(57)【要約】本発明は、微生物内の標的遺伝子クラスタによって合成される二次代謝産物を同定するための方法及びシステムに関する。推定上の又は確認された機能は遺伝子クラスタ内の遺伝子によるものであり、かかる微生物由来の抽出物であって、遺伝子クラスタによって合成される二次代謝産物を含有すると考えられる抽出物が得られる。続いて、かかる抽出物の化学的特性、物理的特性又は生物学的特性について検討し、代謝物を同定し、選択的に単離する。また本発明は、遺伝子クラスタ情報が二次代謝産物生成データリンクする情報リポジトリを提供するものである。本発明はさらに、情報リポジトリにアクセスするためのグラフィカルユーザーインターフェース、及びメモリに格納されるデータ構造を有するデータを格納するためのメモリに関する。
2005514959.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物のゲノムに含まれる標的遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物を同定する方法であって、
ａ）推定上の又は確認済みの機能が、遺伝子クラスター中の少なくとも１つの遺伝子領域に起因する、標的遺伝子クラスターを含む微生物を提供するステップ、
ｂ）標的遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物を含む抽出物を、微生物から得るステップ、
ｃ）抽出物中の代謝産物の化学的、物理的又は生物的特性を測定するステップ、及び
ｄ）ステップｃ）で測定された化学的、物理的又は生物的特性と、遺伝子クラスターに含まれる遺伝子に起因する標的遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物の推定上の又は確認済みの機能に基づいて予測される化学的、物理的又は生物的特性とを比較することによって、ステップｃ）の代謝産物から、標的遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物を同定するステップ、
を含む方法。
【請求項２】
ステップｂ）が、多数の培養条件下で微生物を生育することによって標的遺伝子クラスターを発現させ、少なくとも複数の培養条件下で生成された発酵ブロスの抽出物を得ることを含み、ステップｃ）が、少なくとも複数の抽出物中の代謝産物の化学的、物理的又は生物的特性を測定することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ステップｄ）が、ステップｃ）で測定した化学的、物理的又は生物的特性と、既知の化合物の化学的、物理的又は生物的特性とを比較するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項４】
ステップａ）が、微生物のゲノムに存在する少なくとも１つの二次代謝遺伝子クラスターに関するデータを含む情報リポジトリを参照して、微生物を選択することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項５】
ステップｂ）が、少なくとも１つの二次代謝遺伝子クラスターの生成物が合成される培養条件に関するデータを含む情報リポジトリを参照して選択した多数の培養条件下で、微生物を生育することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項６】
ステップｄ）の比較が、二次代謝遺伝子クラスターによって合成された代謝産物に関するデータを含む情報リポジトリを用いたコンピューター制御下にあることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項７】
ステップｄ）の比較が、化合物の既知の化学的、物理的又は生物的特性に関するデータを含む情報リポジトリを用いたコンピューター制御下にあることを特徴とする、請求項３記載の方法。
【請求項８】
ステップｃ）が、分子量、ＵＶスペクトル、及び生理活性からなるグループから選択される１又は複数の特性を測定することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項９】
二次代謝産物の化学構造を決定するステップを含むことを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
標的遺伝子クラスターによって生成された二次代謝産物の生物活性をテストするステップを含むことを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
生物活性が、抗菌活性、抗真菌活性又は抗癌活性であることを特徴とする、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
標的遺伝子クラスターが微生物に内在することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
ａ）二次代謝産物と標的遺伝子クラスターとの関連性、
ｂ）二次代謝産物の化学的、物理的又は生物的特性、及び
ｃ）微生物が二次代謝産物を合成する条件
のいずれかに関する情報が情報リポジトリに含まれていることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前もって選択したケミカルファミリー(chemical family)から二次代謝産物を同定する方法であって、
ａ）推定上の又は確認済みの機能が遺伝子クラスター中の少なくとも１つの遺伝子領域に起因する、前もって選択したケミカルファミリーと、二次代謝産物の構造的特徴と、標的遺伝子クラスターとの相関関係を設定するステップ、
ｂ）標的遺伝子クラスターを含む微生物を選択するステップ、
ｃ）標的遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物を含む抽出物を微生物から得るステップ、
ｄ）抽出物中の代謝産物の化学的、物理的又は生物的特性を測定するステップ、及び
ｅ）前もって選択したケミカルファミリーと、二次代謝産物の構造的特徴と、遺伝子クラスターに含まれる遺伝子に起因する推定上の又は確認済みの機能との相関関係に基づいて予測される化学的、物理的又は生物的特性と、二次代謝産物の化学的、物理的又は生物的特性とを比較することによって、前もって選択したケミカルファミリーに由来する二次代謝産物を、ステップｄ）の代謝産物から同定するステップ、
を含む方法。
【請求項１５】
ステップｃ）が、多数の培養条件下で微生物を生育して標的遺伝子クラスターを発現させ、少なくとも複数の培養条件下で生成された発酵ブロスの抽出物を得ることを含み、ステップｄ）が、少なくとも複数の抽出物中の代謝産物の化学的、物理的又は生物的特性を測定することを特徴とする、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
ステップｅ）が、ステップｄ）で測定した化学的、物理的又は生物的特性と、既知の化合物の化学的、物理的又は生物的特性とを比較するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
ステップａ）が、天然物、天然物と関連する生物活性、及び天然物の生合成に関わる遺伝子クラスターに関するデータを含む、情報リポジトリを参照することを特徴とする、請求項１４記載の方法。
【請求項１８】
ステップｂ）が、微生物のゲノムに存在する少なくとも１つの二次代謝遺伝子クラスターに関するデータを含む情報リポジトリを参照して、微生物を選択することを特徴とする、請求項１４記載の方法。
【請求項１９】
ステップｂ）が、少なくとも１つの二次代謝産遺伝子クラスターの生成物が合成される培養条件に関するデータを含む情報リポジトリを参照して選択した多数の培養条件下で、微生物を生育することを特徴とする、請求項１４記載の方法。
【請求項２０】
ステップｅ）の比較が、二次代謝遺伝子クラスターによって合成された代謝産物に関するデータを含む情報リポジトリを用いた、コンピューター制御下にあることを特徴とする、請求項１４記載の方法。
【請求項２１】
ステップｅ）の比較が、化合物の既知の化学的、物理的又は生物的特性に関するデータを含む情報リポジトリを用いた、コンピューター制御下にあることを特徴とする、請求項１６記載の方法。
【請求項２２】
ステップｄ）が、分子量、ＵＶスペクトル、及び生理活性からなるグループから選択される１又は複数の特性を測定することを特徴とする、請求項１４記載の方法。
【請求項２３】
二次代謝産物の化学構造を決定するステップを含むことを特徴とする、請求項１４記載の方法。
【請求項２４】
標的遺伝子クラスターによって生成された二次代謝産物の生物活性をテストするステップを含むことを特徴とする、請求項１４記載の方法。
【請求項２５】
生物活性が、抗菌活性、抗真菌活性又は抗癌活性であることを特徴とする、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
標的遺伝子クラスターが、微生物に内在性であることを特徴とする、請求項１４記載の方法。
【請求項２７】
標的遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物を微生物が合成する培養条件が、未知であることを特徴とする、請求項１４記載の方法。
【請求項２８】
ａ）二次代謝産物と標的遺伝子クラスターとの関連性、
ｂ）二次代謝産物の化学的、物理的又は生物的特性、及び
ｃ）微生物が二次代謝産物を合成する条件、
のいずれかに関するデータが、情報リポジトリに含まれていることを特徴とする、請求項１４記載の方法。
【請求項２９】
微生物のゲノムに含まれる標的遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物を同定するためのシステムであって、
ａ）推定上の又は確認済みの機能が、遺伝子クラスター中の少なくとも１つの遺伝子領域に起因する、微生物中での標的遺伝子クラスターの存在を示すゲノムデータ、
ｂ）微生物に由来する抽出物を得るための抽出手段であって、前記抽出物が、標的遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物からなる代謝産物を含む抽出手段、
ｃ）抽出物中の代謝産物の化学的、物理的又は生物的特性を測定するためのアナライザー、及び
ｄ）標的遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物の遺伝子クラスター中の遺伝子に起因する推定上の又は確認済みの機能に基づいて予測される化学的特性、物理的特性又は生物学定特性と、アナライザーで測定した化学的、物理的又は生物的特性とを比較し、抽出物に含まれる代謝産物から、標的遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物を同定するためのコンパレーター、
を含むシステム。
【請求項３０】
前もって選択したケミカルファミリーから二次代謝産物を同定するためのシステムであって、
ａ）前もって選択したケミカルファミリーと、二次代謝産物の構造的特徴と、推定上の又は確認済みの機能が遺伝子クラスター中の少なくとも１つの遺伝子領域に起因する、標的遺伝子クラスターとの相関関係を設定するゲノムデータ、
ｂ）標的遺伝子クラスターを含む微生物を選択するためのセレクター、
ｃ）標的遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物を含む抽出物を、微生物から得るための抽出手段、
ｄ）抽出物中の代謝産物の化学的、物理的又は生物的特性を測定するためのアナライザー、及び
ｅ）前もって選択したケミカルファミリーと、二次代謝産物の構造的特徴と、遺伝子クラスターに含まれる遺伝子に起因する推定上の又は確認済みの機能との相関関係に基づいて予測される化学的、物理的又は生物的特性と、二次代謝産物の化学的、物理的又は生物的特性とを比較することによって、アナライザーで解析した代謝産物から前もって選択したケミカルファミリーに由来する二次代謝産物を、同定するためのコンパレーター、
を含むシステム。
【請求項３１】
微生物のゲノムに含まれる標的遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物を同定するために、微生物に由来する二次代謝産物データを保管する情報リポジトリであって、
ａ）推定上の又は確認済みの機能が、遺伝子クラスター中の少なくとも１つの遺伝子領域に起因する、微生物中での標的遺伝子クラスターの存在を確認するゲノムデータ、
ｂ）代謝産物が標的遺伝子クラスターに起因する二次代謝産物を含み、微生物に由来する抽出物に含まれる前記代謝産物の化学的、物理的又は生物的特性を提供する抽出物を特徴付けるデータ、及び
ｃ）標的遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物の予測される化学的、物理的又は生物的特性を表す比較データであって、抽出物中の代謝産物から、標的遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物を、前記遺伝子クラスター中の少なくとも１つの遺伝子領域に起因する推定上の又は確認済みの機能に基づいて同定するために、前記抽出物を特徴付けるデータと比較する比較データ、
を含む情報リポジトリ。
【請求項３２】
抽出物を特徴付けるデータとリンクする培養条件データを更に含み、前記培養条件が、１つの抽出物を特徴付けるデータが得られる培養条件を同定する、請求項３１記載の情報リポジトリ。
【請求項３３】
抽出物を特徴付けるデータと比較するために、比較データが、複数の既知の化合物の化学的、物理的又は生物的特性を特徴付けるデータを有する既知の化合物ライブラリを含むことを特徴とする、請求項３１記載の情報リポジトリ。
【請求項３４】
抽出物を特徴付けるデータ内の標的遺伝子クラスターに起因する二次代謝産物と比較データとが一致する場合、ゲノムデータ内の記録と比較データ内の記録との間に予測リンクが設けられることを特徴とする、請求項３１記載の情報リポジトリ。
【請求項３５】
抽出物を特徴付けるデータが、抗菌活性、抗真菌活性又は抗癌活性の生物的特性を有することを特徴とする、請求項３１記載の情報リポジトリ。
【請求項３６】
ケミカルファミリーのメンバーの合成を導く二次代謝経路において、推定上の又は確認済みの機能を示すゲノムデータにケミカルファミリーを割り振るゲノムデータにリンクされるケミカルファミリーのデータをさらに含む、請求項３１記載の情報リポジトリ。
【請求項３７】
微生物中のゲノムに含まれる標的遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物を同定するために、微生物に由来する二次代謝産物データを保管する情報リポジトリを作成する方法であって、
ａ）推定上の又は確認済みの機能が遺伝子クラスター中の少なくとも１つの遺伝子領域に起因している、微生物中の標的遺伝子クラスターの存在を確認するゲノムデータを収集するステップ、
ｂ）微生物に由来する抽出物に見られる代謝産物の化学的、物理的又は生物的特性を提供する抽出物を特徴付けるデータを入力するステップであって、前記代謝産物が標的遺伝子クラスターに起因する二次代謝産物を含むステップ、及び
ｃ）抽出物を特徴付けるデータと、標的遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物の予測される化学的、物理的又は生物的特性を表す比較データとを比較し、抽出物中の代謝産物から、標的遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物を、推定上の又は確認済みの機能が前記遺伝子クラスター中の少なくとも１つの遺伝子領域に起因することに基づいて同定するステップ、及び
ｄ）比較するステップで同定した二次代謝産物と、収集するステップで収集したゲノムデータとをリンクすることによって、ステップｃ）の結果を保持するステップ、
を含む方法。
【請求項３８】
抽出物を特徴付けるデータを入力するステップが、抽出物に由来する培養条件を入力するステップをさらに含み、結果を保持するステップが、比較するステップで同定した二次培養代謝物と収集するステップで収集したゲノムデータ両方に培養条件をリンクすることをさらに含むことを特徴とする、請求項３７記載の情報リポジトリを作成する方法。
【請求項３９】
抽出物を特徴付けるデータを入力するステップが、抗菌活性、抗真菌活性、及び抗癌活性の生物的特性の入力をさらに含むことを特徴とする、請求項３７記載の情報リポジトリを作成する方法。
【請求項４０】
標的遺伝子クラスターに由来する二次代謝産物の生成をゲノムデータに基づいて予測するために、微生物に由来する二次代謝産物データを保管する情報リポジトリを作成する方法であって、
ａ）遺伝子クラスター中の少なくとも１つの遺伝子領域に起因している推定上の又は確認済みの機能が、標的遺伝子クラスターの微生物中での存在を確認するゲノムデータを収集するステップ、
ｂ）前記微生物を含む培地を抽出し、その結果抽出物を形成するステップ、
ｃ）前もって選択した化学的、物理的又は生物的特性に基づいて、標的遺伝子クラスターに起因する二次代謝産物の存在する又は存在しないことを示す抽出物を特徴付けるデータを、抽出物からスクリーニングするステップ、
ｄ）抽出物を特徴付けるデータを情報リポジトリに入力するステップ、  
ｅ）標的遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物を推定上の又は確認済みの機能に基づいて抽出物から同定するために、抽出物を特徴付けるデータと、標的遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物の予測される化学的、物理的又は生物的特性を表す比較データとを比較するステップ、
ｆ）抽出した二次代謝産物の同一性を決定するステップ、及び
ｇ）情報リポジトリ内で、ゲノムデータと、前もって選択した化学的、物理的又は生物的特性と、ゲノムデータに基づく二次代謝産物の生成の予測サイクルを可能にする二次代謝産物の同一性との一致を確認するステップ、
を含む方法。
【請求項４１】
微生物のゲノムに含まれる標的遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物を同定するためのデータ処理システムに実行中のアプリケーションプログラムがアクセスする、二次代謝産物データを記憶するメモリであって、前記メモリは、前記メモリに記憶されるデータ構造を備え、該データ構造は、データベースに常駐する情報を含み、データベースは、前記アプリケーションプログラムによって使用され、ｉ）推定上の又は確認済みの機能が、遺伝子クラスター中の少なくとも１つの遺伝子領域に起因する微生物中の標的遺伝子クラスターの存在を確認するゲノムデータ、ｉｉ）前記代謝産物が標的遺伝子に起因する二次代謝産物を含み、微生物に由来する抽出物に含まれる代謝産物の化学的、物理的又は生物的特性を提供する抽出物を特徴付けるデータ、及びｉｉｉ）標的遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物の予測される化学的、物理的又は生物的特性を示す比較データを含み、標的遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物の抽出物の中から遺伝子クラスターの少なくとも１つの遺伝子領域に起因する推定上の又は確認済みの機能に基づいて代謝産物を同定するために、該抽出物を特徴付けるデータと比較データとを比較するメモリであって、二次代謝産物データを記憶するためのメモリ。
【請求項４２】
情報リポジトリに加入するためのグラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）であって、前記リポジトリが、標的遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物を同定するための微生物に由来する二次代謝産物データを保管し、
ａ）推定上の又は確認済みの機能が、情報リポジトリの中から、遺伝子クラスター中の少なくとも１つの遺伝子領域に起因する、微生物中の標的遺伝子クラスターの存在を確認するゲノムデータにアクセスするためのゲノムアクセスエレメント、
ｂ）情報リポジトリの中から、微生物に由来する抽出物に含まれる代謝産物の化学的、物理的又は生物的特性にアクセスするための、抽出物を特徴付けるアクセスエレメントであって、前記代謝産物が標的遺伝子クラスターに起因する二次代謝産物を含むアクセスエレメント、及び
ｃ）前記ゲノムアクセスエレメントを介して存在が確認された微生物中の標的遺伝子クラスターによって合成された代謝産物を、前記遺伝子クラスター中の少なくとも１つの遺伝子領域に起因する推定上の又は確認済みの機能に基づいて同定するために、二次代謝産物の選択された化学的、物理的又は生物的特性と、前記抽出物を特徴付けるアクセスエレメントを介してアクセスした化学的、物理的又は生物的特性とを比較するための、比較アクセスエレメント、
を含む、グラフィカルユーザーインターフェース。
【請求項４３】
前記抽出物を特徴付けるアクセスエレメントを介してアクセスした化学的、物理的又は生物的特性が、抽出物に含まれる代謝産物を特徴付ける、質量スペクトル、分子量、構造データ、又は生物活性を含むことを特徴とする、請求項４２記載のグラフィカルユーザーインターフェース。
【請求項４４】
前記ゲノムアクセスエレメントにより、複数の微生物のゲノムデータへ検索可能なアクセスが可能となることを特徴とする、請求項４２記載のグラフィカルユーザーインターフェース。
【請求項４５】
前記抽出物を特徴付けるアクセスエレメントが、微生物抽出物が得られる培地成分及び成長条件への検索可能なアクセスを提供することを特徴とする、請求項４２記載のグラフィカルユーザーインターフェース。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００２年１月２４日出願の米国仮出願第６０／３５０，３６９号、２００２年７月２９日出願の米国仮出願第６０／３９８，７９５号及び２００２年９月２３日出願の米国仮出願第６０／４１２，５８０号の効果を請求するものである。上記出願の教示は参照によってそのまま本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、一般には微生物における二次代謝産物を同定するためのバイオインフォーマティクスの方法及びシステムに関する。
【背景技術】
【０００３】
天然の代謝産物は、生理活性化合物、染料、可塑剤、界面活性剤、芳香剤、調味料、薬剤、除草剤、殺虫剤及びその応用としてのリード化合物として、広く使用されている。天然の代謝産物の発見方法が改善されれば、多くの分野に恩恵がもたされることとなる。改善された発見方法を早急に必要としている天然物の分野の１つは天然物からなる薬剤の開発である。新規抗生物質の発見率は、過去数十年で著しく低下しているが、抗生物質発見率の分析からは、依然として多くの抗生物-質が放線菌の天然の代謝産物から見出されていないことが示される（Watve et al.,  Arch. Microbiology, 176, 386-390, 2001）。最近のゲノムシーケンスの研究から、生理的に活性な二次代謝産物を生成する放線菌の能力が、非常に過小評価されてきたことが実証される。例えば、Streptomyces avermitilisが生成する天然物は２種のみであると以前報告されていたにも関わらず、全ゲノムショットガンシークエンスによって、２５の二次代謝遺伝子クラスターがStreptomyces avermitilisのゲノム中に同定された（Omura et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 122515-12220）。Streptomyces coelicolorが３つ又は４つの天然物を生成することは既知であるが、同様に、ゲノムプロジェクトにおいてStreptomyces coelicolorのゲノムが１２以上の天然物のための生合成の遺伝子クラスターを含有することを実証している(Bentley, S.D. et al., Nature, 147, 141-147, 2002)。天然の代謝産物を見出すための改善された方法は継続的に必要とされており、微生物のゲノム解析は微生物の二次代謝産物の発見に基礎を提供する。
