(57)【要約】本発明は、糖尿病又は糖尿病関連疾患の治療又は予防のための薬剤の製造における、組織因子、ＴＦに対する阻害因子又は拮抗物質の使用に関する。上記阻害因子又は拮抗物質は主として、それぞれＩ型又はＩＩ型糖尿病、ならびにＩＩ型糖尿病に先立つ代謝症候群に罹患している糖尿病患者の治療を意図する。上記阻害因子又は拮抗物質は、抗ＴＦ抗体又はＴＦ遺伝子に作用するアンチセンス構築物などの、ＴＦの産生を完全に又は部分的に阻害する物質である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖尿病又は糖尿病関連疾患の治療又は予防のための薬剤の製造における、組織因子、ＴＦに対する阻害因子又は拮抗物質の使用。
【請求項２】
インスリン依存性糖尿病、ＩＤＤＭを有する患者へのインスリン産生細胞の移植に関連して投与するための薬剤の製造における、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
心臓血管疾患及び／又は動脈硬化症の治療のための薬剤の製造における、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
ＩＩ型糖尿病又はその前段階を有する患者の治療のための、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
上記のＴＦに対する阻害因子又は拮抗物質が、ＴＦに結合する生物学的作用を有する抗ＴＦ抗体である、先行の請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
上記阻害因子が、ランゲルハンス島からのＴＦの産生及び／又は放出を阻害する物質である、請求項１から４のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
上記のＴＦに対する阻害因子又は拮抗物質が、ＴＦの合成を阻止することができる剤である、請求項１から４のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
上記剤が、ＴＦ遺伝子を遮断するアンチセンス構築物である、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記ＴＦの産生及び／又は放出を阻害する物質が、ランゲルハンス島におけるインスリンの産生を低下させることを特徴とする、請求項１から５のいずれかに記載の使用。
【請求項１０】
上記物質がインスリン又はインスリン類似体である、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
上記のＴＦに対する阻害因子又は拮抗物質を、ヘパリン又はその分画又は誘導体などの抗凝固剤と組み合わせて使用する、先行の請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項１２】
上記のＴＦに対する阻害因子又は拮抗物質をトロンビン阻害因子と組み合わせて使用する、先行の請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項１３】
上記のＴＦに対する阻害因子又は拮抗物質を血小板阻害因子と組み合わせて使用する、先行の請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項１４】
組織因子、ＴＦに対する阻害因子又は拮抗物質をその必要のある被験者に投与することを含む、糖尿病又は糖尿病関連疾患の治療又は予防の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、糖尿病又は糖尿病関連疾患の治療又は予防のための薬剤の製造のための、組織因子、ＴＦに対する阻害因子又は拮抗物質の使用に関する。上記阻害因子又は拮抗物質は主として、それぞれＩ型又はＩＩ型糖尿病、ならびにＩＩ型糖尿病に先立つ代謝症候群に罹患している糖尿病患者の治療を意図する。
【０００２】
前者（Ｉ型糖尿病）の場合は、ランゲルハンス島の生存能力を高めるためにＩ型患者へのランゲルハンス島の移植と関連して上記拮抗物質又は阻害因子を使用する。後者の場合は、ＩＩ型糖尿病患者で見られる動脈硬化症及び心臓血管疾患を予防するために上記拮抗物質又は阻害因子を使用する。
【０００３】
発明の背景
ホメオスタシスは生存のために決定的に重要である。血管壁への損傷のような止血バランスの障害は凝固系の即時活性化を導く。インビボでは凝固系は、主として、凝固の組織因子（外因性）経路の第ＶＩＩａ因子のタンパク分解機能のために、第ＶＩＩ−第ＶＩＩａ因子の開裂のための補因子として及び受容体として働く４７ｋＤａの膜内外糖タンパク質組織因子（ＴＦ）が引き金となる。ＴＦはサイトカイン受容体スーパーファミリー(上科)に属し、第ＶＩＩａ因子と複合したとき、脈管形成、血管外遊出及び炎症に関与する細胞内シグナル変換の引き金となることが示されている。ＴＦは、血管の外膜において、及び胎盤、脳及び肺などの豊富に血管新生される組織においても、細胞によって構成的に発現される。通常は、内皮細胞及び単球などの血管に暴露されている細胞はＴＦを発現しないが、ＬＰＳ、免疫複合体及びサイトカインなどの一部の炎症性刺激はこれらの細胞におけるＴＦ発現を誘導しうる。ＴＦは、血液中では組織因子経路阻害因子（ＴＦＰＩ）によって厳密に調節されている。いくつかの最近の公表文献は、未確認の刺激によって活性化されうる血液中に微量に潜在するＴＦの証拠を提示している。血液に含まれるＴＦは、凝固カスケードの即時活性化を可能にすると考えられるが、同時に、おそらく動脈硬化性の斑（ｐｌａｑｕｅ）において認められるＴＦへの寄与因子でもある。血液中のＴＦの起源はこれまでのところ不明である。
【０００４】
