(57)【要約】  酵母アルコールオキシダーゼ（１）プロモーターの調節領域を含んでなるポリヌクレオチドが提供される。該調節領域を含む、単離されたポリヌクレオチド、組換えポリヌクレオチド、ベクター、発現カセットおよび形質転換細胞が開示されている。また、形質転換細胞により製造される蛋白質が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１６、配列番号１６の断片、配列番号１６の相補配列、または配列番号１６の相補配列の断片；
（ｂ）高緊縮条件下で（ａ）のポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチド；および
（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドと少なくとも８０％の配列相同性を有するポリヌクレオチド、
からなる群から選択される約１０００ヌクレオチド長より短いヌクレオチド配列を含む調節領域を含んでなる、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
（ａ）配列番号１７、配列番号１７の断片、配列番号１７の相補配列、または配列番号１７の相補配列の断片；
（ｂ）高緊縮条件下で、（ａ）のポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチド；および
（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドと少なくとも８０％の配列相同性を有するポリヌクレオチド、
からなる群から選択される約１０００ヌクレオチド長より短いヌクレオチド配列を含む調節領域を含んでなる、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
（ａ）配列番号１８、配列番号１８の断片、配列番号１８の相補配列、または配列番号１８の相補配列の断片；
（ｂ）高緊縮条件下で、（ａ）のポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチド；および
（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドと少なくとも８０％の配列相同性を有するポリヌクレオチド、
からなる群から選択される約１０００ヌクレオチド長より短いヌクレオチド配列を含む調節領域を含んでなる、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
（ａ）配列番号１９、配列番号１９の断片、配列番号１９の相補配列、または配列番号１９の相補配列の断片；
（ｂ）高緊縮条件下で、（ａ）のポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチド；および
（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドと少なくとも８０％の配列相同性を有するポリヌクレオチド、
からなる群から選択される約１０００ヌクレオチド長より短いヌクレオチド配列を含む調節領域を含んでなる、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
（ａ）配列番号２０、配列番号２０の断片、配列番号２０の相補配列、または配列番号２０の相補配列の断片；
（ｂ）高緊縮条件下で、（ａ）のポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチド；および
（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドと少なくとも８０％の配列相同性を有するポリヌクレオチド、
からなる群から選択される約１０００ヌクレオチド長より短いヌクレオチド配列を含む調節領域を含んでなる、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
（ａ）配列番号２１、配列番号２１の断片、配列番号２１の相補配列、または配列番号２１の相補配列の断片；
（ｂ）高緊縮条件下で、（ａ）のポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチド；および
（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドと少なくとも８０％の配列相同性を有するポリヌクレオチド、
からなる群から選択される約１０００ヌクレオチド長より短いヌクレオチド配列を含む調節領域を含んでなる、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
異種翻訳領域に作動可能に結合した請求項１〜６のいずれかの単離されたポリヌクレオチドを含んでなる組換えベクター。
【請求項８】
５’から３’の順に作動可能に結合した、請求項１〜６のいずれかの単離されたポリヌクレオチド、異種翻訳領域、および終止配列を含んでなる発現カセット。
【請求項９】
請求項７のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項１０】
宿主細胞が酵母細胞である、請求項９の宿主細胞。
【請求項１１】
酵母細胞がメチロトローフ酵母細胞である、請求項１０の酵母細胞。
【請求項１２】
酵母細胞がＨａｎｓｅｎｕｌａ（ハンゼヌラ）、Ｃａｎｄｉｄａ（カンジダ）、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ（トルロプシス）、およびＰｉｃｈｉａ（ピキア）からなる属群から選択される、請求項１１のメチロトローフ酵母細胞。
【請求項１３】
酵母細胞がＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ピキア・パストリス）からのものである、請求項１２の酵母細胞。
【請求項１４】
請求項８の発現カセットを含んでなる宿主細胞。
【請求項１５】
宿主細胞が酵母細胞である、請求項１４の宿主細胞。
【請求項１６】
酵母細胞がメチロトローフ酵母細胞である、請求項１５の宿主細胞。
【請求項１７】
メチロトローフ酵母細胞がＨａｎｓｅｎｕｌａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、およびＰｉｃｈｉａよりなる属群から選択される、請求項１６の宿主細胞。
【請求項１８】
酵母細胞がＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓからのものである、請求項１７の宿主細胞。
【請求項１９】
宿主細胞が該ベクターによりコードされた蛋白質を発現する、請求項９の宿主細胞。
【請求項２０】
宿主細胞が該発現カセットによりコードされた蛋白質を発現する、請求項１４の宿主細胞。
【請求項２１】
宿主細胞が該ベクターによりコードされた蛋白質を発現する条件下で請求項１９の宿主細胞を生育させ、そして発現された蛋白質を単離することを含んでなる、蛋白質の製造方法。
【請求項２２】
宿主細胞が該ベクターによりコードされた蛋白質を発現する条件下で請求項２０の宿主細胞を生育させ、そして発現された蛋白質を単離することを含んでなる、蛋白質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般的に、調節ヌクレオチド配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチド、そのような調節配列を含むベクターおよび発現カセット、ならびに該ベクターおよび／または発現カセットを含んでなる宿主細胞に向けられる。特に本発明は、アルコールオキシダーゼ１遺伝子のプロモーター領域内の５’上流調節ヌクレオチド配列、そのような調節配列を含むベクターおよび発現カセット、ならびにベクターおよび／または発現カセットを含んでなる宿主細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
メチロトローフ酵母は、メタノールをその唯一のエネルギー源として利用することが可能である。メチロトローフ酵母は、二つのグループ、Ｃａｎｄｉｄａ（カンジダ）およびＴｏｒｕｌｏｐｓｉｓ（トルロプシス）の種よりなるａｓｐｏｒａｇｅｎｏｕｓ、ならびにＨａｎｓｅｎｕｌａ（ハンゼヌラ）およびＰｉｃｈｉａ（ピキア）の種よりなるａｓｃｏｍｙｃｅｔｏｕｓ（アスコマイセタス、子嚢菌門）を含んでなる。これらの酵母は、保存されたメタノール利用経路を有する。この経路の最初のステップでは、酵素アルコールオキシダーゼがメタノールのホルムアルデヒドへの酸化を触媒する。付随して、この反応はまた、大部分の細胞オルガネラに対して非常に毒性の高い物質である、過酸化水素を発生する。過酸化水素の毒性を避けるために、メタノール代謝は、細胞の他の部分からこの毒性副産物を隔離する、ペルオキシソームと呼ばれる特殊化されたオルガネラ中で高度に区分化されている。アルコールオキシダーゼは、その基質、酸素に対して低い親和性を有する。ペルオキシソーム中でのアルコールオキシダーゼの区分化は、従って、酵素と基質を濃縮するという付加的な役割をもたらし、これにより、少なくとも部分的に、その低い酸素親和性を補っている。
【０００３】
酵母中でのメタノール代謝の調節は、一般的に、転写のレベルで起こり、対応する酵素の合成と活性化の制御を、それらの分解と共に包含している。メタノール代謝酵素の合成は、メタノール、ホルムアルデヒド、および蟻酸塩により誘導され、そしてグルコースおよびエタノールの双方によって抑制される。上記したように、メタノール酸化の鍵酵素は、アルコールオキシダーゼであり、それはまた、転写レベルでプラス方向あるいはマイナス方向の双方に制御される。Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ピキア・パストリス）からのアルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１およびＡＯＸ２）、Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ（カンジダ・ボイジニイ）Ｓ２からのアルコールオキシダーゼ（ＡＯＤ１）、ならびにＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（ハンゼヌラ・ポリモルファ）からのメタノールオキシダーゼ（ＭＯＸ１）をコードするいくつかの遺伝子がよく特性化されている。メタノールの誘導が迅速な新規のアルコールオキシダーゼの合成を引き起こし、アルコールオキシダーゼｍＲＮＡの対応する増加を伴う。例えば、メタノール生育Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて、ＡＯＸは全溶解蛋白質の３０％まで急速に蓄積される。
