(57)【要約】クロマトグラフィー分離及び電場における分離用のマクロポーラスゲル。当該ゲルは、必要に応じて充填剤の存在下、１種以上の水溶性モノマーの水溶液を、水性溶媒の結晶化点より低い温度での凍結下（該温度で、溶媒は、溶媒の非凍結画分に濃縮された溶解物質と共に部分的に凍結され、クライオゲルが形成される）で重合することによって得られる。当該ゲルは、リガンド、荷電基、色素及び疎水性基からなる群から選択されるメンバーを導入することによって更に修飾することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のことによって得られる、クロマトグラフィー分離及び電場における分離用のマクロポーラスゲル：
ａ）Ｎ−置換及び非置換（メタ）アクリルアミド；
Ｎ−アルキル置換Ｎ−ビニルアミド；
ヒドロキシアルキル（メタ）アクリレート；
ビニルアセテート；
ビニルアルコールのアルキルエーテル；
環置換スチレン誘導体；
ビニルモノマー；
（メタ）アクリル酸及びその塩；
ケイ酸；及び
重縮合によりポリマーを形成できるモノマー；
からなる群から選択される１種以上の水溶性モノマーの水溶液を、水性溶媒の結晶化点より低い温度での凍結下で重合し、ここで、該水性溶媒の結晶化点より低い温度で、系中の溶媒が、溶媒の非凍結画分に濃縮された溶解物質と共に部分的に凍結され、クライオゲルが形成されること、及び
ｂ１）（ｉ）クライオゲルの解凍に続いて自体公知の方法による１つ以上の工程において、又は（ｉｉ）適切である場合、重合反応において適切に置換されたモノマーを使用することによって、リガンド、荷電基、色素及び疎水性基からなる群から選択されるメンバーをクライオゲル中に導入することによってクライオゲルを修飾すること；又は
ｂ２）充填剤の存在下で重合を行うこと；又は
ｂ３）充填剤の存在下で重合を行い、クライオゲルの解凍後、上記ｂ１）に記載の通りクライオゲルを修飾すること。
【請求項２】
溶媒又は溶媒系が、水および水と水混和性有機溶媒との混合物からなる群から選択される、請求項１に記載のマクロポーラスゲル。
【請求項３】
リガンドが、ペプチド、金属キレート、糖誘導体、ボロネート誘導体、酵素基質およびそれらのアナログ、酵素インヒビターおよびそれらのアナログ、蛋白質インヒビター、抗体およびそれらのフラグメント、コンビナトリアル化学により得られるリガンド構造体、及びチオール含有物質からなる群から選択される、請求項１に記載のマクロポーラスゲル。
【請求項４】
ゲルが、ゲル中にイオン交換基を導入することによって修飾されるようになっている、請求項１に記載のマクロポーラスゲル。
【請求項５】
充填剤が、粒子状金属及び金属酸化物からなる群から選択される、請求項１に記載のマクロポーラスゲル。
【請求項６】
充填剤が、粒子の形態のイオン交換物質からなる群から選択される、請求項１に記載のマクロポーラスゲル。
【請求項７】
解凍後のクライオゲルが、アルキレンジアミン、グルタルアルデヒド、ジ−およびトリ−グリシジル化合物、及びジビニルスルホンからなる群から選択される架橋剤によって架橋されている、請求項１〜６のいずれかに記載のマクロポーラスゲル。
【請求項８】
開始剤系の存在下、アクリルアミドとＮ，Ｎ−メチレン−ビス−アクリルアミドとの水溶液を凍結下で重合し、このように形成されたクライオゲルを解凍し、エチレンジアミンを用いて該クライオゲルにアミノ基転移を行い、その後、ジビニルスルホンで処理し、続いて、イミノ二酢酸で処理し、最後に、金属結合ペプチドとの結合のためにリガンドとしてＣｕ２＋イオンを負荷することによって得られる、請求項１に記載のマクロポーラスゲル。
【請求項９】
カラムに入れられたモノリスの形態である、請求項１〜８のいずれかに記載のマクロポーラスゲル。
【請求項１０】
粒子の形態である、請求項１〜８のいずれかに記載のマクロポーラスゲル。
【請求項１１】
ディスク又は膜の形態である、請求項１〜８のいずれかに記載のマクロポーラスゲル。
【請求項１２】
マクロポーラスゲル形態のポリマーの製造方法であって、
その特徴が、
Ｎ−置換及び非置換（メタ）アクリルアミド；
Ｎ−アルキル置換Ｎ−ビニルアミド；
ヒドロキシアルキル（メタ）アクリレート；
ビニルアセテート；
ビニルアルコールのアルキルエーテル；
環置換スチレン誘導体；
ビニルモノマー；
（メタ）アクリル酸及びその塩；
ケイ酸；及び
重縮合によりポリマーを形成できるモノマー；
からなる群から選択される１種以上の水溶性モノマーの水溶液を、充填剤の存在下、水性溶媒の結晶化点より低い温度での凍結下で重合し、ここで、該水性溶媒の結晶化点より低い温度で、系中の溶媒が、溶媒の非凍結画分に濃縮された溶解物質と共に部分的に凍結され、クライオゲルが形成されること、及び、次いで、このようにして得られた反応産物を解凍することである、
前記製造方法。
【請求項１３】
マクロポーラスゲル形態のポリマーの製造方法であって、
その特徴が、
Ｎ−置換及び非置換（メタ）アクリルアミド；
Ｎ−アルキル置換Ｎ−ビニルアミド；
ヒドロキシアルキル（メタ）アクリレート；
ビニルアセテート；
ビニルアルコールのアルキルエーテル；
環置換スチレン誘導体；
ビニルモノマー；
（メタ）アクリル酸及びその塩；
ケイ酸；及び
重縮合によりポリマーを形成できるモノマー；
からなる群から選択される１種以上の水溶性モノマーの水溶液を、溶媒の結晶化点より低い温度での凍結下で重合し、ここで、該溶媒の結晶化点より低い温度で、系中の溶媒が、溶媒の非凍結画分に濃縮された溶解物質と共に部分的に凍結され、クライオゲルが形成されること、及び、（ｉ）該クライオゲルの解凍に続いて自体公知の方法による１つ以上の工程において、又は（ｉｉ）適切である場合、重合反応において適切に置換されたモノマーを使用することによって、リガンド、荷電基、色素及び疎水性基からなる群から選択されるメンバーを該クライオゲル中に導入することによって該クライオゲルを修飾することである、
前記製造方法。
【請求項１４】
リガンドが、ペプチド、金属キレート、糖誘導体、ボロネート誘導体、酵素基質およびそれらのアナログ、酵素インヒビターおよびそれらのアナログ、蛋白質インヒビター、抗体およびそれらのフラグメント、コンビナトリアル化学により得られるリガンド構造体、及びチオール含有物質からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
クライオゲルが、解凍後、クライオゲル中にイオン交換基を導入することによって修飾される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