【０００４】
新規薬剤候補のための小分子を見出すために、ハイスループットスクリーニング方法が開発されてきた。従来のハイスループットスクリーニング方法は、試行錯誤法に依存し、事前選択の過程を踏まずに化合物をスクリーニングする場合は、多くの労力が無駄となる。また、利用可能なゲノム情報が多く、シーケンスは継続的により多く試みられているが、ゲノム情報に二次代謝産物の生成物をリンクする情報は不足している。薬剤発見の試みにはゲノム解析が含まれるが、多くの場合、このような発見方法には、標的代謝産物の構造を同定するために不可欠な長い時間や困難なプロセスが必要とされる。ハイスループットで行うことができ、ゲノム情報に基づいて高レベルな予測を可能とする、微生物から代謝産物を同定する方法及びシステムを提供するのが望ましい。 
【非特許文献１】Watve et al.,  Arch. Microbiology, 176, 386-390, 2001
【非特許文献２】Omura et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 122515-12220
【非特許文献３】Bentley, S.D. et al., Nature, 147, 141-147, 2002
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、先行技術の問題点の少なくとも１つを取り除く、又は改善することである。本発明における実施態様の１つでは、１又は複数の以下の利点が得られる。方法及び情報リポジトリ(knowledge repository)には、既得のデータから派生する予測的な特徴が含まれる。これによって、通常ハイスループットの応用と関連している「試行錯誤」型の繰返しに対して本発明が反駁することが可能となる。さらに、本発明は種々の培養条件（成分、温度、浸透圧等）における微生物の応答の情報を有利に組み込む。これにより、不可解な経路を誘発する可能性のある条件の予測が可能となる。二次代謝産物の情報が情報リポジトリにフィードバックされると、システムが効果的になり、本発明の予測力が増大する。ある実施態様では、特定のケミカルファミリー(chemical family)の化合物が発見の過程で見出される場合は、微生物の遺伝的な能力を特定のケミカルファミリーの二次代謝産物にリンクすることによって、効率的となる。
【０００６】
本発明は、微生物のゲノムに含まれる標的遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物を同定する方法を提供することを特徴とする。この方法には、ａ）推定上の又は確認される機能が、遺伝子クラスター内の少なくとも１つの遺伝子領域に起因することを特徴とする、標的遺伝子クラスターを含む微生物を提供するステップと、ｂ）標的遺伝子クラスターによって合成される二次代謝産物を含む抽出物を微生物から得るステップと、ｃ）抽出物の代謝産物の１又は複数の化学的、物理的又は生物的特性を測定するステップ、及びｄ）ステップｃ）で測定された化学的、物理的又は生物的特性と、クラスターに含まれる遺伝子に起因する標的遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物の推定上の又は確認済みの機能に基づいて予測される化学的、物理的又は生物的特性とを、比較することによって、ステップｃ）の代謝産物から、標的遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物を同定するステップが含まれる。かかる特徴を有するある実施態様では、ステップｂ）は、多数の培養条件下で微生物を生育することによって、標的遺伝子クラスターを発現させ、少なくとも複数の培養条件下で生成された発酵ブロスの抽出物を得ることを含む。また、ステップｃ）は、少なくとも複数の抽出物中の代謝産物の化学的、物理的又は生物的特性を測定することを含む。かかる特徴を有する別の実施態様では、ステップｄ）は、ステップｃ）で測定した化学的、物理的又は生物的特性と、既知の化合物の化学的、物理的又は生物的特性とを比較するステップを更に含む。かかる特徴を有する別の実施態様では、ステップａ）が、微生物のゲノムに存在する少なくとも１つの二次代謝遺伝子クラスターに関連するデータを含む情報リポジトリを参照して、微生物を選択することを含む。かかる特徴を有する別の実施態様では、ステップｂ）が、少なくとも１つの二次代謝遺伝子クラスターの生成物が合成される培養条件に関するデータを含む情報リポジトリを参照して選択した多数の培養条件下で、微生物を生育することを含む。かかる特徴を有する別の実施態様では、ステップｄ）の比較が、二次代謝遺伝子クラスターによって合成された代謝産物に関するデータを含む情報リポジトリを用いたコンピュータ制御下にある。かかる特徴を有する別の実施態様では、ステップｃ）は、分子量、ＵＶスペクトル、及び生理活性からなるグループから選択される１又は複数の特性を測定することを含む。別の実施態様では、本方法は、標的遺伝子クラスターによって生成された二次代謝産物の生物活性、特に抗菌活性、抗真菌活性又は抗癌活性についてテストするステップを含む。かかる特徴を含む別の態様では、二次代謝産物と標的クラスターとの関連性に関する情報、二次代謝産物の化学的、物理的又は生物的特性に関する情報、及び微生物が二次代謝産物を生成する条件に関する情報が、情報リポジトリに与えられている。
【０００７】
さらなる特徴では、本発明は、前もって選択したケミカルファミリーから二次代謝産物を同定する方法を提供し、その方法には、ａ）推定上の又は確認済みの機能が遺伝子クラスター内の少なくとも１つの遺伝子領域に起因することを特徴とする、前もって選択したケミカルファミリーと二次代謝産物の構造的特徴と標的遺伝子クラスターとの間に相関関係を設定するステップ、ｂ）標的遺伝子クラスターを含む微生物を選択するステップ、ｃ）標的遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物を含む抽出物を微生物から得るステップ、ｄ）抽出物の化学的、物理的又は生物的特性を測定するステップ、及びｅ）前もって選択したケミカルファミリーと、二次代謝産物の構造的特徴と、遺伝子クラスターに含まれる遺伝子に起因する推定上の又は確認済みの機能との相関関係に基づいて予測される化学的、物理的又は生物的特性と、二次代謝産物の化学的、物理的又は生物的特徴とを比較することによって、ｄ）の代謝産物から前もって選択したケミカルファミリーに由来する二次代謝産物を同定するステップが含まれる。
【０００８】
更なる特徴において、本発明は、微生物のゲノムに含まれる標的遺伝子クラスターによって合成される二次代謝産物を同定するためのシステムを提供する。該システムは、ａ）推定上の又は確認済みの機能が、遺伝子クラスター中の少なくとも１つの遺伝子領域に起因することを特徴とする、微生物中での標的遺伝子クラスターの存在を示すゲノムデータ、ｂ）微生物に由来する抽出物を得るための抽出手段であって、かかる抽出物が、標的遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物からなる抽出手段、ｃ）抽出物の化学的、物理的又は生物的特性を測定するためのアナライザー、及びｄ）標的遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物の遺伝子クラスター中の遺伝子に起因する推定上の又は確認済みの機能に基づいて予測される化学的、物理的又は生物的特性と、アナライザーで測定した化学的、物理的又は生物的特性とを比較し、抽出物に含まれる代謝産物から、標的遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物を同定するためのコンパレーターを含んでいる。かかる特徴を有する別の実施態様では、本発明は、前もって選択したケミカルファミリーから二次代謝産物を同定するためのシステムを提供する。かかるシステムは、ａ）前もって選択したケミカルファミリーと、二次代謝産物の構造的特徴と、推定上の又は確認済みの機能が遺伝子クラスター中の少なくとも１つの遺伝子領域に起因することを特徴とする標的遺伝子クラスターとの間に相関関係を設定するゲノムデータ、ｂ）標的遺伝子クラスターを含む微生物を選択するためのセレクター、ｃ）標的遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物を含む抽出物を、微生物から得るための抽出手段、ｄ）抽出物中の代謝産物の化学的、物理的又は生物的特性を測定するためのアナライザー、及びｅ）前もって選択したケミカルファミリーと、二次代謝産物の構造的特徴と、遺伝子クラスターに含まれる遺伝子に起因する推定上の又は確認済みの機能に基づいて予測される化学的、物理的又は生物的特性と、二次代謝産物の化学的、物理的又は生物的特性とを比較することによって、アナライザーで解析した代謝産物から、前もって選択したケミカルファミリーに由来する二次代謝産物を同定するためのコンパレーターを含む。
【０００９】
更なる特徴において、本発明は、微生物のゲノムに含まれる標的遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物を同定するために、微生物に由来する二次代謝産物データを保管する情報リポジトリを提供する。かかるリポジトリは、ａ）推定上の又は確認済みの機能が、遺伝子クラスター中の少なくとも１つの遺伝子領域に起因することを特徴とする、微生物中での標的遺伝子クラスターの存在を確認するゲノムデータ、ｂ）代謝産物が標的遺伝子クラスターに起因すると考えられる二次代謝産物を含み、微生物に由来する抽出物に含まれる代謝産物の化学的、物理的又は生物的特性を提供する抽出物を特徴付けるデータ、及びｃ）標的遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物の予測される化学的、物理的又は生物的特性を表す比較データであって、抽出物中の代謝産物から、標的遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物を、遺伝子クラスター内の遺伝子の少なくとも１つの領域による推定上の又は確認済みの機能に基づいて同定するために、かかる抽出物を特徴付けるデータと比較することを特徴とする比較データを含んでいる。かかる特徴を有する別の実施態様においては、情報リポジトリは、抽出物を特徴付けるデータとリンクする培養条件データを更に含み、かかる培養条件が、１つの抽出物を条件付けるデータが得られる培養条件を同定する。かかる特徴を有する別の実施態様においては、抽出物を特徴付けるデータと比較するために、複数の既知の化合物の化学的、物理的又は生物的特性を特徴付けるデータを有する既知の化合物ライブラリを含んでいる。かかる特徴を有する別の実施態様においては、抽出物を特徴付けるデータ内の標的遺伝子クラスターに起因する二次代謝産物と比較データとが一致した場合、ゲノムデータ内の記録と比較データ内の記録との間に予測リンクが設けられる。かかる特徴を有する別の実施態様において、情報リポジトリの抽出物を特徴付けるデータは、抗菌活性、抗真菌活性又は抗癌活性の生物的活性を有する。かかる特徴を有する別の実施態様においては、情報リポジトリが、ケミカルファミリーのメンバーの合成を導く二次代謝経路において、推定上の又は確認済みの機能を示すゲノムデータに、ケミカルファミリーを割り振る、ゲノムデータにリンクされるケミカルファミリーのデータを更に含む。
【００１０】
更に別の特徴において、本発明は、微生物のゲノムに含まれる標的遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物を同定するために、微生物に由来する二次代謝産物データを保管する情報リポジトリを作成する方法を提供する。かかる方法は、ａ）推定上の又は確認済みの機能が、遺伝子クラスター内の少なくとも１つの遺伝子領域に起因している、微生物中の標的遺伝子クラスターの存在を確認するゲノムデータを収集するステップ、ｂ）微生物に由来する抽出物に見られる代謝産物の化学的、物理的又は生物的特性を提供する抽出物を特徴付けるデータを入力するステップであって、かかる代謝産物が標的遺伝子クラスターに起因する二次代謝産物を含むステップ、及びｃ）抽出物を特徴付けるデータと、標的遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物の予測される化学的、物理的又は生物的特性を表す比較データとを比較し、抽出物中の代謝産物から、標的遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物を、推定上の又は確認済みの機能がかかる遺伝子クラスター中の少なくとも１つの遺伝子領域に起因することに基づいて同定するステップ、及びｄ）比較するステップで同定した二次代謝産物と、収集ステップで収集したゲノムデータとをリンクすることによって、ステップｃ）の結果を保持するステップを含む。かかる特徴を有する別の実施態様においては、本発明は、抽出物を特徴付けるデータを入力するステップが、抽出物が派生する培養条件を入力するステップを更に含み、結果を保持するステップが、比較するステップで同定した二次培養代謝物と収集するステップで収集したゲノムデータ両方に培養条件をリンクすることを更に含むことを特徴とする、情報リポジトリを作成する方法を提供する。かかる特徴を有する別の実施態様においては、本発明は、抽出物を特徴付けるデータを入力するステップが、抗菌活性、抗真菌活性、及び抗癌活性の生物的特徴を入力することを含むことを特徴とする、情報リポジトリを作成する方法を提供する。
【００１１】
かかる特徴を有する別の実施態様においては、本発明は、標的遺伝子クラスターから派生する二次代謝産物の生成をゲノムデータに基づいて予測するために、微生物に由来する二次代謝産物データを保管する情報リポジトリを作成する方法を提供する。かかる方法は、ａ）遺伝子クラスター中の少なくとも１つの遺伝子領域に起因している推定上の又は確認済みの機能が、標的遺伝子クラスターの微生物中での存在を確認するゲノムデータを収集するステップ、ｂ）かかる微生物を含む培地を抽出し、その結果抽出物を形成するステップ、ｃ）前もって選択した化学的、物理的又は生物的特性に基づいて、標的遺伝子クラスターに起因する二次代謝産物が存在する又は存在しないことを示す抽出物を特徴付けるデータを、抽出物からスクリーニングするステップ、ｄ）抽出物を特徴付けるデータを情報リポジトリに入力するステップ、ｅ）標的遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物を推定上の又は確認済みの機能に基づいて抽出物から同定するために、抽出物を特徴付けるデータと、標的遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物の予測される化学的、物理的又は生物的特性を表す比較データとを比較するステップ、ｆ）抽出した二次代謝産物の同一性を決定するステップ、及びｇ）ゲノムデータと、前もって選択した化学的、物理的又は生物的特性と、ゲノムデータに基づく二次代謝産物の生成の予測サイクルを可能にする二次代謝産物の同一性との一致を確認するステップを含む。
【００１２】
更なる特徴においては、本発明は、微生物のゲノムに含まれる標的遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物を同定するためのデータ処理システムに実行中のアプリケーションプログラムがアクセスする、二次代謝産物データを記憶するためのメモリを提供する。かかるメモリは、かかるメモリに記憶されているデータ構造を備え、かかるデータ構造は、データベースに常駐する情報を含み、データベースは、かかるアプリケーションプログラムによって使用され、推定上の又は確認済みの機能が、遺伝子クラスター中の少なくとも１つの遺伝子領域に起因する微生物中の標的遺伝子クラスターの存在を確認するゲノムデータ、かかる代謝産物が標的遺伝子に起因する二次代謝産物を含み、微生物に由来する抽出物に含まれる代謝産物の化学的、物理的又は生物的特性を提供する抽出物を特徴付けるデータ、及び標的遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物の予測される化学的、物理的又は生物的特性を表す比較データを含み、標的遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物の抽出物の中から遺伝子クラスターの少なくとも１つの遺伝子領域に起因する推定上の又は確認済みの機能に基づいて代謝産物を同定するために、かかる抽出物を特徴付けるデータと比較データとを比較するメモリが含まれる
【００１３】
添付図面と併せて、以下の本発明の実施例の詳細な説明を見ることによって、本発明の他の特徴及び特色が、当業者に明らかとなるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、二次代謝産物の生成物の発見率を増加させることを目的とした、ゲノミクスベースの総合的な発見プラットフォームに関する。アプローチでは、過去には検出されなかったような化合物を同定するために、伝統的な代謝産物の精製技術、及びゲノム技術とバイオインフォーマティクス技術とを用いた単離プロセスが組み合わされている。本発明は、ゲノムベースであり、標的遺伝子クラスターによって生成された代謝産物の化学的、物理的及び生物的特性を予測するために、二次代謝経路に関わる標的遺伝子クラスターに関するゲノム情報を好都合に用いる。ある実施態様においては、標的遺伝子クラスター又は目的の代謝産物の選択、微生物の選択、及び微生物を生育するための培養条件の選択のうち１又複数に更に関与する。本発明は、コンピュータを使用し、バイオインフォーマティクス技術を利用する。本発明は、ハイスループットであり、これにより便利で効率的なフォーマットにおいて、発見を早めることができる。さらに、本発明を反復することができ、各反復で作成されたデータは情報リピポジトリにフィードバックされ、方法の予測力を高め発見量を増加する。
【００１５】
標的遺伝子クラスターについてのゲノム情報が存在する二次代謝産物の合成に関わる標的遺伝子クラスターを含む微生物が提供されるか選択される。微生物に由来した抽出物から、遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物を含むものが得られる。抽出物中に存在する代謝産物の化学的、物理的又は生物的特性を検討し、ゲノム情報に基づいて、代謝産物と関連していると予測される化学的、物理的又は生物的特性と比較する。ゲノムに誘導された発現、スクリーニング及び単離を用いて、標的遺伝子クラスターによって合成された代謝産物を同定し単離する。
【００１６】
「微生物」なる語は、二次代謝産物の合成を目的とする遺伝子クラスターを含むことを知られる又は推測される、あらゆる原核生物又は真核生物の微生物に関する。細菌と真菌は本発明における使用に好ましい微生物である。適当な細菌種には、実質的に全ての細菌種、すなわち動物病原性及び植物病原性の両方及び非病原性が含まれる。好ましい微生物には、放線菌(actinomycetes)とも呼ばれるActinomycetales目の細菌が含まれるが、これに制限されない。好ましい放線菌属には、Nocardia、 Geodermatophilus、Actinoplanes、Micromonospora、Nocardioides、Saccharothrix、Amycolatopsois、Kutsneria、Saccharomonospora、Saccharopolyspora、Kitasatosporia、Kitasatosporia、Streptomyces、Microbispora、Streptosporangium、Actinomaduraが含まれる。放線菌の分類は複雑であるので、本発明で使用される可能性のある属については、Goodfellow, Suprageneric classification of actinomyces, 1989、Williams and Wilkins, Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, vol. 4, pp 2322-2339, Baltimore、 Embley and Stackebrandt, 1994、 The molecular phylogeny and systematics of the actinomycetes, Annu. Rev. Microbiol., 48, 257-289 を参照にする。いくつかの実施態様では、天然物のクラス(class)、標的遺伝子クラスターの存在又は目的の代謝産物の生成に関するゲノム情報に基づいて、優先的に微生物を選択するために情報リポジトリを調べる。
【００１７】
「二次代謝産物(secondary metabolite)」なる語は、「代謝産物(metabolite)」なる語と置き換えて使用してもよく、通常一次代謝プロセスでは使用されない、天然化学生成物である微生物内の遺伝子クラスターに関わる生合成から生じる生成物に関する。代謝産物は、共通の物理的特性を有する天然物の化学物質を分類する、「ケミカルファミリー」のメンバーでもよい。代表的なケミカルファミリーには、ポリペプチド（リポペプチドやグリコリポペプチド等のその亜族を含む）、テルペン、アルカロイド、多糖類、エンジイン(enediynes)、グリコペプチド、オルトソマイシン、ベンゾジアゼピン、アミノグリコシド、β−ラクタム、amphenicols、リンコスアミド、及びポリケチド（マクロライド、アンサマイシン、グリコシル化ポリケチド(glycosylated polyketides)、及び芳香族ポリケチド(aromatic polyketides)等のその亜族を含む）が含まれる。ポリケチドのバックボーンを有する化合物は、「ポリケチド」ケミカルファミリーに属するといえ、ポリエン構造を有する化合物は、「ポリエン」ケミカルファミリーに属するといえること等は、当業者であれば容易に理解されるであろう。当業者であれば、ここに例挙された以外の代謝産物のケミカルファミリーの望ましい物理的特性について容易に決定できることから、これらの代表的なケミカルファミリーは本発明を限定すると考えられるべきではない。
【００１８】
標的遺伝子クラスターなる語は、遺伝子、遺伝子のグループ又は二次代謝産物の生合成に関わる遺伝子の一部に関し、これらのためにゲノム情報がある。「標的」なる語は、単に、これが目的の代謝産物を生じると予測される特別な遺伝子クラスターであることを示すために用いられる。
【００１９】
「ゲノム情報」なる語は、配列情報の機能のアノテーションに加えて標的遺伝子クラスターの核酸配列、対応するポリペプチドのアミノ酸配列、又はこれらの両方に関する。ゲノム情報は、標的遺伝子クラスターを含む生合成の部位によって生成される代謝産物の化学的、物理的又は生物的に関する予測を行うための基礎を提供するのに十分でなくてはならない。
【００２０】