【０００４】
酵母は異種蛋白質の製造に広く用いられており、原核生物発現系に比べていくつかの利点を与える。例えば、原核細胞において産生されるある種の真核生物蛋白質は、不安定であるかまたは生物学的活性を欠くかのいずれかである。従ってこれらの場合には、酵母はそれらの原核生物の対応物に比べて、真核生物蛋白質の正しい折り畳みへより導く細胞内環境を含むという利点を提供する。さらに、酵母は、原核細胞の宿主とは異なり、蛋白質をグリコシル化する能力を有しており、このことは蛋白質の安定性および生物学的活性の双方にとって重要である。
【０００５】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（サッカロマイセス・セレビシアエ）は、そのゲノムおよび生理機能が広く特性化されていることから、最初の、かつ依然として最も一般的に使用されている真核生物発現系である。しかしながら、スケールアップ中のプラスミドの損失、過グリコシル化、および低蛋白質収量の理由により、それは異種蛋白質の大規模製造には必ずしも最適な発現系ではない。近年、メチロトローフ酵母発現系が開発され、それらの対応物、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに比べていくつかの利点を提供している。例えば、メチロトローフ酵母発現系は、単純で確定した培地中で非常に高い細胞密度を達成し、そして、強力な誘導性プロモーターと、遺伝子操作を容易にするような、方法、宿主株および発現ベクターの利用の可能性を有する。
【０００６】
特に、メチロトローフ酵母、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓは、工業的規模での異種蛋白質の製造に広く使用されている。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓは、遺伝子発現に用いられる固有のプロモーター、ＡＯＸ１の存在により、工業的規模での蛋白質の製造に特に好適な発現系である。ＡＯＸ１プロモーターは、上記のように、メタノール調節アルコールオキシダーゼＩ遺伝子に由来し、最も効率的できちんと調節された公知のプロモーターの一つである。例えば、上記のように、メタノール生育Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて、ＡＯＸは全溶解蛋白質の３０％にまで急速に蓄積される。
【０００７】
ＡＯＸ１遺伝子の他に、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓはまた、第二の官能性ＡＯＸ遺伝子、ＡＯＸ２も提供する。ＡＯＸ２は９７％の相同性を持つ蛋白質をコードし、そのＡＯＸ１対応物と同じ比活性を有する。しかしながら、ＡＯＸ１とＡＯＸ２の５’上流調節領域は、双方の遺伝子がグルコース上での増殖中は抑制され、炭素制限中には抑制が解かれ、そしてメタノールを唯一の炭素源とする増殖により誘導されるにもかかわらず、相同性のある有意な領域を有していない。さらに、ＡＯＸ２の誘導は、メタノール生育細胞培養物中で、全アルコールオキシダーゼ活性の１５％を担うのみである。ＡＯＸ１に対してＡＯＸ２の蓄積は限られたものであるため、ＡＯＸ１プロモーターは、大規模な蛋白質製造に対する発現系において使用することがより有利である。
【０００８】
異種蛋白質の高レベル発現はＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓからのＡＯＸ１プロモーターを使用して達成されるが、一般にＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓまたはメチロトローフ酵母中のいずれにおいても、メタノール誘導に含まれる分子機構についてはほとんど知られていない。ＡＯＸ１のプロモーター領域は同定されているが(配列番号１)、この領域内の調節配列は広くは特性化されていない。Ｓｔｒｏｍａｎら、米国特許第４，８５５，２３１号明細書参照。さらに、ＡＯＸ２遺伝子のプロモーター領域もまた同定されており(配列番号２)、特性化されている三つのｃｉｓ−作動性調節エレメント（一つの正の、および二つの負の）よりなる。Ｃｒｅｇｇ、米国特許第５，０３２，５１６号明細書参照。正のｃｉｓ−作動性エレメント、ＡＯＸ２上流活性化因子部位は、メタノールによる転写的誘導への応答に必要である。二つの負のｃｉｓ−作動性エレメントは、ＡＯＸ２プロモーターの抑制を担う。しかしながら、上記のように、ＡＯＸ１とＡＯＸ２の５’上流調節領域は、相同性のある有意な領域を有しておらず、従って、ＡＯＸ２調節の広範な特性化は、ＡＯＸ１プロモーターが調節される機構にほとんど洞察を与えない。
【０００９】
ＡＯＸ１プロモーターの調節領域を特性化する更なる試みにおいて、その配列は、特性化されていないＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株から単離されたアルコールオキシダーゼ遺伝子ＺＺＡ（配列番号３）の５’上流調節領域と比較された。Ｋｕｍａｇａｉら、米国特許第５，６４１，６６１号明細書参照。この株はまた、ＡＯＸ遺伝子の二つのコピーを含む。ＺＺＡの推論されたアミノ酸配列は、最初の１６アミノ酸のうち１４は、ＡＯＸ１およびＡＯＸ２遺伝子のそれと同一であることを示した。しかしながら、ＡＯＸ１およびＡＯＸ２の５’調節領域に類似して、ＺＺＡおよびＡＯＸ１の５’上流調節領域はただ６６％だけの相同性を有する。二つのプロモーターは、従って、完全に別個の機構で調節されると考えられる。
【００１０】
高度に保存されたヌクレオチド配列、（ＴＴＧＮＮＮＧＣＴＴＣＣＡＡＮＮＮＴＧＧＴ）（配列番号４）およびＣＣＮＣＴＴＴＴＴＧ（配列番号５）は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、およびＣ．ｂｏｉｄｉｎｉ  Ｓ２におけるアルコールオキシダーゼ、メタノールオキシダーゼ、およびジヒドロキシアセトンシンターゼ遺伝子の５’側隣接領域において見出されている。Ｋｕｍａｇａｉら、米国特許第５，６４１，６６１号明細書参照。これらの保存された領域は、結合性メタノール特異的ｔｒａｎｓ−作動性因子に関与していると仮定された。しかしながら、ＡＯＸ２プロモーターを特性化する研究において、これらの領域の欠失はＡＯＸ２プロモーターの調節に影響を与えないので、これらの配列はＡＯＸ２遺伝子の転写的調節に関与していなかった（Ｏｈｉら、（１９９４）  Ｍｏｌ．Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２４３：４８９−９９）。そこで、これらの領域はメチロトローフ酵母全体にわたって高度に保存されているが、ＡＯＸ遺伝子の転写調節におけるそれらの影響は、まだ完全に解明すべき課題として残っている。
【００１１】
従って、酵母中での異種蛋白質の制御された発現および／または高レベルの発現に対して、プロモーターおよび他の調節ヌクレオチド配列を同定することが必要である。特に、酵母中での異種蛋白質の制御された発現および／または高レベルの発現に対して、新規なＡＯＸ１プロモーターおよび調節ヌクレオチド配列を提供することが必要である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の概要
本発明のいくつかの態様のうちには、従って、
（ａ）配列番号１６、配列番号１６の断片、配列番号１６の相補配列、または配列番号１６の相補配列の断片；
（ｂ）高緊縮条件下で、（ａ）のポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチド；および
（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドと少なくとも８０％の配列相同性を有するポリヌクレオチド、
からなる群から選択される約１０００ヌクレオチド長より短いヌクレオチド配列を含む、調節領域を含んでなる単離されたポリヌクレオチドが提供される。
【００１３】
他の態様は、
（ａ）配列番号１７、配列番号１７の断片、配列番号１７の相補配列、または配列番号１７の相補配列の断片；
（ｂ）高緊縮条件下で、（ａ）のポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチド；および
（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドと少なくとも８０％の配列相同性を有するポリヌクレオチド、
からなる群から選択される約１０００ヌクレオチド長より短いヌクレオチド配列を含む調節領域を含んでなる単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１４】
さらに他の態様は、
（ａ）配列番号１８、配列番号１８の断片、配列番号１８の相補配列、または配列番号１８の相補配列の断片；
（ｂ）高緊縮条件下で、（ａ）のポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチド；および
（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドと少なくとも８０％の配列相同性を有するポリヌクレオチド、
からなる群から選択される約１０００ヌクレオチド長より短いヌクレオチド配列を含む調節領域を含んでなる単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１５】
本発明のまたさらに他の態様は、
（ａ）配列番号１９、配列番号１９の断片、配列番号１９の相補配列、または配列番号１９の相補配列の断片；
（ｂ）高緊縮条件下で、（ａ）のポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチド；および
（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドと少なくとも８０％の配列相同性を有するポリヌクレオチド、
からなる群から選択される約１０００ヌクレオチド長より短いヌクレオチド配列を含む調節領域を含んでなる単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１６】
本発明のまたさらなる態様は、
