(57)【要約】【解決手段】全血試料中の低分子量ヘパリンを測定するための方法、キット、システム及び試薬が提供される。これらにおいて、ラッセルクサリヘビ蛇毒等の第Ｘａ因子アクチベータが血液凝固アッセイ開始剤として使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
全血試料について低分子量ヘパリン濃度を測定するための方法であって、
（ｉ）アッセイの第一の要素である全血とアッセイの第二の要素とを組合わせて混合物を形成する段階であって、前記第二の要素は乾式血液凝固アッセイ試薬を含み、該試薬は、実質的に平坦な形状に配置されていると共に実質的に均一に全体に分散した磁性粒子を含み且つ第Ｘａ因子アクチベータを含み、前記混合物は、（ｉａ）振動磁界、（ｉｂ）動く永久磁界、（ｉｃ）振動磁界と静止永久磁界の組合せ、又は（ｉｄ）回転磁界に付され、これにより前記第一の要素と前記第二の要素の組合せと実質的に同時に、前記磁性粒子の移動及び血液凝固アッセイの測定が開始される段階と、
（ｉｉ）（ｉａ）、（ｉｂ）、（ｉｃ）又は（ｉｄ）により誘起された前記磁性粒子の移動をモニタして、前記血液凝固アッセイの測定値を得る段階とを含み、
前記血液凝固アッセイ測定値は、全血試料中の低分子量ヘパリン濃度と相関関係にある方法。
【請求項２】
前記全血試料がクエン酸添加全血試料である、請求項１の方法。
【請求項３】
前記磁性粒子は、振動磁界を適用することにより移動が誘起される、請求項１の方法。
【請求項４】
前記磁性粒子は、動く永久磁界を適用することにより移動が誘起される、請求項１の方法。
【請求項５】
請求項１の方法であって、前記方法は、前記方法を実施するためのエレメント内で実施され、前記方法は、前記第一の要素である全血を前記エレメントに添加する段階を含み、前記エレメントはチャンネル構造を含み、該構造は互いに流体連通関係にある試料ウェルと反応容積とを画定し、前記反応容積は前記第二の要素を含有し、前記チャンネル構造は、前記試料ウェル内に置かれた前記第一の要素である全血を毛細管作用により前記反応容積に送って該容積を満たす幾何形状を有し、前記反応容積が満たされた後、前記第一の要素である全血が該容積内に静止して保持される方法。
【請求項６】
前記エレメントが、外部の光源から前記反応容積に光を送るための手段を更に含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記反応容積から散乱した或いはそれに吸収された或いはそれから反射した光を検出するための手段を用いる段階を更に含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記エレメントは、永久磁石及び電磁石に対し、前記永久磁石と前記電磁石とが振動磁界と静止永久磁界の前記組合せを提供するように十分近接して配置されている、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記エレメントが、前記永久磁石と前記電磁石の間に位置している、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記磁性粒子が回転磁界の適用により移動が誘起される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記第Ｘａ因子アクチベータがラッセルクサリヘビ蛇毒（Russell's Viper Venom）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記低分子量ヘパリンがエノキサパリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
全血試料について低分子量ヘパリン濃度を測定するための方法であって、
（ｉ）全血試料をエレメントの試料ウェルに添加する段階であって、前記エレメントは、
チャンネル構造を有し、該チャンネル構造は、互いに流体連通関係にある試料ウェルと反応容積とを画定し、前記反応容積は上面により画定され、前記上面には反射層が取り付けられ、前記反射層は半透過性マトリックスを含み、前記反応容積は少なくとも一種の乾式血液凝固アッセイ試薬を測定された量含み、該試薬は、実質的に平坦な形状に配置されていると共に実質的に均一に全体に分散した磁性粒子を含み、特定量の前記試料は毛細管作用により前記反応容積に送られて前記半透過性層と共に前記試薬と接触し、これにより実質的に同時に血液凝固アッセイ測定が開始される段階と、
（ｉｉ）前記半透過性層の反射率を測定することにより前記血液凝固アッセイ測定を実施する段階とを含み、
前記乾式血液凝固アッセイ試薬が第Ｘａ因子アクチベータを含む方法。
【請求項１４】
全血試料について低分子量ヘパリン濃度を測定するためのキットであって、一以上の容器中に、永久磁石と、時間測定手段と、エレメントとを含み、前記エレメントは少なくとも一種の乾式血液凝固アッセイ試薬を含み、該試薬は、実質的に平坦な形状に配置されていると共に実質的に均一に全体に分散した磁性粒子を含み、前記少なくとも一種の乾式血液凝固アッセイ試薬は第Ｘａ因子アクチベータを含むキット。
【請求項１５】
トランスファーピペットを更に含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記トランスファーピペットは、本質的に非血栓形成性の材料で形成され、通気口付きの先端を有し、毛細管作用により液体試料で満たされることができ、前記通気口付き先端を覆った或いは密閉した後、圧力により前記液体試料を排出することができる、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
全血試料について低分子量ヘパリン濃度を測定するためのシステムであって、
（ｉ）温度制御手段と、振動磁界を生成するため或いは永久磁界を移動させるための手段と、照明手段と、測光モニタリング手段とを有する装置と、
（ｉｉ）前記測定を実施するためのエレメントであって、前記エレメントはチャンネル構造を有し、該チャンネル構造は、互いに流体連通関係にある試料ウェルと反応容積とを画定し、前記チャンネル構造は、前記試料ウェル内に置かれた液体試料を毛細管作用により前記反応容積に送って該容積を満たす幾何形状を有し、前記反応容積は少なくとも一種の乾式血液凝固アッセイ試薬を含み、該試薬は、実質的に平坦な形状に配置されていると共に実質的に均一に全体に分散した磁性粒子を含み、前記少なくとも一種の乾式血液凝固アッセイ試薬は第Ｘａ因子アクチベータを含むエレメントと
