(57)【要約】本発明は、癌患者の生存についての予後を決定するための方法を提供する。１つの方法は、以下：（ａ）癌患者由来の新生物細胞含有サンプルにおけるＴＵＣＡＮのレベルを測定する工程、および（ｂ）サンプル中のＴＵＣＡＮのレベルと、参照のＴＵＣＡＮのレベルとを比較する工程を包含し、ここで、サンプル中の低レベルのＴＵＣＡＮは、患者の増大した生存と相関する。別の方法は、以下：（ａ）癌患者由来のサンプルを含む新生物細胞におけるＴＵＣＡＮのレベルを測定する工程、および（ｂ）第１のグループの患者または、第２のグループの患者とのいずれかに属するとしてを患者を分類する工程であって、ここで、第１のグループの患者は、低いレベルのＴＵＣＡＮを有する第１のグループの患者は、高いレベルのＴＵＣＡＮを有する第２のグループの患者と比較して、増大した生存可能性を有するとして分類される、工程を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌患者の生存について予後を決定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該癌患者由来の新生物細胞含有サンプルにおけるＴＵＣＡＮのレベルを測定する工程、および
（ｂ）該サンプル中のＴＵＣＡＮのレベルと、参照のＴＵＣＡＮのレベルとを比較する工程を包含し、ここで、該サンプル中の低レベルのＴＵＣＡＮは、該患者の増大した生存と相関する、方法。
【請求項２】
前記生存が、全体的生存である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生存が、疾患に罹患していない生存である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記癌患者が、以下：結腸癌、胃腸の癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、白血病、ＣＮＳ癌、黒色腫、前立腺癌、および腎臓癌からなる群より選択される癌を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記サンプルが、結腸腫瘍組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプルが、血液、血清、尿、精液、および便からなる群より選択される流体である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＴＵＣＡＮポリペプチドのレベルが測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＴＵＣＡＮポリペプチドのレベルが、ＴＵＣＡＮと特異的に反応する抗体を用いて測定される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＴＵＣＡＮ核酸のレベルが測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記患者が、初期病期の癌に罹患している、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＴＵＣＡＮのレベルが、再発についての危険性を有しているか否かを決定するために使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＴＵＣＡＮのレベルが、前記患者に対する適切な処置過程を決定するために使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
癌患者の生存についての予後を決定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該癌患者由来の新生物細胞含有サンプルにおける、ＴＵＣＡＮおよび１つ以上のバイオマーカーのレベルを測定する工程であって、該１つ以上のバイオマーカーが、以下：ｃＩＡＰ２、Ａｐａｆ１、Ｂｃｌ−２、およびＳｍａｃからなる群より選択される、工程、ならびに
（ｂ）該サンプル中の該ＴＵＣＡＮおよび該１つ以上の選択されたバイオマーカーのレベルと、ＴＵＣＡＮおよび１つ以上の選択されたバイオマーカーの参照のレベルとを比較する工程を包含し、該サンプル中の低レベルのＴＵＣＡＮおよび高レベルのＡｐａｆ１、Ｂｃｌ−２またはＳｍａｃのいずれか、あるいは低レベルのＴＵＣＡＮおよび低レベルのｃＩＡＰ２は、該患者の増大した生存と相関する、方法。
【請求項１４】
前記生存が全体的生存である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記生存が、疾患に罹患していない生存である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
ｃＩＡＰ２が選択されたマーカーである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
Ａｐａｆ１が選択されたマーカーである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
Ｂｃ１−２が選択されたマーカーである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
Ｓｍａｃが選択されたマーカーである、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記癌患者が、以下：結腸癌、胃腸の癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、白血病、ＣＮＳ癌、黒色腫、前立腺癌、および腎臓癌からなる群より選択される癌を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
前記サンプルが、結腸腫瘍組織である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
前記サンプルが、血液、血清、尿、精液、および便からなる群より選択される流体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２３】
ＴＵＣＡＮポリペプチドまたはバイオマーカーポリペプチドのレベルが測定される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２４】
ＴＵＣＡＮポリペプチドまたはバイオマーカーポリペプチドのレベルがＴＵＣＡＮポリペプチドまたはバイオマーカーポリペプチドと特異的に反応する抗体を用いて測定される、請求項２３に記載の方法
【請求項２５】
ＴＵＣＡＮ核酸またはバイオマーカー核酸のレベルが測定される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２６】
前記患者が、初期病期の癌に罹患している、請求項１３に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＴＵＣＡＮおよび１つ以上のバイオマーカーのレベルが、前記患者が再発の危険を有するか否かを決定するために用いられる、請求項１３に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＴＵＣＡＮおよび１つ以上のバイオマーカーのレベルが、前記患者に対する適切な処置過程を決定するために用いられる、請求項１３に記載の方法。
【請求項２９】
ｃＩＡＰ２、Ａｐａｆ１、Ｂｃｌ−２およびＳｍａｃからなる群より選択される２つ以上のバイオマーカーを選択する工程をさらに包含する、請求項１３に記載の方法。
【請求項３０】
癌に罹患した患者に対する処置過程の効果をモニタリングするための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）処置後の該患者由来の新生物細胞含有サンプルにおけるＴＵＣＡＮのレベルを決定する工程；および
（ｂ）処置前の該患者由来の新生物細胞含有サンプルにおけるＴＵＣＡＮのレベルを決定する工程を包含し、これにより、該処置前のＴＵＣＡＮレベルと該処置後のＴＵＣＡＮレベルとの比較により、該処置の効果が示される、方法。
【請求項３１】
前記癌患者が、以下：結腸癌、胃腸の癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、白血病、ＣＮＳ癌、黒色腫、前立腺癌、および腎臓癌からなる群より選択される癌を有する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記サンプルが、結腸腫瘍組織である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記サンプルが、血液、血清、尿、精液、および便からなる群より選択される流体である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
ＴＵＣＡＮポリペプチドのレベルが測定される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
ＴＵＣＡＮポリペプチドのレベルがＴＵＣＡＮと特異的に反応する抗体を用いて測定される、請求項３４に記載の方法
【請求項３６】
ＴＵＣＡＮ核酸のレベルが測定される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
前記患者が、初期病期の癌に罹患している、請求項３０に記載の方法。
【請求項３８】
癌患者の生存について予後を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該癌患者由来の新生物細胞含有サンプルにおけるＴＵＣＡＮのレベルを測定する工程、および
（ｂ）該患者を、第１のグループの患者または第２のグループの患者のいずれかに属するとして分類する工程であって、低レベルのＴＵＣＡＮを有する該第１のグループの患者が、高レベルのＴＵＣＡＮを有する該第２のグループの患者と比較して、増大した生存可能性を有するとして分類される、工程、
を包含する、方法。
【請求項３９】
前記生存が、全体的生存である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記生存が、疾患に罹患していない生存である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記癌患者が、以下：結腸癌、胃腸の癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、白血病、脳の癌、黒色腫、前立腺癌、および腎臓癌からなる群より選択される癌を有する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記サンプルが、結腸腫瘍組織である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
前記サンプルが、血液、血清、尿、精液、および便からなる群より選択される流体である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
ＴＵＣＡＮポリペプチドのレベルが測定される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
ＴＵＣＡＮポリペプチドのレベルが、ＴＵＣＡＮポリペプチドと特異的に反応する抗体を用いて測定される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ＴＵＣＡＮ核酸のレベルが測定される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４７】
前記患者が、初期病期の癌に罹患している、請求項３８に記載の方法。
【請求項４８】
請求項３８に記載の方法であって、該方法は、以下：
（ａ）前記癌患者由来の新生物含有細胞中のｃＩＡＰ２のレベルを決定する工程、および
（ｂ）該患者を、第１のグループの患者または第２のグループの患者のいずれかに属するとして分類する工程であって、低レベルのＴＵＣＡＮおよび低レベルのｃＩＡＰ２を有する該第１のグループの患者が、高レベルのＴＵＣＡＮおよび高レベルのｃＩＡＰ２を有する該第２のグループの患者と比較して、増大した生存可能性を有するとして分類される、工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項４９】
請求項３８に記載の方法であって、該方法は、以下：
（ａ）前記癌患者由来の新生物細胞含有サンプルにおける、Ａｐａｆ１、ＳｍａｃおよびＢｃｌ−２からなる群より選択されるバイオマーカーのレベルを決定する工程、ならびに
（ｂ）該患者を、第１のグループの患者または第２のグループの患者のいずれかに属するとして分類する工程であって、低レベルのＴＵＣＡＮおよび高レベルのＡｐａｆ１、ＳｍａｃまたはＢｃｌ−２のいずれかを有する該第１のグループの患者が、高レベルのＴＵＣＡＮおよび低レベルのＡｐａｆ１、ＳｍａｃまたはＢｃｌ−２のいずれかを有する該第２のグループの患者と比較して、増大した生存可能性を有するとして分類される、工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項５０】
請求項３０に記載の方法であって、該方法は、処置前および処置後の前記患者由来の新生物細胞含有サンプル中のｃＩＡＰ２、Ａｐａｆ１、ＳｍａｃおよびＢｃｌ−２からなる群より選択されるバイオマーカーのレベルを決定する工程をさらに包含し、処置前の該選択されたバイオマーカーおよびＴＵＣＡＮのレベルが、処置後の該選択されたバイオマーカーおよびＴＵＣＡＮのレベルと比較されて、該処置の効果を示す、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、国立衛生研究所により授与された、助成金番号ＡＧ１５４０２、ＣＡ６９３８１、およびＮＳ３６８２１の下の政府の補助を用いてなされた。合衆国政府は、本発明において特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
本発明は、一般に、癌、より詳細には、癌の診断または予後のために用いられ得るバイオマーカーに関する。
【０００３】
癌は、毎年、診断される１００万人より多くの人、ならびに彼等の家族および友人に根深く影響する、主要な公衆衛生上の問題のままである。米国の人々が、成長し、そして年をとるにつれて、より多くの人々が、癌に罹患する。癌を早期に検出するためのスクリーニング試験の使用は、しばしば、より副作用の少ない、より効果的な処置を導く。早期に癌が見出された患者はまた、症状が現れるまで癌が見出されなかった患者よりも、これらの癌により死亡する確率が低いようである。
【０００４】
１つの型の癌のスクリーニング試験は、患者から得られた流体または組織中のバイオマーカー（例えば、腫瘍マーカー）の検出を含む。腫瘍マーカーは、癌細胞により産生される物質であって、代表的には正常な細胞により産生されない物質である。これらの物質は、一般的に、癌に罹患した患者の体液または組織において検出され得る。不幸なことに、いくつかの腫瘍マーカーはまた、癌に罹患していない人の体液または組織において有意な量で検出され得、このことは、特定のマーカーを、診断について信頼性の低いものにする。それにも関らず、腫瘍マーカーは、癌を診断するための重要なツールのままである。
【０００５】
腫瘍マーカーについての別の重要な使用は、進行した癌について処置されている患者をモニタリングするための使用である。この目的のために腫瘍マーカーを測定することは、治療が、癌を減少させているか否かを決定するために、胸部Ｘ腺、コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャン、骨のスキャン、または他の複雑な試験を繰り返すより侵襲性が低く、より時間がかからず、かつより費用がかからないものであり得る。
【０００６】
腫瘍マーカーについてのさらなる重要な使用は、癌患者の生存の予後を決定するための使用である。そのような予後方法は、外科的処置された患者にさらなる治療的選択が与えられ得るように、癌の再発を経験する可能性のある患者を特定するために用いられ得る。生存の予後のために有用なバイオマーカーはまた、検査または手術のときに測定可能な転移を示していない患者における転移の危険性を決定するために特に有効であり得る。癌患者における転移の可能性の知見は、処置の選択肢の選択における重要な因子であり得る。例えば、転移を経験する可能性がある癌患者は、特に攻撃的な様式を用いて有利に処置され得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、癌のための診断指標または予後指標として用いられ得るバイオマーカーを同定する必要性が存在する。本発明は、この必要性を満たし、そして関連する利点も提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、癌患者の生存についての予後を決定するための方法を提供する。１つの方法は、以下：（ａ）癌患者由来の新生物細胞含有サンプルのＴＵＣＡＮのレベルを測定する工程、および（ｂ）サンプル中のＴＵＣＡＮのレベルと、参照のＴＵＣＡＮのレベルとを比較する工程を包含し、ここで、サンプル中の低レベルのＴＵＣＡＮは、患者の増大した生存と相関する。
【０００９】
癌患者の生存についての予後を決定するための別の方法は、以下：（ａ）癌患者由来の新生物細胞含有サンプルにおける、ＴＵＣＡＮおよび１つ以上のバイオマーカーのレベルを測定する工程であって、１つ以上のバイオマーカーが、ｃＩＡＰ２、Ａｐａｆ１、Ｂｃｌ−２、およびＳｍａｃからなる群より選択される工程、ならびに（ｂ）サンプル中のＴＵＣＡＮおよび１つ以上の選択されたバイオマーカーのレベルと、ＴＵＣＡＮおよび１つ以上の選択されたバイオマーカーの参照のレベルとを比較する工程を包含し、ここでサンプル中の低レベルのＴＵＣＡＮおよび高レベルのＡｐａｆ１、Ｂｃｌ−２またはＳｍａｃのいずれか、あるいは低レベルのＴＵＣＡＮおよび低レベルのｃＩＡＰ２は、該患者の増大した生存に対応する。
【００１０】
癌患者の生存についての予後を決定するさらなる方法は、以下：（ａ）該癌患者由来の新生物細胞含有サンプルにおけるＴＵＣＡＮのレベルを測定する工程、および（ｂ）患者を、第１のグループの患者または第２のグループの患者のいずれかに属するとして分類する工程であって、低レベルのＴＵＣＡＮを有する第１のグループの患者が、高レベルのＴＵＣＡＮを有する第２のグループの患者よりも、増大した生存可能性を有するとして分類される、工程を包含する。
【００１１】
本発明はまた、癌を有する患者の処置経過の有効性をモニタリングするための方法を提供する。この方法は、（ａ）処置の前の癌患者由来の新生細胞含有サンプル中のＴＵＣＡＮレベルを決定する工程、および（ｂ）処置後の患者由来の新生細胞含有サンプル中のＴＵＣＡＮレベルを決定し、それにより、処置前のＴＵＣＡＮレベルと処置後のＴＵＣＡＮレベルとの比較によって処置の有効性を示す工程を包含する。
【００１２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、タンパク質を含有するＣＡＲＤドメイン（ＰＣＴ公開  ＷＯ０１／１６１７０中でＣＡＲＤ−Ｘとして公知である）、ＴＵＣＡＮ（カスパーゼ９の腫瘍アップレギュレートＣＡＲＤ含有アンタゴニスト（Ｔｕｍｏｒ  Ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ＣＡＲＤ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｏｆ  Ｃａｓｐａｓｅ  Ｎｉｎｅ））の発現が、独立してかまたは他のバイオマーカーと組み合わせて、癌を有する患者についての臨床的な結果を効果的に予測するために使用され得るという知見に関する。
【００１３】
本発明の予後診断法は、患者が再発のおそれにある場合の測定のために有用である。癌再発は、種々の型の癌に関連する懸念である。例えば、結腸癌の外科的除去を受けた患者のうち、第ＩＩ病期の結腸癌を有する患者の２５％〜４０％、および第ＩＩＩ病期の結腸癌を有する患者の約５０％が、癌の再発を経験する。癌の再発についての１つの説明は、比較的初期段階の疾患（例えば、第ＩＩ病期または第ＩＩＩ病期）を有する患者は、すでに手術によって除去されなかった、罹患した臓器の外側に広がった少量の癌を有しているということがある。これらの癌細胞は、微小転移巣と呼ばれ、現在利用可能である試験では一般的には検出し得ない。本発明の予後診断法は、癌再発しそうな外科的に処置された患者を同定するために使用され得、その結果、化学療法、照射、生物学的改変剤および他の適切な治療法のような手術前または手術後の補助を含む、さらなる治療オプションを提供し得る。この方法は、試験または手術のときに、測定可能な転位を示さない患者における転位の危険性を測定するために特に有効である。
【００１４】
本発明の予後診断法はまた、癌を有する患者のための適切な処置工程を決定するために有用である。処置工程とは、診断後または癌の処置後の患者のために行なわれる治療測定のことをいう。例えば、癌の再発、拡散、または患者生存についての可能性の決定は、治療に対してより保存的もしくはより根治的アプローチが行なわれるべきか否か、または処置様式が組み合わせられるべきか否かを決定するのを助け得る。例えば、癌再発が起こりそうな場合、化学療法、照射、免疫療法、生物学的改変剤療法、遺伝子治療、ワクチンなどによる手術前の処置もしくは手術後の処置、または患者が処置される時間幅を調節するのに有利であり得る。
【００１５】
本明細書中の実施例ＩＩおよびＶＩＩＩに開示されるように、高められたレベルのＴＵＣＡＮは、それぞれ、結腸腫瘍試料の４９％および６４％で見出された。単変量解析を使用して、より長期の疾患に罹患していない生存（ＤＦＳ）とＴＵＣＡＮの低い発現（ｐ＝０．０００４）との間の有意な相関を測定した。実施例ＩＶに示されるように、腫瘍が低レベルのＴＵＣＡＮを含んでいる患者の７８％（５０人中３９人）は、このタンパク質の高い発現を有する患者においては４４％（４８人中２１人）のみであるのに比べ、この研究によってカバーされる時間の間、生存しかつ疾患を有さないままであった。実施例ＶＩＩＩはまた、ＴＵＣＡＮ免疫染色が、生存していた患者と比べて、結腸癌で死亡した患者においてより有意に高いことを示す。
【００１６】
実施例ＩＶに示されるように、５年間のメジアンの追跡において、ＴＵＣＡＮの高い発現を有する患者の４９％は、結腸癌の再発を有するかまたは結腸癌によって死亡し、そして腫瘍がこのタンパク質を低レベルで発現する患者のグループにおいては、１９％のみが再発し４％が疾患で亡くなった。多変量解析は、高いＴＵＣＡＮの存在が、結腸癌に由来する死の危険性を１７倍増加させたことを示した（ｐ＝０００００４）。従って、癌を有する患者由来のサンプル中の高レベルのＴＵＣＡＮは、腫瘍転位の増加された可能性および減少された生存に関連する。同様に、癌を有する患者由来のサンプル中の低レベルのＴＵＣＡＮは、腫瘍転位の減少された可能性および生存の増加された可能性に関連する。