多くの二次代謝産物は、非リボゾーム性ペプチド合成酵素（ＮＲＰＳ）遺伝子、又はポリケチド合成酵素（ＰＫＳ）遺伝子のような大きな多機能たんぱく質によって合成され、このような場合、「遺伝子クラスター」は遺伝子の一部分に過ぎなくてもよい。ポリケチドは、多数の大きなタンパク質の複合体である、ポリケチド合成（ＰＫＳ）酵素によって合成される。炭素鎖延長の各サイクルやポリケチド合成経路における修正のために、１型モジュラーＰＫＳは１組の別々の触媒活性部位によって形成される。各活性部位はドメインと呼ばれる。１組の活性部位をモジュールという。典型的なモジュラーＰＫＳ多酵素系は複数の大きなポリペプチドからなり、アミノから負荷モジュールのカルボキシ末端、多数拡張モジュール及びチオエステラーゼドメインをしばしば含む解放モジュールへ分離することができる。一般に、負荷モジュールは、ポリケチドを合成するために用いられ、ポリケチドを第１拡張モジュールへと移動させる第１ビルディングブロックをバインドするのに関与している。負荷モジュールは特定のアシル−ＣｏＡを認識し、これをチオールエステルとして負荷モジュールのＡＣＰに移動させる。各拡張モジュール上のＡＴは特定の拡張−ＣｏＡを認識し、これをチオールエステルからその拡張モジュールのＡＣＰへ移動させる。各拡張モジュールは、前のモジュールから化合物を受け入れること、ビルディングブロックをバインドすること、ビルディングブロックを前のモジュールから派生した化合物に結合させること、選択的に１又は複数の更なる機能を果たすこと、及び結果として生じる化合物を次のモジュールへ移動させることに関与している。各拡張モジュールは、ＫＳ、ＡＴ、ＡＣＰ及び成長する炭素環のベータ炭素を修正する０、１、２又は３のドメインを有している。典型的な（非負荷）最小のＩ型ＰＫＳ延長モジュールは、ＫＳドメイン、ＡＴドメイン及びＡＣＰドメインを含んでいてもよい。このようなドメインは、２−炭素延長ユニットを活性化させ、それを成長するポリケチド分子に結合するのに十分である。次の拡張モジュールは同様に、次のビルディングブロックを結合することや、合成が完了するまで、成長する化合物を隣の拡張モジュールへ移動することに関与している。一端ＰＫＳがアシル−ＡＣＰによって初回刺激されると、負荷モジュールのアシル基をチオールエステルを形成する（トランスエステル形成）ために第１拡張モジュールのＫＳで移動させる。このステージで拡張モジュールＩはアシル−ＫＳ及びマロニル−（又は置換マロニル−）ＡＣＰを有している。負荷モジュールから派生するアシル基は次に、付随する脱酸素反応によって、マロニル基のα炭素に共有結合して、炭素−炭素結合を形成し、負荷ビルディングブロックより炭素２個長いバックボーンを有する（拡張又は延長）、新しいアシル−ＡＣＰを生成する。
【００２１】
炭素２個によって各拡張モジュールと共に成長するポリケチド鎖を、流れ作業のような過程で、続いて共有結合したチオールエステルとして拡張モジュールから拡張モジュールへと通す。かかる過程からのみ産生された炭素鎖はケトンを炭素原子の１つおきに有し、ポリケチドという名前のものを生じるポリケトンを生成する。しかし、最も一般には、更なる酵素活性が成長するポリケチド鎖に付加された直後に、しかし次のモジュールに移動する前に、かかる更なる酵素活性各２炭素ユニットのβケト基を修正する。
【００２２】
炭素−炭素結合を形成するために必要である典型的なＫＳ、ＡＴ及びＡＣＰドメインに加え、モジュールにはβ炭素の成分を修正する他のドメインを含んでいてもよい。例えばモジュールは、ケト基をアルコールに還元するケトリダクターゼ（ＫＲ）ドメインを含んでいてもよい。また、モジュールはアルコールを二重結合まで脱水するデヒドラタ−ゼ（ＤＨ）ドメインとＫＲドメインとを含んでいてもよい。さらに、ＫＲドメイン、ＤＨドメイン、及び二重結合生成物を飽和状態の単結合に変えるエノイルリダクターゼ（ＥＲ）ドメインを含んでいてもよい。拡張モジュールは、例えばメチラーゼ活性又はジメチラーゼ活性等の他の酵素活性を含むこともできる。
【００２３】
最後の拡張モジュールを横切った後、ポリケチドは、ＰＫＳからポリケチドを切断し、一般にポリケチドを環化する開放ドメインと遭遇する。さらに適合化している酵素によってポリケチドを修正することができる。これらの酵素は炭水化物基又はメチル基を添加したり、他の修正、すなわち参加や還元をポリケチド核分子に行ったりする。ドメインにはケトシンターゼ（ＫＳ）、アシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）、アシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）、デヒドラターゼ（ＤＨ）、ケトリダクターゼ（ＫＲ）、エノイルリダクターゼ（ＥＲ）等が含まれる。個々のドメインが所定のポリペプチド中で発現する順番は、「ドメインストリング」と表され、これらはハイブリッドＰＫＳ／ＮＲＰＳ系と同様に、ＰＫＳ系、非リボゾーム性ペプチド合成酵素（ＮＲＰＳ）等のこのようなマルチドメインのポリペプチド特有のサインである。マルチモジュールタンパク質のドメイン及びモジュールに関する特異性を考えると、本明細書に使用されるように「遺伝子クラスター」は、マルチモジュール系の１又は複数のドメイン若しくは１又は複数のモジュールを表す遺伝子の一部に関すると考えられる。同様に、本明細書に使用されるように、「ゲノム情報」は遺伝子の一部にのみ関連するゲノム情報に関すると考えられる。
【００２４】
別の実施態様においては、ゲノム情報は、天然の代謝産物の特徴的な成分の生合成に関わる遺伝子グループに関する。更に別の実施態様においては、ゲノム情報は、代謝産物を生成する全長の生合成部位、又はそれぞれが天然物の１クラスの代謝産物を生成する、複数の部分的又は全長の部位に関する。ゲノム情報は、実験結果、又は他の既知の配列とのコンピュータを利用した比較によって遺伝子クラスターに起因する、推定上の機能によって設定された遺伝子クラスターの機能的なアノテーションであってもよい。
【００２５】
ゲノム情報がコンピュータ上に記録され、GenBank National Center for Biotechnology Information、ＮＣＢＩ及びComprehensive Microbial Resource database (The Institute for Genomic Research)等の共通の配列データベースから利用可能な情報でアノテートされるコンピュータデータベースであると考えられるゲノム情報の情報リポジトリから、ゲノム情報を得てもよい。或いは、核酸プローブ、トランスポゾンタギング、変異原性等を使用する方法等の当技術分野で周知のあらゆる方法に従って、ゲノム情報を作成する。また、微生物を全ゲノムシークエンスすることによって、ゲノム情報を作成する。ゲノム情報を作成するために使用する可能性のある他の方法は、カナダ特許第２，３５２，４５１号及び米国特許出願第１０／２３２，３７０号に記載される、遺伝子クラスターを見出すためのハイスル−プット方法であって、これは潜在的な遺伝子クラスター、すなわち微生物のゲノムに見られる遺伝子のクラスターを同定するための方法を有利に提供し、微生物が生成するとこれまで報告されていない天然の代謝産物の生合成に関わる。潜在的な遺伝子クラスター又は潜在的な遺伝子クラスターを含む生合成の部位は、潜在的な遺伝子クラスターを持つ微生物を設定する可能性も設定しない可能性もある、特定の培養条下で生育する場合は発現する可能性がある。ある実施態様では、ゲノム情報は微生物によって生成されたと報告された代謝産物に関するが、代謝産物の構造は解明されていない。
【００２６】
「化学的、物理的又は生物的特性」なる表現は、ゲノムデータに基づいて予測され、続いて本発明によるハイスループットに基づいて測定可能な、代謝産物の特性に関する。「化学的特性」は、化学的構造又はコア構造、目的とする代謝産物の下部構造又は分子種、目的とする代謝産物中に機能性やリンクが見出される化学的置換基等のあらゆる化学的属性又は特徴を意味する。例えば、ロサロマイシン(rosaramicins)のマクロライドラクトン環構造、ベンゾピアゼピンの複素環式環構造、エンジインの発色団、ペプチド代謝産物のアミノ酸残基、代謝産物のオリゴ糖鎖中の糖残基、オルトソマイシンのオルトエステル連鎖、リポペプチドのＮ−アシルペプチド連鎖、ピエリシジン又はドリゴシン(dorrigocin)のポリケチドコア構造はすべて、目的とするそれぞれの代謝産物の化学的特性であると考えられる。「物理的特性」は、代謝産物のあらゆる測定可能な即物的観察を意味し、分子量、ＵＶスペクトルを含むがこれらに限定されない。「生物的特性」は、代謝産物の生物活性又は生物的活性を意味する。代謝産物に関連して本明細書で用いられる代謝産物の「生物活性」と「生物的活性」は、代謝産物が有するあらゆる観察可能な活性に言及するために、ほとんど同じ意味で用いられてもよい。このような活性には、抗ウイルス性活性、免疫抑制活性(immunosuppressant) 、hypocholesteremic、抗寄生虫活性（例えば、条虫、線虫、住血吸虫、吸虫）、駆虫性活性、及び殺虫性活性と同様に、抗菌活性（グラム陽性及び／又はグラム陰性）、抗真菌活性、抗癌活性、アポトーシス性活性又は抗アポトーシス性活性、若しくは細胞損傷活性が含まれるが、これらに限定されない。このような生物活性又は生物的活性のテストは、同業者には既知であるテストを用いて行ってもよい。例えば、抗菌活性又は抗真菌活性をテストするために、細菌又は真菌の生存に対する代謝産物の影響を調べる。同様に、対抗するために、特定の活性に対して伝導的な状況下で細胞を代謝産物に曝露することによって、抗癌活性、アポトーシス活性、抗アポトーシス活性、又は他の観察可能な活性を調べることができる。生物的な誘導アッセイ（ＢＩＡ）を使用してＤＮＡを破壊する薬剤(agent)を検出する。化学的、物理的又は生物的特性の発現は、化学的特性、物理的又は生物的特性であるか、２つ以上のそれらの組み合わせであるかに関わらず、１つの特性に関していてもよいし、化学的特性、物理的特性、生物的特性であるか化学的、物理的特性及び／又は生物的特性の組み合わせであるかに関わらず、２つ以上の特性の組み合わせに関していてもよい。
【００２７】
本発明は、標的遺伝子クラスターから目的の代謝産物を同定するためにゲノミクス誘導(genomics-guided)発現、スクリーニング、単離及び構造解明技術を使用する。「ゲノミクス誘導の」なる表現は、発現、スクリーニング、単離、及び代謝産物の構造を決定する方法に関し、この方法によってゲノム情報の基礎が見出される。調査する微生物や代謝産物の合成を達成するために使用する培養条件に関して、ゲノミクスを使用してこのような決定を誘導することによって、ハイスル−プットスクリーニングのランダムな性質が妨害される。ハイスル−プットスクリーニングを用いた前のプロセスは遺伝情報には誘導されず、その代わりに、生物活性テスト（例えば、抗菌活性）の結果として、このような要因に誘導された。ゲノム情報が使用されないハイスル−プットスクリーニングのこのようなケースでは、このような生物活性テストを非常に多くの生成物について行うが、有効性を示すものは少ない。微生物が目的とする二次代謝産物を生成する能力を有することを示すゲノム情報に基づいて、微生物の最初の選択、又は培養条件若しくは単離プロトコール及び構造解明プロトコール他の決定を誘導することによって、ハイスル−プットスクリーニングテストで陽性の生物活性の結果を得るためにテストしなくてはならないサンプル数を、大幅に減らすことができ、発現／スクリーニングのプロセスが改善される。本発明は、微生物のゲノム内の標的遺伝子クラスターの存在に基づいて、微生物のポテンシャルを検討する方法を提供する。したがって、これらの方法はゲノミクス誘導といわれる。
【００２８】
「抽出物」なる語は、微生物を培養する、又は分裂、他には培養期間に続く細胞培養から代謝産物を引き出すことによって得られる培地又は発酵ブロスに関する。ある実施態様においては、微生物が標的遺伝子クラスターを発現しそうな条件を予測し所望の代謝産物を合成する役目を果たす、情報リポジトリでのリンクに基づき、培養条件下で微生物を培養することによって抽出物を得る。他の実施態様においては、天然物のクラスと微生物がそのクラスの代謝産物を合成すると報告されている培養条件との間のリンクを含む情報リポジトリを参照することによって、培養条件が選択される。ゲノム情報が潜在的な標的遺伝子クラスターに関連する場合は、微生物を誘導して標的遺伝子クラスターを発現させ、多数の培養条件下で微生物を生育することによって、対応する代謝産物を合成させる。培養物の組成及び培養条件における小さな修正が、微生物によって生成された二次代謝産物の範囲に大きな影響を及ぼす可能性がある。ある実施態様では、培養条件は、微生物のゲノム内の各二次代謝経路によって生成された天然の代謝産物を発現する確率を最大化するために選択される。培養物の成長に関連する条件はいずれも、変化するし、例えばｐＨ、温度、培地の組成、湿度、圧力、多面的要因又は情報伝達分子の追加等、本発明に関連して使用する。ＤＮＡ破壊剤の添加、選択的抗生物質及び／又は放射線への曝露等の、天然物の生成に影響を及ぼすことが一般に知られている他の環境条件をスクリーニングと共に本発明に使用して、代替の又は増強した天然物の生成を選択することができる。
【００２９】
参照を簡単にするために、本明細書発明に引用される典型的な培養条件及び水溶性培地の処方に、二文字の記号表示を付す。これらは本明細書及び図面を通して使用される。ＡＡは１０ｇ／ｌのグルコース、４０ｇ／ｌのコーンデキストリン、１５ｇ／ｌのスクロース、１０ｇ／ｌのカゼイン加水分解産物（Ｎ〜ＺアミンＡ）、１ｇ／ｌの硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ）、及び２ｇ／ｌの炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）を含む培地である。ＡＢは、２４ｇ／ｌのグリセロール、２５ｇ／ｌのマンニトール、２５ｇ／ｌの可溶性デンプン、５．８４ｇ／ｌのグルタミン、１．４６ｇ／ｌのアルギニン、１ｇ／ｌの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、１ｇ／ｌの第一リン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、０．５ｇ／ｌの硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ）、及び２ｍｌ／ｌの微量元素溶液(trace element solution)含む培地であり、かかる微量元素溶液は１００ｍｌの脱イオンし、蒸留した（ｄｄ）Ｈ２Ｏに、下記を溶解して調整した。０．１ｇのＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、０．０１ｇのＭｎＳＯ４．Ｈ２Ｏ、０．０１ｇのＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ、０．０１ｇのＺｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ。また、濃硫酸（Ｈ２ＳＯ４）１滴を安定剤として加えた。ＢＡは１５ｇ／ｌの大豆粉末、１０ｇ／ｌのグルコース、１０ｇ／ｌの可溶性デンプン、３ｇの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、１ｇ／ｌの硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ）、１ｇ／ｌの第二リン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、及び下記の１００ｍｌのｄｄＨ２Ｏに１ｍｌ／ｌの溶解して調整した微量元素溶液を含む培地である。０．１ｇのＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、０．８ｇのＭｎＣＬ２．４Ｈ２Ｏ、０．７ｇのＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ、０．２ｇのＺｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ。また、濃硫酸（Ｈ２ＳＯ４）１滴を安定剤として加えた。ＣＡは４０ｇ／ｌのポテトデキストリン、１５ｇ／ｌの甘しゃ糖蜜、１０ｇ／ｌのグルコース、１０ｇ／ｌのカゼイン加水分解産物（Ｎ〜ＺアミンＡ）、１ｇ／ｌの硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ）、及び２ｇ／ｌの炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）を含む培地である。ＣＢは、２０ｇ／ｌのスクロース、２ｇ／ｌのバクトペプトン、５ｇ／ｌの甘しゃ糖蜜、０．１ｇ／ｌの硫酸第一鉄七水和物（ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ）、０．２ｇ／ｌの硫酸マグネシウム七水和物（ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ）、０．５ｇ／ｌのヨウ化カリウム（ＫＩ）、５ｇ／ｌの炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）を含む培地である。ＣＩは、２０ｇ／ｌのグリセロール、２０ｇ／ｌのデキストリン、１０ｇ／ｌの魚粉、５ｇ／ｌのバクトペプトン、２ｇ／ｌの硫酸アンモニウム（ＮＨ４）２ＳＯ４、及び2ｇ／ｌの炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）を含む培地である。ＤＡは、２０ｇ／ｌのポテトデキストリン、１０ｇ／ｌの甘しゃ糖蜜、１０ｇ／ｌのグルコース、１０ｇ／ｌのグリセロール、５ｇ／ｌの可溶性デンプン、５ｇ／ｌの大豆粉末、５ｇ／ｌのコーンスティープ固体、３ｇ／ｌの炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）、１ｇ／ｌのフィチン酸、０．１ｇ／ｌの塩化第一鉄（ＦｅＣｌ２．４Ｈ２Ｏ）、０．１ｇ／ｌの塩化亜鉛（ＺｎＣｌ２）、０．１ｇ／ｌの塩化マンガン（ＭｎＣｌ２．４Ｈ２Ｏ）、０．５ｇ／ｌの硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ）を含む培地であ��。ＤＹは、１０ｇ／ｌのコーンスターチ、５ｇ／ｌのファーマメディア(pharmamedia)、１ｇ／ｌの炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）、０．０５ｇ／ｌのＣｕＳＯ４５Ｈ２Ｏ、０．０００５ｇ／ｌのＮａＩを含む培地である。ＤＺは、１５ｇ／ｌの可溶性デンプン、５ｇ／ｌのグルコース、１０ｇ／ｌの甘しゃ糖蜜、１０ｇ／ｌの魚粉、及び５ｇ／ｌの炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）を含む培地である。ＥＡは、５０ｇ／ｌのラクトース、５ｇ／ｌのコーンスティープ固体、５ｇ／ｌのグルコース、１５ｇ／ｌのグリセロール、１０ｇ／ｌの大豆粉末、５ｇ／ｌのバクトペプトン、３ｇ／ｌの炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）、２ｇ／ｌの硫酸アンモニウム（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｇ／ｌの塩化第一鉄（ＦｅＣｌ２．４Ｈ２Ｏ）、０．１ｇ／ｌの塩化亜鉛（ＺｎＣｌ２）、０．１ｇ／ｌの塩化マンガン（ＭｎＣｌ２．４Ｈ２Ｏ）、０．５ｇ／ｌの硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ）を含む培地である。ＥＳは、４０ｇ／ｌのグルコース、５ｇ／ｌの乾燥酵母、１ｇ／ｌのＫ２ＨＰＯ４、１ｇ／ｌのＭｇＳＯ４、１ｇ／ｌのＮａＣｌ、２ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｇ／ｌのＣａＣＯ３、０．００１ｇ／ｌのＦｅＳＯ４７Ｈ２Ｏ、０．００１ｇ／ｌのＭｎＣｌ２４Ｈ２Ｏ、０．００１ｇ／ｌのＺｎＳＯ４７Ｈ２Ｏ、０．０００５ｇ／ｌのＮａＩを含む培地である。ＥＴは、６０ｇ／ｌの糖蜜、２０ｇ／ｌの可溶性デンプン、２０ｇ／ｌの魚粉、０．１ｇ／ｌの硫酸銅（ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ）、０．５ｍｇ／ｌのヨウ化ナトリウム、及び２ｇ／ｌの炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）を含む培地である。ＦＡは、４０ｇ／ｌのポテトデキストリン、１５ｇ／ｌの甘しょ糖蜜、１０ｇ／ｌのグルコース、１０ｇ／ｌのカゼイン加水分解産物（Ｎ〜ＺアミンＡ）、３ｇ／ｌの無水第二リン酸ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）１ｇ／ｌの硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ）を含む培地であって、ｐＨを７．０に調整したした後に２ｇ／ｌの炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）を加えた培地である。ＧＡは、１０３ｇ／ｌのスクロース、１０ｇ／ｌのグルコース、５ｇ／ｌの酵母抽出物、０．１ｇ／ｌのcasamino acids、１０．１２ｇ／ｌの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ）、及び０．２５ｇ／ｌの硫酸カリウム（Ｋ２ＳＯ４）を含む培地であり、培地１リットルごとに、１０ｍｌのＫＨ２ＰＯ４（０．５％溶液）、８０ｍｌのＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ（３．６８％溶液）、１５ｍｌのＬ−プロリン（２０％溶液）、１００ｍｌのＴＥＳ緩衝液（５．７３％溶液、ｐＨ７．２に調製）、５ｍｌのＮａＯＨ（１Ｎ溶液）、及び２ｍｌの微量元素溶液を含む培地である。ＨＡは、３４０ｇ／ｌのスクロース、１０ｇ／ｌのグルコース、５ｇ／ｌのバクトペプトン、３ｇ／ｌの酵母抽出物、３ｇ／ｌの麦芽抽出物、及び１ｇ／ｌの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ）を含む培地である。ＩＡは、４０ｇ／ｌのの大豆粉末、３０ｇ／ｌの可溶性デンプン、２０ｇ／ｌのグルコース、３ｇ／ｌの硝酸アンモニウム（ＮＨ４ＮＯ３）を含む培地であり、ｐＨを６．２に調整した後に１ｇ／ｌの炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）を加えた培地である。ＩＢは、４０ｇ／ｌのマンニトール、３３ｇ／ｌのカゼイン加水分解産物（Ｎ〜ＺアミンＡ）��１０ｇ／ｌの酵母抽出物、９ｇ／ｌの第一リン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、及び５ｇ／ｌの硫酸アンモニウム（ＮＨ４）２ＳＯ４を含む培地である。ＪＡは、３５ｇ／ｌの麦芽抽出物、３０ｇ／ｌのコーンスターチ、１５ｇ／ｌのコーンスティープリカー、１５ｇ／ｌのファーマメディアを含む培地であり、ｐＨを７．３に調整した後に２ｇ／ｌの炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）を加えた培地である。ＫＡは、１０ｇ／ｌのグルコース、１０ｇ／ｌのコーンスティープリカー、１０ｇ／ｌの大豆粉末、５ｇ／ｌのグリセロール、５ｇ／ｌの乾燥酵母、５ｇ／ｌの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）含む培地であって、ｐＨを５．７に調整した後に２ｇ／ｌの炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）を加えた培地である。ＫＣは、４０ｇ／ｌのトマトピューレ、２ｇ／ｌのグルコース、１５ｇ／ｌのオートミール、５０ｍｃｇ／ｌのＣｏＣｌ２．２Ｈ２Ｏを含む培地である。