(57)【要約】  本発明は、温度およびバッチ培地浸透圧を調節することによってＣＨＯ細胞培養プロセスにおいてＩｇＧの非グリコシル化重鎖変種のレベルを制御する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞培養物において産生されるＩｇＧ非グリコシル化重鎖（ＮＧＨＣ）のレベルを制御する方法であって、該培養物の温度を調節することを含む方法。
【請求項２】
哺乳動物細胞培養物において産生されるＩｇＧ ＮＧＨＣのレベルを制御する方法であって、該培養物のバッチ培地浸透圧を調節することを含む方法。
【請求項３】
哺乳動物細胞培養物において産生されるＩｇＧ ＮＧＨＣのレベルを制御する方法であって、該培養物の温度およびバッチ培地浸透圧を調節することを含む方法。
【請求項４】
細胞培養宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である請求項１、２または３記載の方法。
【請求項５】
細胞培養物が生産培養物である請求項４記載の方法。
【請求項６】
バッチ培地浸透圧を下げることおよび温度を上げることによってＮＧＨＣのレベルを減少させる請求項４記載の方法。
【請求項７】
バッチ培地浸透圧を下げることによってＮＧＨＣのレベルを減少させる請求項４記載の方法。
【請求項８】
バッチ培地浸透圧を上げることによってＮＧＨＣのレベルを増加させる請求項４記載の方法。
【請求項９】
温度を下げることおよびバッチ培地浸透圧を上げることによってＮＧＨＣのレベルを増加させる請求項４記載の方法。
【請求項１０】
温度を上げることによってＮＧＨＣのレベルを減少させる請求項４記載の方法。
【請求項１１】
温度を下げることによってＮＧＨＣのレベルを増加させる請求項４記載の方法。
【請求項１２】
培養物の温度を約３３℃〜約３５℃に調節する請求項４記載の方法。
【請求項１３】
浸透圧を約２８５ｍＯｓｍ〜約４１７ｍＯｓｍに調節する請求項４記載の方法。
【請求項１４】
培養物の温度を約３３℃〜約３５℃に調節し、浸透圧を約２８５ｍＯｓｍ〜約４１７ｍＯｓｍに調節する請求項４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は２００１年３月２７日に出願された米国仮出願番号第６０／２７９,０２６号の利益を主張する。
（発明の分野）
【０００２】
本発明は、組換えにより産生されたＩｇＧにおけるグリコフォーム（glycoform）を制御する方法に関する。
（発明の技術）
【０００３】
モノクローナル抗体（ＩｇＧアイソタイプ）は種々の発現系を用いて産生される。モノクローナル抗体の産生に用いられる発現系の大部分は哺乳動物のものであり、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ハイブリドーマおよびミエローマ細胞またはそれらの誘導体などの宿主系が挙げられる。
【０００４】
抗体はグリコシル化パターンが他の組換えタンパク質とは有意に異なる。グリコシル化はＡｓｎ２９７にある単一のＮ結合バイアンテナリー構造でもってＩｇＧ分子において高度に保存される傾向にある。これはＣＨ２ドメイン間に埋もれている。そして、ＣＨ２内のアミノ酸残基と十分な接触を形成する。典型的には、組換えにより産生されたＩｇＧでは、Ａｓｎ２９７部位にて結合されるコアオリゴ糖構造の不均一なプロセシングがあり、該ＩｇＧは複数のグリコフォームで存在する。対照的に、ＣＨＯ細胞中にて産生される非ＩｇＧタンパク質は複数のＮ結合グリコシル化部位を有することができる。例えば、Ａｓｎ２５およびＡｓｎ９７の２つのグリコシル化部位を有するインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）ならびにＡｓｎ１１７、Ａｓｎ１８４およびＡｓｎ４４８の３つの部位を有するヒト組織プラスミノーゲンアクチベータ（ｔ−ＰＡ）がある。
【０００５】
ＩｇＧ Ｎ結合グリコフォームは、Ａｓｎ部位の部位占有率、すなわち、マクロ不均一性によって、または、グリコシル化部位でのオリゴ糖構造のバリエーション、すなわち、ミクロ不均一性によって異なり得る。これは、糖残基、オリゴ糖の長さ、またはオリゴ糖を形成する枝の数（バイアンテナリー構造およびトリアンテナリー構造）のバリエーションを含む。Jenkins, Parekh, James, (1996) Nature Biotechnology, 14:975-981 を参照。
