(57)【要約】本発明は、遺伝子修飾された環状ヌクレオチド作動性イオンチャンネルに関し、このサブユニットはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１及び２による野生型と比較してｃＧＭＰに対して、より高いｃＡＭＰに関する感受性及び／又はより高いｃＡＭＰに関する選択性を有するように修飾されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウシ由来のα３−サブユニット中のトレオニンＴ５３７に相当する位置で、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１及び２による野生型と比較してｃＧＭＰに対して、より高いｃＡＭＰに関する感受性及び／又はより高いｃＡＭＰに関する選択性を有するように修飾されているサブユニットからなる遺伝子修飾された環状ヌクレオチド作動性イオンチャネル（ＣＮＧチャネル）。
【請求項２】
ウシ及び／又は別の生物由来のＣＮＧチャネルのサブユニットを有することを特徴とする、請求項１記載の遺伝子修飾されたＣＮＧチャネル。
【請求項３】
同じサブユニットからなるホモオリゴマー構成又は種々のサブユニットからなるヘテロオリゴマー構成を有することを特徴とする、請求項１又は請求項２記載の遺伝子修飾されたＣＮＧチャネル。
【請求項４】
少なくとも１つの他の遺伝子修飾を有する、請求項１から３までのいずれか１項記載の遺伝子修飾されたＣＮＧチャネル。
【請求項５】
キメラサブユニットを含有することを特徴とする、請求項１から４までのいずれか１項記載の遺伝子修飾されたＣＮＧチャネル。
【請求項６】
ウシのα３−サブユニット中のトレオニンＴ５３７に相当するアミノ酸がメチオニン又はバリンによって置換されていることを特徴とする、請求項１から５までのいずれか１項記載の遺伝子修飾されたＣＮＧチャネル。
【請求項７】
サブユニットにおいて、ウシ由来のα３−サブユニット中のトレオニンＴ５３７に相当するアミノ酸を別のセリンとは異なる１つのアミノ酸で置換することを特徴とする、ＣＮＧチャネルの製造方法。
【請求項８】
ウシ由来のα３−サブユニット中のトレオニンＴ５３７に相当するアミノ酸をメチオニン又はバリンで置換することを特徴とする、請求項７記載の方法。
【請求項９】
細胞内ｃＡＭＰ濃度の測定のための、請求項１記載のＣＮＧチャネルの使用方法。
【請求項１０】
リガンド、アゴニスト及びアンタゴニストの、Ｇタンパク質結合型レセプターに対する作用並びにアクチベーター及びインヒビターの、細胞内ｃＡＭＰ濃度を調節する別のタンパク質に対する作用の測定のための、請求項１から６までのいずれか１項記載のＣＮＧチャネルの使用方法。
【請求項１１】
請求項１から６までのいずれか１項記載のＣＮＧチャネルのサブユニットをコードすることを特徴とする、修飾された核酸。
【請求項１２】
請求項１１記載の核酸を含有することを特徴とする、発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１から６までのいずれか１項記載のＣＮＧチャネル、請求項１１記載の修飾された核酸又は請求項１２記載の発現ベクターを含有することを特徴とする、細胞株。
【請求項１４】
請求項１から６までのいずれか１項記載のＣＮＧチャネルを発現できることを特徴とする、請求項１３記載の細胞株。
【請求項１５】
細胞内ｃＡＭＰ濃度を調節するタンパク質を、請求項１から６までのいずれか１項記載のＣＮＧチャネルと一緒に異種共発現できることを特徴とする、請求項１３又は１４記載の細胞株。
【請求項１６】
Ｇタンパク質結合型レセプター、ホスホジエステラーゼ、アデニル酸シクラーゼを、請求項１から６までのいずれか１項記載のＣＮＧチャネルと一緒に異種共発現できることを特徴とする、請求項１３から１５までのいずれか１項記載の細胞株。
【請求項１７】
請求項１２記載の発現ベクターで形質転換させることを特徴とする、細胞株の製造方法。
【請求項１８】
タンパク質に関する遺伝子を請求項１２記載の発現ベクターにクローニングし、引き続き細胞株の形質転換を実施することを特徴とする、請求項１７記載の製造方法。
【請求項１９】
真核生物のＣＨＯ細胞株、ＣＯＳ細胞株又はＳＦ９細胞株を異種発現系として使用することを特徴とする、請求項１７又は１８記載の製造方法。
【請求項２０】
ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞株を異種発現系として使用することを特徴とする、請求項１７又は１８記載の製造方法。
【請求項２１】
タンパク質が安定に又は一過性に発現されることを特徴とする、請求項１３から１６までのいずれか１項記載の細胞株の製造方法。
【請求項２２】
タンパク質の１つが安定に発現され、かつ別のタンパク質が一過性に発現されることを特徴とする、請求項１５又は１６記載の細胞株の製造方法。
【請求項２３】
細胞内Ｃａ２＋濃度の測定のための、請求項１３から１６までのいずれか１項記載の細胞株の使用方法。
【請求項２４】
蛍光光学的方法による測定を実施することを特徴とする、請求項２３記載の使用方法。
【請求項２５】
蛍光を発するＣａ２＋指示薬を使用することを特徴とする、請求項２３又は２４記載の使用方法。
【請求項２６】
発光光学的方法による測定を実施することを特徴とする、請求項２３記載の使用方法。
【請求項２７】
発光するアポエクオリン又はそのアイソフォームを使用すること特徴とする、請求項２３又は２６記載の使用方法。
【請求項２８】
Ｃａ２＋濃度の測定をキュベット測定装置又はＣａ２＋イメージング装置中で実施することを特徴とする、請求項２３から２７までのいずれか１項記載の使用方法。
【請求項２９】
Ｃａ２＋濃度の測定を蛍光リーダもしくは発光リーダ中で実施することを特徴とする、請求項２３から２８までのいずれか１項記載の使用方法。
【請求項３０】
マルチウェルプレートを使用することを特徴とする、請求項２３から２９までのいずれか１項記載の使用方法。
【請求項３１】
接着性細胞又は懸濁液中の細胞を使用することを特徴とする、請求項２３から３０までのいずれか１項記載の使用方法。
【請求項３２】
細胞内ｃＡＭＰ濃度を高める又は低下させる医薬品作用物質又は薬理物質の特性決定のための、請求項２３から３１までのいずれか１項記載の使用方法。
【請求項３３】
ＧＰＣＲ、アデニル酸シクラーゼ、ホスホジエステラーゼ又は細胞内ｃＡＭＰ濃度を調節する別のタンパク質の特性決定のための、請求項２３から３１までのいずれか１項記載の使用方法。
【請求項３４】
高スループット（ＨＴＳ）又は超高スループット（ＵＨＴＳ）で作業することを特徴とする、請求項３２又は３３記載の使用方法。
【請求項３５】
実時間内での測定を実施することを特徴とする、請求項２３から３４までのいずれか１項記載の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環状ヌクレオチド作動性イオンチャネル（ＣＮＧチャネル）をコードする遺伝子修飾された核酸、有利にはＤＮＡ及び相応のタンパク質並びにそれらの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
化学物質、例えばホルモン又は神経伝達物質は、いわゆる「ファーストメッセンジャー」（リガンド）として細胞の膜に結合し、かつそれによって多岐にわたる生化学的−生理学的な反応を細胞内部に引き起こし、この反応により細胞はその環境に反応することができる。このプロセスは、リガンドが特異的かつ直接的に結合できる多数の膜局在受容体によって媒介される。このプロセスは部分的に極めて複雑な種々のシグナル伝達カスケードの始まりに位置する。このようなカスケードにわたり前記受容体は種々の細胞性タンパク質（エフェクタータンパク質）の活性を制御し、かつ調節する。このエフェクタータンパク質自体は、細胞内メッセンジャー、いわゆる「セカンドメッセンジャー」の濃度を調節することができる。このようなセカンドメッセンジャーによって初めて、多くの生理学的反応、例えばホルモン及び神経伝達物質の合成及び放出、細胞分裂及び細胞増殖並びに神経細胞の興奮及び興奮性が制御される。特に重要なセカンドメッセンジャーには、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）及びＣａ２＋イオンが該当する。
【０００３】
セカンドメッセンジャーの細胞内濃度は、まずシグナル伝達カスケードによって調節され、このカスケードでは細胞の膜中のＧタンパク質結合型レセプター（ＧＰＣＲ）が細胞外シグナルを感知し、次いで相応するＧタンパク質を活性化し、かつこのＧタンパク質は再び相応のエフェクタータンパク質の活性を刺激するか、又は阻害する（Ｍｏｒｒｉｓ，  Ａ．Ｊ．及びＭａｌｂｏｎ，  Ｃ．Ｃ．著  （１９９９）：“Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｌｉｎｋｅｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ”，  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ．，  ７９，  １３７３−１４３０）。更にそれぞれ個々の成分の活性は多様なフィードバック機構の枠組みの中で他のタンパク質によって調節することができる。
【０００４】
リガンドの生理学的に正常な濃度の偏移又はシグナル伝達カスケードの経路における、例えばそれに関連する成分の機能欠失によって引き起こされる障害は重度の疾患を引き起こすことがある。ＧＰＣＲは細胞の細胞外及び細胞内の媒体間の特に重要な接点であるので、ＧＰＣＲは多数の生体固有（内因性）及び生体異種（外因性）の化学物質の結合部位もしくは攻撃箇所として用いられ、更に極めて多彩にほぼ全ての生命に重要な器官又は組織で重要な生理学的プロセスを制御することで、これらは医学−薬理学な介入のために重要な関心が持たれている。特に重要な適用分野は中枢及び末梢神経系の疾患、心臓−循環器系の疾患及び内部器官の疾患である。
【０００５】
医薬品産業の治療学的目標は、標的タンパク質を活性化する薬理学的作用物質（アゴニスト）、標的タンパク質を阻害する薬理学的作用物質（アンタゴニスト）又は標的タンパク質をその活性において調節する薬理学的作用物質を開発することである。このことは、更に相応の標的タンパク質の詳細な機能的な特性決定を必要とする。そのために近年では、明らかに部分的に柔軟性において、また得られた結果の表現力においても、かつ頑丈さ及び速度、作業費用及びコストの面での効率において異なる種々の方法が開発されている。
【０００６】
こうしたなか多くのレセプターの相補的ＤＮＡがクローニングされ、このレセプターは細胞系において機能的に発現させることができた後で、この研究は主に異種発現されるレセプターで実施される。使用されるストラテジー及び方法並びにその使用に関する先行技術は、例えば文献Ｈｅｒｔｚｂｅｒｇ，  Ｒ．Ｐ．及びＰｏｐｅ，  Ａ．Ｊ．著  （２０００）：“Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：ｎｅｗ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ２１  ｃｅｎｔｕｒｙ”，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．，  ４，  ４４５−４５１；  Ｈｏｗａｒｄ，  Ａ．Ｄ．，  Ｍａｃ  Ａｌｌｉｓｔｅｒ，  Ｇ．，  Ｆｅｉｇｈｎｅｒ，  Ｓ．Ｄ．，  Ｌｉｕ，  Ｑ．，  Ｎａｒｇｕｎｄ，  Ｒ．Ｐ．，  ｖｏｎ  ｄｅｒ  Ｐｌｏｅｇ，  Ｌ．Ｈ．及びＰａｔｃｈｅｔｔ，  Ａ．Ａ．著，  （２００１）：“Ｏｒｐｈａｎ  Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ｌｉｇａｎｄ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ”，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，  ２２，  １３２−１４０，  Ｃｉｖｅｌｌｉ，  Ｏ．，  Ｎｏｔｈａｃｋｅｒ，  Ｈ．Ｐ，  Ｓａｉｔｏ，  Ｙ．，  Ｗａｎｇ，  Ｚ．，  Ｌｉｎ，  Ｓ．Ｈ及びＲｅｍｓｃｈｅｉｄ，  Ｒ．Ｋ．著  （２００１）：“Ｎｏｖｅｌ  ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒｓ  ａｓ  ｎａｔｕｒａｌ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｏｆ  ｏｒｐｈａｎ  Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ”，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，  ２４，  ２３０−２３７並びにそこに挙げられる刊行物である。
【０００７】
公知の６０％を上回るＧＰＣＲは、セカンドメッセンジャーのｃＡＭＰの細胞内濃度を調節する。このようなＧＰＣＲ及び相応のエフェクタータンパク質に対する化学物質の作用の研究のために種々の方法が存在する。
【０００８】
前記の方法の幾つかは、たいてい細胞内ｃＡＭＰ濃度の放射化学的な直接的測定に基づくものである。このために、例えば細胞を刺激し、規定の時間後に生化学的に破壊し、かつｃＡＭＰ濃度の変化を測定する。前記の測定法は確かに非常に高感度であるが、大抵は本来緩慢であり、高価であり、かつ時間のかかるものである。更に細胞内ｃＡＭＰ濃度の変化は実時間内で観察できない。重要な特性、例えば活性又は阻害の速度及び過程は、相当の付加的な費用を伴って多数の付加的な測定によってのみ測定できるにすぎない。この方法の利点は、ＧＰＣＲに対する作用物質の効果を調査できることだけでなく、細胞内ｃＡＭＰ濃度を調節するエフェクタータンパク質に対する作用物質の効果も測定できることである。
【０００９】
