(57)【要約】本発明は、２つの価を含むワクチン組成物に関する；（ｉ）第１の価は、水酸化アルミニウムでアジュバント増強されているものであり、（ｉｉ）第２の価は、１個またはそれ以上のＯ−アセチル基を含む細菌の莢膜多糖を含有しており、かつ、リン酸塩、クエン酸塩または炭酸塩であり得、その吸着を防止する保護化合物の存在のために酸化アルミニウムに吸着されないものである。第１の価は、いずれのワクチン価であってもよい。一の特定の実施態様において、ワクチン組成物は、（ｉ）水酸化アルミニウムに吸着されているＡ型肝炎価、および（ｉｉ）サルモネラ・ティフィ（Salmonella typhi）莢膜多糖Ｖｉによって形成される腸チフス価を含有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）水酸化物基を含むアルミニウム化合物を用いてアジュバント処理されている第１の価、（ｉｉ）１個またはそれ以上のＯ−アセチル基を含む細菌の莢膜多糖を含有する第２の価、および（ｉｉｉ）リン酸イオン、クエン酸イオンまたは炭酸イオンを含むワクチン組成物。
【請求項２】
第１の価がＡ型肝炎価である請求項１記載のワクチン組成物。
【請求項３】
Ａ型肝炎価が不活化Ａ型肝炎ウイルスからなる請求項２記載のワクチン組成物。
【請求項４】
第２の価がサルモネラ・ティフィ（Salmonella typhi）莢膜多糖Ｖｉからなる腸チフス価である請求項１〜３いずれか１項記載のワクチン組成物。
【請求項５】
腸チフス価が少なくとも２４か月間安定な抗原力価を有する請求項４記載のワクチン組成物。
【請求項６】
第１の価が、水酸化アルミニウムまたはヒドロキシリン酸アルミニウムであるアルミニウム化合物を用いてアジュバント処理されている請求項１〜５いずれか１項記載の組成物。
【請求項７】
第１の価がアルミニウム化合物への吸着によりアジュバント処理されている請求項１〜６いずれか１項記載の組成物。
【請求項８】
（ｉ）水酸化物基を含むアルミニウム化合物を用いてアジュバント処理されている第１の価を含有する調製物にリン酸イオン、クエン酸イオンまたは炭酸イオンを添加すること；および
（ｉｉ）（ｉ）で得られた調製物を、１個またはそれ以上のＯ−アセチル基を含む細菌の莢膜多糖からなる第２の価を含有する調製物と混合すること
を含む、請求項１〜７いずれか１項記載のワクチン組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、特に、Ｖｉ価がその免疫原性を少なくとも約２４か月間維持する、安定化された二価のＡ型肝炎／腸チフス（ＨＡ−Ｖｉ）ワクチン組成物に関する。
【０００２】
Ａ型肝炎および腸チフスは、既にワクチンが存在している２つの疾患である。それらは、共に、衛生状態が最適とは掛け離れている世界の地域に見られる。個々の感染因子は共通の伝染経路（口−糞便経路）を有しており、かつ、これらの疾患は風土病の地域が非常に重複しているので、これらの２つの価を同一製剤中にて併用することが有利であると考えられる。特に、旅行者のためのワクチンの範囲内では、ＨＡ−Ｖｉ配合物は、別々に投与しなければならない２つの一価のＨＡおよびＶｉワクチンよりも魅力的であることは容易に理解されよう。
【０００３】
ＨＡ価およびＶｉ価が、特に、無害性、免疫原性および安定性の面で適合することを証明するための研究が既に行われている。これらの研究は、市場に既存している一価のワクチンから調製されたＨＡ−Ｖｉ配合物を使用している；これらの研究には主として２つの研究がある；第１に、スミスクライン・ビーチャム・バイオロジカルス（SmithKline Beecham Biologicals）（ベルギー国リクセンザルト）により生産されているＨａｖｒｉｘTM（ＨＡ）および（Ｖｉ）の一価のワクチンを組み合わせることにより行われた研究、第２に、アヴァンティ・パストゥール（Aventis Pasteur）（フランス国リヨン）により生産されているＡｖａｘｉｍTM（ＨＡ）およびＴｙｐｈｉｍ ＶｉTM（Ｖｉ）の一価のワクチンを組み合わせることにより行われた研究。
