(57)【要約】核レセプター活性を検出およびアッセイし、該核レセプター調節プロセスの成分と相互作用する核レセプターリガンド、補因子および他の化合物についてスクリーニングするシステムおよび方法が提供される。このアッセイ系および方法は、核レセプター活性をアッセイするために、相補的タンパク質融合酵素フラグメント技術を使用する。これらの方法は、核因子レセプターリガンドおよび補因子スクリーニングについての適用を有する。特に、これらの技術は、オーファン核レセプターについてのリガンドを見出すため、およびオーファン核レセプターの機能を決定するために使用され得る。このようにして、本発明の方法は、新たな薬物を見出すために使用され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核レセプター相互作用を検出する方法であって、該方法は、以下の工程：
レポーター酵素の第１の不活性変異形態への融合タンパク質としての第１の核レセプター；および該レポーター酵素の第２の不活性変異形態への融合タンパク質としての結合パートナーを発現する細胞を提供する工程であって、ここで該レポーター酵素の該第１および第２の不活性変異形態は、該第１の核レセプターと該タンパク質パートナーとの間で複合体を形成する際に相互作用して、活性レポーター酵素を形成する、工程；ならびに
該活性レポーター酵素の存在および／または量を決定する工程、
を包含し、
ここでレポーター酵素活性は、該核レセプターと該タンパク質パートナーとの間の複合体の形成を示す、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記タンパク質パートナーは、前記第１の核レセプターの補因子である、方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、前記補因子は、コリプレッサまたはコアクチベーターである、方法。
【請求項４】
請求項２に記載の方法であって、前記補因子は、野生型タンパク質または変異タンパク質である、方法。
【請求項５】
請求項２に記載の方法であって、前記レポーター酵素活性は、生細胞において検出される、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、前記タンパク質パートナーは、第２の核レセプターである、方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、前記第２の核レセプターは、前記第１の核レセプターと同じである、方法。
【請求項８】
請求項６に記載の方法であって、前記第２の核レセプターは、前記第１の核レセプターとは異なる、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、前記細胞はまた、レポーター遺伝子に作動可能に連結されるホルモン応答エレメントを含み、その結果、核レセプター／タンパク質パートナー複合体のホルモン応答エレメントへの結合は、該レポーター遺伝子の発現を生じ、該方法は、さらに以下の工程：
該レポーター遺伝子によってコードされる代理レポータータンパク質の存在および／または量を決定する工程；
を包含し、ここで該代理レポータータンパク質の存在および／または量は、該核レセプター／タンパク質パートナー複合体の転写活性化特性の指標である、
方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、前記代理レポータータンパク質は、前記レポーター酵素とは異なる代理レポーター酵素である、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、前記代理レポーター酵素はルシフェラーゼである、方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法であって、該方法は、さらに以下の工程：
前記細胞を１以上のリガンドを含む化合物に曝す工程；
を包含し、ここで増大したレポーター酵素活性は、該化合物のアゴニスト活性を示し、減少したレポーター酵素活性は、該化合物の逆アゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を示す、
方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、前記第１の核レセプターは、オーファン核レセプターである、方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法であって、該方法は、さらに以下の工程：
前記細胞を溶解する工程；および
前記細胞溶解物を基質とともにインキュベートする工程であって、ここで該基質は、該レポーター酵素による切断後に検出可能なシグナルを発する、工程、
を包含する、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、前記基質は、化学発光性基質または蛍光性基質である、方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の方法であって、前記基質は、化学発光性１，２−ジオキセタン基質である、方法。
【請求項１７】
請求項１０に記載の方法であって、該方法は、さらに以下の工程：
前記細胞を溶解する工程；および
前記細胞溶解物を第１および第２の基質とともにインキュベートする工程であって、ここで該第１の基質は、前記レポーター酵素による切断後に第１の検出可能なシグナルを発し、該第２の基質は、前記代理レポーター酵素による切断後に該第１の検出可能なシグナルとは異なる第２の検出可能なシグナルを発する、工程、
を包含する、方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法であって、前記第１および第２の基質は、化学発光性基質および蛍光性基質からなる群より独立して選択される、方法。
【請求項１９】
請求項１に記載の方法であって、前記細胞は、哺乳動物細胞、線虫細胞、昆虫細胞、酵母細胞および細菌細胞からなる群より選択される、方法。
【請求項２０】
生物学的に活性なハイブリッド核レセプターをコードする配列を含むＤＮＡ分子であって、該ハイブリッド核レセプターは、レポーター酵素の不活性変異形態への融合タンパク質として核レセプターを含む、ＤＮＡ分子。
【請求項２１】
請求項２０に記載のＤＮＡ分子であって、前記レポーター酵素の不活性変異形態は、β−ガラクトシダーゼ変異体である、ＤＮＡ分子。
【請求項２２】
細胞における生物学的に活性なハイブリッド核レセプターの発現を指向し得るＤＮＡ構築物であって、該ＤＮＡ構築物は、以下の作動可能に連結されるエレメント：
プロモーター；および
請求項２０に記載のＤＮＡ分子、
を含む、ＤＮＡ構築物。
【請求項２３】
請求項２２に記載のＤＮＡ構築物であって、前記レポーター酵素の不活性変異形態は、β−ガラクトシダーゼ変異体である、ＤＮＡ構築物。
【請求項２４】
請求項２２に記載のＤＮＡ構築物を含む、細胞。
【請求項２５】
請求項２３に記載のＤＮＡ構築物を含む、細胞。
【請求項２６】
レポーター酵素の不活性変異形態への融合タンパク質として核レセプター補因子の生物学的に活性なハイブリッドをコードする配列を含む、ＤＮＡ分子。
【請求項２７】
請求項２６に記載のＤＮＡ分子であって、前記レポーター酵素の不活性変異形態は、β−ガラクトシダーゼ変異体である、ＤＮＡ分子。
【請求項２８】
