(57)【要約】  アンフェタミンに対してinvivoで抗ハプテン抗体を誘発することができるハプテン−担体結合体が開示されている。ハプテン−担体結合体及び治療組成物を調製する方法も開示されている。ハプテン−担体結合体を含む治療組成物はアンフェタミン中毒の治療において有用である。本発明の結合体に対して生じた抗体を使用する受動免疫化も開示されている。前記治療組成物はアンフェタミン中毒を治療するために他の常用の薬物との共治療に適している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2005516034.tif 000016
（式中、
R1及びR3は、水素、及びC1〜C3アルキルからなる群から選択されており；
R2は、水素、C1〜C3アルキル及びポリメチレン鎖：（CH2）n−COOH、からなる群から選択され、ここで、nは１〜６の整数であり；
R4、R6及びR7は、同じ又は異なっており、そして水素、ハロゲン、−OR9及び−SR9からなる群から選択され、ここでR9は、水素又はC1〜C3アルキルであり；そして
R5は、水素、ポリメチレン鎖：−（CH）m−R10及びオキシ−ポリメチレン鎖：−O−（CH2）m−R10からなる群から選択され、ここで−R10は、カルボキシ、チオール、−CONHR13SH及び−CONHCHR11SHからなる群から選択され、ここでR13は、CH（COOH）CH2−及び−（CH2）m−から成る群から選択され、ここでmは、１〜４の整数であり、但し、R1が水素であり且つR2はメチルであるかあるいはR1がメチルであり且つR2は水素である場合、R5はポリメチレン鎖：−（CH2）m−COOHではない）
を有する（S）−エナンチオマー化合物。
【請求項２】
式（II）：
【化２】
2005516034.tif 000017
（式中、
nは１〜６の整数であり、
R1及びR3は、水素、及びC1〜C3アルキルからなる群から選択されており；
R4、R6及びR7は、同じ又は異なっており、そして水素、ハロゲン、−OR9及び−SR9からなる群から選択され、ここでR9は、水素又はC1〜C3アルキルであり；そして
R5は、水素、ポリメチレン鎖：−（CH）m−R10及びオキシ−ポリメチレン鎖：−O−（CH2）m−R10からなる群から選択され、ここで−R10は、カルボキシ、チオール、−CONHR13SH及び−CONHCHR11SHからなる群から選択され、ここでR13は、CH（COOH）CH2−及び−（CH2）m−から成る群から選択され、ここでmは、１〜４の整数であり、但し、R1が水素であり且つR2はメチルであるかあるいはR1がメチルであり且つR2は水素である場合、R5はポリメチレン鎖：−（CH2）m−COOHではない）
の化合物。
【請求項３】
式（VI）：
【化３】
2005516034.tif 000018
を有する、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
式（VII）：
【化４】
2005516034.tif 000019
を有する請求項２に記載の化合物。
【請求項５】
式（IIIa）：
【化５】
2005516034.tif 000020
（式中、
R1及びR3は、水素、及びC1〜C3アルキルからなる群から選択されており；
R2は、水素、C1〜C3アルキル及びポリメチレン鎖：（CH2）n−COOH、からなる群から選択され、ここでnは、１〜６の整数であり；
R4、R6及びR7は、同じ又は異なっており、そして水素、ハロゲン、−OR9及び−SR9からなる群から選択され、ここでR9は、水素又はC1〜C3アルキルであり；そして
R11は、ポリメチレン鎖：−（CH2）m−及びオキシ−ポリメチレン鎖：−O（CH2）mからなる群から選択され、ここでmは、１〜４の整数であり、但し、R1がメチルである場合、R11はポリメチレン鎖：−（CH2）m−ではない）
を有する化合物。
【請求項６】
式（IV）：
【化６】
2005516034.tif 000021
を有する請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
式（IIIb）：
【化７】
2005516034.tif 000022
（式中、
R1及びR3は、水素、及びC1〜C3アルキルからなる群から選択されており；
R2は、水素、C1〜C3アルキル及びポリメチレン鎖：（CH2）n−COOH、からなる群から選択され、ここでnは、１〜６の整数であり；
R4、R6及びR7は、同じ又は異なっており、そして水素、ハロゲン、−OR9及び−SR9からなる群から選択され、ここでR9は、水素又はC1〜C3アルキルであり；そして
R12は、ポリメチレン鎖：（CH2）m−CONHR13及びオキシ−ポリメチレン鎖：−O（CH2）m−CONHCH−R13からなる群から選択され；ここでR13は、−CH（COOH）CH2−及び−（CH2）m−から成る群から選択され、ここでmは、１〜４の整数であり、但し、R1が水素であり且つR2はメチルであるかあるいはR1がメチルであり且つR2は水素である場合、R5はポリメチレン鎖：−（CH2）m−COOHではない）
を有する化合物。
【請求項８】
式（V）：
【化８】
2005516034.tif 000023
を有する請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
請求項４に記載の化合物を獲得するための方法であって、当該方法は：
（a）図１に示すように、式（IX）を有するメタンフェタミン誘導体を、Br（CH2）nCOOBn（式中、nは、溶媒中１〜６の整数である）の添加によってアルキル化し、そしてそれにより図１に示すような、式（X）の付加産物を獲得し；そして、
（b）式（X）の前記付加産物を水素化することにより、請求項４に記載の化合物を獲得する、
段階を含んで成る方法。
【請求項１０】
請求項５に記載の化合物を獲得するための方法であって、当該方法は：
（a）図２に示すように、式（XI）の化合物をCH3CH2−NO2で濃縮し、それによって図２に示すように、式（XII）のニトロスチレン誘導体を獲得し；
（b）当該ニトロスチレン誘導体（XII）を還元し、それによって図２に示すように、式（XIII）のアンフェタミン誘導体を獲得し；
（c）前記アンフェタミン誘導体の第一アミンをアルキル化することにより、図２に示すように、式（XIV）の化合物を獲得し；
（d）前記アンフェタミン誘導体（XIII）又は前記式（XIV）の化合物上のアミン基をアシル化し、それにより、図２に示すように、式（XV）を有する化合物の保護された誘導体を獲得し；
（e）前記保護された誘導体（XV）を水素化し、それによって、図２に示すような、式（XVI）を有する化合物を獲得し；
（f）前記式（XVI）の化合物のフェノール基をベンジルブロモカルボキシレートでアルキル化し、それによって、図２に示すように、式（XVII）の化合物のベンジルエステル化合物を獲得し；
（g）前記（XVII）のベンジルエステル化合物を水素化し、それによって、図２に示すように、式（XVIII）のカルボキシル誘導体を獲得し；
（h）前記カルボン酸誘導体（XVIII）のアミノ基を脱保護し；そして（ｉ）そのようにして獲得したエナンチオマー分離し、それによって請求項５に記載の化合物を獲得する、
段階を含んで成る方法。
【請求項１１】
段階（a）〜（g）の間に更に：
（h）(R)H−cys(Otrt)−NH2を前記カルボン酸誘導体(XVIII)でアシル化し；
（i）生じたジアステレオマー混合物を分離し、それによって、図２に示すように、式（XIX）を有するS−イソマー(XIX)を獲得し；そして
（j）式(XIX)を有する前記S−イソマーから酸−感受性保護基を除去し、それによって、請求項７に記載の化合物を獲得する、
段階を含んで成る請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記アルキル化段階（c）が：
前記式（XIII）の化合物とトリフルオロ酢酸無水物を接触せしめ；
生じるトリフルオロアセトアミドをハロゲン化アルキルでアルキル化し；そして
塩基性媒体中でトリフルオロアセチル基を除去すること、
を含んで成る、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記アルキル化段階（c）が：
前記式（XIII）の化合物と酸無水物を接触せしめてアミドを獲得し；
当該アミドをリチウムアルミニウムヒドリドで還元すること
を含んで成る、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１４】
（a）図３に示すように、式（XXII）のチロシンエステル誘導体を還元して、それによって、図３に示すように、式（XXIII）のアルコール誘導体を獲得し；
（b）前記アルコール誘導体（XXIII）をアルキル化し、それによって図３に示すように、式（XXIV）の化合物を獲得し；
（c）前記式(XXIV）の化合物を水素化し、それによって、図３に示すように、式（XXV）のフェノール誘導体を獲得し；
（d）前記フェニル誘導体（XXV）とベンジルブロモアルキルカルボキシレートを接触させることによって、図３に示すように、式（XXVI）のエステル誘導体を獲得し：そして
（e）前記エステル誘導体（XXVI）を水素化し、請求項５に記載の化合物を獲得する、
段階を含んで成る、請求項５に記載の化合物を獲得するための方法。
【請求項１５】
担体に対して共有結合させた式(Ｉ)有する化合物を含んで成るアンフェタミン類縁免疫原。
【請求項１６】
担体に対して共有結合させた式(II)：
【化９】
2005516034.tif 000024
（式中、
pは１〜６の整数であり；
R1及びR3は、水素、及びC1〜C3アルキルからなる群から選択されており；
R4、R6及びR7は、同じ又は異なっており、そして水素、ハロゲン、−OR9及び−SR9からなる群から選択され、ここでR9は、水素又はC1〜C3アルキルであり；そして、
R5は、水素、ポリメチレン鎖：−（CH2）m−R10及びオキシ−ポリメチレン鎖：−O−（CH2）m−R10からなる群から選択され、ここでR10は、カルボキシ、チオール、−CONHR13SH、及び−CONHCHR11SHからなる群から選択され、ここでR13は、CH(COOH)CH2−及び−(CH2)m−からなる群から選択され、そしてここでmは、１〜４の整数であり、但し、R1が水素でありR2はメチルであるかあるいはR1がメチルでありR2は水素である場合、R5はポリメチレン鎖：−（CH2）m−COOHではない）
を有する化合物を含んで成るアンフェタミン類縁免疫原I1。
【請求項１７】
担体に対して共有結合させた式(IIIa)：
【化１０】
2005516034.tif 000025
（式中、
R1及びR3は、水素、及びC1〜C3アルキルからなる群から選択されており；
R2は、水素、C1〜C3アルキル及びポリメチレン鎖：（CH2）n−COOH、からなる群から選択され、ここでnは、１〜６の整数であり；
R4、R6及びR7は、同じ又は異なっており、そして水素、ハロゲン、−OR9及び−SR9からなる群から選択され、ここでR9は、水素又はC1〜C3アルキルであり；そして
R11は、ポリメチレン鎖：−（CH2）m及びオキシ−ポリメチレン鎖：−O（CH2）mからなる群から選択され、ここでmは、１〜４の整数であり、但し、R1がメチルである場合、R11はポリメチレン鎖：−（CH2）m−ではない）
を有する化合物を含んで成るアンフェタミン類縁免疫原I2。
【請求項１８】
担体に対して共有結合させた式(IIIb)：
【化１１】
2005516034.tif 000026
（式中、
R1及びR3は、水素、及びC1〜C3アルキルからなる群から選択されており；
R2は、水素、C1〜C3アルキル及びポリメチレン鎖：（CH2）n−COOH、からなる群から選択され、ここで、nは１〜６の整数であり；
R4、R6及びR7は、同じ又は異なっており、そして水素、ハロゲン、−OR9及び−SR9からなる群から選択され、ここでR9は、水素又はC1〜C3アルキルであり；そして