ｃＡＭＰ濃度もしくはｃＧＭＰ濃度の細胞内変化の測定が可能な更なる方法により膜局在ＣＮＧチャネルの特性が利用可能となった。環状ヌクレオチド作動性イオンチャネル（ＣＮＧ）は以下に記載される特徴及び特性を有する膜局在タンパク質である（Ｆｉｎｎ，  Ｊ．Ｔ．，  Ｇｒｕｎｗａｌｄ，  Ｍ．Ｅ及びＹａｕ，  Ｋ．Ｗ．著  （１９９６）：“Ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｇａｔｅｄ  ｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌｓ：ａｎ  ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｆａｍｉｌｙ  ｗｉｔｈ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ”，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｐｈｙｓｉｏ．，  ５８，  ３９５−４２６；  Ｒｉｃｈａｒｄｓ，  Ｍ．Ｊ．及びＧｏｒｄｏｎ，  Ｓ．Ｅ．著  （２０００）：“Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｇａｔｅｄ  ｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌｓ”，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３９，  １４００３−１４０１１）。ＣＮＧチャネルは、（１）おそらく４又は５個のサブユニット（α−サブユニット及び／又はβ−サブユニット）からなり、（２）それぞれ６回膜貫通し、かつ（３）カルボキシ末端の細胞内端部にそれぞれ１つの環状ヌクレオチドのための結合部位を有する。ＣＮＧチャネルは（４）ｃＡＭＰ又はｃＧＭＰによって直接的にかつ用量依存的に活性化され、（５）一価のカチオンについて僅かな選択的伝導性のみを有するにすぎない膜に水性のポアを形成し、（６）二価のカチオン、例えばＣａ２＋イオンについても同様に透過性である。
【００１０】
「環状ヌクレオチドのための結合部位」とは、環状ヌクレオチドｃＡＭＰ及びｃＧＭＰが用量依存的に結合できるＣＮＧチャネル−サブユニット中の断片を表す。前記の断片のアミノ酸配列はｃＡＭＰもしくはｃＧＭＰに関するＣＮＧチャネルの感度（感受性）を決定的に規定する。
【００１１】
「伝導性」とは、細胞外部からの細胞内部へのイオンの程度に差はあるが選択的な流入又は細胞内部から外部へのイオンの流出を可能にするイオンチャネルの特性を表す。このためにイオンチャネルは膜中に開口部（水性ポア）を形成し、それを通してチャネルの活性化状態に依存してイオンをその濃度勾配に相応し流入又は流出することができる。
【００１２】
異種発現系においては、機能的なＣＮＧチャネルを同一のα−サブユニットから（Ｈｏｍｏｏｌｉｇｏｍｅｒｅ；  Ｋａｕｐｐ  ＵＢ，  Ｎｉｉｄｏｍｅ  Ｔ，  Ｔａｎａｂｅ  Ｔ，  Ｔｅｒａｄａ  Ｓ，  Ｂｏｅｎｉｇｋ  Ｗ，  Ｓｔｕｅｈｍｅｒ  Ｗ．  Ｃｏｏｋ  ＮＪ，  Ｋａｎａｇａｗａ  Ｋ，  Ｍａｔｓｕｏ  Ｈ，  Ｈｉｒｏｓｅ  Ｔ，  Ｍｉｙａｔａ  Ｔ，及びＮｕｍａ  Ｓ，著（１９８９）  Ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｏｄ  ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｙｃｌｉｃ  ＧＭＰ−ｇａｔｅｄ  ｃｈａｎｎｅｌ．Ｎａｔｕｒｅ，  ３４２，  ７６２−７６６）、異なるα−サブユニットから（Ｈｅｔｅｒｏｏｌｉｇｏｍｅｒｅ；  Ｂｒａｄｌｅｙ  Ｊ，  Ｌｉ  Ｊ，  Ｄａｖｉｄｓｏｎ  Ｎ，  Ｌｅｓｔｅｒ  ＨＡ，及びＺｉｎｎ  Ｋ．著（１９９４）  Ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｉｃ  ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｇａｔｅｄ  ｃｈａｎｎｅｌｓ：ａ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｔｈａｔ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｃＡＭＰ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９１，  ８８９０−８８９４．；  Ｌｉｍａｎ  ＥＲ及びＢｕｃｋ  ＬＢ．著（１９９４）  Ａ  ｓｅｃｏｎｄ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｇａｔｅｄ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｈｉｇｈ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｃＡＭＰ．Ｎｅｕｒｏｎ  １３，  ６１１−６２１）並びにヘテロオリゴマーとしてα−サブユニット及びβ−サブユニットから（Ｃｈｅｎ  ＴＹ，  Ｐｅｎｇ  ＹＷ，  Ｄｈａｌｌａｎ  ＲＳ，  Ａｈａｍｅｄ  Ｂ，  Ｒｅｅｄ  ＲＲ，及びＹａｕ  ＫＷ．著（１９９３）  Ａ  ｎｅｗ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｇａｔｅｄ  ｃａｔｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｉｎ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｒｏｄｓ．Ｎａｔｕｒｅ，  ３６２，  ７６４−７６７）発現することが可能である。β−サブユニット単独は機能的なチャネルを形成できず、専らヘテロオリゴマーＣＮＧチャネルにおける調節機能を有するのみである（Ｃｈｅｎ  ＴＹ，  Ｐｅｎｇ  ＹＷ，  Ｄｈａｌｌａｎ  ＲＳ，  Ａｈａｍｅｄ  Ｂ，  Ｒｅｅｄ  ＲＲ，及びＹａｕ  ＫＷ．著（１９９３）  Ａ  ｎｅｗ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｇａｔｅｄ  ｃａｔｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｉｎ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｒｏｄｓ．Ｎａｔｕｒｅ，  ３６２，  ７６４−７６７）。ｃＡＭＰ又はｃＧＭＰがＣＮＧチャネルに結合すると、このチャネルは用量依存的に開放して、イオンが細胞内に流れ込む。ＣＮＧチャネルの活性化は生理学的条件下に、高められたチャネルのＣａ２＋伝導性を引き起こし、従って細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇をもたらす。かかる濃度変化は光学的なＣａ２＋測定法で測定できる。これらのイオンチャネルは従って原則的に、細胞内ｃＡＭＰ濃度を調節する全てのレセプターと細胞内タンパク質の調査及び特性決定のための細胞内ｃＡＭＰセンサとして使用できる。直接的なｃＡＭＰ測定と比較して、前記の方法は非常に迅速であり、効率的であり、かつ��価である。この方法は試験の１日あたりの高いスループットを可能にし、かつ実時間内での測定を可能にする。従って原則的に前記の方法は薬理学的な作用物質のスクリーニングのために特に十分に適している。
【００１３】
米国特許第６，００１，５８１号明細書及び国際公開９８／５８０７４号パンフレット並びにＧｏｔｚｅｓ，  Ｆ．著  （１９９５）：“Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ”，  ＩＳＳＮ  ０９４４−２９５２の文献には、鼻の鼻上皮由来のα３−サブユニットからなるＣＮＧチャネルのｃＡＭＰセンサとしての使用が記載されている。しかしながらこのようなＣＮＧチャネルは、このチャネルを医薬品作用物質のスクリーニングにおいて細胞性ｃＡＭＰセンサとして使用する場合に多くの決定的な欠点を有する。これらのＣＮＧチャネルは２μＭのｃＧＭＰによって既に半値活性化されるが、８０μＭのｃＡＭＰによって初めて活性化される（Ｄｈａｌｌａｎ  ＲＳ，  Ｙａｕ  ＫＷ，  Ｓｃｈｒａｄｅｒ  ＫＡ及びＲｅｅｄ  ＲＲ．著（１９９０）  Ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｆｒｏｍ  ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｎｅｕｒｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ，  ３４７，  １８４−１８７；  Ｌｕｄｗｉｇ  Ｊ，  Ｍａｒｇａｌｉｔ  Ｔ，  Ｅｉｓｍａｎｎ  Ｅ，  Ｌａｎｃｅｔ  Ｄ及びＫａｕｐｐ  ＵＢ．著（１９９０）  Ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｃＡＭＰ−ｇａｔｅｄ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｆｒｏｍ  ｂｏｖｉｎｅ  ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，  ２７０，  ２４−２９）。しかしながら細胞内ｃＡＭＰ濃度の変化は通常、数μＭにすぎないので、このようなＣＮＧチャネルは基本的にｃＧＭＰセンサとしては確かに適しているが、ｃＡＭＰセンサとしては不十分であるにすぎない。更にｃＡＭＰ濃度の測定は僅かな細胞内ｃＧＭＰ濃度の変動によっても妨害されることがある。
【００１４】
それに対してα３−サブユニット、α４−サブユニット及びβ１ｂ−サブユニットからなるヘテロオリゴマーのＣＮＧチャネルは約４μＭのｃＡＭＰ濃度でも半値活性化（Ｋ１／２値）されるが、他方でｃＧＭＰについてのＫ１／２値はホモオリゴマーのチャネルと比較して実質的にあまり変化しない（Ｂｏｅｎｉｇｋ  Ｗ，  Ｂｒａｄｌｅｙ  Ｊ，  Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｆ，  Ｓｅｓｔｉ  Ｆ，  Ｂｏｅｋｈｏｆｆ  Ｉ，  Ｒｏｎｎｅｔｔ  ＧＶ，  Ｋａｕｐｐ  ＵＢ及びＦｒｉｎｇｓ  Ｓ．著，  （１９９９）  Ｔｈｅ  ｎａｔｉｖｅ  ｒａｔ  ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｇａｔｅｄ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｉｓ  ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ．  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，  １９，  ５３３２−５３４７）。原則的にこのようなＣＮＧチャネルは細胞性ｃＡＭＰセンサとして非常に適している。しかしながら異種細胞系でのこのようなチャネルの発現は、非常に作業に費用がかかり、かつ時間がかかるのが欠点である。更に細胞内ｃＧＭＰ濃度の僅かな変動はｃＡＭＰセンサとしての機能を妨げることがある。
【００１５】
α−サブユニットのみからなるが、それでもｃＡＭＰに関して高い感受性を有するＣＮＧチャネルは分子生物学的方法によっても製造でき、位置５３７のトレオニンがセリンに交換（Ｔ５３７Ｓ）されたウシ由来のＣＮＧチャネルの遺伝子修飾されたα３−サブユニットが記載されている（Ａｌｔｅｎｈｏｆｅｎ  Ｗ，  Ｌｕｄｗｉｇ  Ｊ，  Ｅｉｓｍａｎｎ  Ｅ，  Ｋｒａｕｓ  Ｗ，  Ｂｏｅｎｉｇｋ  Ｗ及びＫａｕｐｐ  ＵＢ．著（１９９１）  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｇａｔｅｄ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｆｒｏｍ  ｒｏｄ  ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８８，  ９８６８−９８７２）。前記のサブユニットはＣＮＧチャネルを形成し、このチャネルは１４μＭのｃＡＭＰで半値活性化される。トレオニンＴ５３７は、環状ヌクレオチドの結合に決定的に関与しているα３−サブユニットの配列断片中に存在する。明らかに前記の位置のアミノ酸はＣＮＧチャネルの感受性のために特に重要である（Ａｌｔｅｎｈｏｆｅｎ  Ｗ，  Ｌｕｄｗｉｇ  Ｊ，  Ｅｉｓｍａｎｎ  Ｅ，  Ｋｒａｕｓ  Ｗ，  Ｂｏｅｎｉｇｋ  Ｗ，及びＫａｕｐｐ  ＵＢ．著（１９９１）  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｇａｔｅｄ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｆｒｏｍ  ｒｏｄ  ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８８，  ９８６８−９８７２．）。確かに前記の突然変異Ｔ５３７ＳでｃＧＭＰに関するチャネルの感受性も増大する（Ｋ１／２＝０．７μＭ）。このようなチャネル（Ｔ５３７Ｓ突然変異体）は確かに廉価で異種発現させることができるが、このチャネルはｃＡＭＰセンサとして、ヘテロオリゴマーのチャネルよりも更に細胞内ｃＧＭＰ濃度の僅かな変動に妨害を受けやすい。更にｃＡＭＰの感受性は、細胞内ｃＡＭＰ濃度の僅かな変動も確実に感知するためには依然としてあまり満足のできるものではない。
【００１６】
更にｃＡＭＰに関する感受性を高め、更にｃＧＭＰに関する感受性を低減させるＣＮＧチャネルのα３−サブユニット中の突然変異は公知である（Ｒｉｃｈ  ＴＣ，  Ｔｓｅ  ＴＥ，  Ｒｏｈａｎ  ＤＧ，  Ｓｃｈａａｃｋ  Ｊ及びＫａｒｐｅｎ  ＪＷ．著（２００１）  Ｉｎ−ｖｉｖｏ−ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｌｏｃａｌ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ｔａｉｌｏｒｅｄ  ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｏｔｉｄｅ−ｇａｔｅｄ  ｃｈａｎｎｅｌｓ  ａｓ  ｃＡＭＰ  ｓｅｎｓｏｒｓ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｐｈｙｓｏｌ．，  １１８；  ６３−７８）。ラットのα３−サブユニットからなり、その位置４６０のシステイン（Ｃ４６０）がトリプトファン（Ｗ）に交換され、更に位置５８３のグルタミン酸（Ｅ５８３）がメチオニン（Ｍ）に交換（Ｃ４６０Ｗ／Ｅ５８３Ｍ−突然変異体）されているＣＮＧチャネルは約１．２μＭのｃＡＭＰによって半値活性化されるが、１２μＭのｃＧＭＰによって初めて半値活性化される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の課題は、ｃＡＭＰもしくはｃＧＭＰに関するＣ４６０Ｗ／Ｅ５８３Ｍ−突然変異体と類似の感受性を有するが、１つの位置だけが遺伝子修飾されているｃＡＭＰセンサとしてのＣＮＧチャネルを開発することであった。このようなチャネルは簡単かつ迅速な細胞性測定系において効率的かつ汎用的に医薬品作用物質のスクリーニングのために使用できるが、また薬理学的な標的タンパク質又は潜在的に薬理学的な標的タンパク質の特性決定のためにも使用できる。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