細胞における核レセプター補因子の生物学的に活性なハイブリッドの発現を指向し得るＤＮＡ構築物であって、該ＤＮＡ構築物は、以下の作動可能に連結されるエレメント：
プロモーター；および
請求項２６に記載のＤＮＡ分子、
を含む、ＤＮＡ構築物。
【請求項２９】
請求項２８に記載のＤＮＡ構築物であって、前記レポーター酵素の不活性変異形態は、β−ガラクトシダーゼ変異体である、ＤＮＡ構築物。
【請求項３０】
請求項２８に記載のＤＮＡ構築物を含む、細胞。
【請求項３１】
請求項２９に記載のＤＮＡ構築物を含む、細胞。
【請求項３２】
請求項２６に記載のＤＮＡ分子であって、前記核レセプター補因子はＡＣＴＲである、ＤＮＡ分子。
【請求項３３】
細胞であって、以下：
細胞における第１の生物学的に活性なハイブリッド核レセプターの発現を指向し得る第１のＤＮＡ構築物であって、該第１のＤＮＡ構築物は、第１のＤＮＡ分子に作動可能に連結された第１のプロモーターを含み、該第１のＤＮＡ分子は、レポーター酵素の第１の不活性変異形態への融合タンパク質として第１の生物学的に活性な核レセプターをコードする配列を含む、ＤＮＡ構築物；および
細胞における生物学的に活性なタンパク質パートナーの発現を指向し得る第２のＤＮＡ構築物であって、該第２のＤＮＡ構築物は、第２のＤＮＡ分子に作動可能に連結された第２のプロモーターを含み、該第２のＤＮＡ分子は、該レポーター酵素の第２の不活性変異形態への融合タンパク質として生物学的に活性なタンパク質パートナーをコードする配列を含む、第２のＤＮＡ構築物、
を含み、
ここで該レポーター酵素の該第１および第２の不活性変異形態は、該第１の核レセプターと該タンパク質パートナーとの間の複合体の形成の際に相互作用して、活性レポーター酵素を形成する、
細胞。
【請求項３４】
請求項３３に記載の細胞であって、前記タンパク質パートナーは、前記第１の核レセプターについての補因子である、細胞。
【請求項３５】
請求項３３に記載の細胞であって、前記タンパク質パートナーは、第２の核レセプターである、細胞。
【請求項３６】
請求項３５に記載の細胞であって、前記第２の核レセプターは、前記第１の核レセプターと同じである、細胞。
【請求項３７】
請求項３５に記載の細胞であって、前記第２の核レセプターは、前記第１の核レセプターとは異なる、細胞。
【請求項３８】
複数の細胞が堆積される固体支持体であって、該細胞は、以下：
レポーター酵素の第１の不活性変異形態への融合タンパク質としての第１の核レセプター；および
該レポーター酵素の第２の活性変異形態への融合タンパク質としてのタンパク質パートナー；
を発現し、
ここで該レポーター酵素の第１および第２の不活性変異形態は相互作用して、該第１の核レセプターと該タンパク質パートナーとの間の複合体の形成に際に活性レポーター酵素を形成する、
固体支持体。
を含む、固体支持体。
【請求項３９】
請求項３８に記載の固体支持体であって、前記細胞は、酵素不安定性化学基を含む酵素基質を含み、前記レポーター酵素による切断の際に、比色法、蛍光または化学発光によって測定され得る生成物を放出する、固体支持体。
【請求項４０】
請求項３８に記載の固体支持体であって、該固体支持体は、ガラス、プラスチック、セラミック、半導体、シリカ、光ファイバー、ダイヤモンド、生体適合性モノマーおよび生体適合性ポリマー材料からなる群より選択される材料から作製される、固体支持体。
【請求項４１】
核レセプター相互作用を検出する方法であって、該方法は、以下の工程：
レポーター分子の第１のフラグメントへの融合タンパク質としての第１の核レセプター；および該レポーター分子の第２のフラグメントへの融合タンパク質としてのタンパク質パートナーを発現する細胞を提供する工程であって、ここで該レポーター分子の該第１および第２のフラグメントは、レポーター機能を独立して有さず、該レポーター分子の該第１および第２のフラグメントが相互作用して、該第１の核レセプターと該第２のタンパク質パートナーとの間の複合体の形成の際にレポーター機能を回復する、工程；ならびに
該レポーター分子の存在および／または量を決定する工程、
を包含し、
ここで該レポーター分子の存在は、該核レセプターと該タンパク質パートナーとの間の複合体の形成を示す、
方法。
【請求項４２】
請求項４１に記載の方法であって、前記レポーター分子は、単量体酵素、多量体酵素、蛍光タンパク質、発光タンパク質、およびリン光タンパク質からなる群より選択される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００２年３月２５日出願の米国仮特許出願第６０／３６６，５２４号の優先権を主張する。その仮特許出願の全体は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、核レセプター（ＮＲ）活性を検出する方法に関し、ＮＲ活性をアッセイする方法、ＮＲリガンドおよび補因子について（すなわち、補助レセプターおよびコアクチベーターについて）スクリーニングするための方法、オーファンＮＲに対する天然および代理のリガンドをスクリーニングするための方法、ならびにＮＲ調節プロセスの化合物と相互作用する化合物をスクリーニングするための方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
（技術の背景）
遺伝子発現の調節は、独特のＤＮＡ認識特性を有する多数の転写因子が関与している。多くの転写因子は、関連タンパク質のファミリーに属し、そのメンバーは、類似であるが別個のＤＮＡ配列に結合する。
【０００４】
核レセプターは、リガンド活性化転写因子の大きなファミリーを構成し、これらの因子は、調節される遺伝子内の応答要素と相互作用する。核レセプターとしては、ステロイドホルモン、甲状腺ホルモン、ビタミンＡおよびビタミンＤのホルモン形態、ペルオキシソーム活性化因子、ならびにエクジソンに対するレセプターが挙げられる。ステロイドホルモンレセプターの例は、エストロゲンレセプター（ＥＲ）およびプロゲステロンレセプター（ＰＲ）である。他の核レセプターとしては、ＰＰＡＲγ（ペルオキシソーム増殖因子活性化レセプターγ）、ＲＡＲ（レチノイン酸レセプター）、ＲＸＲ（レチノイドＸレセプター）、ＴＲ（甲状腺ホルモンレセプター）およびＶＤＲ（ビタミンＤレセプター）が挙げられる。
【０００５】
ステロイドホルモンによる遺伝子調節は、広く研究されてきた。例えば、ＣｌｅｖｅｒおよびＫａｒｌｓｏｎ，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，２０，６２３（１９６０）を参照のこと。さらに、ステロイドホルモンレセプターが特徴付けられ、精製されており、ホルモンにより調節される遺伝子がクローニングされ、そしてホルモン応答配列が、ステロイドホルモンにより調節される遺伝子の近位で同定された。さらに、ステロイドホルモンについての数十個の調節エレメントが記載されており、実質的に全ての既知のホルモンレセプターのｃＤＮＡがクローニングされている。Ｅｖａｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０，８８９（１９８８）を参照のこと。
【０００６】
ステロイドホルモンが細胞の形質膜を横切って、細胞質または細胞核内のレセプタータンパク質(すなわち、ステロイドホルモンまたは核レセプター)と相互作用し、複合体を形成することによって、それらの生物学的応答を媒介することが広く提唱されてきた。次いで、これらのリガンド／レセプター複合体は、細胞核内に蓄積し、核内でそれらは、ホルモンレセプターエレメント（すなわち、ＨＲＥ）とよばれる特異的調節ＤＮＡ配列に結合する。核レセプター／リガンド複合体の二量体は、適切な応答エレメント（具体的には、応答エレメントのコア配列）に結合すると考えられている。このようにして、この核レセプター／リガンド複合体は、依存遺伝子の転写速度に影響を及ぼし得る。ステロイドホルモンレセプター／リガンド複合体はまた、特定のｍＲＮＡの安定性に影響を及ぼし得る。