R12は、ポリメチレン鎖：（CH2）m CONHR13及びオキシ−ポリメチレン鎖：−O（CH2）mCONHCH−R13からなる群から選択され；ここでR13は、−CH（COOH）CH2−及び−（CH2）m−から成る群から選択されており、ここでmは、１〜４の整数であり、但し、R1が水素であり且つR2はメチルであるかあるいはR1がメチルであり且つR2は水素である場合、R5はポリメチレン鎖：−（CH2）mではない）
を有する化合物を含んで成るアンフェタミン類縁免疫原I3。
【請求項１９】
前記担体が、破傷風毒素、ウシ血清アルブミン、オボアルブミン、KLH、又は前記群におけるタンパク質の任意のペプチド断片から選択されているタンパク質である、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載のアンフェタミン類縁免疫原。
【請求項２０】
式
【化１２】
2005516034.tif 000027
を有するアンフェタミン類縁免疫原TT−Met1。
【請求項２１】
請求項１５に記載のアンフェタミン類縁免疫原を１以上含んで成る医薬組成物。
【請求項２２】
請求項１８又は請求項２０に記載のアンフェタミン類縁免疫原を１以上含んで成るワクチン。
【請求項２３】
１以上のアンフェタミン又はアンフェタミンの誘導体に対して親和性を有する抗体又は免疫グロブリンの断片もしくは鎖。
【請求項２４】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２３に記載の抗体。
【請求項２５】
前記抗体が中和抗体である、請求項２３又は２４に記載の抗体。
【請求項２６】
前記抗体が、２以上の異なるアンフェタミン又はアンフェタミン誘導体を結合できる、請求項２４に記載の抗体。
【請求項２７】
前記２以上の異なるアンフェタミン又はアンフェタミン誘導体がメタンフェタミン及びエクスタシーを含んで成る、請求項２６に記載の抗体。
【請求項２８】
ハイブリドーマDASM243-6H5D1C4によって生産されたモノクローナル抗体。
【請求項２９】
ハイブリドーマDASM243-3A10A6A2によって生産されたモノクローナル抗体。
【請求項３０】
請求項２４に記載のモノクローナル抗体を生産する細胞系統を含んで成る組成物。
【請求項３１】
前記抗体がマウス抗体である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
アクセスNo.CNCMI−2750を有するマウスハイブリドーマDASM243-645D1C4。
【請求項３３】
細胞系統DASM243-645D1C4によって発現されたモノクローナル抗体と同じ抗原特異性を有するモノクローナル抗体を生産する細胞系統。
【請求項３４】
請求項３３に記載のハイブリドーマに由来するモノクローナル抗体。
【請求項３５】
請求項３４に記載のモノクローナル抗体の結合特性を有するモノクローナル抗体に由来する免疫グロブリン断片又は鎖。
【請求項３６】
検出可能なシグナルを提供することができる剤で標識された、請求項２４に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３７】
検出可能なシグナルを提供することができる剤で標識された、請求項３５に記載の免疫グロブリン断片または鎖。
【請求項３８】
１又は複数のアンフェタミン誘導体を結合できる請求項２３に記載の抗体を１以上含んで成る医薬組成物。
【請求項３９】
アンフェタミンを乱用する患者において必要とされているその症状を緩和するための方法であって：
前記患者に請求項３７に記載の医薬組成物を、前記症状を緩和する十分な量で提供することを含んで成る方法。
【請求項４０】
前記症状が、２以上のアンフェタミン誘導体を摂取した結果であり、そして前記１以上の抗体は少なくとも２つの前記２以上のアンフェタミン誘導体を結合できる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
アンフェタミンを乱用する患者において必要とされているその症状を緩和するための方法であって：
請求項２２に記載のワクチンで前記患者を免疫化することを含んで成る方法。
【請求項４２】
前記化合物がS−エナンチオマーである請求項２〜８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項４３】
モノクローナル抗体DASM243-645D1C4又はDASM243-3A10A6A2の重鎖及び軽鎖をコードする単離された核酸。
【請求項４４】
モノクローナル抗体DASM243-645D1C4又はDASM243-3A10A6A2に由来するポリペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項４５】
前記ポリペプチドが軽鎖タンパク質である、請求項４４に記載の単離された核酸。
【請求項４６】
前記核酸がDNAである、請求項４３に記載の単離された核酸。
【請求項４７】
前記核酸分子がcDNAである、請求項４３に記載の単離された核酸。
【請求項４８】
作用可能式に転写及び翻訳調節領域に対して結合した請求項４３に記載の核酸を含んで成る発現ベクター。
【請求項４９】
請求項４８の発現ベクターを含んで成る宿主細胞。
【請求項５０】
前記細胞が真核細胞である、請求項４９に記載の宿主細胞。
【請求項５１】
２以上のアンフェタミン及びアンフェタミン誘導体に対して特異的な免疫グロブリン又は当該免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の可変領域を少なくとも含んで成る免疫学的機能を有する免疫グロブリン断片を生産するための方法であって：
モノクローナル抗体DASM243-645D1C4もしくはDASM243-3A1又はそれらの機能的な断片の重鎖及び軽鎖をそれぞれコードするを含んで成る発現ベクターを含んで成る宿主細胞を、当該核酸が発現するように増殖せしめ、それによって免疫グロブリンを獲得する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
序
技術分野
本発明は、アンフェタミン乱用を治療するための方法及び組成物に関連し、それは乱用者における抗体生産を誘導するために、アンフェタミン−ハプテン結合体を直接的に使用すること又は治療のために使用できる治療抗体を調製するためにそれらを間接的に使用することのいずれかによる。本発明は、２以上のアンフェタミン誘導体(例えば、当該誘導体の１つとしてはエクスタシーがある）と反応する抗体の調製によって例示されている。
【背景技術】
【０００２】
背景
アンフェタミンの乱用は着実に増えつつある（Karchら、J Forensic Sci 1999；vol.44：pp.359〜368）。いくつかの製品が使用されており、例えば、メタンフェタミン(MA)、３,４−メチレンジオキシメタンフェタミン(MDMA；エクスタシー)；及び３，４−メチレンジオキシエタンフェタミン(MDEA、「eve」)があるが、新たなる製品が現れつづけており、それらの大部分は急性及び慢性の毒性の両方を示す(Eliott SP. J Anal Toxicol 2000、Mar；24:85〜89；Portion Aj; Lock E.Forensic Sci Int 1999；100：221〜233；Felgateら、J Anal Toxicol 1998、22:169〜172)。しかし、メタンフェタミンは往々にしてエクスタシーよりも使用されている頻度がかなり少ない。更なる他の誘導体も使用されており、そしてアンフェタミンの混合物は、乱用されている製剤中で頻繁に発見される。加えて、いくつかの他の製品との薬理学的な相互作用が、乱用されている１又は複数の物質の毒性を高めることにつながる。
【０００３】
現在では、アンフェタミン誘導体による中毒に対する特異的治療はない。従って、主たる乱用のアンフェタミンに対して、そして特に、MDMAエクスタシー、特に特にエクスタシー及び他のアンフェタミン誘導体に対する十分な交差反応性を示すモノクローナル及びポリクローナル抗体、特にメタンフェタミン、エクスタシー及び他のアンフェタミン誘導体に対する中和抗体を開発することが注目されている。これらの広い特異的抗体は薬物乱用の緊急治療において有意な治療的価値があるだろう。
【０００４】
関連刊行物
アンフェタミンに対する抗体は様々な異なる抗原を使用し生産されてきた。例えば、Burgess Cら；Eur Psychiatry 2001；vol.15(No.5)：287〜294；米国特許第5,976,812号：及びHuberら；米国特許5,470,997号を参照のこと。一般に記載された抗体は、アンフェタミン及びメタンフェタミンに対して向けられている(例えば、米国特許第5,135,863号：Hiramatsuら、Pharmacol Biochem Behav 1989；vol.33:pp.343〜347;K.A.A Bymes-Blakeら、International Immunopharmacology 1、2001、pp.329〜338；S.Inayamaら、Chem Pharm Bull 28、1980、p.2779；S.Inayamaら、Chem Pharm Bull 1977 vol.35 p.838；K.Aoki Y.Kuroiwa、J.Pharm. Dyn 1983、vol.6．pp.33〜38を参照こと)。多くの場合、獲得された抗体は、単一のアンフェタミンに対して非常に特異的な抗体であり、そしてそれらは特定のアンフェタミンの存在を検出するため及び/又は様々なアンフェタミン誘導体の中での区別をするためのいずれかの分析目的のために使用されている。
【発明の開示】
【０００５】
概要
アンフェタミン及びアンフェタミンの誘導体に基づく新規組成物、並びに物質乱用を治療するためのそれらの使用が供されている。前記組成物は、２以上のアンフェタミンの類似物(１つはエクスタシー、４−メチルチオ−アンフェタミン、メタンフェタミン、又はN−エチルアンフェタミンである)に対して特異的に結合するの新規アンフェタミン誘導体並びに免疫グロブリンもしくは免疫グロブリン断片もしくは鎖を含む。ポリクローナル及びモノクローナル抗体生産のために、動物は、担体タンパク質に対し結合するためのアンフェタミン誘導体の芳香族基又は側鎖に対して結合した連結基を含んで成る抗原で免疫化されている。免疫化されている宿主に由来するB細胞は、アンフェタミン及びアンフェタミンの誘導体に対するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを調製するために使用されて良い又はモノクローナル抗体の重及び/もしくは軽鎖コードする核酸を単離でき且つ組換え免疫グロブリン、断片又は鎖を、真核もしくは原核でありうる宿主細胞中で調製するために使用されて良い。ポリクローナル及びモノクローナル抗体は、アンフェタミンの過剰投与を治療するための、アンフェタミン及びその誘導体に関する、検出アッセイ、及びアンフェタミンの解毒、並びにアンフェタミン誘導体−タンパク質結合体での免疫化を介して乱用及び/又は過剰投与の予防における使用を発見する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
特定の実施態様の簡単な説明