前記課題は、ウシ由来のα３−サブユニット中のトレオニンＴ５３７に相当する位置で、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１及び２による野生型と比較してｃＧＭＰに対する、より高いｃＡＭＰに関する感受性及び／又はより高いｃＡＭＰに関する選択性を有するように修飾されているα３−サブユニットからなるＣＮＧチャネルによって解決される。
【００１９】
これらのイオンチャネルは、Ｃ４６０Ｗ／Ｅ５８３−突然変異体と類似のｃＡＭＰもしくはｃＧＭＰに関する感受性を有する。
【００２０】
本発明の対象は更に前記のチャネルの製造方法である。また本発明の対象は、修飾されたＣＮＧチャネルのための核酸を含有する発現ベクターである。同様に本発明の対象は、前記の発現ベクターで形質転換され、かつこのＣＮＧチャネルを発現できる細胞株である。ＧＰＣＲ、アデニル酸シクラーゼ、ホスホジエステラーゼ又は細胞内ｃＡＭＰ濃度を調節する別のタンパク質を、修飾されたＣＮＧチャネルと一緒に異種共発現できる細胞株が特に有利である。
【００２１】
更に本発明の対象は、発現ベクターを用いて形質転換を実施する前記の細胞株の製造方法である。本発明によれば、有利にはこのタンパク質のための遺伝子を発現ベクターにクローニングし、引き続き細胞株に形質転換を実施する。
【００２２】
本発明によれば、有利にはα３−サブユニットからなるＣＮＧチャネルが使用される。しかしながらウシ由来又は別の生物由来の別のサブユニットも挙げられる。
【００２３】
本発明により使用されるサブユニットでは、有利にはウシのα３−サブユニット中の位置のトレオニンＴ５３７に相当するアミノ酸は、セリンとは異なる別のアミノ酸によって置換されている。この際、トレオニンがメチオニン又はバリンによって置換されているサブユニットが特に有利である。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ３及び４もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ５及び６において、前記のように修飾されたサブユニットをウシ由来のα３−サブユニットの例として示している。
【００２４】
本発明によるイオンチャネルは、とりわけ細胞内ｃＡＭＰ濃度の測定のための細胞性ｃＡＭＰセンサとして適している。同様にこのイオンチャネルは、細胞内ｃＡＭＰ濃度を調節するＧタンパク質結合型レセプター（ＧＰＣＲ）に対するリガンド、アゴニスト及びアンタゴニストの作用の測定に適している。更にこのイオンチャネルは、細胞内ｃＡＭＰ濃度を調節するアデニル酸シクラーゼ及びホスホジエステラーゼ（エフェクタータンパク質）に対するアクチベーター及びインヒビターの作用を測定するために使用できる。
【００２５】
更に本発明は、細胞内ｃＡＭＰ濃度を直接的又は間接的に調節する細胞成分の活性に影響を及ぼす化学物質の測定のために、核酸及び相応のタンパク質を有する細胞性測定系を使用することに関する。
【００２６】
前記の細胞性測定系は医薬品作用物質のスクリーニング及び作用物質の特性決定のため並びに薬理学的に関連するタンパク質の特性決定のためにｃＡＭＰセンサとして汎用かつ柔軟に使用できる。測定されるものは、全てのＧタンパク質結合型レセプター、アデニル酸シクラーゼ、ホスホジエステラーゼ並びにｃＡＭＰシグナル経路に関連している全ての別のタンパク質を含む。
【００２７】
細胞性ｃＡＭＰセンサとして、Ｔ５３７Ｍ突然変異体又はＣ４６０Ｗ／Ｅ５８３Ｍ−突然変異体の代わりに、
（ｉ）ｃＡＭＰに関する類似の高い又はより高い感受性、
（ｉｉ）ｃＡＭＰに関する類似の高い又はより高い感受性又は
（ｉｉｉ）ｃＡＭＰに関する類似の高い又はより高い感受性及び付加的に高い又はより高い選択性
を有する別の遺伝子修飾されたＣＮＧチャネルを製造でき、かつ使用できる。
【００２８】
このようなＣＮＧチャネルは（１）別の生物のα３−サブユニット、（２）ウシ又は別の生物由来の別のＣＮＧチャネル−サブユニット並びにこれらのサブユニットからなるホモオリゴマーもしくはヘテロオリゴマーの構成を有することができる。これらのサブユニットは（４）ウシ由来のＣＮＧチャネルのα３−サブユニット中の位置Ｔ５３７に相当する位置でそれぞれ遺伝子修飾されていてよい。前記の位置でトレオニンはメチオニン又はバリンによって置換されていてよいが、又は別のアミノ酸（セリンを除く）によって置換されていてもよい。このようなサブユニットは（５）別の位置に更なる遺伝子修飾を有することができる。更にこれらのＣＮＧチャネルは（６）前記の位置で同様に遺伝子修飾されているキメラサブユニットを有することができる。
【００２９】
「ウシ由来のＣＮＧチャネルのα３−サブユニット中の位置Ｔ５３７に相当する位置で遺伝子修飾された」は以下のことを意味する：ＣＮＧチャネルの種々のサブユニット（例えばα１、α２、α３及びα４）もしくは種々の生物由来のＣＮＧチャネルの同じサブユニット、例えばウシ由来のα３−サブユニット及びラット由来のα３−サブユニットは互いに高い配列類似性を有する。それでも構造的及び機能的に重要な断片の位置はサブユニットのアミノ酸配列中でたいてい僅かに異なる。しかしながら当業者は互いに相応する配列断片もしくはアミノ酸を配列の比較によって同定することができる。ウシ由来のα３−サブユニット中の環状ヌクレオチドのための結合部位におけるトレオニンＴ５３７は、例えばウシ由来のα３−サブユニット中のトレオニンＴ５３９又はウシ由来のα１−サブユニット中のトレオニンＴ５６０に相当する。
【００３０】
「他の遺伝子修飾」とは、本発明による修飾の他に少なくとも１つの別の位置で１つのアミノ酸が別の１つのアミノ酸に交換されているか、又は少なくとも１つの別の位置で１つのアミノ酸が欠失又は付加されていることを意味する。
【００３１】
「キメラサブユニット」として、少なくとも２つの異なる部分のサブユニットから構成されている係るＣＮＧチャネル−サブユニット、従って例えばα１−サブユニットのアミノ末端部及びα３−サブユニットからのカルボキシ末端部から構成されているサブユニットを表す。このようなキメラは当業者によって分子生物学的手法で容易に製造でき、かつあるタンパク質の規定の特性を別のタンパク質の特性と組み合わせるか、又は規定の特性を別のタンパク質に移すか、又は規定の特性を野生型タンパク質に対して変化させるためにしばしば利用される。種々のＣＮＧチャネル−サブユニットからなるキメラは既に記載されている（Ｓｅｉｆｅｒｔ  Ｒ，  Ｅｉｓｍａｎｎ  Ｅ，  Ｌｕｄｗｉｇ  Ｊ，  Ｂａｕｍａｎｎ  Ａ及びＫａｕｐｐ，  ＵＢ．著（１９９９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  ａ  Ｃａ２＋−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｏｒｅ  ｏｆ  ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｇａｔｅｄ  ｃｈａｎｎｅｌｓ：Ｓ５／Ｓ６  ｓｅｇｍｅｎｔｓ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｐｏｒｅ  ｇｌｕｔａｍａｔｅｓ．ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １８，  １１９−１３０）。
【００３２】
脊椎動物においてＣＮＧチャネルのサブユニットに関する６つの遺伝子が公知である（α１〜α４、β１、β２）。付加的に前記のサブユニットの種々のアイソフォームが存在する（Ｓａｕｔｔｅｒ  Ａ，  Ｚｏｎｈ  Ｘ，  Ｈｏｆｍａｎｎ  Ｆ及びＢｉｅｌ  Ｍ．著（１９９８）  Ａｎ  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｏｄ  ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｇａｔｅｄ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｂｅｔａ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｎｅｕｒｏｎｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  ９５，  ４６９６−４７０１；  Ｂｏｅｎｉｇｋ  Ｗ，  Ｂｒａｄｌｅｙ  Ｊ，  Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｆ，  Ｓｅｓｔｉ  Ｆ，  Ｂｏｅｋｈｏｆｆ  Ｉ，  Ｒｏｎｎｅｔｔ  ＧＶ，  Ｋａｕｐｐ  ＵＢ及びＦｒｉｎｇｓ  Ｓ．著  （１９９９）  Ｔｈｅ  ｎａｔｉｖｅ  ｒａｔ  ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｃｙｃｌｏｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｇａｔｅｄ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｉｓ  ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，  １９，  ５３３２−５３４７）。最初に発見されたのは、網膜の桿体におけるα１−サブユニット（Ｋａｕｐｐ  ＵＢ，  Ｎｉｉｄｏｍｅ  Ｔ，  Ｔａｎａｂｅ  Ｔ，  Ｔｅｒａｄａ  Ｓ，  Ｂｏｅｎｉｇｋ  Ｗ，  Ｓｔｕｅｈｍｅｒ  Ｗ，  Ｃｏｏｋ  ＮＪ，  Ｋａｎｇａｗａ  Ｋ，  Ｍａｔｓｕｏ  Ｈ，  Ｈｉｒｏｓｅ  Ｔ，  Ｍｉｙａｔａ  Ｔ及びＮｕｍａ  Ｓ．  （１９８９）  Ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｏｄ  ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｙｃｌｉｃ  ＧＭＰ−ｇａｔｅｄ  ｃｈａｎｎｅｌ．Ｎａｔｕｒｅ，  ３４２，  ７６２−７６６．）及びβ１−サブユニット（Ｃｈｅｎ  ＴＹ，  Ｐｅｎｇ  ＹＷ，  Ｄｈａｌｌａｍ  ＲＳ，  Ａｈａｍｅｄ  Ｂ，  Ｒｅｅｄ  ＲＲ及びＹａｕ  ＫＷ著（１９９３）  Ａ  ｎｅｗ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｇａｔｅｄ  ｃａｔｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｉｎ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｒｏｄｓ．Ｎａｔｕｒｅ，  ３６２，  ７６４−７６７；  Ｋｏｅｒｓｃｈｅｎ  ＨＧ，  Ｉｌｌｉｎｇ  Ｍ，  Ｓｅｉｆｅｒｔ  Ｒ，  Ｓｅｓｔｉ  Ｆ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ａ，  Ｇｏｔｚｅｓ  Ｓ．  Ｃｏｌｖｉｌｌｅ  Ｃ，  Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｆ，  Ｄｏｓｅ  Ａ，  Ｇｏｄｄｅ  Ｍ，  Ｍｏｌｄａｙ  Ｌ，  Ｋａｕｐｐ  ＵＢ及びＭｏｌｄａｙ  ＲＳ．著（１９９５）  Ａ  ２４０−ｋＤａ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｂｅｔａ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｇａｔｅｄ  ｃａｔｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｆｒｏｍ  ｒｏｄ  ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｎｅｕｒｏｎ，  １５，  ６２７−６３６）、及び網膜の錐体におけるα２−サブユニット（Ｂｏｅｎｉｇｋ  Ｗ，  Ａｌｔｅｎｈｏｆｅｎ  Ｗ，  Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｆ，  Ｄｏｓｅ  Ａ，  Ｉｌｌｉｎｇ  Ｍ，  Ｍｏｌｄａｙ  ＲＳ及びＫａｕｐｐ  ＵＢ．著（１９９３）  Ｒｏｄ  ａｎｄ  ｃｏｎｅ  ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｇｅｎｅｓ  ｆｏｒ  ｃＧＭＰ−ｇａｔｅｄ  ���ｈａｎｎｅｌｓ．Ｎｅｕｒｏｎ，  １０，  ８６５−８７７）及びβ２−サブユニット（Ｇｅｒｓｔｎｅｒ  Ａ，  Ｚｏｎｇ  Ｘ，  Ｈｏｆｍａｎｎ  Ｆ及びＢｉｅｌ  Ｍ．著  （２０００）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｇａｔｅｄ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｆｒｏｍ  ｍｏｕｓｅ  ｒｅｔｉｎａ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，  ２０，  １３２４−１３３２）並びに鼻の嗅細胞におけるα３−サブユニット（Ｄｈａｌｌａｎ  ＲＳ，  Ｙａｕ  ＫＷ，  Ｓｃｈｒａｄｅｒ  ＫＡ及びＲｅｅｄ  ＲＲ．