【０００７】
ホルモン応答エレメントは、いくつかの方法によって同定および特徴付けられており、これらのエレメントは、ホルモンレセプターについてのコンセンサス配列を含むことが示されている。例えば、Ｂｅａｔｏ，Ｃｅｌｌ，５６，３３５−３４４（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ  ｄｅ  Ｈａｒｏら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２６５，２０−２２（１９９０）；ならびにＢａｎｉａｈｍａｄおよびＴｓａｉ，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，５１，１５１−１５６（１９９３）を参照のこと。
【０００８】
核レセプター複合体は、ホモ二量体および／またはヘテロ二量体としてホルモン応答エレメントに結合し得る。ホモ二量体として結合する核レセプターとしては、ステロイドレセプターおよびレチノイドＸレセプターが挙げられる。ヘテロ二量体として結合する核レセプターとしては、レチノイン酸レセプター、甲状腺ホルモンレセプターおよびビタミンＤレセプターが挙げられる。例えば、Ｍｏｒａｓら，「Ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｂｏｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ」，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１０，３８４−３９１（１９９８）を参照のこと。
【０００９】
核レセプターはまた、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）またはデアセチルトランスフェラーゼ複合体との会合を介して、遺伝子発現を調節し得る。例えば、Ｃｈｅｎら，「Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｏｒｍｏｎｅ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｈｙｐｅｒａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｖｉａ  Ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ａｃｅｔｙｌａｓｅ」，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．９８（１９９９）を参照のこと。特に、それらの対応するホルモンの非存在下において、核レセプターは、ヒストンデアセチラーゼ活性を含むコリプレッサ複合体とのそれらの会合を介して標的遺伝子の転写を抑制すると考えられる。ホルモン結合は、これらのコリプレッサの放出を誘導し、コアクチベーターのアレイのその後の会合を可能にすると考えられる。
【００１０】
種々のコアクチベーターが、核レセプターについて同定されている。これらのコアクチベーターとしては、ｐ３００／ＣＢＰ、Ｐ／ＣＡＦ（ＣＢＰ関連因子）、ＡＣＴＲおよびＳＲＣ−１が挙げられる。これらのタンパク質は、核レセプターと相互作用し、それらのトランス活性化活性を強めることが実証されている。Ｃｈｅｎら（１９９９）、前出を参照のこと。例えば、ＡＣＴＲは、Ｐ／ＣＡＦおよびＣＢＰ／ｐ３００とのマルチマー活性化複合体を形成することが見出された。Ｃｈｅｎら，「Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＡＣＴＲ  ｉｓ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｈｉｓｔｏｎｅ  Ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ａｎｄ  Ｆｏｒｍｓ  ａ  Ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  Ｐ／ＣＡＦ  ａｎｄ  ＣＢＰ／ｐ３００」，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．９０，５６９−５８０（１９９７）を参照のこと。
【００１１】
種々の核レセプターバイオアッセイが公知である。例えば、米国特許第５，０７１，７７３号および同第５，２９８，４２９号は、ホルモンレセプターであると疑われるタンパク質が転写活性化特性を有するか否かを決定するためのバイオアッセイ、および化合物がレセプタータンパク質についての機能的リガンドであるか否かを評価するためのバイオアッセイを開示する。さらに、米国特許第５，７７０，１７６号は、細胞または組織サンプル中の機能的核レセプターの存在または非存在を検出する方法を開示する。この方法は、核レセプターを、そのリガンドによって、その関連した応答エレメントへおよび抗レセプター抗体へ占有されるアッセイ下で同時に結合する工程を包含する。
【００１２】
しかし、核レセプターと第２のタンパク質（例えば、第２の核レセプターまたは核レセプターについての補因子）との間のタンパク質間相互作用を直接モニターするために使用され得るバイオアッセイが依然として必要である。このような技術は、ある範囲の細胞および種におけるタンパク質間相互作用のインサイチュでの直接検出を可能にする。このような技術はまた、疑われるリガンドの存在下で、オーファン核レセプターと、コアクチベーターまたは第２の核レセプターとの間の相互作用をモニターすることにより、オーファン核レセプターについてのリガンドを見出すために使用され得る。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
本発明の第１の局面によれば、核レセプター相互作用を検出する方法が提供される。この方法は、第１の核レセプターを、レセプター酵素の第１の不活性変異形態に対する融合タンパク質として発現する細胞を提供する工程を包含する。この細胞はまた、タンパク質パートナーを、このレポーター酵素の第２の不活性変異形態に対する融合タンパク質として発現する。このレポーター酵素の第１および第２の不活性変異形態は、第１の核レセプターとタンパク質パートナーとの間の複合体の形成の際に相互作用して、活性なレポーター酵素を形成し得る。本発明のこの局面に従う方法は、レポーター酵素の存在および／または量を決定する工程をさらに包含する。ここで細胞内のレポーター酵素活性は、核レセプターとタンパク質パートナーとの間の複合体の形成を示す。本発明のこの局面に従う細胞はまた、レポーター遺伝子に作動可能に連結されたホルモン応答エレメントを含み得、その結果、核レセプター/タンパク質パートナー複合体の、ホルモン応答エレメントへの結合が、レポーター遺伝子の発現を生じる。次いで、レポーター遺伝子によってコードされる代理レポータータンパク質の存在および／または量が決定され得、ここで代理レポータータンパク質の存在および／または量が核レセプター/タンパク質パートナー複合体の転写活性化特性の指標である。
【００１４】