対象との関係において本発明の化合物が提供されており、それらはアンフェタミンの誘導体である。前記化合物は、免疫原の生産のための中間体として又は抗原性タンパク質の、例えば、破傷風トキソイドトキシンもしくはキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)に対してアンフェタミン誘導体の芳香族環もしくは側鎖のいずれかを介して結合された場合の免疫原としての使用を発見する。好適に、前記連結基は、アンフェタミン誘導体の芳香族基に対して又は側鎖に対して、芳香族環上で置換されたアフェアタミンに対する抗体が生産されるような位置で結合している。ヒトなどの動物は、薬物乱用の効果を治療及び/又は阻害するために、アンフェタミンの類似物、好適には２以上の類似物、例えば、エクスタシー、４−メチルチオアンフェタミン、メタンフェタミン、又はN−エチルアンフェタミンに対して特異的に結合する抗体を含む抗血清を生産するために免疫化されている。免疫化された動物宿主に由来するB細胞は、同じ特異的スペクトルを有するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを生産するために使用できうる。組換え免疫グロブリン軽鎖及び／もしくは重鎖及びそれらの機能的断片は、モノクローナル抗体軽及び重鎖もしくはそれらの機能的部分をコードする核酸を単離し、そしてそれを大腸菌(E.coli)などの原核宿主又は酵母もしくは哺乳動物細胞などの真核宿主細胞中で発現させることによって組換えにより作製できる。組換え抗体としては、所望の特徴を供するためにアミノ酸配列における変更が挙げられ、例えば、向上した抗原結合特性を供するために可変領域において変化を作ることができる。ハイブリッド抗体は、２つの抗原を同時に認識するように調製することもできる。「ハイブリッド抗体」とは、１対の重及び軽鎖が、１つの抗原に対して産生された抗体に相同的であり、しかも他の対は他の抗原に対して産生されたものに対して相同的である抗体を意味する。好適に、アンフェタミンの過剰投与の治療をすること、アンフェタミンの解毒、並びに乱用及び/又は過剰投与を予防することにおいて使用するために生産及び／又は投与される抗体は、中和抗体である。本明細書中で使用されている場合、用語、抗体とは、重及び軽鎖の両方を含んで成る抗体分子全体を意味するが、前記抗体の任意の断片、例えば、アンフェタミン及びアンフェタミン誘導体に対する所望の結合特異性を維持する(Fab)2、Fab、Fv断片及びScFv断片も意味する。本明細書中で使用されている場合、用語「中和」とは、抗体に言及する場合、かかる抗体が、アンフェタミン又はアンフェタミン誘導体、主にアンフェタミンを消費する対象者の体流体中で発見されるアンフェタミン代謝物、に対して結合し、アンフェタミンが細胞レセプターに対して結合することを妨げることを意味する。好適に、前記抗体はアンフェタミンに対して十分な親和性を有し、リガンドがレセプターに対して結合している場合、レセプターに結合したリガンドの、アンフェタミン又はアンフェタミン誘導体をレセプターから取り除くことができる。
【０００７】
一つの実施態様において、新規化合物が獲得されており、それは適切な担体に対し結合されて動物に対して投与される場合、アンフェタミン誘導体に対して向けられる特異的抗体を誘導できる。本発明は、好適に（S）−エナンチオマー化合物及びこれらの化合物に対する抗体に関連し、ここで（S）−エナンチオマーは式（Ｉ）
【化１】
2005516034.tif 000002
（式中、
−R1及びR3は、水素、及びC1〜C3アルキルからなる群から選択されており；
−R2は、水素、C1〜C3アルキル及びポリメチレン鎖：−（CH2）n−COOHからなる群から選択され、ここでnは、１〜６の整数であり；
−R4、R6及びR7は、同じ又は異なっており、水素、ハロゲン、−OR9及び−SR9からなる群から選択され、ここでR9は、水素又はC1〜C3アルキルであり；
−R5は、水素、ポリメチレン鎖：−（CH2）m−R10及びオキシ−ポリメチレン鎖：−O−（CH2）m−R10からなる群から選択され、ここで−R10は、カルボキシ、チオール、及び−CONHR13SH、及び−CONHR13SHからなる群から選択され、R13は、CH（COOH）CH2−及び−（CH2）m−からなる群から選択され、ここでmは、１〜４の整数であり、但し、R1が水素であり且つR2はメチルであるかあるいはR1がメチルであり且つR2は水素である場合、当該R5はポリメチレン鎖：−（CH2）m−COOHではない）
を有する。
【０００８】
本発明の好適な実施態様は式（II）
【化２】
2005516034.tif 000003
（式中、
−R1、R3、R4、R5、R6及びR7は上記と同じ意味を有し、そして
ここでnは１〜６の整数である）
の化合物である。
【０００９】
本発明の更に好適な実施態様は式（IIIa）
【化３】
2005516034.tif 000004
（式中、
−R1、R2、R3、R4、R5、R6及びR7は上記と同じ意味を有し；
−R11は、ポリメチレン鎖：−（CH2）m−及びオキシ−ポリメチレン鎖：−O−（CH2）m−の中から選択され、そしてmは１〜６の整数であり、
−R11は、ポリメチレン鎖：−（CH2）m−及びオキシ−ポリメチレン鎖：−O（CH2）m−の中から選択され、そしてmは１〜４の整数であり、但し、−R1がメチルであれば、−R11はポリメチレン鎖：−（CH2）m−ではない）
の化合物である。
【００１０】
本発明の他の好適な実施態様は式（IIIb）
【化４】
2005516034.tif 000005
（式中、
−R1、R2、R3、R4、R6及びR7は上記と同じ意味を有し、そしてR12は、ポリメチレン鎖：−（CH2）mCONHR13及びオキシ−ポリメチレン鎖：−O（CH2）mCONHR13からなる群から選択され、そしてR13及びmは上記と同じ意味を有する）
を有する化合物である。
【００１１】
式IIIa及び式IIIbの化合物は、アンフェタミンの芳香族基に対して結合する連結のために適した鎖を有する。この連結は最も好適に、酸素原子によって結合されており、従ってかかる化合物を有する免疫原に対して生産された抗体が、芳香族環上でヘテロ原子により置換されているアンフェタミン（即ち、エクスタシー、４−メトキシアンフェタミン及び４−メチルチオアンフェタミン）を中性化できる。
【００１２】
本発明の特に好適な実施態様は、式（IV）、（Ｖ）、（VI）及び（VII）の化合物である。化合物VIIはMET1にも言及されている。
【化５】
2005516034.tif 000006
【００１３】
本発明の他の目的は、これらの新たなるアンフェタミン誘導体を調製する方法である。この化合物の合成は、アンフェタミン骨格の２つの異なる位置にスペーサーを導入することによって達成されている。
【００１４】
かかる方法は、典型的に、図１に示されているように、以下の段階を含んで成る。その段階とは：
（a）式（X）（式中、R1、R3、R4、R6、R6及びR7は上記と同じ意味を有し且つnは上記と同じ値を有する）の付加産物を獲得するために、式（IX）（式中、R1、R3、R4、R6及びR7は上記と同じ意味を有する）を有するメタンフェタミン誘導体の、Br（CH2）nCOOBn（式中、nは、適切な溶媒中１〜６の整数である）の付加によるアルキル化、
（b）式（II）の化合物を獲得するために前記付加産物式（X）の水素化、
である。
【００１５】
そしてまた、本発明は式（IIIa）を有する化合物を調製する方法に関連し、図２においいて説明されているように、以下の段階を含んで成る。その段階とは：
（a）式（XI）（式中、R3、R4、R6及びR7は上に規定されたようにCH3CH2−NO2と同じ意味を有する）を有するアルデヒド誘導体を濃縮し、式（XII）のニトロスチレン誘導体を獲得し；
（b）当該ニトロスチレン誘導体（XII）をアンフェタミン誘導体（XIII）へ還元し；
（c）化合物（XIII）の第一アミンのアルキル化により化合物（XIV）の形成につなげ；
（d）化合物（XIII）又は化合物（XIV）のアミン基をジtertブチルジカーボネートによるアシル化によって保護し、保護された誘導体（XV）を獲得し；
（e）化合物（XV）のベンジル基を、Pd/C触媒を使用することによる水素化により除去し、化合物（XVI）の形成につなげ；
（f）化合物（XVI）のフェノール基を、ベンジルブロモアルキルカルボキシレートでの反応によりアルキル化し、ベンジルエステル化合物（XVII）を獲得し；
（g）化合物（XVII）を、触媒により水素化しカルボキシル誘導体（XVIII）を産出し；そして
（h）化合物（XVIII）のアミノ基を、TFAとの反応により脱保護し、しかる後にキラルHPLC上で獲得した両方のエナンチオマーを分離し、式（IIIa）の化合物を獲得する、
ことである。
【００１６】
そしてまた本発明は、図２において説明されているように、式（IIIb）を有する化合物を調製する方法に関連し、以下の段階を含んで成る。その段階とは：
（a）式（I）（式中、R3、R4、R6及びR7は上に規定したようにCH3CH2−NO2と同じである）を有するアルデヒド誘導体を濃縮し、式（XII）のニトロスチレン誘導体を獲得し；
（b）当該ニトロスチレン誘導体（XII）をアンフェタミン誘導体（XII）へ還元し；
（c）化合物（XIII）の第一アミンのアルキル化により化合物（XIV）の形成につなげ；
（d）化合物（XIII）又は（XIV）のアミン基を、ジtertブチルジカーボネートによるアシル化によって保護し、保護された誘導体（XV）を獲得し；
（e）化合物（XV）のベンジル基を、触媒としてPd/Cを使用する水素化することよって除去し、化合物（XVI）の形成につなげ；
（f）化合物（XVI）のフェノール基を、ベンジルブロモカルボキシレートとの反応によりアルキル化し、ベンジルエステル化合物（XVII）を獲得し；
（g）化合物（XVII）を、触媒により水素化することによりカルボキシル誘導体（XVIII）を産出し；
（h）（R）−システイン誘導体、（R)H−cys(Otrt)−NH2を、(XVIII)によりカップリング剤(DCC、HOBt)を使用することによりアシル化し、しかる後に獲得されたジアステレオマー混合物をシリカゲルカラム上でのクロマトグラフィーにより分離し、S−イソマー(XIX)を獲得し；そして
(i)化合物(XIX)の酸−感受性保護基、トリフェニルメチル及びBOCを、トリフルオロ酢酸(TFA)により除去し、化合物(IIIb)をもたらす、
段階である。
【００１７】
上記両方法のアシル化段階（c）を達成するために、２つの反応系列が効率的であることが発見された。その系とは：
（a）アミン（XIII）のトリフルオロ酢酸無水物によるアルキル化、しかる後の獲得されたトリフルオロアセトアミドのハロゲン化アルキル（例えば、ヨウ化メチル）によるアルキル化、しかる後のトリフルオロアセチル基の塩基性媒体中での除去、又は
（b）アミン（XIII）の酸無水物（例えば、ホルミル−アセチル混合無水物、無水酢酸）によるアルキル化、しかる後のアミドの、リチウムアルミニウムヒドリドによる還元、
である。
【００１８】
式（IIIa）の化合物を調製する他の代わりの方法は、図３において説明されているように、以下の段階を含んで成る。その段階とは：
（a）式（XXII）のチロシンエステル誘導体を還元して、式（XXIII）のアルコール誘導体を獲得し、
（b）化合物（XXIII）をアルキル化して式（XXIV）の化合物を獲得し、
（c）化合物（XXIV）のベンジル基を、触媒としてPd/Cを使用することでのハロゲン化により除去し、式（XXV）のフェノール誘導体の形成につなげ、
（d）化合物（XXV）のフェノール基をベンジルブロモアルキルカルボキシレートによりアシル化しエステル誘導体（XXVI）の形成につなげ、
（e）化合物（XXVI）を、触媒により水素化し化合物（IIIa）を獲得する、
ことである。
【００１９】
本発明の他の観点は、動物に対して提供された場合に免疫反応を誘導するために、本発明の化合物を有する免疫原に関連する。本発明の免疫原は、本発明の化合物と適切な担体との、当業者に公知のカップリング剤と反応を使用することによる、共有結合よって獲得されている。免疫原を調製するために使用されている担体は、免疫化されるほ乳動物のT細胞を刺激できるT細胞エピトープを１つ以上含む分子である。好適に、ハプテンなどの担体は、ワクチンに対する強力な免疫反応を誘導するため、そして担体により誘導されるエピトープ抑制の現象を避けるために十分に異質であるべきだ。従って、担体としては、対象となる受容者が曝露されていない分子を使用することが好適である。適切な担体分子としては、細菌毒素又は産物の例えば、コレラ毒素B−（CTB）、ジフテリア毒素、破傷風毒素、及び百日咳毒素及び繊維状赤血球凝集素、志賀毒素、並びにシュードモナス（Pseudomonas）外毒素；レクチンの、例えば、リシン-Bサブユニット、アブリン及びスウィートピーレクチン；ウィルスタンパク質の、例えば、レトロウィルス核タンパク質（レトロNP）、狂犬病リボ核タンパク質（狂犬病RPN）、植物ウィルス（例えば、TMV、ササゲ及びカリフラワーモザイクウィルス）、水泡性ウィルス−ヌクレオカプシドタンパク質（VSN−N）、天然痘ウィルスベクター及びセムリキ森林熱ウィルス；並びにマラリアタンパク質抗原及び上記の全てのペプチド断片が挙げられる。小児期に標準的な、例えば、ジフテリア、破傷風の予防接種を行う国々では、破傷風毒素及びジフテリア毒素などのタンパク質は、もし改変されていなければ、ヒトにおいて使用するための免疫原のための適切な担体として望ましさが低い可能性がある。同様に、ウシ血清アルブミンは、大部分のヒトの食事に牛肉が含まれている地域におけるヒトの免疫化のための担体としては望ましさが低いだろう。更に尚、もし担体が本来、免疫原性／アジュバント性（adjuvanticity）を有するそして/又は全身免疫反応及びアンフェタミンに曝された部位での反応、の両方を誘導できるならば非常に有利である。