（ａ）配列番号２０、配列番号２０の断片、配列番号２０の相補配列、または配列番号２０の相補配列の断片；
（ｂ）高緊縮条件下で、（ａ）のポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチド；および
（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドと少なくとも８０％の配列相同性を有するポリヌクレオチド、
からなる群から選択される約１０００ヌクレオチド長より短いヌクレオチド配列を含む調節領域を含んでなる単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１７】
本発明のさらなる態様は、
（ａ）配列番号２１、配列番号２１の断片、配列番号２１の相補配列、または配列番号２１の相補配列の断片；
（ｂ）高緊縮条件下で、（ａ）のポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチド；および
（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドと少なくとも８０％の配列相同性を有するポリヌクレオチド、
からなる群から選択される約１０００ヌクレオチド長より短いヌクレオチド配列を含む調節領域を含んでなる単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１８】
さらなる他の態様は、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１のポリヌクレオチドを含んでなる組換えベクターを提供する。その組換えベクターを含んでなる宿主細胞が同じく提供される。
【００１９】
本発明のさらに他の態様は、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１のポリヌクレオチドを含んでなる発現カセットを提供する。該発現カセットを含んでなる宿主細胞が、同じく提供される。
【００２０】
図面の簡単な説明
本発明のこれらおよび他の特徴、態様、および利点は、下記の記述、添付の特許請求の範囲、および付随する図面を参照して、より良く理解されるであろう。
【００２１】
略号および定義
本発明の理解を促すために、本明細書中で使用されるいくつかの用語と略号を下記に定義する。
【００２２】
本明細書で使用される「単離されたポリヌクレオチド」は、ポリヌクレオチドが由来する生物の天然由来のゲノムにおいて該ポリヌクレオチドに隣接するヌクレオチド配列の、一方または両方がないポリヌクレオチドを意味する。該用語は、例えば、ベクターまたは発現カセットに；自律的に複製するプラスミドまたはウイルスに；原核生物または真核生物のゲノムＤＮＡに組込まれた；あるいは他のポリヌクレオチドと独立な別個の分子として存在する、そのポリヌクレオチドまたは断片を包含する。それはまた、ハイブリッドポリヌクレオチドの一部である組換えキメラポリヌクレオチド、例えば、ポリペプチド配列をコードするもの、を包含する。
【００２３】
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、互換的に使用され、またリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、あらゆる長さのヌクレオチドの重合体（２またはそれ以上の数の単量体）の形態を意味する。ヌクレオチドは通常リン酸ジエステル結合により結合されるが、該用語はまた、アミノエチルグリシン単位からなる中性アミド骨格結合を含む重合ヌクレオチドを包含する。この用語は分子の一次構造のみに関する。そこで、この用語は二本鎖および一本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。それはまた、ポリヌクレオチドの非修飾体と共に、公知のタイプの修飾、例えば、標識、メチル化、「キャップ」、類似体での１以上の天然由来ヌクレオチドの置換、ヌクレオチド間修飾体、例えば無電荷結合（例えばリン酸メチル、リン酸トリエステル、リン酸アミド化、カルバメート等）を伴うもの、例えば蛋白質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナル蛋白質、ポリ−Ｌ−リシン等を含む）のようなペンダント部分を含むもの、干渉物質（例えばアクリジン、ソラレン等）を伴うもの、キレート剤（例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化性金属等）を含むもの、アルキル化剤を含むもの、修飾された結合（例えば、アルファアノマー核酸等）を伴うもの等を包含する。ポリヌクレオチドは、センス鎖およびアンチセンス鎖の双方を包含する。
【００２４】
本明細書で使用される「配列」は、重合体中で単量体が存在する直線的順序を意味し、例えば、ポリペプチド中でのアミノ酸の順序またはポリヌクレオチド中でのヌクレオチドの順序を意味する。
【００２５】
本明細書で使用される、用語「相補的」または「相補性」は、二本鎖核酸中で水素結合を介して結び付く、塩基、プリンおよびピリミジンの対合に関する。下記の塩基対が相補的である：グアニンとシトシン；アデニンとチミン；およびアデニンとウラシル。本明細書で使用される該用語は、完全なおよび部分的な相補性を包含する。
【００２６】
本明細書で使用される、用語「ハイブリダイゼーション」は、核酸の鎖が塩基対合を介して相補的な鎖と結合するプロセスに関する。二つの非同一であるが非常に類似した相補的核酸のハイブリダイゼーションに利用される条件は、その二つの鎖の相補性程度およびその鎖の長さによって異なる。従って、該用語は部分的および完全なハイブリダイゼーションを意図する。そのような手法および条件は、当該分野の熟練者には周知である。
【００２７】
本明細書で使用される「発現カセット」は、ベクターに組込まれうる、遺伝子とその発現に必要な調節領域を含んでなる遺伝子モジュールを意味する。
【００２８】
本明細書で使用される「分泌配列」または「シグナルペプチド」または「シグナル配列」は、新たに合成された分泌蛋白質または膜蛋白質を、小胞体の膜へ、及び膜を介して、または細胞質から細菌の内膜を通りペリプラズムへ、あるいはミトコンドリアの基質から内部空間へ、あるいは葉緑体のストロマからチラコイドへと、導く配列を意味する。異種宿主中で発現されるべき遺伝子へそのような配列を融合すると、宿主細胞から組換え蛋白質の分泌が確実になる。
【００２９】
本明細書で使用される「作動可能に結合される」とは、配向および距離に関係なく、調節配列とコード配列の間の全結合を意味し、ここで該結合は調節配列がコード配列の発現を制御することを可能にする。
【００３０】
本明細書で使用される「異種コード配列」とは、天然に、アルコールオキシダーゼ１蛋白質またはアルコールオキシダーゼ１蛋白質のすべての相同体を、コードするもの以外の全コード配列を意味する。
【００３１】
本明細書で使用される特異的遺伝子を参照して用いられる「調節配列」または「調節領域」は、遺伝子の翻訳領域の調節された発現をもたらすのに必要あるいは充分なその遺伝子内のコードまたは非コードヌクレオチド配列に関する。従って、該用語は、プロモーター配列、調節蛋白質結合部位、上流活性化因子配列等を包含する。調節領域内の特異的ヌクレオチドは、多重の機能を果たしうる。例えば、ある特異的ヌクレオチドは、プロモーターの一部である可能性があり、転写活性化因子蛋白質の結合に関与しうる。
【００３２】
本明細書で使用される「翻訳領域」は、ある蛋白質をコードする遺伝子の部分に関する。用語「非翻訳領域」は、翻訳領域ではない遺伝子の部分に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
好ましい実施態様の説明
出願人は、アルコールオキシダーゼ１（「ＡＯＸ１」）遺伝子の非翻訳領域の一部である調節ヌクレオチド配列を同定している。ＡＯＸ１遺伝子は、（より詳細には上記の通り）メタノールのホルムアルデヒドへの酸化を触媒する、酵素アルコールオキシダーゼ１をコードしている。ＡＯＸ１プロモーターは誘導性プロモーターであり、本来メタノールおよび炭素欠乏により誘導され、グルコースおよびエタノールに応答して抑制される。ＡＯＸ１プロモーターは同定されているが（配列番号１）、出願人が発見する以前には、プロモーター領域内の５’調節ヌクレオチド配列は特性化されていなかった。本明細書で述べられているように、出願人が発見した調節領域は、種々の細胞において対象の遺伝子の発現を増加させるために用いられうる。
【００３４】
本発明の調節領域を同定するために、出願人は１０５２塩基対のＡＯＸ１プロモーター（配列番号１）を、６つの断片、Ａ（配列番号１６）、Ｂ（配列番号１７）、Ｃ（配列番号１８）、Ｄ（配列番号１９）、Ｅ（配列番号２０）、およびＦ（配列番号２１）に分割した。ゲルシフトアッセイと併せて、配列欠失および脱落変異の双方を含んでなる一連の系統的な欠失を通じて、調節およびＤＮＡ−蛋白質相互作用に関与する、ＡＯＸ１プロモーター（配列番号１）エレメントの領域が同定された（下記の実施例の項により詳細に記載される通り）。この欠失分析に基づいて、図２に示すように、断片Ａ（配列番号１６）、Ｂ（配列番号１７）、Ｃ（配列番号１８）、Ｅ（配列番号２０）、およびＦ（配列番号２１）は正の調節部位を含み、一方断片Ｄ（配列番号１９）は負の調節部位を含む。さらに、ゲルシフトアッセイに基づいて、図３および図４に示すように、断片Ａ（配列番号１６）および断片Ｃ（配列番号１８）は異なるＤＮＡ−結合蛋白質のための配列を含むと思われる。調節領域内の特異的ヌクレオチドは、複数の機能を果たしうることを特記するべきであろう。例えば、ある特異的ヌクレオチドは、プロモーターの一部である可能性があり、そして転写活性化因子蛋白質の結合に関与しうる。従って、出願人はＡ（配列番号１６）、Ｂ（配列番号１７）、Ｃ（配列番号１８）、Ｅ（配列番号２０）、およびＦ（配列番号２１）は正の調節部位を含み、断片Ｄ（配列番号１９）は負の調節部位を含むと確信するが、述べた機能以外に、これらの調節領域の各々は、複数の調節機能を果たしうる。
【００３５】