重合が充填剤の存在下で行われる、請求項１３〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
充填剤が、粒子状金属及び金属酸化物からなる群から選択される、請求項１２及び１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
充填剤が、粒子の形態のイオン交換物質からなる群から選択される、請求項１２及び１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
重合が架橋剤の存在下で行われる、請求項１２〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
クライオゲルが、関係のある場合において、解凍後であるが修飾前に、アルキレンジアミン、グルタルアルデヒド、ジ−およびトリ−グリシジル化合物、及びジビニルスルホンからなる群から選択される架橋剤によって架橋される、請求項１２〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
開始剤系の存在下、アクリルアミドとＮ，Ｎ−メチレン−ビス−アクリルアミドとの水溶液を冷却下で重合してクライオゲルポリマーを形成し、該クライオゲルポリマーを解凍し、該クライオゲルポリマーにエチレンジアミンを用いてアミノ基転移を行い、次いで、ジビニルスルホンで処理し、続いて、イミノ二酢酸で処理し、最後に、金属結合ペプチドとの結合のためにリガンドとしてＣｕ２＋イオンを負荷する、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
細胞をそれらの表面の特異的特性に従って細胞混合物から分離するための、請求項１〜４のいずれかに記載のマクロポーラスゲルの使用。
【請求項２３】
マクロポーラスゲルが、請求項８に記載の通りであり、細胞表面で発現する金属結合ペプチドを担持する微生物細胞の吸着アフィニティクロマトグラフィーのために使用される、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
低分子量産物を、該産物の電荷、疎水性、又は、分離媒体で利用可能なリガンド、荷電基もしくは疎水性基に対するアフィニティに従って細胞懸濁液又は粗ホモジネートから分離するための、請求項１〜４のいずれかに記載のマクロポーラスゲルの使用。
【請求項２５】
蛋白質及び他の高分子を、該蛋白質／高分子の電荷、疎水性、又は、マクロポーラスゲルまたは分離媒体で利用可能なリガンド、荷電基または疎水性基に対するアフィニティに従って細胞懸濁液又は粗ホモジネートから分離するための、請求項１〜４のいずれかに記載のマクロポーラスゲルの使用。
【請求項２６】
金属結合ペプチドのタグを有する組換え乳酸脱水素酵素を粗ホモジネートから直接捕捉するための、請求項８に記載のマクロポーラスゲルの使用。
【請求項２７】
ウイルスをそれらの表面の特異的特性に従ってウイルス懸濁液から分離するための、請求項１〜４のいずれかに記載のマクロポーラスゲルの使用。
【請求項２８】
プラスミドをそれらの電荷、形状、塩基の露出、及びコイル様式に従って粗懸濁液から分離するための、請求項１、４及び６のいずれかに記載のマクロポーラスゲルの使用。
【請求項２９】
ａ）細胞をそれらの表面の特異的特性に従って細胞混合物から分離するため；
ｂ）低分子量産物又は蛋白質のような高分子を、該産物の電荷、疎水性、又は、リガンド、荷電基及び疎水性基からなる群から選択される少なくとも１つのメンバーに対するアフィニティに従って細胞懸濁液又は粗ホモジネートから分離するため；
ｃ）ウイルスをそれらの表面の特異的特性に従ってウイルス懸濁液から分離するため；又は
ｄ）プラスミドをそれらの電荷、形状、塩基の露出及びコイル様式に従ってそれらの粗懸濁液から分離するため；
の方法であって、
当該分離するための方法は、該細胞混合物、細胞懸濁液または粗ホモジネート、ウイルス懸濁液及び粗プラスミド懸濁液を、分離媒体にそれぞれ、細胞、低分子量産物または蛋白質のような高分子、ウイルス及びプラスミドを吸着させるために該分離媒体に接触させ、次いで、該分離媒体からそれらを溶出することによるものであり、
その特徴が、
該分離媒体が請求項１３及び１５のいずれかに記載の方法によって製造されるマクロポーラスゲルであることである、
前記分離するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、マクロポーラスゲル(macroporous gel)、その製造及びその使用に関する。より詳細には、本発明は、クロマトグラフィー分離及び電場における分離用のマクロポーラスゲル、クライオゲル(cryogel)の形態のこのような分離媒体の製造並びに該分離媒体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
生物科学での最近の進歩により、研究の関心は、個々の生体分子から、これらの生体分子がどのようにより複雑な構造に組織化され、これらの構造がどのように生細胞で機能するかという問題に、大いに焦点が変わった。個々の生体分子に関する研究の広範な経験により、１０６Ｄａ未満の分子量の分子物体の単離精製のための多数の非常に効率的な技術が開発された。反対に、ナノ粒子（プラスミド、細胞オルガネラ、ウイルス、蛋白質封入体、高分子アセンブリなど）という名でしばしば結び付けられる大きな物体の精製、並びに異なる種の細胞の分離は依然として挑戦すべきもののままである。大きな粒子サイズ（１００−１０００ｎｍ）、低い拡散速度、及び複雑な分子表面により、このような物体は、蛋白質高分子（普通、＜１０ｎｍ）から区別される。
【０００３】
超遠心やミクロ／限外濾過のような、ナノ粒子の単離のために伝統的に使用されるアプローチは、細胞残渣と標的ナノ粒子とのサイズや密度の類似性のせいで、スケール又は分解能が制限されている。水性２相系での分配は、ナノ粒子の単離のために代替的に使用できるが、標的産物を相形成ポリマーから分離する必要性があるという難点がある。
【０００４】
クロマトグラフィーマトリックスへの選択的吸着は、分解能のスケールアップとプロセスの一体化に関して多数の潜在的利点を提供する方法である。ほんの少数の市販のクロマトグラフィーマトリックス（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＰｈａｒｍａｃｉａからのセファクリルＳ−１００ＳＦ）が、粒子内孔内に直径４００ｎｍまでの球形粒子を収容すると主張していることに注目すべきである。
