(57)【要約】本発明は、シクロオキシゲナーゼＣＯＸ−２および５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯ）酵素を同時に阻害する新規な方法を提供する。ＣＯＸ−２および５−ＬＯの同時二重阻害法は、アカシア属の単一植物または多数の植物から単離される多数のフラバンの個々をおよび／または混合物を含む組成物を、それを必要とする受容者に投与することを含む。本発明はまた、ＣＯＸ−２および５−ＬＯ仲介疾患および症状の新規な予防および治療法を含む。ＣＯＸ−２および５−ＬＯ仲介疾患および症状の予防および治療法は、それを必要とする受容者に、有効量の、アカシア属の単一植物または多数の植物から単離される多数のフラバンの個々および／または混合物、並びに薬学的に許容される担体を含む組成物を投与することを含む。本発明は、ＣＯＸ−２および５−ＬＯに対して二重特異性を有するフラバンの組成物をアカシア属植物から単離および精製する方法を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アカシア属植物から選択される植物から単離されるフラバンまたはフラバン混合物を含む組成物を投与することを含む、シクロオキシゲナーゼＣＯＸ−２および５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯ）酵素の同時二重阻害方法。
【請求項２】
フラバンまたはフラバン混合物が、次の構造：
【化１】
2005521715.tif 000015
（式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は独立して、Ｈ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＯＣＨ３、−ＳＣＨ３、−ＯＲ、−ＳＲ、―ＮＨ２、−ＮＲＨ、−ＮＲ２、−ＮＲ３＋Ｘ−、ガレート、アセテート、シンナモイルおよびヒドロキシルシンナモイルエステル、トリヒドロキシベンゾイルエステルおよびカフェオイルエステルよりなる群から独立して選択される置換基のエステル；アルドペントース、メチルアルドペントース、アルドヘキソース、ケトヘキソースおよびそれらの化学的誘導体を含む多数の糖の１つまたは組み合わせの炭素、酸素、窒素または硫黄グリコシド；ニ量体、三量体および他の重合フラバンよりなる群から選択され；ここで、
Ｒは、１〜１０個の炭素原子を有するアルキル基であり；そして
Ｘは、限定されないが、ヒドロキシル、塩化物、ヨウ化物、硫酸塩、リン酸塩、酢酸塩、フッ化物、炭酸塩を含む薬学的に許容される対陰イオンの群から選択される）
を有する化合物の群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
植物が、アカシア・カテチュ（Acacia catechu）、アカシア・コンシナ（Acacia concinna）、アカシア・ファルネシアナ（Acasia farnesiana）、アカシア・セネガル（ Acacia Senegal）、アカシア・スペシオサ（ Acasia speciosa）、アカシア・アラビカ（Acacia arabica）、Ａ．・カエシア（A. caesia）、Ａ．・ペンナタ（A. pennata）、Ａ．・シヌアタ（A. sinuata）、Ａ．・メアルンシ（A. mearnsii）、Ａ．・ピクナンタ（A. picnantha）、Ａ．・デアルバタ（A. dealbata）、Ａ．・アウリクリフォルミス（A. auriculiformis）、Ａ．・ホロセレシア（A. holoserecia）、Ａ．・マンギウム（A. mangium）よりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
フラバンが植物の一部から単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
植物の一部が、茎、茎の皮、幹、幹の皮、小枝、塊茎、根、根の皮、若枝、種子、根茎、花および他の生殖器官、葉および他の空中部分よりなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＣＯＸ−２および５−ＬＯ仲介疾患および症状を同時に予防および治療する方法であって、それを必要とする受容者に、アカシア属植物から選択される植物から単離されるフラバンまたはフラバン混合物および薬学的に許容される担体を含む組成物の有効量を投与することを含む方法。
【請求項７】
フラバンまたはフラバン混合物が、次の構造：
【化２】
2005521715.tif 000016
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は独立して、Ｈ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＯＣＨ３、−ＳＣＨ３、−ＯＲ、−ＳＲ、―ＮＨ２、−ＮＲＨ、−ＮＲ２、−ＮＲ３＋Ｘ−、ガラクテート、アセテート、シンナモイルおよびヒドロキシルシンナモイルエステル、トリヒドロキシベンゾイルエステルおよびカフェオイルエステルよりなる群から独立して選択される置換基のエステル；アルドペントース、メチルアルドペントース、アルドヘキソース、ケトヘキソースおよびそれらの化学的誘導体を含めた単糖類または多糖類の組み合わせの炭素、酸素、窒素または硫黄グリコシド；ニ量体、三量体および他の重合フラバンよりなる群から選択され；ここで、
Ｒは、１〜１０個の炭素原子を有するアルキル基であり；そして
Ｘは、限定されないが、ヒドロキシル、塩化物、ヨウ化物、硫酸塩、リン酸塩、酢酸塩、フッ化物、炭酸塩を含めた薬学的に許容される対陰イオンの群から選択される）
を有する化合物の群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
植物が、アカシア・カテチュ、アカシア・コンシナ、アカシア・ファルネシアナ、アカシア・セネガル、アカシア・スペシオサ、アカシア・アラビカ、Ａ．・カエシア、Ａ．・ペンナタ、Ａ．・シヌアタ、Ａ．・メアルンシ、Ａ．・ピクナンタ、Ａ．・デアルバタ、Ａ．・アウリクリフォルミス、Ａ．・ホロセレシア、Ａ．・マンギウムよりなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
フラバンが植物の一部から単離される、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
植物の一部が、茎、茎の皮、幹、幹の皮、小枝、塊茎、根、根の皮、若枝、種子、根茎、花および他の生殖器官、葉および他の空中部分よりなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＣＯＸ−２および５−ＬＯ仲介疾患および症状が、変形性関節症、慢性関節リウマチ、月経痙攣、全身性エリテマトーデス、乾癬、慢性緊張性頭痛、片頭痛、炎症性腸疾患を伴う炎症；軽い擦り傷、火傷または接触皮膚炎よりなる群から選択される局所創傷および軽い炎症症状；並びに固形癌よりなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
フラバン組成物が０．０１〜１００％のフラバンを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
組成物が０．０１〜２００ｍｇ／ｋｇ体重から選択される用量で投与される、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
投与ルートが、適切な医薬製剤の形での経口、局所、座薬；静脈内、および皮内、胃内、筋肉内、腹腔内および静脈内投与よりなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
ＣＯＸ−２および５−ＬＯに対して２重特異性を有するフラバンの組成物をアカシア属植物から単離および精製する方法であって、
ａ）アカシア属植物から選択される植物の粉砕バイオマスを抽出すること；
ｂ）抽出物を中和および濃縮すること；および
ｃ）中和および濃縮抽出物を精製すること
を含む方法。
【請求項１６】
フラバンの組成物が、水、アルコール、有機溶媒および／またはそれらの組み合わせよりなる群から選択される溶媒で抽出される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
抽出物が、再結晶、溶媒分配、沈殿、昇華、および／またはクロマトグラフィー分離よりなる群から選択される方法を用いることによって精製される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
クロマトグラフィー分離が、限定されないが、イオン交換クロマトグラフィー、吸収クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、限外濾過、またはこれらの方法を２つ以上組み合わせたものを含む方法よりなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般に、ＣＯＸ−２および５−リポキシゲナーゼによって仲介される疾患および症状の予防および治療法に関する。詳しくは、本発明は、アカシア属植物から抽出されるフラバンと呼ばれるある種の特定化合物の投与による、ＣＯＸ−２および５−リポキシゲナーゼによって仲介される疾患および症状の予防および治療法に関する。本発明には、標準化フラバン抽出物を植物源から生成する方法が含まれる。
【０００２】
発明の背景
アラキドン酸（ＡＡ）の細胞膜からの遊離および代謝は、いくつかの異なる経路によって前炎症性代謝を生じる。炎症に至るまでの最も重要な経路の２つが、酵素５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯ）およびシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）によって仲介されることは論証されている。これらは、それぞれ炎症反応の開始および進行に重要な役割を演じるロイコトリエンおよびプロスタグランジンを結果として生じる平行経路である。これらの血管作動性化合物はケモタキシンであり、炎症細胞の組織への浸潤を促し、炎症反応を長引かせる働きをする。従って、これらの炎症仲介物質の生成を招く酵素は、慢性関節リウマチ、変形性関節症、アルツハイマー症およびある種の癌のような疾患の病因となる炎症の治療を目指す多くの新薬の標的となっている。
【０００３】
酵素シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）の阻害は、たいていの非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）が有すると考えられる作用のメカニズムである。ＣＯＸ酵素には２つの明瞭なイソフォーム（isoform）（ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２）があり、配列の約６０％は相同性であるが、発現プロフィールおよび機能が異なる。ＣＯＸ−１は生理学的に重要なプロスタグランジンの産生に関連した酵素の構成形であり、血小板凝集のような正常な生理学的機能、胃における細胞機能の保護および正常な腎臓機能の維持を調節するのに役立つ。（DannhardtおよびKiefer(2001) Eur. J. Med. Chem. 36: 109-2）。第２のイソフォームＣＯＸ−２は、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）および他の成長因子のような前炎症性サイトカインによって誘導される酵素の形である。（Herschmann(1994) Cancer Metastasis Rev. 134: 241-56; Xie等(1992) Drugs Dev. Res. 25: 249-65）。このイソフォームはアラキドン酸（ＡＡ）からのプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の産生を触媒する。ＣＯＸ−２の阻害は一般的なＮＳＡＩＤの抗炎症活性を招く。
