緩衝液Ｂを１ｍｌ／分で１５分間流すことによって、このカラムから溶出させて、３００μｌの未緩衝化Ｔｒｉｓを含むチューブ中に２ｍｌの画分を収集した。適切な画分をプールし、濃縮し、そして５Ｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌに４℃で透析し、そして０．２μｍフィルターを通して濾過した。
【０１１６】
（実施例６）
（ヒトカスパーゼ−３（ＣＡＳＰ−３）のクローニングおよび変異誘発）
カスパーゼ−３（登録番号ＳＷＳ  Ｐ４２５７４）は、細胞のアポトーシスに関与する一連のカスパーゼのうちの１つである。これは、不活性なプロ形態として存在し、そしてカスパーゼ８、カスパーゼ９またはカスパーゼ１０によってプロセシングされて、スモールサブユニットおよびラージサブユニットを形成し得、これらは、ヘテロ二量体を形成して活性形態を構成する。このカスケードにおいてカスパーゼ−３についての基質であるカスパーゼは、カスパーゼ−６、カスパーゼ−７およびカスパーゼ−９である。カスパーゼ−３は、アミロイド−β前駆体タンパク質４Ａの切断について重要なものであることが示されている。この切断は、アルツハイマー病におけるＡβペプチド沈着物の沈着およびニューロンの死滅、ならびに虚血および興奮毒性（ｅｘｉｔｏｘｉｃ）による脳損傷後の海馬ニューロンの死滅と関連付けられている。カスパーゼ−３について利用可能な結晶構造が存在する［１ＣＰ３，Ｍｉｔｔｌ，Ｐ．Ｒ．ら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２：６５３９−６５４７（１９９７）］。
【０１１７】
（ヒトカスパーゼ−３のクローニング）
カスパーゼ−３のヒト版（Ｙａｍａ、ＣＰＰ３２βとしても公知）を、Ｊｕｒｋａｔ細胞（クローンＥ６−１；ＡＴＣＣ）から直接的にクローニングした。手短に述べると、総ＲＮＡを、３７℃／５％  ＣＯ２で増殖しているＪｕｒｋａｔ細胞から、Ｔｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ）を用いて精製した。オリゴヌクレオチドプライマーを、カスパーゼ−３／Ｙａｍａ／ＣＰＰ３２のラージサブユニットおよびスモールサブユニットをコードするＤＮＡの、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅を可能にするように設計した。手短に述べると、アミノ酸２８〜１７５（ラージサブユニットの大部分を含む）をコードするＤＮＡを、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ−ＰＣＲ  Ｂｅａｄｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ）および以下のオリゴヌクレオチドを用いて、１μｇの総ＲＮＡから直接的に増幅した：
【０１１８】
【化１９】
2005503380.tif 000026
アミノ酸１７６〜２７７（スモールサブユニットの大部分を含む）をコードするＤＮＡを、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ−ＰＣＲ  Ｂｅａｄｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ）および以下のオリゴヌクレオチドを用いて、１μｇの総ＲＮＡから直接的に増幅した：
【０１１９】
【化２０】
2005503380.tif 000027
次いで、カスパーゼ−３のラージサブユニットまたはスモールサブユニットのいずれかに対応する、増幅されたＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｄｅＩで切断し、そしてＥｃｏＲＩおよびＮｄｅＩで消化したｐＲＳＥＴ−ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に、標準的な分子生物学の技術を用いて直接的にクローニングした。［例えば、Ｔｅｗａｒｉ．Ｍ．ら，Ｙａｍａ／ＣＰＰ３２  ｂｅｔａ，ａ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ｏｆ  ＣＥＤ−３，ｉｓ  ａ  ＣｒｍＡ−ｉｎｈｉｂｉｔａｂｌｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｔｈａｔ  ｃｌｅａｖｅｓ  ｔｈｅ  ｄｅａｔｈ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，Ｃｅｌｌ  ８１：８０１−８０９（１９９５）を参照のこと］。
【０１２０】
（Ｃａｓｐ−３  Ｃｙｓ変異の作製）
カスパーゼ−３のラージサブユニットまたはスモールサブユニットのいずれかをコードするＤＮＡを含むプラスミドを、別々に、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２  ＣＪ２３６細胞（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）中に形質転換し、そして各々の構築物を含む細胞を、アンピシリン含有寒天プレートで増殖するそれらの能力によって選択した。ラージサブユニットおよびスモールサブユニットの一晩培養物を、２ＹＴ（１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む）中で３７℃で個々に増殖させた。各培養物を１：１００に希釈し、そしてＡ６００＝０．３〜０．６になるまで増殖させた。各培養物の１．５ｍＬのサンプルを取り出し、そして１０μＬのファージＶＣＳ−Ｍ１３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に感染させ、３７℃で６０分間振盪し、そして各々の一晩培養物を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む２ＹＴ中に１：１００に希釈した１ｍＬの感染培養物を用いて調製し、そして３７℃で増殖させた。細胞を３０００ｒｃｆで１０分間で遠心分離し、そして１／５容量の２０％  ＰＥＧ／２．５Ｍ  ＮａＣｌを上清に添加した。サンプルを室温で１０分間インキュベートし、次いで、４０００ｒｃｆで１５分間遠心分離した。このファージペレットをＰＢＳ中に再懸濁し、そして１５Ｋｒｐｍで１０分間回転させて、残りの粒子状物質を除去した。上清を保持し、そして１本鎖ＤＮＡを、ＱＩＡプレップスピンＭ１３キット（Ｑｉａｇｅｎ）についての手順に従って上清から精製した。
【０１２１】
（変異誘発オリゴヌクレオチド）
【０１２２】
【化２１】
2005503380.tif 000028
約１００ｐｍｏｌの各プライマーを、１×ＴＭ緩衝液（０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１Ｍ  ＭｇＣｌ２）、１ｍＭ  ＡＴＰ、５ｍＭ  ＤＴＴ、および５Ｕ  Ｔ４キナーゼ（ＮＥＢ）を含む緩衝液中で３７℃で６０分間インキュベートすることによってリン酸化した。キナーゼ処理プライマーを、８５℃で２分間、５０℃５分間、次いで４℃で３０〜６０分間のインキュベーションによって、２０μＬの反応容量（約５０ｎｇのキナーゼ処理プライマー、１×ＴＭ緩衝液、および１０〜５０ｎｇの１本鎖ＤＮＡ）で、このテンプレートＤＮＡに対してアニーリングさせた。伸長カクテル（２ｍＭ  ＡＴＰ、５ｍＭ  ｄＮＴＰ、３０ｍＭ  ＤＴＴ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）、およびＴ７ポリメラーゼ（ＮＥＢ））を、各アニーリング反応物に添加し、そして室温で３時間インキュベートした。変異誘発したＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬｌ−Ｂｌｕｅ細胞中に形質転換し、そしてプラスミドＤＮＡを含むコロニーを、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ寒天プレートでの増殖によって選択した。ＤＮＡ配列決定を用いて、適切な変異を含むプラスミドを同定した。
【０１２３】
（Ｃａｓｐ−３変異体タンパク質の発現）
このラージサブユニット中でのシステイン変異をコードするプラスミドＤＮＡを、Ｃｏｄｏｎ  Ｐｌｕｓ  ＢＬ２１  Ｃｅｌｌ中に形質転換し、そしてこのスモールサブユニット中でのシステイン変異をコードするプラスミドＤＮＡを、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ  Ｃｅｌｌ中に形質転換した。野生型版のラージサブユニットをコードするプラスミドを含むＣｏｄｏｎ  Ｐｌｕｓ  ＢＬ２１  Ｃｅｌｌ、およびシステイン変異版のラージサブユニットをコードするプラスミドを含むＣｏｄｏｎ  Ｐｌｕｓ  ＢＬ２１  Ｃｅｌｌを、１５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む２ＹＴ中で３７℃で一晩増殖させ、そして直ちに収集した。野生型版のスモールサブユニットをコードするプラスミドを含むＢＬ２１  ｐＬｙｓＳ細胞、およびシステイン変異版のスモールサブユニットをコードするプラスミドを含むＢＬ２１  ｐＬｙｓＳ細胞を、Ａ６００＝０．６になるまで１５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む２ＹＴ中で３７℃で一晩増殖させた。続いて、培養物を、１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導し、そして３７℃でさらに３〜４時間増殖させた。４Ｋｒｐｍで１０分間遠心分離することによって細胞を収集した後に、細胞ペレットを、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／５ｍＭ  ＥＤＴＡ中に再懸濁し、そしてマイクロフルイダイザーで２回処理した。封入体を、９Ｋｒｐｍで１０分間の遠心分離によって単離し、次いで６Ｍ塩酸グアニジン中に再懸濁した。変性したサブユニットを、再生緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、１０％スクロース、０．１％  ＣＨＡＰＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、および１０ｍＭ  ＤＴＴ）中に１００μｇ／ｍＬになるように迅速にそして均一に希釈し、そしてゆっくりと撹拌しながら、室温で６０分間インキュベーションすることによって、再生させた。
【０１２４】
再生したタンパク質を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）、１０ｍＭ  ＤＴＴ、および０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む緩衝液中で一晩透析した。沈澱物を、９Ｋｒｐｍで１５分間遠心分離し、そして上清を、０．２２μＭセルロースニトレートフィルターを通して濾過することによって除去した。次いで、上清をアニオン交換カラム（Ｕｎｏ５  Ｑ−Ｃｏｌｕｍｎ（ＢｉｏＲａｄ））にローディングし、そして適切に折り畳まれたカスパーゼ−３タンパク質を、３ｍｌ／分での０〜０．２５Ｍ  ＮａＣｌ勾配によって溶出させた。各画分のアリコートを、変性ポリヌクレオチドアクリルアミドゲルで電気泳動し、そしてカスパーゼ−３タンパク質を含む画分をプールした。
【０１２５】
（実施例７）
（ヒトタンパク質チロシンホスファターゼ−１Ｂ（ＰＴＰ−１Ｂ）のクローニングおよび変異誘発）