【０００５】
ナノ粒子や細胞は、大きなサイズのせいで、非常に低い拡散係数を有し、対流によってのみ孔内に強制的に入れられ得る。ビーズ状クロマトグラフィーマトリックスに関して、カラム中の対流の大部分は、ビーズの間のボイドを流れる。最近開発された孔サイズ８００ｎｍの超多孔性ビーズでさえ、流れの９５％までが、ビーズの周りのボイドを流れる。
【０００６】
９０年代初期に、Svec, F.およびFrechet, J. M. , Science 273: 205-211 (1996)は、クロマトグラフィーカラム内部での制御された重合によって製造される、成形された連続的クロマトグラフィー媒体、即ち、いわゆるマクロポーラスモノリスを使用することを提案した。典型的には、これらのモノリスは、スチレン又はアクリレートモノマーの重合によって製造され、７００−２０００ｎｍ（０．７−２μｍ）の範囲の直径を有するフロースルーの孔を含む。後に、２０−２００μｍほどの大きさの孔を有する連続的超多孔性クロマトグラフィー媒体が、Gustavsson, P. E.およびLarsson, P-0., J. Chromatog. A. 795: 199-210 (1998); Braas, GMF,ら, Trans. Inst. Chem. Eng. 78: 11-15 (2000)によってアガロースから製造された。これらの孔は、酵母細胞ほどの大きさの物体を容易に収容することができた。
【０００７】
独特の特性の組合せをもった新規クラスの材料として、クライオゲルが最近出現した。広範な種々の形態をもった高度に多孔性のポリマー材料は、クライオトロピックゲル化(cryotropic gelation)技術を用いて、実際的に任意のゲル形成前駆体からも製造することができた。クライオトロピックゲル化（クライオゲル化(cryogelation)又はクライオ構造化(cryostructuration)は、しばしば同義語として使用される）は、特定タイプのゲル形成であり、それは、潜在的にゲル化できる系の低温処理の結果として起こる［Lozinsky, V. I., Vainerman, E. S., Rogozhin, S. V. , Method for the preparation of macroporous polymer materials, SU発明者証明書No. 1008214 (1982)］。クライオゲル化の本質的特徴は、溶媒の強制的結晶化であり、これによって、クライオゲル化は、低温でゲル化が起こる際、例えば、溶媒のいかなる相転移も無く進行するゼラチン又はアガロース溶液のゲル化として、冷却誘導（chilling-induced）ゲル化とは区別される。
【０００８】
クライオゲル化のプロセスは、幾つかの独特の特徴を有する。
１．クライオトロピックゲル形成は、巨視的に凍結したサンプル中に存在する非凍結液体ミクロ相で進行するプロセスである。凍結点より低い適度の温度で、液体の一部は、最初の溶液に存在する全ての溶質を高濃度で非凍結蓄積（いわゆる低温濃縮(cryoconcentrating)）したままである。物理的ゲル化の化学反応又はプロセスは、最初よりも明らかにずっと高い濃度で非凍結ミクロ相において進行する。
【０００９】
２．非凍結液体中に溶解した物質の低温濃縮の結果として、凍結点より高い温度での伝統的ゲル化と比較して、ゲル化の臨界濃度の減少が起こる。
【００１０】
３．適度に凍結したサンプルにおけるクライオゲル化は、通常、凍結点より高い温度での伝統的ゲル化よりも速く進行する。
【００１１】
４．溶媒の凍結結晶は、クライオゲルが形成される際に細孔形成剤(porogen)の役割を演じ、相互連結したマクロ孔の系を生成する。マクロ孔サイズは、数百μｍ（φ）ほどの大きさであり得る。凍結を超える温度で同一前駆体から産生される伝統的な連続的単相ゲルとは反対に、クライオゲルはしばしばスポンジ状形態を有する。クライオゲル中の溶媒の大部分は、毛細管結合しており、機械的に容易に除去し得る。
【００１２】
５．クライオゲル化の温度依存性は、ゲル化を容易にする効果（低温濃縮）とそれを遅らせる因子（低温、液体ミクロ相での高粘度）との間の平衡によって、通常、最適条件を有する。
【００１３】
６．マクロ孔間におけるポリマー壁の弾性のせいで、クライオゲルは、機械的に強く、もろくはない。
【００１４】
７．クライオゲルの多孔性、機械的強度及び密度は、クライオゲル化の温度、サンプルが凍結状態に保たれる時間、及び凍結／解凍速度によって制御され得る。
【００１５】
一般的に、クライオゲルの製造は十分に記載されている。総説として、例えば、Kaetsu, I. , Adv. Polym. Sci. 105: 81 (1993); Lozinsky, V. I.およびPlieva, F. M. , Enzyme Microb. Tech- nol. 23: 227-242 (1998); 及び Hassan, Ch. M.およびPeppas, N. A., Adv. Polym. Sci. 151: 37 (2000)を参照せよ。
【００１６】
最も集中的に研究されたクライオゲルは、入手の容易性のために、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）から製造されるものである。即ち、ＰＶＡ水溶液を０℃より低い範囲内の温度に冷却するとき、ＰＶＡのゲル化と水の結晶化との比は、クライオゲルが容易に形成されるようなものである。しかし、０℃より低い温度への冷却下（該温度で、系中の水は、水の非凍結画分に濃縮された溶解物質と共に部分的に凍結される）でモノマー水溶液を重合してクライオゲルを形成することによるクライオゲルの製造はまた、文献に開示されている。ラジカル重合開始剤の存在下、アクリルアミドとＮ，Ｎ’−メチレン−ビス−アクリルアミドとの水溶液を０℃より低い温度への冷却下で重合することによる、クライオゲルの製造は、例えば、E. M. Belavtsevaら、Colloid & Polymer Sci. 262: 775-779 (1984); V. I. Lozinskyら、Colloid & Polymer Sci. 262: 769-774 (1984) 及び D. G. Gusevら、Eur. Polym. J. Vol. 29, No. 1,49-55, 1993によって開示されている。しかし、これらの参考文献は、このポリマー系のクライオ構造化の研究を報告するのみで、クライオゲルの実際的な使用は、その中には示唆されていない。
