(57)【要約】  本発明は、不妊症の治療におけるレプチンの使用、特に排卵誘発におけるレプチンの使用に関する。
2005509664.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
女性の不妊症の治療のための医薬の製造におけるレプチンまたはその類似体、融合タンパク質、機能的誘導体もしくはフラグメントの使用。
【請求項２】
卵胞の発達を誘導するための請求項１記載の使用。
【請求項３】
排卵を誘導するための請求項１または２記載の使用。
【請求項４】
卵胞破裂を誘導するための１、２または３記載の使用。
【請求項５】
黄体形成を誘導するための請求項１、２、３または４記載の使用。
【請求項６】
女性が排卵誘発剤による治療に反応性でない請求項１、２、３、４または５記載の使用。
【請求項７】
女性がｈＣＧ治療に反応性でない請求項６記載の使用。
【請求項８】
女性がＬＨ治療に反応性でない請求項６記載の使用。
【請求項９】
女性がＧｎＲｈ治療に反応性でない請求項６記載の使用。
【請求項１０】
女性がクエン酸クロミフェン治療に反応性でない請求項６記載の使用。
【請求項１１】
女性がＨＭＧ治療に反応性でない請求項６記載の使用。
【請求項１２】
女性がプロゲステロン治療に反応性でない請求項６記載の使用。
【請求項１３】
医薬が、さらにｈＣＧ、ＬＨ、ＧｎＲｈ、クエン酸クロミフェン、ＨＭＧおよびプロゲステロンから選択される排卵誘発剤を含有する請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２記載の使用。
【請求項１４】
ＬＨまたはｈＣＧの投与により、卵巣過刺激症候群または多嚢胞性卵巣症候群をもたらす危険が増加する女性における請求項１、２、３、４または５記載のレプチンの使用。
【請求項１５】
下垂体性疾患の女性の治療のための請求項１、２、３、４または５記載のレプチンの使用。
【請求項１６】
生殖介助術における治療のための請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５記載のレプチンの使用。
【請求項１７】
インビトロ不妊治療のための請求項１６記載のレプチンの使用。
【請求項１８】
女性における不妊症の治療方法であって、その治療を必要とする女性に、治療に有効な量のレプチンまたはその類似体、融合タンパク質、機能的誘導体もしくはフラグメントを投与することからなる方法。
【請求項１９】
卵胞の発達を誘導するための請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
排卵を誘導するための請求項１８または１９記載の方法。
【請求項２１】
卵胞破裂を誘導するための請求項１８、１９または２０記載の方法。
【請求項２２】
黄体形成を誘導するための請求項１８、１９、２０または２１記載の方法。
【請求項２３】
女性が排卵誘発剤による治療に反応性でない請求項１８、１９、２０、２１または２２記載の方法。
【請求項２４】
女性がｈＣＧ治療に反応性でない請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
女性がＬＨ治療に反応性でない請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
女性がＧｎＲｈ治療に反応性でない請求項２３記載の方法。
【請求項２７】
女性がクエン酸クロミフェン治療に反応性でない請求項２３記載の方法。
【請求項２８】
女性がＨＭＧ治療に反応性でない請求項２３記載の方法。
【請求項２９】
女性がプロゲステロン治療に反応性でない請求項２３記載の方法。
【請求項３０】
さらにｈＣＧ、ＬＨ、ＧｎＲｈ、クエン酸クロミフェン、ＨＭＧおよびプロゲステロンから選択される排卵誘発剤の投与を含む請求項１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８記載の方法。
【請求項３１】
ＬＨまたはｈＣＧの投与により、卵巣過刺激症候群または多嚢胞性卵巣症候群をもたらす危険が増加する女性における請求項１８、１９、２０、２１または２２記載の方法。
【請求項３２】
下垂体性疾患の女性の治療のための請求項１８、１９、２０、２１または２２記載の方法。
【請求項３３】
生殖介助術における治療のための請求項１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１または３２記載の方法。
【請求項３４】
インビトロ不妊治療のための請求項３３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、不妊症の治療におけるレプチンの使用、特に排卵誘発におけるレプチンの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
卵巣は、卵子（女性生殖細胞）が産生される女性の内分泌腺である。脊椎動物においては、卵巣は性ホルモンであるエストロゲンおよびプロゲステロンも分泌する。それらは、生殖器の発育や第二次性徴を制御する。ヒトにおいては、脳下垂体からの性腺刺激ホルモンと卵巣からの性ホルモンとの相互作用が、排卵および月経の毎月の周期を制御している。出生時には、約５０万個の未熟な卵細胞が卵巣皮質に存在する。思春期から始まり、卵細胞は連続的に成熟し、そして１つが卵巣壁を通過し約２８日毎に、排卵として知られる過程に進む。それは、閉経、つまり女性における性機能の停止まで続く。卵細胞が卵巣から放出されたのち、卵子は輸卵管（卵管（uterine tube）またはファローピウス管（fallopian tube））中を通り、子宮に通じる。卵子が精子により受精されると、結果として妊娠が起こる。
【０００３】
卵巣は、卵子を有する卵胞を含む、特殊支質からなる皮質領域で構成される。成熟機能卵巣では、多くの卵胞が休止しているのに対し、他のものは、成熟または退行のそれらの段階に依存して広範囲な組織形態学を示している。髄質は、主に結合組織および極めて豊富な血管供給からなる。
【０００４】
ヒト胎児の発育の期間中に、始原生殖細胞は、発育途中の卵巣に移動し、その中に組み込まれ、卵原細胞と称される。卵原細胞は、有糸分裂により増殖するが、胎児期の初期にそれらは減数分裂に入る。しかしながら、減数分裂事象は、一次減数分裂の前期（ディプロテン期）に理解されていない機序により休止される。これらの細胞は、直径約４０μｍで一次卵母細胞と呼ばれ、扁平上皮細胞の単層内に囲まれ、原始卵胞を形成する。
【０００５】
不活性原始卵胞から成長および成熟一次卵胞への移行は、卵母細胞、卵胞上皮細胞および隣接した結合組織の変化を伴う。卵母細胞の拡大に伴い、卵胞上皮細胞の単層が有糸分裂により大きくなり、最終的に顆粒膜と呼ばれる重層上皮を形成する細胞（顆粒膜細胞）を生じる。多層卵胞の示差的特徴は、卵母細胞と顆粒膜細胞との間に挿入される高度に屈折した透明帯の合成（elaboration）である。透明帯は、卵子と周囲の卵胞上皮細胞との両方から分泌される。顆粒膜細胞の発達に伴い、間質細胞の包皮（卵胞膜）が卵胞の周りに展開し、その後２つの層を形成する。内層は、良好に発達した毛管網と分泌細胞を示し、卵胞内膜と呼ばれる。卵胞内膜の細胞は、アンドロステンジオンを分泌すると考えられている。アンドロステンジオンは、そののち、顆粒膜細胞によりエストラジオールに変換される。二次卵胞は、それらが直径約０．２ｍｍで確認され、顆粒膜細胞の間の透明の液体（卵胞液）で満たされた不規則な空間の存在により認識される。この空間は卵胞の継続成長と共に増大する。最終的には、卵母細胞は、卵胞内の卵胞上皮細胞の台座、卵丘の上に偏在されるようになる。卵母細胞は、卵胞上皮細胞の王冠、放射冠により親密に取り囲まれる。卵丘は、先に言及したより小さな空間の融合から形成される、液体で満たされた単一の大きな空間、洞中に突出する。
【０００６】
一次卵母細胞が完全な大きさに達しても、卵胞は、直径約１０ｍｍに達するまで拡大し続け得る。最大の大きさに成熟し、大きな洞を示し、皮質の全厚さを通して拡張される卵胞は、グラーフ卵胞と称される。排卵の直前、卵巣の表面上の膨らみ（スティグマ）が、排卵が起こるであろう部位を示す。原始卵胞の完全成熟への成長には、約１０〜１４日かかる。卵胞膜、特に卵胞内膜は、成熟卵胞に関連してそれらの最高発達に達する。
【０００７】
月経周期の中期（約１４日目）での、下垂体黄体形成ホルモン（ＬＨ）の急上昇が排卵を誘導する。このとき、一次卵母細胞の最初の減数分裂が起こり、その結果、最初の極体が形成され、二次卵母細胞となる。
【０００８】
排卵ならびに卵胞液および卵母細胞の卵丘塊内での排出に続き、卵胞の壁が破れ、顆粒膜細胞の内張り（lining）が折りたたまれる。卵胞内膜における血管の決裂が、部分的に破れた卵胞中の出血に関連しており、クロットが形成される。顆粒膜層および卵胞内膜の細胞は変形し、それぞれ顆粒膜黄体細胞および卵胞膜黄体細胞と改名される。排卵後の卵胞におけるこれらの変化により、新しく、しかし一時的な器官である黄体（黄体（yellow body）、新鮮な標本でのその外観のため）が生じる。黄体は、ホルモンのプロゲステロンを分泌する。排卵された卵母細胞が受精に失敗すると、黄体は、約１４日間だけ機能をとどめ、そしてその後退化し、最終的には白体（白体（white body））と呼ばれる卵巣内の瘢痕に減じる。受精という事象において、黄体は拡大し、機能的内分泌腺として妊娠のほとんどの期間を通して存続するが、６ヵ月後には退縮し始める。妊娠終了後のその最終的な宿命は、大きな白体になることである。