著（１９９０）  Ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｆｒｏｍ  ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｎｅｕｒｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ，  ３４７，  １８４−１８７；  Ｌｕｄｗｉｇ  Ｊ，  Ｍａｒｇａｌｉｔ  Ｔ，  Ｅｉｓｍａｎｎ  Ｅ，  Ｌａｎｃｅｔ  Ｄ及びＫａｕｐｐ  ＵＢ．著（１９９０）  Ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｃＡＭＰ−  ｇａｔｅｄ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｆｒｏｍ  ｂｏｖｉｎｅ  ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，  ２７０，  ２４−２９）及びα４−サブユニット（Ｂｒａｄｌｅｙ  Ｊ，  Ｌｉ  Ｊ，  Ｄａｖｉｄｓｏｎ  Ｎ，  Ｌｅｓｔｅｒ  ＨＡ及びＺｉｎｎ  Ｋ．著  （１９９４）  Ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｉｃ  ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｇａｔｅｄ  ｃｈａｎｎｅｌｓ：ａ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｔｈａｔ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｃＡＭＰ．  Ｐｒｏｃ．  ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９１，  ８８９０−８８９４；  Ｌｉｍａｎ  ＥＲ  ａｎｄ  Ｂｕｃｋ  ＬＢ．（１９９４）  Ａ  ｓｅｃｏｎｄ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｇａｔｅｄ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｈｉｇｈ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｃＡＭＰ．Ｎｅｕｒｏｎ，  １３，  ６１１−６２１）である。
【００３３】
前記のサブユニットからなるＣＮＧチャネルは更にニューロン細胞及び非ニューロン細胞並びに組織中で検出された（Ｒｉｃｈａｒｄｓ  ＭＪ及びＧｏｒｄｏｎ  ＳＥ．著（２０００）  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｇａｔｅｄ  ｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３９，  １４００３−１４０１１）。更にＣＮＧチャネルは脊椎動物で見いだされるだけでなく、同様に無脊椎動物、例えばドロソフィラ・メラノガスター（Ｂａｕｍａｎｎ  Ａ，  Ｆｒｉｎｇｓ  Ｓ，  Ｇｏｄｄｅ  Ｍ，  Ｓｅｉｆｅｒｔ  Ｒ及びＫａｕｐｐ  ＵＢ．著（１９９４）  Ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−  ｇａｔｅｄ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ｉｎ  ｅｙｅｓ  ａｎｄ  ａｎｔｅｎｎａｅ．ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １３，  ５０４０−５０５０）及び植物（Ｌｅｎｇ  Ｑ，  Ｍｅｒｃｉｅｒ  ＲＷ，  Ｙａｏ  Ｗ及びＢｅｒｋｏｗｉｔｚ  ＧＡ．著（１９９９）  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｆｉｒｓｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｌａｎｔ  ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｇａｔｅｄ  ｃａｔｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  １２１，  ７５３−７６１）中でも見いだされる。原則的に前記の及び全ての別のＣＮＧチャネルのサブユニットは本発明により修飾できる。
【００３４】
遺伝子修飾されたＣＮＧチャネルは細胞性テストシステムにおいて薬理学的調査のためのｃＡＭＰセンサとして
（ｉ）リガンド、アゴニスト及びアンタゴニストの、細胞内ｃＡＭＰ濃度を調節する膜局在のＧタンパク質結合型受容体（ＧＰＣＲ）に対する作用を調節するため
（ｉｉ）アクチベーター及びインヒビターの、ｃＡＭＰを合成又は加水分解するエフェクタータンパク質（酵素）を調査するため
（ｉｉｉ）アクチベーター及びインヒビターの、同様に調節されてｃＡＭＰ−シグナル伝達カスケードに連動する別のタンパク質に対する作用を調査するため、また
（ｉｖ）ＧＰＣＲ、エフェクタータンパク質又はｃＡＭＰ−シグナル伝達カスケードに関連している別のタンパク質の特性を調査するために使用できる。
【００３５】
本発明によれば「膜局在のＧタンパク質結合型レセプター」（ＧＰＣＲ）といわれるタンパク質は、系統発生的に極めて多様な、非常に多岐にわたる膜局在レセプターのファミリー（概略文献：Ｍｏｒｒｉｓ  ＡＪ及びＭａｌｂｏｎ  ＣＣ．著（１９９９）  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｌｉｎｋｅｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｐｈｙｓｉｏ  Ｒｅｖ．，  ７９，  １３７３−１４３０）に属する。ＧＰＣＲのファミリーは恐らく、その配列類似性をもとに（Ｐｒｏｂｓｔ  ＷＣ，  Ｓｎｙｄｅｒ  ＬＡ，  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ  ＤＩ，  Ｂｒｏｓｉｕｓ  Ｊ及びＳｅａｌｆｏｎ  ＳＣ．著（１９９２）  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ．ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  １１，  １−２０）又はその本来のリガンドの化学的性質に基づいて分類できる１０００を上回る種々のメンバを含む。今まで知られているＧＰＣＲの一覧及び分類は、例えば「ＧＰＣＲＤＢ」データバンク（Ｈｏｒｎ  Ｆ，  Ｗｅａｒｅ  Ｊ，  Ｂｅｕｋｅｒｓ  ＭＷ，  Ｈｏｒｓｃｈ  Ｓ，  Ｂａｉｒｏｃｈ  Ａ，  Ｃｈｅｎ  Ｗ，  Ｅｄｖａｒｄｓｅｎ  Ｏ，  Ｃａｍｐａｇｎｅ  Ｆ及びＶｒｉｅｎｄ  Ｇ．著（１９９８）  ＧＰＣＲＤＢ：ａｎ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２６，  ２７５−２７９）中に見いだされる。以下に概略として個々のクラスの幾つかの代表を挙げる。クラスＡ（「ロドプシン様」）には、ロドプシン自体及びそれらの本来のリガンドをもとに分類される配列類似の種々のレセプターが該当する。これには（１）生体原アミンのためのレセプター、例えばムスカリン性アセチルコリンレセプター、アドレナリンレセプター、ドパミンレセプター、ヒスタミンレセプター、セロトニンレセプター、オクトパミンレセプター、（２）ペプチドのためのレセプター、例えばアンギオテンシンレセプター、ケモカインレセプター、エンドセリンレセプター、神経ペプチドレセプター、（３）ホルモンタンパク質のためのレセプター、例えばＦＳＨレセプター、（４）臭い物質のためのレセプター、（５）プロスタノイドのためのレセプター、例えばプロスタグランジンレセプター又は（６）ヌクレオチドのためのレセプター、例えばアデノシンレセプターが該当する。クラスＢ（「セクレチン様」）には、セクレチンレセプター自体並びに、例えばカルシトニン、グルカゴン、利尿ホルモン又はＣＲＦ（副腎皮質刺激ホルモン放出因子）が該当する。クラスＣ（「代謝型グルタミン酸／フェロモン」）には代謝型レセプター自体並びにＧＡＢＡ−Ｂレセプターなどが該当する。他のクラスは植物、菌類、昆虫、細菌由来のレセプターを含む。全てのクラスは、機能が今までまだ不明であるかもしくは本来のリガンドが分かっていないレセプター（オーファンレセプター）を含む。約２００の種々のＧＰＣＲ型のうち、それぞれ本来のリガンドが知られており、他の約１００のＧＰＣＲ型はオーファンＧＰＣＲである。７００以上のＧＰＣＲは恐らく臭い物質又は味覚物質によって活性化される。原則的に、細胞内ｃＡＭＰ濃度を調節する全てのＧＰＣＲを異種発現系において、本発明による遺伝子修飾されたＣＮＧチャネルと一緒にｃＡＭＰセンサとして共発現させ、リガンド、アゴニスト及びアンタゴニストの作用を薬理学的に調査することができる。
【００３６】
また通常、刺激性又は阻害性Ｇタンパク質を介さずに細胞内ｃＡＭＰ濃度を調節するＧＣＲＰを調査することもできる。このようなＧＰＣＲを遺伝子修飾によって、このレセプターがｃＡＭＰシグナル経路に連結されるように修飾することができる。遺伝子修飾は、例えばキメラ−ＧＣＲＰの製造によって行うことができる（Ｌｉｕ  Ｊ，  Ｃｏｎｋｌｉｎ  ＢＲ，  Ｂｌｉｎ  Ｎ，  Ｙｕｎ  Ｊ及びＷｅｓｓ  Ｊ．著（１９９５）  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ／Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｔａｃｔ  ｓｉｔｅ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｆｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９２，  １１６４２−１１６４６）。
【００３７】
「アゴニスト」及び「リガンド」として、ＧＣＲＰを活性化する物質を表す。
【００３８】
それに対して「アンタゴニスト」として、ＧＣＲＰに結合するが、活性化させることができない物質を表す。リガンド又はアゴニストの作用はアンタゴニストによって用量依存的に阻害される。
【００３９】
細胞内ｃＡＭＰ濃度を直接調節する「エフェクタータンパク質」として、アデニル酸シクラーゼ及びホスホジエステラーゼを表す。
【００４０】
活性がＧＰＣＲを媒介して制御される「アデニル酸シクラーゼ」は、Ｍｇ２＋−アデノシン三リン酸からのｃＡＭＰの形成を触媒し、かつヒトの身体の殆どの細胞、組織及び器官に存在する大きな膜局在の酵素である（Ｔａｎｇ  ＷＪ及びＨｕｒｌｅｙ  ＪＨ．著（１９９８）  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ａｄｅｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅｓ．Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，  ５４，  ２３１−２４０）。全体として９種の異なるクラスの前記アデニル酸シクラーゼが知られている。このようなアデニル酸シクラーゼは本発明による細胞性テストシステムにも内在的に発現され、かつ異種発現されたＧＰＣＲによって活性化することができる。従ってこれらのアデニル酸シクラーゼはテストシステムの機能化に決定的に重要な役割を果たす。他のクラスは、活性が恐らくＧＰＣＲを媒介せずに調節される可溶性のアデニル酸シクラーゼを含む（Ｂｕｃｋ  Ｊ，  Ｓｉｎｃｌａｉｒ  ＭＬ，  Ｓｃｈａｐａｌ  Ｌ，  Ｃａｎｎ  ＭＪ及びＬｅｖｉｎ  ＬＲ．著（２０００）  Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  ａｄｅｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ  ｄｅｆｉｎｅｓ  ａ  ｕｎｉｑｕｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｓ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９６，  ７９−８４）。原則的に全てのアデニル酸シクラーゼを異種発現系において、本発明による遺伝子修飾されたＣＮＧチャネルと一緒にｃＡＭＰセンサとして共発現させ、かつインヒビター及びアクチベーターの作用を薬理学的に調査することができる。
【００４１】
「ホスホジエステラーゼ」（ＰＤＥ）は、ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰをアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）もしくはグアノシン一リン酸（ＧＭＰ）に加水分解する細胞内部の酵素である（Ｆｒａｎｃｉｓ  ＳＨ，  Ｔｕｒｋｏ  ＩＶ及びＣｏｒｂｉｎ  ＪＤ．著（２０００）  Ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅｓ：ｒｅｌａｔｉｎｇ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ．  Ａｃｉｄ．  Ｒｅｓ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ６５，  １−５２）。全体として１１種の異なる型のＰＤＥが知られている。相当数のＰＤＥは特異的にｃＧＭＰを、一方で特異的にｃＡＭＰを加水分解し、他方でｃＡＭＰもｃＧＭＰも加水分解する。ＧＰＣＲ及びアデニル酸シクラーゼと同様に、ＰＤＥはヒトの生体の殆どの細胞、組織及び器官で発現される。アデニル酸シクラーゼと対照的に、光レセプターに特異的なＰＤＥ６だけがＧＰＣＲを媒介して活性化される。別のＰＤＥの活性はその代わりに種々の別の機構によって調節される。原則的に、ｃＡＭＰを加水分解する全てのＰＤＥを異種発現系において、本発明による遺伝子修飾されたＣＮＧチャネルと一緒にｃＡＭＰセンサとして共発現させ、かつインヒビター及びアクチベーターの作用を薬理学的に調査することができる。
【００４２】
「アクチベーター」として、アデニル酸シクラーゼ又はＰＤＥと直接的に相互作用し、かつそれによって酵素活性が増大する物質を表す。
【００４３】
それに対して、「インヒビター」として、同様にアデニル酸シクラーゼ又はＰＤＥと直接的に相互作用するが、その活性が低下する物質を表す。