【０００４】
これらの２つの研究において、一価のＨＡワクチンは、水酸化アルミニウムに吸着された不活化Ａ型肝炎ウイルスからなる。同様に、一価の腸チフスワクチンは、アジュバント処理されないままのサルモネラ・ティフィ（Salmonella typhi）莢膜多糖からなる。最終的に、二価の配合物は、同一の方法で、対応する一価のワクチンを単に混ぜ合わせることにより調製される（これらの一価のワクチンは液体剤形で市場にでている）。かくして、１回投与量のＡｖａｘｉｍTMおよび１回投与量のＴｙｐｈｉｍ ＶｉTMを一緒に混ぜ合わせて１回投与量の二価のＨＡ−Ｖｉ配合物が得られる。
【０００５】
これらの２つの研究は、臨床試験に関しては注射投与の２０か月未満前に調製した配合物を用いて行われた。これらの研究は、特に、免疫原性の面で二価の配合物が対応する一価のワクチンと等価であることを示した。スミスクライン・ビーチャム・バイオロジカルスの二価の配合物はイギリス政府当局の要求を満たしており、既にその国における販売許可を受けている。しかしながら、この許可には、製造から１２か月という満了期限の制約がある。
【０００６】
ワクチンの分野では、１２か月の満了期限は、特に、流通前のバッチの管理に要する時間を考慮すれば、十分であるとは考えられない。２４か月、またはより好ましくは、３６か月に満了期限を設定することにより、バッチの販売が非常に容易になる。
【０００７】
この度、本発明者は、ＨＡ−Ｖｉ配合物の場合、製造日から１６〜１８か月を超えるとＶｉ価がその免疫原性を徐々に失うことに気づき、この不安定性の原因に関する仮説を唱えた。詳細には、Ｖｉの免疫原性の特性を示しているＶｉ多糖のＯ−アセチル基が、特に、アルカリ性条件下では、経時的に加水分解する。この加水分解は、Ｖｉ多糖の免疫原性の低下の原因であると考えられ、ＨＡ価のアジュバントとして二価の配合物中に存在する水酸化アルミニウムへのＶｉ成分の吸着によるものと考えられる。Ｖｉ価は、一価のワクチン同士を互いに混ぜ合わせるとすぐにアルミニウムゲルに吸着する。この吸着により、Ｖｉ多糖はアルカリ性環境中に維持される。詳しくは、水酸化アルミニウムは正に荷電されているので、媒質のＯＨ−イオンを引き付け、これによりＶｉが吸着の後に位置するアルミニウムゲルの微小環境中のｐＨが上昇する。Ｏ−アセチルの加水分解に関しては、これは非常に遅い現象であり、その影響は約１６〜１８か月後に実際には顕著となる。
【０００８】
本発明者は、Ｖｉ価の経時的な不安定さの課題を示しただけではなく、二価の配合物に、Ｖｉ価のアルミニウムゲルへの吸着を防止すると同時にＨＡ価をアジュバント処理形態に維持する化合物を加えることにある解決を提供する。有利には、この化合物は、リン酸イオンまたはクエン酸イオンのような陰イオンであり得る。
【０００９】
その最も一般的な教示において、本発明は、（ｉ）水酸化アルミニウムを用いてアジュバント処理されている第１の価、および（ｉｉ）１個またはそれ以上のＯ−アセチル基を含む細菌の莢膜多糖を含有する第２の価であって、第１の価の吸着を妨げることなく第２の価の水酸化アルミニウムへの吸着を防止する付加的化合物の存在により、それによって第１の価がアジュバント処理される水酸化アルミニウムには吸着されない第２の価を含むワクチン組成物に関する。
【００１０】
有利な実施態様によれば、第２の価の吸着は、ワクチン目的に使用するのに必要とされる全ての安全性の保証を有するという条件で、保護陰イオン化合物の存在により防止され得る。この保護化合物は、ホスフェート、シトレート、またはカーボネートであり得る。種々の陰イオンの組合せ、例えば、リン酸イオンおよびクエン酸イオンの組合せを使用することもできる。参考までに、リン酸イオンは、特に、リン酸一カリウム、リン酸二ナトリウムおよび塩化ナトリウムを含有する溶液により提供され得る。