【０００９】
哺乳類において、卵胞の成熟、排卵、黄体形成、そして最終的なその分解の過程は、各発情周期および月経周期で繰り返される。これらの過程は、排卵前の性腺刺激ホルモン：卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）および黄体形成ホルモン（ＬＨ）の増加により開始される。ＦＳＨは卵胞の発達とステロイド合成を刺激し、一方ＬＨは、減数分裂の再開により卵母細胞の成熟を誘導し、それは、排卵ならびに顆粒膜細胞および卵胞膜細胞の黄体化による黄体の形成を伴う（Amsterdam et al. 1987）。ゴナドトロピン誘導卵胞成熟は、血中プロゲステロンの鋭い増加を伴い、予想される卵の着床のために子宮を準備する。
【００１０】
ＬＨおよびＦＳＨは下垂体により分泌され、月経周期および排卵の制御において共に中心的な役割を果たす。ｈＣＧは、妊娠初期の段階から発達中の胎盤により分泌され、その役割は、黄体によるステロイドの分泌を維持することであり、それは妊娠中の排卵を妨げるために必要である。
【００１１】
正常な周期においては、周期の中旬にＬＨ濃度の急上昇があり、続いて排卵が起こる。ＬＨおよびＦＳＨの内因性分泌によりもたらされるエストロゲン濃度の上昇は、ＬＨの急上昇が生じるために必要とされる。エストロゲンは、陽性フィードバック機序を媒介し、その結果ＬＨの分泌が増加する。
【００１２】
各排卵周期の始まりでは、脳下垂体前葉からのＦＳＨシグナルが少量の卵胞を刺激し成長させる。これらの卵胞はＦＳＨの受容体に恵まれ、ＬＨ受容体をもたない時点ではＬＨに反応しない（Chappel et al. 1991）。これらの卵胞は、細胞成長と細胞増殖とによりＦＳＨの最初の刺激に応答する。ＦＳＨは、成長因子をコードする遺伝子の転写を刺激する。これらの因子は、卵胞の微環境内で傍分泌および自己分泌により作用する。それらは、卵胞およびその内容物の最終的な成熟に重要な役割を果たす。卵胞期の中期の間、ＦＳＨ刺激の後、顆粒膜細胞はＬＨ受容体を合成し始め、ＬＨの刺激効果に応答する能力を獲得する（Simon et al. 1988）。
【００１３】
卵巣内の特定細胞のＬＨ刺激は、ステロイドホルモンの産生に必要とされる。２細胞説によって説明されるように、ＬＨは間質卵胞膜細胞からのアンドロゲンの産生のために重要である。卵胞細胞により産生されるアンドロゲンは顆粒膜細胞に移動しエストラジオールに変換される。卵胞期の初期の間、ＬＨ受容体は卵巣の卵胞細胞上にのみ見出される（Erickson et al. 1979）。ＬＨ刺激の後、卵胞細胞は、コレステロールをアンドロゲンに変換する一連の酵素を発現する。アンドロゲンは、ＦＳＨ刺激顆粒細胞内でエストロゲンに変換される（Remohi et al. 1996/1997）。
【００１４】
しかしながら、周期中旬のＬＨの放出（それは妊娠可能な卵子の排卵のために必要である）の重要性についての議論はない。この排卵前のＬＨの急上昇は、卵子内の事象（減数分裂の再開）のみならず、卵胞壁を弱くし、卵胞の内容物の押出しを促進する酵素の活性化も先導する。ＬＨの急上昇は、多数の遺伝子の転写制御と関連しており、卵胞壁を分解する特定のプロテアーゼの合成および／または活性化に関与すると推定されている。プロゲステロン受容体、核受容体転写因子は、ＬＨの急上昇に応答して排卵前の卵胞の顆粒膜細胞において誘導され、排卵には必須であることが示された。なぜなら、プロゲステロン受容体を欠いたマウスは排卵できず、不妊である。動物モデルにおいて、２つのプロテアーゼ、ＡＤＡＭＴＳ−１（トロンボスポンジン様モチーフを有するディスインテグリン（disintegrin）およびメタロプロテアーゼ）およびカテプシン Ｌ（リソソームシステインプロテアーゼ）は、プロゲステロン受容体作用の転写標的であり、したがって、おそらく卵胞壁の分解に関与している（Robker et al. 2000）。
【００１５】
月経周期の卵胞期のあいだの血清ＬＨ濃度の上昇は、卵胞の成熟に不要であるのみならず、正常な生殖過程に有害である（Remohi et al. 1996/1997）。これらの上昇は、外因性ＬＨの投与の結果として、または内因性の病的な過程（たとえば、多嚢胞性卵巣）を通して起こる（Remohi et al. 1996/1997）。
【００１６】
２細胞−２ゴナドトロピン説の再評価は、排卵前期には、正常な卵胞成熟のためには静止濃度のＬＨで充分であることを示唆している。実際、過剰量のＬＨによる卵巣の過剰刺激は、その標的器官が妊性卵子を産生する能力を低下させることがある（Schoot et al, 1994）。
【００１７】
ＬＨは、アンドロゲンを産生し、その後エストラジオールを産生する卵胞膜細胞を刺激することによりエストロゲンの産生にとって重要である。ＬＨ受容体の形成は優性卵胞の顆粒膜細胞においてＦＳＨによって誘導され、これに伴い卵胞はＦＳＨ濃度が低下した場合にその成長を保持するのに重要である。ＬＨ受容体を有する卵胞は、排卵を誘発する機序を活性化するＬＨパルスに応答し得る唯一のものである。
【００１８】
しかし、ＲｅｃＦＳＨによる卵巣刺激のいくつかの研究では、正常な卵胞成長がエストラジオールおよびアンドロステンジオン濃度の低い残留レベルにより誘発された（Dick et al. 1992, Mannaerts et al. 1996, Schoot et al. 1994）。
【００１９】
このことは、卵胞が微量のＬＨ（０．３８ＩＵ／Ｌ未満）の存在下で充分な量のアンドロステンジオン（ＡＤ）を産生できないことを示している（Mannaert et al. 1996, Schoot et al. 1994）。卵胞内で正常なエストロゲン産生が引き続きできないことは２細胞−２ゴナドトロピン仮説に即しており、これはＦＳＨに誘導された顆粒膜細胞アロマターゼ活性が、アロマターゼ基質であるアンドロステンジオンの充分な量が利用可能である場合にのみエストラジオール産生の増大をもたすことができるすぎないことを指摘している（Schoot et al. 1994, Kessel et al. 1985）。
【００２０】
それに関連して、ヒト組み換えＦＳＨ（ｈＲｅｃＦＳＨ）およびヒト組み換えＬＨ（ｈＲｅｃＬＨ）によるラットの刺激試験によって、卵巣エストロゲン分泌の増大が生じるが、これはｈＲｅｃＦＳＨおよびｈＲｅｃＬＨの両者が同時に与えられた場合にのみ生じる（Smyth et al. 1995）。ｈＲｅｃＦＳＨ単独での処置はエストロゲン分泌を伴なわない顆粒膜細胞のアロマターゼ活性を刺激するが、一方でｈＲｅｃＬＨ単独では顆粒膜アンドロゲン合成およびアンドロゲン分泌を刺激した（Smyth et al. 1995）。
【００２１】
これは充分なエストロゲンの産生および最適な誘導に対するＬＨ閾値の概念、ｈＲｅｃＬＨへの曝露が胚生存度および発生率を改善し得るという見解を強調している（Weston et al. 1996）。
【００２２】
ＦＳＨ療法が指示される大多数の患者に対しては、ＬＨ投与は、充分な内因性ＬＨが存在する場合に卵胞の発達を達成するために必要とされない（ＷＨＯグループII無排卵の女性（Schoot et al. 1994）および生殖介助技術を促された患者において示されるように）。反対に、低ゴナドトロピン性性腺機能低下症の大多数の女性（ＷＨＯグループＩ無排卵）は、ＦＳＨ単独での治療のあいだ、最適な卵胞の発達とステロイドの産生に達するために必要な内因性ＬＨの閾値レベルを有さない。これらの女性のあいだで、尿性およびＲｅｃＦＳＨは、ＦＳＨおよびＬＨの両者を含有するＨＭＧ製剤で得られるよりも相当低いエストラジオール濃度を達成することが示された（Hillier et al. 1991）。またこの集団において、ＦＳＨ単独によって刺激された卵胞はｈＣＧ投与後に一貫して破壊しない。それらは黄体形成が乏しく、そして卵母細胞はより低い受精率を有し得る（Hillier et al. 1991）。ＬＨの内因性の供給は適切な卵胞応答を達成するのに必要である。
【００２３】
同じ研究（Schoot et al. 1994）はまた、卵胞の発達を刺激するためにＦＳＨを単独で使用する場合、卵胞成長は生じるが、エストラジオール分泌は最小であり、子宮内膜成長不全をもたらすことを確認している。さらにｈＣＧに曝露される場合、これらの卵胞はしばしば黄体形成できない（Hillier et al. 1991）。
【００２４】
ＨＨおよび正常な下垂体機能を有する女性における排卵の効果的な誘導はパルス状ＧｎＲＨ療法で達成された。パルス状ＧｎＲＨ療法は、下垂体からのパルス状放出ゴナドトロピンを回復するため、選り抜きの治療であった。この治療は、大部分が単一卵胞周期および充分な妊娠率をもたらす。その治療は低い多胎妊娠率に関連し、卵巣過剰刺激症候群を併発しない（The European Recombinant Human LH Study Group 1998）。
【００２５】
