(57)【要約】本発明は、遊離末端を持たないベクターから５’および３’遊離末端を有する直鎖ポリヌクレオチドのインビボ産出の方法に関し、上記直鎖ポリヌクレオチドは宿主細胞ゲノムに組込まれる。本発明による遊離末端を持たないベクターは、開裂部位によって隣接される、直鎖化または切除されるポリヌクレオチドを含み、上記開裂部位は、好ましくは、宿主細胞ゲノム内に見出される。本発明は、例えばタンパク質もしくは他の遺伝子、生体分子、生体物質、遺伝子導入植物、ワクチン、遺伝子導入動物の生成のための、あるいは個体における症状または障害の治療または予防のための、生じた細胞およびその使用にも関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチドを宿主細胞ゲノム内にランダムに組込むための、ベクターからの遊離５’および３’末端を持つ上記直鎖ポリヌクレオチドの宿主細胞への調製による方法であって、上記方法は、
ａ）上記宿主細胞内に、遊離５’および３’末端を持たず、そして上記ポリヌクレオチドを含むベクターを導入することであって、上記ベクターは、宿主細胞ゲノム内に５未満のコピーが見られる少なくとも１の開裂部位を含み、
ｂ）上記宿主細胞において上記部位を開裂させ、それによって上記宿主細胞内に上記ベクターから遊離５’および３’末端を持つ上記ポリヌクレオチドを直鎖形で作成または放出すること、ならびに、
ｃ）上記放出されたポリヌクレオチドの上記宿主細胞ゲノム内へのランダム組込みを行うのに十分な条件下で、十分な期間にわたって宿主細胞を維持すること、
を含む方法。
【請求項２】
上記方法が、更に、工程（ｂ）の前に、上記宿主細胞内に開裂剤または上記開裂剤をコードする核酸を含むベクターを導入する追加の工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
上記方法が、更に、工程（ｂ）の前に、上記宿主細胞内に開裂剤を導入する追加の工程を含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
上記開裂部位が、宿主細胞ゲノム内に２未満のコピーで見られる、請求項１〜３記載の方法。
【請求項５】
上記開裂部位が、宿主細胞ゲノム内に見られない、請求項４記載の方法。
【請求項６】
上記ポリヌクレオチドが、少なくとも１の開裂部位と隣接している、請求項１〜５記載の方法。
【請求項７】
上記ポリヌクレオチドが、２の開裂部位と隣接している、請求項６記載の方法。
【請求項８】
上記開裂部位が、エンドヌクレアーゼ部位であり、そして上記開裂剤が、対応するエンドヌクレアーゼである、請求項１〜７記載の方法。
【請求項９】
上記エンドヌクレアーゼが、少なくとも１２ヌクレオチドの認識部位を持つ、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
上記エンドヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
上記メガヌクレアーゼが、
【表１】
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から成る群より選択される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
上記メガヌクレアーゼが、Ｉ−Ｃｅｕ  Ｉ、Ｉ−Ｃｒｅ  Ｉ、Ｉ−Ｓｃｅ  Ｉから成る群より選択される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
上記エンドヌクレアーゼが、合成物である、請求項９記載の方法。
【請求項１４】
上記ポリヌクレオチドが、宿主細胞ゲノムとの相同組換えを受けることができない、請求項１〜１３記載の方法。
【請求項１５】
上記ポリヌクレオチドの５’および３’配列が、宿主細胞ゲノム配列との相同性を持たない、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
上記ベクターが、プラスミドである、請求項１〜１５記載の方法。
【請求項１７】
上記宿主細胞が、幹細胞、体細胞、配偶子、割球、および卵から成る群より選択される、請求項１〜１６記載の方法。
【請求項１８】
上記宿主細胞が、幹細胞である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
上記宿主細胞が、体細胞である、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
上記宿主細胞が、卵である、請求項１７記載の方法。
【請求項２３】
上記ポリヌクレオチド配列が、ポリペプチドもしくはアンチセンスをコードする配列、調節配列、または分子の認識配列である、請求項１〜１８記載の方法。
【請求項２４】
上記宿主細胞が、魚類、鳥類、非ヒト哺乳類、昆虫、両生類、爬虫類に由来する、請求項１７記載の方法。
【請求項２５】
上記宿主細胞が、メダカ、ゼブラフィッシュ、トゲウオ、アスティアナックス、マウス、ニワトリ、アフリカツメガエル、ヒツジ、雌ウシ、ウサギに由来する、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれか一項記載の方法から生じる細胞。
【請求項２７】
請求項２６記載の細胞を含む、非ヒト遺伝子導入動物。
【請求項２８】
請求項１〜２３のいずれか一項記載の方法から生じる細胞を含む、遺伝子導入植物。
【請求項２９】
タンパク質、生体分子、生体材料、またはワクチンの生成のための、請求項２７に記載の遺伝子導入動物または請求項２８に記載の植物の、請求項２６に記載の細胞の使用。
【請求項３０】
個体における状態または障害の処置または予防のための、請求項２６記載の細胞の使用。
【請求項３１】
非ヒト遺伝子導入動物を作成する方法であって、胚幹細胞が、請求項１〜２５記載の方法によって形質移入され、細胞が、形質移入細胞を組込むことができる期に胚に注入され、次に胚が、代理母に再移植され、そしてキメラ個体が妊娠期間の終わりに得られ、そしてキメラ個体においては生殖細胞系の胚幹細胞によるコロニー形成が観測され、キメラ個体が遺伝子導入動物を得るために交配される、方法。
【請求項３２】
非ヒト遺伝子導入動物を作成する方法であって、受精卵が、請求項１〜２５記載の方法によって形質移入され、卵が、代理母に再移植され、そして遺伝子導入個体が、妊娠期間の終わりに得られる、方法。
【請求項３３】
非ヒト遺伝子導入動物を作成する方法であって、受精卵が、請求項１〜２５記載の方法によって形質移入され、卵が、上記遺伝子導入動物を発生させるために適切な条件でインキュベーションされる方法。
【請求項３４】
形質転換のための組成物であって、
１）５’および３’遊離末端を持たず、そして組込まれる導入遺伝子を含むベクターであって、宿主細胞ゲノム内に５未満のコピーが見られる少なくとも１の開裂部位を含む上記ベクターと、ならびに
２）開裂剤または上記開裂剤をコードする核酸を含むベクターと、
を含む組成物。
【請求項３５】
上記ポリヌクレオチドが、少なくとも１の開裂部位と隣接している、請求項３４記載の組成物。
【請求項３６】
上記ポリヌクレオチドが、２の開裂部位と隣接している、請求項３５記載の組成物。
【請求項３７】
上記開裂部位が、エンドヌクレアーゼ部位であり、そして上記開裂剤が、対応するエンドヌクレアーゼである、請求項３４〜３６記載の組成物。
【請求項３８】
上記エンドヌクレアーゼが、少なくとも１２のヌクレオチドの認識部位を持つ、請求項３７記載の組成物。
【請求項３９】
上記エンドヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼである、請求項３８記載の組成物。
【請求項４０】
上記メガヌクレアーゼが、
【表２】
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から成る群より選択される、請求項３９記載の組成物。
【請求項４１】
上記メガヌクレアーゼが、Ｉ−Ｃｅｕ  Ｉ、Ｉ−Ｃｒｅ  Ｉ、Ｉ−Ｓｃｅ  Ｉから成る群より選択される、請求項４０記載の組成物。
【請求項４２】
上記エンドヌクレアーゼが、合成物である、請求項３９記載の組成物。
【請求項４３】
上記ベクターが、プラスミドである、請求項３４〜４２記載の組成物。
【請求項４４】
直鎖化される上記ポリヌクレオチド配列を含む上記ベクターが、更に上記開裂剤をコードする上記核酸を含む、請求項３４〜４３記載の組成物。
【請求項４５】
上記ポリヌクレオチドが、宿主細胞ゲノムとの相同組換えを受けることができない、請求項３４〜４４記載の組成物。
【請求項４６】
上記ポリヌクレオチドの５’および３’配列が、宿主細胞ゲノム配列との相同性を持たない、請求項４５記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、直鎖ＤＮＡ断片を細胞ゲノムに組込むための、ベクターからの直鎖ＤＮＡ断片のインビボ遊離の工程に関するものである。本発明は更に、本工程の使用および本使用の結果に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