【０００４】
ＣＯＸ−１に比べてＣＯＸ−２選択性を維持しながらＣＯＸ−２および５−ＬＯに対して二重特異性を示す阻害剤は、アラキドン酸代謝の多くの経路を阻害する明らかな利点を有することができる。そのような阻害剤は、ＰＧＥ２の炎症効果、並びにそれらの産生を制限することによる多くのロイコトリエン（ＬＴ）のそれらを妨げることができる。これには、ＬＴＢ４およびＬＴＤ４の血管拡張、血管透過性および化学走性効果、並びにアナフィラキシーの遅反応物質としても知られるＬＴＥ４の効果が含まれる。これらの中で、ＬＴＢ４は最も強力な化学走性およびケモキネシス効果を有し（Moore(1985) Prostanoids: pharmacological, physiological and clinical relevance. Cambridge University Press, N.Y., pp.229-30）、炎症性腸疾患患者の胃腸粘膜（Sharon and Stenson (1983) Gastroenterology 84: 1306-13）および慢性関節リウマチ患者の滑液中（Klicksein等 (1980) J. Clin. Invest. 66: 1166-70; Rae等 (1982) Lancet ii: 1122-4）で高められることが示された。
【０００５】
二重ＣＯＸ−２／５−ＬＯ阻害剤の上記利点に加えて、多くの二重阻害剤は、伝統的なＮＳＡＩＤに起因する胃腸損傷および不快を含むＮＳＡＩＤまたはＣＯＸ−２阻害剤に一般的ないくつかの副作用を生じない。胃の炎症を引き起こすＮＳＡＩＤは５−ＬＯ、特にＬＴＢ４の代謝に主によることが示唆されている。（Kircher等 (1997)  Prostaglandins leukotrienes and essential fatty acids 56: 417-23）。ロイコトリエンは、プロスタノイド阻害後の胃粘膜内における主要なアラキドン酸代謝の役割を演じる。これらの化合物は、ＮＳＡＩＤの使用に起因する著しい胃上皮損傷の一因となる。（CelottiおよびLaufer (2001) Pharmacological Research 43: 429-36）。ＣＯＸおよび５−ＬＯの二重阻害剤は、ラットモデルにおける関節炎由来の心臓（arthritic heart）の環状血管収縮を阻害することも示された。（Gok等 (2000) Pharmacology 60: 41-46）。合わせると、ＣＯＸ−２および５−ＬＯ二重阻害剤には、効果の増加および副作用のなさに加えて、ＣＯＸ−２阻害剤およびＮＳＡＩＤ以上に明瞭な利点があることをこれらの特性は示唆している。
【０００６】
ＣＯＸ阻害剤の作用メカニズムがたいていの一般的なＮＳＡＩＤのそれと重なるので、ＣＯＸ阻害剤は、炎症が重大な役割を演じる一時的症状および慢性的疾患における炎症に伴う痛みおよび腫脹を含む多くの同じ症状を治療するのに用いられる。一時的症状には、軽い擦り傷、火傷または接触皮膚炎に伴う炎症の治療、並びに緊張性頭痛、片頭痛および月経痙攣に伴う痛みの緩和が含まれる。慢性症状への適用には、関節炎、例えば慢性関節リウマチおよび変形性関節症が含まれる。慢性関節リウマチは主として自己免疫疾患であり、変形性関節症は間接の軟骨の劣化に起因するが、それぞれに伴う炎症を減じることは、これら患者の生活の質を著しく高めることになる。（Wienberg (2001) Immunol. Res. 22: 319-41; Wollhiem (2000) Curr. Opin. Rheum. 13: 193-201）。慢性関節リウマチの他に、炎症は一般にリウマチ性疾患の構成要素である。従って、ＣＯＸ阻害剤の使用は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＳ）（Goebel等 (1999) Chem. Res. Tox. 12: 488-500;Patrono等 (1985) J. Clin. Invest. 76: 1011-1018）並びにリウマチ性皮膚症状、例えば強皮症のような疾患にまで拡大した。ＣＯＸ阻害剤はまた、乾癬のようなリウマチ由来ではない炎症性皮膚症状の緩和にも使用され、その場合、プロスタグランジンの過剰産生の結果として生じる炎症の軽減が直接の利点である（Fogh等 (1993) Acta Derm Venerologica 73:191-3）。簡単に言うと、ＣＯＸ阻害剤は慢性炎症性疾患、並びに一時的な炎症に起因するときどきの疼痛および痛みの治療に有用である。
【０００７】
抗炎症薬としての使用の他に、ＣＯＸ阻害剤の別の潜在的な役割は癌の治療におけるものである。ＣＯＸ−２の過剰発現は様々な人の悪性疾患において示されており、ＣＯＸ−２の阻害剤は皮膚、胸および膀胱腫瘍を有する動物の治療に有効であることが示されている。作用メカニズムは完全に分かっていないが、ＣＯＸ−２の過剰発現はアポプトシスを阻害し、腫瘍原性細胞タイプの攻撃性を高めることが示されている。（Dempke等 (2001) J. Can. Res. Clin. Oncol. 127: 411-17; MooreおよびSimmons (2000) Current Med. Chem. 7: 1131-44）。ＣＯＸ−２の過剰発現の結果生じるプロスタグランジンの産生の高まりが細胞増殖を促し、その結果、脈管形成を増大させることは可能である。（Moore (1985) Prostanoids: pharmacological, physiological and clinical relevance, Cambridge University Press, N. Y., pp.229-30; Fenton等 (2001) Am. J. Clin. Oncol. 24: 453-57）。
【０００８】
各種癌の予防および治療における使用の可能性についてＣＯＸ−２阻害剤を評価する臨床研究がいくつかなされてきた。１９９９年に、米国では１３０，０００の新たな結腸直腸癌のケースが診断された。例えば、非特異的ＮＳＡＩＤであるアスピリンが結腸直腸癌の発生率を４０〜５０％まで（Giovannucci等 (1995) N Engl J Med. 333: 609-614）、そして死亡率を５０％まで（Smalley等 (1999) Arch Intern Med. 159: 161-166）減少させることが分かった。１９９９年に、ＦＤＡは、結腸直腸癌の死亡率を減じるためにＦＡＰ（家族性腺腫ポリポーシス）にＣＯＸ−２阻害剤セレコキシブを用いることを認可した。ＣＯＸ−２がかかわっている証拠のある他の癌、例えば、限定されないが、食道癌、頭および首の癌、乳癌、膀胱癌、頸部癌、前立腺癌、肝細胞癌および非小細胞肺癌は、ＣＯＸ−２阻害剤でうまく予防および／または治療しうると考えられる（Jaeckel等 (2001) Arch. Otolarnygol. 127: 1253-59; Kirschenbaum等 (2001) Urology 58: 127-31; DannhardtおよびKiefer (2001) Eur. J. Med. Chem. 36: 109-26）。ＣＯＸ−２阻害剤はまたリスクの高い患者の結腸癌をうまく予防することも証明しうる。ＣＯＸ−２阻害剤がいくつかのタイプの生命を脅かす癌を予防または逆転させうる証拠もある。現在まで、５０もの多くの研究が、ＣＯＸ−２阻害剤が動物の前悪性および悪性腫瘍を防ぐこと、および膀胱、食道および皮膚癌も同様に場合によっては防げることを示している。ＣＯＸ−２阻害剤は、今世紀の最も重要な予防医学業績の１つであることが立証された。
【０００９】
最近の科学的進歩はＣＯＸ−２発現、一般的な炎症およびアルツハイマー症（ＡＤ）の病因間の関連を確認した。（Ho等 (2001) Arch. Neurol. 58: 487-92）。動物モデルにおいて、ＣＯＸ−２酵素を過剰発現する遺伝子導入マウスは、損傷に対してより敏感な神経を有する。国際老化研究所（National Institute on Aging、NIA）は、ＮＳＡＩＤがアルツハイマー症の進行を遅らせうるかどうかを測定する臨床試験を始めている。ナプロキセン（非選択的ＮＳＡＩＤ）およびロフェコキシブ（Ｖｉｏｘｘ、ＣＯＸ−２特異的選択的ＮＳＡＩＤ）が評価されるであろう。先行する証拠は、炎症がアルツハイマー症の一因となることを示している。アルツハイマー協会およびＮＩＡによると、米国では約４百万人がＡＤ患者であり、世紀半ばまでには１千４百万人に増加することが予想される。
【００１０】
ＣＯＸ酵素（プロスタグランジンＨ２シンターゼとしても知られている）は２つの別の反応を触媒する。第１の反応では、アラキドン酸は代謝されて不安定なプロスタグランジンＧ２（ＰＧＧ２）を形成する（シクロオキシゲナーゼ反応）。第２の反応では、ＰＧＧ２はエンドペルオキシドＰＧＨ２に変換される（ペルオキシダーゼ反応）。短命のＰＧＨ２は非酵素的にＰＧＥ２に分解する。ここに記載の化合物は、ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２ペルオキシダーゼ活性の阻害に焦点を合わせた分析と、ＣＯＸ酵素の新規な阻害剤を識別する化学的デレプリケイション（dereplication）法とを組み合わせた発見戦略の結果である。
【００１１】
アカシアはマメ科の高木および低木の属である。アカシア属にはマメ科およびミモソイデアエ）Mimosoideae亜科に属する１０００を越える種類が含まれる。アカシアは中央および南アメリカ、アフリカ、アジアの一部、並びにオーストラリアの熱帯および亜熱帯地域に広く分布しており、最も多くの固有種を有する。アカシアは乾燥および不毛地域で主に見られ、そこでは森は見通しのよいとげだらけの低木であることが多い。アカシア属は、主に葉の形態に基づいて３つの亜属アカシア、アクリフェラム（Aculiferum）およびヘテロフィラム（Heterophyllum））に分けられる。しかしながら、成長しきった木の葉の性質に基づいて、アカシア属は２つの「一般的な」グループに分けることができる：典型的な２回羽状複葉種とフィロデナス（phyllodenous）種。フィロード（phyllode）は、葉状構造に広がった変形葉柄であり、葉はなく、乾性条件に適応する。典型的な２回羽状複葉種は主に熱帯地域全体に見られ、フィロデナス種は主にオーストラリアに見られる。インドでは４０種を越えるアカシアが報告されている。Gambleは彼のFlora of Madras Presidencyで南インドの２３の固有種を載せており、そのうちの１５種はタニ  ナドゥ（Tami Nadu）に見られる。それ以後、多くのアカシアの新種がインドに導入されている。現在、約４０種がタニ  ナドゥで見られる。原産種は主にとげのある木または低木であり、いくつかはとげが多く、例えばA.・アカシア、A.・ペンナタおよびA.・シヌアタである。多くの種類はアフリカおよびオーストラリアから導入されたものであり、例えば２回羽状複葉を有するアカシア・メアルンシ、A.・ピクナンタおよびA.・デアルバタ、フィロデナス種であるA.・アウリクリフォルミス、A.・ホロセレシアおよびA.・マンギウムである。
