(57)【要約】本発明は、破壊されたＳＣＡ２遺伝子を有する変異体非ヒト哺乳動物、特に破壊されたＳＣＡ２遺伝子を有する変異体マウスを提供する。本発明はまた、肥満または記憶障害の処置における使用のための治療剤を同定する方法を提供し、この方法は、破壊されたＳＣＡ２遺伝子を有する変異体非ヒト哺乳動物に化合物を投与する工程、および減少した肥満についてこの変異体非ヒト哺乳動物をスクリーニングし、それによって肥満の処置における使用のための治療剤を同定する工程による。【特許請求の範囲】
【請求項１】
破壊されたＳＣＡ２遺伝子を有する、変異体非ヒト哺乳動物。
【請求項２】
前記非ヒト哺乳動物がマウスである、請求項１に記載の変異体非ヒト哺乳動物。
【請求項３】
前記マウスが、前記ＳＣＡ２遺伝子の破壊についてホモ接合体である、請求項２に記載の変異体マウス。
【請求項４】
前記マウスが、前記ＳＣＡ２遺伝子の破壊についてヘテロ接合体である、請求項２に記載の変異体マウス。
【請求項５】
前記ＳＣＡ２遺伝子が、該ＳＣＡ２のエキソン１を含むＤＮＡ構築物を使用する相同組換えによって破壊される、請求項２に記載の変異体マウス。
【請求項６】
選択マーカーが、前記ＳＣＡ２遺伝子のエキソン１に挿入される、請求項５に記載の変異体マウス。
【請求項７】
前記選択マーカーが、ネオマイシン耐性遺伝子を含む、請求項５に記載の変異体マウス。
【請求項８】
請求項５に記載の変異体マウスであって、該変異体マウスが、以下：
（ａ）肥満；
（ｂ）記憶障害；
（ｃ）ペルオキシレドキシン−２、３−オキソ酸ＣｏＡトランスフェラーゼ、ステアロイル−ＣｏＡデサチュラーゼＩ、核因子１−ＸおよびＥＳＴ  ＡＡ００２８４３、からなる群より選択される遺伝子の発現の減少；ならびに
（ｄ）不活性Ｘ特異的転写物、赤血球分化調節因子、核リボ核タンパク質ＬおよびＥＳＴ  ＡＷ２５８８４２からなる群より選択される遺伝子の発現の増加、
からなる群より選択される変異体ＳＣＡ２表現型を示す、変異体マウス。
【請求項９】
請求項１に記載の非ヒト哺乳動物から単離された、非ヒト哺乳動物細胞。
【請求項１０】
前記細胞がマウス細胞である、請求項９に記載の非ヒト哺乳動物細胞。
【請求項１１】
前記マウスが、前記ＳＣＡ２遺伝子の破壊についてホモ接合体である、請求項１０に記載のマウス細胞。
【請求項１２】
前記マウスが、前記ＳＣＡ２遺伝子の破壊についてヘテロ接合体である、請求項１０に記載のマウス細胞。
【請求項１３】
挿入された選択マーカー配列を有するＳＣＡ２遺伝子のエキソン１を含む、ＤＮＡ構築物。
【請求項１４】
前記選択マーカー配列が、ネオマイシン耐性遺伝子を含む、請求項１３に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１５】
請求項１３に記載のＤＮＡ構築物を含む、ベクター。
【請求項１６】
請求項１３に記載のＤＮＡ構築物を含む、胚性幹細胞。
【請求項１７】
請求項１３に記載のＤＮＡ構築物を含む、単離された非ヒト哺乳動物細胞。
【請求項１８】
前記細胞がマウス細胞である、請求項１に記載の非ヒト哺乳動物細胞。
【請求項１９】
前記細胞が胚性幹細胞である、請求項１８に記載のマウス細胞。
【請求項２０】
破壊されたＳＣＡ２遺伝子を有する変異体マウスであって、該ＳＣＡ２遺伝子は、該ＳＣＡ２遺伝子のエキソン１を含むＤＮＡ構築物を使用する相同組換えによって破壊され、そして該マウスは、変異体ＳＣＡ２表現型を示す、変異体マウス。
【請求項２１】
前記変異体ＳＣＡ２表現型が肥満である、請求項２０に記載の変異体マウス。
【請求項２２】
前記変異体ＳＣＡ２表現型が記憶障害である、請求項２０に記載の変異体マウス。
【請求項２３】
請求項２０に記載の変異体マウスであって、前記変異体ＳＣＡ２表現型が、ペルオキシレドキシン−２、３−オキソ酸ＣｏＡトランスフェラーゼ、ステアロイル−ＣｏＡデサチュラーゼＩ、核因子１−ＸおよびＥＳＴ  ＡＡ００２８４３、からなる群より選択される遺伝子の発現の減少である、変異体マウス。
【請求項２４】
請求項２０に記載の変異体マウスであって、前記変異体ＳＣＡ２表現型が、不活性Ｘ特異的転写物、赤血球分化調節因子、核リボ核タンパク質ＬおよびＥＳＴ  ＡＷ２５８８４２からなる群より選択される遺伝子の発現の増加である、変異体マウス。
【請求項２５】
請求項２０に記載の変異体マウスから単離された細胞であって、該細胞は、前記ＳＣＡ２遺伝子のエキソン１を含むＤＮＡ構築物を使用する相同組換えによって破壊されたＳＣＡ２遺伝子を含む、単離された細胞。
【請求項２６】
挿入されたネオマイシン耐性遺伝子を有するＳＣＡ２遺伝子のエキソン１を含むＤＮＡ構築物を含む、胚性幹細胞。
【請求項２７】
肥満の処置における使用のための治療剤を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）請求項１に記載の変異体非ヒト哺乳動物に化合物を投与する工程；および
（ｂ）減少した肥満について該変異体非ヒト哺乳動物をスクリーニングし、それによって肥満の処置における使用のための治療剤を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２８】
前記非ヒト哺乳動物がマウスである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記マウスが、前記ＳＣＡ２遺伝子の破壊についてホモ接合体である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記マウスが、前記ＳＣＡ２遺伝子の破壊についてヘテロ接合体である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
肥満の処置における使用のための治療剤を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）請求項２１に記載の変異体マウスに化合物を投与する工程；および
（ｂ）減少した肥満について該変異体マウスをスクリーニングし、それによって肥満の処置における使用のための治療剤を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項３２】
記憶障害の処置における使用のための治療剤を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）請求項１に記載の変異体非ヒト哺乳動物に化合物を投与する工程；および
（ｂ）減少した記憶障害について該変異体非ヒト哺乳動物をスクリーニングし、それによって記憶障害の処置における使用のための治療剤を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項３３】
前記非ヒト哺乳動物がマウスである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記マウスが、前記ＳＣＡ２遺伝子の破壊についてホモ接合体である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記マウスが、前記ＳＣＡ２遺伝子の破壊についてヘテロ接合体である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
記憶障害の処置における使用のための治療剤を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）請求項２２に記載の変異体マウスに化合物を投与する工程；および
（ｂ）減少した記憶障害について該変異体マウスをスクリーニングし、それによって記憶障害の処置における使用のための治療剤を同定する工程、
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、神経生物学の分野に関し、より詳細には、ノックアウトマウスモデルに関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
遺伝性運動失調は、小脳および小脳経路の機能不全または病理に帰せられる種々の平衡異常により特徴付けられる、複合した神経変性障害群である。これらの障害の多くにおいて、機能不全または構造異常は、小脳の上に広がり、そして脳幹神経節機能、動眼神経障害および神経障害に関与し得る。優性脊髄小脳性運動失調（ＳＣＡ）は、家族症例の有病率が約１００，０００分の１である、不均質な障害群を示す。
【０００３】
種々の遺伝子および表現型が、神経変性疾患ファミリー（ＳＣＡ１、ＳＣＡ２、マチャド‐ジョセフ病（ＳＣＡ３）、ＳＣＡ６、ＳＣＡ７、ハンティングトン病、脊髄延髄筋萎縮、および歯状核赤核淡蒼球萎縮（ｄｅｎｔａｔｏｒｕｂｒａｌ  ｐａｌｌｉｄｏｌｕｙｓｉａｎ  ａｔｒｏｐｈｙ）を含む）と関連することが同定されている。これらの疾患は、個々の疾患遺伝子によりコードされるタンパク質中のポリグルタミン（ポリＱ）トラクトの拡大と関連する。
【０００４】
正常なヒト脳および罹患したヒト脳の研究は、ポリＱ関連疾患の病理に重要な洞察を提供し得るが、そのような観察は、疾患プロセスの末期段階に限定される。マウスモデルは、この問題を回避し得るが、ヒトポリＱ疾患の多くのマウスモデルは、神経変性を生じるために短縮構築物または非常に長いポリＱトラクトの使用に依存する（Ｉｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１３：１９６〜２０２（１９９６）；Ｍａｎｇｉａｒｉｎｉら、Ｃｅｌｌ  ８７：４９３〜５０６（１９９６）；Ｍａｎｇｉａｒｉｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１５：１９７〜２００（１９９７）；Ｄａｖｉｅｓら、Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ  Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．３５４：９８１〜９８９（１９９９））。さらに、いくつかのポリＱマウスモデルは、ヒトポリＱ疾患を規定する特徴である、顕著なニューロン損失を示さない。さらに、これらの神経変性疾患に関連する遺伝子の機能を理解することが、重要である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
従って、神経変性疾患に関連する遺伝子の機能の非ヒト動物モデル、およびこれらの遺伝子に関連する状態を処置するために有用な治療剤を同定する方法についての必要性が、存在する。本発明は、これらの必要性を満たし、そして関連する利点も提供する。