本発明の第２の局面によれば、生物学的に活性なハイブリッド核レセプターをコードする配列を含むＤＮＡ分子が提供される。このハイブリッド核レセプターは、核レセプターを、レポーター酵素の不活性変異形態への融合タンパク質として含む。
【００１５】
本発明の第３の局面によれば、核レセプター補因子の生物学的に活性なハイブリッドをコードする配列を含むＤＮＡ分子（ここでこのハイブリッド補因子は、核レセプター補因子を、レポーター酵素の不活性変異形態への融合タンパク質として含む）が提供される。
【００１６】
本発明の第４の局面によれば、細胞内の第１の生物学的に活性なハイブリッド核レセプターの発現を指向し得る第１のＤＮＡ構築物および細胞内の生物学的に活性なタンパク質パートナーの発現を指向し得る第２のＤＮＡ構築物を含む細胞が提供される。第１のＤＮＡ構築物は、第１のＤＮＡ分子に作動可能に連結される第１のプロモーターを含み、この第１のＤＮＡ分子は、第１の生物学的に活性な核レセプターを、レポーター酵素の第１の不活性変異形態への融合タンパク質としてコードする配列を含む。第２のＤＮＡ構築物は、第２のＤＮＡ分子に作動可能に連結される第２のプロモーターを含み、この第２のＤＮＡ分子は、第２の生物学的に活性なタンパク質パートナーを、レポーター酵素の第２の不活性変異形態への融合タンパク質としてコードする配列を含む。レポーター酵素の第１および第２の不活性変異形態は、第１の核レセプターとタンパク質パートナーとの間の複合体の形成の際に相互作用して、活性なレポーター酵素を形成し得る。
【００１７】
本発明の第５の局面によれば、複数の細胞が沈着される固体支持体が提供され、ここでこれらの細胞は、第１の核レセプターをレポーター酵素の第１の不活性変異形態への融合タンパク質として発現し、タンパク質パートナーをレポーター酵素の第２の不活性変異形態への融合タンパク質として発現する。このレポーター酵素の第１および第２の不活性変異形態は、相互作用して、第１の核レセプターとタンパク質パートナーとの間の複合体の形成の際に、活性なレポーター酵素を形成し得る。
【００１８】
本発明の第６の局面によれば、核レセプター相互作用を検出する方法が提供される。この方法は、レポーター分子の第１のフラグメントへの融合タンパク質として第１の核レセプターを発現する細胞、およびレポーター分子の第２のフラグメントへの融合タンパク質としてタンパク質パートナーを発現する細胞を提供する工程、ならびにレポーター分子の存在および／または量を決定する工程を包含する。このレポーター分子の第１および第２のフラグメントは、レポーター機能を独立して有さない。しかし、レポーター分子の第１および第２のフラグメントは相互作用して、第１の核レセプターとタンパク質パートナーとの間で複合体を形成する際にレポーター機能を回復し得る。このレポーター分子の存在は、核レセプターとタンパク質パートナーとの間の複合体の形成を示す。このレポーター分子は、酵素（例えば、単量体酵素または多量体酵素）、蛍光タンパク質、発光タンパク質、またはリン光タンパク質であり得る。
【００１９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、核レセプターについてのタンパク質間相互作用アッセイに関する。本発明によれば、核レセプターと第２のタンパク質との間の相互作用は、レポーター酵素(例えば、β-ガラクトシダーゼ)補完によってモニターされ得る。本発明は、核レセプター機能および経路を調べる方法を提供する。
【００２０】
一部の核レセプターのみが、同定されており、なおいくらかは、リガンド（すなわち、ホルモン）と関連づけられている。リガンドまたはホルモンは、レセプターに結合し得、そしてその機能に影響を及ぼし得る任意の低分子であると考えられ得る。同定されたオーファン核レセプターおよび新たに発見されたオーファン核レセプターが、それらのコグネートリガンドおよび生理学的機能と関連づけられる手段は、生物学的研究および生物医学的研究への大きな挑戦を表す。
【００２１】
オーファン核レセプターの同定は、代表的には、個別化したアッセイを要し、核レセプターの機能に関して推測される。しかし、本発明は、核レセプターと第２のタンパク質との間のタンパク質間相互作用に依存する活性化を使用して、レセプターの活性化をモニタリングすることによる、核レセプター機能のインターロゲーションを包含する。第２のタンパク質は、第２の核レセプターまたは補因子であり得る。
【００２２】
本発明に従うと、特定のタンパク質間相互作用は、以下に記載されるように、変異酵素補完技術を使用して測定され得る。このアッセイ系は、核レセプターの機能の推測を排除し得る。なぜなら、このアッセイ系は、他のシグナル伝達事象の事前の知識があってもなくてもいずれでも行われ得るからである。さらに、本発明に従うこのアッセイ系は、比較的感度が高く、簡単に行える。このアッセイ系はまた、核レセプターに対して包括的に適用可能であり得る。なぜなら、核レセプターの多くが、共通の機構によって活性化されるからである。これらの包括的な機構は、例えば、オーファン核レセプターについてのアッセイを開発するために使用され得る。
【００２３】
本発明に従うと、酵素補完技術は、核レセプターと他のタンパク質との間の相互作用をモニターするために使用され得る。酵素補完技術は、２０００年９月１日に出願された米国特許出願第０９／６５４，４９９号（本明細書中以降‘４９９出願）（係属中）および２００２年１月２９日に発行された米国特許第６，３４２，３４５号（本明細書中以降‘３４５特許）に開示され、これらの文献はともに、それらの全体が本明細書中に参考として援用される。
【００２４】
'４９９出願および’３４５特許において記載されるように、酵素補完技術は、２つの不活性酵素(たとえば、β−ガラクトシダーゼ)変異体（これらの各々は、２つの相互作用標的タンパク質対のうちの一方と融合されている）の使用を包含する。活性酵素(例えば、β−ガラクトシダーゼ)複合体の形成は、標的タンパク質の相互作用により駆動される。目的のタンパク質が相互作用しない場合、レポーター酵素は不活性のままである。目的のタンパク質が相互作用する場合(例えば、タンパク質が結合するかまたは二量体化する場合)、レポーター酵素変異体は、一緒になって、活性酵素を形成する。
【００２５】
変異酵素補完以外の補完技術もまた、本発明に従って使用され得る。例えば、タンパク質フラグメント補完アッセイは、本発明に従って、核レセプターと他のタンパク質との間の相互作用を測定するために使用され得る。タンパク質フラグメント補完アッセイは、米国特許第６，２７０，９６４号；同第６，２９４，３３０号；および同第６，４２８，９５１号に開示される。これらの特許の各々は、その全体が本明細書中に参考として援用される。前述の特許に開示されるタンパク質フラグメント補完アッセイのいずれかは、本発明に従って、核レセプターと他のタンパク質との間の相互作用を検出するために使用され得る。
【００２６】