【００１７】
低レベルのｃＩＡＰ２および低レベルのＴＵＣＡＮの組み合わせが、非常に都合よい結果を有する初期段階の結腸癌のサブグループを同定したことがまた、本明細書中で開示される。同齢集団の９２人の患者中の約３分の１の患者が、低レベルのｃＩＡＰ２および低レベルのＴＵＣＡＮの組み合わせを有していた（３３／９２（３６％））。これらの３３人の患者のうち、３２人（９７％）が生存し、かつ３０人（９１％）が本研究によって対象とされる時間において疾患を有さなかったが、これとは対照的に、他のカテゴリーでは、５６％が生存し、４４％が疾患を有さなかった。同様に、同齢集団の８１人の患者中の１７人が、高レベルのＡｐａｆ１発現および低レベルのＴＵＣＡＮ発現の組み合わせを有した。高レベルのＡｐａｆ１発現および低レベルのＴＵＣＡＮ発現を特徴とする全ての患者（１７人）は、この特徴によって特徴付けられなかった患者については６５％（８１人中５３人）のみが生存しかつ５３％（８１人中４３人）で再発しなかったこと比べ、この調査の終わりにおいても生存しかつ再発も有さなかった。従って、癌を有する患者由来のサンプル中の高レベルのｃＩＡＰ２または低レベルのＡｐａｆ１と組み合わせた高レベルのＴＵＣＡＮは、腫瘍転位の増加された可能性および生存の減少された可能性に関連する。それに対して、低レベルのｃＩＡＰ２または高レベルのＡｐａｆ１と組み合わせた低レベルのＴＵＣＡＮは、腫瘍転位の減少された可能性および生存の増加された可能性に関連する。
【００１８】
これらの結果に基づいて、本発明は、新生物状態の診断、癌に罹患している患者の生存の予知、およびバイオマーカーとしてＴＵＣＡＮを使用する癌の段階の決定のための方法を提供する。ＴＵＣＡＮは、単独でかまたは癌に罹患している患者の生存を予知するための特異的バイオマーカーのような他の予知インディケーターと組み合わせて使用され得る。
【００１９】
本明細書中に開示されるように、Ａｐａｆ１、サルビビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）、ＸＩＡＰ、ｃＩＡＰ１、およびｃＩＡＰ２の高められたレベルが、それぞれ結腸腫瘍試料の３８％、５４％、７４％、６１％および３５％において見出された。単変量解析を使用して、より長い疾患に罹患していない生存（ＤＦＳ）と、ｃＩＡＰ２（ｐ＝０．０００２）、β−カテニン（ｐ＝０．０４）、変異ｐ５３タンパク質（ｐ＝０．０３）の低レベルの発現との間、またはより長い疾患に罹患していない生存（ＤＦＳ）Ａｐａｆ１（ｐ＝０．００００８）、Ｂｃｌ−２（ｐ＝０．００５）、およびＳＭＡＣ（ｐ＝０．０３）の高レベルの発現突然変異誘発との間の優位な相関を決定した（図４ａを参照のこと）。従って、腫瘍が低レベルのＴＵＣＡＮを含んでいる患者の７８％（５０人中３９人）は、このタンパク質の高レベルの発現を有する患者の４４％（４８人中２１人）と比べ、この研究によって対象とされる時間の間、生存したままでありかつ疾患を有さなかった。同様に、高いｃＩＡＰ２レベルを有する患者において３６％（３３人中１２人）のみ癌を有していなかったが、低レベルのｃＩＡＰ２発現者（ｅｘｐｒｅｓｓｏｒ）のうちの７４％（６１人中４５人）が、この調査の終わりに癌を有していなかった。５年間のメジアンの追跡において、高いｃＩＡＰ２レベルを有する患者の６０％が再発し、そして４６％が結腸癌によって死亡した。それに対して低レベルのｃＩＡＰ２グループにおいては、２０％が再発し、１８％が結腸癌に関連して死亡した。
【００２０】
本明細書中でさらに開示されるように、高レベルのＡｐａｆ１はより長い生存に関連し、低レベルのＡｐａｆ１発現を有する患者において６２人中２８人（４５％）しか疾患を有さなかったが、結腸癌患者の３８人中３３人（８７％）が疾患を有さないままであった。対照的に、低レベルのＡｐａｆ１を有する患者のうちの４３％が再発し、そして３５％が結腸癌によって死亡した。一方、１４％のみが、高レベルのＡｐａｆ１同齢集団において癌再発を有するかまたは死亡した。低レベルのＢｃｌ−２もまた、乏しい全体としての生存と関連した。高レベルのＢｃｌ−２グループにおいて死亡した患者においては２４％（７６人中１８人）が結腸癌によって死亡したのに対し、このタンパク質の低い発現を有する１８人の患者のうちの１１人（６１％）が結腸癌によって死亡した。同様に、腫瘍が低レベルのＡｐａｆ１染色を含む患者は、Ｂｃｌ−２を過剰発現した患者と比較してより悪い全生存を有した（図１Ｎ）。多変量解析は、高レベルのＡｐａｆ１およびＢｃｌ−２発現が、７５％（ｐ＝０．００４）および８２％（ｐ＝０．００００６）の差をつけた、結腸癌による死の減少に関連することを示した。従って、結腸癌を有する患者由来のサンプル中の、減少されたレベルのＡｐａｆ１またはＢｃｌ−２は、腫瘍転位の増加された発生率および減少された生存数に確実に関連する。
【００２１】
低レベルのｃＩＡＰ２および高レベルのＡｐａｆ１の組み合わせが、非常に都合よい結果を有する初期段階の結腸癌患者のサブグループを同定したという観測がまた、本明細書中で開示される。分析された腫瘍のうちの約４分の１（２５／９４（２７％））が、低レベルのｃＩＡＰ２および高レベルのＡｐａｆ１両方を含んだ。これらの２５人の患者のうち、２５人全てが、術後、調査の終わりにおいて（５年間のメジアン追跡）生存したままでありかつ疾患を有さなかった。従って、他の分類の患者についてそれぞれ５０％および６４％のみであったのに比べ、このグループの患者についての５年間のメジアンが疾患を有さず全体として生存している比率は、１００％であった。従って、結腸癌を有する患者由来のサンプル中の増加されたレベルのｃＩＡＰ２および減少されたレベルのＡｐａｆ１は、腫瘍転位の増加された機会および減少された生存に関連する。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、用語「レベル」は、ＴＵＣＡＮのようなバイオマーカー分子の量、集積量または比率をいう。レベルは、例えば、遺伝子によってコードされるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の量もしくは合成比、遺伝子によってコードされる所定のアミノ酸配列に対応するポリペプチドの量もしくは合成比、または細胞中で集積された分子の生物化学形態の量もしくは合成比によって表され得、例えば、ポリペプチド、核酸もしくは低分子の特定の合成後改変の量を含む。この用語は、サンプル中の分子の絶対量または分子の相対量をいうために使用され得るこれらの量としては、定常状態または非定常状態条件下で決定された量を含む。分子の発現レベルは、サンプル中のコントロール分子と比較して決定され得る。
【００２３】
ＴＵＣＡＮ  ｍＲＡＮまたはポリペプチドに関して使用される場合、レベルという用語は、配列番号１に示される核酸配列もしくは配列番号２に示されるＴＵＣＡＮポリペプチド、または実質的に同一であるヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列の合成の、程度、量または比率をいう。ＴＵＣＡＮの核酸配列およびアミノ酸配列もまた、ＰＣＴ公開ＷＯ０１／１６１７０に記載され、これは、本明細書中に参考として援用される。ｃＩＡＰ２  ｍＲＮＡまたはポリペプチド発現に関して使用される場合、レベルという用語は、配列番号５に示される核酸配列もしくは配列番号６に示されるＣＩＡＰ２ポリペプチド、または実質的に同一のヌクレオチドもしくはアミノ酸配列の合成の、程度、量、または比率のことをいう。β−カテニン  ｍＲＮＡまたはポリペプチドに関して使用される場合、レベルという用語は、配列番号７に示される核酸配列もしくは配列番号８に示されるβ−カテニンポリペプチド、または実質的に同一であるヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列の合成の、程度、量または比率をいう。Ａｐａｆ１  ｍＲＮＡまたはポリペプチドに関して使用される場合、レベルという用語は、配列番号９に示される核酸配列もしくは配列番号１０に示されるＡｐａｆ１ポリペプチド、または実質的に同一であるヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列の合成の、程度、量または比率をいう。Ｂｃｌ−２  ｍＲＮＡまたはポリペプチドに関して使用される場合、レベルという用語は、配列番号１１に示される核酸配列もしくは配列番号１２に示されるＢｃｌ−２ポリペプチド、または実質的に同一であるヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列の合成の、程度、量または比率をいう。Ｓｍａｃ  ｍＲＮＡまたはポリペプチドに関して使用される場合、レベルという用語は、配列番号１３に示される核酸配列もしくは配列番号１４に示されるＳｍａｃポリペプチド、または実質的に同一であるヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列の合成の、程度、量または比率をいう。これらおよび癌の他のバイオマーカー（ＸＩＡＰ、ｃＩＡＰ１、サルビビン、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｂａｘ、ＢＡＧ１、変異ｐ５３、ｐ５３およびＭＩＢ−１を含む）のレベルは、遺伝子発現レベルまたはポリペプチド発現レベルであり得る。
【００２４】
参照アミノ酸として実質的に同一のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列は、参照アミノ酸配列に対して、かなりの程度の配列同一性または類似性（例えば、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または１００％の配列同一性または類似性）を含む。このような変化、ギャップ、および挿入は、天然に存在する変異であり得るかまたはポリペプチドを含むサンプルのプロセシングから生じ得る。参照ヌクレオチド配列と実質的に同一であるヌクレオチド配列は、参照ヌクレオチド配列に対して、かなりの程度の配列同一性または類似性（例えば、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または１００％の配列同一性または類似性）を含む。このような差異は、遺伝子の変異および多型のような個体間の遺伝性差異に起因し得る。ヌクレオチドとアミノ酸配列との間の差異は、Ｓｍｉｔｈ−ＷａｔｅｒｍａｎアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴホモロジー検索プログラム（Ａｌｔｓｃｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））のような入手可能なアルゴリズムおよびプログラムを使用して決定し得る。
【００２５】
分子の遺伝子発現レベルは、バイオマーカー遺伝子の合成の、量、集積または比率を意味することが意図される。この遺伝子発現レベルは、例えば、遺伝子によってコードされるｈｎＲＮＡまたはｍＲＮＡの量または転写比によって表され得る。遺伝子発現レベルは、同様に、例えば、定常状態または非定常状態条件下で、測定された集積量もしくは相対量または合成比をいう。
【００２６】
ポリペプチド発現レベルは、バイオマーカーポリペプチドの合成の、量、集積または比率を意味することが意図される。このポリペプチド発現レベルは、例えば、ポリペプチド、ポリペプチドの前駆体形態またはポリペプチドの翻訳後修飾形態によってあらわされ得る。合成後修飾から生じたポリペプチドの種々の生物化学形態は、サンプル中に含まれる細胞中に存在し得る。このような修飾としては、翻訳後修飾、タンパク質分解、高分子複合体の形成が上げられる。ポリペプチドの翻訳後修飾としては、例えば、リン酸化、脂質化、プレニル化、硫酸化、ヒドロキシル化、アセチル化、炭水化物の添加、補欠分子族または補因子の添加、ジスルフィド結合の形成などが挙げられる。さらに、ポリペプチドのフラグメントは、ポリペプチド発現レベルの定義内に含まれることが理解される。フラグメントとしては、例えば、アミノ末端、カルボキシ末端、または全長ポリペプチドの内部欠失が挙げられ得る。このような修飾を伴うかまたは伴わない集積または合成比は、この用語の意味に含まれる。同様に、ポリペプチド発現レベルはまた、例えば、定常状態または非定常状態条件下で測定されたポリペプチドの絶対量または合成比をいう。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、用語「参照レベル」は、患者の新生細胞含有サンプル中のバイオマーカーの発現の試験レベルを評価するために使用されるバイオマーカーのコントロールの発現レベルをいう。例えば、患者の新生細胞中のＴＵＣＡＮのレベルが、ＴＵＣＡＮの参照レベルよりも高い場合、この細胞は、ＴＵＣＡＮの高レベルの発現または過剰産生を有していると考えられる。逆に、患者の新生細胞中のＴＵＣＡＮレベルが参照レベルよりも低い場合、この細胞は、ＴＵＣＡＮの低レベルの発現または生産不足を有していると考えられる。
【００２８】
参照レベルを複数の方法によって決定し得る。ただし、得られた参照レベルは生物マーカーのレベルを正確に提供し、そのレベルよりも高くに第１のグループの患者が存在し、この第１のグループの患者は、参照レベル未満の生物マーカーレベルを有する第２のグループの患者の生存率とは異なる生存確率を有する。この参照レベルは、例えば、試験される新生物細胞の組織と同じ組織由来の非腫瘍性癌細胞における生物マーカーの発現レベルを測定することによって、決定され得る。参照レベルはまた、インビトロ培養細胞の生物マーカーのレベルでもあり得、これらは、腫瘍細胞を刺激するように操作され得るか、または参照レベルを正確に決定する発現レベルを生じる任意の他の様式で、操作され得る。
【００２９】
参照レベルはまた、同じ癌を患う患者集団において、生物マーカー（例えば、ＴＵＣＡＮ）のレベルの比較によっても決定され得る。このことは、例えば、患者の全体のコホートが図で示されるヒストグラム分析によって達成され得、ここで、第１軸は生物マーカーのレベルを示し、そして第２軸は、新生物細胞が所定のレベルで生物マーカーを発現しているコホートにおける患者数を示す。患者の２つ以上の別個の群は、同じレベルまたは類似のレベルの生物マーカーを有するコホートの集団の部分集合の同定によって決定され得る。次いで、参照レベルの決定が、これらの別個の群を最良に区別するレベルに基づいて、なされ得る。参照レベルはまた、２つ以上のマーカーのレベルを示し得る。２つ以上のマーカーは、例えば、各々の生物マーカーのレベルに対する値の比率によって示され得る。
【００３０】
参照レベルは、あらゆる患者に等しく適用可能な１つの数であり得るか、または参照レベルは患者の特定の部分集団に従って変動し得る。例えば、高齢の男性は、同じ癌に対して、若年の男性とは異なる参照レベルを有し得、そして女性は同じ癌に対して男性とは異なる参照レベルを有し得る。さらに、参照レベルは、各々の患者それぞれに対して決定される、いくつかのレベルであり得る。例えば、この参照レベルは、同一患者中の非腫瘍細胞における生物マーカーレベルに対する、患者の新生物細胞中の生物マーカーの特定の比率であり得る。従って、各患者に対する参照レベルは、１つ以上の生物マーカー（例えば、ＴＵＣＡＮ）の参照比率によって規定され得、ここで、参照比率は、本明細書中に記載される参照レベルを決定するための任意の方法によって、決定され得る。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、用語「新生物細胞」とは、形質転換されて、その結果、正常な恒常性の増殖制御を有さずに増殖する、任意の細胞をいう。このような細胞は、増殖細胞の良性または悪性の病変を結果として生じ得る。このような病変は、生体の種々の組織および器官に局在され得る。以下の表１は、新生物細胞が誘導され得る例示的な型の癌の一覧表を提供する。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、用語「癌」とは、異常な細胞の制御されない増殖によって特徴付けられる疾患のクラスを意味することが意図され、悪性腫瘍として特徴付けれるにせよ、良性腫瘍として特徴付けれるにせよ、軟組織性腫瘍として特徴付けれるにせよ、固形物性腫瘍として特徴付けれるにせよ、公知の全ての癌および新生物状態の全てを含む。特定の癌としては、消化性癌および胃腸癌（例えば、肛門癌、胆管癌、胃腸類癌腫、結腸癌、食道癌、胆嚢癌、肝臓癌、膵臓癌、直腸癌、虫垂癌、小腸癌、および胃癌）；乳癌；卵巣癌；肺癌；腎臓癌；ＣＮＳ癌；白血病ならびに黒色腫が挙げられる。例示によって、公知の癌の一覧表は以下の表１に提示される。
【００３３】
【表１−１】
2005501225.tif 000002
【００３４】
【表１−２】
2005501225.tif 000003
【００３５】
【表１−３】
2005501225.tif 000004
【００３６】
【表１−４】
2005501225.tif 000005
【００３７】
【表１−５】
2005501225.tif 000006
。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、用語「特異的に反応性な」とは、抗体に関して使用される場合、指示される標的ポリペプチドに対する、抗体の識別力ある結合をいう。このような識別性であるべき結合のため、抗体は実質的に他のポリペプチドと交差反応しない。特異的な反応性は、結合特異性、結合親和力（アフィニティー）および結合親和力（アビディティ−）のような結合特性を含み得る。例えば、抗体は、約１０−４Ｍ以上、１０−６Ｍ以上、１０−７Ｍ以上、１０−８Ｍ以上、１０−９Ｍ以上、または１０−１０Ｍ以上の結合親和性（Ｋｄ）で、標的ポリペプチドを結合し得る。抗体の結合を検出または測定するためのいくつかの方法は、当該分野で公知であり、そして本明細書中において開示される。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、用語「サンプル」とは、任意の生物学的流体、細胞、組織、器官またはそれらの一部を意味することが意図され、これは、新生物細胞（例えば、結腸、直腸、乳房、卵巣、前立腺、腎臓、肺、血液、脳、または新生物細胞を含むかもしくは含むことが推測される他の器官もしくは組織に由来の細胞）を包含するか、または潜在的に包含する。この用語は、個体中に存在するサンプル、および個体から獲得されるかまたは個体に由来するサンプルを包含する。例えば、サンプルは生検によって獲得された試料の組織学的切片であり得るか、または組織培養中に置かれるかもしくは組織培養に適合される細胞であり得る。サンプルはさらに、亜細胞画分もしくは亜細胞抽出物であり得るか、または粗製もしくは実質的に純粋な核酸分子もしくはタンパク質調製物であり得る。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、用語「疾患に罹患していない生存」とは、腫瘍の再生および／または蔓延のないこと、および診断後の患者の運命（例えば、腫瘍の再発なしに生存している患者）をいう。語句「全体的な生存率」とは、その患者が腫瘍の再発を有するかどうかにかかわらず、診断後の患者の運命をいう。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、用語「再発危険性」とは、癌の診断後の患者における、腫瘍の再発または蔓延の可能性をいい、ここで、この可能性は本発明のプロセスに従って決定される。
【００４２】
腫瘍再発は、癌の診断後、新生物細胞または癌性細胞のさらなる増殖をいう。特に、再発とは、癌性組織においてさらなる癌性細胞の増殖が生じる場合に生じ得る。腫瘍の蔓延とは、例えば腫瘍転移の間の、癌細胞の局所的な組織および器官、または離れた組織および器官への播種をいう。腫瘍の再発、特に転移は、癌に対する外科手術処置を受けた患者の中での死亡率の重要な原因である。従って、腫瘍の再発または蔓延は、疾患のない患者の生存率および患者の全体的な生存率と相関関係付けられる。
【００４３】
本発明は、癌患者に対して、生存率を予測するため、そして処置の効力をモニターするための生物マーカーとしてのＴＵＣＡＮの使用に関する。ＴＵＣＡＮは、アポトーシスを制御する役割を有する、ＣＡＲＤドメイン含有タンパク質である。アポトーシスは、本質的に全ての自己再生する組織において、細胞の形成と細胞の更新との間で恒常性が維持されることを確実とする、生理学的プロセスである。組織の恒常性の維持に加えて、アポトーシスはまた、種々の外部からの刺激（増殖因子除去、カルシウムレベルの変化、フリーラジカル、細胞傷害性リンホカイン、いくつかのウイスルによる感染、照射および大部分の化学療法剤が挙げられる）に応答して生じる。従って、アポトーシスは、例えば、代謝経路において生じる制御機構と同様な制御機構に供されるようである、誘導性の事象である。このことに関して、アポトーシスの非制御はまた、例えば、対応する正常細胞よりも長時間生存するいくつかの型の癌細胞において、そして成熟前にニューロンが死滅する神経変性疾患において、生じ得、そして観察される。ウイルス感染において、アポトーシスの誘導は、疾患のプロセスの病理生理学において顕著に現れ得る。何故なら、ウイルス感染の免疫ベースの根絶は、アポトーシスを生じる免疫細胞の攻撃による、ウイルス産生宿主細胞の排除に依存するからである。
【００４４】
アポトーシスの原理的なエフェクターは、カスパーゼ（Ｃａｓｐａｓｅ）（システインアスパルチルプロテアーゼ（Ｃｙｓｔｅｉｎｅ  Ａｓｐａｒｔｙｌ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ）についての略語を示す）として既知の細胞内プロテアーゼのファミリーである。カスパーゼは、本質的に全ての動物細胞において不活性なチモーゲンとして見出される。アポトーシスの間、これらカスパーゼは、特定のアスパラギン酸残基でタンパク質分解性のプロセッシングによって活性化され、その結果、代表的に２つの大サブユニットおよび２つの少サブユニットを含むヘテロテトラマーからなる活性なプロテアーゼに組み立てられるサブユニットの生成を生じる（ＴｈｏｒｎｂｅｒｒｙおよびＬａｚｅｂｎｉｋ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：１３１２〜１３１６（１９９８））。アポトーシス現象は、細胞内でのカスパーゼの活性化、その結果生じた特定の基質タンパク質のタンパク質分解性の切断によって、直接的または間接的に生じる。
【００４５】