２０年前の逆遺伝学の最初の大発見は、形質転換であった。形質転換は、外来性ＤＮＡ配列を宿主細胞に導入することを可能にする技法である。例えば哺乳動物によって受精した卵へのＤＮＡ微量注入は、一定の場合において、微量注入されたＤＮＡ分子の受精卵のゲノムへの組込を引き起こす。形質転換は、外来性ＤＮＡ断片が多細胞生物のゲノムに導入され、そして子孫に伝達されることを意味する。
ゆえに、外来性ＤＮＡは、子孫内に伝達されるために、発生の初期段階に胚の中で安定な形で存在しなければならない。
【０００３】
沈殿したリン酸カルシウム沈殿による哺乳動物細胞におけるＤＮＡ形質移入は、いくらかの場合において、安定形質移入と呼ばれる外来性ＤＮＡの宿主細胞のゲノムへの組込も引き起こすことが可能である。外来性ＤＮＡは、２つの形式、直鎖または環状のどちらかで細胞内へ導入することができる。ＤＮＡを直鎖形で導入する場合、直鎖断片は、宿主細胞への導入前に、例えばプラスミドからの制限酵素を用いた所望の断片の切除によってインビトロで調製される。環状形のＤＮＡについては、導入されるＤＮＡは一般に、スーパーコイルプラスミドである。
【０００４】
すべての細胞は、そのＤＮＡの維持および修復のシステムを持つ。これらのシステムの介入を賦活するストレスの特定の信号の１つは、細胞中のＤＮＡ遊離末端の産生である。次に細胞は、この種の問題を解決するための２つの解決策を持つ。
−第一の解決策は、遊離末端を示すＤＮＡの分解である（例えば細胞が、ウイルス活性を持つことが可能なＤＮＡを除去する場合）。この解決策は、維持および修復のこれらのシステムにおける、遊離末端から消化することによってＤＮＡを分解するエキソヌクレアーゼの存在に基づいている。
−他の解決策は、遊離末端の細胞ゲノムとの組換えである。この組換えは、細胞のゲノムへの外来性分子の組込では特に、異なる形を取ることがある。
【０００５】
結果として、環状または直鎖形での裸の二重鎖ＤＮＡの導入による、外来性ＤＮＡの組込を目的とする研究は、いくらかの付帯する問題と共に、３種類の主要な問題に直面している。
−これらの問題のうちで第一の問題は、細胞宿主のＤＮＡへの外来性分子の組込の効率である。効率のこのような欠如は、非常に少ない回数の組込に対して、非常に大量の外来性ＤＮＡの注入を意味する。魚、植物、または昆虫などの一部の種においては、エキソヌクレアーゼが、非常に効率的であるため、外来性ＤＮＡは染色体中に決して組込まれず、エピソームのままとどまる。例えば外来性ＤＮＡに環状形を使用する場合、組込を持つためにはニックが必要である。確かに組込工程は、遊離末端の存在を必要とする。直鎖形を使用する場合、大半の外来性ＤＮＡは、遊離末端の存在により、エキソヌクレアーゼによって分解される。
−第二の問題は、組込ＤＮＡの完全性である。外来性ＤＮＡの直鎖断片は、その遊離末端を、核に到達する前に細胞エキソヌクレアーゼに暴露する。細胞中の末端の長期暴露が、外来性ＤＮＡが細胞ゲノムに完全に組込まれる機会を重大な方法で制限する。ゲノムに完全に組込まれる機会を増加させる方法は、例えば同じ制限酵素を用いた消化により作成した、ある凝集性一本鎖ＤＮＡオーバーハングを外来性ＤＮＡの各末端に添加することに存する。これらの付着末端は、ＤＮＡ断片が多量体中で会合し、組込のＤＮＡの完全な分解を防止することを可能にする。機会を増加させる別の方法は、長いおよび中性のＤＮＡ配列を組込むために、ＤＮＡ断片を包囲することである。外来性ＤＮＡが、スーパーコイルプラスミドに包まれる場合、組込まれた断片は、外来性ＤＮＡだけでなく、ベクター全体も含む。
−第三の問題は、組込コピーの数の制御である。故意または故意でない外来性ＤＮＡの多量体化は、外来性ＤＮＡ断片の複数のコピーの挿入を好むという、不都合さを示す。同様に外来性ＤＮＡが環状形を持つ場合、プラスミドは、コンカテマーとして組込まれる。この複数の挿入は、結果として、染色体の不安定性を導入し、複数のコピーにおける同一遺伝子の存在による発現の制御の問題を生じる。
【０００６】
形質転換は、これまでになく、生物学者にとって必須のツールである。ヒト疾患の研究は、大部分を動物モデルの使用に依存している。製薬業界では、膨大な遺伝子配列情報が利用できる。これらの情報は、薬剤の新しい標的を提供する。しかし、生物中の遺伝子および関連たんぱく質の大多数の機能は未知のままであり、そして標的検証の効率は、著しく変化していないように思われる。
【０００７】
遺伝学研究および構造ゲノミクスは、生化学経路および生理学が動物界のいたるところで高度に保存されていることを示してきた。したがって、ヒト疾患に関連するプロセスを調査するために動物モデルを使用することができる。動物モデルは、最適なスクリーニング標的を効率的に確認および検証するために使用できる。スクリーニング標的の選択は、改良することができ、より少ない失敗および更に有効なな薬剤開発工程につながるであろう。
【０００８】
マウスは、豊富に使用される周知の哺乳動物モデルである。遺伝子導入動物の作成のために最も広範に使用される方法は、受精胚前核へのＤＮＡの微量注入である。本方法は、遺伝子導入マウスの作成にはかなり有効であるが、ウシおよびヒツジなどの大型遺伝子導入哺乳動物の作成には、はるかに有効でない。更に利用可能な形質転換方法による遺伝子導入動物は、導入遺伝子が子孫への導入遺伝子の伝達の欠如を生じるため、モザイクであることが多い。魚または鳥などの一部の動物は、形質転換に高い耐性を示す。そのうち、魚の形質転換の問題を以下で詳細に述べる。
【０００９】
タンクフィッシュは、発生生物学および遺伝学における脊椎動物モデルとして高い人気に達している。確かにゼブラフィッシュ（Danio rerio）は、古典的な遺伝分析を容易に入手可能および操作可能である胚と組合せる機会を与えるため、脊椎動物発生研究での人気のあるモデル系である。ゼブラフィッシュの遺伝子研究は２〜３ヶ月の世代時間、定期的に数百個の卵を産むメスの能力、および成魚の小さいサイズから利益を得る。発生学研究は、大型の透明な胚から利益を得る。
【００１０】
しかしタンクフィッシュの有用性は、一部の方法論的ツール、とりわけ基礎研究の主要技術となり、そして作物学および生物医学での多種多様な用途を持つ形質転換のための簡単ならびに有効な技法の欠如によってなお制限されている。特に、魚において胚幹（ＥＳ）細胞を、形質転換用の細胞ベクターとして確立する試みはこれまで成功していない。
【００１１】
したがって、遺伝子導入魚を産生するための最適な方法は、１細胞期胚の細胞質への高濃度のＤＮＡ（約１０6のプラスミドコピー）の注入のままである。プラスミドは、直鎖および環状形で注入され、両方のタイプの実験で形質転換が実現されている。この技術は、大半の魚卵の透明性および大きなサイズによって高速および容易であるが、不運なことに、通常、２、３パーセントの範囲にあるゲノム組込および生殖細胞伝達の頻度によってあまり効果もない。［Stuartら、1988 Development 103, 403-412; Stuartら、1990, Development 109, 577-584; Culpら、1991, Proc Natl Acad Sci USA, 88, 7953-57; Linら、1994 Dvelopmental biology 161, 77-83; Collasら、1998 Transgenic Research, 7, 303-309］。最近の研究は、このことが遅いおよびモザイク性の組込による可能性があることを示している。ＤＮＡは、卵細胞質中で非組込型のままであり、割球のサブセットによってのみ遺伝される。注入後、プラスミド配列は一時的に増幅され、そして直列に配列されたプラスミドの多数の単一長コピーから成る、長いコンカテマーを形成する（Stuartら 1988, supra）。外来性ＤＮＡは通常、宿主ゲノム中の１部位に挿入するが、通常、元の注入された構築物の直列配置から成る（Culpら、1991, Supra）。
【００１２】
プラスミド微量注入によって産生される遺伝子導入魚の頻度を向上させることが困難であることは、一般に認められている。より大量のＤＮＡを注入することは、胚にとって有毒であるため、組込効率を改善することを試みる必要がある。導入遺伝子の組込および伝達率を改善する試みが数回行われた。例えばＤＮＡ−ＮＬＳ複合体の使用が報告されているが、大半の著者はこの技術に何の改善も見出さなかった［Liangら、2000 Mol Reprod Dev 55, 8-13］。
原則として、アデノ随伴ウイルスの［Fu, 1998 Nature Biotech, 16, 253-257］またはトランスポゾン［Izsvakら、2000 J Mol Biol 302, 93-102］の隣接反復を用いた技術も、導入遺伝子組込を向上できる。しかしながら、発明者の知るところでは、プラスミド中の反復の潜在的に有害な存在からも害を受けるこれらの技法によって、実際的な結果は報告されていない。更にこれらのベクターは、それらの中へ操作することが可能なＤＮＡ配列のサイズについて制限される。