本発明の第１の局面に従って、核レセプター相互作用を、変異酵素補完を使用して検出する方法が提供される。この方法は、以下の工程を包含する：第１の核レセプターをレポーター酵素の第１の不活性変異形態への融合タンパク質として；およびタンパク質パートナーをレポーター酵素の第２の不活性変異形態への融合タンパク質として発現する細胞を提供する工程、ならびにレポーター酵素の存在および／または量を決定する工程。レポーター酵素の第１および第２の不活性変異形態は、第１の核レセプターとタンパク質パートナーとの間で複合体を形成する際に相互作用して、活性なレポーター酵素を形成し得る。レポーター酵素活性は、従って、核レセプターとタンパク質パートナーとの間の複合体の形成を示す。本発明に従うタンパク質パートナーは、公知または周知のいずれかの、野生型タンパク質または変異タンパク質または任意の他の調節タンパク質であり得る。例えば、このタンパク質パートナーは、第１の核レセプターまたは第２の核レセプターについての補因子であり得、この第２の核レセプターは、第１の核レセプターと同じであっても異なっていてもよい。補因子は、核レセプターについてのコリプレッサまたはコアクチベーターであり得る。細胞は、哺乳動物細胞、線虫細胞、酵母細胞、細菌細胞または昆虫細胞であり得る。
【００２７】
本発明の第１の局面に従って、タンパク質フラグメント補完を使用して核レセプター相互作用を検出する方法が提供される。本発明のこの局面に従う方法は、第１の核レセプターをレセプター分子の第１のフラグメントへの融合タンパク質として、およびタンパク質パートナーをレセプター分子の第２のフラグメントへの融合タンパク質として発現する細胞を提供する工程、ならびにこのレセプター分子の存在および／または量を決定する工程を包含する。このレセプター分子の第１および第２のフラグメントは、独立して、レポーター機能を有さない。しかし、このレセプター分子の第１および第２のフラグメントは、相互作用して、第１の核レセプターとタンパク質パートナーとの間で複合体を形成する際に、レセプター機能を回復し得る。このレセプター分子の存在は、核レセプターとタンパク質パートナーとの間の複合体の形成を示す。このレセプター分子は、酵素(例えば、単量体酵素または多量体酵素)、蛍光タンパク質、発光タンパク質、またはリン光タンパク質であり得る。
【００２８】
本発明のさらなる局面に従って、核レセプターとタンパク質パートナーとの間の相互作用は、本発明の方法を用いて、インビボで(すなわち、生細胞内で)検出および定量され得る。生細胞において使用され得る生命に必須の（ｖｉｔａｌ）酵素基質(例えば、生命に必須のβ−ｇａｌ基質）は、米国特許第６，３４２，３４５号に開示される。これらの生命に必須の基質のいずれかが、本発明に従ってインビボ検出のために使用され得る。
【００２９】
核レセプターとタンパク質パートナーとの間の相互作用はまた、本発明に従って、インビトロで検出および定量され得る。例えば、本発明の１つの実施形態に従って、上記の方法は、細胞を溶解する工程、およびその細胞を基質（これは、レポーター酵素による切断の後に検出可能なシグナルを発する）と共にインキュベートする工程をさらに包含し得る。この基質は、化学発光基質、比色基質、または蛍光基質であり得る。本発明の好ましい実施形態に従って、この基質は、化学発光性の１，２−ジオキセタン基質である。
【００３０】
本発明のさらなる局面に従って、細胞はまた、レポーター遺伝子に作動可能に連結されたホルモン応答エレメントを含み得る。その結果、核レセプター複合体がホルモン応答エレメントに結合すると、レポーター遺伝子の発現を生じる。本発明のこの局面に従って、この方法は、レポーター遺伝子によってコードされる代理レポータータンパク質の存在および／または量を決定する工程をさらに包含する。この代理レポータータンパク質の存在および／または量は、従って、核レセプター／タンパク質パートナー複合体の転写活性化特性の指標である。代理レポータータンパク質は、代理レポーター酵素(例えば、ルシフェラーゼ)（これは、上記のレポーター酵素とは異なる）であり得る。本発明のこの局面に従う方法は、細胞を溶解する工程、ならびにその細胞溶解物を、第１および第２の基質とともにインキュベートする工程をさらに包含し得る。ここでこの第１の基質は、レポーター酵素による切断後に第１の検出可能なシグナルを発し、第２の基質は、代理レポーター酵素による切断後に第１の検出可能なシグナルとは異なる第２の検出可能なシグナルを発する。この第１および第２の基質は、化学発光基質または蛍光基質であり得る。
【００３１】
本発明のさらなる局面に従って、その方法はまた、細胞を１以上のリガンドを含む化合物に曝す工程を包含し得、ここで増大したレポーター酵素活性は、化合物のアゴニスト活性を示し、減少したレポーター酵素活性は、化合物の逆アゴニストまたはアンタゴニスト活性を示す。本発明のこの局面に従って、第１の核レセプターは、オーファン核レセプターであり得る。
【００３２】
本発明のさらなる局面に従って、生物学的に活性なハイブリッド核レセプターをコードする配列を含むＤＮＡ分子が提供され、ここでこのハイブリッド核レセプターは、核レセプターを、レポーター酵素の不活性変異形態への融合タンパク質として含む。このレポーター酵素の不活性変異形態は、β-ガラクトシダーゼ変異体であり得る。細胞において生物学的に活性なハイブリッド核レセプターの発現を指向し得るＤＮＡ構築物もまた、提供される。このＤＮＡ構築物は、上記のように、ＤＮＡ分子に作動可能に連結されたプロモーターを含む。ＤＮＡ構築物中のレポーター酵素の不活性変異形態は、β−ガラクトシダーゼ変異体であり得る。上記のＤＮＡ構築物を含む細胞もまた、提供される。
【００３３】
本発明のさらなる局面に従って、核レセプター補因子の生物学的に活性なハイブリッドをコードする配列を含むＤＮＡ分子が提供され、ここでこのハイブリッド補因子は、核レセプター補因子をレポーター酵素の不活性変異形態への融合タンパク質として含む。このレポーター酵素の不活性変異形態は、β−ガラクトシダーゼ変異体であり得る。細胞において生物学的に活性なハイブリッド核レセプター補因子の発現を指向し得るＤＮＡ構築物もまた、提供される。このＤＮＡ構築物は、上記のＤＮＡ分子に作動可能に連結されたプロモーターを含む。このＤＮＡ構築物中のレポーター酵素の不活性変異形態は、β−ガラクトシダーゼ変異体であり得る。上記のＤＮＡ構築物を含む細胞もまた、提供される。本発明のさらなる実施形態に従って、この核レセプター補因子は、ＡＣＴＲであり得る。
【００３４】
本発明のさらなる局面に従って、細胞において第１の生物学的に活性なハイブリッド核レセプターの発現を指向し得る第１のＤＮＡ構築物、および細胞において生物学的に活性なタンパク質パートナーの発現を指向し得る第２のＤＮＡ構築物を含む細胞が、提供される。この第１のＤＮＡ構築物は、第１のＤＮＡ分子に作動可能に連結された第１のプロモーターを含み、この第１のＤＮＡ分子は、第１の生物学的に活性な核レセプターをレポーター酵素の第１の不活性変異形態への融合タンパク質としてコードする配列を含む。第２のＤＮＡ構築物は、第２のＤＮＡ分子に作動可能に連結された第２のプロモーターを含む。この第２のＤＮＡ分子は、生物学的に活性なタンパク質パートナーをレポーター酵素の第２の不活性変異形態への融合タンパク質としてコードする配列を含む。レポーター酵素の第１および第２の不活性変異形態は、第１の核レセプターとタンパク質パートナーとの間で複合体を形成する際に相互作用して、活性なレポーター酵素を形成し得る。タンパク質パートナーは、第１の核レセプターまたは第２の核レセプターについての補因子であり得、この第２の核レセプターは、第１の核レセプターと同じであっても異なっていてもよい。
【００３５】
