(57)【要約】本発明は、インビボで使用した時に、非修飾の相当物に比べ免疫原性が低いまたは実質的に非免疫原性であるヒト成長ホルモン蛋白質をもたらす、ヒト成長ホルモン(high)の修飾体に関する。本発明は更に免疫原性であるヒト成長ホルモンに由来するＴ細胞エピトープ配列に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト成長ホルモン(ｈGH)の生物活性を有し、インビボで使用した時に同じ生物活性を有する非修飾分子と比較して免疫原性の小さいまたは実質的に免疫原性でない修飾された分子。
【請求項２】
本来の非修飾分子に由来する１個または複数のＴ細胞エピトープの除去により、前記免疫原性の喪失が達成される請求項１に記載の分子。
【請求項３】
前記分子に由来するペプチドを結合できるＭＨＣアロタイプの数の低減により、前記免疫原性の喪失が達成される請求項１に記載の分子。
【請求項４】
１つのＴ細胞エピトープが除去されている請求項２または３に記載の分子。
【請求項５】
前記本来存在するＴ細胞エピトープが、ＭＨＣクラスＩＩ上での提示を介してＴ細胞を刺激または結合する能力を示す前記クラスＩＩのリガンドまたはペプチド配列である請求項２〜４のいずれかに記載の分子。
【請求項６】
前記ペプチド配列が、図１に記載される群から選択される請求項５に記載の分子。
【請求項７】
本来存在するＴ細胞エピトープのうちのいずれかにおいて１〜９個のアミノ酸残基が変更された請求項２〜６のいずれかに記載の分子。
【請求項８】
１個のアミノ酸残基が変更された請求項７に記載の分子。
【請求項９】
アミノ酸残基の変更が、特定の位置において本来存在するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基によって置換、付加または欠失したものである請求項７または８に記載の分子。
【請求項１０】
１個または複数のアミノ酸残基の置換が表２に示すようにして行われる請求項９に記載の分子。
【請求項１１】
該置換が除外され、ｈGH遺伝変種を形成し、機能蛋白質に対して不適合となることが知られている、請求項９に記載の分子。
【請求項１２】
さらに１個または複数のアミノ酸残基の置換が表３に示すようにして行われ、前記分子に由来するペプチドを結合することができるＭＨＣアロタイプの数が低減している請求項１０または１１に記載の分子。
【請求項１３】
１個または複数のアミノ酸の置換が表３に示されるようにして行われる請求項９に記載の分子。
【請求項１４】
該置換が除外され、ｈGH遺伝変種を形成し、機能蛋白質に対して不適合となることが知られている、請求項１３に記載の分子。
【請求項１５】
さらに追加の変更が、前記分子の生物活性を回復するように行われる請求項７〜１４のいずれかに記載の分子。
【請求項１６】
前記さらに追加の変更が、特定のアミノ酸の置換、付加または欠失である請求項１５に記載の分子。
【請求項１７】
アミノ酸の変更が、同種のタンパク質配列を参考にして行われる請求項７〜１６のいずれかに記載の分子。
【請求項１８】
アミノ酸の変更が、インシリコのモデリング技術を参考にして行われる請求項７〜１６のいずれかに記載の分子。
【請求項１９】
T細胞アッセイにおいて、対応する野生型タンパク質配列と100％未満のアミノ酸同一性を有し、2.0未満の刺激指数をもつ、請求項１〜１８のいずれかに記載の修飾された分子。
【請求項２０】
T細胞アッセイに置いて、非修飾タンパク質分子と比較して刺激指数が減少することを示す、請求項１〜１８のいずれかに記載の修飾された分子。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれかに記載の修飾されたヒト成長ホルモン(ｈGH)をコードするＤＮＡ配列。
【請求項２２】
前記請求項のいずれかに定義されるヒト成長ホルモン(ｈGH)の生物活性を有する修飾された分子を、場合により薬剤として許容可能な担体、希釈剤または賦形剤とともに含む医薬組成物。
【請求項２３】
以下のステップを含む、前記請求項のいずれかに定義されるヒト成長ホルモン(ｈGH)の生物活性を有する修飾された分子の製造方法：
(i)ポリペプチドのアミノ酸配列またはその一部を決定すること；
(ii)インビトロもしくはインシリコ技術を用いるか、または生物学的アッセイを用いて、ペプチドのＭＨＣ分子への結合を測定することを含む任意の方法により、タンパク質のアミノ酸配列内の１つまたは複数の潜在的なＴ細胞エピトープを識別すること；
(iii)インビトロまたはインシリコ技術を用いるか、または生物学的アッセイを用いて、ペプチドのＭＨＣ分子への結合によって、あるいはペプチド−ＭＨＣ複合体のＴ細胞への結合によって測定したもともと存在するＴ細胞エピトープのうちのいずれかにおいて、１〜９個のアミノ酸残基の置換、付加または欠失によって修飾された、識別した潜在的なＴ細胞エピトープ内に１つまたは複数のアミノ酸を修飾した新規な配列変異体を設計すること；
(iv)組換えＤＮＡ技術によってそのような配列変異体を構築し、かつ前記変異体を試験することによって、所望の特性を備えた１つまたは複数の変種を識別すること；および
(v)場合によってはステップ(ii)〜(iv)を繰り返すこと。
【請求項２４】
ステップ(ii)を以下のステップ：
(a)既知のアミノ酸残基配列を有するペプチド領域を選択すること；(b)所定の均一サイズを有し、少なくとも３個のアミノ酸残基によって構成される重複したアミノ酸残基セグメントを前記選択領域から連続的にサンプリングすること；(c)サンプリングした前記アミノ酸残基セグメント中に存在する個々の疎水性アミノ酸残基側鎖に対する割当て値を合計することにより、サンプリングした前記各セグメントについてＭＨＣクラスＩＩ分子結合スコアを計算すること；および(d)実質的にペプチドの治療上の有用性を低減せずに、ペプチドに対するＭＨＣクラスＩＩ結合スコア全体を変更するために、そのセグメントについて計算したＭＨＣクラスＩＩ結合スコアに基づいて、修飾に適した前記セグメントの少なくとも１つを識別すること、
により実行する請求項２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
ステップ(c)を、好ましくは、12−６ファンデアワールスのリガンド−タンパク質エネルギー反発項およびリガンド対立エネルギー項を含むように修飾したベーム(Bohm)スコアリング関数を用い、(1)ＭＨＣクラスＩＩ分子モデルの第１のデータベースを提供すること；(2)前記ＭＨＣクラスＩＩ分子モデルについて許容されるペプチド骨格の第２のデータベースを提供すること；(3)前記第１のデータベースからモデルを選択すること；(4)前記第２のデータベースから許容されるペプチド骨格を選択すること；(5)サンプリングした各セグメント中に存在するアミノ酸残基側鎖を識別すること；(6)サンプリングした各セグメント中に存在するすべての側鎖に対する結合親和性値を決定すること；および前記各モデルと各骨格についてステップ(1)〜(5)を繰り返すことによって実行する請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
潜在的なMHCクラスＩＩ結合活性を有し、非修飾ヒト成長ホルモン(ｈＧＨ)から生じる、表１に記載されているグループから選択された、13mer Ｔ細胞エピトープペプチド。
【請求項２７】
請求項２６における13merＴ細胞エピトープペプチドのうちの連続する少なくとも９個のアミノ酸残基からなるペプチド配列。
【請求項２８】
T細胞アッセイにおいて、野生型ｈGHが100％のアミノ酸同一性を有し、刺激指数が2.0より大きい、９〜15merペプチド。
【請求項２９】
インビボで使用した際に、免疫原性は非修飾分子と比べ低減されている、または実質的に有しない、生物活性は同一である修飾されたｈGHの製造のための、請求項２６〜２８のいずれかのペプチド配列の使用。
【請求項３０】
T細胞アッセイにおいて、対応する野生型タンパク質と100％未満のアミノ酸同一性を有し、非修飾ｈGH分子と比較して刺激指数が減少するまたは少なくとも2.0未満の刺激指数を示すｈGHの製造のための、請求項２６〜２８のいずれかに記載のペプチド配列の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、特にヒトに投与され、そしてとりわけ治療に使用するポリペプチドに関する。このポリペプチドは修飾されたポリペプチドであり、この修飾により、ポリペプチドがヒトに投与された際に免疫反応を誘発する傾向が低減するという結果をもたらす。本発明は特に、インビボで使用した時に、非修飾の相当物に比べて免疫原性が低い、または実質的に非免疫原性である、ヒト成長ホルモンタンパク質の変異体をもたらすヒト成長ホルモンの修飾に関する。
【０００２】
（発明の背景）
治療用タンパク質に対して望ましくない免疫反応が起こるために、治療用タンパク質の有効性が制限される例が多々ある。いくつかのマウスモノクローナル抗体はヒトの多数の疾病症状において治療剤としての見込みを示すが、ヒト抗マウス抗体(HAMA)反応が著しく誘導するため失敗したケースもある[Schroff, R.W. et al (1985) Cancer Res.45: 879−885; Shawler, D.L. et al (1985) J. Immunol. 135: 1530−1535]。モノクローナル抗体については、HAMA反応を低減させようと多数の技術が開発されている[WO 89／09622；EP 0239400；EP 0438310；WO 91／06667]。これらの組換えＤＮＡ手法は、一般に最終的な抗体コンストラクトにおいてマウス遺伝子情報を低減させる一方、最終コンストラクト中のヒト遺伝子情報を増加させるものである。それにもかかわらず、得られた「ヒト化」抗体は、依然として患者に免疫反応を誘発する場合があった[Issacs J.D. (1990) Sem. Immunol. 2: 449, 456; Rebello, P.R. et al (1999) Transplantation 68: 1417−1420]。
【０００３】
抗体は、治療剤として投与した際にそれに対して免疫反応が発動し得る唯一の種類のポリペプチド分子ではない。ヒトに由来する、しかも人体内に存在するのと同じアミノ酸配列を有するタンパク質でさえ、人体内で免疫反応を引き起こすことがある。顕著な例としては、とりわけ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子[Wadhwa, M. et al (1999) Clin. Cancer Res. 5: 1353−1361]や、インターフェロンアルファ２[Russo, D. et al (1996) Bri. J. Haem. 94: 300−305; Stein, R. et al (1988) New Engl. Med. 318: 1409−1413] の治療上の使用が挙げられる。このように、これらのヒトタンパク質が免疫原性である状況では、通常は、対象でこれらのタンパク質に作用していたはずの免疫学的寛容が破壊されると考えられる。