【００１３】
したがって、形質転換の効率を向上させる新たな方法を改良および開発するための多数の方法が出現した。それにもかかわらず、非常に限られた量の方法によって、よりよい制御が可能となり、多くの種はこの技術について耐性であるか、または非常に無効なままである。遭遇した主要な問題は、
−形質転換の制御および効率、
−早期組込事象（生殖細胞系伝達）、
−組込コピー数の制御、
である。
【００１４】
課題を解決するための手段
本発明は、厳密には、形質転換中のＤＮＡのランダム組込の効率を改善し、そして組込ＤＮＡの完全性のより優れた制御を可能にするとともに、組込ＤＮＡのコピー数を減少させることを可能にする方法を提供することを目的としている。
【００１５】
本発明による外来性ＤＮＡをゲノムＤＮＡにランダム組込するための方法は、ベクターからの５’および３’遊離末端を持たない、宿主内に組込まれるＤＮＡポリヌクレオチドの直鎖化に存する。
【００１６】
本発明による方法は、遊離５’および３’末端を持つ上記直鎖ポリヌクレオチドの宿主細胞への（インビボまたはインオボでの）調製によって、ポリヌクレオチドを宿主細胞ゲノム内にランダムに組込むための方法に存し、上記方法は、
ａ）上記宿主細胞内に、遊離５’および３’末端を持たず、そして直鎖化されるポリヌクレオチド配列を含むベクターを導入することであって、上記ベクターが、少なくとも１の開裂部位を含み、そして上記開裂部位は、宿主細胞ゲノム内に５未満のコピー、好ましくは、２のコピーが見られ、そして更に好ましくは、上記開裂部位が、宿主細胞ゲノム内に見られない、ベクターを導入すること、ならびに、
ｂ）上記宿主細胞において上記部位を開裂させ、それによって上記宿主細胞内に上記ベクターから遊離５’および３’末端を持つ上記ポリヌクレオチドを直鎖形で作成または放出すること、ならびに、
ｃ）上記直鎖化ポリヌクレオチドの上記宿主細胞ゲノムへのランダム組込を行うのに十分な条件下で、十分な期間にわたって宿主細胞を維持すること、
を含む。
【００１７】
場合により、上記方法は、更に工程（ｂ）の前に、上記宿主細胞内に開裂剤または上記開裂剤をコードする核酸を含むベクターを導入する追加の工程を含む。好ましくは、上記方法は、更に工程（ｂ）の前に、上記宿主細胞に上記開裂剤を導入する追加の工程を含む。場合により、上記開裂剤をコードする核酸を含む上記ベクターは、発現ベクターまたはｍＲＮＡである。場合により上記宿主細胞は、上記開裂剤を発現する遺伝子導入細胞である。本発明により組込まれる上記ポリヌクレオチド配列は、宿主細胞ゲノムとの相同組換えを受けることはできない。場合により、組込まれる上記ポリヌクレオチドは、宿主細胞ゲノム配列との７０％未満の同一性を、好ましくは、６０または５０％未満の、更に好ましくは、４０、３０、または２０％未満の同一性を持つ。場合により、組込まれる上記ポリヌクレオチドの５’および３’配列は、宿主細胞ゲノム配列と相同性を持たず、好ましくは、９０％未満の同一性、更に好ましくは、８０または７０％未満の、なお更に好ましくは、５０、４０、３０、または２０％未満の同一性を持ち、ここで上記５’および３’配列は、５kb長、好ましくは、３kb〜１．５kb長、更に好ましくは、１kb、５００bpまたは１００bp長である。好ましくは、開裂部位は、付着末端を産生しない。好ましくは、切除される上記ポリヌクレオチド配列は、開裂部位を含まない。好ましくは、直鎖化される上記ポリヌクレオチド配列を含む上記ベクターは更に、上記開裂剤をコードする上記核酸を含む。好ましくは、上記ポリヌクレオチド配列は、少なくとも１の開裂部位により隣接される。好ましくは、直鎖化される上記ポリヌクレオチド配列は、２の開裂部位により隣接される。好ましくは、上記開裂部位は、エンドヌクレアーゼ部位であり、そして上記開裂剤は対応するエンドヌクレアーゼである。更に好ましくは、上記エンドヌクレアーゼは、少なくとも１２のヌクレオチドの認識部位を持つ。なお更に好ましくは、上記エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、特に図２の１つのメガヌクレアーゼである。場合により、上記メガヌクレアーゼは、
【００１８】
【表３】
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【００１９】
から成る群より選択される。好ましくは、上記メガヌクレアーゼは、Ｉ−Ｃｅｕ  Ｉ、Ｉ−Ｃｒｅ  Ｉ、およびＩ−Ｓｃｅ  Ｉから成る群より選択される。場合により、上記エンドヌクレアーゼは、合成である。好ましくは、上記ベクターは、二重鎖ＤＮＡベクターである。場合により、上記ベクターは、プラスミドまたはウイルス性ベクターである。好ましくは、上記ベクターは、プラスミドである。好ましくは、上記ポリヌクレオチド配列は、ポリペプチドまたはアンチセンスをコードする配列、制御配列、または分子の認識配列である。好ましくは、上記宿主細胞は、幹細胞、体細胞、配偶子、割球、および卵から成る群より選択される。更に好ましくは、上記宿主細胞は、幹細胞、割球、および卵から成る群より選択される。場合により、宿主細胞ゲノム内にポリヌクレオチドをランダムに組込むための上記方法は、安定形質移入または形質転換に使用される。
【００２０】
本発明の１つの好ましい態様において、方法は、ベクターからの遊離５’および３’末端を持つ上記直鎖ポリヌクレオチドの宿主細胞への（インビボまたはインオボでの）調製によって、宿主細胞ゲノムにポリヌクレオチドをランダムに組込む方法に存し、上記方法は以下の工程を含む。
ａ）上記宿主細胞内に、遊離５’および３’末端を持たず、そして直鎖化または切除されるポリヌクレオチド配列を含むベクターを導入することであって、上記ベクターが少なくとも１の開裂部位を含み、そして上記開裂部位は宿主細胞ゲノム内に５未満のコピー、好ましくは、２のコピーが見られ、そして更に好ましくは、上記開裂部位が、宿主細胞ゲノム内に見られない、ベクターを導入すること、
ｂ）場合により、上記宿主細胞に上記ベクターに存在する上記エンドヌクレアーゼ部位を開裂するエンドヌクレアーゼまたは上記エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む発現ベクターのどちらかを導入すること、ならびに
ｃ）上記宿主細胞において（複数の）上記部位を開裂させ、それによって上記宿主細胞内に上記ベクターから遊離５’および３’末端を持つ上記ポリヌクレオチドを直鎖形で作成または放出すること、ならびに、
ｄ）上記直鎖化ポリヌクレオチドの上記宿主細胞ゲノムへのランダム組込を行うのに十分な条件下で、十分な期間にわたって宿主細胞を維持すること、
を含む。
【００２１】
好ましくは、工程ｂ）は、上記宿主細胞に上記エンドヌクレアーゼ部位を開裂するエンドヌクレアーゼを導入することに存する。好ましくは、工程ａ）およびｂ）は、同時である。場合により、上記エンドヌクレアーゼを発現する核酸を含む上記ベクターは、発現ベクターまたはｍＲＮＡである。場合により、上記宿主細胞は、上記エンドヌクレアーゼを発現する遺伝子導入細胞である。本発明により組込まれる上記ポリヌクレオチド配列は、宿主細胞ゲノムとの相同組換えを著しく行うことはできない。場合により、組込まれる上記ポリヌクレオチドは、宿主細胞ゲノム配列との７０％未満の同一性を、好ましくは、６０または５０％未満の、更に好ましくは、４０、３０、または２０％未満の同一性を持つ。場合により、組込まれる上記ポリヌクレオチド５’および３’配列は、宿主細胞ゲノム配列と相同性を持たず、好ましくは、９０％未満の同一性、更に好ましくは、８０または７０％未満の、なお更に好ましくは、５０、４０、３０、または２０％未満の同一性を持ち、ここで上記５’および３’配列は５kb長、好ましくは、３kb〜１．５kb長、更に好ましくは、１kb、５００bpまたは１００bp長である。好ましくは、開裂部位は、付着末端を産生しない。場合により、上記ベクターは更に、エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む。場合により、直鎖化または切除される上記ポリヌクレオチドおよび上記エンドヌクレアーゼをコードする上記核酸はそれぞれ、別個のベクターによって含まれる。好ましくは、直鎖化または切除される上記ポリヌクレオチドは、エンドヌクレアーゼ部位を含まない。好ましくは、上記ポリヌクレオチド配列は、少なくとも１の開裂部位により隣接される。好ましくは、直鎖化される上記ポリヌクレオチド配列は、２の開裂部位により隣接される。好ましくは、上記エンドヌクレアーゼは、少なくとも１２のヌクレオチドの認識部位である。なお更に好ましくは、上記エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、特に図２の１つのメガヌクレアーゼである。場合により、上記メガヌクレアーゼは、
【００２２】
【表４】
2005503161.tif 000004
【００２３】