ＫＤは、１５ｇ／ｌのデキストリン、２０ｇ／ｌの可溶性デンプン、１０ｇ／ｌの大豆粉、３ｇ／ｌの肉抽出物、３ｇ／ｌのポリペプトン、３ｇ／ｌの酵母抽出物、３ｇ／ｌの炭酸カルシウム、及び１ｇ／ｌの塩化ナトリウムを含む培地である。ＫＥは、３０ｇ／ｌのグリセロール、１５ｇ／ｌのディスティラーの可溶物、１０ｇ／ｌのファーマメディア、１０ｇ／ｌの魚粉、６ｇ／ｌの炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）を含む培地である。ＫＦは、１ｇ／ｌのグルコース、２４ｇ／ｌの可溶性デンプン、３ｇ／ｌのバクトペプトン、５ｇ／ｌの酵母抽出物、及び４ｇ／ｌの炭酸カルシウムを含む培地である。ＫＧは、１０ｇ／ｌのバクトペプトン、１０ｇ／ｌのグルコース、２０ｇ／ｌの甘しょ糖蜜、１ｇ／ｌの炭酸カルシウム、及び０．１ｇ／ｌのクエン酸第二鉄アンモニウムを含む培地である。ＬＡは、２５ｇ／ｌの可溶性デンプン、１５ｇ／ｌの大豆粉末、５ｇ／ｌの乾燥酵母、及び２ｇ／ｌの炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）を含む培地である。ＭＡは、２５ｇ／ｌの可溶性デンプン、１５ｇ／ｌの大豆粉末、２ｇ／ｌの乾燥酵母、５ｇ／ｌの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、４ｇ／ｌの炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）、及び２ｇ／ｌの硫酸アンモニウム（ＮＨ４）２ＳＯ４を含む培地である。ＭＣは１０ｇ／ｌのグルコース、１０ｇ／ｌのデンプン、１５ｇ／ｌの大豆粉、１ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、３ｇ／ｌのＮａＣｌ、１ｇ／ｌの硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ）、０．００７ｇ／ｌのＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ、０．００１ｇ／ｌのＦｅＳＯ４Ｋ７Ｈ２Ｏ、０．００８ｇ／ｌのＭｎＣｌ２４Ｈ２Ｏ、０．００２ｇ／ｌのＺｎＳＯ４５Ｈ２Ｏを含む培地である。ＭＵは、２５ｇ／ｌのマンニトール、１０ｇ／ｌの大豆粉末、１０ｇ／ｌの牛肉抽出物、５ｇ／ｌのバクトペプトン、５ｇ／ｌのグルコース、２ｇ／ｌの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、３ｇ／ｌの炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）を含む培地である。ＮＡは、２０ｇ／ｌのグリセロール、１０ｇ／ｌの甘しょ糖蜜、５ｇ／ｌのcaseamino acids、１ｇ／ｌのバクトペプトン、４ｇ／ｌの炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）を含む培地である。ＮＥは、３０ｇ／ｌのグルコース、５ｇ／ｌのバクトペプトン、５ｇ／ｌの牛肉抽出物、５ｇ／ｌの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、２ｇ／ｌの炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３��を含む培地である。ＮＦは、２０ｇ／ｌの可溶性デンプン、２０ｇ／ｌの大豆粉、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、５ｇ／ｌの酵母抽出物、２ｇ／ｌのＣａＣＯ３、０．００５ｇ／ｌのＭｎＳＯ４、０．００５ｇのＣｕＳＯ４、０．００５ｇ／ｌのＺｎＳＯ４を含む培地である。ＮＧは、４０ｇ／ｌのグルコース、１５ｇ／ｌのcaseamino acids、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、２ｇ／ｌのＣａＣＯ３、１ｇ／ｌのＫ２ＨＰＯ４、１２．５ｇ／ｌのＭｇＳＯ４を含む培地である。ＯＡは、１０ｇ／ｌのグルコース、５ｇ／ｌのグリセロール、３ｇ／ｌのコーンスティープリカー、３ｇ／ｌの牛肉抽出
物、３ｇ／ｌの麦芽抽出物、３ｇ／ｌの酵母抽出物、２ｇ／ｌの炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）、０．１ｇ／ｌのチアミンを含む培地である。ＰＡは、１０ｇ／ｌの可溶性デンプン、１０ｇ／ｌのグリセロール、５ｇ／ｌのグルコース、５ｇ／ｌの牛肉抽出物、３ｇ／ｌのバクトペプトン、２ｇ／ｌの酵母抽出物、１ｇ／ｌのcaseamino acids、２ｇ／ｌの炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）、０．０１ｇ／ｌのチアミンを含む培地である。ＰＢは、２５ｇ／ｌの大豆粉、７．５ｇ／ｌの可溶性デンプン、２２．５ｇ／ｌのグルコース、３．５ｇ／ｌの乾燥酵母、０．５ｇ／ｌの硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ）、６ｇ／ｌの炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）を含む培地である。ＱＢは、１０ｇ／ｌの可溶性デンプン、１２ｇ／ｌのグルコース、１０ｇ／ｌのファーマメディア、５ｇ／ｌのコーンスティープリカー、４ｍ／ｌのproflo oilを含む培地である。ＲＡは、２０ｇ／ｌの可溶性デンプン、５ｇ／ｌのファーマメディア、２．５ｇ／ｌの酵母抽出物、１ｇ／ｌの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、０．７５ｇ／ｌ第二リン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、１ｇ／ｌの硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ）、３ｇ／ｌの炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）を含む培地である。ＲＢは、６０ｇ／ｌのコーンスターチ、１５ｇ／ｌのアマニ粕、１０ｇ／ｌのグルコース、５ｇ／ｌの酵母抽出物、１ｇ／ｌの硫酸第一鉄七水和物（ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ）、１ｇ／ｌの硫酸アンモニウム（ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｇ／ｌのリン酸アンモニウム（ＮＨ４Ｈ２ＯＰ４）、１０ｇ／ｌの炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）を含む培地である。ＲＣは、１０ｇ／ｌのコーンデキストリン、１０ｇ／ｌのバクトトリプトン、１０ｇ／ｌの糖蜜、２ｇ／ｌの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、５ｇ／ｌの炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）を含む培地である。ＲＭは、１００ｇ／ｌのスクロース、０．２５％のＫ２ＳＯ４、１０．１２８ｇ／ｌのＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ、２１ｇ／ｌのＭＯＰＳ、１０ｇ／ｌのグルコース、０．１ｇ／ｌのcasamino acids、５ｇ／ｌの酵母抽出物、２ｍ／ｌの微量元素溶液を含む培地である。ＫＨは、１０ｇ／ｌのグルコース、２０ｇ／ｌのポテトデキストリン、５ｇ／ｌの酵母抽出物、５ｇ／ｌのＮＺアミンＡ、及び１ｇ／ｌのミシシッピ石灰（ＣａＣＯ３の代用）を含む培地である。ＳＦは、２５ｇ／ｌのグルコース、１８．７５ｇ／ｌの大豆粉末、３．７５ｇ／ｌの甘しょ糖蜜、１．２５ｇ／ｌのカゼイン加水分解産物（Ｎ〜ＺアミンＡ）、８ｇ／ｌの酢酸ナトリウム、及び３ｇ／ｌの炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）を含む培地である。ＳＭは、５ｇ／ｌのグルコース、５ｇ／ｌのデンプン、７．５ｇ／ｌの大豆粉末、０．５ｇ／ｌのＫ２ＨＰＯ４、１．５ｇ／ｌのＮａＣｌ、０．５ｇ／ｌのＭｇＳＯ４、０．５００ｍｌ／ｌの１０００×金属塩、及び５００ｍｌ／ｌのＨ２Ｏを含む培地である。ＳＰは、２０ｇ／ｌのグルコース、５ｇ／ｌのバクトペプトン、５ｇ／ｌの牛肉抽出物、５ｇ／ｌの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、３ｇ／ｌの酵母抽出物、及び３ｇ／ｌの炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）を含む培地である。ＱＢは、５ｇ／ｌのデンプン、６ｇ／ｌのグルコース、２．５ｇ／ｌのコーンスティープリカー、５ｇ／ｌのファーマメディア、２���ｌ／ｌのproflo oilを含む培地である。ＴＡは、１０３ｇのスクロース、５ｇの酵母抽出物、０．１ｇのcaseamin acids、１０．１２ｇの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ）、０．２５ｇの硫酸カリウム（Ｋ２ＳＯ４）を含む培地であり、オートクレーブした後に、１０ｍｌのＫＨ２ＰＯ４（０．５％溶液）、８０ｍｌのＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ（３．６８％溶液）、１５ｍｌのＬ−プロリン（２０％溶液）、１００ｍｌのＴＥＳ緩衝液（５．７３％溶液、ｐＨ７．２に調整）、５ｍｌのＮａＯＨ（１Ｎ溶液）、及び２ｍｌの微量元素溶液を加えた培地である。ＶＡは、５０ｇ／ｌのグルコース、３０ｇ／ｌの大豆粉末、５ｇ／ｌの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、３ｇ／ｌの硫酸アンモニウム（ＮＨ４）２ＳＯ４及び６ｇ／ｌの炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）を含む培地である。ＶＢは、２０ｇ／ｌのスクロース、２０ｇ／ｌの甘しょ糖蜜、１０ｇ／ｌのグルコース、５ｇ／ｌのsoytone-peptone、及び２５ｇ／ｌの炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）を含む培地である。ＷＡは、０．８ｇ／ｌの酵母抽出物、０．５ｇ／ｌのcaseamino acids、０．４ｇ／ｌのグルコース、２ｇ／ｌの第二リン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）を含む培地である。ＸＡは、１０ｇ／ｌの酵母抽出物、１０ｇ／ｌのカゼイン加水分解産物（Ｎ〜ＺアミンＡ）、５ｇ／ｌの牛肉抽出物、３ｇ／ｌの硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ）、１ｇ／ｌの第二リン酸カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）を含む培地である。ＹＡは、１０ｇ／ｌのバクトペプトン、８ｇ／ｌの牛肉抽出物、３ｇ／ｌの酵母抽出物、５ｇ／ｌのグルコース、５ｇ／ｌのラクトース、２．５ｇ／ｌの第二リン酸カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）、２．５ｇ／ｌの第一リン酸カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）、０．２ｇ／ｌの硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ）、及び０．０５ｇ／ｌの硫酸マンガン（ＭｎＳＯ４．Ｈ２Ｏ）を含む培地である。ＺＡは、１０ｇ／ｌのスクロース、８ｇ／ｌのカゼイン加水分解産物（Ｎ〜ＺアミンＡ）、４ｇ／ｌの酵母抽出物、３ｇ／ｌの第二リン酸カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）、及び０．３ｇ／ｌの硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ）を含む培地である。
【００３０】
図１ａに示すように、微生物を選択する（１１）。かかる微生物はゲノム情報が存在する標的遺伝子クラスターを含む。ゲノム情報を基礎として使用して目的の代謝産物の化学的、物理的、又は生物的特性について予測する（１２）。予測した化学的、物理的、又は生物的特性は、後続のステップに関する。微生物は誘導されて、標的遺伝子クラスターによって合成された代謝産物を生成し、目的とする代謝産物を伴う抽出物を得る（１３）。抽出物中の代謝産物の化学的、物理的又は生物的特性を測定する。測定した化学的、物理的又は生物的特性と、目的の代謝産物の予測した化学的、物理的又は生物的特性とを比較することによって、目的の代謝産物を抽出物から同定する（１４）。リンク（１６）が、代謝産物と標的遺伝子クラスターとの間の情報リポジトリ内に作られてもよい。ある実施態様では、完全な構造がゲノミクス誘導方法を用いて解明される（１５）。図１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｅ、１ｆ及び１ｇは、実施例２、３、４、５及び６それぞれに記載されているように、図１ａの方法の実施態様である。図１ｂは、前もって選択したケミカルファミリーの多数の代謝産物が同定される実施態様を示す。図１ｃ、１ｄ及び１ｆは、本発明の、選択的でコンピュータを利用したデレプリケーションの特徴が使用された実施態様を示す。図１ｃ、１ｄ、及び１ｆは更に、目的の代謝産物の選択的な構造解明ステップが行われる実施態様を示す。図１ｅは、遺伝子クラスターが単に１つの遺伝子の部分からなる実施態様を示す。図１ｃは、微生物がランダムに選択され、そのゲノムが潜在的な遺伝子クラスターの存在について分析される実施態様を示す。
【００３１】
本発明は反復性であり、本発明が反復される度に設定されるデータエレメントの間のリンク又は関連と同様に、本発明が反復される度に作成される情報は、本発明の予測能力を高めるために、情報リポジトリにフィードバックされそこに記憶されてもよい。一例として、ある実施態様では、標的遺伝子クラスターと生成された代謝産物との間にリンクが設けられている。別の実施態様では、生成された代謝産物と選択された微生物との間にリンクが設けられている。更なる実施態様では、リンクはゲノム情報とケミカルファミリーとの間に設けられている。更に別の実施態様では、リンクは、微生物が誘導されて代謝産物を合成する培養条件とかかる代謝産物との間に設けられている。また、別の実施態様では、リンクは、化学的、物理的及び生物的特性と、目的の代謝産物との間に設けられている。本発明では、本発明の方法又はシステムが二次代謝産物を同定するという目的を達成するために、特定のリンクを作成し、情報リポジトリに記憶することを全く必要としないことが理解されるであろう。しかし、様々な実施態様では、上述の１又は複数のリンクのいずれかを作成し、情報リポジトリにフィードバックし、記録するステップを含んでいてもよい。
【００３２】
本発明は、従来の発現、スクリーニング、単離、及び構造解明技術の使用を熟考するものであり、当業者であれば、標的遺伝子クラスター、目的の代謝産物、目的の化学的クラス、選択した微生物、予測した化学的、物理的及び生物的特性等のうち、いずれの１又は複数の因子を考慮に入れて、本発明の使用のための適当な技術を容易に選択できるであろう。好ましい発現、スクリーニング、単離、及び構造解明技術は、ハイスル−プット又はゲノミクス誘導又はハイスル−プットとゲノミクス誘導の両方である。一例として、適当なスクリーニング技術によって、アッセイのバッテリーの使用が可能となる。ある実施態様においては、本発明を用いた抗菌的なスクリーニングアッセイの使用にマルチウェルプレートフォーマット（例えば、９６ウェルプレート）を組み込み、スループットを増加させる。別の実施態様では、選択したスクリーニング技術によって、抗菌活性のための何千の発酵ブロスを同時にスクリーニングすることが可能となる。
【００３３】
ある実施態様では、ゲノミクス誘導生物的スクリーニングステップを使用して、より時間を要する化学的単離プロセスのために最適な候補を同定する。例えば、特定の指標生物（グラム陽性、グラム陰性又は特定の生物に対する活性）に対して活性を有することを知られるクラスの化合物を生成する遺伝子クラスターを微生物が含むことをゲノム情報が示す場合は、バイオアッセイの結果を使用して化学的分析のために適当なブロス又は抽出物を選択する。或いは、特定の指標生物に対する既知の活性を有する前に同定された化合物を微生物が生成することをゲノム情報が示す場合は、化学的解析のために抽出物を選択するときに、これらの指標生物に対する活性を示す抽出物を遠ざけるのが適当であると考えられる。
【００３４】
図２は、代謝産物の生物的特性を測定するために適切な発現、及びスクリーニング技術示す。図２において、抽出物を指標微生物のパネルに対してスクリーニングし、特定の生物活性を有する代謝産物を同定する。細菌（グラム陽性及びグラム陰性）及び真菌病原体を含む可能性のある標識株のパネルに対する抗菌活性について、抽出物をテストする。活性の抽出物を活性プロフィールに従って選別し、代表的な抽出物を化学的解析のために選択する。ある実施態様では、生物的なスクリーニングステップを使用して、より時間を要する化学的単離プロセスのために、最適な候補を同定する。
【００３５】
本発明によって使用するために適切な化学的、物理的及び生物的特性を評価するための簡便なハイスループットのプロトコールは、本明細書及び図面においてＣＨＵＭＢと称される。図３に示すように、ＣＨＵＭＢ法は抽出物を分画し、クロマトグラフィーの可動性によるＵＶの追跡、分画中で化合物の質量を提供するクロマトグラフィーの可動性による質量の追跡、及び分画中の生物活性の評価を含む所定の抽出物中の各分画のためのデータを、容易に情報リポジトリにフィードバックされそこに記憶される形で作成する。ＣＨＵＭＢ法を使用して、抽出物をクロマトグラフィーカラムに通し、選択したクロマトグラフィーの培地のメカニズムに従って分画する。例えば、有機溶剤勾配を用いて行われるＣ−１８（オクタデシルシラン機能シリカゲル）カラムは、化合物の疎水性に基づいてそれらの化合物を分離する傾向がある。カラムからのアウトプットフローは質量分析計分析のために供給されるフローの約１０％とＵＶ検出器を通過する約９０％に分割され、次に疎水性によって分画された９６ウェルプレートに向かう。生物活性分画を同定するために、９６ウェルプレート中のサンプルの生物活性を、１又は複数の標識株又は生物的／生物化学的アッセイを使用して評価する。
【００３６】
標的遺伝子クラスターによって生成される代謝産物を、選択された微生物の純粋培養の発酵から得られた未精製の抽出物から単離する。各サンプルは、標的株に生物活性を示す二次代謝産物、一般には標的株に生物活性を示さない一次代謝産物、酵素、及び培地及び細胞全体からのバイオマスと同様に、一次又は二次代謝化合物の生合成に関わる酵素の分画を含むと予想される。未精製の抽出物を既知の方法により精製し、各サンプル内で測定された代謝産物の化学的、物理的及び生物的特性と、ゲノム情報に基づいて予測した代謝産物の化学的、物理的及び生物的特性との比較により誘導し、１つの天然の代謝産物を含む精製されたサンプルを得る。例えば、各分画中の代謝産物の質量、ＵＶ及び生理活性と、デレプリケーションステップにおける既知の天然物のデータベースとを比較する。使用した微生物に由来したゲノム情報に基づいて予測された化学的、物理的及び生物的特性と、測定された化学的、物理的又は生物的データとを比較することによって、情報リポジトリ又はデータベースを、デレプリケーションステップで使用する。最終的に、周知の分析方法や情報リポジトリにフィードバックしそこに記憶される構造情報を使用して、代謝産物の構造が解明される。
【００３７】
ゲノムを基にした発現プロトコールでは従来の微生物増殖発酵法が用いられるが、標的遺伝子クラスターを発現するために微生物を誘導する可能性のある培養条件に関して合理的な選択を行うように、ゲノム情報が検討される。使用される可能性のある標準的な発酵方法は、次の通りである。適当な培地の寒天板を所望の生物のグリセロールストックでストリークし、コロニーが発現するまで３０℃で２〜７日間培養する。顕微鏡分析によって、コロニーをコンタミネーションについて調べる。複数の菌糸及び／又は胞子のループを滅菌培地（例えばＴＳＢ培地）と共に滅菌遠心管に移し、滅菌遠心管細胞粉砕機で粉砕する。粉砕された細胞懸濁液を適当な種培養（例えばＴＳＢ）とグラスビーズ３つと共に滅菌フラスコに移す。種培養を約２５０ｒｐｍ、３０℃で２〜３日間、かなりの細胞密度が現れるまで振とうする。再び顕微鏡的分析によって培養物をコンタミネーションについて調べる。発酵については、約２５〜５００ｍＬの発酵培地を調製し、大型の三角フラスコ（１２５ｍＬ〜４Ｌ）で滅菌する。種培地の１０ｍＬのうち２ｍＬを、発酵フラスコの培養培地の適量に加え、３０℃、２〜７日間２５０ｒｐｍで振とうしながら培養する。顕微鏡分析によって、培養物をコンタミネーションについて調べる。
【００３８】
使用された培養条件からの発酵ブロスのサンプルを回収し、サンプル中の代謝産物の化学的、物理的又は生物的特性を測定する。化学的、物理的又は生物的特性を、分光学的、クロマトグラフ的又は生物的方法若しくはアッセイを含む多くの従来の方法を使用して評価するが、これらに限定されない。分光学的性質決定方法には、質量分光測定、ＵＶ分光法、ＮＭＲ分光法、ＩＲ分光法及びＸ線回析の分析が含まれる。クロマトグラフ的方法では、サイズ排除クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、及びアフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフのシステムで、これらの可動性、又は可動性を欠失していることに基づいて化合物が特徴付けられる。生物的アッセイには、抗細菌、抗真菌、抗ウイルス、抗原虫性又は真核生物の細胞の分化、代謝又は細胞毒性アッセイのような細胞に基づく方法や、殺虫性又は駆虫性（例えば、条虫、線虫、住血吸虫、吸虫等）のアッセイ等の多細胞生物に基づくアッセイ、若しくは酵素抑制、ＤＮＡ破損検出、免疫学的方法、リガンド結合又は他の生物的アッセイのような、インビボ又はインビトロの生物的アッセイが含まれるが、生物的アッセイは、これらに限定されない。同位体前駆体(isotopic precursor)及び前駆体アナログ取込み法(precursor analog incorporation methods)によって、前駆体及び生成物の機能性に容易にアクセスできるようになる。同位体標識前駆体又は前駆体同位体を含む補足的な発酵増殖培地が、このような同位体、又は化学的標識前駆体を、かかる前駆体を介して生合成された二次代謝産物へ部分的に（０．０５〜６０％以上）取り込む結果となることが、一般に知られている。このような取込みを放射測定（例えば、同位体的放射標識前駆体のための１４Ｃ、３Ｈ、３２Ｐ、３５Ｓの取込み）、質量分光測定（安定した又は不安定な同位体的に標識された前駆体及び前駆体同位体について）、又はＮＭＲ（スピン活性核種について）を含む様々な分析方法によって検討することができるが、分析方法はこれらに限定されない。前駆体には、一次代謝産物、二次代謝産物の中間体、及び前駆相同体が含まれるが、前駆体はこれらに限定されない。所定の生物内の標的遺伝子クラスターと目的の代謝産物によって、標識前駆体を合理的に選択し、増殖培地を補足することが可能となり、同位体濃縮生成物の特性に基づいて、発酵の潜在的な生成物が検出され、回転することが可能となる。
【００３９】
サンプル中の代謝産物の化学的、物理的又は生物的特性と、ゲノム情報に基づいて予測された化学的、物理的又は生物的特性とを比較する、一連の単離及び抽出ステップによって標的遺伝子クラスターによって合成された代謝産物を発酵ブロスから単離する。