【０００４】
例えば血友病Ａ、血友病Ｂ、ゴーシェ病および多くの他の例などの疾患の場合に起こるようなタンパク質の構成的欠如がある遺伝疾患において、ヒトタンパク質が代替療法として投与される場合には、この状況は異なる。そうした場合、治療用代替タンパク質は最初から免疫学的に外来分子として機能する可能性があり、個体が治療用代替タンパク質への免疫応答を惹起しうる場合、治療の効果が著しく損なわれる可能性が高い。
【０００５】
タンパク質治療薬が宿主免疫系によって外来分子として見られるか、またはその分子に対して存在する寛容が克服されるかどうかに関係なく、そのタンパク質に対する免疫反応性の機序は同じである。免疫反応誘導の鍵は、ＭＨＣクラスＩＩ分子上での提示を介してＴ細胞活性を刺激し得るペプチド、いわゆる「Ｔ細胞エピトープ」がタンパク質内に存在することである。このようなＴ細胞エピトープは、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力を備えた任意のアミノ酸残基配列として一般に定義される。暗黙にではあるが、「Ｔ細胞エピトープ」は、ＭＨＣ分子に結合する際、Ｔ細胞レセプター(ＴＣＲ)によって認識され、少なくとも原理的には、ＴＣＲと結びつきＴ細胞応答を促進することによって、これらＴ細胞の活性化を引き起こし得るエピトープを意味する。
【０００６】
ＭＨＣクラスＩＩ分子は、ヘルパーＴ細胞の選択および活性化に中心的な役割を果たす高度に多型的なタンパク質のグループである。ヒトの白血球抗原グループＤＲ(ＨＬＡ−ＤＲ)はこのグループタンパク質で優性なアイソタイプである。しかしながら、アイソタイプＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ−ＤＰも同様の機能を果たす。ヒトの集団においては、各個人は２〜４個のＤＲ対立遺伝子、２個のＤＱおよび２個のＤＰ対立遺伝子を有する。多数のＤＲ分子の構造が解明されており、それらは、ペプチドの疎水性残基(ポケット残基)と結合する多数の疎水性ポケットを有する開放端のペプチド結合溝として現れる[Brown et al Nature (1993) 364: 33; Stern et al (1994) Nature 368：215]。クラスＩＩ分子の様々なアロタイプを識別する多型は、ペプチド結合溝内の様々な異なるペプチド結合表面に寄与し、集団レベルで外来タンパク質を認識し病原性有機体への免疫反応を引き起こす能力に関する最大の柔軟性を保証する。
【０００７】
治療のタンパク質に対する免疫反応は、ＭＨＣクラスＩＩペプチド提示経路経由で進行する。ここに外来タンパク質は、ＤＲ、ＤＱまたはＤＰタイプのＭＨＣクラスＩＩ分子と連携した提示のために飲み込まれ処理される。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、とりわけマクロファージおよび樹状細胞などの専門的な抗原提示細胞(APC)によって発現される。Ｔ細胞表面上の同族のＴ細胞レセプターによるＭＨＣクラスＩＩペプチド複合体の結合は、ＣＤ４分子などの他のある種のコレセプターの相互結合を伴って、Ｔ細胞内での活性化状態を引き起こすことができる。活性化は、サイトカインの放出をもたらし、Ｂ細胞などの他のリンパ細胞をさらに活性化して抗体を産生するか、完全な細胞性免疫反応としてＴキラー細胞を活性化する。
【０００８】
Ｔ細胞エピトープ識別はエピトープ除去に向けての最初のステップである。しかしながら、当技術分野では、エピトープ識別及びエピトープ除去を一つのスキームにまとめることは非常にわずかなケースである。したがって、WO98／52976とWO00／34317では、ポリペプチド配列がヒトのＭＨＣクラスＩＩ ＤＲアロタイプのサブセットに結合する可能性を識別するための計算によるスレッディング(computational threading)手法を教示する。これらの教示では、予想されたＴ細胞エピトープは、興味のあるタンパク質内で慎重なアミノ酸置換を用いることによって除去される。しかしこのスキームおよびエピトープの同定のための他の計算に基づく手順[Godkin, A. J.ら(1998年)、J. Immunol. 第161巻、850〜858頁; Sturniolo, T.ら(1999年)、Nat. Biotechnol.第17巻、555〜561頁]では、ＭＨＣクラスＩＩ分子を結合できると予測されたペプチドは、すべての状況で、特に、プロセッシング経路または他の現象のために、in vivoで、Ｔ細胞エピトープとして機能できるのではない。
【０００９】
同様に、例えばＭＨＣクラスＩＩ結合表面のソースとして定義済みＭＨＣアロタイプのＢ細胞株を用いて、ＭＨＣクラスＩＩ分子を結合する合成ペプチドの能力を測定するためのin vitroでの方法を、ＭＨＣクラスＩＩリガンドの同定に適用することができる[Marshall K.W.ら．(1994年)、J. Immunol. 第152巻、4946〜4956頁; O'Sullivanら(1990年)、J. Immunol.第145巻、1799〜1808頁; Robadey C.ら(1997年)、J Immunol、第159巻、3238〜3246頁］。しかし、そうした技術は、複数の潜在性エピトープをＭＨＣアロタイプの広い範囲にわたってスクリーニングするようにはなされておらず、また結合ペプチドがＴ細胞エピトープとして機能する能力を確認することもできない。
【００１０】
最近、合成ペプチドと組み合わせた、組換えＭＨＣ分子の可溶性複合体を利用する技術が使用されるようになってきた[Kern, F.ら(1998年)、Nature Medicine、第４巻、975〜978頁; Kwok, W. W.ら(2001年)、TRENDS in Immunol. 第22巻、583〜588頁］。これらの試薬および手順は、特定のＭＨＣ−ペプチド複合体に結合でき、複数の潜在性エピトープをＭＨＣアロタイプの広い範囲にわたってスクリーニングするのには適合しない、ヒトまたは実験用動物対象からの末梢血サンプルから、Ｔ細胞クローンの存在を同定するために使用される。
【００１１】
Ｔ細胞活性化の生物学的アッセイは、試験ペプチド／タンパク質配列が免疫応答を誘起する能力の解読をもたらす実際的な選択肢を提供する。この種のアプローチの例には、細菌性タンパク質スタフィロキナーゼに対してＴ細胞増殖アッセイを用い、続いてＴ細胞株を刺激するための合成ペプチドを用いてエピトープ・マッピングを行っている、Petraらの研究[Petra, A.M.ら(2002年)、J. Immunol. 第168巻、155〜161頁]が含まれる。
【００１２】
同様に、破傷風毒素タンパク質の合成ペプチドを用いたＴ細胞増殖アッセイは、毒素の免疫優性エピトープ領域の定義をもたらす結果となった[Reece J.C.ら 1993年、J. Immunol. 第151巻、6175〜6184頁]。WO99／53038は、ヒト免疫細胞の単離されたサブセットを用い、当該合成ペプチドの存在下で、in vitroでのその分化および細胞の培養を促進し、培養したＴ細胞中での誘発されたすべての増殖を測定することによって、試験タンパク質中のＴ細胞エピトープを決定できるアプローチを開示している。同様の技術がSticklerら[Stickler, M.M.ら(2000年)、J. Immunotherapy、第23巻、654〜660頁]によっても記載されている。そこでは両方の例において、この方法が細菌性スブチリシン内のＴ細胞エピトープの検出に適用されている。そうした技術は、細胞分離技術の注意深い適用と、所望の免疫細胞サブセット(樹状細胞、ＣＤ４＋およびまたはＣＤ８＋Ｔ細胞)を得るために複数のサイトカインを補充した細胞培養を必要とするが、複数のドナーサンプルを用いた迅速なスループットスクリーニングには役立たない。
【００１３】
上記のように、およびその結果として、基本的に治療上価値があるが本来は免疫原性であるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質からＴ細胞エピトープを識別しさらに除去または少なくとも低減することが望ましいであろう。これらの治療上有益な分子のうちの１つはヒト成長ホルモンである(ここではｈGHと略記する。)。
【００１４】
天然のｈGHは分子量22ｋDaの下垂体ホルモンであり、191アミノ酸残基である。代替スプライシングによって抽出された代替20ｋDa生成物は識別され、22ｋDaの型と比較するといくつかの変更された性質を有する[Wada, M. et al(1997) Mol. Cell Endocrinol. 133: 99-107]。上記22ｋDa蛋白質は、いろいろな宿主生物内で組換技術を用いて生成される。その宿主生物として、Ｅ．Ｃｏｌｉ[Goeddel, D. et al (1979) Nature 281: 544-548]、枯草菌(Bacillus subtilis)[Honjo, J. et al (1987) J.Biotech 6: 191-204]、酵母菌[Hiramatsu, R. et al (1991) Appl. Environ. Microbiol. 57: 2052-2056]及び動物細胞[Lupker, J. et al (1983) Gene 24: 281-287]が含まれる。ｈGH医薬品は、下垂体性小人症、小児性慢性腎不全及び似たような症状の処置に用いられる。成長を促進するその性質に加えて、上記蛋白質は、マクロファージ及びインスリン様効能の活性化を含む様々な生物学的活性を有する[Chawler, R. (1993) Ann. Rev. Med. 34: 519; Edwards, C. et al (1998) Science 239:769]。
【００１５】
本発明はヒト成長ホルモン(ｈGH)に関し、一文字コードで示すｈGHタンパク質の分泌される形のアミノ酸配列は以下の通りである：
【００１６】
【表１】
2005501546.tif 000002
【００１７】
特に本発明の目的は、免疫特性が低減された数の潜在的Ｔ細胞エピトープによって修正されている修飾形ｈＧＨ蛋白質を提供することである。
【００１８】