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、破壊されたＳＣＡ２遺伝子を有する変異体非ヒト哺乳動物を提供し、特に、破壊されたＳＣＡ２遺伝子を有する変異体マウスを提供する。本発明はまた、肥満の処置における使用または記憶障害の処置における使用のための治療剤を同定する方法を提供し、この方法は、破壊されたＳＣＡ２遺伝子を有する変異体非ヒト哺乳動物に化合物を投与する工程；および減少した肥満についてその変異体非ヒト哺乳動物をスクリーニングし、それによって肥満の処置における使用のための治療剤を同定する工程；による。
【０００７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、破壊されたＳＣＡ２遺伝子を有する変異体非ヒト哺乳動物を提供し、特に、ＳＣＡ２ノックアウトマウスを提供する。このＳＣＡ２変異体ノックアウトは、成体としての肥満と、損なわれた記憶機能とを示す。破壊されたＳＣＡ２遺伝子を有する変異体非ヒト哺乳動物は、アタキシン２（ａｔａｘｉｎ−２）の機能を同定するため、ＳＣＡ２遺伝子によりコードされるポリペプチドを同定するため、ならびに肥満または記憶障害を処置する際に使用するための治療剤を同定するために、有用である。
【０００８】
脊髄小脳性運動失調２型（ＳＣＡ２）は、不安定なＣＡＧ反復の拡大により引き起こされる、常染色体優性神経変性疾患である（Ｐｕｌｓｔら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１４：２６９〜２７６（１９９６）；Ｓａｎｐｅｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１４：２７７〜２８４（１９９６）；Ｉｍｂｅｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１４：２８５〜２９１（１９９６））。ＳＣＡ２遺伝子の遺伝子産物であるアタキシン２は、分子量１２０ｋＤａを有する１３１２アミノ酸残基のタンパク質である。ほとんどの正常な対立遺伝子は、グルタミンをコードする２２個または２３個のＣＡＧ反復を含み、これらのＣＡＧ反復に、プロリンリッチドメインおよびセリンリッチドメインの領域が隣接する一方、疾患対立遺伝子は、３４個のＣＡＧ反復〜６４個のＣＡＧ反復の範囲である。
【０００９】
アタキシン２のマウスホモログは、そのヒトタンパク質とアミノ酸レベルで９１％同定であり９２％類似する（Ｎｅｃｈｉｐｏｒｕｋら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．７：１３０１〜１３０９（１９９８））。しかし、このマウスホモログは、ヒトポリＱトラクトの部位に１つのグルタミンしか含まない。このことは、アタキシン２の正常な機能は、ＣＡＧ反復に依存しないことを示唆する。非ヒト霊長類における多くのポリＱタンパク質の相同性遺伝子は、ＣＡＧ反復を含むが、これらは、かなり短い（Ｄｉｊａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：４１７〜４２１（１９９６））。ｃＤＮＡの配列分析は、この遺伝子が、異なる５つの哺乳動物種およびニワトリにおいて高度に保存されていることを示す。他のホモログが、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、ＸｅｎｏｐｕｓおよびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ中に存在する。ＲＮＡ干渉を使用して、このＣ．ｅｌｅｇａｎｓのａｔｘ−２遺伝子が、早期胚発生において必須の役割を有することが示された（Ｋｉｅｈｌら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５：２３１〜２４１（２０００））。この虫の遺伝子は、神経系、腸管壁、体壁筋および生殖系列において発現される。
【００１０】
アミノ酸２５６〜４０５に広がる酸性ドメイン以外は、アタキシン２は、高度に塩基性のほぼ非球状のタンパク質である。いくつかの機能性エレメントが、この十分に保存されたドメインにおいて同定された（ＲＮＡスプライシングモチーフＳｍ１／Ｓｍ２を含む）（Ｎｅｕｗａｌｄら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７６：３〜５（１９９８））。これらは、スプライセオソーム低分子リボ核タンパク質（ｓｎＲＮＰ）の中心的エレメントであるＳｍタンパク質の特徴であり、これは、タンパク質−タンパク質相互作用に関与し、おそらくタンパク質−ＲＮＡ相互作用に関与すると考えられている（Ｈｅｒｍａｎｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：２０７６〜２０８８（１９９５））。このアタキシン２配列はまた、アミノ酸残基３９７〜４００に、アポパインについてのコンセンサス切断部位ＤＸＸＤ（Ｓａｎｐｅｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１４：２７７〜２８４（１９９６））を含む。ハンティングトン病に関する研究（Ｇｏｌｄｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１３：４４２〜４４９（１９９６））は、アポパインによる切断率が、ポリグルタミントラクトの長さとともに増加し、そして神経毒性における切断産物と関係することを示す。この配列中に存在する別の推定モチーフは、ＥＲ脱出シグナルである。
【００１１】
酵母ツーハイブリッドスクリーニングを使用するアタキシン２の相互作用パートナーについての探索は、アタキシン２結合タンパク質１（ａｔａｘｉｎ−２−ｂｉｎｄｉｎｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ  １）（Ａ２ＢＰ１）（Ｓｈｉｂａｔａら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．９：１３０３〜１３（２０００））の発見をもたらした。このＡ２ＢＰ１は、アタキシン２のＣ末端に結合する。これらのタンパク質の関係は、共免疫沈降、細胞成分分画、および免疫蛍光（Ｓｈｉｂａｔａら、前出）、および成体マウスおよび胎児マウスにおける相同性によって調査された。最近、ヒトポリＡ結合タンパク質のＣ末端の溶液構造が、同定され（Ｋｏｚｌｏｖら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：４４０９〜４４１３（２００１））、そして結合ペプチドのコンセンサス配列が、規定された。このコンセンサスと一致するタンパク質は、アタキシン２およびＡ２ＲＰであった。興味深いことに、Ａ２ＢＰ１は、種々の生物におけるポリＡ結合タンパク質と顕著な相同性を有する（Ｍａｎｇｕｓら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：７３８３〜９６（１９９８）；Ｓｈｉｂａｔａら（前出））を有する。
【００１２】
ＳＣＡ２  ｍＲＮＡは、成体マウスの種々の組織において、特に脳において発現され、心臓、筋肉、腸、脾臓、肝臓、腎臓、および肺においても発現される。対照的に、ＳＣＡ２  ｍＲＮＡは、ヒト腎臓およびヒト肺において、ほとんど見出されないかまたは全く見出されない（Ｐｕｌｓｔら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１４：２６９〜２７６（１９９６））。マウス全胚の総ＲＮＡ抽出物は、高レベルのＳＣＡ２  ｍＲＮＡを含み、これは、在胎８日目から在胎１６日目まで増加する（Ｎｅｃｈｉｐｏｒｕｋら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．７：１３０１〜１３０９（１９９８））。３つの選択的ＳＣＡ２  ｍＲＮＡ転写物が、同定されている。
【００１３】
ＳＣＡ２遺伝子によりコードされるタンパク質（アタキシン２と呼ばれる）は、成体マウス脳のニューロン細胞（例えば、大錐体ニューロン）および海馬部分集団、視床部分集団、および視床下部部分集団（Ｎｅｃｈｉｐｏｒｕｋら（前出））ならびに小脳プルキンエ細胞）ＳＣＡ２神経変性の主要部位）において強力に発現される。非ニューロン組織もまた、特に心臓および骨格筋において高レベル発現を示す。アタキシン２は、マウス胚形成の８日目程度の早期に発現される。成体マウスＡ２ＢＰ１および胎児マウスＡ２ＢＰ１に関する組織発現データは、アタキシン２に関するデータと同一である。妊娠８日目と１０日目との間で、これらのタンパク質は、心臓および間葉に存在するが、原始神経系には存在しない。しかし、１１日目に始まって、脊髄および脳において両方のタンパク質の迅速な増加が存在する。アタキシン２は、正常な脳において細胞質局在を有し、プルキンエ細胞ならびに特定の脳幹ニューロンおよび皮質ニューロン群において発現される（Ｈｕｙｎｈら（前出）；Ｓｈｉｂａｔａら（前出））。これらの研究はまた、トランスゴルジネットワークのマーカーを含むこれらのタンパク質の共存を示した。
【００１４】
アタキシン２の正常な機能を解明するために、本明細書中に開示されるように、相同組換えによりＳＣＡ２遺伝子中で標的化欠失されたマウスモデルが作製された。ノーザンブロットによって、その標的化対立遺伝子についてホモ接合体のマウスにおいてＳＣＡ２転写物が存在しないことが確認された。そしてウェスタンブロットによって、免疫反応性タンパク質が存在しないことが確認された。発生の間のアタキシン２の広範な発現にも関わらず、ＳＣＡ２−／−マウスは生存可能であった。そしてこのマウスは、明らかな欠損も移動性の増加も有さない。若齢野生型（ＷＴ）マウスおよびヌル接合型（ｎｕｌｌｉｚｙｇｏｕｓ）ＳＣＡ２ノックアウト（ＫＯ）マウスの詳細な巨視的分析および顕微分析によって、大きな差異は示されなかった。しかし、老齢のＫＯマウスは、顕著な肥満を示し、そして記憶の減損を示した。
【００１５】
本発明は、変異体ＳＣＡ２遺伝子を含む変異体非ヒト哺乳動物を提供する。本明細書中に開示される場合、「変異体」とは、遺伝子変化を指し、例えば、核酸またはコードされるポリペプチドの変異体形態とは、その核酸が、親核酸（例えば、その核酸の野生型形態）と比較して遺伝子改変を含むことを意味する。同様に、動物に関して使用される場合、「変異体」とは、遺伝子改変された動物を指す。その遺伝子改変は、「トランスジェニック」動物を生じる、遺伝子の挿入であり得る。本明細書中で使用される場合、トランスジェニック動物に関して使用される場合、「トランスジーン（導入遺伝子）」とは、正常な遺伝子としての機能、複製、および伝達を保証する様式で動物の生殖系列中に挿入される、遺伝子を指す。その遺伝子改変はまた、「ノックアウト」動物を生じる、遺伝子の欠失または破壊であり得る。「ノックアウト」変異体動物とは、細胞における内因性ＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質の少なくとも一部の発現の部分的抑制または完全な抑制を指す。同様に、破壊された遺伝子は、その遺伝子の完全な抑制または部分的な抑制を生じる。
