(57)【要約】本発明は核酸の修飾のための方法および組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的組成物中の核酸分子を修飾する方法であって、前記方法が、前記生物学的組成物と、式：
【化１】
2005524707.tif 000034
式中、各R1は、独立に、H、C2-4アルケニル、フェニルおよびベンジルからなる群から選択される、
を有する化合物またはその塩とを接触させるステップを含み、前記接触が、前記生物学的組成物中の核酸分子の少なくとも一部を修飾するのに充分な条件下および期間で行われる、前記方法。
【請求項２】
化合物が：
【化２】
2005524707.tif 000035
である、請求項１に記載に記載の方法。
【請求項３】
生物学的組成物中の核酸分子を修飾する方法であって、前記方法が、前記生物学的組成物と、式：
【化３】
2005524707.tif 000036
式中、各R1は、独立に、H、C1-4アルキル、C2-4アルケニル、フェニルおよびベンジルからなる群から選択され、但し、少なくとも１つのR1はフェニルまたはベンジルである、
を有する化合物またはその塩とを接触させるステップを含み、前記接触が、前記生物学的組成物中の核酸分子の少なくとも一部を修飾するのに充分な条件下および期間で行われる、前記方法。
【請求項４】
化合物が：
【化４】
2005524707.tif 000037
のうちの１種である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
生物学的組成物中の核酸分子を修飾する方法であって、前記方法が、前記生物学的組成物と、式：
【化５】
2005524707.tif 000038
式中、R1は、H、C1-4アルキル、C2-4アルケニル、フェニルおよびベンジルからなる群から選択される、
を有する化合物またはその塩とを接触させるステップを含み、前記接触が、前記生物学的組成物中の前記核酸分子の少なくとも一部を修飾するのに充分な条件下および期間で行われる、前記方法。
【請求項６】
化合物が：
【化６】
2005524707.tif 000039
である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
生物学的組成物中の核酸分子を修飾する方法であって、前記方法が、前記生物学的組成物と、式：
【化７】
2005524707.tif 000040
式中、R1は、C1-4アルキルであり、R2およびR3はそれぞれ、独立に、HまたはC1-4アルキルである、
を有する化合物またはその塩とを接触させるステップを含み、前記接触が、前記生物学的組成物中の前記核酸分子の少なくとも一部を修飾するのに充分な条件下および期間で行われる、前記方法。
【請求項８】
化合物が：
【化８】
2005524707.tif 000041
である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
生物学的組成物中の核酸分子を修飾する方法であって、前記方法が、前記生物学的組成物と：
【化９】
2005524707.tif 000042
またはその塩とを接触させるステップを含み、前記接触が、前記生物学的組成物中の前記核酸分子の少なくとも一部を修飾するのに充分な条件下および期間で行われる、前記方法。
【請求項１０】
生物学的組成物中の核酸分子を修飾する方法であって、前記方法が、前記生物学的組成物と、式：
【化１０】
2005524707.tif 000043
を有する化合物またはその塩とを接触させるステップを含み、前記接触が、前記生物学的組成物中の前記核酸分子の少なくとも一部を修飾するのに充分な条件下および期間で行われる、前記方法。
【請求項１１】
生物学的組成物が、哺乳類血液、赤血球濃厚液、血小板濃厚液、血漿、多血小板血漿、胎盤抽出物、哺乳類細胞培養物、哺乳類培養培地、発酵産物、血漿濃縮物、血漿タンパク質分画、精製血中タンパク質、血漿分画からの上清もしくは沈殿物、低温沈殿物、低温上清、または、正常な細胞もしくは形質転換された細胞による細胞培養において産生された生成物である、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
生物学的組成物が、精製された哺乳類除核細胞の調製物である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
除核細胞が赤血球である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
除核細胞が血小板である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
核酸分子が、微生物の核酸分子である、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
微生物がウイルスを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ウイルスが、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルスおよびパルボウイルスからなる群より選択される少なくとも１種のウイルスを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
微生物がバクテリアを含む、請求項１５に記載の方法。    
【請求項１９】
バクテリアが、表皮ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌、セレウス菌、大腸菌、肺炎桿菌、セラチア  マルセッセンス、セラチア  リクファシエンス、ウェルシュ菌、化膿連鎖球菌、緑色連鎖球菌、プロピオニバクテリウム  アクネス、コリネバクテリウム  ジフテロイドス、アスペルギルス  テレウス、ネズミチフス菌、サルモネラ  コレリアスイス、エルシニア  エンテロコリティカ、緑膿菌、シュードモナス  プチダ、エンテロバクター  アエロゲネス、およびエンテロバクター クロカエからなる群より選択される少なくとも１種のバクテリアを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
微生物が寄生虫を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
寄生虫が、プラスモジウム、バベシア  ミクロティ、バベシア  ジベルゲンス、リーシュマニア  トロピカ、リーシュマニア、リーシュマニア  ブラジリエンシス、リーシュマニア  ドノバニ、トリパノソーマ  ガムビエンセ、トリパノソーマ  ローデシエンセ、トリパノソーマ  クルジ、およびトキソプラズマ  ゴンディからなる群より選択される少なくとも１種の寄生虫を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
化合物と核酸分子との間の接触が、生物学的組成物中の感染微生物の数を減少させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
感染微生物の数が少なくとも１log減少する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
感染微生物の数が少なくとも２log減少する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
化合物を接触させた生物学的組成物を哺乳動物に輸血するステップをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
不活性化化合物の少なくとも一部が、輸血前に取り除かれる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
不活性化化合物が、不活性化化合物を接触させた生物学的組成物を洗うことにより取り除かれる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
哺乳動物がヒトである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
方法が、接触させるステップの後に、クエンチング剤を用いて化合物をクエンチングすることをさらに含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
クエンチング剤を接触させた生物学的組成物を、哺乳動物に輸血するステップをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
哺乳動物がヒトである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
クエンチング剤が可溶性である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
クエンチング剤が固体担体に結合している、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
式：
【化１１】
2005524707.tif 000044
式中、各R1は、独立に、H、C1-4アルキル、C2-4アルケニル、フェニルおよびベンジルからなる群から選択され、但し、少なくとも１つのR1はフェニルもしくはベンジルである、
を有する精製化合物またはその塩。
【請求項３５】
不活性化化合物が、
【化１２】
2005524707.tif 000045
またはその塩のうちの１種である、請求項３４に記載の化合物。
【請求項３６】
式：
【化１３】
2005524707.tif 000046
のうちの１つを有する精製化合物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連する出願
本出願は、２００２年５月６日に出願された米国仮出願60/378,184の35 U. S. C. §119(e)に基づく利益を主張する。
技術分野 
本発明は、核酸の修飾のための方法および組成物に関する。
【０００２】
発明の背景
外傷の後（または手術中）、生体は、血液の喪失による死を回避するために輸血を必要とすることがある。ヒトおよびある家畜においては、輸血は、輸血をしなければ血液の喪失により死んでいたであろう損傷した個体の生存を可能にしてきた。
全血は、多くの異なるタイプのタンパク質および細胞から構成されている。血中タンパク質は、抗体、補体タンパク質、および血液凝固カスケードに関与するタンパク質を含む。