【００１７】
系中の溶媒が該溶媒の非凍結画分に濃縮された溶解物質と共に部分的に凍結される温度での冷却下、モノマーの水溶液を重合することによって製造される更なるクライオゲルは、ＳＵ発明者証明書N0.1008214に開示されている。しかし、分離媒体としてのクライオゲルの使用は、その中に開示されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明の目的は、クロマトグラフィー分離及び電場における分離用の分離媒体として使用し得る新規マクロポーラスゲルを提供することである。
【００１９】
本発明の別の目的は、溶媒の結晶化点より低い温度への凍結下、溶液中の１種以上のモノマーを重合することによって製造され、かつ、該溶液中の特定の添加剤の存在によって改善された特性を有するマクロポーラスゲルを提供することである。
【００２０】
本発明の更に別の目的は、溶媒の結晶化点より低い温度への凍結下、溶液中の１種以上のモノマーを重合することによって製造され、かつ、分離媒体としての使用に特に適した特性を示すように修飾されているマクロポーラスゲルを提供することである。
【００２１】
本発明の別の目的は、細胞、ウイルス又はナノ粒子をそれらの懸濁液から分離するために使用し得るマクロポーラスゲルを提供することである。
【００２２】
本発明の更なる目的は、細胞をそれらの表面の特異的特性に従って細胞混合物から分離するために使用し得るマクロポーラスゲルを提供することである。
【００２３】
本発明の目的はまた、それらの表面で発現する金属結合ペプチドを担持する微生物細胞の吸着アフィニティクロマトグラフィーのために使用することができるマクロポーラスゲルを提供することである。
【００２４】
本発明のなお更なる目的は、低分子量産物または蛋白質を該産物または蛋白質の電荷、疎水性又はアフィニティに従って細胞懸濁液又は粗ホモジネートから分離するために使用することができるマクロポーラスゲルを提供することである。
【００２５】
これらの目的及び他の目的は、本発明によって達成される。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
発明の開示
本発明の１局面によれば、以下のことによって得られるマクロポーラスゲルが提供される：
ａ）Ｎ−置換及び非置換（メタ）アクリルアミド；
Ｎ−アルキル置換Ｎ−ビニルアミド；
ヒドロキシアルキル（メタ）アクリレート；
ビニルアセテート；
ビニルアルコールのアルキルエーテル；
環置換スチレン誘導体；
ビニルモノマー；
（メタ）アクリル酸及びその塩；
ケイ酸；及び
重縮合によりポリマーを形成できるモノマー；
からなる群から選択される１種以上の水溶性モノマーの水溶液を、溶媒の結晶化点より低い温度での凍結下で重合し、ここで、該水性溶媒の結晶化点より低い温度で、系中の溶媒が、溶媒の非凍結画分に濃縮された溶解物質と共に部分的に凍結され、クライオゲルが形成されること、及び
ｂ１）（ｉ）クライオゲルの解凍に続いて自体公知の方法による１つ以上の工程において、又は（ｉｉ）適切である場合、重合反応において適切に置換されたモノマーを使用することによって、リガンド、荷電基、色素及び疎水性基からなる群から選択されるメンバーをクライオゲル中に導入することによってクライオゲルを修飾すること；又は
ｂ２）充填剤の存在下で重合を行うこと；又は
ｂ３）充填剤の存在下で重合を行い、クライオゲルの解凍後、上記ｂ１）に記載の通りクライオゲルを修飾すること。
【００２７】
マクロポーラスゲルは、ホモポリマー及びコポリマーであり得る。
【００２８】
本発明の使用に関し、必要なとき、文献と実施から、クライオゲルの製造のために考えられる低温でポリマーを形成するのに十分に反応性であると期待され得るモノマー、モノマーの組合せ、及び反応開始剤系が選択される。
【００２９】
本発明によるマクロポーラスゲルの製造に使用されるＮ−置換及び非置換（メタ）アクリルアミドの例は、アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジアリルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−メチレン−ビス−アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−メチレン−ビス−メタクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−ヘキサメチレン−ビス−アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−ブチルアクリルアミド、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドである。
【００３０】
本発明によるマクロポーラスゲルの製造に使用されるＮ−アルキル置換Ｎ−ビニルアミドの例は、Ｎ−ビニルピロリドン、Ｎ−ビニルカプロラクタム、Ｎ−ビニル−Ｎ−メチルアセトアミド、Ｎ−ビニル−Ｎ−エチルアセトアミドである。
【００３１】
本発明によるマクロポーラスゲルの製造に使用されるヒドロキシアルキル（メタ）アクリレートの例は、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート、（エチレングリコール）ジメタクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、２−ヒドロキシプロピルメタクリレート、２−ヒドロキシエチルアクリレート、４−ヒドロキシブチルメタクリレートである。
【００３２】
本発明によるマクロポーラスゲルの製造に使用されるビニルアルコールのアルキルエーテルの例は、ビニルメチルエーテル、ビニルエチルエーテル、ビニルプロピルエーテル、ビニルイソプロピルエーテル、ビニルブチルエーテルである。
【００３３】
本発明によるマクロポーラスゲルの製造に使用される環置換スチレン誘導体の例は、４−スチレンスルホン酸ナトリウム塩、４−クロロ−メチルスチレン、メチルスチレン、４−ビニル安息香酸である。
【００３４】
本発明によるマクロポーラスゲルの製造に使用されるビニルモノマーの例は、２−ビニルピリジン、４−ビニルピリジン、Ｎ−ビニルカルバゾール、１−ビニルイミダゾール、ビニルアザラクトン、Ｎ−ビニルウレアである。