【００１２】
アカシアは、タンニン、ガム、木材、燃料および飼い葉源を提供する経済的に非常に重要なものである。主に樹皮から単離されるタンニンは、皮革および生皮をなめすのに広く用いられる。いくつかのアカシアの樹皮は地方酒の風味づけにも用いられる。A.・シヌアタのようないくつかの原産種はまたサポニンを生じ、これらは様々な植物グルコシドであり、水と混合および攪拌すると、滑らかな泡を形成する。サポニンは洗浄剤、発泡剤および乳化剤に用いられる。いくつかのアカシア種の花は芳香性であり、香料の製造に用いられる。例えば、カシー（cassie）香料はアカシア・フェルゲネア（Acasia ferrugenea）から得られる。多くのアカシアの心材は農業用具の製造に用いられ、またたきぎ源にもなる。アラビアゴムは薬剤および菓子に、そして繊維工業におけるサイジングおよび仕上げ材として広い用途がある。ラック虫はA.・ニロティカ（A. nilotica）およびA.・カテチュを含む数種の上で成長することができる。A.・ニロティカを含むいくつかの種類は荒地の植林に用いられてきており、これらは多少の洪水に耐えることができ、そのような地域のいくつかはバードサンクチュアリになっている。
【００１３】
これまで、約３３０の化合物が様々なアカシア種から単離されている。水溶性植物顔料の１種であるフラボノイドはアカシアから単離される主要な種類の化合物である。約１８０の異なるフラボノイドが確認されており、それらのうちの１１種はフラバンである。テルペノイドはアカシア属の種類から単離される第２の最も多い種類の化合物であり、４８の化合物が確認されている。アカシアから単離される他の種類の化合物には、アルカロイド（２８）、アミノ酸／ペプチド（２０）、タンニン（１６）、炭水化物（１５）、酸素複素環（１５）および脂肪族化合物（１０）が含まれる。（Buckingham, The Combined Chemical Dictionary, Chapman & Hall CRC, version 5: 2, Dec. 2001）。
【００１４】
フェノール系化合物、特にフラバンは全てのアカシア種に中ないし高濃度で見られる。（Abdulrazak等 (2000) Journal of Animal Sciences. 13: 935-940）。歴史的には、アカシア種のたいていの植物および抽出物は、胃腸疾患、下痢および消化不良を治療するおよび出血を止める収斂剤として用いられてきた。（Vautrin (1996) Universite Bourgogne (フランス) European abstract 58-01C: 177; Saleem等 (1998) Hamdard Midicus. 41: 63-67）。アカシア・アラビカ野生種の樹皮およびさやは大量のタンニンを含み、収斂剤および去痰剤として用いられてきた。（Nadkarni (1996) India Materia Medica, Bombay Popular Prakashan, pp.9-17）。ソマリアのアカシア・トルティリス（Acacia tortilis）の茎皮から単離されるジアリールプロパノール誘導体は、平滑筋弛緩効果を有することが報告されている。（Hagos等 (1987) Planta Medica. 53: 27-31, 1987）。アカシア・ビクトリアエ（Acacia victoriae）から単離されるテルペノイドサポニンが、ジメチルベンズアントラセンにより誘導されるネズミの皮膚の発癌に抑制効果を有し（Hanausek等 (2000) Proceedings American Association for Cancer Research Annual Meeting 41: 663）、そしてアポプトシスを誘導する（Haridas等 (2000) Proceedings American Association for Cancer Research Annual Meeting 41: 600）ことが報告されている。アカシア・ニロティカからの植物抽出物は、スパスモーゲン、血管収縮および抗高血圧性活性（Amos等 (1999) Phytotherapy Research 13: 683-685; Gilani等 (1999) Phytotherapy Research 13: 665-669）および抗血小板凝集活性（Shah等 (1997) General Pharmacology 29: 251-255）を有することが報告されている。抗炎症活性はA.・ニロティカから報告されている。フラボノイド、多糖類および有機酸が潜在的な活性化合物であると考えられた。（DafallahおよびAl-Mustafa (1996) American Journal of Chinese Medicine 24: 263-269）。これまで、唯一報告されたアカシアから単離された５−リポキシゲナーゼ阻害剤はモノテルペノイドのカルボキサミドである（Seikine等 (1997) Chemical and Pharmaceutical Bulletin 45: 148-11）。
【００１５】
アラビアゴムは他の植物成分と共に配合され、活性化合物の認定なしに、潰瘍予防に用いられてきた。（Fuisz、米国特許第５，６５１，９８７号）。アラビアゴムはまた他の植物成分と共に配合され、栄養補給組成物の粘度を下げることによって薬剤溶解の改善（Blank、米国特許第４，９４６，６８４号）に用いられてきた（Chancellor、米国特許第５，５４５，４１１号）。
【００１６】
アカシアの樹皮からの抽出物はホワイトニング剤として（阿部、ＪＰ１００２５２３８）、歯科用のグルコシルトランスフェラーゼ阻害剤として（阿部、ＪＰ０７２４２５５５）、たんぱく質合成阻害剤として（深井、ＪＰ０７１６５５９８）、外用皮膚製剤用の活性酸素掃去剤として（本田、ＪＰ０７０１７８４７、Bindra米国特許第６，１２６，９５０号）、および炎症、花粉症および咳きを防ぐ経口用ヒアルロニダーゼ阻害剤として（小倉、ＪＰ０７０１０７６８）外用のために日本で特許されている。
【００１７】
カテキンは主に緑茶に見られるフラバンであり、次の構造を有する：
【００１８】
【化１】
2005521715.tif 000002
【００１９】
カテキンは単独でおよび茶に見られる他のフラボノイドと共に作用し、抗ウイルスおよび抗酸化活性を有する。カテキンはウイルス性肝炎の治療に効果的であることが示されている。心臓、腎臓、肺および脾臓への酸化性損傷を防ぐことも明らかである。カテキンはまた、胃癌細胞の成長を抑制することも示されている。
【００２０】
カテキンおよびその異性体エピカテキンはプロスタグランジンエンドペルオキシドシンターゼを阻害し、４０μｍｏｌ／ＬのＩＣ５０値を有する。（Kalkbrenner等 (1992) Pharmacol. 44: 1-12）。４種の植物（Atuna racemosa, Syzygium carynocarpum, Syzygium malaccenseおよびVantanea peruviana）から単離された（＋）−カテキンおよびガロカテキンを含む５つのフラバン−３−オール誘導体は、ＣＯＸ−１に比べて、ＣＯＸ−２に対してより弱い阻害活性を同様に示し、ＩＣ５０値は３．３〜１３８μＭである（Noreen等 (1998) Planta Med. 64: 520-524）。セイバ・ペンタンドラ（Ceiba pentandra）の樹皮から単離される（＋）−カテキンはＣＯＸ−１を阻害し、ＩＣ５０値は８０μＭである（Noreen等 (1998) J. Nat. Prod. 61: 8-12）。商業的に入手しうる純粋な（＋）−カテキンはＣＯＸ−１を阻害し、ＩＣ５０値は実験条件により約１８３〜２７９μＭであり、ＣＯＸ−２に対する選択性はない。（Noreen等 (1998) J. Nat. Prod. 61: 1-7）。
【００２１】
緑茶カテキンをオスのドーリーラットの食餌に補充すると、血小板ホスホリパーゼＡ２の活性レベルを低下させ、血小板シクロオキシゲナーゼレベルを有意に減少させた。（Yang等 (1999) J. Nutr. Sci. Vitaminol. 45: 337-346）。カテキンおよびエピカテキンは伝えられるところによれば、人の結腸癌ＤＬＤ−１細胞においてＣＯＸ−２遺伝子転写を弱く抑制する（ＩＣ５０＝４１５．３μＭ）。（武藤等 (2000) Jpn. J. Cancer Res. 91: 686-691）。赤ワインからの（＋）−カテキンの神経保護能力は、シクロオキシゲナーゼ、リポキシゲナーゼ、または酸化窒素シンターゼのような細胞内酵素への阻害効果というよりはむしろ、カテキンの抗酸化性の結果として生じる（Bastianetto等 (2000) Br. J. Pharmacol. 131: 711-720）。緑茶および紅茶から精製されたカテキン誘導体、例えばエピガロカテキン−３−ガレート（ＥＧＣＧ）、エピガロカテキン（ＥＧＣ）、エピカテキン−３−ガレート（ＥＣＧ）、およびテアフラビンは、人の結腸粘膜および結腸腫瘍組織におけるアラキドン酸のシクロオキシゲナーゼおよびリポキシゲナーゼ依存性代謝の阻害を示し（Hong等 (2001) Biochem. Pharmacol. 62: 1175-1183）、ＣＯＸ−２発現およびＰＧＥ（２）産生を誘導する（Park等 (2001) Biochem. Biophys. Res. Commun. 286: 721-725）。セラストラス・オルビクラタス（Celastrus orbiculatus）の空中部分から単離されるエピアフゼレチンはＣＯＸ−１活性の投与量依存性阻害を示し、ＩＣ５０値は１５μＭであり、１００ｍｇ／ｋｇの用量での経口投与後にカラギーニンによって誘導されるマウスの足の水腫に対する抗炎症活性も示した（Min等 (1999) Planta Med. 65: 460-462）。
【００２２】
各種植物源、特に緑茶の葉からのカテキンおよびその誘導体はＨＰＶ感染尖圭コンジロームの治療（Cheng, 米国特許第５，７９５，９１１号）および乳頭腫ウイルスに起因する増殖症の治療（Cheng, 米国特許第５，９６８，９７３号および第６，１９７，８０８号）に用いられている。カテキンおよびその誘導体はまた、哺乳動物組織における脈管形成、例えば皮膚癌、乾癬、クモ状静脈またはアンダーアイサークル（under eye circle）（Anderson, 米国特許第６，２４８，３４１号）、マウスのＵＶＢ誘導腫瘍形成（Agarwal等 (1993) Photochem. Photobiol. 58: 695-700）を防ぐのに、遺伝子発現および酵素活性レベルでの酸化窒素シンターゼの阻害に（Chan, 米国特許第５，９２２，７５６号）、育毛剤として（高橋、米国特許第６，１２６，９４０号）局所的に用いられている。カテキンに基づく組成物はまた、ざ瘡（Murad, 米国特許第５，９６２，５１７号）、消化器官組織の硬化（Shi, 米国特許第５，４７０，５８９号）の治療、アンドロゲン作用障害関連疾患および癌（Liao, 米国特許第５，６０５，９２９号）の治療における５α−レダクターゼ活性の阻害のために、他の抽出物およびビタミンと共に配合されている。緑茶抽出物は、ＣＯＸ−２酵素の阻害によって炎症を軽減するために、特定活性化合物の認定なしに、７つの他の植物抽出物と共に配合されてきた（Mewmark, 米国特許第６，２６４，９９５号）。