他にも、修飾形ｈＧＨを含むｈＧＨ分子、及びその組換え生成物、精製物及び治療に用いるためのスキームを供給している[EP0107890, US4,517,181, EP0105759; US4,703,035; US4,658,021; EP0022242; EP0001929; EP0001939; US4,342,832; US4,601980; US4,604,359; US4,634,677; US4,898,830; US5,424,119; US4,366,246; US4,425,437; US4,431,739; US4,563,424; US4,571,421; EP0131843; EP0319049; US4,831,120; US4,871,835; US4,997,916; US5,612,315; US5,633,352; US5,618,697; US5,635,604; EP0127658; EP0217814; US5,898,030; EP0804223]。しかし、これらの教示のいずれも、タンパク質の免疫原特性に対するＴ細胞エピトープの重要性を対処するものではないし、本発明のスキームに従って特異的かつ制御されたかたちでこうした特性に直接影響を及ぼすとは考えられていない。この点における例としてはLowmanおよびWellsによって提供されている[Lowman H.B. & Wells J.A. (1993) J. Mol. Biol. 243: 564-578]。彼等はｈGH変異体の精製にファージ提示法を用いており、ｈGH受容体に対しておよそ400倍に増加した結合親和力を示す。この高い親和性変異体は15アミノ酸置換を含むが、この新しい変異体分子の免疫活性の検討はされていない。
【００１９】
しかしながら以下に初めて開示するように、本発明者らは、高い親和性変異体を有するそれらの15の置換のうち、７位(10、14、42、45、54，176及び179位)では本発明のスキームによると免疫的な利益を示すことが期待されている、ことを発見した。
【００２０】
ヒトに免疫反応を引き起こす可能性が低減されているか可能性のないｈGHの提供が強く望まれている。
【００２１】
(発明の概要及び説明)
本発明は、ｈGHの修飾形(潜在的なＴ細胞エピトープの数の低減または除去によって免疫の特性は修正されているもの)を提供する。
【００２２】
本発明は、ＭＨＣクラスＩＩ結合能力により潜在的なＴ細胞エピトープであるｈGHの１次配列内に識別された配列を開示する。この開示は特に上記され、191アミノ酸残基を含むヒトｈGHタンパク質に関する。
【００２３】
本発明はヒトにおいて免疫原性であるｈGH一次配列の主要領域を開示し、したがってこれらの部位の免疫原性の有効性を除去または低減するために、それらの配列を修飾するのに必要な重要な情報を提供する。
【００２４】
１つの実施形態では、免疫原性の領域を含む合成ペプチドを、分子全体への寛容原的応答を促進する目的のための薬剤組成物に提供することができる。
【００２５】
さらなる実施形態では、本明細書で開示したエピトープ領域内で修飾されたｈGH分子を薬剤組成物に使用することができる。
【００２６】
要約すると、本発明は以下の対象となる事項に関する：
・ｈGHの生物活性を有し、インビボで使用した時に実質的に免疫原性でないか、同じ生物活性を有する非修飾分子と比較して免疫原性の小さい修飾された分子；
・これに応じた特定の分子(本来の非修飾分子に由来する１個または複数のＴ細胞エピトープの除去により、前記免疫原性の喪失が達成されているもの)；
・これに応じた特定の分子(前記分子に由来するペプチドを結合し得る多数のＭＨＣアロタイプの低減により、前記免疫原性の喪失が達成されるもの)；
・これに応じた特定の分子(１つのＴ細胞エピトープが除去されているもの)；
・これに応じた特定の分子(もともと存在するＴ細胞エピトープがクラスＩＩ上での提示を介してＴ細胞を刺激するか結合する能力を示すＭＨＣクラスＩＩリガンドであるかペプチド配列であるもの)；
・これに応じた特定の分子(前記ペプチド配列が表１に記載される群から選択されるもの)；
・これに応じた特定の分子(１〜９個のアミノ酸残基、好ましくは本来存在するＴ細胞エピトープのうちのいずれか１つのアミノ酸残基が変更されたもの)；
・これに応じた特定の分子(アミノ酸残基の変更が、特定の位置において本来存在するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基によって置換、付加または欠失したもの)；
・これに応じた特定の分子(１つまたは複数のアミノ酸残基の置換が表２に示すようにして行われるもの)；
・これに応じた特定の分子((さらに)１つまたは複数のアミノ酸残基の置換が表３に示すようにして行われ、前記分子から誘導されるペプチドを結合することができるＭＨＣアロタイプの数が低減しているもの)；
・これに応じた特定の分子(必要であれば、加えて、特定のアミノ酸の通常、置換、付加または欠失によるさらなる変更が、前記分子の生物活性を回復するようにされているもの)；
・これに応じた特定のｈGH分子(表２または３に指定されたいずれかのアミノ酸に対応する位置で１つまたは複数のアミノ酸置換が行われるもの)；
・これに応じた特定のｈGH分子(ｈGH遺伝的な変異の記録から機能性タンパク質と適合しないことが既知であるどの置換も除外して、表２または３に指定されたアミノ酸のいずれかに対応する位置で１つまたは複数のアミノ酸置換が行われるもの)；
・ＭＨＣクラスＩＩに結合する活性を有する上記ペプチドまたは修飾されたペプチドのいずれかを含む医薬組成物；
・先に定義したおよび以下に定義するいずれかの前記指定された修飾分子をコードするＤＮＡ配列または分子、
・上記および／または特許請求の範囲に定義されるｈGHの生物活性を有する修飾された分子を、場合により薬学的に受容可能な担体、希釈剤または賦形剤とともに含む医薬組成物；
・以下のステップを含む、上に引用した特許請求の範囲の請求項のいずれかに定義されるｈGHの生物活性を有する修飾された分子の製造方法：(i)ポリペプチドまたはその一部のアミノ酸配列を決定すること；(ii)インビトロ(in vitro)またはインシリコ(in silico)技術を用いるか生物学的アッセイを用いて、ペプチドのＭＨＣ分子への結合を測定することを含む任意の方法により、タンパク質のアミノ酸配列内の１つまたは複数の潜在的なＴ細胞エピトープを識別すること；(iii)インビトロまたはインシリコ技術を用いるか生物学的アッセイを用いて測定されたペプチドのＭＨＣ分子への結合により示されるＴ細胞エピトープの活性を実質的に低減するか除去するように、識別された潜在的なＴ細胞エピトープ内において１つまたは複数のアミノ酸が修飾(変更)された新規な配列変異体を設計すること；(iv)組換えＤＮＡ技術によってそのような配列変異体を構成し、所望の特性を備えた１つまたは複数の変異体を識別するために前記変異体を試験すること；および(v)場合によってはステップ(ii)〜(iv)を繰り返すこと；
・ステップ(iii)が本来存在するＴ細胞エピトープのうちのいずれかにおいて１〜９個のアミノ酸残基の置換、付加または欠失により行われる、これに応じた特定の方法；
・変更が、同族体タンパク質配列に関して、および／またはインシリコモデリング技術において行われる、これに応じた特定の方法；
・これに応じた特定の方法であって、上記のステップ(ii)が以下のステップ：(a)既知のアミノ酸残基配列を有するペプチド領域を選択すること；(b)予め定義した均一サイズを有し、少なくとも３個のアミノ酸残基によって構成される重複したアミノ酸残基セグメントを選択された領域から連続的にサンプリングすること；(c)サンプリングされた前記セグメント中に存在する個々の疎水性アミノ酸残基側鎖に対し割り当てられた値を合計することにより、サンプリングされた前記セグメントの各々についてＭＨＣクラスＩＩ分子結合スコアを計算すること；および(d)実質的にペプチドの治療上の有用性を低減させずに、ペプチドに対するＭＨＣクラスＩＩ結合スコア全体を変更するために、そのセグメントについて計算されたＭＨＣクラスＩＩ結合スコアに基づいて、修飾に適した前記セグメントの少なくとも１つを識別することにより実行され；ステップ(c)を、好ましくは、12−６ファンデアワールスのリガンド−タンパク質エネルギー反発項およびリガンド立体構造のエネルギー項を含むように修飾されたベームスコアリング関数(Boehm scoring function)を用い、(1)ＭＨＣクラスＩＩ分子モデルの第１のデータベースを提供すること；(2)前記ＭＨＣクラスＩＩ分子モデルについて許容されるペプチド骨格の第２のデータベースを提供すること；(3)前記第１のデータベースからモデルを選択すること；(4)前記第２のデータベースから許容されるペプチド骨格を選択すること；(5)サンプリングされた各セグメント中に存在するアミノ酸残基側鎖を識別すること；(6)サンプリングされた各セグメント中に存在するすべての側鎖に対する結合親和性値を決定すること；および前記各モデルと各骨格についてステップ(1)〜(5)を繰り返すことによって実行する方法；
・潜在的なＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有し、免疫遺伝学的に非修飾ｈGHから作成され、表１に記載された群から選択される13merのＴ細胞エピトープペプチド、および、インビボで使用した時に、同一の生物活性を有する非修飾の分子よりも免疫原性が低いまたは実質的に非免疫原性であるｈGH製造のためのその使用；
・上記13merのＴ細胞エピトープペプチドのうち少なくとも９個の連続するアミノ酸残基からなるペプチド配列、および、インビボで使用した時に、同一の生物活性を有する非修飾の分子よりも免疫原性が低いまたは実質的に非免疫原性であるｈGH製造のためのその使用；
・生物学的Ｔ細胞アッセイにおいて合成ペプチドのパネルを使用して、ヒトｈGHの免疫原性領域の地図を作成すること、
・生物学的Ｔ細胞アッセイにおいてｈGHタンパク質変異体のパネルを使用して、in vitroで最少の免疫原性を示す変異体を選択すること、
・生物学的Ｔ細胞アッセイにおいて合成ペプチド変異体のパネルを使用して、in vitroで最少の免疫原性を示すペプチド配列を選択すること、
・Ｔ細胞刺激の生物学的アッセイを用いて、未処置Ｔ細胞アッセイで2.0、好ましくは1.8未満の刺激指数を示すタンパク質変異体を選択すること、
・健康なドナーから単離したＰＢＭＣ、および以下のステップ、すなわちi)合成ペプチドまたはタンパク質免疫原全体を用いて最大７日間の培養期間、in vitroで初回抗原刺激すること、ii)ＩＬ−２を加え、最大３日間培養すること、iii)照射自己ＰＢＭＣに初回抗原刺激されたＴ細胞を加え、抗原を用いてさらに４日間の培養期間で再チャレンジすること、およびiv)適切な任意の方法による増殖指数の測定すること、
を含むスクリーニング方法を用いたｈGHタンパク質のＴ細胞エピトープ地図の作成、
・未処置Ｔ細胞アッセイにおいて、1.8超、好ましくは2.0超の刺激指数を誘起することができるｈGH由来ペプチド配列、
・未処置Ｔ細胞アッセイにおいて、1.8超、好ましくは2.0超の刺激指数を有するｈGH由来ペプチド配列であって、ペプチドが最小限に修飾され、未処置Ｔ細胞アッセイで試験して2.0未満の刺激指数を有することが判明している配列、
・野生型タンパク質配列と100％のアミノ酸同一性を共有しており、Ｔ細胞アッセイで1.8超、好ましくは2.0超の刺激指数を誘起することができるｈGH由来ペプチド配列、
・これに応じた特定のｈGHペプチド配列であって、野生型タンパク質配列を有する100％未満のアミノ酸同一性を含むように修飾され、Ｔ細胞アッセイで試験した場合2.0未満の刺激指数を誘起する配列、