から成る群より選択される。好ましくは、上記メガヌクレアーゼは、Ｉ−Ｃｅｕ  Ｉ、Ｉ−Ｃｒｅ  Ｉ、Ｉ−Ｓｃｅ  Ｉから成る群より選択される。場合により、上記エンドヌクレアーゼは、合成物である。好ましくは、上記ベクターは、二重鎖ＤＮＡベクターである。好ましくは、上記ポリヌクレオチド配列は、ポリペプチドまたはアンチセンスをコードする配列、プロモーターまたはエンハンサーなどの制御配列、および／または分子の認識配列を含むことができる。好ましくは、上記宿主細胞は、幹細胞、体細胞、配偶子、割球、および卵から成る群より選択される。更に好ましくは、上記宿主細胞は、幹細胞、割球、および卵から成る群より選択される。場合により、宿主細胞ゲノム内にポリヌクレオチドをランダムに組込むための上記方法は、安定形質移入または形質転換に使用される。
【００２４】
本発明は、形質転換または安定形質移入のための組成物であって、
１）５’および３’遊離末端を持たず、そしてランダムに組込まれる導入遺伝子を含むベクターであって、宿主細胞ゲノム内に５未満のコピーが、好ましくは、２のコピーが見られる少なくとも１の開裂部位を含み、そして更に好ましくは、上記開裂部位が、宿主細胞ゲノム内に見られない上記ベクターと、
２）開裂剤または上記開裂剤をコードする核酸を含むベクターと、
を含む組成物に関する。
【００２５】
好ましくは、上記組成物は、形質転換に使用される。好ましくは、上記組成物は、開裂剤を含む。場合により、上記開裂剤をコードする核酸を含む上記ベクターは、発現ベクターまたはｍＲＮＡである。本発明により組込まれる上記導入遺伝子は、宿主細胞ゲノムとの相同組換えを有効に行うことはできない。場合により、組込まれる上記導入遺伝子は、宿主細胞ゲノム配列との７０％未満の同一性を、好ましくは、６０または５０％未満の、更に好ましくは、４０、３０、または２０％未満の同一性を持つ。場合により、組込まれる上記導入遺伝子５’および３’配列は、宿主細胞ゲノム配列と相同性を持たず、好ましくは、９０％未満の同一性、更に好ましくは、８０または７０％未満の、なお更に好ましくは、５０、４０、３０、または２０％未満の同一性を持ち、ここで上記５’および３’配列は、５kb長、好ましくは、３kb〜１．５kb長、更に好ましくは、１kb、５００bpまたは１００bp長である。好ましくは、開裂部位は、付着末端を産生しない。好ましくは、上記導入遺伝子は、開裂部位を含まない。場合により、上記導入遺伝子を含む上記ベクターは更に、開裂剤をコードする核酸を含む。場合により、上記導入遺伝子および上記開裂剤をコードする上記核酸はそれぞれ個別のベクターによって含まれる。好ましくは、上記導入遺伝子は、少なくとも１の開裂部位により隣接される。好ましくは、上記導入遺伝子は、２の開裂部位により隣接される。好ましくは、上記開裂部位は、エンドヌクレアーゼ部位であり、そして上記開裂剤は対応するエンドヌクレアーゼである。好ましくは、上記エンドヌクレアーゼは、少なくとも１２のヌクレオチドの認識部位である。なお更に好ましくは、上記エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、特に図２の１つのメガヌクレアーゼである。場合により、上記メガヌクレアーゼは
【００２６】
【表５】
2005503161.tif 000005
【００２７】
から成る群より選択される。好ましくは、上記メガヌクレアーゼは、Ｉ−Ｃｅｕ  Ｉ、Ｉ−Ｃｒｅ  Ｉ、およびＩ−Ｓｃｅ  Ｉから成る群より選択される。場合により、上記エンドヌクレアーゼは、合成である。好ましくは、上記ベクターは、二重鎖である。好ましくは、上記ベクターは、プラスミドである。場合により、上記導入遺伝子は、ポリペプチドまたはアンチセンスをコードする配列、プロモーターまたはエンハンサーなどの制御配列、および／または分子の認識配列を含むことができる。
【００２８】
本発明は、遺伝子導入細胞、非ヒト動物、または植物を生成するための、本発明による組成物の使用に関する。好ましくは、上記非ヒト動物は、非ヒト動物、鳥類、爬虫類、両生類、および魚類から選択される。例えば本発明は、畜牛（雌ウシ）、ヤギ、ウサギ、げっ歯類、マーモット、サル、昆虫類（クモ、チョウ、ハエ）魚類、イカ、ナメクジウオ、アフリカツメガエル、鳥類、ニワトリ、ホヤ類、およびヒツジ種（ヒツジ）を意図する。更に詳細には、本発明は、トゲウオ、アスティアナックス、メダカ、およびゼブラフィッシュなどの魚類、ニワトリなどの鳥類およびマウスなどのげっ歯類を意図する。
【００２９】
本発明は、例えばタンパク質または他の遺伝子、生体分子、生体材料、遺伝子導入植物、ワクチン、遺伝子導入植物、および動物の作成のための、あるいは個体における症状または障害の治療または予防のための、本発明によるポリヌクレオチドのインビボまたはインオボ直鎖化およびランダムポリヌクレオチド組込の方法から生じた細胞および、その使用にも関する。更に詳細には、本発明は、本発明によるポリヌクレオチドのインビボ直鎖化およびランダムポリヌクレオチド組込の方法から生じた細胞を含む、非ヒト遺伝子導入動物および遺伝子導入植物に関する。本発明はまた、タンパク質、アンチセンス、生体分子、生体材料、またはワクチンの作成のための、本発明による細胞の、非ヒト遺伝子導入動物の、または遺伝子導入植物の使用に関する。本発明は更に、個体における症状または障害の治療または予防のために生じた細胞の使用に関する。
【００３０】
その上、本発明は、ポリヌクレオチドのランダム組込による、その必要がある個体における遺伝病の治療または予防の方法であって、
ａ）上記個体細胞内に、遊離５’および３’末端を持たず、そして上記ポリヌクレオチド配列を含むベクターを導入する工程であって、上記ベクターが、個体細胞ゲノム内に５未満のコピーが、好ましくは、２のコピーが見られる少なくとも１の開裂部位を含み、そして更に好ましくは、上記開裂部位が、宿主細胞ゲノム内に見られない、工程と、
ｂ）上記個体細胞において（複数の）上記部位を開裂させ、それによって上記個体細胞内に上記ベクターから遊離５’および３’末端を持つ上記ポリヌクレオチドを直鎖形で作成または放出する工程と、ならびに、
ｃ）上記ポリヌクレオチドの上記ランダム組込が上記遺伝病を引き起こす遺伝的欠陥を補償する、上記直鎖化または切除ポリヌクレオチドの上記個体細胞ゲノムへのランダム組込を行うのに十分な条件下で、十分な期間にわたって宿主細胞を維持する工程と、
を含む方法に関する。
【００３１】
場合により、上記方法は、更に工程（ｂ）の前に、上記個体細胞内に開裂剤または上記開裂剤をコードする核酸を含むベクターを導入する追加の工程を含む。本発明により組込まれる上記ポリヌクレオチド配列は、宿主細胞ゲノムとの相同組換えを受けることはできない。場合により、組込まれる上記ポリヌクレオチドは、宿主細胞ゲノム配列との７０％未満の同一性を、好ましくは、６０または５０％未満の、更に好ましくは、４０、３０、または２０％未満の同一性を持つ。場合により、組込まれる上記ポリヌクレオチド５’および３’配列は、宿主細胞ゲノム配列と相同性を持たず、好ましくは、９０％未満の同一性、更に好ましくは、８０または７０％未満の、なお更に好ましくは、５０、４０、３０、または２０％未満の同一性を持ち、ここで上記５’および３’配列は、５kb長、好ましくは、３kb〜１．５kb長、更に好ましくは、１kb、５００bpまたは１００bp長である。好ましくは、開裂部位は、付着末端を産生しない。好ましくは、切除される上記ポリヌクレオチド配列は、開裂部位を含まない。好ましくは、直鎖化または切除される上記ポリヌクレオチド配列を含む上記ベクターは更に、上記開裂剤をコードする上記核酸を含む。好ましくは、直鎖化または切除される上記ポリヌクレオチド配列は、少なくとも１の開裂部位により隣接される。好ましくは、直鎖化または切除される上記ポリヌクレオチド配列は、２の開裂部位により隣接される。好ましくは、上記開裂部位は、エンドヌクレアーゼ部位であり、そして上記開裂剤は、対応するエンドヌクレアーゼである。更に好ましくは、上記エンドヌクレアーゼは、少なくとも１２のヌクレオチドの認識部位である。なお更に好ましくは、上記エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、特に図２の１つのメガヌクレアーゼである。場合により、上記メガヌクレアーゼは、
【００３２】
【表６】
2005503161.tif 000006
【００３３】
から成る群より選択される。好ましくは、上記メガヌクレアーゼは、Ｉ−Ｃｅｕ  Ｉ、Ｉ−Ｃｒｅ  Ｉ、およびＩ−Ｓｃｅ  Ｉから成る群より選択される。場合により、上記エンドヌクレアーゼは、合成である。好ましくは、上記ベクターは、二重鎖ＤＮＡベクターである。場合により、上記ベクターは、プラスミドまたはウイルス性ベクターである。好ましくは、上記ベクターは、プラスミドである。好ましくは、上記ポリヌクレオチド配列は、ポリペプチドまたはアンチセンスをコードする配列、制御配列、または分子の認識配列である。好ましくは、上記個体細胞は、幹細胞または体細胞である。
【００３４】
