(57)【要約】修飾抗体を含む新規化合物、組成物および方法が提供される。好適な実施態様において、開示された修飾抗体は、標的局在化の増強と迅速な血液クリアランスのような有益な生理学的性質を与えるように改変または欠失された、１つ以上の定常領域ドメインを有する抗体を含む。開示された化合物は、骨髄抑制患者の新生物疾患の治療に特に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に図４Ａに記載のアミノ酸配列を有する重鎖を含む、ＴＡＧ−７２と反応性のドメイン欠失ＣＣ４９抗体。
【請求項２】
細胞障害剤をさらに含む請求項１のドメイン欠失ＣＣ４９抗体。
【請求項３】
細胞障害剤は放射性核種である請求項２のドメイン欠失ＣＣ４９抗体。
【請求項４】
放射性核種は、131Ｉと90Ｙよりなる群から選択される請求項３のドメイン欠失ＣＣ４９抗体。
【請求項５】
放射性核種は90Ｙである請求項４のドメイン欠失ＣＣ４９抗体。
【請求項６】
アミノ酸スペーサーをさらに含む請求項１のドメイン欠失ＣＣ４９抗体。
【請求項７】
１つ以上の２官能性キレート剤に共有結合した、実質的に図４Ａに記載の重鎖アミノ酸配列を有するドメイン欠失ＣＣ４９抗体を含む、新生物疾患の治療用組成物であって、１つ以上の２官能性キレート剤は90Ｙに結合している上記組成物。
【請求項８】
２官能性キレート剤は、ＭＸ−ＤＴＰＡとＣＨＸ−ＤＴＰＡよりなる群から選択される請求項７の組成物。
【請求項９】
実質的に図１Ｂに記載のアミノ酸配列を有する重鎖を含む、ＣＤ２０と反応性のドメイン欠失Ｃ２Ｂ８抗体。
【請求項１０】
細胞障害剤をさらに含む請求項９のドメイン欠失Ｃ２Ｂ８抗体。
【請求項１１】
細胞障害剤は放射性核種である請求項１０のドメイン欠失Ｃ２Ｂ８抗体。
【請求項１２】
放射性核種は、131Ｉと90Ｙよりなる群から選択される請求項１１のドメイン欠失Ｃ２Ｂ８抗体。
【請求項１３】
放射性核種は90Ｙである請求項１０のドメイン欠失Ｃ２Ｂ８抗体。
【請求項１４】
イメージングが必要な患者の腫瘍関連抗原を含む新生物をイメージングする方法であって、
イメージング剤に結合しており腫瘍関連抗原に結合する修飾抗体を、該患者に投与し、そして
該患者をイメージングして該新生物を明らかにする、
ことを含む上記方法。
【請求項１５】
イメージング剤はラジオアイソトープである請求項１４の方法。
【請求項１６】
ラジオアイソトープは、２官能性キレート剤を介して修飾抗体に結合している請求項１５の方法。
【請求項１７】
ラジオアイソトープは、111Ｉｎと90Ｙよりなる群から選択される請求項１５の方法。
【請求項１８】
治療上有効量の修飾抗体を該患者に投与する工程を含む、新生物疾患に罹った骨髄抑制患者の治療方法。
【請求項１９】
修飾抗体はドメイン欠失抗体を含む請求項１８の方法。
【請求項２０】
ドメイン欠失抗体はＣH２ドメインが欠如した請求項１９の方法。
【請求項２１】
ドメイン欠失抗体はアミノ酸スペーサーを含む請求項２０の方法。
【請求項２２】
修飾抗体は腫瘍関連抗原と反応する請求項１８の方法。
【請求項２３】
腫瘍関連抗原は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＭＵＣ−１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ  Ｅ６、ＨＰＶ  Ｅ７、ＴＡＧ−７２、ＣＥＡ、Ｌ６−抗原、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３７、ＨＬＡ−ＤＲ、ＥＧＦ受容体およびＨＥＲ２受容体よりなる群から選択される請求項２２の方法。
【請求項２４】
腫瘍関連抗原はＣＤ２０を含む請求項２２の方法。
【請求項２５】
腫瘍関連抗原はＴＡＧ−７２を含む請求項２２の方法。
【請求項２６】
修飾抗体は細胞障害剤に結合している請求項１７の方法。
【請求項２７】
細胞障害剤はラジオアイソトープを含む請求項２５の方法。
【請求項２８】
ラジオアイソトープは、90Ｙ、125Ｉ、131Ｉ、123Ｉ、111Ｉｎ、105Ｒｈ、153Ｓｍ、67Ｃｕ、67Ｇａ、166Ｈｏ、177Ｌｕ、186Ｒｅおよび188Ｒｅよりなる群から選択される請求項２６の方法。
【請求項２９】
ラジオアイソトープは90Ｙを含む請求項２７の方法。
【請求項３０】
新生物疾患は血液新生物である請求項１８の方法。
【請求項３１】
骨髄抑制患者は約１５００/mm3未満のＡＮＣを示す請求項１８の方法。
【請求項３２】
骨髄抑制患者は約１０００/mm3未満の白血球数を有する請求項３１の方法。
【請求項３３】
新生物疾患を示す患者の治療方法であって、
治療上有効量の少なくとも１つの化学療法剤を該患者に投与する工程、そして
治療上有効量の少なくとも１つの修飾抗体を該患者に投与する工程
とを含み、該化学療法剤と該修飾抗体は、任意の順序または同時に投与される上記方法。
【請求項３４】
修飾抗体はドメイン欠失抗体を含む請求項３３の方法。
【請求項３５】
ドメイン欠失抗体はＣH２ドメインが欠如した請求項３４の方法。
【請求項３６】
ドメイン欠失抗体はスペーサーを含む請求項３５の方法。
【請求項３７】
修飾抗体は腫瘍関連抗原と反応する請求項３３の方法。
【請求項３８】
腫瘍関連抗原は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＭＵＣ−１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ  Ｅ６、ＨＰＶ  Ｅ７、ＴＡＧ−７２、ＣＥＡ、Ｌ６−抗原、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３７、ＨＬＡ−ＤＲ、ＥＧＦ受容体およびＨＥＲ２受容体よりなる群から選択される請求項３７の方法。
【請求項３９】
腫瘍関連抗原はＣＤ２０を含む請求項３７の方法。
【請求項４０】
腫瘍関連抗原はＴＡＧ−７２を含む請求項３７の方法。
【請求項４１】
修飾抗体は細胞障害剤に結合している請求項３３の方法。
【請求項４２】
細胞障害剤はラジオアイソトープを含む請求項４１の方法。
【請求項４３】
ラジオアイソトープは、90Ｙ、125Ｉ、131Ｉ、123Ｉ、111Ｉｎ、105Ｒｈ、153Ｓｍ、67Ｃｕ、67Ｇａ、166Ｈｏ、177Ｌｕ、186Ｒｅおよび188Ｒｅよりなる群から選択される請求項４２の方法。
【請求項４４】
ラジオアイソトープは90Ｙを含む請求項４２の方法。
【請求項４５】
新生物疾患は血液新生物である請求項３３の方法。
【請求項４６】
患者は約１５００/mm3未満の白血球数を有する請求項３３の方法。
【請求項４７】
患者は約１０００/mm3未満の白血球数を有する請求項３３の方法。
【請求項４８】
化学療法剤は修飾抗体の前に投与される請求項３３の方法。
【請求項４９】
修飾抗体は該化学療法剤の１ヶ月以内に投与される請求項４８の方法。
【請求項５０】
修飾抗体は化学療法の２週間以内に投与される請求項４８の方法。
【請求項５１】
治療上有効量の修飾抗体を該患者に投与する工程を含む、現在化学療法コースを受けている患者の新生物疾患を治療する方法。
【請求項５２】
治療上有効量の修飾抗体を該患者に投与する工程を含む、血液新生物の患者を治療する方法。
【請求項５３】
修飾抗体はドメイン欠失抗体である請求項５２の方法。
【請求項５４】
ドメイン欠失抗体はＣH２ドメインが欠如した請求項５３の方法。
【請求項５５】
ドメイン欠失抗体はＣＤ２０と反応する請求項５４の方法。
【請求項５６】
ドメイン欠失抗体は、実質的に図１Ｂに記載のアミノ酸配列を有する重鎖を含む請求項５５の方法。
【請求項５７】
血液新生物は非ホジキンリンパ腫を含む請求項５６の方法。
【請求項５８】
治療上有効量の修飾抗体を該患者に投与する工程を含む、新生物疾患を示す再発患者の治療方法。
【請求項５９】
治療上有効量ののｈｕＣＣ４９．ΔＣH２を投与する工程を含む、結腸癌を有する患者の治療方法。
【請求項６０】
治療上有効量のＣ２Ｂ８．ΔＣH２を投与する工程を含む、血液悪性腫瘍に罹った患者の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国仮出願第６０／２６４，３１８号（２００１年１月２９日出願）の一部継続出願であり、米国仮出願第６０／３３１，４８１号（２００１年１１月１６日出願）の優先権を主張する（これらは、それぞれ参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０００２】
（発明の分野）
広い態様において本発明は、新生物疾患の治療のための修飾免疫グロブリンを含む、改良された組成物と方法に関する。さらに詳しくは本発明は、悪性腫瘍の免疫療法のための改良された腫瘍局在化と優れた生理学的プロフィールを示す、修飾免疫グロブリンの使用を含む。開示された方法と組成物は、化学療法剤、外部放射線照射、または放射線免疫療法を受けたために、骨髄が弱体化（myelocompromised）した癌患者の治療に特に有用である。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
比較的多様な悪性腫瘍に罹った患者は、過去数十年間癌治療の進歩の利益を受けてきた。現代の治療法は、実質的に緩解率を上昇させ、生存期間を延長してきたが、残念なことに、ほとんどの患者は、最終的にその疾患に倒れている。より顕著な結果を達成するための障害は、腫瘍細胞の耐性と利用可能な治療法の受け入れがたい毒性（例えば、骨髄毒性）であり、これらは最適な細胞障害剤投与を制限し、免疫無防備状態で衰弱したかまたは高齢の患者に対して、しばしば現在の治療法を利用不可能とする。これらの制限は、以前治療を受けたかまたは再発した患者の治療を試みる時に、特に顕著である。すなわち、毒性が低く、より有効な標的化治療法を開発することは、未だに困難な課題である。
【０００４】
このような治療法の有効性を増強する１つの試みは、１つ以上の細胞障害剤の好ましくない交差反応性を低下させ腫瘍細胞局在化を上昇させるための、治療抗体の使用を含む。新生物疾患の治療に使用するために抗体を動員する考えは、少なくとも１９５３年にさかのぼり、この時、腫瘍細胞を特異的に標的化するために抗体が使用された。しかし、規定の抗原を特異的に標的化するモノクローナル抗体の連続的供給を可能にしたのは、ハイブリドーマ技術におけるコーラー（Kohler）とミルスタイン（Milstein）の重要な研究であった。１９７９年までに、ヒト患者の悪性腫瘍疾患を治療するのに、モノクローナル抗体（MAb）が使用されていた。さらに最近は、３つの非結合モノクローナル抗体（リツキサン（Rituxan）（登録商標）、カンパス（Campath）（登録商標）およびヘルセプチン（Herceptin）（登録商標））が、それぞれ非ホジキンリンパ腫、ＣＬＬおよび乳癌の治療用に認可された。現在、種々の細胞障害剤（例えば、ラジオアイソトープまたはタンパク質毒素）に結合した多くのモノクローナル抗体が、種々の悪性腫瘍疾患の治療に関して臨床治験中である。過去１０年間、多様な腫瘍特異的抗体と抗体断片が開発され、抗体を、薬物、毒素、放射性核種または他の物質に結合させる方法、および結合体を患者に投与する方法も開発されている。これらの試みは、有望であることを示したが、多くのおもに予測できない問題のために、これまで開発された一部の試薬の診断的および治療的有用性が限定されている。
【０００５】
最も困難な問題の１つは、ヒトの免疫系自体により引き起こされるものであり、これは、外来抗原としての標的化結合体に応答することがある。例えば、ネズミのモノクローナル抗体（これは、最も一般的に使用されるヒトに対する標的化抗体である）と複合体を形成した薬剤または放射性核種で治療された患者では、循環するヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）が発生し、結合体の抗体部分に対する全身性の即時III型過敏症が出現する。さらに、有害な副作用が小さい（例えば、単回投与のように）場合でも、循環ＨＡＭＡは、患者において標的化物質の有効な濃度を低下させ、従って診断物質または治療物質が標的部位に到達することを制限する。
【０００６】
種々の問題が、ＲＩＴの臨床的有用性を制限し続けている。最も一般的には、循環する放射能標識免疫結合体（ＩＣ）が赤色髄中に存在する正常な血液細胞に暴露されるために、放射能標識ＭＡｂ免疫療法（ＲＩＴ）の実施が、骨髄毒性により制限される。以前、伝統的な化学療法を受けた患者は、広範な以前の薬物治療のために赤色髄貯蔵量が低下していて、特に影響を受けやすい。これは、細胞障害性薬物（その多くは、照射された腫瘍細胞の抗腫瘍応答を相乗させやすい）と組合せたＲＩＴの使用を制限してきた。例えば、ドキソルビシンと組合せた131Ｉ標識抗ＣＥＡ  ＭＡｂの投与は、肺癌のネズミ異種移植片モデルにおける個々の薬剤の治療効果を上昇させることが証明されている。しかし、この組合せは、各成分を別々に投与した場合より、毒性が強かった。ＲＩＴをシスプラチンと組合せて使用すると、同様の結果が得られた。ＲＩＴと相乗作用をすることが証明されている他の薬物には、特に限定されないが、トポイソメラーゼ酵素インヒビター（ポドヒロトキシン、例えば、エトポシド）、抗代謝物（例えば、フルオロウラシル）、ポルフィリン（ガドリニウム−テキサフィリン）またはＤＮＡインターカレーター（例えば、アントラサイクリン、カンプトテシンなど）を含む代謝酵素インヒビター（例えば、MTX、トムデックス（Tomudex））がある。
【０００７】
さらに、広範な骨髄転移を有する癌患者は特に、放射能標識ＩＣにより標的化された隣接腫瘍細胞を介して赤色髄の余分な照射を受けるリスクがある。例えば、顕著な骨髄転移を有する、イットリウム標識ゼバリン（Zevalin）または131Ｉ標識ベックサー（Bexxar）で治療した非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）患者およびＬｙｍ−１で治療した慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）患者は、骨髄関与の無い患者より用量限定性毒性を発現しやすい。従って、細胞障害剤治療法と組合せて使用すると、これらの患者集団で骨髄毒性のリスクをさらに上昇させる。
【０００８】
ＲＩＴの治療効果を上げる１つの方法は、投与されるＲＩＴの用量を増加させて、こうしてＭＡｂを介して腫瘍に送達または標的化されるアイソトープの量を増加させることである。従来の研究は、標的化癌細胞に対して高親和性結合を保持し、かつ骨髄に対する毒性を低下させるために血液から迅速にクリアランスされる、酵素消化もしくは遺伝子操作したＭＡｂ断片を使用してきた。その例には、１価（例えば、ｓｃＦｖおよびＦab断片）および多価（例えば、Ｆ(ab')2、逆Ｆ(ab')2、および２本鎖Ｆｖ断片）抗体断片を含む。これらの構築体は、従来のＩＣと比較すると、ネズミの動物モデルおよびヒトの臨床治験で、血液からの迅速なクリアランスを示した。迅速な血液クリアランスは、赤色髄照射の低下と低レベルの毒性を伴った。残念ながら、このような構築体はまた、従来の完全なＭＡｂより急速に腫瘍からクリアランスされ、腫瘍集団にアイソトープを標的化する能力は効率が悪かった。すなわち、血液クリアランスがより速く、抗癌剤との併用療法でＭＡｂ断片の毒性がより低いという利点の可能性は、アイソトープを腫瘍部位に効率的に標的化することができないことによりうち消された。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、本発明の目的は、新生物細胞を標的化するのに使用される低毒性化合物を提供することである。
【００１０】
本発明の別の目的は、骨髄抑制患者を治療するのに有効に使用される化合物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要約）
これらおよび他の目的は、広い意味で、新生物疾患の治療に使用される方法、化合物および組成物に関する本発明により提供される。このために本発明は、種々の癌を罹った患者を治療するのに使用される修飾抗体を提供する。この点で、本発明の修飾抗体または免疫グロブリンは驚くべきことに、これらを骨髄抑制患者の治療に特に有用としている生化学的特徴を示すことがわかった。さらに詳しくは、本明細書に記載の修飾抗体は、血液から急速にクリアランスされ、一方有効な腫瘍局在化を与えることが、予想外に見いだされた。従って開示された化合物は、従来の免疫結合体の非特異的分布に起因する毒性を実質的に低下させ、一方腫瘍部位において治療上有効なレベルの選択された細胞毒素を提供するのに使用される。これは、修飾抗体が放射免疫結合体として使用される時に、特にそうである。
【００１２】
従って、本発明の１つの重要な態様は、新生物疾患を治療するための、放射免疫結合体としての修飾抗体の使用を含む。すなわち修飾抗体は、90Ｙもしくは131Ｉのような治療用ラジオアイソトープに結合し、多くの癌の１つに罹った患者に投与される。開示された化合物の驚くべき性質（例えば、迅速な血液クリアランスと有効な腫瘍局在化）は、健康な臓器（特に骨髄）への関連する毒性を実質的に低下させ、一方、治療上有効量を直接腫瘍へ送達する。この示された骨髄毒性の低下は、骨髄抑制されているかまたは骨髄弱体化した患者の治療において、本発明を特に有用なものとする。
【００１３】
骨髄抑制はしばしば、化学療法（例えば、放射線照射または毒性物質の投与）の副作用として見られる。従って、本発明の他の重要な態様は、補助的化学療法または放射線照射と組合せた開示された化合物（結合したラジオアイソトープ有りまたは無し）の使用である。これは、再発したかまたは以前化学療法を受けて骨髄抑制状態になった患者に、特に有用である。そのような患者（およびしばしば、比較的健康な患者）では、放射能標識抗体の用量制限毒性は、正常骨髄細胞が循環ラジオアイソトープに暴露されることによる骨髄毒性である。本発明は、この暴露と対応する毒性を低下させ、こうして、より有効で高用量の投与を可能にする。しかし毒性を下げる先行技術の化合物と異なり、本発明の修飾抗体は、有効な腫瘍局在化を示し、こうして患者に対する利益を増加させる。