高インスリン血症／高血糖症と凝固カスケードの活性化との間には潜在的な結びつきが存在する。Ｃｅｒｉｅｌｌｏらは、食事後に凝固活性化が上昇することを報告した。これは、正常被験者において、グルコースの注入が、ＴＦ経路の活性化を反映するＦＶＩＩａの生成及びトロンビン生成の一過性の上昇を誘導することを示した研究によってさらに強調された。この作用は、長期間の高血糖症／高インスリン血症を有する２型糖尿病患者ではさらに一層著明であった。特に、内部のインスリン分泌を抑えるインスリンの同時注入を組み合わせた同じレベルの高血糖症は、ＴＦ経路の活性を排除した。２型糖尿病を有する個人だけでなく高いＢＭＩを有する個人、すなわちインスリン抵抗性を有し、それ故循環インスリンの高い産生とレベルを有する個人も、高いＴＦ系活性を有する。２型糖尿病を有する患者でのこの凝固能亢進状態は、この患者群における糖尿病性の血管合併症の高い危険度についての考えられる説明である。
【０００５】
ＴＦとランゲルハンス島の間のもう１つの潜在的な結びつきは、臨床上の島移植及び実験的な研究の両方において、ＡＢＯ型適合性血液に暴露した島によって引き起こされる凝固反応である。即時性血液媒介炎症反応（ＩＢＭＩＲ）と称されるこの反応は、共に島の完全性の破壊をもたらし、島の周囲の血栓を導く、凝固系及び補体系の初期活性化、血小板の速やかな結合と活性化、白血球の結合によって特徴付けられる。
【０００６】
長年にわたって臨床上の島移植は、１年後のインスリン非依存性として評価したとき、約１０％の成功率を有してきた。昨年、Ｓｈａｐｉｒｏらは、患者を２名以上のドナーからの反復移植で治療すればインスリン非依存性が得られることを示すという突破口を開いた。引き続いての研究では、同じ群が、移植患者は２名以上のドナーから島を移植されていたにもかかわらず、健常個人のわずか２０％に相当するβ細胞機能しか有していないことを示した。合わせて考えると、これらの所見は、不利な過程、おそらく移植組織の喪失を伴っているに違いないことを強調した。
【０００７】
発明の概要
本発明者らは意外にも、組織因子がヒトランゲルハンス島において発現されることを見出した。組織因子はランゲルハンス島内の内分泌細胞の大部分で認められたが、外分泌組織の細胞では認められなかった。ＴＦがランゲルハンス島の内分泌細胞によって発現され、産生される（「島産生ＴＦ」）という予想外の所見は、ＴＦがインスリンの放出に関連して放出されることを示唆する。このＴＦはおそらく、ＩＩ型糖尿病又はその前段階を有する患者及び耐糖能障害を有する被験者における動脈硬化症及び心臓血管疾患の増加する危険度の原因であろう。そこで、ランゲルハンス島におけるＴＦ産生又は島からの組織因子の放出、あるいは少なくともその活性形態の放出に対する阻害因子又は拮抗物質は、これらの患者において動脈硬化症及び心臓血管疾患を予防するために使用できる。
【０００８】
ＩＢＭＩＲが臨床上の島移植のときに起こる初期の組織喪失を説明すると考えることは妥当である。ＩＢＭＩＲの引き金は不明であるが、本発明者らは、ＩＢＭＩＲがインビトロで、トロンビン阻害因子であるメラガトランによって排除されうることを示し、ＩＢＭＩＲがトロンビンの活性化に決定的に依存することを示唆した。トロンビンは、組織因子経路（外因性経路）及び内因性経路を含む拡大ループの２つの経路によって生成されうる。よって、ヒト島におけるＴＦの局所的な生成は、おそらくＩＢＭＩＲの反応開始因子である。それ故、ＴＦに対する阻害因子又は拮抗物質はＩＢＭＩＲを抑制又は排除することができ、この方法は、移植された島の生存を促進し、拒絶反応を回避するために島移植と組み合わせてＩ型糖尿病患者の治療のために使用できる。
【０００９】
そこで、本発明の最初の局面では、本発明は、糖尿病又は糖尿病関連疾患の治療又は予防のための薬剤の製造における、組織因子、ＴＦに対する阻害因子又は拮抗物質の使用、又は使用方法に関する。「糖尿病又は糖尿病関連疾患」の表現は、インスリンの異常産生（例えばインスリンの過剰分泌）を伴う耐糖能障害又はインスリン抵抗性、及び動脈硬化症、心臓血管疾患（例えば急性心筋梗塞）及び脳血管疾患（例えば出血及び梗塞）のような代謝条件から生じる疾患を包含する。
【００１０】
該阻害因子／拮抗物質は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質レベルでＴＦに影響を及ぼす剤であってもよく、それ故既知のＴＦ阻害因子の群から選択されうるが、該剤はそれらに限定されない。
【００１１】
本発明において、「ＴＦの阻害」の表現は、ＴＦの産生ならびに島からのＴＦの放出、特にその活性形態の放出の完全な又は部分的阻害を意味する。本発明はさらに、放出された島産生ＴＦの阻害を含む。「阻害因子」とは、そのようなＴＦの阻害を行うことができる物質を意味する。
【００１２】
最初の実施態様では、本発明は、インスリン依存性糖尿病、ＩＤＤＭを有する患者へのインスリン産生細胞の移植と組み合わせた投与のための薬剤の製造における上記のような使用を提供する。
【００１３】
第二の実施態様では、本発明は、心臓血管疾患及び／又は動脈硬化症の治療のための薬剤を製造するための、ＴＦに対する阻害因子／拮抗物質の使用を提供する。遊離ＴＦは動脈硬化性の斑に結合し、例えば心筋梗塞において血栓症の危険度上昇に寄与する。この使用は、ＩＩ型糖尿病又はその前段階を有する患者の治療のために特に重要であると期待される。
【００１４】
ＴＦに対する該阻害因子又は拮抗物質は、ＴＦ、特に島産生ＴＦに結合する生物学的作用を有する抗−ＴＦ抗体でありうる。
【００１５】
ＴＦに対する該阻害因子又は拮抗物質はまた、ＴＦ遺伝子を遮断するアンチセンス構築物のような、ＴＦの合成を阻止することができる剤であってもよい。
【００１６】
代替的実施態様では、ＴＦに対する該阻害因子又は拮抗物質を、ヘパリン又はその分画又は誘導体などの抗凝固剤と組み合わせて使用する。他の可能な組合せは、トロンビン阻害因子及び／又は血小板阻害因子を含む。
【００１７】
第二の局面では、本発明は、組織因子、ＴＦに対する阻害因子又は拮抗物質をその必要のある被験者に投与することを含む、糖尿病又は糖尿病関連疾患の治療又は予防の方法に関する。該方法は、例えば、糖尿病患者及び耐糖能障害を有する患者の治療を意図する。該方法は、ランゲルハンス島におけるＴＦ産生又はランゲルハンス島からのＴＦ放出を完全に又は部分的に阻害する抗−ＴＦ剤の投与を含む。