【００１１】
特に、保護化合物の使用は、長期間（２４か月またはそれ以上）にわたって、好ましくは、通常の貯蔵温度またはそれ以上（例えば、３７℃）での保存の間じゅう、第２の価の抗原性を安定させることができる。免疫原性の安定性は、種々の技法を用い、当該組成物の生産時に免疫原性を測定し、次いで、経時的にまたは生産日から少なくとも２４か月後に同測定を行い、得られた結果を比較することにより評価することができる。得られた数値が互いに統計学的に異なるとは示されない場合に免疫原性が安定であると考えるべきである。抗原の免疫原性は、特に、ワクチンの分野で一般的に用いられているＥＬＩＳＡ技法によりアッセイされ得る。
【００１２】
第１の価は、もちろんそれがアジュバント処理される必要があるという条件で、タイプの制限も構造の制限もなしにいずれものワクチン価であってよい。特に、Ａ型肝炎（ＨｅｐＡまたはＨＡ）価、Ｂ型肝炎（ＨｅｐＢ）価および肺炎球菌価が挙げられる。この第１の価は、不活化ＨＡウイルスまたは不活化ポリオウイルスのような不活化ウイルス；弱毒化ウイルス；Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原またはジフテリアもしくは破傷風毒素のようなウイルス性または細菌性サブユニット抗原からなっていてよい。
【００１３】
第２の価は、定義により、複合であってもなくてもよい、その反復単位内に１個またはそれ以上のＯ−アセチル基を含む多糖からなる。サルモネラ・ティフィの莢膜多糖（Ｖｉ多糖とも称される）およびナイセリア・メニンギティディス（Neisseria meningitidis）グループＡの莢膜多糖は、この定義を満足している。したがって、これらの場合、Ｖｉまたは腸チフス価およびメニンゴ（meningo）Ａ価が挙げられる。
【００１４】
「細菌の莢膜多糖」なる用語は、莢膜多糖に特徴的な鎖の反復単位からなる多糖を意味するものであり、それはどのくらいの大きさであってもよく、かつ、補足的な修飾とも無関係である。本発明の組成物を構成する多糖の反復単位は、必ず、少なくとも１個のＯ−アセチル基を含んでいる。
【００１５】
本発明の目的のために、該多糖は、全く慣用的な技法に従って起源の細菌から精製された形態で得られ得る。必要に応じて、該多糖は、（ｉ）断片化されているかまたはされていなくてもよく、（ｉｉ）ジフテリア毒素または破傷風毒素のような担体ポリペプチドに結合されているかまたはされていなくてもよい。
【００１６】
さらに詳しくは、本発明の課題は、（ｉ）水酸化アルミニウムを用いてアジュバント処理されているＨＡ価および（ｉｉ）Ｖｉ多糖からなる腸チフス価を含むワクチン組成物であり；これは、Ｖｉ価が水酸化アルミニウムに吸着されていない組成物である。
【００１７】
本発明の目的のために、第１の価は、水酸化アルミニウムによる沈降または水酸化アルミニウムへの吸着によりアジュバント処理され得る。
【００１８】
第１の価をアジュバント処理するのに使用される水酸化アルミニウムは、純粋な水酸化アルミニウム（すなわち、Ａｌ３＋イオンおよび水酸化物基だけを含むアルミニウム化合物）、または化学的見解からそれらが水酸化アルミニウムだけからなっているわけではなくてもこの名称の下に知られているいずれものアルミニウムであってよい。かくして、それらはまた、ヒドロキシリン酸アルミニウムまたはヒドロキシ硫酸アルミニウムの名の下に示されるもののようなアルミニウム化合物を混合したものであってもよい。一般に、それらは、特に、水酸化物基を含むいずれものアルミニウム化合物であってよい。例えば、スーパーフォス・バイオセクター（Superfos Biosector）という会社により市販されている水酸化アルミニウム、ＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌTMが挙げられる。