【００２０】
アンフェタミンは一般に経口的に摂取されているので、好適な担体は全身反応だけではなく予存（pre-existing）粘膜抗体反応をも誘導する。かかる粘膜反応において、アンフェタミンと抗体の反応は、薬物が血流中を循環し始める前にそれを妨害するほどに十分に迅速に生ずる。かかる理想的な担体の一つは、コレラ毒素B（CTB）であり、強い全身反応及び粘膜抗体反応を刺激できる高免疫原性のタンパク質サブユニットである。コレラ毒素のBサブユニットは、ハプテンのため、腸内層におけるM細胞のため、の両方の標的分子としても働く。CTBは、コレラワクチンに関する臨床トライアルにおいて、ヒトの使用のために安全であることが示されている（Holmgrenら、（1994）Am.J.Trop.Med.Hyg.vol.50:pp.42〜54；Jertbornら（1994）Vaccine vol.12:pp.1078〜1082；「The Jordan Report、Accelerated Development of Vaccine」1993、NIAID、1993）。粘膜反応を増強できる他の有用な担体としては、LTBファミリーの細菌毒素、レトロウィルス核タンパク質（レトロNP）、狂犬病核タンパク質（狂犬病RNP）、水泡症ウィルスヌクレオカプシドタンパク質（VSV-N）、組換え天然痘ウィルスサブユニット、及び多抗原性ペプチド（MAP）が挙げられる。
【００２１】
担体と本発明の化合物との間でのカップリング反応は、第一アミン、カルボキシル基とチオール基との間での周知の反応、例えば混合無水物法（mixed anhydride method）、カルボジイミド法などを使用することで行うことができうる。一般に、このカップリング段階は、ある反応物の遊離カルボキシル基と他の反応物の遊離アミノ基との、カップリング剤の存在下での連結アミド結合（linking amid bond）を形成する、脱水カップリングを伴う。カップリング剤は、商業的に、例えば、Pierce Chemical Company USAから入手できる。適切なカップリング剤の例としては、カルボジイミド又はN,N’−ジシクロヘキシルカルボジイミド、N,N’−ジシクロヘキシルカルボジイミド又はN−エチル−N’−［（３−ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミドの存在下での１−ヒドロキシベンゾトリアゾールが挙げられる。実用的なカップリング剤は、商業的に入手できる（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリス−（ジメチルアミノ）フォスホニウムヘキサフルオロフォスフェート（それ自身かあるいは１−ヒドロキシベンゾトリアゾールの存在下における）である。対象発明との使用を発見し且つ商業的に入手できる他のカップリング剤としては、２−（１H−ベンゾトリアゾール−１−イル）−N,N,N’,N'−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート及びO−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−N,N,N’,N'−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロフォスフェートが挙げられる。典型的に、カップリング反応は、ジクロロメタン、アセトニトリル又はジメチルホルムアミドなどの不活性溶媒中で行われている。過剰の第三アミノ、例えば、ジイソプロピルアミノ、N−メチルモルホリン又はN−メチルピロリジンが、反応混合物を約８のpHに保つために加えられている。反応温度は通常０〜５０℃の範囲である。反応時間は通常１５分から２４時間の範囲である。これらのカップリング反応は液層又は固層のいずれかで行なわれて良い。
【００２２】
本発明は、担体に対して結合した式I1（下を参照のこと）を有する免疫原に関連する。  これらの免疫原は、例えば、式I1（式中、式I1のR2は−（CH2）n−COOHである）の化合物を担体に対して、カルボジイミド法により連結せしめることによって調製できる。1−エチル−3−（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドはカルボキシル基と反応して、それを反応混合物中のアミノ基に対して結合可能になる。従って、カルボジイミド法は、担体上で第一アミンと反応するように側鎖カルボキシル基を活性化する。活性された化合物は、最終結合体を生産するために、担体タンパク質の例えば、コレラ毒素Bサブユニットなどと混合されている。カルボジイミド法並びに他のカップリング剤及び方法の記載は、M.Bodanszky、「Peptide Chemistry」第２版、Springer-Verlg、Berlin、Germany（1993）中で発見されうる。免疫原に結合した担体の例は以下に示されている。
式I1の免疫原：
【化６】
2005516034.tif 000007
（式中、R1、R3、R4、R5、R6及びR7は上記と同じ意味であり、nは１〜６の整数であり；そしてpは１〜６の整数である）
式I2の免疫原：
【化７】
2005516034.tif 000008
（式中、R1、R2、R3、R4、R6、R7及びR11は上記と同じ意味である）
及び；
式I3の免疫原
【化８】
2005516034.tif 000009
（式中、R1、R2、R3、R4、R6、R7及びR12は上記と同じ意味である）
【００２３】
本発明の他の目的は、免疫原、例えば、I1、I2及びI3の、特異的にアンフェタミン誘導体を認識するモノクローナル及びポリクローナル抗体を生産するための使用である。本発明の他の観点は、アンフェタミン又はアンフェタミン類縁薬物を、これらの使用者が乱用した後で中和することができる抗体に関連する。従って、本発明は、アンフェタミン中毒を予防的に、詳細には、乱用者により抗アンフェタミン抗体の生産をもたらす免疫反応を誘導するために使用できうるアンフェタミン類縁免疫原の形態において治療するための新たなる方法に関連し、それは、薬物摂取の場合、摂取されたアンフェタミンを中和し、従って乱用された薬物の薬理学的な効果を低下させることができる。
【００２４】
次いで、本発明の主たる目的は、アンフェタミン乱用を治療するために有用な新たなる医薬組成物を提供することである。本発明は、アンフェタミン乱用病理の治療及び/又は予防するためのワクチンを調製するために、本発明のアンフェタミン類縁免疫原を１以上含んで成る医薬組成物に関連する。アンフェタミン乱用を被っている患者に対する、本発明のアンフェタミン類縁免疫原を含んで成る医薬組成物の投与は、類縁薬物を中和するヒト特異的抗体誘導を伴う受動的免疫化の発達につながる。本発明の治療組成物としては、医薬的に許容できる製剤、例えば塩類溶液中、アンフェタミン類縁免疫原を約１〜１００mg/mL、好適には、約１０〜６０mg/Lの濃度で含む組成物が挙げられる。
【００２５】
本発明は、乱用のアンフェタミン、例えばエクスタシー及びメタンフェタミンを中和する抗体にも関連し、そして一層詳細には複数のアンフェタミン又は誘導体を同時に中和する抗体に関連する。
【００２６】
好適に、本発明の化合物に対して測定した場合、前記抗体は、アンフェタミン又はその構造類似物に対して１０6M-1、好適には、１０9M-1以上、及び最も好適には、約１０10M-1の親和定数（Ka）を有する。
【００２７】
本発明は、免疫グロブリン、好適には主に、メタンフェタミン及びその構造類似物に対して向けられたマウスIgGクラス免疫グロブリンを生産、及び好適に分泌するハイブリドーマにも言及する。好適な抗体は、予め上記の免疫原で免疫化されたマウスから、マウス脾臓細胞、及びマウスミエローマ細胞、例えば、SP2O/Ag-14細胞の同士の融合によって、獲得されたマウスモノクローナル抗体である。融合後、マウスハイブリドーマが獲得され、そしてそれらはマウス免疫グロブリン、主にメタンフェタミン及びその構造類似物に対して向けられたIgGクラス免疫グロブリンを生産及び分泌する能力に基づいて特異的に選択される。好適な抗体は、２以上の異なるアンフェタミン誘導体、好適には、メタンフェタミンとエクスタシーを同時に中和できるモノクローナル抗体でもある。本発明の特に好適なモノクローナル抗体は、DASM243-6H5D1C4及びDASM243-3A10A6A2である。好適なマウスハイブリドーマは、モノクローナル抗体DASM243-6H5D1C4及びDASM243-3A10A6A2を生産及び分泌するマウスクローンである。最も好適なハイブリドーマは、即ち、アクセスNo.CNCMI-2750を有するDASM243-645D1C4である。「モノクローナル」抗体を作り出すハイブリドーマ技術は、当業者に周知（Kohlerら、Eur.J.Immunol.、vol.6:p511（1976））である。この方法において、抗原が注射されている動物に由来する脾臓細胞及びリンパ球は、腫瘍細胞株と融合され、従って、ハイブリッド細胞又は「ハイブリドーマ」が生産され、それはどちらも不死であり且つ遺伝的にコードされたB細胞の抗体を生産することができる。このようにして形成されたハイブリッドは、選択、希釈及び再増殖によって単一の遺伝系統に分けられ、そしてこのような各系統は単一の遺伝的系統を示す。従って、それらは所望の抗原に対する免疫反応性が均一な抗体を生産する。一般にハイブリドーマ技術はマウス系統の融合を使用するが、ヒト−ヒトハイブリドーマ（Olsson、L.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）、vol.77：p5429（1980））；ヒト-マウスハイブリドーマ（Schlom、J.ら（ibid）vol.77：6841（1980））及びいくつか他の異種間ハイブリッド組み合わせも報告されている。
【００２８】
抗体も組換え手段によって調製できうる。重又は軽鎖をコードするmRNAが適切な源、例えば、成熟B細胞又は所望の特異性の抗体を作製するハイブリドーマ培養物から、RNA単離の標準的な技術を使用することで、そしてポリ-A mRNAを分離するオリゴ-dTセルロースカラムクロマトグラフィーの使用により単離されている。ポリ-A mRNAは、所望の抗体の重又は軽鎖のアミノ酸配列をコードする十分なサイズの配列を獲得するために断片化されて良い。次いで、cDNAライブラリーが、mRNAの混合物から、適切なプライマー、好適には所望のcDNAの特徴を有する核酸配列を使用して調製されている。かかるプライマーは、仮説立てられて、そしてもし抗体のアミノ酸配列が既知であれば、その配列に基づいて合成されて良い。代わりの方法において、所望の抗体又はポリ-dTを生産する細胞系統に由来する断片化されていないポリ-A mRNAに由来するcDNAも使用されて良い。生成されるcDNAを含むクローニングベクターが調製されて適切な宿主細胞系統、典型的には、大腸菌（E.coli）を形質転換するために使用される。首尾良い形質転換は、例えば、クローニングベクタープラスミド上に在中するテトラサイクリン耐性又は他の表現特長（phenotypic characteristics）によって同定されている。次いで、形質転換培養物は、cDNA中の所望の配列に対して相補的であることが知られている塩基を含む適切なヌクレオチド配列により標識されている。首尾良くハイブリダイズするクローン由来のプラスミドが単離されて、遺伝子が存在する所望の部分を確かめる当業界で公知の方法によって配列決定されている。所望の遺伝子断片が切り出されて、適切な発現ベクターへと挿入される場合、制御セグメントを伴う適切なリーディングフレームを確保するように調整（tailord）される。次いで、この調整された遺伝子配列は、遺伝子を伴うリーディングフレーム中にプロモーターを含み且つ提案された宿主細胞と適合するベクター中に配置される。適切なプロモーター、制御配列、リボソーム結合部位、及び転写終結部位、並びに便利なマーカーを既に含んでいる多くのプラスミドが当業者に公知である。