ＰＴＰ−１Ｂ（登録番号ＳＷＳ  Ｐ１８０３１）は、小胞体（ＥＲ）に結合するＣ末端ドメイン、および細胞質に面するホスファターゼドメインを有するチロシンホスファターゼである。ＰＴＰ−１Ｂが脱リン酸化するタンパク質は、小胞によってこの場所に輸送される。ＰＴＰ−１Ｂの活性は、セリンでのリン酸化およびタンパク質分解によって調節される。ＰＴＰ−１Ｂは、インスリンのシグナル伝達のネガティブレギュレーターであり、そしてインターフェロン刺激に対する細胞応答において役割を果たす。このホスファターゼは、レプチンに対する生物の感度を下げ、それによって食欲を増すことによって、肥満において役割を果たし得る。さらに、ＰＴＰ−１Ｂは、細胞増殖の制御において役割を果たす。結晶構造は、ＰＴＰ−１Ｂについて解かれている［１ＰＴＹ，Ｐｕｉｕｓ，Ｙ．Ａ．ら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：１３４２０−１３４２５（１９９７）］。
【０１２６】
（ヒトＰＴＰ−１Ｂのクローニング）
全長ヒトＰＴＰ−１Ｂは、４３５アミノ酸長である；そのプロテアーゼドメインは、最初の２８８アミノ酸を含む。このプロテアーゼドメインを含むＰＴＰ−１Ｂの短縮化部分は、完全に活性であるので、種々の短縮版のＰＴＰ−１Ｂがしばしば用いられる。ヒトＰＴＰ−１Ｂの最初の３２１アミノ酸をコードするｃＤＮＡを、ヒト胎児心臓の総ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から単離した。ＰＴＰ−１Ｂ  ｃＤＮＡ［Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｍ３１７２４．１，Ｃｈｅｒｎｏｆｆ，Ｊ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：２７３５−２７３９（１９９０）］のヌクレオチド９１〜１１４に対応するオリゴヌクレオチドプライマー（Ｆｏｒ）およびヌクレオチド１０３０〜１０５３に相補的であるオリゴヌクレオチドプライマー（Ｒｅｖ）を合成し、そしてこれを用い、ポリメラーゼ連鎖反応を用いてＤＮＡを作製した。
【０１２７】
【化２２】
2005503380.tif 000029
プライマーＦｏｒｗａｒｄは、ＮｄｅＩ制限部位を第一ＡＴＧコドンに取り込み、そしてプライマーＲｅｖは、ＵＡＡ停止コドン、続いてＥｃｏＲＩ制限制限部位を、ヌクレオチド１０５３の後ろに挿入する。ｃＤＮＡを、制限ヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、そして標準的な分子生物学技術を用いて、ｐＲＳＥＴｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングした。単離されたｃＤＮＡの正体を、ＤＮＡ配列分析（方法論を後の段落に概説する）によって確認した。
【０１２８】
アミノ酸残基１〜２９８をコードする、より短いｃＤＮＡ（ＰＴＰ−１Ｂ  ２９８）を、オリゴヌクレオチドプライマーＦｏｒｗａｒｄおよびオリゴヌクレオチドプライマーＲｅｖ２、ならびに上記のクローンをポリメラーゼ連鎖反応におけるテンプレートとして用いて作製した。
【０１２９】
【化２３】
2005503380.tif 000030
（ＰＴＰ−１Ｂシステイン変異体の作製）
ＰＴＰ−１Ｂ（アミノ酸１〜３２１）、ＰＴＰ−１Ｂ  ２９８（アミノ酸１〜２９８）およびＰＴＰ−１Ｂ  ２９８−２Ｍ（Ｃｙｓ３２およびＣｙｓ９２が、それぞれ、ＳｅｒおよびＶａｌへと変更されている）の部位特異的変異体を、１本鎖ＤＮＡ法（Ｋｕｎｋｅｌの改変版，１９８５）によって調製した。２９８−２Ｍを、以下のオリゴヌクレオチドを用いて作製した。
【０１３０】
【化２４】
2005503380.tif 000031
オリゴヌクレオチドを、所望の変異およびこの変異の両側の１２塩基の隣接配列を含むように設計した。１本鎖形態のＰＴＰ−１Ｂ／ｐＲＳＥＴプラスミド、ＰＴＰ−１Ｂ  ２９８／ｐＲＳＥＴプラスミドおよびＰＴＰ−１Ｂ  ２９８−２Ｍ／ｐＲＳＥＴプラスミドを、ＣＪ２３６細胞株中への２本鎖プラスミドの形質転換によって調製した（１μｌの２本鎖プラスミドＤＮＡ、２μｌの５×ＫＣＭ塩、７μｌの水、１０μｌのＰＥＧ−ＤＭＳＯコンピテントＣＪ２３６細胞；氷上で２０分間、続いて２５℃で１０分間インキュベートした；１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ／寒天にプレーティングし、そして３７℃で一晩インキュベートした）。次いで、ＣＪ２３６細胞のシングルコロニーを、１００ｍｌの２ＹＴ培地中で、対数中期になるまで増殖させた；次いで、５μｌのＶＣＳヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を添加し、そして混合物を３７℃で一晩インキュベートした。１本鎖ＤＮＡを、ファージの沈降によって上清から単離した（１／５容量の２０％  ＰＥＧ  ８０００／２．５Ｍ  ＮａＣｌ；１２Ｋで１５分間遠心分離する）。次いで、１本鎖ＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  １本鎖ＤＮＡキットから単離した。
【０１３１】
部位特異的変異誘発を以下の通りに達成した。オリゴヌクレオチドを、ＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に、１０ＯＤの濃度になるように溶解し、そして５’末端をリン酸化した（２μｌのオリゴヌクレオチド、２μｌの１０ｍＭ  ＡＴＰ、２μｌの１０×Ｔｒｉｓ−塩化マグネシウム緩衝液、１μｌの１００ｍＭ  ＤＴＴ、１２．５μｌの水、０．５μｌのＴ４  ＰＮＫ；３７℃で３０分間インキュベートする）。次いで、リン酸化したオリゴヌクレオチドを、１本鎖ＤＮＡテンプレートに対してアニーリングした（２μｌの１本鎖プラスミド、０．６μｌのオリゴヌクレオチド、６．４μｌの水；９４℃で２分間加熱し、室温までゆっくりと冷却する）。次いで、２本鎖ＤＮＡを、このアニーリングしたオリゴヌクレオチド／テンプレートから調製した（２μｌの１０×ＴＭ緩衝液、２μｌの２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、１μｌの１００ｍＭ  ＤＴＴ、０．５μｌの１０ｍＭ  ＡＴＰ、４．６μｌの水、０．４μｌのＴ７  ＤＮＡポリメラーゼ、０．２μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼを添加する；室温で２時間インキュベートする）。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＸＬ１  ｂｌｕｅ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、この２本鎖ＤＮＡで形質転換し（５μｌの２本鎖ＤＮＡ、５μｌの５×ＫＣＭ、１５μｌの水、２５μｌのＰＥＧ−ＤＭＳＯコンピテント細胞；氷上で２０分間、室温で１０分間インキュベートする）、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ／寒天にプレーティングし、そして３７℃で一晩インキュベートした。各プレートからの約４個のコロニーを用いて、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む５ｍｌの２ＹＴに接種する；これらの培養物を、３７℃で１８〜２４時間増殖させた。次いで、プラスミドを、Ｑｉａｇｅｎミニプレップキットを用いてこの培養物から単離した。これらのプラスミドを配列決定して、どのクローンが所望の変異を含むかを決定した。
【０１３２】
構築物および各状況で作製されたシステインに対する単一変異のリストを以下に示す。
【０１３３】
【表１】
2005503380.tif 000032
しかし、これらのうちの任意の部位特異的変異体が、ＰＴＰ−１Ｂの任意の構築物において作製され得ることが理解されるべきである。例えば、別の構築物は、以下に配列番号１０９として示す、残基１〜３８２を有する別の短縮版のＰＴＰ−１Ｂである。
【０１３４】
【化２５】
2005503380.tif 000033
【０１３５】
【化２６】
2005503380.tif 000034
【０１３６】
【化２７】
2005503380.tif 000035
システインに対する変異以外に、天然に存在するシステインを除去する変異もまた作製され得る。例えば、Ｃｙｓ  ２１５の２つの異なる「スクラブ」を、ＰＴＰ−１Ｂ  ２９８−２Ｍの状況において、以下のオリゴヌクレオチドを用いて作製した：
【０１３７】
【化２８】
2005503380.tif 000036
ＰＴＰ−１Ｂ  ２９８の状況では、２つの四重変異体を、以下に示すＣ９２Ａオリゴヌクレオチドを用いて作製した。これらは、Ｃ３２Ｓ、Ｃ９２Ａ、Ｖ２８７Ｃ、Ｃ２１５Ａ（これは、配列番号１０７、配列番号１４０、配列番号１３７および配列番号１３８を用いた）、およびＣ３２Ｓ、Ｃ９２Ａ、Ｅ２７６Ｃ、Ｃ２１５Ａ（これは、配列番号１０７、配列番号１４０、配列番号１３５および配列番号１３８を用いた）である。
【０１３８】
【化２９】
2005503380.tif 000037
ＰＴＰ−１Ｂクローンの配列決定を、以下の通りに達成した。プラスミドＤＮＡの濃度を、２８０ｎｍでの吸光度によって定量した。１０００ｎｇのプラスミドを、配列決定試薬（１μｇのＤＮＡ、６μｌの水、３．２ｐｍ／μｌでの配列決定プライマーを１μｌ、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ［Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ］を含む、８μｌの配列決定混合物）。配列決定プライマーは、配列番号１７および配列番号１８である。次いで、混合物についてＰＣＲサイクル（９６℃で１０秒間；５０℃で５秒間；６０℃で４分間；２５サイクル）を実施し、そしてＤＮＡ反応産物を沈澱させた（２０μｌの混合物、８０μｌの７５％イソプロパノール；室温で２０分間インキュベートし、次いで１４Ｋｒｐｍで２０分間ペレット化した；２５０μｌの７５％イソプロパノールで洗浄する；９４℃で１分間加熱する）。次いで、沈澱した産物を２０μｌのＴＳＢ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中に再懸濁し、そしてこの配列を読取り、そしてＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３１０キャピラリーゲルシークエンサーによって分析した。概して、プラスミドのうちの１／４は、所望の変異を含んでいた。
【０１３９】
（ＰＴＰ−１Ｂのシステイン変異体の発現）
変異体タンパク質を、以下の通りに発現させた。ＰＴＰ−１Ｂクローンを、ＢＬ２１コドンプラス細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に形質転換し（１μｌの２本鎖ＤＮＡ、２μｌの５×ＫＣＭ、７μｌの水、１０μｌのＤＭＳＯコンピテント細胞；４℃で２０分間、室温で１０分間インキュベートする）、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ／寒天にプレーティングし、そして３７℃で一晩インキュベートした。２つのシングルコロニーを、プレートから拾ったか、またはこれらの変異体の凍結したグリセロールストックから拾い、そして５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含む１００ｍｌの２ＹＴ中に接種し、そして３７℃で一晩増殖させた。一晩培養物由来の５０ｍｌを、１．５Ｌの２ＹＴ／カルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）に添加し、そして対数後期（６００ｎｍで約０．８〜０．９の吸光度）になるまで３７℃で３〜４時間インキュベートした。この時点で、タンパク質発現を、１ｍＭの最終濃度となるようなＩＰＴＧの添加によって誘導した。培養物を、３７℃でさらに４時間インキュベートし、次いで細胞を遠心分離（７Ｋｒｐｍ、７分間）によって収集し、そして−２０℃で凍結した。