ＴＵＣＡＮは、少なくとも２つのタンパク質ドメイン（これらのうち１つはＣＡＲＤ（カスパーゼ関連随補充ドメイン）である）を含む。ＣＡＲＤは、いくつかのカスパーゼのＮ末端プロドメインおよびＣＡＲＤ含有プロカスパーゼの活性を活性化するかまたは抑制するかのいずれかのアポトーシス調節タンパク質において見出されたタンパク質相互作用モチーフである。哺乳動物において、８つのＣＡＲＤ保有カスパーゼ（プロカスパーゼ１、プロカスパーゼ２、プロカスパーゼ４、プロカスパーゼ５、プロカスパーゼ９、プロカスパーゼ１１、プロカスパーゼ１２およびプロカスパーゼ１３が挙げられる）が同定された。現在のところ、複数の非カスパーゼＣＡＲＤ含有タンパク質（Ａｐａｆｌ、Ｎｏｄｌ（ＣＡＲＤ４）、ＮＡＣ（ＤＥＰＣＡＰ）、Ｒａｉｄｄ（ＣＲＡＤＤ）、Ｃａｒｄｉａｋ（Ｒｉｐ２，ＲＩＣＫ）、ＢｃｌｌＯ（ＣＩＰＥＲ）、ＡＲＣ（Ｎｏｐ３０）、Ａｓｃ、ＣＡＲＤ９、ＣＡＲＤ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＡＲＤ１４、ｃＩＡＰ１、ｃＩＡＰ２およびＣＬＡＮが挙げられる）が、発見され、そして機能的に特徴付けられた。多数のこれらのタンパク質のＣＡＲＤドメインは、プロテアーゼ活性を促進するかまたは阻害するかのいずれかの、特定のＣＡＲＤ保有カスパーゼのＣＡＲＤ含有プロドメインに結合され得る。
【００４６】
ＴＵＣＡＮのＣＡＲＤドメインは、それぞれのＣＡＲＤおよびプロカスパーゼ９に選択的に結合する（実施例ＩＸを参照のこと）。さらに、プロカスパーゼ９へのＴＵＣＡＮの結合は、Ａｐａｆｌと相互作用するためのプロカスパーゼ９の能力を妨害することが示された。プロカスパーゼ９とＡｐａｆｌとの間の相互作用を阻害することによって、ＴＵＣＡＮは、ミトコンドリア経路／チトクロムｃ経路におけるアポトーシスシグナル伝達を阻害する。この観察と一貫して、ＴＵＣＡＮの過剰発現が、カスパーゼ活性化のためのミトコンドリア経路を活性化することが公知である刺激（Ｂａｘ、ＤＮＡ損傷薬物およびスタウロスポリンが挙げられる）によって誘発されたアポトーシスを減少させるという知見である。対照的に、代替の経路（ＧｒａＢおよびＦａｓ（ＴＮＦファミリーデスレセプター）が挙げられる）を介して誘発されるアポトーシスは、ＴＵＣＡＮによって阻害されない。さらに、安定なトランスフェクションまたは一過性のトランスフェクションによる細胞内のＴＵＣＡＮの過剰発現は、Ａｐａｆｌ／カスパーゼ９依存性刺激（Ｂａｘ、ＶＰ１６およびスタウロスポリンが挙げられる）によって誘発されるが、Ａｐａｆｌ／カスパーゼ９非依存性刺激（ＦａｓおよびグランザイムＢ）によっては誘発されないアポトーシスおよびカスパーゼ活性化を阻害する。ＴＵＣＡＮのこれらの細胞機能性は、ミトコンドリアのシグナル伝達経路誘発アポトーシスを阻害するのに重要な役割を果たすことを示す。
【００４７】
ＴＵＣＡＮはまた、ＮＡＣタンパク質（Ａｐａｆｌアポトソーム（ａｐｏｐｔｏｓｏｍｅ）のＣＡＲＤ保有調節因子）のセグメントと類似するアミノ酸を共有するＮ末端ドメインを含む（Ｃｈｕら  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：９２３９−９２４５（２００１）５およびＨｌａｉｎｇら  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：９２３０−９２３８（２００１））。このＴＵＣＡＮのＮ末端ドメインは、いくつかの候補リン酸化部位（アミノ酸７２、２８６、３１３および４１６でのＰＫＣ（Ｓ／Ｔ−ｘ−Ｒ／Ｋ）部位、２８９、３７６、３９８、４１４および４１６でのカゼインキナーゼＩＩ（Ｓ／Ｔ−ｘ−Ｄ／Ｅ）部位および１８７ならびに２８９でのＭＡＰキナーゼ／ＣＤＫ（Ｓ／Ｔ−Ｐ）部位が挙げられる）を含む。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ実験におけるそれらの異なる移動度によって同定されたＴＵＣＡＮの観察された複数の形態（例えば、図６Ｂを参照のこと）は、ＴＵＣＡＮの異なったリン酸化形態であり得る。ＴＵＣＡＮはまた、残基２４３〜２４６での候補カスパーゼ切断部位（ＤＥＥＤ）を含む。
【００４８】
これらの分子および他の分子の特徴付けならびにＴＵＣＡＮの細胞機能性は、例えば、Ｐａｔｈａｎら  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３２２２０−３２２２９（２００１）（その全体が本明細書中に参考として援用される）に記載される。
【００４９】
本明細書中の実施例ＶＩＩに開示されるように、ＴＵＣＡＮの相対的に高いレベルは、いくつかのヒト癌細胞株において見出される。さらに、実施例ＩＩおよびＶＩＩＩに開示されるように、正常な結腸の粘膜と比較して、ＴＵＣＡＮの免疫染色は、悪性の形質転換に関連する、この抗アポトーシスタンパク質の異常な過剰発現を示す初期段階の結腸癌の約３分の２において病理学的に増強した。プロカスパーゼ９のノックアウトマウス由来の細胞の研究は、ｐ５３依存経路における腫瘍サプレッサーとしてのプロカスパーゼ９機能を示した（Ｓｏｅｎｇａｓら  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４：１５６−１５９（１９９９））。プロカスパーゼ９の調節におけるＴＵＣＡＮの役割を考慮して、ＴＵＣＡＮの過剰発現は、プロカスパーゼ９の損失と機能的に同等であり得、ＴＵＣＡＮの増強したレベルが、腫瘍の病原性または進行を促進し得ることを示す。本明細書中の実施例ＩＶおよびＶＩＩＩに示されるように、結腸癌患者（患者の腫瘍は、高いレベルのＴＵＣＡＮを含む）は、記録保管用標本を使用する、遡及的な分析に起因して、これらの疾患がもとで死亡する傾向が実際に強い。
【００５０】
従って、本発明は、ＴＵＣＡＮを使用して癌患者に対する生存の予後を決定するための方法を提供する。この発明は、（ａ）癌患者由来の新生物細胞含有サンプル中のＴＵＣＡＮのレベルを測定する工程、および（ｂ）ＴＵＣＡＮの参照レベルとサンプル中のＴＵＣＡＮレベルとを比較する工程（ここで、サンプル中の低いレベルのＴＵＣＡＮが、患者の増大した生存率と相関する）を包含する。
【００５１】
ＴＵＣＡＮの決定された基本レベルまたは参照レベルを上回る、新生物細胞含有サンプル中のＴＵＣＡＮレベルは、腫瘍の再発または腫瘍の広がりにおける有意な因子であり得る。腫瘍細胞を用いて決定した参照レベルが上回る場合、ＴＵＣＡＮのレベルは、高いか、または過剰産生と特徴付けられる。高いＴＵＣＡＮかまたは過剰産生したＴＵＣＡＮは、腫瘍の再発または腫瘍の広がりの増大した危険性を示され得る。低いＴＵＣＡＮまたは減産したＴＵＣＡＮは、腫瘍の再発または腫瘍の広がりの減少した危険性を示され得る。
【００５２】
癌患者の生存率を予知するための本発明の方法は、患者からサンプルを得る工程、および１つ以上のバイオマーカー（例えば、ＴＵＣＡＮ）のレベルを測定する工程を包含する。バイオマーカー（例えば、ＴＵＣＡＮ）のレベルを使用して、疾患を有さないかまたは癌患者の全体の生存率に対する予後を本明細書中で提供される相関に基づいて決定する。腫瘍の再発または広がりの可能性は、腫瘍細胞中のＴＵＣＡＮのレベルと相関するので、このような予後は、可能である。例えば、実施例ＶＩおよびＶＩＩＩに示されるように、ＴＵＣＡＮ発現レベルが低い場合、癌の再発の可能性は低いことが見出された。患者由来の新生物細胞含有サンプル中のＴＵＣＡＮのレベルは、疾患状態の評価における単独の因子として使用され得るか、または他の予測的な方法に加えて使用され得る。
【００５３】
ＴＵＣＡＮを使用して、生存を予知し得るか、または様々な型の癌を罹患する患者に対する処置の過程の有効性をモニターし得る。実施例ＶＩＩに記載されるように、ＴＵＣＡＮは、複数の異なる癌細胞型（白血病、黒色腫ならびに胸部癌、卵巣癌、肺癌、ＣＮＡ癌、前立腺癌および腎臓癌が挙げられる）に存在する。上記されるようにまた、ＴＵＣＡＮの細胞機能性は、ミトコンドリアシグナル伝達経路誘発アポトーシスの抑制である。ミトコンドリアシグナル伝達経路誘発アポトーシスは、任意の細胞型において生じ得、そして任意の細胞型において、調節不全かまたは抑制の状態になり得るアポトーシス機構であり、正常なホメオスタシスの増殖制御を伴わずに、増殖するような細胞の形質転換を生じる。従って、ＴＵＣＡＮのレベルは、腫瘍の再発または任意の型の細胞を有する患者の生存率と相関され得る。本明細書中で提供されるガイダンスおよび他の周知の方法を使用して、当業者は、特定の腫瘍細胞型おけるＴＵＣＡＮのレベルが、患者の生存率と相関するか否かを決定し得る。決定されたＴＵＣＡＮの参照レベルと癌患者の生存率との間の相関を有して、当業者は、癌患者の生存率についての予後を決定するための方法、および本明細書中に記載される癌を有する患者を処置する過程の有効性をモニターするための方法を実行し得る。
【００５４】
本発明の方法において、サンプルは、例えば、生検手順を使用して得られた細胞または組織であり得るか、あるいは細胞を含む流体サンプル（例えば、血液、血清、精液、尿または便）であり得る。当業者は、癌の型、そして必要である場合、生検サンプルを得るための適切な方法に依存する、適切なサンプルを決定し得る。可能である場合、最少の侵襲性回収手順を使用して、患者からサンプルを得ることが所得され得る。例えば、患者からの流体サンプル（例えば、血液、唾液、血清、精液、尿または便）を得ることは、組織サンプルを回収することよりも侵襲性でない。
【００５５】
１つの実施形態において、ＴＵＣＡＮのレベルは、選択的結合剤（例えば、ＴＵＣＡＮポリペプチドと特異的に反応する抗体）を使用して、ＴＵＣＡＮの量を測定することによって決定され得る。他の選択的結合剤としては、ＴＵＣＡＮポリペプチドに結合するポリペプチド例えば、ＴＵＣＡＮ  ＣＡＲＤドメイン（アミノ酸３４５〜４３１（配列番号３）を含むＴＵＣＡＮポリペプチド、およびカスパーゼ９ポリペプチド（このアミノ酸配列（配列番号４）は、Ｐｒｏｓｉｔｅデータベース中のＰ５５２１１として参照される）、またはＴＵＣＡＮポリペプチドに結合するその改変体が挙げられる。プロカスパーゼおよびそれ自体へのＴＵＣＡＮの選択的結合は、実施例ＩＸに記載される。
【００５６】
親和性結合アッセイの必須の全ての様式は、サンプル中のＴＵＣＡＮまたは別のバイオマーカーポリペプチド（例えば、ｃＩＡＰ２、Ａｐａｆ１、Ｓｍａｃ、β−カテニン、Ｂｃ１−２またはｐ５３）のレベルの決定における使用のために適用可能である。このような方法は、迅速であり、有効性であり、そして感受性である。さらに、親和性結合方法は単純であり、そして多様な臨床的な設定および多様な特定の必要性に適するような状態下で実行されるように改変され得る。公知であり、そして本発明の方法に使用され得る親和性結合アッセイとしては、可溶性相形式および固相形式の両方が挙げられる。可溶性相親和性結合アッセイ（ｓｏｌｕｂｌｅ  ｐｈａｓｅ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙ）の特定の例は、バイオマーカーの選択的抗体または他の結合剤を使用する免疫沈降である。固相型式は、迅速であり、そして感受性または正確さを失うことなく同時に複数の異なるサンプルでより容易に実行され得るので、本発明の方法にとって有利である。さらに、固相親和性結合アッセイは、高スループットスクリーニングおよび自動化に適切である。
【００５７】
固相親和性結合アッセイの特定の例としては、免疫組織化学的結合アッセイ、免疫親和性結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡおよび放射免疫アッセイ（ＲＩＡ））が挙げられる。他の固相親和性結合アッセイは、当業者に公知であり、そして本発明の方法に適用可能である。親和性結合アッセイは、一般に、目的の分析物またはリガンドに対して選択的な抗体結合分子を用いる使用のためにフォーマットされるが、特に任意の結合剤は、選択的結合抗体と代替的に置換され得る。このような結合剤としては、例えば、高分子（例えば、ポリペプチド、ペプチド、核酸分子、脂質および糖）ならびに低分子化合物が挙げられる。特定の分析物またはリガンドに選択的に結合するこのような分子を同定するための方法は、当該分野で公知であり、そしてこれらとしては、例えば、表面提示ライブラリーおよびコンビナトリアルライブラリーが挙げられる。従って、親和性結合アッセイにおいて使用されるような抗体以外の分子について、必要とされる全ての分子は、バイオマーカーに対する選択的結合活性を示すような結合剤である。
【００５８】
親和性結合アッセイ（例えば、免疫親和性結合アッセイ）の種々の様式としては、例えば、免疫組織学化学的方法、固相ＥＬＩＳＡおよびＲＩＡならびにそれらの改変が挙げられる。このようなそれらの改変としては、例えば、捕獲アッセイおよびサンドイッチアッセイ、ならびに競合アッセイ形式との組み合わせのいずれかの様式の使用が挙げられる。使用のための免疫親和性結合アッセイのこれらの様式または形式の選択は、使用者の意図に依存する。このような方法は、一般的な実験室マニュアル（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９））の記載に、見出され得る。
【００５９】
本発明の方法において有用な抗体としては、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ならびにこのような抗体の抗原結合フラグメントが挙げられる。ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を調製する方法は、当業者に周知であり、そして実施例ＩおよびＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）に記載される。
【００６０】
本発明の方法に有用な抗体としてはまた、天然に存在する抗体ならびに天然に存在しない抗体（例えば、一本鎖抗体、キメラ抗体、二機能性抗体およびヒト化抗体、ならびにそれらの抗原結合フラグメントを含む）が挙げられる。このような天然に存在しない抗体は、固相ペプチド合成を使用して構築され得るか、組換え的に産生され得るか、または、例えば、Ｈｕｓｅら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１（１９８９））によって記載されるような可変性の重鎖および可変性の軽鎖からなるコンビナトリアルなライブラリーをスクにーニングすることによって得られることができる。これらの方法、ならびに例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、ＣＤＲ移植抗体、一本鎖抗体および二機能性抗体を作製する他の方法は、当業者に周知である（ＷｉｎｔｅｒおよびＨａｒｒｉｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １４：２４３−２４６（１９９３）；Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６（１９８９）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，前出，１９８８）；Ｈｉｌｙａｒｄら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９９２）；Ｂｏｒｒａｂｅｃｋ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，第２編（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５））。
【００６１】
親和性結合を利用する形式は、種々の検出標識および分析されたサンプル中のバイオマーカーの量を定量化するための当該分野で公知のシステムとの組み合わせにおいて使用され得る。検出システムとしては、直接的手段および間接的手段の両方によって結合されたバイオマーカーの検出が挙げられる。直接的検出方法としては、バイオマーカー特異的反応性抗体または結合剤の標識化が挙げられる。間接的検出システムとしては、例えば、標識された二次抗体および結合剤の使用が挙げられる。
【００６２】
二次抗体、標識および検出システムは、当該分野で周知であり、そして商業的に得られ得るか、または当該分野で周知の技術によって得ることができる。バイオマーカー選択的結合剤とともに使用される検出可能な標識およびシステムは、バイオマーカーへの試薬の結合を損なうべきではない。さらに、複数の抗体および標識システムは、所望である場合、結合アッセイの感受性を増強するような結合されたバイオマーカー特異的反応性抗体を検出するために使用され得る。
【００６３】
検出可能な標識は、分析方法によって定量され得るか測定され得る必須の任意の標識であり得る。このような標識としては、例えば、酵素、放射性同位元素、蛍光色素ならびに化学発光化合物および生物発光化合物が挙げられる。酵素標識の特定の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼおよびルシフェラーゼが挙げられる。
【００６４】
西洋ワサビペルオキシダーゼの検出システムは、例えば、色素生産基質のテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）とともに使用され得、過酸化水素の存在において、４５０ｎｍでの吸光度を測定することによって検出可能である可溶性産物を得る。アルカリ性ホスファターゼ検出システムは、色素生産基質のｐ−ニトロフェニルリン酸とともに使用さえ得、例えば、４０５ｎｍでの吸光度を測定することによって検出可能である可溶性産物を得る。同様に、β−ガラクトシダーゼの検出システムは、色素生産基質のｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）とともに使用され得、４１０ｎｍでの吸光度を測定することによって検出可能である可溶性産物を得るか、またはウレアーゼの検出システムは、基質（例えば、尿素−ブロモクレゾールパープル（Ｓｉｇｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））とともに使用され得る。ルシフェリンは、ＡＴＰ依存性酸化の後に発光するルシフェラーゼに対する基質化合物である。
【００６５】
蛍光色素検出標識は、光または別のエネルギー供給原による励起の後、紫外線の光または可視波長の光の放出を介して検出可能に表される。ＤＡＰＩ、フルオレセイン、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８、Ｒ−フィコシアニン、Ｂ−フィコエリトリン、Ｒ−フィコエリトリン、ローダミン、テキサスレッドおよびリーサミン（ｌｉｓｓａｍｉｎｅ）は、本発明の親和性結合形式において使用され得る蛍光色素検出標識の特定の例である。特に有用な蛍光色素は、フルオレセインまたはローダミンである。
【００６６】
化学発光および生物発光の検出レベルは、感受性（バイオマーカーの非放射活性検出）にとって都合がよく、そして様々な供給源（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ））から市販され得る。
【００６７】
あるいは、放射性同位元素は、本発明の方法において検出可能な標識として使用され得る。ヨウ素−１２５は、検出可能な標識として有用な放射性同位元素の特定の例である。
【００６８】
検出可能な標識からのシグナルは、以下を使用して分析され得る：例えば、色素生産基質からの色を検出するための分光光度計；特定波長の光の存在における蛍光発光を検出するための蛍光光度計；または放射線を検出するための放射線計数管（例えば、ヨウ素−１２５の検出のためのγ計数管）。酵素結合二次抗体の検出について、例えば、結合剤の量の定量的分析は、製造者の指示書に従って、分光光度計（例えば、ＥＭＡＸ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）を使用してなされ得る。所望である場合、本発明のアッセイは、自動化され得るか、または機械的に実施され、そして複数のサンプルからのシグナルは、同時に検出され得る。
【００６９】
本発明の予後形式は、米国特許第４，３７６，１１０号および同第４，７７８，７５１号に記載されるように、前、後、または同時であり得る。本明細書に記載される種々のアッセイ形式のための分離工程（結合していない２次抗体の除去を含む）は、当該分野で公知の方法（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前出）によって実行され得る。例えば、適切な緩衝液を用いる洗浄は、濾過、吸入、減圧または磁気分離（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）、および遠心分離に続き得る。
【００７０】
バイオマーカーについて選択的な結合剤はまた、バイオマーカーに標的化される（新生物細胞を表す）画像化方法において利用され得る。これらの画像化技術は、標準的な処置（例えば、結腸のような胃腸管系器官の外科的切除、および放射線治療が挙げられる）に続く、原発部位における残りの新生物細胞の同定において有用性を有する。さらに、新生物細胞を検出する画像化技術は、転移の第二部位の検出において有用性を有する。バイオマーカー特異的結合剤は、（例えば、１１１インジウム）を用いて放射標識され得、そしてＫａｈｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｕｒｏｌｏｇｙ  １５２：１９５２−１９５５（１９９４）によって記載されるように、静脈内に注入され得る。バイオマーカーについて選択的な結合剤は、例えば、ＴＵＣＡＮまたは別のバイオマーカー（例えば、ｃＩＡＰ２、Ａｐａｆ１、Ｓｍａｃ、β−カテニン、Ｂｃｌ−２またはｐ５３）と特異的に反応するモノクローナル抗体であり得る。画像化は、例えば、Ｋａｈｎら（前出）によって記載されるような、放射免疫シンチグラフィーによって達成され得る。
【００７１】
ＴＵＣＡＮまたは別のバイオマーカー（例えば、ｃＩＡＰ２、Ａｐａｆ１、Ｓｍａｃ、β−カテニン、Ｂｃｌ−２またはｐ５３）のレベルはまた、核酸プローブのようなバイオマーカーのための選択的結合剤を用いて、バイオマーカーのｍＲＮＡまたはＤＮＡの量を測定することによって決定され得る。ｍＲＮＡレベルを検出するために使用される方法としては、バイオマーカーをコードするｍＲＮＡのハイブリダイゼーションまたは増幅の検出が挙げられる。この検出は、ｔｈｅ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９９）；米国特許第５，８８２，８６４号などにおいて例示されるような、当業者に公知の方法のうちの１つを用いて、インビトロまたはインサイチュのいずれかでのｍＲＮＡの分析によって実行され得る。検出されるＴＵＣＡＮ  ｍＲＮＡまたは他のバイオマーカーのｍＲＮＡは、ＴＵＣＡＮ遺伝子もしくはそのフラグメント、あるいはｃＩＡＰ２遺伝子、Ｂｃｌ−２遺伝子、ｐ５３遺伝子、ｂ−カテニン遺伝子、ｓｕｒｖｉｖｉｎ遺伝子もしくはＡｐａｆ１遺伝子、またはそれらのフラグメントの任意のＲＮＡ転写物である。
【００７２】