【００１６】
本発明の変異体動物は、任意の非ヒト哺乳動物（例えば、マウス）であり得る。変異体動物はまた、例えば、他の非ヒト哺乳動物（例えば、ラット、ウサギ、ヤギ、ブタ、モルモット、ヒツジ、ウシ）、非ヒト霊長類または任意の非ヒト哺乳動物であり得る。ＳＣＡ２変異体を発現する変異体動物（例えば、本明細書中に開示されるような、ＳＣＡ２ノックアウト動物）または本明細書中に開示されるアタキシン２変異体マウスに加えて他の変異体形態のＳＣＡ２を発現する変異体動物が、本発明の方法において使用され得ることが、理解される。
【００１７】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、２アミノ酸以上のペプチドまたはポリペプチドを指すことが意図される。用語「ポリペプチドアナログ」とは、本明細書中に特に記載される配列と実質的に同じアミノ酸配列を有する任意のポリペプチドを包含し、このアミノ酸配列において、１つ以上の残基が、機能的に類似の残基で保存的置換されており、そしてこのアミノ酸配列は、本明細書中に記載されるようなアタキシン２ポリペプチドを機能的に模倣する能力を示す。アタキシン２ポリペプチドの「改変」はまた、アタキシン２ポリペプチドアミノ酸配列の保存的置換を包含する。コードされるアミノ酸の保存的置換としては、例えば、以下の群中に属するアミノ酸が挙げられる：（１）非極性アミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅ）；（２）極性中性アミノ酸（Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、およびＧｌｎ）；（３）極性酸性アミノ酸（ＡｓｐおよびＧｌｕ）；（４）極性塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓ）ならびに（５）芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ，Ｔｒｐ，およびＨｉｓ）。他のわずかな改変は、そのポリペプチドがアタキシン２ポリペプチドの構造特徴および／または機能特徴のうちのいくらかまたはすべてを保持する限り、アタキシン２ポリペプチドに包含される。例示的な構造特徴としては、配列同一性または配列の実質的類似性、抗体反応性、および保存的構造ドメイン（例えば、ＲＮＡ結合ドメインまたは酸性度メイン）の存在が挙げられる。
【００１８】
アタキシン２ポリペプチドと同様に、本発明はまた、アタキシン２ポリペプチドの機能誘導体を提供する。用語「機能的」とは、本発明のアタキシン２ポリペプチドの改変遺伝子または、そのポリペプチドフラグメントとして本明細書中で使用される場合、アタキシン２ポリペプチドに類似の機能特性を提示するポリペプチドをいう。アタキシン２ポリペプチドの例示的機能特性としては、ＲＮＡ結合、分子輸送、またはポリグルタミントラクト（ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｔｒａｃｔ）のサイズに基づく潜在的な神経変性表現型を示すことが挙げられる（すなわち、より少ないポリグルタミンを有するアタキシン２ポリペプチドは、正常な表現型を有し、そして、より多いポリグルタミン（例えば、３２以上のポリグルタミン）を有するアタキシン２ポリペプチドは、神経変性表型を有する）。当業者は、ポリペプチドまたはコード核酸配列が実質的にその参照配列と同じであるか否かを、それらのコードされるポリペプチドの機能特性を参照アタキシン２ポリペプチドの機能特性に対して比較することによって容易に決定し得る。
【００１９】
本発明のノックアウト非ヒト哺乳動物に関して、ノックアウトは、上述されたように、アタキシン２ポリペプチドの１つ以上の機能の破壊である得、これらの機能としては、本明細書中に記載されるように（実施例Ｉを参照のこと）、破壊されたＳＣＡ２遺伝子を有する変異体非ヒト哺乳動物の場合、本質的に全てのアタキシン２の機能が挙げられる。従って、ＳＣＡ２ノックアウト非ヒト哺乳動物は、アタキシン２ポリペプチドが発現されない場合または部分的な発現を有し得る場合（例えば、ヘテロ接合型の場合）に、機能の本質的に完全な消失状態であり得る。
【００２０】
本発明の変異体哺乳動物の１つ実施形態おいて、本発明はホモ接合型ＳＣＡ２変異体非ヒト哺乳動物を提供し、ここで、そのＳＣＡ２遺伝子の２つの対立遺伝子は、ノックアウトされている。別の実施形態において、本発明はヘテロ接合体ＳＣＡ２変異体非ヒト哺乳動物を提供し、ここで、そのＳＣＡ２遺伝子の１つの対立遺伝子のみが存在する。特に、本発明は、ＤＮＡ構築物を使用する相同組換えによってそのＳＣＡ２遺伝子が破壊されている変異体非ヒト哺乳動物を提供し、ここで、このＤＮＡ構築物は、そのＳＣＡ２遺伝子のエキソン１を含んでいる。特定の実施形態において、本発明は、両方の内因性ＳＣＡ２対立遺伝子が破壊されている場合に、ホモ接合体ＳＣＡ２変異体マウスを提供する。別の実施形態において、本発明は、１つの内因性ＳＣＡ２対立遺伝子のみが破壊されている場合に、ヘテロ接合型ＳＣＡ２変異体マウスを提供する。
【００２１】
本発明の変異体非ヒト動物は、「変異体ＳＣＡ２表現型」を提示し得る。本明細書中で使用される場合、用語「変異（体）ＳＣＡ２表現型」とは、内因性ＳＣＡ２遺伝子によってコードされるアタキシン２ポリペプチドの発現の部分的または完全な抑制を引き起こす変異ＳＣＡ２遺伝子を有している非ヒト哺乳動物の観察可能な、生理学的特徴、神経学的特徴、および生物学的特徴を意味する。変異ＳＣＡ２表現型は、正常なＳＣＡ２遺伝子発現の消失およびそれに対応する、ＳＣＡ２遺伝子活性の正常レベルに関連する遺伝子発現の正常なパターンの消失の結果である。実施例ＩＩに記載されるにように、変異ＳＣＡ２非ヒト哺乳動物の正常なＳＣＡ２遺伝子発現の消失は、肥満（例えば、遅発性肥満）および記憶（機能）障害を生じ得る。実施例ＩＩＩに記載されるように、変異ＳＣＡ２非ヒト哺乳動物の正常なＳＣＡ２遺伝子発現の消失は、ＳＣＡ２によって調節される種々の遺伝子の変更された発現を生じ得る。変異ＳＣＡ２表現型を有する非ヒト哺乳動物における増大した発現を有する例示的な遺伝子は、不活性Ｘ特異的転写物、赤血球分化調節因子、核リボ核タンパク質ＬおよびＥＳＴ  ＡＷ２５８８４２である。変異ＳＣＡ２表現型を有する非ヒト哺乳動物における減少した発現を有する例示的な遺伝子は、ペルオキシレドキシン−２，３−オキソ酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ−２，３−ｏｘｏａｃｉｄ  ＣｏＡ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ステアロイル−ＣｏＡデサチュラーゼＩ、核因子１−ＸおよびＥＳＴ  ＡＡ００２８４３である。
【００２２】
したがって、変異ＳＣＡ２表現型としては、生理学的変化（例えば、肥満、神経状態変化（例えば、記憶障害）および生物化学的変化（例えば、増減した遺伝子発現）が挙げられ得る。変異ＳＣＡ２表現型を提示する動物およびそれに由来する細胞は、ＳＣＡ２表現型に関連する障害（例えば、記憶障害および肥満）を処置するのに有効な化合物を同定するためのスクリーニング法において有用である。変異ＳＣＡ２表現型提示する非ヒト哺乳動物およびそれに由来する細胞はまた、変異ＳＣＡ２表現型に関連する障害を処置するために調節され得る潜在的な薬物標的を同定するのに有用である。
【００２３】
破壊されたＳＣＡ２遺伝子を有する変異動物を作製する方法は、例えば、以下に記載されているように、当業者にとって周知である：Ｓｈａｓｔｒｙ，Ｅｘｐｅｒｅｎｔｉａ  ５１：１０２８−１０３９（１９９５）；Ｓｈａｓｔｒｙ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８１：１６３−１７９（１９９８）；ならびに米国特許第５，６１６，４９１号（１９９７年４月１日発行）、同第５，７５０，８２６号（１９９８年５月１２日発行）および同第５，９８１，８３０号（１９９９年１１月９日発行）。例えば、変異動物は、遺伝子において適切な挿入を有するＤＮＡ構築物を胚性幹細胞に導入し、その結果、胚性幹細胞中の導入された遺伝子の相同性組換えによってその遺伝子の破壊が生じることによって作製され得る。
【００２４】
本明細書中に開示されるように、ＤＮＡ構築物は、ＳＣＡ２遺伝子のエキソン１に選択マーカーを挿入することによって作製された（実施例Ｉを参照のこと）。そのＳＣＡ２エキソン１挿入物を含むＤＮＡ構築物は、胚性幹細胞に導入され、そして、トランスフェクトされた細胞が選択された。トランスフェクトされた胚性幹細胞をマウス胚盤胞に導入ることによって、変異されたＳＣＡ２遺伝子を生殖系列に保持するマウスが生じた。したがって、本発明は、本発明のＳＣＡ２変異マウスを作製するための方法、特に、ＳＣＡ２ノックアウトマウスを作製するために方法を提供する。
【００２５】
ＳＣＡ２遺伝子にコードされるポリペプチドアタキシン２の生理学的役割を決定するために有用な動物モデル系がまた提供され、そして、それは、アタキシン２の発現が種々の技術を用いて変更されてるトランスジェニック動物を作製することによって作製される。このような技術の例としては、アタキシン２ポリペプチドをコードする核酸の正常バージョンまたは変異バージョンをマイクロインジェクション、レトロウイルス感染、または当業者に他の周知の手段によって適切な受精胚に挿入し、トランスジェニック動物を作製することが挙げられる（例えば、Ｈｏｇａｎら，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８６）、ならびに米国特許第５，６１６，４９１号および同第５，７５０，８２６号を参照のこと）。
【００２６】
本発明は、それらの細胞に全てにおいてＳＣＡ２遺伝子がノックアウトされた変異非ヒト哺乳動物を提供する。本発明は、全部ではないがそのいくつかの細胞においてＳＣＡ２のノックアウトが存在する動物（すなわち、モザイク動物）をさらに提供する。さらに、破壊されたＳＣＡ２遺伝子を有する、本発明のＳＣＡ２変異非ヒト哺乳動物が、所望される場合、他のＳＣＡ２変異動物（ＳＣＡ２導入遺伝子を含む）とかけあわされ得る。
【００２７】