本発明は、遺伝子導入動物を作成するための方法に関する。更に詳細には、本発明は、胚幹細胞が、本発明による方法によって形質移入され、そしてランダム組込事象についてスクリーニングされ、細胞が、遺伝子導入細胞を組込むことができる期、例えば胚盤胞期にて胚に細胞が注入され、次に胚が、代理母に再移植され、そして妊娠期間の終わりに得られる、そして生殖系列の胚幹細胞によるコロニー形成が見られたキメラ個体は、遺伝子導入動物を得るために交配される、非ヒト遺伝子導入動物を作成するための方法に関する。
あるいは、本発明は、受精卵が、本発明による方法によって形質移入され、いずれかの卵が、代理母に再移植され、そして妊娠期間の終わりに得られた遺伝子導入個体または卵を、遺伝子導入動物の発生に適した条件でインキュベートする、非ヒト遺伝子導入動物を作成する方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
定義
＜＜形質転換＞＞とは、好ましくは、遺伝子導入動物または植物の生成を生じる、ゲノムへの新たなＤＮＡ配列の導入を意味する。
【００３６】
本明細書で互換的に使用されるように、「核酸」「オリゴヌクレオチド」、および「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、または単鎖もしくは二重鎖形の１を超えるヌクレオチドのＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列を含む。「ポリヌクレオチド」という用語は、プリンもしくはピリミジン、リボースもしくはデオキシリボース糖部分、およびリン酸塩基、またはホスホジエステル結合を含む単位のポリマーを指す。「ポリヌクレオチド」は、少なくとも１の以下の修飾、（ａ）代わりの結合基、（ｂ）プリンの類似形、（ｃ）ピリミジンの類似形、または（ｄ）類似糖を含む、「修飾ヌクレオチド」を含むポリヌクレオチドも指す。
【００３７】
＜＜インビボ＞＞とは、細胞内を意味し、上記細胞は、分離されるか、または生体に含まれる。＜＜インビボ＞＞という用語は、＜＜インオボ＞＞を含む。＜＜インオボ＞＞とは、卵内を意味する。
【００３８】
隣接された：直鎖化または切除されるポリヌクレオチドは、そのような開裂部位がポリヌクレオチドの一端もしくは両端に、またはその付近に存在する場合、開裂部位により隣接されている。直鎖化もしくはは切除されるポリヌクレオチドの一端に、またはその付近に１の開裂部位が存在することが可能であるか、あるいは直鎖化もしくは切除されるポリヌクレオチドの一端に、またはその付近に２の開裂部位が存在することが可能である。「付近に」とは好ましくは、本発明において、開裂部位は、組込まれるポリヌクレオチドの末端の１kb未満に、好ましくは、５００bp未満に、更に好ましくは、２００、または１００bp未満に位置する。
【００３９】
開裂とは、本発明におけるＤＮＡ二重鎖切断の形成を意味する。「開裂剤」とは、「開裂部位」を開裂させることができる薬剤を意味する。
【００４０】
「エンドヌクレアーゼ」とは、高特異性位置にてＤＮＡ分子内に二重鎖切断を作成する酵素を意味する。このエンドヌクレアーゼは、天然型でありうる。好ましくは、酵素は、ホーミングエンドヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼである。このエンドヌクレアーゼは合成でもよい。
【００４１】
「生体分子」とは本発明において、ポリペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、またはＲＮＡポリヌクレオチドなどの生物の必須の部分である有機分子であることを意味する。
【００４２】
「遊離末端」とは、エキソヌクレアーゼ分解で利用可能な平滑末端ならびに５’および３’オーバーハングを意味する。したがって直鎖分子の場合、エキソヌクレアーゼ分解を廃止または著しく低下させる５’および３’の修飾は、遊離末端とはみなされないであろう。例えば二次構造を含む直鎖ポリヌクレオチドまたは末端にてエキソヌクレアーゼ耐性を与える修飾ヌクレオチドは、遊離末端を持っているとは見なされない。
【００４３】
「細胞」または「宿主細胞」は、本明細書で互換的に使用される用語である。そのような用語は特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫を指す。ある修飾が、変異または環境影響のいずれかにより続く世代に生じることがあるため、そのような子孫は、親細胞と同一でないことがあるが、本明細書で使用されるように用語の範囲内になお含まれる。細胞は、幹細胞（好ましくは、胚幹細胞）、体細胞、配偶子、割球、および卵（好ましくは、受精卵）でありうる。
【００４４】
＜＜外来性ポリヌクレオチド＞＞とは、宿主細胞染色体と類似性がないポリヌクレオチドを意味する。＜＜類似性なし＞＞とは、宿主細胞染色体の１の配列との５０％未満の同一性、好ましくは、４０または３０％の同一性、更に好ましくは、２０％未満の同一性を意味する。ポリヌクレオチド類似性は、非常に低いため、ポリヌクレオチドは、宿主細胞染色体との相同性組換えを行うことはできない。
【００４５】
「同一性」は、２の核酸分子間の配列同一性を指す。同一性は、比較のために整列された各配列中の位置を比較することによって決定することができる。比較配列中の位置が同じ塩基によって占有される場合、次に分子は、その位置において同一である。核酸間の類似性度または同一性度は、核酸配列により共有される位置における同一のもしくは一致するヌクレオチドの数の関数である。各種の整列アルゴリズムおよび／またはプログラムは、ＧＣＧ配列分析パッケージ（University of Wisconsin, Madison, Wis.）の一部として利用可能であり、例えばデフォルト設定を持ちいて利用できるＦＡＳＴＡ、およびＢＬＡＳＴを含む、２つの配列間の同一性を計算するために使用できる。
【００４６】
本明細書で使用されるように、「導入遺伝子」という用語は、細胞ゲノムに導入された核酸配列（またはそこへのアンチセンス転写物）を意味する。導入遺伝子は、それが導入される遺伝子導入動物／植物または細胞に対して部分的もしくは全体的に非相同、すなわち外来性でありうる。あるいはそれが導入されるが、天然遺伝子とは異なる位置にて動物のゲノムへ挿入される導入遺伝子または細胞の内因性遺伝子に対して相同性である。導入遺伝子は、１またはそれ以上の転写制御配列および選択された核酸の最適な発現に必要であるイントロンなどの他の核酸を含むことができる。本発明を通じて、直鎖化または切除および組込されるポリヌクレオチドは導入遺伝子である。
【００４７】
本発明の「非ヒト動物」または「遺伝子導入動物」は、これに限定されるわけではないが、げっ歯類、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、雌ウシなどの哺乳類、ニワトリ、両生類、爬虫類、魚類、ホヤを含む。アフリカツメガエル属のメンバなどの遺伝子導入両生類、および遺伝子導入ニワトリ、雌ウシ、ヒツジ、および魚類も重要なツールを供給するが、好ましい非ヒト動物は、ラットおよびマウスを含むげっ歯類科、最も好ましくは、マウスから選択される。
【００４８】
「遺伝子導入動物」または「遺伝子導入植物」は、動物または植物の１もしくはそれ以上の細胞が、当業界で周知の遺伝子導入技法などの、人間の介入による導入遺伝子を含有する、の任意の動物または植物を指す。導入遺伝子は、微量注入または組換えウイルスによる感染などによる慎重な遺伝子操作によって、細胞の前駆体内への導入により、直接的または間接的に細胞内に導入される。遺伝子操作という用語は、古典的な異種交配またはインビトロ受精を含まないが、むしろ組換えＤＮＡ分子の導入を指示する。この分子は、染色体内に組込まれる。更に「遺伝子導入動物」または「遺伝子導入植物」は、アンチセンス技法を含む１またはそれ以上の遺伝子の遺伝子破壊が人間の介入により行われる、これらの組換え動物または植物も含む。遺伝子導入動物とは、遺伝子導入胚も意味する。
【００４９】
「ベクター」という用語は、それが結合される別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。好ましいベクターの１つの種類は、エピソーム、すなわち染色体外複製が可能である核酸である。好ましいベクターは、それらが結合する核酸の自律的複製／または発現が可能なベクターである。それらが作動可能による結合される遺伝子の発現を指示することができるベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。本発明によるベクターは、これに限定されるわけではないが、ＹＡＣ（酵母人工染色体）、ＢＡＣ（人工細菌）、バキュロウイルスベクター、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルスベクター、プラスミド、染色体性、非染色体性、半合成、または合成ＤＮＡから成るＲＮＡベクターまたは直鎖もしくは環状ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を含む。一般に、組換えＤＮＡ技法で有用な発現ベクターは、そのベクター形が、染色体に結合されていない環状二重鎖ＤＮＡループを一般に指す「プラスミド」の形であることが多い。以下の細菌性ベクターなどの、多数の適切なベクターが当業者に既知であり、そして市販されている。ｐＱＥ７０，ｐＱＥ６０，ｐＱＥ−９（Qiagen），ｐｂｓ，ｐＤＩＯ，ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ，ｐｓｉＸ１７４．ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ．ｐｂｓｋｓ．ｐＮＨ８Ａ．ｐＮＨＩ６Ａ，ｐＮＨ１８Ａ，ｐＮＨ４６Ａ（Stratagene）；ｐｔｒｃ９９ａ，ｐＫＫ２２３−３，ｐＫＫ２３３−３，ｐＤＲ５４０，ｐＲＩＴ５（Pharmacia）；ｐＷＬＮＥＯ．ｐＳＶ２ＣＡＴ，ｐＯＧ４４，ｐＸＴ１，ｐＳＧ（Stratagene）；ｐＳＶＫ３，ｐＢＰＶ，ｐＭＳＧ，ｐＳＬＶ（Pharmacia）；ｐＱＥ−３０（QIAexpress）。