相補的プローブを用いる特異的または選択的なハイブリダイゼーションによって核酸分子を検出するための、当該分野で周知の方法が多数存在する。簡単に言うと、ハイブリダイゼーションによる検出のために、検出可能なレベルを有する、ＴＵＣＡＮ遺伝子に相補的なＴＵＣＡＮ核酸プローブは、このプローブのＴＵＣＡＮ  ＲＮＡへのアニーリングを可能にする条件下で、癌を有する個体または癌を有することが疑われる個体から得られた新生物細胞含有サンプルに添加され得る。サンプル中のＴＵＣＡＮ  ＲＮＡを検出するための方法としては、例えば、ＲＴ−ＰＣＲの使用が挙げられ得る。条件は、溶液および固相のハイブリダイゼーション手順の両方について当該分野において周知である。さらに、ハイブリダイゼーション条件の最適化は、所望される場合、異なる温度、持続時間および異なる緩衝液条件におけるサンプルのアリコートのハイブリダイゼーションによって実行され得る。このような手順は慣用的であり、そして当業者に周知である。アニーリング後、このサンプルを洗浄し、そしてシグナルを測定し、そして適切なコントロール値または標準値と比較する。ハイブリダイゼーションシグナルの程度は、ＴＵＣＡＮのｍＲＮＡレベルに直接比例する。新生物細胞含有サンプルにおけるＴＵＣＡＮ  ｍＲＮＡのレベルは、ＴＵＣＡＮ  ｍＲＮＡに対する適切な参照レベルと比較される。他のバイオマーカー（例えば、ｃＩＡＰ２、Ａｐａｆ１、Ｓｍａｃ、β−カテニン、Ｂｃｌ−２またはｐ５３）ｍＲＮＡのレベルは、同様に決定され得、そして特定のバイオマーカーに対する適切な参照レベルと比較され得る。
【００７３】
方法の他の例としては、ＰＣＲおよび他の増幅方法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、５’ＲＡＣＥもしくは３’ＲＡＣＥ、ＲＮａｓｅ保護、ＲＮＡブロット、ドットブロットまたは他の膜ベースの技術、ディップスティック、ピン、ＥＬＩＳＡまたは固体支持体上に固定された二次元アレイ）が挙げられる。これらの方法は、定質的測定または定量的測定のいすれかを用いて実行され得、これらの全ては、当業者に周知である。
【００７４】
ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲは、単離されたＲＮＡまたは粗細胞溶解調製物を用いて使用され得る。出発材料の量を制限する場合、ＰＣＲは有益である。ＰＣＲ法のさらなる記載は、例えば、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ，Ｃ．Ｗ．およびＤｖｅｋｓｌｅｒ，Ｇ．Ｓ．、ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９５）に見出され得る。マイクロアレイのような多数サンプル形式は、単一アッセイにおいて、多数の異なるサンプルを分析することの利点を提供する。対照的に、固相ディップスティックベースの方法は、即時の結果のために、患者の流体サンプルを迅速に分析することが可能であるという利点を提供する。
【００７５】
バイオマーカー（例えば、ｃＩＡＰ２、ＴＵＣＡＮ、Ａｐａｆ１、β−カテニン、Ｂｃｌ−２またはＳｍａｃ）の発現レベルをハイブリダイゼーションによって測定するために有用な核酸プローブとしては、例えば、本明細書中に提供されるヌクレオチド配列を用いて調製されるプローブが挙げられる。全体のｃＤＮＡ配列およびそのフラグメント（ｃＩＡＰ２、ＴＵＣＡＮ、Ａｐａｆ１、β−カテニン、Ｂｃｌ−２またはＳｍａｃのヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドが挙げられ、そしてこれらは、ｃＩＡＰ２  ＲＮＡ、ＴＵＣＡＮ  ＲＮＡ、Ａｐａｆ１  ＲＮＡ、β−カテニン  ＲＮＡ、Ｂｃｌ−２  ＲＮＡまたはＳｍａｃ  ＲＮＡに特異的または選択的にハイブリダイズし得る）に対応する核酸分子は、ハイブリダイゼーション方法にとって有用である。
【００７６】
参照レベルは、患者の癌性細胞におけるバイオマーカーのレベルを評価するために使用されるバイオマーカー（例えば、ｃＩＡＰ２、ＴＵＣＡＮ、Ａｐａｆ１、Ｓｍａｃ、β−カテニンまたはＢｃｌ−２）のレベルである。特に、患者の癌性細胞におけるバイオマーカーのレベルが参照レベルよりも高い場合、これらの細胞は高レベルのバイオマーカーまたは過剰産生のバイオマーカーを有するとみなされる。逆に、患者の癌際細胞におけるバイオマーカーのレベルが参照レベルよりも低い場合、これらの細胞は、低レベルのバイオマーカーまたは過少産生のバイオマーカーを有するとみなされる。
【００７７】
高レベルのバイオマーカー遺伝子（例えば、ｃＩＡＰ２、ＴＵＣＡＮ、Ａｐａｆ１、Ｓｍａｃ、β−カテニン、Ｂｃｌ−２またはｐ５３）、あるいは過剰産生のバイオマーカー遺伝子は、決定した基礎レベルより高いのバイオマーカーのレベルと関連する。従って、癌細胞におけるバイオマーカー（例えば、ｃＩＡＰ２、ＴＵＣＡＮ、Ａｐａｆ１、Ｓｍａｃ、β−カテニン、Ｂｃｌ−２またはｐ５３）の参照レベルまたは基礎レベルは、「カットオフ」値として同定され、「カットオフ」値より上では、バイオマーカーの存在と、減少または増加した腫瘍の再発または広がりとの間に有意な相関が存在する。当業者は、いくつかの「カットオフ」値が明確でない（臨床的相関はカットオフの片側の値の範囲にわたって、なお有意である）ことを認識する；しかし、癌細胞の型に対するバイオマーカーレベルの至適なカットオフ値（例えば、変動するＨ−スコアなど）を選択することが可能である。至適なカットオフ値における改善が、参照値または基礎値を決定するために使用される統計学的方法の高度化、および参照値または基礎値を決定するために使用されるサンプルの数および供給源に依存して決定され得ることが理解される。
【００７８】
このような過剰産生は、代表的に、絶対的なバイオマーカーレベルに関して計算されないが、相対的測定を用いて決定される。これらの相対的測定値は、内部標準を用いた定量化の目的のために例示される；しかし、決定の他の標準または方法（例えば、外部標準、バイオマーカーポリペプチド測定値、バイオマーカーｍＲＮＡ測定値、タンパク質の絶対値、ｍＲＮＡレベルまたはＤＮＡレベルなどとの比較）が、使用され得ることが理解される。
【００７９】
参照レベルはまた、癌を有する患者の集団（例えば、同一段階の癌を有する患者）におけるバイオマーカーレベルの比較によって決定され得る。これは、ヒストグラム分析（試験した患者の全体集団が図解される）によって達成され得、ここで、第一の軸はバイオマーカーのレベルを示し、そして第二の軸は、腫瘍細胞が所定レベルのバイオマーカーを含む集団における患者数を示す。患者の２つ以上の別個の群は、同一レベルまたは類似レベルのバイオマーカーを有する集団のサブセット集団の同定によって決定され得る。次いで、参照レベルの決定は、これらの別個の群を最も良好に区別するバイオマーカーレベルに基づいてなされ得る。
【００８０】
参照レベルが、参照バイオマーカーより高いのレベルを発現する癌患者に対して、参照バイオマーカーより低いのレベルを発現する癌患者における、腫瘍の再発または広がりの可能性を区別するという検証は、単一の可変分析または複数の可変分析を使用して実行され得る。これらの方法は、１つ以上の可変の結果と所定の結果との間の相関の可能性を決定する。特定の場合において、これらの方法は、バイオマーカーレベル（または別の変数と結合したバイオマーカーレベル）と、疾患を有さないか、または癌患者の全般的な生存との間の相関の可能性を決定する。これらの分析を実行するために、当業者に周知の複数の方法の任意の１つが、使用され得る。単一可変分析の例は、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｒ法またはログランク試験（ｌｏｇ−ｒａｎｋ  ｔｅｓｔ）である。複数の可変分析の例は、Ｃｏｘ比例危険回帰モデル（例えば、実施例ＶＩを参照のこと）である。
【００８１】
参照レベルの集団ベースの決定（例えば、ヒストグラム分析による）は、異なるバイオマーカーレベルを有する患者の２つ以上の別個の群を決定するために、十分なサイズの患者集団を用いて実施され得る。代表的に、このような集団は、少なくとも２５人の患者、例えば、少なくとも５０人の患者、少なくとも７５人の患者および少なくとも１００人の患者を含む。同様に、決定される参照レベルの検証はまた、少なくとも２５人の患者、例えば、少なくとも５０人の患者、少なくとも７５人の患者および少なくとも１００人の患者を含み得る。
【００８２】
参照レベルは、単一の数（各々の患者に等しく適用可能である）であり得るか、または参照レベルは、患者集団の特定のサブ集団に従って変動し得る。例えば、男性は、同一の癌について女性とは異なる参照レベルを有し得る。さらに、参照レベルは、各個別の患者に対して決定されるレベルであり得る。例えば、参照レベルは、同一の患者内の非腫瘍細胞におけるバイオマーカーレベルに対する患者の腫瘍細胞におけるバイオマーカーレベルの特定の比となり得る。従って、各患者についての参照レベルは、バイオマーカーレベルの参照比によって禁止され得、ここで、参照比は、上記の参照レベルを決定するための任意の方法によって決定され得る。
【００８３】
さらに、参照レベルは、患者の２つの群を分け得るが、複数の集団を分ける多くの参照値が存在し得ることは、本発明の範囲内である。例えば、２つの参照値は、高レベルのバイオマーカーを有する患者の第一群を、中間レベルのバイオマーカーを有する患者の第二群と低レベルのバイオマーカーを有する患者の第三群から分離し得る。異なる数の参照レベルは、曲線（例えば、連続する線）を禁止するのに十分であり得、これは、患者におけるバイオマーカーレベルの機能として、疾患を有さない可能性または患者における全般的な生存の可能性を記載する。このような曲線は、「連続した」バイオマーカーレベルを構成し、ここで、疾患を有さないかまたは患者における全般的な生存の可能性は、このような患者におけるバイオマーカーに比例する。２つ以上のバイオマーカーレベルはまた、このような曲線によって示され得る。
【００８４】
参照レベルはまた、細胞の１つ以上の区画におけるバイオマーカータンパク質（例えば、ｃＩＡＰ２、ＴＵＣＡＮ、Ａｐａｆ１、Ｓｍａｃ、β−カテニン、Ｂｃｌ−２またはｐ５３）のレベルを示す。代表的に、参照レベルは、（ａ）細胞全体、（ｂ）核、または（ｃ）細胞質におけるバイオマーカータンパク質のレベルを示す。このレベルは、そのタンパク質の細胞区画化が、腫瘍の再発または特定の癌の広がりの危険性と相関する場合、有用である。同様に、参照レベルは、異なる区画におけるバイオマーカータンパク質のレベル比（例えば、細胞全体のバイオマーカータンパク質に対する核バイオマーカータンパク質の比、または細胞質のバイオマーカータンパク質に対する核の比）であり得る。
【００８５】
バイオマーカー（例えば、ｃＩＡＰ２、ＴＵＣＡＮ、Ａｐａｆ１またはＳｍａｃ）の参照レベルは、疾患を有さない可能性、または癌についての全般的な生存の可能性の統計学的に有意な指標であることが見出される、別の可変指標と組み合わせてさらに使用され得る。このような指標としては、既知の癌マーカー（例えば、結腸癌マーカーとしては、シアロシル−ＴｎＣＥＡ、ＣＡ１９−９、およびＬＡＳＡが挙げられる）の存在またはレベルが挙げられるか、あるいは臨床的指標または病理学的指標（例えば、年齢、腫瘍サイズ、腫瘍病歴、臨床段階、家族の病歴など）があり得る。例えば、癌の臨床段階はまた、疾患を有さないか、または全般的な生存の、統計学的に有意な指標であり、ここで、バイオマーカーの参照レベルは、癌の臨床段階に従って変動し得る。例えば、バイオマーカーのレベル（例えば、所定の患者について癌の臨床段階ＩＩに関連する低レベルのＴＵＣＡＮ）は、ともに、疾患を有さない可能性または全般的な生存の可能性の増大についての指標である。従って、バイオマーカーの参照レベルは、疾患を有さない可能性または癌についての全般的な生存の可能性の、別の統計学的に有意な指標関数として変動し得る。
【００８６】
癌細胞におけるバイオマーカー（例えば、ｃＩＡＰ２、Ａｐａｆ１、ＴＵＣＡＮ、Ｂｃｌ−２またはＳｍａｃ）のレベルは、互いに相関し得、そして他の分子と相関し得る。なぜなら、これらの分子は、癌細胞の過剰増殖状態に寄与する、一般的に調節不全の分子経路に関与するからである。従って、１つ以上のさらなるバイオマーカーとＴＵＣＡＮとの組み合わせは、癌患者の生存についての予後を決定するための本発明の方法において使用され得る。第２のバイオマーカーまたはさらなるバイオマーカーは、例えば、Ａｐａｆ１、ｃＩＡＰ１、ｃＩＡＰ２、ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＡＩＦ、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｂａｘ、Ｂｉｄ、ＢＡＧ１、ｐ５３、変異体ｐ５３、β−カテニン、ＭＩＢ−１または別の周知の腫瘍マーカー（例えば、以下に記載される例示的な市販の腫瘍マーカー）であり得る。さらに、ＴＵＣＡＮと、１つ以上のバイオマーカーとの組み合わせの使用は、増加した予後の有意性または予後決定における信頼を提供する。
【００８７】
従って、本発明は、癌患者の生存についての予後を決定するための方法を提供し、この方法は、２つ以上のバイオマーカーの使用を包含する。この方法は、（ａ）癌患者に由来する新生物細胞含有サンプルにおいて、ＴＵＣＡＮのレベル、ならびにｃＩＡＰ２、Ａｐａｆ１、Ｂｃｌ−２およびＳｍａｃからなる群より選択される１つ以上のバイオマーカーのレベルを測定する工程、ならびに（ｂ）上記サンプルにおけるＴＵＣＡＮおよび１つ以上の選択されたバイオマーカーのレベルと、ＴＵＣＡＮおよびバイオマーカーの参照レベルとを比較する工程によって実施される。ここで、上記サンプルにおける、低レベルのＴＵＣＡＮと高レベルの任意のＡｐａｆ１、Ｂｃｌ−２またはＳｍａｃ、あるいは低レベルのＴＵＣＡＮと低レベルのｃＩＡＰ２は、上記患者の増大した生存と相関する。
【００８８】
本発明の方法は、例えば、増大または減少した発現が改善された生存と相関する、ＴＵＣＡＮと、１つ以上のバイオマーカー（例えば、任意のｃＩＡＰ２、Ａｐａｆ１、Ｂｃｌ−２、Ｓｍａｃまたは癌に対する別の既知のバイオマーカーまたは標準的なバイオマーカー）との組み合わせを選択することによって実施され得る。選択されたバイオマーカーは、複数の型の癌にとって有用な、一般的な診断マーカーまたは予後マーカー（例えば、ＣＡ１２５、ＣＥＡもしくはＬＤＨ）であり得るか、あるいは癌特異的診断マーカーまたは予後マーカー（例えば、結腸癌マーカー（例えば、シアロシル−ＴｎＣＥＡ、ＣＡ１９−９またはＬＡＳＡ）、乳癌マーカー（例えば、ＣＡ１５−２、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕおよびＣＡ２７．２９）、卵巣癌マーカー（例えば、ＣＡ７２−４）、肺癌（例えば、神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）および組織ポリペプチド抗原（ＴＰＡ））、前立腺癌（例えば、ＰＳＡ、前立腺特異的膜抗原および前立腺酸性ホスファターゼ）、黒色腫（例えば、Ｓ−１００およびＴＡ−９０）、ならびに他の型の癌に特異的な他のバイオマーカー）であり得る。当業者は、ＴＵＣＡＮと組み合わせて、検出のために有用な診断マーカーまたは予後マーカーを選択することが可能である。同様に、３つ以上、４つ以上もしくは５つ以上または多くのバイオマーカーが、癌患者の生存についての予後を決定するために一緒に使用され得る。
【００８９】
２つ以上のバイオマーカーの使用は、予後の結果に増大した信頼性を提供し得る。例えば、本明細書中に開示されるように、低いｃＩＡＰと低いＴＵＣＡＮとの組み合わせ、および高いＡｐａｆ１と低いＴＵＣＡＮとの組み合わせは、増大した、疾患に罹患していない生存と相関した（実施例Ｖを参照のこと）。特に、新生物細胞含有サンプルにおけるｃＩＡＰおよびＴＵＣＡＮのレベルについて試験した３３人の患者のうち、他のカテゴリーに属する患者については５６％が生存し、そして４４％が疾患を有さないのに対して、低いＩＡＰおよび低いＴＵＣＡＮを有する患者の９７％は生存し続けた（９１％は疾患を有さない）。さらに、新生物細胞含有サンプルにおけるＡｐａｆ１およびＴＵＣＡＮのレベルについて試験した１７人の患者のうち、他のカテゴリーに属する患者については６５％が生存し、そして５３％が疾患を有さないのに対して、高いＡｐａｆ１および低いＴＵＣＡＮを有する患者の１００％は生存し続け、そして疾患を有さなかった。当業者は、このような相関が、本明細書中に記載される方法を用いて、バイオマーカーの他の組み合わせを使用して観察され得ることを認識する。
【００９０】
本発明の予後方法において有用なバイオマーカーの組み合わせとしては、例えば、ｃＩＡＰ２およびＴＵＣＡＮ、Ａｐａｆ１およびＴＵＣＡＮ、ならびにバイオマーカー（例えば、ｃＩＡＰ２、Ａｐａｆ１、Ｂｃｌ−２およびＳｍａｃならびに他の分子（ＡＩＦ、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｂａｘ、Ｂｉｄ、ＢＡＧ１、ｐ５３、変異ｐ５３、β−カテニン、ＭＩＢ−１ならびに種々の他の一般的バイオマーカーおよび腫瘍特異的バイオマーカー（例えば、本明細書中に上記されるような市販の診断マーカー）を含む））とＴＵＣＡＮとの、多数の他の組み合わせが挙げられる。これらのバイオマーカーの上昇したレベルは、評価された全ての癌検体の部分において観察されたので（実施例ＩＩを参照のこと）、このような組み合わせは、癌細胞の転移状態の有用な指標であり得る。さらに、別の結腸癌マーカーであるＫｉ−６７と相関する種々のバイオマーカーのレベルの上昇、およびバイオマーカーの発現間（例えば、患者集団におけるｃＩＡＰ２とＴＵＣＡＮとの間（ｐ＝０．００３））の陽性の相関が観察された。
【００９１】
本発明はまた、癌に罹患する患者についての処置過程の有効性をモニタリングするための方法を提供する。この方法は、以下の工程：（ａ）癌患者由来の新生物細胞含有サンプル中のＴＵＣＡＮのレベルを決定する工程、および（ｂ）処置後の患者由来の新生物細胞含有サンプル中のＴＵＣＡＮのレベルを決定する工程、を包含し、これによって、処置前のＴＵＣＡＮレベルと処置後のバイオマーカーレベルとの比較が、処置の有効性を示す。
【００９２】
処置過程に関して使用される場合、「有効性」とは、この処置過程が腫瘍の再発または広がりの危険性を低減する能力をいい、従って、患者が疾患を有さない可能性または患者の全体的生存の可能性を増大させる能力をいう。この方法は、患者の腫瘍細胞におけるバイオマーカー（例えば、ｃＩＡＰ、ＴＵＣＡＮ、Ａｐａｆ１またはＳｍａｃ）のレベルが、患者の非腫瘍細胞におけるｃＩＡＰ、ＴＵＣＡＮ、Ａｐａｆ１およびＳｍａｃのレベルと比較して異常である場合、特に有用性を有する。処置の前および後の患者由来の新生物細胞含有サンプル中のバイオマーカーレベルの比較は、それによって、バイオマーカーレベルが非腫瘍細胞のレベルに戻っている（これは、より有効な処置過程を意味している）か否か、またはバイオマーカーレベルが異常なままであるかもしくは異常性を増している（これは、処置過程があまり有効でないことを示している）か否かを示すように働く。例えば、処置後の患者サンプル中のＡｐａｆ１、Ｂｃｌ−２またはＳｍａｃのレベルの増加は、Ａｐａｆ１またはＳｍａｃの高いレベルが、結腸癌の再発の低い発生率と相関するので、この処置が有効であることを示す。さらに、処置後の患者サンプルにおける低レベルのβ−カテニン、ｃＩＡＰ２またはＴＵＣＡＮは、低レベルのβ−カテニン、ｃＩＡＰ２またはＴＵＣＡＮが、結腸癌の再発の低い発生率と相関するので、この処置が有効であることを示す。
【００９３】
癌を有する患者は、高レベルの特定のバイオマーカーまたは低レベルのバイオマーカーが、この患者から得られた新生物細胞含有サンプルにおいて測定されるか否かにしたがって分類され得る。患者についての予後の決定は、この患者が割り当てられたグループが、この患者が割り当てられなかったグループに関して、より高いかまたはより低い、疾患に罹患していない生存の可能性または全体的生存の可能性と相関するか否かを決定することによって、なされ得る。
【００９４】
従って、本発明はまた、患者の分類を含む、癌患者の生存についての予後を決定する方法を提供する。この方法は、以下の工程：（ａ）癌患者由来の新生物細胞含有サンプル中のＴＵＣＡＮレベルを測定する工程、および（ｂ）第一または第二の患者グループのいずれかに属するとして患者を分類する工程、によって実施され、ここで、低レベルのＴＵＣＡＮを有する第一のグループの患者は、高レベルのＴＵＣＡＮを有する第二のグループの患者と比較して、生存の可能性が増大しているとして分類される。
【００９５】
高レベルのＴＵＣＡＮまたはＴＵＣＡＮの過剰発現は、腫瘍の再発または広がりの危険性が増大した患者と相関する。従って、高レベルのＴＵＣＡＮを有する第一のグループに属する患者は、低レベルのＴＵＣＡＮを有する第二のグループと比較して、腫瘍の再発または広がりの危険性が増大しているとして分類される。低レベルのＴＵＣＡＮを有する第一のグループに属する患者は、高レベルのＴＵＣＡＮを有する第二のグループと比較して、生存の可能性が増大しているとして分類される。
【００９６】
癌患者の生存についての予後を決定する方法は、１以上のさらなるバイオマーカーを使用して実施され得る。種々のバイオマーカー（公知の癌マーカーおよび本明細書中に開示される予後バイオマーカーを含む）は、癌患者の生存についての予後を決定するために、ＴＵＣＡＮと組み合わせて使用され得る。１実施形態において、この方法は、以下の工程：（ａ）癌患者由来の新生物細胞含有サンプル中のｃＩＡＰ２レベルを決定する工程、および（ｂ）第一または第二の患者グループのいずれかに属するとして患者を分類する工程、を包含し、ここで、低レベルのＴＵＣＡＮおよび低レベルのｃＩＡＰ２を有する第一のグループの患者は、高レベルのＴＵＣＡＮおよび高レベルのｃＩＡＰ２を有する第二のグループの患者と比較して、生存の可能性が増大しているとして分類される。
【００９７】
別の実施形態において、この方法は、以下の工程：（ａ）癌患者由来の新生物細胞含有サンプル中のＡｐａｆ１、ＳｍａｃおよびＢｃｌ−２からなる群より選択されるバイオマーカーのレベルを決定する工程、ならびに（ｂ）第一または第二の患者グループのいずれかに属するとして患者を分類する工程、を包含し、ここで、低レベルのＴＵＣＡＮおよび高レベルのＡｐａｆ１、ＳｍａｃまたはＢｃｌ−２のいずれかを有する第一のグループの患者は、高レベルのＴＵＣＡＮおよび低レベルのＡｐａｆ１、ＳｍａｃまたはＢｃｌ−２のいずれかを有する第二のグループの患者と比較して、生存の可能性が増大しているとして分類される。
【００９８】
患者サンプル中の１以上のバイオマーカーのレベルを決定し、参照レベルと比較した後、次いで、患者は、疾患に罹患していない生存の特定の可能性または全体的生存の特定の可能性を有するグループへと分類される。次いで、患者についての疾患を有さない可能性または全体的生存の可能性は、そのグループ中の患者についての患者についての疾患を有さない可能性または全体的生存の可能性に基づいて評価される。
【００９９】