このように本発明は、配列番号１６、配列番号１６の断片、配列番号１６の相補配列、または配列番号１６の相補配列の断片を含む調節領域を含んでなる単離されたポリヌクレオチドを包含する。一つの実施態様において、該ポリヌクレオチド（または断片、あるいはポリヌクレオチドまたは断片のいずれかの相補配列）は、約１０００ヌクレオチド長未満であり、もう一つの実施態様において、該ポリヌクレオチドは約４ヌクレオチドから約７５０ヌクレオチド長の間である。しかしながらより好ましくは、該ポリヌクレオチドは約２５０ヌクレオチドから約７５０ヌクレオチド長の間である。断片は、配列番号１６または関連配列に対するプローブとして使用しうる。高緊縮条件下で、配列番号１６、または配列番号１６の相補配列にハイブリダイズする、単離されたポリヌクレオチドもまた包含される。一つの実施態様において、これらのポリヌクレオチドは約１０００ヌクレオチド長未満であり、もう一つの実施態様においては、これらのポリヌクレオチドは、約４ヌクレオチドから約７５０ヌクレオチド長の間である。そのようなポリヌクレオチドは、配列番号１６または関連配列に対するプローブとして使用しうる。
【００３６】
さらに他の一実施態様は、配列番号１７、配列番号１７の断片、配列番号１７の相補配列、または配列番号１７の相補配列の断片を含む調節領域を含んでなる単離されたポリヌクレオチドを提供する。一つの実施態様において、そのポリヌクレオチド（または断片、あるいはポリヌクレオチドまたは断片のいずれかの相補配列）は、約１０００ヌクレオチド長未満であり、もう一つの実施態様において、該ポリヌクレオチドは約４ヌクレオチドから約７５０ヌクレオチド長の間である。しかしながらより好ましくは、該ポリヌクレオチドは約２５０ヌクレオチドから約７５０ヌクレオチド長の間である。断片は、配列番号１７または関連配列に対するプローブとして使用しうる。高緊縮条件下で、配列番号１７、または配列番号１７の相補配列にハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチドもまた包含される。一つの実施態様において、これらのポリヌクレオチドは約１０００ヌクレオチド長未満であり、もう一つの実施態様においては、これらのポリヌクレオチドは、約４ヌクレオチドから約７５０ヌクレオチド長の間である。そのようなポリヌクレオチドは、配列番号１７または関連配列に対するプローブとして使用しうる。
【００３７】
さらにまた他の実施態様において、本発明は、配列番号１８、配列番号１８の断片、配列番号１８の相補配列、または配列番号１８の相補配列の断片を含む調節領域を含んでなる単離されたポリヌクレオチドを包含する。一つの実施態様において、該ポリヌクレオチド（または断片、あるいはポリヌクレオチドまたは断片のいずれかの相補配列）は、約１０００ヌクレオチド長未満であり、もう一つの実施態様において、該ポリヌクレオチドは約４ヌクレオチドから約７５０ヌクレオチド長の間である。しかしながらより好ましくは、該ポリヌクレオチドは約２５０ヌクレオチドから約７５０ヌクレオチド長の間である。断片は、配列番号１８または関連配列に対するプローブとして使用しうる。（本明細書中で定義される通り）高緊縮条件下で、配列番号１８、または配列番号１８の相補配列にハイブリダイズする、単離されたポリヌクレオチドもまた包含される。一つの実施態様において、これらのポリヌクレオチドは約１０００ヌクレオチド長未満であり、もう一つの実施態様においては、これらのポリヌクレオチドは、約４ヌクレオチドから約７５０ヌクレオチド長の間である。そのようなポリヌクレオチドは、配列番号１８または関連配列に対するプローブとして使用しうる。
【００３８】
更なる一実施態様は、配列番号１９、配列番号１９の断片、配列番号１９の相補配列、または配列番号１９の相補配列の断片を含む調節領域を含んでなる単離されたポリヌクレオチドを提供する。一つの実施態様において、該ポリヌクレオチド（または断片、あるいはポリヌクレオチドまたは断片のいずれかの相補配列）は、約１０００ヌクレオチド長未満であり、もう一つの実施態様において、該ポリヌクレオチドは約４ヌクレオチドから約７５０ヌクレオチド長の間である。しかしながらより好ましくは、該ポリヌクレオチドは約２５０ヌクレオチドから約７５０ヌクレオチド長の間である。断片は、配列番号１９または関連配列に対するプローブとして使用しうる。高緊縮条件下で、配列番号１９、または配列番号１９の相補配列にハイブリダイズする、単離されたポリヌクレオチドもまた包含される。一つの実施態様において、これらのポリヌクレオチドは約１０００ヌクレオチド長未満であり、もう一つの実施態様においては、これらのポリヌクレオチドは、約４ヌクレオチドから約７５０ヌクレオチド長の間である。そのようなポリヌクレオチドは、配列番号１９または関連配列に対するプローブとして使用しうる。
【００３９】
さらに他の一実施態様において本発明は、配列番号２０、配列番号２０の断片、配列番号２０の相補配列、または配列番号２０の相補配列の断片を含む調節領域を含んでなる単離されたポリヌクレオチドを包含する。一つの実施態様において、該ポリヌクレオチド（または断片、あるいはポリヌクレオチドまたは断片のいずれかの相補配列）は、約１０００ヌクレオチド長未満であり、もう一つの実施態様において、該ポリヌクレオチドは約４ヌクレオチドから約７５０ヌクレオチド長の間である。しかしながらより好ましくは、該ポリヌクレオチドは約２５０ヌクレオチドから約７５０ヌクレオチド長の間である。断片は、配列番号２０または関連配列に対するプローブとして使用しうる。高緊縮条件下で、配列番号２０、または配列番号２０の相補配列にハイブリダイズする、単離されたポリヌクレオチドもまた包含される。一つの実施態様において、これらのポリヌクレオチドは約１０００ヌクレオチド長未満であり、もう一つの実施態様においては、これらのポリヌクレオチドは、約４ヌクレオチドから約７５０ヌクレオチド長の間である。そのようなポリヌクレオチドは、配列番号２０または関連配列に対するプローブとして使用しうる。
【００４０】
本発明の更なる一実施態様は、配列番号２１、配列番号２１の断片、配列番号２１の相補配列、または配列番号２１の相補配列の断片を含む調節領域を含んでなる単離されたポリヌクレオチドを提供する。一つの実施態様において、該ポリヌクレオチド（または断片、あるいはポリヌクレオチドまたは断片のいずれかの相補配列）は、約１０００ヌクレオチド長未満であり、もう一つの実施態様において、該ポリヌクレオチドは約４ヌクレオチドから約７５０ヌクレオチド長の間である。しかしながらより好ましくは、該ポリヌクレオチドは約２５０ヌクレオチドから約７５０ヌクレオチド長の間である。断片は、配列番号２１または関連配列に対するプローブとして使用しうる。高緊縮条件下で、配列番号２１、または配列番号２１の相補配列にハイブリダイズする、単離されたポリヌクレオチドもまた包含される。一つの実施態様において、これらのポリヌクレオチドは約１０００ヌクレオチド長未満であり、もう一つの実施態様においては、これらのポリヌクレオチドは、約４ヌクレオチドから約７５０ヌクレオチド長の間である。そのようなポリヌクレオチドは、配列番号２１または関連配列に対するプローブとして使用しうる。
【００４１】
当該分野において周知の通り、緊縮性は生成するハイブリッドのＴｍに関連する。核酸ハイブリッドのＴｍ（融点）は、５０％の塩基が塩基対をなしている温度である。例えば、ハイブリッド中の一方のパートナーが約２０塩基の短いオリゴヌクレオチドであれば、二本鎖の５０％が、Ｔｍで典型的に鎖が分離している。この場合、Ｔｍはオリゴヌクレオチドの濃度に依存する時間依存性の平衡を反映する。対照的に双方の鎖がもっと長ければ、Ｔｍは、交互になった二本鎖と変性した領域を含む構造で、鎖が一緒に保たれている状況に相当する。この場合、Ｔｍは、時間およびポリヌクレオチド濃度に非依存性の分子内平衡を反映する。
【００４２】
当該分野において周知の通り、Ｔｍはポリヌクレオチドの組成（例えば、長さ、二本鎖のタイプ、塩基組成、および正確な塩基対合の範囲）ならびに溶媒の組成（例えば、塩濃度およびホルムアミドのような変性剤の存在）に依存する。Ｔｍの計算式は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，第二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９）中に見出すことができ、それは、
Ｔｍ＝８１．５℃−１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＝０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６３（％ホルムアミド）−６００／Ｌ）
である。ここでＬは塩基対中のハイブリッドの長さであり、Ｎａ＋の濃度は０．０１Ｍ〜０．４Ｍの範囲にあり、そしてＧ＋Ｃ含量は３０％〜７５％の範囲にある。ＲＮＡを含むハイブリッドに対する式は、同じ文献に見出すことができる。別の式は、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第二版、ＡｐｐｌｅｔｏｎおよびＬａｎｇｅ、１９９４、Ｓｅｃ  ６〜８中に見出すことができる。
【００４３】
ハイブリダイゼーションおよび洗浄方法は当該分野で周知であり、本明細書中に引用したような分子生物学における標準的な参考文献中に見出すことができる。一般に、ハイブリダイゼーションは通常、高イオン強度（６×  ＳＳＣまたは６×  ＳＳＰＥ）の溶媒中、Ｔｍより２０〜２５℃低い温度で実行される。高緊縮洗浄条件は、しばしば予備実験で経験的に決定されるが、通常、塩とＴｍより約１２〜２０℃低い温度の組合せを含んでいる。高緊縮条件の一例は、６０℃での１×  ＳＳＣである。高緊縮洗浄条件のもう一つの例は、４２℃で０．１×  ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳである（ＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３８：２６７−２８４、１９８４）。さらに高い緊縮洗浄条件の例は、５０〜６５℃で、０．１×  ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳである。一つの好ましい実施態様では、高緊縮洗浄は、１×  ＳＳＣおよび６０℃の条件下で行われる。
【００４４】
他の一実施態様において、本発明は、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、または配列番号２１、もしくは配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、または配列番号２１の相補配列に対し、少なくとも８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％、さらにより好ましくは９７％、そしてよりさらに好ましくは９９％の配列相同性を有する、単離されたポリヌクレオチド配列を提供する。