【００４４】
原則的に、細胞内ｃＡＭＰ濃度を調節する全てのタンパク質を異種発現系において、本発明による遺伝子修飾されたＣＮＧチャネルと一緒にｃＡＭＰセンサとして共発現させ、薬理学的に調査することができる。
【００４５】
調査すべきタンパク質は異種発現系において一過性に又は、有利には安定に発現させることができる。
【００４６】
「一過性発現」とは、異種発現されるタンパク質が発現系の細胞から規定の時間にわたってのみ発現されることを意味する。
【００４７】
「安定発現」とは、導入された遺伝子が異種発現系の細胞のゲノム中に安定に組み込まれることを意味する。こうして作成される新規の細胞株は各々の後継の細胞世代において相応のタンパク質を発現する。
【００４８】
発現のためには、調査されるべきタンパク質をコードするｃＤＮＡを発現ベクターにクローニングし、かつ好適な発現系の細胞に形質転換する。
【００４９】
「発現ベクター」として、相応の細胞株にｃＤＮＡを導入（「形質転換」）でき、かつ相応のタンパク質をそこで機能的に発現できる（「異種発現」）全てのベクターを表す。形質転換は、有利にはｐｃＤＮＡ−ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて実施できる。
【００５０】
「異種発現系」として、原則的に全ての真核細胞、例えば酵母細胞、アスペルギルス細胞、昆虫細胞、脊椎動物細胞及び、特に哺乳動物細胞が適している。好適な細胞株は、例えばＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣）、例えばＰｒｏ−５変異体（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７８１）を含むＫ１系統（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ６１）、ＣＯＳ細胞（アフリカミドリザル）、例えばＣＯＳ−１変異体（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０）及びＣＯＳ−７変異体（ＡＴＣＣ  １６５１）を含むＣＶ−１系統（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）、ＢＨＫ細胞（ハムスター胎児腎臓）、例えばＢＨＫ−２１系統（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １７１）、マウスＬ細胞、マウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５８）、マウスＣ１２７細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６１６）、ヒト癌腫細胞、例えばＨｅＬａ系統（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）、ＩＭＲ−３２系統の神経芽細胞腫細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １２７）、神経２Ａ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＬＬ  １３１）、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ  １０）及びＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ  １１）、ＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７２１）並びにＳｆ９細胞（スポドプテラ・フルギペルダ）（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７１１）である。有利にＳＦ変異体（ＡＴＣＣ  １５７３．１）を含むＨＥＫ２９３細胞（ヒト胚腎臓）（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５７３）が使用される。本発明により製造される細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ２５１６が特に有利である。
【００５１】
試験物質の、調査されるべきタンパク質に対する作用は蛍光光学的測定法によって実施できる。
【００５２】
調査されるべきタンパク質を細胞性テストシステムにおいて本発明によるｃＡＭＰセンサと一緒に異種発現させ、リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト、アクチベーター又はインヒビターで活性化もしくは阻害する。ｃＡＭＰセンサはｃＡＭＰ濃度の変化を感知し、かつＣａ２＋イオンはより大規模に又はより小規模に細胞中に流入する。
【００５３】
「蛍光光学的測定法」とは、細胞内Ｃａ２＋濃度の変化を、蛍光を発するＣａ２＋指示薬で可視化させることを意味する。こうした中、多数の種々のＣａ２＋指示薬が知られている（Ｈａｕｇｌａｎｄ  ＲＰ，著（１９９６）  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．）。この指示薬には、例えばＦｌｕｏ−３、カルシウムグリーン、Ｆｕｒａ−２及び本発明により有利なＦｌｕｏ−４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）が該当する。このような指示薬は通常水溶性であり、かつ従って細胞の疎水性の脂質膜を通過できないので、この指示薬はその代わりにアセトキシメチルエステル化合物の形で適用される（Ｔｓｉｅｎ  ＲＹ．著（１９８１）  Ａ  ｎｏｎ−ｄｉｓｒｕｐｔｉｖｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  ｌｏａｄｉｎｇ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｂｕｆｆｅｒｓ  ａｎｄ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ  ｉｎｔｏ  ｃｅｌｌ．Ｎａｔｕｒｅ，  ２９０，  ５２７−５２８）。それに対して前記のエステル化化合物は疎水性であり、かつ細胞によって取り込まれる。細胞内部で、このエステル結合は内因性の細胞内エステラーゼによって分解され、かつこの指示薬は再びその水溶性形で存在する。前記の形において、指示薬は細胞内部に残留し、細胞内部に集積し、かつ従って細胞内Ｃａ２＋指示薬として使用できる。これらの指示薬を次いで好適な波長を有する光で励起すると、細胞内Ｃａ２＋濃度に依存する蛍光を示す。蛍光の程度（規模）と時間的経過（キネティック）は調査されるタンパク質の活性の程度及び経過と相関し、かつ蛍光検出器を用いて実時間内に非常に良好な信号／雑音比で観察され、かつ好適なソフトウェアで図示できる。
【００５４】
細胞内Ｃａ２＋濃度の測定のために、同様にアポエクオリン及び発色団コファクターのセレンテラジンからなるイクオリン−タンパク質複合体又は匹敵する複合体をＣａ２＋指示薬として使用することができる（Ｂｒｉｎｉ  Ｍ，  Ｐｉｎｔｏｎ  Ｐ，  Ｐｏｚｚａｎ  Ｔ及びＲｉｚｚｕｔｏ  Ｒ．著（１９９９）  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｅｑｕｏｒｉｎｓ：ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  （Ｃａ）  ｉｎ  ｔｈｅ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ａ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌ．Ｍｉｃｒｓｃ  Ｒｅｓ  Ｔｅｃｈ．，  ４６，  ３８０−３８９）。このためにアポエクオリンを本発明によるｃＡＭＰセンサ及び調査されるべきタンパク質と一緒に細胞性テストシステムにおいて異種発現させなければならない。この測定の前に、細胞をセレンテラジンと一緒に、アポエクオリンとセレンテラジンが活性イクオリン複合体に会合できるようにインキュベートせねばならない。細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇する場合に、セレンテラジンがセレンテラミドに酸化される。この過程でＣＯ２が形成し、発光が放出される。前記の過程が不可逆的であることは欠点である。その発光は好適な光学検出装置で確認できる（発光光学的測定法）。前記の光学的測定法は蛍光光学的測定法と同様に高感度であるが、実時間内の反応の経過を観察する測定のためにはあまり適していない。
【００５５】
本発明によるテストシステムによる蛍光光学的測定法又は発光光学的測定はキュベット測定装置、Ｃａ２＋イメージング顕微鏡又は蛍光リーダもしくは発光リーダにおいて実施できる。
【００５６】
本発明によれば有利には測定はプラスチック容器（マルチウェルプレート）のウェルにおいて蛍光リーダ中で実施される。細胞は懸濁液中で又は、有利にはウェルの底部に付着されて存在することができる。種々の数のウェルを有するマルチウェルプレート、例えば９６、３８４、１５３６又はそれ以上のウェルを有するマルチウェルプレートを使用することができる。マルチウェルプレートにより、ただ一つのプレートにおいて多数の同じ又は異なる測定を実施することができる。
【００５７】
「蛍光リーダ」もしくは「発光リーダ」は、蛍光もしくは発光をマルチウェルプレートにおいて測定できる非常に高感度な光学的測定装置である。このような装置においてリガンド、アゴニスト、アンタゴニスト、アクチベーター又はインヒビターの作用を非常に迅速にかつ高いスループットで調査することができる。
【００５８】
本発明によれば、ＧＰＣＲ、エフェクタータンパク質又はｃＡＭＰシグナル伝達カスケードに関連する別のタンパク質の特性を、蛍光−又は発光光学的測定によって定量的に調査することができる。
【００５９】
しかしながら本発明によれば原則的に測定は１日あたりに試験の高いスループットで実施できる。従って新規の薬理学的作用物質のスクリーニングが可能である。この場合、１０００００個までの物質を１日あたりに（ハイスループット−スクリーニング、ＨＴＳ−スクリーニング）もしくは１０００００個を上回る物質を１日あたりに（超ＨＴＳ−スクリーニング、ＵＨＴＳ−スクリーニング）試験することができる。
【００６０】
例えばＦＬＩＰＲ３８４−蛍光リーダ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、３８４種の互いに無関係な測定を同時に実施でき、かつ蛍光は実時間内で観察できる。
【００６１】
以下に本発明を実施例及び添付図面を用いて詳細に説明する。
【実施例１】
【００６２】
【実施例２】
【００６３】
【実施例３】
【００６４】
【実施例４】
【００６５】
(実施例１〜４）
【００６６】
野生型チャネルのトレオニンＴ５３７の代わりにメチオニン（Ｔ５３７Ｍ）もしくはバリン（Ｔ５３７Ｖ）を配列中に有する遺伝子修飾されたホモオリゴマーのウシ由来のα３−ＣＮＧチャネルを製造した。
【００６７】
そのために、ウシ由来のＣＮＧチャネルのα３−サブユニットをコードする核酸（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１）を部位特異的突然変異による分子生物学的手法で、Ｔ５３７Ｍ−突然変異体をコードする核酸（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ３）とＴ５３７Ｖ−突然変異体をコードするもう一つの核酸（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ５）が生じるように修飾（「遺伝子修飾」）させた（方法を参照）。
【００６８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２、４及び６は、野生型チャネル、Ｔ５３７Ｍ−突然変異体もしくはＴ５３７Ｖ−突然変異体のアミノ酸配列を示している。
【００６９】
Ｔ５３７Ｍ−突然変異体及びＴ５３７Ｖ−突然変異体のｃＡＭＰ及びｃＧＭＰに対する感受性及び選択性を電気生理学的方法で測定し（方法を参照）、野生型チャネルの特性と比較した。そのために相応の核酸を発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングした（方法を参照）。この発現構築物で次いでヒト胚腎臓細胞株２９３（ＨＥＫ２９３細胞）の細胞を形質転換させ、かつ相応のタンパク質を細胞中で機能的に一過性又は安定にいずれかで発現させた（方法を参照）。調査の結果を図１〜４に示す。
【００７０】
図１Ａ、２Ａ、３Ａ及び４Ａは、それぞれ種々の濃度のｃＡＭＰ（１Ａ、３Ａ）もしくはｃＧＭＰ（２Ａ、４Ａ）の存在下での異種発現された遺伝子修飾されたＣＮＧチャネルの電流−電圧（ＩＶ）関係を示している。これらは、それぞれｃＡＭＰもしくはｃＧＭＰの存在下でのＣＮＧチャネルに典型的な電流−電圧関係を示し、かつこのチャネルがＨＥＫ２９３細胞において機能的に発現されていることを裏付けている。
【００７１】
平均電流のｃＡＭＰ濃度もしくはｃＧＭＰ濃度に対する依存性を、図１〜４Ｂにそれぞれ用量−作用関係の形で示す。これらの測定の結果は、ｃＡＭＰもしくはｃＧＭＰに関するＣＮＧチャネルの感受性を計算するために利用した。チャネルが最大の可能な電流の半分を流すＶｍ＝＋１００ｍＶにおけるｃＡＭＰもしくはｃＧＭＰの濃度（Ｋ１／２値）をＣＮＧチャネルの感受性のための尺度として利用した。Ｋ１／２値が低ければ低いほど、相応の環状ヌクレオチドに関するチャネルの感受性は高い。
【００７２】
図１Ｂ（Ｔ５３７Ｍ−突然変異体）及び３Ｂ（Ｔ５３７Ｖ−突然変異体）は、それぞれｃＡＭＰに関する用量−作用関係を示し、図２Ｂ（Ｔ５３７Ｍ−突然変異体）及び４Ｂ（Ｔ５３７Ｖ−突然変異体）はそれに対してそれぞれｃＧＭＰに関する用量−作用関係を示している。図１Ｃ（Ｔ５３７Ｍ−突然変異体）及び３Ｃ（Ｔ５３７Ｖ−突然変異体）においては、それぞれ突然変異体の規格化された用量−作用関係をｃＡＭＰに関するα３−野生型チャネルのそれと比較し、図２Ｃ（Ｔ５３７Ｍ−突然変異体）及び４Ｃ（Ｔ５３７Ｖ−突然変異体）においてはそれに対して、それぞれ規格化された用量−作用関係をｃＧＭＰに関するα３−野生型チャネルのそれと比較している。
【００７３】