【００２９】
遺伝子も変更された抗体を生産するために調整されて良い。例えば、ほ乳類重鎖は完全に単一の源又は単一の種に由来する必要はなく、ある配列の一部は、mRNAの様々なプール、例えば、マウス-マウスハイブリドーマ、ヒト-マウスハイブリドーマ、又は一連の抗原チャレンジに対する反応において分化したB細胞から回収できる。各場合における所望の部分の配列は、上記プローブ及び分析手段を使用して回収でき、そして発現ベクター中で組換えることができる。かかるキメラ鎖は任意の所望の長さで構築されて良く；従って、例えば、完全な重鎖が構築されるかあるいはそれらのFab領域に関する配列のみであって良い。複合抗体も調製できうる。例えば、抗メタンフェアタミン軽鎖/抗エクスタシー重鎖複合抗体を作製するために、軽鎖クローンのための鋳型として使用されるmRNAに関する適切な源は、抗メタンフェタミン生産細胞系統を含んで成る。重鎖に対応するmRNAはエクスタシーに反応して生じたB細胞に由来するかあるいは抗エクスタシー生産ハイブリドーマに由来する。
【００３０】
キメラ抗体の構築のために、例えば、可変配列は個別に定常配列（constant sequence）に由来し、適切な、様々な源から重鎖及び軽鎖の部分をコードする遺伝子の所望の部分が回収され、そして各鎖をコードする遺伝子を再構築するためにライゲーションされている。例えば、マウスハイブリドーマによって生産される抗体の可変配列をコードする重鎖遺伝子の部分及び軽鎖遺伝子の部分はクローン化されており、そしてヒト抗体の重鎖及び軽鎖の定常領域をコードする遺伝子断片は、例えば、ヒトミエローマ細胞からクローン化されている。次いで、マウス遺伝子の可変部分は、各２鎖のヒト遺伝子の定常領域に対してライゲーションされている。１又は複数の鎖の部分のスプライシングではなく、適切なアミノ酸の変更、欠失、付加が、有効な技術の突然変異誘発などを使用して作製され、所望の特徴が提供される。
【００３１】
軽鎖をコードする遺伝子及び重鎖をコードする遺伝子は、各々が適切なプロモーター及び転写制御下にある限り、個別に発現プラスミド中へ挿入されて良い、又は一緒に同プラスミド中に挿入され、そして所望のタンパク質を生産するのに適した条件下で増殖する適切な細胞を形質転換するために使用されて良い。かかる条件は、所望のタンパク質の性質によってではなく、発現ベクター中で使用されているプロモーター及び制御系の種類によって主に支配されている。次いで、このようにして生産されたタンパク質は、当業者に公知の方法によって培養細胞から回収さており、その方法の選択はタンパク質が発現している形体に依存して必要である。軽鎖と重鎖が同じ宿主中で同時に発現している場合、単離手段は、再構築された抗体を回収するように設計されている。これは当業者に周知の方法を使用することで達成される。
【００３２】
本発明の特異的抗体断片、例えば、（Fab）2、Fab、及びFv断片（ここでアンフェタミン及びその構造類似物に対する特異性は保存されている）は、周知の方法（例えば、Weir（1986）.Handbook of Experimental Immunology.第4版.Balackewell、Oxford、vol.1.Immunochemistry）により完全抗体を化学解裂させることによって獲得できる。（Fab）2、Fab、Fv及びScFv断片は、重及び/もしくは軽抗体鎖の可変領域をコードする遺伝子又はアンフェタミンもしくはその構造類似物を単独で特異的に認識する抗体領域をコードする配列を有するそれらの部分をクローニングすることによる組換え技術によってかあるいは特異的組換えFabもしくはScFv断片を獲得するために再結合形態において獲得できうる。
【００３３】
本発明の医薬組成物は、ヒトに対し非経口的に例えば、静脈内、皮下、皮内、腹腔内、又は筋内に投与するための様々なデリバリーシステムにおける使用に適している。抗原製剤は、当業者に周知の移植されたミニポンプを使用することでデリバリーできる。組成物としては、１もしくは複数の精製されたアンフェタミン−ハプテン結合体及び/もしくはアンフェタミン誘導体−ハプテン結合体並びに１もしくは複数のアンフェタミン及び/もしくはアンフェタミン誘導体に対して特異的な抗体を含んで成る製剤が挙げられる。抗体は、アンフェタミン及びアンフェタミン誘導体に対する抗体が産生されてうる任意の動物に由来する血清から精製できうる。好適に、抗体はヒト化抗体である。ヒト化抗体は、ヒト抗体を生産するトランスジェニック動物で生産されて良い。ヒト化抗体は、非ヒト化抗体、例えば、マウスモノクローナル抗体の生化学的な変更により生産されても良く、それは、マウスモノクローナル抗体の抗原非結合もしくはFc領域とヒト抗体の非結合もしくはFc領域を融合することをも含みうる。これら又は他の方法によって生じたヒト化抗体は、所望の抗原結合特異性を保存し、一般に、抗体自身に対する不都合な免疫反応を生じることはない。
【００３４】
本発明の組成物と使用するための医薬的に許容できる担体と製剤の例は、Reminton’s Pharmaceutical Science、Mack Publishing Company、Philadelphia、PA、第17版（1985）（その内容は本明細書中に参照によって組み込まれている）中で発見されている。ドラッグデリバリーの方法に関しては、Langer（1990）Science Vol.249：pp1527〜1533（その内容は本明細書中に参照によって組み込まれている）を参照のこと。ワクチンの使用と生産に関しては、Plotkinら（著者）（1999）Vacccine、第3版、W.B.Saunders、Philadelphia、及びZegersら（著者）（1995）Immunological Recognition of Peptides in Medicine and Biology、CRC出版、Boca Raton、Floroda（その内容は本明細書中に参照によって組み込まれている）を参照のこと。粘膜ワクチンデリバリーに関して、Ryanら（2001）Trends Biotechnol vol.19：293〜304、及びOgraら、（2001）Clin Microbiol Rev vol.14：pp.430〜445（その内容は本明細書中に参照によって組み込まれている）を参照のこと。アジュバントに関しては、Gregoriadis、G、著者（1990）、Immunological Adjuvants and Vaccines（NATO Asi Series A、Life Science、Vol.179）（その内容は本明細書中に参照によって組み込まれている）を参照のこと。
【００３５】
本発明医薬組成物を調製する際、本発明の組成物を、それらの免疫原性及び体内分布を変化せしめるために変更を加えることが所望でありうる。薬動力学の一般論に関しては、上記Remington’s Pharmaceuticals Science、第37〜39章を参照のこと。薬動力学、免疫原性及び体内分布を変化せしめるための多くの方法は当業者に公知である（例えば、上記Langer、上記Gregoriadis（1990）を参照のこと）。かかる方法の例としては、タンパク質、脂質（例えば、リポーム）、炭水化物、又は合成ポリマーなどの物質からなるベシクル中での剤の保護が挙げられる。例えば、本発明のワクチンは、それらの免疫原性及び体内分布の特徴を増強するためにリポソーム中へと組み込むことができる。ワクチン剤をマイクロ封入し、そしてポリマーコートさえたリポソームは、放出速度を制御するために有用であり、従って、腹腔内及び経口的に投与されたワクチンの効率化に有用である。リポソームを調製するためには、Szokaら、（1980）Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9：467、米国特許第4,235,871号、第4,501,728号及び第4,837,028号その内容は本明細書中に参照によって組み込まれている）に記載されているように、沢山の方法がある。リポソームの、抗原補足及びデリバリーアジュバントとして又は免疫調節物質としての使用の簡単な確認は、Gregoriadis（1999）Method.Vol19：pp.156〜162、及びRogersら、（1988）Crit Rev Ther Drug Carrier Syst vol.15：pp.421〜480（その内容は本明細書中に参照によって組み込まれている）を参照のこと。ポリ（D、L−ラクチド）の沈殿によって生産されたポリマー状薄層基質粒子（polymeric lamellar substrate particle）は、抗原を吸着するためのポリマー系を形成する。この方法によりpH変化、有機溶媒への曝露を避け、そして維持されるべき抗原が完全であることが可能になる（Jabbal-Gillら、（2001）Adv Drug Deliv Rev vol.51：97〜111（その内容は本明細書中に参照によって組み込まれている）を参照のこと）。
【００３６】
注射用製剤を調製するために、組成物の溶液は、許容できる担体、好適には水性担体中で溶かすかあるいは懸濁されている。医薬的に許容できる様々な水性担体が使用でき、例えば水、緩衝水、０．４％塩類溶液、０．８５％塩類溶液、０．３％グリシン、ヒアルロン酸などが挙げられる。結合体製剤は、抗原に対する活性免疫反応を刺激するためにアジュバントをも含んで成る。アジュバントの例は、当業者に公知であり、そして例えば水酸化アルミニウム（Spectrum Chem.Mtg.Corp.New Brunswick、N.J.）又はリン酸アルミニウム（Spectrum）、リン酸カルシウム、サポニン、モノフォスホリルリピドA、Freundsアジュバント、リポソーム、ポリマーコートされたリポソーム、ポリマー状薄層基質粒子、及びサイトカインの例えばインターロイキン2が挙げられる。
【００３７】
前記組成物は、医薬的に許容できる担体、物質の例えば、pH調整及び緩衝剤、緊張調節剤、湿潤剤の例えば、酢酸ナトリウム、酪酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化カリウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエートなど、並びに防腐剤の例えば、チメリソール（thimerisol）など、そしてタンパク質担体の例えば、ヒト血清アルブミン又は動物血清を、生理条件を近似させるために必要に応じて含んで良い。組成物は常用の、当業者に公知の方法、例えば、無菌ろ過によって滅菌できる。生ずる水性溶液又は懸濁はそのままで使用するためにパッケージングされる、又は凍結乾燥され、当該凍結乾燥された調製物は、投与前に無菌溶液と組み合わされている。固体組成物に関して、無毒性の医薬的に許容できる常用の担体が使用されて良く、それは例えば、医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどである。
【００３８】
経口ワクチンはいくつかの方法において調製でき、例えば、水溶液、懸濁、錠剤、ピル、カプセル、又は粉末、並びに持続放出製剤の例えば、抗原（例えば、生分解性ポリ（ラクチド/グリコリド）又はポリ（ラクチド。一般に約１０％〜約９５％、好適には、約２５％〜約７０％の活性成分を含む））の持続可能な、プログラム化可能な放出のための正確に制御された（ascontrolled）放出マイクロカプセル医薬製剤として調製できうる。経口ビヒクルとしては、賦形剤の例えば、マンニトール、ラクトース、デンプン、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム及びサッカリンナトリウムセルロースが挙げられうる。持続及び制御放出製剤は、組成物をリポソーム、再吸収不能不透性ポリマー、例えばエチレンビニルアセテートコポリマー、膨順ポリマーの例えば、ヒドロゲル、又は再吸収可能ポリマーの例えば、コラーゲン及び所定の多酸又はポリエステル中へと導入することによって調製できうる。