を含むシステム。
【請求項１８】
トランスファーピペットを更に含む、請求項１７に記載のシステム。
【請求項１９】
前記トランスファーピペットは、本質的に非血栓形成性の材料で形成され、通気口付きの先端を有し、毛細管作用により液体試料で満たされることができ、前記通気口付き先端を覆った或いは密閉した後、圧力により前記液体試料を排出することができる、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２０】
前記装置が更に加熱手段を含み、該加熱手段は、前記エレメントに近接して配置された抵抗性ヒータストリップとサーミスタとを含む、請求項１７に記載のシステム。
【請求項２１】
請求項１７に記載のシステムであって、前記エレメントは全血血液凝固アッセイを実施するのに適しており、前記チャンネル構造は、前記試料ウェル内に置かれた血液試料を毛細管作用により前記反応容積に送って該容積を満たす幾何形状を有し、前記反応容積が満たされた後、前記血液試料は該容積内に静止して保持され、前記エレメントは光学的若しくは磁気的にコード可能な情報手段又はその両方を更に含み、該情報手段は、較正、品質制御、テストパラメータ及び患者情報の内の少なくとも一種を提供できるシステム。
【請求項２２】
前記照明手段は、前記エレメントに光を照射する一以上の光源を含み、前記測光モニタリング手段は、前記反応容積に存在する呈色種又は呈色調節（chromomodulating）種を測光学的にモニタリングするための一以上の検出器を含む、請求項１７に記載のシステム。
【請求項２３】
全血試料における低分子量ヘパリン濃度を測定するためのシステムであって、
（ｉ）（１）液体試料を収容するための試料ウェルと、（２）実質的に平坦な形状に配置されていると共に磁性粒子が実質的に均一に全体に埋め込まれている乾式血液凝固アッセイ試薬を含む反応チャンバとを含む反応エレメント、を含み、
（ｉｉ）前記試料ウェル及び前記反応チャンバは輸送ゾーンを介して流体連通関係にあり、該ゾーンは、前記試料ウェル内に配置され前記反応チャンバの容積に対応する体積の液体試料が同時に前記試料ウェルから前記反応チャンバに輸送される幾何形状を有し、
（ｉｉｉ）前記反応チャンバを光学的にモニタリングするための手段を含み、
（ｉｖ）前記反応チャンバを振動磁界に付すための手段を含み、
（ｖ）これにより、前記試料が前記反応チャンバに導入されると、前記乾式血液凝固アッセイ試薬は溶解し、これにより前記磁性粒子は前記振動磁界により誘起される振動パターンで自在に移動し、これにより前記振動磁界に対する前記磁性粒子の移動の程度の変化に対応して、前記血液凝固アッセイの動力学の測定を提供し、
前記乾式血液凝固アッセイ試薬は第Ｘａ因子アクチベータを含む、
ことを特徴とするシステム。
【請求項２４】
前記液体試料の前記試料ウェルから前記反応チャンバへの輸送が開始される時点を制御するための手段を更に含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記試料ウェルと流体連通関係にある複数の反応チャンバと、全血試料又は血漿試料を前記複数の反応チャンバの内の一個から前記複数の反応チャンバの内の別の一個に輸送するための手段とを更に含む、請求項２３に記載のシステム。
【請求項２６】
全血試料における低分子量ヘパリン濃度を測定するための方法であって、
（ｉ）反応エレメントを振動磁界に付す段階であって、前記反応エレメントは、（１）全血試料を収容するための試料ウェルと、（２）乾式血液凝固アッセイ試薬を含む反応チャンバとを有し、該試薬は、実質的に平坦な形式に配置されていると共に磁性粒子が実質的に均一に全体に埋め込まれており、前記試料ウェル及び前記反応チャンバは輸送ゾーンを介して流体連通関係にあり、該ゾーンは、前記試料ウェル内に配置され前記反応チャンバの容積に対応する体積の液体試料が同時に前記試料ウェルから前記反応チャンバに輸送される幾何形状を有する段階と、
（ｉｉ）血液凝固しやすい全血試料を前記試料ウェルに添加し、これにより前記試料の少なくとも一部を前記反応チャンバに同時に導入し、前記試薬が溶解されると共に前記粒子は前記振動磁界により誘起される振動パターンで自在に移動する段階と、
（ｉｉｉ）光学的に前記反応チャンバをモニタリングして、前記磁界に対する前記磁性粒子の移動の程度の変化に対応した血液凝固アッセイのための動力学を測定する段階と
を含み、
前記乾式血液凝固アッセイ試薬は第Ｘａ因子アクチベータを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全血試料中の低分子量ヘパリン量を測定するためのドライ・ケミストリー・フォーマットアッセイ並びに該アッセイを実施するためのシステム及び試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）類は、未分画ヘパリン（ＵＦＨ）から多岐にわたる化学的あるいは酵素的プロセスにより産生される異種様々な抗血栓薬群である。ＵＦＨ等のＬＭＷＨは、アンチトロンビン（ＡＴ）と複合体を形成することにより抗凝固作用を示し、血液凝固酵素の幾つかを不活化してフィブリン形成を阻害する。この中で、第Ｘａ因子とトロンビン（ＩＩａ）は阻害に対し最も良好に応答する。ＬＭＷＨは、１９８０年代半ばに抗血栓薬として導入され、今日では外科的血栓予防のために選択される薬剤として確立されており、静脈血栓塞栓性不全の急性期治療においてはＵＦＨに替わって使用される頻度が高まっている。低分子量ヘパリンであるエノキサパリンは、不安定狭心症（ＵＡ）や非Ｑ波心筋梗塞（ＮＱＭＩ）の患者で経皮的冠動脈形成術（ＰＣＩ）（ロベノックス（エノキサパリンナトリウム）注入パッケージインサート（マルシーマーク）１９９８、０１／２００１改訂）へ移行している患者に使用される機会が増えている（Ｊ．ファリード（Fareed）ら「低分子量ヘパリン分化に関する過去、現在及び将来の考察：エピローグ（Past, present and future considerations on low molecular weight heparin differentiation: an epilogue）」Ｓｅｍｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈｅｍｏｓｔ，２５  Ｓｕｐｐｌ  ３：１４５−７（１９９９）、及びＪ．