次に記載する表は遺伝子修飾されたＣＮＧチャネルと野生型チャネルの感受性特性をまとめている。ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰに関するＫ１／２値が列記されている。
【００７４】
【表１】
2005507245.tif 000002
Ｔ５３７Ｍ−突然変異体を２．７μＭのｃＡＭＰによって（図１Ｃ）、Ｔ５３７Ｖ−突然変異体を３４μＭのｃＡＭＰによって（図３Ｃ）、かつ野生型を８０μＭのｃＡＭＰによって（図１Ｃ、３Ｃ）半値活性化させる。野生型と比較して、Ｔ５３７Ｍ−突然変異体はｃＡＭＰに関して約３０倍だけ、Ｔ５３７Ｖ−突然変異体はｃＡＭＰに関して約３倍だけ感受性である。Ｔ５３７Ｓ−突然変異体と比較してＴ５３７Ｍ−突然変異体はｃＡＭＰに関して約５倍だけ感受性であり、一方でＴ５３７Ｖ−突然変異体はｃＡＭＰに関してＴ５３７Ｓ−突然変異体よりも約２．５倍だけ感受性が低い。
【００７５】
Ｔ５３７Ｍ−突然変異体を１４．９μＭのｃＧＭＰによって（図２Ｃ）、Ｔ５３７Ｖ−突然変異体を２４１μＭのｃＧＭＰによって（図４Ｃ）、かつ野生型を１．６μＭのｃＡＭＰによって（図２Ｃ、４Ｃ）半値活性化させる。野生型と比較して、Ｔ５３７Ｍ−突然変異体はｃＧＭＰに関して約９倍だけ、Ｔ５３７Ｖ−突然変異体はｃＧＭＰに関して約１５０倍だけ感受性が低い。Ｔ５３７Ｓ−突然変異体と比較して、Ｔ５３７Ｍ−突然変異体はｃＧＭＰに関して約２１倍だけ、Ｔ５３７Ｖ−突然変異体はそれどころかｃＧＭＰに関して約３５０倍だけ感受性が低い。
【００７６】
ｃＡＭＰもしくはｃＧＭＰに関するＣＮＧチャネルの選択性はＫ１／２値の比較により判明する。実施例：Ｔ５３７Ｍ−突然変異体はｃＡＭＰに関して２．７μＭのＫ１／２値を有し、ｃＧＭＰに関して１４．９μＭのＫ１／２値を有する。このことは、この突然変異体が既に２．７μＭのｃＡＭＰによって半値活性化されるが、１４．９μＭのｃＧＭＰによって初めて半値活性化されることを意味する。この突然変異体は従ってｃＡＭＰに関して、ｃＧＭＰに関するよりも明らかに感受性である。商（１４．９μＭ／２．７μＭ）は相対選択性を示す。Ｔ５３７Ｍ−突然変異体は従ってｃＡＭＰに関して約６倍高い選択性を有する。Ｔ５３７Ｖ−突然変異体は同様にｃＡＭＰに関して約６倍選択性である。それに対してＴ５３７Ｓ−突然変異体はｃＧＭＰに関して２０倍高い選択性を有し、かつ野生型チャネルはそれだけでなくｃＧＭＰに関して約５０倍高い選択性を有する。
【００７７】
測定の結果を以下に示す：（１）野生型チャネルよりも極めて高い絶対ｃＡＭＰ感受性を有し、（２）ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰに関する選択性が逆になったＣＮＧチャネル突然変異体を作成し、かつ同定した。遺伝子修飾によって、前記のＣＮＧチャネルはｃＡＭＰに関する非常に高い選択的な感受性を獲得する。付加的に両方の遺伝子修飾されたＣＮＧチャネルは、より大きな細胞内ｃＧＭＰ濃度の変化でさえもｃＡＭＰ濃度の測定を妨げないほどｃＧＭＰに関して非感受性である。特に本発明により有利なＴ５３７Ｍ−突然変異体は、細胞性ｃＡＭＰセンサとして特に適している。この突然変異体は、例えば細胞内テストシステムにおいて細胞内ｃＡＭＰ濃度に影響を及ぼしうる物質の作用の調査のために使用でき、このようなテストシステムを初めて実用可能にする。このようなセンサを用いて更に、例えばＧＰＣＲの活性化によって引き起こされるような細胞内ｃＡＭＰ濃度の僅かな変化も非常に良好な信号／雑音比で確実に確認でき、実時間内で観察できる。
【００７８】
方法
遺伝的に活発化されたＣＮＧチャネルの部位特異的突然変異誘発による製造
ウシ由来のＣＮＧチャネルのα３−サブユニットに関するｃＤＮＡを適当な制限エンドヌクレアーゼ（ＥｃｏＲＶ及びＮｓｉＩ）を用いてプラスミドｐＣＨＯＬＦ１０２（Ａｌｔｅｎｈｏｆｅｎ  Ｗ，  Ｌｕｄｗｉｇ  Ｊ，  Ｅｉｓｍａｎｎ  Ｅ，  Ｋｒａｕｓ  Ｗ，  Ｂｏｅｎｉｇｋ  Ｗ  ｕｎｄ  Ｋａｕｐｐ  ＵＢ．（１９９１）  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｇａｔｅｄ  ｃｈａｎｎｅｌｓ  ｆｒｏｍ  ｒｏｄ  ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８８，  ９８６８−９８７２）から切り出し、ｐｃＤＮＡｌａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングした。このプラスミドをｐｃＡ−ｂｏｌｆと表す。このｃＤＮＡ断片を次いでＥｃｏＲＶ及びＸｂａＩを介してｐｃＤＮＡ３誘導体中にクローニングした。このプラスミドをｐｃ３−ｂｏｌｆと表す。
【００７９】
遺伝子修飾されたＣＮＧチャネルのα３−サブユニットの製造を部位特異的突然変異誘発によって実施した（Ｈｅｒｌｉｔｚｅ，  Ｓ．  ａｎｄ  Ｋｏｅｎｅｎ，  Ｍ．  （１９９０）．Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ａｎｄ  ｒａｐｉｄ  ｍｕｔａｇｅｎｉｓｉｓ  ｍｅｔｈｏｄ  ｕｓｉｎｇ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｇｅｎｅ，  ９１，  １４３−１４７）。
【００８０】
Ｔ５３７Ｍ−α３−サブユニットの製造のための突然変異誘発プライマーは以下の配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ７）を有していた：
５′−ＣＧＡＣＧＣＡＴＧＧＣＧＡＡＣＡＴＣＣＧＣＡＧＴＣＴ−３′
Ｔ５３７Ｖ−α３−サブユニットの製造のための突然変異誘発プライマーは以下の配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ８）を有していた：
５′−ＣＧＡＣＧＣＧＴＣＧＣＧＡＡＣＡＴＣＣＧＧＡＣＴＣＴ−３′
まず前記の突然変異誘発プライマー及びリバースプライマー＃１８１７（５′−ＴＴＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＡＴＴＡＴＧＧＣＴＴＣＴＣＧＧＣＡＧ−３′）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ９）でのＰＣＲをｐｃ３−ｂｏｌｆ上で実施した。１００μｌのＰＣＲ混合物は１０ｎｇの鋳型ＤＮＡ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２を含むＴａｑポリメラーゼ用の１×ＰＣＲバッファー、２００μＭのｄＮＴＰ、１ＵのＴａｑポリメラーゼ及びそれぞれ１５０ｎｇの両者のプライマーを含有していた。ＰＣＲ条件は以下の通りである：９４℃での２分間の変性、引き続き９４℃で４５秒、４６℃で４５秒、７２℃で４５秒を２５サイクル。
【００８１】
４０４塩基対の大きさの断片を精製し、かつ重複する６６６塩基対の大きさのＳｍａＩ／ＰｖｕＩＩ−制限断片と一緒に更なるＰＣＲのための鋳型として使用した。増幅のために隣接するプライマー＃１８１３（５′−ＧＴＣＧＧＡＴＣＣＴＣＣＡＣＡＣＴＣＡＡＧＡＡＡＧＴＧ−３′）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１０）及び＃１８１７を使用した。このＰＣＲ混合物は前記に示したのと同じ組成を有するが、その際、１０ｎｇのプラスミドＤＮＡの代わりに鋳型として２５０ｎｇの第一のＰＣＲ断片及び１０ｎｇの制限断片を使用した。このＰＣＲ断片をＢｓｒＧＩで切断し、かつｐｃ３−ｂｏｌｆにおいて相応の断片と交換した。修飾されたＤＮＡ断片の配列を配列決定によって調査した。
ｃＤＮＡクローンの単離
ＣＲＦレセプターのクローニングのためにプライマー＃８４３（５′−ＡＧＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＣＧＧＣＧＣＣＣＧＣＡ−３′）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１１）及び＃８４２（５′−ＧＧＣＣＴＧＧＡＧＣＴＣＡＣＡＣＴＧ−３′）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１２）でのＰＣＲをラットの第一鎖ｃＤＮＡ上で実施した。１００μｌのＰＣＲ混合物は１０ｎｇの第一鎖ｃＤＮＡ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２を含むＴａｑポリメラーゼ用の１×ＰＣＲバッファー、２００μＭのｄＮＴＰ、１ＵのＴａｑポリメラーゼ及びそれぞれ１５０ｎｇの両者のプライマーを含有していた。ＰＣＲ条件は以下の通りである：９４℃での２分間の変性、引き続き９４℃で４５秒、５６℃で４５秒、７２℃で７５秒を４４サイクル。
【００８２】
１２７１塩基対の大きさの断片をＢａｍＨＩ及びＳａｃＩを介してｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ−中にクローニングした（ｐＢＣＲＦＲ１）。この配列は公表された配列Ｌ２５４３８（Ｃｈａｎｇ，  ＣＰ，  Ｐｅａｒｓｅ  ＲＶＩＩ，  Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌ  Ｓ及びＲｏｓｅｎｆｅｄ  ＭＧ著（１９９３）.  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｅｖｅｎ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｈｅｌｉｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｓａｕｖａｇｉｎｅ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｂｒａｉｎ．Ｎｅｕｒｏｎ，  １１，  １１８７−１１９５）と一致した。異種発現のためにこのｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ誘導体中に再クローニングした（ｐｅＣＲＦＲ１）。
【００８３】
ドロソフィラ由来のドパミンレセプターのｃＤＮＡ（Ｇｏｔｚｅｓ  Ｆ，  Ｂａｌｆａｎｚ  Ｓ及びＢａｕｍａｎｎ  Ａ．著（１９９４）  Ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｄｏｐａｍｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  Ｄ１／５  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ，  ２，  １３１−１４１）を含有するプラスミドｐｃＫ１ＭはＦ．Ｇｏｔｚｅｓの好意により提供された。
ＨＥＫ２９３細胞における異種発現及び安定な細胞株の製造
ＨＥＫ２９３細胞における一過性発現をＢａｕｍａｎｎ  Ａ，  Ｆｒｉｎｇｓ  Ｓ，  Ｇｏｄｄｅ  Ｍ，  Ｓｅｉｆｅｒｔ  Ｒ及びＫａｕｐｐ  ＵＢ．著（１９９４）  Ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｇａｔｅｄ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ｉｎ  ｅｙｅｓ  ａｎｄ  ａｎｔｅｎｎａｅ．ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １３，  ５０４０−５０５０に記載されるように実施した。電気生理学的特性決定のために、これらの細胞をトランスフェクションの翌日に、ポリ−Ｌ−リシンで被覆されているガラスプレート上に移した。電気生理学的調査を次いでその翌日に実施した。
【００８４】
安定な細胞株の製造のために細胞を同様にトランスフェクションさせた。所望の遺伝子を安定に発現する細胞クローンの選択のためにトランスフェクションの翌日に２×１０４細胞を９ｃｍの細胞培養皿上に播種した。この細胞を２０日間培養し、その際、細胞培養培地にＧ４１８（８００μｇ／ｍｌ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ゼオシン（１００μｇ／ｍｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又はハイグロマイシン（１００μｇ／ｍｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のいずれかを添加した。２０日後に、耐性遺伝子を発現する細胞クローンを単離し、かつＣＮＧチャネル遺伝子もしくはレセプター遺伝子の発現をウェスタンブロット及び機能的調査（電気生理学的測定及び蛍光光学的測定）によって調査した。ウェスタンブロット分析のために、細胞を溶菌バッファー中に均質化し（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１ｍＭのＤＴＴ及び１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、５回急速冷凍（液体窒素中）し、かつ最後に５５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。膜ペレットを溶解バッファー中に再懸濁（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、０．１ｍＭのＥＧＴＡ及び０．５％のトライトンＸ−１００）した。それぞれ３μｇの膜タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、イモビロン膜上に移し、かつ特異抗体で標識した。免疫活性をＥＣＬ−検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて可視化させた。
【００８５】
二重安定細胞株の製造のために、ＣＮＧチャネル遺伝子又はレセプター遺伝子のいずれかを発現する細胞クローンを更に培養し、かつそれぞれ別のｃＤＮＡによるトランスフェクションのために使用した。セレクション及び細胞クローンの選択は前記に記載のように実施した。
【００８６】