【０００６】
さらに詳しくは、ＣＨＯ細胞プロセスにおいて産生されたグリコフォームは構造における末端オリゴ糖形態、構造の長さおよび非グリコシル化重鎖（ＮＧＨＣ）の３つの主要なバリエーションが観察される。ＣＨＯ系におけるＮＧＨＣ形成は、他の細胞培養系において立証されているようにグルコース欠損と関係付けることができる。Stark, Heath, (1979) Archives of Biochemistry and Biophysics, 192 (2):599-609、Turco, (1980) Archives of Biochemistry and Biophysics, 205(2):330-339 および Davidson, Hunt, (1985) Journal of General Virology, 66:1457-1468 を参照。
【０００７】
数人の研究者によって本発明において記載される条件とは異なる条件下でＩｇＧ調製物におけるグリコフォーム制御が観察された。例えば、低い溶存酸素で培養したネズミＢ−リンパ球ハイブリドーマ細胞系によって産生されたＩｇＧではガラクトシル化が減少した。Kunkel, Jan, Butler, Jamieson, (2002) Biotechnol. Prog., 16:462-470 を参照。別のＩｇＧ産生ハイブリドーマ系においては、腹水、または無血清もしくは血清添加培地のいずれにおける培養方法でも種々のグリコシル化パターンが得られた。Patel, Parekh, Moellering, (1992) Biochem. J., 285:839-845 を参照。
【０００８】
米国特許第5,705,364号には、アルカン酸の存在下にて温度および浸透圧を制御することによってＣＨＯのような哺乳動物宿主細胞中にて産生される糖タンパク質中のシアル酸含有量を制御する方法が記載されている。
【０００９】
非ＩｇＧタンパク質においては、培養ｐＨおよびアンモニア濃度は、ＣＨＯ細胞中で産生される組換えマウス胎盤ラクトゲンタンパク質のグリコシル化に影響を与えた。Borys, Linzer, Papoutsakis, (1993) Bio/Technology, 11:720-724 および Borys, Linzer, Papoutsakis, (1993) Biotechnology and Bioengineering, 43: 505-514 を参照。ＣＨＯ産生ヒト卵胞刺激ホルモンにおいて、溶存酸素の定常状態を変えることおよびブチラートの添加による特異的生産力の増大はシアル酸含有量の増加と一致した。Chotigeat, Watanapokasin, Mahler, Gray, (1994) Cytotechnology, 15:217-221 を参照。ＢＨＫ−２によって産生される組換えｈｕ−ＩＬ−２における人工的Ｎ−グリコシル化認識部位のグリコシル化はアンモニアおよびグルコサミンの影響を受けた。シアリル化、近位フコシル化およびアンテナリティにおいて大きな差異が観察された。Gawlitzek, Valley, Nimtz, Wagenr, Conradt, Animal Cell Technology: Developments towards the 21st Century, 379-384 を参照。ＣＨＯ産生組織プラスミノーゲンアクチベータにおける部位占有率は、バッチ培養が長くなるにつれて増大し、また、ブチラートおよび温度の影響も受けた。Anderson, Bridges, Gawlitzek, Hoy, (2000) Biotechnology and Bioengineering, 70:25-31 を参照。
【００１０】