しかしながら、パルス状ＧｎＲＨに適切に応答しない患者または下垂体性疾患の患者にとって、１日１回の注入によって投与されるＨＭＧ療法（ＦＳＨおよびＬＨの両者を含有する製剤）は、排卵誘発のための単に代替的な治療に過ぎなかった。
【００２６】
受胎および分娩を干渉し得る女性の多くの種々の機能性疾患を補正し、かつ回避するために種々の方法が使用される。
【００２７】
女性の不妊の最も一般的な原因は排卵不全である。あるケースでは、これは薬剤のクエン酸クロミフェン（クロミド、セロフェン）により矯正することができた。１９６７年に導入されたクロミフェンは、性腺刺激ホルモン：卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）および黄体形成ホルモン（ＬＨ）の放出を刺激する。ＦＳＨは卵胞（卵およびその周囲の液体およびホルモン）の刺激に機能し、ＬＨは排卵を誘発する。いくつかの研究では、クロミフェンは卵巣癌のリスクの増大と関連した。
【００２８】
１９７０年に導入されたヒトの閉経期ゴナドトロピンまたはメノトロピン（ペルゴナール）は、閉経期の女性の尿からの抽出物である。該抽出物はＦＳＨおよびＬＨを含有し、そして排卵を促進する。しばしば、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）（妊娠中に胎盤によって分泌され、妊婦の尿から得られるホルモン）と一緒に投与される。
【００２９】
尿性卵胞性刺激ホルモン（メトロジン）は、ＬＨではなく、実質的にＦＳＨである。ＦＳＨが少な過ぎＬＨが多過ぎる傾向にある多嚢胞性卵巣症候群の女性において特に使用される。
【００３０】
プロゲステロンは受精卵の有効な着床に必須の子宮内膜における分泌変化を誘導する女性ホルモンである。該ホルモンは卵子が放出された後に卵巣によって放出される。それは、卵子の受精は起こるが、流産を繰り返したり妊娠中に出血するなどのように、子宮内膜が発育中の胎児を支持できないという根拠がある場合に投与される。
【００３１】
精子と卵とを融合するように設計された方法がいくつかある。これらの方法は、不妊を引き起こすいくつかの因子を完全に回避する。一括して、これらの方法は生殖介助術（ＡＲＴ）と呼称される。ほとんどのカップルはこれらの妊娠方法を必要としないけれども、ＡＲＴは他の療法に効き目を示さない患者のために利用可能である。
【００３２】
ＡＲＴ法は、できるだけ多くの卵母細胞の成長を刺激するために種々のホルモンの使用を必要とする。この多重の卵母細胞の発達は、受精および妊娠の機会を高める。最も一般的なＡＲＴ法は：
１  −  インビトロ受精法（ＩＶＦ）
２  −  細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）
３  −  卵管内配偶子移植法（ＧＩＦＴ）
である。
【００３３】
ＩＶＦは本来、遮断されたまたは損傷を受けた卵管によって引き起こされる不妊症を治療するために開発された。現在、種々の不妊問題を治療するために使用されている。
【００３４】
ＩＶＦはカップルから卵および精子を回収し、そして研究室環境でそれらを一緒にすることを含む。そののち、通常３つまでの受精卵または胚を女性の子宮（uterus）（または子宮（womb））中に移す。そこでは着床および胚発達が、望ましくは正常な妊娠とまったく同じように生じるであろう。
【００３５】
インビトロ受精（ＩＶＦ）は４段階法である：
１段階目  −  卵巣刺激およびモニタリング
２段階目  −  卵（卵母細胞）回収
３段階目  −  受精
４段階目  −  胚移植
【００３６】
各ＩＶＦの試みによる有効な受精の機会を最大にするために、卵巣刺激は、正常には各月で発達する単一の卵よりむしろ、多重の成熟卵胞を産生させるために使用される。受精および移植のために利用可能な成熟卵をいくつか有することによって、受精および妊娠の機会が増大する。
【００３７】
卵巣刺激は、多重の卵母細胞の発達のために必要なホルモンである卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の使用を伴う。ＦＳＨは３つの形で利用できる：ＦＳＨ／ＬＨ組み合わせ比が１対１；１９９４年にカナダで紹介されたほとんどＬＨを含まない高度に精製されたＦＳＨ；および１９９７年以来利用可能な組み換えＦＳＨ。
【００３８】
ＦＳＨは毎日の注入によって投与される。その治療に対する応答は、一般に５〜７日後に現れる。日数および用量は卵胞の発達に依存して変わるであろう。医師はその治療に対する応答および時間をモニタリングし、女性における排卵を誘発する二次生成物、注入のためのヒト絨毛性ゴナドトロピンの投与は通常ＦＳＨの最終投与の後に投与される。
【００３９】
卵巣刺激およびＡＲＴは“ダウンレギュレーション”または“下垂体脱感作”によって開始され得る。これは、脳下垂体（通常、単一卵胞を刺激して発育させるＦＳＨを産生し、かつ未刺激の周期において排卵の引き金となるＬＨを産生する）の正常な機能の医学的抑制である。この制御を達成するために、薬剤をＦＳＨ療法の開始数日前に摂取し始めることを指示されることがある。血液検査は、下垂体脱感作が起こり、そしてＦＳＨ療法を開始する場合に測定される。抑制の使用は成熟卵の収率を高め、そして採卵または回収前に体が成熟卵を放出するのを妨げる。抑制医薬はＦＳＨ療法のあいだ中摂取される。
【００４０】
一連の超音波走査を行なって、卵巣中の卵胞の成長をモニタリングする。卵胞の成熟の際に卵巣はより大きく成長する。超音波により、卵胞の成長、数および大きさを把握し、日用量で任意の必要な調整を可能とし、かつ卵胞成熟性およびｈＣＧ投与のための理想的な時間を決定する。
【００４１】
発達中の卵胞は、女性ホルモンのエストロゲン、特にエストラジオール（Ｅ２）の分泌量を増大する。超音波と一緒にＥ２濃度を使用して、ｈＣＧの投与のための最適なタイミングを決定できる。
【００４２】
療法の次の段階は、いわゆる卵回収または採卵である。いったんｈＣＧを投与したら、できる限り多くの成熟卵を採取する。超音波誘導アスピレーション（たとえば真空吸入）は現在、採卵のための最も一般的な方法である。卵回収は経膣的手法によって達成される。これは軽い鎮静または局所麻酔下に実施できる。超音波像は卵胞の正確なアスピレーションを見込んでいる。卵は次いで顕微鏡下で発生学者によって同定され、そして受精前に入念に調節された環境に移される。
【００４３】
卵を採取する直前に、精子試料を男性パートナー（またはドナー）により回収し、そして種々の研究室技術を用いて処理する。最も強く、最も活性な精子を精液から精子洗浄を通して得ることを目的としている。
【００４４】
成熟卵を採取したら、精子および卵を研究室において一緒にし、そして入念に調製された培養培地中で女性の体内の温度と同じ温度でインキュベートする。約４８時間後に、卵が効果的に受精し、かつ正常に成長した場合に、これらは子宮に移植する準備ができている。
【００４５】
通常３つまでの胚を一緒にし、そして膣を介して子宮に移植する。移植されない高い品質の胚はいずれも凍結させ（または低温保存）、将来的使用のために貯蔵できる。
【００４６】
排卵またはインビトロ受精技術（ＩＶＦ）での卵母細胞回収のための卵胞アスピレーションの準備としてヒト閉経期尿性ゴナドトロピンで治療された女性は、しばしばＬＨ分泌の正のフィードバックを引き起こすのに充分な血清エストラジオール濃度にもかかわらず、適時のＬＨ急上昇を実証できない。通常ｈＣＧはＬＨの代わりに排卵を誘導するために使用される。卵巣過剰刺激症候群の問題の１つは、排卵を達成するためのｈＣＧ用量の投与である（Hiller et al. 1995）。
【００４７】
ヒト閉経期尿性ゴナドトロピンに対する個々の応答は顕著に変動し、それにより最も柔軟性のある（個別化された）プロトコールを使用する場合でさえも患者の管理を複雑にする。
【００４８】
レプチンは、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて肥満、糖尿病およびインスリン抵抗性の表現型を担う肥満（ｏｂ）遺伝子によってコードされる脂肪細胞分泌性タンパク質である（Zhang et al. 1994）。該遺伝子は高度に保存され、マウスタンパク質と８４％の同一性を示す（Zhang et al. 1994）。血漿レプチンのためのアッセイ（Considine et al. 1996）は、肥満個体において肥満指数および血漿レプチンのあいだに厳密な相関を示し、それはヒトの肥満の最も頻繁な形がレプチン抵抗性の現象に関連することを示唆している。
【００４９】
その代謝機能の他に、レプチンは生殖において重要な役割を担う。肥満のレプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスは、性腺機能低下症および無排卵のげっ歯類モデルとして用いられる。その不妊症は、視床下部−下垂体ホルモン不全のためであり、組み換えレプチンの投与によって回復できる（Barash et al. 1996 , Mounzih et al. 1997, Hwa et al. 1997, Muzzin et al. 1996, Chehab et al. 1996 and Schwarts et al. 1996）。ヒトにおける先天性のレプチン不全は報告されており、かつ低ゴナドトロピン性性腺機能低下症に関連することが見いだされた（Strobel et al. 1998 and Farooqi et al. 1999）。