例えば、癌患者由来の新生物細胞含有サンプルは、参照レベルと比較して、高レベルのＡｐａｆ１、Ｂｃｌ−２またはＳｍａｃを有すると決定され得る。次いで、この患者は、高レベルのＡｐａｆ１、Ｂｃｌ−２またはＳｍａｃを有する患者のグループへと分類される。（癌細胞中で低レベルのＡｐａｆ１、Ｂｃｌ−２またはＳｍａｃを発現する患者のグループと比較して）癌細胞中で高レベルのＡｐａｆ１、Ｂｃｌ−２またはＳｍａｃを発現する患者のグループについての、疾患が存在しない可能性または全体的生存の可能性が増大していることが発見されているので、特定の癌患者は、疾患が存在しない生存の可能性または全体的生存の可能性が増大しているとみなされる。
【０１００】
逆に、癌患者由来の新生物細胞含有サンプルは、参照レベルと比較して、高レベルのｃＩＡＰ２、β−カテニンまたはＴＵＣＡＮを有すると決定され得る。次いで、この患者は、高レベルのｃＩＡＰ２、β−カテニンまたはＴＵＣＡＮを有する患者のグループへと分類される。（癌細胞中で低レベルのｃＩＡＰ２、β−カテニンまたはＴＵＣＡＮを発現する患者のグループと比較して）癌細胞中で高レベルのｃＩＡＰ２、β−カテニンまたはＴＵＣＡＮを発現する患者のグループについての、疾患が存在しない生存の可能性または全体的生存の可能性が減少していることが発見されているので、特定の癌患者は、疾患に罹患していない生存の可能性または全体的生存の可能性が減少しているとみなされる。
【０１０１】
本発明の方法は、癌の発達についての個体の感受性を決定するために適用可能である。この方法は、種々の癌（胃腸、肺、結腸、前立腺、乳房、卵巣、皮膚、血液および腎臓の癌を含む）に対して適用可能である。特に、結腸癌は、腺腫様結腸ポリープとして公知の前悪性前駆病変から発達する。複数の疫学的研究は、家族の一員が一旦腺腫様結腸ポリープを発症すると、その兄弟姉妹は、結腸腺腫および結腸癌の両方を発症する危険性が非常に上昇していることを実証した。当業者は、本発明の方法が、例えば、適切な生検サンプルを収集することによって、結腸新生物状態（例えば、腺腫様結腸ポリープ）を含む新生物状態について本明細書中に記載されるように実施され得る。
【０１０２】
癌患者の生存についての予後を決定するための本発明の方法は、腫瘍進行の任意の病期において患者に適用可能であり、そしてさらに、腫瘍進行の病期を決定するために使用され得る。腫瘍の病期とは、腫瘍の進行の程度をいう。腫瘍発達の種々の病期は、Ｍａｒｋｍａｎ「Ｂａｓｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」、Ｓａｕｎｄｅｒｓ（Ｚｏｒａｂ，Ｒ．編）（１９９７）中に例示されるように、当業者に周知である。例えば、癌は、以下の３つの一般的な病期に病期分けされ得る：局在、局所的広がりおよび離れた広がり。癌はまた、ＴＮＭシステムを使用して病期分けされ得、このシステムは、罹患した組織および近傍の組織内への直接的広がりの程度、リンパ節近傍への広がりの程度、ならびに離れた器官への広がりの程度を考慮する。これらの特徴に基づいて、癌の広がりは、０〜ＩＶまでのローマ数字を割り当てることによって要約され得る。当業者は、特定の型の癌に適切な病期分け系を選択し得る。
【０１０３】
特に、結腸癌は、Ｄｕｋｅｓ系、Ａｓｔｌｅｒ−Ｃｏｌｌｅｒ系およびＡＪＣＣ／ＴＮＭ系を使用して段階分けされ得、これらの系は、結腸または直腸の壁の層、結腸および直腸に隣接する器官、ならびに遠く離れた他の器官に関連する癌の広がりを記載する。Ｄｕｋｅｓ病期Ａは、ＡＪＣＣ／ＴＮＭ病期ＩおよびＡｓｔｌｅｒ−Ｃｏｌｌｅｒ病期Ａ、ＢＩと等価であり；Ｄｕｋｅ病期Ｂは、ＡＪＣＣ／ＴＮＭ病期ＩＩおよびＡｓｔｌｅｒ−Ｃｏｌｌｅｒ病期Ｂ２、Ｂ３と等価である。Ｄｕｋｅｓ病期Ｃは、ＡＪＣＣ／ＴＮＭ病期ＩＩＩおよびＡｓｔｌｅｒ−Ｃｏｌｌｅｒ病期Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３と等価である。結腸直腸がんのＡＪＣＣ／ＴＮＭ病期は、以下のようである：病期０：この癌は、結腸または直腸の内層（粘膜）を越えて増殖していない。この病期は、またはインサイチュ癌腫または粘膜内癌腫としても公知である；病期Ｉ：この癌は、粘膜から粘膜下へと増殖しているか、または固有（ｐｒｏｐｒｉａ）筋層へも増殖しているかもしれないが、壁自体の外側に、リンパ節のような近傍組織へと広がってはいない；病期ＩＩ：この癌は、結腸または直腸の壁を越えて、最外層へと増殖しており、そして他の近傍組織を浸潤しているかもしれないが、近傍のリンパ節へと広がってはいない；病期ＩＩＩ：この癌は、任意の大きさであり得るが、３個以下の近傍リンパ節に広がっているか、または４個以上の節に広がっているが、身体の他の部分へは広がっていない；病期ＩＶ：この癌は、離れた器官（例えば、肝臓、肺、腹膜または卵巣）に広がっている。
【０１０４】
腫瘍発達の初期段階は、原発性腫瘍の器官に対して局所的なリンパ節以上には検出可能に広がっていない、腫瘍発達中の病期をいうことが理解されるべきである。代表的に、初期病期は、病期ＩおよびＩＩであるとみなされる。
【０１０５】
本発明の方法の予測的価値は、癌の初期病期の患者の場合に特に有効である。これは、本発明の方法が、検査の時点で測定可能な転移を実証しない患者における転移の危険性を決定する際に、有利に有効であるからである。当業者は、病期Ｉの癌に罹患している癌患者についての生存率の予後指標が、病期ＩＶの癌に罹患している癌患者についての生存率の予後指標とは異なり得ることを理解する。例えば、病期Ｉの癌患者についての予後は、癌の継続的増殖および／または転移の可能性に向けられ得、一方で、病期ＩＶの癌患者についての予後は、癌を処置するための治療方法の有効性の可能性に向けられ得る。
【０１０６】
癌進行の病期は、１以上のバイオマーカーのレベル（例えば、ＴＵＣＡＮ、Ａｐａｆ１またはＩＡＰ（例えば、ｃＩＡＰ２）またはＳｍａｃのレベル）と相関し得る。従って、癌患者由来のサンプルにおけるバイオマーカーのレベルの決定は、このサンプルを特定の病期の癌のバイオマーカー指標の参照レベルと比較することによって、得られたサンプル由来の腫瘍の病期を決定するために使用され得る。
【０１０７】
本発明の方法は、癌または新生物状態を有するかまたは有する疑いのある個体から単離または獲得された、種々の異なる型のサンプルを用いる使用のために適用可能である。例えば、本発明の１以上の予後形式における使用のために適用可能なサンプルとしては、組織サンプルおよび細胞サンプルが挙げられる。組織サンプルまたは細胞サンプルは、例えば、生検または手術によって患者から得られた流体サンプルから獲得され得る。例えば、転移していない固形腫瘍の場合、手術によって取り出された腫瘍由来の組織サンプルは、従来の技術によって試験するために、獲得および調製され得る。さらに、サンプルは、例えば、周知の生検手順を使用して、患者から取り出され得る。例えば、結腸癌の場合、非常に小さい隆起したポリープのサンプルを得るために、結腸鏡がスネアに嵌合されて、結腸の壁に対する損傷なしにポリープを取り出し得る（ポリープ切除術）；または小さい平らなポリープを得るために、生検鉗子が結腸鏡に装着されて、小さい組織サンプルを収集し得る。
【０１０８】
以下に記載するように、そして方法の形式に依存して、この組織は、全体で使用され得るか、または当該分野で公知の種々の方法に供されて、サンプルをより小さい細片、細胞凝集物または個々の細胞へと分離し得る。さらに、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような増幅方法と組み合わせた場合に、単一細胞サンプルは、ハイブリダイゼーション検出方法を使用する本発明の予後アッセイにおける使用に十分である。同様に、バイオマーカーのポリペプチドレベルを測定する場合、酵素カップリングまたは光度測定増強を用いる信号の増幅は、いくつかまたは少数の細胞だけを用いて使用され得る。
【０１０９】
生検または手術から得られた全組織は、新生物細胞含有サンプルの１例である。腫瘍組織細胞サンプルは、以下に記載の形式のいずれかを使用してアッセイされ得る。例えば、腫瘍組織サンプルは、取り付けられ、そしてバイオマーカー核酸プローブとインサイチュでハイブリダイズされ得る。タンパク質検出方法およびインサイチュ活性アッセイを使用する類似の組織学的形式もまた、全組織腫瘍細胞サンプル中のバイオマーカーポリペプチドを検出するために使用され得る。タンパク質検出方法としては、例えば、本明細書中の実施例ＩＩに記載されるような、バイオマーカー特異的抗体を用いる染色が挙げられる。このような組織学的方法および当該分野で周知の他の方法は、新生物細胞含有サンプルの供給源として全組織を使用する本発明の予後方法における使用のために適用可能である。サンプルを調製および取り付けするための方法は、当該分野で周知である。
【０１１０】
新生物状態または癌を有するかまたは有することが疑われる個体由来の個々の細胞および細胞凝集物は、バイオマーカーのＲＮＡまたはポリペプチドの発現の増加または減少について分析され得る新生物細胞含有サンプルの別の例である。これらの細胞は、培養物中で増殖され得、そして上記のような手順を使用して分析され得る。バイオマーカー発現に関連する細胞表面マーカーを発現する全細胞サンプルは、蛍光活性化細胞分類または磁気活性化細胞分類（ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳ）を、表面マーカーに選択的な標識された結合剤を用いて、または例えば、特定の細胞集団について選択的な結合剤を用いて使用し、次いで、この集団内のバイオマーカーのレベルを決定して、迅速に試験され得る。バイオマーカーのレベルは、例えば、バイオマーカーについての結合特異的反応剤を使用して、またはバイオマーカー特異的プローブへのハイブリダイゼーションによって、決定され得る。全細胞サンプル中のバイオマーカーのレベルを測定するための他の方法は、当該分野で公知であり、そして以下に記載される予後形式のいずれかにおいて同様に適用可能である。
【０１１１】
個体から獲得された組織腫瘍細胞サンプルまたは全細胞腫瘍細胞サンプルはまた、本明細書中に記載される形式のいずれかを使用して、細胞を溶解し、そしてこの溶解物、その分画された部分またはその精製成分中のバイオマーカーのレベルを測定することによって、バイオマーカーレベルの増加または減少について分析され得る。例えば、ハイブリダイゼーション形式が使用される場合、バイオマーカーＲＮＡは、ＰＣＲまたは当該分野で周知の他の増幅手順（例えば、バイオマーカー核酸分子のレベルを直接測定するための、ＲＴ−ＰＣＲ、５’ＲＡＣＥまたは３’ＲＡＣＥ）を使用して、溶解物から直接増幅され得る。ＲＮＡはまた、単離され得、そして例えば、溶液ハイブリダイゼーションによって直接的に探査され得るか、または固定化ＲＮＡへのハイブリダイゼーションによって間接的に探査され得る。同様に、ポリペプチド検出形式を使用してバイオマーカーのレベルを決定する場合、溶解物は直接アッセイされ得るか、またはバイオマーカーについて富化するために、さらに分画され得る。例えば、免疫化学的方法（例えば、イムノブロット分析（実施例ＩＩＩを参照のこと））が、新生物細胞含有サンプルを使用して実施され得る。全腫瘍細胞サンプルでの使用に適用可能な多数の他の方法は、当業者に周知であり、そして本発明の方法においてしかるべく使用され得る。
【０１１２】
腫瘍組織または細胞サンプルは、個体から直接的に獲得され得るか、あるいは、試験用に他の供給源から獲得され得る。同様に、細胞サンプルは、新たに単離されたときに試験され得るか、または正確さまたは感受性を実質的に失うことなく、短期間もしくは長期間凍結保存された後に試験され得る。サンプルが、不確定な期間の後に試験される場合、そのサンプルは、獲得され得、次いで、凍結保存され得るか、または、例えば、短期間４℃で保存され得る。本発明の予後方法の利点は、サンプルの組織学的分析を必要としないことである。従って、サンプルは、最初に脱凝集され得るか、溶解され得るか、分画され得るか、または精製され得、そして活性成分が、後の診断のために保存される。
【０１１３】
本発明の予後方法は、腫瘍細胞サンプルではない種々の異なる型のサンプルを用いる用途に適用可能である。例えば、細胞外空間（循環液および他の体液を含む）に放出されるバイオマーカーポリペプチドまたはそのフラグメントが、バイオマーカーポリペプチドに関連する分泌型ポリペプチドまたはフラグメントを検出するための予後方法において使用され得る。このような場合、本発明の方法は、新生物状態または癌を有するかまたは有することが疑われる個体から収集された液体サンプルを用いて適用可能である。
【０１１４】
バイオマーカーレベルについて測定され得る液体サンプルとしては、例えば、血液、血清、リンパ液、尿、または糞便が挙げられる。他の体液は、当業者に公知であり、そして、同様に、本発明の予後方法においてサンプルとしての用途に適用可能である。液体サンプルを分析する１つの利点は、それらが、生検および手術に必要とされるような浸襲手順を伴わずに十分な量で容易に獲得可能であることである。液体サンプル（例えば、血液、血清、および尿）の分析は、一般的に、本明細書中に記載される、バイオマーカーポリペプチドレベルを測定する予後形式である。バイオマーカーに関連するポリエピトープは、溶液形態で循環しているので、この方法は、細胞溶解物、それらの分画部分、または精製成分から発現レベルを測定する方法と同様である。
【０１１５】
新生物状態および癌は、腫瘍性細胞含有サンプル、循環液、または個体から獲得され得る他の体液中のバイオマーカーレベルを測定することにより、診断、予測、または予後され得る。本明細書中に記載される場合、バイオマーカーのレベルは、当該分野で公知の種々の方法により測定され得る。
【０１１６】
当業者は、本明細書中に提供される教示および手引きが与えられれば、適切なアッセイ系を容易に決定し得、そしてＲＮＡまたはポリペプチドの測定に基づく方法を選択し得る。サンプルの型、利用可能性、および量のような考慮もまた、特定の予後形式の選択に影響を与える。例えば、サンプルが腫瘍細胞サンプルであり、少量しか利用可能でない場合、例えば、ＰＣＲ増幅によってバイオマーカーＲＮＡの量を測定するか、または例えば、ＦＡＣＳ分析によってバイオマーカーポリペプチドを測定する予後形式が、バイオマーカーのレベルを決定するのに適切な選択であり得る。あるいは、サンプルが血液サンプルであり、そしてユーザーが多くの異なるサンプルを同時に分析する（例えば、臨床環境にて）場合、バイオマーカーポリペプチドの量を測定する多サンプル形式（例えば、酵素連結イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ））が、バイオマーカーのレベルを決定するのに適切な選択であり得る。さらに、腫瘍性細胞または病理学的細胞から体液中に放出されるバイオマーカー核酸分子はまた、例えば、ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲによって分析され得る。当業者は、どの形式が特定の適用に受け入れられるか、および当該分野で公知のどの方法または改変が特定の型の形式と適合可能かを認知しているかまたは決定し得る。
【０１１７】
核酸プローブは、当該分野で周知の方法を用いて、組換え合成または化学合成され得る。さらに、ハイブリダイゼーションプローブは、種々の検出可能な標識（例えば、放射性同位元素、蛍光タグ、レポーター酵素、ビオチン、および他のリガンドを含む）で標識され得る。さらに、このような検出可能な標識は、分光光度測定検出のために、例えば、比色指標基質または測光指標基質と連結され得る。このようなプローブを標識および検出する方法は、当該分野で周知であり、そして例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）、およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（補遺４７）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９）に記載されているのが見出され得る。
【０１１８】
サンプル中のバイオマーカーを検出するのに有用な核酸プローブは、当業者に容易に決定される、種々のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズされ得る。特定のアッセイに依存して、当業者は、ストリンジェンシー条件を、特定のサンプル型における特定のバイオマーカーの検出に最適化するよう容易に変更し得る。
【０１１９】
一般的には、ハイブリッドの安定性は、イオン濃度および温度の関数である。代表的には、ハイブリダイゼーション反応は、低ストリンジェンシーの条件下で実施され、その後、種々の（しかしより高い）ストリンジェンシーで洗浄される。中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーションとは、核酸分子（例えば、プローブ）が相補的な核酸分子に結合することを許容する条件をいう。ハイブリダイズした核酸分子は、一般的に、少なくとも６０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８５％の同一性、または少なくとも９０％の同一性を有する。中程度にストリンジェントな条件は、５０％ホルムアミド、５×Ｄｅｎｈａｒｔ溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％  ＳＤＳ中、４２℃でのハイブリダイゼーション、それに続く０．２×ＳＳＰＥ、０．２％  ＳＤＳ中、４２℃での洗浄と等価な条件である。高ストリンジェンシー条件は、例えば、５０％ホルムアミド、５×Ｄｅｎｈａｒｔ溶液、５×ＳＳＰＥ，０．２％  ＳＤＳ中、４２℃でのハイブリダイゼーション、それに続く、０．１×ＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳ中、６５℃での洗浄により提供され得る。
【０１２０】
低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションとは、１０％ホルムアミド、５×Ｄｅｎｈａｒｔ溶液、６×ＳＳＰＥ、０．２％  ＳＤＳ中、２２℃でのハイブリダイゼーション、それに続く１×ＳＳＰＥ、０．２％  ＳＤＳ中、３７℃での洗浄と等価な条件をいう。Ｄｅｎｈａｒｔ溶液は、１％Ｆｉｃｏｌｌ、１％ポリビニルピロリドン、および１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む。２０×ＳＳＰＥ（塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、エチレンジアミド四酢酸（ＥＤＴＡ））は、３Ｍ塩化ナトリウム、０．２Ｍリン酸ナトリウム、および０．０２５Ｍ（ＥＤＴＡ）を含む。他の適切な中程度のストリンジェンシーおよび高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション緩衝液および条件は、当業者に周知であり、そして例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）；およびＡｕｓｕｂｅｌら、前出、１９９９）に記載されている。ポリペプチドをコードする核酸分子は、中程度にストリンジェントな条件下または高ストリンジェンシー条件下で、ｃＩＡＰ２、ＴＵＣＡＮ、Ａｐａｆ１、Ｂｃｌ−２、Ｓｍａｃ、β−カテニン、または別のバイオマーカーの核酸配列の全配列、または実質的な部分（例えば、代表的に、少なくとも１５〜３０ヌクレオチド）にハイブリダイズする。
【０１２１】
本発明は、多量または少量の特定のバイオマーカー（ｃＩＡＰ２、ＴＵＣＡＮ、Ａｐａｆ１、Ｂｃｌ−２、βカテニン、およびＳｍａｃを含む）が、癌を有する患者の生存度の指標となるという発見に関連する。これらのバイオマーカーの過剰発現または発現抑制は、制御されない増殖を誘導する癌細胞の遺伝子的機能不全に寄与し得る。従って、癌細胞におけるバイオマーカーのレベルの、正常細胞と一致するレベルへの調節は、癌細胞を、より正常な増殖状態に戻すために使用され得る。過剰発現されるバイオマーカー遺伝子（例えば、ｃＩＡＰ２、ＴＵＣＡＮ、およびｂ−カテニン）の場合、種々のストラテジーが、遺伝子発現を減少させるために使用され得る。例えば、ｃＩＡＰ２、ＴＵＣＡＮ、およびｂ−カテニンの転写もしくは翻訳の開始、またはｃＩＡＰ２、ＴＵＣＡＮ、およびｂ−カテニンポリペプチドの活性量の減少が、これらのバイオマーカーのレベルを正常細胞で示されるレベルまで減少させるために使用され得る。発現抑制されるバイオマーカー遺伝子（Ａｐａｆ１、Ｂｃｌ−２、およびＳｍａｃ）の場合、種々のストラテジーが、遺伝子発現を増大するのに使用され得る。例えば、外因性核酸分子由来のＡｐａｆ１、Ｂｃｌ−２、もしくはＳｍａｃの導入、Ａｐａｆ１、Ｂｃｌ−２、もしくはＳｍａｃの転写または翻訳の促進、または活性なＡｐａｆ１、Ｂｃｌ−２、またはＳｍａｃポリペプチドの量の促進が、これらのバイオマーカーのレベルを正常な細胞で示されるレベルまで増大させるのに使用され得る。
【０１２２】
従って、本発明は、さらに、新生物状態（例えば、癌）の進行を、腫瘍性細胞増殖を減少させることにより処置または減少させる方法を提供する。１つの実施形態において、本方法は、Ａｐａｆ１、Ｂｃｌ−２、またはＳｍａｃをコードする核酸を、腫瘍性細胞に投与する工程および腫瘍性細胞増殖を減少させるのに有効な量でＡｐａｆ１、Ｂｃｌ−２、またはＳｍａｃポリペプチドを発現する工程を包含する。別の実施形態において、腫瘍性細胞増殖を減少する方法は、十分な条件下で、細胞中でＡｐａｆ１、Ｂｃｌ−２、またはＳｍａｃの量を増加する有効量の薬剤と、腫瘍性細胞とを接触させる工程を包含する。
【０１２３】
このような薬剤は、例えば、細胞中でのバイオマーカーポリペプチドの量を増大することにより（例えば、増加したｍＲＮＡ発現を刺激することにより）、直接的にかまたは間接的にバイオマーカーの量を増大し得る。Ａｐａｆ１、Ｂｃｌ−２、またはＳｍａｃのｍＲＮＡ発現は、例えば、Ａｐａｆ１、Ｂｃｌ−２、またはＳｍａｃの遺伝子の転写を誘導または抑制解除することにより、および遺伝子発現を調節する転写因子として作用する細胞タンパク質の発現を調節することにより、増大され得る。薬剤は、Ａｐａｆ１、Ｂｃｌ−２、またはＳｍａｃのｍＲＮＡまたはポリペプチドの安定性を増大することにより（例えば、細胞分解活性（例えば、プロテアーゼ活性）を減少させることにより）、Ａｐａｆ１、Ｂｃｌ−２、またはＳｍａｃの量を増大するよう作用し得る。Ａｐａｆ１、Ｂｃｌ−２、またはＳｍａｃの発現の調節を媒介する分子（例えば、レセプターおよび対応するシグナル伝達分子）はまた、細胞中でのＡｐａｆ１、Ｂｃｌ−２、またはＳｍａｃの量を増大する薬剤の標的であり得る。例えば、Ａｐａｆ１、Ｂｃｌ−２、またはＳｍａｃの発現を刺激するシグナル伝達経路は、例えば、Ａｐａｆ１、Ｂｃｌ−２、またはＳｍａｃの合成速度または遺伝子発現が活発である時間を増加させることにより、Ａｐａｆ１、Ｂｃｌ−２、またはＳｍａｃの発現レベルを増大するよう調節され得る。
【０１２４】
結果的に、細胞中でのバイオマーカーの量の減少は、上記と反対のバイオマーカーの転写、翻訳、またはタンパク質の安定性の変化を誘導することにより影響を受け得る。このように、さらなる実施形態において、腫瘍性細胞の増殖を減少する方法は、十分な条件下で、細胞中でｃＩＡＰ２、ｂ−カテニン、またはＴＵＣＡＮの量を減少する有効量の薬剤と、腫瘍性細胞とを接触する工程を包含する。