蛍光光学的測定のために部分的に、ＣＮＧチャネルの遺伝子修飾されたα３−サブユニットを安定に、かつドロソフィラ由来のドパミンレセプターを一過性に発現する細胞を使用した。このために安定なＴ５３７Ｍ−細胞株の細胞をＢａｕｍａｎｎ  Ａ，  Ｆｒｉｎｇｓ  Ｓ，  Ｇｏｄｄｅ  Ｍ，  Ｓｅｉｆｅｒｔ  Ｒ  ｕｎｄ  Ｋａｕｐｐ  ＵＢ．（１９９４）  Ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｇａｔｅｄ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ｉｎ  ｅｙｅｓ  ａｎｄ  ａｎｔｅｎｎａｅ．ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １３，  ５０４０−５０５０に記載されるようにトランスフェクションした。トランスフェクションの翌日にこれらの細胞を９６個のウェルを有するマルチウェルプレートに播種した。ウェルあたりの細胞密度は２×１０４細胞であった。
【００８７】
安定な細胞株の蛍光光学的測定のために、これらの細胞を測定の１〜２日前に９６個のウェルを有するマルチウェルプレートに播種した。細胞密度は１．５〜４×１０４細胞であった。
電気生理学
遺伝子修飾されたＣＮＧチャネル及び野生型のＣＮＧチャネルをそれぞれＨＥＫ２９３細胞中で異種発現させた（Ｂａｕｍａｎｎ  Ａ，  Ｆｒｉｎｇｓ  Ｓ，  Ｇｏｄｄｅ  Ｍ，  Ｓｅｉｆｅｒｔ  Ｒ  ｕｎｄ  Ｋａｕｐｐ  ＵＢ．（１９９４）  Ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｇａｔｅｄ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ｉｎ  ｅｙｅｓ  ａｎｄ  ａｎｔｅｎｎａｅ．ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １３，  ５０４０−５０５０）。遺伝子修飾されたＣＮＧチャネルの電気生理学的特性決定を電圧クランプ条件下にパッチ−クランプ法で実施した。チャネルの活性化特性を測定し、かつ野生型のチャネルの特性と比較した（図１〜４）：
遺伝子修飾されたＣＮＧチャネル又は野生型のＣＮＧチャネルを安定に発現する細胞からインサイドアウト−パッチを切り取った。この膜パッチを浴溶液中の種々の濃度の環状ヌクレオチドで再洗浄した。０ｍＶの保持電圧から出発して、電圧ジャンプを２０ｍＶのステップ幅で−１００ｍＶ〜＋１００ｍＶの試験電圧にこのパッチ上に印加した。電流を標準的方法で検知し、かつ分析した。
【００８８】
図１Ａはウシ由来のＣＮＧチャネルのＴ５３７Ｍ−α３−サブユニットの電流−電圧（ＩＶ）関係を示している。種々の濃度のｃＡＭＰにおける電圧（Ｖｍ）に対する平均電流（Ｉ）がプロットされている：０μＭ（塗りつぶしの丸）、０．３μＭ（白抜きの丸）、１μＭ（塗りつぶしの三角）、３μＭ（白抜きの三角）、１０μＭ（塗りつぶしの正方形）、３０μＭ（白抜きの正方形）、１００μＭ（塗りつぶしの菱形）。
【００８９】
図１Ｂは、＋１００ｍＶの電圧でのウシ由来のＣＮＧチャネルのＴ５３７Ｍ−α３−サブユニットについての、平均電流のｃＡＭＰ濃度に対する依存性を示している（塗りつぶしの方形）。実線はヒル式  Ｉ＝（Ｉｍａｘ−Ｉｍｉｎ）ｃｎ／（Ｋｎ＋ｃｎ）＋Ｉｍｉｎ（Ｉ：電流、Ｉｍａｘ：最大電流、Ｉｍｉｎ：最小電流、Ｋ１／２：チャネルが半値活性化されている濃度、ｎ：ヒル係数、ｃ：ｃＡＭＰ濃度）に従って以下のパラメータを用いて計算されている：Ｉｍａｘ＝３２８ｐＡ、Ｉｍｉｎ＝２４ｐＡ、Ｋ１／２＝２．９μＭ、ｎ＝２．４。
【００９０】
図１Ｃは＋１００ｍＶでの、ウシ由来のＣＮＧチャネルのＴ５３７Ｍ−α３−サブユニット（塗りつぶしの線）及びウシ由来の野生型のα３−サブユニット（点線）の規格化された用量−作用関係を示している。実線並びに点線は、規格化されたヒル式  Ｉｎｏｒｍ＝ｃｎ／（ｃｎ＋Ｋｎ）に従って、以下の平均的パラメータを用いて計算されている：（塗りつぶしの線：Ｋ１／２＝２．７μＭ、ｎ＝２．４、点線：Ｋ１／２＝８０μＭ、ｎ＝２．０）。
【００９１】
図２Ａはウシ由来のＣＮＧチャネルの異種発現されたＴ５３７Ｍ−α３−サブユニットの電流−電圧（ＩＶ）関係を示している。種々の濃度のｃＧＭＰにおける電圧（Ｖｍ）に対する平均電流（Ｉ）がプロットされている：０μＭ（塗りつぶしの丸）、１μＭ（白抜きの丸）、３μＭ（塗りつぶしの三角）、１０μＭ（白抜きの三角）、３０μＭ（塗りつぶしの正方形）、１００μＭ（白抜きの正方形）、３００μＭ（塗りつぶしの菱形）、２０００μＭ（白抜きの菱形）。
【００９２】
図２Ｂは、＋１００ｍＶの電圧でのウシ由来のＣＮＧチャネルのＴ５３７Ｍ−α３−サブユニットに関する、平均電流のｃＧＭＰ濃度に対する依存性を示している（塗りつぶしの方形）。実線はヒル式  Ｉ＝（Ｉｍａｘ−Ｉｍｉｎ）ｃｎ／（Ｋｎ＋ｃｎ）＋Ｉｍｉｎ（Ｉ：電流、Ｉｍａｘ：最大電流、Ｉｍｉｎ：最小電流、Ｋ１／２：チャネルが半値活性化されている濃度、ｎ：ヒル係数、ｃ：ｃＧＭＰ濃度）に従って以下のパラメータを用いて計算されている：Ｉｍａｘ＝１６７ｐＡ、Ｉｍｉｎ＝１１ｐＡ、Ｋ１／２＝１２．０μＭ、ｎ＝２．０。
【００９３】
図２Ｃは＋１００ｍＶでの、ウシ由来のＣＮＧチャネルのＴ５３７Ｍ−α３−サブユニット（塗りつぶしの線）及びウシ由来の野生型のα３−サブユニット（点線）の規格化された用量−作用関係を示している。実線並びに点線は、規格化されたヒル式  Ｉｎｏｒｍ＝ｃｎ／（ｃｎ＋Ｋｎ）に従って、以下の平均的パラメータを用いて計算されている：（塗りつぶしの線：Ｋ１／２＝１４．９μＭ、ｎ＝１．９、点線：Ｋ１／２＝１．６μＭ、ｎ＝２．０）。
【００９４】
図３Ａはウシ由来のＣＮＧチャネルの異種発現されたＴ５３７Ｖ−α３−サブユニットの電流−電圧（ＩＶ）関係を示している。種々の濃度のｃＡＭＰにおける電圧（Ｖｍ）に対する平均電流（Ｉ）がプロットされている：０μＭ（塗りつぶしの丸）、３μＭ（白抜きの丸）、１０μＭ（塗りつぶしの三角）、３０μＭ（白抜きの三角）、１００μＭ（塗りつぶしの正方形）、３００μＭ（白抜きの正方形）、１０００μＭ（塗りつぶしの菱形）。
【００９５】
図３Ｂは、＋１００ｍＶの電圧でのウシ由来のＣＮＧチャネルのＴ５３７Ｖ−α３−サブユニットに関する、平均電流のｃＡＭＰ濃度に対する依存性を示している（塗りつぶしの方形）。実線はヒル式  Ｉ＝（Ｉｍａｘ−Ｉｍｉｎ）ｃｎ／（Ｋｎ＋ｃｎ）＋Ｉｍｉｎ（Ｉ：電流、Ｉｍａｘ：最大電流、Ｉｍｉｎ：最小電流、Ｋ１／２：チャネルが半値活性化されている濃度、ｎ：ヒル係数、ｃ：ｃＡＭＰ濃度）に従って以下のパラメータを用いて計算されている：Ｉｍａｘ＝１８１ｐＡ、Ｉｍｉｎ＝１１ｐＡ、Ｋ１／２＝２３．４μＭ、ｎ＝２．２。
【００９６】
図３Ｃは＋１００ｍＶでの、ウシ由来のＣＮＧチャネルのＴ５３７Ｖ−α３−サブユニット（塗りつぶしの線）及びウシ由来の野生型のα３−サブユニット（点線）の規格化された用量−作用関係を示している。実線並びに点線は、規格化されたヒル式  Ｉｎｏｒｍ＝ｃｎ／（ｃｎ＋Ｋｎ）に従って、以下の平均的パラメータを用いて計算されている：（塗りつぶしの線：Ｋ＝３４μＭ、ｎ＝１．５、点線：Ｋ１／２＝８０μＭ、ｎ＝２．０）。
【００９７】
図４Ａはウシ由来のＣＮＧチャネルの異種発現されたＴ５３７Ｖ−α３−サブユニットの電流−電圧（ＩＶ）関係を示している。種々の濃度のｃＧＭＰにおける電圧（Ｖｍ）に対する平均電流（Ｉ）がプロットされている：０μＭ（塗りつぶしの丸）、３０μＭ（白抜きの丸）、１００μＭ（塗りつぶしの三角）、３００μＭ（白抜きの三角）、１０００μＭ（塗りつぶしの正方形）、２０００μＭ（白抜きの正方形）。
【００９８】
図４Ｂは、＋１００ｍＶの電圧でのウシ由来のＣＮＧチャネルのＴ５３７Ｖ−α３−サブユニットに関する、平均電流のｃＧＭＰ濃度に対する依存性を示している（塗りつぶしの方形）。実線はヒル式  Ｉ＝（Ｉｍａｘ−Ｉｍｉｎ）ｃｎ／（Ｋｎ＋ｃｎ）＋Ｉｍｉｎ（Ｉ：電流、Ｉｍａｘ：最大電流、Ｉｍｉｎ：最小電流、Ｋ１／２：チャネルが半値活性化されている濃度、ｎ：ヒル係数、ｃ：ｃＧＭＰ濃度）に従って以下のパラメータを用いて計算されている：Ｉｍａｘ＝１３８９ｐＡ、Ｉｍｉｎ＝１３ｐＡ、Ｋ１／２＝２５５．２μＭ、ｎ＝２．２。
【００９９】
図４Ｃは＋１００ｍＶでの、ウシ由来のＴ５３７Ｖ−α３−サブユニット（塗りつぶしの線）及びウシ由来の野生型のα３−サブユニット（点線）の規格化された用量−作用関係を示している。実線並びに点線は、規格化されたヒル式  Ｉｎｏｒｍ＝ｃｎ／（ｃｎ＋Ｋｎ）に従って、以下の平均的パラメータを用いて計算されている：（塗りつぶしの線：Ｋ＝２４１μＭ、ｎ＝２．１、点線：Ｋ１／２＝１．６μＭ、ｎ＝２．０）。
蛍光光学的測定
細胞内Ｃａ２＋濃度の蛍光測定を９６個のウェルを有するマルチウェル中で実施した（図５Ａ〜５Ｇ）。細胞を測定の１時間前にＣａ２＋感受性蛍光色素Ｆｌｕｏ−４で負荷した。負荷溶液は１２０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、５０ｍＭのグルコース、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、３ｍＭのＭｇＣｌ２及び４μＭのＦｌｕｏ４−ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を含有していた。測定溶液は１２０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、５０ｍＭのグルコース、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）及び３ｍＭのＣａＣｌ２を含有していた。アゴニスト、アンタゴニスト、酵素アクチベーター又は酵素インヒビターの添加後に蛍光強度の経時変化を蛍光リーダ（ＦＬＵＯｓｔａｒ、ＢＭＧ−Ｌａｂｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で確認した。励起波長は４８５ｎｍであった。発光波長は５２０ｎｍであった。
【実施例５】
【０１００】
図５Ａは、ドロソフィラ由来のドパミンレセプター（ＤＲ）（Ｇｏｔｚｅｓ，  Ｆ．，  Ｂａｌｆａｎｚ，  Ｓ．  ａｎｄ  Ｂａｕｍａｎｎ，  Ａ．  （１９９４）：“Ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｄｏｐａｍｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  Ｄ１／５  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ”，  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ，  ２，  １３１−１４１）を一過性に、かつα３−ＣＮＧチャネルのＴ５３７Ｍ突然変異体を安定に発現する細胞における細胞内Ｃａ２＋濃度の蛍光測定された変化を示している。種々の濃度のアゴニストのドパミンによる細胞の刺激後の蛍光強度（ＲＦＵ：相対蛍光単位）の時間的過程を示している。矢印は細胞をドパミンで刺激した時点を示している。ドパミンレセプターのドパミンに誘導される活性化は細胞中にまず刺激性Ｇタンパク質の活性化をもたらし、かつ最終的にｃＡＭＰを合成するアデニル酸シクラーゼの活性化をもたらす。ｃＡＭＰの結合によってＣＮＧチャネルが開放し、かつＣａ２＋イオンが細胞内に流入する。Ｃａ２＋濃度の変化の速度及び程度はドパミン濃度に依存する。ドパミン濃度は２５ｎＭ（塗りつぶしの丸）、５０ｎＭ（白抜きの丸）、４００ｎＭ（塗りつぶしの三角）又は６００ｎＭ（白抜きの三角）であった。比較のために、ドパミンレセプターを発現しない細胞を２５ｎＭのドパミンで刺激した（塗りつぶしの四角）。
【実施例６】
【０１０１】
図５Ｂは、副腎皮質ホルモン放出因子（ＣＲＦ）レセプターとα３−ＣＮＧチャネルのＴ５３７Ｍ突然変異体のいずれも安定に発現する細胞中の細胞内Ｃａ２＋濃度の蛍光測定された変化を示している。アゴニストのＣＲＦでの細胞の刺激の後の蛍光強度の時間的過程を示している。矢印は細胞をＣＲＦで刺激した時点を示している。ＣＲＦレセプターのＣＲＦに誘導される活性化は、まず刺激性Ｇタンパク質の活性化をもたらし、かつ最終的にｃＡＭＰを合成するアデニル酸シクラーゼの活性化をもたらす（例えばＥｃｋａｒｔ  Ｋ，  Ｒａｄｕｌｏｖｉｃ  Ｊ，  Ｒａｄｕｌｏｖｉｃ  Ｍ，  Ｊａｈｎ  Ｏ，  Ｂｌａｎｋ  Ｔ，  Ｓｔｉｅｄｌ  Ｏ．  ｕｎｄ  Ｓｐｉｅｓｓ  Ｊ．  （１９９９）  Ａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＣＲＦ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｎａｌｏｇｓ．Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．，  ６，  １０３５−１０５３；  Ｐｅｒｒｉｎ，  Ｍ．Ｈ  ａｎｄ  Ｖａｌｅ，  Ｗ．Ｗ  （１９９９）．Ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ  ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｌｉｇａｎｄ  ｆａｍｉｌｙ．  Ａｎｎ．  Ｎ．  Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ８８５，  ３１２−３２８を参照）。ｃＡＭＰの結合によってＣＮＧチャネルが開放し、かつＣａ２＋イオンが細胞内に流入する。Ｃａ２＋濃度の変化の速度及び程度はＣＲＦ濃度に依存する。ＣＲＦ濃度は１００ｐＭ（塗りつぶしの三角）、３００ｐＭ（白抜きの丸）又は１０００ｐＭ（塗りつぶしの丸）であった。
【０１０２】
図５Ａ及び５Ｂは、例えば刺激性Ｇタンパク質に結合する２つの異なるＧＣＲＰに関して、本発明による方法によってこのＧＣＲＰに対するアゴニストの作用を高い感度で測定できることを示している。この方法は同様に、刺激性Ｇタンパク質に結合する全ての別のＧＣＲＰのために適当である。図５Ａ及び５Ｂからの例は、本発明による方法に関して、異種発現されるタンパク質（遺伝子修飾されたＣＮＧチャネルのα−サブユニット及びＧＣＲＰ）を細胞内で一過性にも安定にも発現できることを示している。
【実施例７】
【０１０３】