【００１４】
これらの同じ性質が、本発明の化合物と組成物を、診断法（例えば、腫瘍の放射線イメージング）に特に適したものにする。すなわち本発明の修飾抗体は、診断用ラジオアイソトープ（すなわち、111Ｉｎ）に結合することができ、新生物疾患または他の疾患の診断または追跡に使用される。この点で、非結合修飾抗体の迅速なクリアランス、および強く迅速な腫瘍局在化は、従来の放射線イメージングを使用して得られるものより、実質的に良好なシグナル対ノイズ比を有する増強された画像を与えるであろう。もちろん当業者は、イメージングのタイプ（例えば、ＭＲＩ、放射線イメージング、超音波など）およびどのイメージング剤が本明細書に開示の化合物とともに有効に使用できるかを、容易に決定できるであろう。
【００１５】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の好適な例の説明を考慮すれば、当業者には明らかであろう。
【００１６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、多くの異なる形で具体化されるが、本明細書に開示されるのは、本発明の原理を例示するその具体例である。本発明は、例示された具体例に限定されないことを協調したい。
【００１７】
本発明は、少なくとも一部は、新生物細胞に関連する抗原と免疫反応する抗体は、骨髄抑制患者に対する治療プロトコールで使用される時、増強された生化学的特徴と改良された効果を提供するように、修飾または改変されるという事実に基づく。好ましくは、修飾抗体は、放射性核種または抗新生物薬のような細胞障害剤と結合される。この点で、驚くべきことに本発明により修飾された抗体は、赤色髄貯蔵が減少した患者に対して放射免疫療法を提供するのに、有利に使用されることがわかった。さらに詳しくは、本発明の修飾抗体は、同じ結合特異性を有する全抗体と比較して、より効率的な腫瘍局在化とより短い血清半減期を示すようである。従ってこれらは、健康な細胞（例えば、血液細胞）への好ましくない暴露を最小にしながら、放射性核種のような細胞毒素を悪性腫瘍細胞または腫瘍に標的化するのに特に有用である。この増強された効果は、化学療法をすでに受けたかまたは現在受けている患者のような骨髄抑制患者の、悪性腫瘍のより積極的な治療を可能にする。
【００１８】
本明細書において「修飾抗体」という用語は、腫瘍関連抗原と免疫反応する任意の抗体、またはその結合断片もしくは組み換え体を意味し、ここで、ほぼ同じ結合特異性を有する全、非改変抗体と比較した時、所望の生化学的特徴（例えば、腫瘍局在化の上昇、または血清半減期の低下）を与えるように、１つ以上の定常領域ドメインの少なくとも一部が欠失しているかまたは改変されている。好適な実施態様において、本発明の修飾抗体は、定常領域の１つの少なくとも一部が欠失している。本開示において、そのような構築体は、「ドメイン欠失」と呼ぶ。好ましくは、修飾抗体の定常領域の１つのドメイン全体が欠失しており、さらに好ましくはＣH２ドメイン全体が欠失している。より詳細に後述するように、各所望の変種は、全前駆体または親抗体から公知の技術を使用して、各所望の変種を作成または構築できる。
【００１９】
当業者は、本発明の化合物、組成物および方法が、腫瘍関連抗原を示す新生物疾患、腫瘍または悪性腫瘍を治療するのに有用であることを理解するであろう。上記したように、本発明の修飾抗体は、１つ以上の腫瘍関連抗原と免疫反応性である。すなわち、開示された修飾抗体の抗原結合部分（すなわち、可変領域またはその免疫反応性断片もしくは組み換え体）は、悪性腫瘍の部位で、選択された腫瘍関連抗原に結合する。報告された腫瘍関連抗原の数および関連抗体の数を考慮すれば、当業者は、本発明の開示された修飾抗体は、多くの全抗体の任意のものから誘導されることは理解できるであろう。より一般的には、本発明で有用な修飾抗体は、腫瘍関連抗原と反応する任意の抗体（すでに文献で報告されているものを含む）から得られるまたは誘導されてよい。さらに、開示された修飾抗体を生成するのに使用される親抗体もしくは前駆体抗原またはその断片は、ネズミ、ヒト、キメラ、ヒト化、非ヒト霊長類または霊長類化されたものでもよい。他の好適な実施態様において、本発明の修飾抗体は、本明細書に記載の改変定常ドメインを有する１本鎖抗体構築体（米国特許第５，８９２，０１９号に開示されたもの、これは参照することにより本明細書に組み込まれる）でもよい。従って、本明細書の教示に従って修飾されるこれらの任意の型の抗体は、本発明に適合する。
【００２０】
本明細書において「腫瘍関連抗原」とは、腫瘍細胞に一般に関連する任意の抗原、すなわち正常細胞への関連と比較して同じかまたはより多く関連する抗原を意味する。より一般的には、腫瘍関連抗原は、非悪性腫瘍細胞上での発現に無関係に、新生物細胞への免疫反応性抗体の局在化を提供する抗原を含む。そのような抗原は、比較的腫瘍特異的であり、非悪性腫瘍組織と比較して、悪性腫瘍細胞の表面への発現が限定されているか、または悪性腫瘍集団上の細胞表面発現の増加を示す。ＣＥＡ、ＭＵＣ−１およびＴＡＧ−７２と反応性のＭＡｂが、その例である。あるいはそのような抗原は、悪性腫瘍細胞および非悪性腫瘍細胞上で構成的に発現される。例えば、ＣＤ２０は、非ホジキンリンパ腫の治療のための、免疫療法抗体の非常に有効な標的であることがわかった、悪性腫瘍細胞と非悪性腫瘍Ｂ細胞の両方の表面に見いだされる汎Ｂ抗原である。この点で汎Ｔ細胞抗原（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ６およびＣＤ７）はまた、本発明の意味において腫瘍関連抗原を含む。他の腫瘍関連抗原の例は、特に限定されないが、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ  Ｅ６とＥ７、Ｌ６−抗原、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３７、ＨＬＡ−ＤＲ、ＥＧＦ受容体およびＨＥＲ２受容体である。多くの場合に、これらの抗原のそれぞれについて免疫反応性抗体が、文献に報告されている。当業者は、これらの各抗体は、本発明の修飾抗体の前駆体となることを理解するであろう。
【００２１】
本発明の修飾抗体は、好ましくは上記の腫瘍関連抗原に関連および結合する。従って、後に詳述されるように、本発明の修飾抗体は、腫瘍関連抗原と反応する多くの抗体の１つから、誘導、生成または作成される。好適な実施態様において修飾抗体は、共通の遺伝子操作法を使用して誘導され、こうして、１つ以上の定常領域ドメインの少なくとも一部が欠失または改変されて、所望の生化学的特徴（例えば、血清半減期の低下）を与える。さらに詳しくは、後に例示されるように当業者は、対象の抗体の可変領域および／または定常領域に対応する遺伝子配列を容易に単離し、適切なヌクレオチドを欠失または改変させて、本発明の修飾抗体を得てもよい。さらに、修飾抗体は、充分確立されたプロトコールを使用して、臨床的または商業的スケールで発現および産生されることが、さらに理解される。
【００２２】
選択された実施態様において、本発明で有用な修飾抗体は、腫瘍関連抗原に対する公知の抗体から誘導される。これは、親抗体のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を得て、本明細書に記載のように修飾を行うことにより、容易に行われる。他の実施態様については、既知の抗体の抗原結合領域（例えば、可変領域または相補性決定領域）のみを使用して、これらを、修飾した定常領域と一緒にして、所望の修飾抗体を産生することが好ましい。適合性のある１本鎖構築体は、同様の方法で作成される。いずれにしても、本発明の抗体はまた、当該分野で公知のように親和性を改善するかまたは免疫原性を低下させるように操作してもよい。例えば、本発明の修飾抗体は、ヒト化またはキメラ化抗体から誘導または作成される。すなわち、本発明に一致する修飾抗体は、天然に存在するネズミ、霊長類（ヒトを含む）または他の哺乳動物モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、２特異的抗体または１本鎖抗体構築体、ならびに各タイプの免疫反応性断片から誘導されるか、および／またはこれらを含む。
【００２３】
上記したように、腫瘍関連抗原と反応するすでに報告されている抗体は、本発明の修飾抗体を提供するために、本明細書に記載のように改変してもよい。開示された修飾抗体の抗原結合領域を提供するのに、これらの抗体を生成するのに、または誘導するのに使用される抗体の例には、特に限定されないが、Ｙ２Ｂ８とＣ２Ｂ８（ゼバリン（Zevalin）およびリツキサン（Rituxan）（登録商標）、アイディーイーシー・ファーマシューチカルズ社（IDEC Pharmaceuticals Corp.）、サンジエゴ）、Ｌｙｍ１とＬｙｍ２（テクニクローン（Techniclone））、ＬＬ２（イムノメディックス社（Immunomedics Corp.）、ニュージャージー州）、ＨＥＲ２（ヘルセプチン（Herceptin）（登録商標）、ゲネンテク社（Genentech Inc.）、サウスサンフランシスコ）、Ｂ１（ベックサー（Bexxar）（登録商標）、コールター・ファーム（Coulter Pharm.）、サンフランシスコ）、ＭＢ１、ＢＨ３、Ｂ４、Ｂ７２．３（サイトゲン社（Cytogen Corp.））、ＣＣ４９（国立癌研究所（National Cancer Institute））、およびＳＥ１０（アイオワ大学）がある。好適な実施態様において、本発明の修飾抗体は、上記の抗体と同じ腫瘍関連抗原に結合する。特に好適な実施態様において修飾抗体は、Ｙ２Ｂ８、Ｃ２Ｂ８、ＣＣ４９およびＣ５Ｅ１０と同じ抗原から誘導されるか、またはこれらの抗原に結合し、より好ましくは、ドメイン欠失抗体（すなわち、ΔＣH２抗体）を含む。後述の考察と例に記載のように、そのような修飾抗体は、骨髄抑制患者の治療または化学療法との併用に、特に有用である。
【００２４】
第１の好適な実施態様において、修飾抗体は、リツキサン（Rituxan）（登録商標）と同じ腫瘍関連抗原に結合する。リツキサン（Rituxan（リツキシマブ（Rituximab）、ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８およびＣ２Ｂ８としても知られている）は、ヒトＢ細胞リンパ腫の治療のための最初のＦＤＡ認可モノクローナル抗体である（米国特許第５，８４３，４３９号、５，７７６，４５６号、および５，７３６，１３７号を参照されたい、これらはそれぞれ、参照することにより本明細書に組み込まれる）。Ｙ２Ｂ８は、Ｃ２Ｂ８の親であるネズミのものである。リツキサン（Rituxan）は、増殖阻害性であり、化学療法剤によるインビトロのアポトーシスのためにあるリンパ腫細胞株を感作すると報告されている、キメラの抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（ＭＡｂ）である。この抗体は、ヒト補体に効率的に結合し、強いＦｃＲ結合を有し、補体依存性（ＣＤＣ）および抗体依存性（ＡＤＣＣ）機構により、ヒトリンパ球をインビトロで有効に死滅させる（レフ（Reff）ら、Blood 83: 435-445 (1994)）。当業者は、本発明に従って修飾されたＣ２Ｂ８またはＹ２Ｂ８の変種が、ＣＤ２０＋悪性腫瘍を示す患者を有効に治療するのに、結合または非結合型で使用されることを、理解するであろう。より一般的には、本明細書に開示の修飾抗体は、「裸の」もしくは非結合状態でまたは細胞障害剤に結合した状態で、多くの新生物疾患の任意のものを有効に治療するのに使用されることは、理解されるであろう。
【００２５】
他の好適な実施態様において、修飾抗体は、ＣＣ４９と同じ腫瘍関連抗原から誘導されるか、またはこれに結合する。上記したように、ＣＣ４９は、ヒト起源のある腫瘍細胞（特に、ＬＳ１７４Ｔ腫瘍細胞株）の表面に結合しているヒト腫瘍関連抗原ＴＡＧ−７２に結合する。ＬＳ１７４Ｔ［アメリカンタイプカルチャーコレクション（ここでは、ＡＴＣＣ）No.ＣＬ１８８］は、ＬＳ１８０（ＡＴＣＣ  No.ＣＬ１８７）結腸腺癌株の変種である。
【００２６】
さらに、ＴＡＧ−７２に対する結合特異性を有する多くのネズミモノクローナル抗体が開発されていることが理解されるであろう。これらのモノクローナル抗体の１つ（Ｂ７２．３）は、ハイブリドーマＢ７２．３（ＡＴＣＣ  No.ＨＢ−８１０８）により産生されるネズミＩｇＧ１である。Ｂ７２．３は、ヒト乳癌抽出物を免疫原として使用して開発された第１世代モノクローナル抗体である（コルチャー（Colcher）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 78: 3199-3203 (1981)；および米国特許第４，５２２，９１８号と４，６１２，２８２号を参照、それぞれ参照することにより本明細書に組み込まれる）。ＴＡＧ−７２に対して作成された他のモノクローナル抗体は、「ＣＣ」と呼ぶ（結腸癌）。シュロム（Schlom）ら（米国特許第５，５１２，４４３号、これは参照することにより本明細書に組み込まれる）が記載したように、ＣＣモノクローナル抗体は、Ｂ７２．３で精製したＴＡＧ−７２を使用して調製された第２世代ネズミモノクローナル抗体のファミリーである。ＴＡＧ−７２に対するその比較的良好な結合親和性のために、以下のＣＣ抗体がＡＴＣＣに寄託されており、入手は限定されるように要求されている：ＣＣ４９（ＡＴＣＣ  No.ＨＢ９４５９）；ＣＣ８３（ＡＴＣＣ  No.ＨＢ９４５３）；ＣＣ４６（ＡＴＣＣ  No.ＨＢ９４５８）；ＣＣ９２（ＡＴＣＣ  No.ＨＢ９４５４）；ＣＣ３０（ＡＴＣＣ  No.ＨＢ９４５７）；ＣＣ１１（ＡＴＣＣ  No.９４５５）；およびＣＣ１５（ＡＴＣＣ  No.ＨＢ９４６０）。米国特許第５，５１２，４４３号は、例えば、当該分野で公知の組換えＤＮＡ技術を用いてマウス定常領域をヒト定常領域（Ｆｃ）ドメインで置換することにより、開示された抗体がさらにキメラ型に改変できることを、教示している。ネズミおよびキメラ抗ＴＡＧ−７２抗体を開示する以外に、シュロム（Schlom）らはまた、ＰＣＴ／ＵＳ９９／２５５５２に記載のように、ヒト化ＣＣ４９抗体の変種を産生させ、米国特許第５，８９２，０１９号に記載のように、１本鎖構築体を産生させた（これらはそれぞれ、参照することにより本明細書に組み込まれる）。当業者は、前記抗体、構築体または組み換え体、およびこれらの変種のそれぞれが、本発明に従って修飾され使用されることを理解するであろう。
【００２７】
前記抗ＴＡＧ−７２抗体以外に、いろいろなグループが、ドメイン欠失ＣＣ４９とＢ７２．３抗体の構築と部分的性状解析を報告している（例えば、カルボ（Calvo）ら、Cancer Biotherapy, 8(1): 95-109 (1993)、スラビン−チオリニ（Slavin-Chiorini）ら、Int. J. Cancer 53: 97-103 (1993) およびスラビン−チオリニ（Slavin-Chiorini）ら、Cancer Res. 55: 5957-5967 (1995)）。開示された構築体は、本発明の方法と組成物に適合する修飾抗体を提供することを理解されるであろう。しかし、引用文献は、全親抗体と比較して、ドメイン欠失構築体のクリアランス時間は加速されることを証明したが、開示された構築体が、本出願に記載のように化学療法を受けたかまたは受けている骨髄抑制患者の治療において、特に有効であることを示唆しない。むしろ、これらの文献は、構築体の迅速なクリアランスが、それらを、本発明に記載されるように、併用療法より診断法に特に有用であることが示唆するようである。
【００２８】
本発明のさらに別の好適な実施態様は、Ｃ５Ｅ１０と同じ腫瘍関連抗原から誘導されるかまたはこれと結合する修飾抗体を含む。同時係属出願米国特許第６，２０７，８０５号に記載のように、Ｃ５Ｅ１０は、前立腺腫瘍細胞株（例えば、ＤＵ１４５、ＰＣ３、またはＮＤ１）に特異的と思われる約１１５kDaの糖脂質決定基を認識する抗体である。すなわち、本発明に関連して、Ｃ５Ｅ１０抗体に認識される同じ腫瘍関連抗原に特異的に結合する修飾抗体（例えば、ＣH２ドメイン欠失抗体）は、新生物疾患の治療のために、結合型または非結合型で産生され使用される。特に好適な実施態様において、修飾抗体は、ＡＴＣＣ受け入れ番号ＰＴＡ−８６５を有するハイブリドーマ細胞株から分泌されるＣ５Ｅ１０抗体の抗原結合領域のすべてまたは一部から誘導されるか、またはこれを含む。次に、生じる修飾抗体は、後述のように放射性核種に結合され、本明細書の方法に従って前立腺癌に罹った患者に投与される。
【００２９】
上記抗体以外に、共通の免疫学的技術とともに免疫を使用して作成した新規抗体の抗原結合領域から誘導されるかまたはこれを含む修飾抗体を提供することが好ましい。当該分野で認識されているプロトコールを使用して、好ましくは哺乳動物で、関連抗原（例えば、精製した腫瘍関連抗原またはそのような抗原を含む細胞もしくは細胞抽出物）とアジュバントの、複数回の皮下または腹腔内注射により、抗体が作成される。この免疫は典型的には、活性化脾細胞またはリンパ球からの抗原反応性抗体の産生を含む免疫応答を誘発する。生じる抗体は、動物の血清から採取されてポリクローナル調製物を与えるが、脾臓、リンパ節または末梢血から個々のリンパ球を単離して、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）の均一な調製物を与えることが、しばしば好ましい。好ましくは、リンパ球は、脾臓から得られる。
【００３０】