【０１２５】
細胞中でのバイオマーカー（例えば、ｃＩＡＰ２、ＴＵＣＡＮ、ｂ−カテニン、Ｂｃｌ−２、Ａｐａｆ１、またはＳｍａｃ）の量は、例えば、外因性核酸分子由来のバイオマーカーの発現を増加させることにより、バイオマーカーポリペプチドまたはその機能的アナログを細胞中に導入することにより、バイオマーカーポリペプチドのインヒビターを細胞中に導入することにより、そして細胞中のバイオマーカーのレベルを調節する遺伝子またはタンパク質産物の発現または活性を調節することにより、調節され得る。細胞中のバイオマーカーの量はまた、バイオマーカーｍＲＮＡの転写または翻訳をブロックするアンチセンス分子を用いて調節され得る。詳細には、細胞は、ｃＩＡＰ２、β−カテニン、またはＴＵＣＡＮ核酸分子に相補的な配列で形質転換され得る。このような方法は、当該分野で周知であり、そしてセンスもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそれより長いフラグメントは、バイオマーカーをコードする配列のコード領域または制御領域に沿って種々の位置から設計され得る。従って、アンチセンス分子は、バイオマーカー活性を調節するため、または遺伝子機能の調節を達成するために使用され得る。
【０１２６】
酵素的ＲＮＡ分子であるリボザイムはまた、バイオマーカーｍＲＮＡ（例えば、ｃＩＡＰ２、β−カテニン、またはＴＵＣＡＮ）の特異的切断を触媒するために使用され得る。リボザイム作用の機構は、相補的標的であるバイオマーカーＲＮＡに対するリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーション、それに続くヌクレオチド内部分解切断を含む。任意の潜在的なＲＮＡ標的内の特異的なリボザイム切断部位は、以下の配列を含むリボザイム切断部位についてバイオマーカーＲＮＡをスキャンすることにより同定される：ＧＵＡ、ＧＵＵ、およびＧＵＣ。一旦同定されると、この切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する１５リボヌクレオチドと２０リボヌクレオチドとの間の短いＲＮＡ配列は、そのオリゴヌクレオチドを手術不能にし得る二次構造の特徴について評価され得る。候補標的の適合性はまた、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに対するアクセシビリティを試験することによって評価され得る。本発明のアンチセンス分子およびリボザイムは、核酸分子の合成について当該分野で公知の任意の方法により調製され得る。
【０１２７】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）はまた、バイオマーカーｍＲＮＡ（例えば、ｃＩＡＰ２、β−カテニン、またはＴＵＣＡＮ）の量を調節するために使用され得る。ＲＮＡｉは、翻訳後ＲＮＡ分解による配列特異的遺伝子サイレンシングのプロセスである。このプロセスは、配列中のサイレンシングを受ける遺伝子と相同な二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）により開始される。ＲＮＡｉに適切な二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、１９ＲＮＡ塩基対を形成し、各々の３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハングを残す、標的化される遺伝子に対応する約２１連続ヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４９４−４９８（２００１）；Ｂａｓｓ、Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４２８−４２９（２００１）；Ｚａｍｏｒｅ、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．８：７４６−７５０（２００１））。約２５〜３０ヌクレオチドのｄｓＲＮＡもまた、ＲＮＡｉとしての使用に成功している（Ｋａｒａｂｉｎｏｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９８：７８６３−７８６８（２００１））。ｄｓＲＮＡは、インビトロで合成され得、そして当該分野で公知の手段により細胞中に導入され得る。
【０１２８】
細胞（癌細胞を含む）中への核酸分子の導入のための種々の方法が、当該分野で公知である。このような方法としては、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクションまたはポリリジン媒介トランスフェクション、および抗体、グラミシジンＳ、人工ウイルスエンベロープまたは他の細胞内キャリア（例えば、ＴＡＴ）への結合が挙げられる。例えば、細胞は、Ｃｉｂｅｌｌｉら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：６４２−６４６（１９９８）またはＬａｍｂおよびＧｅａｒｈａｒｔ、Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎ．Ｄｅｖ．５：３４２−３４８（１９９５）に記載されるようにマイクロインジェクションにより；またはＣｈｏｉ（米国特許第６，０６９，０１０号）またはＬａｍｂおよびＧｅａｒｈａｒｔ、Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎ．Ｄｅｖ  ５．３４２−３４８（１９９５）に記載されるようにリポフェクションにより；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、ｐｐ９．１６．４〜．９．１６．１１（２０００）またはＣｉｂｅｌｌｉら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：６４２−６４６（１９９８）に記載されるようにエレクトロポレーションにより；あるいは、酵母スフェロプラストとの融合により（ＬａｍｂおよびＧｅａｒｈａｒｔ、Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎ．Ｄｅｖ．５：３４２−３４８（１９９５））、形質転換され得る。
【０１２９】
バイオマーカーポリペプチド（例えば、Ａｐａｆ１、Ｂｃｌ−２、またはＳｍａｃ）、または癌細胞の増殖を減少させるのに有用な他の分子をコードする核酸は、当該分野で周知の適切なベクターを用いて、インビボまたはインビトロのいずれかで、哺乳動物細胞に送達され得る。バイオマーカーポリペプチドをコードする核酸を哺乳動物細胞に送達するのに適切なベクターとしては、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクター（例えば、プラスミドベクター）が挙げられる。このようなベクターは、治療量のバイオマーカーポリペプチド（例えば、Ａｐａｆ１、Ｂｃｌ−２、またはＳｍａｃ）を提供するため、ならびにアンチセンス核酸分子およびリボザイムを送達するために有用である。
【０１３０】
ウイルスベースの系は、種々の細胞に比較的高レベルの異種核酸を導入し得るという利点を提供する。バイオマーカーポリペプチド（例えば、Ｂｃｌ−２、Ｓｍａｃ、またはＡｐａｆ１）をコードする核酸を哺乳動物細胞に導入するのに適切なウイルスベクターは、当該分野で周知である。これらのウイルスベクターとしては、例えば、単純疱疹ウイルスベクター（Ｇｅｌｌｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１：１６６７−１６６９（１９８８））；ワクシニアウイルスベクター（Ｐｉｃｃｉｎｉら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５３：５４５−５６３（１９８７））；サイトメガロウイルスベクター（Ｍｏｃａｒｓｋｉら、Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｙ．ＧｌｕｚｍａｎおよびＳ．Ｈ．Ｈｕｇｈｅｓ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８８、ｐｐ．７８−８４））；モロニーマウス白血病ウイルス（Ｄａｎｏｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：６４６０−６４６４（１９８８）；Ｂｌａｅｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０：４７５−４７９（１９９５）；Ｏｎｏｄｅｒａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７２：１７６９−１７７４（１９９８））；アデノウイルスベクター（Ｂｅｒｋｎｅｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６：６１６−６２６（１９８８）；Ｃｏｔｔｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：６０９４−６０９８（１９９２）；Ｇｒａｈａｍら、Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、７：１０９−１２７（１９９１）；Ｌｉら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、４：４０３−４０９（１９９３）；Ｚａｂｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、６：７５−８３（１９９４））；アデノ随伴ウイルスベクター（Ｇｏｌｄｍａｎら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１０：２２６１−２２６８（１９９７）；Ｇｒｅｅｌｉｓｈら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、５：４３９−４４３（１９９９）；Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６：３９０６−３９１０（１９９９）；Ｓｎｙｄｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、５：６４−７０（１９９９）；Ｈｅｒｚｏｇら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、５：５６−６３（１９９９））；レトロウイルスベクター（Ｄｏｎａｈｕｅら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、４：１８１−１８６（１９９８）；Ｓｈａｃｋｌｅｆｏｒｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：９６５５−９６５９（１９８８）；米国特許第４，４０５，７１２号、同第４，６５０，７６４号、および同第５，２５２，４７９号、ならびにＷＩＰＯ公開ＷＯ９２／０７５７３、ＷＯ９０／０６９９７、ＷＯ８９／０５３４５、ＷＯ９２／０５２６６、およびＷＯ９２／１４８２９；ならびにレンチウイルスベクター（Ｋａｆｒｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１７：３１４−３１７（１９９７））が挙げられる。永久的発現および一過的発現の両方が、本発明の方法において有用であり得ることが理解される。
【０１３１】
Ａｐａｆｌポリペプチド、Ｂｃｌ−２ポリペプチドまたはＳｍａｃポリペプチドをコードする組換え核酸は、例えば、ベクター標的性遺伝子発現または組織限定的遺伝子発現によって、特定の組織または器官系に指向され得る。従って、Ａｐａｆｌポリペプチド、Ｂｃｌ−２ポリペプチドまたはＳｍａｃポリペプチドをコードする核酸の治療投与のために有用なベクターは、ポリペプチドの組織特異的発現を提供する調節エレメントを含み得る。例えば、Ａｐａｆｌポリペプチド、Ｂｃｌ−２ポリペプチドまたはＳｍａｃポリペプチドをコードする核酸配列は、細胞特異的プロモーターに作動可能に連結され得る。
【０１３２】
任意の種々の誘導可能なプロモーターまたはエンハンサーもまた、本発明の核酸またはベクター中に含まれ得、これらは、Ａｐａｆｌポリペプチド、Ｂｃｌ−２ポリペプチドまたはＳｍａｃポリペプチド、あるいは細胞増殖を調節するために有用な別の分子（例えば、アンチセンス核酸分子またはリボザイム）の発現を、追加刺激または追加分子によって制御することを可能にする。このような誘導可能な系としては、例えば、以下が挙げられる：テトラサイクリン誘導系（ＧｏｓｓｅｎおよびＢｉｚａｒｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７−５５５１（１９９２）；Ｇｏｓｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：１７６６−１７６９（１９９５）；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）；重金属によって誘導されるメタロチオネンプロモーター；エクジソンまたは関連ステロイド（例えば、ムリステロン（ｍｕｒｉｓｔｅｒｏｎｅ））に応答性の昆虫ステロイドホルモン（Ｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：３３４６−３３５ｌ（１９９６）；Ｙａｏら、Ｎａｔｕｒｅ，３６６：４７６−４７９（１９９３）；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）；グルココルチコイドおよびエストロゲンのようなステロイドによって誘導されるマウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）（Ｌｅｅら、Ｎａｔｕｒｅ，２９４：２２８−２３２（１９８１）；ならびに、温度変化によって誘導可能な熱ショックプロモーター。
【０１３３】
治療投与のために特に有用な誘導可能な系は、個体に投与される所定の薬物レベルに応答して、治療用生成物レベルを送達し、かつその薬物の非存在下において治療用生成物の発現をほとんど有さないかまたは全く有さないように、調節され得る誘導可能なプロモーターを利用する。１つのこのような系は、改変したアデノウイルスベクター中で、ミフェプリストンのような抗黄体ホルモンによって誘導可能であるＧａ１４融合体を利用する（Ｂｕｒｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：３５５−３６０（１９９９）。ＧＥＮＥ  ＳＷＩＴＣＨの誘導可能な発現系（米国特許第５，９３５，９３４号および同第５，８７４，５３４号）は、このような系の一例である。他の誘導可能な系は、アデノ随伴ウイルスベクターにおいて、ＦＫＢＰ１２およびＦＲＡＰのラパマイシン結合ドメインを含有する転写性アクチベータの再構築を誘導するために、薬物ラパマイシンを使用し（Ｙｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８３：８８−９１（１９９９））、転写を制御するためにテトラサイクリンを使用し（Ｂａｒｏｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：２７２３−２７２９，（１９９７））、そして、遺伝子発現を調節するために合成二量体（ｄｉｍｅｒｉｚｅｒ）を使用する（Ｐｏｌｌｏｃｋら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３０６：２６３−２８１（１９９９））。このような調節可能で誘導可能な系が、有利である。なぜなら、治療用生成物の発現レベルが、個体に投与される薬物の量によって制御され得るか、または所望の場合、この治療生成物の発現が、薬物の投与を停止することによって終結され得るからである。
【０１３４】
本発明の種々の実施形態の活性化に実質的に影響しない改変もまた、本明細書中に適用される本発明の定義内に包含されることが、理解される。従って、以下の実施例は、本発明の例示と解釈されるが、本発明を限定しない。
【実施例】
【０１３５】
（実施例Ｉ）
（ＩＡＰおよびＡｐａｆｌの免疫検出のための抗体の作製）
この実施例は、ＩＡＰおよびＡｐａｆｌを検出するために有用な抗体の調製および特徴付けを示す。
【０１３６】
サルビビン、ＸＩＡＰ、Ａｐａｆｌ、ＡＩＦおよびＳｍａｃの免疫検出のために、抗血清を、組換えタンパク質および合成ペプチドに対して惹起した。癌を分析するためにこれらの抗体を使用する前に、これらの抗体の意図したタンパク質標的に対する特異性を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／免疫ブロット分析によって確認した。データの例を、図３に与える。図３Ａは、インビトロで翻訳された、サルビビン、ＸＩＡＰ、ｃＩＡＰ１、ｃＩＡＰ２、ＮＡＩＰ、ＢＲＵＣＥを示し、バキュロイウイルスＣｐ−ＩＡＰタンパク質を、ポリクローナルＸＩＡＰ抗血清（ＡＲ−２７Ａ）を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／免疫ブロット分析に供した。ＸＩＡＰ抗血清とのインキュベーションは、インビトロで翻訳されたタンパク質のうちＸＩＡＰのみを検出した。界面活性剤溶解物を、種々の正常なヒト組織から調製し、全タンパク質含有量（５０μｇ）について正規化し、そしてサルビビン（Ｂ）、Ａｐａｆｌ（Ｃ）、ＳＭＡＣ（Ｄ）またはＡＩＦ（Ｅ）に特異的な抗血清を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／免疫ブロットアッセイに供した；分子量マーカーを、キロダルトン（Ｆ）で示した。さらに、結腸癌（Ｔ）検体および正常な結腸粘膜（Ｎ）検体の５つの対応する対からの溶解物を、全タンパク質含有量（１レーンあたり１００ｍｇ）について分析し、そしてｃ−ＩＡＰ１、ｃ−ＩＡＰ２、ＸＩＡＰ、サルビビン、Ａｐａｆ−１、およびＴＵＣＡＮ（Ｇ）に特異的な抗血清を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／免疫ブロット分析に供した。抗体検出を、ＥＣＬ方法によって実施した。免疫ブロットデータを、Ｐｒｏ−Ｉｍａｇｅソフトウエアシステムを使用するスキャニングデンシトメトリーによって、定量した。
【０１３７】
抗ＸＩＡＰ抗血清は、予測された約５７ｋＤａのＸＩＡＰタンパク質と特異的に反応したが、他のＩＡＰファミリーメンバー（サルビビン、ｃＩＡＰ１、ｃＩＡＰ２、ＮＡＩＰ、ＢＲＵＣＥ、およびバキュロウイルスＣｐ−ＩＡＰを含む）（これら全てを、ｃＤＮＡからのインビトロ転写および翻訳によって作製した）とは反応しなかった（図３Ａ）。同様に、抗サルビビン抗血清の単一特異性（ｍｏｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を、組換えＩＡＰファミリーメンバーのタンパク質、ならびにサルビビンタンパク質を発現する腫瘍細胞株に対して、サルビビン  ｍＲＮＡおよびタンパク質を欠いた正常細胞由来の溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ／免疫ブロット分析によって実証した（図３Ｂ）。抗Ｓｍａｃ抗血清は、ＧＳＴ−Ｓｍａｃ組換えタンパク質に対して特異的な反応性を示した（図３Ｃ）。この抗体は、ＲＳ１１細胞およびＪｕｒｋａｔ細胞、ならびに数種のヒト組織（例えば、表皮、脳および精巣）において、多量のＳｍａｃタンパク質を検出した。正常結腸においてわずかに検出可能なＳｍａｃレベルは、結腸癌溶解物における相対的に多量のこのタンパク質とは、対照的であった。
【０１３８】
サルビビン、Ａｐａｆｌ、ＸＩＡＰおよびＳｍａｃに対するポリクローナル抗血清を、組換えタンパク質免疫原を用いてウサギ内で作製した。サルビビン（全長タンパク質）およびＡｐａｆｌ（２６４〜２８２残基）を、宿主株として大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を使用して、ｐＧＥＸベクター由来のＧＳＴ融合タンパク質として生成した。このタンパク質精製方法は、以前に記載されている。さらなる抗Ａｐａｆ−１血清を、免疫原として合成ペプチドを使用して、ウサギ内で作製した。マレイミド活性化キャリアタンパク質であるＫＬＨおよびＯＶＡ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｉｎｃ．）への結合体化を可能にするように付加されたＮ末端システインを有する、ヒト（ｈｕ）Ａｐａｆ−１の２６４〜２８２残基に対応するペプチド（ＮＨ２−ＣＧＰＫＹＶＶＰＶＥＳＳＬＧＫＥＫＧＬＥ−アミド（配列番号１５））を、合成した。このペプチド結合体を使用して、ポリクローナル抗血清（ＡＲ−２３）をウサギ内で作製した。アフィニティー精製したＨｉｓ６タグ化ＸＩＡＰ  ＢＩＲ２組換えタンパク質を、公式の方法を使用して生成し、そしてこれを免疫原として使用して、ＸＩＡＰ特異的抗血清（ＡＲ−２７Ａ）を作製した。抗ＡＩＦ血清を、ヒトＡＩＦの１５１〜１７０残基に対応する合成ペプチドを使用して、ウサギ内で作製した。ニュージーランド白色雌性ウサギに、０．２５ｍｌのＫＬＨペプチド（１ｍｇ／ｍｌ）、０．２５ｍｌのＯＶＡペプチド（１ｍｇ／ｍｌ）、または組換えタンパク質（１回の免疫付与あたり、０．１〜０．２５μｇのタンパク質）および０．５ｍｌのフロイント完全アジュバント（１０ヶ所の注射部位にわたって分割された用量）の混合物を皮下注射し、次いで、１週間の間隔を空けて３回ブーストし、続いて１ヶ月の間隔を空けて、フロイント不完全アジュバント中、ＫＬＨペプチド、ＯＶＡペプチド、または組換えタンパク質の免疫原を各々０．２５ｍｇ用いて、さらに３〜２０回ブーストし、各ブーストの１〜３週間後に血液を収集して、免疫血清を得た。Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｂａｘ、およびＴＵＣＡＮの特異的抗血清の作製は、記載されている。抗ｃ−ＩＡＰ１抗体および抗ｃ−ＩＡＰ２抗体を、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．，ＣＡ  ａｎｄ  Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から得、β−カテニン抗血清をＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得、そしてｐ５３クローンＤＯ−７抗血清、ＭＩＢ−１抗血清、およびＢＡＧ１クローンＫＳ−６Ｃ８抗血清を、ＤＡＫＯから得た。
【０１３９】
（実施例ＩＩ）
（正常な結腸粘膜および結腸癌におけるＩＡＰおよび他の生物マーカーの免疫組織化学分析）