本発明は、選択マーカー配列が挿入されている、ＳＣＡ２遺伝子のエキソン１を含むＤＮＡ構築物をさらに提供する。本明細書中に使用される場合、用語「ＤＮＡ構築物」は、ＤＮＡ分子における遺伝的要素の具体的な配置をいう。本発明のＤＮＡ構築物は、一般的に、目的の遺伝子（例えば、ＳＣＡ２）の部分に対して相同性である配列を含む。相同性組換えによって、動物における内因性遺伝子の発現を破壊するのに使用する場合、その相同性配列は、そのＤＮＡ構築物における相同性領域と内因性遺伝子の組換えがその内因性遺伝子の破壊を生じる限り、任意のゲノム配列から選択され得る。特に、その相同性配列は、エキソンを含み得る。マウスＳＣＡ２の部分ヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ７０６７０）は配列番号１として参照され、他方そのコードされる部分アミノ酸配列は、配列番号２として参照される。マウスＳＣＡ２の全長ヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０４１４７２）は、配列番号３として参照され、一方、そのコードされるアミノ酸配列は、配列番号４として参照される。ヒトＳＣＡ２の全長ヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ７０３２３）は、配列番号５として参照され、一方、そのコードされるアミノ酸配列は、配列番号６として参照される。
【００２８】
本発明のＤＮＡ構築物では、ノックアウト構築物として使用される核酸配列は、代表的には遺伝子のいくつかの部分に由来するＤＮＡ（例えば、エキソン配列、イントロン配列、および／またはプロモーター配列）、および細胞においてＤＮＡ構築物の存在を検出するために用いられるマーカー配列で構成される。このＤＮＡ構築物は、細胞に挿入され、そしてネイティブＤＮＡ配列の転写を妨害または中断するような位置で細胞のゲノムＤＮＡに組み込む。このような挿入は、通常、相同的組換えによって生じる。ここでは、内因性ＤＮＡ配列に相同なＤＮＡ構築物の領域が、ＤＮＡ構築物が細胞に挿入されるときに互いに対してハイブリダイズし、そしてＤＮＡ構築物が内因性ＤＮＡの対応する部分に取り込まれるように組み換わる。このＤＮＡ構築物配列は、抑制されるべき遺伝子の１つ以上のエキソンおよび／またはイントロンの全配列または部分配列、抑制されるべき遺伝子のプロモーターの全配列または部分配列、あるいはそれらの組み合わせを含み得る。
【００２９】
動物における内因性遺伝子の発現を破壊するために使用される場合、ＤＮＡ構築物は、一般に、相同領域に挿入片を含有する。この挿入片は、例えば、選択マーカーであり得る。本明細書中で使用される場合、「選択マーカー」とは、選択マーカーが導入される細胞に、選択表現型を提供する遺伝エレメントをいう。一般に、選択マーカーは、細胞増殖を阻害するか、または細胞を殺傷する因子に対する耐性をその遺伝子産物が提供する遺伝子である。種々の選択マーカーが、本発明のＤＮＡ構築物において使用され得る。このようなマーカーとしては、例えば、Ｎｅｏ遺伝子、Ｈｙｇ遺伝子、ｈｉｓＤ遺伝子、Ｇｐｔ遺伝子およびＢｌｅ遺伝子（例えばＡｕｓｕｂｅｌら、（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（補遺４７）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９）および米国特許第５，９８１，８３０号に記載される）が挙げられる。選択マーカーの存在について選択するために有用な薬物は、例えば、Ｇ４１８（Ｎｅｏに対して）、ハイグロマイシン（Ｈｙｇに対して）、ヒスチジノール（ｈｉｓＤに対して）、キサンチン（Ｇｐｔに対して）、およびブレオマイシン（Ｂｌｅに対して）が挙げられる（Ａｕｓｕｂｅｌら、前出（１９９９）；米国特許第５，９８１，８３０号を参照のこと）。本発明のＤＮＡ構築物は、ポジティブ選択マーカー、ネガティブ選択マーカー、または両方を取り込み得る（例えば、米国特許第５，９８１，８３０号を参照のこと）。
【００３０】
本発明のＤＮＡ構築物は、増殖または適切な細胞（例えば、胚性幹細胞）へのトランスフェクションのためのベクター中に取り込まれ得る。当業者は、例えば、特定の細胞（例えば、哺乳動物細胞または細菌細胞）におけるベクターの生産のために、所望の特性に基づいてベクターを選択し得る。所望の場合、このＤＮＡ構築物は、適切な細胞または組織におけるＤＮＡ構築物中の遺伝エレメントの発現を可能にするように適切な発現エレメント（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）に作動可能に連結され得るように操作され得る。
【００３１】
本発明はさらに、本発明のＤＮＡ構築物を含む胚性幹細胞を提供する。本明細書中で使用される「胚性幹細胞」は、導入遺伝子の導入が所望される同族生物の胚に由来する多能性幹細胞である。特に、本発明は、選択マーカーが挿入されたＳＣＡ２の相同領域（例えば、ＳＣＡ２のエキソン１）を含むＤＮＡ構築物を含む胚性幹細胞を提供する。破壊された遺伝子を有する変異体マウスを生成するために胚性幹細胞を用いる方法は、当業者に周知である（例えば、米国特許第５，６１６，４９１号および第５，７５０，８２６号を参照のこと）。
【００３２】
変異体マウスの生成のために、胚性幹細胞は、マウスまたは他の適切な非ヒト哺乳動物から得られ得る。あるいは、適切な胚性幹細胞株が、本発明のＤＮＡ構築物を導入するために使用され得る。
【００３３】
本発明はさらに、本発明のＤＮＡ構築物を含有する単離されたマウス細胞を提供する。ＤＮＡ構築物は、周知のトランスフェクション方法のいずれかによって（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌら、前出（１９９９））、細胞に導入され得る。あるいは、マウス細胞は、本発明の変異体マウスから細胞を単離し、そして初代培養物を樹立することによって得られ得る。従って、本発明は、ＳＣＡ２変異体非ヒト哺乳動物（例えばマウス）から単離された細胞を提供する。細胞は、同型接合ＳＣＡ２変異体非ヒト哺乳動物（例えばマウス）または異型接合ＳＣＡ２変異体非ヒト哺乳動物から得られ得る。
【００３４】
本発明のＳＣＡ２変異体非ヒト哺乳動物は、肥満または記憶障害を処置するために用いられ得る治療剤についてスクリーニングするために、有利に使用され得る。例えば、ＳＣＡ２変異体ノックアウトマウスは、成体で肥満を増大した（実施例ＩＩを参照のこと）。従って、本発明は、破壊されたＳＣＡ２遺伝子を有するＳＣＡ２変異体非ヒト哺乳動物に化合物を投与し、そして肥満の減少についてこの変異体非ヒト哺乳動物をスクリーニングし、それにより、肥満の処置に用いられる治療剤を同定することによる、肥満を処置するのに用いられる治療剤を同定する方法を提供する。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、「肥満の減少」とは、ＳＣＡ２変異体非ヒト哺乳動物の肥満表現型のいかなる減少をもいう。このような減少としては、減量、体重増加の減少、体重増加の割合の減少、または肥満に関連した任意の特徴の減少が挙げられる。当業者は、肥満の測定の周知の方法に基づいて肥満の減少を容易に決定し得る。
【００３６】
ＳＣＡ２変異体ノックアウトマウスはまた、記憶障害を示した（実施例ＩＩを参照のこと）。従って、本発明はまた、破壊されたＳＣＡ２遺伝子を有するＳＣＡ２変異体非ヒト哺乳動物に化合物を投与し、そして記憶障害の減少についてこの変異体非ヒト哺乳動物をスクリーニングし、それにより、記憶障害において用いられる治療剤を同定することによる、記憶障害を処置するのに用いられる治療剤を同定する方法を提供する。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、「記憶障害の減少」とは、記憶障害のいかなる減少をもいう。このような減少としては、記憶の改善が挙げられる。記憶障害は、特定の生物において有用な記憶についての種々の周知の試験を用いてスクリーニングされ得る。記憶変化についての典型的な試験としては、例えば、Ｍｏｒｒｉｓ水迷路または他の記憶試験法の使用が挙げられる。当業者は、適切な記憶測定の改善された結果に基づいて記憶障害の減少を容易に決定し得る。
【００３８】
実施例ＩＩＩに記載のように、肥満および記憶障害を示すことに加えて、ＳＣＡ２変異体マウスはまた、野生型マウスに比較して、いくつかの遺伝子の発現の変化を示した。例えば、ＳＣＡ２ノックアウトマウスは、不活性Ｘ特異的転写物、赤血球分化調節因子、核リボ核タンパク質ＬおよびＥＳＴ  ＡＷ２５８８４２の発現増大、ならびにペルオキシレドキシン−２，３−オキソ酸ＣｏＡトランスフェラーゼ、ステアロイル−ＣｏＡ  デサチュラーゼＩ、核因子１−ＸおよびＥＳＴ  ＡＡ００２８４３の発現の減少によって特徴付けられる。これらの遺伝子の各々、ならびに変異体ＳＣＡ２非ヒト哺乳動物において発現を変化した他の遺伝子の発現の変化は、ＳＣＡ２が、通常、野生型動物においてこれらの遺伝子の発現を調節することを示す。従って、不活性Ｘ特異的転写物、赤血球分化調節因子、核リボ核タンパク質ＬおよびＥＳＴ  ＡＷ２５８８４２、ペルオキシレドキシン−２，３−オキソ酸ＣｏＡトランスフェラーゼ、ステアロイル−ＣｏＡ  デサチュラーゼＩ、核因子１−ＸおよびＥＳＴ  ＡＡ００２８４３は、変異体ＳＣＡ２表現型の生理学的特徴、神経学的特徴、および生化学的特徴を逆転、または少なくとも部分的に逆転させるために調整され得る遺伝子を表す。例えば、変異体ＳＣＡ２非ヒト哺乳動物において発現が変化している標的遺伝子の、より通常の発現レベルを回復する化合物は、肥満の減少または記憶障害の減少を生じ得る。従って、変異体ＳＣＡ２非ヒト哺乳動物において発現が変化している標的遺伝子を、より通常の発現レベルに回復させる化合物は、肥満、記憶障害、および関連障害の処置のために有用である可能性がある治療化合物である。
【００３９】
従って、本発明は、変異体ＳＣＡ２非ヒト哺乳動物において変更された発現を有する標的遺伝子を同定するための方法、および変異体ＳＣＡ２非ヒト哺乳動物において変更された発現を有する標的遺伝子を、より正常な発現レベルに回復させる化合物を同定するための方法を提供する。
【００４０】
変異体ＳＣＡ２非ヒト哺乳動物において変更された発現を有する標的遺伝子を同定するための方法は、上記変異体非ヒト哺乳動物において変更された発現を有する遺伝子を同定するために、破壊されたＳＣＡ２遺伝子を有する変異体非ヒト哺乳動物における１つ以上の遺伝子の発現と、野生型動物における上記１つ以上の遺伝子の発現とを比較する工程を包含し、それにより、変異体ＳＣＡ２非ヒト哺乳動物において変更された発現を有する標的遺伝子を同定する。
【００４１】
変異体ＳＣＡ２非ヒト哺乳動物において変更された発現を有する標的遺伝子を同定するための本発明の方法は、変異体ＳＣＡ２非ヒト哺乳動物の１つ以上の器官内に含まれる１つ以上の遺伝子の発現を比較する工程を包含し得る。実施例ＩＩＩに示すように、変異体ＳＣＡ２非ヒト哺乳動物の大脳、小脳、心臓および骨格筋における遺伝子発現を、野生型哺乳動物と比べて試験した。変異体ＳＣＡ２非ヒト哺乳動物の他の多様な器官、組織または細胞を、遺伝子発現における変更を決定するために、野生型の動物の他の多様な器官、組織または細胞と比較し得る。