【００４０】
本発明の一実施態様による代謝産物を同定するための代表的なゲノム誘導発現又はスクリーニングスキームを、図４に示す。候補の純粋培養微生物を様々な状況下で生育し、あらゆる経路が発現する可能性を最大にする。例えば、メチシリン耐性のStaphyloccus aureus (ＭＲＳＡ)、バンコマイシン耐性のEnterococcus faecalis（ＶＲＥ）、及びアゾール薬又はポリエン薬に耐性を有するCandida albicans真菌の病原体のような様々な非病原性微生物系に対する活性のために、標識株のパネルに対する抗菌活性について培地ブロスをテストする。未精製の抽出物が１又は複数の生物活性化合物を含む場合は、かかる抽出物は第一ＣＨＵＭＢ評価に進む。各テスト株について、スクリーニング活性データポイントと同様に質量分光測定、ＵＶスペクトル、及び保持時間を回収し、活性プロフィールを情報リポジトリに記憶させる。かかる情報リポジトリによって、経路のクラスと、最適な発現条件と、抗菌スペクトルと物性との間の相関関係がもたらされる。多くの生育条件のためのＣＨＵＭＢの大域解析を、ＣＨＵＭＢ−１解析と呼ぶ。ＣＨＵＮＢ−１の解析のＵＶ／質量スペクトルデータによって、あるケースではデレプリケーション、他のケースでは部分的な構造の解明又は機能的なグループの同定が可能となる。情報リポジトリ内での相関関係に基づき、構造の解明のために必要とされる発酵をスケールアップするために、条件を選択する。抽出手順を使用して大規模な発酵に由来する全ての代謝産物を捕獲する。例えば、以下に説明するある一般的な手続きによって、細胞の部位と極性に基づいて、所定の代謝産物を５つの分画のうちの１又は複数に局在させる。また、これらの抽出物にＣＨＵＭＢ処理をし、標的の代謝産物の存在を確認するためにＣＨＵＭＢ−１解析で解析する。所定の大規模発酵の一般的な抽出分画の解析を、ＣＨＵＭＢ−２解析と呼ぶ。
【００４１】
一般的な抽出手続きの１つを、以下に記載するように図５に示す。発酵ブロス（５００ｍｌ）を遠心分離し、菌糸から上清を分離するためにデカントする。上清に３０ｍｌのＨＰ−２０樹脂を加える。かかるスラリーを２０分間攪拌し、その後ＨＰ−２０樹脂（３０ｍｌ）のショートカラムを通して濾過する。次にカラムを１００ｍｌの水で洗浄する。洗浄は最初の溶出を伴う。溶出物を抽出物Ｎｏ．５と標識する。その後カラムを１００ｍｌの６０％ＭｅＯＨ／水で溶出し、溶出物を抽出物Ｎｏ．３と標識する。次にカラムを１００ｍｌの１００％ＭｅＯＨで溶出し、続いて１００ｍｌのアセトニトリルで溶出する。これらをＮｏ．４として混合する。菌糸に１００ｍｌの１００％ＭｅＯＨを加え、１０分間攪拌し、１５分間遠心分離し、上清をデカントする。菌糸に１００ｍｌのアセトンを加える。混合物を１０分間攪拌し、１５分間遠心分離し、上清をデカントし、これを前のメタノリック上清に加える。かかる混合物を抽出物Ｎｏ．１と標識する。菌糸に １００ｍｌの２０％ＭｅＯＨ／水を加える。かかる混合物を１０分間攪拌し、１５分間遠心分離し、デカントする。かかる上清液を抽出物Ｎｏ．２と標識する。使用した菌糸を廃棄する。
【００４２】
要約すると、多数の条件下で生育する所定の生物のための代謝産物の組成物を、ＣＨＵＢＭ−１解析によって同定し、既知の化合物の情報リポジトリとの比較によって「デレプリケーションする」（既知の化合物から区別される）、又は新しい化合物として可能性のある化合物を同定することができる。標的を選択した後、新しい化合物の可能性のある化合物を表すことや、発酵をスケールアップが行われ、分光分析又は他の方法によって、構造を解明するために十分な量の化合物を生成し、単離する。発見プロセスの効率は、情報リポジトリ内で生合成経路に委譲された各化学構造によって増加する。
【００４３】
図６、７及び８は、本発明の一実施態様に従って天然の代謝産物を見出すために使用される、三相のゲノミクス誘導抽出／単離／構造解明プロトコールの概要を提供する。図６、７及び８は、活性組成物が既知の化合物又は新規の可能性がある場合、速やかに評価することを目的とする３ステージ精製プロセスから抽出物が得られるスキームを示している。情報リポジトリからのゲノム情報は、予測可能な化合物の範囲を決めることによって、各ステージにおける化合物の同定を容易にしている。ステージＩ及びステージＩＩ（図６及び７）は、多数のステップを有する精製プロトコールであり、標的化合物が極的か否かによって用いられる手続きが決まる。例えばスクリーニング前のＣＨＵＭＢ及びゲノム情報によって決定される。プロトコールのステージＩＩを概略的に図７に示す。ステージＩＩＩ（図8）は構造解明カスケードを提供する。ステージＩ（図６）は、発酵ブロスから生理活性組成物を抽出し濃縮することを意図するものである。ステージＩの終わりには、残留するスラリー中には何千もの化合物が依然として存在する。ある実施態様においては、ステージＩは、約５００ｍｌから２Ｌの未精製の発酵ブロスで始まるが、ステージＩの終わりには、抽出と濃縮によって、ステージＩＩ（図７）とステージＩＩＩ（図８）での使用には約２ｍｌに減量している。ステージＩの抽出プロセスにおける実際のステップ及びステップの順序は、標的化合物の性質によって変化する可能性がある。本発明には、エチルアセテート又はアセトンのような非極性溶剤を使用する疎水的化合物の単離のための標準的な手続きが組み込まれていてもよい。他のプロトコールを適応させて又は開発して疎水性化合物の単離を可能にする。非極性化合物の例にはポリケチド及びポリサッカロイドが含まれ、極性化合物の例には、ダプトマイシン、β−ラクタム、ラモプラニン、及びバンコマイシン等のペプチドを基にした小分子が含まれる。ある実施態様では、酸性の溶媒抽出によって、極性化合物は発酵ブロスから抽出される。すなわち、スラリーのｐHが約ｐH３程度に低くなっている場合は、ある極性化合物は有機溶剤中に溶解するようになる。様々なクロマトグラフィーの手続きを使用して未精製のブロスを抽出し分画し、活性組成物の最初の化学的特性を決定する。クロマトグラフィーの結果を情報リポジトリにフィードバックしそこに記憶させてもよく、活性組成物が既知の化合物である場合は、それによって決定のための機会が早く提供される微生物の部位情報にリンクさせる。
【００４４】
ステージＩ（図６）で生成され、残留しているスラリー中の活性組成物が単離され同定されている可能性がある、図７の一般的なプロトコールの一実施態様を図６のステージＩＩに示す。使用されたクロマトグラフィーシステム及び精製プロセス中のステップの順序は、標的化合物の性質によって変化する。本発明で使用可能な極性プロトコールはＬＨ２０分画（サイズと極性による分画）を含み、続いて正に電荷した化合物を分画するＤＥＡＥアニオン交換及びＣＨＵＭＢが行われる。本発明によって使用可能な非極性プロトコールは標準的な二酸化ケイ素(sislica dioxide)分化を含み、続いてＣＨＵＭＢを行う。精度評価の後、化合物はステージＩＩＩの構造解明に進む。
【００４５】
図８は、図６及び7に示されるある実施態様による、３ステージの抽出／単離／構造解明プロトコールのステージIII構造解明組成物を概略的に示す。従って、ステージII（図６）でデレプリケーション的に同定されない化合物には新規の化合物（ＮＣＥ）の可能性があるか、新規の化合物そのものであり、ＵＶ／可視、赤外線タンデム質量スペクトル及び１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ及び多次元ＮＭＲ法によって、明確な構造の情報を提供するために解析されてもよい。これらにはＤＥＰＴ，ＨＳＱＣ、ＨＭＱＣ、ＣＯＳＹ、ＤＱＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹ及びＨＮＢＣ  ＮＭＲパルス配列が含まれるが、これらは極性形成転移のひずみのない増化(distortionless enhancement of polarization transfer)、異核一量子干渉(heteronuclear single quantum coherence)、異核多量子結合干渉(heteronuclear multiple bond coherence) 、相関分光法(correlation spectoscopy)、二量子濾過相関分光法(double quantum-filtered correlation)、全相関分光法(total correlation spectoscopy)、及び異核多数結合干渉(heteronuclear multiple bond coherence)を、それぞれ頭文字で表したものである。図８は、構造解明のためのあるスキームを提供する。図８に示す実施態様において、ＮＭＲ手続きには、ステージII（図６）から得られる単離物のアリコートが必要とされる。ペプチドの場合は、アミノ酸解析（ＰＩＣＯＴＡＧ又はＭＳ／ＭＳ解析）でピコモル量の物質のみが必要とされる。適切な量は、アミノ酸残基の同定を達成するためのＣＨＵＭＢプレートから得ることができる。図８を参照にすると、概略図はステージIIでの既知の化学物質と一致しない精製された化合物のステージで始まる。更に化合物の特徴づけを行い、デレプリケーションを再び用いて、次のステップが目的の二次代謝産物が既知の化学物質に一致しない時にのみ先に進むことを確かめる。ＬＡＮＣＥという記号は、部位に関連した新規の化学物質を意味する。すなわち遺伝子クラスターにリンクしているＮＣＥのために遺伝子情報があることを意味する。ＯＮＣＥという記号はオーファン新規化学物質を意味する。すなわち、いまだ遺伝子クラスターにリンクしていないＮＣＥのために遺伝子情報があることを意味する。ＯＣＥという記号は、オーファン新規化学物質を意味し、構造解明カスケードのあらゆるポイントでデレプリケーションする代謝産物、すなわち前述の化合物に一致すると見出される代謝産物であって、ゲノム情報がある遺伝子クラスターにリンクしていないことを意味する。ＬＡＣＥという記号は部位に関連した化学物質を意味し、デレプリケーションされ、ゲノム情報がある遺伝子クラスターにリンクしている代謝産物を意味する。
【００４６】
システム：  本発明は、微生物のゲノムに含まれる遺伝子クラスターによって合成される二次代謝産物を同定するためのシステムを提供し、そのシステムはコンピュータ化されるか、コンピュータ化された要素を含んでいてもよい。図9は、ゲノムデータ（５２）を含む標的遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物を同定するシステム（５０）、抽出手段（５４）、アナライザー（５６）、コンパレーター（５８）を示す。それぞれを以下により詳細に説明する。本明細書ではゲノムデータはゲノム情報とも称される。
【００４７】
本システムでは、標的遺伝子クラスターによって生成された目的の代謝産物を含む微生物から抽出物を得ることができる抽出手段を使用する。このような抽出システムは選択した条件群下で細胞を培養してもよく、従って、培養中に細胞によって発せられた生成物を得るか、培養期間の終わりに細胞を分裂させるかのいずれかによって、適切な培養後に細胞から抽出物を引き出す培養システムでもよい。このような方法は当業者には既知であるか実施可能あると考えられる。
【００４８】
システムは、抽出物中の代謝産物の化学的、物理的又は生物的特性を測定するために使用されるアナライザーを更に含む。ここに検討されるように、ＵＶスペクトル、ＨＰＬＣ、活性アッセイ、クロマトグラフィー及び代謝産物の化学的、物理的又は生物的特性の他の検出方法をシステムのアナライザー要素に使用する。
【００４９】
本発明のコンパレーターを使用して、アナライザーによって得られたこれらの測定済みの特性から、目的の代謝産物の存在を同定する。コンパレーターは、ユーザーからの質問を受け入れるために使用されるンピュータシステムでもよいし、前もって決定された方法で質問をもたらすことに関してこのようにプログラムされていてもよい。コンパレーターは比較を行うために機能するだけでなく、例えばシステムの個々の構成要素から派生する保管データによって、システムのあらゆる又は他の構成要素との相互作用を選択的に有していてもよい。
【００５０】
同様に、本発明は前もって選択したケミカルファミリーから二次代謝産物を同定するためのシステムを提供する。図１０は、そのようなシステムの概略的な説明を提供する。システム（７０）は、上述の構成要素、すなわちゲノムデータ（７２）、抽出手段（７４）、アナライザー（７６）、及びコンパレーター（７８）を含むが、標的遺伝子クラスターを含む微生物を選択するためのセレクター（８０）も含む。セレクターは、例えばグラフィカルユーザーインターフェースからアクセスされる選択可能なアイテムであってもよい。このようにして、本発明によるシステムは、利用可能なゲノムデータに基づいて、代謝産物のクラス（又はファミリー）から所定の所望の代謝産物を生成することができる適当な微生物の選択を可能にする。コンパレーターは、コンパレーターは比較を行うために機能するだけでなく、例えばシステムの個々の構成要素から派生する保管データによって、システムのあらゆる又は他の構成要素との相互作用を選択的に有していてもよい。
【００５１】
情報リポジトリ：  本発明によって、微生物に由来する二次代謝産物データを保管する情報リポジトリが提供される。かかる情報リポジトリを使用して、微生物のゲノム中に含まれる標的遺伝子クラスターによって合成される二次代謝産物を同定することができる。リポジトリは微生物中の標的遺伝子クラスターの存在を確認するゲノムデータ、及び遺伝子クラスターに関連するゲノム情報を含んでいる。リポジトリは更に、微生物に由来する抽出物に含まれる代謝産物の化学的、物理的又は生物的特性を提供する抽出物を特徴付けるデータを保管する。これらの代謝産物は、標的遺伝子クラスターに起因する二次代謝産物を含んでいる。その上、リポジトリは、標的遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物の予測された化学的、物理的又は生物的特性を表す比較データを含んでいる。情報リポジトリ内で、抽出物中の代謝産物の二次代謝産物を同定するために、抽出物を特徴付けるデータと比較データとを比較する。
【００５２】
情報リポジトリは、例えばデータが記憶される位置、若しくは１又は複数のデータベース内でのデータの分類であってもよい。本発明によると、情報リポジトリによって、関連する情報を必要に応じて記憶し、加え、訂正し、比較し、保持することが可能となる。情報リポジトリはコンピュータ制御化にあってもよく、代謝産物の化学的、物理的及び生物的特性（例えば、構造、分子量、UVスペクトル又は生理活性）、微生物に関する遺伝情報、又は微生物が代謝産物を生成する培養条件のような、様々なタイプの情報を記憶する。情報リポジトリは、本発明によって獲得した新規に作成されたデータと同様に、公共の又は私的なデータベースへのアクセスを介して獲得した前もって設定されたデータを含んでもよい。
【００５３】
情報リポジトリは、リポジトリ内のそれぞれの記録の間に「予測リンク」を提供する。例えば、標的遺伝子の代謝産物が予測された特性を有しているという実際の観察を通して設定された場合は、ゲノムデータ及び比較データ（代謝産物の予測される化学的、物理的又は生物的特性を表す）を、予測リンクを介して相関させる。このような情報リンク内に形成された予測リンクは、標的遺伝子クラスター又はその一部を有する新規の微生物が同定された場合に、情報リポジトリの予測値を高める。このようにして、情報リポジトリは有利に、前もって設定されたデータ及びそこに加えられた新規のデータから利益を得て、新規の微生物（このうちの１つの二次代謝産物は未だ完全に解明されていない）の可能性を予測し、化合物の所定のクラスやファミリーのメンバーを提供する。
【００５４】
関連する特徴においては、本発明は、遺伝子クラスター情報が二次代謝産物生成データにリンクしている情報リポジトリを提供する。更に本発明は、情報リポジトリにアクセスするためのグラフィカルユーザーインターフェースに関する。また、本発明の実施態様によると、データを記憶するためのメモリを、情報リポジトリの構成要素である、すなわちそこに記憶されたデータ構造を有するメモリであると考えてもよい。メモリは特定のタイプのデータとの間にリンクを含んでいてもよい。例えば、ある実施態様では、代謝産物の化学的構造を表すデータは、遺伝子クラスター又は情報リポジトリ中に保管されたゲノムデータ内の遺伝子の部位にリンクされていてもよく、その結果本発明の予測力が向上し、既知の化合物又は化合物のクラス（ケミカルファミリー内の）をより早く精製プロセスで同定できるようになる。
【００５５】
本発明は更に、微生物のゲノム中に含まれる標的遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物を同定するために、データ処理システムで実行中のアプリケーションプログラムによるアクセス用に二次代謝産物を記憶するためのメモリを提供する。メモリは、メモリに記憶されているデータ構造を含み、データ構造は、アプリケーションプログラムで使用されるデータベース中に常駐する情報を含んでいる。かかるデータベースは、（ｉ）推定上の又は確認済みの機能が遺伝子クラスター中の少なくとも少なくとも１つの遺伝子領域に起因する、微生物中の標的遺伝子クラスターの存在を確認するゲノムデータ、（ｉi）代謝産物が標的遺伝子に起因する二次代謝産物を含む、微生物に由来する抽出物に含まれる代謝産物の化学的、物理的又は生物的特性を提供する抽出物を特徴付けるデータ、及び（ｉｉｉ）標的遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物の予測された化学的、物理的又は生物的特性を表す比較データを含む。抽出物を特徴付けるデータを、標的遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物を抽出物中の代謝産物から同定するために、遺伝子クラスター中の少なくとも１つの遺伝子領域に起因する推定上の又は確認済みの機能に基づいて比較データと比較する。
【００５６】
本発明はまた、微生物に由来する二次代謝産物データを保管する情報リポジトリを作成する方法に関する。かかる方法には以下のステップが含まれる。ゲノムデータを収集し、推定上の又は確認済みの機能が遺伝子クラスター中の少なくとも１つの遺伝子領域に起因している、標的遺伝子クラスターの微生物における存在を確認する。代謝産物が標的遺伝子クラスターに起因する二次代謝産物を含む、微生物に由来する抽出物中に確認される代謝産物の化学的、物理的又は生物的特性を提供するように、抽出物を特徴づけるデータを入力する。
【００５７】
更に、抽出物を特徴付けるデータを、標的遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物の予測される化学的、物理的又は生物的特性を表す比較データと比較する。かかるステップによって、遺伝子クラスター中の少なくとも１つの遺伝子領域に起因する推定上の又は確認済みの機能に基づいて、抽出物中の代謝産物からの標的遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物の同定が可能となる。最終的に、収集ステップで収集されたゲノムデータとの比較するステップで同定された二次代謝産物とリンクすることによって、抽出物を特徴付けるステップの結果を保持する。
【００５８】
抽出物を特徴付けるデータを入力するステップは、抽出物が派生する培養条件を入力することを選択的に含んでいてもよく、結果を保持するステップは、比較するステップで同定された二次代謝産物と、収集ステップで収集されたゲノムデータの両方に培養条件をリンクすることを更に含んでいてもよい。抽出物を特徴付けるデータを入力するステップは、抗菌活性、抗真菌活性、又は抗癌活性等の生物活性を入力することを含んでいてもよい。
【００５９】
同様に、本発明により、標的遺伝子クラスターに由来する二次代謝産物の生成をゲノムデータに基づいて予測するための、微生物に由来する二次代謝産物データを保管する情報リポジトリの別の作成方法が提供される。かかる方法には、推定上の又は確認済みの機能が、遺伝子クラスター中の少なくとも１つの遺伝子領域に起因している、微生物内の標的遺伝子クラスターの存在を確認するゲノムデータの収集が含まれる。これには、かかる微生物を含む培地を抽出し、その結果抽出物が形成されるステップ、前もって選択した化学的、物理的又は生物的特性に基づいて、遺伝子クラスターに起因する二次代謝産物が存在する又は存在しないことを示す抽出物を特徴付けるデータのために、抽出物をスクリーニングするステップ、抽出物を特徴付けるデータを情報リポジトリに入力するステップ、推定上の又は確認済みの機能に基づいて、抽出物から標的遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物を同定するために、標的遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物の予測される化学的、物理的又は生物的特性を表す比較データと抽出物を特徴付けるデータとを比較するステップ、抽出された二次代謝産物の同一性を決定するステップ、及びゲノムデータに基づいて、二次代謝産物の生成の予測サイクルを可能にする、ゲノムデータと、前もって選択した化学的、物理的又は生物的特性と、二次代謝産物の同一性との一致を情報リポジトリ内で確認するステップが含まれる。
【００６０】
情報リポジトリへのフィードバック：  本発明は、微生物によって生成される代謝産物に関して、化学的、物理的又は生物的特性を測定することを意図するものである。スクリーニングする活性データポイントを発現／スクリーニングプロセスを始める各微生物について回収する。ある実施態様では、活性プロフィールを情報リポジトリに記憶させる。例えば、生物活性を決定するために使用されるあらゆるバイオアッセイの結果をコンピュータにフィードバックし、記憶し、グラフ又は着色した棒グラフとして表していずれの分画に生物活性があるかを示す。活性プロフィールによって、経路と、化学クラス又はケミカルファミリーと、最適な発現条件と、抗菌（又は他の生理活性）スペクトルとの間に相関関係がもたらされる。同様に、代謝産物の物理的特性（ＣＨＭＵＢステップで得られるＵＶスペクトル及び質量等）に関するデータを情報リポジトリにフィードバックしそこに記憶する。より多くのデータが加えられ、より多くの相関関係が見出されるに従って、予測リンクの形成を助けるためのデータベースの予測値が向上する。
【００６１】
グラフィカルユーザーインターフェース：  本発明によって、情報リポジトリに加入するためにグラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）が提供される。リポジトリに「加入する」ことにより、データにアクセスし、その中のデータを加える又は修正すること、情報リポジトリからリポートを作成すること又は情報リポジトリ内を検索することが意味される。リポジトリは、標的遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物を同定するために、少なくとも１つの微生物に由来する二次代謝産物データを保管する。状況に応じて、１つ以上の微生物に由来するデータをリポジトリ内に保管してもよく、データをリポジトリ内に保管するための観察又は微生物の数には上限がない。実際に何千もの微生物に由来するデータをリポジトリに保管する。
【００６２】
グラフィカルユーザーインターフェースは、情報リポジトリの中からゲノムデータにアクセスするためのゲノムアクセスエレメントを含む。かかるゲノムデータは、推定上の又は確認済みの機能が遺伝子クラスター中の少なくとも１つの遺伝領域に起因している、微生物中の標的遺伝子クラスターの存在を確認するものである。ゲノムアクセスエレメントはコンピュータスクリーン上に位置してもよく、例えば、微生物の名前を入力することにより、又はアイコン若しくは目的のゲノム領域他の表示をクリックする（選択する）ことにより、選択可能なプルダウンメニューを用いてコマンドをユーザーからインターフェースで受け取る場合、情報リポジトリ内のゲノムデータにアクセスする。