【０１４０】
ＰＴＰ−１Ｂタンパク質を、以下に記載の通りに、凍結した細胞ペレットから精製した。最初に、細胞を、２０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、および１０％グリセロール緩衝液を含む、１００ｍｌの緩衝液中で、マイクロフルイダイザーにおいて溶解させ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ［Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  １１０Ｓ］に３回通した）、そして封入体を、遠心分離（１０Ｋｒｐｍ、１０分間）によって除去した。全てのＰＴＰ−１Ｂ変異体の精製を、４℃で達成した。この遠心分離由来の上清を、０．４５μｍ酢酸セルロースを通して濾過し（５μｌのこの物質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した）、そして緩衝液Ａ（２０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１％グリセロール）中で平衡化したＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｆａｓｔ  ｆｌｏｗカラム（直径２．５ｃｍ×長さ１４ｃｍ）に４ｍｌ／分でローディングした。
【０１４１】
次いで、このタンパク質を、６０分間かけた０〜５０％の緩衝液Ｂ（緩衝液Ｂ：２０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１％グリセロール、１Ｍ  ＮａＣｌ）の勾配を用いて溶出させた。収率および純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって調べ、そして必要に応じて、ＰＴＰ−１Ｂを、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によってさらに精製した。タンパク質に、１．４Ｍの最終濃度に到達するまで、硫酸アンモニウムを補充した。このタンパク質溶液を濾過し、そして緩衝液Ａ２（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１．４Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｍＭ  ＤＴＴ）中でＨＩＣカラムに４ｍｌ／分でローディングした。タンパク質を、３０分間かけた０〜１００％の緩衝液Ｂ（緩衝液Ｂ２：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１％グリセロール）の勾配を用いて溶出させた。最後に、精製したタンパク質を、適切なアッセイ緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１％グリセロール）中で４℃で透析した。収率は、変異体毎に変化したが、代表的には、３〜２０ｍｇ／Ｌ培養物の範囲内であった。
【０１４２】
（実施例８）
（ヒト免疫不全ウイルスインテグラーゼ（ＨＩＶ  ＩＮ）のクローニングおよび変異誘発）
ＨＩＶ  ＩＮは、ヒト免疫不全ウイルスの３つの重要な酵素標的のうちの１つである；これは、２つのヌクレオチドを、元々平滑なウイルスＤＮＡの３’末端から除去し、そしてこのウイルスＤＮＡを宿主ＤＮＡ中に鎖移入（ｓｔｒａｎｄ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）によって挿入する。組込みプロセスは、宿主のＤＮＡ修復酵素によって完了する。ＨＩＶ  ＩＮは、以下の３つの別個のドメインを有する：Ｎ末端ドメイン、触媒性コアドメイン、およびＣ末端ドメイン。これらの単離されたドメインの各々のＸ線結晶構造が解かれているが、どのようにしてこれらが互いに相互作用するかは未だ明らかではない。組込みは、このウイルスの複製および疾患の進行に絶対に必須であり、従ってインテグラーゼインヒビターは、ＨＩＶ／ＡＩＤＳの処置において用いられ得る。インテグラーゼのコアドメインの構造は入手可能である［１ＥＸＱ，Ｃｈｅｎ，Ｊ．Ｃ．−Ｈ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７：８２３３−８２３８（２０００）；１ＢＬ３，Ｍａｉｇｎａｎ，Ｓ．ら，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２８２：３５９−３６８（１９９８）；テトラフェニルアルソニウムとの複合体状態の１ＨＹＺおよび１ＨＹＶ，Ｍｏｌｔｅｎｉ，Ｖ．ら，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇ．，５７：５３６−５４４（２００１）］。
【０１４３】
（ＨＩＶ  ＩＮのクローニング）
野生型および変異型ＨＩＶ−１インテグラーゼ残基の番号付けは、成熟タンパク質の第１のアミノ酸残基を残基番号１とし、そしてＨＩＶ−１インテグラーゼ触媒コアドメインが残基５２〜２１０からなるとする慣習に従う［Ｌｅａｖｉｔｔ，Ａ．Ｄ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６８：２１１３〜２１１９（１９９３）］。
【０１４４】
プラスミド構築物、ｐＴ７−７  ＨＴ−ＩＮｔｅｔｒａ（ＨＩＶ−１インテグラーゼコアドメイン（残基５２〜２１０）をコードし、ｐＴ７−７（Ｎｏｖａｇｅｎ）ベクター背景中Ｎ末端６×ヒスチジンタグおよびトロンビン切断可能リンカー、ならびにＣ５６Ｓ、Ｗ１３１Ｄ、Ｆ１３９Ｄ、およびＦ１８５Ｋ変異を有する）［Ｃｈｅｎ，Ｊ．Ｃ．−Ｈ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７：８２３３−８２３８（２０００）］を、ＵＣＳＦのＡｎｄｙ  Ｌｅａｖｉｔｔ博士から得た。他のインテグラーゼコア構造に対する、このコアドメイン改変体の結晶構造の比較［Ｃｈｅｎ，Ｊ．Ｃ．−Ｈ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７：８２３３−８２３８（２０００）］において、Ｆ１３９Ｄ変異（このタンパク質の可溶性を増大させるように設計された）が、触媒に重要なＡｓｐ１１６の変形を伝える側鎖の回転を起こすことが言及された。従って、この変異を、Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ変異誘発（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によって、製造業者の指示書に従い、そして配列番号１４１および配列番号１４２を使用して、野生型フェニルアラニンに戻した。
【０１４５】
【化３０】
2005503380.tif 000038
これによって、インテグラーゼコアの三重変異体（Ｃ５６Ｓ、Ｗ１３１Ｄ、Ｆ１８５Ｋ）（配列番号１４３）をコードするｐＴ７−７  ＨＴ−ＩＮｔｒｉを産生した。
【０１４６】
【化３１】
2005503380.tif 000039
係留部位においてシステイン変異を作製するための調製において、２つの野生型システイン（Ｃ１３０およびＣ６５）を、アラニン残基によって置換し、そしてＨｉｓタグ付きＩＮｔｒｉコアドメインをコードするＤＮＡを、ｐＲＥＳＴ  Ａベクター中に移した。ｐＲＥＳＴ  Ａベクターは、一本鎖プラスミドＤＮＡの調製を（故にＫｕｎｋｅｌ法［Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０４：１２５−１３９（１９９１）］による変異誘発を）可能にするＦ１複製起点を含む。アラニンによるＣ１３０の置換を、配列番号１４４および配列番号１４５から構成される二本鎖カセットを使用するカセット変異誘発によって達成した。このカセット（各末端に適切な突出を含む）を、ＢｓｉＷＩおよびＥｃｏＲＩで消化したｐＴ７−７  ＨＴ−ＩＮｔｒｉ中にライゲーションした。
【０１４７】
【化３２】
2005503380.tif 000040
Ｃ６５Ａ変異を、配列番号１４６および配列番号１４７を使用して、ｐＴ７−７  ＨＴ−ＩＮｔｒｉ上でのＱｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ変異誘発よって独立して実施した。
【０１４８】
【化３３】
2005503380.tif 000041
ＨＴ−Ｃ１３０ＡインテグラーゼコアドメインをコードするＤＮＡを、ＰＣＲクローニングによってｐＲＥＳＴ  Ａベクター中にサブクローニングした。配列番号１４８および配列番号１４９を、ＰＣＲプライマーとして使用し、そして得られた増幅産物を、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そして同じ酵素で消化されたｐＲＥＳＴ  Ａ中にライゲーションして、ｐＲＳＥＴ−ＨＴ−Ｃ１３０Ａ−ＩＮｔｒｉを作製した。
【０１４９】
【化３４】
2005503380.tif 000042
Ｃ６５Ａ変異を含むｐＴ７−７  ＨＴ−Ｃ６５Ａ−ＩＮｔｒｉのＢａｍＨＩフラグメントを、ｐＲＳＥＴ−ＨＴ−Ｃ１３０Ａ−ＩＮｔｒｉ中にライゲーションして、ｐＲＳＥＴ−ＨＴ−ＩＮｔｅｍｐｌａｔｅを作製した。このプラスミドは、係留のために選択された位置におけるシステイン置換を導入するためのさらなるＫｕｎｋｅｌ変異誘発のためのテンプレートとして役立った。配列番号１７を、配列決定するために使用した。
【０１５０】
（変異原性オリゴヌクレオチド）
【０１５１】
【化３５】
2005503380.tif 000043
【０１５２】
【化３６】
2005503380.tif 000044
（ＩＮシステイン変異体の発現）
ｐＴ７−７およびｐＲＳＥＴインテグラーゼコアドメイン発現プラスミドを、標準的な手順によって、ＢＬ２１  ｓｔａｒ  Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に形質転換し、そして得られたプレートからのシングルコロニーを使用して、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む２５０ｍＬの２×ＹＴ培地に接種した。３７℃において一晩増殖後、この細胞を、４Ｋｒｐｍの遠心分離によって回収し、そして１００ｍＬの２×ＹＴ／アンピシリン中に再懸濁した。４０ｍＬの洗浄した細胞を使用して、１．５Ｌの同じ培地に接種し、そして６００ｎｍにおけるＯＤが０．５と０．８との間になるまで３７℃で増殖後、この培養物を２２℃に移して冷却した。ＩＰＴＧを、最終濃度０．１ｍＭまで添加して、２２℃で発現を１７〜１９時間続けた。細胞を、４Ｋｒｐｍで遠心分離して回収した。細胞ペレットを、１００ｍＬのＷａｓｈ  ５緩衝液（Ｗａｓｈ  ５：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  イミダゾール、５ｍＭ  β−メルカプトエタノール、ｐＨ７．４）中に再懸濁し、そして溶解を、１分間の超音波処理を２分間の間を置いて計３回繰り返すことによって達成した。１４Ｋｒｐｍで遠心分離し、続いて濾過することによって、細胞の破片を除去した。インテグラーゼコアドメインを、Ｎｉ−ＮＴＡ  ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）における４℃でのアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。