【００５０】
レプチンの作用様式について、レプチンのその視床下部受容体への結合が、下垂体ＦＳＨおよびＬＨの合成および放出をのちに誘導するゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）の放出のために必要であると判明した（Nagatani et al. 1998）。さらに血清レプチンは卵胞期のあいだに増加し、自発周期の黄体期でピークに達し、このことは排卵におけるレプチンの役割を強く示唆している（Hardie et al. 1997, Shimizu et al. 1997 and Messinis et al. 1998）。今までのところ生殖におけるレプチンの役割は完全に理解されておらず（Ahima et al. 1996, Erickson et al. 1996 and Yu et al. 1997）、かつ報告される結果は卵子細胞に対するレプチンの直接的な作用の可能性を示している。
【００５１】
ある研究では、レプチン受容体はヒトの卵巣で発現されると示され、レプチンは卵胞液中に見いだされ、そしてヒトの顆粒膜細胞の一次培養においてＬＨに誘導されるエストラジオール産生を抑制することが報告されており、それはレプチンが顆粒膜細胞に生物学的効果を及ぼすことを示している（Karlsson et al. 1997）。ＩＶＦ法に関する別の研究において、血清レプチン濃度は卵巣抑制−刺激プログラムのあいだモニタリングされた。レプチン濃度は正常な黄体中期から卵胞抑制まで著しく低下し、そして肥満指数に拘わらずＨＭＧ／ＦＳＨによる卵巣刺激の後に著しく増大した。これらのレプチンにおける変化はエストロゲン様環境における並行した変化によって引き起こされ得る。卵巣刺激のあいだのエストラジオールおよびレプチンにおける増大のあいだの関係は、効果的なＩＶＦ結果に対する重要な因子であり得る。さらに妊娠の成功した結果は胚移植後の１２日におけるレプチンの高濃度と関係があった（Unkila-kallio et al 2001）。
【００５２】
前記の発見は、排卵および受精におけるレプチンの内分泌性の有用な作用と一致している。反対に、以下の発見は排卵および受精におけるレプチンの負の作用を示す。
【００５３】
ＦＳＨによる顆粒膜細胞（ＧＳ）のインビトロ処置によりＥ２およびＰ４の産生の刺激がもたらされる。ＩＧＦ−ＩはＦＳＨ活性を相乗すると提唱されている感作因子であり、したがってＩＧＦ−Ｉの存在下でＦＳＨ依存性Ｅ２濃度が増大される。この研究は、レプチンが卵巣ＧＣに直接作用して、選択的にＥ２を低下させるが、Ｐ４の産生は低下させないことを示している。ＦＳＨ依存性Ｅ２産生は、レプチンによって低減されないが、一方でレプチンは、ＧＣによるＦＳＨ依存性Ｅ２合成に対するＩＧＦ−１の感作効果を損なわせる（Zachow et al. 1997）。卵巣ステロイド産生におけるレプチンの直接的な効果はBarkan et al.（1999）によって示されている。レプチンが、ＦＳＨのデキサメタゾンによって同時刺激される卵巣ステロイド合成ならびにフォルスコリンおよびデキサメタゾンによるプロゲステロン産生の同時刺激を抑制することが示された。類似の試験設定において、Greisen et al.（2000）により、レプチンが基底のおよびＦＳＨ刺激されたエストラジオールおよびプロゲステロン産生を培養顆粒膜細胞において阻害することが判明した。
【００５４】
排卵の誘導のためにクエン酸クロミフェン療法を受ける患者におけるレプチンのインビボ濃度は、無排卵のままである患者においてはより低いと判明した（Imani et al. 2000）。
【００５５】
排卵の誘導のために性腺刺激ホルモン療法を受けている患者のレプチンのインビボ濃度をモニタリングした。妊娠率の進行性の低下は肥満指数率を越えて血清レプチンの増大と相関することが判明した（Brannian et al. 2001）。これらの結果を考慮すると、女性はその受胎能を、循環レプチン濃度を低下させる食事や生活の変更を通して改善することができるということが示唆された。
【００５６】
これらの明らかな矛盾した観察のための明確な説明は明らかではないが、分化作用は、卵巣の的を絞った刺激と間接的な二次効果（代謝状態、体重損失、循環インスリン濃度などの一般的な変化）との寄与からもたらされるかもしれない。レプチン投与および／または循環中のレプチン測定のタイミングは、種々の群によって得られる結果に影響することがある。
【００５７】
明らかな倫理的理由のため、最低限の直接的に得られる科学情報しか、ヒトにおける卵胞の発達、着床および懐妊に対する卵巣刺激の影響において存在しない。したがってかかる研究の大部分にとって、げっ歯類は好ましいモデルである。形態および代謝に関して、発生の初期段階では多くの哺乳類種のあいだに相当の類似性が存在する。これは、研究動物から卵母細胞発生で得られる情報がヒトの検体のものに適用可能であることを示唆している。
【００５８】
したがって、ＬＨおよびｈＣＧ治療に反応性でないか、またはこれらのゴナドトロピンの投与が卵巣過剰刺激症候群または多嚢胞性卵巣症候群の危険を増大させる女性における排卵を支持する方法を提供する必要がある。本発明は、排卵におけるレプチンの関与に関する前記の矛盾した動機にもかかわらず排卵の見込みを増大させるためのレプチンの使用を開示している。
【発明の開示】
【００５９】
本発明は、排卵、卵胞の発達、黄体形成および卵胞破裂を誘発するため、女性の不妊症の治療のための医薬の製造におけるレプチンまたはその類似体、融合タンパク質、機能的誘導体もしくはフラグメントの使用に関する。
【００６０】
特に、本発明は、排卵誘発剤による治療に反応性でない女性における、レプチンまたはその類似体、融合タンパク質、機能的誘導体もしくはフラグメントの使用に関する。
【００６１】
本発明はまた、ＬＨまたはｈＣＧの投与により、卵巣過刺激症候群または多嚢胞性卵巣症候群をもたらす危険が増加する女性における、レプチンまたはその類似体、融合タンパク質、機能的誘導体もしくはフラグメントの使用、または下垂体性疾患の女性におけるレプチンまたはその類似体、融合タンパク質、機能的誘導体もしくはフラグメントの使用に関する。
【００６２】
レプチンまたはその類似体、融合タンパク質、機能的誘導体もしくはフラグメントと共に、ＦＳＨ、ＧｎＲｈ、クエン酸クロミフェン、ＨＭＧおよびプロゲステロンなどの排卵誘発剤を、本発明にしたがって投与し得る。
【００６３】
さらに、レプチンまたはその類似体、融合タンパク質、機能的誘導体もしくはフラグメントは、インビトロ不妊治療などの生殖介助術における治療のために使用され得る。
【００６４】
他の側面において、本発明は、不妊症の治療方法であって、その治療を必要とする女性患者に、治療に有効な量のレプチンまたはその類似体、融合タンパク質、機能的誘導体もしくはフラグメントを投与することからなる方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６５】
本発明は、女性の不妊症の治療における、レプチンまたはその類似体、融合タンパク質、機能的誘導体またはフラグメントの、単独または排卵誘発剤との組合せでの投与に関する。不妊症は、避妊をしないで通常の交わりで１年経て子供が出来ないこと、として定義される。女性の不妊症は、不妊症が男性よりむしろ女性の状態から生じる場合に使用される用語である。
【００６６】
本発明は、アンタイド処置ｏｂ／ｏｂマウス、つまり性腺機能低下症および無排卵のげっ歯類モデル、ならびに思春期前のＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、レプチンが、ＧｎＲＨ非依存的経路により卵胞の発達および排卵を直接的に誘発するという知見に基づく。
【００６７】
本発明の実施態様において、アンタイド処置マウス（下垂体よりＬＨを放出することができず、したがって非常に低い濃度の循環ＬＨを示す）へのレプチンの投与が、卵胞の発達を媒介するということが明らかにされた。さらに、性腺機能低下症のｏｂ／ｏｂマウスでの卵胞の発達は、非常に急速で、大きな腔の卵胞がレプチン投与の早くも９時間後に見られる。したがって、レプチンは、ＧｎＲＨ非依存的経路により卵胞の発達を誘発する。
【００６８】
もう１つの実施態様において、レプチンは、排卵の誘導において、ｈＣＧの活性、ＬＨの模倣を置き換えることが示された。より詳しくは、ｏｂ／ｏｂマウスおよび思春期前のＣ５７ＢＬ／６マウスで排卵を研究した。すべてのマウスを、レプチンによるＬＨの誘導を妨げるためにアンタイドで処置した。排卵は、ＰＭＳＧの非過剰排卵服用量とｈＣＧとの組み合わせによって対照マウスで達成された。第２群のマウスでは、ｈＣＧをレプチンで置き換えた。種々の処置ののち、マウスを犠牲死させ、卵母細胞を最初の注射から７２時間でアンプルから採取し計測した。排卵マーカーである黄体の形成も、卵巣部分の染色により調査した。
【００６９】
その結果、ｈＣＧがレプチンで置き換えられたマウスにおいて排卵も観察された。したがって、レプチンは、ｏｂ／ｏｂマウスおよび正常で未熟なＣ５７Ｂ１マウスの双方において、排卵の誘導因子として、ｈＣＧに置き換わることができる。
【００７０】