【００２３】
これまで、多くの天然フラボノイドが様々な用途に商品化されてきた。例えば、スクテラリア（Scutellaria）抽出物のリポソーム配合物はスキンケアに用いられてきた（米国特許第５，６４３，５９８号および第５，４４３，９８３号）。バイカリンは、腫瘍遺伝子へのその抑制効果のため、癌の予防に用いられてきた（米国特許第６，２９０，９９５号）。バイカリンおよび他の化合物は抗ウイルス、抗バクテリアおよび免疫調節剤として（米国特許第６，０８３，９２１号）および天然の抗酸化剤として（ポーランド公開特許第９，８４９，２５６号）用いられてきた。クリシンはその不安緩和性のために用いられてきた（米国特許第５，７５６，５３８号）。抗炎症性フラボノイドは肛門直腸および結腸疾患の抑制および治療（米国特許第５，８５８，３７１号）およびリポキシゲナーゼの阻害（米国特許第６，２１７，８７５号）に用いられる。これらの化合物はまた、結合組織の修復および維持のためにグルコサミンコラーゲンおよび他の成分と共に配合される（Bath、米国特許第６，３３３，３０４号）。フラボノイドエステルは化粧用組成物の活性成分を構成する（米国特許第６，２３５，２９４号）。フェロデンドロン・アムレンセ（Phellodendron amurense）から誘導される樹皮抽出物および化合物は炎症性疾患の治療使用に特許されている（米国特許第５，７６６，６１４号、第５，９０８，６２８号、第６，１１３，９０９号、第６，１９３，９７７号）。アントシアニンタイプの構造を有するプルナス・アヴィウム（Prunus avium）およびプルナス・セラサス（Prunus cerasus）からのチェリーバイオフラボノイドはシクロオキシゲナーゼ阻害剤として特許されている（米国特許第６，１９４，４６９号、米国特許出願第２００１０００２４０７号）。
【００２４】
発明の概要
本発明は、ＣＯＸ−２および５−リポキシゲナーゼの同時阻害に効果的な方法に関する。酵素ＣＯＸ−２および５−ＬＯの同時二重阻害法は、アカシア属植物の単一植物または複数の植物から単離される多数のフラバンの個々をおよび／または混合物を含む組成物を、それを必要とする受容者に投与することを含む。
【００２５】
本発明はまた、ＣＯＸ−２および５−ＬＯ仲介疾患および症状の予防および治療法に関する。ＣＯＸ−２および５−ＬＯ仲介疾患および症状の予防および治療法は、それを必要とする受容者に、有効量の、アカシア属植物の単一植物または複数の植物から単離される多数のフラバンの個々および／または混合物、そして薬学的に許容される担体を含む組成物を投与することを含む。
【００２６】
下記に従って用いることができるフラバンには、次の一般的な構造：
【００２７】
【化２】
2005521715.tif 000003
【００２８】
（式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は独立して、Ｈ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＯＣＨ３、−ＳＣＨ３、−ＯＲ、−ＳＲ、―ＮＨ２、−ＮＲＨ、−ＮＲ２、−ＮＲ３＋Ｘ−、限定されないが、ガレート、アセテート、シンナモイルおよびヒドロキシルシンナモイルエステル、トリヒドロキシベンゾイルエステルおよびカフェオイルエステルを含む置換基のエステル；限定されないが、アルドペントース、メチルアルドペントース、アルドヘキソース、ケトヘキソースおよびそれらの化学的誘導体を含む多数の糖の１つまたは組み合わせの炭素、酸素、窒素または硫黄グリコシド；ニ量体、三量体および他の重合フラバンよりなる群から選択され；ここで、
Ｒは、１〜１０個の炭素原子を有するあるアルキル基であり；そして
Ｘは、限定されないが、ヒドロキシル、塩化物、ヨウ化物、硫酸塩、リン酸塩、酢酸塩、フッ化物、炭酸塩等を含む薬学的に許容される対陰イオンの群から選択される）
で表される化合物が含まれる。
【００２９】
本発明の方法は、限定されないが、、変形性関節症、慢性関節リウマチ、月経痙攣、全身性エリテマトーデス、乾癬、慢性緊張性頭痛、片頭痛、局所創傷および軽い炎症症状、炎症性腸疾患および固形癌を含む多くのＣＯＸ−２および５−ＬＯ仲介疾患および症状の治療および予防に用いることができる。
【００３０】
上記のように、本発明のフラバンはアカシア属から選択される植物から得られる。好ましい態様では、植物は、アカシア・カテチュ、アカシア・コンシナ、アカシア・ファルネシアナ、アカシア・セネガル、アカシア・スペシオサ、アカシア・アラビカ、Ａ．・カエシア、Ａ．・ペンナタ、Ａ．・シヌアタ、Ａ．・メアルンシ、Ａ．・ピクナンタ、Ａ．・デアルバタ、Ａ．・アウリクリフォルミス、Ａ．・ホロセレシア、Ａ．・マンギウムよりなる群から選択される。
【００３１】
本発明の組成物は、本技術分野における当業者に公知のどのような方法で投与してもよい。投与方式には、限定されないが、腸内（経口）投与、非経口（静脈内、皮下および筋肉内）投与および局所適用が含まれる。本発明による治療法は、治療を必要とする患者に、限定されないが、合成、天然またはこれらの組み合わせの単一または複数源からの多数のフラバンの個々および／または混合物を有効量で経口または局所投与することを含む。
【００３２】
本発明は、アカシア属植物からフラバンを単離および精製する方法を含む。本発明の方法は、ａ）アカシア属植物から選択される植物の粉砕バイオマスを抽出すること；ｂ）抽出物を中和および濃縮すること；およびｃ）中和および濃縮抽出物を精製することを含む。本発明の好ましい態様では、抽出物は、再結晶、沈殿、溶媒分配および／またはクロマトグラフィー分離よりなる群から選択される方法を用いて精製される。本発明は、望ましい生理学的活性を有するアカシアフラバンを単離および精製するための商業的に実行可能な方法を提供する。
【００３３】
本発明は、ＣＯＸ−２および５−ＬＯ酵素活性および炎症を特異的に阻害するこれら抽出物中の活性植物抽出物および特定の化合物を識別する、一連の生物分子スクリーンと化学デレプリケイション法とを組み合わせた戦略を実行するものである。合計１２３０の植物抽出物を、組換えＣＯＸ−２に伴うペルオキシダーゼ活性を阻害する能力についてスクリーンした。この主要なスクリーンで２２の植物抽出物を識別し、これらをさらに、細胞に基づく分析および全血分析において試験管内でＣＯＸ−２を特異的にかつ選択的に阻害する能力について調べた。試験管内で有効であったこれらの抽出物を次に、複数のルート（ＩＰおよび経口）により投与したときの炎症の空気嚢および局所的な耳の腫脹モデルを用いて、生体内炎症抑制能力について試験した。これらの試験から、ＣＯＸ−２活性を阻害し、試験管内および生体内の両方で有効である植物抽出物を発見した。次に、これらの抽出物を５−ＬＯ阻害能力について試験した。これらの試験から、アカシア属植物からのフラバン抽出物がＣＯＸ−２および５−ＬＯに対して二重特異性を示すことを識別した。ＣＯＸ−２および５−ＬＯに対してこの二重特異性を示すアカシア属植物から単離された物質の組成物についての報告は初めてであると考える。
【００３４】
上記の一般的な記載および下記の詳細な記載は説明であり、本発明を制限するものでないことは無論のことである。
【００３５】
発明の詳細な説明
本発明の側面を示す様々な用語をここで用いる。本発明の組成物の説明を明確にするために、次に定義を示す。
「フラバン」は特定の種類のフラボノイドであり、次の一般的な構造：
【００３６】
【化３】
2005521715.tif 000004
【００３７】
（式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は独立して、Ｈ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＯＣＨ３、−ＳＣＨ３、−ＯＲ、−ＳＲ、―ＮＨ２、−ＮＲＨ、−ＮＲ２、−ＮＲ３＋Ｘ−、限定されないが、ガレート、アセテート、シンナモイルおよびヒドロキシルシンナモイルエステル、トリヒドロキシベンゾイルエステルおよびカフェオイルエステルを含む置換基のエステル；限定されないが、アルドペントース、メチルアルドペントース、アルドヘキソース、ケトヘキソースおよびそれらの化学的誘導体を含む多数の糖の１つまたは組み合わせの炭素、酸素、窒素または硫黄グリコシド；ニ量体、三量体および他の重合フラバンよりなる群から選択され；ここで、
Ｒは、１〜１０個の炭素原子を有するあるアルキル基であり；そして
Ｘは、限定されないが、ヒドロキシル、塩化物、ヨウ化物、硫酸塩、リン酸塩、酢酸塩、フッ化物、炭酸塩等を含む薬学的に許容される対陰イオンの群から選択される）
で表すことができる。
【００３８】
ここで用いられる「治療」には、治療および／または予防が含まれ、人並びに他の動物に関して用いられる。
「薬学的にまたは治療に有効な投与量または量」は、望ましい生物学的結果を引き出すのに十分な用量レベルを指す。その結果とは、薬剤の放出、徴候、症状もしくは疾患原因の軽減、または生物学的システムの他の望ましい変化でありうる。
【００３９】
「受容者」は、ここに記載の組成物が投与される、生きている対象、人または動物である。
この出願明細書に様々な引例が挙げられていることに注意されたい。各引例は、参照することによってここに記載されたものとする。
【００４０】
本発明は、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ−２）および５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯ）酵素の両者を同時に阻害するのに効果的な方法に関する。ＣＯＸ−２および５−ＬＯ酵素の同時二重阻害法は、アカシア属の単一植物または複数の植物から単離される多数のフラバンの個々をおよび／または混合物を含む組成物を、それを必要とする受容者に投与することを含む。
【００４１】
本発明はまた、ＣＯＸ−２および５−ＬＯ仲介疾患および症状の予防および治療法に関する。ＣＯＸ−２および５−ＬＯ仲介疾患および症状の予防および治療法は、それを必要とする受容者に、有効量の、アカシア属の単一植物または複数の植物から単離される多数のフラバンの個々および／または混合物、並びに薬学的に許容される担体を含む組成物を投与することを含む。
【００４２】
本発明の方法に従って用いうるフラバンには、上記一般構造によって示される化合物が含まれる。本発明のフラバンはアカシア属植物から単離される。好ましい態様では、植物は、アカシア・カテチュ、アカシア・コンシナ、アカシア・ファルネシアナ、アカシア・セネガル、アカシア・スペシオサ、アカシア・アラビカ、Ａ．・カエシア、Ａ．・ペンナタ、Ａ．・シヌアタ、Ａ．・メアルンシ、Ａ．・ピクナンタ、Ａ．・デアルバタ、Ａ．・アウリクリフォルミス、Ａ．・ホロセレシア、Ａ．・マンギウムよりなる群から選択される。
【００４３】
フラバンは、限定されないが、茎、茎の皮、幹、幹の皮、小枝、塊茎、根、根の皮、若枝、種子、根茎、花および他の生殖器官、葉および他の空中部分を含む、植物の様々な部分に見られる。
【００４４】