この公知の方法（コーラー（Kohler）ら、Nature, 256: 495 (1975))において、抗原を注入された哺乳動物からの、比較的短命のまたは致死のリンパ球が、不死の腫瘍細胞株（例えば、骨髄腫細胞株）と融合され、こうして、不死であってかつＢ細胞の遺伝子的にコードされた抗体を産生することができるハイブリッド細胞または「ハイブリドーマ」が産生される。生じるハイブリッドは、単一の抗体の生成のための特異的遺伝子を含む個々の株を用いて、選択、希釈、および再増殖することにより、単一の遺伝子株に分離される。従ってこれらは、所望の抗原に対して均一の、および純粋な遺伝子血統に対して、「モノクローナル」と呼ばれる抗体を産生する。
【００３１】
こうして調製したハイブリドーマ細胞は、好ましくは非融合の親骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する１つ以上の物質を含有する適当な培地中に、接種され増殖される。当業者は、ハイブリドーマの選択のための試薬、細胞株および培地は、多くの業者から販売されており、標準的プロトコールが充分確立していることを理解するであろう。一般に、ハイブリドーマが増殖している培地は、所望の抗原に対するモノクローナル抗体の産生について測定される。好ましくは、モノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降法、またはインビトロ測定法、例えば放射免疫定量法（ＲＩＡ）もしくは酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により測定される。所望の特異性、親和性および／または活性を有するハイブリドーマ細胞を同定した後、クローンは、限界希釈法によりさらにサブクローニングされ、標準的方法（ゴディング（Goding）、モノクローナル抗体：原理と実際（Monoclonal Antibodies: Principles and Practice）、５９〜１０３頁（アカデミックプレス（Academic Press）、１９８６年））により増殖される。さらに、サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、培地、腹水または血清から、例えばプロテインＡ、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析または親和性クロマトグラフィーのような通常の精製法により分離されることは、理解されるであろう。
【００３２】
他の適合する実施態様において、所望のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、通常法（例えば、ネズミ抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用して）を使用して容易に単離され、配列決定される。単離されサブクローニングされたハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好適な供給源となる。いったん単離されると、ＤＮＡは発現ベクター中に入れられ、次にこれは、原核または真核宿主細胞（例えば、大腸菌（E. coli）、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または、本来は免疫グロブリンを産生しない骨髄腫細胞）中にトランスフェクトされる。さらに詳しくは、単離したＤＮＡ（これは、本明細書で修飾される）は、ニューマン（Newman）ら、米国特許第５，６５８，５７０号（これは参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載のように抗体の製造のために、定常領域および可変領域配列をクローニングするのに使用される。これは基本的に、選択された細胞からのＲＮＡの抽出物、ｃＤＮＡへの変換、およびＩｇ特異的プライマーを使用するＰＣＲによるその増幅を含む。後に詳述されるように、所望の抗体を発現する形質転換細胞は、比較的大量に培養されて、免疫グロブリンの臨床的および商業的供給を提供する。
【００３３】
当業者はまた、抗体または抗体断片をコードするＤＮＡが、例えばＥＰ３６８６８４Ｂ１および米国特許第５，９６９，１０８号（これらはそれぞれ、参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載のように抗体ファージライブラリーから誘導されることを、理解するであろう。いくつかの文献（例えば、マークス（Marks）ら、Bio/Technology 10: 779-783 (1992)）は、大きいファージライブラリーを構築するための方法として、鎖シャフリング、ならびにコンビナトリアル感染およびインビボ組換えにより、高親和性ヒト抗体の産生を記載している。そのような方法は、モノクローナル抗体の単離と以後のクローニングのための伝統的なハイブリドーマ法の有用な代替法となり、従って、明らかに本発明の範囲内にある。
【００３４】
本発明のさらに別の実施態様は、内因性免疫グロブリン産生ができないトランスジェニック動物（例えば、マウス）中の、実質的にヒト抗体の生成を含む（例えば、米国特許第６，０７５，１８１号、５，９３９，５９８号、５，５９１，６６９号、および５，５８９，３６９号を参照されたい、これらのそれぞれは、参照することにより本明細書に組み込まれる）。例えば、キメラおよび生殖細胞系変異マウスの抗体重鎖結合領域のホモ接合体欠失は、内因性抗体産生を完全に阻害することが記載されている。そのような生殖細胞系変異マウス中のヒト免疫グロブリン遺伝子アレイの移送は、抗原刺激によるヒト抗体の産生を引き起こす。ＳＣＩＤマウスを使用してヒト抗体を生成する別の好適な手段が、本出願人による同時係属米国特許第５，８１１，５２４号（これは参照することにより本明細書に組み込まれる）に開示されている。これらのヒト抗体に関連する遺伝子物質もまた、本明細書に記載のように単離され操作されることは理解されるであろう。
【００３５】
組換え抗体を生成するためのさらに別の効率の高い手段は、ニューマン（Newman）、Biotechnology, 10: 1455-1460 (1992)に開示されている。特に、この技術により、サル可変ドメインとヒト定常配列とを含有する霊長類化抗体が生成される。この文献は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。さらにこの技術はまた、本本出願人による米国特許第５，６５８，５７０号、５，６９３，７８０号、および５，７５６，０９６号に記載されている（これらはそれぞれ、参照することにより本明細書に組み込まれる）。
【００３６】
本明細書から明らかなように、本発明の修飾抗体を産生するのに有用な遺伝子配列は、多くの異なる供給源から得られる。例えば、上記したように、多様なヒト抗体遺伝子が、公に利用可能な寄託物の形で利用可能である。抗体と抗体をコードする遺伝子の多くの配列が公表されており、大体上記したように、これらの配列から適当な抗体遺伝子を合成することができる。あるいは、抗体産生細胞株を選択し、当業者に公知の方法を使用して培養してもよい。そのような方法は、種々の実験室マニュアルや１次刊行物に記載されている。この点で、後述の本発明での使用に適した技術は、「免疫学の現代のプロトコール（Current Protocols in Immunology）」、コリガン（Coligan）ら編、グリーンパブリシングアソーシエーツアンッドウィリーインターサイエンス（Green Publishing Associates and Wiley-Interscience）、ジョンワイリーアンドサンズ（John Wiley and Sons）、ニューヨーク（１９９１年）（これは、その増刊を含めて、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【００３７】
本発明の範囲は、本明細書に記載のＤＮＡ配列のすべての対立遺伝子、変種および変異体を包含することも、理解されるであろう。
【００３８】
公知のように、ＲＮＡは、ハイブリドーマ細胞または他の形質転換細胞から標準的方法（例えば、グアニジニウムイソシアネート抽出物、および次の遠心分離またはクロマトグラフィー）により単離される。所望であれば、総ＲＮＡから標準的方法（例えば、オリゴｄＴセルロース上のクロマトグラフィー）により、ｍＲＮＡが単離される。これらの目的に適した技術は、当該分野で公知であり、前記文献に記載されている。
【００３９】
逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを公知の方法に従って使用して、抗体の軽鎖と重鎖とをコードするｃＤＮＡが、同時または別々に作成される。これは、公表された重鎖と軽鎖ＤＮＡおよびアミノ酸配列に基づき、共通の定常領域プライマーまたはより特異的プライマーにより開始される。上記したように、ＰＣＲはまた、抗体軽鎖と重鎖をコードするＤＮＡクローンを単離するのに使用される。この場合、共通のプライマーまたはより大きな相同的プローブ（例えば、マウス定常領域プローブ）により、ライブラリーがスクリーニングされる。
【００４０】
ＤＮＡ（典型的には、プラスミドＤＮＡ）は、組換えＤＮＡ技術に関する前記文献に詳述される標準的な公知の方法に従って、上記した細胞から単離され、制限マッピングされ、配列決定される。もちろんＤＮＡは、単離法の任意の時点または以後の分析で、本発明に従って修飾される。
【００４１】
好適な抗体配列は、本明細書に開示される。本発明のこの態様に適合するオリゴヌクレオチド合成は、当業者に公知であり、いくつかの市販の自動合成機の任意のものを使用して行われる。さらに、本明細書に記載の重鎖および軽鎖のいくつかの型をコードするＤＮＡ配列は、市販のＤＮＡ合成ベクターを利用して、得ることができる。前記の任意の方法を使用して得られた遺伝子物質は、次に改変または修飾されて、本発明に適合する抗体を提供する。
【００４２】
本発明に従って、種々の異なる型の抗体が得られかつ修飾されるが、本発明の修飾抗体は、多くの共通の形質を共有する。このために、用語「免疫グロブリン」は、関連する特異的免疫反応性の有無には無関係に、テトラマー（２つの重鎖と２つの軽鎖）またはその凝集体を意味する。「抗体」とは、抗原（例えば、腫瘍関連抗原）に対する顕著な公知の特異的免疫反応活性を有し、その間の共有結合有りまたは無しで軽鎖と重鎖を含む、集団である。上記したように、本発明の「修飾抗体」は、１つ以上の定常領域ドメインの少なくとも一部が、欠失しているかまたは改変されていて、ほぼ同じ免疫原性を有する全、非改変抗体と比較した時、所望の生化学的特徴（例えば、腫瘍局在化の上昇または血清半減期の低下）を提供する、抗体、またはその免疫反応性断片もしくは組み換え体を意味する。本発明の目的において、改変されたまたは欠失された定常領域ドメインを有する免疫反応性１本鎖抗体構築体は、修飾抗体と見なされる。上記したように、本発明の好適な修飾抗体は、ある定常ドメインの少なくとも一部が欠失している。さらに好ましくは、修飾抗体の定常領域のあるドメイン全体が欠失されて、さらに好ましくは全ＣH２ドメインが欠失される。
【００４３】
脊椎動物系の基本的な免疫グロブリン構造は、比較的よく理解されている。後に詳述されるように、「免疫グロブリン」という総称は、生化学的に区別することができる５つのクラスの抗体を含む。５つのすべてのクラスは、明らかに本発明の範囲内であるが、以下の考察は、ＩｇＧ分子のクラスに関する。ＩｇＧについては、免疫グロブリンは、分子量が約２３，０００ダルトンの２つの同一の軽ポリペプチド鎖と、分子量が約５３，０００〜７０，０００ダルトンの２つの同一の重鎖からなる。この４つの鎖は、「Ｙ」配置でジスルフィド結合により連結され、軽鎖は、「Ｙ」の口の部分から重鎖と一緒になって可変領域まで続いている。
【００４４】
さらに詳しくは、軽鎖と重鎖の両方とも、構造と機能が類似した領域に分けられる。「定常」と「可変」という用語は、機能的に使用される。この意味で、軽鎖（ＶL）と重鎖（ＶH）の可変ドメインは、抗原認識と特異性を決定すると理解される。逆に、軽鎖（ＣL）と重鎖（ＣH１、ＣH２またはＣH３）の可変ドメインは、分泌、経胎盤移動性、Ｆｃ受容体結合、補体結合などの生理学的性質を付与する。慣習的に、定常領域ドメインは、抗体の抗原結合部位またはアミノ末端から離れるに従ってその数は増加する。すなわち、ＣH３とＣLドメインは実際、それぞれ重鎖と軽鎖のカルボキシ末端を含む。
【００４５】
軽鎖は、カッパまたはラムダ（κ、λ）として分類される。各重鎖クラスは、カッパまたはラムダ軽鎖が結合する。一般に軽鎖と重鎖は、互いに共有結合し、２つの重鎖の「テイル」部分は、免疫グロブリンが、ハイブリドーマ、Ｂ細胞または遺伝子操作した宿主細胞により生成される時、互いにジスルフィド結合でつながる。しかし鎖の非共有結合が正しい形で行われると、非ジスルフィド結合した鎖の凝集体は、まだ抗原と反応することができる。重鎖では、アミノ酸配列は、Ｙ配置の分岐末端のＮ末端から、各鎖の下のＣ末端まで続く。Ｎ末端は可変領域であり、Ｃ末端は定常領域である。当業者は、重鎖が、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）に分類され、それぞれにサブクラスがあることを、理解しているであろう。この鎖の性質が、抗体の「クラス」をＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭとして決定する。免疫グロブリンサブクラス（イソタイプ）（例えばＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4、ＩｇＡ1など）は、充分性状解析されており、機能的特殊性を付与することが知られている。当業者は、これらのクラスおよびイソタイプのそれぞれの修飾体を、本開示から容易に区別でき、従って、これらは本発明の範囲内である。
【００４６】
上記したように、可変領域は、抗体が、免疫反応性抗原上のエピトープを認識し特異的に結合することを可能にする。すなわち、抗体のＶLドメインとＶHドメインは一緒になって、可変領域を形成し、３次元の抗原結合部位を規定する。この４要素からなる構造は、Ｙの各アームの末端に存在する抗原結合部位を提供する。さらに詳しくは、抗原結合部位は、ＶHとＶL鎖のそれぞれの上の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）により規定される。
【００４７】
６つのＣＤＲは、抗体が、水性環境でその３次元構造を取るとき、抗原結合部位を形成するように特異的に位置したアミノ酸の短い非連続的配列である。重鎖と軽鎖可変ドメインの残りは、アミノ酸配列の分子間変動が小さく、フレームワーク領域と呼ばれる。フレームワーク領域は、主にβシートコンフォメーションを取り、ＣＤＲは、βシート構造を連結、またはある場合にはその一部を形成するループを形成する。すなわち、これらのフレームワーク領域は、６つのＣＤＲが鎖間の非共有結合的相互作用により正しい配置で位置させる足場を形成するように作用する。いずれにしても、配置されたＣＤＲにより形成される抗原結合部位は、免疫反応性抗原上のエピトープに相補的な表面を規定する。この相補的な表面が、免疫反応性抗原エピトープへの抗体の非共有結合を促進する。
【００４８】
本発明の目的において、開示された修飾抗体は、抗体と選択された腫瘍関連抗原との結合を提供する任意のタイプの可変領域を含有してもよいことは理解されたい。この点で、可変領域は、体液性応答を開始し、所望の腫瘍関連抗原に対する免疫グロブリンを生成するように誘導することができる任意の型の哺乳動物を含むか、またはこれから誘導される。従って、修飾抗体の可変領域は、例えば、ヒト、ネズミ、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル、マカークザルなど）またはオオカミ起源でもよい。特に好適な実施態様において、修飾免疫グロブリンの可変領域と定常領域は、ヒトである。他の選択された実施態様において、適合性のある抗体（通常、非ヒト起源から得られる）の可変領域は、分子の結合性を改良するかまたは免疫原性を低下させるように、操作されるかまたは特異的に修飾される。この点で、本発明に有用な可変領域は、ヒト化されるか、または取り込んだアミノ酸配列を含めることにより改変される。
【００４９】
「ヒト化抗体」とは、親抗体の抗原結合性を保持するかまたは実質的に保持するが、ヒトでの免疫原性のより小さい、非ヒト起源、典型的にはネズミ抗体から誘導される抗体である。これは、（ａ）全非ヒト可変ドメインをヒト定常領域に移植して、キメラ抗体を生成する；（ｂ）１つ以上の非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも一部を、ヒトフレームワークと、決定的に重要なフレームワーク残基が有るかもしくは無い定常領域とに移植する；または（ｃ）全非ヒト可変ドメインを移植するが、これらを、表面残基を置換することによりヒト様の部分で「おおう」、を含む種々の方法により行われる。そのような方法は、モリソン（Morrison）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 6851-5 (1984)；モリソン（Morrison）ら、Adv. Immunol. 44: 65-92 (1988)；ベルホーエン（Verhoeyen）ら、Science 239: 1534-1536 (1988)；パドラン（Padlan）、Molec Immun. 28: 489-498 (1991)；パドラン（Padlan）、Molec Immun. 31: 169-217 (1994) および米国特許第５，５８５，０８９号、５，６９３，７６１号および５，６９３，７６２号（これらはすべて、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【００５０】