したがって、卵胞の成長を誘導する（実施例１参照）うえに、ｈＣＧおよびＬＨのようにレプチンは直接排卵を誘発する。したがって、レプチンまたはその類似体、融合タンパク質、機能的誘導体またはフラグメントは、女性の不妊症の治療において、卵胞の発達および／または排卵を誘導するために、ＬＨとｈＣＧの代替品として使用され得る。
【００７１】
ＬＨの急上昇は、多数の遺伝子の転写制御と関連しており、卵胞壁を分解する特定のプロテアーゼの合成および／または活性化に関与すると推定されている。プロゲステロン受容体、核受容体転写因子は、ＬＨの急上昇に応答して排卵前の卵胞の顆粒膜細胞に誘導される。２つのプロテアーゼ、ＡＤＡＭＴＳ−１（トロンボスポンジン様モチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ）およびカテプシンＬ（リソソームシステインプロテアーゼ）は、プロゲステロン受容体作用の転写標的であり、したがって、おそらく卵胞壁の分解に関与している（Robker et al. 2000）。本発明のある実施態様において、レプチンが排卵前の卵胞におけるＡＤＡＭＴＳ−１の発現を直接誘導するということが証明された。これは、ＬＨのように、レプチンが卵胞の破裂に役割を果たしているということを示している。したがって、レプチンまたはその類似体、融合タンパク質、機能的誘導体またはフラグメントはＬＨの代わりに卵胞の破裂を得るために使用され得る。
【００７２】
したがって、本発明は、女性の不妊症の治療のためのレプチンまたはその類似体、融合タンパク質、機能的誘導体またはフラグメントの使用、より具体的には、卵胞の発達の支援、および／または排卵の誘導、および／または卵胞破裂の誘導、および／または黄体形成の誘導のためのレプチンまたはその類似体、融合タンパク質、機能的誘導体またはフラグメントの使用に関する。レプチンまたはその類似体、融合タンパク質、機能的誘導体またはフラグメントは、女性の不妊症の治療のために、単独またはｈＣＧ、ＬＨ、ＧｎＲＨ、クエン酸クロミフェン、ＨＭＧおよびプロゲステロンなどの排卵誘発剤と組合わせて投与され得る。
【００７３】
排卵は、月経周期のあいだの卵巣からの成熟卵子の放出である。
【００７４】
本発明は、レプチンの類似体に関する。類似体は、レプチンの天然由来の配列のみを本質的に有するレプチンと本質的に同じ生物学的活性を保持する。そのような「類似体」は、レプチンタンパク質において約３０個までのアミノ酸残基が欠失、付加または他のアミノ酸で置換されていて、それによりこの種の改変が、卵胞の発達および／または排卵および／または卵胞破裂に関してタンパク質類似体の生物学的活性を実質的に変化しないようなものであればよい。
【００７５】
このような類似体は、既知の合成法によりおよび／または位置指定突然変異誘発技術により、またはそれに適したあらゆる他の既知の技術により製造される。
【００７６】
そのような類似体はいずれも、元のレプチンと実質的に同じ活性を有するように、好ましくは元のレプチンのアミノ酸配列と充分な再現性のあるアミノ酸配列を有する。したがって、所定の類似体が実質的に本発明の元のキメラタンパク質と同じ活性を有するかどうかを、その類似体を以下の実施例に述べる生物学的活性テストに付すことからなるルーチンな実験により決定することができる。
【００７７】
本発明により使用され得るレプチンタンパク質の類似体、またはそれをコードする核酸は、過度の実験をすることなく、本明細書に示した教示および指導に基づき、当業者によってルーチンに得られることができる置換ペプチドまたはポリヌクレオチドとして実質的に相当する有限の組を包含する。タンパク質の化学と構造の詳細な説明として、Schulz, G.E. et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York, 1978; and Creighton, T.E., Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1983（これらは参考文献として本明細書に組み込まれる）を参照。コドン選択などのヌクレオチド配列置換の提示として、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publications and Wiley Interscience, New York, NY, 1987-1995; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989を参照。
【００７８】
本発明による類似体についての好ましい変化は、「保存的」置換として知られるものである。本質的に天然に生ずるレプチンの配列を有するキメラタンパク質における保存的アミノ酸置換は、充分に類似した物理化学的な特性を有する群の範囲内の同義アミノ酸を含み得るものであり、その群のメンバー間における置換は分子の生物学的機能を保存するものであろう（Grantham, Science, Vol. 185, pp.862-864 (1974)）。とくに挿入または欠失が、たとえば３０以下、好ましくは１０以下のわずかなアミノ酸のみを含むものであり、たとえばシステイン残基など機能的配座に重要なアミノ酸の除去または入れ替えをしない場合、アミノ酸の挿入および欠失もまた、その機能を変化させることなく前記配列内でなされることは明らかである（Anfinsen,“Principles That Govern The Folding of Protein Chains”, Science, Vol. 181, pp.223-230 (1973)）。このような欠失および／または挿入によって産生される類似体は、本発明の範囲内である。
【００７９】
好ましくは、同義のアミノ酸群は、表Ｉに規定される群である。より好ましくは、同義のアミノ酸群は、表IIに規定される群である。そして、最も好ましくは、同義のアミノ酸群は、表IIIに規定される群である。
【００８０】
【表１】
2005509664.tif 000003
【００８１】
【表２】
2005509664.tif 000004
【００８２】
【表３】
2005509664.tif 000005
【００８３】
本発明に使用するためのタンパク質の類似体を得るために使用され得る、タンパク質でのアミノ酸置換の製造例としては、マーク（Mark）らによる米国特許ＲＥ第３３，６５３号明細書、米国特許第４，９５９，３１４号明細書、同第４，５８８，５８５号明細書および同第４，７３７，４６２号明細書；コース（Koths）らによる同第５，１１６，９４３号明細書、ナーメン（Namen）らによる同第４，９６５，１９５号明細書、コング（Chong）らによる同第４，８７９，１１１号明細書、リー（Lee）らによる同第５，０１７，６９１号明細書などにおいて示された周知の方法手順；および米国特許第４，９０４，５８４号明細書（Shaw et al）に示されたリジン置換タンパク質などがあげられる。
【００８４】
本発明のもう１つの好ましい態様では、本発明に使用するためのレプチンタンパク質の類似体はいずれも、前記本発明のレプチンタンパク質のアミノ酸配列に本質的に相当するアミノ酸配列を有する。用語「本質的に相当する」とは、キメラタンパク質の基礎的な特徴に影響しない、特にレプチンが関与するその能力の範囲内で、元のキメラタンパク質の配列に比較的重要でない変化を有する類似体を包含することを意味する。通常「本質的に相当する」との用語内に入るとみなされる変化の種類は、本発明のレプチンタンパク質をコードするＤＮＡの従来の突然変異技術から得られ、結果としてわずかな比較的重要でない改変が生じ、前述の方法で所望の活性に対しスクリーニングしたものである。
【００８５】
本発明は、レプチンの変異体も包含する。好ましいレプチンの変異体は少なくとも８０％アミノ酸同一性を有するものであり、より好ましいレプチンの変異体は少なくとも９０％同一性を有するものであり、最も好ましい変異体はレプチンのアミノ酸配列に９５％同一性を有するものである。
【００８６】
本明細書において使用される用語「配列同一性」は、アミノ酸配列がHanksおよびQuinn(1991)に従い、Ｃｌｕｓｔａｌ−Ｘプログラム（ＣｌｕｓｔａｌＷ  多重配列アライメントプログラムのウインドウズインターフェイスである）を用いた低い相同領域の精錬でアライメントにより比較される（Thompson et al., 1994）。Ｃｌｕｓｔａｌ−Ｘプログラムは、ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/clustalx/でインターネットから利用可能である。もちろん、このリンクが使えなくなっても、当業者は、過度の実験をすることなく、標準的なインターネットの検索技術を用いて他のリンクでこのプログラムのバージョンを見つけることができるということは理解されるべきである。特段の定めのない限り、本明細書に言及されるプログラムの最も新しいバージョン（本願の有効な出願日の時点で）が、本発明の実施のために使用されるものである。
【００８７】