ハーシュ（Hirsh）ら「ヘパリン及び低分子量ヘパリン：作用機構：薬動力学、用量、モニタ、効能及び安全性（Heparin and low-molecular-weight heparin: mechanisms of action, pharmacokinetics, dosing, monitoring, efficacy, and safety）」Ｃｈｅｓｔ，Ｊａｎ；１１９（１  Ｓｕｐｐｌ）：６４Ｓ−９４Ｓ（２００１））。活性化部分的トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）や活性化凝固時間（ＡＣＴ）が最も一般にＵＦＨをモニタするのに用いられている方法であるが、これらのＬＭＷＨ（エノキサパリン等）に対する感受性は比較的低い。ＬＭＷＨ濃度をモニタするのに呈色抗Ｘａアッセイが広く使用されているが、このようなアッセイでは、薬の濃度を間接的に測定するに過ぎず、心臓カテーテル法による実験室的環境では結果が規定通りに得られない。
【０００３】
ＬＭＷＨの平均分子量は４０００〜６０００ダルトンであり、トロンビンを不活性化する能力はＵＦＨに比べて低い。各ＬＭＷＨは特定の混合物であり、独特の抗Ｘａ／抗ＩＩａ比及び特徴的な抗凝固プロファイルをしばしば示す。即ち、ＵＦＨ(Lovenox P.I.)は抗Ｘａ／抗ＩＩａ比が１：１であるのに対し、ＬＭＷＨの抗Ｘａ／抗ＩＩａ比は（ＬＭＷＨの銘柄、用量、投与経路に依存して）約３〜１４：１である。ＬＭＷＨであるエノキサパリンは、平均分子量が約４５００ダルトンであり、皮下投与（ＳＣ）での用量が１．５ｍｇ／ｋｇの場合、（抗−因子活性対時間曲線下の面積に基づく）抗Ｘａ因子活性：抗ＩＩａ因子活性の比（平均±ＳＤ、１４．０±３．１）は、ヘパリンの場合の比（平均±ＳＤ、１．２２±０．１３）(Lovenox P.I.)と比べ高いことを特徴とする。この違いは、ａＰＴＴやＡＣＴを長くする能力は抗ＩＩａ活性と比例するため重要である。呈色抗Ｘａアッセイで得られるのは、希釈し添加物を加えた血漿内のみのエノキサパリン濃度の概算値であるため、ポイント・オブ・ケア（ＰＯＣ）試験には適さない。
【０００４】
更に最近では、臨床試験により、急性冠動脈症候群（ＡＣＳ）の管理におけるＬＭＷＨ、エノキサパリンナトリウム（ロベノックス（登録商標）、クレキサン（登録商標））の安全性と有効性とが確認された（Ｊ．ファリード（Ｆａｒｅｅｄ）ら「血栓及び鬱血（Thromosis and Hemostasis）」Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３、Ｖｏｌ．２５、３−４（１９９９））。
【０００５】
血液凝固反応は一般に、フィブリンクロット形成に必要とされる時間を測定するための臨床的アッセイとして用いられている。血液凝固アッセイは主に、スクリーニングや診断のため、或いは抗凝固療法を受けている患者をモニタするために用いられている。血液凝固アッセイには多くの種類がある。それらには、プロトロンビン時間（ＰＴ）、部分トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）、フィブリノーゲンアッセイ、トロンビン凝固時間（ＴＣＴ）、活性化凝固時間（ＡＣＴ）等が挙げられる。
【０００６】
従来の血液凝固試験は、実施前に血液試料を採取して抗凝固剤（クエン酸塩）を含有するチューブやシリンジに入れる。血液試料を遠心分離に付し、（デカンテーション等により）血漿と赤血球を分離する。所定量（通常０．１ｍＬ）の血漿を、ピペットを用いて反応容器或いはキュベットに入れる。次に、所定量の試薬を、ピペットで手で、或いは既知の所定量の試薬を計量できる他の容積移送システムにより自動で添加する。これに替え、試料を試薬に直接添加することもできる。
【０００７】
通常、試薬は０．２ｍＬ用いる。試薬を添加すると反応が開始される。既存の多くの血液凝固アッセイでは、性能が達成されにくい、高度な技能を必要とする、測定精度が低い、試薬が不安定である、試薬の消費量が多い等の欠点を少なくとも一種有する。
【０００８】
この問題に対する一解決法は、オーバーハード（Oberhardt）（米国特許第５１１０７２７号）に向けられた。ここでは、血液凝固アッセイを迅速、正確且つ簡単に行うため、乾式試薬に基づく反応スライドが提供される。このテストは、ファーマネティクス社（Pharmanetics, Inc.)で販売されている。
【０００９】
血液が凝固するかしないかは、多種類の酵素因子と酵素補因子に依存する。中央臨床検査部が全血試料或いは血漿試料中のＬＭＷＨのアッセイを高い信頼性を以って且つ簡便に実施できるかどうかは、ＬＭＷＨ療法中の患者のモニタリングにおいて鍵となり得る。血液凝固系は、チモーゲンと呼ばれる不活性な前駆体の連続的なタンパク質分解活性反応に支配されている。早い血液凝固反応は、クロット形成の範囲を制限し且つ線溶系に血液凝固を再溶解させる働きをする抗凝固チモーゲンを同時に活性化させることにより制御される。
【００１０】
従って、医療用途等において血液凝固アッセイを簡単、容易且つ正確に実施できる方法が強く望まれている。このような方法では、試料或いは試薬の操作回数を最小限にすべきである。理想的には、このような方法では、高度の臨床検査訓練がない人でも容易に利用でき、また、試薬調製や試薬含有溶液の調製の必要がないことが必要である。また、試薬の不安定性に関する問題がなく、それでいて非常に正確であるべきである。試料と試薬は良好に混合されうるべきである。試料の必要量は極く少量であるべきである。更に、試料の処理を、例えば血液試料の遠心分離や他のオフライン細胞分離プロセスを必要とせず、自動的に実施できなければならない。現在利用可能な凝固パラメータアッセイは等しく、見過ごすことのできない欠点を有している。
【００１１】
ＬＭＷＨに関して使用されている現行の検査は呈色アッセイであり、全血試料に由来する血漿の分離が必要であると共に、アッセイを実施するためには多くの処理時間を費やす必要がある。このため、ＬＭＷＨの治療的レベルを迅速に決定するために、全血試料を用いて素早く且つ容易にＬＭＷＨを定量測定でき、ベッドサイドで実施できるアッセイが必要とされている。
【００１２】