当業者は、上記選択肢（ａ）に記載の方法が「古典的」キメラ抗体を産生することを理解するであろう。本出願の意味において、用語「キメラ抗体」は、免疫反応性領域または部位が、第１の種から得られるかまたは誘導され、定常領域（これは、完全、部分的、または本発明に従って修飾されている）が第２の種から得られる抗体を意味する。好適な実施態様において抗原結合領域または部位は、非ヒト起源（例えばマウス）であり、定常領域はヒトである。可変領域の免疫原性特異性は、一般にその起源により影響を受けず、ヒト定常領域は、非ヒト起源の定常領域より、ヒト被験体から免疫応答を誘発する可能性は小さい。
【００５１】
好ましくは、重鎖と軽鎖の両方の可変ドメインは、１つ以上のＣＤＲの少なくとも一部の置換により改変され、必要であれば、部分的フレームワーク領域の置換と配列変化により改変される。ＣＤＲは、フレームワーク領域が誘導される抗体と同じクラスまたはさらにはサブクラスの抗体から誘導されるが、ＣＤＲは、異なるクラスの抗体、好ましくは異なる種の抗体から誘導されることも企図される。１つの可変ドメインの結合能力を他のドメインに移すのに、供与体可変領域からの完全なＣＤＲで、ＣＤＲのすべてを置換する必要は無いことを協調したい。むしろ、抗原結合部位の活性を維持するのに必要な残基のみを移動することが必要なだけである。米国特許第５，５８５，０８９号、５，６９３，７６１号および５，６９３，７６２号の説明から、ルーチンの実験を行うか、または試行錯誤の試験により、免疫原性の低下した機能性抗体を得ることは、当業者の能力の範囲内であろう。
【００５２】
可変領域の改変にもかかわらず、本発明の修飾抗体は、完全なまたは非改変定常領域を含むほぼ同じ免疫原性の抗体と比較した時、所望の生化学的特徴（例えば、腫瘍局在化の上昇、または血清半減期の低下）を与えるように、１つ以上の定常領域ドメインの少なくとも一部が欠失しているか、または改変されている、抗体またはその免疫反応性断片を含むことを、当業者は理解するであろう。好適な実施態様において、修飾抗体の定常領域は、ヒト定常領域を含む。本発明に適合する定常領域の修飾には、１つ以上のドメイン中の１つ以上のアミノ酸の付加、欠失または置換がある。すなわち、本明細書に開示の修飾抗体は、３つの重鎖定常ドメイン（ＣH１、ＣH２またはＣH３）および／または軽鎖定常ドメイン（ＣL）の１つ以上の改変または修飾を含む。後に詳述され、例で証明されるように、本発明の好適な実施態様は、１つ以上のドメインが部分的または完全に欠失した修飾定常領域を含む。特に好適な実施態様において、修飾抗体は、完全なＣH２ドメインが除去されているドメイン欠失構築体または変種（ΔＣH２構築体）を含む。さらに別の好適な実施態様において、除去された定常領域ドメインは、典型的には存在しない定常領域により付与される分子可撓性の一部を提供する短いアミノ酸スペーサー（例えば、１０残基）により置換される。
【００５３】
上記したように、種々の免疫グロブリンクラスの定常領域のサブユニット構造と３次元配置は、よく知られている。例えば、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のＣH２ドメインは、通常の番号付け法を使用すると、ほぼ残基２３１から残基３４０まで伸長する。ＣH２ドメインは、他のドメインと密接に対合しない点でユニークである。むしろ、２つのＮ結合分岐炭水化物鎖が、完全な未変性のＩｇＧ分子の２つのＣH２ドメインの間に配置される。ＣH３ドメインは、ＩｇＧ分子のＣH２ドメインからＣ末端まで伸長し、約１０８残基を含み、一方ＩｇＧ分子のヒンジ領域は、ＣH２ドメインとＣH１ドメインと連結させることは、充分記録されている。このヒンジ領域は、２５残基の大きさを含有し、可撓性であり、従って２つのＮ末端抗原結合領域が独立に動くことを可能にする。
【００５４】
これらの配置以外に、定常領域はいくつかのエフェクター機能を仲介することが、当該分野で公知である。例えば、補体のＣ１成分の抗体への結合は、補体系を活性化する。補体の活性化は、細胞病原体のオプソニン作用と溶解で重要である。補体の活性化はまた、炎症応答をシニュレートし、また自己免疫過敏症に関与することもある。さらに、抗体はＦｃ領域を介して細胞に結合し、抗体Ｆｃ領域上のＦｃ受容体部位が細胞上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合する。異なるクラスの抗体に特異的な多くのＦｃ受容体があり、ＩｇＧ（ガンマ受容体）、ＩｇＥ（エータ受容体）、ＩｇＡ（アルファ受容体）およびＩｇＭ（ミュー受容体）。細胞表面上のＦｃ受容体への抗体の結合は、多くの重要かつ多様な生理学的応答（抗体被覆粒子の抱き込みと破壊、免疫複合体のクリアランス、キラー細胞による抗体被覆標的細胞の溶解（抗体依存性細胞障害と呼ばれる、ＡＤＣＣ）、炎症性メディエーターの放出、胎盤移動、免疫グロブリン産生の制御を含む）を開始させる。種々のＦｃ受容体と受容体部位が、ある程度研究されているが、その位置、構造および機能について不明な点がまだ多い。
【００５５】
本発明の範囲を限定しないが、上記したように定常領域が修飾された抗体は、改変エフェクター機能を提供し、次にこれが、投与された抗体の生物学的プロフィールに影響を与える。例えば、定常領域ドメインの欠失または不活性化（点突然変異または他の手段により）は、循環している修飾抗体のＦｃ受容体結合を低下させ、こうして腫瘍局在化を上昇させることがある。他の場合には、本発明に一致する定常領域の修飾は、補体結合を低下させ、こうして、結合細胞毒素の血清半減期と非特異結合を短縮することがある。さらに別の定常領域の修飾は、上昇した抗原特異性または抗体可撓性のために、局在化の増強を可能にするジスルフィド結合またはオリゴ糖部分を排除するのに使用される。さらに一般的には、上記したように修飾された抗体は、認識できるかまたはできない多くの小さな作用を示すことがあることを、当業者は理解するであろう。しかし、後の例で証明するように、修飾の生じる生理学的プロフィール、バイオベイラビリティおよび他の生化学的効果（例えば、腫瘍局在化と血清半減期）は、過度の実験をすることなく公知の免疫法を使用して、容易に測定し定量することができる。
【００５６】
同様に、本発明に従う定常領域の修飾は、当業者の技術範囲内で、公知の生化学的または分子的操作法を使用して、容易に作成される。この点で、本明細書の請求の範囲は、本発明に従って定常領域が修飾された種々の構築体を提供する。さらに詳しくは、例示された構築体は、ＣH２ドメインを欠失させるように操作されたヒト定常領域を有するキメラおよびヒト化抗体を含む。当業者は、そのような構築体が、抗体の異化速度に対するＣH２ドメインの制御性のために、特に好ましいことを理解するであろう。
【００５７】
例と図に記載のΔＣH２ドメインが欠失された抗体は、ＣＤ２０汎Ｂ細胞抗原に免疫特異的なキメラＣ２Ｂ８抗体、およびＴＡＧ７２抗原に特異的なヒト化ＣＣ４９抗体から誘導される。より詳細に後述されるように、両方のドメイン欠失構築体は、ＩｇＧ１ヒト定常ドメインをコードする専用のベクター（アイディーイーシー・ファーマシューチカルズ(IDEC Pharmaceuticals）、サンジエゴ）から誘導された。基本的に、ＣH２ドメインを欠失させ、ドメイン欠失ＩｇＧ１定常領域を発現する修飾ベクターを提供するように、ベクターを操作した。Ｃ２Ｂ８抗体のネズミ可変領域またはヒト化ＣＣ４９抗体の可変領域をコードする遺伝子を、次に修飾ベクターに挿入し、クローン化した。形質転換細胞中で発現させると、これらのベクターは、それぞれｈｕｃＣＣ４９．ΔＣH２またはＣ２Ｂ８．ΔＣH２を与えた。本明細書に例示するように、これらの構築体は、多くの性質を示し、これらは、骨髄抑制した癌患者または骨髄抑制の可能性のある補助療法を受けている癌患者で使用される特に魅力的な候補とする。
【００５８】
前記構築体の例は、ＣH３ドメインを直接、各修飾抗体のヒンジ領域に融合するように作成した。他の構築体においては、ヒンジ領域と修飾されたＣH２および／またはＣH３ドメインとの間にペプチドスペーサーを提供することが好ましい。例えば、ＣH２ドメインが欠失されており、残りのＣH３ドメイン（修飾または非修飾）が５〜２０個のアミノ酸スペーサーを用いてヒンジ領域に連結している、適合性のある構築体を発現できるであろう。この点で、１つの好適なスペーサーは、アミノ酸配列ＩＧＫＴＩＳＫＫＡＫ（配列ＩＤ  Ｎｏ．１）を有する。例えば、定常ドメインの制御要素が遊離で利用可能であり、ヒンジ領域が可撓性があることを確実にするために、そのようなスペーサーが加えられる。しかし、アミノ酸スペーサーは、ある場合には、免疫原性であり、構築体に対して好ましくない免疫応答を誘発するかも知れないことに注意されたい。従って、修飾抗体の所望の生化学的性質を維持したいなら、構築体に加えられるスペーサーは、比較的非免疫原性であるか、または、さらに好ましくはまったく存在しないことが好ましい。
【００５９】
全定常領域ドメインの欠失以外に、本発明の抗体は、いくつかのまたは１つのアミノ酸の部分的欠失または置換により提供されることは理解されるであろう。例えば、ＣH２ドメインの選択された領域中の単一のアミノ酸の突然変異は、Ｆｃ結合を実質的に低下させるのに充分であり、従って腫瘍局在化を上昇させ得る。同様に、調節すべきエフェクター機能（例えば、補体ＣＬＱ結合）を制御する１つ以上の定常領域ドメインの一部だけを欠失させることが好ましいかも知れない。そのような定常領域の部分的欠失は、抗体の選択された特徴（血清半減期）を改良する一方、対象の定常領域ドメインに関連する他の好ましい機能をそのまま残すことができる。さらに上記したように、開示された抗体の定常領域は、生じる構築体のプロフィールを増強する１つ以上のアミノ酸の突然変異または置換により修飾される。この点で、保存された結合部位により提供される活性（例えば、Ｆｃ結合）を実質的に破壊しながら、修飾抗体の構造と免疫原性プロフィールを実質的に維持することが可能である。さらに別の好適な実施態様は、好ましい特徴（例えば、エフェクター機能）を増強するために、またはより多くの細胞毒素または炭水化物結合を提供するために、定常領域に１つ以上のアミノ酸を付加する。そのような実施態様において、選択された定常領域ドメインから誘導される特異配列を挿入または複製することが好ましい。
【００６０】
上記した修飾抗体を提供するために、単離された遺伝子物質を操作した後、遺伝子を典型的には発現ベクターに挿入して宿主細胞中に導入し、これを使用して所望量の修飾抗体を産生する。
【００６１】
「ベクター」または「発現ベクター」という用語は、本明細書において明細書と特許請求の範囲のために使用され、細胞中に所望の遺伝子を導入しそこで発現するためのビヒクルとして、本発明に従って使用されるベクターを意味する。当業者に公知のように、そのようなベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルスおよびレトロウイルスよりなる群から容易に選択される。一般に、本発明に適合するベクターは、所望の遺伝子のクローニングを促進するための選択性マーカー、適切な制限部位を含み、真核細胞または原核細胞に入るかおよび／またはそこで複製するための能力を有する。
【００６２】
本発明の目的において、無数の発現ベクター系が使用される。例えば、あるクラスのベクターは、動物ウイルス、例えばウシ乳頭腫ウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶまたはＭＯＭＬＶ）またはＳＶ４０ウイルスから誘導されるＤＮＡ要素を利用する。他のものは、内部リボゾーム結合部位を有するポリシストロン系を使用する。さらに、その染色体中にＤＮＡを組み込んだ細胞は、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にする１つ以上のマーカーを導入することにより選択される。マーカーは、原栄養性、殺生物剤耐性（例えば、抗生物質）または銅のような重金属に対する耐性を提供する。選択マーカー遺伝子は、発現すべきＤＮＡ配列に直接連結することができるか、または同時形質転換により同じ細胞に導入することができる。ｍＲＮＡの最適合成のために、追加の要素も必要である。これらの要素には、スプライスシグナル、ならびに転写プロモーター、エンハンサー、および停止シグナルがある。
【００６３】
特に好適な実施態様では、クローン化された可変領域遺伝子は、上記したように修飾された重鎖および軽鎖定常領域遺伝子（好ましくはヒト）とともに、発現ベクター中に挿入される。好ましくはこれは、アイディーイーシー社（IDEC Inc.）の専用の発現ベクター（ネオスプラ（NEOSPLA）と呼ぶ）を使用して行われる。このベクターは、サイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサー、マウスベータグロビン主要プロモーター、ＳＶ４０複製開始点、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼエキソン１とエキソン２、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、およびリーダー配列を含有する。以下の例で見られるように、このベクターは、可変領域と定常領域遺伝子の取り込み、ＣＨＯ細胞中のトランスフェクション、次にＧ４１８含有培地中の選択、およびメソトレキセート増幅により、抗体の非常に高レベルの発現を引き起こすことがわかった。このベクター系は、本出願人による米国特許第５，７３６，１３７号および５，６５８，５７０号（それぞれ、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に、実質的に開示されている。この系は、高い発現レベル（すなわち、＞３０pg/細胞/日）を与える。
【００６４】
他の好適な実施態様において、本発明の修飾抗体は、同時係属米国仮出願第６０／３３１，４８１号（２００１年１１月１６日出願）（参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されているようにポリシストロン構築体を使用して発現される。これらの新規発現系において、抗体の重鎖と軽鎖のような目的の複数の遺伝子産物が、単一のポリシストロン構築体から産生される。これらの系は、内部リボゾーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を有利に使用して、真核生物宿主細胞中で比較的高レベルの修飾抗体を提供する。適合性のあるＩＲＥＳ配列が、米国特許第６，１９３，９８０号に開示されている（これも、参照することにより本明細書に組み込まれる）。そのような発現系が、本出願に開示された完全な範囲の修飾抗体を有効に産生するのに使用されることを、当業者は理解するであろう。
【００６５】
より一般的には、修飾抗体を含有するベクターまたはＤＮＡ配列がいったん調製されると、発現ベクターが適切な宿主細胞に導入される。すなわち、宿主細胞が形質転換される。宿主細胞へのプラスミドの導入は、当業者に公知の種々の方法により行われる。これらには、特に限定されないが、トランスフェクション（電気泳動と電気穿孔法を含む）、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、エンベロープのあるＤＮＡとの細胞融合がある。リッジウェイ（Ridgway, A.A.G.）「哺乳動物発現ベクター」（"Mammalian Expression Vectors"）第２４．２章、４７０〜４７２頁、ベクター（Vectors）、ロドリゲス（Rodriguez）とデンハルト（Denhardt）編（バターワース（Butterworths）、ボストン、マサチューセッツ州、１９８８年）を参照されたい。さらに好ましくは、宿主へのプラスミド導入は、電気穿孔法により行われる。形質転換された細胞は、軽鎖と重鎖の産生に適した条件下で増殖され、重鎖および／または軽鎖タンパク質合成系について測定される。測定法の例には、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫定量法（ＲＩＡ）、または蛍光活性化細胞ソーター解析（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学などがある。
【００６６】
本明細書において「形質転換」という用語は、広い意味で、受容体宿主細胞へのＤＮＡの導入を意味し、これは、遺伝子型を変化させ、従って受容体細胞を変化させる。
【００６７】
同じ線に沿って「宿主細胞」は、組換えＤＮＡ技術を使用して構築され、少なくとも１つの異種遺伝子を含有するベクターで形質転換した細胞を意味する。本明細書で規定されたように、宿主細胞により産生される抗体またはその修飾体は、この形質転換による。組換え宿主からの抗体の単離法の説明において、「細胞」および「細胞培養物」という用語は、特に明記しない場合は、抗体の起源を意味するのに同義で使用される。すなわち、「細胞」からの抗体の回収は、全細胞を遠心分離するか、または培地と懸濁された細胞とを含有する細胞培養物から得られることを意味する。
【００６８】