細胞溶解物を負荷した後、このカラムを、Ｗａｓｈ  ４０緩衝液（Ｗａｓｈ  ４０：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、４０ｍＭ  イミダゾール、５ｍＭ  β−メルカプトエタノール、ｐＨ７．４）で洗浄し、Ｈｉｓ−タグ付きＩＮコアドメインを、Ｅ４００緩衝液（Ｅ４００：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、４００ｍＭ  イミダゾール、５ｍＭ  β−メルカプトエタノール）で溶出した。精製した酵素を、４℃において２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、５ｍＭ  β−メルカプトエタノール、ｐＨ７．４に対して透析し、そして１．５ｍＬチューブ中に等分した。ビオチン化トロンビン（Ｎｏｖａｇｅｎ）（１ｍｇのタンパク質あたり２単位のトロンビン）を添加し、そしてこのチューブを、４℃で一晩回転させ、続いてストレプトアビジンアガロース樹脂（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用してトロンビンを除去し、そしてＮｉ−ＮＴＡ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｆａｓｔ−ｆｌｏｗの第二のカラムを通して切断された物質からＨｉｓタグ付きのタンパク質およびペプチドを分離した。精製された、切断されたインテグラーゼコアドメインを、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＤＴＴおよび５％グリセロール、ｐＨ７．４に対して透析し、そして−２０℃で保存した。タンパク質の濃度を、ＮＡＰ−５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）における脱塩後、ε２８０１％＝（１．１７４）を使用して２８０ｎｍでの吸光度によって決定し、そして分子量を、ＥＳＩ質量分析法（Ｆｉｎｎｉｇａｎ）によって確認した。
【０１５３】
（実施例９）
（ヒトベータ部位アミロイド前駆体タンパク質切断酵素１（ＢＡＣＥ１））
ＢＡＣＥ１（登録番号ＳＷＳ  ５６８１７）は、アスパラギン酸プロテアーゼである１型内在性糖タンパク質（ｉｎｔｅｇｒａｌ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）である。ＢＡＣＥ１（主にゴルジに見られる）は、アミロイド前駆体タンパク質を切断してＡβペプチドを形成する。大脳におけるこのペプチドの沈着とアルツハイマー病との間に強い関連性が示されている；従って、ＢＡＣＥ１は、この疾患の主要な標的の１つである。ＢＡＣＥ１の結晶構造が、解析されている［１ＦＫＮ、Ｈｏｎｇ，Ｌ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０：１５０−１５３（２０００）］。
【０１５４】
（ヒトＢＡＣＥ１のクローニング）
プロプロテアーゼドメイン遺伝子配列（塩基  ６４〜１３６２、アミノ酸残基  ２２〜４５４）を、ＰＣＲによって、ｐＦＢＨＴからＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＲＳＥＴＣ中にサブクローニングし、ｐＢ２２（これは、システイン係留部位を組み込むための変異誘発のテンプレートとして役立つ）を作製した。ｐＦＢＨＴ（改変されたｐＦａｓｔＢａｃプラスミド）については、上記の実施例４を参照のこと。以下のようにして、サブクローニングを達成した。全長ヒトＢＡＣＥ１（塩基１〜１５５１）をコードするｃＤＮＡ（開始Ｍｅｔコドンから始まり、そして終止コドンに続く、ｍＲＮＡ転写物の余分な４８塩基を含む）［Ｖａｓｓａｒ，Ｒ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６：７３５−７４１（１９９９）］を、ヒトｃＤＮＡライブラリーからの３’の１４２５塩基のＰＣＲクローニングと連続重複ＰＣＲによる残りの５’の１２６塩基の合成との組合せによって、得た。全てのＰＣＲ反応を、Ａｄｖａｎｔａｇｅ２ポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、製造業者の指示書に従って使用して実施した。塩基１２６〜３７４に広がるフラグメントを、ヒト大脳皮質ライブラリーならびに配列番号１７０および配列番号１７１からＰＣＲによって得た；塩基３３９〜７７０に広がるフラグメントを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｕｎｉｚａｐ  ＸＲヒト脳ｃＤＮＡライブラリーならびに配列番号１７２および配列番号１７３からＰＣＲによって得た；そして３’末端フラグメント（塩基７３５〜１５５１に広がる）を、配列番号１７４および配列番号１７５を使用して、ヒト脳ライブラリーからＰＣＲによって得た。３つのフラグメント（連結部に３５ｂｐの重複を有する）を、ゲル精製し、そして１つのＰＣＲ反応中に組み込み、末端までのプライマー（配列番号１７０および配列番号１７６）を使用して１２６〜１５５１生成物を増幅した。
【０１５５】
【化３７】
2005503380.tif 000045
この１２６〜１５５１断片、およびそれに続く長い生成物を、残りの５’の１２６塩基を加えるために、順方向プライマーとして配列番号１７７、配列番号１７８および配列番号１７９を、逆方向プライマーとして常に配列番号１７６を共に使用して、連続重複ＰＣＲ反応のためのテンプレートとして使用した。
【０１５６】
【化３８】
2005503380.tif 000046
配列番号１７９および配列番号１７６は、それぞれＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ制限部位を含み、そしてこのＰＣＲ産物とバキュロウイルス発現ベクターｐＦＢＨＴを同じ酵素で消化し、続いてゲル精製し、そして得られたＤＮＡフラグメントをライゲーションして構築物ｐＦＢＨＴ−ＢＡＣＥを得た。この構築物を、配列番号１８０および配列番号１８１を用いる、塩基１〜１３６２（プレプロＢＡＣＥ可溶性プロテアーゼドメインに対応する）のＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして使用した。
【０１５７】
【化３９】
2005503380.tif 000047
配列番号１８０および配列番号１８１は、それぞれＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を含み、そしてこのＰＣＲ産物とＥ．Ｃｏｌｉ発現ベクターｐＲＳＥＴＣを同じ酵素で消化し、続いてゲル精製し、そして得られたＤＮＡフラグメントをライゲーションして構築物ｐＢ１を得た。次いで、ベクターｐＢ１を、Ｋｕｎｋｅｌ変異誘発［Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２（１９８７）］のためのテンプレートとして使用してＢＡＣＥプレ配列（塩基１〜６３）を欠失させ、構築物ｐＢ２２を作製した。ｐＢ２２は、Ｋｕｎｋｅｌ法またはＱｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、システイン係留部位を組み込むための変異誘発のテンプレートとして役立った。
【０１５８】
（変異原性オリゴヌクレオチド）
【０１５９】
【化４０】
2005503380.tif 000048
（ヒトＢＡＣＥ１変異体の発現）
ｐＢ２２を、標準的な手順によって、ＢＬ２１  ｓｔａｒ  Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に形質転換し、そして得られたプレートからのシングルコロニーを使用して、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む５０ｍＬの２×ＹＴ培地に接種した。３７℃において一晩増殖後、４０ｍＬの培養物を使用して、１．５Ｌの同じ培地に接種し、そして６００ｎｍにおけるＯＤが０．５と０．８との間になるまで３７℃で増殖後、ＩＰＴＧを、最終濃度１．０ｍＭまで添加して、３７℃で発現を３時間続けた。細胞を、４Ｋｒｐｍで遠心分離して回収した。細胞ペレットを、１００ｍＬのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中に再懸濁し、そして溶解を、Ｆｒｅｎｃｈ  Ｐｒｅｓｓマイクロフリューダイザーを使用して（２回通過）達成した。粗抽出物（ＢＡＣＥ１を不溶性の封入体として含む）を、１４Ｋｒｐｍで１５分間遠心分離し、そして得られたペレットをＰＢＳ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で再懸濁し、続いて１４Ｋｒｐｍで２０分間遠心分離することにより洗浄した。洗浄した封入体ペレットを、５０ｍＭ  ＣＡＰＳ、８Ｍ  尿素、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および１００ｍＭ  β−メルカプトエタノール、ｐＨ１０．０中で可溶化し、そして残りの不溶性の破片を、２０Ｋｒｐｍで３０分間遠心分離して除去した。迅速に撹拌した、５０体積と１００体積との間の水、または１０ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３（ｐＨ１０）に、この尿素可溶化タンパク質をゆっくり注入し、続いて室温で３〜７日間インキュベートすることによって、ＢＡＣＥ１を再折りたたみした。ＢＡＣＥ１酵素活性が、もはや経時的に増大しなくなったら、５ｍＭ（最終濃度）Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの添加によって、再折りたたみ溶液のｐＨをｐＨを８．０に調整し、そしてＱ−セファロースカラムに負荷した。１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中の、０ｍＭ〜５００ｍＭのＮａＣｌの直線勾配を用いて、タンパク質を溶出した。ｐＨ４．５でのＳ−セファロースクロマトグラフィーによって、ＢＡＣＥ１をさらに精製した。精製した酵素を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．１２５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２に対して４℃で透析し、そして４℃で保存した。タンパク質の濃度を、ε２８０１％＝（０．７４）を使用して、２８０ｎｍでの吸光度によって決定した。
【０１６０】
（実施例１０）
（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ／細胞外シグナル調節キナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）のクローニングおよび変異誘発）
ＭＥｋ−１（登録番号  ＳＷＳ  Ｑ０２７５０）は、マイトジェン刺激に応答性の細胞増殖および細胞生存において重要な役割を果たす二重特異性キナーゼである。ＭＥｋ−１は、一般的にＭＡＰキナーゼカスケードと呼ばれる３キナーゼカスケードの中心的な構成要素である。このＲａｆ−Ｍｅｋ−Ｅｒｋキナーゼカスケードは、細胞表面レセプター（例えば、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＰＤＧＦＲ、ＦＧＦＲ、ＩＧＦなど）から核へと情報を伝達する。この経路は、全ての腫瘍型の約３０％において、特定の細胞表面レセプター（例えば、乳癌におけるＨＥＲ２）の過剰発現を介してか、またはＲａｓ（この経路の重要な上流構成要素）の活性化変異を介してかのいずれかで上方制御されている。Ｍｅｋ−１機能の破壊は、細胞培養物および動物の両方において劇的な抗腫瘍効果を有する。Ｍｅｋ−２（登録番号ＳＷＳ  Ｐ３６５０７）は、Ｍｅｋ−１に非常に相同（７９％同一性）であり、そしてＭｅｋ−１と協調的に発現される二重特異性キナーゼである。従って、Ｍｅｋ−１およびＭｅｋ−２は、新規の抗癌治療の開発のための魅力的な標的を表す。今日まで、Ｍｅｋ−１についても、Ｍｅｋ−２についても、結晶構造は、存在しない。