【００４５】
「相同性」は、当該分野でよく理解されている通り、２以上のポリペプチド配列または２以上のポリヌクレオチド配列間で、該配列を比較することにより決定される関係である。当該分野において「相同性」はまた、そのような配列の鎖の間の一致により決定される、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド間の配列関連性の程度を意味する。「相同性」は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９９３；  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．とＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、ニュージャージー（１９９４）；  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．とＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，編、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（１９９１）；および、Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，とＬｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ，４８：１０７３（１９８８）に記載のものを含むが、それらに限定されない公知の方法により容易に計算することができる。相同性を決定するための方法は、試験される配列の間で最大の一致が得られるよう設計されている。また、相同性を決定する方法は、公に入手可能なプログラムで組まれている。二つの配列の間の同一性／相同性を決定するために用いることができるコンピュータープログラムは、ＧＣＧ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２（１）：３８７（１９８４）；一揃いの５つのＢＬＡＳＴプログラム、３つはヌクレオチド配列照会（ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、およびＴＢＬＡＳＴＸ）用に設計され、２つは蛋白質配列照会（ＢＬＡＳＴＰとＴＢＬＡＳＴＮ）（Ｃｏｕｌｓｏｎ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１２：７６−８０（１９９４）；Ｂｉｒｒｅｎら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、１：５４３−５５９（１９９７））用に設計されたものを含むが、それらに限定されない。ＢＬＡＳＴ  Ｘプログラムは、ＮＣＢＩおよび他のソース（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０））から公に入手可能である。周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムもまた、相同性の決定に用いることができる。
【００４６】
本発明の調節領域を含んでなる単離されたポリヌクレオチドは、いかなる特別な限定に縛られることなく、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、および配列番号２１のいかなる組合せまたはこれらの配列のいずれかの断片を含んでなるものであってよい。また、該調節領域は、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、および配列番号２１の相補配列のいかなる組合せまたはこれらの配列のいずれかの相補配列の断片を含んでなるものであってよい。調節領域は、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、および配列番号２１に、高緊縮条件下でハイブリダイズするあるいは配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、および配列番号２１の相補配列に、高緊縮条件下でハイブリダイズする、単離されたポリヌクレオチドのいかなる組合せを含んでなるものであってもよい。さらに、調節領域は、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、および配列番号２１と少なくとも８０％の配列相同性を有するあるいは配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、および配列番号２１の相補配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する、単離されたポリヌクレオチドのいかなる組合せを含んでなるものであってよい。従って、例えば、本発明の一つの実施態様においては、調節領域は、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０の１個〜約３個のコピー、および配列番号２１を含んでなる。さらにもう一つの実施態様においては、調節領域は、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２０、および配列番号２１を含んでなる。
【００４７】
本発明の調節領域を含んでなるポリヌクレオチドは、核酸配列の非翻訳領域を単離するための当該分野で一般に公知のいずれかの方法によって単離しうる。一つのそのような方法は、プローブのゲノムライブラリーへのハイブリダイゼーションを用いて共有するヌクレオチド配列を検出することを含んでなり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第三版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９９５）に詳述されている。
【００４８】
同じく、上で詳細に述べた通り、本発明の単離されたポリヌクレオチド調節配列またはその相補配列を含んでなるベクターが包含される。酵母中での増殖に好適ないかなるベクターをも用いることができ、例えば、ｐＩＢ１（Ｓｅａｒｓら、（１９９８）Ｙｅａｓｔ  １４：７８３−９０）、ｐＰＩＣＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニアを通して市販）ベクターシリーズ、およびｐＰＩＣ９Ｋ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア、を通して市販）等である。ベクターはまた、クローニングベクターまたは発現ベクターのどちらでもありうる。クローニングベクターは、ＤＮＡセグメントを宿主細胞に維持させる自己複製型ＤＮＡ分子である。クローニングベクターの最も一般的なタイプは、細菌プラスミドである。発現ベクターは、特定の部位に挿入された配列がｍＲＮＡに転写され、そしてさらに蛋白質に翻訳されるよう設計された、クローニングベクターである。クローニングベクターおよび発現ベクターは両方とも、通常は、ベクターが１以上の適当な宿主中で複製されうるヌクレオチド配列を含んでいる。クローニングベクター中では、この配列は一般に、ベクターが宿主細胞染色体とは独立に複製することを可能にするもので、また複製開始点もしくは自己複製配列のいずれかを含む。種々の細菌性および酵母性複製開始点が当業者に周知であり、ｐＢＲ３２２プラスミド開始点および２μプラスミド開始点が挙げられるが、それらに限定されるものではない。Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第三版、Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９５。
【００４９】
本発明の調節配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチドは、種々の方法でベクターに挿入されうる。更なる実施態様においては、異種翻訳領域に作動可能に結合した調節配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチドが、ベクターに挿入されうる。最も一般的な方法では、一般的に当業者に公知である、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第三版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９９５）に詳述された手順を用いて、該配列は適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。
【００５０】
発現ベクターおよびクローニングベクターは選択遺伝子または選択マーカーを含むことができ、そして通常は含んでいる。典型的には、この遺伝子は、ベクターで形質転換された宿主細胞の生存または増殖に必要な蛋白質をコードしている。好適な選択マーカーの例として、ＨＩＳ４、ＡＲＧ４、ｂｌｅ、およびｋａｎが挙げられる（Ｃｒｅｇｇら、（２０００）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：２３−５２）。選択マーカーは、該マーカーの発現がポリヌクレオチド構築物とは独立に生起するように、それ自体のプロモーターを持つことができる。マーカーのプロモーターは、構成プロモーターまたは誘導性プロモーターのいずれかであることができる。
【００５１】
更なる実施態様において、本発明のベクターはまた、典型的には、特定の遺伝子座、例えばＨｉｓ４遺伝子またはＡＯＸ遺伝子（双方とも、酵母遺伝子）の部分で宿主の配列と相同である配列を含み、ベクターを相同的組換えにより宿主の染色体に挿入することを可能にする。好ましくは、本発明で用いられる相同配列は、長さが少なくとも約２００ヌクレオチドであり、そして酵母ゲノムＤＮＡに相同性を有する。出願人は、特に宿主がＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの場合に、組込まれていないベクターが不安定となる傾向があることから、そのような組込みが望ましいことを見出した。
【００５２】
