(57)【要約】  本発明は、ヘリコバクターピロリ感染の新規診断方法に関する。更に詳しくは、本発明は、バイオセンサーを基本とした測定での生物試料におけるヘリコバクターピロリ抗原または該細菌によって産生された代謝産物の存在または不存在を検出するための新規な非侵襲的方法に関する。本発明は、また、非特異的結合を防止する生体分子忌避ポリマーと共に固定化された、ヘリコバクターピロリに対する特異抗体またはその抗原結合断片を含むバイオセンサーの使用に関する。また、本発明は本方法に有用な試験キットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘリコバクターピロリに感染した患者または感染の疑いがある患者から得られた生物試料を、生体分子忌避分子と共にヘリコバクターピロリに対する抗体または抗原結合断片を付着させた担体基材を含むバイオセンサーと接触させ、そして抗体抗原複合体の形成に起因する信号を検出することを特徴とする、生物試料中のヘリコバクターピロリ抗原または該細菌によって産生された代謝物の存在または不存在を検出するための非侵襲的方法。
【請求項２】
該生体分子忌避分子が、中性親水性モノマー類またはポリマー類であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
該生体分子忌避分子が、ポリアクリルアミド、ポリ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、ポリビニルアルコール、エチレンビニルアルコール共重合体、ポリ（メタクリル酸ヒドロキシエチル）、ポリ（エチレンオキシド）およびポリ(エチレングリコール）、およびポリエチレンフタレート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリウレタンおよび類似の生体適合性ポリマー類から選択されることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
該生体分子忌避分子が、ポリアクリルアミドとポリ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドから選択されることを特徴とする請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
該生体分子忌避分子が、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アクリルアミド分子であることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項６】
該ヘリコバクターピロリ抗原が担体基材の固体表面に直接付着していることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
該生体分子忌避分子が担体基材の固体表面に直接付着していることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
該担体基材の表面の固体表面が表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）適合性材料の膜であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
該担体基材の表面の固体表面が金、銀、銅、アルミニウム、パラジウムまたはその他の好適な金属のフィルムであることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
該担体基材の表面の固体表面が金のフィルムであることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
該検出が表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法によって行われることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
生物試料中のヘリコバクターピロリ抗原または該細菌によって産生された代謝物の存在または不存在を検出するためのバイオセンサーの使用であって、ヘリコバクターピロリに対する特異的抗体またはその抗原結合断片が、固定化抗体またはその抗原結合断片の間の表面を覆っている生体分子忌避分子と共に直接付着している担体基材を含むバイオセンサーの使用。
【請求項１３】