この実施例は、１０２人の個体から得た組織サンプルを表す組織マイクロアレイにおける、ＩＡＰおよび他の生物マーカーの免疫組織化学分析を示す。
【０１４０】
組織マイクロアレイを、第ＩＩ期疾患（ＤｕｋｅｓのＢ段階）を示す、相対的に同種のコホートの１０２人の患者由来の初代腫瘍検体を使用して、単一の施設に構築した。患者を、治療目的で、外科的切除によって処置した。結腸癌検体を、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｙｏｎｓｅｉ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａから得た。サンプルを、ＤｕｋｅｓのＢ段階［Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｕｎｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｅ  Ｃｏｎｔｒｅ  ｌｅ  Ｃａｎｃｅｒ（ＡＪＣＣ／ＵＩＣＣ）基準によって規定されるような、第ＩＩ期疾患]を有する、１９８６年と１９９６年との間に生存した患者由来の５つの初代の腫瘍から採取した。ＤｕｋｅｓのＢ２段階（Ｔ３Ｎ０Ｍ０）を有する患者が、コホートの９１％を構成したのに対して、９％は、ＤｕｋｅｓのＢ３段階（Ｔ４Ｎ０Ｍ０）である癌に罹患した。全ての患者を、結腸に関連した断片の外科的切除によって処置した。手術後のアジュバント化学療法を、全ての場合において初めから行ったわけではなかった。しかし、化学療法を、数人の患者について、再発後に投与した。臨床データは、６０ヶ月までの追跡のメジアンを表す。
【０１４１】
結腸癌マイクロアレイを構築するために、１ｍｍ直径の組織の２〜５個のシリンダーを、８％ホルマリン固定化した腫瘍を含有するアーカイバル（ａｒｃｈｉｖａｌ）パラフィンブロックの代表的な領域から採取し、そして新たなレシピエントパラフィンブロック中に、特注の精密機器（Ｂｅｅｃｈｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ，ＭＤ）を用いて整列させた。連続的な切片（４μｍ）を、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＥＳ）でコーティングしたスライド（Ｓｉｇｍａ）に適用した。
【０１４２】
ＩＡＰファミリーメンバーであるサルビビン、ＸＩＡＰ、ｃＩＡＰ１、およびｃＩＡＰ２（Ｆｉｇｕｒｅ  １Ａ）、ならびに他のマーカー（例えば、Ａｐａｆｌ、Ｓｍａｃ、ＡＩＦ、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｂａｘ、ＢＡＧ１、β−カテニン、ＭＩＢ−１、およびｐ５３）に特異的な抗血清を使用して、マイクロアレイを免疫染色した。脱ろうした組織切片を、自動免疫染色器（Ｄａｋｏ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）を使用するＥｎｖｉｓｉｏｎ−Ｐｌｕｓ−Ｈｏｒｓｅ  Ｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）システム（ＤＡＫＯ）を用いる、詳細に記載したジアミノベンジジン（ＤＡＢ）ベースの検出方法を使用して、免疫染色した。サルビビン、ＸＩＡＰ、Ａｐａｆｌ、ＴＵＣＡＮ、ＡＩＦ、Ｓｍａｃ、Ｂａｘ、およびＢｉｄに特異的な抗血清を、１：３０００〜１：１００００（ｖ／ｖ）で適用し、Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ＸＬに特異的な抗血清を、１：２０００（ｖ／ｖ）で適用した。ｃ−ＩＡＰ１抗体、ｃ−ＩＡＰ２抗体およびβ−カテニン抗体の希釈は、１：６００（ｖ／ｖ）であり、ＢＡＧ１抗体およびＭＩＢ−１抗体の希釈は、１：１００であり、そしてｐ５３抗体の希釈は、１：５０であった。試験した全ての組織について、免疫染色手順を、免疫前血清を並列して使用して行い、結果の特異性を検証した。抗体特異性の初期確認はまた、５〜１０μｇ／ｍｌの合成ペプチド免疫原または組換えタンパク質免疫原のいずれかを用いて血清を予め吸収する実験を含んだ。腫瘍免疫染色のスコア付けは、染色強度スコア（０／１／２／３）を掛けた免疫陽性細胞の割合（０〜１００）に基づき、０〜３００のスコアを得た。全ての免疫染色の結果を、免疫陽性細胞のおよその割合（０〜１００％）および０〜３スケールに対する免疫強度に従って定量し、次いで、免疫スコアを、免疫陽性度％および免疫強度の結果（０〜３００）から算出した。
【０１４３】
組織切片を、上記のように、種々の抗血清を使用して、免疫染色し、続いて、ジアミノベンジジン比色基質（褐色）を用いるＨＲＰａｓｅベースの方法を使用して、検出した。核を、ヘマトキシリン（青色）を用いて対比染色した。代表的なデータを、図１に示す。図１Ａは、ｃＩＡＰ２について染色した結腸癌のマイクロアレイスライドを示す（×５倍の拡大率）。正常な結腸上皮免疫染色の例を、ｃＩＡＰ１（Ｂ；×１００）、サルビビン（Ｄ；×１５０）、Ｓｍａｃ（Ｅ；×１５０）、ＡＩＦ（Ｇ；×１５０）、およびＴｕｃａｎ（Ｋ；×２０）について示す。浸潤癌の領域における免疫染色の結果を、Ｓｍａｃ（Ｆ；×４００）、ＡＩＦ（Ｈ；×２５０）、Ａｐａｆｌ（Ｉ、Ｊ；×２００）、ＴＵＣＡＮ（Ｌ  ×２０；Ｍ  ×４００）、およびＢｃｌ−２（Ｎ；×１５０）について示す。悪性結腸上皮、およびその隣接の正常結腸上皮の例を、ｃＩＡＰ２（Ｃ；×４０）、ｐ５３（Ｏ；×１５０）およびＭＩＢ−１（Ｐ；×４００）について示す。
【０１４４】
アレイ上の１０２人の腫瘍検体のうちのいくつか（約６５％）が、特定のスライドに依存して、隣接性の正常な結腸粘膜（５９〜７０）を含み、これにより、正常上皮  対  悪性上皮についての免疫染色結果を並べて比較することが可能になる。さらに、結腸癌を有するとは診断されていない個体由来の正常結腸の４検体を、別々に染色した。ｃＩＡＰ１タンパク質およびｃＩＡＰ２タンパク質に対する免疫反応性を、試験した正常な結腸粘膜検体の、それぞれ、６２／６２（１００％）および３４／６５（５２％）において検出した。非悪性上皮におけるｃＩＡＰ１染色の強度は、陰窩の基底から管腔表面まで徐々に増加した（図１Ｂ）。対照的に、ｃＩＡＰ２の低い免疫反応性が、陰窩−絨毛軸に沿って、より均一に分布したが、しばしば絨毛の上方領域における免疫強度のわずかな増加が、明らかであった。ＸＩＡＰはまた、非悪性結腸上皮において発現され（６３／６３［１００％］）そして、これは、ｃＩＡＰ１と類似の勾配で分布し、ＸＩＡＰ免疫反応性は、絨毛の上方部分において、最も高かった。低強度のサルビビン免疫染色が、正常な結腸上皮を含有する検体の６０／６２（９７％）において存在した。サルビビン免疫反応性は、優勢には、陰窩上皮細胞の核であり、そして免疫強度を徐々により増加させ、そして優勢には、陰窩−絨毛軸に沿って管腔表面に向かう、細胞質であった（図１Ｄ）。正常な結腸粘膜におけるＡｐａｆ１の免疫組織化学分析は、検体の５８／６０（９７％）における免疫反応性の存在を明らかにした。Ａｐａｆｌの免疫反応性は、正常な結腸上皮細胞における核周囲および細胞質位置において、優勢に存在し、その強度は、細胞が陰窩基底から絨毛の上方に移動するにつれて、わずかに増加した。Ａｐａｆｌと一緒に、Ｓｍａｃタンパク質の細胞内濃度は、正常な結腸粘膜検体の５８／６２（９４％）において、管腔表面に向かって増加した（図１Ｅ）。相対的に高度な主に顆粒状のＡＩＦ細胞質発現は、１００％の検体（６０／６０）において、結腸陰窩に沿って均一に分布した（図１Ｇ）。これらの免疫染色結果の特異性を、免疫前血清または同等の免疫原で予め吸収させた免疫抗血清のいずれかを使用して行うコントロール染色によって確認した。
【０１４５】
マイクロアレイによる腫瘍組織の免疫組織学化学分析は、これらのアポトーシス調節タンパク質の発現における、癌特異的な変更のいくつかの例を明らかにした。図１は、腫瘍検体についての免疫染色結果のいくつかの例を示す。全ての調査したタンパク質に関して、免疫染色の平均強度は、正常な結腸上皮と比較して、浸潤癌において有意により高かった（図１Ｃ、Ｅ〜Ｆ、Ｋ〜Ｍ、Ｏ、Ｐ）（ただし、Ｂｃｌ−２、Ｂａｘ、およびＡＩＦ（図１Ｇ、Ｈ）を除く）。さらに、免疫染色の結果は、試験した検体の間で広範に変化したが、癌の検体の一部の免疫スコアは、正常な検体と比較した場合、免疫反応性において明らかな上昇を示す群内でクラスター形成した。例えば、全ての結腸検体は、２００未満のｃＩＡＰ１免疫スコアを有したが、９４個の浸潤癌検体のうち３５個（３７％）は、２００の免疫スコアを有し（ｐ＜０．０００１）、従って、これらのことは、結腸癌の亜群が、この抗アポトーシスタンパク質のレベルの病理学的上昇を生じさせることを示唆する。同様に、ｃＩＡＰ２免疫スコアは、正常な結腸上皮について、１００未満であり、浸潤癌とは対照的に、９４個のうちの２５個（２７％）が、１００より高い免疫スコアを有した（ｐ＜０．０００１）。同様に、全ての正常な結腸上皮サンプルが、ＸＩＡＰについて、１９０未満の免疫スコアを有したが、一方、浸潤癌の９７個のうちの３４個（３５％）が、１９０より高いＸＩＡＰ免疫スコアを有した（ｐ＜０．０００１）。非悪性上皮についてのサルビビン免疫スコアは、１９０未満であり、浸潤癌と比較して、１９０より高いスコアが、１００人の検体のうちの３３人（３３％）について、見出された（ｐ＜０．０００１）。Ａｐａｆｌについて、免疫スコアの２つのクラスターが、正常上皮と悪性上皮の両方について現れた。大部分の正常な結腸検体（５０／６０；８３％）は、１００未満の免疫スコアを有した。腫瘍において、同様に低い免疫スコア（１００未満）を有する検体の群が、観察されたが（６４／１０２；６３％）（図１Ｊ）、免疫スコアが１００を超えて（１４０〜２８０の範囲）クラスター形成する、癌のさらなる群（３８／１０２；３７％）を、同定した（図１Ｉ）。これらの結果は、試験した全ての生物マーカーについて、発現の腫瘍関連アップレギュレーションの証拠が、評価された癌検体の一部において観察されたことを示す。
【０１４６】
ｃＩＡＰ２、サルビビン、およびβ−カテニンの上昇したレベルは、高いＫｉ−６７標識指標（それぞれｐ＝０．００６、ｐ＝０．００５、およびｐ＝＜０．０００１）と相関する。統計学的分析は、サルビビンのレベルとＸＩＡＰおよびｃＩＡＰ１（ｐ＝０．０１）またはｃＩＡＰ２（ｐ＝０．００８）のレベルとの間に有意な相関があることを明らかにした。サルビビンの上昇したレベルは、Ｂｃｌ−２の高発現と関連していた。ｃＩＡＰ２およびＴＵＣＡＮ（ｐ＝０．００３）の発現の間のポジティブな相関は、観察されたポジティブな影響と一致し、低レベルのこれらのタンパク質の組み合わせは、本発明者らの結腸癌患者のコホートにおいて生存性を有する。しかし、ＴＵＣＡＮとＢｃｌ−２またはＡＩＦとの間の逆相関は、統計学的な有意性に達しなかった。ｃＩＡＰ２とＡｐａｆｌまたはＢｃｌ−２との間に有意な関連は見出されなかった。本発明者らのコホートにおいて良好な予後マーカーであることが示唆されるＢｃｌ−２は、いくつかのプロアポトーシスタンパク質（例えば、Ａｐａｆｌ（ｐ＜０．０００１）、ＡＩＦ（ｐ＝０．００２）およびＳｍａｃ（ｐ＝０．００８））と有意に相関するだけでなく、乳癌（＃７８７４）の初期段階での長期間の生存を予想することが発見されている抗アポトーシスＢＡＧ１タンパク質とも相関する。その８０％がｐ５３点ミスセンス変異に関連するｐ５３の増加した核濃度は、Ｂｃｌ−ＸＬ（ｐ＜０．０００１）の発現の増加と相関した。
【０１４７】
（実施例ＩＩＩ）
（結腸癌におけるＩＡＰｓおよびＡｐａｆｌの免疫ブロット分析）
この実施例は、５つの凍結した結腸癌標本におけるＩＡＰｓ、Ａｐａｆ１および他のアポトーシスレギュレーターの免疫ブロット分析を示す。
【０１４８】
免疫組織化学的データを確認するために、５つの凍結した結腸癌標本が、ＩＡＰｓ、Ａｐａｆｌ、および他のタンパク質について特異的な抗体を用いて免疫ブロット分析について、十分な量の隣接する正常な（Ｎ）組織および腫瘍（Ｔ）組織の両方を有することを同定した。これらの組織標本の界面活性剤溶解物を調製し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ／免疫ブロット分析の前に総タンパク質含量について標準化した（図３Ｅ）。デンシトメトリー（Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙ）分析をまた実行して、バンド強度を定量し、そしてローディングコントロールブロットからの結果を使用して、全てのデータを標準化した（図３Ｆ）。
【０１４９】
支質に対する癌細胞の割合が高い（＞７０％）を有する結腸癌標本（ｎ＝１０）を、免疫ブロット分析について選択した。このタンパク質溶解物を、さらなる顕微解剖または分別せずに調製した。同じ患者由来の腫瘍溶解物、および正常な粘膜のサンプルを、完全なプロテアーゼインヒビターカクテル（ＳＩＧＭＡ）、Ｐａｎ−カスパーゼインヒビター、ｚ−Ａｓｐ−２．６−ジクロロベンゾイルオキシ−メチルケトンおよびＺＶＡＤ−ｆｍｋを含む改変したＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ  トリス［ｐＨ  ７．４］、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２５％  Ｎａ−デオキシコレート、１％  ＮＰ４０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）を用いて調製し、総タンパク質含量（１００μｇ）に対して標準化し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％および１５％ゲル）により解析した。タンパク質定量を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて実行した。タンパク質を、ＰＶＤＦ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にトランスファー（１５０  ｍＡ、４℃、一晩）した。室温で２時間、５％スキムミルクを含むＴＢＳＴ（５０ｍＭ  トリス［ｐＨ  ７．６］、１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）中でブロッキングした後、ブロットを、４℃で１：１，０００〜１：１０，０００（ｖ／ｖ）の希釈を用いて、特定のＩＡＰファミリーメンバー（ＡｐａｆｌおよびＴＵＣＡＮ）に特異的な抗血清と伴に一晩インキュベートした。ＨＲＰａｓｅ−結合体化２次ヤジ抗ウサギ（Ｂｉｏ−ＲａｄまたはＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚのいずれかの）抗体と伴に室温で１時間インキュベートした後、免疫検出を、Ｘ線フィルム（Ｋｏｄａｋ／ＸＡＲ）への曝露と伴に、増強した化学蛍光（ＥＣＬ）方法（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって達成した。デンシトメトリーを実行して、Ｉｍａｇｅ−ｐｒｏ  Ｐｌｕｓソフトウェアを用いてバンドの強度を定量した。
【０１５０】
より高いレベルのｃＩＡＰ２、ＸＩＡＰ、サルビビンおよびＡｐａｆｌを、上昇した全ての標本において検出し、ケースが一致した正常組織と比較した。ｃＩＡＰ１タンパク質、および抗アポトーシスタンパク質ＴＵＣＡＮのレベルは、正常な標本と比較していくつかの腫瘍標本において上昇していたが、他では上昇していなかった。二次ＥＣＬ抗体（Ｂｉｏｒａｄ）を用いたプレブロッキング手順の間に得られた非特異的バンドを、ローディングコントロールとして供給した。
【０１５１】
免疫ブロッティングの結果は、実施例ＩＩ（図１Ｅ、Ｆ）に記載される免疫組織化学的観察を確認した。より高いレベルのｃＩＡＰ２、ＸＩＡＰ、サルビビンおよびＡｐａｆｌを、ケースが一致した正常な組織と比較して上昇したレベルを全ての標本について検出した。ｃＩＡＰ１およびＴＵＣＡＮのレベルは、正常な標本と比較していくつかの腫瘍標本で上昇していたが、他のものでは上昇していなかった。
【０１５２】
（実施例ＩＶ）
（臨床学的結果とタンパク質発現との相関）
患者の生存とバイオマーカーとの関連を分析するために、図３に示される正常な結腸上皮および結腸癌について得られた免疫供給源の比較を使用して、データの二分化について理論的なカットオフ（ｃｕｔ−ｏｆｆ）を設定した。
【０１５３】
臨床学的データは、５年までのメジアンで、再発および全体的な生存に関する組織マイクロアレイに関する全ての患者標本について利用可能であった。患者を以下のように分類した：（ｉ）疾患を有さずに生存（Ａ）；（ｉｉ）再発性の疾患を有して生存（Ｒ）；または（ｉｉｉ）死（Ｄ）。表２に示されるように、Ａ、Ｒ、およびＤグループの患者を比較した場合に、ｃＩＡＰ１、ＸＩＡＰまたはサルビビンについての免疫スコアにおいて有意な差異は観察されなかった。ｃＩＡＰ２免疫染色は、疾患で死亡（Ｄ）したか、または手術後再発（Ｒ）したかのいずれかの結腸癌患者に置いて有意に高かった（ｐ＜０．０００１）。対照的に、Ａｐａｆｌについての免疫スコアは、疾患を有さずに生存している患者と比較して、再発（Ｒ）または死（Ｄ）した患者のグループにおいて有意に低かった（表２）（ｐ＜０．０００１）。不対のｔ検定方法を、Ａ、Ｒ、およびＤグループの患者におけるＸＩＡＰ、サルビビン、ｃＩＡＰ１、ｃＩＡＰ２、およびＡｐａｆｌ免疫スコアの比較のために使用した。Ｐ値は、組み合わせた群ＲおよびＤと群Ａとの比較をいう。
【０１５４】
（表２：結腸癌患者についての免疫染色結果の要約）
【０１５５】
【表２】
2005501225.tif 000007
別の方法によって患者の生存に対するバイオマーカーの関係を分析するために、これらのタンパク質についての免疫染色データを、高い発現群  対  低い発現群に二分化した。この目的のために、図２に示される結腸上皮および結腸癌について得られた免疫スコアの比較を使用して、データの二分化についての理論的なカットオフを設定した。正常な結腸上皮および悪性の結腸上皮についての免疫スコアを、図２にグラフの形態で描写した。正常な結腸上皮との比較に基づいて、二分化免疫染色データについてのカットオフを選択した。９５％の正常な標本についての免疫スコアの範囲は、ｃＩＡＰｌ、ｃＩＡＰ２、ＸＩＡＰ、サルビビン、Ｂｃｌ−ＸＬおよびＢＡＧ１について低い免疫スコアを有する腫瘍の群を規定した。タンパク質の複峰性二分化は、Ｂａｘ、ＡｐａｆｌおよびＴＵＣＡＮについてのカットオフの同定を補助した。  Ｂｃｌ−２、Ｂｉｄ、ＡＩＦ、Ｓｍａｃおよびβ−カテニンについてのカットオフとしての中央免疫スコアの適用は、低発現体（ｅｘｐｒｅｓｓｏｒ）および高発現体への腫瘍のサブカテゴライズ（ｓｕｂｃａｔｅｇｏｒｉｓａｔｉｏｎ）における正確性を増大させた。ｐ５３およびＭＩＢ−１についてのヒストグラムは、免疫パーセンテージを示し、これは＞０％のケースを高ｐ５３発現体として分類し、そして＝２０％を高レベルのＭＩＢを発現する発現体として分類した。
【０１５６】
この方法に基づいて、高レベルのＡｐａｆｌ、ＴＵＣＡＮ、サルビビン、ＸＩＡＰ、ｃＩＡＰｌ、およびｃＩＡＰ２を、それぞれ３８％、４９％、５４％、７４％、６１％および３５％の腫瘍標本において見出した。一変量分析において、有意な相関を、このコホートにおいて、より長い疾患に罹患していない生存（ＤＦＳ）と低発現のｃＩＡＰ２（ｐ＝０．０００２）、ＴＵＣＡＮ（ｐ＝０．０００４）、β−カテニン（ｐ＝０．０４）、変異ｐ５３タンパク質（ｐ＝０．０３）、または高レベルのＡｐａｆｌ（ｐ＝０．００００８）、Ｂｃｌ−２（ｐ＝０．００５）、およびＳＭＡＣ（ｐ＝０．０３）との間で観察した（図４ａ）。従って、その腫瘍が低レベルのＴＵＣＡＮを含む患者の７８％（３９／５０）は生存し続け、そして高発現のこのタンパク質を有する患者の４４％（２１／４８）のみと比較して、この研究によって網羅される時間の間疾患を有さない。同様に、７４％（４５／６１）の低ｃＩＡＰ２発現体は、３６％（１２／３３）のみの高ｃＩＡＰ２レベルを有する発現体と比較して最後の手術時に結腸癌のない人生が約束されている。対照的に、高レベルのＡｐａｆｌは、結腸癌患者のこのコホートにおけるより長い生存と関連しており、患者の３３／３８（８７％）は、低いＡｐａｆ１発現を伴なう結腸癌患者の２８／６２（４５％）のみと比較して、疾患がないままである。
【０１５７】
全体的な生存性の最も有意な改善を、その結腸癌標本が低レベルのＴＵＣＡＮ（ｐ＜．０００１）を含む患者のグループにおいて観察した（図４ｂ）。患者の５４％（２６／４８）の患者が高レベルのＴＵＣＡＮタンパク質を示すことに対して、低いＴＵＣＡＮを発現する５０人の患者の間で、４％（２／５０）のみが死亡した。有意な相関をまた、より長い全体的な生存と低ｃＩＡＰ２（ｐ＝０．０１）または低変異ｐ５３タンパク質（ｐ＝０．０３）との間で観察した。低いＢｃｌ−２レベルは、全体的な乏しい生存と関連していた。このタンパク質の低い発現を有する１８人の患者のうち、高Ｂｃｌ−２群（１８／７６）で死亡した２４％の患者と比較して、１１人（６１％）が結腸癌で死亡した。同様に、その腫瘍が低いＡｐａｆｌ染色を含む患者は、Ｂｃｌ−２を過剰発現する患者と比較してより劣悪な全体的な生存を有していた（図１Ｎ）。
【０１５８】
Ｂｃｌ−２の上昇したレベルは、全体的な生存（ｐ＝０．０００８）および疾患を有さずに生存（ｐ＝０．００５）の両方について優位な利点を与えた。その腫瘍が高Ｂｃｌ−２を明らかにする７６人の患者のうち、低Ｂｃｌ−２レベルを有する３９％および３３％の患者と比較して、５８人（７６％）が生存し、そして５０人（６６％）が再発しなかった。その抗アポトーシス機能に依存せずに、Ｂｃｌ−２は、細胞周期への移行を遅延し得、そしてその周期からの細胞の退去を促進し得る。従って、臨床学的結果におけるＢｃｌ−２のポジティブな効果は、その細胞周期阻害の役割に関連し得る。
【０１５９】
図４は、疾患を伴なわない生存（Ａ）および結腸癌患者についての全体的な生存（Ｂ）とのバイオマーカーの免疫染色データの相関を示す。全てのバイオマーカーデータおよび結果測定を、ＳＴＡＴＩＳＴＩＣＡソフトウェアシステム（ＳｔａｔＳｏｆｔ）を用いてデータベースに入力した。ｌｏｇランクテストを、患者の生存についての免疫スコアデータの相関について使用した。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線は、患者のこのコホートについての生存と研究されたバイオマーカーとの相関を例示する。
【０１６０】
要約すると、５年までのメジアンで、高いｃＩＡＰ２レベルを有する患者の６０％が再発し、そして４６％が結腸癌で死亡した。その一方で、低ｃＩＡＰ２群において、２０％が再発し、そして１８％が結腸癌に関連して死亡した。同じ時間で、ＴＵＣＡＮの高い発現を伴なう患者の４９％は、再発するか、または結腸癌で死亡し、そしてその腫瘍が低レベルのこのタンパク質を発現した患者のグループにおいて１９％のみが再発し、そして４％が疾患で死亡した。対照的に、低いＡｐａｆｌを有する患者の４３％が再発し、そして３５％が結腸癌で死亡した。その一方で１４％のみが癌を再発するか、または高いＡｐａｆｌコホートで死亡した。従って、これらの発見は、高レベルの抗アポトーシスタンパク質ｃＩＡＰ２および低レベルのプロアポトーシスタンパク質Ａｐａｆｌが、結腸癌の初期段階を有する患者において逆の結果と関連することを示す。有意な差異は、ｃＩＡＰ２、Ａｐａｆｌ、またはＴＵＣＡＮについての高発現群  対  低発現群における患者の年齢、または性別において見られなかった。