本発明のさらなる局面に従って、複数の細胞が沈着された固体支持体が提供される。本発明のこの局面に従って、細胞は、第１の核レセプターをレポーター酵素の第１の不活性変異形態への融合タンパク質として発現し、タンパク質パートナーをレポーター酵素の第２の不活性変異形態への融合タンパク質として発現する。レポーター酵素の第１および第２の不活性変異形態は、相互作用して、第１の核レセプターとタンパク質パートナーとの間で複合体を形成する際に活性なレポーター酵素を形成し得る。本発明のこの局面に従って、細胞は、酵素不安定基を含む酵素基質をさらに含み得る。この酵素不安定基は、レポーター酵素による切断の際に、検出可能なシグナルを発する。このシグナルは、比色シグナル、蛍光シグナル、または化学発光シグナルであり得る。この固体支持体は、硝子、プラスチック、セラミック、半導体、シリカ、光ファイバー、ダイヤモンド、および生体適合性材料(例えば、生体適合性モノマーまたはポリマー)から作製され得る。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態に従って、第１の不活性β−ガラクトシダーゼ変異体は、第１の核レセプターに融合され、第２のβ−ガラクトシダーゼ-変異体は、第２のタンパク質(すなわち、タンパク質パートナー)に融合される。第２のタンパク質は、第１の核レセプターと相互作用し得る。第１および第２の不活性β−ガラクトシダーゼ変異体は、第１の核レセプターおよび第２のタンパク質が相互作用して複合体を形成する場合に、活性な酵素を形成し得る。この第２のタンパク質は、第２の核レセプター(これは、第１の核レセプターと同じであっても異なっていてもよい)または第１の核レセプターについての補因子であり得る。
【００３７】
図１Ａ〜１Ｃは、本発明に従うβ−ガラクトシダーゼ補完技術の使用を例示する。ここで２つの不活性β−ガラクトシダーゼ変異体２、４（例えば、ΔαおよびΔω）は、この２つの不活性β−ガラクトシダーゼ変異体のタンパク質融合パートナー６、８が相互作用して、二量体１４を形成する場合、活性１６になる。図１Ａ〜１Ｃに示されるように、これらのタンパク質融合パートナー６、８は、第１および第２の核レセプター（例えば、ＮＲ１およびＮＲ２）であり、これらの各々は、それらそれぞれのリガンド１０、１２によって活性化される。図１Ａは、リガンド活性化前のタンパク質融合パートナー６、８（すなわち、核レセプター）を示す。図１Ｂは、それらそれぞれのリガンド１０、１２と会合した核レセプター６、８を示す。図１Ｃは、二量体１４の形成後のレセプター６、８を示す。本発明に従って、その２つのタンパク質融合パートナー６、８の相互作用から生じた活性β-ガラクトシダーゼ１６は、化学発光基質上の酵素不安定基を切断して、光を発し得る。
【００３８】
図１Ａ〜１Ｃに示される第１および第２の核レセプター６、８は、同じであり得る。この場合、ホモ二量体形成がモニターされ得る。あるいは、第１および第２の核レセプター６、８は異なり得る。この場合、ヘテロ二量体形成がモニターされ得る。図１Ｂおよび１Ｃに示されるように、核レセプター６、８の各々は、それぞれ、リガンド１０、１２と会合している。核レセプター二量体形成（図１Ｃに例示される）は、リガンド活性化され得、この場合、核レセプターについてのリガンドが存在すると、増大した化学発光が観察され得る。図１Ａ〜１Ｃに示されるように、アゴニスト活性１５は、二量体形成を促進するが、アンタゴニストまたは逆アゴニスト活性１７は、単量体形成を促進する。本発明に従って、種々の化合物の、核レセプター複合体形成のアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性がモニターされ得る。
【００３９】
図２Ａ〜２Ｃは、本発明に従う補完技術の使用を例示し、ここで２つの不活性β−ガラクトシダーゼ変異体２、２０（例えば、ΔαおよびΔω）は、その２つの不活性β−ガラクトシダーゼ変異体６、１８のタンパク質融合パートナー（すなわち、核レセプターおよび補因子）が相互作用して、二量体２２を形成する場合、活性２４になる。図２Ａ〜２Ｃにおいて、核レセプター６は、第１のβ−ガラクトシダーゼ変異体２（例えば、Δα）との融合タンパク質として示され、補因子１８（例えば、ＡＣＴＲ）は、第２のβ−ガラクトシダーゼ変異体２０（例えば、Δω）との融合タンパク質として示される。図２Ａは、リガンド１０による活性化前の核レセプター６を示す。図２Ｂは、リガンド活性化レセプター６を示し、図２Ｃは、核レセプター−補因子複合体２２を示す。
【００４０】
酵素補完後、本発明に従う酵素活性は、当該分野で公知の技術に従う酵素活性アッセイによって測定され得る。増大したβ−ガラクトシダーゼ活性は、レセプターおよび補因子が相互作用して、複合体を形成したことの指標であり得る。
【００４１】
本発明に従う核レセプターアッセイはまた、オーファン核レセプターについてのリガンドを決定するために使用され得る。このプロセスは、一般に、「脱オーファン化（ｄｅ−ｏｒｐｈａｎｉｎｇ）」または「リガンド釣り上げ」プロセスといわれる。この型の手順は、図３Ａおよび３Ｂに例示され、ここでオーファンレセプター６（例えば、ＮＲＯ−Δα）のβ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質３０は、試験細胞３２において、核レセプターについての既知の補因子１８（例えば、ＡＣＴＲ−Δω）の融合タンパク質３４として同時発現される。図３Ａおよび３Ｂにおいて、オーファンレセプター６および補因子１８に融合されたβ−ガラクトシダーゼ変異体は、それぞれ、参照番号２および１８で示される。
【００４２】
図３Ｂに示されるように、試験細胞３２が、種々のリガンド３６を含む（レセプター６についてのリガンド３８を含む）化合物に供されると、核レセプター６についてのリガンド活性化は、レセプター−補因子複合体３９の形成を生じ得る。本発明に従って、複合体３９の形成は、β−ガラクトシダーゼ４０活性化における増大を生成し得る。この活性化は、その化合物が、核レセプターについての天然リガンドまたは代理リガンドのいずれかを含むことを示すために使用され得る。
【００４３】
図３Ａおよび３Ｂにおいて例示される技術はまた、オーファン核レセプターについての補因子とではなく、オーファン核レセプターと二量体形成し得る第２の核レセプターを用いて実施され得る。
【００４４】
上記のアッセイ技術は、オーファン核レセプターに対する潜在的な薬物を見出し、開発するために使用され得る。例えば、化合物で処理した後の試験細胞における増大したβ−ガラクトシダーゼ活性は、その化合物のアゴニスト活性を示し得る。あるいは、試験細胞における減少したβ−ガラクトシダーゼ活性は、その化合物のアンタゴニスト活性または逆アンタゴニスト活性を示し得る。
【００４５】
また、本発明に従って、核レセプター複合体形成を測定するための補完技術は、遺伝子発現に対する核レセプター複合体形成の効果をモニターするために、代理レセプター(例えば、ルシフェラーゼ)の使用と組み合わせられ得る。レポーター遺伝子アッセイは、遺伝子のプロモーターの活性を測定するために、当該分野で広く使用されている。この技術は、任意のプロモーターの制御下の異種遺伝子が哺乳動物細胞のゲノムに導入鎖得される分子生物学技術を利用する。例えば、Ｇｏｒｍａｎら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２，１０４４−１０５１（１９８２）；およびＡｌａｍら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８８，２４５−２５４（１９９０）を参照のこと。プロモーターの活性化は、レポーター遺伝子の発現を誘導する。設計によって、レポーター遺伝子は、容易に検出および測定され得るレポータータンパク質をコードする。このレポータータンパク質は、代表的には、レポーター酵素であり、この酵素は、基質(例えば、蛍光基質または化学発光基質)を生成物に変換し得る。この変換は、直接光学測定により簡便に追跡され得、従って、生成されるレポーター酵素活性の量の定量が可能になる。