生物試料中のヘリコバクターピロリ抗原または該細菌によって産生された代謝物の存在または不存在を検出するための試験キットであって、該試験キットが、ヘリコバクターピロリに対する特異的抗体またはその抗原結合断片が、固定化抗体または抗体断片の間の表面を覆っている生体分子忌避分子と共に直接付着している担体基材、検定および品質管理に必要な試薬、ならびに洗浄液および希釈緩衝液のような補助試薬を含むバイオセンサーであることを特徴とする試験キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘリコバクターピロリ感染の新規診断方法に関する。更に詳しくは、本発明は、バイオセンサーを基本とした測定での生物試料におけるヘリコバクターピロリ抗原または該細菌によって産生された代謝産物の存在または不存在を検出するための新規な非侵襲的方法に関する。本発明は、また、非特異的結合を防止する生体分子忌避ポリマーと共に固定化されたヘリコバクターピロリに対する特異抗体またはその抗原結合断片を含むバイオセンサーの使用に関する。また、本発明は本方法に有用な試験キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘリコバクターピロリは、ヒトの上部胃腸管に見出された湾曲したグラム陰性細菌である。この細菌が１９８２年に最初に単離されて以来、消化不良（胸やけ、膨満感および吐き気）、慢性表層性胃炎または慢性活動型胃炎として発現する胃粘膜の症候性または無症候性炎症、胃および十二指腸の消化性潰瘍、ならびに胃癌および種々の胃リンパ腫でさえも包む種々の胃障害にヘリコバクターピロリが関与しているという大量の証拠が蓄積されている（Ｄｕｎｎ，Ｂ．Ｅ．ら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １０（１９９７）７２０−７４０）。以前には突発性と考えられていた消化性潰瘍のほとんど全ての症例が、現在は実際ヘリコバクターピロリ感染に起因していると信じられている（ＮＩＨ  Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，ＪＡＭＡ  ２７６（１９９４）１７１０）。
【０００３】
ヘリコバクターピロリは世界的なヒト病原菌である。この細菌を保菌している別の知られている種は非ヒト霊長類である。ヘリコバクターピロリ感染は社会経済の発展に関連している。例えば、発展途上国においては、人口の７０％から９０％がこの細菌を保菌しているが、これに対して先進諸国では、この感染率はおよそ２５％から５０％である。この感染は小児期、通常１０才以前に起こり、発病率は衛生状態の改善と共に減少すると信じられている。しかしながら、糞−口経路および口−口の経路が最も重要であると考えられているものの、感染の伝達経路は明確には知られていない（Ｄｕｎｎ，Ｂ．Ｅ．ら、上記）。
【０００４】
ヘリコバクターピロリ感染の診断には侵襲的および非侵襲的な種々の方法および測定が利用されている。侵襲的方法としては、胃または十二指腸の生検がある。生検試料を、検鏡または組織学的な試験、細菌の培養、ヘリコバクターピロリによって産生されるウレアーゼ酵素についての試験、あるいは遺伝子工学による解析によって調べることができる。これらのほとんどの方法について市販の製品が利用できる。非侵襲的方法としては、ヘリコバクターピロリに対する抗体の検出のための血清学的試験および１３Ｃまたは１４Ｃ標識尿素を用いた尿素呼気検査が挙げられ、これら両者に対しては複数の市販試験が利用できる。さらに、血清中（Ｍｏｕｌｔｏｎ−Ｂａｒｒｅｔ，Ｒ．Ｇ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  ８８（１９９３）３６９−３７４）および尿中（Ｐａｔｈａｋ，Ｃ．Ｍ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  ８９（１９９３）７３４−７３８）のヘリコバクターピロリの代謝物基質を測定する解析方法が記載されている。
【０００５】
イムノアッセイでは、患者の血清または血液試料（例えば、米国特許第５，２６２，１５６号；ピロリセットＥＩＡ−ＡおよびＥＩＡ−Ｇ、Ｏｒｉｏｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ，Ｆｉｎｌａｎｄを参照）、尿試料（例えば、米国特許第５，２６２，１５６号を参照）および唾液またはその他の粘液分泌検体（例えば、米国特許第６，０６８，９８５号；家庭でのヘリコバクター試験、Ａｎｔｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＯＹ、フィンランド）におけるヘリコバクターピロリに対するＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＭ抗体の存在が測定される。ヘリコバクターピロリに対する抗体の測定は、抗体を補足するのに使われる抗原調製物の強い依存性や、関連した細菌種からの抗体の交差反応および信頼できる試験結果を得るには比較的長時間が必要なことなど、いくつかの欠点を有している。