ＣＨＯ中で産生されるＩＦＮ−γのグリコシル化は複数の培養要因に対して感受性があることが示された。バッチ培養において、非グリコシル化形態は３時間目での合計ＩＦＮ−γの３〜５％から１９５時間目での３０％まで増加した。Curling, Hayter, Baines, Bull, Gull, Strange, Jenkins, (1990) Biochem. J. 272:333-337 を参照。長期培養もまたＡｓｎ９７でオリゴマンノースおよびトランケート構造を増加させることが示された。Hooker, Goldman, Markham, James, Ison, Bull, Strange, Slamon, Baines, Jenkins, (1995) Biotechnology and Bioengineering, 48:639-648 を参照。脂質サプリメントであるＥｘＣｙｔｅが培養物中の完全にグリコシル化されたＩＦＮ−γの割合に影響を与えることも示された。また、培地中のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を無脂肪酸ＢＳＡに部分的に取り換えることによりグリコシル化が改善された。Jenkins, Castro, Menon, Ison, Bull, (1994) Cytotechnology, 15:209-215 を参照。Ｌｕｔｒｏｌ Ｆ６８がＩＦＮ−γグリコシル化に影響を与えるかもしれないことも示唆されている。Castro, Ison, Hayer, Bull, (1995) Biotechnol. Appl. Biochem. 21:87-100 を参照。動物組織加水分解物であるＰｒｉｍａｔｏｎｅ ＲＬは、バッチ様式および加流様式におけるＩＦＮ−γのシアリル化に影響を与える。Gu, Zie, Harmon, Wang, (1997) Biotechnology and Bioengineering, 56:353-360 を参照。グルコース制限はヌクレオチド生合成の減少のためにＩＦＮ−γの部位占有率に影響を与えることが示唆されている。Nyberg, Balcarcel, Follstad, Stephanopoulos, Wang, (1998) Biotechnology and Bioengineering, 62:336-347 を参照。
【００１１】
オリゴ糖側鎖のＩｇＧ機能への寄与が大いに討論された。炭水化物構造の重要な機能の１つは補体結合経路におけるものであり、グリコシル化度は抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）および補体の動員と直接関連があった。Jeffries, Lund, Pound, (1998) Immunology Review, 163:50-76 を参照。Ｆｃ受容体結合は非グリコシル化されるキメラマウス−ヒトＩｇＧにおいて減少した。Tao, Morrison, (1989) The Journal of Immunology, 143:2595-2601 を参照。炭水化物構造は、タンパク質の折りたたみ、オリゴマー構築および分泌、ならびに糖タンパク質のインビボクリアランスにも影響を及ぼす。いくつかのグリコフォームは抗原性であり得、そのため、取り締まり官庁は組換えタンパク質における炭水化物構造の分析の増加を要求している。Jenkins, Parekh, James, (1996) Nature Biotechnology, 14:975-981 を参照。さらに、治療的ＩｇＧについての行政機関の規制要件は生産物調製における一貫性を要求している。かくして、ＩｇＧタンパク質の複数のグリコフォームの生産を最小限にするプロセスが必要とされている。
【００１２】
（発明の概要）
本発明の一の態様は、細胞培養物中のＩｇＧ ＮＧＨＣのレベルを制御する方法であって、該培養物の培養温度を調節することを含む方法である。
本発明の別の態様は、細胞培養物中のＩｇＧ ＮＧＨＣのレベルを制御する方法であって、該培養物のバッチ培地浸透圧を調節することを含む方法である。
本発明の別の態様は、細胞培養物中のＩｇＧ ＮＧＨＣのレベルを制御する方法であって、培養温度および該培養物のバッチ培地浸透圧を調節することを含む方法である。
【００１３】
（発明の詳細な説明）
特許および特許出願を包含するがそれらに限定されない本明細書にて引用されている全ての刊行物は、あたかも完全に記載されているかの如く出典明示により本明細書の記載とする。
【００１４】
本発明は、組換えモノクローナル抗体を生産する細胞培養プロセスにおけるＩｇＧ非グリコシル化重鎖（ＮＧＨＣ）のレベルを制御する方法を提供する。生産培養物のような細胞培養物の、培養温度の調節、バッチ培地浸透圧の調節、または温度およびバッチ培地浸透圧の両方の調節によって、ＮＧＨＣのレベルを減少または増加させることができる。生産培養物に播種するために使用される最終種培養物のバッチ培地浸透圧は生産培養物のものに匹敵するように任意に調節することができる。