【００１８】
第三の局面では、本発明は、ランゲルハンス島におけるＴＦ産生又はランゲルハンス島からのＴＦ放出を完全に又は部分的に阻害する性質を有する阻害因子／拮抗物質自体に関する。
【００１９】
発明の詳細な記述
ここで、その内容を下記で簡単に述べる添付の図面に関連して本発明を説明する。
【００２０】
ヒト島におけるＴＦの発現及び産生
ＴＦの存在を調べるためにヒト膵臓切片をｍＡｂ  ４５０９で染色した（図１ａ）。ＴＦは、ランゲルハンス島の内分泌細胞の、全部ではないが大部分に分布することが認められた。染色パターンは、ＴＦが大半の島細胞の顆粒中に位置することを示唆した。またヒト膵臓から単離した島は、ＴＦの発現が単離手順によって影響されないことを示す、ＴＦの同様の分布を示した（図１ｂ）。ＴＦはより大きな血管の外膜においても認められた。内皮細胞は染色されず、ＴＦが炎症シグナルに応答して発現されなかったことを示した。外分泌性膵臓の腺房細胞ではＴＦを認めなかった。
【００２１】
ＴＦがヒトの島に存在することを確認するため、２つの異なるｍＡｂ（Ｎｏ．４５０３及び４５０９）抗−ＴＦ抗体でタンパク質を純粋な島の溶解産物から抽出した。該抗体−結合タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、その後ウエスタンブロットに供した。ポリクローナル抗−ＴＦを用いて沈殿したタンパク質を特定した。同様の実験において、ＴＦをポリクローナル抗−ＴＦで抽出し、２つのｍＡｂのいずれかで特定した（図示していない）。該ポリペプチドはＴＦと同じ４７ｋＤａの分子量を有していた（図１ｃ）。ＥＬＩＳＡによる溶解産物中のＴＦの定量後、培養した島当りのＴＦの量を算定した（図１ｄ）。島単離直後、その含量は１３ｐｇ／島であった。培養中、２日目に一時的に３倍に上昇したが（４２ｐｇ／島）、７日目にはかなり低かった（２１ｐｇ／島）。純粋に精選した単離島に関して実施したＲＴ−ＰＣＲは、ｍＲＮＡレベルでもＴＦの発現を確認した（図１ｅ）。
【００２２】
ヒト島におけるＴＦの電子顕微鏡検出
２つの正常膵臓からのインサイチューの島及び２バッチの単離島に関して、低温処理したロイクリル包埋標本でのイムノゴールド手法を用いてＴＦの電子顕微鏡検査を実施した（図２）。検査したすべての島の内分泌細胞は超微細構造レベルで良好に保存されたが、組織をオスミウムで処理しなかったため、細胞内構造の対比は最適ではなかった。インサイチューの膵島と単離島の両方で、金粒子はα及びβ細胞の両方におけるＴＦの存在を明らかにした。両細胞型において、ＴＦは、滑面小胞体（図２ａ）、ゴルジスタック及びトランスゴルジスタックの一過性小胞出芽（図２ｂ）、及びα及びβ細胞のホルモン顆粒（図２ｃ及びｄ）にも局在した。ＴＦ分子は、β細胞顆粒、好ましくは電子密度の高いコアにおいて、中等度の濃度で検出されたが、α細胞顆粒の基質全体により高い濃度でランダムに分布していた。δ又はＰＰ細胞ではＴＦ免疫反応性を示さなかった。すべての陰性対照標識実験は陰性であった。
【００２３】
抗−ＴＦ抗体によるＩＢＭＩＲの阻害
非−抗凝固化ヒト血漿と接触したヒトランゲルハンス島は、緩衝液だけを含む対照と比較して粘度測定によってモニターしたとき約９．５分後にゲル化を誘導したが、対照は６０分以内に凝固を誘導せず、島が凝固活性化を誘導できることを示唆した（図３ａ）。島のＴＦの発現をプロ凝固活性と結びつけるために、抗−ＴＦ抗体で活性を阻害することを試みた。阻害性抗−ＴＦ（ｍＡｂ  ４５０９）の存在下では、ゲル化が５３分まで５．６倍遅延し、一方ＴＦの非−機能性エピトープに対する対照ｍＡｂ（ｍＡｂ  ４５０３）については１．８倍遅延した。
【００２４】
ＴＦがＩＢＭＩＲの引き金となるのかどうかを調べるため、ヒト島をチュービングループモデルにおいて新鮮ヒトＡＢＯ適合性血液で３０分間洗い流した（図３）。島を抗−ＴＦ抗体と共に１０分間インキュベートし、その後３回洗った後、チュービングループに加えた。対照培地及び非−阻害性抗ＴＦ（４５０３）を含む培地では、１５分以内に凝固が起こったが、阻害性抗−ＴＦ（４５０９）を含む培地では観察期間全体を通じて凝固が阻害された。これは、血小板の消費（血小板数）、血小板のａ−顆粒含量（ｂ−トロンボグロブリン）の放出、及びトロンビン−アンチトロンビン、プロトロンビンフラグメント１＋２及び第ＸＩａ因子−アンチトロンビン複合体の生成に反映し、これらはすべて４５０９によって抑制されたが４５０３によっては抑制されなかった（図３、表Ｉ）。これらの所見はＴＦがＩＢＭＩＲの引き金であったことを明らかにしている。
【００２５】
培養膵島から放出されるＴＦによるヒト血漿の凝固
培地をヒト血漿と混合したとき、培養島の培地においてプロ凝固活性が認められた（図４）。培地の存在下で、血漿は５分以内に凝固した。凝固活性はｍＡｂ  ４５０９によって阻止されたが、ｍＡｂ  ４５０３は影響を及ぼさなかった。上清を×１００，０００ｇで超遠心分離した場合、その上清に関しては凝固を認めなかったが、ペレットは非分離培地と比較して２倍の活性を有していた。これは、ＴＦの活性が高分子量の分画に関連すること、及びＴＦは膜貫通部分を有する膜結合タンパク質であるので、該タンパク質はおそらく微粒子に結合するであろうことを示した。
【００２６】
抗−ＴＦ抗体及びｉＦＶＩＩａによるＩＢＭＩＲの阻害
ヒトランゲルハンス島と添加物を含まない新鮮ヒト血漿のインキュベーションは、（粘度測定によってモニターしたとき）約９．５分後にゲル化を誘導したが、緩衝液単独では６０分後に凝固を誘導せず、該島が凝固活性化を誘導できることを示した（ｎ＝７。図示していない）。島におけるＴＦの発現をプロ凝固活性と結びつけるために、抗−ＴＦ抗体でゲル化を遮断することを試みた。阻害性抗−ＴＦ（ｍＡｂ  ４５０９）の存在下では、ゲル化は、ＴＦの非−機能性エピトープに対する対照ｍＡｂ（ｍＡｂ  ４５０３）に暴露した島については１．８倍緩やかであったのに比べて、５．６倍遅れて起こった（５３分後）。