医師の診察室で使用するために提供さる、いわゆる「診察室での」または「患者の近くで」の試験の精度は、通常の臨床検査のそれよりも劣る［Ｃｏｈｅｎ，Ｈ．ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １１０（１９９６）Ａ８３；Ｓａｄｏｗｓｋｉ，Ｄ．ら，Ｇａｓｔｏｒｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １１０（１９９６）Ａ２４６］。重要なことは、ヘリコバクターピロリに対する特異抗体の検出に頼っているこれらアッセイは、上昇している抗体レベルが感染の治療と治癒後長期間保持されるので、治療および治癒の評価および追跡に使用するにはあまり適さないことである。追跡研究では、治療後の抗体レベルの減退に大きなバラツキがあることが示されている［Ｋｏｓｕｎｅｎ，Ｔ．Ｕ．ら、Ｌａｎｃｅｔ  ３３９（１９９２）８９３−８９５；Ｃｕｌｔｅｒ，Ａ．ら，Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．３８（１９９３）２２６２−２２６６］が通常は、高い信頼性で治癒が予測される減退には数ヶ月を要する。
【０００６】
生物試料中でのヘリコバクターピロリに対する特異抗体の代わりにヘリコバクターピロリ抗原または代謝産物を検出することで、この欠点がカバーできる。米国特許第５，７１６，７９１号、第５，８７１，９４２号および第５，９３２，４３０号は、とりわけ、ポリクローナル抗体と抗原を複合体化し、形成された複合体を第２抗体によって検出することによって、糞試料中のヘリコバクターピロリ抗原を検出する方法を開示している。国際出願ＷＯ０１／４４８１５は、例えば、ＥＬＩＳＡ法によって血液試料中のヘリコバクターピロリ抗原を検出することを開示している。ヘリコバクターピロリ感染の治療効果の追跡のためにこれらの方法が提示されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、通常のイムノアッセイは、放射能標識、酵素標識、蛍光標識またはケミルミネセンス標識のような標識分子に依存しており、いくつかのインキュベーション、洗浄および分離ステップが実際の検出前に必要とされるので、骨が折れ、時間のかかるものである。さらに、信頼できる実施のためには、熟練した人と高価な測定器機を必要とする。試料、特に糞試料にも問題がある。多くの患者は、追跡に必要ないくつかの糞試料の採取はもちろんのこと、一つの糞試料採集でさえ不快でそして衛生的でないと感じているため、順調な治療が困難となっている。職員も同様に、内在する感染のリスクゆえに、糞試料の取扱いや、そのようなアッセイのための試料の調製を好まないであろう。
【０００８】
ヘリコバクターピロリ感染の診断のため、さらに改良された診断方法が明らかに必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
従って、本発明の一つの目的は、生体試料中のヘリコバクターピロリ抗原および／または同細菌によって産生された代謝産物の非侵襲的検出および測定のための高感度で特異的な方法および手段を提供することである。
【００１０】
本発明のもう一つの目的は、ヘリコバクターピロリ感染と闘う薬物療法の効果の信頼できる追跡のための、および患者の治癒を確かめるための患者にとって不愉快さが少ない改良された方法および手段を提供することである。
【００１１】
本発明の更なる目的は、ヘリコバクターピロリ感染の検出のための改良された方法および手段であって、職員の技術的熟練度や日常的作業が臨床検査室ほどには進歩していない医師の診療所や保健所において使用するために信頼して応用できる方法を提供することである。
【００１２】
本発明の更なる目的は、ヘリコバクターピロリ感染の検出のための改良された方法および手段であって、病院または診療所で患者の訪問中にでも試験結果を得ることができ、それによって度重なる患者の来院を避けることができる、簡単で、迅速でリアルタイムの方法を提供することである。
【００１３】
（発明の概要）
高度に特異的で高感度のバイオセンサーの使用に基づく方法を採用することによって、生体試料中のヘリコバクターピロリの存在または不存在を非侵襲的に検出することと、そうすることで本発明の目的に合致することが可能であることが予期せずに見出された。本発明で有用なバイオセンサーは、ヘリコバクターピロリに対する特異的抗体または抗原結合断片が、固定化抗体間または抗体断片間の表面を被覆している生体分子忌避分子と共に結合した担体基材を含む。これら生体分子忌避分子は、検体および生体試料中に存在する不純物の（生体）分子との望ましくない非特異的結合を効果的に防止し、アッセイの感度を高度に増大させる。そのようなバイオセンサーの使用によって、どのような生物検体においてもヘリコバクターピロリ抗原および／または同細菌によって産生される代謝産物が高い信頼度で検出できる。