【０１６１】
（ヒトＭｅｋ−１およびヒトＭｅｋ−２のクローニング）
野生型Ｍｅｋ−１残基および野生型Ｍｅｋ−２残基ならびに変異体Ｍｅｋ−１残基および変異体Ｍｅｋ−２残基の番号付けは、ＮＣＢＩに報告された配列（Ｍｅｋ−１についてＮＣＢＩ登録番号Ｌ０５６２４およびＭｅｋ−２についてＮＣＢＩ登録番号ＨＵＭＭＥＫ２Ｆ）に従って、開始メチオニンを残基番号１として、それぞれのアミノ末端で始まる。全ての標準的なクローニング工程および変異誘発工程を、酵素の製造業者の推奨に従って実施した。
【０１６２】
ヒトＭｅｋ−１をコードするＤＮＡを、プラスミドｐＵＳＥ  ＭＥＫ１（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）から単離し、そして以下のようにしてインフレームでＧＳＴを有するプラスミドｐＧＥＸ−４Ｔ−１（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に挿入した。まず、ｐＵＳＥ  ＭＥＫ１をＮｏｔＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、３’突出をＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメント（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で埋め、そしてＭＥＫ１をコードする１１９３ｂｐ産物を、アガロースゲルから単離した。ｐＧＥＸ−４Ｔ−１をＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）での消化によって線状化し、そして同様にして３’突出をＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメント（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で埋めた。次いで、ＭＥＫ１およびｐＧＥＸ−４Ｔ−１のＤＮＡフラグメントを、Ｔ４リガーゼでライゲーションし、そしてＥ．ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ１０Ｆ’株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で増幅してプラスミドｐＧＥＸ−ＭＥＫ１を作製した。
【０１６３】
ヒトＭｅｋ−２をコードするＤＮＡを、プラスミドｐＵＳＥ  ＭＥＫ２（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）から単離し、そして以下のようにしてインフレームでＧＳＴを有するｐＧＥＸ−４Ｔ−１（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に挿入した。まず、ｐＵＳＥ  ＭＥＫ２をＮｏｔＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、３’突出をＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメント（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で埋め、そしてＭＥＫ２をコードする１２１３ｂｐ産物を、アガロースゲルから単離した。ｐＧＥＸ−４Ｔ−１をＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）での消化によって線状化し、そして同様にして３’突出をＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメント（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で埋めた。次いで、ＭＥＫ２およびｐＧＥＸ−４Ｔ−１のＤＮＡフラグメントを、Ｔ４リガーゼでライゲーションし、そしてＥ．ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ１０Ｆ’株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で増幅してプラスミドｐＧＥＸ−ＭＥＫ２を作製した。
【０１６４】
（Ｍｅｋ−１システイン変異体およびＭｅｋ−２システイン変異体の作製）
全ての変異誘発工程を、長距離ＰＣＲを使用して実施した。反応物は、親プラスミド（２ｎｇ／μｌ）、センス鎖変異体プライマー（０．５μＭ）、およびアンチセンス鎖変異体プライマー（０．５μＭ）（これらは、各反応に固有である）を含有した。さらに、すべての反応物は、ｄＮＴＰ（２５μＭ）およびＰｆｕポリメラーゼ（０．０５単位／μｌ  Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含有した。反応物を、９５℃で１分間、続いて１６サイクルの（９５℃で０．５分間、５５℃で１分間、および６８℃で２分間）ならびに６８℃で最後の１０分間インキュベートした。次いで、親プラスミドＤＮＡを、ＤｐｎＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、そして残りの直鎖のＰＣＲ産物を、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ１０Ｆ’株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に形質転換した。変異誘発されたプラスミドＤＮＡ（インビボでの組換えおよびそれに続く増幅の結果である）を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（Ｑｉａｇｅｎ）カラムを使用して精製し、そして配列決定により確認した。
【０１６５】
まず、センスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド、それぞれＭＥＫ１−６ＨＩＳ−ｓおよびＭＥＫ１−６ＨＩＳ−ａｓを使用して、６×ＨＩＳエピトープタグを、ｐＧＥＸ−ＭＥＫ１中にＭＥＫ１のカルボキシ末端において導入し、ｐＧＥＸ−ＭＥＫ１−ＨＩＳを作製した。同様にして、センスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド、それぞれＭＥＫ２−６ＨＩＳ−ｓおよびＭＥＫ２−６ＨＩＳ−ａｓを使用して、６×ＨＩＳエピトープタグを、ｐＧＥＸ−ＭＥＫ２中にＭＥＫ２のカルボキシ末端において導入し、ｐＧＥＸ−ＭＥＫ２−ＨＩＳを作製した。
【０１６６】
【化４１】
2005503380.tif 000049
続いて、１６個の個々の変異を、ｐＧＥＸ−ＭＥＫ１−ＨＩＳに導入した。同様に、類似性の１６個の個々の変異を、ｐＧＥＸ−ＭＥＫ２−ＨＩＳに導入した。これらの各々の変異は、ＭＥＫ１タンパク質またはＭＥＫ２タンパク質中にシステインを導入し、そして各々は、結果として生じたアミノ酸置換に従って命名される。例えば、プライマー対ＭＥＫ１−Ｎ７８Ｃ−ｓｅｎｓｅおよびＭＥＫ１−Ｎ７８Ｃ−ａｎｔｉｓｅｎｓｅは、ＭＥＫ１のＮ７８の代りにシステインを導入し、ｐＧＥＸ−ＭＥＫ１／Ｎ７８Ｃ−ＨＩＳを作製するために使用された。
【０１６７】
（変異原性オリゴヌクレオチド）
【０１６８】
【化４２】
2005503380.tif 000050
【０１６９】
【化４３】
2005503380.tif 000051
【０１７０】
【化４４】
2005503380.tif 000052
（Ｍｅｋ−１変異体およびＭｅｋ−２変異体の発現）
変異体対立遺伝子Ｍｅｋ−１およびＭｅｋ−２を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、そして基本的にＭｅｋ−１について記載されるように精製した［ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｏ．Ｂ．ら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２６８：３１８−３２９  （１９９９）］。変異体Ｍｅｋ−１対立遺伝子および変異体Ｍｅｋ−２対立遺伝子を含むプラスミドを、製造業者の提案に従ってＢＬ２１  ＤＥ３  ｐＬｙｓＳ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に形質導入した。培養物を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび１００μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを補充した１００ｍｌの２ＹＴ培地中で、シングルコロニーから３７℃一晩増殖させた。次いで、この培養物を、約０．０５のＯＤ６００を達成するように、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補充した１．５Ｌの２ＹＴ培地に添加し、次いで３０℃で約０．７のＯＤ６００まで増殖させた。最終濃度が１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加して発現を誘導し、そしてこの培養物を、２５℃で４時間インキュベートした。細胞を、Ｓｏｒｆａｌｌ  ＧＳＡローターにおいて６Ｋｒｐｍ１５分間でペレットにし、そして−８０℃で保存した。
【０１７１】
Ｍｅｋ−１変異体およびＭｅｋ−２変異体を、まず、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む氷冷ＰＢＳ中に細胞ペレットを再懸濁し、氷上で４５分間インキュベートし、続いて大規模な超音波処理によって、細胞から精製した。溶解物を、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＧＳＡローターにおいて１２Ｋｒｐｍで１時間遠心分離することによって清澄にした。融合タンパク質を、製造業者の提案に従って、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）でまず精製し、続いて記載［ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｏ．Ｂ．ら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８：３１８−３２９（１９９９）による］のようにグルタチオンアガロースでさらに精製した。トロンビン切断でエピトープタグを除去し、精製タンパク質のアリコートを、１０％グリセロールを含むＴＢＳ中で−８０℃で保存した。
【０１７２】
（実施例１１）
（ヒトカテプシンＳ（ＣＡＴＳ）のクローニングおよび変異誘発）
カテプシンＳ（登録番号ＳＷＳ  Ｐ２５７７４）は、主にリソソーム中に位置付けらるチオールプロテアーゼである。この酵素は、ＭＨＣ−ＩＩ抗原レセプターのプロセシングによる抗原提示において機能する；従って、この酵素に対するインヒビターは、炎症および自己免疫のような疾患（例えば、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、喘息および器官拒絶）に対して使用され得る。ｃａｔＳが、アルツハイマー病およびダウン症候群の脳において、正常の脳と比較して増大したレベルで存在することがまた、報告されている。カテプシンＳの構造モデル［１ＢＸＦ，Ｆｅｎｇｌｅｒ，Ａ．およびＢｒａｎｄｔ  Ｗ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １１：１００７−１０１３（１９９８）］およびＣ２５Ｓ変異体の結晶構造［Ｔｕｒｋｅｎｂｕｒｇ，Ｊ．Ｐ．ら、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇ  ５８：４５１−４５５（２００２）］が利用可能である。