【００２７】
観察されたＴＦがＩＢＭＩＲの引き金となるのかどうかを調べるため、ヒト島をチュービングループモデルにおいて新鮮ヒトＡＢＯ適合性血液で３０分間洗い流した（図５）。島を阻害性又は非−阻害性抗−ＴＦ  ｍＡｂと共に１０分間インキュベートし、その後３回洗った後、チュービングループに加えた。対照試料（島だけを含む又は非−阻害性抗−ＴＦ  ｍＡｂ  ４５０３を含む血液）では、１５分以内に凝固が起こったが、阻害性抗−ＴＦ（ｍＡｂ  ４５０９）を含む試料では、観察期間全体にわたって凝固が阻害された。この差は、血小板の消費（血小板数）、血小板のα−顆粒含量（β−トロンボグロブリン）の放出、及びＴＡＴ、Ｆ１＋２及びＦＸＩａ−ＡＴの生成に反映し、これらはすべて阻害性ｍＡｂ  ４５０９によって抑制されたが、非−阻害性ｍＡｂ  ４５０３によっては抑制されなかった（図５ａからｃ、表Ｉ）。ＩＢＭＩＲのさらに一層著明な阻害が、ＴＦ活性の効率的な阻害因子であるｉＦＶＩＩａによって得られた。４０ｐｍｏｌ／ＬのｉＦＶＩＩａを含む血液は、血小板数の低下、及びＴＡＴ、ＦＸＩａ−ＡＴ及びＣ３ａの上昇を完全に阻害した（図５ｄからｈ）。これら２つの阻害因子の作用は、ＴＦがＩＢＭＩＲの引き金であることを強く示す。
【００２８】
抗−ＴＦ抗体及び部位−不活性化ＦＶＩＩａ
ヒト組織因子に対する抗体（ｍＡｂ  ４５０９及び４５０３及びポリクローナル抗体４５０２）をコネティカット州グリーンウィッチ（Ｇｒｅｅｎｗｉｃｈ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）のアメリカン・ダイアグノスティカ社（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｉｎｃ．）より購入した。ＭＡｂ  ４５０９はＴＦ活性を阻害し、ｍＡｂ  ４５０３はＴＦの非機能性エピトープを認識する。ポリクローナルヤギ抗−マウス／１０及び１５ｎｍ  Ａｕ（ＧＡＭ−Ｇ１０／１５）及びポリクローナルヤギ抗−ウサギ／１０及び１５ｎｍ  Ａｕ（ＧＡＲ−Ｇ１０／１５）をイギリス、バックス州アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｂｕｃｋｓ，Ｅｎｇｌａｎｄ）のアマーシャム・インターナショナル社（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）より購入した。部位−不活性化第ＶＩＩａ因子（ｉＦＶＩＩａ）は、Ｗｉｌｄｇｏｏｓｅらに従ってＦＶＩＩａ（デンマーク、ノボ・ノルディック（Ｎｏｒｄｉｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）のノボ・セブン社（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ，Ｎｏｖｏ））をダンシル−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇクロロメチルケトンで不活性化することによって得た。
【００２９】
考察
本試験における結果は、ＴＦがランゲルハンス島のα及びβ−細胞によって生産され、分泌されることを異議無く示す。免疫沈降法、ＲＴ−ＰＣＲ及び電子顕微鏡検査は、ＴＦがα−及びβ−細胞の両方によって発現されるが、δ又はＰＰ細胞によっては発現されないことを示す。培養上清において認められたＴＦ活性は、ＴＦが島から放出されることを示す。ＴＦがα−及びβ−細胞顆粒に局在することは、ＴＦがインスリン及びグルカゴンと共に放出されることを示す。ＴＦ合成の調節は、しかしながら、不明である。
【００３０】
ＩＢＭＩＲが抗−ＴＦによって阻害されたという事実を、ＩＢＭＩＲの過程の大部分がトロンビンによって駆動され、増幅されるという最近の所見と合わせて考えると、この反応がどのようにして推進されるかという仮説を提起することができるが、但しいかなる意味においても我々はこの仮説に縛られるものではなく、またこの仮説は、特許請求の範囲で定義される本発明の範囲への限定と解釈されるべきではない。島発現ＴＦによるトロンビンの初期生成後、トロンビン活性化血小板が島表面への結合を開始する。血小板が島表面で結合するリガンドはまだ特定されていないが、Ｉ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型及びＶ型コラーゲンがヒト島を取り巻くことが報告されている。コラーゲンは血小板の結合と活性化の既知のメディエイターである。これに続いて、血液から血小板の速やかな喪失が起こる。第ＸＩ因子及び活性化血小板を含む増幅ループによって、島を取り巻くフィブリン被膜を生成するより多くのトロンビンが形成される。
【００３１】
移植の前に島結合ＴＦ活性を阻害することは、臨床上の島移植においてＩＢＭＩＲを予防すると考えられる。ＴＦ発現を遮断することができる剤（抗−ＴＦ抗体）及びＴＦ合成を遮断することができる剤、例えばアンチセンスから成る前処理プロトコールが近い将来開発されると考えられる。移植に先立つ島の前処理は、受容者の止血に有害作用を及ぼさないので、明らかな臨床上の恩恵を有するであろう。
【００３２】
血中ＴＦの潜在的なソースは、微粒子結合ＴＦを生産することが知られている白血球である。グルコース注入に応答してＴＦ経路の活性が上昇するという正常個人での所見は、ＴＦ−活性が代替的グルコース感受性機構によって開始されることを強く示す。ＴＦがインスリンと共に放出されることは、見かけ上は進行中の炎症過程がない個人においてそのような緊密な関係を生じさせる。破裂した動脈硬化斑はＴＦを含有し、ＴＦの量は斑のトロンボゲン形成性に相関する。ＴＦの濃度は斑の管腔表面近くで上昇するので、斑に関連するＴＦは血液由来であると提起された。この所見の裏づけとして、血液中のＴＦは動脈硬化斑に結合して、その後局所的動脈血栓症の発症を開始させることができる。本試験は、血中ＴＦの少なくとも一部は膵島細胞から生じることを示唆する。２型糖尿病患者及び、おそらくはインスリン抵抗性及び高インスリン血症を有する他の個人での、高血糖に応答したトロンビンの高い生成を考慮すると、より活性なＴＦが存在し、動脈硬化斑に結合することができると考えられる。これは、これらの条件を有する患者において血栓症の危険度を上昇させる。