【００１４】
本発明は、ヘリコバクターピロリに感染した患者または感染の疑いがある患者から得られた生物試料を、生体分子忌避分子と共にヘリコバクターピロリに対する抗体または抗原結合断片を結合させた担体基材を含むバイオセンサーと接触させ、そして抗体抗原複合体の形成に起因する信号を検出することを含む、生物試料中のヘリコバクターピロリ抗原または該細菌によって産生された代謝物の存在または不存在を検出するための非侵襲的方法に関する。
【００１５】
本発明は、さらに、ヘリコバクターピロリに対する特異的抗体またはその抗原結合断片が、固定化抗体またはその抗原結合断片の間の表面を覆っている生体分子忌避分子と共に直接結合している担体基材を含むバイオセンサーの、ヘリコバクターピロリ感染の診断のための使用に関する。
【００１６】
本発明は、また、生物試料中のヘリコバクターピロリ抗原または該細菌によって産生された代謝物の存在または不存在を検出するための試験キットに関するものであり、該試験キットは、ヘリコバクターピロリに対する特異的抗体またはその抗原結合断片が、固定化抗体の間または抗原結合断片の間の表面を覆っている生体分子忌避分子と共に直接結合している担体基材を、検出に必要な試薬と共に含む。
【００１７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ヘリコバクターピロリ細菌に特異的な固定化抗体またはその抗原結合断片、ピロリ細菌の抗原および／またはその細菌によって産生された代謝産物およびヘリコバクターピロリ由来の抗原の間の免疫反応で形成された少量の抗体抗原複合体を検出および／または測定するのに充分敏感かつ特異的な方法および手段の開発に基づくものである。そのような方法および手段によって、ヘリコバクターピロリに感染した患者から非侵襲的に得られるいかなる生物試料においても、ヘリコバクターピロリ抗原および／または該細菌によって産生された代謝物が検出できる。
【００１８】
本明細書で使用される用語「ヘリコバクターピロリ抗原」および「ヘリコバクターピロリ由来の抗原」は、表面抗原あるいはヘリコバクターピロリ細菌の分解または代謝物から得られる抗原のことである。本明細書で使用される用語「抗原結合断片」および「抗体断片」は、ヘリコバクターピロリ抗原に特異的な抗体の（Ｆａｂ’）２またはＦａｂ’断片のことである。
【００１９】
本発明の方法に於いて有利な点は、特別な担体基材およびそのような担体基材を含むバイオセンサーに由来する。これら担体基材およびバイオセンサーは、本明細書に参考として載せてあるフィンランド特許出願第２００１１８７７号に一般的に開示されている。本発明において有用な担体基材は、ヘリコバクターピロリ細菌またはヘリコバクターピロリ抗原またはこれら抗体の抗原結合断片に対して高められた特異的抗体を含有しており、これら抗体は担体基材に付着している。さらに、これら担体基材は、生体試料中に存在する望ましくない汚染（生体）分子の非特異的結合を防止するため、抗体または抗体断片と同じ担体基材上に結合している生体分子忌避モノマー／ポリマー分子も含有している。
【００２０】
特に、本基材は、抗体または抗体断片中に存在する官能基を介して、担体基材の固体表面上に直接固定化された、ヘリコバクターピロリに対する抗体またはそれらの抗原結合断片を担持し、配向した抗原結合部位を形成する（図１）。抗体または抗体断片は、活性抗原結合部位を露出して、基材表面に親和性を有する官能基が表面に結合された状態で基材表面に自己集合する。
【００２１】
抗体または抗体断片中の遊離のスルフヒドリル基は官能基として作用し、金、銀、銅、アルミニウムおよびパラジウム表面のような金属表面に金属原子と硫黄原子の間の共有結合を介して化学吸着することができ、その結果、単分子層を形成する。抗体または抗体断片中に存在して、自己集合できるその他の部位としては、硫黄含有官能基を介して金属表面に自然に化学吸着する、チオール、ジスルフィドおよびスルフィド基が挙げられる。所望ならばそして望ましければ、抗体または抗体断片に、その構造部分を官能基に変換することによって、あるいは官能基を含有するリンカー分子を使用することによって、新しい官能基を導入することもできる。
【００２２】