【００１５】
本発明の一の実施態様において、細胞培養物の温度を上げることによりＮＧＨＣを減少させることができる。同様に、細胞培養物の温度を下げることによりＮＧＨＣを増加させることができる。該プロセスのための好ましい温度は約３３℃〜約３５℃の範囲内である。
【００１６】
本発明の別の実施態様において、細胞培養物におけるバッチ培地浸透圧を下げることによりＮＧＨＣを減少させることができる。同様に、細胞培養物のバッチ培地浸透圧を上げることによりＮＧＨＣを増加させることができる。該プロセスのための好ましい浸透圧は約２８５ｍＯｓｍ〜約４１７ｍＯｓｍの範囲内である。
【００１７】
本発明の別の実施態様において、細胞培養物の高い温度および低いバッチ培地浸透圧の組み合わせによってＮＧＨＣレベルを減少させることができる。
【００１８】
本発明のさらに別の実施態様において、細胞培養物の低い温度および高いバッチ培地浸透圧を組み合わせることによりＮＧＨＣレベルを増加させることができる。
【００１９】
本発明のプロセスは、バッチ培地浸透圧が一定であるならば、好ましい範囲内のいずれもの温度で一定レベルのＮＧＨＣ制御をもたらす。同様に、温度が一定に維持されているならば、好ましい範囲内のいずれものバッチ培地浸透圧でＮＧＨＣを一定レベルに制御することができる。
【００２０】
以下の詳細な非限定的実施例を引用して本発明について記載する。
【００２１】
（実施例）
培地の処方
実施例１〜６について、培地組成物は、ＰＣＴ国際公開番号WO92/05246に記載されているものと同様のアミノ酸、塩、微量元素、およびビタミンを含有する規定処方物からなっていた。ＴＣ ｙｅａｓｔｏｌａｔｅのような酵母加水分解物を５ｇ／Ｌまたは１０ｇ／Ｌの量で添加した。追加のグルコースを４.５ｇ／Ｌまたは９ｇ／Ｌのいずれか添加した。培地にフルクトース第二鉄またはＥＤＴＡ第二鉄、組換えインスリンおよび脂質混合物を添加した。炭酸水素ナトリウムをバッファーとしてバッチ培地に加え、メトトレキセートを、組換えタンパク質の発現を維持するための選択剤としてバッチ培地に加えた。界面活性剤Ｌｕｔｒｏｌ Ｆ６８もまたバッチ培地に加えた。種用および生産用バイオリアクターについてのバッチ培地浸透圧は各実施例に記載されている。ＮａＣｌおよびＫＣｌを加えることによりバッチ培地の浸透圧を調節した。バイオリアクター中での培養の間じゅう、ｐＨ制御を必要とする場合には炭酸ナトリウムを添加した。０.１または０.２ミクロンのいずれかの濾過によって培地を滅菌した。
【００２２】
実施例７においては、上記した専売の培地を使用した。加えて、細胞を２つの市販の培地ＣＤ−ＣＨＯ（ミズーリ州ロックヴィルのインビトロジェン（Invitrogen））およびＥＸ−ＣＥＬＬ ３２５（カンザス州リネクサのジェイ・アール・エイチ・バイオサイエンシズ（JRH Biosciences））に適応させた。次いで、全ての培養物を種々の温度およびバッチ培地浸透圧でのＮＧＨＣ生産について評価した。
【００２３】
実施例１〜５についてのスケールアップおよび生産条件
振盪フラスコおよび３ＬのＡｐｐｌｉｋｏｎバイオリアクター中にてＩｇＧ１抗ＣＤ４モノクローナル抗体を生産する組換えＣＨＯ細胞系の培養によりデータを得た。この抗体は米国特許第6,136,310号においてＣＥ９.１と記載されている。振盪フラスコスケールアップ培養物を、３７０〜３８０ｍＯｓｍの範囲の浸透圧を有する培地にて増殖させ、３７℃で５％二酸化炭素インキュベーター中にて１５０ＲＰＭで振盪した。細胞を６００,０００生細胞／ｍＬの標的シーディング濃度で３〜４日スケジュールで継代させた。継代日に、細胞をトリプシン処理し、生存率％についてはトリパンブルー排除法および血球計算盤を使用してカウントし、総細胞数についてはＺＭ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒを使用してカウントした。
【００２４】
溶存酸素を整定値に維持するために要求があり次第５ｍＬ／分でＯ２を散布しながら、または、ｐＨを６.９〜７.０の整定バンドに制御するために要求があり次第ヘッドスペースへ５ｍＬ／分で１００％二酸化炭素を散布するかもしくは要求があり次第１.５Ｍ Ｎａ２ＣＯ３を添加しながら、３Ｌの種用バイオリアクターを３７℃にて２００ＲＰＭで操作した。バイオリアクターは一定の２０ｍＬ／分のエアーオーバーレイを有していた。