・個別に試験した場合、Ｔ細胞アッセイで2.0未満の刺激指数を誘起する修飾ペプチド配列を含むｈGH分子、
・Ｔ細胞アッセイで試験した場合、非修飾タンパク質分子と比較して低減された刺激指数を誘起するような修飾を含むｈGH分子、
・Ｔ細胞アッセイを用いて地図が作成され、次いでＴ細胞アッセイで再試験して、修飾タンパク質が親(非修飾)分子より小さい、最も好ましくは2.0未満の刺激指数を誘起するように免疫原性領域が修飾されているｈGH分子。
【００２７】
「Ｔ細胞エピトープ」という用語は、本発明についての理解によれば、ＭＨＣクラスＩＩを結合可能で、Ｔ細胞を刺激するおよび／または(必ずしも測定可能な程度に活性化せずに)Ｔ細胞を複合体中でＭＨＣクラスＩＩに結合可能であるアミノ酸配列を意味する。
【００２８】
本明細書および添付する特許請求の範囲において「ペプチド」という用語は、２個以上のアミノ酸を含む化合物である。アミノ酸はペプチド結合(以下に定義される)によって互いに連結される。ペプチドの生物学的生産に関わる20個の異なる天然アミノ酸が存在し、これらが任意の数、任意の順序で連結して、ペプチド鎖または環を形成する。ペプチドの生物学的生産で使用される天然アミノ酸はすべてＬ‐配置である。合成ペプチドは、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸またはこれら２種の異なる配置のアミノ酸の様々な組合せを使用して従来の合成方法を用いて調製できる。ペプチドによっては数単位のアミノ酸しか含まないものもある。短いペプチド、例えばアミノ酸単位が10個未満のものは、時に「オリゴペプチド」と呼ばれる。他のペプチドは多数のアミノ酸残基、例えば100個以上を含み「ポリペプチド」と呼ばれる。従来、「ポリペプチド」は３個以上のアミノ酸を含む任意のペプチド鎖と考えられ、「オリゴペプチド」は通常、特に「短い」タイプのポリペプチドと見なされる。したがって、本願では「ポリペプチド」へのどのような言及もオリゴペプチドを含むと理解される。さらに、「ペプチド」へのどのような言及もポリペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質を含む。アミノ酸の個々の異なる配置は異なるポリペプチドまたはタンパク質を形成する。形成することができるポリペプチドの数、したがって異なるタンパク質の数は、実際上無制限である。
【００２９】
「アルファ炭素(Ｃα)」はペプチド鎖中の炭素水素(ＣＨ)部分の炭素原子である。「側鎖」はＣαへの吊り下がり(ペンダント)基であり、ペプチドの寸法と比較して著しく変動幅の広い物理的な寸法を有する、単純もしくは複雑な基または部分を含むことができる。
【００３０】
本発明は、実質的にここに示されたものと同じ１次アミノ酸配列を有する任意のｈGH分子種に適用でき、したがって、遺伝子工学的手段その他の方法によって誘導されたｈGH分子を含み、大体191個のアミノ酸残基を含んでもよい。本開示のペプチド配列の多くは、共通に非ヒトのｈGH蛋白質由来のペプチド配列を有し、または少なくとも非ヒト蛋白質からのものと実質同じであるペプチド配列を有する。したがって、このようなタンパク質配列も等しく本発明の範囲内に入る。
【００３１】
本発明は、ヒトにおいて治療を意図として導入された可溶性タンパク質が免疫反応を引き起こし、その可溶性タンパク質に結合する宿主抗体の進行をもたらしうるという、実際ある現実を克服することを想定している。本発明は、ヒト宿主への投与において免疫反応を誘導する傾向性が変更されたｈGHタンパク質を供給することにより、この問題の解決を図る。ここに記載されている方法によると、本発明者等は、本蛋白質に対して免疫応答を導く重要なT細胞エピトープを含むｈGH分子の領域を発見した。
【００３２】
修飾されたｈGHをもたらす本発明の一般的な方法は、次のステップを含む：
(a)ポリペプチドまたはその一部のアミノ酸配列を決定すること；
(b)インビトロまたはインシリコ技術を用いるか生物学的アッセイを用いてペプチドのＭＨＣ分子への結合を測定することを含む任意の方法によりタンパク質のアミノ酸配列内の１つまたは複数の潜在的なＴ細胞エピトープを識別すること；
(c)インビトロまたはインシリコ技術を用いるか生物学的アッセイを用いてペプチドのＭＨＣ分子への結合を測定したＴ細胞エピトープ活性を実質的に低減するか除去するように、識別された潜在的なＴ細胞エピトープ内の１つまたは複数のアミノ酸を用いて新規な配列変異体を設計する。このような配列変異体は、そのような新しい潜在的なＴ細胞エピトープが、設計毎に、Ｔ細胞エピトープの活性を実質的に低減するか除去するように修飾されないのであれば、配列変化によって新しい潜在的なＴ細胞エピトープの生成を回避する方法で作成される。そして、(d)組換えＤＮＡ技術によってそのような配列変異体を構築し、所望の特性を備えた１つまたは複数の変異体を識別するために前記変異体をよく知られた組換えＤＮＡ技術によって試験する。
【００３３】
ステップ(b)による潜在的なＴ細胞エピトープの識別は従来法によって実行することができる。適当な方法はWO 98／59244；WO 98／52976；WO 00／34317に開示されており、ｈGHから誘導されるペプチドのＭＨＣクラスＩＩ分子への結合性向を識別するために好適に使用できる。
【００３４】
計算によってＴ細胞エピトープを識別する別の非常に効果的な方法は、この発明によって好ましい実施形態である実施例１に記述される。
【００３５】
ヒトｈＧＨタンパク質配列についての上記スキームのステップ(b)による分析結果を表１に示す。
【００３６】
【表２】
2005501546.tif 000003
【００３７】
ペプチドは13mersであり、アミノ酸は１文字コードを用いて表してある。
【００３８】
上記スキームのステップ(c)および(d)に従い本発明の修飾された分子に関する構築および設計の結果を、表２および３に示す。
【００３９】
【表３】
2005501546.tif 000004
【００４０】
【表４】
2005501546.tif 000005
【００４１】
【表５】
2005501546.tif 000006
【００４２】
【表６】
2005501546.tif 000007
【００４３】
【表７】
2005501546.tif 000008
【００４４】
【表８】
2005501546.tif 000009
【００４５】
Ｔ細胞エピトープを検出するための他の技術的アプローチは生物学的Ｔ細胞アッセイによるものである。ｈGH分子中のＴ細胞エピトープの検出に特に有効な方法は、表１のペプチド配列のすべてまたはいずれかについて、in vitroで培養したヒトＴ細胞中での増殖応答を誘起するその能力を試験することであろう。好ましい方法は、実際において、個体での遺伝子欠失の性質に起因するｈGHタンパク質抗原が外来タンパク質を構成できる、個体からの末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)を利用することであろう。この意味で、タンパク質はin vivoで強力な抗原を示す可能性が非常に高い。これは、in vitroで複数のラウンドの抗原(ｈGH)刺激にかけ、続いてＩＬ−２の存在下で直ちに増殖させたＴ細胞を用いて達成することができる。ポリクローナルＴ細胞株を確立するためには、多数の抗原特異性細胞を発生させるのに、一般に２〜３ラウンドの抗原刺激で十分である。これらは、多数の合成ペプチド(例えばペプチドプールの形で)をスクリーニングするのに用いられ、また極低温で貯蔵して後日使用することができる。７日間のｈGH抗原とＰＢＭＣの共インキュベーションを含む最初のラウンドの抗原刺激の後、続く抗原での再チャレンジを最も好ましくは抗原提示細胞としての自己照射ＰＢＭＣの存在下で実施する。抗原選択のこれらのラウンドを３〜４日間行い、ＩＬ−２での刺激を含む増殖相によって散布する。これは３日間ごとに追加して合計約９日間としてよい。最終の再チャレンジは、「休止(rested)していた」Ｔ細胞、すなわち、約４日間ＩＬ−２で刺激されていないＴ細胞を用いて行う。これらの細胞を、最も好ましくは自己抗原提示細胞を用いて、上記と同様に約４日間かけて、抗原(例えば合成ペプチドまたはタンパク質全体)で刺激し、その後、引き続き増殖応答(あれば)を測定する。増殖応答は通常の任意の手段で測定でき、広く知られた方法は、例えば3Ｈチミジン混合アッセイを使用する方法であろう。
【００４６】
したがって、本明細書の上記の実施形態で示した方法は、個体から採取したＰＢＭＣサンプル由来のＴ細胞系またはオリゴクローナルな培養物を作製することを含み、そこでは以前はｈGHを用いて代償療法が行われており、更にそこでは代償療法は治療蛋白質に対する免疫応答を誘発する結果をもたらしている。そのような個体からの株や培養物は、合成ペプチドまたは蛋白質全体の調製と関係しており、いかなるin vitroにおける増殖効果も測定される。個々の合成ペプチドまたは蛋白質に対して、変異体を産生し、T細胞株または培養物において大幅な増殖応答を促進する持続的な能力があるかを再試験する。したがって、例えば、表２または表３に定義されている、いかなる置換体または置換体の組合せを含む合成ペプチドがアッセイをしてテストされる。
【００４７】
このスキームでは、著しい数のこれらの個体のＴ細胞レパートリーによって定義されたｈGHタンパク質のエピトープ地図が、in vivoの状況で提示が可能な最も一般的なペプチドエピトープの代表であることが望ましい。この意味で、先に示した免疫応答がある患者からのＰＢＭＣは、in vivoでの初期抗原刺激ステップの産生物を構成し、そうした個体からのＰＢＭＣ細胞株の使用が原則的に免疫学的in vitroリコールアッセイであるとすると、いかなる与えられた刺激ペプチドまたはタンパク質に対しても、より非常に大きな増殖応答の能力があるという実際的な利点がさらに提供される。これは増殖測定を実行することの技術的困難さを低減し、そうした状況で、複数のＭＨＣクラスＩＩペプチドリガンド、したがって、複数またはコンプレックス(すなわち重複)Ｔ細胞エピトープを宿す(harbour)ことを、本明細書で計算によって示したｈGHの場合のように、免疫優性エピトープの可能的な階層の定義の機会をもたらす可能性を与える。
【００４８】
先の治療ｈGH補充療法がｈGHに対する免疫応答の誘発をもたらした個体からのオリゴクローナルな培養物のＴ細胞系を確立することは特に有用なことであるが、これらがin vivo関連免疫原性エピトープの地図を作成するのに用いられる唯一の細胞源であるわけではない。健康なドナーから得た未処置Ｔ細胞のアッセイも同様に使用できるが、そうした場合、個々の任意のペプチドについてスコアをつけた刺激指数の大きさは低い可能性が大きく、ペプチドまたはタンパク質が誘発した刺激と、背景による刺激とを見分けるために高感度の測定を必要とする。本発明者らは、そうしたアッセイの操作においてよく知られた技術を用いて、2.0以上の刺激指数が、誘発された増殖の有用な尺度であることを立証した。ここで、刺激指数は試験(ポリ)ペプチドについて測定された(例えば、3Ｈ−チミジン混合法を用いた場合、１分当たりのカウント数)増殖スコアは、試験(ポリ)ペプチドと接触していない細胞中で測定した増殖スコアで除して誘導される。このタイプの適切な方法を実施例２に詳細に示す。