【０１６１】
（実施例Ｖ）
（ｃＩＡＰ２およびＡｐａｆｌ発現データの組み合わせ分析）
この実施例は、ｃＩＡＰ２およびＡｐａｆｌの発現データの組み合わせた分析を示す。
【０１６２】
特定のタンパク質は、有意な予後価値を有していたので、組み合わせた２つのバイオマーカーが、異なる生存特性を有する患者のサブグループを同定し得るか否かを決定した。２つの好ましい変数（低ｃＩＡＰ２および高Ａｐａｆｌ）を有する患者を、このコホートにおいて全ての他の患者と比較した。
【０１６３】
図５は、バイオマーカーと結腸癌患者についての疾患を有さずに生存（Ａ、Ｂ）および全体的な生存（Ｃ、Ｄ）とのその組み合わせの相関を示す。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線を使用して、パネルＡおよびＢは、疾患に罹患していない生存におけるポジティブな影響を有するバイオマーカー［低ｃＩＡＰ２および高Ａｐａｆｌ（Ａ）；低ｃＩＡＰ２および低ＴＵＣＡＮ（Ｂ）］の組み合わせを例示する。生存に不利な効果を有するマーカーの２つの組み合わせは、パネルＣ（低Ａｐａｆｌおよび高ＴＵＣＡＮ）、およびパネルＤ（低Ｂｃｌ−２および高ｃＩＡＰ２）に示される。
【０１６４】
ｃＩＡＰ２およびＡｐａｆｌについて都合よく分析された９４人の患者のサンプルのうち、２５人（２７％）は、低ｃＩＡＰ２および高Ａｐａｆｌ免疫スコアの両方を有していた。５２％の疾患を有していない患者、または６４％の他の生存患者（ＯＳについてｐ＝０．００００７；ＤＦＳについてｐ＜０．０００１）と比較して、低ｃＩＡＰ２および高Ａｐａｆｌの組み合わせを有するこれらの患者の全て（１００％）は生存し、そして診断の５年後でも疾患を有していなかった（図５Ａ；ＤＦＳ）。同じ時点で、低ｃＩＡＰ２と低ＴＵＣＡＮの組み合わせを有する患者９７％が生存し、そして５９％の生存患者および５０％の疾患を有していない他の患者と比較して（ｐ＝０．００００１）、９４％が疾患を有していなかった（図５Ｂ；ＤＦＳ）。従って、ｃＩＡＰ２とＡｐａｆｌとの組み合わせ、またはｃＩＡＰ２とＴＵＣＡＮ免疫染色データの組み合わせは、別個の生存特性を有する結腸癌患者のサブグループを同定する。しかし、２つの不利なバイオマーカー（低Ａｐａｆｌおよび高ＴＵＣＡＮ）を有する患者を、他の患者と比較した場合に、この組み合わせのタンパク質を有する患者の３４％および９０％の他の患者が、診断の５年後に生存していた（ｐ＜０．０００１）（図４Ｃ）。この不一致は、手術の最後でもなお大きく、それぞれ０％および９０％が生存し続けていた。組み合わせデータを、別の対の不利なバイオマーカー（ｃＩＡＰ２高およびＢｃｌ−２低）について試験した場合に、手術の５年後にこの群で生存している患者はいなかったが、他の患者では７５％生存していた（ｐ＝００４）（図４Ｄ）。これらの結果は、ＬＥＲＳデータ分析の結果と一致していた。
【０１６５】
（実施例ＶＩ）
（多変数分析は、結腸癌の初期段階における生存の独立した予後指標としてｃＩＡＰ２、Ａｐａｆｌ、ＴＵＣＡＮおよびＢｃｌ−２を同定する）
この実施例は、多変数分析が、ｃＩＡＰ２、Ａｐａｆｌ、ＴＵＣＡＮおよびＢｃｌ−２は、結腸癌の初期段階における生存の独立した予後指標であることを確認することを示す。
【０１６６】
多変数Ｃｏｘ比例ハザードモデルを、バイオマーカーの上昇したレベルが、疾患に罹患していない生存（ＤＦＳ）および全体的な生存（ＯＳ）に関連するか否かを評価するために適合させた。この変数は、この研究に関する少数の患者に起因してＴ３Ｎ０Ｍ０およびＴ４Ｎ０Ｍ０のサブグループに階層化されなかった。さらに、このデータ採掘システムＬＥＲＳ（ラフなセット（Ｒｏｕｇｈ  Ｓｅｔ）に基づいた実施例からの学習）を使用して、免疫組織化学的染色データの多変数分析を実行した。
【０１６７】
この計画において、アルゴリズムＬＥＭ２をこのデータについて最も適用性があると決定し、従って多変数分析について使用した。高ｃＩＡＰ２および高ＴＵＣＡＮの存在は、それぞれ２．７倍（ｐ＝０．０１）および１７倍（ｐ＝０００００４）の患者のこのコホートにおける結腸癌からの死の危険性を増加させた。高ＡｐａｆｌおよびＢｃｌ−２発現は、結腸癌による死の相対的な危険性の７５％（ｐ＝０．００４）および８２％（ｐ＝０．００００６）の減少と関連していた。
【０１６８】
疾患に罹患していない生存とタンパク質レベルとの関係が多変数分析によって評価される場合に、ｃＩＡＰ２およびＴＵＣＡＮは、それぞれ６倍および３．４倍の再発の危険性を増大させる高レベルのこれらのタンパク質と予後の有意性（ｐ＝０．０００００５、ｐ＝０．０００５）を維持した。ＡｐａｆｌおよびＢｃｌ−２はまた、その有意な予後の役割を保持し（ｐ＝０．００６、ｐ＝０．０００４）、約７５％まで結腸癌の再発の危険率を減少させた。さらに、高レベルのＳｍａｃは、６３％まで再発の危険性を減少させた。このコホートにおける患者の全ての生存についてＳｍａｃの役割は確認されなかった。まとめると、これらの発見は、ｃＩＡＰ２、Ａｐａｆｌ、ＴＵＣＡＮ、Ｂｃｌ−２およびこれらの組み合わせについての免疫染色が、結腸癌の初期段階を有する患者について予後有意性を有し得ることを示す。表３Ａ〜Ｂは、バイオマーカーの上昇したレベルが、疾患に罹患していない生存または全ての生存と関連するか否かを評価するための後方段階的Ｃｏｘ比例ハザード逆行分析（ｂａｃｋｗａｒｄ  ｓｔｅｐｗｉｓｅ  Ｃｏｘ  ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ  ｈａｚａｒｄｓ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を用いた段階ＩＩの結腸癌患者におけるＤＦＳ（Ａ）およびＯＳ（Ｂ）の多変数分析を示す。
【０１６９】
（表３：第ＩＩ病期の結腸癌腫患者のＤＦＳ（Ａ）およびＯＳ（Ｂ）の多変量解析）
【０１７０】
【表３】
2005501225.tif 000008
（実施例ＶＩＩ）
（複数の癌細胞株におけるＴＵＣＡＮの発現）
この実施例は、ＴＵＣＡＮが幾つかの腫瘍細胞株において発現されていることを示している。
【０１７１】
癌におけるＴＵＣＡＮの発現を決定するために、６０のヒト腫瘍細胞株のＮＣＩパネル（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １７：３４３〜３４９（１９９７））を、ＴＵＣＡＮに特異的な抗血清を使用して免疫ブロッティングによって分析した（図６Ａ）。このパネルに含まれる細胞株を以下の表４に示す。
【０１７２】
（表４  ６０のヒト腫瘍細胞株のＮＣＩパネル）
【０１７３】
【表４−１】
2005501225.tif 000009
【０１７４】
【表４−２】
2005501225.tif 000010
【０１７５】
【表４−３】
2005501225.tif 000011
溶解物を、分析前にタンパク質の総含有量について規格化した。ＴＵＣＡＮタンパク質の相対レベルは、試験した腫瘍株の中で広範に変化し、その幾つかの細胞株（例えば、ＭＣＦ７乳癌細胞、ＯＶＣＡＲ５卵巣癌細胞およびＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ肺癌細胞）は、特に大量のこのタンパク質を含んでいた。ＴＵＣＡＮタンパク質はまた、ＨＬ−６０白血病細胞、ＳＮＢ−１９  ＣＮＳ癌細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞、ＩＧＲＯＶ１卵巣癌細胞、ＮＣＩ−Ｈ２２６非小細胞肺癌細胞、ＮＣＩ−Ｈ２３非小細胞肺癌細胞、Ｍ１４黒色腫細胞、Ｄｕ−１４５前立腺癌細胞、ＵＯ−３１腎臓癌細胞、およびＫ５６２白血病細胞において存在した。これらの腫瘍細胞株の幾つかにおいて、ＴＵＣＡＮは、ブロードなバンドとしてかまたは明確なダブレット（二重線）としてＳＤＳ−ＰＡＧＥに中を移動し、このことは、複数形態のＴＵＣＡＮタンパク質が癌細胞に存在し得る（図６Ａ）こと示した。
【０１７６】
これらの癌細胞株のうちの幾つかにおける内因性ＴＵＣＡＮタンパク質のレベルを、トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびＪｕｒｋａｔ細胞と比較した。一過的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞において産生されるプラスミドに由来するＴＵＣＡＮのレベルは、ＭＣＦ７乳癌細胞において見出されるＴＵＣＡＮの内因性レベルに匹敵した（図６Ｂ）。安定にトランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ細胞において産生されたプラスミド由来のＴＵＣＡＮのレベルは、ＯＶＡＣＡＲ５卵巣癌細胞株およびＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ肺癌細胞株で測定された内因性のＴＵＣＡＮに量的に匹敵した。
【０１７７】
要約すると、ＴＵＣＡＮは種々の腫瘍細胞株（ヒト胸部腫瘍、卵巣腫瘍、肺腫瘍、ＣＮＳ腫瘍、白血病、腎臓腫瘍、前立腺腫瘍、皮膚および結腸腫瘍から得られる細胞を含む）において発現される。
【０１７８】
（実施例ＶＩＩＩ）
（結腸癌におけるＴＵＣＡＮ発現レベルの上昇と患者の生存率の減少は相関する）
この実施例は、ＴＵＣＡＮ発現が結腸癌において増大していることを示し、かつＴＵＣＡＮの増大は、結腸癌患者の生存率の減少と相関する。
【０１７９】
抗ＴＵＣＡＮ抗体を使用して、ＴＵＣＡＮタンパク質の発現を、一貫した臨床的段階（Ｄｕｋｅ  Ｂ；第ＩＩ病期）および処置（アジュバント化学療法を使用しない外科手術）における患者に由来する１０２のパラフィン包埋結腸癌標本の収集物を免疫組織化学的方法によって分析した。全ての１０２の腫瘍検体が単一のスライドガラス上で分析でき、これによって技術上の人為的影響に起因する免疫強度の差異を最小化するように、組織顕微鏡を操作した（図７）。
【０１８０】
免疫組織化学分析のための正常ヒト組織を、Ｂｏｕｉｎ溶液（Ｓｉｇｍａ）中で固定してパラフィンで包埋した生検標本および検死標本から得た。結腸癌腫標本を、延世大学医学部病理学専攻（韓国；ソウル）から入手した。組織サンプルとしては、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｕｎｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｅ  Ｃｏｎｔｒｅ  ｌｅ  Ｃａｎｃｅｒ（ＡＪＣＣ／ＵＩＣＣ）基準に規定されるような、第ＩＩ病期（Ｄｕｋｅ  Ｂ病期）を有して１９８６〜１９９６年に生存した患者に由来する１０２の原発性腫瘍を含む。全ての患者を、結腸の浸潤切片の外科的切除によって処置する。術後アジュバント化学療法を全ての症例において初期に実施しなかった。しかし、化学療法剤を再発後に一部の患者に投与した。臨床データは、６０ヶ月間までのメジアン追跡を示している。
【０１８１】
結腸癌マイクロアレイを構築するために、直径１ｍｍの組織の２〜５のシリンダーを、８％ホルマリン固定した腫瘍を含む永久パラフィン塊の代表的な領域から採取し、そして、カスタムビルド精密機器（Ｂｅｅｃｈｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ，ＭＤ）を使用して新規のレシピエントパラフィン塊へと配置した。連続した切片（４μｍ）を、Ｒｅｎｔｒｏｐら、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｊ．１８：２７１〜２７６（１９８６）に記載されるように、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＥＳ）被覆スライド（Ｓｉｇｍａ）に適用した。
【０１８２】
免疫組織化学のために、脱ろう組織切片を、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）に基づく検出方法を用いて免疫染色したが、ここで、自動免疫染色機（Ｄａｋｏ  Ｕｎｉｖｅｒａｌ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）を用いてＥｎｖｉｓｉｏｎ−Ｐｌｕｓ−Ｈｏｒｓｅ  Ｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）ｓｙｓｔｅｍ（ＤＡＫＯ）を使用した（Ｋｒａｊｅｗｓｋｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：５７５２〜５７５７（１９９９））。抗ＴＵＣＡＮ抗体は、１：５０００（ｖ／ｖ）で適用した。５μｇ／ｍｌの合成ペプチド（ＢＵＲ２１５）免疫原または組換えＧＳＴ−ＣＡＲＤ／ＴＵＣＡＮタンパク質（ＢＵＲ２０６）免疫原のいずれかによって予備吸収した抗血清とのインキュベーションを用いてこの結果の特異性の確証を得るために使用した。腫瘍染色のスコア付けは、免疫陽性細胞（０〜１００）のパーセンテージと染色強度スコア（０／１／２／３）との積に基づいていており、この積は０〜３００のスコアとなる。
【０１８３】
データを、ＪＭＰ統計ソフトウェアパッケージ（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を使用して解析した。片側ｔ検定法およびピヤソンχ２検定法を、患者の生存とＴＵＣＡＮ免疫染色データとの相関について使用した。
【０１８４】
分析された１０２腫瘍検体のうち、６６は、同一の切片の中に隣接した正常な結腸上皮を含み、正常細胞に対する腫瘍におけるＴＵＣＡＮ免疫染色の強度の比較を可能にする。ＴＵＣＡＮ免疫強度は、６６のこれらの標本のうち４２（６４％）の正常結腸上皮細胞と比較して浸潤癌細胞においてより強力であったが、これは、大まかに３分の２の結腸癌がＴＵＣＡＮタンパク質のアップレギュレートされたレベルを有する。ＴＵＣＡＮ免疫反応性は、これらの細胞の細胞質に亘って放射状に存在していた（図７）。ＴＵＣＡＮ免疫原とともに予め吸収された予備免疫血清または抗ＴＵＣＡＮ抗血清のいずれかを使用して実施した対照染色によって、これらの結果が抗ＴＵＣＡＮにとって特異的であることを確認した。
【０１８５】
腫瘍免疫染色の結果は、免疫強度（０〜３のスケールでランク付けした）、免疫陽性百分率（０〜１００％）および免疫スコア（これは、免疫強度と免疫百分率との積である）に関してスコア付けし、そして、これらのデータは患者の生存情報と相関していた。ＴＵＣＡＮ免疫染色は、疾患を有さずに生存している患者（ｎ＝６１）または再発した疾患を有して生存している患者（ｎ＝１０）と比較して、これらの癌によって死亡した患者（ｎ＝３１）の中で有意に高かった。ＴＵＣＡＮ免疫染色の結果の要約は、以下の表５において示す。
【０１８６】
（表５  ＴＵＣＡＮ免疫染色の結果の概要）
【０１８７】
【表５】
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要約すると、ＴＵＣＡＮ発現は、初期結腸癌の実質的な割合において異常に上昇した。さらに、上昇したＴＵＣＡＮ発現は低減した患者の生存と相関している。
【０１８８】
（実施例ＩＸ）
（ＴＵＣＡＮは、プロカスパーゼ−９およびそれ自体に対して選択的に結合する）
この実施例は、ＴＵＣＡＮがプロカスパーゼ−９およびそれ自体に選択的に結合することを示す。ＣＡＲＤＳは、これらの互いに結合する能力について知られているので、ＴＵＣＡＮをＣＡＲＤ含有タンパク質であるプロカスパーゼ１、プロカスパーゼ２、プロカスパーゼ９、Ａｐａｆ１、Ｎｏｄ１（ＣＡＲＤ４）、ＣＥＤ４、ＮＡＣ（ＤＥＦＣＡＰ）、Ｃａｒｄｉａｋ（ＲＩＰ２）、Ｒａｉｄｄ（ＣＲＡＤＤ）、Ｂｃｌ１０（ＣＩＰＥＲ；ｈｕＥ１０）、ｃＩＡＰ１、ｃＩＡＰ２、ＣＬＡＮ、ＣＡＲＤ、ＣＡＲＤ９、およびそれ自体との相互作用について試験した。これらの中で、ＴＵＣＡＮは、プロカスパーゼ−９およびＴＵＣＡＮ自体とのみ会合した。
【０１８９】
図８は、代表的結果がＦｌａｇエピトープタグまたはＭｙｃエピトープタグのいずれかを含むＴＵＣＡＮを使用して実施する同時免疫沈降実験から得られることを示している。ＴＵＣＡＮポリペプチドを、エピトープタグ化プロカスパーゼ−９または他のタンパク質と一緒に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で一過性トランスフェクションによって発現した。触媒システインがアラニンで置換されている（Ｃｙｓ２８７／Ａｌａ）プロカスパーゼ−９の不活性変異体を、アポトーシスの導入を回避するためにこれらの実験のために使用した（Ｃａｒｄｏｎｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１３１８〜１３２１（１９９８））。細胞溶解物は、トランスフェクトした細胞から調製され、そして、免疫沈降を抗Ｆｌａｇ抗体または抗Ｍｙｃ抗体を使用して実施して、その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／免疫ブロッティング分析を行った。代表的な結果は、図８Ａにおいて提供した。この図８は、ＴＵＣＡＮが、プロカスパーゼと同時免疫沈降するが、ＣＡＲＤ含有タンパク質Ａｐａｆ１とは同時免疫沈降しないことを示す。ＴＵＣＡＮはまた、ＣＡＲＤ含有タンパク質、プロカスパーゼ−１、プロカスパーゼ−２、Ｎｏｄ１、ＣＥＤ４、ＮＡＣ、Ｃａｒｄｉａｋ、Ｒａｉｄｄ、Ｂｃｌ１０、ＣＬＡＮ、ＣＡＲＤ９、ｃＩＡＰ1およびｃＩＡＰ２と同時免疫沈降しなかった。さらに、同時免疫沈降実験は、ＤＥＤ含有カスパーゼ、プロカスパーゼ−８、プロカスパーゼ−１０との相互作用しなかったのでＴＵＣＡＮは、カスパーゼと非特異的に会合しなかった（図８Ａ）。
【０１９０】
プロカスパーゼ−９との相互作用についてＴＵＣＡＮの内のＣＡＲＤドメインの役割を決定するために、ＴＵＣＡＮのフラグメントを発現した。このＴＵＣＡＮフラグメントは、本質的にＣＡＲＤ（残基３４５〜４３１）のみを含むかまたはＣＡＲＤを欠く（残基１〜３３７）（ΔＣＡＲＤ）。プロカスパーゼ−９は、全長ＴＵＣＡＮおよびＣＡＲＤのみのフラグメントと同時免疫沈降するが、ＴＵＣＡＮのΔＣＡＲＤフラグメントとは同時免疫沈降しない（図８Ｂ）。従って、ＴＵＣＡＮのＣＡＲＤドメインは、プロカスパーゼ−９との会合のために必要かつ十分である。ＴＵＣＡＮの自己会合はまた、ＨＡおよびＭｙｃタグ化タンパク質を使用し、全長タンパク質、ＣＡＲＤのみのタンパク質、およびΔＣＡＲＤタンパク質と対照する、同時免疫沈降実験によって確認される。全長ＴＵＣＡＮは、全長ＴＵＣＡＮおよびＣＡＲＤのみのフラグメントと相互作用するが、ΔＣＡＲＤフラグメントとは相互作用しない（図８Ｃ）。従って、ＴＵＣＡＮのＣＡＲＤドメインは、自己会合のために必要かつ十分である。
【０１９１】
本出願に亘って、種々の刊行物は括弧内で参照されている。これらの刊行物の開示の全体が、本出願が関連する技術の状態をより完全に記載するために本明細書中で本出願における参考として援用される。
【０１９２】
本発明は、開示された実施形態を参照して記載されるが、当業者は、詳説された具体的な実施形態は本発明の単なる例示であると容易に解釈する。種々の改変が本発明の精神を逸脱することなく実施され得ることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１９３】
【図１】図１は、正常組織および悪性結腸組織中のＩＡＰファミリータンパク質、Ａｐａｆ１およびＴＵＣＡＮの免疫組織化学検出の例を示す。
【図２−１】図２Ａ〜２Ｄは、正常組織および悪性結腸組織についての免疫スコアの比較を示す。
【図２−２】図２Ｅ〜２Ｈは、正常組織および悪性結腸組織についての免疫スコアの比較を示す。
【図２−３】図２Ｉ〜２Ｌは、正常組織および悪性結腸組織についての免疫スコアの比較を示す。
【図２−４】図２Ｍ〜２Ｐは、正常組織および悪性結腸組織についての免疫スコアの比較を示す。
【図３−１】図３Ａ〜３Ｄは、イムノブロットによる結腸癌中のＩＡＰ、Ａｐｆ１およびＴＵＣＡＮタンパク質の抗体の特異性および発現を示す。
【図３−２】図３Ｅは、イムノブロットによる結腸癌中のＩＡＰ、Ａｐｆ１およびＴＵＣＡＮタンパク質の抗体の特異性および発現を示す。
【図３−３】図３Ｆは、イムノブロットによる結腸癌中のＩＡＰ、Ａｐｆ１およびＴＵＣＡＮタンパク質の抗体の特異性および発現を示す。
【図４−１】図４Ａ〜４Ｈは、結腸癌患者に対する「疾患に罹患していない生存」（図４Ａ）および「全体的な生存」（図４Ｂ）のバイオマーカー免疫染色データの相関を示す。
【図４−２】図４Ｉ〜４Ｐは、結腸癌患者に対する「疾患に罹患していない生存」（図４Ａ）および「全体的な生存」（図４Ｂ）のバイオマーカー免疫染色データの相関を示す。
【図４−３】図４Ｑ〜４Ｘは、結腸癌患者に対する「疾患に罹患していない生存」（図４Ａ）および「全体的な生存」（図４Ｂ）のバイオマーカー免疫染色データの相関を示す。
【図４−４】図４Ｙ〜４Ｚおよび図４Ａ−１〜図４Ｆ−１は、結腸癌患者に対する「疾患に罹患していない生存」（図４Ａ）および「全体的な生存」（図４Ｂ）のバイオマーカー免疫染色データの相関を示す。
【図５−１】図５Ａおよび５Ｂは、結腸癌患者に対する「疾患に罹患していない生存」（図５Ａ）および「全体的な生存」（図５Ｂ）のバイオマーカー免疫染色データの相関を示す。
【図５−２】図５Ｃおよび５Ｄは、結腸癌患者に対する「疾患に罹患していない生存」（図５Ａ）および「全体的な生存」（図５Ｂ）のバイオマーカー免疫染色データの相関を示す。
【図６】図６は、いくつかの腫瘍細胞株中のＴＵＣＡＮの発現を示す。
【図７】図７は、結腸直腸中のＴＵＣＡＮ発現の免疫組織化学分析を示す。
【図８−１】図８Ａは、ＴＵＣＡＮが、プロカスパーゼ−９およびＴＵＣＡＮ自身に対して選択的に結合することを示す。
【図８−２】図８Ｂおよび８Ｃは、ＴＵＣＡＮが、プロカスパーゼ−９およびＴＵＣＡＮ自身に対して選択的に結合することを示す。
【図２−１】
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【図２−４】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【国際公開パンフレット】
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2005501225.tif 000177
2005501225.tif 000178
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005501225.tif 000179
【国際調査報告】
2005501225.tif 000180
2005501225.tif 000181