ＣＯＸ酵素を阻害することができる化合物を識別するために、抽出物収集は、中国、インドおよび他の国々から収集した６１５の薬用植物からの１２３０の抽出物からなる。この主要なスクリーンで２２の植物抽出物を識別し、これらをさらに、細胞に基づく分析および全血分析において試験管内でＣＯＸ−２を特異的かつ選択的に阻害する能力について試験した。抽出物の一般的な製法は実施例１に記載する。実施例１では、説明のためにアカシア・カテチュ種を用いる。アカシア・カテチュからの樹皮の粉砕粉末を有機溶媒で、そしてその後、脱イオン（ＤＩ）水で抽出した。抽出プロセスで、試験するそれぞれの種類の有機および水性抽出物が得られる。抽出結果は表１に示す。これらの主要な抽出物は、上で詳記したように、シクロオキシゲナーゼの主要な機能活性の１つであり、ＰＧＧ２のＰＧＨ２への、そして最終的にはＰＧＥ２への変換を招くシクロオキシゲナーゼ酵素のペルオキシダーゼ活性を阻害する阻害剤の予備識別分析に用いられる材料源である。この分析は実施例２に記載されており、結果は表２に示す。表２を参照すると、アカシア・カテチュからの有機および水性抽出物はＣＯＸ−２のペルオキシダーゼ活性を異なる程度に阻害した。
【００４５】
粗製抽出物の主要な分析からのＣＯＸ−２阻害活性は、投与量反応およびＩＣ５０（酵素活性の５０％を阻害するのに必要な濃度）の測定によって確認した。ＩＣ５０値は表３に示す。この分析では、アカシア・カテチュ有機抽出物がヒト／ヒツジＣＯＸ−２（ＩＣ５０＝３／６μｇ／ｍＬ）およびヒツジＣＯＸ−１（ＩＣ５０＝２．５μｇ／ｍＬ）に対して有効であった。従って、ＣＯＸ酵素の阻害剤についての主要なスクリーンは、アカシア属からの有機抽出物がＣＯＸ−２酵素に対して有効であることを示した。
【００４６】
植物抽出物からの活性化合物を効果的に識別するために、実施例３に記載のように、高処理フラクションプロセスを用いた。簡単に言うと、アカシア・カテチュからの有機および水性抽出物をデュー(due)チャンネルブロードバンドＵＶ検出器および２つのGilson 222XL液体ハンドラーと連結した高処理精製システムで分別した。８８のフラクションを９６深穴プレートに集めた。各フラクションを、実施例４に記載のように、主要な分析のとおりＣＯＸ活性阻害能力について試験し、構造デレプリケイションをオフラインＬＣ／ＰＤＡおよびＬＣ／ＭＳ分析を用いてポジティブＨＴＰについて開始した。結果は図１および２に示す。これらの図は、アカシア・カテチュの有機および水性抽出物からそれぞれ誘導された各種ＨＴＰフラクションによるＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２阻害の様子を示す。多くのＨＴＰフラクションが選択的ＣＯＸ−２阻害活性を実際に示すことに留意すべきであり、このことは、全体抽出物の観察される選択的阻害効果に寄与する多数の化合物が抽出物中にあることを示唆している。
【００４７】
穴＃Ｃ８〜Ｆ７と標識された水性抽出物からの活性ＨＴＰフラクションは、ポジティブモードでＬＣ／ＭＳを用いて分析された。フラクションＤ１１のＬＣ／ＰＤＡ／ＰＤＡ／ＭＳ分析は図３に示す。最初の活性ピークはフラクションＣ９〜Ｄ９の間にあり、カテキン成分を含み、２９１ｍ／ｚに［分子イオン＋１］＋を有する。第２の活性ピークは、ＣＯＸ−１選択性を示し、フラクションＤ９〜Ｅ２の間にあり、カテキン２量体を含み、５７８ｍ／ｚに分子イオンを有する。第３の活性ピークは、ＣＯＸ−２選択性を示し、フラクション＃Ｅ８〜Ｆ８の間にあり、多数の成分を含み、５７３＆５７９にｍ／ｚを有し、これはそれぞれ４−ヒドロキシシンナモイル−オレアネン−３−オールおよびロビネチニドール−カテキンに相当する。
【００４８】
アカシア・カテチュの有機抽出物中に存在する活性成分の分離、精製および認定は実施例５に記載する。実施例に記載の方法を用いて、カテキンおよびエピカテキンをアカシア・カテチュの根からの有機抽出物中の２つの主要活性成分として認定し，ＩＣ５０値は５〜７μｇ／ｍＬであった。
【００４９】
アカシア・カテチュからの活性抽出物のＨＰＬＣ定量は実施例６に記載する。結果は表４に示す。表４は、有機および水性抽出物中のフラバン含有量が、ＨＰＬＣで測定して、それぞれ３０．４％および１．０％であることを示している。このことは、なぜ有機抽出物の阻害活性が水性抽出物のそれの２倍を越えるかを説明している。ＨＰＬＣ分析はまた、各抽出物がより少量のフラバン成分を含有し、これらが選択的ＣＯＸ−２阻害活性に寄与することも示している。ＨＰＬＣ結果は図４ＡおよびＢに示す。
【００５０】
実施例２に記載の主要な分析は組換え酵素を用いる細胞非含有システムである。活性抽出物および化合物の生物学的活性をさらに説明するために、細胞に基づく試験管内効果および動物に基づく生体内効果を示す２つのモデルを用いた。試験管内効果および選択性の評価に用いる方法は実施例７に記載する。それぞれ主としてＣＯＸ−１（ＴＨＰ−１細胞）およびＣＯＸ−２（ＨＯＳＣ細胞）の発現を誘導することができる２つの細胞系を選んだ。各細胞系をＰＧＥ２の産生、ＣＯＸ酵素の主要な産生について試験した。結果は表５に示す。表５は、アカシア有機抽出物がＣＯＸ−１、およびＣＯＸ−１酵素に対して優位であるＣＯＸ−２の両方を阻害することを示している。ＴＨＰ−１細胞系の使用は重要であり、活性化合物が細胞膜を横切る能力を示すが、これは不滅化細胞系であり、従って、より適切なモデルシステムに基づく効果の評価が望ましい。その結果、抽出物はまた、ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２両活性の主要な源として全血を用いて評価した。このシステムは、ＰＧＥ２対ＴＸＢ２の産生の阻害を測定して、ＣＯＸ−１とＣＯＸ−２との間の阻害活性を区別する。表５に示す結果は、ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２酵素はいずれもアカシア抽出物によって阻害されることを示している。ＩＣ５０値は、このシステム内で、アカシア抽出物がＣＯＸ−２に対してより効果的であることを示唆している。全体として、これら抽出物内の活性化合物の阻害効果は、試験管内での細胞非含有および細胞に基づくいずれのシステムにおいても有意かつ有効である。
【００５１】
上述のように、ＣＯＸおよび５−ＬＯ両酵素の二重阻害剤はＣＯＸ阻害剤単独よりも明らかに有利である。これらの利点には、限定されないが、アラキドン酸代謝の阻害へのより広い効果、胃腸毒性のないことおよび血管収縮の減少の可能性が含まれる。従って、アカシア有機抽出物を、実施例８に記載のように、５−ＬＯ阻害への効果について試験した。簡単に言うと、組換えヒト５−ＬＯを、酵素基質（ウンベリフェリルアラキドネート）を加える前の１５分間、アカシア抽出物と共にインキュベートした。結果は図５に示す。アカシア抽出物はこの細胞非含有試験管内システムにおいて５−ＬＯ活性を阻害し、７０μｇ／ｍＬのＩＣ５０値を示した。５−ＬＯに対するアカシア抽出物のＩＣ５０値は、ＣＯＸ−２に対する同じ抽出物のそれよりも高いが、これはアラキドン酸代謝に起因する炎症の治療に有意な利点を加える可能性がある。
【００５２】
２つの別の生体内モデルを用いて、アカシア抽出物から観察された試験管内効果を生体内炎症反応抑制能力に言い換えられるかどうか調べた。２つのモデルは実施例９に記載する。これらシステムの第１のシステムは、アラキドン酸代謝経路から直接生じる炎症を調べるように設計する。この例では、マウスをアカシアからの抽出物で処理し、その後、耳にＡＡを局所塗布して炎症反応を誘導した。次に、動物の予備処理効果を、マイクロメーターを使用して耳の腫脹の抑制によって測定した。アカシア抽出物は良好な抑制反応を示し、ＡＡ誘導炎症反応の特異的阻害を示唆している。結果は図６Ａおよび６Ｂに示す。さらに、抽出物はまた、経口または腹腔内投与したとき有意な阻害を示した。従って、アカシア抽出物は多くの投与ルートにより炎症を軽減するのに有効であることが示された。
【００５３】
アカシアからの有機抽出物はアラキドン酸によって直接引き起こされる炎症に対して最も有効であった。従って、標準化されたアカシア抽出物の有効性を、炎症の多くのメカニズムが結局は最終効果の原因である第２のモデルを用いて試験した。このシステムは従って、自然に生じる炎症反応により適切なものである。このモデルを用いて、補足システムの非常に有効な活性剤をBalb／Ｃマウスの背中につくった空気嚢に注入する。これによって、炎症細胞の浸潤、ＣＯＸ酵素の活性化を含む炎症現象のカスケードが生じ、その結果、ＰＧＥ２、酵素ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）の放出、および非常に特異的なプロフィールを有するＴＮＦ−αを含む前炎症性サイトカインの産生が生じる。これらの試験は、アカシアが空気嚢への炎症細胞の初期の浸潤（化学走性反応）を阻害しなくても、これらの細胞の活性化を妨害することを示した。これは、嚢の細胞外液へ排出されたＭＰＯがないことおよびＴＮＦ−αの産生がないことによって証明される。結果は実施例７に示す。データは、アカシア抽出物が、多くの炎症経路が活性であるモデルシステムにおいて、炎症反応の制御に有効かつ役立つことを示している。しかしながら、標準化抽出物は、アカシア抽出物ＩＰの最高濃度（２００ｍｇ／ｋｇ）を受け入れた動物の致死率が６０％という毒性作用を生じた。この毒性作用は食事によって同じ投与量を受け入れた動物では観察されなかった。
【００５４】
医薬製剤の形で投与する製品の製造は、本技術分野における当業者に周知の様々な方法で行うことができる。フラバンはその自然に存在する形のハーブ粉末として；様々な濃度の溶媒および／または臨海超過液体抽出物として；再結晶、カラム分離、溶媒分配、沈殿および他の手段による濃縮および精製化合物として；合成法によって製造された実質的に精製されたフラバンを含有する純粋物質および／または混合物として配合しうる。
【００５５】
本技術分野では様々な放出システムが知られており、本発明の治療組成物の投与に用いることができ、その例は水溶液、リポソームへの封入、微粒子、およびマイクロカプセルである。
【００５６】
本発明の治療組成物は注射によって非経口投与しうるが、他の効果的な投与形、例えば関節内注入、吸入ミスト、経口活性製剤、経皮イオン浸透療法または座薬も考えられる。１つの好ましい担体は生理食塩水であるが、他の薬学的に許容される担体も用いうる。１つの好ましい態様では、担体およびフラバンが生理学的に適合した遅放出製剤を構成することが考えられる。そのような担体中の主要溶媒は水性でも非水性でもよい。さらに、担体は、製剤のｐＨ、オスモル濃度、粘度、透明度、色、滅菌性、安定性、溶解速度、または臭いの調節または維持のために他の薬理学的に許容される賦形剤を含んでいてもよい。同様に、担体はまた、安定性、溶解速度、リガンドの放出または吸収を調節または維持するために他の薬理学的に許容される賦形剤を含んでいてもよい。そのような賦形剤は単位投与形または多数回投与形での非経口投与用の用量を配合するのに普通および通例用いられるものである。
【００５７】
治療組成物が配合されたら、滅菌バイアル中に、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、または脱水もしくは凍結乾燥粉末として貯蔵しても；あるいは経口投与用の他の不活性担体と共に直接カプセル化および／または錠剤化してもよい。そのような製剤はすぐ使用できる形でまたは投与直前に作り直す必要のある形で貯蔵してもよい。全身放出用の組成物を含有する製剤を投与する方法は、経口、皮下、筋肉内、静脈内、鼻内または膣もしくは直腸座薬によってもよい。