【００２５】
実施例に応じて異なる温度およびｐＨ整定値以外は種用リアクターと同様に３Ｌの生産用バイオリアクターを操作した。１または２日ごとに、種用および生産用バイオリアクター中の細胞をトリプシン処理し、生存率％についてはトリパンブルー排除法および血球計算盤を使用してカウントし、総細胞数についてはＺＭ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒを使用してカウントした。バッチ培地浸透圧は各実施例において詳述するとおりであった。
【００２６】
実施例６のスケールアップおよび生産条件
組換え細胞系の振盪フラスコスケールアップ培養を上記のとおり実施した。次いで、細胞を、１７Ｌの培養容量を有する８０Ｌの種用バイオリアクターにスケールアップした。３７℃およびｐＨ６.９〜７.０で４８ｍｍＨｇの溶存酸素で数日間培養した後、該バイオリアクターに新鮮培地を７１Ｌまで供給した。３７℃およびｐＨ６.９〜７.０で４８ｍｍＨｇの溶存酸素で数日間培養した後、培養物７１Ｌを使用して、３００Ｌの培養容量を有する７５０ＬのＡＢＥＣ種用バイオリアクターに播種した。３７℃およびｐＨ６.９〜７.０で４８ｍｍＨｇの溶存酸素で数日間培養した後、該３００Ｌを使用して、１２００Ｌの培養容量を有する１５００ＬのＡＢＥＣ生産用バイオリアクターに播種した。産生リアクターを、実施例に詳述された温度およびｐＨ６.９〜７.０で４８ｍｍＨｇの溶存酸素で操作した。８０Ｌの種用リアクターについてのバッチ培地浸透圧は３７０〜３８０ｍＯｓｍであった。７５０ＬのＡＢＥＣ種用リアクターおよび１５００ＬのＡＢＥＣ生産用リアクターについてのバッチ培地浸透圧は実施例に詳述されているとおりであった。
【００２７】
実施例７のスケールアップおよび生産条件
組換え細胞系の振盪フラスコスケールアップ培養物を３７℃で５％二酸化炭素インキュベーター中にて１５０ＲＰＭで振盪した。細胞を８００,０００ＶＣＣ／ｍＬの標的シーディング濃度で３〜４日スケジュールで継代させた。継代日に、細胞をトリプシン処理し、生存率％についてはトリパンブルー排除法および血球計算盤を使用してカウントし、総細胞数についてはＺ１ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒを使用してカウントした。
【００２８】
細胞のバイアルを解凍し、４継代の間、上記培地を使用してスケールアップした。この培地を使用してこれらの細胞のサブセットをスケールアップし続け、２つの他の部分を２つの市販の培地ＣＤ−ＣＨＯ（インビトロジェン）およびＥＸＣＥＬＬ−３２５（ジェイ・アール・エイチ・バイオサイエンシズ）に適応させた。５継代の間にわたって市販の培地に対する自家（in-house）培地を以下の割合で使用した：１００／０、５０／５０、０／１００。スケールアップおよび適応のためのバッチ培地浸透圧は、自家培地では３５８ｍＯｓｍであり、市販の培地では３５３ｍＯｓｍであった。３７℃での最後の種継代について、各培地中の細胞を低度、中度、および高度の浸透圧でバッチ化した同様の培地中にて継代培養した。これらは、自家培地については、各々、３１０、３５８および４０５ｍＯｓｍであった。これらは、市販の培地については、各々、３００、３５３および４０５ｍＯｓｍであった。この最後の種継代の終わりに、各培地／浸透圧処理したフラスコを使用して同様の培地／浸透圧処理した生産用振盪フラスコに播種した。次いで、各培地／浸透圧処理のための生産用フラスコを３３℃、３４℃または３５℃でインキュベートした。生存率が約６０％またはそれ以下になった時に生産培養物を収集した。これは、約１４〜１７日の培養の後に生じた。フラスコを残留グルコースについてモニターして、収集当日にグルコースが欠損していないことを保証した。
【００２９】
ＮＧＨＣレベルついての分析
実施例１〜５においては、生産培養物から細胞を濾取した。各バッチについて、タンパク質Ａアフィニティカラムにて生産物を捕獲および濃縮した。次いで、還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのデンシトメトリースキャンによって生産物溶出液をＮＧＨＣ％について分析した。ＮＧＨＣは、各実施例において詳述した、重鎖の総数のパーセンテージとして、または、重鎖および軽鎖の総数のパーセンテージとして報告された。
【００３０】