【００４６】
本発明に従う遺伝子発現はまた、当該分野で公知の他のアッセイ技術を使用してモニターされ得る。例えば、ｍＲＮＡは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応アッセイを用いて定量され得る。この型のアッセイは、「ＴａｑＭａｎ」アッセイである。このアッセイは、ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性を利用して、その標的アンプリコンに結合したハイブリダイゼーションプローブを加水分解する。「ＴａｑＭａｎ」は、Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ−Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｃ．の登録商標である。「ＴａｑＭａｎ」アッセイおよびｍＲＮＡを定量する他の方法は、Ｂｕｓｔｉｎ，Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｕｓｉｎｇ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ，Ｊ．ｏｆ  Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，２５，１６９−１９３（２０００）において総説されている。
【００４７】
図４および５は、核レセプター複合体形成（例えば、二量体化）および遺伝子発現に対する複合体形成の下流効果がともに、どのように組換え細胞株においてモニターされ得るかを示す。図４および５において、核レセプターのβ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質は、第２のレセプターの融合タンパク質とともに、試験細胞において同時発現される。図４において、その第２のレセプターは、第１のレセプターと同じであるのに対して、図５においては、その第２のレセプターは、第１のレセプターとは異なっている。試験細胞はまた、レポーター遺伝子に作動可能に連結されるホルモン応答エレメントをコードするＤＮＡ配列を含み得る。この型のＤＮＡ配列は、米国特許第５，０７１，７７３号および同第５，２９８，４２９号（これらは、その全体が、本明細書中に参考として援用される）に記載される。
【００４８】
図４は、Ｉ型核レセプターについての二量体化および遺伝子発現を例示する。Ｉ型リガンド(例えば、コルチゾール、テストステロンなど)およびエストロゲン(すなわち、エストラジオール)が、サイトゾル中のそれらの対応する核レセプターに結合することが公知である。図４に示されるように、リガンド４２は、形質膜４５を介して、細胞４１の細胞質４７へと移行される４４。図４に示されるように、細胞４１は、熱ショックタンパク質４８と会合した核レセプター５０を含む。一旦リガンド４２が、核レセプター５０に結合すると４６、４８、核レセプター５０は、熱ショックタンパク質４９から解離して５２、ホルモン応答エレメントへの結合について「活性化」される。次いで、活性化レセプターは、細胞４１の核４３へと動き得る５４、５６。一旦核４３の中に入ると、活性化レセプターは、二量体化し、次いで対応するホルモン応答エレメント（ＨＲＥ）５２に結合する５４、５７か、または連続して結合する５６かのいずれかである。結果として、二量体が結合した特定のＤＮＡの転写５８は、調節され得る。核４３における転写されたメッセンジャーＲＮＡは、次いで、サイトゾル４７へと動き得る５９。ここでこのメッセンジャーＲＮＡは、リボソーム上でタンパク質へと翻訳され得る。
【００４９】
本発明に従って、タンパク質間相互作用５４、５６は、第１のシグナル５１を生成するために使用され得、遺伝子発現５８、５９は、第２のシグナル５３を生成するために使用され得る。第２のシグナル53は、レポーター遺伝子の発現から生成され得る。このようにして、核レセプター相互作用および遺伝子発現に対するこれらの相互作用の下流効果が、モニターされ得る。
【００５０】
図５は、ＩＩ型核レセプターについての二量体化および遺伝子発現を例示する。ＩＩ型核レセプターについてのリガンドとしては、ビタミンＤ、甲状腺ホルモン（Ｔ３）およびレチノイド（ビタミンＡ）が挙げられる。ＩＩ型レセプターの活性化は、ホモ二量体化またはヘテロ二量体化（これは、図５に示される）のいずれかをもたらし得、次いで、ＤＮＡ結合をもたらし得る。レチノイン酸レセプター（ＲＡＲ）の場合、例えば、ＤＮＡ応答エレメントは、全トランスレチノイン酸リガンドの存在下で同じ型の２つのレセプターを結合し（ホモ二量体）、ＤＮＡ転写を抑制する。しかし、Ｔ３（例えば、トリヨードサイロニン）の存在下で、Ｔ３についての１つのレセプターは、結合ＲＡＲの１つのレセプターと換わって、ＲＡＲ／Ｔ３レセプターヘテロ二量体を生成する。このヘテロ二量体は、ＤＮＡ転写のスイッチを入れる。活性化レセプターのその標的ＤＮＡに対する効果は、種々の要因に依存し得る。これらの要因としては、そのホルモン応答エレメントと他のＤＮＡエレメントとの関係、およびその特定のＤＮＡ分子の転写因子が挙げられる。
【００５１】
図５に示されるように、リガンド６２、６６は、形質膜７１および細胞質７２を通って、細胞６０の核７４へと、いかなるレセプターも結合することなく移動する６１、６５。一旦核に入ると、リガンド６２、６６は、レセプター６４、６８を活性化し得る。次いで、このリガンド活性化レセプターは、そのホルモン応答エレメント７０に連続的に結合する７７，７９か、またはまず二量体化して７３，７５、次いで二量体形態８１でホルモン応答エレメント７０に結合し得る。結果として、メッセンジャーＲＮＡ（すなわち、ｍＲＮＡ）の転写がもたらされ得る。図５に示されるように、核中の転写されたメッセンジャーＲＮＡは、次いで、サイトゾル７２へと動き得る８５。サイトゾルで、このメッセンジャーＲＮＡは、リボソーム上でタンパク質へと翻訳され得る。本発明に従って、タンパク質間相互作用７３、７５または７７、７９は、第１のシグナル７６を生成するために使用され得、遺伝子発現８３、８５は、第２のシグナル７８を生成するために使用され得る。このようにして、核レセプター相互作用および遺伝子発現に対するこれらの相互作用の下流効果がともに、モニターされ得る。
【００５２】
本発明に従って、転写されたｍＲＮＡは、当該分野で公知の種々の技術を用いてアッセイされ得る。このようにして、遺伝子発現に対するタンパク質間相互作用の効果が、モニターされ得る。あるいは、プロモーター（例えば、特定のホルモン応答エレメントの調節配列）に連結されたレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）は、遺伝子発現に対するタンパク質間相互作用の効果を決定するために使用され得る。このようにして、レポーター遺伝子の発現に対するタンパク質間相互作用の影響は、目的の遺伝子の発現に関連し得る。
【００５３】
図４および５は、存在し得る、かつ細胞内で相互作用し得る種々の因子を例示するために意図されるに過ぎない。これらの図およびその考察は、本発明を如何様にも限定することを意図しない。
【００５４】