更に、従来の呈色アッセイでは、血漿試料中の実際のＬＭＷＨレベルが測定されるが、患者の血液の実際の凝固動態は反映されない。凝固動態は、種々の因子に依存し、それら因子により複雑なものになることがあるため、凝固時間と試料中のＬＭＷＨ量を関連付けると共に、ＬＭＷＨからは独立した凝固動態において生じうる他の問題も検出できるアッセイが必要とされている。
【００１３】
本明細書では、凝固パラメータアッセイとは、終点を得るためにクロット形成も凝血溶解も利用しない、広範な血液凝固診断における機能及び構造に基づくアッセイをいう。これらアッセイの多くは、呈色作用のある合成基板を利用して、血液凝固に関連する分子マーカー又は特定の因子或いは成分を定量する。これらは通常、機能的反応に基づくアッセイであり、多くのイムノアッセイとは異なる。多くのイムノアッセイでは、同一の分子を検出するが、構造認識を利用しているため、機能的でない、阻害されている成分や不完全な成分も同定されるであろう。
【発明の開示】
【００１４】
従って、本発明の一目的は、ＬＭＷＨ、特にエノキサパリンのための改善された血液凝固アッセイを提供することである。
【００１５】
本発明の別の目的は、全血を用いて実施できるこのようなアッセイを提供することである。
【００１６】
本発明の更に別の目的は、ドライ・ケミストリー・フォーマットに基づくこのようなアッセイを提供することである。
【００１７】
本発明の更に別の目的は、ＬＭＷＨ測定のための血液凝固アッセイ用試薬を提供することである。
【００１８】
本発明の更に別の目的は、全血試料の凝固時間に影響を及ぼす可能性のある因子への感受性を保持したまま、凝固時間を全血試料中のＬＭＷＨレベルと関連付ける、血液凝固に基づくドライ・ケミストリー・フォーマット（乾式）のアッセイを提供することである。
【００１９】
本発明のこれら及びその他の目的は、血液凝固カスケード反応を用いて全血試料中の低分子量ヘパリン濃度を測定し、血液凝固時間或いは動力学をモニタするためのアッセイ、試薬、方法及びキットを見出すことにより達成された。ここで、血液凝固試薬は、磁性粒子と、ラッセルクサリヘビ蛇毒（Russell's Viper Venom）等の第Ｘａ因子アクチベータとを含むドライ・フォーマット試薬である。
【００２０】
本発明の多くの付随する特徴は、添付図面を参照しつつ下に続く詳細な説明を参照することによって理解がより深まるにつれ、容易に理解されるようになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は、全血試料について低分子量ヘパリン濃度を測定するための方法に関する。該方法は、
（ｉ）アッセイの第一の要素である全血とアッセイの第二の要素とを組合わせる段階であって、第二の要素は乾式血液凝固アッセイ試薬を含み、該試薬は、実質的に平坦な形状に配置されていると共に実質的に均一に全体に分散した磁性粒子を含み且つ第Ｘａ因子アクチベータを含み、得られた混合物は、（ｉａ）振動磁界、（ｉｂ）動く永久磁界、（ｉｃ）振動磁界と静止永久磁界の組合せ、又は（ｉｄ）回転磁界に付され、これにより第一の要素と第二の要素の組合せと実質的に同時に、磁性粒子の移動及び血液凝固アッセイの測定が開始される段階と、
（ｉｉ）（ｉａ）、（ｉｂ）、（ｉｃ）又は（ｉｄ）により誘起された磁性粒子の移動をモニタして、血液凝固アッセイの測定値を得る段階とを含み、
前記血液凝固アッセイ測定値は、全血試料中の低分子量ヘパリン濃度と相関関係にある。
【００２２】
本発明の方法においては、この方法は、この方法を実施するためのエレメント内で実施され、該エレメントはチャンネル構造を含み、該チャンネル構造は互いに流体連通関係にある試料ウェルと反応容積とを画定し、反応容積は好ましくは第二の要素を含有する。チャンネル構造は好ましくは、試料ウェル内に置かれた第一の要素である全血を毛細管作用により反応容積に送って該容積を満たす幾何形状を有し、反応容積が満たされた後、第一の要素である全血は（ここで第二の要素と組み合わされて反応混合物を形成し）該容積内に静止して保持される。
【００２３】
前記エレメントは好ましくは、ファーマネティクス特許に記載したような、外部の光源から反応容積に光を送るための手段を更に含む。本発明の方法は更に、反応容積から散乱した或いはそれに吸収された或いは反射した光を検出して反応をモニタリングするための手段を使用することを更に含む。光を検出するための好適な手段は、ファーマネティクス特許に記載されている。好ましくは、反応エレメントは、永久磁石及び電磁石に対し、永久磁石と電磁石とが振動磁界と静止永久磁界の組合せを提供するように十分近接して配置されている。より好ましくは、前記エレメントは、永久磁石と電磁石の間に位置している。
【００２４】
本発明は更に、全血試料について低分子量ヘパリン濃度を測定するための方法であって、
（ｉ）全血試料をエレメントの試料ウェルに添加する段階であって、該エレメントは、
チャンネル構造を有し、該チャンネル構造に、互いに流体連通関係にある試料ウェルと反応容積とを画定し、該反応容積は上面により画定され、該上面には反射層が取り付けられ、該反射層は半透過性マトリックスを含み、該反応容積は少なくとも一種の乾式血液凝固アッセイ試薬を所定量含み、該試薬は、実質的に平坦な形状に配置されていると共に実質的に均一に全体に分散した磁性粒子を含み、特定量の試料は毛細管作用により該反応容積に送られて半透過性層と共に試薬と接触し、これと実質的に同時に血液凝固アッセイ測定が開始される段階と、
（ｉｉ）前記半透過性層の反射率を測定することにより血液凝固アッセイ測定を実施する段階とを含み、
乾式血液凝固アッセイ試薬が第Ｘａ因子アクチベータを含む方法に関する。
【００２５】
本発明は更に、全血試料について低分子量ヘパリン濃度を測定するためのキットに関する。該キットは、一以上の容器中に、永久磁石と、時間測定手段と、エレメントとを含み、該エレメントは少なくとも一種の乾式血液凝固アッセイ試薬を含み、該試薬は、実質的に平坦な形状に配置されていると共に実質的に均一に全体に分散した磁性粒子を含み、少なくとも一種の乾式血液凝固アッセイ試薬は第Ｘａ因子アクチベータを含む。
【００２６】
更に、本発明は、全血試料について低分子量ヘパリン濃度を測定するためのシステムに関する。該システムは、
（ｉ）温度制御手段と、振動磁界を生成するため或いは永久磁界を移動させるための手段と、照明手段と、測光モニタリング手段とを有する装置と、