さらに、それぞれの異なるタイプの血液細胞は、生体の健康の維持において固有の役割を果たしている。例えば、赤血球は、多細胞生体の細胞におよび多細胞生体の細胞から、酸素および二酸化炭素を運搬するのに不可欠である。他のタイプの血液細胞である血小板は、血液凝固の開始に関与する；血小板減少症患者は、血小板が欠乏しており出血性疾患になりやすい。
【０００３】
生物学的組成物中において検出される微生物を、不活性化することができる剤を同定することが望まれている。輸血は、提供者の血液から被提供者に血液感染性のウイルスを感染させる危険がある。血液または血液製剤によるウイルス性疾患（例えば、Ａ、ＢおよびＣ型肝炎、後天性免疫不全症候群およびサイトメガロウイルス感染）の感染は、医療における重大な問題である。提供者の血液のウイルスマーカーによるスクリーニングは、被提供者へのウイルス感染を減少させるのに役立ち得るが、多くのスクリーニング方法は、数種の個々のウイルスに対するものでしかなく、したがって、不充分であるかまたは１００％感受性でない。バクテリアの感染はまた、輸血の被提供者に重大なリスクをもたらす。保存条件がバクテリアの汚染を数倍に増加させる場合もあり、輸血の被提供者において敗血症をひきおこす。効果的な処置はいずれも、毒性または発ガン性を惹起することなく、広いスペクトルのセルフリー（cell-free）および細胞に関連した（cell-associated）ウイルスおよびバクテリアを不活性化すべきであるので、細胞生物学的組成物から産生されるかまたは生物学的組成物を含む安全な製剤を保証することは困難になっている。
さらに、ヒトまたは脊椎動物用の最大限安全で効果的な死菌ワクチン（killed vaccine）の製造には、生きた微生物、例えばウイルス、バクテリアおよび寄生虫を、完全かつ確実に非感染性にする方法が必要である。
【０００４】
発明の概要
概して、本発明は、核酸の修飾のための方法および組成物に関する。特定の態様においては、方法および組成物は、インビトロまたはインビボに用いる生物学的組成物中の、ウイルス、バクテリア、または寄生虫などの微生物を不活性化するのに有用である。
したがって、１番目の態様において、本発明は、生物学的組成物中の核酸分子を修飾する方法に関する。この方法は、生物学的組成物と、式（I)：
【化１】
2005524707.tif 000002
式中、各R1が、独立に、H、C2-4アルケニル、フェニルおよびベンジルからなる群から選択される、
を有する、アジリジノ（aziridino）不活性化化合物（inactivating  compound）またはその塩とを接触させるステップを含み、前記接触は、生物学的組成物中の核酸分子の少なくとも一部を修飾するのに充分な条件下および期間で行われる。特定の態様においては、化合物は1-アジリジンプロパンアミンもしくは1-アジリジンブタンアミン（それぞれ、化合物１および２）である：
【化２】
2005524707.tif 000003
【０００５】
２番目の関連する態様においては、本発明は、生物学的組成物中の核酸分子を修飾するための別の方法であって、その方法は、生物学的組成物と、式：
【化３】
2005524707.tif 000004
式中、各R1は、独立に、H、C1-4アルキル、C2-4アルケニル、フェニルおよびベンジルからなる群から選択され、但し、少なくとも１つのR1はフェニルまたはベンジルである、
を有するアジリジノ不活性化化合物またはその塩とを接触させるステップを含み、ここで接触が、生物学的組成物中の核酸分子の少なくとも一部を修飾するのに充分な条件下および期間で行われる、前記方法に関する。
【０００６】
式（II）に含まれる、典型的なアジリジノ不活性化化合物は、3-フェニル-1-アジリジンプロパンアミン、N,N-ジベンジル-1-アジリジンエタンアミン、およびN-ベンジル-N-エチル-1-アジリジンエタンアミンおよび2-ベンジル-1-アジリジンエタンアミン（それぞれ化合物３、４、５および６）である。
【化４】
2005524707.tif 000005
【０００７】
三番目の態様においては、本発明は、生物学的組成物中の核酸分子を修飾するためのまた別の方法であって、この方法は、生物学的組成物と、式：
【化５】
2005524707.tif 000006
式中、R1は、H、C1-4アルキル、C2-4アルケニル、フェニルおよびベンジルからなる群から選択される、
を有するアジリジノ不活性化化合物またはその塩とを接触させるステップを含み、ここで接触が、生物学的組成物中の核酸分子の少なくとも一部を修飾するのに充分な条件下および期間で行われる、前記方法に関する。
【０００８】
式（III）を満たす、典型的な化合物は、1,1'-[イミノビス(ジメチレン)] ビスアジリジンおよび1,1'- [イミノビス(トリメチレン)] ビスアジリジン(それぞれ化合物8および9)である。
【化６】
2005524707.tif 000007
【０００９】
４番目の態様においては、本発明は、生物学的組成物中の核酸分子を修飾するためのさらに別の方法であって、この方法は、生物学的組成物と、式：
【化７】
2005524707.tif 000008
式中、R1は、C1-4アルキルであり、R2およびR3はそれぞれ、独立に、HまたはC1-4アルキルである、
を有する、アジリジノ不活性化化合物またはその塩とを接触させるステップを含み、ここで接触が、生物学的組成物中の前記核酸分子の少なくとも一部を修飾するのに充分な条件下および期間で行われる、前記方法に関する。式（IV)の典型的な化合物は：
【化８】
2005524707.tif 000009
である。
【００１０】
５番目の態様においては、本発明は、生物学的組成物中の核酸分子を修飾するためのさらに別の方法であって、この方法は、前記生物学的組成物と下記のアジリジノ不活性化化合物：
【化９】
2005524707.tif 000010
またはその塩のうちの１種とを接触させるステップを含み、ここで接触が、生物学的組成物中の核酸分子の少なくとも一部を修飾するのに充分な条件下および期間で行われる、前記方法に関する。
【００１１】
６番目の態様においては、本発明は、生物学的組成物中の核酸分子を修飾するためのまた別の方法であって、この方法は、生物学的組成物と、式：
【化１０】
2005524707.tif 000011
を有するアジリジノ不活性化化合物またはその塩とを接触させるステップを含み、ここで接触が、生物学的組成物中の核酸分子の少なくとも一部を修飾するのに充分な条件下および期間で行われる、前記方法に関する。式（V)の典型的な化合物は：
【化１１】
2005524707.tif 000012
である。
【００１２】
本発明の化合物のアジリジノ環は、Xが-Cl、-Br、-F、-I、-O-S(=O)2-CH3、-O-S(=O)2-CH2-C6H5、または-O-S(=O)2-C6H4-CH3である、構造X-CH2-CH2-N-により置換されていてもよい。例えば、式(I)の化合物の置換された形態は、 Xが、-Cl、-Br、-F、-I、-O-S(=O)2-CH3、-O-S(=O)2-CH2-C6H5、または-O-S(=O)2-C6H4-CH3であり、各R1が、独立に、H、C2-4アルケニル、フェニルおよびベンジルからなる群から選択される、下記式： 
X-CH2-CH2-N-(CH2)(3-5)-N(Rl)2           (VI)
を有してもよい。Xが、-Cl、-Br、-F、または-Iである場合には、これらの化合物はしばしばナイトロジェン  マスタード（nitrogen mustard）と呼ばれる。ナイトロジェン  マスタードは、強力な求電子剤であり、直接または各アジリジンへの中間変換を介して核の塩基（nucleic base）の求核基をアルキル化する。１つの態様においては、これらの置換された化合物は、生物学的組成物中の核酸を修飾するためおよび／または微生物を不活性化するために、アジリジノ不活性化化合物として用いられてもよい。
【００１３】
本発明の不活性化化合物は、生理学的ｐHで１個または２個以上の窒素がプロトン化される（すなわち、正電荷を帯びる）。例えば、式(I)(II)および(III)のプロトン化された化合物は、各下記式：
【化１２】
2005524707.tif 000013
式中、各R1が、独立に、H、C2-4アルケニル、フェニルおよびベンジルからなる群から選択され、Xは薬学的に許容しうる対イオン（counter-ion）（例えば、硫酸塩、硝酸塩、ハロゲン化物、トシレート、リン酸塩など）である、
を有する。式（VIII）または（IX）に含まれる化合物において、またC1-4アルキルであってもよい。式（VIII）に含まれる化合物はまた、フェニルまたはベンジルであるR1を少なくとも１つ有する。
本明細書で記載され、（また「塩」として言及される）、化合物のこれらのプロトン化した形態および、本発明の方法におけるこれらの使用は、特に本発明の一部として含まれる。
【００１４】
本明細書において記載される本発明の化合物はまた、ジアステレオマーおよびエナンチオマーなどの異性体、ラセミ混合物を含む異性体の混合物、溶媒和物およびこれらの多形を含む。
１番目、２番目、３番目、４番目、５番目または６番目の態様の１つの態様においては、生物学的組成物中に同様に存在する非核酸分子成分、例えば細胞またはタンパク質、炭水化物もしくは脂質などの生体高分子が、その機能において実質的に修飾されることなく、核酸分子の修飾または微生物の不活性化が達成される。１番目、２番目、３番目、４番目、５番目または６番目の態様の特に好ましい態様においては、生物学的組成物中に同様に存在する非核酸分子成分、例えば細胞またはタンパク質などの生体高分子の構造および機能を維持したまま、核酸分子の修飾が行われる。
【００１５】
この生体高分子の修飾の程度は、例えば、オートラジオグラフィーまたは適切な方法による検出を用いた、等電点電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣおよび他の形態のクロマトグラフィーを含む、当分野において既知の方法により決定され得る。細胞機能の修飾は、本明細書で用いられているように、細胞の生成物の代謝的または機構的完全性における影響となる。細胞機能の修飾は、既知の方法を用いて、ＡＴＰなどの細胞機能の維持に用いられる基質を生成する細胞の能力を含む、代謝のパラメーターを観察することにより決定されてもよい。機構的完全性は、本明細書において用いられているように、細胞膜構造の可変性の維持に関連する。機構的完全性の減少は、既知の方法を用いて検出し得る細胞溶解（例えば、赤血球の溶血反応）の傾向が増加する結果となる。細胞機能における実質的な変化は、本明細書で用いられているように、細胞生成物の治療的有用性を減少させる。例えば、赤血球の場合においては、実質的な変化は、導入から２４時間後に循環血液中に残っている血液細胞が７５％未満になるという結果をもたらす。