【００４９】
複数の潜在性エピトープを同定する場合、特に多くのペプチド配列が生物学的アッセイにおいてＴ細胞を刺激することができることが判明した場合、ＭＨＣクラスＩＩ提示経路経由で免疫応答を誘起するその傾向に関連して、タンパク質の構造的特徴の認識を行うこともできる。例えば、当該タンパク質の結晶構造が既知である場合、結晶性Ｂ因子のスコアは、タンパク質内の構造的不規則さを証明するために分析され、生物学的に関連する免疫優性ペプチドエピトープとの近接との相関が示唆されるパラメータである可能性がある[Dai G.ら(2001年)、J. Biological Chem.第276巻：41913〜41920頁]。ｈGH結晶構造[PDB ID: 1HGU Chantalat, L. et al (1995), Protein And Peptide Letters 2: 333 & PDB ID 1A22 Chackson, T. et al (1998), J. Mol. Biol. 277:1111]に対して実施した場合、このような分析は、非受容体結合構造[PDB ID 1HGU]内において、平均B因子スコアを超える少なくとも7個のピークを有する、複数の免疫優性エピトープの可能性が高いことを示唆している。生物学的に関連のあるT細胞エピトープがグルタミン残基41からｈGH配列を下る領域にマッピングすることをこの分析は示している。したがって、表２および表３に示したアミノ酸置換の、本発明のこのデータのスキームでは、最も好ましい置換は、残基42〜180番内に包含される残基に向けられたものを含む。
【００５０】
実際には多くの変異体ｈGHタンパク質が産生され、所望の免疫的および機能的特徴を試験されることになる。出版されている文献において、その分子の機能的な特徴の変更による結果が公知である突然変異体が参照することができ[Lowman H.B. & Well. J. A. (1993) J. Mol. Biol. 243: 564-578; Wells J. A. et al (1993) Recent prog. Horm. Res. 48: 253-275] 、更にそれらの表２及び表３に記載の、蛋白質の機能に対して有害である置換体は分析から除外してもよく、あるいは蛋白質の機能的活性を回復するために選択された代償的変異を行うことができる。すべての場合、変異体タンパク質は、好ましくは広く知られた組換えＤＮＡ技術の方法によって産生されるが、ｈGHフラグメントの化学合成を含む他の方法も考えられる。
【００５１】
本発明は、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換が、タンパク質からの１個または複数の潜在性Ｔ細胞エピトープの活性の実質的な低減、または該エピトープの除去をもたらす位置で行われるｈGH類似体に関する。アミノ酸修飾(例えば置換)が親分子の最も免疫原性的領域内で行われるｈGH分子を提供することが最も好ましい。本発明の主要な好ましい実施形態は、その分子に対してＭＨＣクラスＩＩリガンドのいずれかが、結合を除去するように変更されるか、そうでない場合、ペプチドが結合できるＭＨＣアロタイプの数を削減するように変更されるｈGH分子を含む。
【００５２】
Ｔ細胞エピトープの除去において、アミノ酸置換は、好ましくはＴ細胞エピトープの活性の実質的な低減または除去を達成すると予想されるペプチド配列内の適切なポイントで行われる。実際上、適切なポイントは、ＭＨＣクラスＩＩ結合溝内に与えられる疎水性ポケットのうちの１つにおいて結合するアミノ酸残基と一致することが好ましいであろう。
【００５３】
ペプチドのいわゆるＰ１またはＰ１アンカー位置で溝の第１のポケット内に結合するものを変更することが最も好ましい。ペプチドのＰ１アンカー残基と、ＭＨＣクラスＩＩ結合溝第１ポケットとの間の結合相互作用の特性は、ペプチド全体に対する総合的な結合親和性の主な決定要素であると認められる。ペプチドのこの位置での適切な置換は、ポケット内にはより収容されにくい残基のためであり、例えばより親水性の大きな残基への置換である。ＭＨＣ結合溝内の他のポケット領域内での結合と同等な位置でのペプチド中のアミノ酸残基も考慮され、本発明の範囲に入る。
【００５４】
所与の潜在的Ｔ細胞エピトープ内の単一のアミノ酸置換が、エピトープ除去の最も好ましいルートであることが理解される。単一のエピトープ内での置換の組合せも考えられ、例えば、個別に定義されたエピトープが互いに重複する場合には特に適切になものとなり得る。さらに、所与のエピトープ内における単一のアミノ酸置換または単一のエピトープ内における置換の組合せは、ＭＨＣクラスＩＩ結合溝に関して「ポケットペプチド」と同等な位置でなくともペプチド配列内のどのポイントでされていてもよい。置換は、同族体構造に関してか当技術分野で知られたインシリコ技術を用いて生成する構造的方法で行われてもよいし、本発明による分子の公知の構造上の特徴に基づくものでもよい。そのような置換はすべて本発明の範囲内に入る。
【００５５】
特に、リストに挙げたペプチド内で行われた置換と組み合わせて行う場合、上に識別されたペプチド内以外のアミノ酸置換を考えてもよい。例えば、変異体分子の構造や生物活性を回復するために変更を考えることができる。そのような補償的変更およびｈＧＨポリペプチドからの特定のアミノ酸残基の除去または付加を含む変更は、所望の活性で、かつ開示するペプチドのうちのいずれかの変化と組み合わせた変異体をもたらし、本発明の範囲内に入る。
【００５６】
本発明の修飾されたｈＧＨに関する限り、そのような修飾されたｈＧＨタンパク質または修飾されたｈＧＨタンパク質の断片を含む組成物および関連する組成物は、本発明の範囲内と考えるべきである。別の実施態様では、本発明は修飾されたｈＧＨ実在物をコードする核酸に関する。別の実施態様では、本発明は修飾されたｈＧＨタンパク質を使用するヒトの治療方法に関する。
【００５７】
更に、さらなる態様において、本発明は、ここに開示する配列と、配列同一性もしくは部分的な同一性を有する誘導体またはペプチドを含む、医薬品を用いた治療処置の方法に関する。
【００５８】
（実施例１）
タンパク質やポリペプチドの全体的構造を決定するのに重要な役割を果たす要因は多数存在する。第１に、ペプチド結合、アミノ酸を鎖状に互いに連結するその結合は、共有結合である。この結合は平面構造であり実質的に置換アミドである。「アミド」は−ＣＯＮＨ−基を含む有機化合物の任意の基である。
【００５９】
隣接アミノ酸のＣαを連結する平面状ペプチド結合は以下に示すように表すことができる：
【００６０】
【化１】
2005501546.tif 000010
【００６１】
Ｏ＝ＣおよびＣ−Ｎ原子は比較的剛性な平面内にあるので、これらの軸の周りに自由な回転は生じない。このため、破線によって模式的に描いた平面は時として「アミド平面」または「ペプチド平面」と呼ばれ、この平面にはペプチド骨格の酸素(Ｏ)、炭素(Ｃ)、窒素(Ｎ)および水素(Ｈ)原子が載る。このアミド平面の相対する両隅にはＣα原子が位置する。ペプチド平面すなわちアミド平面内では、Ｏ＝ＣおよびＣ−Ｎ原子の周りの回転が実質的にないので、ポリペプチド鎖はＣα原子を連結する一連の平面状ペプチド結合を含む。
【００６２】
ポリペプチドまたはタンパク質の全体構造または立体構造を規定する上で重要な役割を果たす第２の要因は、共通なＣα連結の周りの各アミド平面の回転角である。「回転角」および「ねじり角」という用語は以下では同義語と見なされる。アミド平面にＯ、Ｃ、ＮおよびＨ原子が載ると仮定すると(立体構造によってはこれらの原子のうちいくつかは平面から若干ずれるかもしれないが、これは通常有効な仮定である)、これらの回転角はＮとＲポリペプチドの骨格の立体構造、つまり隣接残基間に存する構造を定義する。これらの２つの角度はφおよびψとして知られている。したがって、１組の角度、φiおよびψi(ここで添字ｉはポリペプチド鎖の特定の残基を表す)はポリペプチドの２次構造を有効に規定する。角度φおよびψを定義するのに使用される慣用規則、すなわち、所与のポリペプチドについてのアミド平面が角度０を形成する参照ポイント、並びに角度φの定義および角度ψの定義は、文献に定義される。例えば、(Ramachandran et al. Adv. Prot. Chem. 23: 283-437 (1968)、特に285−94頁参照(これらの頁は言及によって本願に組み込まれる))。
【００６３】
本発明の方法は任意のタンパク質に適用することができ、ヒトでは、ＭＨＣクラスＩＩ分子結合溝の主要なポケット１アンカー位置が、特定のアミノ酸側鎖に対してよく設計された特異性を有するという発見に部分的に基づいている。このポケットの特異性は、ＭＨＣクラスＩＩ分子のベータ鎖の位置86でのアミノ酸の同一性によって決定される。このサイトはポケット１の底に位置し、このポケットに収容され得る側鎖の大きさを決定する。Marshall, K. W.、 J. Immunol.、152: 4946-4956 (1994)。この残基がグリシンである場合、すべての疎水性脂肪族および芳香族アミノ酸(疎水性脂肪族は以下のものである: バリン、ロイシン、イソロイシンおよびメチオニン、また芳香族は以下のものである: フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン)は、ポケット内に収容され得る(芳香族側鎖が優先される)。このポケット残基がバリンである場合、このアミノ酸側鎖はポケット内部に突出するので、収容できるペプチド側鎖のサイズを制限する(例えば疎水性脂肪族側鎖だけが収容可能である)。したがって、アミノ酸残基配列において、疎水性脂肪族および芳香族側鎖を有するアミノ酸が存在する場合にはいつでも、ＭＨＣクラスＩＩ制限Ｔ細胞エピトープが存在する可能性がある。しかし、側鎖が疎水性脂肪族である場合は、芳香族側鎖の場合と比較して、(全人口において、ポケット１タイプの分布がほぼ均一であると定すれば)Ｔ細胞エピトープに関連する可能性はおよそ２倍である。
【００６４】
本発明を具体化する計算方法は、以下のようにＴ細胞エピトープを含むペプチド領域の可能性を特徴づける：