【００１９】
リン酸イオン、クエン酸イオン、または炭酸イオン（保護化合物）は、第２の価の吸着を防止すると同時に第１の価をアジュバント処理形態に維持するのに十分な量で添加しなければならない。この量は、種々の因子、とりわけ、第１の価の量および性質、そのアジュバント処理方法、水酸化アルミニウムの量および性質、ならびに第２の価の量に左右される。ワクチン分野の当業者は、水酸化アルミニウムがリン酸イオンで飽和されると同時に第１の価をアジュバント処理状態に維持するように残りの因子がいったん確立されると第２の価の吸着を防止するのに適当な該化合物の量を決定するために、これらの制約を考慮することが完全にできる。
【００２０】
しかしながら、市販のワクチンは慣用的に１ｍｌあたりアルミニウム０.６〜１.５ｍｇを含有する。市販のＨｅｐＡワクチンにおいては、アルミナゲルの吸着部位が少しも飽和されていないので、慣用の投与量（アルミニウムの量として表される）で存在するアルミナゲルはＨｅｐＡ抗原に対して大過剰である。かくして、実際的には、アルミニウムの量だけが、存在していなければならない保護化合物の量を確立する際の決定因子であると考えられる。
【００２１】
容量０.５ｍｌ中に水酸化アルミニウムの形態でアルミニウム０.３ｍｇを含有する本発明の組成物については、約２０ｍＭのリン酸イオンが添加されるべきである。この同容量中のアルミニウムの投与量が２倍である場合、２倍の量、すなわち４０ｍＭのリン酸イオンが添加されるべきである。しかしながら、容量１ｍｌ中にアルミニウム０.６ｍｇを含有する本発明の組成物については、２０ｍＭのリン酸イオンで十分である。
【００２２】
例えば、本発明の二価のワクチンは、容量０.５ｍｌ中に、（ｉｉ）アルミニウム０.３ｍｇを含有する水酸化アルミニウムに吸着した（ｉ）１６０抗原単位または１４４０ ＥＬＩＳＡ単位の不活化Ａ型肝炎ウイルス；（ｉｉｉ）Ｖｉ多糖０.０２５ｍｇ；および（ｉｖ）２０ｍＭのリン酸イオンを含有し得る。
【００２３】
上記抗原単位およびＥＬＩＳＡ単位は、各々、アヴァンティ・パストゥールおよびスミスクライン・ビーチャム・バイオロジカルスに固有の基準ＥＬＩＳＡアッセイを使用して確立された単位である（van Hoecke et al., J. Travel. Med. (1998) 5: 116 および Andre et al., in Prog. Med. Virol., Melnick JL Ed, Basle, Karger (1990) 37:72）。ＨｅｐＡワクチンについての国際的な標準化された基準はないので、他には考えられない。
【００２４】
本発明の組成物は、有利には、液体形態であり、ワクチン製剤は、有利には、０.５ｍｌ以上１ｍｌ以下の容量に処方される。
【００２５】
本発明の組成物は、
（ｉ）水酸化アルミニウムを用いてアジュバント処理されている、腸チフス価以外の価を含有する調製物にリン酸イオン、クエン酸イオンまたは炭酸イオンを添加すること；および
（ｉｉ）（ｉ）で得た調製物と、腸チフス価を含有する調製物とを混合すること
により調製され得る。
【００２６】
実施例：本発明のＨＡ Ｖｉ組成物の調製
Ａ − 吸着したＨＡ成分の調製
抗原力価が８８５ ＥＬＩＳＡ単位／ｍｌである不活化ＨＡウイルスのバッチ９９ｍｌを２５％の２−フェノキシエタノール５.９４ｍｌと混合する。１５分間ホモジナイズし、次いで、該調製物をＭｉｌｌｉｐａｋ ４０ ＭＰＧＬ ０４ＳＨ２フィルターにて濾過する。濾過後、８３５ ＥＬＩＳＡ単位／ｍｌの力価を有する調製物９５ｍｌを得る。