タンパク質発現に使用される宿主細胞株は、好ましくは哺乳動物起源である。発現すべき所望の遺伝子産物に最も適した特定の宿主細胞株を選択的に決定する能力を、当業者は有するであろう。宿主細胞株の例には、特に限定されないが、ＤＧ４４とＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣細胞株、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頚癌）、ＣＶＩ（サル腎臓株）、ＣＯＳ（ＳＶ４０  Ｔ抗原を有するＣＶＩの誘導体）、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター繊維芽細胞）、ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス繊維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓株）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、Ｐ３×６３−Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ−１ｃｌＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪ１（ヒトリンパ球）および２９３（ヒト腎臓）がある。ＣＨＯ細胞が、特に好ましい。宿主細胞株は典型的には、販売業者、アメリカンタイプカルチャーコレクション、または公表文献から入手できる。
【００６９】
インビトロ製造は、スケールアップを可能にして、大量の所望の抗体を与える。組織培養条件下での哺乳動物細胞培養法は、当該分野で公知であり、例えばエアリフト反応槽または連続攪拌反応槽中の均一懸濁培養、または中空繊維、マイクロカプセル中、アガロースマイクロビーズまたはセラミックカートリッジ上での固定化もしくは捕捉細胞培養がある。修飾抗体の単離のためには、培養上清中の免疫グロブリンが、硫酸アンモニウムによる沈殿、吸湿性材料（例えば、ＰＥＧ）で透析、選択性膜による濾過などにより、まず濃縮される。必要であればおよび／または所望であれば、濃縮された抗体は、通常のクロマトグラフィー法、例えばゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥセルロースのクロマトグラフィー、または（免疫）親和性クロマトグラフィーにより精製される。
【００７０】
修飾された免疫グロブリン遺伝子はまた、細菌または酵母のような非哺乳動物細胞で発現される。この意味で、細菌のような種々の単細胞非哺乳動物微生物（培養物または発酵で増殖することができるもの）も形質転換することができることは理解されるであろう。形質転換を受けやすい細菌には、例えば大腸菌（Escherichia coli）のような腸内細菌科、サルモネラ菌、枯草菌（Bacillus subtilis）のようなバチルス（Bacillus）科、肺炎球菌、連鎖球菌、インフルエンザ菌のメンバーがある。さらに、細菌で発現されると、免疫グロブリン重鎖と軽鎖は典型的には、封入体の一部になることを理解されたい。次に鎖は、単離され、精製され、次に組み立てられて機能性免疫グロブリン分子になる。
【００７１】
原核生物以外に、真核性微生物も使用される。サッカロミセスセレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）またはパン酵母は、真核性微生物の中では最も一般的に使用されるが、他の多くの株も入手できる。サッカロミセス（Saccharomyces）中での発現のために、例えばプラスミドＹＲｐ７（スティンクコーム（Stinchcomb）ら、Nature 282: 39 (1979)；キングスマン（Kingsman）ら、Gene 7: 141 (1979)；チェンパー（Tschemper）ら、Gene 10: 157 (1980)）が一般的に使用される。このプラスミドはすでに、ｔｒｐｌ遺伝子を含有し、これは、トリプトファン中で増殖する能力が欠如した酵母の変異株の選択マーカーを提供し、例えばＡＴＣＣ  No.４４０７６またはＰＥＰ４−１がある（ジョーンズ（Jones）、Genetics 85: 12 (1977)）。酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのｔｒｐｌ病変の存在は、トリプトファンの非存在下での増殖により形質転換を検出するための有効な環境を提供する。
【００７２】
いかに臨床的に有用な性質が得られるかに関係無く、本発明の修飾抗体は、多くの結合型（すなわち、免疫結合体）または非結合型の任意の型で使用される。特に本発明の抗体は、細胞毒素（例えば、ラジオアイソトープ、治療薬、静細胞薬、生物学的毒素またはプロドラッグ）に結合される。あるいは本発明の修飾抗体は、非結合または「裸」型で使用されて、被験体の自然の防御機構（補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ））を利用して悪性腫瘍細胞を排除する。特に好適な実施態様において、修飾抗体は、多くの公知のキレート剤または直接標識物により、ラジオアイソトープ、例えば90Ｙ、125Ｉ、131Ｉ、123Ｉ、111Ｉｎ、105Ｒｈ、153Ｓｍ、67Ｃｕ、67Ｇａ、166Ｈｏ、177Ｌｕ、186Ｒｅおよび188Ｒｅに結合される。他の実施態様において、開示された組成物は、薬剤、プロドラッグまたは生物学的応答調節物質（例えば、メソトレキセート、アドリアマイシン）およびリンホカイン（例えば、インターフェロン）に結合される。本発明のさらに別の実施態様は、特異的生物毒素（例えば、リシンまたはジフテリア毒素）に結合した修飾抗体の使用を含む。さらに他の実施態様において、修飾抗体は、他の免疫活性リガンド（例えば、抗体またはその断片）と複合体を形成し、ここで、生じる分子は、新生物細胞とエフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の両方に結合する。結合または非結合修飾抗体のいずれを使用するかの選択は、癌のタイプとステージ、補助療法（例えば、化学療法または外部放射線照射）の使用、および患者の状態に依存する。当業者は、本明細書の教示によりそのような選択を容易に行うことができるであろう。
【００７３】
本明細書において「細胞毒素または細胞障害剤」とは、細胞の増加や増殖に有害であり、これに暴露された時、悪性腫瘍を縮小、阻害または破壊する任意の物質を意味する。細胞毒素の例には、特に限定されないが、生物毒素、静細胞性または細胞毒性治療薬、プロドラッグ、免疫活性リガンドおよび生物学的応答調節物質（例えば、サイトカイン）がある。後に詳述されるように、放射性核種細胞毒素が、本発明での使用に特に好ましい。しかし、悪性腫瘍細胞の増殖を遅延または遅くするように作用するか、または悪性腫瘍細胞を排除しかつ本明細書に開示された修飾抗体と関連している細胞毒素は、本発明の範囲内にある。
【００７４】
アイソトープで標識された抗腫瘍抗体は、動物モデルの、およびある場合はヒトの、固形腫瘍ならびにリンパ腫／白血病の細胞を破壊するために使用して成功していることを理解されたい。放射性核種は、イオン化放射線照射を作りだすことにより作用し、これは、核ＤＮＡ中の複数の鎖の切断を引き起こして、細胞死滅に至る。治療用結合体を産生するのに使用されるアイソトープは、典型的には治療上有効な経路長を有する高エネルギーのα−、γ−、またはβ−粒子を産生する。そのような放射性核種は、近傍にある細胞（例えば、結合体が結合したかまたは入った新生物細胞）を死滅させる。これらは一般に、非局在化細胞に対しては、ほとんどまたは全く効果が無い。放射性核種は、基本的に非免疫原性である。
【００７５】
本発明の放射能標識結合体の使用に関して、修飾抗体は、直接標識（例えば、ヨード化により）されるか、またはキレート剤を使用して間接的に標識される。本明細書において、「間接標識」および「間接標識法」という用語は、キレート剤が抗体に共有結合して、少なくとも１つの放射性核種がキレート剤と結合していることを意味する。そのようなキレート剤は、ポリペプチドとラジオアイソトープの両方に結合するため、典型的には２官能性キレート剤と呼ばれる。特に好適なキレート剤は、１−イソチオシアネートベンジル−３−メチルジオテレントリアミン５酢酸（「ＭＸ−ＤＴＰＡ」）およびシクロヘキシルジエチレントリアミン５酢酸（「ＣＨＸ−ＤＴＰＡ」）誘導体を含む。他のキレート剤は、Ｐ−ＤＯＴＡとＥＤＴＡ誘導体を含む。間接標識のための特に好適な放射性核種は、111Ｉｎと90Ｙを含む。
【００７６】
本明細書において「直接標識」および「直接標識法」という用語は両方とも、放射性核種が抗体に直接共有結合（典型的には、アミノ酸残基を介して）していることを意味する。さらに詳しくは、これらの結合法には、ランダム標識および部位特異的標識がある。後者の場合、標識は、ダイマーまたはテトラマー上の特定の部位、例えば結合体のＦｃ部分上にのみ存在するＮ結合糖残基で行われる。さらに、種々の標識法やプロトコールが、本発明に適合する。例えば、テクネチウム−９９ｍ標識抗体は、リガンド交換法により、パーテクネート（ＴｃＯ4-）を第一スズイオン溶液で還元し、還元されたテクネチウムとセファロースカラムにキレート結合させ、そしてこのカラムに抗体を適用するか、またはバッチ標識法により、例えば、パーテクネート、ＳｎＣｌ2のような還元剤、緩衝液（例えば、ナトリウム−カリウムフタレート溶液）、および抗体をインキュベートすることにより、調製される。いずれにしても、抗体を直接標識するための好適な放射性核種は、当該分野で公知であり、直接標識のための特に好適な放射性核種は、チロシン残基で共有結合した131Ｉである。本発明の修飾抗体は、例えば放射性ヨウ化ナトリウムまたはカリウムおよび化学酸化剤（例えば、次亜塩素酸ナトリウム、クロラミンＴなど）または酵素的酸化剤（例えば、ラクトペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ）およびグルコースを用いて、誘導される。しかし本発明の目的において、間接標識法が特に好ましい。
【００７７】
キレート剤およびキレート剤結合体に関する特許は、当該分野で公知である。例えば、ガンソウ（Gansow）の米国特許第４，８３１，１７５号は、ポリ置換ジエチレントリアミン５酢酸キレート剤、およびこれを含有するタンパク質結合体、およびこれらの調製法に関する。ガンソウ（Gansow）の米国特許第５，０９９，０６９号、５，２４６，６９２号、５，２８６，８５０号、５，４３４，２８７号、および５，１２４，４７１号もまた、ポリ置換ＤＴＰＡキレート剤に関する。これらの特許は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。適合性のある金属キレート剤の他の例は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン５酢酸（ＤＴＰＡ）、１，４，８，１１−テトラアザテトラデカン、１，４，８，１１−テトラアザテトラデカン−１，４，８，１１−四酢酸、１−オキサ−４，７，１２，１５−テトラアザヘプタデカン−４，７，１２，１５−四酢酸などである。シクロヘキシル−ＤＥＰＡまたはＣＨＸ−ＤＴＰＡは特に好ましく、後に広範に例示される。さらに別の適合性あるキレート剤（まだ発見されていないものを含む）は、当業者により容易に区別され、明らかに本発明の範囲内にある。
【００７８】
適合性あるキレート剤（同時係属出願第０８／４７５，８１３号、０８／４７５，８１５号、０８／４７８，９６７号のキレート化を促進するのに使用される特異的２官能性キレート剤を含む）は好ましくは、３価金属に対して高親和性を与え、腫瘍対非腫瘍比の上昇を示し、骨取り込みの低下を示し、ならびに標的部位（すなわち、Ｂ細胞リンパ腫部位）での放射性核種のより大きなインビボ保持を示すように、選択される。しかし、これらのすべての特徴を含むかまたは含まない他の２官能キレート剤が、当該分野で公知であり、また腫瘍治療法で有用である。
【００７９】
また、本明細書の教示に従って、修飾抗体は、診断および治療目的で異なる放射能標識物に結合してもよいと理解される。このために、前記の同時係属出願（参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）は、治療用抗体の投与前に、腫瘍の診断「イメージング」のための放射能標識した治療用結合体を開示する。「Ｉｎ２Ｂ８」結合体は、ヒトＣＤ２０抗原に特異的なネズミモノクローナル抗体２Ｂ８を含む。これは、２官能性キレート剤、すなわちＭＸ−ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン５酢酸）を介して111Ｉｎに結合しており、これは、１−イソチオシアネートベンジル−３−メチル−ＤＴＰＡと１−メチル−３−１−イソチオシアネートベンジル−ＤＴＰＡの１：１混合物を含む。111Ｉｎは、毒性が検出されずに約１〜約１０mCiが安全に投与できるため、診断放射性核種として特に好ましい。イメージングデータは、一般に以後の90Ｙ標識抗体分布を予測させる。多くのイメージング研究は５mCiの111Ｉｎ標識抗体を使用し、これは、この投与量が、安全であり、低用量と比較してイメージング効率が上昇しており、最適なイメージングが、抗体投与の３〜６日後に起きるためである。例えば、ムレイ（Murray）、J. Nuc. Med. 26: 3328 (1985)およびカラギロ（Carraguillo）ら、J. Nuc. Med. 26: 67 (1985)を参照されたい。
【００８０】
上記したように、種々の放射性核種が本発明に適用可能であり、当業者は、種々の条件下でどの放射性核種が最も適切であるかを容易に決定する能力を有する。例えば、131Ｉは、標的化免疫療法で使用される公知の放射性核種である。しかし、131Ｉの臨床的有用性は、いくつかの要因により限定される：物理的半減期が８日間；血液と腫瘍部位の両方でヨード化抗体の脱ハロゲン化；および、腫瘍での局在化用量沈着にはあまり適していない発光特性（例えば、大きいガンマ成分）。優れたキレート剤の出現により、金属キレート基をタンパク質に結合させる機会は、他の放射性核種（例えば、111Ｉｎおよび90Ｙ）を利用する機会を増加させた。90Ｙは、放射免疫治療応用で利用するためのいくつかの長所を有する：90Ｙの半減期６４時間は、腫瘍による抗体蓄積を可能にするのに充分長い、および例えば131Ｉと異なり、90Ｙは、高エネルギーの純粋なベータエミッターであり、その崩壊でガンマ放射線を伴わず、組織中の範囲が１００〜１，０００細胞直径である。さらに、貫通性放射線の最少量は、90Ｙ標識抗体の通院投与を可能にする。さらに、細胞死滅に、標識抗体のインターナリゼーションは必要ではなく、イオン化放射線の局所的放出は、標的抗原が欠如した隣接腫瘍細胞にとって致死的である。
【００８１】
90Ｙ標識修飾抗体の有効な単回治療線量（すなわち、治療上有効量）は、約５〜約７５mCi、さらに好ましくは約１０〜約４０mCiである。131Ｉ標識抗体の有効な単回治療非骨髄アブレーティブ線量は、約５〜約７０mCi、さらに好ましくは約５〜約４０mCiである。131Ｉ標識抗体の有効な単回治療アブレーティブ線量（すなわち、自己骨髄移植を必要とすることがある）は、約３０〜約６００mCi、さらに好ましくは約５０〜約５００mCiである。キメラ抗体と組合せると、ネズミ抗体に対してより長い循環半減期のために、131Ｉ標識キメラ抗体の有効な単回治療非骨髄アブレーティブ線量は、約５〜約４０mCi、さらに好ましくは約３０mCi未満である。例えば111Ｉｎ標識物のイメージング基準は、典型的には約５mCi未満である。
【００８２】
131Ｉと90Ｙを用いて多量の臨床的経験が得られているが、他の放射能標識物は当該分野で公知であり、同様の目的に使用されている。さらに別のラジオアイソトープが、イメージングに使用されている。例えば、本発明の範囲に適合する追加のラジオアイソトープには、特に限定されないが、123Ｉ、125Ｉ、32Ｐ、57Ｃｏ、64Ｃｕ、67Ｃｕ、77Ｂｒ、81Ｒｂ、81Ｋｒ、87Ｓｒ、113Ｉｎ、127Ｃｓ、129Ｃｓ、132Ｉ、197Ｈｇ、203Ｐｂ、206Ｂｉ、177Ｌｕ、186Ｒｅ、212Ｐｂ、212Ｂｉ、47Ｓｃ、105Ｒｈ、109Ｐｄ、153Ｓｍ、188Ｒｅ、199Ａｕ、225Ａｃ、211Ａｔ、および213Ｂｉがある。この点で、ガンマおよびベータエミッターは、すべて本発明に適合する。さらに、本開示から、当業者は、過度の実験をすることなく、どの放射性核種が、選択された治療コースに適合するかを容易に決定できるであろう。このために、臨床診断ですでに使用されている追加の放射性核種には、125Ｉ、123Ｉ、99Ｔｃ、43Ｋ、52Ｆｅ、67Ｇａ、68Ｇａ、ならびに111Ｉｎがある。抗体もまた、標的化免疫療法で使用する可能性のために、多様な放射性核種で標識されてきた。ペイレルツ（Peirersz）ら、Immunol. Cell Biol. 65: 111-125 (1987)。これらの放射性核種には、188Ｒｅと186Ｒｅ、ならびに程度は小さいが199Ａｕと67Ｃｕがある。米国特許第５，４６０，７８５号は、そのようなラジオアイソトープに関する追加のデータを提供し、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００８３】
放射性核種以外に、本発明の修飾抗体は、多くの生物学的応答調節物質、薬剤、毒素、または免疫活性リガンドの任意の１つに、結合または会合されている。当業者は、選択された細胞毒素に依存して、多様な方法を使用して、これらの非放射性結合体を組み立てることができることを理解するであろう。例えば、ビオチンとの結合体は、例えば修飾抗体にビオチンの活性化エステル（例えば、ビオチンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）を反応させることにより調製される。同様に、蛍光マーカーとの結合体は、結合剤（例えば、上記したもの）の存在下で、またはイソチオシアネート（好ましくは、フルオレセインイソチオシアネート）との反応により調製される。静細胞／細胞毒性物質および金属キレート剤との本発明のキメラ抗体の結合体は、同様の方法で治療される。
【００８４】