本発明に従って、タンパク質間相互作用から生じるβ−ガラクトシダーゼ活性は、細胞溶解が、β−ガラクトシダーゼレポーター酵素活性の化学発光検出と組み合わせられるアッセイ系を使用して検出され得る。本発明に従うこのアッセイ系は、例えば、化学発光基質（例えば、酵素不安定置換基および１つ以上の安定化基を有する１，２−ジオキセタン化合物）を使用し得る。この型の化学発光基質は、例えば、米国特許第５，８５１，７７１号；同第５，５３８，８４７号；同第５，３２６，８８２号；同第５，１４５，７７２号；同第４，９７８，６１４号および同第４，９３１，５６９号（これら各々の内容は、その全体が本明細書中に参考として援用される）に開示される。前述の参考文献に開示される任意の化学発光基質は、本発明に従うアッセイにおいて使用され得る。他の化学発光基質もまた使用され得る。酵素切断の際に光を発する任意の基質が、本発明に従って使用され得る。本発明の好ましい実施形態に従って、化学発光基質は、アダマンチル安定化基を有する１，２−ジオキセタンである。この型の材料は、商標名Ｇａｌａｃｔｏｎ−Ｓｔａｒ（登録商標）の下で入手可能であり、これは、Ａｐｐｌｅｒａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎまたはその子会社の登録商標である。
【００５５】
本発明に従う酵素活性から得られる発光は、ルミノメーターにおいて測定され、それによって、核レセプター複合体形成および遺伝子発現に対する複合体形成の効果の尺度を提供し得る。例えば、β−ガラクトシダーゼレポーター酵素活性は、核レセプター複合体形成の尺度を提供し得るのに対して、代理レポーター（例えば、ルシフェラーゼ）の酵素活性は、遺伝子発現の尺度を提供し得る。本発明に従う発光はまた、シンチレーションカウンターまたは任意の他の公知の光測定デバイスを用いて測定され得る。
【００５６】
本発明に従うアッセイは、細胞溶解物を、化学発光基質および必要に応じて化学発光基質増強剤を含む反応緩衝液とともにインキュベートすることによって実施され得る。任意の公知の化学発光基質増強剤は、本発明に従って使用され得る。インキュベーションは、最大発光に達し、その時点での発光が測定され得るまで、行われ得る。この型のアッセイ系は、商標名Ｇａｌａｃｔｏ−ＳｔａｒＴＭの下で入手可能であり、これは、Ａｐｐｌｅｒａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎまたはその子会社の登録商標である。しかし他のアッセイ系および技術もまた、本発明に従って使用され得る。
【００５７】
上記のように、本発明は、タンパク質間相互作用スクリーニングを使用して、シグナル伝達経路をマッピングすることにより一部達成される。この技術は、多様な機能を有する既知および未知の核レセプター（オーファン核レセプター（そのレセプターに対する天然のリガンドは同定されていない）を含む）とともに使用され得る。
【００５８】
ガラクトシダーゼ補完技術の使用は、任意の細胞下区画膜（例えば、サイトゾルまたは核）におけるタンパク質相互作用をモニターする能力を含め、核レセプタースクリーニングプロセスに多くの利点を提供する。さらに、本発明は、核レセプター結合アッセイを提供する。このアッセイは、迅速な、非放射性形式において、細胞環境内で直接達成され得る。本発明のアッセイ技術は、従って、タンパク質の過剰発現を必要とすることなく、より多くの生理学的に関連するモデルを提供し得る。本発明のアッセイ系はまた、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）に供しやすい核レセプター経路を調べるための細胞ベースの方法を提供し得る。
【００５９】
本発明は、多くのさらなる利点を有する。第１に、哺乳動物細胞、線虫細胞、酵母細胞、細菌細胞、および昆虫細胞を含む種々の細胞に適用可能である。第２に、細胞のサイトゾルまたは核において相互作用を検出し得る。また、転写活性化のような間接的な読み取りに依存するのではなく、むしろ、核レセプターと第２のタンパク質との間の相互作用が直接モニターされることを可能にする。本発明は、従って、高度な生理学的関連性を有するアッセイを提供し得る。
【００６０】
本発明の方法は、核レセプターと第２のタンパク質との間の相互作用に対する変異の効果を決定するために使用され得る。例えば、核レセプターと他のタンパク質との間の相互作用に対するコードＳＮＰのような一ヌクレオチド多型（すなわち、ＳＮＰ）の効果は、本発明に従って決定され得る。コードＳＮＰは、変化したまたは変異した遺伝子によってコードされる、タンパク質の配列が変化しているＳＮＰである。本発明に従って、核レセプターのＳＮＰとタンパク質パートナー（例えば、補因子）との間の相互作用が決定され得る。あるいは、核レセプターとタンパク質パートナー（例えば、補因子）のＳＮＰとの間の相互作用もまた、本発明に従って決定され得る。さらに、２つのタンパク質間の相互作用に対する核レセプターおよび／またはタンパク質パートナー（例えば、補因子）の種々の変異の効果は、本発明に従って決定され得る。
【００６１】
本発明のアッセイ、ならびにそれらの適用および調製は、一般に、または具体的な実施例の両方によって記載されてきた。しかし、実施例は、限定することを意図されない。他の実施形態は、創作能力を働かせることなく、当業者に想起される。このような改変は、依然として本発明の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
本発明は、添付の図面を参照して記載される：
【図１】図１Ａ〜１Ｃは、本発明に従う、核レセプター二量体化をモニターする方法を例示する。ここで第１の核レセプターは、１つの補完酵素フラグメントに融合され、第２のＮＲは、第２の補完酵素フラグメントに融合され、これら２つのＮＲの二量体化は、これらの酵素フラグメントの補完を生じて、活性な酵素複合体を生成する。
【図２】図２Ａ〜２Ｃは、本発明の方法における補完技術の使用を例示する。ここで２つの不活性変異レポーター酵素は、第１のガラクトシダーゼフラグメントに融合された核レセプターおよび第２のガラクトシダーゼフラグメントに融合された核レセプターについての補因子が相互作用する際に、活性になる。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、β−ガラクトシダーゼ変異補完によって、オーファン核レセプターについてのリガンドを決定する方法(例えば、リガンドの釣り上げ)を例示する。ここで２つのβ−ｇａｌ融合タンパク質（例えば、第１のガラクトシダーゼフラグメント−ＮＲオーファン−Δαに融合されたオーファン核レセプター）および既知の補因子(例えば、第２のガラクトシダーゼフラグメント−ＡＣＴＲ−Δωに融合されたＡＣＴＲ）を発現する試験細胞は、リガンドを含むサンプルでの処理に供される。
【図４】図４は、細胞におけるＩ型核レセプター複合体形成(すなわち、ホモ二量体化)および遺伝子発現を例示し、ここでリガンドは、細胞質において核レセプターに結合し、細胞核へ輸送するためにレセプターを活性化し、細胞核内のホルモン応答エレメントに結合する。
【図５】図５は、細胞におけるＩＩ型核レセプター複合体形成(すなわち、ヘテロ二量体化)および遺伝子発現を例示し、ここで核レセプターの各々についてのリガンドは、細胞核に輸送され、細胞核において核レセプターの各々に結合し、その後、二量体化および細胞核内のホルモン応答エレメントに結合する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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