この調製物にアルミニウム３.１４ｍｇ／ｍｌを含有するアルミナゲル４７.５ｍｌを添加する。４０ｍＭ ＰＢＳ（リン酸緩衝液）４８ｍｌで容量を調整する。該混合物を５℃で一夜（１８時間）撹拌してＨＡ成分をアルミナゲルに吸着させる。ｐＨは７.２８である。
【００２７】
Ｂ − Ｖｉ多糖の１０倍濃縮溶液の調製
Gotschlich et al., Prog. Immunobiol. Standard (1972) 5:485 の方法に従って、Ｖｉ多糖粉末を調製する。Ｖｉ １６.６４ｍｇ（残留水９.５グラム％、すなわち、乾燥重量１５.０６ｍｇ）を入れた３０ｍｌフラスコに、注射用に調製した（ｐｆｉ）蒸留水２５.１ｍｌを少しずつ、連続的に撹拌しながら注ぐ。この撹拌を５℃で２４時間続けて多糖を完全に溶解させる。この調製物を０.２２μｍ Ｍｉｌｌｅｘ ＧＶ ＳＬＧＶ ０２５フィルターで濾過する。フィルターをｐｆｉ蒸留水５ｍｌですすぐ。最終容量は３０.１ｍｌである。
【００２８】
Ｃ − 二価のＨＡＶｉワクチンの調製
上記工程Ａで得た調製物（ＨＡ）６２ｍｌに９４ｍＭのリン酸塩溶液１０.６ｍｌ、次いで、上記工程Ｂで得た調製物（Ｖｉ）８.１ｍｌを添加する。このようにして得られるワクチンの特徴は、以下のとおりである：
最終リン酸塩濃度：  ２０ｍＭ
ｐＨ：  ７.３
容量オスモル濃度：  ５７８ｍｏｓｍ／ｋｇ
【００２９】
次いで、調製物Ｐ２と命名したこの調製物を投与量０.５ｍｌずつに分ける。
【００３０】
平行して、２０ｍＭのリン酸塩に代えて各々１０ｍＭおよび４０ｍＭのリン酸塩を含有する２つの別の二価の組成物Ｐ２'およびＰ２''を調製した。このために、種類に応じて１７.６ｍＭまたは２４６ｍＭのリン酸塩溶液１０.６ｍｌを添加する。
すぐに、さらなる操作を行わずに、または、遠心分離後に、Ｐ２、Ｐ２'およびＰ２''組成物中のＨＡ成分およびＶｉ成分をＥＬＩＳＡによりアッセイすることによって、該組成物中のこれらの成分の挙動を研究した。１０ｍＭのリン酸塩では、ＨＡは吸着されたままであり、Ｖｉはアルミナゲルに吸着されるが、一方、４０ｍＭのリン酸塩では、Ｖｉはもはや吸着されず、ＨＡが部分的に吸着されることが示された。２０ｍＭのリン酸塩では、ＨＡは吸着されたままであり、一方、Ｖｉは吸着されない、という所望の条件を満たす。
【００３１】
続いて、Ｐ２投与量の安定性を５℃±３℃で３０か月間研究した。全体として採取されたワクチン製剤中のＶｉ多糖の抗原性能および（アルミナゲル沈降物に吸着されている成分および該ゲルの）遠心分離後の上清中のＶｉ多糖の抗原性能を、特に、ＥＬＩＳＡにより評価した；これによりまた、吸着されないＶｉのパーセンテージを確立することもできる。
【００３２】
間接ＥＬＩＳＡ法を用いる。アッセイすべきＶｉ抗原を、プレートの底面を覆っている抗Ｖｉ抗体とマウス抗Ｖｉ抗体との間にサンドイッチする。ビオチン化抗マウスＩｇＧ抗体を加え、次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合したビオチン化ストレプトアビジン複合体を加える。該反応を基質オルトフェニレンジアミン・二塩酸塩（ＯＰＤ）を加えることにより明らかにする。ＯＰＤの分解により、Ｖｉ抗原の量と比例する橙−茶色の着色が生じる。その強度を分光光度計にて測定する。
【００３３】
抗サルモネラ・ティフィ血清１００μｌを９６ウェルプレートに分配する。これを３７℃で５時間インキュベートし、次いで、該プレートを空にし、０.０５％Ｔｗｅｅｎを含有するＰＢＳ（リン酸塩緩衝液）で３回洗浄する。ＰＢＳで希釈した粉乳の溶液２００μｌを添加することにより遊離部位を飽和させる。３７℃で１時間３０分インキュベートし、次いで、該プレートを空にし、３回洗浄する。標準ワクチンの二倍段階希釈物を調製して標準的な範囲を得る。アッセイすべきワクチン投与量および参照投与量（較正範囲の確認を可能にする）を適当に希釈する；各希釈物１００μｌをウェル中に分配し、３７℃で一夜インキュベートさせる。