前記の「配列同一性」の決定方法が、何らかの理由で使用できないとみなされる場合は、以下の技術によって配列同一性を決定し得る。配列をＧｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ’ｓ  ＧＤＡＰのバージョン９（グローバルアライメントプログラム）を用いて、ギャップオープンペナルティー（ギャップの最初の空白に対して）−１２およびギャップ延長ペナルティー（ギャップにおける連続した各空白につき）−４と共に、デフォルト（ＢＬＯＳＵＭ６２）マトリクス（値−４から＋１１まで）を使用して整列する。アライメントの後、％同一性を、主張した配列におけるアミノ酸の数の百分率として、一致した数を表わすことにより計算する。
【００８８】
本発明による類似体は、本発明によるレプチンタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡであってレプチンをコードする天然由来の配列の本質的に全てを含むＤＮＡまたはＲＮＡに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸によりコードされているものも含む。たとえば、そのようなハイブリダイズするＤＮＡまたはＲＮＡは、遺伝コドンの縮重（すなわち、ヌクレオチド配列が多少異なるにもかかわらず同じアミノ酸をコードし得る）によって、ヌクレオチド配列が天然由来のヌクレオチド配列と異なるヌクレオチドを有し、この縮重のため同一のタンパク質をコードするものであり得る。さらに、前述したように、アミノ酸の変化（欠失、付加、置換）の量は、約３０個のアミノ酸までに制限される。
【００８９】
本明細書において使用される用語「ハイブリダイゼーション」は、核酸のストランドが塩基の対を通してその相補鎖と結合するようないずれの方法をも包含すべきである（Coombs J, 1994, Dictionary of Biotechnology, stokton Press, New York NY）。「増幅」は、核酸配列の付加的なコピーの産生として定義され、通常当業者に周知のポリメラーゼ連鎖反応技術を用いて行なわれる（Dieffenbach and Dveksler, 1995, PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY）。
【００９０】
「ストリンジェンシー」は、通常約Ｔｍ−５（プローブの融点より５℃低い）からＴｍ以下約２０℃〜２５℃の範囲で生じる。
【００９１】
用語「ストリンジェントな条件」は、当業者が、慣習的に、「ストリンジェント」と呼ぶハイブリダイゼーションおよびその後の洗浄条件を意味する。Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience、N.Y., §§6.3 and 6．4 (1987, 1992）、およびSambrook et al. (Sambrook, J.C., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）を参照。
【００９２】
本明細書で使用される場合、ストリンジェントな条件は、ハイブリダイゼーション実験に使用される温度、一価のカチオンのモル濃度およびハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの割合の関数である。所定のセットの条件にかかわるストリンジェンシーの程度を決定するために、まずＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの融点Ｔｍとして表わされる１００％同一のハイブリッドの安定性を決定するためのMeinkoth et al. (1984)の方程式を使用する。
Ｔｍ＝８１．５Ｃ＋１６．６（ＬｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ホルム）−５００／Ｌ
式中、Ｍは一価のカチオンのモル濃度であり、％ＧＣはＧおよびＣヌクレオチドの割合であり、％ホルムはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの割合であり、Ｌはハイブリッドの塩基対の長さである。１００％同一性のハイブリッドに対して算出されるＴｍからＴｍが減少する１Ｃ毎に、許容されるミスマッチの量は約１％増加される。したがって、特定の塩およびホルムアミド濃度で所定のハイブリダイゼーション実験に使用されるＴｍが、Meinkothの方程式より１００％ハイブリッドに対して算出されるＴｍから１０Ｃ低い場合、ハイブリダイゼーションは約１０％までのミスマッチがある場合でも起こるであろう。
【００９３】
本明細書において使用される場合、「高度にストリンジェントな条件」は、前記式により計算される場合、または実測の場合のどちらかで、標的配列との完全な二重鎖に対して予想されるＴｍよりも１０Ｃ以下低いＴｍを提供する条件である。「中程度にストリンジェントな条件」は、前記式により計算される場合、または実測の場合のどちらかで、標的配列との完全な二重鎖に対して予想されるＴｍよりも２０Ｃ以下低いＴｍを提供する条件である。制限ではなく、高度にストリンジェントな条件（ハイブリッドの計算または実測Ｔｍより５〜１０Ｃ低い）および中程度にストリンジェントな条件（ハイブリットの計算または実測Ｔｍより１５〜２０Ｃ低い）は、ハイブリッドの計測Ｔｍより適当に低い温度で２×ＳＳＣ（標準食塩クエン酸）および０．５％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の洗浄溶液を使用する。特に使用されるハイブリダイゼーション条件が、不安定なハイブリッドを安定なハイブリッドと共に形成させる条件である場合、条件の最終的なストリンジェンシーは、主に洗浄条件による。より高いストリンジェンシーでの洗浄条件は、その結果不安定なハイブリッドを除去する。前記の高度にストリンジェントな洗浄条件から中程度にストリンジェントな洗浄条件と使用され得る一般的なハイブリダイゼーション条件は、Ｔｍより約２０〜２５Ｃ低い温度での、６×ＳＳＣ（または６×ＳＳＰＥ（標準食塩−リン酸−ＥＤＴＡ））、５×デンハルト（Denhardt’s）試薬、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡの溶液におけるハイブリダイゼーションである。混合プローブを使用する場合、ＳＳＣの代わりにテトラメチルアンモニウムクロライド（ＴＭＡＣ）を用いることが好ましい。
【００９４】
用語「融合タンパク質」は、たとえば体液内において長期の滞留時間を有する他のタンパク質と融合された、レプチンまたはその類似体もしくはフラグメントからなるポリペプチドを意味する。したがって、レプチンまたはその類似体、機能的誘導体もしくはフラグメントは、たとえば免疫グロブリンまたはそのフラグメントといった他のタンパク質、ポリペプチドなどと融合され得る。
【００９５】
本明細書中で使用される場合、「機能的誘導体」は、本技術分野において周知の方法で、残基の側鎖またはＮ末もしくはＣ末基として存在する官能基から製造され得るレプチンの誘導体ならびにそれらの類似体および融合タンパク質を含み、薬学的に許容し得るかぎり、すなわちレプチンの活性と実質的に同様のタンパク質の活性を破壊せず、それを含む組成物において毒性を与えないかぎり、本発明に含まれる。
【００９６】
これらの誘導体としては、たとえば、ポリエチレングリコール側鎖を含むことができ、該側鎖は、抗原部位を覆い、かつレプチンの体液中での滞留を拡大し得る。他の誘導体としては、カルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニアまたは一級もしくは二級アミンとの反応によるカルボキシル基のアミド、アシル部分（たとえば、アルカノイル基または炭素環式アロイル基）と形成されるアミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体、あるいはアシル部分と形成される遊離ヒドロキシル基（たとえば、セリル基またはトレオニル基のヒドロキシル基）のＯ−アシル誘導体があげられる。
【００９７】
本発明のレプチンまたはその類似体、融合タンパク質、機能的誘導体の「フラグメント」は、さらに、該フラグメントが、レプチンと実質的に同様の活性を有するという条件で、タンパク質分子単独の、または関連分子またはそこに連結した残基、たとえば、糖またはリン酸残基と一緒のポリペプチド鎖のあらゆるフラグメントまたは前駆体、またはタンパク質分子の凝集体、または糖残基それら自身を網羅する。
【００９８】
用語、排卵誘発剤は、本来受胎のために必要なホルモンの産生を擬似するかまたは刺激する薬剤を意味するが、ホルモンが不妊症治療のプログラムの一部として投与される場合には、そのホルモンそのものを意味するように使用されることもある。良く使用される排卵誘発剤は以下の通りである。
【００９９】
クエン酸クロミフェン（クロミド、セロフェン（Serophene））は、性腺刺激ホルモン：卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）および黄体形成ホルモン（ＬＨ）の放出を刺激する。
ＦＳＨは卵胞（卵ならびにその環境液およびホルモン）を刺激するように機能する。
ＬＨは排卵を誘発する。
ＧｎＲＨは、下垂体からのＦＳＨおよびＬＨの放出を誘導する。
絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）は、しばしばＦＳＨおよびＬＨと共に投与される。その作用は、黄体形成ホルモンの作用と同様である。
ＨＭＧ：ＦＳＨとＬＨとの両方を含有する製剤。
【０１００】
プロゲステロンは受精卵の有効な着床に必須の子宮内膜における分泌変化を誘導する女性ホルモンである。該ホルモンは卵子が放出された後に卵巣によって放出される。それは、卵子の受精が生じるが、流産を繰り返したり妊娠中に出血するなどのように、子宮内膜が発育中の胎児を支持できないという根拠がある場合に投与される。
【０１０１】
ｈＣＧ投与の問題の１つは、卵巣過剰刺激症候群の傾向を有することである。したがって、レプチンまたはその類似体、融合タンパク質、機能的誘導体もしくはフラグメントのｈＣＧの代わりの使用に対するもう一つの重要な動機は、卵巣過剰刺激症候群の高い危険性を有する患者に対するものである。
【０１０２】
女性を、レプチンまたはその類似体、融合タンパク質、機能的誘導体もしくはフラグメント単独、または排卵もしくはインビトロ受精法（ＩＶＦ）用の卵母細胞を得るための卵胞アスピレーションの準備としての排卵誘発剤と組み合わせて治療してよい。この方法の利点は、血清エストラジオール濃度にもかかわらず適時のＬＨ急上昇の欠損をしばしば克服することである。
【０１０３】
ＬＨ受容体の発現は顆粒膜細胞においてＦＳＨによって誘発される。ＬＨ受容体を有する卵胞は排卵を誘発する機序を活性化するＬＨパルスに応答し得る唯一のものである。
【０１０４】
レプチン、その類似体、融合タンパク質機能的誘導体またはフラグメントは、単独または排卵誘発剤と組み合わせて使用して、ＬＨ受容体の欠損またはＬＨ受容体不全のためＬＨに対して非感受性である患者の排卵を支持することができる。
【０１０５】
レプチンまたはその類似体、融合タンパク質、機能的誘導体もしくはフラグメントを、単独でまたは排卵誘発剤と組み合わせて、ＬＨの投与が有害な場合（たとえば血清ＬＨ濃度の上昇が病的な過程、たとえば多嚢胞性卵巣症候群の結果として卵胞期のあいだに既に見られる場合）に、月経周期のあいだの種々の段階で投与し、ＬＨの代わりに排卵を支持することができる。
【０１０６】
ＦＳＨ療法が指示される大多数の患者に対しては、ＬＨ投与は、充分な内因性ＬＨが存在する場合に卵胞の発達を達成するために必要とされない（ＷＨＯグループII無排卵の女性（Schoot et al. 1994）および生殖介助技術を促された患者において示されるように）。反対に、低ゴナドトロピン性性腺機能低下症の大多数の女性（ＷＨＯグループＩ無排卵）は、ＦＳＨ単独での治療のあいだ、最適な卵胞の発達とステロイドの産生に達するために必要な内因性ＬＨの閾値レベルを有さない。レプチンまたはその類似体、融合タンパク質、機能的誘導体もしくはフラグメントを単独または排卵誘発剤と組み合わせて使用し、ＬＨの代わりに排卵を支持することができる。
【０１０７】
レプチンまたはその類似体、融合タンパク質、機能的誘導体もしくはフラグメントを、生殖介助術（ＡＲＴ）において、ＬＨ、ｈＣＧ、クエン酸クロミフェン、ＧｎＲＨなどの排卵誘発剤による治療に応答しない患者に投与できる。またレプチンまたはその類似体、融合タンパク質、機能的誘導体もしくはフラグメントを、排卵誘発剤による治療が不充分であった患者に投与できる。
【０１０８】
レプチンまたはその類似体、融合タンパク質、機能的誘導体もしくはフラグメントを、ｈＣＧ投与によって卵胞破壊または黄体形成が誘発されない最適な卵胞形成を達成するのに必要なＬＨの内因性の閾値を有さない低ゴナドトロピン性性腺機能低下症を現す患者に投与できる。
【０１０９】
また、レプチンまたはその類似体、融合タンパク質、機能的誘導体もしくはフラグメントは、パルス状ＧｎＲＨに充分に反応性でない患者または下垂体性疾患の患者に投与することができる。
【０１１０】
本発明は、ＬＨおよびｈＣＧ治療に反応性でない女性、またはこれらゴナドトロピン類の投与が卵巣過刺激症候群または多嚢胞性卵巣症候群をもたらす危険を増加させる女性における排卵を支援する方法を提供する。
【０１１１】
本発明はまた、レプチンまたはその類似体、融合タンパク質、機能的誘導体もしくはフラグメントを生理学的に許容し得る担体、および／または安定化剤および／または賦形剤と混合し、たとえば投薬バイアルでは凍結乾燥によって投薬形態に調製することにより、レプチンの投与のために製造される医薬組成物に関する。
【０１１２】
本発明はさらに、女性の不妊症の治療における薬学的に許容し得る担体およびレプチンまたはその類似体、融合タンパク質、機能的誘導体もしくはフラグメントを含む医薬組成物に関する。
【０１１３】
医薬組成物は、薬学的に許容し得る担体、レプチンまたはその類似体、融合タンパク質、機能的誘導体もしくはフラグメントを含有することができ、そして任意にはさらに１つまたはそれ以上の排卵誘発剤を含有することができる。
【実施例１】
【０１１４】
レプチンは、アンタイド処置ｏｂ／ｏｂマウスおよび思春期前のＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて卵胞の発達を誘導する
雌性レプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスの不妊症は、長期間のレプチン治療により完全に治すことができ、結果として排卵し、妊娠し、分娩した（Chehab et al. 1996）。
【０１１５】
のちに、レプチンが、脳下垂体からのＦＳＨおよびＬＨの放出（排卵に必要とされる）のために必要とされる視床下部からのＧｎＲＨの放出を誘導することが発見された（Yu et al. 1997）。
【０１１６】
卵胞の発達でのレプチンの効果を、ＧｎＲＨアンタゴニスト、アンタイドで処置したｏｂ／ｏｂマウスにおいて調べた（Phillips et al. 1988）。したがって、アンタイド処置マウスへのレプチンの投与に続いて、非処置マウスとは対照的に、脳下垂体からのＬＨまたはＦＳＨの放出は生じないであろうことは予測された。
【０１１７】
８〜１０週齢の肥満のＣ５７Ｂｌ−ｏｂ／ｏｂ雌性マウスにはすべて、アンタイド（１．２５μｇ／ｇ体重）を注射した（時間０）。マウスをいくつかの群に分けた。対照群には生理食塩水のみを注射した。第２群には、時間０および９時間でマウスレプチン（ｉｐ、２×５μｇ／ｇ体重、Ｒ＆Ｄシステムズから購入）を注射した。第３群には妊馬血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ、３ ＩＵ／マウス、ｓｃ）を注射した。第４群には、ＰＭＳＧとレプチンとの組み合わせを投与した。マウスを、最初の処置の後９、２４、および４８および７２時間で犠牲死させ、卵巣を摘出し、パラフィンで固定し、ヘマトキシリン−エオシンにより染色し、卵胞と卵巣の成長を視覚化した。
【０１１８】
予想されたように、アンタイドのみで処置した対照の性腺機能低下のｏｂ／ｏｂマウスの卵巣部分は、小さな腔の卵胞を包含する一次段階での卵胞などの卵胞成長の初期段階のみを示した（示さない）。対照的に、ＦＳＨ受容体を活性化するＰＭＳＧで処置したマウスでは、大きな腔の卵胞が７２時間で形成された。驚くべきことに、ＰＭＳＧの代わりのレプチンによるｏｂ／ｏｂマウスの処置も、アンタイド処置ｏｂ／ｏｂマウスにおいて、大きな卵胞により明らかにされる急速な卵胞の成長を誘導した。それはレプチン処置の開始後早くも９時間で観察された。この結果は、ＧｎＲＨの誘導因子としてのその役割に加えて、レプチンはＧｎＲＨ非依存的経路によって卵胞の発達を刺激するということを示す。ｏｂ／ｏｂマウスは、ＰＭＳＧとレプチンで付随的に処置された場合、間質細胞の成長とさらに卵巣の成長が７２時間後に観察された。さらに驚くべきことに、黄体も、時間０でＰＭＳＧ処置し、４８時間でｈＣＧの代わりにレプチンで処置したｏｂ／ｏｂマウスの卵巣で７２時間で見られた（示さない）。
【０１１９】
同様の応答がアンタイド処置した思春期前のＣ５７ＢＬ／６マウスにおいても観察されたので、レプチンは卵胞の誘導においてｈＣＧの役割を担い得ると推論される。
【０１２０】
したがって、これらの結果は、レプチンの作用が卵胞の発達を直接的に媒介するということを示す。
【実施例２】
【０１２１】
レプチンは、アンタイド処置ｏｂ／ｏｂおよびＣ５７Ｂｌマウスおよび思春期前のＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて排卵を誘導する
ＰＭＳＧで、続いてレプチンで処置したマウスの卵巣における黄体の検出（先の実施例参照）により、我々はレプチンが排卵の誘導因子としてｈＣＧに置き換わることができる可能性をテストした。
【０１２２】
げっ歯類における排卵刺激プロトコールは、過剰排卵用量のＰＭＳＧ（ＦＳＨの源、４０ ＩＵ）単独、非過剰排卵用量のＰＭＳＧ（３〜４ ＩＵ）と他のゴナドトロピン（３〜４ ＩＵ ＬＨまたはｈＣＧ）との組み合わせ、または精製ＦＳＨ製剤と黄体形成ホルモン（ＬＨ）またはヒト絨毛性ゴナドトロピンとの組み合わせの７２時間以上の持続皮下注入（ｈＣＧ、Leveille et al 1989）のいずれかに基づく。
【０１２３】