【００６３】
グラフィカルユーザーインターフェースはまた、微生物に由来する抽出物中に含まれる代謝産物の化学的、物理的又は生物的特性に情報リポジトリの中からアクセスするために、抽出物を特徴付けるアクセスエレメントを含む。抽出物を特徴付けるアクセスエレメントはコンピュータスクリーン上に置かれていてもよく、抽出物を特徴付ける特性を示す用語を入力することによって、又は培地の種類、培養条件又は生物活性のような特定の抽出物を特徴付けるデータを表すアイコンをクリックする（選択する）ことによって、選択的なプルダウンメニューを介して情報リポジトリへアクセスすることが可能となる。微生物の抽出物が得られる培地組成物及び生育条件へのサーチ可能なアクセスを提供するように、かかるエレメントを設定する。これは、特定の生物によって通常は正常に生成されない代謝産物がある抽出物中に存在することが見られる場合であって、特定の潜在的な経路が「オンする」条件をユーザーが決定しようとする場合に特に有益なクエリーである。これらの条件はこのように位置しているので、ゲノムデータ内で同様の標的遺伝子クラスターを有していたように見られる他の微生物中おける同様の代謝産物経路をオンしようとして使用することもできる。
【００６４】
グラフィカルユーザーインターフェースは更に、選択した望ましい化学的、物理的又は生物的特性と、抽出物中で測定した又は検出した化学的、物理的又は生物的特性とを比較を行うための、比較アクセスエレメントを含む。この比較は、微生物中の遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物の同定を可能にするために行われる。したがって、本発明のグラフィカルユーザーインターフェースによって、本発明の情報リポジトリへのサーチ可能な又はクエリーに基づくアクセスが可能となる。
【００６５】
図１１は、本発明による典型的なグラフィカルユーザーインターフェースの概略的な説明を示す。グラフィカルユーザーインターフェース（１００）を用いて情報リポジトリ（１０２）に加入する。インターフェースは、情報リポジトリの中のゲノムデータ（１０６）にアクセスするためのゲノムアクセスエレメント（１０４）を含む。代謝産物の化学的、物理的又は生物的特性（１１０）に情報リポジトリの中からアクセスするために、抽出物を特徴付けるアクセスエレメント（１０８）が備えられている。また、微生物中の標的遺伝子クラスターによって合成された代謝産物を同定するために、ゲノムデータに基づき、比較が予測された特性又は望ましい特性と代謝産物の実際の特性との間で比較が行われることを可能にする比較アクセスエレメント（１１２）を備えている。
【００６６】
本発明によるデータの編成及びディスプレイのためには、グラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）の外観には多くの変形が考えられるが、これらは本発明のグラフィカルユーザーインターフェースの範囲に含まれる。
【００６７】
本発明のある実施態様による、異なるステージ又は手続きの状態を、コンピュータスクリーン上に表示されるレポートの形式でコンピュータメディアにディスプレイする。このようなレポートは印刷の形式で作成してもよい。各抽出物を分析するためのステージを、かかるレポート内に設けてもよいし、各ステージのためにサクセス修飾子(success qualifier)を設けることができる。
【００６８】
そのような状況レポートの例としては、本発明の方法又はシステムを使用するプロジェクト実行の化学的特徴に関する情報を「化学プロジェクトレポート」で作成することができる。化学プロジェクトレポートは微生物同定データ、抽出及び培地同定データ等のパラメータ、レポートにおける特定の入力に対する責任のある科学者、レポート中に入力されるデータ、又は特定の抽出物のフェーズステータスが含まれる。フェーズステータスは、例えば発見プラットフォームのステージが完了したか否かのレポートであってもよい。フェーズステータスの評価及び監視を、サクセス修飾子を天然物発見カスケードの各離散ステータスへの割り振る方法等の多くの方法で行ってもよい。サクセス修飾子は、例えばレポートに異なる色や形でディスプレイされ、凡例によってサクセスを示すビジュアルディファレンシエーターでもよい。例えば、化学プロジェクトレポートでは、ステージＩのプロセスは抽出、最初の分画及び培養の処方における所定の微生物のバイオアッセイを含んでいてもよい。ステージIIのプロセスは、抽出物の活性組成物の同定及びＨＰＬＣ／ＭＳを介したその分子量の決定を含んでいてもよい。また、ステージIIIのプロセスはかなりの量の活性組成物及びその構造の単離及び解明を含んでいてもよい。これらのステージをそれぞれ評価することができ、ステータスをレポートにもたらすことができる。
【００６９】
ビジュアルディファレンシエーターが使用される場合、凡例において各修飾子の色を決めることができる。色に基づくビジュアルディファレンシエーターの例としては、緑のサクセス修飾子を用いて、プロジェクトが試みられポジティブな結果が得られたことを示すことができる。赤いサクセス修飾子を用いて、プロジェクトが試みられネガティブの結果が得られたことを示す可能性がある。黄色のサクセス修飾子を用いて、プロジェクトが完了したことを示す可能性がる。紫色のサクセス修飾子を用いてプロジェクトが継続されないことを示すことができる。青のサクセス修飾子を用いてプロジェクトが進行することを示す。例えば、ビジュアルディファレンシエーターを用いて、グラフィックユーザーインターフェースで作成された化学プロジェクトレポートによって、単にデータ値をディスプレイすることから可能になるよりも広い範囲でユーザーに迅速なビジュアルアシスタントが提供される。
【００７０】
利用可能なレポートは多数の情報のカラム及び／又は行をディスプレイしてもよく、必要であれば、コメントカラムを特定の抽出物中に検出した二次代謝産物及び／又は活性レベルについての知見を関連付けるために使用してもよい。
【００７１】
生物に由来する抽出物の大規模の一次スクリーニングの結果を表すスクリーニング表を含む、他の種類のレポートを提供することができる。培養物の回収物におけるこれらの生物からのスクリーニング結果をレポートのフォーマットで提供することができる。このようなレポートのうち１つのカラムに、使用された培地成長条件を供給することができ、表のフォーマット中の生物活性配列を提供するように、生物活性を評価するために使用される様々なテスト生物（例えば抗菌活性又は抗真菌活性）を列にリストしてもよい。効力によって生物活性を評価することができ、独特な活性を有する生物のグループをこの方法で確かめ、一次ＣＨＵＭＢ解析に提供することができる。
【００７２】
一端ＣＨＵＭＢ解析が完了すると、情報リポジトリを作成するようにデータをインップットしてもよい。グラフィカルユーザーインターフェースを介してかかるデータにアクセスしてもよい。ＣＨＵＭＢパラメータ（Ｃ１８、ＨＰＬＣ、ＵＶ、質量及び生理活性）のの「ＣＨUＭＢ」グラフを介してデータをディスプレイしてもよい。典型的なＣＨＵＭＢグラフでは、クロマトグラムの各ポイントをＵＶスペクトル、質量スペクトル及び生理活性に関して評価することができる。例えば、グラフを作成するために何百の個々のＣＨＵＭＢ分画を使用する。この結果伝統的なスクリーンングデータにクロマトグラフの次元が加えられ、様々な条件下における様々なテスト生物に対して活性のある広い範囲の極性を有する化合物のグループの表示が提供される。生理活性ポイントのスペクトルの調査を用いて既知の化合物を同定（デレプリケーション）することができ、可能性のある新規化学物質を割当てることができる。
【００７３】
本発明によると、グラフィカルユーザーインターフェースを用いて、様々な条件下で生育しあらゆる特定の生物に由来する抽出物を提示するマトリックスのスクリーニング結果が説明される。生育条件をインターフェース上にディスプレイしてもよいし、階層を介して生育条件にアクセスしてもよく、その最高レベルはスクリーニングマトリックス上にディスプレイされる。マトリックスは行ヘッダー上でクリックすることによりソート可能となる。例えば、表示パネル全体に所定の培地の活性プロフィールをディスプレイする「状態」によって、ユーザーがソートすることが可能となる。これは同様の活性プロフィールによる培地の分類に役立つ。
【００７４】
グラフィカルユーザーインターフェースは情報リポジトリ以外のソースにアクセスしてもよい。例えば、インターフェースによって、インターネット接続を通して又はＣＤに記憶された電子情報に基づいて、ユーザーが公的又は私的なデータベースに空くセウすることが可能となる。このような化合物の物理的特性によって検索可能な既知の天然物のデータベースには、Dictionary of Natural Products and Antibaseが含まれる。本発明によるグラフィカルユーザーインターフェースは、適当なデータベース又はウェブサイトすべてにアクセスすることが可能である。
【００７５】
既知の化合物から派生する予測した質量が特定の代謝産物の存在を示す場合は、例えば、グラフィカルユーザーインターフェースを用いてデータポイントを「デレプリケーション」してもよい。目的の生物が既知の化合物を作ることが前もって見られる場合は、その時点で情報リポジトリに含まれている情報からその化合物をデレプリケーションすることができる。ＣＨＵＭＢ処理中はデプリケーションされないこれらの化合物については（すなわち、情報リポジトリ中で一致しない）、潜在的な新規の化学物質として考えることができる。
【００７６】
グラフィカルユーザーインターフェースによって、特定の生合成部位の存在に基づくクエリーが可能となる。情報リポジトリ内の同定された部位を選択する（クリックする）ことによって、ユーザーがかかる部位によってコードされる代謝産物の種類に関する情報へアクセスすることを可能にする、アイコン又は他の表示で表示されてもよい。
【００７７】
グラフィカルユーザーインターフェースはまた、特定のゲノムシーケンスがデータベースレポート中のゲノム情報に対して「ＢＬＡＳＴ」されることを可能とする。すなわち、配列（アミノ酸又は核酸）を整列させ、バイオインフォーマティクス解析を用いて決定したように情報リポジトリ内の他の配列と一致のために比較する。このようなクエリーの感受性（一致として配列を認定するために必要な同定のパーセンテージ）を、ユーザーに設定してもよい。
【００７８】
実施例１：エンジイン天然物生合成経路の発見と発現
高度な反応性の発色団環構造の合成又はあらゆるエンジインを特徴付ける「弾頭」に関わる保存された遺伝子群に関するゲノム情報を、米国特許出願第１０／１５２，８８６号及び米国特許出願第６０／３９８，７０５号に記載されるように作成した。保存した遺伝子は、一方向性転写及び翻訳開始コドンと終始コドンとの頻繁な重複によって一般的にオペロン構造に配列され、これらの遺伝子産物が協調的に発現し機能的に関係していることを示している。これらの遺伝子は配列相同性に基づき、ある場合にはドメイン組織にも基づく５つの異なるタンパク質ファミリーである。ファミリーはＰＫＳＥ、ＴＥＢＣ、ＵＮＢＬ、ＵＮＢＶ、ＵＮＢＵといい、これらの配列情報は米国特許出願第１０／１５２，８８６号に含まれている。ＰＫＳＥファミリーは、以下により詳細に説明する例外的な順序で複数のドメインから組成された多モジュラーポリケチド合成酵素（ＰＫＳ）からなる。これらのタンパク質配列とＧｅｎＢａｎｋの重複しないデータベースに見られる配列とを比較することによって、推定上の機能はＰＫＳＥ、ＴＥＢＣ、ＵＮＢＬ、ＵＮＢＶ及びＵＮＢＵに起因していた。ＰＫＳＥファミリーは例外的な順序で複数のドメインで組成された多モジュラーＰＫＳからなる。ＰＫＳＥは他のタイプのＰＫＳにわずかに関連する。ＴＥＢＥタンパク質は、触媒作用に重要な役割を果たすと見られるタンパク質の領域の、Pseudomonas sp. ＣＢＳ−３株の４−ヒドロキシベンゾイル−ＣｏＡチオエステラーゼ（１ＢＶＱ）に類似していることが見出された（Benning, M.M. et al., J. Biol. Chem. 273, 33572-3579 (1998)）。したがってポリケチド鎖解放及び／又は環化に関わると考えられる。ＵＮＢＬ、ＵＮＢＶ及びＵＮＢＵタンパク質はパブリックデータベースのタンパク質に対して高い相同性を示さない。したがって、エンジインの生合成部位に特異的であると見られる新規のタンパク質ファミリーを表す。ＵＮＢＶタンパク質のＰＳＯＲＴ解析(Nakai, K. & Horton, Trends Biochem. Sci. 24, 34-36 (1999))は、それらがＮ末端シグナル配列を有する分泌されたタンパク質であることを予測するが、ＵＮＢＵタンパク質はと７又は８つの推定上の膜をスパンするαらせん体と一体の膜タンパク質であると予測される。
【００７９】
ＤＥＣＩＰＨＥＲョデータベース(Ecopia BioSciences Inc., St.-Laurent, QC, CANADA)を検索し、エンジイン弾頭カセットクラスターを含むがエンジイン化合物を生成することをこれまで知られていない微生物を同定した。Amycolatopsis orientalis ＡＴＣＣ  ４３４９１（既知のバンコマイシン生産菌）、Streptomyces ghanaensis ＮＲＲＬ  Ｂ−１２１０４（既知のモエノマイシン生産菌）、Kitasatosporia sp. ＣＥＣＴ  ４９９１（既知のタキサン生産菌）、Micromonospora megalomicea subsp.nigra  ＮＲＲＬ  ３２７５（既知のメガロマイシン生産菌）、Streptomyces cavourensis subsp. washingtonensis ＮＲＲＬ  Ｂ−８０３０（既知のクロモマイシン生産菌）、Saccharothrix aerocolonigenes  ＡＴＣＣ  ３９２４３（既知のレベッカマイシン生産菌）、Streptomyces Kaniharaensis ＡＴＣＣ  ２１０７０（既知のコホルマイシン生産菌）、Streptomyces citricolor ＩＦＯ  １３００５（既知のアリステロマイシン及びネプラノシンＡ生産菌）中に、このような潜在的なエンジイン遺伝子クラスターを同定した。他の天然物カセットをコードする生合成部位で頻繁に見出される他のフランキング遺伝子と同様に保存されたエンジイン弾頭カセット遺伝子の存在によって、潜在性エンジイン生合成部位を同定した。
【００８０】
ＰＫＳＥ、ＴＥＢＣ、ＵＮＢＬ、ＵＮＢＶ及びＵＮＢＵだけがすべてのエンジイン部位に共通であり、既知のエンジイン全てに見出される構造的特徴の１つはは弾頭である(Nicolaou, K.C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5881-5888 (1993))ので、弾頭の生合成の原因となる機能的なユニットとしてのゲノミクスに基づくＰＫＳＥ、ＴＥＢＣ、ＵＮＢＬ、ＵＮＢＶ及びＵＮＢＵ遺伝子の相関関係が設定された。ＰＫＳＥは、アシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）ドメインを炭素環の成長のための共有結合部位として用いて、アシル−補酵素Ａ（アシル−ＣｏＡ）縮合、ケト還元及び脱水の相互活性環を触媒することによって、弾頭の炭素骨格を作成するようである。ＰＫＳＥは、ＡＣＰドメインと同様にケトアシルシンターゼ（ＫＳ）、アシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）、ケトリダクターゼ（ＫＲ）及びデヒドラターゼ（ＤＨ）を含む既知のＰＫＳに特徴的な酵素ドメインを含む。ＰＫＳＥ配列を更に解析することによって、タンパク質のＣ末端領域で４エ−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（ＰＰＴase）(Walsh, C.T., et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 1, 309-315 (1997) )に類似した新たなドメインが明らかにされた。これは翻訳後のＰＫＳＥの自己活性化に関わると考えられる。ＴＥＢＣ、ＵＮＢＬ、ＵＮＢＶ及びＵＮＢＵタンパク質の機能は未だ知られていないが、これらのタンパク質と弾頭ＰＫＳとの正確な連合やすべてのエンジイン生合成部位におけるこれらの存在によって、エンジイン弾頭の形成、安定化又は輸送においてこれらが不可欠の役割を果たしていることが強く示される。
【００８１】
共有する弾頭構造によってすべてのエンジインにＤＮＡを破壊する能力が与えられる。エンジインの作用メカニズムは、エンジイン化合物をＤＮＡに結合することに関する。弾頭発色団に熱力学的に好ましいバーグマン環化を行い、その結果ゲノムＤＮＡの鎖切断が起こる。生化学的誘導アッセイ（ＢＩＡ）は、ＤＮＡを破壊する媒介物を検出する修正されたプロファージ誘導アッセイ(Elespuru, R.K. & Yarmolinsky, M. B., Environmental Mutagenesis. 1, 65-78 (1979))である。特定の発酵条件下で培養され、エンジイン遺伝子に関連する遺伝子クラスターの発現を誘導する場合、弾頭遺伝子を含む系統は、同様にＢＩＡを用いて検出できるエンジイン天然物を生成すると予測される。
【００８２】
潜在的エンジイン生合成遺伝子座を含む微生物を多数の培養条件下で生育し、エンジイン代謝産物を含む抽出物を得た。潜在的なエンジイン生合成遺伝子座を含むと見られる株を様々な発酵培地で培養した。始めに、生物を２５ｍｌのＴＳＢ種培地で (Kieser, T. et al., Practical Streptomyces Genetics, The John Innes Foundation, Norwich, United Kingdom, (2000)) で６０時間２８℃で生育し、２５ｍｌの生成培地で３０倍に希釈した。常に攪拌しながら生成培地（２５ｍｌ）を７日間２８℃で培養した。２ｍｌの培地を取り除き、遠心分離により清澄化して上清サンプルを用意した。残りの培地（上清と菌糸）を３０分間攪拌しながら同量のメタノールで抽出した。抽出物を遠心分離によって清澄化し、それに応じて５０％メタノールを補充したそれぞれの培地で希釈した。Elespure, R.K. & Yarmolinsky, M.B., Environmental Mutagenesis. 1, 65-78 (1979)に記載されるように、ＢＩＡを行った。簡潔に説明すると、１０オｌの上清又は抽出物とその２倍連続希釈物を、Escherichia coli  ＢＲ５１３を播種し３時間３７℃で培養した寒天プレートに用いた。０．７ｍｇ／ｍｌのＸ−Ｇａｌを含む軟寒天をプレートに加え、３０分着色を観察した。
【００８３】
本研究に使用したすべての生成培地はそれらのみでアッセイを行った。ほとんどの培地では株の成長は検出可能なＢＩＡ活性の結果とならなかった。しかし、エンジイン産生を補助する能力のために選択された特殊な培地で生育した場合には、すべての株でＢＩＡＧ活性が生成された（図１２）。カリケアマイシン、マクロマイシン、及びdynemicinについては、エンジイン生合成部位の発現をトリガーする生成培地は、ＣＢ、ＥＳ及びＤＹであった。ネオカルチノスタチンエンジイン生合成部位の発現をトリガーする生成培地は、ＮＧであった。Amycolatopsis orientalisにおいて潜在的エンジイン生合成部位の発現を補助する生成培地はＣＢであった。Streotimyces ghanaensisにおいて潜在的エンジイン生合成部位の発現を補助する生成培地はＫＥであった。Saccharothrix aerocolonigenesにおいて潜在的エンジイン生合成部位の発現を補助する生成培地はＥＴであった。Streotimyces kaniharaensisにおいて潜在的エンジイン生合成部位の発現を補助する生成培地はＥＴであった。Ｅｃｏｐｉａ株１７１において潜在的エンジイン生合成部位の発現を補助する生成培地はＤＹであった。Streptomyces citricolorにおいて潜在的エンジイン生合成部位の発現を補助する生成培地はＭＣであった。Ｅｃｏｐｉａ株０４６において潜在的エンジイン生合成部位の発現を補助する生成培地はＭＣであった。Streptomyces cavourensis subsp. wasingtonensisにおいて潜在的エンジイン生合成部位の発現を補助する生成培地はＳＰであった。エンジイン生成を補助しない培地の例には、本発明ではそれぞれ培地ＹＡ及びＺＡ称するＣＥＣＴ培地３２及び１３１(Coleccion Espanola de Cultivos Tipo, Valencia, Spain)が含まれる。
【００８４】
作成されたデータは、（ｉ）エンジイン代謝産物を生成すると以前に報告されたものとは明らかに異なる、各微生物中におけるＰＫＳＥ、ＴＥＢＣ、ＵＮＢＬ、ＵＮＢＵ及びＵＮＢＶ遺伝子の存在、(ｉｉ) エンジイン部位におけるＰＫＳＥ、ＴＥＢＣ、ＵＮＢＬ、ＵＮＢＵ及びＵＮＢＶタンパク質に起因する推定上の機能、（ｉｉｉ）株を生育する多数の培養条件、及び（ｉｖ）生化学誘導アッセイ及び他のバイオアッセイの結果を、ＤＥＣＩＰＨＥＲョデータベースに加えた。これらのデータによってこの後のエンジイン活性の比較とデレプリケーションが容易になる。
【００８５】
実施例２：潜在的な生合成部位に由来する代謝産物の単離及び構造解明
本発明のシステム、方法、及び情報リポジトリを使用して、潜在的な生合成部位によって合成された代謝産物、すなわち未知の生成物の構造を単離し、解明することができる。Agricultural Research Service Clture Collection Peoria, Illinois 61604) から生物のサンプルStereptomyces cattleya （ＮＲＲＬ  ８０５７）を得た。文献検索（ＰｕｂＭｅｄ）によって、Stereptomyces cattleya （ＮＲＲＬ８０５７）がチエナマイシンと他のβ−ラクタムクラスの化合物以外の天然物を全く生成しないことは報告されていなかったことが明らかになった（米国特許第３，９５０，３５７号）。
【００８６】
Stereptomyces cattleyaに米国特許出願第１０／２３２，３７０号に記載のゲノムスキャン方法を行った結果、少なくとも１２の推定上の天然物生合成部位がStereptomyces cattleyaゲノムにおいて発見された。配列解析によってさらにこれらを特徴付け、異なる生合成部位であると決定した。３７００ＡＢＩキャピラリー電気泳動法ＤＮＡシーケンサー(Applied Biosystems)を用いて配列解析を行い、配列情報からリーディングフレームを同定した。ＯＲＦのＤＮＡ配列をアミノ酸配列に翻訳し、デフォルトパラメータによるＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いて(Altschul et al., supra)、National Center for Biotechnology Information （ＮＣＢＩ）の非冗長タンパク質データベースと比較した。既知のタンパク質の定義された機能との配列の類似性によって、１２の生合成部位それぞれにおいて遺伝子数に起因する推定上の機能が生じた。見出された１２の生合成部位のうち６つは、ドメイン組織に基づく様々な推定上のポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）を含んでいた。
【００８７】
Stereptomyces cattleyaを６つの培養組成物、すなわちＢＡ、ＤＡ、ＥＡ、