【００３９】
経口ワクチンは食品、例えば、シュガーキューブなどとして、そしてトランスジェニック植物の食用部分（この食用部分で抗原を発現するように遺伝的変更が加えられている）として調製できうる。前記食用部分は未加工の、フルーツ又は野菜など、好適には粗製のもしくは当該食用部分から調製された産物でありうる。Charles Arntzenらは、所望の免疫原を発現するトランスジェニック植物は、摂取された場合、当該免疫原に対する免疫反応を生み出すことを発見した。例えば、Lamら、（1996）米国特許第5,484,719号、Lamら、（1997）米国特許5,612,487号、Arntzenら、（1998）米国特許第5,792,935号、Arntzenら、（1999）米国特許第5,914,123号、Lamら、（2000）米国特許第6,034,298号、Arntzenら、（2000）米国特許第6,136,320号、Arntzenら、（2001）米国特許6,194,560号及びArntzenら（1994）Vaccines、pp.339〜344を参照のこと。現在まで、ワクチンは、バナナ、ポテト、トマト、レタス、ライス、コムギ、ダイズ及びコーン中で生産されてきた（Langridge（2000）Sci.Am.Vol.283:pp.66〜71）。
【００４０】
鼻孔間製剤は、一般に、鼻孔粘膜に対する有意な刺激を引き起こすことのない又は毛様態機能を混乱させることがないビヒクルを含んで成る。希釈剤としては水及び塩類溶液が挙げられる。鼻製剤は、防腐剤の例えば、クロロブタノール及び塩化ベンザルコニウムをも含んで成る。界面活性剤又は他の浸透増強剤は、対象タンパク質の鼻粘膜による吸収を増強させるために存在していて良い。例えば、米国特許第6,136,606号；米国特許第6,077,516号；米国特許第6,077,514号；米国特許第6,048,536号；米国特許第5,932,222号；及び米国特許第5,756,104号を参照のこと。
【００４１】
エアロゾル投与に関して、医薬粗製物は、好適に、医薬的に許容できる担体中で、界面活性剤及び推進剤と共に、微細に分割された形体で供給されている。前記界面活性剤は、無毒性であるべきで、そして好適には推進剤中に可溶性であるべきだ。代表的なかかる剤は、６〜２２個の炭素原子を含む脂肪酸のエステルまたは部分エステル、例えば、カプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノレン酸、オレステイル酸（olesteric acid）及びオレイン酸そして脂肪族多価アルコール又はその環状無水物である。混合されたエステル、例えば、混合されている又は天然のグリセリドが使用できる。担体、例えば、鼻腔内デリバリーのためにレクチンなども所望ならば含んでも良い。製剤は、座薬の形態においても投与できうる。座薬は一般的に、結合剤及び担体を含み、例えば、ポリアルキレングリコール及びトリグリセリドが挙げられる。座薬は、約０.５％（w/w）〜約１０％（w/w）、好適には約１％（w/w）〜約２％（w/w）の範囲で抗原を含む混合物から形成されうる。
【００４２】
本発明は、アンフェタミンを乱用している患者を、適用量のアンフェタミン又はアンフェアミン類縁免疫原を投与することにより治療する方法にも関連する。各ワクチン投与における抗原の量は、典型的なワクチンにおける有意な有害な副作用を伴わずに、免疫保護反応を誘導する量として選択されている。かかる量は、使用されている特異的免疫原に依存し変わるだろう。一般に、各容量は、約１〜１０００μg、好適には約２〜１００μg、一層好適には約１〜４０μg、そして最も好適には１〜５μgの合計免疫原を含んで成ることが期待されている。各特定のワクチンの至適量は、対象者における抗体力価及び他の反応の観察を伴う標準的な研究により確認できうる。一次ワクチン化治療単位（primary vaccination course）は、１〜２週間隔で投与されるワクチンの２又は３回の投与を伴うことができるが、しかし、遺伝的及び他の因子が原因で、任意のワクチン製剤に対する抗体反応は、製剤及び個体間で多彩である。抗アンフェタミン又は抗アンフェタミン誘導体結合体によるワクチン化に対する反応は、短期及び長期ワクチン効果の両方を特定するために監視されており、前者は結合体製剤を評価するために、そして後者は個体についてそれらが「ブースター」ワクチン化を必要とするかを評価するために使用できうる。アンフェタミン誘導体と結合した様々なタンパク質によるワクチン化後の抗体力価を決定するために、ワクチン化された成人に由来する血液標本は、当業者に周知の標準的な技術、例えば、ELISAなどを使用することで分析されている。好適に、血液標本は、各患者からのワクチン化の前（即ち、ネガティブコントロール）及び４週後及びその後約２〜６月の間隔での試料を含む。必要に応じ、ブースターワクチン化が投与されて良い。
【００４３】
この組成物は、アンフェタミン結合体調製物でワクチン化された動物に由来する血清から獲得できる精製された抗体を投与することによって、アンフェタミン毒性に対する受動免疫保護を供するためにも使用できる。この保護の効率は、アンフェタミンもしくはアンフェタミン類似物に関連した生理症状、例えば、血圧の増加、心拍数の増加、又は瞳孔拡張などを生み出すために必要である乱用したアンフェタミンもしくはアンフェタミン誘導体の量の増加によって特定できる。精製された抗体製剤は、アンフェタミン乱用又はアンフェタミン類似物乱用、並びに過剰投与に関連した症状を示す患者を治療するためにも使用できる。提供される抗体製剤の用量は、十分な量の遊離アンフェタミン及び/又はタンフェタミン誘導体を結合でき、患者の症状を和らげる量、一般に、実質上、患者の血中の全ての遊離アンフェタミンを結合する量であるあるべきだ。前記抗体は、患者に対する直接投与によって又は抗体を含んで成りそして任意に活性炭をも含むことができる体外装置を介して患者の血液を通過させることによって提供できる。治療の効果は、乱用及び/又は過剰投与に関連した症状の萎縮（conteraction）によって監視できうる。
【００４４】
慢性及び急性治療法のための両方の製剤中で使用される抗体は、典型的に乱用されている２〜４以上、一層好適には２〜６以上、そして最も好適には２〜１０以上のアンフェタミンに対して結合し、従って、保護又は広範囲なアンフェタミン及びそれらの類似物に対する症状の軽減を供する。好適に、抗体が結合する２以上の類似物は、エクスタシー、４−メチルチオ−アンフェタミン、メタンフェタミン、又はN−エチルアンフェタミンである。そしてまた、好適に、抗体は、アンフェタミン化合物に対する高い親和性、好適には約１０6M-1以上、及び一層好適には約１０8M-1以上を有し、そして最小親和性、好適には約１０5M-1未満のそして一層好適には約１０3M-1の生物学的に不活性なメタンフェタミン代謝物に対する親和性を有する。都合良く、前記製剤は、医者が当該バイアルを直接使用して良いように無菌バイアル中単一投与キットで提供されて良く、ここで、当該バイアルは、所望量且つ濃度の製剤を有する。前記バイアルが直接使用のための製剤を含む場合、通常、この方法と共に使用するための他の製剤を必要とはしないだろう。対象の組成物はパッケージング材料中に入っていて良く、パッケージング材料は、当該対象組成物が、ヒトにおけるアンフェタミン及びアンフェタミン類似物乱用及び/又は過剰投与を治療するために使用できることを示すラベルを含んで成る。以下の例は、限定する意味ではなく説明のために今日されている。
【実施例】
【００４５】
実施例１
アンフェタミン誘導体の合成
本発明の式（II）の化合物の合成をこの下の例において詳説してあり、そして図１で説明している。番号は図中に示した段階を意味する。
１．１．化学
１．１．１．ハプテン型IIの調製
１．１．１．１．メタンフェタミンのアルキル化
方法１．
DMAP(2.44g)を、THF中Sigmaから購入したd−メタンフェタミン1(化合物(IX)、ここでR1＝−CH3、R3＝R4＝R5＝R6＝R7＝Hである)の溶液へと加えた。THF中BrCH2COOBn(3.2mL)を滴下して加えた。この反応混合物を２時間に渡り撹拌した。
【００４６】
精製された産物２a（化合物（X）ここでR1＝−CH3、n＝１、及びR3＝R4＝R5＝R6＝R7＝Hである）を、トルエン/酢酸エチルを溶離液として使用するカラムクロマトグラフィーによって獲得した。
【００４７】
産物の水素化を、エタノールの溶液中、H2/Pdを使用することによって行った。獲得した固体をイソプロパノールから再結晶化し、３a（化合物（II）ここでR1＝−CH3、n＝１及びR3＝R4＝R5＝R6＝R7＝Hである）の白色結晶又はプレートを獲得した。
【００４８】
１．１．１．２．メタンフェタミンのアルキル化
方法２
アセトニトリル中NaI（０．２６２g）及びBr（CH2）5COOBn（０．５g）の溶液２０mLを６０℃で３０分に渡り加熱した。この溶液に対して、K2CO3（０．２５８g）及びd−メタンフェタミンを加えた。次いでこの混合物を６０℃で３時間に渡り加熱した。
【００４９】
反応が完了した後、この反応混合物を酢酸エチルで抽出して、産物２b（化合物（X）ここでR1＝CH3、n＝５、R3＝R4＝R5＝R6＝R7＝Hである）を獲得した。産物Dの還元を行い、産物３b（化合物（II）ここでR1＝−CH3、n＝５、及びR3＝R4＝R5＝R6＝R7＝Hである）（２．３g）を油として獲得した。
【００５０】
塩化水素を、エーテル溶液中で無水ガス状塩酸によって形成させた。
【００５１】
１．１．２．ハプテンIII型の調製
本発明の式（IIIb）の化合物の合成の詳細をこの下の例で記載しそして図２及び３に例示している。
【００５２】
１．１．２．１  １−ベンジルオキシ−４−（２−ニトロプロプ−１−エニル）ベンゼン５（化合物）（XII）（ここでBn＝−CH2−C6H5、及びR3＝R4＝R6＝R7＝Hである）
ニトロエタン（１２５mL）中４−ベンジルオキシベンズアルデヒド４（化合物）（XI）（ここでBn＝−CH2−C6H5、及びR3＝R4＝R6＝R7＝Hである）（２５g）及びエチレンジアミン（０．５ml）の溶液を加熱し５〜６時間に渡り還流させた。冷却により、化合物５の黄色結晶が沈殿し、そしてろ過して、１０mLのメタノールで洗浄して、そして乾燥し、（２４．７６g）、収率７７%、m.p.１４３〜１４５℃、1H NMR（CDCl3）ppm：２．４１（s 3H，CH＝CCH3NO2）、５．０５（s，2H，C6H5CH2O−）、７．４（d，2H J＝8Hz）、６．９５（d，2H，J＝8Hz）、８．００（s,１H，−CH＝CCH3NO2）を得た。分析、（C16H15NO3）C、H、O、N。
【００５３】
１．１．２．２．  ２−（４−ベンジルオキシ−フェニル）−１−メチル−エチルアミン６a（化合物）（XIII ）（ここでBn＝−CH2−C6H5、及びR3＝R4＝R6＝R7＝Hである）の合成
リチウムアルミニウムヒドリド（２２．７１g）を３首丸底フラスコにおいた。次いで、無水THFを滴下して加えてこの反応を氷浴中で行った。THF中、１−ベンジルオキシ−４−（２−ニトロプロプ−１−エニル）ベンゼン（２４.７６g）を滴下して加え；この添加が完了した場合、反応混合物を１時間に渡り撹拌した。次いで、６時間に渡り６０〜７０℃で還流させた。
【００５４】
この反応が完了した後、反応混合物を加水分解を行う前の室温に戻しておき、化合物６a（２１.１３g）、収率８５．５%、1H NMR（CDCl3）δppm：１．０５（d,J＝６．７１Hz,3H,−CH−CH3−）、１．３５（s，２H，NH2）２．１（s,２H,−CH2CH−）２．４（dd，１H CH−CH3−）、２．５１（dd，１H，−CH−CH3−）、４．９５（C6H5CH2O−）６．９５（d,２H,J＝８．５Hz）７．４（m,H芳香族）分析（C16H19NO）C,H,O,N。産物６aを化合物６b（化合物（XIV）、ここでBn＝−CH2−C6H5、R1＝−CH3及びR3＝R4＝R6＝R7＝Hである、に３段階で転換した：６aのトリフルオロ酢酸によるアセチル化、しかる後にヨウ化メチルでのアルキル化が続く。最後に、トリフルオロアセチル基を塩基性媒体中で除去した。