【００１６】
１番目、２番目、３番目、４番目、５番目または６番目の態様のまた別の態様においては、修飾される核酸分子は、微生物の核酸分子であり、これにより微生物の不活性化（すなわち、微生物の複製の不能）がもたらされる。本発明の方法により不活性化される微生物は、例えば、細胞に含まれる（cell-contained）もしくはセルフリー（cell-free）であるウイルス、バクテリアまたは寄生虫を含む。
本発明の方法および化合物により不活性化されるウイルスは、DNAおよびRNAウイルスもしくはウイロイドを含む。本発明の方法により不活性化されるウイルスは、被膜（enveloped）もしくは非被膜（non-enveloped）ウイルスの両方を含む。好ましい態様においては、不活性化されるウイルスは、感染性の脊椎動物ウイルスである。特に好ましい態様においては、不活性化されるウイルスは、感染性のヒトウイルスである。典型的なウイルスは：ポックスウイルス（poxvirus）、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、パポバウイルス（papovavirus）、パルボウイルス（parvovirus）、レオウイルス（reovirus）、オルビウイルス（orbivirus）、ピコルナウイルス（picornavirus）、ロタウイルス（rotavirus）、アルファウイルス（alphavirus）、ルビウイルス（rubivirus）、例えばAおよびB型を含むインフルエンザウイルス、フラビウイルス（flavivirus）、コロナウイルス（coronavirus）、パラミクソウイルス（paramyxovirus）、モービリウイルス（morbillivirus）、ニューモウイルス（pneumovirus）、ラブドウイルス（rhabdovirus）、リッサウイルス（lyssavirus）、オルトミクソウイルス（orthmyxovirus）、ブンヤウイルス（bunyavirus）、フレボウイルス（phlebovirus）、ナイロウイルス（nairovirus）、ヘパドナウイルス（hepadnavirus）、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、アレナウイルス（arenavirus）、ヒト免疫不全ウイルスを含むレトロウイルス、エンテロウイルス（enterovirus）、ライノウイルス（rhinovirus）および／またはフィロウイルス（filovirus）を含む。TTVは、さらなる典型的なウイルスである。
本発明の方法および組成物により不活性化されるウイルスは、死菌ワクチンに含まれていてもよい。
【００１７】
本発明の方法および化合物は、限定されないが、グラム陰性またはグラム陽性バクテリアを含む感染性バクテリアを不活性化するために用いられてもよい。本発明の化合物および方法により不活性化されるグラム陽性バクテリアは、パスツレラ（Pasteurella）属、ブドウ球菌（Staphylococci）属および 連鎖球菌（Streptococcus）属を含むが、これらに限定されない。本発明の化合物および方法により不活性化されるグラム陰性バクテリアは、大腸菌、シュードモナス属（Pseudomonas）およびサルモネラ属を含むが、これらに限定されない。本発明の化合物および方法により不活性化される感染性バクテリアの具体例は、限定されないが：ヘリコバクター  ピロリ（Helicobacter pylori）、ボレリア  ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）、レジオネラ  ニューモフィラ（Legionella pneumophila）、マイコバクテリア（Mycobacteria）属 (例えば、M. tuberculosis、M. avium、M. intracellulare、M. kansaii、M. gordonae)、セレウス菌（Bacillus cereus）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、リステリア菌（Listeria monocytogenes）、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes） (A群連鎖球菌)、アガラクチア菌（Streptococcus agalactiae）(B群連鎖球菌)、緑色連鎖球菌（Streptococcus viridans ）(ビリダンス群)、大便連鎖球菌（Streptococcus faecalis）、ストレプトコッカス  ボビス（Streptococcus bovis）、連鎖球菌（Streptococcus）(嫌気性種)、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、病原性カンピロバクター（Campylobacter）属、エンテロコッカス（Enterococcus）属、ヘモフィラス  インフルエンザ（Haemophilus influenzae）、炭疽菌（Bacillus anthracis）、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）、コリネバクテリウム  ジフテロイドス（Corynebacterium diphtheroides）、ブタ丹毒菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）、破傷風菌（Clostridium tetani）、エンテロバクター  アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、およびエンテロバクター クロカエ（Enterobacter cloacae）、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、パスツレラ  ムルトシダ（Pasteurella multocida）、バクテロイド（Bacteroides）属、フソバクテリウム ナクレタム（Fusobacterium nucleatum）、ストレプトバシラス  モニリフォルミス（Streptobacillus moniliformis）、トレポネーマ  パリジウム（Treponema pallidium）、トレポネーマ  ペルテヌエ（Treponema pertenue）、レプトスピラ（Leptospira）属、リケッチア（Rickettsia）属、イスラエル放線菌（Actinomyces israelii）、大腸菌（Escherichia coli）、セラチア  マルセッセンス（Serratia marcescens）、セラチア  リクファシエンス（Serratia liquefaciens）、プロピオニバクテリウム  アクネス（Propionibacterium acnes）、アスペルギルス  テレウス（Aspergillus terreus）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、サルモネラ  コレリアスイス（Salmonella choleriasuis）、エルシニア  エンテロコリティカ（Yersinia enterocolitica）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、およびシュードモナス  プチダ（Pseudomonas putida）を含む。さらなる典型的なバクテリアは、バルトネラ（Bartonella）spp.、トロフェリマ  フィッペリ（Tropheryma whippelii）、例えば肺炎マイコプラズマ（Mycoplasma pneumoniae）などのマイコプラズマ（Mycoplasma）、および例えば肺炎クラミジア（Chlamydophila pneumoniae）などのクラミジア（Chlamydophila）である。
本発明の組成物および方法により不活性化されるバクテリアは、死菌ワクチンに含まれていてもよい。
【００１８】
本発明の方法および組成物により不活性化される寄生虫の例は、下記：プラスモジウム（Plasmodium）、バベシア  ミクロティ（Babesia microti）、バベシア  ジベルゲンス（Babesia divergens）、リーシュマニア  トロピカ（Leishmania tropica）、リーシュマニア（Leishmania）、リーシュマニア  ブラジリエンシス（Leishmania braziliensis）、リーシュマニア  ドノバニ（Leishmania donovani）、トリパノソーマ  ガムビエンセ（Trypanosoma gambiense）、トリパノソーマ  ローデシエンセ（Trypanosoma rhodesiense）(アフリカ睡眠病（African sleeping sickness)）、トリパノソーマ  クルジ（Trypanosoma cruzi ）(シャーガス病（Chagas’ disease）)、およびトキソプラズマ  ゴンディ（Toxoplasma gondii ）などの血液感染性および／または組織寄生虫である。
本発明の組成物および方法により不活性化される寄生虫は、死菌ワクチンに含まれていてもよい。
【００１９】
本発明の組成物および方法は、不活性化ステップの前の生物学的組成物中の微生物の数と比較して、不活性化化合物を接触させた生物学的組成物中の感染性微生物の数を減少させる。ある態様においては、不活性化化合物を接触させた生物学的組成物中の感染性微生物の数は、不活性化ステップの前の生物学的組成物中における微生物の数と比較して、少なくとも１log、好ましくは少なくとも２log、好ましくは少なくとも３log、またはさらに好ましくは少なくとも４log減少する。好ましい態様においては、不活性化化合物を接触させた生物学的組成物中の感染性微生物の数は、不活性化ステップの前の生物学的組成物中における微生物の数と比較して、少なくとも５log、さらに好ましくは少なくとも６log、さらに好ましくは少なくとも７log、さらに好ましくは少なくとも８log、そしてさらに好ましくは少なくとも９log減少する。不活性化化合物を接触させた生物学的組成物中の感染性微生物の数が、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４または１５logも減少することも可能である。
【００２０】