代替法として、特異性および感受性の判断基準を満たしさえすれば、抗体の制御された固定化を達成する公知方法が使用可能である。そのような方法としては、とりわけ、プロテインＡまたはプロテインＧを介した選択的結合［例えば、Ｌｅｋｋａｌａ，Ｊ．とＳａｄｏｗｓｋｙ，Ｊ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５（１９９４）１９９−２１３を参照］、Ｆａｂ’断片のヒンジ領域の遊離スルフヒドリルを介した共有結合付着［例えば、Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｂ．ら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、９（１９９３）１３６−１４０］およびビオチン／（ストレプト）アビジン化学によって表面に結合したビオチン化抗体［Ｍｏｒｇａｎ，Ｈ．とＴａｙｌｏｒ，Ｄ．Ｍ．，Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．７（１９９２）４０５−４１０］が挙げられる。
【００２３】
また同様に、生体分子忌避分子は遊離のスルフヒドリルまたはその他の硫黄含有基を介して表面に自己集合し、そして、抗体又は抗体断片の間の固体表面を被覆する。ここで使用される用語「生体分子忌避分子」は、固定化抗体間の親水性層を形成する固体表面に結合し、その吸引力が、検体および汚染（生体）分子に関する反発力よりも小さい分子のことである。本発明のバイオセンサーにおいて有用なこの生体分子忌避分子としては、中性で親水性のモノマー類または、ポリアクリルアミド、ポリ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、ポリビニルアルコール、エチレン−ビニルアルコールコポリマー、ポリ（メタクリル酸ヒドロキシエチル）、ポリ（エチレンオキシド）およびポリ（エチレングリコール）のようなポリマー類が挙げられる。またその他のポリマー類、例えばポリエチレンフタレート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリウレタンおよび類似の生体適合性ポリマー類も使用できる。本発明における有用な好ましい生体分子忌避分子は、ポリアクリルアミドおよびポリ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドであり、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アクリルアミドが特に好ましい。
【００２４】
これら生体分子忌避分子は、好ましくは、ポリマーの一端に、スルフィド、ジスルフィドまたはチオールのような、好適な官能基（末端アンカー基）を介して固体表面に共有結合で付着している。これら生体分子忌避分子は、典型的には、分子の他の末端にＯＨ基を含有し、かくして親水性層を形成する。これら生体分子忌避分子層の厚さは、固体表面上の抗体層の厚さよりも幾分か薄いことが好ましい。
【００２５】
本発明において有用な担体基材の固体表面は、基材、固定化抗体または抗体断片および結合した検体の組合せと相互作用する基材に放出される信号の変化を誘導できるタイプのものであり、そして次いで検出された場合、この信号変化が基材上の物質量の増加（すなわち、基材の表面に固定化された生体分子に選択的に結合した検体分子の蓄積）を表すものである。
【００２６】
使用されるこの固体表面物質は、選択された分析方法に依存し、表面での増加量の検出に使用することができる、適切な厚さと適切な材料のフィルムである。それゆえ本固体表面はそれぞれ、表面プラズモン共鳴測定が分析に使用される場合には、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）適合性材料、例えば金、銀、銅、アルミニウム、パラジウム、またはその他の適切な金属、好ましくは金のフィルムであり得て、水晶結晶微量天秤（ＱＣＭ）技法が使用される場合には、金またはその他の金属、例えば上記金属の一つ、好ましくは金で被覆された電極であり得て、あるいは表面弾性波（ＳＡＷ）を基本にした技法または電気化学的方法が使用される場合には、表面弾性波（ＳＡＷ）装置内または電極上の適切な金属被覆であり得る。
【００２７】
必要ならば代替法として、固体表面に使用されるのと類似の被覆材料のコロイドまたはナノ粒子のような別の粒子を、検出信号を増幅するために反応混合物に含ませることができる（図２）。
【００２８】
本発明において有用な抗体および抗体断片は、ヘリコバクターピロリ抗原に結合し得るポリクロナールまたはモノクローナル抗体または抗体断片のいずれでもあり得る。また、検出の感度と特異性を確かめるために、異なったヘリコバクターピロリ株に対して高められた抗体または抗体断片の混合物も担体基材に付着させ得る。好ましくは単一特異性ポリクロナールまたはモノクローナル抗体、最も好ましくはモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片が使用される。正確な配向を確実にするために、抗体断片、すなわち（Ｆａｂ’）２およびＦａｂ’断片が好ましく、Ｆａｂ’断片が感度が高くなっているので最も好ましい。例示としては、フィンランドＫａｕｎｉａｉｎｅｎのＭｅｄｉｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社から市販されている、クローン７１０１および７１０２によって産生されるモノクローナル抗ヘリコバクターピロリ抗体またはその抗原結合断片がある。