【００５５】
１．１．２．３．化合物７の合成
７a（化合物（VX）、ここでBn＝−CH2−C6H5、及びR1＝R3＝R4＝R6＝R7＝Hである）の例
CH2Cl2及びTHF及びEt3N（１２．２mL）中の化合物６a（２１．１３g）を丸底フラスコ中において反応を０℃でおこなった。次いで、THF中（BOC）2O（３１．３g、１．５当量）を滴下によって加えた。室温で５時間後、溶媒を蒸発させて酢酸エチル及びHCl（２N）で抽出した。この抽出物を（Na2SO4）で乾燥させ、蒸発させ、そして残留物をクロマトグラフィー（シクロヘキサン、次いで酢酸エチル）で精製し、化合物９（１７．５g）、収率５８%、1H NMR（CDCl3）δppm：１．０（d,３H,−CH−CH3−）、１．３５（s，３H，−OCH3−）、３．２５（NH−,1H）２．５（−CH2CHCH3−）、４．９５（C6H5CH2O−）、７．４（m,H芳香族）分析（C16H19NO）C,H,O,Nを得た。
【００５６】
１．１．２．４産物７の触媒による水素化によりベンジル基を除去することによるフェノール８の調製
８a（化合物（XVI）、ここでBn＝−CH2−C6H5、及びR1＝R3＝R4＝R6＝R7＝Hである）の例
化合物７a（１７．５g）をエタノール中に溶かして減圧下、Pd−C１０%触媒を使用し、水素ガス（６bar、２３℃）を通過させることによって還元した。この反応が終結した後、溶液を微小孔フィルター上でろ過した。産物を溶液の蒸発によって単離し、化合物８a（１１．２g）、収率９４．８%、1H NMR（CDCl3）δppm：１．０５（d,J＝６．７１Hz，３H，−CH−CH3−）１．３５（s、9H、−OC（CH3）3）２．５（dd，１H，J＝７．３２Hz）３．２７（NH，１H）、６．６９（d，２H，J＝８．５４Hz）６．９５（d，２H，J＝８．５４Hz）分析（C12H21NO3）、C,H,O,Nを得た。
【００５７】
１．１．２．５  化合物８のアルキル化による９の合成
９a（化合物）（XVII）ここでBn＝−CH2−C6H5、及びR1＝R3＝R4＝R6＝R7＝Hである）の例
【００５８】
８a（９．４８g）及び炭酸カリウム（５．２g）及びメチルトリオクチルアンモニウムクロリド（０．５g）の懸濁に対して、ベンジルブロモアセテート加えてこの反応混合物を６０℃で６時間に渡り還流させた。
【００５９】
この反応が終結した後、溶媒を蒸発させて残留物を酢酸エチルと水（３×２０mL）で抽出した。生じる抽出物をNa2SO4で乾燥させて、蒸発させた。残留物をクロマトグラフィー（トルエン、次いで酢酸エチル）で精製し、化合物９a（６．６g）、収率５４．３%、1H NMR（CDCl3）δppm：１．０５（d,J＝６．７１Hz，３H，−CH−CH3−）及び１．４５（s，9H）−OC（CH3）3）、２．１（m，１H，−CH2CHNH−）５．１５（s，２H，C6H5CH2O−）６．７１（d，２H，J＝８．５４Hz）を得た。
【００６０】
１．１．２．６触媒による水素化でのベンジル基の除去
１０a（化合物（XVIII）ここでBn＝−CH2−C6H5、R1＝R3＝R4＝R6＝R7＝Hである）の例
化合物９a（７．６g）をエタノール中に溶かして減圧下、Pd−C１０%触媒を使用し、水素ガス（６bar、２３℃）を通過させることによって還元した。この反応が終結した後、溶液を微小孔フィルター上でろ過した。産物を溶液の蒸発によって単離し、化合物１０a（３．６g）、収率７１．５%、1H NMR（CDCl3）□~1□（d,J＝６．７１Hz，３H，−CH−CH3−）１．３５（s、9H、−OC（CH3）3）、２．５（dd，１H，−CH2CHNH−）３．３５（１H，−NH−）、４．５１（s，２H，HOOCCH2O−）６．７５（d，２H，J＝８．５４Hz）、７（d，２H，J＝8.54Hz）を得た。
【００６１】
１．１．２．７  脱保護されたシステインのアシル化による化合物１１の合成
１２a（化合物（III b）、ここでR3＝R4＝R6＝R7＝H及びR12＝−O−（CH2）m−CONHCONH2である）の例
丸底フラスコ中、化合物１０a（１．６g）を酢酸エチル中に溶かし；５分の撹拌後、HOBt（０．０２６３g、１．３当量）を０℃で加え、DCC（０．４g、１．３当量）を加えた。沈殿したジシクロヘキシルウレアをろ過によって取り除いた。
【００６２】
酢酸エチル中、H−Cys（Trt）−NH2（０．５g）を丸底フラスコに置いて、ろ過物を加え、そしてトリエチルアミン（０．２５mL）を加えた。
【００６３】
反応混合物を１日に渡り撹拌して、T.L.C（トルエン/酢酸エチル７/３）によって監視した。溶媒をこの混合物から蒸発させて酢酸エチル中で残留物をアルカリ溶液で洗浄した。
【００６４】
有機相を回収して、リン酸ナトリウムで乾燥させて蒸発させた。
【００６５】
純粋な化合物１１a（化合物（XIX）、ここでR1＝R3＝R4＝R6＝R7＝Hである）（０.８g）をトルエン/酢酸エチルを溶離液として使用するカラムクロマトグラフィーによって獲得した。収率５１%、1H NMR（CDCl3）δppm：１．００（d,３H,CH−CH3−）２．６（m、１H、CH−CH3−），１．４（s,９H，−OC（CH3）3），4．4（s，２H，−COCH2O−）６．２５（ｄ，２H，J＝８．５４）、７．２（m，H，Trt）分析（C38H43N3O5S−）C,H,O,N，S。
【００６６】
１．１．２．８  Trt及びBOC基の除去による１２の調製
１２a（化合物（IIIb）、ここでR3＝R4＝R6＝R7＝H及びR12＝−O（CH2）m−CONHCONH2である）の例
１５mLの１：１ TFA：CH2Cl2（１５mL）中１１a（０．８g）の溶液を室温で３時間に渡り撹拌した。溶媒を真空で除去して、残留した油状残留物をヘキサンで洗浄し、０．１%TFAを含む１：１メタノール：水（０．１%のTFAを含む）に溶かし、そして溶離液としてトルエン/酢酸エチルを使用するクロマトグラフィーによって精製し、化合物１２a、０．５gを得た。収率４１%、1H NMR（CDCl3）δppm：１．０３（d,３H,J＝６．７Hz）、２．３（m、１H、−CH2CHNH2−）、３．３５（m,1H，−CHNHCO−）、３．７５（m，1H，−NHCOCH2−）４．０２（ｓ，２H，−COCH2O−）６．９（d，２H，J＝８．５４Hz）。
【００６７】
実施例２
免疫原の調製
様々な数の化合物分子をタンパク質担体、例えば、破傷風毒素、コレラ毒素Bサブユニット、ウシ血清アルブミン、オボアルブミン、又はKLHとカップリングさせることによって、化合物II又はIII a、III bから免疫原を調製した。
【００６８】
２．１−式IIを有する化合物のカップリング
式IIを有する化合物をタンパク質担体に対して混合無水物法によってかあるいは他のカップリング剤を使用することによってカップリングさせた。化合物（II）の結合体を２段階で達成した。即ち、マレイミドをタンパク質担体のアシル化によって導入した。架橋を従来記載された（Yoshitakeら、J Biochem、Tokyo、1982；vol.92：pp.1413〜24）ように達成した。
【００６９】
実施例３
マウスモノクローナル抗体（mAbs）の調製
３．１−マウスの免疫化
５匹のBALB/cマウスを、ハプテン１（TT−Met1）に対する破傷風毒素（TT）結合体５０μgの腹腔内注射によって免疫化した。注射を下の表１に計画により、３〜６週間隔で行った。免疫原を完全又は不完全Freundsアジュバントと１：１（vol:vol）で混合した。注射１を完全Freundsアジュバント（FC）で行ったが、その後の注射は不完全Freundsアジュバント（IFC）で行った。血液試料を動物から最初の注射の前にそして各注射の３〜５日後に回収した。
【表１】
2005516034.tif 000010
【００７０】
動物の免疫反応を、ウシ血清アルブミン（BSA）結合体（BSA−Met1）で行ったELISAにより観測した。手早く、５０μLの各BSA−Met1（０．１M炭酸塩緩衝液中１０μg/mL、pH９．０）をELISAプレート（Maxisorb、Nunc）に対して適用した。３７℃で１時間及び／又は４℃で１８時間に渡るインキュベーション後、トリス塩類緩衝液（TBS）、pH７．４中に溶かした２００μLの１％ゼラチンの添加によりプレートを飽和させ、そして３７℃で１〜２時間に渡るインキュベーションをした。１５μLの連続希釈した動物血清を、０．０５％Tween20を含むTBSで洗浄する前に、３７℃で１時間に渡りインキュベートし、そして２次抗体で標識したペルオキシダーゼ（マウスIgGに対して向けられたペルオキシダーゼ標識されたウサギIgG抗体；BioAtrantic、Nantes、France）と更にインキュベーションした。免疫複合体をOPD染色によって視覚化した。力価を、速やかに、OD値＞０．２を与える希釈の逆数（inverse）として測定した。５匹のマウス（M30〜M34）で獲得されたデータを下の表IIに示している。
【表２】
2005516034.tif 000011
【００７１】
強力な免疫反応を全てのマウスで獲得した。マウス＃３４を、ハイブリドーマ培養細胞中でモノクローナル抗体を調製するために選択した。
【００７２】
３．２−ミエローマ細胞との融合
Sp2/O−AG14マウスミエローマ細胞を融合パートナーとして使用した。本質的にLoriat15によるポリエチレングリコール法によって融合を行った。
【００７３】
３．３−ハイブリドーマの選択
ハイブリドーマを最初に、BSA−Met1でコートしたプレートを伴いELISAによって選択した。BSA−Met1に対して有意に結合（OD＞３）する抗体を分泌するハイブリドーマを増幅し、２４ウェル培養プレート中で１mLの培養上清を生産した。上清を再度ELISAによって試験し、力価を測定した。次いで、選択した抗体をイソ型の測定のために試験し、そしてメタンフェタミン及びエクスタシーを阻害物質として使用する競合ELISAによって調査した。
【００７４】
３．４−競合試験
メタンフェタミン及びエクスタシーの各々を脱イオン水（Milli Q quality）中1mg/mLで溶かして、阻害活性について０．１及び０．０１mg/mLで試験した。競合アッセイを以下の様にして行った。３０μLのハイブリドーマ上清を、OD値が０．７〜１．０（最大OD値の３０〜５０％）の範囲において獲得するために希釈し、そして３０μLの阻害物質と共に３７℃で１時間に渡りインキュベートした。１５μlLの混合物を、BSA−Met1でコートされたELISAプレートのマイクロウェルに対して加え、３７℃で１時間に渡りインキュベートした。プレートを更に３．１．に記載したように処理した。メタンフェタミン及びエクスタシーの阻害活性をパーセンテージ［１−（OD阻害物質あり/OD阻害物質なし）×１００］で評価した。
【００７５】
３．５−イソ型特定を記載（Loiratら、1992）15されているように行った。
【００７６】
３．６−クローニング
期待された特徴、即ち、OD値＞１．０、を伴う抗体、イソ型：IgG1、IgG2a又はIgG2b、（０．０１mg/mLでのメタンフェタミンとエクスタシーでの阻害率＞５０％）を分泌するハイブリドーマを、記載された（Loiratら、1992）ように限界希釈によってクローン化した。ハイブリドーマ細胞を培養培地中で希釈して、９６ウェル培養プレート中ウェル当り１又は０．５の細胞が統計的に分配されるように分配した。培養をスクリーニングする８〜１２日前に３．３.において記載したように行っている。
【００７７】
クローニングを２回行った。３５の分泌ハイブリドーマ及び６の最終クローン（6DL2）を獲得した。
【００７８】
３．７−特性決定
特性決定を、５０mL培養フラスコ中で生産した培養上清及び腹水流体から獲得した精製した抗体に対して行った。腹水をBALB/c マウスにおいて生産させた。即ち、この動物は１４日に渡りプリスタンで処理されており、およそ３百万個のハイブリドーマ細胞を腹腔内に注射されており、そして腹水を細胞注射の８〜１２日後に回収した。IgGの精製を固定化タンパク質Aに対する親和性クロマトグラフィーにより行い；結合したIgGをゲルからpH６．０（IgG1）又はpH３．０（IgG２b）で溶出させた。