１番目、２番目、３番目、４番目、５番目または６番目の態様のうちのある態様において、生物学的組成物は、血液、構成を含む赤血球、赤血球濃厚液、血小板濃厚液、血漿、多血小板血漿、胎盤抽出物、細胞培養生成物または細胞培養培地、発酵産物、あるいは腹水である。別の態様においては、生物学的組成物は、血清、血液細胞タンパク質、血漿濃縮物、血漿タンパク質分画、精製もしくは部分的に精製された血中タンパク質または他の成分、血漿のあらゆる分画からの上清もしくは沈殿物、精製もしくは部分的に精製された血液成分（例えばタンパク質または脂質）、コロストロム（colostrum）、乳汁（milk）、尿、だ液、細胞溶解物、低温沈殿物、低温上清、あるいはこれらの一部または派生物、血液細胞中で誘導されたタンパク質を含有する組成物、および、正常な細胞もしくは形質転換された細胞（例えば、組み換えDNAまたはモノクローナル抗体技術）による細胞培養において産生された生成物を含有する組成物である。本発明の好ましい態様において、生物学的組成物は脊椎動物由来である。他の好ましい態様においては、生物学的組成物は哺乳動物由来である。本発明のさらに好ましい態様において、生物学的組成物はヒト由来である。本発明の特に好ましい態様において、生物学的組成物は精製されたヒト除核細胞組成物であり、特には、精製された赤血球組成物である。
【００２１】
必要であれば、１番目、２番目、３番目、４番目、５番目または６番目の態様の方法は、ヒトなどの哺乳動物に不活性化化合物を接触させた生物学的組成物を輸血するステップをさらに含んでもよい。前記の不活性化化合物の少なくとも一部は、例えば洗浄または固体相の除去により、輸血前に除去されてもよい。不活性化化合物の除去に加え（または代わりに）、不活性化化合物は接触させるステップの後に、クエンチング剤（quenching agent）を用いてクエンチングされ（quenched）てもよい。クエンチング剤は、可溶性であってもよく、引き続き取り除かれ得る固体担体に結合していてもよい。
【００２２】
また、上記の方法のうちの１つにより生成した不活性化された微生物は、ハーベストされ、動物（例えばヒト）にその微生物に対するワクチンを接種するための免疫原として用いられてもよい。したがって、１番目、２番目、３番目、４番目、５番目または６番目の態様の方法はまた、ヒトもしくは他の動物への投与のためのワクチンまたは免疫原を作製するための方法と考えることもできる。不活性化された微生物を含む組成物がまた提供され、これは１種または２種以上のアジュバントを任意に含んでよい。
【００２３】
７番目の態様においては、本発明は、式：
【化１３】
2005524707.tif 000014
式中、各R1は、独立に、H、C1-4アルキル、C2-4アルケニル、フェニルおよびベンジルからなる群から選択され、但し、少なくとも１つのR1はフェニルまたはベンジルである、
を有する精製された化合物に関する。式（II）に含まれる不活性化化合物は、例えば、上記の3-フェニル-1-アジリジンプロパンアミン、N,N-ジベンジル-1-アジリジンエタンアミン、およびN-ベンジル-N-エチル-1-アジリジンエタンアミンおよび2-ベンジル-1-アジリジンエタンアミン（それぞれ化合物３、４、５および６）である。
８番目の態様においては、本発明は：
【化１４】
2005524707.tif 000015
から選択される精製された化合物に関する。
【００２４】
本発明の化合物および方法は、キットの一部として、例えば病院、研究室などのあらゆる状況において、細胞またはタンパク質を含有する組成物中の、ウイルス、バクテリアまたは寄生虫、特に血液感染性のウイルス、バクテリアまたは寄生虫を不活性化させるために用いられ得る。細胞組成物はまた種々のタンパク質を含むので、本明細書において記載される微生物の不活性化方法は、限定されないが、凝固因子（因子VIIIおよび因子IXなど）、血清アルブミンまたは免疫グロブリンを含有する分画を含む、血漿タンパク質分画または精製された血液製剤などのタンパク質分画にも適用できる。微生物の不活性化は、本明細書において記載されるように、本発明の化合物でタンパク質分画または精製されたタンパク質を処理することにより達成される。
【００２５】
ある態様においては、１種以上の不活性化アジリジノ化合物を生物学的組成物と接触させてもよい。ある態様においては、本発明の方法および組成物は、ウイルスを不活性化するさらなる他の方法を組み合わせてもよい。例えば、本発明の化合物および方法は、参照により本明細書に組み込まれる、Budowskyらの米国特許6,369, 048号により記載されている溶媒／界面活性剤法（Solvent/Detergent procedure）において用いられてもよい。他の例においては、医薬製剤の調製において用いられるいくつかの方法（例えば、低pHの緩衝液中でのクロマトグラフィー、またはカルシウムキレート剤を含有する酸性溶液中での赤血球の保存など）は、選択された感受性の高いウイルス、通常は被膜ウイルスに対して偶然的なウイルス不活性化特性を有することがある。
他の態様においては、血液製剤が、本発明の方法および組成物により汚染が除去されて提供される。
【００２６】
「精製された」により、示される成分を少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、よりさらに好ましくは少なくとも９５％、そして最も好ましくは少なくとも９８％の体積または重量で含む調製物または組成物が意味される。例えば、赤血球の精製された調製物は、赤血球の体積により少なくとも５０％を含有し、一方、精製された3-フェニル-1-アジリジンプロパンアミンは、3-フェニル-1-アジリジンプロパンアミンの体積により少なくとも５０％が存在する。 
「核酸」により、１本鎖および２本鎖の両者、DNAおよびRNAの両者が意味される。
核酸について言及している場合には、「修飾すること」、「修飾」または「修飾する」は、例えば、複製するまたはメッセージ（message）を転写もしくは翻訳する能力が破壊されることにより、DNAまたはRNAの鋳型活性が実質的に消失することを意味する。例えば、RNA分子の翻訳の阻害は、適切なインビトロまたはインビボでの翻訳システムにおいて産生される明確な量のRNAによってコードされたタンパク質の量を測定することにより決定されてもよい。
【００２７】
微生物について言及する場合に、「不活性化すること」、「不活性化」または「不活性化される」とは、その増殖能を消失させることを意味する。バクテリアまた寄生虫について言及する場合には、この語は、複製もしくは増殖できる生きたバクテリアまたは寄生虫の数を減少させることを意味する。ウイルスについて言及する場合には、この語は、ミリリットルあたりの感染性ウイルス粒子の感染性力価もしくは数の減少として測定される、感染性ウイルス粒子の数を減少あるいは消失を意味する。感染性ウイルス粒子のそのような減少は、当業者によく知られたアッセイによって決定される。
「微生物不活性化条件」とは、本発明の化合物とインキュベートされた微生物が不活性化される条件をいう。例えば、所望の程度にまで微生物を不活性化するための、処理時間、pH、温度、塩の組成、イオン強度および不活性化化合物の濃度などの変数が含まれる。
【００２８】
「微生物の少なくとも一部を不活性化する」とは、感染性微生物の数が、不活性化ステップの前の生物学的組成物中における微生物の数に対して、少なくとも１log、好ましくは少なくとも２log、好ましくは少なくとも３log、またはさらに好ましくは少なくとも４log減少することを意味する。好ましい態様においては、不活性化化合物を接触させた生物学的組成物中の感染性微生物の数は、不活性化ステップの前の生物学的組成物中における微生物の数に対して、少なくとも５log、さらに好ましくは少なくとも６log、さらに好ましくは少なくとも７log、さらに好ましくは少なくとも８log、そしてさらにより好ましくは少なくとも９log減少する。不活性化化合物を接触させた生物学的組成物中の感染性微生物の数が、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４または１５logも減少することも可能である。
【００２９】
同様に、「核酸分子の少なくとも一部を修飾する」とは、処理された生物学的組成物中の核酸分子のうちの少なくとも５０％が修飾されていること、好ましくは処理された生物学的組成物中の核酸分子のうちの少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％が修飾されていることを意味する。核酸の修飾を検出するための方法は、質量分析または放射性標識されたアジリジノ化合物のいずれかを用いて共有結合の化学的付加の検出を含む。核酸の修飾を検出するための他の方法は、核酸分子がポリメラーゼ酵素により複製される能力が評価される、PCRという分子科学技術を用いるものである。適切なプライマーが用いられる場合には、核酸の損傷の存在は、複製される核酸分子の能力の喪失という結果をもたらし得る。
【００３０】
「生物学的組成物」とは、細胞またはタンパク質を含有する組成物を意味する。細胞を含有する組成物は、例えば、血液、赤血球濃厚液、血小板濃厚液、血漿、多血小板血漿、胎盤抽出物、細胞培養生成物または細胞培養培地、発酵産物、および腹水を含む。生物学的組成物はまた、セルフリーであってもよい。タンパク質を含有する生物学的組成物は、例えば、血清、血液細胞タンパク質、血漿濃縮物、血漿タンパク質分画、精製もしくは部分的に精製された血中タンパク質または他の成分、血漿のあらゆる分画からの上清もしくは沈殿物、精製もしくは部分的に精製された血液成分（例えばタンパク質または脂質）、コロストロム、乳汁、尿、だ液、細胞溶解物、低温沈殿物、低温上清、あるいはこれらの一部または派生物、血液細胞中で誘導されたタンパク質を含有する組成物、および、正常な細胞もしくは形質転換された細胞（例えば、組み換えDNAまたはモノクローナル抗体技術）による細胞培養において産生された生成物を含有する組成物を含む。本発明の好ましい態様において、生物学的組成物は脊椎動物由来である。他の好ましい態様においては、生物学的組成物は哺乳動物由来である。本発明のさらに好ましい態様において、生物学的組成物はヒト由来である。本発明の特に好ましい態様において、生物学的組成物は精製されたヒト除核細胞であり、特には、精製された赤血球である。
【００３１】
「除核細胞」とは、成熟している場合に核を欠失している細胞を意味する。除核細胞の例は、血小板および赤血球である。
「不活性化化合物をクエンチングしない溶液」とは、クエンチング剤（例えば、チオホスフェートまたはチオサルフェート）を含有しない溶液を意味する。クエンチング剤は、化合物と接触する場合には、接触された不活性化化合物を非反応性にならしめる。本発明の化合物と反応しない典型的な溶液は、バッファリングされていない（unbuffered）生理食塩水および水である。