【００３５】
本発明によるマクロポーラスゲルの製造に使用され得る（メタ）アクリル酸の塩は、主にＮａ、Ｋおよびアンモニウム塩である。
【００３６】
本発明によるマクロポーラスゲルの製造に使用される、重縮合によりポリマーを形成できるモノマーの例は、水溶性カルボジイミド存在下での、ポリアミン（例えば、ジアミノベンゼン、トリアミノベンゼン、リシルリシンなど）、ジアルデヒド（例えば、グリオキサール、グルタルアルデヒド、テレフタルアルデヒドなど）、多官能性アミノ酸およびペプチド、などである。
【００３７】
上記で特定した群のモノマー又はモノマーの組合せの重合と関連して通常使用される開始剤系は、必要なとき、又は所望のとき、使用される。
【００３８】
低温重合(cryopolymerization)に使用される溶媒又は溶媒系は、水および水と水混和性有機溶媒との混合物からなる群から選択される。
【００３９】
好ましくは、低温重合に使用される溶媒は、水単独であるが、少量の１種以上の水混和性有機溶媒（例えば、メタノール、エタノール、ジオキサン、アセトン、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びアセトニトリル）と混合した水も意図してよい。
【００４０】
凍結又は冷却が行われる温度は、各々の特定の場合に使用される溶媒又は溶媒系の結晶化点に依存する。該温度は、一般的に、結晶化時間を少なく保つために溶媒又は溶媒系の凍結点より少なくとも５℃低くあるべきである。例えば、溶媒として水の場合、凍結は一般的に、−５℃〜−４０℃、好ましくは−１０℃〜−３０℃の範囲内の温度まで行われる。
【００４１】
反応終了後、解凍が行われ、その後、形成されたクライオゲルは、適当な液体（例えば、水、緩衝液、界面活性剤含有溶液、有機溶媒、有機溶媒と水又は互いとの混合物）で徹底的に洗浄され、非重合不純物が除去される。
【００４２】
本発明のマクロポーラスゲルの好適な実施態様によれば、上記のように形成されたクライオゲルは、解凍後、自体公知の方法による１つ以上の後続工程において、リガンド、荷電基、及び疎水性基からなる群から選択されるメンバーを該クライオゲル中に導入することによって、修飾されている。
【００４３】
本発明のマクロポーラスゲルのこの実施態様によれば、このように導入されるリガンドは、ペプチド、金属キレート、糖誘導体、ボロネート誘導体、酵素基質およびそれらのアナログ、酵素インヒビターおよびそれらのアナログ、蛋白質インヒビター、抗体およびそれらのフラグメント、コンビナトリアル化学により得られるリガンド構造体、及びチオール含有物質からなる群から選択され得る。
【００４４】
また、本発明のマクロポーラスゲルのこの実施態様によれば、該ゲルは、色素及びイオン交換基からなる群から選択されるメンバーを該ゲル中に導入することによって、修飾されるようになっていてもよい。
【００４５】
本発明のこの実施態様によるマクロポーラスゲルの例は、開始剤系の存在下、アクリルアミドとＮ，Ｎ−メチレン−ビス−アクリルアミドとの水溶液を凍結下で重合し、このようにして形成されたクライオゲルを解凍し、エチレンジアミンを用いて該クライオゲルのアミノ基転移を行い、その後、ジビニルスルホンで処理し、次いで、イミノ二酢酸で処理し、最後に、金属結合ペプチドとの結合のためにリガンドとしてＣｕ２＋イオンを負荷することによって得られるマクロポーラスゲルである。
【００４６】
本発明のマクロポーラスゲルの別の実施態様（この実施態様は、上記実施態様とは別々に、および上記実施態様と組み合わせて実施し得る）によれば、１種以上のモノマーの溶液の重合は、充填剤の存在下で行われている。
【００４７】
該充填剤は、例えば、クライオゲルの密度を増加させるための、二酸化チタン、モリブデン、ステンレススチール、酸化鉄（ＩＩＩ）及び二酸化ジルコニウムなどの金属酸化物及び金属粉からなる群から選択される粒子状物質であり得る。
【００４８】
代替として、充填剤は、粒子の形態のイオン交換物質からなる群から選択され得る。
【００４９】
本発明によるマクロポーラスゲルは、出発モノマーの組合せ（出発モノマーの１つは、２つの重合可能な二重結合を示す物質、例えば、Ｎ，Ｎ’−メチレン−ビス−アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−メチレン−ビス−メタクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−ヘキサメチレン−ビス−アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジアリルアクリルアミドジアリルフマレート、ジアリルフタレート及びポリ（エチレングリコール）ジアクリレートである）を選択することによって、架橋ポリマーの形態で得られ得る。しかし、本発明のマクロポーラスゲルの更なる実施態様によれば、重合によって形成されるクライオゲルは、解凍後、アルキレンジアミン、グルタルアルデヒド、ジ−およびトリ−グリシジル化合物、及びジビニルスルホン（ＤＶＳ）からなる群から選択される架橋剤によって更に架橋されている。
【００５０】
この実施態様に従って架橋剤として使用されるアルキレンジアミンの炭素鎖は、直鎖又は分岐鎖であり得、好ましくは、直鎖で２〜８個の炭素原子、より好ましくは４〜６個の炭素原子を有する。
【００５１】
本発明のマクロポーラスゲルのこの実施態様に従って架橋剤として使用されるジ−およびトリ−グリシジル化合物の例は、ジグリシジル  １，２−シクロヘキサン−ジカルボキシレート、ジグリシジル  １，２，３，６−テトラヒドロフタレート、Ｎ，Ｎ−ジグリシジルアニリン及びＮ，Ｎ−ジグリシジル−４−グリシジルオキシアニリンである。
【００５２】
本発明によるマクロポーラスゲルは、カラムに入れられたモノリスの形態であり得る。この場合に、モノマー（単数又は複数）と可能な開始剤物質と懸濁充填剤との溶液を凍結してクライオゲルを形成することは、カラム内部で該溶液を用いて行われる。凍結は所定の温度で所定の時間行われ、該所定の温度で、系中の溶媒は、溶媒の非凍結画分に濃縮された溶解物質と共に部分的に凍結され、その後、カラムの内容物は解凍される。次いで、カラムは溶媒ですすがれ、可溶性画分が洗い出される。
【００５３】