【００４２】
変異体ＳＣＡ２非ヒト哺乳動物において変更された発現を有する標的遺伝子を、より正常な発現レベルに回復させる化合物を同定するための方法は、以下の工程を包含する：（ａ）変異体ＳＣＡ２非ヒト哺乳動物において変更された発現を有する標的遺伝子と、試験化合物とを接触させる工程；（ｂ）上記標的遺伝子の発現を決定する工程、および（ｃ）上記標的遺伝子の発現を、野生型の発現レベルと一致する発現レベルに調節する化合物を同定する工程。
【００４３】
標的遺伝子の発現の「より正常なレベル」とは、野生型動物における標的遺伝子の発現レベルと類似した、標的遺伝子の発現レベルである。変異ＳＣＡ２非ヒト哺乳動物において変化された発現を有する標的遺伝子を、より正常な発現レベルまで回復させる試験化合物は、野生型非ヒト哺乳動物のインタクトな細胞または細胞調製物における正常な発現レベルの少なくとも約５０％のレベルまで、その発現レベルを変化させる。例えば、変異ＳＣＡ２非ヒト哺乳動物において減少された発現を有する標的遺伝子を、より正常な発現レベルまで回復させる試験化合物は、正常な発現レベルの少なくとも約５０％のレベルまで、その発現レベルを増加させることによって、そのように変化する。同様に、変異ＳＣＡ２非ヒト哺乳動物において増加された発現を有する標的遺伝子を、より正常な発現レベルまで回復させる試験化合物は、正常な発現レベルの少なくとも約５０％のレベルまで、その発現レベルを減少させることによって、そのように変化する。例えば、試験化合物は、野生型非ヒト哺乳動物における正常な発現レベルの、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または本質的には約１００％までも、回復させ得る。
【００４４】
変化された発現を有する標的遺伝子は、例えば、変異非ヒト哺乳動物に、この変異非ヒト哺乳動物から単離された器官、組織または細胞に、あるいは標的遺伝子の発現が調節され得る細胞調製物に、含有され得る。
【００４５】
変異ＳＣＡ２非ヒト哺乳動物において改変された発現を有する標的遺伝子をより正常なレベルの発現に回復する化合物をスクリーニングするための本発明の方法は、変異ＳＣＡ２非ヒト哺乳動物に特徴的な標的遺伝子の改変された発現を示すサンプルを、試験化合物と接触させる工程を包含する。試験化合物は、標的遺伝子の発現レベルをより正常なレベルに回復し得ることが推測される任意の物質、分子、化合物、分子もしくは化合物の混合物、または任意の他の組成物であり得る。
【００４６】
試験化合物は、高分子、例えば、生物学的ポリマー（ポリペプチド、多糖および核酸を含む）であり得る。潜在的治療剤として有用な化合物は、当業者に周知の方法によって作製され得、例えば、複数の化合物（単純なまたは複雑な有機分子、金属含有化合物、炭水化物、ペプチド、タンパク質、ペプチド模倣物、糖タンパク質、リポタンパク質、核酸、抗体などのような化学的または生物学的分子を含む）を作製するための周知の方法は、当該分野において周知であり、そして、例えば、Ｈｕｓｅ、米国特許第５，２６４，５６３号；Ｆｒａｎｃｉｓら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：４２２−４２８（１９９８）；Ｔｉｅｔｚｅら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，２：３６３−３７１（１９９８）；Ｓｏｆｉａ，Ｍｏｌ．Ｄｉｖｅｒｓ．３：７５−９４（１９９８）；Ｅｉｃｈｌｅｒら、Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．１５：４８１−４９６（１９９５）；などに記載される。多数の天然および合成の化合物を含むライブラリーもまた、市販の供給源から得られ得る。分子のコンビナトリアルライブラリーは、周知のコンビナトリアルケミストリー方法を使用して調製され得る（Ｇｏｒｄｏｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３−１２５１（１９９４）；Ｇｏｒｄｏｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１３８５−１４０１（１９９４）；Ｇｏｒｄｏｎら、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２９：１４４−１５４（１９９６）；ＷｉｌｓｏｎおよびＣｚａｒｎｉｋ編、Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９７））。
【００４７】
さらに、試験化合物は、種々の基準に基づいて予め選択され得る。例えば、変異ＳＣＡ２表現型に関与することが推測される経路において、既知の調節活性を有する適切な試験化合物は、スクリーニング方法を試験するために選択され得る。あるいは、試験化合物は、無作為に選択され得、そして本発明のスクリーニング方法によって試験され得る。試験化合物は、単一の濃度あるいは約１ｎＭ〜１ｍＭの濃度範囲で、反応系に投与され得る。
【００４８】
本発明の方法を使用して試験される異なる試験化合物の数は、方法の適用に依存する。候補化合物の数が多くなればなるほど、スクリーニングアッセイにおいて所望の活性を有する化合物を同定する可能性が大きくなることが、一般的に理解される。この方法は、単一のまたは複数のサンプル形式で実行され得る。多数の化合物は、自動化され得るかまたは半自動化され得る高処理能力形式で処理され得る。
【００４９】
標的遺伝子の発現、または試験化合物による標的遺伝子の発現の調節は、発現の変化を測定することによって決定され得る。本発明の方法は、サンプル中に存在するｍＲＮＡまたはポリペプチドの量を決定することによって遺伝子発現の変化を測定することを包含する。ｍＲＮＡの量およびポリペプチドの量の両方を測定するための方法は、当該分野において周知である。ｍＲＮＡを測定するための方法は、代表的に、溶液または固相形式で、相補的なプローブとの特異的なハイブリダイゼーションによって核酸分子を検出することを包含する。このような方法としては、ノザンブロット、ＲＮＡの逆転写の後のポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、およびヌクレアーゼ保護が挙げられる。経路成分の応答の測定は、大スケール遺伝子発現方法を使用して実施され得る。
【００５０】
大スケール遺伝子発現方法は、器官、組織または細胞において発現された遺伝子の大集団を測定するために有利に使用され得る。遺伝子の集団の発現の変化を測定するのに適用可能な当該分野で周知の方法の例としては、ｃＤＮＡ配列決定、クローンハイブリダイゼーション、ディファレンシャルディスプレー、差引きハイブリダイゼーション、ｃＤＮＡフラグメントフィンガープリント法、遺伝子発現の連続的分析（ＳＡＧＥ）、およびＤＮＡマイクロアレイが挙げられる。これらの方法は、例えば、野生型コントロール動物の遺伝子発現と比較した、変異ＳＣＡ２非ヒト哺乳動物の器官、組織または細胞における遺伝子発現における差異を同定するために有用である。実施例ＩＩＩは、野生型マウスと比較した、ＳＣＡ２マウスにおける遺伝子集団の発現の変化を決定するためのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘチップの使用を記載する。遺伝子発現の変化を検出するための方法は、定性的または定量的の両方で実施され得る。
【００５１】
遺伝子発現レベルに対応するタンパク質発現レベルもまた、望まれる場合は決定され得る。当該分野で周知の種々の方法が、タンパク質レベルを直接的または間接的のいずれかで決定するために使用され得る。そのような方法としては、免疫化学法（例えば、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、およびＲＩＡ、ゲル電気泳動法（一次元ゲルおよび二次元ゲルを含む）、タンパク質もしくはペプチドのクロマトグラフィー分離に基づく方法、タンパク質融合レポーター構築物および比色計測値を使用する方法、活性に翻訳されるポリソームｍＲＮＡの特徴づけおよび質量分析検出に基づく方法が、挙げられる。
【００５２】
変異体ＳＣＡ２非ヒト哺乳動物中で変化した発現を有する標的遺伝子をより正常なレベルの発現に回復させる化合物を同定するための本発明の方法は、標的遺伝子の活性を決定する工程を包含し得る。分子の活性は、特定の標的に適切な種々のアッセイを使用して決定され得る。標的遺伝子の検出可能な機能は、標的遺伝子の既知の特徴または推定される特徴に基づいて決定され得る。例えば、ペルオキシレドキシン２遺伝子は、酸化的ストレスを減少する際に役割を有し、不活性Ｘ特異的転写物（ＸＩＳＴ）遺伝子は、Ｘ不活化において役割を有し、そして赤血球分化調節因子遺伝子は、分化を調節する際に普遍的な役割を有する。従って、変異体ＳＣＡ２非ヒト哺乳動物において調節された発現を有するこれらの遺伝子の既知の特徴に基づいて、遺伝子機能を決定するための適切なアッセイが決定され得る。
【００５３】
本発明の方法により治療剤として同定された化合物は、例えば、肥満、記憶障害、または本発明のＳＣＡ２変異体非ヒト哺乳動物と関連する任意の表現型と関連する、徴候もしくは症状を軽減するために個体に投与され得る。当業者は、肥満または記憶障害と関連する徴候もしくは症状の軽減を知っているか、または容易に決定し得る。
【００５４】
望ましい場合、適切なコントロール動物が、スクリーニングされた化合物の治療効力を実証するために使用され得る。例えば、コントロール動物は、野生型動物のような、ＳＣＡ２を発現する動物であり得る。あるいは、コントロール動物は、変異体ＳＣＡ２表現型（例えば、肥満または記憶障害）を生じないアタキシン２ポリペプチドの形態を発現し得る。
【００５５】
治療剤としての使用のために、その化合物は、薬学的組成物を生成するために、薬学的に受容可能なキャリアを用いて処方され得、その薬学的組成物は、個体に投与され得、その個体は、ヒトでも他の哺乳動物でもあり得る。薬学的に受容可能なキャリアは、例えば、水、リン酸ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝化生理食塩水、通常の生理食塩水もしくはリンガー溶液、または他の生理学的に緩衝化された生理食塩水、または他の溶媒もしくはビヒクル（例えば、グリコール、グリセロール、油（例えば、オリーブ油）または注射可能な有機エステルであり得る。薬学的に受容可能なキャリアはまた、例えば、調節化合物の吸収を安定化または増加するように作用する、生理学的に受容可能な化合物を含み得る。当業者には、薬学的に受容可能なキャリア（生理学的に受容可能な化合物を含む）の選択は、例えば、その組成物の投与経路に依存することが公知である。