(1)予め定義した長さのペプチドセグメントの１次配列を走査し、存在する疎水性脂肪族と芳香族側鎖をすべて識別する。(2)疎水性脂肪族側鎖には芳香族側鎖用のそれより大きな値、好ましくは芳香族側鎖に割り当てる値の約２倍を割り当てる(例えば、疎水性脂肪族側鎖に対しては値２を、芳香族側鎖に対しては値１を割り当てる)。(3)ペプチド内の予め定義した一定の長さの各重複するアミノ酸残基セグメント(ウィンドウ)について存在が決定された値を合計し、特定のセグメント(ウィンドウ)に対する値の合計を、セグメント(ウィンドウ)の中間位置で単一のアミノ酸残基、好ましくは、サンプリングされたセグメント(ウィンドウ)の中間点付近の残基に割り当てる。この手続きを、サンプリングされた各重複するアミノ酸残基セグメント(ウィンドウ)について繰り返す。したがって、ペプチドの各アミノ酸残基は、特定のセグメント(ウィンドウ)内に存在するＴ細胞エピトープの可能性に関係のある値を割り当てられる。(4)上記ステップ３に記載するように計算し割り当てた値は、評価するアミノ酸残基配列全体のアミノ酸座標に対してプロットすることができる。(5)予め定義した値(例えば値１)のスコアを有する配列のすべての部分は、Ｔ細胞エピトープを含むと認められ、必要であれば、修飾することができる。本発明のこの特定の実施態様は、Ｔ細胞エピトープを含むであろうペプチド領域を記述できる一般的な方法を提供する。これらの領域内のペプチドに対する修飾は、ＭＨＣクラスＩＩ結合特性を修飾する可能性を有する。
【００６５】
本発明の別の実施態様によれば、ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子モデルによりペプチドの相互作用を考慮に入れたより精巧な計算方法を使用して、Ｔ細胞エピトープをより高精度で予想できる。特にこの実施態様によるペプチド内に存在するＴ細胞エピトープの計算上の予想では、すべての公知のＭＨＣクラスＩＩ分子の構造に基づく少なくとも42個のＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子のモデルの構築が考えられ、Ｔ細胞エピトープの計算による識別におけるこれらのモデルの使用、相対的なペプチド骨格アルファ炭素(Ｃα)位置の知られた変わりやすさを考慮に入れるための各モデルのペプチド骨格のライブラリーの構築、ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子との間の相互作用において重要な位置での20個のアミノ酸置換各々のための各モデルを備えた各骨格ドック(dock)のアミノ酸側鎖コンホメーションのライブラリーの構築、および特定のＭＨＣクラスＩＩ分子に収容(dock)された特定のペプチドについての最適な骨格および側鎖コンホメーション選択のための、これら骨格および側鎖コンホメーションライブラリーの使用、並びにこの相互作用からの結合スコアの誘導が考えられる。
【００６６】
ＭＨＣクラスＩＩ分子のモデルは相同モデリングによって、ブルックヘブン(Brookhaven)タンパク質データバンク(「ＰＤＢ」)で見出された多数の同様の構造から誘導できる。これらは、エネルギー最小化のためのＣＨＡＲＭｍ力場(Molecular Simulations Inc.、San Diego、Ca.から入手可能)と共に、シミュレートされたアニーリング機能を組み込んだ半自動的な相同モデリングソフトウェア(Modeller, Sali A.＆ Blundell TL.、1993. J. Mol. Biol 234: 779-815)によって形成できる。別のモデリング方法も同様に利用できる。
【００６７】
本願の方法は、ＭＨＣクラスＩＩ分子の小さな集合について結合溝内の各位置での各アミノ酸選択肢の実験により得た結合データのライブラリーを使用する他の計算方法(Marshall, K. W. et al.、 Biomed. Pept. Proteins Nucleic Acids、 1(3): 157-162) (1995)や溝内の特定タイプの結合ポケットの結合特性を定義するために実験による同様の結合データを使用し(ここでもまたＭＨＣクラスＩＩ分子の比較的小さな部分集合を使用する)次いでこのポケットライブラリーからポケットタイプを「混合およびマッチング」して人為的に別の「仮想的な」ＭＨＣクラスＩＩ分子を生成するさらに別の計算方法(Sturniolo T.、et al.、Nat. Biotech、17(6): 555-561 (1999)と著しく異なる。先行技術は両方とも分析が複雑である点および多数のペプチド変異体を合成する必要がある点の不利益を被り、少数のＭＨＣクラスＩＩ分子しか実験的に走査できない。したがって、第１の先行技術の方法は少数のＭＨＣクラスＩＩ分子の予想しかできない。第２の先行技術の方法は、異なるクラスＩＩ対立遺伝子間においては、１個の分子中で類似したアミノ酸で裏打ちされているポケットは同じ結合特性を持つという仮定も前提としており、ポケットライブラリーに含まれるポケットを含むそうしたＭＨＣクラスＩＩ分子だけが「仮想的に」生成されるという欠点をさらに有する。本明細書に述べるモデリング手法を使用すれば、任意の数およびタイプのＭＨＣクラスＩＩ分子の構造を推定でき、したがって全集団を代表する対立遺伝子を特異的に選択できる。さらに、走査されるＭＨＣクラスＩＩ分子の数は、複雑な実験によって追加データを生成する必要以上にさらにモデルを生成することにより増加させることができる。
【００６８】
骨格ライブラリーの使用により、走査されている様々なペプチドについて、特定のＭＨＣクラスＩＩ分子に収容された時のＣα原子位置における変化を考慮に入れることができる。この点もまた、上記の先行技術における計算方法(これらは特定のポケット中でアミノ酸結合を走査するため単純化されたペプチド骨格の使用に依存している)と対照的である。これらの単純化された骨格は、「実際の」ペプチドで見つかる骨格構成の代表ではないであろうし、その結果、ペプチド結合の予想が不正確になる。本発明の骨格ライブラリーは、タンパク質データバンク内で見出されるＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するすべてのペプチドの骨格を重ね、結合溝内に位置する11個のアミノ酸各々のＣα原子間の２乗平均平方根(RMS)偏差を記録することにより生成される。このライブラリーは、より大きな変動の可能性までも考慮に入れるために、少数(現在13個)の適切な利用可能なマウスおよびヒト構造から誘導できる一方、各Ｃ"−αについてのＲＭＳ数値は、50％増加する。その後、各アミノ酸の平均のＣα位置が決定され、その半径がその位置でのＲＭＳ偏差プラス50％と等しい球がこの点のまわりに描かれる。この球体は許容されるＣα位置をすべて表す。
【００６９】
最小のＲＭＳ偏差を有するＣα(これは、上記のポケット１中のアミノ酸であり、結合溝中の11個の残基の位置２と等価である)を動かして、球体は３次元的にグリッド化され、次いでグリッド内の各頂点はそのアミノ酸のＣαのために可能な位置として使用される。結果として得られるアミド平面は、引き続きアミノ酸へのペプチド結合に対応し、これらのＣαの各々にグラフトされ、次のＣαを位置付けるためにφおよびψ角を所定の間隔で回転させる。引き続きＣαがＣαに対して「許容される位置の球」内にある場合にはジペプチドの向きが許容され、それが球の外部になる場合には、ジペプチドは拒絶される。
【００７０】
その後、先行するＣαのあらゆる組合せから９個の後続Ｃαがすべて位置付けられるまで、ペプチドがポケット１ Ｃα「種子」から成長するように後続Ｃα位置の各々についてこのプロセスを繰り返す。次いで、ポケット１の前の単一Ｃαについてこのプロセスをもう一度繰り返して結合溝内に位置する骨格Ｃα位置のライブラリーを生成する。
【００７１】
生成された骨格の数はいくつかの要因に依存する：「許容される位置の球」の大きさ；ポケット１位置の「１次球」のグリッドの精密さ；後続Ｃαを位置付けるために用いるφおよびψの段階的回転角の精密さ。このプロセスを使用すると、大きな骨格ライブラリーを生成できる。骨格ライブラリーが大きい程、ＭＨＣクラスＩＩ分子の結合溝内の特定のペプチドに対して最もよく適合するものが見つかる可能性は大きくなる。各対立遺伝子について、結合領域のアミノ酸との衝突により、必ずしもすべての骨格がＭＨＣクラスＩＩ分子のすべてのモデルに収容されるのには適さないため、その対立遺伝子によって収容され得る骨格を含むライブラリーの部分集合が生成される。
【００７２】
骨格ライブラリーの使用は、ＭＨＣクラスＩＩ分子モデルと共に、各許容される骨格に収容される各ＭＨＣクラスＩＩ分子について結合溝の各位置の各アミノ酸の許容される側鎖コンホメーションからなる徹底的なデータベースを作成する。このデータセットは、単純な立体的重なり関数を用いて生成され、ここで、ＭＨＣクラスＩＩ分子は骨格と結合し、アミノ酸側鎖は所望の位置で骨格上にグラフトされる。各々の側鎖の回転可能な結合を設定した間隔で段階的に回転させ、得られる原子位置は注目する結合に依存する。原子と結合溝の側鎖の原子との相互作用が注目され、位置は次の基準によって許容されるか拒絶される: ここまでに位置付けられたすべての原子の重なりの合計は、予め決めた値を超過してはならない。したがって、コンホメーション探索の厳格性は、結合の段階的回転で用いる間隔と全重なりについて予め決めた限界の関数である。特定のポケットが剛性であると知られている場合、この後者の値は小さくなり得るが、ポケット側鎖の位置に比較的柔軟性があると知られている場合は、比較的緩和である。したがって、許容は結合溝ポケット内の柔軟性における変化を模倣するようになすことができる。次いで、ＭＨＣクラスＩＩ分子の各々に収容された時、このコンホメーション探索を各骨格のすべての位置にあるすべてのアミノ酸について繰り返し、側鎖コンホメーションの徹底的なデータベースを作成する。
【００７３】
適切な数式を用いて、上記骨格／側鎖コンホメーションの大きなデータベースの走査により経験的に導き出さなければならないペプチドリガンドコンホメーションと組み合うＭＨＣクラスＩＩ分子モデル間の結合エネルギーを評価する。したがって、９〜20アミノ酸の範囲で長さが変化する(もっとも、長さは各走査に対しては一定にしておく)可能なペプチドに、以下の計算を施すことにより、タンパク質を潜在的なＴ細胞エピトープについて走査する: ＭＨＣクラスＩＩ分子をその分子に許容されるペプチド骨格とともに選択し、所望のペプチド配列に対応する側鎖をグラフトする。骨格上の特定の位置での原子の識別および特定の側鎖に関する原子間距離データを、そのアミノ酸の許容される各コンホメーションについて集める(上記データベースから得られる）。これを骨格に沿って各側鎖に対して繰り返し、スコアリング関数を用いてペプチドスコアを導く。その骨格のための最良のスコアを保持し、選択されたモデルについて各許容される骨格に対してこのプロセスを繰り返す。すべての許容される骨格から得られたスコアを比較し、最高のスコアをそのＭＨＣクラスＩＩモデル中の所望のペプチドについてのペプチドスコアであると見なす。次いで、このプロセスを、走査されているタンパク質に由来するあらゆる可能なペプチドを備えた各モデルについて繰り返し、ペプチド対モデルのスコアを表示する。
【００７４】
本発明の状況では、結合親和性計算のために提示される各リガンドは、上に議論されるようなペプチドまたはタンパク質から選択されるアミノ酸断片である。したがって、リガンドは、公知の配列のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質から得られ、長さがおよそ９〜20個のアミノ酸である選択されたアミノ酸伸張物である。「アミノ酸」および「残基」という用語は以下においては同義語と見なされる。