【００５０】
ウイルス性ベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（例えばアデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス、オルソミクソウイルス（例えばインフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば狂犬病および水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば麻疹およびセンダイ）などのマイナス鎖ＲＮＡウイルス、ピコルナウイルス、およびアルファウイルスなどのプラス鎖ＲＮＡウイルス、およびアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルスタイプ１および２、ＥＢウイルス、サイトメガロウイルス）、およびポックスウイルス（例えばワクシニア、鶏痘、およびカナリア痘）を含む二重鎖ＤＮＡウイルスを含む。他のウイルスは、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、および肝炎ウイルスを含む。レトロウイルスの例は、トリ白血病肉腫、哺乳類Ｃ型、Ｂ型ウイルス、Ｄ型ウイルス、ＨＴＬＶ−ＢＬＶ群、レンチウイルス、スプマウイルスを含む（Coffin, J.M., Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology, Third Edition, B.N.Fieldsら、Eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996）。他の例は、マウス白血病ウイルス、マウス肉腫ウイルス、マウス乳腺癌ウイルス、ウシ白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、ヒヒ内在性ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、Mason-Pfizerサルウイルス、サル免疫不全ウイルス、サル肉腫ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、およびレンチウイルスを含む。ベクターの他の例は、例えば、McVeyら，U.S5,801,030に述べられており、その教示は、参照により本明細書に組み入れられている。
【００５１】
本発明によるベクターは、トランスポゾン（Iviczら 1997, Cell, 91, 501-510; Razら、1998, Current Biology, 8, 82-88；その開示は、参照として本明細書に組み入れられる）を含むことができる。
【００５２】
ベクターは、選択可能マーカー（例えばネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、グルタミンシンテターゼ、および真核細胞培養のためのヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ；S.CerevisiaeのＴＲＰ１；テトラサイクリン、E.coliにおけるリファンピシンまたはアンシピリン耐性；など）を含むことができる。しかし本発明は、同等の機能を果たし、そして本明細書で後に当業界で既知となる、発現ベクターのそのような他の形も含むものである。
【００５３】
（発明の概要）
本発明は、厳密には、形質転換および安定形質移入中のＤＮＡのランダム組込の効率を改善し、そして組込ＤＮＡの完全性のより優れた制御を可能にするとともに、組込ＤＮＡのコピー数を減少させることを可能にする方法を提供することを目的としている。本発明の更に興味深い用途は、形質転換、更に詳細には、形質転換プロセスが無効である種における形質転換である。
【００５４】
本発明による方法は、宿主細胞ゲノムに組込まれるＤＮＡポリヌクレオチドの宿主細胞への（インビボ）直鎖化または切除に存する（図１を参照）。本発明は、組込まれるポリヌクレオチドがベクターからインビボで直鎖化または切除される、宿主細胞のゲノムＤＮＡに外来性ＤＮＡをランダムに組込むための方法に関する。ポリヌクレオチドのインビボ直鎖化または切除は、宿主細胞のゲノムＤＮＡとの組換えに利用可能な遊離末端を持つ直鎖断片を産生することを可能にする。本方法により、上記ベクターは、分解に対して導入遺伝子の保護を可能にする遊離末端を持たない。本発明による方法は、相同性組換えを使用しない。ポリヌクレオチド組込はランダムであり、標的化されない。
【００５５】
したがって本発明は、５’および３’遊離末端を持たないポリヌクレオチドからの、実質的に導入遺伝子に相当する、５’および３’遊離末端を持つ直鎖ポリヌクレオチドのインビボ産生のための方法に関し、上記直鎖ポリヌクレオチドは宿主細胞ゲノム内にランダムに組込まれる。この方法の詳細な態様において、上記ポリヌクレオチドは、開裂部位を持つベクターによって含まれ、上記開裂部位は、宿主細胞ゲノム内に５未満のコピーが、好ましくは、２のコピーが見られ、そして更に好ましくは、上記開裂部位は、宿主細胞ゲノム内に見られない。この方法の好ましい態様において、上記ポリヌクレオチドは、ベクターによって含まれ、そして開裂部位によって隣接され、上記開裂部位は、宿主細胞ゲノム内に５未満のコピーが、好ましくは、２のコピーが見られ、そして更に好ましくは、上記開裂部位は、宿主細胞ゲノム内に見られない。好ましくは、開裂部位は、付着末端を産生しない。好ましくは、インビボ直鎖化または切除される上記ポリヌクレオチドは、開裂部位を含まない。場合により、上記ベクターは更に、開裂剤をコードする核酸配列を含む。好ましくは、上記開裂部位は、エンドヌクレアーゼ部位であり、そして上記開裂剤は、対応するエンドヌクレアーゼである。場合により、開裂剤をコードする核酸は、発現ベクターによって含まれる。場合により、開裂剤をコードする核酸は、ｍＲＮＡである。場合により、上記ポリヌクレオチドは、ポリペプチドもしくはアンチセンスをコードする配列、プロモーターまたはエンハンサーなどの制御配列、および／または分子の認識配列を含むことができる。
【００５６】
本発明による方法は、ベクターからの遊離５’および３’末端を持つ上記直鎖ポリヌクレオチドのインビボ調製によって、ポリヌクレオチドを宿主細胞ゲノム内にランダムに組込むための方法に存し、上記方法は以下の、
ａ）上記宿主細胞内に、遊離５’および３’末端を持たず、そして上記ポリヌクレオチド配列を含むベクターを導入する工程であって、上記ベクターが、宿主細胞ゲノム内に５未満のコピー、好ましくは、２のコピーが見られる少なくとも１の開裂部位を含み、そして更に好ましくは、上記開裂部位が、宿主細胞ゲノム内に見られない、ベクターを導入する工程と、
ｂ）上記宿主細胞において（複数の）上記部位を開裂させ、それによって上記宿主細胞内に、遊離５’および３’末端を持つ上記ベクターからの上記ポリヌクレオチドを直鎖形で作成または放出する工程と、ならにびに、
ｃ）上記直鎖化または切除されるポリヌクレオチドの上記宿主細胞ゲノムへのランダム組込を行うのに十分な条件下で、十分な期間にわたって宿主細胞を維持する工程と、
を含む。
【００５７】
好ましくは、本発明による方法は、ベクターからの遊離５’および３’末端を持つ上記直鎖ポリヌクレオチドのインビボ調製によって、ポリヌクレオチドを宿主細胞ゲノム内にランダムに組込むための方法に存し、上記方法は以下の、
ａ）上記宿主細胞内に、遊離５’および３’末端を持たず、そして上記ポリヌクレオチド配列を含むベクターを導入する工程であって、上記ポリヌクレオチドが、宿主細胞ゲノム内に５未満のコピー、好ましくは、２のコピーが見られる少なくとも１の開裂部位に隣接され、そして更に好ましくは、上記開裂部位が、宿主細胞ゲノム内に見られない、ベクターを導入する工程と、
ｂ）上記宿主細胞において（複数の）上記部位を開裂させ、それによって上記宿主細胞内に、遊離５’および３’末端を持つ上記ベクターからの上記ポリヌクレオチドを直鎖形で作成または放出する工程と、ならびに、