ＫＡ、ＮＡ、ＯＡの中で７日間生育した。非極性抽出手続きを用いて培養ブロスから天然物に基づくポリケチドを捕獲した。同量のエチルアセテートをブロス全体に加え、次にそれをオービタルシェーカー上で３０分間攪拌した。有機層を分離し、硫化マグネシウム上で乾燥し、蒸発させて未生成の抽出物を得た。抽出物を薄層クロマトグラフィー、及び複数の指標株(B. subtillis, S. aureus, E. coli, C. albicans, M. lutus, K. pneumonia, P. aeruginosa)を用いたオーバーレイアッセイで解析した。抗菌活性の多数のゾーンを、様々な培地からの抽出物でのオーバーレーアッセイで観察した。これらの抗菌／抗真菌活性はSteptomycesの二次代謝産物と会合することが多く、精製の進行（バイオアッセイ誘導分画化）を後に続けるために使用することができる。培地ＤＡからの抽出物はMicrococcus luteus活性を示した。この抽出物はフラッシュクロマトグラフィーによる精製（ＳｉＯ２プラグ、５％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２−１００％ＭｅＯＨ）、とそれに続くSephadex ＬＨ−２０クロマトグラフィー（１００％ＭｅＯＨ）による精製とによって選択され、ＴＬＣ解析で純粋である化合物を生じる。５．５〜６．５ｐｐｍのピーク（アルケン二重結合に一致）、３．５〜４．５ｐｐｍのピーク（Ｃ−Ｈ結合接着ヒドロキシに一致）及び０．５〜３ｐｐｍ（アルキル基に一致）から証明されるように  １Ｈ  ＮＭＲ解析によって化合物の純度がかなり高く、多数二重結合を有するポリケチドクラス分子であることを示すことが確かめられた。
【００８８】
情報リポジトリのゲノム情報は構造解明プロセスにおいて補助となった。ＤＥＣＩＰＨＥＲョデータベースを検索し、ポリケチド代謝産物の測定した化学的、物理的及び生物的特性を、Streptomyces cattleya由来の「潜在的な」生合成部位（標的部位）の１つと会合させた。ＰＫドメインの同定を標的部位で行った。ゲノム解析によって、標的部位によるポリケチド代謝産物の生成のための生合成スキームを、ポリケチド鎖のバイオインフォーマティクス解析とＤＥＣＩＰＨＥＲョデータベース中の他のＰＫＳ酵素の構造との比較分析を用いて推測することができた。特に、分析によって、様々な構造要素が派生するドメインストリングが示唆された。部分的なゲノムの推測及び一致する構造の推測を以下に示す。
［ＫＳ−ＩＸ−ＫＲ−ＭＴ−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＩＸ−ＫＲ−ＡＣＰ］[ＫＳ−ＩＸ−ＡＣＰ]
［Ｃ−Ａ（Ｇｌｙ＿）−ＡＣＰ］［ＫＳ］［ＩＸ−ＤＨ−ＫＲ−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＩＸ−ＤＨ−ＫＲ−ＭＴ−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＩＸ−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＩＸ−ＫＲ−ＡＣＰ］
［ＫＳ−ＩＸ−ＫＲ−ＡＣＰ］［ＫＳ］［ＤＨ−ＡＣＰ−ＫＲ］［ＫＳ−ＩＸ−ＤＨ−ＫＲ−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＩＸ−ＤＨ−ＫＲ−ＡＣＰ］
2005514959.tif 000003
ここで、略称は、ポリケチドノの凝縮活性（Ｃ）及びアデニル化活性（Ａ）と同様に、ポリケチド合成に関わる、ケトアシルシンターゼ（ＫＳ）、アシルトランスファーゼ相互作用ドメイン（ＩＸ）、ケトリダクターゼ（ＫＲ），デヒドラターゼ（ＤＨ）、及びエノイルリダクターゼ（ＥＲ）、アシルキャリアプロテイン（ＡＣＰ）、メチルトランスフェラーゼ（ＭＴ）、及びチオエステラーゼ（ＴＥ）活性に対応する進化性の酵素活性又は他の機能を表す。
【００８９】
これらの構造エレメントを、ＤＱＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹ、ＨＳＱＣ及びＨＭＢＣ等の多次元ＮＭＲ実験による構造解明の研究のための可能性のある開始ポイントとして使用した。ゲノム情報から推定した構造エレメントはＮＭＲ実験のデータに一致し、部分的な構造の解明が容易になった。このように得られた部分的な構造を使用して既知の天然物のデータベースのクエリーを行い、既知の化合物Ｌ−６８１，２１７を同定した。報告された化合物物Ｌ−６８１，２１７のデータは、Streptomyces cattleyaから同定した化合物について回収された分光学的データと完全に一致した。化合物Ｌ−６８１，２１７の構造を以下に示す。
2005514959.tif 000004
【００９０】
化合物Ｌ−６８１，２１７の構造は、Streptomyces cattleyaの生合成部位と会合しており、ＤＥＣＩＰＨＥＲ（登録商標）データベースでは構造データとゲノムデータと間にリンクが設けられていた。同様に、この会合を用いて、その生物(Streptomyces filippiniesis, heneicomycin)によって生成されるとして知られる構造的に同様の他の生物内の個々の部位にリンク又は会合した。特に、Ｌ−６８１，２１７とheneicomycinとの構造の比較により、heneicomycin生産菌Streptomyces filippiniesis中にドメインストリングが見出されるという予測が導かれた。この予測の裏付けには、以下に示すように、このようなドメインストリングをコードする標的部位が、Streptomyces filippiniesisに由来するゲノムデータ中に同定された。
2005514959.tif 000005
Ｌ６８１２１７部位のドメイン
［ＴＰ］
［ＡＣＰ］［ＫＳ−ＩＸ−ＡＣＰ］［ＫＳ］
［ＤＨ−ＡＣＰ−ＫＲ］［ＫＳ−ＩＸ−ＫＲ−ＭＴ−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＩＸ−ＫＲ−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＩＸ−ＡＣＰ］
［Ｃ−Ａ（Ｇｌｙ＿）−ＡＣＰ］［ＫＳ］
［ＩＸ−ＤＨ−ＫＲ−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＩＸ−ＤＨ−ＫＲ−ＭＴ−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＩＸ−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＩＸ−ＫＲ−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＩＸ−ＫＲ−ＡＣＰ］［ＫＳ］
［ＤＨ−ＡＣＰ−ＫＲ］［ＫＳ−ＩＸ−ＤＨ−ＫＲ−ＡＣＰ］
［ＫＳ−ＩＸ−ＤＨ−ＫＲ−ＡＣＰ］[ｋｓ−at]
［ＡＴ］［ＡＴ］［ＮＰＤＣ−ＸＸ］
2005514959.tif 000006
部分的ドメインストリング
...［ＡＣＰ］［ＫＳ−ＩＸ−ＫＲ−ＡＣＰ］［ＫＳ］
［ＤＨ−ＡＣＰ−ＫＲ］［ＫＳ−ＩＸ−ＫＲ−ＭＴ−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＩＸ−ＫＲ−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＩＸ−ＡＣＰ］
［Ｃ−Ａ（Ｇｌｙ＿）−ＡＣＰ］［ＫＳ］
［ＤＨ−ＫＲ−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＩＸ−ＤＨ−ＫＲ−ＭＴ］［ＫＳ−ＩＸ−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＩＸ−ＫＲ−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＩＸ−ＡＣＰ］［ＫＳ］
【００９１】
実験例３：前もって選択したケミカルファミリーの二次代謝産物の同定：
本発明の方法、システム及び情報リポジトリを使用して、前もって選択したケミカルファミリーから二次代謝産物を同定することができる。かかる実施例では、前もって選択した「ポリエン」のケミカルファミリーのメンバーである、抗真菌ポリケチドAyfactinの同定について説明する。
【００９２】
情報リポジトリを検索して、ポリエンポリケチドのケミカルファミリーデータを決定した。ＤＥＣＩＰＨＥＲ（登録商標）データベース（Eciopia Bioscience Inc., St.-Laurent, Canada）に存在するゲノム情報のバイオインフォーマティクス解析に基づいて、推定上のポリエン代謝産物をコードする標的遺伝子クラスターを同定した。前もってシーケンスされたpartricin、candicidin 及び nystatin等のための抗真菌ポリエン生合成部位によってコードされるタンパク質に類似した他のタンパク質と同様に、標的遺伝子クラスターはポリケチドシンターゼをコードする。特に、部分ドメインストリングを含むシーケンスされたポリケチドシンターゼのドメイン構造を、７以上の共役二重結合によるポリケチド鎖の合成やcandicidinのようなポリエンと一致する構造的特徴と一致する...ＤＨ−ＫＲ−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＡＴ−ＤＨ−ＫＲ−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＡＴ−ＤＨ−ＫＲ−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＡＴ−ＤＨ−ＫＲ−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＡＴ−ＤＨ−ＫＲ−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＡＴ−ＤＨ−ＫＲ−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＡＴ−ＤＨ−ＫＲ−ＡＣＰ］....であると推定した。ドメインストリング中の全てのＡＴドメインをマロニル−ＣｏＡ拡張ユニットに特異的であると予測した。遺伝子クラスターは、ポリエン化合物であるcadicidinをコードするStreptomyces griseus ＩＭＲＵ  ３５７０生合成遺伝子クラスター中に見出される遺伝子に最も近い遺伝子も含んでいる。これらの遺伝子はcadicidinクラスター中のシンターゼ(ＧｅｎＢａｎｋ 信託番号ＣＡＣ２２１１７)に７７％の同一性と８２％の類似性を示すパラアミノ安息香酸シンターゼ、cadicidinクラスター中のチオエステラーゼ(GenBank 信託番号ＣＡＣ２２１１６)に６９％の同一性と８１％の類似性を示すチオエステラーゼ、及びcadicidinクラスター中のアミノトランスフェラーゼ(GenBank 信託番号ＣＡＣ２２１１３)に７９％の同一性と８９％の類似性を示すアミノトランスフェラーゼを含む。
【００９３】
ＤＥＣＩＰＨＥＲ（登録商標）データベースから同定した標的遺伝子クラスターを含む微生物（ここでは生物１００として表す）は、Ecopia培養コレクションの１つであった。複数の天然物生合成部位が発見され、そのうち７つは更にハイスル−プットシーケンスで特徴付けられた実施例１を参照し、ゲノムスキャン方法を用いて生物１００を解析した。ゲノムスキャン方法及びハイスループットシーケンスの結果をＤＥＣＩＰＨＥＲ（登録商標）データベースに入力した。このようにして生物１００が７つ以上の共役二重結合を含む推定上の抗真菌ポリエンの生成をコードする、生合成部位（ここでは部位１００Ｃとして表す）含むと予測した。
【００９４】
代謝産物アプローチを用いて推定上のポリエンを含む抽出物が生物１００から得られ、部位１００Cの生成物が発現する条件が同定された。かかるアプローチによって、特定の培養条件下で生育する場合に、特定の時間に所定の生物における分子量が少ない代謝産物の分析的な測定が得られる。生物１００を４８の異なる培地、すなわちＡＡ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＩ、ＤＡ、ＤＹ、ＤＺ、ＥＡ、ＥＳ、ＥＴ、ＦＡ、ＧＡ、ＩＢ、ＪＡ、ＫＡ、ＫＥ、ＬＡ、ＭＡ、ＭＣ、ＭＵ、ＮＡ、ＮＥ、ＮＦ、ＮＧ、ＯＡ、ＰＡ、ＰＢ、ＱＢ、ＲＡ、ＲＢ、ＲＣ、ＲＭ、ＳＦ、ＳＰ、ＴＡ、ＶＡ、ＶＢ、ＷＡ、ＷＳ、ＸＡ、ＹＡ、ＺＡで生育させ、細胞培養全体から同量のメタノールを添加して代謝産物を抽出する。固体状のデブリスを除去した後、抽出物を濃縮し、代謝産物を解析しＵＶデータ及び質量データを得るＨＰＬＣ／ＭＳシステムに注入した。精製した分画を９６ウェルプレート中で回収し、グラム陽性及びグラム陰性細菌や真菌に対する抗菌活性を含む多数の活性をアッセイする。クロマトグラフによる解析及び生理活性プロフィールによる解析によって、複数の抽出物中に可能性のある抗真菌活性の存在が示された。例えば、培地ＲＭは、Candida指標株に対する抗真菌活性を示すかなり多くのクロマトグラフ的に特徴のある化合物を生成した。
【００９５】
最終的に、各４８の培地下で生育した生物１００によって生成された抽出物を、ポリエンの物理的、化学的及び生物的特徴を有する代謝産物について解析を行った。かかる解析によって、ヘプタエンと一致する拡張したＵＶ発色団（すなわち、７つの共役二重結合を有する）と抗真菌活性を有する質量１１１３Ｄａの化合物が同定された。かかる質量とＵＶを有する２５０００より多くの既知の微生物の天然物に関するデータベースを検索したところ、生物活性データは、ポリエンが既知の抗真菌剤ayfactinであるという決定的な証拠を含んでいた。かかる構造を以下に示す。
2005514959.tif 000007
【００９６】
Ayfactin
部位１００の生成物の測定した化学的、物理的及び生物的特性は、報告されたayfactinの化学的、物理的及び生物的特性と一致することが見出された。またこれらは、抗真菌性ポリエンに対してなされたバイオインフォーマティックな予測と完全に一致している。ＤＥＣＩＰＨＥＲ（登録商標）データベースをアップデートして生物１００内の部位１００をayfactinの化学構造に会合するリンクを確立した。
【００９７】
実施例４：Streptomyces refuineus subsp. thermotolerance ＮＲＲＬ  ３１４３由来のリポペプチド代謝産物の検出
リポペプチドは、抗菌剤、抗真菌剤、又は抗ウイルス剤としてバイオテクノロジー及び医薬品への応用に対する高い可能性を有する、強力で幅広いスペクトル抗菌活性を示す天然産物である。１つの微生物は、遊離アミンを介しペプチドの核、通常はペプチドの核のＮ末端アミンに付着すると考えられる脂質の成分が異なるリポペプチドに関連する混合物を生成する。脂質の成分は、リポペプチド天然物の生物的活性に大きな影響を及ぼすことができる。  
【００９８】
非リボソーム性ペプチドシンセターゼ（ＮＲＰＳ）と称される多くの機能を有する大きなタンパク質上に、細菌によって生成されるリポペプチドを非リボソーム性に合成する(Doekel and Marahiel, 2001, Metabolic Engineering, Vol. 3, pp. 64-77)。ＮＲＰＳは、それぞれがモジュールからなる１つ以上の多機能性ポリペプチドで構成されるモジュラータンパク質である。アミノ末端からカルボキシ末端への順序、及び連続的な順序に一致する個々のモジュールの特異性、及びペプチド生成物のアミノ酸残基の同定。各ＮＲＰＳモジュールは、特異的なアミノ酸基質を認識し、成長するペプチド鎖から成長するペプチド鎖への段階的な縮合を触媒する。特定のユニットによって認識されるアミノ酸の同一性を、既知の特異性を有する他のユニットとの比較によって決定することができる(Challis and Ravel, 2000, FEMS Microbiology Letters, Vol. 187, pp 111-114)。多くのペプチドシンセターゼの中には、ペプチドシンセターゼ内で繰り返されるユニットの順序とそれぞれのアミノ酸がペプチド生成物内で発現する順序との間に厳密な相関関係が存在し、Mycobacterium tuberculosisのゲノム由来のmycobactin生合成遺伝子クラスターの同定によって証明されるように、既知のペプチドの構造と、その合成をコードする推定上の遺伝子とを相互に関連することができる(Quadri et al., 1998, Chem. Biol. Vol. 5, pp. 631-645)。
【００９９】
ペプチドシンセターゼのモジュールは、小さなユニット又はペプチド生成物を形成するための認識、活性化、修正及びアミノ酸前駆体の連結においてそれぞれが特異的な役割を果たしている「ドメイン」からなる。ドメインのタイプの１つである、アデニル化（Ａ）ドメインは、ペプチドシンセターゼの特定のユニットによって取り入れられているはずのアミノ酸を選択的に認識して活性化する原因となっている。活性化したアミノ酸を、別のタイプのドメインであるthiolation（Ｔ）ドメインを介して共有結合的にペプチドシンセターゼに付着させる。Ｔドメインは通常Ａドメインの近接に位置する。ペプチドシンセターゼの連続するユニットに連結したアミノ酸は、次に別のタイプのドメインである縮合（Ｃ）ドメインによって触媒されたアミノ結合の形成によって、かなり共有結合的にリンクする。場合によって、ＮＲＰＳモジュールは、補助反応を起こす更なる機能ドメインを含むことができる。最も一般的な補助反応は、ＬからＤ型へのアミノ酸基質のエピマー化である。この反応は、通常は所定のＮＲＰＳモジュールのＴドメインの近接に位置するエピマー化（Ｅ）と称するドメインによって触媒される。したがって、典型的なＮＲＰＳモジュールは次のドメイン組織Ｃ−Ａ−Ｔ−（Ｅ）を有する。
【０１００】
リポペプチドは、通常ペプチドのコア構造のＮ末端アミノに付着している脂質の成分を含むという点で通常のペプチドとは異なる。通常のペプチドと反対に、リポペプチドをコードするＮＲＰＳクラスター中の、ペプチドの核の第一アミノ残基の活性化と繋ぎ止め原因となるアデニル化ドメインは、異常な縮合ドメイン（Ｃドメイン）に先行される。Ｃドメインに関するゲノム情報を、リポペプチドの組成、方法及びシステムの発見という発明の名称で２００２年１２月２４日付で出願された同時継続出願である米国特許出願番号Ｎ第１０／３２９，０２７号、及びリポペプチドの生合成に関わる遺伝子及びタンパク質という発明の名称で２００２年１２月２４日付で出願された米国特許Ｎ第ＸＸ／ＸＸＸ，ＸＸＸ号に記載されるように作成した。これらの内容は参照によって本明細書に組み入れられる。米国特許出願第１０／３２９，０２７号及び米国特許出願第ＸＸ／ＸＸＸ，ＸＸＸ号の同時継続出願では、異常なＣドメインを「アシル特異的Ｃドメイン」と称する。ＮＲＰＳシステムの開始モジュールにおけるかかるドメインの特異的な位置とＮＲＰＳシステムにおけるアシル特異的Ｃドメインの存在は、ＮＲＰＳによってコードされる生成物がリポペプチドである可能性があることを示唆している。
【０１０１】
リポペプチドを生成する可能性がある微生物を調べるために、ＤＥＣＩＰＨＥＲ（登録商標）データベースを検索して、そのゲノム内にアシル特異的Ｃドメインを含む微生物を同定する。明らかにアシル特異的Ｃドメインに含まれるＤＥＣＩＰＨＥＲ（登録商標）データベースから選択した微生物の１つはStreptomyces refuineus ＮＲＲＬ３１４３であった。米国特許出願第１０／３２９，０２７号及び米国特許出願第ＸＸ／ＸＸＸ，ＸＸＸ号の同時継続出願に詳細に記載される更なる解析によって、かかる異常な縮合ドメインが、ここで部位０２４Ａと称されるStreptomyces refuineus中の大きなＮＲＰＳシステムに含まれることが設定された。アシル特異的Ｃドメインの正確な位置を、ＮＲＰＳシステムの開始ローディングドメイン内にあると決定した。これは０２４ＡがＮアシル化リポペプチド生成物をコードすることを示唆している（図１３）。
【０１０２】
ＤＥＣＩＰＨＥＲ（登録商標）データベースに含まれるゲノム情報の解析によって、Streptomyces refuineus０２４Ａ部位に異常なＣドメインを含むＮＲＰＳシステムが、Streptomyces refuineusによって生成された既知のリポペプチドＡ５４１４５の合成足場と同一のポリペプチドの合成足場を導くという予測が可能となった（図１３）。ここでＡ５４１と称するリポペプチドＡ５４１４５の生合成の原因となる遺伝子部位はＤＥＣＩＰＨＥＲ（登録商標）データベースに存在する。全体的な遺伝子の類似性が生合成部位０２４ＡとＡ５４１との間に観察され、両方の部位が２つのStreptomyces種における同様の生育条件下で発現することも示唆される（米国特許出願第ＸＸ／ＸＸＸ，ＸＸＸ号及びZazopoulos et al., 2003, Nature Biotechnol., Vol 21）。２つの化合物の構造の類似性の予測に基づいて、０２４ＡをコードするリポペプチドがＡ５４１４５の特性に類似した化学的、物理的及び生物的特性を有することもまた予測された。
【０１０３】
次にパテントデータベースを検索して、Streptomyces fradiae 中のリポペプチドＡ５４１４５が発現する培養条件を選択した（米国特許第４，９７７，０８３号）。Streptomyces fradiae及びStreptomyces refuineusを部位０２４Ａの誘導を評価するために同一の培養条件で生育し、特定の生成物の性質を決定した。  
【０１０４】
両方の微生物を、水道水( tap water)中でグルコース（１０ｇ／Ｌ）、ポテトスターチ（３０ｇ／Ｌ）大豆粉末（２０ｇ／Ｌ）、ファーマメディア （２０ｇ／Ｌ）及びＣａＣＯ３（２ｇ／Ｌ）からなる２５ｍＬの種培地中の旋回式シェーカー内で３０℃で４８時間生育した。かかる種培地の５ｍＬを用いて４Ｌバッフルフラスコで５００ｍＬの産生培地に播種した。産生培地は、水道水中でグルコース（２５ｇ／Ｌ）、大豆グリット（１８．７５ｇ／Ｌ）、廃糖蜜（３．７５ｇ／Ｌ）、カゼイン（１．２５ｇ／Ｌ）、酢酸ナトリウム（８ｇ／Ｌ）及びＣａＣＯ３（３．１３ｇ／ｌ）からなり、続いて７日間３０℃で旋回シェーカーへで生育した。産生培養物を遠心分離し、濾過して菌糸と固形物を除去した。ｐＨを６．４に調製し、４６ｍＬのDiaion  ＨＰ２０を添加し３０分間攪拌した。ブフナー濾過によってＨＰ２０樹脂を回収し、１４０ｍＬの水と９０ｍＬの１５％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏで連続的に洗浄し、洗浄液を廃棄した。次にＨＰ２０樹脂を１４０ｍｌの５０％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏで希釈した（ＨＰ２０  Ｅ２分画）。このプールを５ｍｌのAmberlite  ＩＲＡ６７カラム（アセテート環）に通し、通過物（分画ＩＲＡ  ＦＴ）をバイオアッセイのために保存した。カラムを２５ｍＬの５０％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏで洗浄し、０．１Ｎ  ＨＯＡｃ（分画ＩＲＡ  Ｅ１）を含む２５ｍＬの５０％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏで希釈し、続いて１．０Ｎ  ＨＯＡｃ（分画ＩＲＡ  Ｅ２）を含む２５ｍＬの５０％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏで希釈した。５ｍＬのＣａＣｌ２を含む栄養寒天においてMicrococcus luteusを用いたバイオアッセイによる精製に続いて生物活性が行われた。
【０１０５】