該プレートを空にし、洗浄する。次いで、１ウェルあたり１００μｌの適当に希釈した抗Ｖｉマウス血清を加える。これを３７℃で１時間インキュベートさせ、次いで、該プレートを空にし、洗浄する。次いで、ビオチン化抗マウス免疫グロブリン（１ウェルあたり１００μｌの適当な希釈物）を結合させる。これを３７℃で１時間インキュベートし、次いで、該プレートを空にし、洗浄する。次いで、ペルオキシダーゼと結合したビオチン化ストレプトアビジン（１ウェルあたり１００μｌの適当な希釈物）を結合させる。これを３７℃で１時間インキュベートし、次いで、該プレートを空にし、洗浄する。クエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５）中１ｍｇ／ｍｌのＯＰＤの溶液を１ウェルあたり１００μｌ加えることにより該プレートを発色させる。これを暗所にて周囲温度で３０分間インキュベートした後、該ウェルに２Ｎ硫酸１００μｌを加える。該プレートを分光光度計にて４９２ｎｍで測定する。濃度の関数としての吸光度の標準曲線を確立する。アッセイした希釈物の各々の力価を標準曲線と比較して算出し、ｎｇ／ｍｌで表す。アッセイした各ワクチン投与量についての平均力価を得るために、全ての希釈物を用いて得られた力価の平均を算出する。力価は、μｇ／投与量で示される。
【００３４】
遠心分離後の上清中に存在するＶｉ多糖Ｏ−アセチルの量もまた測定した。ヒドロキシルアミンを用いる比色法でＯ−アセチルを滴定する（Hestrin S. J. Biol. Chim. (1949) 180: 249）。アルカリ性媒質中のヒドロキシルアミンはエステルとともにヒドロキサム酸を形成し、これは第二鉄塩の存在下で茶色の着色を生じ、その強度は分光光度計にて５４０ｎｍで測定される。
【００３５】
平行して、二価のワクチンの調製時にリン酸塩を加えない点だけが異なる以外はＰ２と同様に調製した調製物Ｐ１と称される調製物を用いて同研究を行った。この場合、Ｖｉ成分は、すぐにアルミナゲルに吸着し、Ｐ２についてと同様に遠心分離後にアッセイするためには、あらかじめ脱着すべきである。この脱着は媒質のｐＨおよびイオン強度を変更することにより得られる。遠心分離後、３７℃で６時間、アルミナゲルを１５０ｍＭクエン酸三ナトリウム溶液と接触させる。次いで、該混合物を遠心分離して、Ｖｉ成分が見出される上清を回収する。
【００３６】
結果を下記表Ｉに示す。
【００３７】
【表１】
2005501081.tif 000002
【００３８】
Ｐ２製剤の安定性を２５℃±２℃で６か月間、および３７℃±３℃で３か月間研究した。結果を下記表ＩＩおよび表ＩＩＩに示す。
【００３９】
【表２】
2005501081.tif 000003
【００４０】
【表３】
2005501081.tif 000004
【国際公開パンフレット】
2005501081.tif 000005
2005501081.tif 000006
2005501081.tif 000007
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2005501081.tif 000012
2005501081.tif 000013
2005501081.tif 000014
2005501081.tif 000015
2005501081.tif 000016
2005501081.tif 000017
2005501081.tif 000018
【国際調査報告】
2005501081.tif 000019
2005501081.tif 000020
2005501081.tif 000021
2005501081.tif 000022
2005501081.tif 000023
2005501081.tif 000024