ｃ）上記直鎖化または切除されるポリヌクレオチドの上記宿主細胞ゲノムへのランダム組込を行うのに十分な条件下で、十分な期間にわたって宿主細胞を維持する工程と、
を含む。
【００５８】
本発明の１つの態様において、ベクターからの遊離５’および３’末端を持つ上記直鎖ポリヌクレオチドのインビボ調製により、ポリヌクレオチドを宿主細胞ゲノム内にランダムに組込むための方法は、以下の、
ａ）上記宿主細胞内に、遊離５’および３’末端を持たず、そして上記ポリヌクレオチド配列を含むベクターを導入する工程であって、上記ポリヌクレオチドが、宿主細胞ゲノム内に５未満のコピーが見られる少なくとも１の開裂部位に隣接される、ベクターを導入する工程と、
ｂ）開裂剤または上記開裂剤をコードするベクターを導入する工程と、
ｃ）上記宿主細胞において（複数の）上記部位を開裂させ、それによって上記宿主細胞内に、遊離５’および３’末端を持つ上記ベクターからの上記ポリヌクレオチドを直鎖形で作成または放出する工程と、ならびに、
ｄ）上記直鎖化または切除されるポリヌクレオチドの上記宿主細胞ゲノムへのランダム組込を行うのに十分な条件下で、十分な期間にわたって宿主細胞を維持する工程と、
を含む。
【００５９】
本発明の更なる態様において、ベクターからの遊離５’および３’末端を持つ上記直鎖ポリヌクレオチドのインビボ調製により、ポリヌクレオチドを宿主細胞ゲノム内にランダムに組込むための方法は、以下の、
ａ）上記宿主細胞内に：
−遊離５’および３’末端を持たず、そして上記ポリヌクレオチド配列を含むベクターであって、上記ポリヌクレオチドが、宿主細胞ゲノム内に５未満のコピーが見られる少なくとも１の開裂部位に隣接される、ベクターと；および
−開裂剤；
を導入する工程と、
ｂ）上記宿主細胞において（複数の）上記部位を開裂させ、それによって上記宿主細胞内に、遊離５’および３’末端を持つ上記ベクターからの上記ポリヌクレオチドを直鎖形で作成または放出する工程と、ならびに、
ｃ）上記直鎖化または切除されるポリヌクレオチドの上記宿主細胞ゲノムへのランダム組込を行うのに十分な条件下で、十分な期間にわたって宿主細胞を維持する工程と、
を含む。
【００６０】
本発明のプロセスは、組込まれるポリヌクレオチドの放出が、恐らく核内で、宿主細胞のプラスミド膜の通過後にインビボでのみ行うことが可能であるため、優れている。プラスミド膜の通過後、好ましくは、エンドヌクレアーゼによるポリヌクレオチド末端の放出は、いつでもまたは宿主細胞のどのコンパートメントでも実施することができる。
【００６１】
驚くべきことに、組込まれるポリヌクレオチドの完全性は維持され、形質転換の効率は、環状ＤＮＡまたはインビトロ直鎖化ＤＮＡのどちらに比較しても著しく上昇し、およびポリヌクレオチドは非常に小さいコピー数で組込まれる。マウスの場合、形質転換率は、本発明の方法によって３〜５倍上昇する。更に導入遺伝子の完全性は、優れており、そして導入遺伝子は３コピー未満が、更に高頻度で１コピーのみが細胞ゲノムに組込まれる。従来の方法により、少なくとも１０〜２０のコピーがコンカテマーとして組込まれ、そして非常にまれな事象であるが１コピーのみが組込まれる場合、導入遺伝子の完全性は維持されない。
【００６２】
更に詳細には本開示は、メガヌクレアーゼ仲介形質転換が、魚類において最近報告された他の方法よりもめざましく有効である、非常に簡単な技法であることを示す。本発明による方法は、ＤＮＡを魚ゲノム、更に詳細にはメダカ（Oryzias laptipes）またはゼブラフィッシュ（Danio rerio）ゲノムに効率的に組込むことを可能にする（実施例２を参照）。導入遺伝子の発現は、めざましく改良されている。更になお顕著なのは、生殖系列伝達における劇的な上昇である。古典的な卵注入実験において、大半の場合において遅いキメラ組込によって２，３パーセントを超えないのに対して、メガヌクレアーゼと同時注入された魚における生殖系列伝達の頻度は、５０％まで上昇し、創始魚の１細胞期に単一挿入が生じたことを示唆している。その上、大半の場合で、が起こる。したがって、メガヌクレアーゼ誘起インオボ直鎖化は、組込前ＤＮＡ遊離末端の分解を制限することにより、卵注入による形質転換を改良するための簡単および有効なプロセスである。その上、細胞中でのポリヌクレオチド遊離末端の産生は、導入遺伝子組込を改良できる組換え中心を作成することがある。
【００６３】
したがって本発明の方法は、形質転換または安定形質移入の効率が上昇し、そして組込ポリヌクレオチドのコピー数が減少するいくつかの利点を示す。
【００６４】
本発明による方法は、導入遺伝子のランダム組込に関する。したがって導入遺伝子は、宿主細胞ゲノムとの相同性組換えを受けるように設計されていない。ゲノム内に組込まれるポリヌクレオチドの５’および３’配列は、宿主ゲノムの１の座との著しい相同性を持たない。場合により、組込まれる上記ポリヌクレオチドは、宿主細胞ゲノム配列との７０％未満の同一性を、好ましくは、６０または５０％未満の、更に好ましくは、４０、３０、または２０％未満の同一性を持つ。場合により、組込まれる上記ポリヌクレオチド５’および３’配列は、宿主細胞ゲノム配列と相同性を持たず、好ましくは、９０％未満の同一性、更に好ましくは、８０または７０％未満の、更に好ましくは、５０、４０、３０、または２０％未満の同一性を持ち、ここで上記５’および３’配列は５kb長、好ましくは、３kb〜１．５kb長、更に好ましくは、１kb、５００bp、または１００bp長である。
【００６５】
相同組換えによるマウス卵への導入遺伝子の導入では、当業者は、通常、導入遺伝子に３kb未満ではない、約５kbの相同性配列を隣接させる。卵における相同組換えは、極めてまれな事象である。確かに約５kbの相同性配列により、相同組換えは、受精卵１０００万個のうち１クローンのみ生じる。胚性魚細胞において、特に魚受精卵において、相同組換えは決して起きない。
【００６６】
形質転換では、開裂剤は、好ましくは、導入遺伝子を含むベクターと同時注入される。確かに開裂剤の同時注入は、開裂剤の発現による遅延を回避する。導入遺伝子の早期組込は、モザイク現象を減少させるために重要である。
【００６７】
本発明の１つの態様において、方法は、ベクターからの遊離５’および３’末端を持つ上記直鎖ポリヌクレオチドのインビボ調製によって、ポリヌクレオチドを宿主細胞ゲノム内にランダムに組込むための方法に存し、上記方法は、以下の、
ａ）上記宿主細胞内に、遊離５’および３’末端を持たず、そして上記ポリヌクレオチド配列を含むベクターを導入する工程であって、上記ポリヌクレオチドが、宿主細胞ゲノム内に５未満のコピー、好ましくは、２のコピーが見られる少なくとも１のエンドヌクレアーゼ部位に隣接され、そして更に好ましくは、宿主細胞ゲノム内に決して見られない、ベクターを導入する工程と、
ｂ）場合により、上記宿主細胞内に、上記ベクターに存在する上記エンドヌクレアーゼ部位を開裂するエンドヌクレアーゼまたは上記制限エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含むベクターのどちらかを、上記ベクターに導入する工程と、ならびに
ｃ）上記宿主細胞において（複数の）上記部位を開裂させ、それによって上記宿主細胞内に、遊離５’および３’末端を持つ上記ベクターからの上記ポリヌクレオチドを直鎖形で作成または放出する工程と、ならびに、
ｄ）上記切除されるポリヌクレオチドの上記宿主細胞ゲノムへのランダム組込を行うのに十分な条件下で、十分な期間にわたって宿主細胞を維持する工程と、
を含む。
【００６８】
本方法の詳細な態様において、直鎖化または切除される上記ポリヌクレオチドは、２つのエンドヌクレアーゼ部位によって隣接される。好ましくは、工程ｂ）は、上記宿主細胞に、上記ベクターに存在する上記エンドヌクレアーゼ部位を開裂するエンドヌクレアーゼを導入することに存する。好ましくは、工程ａ）およびｂ）は、同時である。好ましくは、開裂部位は、付着末端を産生しない。場合により、上記ベクターは更に、エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む。場合により、直鎖化または切除される上記ポリヌクレオチドおよび上記エンドヌクレアーゼをコードする上記核酸はそれぞれ、別個のベクターによって含まれる。好ましくは、直鎖化または切除される上記ポリヌクレオチドは、開裂部位を含まない。好ましくは、上記ベクターは、二重鎖である。場合により、上記ポリヌクレオチドは、ポリペプチドもしくはアンチセンスをコードする配列、プロモーターまたはエンハンサーなどの制御配列、および／または分子の認識配列を含むことができる。好ましくは、上記宿主細胞は、幹細胞、体細胞、配偶子、割球、および卵から成る群より選択される。
【００６９】
本発明は、形質転換のための組成物であって、
１）５’および３’遊離末端を持たず、そしてランダムに組込まれる導入遺伝子を含むベクターであって、上記導入遺伝子が、宿主細胞ゲノム内に５未満のコピーが、好ましくは、２のコピーが見られる少なくとも１の開裂部位によって隣接され、そして更に好ましくは、上記開裂部位が、宿主細胞ゲノム内に見られないベクターと、