【００２９】
好ましくは、ＩｇＧクラスに属する抗体または抗体断片が担体基材に付着される。しかしながら、適用できるならば、ＩｇＭまたはＩｇＡ免疫グロブリンクラスに属する抗体または抗体断片もまた使用できる。
【００３０】
担体基材の調製、ならびに必要な場合、抗体断片の調製に使用される抗体または抗体断片の量は、当業者の知識の範囲内のことである。同様に、担体基材の調製に使用される生体分子忌避分子の量は、当業者によって標準的手順を用いて求め得る。通常、抗体またはその抗原結合断片および生体分子忌避分子の両者は、担体基材の最適な性能を確実にするため過剰に使用される。この点に関して、以下で示される実施例１および参考までに本明細書に載せてあるフィンランド特許出願第２００１１８７７号も参照される。担体基材の調製において、抗体または抗体断片および生体分子忌避分子を、同時にまたは逐次的に付着させ得る。代替法として、生体分子忌避分子を、固定化抗体を既に含有している担体基材に付着させ得る。
【００３１】
抗体または抗体断片を含有する層は、ｐＨが１から２で０．１ＭのＨＣｌグリシン溶液、またはｐＨが２から７の０．１Ｍリン酸緩衝液のような適切な溶液を用いて再生できる。このことは、担体基材にさらなる利点を与える。すなわち、この基材が１０回まで再使用できるためユーザーに対してコストおよび利便性の両方における実質的な利点を提供する。
【００３２】
分析される生物試料は、液体または可溶性の生物試料のいずれでもよい。それゆえ、生物試料は、全血、血清、尿、唾液またはその他の粘液分泌物、涙液あるいは糞便のいずれであってもよい。また生検試料由来の試料も、必要ならば、本発明の方法で分析できる。この試料は、そのままでも、また通常の技術を用いた濃縮体としても分析できる。
【００３３】
本発明の担体基材における特異抗体または抗体断片の正確な配向、および生体分子忌避分子の使用によって、生物試料からヘリコバクターピロリ感染を単純、迅速かつ非侵襲的に検出できる。さらに、これらの特長によって、所望ならば、定性的測定に加えて、ヘリコバクターピロリ抗原の定量的または半定量的測定を実行するのに充分高い特異性および感度が得られる。このことは、ヘリコバクターピロリ感染の薬物療法の効力の追跡において特に有利であり、それによって、通常は非常に大変で長期にわたる治療実行計画を、もし選択した治療の効果がない場合に、初期の段階で変更することができる。抗体測定によるよりもより早期に全治を明らかにできる。また、新規感染または再発感染が容易に検出できる。また、ヘリコバクターピロリ抗原の定量的測定によって、感染の期間および重症度に関する情報が得られ、それが薬物投与の選択に役立ち得る。
【００３４】
本発明の方法においては、ヘリコバクターピロリに感染している、または、感染している疑いがある患者から得られた生物試料を、上に詳述したように、バイオセンサーの担体基材と接触させ、抗体・抗原複合体の形成の結果から得られる信号を検出する。本発明の担体基材およびバイオセンサーは、バイオセンサーを基礎とした測定に採用されるいかなる標準的検査法にも応用できる。しかしながら、本発明の方法に特に適している検出方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、水晶振動子微量天秤法（ＱＸＭ）のような厚み剪断モード共鳴振動法、表面弾性波（ＳＡＷデバイス）および電気化学的測定である。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）が特に好ましい。
【００３５】
本発明の試験キットは、本発明の方法を実施するための試薬を含む。特に、本試験キットは、ヘリコバクターピロリに対する特異的抗体またはその抗原結合断片が、固定化抗体または抗体断片の間の表面を覆っている生体分子忌避分子と共に担体基材上に直接結合している担体基材、ならびに標準品、対照品、洗浄液および希釈溶液のような、測定に必要な試薬を含むバイオセンサーを含む。
【００３６】
本発明を、以下の非限定的実施例を用いて説明する。
【実施例１】
【００３７】
本発明の担体基材の調製のための一般的操作手順