図１４ａは、Streptomyces fradiaeからアニオン性リポペプチドが抽出されている時に作成されたプレートの写真で、酸性リポペプチドの発現と一致する、ＩＲＡ６７アニオン交換クロマトグラフィーに基づく豊富な活性を示している。溶解環の直径が増したことから示唆されるように、かかる活性は抽出を手続き中に縮合される。Ａ５４１４５Ｃ、Ｄの構造（米国特許第４，９９４，２７０）と一致する質量イオンＥＳ２＋＝８３０．５からも明らかであるように、Ａ５４１４５を分画ＩＲＡ  Ｅ２中のＨＰＬＣ／ＭＳを介して検出した。図１４ｂは、Streptomyces refuineus ＮＲＲＬ  ３１４３に由来の抽出物に同様の抽出スキームが行われている間に作成されたプレートの写真で、酸性リポペプチド(acidic lipopeptide)の発現に一致する、ＩＲＡ６７アニオン交換クロマトグラフィーに基づく豊富な活性を示している。溶解環の直径が増したことから示唆されるように、かかる活性は抽出手続き中に縮合される。Ａ５４１４５の質量イオンと一致する質量イオンＥＳ２＋＝８３０．５がＩＲＡ  Ｅ２分画に発現した。これによって、Ａ５４１４５Ｃ及びＤに一致するＮアシル化リポペプチドが、ＤＥＣＩＰＨＥＲ（登録商標）データベースに含まれるゲノムデータから予測されたように、Streptomyces refuineus subsp.thermotolerans中の０２４Ａによって生成されることが確認された。
【０１０６】
実施例５：代謝産物の解析を介する潜在的な生合成部位から新規のポリケチドの同定
Streptomyces aizunensisに実施例１に記載のゲノムスキャン方法を行ったところ、多くの推定上の天然物生合成部位を発見し、そのうち５つを更にシーケンス解析で特徴づけ、異なる生合成部位であることが決定された。解析された５つの生合成部位のうち３つはＮＲＰＳ遺伝子を含み、ペプチドの生成（部位記号０２３Ｂ、０２３Ｃ及び０２３Ｆ）をコードすると予測され、そのうち１つは大きなポリケチド（部位記号０２３Ｄ）の生成をコードすると予測された。ゲノム情報に基づき、概略的な化合物の構造を部位０２３Ｂ、０２３Ｃ、０２３Ｆ及び０２３Ｄによってコードされる化合物について予測した。
【０１０７】
2005514959.tif 000008
【０１０８】
次に、メタボロミクスアプローチを用いて、二次代謝産物を発現し、それらを解析し、上記の生合成部位に相関する条件を同定した。かかるアプローチによって特定の培養条件下における特定の時間での、所定の生物内中のあらゆる低分子量代謝産物（０〜５０００Ｄａ）の分析的測定が得られる。Streptomyces aizunensis を４８の異なる培地、すなわちＡＡ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＩ、ＤＡ、ＤＹ、ＤＺ、ＥＡ、ＥＳ、ＥＴ、ＦＡ、ＧＡ、ＩＢ、ＪＡ、ＫＡ、ＫＥ、ＬＡ、ＭＡ、ＭＣ、ＭＵ、ＮＡ、ＮＥ、ＮＦ、ＮＧ、ＯＡ、ＰＡ、ＰＢ、ＱＢ、ＲＡ、ＲＢ、ＲＣ、ＲＭ、ＳＦ、ＳＰ、ＴＡ、ＶＡ、ＶＢ、ＷＡ、ＷＳ、ＸＡ、ＹＡ、ＺＡで生育した。これらの多くは、幅広い天然物の生成を補助すると報告されている培地の代表的なものである。同量のメタノールを添加して細胞培養全体から代謝産物を抽出した。固体壊死組織片を除去した後、抽出物を濃縮しＣＨＵＭＢ法で解析した。クロマトグラフによる解析及び生物活性プロフィールによって、複数の抽出物中にクロマトグラフ的に特徴のあるピークが存在することが示唆された。このピークは１２９７Ｄａ（１２９６．１ＥＳ−）の分子イオン、１１３１Ｄａ（ＥＳ−）の分画及び３１７．７７、３３２．７７、及び３５０．７７のＵＶマキシマ(UV maxima)を有していた。例えば、培地ＱＢで生育すると、かなりの量のクロマトグラフ的に特徴のある化合物が得られる。これを以後ＥＣＯ−０２３０１と称す。ＥＣＯ−０２３０１は複数のCandida種に対する抗真菌活性と同様に、Staphylococcus aureusに対する抗菌活性を示す。ＥＣＯ−０２３０１の物理的データ及び生物的データは多数の共役二重結合を有する大きな天然物であることを示している。Streptomyces aizunensisの生合成部位を調べたところ、部位０２３Ｄを候補なり得るとして同定した。かかる部位はグリコシルトランスフェラーゼ、デオキシヘキソース生合成遺伝子及び未知の機能の補助遺伝子と同様に、ＥＣＯ−０２３０１の観察された質量と一致するポリケチドシンターゼを約２６分子含んでいた。質量分画１１３１．９Ｄａはでオキシヘキソース成分（デオキシヘキソース質量＝１６４．１６）の減少分と一致しており、更に部位０２３ＤがＥＣＯ−０２３０１の生成の原因であるという仮説を裏付けるものであった。部位０２３Ｄの予測されたドメインの配列は、
［ＡＣＰ］［ＫＳ−ＡＴ（Ｍ）−ＫＲ−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＡＴ（Ｍ）−ＫＲ−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＡＴ（Ｍ）−ＤＨ−ＫＲ−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＡＴ（Ｍ）−ＫＲ−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＡＴ（Ｍ）−ＫＲ−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＡＴ（Ｍ）−ＤＨ†−ＫＲ−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＡＴ（Ｍ）−ＫＲ−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＡＴ（Ｍ）−ＤＨ−ＫＲ−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＡＴ（Ｍ）−ＫＲ−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＡＴ（Ｍ）−ＫＲ−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＡＴ（Ｍ）−ＤＨ†−ＫＲ−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＡＴ（ＭＭ）−ＫＲ*−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＡＴ（Ｍ）−ＫＲ−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＡＴ（Ｍ）−ＤＨ−ＫＲ−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＡＴ（Ｍ）−ＤＨ−ＫＲ−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＡＴ（Ｍ）−ＤＨ−ＫＲ−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＡＴ（Ｍ）−ＤＨ−ＫＲ−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＡＴ（Ｍ）−ＤＨ−ＫＲ−ＡＣＰ］［ＫＡ−ＡＴ（ＭＭ）−ＫＲ−ＡＣＰ］［ＫＡ−ＳＴ（ＭＭ）−ＫＲ−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＡＴ（Ｍ）−ＤＨ†−ＫＲ−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＡＴ（Ｍ）−ＤＨ−ＥＲ−ＫＲ−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＡＴ（Ｍ）−ＤＨ−ＫＲ−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＡＴ（Ｍ）−ＤＨ−ＫＲ−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＡＴ（Ｍ）−ＤＨ−ＫＲ−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＡＴ（Ｍ）−ＤＨ−ＫＲ−ＡＣＰ−ＴＥ
である。ここで省略記号は、アシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）及びチオエステラーゼ（ＴＥ）活性だけでなく、ケトアシルシンターゼ（ＫＳ）、アシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）、ケトリダクターゼ（ＫＲ）、デヒドラターゼ（ＤＲ）及びエノイルリダクターゼ（ＥＲ）活性に対応する進化性の酵素活性を表す。ＡＴドメインの特異性（ｍ、マロニル；ｍｍ、メチルマロニル）についても示されている。アスタリスク（*）は不活性であると予測されたドメインを示し、†は配列の推論に基づいて決定することができなかった活性を有するドメインを表す。
【０１０９】
次にStreptomyces aizunensisを大規模発酵（０．５Ｌ）で７日間培地ＱＢで生育し、沈殿した菌糸を同量のメタノールで攪拌することによって抽出し、遠心分離によって清澄化した。ＨＰ−２０ビーズへのロータリーエバポレーションを通して抽出物をDiaionＨＰ−２０樹脂に吸収させ、メタノールステップグラディエントを用いて希釈した。ＥＣＯ−０２３０１を含む分画をプールし、調整用のＨＰＬＣクロマトグラフィー（Ｃ−１８ＯＤＳ）を介してクロマトグラフし、純粋ＥＣＯ−０２３０１を生成した。構造的テンプレートとしてＰＫＳの推定上の部位０２３Ｄの構造を用いて、ＮＭＲ分光学によって構造の解明する速度を高め、ＥＣＯ−０２３０１の構造が、下に示すように、通常と異なるaminohydroxycyclopentenone成分を有する大きなglycosylated linear polyeneic化合物であることが明らかとなった。
2005514959.tif 000009
【０１１０】
現存する化学文献や化学データベースを検索し、かかる化合物がこれまで説明されておらず、したがって新規の化学物質（ＮＣＥ）であることが明らかとなった。ＥＣＯ−０２３０１のポリケチドのバックボーン及び糖部分は推定上の生合成部位０２３Ｄの化学構造とよく相関していた。グリコシル化及びaminohydroxycyclopentenoneの機能性の存在と同様、ＥＣＯ−０２３０１はバックボーンの酸化状態においては異なっているが、ＥＣＯ−０２３０１のポリケチドのバックボーンはlinearmycin化合物に類似している。アミノレブリン酸の生成を確実にする可能性のある前駆体アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子が０２３Ｄ部位に存在することにより、アミノレブリン酸の分子内の環化の生成物と仮定されるaminohydroxycyclopentenoneの成分が実証された。
【０１１１】
実施例６：同位体取込み実験による潜在的生合成部位からの新規ポリケチドの同定
Streptomyces ghanaensis（ＮＲＲＬ  Ｂ−１２１０４）に、実施例１に記載のゲノムスキャン方法を行ったところ、多くの推定上の天然物生合成部位のStreptomyces ghanaensisゲノムが発見され、更にこのうち７つをシーケンス解析によって特徴づけ、特徴的な生合成部位であることを決定した。解析した７つの生合成部位のうち４つは、ペプチドの生成（部位記号００９Ｄ、００９Ｅ、００９Ｆ、００９Ｈ）をコードすると予測され、２つは大きなポリケチド（部位記号００９Ｂ及び００９I）の生成をコードすると予測されるＮＲＰＳ遺伝子を含んでいた。ゲノム情報に基づいて、Streptomyces ghanaensisの部位によってコードされる化合物について概略的な化学構造が予測された。
2005514959.tif 000010
【０１１２】
例えば、００９Ｈ及び００９Ｉは、メチル化酵素又はメチルトランスフェラーゼの生成をコードする遺伝子に類似した遺伝子配列を有している。部位００９Ｈ及び００９Ｉによってコードされる仮定の代謝産物の場合は、配列の類似性によってメチル基のための生合成の前駆体が、第一代謝産物中でメチオニンを介して生合成されたＳ−アデノシルメチオニンであることが示された。００９Ｈ及び００９Ｉによって生成された化合物の構造の部分的な推論によって、それらがそれぞれポリペプチド及びポリケチドであることが示された。００９Ｉのポリケチドシンセターゼの提案されたドメイン組織を予測し、かかるデータから派生する構造は、
［ＫＳ−ＡＴ（ＭＭ）−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＡＴ（ＭＭ）−ＫＲ−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＡＴ（Ｍ）−ＫＲ−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＡＴ（ＭＭ）−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＡＴ（ＭＭ）−ＫＲ−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＡＴ（Ｍ（ＯＣＨ３）Ｍ）−ＫＲ−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＡＴ（Ｍ）−ＤＨ−ＫＲ−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＡＴ（ＭＭ）−ＤＨ−ＫＲ−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＡＴ（ＭＭ）−ＤＨ−ＥＲ−ＫＲ−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＡＴ（ＭＭ）−ＫＲ−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＡＴ（ＭＭ）−ＤＨ−ＫＲ−ＡＣＰ］［ＫＳ−ＡＴ（ＭＭ）−ＤＨ−ＫＲ−ＡＣＰ−ＴＥ］
2005514959.tif 000011
である。ここで、省略記号は、アシルキャリアプロテイン（ＡＣＰ）及びチオエステラーゼ（ＴＥ）活性や、ケトアシルシンターゼ（ＫＳ）、アシルトランスファーゼ（ＡＴ）、ケトリダクターゼ（ＫＲ），デヒドラターゼ（ＤＨ）、及びエノイルリダクターゼ（ＥＲ）活性に対応する進化性の酵素活性を示す。６番目のＡＴドメインのmethoxymalonyl（ｍｍ）特異性が、ＤＥＣＩＰＨＥＲ（登録商標）データベース中のＡＴドメインのデータベースとのドメインの比較によって明らかとなった。これは、部位００９Ｉにコードされる代謝産物内のかかる機能性のための前駆体であるmethoxymalonyl−ＡＣＰを生成することが知られている酵素をコードする遺伝子の存在によって裏付けられた。
【０１１３】
したがって、Streptomyces ghanaensisの多数産生培地を標識されたメチオニン、特にtrideuteromethionine（メチル−D３）で補充することによって、重いメチオニンを組み込む代謝産物の存在についてメタボロームをスキャンすることが容易になると予測された。このような重いメチオニンを組み込む代謝産物は、分子イオンとより少ない強度を持つが親より３ダルトン大きい関連する分子イオンからなる質量スペクトルのパターンを示すと予測された。
【０１１４】
次にメタボロミクスアプローチを用いて二次代謝産物が発現する条件を同定し、それらを解析し、同位体取込みパターンに基づいて前述の生合成部位に相関させた。かかるアプローチによって特定の時間に特定の培養条件下で所定の生物中のあらゆる低分子量代謝産物（０〜５０００Ｄ）の解析的な測定が得られた。Streptomyces ghanaensisを４８の異なる培地（ＡＡ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＩ、ＤＡ、ＤＹ、ＤＺ、ＥＡ、ＥＳ、ＥＴ、ＦＡ、ＧＡ、ＩＢ、ＪＡ、ＫＡ、ＫＥ、ＬＡ、ＭＡ、ＭＣ、ＭＵ、ＮＡ、ＮＥ、ＮＦ、ＮＧ、ＯＡ、ＰＡ、ＰＢ、ＱＢ、ＲＡ、ＲＢ、ＲＣ、ＲＭ、ＳＦ、ＳＰ、ＴＡ、ＶＡ、ＶＢ、ＷＡ、ＷＳ、ＸＡ、ＹＡ、ＺＡ）で生育した。これらの多くは広い範囲の天然物の生成を補助すると報告されている代謝産物を代表するものである。各培地にtrideuteromethionine（メチル−D３、１〜５mＭ）を補充した。同量のメタノールを添加してすべての細胞培養から代謝産物を抽出した。固体壊死組織片を除去した後、抽出物を濃縮し、ＣＨＵＭＢ法で解析した。親対「３大きいイオン」の比率が約１０：１から２：１である、質量５７４Ｄａに一致する親分子イオンと親イオンより３ダルトン大きい関連するイオンの存在によって確認されるように、クロマトグラフによる解析及び生物活性プロフィールによって、複数の抽出物中、特に培地ＲＭでの生育に由来する抽出物中に、trideuteromethionineの同位体取込みを示すクロマトグラフ的に特徴のあるピークが存在することが示唆された。
【０１１５】
培地ＲＭは発酵を５００ｍＬにスケールアップするために選択され、得生育の１０日後に回収された。本明細書のいたるところに記載の通常の抽出プロトコールを用いて分画１及び２が標的イオンを含んでいることが明らかとなった。メチル化した標的の１つをＣ−１８固体相抽出、更にＣ−１８ＨＰＬＣによって同定した。プロトン、炭素、ＣＯＳＹ、ＨＳＱＣ及びＨＭＢＣスペクトルを含むかかる化合物についてＮＭＲデータを回収した。始めに分光法のデータを用いて遺伝子の予測から派生するポリケチドバックボーンを編集した。これにより、構造の解明が早まった。ゲノムデータとＮＭＲデータとの唯一の違いは、アシル化機能をもたらすための予測した構造における二次ヒドロキシの明らかな脱水である。ＨＭＢＣデータによって、構造を説明するラクトン結合組成のレジオケミストリーが確認された。Dictionary of Natural Productsでの検索に基づき、同定された化合物が、かかる生物によって生成されることが知られていなかった、既知の化合物oxohygrolidin（以下参照）であることが明らかとなった。
2005514959.tif 000012
【０１１６】
前述の本発明の実施態様は、実施例であるに過ぎない。ここに付記された請求項によってのみ定義される本発明の範囲から逸脱することなく、当業者によって特定の実施態様に変更、改変及び変形がなされてもよい。したがって、ここに引用されたあらゆる特許、特許出願及び公知文献は、参照に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
本発明の実施態様について、添付図面を参照にして実施例としてのみ説明する。
【図１ａ】図１ａは、本発明の一実施例による、二次代謝産物を同定する一般的な方法及びシステムの概略図である。
【図１ｂ】図１ｂは、実施例１にそれぞれ記載されるように、図１ａの一般的な方法及びシステムを例示するものである。
【図１ｃ】図１ｃは、実施例２にそれぞれ記載されるように、図１ａの一般的な方法及びシステムを例示するものである。
【図１ｄ】図１ｄは、実施例３にそれぞれ記載されるように、図１ａの一般的な方法及びシステムを例示するものである。
【図１ｅ】図１ｅは、実施例４にそれぞれ記載されるように、図１ａの一般的な方法及びシステムを例示するものである。
【図１ｆ】図１ｆは、実施例５にそれぞれ記載されるように、図１ａの一般的な方法及びシステムを例示するものである。
【図１ｇ】図１ｇは、実施例６にそれぞれ記載されるように、図１ａの一般的な方法及びシステムを例示するものである。
【図２】図２は、本発明の一実施例による、二次代謝産物を含む抽出物を微生物から得るためのゲノミクス誘導の発現手段、及び代謝産物の生物的特性を測定するためのゲノミクス誘導のスクリーニング技術手段を示す概略図である。
【図３】図３は、本発明の一実施例で用いられる、代謝産物の化学的、物理的及び生物的特性を得るためのハイスループットＣＨＵＭＢ示す図である。
【図４】図４は、本発明の一実施例による、ゲノミクス誘導の発現及び代謝産物を同定するためのスクリーニング技術の代表を示す概略図である。
【図５】図５は、本発明の一実施例による、代謝産物を単離するための、ゲノミクス誘導の抽出技術の代表を示す概略図である。
【図６】図６、７及び８は、本発明の一実施例による、典型的なゲノミクスにガイドされた３ステージの抽出／単離／構造解明プロトコールを示す概略図である。プロトコールのステージＩを図６に示す。
【図７】プロトコールのステージＩＩを図７に概略的に示す（図７のステージＩＩプロトコールの一例を図６に示す）。
【図８】プロトコールのステージＩＩを図８に示す。
【図９】図９は、標的遺伝子クラスターによって合成された二次代謝産物を同定するためのシステムを示す略図である。
【図１０】図１０は、前もって選択したケミカルファミリーから派生する二次代謝産物を同定するためのシステムを示す略図である。
【図１１】図１１は、本発明による典型的なグラフィカルユーザーインターフェースを示す略図である。
【図１２ａ】図１２ａ及び１２ｂは、ＤＮＡを損傷する能力に基づいてエンジイン代謝産物を検出するための、生化学的誘導アッセイ(biochemical induction assay)の結果を示す図である。図１２ａにおいて、ＣＡＬＩはカリケアマイシン(calicheamicin)、ＭＡＣＲはマクロマイシン(macromomycin)、ＤＹＮＥはダイネマイシン(dynemicin)、及びＮＥＯＣはネオカルジノスタチン(neocarzionostatin)を表す。
【図１２ｂ】図１２ｂにおいて、００７ＡはAmycolatopsis orientalis由来の推定上のエンジイン、００９ＣはStreptomyces ghanaensis由来の推定上のエンジイン、１４５ＢはStreptomyces citricolor由来の推定上のエンジイン、０４６Ｅ及び１７１Ｂは及びエコピアが私有する培養物のコレクションの中の微生物由来の推定上のエンジインを表す。
【図１３】図１３は、Streptomyces refuineus由来の推定上のリポペプチド生合成遺伝子座である０２４Ａを例示し、図上には塩基対でのスケールを示し、続いて０２４Ａの遺伝子部位の範囲が一本鎖連続ＤＮＡ配列に示され、遺伝子座を形成する１６のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の相対部位及び定位が続いて示され、０２４Ａ遺伝子座のＮＰＲＳシステム（ＯＲＦ４）における異常なＣドメインを黒で示す。０２４Ａによって合成されたリポペプチド（０２４Ａ化合物）と、Streptomyces fradiaeによって生成された既知のリポペプチドＡ５４１４５との構造上の類似性を、最後に示す。
【図１４ａ】図１４ａは、Streptomyces fradiae由来、Streptomyces refuineusＮＲＲＬ３１４３由来のアニオン性リポペプチドの抽出中に作成されたプレートの写真である。かかる２つの写真は、酸性リポペプチドの発現と一致して、ＩＲＡ６７アニオン交換クロマトグラフィーに基づく豊富な活性を示している。
【図１４ｂ】図１４ｂは、Streptomyces fradiae由来、Streptomyces refuineusＮＲＲＬ３１４３由来のアニオン性リポペプチドの抽出中に作成されたプレートの写真である。かかる２つの写真は、酸性リポペプチドの発現と一致して、ＩＲＡ６７アニオン交換クロマトグラフィーに基づく豊富な活性を示している。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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【図１ｆ】
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【図１ｇ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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