より特別には、他の実施態様において、異種翻訳領域に作動可能に結合した本発明の上記の調節領域のいずれかを含んでなる組換えポリヌクレオチドが提供される。そのような組換えポリヌクレオチドは、他の用途が可能であるが、（上記に詳述の）クローニングベクターまたは発現ベクターにおいて一般的に用いられる。異種翻訳領域は、宿主細胞で発現するのに好適な、対象となるいずれの蛋白質、例えば酵素、ホルモン、調節蛋白質、構造蛋白質、または抗原（免疫応答の誘導において使用するため）をコードしていてもよい。
【００５３】
本発明の単離されたポリヌクレオチドは、作動可能に５’から３’の方向に結合した、本発明の調節領域を含んでなるポリヌクレオチド、異種翻訳領域および宿主細胞において機能する転写終止シグナル配列機能を最低限含んでなる、発現カセットの部分でありうる。発現カセットは、先に論述したように、本発明の単離されたポリヌクレオチド調節領域のいずれかを含んでなるものであってよい。さらに、異種翻訳領域は、宿主細胞で発現するのに好適な、対象となるいずれの蛋白質、例えば酵素、ホルモン、調節蛋白質、構造蛋白質、または抗原（免疫応答の誘導において使用するため）をコードしていてもよい。
【００５４】
更なる実施態様において、発現カセットはまた、産生された蛋白質を所望の位置に輸送することを指示しうる、作動可能に結合したターゲティング配列、輸送または分泌ペプチド翻訳領域を含むことができる。発現カセットはまた、さらに、選択可能なマーカーおよび／または精製部分をコードするヌクレオチド配列を含みうる。そのような親和性精製部分を蛋白質へ付加するための種々の方法が考案されている。代表例は、米国特許第４，７０３，００４号、第４，７８２，１３７号、第４，８４５，３４１号、第５，９３５，８２４号および第５，５９４，１１５号の各明細書中に見出すことができる。精製部分をコードするヌクレオチド配列の付加のための当該分野で公知のいずれかの方法、例えばＩｎｎｉｓら、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）およびＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、（１９８９）に含まれるもの、を用いることができる。更に他の実施態様において、発現カセットは、特定の遺伝子座で宿主の配列と相同であり、相同的組換えによりカセットが宿主の染色体に挿入することを可能にする配列を含んでなることができる。
【００５５】
本発明のポリヌクレオチド調節配列を含んでなる本明細書に記載の構築物のいずれかで形質転換された宿主細胞は本発明の範囲に包含される。宿主細胞は、好ましくは酵母細胞である。本発明の調節配列を用いたときに、酵母の使用が遺伝子発現を調節する手段を提供するので、酵母は、好ましい宿主である。上記のように、本発明の調節領域は、形質転換した酵母を炭素欠乏に処した時に、抑制性炭素源（例えば、グルコース、エタノール、フルクトース、ガラクトース、スクロースおよびグリセリン）に応答して抑制でき、また非抑制性炭素源（例えば、ソルビタール、マンニトール、トレハロース、およびアラニン）に応答して誘導できる。従って遺伝子発現は、細胞を生育させるために選択した培地に基づき、厳密に調節することができる。
【００５６】
しかしながら、より好ましいのは、宿主がメチロトローフ酵母細胞であることだろう。メチロトローフ酵母細胞がＨａｎｓｅｎｕｌａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、およびＰｉｃｈｉａよりなる属群から選択されることがさらにより好ましい。酵母細胞がＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓからのものであることがより好ましい。メチロトローフ酵母の使用は、本発明の調節領域を用いるときに、遺伝子発現を制御するための更なる手段を提供する。一般的な酵母とは反対に、メチロトローフ酵母は、それらの唯一の炭素およびエネルギー源としてメタノール上で増殖可能である。さらに、上記のように、メタノールは本発明の調節配列の強力な誘導剤である。例えば、メタノール生育Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞において、ＡＯＸは全溶液蛋白質の３０％まで急速に蓄積される。このように、本発明におけるメチロトローフ酵母の宿主細胞としての使用は、遺伝子発現を確実に制御し、そして同時に、高率での発現を達成することの両方のための機構を提供する。構築物の宿主細胞への導入は、当該分野で公知のいずれかの方法により達成することができる。
【００５７】
本発明はまた、所望の蛋白質をコードする遺伝子に作動可能に結合した本発明のポリヌクレオチド調節領域を含む本明細書中で特性化された構築物のいずれかで形質転換された上記の宿主細胞から蛋白質を製造する方法を包含する。蛋白質はいずれかの好適な宿主細胞中で発現させることができるが、先に明らかにした理由で、酵母宿主細胞中で発現することが好ましい。宿主細胞は、対象の核酸配列を含む発現ベクターを導入することにより、遺伝的に形質転換されて当該蛋白質を生産する。好適なクローニングベクターの特徴および宿主細胞へのそれらの導入方法は、先に論述している。そのような蛋白質の生産のための方法は、当業者に公知である。（Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（１９８６）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第二版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９９２））。
【００５８】
宿主細胞は、適当な条件下で好適な細胞密度まで培養されて、蛋白質の発現が最大限となる。蛋白質が宿主細胞中に蓄積されると、細胞は、例えば、遠心または濾過により収穫される。次いで、細胞は物理的あるいは化学的手段で破壊されて蛋白質は細胞抽出物中に放出され、そこから蛋白質が精製される。宿主細胞が蛋白質を培地中に分泌する場合には、細胞と培地を分離し、そして培地を蛋白質の精製のために維持した。
【００５９】
より多量の蛋白質は、対象の配列の増幅コピーを有する細胞から得ることができる。この方法において、配列は、選択マーカーをもつベクター中に含まれ、宿主細胞に移入されるか、あるいは選択マーカーが、対象の配列と共に、宿主細胞に共移入される。次いで、配列の多数のコピーが増幅された宿主細胞系が選択される。多数の好適な選択マーカーが、当業者に直ちに明らかである。例えば、ｓｈ  ｂｌｅ遺伝子が共増幅のマーカーとして広く使用される。ｓｈ  ｂｌｅ遺伝子産物は、Ｅ．ｃｏｌｉおよび酵母の双方において、薬物ゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ）に対する耐性を付与する。
【００６０】
回収された蛋白質は、硫酸アンモニウム析出、免疫沈降、エタノールまたはアセトン析出、酸抽出、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、電気泳動、および限外濾過を含み、それらに限定されない種々の一般的に使用される方法により精製することができる。所望であれば、蛋白質再折り畳み系を用いて、蛋白質の立体配置を完全なものにすることができる。
【００６１】
上で詳述したように、本発明の調節配列をコードするポリヌクレオチドは、種々の宿主細胞において対象遺伝子の発現を増大させるために用いられる。しかしながら、遺伝子発現の増大に加えて、出願人の発見は、他の機能のために用いうる。例えば、本発明の調節配列は、プロモーターの機能を更に特性化し、ペルオキシソームの生物発生を研究するために、研究場面で用いうる。
【００６２】
上で述べた詳細な説明は、本発明の実施にあたって当業者を手助けするために提供されている。たとえそうであっても、本発明の発見の精神および範囲から逸脱することなく本明細書中で論議した実施態様を修正または変更することが可能であるので、この詳細な説明を、本発明を不当に限定するものとして解すべきではない。
【００６３】
すべての出版物、特許、特許出願および他の参考文献は、個々の出版物、特許、特許出願または他の参考文献が具体的にまた個別的に参照して組み入れられると指示されているかのように、それらの全体が参照して本明細書に組み入れられる。
【００６４】
更なる努力無しに、前述の説明を用いて、当業者はその完全な程度まで、本発明を利用することができる。従って、以下の好ましい具体的な実施態様は、単なる例示として解されるべきであり、どんなものであれ、開示の残余の模倣では決してない。
【実施例】
【００６５】
実施例
材料と方法
菌株とプラスミド。プラスミドｐＳＡＯＨ５（Ｔｓｃｈｏｐｐら、（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：３８５９−７６）およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＧＳ１１５（Ｔｓｃｈｏｐｐら、（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：３８５９−７６）（ｈｉｓ４）株は、Ｊ．Ｍ．Ｃｒｅｇｇ、Ｋｅｃｋ  Ｇｒａｄｕａｔｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃｌａｒｅｍｏｎｔ、カリフォルニア州の、寛大な贈与であった。ｐＩＢ１プロモーター欠損発現ベクターはＢ．Ｓ．Ｇｌｉｃｋ（シカゴ大学、Ｃｈｉｃａｇｏ、イリノイ州）より提供された。Ｅ．ｃｏｌｉ株ＪＭ１０９（ｅｎｄＡ１、ｒｅｃＡ１、ｇｙｒＡ９６、ｔｈｉ、ｈｓｄＲ１７（ｒｋ−、ｍｋ＋）、ｒｅｌＡ１、ｓｕｐＥ４４、ｌ−、Ｄ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）、［Ｆ’、ｔｒａＤ３６、ｐｒｏＡ＋Ｂ＋、ｌａｃＩｑＺＤＭ１５］およびＥＳ１３０１  ｍｕｔＳ（ＬａｃＺ５３、ｍｕｔＳ２０１：：Ｔｎ５、ｔｈｙＡ３６、ｒｈａ−５、ｍｅｔＢ１、ｄｅｏＣ，ＩＮ（ｒｒｎＤ−ｒｒｎＥ）、ｐＡＬＴＥＲ（商標）−１プラスミドは、Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｓｉｔｅｓ（商標）ＩＩインビトロ変異誘発システム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）の構成成分として購入した。
【００６６】
培地、培養条件および酵素分析。酵母は最小グリセリン培地（ＭＧＹ：１．３４％アミノ酸無しの酵母窒素ベース、１％グリセリン、４×１０−５％ビオチン）中で生育させ、形質転換細胞は、最小デキストロース（ＭＤ）プレート（１．３４％アミノ酸無しの酵母窒素ベース（ＹＮＢ）、２％グルコース、４×１０−５％ビオチンおよび１．５％寒天）上で選択した。必要ならば、０．０００４％ヒスチジンを培地に加えた。