実施例６においては、生産培養物から細胞を濾取した。各バッチについて、アフィニティカラム上にて生産物を捕獲および濃縮し、次いで、さらに２つのクロマトグラフィー工程によって処理した。次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのデンシトメトリースキャンによって最終生成物をＮＧＨＣ％について分析した。
【００３１】
実施例７においては、生産培養物から細胞を濾取した。各バッチについて、アフィニティカラム上にて生産物を捕獲および濃縮した。次いで、Ａｇｉｌａｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用してミクロキャピラリーアレーにて行われるキャピラリーＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離によって生産物溶出液をＮＧＨＣ％について分析した。
【００３２】
実施例１
培養温度のＮＧＨＣ形成に対する効果
まず、２Ｌの培養容量を有する３ＬのＡｐｐｌｉｋｏｎバイオリアクター中にて培養温度の培養物におけるＮＧＨＣ形成に対する影響を観察した。該生産用リアクターの標準的なプロセス整定値は、温度３４℃、ｐＨ６.９〜７.０および３０％の溶存酸素であった。要因試験は、種培養物の品質、培養温度、ｐＨおよび溶存酸素の力価に対する影響を評価するように設計された。種培養物の品質は、種用リアクターへの播種濃度および播種材料の年齢を典型的な種用リアクターにおいて使用されるものから変更することにより様々であった。試験された因子の組み合わせおよび重鎖のパーセントとしての得られたＮＧＨＣレベルを表１に示す。統計学的分析は、培養温度がＮＧＨＣの形成において統計学的に有意なものであることを示した（ｐ＜０.００２）。調節されたＲ−ｓｑは６１.５％であり、温度がＮＧＨＣのバリエーションの一部を説明するだけであることを示している。図１は直線回帰を示している。
【００３３】
【表１】
2005509403.tif 000002
【００３４】
実施例２
培養温度およびバッチ培地浸透圧のＮＧＨＣ形成に対する効果
培養温度およびバッチ培地浸透圧の力価およびＮＧＨＣの形成に対する効果を測定した。２Ｌの培養容量を有する３Ｌのバイオリアクター中にて３３.４℃〜３４.２℃の間の培養温度および３４０ｍＯｓｍ、３７０ｍＯｓｍおよび４００ｍＯｓｍの浸透圧を評価した。重鎖のパーセントとしてのＮＧＨＣを表２に示す。該データは、実施例１に記載される培養温度のＮＧＨＣ形成に対する効果を確認し、また、高いバッチ培地浸透圧がＮＧＨＣ形成に寄与することを示唆している。ＩＶＣは生細胞の積分を表す。
【００３５】
全ての培養はグルコースを残したまま終わり、増加したＮＧＨＣレベルがグルコース欠損と相関関係になかったことを示した。図２は、ＮＧＨＣ対温度および浸透圧を示す。
【００３６】
【表２】
2005509403.tif 000003
【００３７】
実施例３
培養温度およびバッチ培地浸透圧の操作によるＮＧＨＣの豊富化および減少
実施例１および実施例２において得られたデータに基づいてＮＧＨＣを豊富化させる試みおよびＮＧＨＣを最小化させる試みの中で、２Ｌの培養容量を有する３Ｌのバイオリアクター４個を様々な温度（３３℃、３３.２℃、３５℃および３４.４℃）およびバッチ培地浸透圧（３４０、３７０および４００ｍＯｓｍ）で運転した。重鎖のパーセントとしてのＮＧＨＣレベルを表３に示す。
【００３８】
【表３】
2005509403.tif 000004
【００３９】
実施例４
低いＮＧＨＣを生じる条件の確認
２Ｌの培養容量を有する３Ｌのバイオリアクター８個を３４.２℃〜３５.０℃の間の温度および２８５ｍＯｓｍ、３０４ｍＯｓｍまたは３３１ｍＯｓｍのバッチ培地浸透圧で運転した。全てのバッチについてＮＧＨＣは３.５％未満であった。総タンパク質のパーセントとしてのＮＧＨＣを表４に示す。
【００４０】
【表４】
2005509403.tif 000005
【００４１】
実施例５
ＮＧＨＣ形成に対する培養温度およびバッチ培地浸透圧効果のさらなる評価
２Ｌのバイオリアクター２１個を、３３.６℃〜３４.４℃の間で培養温度を０.２℃ずつ上げ、３３７ｍＯｓｍ〜４１７ｍＯｓｍの間の６種類のバッチ培地浸透圧で運転した。総タンパク質のパーセントとしてＮＧＨＣを表５に示す。データは、培養の最終日の翌日または最終日のグルコース欠損が高いＮＧＨＣレベルと相関関係になかったことを示している。