【００７５】
リガンドは、骨格ライブラリーから得た骨格上にグラフトされて検査されるペプチドの連続アミノ酸の形をしており、ペプチド骨格のＣ"−α原子の座標を介して、ＭＨＣクラスＩＩ分子モデルライブラリーから得られるＭＨＣクラスＩＩ分子の結合溝中に位置し、各側鎖に対して許容されるコンホメーションは許容されるコンホメーションデータベースから選択される。関連する原子同一性および原子間距離もこのデータベースから検索し、ペプチド結合スコアを計算するために使用する。ＭＨＣクラスＩＩ結合ポケットへの高い結合親和性を備えたリガンドには、部位指図突然変異生成に対する候補としてフラグが立てられる。フラグが立てられたリガンド(したがって対象タンパク質)でアミノ酸置換を行い、これはその後、結合親和性を予め定義した閾値以下に低減する変更を決定するためにスコアリング関数を使用して再試験する。次いで、これらの変更を対象タンパク質に組み入れ、Ｔ細胞エピトープを除去する。
【００７６】
ＭＨＣクラスＩＩ分子のペプチドリガンドと結合溝の間は、非共有結合性の相互作用(水素結合、静電気的相互作用、疎水性(親油性)相互作用およびファンデアワールス相互作用を含むが、これらに限定されない)を含む。これらは、以下に詳細に述べるペプチドスコアリング関数に含まれている。
【００７７】
水素結合は極性または帯電基間で形成され得るもので、２つの他の原子によって共有された水素原子からなる非共有結合であることが理解されるべきである。水素受容体が部分的に負帯電を有する一方で、水素供与体の水素は正電荷を有する。ペプチド／タンパク質相互作用のために、水素結合供与体は、水素と結合した窒素または酸素もしくは窒素に結合した水素のいずれでもよい。水素結合受容体原子は水素と結合していない酸素、水素が全く結合しておらず１個か２個の結合がある窒素、または１つの結合のみある硫黄でもよい。水素を結合した酸素またはイミン窒素(例えばＣ＝ＮＨ−)などのある種の原子は、水素受容体とも供与体ともなり得る。水素結合エネルギーは３〜７kcal／molの範囲であり、ファンデアワールス結合よりはるかに強いが共有結合よりは弱い。水素結合はまた指向性が強く、供与体原子、水素原子および受容体原子が同一直線上にある場合に最も強い。
【００７８】
静電的結合は反対荷電のイオン対間で形成され、相互作用の強さはクーロンの法則による原子間の距離の二乗に反比例する。イオン対間の最適距離は約2.8Åである。タンパク質／ペプチド相互作用では、静電的結合がアルギニン、ヒスチジンまたはリジンとアスパラギン酸塩またはグルタミン酸塩との間で形成され得る。それらは水素結合と強さがほぼ似ているが、結合の強さはイオン化基のｐＫａおよび媒体の誘電率に依存するであろう。
【００７９】
親油性(脂肪親和性)相互作用は、タンパク質とペプチドリガンド間に生じる良好な疎水性−疎水性接触である。通常、これらは結合溝のポケット内に埋没したペプチドの疎水性アミノ酸側鎖間に、それらが溶媒に露出しないように生じる。疎水性残基の溶媒への露出は、周囲の溶分子が互いに水素結合を強いられ、かご状のクラスレート構造を形成するので非常に不利である。結果として生じるエントロピーの減少は非常に不利である。脂肪親和性の強い原子は、極性でもなく水素受容体でもない硫黄や非極性の炭素原子などである。
【００８０】
ファンデアワールス結合は３〜４Å離れた原子間で見られる非特異的な結合である。これは水素結合や静電的結合より弱く特異性も低い。原子のまわりの電荷分布は時間とともに変化し、どの瞬間でも、電荷分布は対称ではない。電荷分布におけるこの一時的な非対称性は、近隣の原子にも同様の非対称性を引き起こす。この結果生じる原子間引力は、ファンデアワールス接触距離で最大に達するが、約２Å〜約１Åに至ると非常に急速に低減する。逆に、原子間の隔たりが接触距離未満になるとともに、原子の外殻電子雲が重なるため、強い斥力が支配的になる。引力は静電的結合や水素結合に比べて比較的弱いが(約0.6 Kcal／mol）、斥力は特に、ペプチドリガンドがタンパク質に成功裡に結合するかどうか決する上で非常に重要であろう。
【００８１】
１つの実施形態では、ベーム(Boehm)スコアリング関数(SCORE１手法)が結合定数を評価するために使用される(Boehm, H. J.、 J. Comput Aided Mol. Des.、 8 (3): 243-256 (1994)、その内容は言及によってその全体が本願に組み入れられる)。別の実施形態では、スコアリング関数(SCORE２手法)が、Ｔ細胞エピトープを含むリガンドの指標として結合親和力を評価するために使用される(Boehm, H. J.、 J. Comput Aided Mol. Des.、 12 (4): 309-323 (1998)、その内容は言及によってその全体が本願に組み入れられる)。しかし、上記の文献に記述されているベームスコアリング関数は、タンパク質へのリガンドの結合親和力を評価するために使用されるが、この場合、リガンドがタンパク質に成功裡に結合することが既に知られており、タンパク質／リガンド複合体はその構造が解明されタンパク質データバンク(「PDB」）の中に存在するものである。したがって、スコアリング関数は、陽性であることが知られた結合データを利用して開発されている。陽性および陰性バインダー間の区別を考慮に入れるために、方程式に反発項を加えなければならない。さらに、結合エネルギーのより満足な評価は、上記のベーム関数の領域ベースのエネルギー項を用いるのではなく対同士の方法で脂肪親和性の強い相互作用を計算することで達成される。
【００８２】
したがって、好ましい実施形態では、結合エネルギーは修正されたベームスコアリング関数を使用して評価される。修正されたベームスコアリング関数では、タンパク質とリガンド間の結合エネルギー(ΔＧbind)は、以下のパラメーターを考慮して評価される：リガンド(ΔＧo)の並進エントロピーと回転エントロピーの全面的な喪失による結合エネルギーの低減；少なくとも１個のパートナーが中性である、理想的な水素結合からの寄与(ΔＧhb)；摂動のないイオン間相互作用(ΔＧionic)からの寄与；脂肪親和性リガンド原子と脂肪親和性受容体原子の間の脂肪親和性相互作用(ΔＧlipo)；リガンド中の内部自由度の凍結による結合エネルギーの喪失、つまり、各Ｃ−Ｃ結合の周りの回転自由度が低減する(ΔＧrot)；タンパク質とリガンド間の相互作用エネルギー(ＥvdW)。これらの項を考慮すると方程式１が与えられる：
(ΔＧbind)＝(ΔＧo)＋(ΔＧhbｘＮhb)＋(ΔＧionicｘＮionic)＋(ΔＧlipoｘＮlipo)＋(ΔＧrot＋Ｎrot)＋(ＥvdW)
式中、Ｎは特定の項の相互作用を特徴付ける数であり、１つの実施形態では、ΔＧo、ΔＧhb、ΔＧionic、ΔＧlipoおよびΔＧrotは、それぞれ5.4、−4.7、−4.7、−0.17および1.4の値を与えられる定数である。
【００８３】
Ｎhbは方程式２：
Ｎhb＝Σh-bondsｆ(ΔＲ，Δα)×ｆ(Ｎneighb)×ｆpcs
によって計算される。
【００８４】
ｆ(ΔＲ，Δα)は、理想状態からの水素結合の大きな偏差を説明し、方程式３によって計算されるペナルティ関数である：
ｆ(ΔＲ，Δ−α)＝ｆ１(ΔＲ)×ｆ２(Δα)
ここで、ｆ１(ΔＲ)＝１(ΔＲ＜＝ＴＯＬの場合)、
または      ＝１−(ΔＲ−ＴＯＬ)／0.4（ΔＲ＜＝0.4＋ＴＯＬの場合）、
または      ＝０(ΔＲ＞0.4＋ＴＯＬの場合)。
さらに、ｆ２(Δα)＝１(Δα＜30°の場合)
または    ＝１−(Δα−30)／50(Δα＜＝80°の場合)
または    ＝０(Δα＞80°の場合)。
【００８５】
ＴＯＬは水素結合長さ(＝0.25Å)で許容される偏差、
ΔＲはＨ−Ｏ／Ｎ水素結合長さの理想的な値(＝1.9Å)からの偏差、
Δαは水素結合角度∠N/O-H,O/Nの理想的な値(＝180°)からの偏差、
ｆ（Ｎneighb）は、タンパク質表面の凹面と凸面の部分を識別し、したがってタンパク質表面で見られるものではなくポケットで見られる極性相互作用に大きな重みを割り当てる。この関数は下記方程式４：
ｆ(Ｎneighb)＝(Ｎneighb／Ｎneighb,0)α(ここで、α＝0.5)
によって計算される。
【００８６】
Ｎneighbは任意の所与のタンパク質原子に５Åより接近している非水素タンパク質原子の数であり、
Ｎneighb,0＝定数25である。
【００８７】
ｆpcsは１つの水素結合当たり極性接触表面積を考慮に入れた関数であり、したがって強い水素結合と弱い水素結合を区別し、その値は次の基準によって決定される：
ｆpcs＝β(Ａpolar／ＮHB＜10Å2の場合)、
またはｆpcs＝１(Ａpolar／ＮHB＞10Å2の場合)
Ａpolarはタンパク質リガンド接触表面の大きさであり、
ＮHBは水素結合の数であり、
βは定数＝1.2である。
【００８８】
修正されたベームスコアリング関数の実行のためには、イオン相互作用からの寄与、ΔＧionicを上記水素結合からの寄与と同様の方法で計算する(同じ幾何学依存性が仮定されるため）。
【００８９】
Ｎlipo項は方程式５によって計算される：
Ｎlipo＝ΣILｆ(ｒIL[t1])
ｆ(ｒIL)はすべての脂肪親和性リガンド原子について、１また、すべての脂肪親和性タンパク質原子についてＬであり、以下の基準により計算される：
ｆ(ｒIL)＝１(ｒIL＜＝Ｒ１ｆ(ｒIL)＝(ｒIL−Ｒ１)／(Ｒ２−Ｒ１)でＲ２＜ｒIL＞Ｒ１の場合、
ｆ(ｒIL)＝０(ｒIL＞＝Ｒ２の場合)。
【００９０】
ここで、Ｒ１はｒ１vdw＋ｒLvdw＋0.5および
Ｒ２＝Ｒ１＋3.0であり、
ｒ１vdwは、原子１のファンデアワールスの半径であり、
ｒLvdwは、原子Ｌのファンデアワールスの半径である。
【００９１】
Ｎrotはアミノ酸側鎖の回転可能な結合の数であり、非環式のsp3−sp3結合およびsp3−sp2結合の数である。末端ＣＨ3またはＮＨ3の回転は考慮に入れない。
【００９２】
最後の項Ｅvdwは方程式６によって計算される：
Ｅvdw＝ε1ε2((ｒ1vdw＋ｒ2vdw)12／ｒ12−(ｒ1vdw＋ｒ2vdw)6／ｒ6）。
【００９３】
ここでε1とε2は原子同一性に依存する定数であり、
ｒ1vdw＋ｒ2vdwはファンデアワールスの原子半径であり、
ｒは１対の原子間の距離である。
【００９４】
方程式６に関して、１つの実施形態では、定数ε1とε2はそれぞれ原子ごとに以下の値を与えられる：Ｃ：0.245、Ｎ：0.283、Ｏ：0.316、Ｓ：0.316(つまり、炭素、窒素、酸素および硫黄のそれぞれの原子について)。方程式５および６については、ファンデアワールスの半径はそれぞれ原子ごとに以下の値を与えられる：Ｃ：1.85、Ｎ：1.75、Ｏ：1.60、Ｓ：2.00Å。
【００９５】