担体基材の調製のために、以下のようにして、特異的モノクローナル抗ヘリコバクターピロリ抗体からＦａｂ’断片を先ず調製した。先ず、Ｆ（ａｂ’）２断片を、モノクローナル抗ヘリコバクターピロリ抗体クローン７１０１および７１０２（Ｍｅｄｉｘ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａ社，Ｋａｕｎｉａｉｎｅｎ、フィンランド）のようなモノクローナル抗ヘリコバクターピロリ抗体から、ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅＦ（ａｂ’）２調製キット（ＰＩＥＲＣＥ、米国）を用いて調製した。他の公知の市販キットおよび方法も同じく使用できる。次いで、Ｆ（ａｂ’）２断片を、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５ｍＭのＥＤＴＡを含有するｐＨ６．０のＨＥＰＥＳ／ＥＤＴＡ緩衝液中のジチオトレイトール（ＤＴＴ、Ｍｅｒｃｋ）を用いて、石川［Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｅ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，４（１９８３）２０９−３２０］によって記載されたようにミクロ透析チューブ中で、典型的には一晩かけてＦａｂ’断片に分解した。簡単にいえば、濃度０．２から０．５ｍｇ／ｍｌのＦ（ａｂ’）２断片をミクロ透析チューブ中でＨＥＰＥＳ／ＥＤＴＡ緩衝液および６．２５ｍＭのＤＴＴ溶液と混合した。この透析チューブを、アルゴンでパージしたＨＥＰＥＳ／ＥＤＴＡ緩衝液２５０ｍｌ中に液浸し、アルゴン気流下、室温で一晩透析した。Ｆａｂ’断片をアルゴン気流下に保持し、直ちに付着に使用した。
【００３８】
固体表面を以下のようにして調製した。金の接着を強化させるために先ず、ガラススライドをチタンの薄膜、次いで、金の薄膜で真空蒸着によって被覆した。使用直前に、スライドをＨ２Ｏ２：ＮＨ４ＯＨ：Ｈ２Ｏ（１：１：５）の熱溶液中で洗浄し、次いで水でゆすいだ。スライドを、指数一致油（ｉｎｄｅｘ  ｍａｔｃｈｉｎｇ  ｏｉｌ）を介して、表面プラズモン共鳴装置（ＳＰＲＤＥＶＩ，ＶＴＴ，Ｔａｍｐｅｒｅ，Ｆｉｎｌａｎｄ）上のＳＰＲプリズムに付着させ、フローセルをプリズム上に組立て、高純水（１８．２ＭΩｃｍ；Ｍｉｌｌｉ−Ｑ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ、米国）で調製した１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌを含有するｐＨ６の緩衝液溶液で、このフローセルを完全にゆすいだ。
【００３９】
ｐＨが６で１０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＥＤＴＡ緩衝液中、７０μｇ／ｍｌの濃度のＦａｂ’断片（８５０μｌ）をフローセルに加えた。このＦａｂ’断片を、典型的には５分間、金被覆表面と相互作用させ、次いで、表面をＨＥＰＥＳ／ＥＤＴＡ緩衝液で５分間ゆすいだ。次に緩衝液を、ｐＨ７．２の０．１Ｍリン酸緩衝液生理食塩水（ＰＢＳ）に変更し、ＰＢＳ緩衝液中０．１５ｍｇ／ｍｌの濃度で１から１．５ｍｌのＮ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アクリルアミド溶液を、表面と５分間相互作用させた。次いで、表面をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックした。
【実施例２】
【００４０】
ＳＰＲを用いるヘリコバクターピロリ抗原の測定の一般的操作手順
以下の一般的なＳＰＲ操作手順を用いて、ヘリコバクターピロリ抗原を生物試料中で測定できる。実施例１で記載されたようにして調製された担体基材の表面をｐＨ７．２のＰＢＳでゆすいだ。陰性試料（ブランク）を先ず試験した。使用する陰性試料は、測定される生物試料によって決まる。従って例えば、糞試料を測定する場合の陰性試料は、ヘリコバクターピロリが陰性の糞試料であり、尿試料を測定する場合の陰性試料は、ヘリコバクターピロリ感染のない被験者から得られた尿試料であり、血清試料を測定する場合の陰性試料は、ヘリコバクターピロリ感染のない被験者から得られた血清試料である。次いで、測定装置のフローセルをそれぞれの測定される溶液で１０分間満たすことによって、担体基材の表面を標準溶液、陽性および陰性対照、および試料と逐次的に接触させ、そしてＳＰＲ信号を記録する。フローセルは、測定と測定の間で、ｐＨ７．２のＰＢＳで５分間ゆすぐ。
【実施例３】
【００４１】
標準曲線の作成および測定の再現性