【００４２】
【表５】
2005509403.tif 000006
*生産培養の最終日の翌日または最終日のグルコースレベル
**標準的なプロセス条件についての内部対照
【００４３】
統計学的分析のために実施例４からのデータを実施例５からのデータと合わせた。この分析から、以下の回帰方程式：
ＮＧＨＣ＝３.１３−２.５７＊（温度）＋１.８９＊（浸透圧）−４.８（温度＊浸透圧）
が得られた。培養温度、バッチ培地浸透圧、ならびに培養温度およびバッチ培地浸透圧の相互作用についてｐ＜０.００１。自由度修正済Ｒ2＝８７.８％および全体的なｐ＝０.０００。このモデルは図３にグラフで示されており、３４.６℃〜３４.７℃の間の温度でＮＧＨＣが一定レベルに維持され得ることを予想している。同様に、３１６ｍＯｓｍのバッチ培地浸透圧で、ＮＧＨＣは３３.５℃〜３５.１℃の間の全ての温度について一定レベルに維持され得る。
【００４４】
実施例６
培養温度の上昇およびバッチ培地浸透圧の低下は１２００ＬパイロットプラントスケールでＮＧＨＣ形成を減少させる。
培養温度を上げることおよびバッチ培地浸透圧を下げることによって１２００Ｌのバイオリアクター培養物中でＮＧＨＣが減少し得ることが示された。標準的な生産用バイオリアクター培養温度は３３.９℃であり、種用フラスコ、種用バイオリアクターおよび生産用リアクターについての浸透圧は３７０〜３８０ｍＯｓｍであった。２０個のバッチのうち２個において、生産用バイオリアクターの培養温度を３４.５℃に上げ、バッチ培地浸透圧を３０５〜３１５ｍＯｓｍに下げた。これらの２個のバッチについて、最終の７５０Ｌの種用バイオリアクターのバッチ浸透圧もまた３０５〜３１５ｍＯｓｍに下げた。１８個の標準的なバッチについての平均ＮＧＨＣは５.７％であった。２つの「低ＮＧＨＣ」バッチについての総タンパク質のパーセントとしてのＮＧＨＣ値は１.７％および「非検出」であった。図４は全てのバッチにおける総タンパク質のパーセントとしてのＮＧＨＣレベルを示す。
【００４５】
実施例７
自家培地および２つの市販の細胞培養培地における培養温度およびバッチ培地浸透圧のＮＧＨＣ形成に対する影響
温度および浸透圧を調節することによって自家培地および２つの市販の培地ＣＤ−ＣＨＯ（インビトロジェン）およびＥＸＣＥＬＬ−３２５（ジェイ・アール・エイチ・バイオサイエンシズ）を使用してＮＧＨＣが減少し得ることを示した。各培地について、３つの温度および３つの浸透圧を振盪フラスコ中にて評価した。温度は３３℃、３４℃および３５℃であった。専売の培地についての浸透圧は３１０、３５８および４０５ｍＯｓｍであった。市販の培地についての浸透圧は３００、３５３および４０５ｍＯｓｍであった。表６および図５は、上記実施例において示したものと同様の傾向を示した。低温では、中温および高温に比べて、総タンパク質の％としてのＮＧＨＣ形成は高く、かつ、バッチ培地浸透圧に対する感受性が高い。グルコースはいずれの試験条件下でも欠損していなかった。
【００４６】
【表６】
2005509403.tif 000007
【００４７】
本発明は、その趣旨または本質的な特性から逸脱することなく他の特定の形態で具体化でき、したがって、本発明の範囲を示すものとして上記明細書よりもむしろ特許請求の範囲に言及すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１は培養温度のＮＧＨＣ形成に対する効果を示す実験結果のグラフである。
【図２】図２は培養温度およびバッチ培地浸透圧のＮＧＨＣ形成に対する効果を示す実験結果のグラフである。
【図３】図３は培養温度およびバッチ培地浸透圧のＮＧＨＣ形成に対する効果を予想する実験結果の統計学的回帰のグラフである。
【図４】図４は培養温度の上昇およびバッチ培地浸透圧の低下による２つの１２００ＬパイロットプラントバッチにおけるＮＧＨＣの減少を示す実験結果のグラフである。
【図５】図５は温度およびバッチ培地浸透圧を操作することによる自家培地および２つの市販の培地を使用してＮＧＨＣの減少を示す実験結果のグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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