タンパク質リガンド相互作用についての現時点での理解の制約内ではあるが、上記の方程式に現われるすべての所定の値および定数がすべて決定されることは理解されるべきである（特に本願で試みられている計算のタイプについて）。したがって、このスコアリング関数がさらに精緻化された場合には、これらの値および定数を変更することが可能で、したがって、リガンドへのタンパク質の結合エネルギーを評価する項において所望の結果を与える適当な数値を使用してもよく、したがって、本発明の範囲内である。
【００９６】
上記のように、スコアリング関数は、側鎖コンホメーション、原子同一性および原子間の距離のデータベースから抽出されたデータに適用される。本発明を説明する目的のために言えば、このデータベースに含まれるＭＨＣクラスＩＩ分子の数は４２個のモデルと４つの解決された構造である。本発明の計算方法の構築はモジュール化された性質を有するため、新しいモデルを加えペプチド骨格ライブラリーと側鎖コンホメーション関数を用いて走査するだけで、上記のペプチドスコアリング関数によって処理できる追加のデータセットを作成できることは上記の説明から明らかである。これにより、走査されたＭＨＣクラスＩＩ分子のレパートリーを容易に増加させることが可能になり、あるいは、データが入手できる場合には構造および関連データを置き換えて、既存の対立遺伝子のより正確なモデルを作製することができる。
【００９７】
本発明の予想方法は、様々なＭＨＣクラスＩＩ分子に対する有する親和性が実験的に測定された多数のペプチドを含むデータセットにより較正できる。計算値を実験値と比較することによって、すべての実験的に測定したＴ細胞エピトープが正確に予想されることがわかれば有益性の一端を決定できる。
【００９８】
利用可能ないくつかの精巧な方法論と比較して、上記のスコアリング関数は比較的単純であるが、計算が非常に急速に実行される、ということが理解されるべきである。また、目的が、選択されたＭＨＣクラスＩＩタンパク質の結合溝に収容される各ペプチドについて真の結合エネルギーそれ自身計算するものではないことも理解されるべきである。根本的な目的は、選択されたタンパク質の１次構造(すなわち、アミノ酸配列)に基づいてＴ細胞エピトープの位置を予想する助けとして相対的な結合エネルギーデータを得ることである。比較的高い結合エネルギー、すなわち選択された閾値以上の結合エネルギーは、リガンド中のＴ細胞エピトープの存在を示唆するだろう。次いで、リガンドに少なくとも１回のアミノ酸置換を施し、結合エネルギーを再計算すればよい。計算が迅速性を有するため、ペプチド配列のこれらの操作はコストに見合う利用可能なコンピューターハードウェアにおいてプログラムのユーザインターフェース内で対話形式に実行できる。したがって、コンピューターハードウェアへの大きな投資は要求されない。
【００９９】
同じ目的のために他の利用可能なソフトウェアを使用できるかもしれないことは当業者には明白であろう。特に、タンパク質結合サイト内にリガンドをドッキングさせ得るより精巧なソフトウェアを、エネルギー最小化と共に使用してもよい。ドッキングソフトウェアの例は次の通りである: DOCK (Kuntz et al.、 J. Mol. Biol.、 161: 269-288 (1982))、LUDI (Boehm, H. J.、 J. Comput Aided Mol. Des.、 8: 623-632 (1994))およびFLEXX (Rarey M.、 et al.、 ISMB、3: 300-308 (1995))。分子モデリングおよび操作ソフトウェアの例としては: AMBER (Tripos)およびCHARm (Molecular Simulations Inc.)。これらの計算方法の使用は、必要な計算を行うために要求される処理時間の長さにより本発明方法の処理能力を厳しく制限するだろう。しかし、本発明の方法によって「陽性なバインダー」であると判明したペプチドについて結合エネルギーのより正確な計算結果を得るために「第２のスクリーン」として、このような方法を使用し得るというのもあり得ることである。
【０１００】
洗練された分子の機械的または分子の動的な計算のための処理時間の制限は、これらの計算を行うソフトウェアの設計およびコンピューターハードウェアの現在の技術制限の両者によって決まる。将来的には、より効率的なコードが書かれ、さらにコンピュータープロセッサー速度の持続的な増加によって、より扱いやすい時間枠内でそのような計算を行うことが実現可能になるかもしれない。巨大分子に適用されるエネルギー関数および折り畳まれたタンパク質構造内で起こる様々な相互作用についての考慮に関するさらに詳しい情報は以下に見られる: Brooks, B.R., et al.、 J. Comput. Chem.、 4: 187-217 (1983)。一般的なタンパク質−リガンド相互作用に関するさらに詳細な情報は以下に見られる：Dauber-Osguthorpe et al.、 proteins 4(1): 31-47(1988)。その内容の全体は言及によって本願に組み入れられる。有用な背景的事項は、例えば以下に見られる: Fasman, G.D.、 ed.、Prediction of Protein Structure and the Principles of Protein Conformation、Plenum Press、New York、ISBN：0−306 4313−9。
【０１０１】
（実施例２）
合成ペプチドを用いた未処置T細胞アッセイの方法
ＭＨＣ、ペプチドおよびＴ細胞レセプター(ＴＣＲ)の間の相互作用は、Ｔ細胞認識の抗原特異性に構造的基礎を与える。Ｔ細胞増殖分析により、ペプチドのＭＨＣへの結合およびＭＨＣ／ペプチド複合体のＴＣＲによる認識を試験する。この実施例のインビトロでのＴ細胞増殖分析は、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)の刺激と関係しており、抗原提示細胞(ＡＰＣ)およびＴ細胞を含んでいる。刺激はインビトロで、合成ペプチド抗原、実験によってはタンパク質抗原全体を使用して行った。刺激されたＴ細胞増殖を、3Ｈ−チミジン(3Ｈ−Ｔｈｙ)を用いて測定し、組み込んだ3Ｈ−Ｔｈｙの存在を、洗浄した固定細胞のシンチレーションカウントを使用して評価した。
【０１０２】
保存時間12時間未満のヒト血液からの軟膜層(buffy coat)を、National Blood Service (Addenbrooks病院、Cambridge、英国)から得た。フィコールパック(Ficoll−paque)はAmersham Pharmacia Biotech(Amersham、英国)から得た。主要ヒトリンパ細胞の培養用の、血清を含まず、Ｌ−グルタミン、50μｇ／mlストレプトマイシン、10μｇ／mlゲントマイシン(gentomycin)および0.1％ヒト血清アルブミンを含むＡＩＭ Ｖ培地は、Gibco-BRL(Paisley、英国)から得た。合成ペプチドは、Pepscan (オランダ)およびBabraham Technix (Cambridge、英国)から得た。
【０１０３】
軟膜層の温和な遠心分離により赤血球と白血球とを血漿と血小板とから分離する。最上相(血漿と血小板を含む)を除去、廃棄する。赤血球と白血球を１：１リン酸塩バッファー食塩水(PBS)で希釈し15mlフィコールパック(Amersham Pharmacia (Amersham、英国))上で層状にする。遠心分離はメーカー推奨条件によって行い、ＰＢＭＣを血清＋PBS／フィコールパック界面から収集する。ＰＢＭＣをPBSと混合(1：1)し、遠心分離によって回収する。上清を除去、廃棄し、50ml PBS中にＰＢＭＣペレットを再懸濁させる。細胞を遠心分離によって再びペレット化し、PBSの上清を捨てる。細胞を50ml ＡＩＭ Ｖ培地を使用して再懸濁し、この時点で計数しトリパンブルー(trypan blue)染料排除法を使用して生存度(viability)を評価する。細胞を遠心分離によって再び集め上清を廃棄する。細胞は、１ml当たり３×107の密度で低温貯蔵用に再懸濁する。貯蔵培地は加熱不活性化したＡＢヒト血清(Sigma、Poole、英国)90％(v/v)とDMSO(Sigma、Poole、英国)10％(v/v)とする。細胞は、長期間保存のために液体窒素に移す前に、制御された冷凍容器(Sigma)に移し、−70℃で終夜置く。使用のために必要になった時、細胞を水浴中37℃で急速解凍し、予め温めたＡＩＭ Ｖ培地10mlに移す。
【０１０４】
96ウェル水平底プレート中、ＰＢＭＣを２×105 ＰＢＭＣ／ウェルの密度で、タンパク質とペプチド抗原で刺激する。ＰＢＭＣを37℃で７日間インキュベートし、3Ｈ−Thy (Amersham-Pharmacia、Amersham、英国)でパルス処理する。この研究のために、３アミノ酸増分によって重複した合成ペプチド(15mer)を生成し、これはｈGHもしくは表1に記載のペプチドの全てまたはそのいずれかの全配列にわたるものである。あるいは、表２または表３に記載の置換を含むペプチドが精製され、用いることができる。
【０１０５】
各ペプチドは、20の未処置ドナーから分離されたＰＢＭＣに対して３重で個別にスクリーニングする。事前に免疫原性であると示された２種の対照ペプチド、および強力な非リコール(non−recall)抗原ＫＬＨを、各ドナー分析で使用する。
【０１０６】
対照抗原は以下の通りであった：
【０１０７】
【表９】
2005501546.tif 000011
【０１０８】
ペプチドをDMSOに溶解した(最終濃度10mM)、これらのストック溶液は次いで、ＡＩＭ Ｖ培地で１／500に希釈する(最終濃度20μＭ)。ペプチドを、100μｌ中の最終濃度が２μＭおよび20μＭとなるように、水平底96ウェルプレートに加えた。解凍したＰＢＭＣの生存度(viability)をトリパンブルー染料排除法を使用して評価し、次いで細胞を２×106細胞／mlの密度に再懸濁し、100μｌ(２×105ＰＢＭＣ／ウェル)をペプチドを含む各ウェルに移した。三重ウェル 培養を各ペプチド濃度で分析する。プレートを湿潤大気中37℃ ５％ＣＯ2で７日間インキュベートする。細胞を18〜21時間、１μＣｉの3Ｈ−Thy／ウェルでパルス処理し、フィルタマット上に収集する。Wallac マイクロプレートベータトッププレートカウンター(Perkin Elmer)もしくは同様の物を使用してＣＰＭ値を測定した。結果は刺激指数として表し、以下の式を用いて決定する：
ペプチドＣＰＭを試験する増殖／非処理ウェルＣＰＭ中での増殖
この種の未処置T細胞アッセイにおいて、2.0より大きい刺激指数を陽性刺激としている。同じ試験ペプチドがドナーサンプルよりも大きい、2.0より大きな刺激指数である場合、これは免疫優性の(immunodominant)エピトープの証明として考えられる。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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