【０１７３】
（ヒトｃａｔＳのクローニング）
ヒトカテプシンＳ（ｃａｔＳ）をコードするＤＮＡ配列を、以下に列挙するＰＣＲプライマー（このタンパク質のＮ末端およびＣ末端に対応する）を使用して、プラスミドｐＤｕａｌＧＣ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＃Ｅ０１０８９）からＰＣＲにより単離した。これらのプライマーは、改変ｐＦａｓｔＢａｃベクター、ｐＦＢＨＴ中へのサブクローニングのために、制限エンドヌクレアーゼ部位ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩを含むように設計された（上記の実施例４を参照のこと）。配列番号２６３を、配列番号２６４および配列番号２６５とともに使用して、それぞれ６×ｈｉｓタグを有するｃａｔＳおよび６×ｈｉｓタグを有さないｃａｔＳを作製した。
【０１７４】
【化４５】
2005503380.tif 000053
ＰＣＲ反応物を、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｃｏｌｕｍｎ（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。ｃａｔＳ配列を含むＰＣＲ産物を、制限エンドヌクレアーゼで切断した（４２μｌのＰＣＲ産物、１μｌの各エンドヌクレアーゼ、５μｌの適切な１０×緩衝液；３７℃で３時間インキュベートした）。ｐＦＢＨＴベクターを、制限エンドヌクレアーゼで切断した（５μｇのＤＮＡ、１μｌの各エンドヌクレアーゼ、３μｌの適切な１０×緩衝液、３０μｌまでの水；３７℃で３時間インキュベートした；１μｌのＣＩＰを添加し、そして３７℃で６０分間インキュベートした）。ヌクレアーゼで切断された生成物を、アガロースゲル（１％アガロース、ＴＢＥ緩衝液）から単離し、そしてＴ４ＤＮＡリガーゼを使用して、一緒にライゲーションした（１０μｌ中の５０ｎｇのｐＦＢＨＴベクターおよび５０ｎｇのｃａｔＳ  ＰＣＲ産物、１０μｌの２×リガーゼ緩衝液（Ｒｏｃｈｅ）、１μｌのリガーゼ、２５℃で１５分間インキュベートした）。ライゲーション反応物のうち１μｌを、Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ＤＨ５α細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に形質転換（１μｌのライゲーション反応物、１００μｌのコンピテント細胞、；４℃で３０分間、４２℃で４５秒間、４℃で２分間インキュベートし、次いで９００μｌのＳＯＣ培地を添加し、そして３７℃において２２５ｒｐｍで振盪しながら１時間インキュベートした）し、そして、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ／寒天プレート上にプレーティングした。３７℃で一晩インキュベートした後、シングルコロニーを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む３ｍｌのＬＢ培地中で８時間増殖させた。次いで、細胞を単離し、そして二本鎖ＤＮＡをＱｉａｇｅｎ  ＤＮＡミニプレップキットを使用して細胞から抽出した。ｃａｔＳ遺伝子の配列決定を、Ｍ１３／ｐＵＣ  Ｆｏｒｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｉｍｅｒｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１８４３０−０１７）を使用して達成した。
【０１７５】
（ＣａｔＳシステイン変異の作製）
前述［Ｋｕｎｋｅｌ  Ｔ．Ａ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２（１９８７）］のようにして、変異を作製した。使用したＤＮＡオリゴヌクレオチドを、以下に示し、そしてプラスミド由来のセンス鎖ＤＮＡとハイブリダイズするように設計した。配列番号７４および配列番号７５を有するプライマーを使用して、配列を確認した。
【０１７６】
（変異原性オリゴヌクレオチド）
【０１７７】
【化４６】
2005503380.tif 000054
【０１７８】
【化４７】
2005503380.tif 000055
以下のオリゴヌクレオチドを使用して、システインの取り消し（ｓｃｒｕｂ）変異もまた、作製した。
【０１７９】
【化４８】
2005503380.tif 000056
ＣａｔＳ変異体タンパク質の発現
すべてのＣａｔＳ−ＦＢＨＴプラスミドは、このプラスミドを、ＤＨ１０ｂａｃ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）コンピテント細胞中に以下のように形質転換することによって、バキュロウイルスシャトルベクター（ｂａｃｍｉｄ）中に部位特異的に輸送された：１μｌ  ＤＮＡを５ｎｇ／μｌで、１０μｌの５×ＫＣＭ［０．５Ｍ  ＫＣｌ、０．１５Ｍ  ＣａＣｌ２、０．２５Ｍ  ＭｇＣｌ２］、３０μｌの水を５０μｌのＰＥＧ−ＤＭＳＯコンピテント細胞と混合し、４℃で２０分間、２５℃で１０分間インキュベートし、９００μｌのＳＯＣを添加し、そして３７℃で４時間振盪しながらインキュベートし、次に、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン，７μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン、１００μｇ／ｍｌのＢｌｕｏ−ｇａｌ、１０μｇ／ｍｌのＩＰＴＧを含むＬＢ／寒天プレート上にまいた。３７℃で２４時間のインキュベーションの後、大きな白色コロニーを釣り上げ、そして３ｍｌの２ＹＴ培地で一晩増殖させた。次いで、細胞を単離し、そしてこれらの細胞から二本鎖ＤＮＡを以下のように抽出した：ペレットを、２５０μｌの溶液１［１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００μｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅＡ］中に再懸濁した。２５０μｌの溶液２［０．２Ｎ  ＮａＯＨ、１％ＳＤＳ］を添加し、穏やかに攪拌し、そして室温で５分間インキュベートした。２５０μｌの３Ｍ酢酸カリウムを添加し、混合し、そして氷上に１０分間置いた。１４，０００×ｇで１０分間遠心分離し、そして上清液を、０．８ｍｌのイソプロパノールを含むチューブに移した。混合し、そして氷上に１０分間置いた。１４，０００×ｇで１５分遠心分離し、７０％エタノールで洗浄し、ペレットを風乾し、そして４０μｌのＴＥ中にＤＮＡを再懸濁した。
【０１８０】
このｂａｃｍｉｄＤＮＡを用いてＳｆ９細胞をトランスフェクトした。Ｓｆ９細胞は、抗生物質−抗カビ剤の０．５×濃度を含むＳｆ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地の２ｍｌ中、３５ｍｍのウェルあたり９×１０５細胞で接種し、そして２７℃で１時間付着させた。この時間の間に、５μｌのｂａｃｍｉｄＤＮＡを抗生物質なしの培地１００μｌ中に希釈し、６μｌのＣｅｌｌＦＥＣＴＩＮ試薬を抗生物質なしの培地１００μｌ中に希釈し、そして次にこの２つの溶液を穏やかに混合し、そして室温で３０分間インキュベートさせた。細胞を、抗生物質なしの培地で１回洗浄し、この培地を吸引し、そして次に０．８ｍｌの培地を脂質−ＤＮＡ複合体に添加し、そして細胞の上に重層した。細胞を２７℃で５時間インキュベートし、トランスフェクション培地を取り除き、そして抗生物質を含む２ｍｌの培地を添加した。細胞を、２７℃で７２時間培養し、そしてウイルスを細胞培養培地から回収した。
【０１８１】
ウイルスを、Ｓｆ９細胞が２×１０６細胞／ｍｌの５０ｍｌの培養に１．０ｍｌのウイルスを添加し、そして２７℃で７２時間インキュベートすることにより増幅した。ウイルスを、細胞培養培地から回収し、そしてこのストックを、Ｈｉｇｈ−Ｆｉｖｅ細胞中の種々のｃａｔＳ構築物を発現するために用いた。２×１０６細胞／ｍｌのＨｉｇｈ−Ｆｉｖｅ細胞の１Ｌの培養物を、約２のＭＯＩでウイルスに感染させ、そして７２時間インキュベートした。細胞を遠心分離によりペレット化し、そして上清液を２０ＬのＬｏａｄ緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾール）に対して透析し、濾過し、そしてＮｉ−ＮＴＡ（Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ  Ｎｉ−ＮＴＡ、Ｑｉａｇｅｎ）カラム上に１ｍｌ／分で添加し、Ｌｏａｄ緩衝液を用い２ｍｌ／分で洗浄し、そして５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾールで溶出した。
【０１８２】
（実施例１２）
（カスパーゼ１）
カスパーゼ１（受託番号ＳＷＳ  Ｐ２５７７４）は、その他のカスパーゼのように、不活性プロ形態として存在し、そしてタンパク質分解によって大サブユニットおよび小サブユニットにプロセッシングされ、それらは、次に、結合されて活性酵素になる。カスパーゼ１の重要な基質は、インターロイキン１（β）のプロ形態である。カスパーゼ１は、このサイトカインの活性形態を生成し、これは、炎症、敗血症性ショックおよび創傷治癒のようなプロセスで役割を演じる。さらに、活性カスパーゼ１は、アポトーシスを誘導し、そしてハンチントン病の進行で役割を演じる。カスパーゼ１の構造は、解明されている［１ＢＭＱ、Ｏｋａｍｏｔｏ、Ｙ．ら、Ｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｕｌｌ（Ｔｏｋｙｏ）、４７：１１−２１（１９９９）］。
【０１８３】
（ＩＬ−１３）
主に活性化Ｔｈ２細胞により産生されるＩＬ−１３（受託番号ＳＷＳ  Ｐ３５２２５）は、ＩＬ−４に構造的および機能的類似性を示す。ＩＬ−４のように、それは、Ｂ細胞による免疫グロブリンＥの分泌を増加し、そして寄生体の排除に関与する。さらに、ＩＬ−１３は、刺激された単球による、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−８を含むサイトカインの産生を下方制御する。ＩＬ−１３はまた、単球生存を延長し、単球の表面上のＭＨＣクラスＩＩおよびＣＤ２３の発現を増大し、そしてＢ細胞上のＣＤ２３の発現を増大する。さらに、ＩＬ−２とＩＬ−１３とは、インターフェロン−γ合成の調節において協力する。これらの影響に起因して、ＩＬ−１３は、アレルギーおよび喘息のような状態で役割を演じている。特に、１３０位における多形（Ｑ）は、喘息発症のリスクを増大する。ＩＬ−１３の構造は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって解明されている［１ＧＡ３、Ｅｉｓｓｅｎｍｅｓｓｅｒ、Ｅ．Ｚ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１０：２３１−２４１（２００１）］。
【０１８４】
（ＣＤ４０Ｌ）