図５Ｃは、この方法が種々のアゴニストの作用を定量的に測定するために適している。副腎皮質ホルモン放出因子（ＣＲＦ）レセプター及びα３−ＣＮＧチャネルのＴ５３７Ｍ−突然変異体を安定に発現する細胞をヘリックス型のアンタゴニスト９−４１（Ｒｉｖｉｅｒ  Ｊ，  Ｒｉｖｉｅｒ  Ｃ．  ａｎｄ  Ｖａｌｅ，  Ｗ．Ｗ．  （１９８４）  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｏｆ  ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ：ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  ＡＣＴＨ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２２４，  ８８９−８９１）で処理し、それからＣＲＦ（１ｎＭ）で刺激した。蛍光強度の時間的過程を示している。矢印は細胞をＣＲＦで刺激した時点を示している。同じＣＲＦ濃度ではＣａ２＋濃度の変化の速度及び程度はアンタゴニストの濃度に依存する。アンタゴニストの濃度は０ｎＭ（塗りつぶしの丸）、１０ｎＭ（白抜きの丸）又は１００ｎＭ（塗りつぶしの三角）であった。
【実施例８】
【０１０４】
図５Ｄは、この方法が規定の酵素アクチベーターの作用を測定するために適していることを示している。細胞内Ｃａ２＋濃度の変化に対するアデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）のアクチベーターの効果を示している。α３−ＣＮＧチャネルのＴ５３７Ｍ−突然変異体を安定に発現する細胞を種々の濃度のＡＣアクチベーターのフォルスコリンで刺激した。蛍光強度の時間的過程を示している。矢印は細胞をフォルスコリンで刺激した時点を示している。
【０１０５】
フォルスコリンは細胞の内因性アデニル酸シクラーゼを直接的に活性化する（Ｓｅａｍｏｎ，  Ｋ．Ｂ．及びＤａｌｙ，  Ｊ．Ｗ．著（１９８１）  Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ：ａ  ｕｎｉｑｕｅ  ｄｉｔｅｒｐｅｎｅ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｃｙｃｌｉｃ  ＡＭＰ−ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍｓ．  Ｊ．  Ｃｙｃｌｉｃ．  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｒｅｓ．，  ７，  ２０１−２２４）。
【０１０６】
細胞内Ｃａ２＋濃度の変化の速度及び程度はＡＣアクチベーター濃度に依存する。フォルスコリンの濃度は０．５μＭ（白抜きの三角）、０．７５μＭ（塗りつぶしの三角）、２μＭ（白抜きの丸）又は４μＭ（塗りつぶしの丸）であった。
【実施例９】
【０１０７】
図５Ｅは、この方法が規定の酵素インヒビターの作用を測定するために適していることを示している。細胞内Ｃａ２＋濃度のフォルスコリンに誘導される変化に対するホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）インヒビターの効果を示している。α３−ＣＮＧチャネルのＴ５３７Ｍ−突然変異体を安定に発現する細胞を、まず種々の濃度のＰＤＥインヒビターのＩＢＭＸで処理し、次いで５μＭのフォルスコリンで刺激した。蛍光強度の時間的過程が適用されている。矢印は細胞をフォルスコリンで刺激した時点を示している。ＰＤＥインヒビターは内因性ＰＤＥの活性を刺激し、かつそれによって内因性ＡＣの刺激によって合成されるｃＡＭＰの合成を低減させる。細胞内Ｃａ２＋濃度の変化の程度はＰＤＥインヒビターの濃度に依存する。ＩＢＭＸ濃度は０μＭ（塗りつぶしの丸）、１０μＭ（白抜きの丸）、５０μＭ（塗りつぶしの三角）又は１００μＭ（白抜きの三角）であった。
【０１０８】
この例は、この方法がＰＤＥインヒビターの作用を高感度で測定するために適していることを示している。内因性ＰＤＥのインヒビター、また異種発現されたＰＤＥのインヒビターを調査できる。
【０１０９】
本発明による方法は、阻害性Ｇタンパク質のＧｉに結合するＧＣＲＰの活性の測定のためにも適している。このようなＧＣＲＰが活性化されると、細胞中のｃＡＭＰ濃度が低下する。それというのもＡＣが阻害されるからである。本発明による方法のために、細胞をまずｃＡＭＰ合成のために刺激し（例えばＡＣアクチベーターのフォルスコリン）、それから次いでアゴニストの活性を測定することができる。アンタゴニスト及びアゴニストの同時の又は連続的な適用によって、このようなＧＣＲＰについてのアンタゴニストの作用を試験できる。
【０１１０】
この方法は同様に、何らかの様式で細胞内のｃＡＭＰ濃度を高める又は低めることができる全ての物質の測定のために適している。前記の物質（例えばＧＣＲＰ又は酵素）の直接的な攻撃点は細胞中に内在的に存在するか、又は遺伝子修飾されたＣＮＧチャネルと一緒に細胞内で一過性に又は安定に発現することができる。
【実施例１０】
【０１１１】
図５Ｆ（１）は、この方法によって定量分析も可能であることを示している。内因性アデノシンレセプター（Ｃｏｏｐｅｒ，  Ｊ．，  Ｈｉｌｌ，  Ｓ．Ｊ．及びＡｌｅｘａｎｄｅｒ，  Ｓ．Ｐ．著（１９９７）：“Ａｎ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  Ａ２Ｂ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｔｏ  ｃｙｃｌｉｃ  ＡＭＰ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  （ＨＥＫ  ２９３）  ｃｅｌｌｓ”，  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，  １２２，  ５４６−５５０）及びα３−ＣＮＧチャネルのＴ５３７Ｍ−突然変異体を安定に発現する細胞を種々の濃度のアデノシンで刺激した。蛍光強度の時間的過程を示している。矢印は細胞をアデノシンで刺激した時点を示している。アデノシンレセプターのアデノシンに誘導される活性化は細胞中にまず刺激性Ｇタンパク質の活性化をもたらし、かつ最終的にｃＡＭＰを合成するアデニル酸シクラーゼの活性化をもたらす。ｃＡＭＰの結合によってＣＮＧチャネルが開放し、かつＣａ２＋イオンが細胞内に流入する。Ｃａ２＋濃度の変化の速度及び程度はアデノシン濃度に依存する。アデノシン濃度は０．９μＭ（塗りつぶしの丸）及び１．５μＭ（白抜きの丸）、３μＭ（塗りつぶしの三角）、６μＭ（白抜きの三角）、２５μＭ（塗りつぶしの四角）又は３７．５μＭ（白抜きの四角）であった。
【０１１２】
図５Ｆ（２）はアデノシンについての用量−作用関係を示している。アデノシンの添加後に蛍光が変化する速度（初期速度）はアデノシンの濃度に相関する。初期速度はアデノシン濃度に対してプロットされている。実線はヒル式：初期上昇＝ａ×ｃｎ／（Ｋｎ＋ｃｎ）ｎ（ｃ＝アデノシン濃度、Ｋ：半最大の初期速度に達する濃度、ｎ：ヒル係数、ａ＝最大初期上昇）に従って以下のパラメータを用いて計算されている：ａ＝１４０３ＲＦＵ／秒、Ｋ＝５．１５μＭ、ｎ＝２．１６）。こうして計算されたＫ１／２値は文献に挙げられる５μＭの値と非常に良好に一致する（Ｐｅａｋｍａｎ，  Ｍ．Ｃ．及びＨｉｌｌ，  Ｓ．Ｊ．著  （１９９４）  Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  Ａ２Ｂ−ｒｅｃｅｐｔｏｒｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｃｌｉｃ  ＡＭＰ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｒａｔ  ａｔｒｏｃｙｔｅｓ．  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，  １１１，  １９１−１９８）。
【実施例１１】
【０１１３】
図５Ｇはα３−ＣＮＧチャネルの修飾されたサブユニットの使用による測定系の感度の相当の改善を裏付けている。α３−ＣＮＧチャネルのＴ５３７Ｍ−突然変異体を安定に発現する細胞は３μＭのアデノシン（白抜きの丸）で半最大刺激され、又は２５μＭのアデノシン（塗りつぶしの丸）で最大刺激された。細胞内Ｃａ２＋濃度（蛍光シグナル）の変化の程度は時間に対してプロットされた。矢印は細胞をアデノシンで刺激した時点を示している。半最大のアデノシン濃度による刺激の後にすでに蛍光シグナルの明らかな上昇が観察できる。それに対して、野生型のα３−ＣＮＧチャネルを安定に発現する細胞は２５μＭのアデノシンでの最大の刺激の後でさえも、蛍光シグナル（塗りつぶしの三角）の増大を示さない。比較するとα３−ＣＮＧチャネルのＴ５３７Ｓ−突然変異体を安定に発現する細胞も刺激された。内因性のアデノシンレセプターの最大刺激の後に、非常に僅かな蛍光シグナルの上昇だけが観察できる（塗りつぶしの四角）。
【０１１４】
本発明による遺伝子修飾されたサブユニットの使用によって、ｃＡＭＰシグナル経路に影響を及ぼす物質の作用の調査のための細胞内テストシステムの感度はかなり増大し、かつそれによって初めて実用可能になる。このシグナルは定量分析も可能にするほど非常に大きく、かつ信号／雑音比もこうして非常に良好である。
【０１１５】
本発明による細胞株（ＨＥＫ２９３細胞だけでなく）、細胞培養で培養可能な原則的に全ての真核細胞の製造のために適当である。接着増殖された細胞も懸濁液で増殖された細胞も使用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１Ａ】図１Ａはウシ由来のＣＮＧチャネルのＴ５３７Ｍ−α３−サブユニットの電流−電圧（ＩＶ）関係を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、＋１００ｍＶの電圧でのウシ由来のＣＮＧチャネルのＴ５３７Ｍ−α３−サブユニットについての、平均電流のｃＡＭＰ濃度に対する依存性を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは＋１００ｍＶでの、ウシ由来のＣＮＧチャネルのＴ５３７Ｍ−α３−サブユニット（塗りつぶしの線）及びウシ由来の野生型のα３−サブユニット（点線）の規格化された用量−作用関係を示す。
【図２Ａ】図２Ａはウシ由来のＣＮＧチャネルの異種発現されたＴ５３７Ｍ−α３−サブユニットの電流−電圧（ＩＶ）関係を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、＋１００ｍＶの電圧でのウシ由来のＣＮＧチャネルのＴ５３７Ｍ−α３−サブユニットに関する、平均電流のｃＧＭＰ濃度に対する依存性を示す（塗りつぶしの方形）。
【図２Ｃ】図２Ｃは＋１００ｍＶでの、ウシ由来のＣＮＧチャネルのＴ５３７Ｍ−α３−サブユニット（塗りつぶしの線）及びウシ由来の野生型のα３−サブユニット（点線）の規格化された用量−作用関係を示す。
【図３Ａ】図３Ａはウシ由来のＣＮＧチャネルの異種発現されたＴ５３７Ｖ−α３−サブユニットの電流−電圧（ＩＶ）関係を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、＋１００ｍＶの電圧でのウシ由来のＣＮＧチャネルのＴ５３７Ｖ−α３−サブユニットに関する、平均電流のｃＡＭＰ濃度に対する依存性を示す（塗りつぶしの方形）。
【図３Ｃ】図３Ｃは＋１００ｍＶでの、ウシ由来のＣＮＧチャネルのＴ５３７Ｖ−α３−サブユニット（塗りつぶしの線）及びウシ由来の野生型のα３−サブユニット（点線）の規格化された用量−作用関係を示す。
【図４Ａ】図４Ａはウシ由来のＣＮＧチャネルの異種発現されたＴ５３７Ｖ−α３−サブユニットの電流−電圧（ＩＶ）関係を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、＋１００ｍＶの電圧でのウシ由来のＣＮＧチャネルのＴ５３７Ｖ−α３−サブユニットに関する、平均電流のｃＧＭＰ濃度に対する依存性を示す（塗りつぶしの方形）。
【図４Ｃ】図４Ｃは＋１００ｍＶでの、ウシ由来のＴ５３７Ｖ−α３−サブユニット（塗りつぶしの線）及びウシ由来の野生型のα３−サブユニット（点線）の規格化された用量−作用関係を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、細胞内Ｃａ２＋濃度の蛍光測定された変化を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、細胞内Ｃａ２＋濃度の蛍光測定された変化を示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、この方法が種々のアゴニストの作用を定量的に測定するために適することを示す。
【図５Ｄ】図５Ｄは、この方法が規定の酵素アクチベーターの作用を測定するために適していることを示す。
【図５Ｅ】図５Ｅは、この方法が規定の酵素インヒビターの作用を測定するために適していることを示す。
【図５Ｆ（１）】図５Ｆ（１）は、この方法によって定量分析も可能であることを示す。
【図５Ｆ（２）】図５Ｆ（２）はアデノシンについての用量−作用関係を示す。
【図５Ｇ】図５Ｇはα３−ＣＮＧチャネルの修飾されたサブユニットの使用による測定系の感度の相当の改善を示す。
【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ（１）】
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【図５Ｆ（２）】
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【図５Ｇ】
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【国際公開パンフレット】
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2005507245.tif 000102
2005507245.tif 000103
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005507245.tif 000104
【国際調査報告】
2005507245.tif 000105
2005507245.tif 000106
2005507245.tif 000107
2005507245.tif 000108
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