本実施例において、排卵は、ｏｂ／ｏｂマウスおよび思春期前のＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて研究された。すべてのマウスは、レプチンによるＬＨの誘導を妨げるためにアンタイドで処置した。排卵は、非過剰排卵用量のＰＭＳＧとｈＣＧとの組み合わせにより対照マウスで達成された。第２群のマウスでは、ｈＣＧはレプチンによって置き換えられた。種々の処置の後、マウスを犠牲死させ、卵母細胞を最初の注射から７２時間でアンプルから採取し、計測した。
【０１２４】
対照ｏｂ／ｏｂマウスはＰＭＳＧ（３ ＩＵ／匹、Tiferet Hacarmel pharmacy、Tel Yizhack、イスラエルから購入）を注射され、４８時間後にＬＨの擬似物であるｈＣＧ（ヒトｈＣＧ  ギブコ、米国、５ ＩＵ／匹）を注射された。同様に、ｏｂ／ｏｂマウスのある群は、ＰＭＳＧ（３ ＩＵ／匹）を注射され、４８時間後にレプチン（２×５μｇ／ｇ重さ）を注射された。ｈＣＧまたはレプチン処置から２４時間後（ＰＭＳＧ処置から７２時間）、動物を犠牲死させ、卵巣を摘出し、排卵のマーカーである黄体の形成を卵巣部分の染色により調べた。排卵は、顕微鏡下で輸卵管の卵母細胞を計測することによりモニターされる。表１にまとめた結果は、ｈＣＧまたはレプチンのいずれかを投与されたマウスにおいてのみ排卵が観察されたことを示す。
【０１２５】
したがって、レプチンは、ｏｂ／ｏｂおよび正常な未熟なＣ５７Ｂｌマウスの両方で排卵の誘導因子としてｈＣＧに取って代わることができると考えられる。
【０１２６】
したがって、卵胞成長の誘導因子という能力（実施例１参照）に加えて、レプチンはｈＣＧやＬＨのように直接排卵を誘発する。
【０１２７】
【表４】
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【実施例３】
【０１２８】
ＬＨはアンタイド処置マウスにおいてレプチンによって誘導されない
レプチンは、視床下部からのＧｎＲＨ放出を誘導し、それは、脳下垂体からＦＳＨおよびＬＨを順次放出する（Yu et al. 1997）。レプチンによってアンタイド処置Ｃ５７ＢＬマウスおよびｏｂ／ｏｂマウスにおいて誘導される卵胞の発達および排卵が、ＬＨ放出によって介在されているかどうかを試験するために、血清ＬＨならびにプロゲステロン（ＬＨ誘導マーカーである）を測定した。血漿マウスＬＨ（ｍＬＨ）およびプロゲステロンの測定は、特異的ラジオイムノアッセイで行なった。プロゲステロンはＲＩＡによりマウスの血清で決定した（Kohen 1975）。ＬＨは、国立ホルモン＆下垂体プログラム（the National Hormone & Pituitary Program）、ハーバーＵＣＬＡ医療センター（トランス、カリフォルニア）より得た特異的ＲＩＡによりマウスで決定した。ｍＬＨのレベルはすべてのケースで０．２ｎｇ／ｍｌ以下であった（表２）。ＬＨのレベルは、レプチン処置マウスでは卵胞成長および排卵の始めから終わりまで低いままであった。しかしながら、陽性対照においてさえ、ＬＨの急上昇を検出することは難しい。したがって、ＬＨ−誘導血清プロゲステロンの測定が、循環ＬＨのより信頼性のあるマーカーとしての役目を果たす。血清プロゲステロンの結果を、図１に示す。その結果は、レプチン処置マウスにおいて有意なプロゲステロンの合成がないことを示す。対照的に、ＬＨ−等価ｈＣＧで処置したマウスでは、血清プロゲステロンが増加した。
【０１２９】
ｈＣＧおよびレプチン処置との相違点は、子宮の様子からも気付かれた。周期の発情前期と発情期の間、マウスの子宮は高血清エストラジオールにより最大膨張を示す。この様子は、ＰＭＳＧ処置マウスで明確に観察された（示さない）。しかしながら、膨張と充血とは、血清エストラジオールの減少と血清プロゲステロンの同時に起こる増加を反映するＬＨ急上昇（Tienhoven, 1968）ののちに、同様にｈＣＧの投与に付随して、正常なレベルにもどる。対照的に、レプチンの投与により排卵したｏｂ／ｏｂマウスの子宮は、充血したままで、最大膨張を示した（示さない）。実際、レプチンによる処置は、ＰＭＳＧの非存在下でさえ子宮を充血した。これらの同じ子宮の特徴は、アンタイド処置Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいても観察された。子宮の生理学および外観におけるこれらの違いは、さらにレプチン誘導排卵がＬＨ活性と独立しているという知見を支持する。
【０１３０】
これらの結果は、レプチンが、アンタイド処置マウスにおいてＬＨ非依存的機序により卵胞の発達および排卵を誘導することを証明する。
【０１３１】
【表５】
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【実施例４】
【０１３２】
レプチンは、排卵前の卵胞において破裂関連プロテアーゼを誘導する
ＬＨの排卵前の急上昇は、卵胞の内容物を容易に押し出すために卵胞壁を弱くする酵素の活性化などのいくつかの機序により排卵を誘導する。これらの酵素には、トロンボスポンジン様モチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ（ＡＤＡＭＴＳ−１）およびカテプシン Ｌ（Robker, 2000）があげられる。
【０１３３】
レプチンが、卵巣への直接的な作用によりＡＤＡＭＴＳ−１およびカテプシン Ｌの発現を誘導できるかどうかテストするために、４８時間ＰＭＳＧ（３ ＩＵ／匹）で処理した２１日齢のＣ５７ＢＬ／６マウスから得た排卵前の卵胞でインビトロ実験を行なった。排卵前の卵胞を取り出し、培養し、さらにレプチン（２５０ｎｇ／ｍｌ）またはｈＣＧ（１ ＩＵ）のいずれかの非存在下、または存在下で１７時間処理した。総ＲＮＡを卵胞から単離し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）（ロッシュ  ダイアグノスティクス（Roche diagnostics））を用いて定量ＲＴ−ＰＣＴに付した。マウスのＡＤＡＭＴＳ−１転写物の検出用に使用したプライマーは以下のものである。
フォーワードプライマー（配列番号１）：５’ＣＡＧＴＡＣＣＡＧＡＣＣＴＴＧＴＧＣＡＧＡＣＣＴＴ３’
リバースプライマー（配列番号２）：５’ＣＡＣＡＣＣＴＣＡＣＴＧＣＴＴＡＣＴＧＧＴＴＴＧＡ３’
マウスのカテプシン Ｌ転写物の検出用に使用したプライマーは以下のものである。
フォーワードプライマー（配列番号３）：５’ＴＧＡＣＡＣＡＧＧＧＴＴＣＧＴＧＧＡＴＡ３’
リバースプライマー（配列番号４）：５’ＡＣＣＧＣＴＡＣＣＣＡＴＣＡＡＴＴＣＡＣ３’
【０１３４】
ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動において検出されたＡＤＡＭＴＳ−１およびカテプシン ＬのＲＮＡｓレベルは、マウスのリボソームタンパク質Ｌ１９のＲＮＡｓレベル（フォーワードプライマー（配列番号５）：５’ＣＴＧＡＡＧＧＴＣＡＡＡＧＧＧＡＡＴＧＴＧ３’、リバースプライマー（配列番号６）：５’ＧＧＡＣＡＧＡＧＴＣＴＴＧＡＴＧＡＴＣＴＣ３’）で標準化した。
【０１３５】
図２に示す結果は、レプチン（２５０ｎｇ／ｍｌ）またはｈＣＧ（１ ＩＵ）処置卵胞において１７時間でＡＤＡＭＴＳ−１の有意な誘導が検出されたことを証明する。カテプシン Ｌの僅かな誘導が認められたが、統計的に有意なものではなかった（示さない）。
【０１３６】
これらの結果は、レプチンは卵胞壁の破壊に欠かせない役割を果たす少なくとも１つのプロテアーゼの発現を誘導できるということを示唆している。
【０１３７】
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【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】ｏｂ／ｏｂおよびＣ５７ＢＬ／６マウスにおける血清プロゲステロンを示す。マウスは、時間０にＰＭＳＧで、４８ｈに表示試薬で処理した。プロゲステロンは、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（灰色の棒）およびｏｂ／ｏｂマウス（白抜きの棒）の血清で、ＲＩＡにより７２ｈで測定した。
【図２】レプチンが排卵前の卵胞におけるプロテアーゼの発現を誘導することを示す。排卵前の卵胞は取り出され、培養され、さらにレプチン（２５０ｎｇ／ｍｌ）またはｈＣＧ（１ ＩＵ）のいずれかの非存在下（ｃ）、または存在下で１７時間処理された。総ＲＮＡを卵胞から単離し、２つのプロテアーゼに対する特異的プライマー、ＡＤＡＭＴＳ−１およびカテプシン Ｌを用いて定量ＲＴ−ＰＣＴに付した。ＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動で分離し、読み取った。ＡＤＡＭＴＳ−１のＲＮＡ濃度は、リボソームタンパク質のＲＮＡ濃度で標準化した。
【図１】
2005509664.tif 000008
【図２】
2005509664.tif 000009
【配列表】
2005509664000001.app
【国際調査報告】
2005509664.tif 000010
2005509664.tif 000011
2005509664.tif 000012
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