【００５８】
個々の疾患または症状の治療に効果的な組成物の量は疾患または症状の特徴により、標準的な臨床技術によって決定することができる。さらに、最適な投与量範囲の認定を助けるのに、試験管内または生体内分析を任意に用いてもよい。製剤中に用いる正確な投与量はまた、投与ルート、および疾患または症状の重症度または進行度によって決まり、開業医および各患者の状況により決定すべきである。効果的な投与量は、試験管内または動物モデル試験システムから誘導される投与量−反応曲線から外挿しうる。例えば、本発明の組成物の効果的な量は、本発明の組成物の勾配投与量を投与し、そして望ましい効果を観察することによって容易に決定される。
【００５９】
本発明による治療法は、治療を必要とする患者に、治療に有効な量の、単一源または複数源からの多数のフラバンの個々および／または混合物を、体内にまたは局所に投与することを含む。多数のフラバンの個々のおよび／または混合物の純度は、限定されないが、化合物を得る方法により、０．０１〜１００％である。好ましい態様では、フラバンおよびフラバン含有医薬組成物の投与量は、０．０１〜２００ｍｇ／ｋｇ体重から一般に選択される有効で非毒性の量である。定期的な臨床試験を用いる技術に熟練した人々は、治療すべき疾患に最適な投与量を決定することができる。
【００６０】
本発明には、アカシア植物からフラバンを単離および精製する改良法が含まれ、これは
実施例１０に記載されている。実施例１０では、アカシア・カテチュからのフラバンを様々な溶媒系で抽出した。結果は表６に示す。この発明の改良法は、フラバンを含有する植物の粉砕バイオマスの有機溶媒または有機溶媒および／または水での抽出；中和および中和抽出物の濃縮；並びに再結晶および／またはクロマトグラフィーによる抽出物の精製が含まれる。表６から、水中の８０％メタノールがアカシア植物からのフラバンの抽出に好ましい溶媒の１つであることが分かる。上記のように、これらのフラバンはアカシア属植物から単離することができる。本発明の方法は、これらの化合物を含有するどのような植物源からのこれらの化合物の単離にも広げることができる。
【００６１】
さらに、フラバンは、限定されないが、植物全体、茎、茎の皮、小枝、塊茎、花、果実、根、根の皮、若枝、種子、根茎、および空中部分を含む植物の様々な部分から単離することができる。好ましい態様では、フラバンは根、生殖器官または植物全体から単離される。
【００６２】
植物の粉砕バイオマスの抽出に用いうる溶媒は、限定されないが、水、酸性水、水と混和性ヒドロキシル化有機溶媒、例えばメタノールまたはエタノールとの組み合わせ、およびアルコールと他の有機溶媒、例えばＴＨＦ、アセトン、酢酸エチル等との混合物がある。１つの態様では、抽出物はｐＨ４．５〜５．５に中和され、その後、濃縮、乾燥されて粉末にされる。次に、フラバンは、限定されないが、再結晶、溶媒分配、沈殿、昇華、および／またはクロマトグラフィー法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、吸収クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、限外濾過またはこれらの組み合わせを含む各種方法によって精製することができる。
【００６３】
実施例１１では、慢性関節リウマチまたは膝および／または腰の変形性関節症に起因する痛みの緩和へのフラバンの効果を評価する臨床試験を説明する。試験はシングル−センター無作為二重盲検偽薬対照試験であった。慢性関節リウマチまたは膝および／または腰の変形性関節症患者６０人（ｎ＝６０）を無作為に４つのグループにし、偽薬、組成物Ａ（２５０ｍｇ／日もしくは５００ｍｇ／日）またはセレコキシブ（２００ｍｇ／日）で６０日間治療した。組成物Ａは、アカシア・カテチュの抽出物を含む特許比率の標準化抽出物からなり、合計フラバン含有率は１０．３５（ｗ／ｗ）である。セレブレックスとしても知られるセレコキシブは、ＣＯＸ−２選択的阻害剤である処方薬の登録商標名である。表７は治療前のＷＯＭＡＣ指数評点（ベースライン評点）を示し、表８は治療後のＷＯＭＡＣ指数評点変化を示す。図９〜１２は試験結果をグラフで説明するものである。
【００６４】
図９〜１２に示すように、痛み、こわばりおよび身体機能に関係するＷＯＭＡＣ複合評点および個々の下位評点は、偽薬グループに比べてフラバンの投与後に有意な改善を示した。さらに、フラバンは、痛みの緩和および身体機能改善に処方薬セレコキシブと同じ効果を示した。最後に、２つの異なる投与量で投与したフラバンでは効果に差は観察されなかった。
【００６５】
次の実施例は説明のためのものであり、本発明の範囲を制限するものではない。
実施例
実施例１．アカシア・カテチュからの有機および水性抽出物の製造
アカシア・カテチュ（Ｌ）野生種からの植物材料を２ｍｍ以下の粒子サイズに粉砕した。次に、乾燥粉砕植物材料（６０ｇ）を三角フラスコに移し、メタノール：ジクロロメタン（１：１）（６００ｍＬ）を加えた。混合物を１時間振とうし、濾過し、そしてバイオマスを再びメタノール：ジクロロメタン（１：１）（６００ｍＬ）で抽出した。有機抽出物を合わせ、真空蒸発させて有機抽出物を得た（以下の表１参照）。有機抽出後、バイオマスを空気乾燥し、超純水（６００ｍＬ）で１回抽出した。水溶液を濾過し、凍結乾燥して水性抽出物を得た。
表１．アカシア・カテチュの有機および水性抽出物の収量
【００６６】
【表１】
2005521715.tif 000005
【００６７】
実施例２．アカシア・カテチュからの植物抽出物によるＣＯＸ−２およびＣＯＸ−１ペルオキシダーゼ活性の阻害
特異的ＣＯＸ−２阻害剤識別のためのバイオアッセイスクリーニング法は、下記のように酵素のペルオキシダーゼ活性を分析するように設計した。
【００６８】
ペルオキシダーゼ分析：ＣＯＸ−２の阻害剤を検出する分析は、高処理プラットフォーム（RazおよびNeedleman (1990) J. Biol. Chem. 269: 603-607）を変形した。簡単に言うと、ペルオキシダーゼバッファー（１００ｍＭ、ＴＢＳ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１μＭ  Ｈｅｍｅ、０．０１ｍｇエピネフリン、０．０９４％フェノール）中の組換えヒツジのＣＯＸ−２（ケイマン）を抽出物（１：５００希釈）と共に１５分間インキュベートした。クワンタブル（Quantablu）（Pierce）基質を加え、２５℃で４５分間発光させた。次に、Wallac Victor 2プレートリーダーを使用してルミネッセンスを読み取った。結果は表２に示す。表２のデータは、組換えヒツジのＣＯＸ−２酵素および基質単独に対するペルオキシダーゼ活性の百分率として示される。阻害率は、水性抽出物の場合の３０％（対照の７０％）から有機抽出物の場合の７５％までであった。データは、有機抽出物が試験管内においてより有効であることを明らかに示した。
表２．アカシア・カテチュによるＣＯＸ−２ペルオキシダーゼ活性の阻害
【００６９】
【表２】
2005521715.tif 000006
【００７０】
ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２イソフォームの相対的阻害の比較は、これら酵素のそれぞれのＩＣ５０値をつくる必要がある。ＩＣ５０は、対照に関する酵素活性の５０％阻害が特定の阻害剤によって達成される濃度として定義される。この場合、ＩＣ５０値は、表３に示すように、ＣＯＸ−２およびＣＯＸ−１酵素の場合、それぞれ３〜６μｇ／ｍＬおよび２．５μｇ／ｍＬであることが分かった。
表３．ヒトおよびヒツジのＣＯＸ−２およびＣＯＸ−１に対するＩＣ５０値
【００７１】
【表３】
2005521715.tif 000007
【００７２】
実施例３．活性抽出物のＨＩＰ分別
アカシア・カテチュからの有機抽出物（４００ｍｇ）をプレパックフラッシュカラム（２ｃｍＩＤ×８．２ｃｍ、１０ｇシリカゲル）に装填した。カラムは日立高処理精製（ＨＴＰ）システムを使用し、（Ａ）５０：５０ＥｔＯＡｃ：ヘキサンおよび（Ｂ）メタノールの１００％Ａ〜１００％Ｂの勾配移動相を３０分、５ｍＬ／分の流量で用いて溶離した。分離はブロードバンド波長ＵＶ検出器を使用してモニターし、フラクションは、ギルソンフラクション採取器を使用して、９６深穴プレートに１．９ｍＬ／穴にて集めた。試料プレートは低真空および遠心作用の下で乾燥した。ＤＭＳＯ（１．５ｍＬ）を用いて、試料を各細胞に溶解し、一部（１００μＬ）をＣＯＸ阻害分析のために採取した。
【００７３】
アカシア・カテチュからの水性抽出物（７５０ｍｇ）を水（５ｍＬ）に溶解し、１μｍシリンジフィルターに通して濾過し、４ｍＬＨＰＬＣバイアルに移した。次に、混合物を自動試料採取器によってプレパック逆相カラム（Ｃ−１８、１５μｍ粒子サイズ、２．５ｃｍＩＤ×１０ｃｍ、プレカラム挿入）に注入した。カラムは日立高処理精製（ＨＴＰ）システムを使用し、（Ａ）水および（Ｂ）メタノールの１００％Ａ〜１００％Ｂの勾配移動相を２０分間、次いで、１００％メタノールを５分間、１０ｍＬ／分の流量で用いて溶離した。分離はブロードバンド波長ＵＶ検出器を使用してモニターし、フラクションは、ギルソンフラクション採取器を使用して、９６深穴プレートに１．９ｍＬ／穴にて集めた。試料プレートは凍結乾燥した。超純水（１．５ｍＬ）を用いて、試料を各細胞に溶解し、一部（１００μＬ）をＣＯＸ阻害分析のために採取した。穴＃Ｃ８〜Ｆ７からの活性ＨＴＰフラクションは、超音波イオン化源を用いてポジティブモードでＬＣ／ＭＳ／ＰＤＡで分析した。活性フラクションＤ１１についての結果は図３に示す。
【００７４】
実施例４．アカシア・カテチュからのＨＴＰフラクションによるＣＯＸペルオキシダーゼ活性の阻害
個々の有機抽出物を、ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２両組換え酵素のペルオキシダーゼ活性阻害能力についてＨＴＰフラクションのそれぞれを試験することによってさらに特徴づけた。結果は図１および２に示す。これらの図は、実施例１に記載のように単離されたアカシアからのＨＴＰフラクションによるＣＯＸ−２およびＣＯＸ−１活性の阻害を示す。図１に示すプロフィールは、ＣＯＸ−２に対して非常に選択的な阻害ピークおよび同等の有効性で両酵素を阻害する多数のピークを示す。しかしながら、ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２酵素はいずれも多数の阻害ピークを示し、初期阻害プロフィールに寄与する１つ以上の分子があることを示唆している。
【００７５】
実施例５．アカシア・カテチュの有機抽出物からの活性化合物の単離および精製