【００６７】
細胞は、最小メタノール（ＭＭ、１．３４％ＹＮＢ、４×１０−５％ビオチン、０．５％メタノール）および最小メタノール−エタノール（ＭＭＥ、１．３４％ＹＮＢ、４×１０−５％ビオチン、０．５％メタノールおよび０．５％エタノール）上で、光学密度（６００ｎｍ）が３０℃で１．５〜２．０に達するまで生育させた。β−Ｇａｌ活性は、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．β−ガラクトシダーゼのアッセイにより報告された通り、ＯＮＰＧ（ｏ−ニトロフェニル  Ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド）を用いてアッセイした。Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．（編）、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ、  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ｐｐ．３５２−３５５（１９７２）中には、ＧｕａｒｅｎｔｅとＰｔａｓｈｎｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｌａｃＺの、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのシトクロムｃ遺伝子への融合．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８，２１９９−２０３（１９８１）により提案された修正を組込む。細胞はクロロホルムとデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で透過処理され、その結果はＭｉｌｌｅｒ単位で報告された。
【００６８】
一般的ＤＮＡ法。制限酵素およびプライマーはＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ、マサチューセッツ州）からのものであった。部位特異的変異誘発は、製造者のマニュアルに従って、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）からのＡｌｔｅｒｅｄ  Ｓｉｔｅｓ（商標）ＩＩインビトロ変異誘発システムで行った。プライマーはＳｉｇｍａ／Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｔｈｅ  Ｗｏｏｄｌａｎｄ、テキサス州）から購入した。該システムに対するプロトコルは、技術マニュアルに記載のように従った。すべての他のＤＮＡ操作は、先に記したとおりであった（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）。ｐＡＬ２からの１．５ｋｂ  ＨＩＳ４断片が、単一コピー形質転換体を選択するサザン分析に使用された。
【００６９】
プラスミド構築。プラスミドｐＳＡＯＨ５は最初に、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＡＯＸ１プロモーターの制御下にＬａｃＺ遺伝子の調節を特性化するための親プラスミドとして用いられた。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ中でプラスミドｐＳＡＯＨ５が不安定であるため、ｐＡＬ２、組込みプラスミドが構築された。ｐＳＡＯＨ５の３．６ｋｂ  Ｅｃｏ  ＲＩ−Ｎｒｕ  Ｉ断片は、ｐＩＢ１、プロモーター欠損Ｐｉｃｈｉａ発現ベクターのＥｃｏ  ＲＩ−Ｓｍａ  Ｉ領域に挿入され、ｐＡＬ２親プラスミドが得られた。ｐＳＡＯＨ５のＥｃｏ  ＲＩ−Ｎｒｕ  Ｉ断片は、５’非翻訳領域およびコドン９でｌａｃＺ遺伝子に融合したＡＯＸ１の最初の１５アミノ酸を含んでいた。変異誘発プラスミド、ｐＭＭＩ１０１は、ｐＳＡＯＨ５の１１２０塩基対のＥｃｏ  ＲＩ−Ｂａｍ  ＨＩ断片をｐＡＬＴＥＲ−１に挿入することにより構築された（図１）。
【００７０】
ＡＯＸ１プロモーターの５’欠失誘導体を含むプラスミドは、Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｓｉｔｅｓ（商標）ＩＩインビトロ変異誘発システムを用いて構築され、プロモーターエレメントに沿って種々の位置にＥｃｏ  ＲＩ部位が挿入された。ＡＯＸ１プロモーターの５’欠失誘導体を得るために用いられたプライマーは以下の通りである。
【００７１】
ＡＯＸＲＩ１３２  ５’−ＡＣＧＣＡＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣＣＡＣＴＣ−３’（配列番号２２）
ＡｏｘＲｚ２８５  ５’−ＧＧＣＧＡＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＴＴＧＴ−３’（配列番号２３）
ＡｏｘＲＩ４２４  ５’−ＧＴＣＴＴＧＧＡＡＴＴＣＣＴＡＡＴＡＴＧＡＣ−３’（配列番号２４）
ＡｏＸＲＩ５５１  ５’−ＧＧＴＡＴＴＧＡＡＴＴＣＡＣＧＡＡＴＧＣＴＣ−３’（配列番号２５）
ＡＯＸＲＩ６９９  ５’−ＣＴＴＣＣＡＡＧＡＡＴＴＣＴＧＧＴＧＧＧ−３’（配列番号２６）
【００７２】
変異体プラスミド（ｐＭＭＩ１３２〜ｐＭＭＩ６６９）はＥｃｏ  ＲＩ／Ｓｍａ  Ｉで消化され、その断片はｐＡＬ２中の天然のＡＯＸ１プロモーターと交換された。
【００７３】
内部ＡＯＸ１プロモーター配列を除去するｐＡＬＤシリーズの構築は、以下のとおりである：変異体Ｅｃｏ  ＲＩ部位を有し、５’上流ＡＯＸ１プロモーター断片、Ａ（配列番号１６）、ＡＢ（各々、配列番号１６および配列番号１７）、ＡＢＣ（各々、配列番号１６、配列番号１７、および配列番号１８）、ＡＢＣＤ（各々、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９）のそれぞれを欠失したｐＭＭＩシリーズのプラスミド、ｐＭＭＩ１３２、ｐＭＭＩ２８５、ｐＭＭＩ４２４およびｐＭＭＩ５５１。これらの断片は、ＡＯＸ１プロモーターの配列欠失誘導体、ｐＡＬ２８５、ｐＡＬ４２４、ｐＡＬ５５１、ｐＡＬ６６９を有する発現プラスミドに挿入され、そしてプラスミドはそれぞれ、ｐＡＬＤ１、ｐＡＬＤ２、ｐＡＬＤ３およびｐＡＬＤ４と名づけられた。結果として、各々のｐＡＬＤプラスミドは、それぞれ、Ｂ（配列番号１７）、Ｃ（配列番号１８）、Ｄ（配列番号１９）およびＥ（配列番号２０）プロモーター断片を欠く。
【００７４】
バンドシフトアッセイ用に、断片Ｂ（配列番号１７）、Ｃ（配列番号１８）、Ｄ（配列番号１９）およびＥ（配列番号２０）の領域を精製するために、部位特異的変異誘発の第二ラウンドを行った。ｐＭＭＩ１３２、ｐＭＭＩ２８５、ｐＭＭＩ４２４、ｐＭＭＩ５５１  ｓｓＤＮＡおよびＡＯＸＲＩ２８５、ＡＯＸＲＩ４２４、ＡＯＸＲＩ５５１およびＡＯＸＲ１６６９プライマーをＳＤＭ（部位特異的変異誘発）反応のために使用し、それぞれ、Ｂ（配列番号１７）、Ｃ（配列番号１８）、Ｄ（配列番号１９）およびＥ（配列番号２０）断片を脱落した。例えば、断片Ｂ（配列番号１７）を精製するために、ｐＭＭＩ１３２一本鎖ＤＮＡおよびプライマーＡＯＸ１２８５を使用して、第三のＥｃｏＲＩ部位をＡＯＸ１プロモーターに挿入した。部位特異的変異誘発ののち、断片Ａ（配列番号１６）、Ｂ（配列番号１７）、Ｃ（配列番号１８）、Ｄ（配列番号１９）、Ｅ（配列番号２０）およびＦ（配列番号２１）の各々を、Ｇｅｎｅ  Ｃｌｅａｎ  ＩＩ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏ１０１，Ｉｎｃ．Ｖｉｓｔａ、カリフォルニア州）でゲル精製した。
【００７５】
形質転換の前に、欠失物およびｃｈｉｍｅｎ  ｃプラスミドを、ベクターを一度ＨＩＳ４配列内で切断して宿主ＧＳ１１５株のｈｉｓ４座における組込みイベントを司る、ＳｔｕＩで消化した。形質転換体はヒスチジンを含まないＭＤ培地上で選択した。形質転換株のプラスミドの単一コピーは、サザンブロットアッセイにより決定した。少なくとも３種の独立の単一コピー形質転換体を選択し、ＭＭ培地で誘導し、該株内で、β−Ｇａｌ活性をモニターした。一つの代表株を更なる検討に用いた。ＭＭおよびＭＭＥ培地中で少なくとも３回の独立した誘導実験を行い、β−ｇａｌ活性を評価した。
【００７６】
ゲルシフトアッセイ用のＤＮＡプローブ。第二ラウンドのＳＤＭ（部位特異的変異誘発）を行い、プラスミドｐＭＭＩ１３２、ｐＭＭＩ２８５、ｐＭＭＩ４２４、ｐＭＭＩ５５１を精製し、断片Ｂ（配列番号１７）、Ｃ（配列番号１８）、Ｄ（配列番号１９）およびＥ（配列番号２０）をそれぞれ遊離させた。ｐＭＭＩ１３２のＥｃｏ  ＲＩ断片およびｐＭＭＩ６６９のＥｃｏ  ＲＩ／Ｓｍａ  Ｉ断片を、それぞれ、断片Ａ（配列番号１６）およびＦ（配列番号２１）として用いた。各々の断片をアガロースゲルから精製し、赤外標識ｄＡＴＰ（Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｉｎｃ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ネブラスカ州）を用いて、ＤＮＡポリメラーゼで末端標識した。
【００７７】
酵母細胞抽出物の調製。酵母は、２５ｍｌのＭＭまたはＭＭＥ培地中３０℃で１．５ＯＤ（６００ｎｍ）まで培養した。細胞を室温、２，０００×ｇで遠心し、１Ｍソルビトールで２回洗浄し、５００ｍｌの緩衝液Ｃ［２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．０、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍＭジチオトレチオール（ＤＴＴ）、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）、０．４２Ｍ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および２５％グリセリン］中に懸濁した。細胞を、ビーズビーター（Ｂｉｏｓｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）（７×３０秒）中、ガラスビーズ（直径０．４５〜０．５ｍｍ）で破壊した。１９，０００×ｇで４℃１５分間遠心したのち、上清をゲル遅延アッセイに使用した。細胞抽出物からの全蛋白質を、ＢＳＡを標準蛋白質として用いて、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）により評価した。