本発明で使用される好適な物質は、細胞毒性薬、特に癌治療に使用されるものである。そのような薬剤には、一般に、静細胞剤、アルキル化剤、抗代謝物、抗増殖剤、チュブリン結合剤、ホルモン、およびホルモンアンタゴニストなどがある。本発明に適合する静細胞剤の例には、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、トリエチレンホスホラミド、シクロホスファミド、イフォスファミド、クロランブシル、ブスルファン、メルファラン、またはトリアジクオン）、またニトロソ尿素化合物（例えば、カルムスチン、ロムスチン、またはセムスチン）がある。他の好適なクラスの細胞毒素剤には、例えば、アントラサイクリンファミリーの薬剤、ビンカ薬剤、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞毒性ヌクレオチド、プテリジンファミリーの薬剤、ジニネン（diynene）、およびポドフィロトキシンがある。これらのクラスの特に有用なメンバーには、例えば、アドリアマイシン、カルミノマイシン、ダウノルビシン（ダウノマイシン）、ドキソルビシン、アミノプテリン、メソトレキセート、メトプテリン、ミスラマイシン、ストレプトニグリン、ジクロロメソトレキセート、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、ポルフィロマイシン、５−フルオロウラシル、フルクスリジン、フトラフール、６−メルカプトプリン、シタラビン、シトシンアラビノシド、ポドリフォトキシン、またはポドフィロトキシン誘導体、例えばエトポシドまたはエトポシドホスフェート、メルファラン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ロイロシジン、ビンデシン、ロイロシンなどがある。本明細書の教示に適合するさらに別の細胞毒素には、タキソール、タキサン、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、テノポシド、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびプロマイシンとその類似体もしくは同族体がある。ホルモンやホルモンアンタゴニスト、例えば、コルチコステロイド、例えばプレドニソン、プロゲスチン、例えばヒドロキシプロゲステロンまたはメドロプロゲステロン、エストロゲン、例えばジエチルスチルベストロール、抗エストロゲン、例えばタモキシフェン、アンドロゲン、例えばテストステロン、およびアロマターゼインヒビター、例えばアミノグルテチミドもまた、本発明の教示に適合する。上記したように、当業者は所望の化合物に化学修飾を行って、その化合物の反応を、本発明の結合体の調製のためにより便利なものにすることができるであろう。
【００８５】
特に好適な細胞毒素の１つの例は、エネジイン（enediyne）ファミリーの抗腫瘍抗生物質（カリケアミシン、エスペラミシンまたはジネミシンを含む）がある。これらの毒素は極めて強力であり、核ＤＮＡを切断することにより作用し、細胞死滅を招く。インビボで切断されて多くの不活性な、しかし免疫原性のポリペプチド断片を与えるタンパク質毒素と異なり、カリケアミシン、他のエネジインのような毒素は、基本的に非免疫原性の小分子である。これらの非ペプチド毒素は、モノクローナル抗体や他の分子を標識するのに従来使用されている方法により、ダイマーまたはテトラマーに化学結合される。これらの結合法には、結合体のＦｃ部分上にのみ存在するＮ結合糖残基を介する部位特異的結合がある。そのような部位特異的結合法は、結合体の結合性への結合の可能な作用を低下させるという利点がある。
【００８６】
上記したように、適合性のある細胞毒素はプロドラッグを含む。本明細書において「プロドラッグ」という用語は、親薬剤と比較して腫瘍細胞に対する毒性が少し低く、酵素的に活性化されるかまたはより活性な親型に変換することができる、薬剤活性のある物質の前駆体または誘導体型を意味する。本発明に適合するプロドラッグには、特に限定されないが、ホスフェート含有プロドラッグ、チオホスフェート含有プロドラッグ、サルフェート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、β−ラクタム含有プロドラッグ、随時置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ、または随時置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシンおよび５−フルオロウリジンプロドラッグがあり、これらは、より細胞毒性の高い遊離の薬剤に変換することができる。本発明で使用されるプロドラッグに誘導体化できる細胞毒素薬剤のさらなる例は、前記の化学療法剤を含む。
【００８７】
他の細胞毒素については、抗体はまた、リシンサブユニットＡ、アブリン、ジフテリア毒素、ボツリヌム、シアンギノシン、サキソ毒素、シガ毒素、破傷風、テトロドトキシン、トリコテセン、ベルコロゲン、または毒性酵素として、生物毒素に結合することができる。好ましくは、そのような構築体は、抗体−毒素構築体の直接発現を可能にする遺伝子操作法を使用して作成される。本発明の修飾抗体と結合してもよい他の生物学的応答調節物質には、リンホカインやインターフェロンのようなサイトカインを含む。さらに上記したように、同様の構築体を使用して、免疫活性リガンド（例えば、抗体またはその断片）を本発明の修飾抗体に結合してもよい。好ましくは、これらの免疫活性リガンドは、免疫活性エフェクター細胞の表面上の抗原に向けられる。これらの場合、構築体を使用して、エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）を、腫瘍関連抗原を有する新生物細胞の近傍に持ってきて、こうして所望の免疫応答を誘発することができる。本開示を考慮すると、当業者は、従来法を使用してそのような構築体を容易に形成することができる。
【００８８】
開示された修飾抗体と組合せて使用される他のクラスの適合性のある細胞毒素は、腫瘍細胞に有効に向けられる放射線感作薬剤である。そのような薬剤は、イオン化放射線に対する感受性を増強し、こうして放射線療法の効果を上昇させる。腫瘍細胞によりインターナリゼーションを受けた抗体結合体は、放射線感作物質を、核（ここで、放射線感作が最大になる）の近くに送る。非結合放射線感作物質結合修飾抗体は、血液から迅速にクリアランスされ、残りの放射線感作物質を標的腫瘍に局在化し、正常組織での取り込みを最少にする。血液からの迅速なクリアランス後、以下の３つの方法の１つで補助療法を行う：１）腫瘍に特異的に外部光線を照射する、２）腫瘍中に直接放射能を移植する、または３）同じ標的化抗体を用いる全身性放射免疫療法。このアプローチのおそらく魅力的な変法は、放射線感作物質免疫結合体への治療用ラジオアイソトープの結合であり、こうして患者に単一の薬剤が便利に投与される。
【００８９】
開示された抗体が結合型または非結合型で使用されても、本発明の主要な利点は、放射線療法または化学療法のような補助療法を受けているかまたは受けたことがある骨髄抑制患者で、これらの抗体を使用できることであることが理解される。すなわち、修飾抗体の有利な送達プロフィール（すなわち、比較的短い血清滞留時間と局在化の増強）は、これらを、赤色髄貯蔵量が低下し骨髄毒性に感受性の患者を治療するのに、特に有用なものにしている。この点で、修飾抗体のユニークな送達プロフィールは、これらを、骨髄抑制癌患者に放射能標識結合体を投与するのに、非常に有効なものにしている。従って、修飾抗体は、外部光線照射または化学療法のような補助療法を以前受けた患者において、結合または非結合型でも有用である。他の好適な実施態様において、修飾抗体（再度、結合型または非結合型）は、化学療法剤とともに併用療法で使用される。当業者は、そのような治療法が、開示された抗体および１つ以上の化学療法剤の連続的、同時、または同じ時間範囲内の投与を含むことは、理解されるであろう。好ましくは、本発明のこの態様の好適な実施態様は、放射能標識抗体の投与を含む。
【００９０】
修飾抗体は、直前に記載したように投与されるが、他の実施態様では、結合および非結合修飾抗体は、それ以外は健康な癌患者に、最初の治療薬として投与してもよいことを協調したい。そのような実施態様において、修飾抗体は、正常のまたは平均的赤色髄貯蔵量を有する患者、および／または外部光線照射または化学療法のような補助療法を以前受けたことがある、受けたことが無い、受けている患者に、投与してもよい。
【００９１】
しかし上記したように、本発明の選択された実施態様は、骨髄抑制患者への、または放射線療法もしくは化学療法のような１つ以上の補助療法と組合せた（すなわち、併用療法）修飾抗体の投与を含む。本明細書において、補助療法と併用した修飾抗体の投与は、治療法と開示された抗体との、連続的、同時、同範囲時間、同時、同時、もしくは即時投与または適用を意味する。当業者は、併用療法の種々の成分の投与または適用が、治療の全体的有効性を増強させるようにタイミングを合わせられることを理解するであろう。例えば、化学療法剤は、標準的な公知の治療コース後に、数週間以内に本発明の放射免疫結合体を投与することができる。逆に、細胞毒素結合修飾抗体は、静脈内投与し、次に腫瘍の局在化した外部光線照射を行う。さらに別の実施態様において、修飾抗体は、一回の医師への訪問で１つ以上の選択された化学療法剤と同時に投与される。当業者（例えば、熟練した癌専門家）は、選択された補助療法と本発明の教示に基づき、過度の実験をすることなく、有効な併用療法を認識できるであろう。
【００９２】
この点で、修飾抗体（細胞毒素有りまたは無し）と化学療法剤との併用は、任意の順序で、または患者に治療効果のある任意の時間枠内で行われる。すなわち、化学療法剤と修飾抗体は、任意の順序でまたは同時に投与される。選択された実施態様において本発明の修飾抗体は、以前化学療法を受けたことがある患者に投与される。さらに別の実施態様において、修飾抗体投与と化学療法は、実質的に同時に行われる。例えば患者に、化学療法を受けながら修飾抗体を投与してもよい。好適な実施態様において修飾抗体は、化学療法剤投与または治療の１年以内に投与される。他の好適な実施態様において修飾抗体は、化学療法剤投与または治療の１０、８、６、４または２ヶ月以内に投与される。さらに別の好適な実施態様において、修飾抗体は、化学療法剤投与または治療の４、３、２または１週間以内に投与される。さらに別の好適な実施態様において、修飾抗体は、化学療法剤投与または治療の５、４、３、２または１日以内に投与される。２つの薬剤または治療法は、数時間または数分間以内（すなわち、実質的に同時）に患者に投与してもよいことも理解される。
【００９３】
さらに本発明において、骨髄抑制患者とは、血球数の減少を示す患者を意味する。骨髄抑制の臨床的指数として通常使用されるいくつかの血球パラメータがあり、患者で起きている骨髄抑制の程度を容易に測定することができることを、当業者は理解するであろう。当該分野で認められている骨髄抑制測定値の例は、好中球の絶対数（ＡＮＣ）または血小板数である。そのような骨髄抑制または部分的骨髄喪失は、種々の生化学的障害または疾患の結果であるか、または以前の化学療法または放射線療法の結果である。この点で当業者は、伝統的化学療法を受けた患者は、典型的には赤色髄貯蔵量の減少を示すことを、理解するであろう。上記したように、そのような患者は、許容し難い副作用（例えば、貧血、または死亡率もしくは罹患率を上昇させる免疫抑制）のために、最適レベルの細胞毒素（すなわち、放射性核種）を使用して治療できないことが、しばしばある。
【００９４】
さらに詳しくは、本発明の結合または非結合修飾抗体は、ＡＮＣが約２０００/mm3未満であるか、または血小板数が約１５０，０００/mm3未満である患者を、有効に治療するのに使用される。さらに好ましくは本発明の修飾抗体は、ＡＮＣが約１５００/mm3未満、約１０００/mm3未満、またはさらに好ましくは約５００/mm3未満である患者を、治療するのに使用される。同様に、本発明の修飾抗体は、血小板数が約７５，０００/mm3未満、約５０，０００/mm3未満、またはさらには約１０，０００/mm3未満である患者を、治療するのに使用される。より一般的な意味で当業者は、政府の決めたガイドラインおよび方法を使用して、患者が骨髄抑制である時を、容易に決定することができるであろう。
【００９５】
上記したように多くの骨髄抑制患者が、化学療法、移植放射線療法または外部光線照射を含む治療を受けている。後者の場合外部照射源は、悪性腫瘍の局所的照射である。放射線療法埋め込み法について、放射活性試薬を、外科的に悪性腫瘍内に入れ、こうして疾患部位に選択的に照射する。いずれにしても、開示された修飾抗体は、原因に無関係に骨髄抑制を示す患者の新生物疾患を治療するのに使用され、特に外部光線照射または埋め込み放射線療法とともに使用される。
【００９６】
この点で、本発明の修飾抗体は、インビボで新生物細胞の増殖を排除、低下、阻害または制御する任意の化学療法剤または化学療法（例えば、併用療法を提供するために）と併用してもよいと理解される。上記したように、そのような薬剤はしばしば、赤色髄貯蔵量の減少を引き起こす。この減少は、そのような患者での新生物の攻撃的治療を有利に可能にする、本発明の化合物の低下した骨髄毒性により、すべてまたは一部がうち消される。他の好適な実施態様において、本明細書に開示の放射能標識免疫結合体は、放射性核種に対する新生物細胞の感受性を上昇させる放射線感作物質とともに、有効に使用される、例えば、放射線感作化合物は、放射能標識修飾抗体は、血流から大体クリアランスされた後であるが、腫瘍部位に治療上有効なレベルで残存する時に投与される。
【００９７】
本発明のこれらの態様に関して、本発明に適合性のある化学療法剤の例は、アルキル化剤、ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチンとビンブラスチン）、プロカルバジン、メソトレキセートおよびプレドニソンがある。４薬剤組合せＭＯＰＰ（メクレタミン（ナイトロジェンマスタード）、ビンクリスチン（オンコビン）、プロカルバジンおよびプレドニソン）は、種々のタイプのリンパ腫を治療するのに非常に有効であり、本発明の好適な実施態様を含む。ＭＯＰＰ耐性患者では、ＡＢＶＤ（例えば、アドリアマイシン、ブレオマイシン、ビンブラスチンおよびダカルバジン）、ＣｈｌＶＰＰ（クロランブシル、ビンブラスチン、プロカルバジンおよびプレドニソン）、ＣＡＢＳ（ロムスチン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、およびストレプトゾトシン）、ＭＯＰＰ＋ＡＢＶＤ、ＭＯＰＰ＋ＡＢＶ（ドキソルビシン、ブレオマイシンおよびビンブラスチン）またはＢＣＶＰＰ（カルムスチン、シクロホスファミド、ビンブラスチン、プロカルバジンおよびプレドニソン）組合せを、使用することができる。フリードマン（Arnold S. Freedman）とナドラー（Lee M. Nadler）、「悪性リンパ腫（Malignant Lymphomas）」、「ハリソンの内科学原理（Harrison's Principles of Internal Medicine）」、1774-1788頁中（イッセルバチャー（Isselbacher）ら編、第１３版、１９９４年）とデビタ（V.T. DeVita）ら（１９９７年）、および標準的投与とスケジュールについてそこに引用された文献。これらの治療法は、本明細書に記載の１つ以上の修飾抗体と組合せて、変化無しで、または特定の患者の必要に応じて改変されて使用される。
【００９８】
本発明において有用な追加の方法は、シクロホスファミドまたはクロランブシルのようなアルキル化剤、またはＣＶＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチンおよびプレドニソン）、ＣＨＯＰ（ＣＶＰおよびドキソルビシン）、Ｃ−ＭＯＰＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニソンおよびプロカルバジン）、ＣＡＰ−ＢＯＰ（ＣＨＯＰ＋プロカルバジンおよびブレオマイシン）、ｍ−ＢＡＣＯＤ（ＣＨＯＰ＋メソトレキセート、ブレオマイシンおよびロイコボリン）、ＰｒｏＭＡＣＥ−ＭＯＰＰ（プレドニソン、メソトレキセート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エトポシドおよびロイコボリン＋標準的ＭＯＰＰ）、ＰｒｏＭＡＣＥ−ＣｙｔａＢＯＭ（プレドニソン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エトポシド、シタラビン、ブレオマイシン、ビンクリスチン、メソトレキセート、およびロイコボリン）、およびＭＡＣＯＰ−Ｂ（メソトレキセート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、固定用量プレドニソン、ブレオマイシン、およびロイコボリン）のような組合せの使用を含む。当業者は、標準的用量と各方法のスケジュールを容易に決定できるであろう。ＣＨＯＰはまた、ブレオマイシン、メソトレキセート、プロカルバジン、ナイトロジェンマスタード、シトシンアラビノシド、およびエトポシドと組合わされている。他の適合性のある化学療法剤には、特に限定されないが、２−クロロデオキシアデニン（２−ＣＤＡ）、２’−デオキシコホルマイシンおよびフルダラビンがある。
【００９９】
緩解または再発をしない中グレードまたは高グレードＮＨＬの患者については、サルベージ治療が行われる。サルベージ治療は、シトシンアラビノシド、シスプラチン、エトポシドおよびイホスファミドのような薬剤を、単独または組合せで使用する。いくつかの新生物疾患の再発型または攻撃型では、以下のプロトコールがしばしば使用される。ＩＭＶＰ−１６（イホスファミド、メソトレキセートおよびエトポシド）、ＭＩＭＥ（メチル−ｇａｇ、イホスファミド、メソトレキセートおよびエトポシド）、ＤＨＡＰ（デキサメタゾン、高用量シタラビンおよびシスプラチン）、ＥＳＨＡＰ（エトポシド、メチルプレドニソロン、ＨＤシタラビン、シスプラチン）、ＣＥＰＰ（Ｂ）（シクロホスファミド、エトポシド、プロカルバジン、プレドニソンおよびブレオマイシン）およびＣＡＭＰ（ロムスチン、ミトキサントロン、シタラビンおよびプレドニソン）、それぞれ公知の用量とスケジュールで使用される。