実施例１に記載のように単離されたアカシア・カテチュの根からの有機抽出物（５ｇ）を、プレパックフラッシュカラム（１２０ｇシリカ、４０μｍ粒子サイズ３２〜６０μｍ、２５ｃｍ×４ｃｍ）に装填し、（Ａ）５０：５０ＥｔＯＡｃ：ヘキサンおよび（Ｂ）メタノールの１００％Ａ〜１００％Ｂの勾配移動相を６０分、１５ｍＬ／分の流量で用いて溶離した。フラクションは１０ｍＬ／フラクションで試験管に集めた。溶媒は真空蒸発させ、各フラクション中の試料はＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解し、２０μＬのアリコートを９６穴浅皿プレートに移し、ＣＯＸ阻害活性について試験した。ＣＯＸ分析結果に基づいて、活性フラクション＃３２〜＃４１を合わせ、蒸発させて２．６ｇの固体を得る。ＨＰＬＣ／ＰＤＡおよびＬＣ／ＭＳによる分析は、それぞれ、１５．８および１６．１分の保持時間を有する２つの主要な化合物を示した。生成物は、２１２．４ｍｇの生成物を充填し、そして（Ａ）水および（Ｂ）アセトニトリル（ＡＣＮ）の勾配移動相で６０分間にわたり５ｍＬ／分の流量で溶離するＣ１８セミ−プレパラトリーカラム（２５ｃｍ×１ｃｍ）で精製した。８８のフラクションを集め、２つの活性化合物を単離した。化合物１（１１．５ｍｇ）および化合物２（１６．６ｍｇ）。純度は、標準（カテキンおよびエピカテキン）およびＮＭＲデータと比較することによりＨＰＬＣ／ＰＤＡおよびＬＣ／ＭＳデータによって測定した。
化合物１．
【００７６】
【数１】
2005521715.tif 000008
【００７７】
この化合物はカテキンとして確認された。ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２酵素に対するカテキンのＩＣ５０値はそれぞれ６μｇ／ｍＬおよび４０μｇ／ｍＬである。
化合物２．
【００７８】
【数２】
2005521715.tif 000009
【００７９】
この化合物はエピカテキンとして確認された。ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２酵素に対するエピカテキンのＩＣ５０値はそれぞれ７μｇ／ｍＬおよび２０μｇ／ｍＬである。
【００８０】
実施例６．アカシア・カテチュからの活性抽出物のＨＰＬＣ定量
アカシア・カテチュからの有機および水性抽出物中のフラバン含有量は、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、フォトダイオード・アレー検出器（ＨＰＬＣ／ＰＤＡ）およびルナＣ１８カラム（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ）を使用して定量した。フラバンは、２０分にわたる１０％〜３０％ＡＣＮのアセトニトリル勾配、次いで５分間の６０％ＡＣＮを用いてカラムから溶離した。結果は表４に示す。フラバンは、標準としてカテキンおよびエピカテキンを用いて、保持時間およびＰＤＡデータに基づいて定量した。２つの主要なフラバンの保持時間はそれぞれ１２．７３分および１５．７６分であった。ＨＰＬＣクロマトグラムは図４Ａおよび４Ｂに示す。
表４．活性植物抽出物中のＢ環のないフラボノイド含有量
【００８１】
【表４】
2005521715.tif 000010
【００８２】
＊ＡＥ：水性抽出物
＊ＯＥ：有機抽出物
【００８３】
実施例７．アカシア・カテチュからの有機抽出物のＣＯＸ阻害活性についての試験管内試験
アカシア・カテチュからの抽出物の試験管内効果およびＣＯＸ−２特異性は、アラキドン酸代謝の発生阻害能力について、細胞に基づくシステムで試験した。ＣＯＸ−２およびＴＨＰ−１を構造的に発現し、ＣＯＸ−１を発現する、細胞系ＨＯＳＣを、アラキドン酸の存在下でプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）を生じる能力について試験した。
【００８４】
ＣＯＸ−２  細胞に基づく分析：  ＨＯＳＣ（ＡＴＣＣ＃８３０４−ＣＲＬ）細胞を８０〜９０％の集密率にまで培養した。細胞をトリプシン処理し、洗浄し、そして組織培養基（ＭＥＭ）１０ｍＬ中に１×１０６細胞／ｍＬで再懸濁した。細胞懸濁液（２００μＬ）を９６穴組織培養プレートで平板培養し、３７℃および５％ＣＯ２で２時間インキュベートした。次に、培養基を、１ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−１ｂを含有する新しいＨＯＳＣ培養基に取り替え、一晩インキュベートした。培養基を再度除き、１９０ｍＬ  ＨＯＳＣ培養基に取り替えた。次に、試験化合物を１０μＬのＨＯＳＣ培養基に加え、３７℃で１５分間インキュベートした。ＨＯＳＣ培養基中のアラキドン酸（２０ｍＬ、１００μＭ）を加え、混合物を振とう機上で室温にて１０分間インキュベートした。上澄み（２０μＬ）を、ＥＬＩＳＡバッファー中１００μＭインドメタシンの１９０μＬ／穴を含む新しいプレートに移した。上澄みはＥＬＩＳＡにより下記のように分析した。
【００８５】
ＣＯＸ−１  細胞に基づく分析：  ＴＨＰ−１細胞を３０ｍＬの体積に懸濁した（５×１０５細胞／ｍＬ）。ＴＰＡを加えて、１０ｎＭ  ＴＰＡの最終濃度にし、４８時間培養して、細胞をマクロファージ（付着性）に対して見分ける。細胞はＨＢＳＳ（２５ｍＬ）に再懸濁し、９６穴プレートに２００ｍＬ体積中、５×１０５細胞／穴で加えた。次に、ＲＰＭＩ１６４０（１０μＬ）中の試験化合物を加え、３７℃で１５分間インキュベートした。次いで、ＲＰＭＩ（２０μＬ）中のアラキドン酸を加え、混合物を振とう機上で室温にて１０分間インキュベートした。上澄み（２０μＬ）を、インドメタシン（１００μＭ）を含有するＥＬＩＳＡバッファー（１９０μＬ）に加えた。次に、上澄みを下記のようにＥＬＩＳＡにより分析した。
【００８６】
ＣＯＸ−２  全血分析：  正常で健康なドナーから末梢血を静脈穿刺によって集めた。全血（５００μＬ）は試験化合物と共にインキュベートし、３７℃で１５分間抽出した。リポ多糖類（E. coli serotype 0111: B4から）を加えて１００μｇ／ｍＬの最終濃度にし、３７℃で一晩培養した。血液を遠心分離し（１２，０００×ｇ）、血漿を集めた。血漿（１００μＬ）をメタノール（４００μＬ）に加えてたんぱく質を沈殿させた。上澄みをＥＬＩＳＡによってＰＧＥ２産生について測定した。この手順は、Brideau等 (1996) Inflamm. Res. 45: 68-74に記載の方法の変形である。
【００８７】
ＣＯＸ−１  全血分析：  抗凝固薬を含まない新鮮な血液を管に集め、シリコーン処理されたマイクロ遠心分離管中の５００μＬアリコートに直ちに分けた。試験試料を加え、渦状に混ぜ、３７℃で１時間凝固させた。次に、試料を遠心分離し（１２，０００×ｇ）、血漿を集めた。血漿（１００μＬ）をメタノール（４００μＬ）に加えてたんぱく質を沈殿させた。上澄みをＥＬＩＳＡによってＴＸＢ２産生について測定した。この手順は、Brideau等 (1996) Inflamm. Res. 45: 68-74に記載の方法の変形である。
【００８８】
ＥＬＩＳＡ分析：  イムノロン−４ＥＬＩＳＡプレートを、炭酸塩バッファー（ｐＨ９．２）中の捕捉抗体０．５〜４μｇ／ｍＬで４℃にて一晩被覆した。プレートを洗浄し、室温でブロッキングバッファー（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ）と共に２時間インキュベートした。プレートを再び洗浄し、試験試料（１００μＬ）を加え、振とうしながら、室温で１時間インキュベートした。ペルオキシダーゼ結合２次抗体を０．５〜４ｍｇ／ｍＬ含有５０μＬ体積に加え、振とうしながら、室温で１時間インキュベートした。次に、プレートを３回洗浄し、ＴＭＢ基質（１００μＬ）を加えた。プレートを３０分間発光させ、その後、１Ｍリン酸（１００μＬ）を加えることによって反応を停止した。次に、Wallac Victor２プレートリーダーを使用してプレートを読み取った。
【００８９】
細胞毒性：  細胞毒性は、損傷細胞中のラクテートデヒドロゲナーゼの放出を測定する比色キット（オックスフォード・バイオケミカル・リサーチ）を使用して調べた。分析は製造業者の指示に従って終えた。アカシア・カテチュからの精製フラバンおよび標準化抽出物の両者を試験した。どの試験化合物にも細胞毒性は見られなかった。
【００９０】
分析結果は表５に示す。データは直接比較のためＩＣ５０値として示す。表５を参照すると、ＩＣ５０値はＣＯＸ−１の場合、ＣＯＸ−２よりも一般に低い。さらに、全血はＰＧＥ２産生（このシステムにおけるＣＯＸ−２の測定）またはトロンボキサンＢ２（ＴＸＢ２）（ＣＯＸ−１活性の測定）の様々な阻害についても測定した。表５を参照すると、これらの試験は、全血細胞に基づく分析中でＣＯＸ−２阻害に対する特異性を明らかに示している。しかしながら、ＴＨＰ−１およびＨＯＳＣに基づくモデルシステムを用いる試験は、ＣＯＸ−１に対する選択性がより高いことを実際に示した。この矛盾について理由は、おそらく、各酵素を構造的に発現する不滅化細胞系と、ＣＯＸ酵素発現が誘導される全血からの初代細胞との間の根本的な違いである。初代細胞は生体内の炎症を調べるのにより適切なモデルである。さらに、ＣＯＸ−１対ＣＯＸ−２活性の識別に用いた化合物は、これらのシステムのそれぞれにおいて変化し、従って、直接比較できない。
表５．  全体細胞システムにおけるＣＯＸ活性の阻害
【００９１】
【表５】
2005521715.tif 000011
【００９２】
実施例８．アカシア・カテチュからの有機抽出物による５−リポキシゲナーゼの阻害
５−リポキシゲナーゼ分析：  ヒト組換え５−リポキシゲナーゼ酵素（ケイマン）を分析バッファー（５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＡＴＰ）に希釈した（１：５０）。同体積の試料（１：５００希釈）および希釈酵素を、１５分間振とうしながら、一緒にインキュベートした。基質（ウンベリフェリルアラキドネート、分析バッファー中１：５０００）を加え、混合物を振とうしながら室温でインキュベートした。得られたルミネッセンスはWallac Victor 2プレートリーダーで読み取った。結果は図５に示す。
【００９３】
実施例９．アカシア・カテチュからの有機抽出物のＣＯＸ阻害活性の生体内試験
炎症の生体内抑制は２つのモデルを用いて測定した。第１のシステム（耳の腫脹モデル）は、アラキドン酸によって直接誘導される炎症を測定する。これはＣＯＸ−２阻害のすぐれた測定であるが、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）による細胞膜リン脂質からのアラキドン酸遊離の上流で生じるあらゆる細胞現象を測定するものではない。従って、阻害剤作用をより生物学的に適切な反応で測定するために、空気嚢モデルを用いた。このモデルは、サイトカイン並びにアラキドン酸代謝を含む強力な細胞浸潤および炎症仲介物質産生で特徴づけられる炎症反応を誘導する補体の強力な活性剤を用いる。
【００９４】
耳の腫脹モデル：  耳の腫脹モデルは、アラキドン酸代謝阻害を直接測定するものである。簡単に言うと、アセトン中のアラキドン酸をマウスの耳に局所塗布する。アラキドン酸の代謝は、ＣＯＸ−２のような酵素作用によって生成される前炎症仲介物質を結果として産生する。腫脹の抑制は、この経路にかかわる酵素阻害の直接の程度である。結果は図６に示す。図６は、２つの時点（２４時間および１時間）で胃管栄養法による経口または腹腔内（ＩＰ）のいずれかで投与された抽出物の効果を示す。アカシア・カテチュからの抽出物は、ＩＰおよび胃管栄養法によって投与したとき、腫脹を抑制した（図６Ａおよび図６Ｂ）。
【００９５】