【００５６】
本発明の方法は、所望の目的のために、ホモ接合体ＳＣＡ２変異体非ヒト哺乳動物またはヘテロ接合体ＳＣＡ２変異体非ヒト哺乳動物から単離された、細胞を有利に使用し得る。本発明の方法はまた、ＳＣＡ２遺伝子が破壊された細胞（例えば、トランスフェクトされた細胞株）を用いて使用され得る。
【００５７】
アタキシン２ポリペプチドをコードするＳＣＡ２を発現する細胞は、肥満または記憶障害を処置するための潜在的な治療剤としての化合物をスクリーニングするためのインビトロ方法として使用され得る。このような方法において、化合物は、破壊されたＳＣＡ２発現を有する細胞（トランスフェクトされた細胞またはＳＣＡ２変異体非ヒト哺乳動物由来の細胞のいずれか）と接触され、そしてＳＣＡ２遺伝子の発現の減少と関連する表現型における変化についてスクリーニングされる。
【００５８】
本発明はさらに、肥満または記憶障害を処置するにおいて使用するための潜在的治療剤を同定する方法を提供する。この方法は、変異体アタキシン（ａｔａｘｉｎ）−２ポリペプチドをコードする核酸を含むＤＮＡ構築物を含有する細胞を、化合物と接触させる工程；および、この変異体アタキシン−２ポリペプチド（アタキシン−２の発現減少を含む）と関連付けられる特定の表現型の改善について、この細胞をスクリーニングする工程であって、それにより、関連付けられた表現型（例えば、肥満または記憶障害）を処置するにおいて使用するための潜在的治療剤を同定する工程、を包含する。この細胞は、変異体アタキシン−２ポリペプチドを発現するトランスフェクト細胞であり得るか、または破壊されたＳＣＡ２遺伝子を含有する有核細胞を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物から単離され得る。
【００５９】
変異体アタキシン−２ポリペプチドを発現する細胞（アタキシン−２の発現減少を有する細胞を含む）を、予備的スクリーニングにおいて使用して、ＳＣＡ２の発現減少と関連付けられる表現型を改変する活性を有する潜在的治療剤として化合物を同定し得る。ＳＣＡ２変異体非ヒト哺乳動物を使用するインビボスクリーニングの場合と同様に、適切なコントロール細胞（例えば、ＳＣＡ２遺伝子を発現するコントロール細胞（例えば、ＳＣＡ２の破壊と関連付けられる表現型（例えば、肥満または記憶障害）を示さない形態のＳＣＡ２を発現する、野生型細胞またはコントロール細胞））を使用して、スクリーニングの結果を比較し得る。ＳＣＡ２遺伝子発現を減少した細胞を使用する最初のインビトロスクリーニングによって同定される化合物の有効性は、所望される場合には、本発明のＳＣＡ２変異体非ヒト哺乳動物を使用して、インビボでさらに試験され得る。従って、本発明は、細胞ベースのアッセイを使用して（例えば、ハイスループットスクリーニングを使用して）、多数の化合物をスクリーニングする方法、ならびに本発明のＳＣＡ２変異体非ヒト哺乳動物を使用して、動物モデルにおいて、治療剤として化合物をさらに試験する方法を提供する。
【００６０】
本研究は、相同組換えによって作製された、マウスＳＣＡ２遺伝子の標的化破壊に関する初めての記載である。本研究の結果によって、細胞質タンパク質であるアタキシン−２が、種々の胚段階および成体段階での広範な発現にもかかわらず、発達に必須ではないようであることを示す。しかし、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、Ｘｅｎｏｐｕｓ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ（Ｋｉｅｈｌら、２０００）およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおけるホモログとのその著しく高い程度の進化的保存は、細胞の重要な基本的機能を示している。
【００６１】
発生における広範囲に及ぶ発現にもかかわらず、アタキシン−２の非本質的役割は、おそらくオルソログおよびその機能をレスキューし得る機構により説明され得る。例えば、第１６染色体上のアタキシン−２関連タンパク質（Ａ２ＲＰ）は、アタキシン−２に対してアミノ酸配列が４１％類似および１６％同一である。このことは、推定祖先遺伝子からのかなりの分岐を示すが、Ａ２ＲＰは、そのノックアウトにおいて、アタキシン−２機能のいくつかをなおレスキューし得る。これら２つの間で共有されるモチーフは、Ｓｍ１  ＲＮＡスプライシングモチーフおよびＳｍ２  ＲＮＡスプライシングモチーフ、ａｐｏｐａｉｎ切断部位、ＥＲ退去シグナル（ｅｘｉｔ  ｓｉｇｎａｌ）およびトランスゴルジシグナルである。アタキシン−２およびＡ２ＲＰの両方は、従って、Ｓｍタンパク質に対してかなりの類似性を有する（Ｎｅｕｗａｌｄ  ａｎｄ  Ｋｏｏｎｉｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，７６：３−５（１９９８））。真核生物転写産物の翻訳が生じるために、新たに合成されたｍＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）が、スプライシング機構によりプロセシングされる。イントロンは、スプライセオソームにより除去され、大きな複合体が、小さな核リボ核タンパク質粒子（ｓｎＲＮＰ）から作製される。多くのＳＭ様タンパク質は、配列比較により同定され得る。ｍＲＮＡプロセシングおよび分解におけるそれらの役割は明白であるが、標的結合特異性についてのデータは、限定されている。各ＳＭタンパク質が、多くの異なる標的ＲＮＡに結合することが仮定され得る。これらの標的中の重複はありそうなことであるので、１つのスプライシング機構の欠如は、必ずしも細胞に致命的にならずに、特定の転写産物のレベルを変化させると予測され得る。さらに、構造的に関連しない遺伝子による補完的機構が関与し得る。
【００６２】
アタキシン−２およびＡ２ＢＰ１に対してかなりの配列類似性を有する酵母タンパク質は、ポリアデニル化に関与している（Ｍａｎｇｕｓら，前出）。実際、酵母ＰＢＰ１（これは、アタキシン−２に類似する）とＰａｂｌｐ（Ａ２ＢＰ１に類似）との間の相互作用は、翻訳機構において重要な役割を果たしている。ヒト対応物は、ポリ（Ａ）結合タンパク質（ＰＡＢＰ）およびその相互作用因子（ｉｎｔｅｒａｃｔｏｒ）であるＰＡＩＰ１である。これらは、真核生物開始因子４Ｇ（ｅＩＦ４Ｇ，Ｃｒａｉｇら，Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：５２０−３（１９９８））を介して作用して、翻訳を開始する。Ａ２ＢＰ１は、広い範囲の生物に由来するポリアデニレート結合タンパク質に対する相同性を有する。ヒトＰＡＢＰの部分的構造が、最近決定され（Ｋｏｚｌｏｖら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：４４０９−４４１３（２００１））、アタキシン−２は、潜在的な結合パートナーであると同定された。
【００６３】
アタキシン−２およびＡ２ｂｐｌの発現を胚発生の間に試験した場合、厳しく調節された一時的かつ組織特異的発現が存在することが明らかになった。以前の研究では、発生におけるこれらのタンパク質を関連づけた（Ｎｅｃｈｉｐｏｒｕｋら，（１９９８）；Ｋｉｅｈｌら，前出）。異なる組織型を超えて、特徴的な免疫細胞化学染色パターンが存在し、このパターンにおいて、細胞の特定の亜集団のみが、標識された。このノックアウトにおける明白な胚表現型がないことについては、多くの理由が考えられ得る。上記のように、相同遺伝子が、機能のいくつかを肩代わりし得る。アタキシン−２が、実際に、ＰＡＢＰのリガンドである場合、他のリガンドが、同様なＲＮＡ特異性および重複するＲＮＡ特異性を有し得る。
【００６４】
成体の体重は、食品のカロリーとしてのエネルギー取り込みならびに代謝および活動の形態での消費の結果として維持される。この研究は、成体ＳＣＡ２（−／−）動物にて有意に増加した体重を示した。このことが、代謝的要因または行動的要因に起因するか否かは、現在のところ不明である。肥満表現型を有するいくつかのノックアウトマウスモデルは、増大した食物効率（摂取したカロリーあたりの体重増加が大きいことを意味する）を有することが示された。最近、メラノコルチン−３（ｍｃ３ｒ，Ｃｈｅｎら，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２６：９７−１０２  （２０００））およびメラノコルチン−４（ｍｃ４ｒ，Ｓｔｅ．Ｍａｒｉｅら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７：１２３３９−４４（２０００））に対するレセプターが、２つの異なる機構により肥満を導くことが示された。ｍｃ３レセプターは、食物効率および脂肪質量を調節する一方、ｍｃ４レセプターは、食物取り込みおよびエネルギー消費の調節に関与する。この表現型は、二重ノックアウトにおいて悪化される（Ｃｕｍｍｉｎｇｓら，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２６：８−９（２０００））。これらのメラノコルチンは、マウスにおけるｏｂ遺伝子の遺伝子産物である、レプチンの作用のメディエーターである（Ｚｈａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ  ３７２：４２５−３２（１９９４））。レプチン欠損（ｏｂ／ｏｂ）マウスは、過食症および低下した代謝という複雑な肥満表現型を有する。代謝率の低下についての理由は未知であるが、過食症は、メラノサイト刺激ホルモン（ＭＳＨ）分泌がないことから生じる（Ｃｈｅｕｎｇら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３８：４４８９−９２（１９９７）；Ｔｈｉｅｌｅら，Ａｍ．Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２７４：２４８−５４（１９９８））。アタキシン−２の関与がないことは、これらの機構のいずれにおいても既知である。他方、純粋に行動的な変化はまた、この表現型を説明し得るが、低下した身体的活動は観察されない。低カロリーの食餌に対する迅速な応答は、これらのマウスが、過食症であり得ることを示唆する。
【００６５】
本発明の種々の実施形態の活性に実質的に影響を与えない改変はまた、本明細書中に提供される本発明の定義の範囲内で提供されることが理解される。従って、以下の実施例は、本発明を例示するのであって、本発明を限定しないことが意図される。
【実施例】
【００６６】
（実施例Ｉ：マウスＳＣＡ２遺伝子の標的化された破壊）