ＣＤ４０Ｌ（受託番号ＳＷＳ  Ｐ２９９６５）は、膜貫通形態と、そしてまた活性なタンパク質分解によりプロセッシングされた細胞外可溶性形態との２つの形態で見出される。この膜貫通形態は、ＣＤ４＋Ｔリンパ球の表面上で発現される。ＴＮＦファミリーのその他のメンバーのように、それは、ホモ３量体の形態である。ＣＤ４０Ｌは、Ｂ細胞、上皮細胞、線維芽細胞、および平滑筋細胞の増殖を媒介する。ＣＤ４０Ｌの、Ｔ細胞上のＣＤ４０レセプターへの結合は、イソ型クラスのスイッチングおよび免疫グロブリン抗体産生の重要なシグナルを提供する。ＣＤ４０Ｌ中の欠陥は、ＩｇＭレベルの上昇、およびその他のすべての免疫グロブリンサブタイプにおける欠損に至り得る。ＣＤ４０Ｌに対するインヒビターは、自己免疫疾患および移植片拒絶の処置における使用を見出し得る。さらに、ＣＤ４０Ｌとそのレセプターとの間の低減された相互作用は、アルツハイマー病のマウスモデルにおけるタウリン酸化亢進の程度を低減する。ＣＤ４０Ｌの結晶構造は、解明されている［１ＡＬＹ、Ｋａｒｐｕｓａｓ、Ｍ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ３：１０３１−１０３９（１９９５）、ｅｒｒａｔｕｍ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ３：１０４６（１９９５）］。
【０１８５】
（ヒトＢ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ））
ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーであるＢＡＦＦ（受託番号ＳＷＳ  Ｑ９Ｙ２７５）は、ホモ３量体であり、そして膜貫通形態および可溶性形態の両方で見出される。膜貫通形態は、プロタンパク質転換酵素のフリン（ｆｕｒｉｎ）ファミリーによりプロセッシングされる。ＢＡＦＦは、インターフェロン−γにより上方制御され、そしてＰＭＡ／イオノマイシン処理により下方制御される。ＢＡＦＦは、３つの異なるレセプターに結合する。それが、Ｂ細胞特異的レセプター（ＢＡＦＦＲ）に結合するとき、それは、Ｂ細胞の生存およびＢ細胞応答を促進する。さらに、ＢＡＦＦおよび増殖誘導性リガンド（ＡＰＲＩＬ）の両方は、レセプター膜貫通アクティベーターおよびＣＡＭＬインターラクター（ＴＡＣＩ）およびＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に結合し、Ｔ細胞およびＢ細胞機能ならびに体液性免疫の刺激に応答性である２リガンド−２レセプター経路を形成する。ＢＡＦＦのインヒビターは、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および慢性関節リウマチ（ＲＡ）のような異常Ｂ細胞活性により特徴付けられる自己免疫疾患のための治療薬として供され得る。可溶性タンパク質の構造は入手可能である［１ＪＨ５、Ｌｉｕ、Ｙら、Ｃｅｌｌ、１０８：３８３−３９４（２００２）］。
【０１８６】
（腫瘍サプレッサーＰ５３）
腫瘍増殖を抑制し得る転写因子であるＰ５３（受託番号ＳＷＳ  Ｐ０４６３７）は、ホモ３量体としてＤＮＡを結合し、そしてセリン残基のリン酸化により活性化される。細胞型に依存して２つの腫瘍抑制の機構がある：増殖休止の誘導およびアポトーシスの活性化である。Ｐ５３は、遺伝子のセットの発現を調節することにより細胞増殖を制御する；例えば、それは、サイクリン依存性キナーゼのインヒビターの転写を増大する。アポトーシスは、ＢａｘまたはＦａｓ発現のｐ５３媒介刺激、またはＢｃｌ２発現の減少から生じる。Ｐ５３は、既知の癌の約６０％で変異または不活性化されており、そしてまたしばしば種々の腫瘍組織中で過剰発現される。ｐ５３の可逆的インヒビターは、従来の放射線療法および化学療法の付属物として用いられ得、処置およびその重篤な副作用の間に、正常組織への損傷を防ぐ。このようなインヒビターは、マウスを、腫瘍形成の促進なくして、放射線照射の致死用量から保護することが示された。Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ  ｍｄｍ２タンパク質に結合したヒトｐ５３の結晶構造がある［１ＹＣＱ、Ｋｕｓｓｉｅ、Ｐ．Ｈ．、ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：９４８−９５３（１９９６）］。
【０１８７】
（ｐ５３結合性タンパク質ＭＤＭ２）
ＤＮＡ損傷に応答して、ｐ５３は、タンパク質ｍｄｍ２（受託番号ＳＷＳ  Ｑ００９８７）の転写を増大する。ネガティブフィードバックの形態で、ｍｄｍ２は、２つの手段によりｐ５３誘導細胞周期休止およびアポトーシスを阻害する。第１は、ｍｄｗ２は、ｐ５３の転写活性化ドメインに結合し、その転写活性化活性を低減する。第２は、ユビキチンＥ１およびＥ２の存在下で、ｍｄｍ２は、それ自身およびｐ５３の両方のためのユビキチンタンパク質リガーゼＥ３として役に立つ。ｐ５３のユビキチン結合は、核から、それが破壊されるプロテオソームへの搬出を可能にする。アルターナティブスプライシングにより産生される８つのｍｄｍ２のイソ型がある。それらは、ｍｄｍ２、ｍｄｍ２−Ａ、ｍｄｍ２−Ａ１、ｍｄｍ２−Ｂ、ｍｄｍ２−Ｃ、ｍｄｍ２−Ｄ、ｍｄｍ２−Ｅ、およびｍｄｍ２−αである。これらのうちで、ｍｄｍ２−Ａ、ｍｄｍ２−Ｂ、ｍｄｍ２−Ｃ、ｍｄｍ２−Ｄ、およびｍｄｍ２−Ｅは、ヒト癌で観察されるが、正常組織では観察されない。ｍｄｍ２増幅はまた、軟組織肉腫、骨肉腫、およびグリオ芽細胞腫を含む、特定の腫瘍型で観察されている。これらの腫瘍は野生型ｐ５３をしばしば含む。ｍｄｍ２の低分子インヒビターは、野生型ｐ５３のプロアポトーシス活性を促進し得、そして癌治療における使用を見出す。ヒトｐ５３との複合体におけるＸｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ  ｍｄｍ２の構造が解明されている［１ＹＣＲ、Ｋｕｓｓｉｅ、Ｐ．Ｈ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：９４８−９５３（１９９６）］。
【０１８８】
（ＢＣＬ−Ｘ）
Ｂｃｌ−ｘ（受託番号ＳＷＳ  Ｑ０７８１７）は、タンパク質のＢｃｌ２ファミリーのメバーであり、そしてアルターナティブスプライシングにより産生される２つの主要なイソ型ｂｃｌ−ｘ（Ｌ）、ｂｃｌ−ｘ（Ｓ）を有する。長いソイ型ｂｃｌ−ｘ（Ｌ）は、長寿命の分裂後細胞中に見出され、そしてアポトーシスを阻害する。その一方、短いイソ型ｂｃｌ−ｘ（Ｓ）は、高い代謝速度をもつ細胞中で見出され、そしてアポトーシスを促進する。長いイソ型は、電圧依存性アニオンチャネル（ＶＤＡＣ）に結合することによりアポトーシスを阻害し、そしてミトコンドリア膜からのアポトーシスアクティベーターチトクロムｃの放出を防ぐ。この抗アポトーシス活性は、Ｂｃｌ−ｘ（Ｌ）のＢＨ４（ｂｃｌ−２相同性）に依存する；このタンパク質の他のＢｃｌ２ファミリーメンバーへの結合は、ＢＨ１およびＢＨ２ドメインに依存する。Ｂｃｌ−ｘ（Ｌ）の発現は、主に、大部分のリンパ腫の事例における腫瘍細胞により発現されることが観察されている。いくつかの細胞株におけるｂｃｌ−ｘ（Ｌ）発現の阻害は、アポトーシスを生じる。従って、その抗アポトーシス効果に起因して、ｂｃｌ−ｘ（Ｌ）は癌治療の標的である。興味深いことに、Ｂｃｌ−ｘ（Ｌ）の別のＢｃｌ２ファミリーメンバーであるプロアポトーシスタンパク質Ｂａｘへの結合は、アポトーシスの増加を生じる（以下を参照のこと）。Ｂｃｌ−ｘ（Ｌ）の結晶構造は解明されている［１ＭＡＺ、Ｍｕｃｈｍｏｒｅ、Ｓ．Ｗ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８１：３３５−３４１（１９９６）］。
【０１８９】
（ＢＡＸ）
Ｂａｘ［受託番号ＳＷＳ  Ｑ０７８１２（ＢＡＸα）；ＳＷＳ  Ｑ０７８１４（ＢＡＸβ）；ＳＷＳ  Ｑ０７８１５（ＢＡＸγ）；ＳＷＳ  Ｐ５５２６９（ＢＡＸδ）］は、抗アポトーシスタンパク質ｂｃｌ−ｘ（Ｌ）に結合し、チトクロムｃの放出を誘導し、そしてカスパーゼ３を活性化することによりアポトーシスを促進する。Ｂａｘは、アルターナティブスプライシングにより産生されたいくつかのイソ型を有し；いくつかは膜に結合し、そしてその他は細胞質にある。ＢａｘのＢＨ３ドメインは、抗アポトーシス性のＢｃｌ２ファミリーメンバーへのその結合に必要である。Ｂａｘ中の欠陥が、造血癌からのいくつかの細胞系統で観察されている。Ｂａｘアゴニストは癌治療で用いられ得、その一方、Ｂａｘインヒビターが、虚血、脊髄損傷、パーキンソン病およびアルツハイマー病から生じる神経細胞死を防ぐために用いられ得る。ＢＡＸのＮＭＲ構造が解明されている［１Ｆ１６、Ｓｕｚｕｋｉ、Ｍ．、ら、Ｃｅｌｌ  １０３：６５６−６５４（２０００）］。
【０１９０】
（ＣＤＣ２５Ａ）
ＣＤＣ２５Ａ（受託番号ＳＷＳ  Ｐ３０３０４）は、Ｍ期誘導ホスファターゼ１（ＭＰＩ１）としても知られる二重特異性ホスファターゼである。サイクリンＢにより誘導されて、ＣＤＣ２５Ａは、細胞周期の進行に必要であり、そして用量依存様式で有糸分裂を誘導する。ＣＤＣ２５は、ＣＤＣ２を脱リン酸化し、それによってその活性を減少させる。ＣＤＣ２５が、サイクリンＥとの複合体中のＣＤＫ２を脱リン酸化することがインビトロで示されている。ＣＤＣ２５の上昇したレベルは、制御されない細胞増殖の引き金となり得、そして乳癌患者中の増加する死亡率と関連している。活性化されたＣＤＣ２５Ａがまた、アルツハイマー病の脳の変性するニューロン中で観察されている。触媒コアの構造が解明されている［１Ｃ２５、Ｆａｕｍａｎ、Ｆ．Ｂ．、ら、Ｃｅｌｌ  ９３：６１７−６２５（１９９８）］。
【０１９１】
（ＣＤ２８）
ＣＤ２８（受託番号ＳＷＳ  Ｐ１０７４７）は、活性化Ｂ細胞およびＴ細胞のサブセット上で発現されるジスルフィド結合ホモ２量体膜貫通タンパク質である。このタンパク質は、３つのその他：Ｂ７−１、Ｂ７−２、およびＣＴＬＡ−４を結合し得る。ＣＤ２８の、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上に存在するＢ７−１およびＢ７−２との相互作用は、未処理Ｔ細胞活性化の同時刺激を生じ、その一方、同じＢ７−１およびＢ７−２分子のＣＴＬＡ−４との引き続く相互作用は、Ｔ細胞刺激の減衰に至る。ＣＤ２８関連シグナル伝達経路は、自己免疫疾患、対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）、移植片拒絶、および腫瘍に対する免疫の促進のための重要な治療標的である。ＣＤ２８の構造は現在まで解明されていない。
【０１９２】
（Ｂ７）
２つのＢ７タンパク質：ＣＤ８０としても知られるＢ７−１（受託番号ＳＷＳ  Ｐ３３６８１）、およびＣＤ８６としても知られるＢ７−２（受託番号ＳＷＳ  Ｐ４２０８１）がある。両者は、活性化Ｂ細胞上で発現される、高度にグルコシル化された膜貫通タンパク質である。免疫応答における初期事象は、これら分子のＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４（上記を参照のこと）との相互作用により制御される。従って、Ｂ７−１とＢ７−２とは、自己免疫疾患を処置する治療の顕著な標的を形成する。ＣＴＬＡ−４との複合体中のＢ７−１の構造に［１Ｉ８Ｌ、Ｓｔａｍｐｅｒ、Ｃ．Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ４１０：６０８−６１１（２００１）］に加え、Ｂ７−１の可溶性形態の構造が解明されている［１ＤＲ９、Ｉｋｅｍｉｚｕ、Ｓ．、ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １２：５１−６０（２０００）］。さらに、ＣＴＬＡ−４との複合体中のＢ７−２の構造が解明されている［１Ｉ８５、Ｓｃｈｗａｒｔｚ、Ｊ．−Ｃ．Ｄ．、ら、Ｎａｔｕｒｅ  ４１０：６０４−６０８（２００１）］。
【０１９３】
（Ｃ５Ａ）