【００７８】
ゲル遅延アッセイ。結合反応混合物は、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍｇのポリ（ｄＩ−ｄＣ）・ポリ（ｄＩ−ｄＣ）（デオキシイノシン−デオキシシトシン）、０．０５％ノニデット−４０、１０％グリセリンおよび末端標識ＤＮＡを２０ｍＬの容積で含んでいた。結合反応混合物は、６ｍｇの蛋白質抽出物を含んでいた。室温で２０分間インキュベーションしたのち、混合物を６％非変性プレキャストポリアクリルアミドゲル（Ｎｏｖｅｘ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）に載せた。電気泳動は、ＴＢＥ（４５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ホウ酸塩、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で、９０分間、１０ｖ／ｃｍ−ゲルで行った。ゲルを乾燥し、Ｂａｓｅ  ＩｍａｇＩＲ  ｖ．４．０ソフトウエア（Ｌｉ−Ｃｏｒ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ネブラスカ州）を用いて、プロトタイプＹ軸スキャナーでスキャンした。
【００７９】
結果
ＡＯＸ１プロモーターの欠失誘導体の調節。配列欠失（ｐＡＬシリーズ）および脱落変異（ｐＤＡＬシリーズ）を有するプラスミドは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓＧＳ１１５株の染色体のｈｉｓ４座に組込まれ、単一コピー形質転換体はサザンブロット分析（結果は示されていない）により選別された。少なくとも三つの単一コピー形質転換体がＭＭ培地でのβ−Ｇａｌ発現により選別され、一つの代表株が更なる誘導実験に使用された。各々の形質転換体は、ＭＧＹ（最小グリセリン培地）培地中で一晩培養された。培養物を用いて、ＭＭおよびＭＭＥ培地に接種し、収穫する前に、細胞を光学密度１．５〜２．０（６００ｎｍ）まで生育させた。ＡＯＸ１−ｌａｃＺ融合物の活性は、ｐＡＬ２を含むメタノール生育細胞の活性の百分率として測定され、報告された。
【００８０】
ＡＯＸ１プロモーターの各々の欠失誘導体は、天然のプロモーターに比べて、ＭＭ培地中でのβ−Ｇａｌ活性を減少させた（図２）。断片Ｄ（配列番号１９）（−５１８／−３９０）の欠損（ｐＡＬ５５１）は、ｐＡＬ４２４に比べて、β−ｇａｌ活性の約２倍の増加をもたらし、一方、断片Ｅ（配列番号２０）（−３９０／−２３９）の欠損は、発現に最も深刻な効果を与えた。
【００８１】
ｃｉｓ−作動配列の蓄積効果を無視しているため、一連の欠失は必ずしも相対的なプロモーター活性を反映しない。従って、一連のＡＯＸ１プロモーター誘導体が、内部欠失（ｐＡＬＤｓ）で構築され、各断片のそれだけの効果が決定された。配列Ｂ（配列番号１７）およびＥ（配列番号２０）の欠損のみがｌａｃＺ発現に有意な効果を与え、正のエレメントがこれらの欠失区間の中に位置することを示唆していた。β−Ｇａｌ活性に対する最も有意な効果は、断片Ｅ（配列番号２０）（−３９０／−２３９）の欠失により観察され、そこでは、ＡＯＸ１プロモーターは８４％の活性を失った。
【００８２】
ＡＯＸ１プロモーターの欠失誘導体はメタノ−ル生育細胞のプロモーター活性に有意な効果を与えたが、欠失および脱落プラスミドは、ＡＯＸ１プロモーターのエタノールで誘導される抑制を損なわなかった（図２）。
【００８３】
ゲル遅延アッセイ。ＧＳ１１５（ｐＡＬ２）株を、抑制（ＭＭＥ）または誘導（ＭＭ）条件で生育する全蛋白質抽出物を得るために使用した。断片Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦ（配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、および配列番号２１）を、ゲルシフトアッセイで試験した。細胞が誘導条件（メタノール）下で生育された場合、断片Ａ（配列番号１６）は、特異的ＤＮＡ−蛋白質複合体の形成をもたらした（図３、レーン２）。しかしながら、エタノール生育細胞−蛋白質抽出物は、全くＤＮＡ−蛋白質複合体を示さなかった（図３、レーン６）。特異性は、非標識競合体および非標識非特異的ＤＮＡを加えて試験した（レーン２および５）。２ｍｇのポリｄＩ・ｄＣポリｄＩ・ｄＣおよび５００−ｂｐのＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（リステリア・モンサイトゲネス）遺伝子産物を非特異的ＤＮＡとして用いた。競合体（非標識Ａ断片）の添加は、該シグナルの欠損という結果に終わった（レーン３）。さらに、非標識Ｃ（配列番号１８）（レーン４）の添加は、断片Ａ（配列番号１６）と競合せず、このことは断片Ｃ（配列番号１８）に結合するＤＮＡは特異的であり、また断片Ａ（配列番号１６）に結合する蛋白質は断片Ｃ（配列番号１８）と複合体を形成しないことを暗示している。
【００８４】
断片Ｃ（配列番号１８）および誘導および非誘導条件下で酵母菌から抽出された全蛋白質抽出物を用いるゲルシフトアッセイから、特異的ＤＮＡ−蛋白質複合体の形成が明らかになった。この場合、断片Ａ（配列番号１６）および非特異的ＤＮＡ（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＮＡ）は、蛋白質と競合しなかった（図４、各々、レーン４、８およびレーン５、９）。
【００８５】
エタノール／メタノール生育細胞からの抽出物は、断片Ｃ（配列番号１８）と複合体を形成するが、シグナルの強度は、同量の全細胞抽出物（６ｍｇ全蛋白質）を用いてメタノール生育細胞で観察されたものよりも弱かった。
【００８６】
異なるゲル−シフト実験条件が試験されたが、断片Ｂ（配列番号１７）、Ｄ（配列番号１９）、Ｅ（配列番号２０）およびＦ（配列番号２１）を用いたゲルシフトアッセイは、全くＤＮＡ−蛋白質複合体を示さなかった（結果は示されていない）。断片Ｆ（配列番号２１）のゲルシフト結果が図５に示されている。さらに、図６はメチロトローフ酵母のメタノール調節プロモーターの共通配列を示す。
【００８７】
本発明の詳細な説明および上記の実施例に照らして、本発明のいくつかの態様が達成されることをよく理解することができる。
【００８８】
本発明での当業者にその原理およびその実際的な用途を知らせるために、本発明は例示および実施例により、詳細に説明されていることを理解されたい。本発明の特定の処方および製法は、提示された具体的な実施態様の記載に限定されるものではなく、むしろ、説明および実施例は特許請求の範囲およびそれらの均等物の観点で見るべきである。上記のいくつかの実施例および説明は、本発明が機能する方法についてある結論を含んでいるが、発明者はそれらの結論や機能により縛られることを意図するものではなく、それらを単に考えうる解釈として提示するものである。
【００８９】
さらに、記載された本発明の特異的な実施態様は、本発明を網羅するものまたは限定するものとして意図されたものではないこと、および、上記の実施例および詳細な説明に照らして、多くの変更、修正、および変形が当業者にとって明らかであるということを理解されたい。従って、本発明は、特許請求の範囲の精神および範囲の内に入るそのようなすべての変更、修正、および変形を包含するものである。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】図１は、発現ベクターｐＡＬ２および変異誘発ベクターｐＭＭＩ１０１の構築を示す。ＰＡＬ２は、ｐＳＡＯＨ５のＥｃｏ  ＲＩ／Ｓｍａ  Ｉ断片をｐＩＢ１プロモーターのないベクターに挿入することにより構築された。ベクターｐＭＭＩ１０１は、ｐＳＡＯＨ５のＥｃｏ  ＲＩ／Ｂａｍ  ＨＩ断片をＥｃｏ  ＲＩ／Ｂａｍに挿入することにより構築された。
【図２】図２は、ＡＯＸ１プロモーターの欠失分析を示す。プラスミドはＧＳ１１５  ｈｉｓ４座に挿入された。単一コピー被積分関数は、ＨＩＳ４遺伝子をプローブとして用いてサザンアッセイにより同定した。細胞は、ＭＭ（誘導)およびＭＭＥ（抑制）条件で増殖された。ＡＯＸ１−ｌａｃＺ融合物のβ−Ｇａｌ活性は、ｐＡＬ２を含むメタノール生育細胞の活性の百分率として測定および報告された。ＴＡＴＡボックスは黒四角で示され、そして＋１  ＡＴＧは逆さの黒三角で示される。
【図３】図３は、断片Ａ（配列番号１６）に対するゲルシフトアッセイの結果を示す。レーン１、蛋白質無添加；レーン２〜５、ＭＭ生育細胞からの６ｍｇ蛋白質；レーン６、ＭＭＥ生育細胞からの６ｍｇ蛋白質；レーン３、３０倍冷却特異的ＤＮＡ（断片Ａ（配列番号１６））；レーン４、３０倍冷却断片Ｃ（配列番号１８）；レーン５、３０倍Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓｅｓ  ＤＮＡ。
【図４】図４は、断片Ｃ（配列番号１８）に対するゲルシフトアッセイの結果を示す。レーン１、蛋白質無添加；レーン２〜５、ＭＭ生育細胞からの蛋白質；レーン７〜９、ＭＭＥ生育細胞からの蛋白質；レーン３および７、３０倍冷却特異的競合物（断片Ｃ（配列番号１８））；レーン４および６、３０倍冷却非特異的競合物（断片Ａ（配列番号１６））；レーン５および９、３０倍冷却非特異的Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＮＡ。
【図５】図５は、断片Ｆ（配列番号２１）に対するゲルシフトアッセイの結果を示す。レーン１、蛋白質無添加；レーン２、ＭＭ生育細胞からの６ｍｇ蛋白質；レーン３、ＭＭ生育細胞からの１２ｍｇ蛋白質；レーン４、ＭＭＥ生育細胞からの６ｇ蛋白質；レーン５、ＭＭＥ生育細胞からの１２ｍｇ蛋白質。
【図６】図６は、メチロトローフ酵母のメタノール調節プロモーターの共通配列を示す。ＡＯＸ１プロモーター中のＴＴＣＣＡＡ（Ａ）（Ｋｕｍａｇａｉら、１９９３）およびＧＡＴＡＧ（Ｂ）（Ｏｈｉら、１９９４）コア共通配列の発生。Ｃ，ＭＯＸ  ＵＡＳ２のＡＯＸ１プロモーターとの配列比較（Ｇｏｄｅｃｋｅら、１９９４）。マイナスの数字は＋１ＡＴＧコドンと比較して与えられ、＋／−はプラス／マイナス鎖を示す。配列を含む断片文字はまた、右欄に与えられる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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