【０１００】
本発明の修飾抗体と組合せて使用される化学療法剤の量は、患者ごとに変動するか、または当該分野で公知のように投与される。例えば、チャブナー（Bruce A. Chabner）ら、「抗新生物剤（Antineoplastic Agents）」、「グッドマンとギルマンの治療薬の薬学的基礎（Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics）」、1233-1287頁中（ハードマン（Joel G. Hardman）ら編、第９版、１９９６年）を参照されたい。
【０１０１】
上記したように本発明の修飾抗体、その免疫反応性断片または組み換え体は、哺乳動物の悪性腫瘍のインビボ治療のために、薬剤学的に有効量で投与される。この点で、開示された抗体は、活性物質の投与を促進し安定性を促進するように調製されると理解される。好ましくは、本発明の医薬組成物は、非毒性の無菌担体（例えば、生理食塩水、非毒性緩衝液、保存剤など）を含む。本出願の目的において、治療薬に結合したかまたは結合していない、修飾抗体、その免疫反応性断片または組み換え体の薬剤学的に許容される量は、新生物細胞上で選択された免疫反応性抗原と有効な結合を達成し、これらの細胞の死滅を増強するのに充分な量を意味する。もちろん、本発明の医薬組成物は、単回または複数回投与されて、薬剤学的に有効量の修飾抗体を提供する。
【０１０２】
さらに詳しくは、開示された抗体は、腫瘍サイズを減少させるのに充分なはずで、腫瘍増殖を阻害し、および／または担癌動物の生存期間を延長させる。従って本発明はまた、ヒトまたは動物に、有効な非毒性量の修飾抗体を投与することにより、ヒトまたは他の動物の腫瘍を治療する方法に関する。当業者は、ルーチンの実験により、悪性腫瘍を治療するための修飾抗体の有効で非毒性の量を決定することができるであろう。例えば、治療上有効量の修飾抗体は、疾患のステージ（例えば、ステージＩ対ステージIV）、年齢、性、合併症（例えば、免疫抑制剤状態または疾患）、および患者の体重、および患者で所望の応答を誘発するための抗体の能力などの要因に従って変動する。投与法は、最適の治療応答を与えるように調整される。例えば、いくつかの分割用量が毎日投与されるか、または治療状況の緊急性に従って、比例して減少される。しかし一般に、有効量は、１日につき体重１kgあたり約０．０５〜１００mg、およびさらに好ましくは１日につき体重１kgあたり約０．５〜１０mgの範囲であると予測される。
【０１０３】
本開示の範囲に一致して、本発明の修飾抗体は、ヒトまたは他の動物に、前記治療法に従って、治療的または予防的程度に、効果を示すのに充分な量で投与される。本発明の抗体は、公知の方法に従って、本発明の抗体を従来の薬剤学的に許容される担体または希釈剤とを一緒にすることにより、従来の剤形でヒトまたは他の動物に投与することができる。薬剤学的に許容される担体または希釈剤の型および特徴は、組合せられる活性成分の量、投与経路および他の公知の変数に支配されることは、当業者により認識されるであろう。当業者はさらに、本発明の１つ以上の種のモノクローナル抗体を含むカクテルが、特に有効なことがあることを、理解するであろう。
【０１０４】
抗体、その免疫反応性断片または組み換え体、および治療薬の調製法と投与法は、当業者に公知であるかまたは当業者が容易に決定できる。本発明の抗体の投与経路は、経口、非経口、吸入、または局所投与でもよい。本明細書において非経口という用語は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸または膣投与がある。非経口投与の静脈内、動脈内、皮下、および筋肉内型が、一般に好ましい。これらの投与型のすべては、本発明の範囲内であると考えられるが、好適な投与型は、注射溶液、特に静脈内または動脈内注射または点滴注入である。通常、注射に適した医薬組成物は、緩衝液（例えば、酢酸、リン酸またはクエン酸緩衝液）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、随時安定剤（例えば、ヒトアルブミン）などを含む。しかし、本明細書の教示に適合する他の方法では、修飾抗体は、直接、悪性腫瘍部位に送られ、こうして、治療薬への新生物組織の暴露を上昇させる。
【０１０５】
非経口投与用の調製物は、無菌の水性または非水性溶液、懸濁液およびエマルジョンを含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ＰＥＧ、植物油（例えば、オリーブ油）および注入可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）である。水性担体には、水、アルコール性／水性溶液、エマルジョンまたは懸濁液（食塩水および緩衝液化媒体を含む）がある。本発明において、薬剤学的に許容される担体には、特に限定されないが、０．０１〜０．１Ｍおよび好ましくは０．０５Ｍリン酸緩衝液または０．８％食塩水がある。他の共通の非経口ビヒクルには、リン酸ナトリウム溶液、リンゲルのブドウ糖、ブドウ糖、および塩化ナトリウム、乳酸化リンゲル溶液、または固定油がある。静脈内ビヒクルには、流体および栄養補充剤、電解質補充剤、例えばリンゲルのブドウ糖に基づくものなどがある。抗微生物、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどの保存剤および他の添加物も存在してもよい。
【０１０６】
さらに詳しくは、注射に適した医薬組成物には、無菌水性溶液（水溶性である）または、分散物および無菌注射溶液または分散物の即時調製のための無菌粉末がある。そのような場合、組成物は無菌でなければならず、容易にシリンジで操作できる程度に流動性でなければならない。これは、製造と保存の条件下で安定であり、好ましくは、微生物（例えば、細菌や真菌）の汚染作用に対して保存される。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体プロピレングリコールなど）、およびこれらの適当な混合物を含有する溶媒または分散物でもよい。適度な流動性は、例えばレシチンのようなコーティングの使用、分散物の場合は必要な粒子サイズ、および界面活性剤の使用により、維持することができる。
【０１０７】
微生物の作用の予防は、種々の抗細菌剤、および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより行われる。多くの場合に、等張剤、例えば糖、ポリアルコール（例えば、マンニトール、ソルビトール）、または塩化ナトリウムを組成物中に含有させることが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、組成物中に、吸収を遅らせる物質（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を含有させることにより達成される。
【０１０８】
いずれの場合も、無菌の注射溶液は、活性化合物（例えば、修飾抗体自体、または他の活性物質と組合せて）を、必要な量、適切な溶媒中で、必要に応じて、本明細書に記載の成分の１つまたは組合せで、取り込ませて、次にろ過滅菌により調製される。一般に、分散物は、活性化合物を無菌ビヒクル（これは、分散媒体と上記からの必要な他の成分を含有する）に取り込むことにより調製される。無菌注射溶液の調製のための無菌粉末の場合は、好適な調製法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これは、活性成分と、前記無菌ろ過した溶液からの追加の所望の成分とを与える。注射用調製物は、当該分野で公知の方法に従って、処理され、アンプル、バッグ、ビン、シリンジまたはバイアルなどの容器に充填され、無菌状態で密封される。さらに、調製物は、包装され、同時係属Ｕ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.０９／２５９，３３７号およびＵ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.０９／２５９，３３８号（それぞれ、参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載のように、キットの形で販売される。そのような製造物品は、好ましくは、関連組成物が、癌、悪性腫瘍または新生物疾患に罹っているかまたは罹りやすい患者の治療に有用であることを示す、ラベルまたは添付文書を有する。
【０１０９】
詳細に上記したように、本発明は、治療の必要な哺乳動物被験体中の新生物疾患の治療のための、化合物、組成物、キットおよび方法を提供する。好ましくは、被験体はヒトである。新生物疾患（例えば、癌と悪性腫瘍）は、黒色腫、神経膠腫、肉腫、および癌のような固形腫瘍、ならびに骨髄性もしくは血液性悪性腫瘍（例えば、リンパ腫および白血病）を含む。一般に、開示された発明は、修飾抗体による癌細胞の標的化を可能にする抗原性マーカーを含む新生物を、予防的または治療的に処理するのに使用される。治療される癌の例には、特に限定されないが前立腺、結腸、皮膚、乳房、卵巣、肺および膵臓がある。好適な実施態様において、本発明の選択された修飾抗体（例えば、ＣＣ４９．ΔＣH２）は、結腸癌または他の消化器癌を診断または治療するのに使用される。さらに詳しくは、本発明の抗体は、カポジ肉腫、ＣＮＳ新生物（毛細血管性血管腫、髄膜腫、および脳転移）、黒色腫、消化管および腎臓肉腫、横紋筋肉腫、神経膠芽細胞腫（好ましくは多形神経膠芽腫）、平滑筋肉腫、網膜芽細胞腫、卵巣の乳頭状腺癌、ウィルムス腫瘍、または小細胞肺癌を治療するのに使用される。適切な抗体は、本開示を考慮して、過度の実験をすることなく、前記新生物のそれぞれに関連する腫瘍関連抗原について、誘導されることは理解されるであろう。
【０１１０】
開示された発明による治療に適した血液悪性腫瘍の例には、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫、ならびにＡＬＬ−Ｌ３（バーキット型白血病）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）および単球性白血病を含む白血病がある。本発明の化合物と方法は、種々のＢ細胞リンパ腫、例えば低グレード／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、細胞リンパ腫（ＦＣＣ）、マントルセルリンパ腫（ＭＣＬ）、びまん性大細胞性リンパ腫（ＤＬＣＬ）、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中間グレード／濾胞性ＮＨＬ、中間グレードびまん性ＮＨＬ、高グレード免疫芽球性ＮＨＬ、高グレードリンパ芽球性ＮＨＬ、高グレード小非切断細胞ＮＨＬ、大型疾患ＮＨＬ、およびワルデンストレームマクログロブリン血症の治療に、特に有効であることは理解される。分類システムの変化のために、これらのリンパ腫と白血病がしばしば異なる名前を持ち、異なる名前で分類された血液悪性腫瘍を有する患者が、本発明の併用療法の利益を受けることは、当業者は理解するであろう。上記新生物疾患以外に、開示された発明は、適合性のある腫瘍関連抗原を有する追加の悪性腫瘍を治療するのに有利に使用されることは、理解されるであろう。
【０１１１】
前記説明は、以下の例を参照してより詳細に理解されるであろう。しかし、そのような例は、本発明の好適な実施法を示すものであって、決して本発明の範囲または請求の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【０１１２】
Ｃ２Ｂ８．ΔＣH２免疫グロブリンの構築と発現
キメラ抗体Ｃ２Ｂ８（アイディーイーシー・ファーマシューチカルズ（IDEC Pharmaceuticals））を修飾して、ヒトガンマ１定常領域内でＣH２ドメインが欠失したドメイン欠失バージョンを作成した。Ｃ２Ｂ８とプラスミドＮ５ＫＧ１（これは、ヒトカッパ軽鎖定常領域ならびにヒトガンマ１定常領域とをコードする「空の」ベクターである）は、米国特許第５，６４８，２６７号および５，７３６，１３７号（それぞれ、参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載されている。ＣH２ドメイン欠失バージョンの作成は、重複ＰＣＲ突然変異誘発により行った。
【０１１３】
ガンマ１定常ドメインは、プラスミドにコードされたＮｈｅＩ部位（これは、免疫グロブリン配列との翻訳読みとり枠内にある）で始まる。ＮｈｅＩ部位ならびにそのすぐ下流配列をコードする５’ＰＣＲプライマーを構築した。３’プライマーは、免疫グロブリンヒンジ領域の３’末端とアニーリングして、フレーム内でガンマ１ＣＨ３ドメインの最初の数個のアミノ酸をコードするように構築した。第２のＰＣＲプライマー対は、５’プライマーとしての第１の対（前記）からの３’ＰＣＲプライマーの逆相補体と、ＣH３ドメイン内のＢｓｒＧＩ制限部位にまたがる遺伝子座でアニーリングする３’プライマーとからなった。各ＰＣＲ増幅後に、生じた生成物を鋳型として、ＮｈｅＩとＢｓｒＧＩ  ５’および３’プライマーとともに使用した。次に増幅した生成物をＮ５ＫＧ１に戻してクローン化して、プラスミドＮ５ＫＧ１ΔＣH２を作成した。この構築により、完全なＣＨ３ドメインは、完全なヒンジ領域のすぐ下流でフレーム内にくる。これは「空の」ベクターであるため、次にＣ２Ｂ８免疫グロブリン軽鎖および重鎖可変ドメインを、適切なクローニング部位に挿入した。
【０１１４】
免疫グロブリンコード領域の配列確認後、この発現構築体をＣＨＯ  ＤＧ４４細胞中にトランスフェクションし、Ｇ４１８耐性（ベクターにコードされたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子により付与される）について選択した。次に、耐性の細胞単離体をＨｕｃＣＣ４９免疫グロブリン発現について測定した。生じる構築体の配列を、図１〜３に示す。
【実施例２】
【０１１５】
ｈｕｃＣＣ４９．ΔＣH２免疫グロブリンの構築と発現
国立癌研究所（National Cancer Institute）から、ＣＣ４９抗体のヒト化バージョン（ＡＴＣＣ  No.ＨＢ９４５９）を得た。軽鎖は、ｐＬＮＣＸ  II  ＨｕＣＣ４９  ＨｕＫと呼ぶプラスミドにコードされた。重鎖は、ｐＬｇｐＣＸ  II  ＨｕＣＣ４９Ｇ１．ΔＣH２と呼ぶプラスミドにコードされた。
【０１１６】
軽鎖および重鎖可変ドメインのみが、これらのプラスミドからＰＣＲ増幅により単離された。制限エンドヌクレアーゼ部位が含まれて、ＩＤＥＣの専用発現ベクターＮ５ＫＧ１．ΔＣH２中への以後のサブクローニングを可能にするように、ＰＣＲプライマーを構築した。
【０１１７】
軽鎖制限酵素は、５’末端がＢｇｌII（ＮＣＩプラスミドによりコードされる天然のリーダーペプチドの翻訳開始コドンのすぐ上流）で、３’末端がＢｓｉＷＩ（ＩＤＥＣのベクターにコードされるヒトカッパ軽鎖定常ドメインと翻訳読みとり枠内）であった。軽鎖可変ドメイン内のアミノ酸は、ＮＣＩ配列からの変化は無かった。
【０１１８】
重鎖制限酵素は、５’末端がＭｌｕＩ（フレーム内で、ＩＤＥＣの発現ベクターによりコードされる「合成」免疫グロブリン重鎖シグナルペプチドのアミノ酸残基−５と−４をコードする）であった。ＰＣＲプライマーはまた、重鎖可変ドメインの最初に関して残基−３、−２、および−１をコードした。３’重鎖ＰＣＲプライマーは、制限酵素ＮｈｅＩをコードし、これは、ＩＤＥＣのガンマ１ドメイン欠失重鎖定常領域のフレーム内でコードする。最終的結果は、以下の成分を有するＨｕＣＣ４９ドメイン欠失抗体をコードする発現構築体である。重鎖可変ドメイン内のアミノ酸は、ＮＣＩ配列からの変化は無かった。
【０１１９】
軽鎖：天然の軽鎖リーダー−ＮＣＩ可変ドメイン−ＩＤＥＣのヒトカッパ定常ドメイン。
重鎖：ＩＤＥＣの合成重鎖リーダー−ＮＣＩ可変ドメイン−ＩＤＥＣのＣＨ２ドメイン欠失ガンマ１重鎖定常ドメイン。
【０１２０】
免疫グロブリンコード領域の配列確認後、この発現構築体をＣＨＯ  ＤＧ４４細胞中にトランスフェクションし、Ｇ４１８耐性（ベクターにコードされたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子により付与される）について選択した。次に、耐性の細胞単離体をＨｕＣＣ４９免疫グロブリン発現について測定した。ｈｕｃＣＣ４９．ΔＣH２重鎖と軽鎖の配列を、図４と図５に示す。
【実施例３】
【０１２１】
Ｃ５Ｅ１０．ΔＣH２免疫グロブリンの構築と発現
ネズミＣ５Ｅ１０を発現するハイブリドーマをアイオワ大学から受け取った。ＲＮＡからのオリゴｄＴを使用して、細胞からのＲＮＡをｃＤＮＡとした。一連のマウスカッパと重鎖可変領域プライマーを使用して、ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物をアガロースゲルにかけた。公知の技術を使用して、プライマーを使用して、アガロース中で軽鎖と重鎖をバンドとして単離し同定した。バンドを単離し、制限酵素で切断し、実質的に実施例１と実施例２に記載のように、軽鎖可変領域をＮｅｏｓｐｌａ  Ｎ５ＫＧ１ベクター中にクローン化した。次に、重鎖可変領域をＮｅｏｓｐｌａ  ΔＣH２ベクター中にクローン化（これも実質的に実施例１と実施例２に記載のように）して、ＣH２ドメインの欠失した抗体を作成した。親抗体とドメイン欠失構築体の重鎖と軽鎖可変領域のＤＮＡとアミノ酸配列を、図６〜８に記載のように配列決定した。当該分野で公知の方法を使用して、ベクターをＣＨＯ細胞中に電気穿孔して、安定な細胞株を得た。ＣＨＯ細胞の増殖と生成物の発現後、親和性クロマトグラフィーを使用して修飾抗体を精製した。