免疫系は、一部に、補体カスケードを含み、これは、２０を超えるタンパク質のセットである。Ｃ５ａは、これら補体タンパク質の１つであり；それは、Ｃ５のサイトカイン様活性化産物である。Ｃ５ａは炎症を行い、そして詳細には、細菌感染に応答して好中球の召集で役割を有している。血液を通じる細菌毒素の生命を脅かす拡散である敗血症では、好中球がこの補体タンパク質の過剰量に過剰に曝されることに起因して、Ｃ５ａの効果が消耗する。さらに、Ｃ５ａレセプター（受託番号ＳＷＳ  Ｐ２１７３０）の発現レベルは、敗血症の間に特定の生存器官中で増加する。したがって、Ｃ５ａおよびＣ５ａレセプターの阻害は、敗血症の処置を支援し得る。Ｃ５ａのインヒビターはまた、最も一般的な自己免疫水泡形成疾患である、水疱性類天疱瘡の処置で用いられ得る。Ｃ５ａの別の効果は、Ａｂｅｔａペプチドとのその相乗作用であり、ヒトマクロファージ様ＴＨＰ−１細胞中のＩＬ−１およびＩＬ−６の分泌を促進する；従って、Ｃ５ａは、アルツハイマー病の病因に関連し得る。Ｃ５ａの構造は、ＮＭＲにより解明されているが［１ＫＪＳ、Ｚｈａｎｇ、Ｘ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ２８：２６１−２６７（１９９７）］、現在まで、Ｃ５ａレセプターの構造はない。
【０１９４】
（ＡＫＴ）
Ａｋｔは、増殖因子レセプターのシグナル伝達経路の重要な成分である。３つの高度に関連したＡｋｔ遺伝子（Ａｋｔ１〜３）（受託番号ＳＷＳ  Ｐ３１７４９、Ａｋｔ１；ＳＷＳ  Ｐ３１７５１、Ａｋｔ２；ＳＷＳ  Ｑ９Ｙ２４３）があり、これらは、互いに補償効果を示す。しかし、それらは異なる発現パターンを有し、各々がまた、特有の機能を有し得ることを示唆する。各Ａｋｔは、複数残基のリン酸化により活性化され、そしてキナーゼＩＬＫにより活性化される。活性化ＡｋｔのＰＩ３Ｋ（ホスファチジルイノシトール３キナーゼ）への結合は、活性Ａｋｔの原形質膜への転座を生じる。Ａｋｔは、細胞生存を導く多面発現性効果を有する。さらに、Ａｋｔ増幅およびＡｋｔの上昇したレベルがいくつかの癌で見出されている。ＰＫＢ−βとしても知られるＡｋｔ２のキナーゼドメインの結晶構造が、最近得られた［Ｙａｎｇ、Ｊ．、ら、Ｍｏｌｅｃｕａｌｒ  Ｃｅｌｌ  ９：１２２７−１２４０（２００２）］。
【０１９５】
（ＣＤ４５）
ＣＤ４５（受託番号ＳＷＳ  Ｐ０８５７５）は、白血球の原形質膜中に主に位置するレセプタータンパク質チロシンホスファターゼである；それは、その重要性が現在未知である細胞外ドメインが異なるいくつかのイソ型を有する。ＣＤ４５の基質は、キナーゼｌｙｃ、ｆｙｎ、およびその他のｓｒｃキナーゼを含む。さらに、ＣＤ４５は、リンパ球ホスファターゼ関連タンパク質（ＬＰＡＰ）との非共有結合的相互作用に従事する。ＣＤ４５は、Ｔ細胞よびＢ細胞上の抗原レセプターを通じる活性化に重要であり、そしてまたその他の白血球における抗原媒介活性化のためにも重要であり得る。ＣＤ４５の２量体化は、その機能を無効にする。ＣＤ４５のインヒビターは、同種移植片拒絶を防ぐために用いられ得る。現在までＣＤ４５の構造はない。
【０１９６】
（チロシンキナーゼ型細胞表面レセプターＨＥＲ２）
ＨＥＲ−２（受託番号ＳＷＳ  Ｐ０４６２６）は、そうでなければＥｒｂＢ２としても知られ、これは、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１）に関連するレセプターチロシンキナーゼである。単離されたＨＥＲ−２に対する既知のリガンドはないけれども、ＨＥＲ−２が、ＥｒｂＢファミリーの他のメンバー、すなわち、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４と２量体化するとき、この２量体複合体は、多くのリガンドに結合し得る。結合は、どのＥｒｂＢタンパク質がヘテロダイマー中に存在するかに依存するが、これらのリガンドは、ヘレグリン、ＥＧＦ、ベタセルリン（ｂｅｔａｃｅｌｌｕｌｉｎ）、およびＮＲＧを含む。リガンド結合は、ＨＥＲ−２のリン酸化を増大し、そして次の細胞内シグナル伝達ステップを行う。ＨＥＲ−２は、しばしば乳癌細胞中で過剰発現され、そしてこの過剰発現は、それらの増殖を媒介し得る。ＨＥＲ−２を過剰発現する乳癌細胞はまた、ＨＥＲ−２インヒビターにより応答性である。ＨＥＲ−２はまた、卵巣、前立腺、肺、ファローピウス管、骨肉腫、小児期髄質芽細胞腫のようなその他の多くの癌に関与している。このレセプターの構造は、いまだ解明されていない。
【０１９７】
（ヒトグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＧ−３））
ＧＳＫ−３（受託番号ＳＷＳ  Ｐ４９８４０、ＧＳＫ−３α；ＳＷＳ  Ｐ４９８４１、ＧＳＫ−３β）は、Ｍｙｂ、グリコーゲンシンターゼ、およびｃ−ｊｕｎのホルモン制御に関連している。ｃ−ｊｕｎのＧＳＫ−３によるリン酸化は、ＤＮＡに対するｃ−ｊｕｎの親和性を低減する。さらに、ＧＳＫ−３は、ＩＬＫ−１およびＡｋｔ−１によりリン酸化される。Ａｋｔ１によるリン酸化は、ＧＳＫ−３の触媒活性の阻害を引き起こし、これは、通常、サクリンＤをリン酸化し、それによって、破壊のためにサイクリンＤを標的にする。増加したＧＳＫ−３活性は、糖尿病患者からの組織で見出されており、インシュリン耐性の発症におけるその役割と一致している。さらに、ＧＳＫ−３βは、アルツハイマー病の脳で過剰発現し、そしてこの過剰発現は、この疾患の特徴である、タウタンパク質超リン酸化をともなう。最後に、リチウムのようないくつかの気分安定化薬物の効果は、ＧＳＫの阻害により媒介されるようである。したがって、ＧＳＫ−３インヒビターは、いくつかの神経賦活性薬物の有効性を増大し得る可能性がある。ＧＳＫ−３βについて利用可能な構造がある［１Ｈ８Ｆ、Ｄａｊａｎｉ、Ｒ．、ら、Ｃｅｌｌ  １０５：７２１−７３２（２００１）］。
【０１９８】
（α−Ｅ／β−７）
タンパク質複合体α−Ｅ／β−７は、リンパ球移動およびホーミングで役割を演じる膜貫通インテグリンである。詳細には、この複合体は、Ｅ−カドヘリンのレセプターとして供される。α−Ｅ（受託番号ＳＷＳ  Ｐ３８５７０）は、２つのサブユニットαおよびβから構成されており、αサブニユットそれ自身がジスルフィド結合により連結された軽鎖および重鎖から構成される。同様に、β−７（受託番号ＳＷＳ  Ｐ２６０１０）もまたαおよびβサブユニットから構成されている。このα−Ｅ／β−７複合体は、通常、粘膜上皮細胞層への上皮内Ｔリンパ球の接着を媒介する；それはまた、非ホジキンリンパ腫の播種で役割を演じている。さらに、炎症の可能な機構は、腸上皮から身体の他の部分へのリンパ球の移動を含む。α−Ｅ／β−７レベルにおける変化は、種々の疾患で観察されている。このインテグリンの上昇したレベルは、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）をもつ患者中、間質性肺疾患をもつ患者の肺上皮中、および慢性関節リウマチをもつ患者の滑液中で観察され得る。α−Ｅ／β−７発現の改変されたパターンが、クローン病をもつ患者で観察されており、そしてこの複合体に対する抗体が、マウスモデルにおいて免疫誘導された大腸炎を予防することが示された。それ故、この複合体に対するインヒビターは、炎症、特に粘膜炎症の処置に価値が存在し得る。α−Ｅ／β−７について利用可能な構造はない。
【０１９９】
（組織因子）
ヒト組織因子（受託番号ＳＷＳ  Ｐ１３７２６）は、トロンボプラスチンとしても知られ、血管外細胞表面に通常位置する内在性膜貫通タンパク質である。皮膚への損傷に際し、組織因子は血液に曝され、そして第ＶＩＩＡ因子として知られる（以下を参照のこと）凝固酵素第ＶＩＩ因子の活性形態と複合体化する。組織因子は、凝固第ＶＩＩ因子の不活性形態および活性形態の両方に結合し、そして凝固カスケードを起こすことにおいて、第ＶＩＩＡ因子の必須のコファクターである。さらに、組織因子は、血栓症において主要な役割を演じているので、この因子の阻害は、アテローム性動脈硬化症、動脈閉塞、発作、および心筋梗塞のような血栓症の臨床発症のリスクを低減することが予期され得る。組織因子の細胞外ドメインの構造が解明されている［２ＨＦＴ、Ｍｕｌｌｅｒ、Ｙ．Ａ．、ら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２５６：１４４−１５９（１９９６）］。
【０２００】
（第ＶＩＩ因子）
第ＶＩＩ因子（受託番号ＳＷＳ  Ｐ０８７０９）は、セリン凝固第ＶＩＩａ因子のチモーゲン（不活性前駆体）形態である。このプロテアーゼの９９％以上は、不活性な一本鎖形態で循環し；いくつかの因子の１つによるＡｒｇ−Ｉｌｅペプチド結合の切断に際し、活性な２鎖形態が生成される。この２鎖形態は、ジスルフィド結合により連結された重鎖および軽鎖を含む。ビタミンＫに依存する、第ＶＩＩ因子のＧｌｕ残基の酵素的カルボキシル化は、このタンパク質をカルシウムに結合するようにする。カルシウムおよびコファクターヒト組織因子（上記を参照のこと）の存在下で、第ＶＩＩａ因子は、第Ｘ因子および第ＩＸ因子を切断し、それらの個々の活性形態を生成し、これは凝固カスケードを広める。第ＶＩＩ因子における欠陥は、放血障害に至り得、ここで、組換え第ＶＩＩａ因子が処置としての使用を見出す。逆に、第ＶＩＩ遺伝子のいくつかの多形は、心筋梗塞の増加したリスクをともない、これは、しばしば、血餅によって引き起こされる。第ＶＩＩ因子インヒビターは、心臓疾患を防ぐことにおいて使用を見出すことが予期される。阻害性ペプチドと複合体化した第ＶＩＩ因子のチモーゲン形態の構造が解明されている［１ＪＢＵ、Ｅｉｇｅｎｂｒｏｔ、Ｃ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ９：６２７−６３６（２００１）］。
【図面の簡単な説明】
【０２０１】
【図１】図１は、標的がタンパク質であって共有結合がジスルフィドである係留方法の１つの実施形態を模式的に図示する。チオール含有タンパク質は、複数のリガンド候補と反応させられる。その標的に対して固有の結合親和性を保有するリガンド候補が同定され、そして同定された結合決定基（丸で表される）を含むリガンドが作製される。
【図２Ａ】図２は、係留実験の代表例である。図２Ａは、ＴＳとの結合親和性がほとんどまたは全くない１０個の異なるリガンド候補のプールを用いたチミジル酸シンターゼ（「ＴＳ」）の反応の逆重畳された質量スペクトルである。
【図２Ｂ】図２は、係留実験の代表例である。図２Ｂは、リガンド候補のうちの１つが、この酵素に対する固有の結合親和性を有する、１０個の異なるリガンド候補のプールを用いたＴＳの反応の逆重畳された質量スペクトルである。
【図３Ａ】図３は、各々システインになるように変異した残基の分布パターンの３つの例示的な例を示す。図３Ａは、これらの残基がほぼ１つの目的の部位に分布している例である。この構造は、ＨＩＶインテグラーゼのコアドメインのものであり、目的の部位を含む部分に暗灰色に影をつけている。
【図３Ｂ】図３は、各々システインになるように変異した残基の分布パターンの３つの例示的な例を示す。図３Ｂは、これらの残基がほぼ２つの目的の部位に分布している例である。この構造は、ヒトインターロイキン−１レセプターのものであり、目的の２つの部位を含む部分に暗灰色に影を付けている。
【図３Ｃ】図３は、各々システインになるように変異した残基の分布パターンの３つの例示的な例を示す。図３Ｃは、これらの残基が、タンパク質の表面全体に分布している例である。この構造は、ヒトＴＮＦ−αの三量体構造である。
【図４Ａ】図４Ａは、β−シートにおけるシステインの側鎖回転異性体を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、α−ヘリックスにおけるシステインの側鎖回転異性体を示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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