（ｉｉ）測定を実施するためのエレメントであって、該エレメントはチャンネル構造を有し、該チャンネル構造は、互いに流体連通関係にある試料ウェルと反応容積とを画定し、該チャンネル構造は、試料ウェル内に置かれた液体試料を毛細管作用により反応容積に送って該容積を満たす幾何形状を有し、該反応容積は少なくとも一種の乾式血液凝固アッセイ試薬を含み、該試薬は、実質的に平坦な形状に配置されていると共に実質的に均一に全体に分散した磁性粒子を含み、少なくとも一種の乾式血液凝固アッセイ試薬は第Ｘａ因子アクチベータを含むエレメントとを含む。
【００２７】
本発明のシステムは更に、トランスファーピペットを含むことができる。該ピペットは、好ましくは、本質的に非血栓形成性の材料で形成され、通気口付きの先端を有する。トランスファーピペットは好ましくは、毛細管作用により液体試料で満たされることができ、通気口付き先端を覆った或いは密閉した後、圧力により液体試料を排出することができる。システムの装置は、更に加熱手段を含むことができ、該加熱手段は、前記エレメントに近接して配置された抵抗性ヒータストリップとサーミスタとを含む。本発明のシステムにおいては、前記エレメントは好ましくは、全血血液凝固アッセイを実施するのに適しており、試料ウェル内に置かれた血液試料を毛細管作用により反応容積に送って該容積を満たす幾何形状のチャンネル構造を有し、反応容積が満たされた後、血液試料は該容積内に静止して保持され、前記エレメントは光学的若しくは磁気的にコード可能な情報手段又はその両方を更に含み、該情報手段は、較正、品質制御、テストパラメータ及び患者情報の内の少なくとも一種を提供できる。システムの照明手段は好ましくは、エレメントに光を照射する一以上の光源を含む。測光モニタリング手段は好ましくは、反応容積に存在する呈色種又は呈色調節（chromomodulating）種を測光学的にモニタリングするための一以上の検出器を含む。本発明のシステムの物理的なデバイスに好適な手段は、ファーマネティクス特許に記載されている。
【００２８】
本発明は、更に好ましくは、全血試料における低分子量ヘパリン濃度を測定するためのシステムであって、
（ｉ）（１）液体試料を収容するための試料ウェルと、（２）実質的に平坦な形状に配置されていると共に磁性粒子が実質的に均一に全体に埋め込まれている乾式血液凝固アッセイ試薬を含む反応チャンバとを含む反応エレメントを含み、
（ｉｉ）試料ウェル及び反応チャンバは輸送ゾーンを介して流体連通関係にあり、該ゾーンは、試料ウェル内に配置され反応チャンバの容積に対応する体積の液体試料が同時に試料ウェルから反応チャンバに輸送される幾何形状を有し、
（ｉｉｉ）反応チャンバを光学的にモニタリングするための手段を含み、
（ｉｖ）反応チャンバを振動磁界に付すための手段を含み、
（ｖ）これにより、試料が反応チャンバに導入されると、乾式血液凝固アッセイ試薬は溶解し、これにより磁性粒子は振動磁界により誘起される振動パターンで自在に移動し、これにより振動磁界に対する磁性粒子の移動の程度の変化に対応して、血液凝固アッセイの動力学の測定を提供し、
乾式血液凝固アッセイ試薬は第Ｘａ因子アクチベータを含むシステムに関する。
【００２９】
システムは好ましくは更に、液体試料の試料ウェルから反応チャンバへの輸送が開始される時点を制御するための手段を含む。このような手段で好適なものは、ファーマネティクス特許に記載されている。本発明のシステムは更に、試料ウェルと流体連通関係にある複数の反応チャンバと、全血試料又は血漿試料を複数の反応チャンバの内の一個から複数の反応チャンバの内の別の一個に輸送するための手段とを含むことができる。このような配置では、患者の試料を複数の反応チャンバに分割させ、各反応チャンバには異なる血液凝固試薬を入れ、患者の血液の異なる面をモニタリングすることができる。このような複数の反応チャンバエレメントの好適なものについても同様、ファーマネティクス特許に記載されている。
【００３０】
本発明は更に、全血試料における低分子量ヘパリン濃度を測定するための方法であって、
（ｉ）反応エレメントを振動磁界に付す段階であって、該反応エレメントは、（１）全血試料を収容するための試料ウェルと、（２）乾式血液凝固アッセイ試薬を含む反応チャンバとを有し、該試薬は、実質的に平坦な形式に配置されていると共に磁性粒子が実質的に均一に全体に埋め込まれており、前記試料ウェル及び反応チャンバは輸送ゾーンを介して流体連通関係にあり、該ゾーンは、試料ウェル内に配置され反応チャンバの容積に対応する体積の液体試料が同時に試料ウェルから反応チャンバに輸送されるような幾何形状を有する段階と、
（ｉｉ）血液凝固しやすい全血試料を試料ウェルに添加し、これにより試料の少なくとも一部を反応チャンバに同時に導入し、試薬が溶解されると共に粒子は振動磁界により誘起される振動パターンで自在に移動する段階と、
（ｉｉｉ）光学的に反応チャンバをモニタリングして、磁界に対する磁性粒子の移動の程度の変化に対応した血液凝固アッセイのための動力学を測定する段階と
を含み、
前記乾式血液凝固アッセイ試薬は第Ｘａ因子アクチベータを含む方法に関する。
【００３１】
本発明は、乾式試薬を用いた全血試料中のＬＭＷＨ、特にエノキサパリン（ＥＮＯＸ）のためのアッセイに関する。アッセイに用いる好ましいエレメント（テストカード等）及びその調製方法は、米国特許第４８４９３４０号、第５１１０７２７号、第５３５０６７６号、第５５０８５２１号、第５６０１９９１号、第５６５８７２３号、第５６７０３２９号、第５６７７１３３号、第６１６５７９５号及び第６１９７４９４号に記載されており、これらの内容の全体を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する（以下、これらを「ファーマネティクス特許」と称する）。しかしながら、アッセイは、下に示す他の種類のアッセイエレメントを用いて行うことができる。
【００３２】
本発明のアッセイは、ＬＭＷＨ、好ましくはエノキサパリンナトリウム(ロベノックス（Lovenox）（登録商標）、クレキサン（Clexane）（登録商標）)により提供される抗凝固作用についても結果が迅速に得られるように設計されている。これは、バイエル社（Bayer Corp.）から入手可能なラピッドポイント血液凝固（Rapidpoint Coag）アナライザやファーマネティクス社から入手可能なＴＡＳアナライザを用いて実施される一段階の血液凝固方法である。このテストでは、クエン酸添加或いはクエン酸非添加の全血を用いる。ファーマネティクス特許に記載の他のテスト装置と同様、このＬＭＷＨテストも乾式テストカードである。このテストを実施するのに必要な要素は全て、患者からの試料を除きカードの反応チャンバに含まれている。