「クエンチング剤」とは、本発明の化合物と接触した場合に、接触された不活性化化合物を非反応性にならしめることができる化合物を意味する。典型的なクエンチング剤は、チオホスフェートまたはチオサルフェートであり、あるいはチオホスフェートまたはチオサルフェートを含有する化合物である。
本発明の他の特徴および利点は、以下の記載により明らかになるであろう。
【００３２】
発明の詳細な説明
本発明は、生物学的組成物中の核酸を、不活性化アジリジノ化合物を前記組成物に接触させることにより、修飾する組成物および化合物に関する。例えば、本発明の方法および組成物は、微生物を不活性化する条件下で、本発明の不活性化アジリジノ化合物を前記組成物に接触させることにより、生物学的組成物中の微生物の核酸分子を修飾するために用いられてもよく、これにより微生物の不活性化がもたらされる。本発明の不活性化アジリジノ化合物は、下記４つの式：
【化１５】
2005524707.tif 000016
式中、各R1は、独立に、H、C2-4アルケニル、フェニルおよびベンジルからなる群から選択される、
のうちの１つを有してもよい。式（II）または（III）に含まれる化合物において、またC1-4アルキルであってもよい。式（II）に含まれる化合物は、フェニルまたはベンジルであるR1を少なくとも１つ有する。
【００３３】
本発明のアジリジノ不活性化化合物は、また、下記構造：
【化１６】
2005524707.tif 000017
式中、R1がC1-4アルキルであり、R2およびR3がそれぞれ独立に、HまたはC1-4アルキルである、
を有していてもよい。
さらに、本発明のアジリジノ不活性化化合物は、下記構造：
【化１７】
2005524707.tif 000018
のうちの１つを有してもよい。
【００３４】
微生物中の核酸分子を含む核酸分子は、核酸もしくは核酸を含む微生物を含有する組成物を、約０．０１M〜約０．５Mのイオン強度を有する溶液中における、約０．００００１〜約０．２５０M、好ましくは約０．０００１〜約０．０１５Mの本発明による不活性化アジリジノ化合物に、約４．５〜８．５、好ましくは約６．０〜８．０、好ましくは約６．５〜７．５のpHで、約４℃〜約６０℃、好ましくは約４℃〜約３０℃の温度にて、核酸を所望の程度にまで修飾するのに充分な時間で接触させることにより、修飾される。反応時間は約１分〜約５００時間までであり、例えば、約１分、約１時間、約６時間、約１２時間、約２４時間、約４８時間または約148時間であってもよい。用いられる塩は、生物学的用途に用いられる通常の塩のいずれでもよく、ナトリウム、カリウム、酢酸塩などを含む。当業者は、酢酸、HEPES、MOPSなどの、生体高分子または細胞を扱うために当分野において通常用いられる多くのバッファーを用いて、溶液のpHを調整することができる。
【００３５】
当業者はまた、反応物質の濃度、温度、インキュベーション時間などの因子を調整することができる。しかし、反応速度、反応溶液のイオン強度、温度およびアジリジノ不活性化化合物の濃度は、相互依存的であることに注意すべきである。一般的に、アジリジノ不活性化化合物の濃度、反応温度を上昇させること、および／またはイオン強度を減少させることは、所望の程度の核酸の修飾または微生物の不活性化を達成するための、反応時間が短くなるという結果をもたらす。したがって、当業者は、反応温度を上昇させることにより、所望の程度の核酸の修飾または微生物の不活性化を達成するための、アジリジノ不活性化化合物の濃度、反応時間を減少させ、および／またはイオン強度を増加させる。同様に、反応溶液のイオン強度の増加は、所望の程度の核酸の修飾または微生物の不活性化を達成するための、より長い反応時間、増加したアジリジノ不活性化化合物の濃度またはより上昇した温度をもたらす。
【００３６】
本発明のアジリジノ不活性化化合物は、例えば、赤血球を、治療環境における使用に（例えば輸血における使用に）好適なまま、赤血球調製物を汚染している微生物（例えば、ウイルス、バクテリアおよび／または寄生虫）を不活性化するための、赤血球調製物の処理における使用に適している。
被提供動物に、処理された赤血球を導入する前に、細胞からアジリジノ化合物を除去するまたはアジリジノ化合物の濃度を減少させることが望ましい。
細胞を含む生物学的組成物、例えば処理された赤血球調製物からアジリジノ化合物を除去する１つの方法は、参照によりその全体が参照により本明細書に組み込まれる、同時係属中の米国特許出願10/055,143号において記載されているような、適切な洗浄溶液で細胞を繰り返し洗浄することである。
【００３７】
アジリジノ不活性化化合物を除くための洗浄に加え、または、その代わりに、透析、ダイアフィルトレーション（diafiltration）、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーを含む標準的実験方法を用いて、および、静電気的または共有結合的化学反応のいずれかによるアジリジノ化合物への親和性を有する樹脂を用いることにより、アジリジノ不活性化化合物を生物学的混合物から除去することができる。前記の樹脂は、フリー形態でまたはフィルターマトリックスの一部として生物学的混合物に用いられる。
【００３８】
さらに、アジリジノ不活性化化合物を除くための洗浄に加え、または、その代わりに、アジリジノ不活性化化合物の反応性をクエンチングする剤を用いることは望ましいかもしれない。任意に、クエンチング剤およびクエンチングされる不活性化化合物は、クエンチング剤がクエンチングされた不活性化化合物と共に生物学的組成物から完全かつ確実に分離されるような、クエンチング剤に特性を与える第二の部分（別の骨格（separation moiety)）に対する求核物質に、クエンチング剤、例えばチオサルフェートまたはチオホスフェート基を結合させることにより、生物学的組成物から除去されてもよい。これら修飾されたクエンチング化合物は、本明細書に記載されている不活性化化合物などの求電子物質と反応し、それをクエンチングすることができる。クエンチングの方法は、その全部において参照により本明細書に組み込まれる、同時係属中のU.S.S.N. 09/260,375 およびU.S. Pat. Ser. No. 6,150,109において記載されている。
【００３９】
この方法は、その全部において参照により上記で本明細書に組み込まれる、Budowskyらの米国特許6,369,048号により記載されている、溶媒／界面活性剤法によりウイルスが不活性化される、タンパク質を含有する調製物から溶媒および界面活性剤を除く方法と共に両立できるというさらなる利点を有する。
ウイルス活性化に対する溶媒／界面活性剤法は、本明細書において記載された化合物により微生物の不活性化と両立できる。したがって、２つの不活性化方法は順番にまたは同時に行うことができる。また、本明細書において記載される方法を用いたクエンチング、クエンチング剤の除去、および化合物の不活性化が続いて行われる、本発明の方法の使用による微生物の不活性化は、溶媒／界面活性剤法を使用せずに行われてもよい。また、クエンチング剤が、その除去をモニターするために容易に検出できることは有利である。これは、260nmの吸収により容易に検出されるチミジンの添加により達成されてもよい。
【００４０】
本発明において用いられるチオホスフェート基は、例えば、１つの置換基により置換されていてもよく(例えば、チオホスホモノエステルとも呼ばれる、[別の骨格]-OP(=S)(OH)2)、２つの置換基により置換されていてもよく(例えば、[別の骨格]-OP(=S)(OH)(OAlk)、チオホスホジエステル)、あるいは、３つの置換基により置換されていてもよい(例えば、[別の骨格]-OP(=S)(OAlk)2、ホスホチオトリエステル)。置換基は、例えば、１〜４０の炭素原子を有する直鎖、分枝または環状飽和または不飽和炭化水素、ベンジル基、多環式芳香族基、非置換アルキル基、あるいは、ヒドロキシル、アミノ、アジドまたはシアノ基で置換されたアルキル基であってもよい。
【００４１】
ポリチオホスフェート骨格（例えば、２個または３個以上の近接するホスフェートを有する骨格）もまた、本発明において用いられてもよい。例えば、その中の１個または２個以上のホスフェート基がトリホスフェート基である、グアノシンジホスフェート (GDP)またはグアノシントリホスフェート(GTP)は、本発明において用いられてもよい。グアノシンジホスフェートの場合においては、１個または両方のホスフェート基がチオホスフェート基であってもよい。グアノシントリホスフェートの場合においては、１個、２個または全ての３個のホスフェート基がチオホスフェート基であってもよい。GDPまたはGTPは、例えば、2'または3' ヒドロキシル基において別の骨格に結合していてもよく、複素環塩基に結合していてもよい。 
本発明のクエンチングシステムは、下記のように用いられてもよい、1-アジリジンプロパンアミンなどの不活性化化合物は、本明細書において記載されるように、微生物を不活性化する条件下で、生物学的組成物に加えられる。微生物の不活性化に必要な時間の終わりに、生物学的組成物を、クエンチング剤、例えば、別の骨格に結合した１個または２個以上のチオサルフェートもしくはチオホスフェート骨格を含む化合物と接触させる。生物学的組成物およびクエンチング剤は、所望の時間、接触させておく。等価の不活性化化合物に対して過剰量のチオサルフェートまたはチオホスフェート基が一般的に用いられる。
【００４２】
チオサルフェートまたはチオホスフェート骨格は、不活性化化合物またはそのハロ誘導体塩の高い反応性骨格と反応し、これらの化合物と共有結合する。したがって、結合したチオサルフェートまたはチオホスフェート骨格が生物学的組成物から除去される場合には、クエンチングされた不活性化化合物も同様に除去される。最終的な結果は、感染性微生物（例えばウイルス）、クエンチングされた不活性化化合物およびクエンチング剤を実質的に含まない。
死菌ワクチンは、ウイルスまたは他の微生物を、微生物が不活性化する条件下で、不活性化化合物と接触させることにより作製されてもよい。微生物が不活性化する条件は、本明細書において記載されている方法から選択されてもよい。１つの例においては、約107  〜108 ユニット／mLの力価のウイルスは、約pH6.5〜約pH7.5で、約0.5M以下のイオン強度を有する溶液中において、約４℃〜約４０℃にて、不活性化剤とインキュベートされる。処理時間（不活性化の終点）は、それぞれのウイルスの構造および構成、インキュベーション温度、イオン強度、および、不活性化剤中のプロトン化し得る基もしくは正に帯電した基の数に依存する。しかし、動態（kinetic）研究は、pHおよび不活性化されるべきウイルスに依存して、インキュベーション時間は数秒くらいに短くてもよく、また、１時間、５時間、５０時間、１００時間、３００時間あるいは５００時間であってもよいことを示している。殺されたウイルスは、直接ワクチン製剤において用いられてもよく、後の薬学的に許容しうる担体との混合のために、各用量または複数の用量の容器中で凍結乾燥されていてもよい。ワクチンの製造方法は、当分野においてよく知られている。