ＳＣＡ２遺伝子のマウスホモログを、以前のように同定し、特徴付けした（Ｎｅｃｈｉｐｏｒｕｋら，１９９８）。マウスＳＣＡ２  ｃＤＮＡを、マウスＳＣＡ２遺伝子のエキソン１を含む１２．２ｋｂフラグメントを含む、１２９ＳＶゲノムライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から単離した。このフラグメント中にエキソン１が存在することが、制限酵素マッピングおよびサザン分析により確認された。次いで、標的化構築物を、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ中に生成した。このｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ中には、図１Ａに例示されるように、ＰＧＫ−ネオマイシン耐性カセットがエキソン１中のＮｏｔＩ部位に挿入されている。この構築物を直鎖状にし、１２９／ＳｖＪ胚性幹（ＥＳ）細胞（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，現在では、Ｉｎｃｙｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）にエレクトロポレーションした。細胞を、記載されるように（Ｋｏｅｎｔｇｅｎ  ａｎｄ  Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２２５：８７８−８８９（１９９３））、Ｇ４１８およびガンシクロビル（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中の二重選択下で増殖させた。
【００６７】
図１は、ＳＣＡ２遺伝子および標的化ストラテジーを示す。１．６ｋｂのＳＣＡ２遺伝子のＮｅｏカセットでの相同組換えによる置換は、エキソン１の破壊を生じる。制限部位：Ｂ＝ＢａｍＨＩ、Ｅ＝ＥｃｏＲＩ、Ｎ＝ＮｏｔＩ、Ｐ＝ＰｓｔＩ、Ｘ＝ＸｈｏＩ。（Ｂ）標的化対立遺伝子のサザンハイブリダイゼーションによる同定。標的化対立遺伝子は、示された５’外部フラグメントでプローブした場合、ＸｈｏＩ制限フラグメント中に７ｋｂの増加によって、３’末端とハイブリダイズするＢａｍＨＩフラグメントでプローブした場合、６．５ｋｂの減少によって診断される。（Ｃ）既知のモチーフを含むアタキシン−２タンパク質配列の外観。ポリグルタミントラクトは、マウスにおいては存在しない。酸性ドメインは、Ｓｍタンパク質に非常に類似したモチーフを含む。アタキシン−２は、Ａ２ＢＰ１にそのＣ末端を介して結合する。Ｐｏｌｙ（Ａ）結合タンパク質のＣ末端（ＰＡＢＣ）への推定結合部位は、ａａ９０８〜９２５に位置する。
【００６８】
標的化ＥＳ細胞クローンを、サザンブロットによりスクリーニングした（図１Ｂ）。ＥＳ細胞クローンのほぼ２５％が、正確な変異を保持した。陽性のクローンを、Ｃ５７Ｂ１／６の胚盤胞に注入して、キメラを生成し、偽妊娠雌に移植した。生殖系列伝達を、キメラ雄とＣ５７Ｂ１／６雌とを交配することにより達成した。ヌル接合体（ｎｕｌｌｉｚｙｇｏｕｓ）動物におけるＳＣＡ２遺伝子発現の喪失を確認するために、ＲＮＡを、野生型マウスおよびＳＣＡ２（−／−）マウスの種々の組織から調製した。
【００６９】
マウスＳＣＡ２遺伝子の３’末端に対するプローブを使用したノザン分析およびＲＴ−ＰＣＲは、全長ｍＲＮＡがないことを明らかにした（図２）。ノザン分析のために、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して、総ＲＮＡサンプルを、マウス脳の異なる領域および骨格筋から抽出した。ＲＮＡを、１．２％アガロースゲルにより電気泳動し、ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ  Ｐｌｕｓ膜（ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）上にブロットした。プローブを、ＲａｄＰｒｉｍｅランダムプライミングキット（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）により、α−（３２Ｐ）ｄＣＴＰで標識した。ハイブリダイズおよび洗浄の条件は、供給元のプロトコル（ＮＥＮ）に従った。各レーンに対する総ＲＮＡの相対的装填および強度を、β−アクチン（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）とのその後のハイブリダイゼーションにより確認した。
【００７０】
逆転写ＰＣＲを、大脳皮質総ＲＮＡから行い、標的化遺伝子座に産物がないことを示した。コントロール（Ａ２ＢＰ１）は、影響を受けなかった。ＲＴ−ＰＣＲを、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）セットを使用して、供給元のプロトコルに従って、大脳皮質および骨格筋組織に対して行った。ＳＣＡ２遺伝子転写産物の検出のために使用したプライマー対は、遺伝子型決定のために使用したものと同一であった（ｍＳＣＡ２Ｍ２０ＡおよびＢ）。これは、以下に記載される。コントロール（Ａ２ＢＰ１）についてのプライマーは、ｍＡ２ｂｐｌ−Ｃ（５’ＧＡＣＣＣＧＡＧＡＡＡＣＣＡＣＣＡＧＴ’）（配列番号７）およびｍＡ２ｂｐｌ−Ｄ（５’ＡＧＡＧＧＣＡＡＣＧＡＡＴＴＡＧＧＡＴＧＴ’）（配列番号８）であった。
【００７１】
アタキシン−２に対する特異的抗体を使用するウェスタンブロット分析により、ＳＣＡ２遺伝子破壊についてホモ接合体のマウスにおいて１２０ｋＤのアタキシン−２タンパク質がないことが確認された。このタンパク質がないこともまた、種々の組織の免疫細胞化学アッセイにより確認した。新たな組織を、２ヶ月齢のＳＣＡ２（−／−）マウスおよび野生型コントロールマウスから得た。ホモジナイズ後、溶解物を、三重界面活性剤緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１％  ＮＰ４０、０．５％  ＳＤＳ、０．５％  デオキシコール酸、１ｍＭ  Ｐｅｆａｂｌｏｃ  ＳＣ、１μｇ／ｍｌ  ペプスタチンＡ、２μｇ／ｍｌ  アプロチニン、５０μｇ／ｍｌ  ロイペプチン（全てＲｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）中に再懸濁し、ポリトロンホモジナイザーを使用してホモジナイズした。タンパク質抽出物を、始めに、１０００ｇ（ＪＡ１７ローターにて３１００ｒｐｍ）で５分間、遠心分離した。その上清を、１０５，０００ｇ（ＴＬＮ１００ローターにて５４，０００ｒｐｍ）で１時間再び遠心分離した。次いで、上清をアリコートに分け、−８０℃にて保存した、タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して決定した。ポリアクリルアミドゲルに装填する前に、タンパク質を、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  １０（Ａｍｉｃｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）またはアセトン沈殿を使用して濃縮した。１００μｇのタンパク質を、成形済み４〜２０％勾配ＳＤＳ−ポリアクリルアミドミニゲル（ＢｉｏＲａｄ）のレーン毎に装填し、１００Ｖにて１〜２時間電気泳動した。タンパク質を、ニトロセルロースフィルター（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に転写した。そのフィルターを、短時間、ＴＢＳ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０）ですすぎ、特注のウサギ一次抗体のために５％脱脂粉乳（ＢｉｏＲａｄ）で１時間ブロッキングした。次いで、そのフィルターを、試験抗体の所望の希釈物と、１時間室温にてインキュベートした。一次抗体を、セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合体化抗ウサギＩｇＧ抗体を使用して、ＥＣＬウェスタンブロッティング検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で検出した。
【００７２】
アタキシン−２の特異的発現もまた、ヒト卵巣切片中の一次卵胞において示された。図３Ａは、ＳＣＡ２−Ｂ抗体を使用した免疫細胞化学を示す。これは、一次卵胞中の卵母細胞の非常に特異的な染色および卵巣支質のバックグラウンド染色がほとんどないことを示す。図３Ｂは、２０×倍率を示し、これは、免疫反応性が、卵母細胞の細胞質および周りの透明帯に限定されるのに対し、核は反応しないで残っていることを示した。
【００７３】
ウェスタン分析のために使用した２つのウサギ抗アタキシン−２抗血清を、以前に記載のように（Ｈｕｙｎｈら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，４５：２３２−２４１（１９９９）；Ｈｕｙｎｈら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２６：４４−５０（２０００））惹起した。γ−アダプチン（ａｄａｐｔｉｎ）およびトランスゴルジ５８に対するマウスモノクローナル抗体を、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。成体マウス組織を、野生型動物およびホモ接合体ＳＣＡ２ノックアウト動物から得た。胚切片を、Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から購入した。６ミクロンの切片を切り出し、Ｓｕｐｅｒｐｌｕｓ顕微鏡用スライドガラス（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）上にマウントした。ヒトパラフィン包埋卵巣切片を、外科標本から得た。その切片を、５分間隔でキシレン、１００％エタノール、９５％エタノール、および７０％エタノール中で２回すすぐことにより再水和した。脱パラフィンした後、切片を、プロテアーゼカクテルで処理し、アビジン／ビオチンおよび３％正常ヤギ血清でブロッキングした。次いで、切片を、１０〜２０ｍｇ／ｍｌのアフィニティー精製したアタキシン−２抗体とともに一晩４℃にてインキュベートした。一次抗体を、ＶｅｃｔｏｒウサギＡＢＣ  ｅｌｉｔｅ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅキット（Ｖｅｃｔｏｒ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を使用して検出し、ＤＡＢ増幅剤（ｅｎｈａｎｃｅｒ）により増幅し、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ，Ｂｉｏｍｅｄａ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）を用いて可視化した。切片を、ヘマトキシリン水溶液（Ｚｙｍｅｄ，Ｓ．Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を用いて対比染色した。コントロールは、１００ｍＭのそれぞれのペプチドで予め吸収させた抗体および匹敵する濃度（１／５００）の免疫前血清からなった。直接比較のために、全てのスライドガラスを、単一バッチ中で処理して、変動を最小限にした。