あるいは、本発明のマクロポーラスゲルは、粒子の形態で製造される。溶媒として水を含有する系からの粒子形態のクライオゲルの製造は、文献に広範に記載されている。V. I. Lozinsky, Zubov A. L. , The plant for formation of spherical granules from material based on aqueous systems, ロシア連邦特許 2036095 (1992年10月20日)。
【００５４】
要するに、モノマーと可能な開始剤物質と懸濁充填剤との水溶液は、液体ジェットヘッド中に圧縮され、そこでは、ジェットは、水非混和性溶媒の流れによって小滴に分裂させられる。小滴は、同一の溶媒を含有するカラム中に落下させられ、凍結点より低い温度、例えば、−１０℃〜−３０℃に冷却される。小滴は、カラムに沿って沈殿する際に凍結し、コレクターに採取される。解凍および水での濯ぎ後、ビーズ状クライオゲルの形態の最終産物が得られる。
【００５５】
本発明のマクロポーラスゲルはまた、ディスク又は膜の形態であり得る。この場合、モノマー（単数又は複数）と可能な開始剤物質と懸濁充填剤との溶液を凍結してクライオゲルを形成することは、特別の型枠または鋳型内で該溶液を用いて行われる。クライオゲルの上記ディスクは、特別のホルダー内で柱状構築物を形成するように組み立てられ得る。
【００５６】
本発明の更なる局面によれば、以下の方法が提供される：
マクロポーラスゲル形態の分離媒体の製造方法であって、
その特徴が、
Ｎ−置換及び非置換（メタ）アクリルアミド；
Ｎ−アルキル置換Ｎ−ビニルアミド；
ヒドロキシアルキル（メタ）アクリレート；
ビニルアセテート；
ビニルアルコールのアルキルエーテル；
環置換スチレン誘導体；
ビニルモノマー；
（メタ）アクリル酸及びその塩；
ケイ酸；及び
重縮合によりポリマーを形成できるモノマー；
からなる群から選択される１種以上の水溶性モノマーの水溶液を、充填剤の存在下、溶媒の結晶化点より低い温度での凍結下で重合し、ここで、該水性溶媒の結晶化点より低い温度で、系中の溶媒が、溶媒の非凍結画分に濃縮された溶解物質と共に部分的に凍結され、クライオゲルが形成されること、及び、次いで、このようにして得られた反応産物を解凍することである、上記方法。
【００５７】
本発明のこの更なる局面によれば、以下の方法もまた、提供される：
マクロポーラスゲル形態の分離媒体の製造方法であって、
その特徴が、
Ｎ−置換及び非置換（メタ）アクリルアミド；
Ｎ−アルキル置換Ｎ−ビニルアミド；
ヒドロキシアルキル（メタ）アクリレート；
ビニルアセテート；
ビニルアルコールのアルキルエーテル；
環置換スチレン誘導体；
ビニルモノマー；
（メタ）アクリル酸及びその塩；
ケイ酸；及び
重縮合によりポリマーを形成できるモノマー；
からなる群から選択される１種以上の水溶性モノマーの水溶液を、溶媒の結晶化点より低い温度での凍結下で重合し、ここで、該溶媒の結晶化点より低い温度で、系中の溶媒が、溶媒の非凍結画分に濃縮された溶解物質と共に部分的に凍結され、クライオゲルが形成されること、及び、（ｉ）該クライオゲルの解凍に続いて自体公知の方法による１つ以上の工程において、又は（ｉｉ）適切である場合、重合反応において適切に置換されたモノマーを使用することによって、リガンド、荷電基、色素及び疎水性基からなる群から選択されるメンバーを該クライオゲル中に導入することによって該クライオゲルを修飾することである、上記方法。
【００５８】
このように導入されたリガンドは、上記分離媒体に関して同定された群から選択され得る。
【００５９】
あるいは、クライオゲルは、解凍後、イオン交換基からなる群から選択されるメンバーを該クライオゲル中に導入することによって修飾され得る。
【００６０】
本発明の方法の実施態様によれば、重合は充填剤の存在下で行われ、該充填剤は、本発明の分離媒体に関して上記で同定した通りであり得る。
【００６１】
本発明の方法の別の実施態様によれば、重合は架橋剤の存在下で行われる。あるいは、架橋は、形成されるクライオゲルの解凍後であるが該クライオゲルの可能な修飾の前に、行われ得る。
【００６２】
この実施態様で使用される架橋剤は、本発明の分離媒体に関して上記で同定した通りであり得る。
【００６３】
本発明の方法の特定の実施態様の例によれば、開始剤系の存在下、アクリルアミドとＮ，Ｎ−メチレン−ビス−アクリルアミドとの水溶液を凍結下で重合してクライオゲルポリマーを形成し、該クライオゲルポリマーを解凍し、これにエチレンジアミンを用いてアミノ基転移を行い、次いで、ジビニルスルホンで処理し、続いて、イミノ二酢酸で処理し、最後に、金属結合ペプチドとの結合のためにリガンドとしてＣｕ２＋イオンを負荷する。
【００６４】
本発明の更なる局面によれば、細胞をそれらの表面の特異的特性に従って細胞混合物から分離するための、上記のように修飾された本発明のマクロポーラスゲルの使用が提供される。
【００６５】
本発明のこの局面によれば、それらの表面で発現する金属結合ペプチドを担持する微生物細胞の吸着アフィニティクロマトグラフィーのための、請求項８に記載の本発明のマクロポーラスゲルの使用もまた提供される。
【００６６】
本発明のこの局面によれば、低分子量産物を、該産物の電荷、疎水性、又は、分離媒体で利用可能なリガンド、荷電基もしくは疎水性基に対するアフィニティに従って細胞懸濁液又は粗ホモジネートから分離するための、上記のように修飾された本発明のマクロポーラスゲルの使用もまた提供される。
【００６７】
本発明のこの局面によれば、蛋白質及び他の高分子を、該蛋白質／高分子の電荷、疎水性、又は、マクロポーラスゲルまたは分離媒体で利用可能なリガンド、荷電基または疎水性基に対するアフィニティに従って細胞懸濁液又は粗ホモジネートから分離するための、上記のように修飾された本発明のマクロポーラスゲルの使用もまた提供される。
【００６８】
更に本発明のこの局面によれば、金属結合ペプチドのタグを担持する組換え乳酸脱水素酵素を粗ホモジネートから直接捕捉するための、請求項８に記載の本発明のマクロポーラスゲルの使用もまた提供される。
【００６９】
本発明のこの局面によれば、ウイルスをそれらの表面の特異的特性に従ってウイルス懸濁液から分離するための、上記のように修飾された本発明のマクロポーラスゲルの使用もまた提供される。
【００７０】
本発明のこの局面によれば、プラスミドをそれらの電荷、形状、塩基への曝露(based exposure)、及びコイル様式(coiling mode)に従って粗懸濁液から分離するための、請求項１、４及び６のいずれかに記載のマクロポーラスゲルの使用もまた提供される。
【００７１】
本発明のなお更なる局面によれば、以下の方法が提供される：