【００３３】
本発明のさらなる局面によれば、ＴＦの産生及び／又はその放出は、インスリン又はインスリン産生を低下させる他の物質の投与によって阻害することができる。
【００３４】
インスリンを投与された患者は、心臓血管疾患を呈する割合が有意に低いことが発見されている。提起される説明は、ＴＦは、インスリンが生産される場所であるランゲルハンス島においてインスリンと緊密に関連しているので、島からのＴＦの放出率はインスリン放出の低下に付随して低下するというものである。
【００３５】
提起される関与機構は、インスリンは血液中のグルコールのレベルを低下させ、グルコースセンサー系はこのグルコースレベルの低下を認識して、島からさらなるインスリンを放出させないようにし、それによってＴＦの放出も低下させるというものである。
【００３６】
現在、２型糖尿病に罹患している患者はインスリンによる治療を受けない。その代わりに、ＣＨＤが起こる危険度を上昇させる、付随するＴＦの放出を伴った島からのインスリン放出の引き金となる薬剤を投与される。
【００３７】
これは、ＣＨＤを発症する危険度の高い患者、例えば２型糖尿病及びその前駆症状の状態であるインスリン抵抗性を有する患者において、インスリンをＣＨＤの予防のために使用することができることを意味する。従って、本発明は、インスリンの産生及び／又は放出を低下させることを特徴とするが、ＴＦの阻害を介して作用しうる物質を投与することを含む、これらの患者の治療のための新しい方法を提供する。
【００３８】
本発明の範囲内のさらにもう１つの重要な所見は、２型糖尿病に罹患している患者では
高インスリン血症と心臓血管疾患の間に結びつきが存在するということである。それ故、ランゲルハンス島におけるＴＦ発現と、２型糖尿病を有する患者での冠動脈心疾患（ＣＨＤ）の周知の高い危険度との結びつきの発見は、薬剤及び治療を提供するために本発明の範囲内で使用できる。
【００３９】
高インスリン血症は、２型糖尿病及びその前駆症状の状態であるインスリン抵抗性の両方に共通する特徴である。両方の状態において、膵島のβ−細胞は、漸進的に上昇するインスリン抵抗性の結果である相対的高血糖を抑制するために漸増量のインスリンを生産する。これらの状態はどちらもＣＨＤの高い危険度に結びつく。それにより、さもなければ健康な２型糖尿病患者における心筋梗塞の危険度は、既に梗塞を起こしている患者と同じくらい高い。
【００４０】
いくつかの公表文献において、食事後に凝固活性化が起こることが報告されている。これらの所見は、健常被験者においてグルコースの注入が、ＴＦ経路の活性化を反映する第ＶＩＩａ因子の生成及びトロンビン生成の一過性の上昇を誘導するという報告によってさらに裏付けられている。その作用は、長期間の高インスリン血症／高血糖症を経験する２型糖尿病においてはさらに一層著明である。特に興味深いのは、内因性インスリン分泌を低下させるためのインスリンの同時注入と組み合わせたとき、同じレベルの高血糖がＴＦ経路活性を無効にすることができるという観察であり、これはインスリンの内因性産生が凝固活性化にとっての必須条件であることを示す。
【００４１】
微粒子−結合ＴＦの血小板への結合は血栓の進行にとって重要であると思われる。特に、血中ＴＦは、急性心筋梗塞及び不安定狭心症を有する患者において有意に上昇する。
【００４２】
ヒト島におけるＴＦの局所産生及び長期間の高血糖に応じた排出は、高インスリン血症における全身性ＴＦ経路の活性化についての仮説的説明を提供する。
【００４３】
動脈硬化斑はＴＦを含有し、ＴＦの量は斑の血栓形成性に相関する。これらの斑におけるＴＦの由来は十分には理解されていないが、平滑筋細胞及び斑の脂質コア中の泡沫細胞の両方がＴＦを産生することが知られている。動脈硬化斑は、斑が破裂してそのＴＦ−含有脂質コアを露出する、又は斑の内皮表面が裸出してその下にある組織が血栓形成を誘導する、という２つの方法で血栓形成の引き金となりうる。後者の場合は、血液中のＴＦが内皮下の表面に付着して血栓の引き金となりうる。
【００４４】
それ故、本発明の１つの局面によれば、ＴＦ阻害因子のリストは、インスリンの分泌を低下させることができ、従ってランゲルハンス島からのＴＦの放出を低下させる物質を含む。そのような物質の例は、インスリン抵抗性を低減するチアゾリンジオン、及び／又は外因性インスリン、あるいは天然又は組換えインスリン類似体を含む。
【００４５】
材料及び方法
島の単離
我々は、リベラーゼ（Ｌｉｂｅｒａｓｅ）灌流とそれに続く冷却ＣＯＢＥ  ２９９１遠心分離機（米国コロラド州レイクウッド（Ｌａｋｅｗｏｏｄ，ＣＯ，ＵＳＡ）のＣＯＢＥブラッド・コンポーネント・テクノロジー社（ＣＯＢＥ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））での連続密度フィコール勾配精製を用いて、（倫理委員会によって承認された）ヒト死体ドナーから、別で述べたように、島を単離した。島試料を３７℃で（５％ＣＯ２）で１から７日間、培地（ＣＭＲＬ  １０６６；カリフォルニア州コスタ・メザ（Ｃｏｓｔａ  Ｍｅｓａ，ＣＡ）のＩＣＮバイオメディカル社（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）に保持した。ジフェニルチオカルバゾンで染色した後顕微鏡測定によって容積と純度を測定した。生存能力を、動的浴液洗浄系でのグルコース攻撃（１．６７、１６．７及び再び１．６７μｍｏｌ／Ｌグルコース）に応答したインスリン分泌として評価した。
【００４６】
抗−ＴＦ抗体