【００４３】
本発明のワクチンは、動物またはヒトの病気の予防において有用である。所望の程度の免疫を与えることができるワクチンは、もちろん、免疫反応を惹起するのに効果的な量の不活性化された微生物を含有する。死菌ワクチンの製造においては、微生物の試料を本発明のアジリジノ不活性化剤と共に、免疫原性を維持したまま微生物を不活性化するかかる条件下でインキュベートする。
ワクチンは、アジュバント、すなわち、抗原と共に用いられる場合に免疫反応を増強する物質中において、またはアジュバントと共に、投与されてもよい。ワクチンは免疫化用量（immunization dose）で与えられる。免疫化用量は、免疫反応を生成するかまたは増強するのに必要な抗原あるいは免疫原の量である。その量は、動物および免疫原または抗原またはアジュバントによって変化するが、一般に用量あたり１０００μg以下である。妥当な宿主動物の免疫化および課題研究を統計的に行うことなどにより、免疫化用量は当業者によく知られた方法で容易に決定される。
対象に投与されるべきワクチンの特定の投与量は、微生物の性質、投与スケジュール、対象の年齢および身体的特徴などを含む種々の検討事項に依存する。適切な投与量は、医薬分野によく知られた臨床的アプローチを用いて確立されてもよい。
【００４４】
例
例１：1-アジリジンプロパンアミンの合成
1-アジリジンプロパンアミンは以下のように製造される。
【化１８】
2005524707.tif 000019
スキーム1において示されるように、アジリジン (19 mL；0.37モル) を20 mL (0.3モル) のアクリロニトリルに1.5時間かけて滴下添加した。添加は発熱性であった。添加の間、温度は40℃以下に維持した。反応混合物を室温で一晩撹拌し、 その後減圧下でvigreux蒸留装置中で蒸留した。この工程により、27.1gの無色透明液体である1-アジリジンプロパンニトリル (b.p. 56-57℃／3mm)が得られ、GCにより99.5%であった。薄層クロマトグラフィー (TLC；10％ MeOH：CHCl3)は少量のより極性の不純物を示す。NMRは構造と一致している。収率は92％であった。
【００４５】
【化１９】
2005524707.tif 000020
スキーム２について、1-アジリジンプロパンニトリル (27.1g；0.2モル)を60mLのメタノールに溶解し；これに4.8 gのラネー（Raney）2800ニッケルを加えた。反応はParr 4562 Mini 反応装置中で、約1500 psi H2 下、50℃で 約15時間行われた。反応混合物を冷却し、セライト（celite）を通してろ過し、その後メタノールで洗った。ろ過物を減圧下、vigreux蒸留装置中で蒸留した。以下のフラクションが集められた：(#1) ~100 mL 無色透明液体 (b.p. 21〜40℃／183mm)；(#2) 4.2 g 無色透明液体 (b.p. 32℃／3mm)；(#3) 4.6 g 無色透明液体 (b.p. 32oC/3mm)；(#4) 9.0 g 無色透明液体 (b.p. 32-36℃／3mm)。容器の残渣は5.6 gの濁った緑色液体で構成されていた。 
フラクション2〜4を混ぜて、減圧下でvigreux蒸留装置中で再蒸留し、下記フラクションを得た：(#1) 0.2 g 無色透明液体 (b.p. 22℃／108mm GCにより99.8％ メタノール)；(#2) 0.1 g 無色透明液体 (b.p. 22〜75℃／107mm GCにより96.6％)；(#3) 1.2 g 無色透明液体 (b.p. 22〜37℃／6 mm GCにより97.5％)；(#4) 14.7 g 無色透明液体 (b.p. 29〜37℃／6 mm GCにより97.1％)。容器の残渣は0.5 gの黄色透明液体であった。フラクション#4のNMRは1-アジリジンプロパンアミン(収率52％)の構造と一致している。
【００４６】
例２：1-アジリジンブタンアミンの合成
1-アジリジンブタンアミンは以下のように製造される。
【化２０】
2005524707.tif 000021
スキーム３について、4.84 g (0.035 モル) の(粉末になった、無水物の)炭酸カリウムを14.5 mL(0.28モル)のアジリジンに懸濁した。この混合物に素速く4.72g(0.032モル) の4-ブロモブチロニトリルを加える。〜30秒後、反応混合物が発熱した。反応混合物を氷浴中で冷却し；その間さらに５分間、反応をそのまま還流した。反応混合物を室温で一晩撹拌し、その後、減圧下でvigreux蒸留装置中で蒸留した。3.1 g の粗蒸留物(b.p. 63〜73℃／6 mm) を、35.4gの シリカゲル(70〜200メッシュ) でクロマトグラフィーを行い、CHCl3で溶出しその後10％ MeOH：CHCl3で溶出した。適切なフラクションを、減圧下(6 mm)、回転式エバポレーターで濃縮した。 その後残渣を減圧下でkugelrohr蒸留し、1.3gの1-アジリジンブタンニトリルである、無色透明液体 (b.p. 25-80℃／6mm；収率37％)を得た。TLC (9/1) (7：1：1：1/NH4OH) (7：1：1：1=nBuOH：H2O：EtOH：NH4OH) は１つのスポットを示す。純度はGCにより99.1％である。NMRは構造と一致している。
【００４７】
【化２１】
2005524707.tif 000022
スキーム４について、1.10 g (0.027モル)の水素化リチウムアルミニウムをアルゴン下でフラスコに秤量した。エーテル(54 mL) を加えて混合物を氷浴中で冷却した。3.0 g (0.027 モル) の1-アジリジンブタンニトリル を7 mLのエーテルに溶解し、15分かけて滴下添加した。添加は、発熱性であり、H2を発生した。混合物は氷浴中で撹拌した。10分後、1 mL の脱イオン水、1 mLの20％NaOH、および2 mLの脱イオン水を加えた。反応混合物を冷蔵庫中に2時間置き、その後ろ過した。固体を約100 mLのエーテルで洗い、ろ過物を最初にアルゴン下、次いで減圧下で蒸留する。大気圧蒸留をvigreux蒸留装置中で行った。減圧蒸留をkugelrohr装置中で行った。1.6 g の無色透明液体 (b.p. 25〜90℃／6 mm) が得られた。TLC (9/1) (7：1：1：1/NH4OH) (7：1：1：1=nBuOH：H2O：EtOH：NH4OH) は、より極性の不純物およびより極性が少ない不純物のトレースを示す。GCにより98.6％。NMRは1-アジリジンブタンアミンの構造と一致しており、50％の収率で1〜3％の範囲の不純物があった。
【００４８】
例3：N-ベンジル-N-エチル-1-アジリジンエタンアミンの合成
N-ベンジル-N-エチル-1-アジリジンエタンアミンは下記のように製造された。
【化２２】
2005524707.tif 000023
スキーム5について、炭酸カリウム (31.0 g；0.22 モル)、2-(エチルアミノ)エタノール (17.83 g；0.2 モル)、および100 mLのアセトニトリルを一緒に懸濁した。ベンジルブロマイド (26 mL；0.22 モル) を50 mLのアセトニトリルに溶解し、前記の懸濁物（slurry）に1 時間かけて滴下添加した。添加は発熱性であった。混合物を室温で４時間撹拌し、その後ろ過した。ろ過物を、減圧下(6 mm)、回転式エバポレーターで濃縮した。反応混合物を高真空下でvigreux蒸留装置で蒸留し、下記フラクションを得た：(#1) 1.7g 無色透明液体 (b.p. 20-75℃／0.16 mm)、GCにより97％；(#2) 22.4 g 無色透明液体 (b.p. 75-80℃／0.15 mm)、GCにより99％；(#3) 4.9 g 無色透明液体 (b.p. 74-79℃／0.15 mm)、GCにより98％；容器の残渣8.0 g 黄色ロウ状オイル。フラクション2および3を混ぜて27.8 gの無色透明液体である、N-ベンジル-2-(エチルアミノ)エタノールを得た。TLC (20％ MeOH：EtOAc) は１つのスポットを示す。NMRは構造と一致している。収率77％。
【００４９】
【化２３】
2005524707.tif 000024
スキーム6について、N-ベンジル-2-(エチルアミノ)エタノール (5.38 g；0.03 モル) および8.4 mL (0.06 モル)のトリエチルアミンを100 mLのジクロロメタンに溶解した。反応混合物は、氷浴中で0.5時間冷却した。メタンスルホニルクロライド(4.7 mL；0.06 モル)を11 mLのジクロロメタンに溶解し、前記の反応混合物に約10分かけて滴下添加した。反応混合物を４時間かけて室温まで温め、その後101.4 gのシリカゲル (60-200メッシュ)カラムに注ぎ、ヘキサン、続いて10％ EtOAc：ヘキサンにより溶出した。適切なフラクションを、減圧下(6 mm)、回転式エバポレーターで濃縮した。その後残渣を高真空下でkugelrohr蒸留し3.1 gの無色透明液体である、1-メタンスルホニルオキシ-3-アザ-3-ベンジルペンタン (b.p. 25〜90℃／0.03 mm)を得た。TLC (10％ EtOAc：ヘキサン)は１つのスポットを示す。収率40％。
【００５０】
【化２４】
2005524707.tif 000025
スキーム7について、アジリジン(1.3 mL；0.025 モル)、炭酸カリウム (3.49 g；0.025 モル)、および91 mLのアセトニトリルを一緒に混合し、０．５時間氷浴中で冷却した。1-メタンスルホニル-3-アザ-3-ベンジルペンタン (3.1 g；0.012 モル)を13 mLのアセトニトリルに溶解し、１５分かけて滴下添加し、室温で一晩撹拌し、３時間還流した。反応混合物をろ過し、ろ過物を減圧下(6mm)、回転式エバポレーターで濃縮した。残渣をトリエチルアミンで飽和させた60.3 g のシリカゲル (60〜200メッシュ) でクロマトグラフィーを行い、連続的にEtOAcおよび40％ MeOH：EtOAcで溶出する。適切なフラクションを濃縮し、残渣を高真空下でkugelrohr蒸留し、1.0 gの無色透明液体であるN-ベンジル-N-エチル-1-アジリジンエタンアミン (b.p. 25〜88℃／0.05 mm)を得た。 TLC(20％ MeOH：EtOAc) はより極性の少ない不純物のトレースを示し、GCにより99.4％である。NMRは構造と一致している。収率40％。