空気嚢モデル：  アカシア有機抽出物は耳の腫脹モデルにおいて有効であったので、炎症の空気嚢モデルを用いて、標準化アカシア抽出物も試験した。簡単に言うと、３ｍＬの滅菌空気を注射することによって、空気嚢をマウスの背中につくった。空気嚢は、１週間毎日１ｍＬの滅菌空気をさらに注射することによって維持した。動物には耳の腫脹モデルに対して記載したのと同じ方法および濃度で投与し、そしてチモサンを（空気嚢へ）注入して、炎症反応を開始した。４時間後、嚢中の液を集め、炎症細胞の浸潤、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性（細胞活性、脱顆粒の測定）について測定した。結果は図７に示す。
【００９６】
図７Ａは、空気嚢液から集められた細胞の合計数を示す。対照（インドメタシン）によって阻害された強い反応があったが、標準化アカシア抽出物は炎症細胞の浸潤を抑制しなかった（ケモキネシス）。化学走性反応は消えなくても、液を調べて、ＭＯＰ活性を測定することによって、浸潤細胞が活性になったかどうか測定した。図７Ｂおよび図７Ｃは、抽出物を、胃管栄養法によるのではなく、ＩＰ投与すると、ＭＰＯ活性が有意に減少することを示す。これらのデータは、抽出物は補体活性によって誘導された化学走性反応を抑制しないが、前炎症仲介物質の放出および産生を妨げることにより、炎症を減じるのにやはり効果的であることを示している。
【００９７】
アラキドン酸によって誘導される耳の腫脹：  アカシア抽出物の生体内炎症を直接抑制する能力を前記のように測定した。（Greenspan等 (1999) J. Med. Chem. 42: 164-172; Young等 (1984) J. Invest. Dermat. 82: 367-371）。簡単に言うと、５Balb／Ｃマウスのグループに試験化合物を、アラキドン酸（ＡＡ）を塗布する前の２４時間および１時間、腹腔内（ＩＰ）または胃管栄養法による経口のいずれかで投与した。アセトン中のＡＡ（２ｍｇ／１５μＬ）を左の耳に塗布し、アセトン（１５μＬ）をネガティブ対照として右の耳に塗布した。１時間後、動物をＣＯ２吸入によって犠牲にし、耳の厚さをエンジニアのマイクロメーターを使用して測定した。対照にＡＡを与えた動物を加え、抗炎症剤で治療はせず、そして動物をＡＡおよびインドメタシン（ＩＰ）５ｍｇ／ｋｇで治療した。
【００９８】
空気嚢の炎症モデル：  空気嚢モデルは、Rioja等 (2000) Eur. J. Pharm. 397: 207-217の方法から適応させた。空気嚢は、滅菌空気（３ｍＬ）を注射することによって５Balb／Ｃマウスのグループにつくり、そして６日間、２日毎に１ｍＬの滅菌空気を追加注射することによって維持した。動物には試験化合物を、１％チモサン（１ｍＬ）を嚢に注射する前の２４時間および１時間、腹腔内（ＩＰ）または胃管栄養による経口のいずれかで投与した。４時間後、動物をＣＯ２吸入によって犠牲にし、空気嚢を滅菌食塩水（３ｍＬ）で洗浄した。洗浄液を遠心分離し、浸潤細胞の合計数を測定した。上澄みも保持し、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性および    ＴＮＦ−αの存在をＥＬＩＳＡによって活性の程度として分析した。
【００９９】
実施例１０．アカシア・カテチュからの標準化抽出物の開発
アカシア・カテチュ（５００ｍｇの粉砕した樹皮）を次の溶媒系で抽出した。（１）１００％水、（２）８０：２０  水：メタノール、（３）６０：４０  水：メタノール、（４）４０：６０  水：メタノール、（５）２０：８０  水：メタノール、（６）１００％メタノール、（７）８０：２０  メタノール：ＴＨＦ、（８）６０：４０  メタノール：ＴＨＦ。抽出物を濃縮し、低真空下で乾燥した。化学化合物の確認は、フォトダイオード・アレー検出器（ＨＰＬＣ／ＰＤＡ）および２５０ｍｍ×４．６ｍｍＣ１８カラムを使用して、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって行った。化学化合物は、カテキンおよびエピカテキンを標準として用い、保持時間およびＰＤＡデータに基づいて定量した。結果は表６および図８に示す。表６および図８に示すように、８０％メタノール／水での溶媒抽出から得たフラバン抽出物は、フラバン成分の最良の濃度であった。
表６．  アカシア・カテチュから標準化抽出物を生成するための溶媒
【０１００】
【表６】
2005521715.tif 000012
【０１０１】
実施例１１．慢性関節リウマチまたは膝および／または腰の変形性関節症に起因する痛みの緩和へのフラバンの効果の臨床評価
臨床試験は、シングル−センター無作為二重盲検偽薬対照試験であった。慢性関節リウマチまたは膝および／または腰の変形性関節症患者６０人（ｎ＝６０）を無作為に４つのグループにした：
Ａ０  偽薬    ｎ＝１５  偽薬
Ａ１  投与１  ｎ＝１５  組成物Ａ  ２５０ｍｇ／日（１２５ｍｇ  ｂ．ｉ．ｄ．）
Ａ２  投与２  ｎ＝１５  組成物Ａ  ５００ｍｇ／日（２５０ｍｇ  ｂ．ｉ．ｄ．）
Ａ３  活性対照  ｎ＝１５  セレコキシブ  ２００ｍｇ／日（１００ｍｇ  ｂ．ｉ．ｄ．）
化合物Ａは、標準化抽出物の特許混合物からなり、アカシア・カテチュの抽出物を含み、全体フラバン含有率は１０．３５（ｗ／ｗ）である。セレブレックスとしても知られるセレコキシブは、ＣＯＸ−２選択的阻害剤である処方薬の登録商標名である。
【０１０２】
患者は性別を調和させ、４０〜７５歳を採用した。治療は、上記の投与計画に従い、偽薬または活性化合物（組成物Ａまたはセレコキシブ）を６０日間経口投与することよりなる。ＮＳＡＩＤを摂取している患者には、試験開始前２週間の追い出しを約束させた。身体活動制限はしなかった。患者は、試験からいつどのような理由で撤退しても自由であった。治療効果は経口投与の６０日後に、医師によってウエスタン・オンタリオおよびマックマスター大学（ＷＯＭＡＣ）変形性関節症指数を用いて評価した。（Lingard等 (2001) The Journal of Bone & Joint Surgery 83(12): 1856-1864; SodermanおよびMalchau (2000) Acta Orthop Scand. 71(1): 39-46参照）。このプロトコルはモントリオール大学のＩＲＢ委員会によって精査および推奨された。表７は治療前のＷＯＭＡＣ指数評点（ベースライン評点）を示し、表８は６０日間治療後のＷＯＭＡＣ指数評点変化を示す。図９〜１２は、試験結果を示すグラフである。
表７．治療前のＷＯＭＡＣ指数評点（ベースライン評点）
【０１０３】
【表７】
2005521715.tif 000013
【０１０４】
全てのグループの患者ＢＭＩは３１〜３３±６．５であった。
治療グループに統計学的に有意な差は観察されなかった。
表８．６０日間治療後のＷＯＭＡＣ指数評点
【０１０５】
【表８】
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【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】アカシア・カテチュの有機抽出物からのＨＴＰフラクションによる、ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２の阻害のプロフィールを示すグラフである。抽出物を、組換えヒツジＣＯＸ−１（■）またはヒツジＣＯＸ−２（●）のペルオキシダーゼ活性阻害について試験した。データは未処理対照の百分率として表す。
【図２】アカシア・カテチュの水性抽出物からのＨＴＰフラクションによる、ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２の阻害の様子を示すグラフである。抽出物は、組換えヒツジＣＯＸ−１（■）またはヒツジＣＯＸ−２（●）のペルオキシダーゼ活性阻害について試験した。データは未処理対照の百分率として表す。
【図３Ａ】実施例３に記載のＨＴＰフラクションＤ１１のＬＣ／ＰＤＡクロマトグラムを示す。
【図３Ｂ】実施例３に記載のＨＴＰフラクションＤ１１のｍ／ｚ＝５７９での選択されたイオンクロマトグラムおよび化合物ロビネチニドール−（４−６／８）−カテキンの構造を示す。
【図３Ｃ】実施例３に記載のＨＴＰフラクションＤ１１のｍ／ｚ＝２９１での選択されたイオンクロマトグラムおよび化合物カテキンの構造を示す。
【図４Ａ】アカシア・カテチュからの有機抽出物の高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）トレースを示す。
【図４Ｂ】アカシア・カテチュからの水性抽出物の高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）トレースを示す。
【図５】アカシア・カテチュ有機抽出物の５−リポキシゲナーゼ活性への効果を示すグラフである。
【図６Ａ】アカシア・カテチュによるアラキドン酸誘導炎症の抑制を示す図である。生体内効果は実施例９に記載のようにアラキドン酸の直接塗布によって誘導された腫脹の抑制能力に基づいて評価した。治療した耳と対照の耳との間の腫脹の平均的な差を示す。
【図６Ｂ】アカシア・カテチュによるアラキドン酸誘導炎症の抑制を示す図である。生体内効果は実施例９に記載のようにアラキドン酸の直接塗布によって誘導された腫脹の抑制能力に基づいて評価した。アラキドン酸治療対照と比較した各グループの抑制率を示す。
【図７Ａ】標準化アカシア抽出物のチモサン誘導炎症への効果を示す。チモサンは実施例９に記載のように空気嚢における前炎症反応を引き出すのに用いた。前炎症細胞の浸潤を含む炎症のマーカーを用いて、アカシア抽出物の抗炎症活性作用の効果およびメカニズムを評価した。
【図７Ｂ】標準化アカシア抽出物のチモサン誘導炎症への効果を示す。チモサンは実施例９に記載のように空気嚢における前炎症反応を引き出すのに用いた。異なる実験条件下でのＭＰＯ濃度を用いて、アカシア抽出物の抗炎症活性作用の効果およびメカニズムを評価した。
【図７Ｃ】標準化アカシア抽出物のチモサン誘導炎症への効果を示す。チモサンは実施例９に記載のように空気嚢における前炎症反応を引き出すのに用いた。空気嚢液内のＭＰＯ活性の抑制率を用いて、アカシア抽出物の抗炎症活性作用の効果およびメカニズムを評価した。
【図８】水中の８０％ＭｅＯＨを用いてアカシア・カテチュから抽出したフラバンのＨＰＬＣの広がりを示す。
【図９】実施例１１に記載のように偽薬、用量２００ｍｇ／日のセレコキシブ、用量２５０ｍｇ／日の組成物Ａおよび用量５００ｍｇ／日の組成物Ａで６０日治療した後の複合ＷＯＭＡＣ指数評点の変化率を示すグラフである。
【図１０】実施例１１に記載のように偽薬、用量２００ｍｇ／日のセレコキシブ、用量２５０ｍｇ／日の組成物Ａおよび用量５００ｍｇ／日の組成物Ａで６０日治療した後のこわばりのＷＯＭＡＣ指数評点の変化率を示すグラフである。
【図１１】実施例１１に記載のように偽薬、用量２００ｍｇ／日のセレコキシブ、用量２５０ｍｇ／日の組成物Ａおよび用量５００ｍｇ／日の組成物Ａで６０日治療した後の身体機能に関するＷＯＭＡＣ指数評点の変化率を示すグラフである。
【図１２】実施例１１に記載のように偽薬、用量２００ｍｇ／日のセレコキシブ、用量２５０ｍｇ／日の組成物Ａおよび用量５００ｍｇ／日の組成物Ａで６０日治療した後の痛みに関するＷＯＭＡＣ指数評点の変化率を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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