【００３３】
本発明のアッセイにおいては、第Ｘ因子は、ラッセルクサリヘビ蛇毒（ＲＶＶ−Ｘ）等の第Ｘａ因子アクチベータを含む試薬により、素早く第Ｘａ因子に変換され、血液凝固プロセスを開始する（図１参照）。アッセイエレメント、好ましくはファーマネティクス特許に記載されているようなテストカードには第Ｘａ因子アクチベータが含まれているが、テスト機能に必要な血液凝固因子は全て（第Ｘ因子、第Ｖ因子、プロトロンビン、フィブリノーゲン及びアンチトロンビン）、患者の試料からもたらされる。このアッセイは、低分子量ヘパリンの抗Ｘａ活性と抗ＩＩａ活性とを併せた活性を測定するものであり、匹敵する(comparable)スパイク化した全血（ＣＷＢ）由来の血漿の広範囲な活性に亘って、クエン酸添加全血における凝固時間を測定するように設計されている。ＬＭＷＨのための従来のテストは、抗Ｘａ活性が０．０〜１．０（抗Ｘａ  ＩＵ／ｍＬ）程度の範囲までしか適用できない。しかしながら、本アッセイは、ＬＭＷＨの抗Ｘａ活性と抗ＩＩａ活性とを併せて提供し、抗Ｘａ範囲が０．０〜３．０抗Ｘａ  ＩＵ／ｍＬ  ＬＭＷＨのスパイク化した全血由来の血漿に匹敵するＣＷＢにおける凝固時間を測定する。本アッセイにより得られる結果は、全血中のＬＭＷＨにより得られる抗凝固作用全体を示すものである。
【００３４】
試薬は、磁性粒子と第Ｘａ因子アクチベータとを含む。好適な第Ｘａ因子アクチベータとしては、ヘビ毒由来の各種Ｘａ活性化酵素、例えば、ラッセルクサリヘビ蛇毒（ＲＶＶ−Ｘ）、アスプクサリヘビ（Vipera aspis aspis）、アメリカハブ属ガラガラヘビ（Bothrops atrox）、ノコギリヘビＥｃｈｉｓ  ｃａｒｉｎａｔｕｓの毒（Saw-scaled viper Echis carinatus venom）、サハラツノクサリヘビ蛇毒（Cerastes cerastes venom）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３５】
本発明のＬＭＷＨ アッセイ試薬は、バッファ、凍結乾燥助剤、非イオン性界面活性剤及びタンパク質からなる群から選択される一以上の要素を更に含むことができる。好適なバッファとしては、ｐＨ範囲が６．０〜８．０、より好ましくはｐＨ６．０〜７．０、最も好ましくはｐＨ６．３〜６．８のＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＳ、及びＰＩＰＥＳが挙げられるがこれらに限定されない。好ましい凍結乾燥助剤としては、ショ糖、乳糖、マンニロール、及びトレハロースが挙げられ、中でもトレハロースが最も好ましいが、これらに限定されない。非イオン性界面活性剤は、好ましくは一以上のポリシロキサンに各種プルロニック（登録商標）界面活性剤及びＰＥＯ／ＰＰＯブロック共重合体から選択される一以上の界面活性剤を組み合わせたものが挙げられる。これらの成分は、好ましくはポリシロキサンを１〜１０重量％、プルロニック(或いはＰＥＯ／ＰＰＯブロック共重合体を９０〜９９重量％混合して用いる。最も好ましくはポリシロキサン：プルロニック（登録商標）或いはＰＥＯ／ＰＰＯブロック共重合体の比を１：９９として用いる。ここで使用するポリシロキサンは、任意の種類のポリシロキサン界面活性剤とすることができ、好ましくはポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）界面活性剤である。本試薬に有用なタンパク質としては、好ましくはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミンが挙げられ、ＢＳＡが最も好ましいが、これらに限定されるものではない。
【００３６】
本アッセイにおいては、第Ｘ因子は、第Ｘａ因子アクチベータにより素早く第Ｘａ因子に変換され、血液凝固プロセスを開始する。患者の血液から得たＬＭＷＨ、好ましくはエノキサパリンはアンチトロンビンと複合体を構成し、第Ｘａ因子を阻害し、凝固時間を用量依存的に延ばす。報告された凝固時間は、試料中に存在するＬＭＷＨの濃度に対して用量依存的に増加する。このテストにより得られる結果は、全血中のＬＭＷＨにより得られる抗凝固作用の指標となる。
【００３７】
これに加え、本アッセイの結果は、患者がＬＭＷＨ治療に対し正常に応答するか否かを決定するのに用いることができる。例えば、ある患者において、血液はＵＦＨやＬＭＷＨの抗凝固作用を働かせるのに必要な必須の因子であるアンチトロンビンがない。このような患者を従来の呈色ＬＭＷＨアッセイによりモニタすると、アッセイにより得られる結果はＬＭＷＨレベルのみであり、患者の血液凝固システムの血液凝固動態は反映されない。しかしながら、本発明のテストの場合、添加するＬＭＷＨの量が増えても凝固時間が殆ど変化しないため、医師は、得られる凝固時間測定値によって、ＬＭＷＨレベルがこの患者に殆ど又は全く影響を有しないことが容易に分かるであろう。このため、医師は即座に、患者の抗凝固状態には別の問題があることがわかり、よって貴重な時間を治療法の変更に割くことができる。従来の呈色テストでは、このような結果を得るのに二種類以上のテストが必要であろうし、簡単に見落としてしまうであろう。
【００３８】
本発明のテストカードは、クエン酸添加或いはクエン酸非添加の全血における低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）の作用、好ましくはロベノックス（登録商標）／クレキサン（登録商標）（エノキサパリンナトリウム）の作用をモニタするのに用いることができる。
【００３９】
このテストでは、第Ｘａ因子活性化血液凝固方法を用いて凝固時間を測定することにより、エノキサパリン等のＬＭＷＨに対する患者の全血の応答についての情報が提供される。本発明者らの認識では、本アッセイは、全血を用いて正確に実施できる初めてのＬＭＷＨアッセイを提供する。
【００４０】
本発明においては、磁性粒子の移動は、（１）振動磁界、（２）動く永久磁界、（３）振動磁界と静止永久磁界の組合せ、或いは（４）回転磁界に付すことにより誘起される。次に、アッセイの実施において磁性粒子の移動がモニタされる。本発明における磁界は、ファーマネティクス特許に記載の任意の磁界発生手段により生成することができる。磁性粒子の移動は、同様にファーマネティクス特許に記載のとおり好ましくは検出され分析される。