【実施例４】
【０１２２】
111Ｉｎと90Ｙ放射能標識構築体の調製
後述のインビボの生体分布とバイオベイラビリティ試験のために、実施例１〜３からの修飾抗体構築体または実質的な同等物および適切な対照を、放射性インジウムとイットリウムで標識した。上記したように、タンパク質中の放射性金属（例えば、111Ｉｎと90Ｙ）の直接取り込みは、一般的に有効ではない。従って、典型的にはキレート剤が使用して、これらのアイソトープを抗体に連結して、所望の放射免疫結合体を得る。本明細書に記載の試験については、ＭＸ−ＤＴＰＡキレート剤を使用して、111Ｉｎと90Ｙを取り込んだ。
【０１２３】
結合前に、モノクローナル抗体２Ｂ８、２Ｂ８．Ｆ(ab')2およびＣ２Ｂ８．ΔＣH２を、低濃度金属含有食塩水（ＬＭＣ−食塩水、ｐＨは０．５Ｍホウ酸を使用して８．６に調整した）中に透析ろ過した。あらかじめ洗浄したセントリコン（Centricon）３０フィルターを使用してモノクローナル抗体を透析ろ過（２回、製造業者の説明書に従って）し、モノクローナル抗体濃度をＡ２８０（１mg/ml＝１．７ＡＵ）で測定し、ＬＭＣ−食塩水（ｐＨ８．６）を使用して約１０．０mg/mlに希釈した。モノクローナル抗体とＭＸ−ＤＴＰＡとを４：１モル比（キレート対モノクローナル抗体）で、室温で１４〜１６時間反応させた。インキュベーション後、セントリコン（Centricon）３０フィルターを使用して、未反応のキレートから結合体を清澄化（３回）し、Ａ２８０によりタンパク質濃度を測定し、ＬＭＣ−食塩水を使用して最終濃度を２．０mg/mlに調整した。
【０１２４】
同じプロトコールを使用して、ＣＣ４９をＣＣ４９．ΔＣH２をＭＸ−ＤＴＰＡに結合させたが、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体のために使用したキレート対モノクローナル抗体のモル比４：１の代わりに２：１を使用した。ＣＣ４９とＣＣ４９．ΔＣH２の抗体濃度を、Ａ２８０（１mg/ml＝１．０）で測定した。
【０１２５】
結合後、ドメイン欠失構築体と対照抗体および断片を、111Ｉｎと90Ｙで放射能標識した。111Ｉｎを、比活性１〜３mCi/mgタンパク質の範囲で標識した。希塩酸（ニコメッドアマシャム（Nycomed Amersham）またはシクロトロンプロダクツ社（Cyclotron Products Inc.））中の塩化インジウム［111］を、５０mM酢酸ナトリウムを使用してｐＨ４に調整した。免疫グロブリン結合体を加え、混合物を周囲温度でインキュベートした。３０分後、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．２、７．５％ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）と１mMジエチレントリアミン５酢酸（ＤＴＰＡ）を含有）（調製緩衝液）を使用して、混合物を最終抗体濃度０．２mg/mlに希釈した。
【０１２６】
構築体と対照はまた、比活性１０〜１９mCi/mgタンパク質で90Ｙで放射能標識した。希塩酸（ニコメッドアマシャム（Nycomed Amersham）またはエヌイーエヌデュポン（NEN Dupont））中の塩化イットリウム［90］を、５０mM酢酸ナトリウムを使用してｐＨ４に調整した。抗体結合体を加え、混合物を周囲温度でインキュベートした。５分後、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．２、７．５％ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）と１mMジエチレントリアミン５酢酸（ＤＴＰＡ）を含有）（調製緩衝液）を使用して、混合物を最終抗体濃度０．２mg/mlに希釈した。
【実施例５】
【０１２７】
125Ｉ放射能標識構築体の調製
実施例１〜３の構築体と適切な対照を、後述の生体分布とバイオベイラビリティ試験のために、放射性ヨードでも標識した。さらに詳しくは、構築体と対照をヨード−ビーズ（バイオラッドインダストリーズ（Bio-Rad Industries））を使用して、製造業者の一般的ガイドラインに従って放射能標識した。２mCiのＮａ125Ｉを、100mMリン酸ナトリウム（ｐＨ７０）中のヨード−ビーズで５分プレインキュベートした。約０．２mgの免疫グロブリンを加え、反応混合物を２分間インキュベートした。取り込まれていないヨードを、セファデックスＧ−２５（ファルマシア（Pharmacia）Ｐ−１０カラム）で１×ＰＢＳ中に脱塩して除去した。
【実施例６】
【０１２８】
放射能標識ｈｕＣＣ４９．ΔＣH２の血液クリアランス速度
図９は、マウスにおける111Ｉｎ、90Ｙおよび125Ｉ標識ドメイン欠失ｈｕｃＣＣ４９と111Ｉｎまたは125Ｉ標識親抗体ＣＣ４９の血液クリアランス速度を比較する。ドメイン欠失構築体またはその実質的な同等物を、実施例１〜５に記載のように調製した。標識ＣＣ４９構築体を、正常マウスまたはＬＳ１７４Ｔ  ＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ／ｎｕ担癌マウスで評価した。ＬＳ１７４Ｔは、ヒト結腸癌から誘導されたＴＡＧ−７２陽性腫瘍である。腫瘍異種移植片を樹立し、１×１０6洗浄組織培養細胞の皮下注射により、マウス中で増殖させた。図９に示すように、種々のアイソトープで標識したすべてのドメイン欠失構築体は、担癌および非担癌マウスの両方で、血液からの同様のクリアランス速度を示した。接種後２４時間後に、９９％を越える標識ドメイン欠失構築体が血液から除去されたことが注目される。種々のアイソトープを使用しても、クリアランス速度に差は見られなかった。これとは対照的に、注射後３日を越えても、高レベルの放射能標識全抗体が循環流中に残存した。上記で詳述したように、投与した放射能標識化合物の循環と非特異的沈着の延長により、実質的な骨髄毒性を引き起こすことがあり、多くの場合、投与される放射性結合体の量を実際に限定する。放射性結合体の迅速なクリアランスは、この骨髄毒性を大きく低下させ得る。すなわち本例は、好ましくない副作用の低下と、投与された殺腫瘍薬剤の用量と上昇させる可能性の低下とにおける本発明の利点を、グラフで例示する。
【実施例７】
【０１２９】
血液クリアランス速度と腫瘍局在化の比較
マウス抗体２Ｂ８とそのキメラ体Ｃ２Ｂ８は、いずれもヒトＣＤ２０抗原に反応する。担癌マウスで２Ｂ８、Ｃ２Ｂ８．ΔＣH２および２Ｂ８．Ｆ(ab')2（すべて111Ｉｎで標識されている）を使用して、血清クリアランスと腫瘍局在化の薬物動態を調べた。
【０１３０】
１×１０6個の洗浄した組織培養細胞を皮下注射して、ダウディ（Daudi）腫瘍（ＣＤ２０陽性）をメスのＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ／ｎｕマウス中で増殖させた。腫瘍容量が約５０〜１００mm3の大きさになった時、放射能標識モノクローナル抗体または構築体を静脈内注射した。種々の構築体の生体分布と腫瘍局在化のために、動物を屠殺し、指定の時間に放血させた。この点で、動物から腫瘍を除去し、ＰＢＳで洗浄し、重量を測定した。標準化した血液試料を取り、分析するまで保存した。当該分野で公知の方法を使用して、腫瘍と血液中の放射活性を、ガンマカウンターを使用して定量し、物理的崩壊について補正した。結果は、１時点あたり３匹の動物の平均であり、図１０にグラフで示す。さらに詳しくは図１０Ａは、完全なＣ２Ｂ８についての血液クリアランスと腫瘍局在化速度を示し、図１０Ｂと１０Ｃは、標識Ｆ(ab')2構築体とドメイン欠失体についての、同じ測定値を示す。
【０１３１】
曲線は、111Ｉｎ標識Ｃ２Ｂ８．Ｆ(ab')2（図１０Ｂ）またはＣ２Ｂ８．ΔＣH２（図１０Ｃ）構築体を使用して、注入の２４時間後に、循環中に供給放射活性がほとんど残っていないことを示す。逆に、血清中には注入２４時間後に、比較的高レベルの111Ｉｎ−２Ｂ８．ＩｇＧが残っていた（図１０Ａ）。従って、ドメイン欠失とＦ(ab')2構築体の両方の血液クリアランス速度は、完全なＩｇＧ分子より有意に速かった。さらに詳しくは、血液クリアランス速度から計算された有効半減期は、Ｃ２Ｂ８．ΔＣH２について５．７時間で、２Ｂ８．Ｆ(ab')2断片について１２．９時間であり、これに対して完全な２Ｂ８  ＩｇＧ分子は３８時間であった。ドメイン欠失構築体についての有意に速い血液クリアランス速度は再度、骨髄に送達される放射線線量を実質的に低下させる本発明の能力を証明する。
【０１３２】
逆に、本発明の修飾抗体は、腫瘍自体に治療上有効量の放射活性を送達するのに、極めて優れている。この点で、111Ｉｎ標識構築体の腫瘍局在化をまた、図１０に示す。図１０Ａでは、111Ｉｎ−２Ｂ８．ＩｇＧは、注入後２４〜４８時間後に、ピークの腫瘍局在化を示した。これに対して、それぞれ図１０Ｂと図１０Ｃに示すように、２Ｂ８．Ｆ(ab')2またはＣ２Ｂ８．ΔＣH２構築体の両方は、注入後６時間にピーク局在化を示した。しかし、他の構築体と比較して注入線量／gmパーセントの大幅な低下を示した２Ｂ８．Ｆ(ab')2と異なり、Ｃ２Ｂ８．ΔＣH２は、111Ｉｎ２Ｂ８を使用して得られた量に匹敵する腫瘍局在化パターンを示した（図１０Ａと１０Ｃ）。この例では、２Ｂ８．Ｆ(ab')2を使用して６時間目の％注入線量／gm組織（％ID/gm）として表したピーク腫瘍局在化は６．２であり、一方６時間目のドメイン欠失体は１７．１％であった。これに対して、６時間目には、４％のみの２Ｂ８．ＩｇＧが腫瘍に局在化した。２Ｂ８．ＩｇＧの最も高いピーク局在化は、２４時間目で、１９．４％であった。
【０１３３】
すなわち、本発明の修飾抗体のみが、比較的迅速な血液クリアランスと高い腫瘍局在化が組合わさった所望の特徴を示す。より一般的には、完全な抗体は、比較的高い腫瘍局在化（かなり長時間後ではあるが）を示すようであるが、長い血液半減期のためにかなり骨髄毒性である。逆に、Ｆ(ab')2構築体は、比較的迅速な血液クリアランスを示すが、腫瘍局在化は極めて低い。これらの限定は、本明細書に開示の修飾抗体により克服されることが理解される。
【実施例８】
【０１３４】
血液クリアランス速度と腫瘍局在化の試験
構築体の有効半減期と骨髄へのＭＩＲＤ線量推定照射を、血液クリアランスデータから計算し、以下の表１に示す。免疫結合体の腫瘍局在化データを表２に示す。報告されている線量を、適切な腫瘍（すなわち、実施例６と７からのダウディ（Daudi）またはＬＳ１７４Ｔマウス）を示すＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ／ｎｕマウスに注入し、あらかじめ決められた時点に血液を採取した。
【０１３５】
骨髄へのＭＩＲＤ（吸収された放射活性）線量推定値は、注入後１〜７２時間に取った試料を使用して、接種線量／gm組織パーセント（％ID/gm）から計算し、表１に報告する。
【０１３６】
2005503109.tif 000002
【０１３７】
表１の評価は、ドメイン欠失構築体が、実質的に短い半減期と、骨髄への対応して低い線量の放射活性を与えることを再確認する。さらに詳しくは、表１は、Ｆ(ab')2  Ｃ２Ｂ８構築体と完全なＩｇＧの半減期が、それぞれ１２．９時間と３８時間であることを示す。これとはまったく対照的に、ドメイン欠失ＣＣ４９構築体は、同じ線量で半減期はわずかに６．５時間であった（すなわち、完全なＩｇＧより５倍以上小さい）。この短い半減期は、好ましくない放射性エネルギーへの血液と赤色髄の暴露を実質的に少なくすることが、重要である。ＭＩＲＤレベル（特に、骨髄に送達された放射性エネルギー）を再検討すると、完全なＣ２Ｂ８  ＩｇＧは、同じ量のドメイン欠失ＣＣ４９が与えるもののほとんど４倍の線量を与えた（すなわち、２．２rad/mCi対０．６１rad/mCi）。骨髄暴露のこの低下は、骨髄毒性（癌治療のための治療法の開発において決定的に重要な因子）をかなり小さくすることを、強調したい。
【０１３８】
上記したように表２は、放射性核種の高腫瘍局在化を与える本発明の利点を示す。上記の迅速な血液クリアランスと一緒になったこの局在化の上昇は、新生物細胞の部位への、放射性または細胞毒素化合物の特に有効な投与を可能にすることが理解される。
【０１３９】
2005503109.tif 000003
【０１４０】
表２に示すように、111Ｉｎ−２Ｂ８、111Ｉｎ−ｈｕＣＣ４９．ΔＣH２、および125Ｉ−ｈｕＣＣ４９．ΔＣH２は、同様の腫瘍滞留時間を示した（それぞれ、０．９５、１．１５および０．９２uCi-hr/uCi）。さらに、111Ｉｎ−ｈｕＣＣ４９．ΔＣH２、125Ｉ−ｈｕＣＣ４９．ΔＣH２、および111Ｉｎ−２Ｂ８のピーク局在化（それぞれ、１８．５、１６．２、および１７．８%ID/gm）もまた同様であったが、完全な２Ｂ８が接種後２４時間にピークに達したのと比較して、ドメイン欠失構築体では注入後６時間にピークに達した。ドメイン欠失構築体（111Ｉｎまたは125Ｉ標識断片を使用して）の早期局在化は、完全な親モノクローナル抗体２Ｂ８と比較して、腫瘍への放射線線量の推定３倍の上昇を引き起こした（すなわち、３６３７rad/mCi対１３３１rad/mCi）。
【０１４１】
再度、ピーク腫瘍局在化または腫瘍滞留時間で妥協することなく血液クリアランスがより速く腫瘍標的化が上昇したことは、ドメイン欠失構築体を使用することが、併用薬剤療法を使用する臨床プロトコールの大きな利点であることを示すことを、強調したい。
【実施例９】
【０１４２】
修飾抗体の相乗性
４０匹の無胸腺メスマウスの皮下に、０．２mlの２×１０6のＬＳ１７４Ｔ細胞を注射した。ＴＡＧ−７２+腫瘍を、触診可能なサイズの１５０〜２００mm3まで増殖させた。この時点で、マウスを各１０匹の４群に分けた。４群は以下のように処理した：
【０１４３】
１．エトポシド単独
２．90Ｙ−ｈｕＣＣ４９．ΔＣH２単独
３．90Ｙ−ｈｕＣＣ４９．ΔＣH２単独＋エトポシド
４．希釈剤対照（ＰＢＳ／ＤＭＳＯ）
【０１４４】
さらに詳しくは、エトポシドのストック溶液を、ＤＭＳＯ中１００mg/mlで作成した。次にこれをＰＢＳで６．８８mg/mlに希釈した。群１では、マウスに１．７２mgのエトポシドを、４日毎に繰り返して注射し、全部で３回注射した。群２では、ＣＨｘ−ＤＴＰＡキレート剤を使用して０．０５mCiの90Ｙ−ｈｕＣＣ４９．ΔＣH２をマウスに注射して、ラジオアイソトープを固定させた。群３では、マウスに、０．０５mCiの同じ放射能標識修飾抗体と１．７２mgのエトポシドを注射し、次に１．７２mgのエトポシドを２回注射した。対照群マウス（４）には、ＰＢＳ／ＤＭＳＯを６．９％ＤＭＳＯの濃度で、４日毎に繰り返して注射し、全部で３回注射した。腫瘍を、週に２回または３回測定し、図１１に示す。
【０１４５】
図１１は、エトポシド単独とドメイン欠失放射能標識ＣＣ４９抗体の組合せが、腫瘍マスの増加を薬剤単独より遅らせることを示す。この相乗作用は、２５日目に特に顕著であり、この時腫瘍の大きさは、90Ｙ−ｈｕＣＣ４９．ΔＣH２またはエトポシドで処理したマウスと比較して、薬剤の組合せの使用によりほとんど半分低下する。
【０１４６】
当業者は、本発明の精神を逸脱することなく、他の具体的な型で本発明が具体化されることを、理解するであろう。本発明の前記説明において実施態様のみが開示されているが、他の変更態様も本発明の範囲内にあることを理解されたい。従って、本発明は、本明細書に記載の具体例に限定されるものではない。むしろ、本発明の範囲と内容は、添付の特許請求の範囲を参照されたい。
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】ＡとＢはそれぞれ、完全なＣ２Ｂ８重鎖のアミノ酸配列と、ＣH２ドメインが欠失している誘導されたドメイン欠失Ｃ２Ｂ８構築体のアミノ酸配列を示す。
【図２】ＡとＢはそれぞれ、完全なＣ２Ｂ８重鎖のヌクレオチド配列と、ＣH２ドメインが欠失している誘導されたドメイン欠失Ｃ２Ｂ８構築体のヌクレオチド配列を示す。
【図３】ＡとＢはそれぞれ、Ｃ２Ｂ８軽鎖のヌクレオチド配列と、同じ軽鎖の対応するアミノ酸配列を示す。
【図４】ＡとＢはそれぞれ、ＣH２ドメインが欠失しているｈｕＣＣ４９ドメイン欠失重鎖のアミノ酸配列と、同じ重鎖の対応するヌクレオチド配列を示す。
【図５】ＡとＢはそれぞれ、ｈｕｃＣＣ４９軽鎖のアミノ酸配列と、同じ軽鎖の対応するヌクレオチド配列を示す。
【図６】ＡとＢはそれぞれ、完全なＣ５Ｅ１０重鎖のアミノ酸配列と、ＣH２ドメインが欠失している誘導されたドメイン欠失Ｃ５Ｅ１０構築体のアミノ酸配列を示す。
【図７】ＡとＢはそれぞれ、完全なＣ５Ｅ１０重鎖のヌクレオチド配列と、ＣH２ドメインが欠失している誘導されたドメイン欠失Ｃ５Ｅ１０構築体のヌクレオチド配列を示す。
【図８】ＡとＢはそれぞれ、Ｃ５Ｅ１０軽鎖のヌクレオチド配列と、同じ軽鎖の対応するアミノ酸配列を示す。
【図９】ＬＳ１４７Ｔ腫瘍担持マウス中の、種々のラジオアイソトープで標識した完全なｈｕｃＣＣ４９とｈｕｃＣＣ４９．ΔＣH２の血液クリアランス速度のグラフを示す。
【図１０】Ａ、ＢおよびＣはそれぞれ、ダウジ（Daudi）（ＣＤ２０＋）腫瘍ネズミ異種移植片モデルで測定した、放射能標識した完全なＣ２Ｂ８、Ｃ２Ｂ８．Ｆ(ab')2、およびＣ２Ｂ８．ΔＣH２の血液クリアランスと腫瘍局在化速度のグラフを示す。
【図１１】抗新生物薬の個々の使用と比較した、放射能標識ｈｕｃＣＣ４９．ΔＣH２とエトポシドの組合せにより提供される相乗作用を例示する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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