ヒト組織因子に対する抗体（ｍＡｂ  Ｎｏ．４５０９、Ｎｏ．４５０３及びポリＡｂ  Ｎｏ．４５０２）をコネティカット州グリーンウィッチ（Ｇｒｅｅｎｗｉｃｈ，ＣＴ，ＵＳＡ）のアメリカン・ダイアグノスティカ社（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｉｎｃ．）より購入した。
【００４７】
免疫組織化学的染色
全膵臓の断片及び単離した島を包埋培地（ティシュー・テック（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ）；インディアナ州エックハート（Ｅｃｋｈａｒｔ，ＩＮ）のマイルズ社（Ｍｉｌｅｓ））に収集し、液体窒素中で急速凍結した。試料を切片化して、ｍＡｂ  Ｎｏ．４５０９、次いでＨＲＰ複合ブタ抗マウスＩｇ（デンマーク、グロストラップ（Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）のダコー社（ＤＡＫＯ  Ａ／Ｓ））で染色した。
【００４８】
精製ヒト島からのＴＦの免疫沈降反応
２０００の島を、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭベンズアミジン、０．１ｍｇ／ｍｌのダイズトリプシン阻害因子及び１ｍＭ  ＰＭＳＦを含むＰＢＳを用いて室温（ＲＴ）で９×ｇの遠心分離によって５回洗った。そのペレットを、１％トリトンＸ−１００（シグマ社（Ｓｉｇｍａ））を補足した同じ緩衝液０．５ｍｌ中、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、細胞破片（ｄｅｂｒｉｓ）を１０，０００×ｇで５分間の遠心分離によって除去した。ｍＡｂ  Ｎｏ．４５０９又はＮｏ．４５０３  ３μｇを細胞溶解産物２５０μｌと共に３７℃で３０分間インキュベートし、プロテインＧセファロース（スウェーデン、ストックホルムのファーマシア・アップジョン社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｕｐｊｏｈｎ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）で沈降させた。その試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びポリＡｂ  Ｎｏ．４５０２とウサギ免疫グロブリンに対するＨＲＰ複合抗体（ダコー社）を用いたウエスタンブロット分析に供した。
【００４９】
電子顕微鏡検査
超微細構造分析のために、２名の男性患者からの正常膵組織標本及び２名の膵臓ドナーからの単離島を採取した。いずれの患者又はドナーも代謝疾患には罹患しておらず、すべての膵臓は肉眼的及び顕微鏡的に正常であり、アミロイド沈着を示さなかった。抗原性を保存するために、標本を低温法で処理した。ニッケルグリッド上に置いた超薄切片をイムノゴールド手法で免疫標識した。ＴＦ抗体ｍＡｂ  Ｎｏ．４５０９、Ｎｏ．４５０３及びｐＡｂ  Ｎｏ．４５０２、１：２５希釈）（表１も参照のこと）、及び１０又は１５ｎｍのコロイド状金粒子を高電子密度マーカーとして使用した。フィリップス２０１電子顕微鏡での検査の前に、切片を酢酸ウラニルとクエン酸鉛で対比させた。
【００５０】
凝固時間
血漿における凝固時間を、ＧＨＩ（スウェーデン、リンチェーピング（Ｌｉｎｋｏｐｉｎｇ，Ｓｗｅｄｅｎ）のグローバル・ヘモスタシス・インスティテュート社（Ｇｌｏｂａｌ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＡＢ））からの４チャンネル自由振動式レオメーター（ｆｏｕｒ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｆｒｅｅ  ｏｓｃｉｌｌａｔｉｎｇ  ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ）、ＲｅｏＲｏｘ  ４で測定した。
【００５１】
モデルとしてのチュービングループ
我々は、これまでに記述されているモデルの修正を使用した。ＰＶＣチュービングで作られたループ（直径＝６．３、長さ３９０ｍｍ）に、製造者の推奨に従ってコーリンヘパリン表面（スウェーデン、ウプサラ（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）のコーリン社（Ｃｏｒｌｉｎｅ））を備えさせた。
【００５２】
洗浄した島（ＣＭＲＬ  １０６６中２回）４μｌ（〜４，０００ＩＥＱ）を、１５μｌのｍＡｂ  Ｎｏ．４５０９、対照ｍＡｂ  Ｎｏ．４５０３又はＰＢＳのいずれかと共に室温で１０分間プレインキュベートした。３回の洗浄段階後、島をＣＭＲＬ  １０６６  １５０μｌに再懸濁し、ループに入れて、その後、新鮮ＡＢＯ適合性ヒト血液（５ｍＬ）を加えた。約１００ｍＬ／分の血流を作り出すために、それらをロッキング装置上に置き、３７℃のインキュベーターに３０分間入れた。また、ＣＭＲＬ  １０６６  １５０μＬを補足した血液を含むが島は含まない対照ループも含んだ。灌流前及び５、１５及び３０分に、さらなる分析のためにＥＤＴＡ（４．１ｍＭ、最終濃度）中に血液試料を採集した。
【００５３】
血液及び血漿分析
血液中の血小板及び分画白血球を、クルターＡｃＴ  ｄｉｆｆ分析器（米国フロリダ州（ＦＬ，ＵＳＡ）のベックマン・クルター社（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ））を用いて計数した。
【００５４】
プロトロンビンフラグメント１＋２（Ｆ１＋２）及びトロンビン−アンチトロンビン複合体（ＴＡＴ）の血漿レベルを、市販のＥＩＡキット（Ｅｎｚｙｇｎｏｓｔ(登録商標)Ｆ１＋２及びＴＡＴ、ドイツ、マールブルグ（Ｍａｒｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のデイドベーリング社（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ））を用いて定量した。血漿ＦＸＩａ−ＡＴ複合体をＳａｎｃｈｅｚらに従って定量した。β−トロンボグロブリン（β−ＴＧ）を、アセラコム（Ａｓｓｅｒａｃｈｏｍ）（フランス、アスニエール・シュール・セーヌ（Ａｓｎｉｅｒｅｓ−ｓｕｒ−Ｓｅｉｎｅ，Ｆｒａｎｃｅ）のディアグノスチカ・スターゴ社（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ））を用いて分析した。補体活性化産物Ｃ３ａ及びｓＣ５ｂ−９を先に記述されているように測定した。