【００７９】
特性決定には：
−イソ型特定；
−ELISA及びRIAによる力価の測定；
−RIAによる親和性及び交差反応性の測定；
−一連の類似物による阻害試験（表３の結果を参照のこと）
−ヒト血球及びヒト血しょうタンパク質との交差反応性分析
が伴う。
【００８０】
３．７．１−RIA法：
試料の力価は、５０％の存在する標識された代謝物を結合する抗体の希釈逆数である。
【００８１】
様々な抗体希釈体を既知量のトレーサーとインキュベートした。インキュベーション後、トレーサー−抗体複合体が沈殿し、そして上清中に存在する結合しなかったトレーサーの量を測定している。
【００８２】
親和性を標識した代謝物と標識していない代謝物間の交差反応性を試験することによって測定している。それは、Muller16の方法によって計算している。
【００８３】
標識していない代謝物の様々な希釈体を既知のトレーサー及び濃縮抗体とインキュベートした。インキュベーション後、代謝物−抗体複合体が沈殿し、そして上清中に存在する結合しなかったトレーサー量を測定している。
Kaを以下の式IIより計算している
【数１】
2005516034.tif 000012
（式中、
ｂ＝比［（AT−NS）遊離最大］/（AT−NS）、ここで（AT−NS）は抗体に対して結合した標識した代謝物の最大量であり、
T：標識した代謝物の合計モル濃度
IC50＝抗体とトレーサーの結合の５０％を阻害する標識されていない代謝物の濃度である）
【００８４】
力価をメタンフェタミン−3H（１．８×１０-9Mの濃度において）及びエクスタシー−3H（７．６×１０-10Mの濃度において）測定した。親和性をメタンフェタミンオキサレートで計算した。
【００８５】
３．７．２選択されたマウスモノクローナル抗体の特徴
Etablissement Francais de Sang−Pays de la Loire（場所はNates）で行った融合２４３に由来する２つのクローンを２回の限界希釈の後に獲得した。それらを、DASM243−6H5D1C4及びDASM243−3A10A6A2として同定した。
【００８６】
３．７．３−イソ型、力価及び親和性定数をRIA及びELISAそして精製mAbsで測定した。結果を下の表IIIに示している。
【表３】
2005516034.tif 000013
【表４】
2005516034.tif 000014
【００８７】
表Ｖに示しているように、どちらの抗体もメタンフェタミン及びエクスタシーを認識した。6H5D1C4はメタンフェタミン及びエクスタシーの両方を認識したが、それはエクスタシーよりもメタンフェタミンを１０倍超認識した。
【００８８】
３．７．４  ヒト血球との交差反応性
マウス抗体とヒト末梢血球との交差反応性をフローサイトメトリーで調べた。新鮮細胞を、薬物摂取していない健常なヒトから採取した同日血液標本（又は赤血球及び白血球に関して１日齢、４℃で保存されている）から回収して、使用した。結果を下に示している。データは平均蛍光強度として示している。
【表５】
2005516034.tif 000015
【００８９】
これらのデータは、試験した２つのモノクローナル抗体はヒト末梢血球と交差反応性を示さないことを示している。
【００９０】
３．７．５.  ヒト結晶タンパクとの交差反応性
抗体とヒト血しょうタンパク質との交差反応性を、図４の凡例に示したようなウェスタンブロッティングによって調べた。
【００９１】
３．７．５．１．  実験：
１）１０％ポリアクリルアミドゲル中での、Laemmli（1970）による、SDS中で可溶化される血しょうタンパク質の電気泳動；２）ニトロセルロースシートへの電気泳動体の移動；３）免疫ブロッティング：膜を１％の脂肪を含まないミルクで飽和させ、メタンフェタミンに対するmAbs（１/１０希釈した抗体）と１時間に渡り室温でインキュベートし、二次抗体（ペルオキシダーゼ標識した抗−マウスIgG）とインキュベートし、そしてELC法（Amersham）を使用して検出する。結果を図４に示しており：レーン１〜５：１）3A10A6A2；２）3A10E5E7;３）抗体6H5D1C4；４）抗体6H5E1G12;５)培養培地(ネガティブコントロール)。
【００９２】
免疫ブロッティング分析によりヒト血しょうタンパク質との有意な交差反応性がないことが示された。
【００９３】
実施例４．
ワクチン調製物
免疫原に対して結合させたアンフェタミン−ハプテン結合体を含んで成るヒトワクチンを、化合物II又はIIIa、IIIbから、上記カルボジイミド法を使用し、当該化合物分子とコレラ毒素のBサブユニットをカップリングさせることによって調製している。これらの調製物を塩類溶液中に、２００μg/mLのタンパク質濃度で溶かし、フィルター滅菌して４℃で保存している。
【００９４】
実施例５．
免疫化のプロトコール
ヒト成人患者に由来する血清試料を免疫化の直前及び免疫化の４週後に採取して、ワクチン化プロトコールの効率を特定した。患者を、様々なアンフェタミン誘導体で調製した結合体ワクチンを受けた２つの群に分けている。これらの群は、性別、類、及び結合体ワクチン化の最初の投与の年齢が類似している。組み合わされたアンフェタミン誘導体、即ち、抗体反応を誘導するためのコレラB毒素サブユニットの至適用量を決定するために、ヒト成人を当該結合体の１回の筋内注射によりチャレンジした。結合体の用量は、０．５mLの塩類溶液中、１〜１００μgの範囲のタンパク質である。
【００９５】
実施例６．
免疫反応の評価
この実験の目的は、例４において調製した結合体について、それらがヒト中で免疫反応を誘導する能力を評価することである。抗アンフェタミン又は抗アンフェタミン誘導体抗体反応は、短期及び長期ワクチン反応を評価する場合に有用である。
【００９６】
様々なタンパク質によるワクチン化後の抗体力価を測定するために、アンフェタミン誘導体、ワクチン化された成人に由来する血液標本をELISAによって分析している。前記血液標本としては、ワクチン化の前の各患者に由来する試料（即ち、ネガティブコントロール）及びワクチン化の約４週間後の試料を含む。前記ELISAを、９６ウェルポリスチレンプレートを１μg/ウェルのアンフェタミンでコーティングすることによって３７℃で２時間に渡り行った。非特異的結合部位を、リン酸緩衝塩類溶液（PBS）中５％の粉末状ミルク及び０．１％Tween80で３７℃で３０分に渡り遮断した。このプレートをPBS及び０．１％Tweenで１度洗浄した。血液試料を様々な希釈率（例えば、１：１００、１：１０００及び１：１００００）において、各希釈体を、３そろいの抗原コートプレートに加えることによって試験した。インキュベーションの２時間後、このプレートを３度、PBS及び０．１％Tweenで洗浄した。１：２５０〜１：１０００に希釈してヒツジ抗ヒトIgGに対して結合させた西洋ワサビペルオキシダーゼ（Boehringer−Mannheim Biochemicals）１００μlを、各ウェルごとに加えている。このプレートを３７℃で１時間に渡りインキュベートしてPBS及び０．１％Tweenで３度洗浄した。クエン酸塩緩衝剤（pH５．０）中ｏ−フェニル−ジアミンの１：５０希釈体５０μl、そして１μl/mLの３０％H2O2を加え、そして室温で２０分に渡りインキュベートした。各ウェルにおける４９５nmでの吸光度を測定し、そして結果を３つのプレートの平均光密度として表している。
【００９７】
実施例７
アンフェタミンの毒性に対する活性免疫保護
アンフェタミン結合体調製物がアンフェタミン及び誘導体の毒性効果に対して保護をする能力を動物モデルにおいて評価し、それは免疫化されたマウス集団と免疫化されていないマウス集団における各化合物の致死量（LD50として示している）を測定することによる。マウスを、塩類溶液における結合体調製物の１回の筋内注射で免疫化した。最初の注射には同結合体のブースター注射が続いて良い。ワクチン化の後、各々のマウスを出血させ、そして血清抗体力価を、抗マウス抗体酵素結合体をヒト抗体結合体におきかえて、例６に類似するようなELISAで測定した。各ワクチン調製物内の至適結合体濃度をELISAにより実験的に決定している。１度、各結合体調製物について、有効なワクチン計画を実験的に確立し、マウスを群に分けて様々な結合体調製物でワクチン化している。ワクチン化していないコントロールの群にはコントロールの塩類を与えている。各群内で、マウスを様々な濃度のメタンフェタミン又はその誘導体でチャレンジし各調製物に関するLD50を測定した。効率的なワクチン計画が動物を１以上のアンフェタミン誘導体から、その群内で１以上の誘導体のLD50を有意に高めることによって保護する。複数の誘導体に対する保護も実験的に証明しており；１つのアンフェタミン誘導体に対するワクチン化に続いて、他の誘導体の毒性効果からの保護を、様々な誘導体によるチャレンジ後のLD50の有意な増加を確認することによって特定している．最も広い保護、即ち、広範囲なアンフェタミン誘導体に対する保護を供する活性ワクチンは、ヒトの臨床トライアルにおいて候補調製物を同定するために使用されている。
【００９８】
実施例８
アンフェタミンの毒性に対する受動免疫保護
アンフェタミン及び誘導体の毒性効果に対し保護をするためにアンフェタミン結合体調製物によりワクチン化した動物から調製した血清の能力をマウスモデルで証明した。ウサギを、例７の手段により特定した、様々なアンフェタミン誘導体に対する最も広い保護を供するワクチン誘導体で免疫化している。ウサギにおいて免疫化の４週後、抗体力価を例６のELISAプロトコール（抗ウサギ抗体ペルオキシダーゼ接合体を抗ヒト抗体ペルオキシダーゼ結合体に代えている）によって測定した。ウサギを出血させて血清を全血から分離し、フィルター滅菌して４℃で保存した。マウスを集団に分けて、各群あたりLD50の１つのアンフェタミンでチャレンジした。アンフェタミン誘導体でチャレンジした直後、マウスへウサギ血清を静脈内注射によって投与した。各々のLD50を有意に高めるのに必要とされる最小保護体積を実験によって特定している。アンフェタミン誘導体によりチャレンジした後の免疫化したマウス集団及び免疫化していないマウス集団における保護プロトコールの効率を、マウスの集団のいずれかにおける各試験したアンフェタミン誘導体のLD50の有意な増加によって測定している。最も広い保護、即ち、最も広範囲なアンフェタミンに対する保護を供する受動免疫は、臨床トライアルにおいてヒトの受動保護のための候補調製物を同定するために使用されている。
【００９９】
上の結果により、２以上のアンフェタミン及び／又はアンフェタミン誘導体に対して特的な抗体を本発明の化合物を使用して調製できることが示された。
【０１００】
この出願において説明した全ての刊行物及び特許出願は本発明が関わる当業者の水準での説明である。全ての刊行物及び特許出願は本明細書中、各々の刊行物又は特許出願が詳細且つ個別に、参照によって組み込まれていることを示すのと同じ程度、参照によって組み込まれている。
【０１０１】
本発明は十分に記載されており、それは発明の精神又は範囲から逸脱することなく当業者が多くの変化及び変更をできることは明らかだろう。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】式IIの化合物の合成を示す。
【図２】式IIIa及び式IIIbの化合物の合成を示す。
【図３】式IIIbの化合物の代わりの合成を示す。
【図４】ヒト結晶タンパク質を伴うMet1に対して産生したマウスモノクローナル抗体の交差反応性分析に由来する結果を示す(ゲル１０％)。
【図１】
2005516034.tif 000028
【図２】
2005516034.tif 000029
【図３】
2005516034.tif 000030
【図４】
2005516034.tif 000031
【国際調査報告】
2005516034.tif 000032
2005516034.tif 000033
2005516034.tif 000034
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