ａ）細胞をそれらの表面の特異的特性に従って細胞混合物から分離するため；
ｂ）低分子量産物又は蛋白質のような高分子を、該産物の電荷、疎水性、又は、リガンド、荷電基及び疎水性基からなる群から選択される少なくとも１つのメンバーに対するアフィニティに従って細胞懸濁液又は粗ホモジネートから分離するため；
ｃ）ウイルスをそれらの表面の特異的特性に従ってウイルス懸濁液から分離するため；又は
ｄ）プラスミドをそれらの電荷、形状、塩基の露出及びコイル様式に従ってそれらの粗懸濁液から分離するため；
の方法であって、
当該分離するための方法は、該細胞混合物、細胞懸濁液または粗ホモジネート、ウイルス懸濁液及び粗プラスミド懸濁液を、分離媒体にそれぞれ、細胞、低分子量産物または蛋白質のような高分子、ウイルス及びプラスミドを吸着させるために該分離媒体に接触させ、次いで、該分離媒体からそれらを溶出することによるものであり、
その特徴が、
該分離媒体が請求項１３及び１５のいずれかに記載の方法によって製造されるマクロポーラスゲルであることである、上記分離するための方法。
【実施例】
【００７２】
今、幾つかの非限定実施例によって、本発明を更に説明する。
【００７３】
実施例１．超マクロポーラスモノリスカラムの製造
カラム中でのアクリルアミドとＮ，Ｎ−メチレン−ビス−アクリルアミドとの共重合
２０ｍｌの水中のアクリルアミド（０．６ｇ）、Ｎ，Ｎ−メチレン−ビス−アクリルアミド（０．０４ｇ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）（１０μｌ）の溶液を脱気し、固体過硫酸アンモニウム５ｍｇの添加後、ガラスカラム中、ＣＣｌ４層の上部にゆっくりと注いだ。カラム中のポリマー溶液を凍結し、一晩−１８℃に保った。次いで、カラムを解凍し、このように形成されたスポンジ状の柱状クライオゲルを徹底的に洗浄し、非重合不純物を除去した。
【００７４】
カラム中での連続的ポリアクリルアミドマトリックスの修飾
最初は室温でゆっくりとエチレンジアミン（ＥＤＡ）をポンプで注入して水を置き換えることによって、アミノ基転移を行った。次いで、ＥＤＡを、再循環様式にて、１５０−２００ｍｌ／時間の高い流量でポンプによってカラムに注入し、９０℃の温度の水をジャケットを通して循環させた。反応８−９時間後、カラムを室温に冷却し、０．２Ｍ  ＮａＣｌ溶液５００ｍｌ、次いで、水、最後に、１００ｍｌの０．５Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３で洗浄した。カラムの上部から切り出したマトリックスの小片を、新たに調製したＴＮＢＳ試薬（２ｍｌ飽和ホウ酸ナトリウム溶液中に溶解したトリニトロ安息香酸の５％水溶液５μｌ）に浸した際の鮮明な黄色によって、アミノ基転移の進行を定性的に確認した。次いで、磁気撹拌子を用いて２ｍｌのＤＶＳを２０ｍｌの０．５Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３と激しく混合することによって製造したジビニルスルホン（ＤＶＳ）懸濁液を、再循環様式にて、流量１５０−２００ｍｌ／時間で２時間、ポンプによってカラムに注入した。ＴＮＢＳによる定性的試験は淡黄色を示し、これは、遊離アミノ基のほぼ完全な修飾を示していた。マトリックスを、洗浄液のｐＨが中性近くになるまで洗浄し、そして１００ｍｌの０．５Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３および１００ｍｌの１Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３で洗浄した。次いで、ＩＤＡ溶液（３０ｍｌの１Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３中に溶解したイミノ二酢酸３．５ｇ、及びＮａＯＨでｐＨを１０−１１に調整）を、再循環様式にて、流量１５０−２００ｍｌ／時間でポンプによってカラムに注入した。最後に、洗浄液のｐＨが中性近くになるまで、３００ｍｌの０．５Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３、蒸留水でカラムを洗浄し、そして、１００ｍｌのトリス−ＨＣｌ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ含有）でカラムを洗浄した。流量１００ｍｌ／分でトリス−ＨＣｌ緩衝液中の０．１Ｍ  ＣｕＳＯ４溶液をポンプで注入し、トリス−ＨＣｌ緩衝液で徹底的に洗浄することによって、ＩＤＡ修飾マトリックスにＣｕ２＋を負荷した。Ｃｕ２＋負荷マトリックスは、強い青色を獲得した。大きな孔サイズおよび相互連結した孔構造のせいで、連続的クロマトグラフィーポリ（アクリルアミド）マトリックスは、非常に低い流体抵抗を有している。カラムの上方１ｍに水リザーバーを持ち上げることによって圧力（０．０１ＭＰａ）を作り出した場合、移動相は、ベッド高さに依存して、流量２０−４０ｍｌ／分でカラムを自由に流れる（８００−１５００ｃｍ／時間）。この流れで、連続的マトリックスに可視の変化は観察されなかった。
【００７５】
実施例２．超マクロポーラスカラムでの微生物細胞の吸着アフィニティクロマトグラフィー
サイズ１×３μｍのＥ．ｃｏｌｉ細胞は、実施例１で製造した連続的ポリ（アクリルアミド）超マクロポーラスマトリックスの孔をかなり容易に通過する。反対に、細胞表面で発現された金属結合ペプチドＨｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｈｅを有する組換えＥ．ｃｏｌｉ細胞は、Ｃｕ−ＩＤＡ−ポリ（アクリルアミド）超マクロポーラスマトリックスと特異的に結合し、ＥＤＴＡ含有緩衝液によって溶出される。ＥＤＴＡは、Ｃｕイオンを捕捉し、従って、組換えＥ．ｃｏｌｉ細胞とＩＤＡ−ポリ（アクリルアミド）クライオゲルマトリックスとの間の特異的相互作用を破壊する。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞と、細胞表面で発現された金属結合ペプチドを有する組換えＥ．ｃｏｌｉ細胞との混合懸濁液をカラムにかけると、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞は、結合せずカラムを素通りしたが、組換え細胞は、顕著にカラムに保持され、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液で溶出される。