【００５５】
ＲＴ−ＰＣＲ分析
島からの細胞質ＲＮＡを本文中で述べたように単離した。オリゴ（ｄＴ）プライミング（アマーシャム・ファーマシア社）を用いて一本鎖ｃＤＮＡを作製した。ＰＣＲプライマーを組み合わせて、ｃＤＮＡだけを増幅し、極微量のゲノムＤＮＡを増幅しないように、ＴＦ転写産物の２又はそれ以上のエクソンに及ぶＰＣＲ産物を生成した。高適合度ＰＣＲ成分（ドイツベーリンガー・マンハイム社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のエクスパンド（Ｅｘｐａｎｄ））を用いてＲＴ−ＰＣＲを３５サイクル実施し、その後生成物を、０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイドにより３％アガロースゲル上で分析した。
【００５６】
統計分析
結果はすべて平均±ＳＥＭで表わした。フリードマンＡＮＯＶＡを用いて平均値を比較した。有意性はα＝０．０５で決定した。
【００５７】
表１
使用した抗体                                                      由来
１．モノクローナル抗−ヒト組織因子抗体（Ｎｏ．４５０９）          マウス
２．ポリクローナル抗−ヒト組織因子抗体（Ｎｏ．４５０２）          ウサギ
３．モノクローナル抗−ヒト組織因子抗体（Ｎｏ．４５０３）          マウス
４．モノクローナル抗−ヒトインスリン（ＸＸ）                      マウス
５．ポリクローナルヤギ抗−マウス／１０ｎｍ  Ａｕ（ＧＡＭ−Ｇ１０）ヤギ
６．ポリクローナルヤギ抗−ウサギ／１５ｎｍ  Ａｕ（ＧＡＲ−Ｇ１５）ヤギ
１、２、３及び４：コネティカット州グリーンウィッチ（Ｇｒｅｅｎｗｉｃｈ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）のアメリカン・ダイアグノスティカ社（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｉｎｃ）
５及び６：イギリス、バックス州アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｂｕｃｋｓ，Ｅｎｇｌａｎｄ）のアマーシャム・インターナショナル社（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）
ＴＦの合成及び分泌の阻害
島の培養に使用される標準培地である、１０ｍＭニコチンアミドを含むＣＭＲＬ培地で島を２４時間培養した。その後培地を、ニコチンアミドを含まないＣＭＲＬ培地に交換した。さらに２４時間の基線期間後、ＴＦ含量の分析のために島を精選した。単球及び内皮細胞においてＴＦ発現に影響を及ぼすことが知られている剤を含む培地で培養を４８時間継続した。これらは、Ｌ−アルギニン、サイクロスポリンＡ、エナラプリル、アセチルシステイン及びニコチンアミドであった。島を採集し、市販のＥＩＡキットを用いてＴＦ含量を分析し、インビトロループモデルにおいて島を試験した。
【００５８】
ビタミンＢニコチンアミドと共に島を培養すると、組織因子の合成と分泌が低下した。島を０から５０ｍＭの範囲の濃度のニコチンアミドと共に培養したとき、組織因子の産生は島において用量依存的に阻害された（図１Ａ）。同様に、ヒト血液と接触したインビトロループ系において試験したとき、ＴＦの細胞内含量は、ＴＡＴの生成によって反映されるように凝固活性化と相関した（図１Ｂ）。これは、島細胞のＴＦ含量及びＴＦの分泌がニコチンアミドによって用量依存的に阻害されたことを明らかにする。同様の作用が、免疫抑制剤、サイクロスポリンＡ（図２）、アミノ酸、Ｌ−Ａｒｇ（図２）、アンギオテンシン変換酵素阻害因子、エナラプリル（図２）、及び抗酸化薬、アセチルシステイン（図示していない）によって得られた。
【００５９】
図６から８はニコチンアミドの作用を示す。
【００６０】
０、１０、２５及び５０ｍＭニコチンアミドを含む培地で島を４８時間培養し、細胞内ＴＦ濃度を評価した。図６参照。それらの島をまた、インビトロループモデルにおいて新鮮ヒトＡＢＯ適合性血液に暴露した。５、１５、３０及び６０分後に試料を回収し、ＴＡＴに関して分析した。図７参照。
【００６１】
エナラプリル（４０μｇ／ｍｌ）、サイクロスポリンＡ（１０μｍｏｌ／Ｌ）、Ｌ−アルギニン（１ｍｍｏｌ／Ｌ）、ニコチンアミド（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）を含む培地で島を４８時間培養し、細胞内ＴＦ濃度を評価した。ＴＦの濃度を未処理対照のパーセンテージとして表わしている。図８参照。
【００６２】
ニコチンアミドが、その活性の責任を担う機構における重要因子であると考えられる、抗酸化特性を有することにも注目すべきである。それ故、この物質群内の他の化合物は本発明に従って使用できると予想される。そのような化合物のさらなる例として、網羅的な列挙ではないが、ビタミンＥ、グルタチオン、アセチルシステイン、ピロリジンジチオカルバメート、ピリチオン、ペントキシフィリン、ヘモキシゲナーゼ−１（Ｈｅｍｏｘｙｇｅｎａｚｅ−１）／ＣＯ−ビリルビン、プロスタグランジンＡ１が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図1：パネルａ．  ｍＡｂ  Ｎｏ．４５０９で染色したヒト膵臓の切片は、膵島の顕著な染色を示す。
【００６４】
パネルｂ．  ｍＡｂ抗−ＴＦ  Ｎｏ．４５０９で染色した単離ヒト島の切片。島の細胞の大部分においてＴＦが認められる。