【００４１】
本発明の血液凝固アッセイは反応エレメント上で実施される。この反応エレメントは、アッセイで使用される試薬を支持すると共に、磁性粒子の移動をモニタすることを許容する任意のエレメントとすることができる。このような反応エレメントとしては、マイクロタイタープレートやその同等物、実質的に平坦な表面、ファーマネティクス特許により提供される反応スライド等が挙げられる。
【００４２】
本発明アッセイの磁性粒子は、乾燥試薬ｍＬあたり０．５以下〜５０ｍｇ、好ましくは１〜１０ｍｇ存在する。
【００４３】
以下、本発明の実施例を示す。しかしながら、これらの実施例は単に説明のために記載するものであって、本発明を思想においても範囲においても限定するものではないと理解されるべきである。当業者であれば、用量や方法のいずれにおいても各種の変更が可能であろう。
【実施例】
【００４４】
本アッセイのエノキサパリン実施態様の用量応答
１０被験者の平均ＥＮＯＸ  ＣＷＢ凝固時間と派生血漿エノキサパリン濃度との間のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの用量応答の関係を図２と表１に示す。
【００４５】
【表１】
2005513424.tif 000002
【００４６】
健常な成人の全血を、０．１０５Ｍ（３．２％）クエン酸ナトリウムを含むバキュテイナー（Vacutainer）ブランドの試料採取管に、クエン酸塩１部に対して血液９部の割合で加えた。管を穏やかに逆さにして混合した後、クエン酸添加全血を分割量取り出しプラスチック管に入れ、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）、ロベノックス（登録商標）（エノキサパリンナトリウム）、を添加して、エノキサパリンの公称濃度が約０．０〜約３．０ＩＵ／ｍＬの範囲の５種類の全血エノキサパリン溶液を作成した。各試料に対して一回ずつ乾式ＬＭＷＨ試験を行なった。全血溶液の遠心分離を５分以内で行い、貧血小板血漿を得た。次に、貧血小板血漿をエノキサパリン濃度について試験した。試験は、呈色ＳＴＡＣＨＲＯＭ（登録商標）ＬＭＷＨアッセイ（カタログ型番００９０６；パーシパニー（Parsippany）、ニュージャージー）を用い、Ｅｌｅｃｔｒａ９００Ｃアナライザ（メディカルラボラトリオートメーション（Medical Laboratory Automation, Inc.）社、プレザントヴィル（Pleasantville）、ニューヨーク）上で行なった。結果をエノキサパリン（アベンティス（Aventis）Ｌ／Ｎ  ＷＳＤ３０７５）調製物で較正した。この手順を合計１０人の健常な成人に繰り返した。個々の結果と全１０被験者の平均を表２と図２に示す。
【００４７】
【表２】
2005513424.tif 000003
【００４８】
これらの結果は、エノキサパリン濃度の増加に対する凝固時間の増加を示し、また実験室基準試験との良い相関を示す。
１０被験者の用量応答関係の平均相関（ｒ）は０．９６３であった。
【００４９】
好ましいエノキサパリン実施態様
小規模臨床試験が、４センターにおいて、第１に急性冠動脈症候群の治療及び／又は経皮的冠動脈形成術（ＰＣＩ）のためにエノキサパリン投与を受けている同意した患者（ｎ＝３５）、第２に膝／股関節全置換術（ＴＫＨＲ）の際に深部静脈血栓症（ＤＶＴ）を防ぐためにエノキサパリン投与を受けている同意した患者（ｎ＝８）について行なわれた。エノキサパリンの皮下投与（３０ｍｇ−ＢＩＤ  ＳＣ）を受けているＴＫＨＲ患者からは、２〜４試料が採取された。試料は、抗Ｘａ活性ピーク（投与後３〜５時間）と最下点（投与直前）を反映するように採取され、抗Ｘａ活性の全範囲に亘る試料を得た。ＰＣＩを受けた患者からは、少なくとも３試料が採取された。ＰＣＩ患者は、手順の最初に、静脈内（ＩＶ）ボーラス（０．７５ｍｇ／ｋｇ）によって薬の投与を受けた（Ｄ．Ｊ．ケレイアケス（Kereiakes）ら、（「経皮的冠動脈形成術の際のエノキサパリンとアブシキシマブの組合せ療法（Combination enoxaparin and abciximab therapy during percutaneous coronary intervention："NICE guys finish first"）  Ｊ  Ｉｎｖａｓｉｖｅ  Ｃａｒｄｉｏｌ  Ｆｅｂ；１２  Ｓｕｐｐｌ  Ａ：ｌＡ−５Ａ，（２０００）」」。試料は、薬投与前（ベースライン）、ピーク（ボーラス投与５〜１５分後）、治療領域（ボーラス投与４５〜６０分後）、及びシースを引き抜く直前（ボーラス投与約８〜１０時間後）に採取した。この研究においては、ＵＦＨや直接トロンビン阻害剤、ビタミンＫ拮抗剤の投与を受けている患者は適格ではない。バッチ抗Ｘａ測定は、ＳＴＡＣＨＲＯＭ（登録商標）ＬＭＷＨアッセイ（ダイアグノースティカスタゴ（Diagnostica Stago）、パーシパニー、ニュージャージー）を用い、Ｅｌｅｃｔｒａ９００Ｃアナライザ（メディカルラボラトリオートメーション社、プレザントヴィル、ニューヨーク）によって行なった。このアナライザは抗Ｘａ活性をアミドリティック（amidolytic）法によって測定する。結果を、エノキサパリンの標準品（Ｌ／Ｎ  ＷＳＤ３０７５  アベンティスファーマセウティカルス（Aventis Pharmaceuticals, Inc.）社、ストラスバーグ６７９１７、フランス）によって較正した。
【００５０】
試料は、４つのサイトで男性患者３１人と女性患者１２人から採取した。各患者の、動態統計、生年月日、性別、年齢、身長、体重、全体表面積（ＴＢＳＡ）を表３に示す。サイト３における主な入院適応は、膝や股関節置換手術であり、他のサイトでの入院適応は、ＰＣＩであった。４箇所の貢献サイトの治療情報を表４に要約する。ＩＶエノキサパリン投与によって、派生血漿中の抗Ｘａレベルを、１〜２抗Ｘａ  ＩＵ／ｍＬにすることができた。この研究では、４３人の患者からの合計１１６個の試料が含まれる。
【００５１】
【表３】
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【００５２】
【表４】
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【００５３】