【００５１】
例4：N,N-ジベンジル-1-アジリジンエタンアミンの合成
N,N-ジベンジル-1-アジリジンエタンアミンは下記のように製造される。
【化２５】
2005524707.tif 000026
スキーム8について、炭酸カリウム (60.06 g；0.43 モル), モノエタノールアミン (12.22 g；0.2 モル)、および150 mLのアセトニトリルを一緒に混合する。混合物は氷浴中で０．５時間冷却した。ベンジルブロマイド(50 mL；0.42 モル)を50 mLのアセトニトリルに溶解し、２０分かけて滴下添加した。その後、反応混合物を室温で撹拌し、ろ過する。ろ過物を減圧下(6mm)、回転式エバポレーターで濃縮した。残渣を高真空下でvigreux蒸留装置で蒸留し、下記フラクションを得た：(#1) 6.8 g 無色透明液体 (b.p. 22-27℃／0.1 mm)、GCにより97％ ベンジルブロマイド；(#2) 1.4 g 澄んだ黄色の液体 (b.p. 22-123℃／0.06 mm)、GCにより94％；(#3) 10.6 g 黄色オイル (b.p. 123-133℃／0.06 mm)、GCにより98％；(#4) 29.9 g 黄色オイル(b.p. 123-133℃／0.06 mm)、GCにより98％；容器残渣2.5 g 橙色オイル。フラクション#3および#4を混ぜて、40.5 g のN,N-ジベンジルエタノールアミンとした。TLC (20％ EtOAc：ヘキサン)はより極性の少ないトレースを示す。NMRは構造と一致している。オイルをゆっくり結晶化させた(m.p.41-44°C；収率83％)。
【００５２】
【化２６】
2005524707.tif 000027
スキーム10について、N,N-ジベンジルエタノールアミン (9.65 g；0.04 モル)およびトリエチルアミン(6.1 mL；0.044 モル)を90 mLのジクロロメタンに溶解した。この混合物に、10 mLのジクロロメタンに溶解しているメタンスルホニルクロライド(3.4 mL；0.044 モル)を素速く加えた。添加は発熱性であった。反応物を室温で４時間撹拌した。その後反応混合物を122.4 gのシリカゲル(60-200メッシュ)でクロマトグラフィーを行い、ヘキサン次いで20％ EtOAc：ヘキサンで溶出した。適切なフラクションを回転式エバポレーターで濃縮し、4.8 gの無色透明液体 (2-[ビス(フェニルメチル)アミノ]エタノールメタンスルホネート)を得た。TLC (10％ EtOAc：ヘキサン) は少量のより極性の不純物を示した。収率37％。
【００５３】
【化２７】
2005524707.tif 000028
スキーム11について、アジリジン(2.3 mL；0.044 モル)および炭酸カリウム (6.23 g；0.045 モル)を90 mLのアセトニトリル中で一緒に混合し、氷浴中で２５分間冷却した。2-[ビス(フェニルメチル)アミノ]エタノールメタンスルホネート (4.8 g；0.015 モル)を10 mL のアセトニトリル中に溶解し、５分かけて滴下添加した。得られた混合物を４時間還流し、その後冷却してろ過した。ろ過物を減圧下(6mm)、回転式エバポレーターで濃縮し、残渣をトリエチルアミンで飽和させた99.5 gのシリカゲル(60-200メッシュ)でクロマトグラフィーを行い、その後ヘキサン、40％ EtOAc：ヘキサン、およびEtOAcで溶出した。適切なフラクションを濃縮し、残渣を高真空下でkugelrohr蒸留し、1.6gの無色透明液体 (N,N-ジベンジル-1-アジリジンエタンアミン；b.p. 25-165℃／0.11 mm)を得た。TLC(EtOAc) は少量のより極性およびより極性の少ない不純物を示し、GCにより94％であった。NMRは構造と一致している。収率40％。 
【００５４】
例5：3-フェニル-1-アジリジンプロパンアミンの合成
3-フェニル-1-アジリジンプロパンアミンを下記のように製造した。
【化２８】
2005524707.tif 000029
スキーム12について、10.3 g (0.079 モル)のシンナモニトリル、24.1 g (0.56 モル)のアジリジン、5.5 mL (0.39 モル)のトリエチルアミン、および3.0 g (0.02 モル)のDBUの混合物を76時間還流した。反応混合物を回転式エバポレーターで濃縮した。残渣をシリカゲルでクロマトグラフィーを行い、ヘキサン次いで50％ EtOAc：ヘキサンで溶出した。適切なフラクションを濃縮して、13.4 g の3-フェニル-1-アジリジンプロパンニトリルをオイルとして得た。収率98％。
【００５５】
【化２９】
2005524707.tif 000030
スキーム13について、3-フェニル-1-アジリジンプロパンニトリル(3.0 g；0.17 モル)を100 mLのエタノール中の10％アンモニアに溶解した。次いで、ラネーニッケル(0.35 g)を加えて混合物をParrシェイカー中で50 psi H2 にて還元した。２６時間後、反応混合物をセライトによりろ過し、ろ過物を回転式エバポレーターで濃縮した。残渣をシリカゲルでクロマトグラフィーを行い、連続して1：1 MeOH：CH2Cl2、MeOH、および2：1 MeOH：トリエチルアミンで溶出し、ついで適切なフラクションを濃縮して1.98 g の3-フェニル-1-アジリジンプロパンアミンを得た。NMRは構造と一致している。収率64％。 
【００５６】
例6：N-[3-(1-アジリジニル)プロピル]-1,4-ブタンジアミンの合成
N-[3-(1-アジリジニル)プロピル]-1,4-ブタンジアミンは下記のように製造した。 
【化３０】
2005524707.tif 000031
スキーム14について、8.2 mL (0.16 モル) アジリジンを55 mLのエーテルに溶解し、２０分間氷浴中で冷却した。10mL (0.15 モル) のアクロレインを35 mLのエーテルに溶解し、２５分間かけて滴下添加した。 反応混合物を氷浴中でさらに１５分間撹拌し、その後室温まで温め、２時間撹拌した。反応混合物を減圧下(6mm)、回転式エバポレーターで濃縮し18.1 gの無色透明オイルを得た。TLCはより極性および極性の少ない不純物を示す。  粗製アルデヒドを４つに分注し、下記方法で反応させた。1,4-ジアミノブタン (1.4 g；16.2 ミリモル) を40 mL メタノールに溶解した。粗製アルデヒド (3.2g；32ミリモル) を30 mL メタノールに溶解し、１５分かけて滴下添加した。反応混合物を室温で１５分間撹拌し、氷浴中で冷却した。 冷却されたこの混合物に2.6g (68 ミリモル) 水素化ホウ素ナトリウムを１５分かけて少しずつ加えた。反応混合物を氷浴から取り除き、４時間室温で撹拌した。反応混合物に 6N メタノール性HCl をH2 が発生しなくなるまで滴下添加した。反応混合物を減圧下(6mm)、回転式エバポレーターで濃縮した。残渣を40 mLのdiH2Oに溶解し、その後40％NaOHで塩基性(~pH 12)にした。溶液を3 x 120 mL のエーテルで抽出し、混ぜ合わせた有機層をNa2SO4で乾燥させ、ろ過し、ろ過物を濃縮した。残渣は高真空下でkugelrohr蒸留した。各４つのバッチからの蒸留液を混ぜ合わせて、ついで高真空下でvigreux蒸留装置により蒸留し、1.0 gの無色透明液体である、N-[3-(1-アジリジニル)プロピル]-1,4-ブタンジアミン、b.p. 58-61℃／0.06mm (GCにより95％)を得た。TLCは極性の低い不純物を示す。NMRは構造と一致している。収率2％。 
【００５７】
例7：1-エチルアジリジンの合成
1-エチルアジリジンを下記のように製造した。
【化３１】
2005524707.tif 000032
スキーム15について、23mL (0.41 モル) の濃硫酸を80 mLの水に溶解した冷たい溶液を80mLの水中の40 g (0.45 モル)の2-(エチルアミノ)エタノールに分割して加えた。その後水は、反応混合物の温度が１１５℃になるまで大気圧下で蒸留した。反応混合物は、その後加熱しながら減圧下(~15mm) で蒸留した。浴温度を１７５℃に上げて反応混合物が凝固するまで約１時間真空にした。56.0 g (0.85 モル)の水酸化カリウムを60 mL の水に溶解した溶液を、混合物に溶解した。反応混合物は、浴温度が１３０℃になるまで加熱し、水および所望の生成物の混合物を蒸留した。94〜97℃で沸騰するフラクションを集めて、50 g のKOHで処理し、氷浴中で冷却した。２つの層を分けて有機層をKOHで乾燥させ、ろ過し、大気圧で蒸留して13.8 gの無色透明液体である、1-エチルアジリジン、bp 47℃を得た。NMRは構造と一致している。収率43％。
【００５８】
例8：1,1’-[イミノビス(トリメチレン)]ビスアジリジンの合成
1,1’-[イミノビス(トリメチレン)]ビスアジリジンを下記のように製造した。
【化３２】
2005524707.tif 000033
スキーム16について、19 mL (0.37 モル) のアジリジンを20 mL (0.3 モル) のアクリロニトリルに1.5 時間かけて滴下添加した。添加は発熱性であった。添加の間、温度は４０℃以下に維持した。反応混合物を室温で一晩撹拌し、減圧下vigreux蒸留装置中で蒸留し、27.1 g の無色透明液体である、1-アジリジンプロパンニトリル (b.p. 56-57℃／3 mm；GCにより99.5％)を得た。TLC (10％ MeOH：CHCl3)は少量のより極性の不純物を示す。NMRは構造と一致している。収率92％。
1-アジリジンプロパンニトリル (19.23 g；0.2 モル)、炭素上の1.63g の5％ロジウムおよび250 mL メタノールをParr 4562 Mini-reactor中で混合した。混合物を撹拌し、1000 psi H2 で45時間30℃に加熱した。混合物をろ過し、ろ過物を減圧下(6mm)、回転式エバポレーターで濃縮した。残渣を減圧下、２回、vigreux蒸留装置中で蒸留し、4.3 g の無色透明液体である、1,1’-[イミノビス(トリメチレン)]ビスアジリジン (b.p. 20-76oC/0.02 mm)を得た。NMRは構造と一致している。GCにより96.4％。TLC [9/1 7：1：1：1/NH4OH (7：1：1：1= nBuOH：EtOH：H2O：NH4OH)]は少量のより極性の不純物を示す。収率23％。
【００５９】
例9：1-アジリジンプロパンアミンによる大腸菌（Escherichia coli）の不活性化 