【００７６】
Ｃｕ−ＩＤＡ−ポリ（アクリルアミド）クライオゲルマトリックスの孔内部に細胞が結合していることを証明するために、細胞結合後、１個のモノリスカラムを犠牲にし、カラムからモノリスを取り出し、モノリスの中央からディスクを切り出した。更に、ディスクを、１個の中央片と４個の周囲片に切り、全ての片を、アンピシリン含有栄養培地を有するペトリ皿上に置いた。アンピシリンの存在のせいで、組換え細胞だけがこの培地で増殖できた。細胞増殖は、全ての片の周りでほぼ同一であり、このことは、金属結合ペプチドを有するＥ．ｃｏｌｉ細胞が、全ての断面積を通して同じレベルでマトリックスに結合し、従って、モノリスの内側の孔を通過することを明確に示す。
【００７７】
実施例３．連続的カラム上での、粗ホモジネートからの組換え乳酸脱水素酵素の直接的捕捉
６個のヒスチジン残基のタグを有する（好熱菌バシラス・ステアロサーモフィラス由来の）乳酸脱水素酵素（Ｈｉｓ６−ＬＤＨ）を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉ細胞を増殖させ、酵素産生を誘導した。遠心分離によって細胞を採取し、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．３で洗浄し、音波処理によって破壊した。
【００７８】
前もって精製していない粗抽出物を、流量１．６ｍｌ／分（６０ｃｍ／時間）で、実施例１で製造したモノリスカラム(２ｘ１．４ｃｍ内径)にかけた。２５ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．３でカラムを洗浄し、５０ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する同じ緩衝液で溶出した。酵素は、粗抽出物からほぼ定量的に捕捉され、通り抜け画分中に溶出した酵素活性の合計はわずかに４％であった。このことは、固有に非組換えの（そして、それ故、モノリスカラムに結合できない）乳酸脱水素酵素の混合のせいであり得た。結合した酵素は、約２カラム体積の少量の５０ｍＭ  ＥＤＴＡ中に定量的に溶出された。
【００７９】
実施例４．アクリルアミドとアリルグリシジルエーテルとの共重合による超マクロポーラスモノリスカラムの製造
モノマー（表１）を脱イオン水に溶解し、混合物を真空下で脱気し、アリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）（（ＡＡｍ＋ＡＧＥ）／ＭＢＡＡｍ＝５．３／１、ＡＧＥ／ＡＡｍ＝１：１０）を溶液中に注いだ。ＴＥＭＥＤ（モノマーの合計重量の１．０％）および過硫酸アンモニウム（モノマーの合計重量の０．９８％）の添加後、反応混合物を撹拌し、底部に閉鎖した出口を有するプラスチック製の５ｍｌシリンジ中に５ｍｌの部分を注いだ。シリンジ中の溶液を−１２℃で凍結した。凍結サンプルを、−１２℃で２４時間又は−１２℃で５時間、次いで−１８．０℃で一晩、凍結したまま維持した後、室温で解凍した。各シリンジ中で製造されたクライオゲルマトリックスを、流量１ｍｌ／分で２００ｍｌの水を通過させることによって、徹底的に洗浄した。
【００８０】
（ＡＡｍ＋ＡＧＥ）／ＭＢＡＡｍが５：１−１０：１（モル／モル）の範囲にあった場合、高い流量の超マクロポーラスゲルが製造された。低い流量は、最初の反応混合物における比（ＡＡｍ＋ＡＧＥ）／ＭＢＡＡｍにそれほど依存しなかった（表２）。
【００８１】
製造された超マクロポーラスモノリスカラムは、活性エポキシ基を含み、これは、種々のリガンド、例えば、ＩＤＡの共有結合のために使用され得る。５０ｍｌの０．５Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３溶液、次いで５０ｍｌの１．０Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３溶液を、流量１ｍｌ／分でゲルマトリックスを通過させた。ＩＤＡ溶液（１．０Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３中の０．５Ｍ、ｐＨ１０．０）を、室温で２４時間、リサイクル様式にて、流量１ｍｌ／分でカラムにかけた。その後、カラム中の修飾クライオゲルを０．５Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３（１００ｍｌ）で洗浄し、次いで、ｐＨが中性になるまで水で洗浄した。
【００８２】
【表１】
2005509168.tif 000002
【００８３】
表２．異なる（ＡＡｍ＋ＡＧＥ、１０：１）／ＭＢＡＡｍ比を有するコモノマー混合物から製造されたモノリス超マクロポーラスカラム（内径１．２４ｃｍ）を通る流量。低温重合の条件：凍結温度−１２．０℃、−１２℃で５時間、次いで、−１８．０℃で一晩保存、室温で解凍。モノマー（ＡＡｍ＋ＭＢＡＡｍ）の合計濃度４．０ｗ／ｖ％。並行して３つのカラムで行った測定の平均値を示す。
【００８４】
【表２】
2005509168.tif 000003
【００８５】
実施例４．アクリルアミドと２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレートとの共重合による超マクロポーラスモノリスカラムの製造
モノマー（表３）を脱イオン水に溶解し、混合物を真空下で脱気した。（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート（ＤＥＭ）（（ＡＡｍ＋ＤＥＭ）／ＭＢＡＡｍ＝５．４／１、ＤＥＭ／ＡＡｍ＝１：１０）を溶液に注いだ。ＴＥＭＥＤ（モノマーの合計重量の１．０％）および過硫酸アンモニウム（モノマーの合計重量の０．９％）の添加後、反応混合物を撹拌し、底部に閉鎖した出口を有するプラスチック製の５ｍｌシリンジ中に５ｍｌの部分を注いだ。シリンジ中の溶液を−１２℃で凍結した。凍結したサンプルを、−１２℃で５時間、次いで−１５．０又は−１８．０℃で一晩、凍結したまま維持した後、室温で解凍した。各シリンジ中で製造されたクライオゲルマトリックスを、流量１ｍｌ／分で２００ｍｌの水を通過させることによって、徹底的に洗浄した。
【００８６】
【表３】
2005509168.tif 000004
【国際調査報告】
2005509168.tif 000005
2005509168.tif 000006
2005509168.tif 000007
2005509168.tif 000008