Ｒａｐｉｄｐｏｉｎｔ（登録商標）ＥＮＯＸ試験によって測定したクエン酸添加全血ＣＷＢ試料の凝固時間（ＣＴ）は、８０〜４７０秒の範囲であった。５１試料（４４％）のＣＴは１９９秒以下であり、３６試料（３１％）のＣＴは２００〜３００秒であり、２９試料（２５％）のＣＴは３００秒より長かった。全血における、二連で行なった凝固時間測定の母集団の変動係数（ＣＶ）は、８．８％であった。これらの変動係数は許容できるものである。対応する派生血漿エノキサパリン濃度は、０．０〜１．８抗Ｘａ  ＩＵ／ｍＬの範囲であった。これらの臨床試料（ｎ＝１１６）由来の血漿中にみられるエノキサパリン濃度の分布は、４１試料（３６％）では０．１ＩＵ／ｍＬより低く、４９試料（４３％）では０．１〜１．０ＩＵ／ｍＬであり、２６試料（２２％）では１．１〜１．８ＩＵ／ｍＬであった。これらは、スタゴＳｔａｃｈｒｏｍ抗Ｘａアッセイによって測定した。二連で行なった抗Ｘａ  ＩＵ／ｍＬ測定を用いたＳＴＡＣＨＲＯＭ（登録商標）ＬＭＷＨ法の母集団の変動係数は９．４％であった。この比較的高いＣＶは、ＳＴＡＣＨＲＯＭ（登録商標）ＬＭＷＨ試験の範囲（この範囲は０．０〜１．０抗Ｘａ  ＩＵ／ｍＬである）を超えるエノキサパリン濃度を含む試料の希釈によってもたらされた付加的な誤差によるものであろう。
【００５４】
ＣＷＢのＥＮＯＸ試験凝固時間とＳＴＡＣＨＲＯＭ（登録商標）ＬＭＷＨ抗Ｘａ  ＩＵ／ｍＬ値（派生血漿から）の関係を図５に示す。ＥＮＯＸ試験カード凝固時間とＳＴＡＣＨＲＯＭ（登録商標）ＬＭＷＨの結果との相関を回帰直線で示し、相関係数（ｒ）は０．８０５である。個々の凝固時間測定の結果が単一のＳＴＡＣＨＲＯＭ（登録商標）ＬＭＷＨ抗Ｘａ  ＩＵ／ｍＬ測定値（ｒ＝０．７７７）に匹敵する場合は、ＥＮＯＸ試験とＳＴＡＣＨＲＯＭ（登録商標）ＬＭＷＨとの間に同様な関係が観察された。全体として、トライアルは、ＥＮＯＸ試験カードの評価のためのエノキサパリン含有試料の適切な濃度幅を提供した。特に、エノキサパリンが０．６〜１．８抗Ｘａ  ＩＵ／ｍＬの範囲であるＰＣＩ患者に関して適切な濃度幅を提供した（Ｊ．Ｐ．コレット（Collet）ら、「不安定狭心症患者に対する皮下エノキサパリン前治療後の経皮的冠動脈形成術（Percutaneous coronary intervention after subcutaneous enoxaparin pretreatment in patients with unstable angina pectoris）」  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｆｅｂ  ６；１０３（５）：６５８−６３（２００１））。
【００５５】
図４に、ＥＮＯＸ試験の反応と対応する派生血漿抗Ｘａ値を、エノキサパリン投与時点からの時間の関数として示す。二セットのデータは互いに、ｉｎ  ｖｉｖｏエノキサパリン濃度は注入１０分以内でピークとなり、またＥＮＯＸ試験反応もこの時間で最大となることを反映している。これらの結果は、ＥＮＯＸ試験の反応はエノキサパリンの薬動力学に従うことを示している。
【００５６】
干渉の研究
Ａ．欠乏血漿の研究
正常にプールしアフィニティを減少させた血漿を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで研究を行ない、この試験の因子の感度を測定した。フィブリノーゲン、プロトロンビン、及び第Ｘ因子のレベルが正常値の＜１０％、＜１０％、及び６０％にそれぞれ減少した場合、血漿当量で１．０抗Ｘａ  ＩＵ／ｍＬにおいて、エノキサパリン凝固時間は２０％以上増加した。第Ｘ因子に関する研究の代表的な概要を図６に示す。抗トロンビンの正常値に対する９０％の減少は、凝固時間を２５％減少させた。ＥＮＯＸ試験は、共通カスケードにおけるこれらの重要な各種凝固因子に依存する。
【００５７】
Ｂ．薬の効果及び共通干渉
クエン酸添加全血を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏでの実験は、このＥＮＯＸ試験が、脂質（２０ｍｇ／ｍＬまで）、抗血小板剤（アブシキシマブ、エプティフィバタイト（eptifibatide）、チロフィバン(tirofiban)、アスピリン）や線溶剤（アルテプラーゼ（alteplase）、テネクテプラーゼ（tenecteplase））、及びヘマトクリットに対して敏感ではないことを示す。イソライト（IsoLyte）や生理食塩水により１５％に血液希釈をしても、図５の試験結果に影響を及ぼさなかった。
【００５８】
【表５】
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【００５９】
アッセイの調製及びアッセイの性能の再現性
０．０ＩＵ／ｍＬと１．０ＩＵ／ｍＬのエノキサパリン試料のラン内でのＣＶ値はそれぞれ６.３％と５.５％であった。また、０．０ＩＵ／ｍＬと１．０ＩＵ／ｍＬのエノキサパリン試料のロット間のＣＶ値はそれぞれ５．２％と５．５％であった。１．０ＩＵ／ｍＬエノキサパリンにおける全不正確性は＜７.０％であった。
【００６０】
本発明には多くの変形例が存在し、これら変形例は、添付の特許請求の範囲に記載した本発明の範囲に属すると考えられるものであることは、上述の詳細な説明から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】血液凝固カスケードにおける関連部分のグラフである。
【図２】好ましいＬＭＷＨであるエノキサパリンの種々のレベルでの、クエン酸添加全血のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの凝固時間応答のグラフである。
【図３】４種類の他のＬＭＷＨのレベルを変えた際の、クエン酸添加全血のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの凝固時間応答のグラフである。
【図４】好ましいＥＮＯＸテストの応答及び対応する派生血漿の抗Ｘａ値をエノキサパリン投与からの時間に対する関数として示す。
【図５】小規模の臨床検査における、ＣＷＢのＥＮＯＸテスト凝固時間とＳＴＡＣＨＲＯＭ（登録商標）ＬＭＷＨ  抗Ｘａ  ＩＵ／ｍＬ値（派生血漿から）の関係を示す。
【図６】ＥＮＯＸテスト凝固時間において、血液試料中の各種因子の減少(depletion)に関する研究結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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