1-アジリジンプロパンアミンの大腸菌に対する不活性化能は下記アッセイにより示される。ＬＢ培地中、３７℃で一晩増殖することにより調製された大腸菌の定常相（stationary phase）培養物は、低イオン強度培地(LISM：4.3％ デキストロース(239 mM)、12.5 mM リン酸Na pH 7.1〜7.2、浸透圧：285〜290 mOsm)中で106 〜107 cfu/mlの濃度にまで増殖する。大腸菌培養物を50 mL培養フラスコに10 mLずつ４つに分ける。上記に記載されたように製造された化合物を特定の量で0.32 M NaH2PO4溶液に加えることにより、1-アジリジンプロパンアミン20x ストック溶液を使用直前に用意する。新しく用意された1-アジリジンプロパンアミン20xストック溶液(pH 7.5〜7.6)は、最終濃度12 mMで２つのフラスコに加えるまでは氷上に置く。1-アジリジンプロパンアミンを含まない１つのコントロールフラスコおよび12mMの1-アジリジンプロパンアミンが入っているフラスコは、３７℃で１０時間インキュベートする。1-アジリジンプロパンアミンを含まない別のコントロールフラスコおよび 12mMの1-アジリジンプロパンアミンが入っているフラスコは、２２℃で１０時間インキュベートする。１mLの分注物をコントロールフラスコおよび処理されているフラスコから２時間ごとに無菌的に採取し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で連続的に希釈して、LB寒天プレートにまく。プレートは３７℃で４８時間インキュベートし、バクテリアのコロニーを数える。検出限界は100 cfu/mLである。
低イオン強度培地における３７℃での12 mM 1-アジリジンプロパンアミンの存在により、２時間後に完全な大腸菌細胞の喪失が認められ、一方、コントロールでは大腸菌細胞の濃度は約107 cfu/mlであった。２２℃で細胞を培養した場合にも同様の結果が得られ、全ての大腸菌細胞を不活性化するのに必要な時間が２時間から８時間に増えたという点で異なっていた。
【００６０】
例10：1-アジリジンプロパンアミンおよび1-アジリジンブタンアミンによるエルシニアエンテロコリティカ（Yersinia enterocolitica）の不活性化
それぞれ1-アジリジンプロパンアミンおよび1-アジリジンブタンアミンはエルシニア(Y.) エンテロコリティカOを不活性化した：インビトロで20細胞。これは下記方法により示された。  
ＬＢ培地中、３７℃で一晩増殖することにより調製されたエルシニア  エンテロコリティカの定常相培養物は、低イオン強度培地(LISM：4.3％ デキストロース(239mM)、12.5 mM リン酸Na pH 7.1〜7.2、浸透圧：285〜290 mOsm)中で106 〜107 cfu/mlの濃度にまで増殖する。エルシニア  エンテロコリティカの定常相培養物を50 mL培養フラスコに10 mLずつ３つに分ける。上記に記載されたように製造され、0.32 M NaH2PO4中に新しく希釈された1-アジリジンプロパンアミンを、20xストック(pH 7.5〜7.6)として最終濃度12 mMになるようにフラスコの１つに加える。上記に記載されたように製造され、0.38M NaH2PO4中に新しく希釈された1-アジリジンブタンアミンを、別のフラスコに最終濃度が12ｍＭになるように加える。1-アジリジンプロパンアミンまたは1-アジリジンブタンアミンを含まない１つのコントロールフラスコ、12mMの1-アジリジンプロパンアミンが入っているフラスコ、および12mMの1-アジリジンブタンアミンが入っているフラスコを、２２℃で６時間インキュベートする。１mLの分注物をコントロールフラスコおよび処理されているフラスコから２時間ごとに無菌的に採取し、LB寒天プレートにまく。プレートは３７℃で２日間インキュベートし、バクテリアのコロニーを数える。検出限界は100 cfu/mLである。
低イオン強度培地における２２℃での12 mM 1-アジリジンプロパンアミンの存在により、２時間後にY.エンテロコリティカ細胞の完全な不活性化が認められ、一方、陽性コントロールでは２時間の時点で濃度は約107 cfu/mlであった。６時間の時点で約109 cfu/ml の濃度を有していた陽性コントロールと比べて、６時間後では1-アジリジンブタンアミンは、Y.エンテロコリティカのcfuの数を約７log減少させた。
【００６１】
例１１：1-アジリジンプロパンアミンによるブタパルボウイルス（porcine parvo virus）の不活性化
1-アジリジンプロパンアミンのブタパルボウイルス(“PPV”) に対する不活性化能は以下のアッセイにおいて示される。 
1-アジリジンプロパンアミンは上記の通りに製造される。20xストック溶液は、使用直前に、1-アジリジンプロパンアミンを0.32 M NaH2PO4 に希釈することにより調製し(20xストックの最終pHは7.5〜7.6)、氷上におく。PPVは、精製ならびに感染性および安定性の決定を含む従来の方法により調製される。ウイルスストックの分注物を、融解した新鮮な凍結血漿（frozen plasma (“FP”)）のチューブに加え、106 〜107 TCID50/mlの濃度を得る。コントロールチューブには1-アジリジンプロパンアミンを加えないのを除き、1-アジリジンプロパンアミン溶液ストックの分注物をFP中のPPVのチューブに加えて最終濃度を6 mMにする。
チューブは２２℃でインキュベートし、分注物を各反応チューブおよびコントロールから１時間、３時間および６時間で無菌的に採取する。分注物はマイクロタイタープレートに全部で８マイクロタイターウェルになるように連続的に希釈する。２５μlの各希釈物を６日間、PT-1細胞(ブタ精巣細胞（porcine testicle cell）) と共にマイクロタイタープレート中でインキュベートする。細胞変性効果についてウェルを調べる。検出限界は＞5 TCID50/mLである。
２２℃で１時間、３時間および６時間インキュベートされた、FPにおける6 mM 1-アジリジンプロパンアミンの存在により、同じ時点の陽性コントロールと比べて、それぞれ2 log未満、2 log以上および約3 logのPPVの減少が認められた。
【００６２】
例12：1,1’-[イミノビス(トリメチレン)]ビスアジリジンによるブタパルボウイルスの不活性化
1,1’-[イミノビス(トリメチレン)]ビスアジリジンのPPVに対する不活性化能は下記アッセイにおいて示される。
1,1’-[イミノビス(トリメチレン)]ビスアジリジンは上記のように製造し、20xストック溶液は 1,1’-[イミノビス(トリメチレン)]ビスアジリジンを0.5 M NaH2PO4 (20xストックの最終はpH 7.4)で希釈することにより調製し、氷上に置く。PPVは、精製ならびに感染性および安定性の決定を含む従来の方法により調製される。ウイルスストックの分注物を、融解した新鮮な凍結血漿（frozen plasma (“FP”)）および赤血球濃厚液(“RBCC”) のチューブに加え、106〜107 TCID50/mlの濃度を得る。コントロールチューブには1,1’-[イミノビス(トリメチレン)]ビスアジリジンを加えないのを除き、1,1’-[イミノビス(トリメチレン)]ビスアジリジンの20xストック溶液の分注物をFPおよびRBCC中のPPVのチューブに加えて最終濃度を12 mMにする。
チューブは２２℃でインキュベートし、分注物を各反応チューブおよびコントロールから１時間、３時間および６時間で無菌的に採取する。分注物はマイクロタイタープレートに全部で８マイクロタイターウェルになるように連続的に希釈する。２５μlの各希釈物を６日間、PT-1細胞(上述)と共にマイクロタイタープレート中でインキュベートする。細胞変性効果についてウェルを調べる。検出限界は＞5 TCID50/mLである。
２２℃で１時間、３時間および６時間インキュベートされた、FPにおける12mM 1,1’-[イミノビス(トリメチレン)]ビスアジリジンの存在により、陽性コントロールと比べて、それぞれ１log未満、１log以上および2 logのPPVの減少が認められた。
２２℃で１時間、３時間および６時間インキュベートされた、RBCCにおける12mM 1,1’-[イミノビス(トリメチレン)]ビスアジリジンの存在により、陽性コントロールと比べて、それぞれ１log未満、３logおよび３ log以上のPPVの減少が認められた。
【００６３】
例13 ：1-エチルアジリジンによる脳心筋炎ウイルス（encephalomyocarditis virus）の不活性化
1-エチルアジリジンの脳心筋炎ウイルス (“EMCV”) に対する不活性化能は下記アッセイにおいて示される。
1-エチルアジリジンは上記の通りに製造する。20xストック溶液は、使用直前に1-エチルアジリジンを0.18 M NaH2PO4 (20xストックの最終pHは7.1〜7.3),で希釈することにより調製し、氷上に置く。
EMCV は精製ならびに感染性および安定性の決定を含む従来の方法により調製される。ウイルスストックの分注物を、12.5 mMリン酸ナトリウムpH 7.2のチューブに加え、106 -〜107 TCID50/mLの濃度にする。ストックの1-エチルアジリジンの分注物をEMCVおよびリン酸ナトリウムのチューブに加え、最終濃度を12 mMにする。コントロールチューブには1-エチルアジリジンを加えない。
チューブは３７℃でインキュベートし、分注物を反応チューブおよびコントロールから４時間で無菌的に採取する。分注物はマイクロタイタープレートに全部で８マイクロタイターウェルになるように連続的に希釈する。２５μlの各希釈物を６日間、アフリカミドリザル腎臓細胞(African green monkey kidney cell)と共にマイクロタイタープレート中でインキュベートする。細胞変性効果についてウェルを調べる。検出限界は＞5 TCID50/mLである。
３７℃で４時間インキュベートされた、RBCCにおける12.5 mMリン酸ナトリウム中の12mM 1-エチルアジリジンの存在により、陽性コントロールと比べて、5 logを大きく上回るEMCVの減少が認められた。
【００６４】
他の態様
本明細書において言及された全ての刊行物、特許出願および特許は、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、特定の態様に関連して記載されているが、さらなる修飾が可能であることが理解される。したがって、本出願により、当分野の範囲内での既知のまたは慣用の実践に含まれる本開示からの逸脱を含む、一般に本発明の原則に従う、本発明のいかなる変更、用途、または適応をも対象とすることが意図される。
【国際調査報告】
2005524707.tif 000047
2005524707.tif 000048