【００７４】
遺伝子型決定（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）ＰＣＲにより、変異体中の挿入されたネオマイシンカセットからの２８３ｂｐ産物および野生型中中の１５０ｂｐ産物（エキソン１）が増幅された。遺伝子型決定を、マウスＳＣＡ２遺伝子のエキソン１を増幅する２セットのプライマー：５’−ＣＣＡＧＡＧＧＧＡＧＧＣＡＣＡＧＴＡＧＴ−３’（プライマーｍＳＣＡ２Ｍ２０Ａ）（配列番号９）および５’−ＴＴＡＡＡＡＣＧＧＡＧＡＧＧＣＡＧＡＴＧ−３’（配列番号１０）（プライマーｍＳＣＡ２Ｍ２０Ｂ）を用いるＰＣＲにより行った。第２のセット５’−ＧＣＴＴＧＧＧＴＧＧＡＧＡＧＧＣＴＡＴＴＣ−３’（配列番号１１）（プライマーＮｅｏ−Ａ）および５’−ＣＡＡＧＧＴＧＡＧＡＴＧＡＣＡＧＧＡＧＡＴＣ−３’（配列番号１２）（プライマーＮｅｏＢ）は、挿入されたネオマイシン耐性カセットを増幅する。９５℃／５分変性、３５サイクルの９４℃／１分変性、５５℃／３０秒アニーリングおよび７２℃／３０秒伸長のＰＣＲ条件にて、１５０ｂｐアンプリコンが、ＳＣＡ２−エキソン１から生成し、２８３ｂｐアンプリコンが、Ｎｅｏカセットから生成する。図２は、変異体中の挿入されたネオマイシンカセットからの２８３ｂｐ産物および野生型中の１５０ｂｐ産物（エキソン１）を示す。
【００７５】
マウスＳＣＡ２遺伝子の染色体位置を、エキソン１特異的プライマーを使用したマウスＴ３１照射ハイブリッドパネル（ＭｃＣａｒｔｈｙら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：１１５３−１１６１（１９９７））のＰＣＲ増幅により決定した。この遺伝子を、ヒト第１２染色体とシンテニーの大きな領域中のマーカーＤ５Ｍｉｔ３６８（ｌｏｄ＞３．０）から、マウス第５染色体の１３．０１ｃＲにマッピングした。マウス／ハムスター照射ハイブリッドパネル（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）もまた使用して、マウスＳＣＡ２遺伝子の染色体位置をマッピングした。プライマーは、遺伝子型決定のために使用した同じエキソン１特異的プライマーであった（ｍＳＣＡ２Ｍ２０ＡおよびｍＳＣＡ２Ｍ２０Ｂ）。同様に、ＰＣＲ条件は同じであった。ＰＣＲ産物を、２％  アガロースゲル上でエチジウムブロミド染色により分析し、引き続き、プローブとして５’ＵＴＲを含むＡ２ＢＰ１  ｃＤＮＡを使用するサザンブロット分析により確認した。結果を、ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃｏｎｔｉｇ／ｒｈｍａｐｐｅｒ．ｐｌにおけるサーバーを使用して分析した。同じプライマー対をまた使用して、マッピング結果を確認するために１染色体体細胞ハイブリッドパネル（Ｂｉｏｓ，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）をスクリーニングした。
【００７６】
表現型分析を、独自のＣ５７Ｂｌ／６−１２９混合系統（これは、純系のＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドへと引き続いて戻し交配した）に対して行った。
【００７７】
これらの研究の確認した結果は、アタキシン−２がホモ接合性ＳＣＡ２ノックアウトマウス中で生成されないことを実証する。アタキシン−２の喪失は、アタキシン−２結合タンパク質１（Ａ２ＢＰ１）の発現に影響を及ぼさなかった。このことは、マウスＡ２ＢＰ１発現が、アタキシン−２のレベルにより影響を受けないことを示す。
【００７８】
（実施例ＩＩ：ＳＣＡ２ノックアウトマウスの特徴付け）
この実施例は、ＳＣＡ２ノックアウトマウスの表現型が、肥満および記憶障害を含むことを示す。
【００７９】
ＳＣＡ２の発現を、発生中のマウス胚において試験した。以前に記載したように、ＳＣＡ２  ｍＲＮＡは、妊娠８日目から検出することができる（Ｎｅｃｈｉｐｏｒｕｋら，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，７：１３０１−１３０９（１９９８））。アタキシン−２抗体を使用して、異なる発生段階のマウス胚のパラフィン包埋切片中でのその発現を試験した。アタキシン−２免疫反応性を、全ての胚段階を通じて、心臓組織および間葉組織において検出した。対照的に、１２日目までの未発達の神経系においては、アタキシン−２免疫反応性は存在しなかった。全体的に、標識は、関連するマウス遺伝子Ａ２ｂｐ１と実質的に同一であった。
【００８０】
ホモ接合体ＳＣＡ２−／−マウスは、生存可能で受胎能があり、そしてこれらの野生型同腹仔と比較して、明らかな欠損および死亡率の増加を示さなかった。異常な行動パターンは、オープンケージの観察において観察されなかった。野生型マウスおよびＳＣＡ２−／−マウスは、加速ロータロッドのような運動性能試験において等しく良好に行動した。中枢神経系、心臓、骨格筋、肝臓および腎臓の注意深い組織病理学的試験は、ノックアウト動物とそれらの野生型同腹仔との間に観測可能な差異が存在しないことを実証した。
【００８１】
しかし、ＳＣＡ２−／−マウスが加齢するにつれて、ＳＣＡ２ノックアウトの表現型が観測可能になった。具体的には、標準的なＮＩＨのげっ歯類食餌で維持すると、ホモ接合体ＳＣＡ２ノックアウトは、顕著な成体発症肥満を示した。誕生時および離乳齢での体重は、野生型マウスと同じであるが、３月齢（野生型より１０％高い）、６月齢（２９．８％）および１年齢（６６％）では、進行性の増加が存在する。これらの動物は、低活動性であるようには見えず、そして増加した体重は、低カロリー食餌に迅速に応答性であった。オスマウスおよびメスマウス中に存在するこれらの表現型は、繁殖の問題に関連した。
【００８２】
図４は、離乳時、次いで３月齢、６月齢、９月齢および１２月齢での、１週間毎の体重を示す成長曲線を示す。離乳時には有意な差異は存在しないが、加齢と共に、ノックアウト動物と野生型動物との間の差異は広がる。
【００８３】
さらに、ＳＣＡ２ノックアウトは、記憶障害を示した。アタキシン−２発現の非存在は、ＣＮＳ記憶欠損を導く。特に、ＳＣＡ２ノックアウトは、海馬記憶試験において不十分にしか機能しないことが見出された。
【００８４】
まとめると、この実施例は、ＳＣＡ２ノックアウトマウスの表現型には、肥満（後期発症肥満を含み得る）および記憶障害が挙げられることを示す。
【００８５】
（実施例ＩＩＩ）
（潜在的アタキシン−２治療標的遺伝子の同定）
この実施例は、ＳＣＡ２ノックアウトマウスにおいて野生型マウスと比較して変化した発現を有する、いくつかの遺伝子の同定を記載する。同定された遺伝子は、肥満、記憶障害および関連障害の処置のための潜在的アタキシン−２治療標的を示す。
【００８６】
ＳＣＡ２ノックアウトマウスおよび野生型マウスにおける遺伝子発現を、いくつかの組織（大脳、小脳、心臓および骨格筋を含む）において比較した。遺伝子発現分析を、製造業者の指示書に実質的に従って、１２，０００のマウス遺伝子を含むＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘチップを使用して実施した。
【００８７】
いくつかの遺伝子は、野生型マウスと比較してＳＣＡ２ノックアウトにおいて有意に異なるレベルで発現された。表１に示すように、遺伝子発現レベルの増加および減少の両方が観察され、そしていくつかの場合、遺伝子発現レベルにおけるこれらの変化は、組織特異的であった。
【００８８】
（表１：野生型マウスと比較して、ＳＣＡ２ノックアウトマウスにおいて変化した発現を有する遺伝子）
【００８９】
【表１】
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これらの遺伝子の多くの機能が記載されている。例えば、ペルオキシレドキシン−２遺伝子は、酸化ストレスを低減することにおいて役割を有し、不活性Ｘ特異的転写物（ＸＩＳＴ）遺伝子は、Ｘ不活化において普遍的な役割を有し、そして赤血球分化調節因子遺伝子は、分化の調節において役割を有する。特徴付けられていない遺伝子（例えば、ＥＳＴに含まれる遺伝子）の機能は、他の遺伝子との構造的相同性に基づいて、そして遺伝子機能を決定するための他の周知の方法を使用して、決定され得る。
【００９０】
この実施例は、いくつかの遺伝子の発現が、野生型マウスと比較して、ＳＣＡ２遺伝子の欠失についてホモ接合体のマウスにおいて調節されることを示す。
【００９１】
本出願を通じて、種々の刊行物が参照されてきた。これらの刊行物の開示は、本発明が属する分野の水準をより十分に記載するために、その全体が本明細書中で参考として援用される。本発明を、上記に提供された実施例を参照して記載してきたが、種々の改変が、本発明の精神から逸脱することなくなされ得ることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】図１Ａは、ＳＣＡ２遺伝子および標的化ストラテジーの図示を示す。図１Ｂは、サザンハイブリダイゼーションによる、標的化された対立遺伝子の同定を示す。図１Ｃは、アタキシン２アミノ酸配列を示す。
【図２】図２は、野生型マウス（１５０ｂｐ産物）と比較した、ＳＣＡ２変異体マウス中に挿入されたネオマイシンカセット（２８３ｂｐ産物）を検出するためのＰＣＥ分析の結果を示す。
【図３】図３は、ヒト卵巣切片の初代卵胞中の卵母細胞におけるアタキシン２発現を示す。図３Ａは、初代卵胞中の卵母細胞の非常に特異的な染色と、卵巣支室におけるはずかなバックグラウンド染色とを示す、ＳＣＡ２−Ｂ抗体を使用する免疫細胞学を示す。図３Ｂは、図３Ａの２０倍拡大を示し、これは、卵母細胞および周囲の透明帯の細胞質に免疫反応性が限定される一方で、核が除かれている（ｓｐａｒｅ）ことを示す。
【図４】図４は、離乳時、３ヶ月目、６ヶ月目、９ヶ月目、および１２ヶ月目の、野生型およびＳＣＡ２変異体マウスの毎週の体重を示す成長曲線を示す。
【図１】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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