【００６５】
パネルｃ.  ３名からの純粋ヒト島をｍＡｂ抗ＴＦ  Ｎｏ．４５０３又は４５０９のいずれかで免疫沈降させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウサギポリクローナル抗−ＴＦ  Ｎｏ．４５０２を用いたウエスタンブロット法に供した。レーン１−６は、ｍＡｂ  ４５０３（レーン１、３、５）及びｍＡｂ４５０９（レーン２、４、６）で沈降させた３対のＴＦを示し、レーン７は沈降抗体単独を示す。
【００６６】
パネルｄ.  ０．３ｋｂ生成物を生じた、６名からの単離ヒト島のＲＴ−ＰＣＲ（レーン２−７）。レーン７は分子量標準品を含む。
【００６７】
パネルｅ.  ０、２及び７日間培養したヒト島におけるＴＦの定量（ｎ＝３）。
【図２】図２.単離島からの切片に関するｍＡｂ抗−ＴＦ  Ｎｏ．４５０９でのイムノゴールド標識からの代表的結果を示す電子顕微鏡写真。金粒子はすべて直径１５ｎｍである。バーはすべて１００ｎｍを示す。
【００６８】
ａ）β細胞の滑面小胞体において明らかにされたＴＦ分子（矢印）（×５４０００）。
【００６９】
ｂ）ゴルジスタック（矢じり）、ゴルジトランス領域から出芽した一過性小胞（大きな矢印）及び分泌顆粒（小さな矢印）におけるＴＦ分子を示す、金粒子を伴うα細胞中のゴルジ装置（×３６０００）。
【００７０】
ｃ）β細胞顆粒のコアにおけるＴＦ（矢印）貯蔵（×３６０００）。
【００７１】
ｄ）α細胞顆粒中にランダムに分布したＴＦ（矢印）貯蔵（×５４０００）。
【図３】図３：パネルａ.  ヒト島が引き金となる凝固時間への抗ＴＦの作用。ヒト島４μｌを、培地、非阻害性ｍＡｂ抗−ＴＦ  Ｎｏ．４５０３（対照ｍＡｂ）、及び阻害性抗−ＴＦ  Ｎｏ．４５０９によって室温で１０分間前処理した。その後、島を非−抗凝固化ヒト血漿２５０μｌと共にインキュベートし、レオロックス（ＲｅｏＲｏｘ(商標)）装置で凝固時間を監視した（ｎ＝７）。チュービングループモデルにおいて島によってＩＢＭＩＲを誘導した。島は、培地（白い四角）、非阻害性ｍＡｂ抗−ＴＦ  Ｎｏ．４５０３（対照ｍＡｂ）（白い三角）、及び阻害性抗−ＴＦ  Ｎｏ．４５０９（黒い丸）によって室温で１０分間前処理した。島を含まない培地は黒いひし形で示している。その後、ヘパリン添加チュービングループにおいて、ヒト島４μｌを非−抗凝固化ヒトＡＢＯ−適合性血液５ｍｌとインキュベートした。ＩＢＭＩＲを、ｂ）血小板数、及びｃ）ＴＡＴ、ｄ）Ｆ１＋２及びｅ）ＦＸＩａ−ＡＴについてのＥＩＡによって監視した。
【図４】図４：ヒトクエン酸塩血漿２５０μｌを様々な容量のヒトランゲルハンス島培養物からの培地と混合した。レオロックス（ＲｅｏＲｏｘ(商標)）装置において、血漿のカルシウム再添加後、凝固時間を評価した。パネルａは１つの島バッチからの培地の代表的連続希釈であり、パネルｂは、ＰＢＳ、ｍＡｂ  ４５０３又はｍＡｂ  ４５０９で処理した３名の異なる個人の島からの培地６０μＬである（平均±ＳＥＭ）。
【図５】：ヒト島が引き金となるＩＢＭＩＲは抗−ＴＦ及びｉＦＶＩＩａによって遮断される。
【００７２】
チュービングループモデルにおいて島によってＩＢＭＩＲを誘導した。島を、ＰＢＳ（●）、非阻害性抗−ＴＦ  ｍＡｂ  ４５０３（対照ｍＡｂ；▲）、又は阻害性抗−ＴＦ  ｍＡｂ  ４５０９（□）で前処理した。◇は島を含まない培地を示す。ヘパリン添加チュービングループにおいて、島を非抗凝固化ヒトＡＢＯ−適合性血液と共にインキュベートした。ＩＢＭＩＲを、ａ）血小板数、及びｂ）ＴＡＴ及びｃ）ＦＸＩａ−ＡＴについてのＥＩＡによって監視した。（島だけを含むループと比較したとき＊ｐ＜０．０５）。あるいは、４０ｐｍｏｌ／ＬのｉＦＶＩＩａの存在下（□）又は不在下（●）で島のインキュベーションを実施した。◇は島を含まない培地を示す。ＩＢＭＩＲを、ｄ）血小板数、及びｅ）ＴＡＴ及びｆ）ＦＸＩａ−ＡＴについてのＥＩＡによって監視した。（ｉＦＶＩＩａを含まないループと比較したとき＊ｐ＜０．０５）。
【図６】図６：ニコチンアミドを含む培地で培養した後、対照と比較して評価した細胞内ＴＦ濃度。
【図７】図７：凝固活性化を反映する、ＴＡＴの生成。
【図８】図８：それぞれ、エナラプリル（４０μｇ／ｍｌ）、サイクロスポリンＡ（１０μｍｏｌ／Ｌ）、Ｌ−アルギニン（１ｍｍｏｌ／Ｌ）、ニコチンアミド（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）を含む培地で培養した後、対照と比較して評価した細胞内ＴＦ濃度。
【図１ａ】
2005528343.tif 000002
【図１ｂ】
2005528343.tif 000003
【図１ｃ】
2005528343.tif 000004
【図１ｄ】
2005528343.tif 000005
【図１ｅ】
2005528343.tif 000006
【図２】
2005528343.tif 000007
【図３ａ】
2005528343.tif 000008
【図３ｂ−３ｅ】
2005528343.tif 000009
【図４ａ】
2005528343.tif 000010
【図４ｂ】
2005528343.tif 000011
【図５ａ−５ｂ】
2005528343.tif 000012
【図５ｃ−５ｄ】
2005528343.tif 000013
【図５ｅ−５ｆ】
2005528343.tif 000014
【図６】
2005528343.tif 000015
【図７】
2005528343.tif 000016
【図８】
2005528343.tif 000017
【国際調査報告】
2005528343.tif 000018
2005528343.tif 000019
2005528343.tif 000020
2005528343.tif 000021
2005528343.tif 000022
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