標準として使用されたヘリコバクターピロリ抗原を、ＲａｕｔｅｌｉｎとＫｏｓｕｎｅｎ［Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５（１０）（１９８７）１９４４−１９５１］によって記載されたグリシン−酸抽出方法を用いて、ヘリコバクターピロリＡＴＣＣ４９５０３の細菌集団から抽出した。タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ［Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２（１９７６）２４８］を用いて測定した。標準品を、ｐＨ７．２で０．１ＭのＰＢＳを用いて、０．００１、０．０１、０．１、１、１０、１００および２７０μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、実施例２に記載された一般的方法に従って試験した。再現性を解析するために、三つの別々の実験を連続した日に行った。
【００４２】
結果を図３Ａに示す。図３Ａに示した標準曲線は、応答が片対数目盛で抗原濃度と直接比較できることを示している。表１は、連続した日での標準曲線の三つの別々の測定からの標準偏差を示す（図３Ｂ）。優れた再現性が得られている。
【００４３】
【表１】
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【実施例４】
【００４４】
尿および糞試料中のヘリコバクターピロリ抗原の検出
ヘリコバクターピロリに感染した患者（感染は生検により実証した）および非感染患者から得られた尿および糞試料を、実施例２に記載された一般的方法に従ってＳＰＲを用いて分析した。患者のヘリコバクターピロリ感染を、市販の迅速ウレアーゼ試験で生検試料から診断し、病理学者の評価によって確認した。
【００４５】
糞試料を、以下のようにして調製した。糞０．１ｇをｐＨ７．２の０．１Ｍリン酸緩衝液生理食塩水５００μｌに懸濁させ、１５秒間、渦撹拌した。この懸濁液を５０００ｒｐｍで５分間、遠心分離して上澄を測定に用いた。尿試料は、そのまま分析した。
【００４６】
測定した糞試料の二つＢＳＦ３７およびＢＳＦ４８は、生検によって実証されたヘリコバクターピロリ感染患者からのものであった。第三の試料ＢＳＦ５１は、ヘリコバクターピロリが陰性の患者から得られたものであった。これらの測定を、二つの別々のフィルムで実施した。結果を図４に示す。層への非特異的結合は、０．００１３±０．０００６ｍＶ（ｎ＝３、二つの異なった層を比較した）であった。患者試料ＢＳＦ４８の応答は０．０１３６±０．０００４ｍＶであり、患者試料ＢＳＵ３７のそれは０．０１１３ｍＶであり、つまり、バックグラウンドのそれに対して、それぞれ１０倍ないし８倍であった。陰性患者試料ＢＳＦ５１は強度０．０００９６ｍＶを示した。結果は、本発明の方法が、糞試料中に存在するヘリコバクターピロリ抗原を特異的に検出することを明確に示している。
【００４７】
測定した尿試料の二つ、試料１および３は、生検によって実証されたヘリコバクターピロリ感染患者からのものであった。第三の試料、試料２は、ヘリコバクターピロリが陰性の患者からのものであった。結果を図５に示す。層への非特異的結合は、０．０１８５±０．００５０ｍＶであった。患者試料１の応答は、０．１１７ｍＶであり、患者試料３のそれは０．０４４ｍＶであり、すなわちバックグラウンドのそれに対して、それぞれ、６．３倍および２．４倍であった。陰性患者試料２は、強度０．００８ｍＶを示した。結果は、本発明の方法が、尿試料中に存在するヘリコバクターピロリ抗原を特異的に検出することを明確に示している。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】付着した生体分子忌避分子と共に、ヘリコバクターピロリに対する抗体のＦａｂ’断片を含有する、本発明の方法で使用される担体基材／バイオセンサーの模式的表示である。
【図２】検出／信号の増幅のためのコロイド／ナノ粒子を有する、本発明の方法で使用される担体基材／バイオセンサーの模式的表示である。
【図３】ＡおよびＢは、ＳＰＲ測定用の標準曲線および標準偏差を示す。
【図４】糞試料中のヘリコバクターピロリ検出のＳＰＲ結合等温曲線を示す。棒は別々のフィルムでの２回の測定を示す。ＢＳＦ３７およびＢＳＦ４８は、ヘリコバクターピロリ陽性患者から得られた試料であり、ＢＳＦ５１は、ヘリコバクターピロリ陰性患者から得られた試料である。“ｒｅｆ”はブランクを示す。
【図５】尿試料中のヘリコバクターピロリ検出のＳＰＲ結合等温曲線を示す。試料１および３は、ヘリコバクターピロリ陽性患者から得られた試料であり、試料２は、ヘリコバクターピロリ陰性患者から得られた試料である。“ｒｅｆ”はブランクを示し、ＢＳＵは患者尿試料を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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