２）開裂剤または上記開裂剤をコードする核酸を含むベクターと、
を含む組成物に関する。
【００７０】
好ましくは、上記組成物は、開裂剤を含む。場合により、上記開裂剤をコードする核酸を含む上記ベクターは、発現ベクターまたはｍＲＮＡである。本発明により組込まれる上記導入遺伝子は、宿主細胞ゲノムとの相同組換えを有効に行うことはできない。場合により、組込まれる上記導入遺伝子は、宿主細胞ゲノム配列との７０％未満の同一性を、好ましくは、６０または５０％未満の、更に好ましくは、４０、３０、または２０％未満の同一性を持つ。場合により、組込まれる上記導入遺伝子の５’および３’配列は、宿主細胞ゲノム配列と相同性を持たず、好ましくは、９０％未満の同一性、更に好ましくは、８０または７０％未満の、なお更に好ましくは、５０、４０、３０、または２０％未満の同一性を持ち、ここで上記５’および３’配列は５kb長、好ましくは、３kb〜１．５kb長、更に好ましくは、１kb、５００bp、または１００bp長である。好ましくは、開裂部位は、付着末端を産生しない。好ましくは、上記導入遺伝子は、開裂部位を含まない。場合により、上記導入遺伝子を含む上記ベクターは更に、上記開裂剤をコードする上記核酸を含む。場合により、上記導入遺伝子および上記開裂剤をコードする上記核酸はそれぞれ、個別のベクターによって含まれる。好ましくは、上記導入遺伝子は、２の開裂部位により隣接される。好ましくは、上記開裂部位は、エンドヌクレアーゼ部位であり、そして上記開裂剤は、対応するエンドヌクレアーゼである。好ましくは、上記エンドヌクレアーゼは、少なくとも１２のヌクレオチドの認識部位である。なお更に好ましくは、上記エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、特に図２の１つのメガヌクレアーゼである。場合により、上記メガヌクレアーゼは
【００７１】
【表７】
2005503161.tif 000007
【００７２】
から成る群より選択される。好ましくは、上記メガヌクレアーゼは、Ｉ−Ｃｅｕ  Ｉ、Ｉ−Ｃｒｅ  Ｉ、およびＩ−Ｓｃｅ  Ｉから成る群より選択される。場合により、上記エンドヌクレアーゼは、合成である。好ましくは、上記ベクターは、二重鎖である。好ましくは、上記ベクターは、プラスミドである。場合により、上記導入遺伝子は、ポリペプチドまたはアンチセンスをコードする配列、プロモーターまたはエンハンサーなどの制御配列、および／または分子の認識配列を含むことができる。
【００７３】
本発明は、遺伝子導入細胞、動物、または植物を作成するための、本発明による組成物の使用に関する。
【００７４】
開裂部位および開裂剤
本発明による開裂部位は、好ましくは、宿主細胞のゲノム内に見られない。本開裂部位が、細胞ゲノム内に存在する場合、細胞ゲノムは、５以下の、好ましくは、２の部位を示す。隣接部位以外のある開裂部位がベクター内に存在する場合、それらは、好ましくは、直鎖化または切除されるポリヌクレオチドを含む領域の外側に位置する。
【００７５】
本発明による開裂部位は、配列または開裂剤に固有の要素である。開裂剤は、例えば、リボザイム、エンドヌクレアーゼでもよい。好ましくは、開裂剤は、エンドヌクレアーゼである。本発明による開裂部位は、適した条件下でＤＮＡ開裂を引き起こす修飾ヌクレオチドである。そのような修飾ヌクレオチドは、例えば歩行不能ヌクレオチド（Lhommeら、1999, Biopolymer, 52, 65-83、その開示は、参照として本明細書に組み入れられる）。歩行不能ヌクレオチドの存在は、例えばエキソヌクレアーゼIIIなどのＡＰ−エンドヌクレアーゼの作用による開裂を引き起こす。
【００７６】
本発明の詳細な態様において、２またはそれ以上の異なるエンドヌクレアーゼを本方法で使用することができる。組込まれるポリヌクレオチドは、例えば、２の異なるエンドヌクレアーゼ部位によって隣接され、および方法は、各エンドヌクレアーゼまたは使用したエンドヌクレアーゼをコードする１もしくは複数のベクターを導入する工程を含む。
【００７７】
好ましくは、組込まれるポリヌクレオチド配列に隣接する部位は、開裂後に付着末端を産生しない。したがって部位の開裂が、付着末端の産生を引き起こす可能性がある場合、部位は、好ましくは、付着末端による多量体化を回避するために、逆配向を持つ。
【００７８】
エンドヌクレアーゼは、宿主細胞のゲノムにおいて、この細胞に対する損傷なしに細胞によって容易に修復できる非常に少数の開裂を産生するように選択される。確かに、損傷のない細胞は、染色体内での非常に少数の開裂、一般に５未満の二重鎖切断、更に好ましくは、２の二重鎖切断を許容する。好ましくは、エンドヌクレアーゼは、宿主細胞染色体内で二重鎖切断を発生しないように選択される。
【００７９】
一般に使用される４および６塩基切断制限酵素は、細胞ＤＮＡ内の多くの制限部位の存在により通常は、染色体ＤＮＡの開裂および細胞死を引き起こすため、本発明には好都合ではない。
【００８０】
好ましくは、本発明による直鎖化または切除されるポリヌクレオチド配列に隣接するエンドヌクレアーゼは、宿主細胞においては自然には生じない。好ましくは、直鎖化または切除されるポリヌクレオチド配列を含むベクターが、プラスミドである場合、隣接エンドヌクレアーゼ部位は、プラスミド生成に使用される細菌中では発生しない。好ましくは、隣接エンドヌクレアーゼ部位は、少なくとも１０、１２、１５、１８、２０、２２、または２５のヌクレオチドの認識部位を持つエンドヌクレアーゼに相当する。詳細な態様において、本発明で使用されるエンドヌクレアーゼは、その認識部位中の１０％の、好ましくは、５％の、更に好ましくは、２％の変化を許容することができる。
【００８１】
大きなＤＮＡ配列を認識するホーミングエンドヌクレアーゼまたメガヌクレアーゼは、本発明で使用できるエンドヌクレアーゼの例である（Dalgaardら、1997, Nucleic Acids Research, 25, 4626-463; Chevalier et Stoddam, 2001, Nucleic Acids Research, 29, 3757-3774）。メガヌクレアーゼ酵素の例は、ネズミまたはヒトＤＮＡで表現されるように思われない１８bp部位を認識するＩ−Ｓｃｅ  Ｉである。Ｉ−Ｓｃｅ  Ｉは、３’ＯＨオーバーハングを持つ４bpの互い違いの切断を生じる。Ｉ−Ｓｃｅ  Ｉメガヌクレアーゼの更なる情報については、米国特許第６，２３８，９２４号を参照のこと、その教示は、参照により本明細書に組み入れられる。好ましい態様において、本発明による方法は、Ｉ−Ｓｃｅ  Ｉエンドヌクレアーゼおよび対応する認識および開裂部位を使用する。
【００８２】
メガヌクレアーゼは、非常にまれな切断をする酵素のファミリーを構成する。メガヌクレアーゼのリストは図２を参照のこと。イントロンＯＲＦ、独立遺伝子、または介入配列（インテイン）によってコードされるホーミングエンドヌクレアーゼは、現在、「メガヌクレアーゼ」として定義される。それらは、ＤＮＡの１２〜２４bpに広がる認識配列を持つが、これに対して「古典的な」制限酵素は、３〜８bp範囲のＤＮＡのはるかに短いストレッチを認識する（レアカッターでは最大１２bp）。メガヌクレアーゼは、構造的および機械的にかなりよく特徴付けられている。それらはよく保存されたアミノ酸モチーフに基づいて、４つの個別のファミリーに分けられる。
【００８３】
１−ドデカペプチドファミリー（ドデカマー、ＤＯＤ、Ｄ１−Ｄ２、ＬＡＧＬＩ−ＤＡＤＧ、Ｐ１−Ｐ２）
これは、その最も一般的な保存配列モチーフによってクラスター形成されたタンパク質の最大のファミリーである（１５０配列を超える）。１２残基配列の１（５配列）または２のコピー（大多数）：ジドデカペプチド。１のドデカペプチド（Ｄ）を持つメガヌクレアーゼは、分子量が約２０kDaであり、そしてホモダイマーとして作用する。２のコピーを持つこれら（ＤＤ）は、各モチーフ間に７０〜１５０の残基を持ち、２５kDa（２３０ＡＡ）〜５０kDa（ＨＯ、５４５ＡＡ）の範囲であり、そしてモノマーとして作用する。
【００８４】
２−ＧＩＧファミリー
ジョイントリーモチーフは、短いが、かなりよく保存されている。ＫＳＧＩＹ（１０／１１  ＡＡ）ＹＩＧＳ。これらのメガヌクレアーゼ（２８配列）では、開裂部位は認識配列とは異なる。
【００８５】
３−ＨＣファミリー
この群の配列は、ヒスチジンおよびシステイン残基が豊富であり、そして保存配列は、ほぼ「ＳＨＬＣ−Ｇ−Ｇ−Ｈ−Ｃ」である。最もよく特徴付けられた酵素は、Ｉ−Ｐｐｏ  Ｉである。
【００８６】
４−ＨＮＨファミリーおよびモチーフなし
前のモチーフをいずれも持っていないために集められた配列の最後の群は、構造的にうまく特徴付けられていない。コンセンサス配列（３５のアミノ酸残基のウィンドウにおいて、ＨＨ−Ｎ−Ｈ−Ｈ）はかなり複雑である。これらのタンパク質のいくつかの特性は、二重鎖切断の後に２kbの５’伸長を残すか、または少なくとも１０のヌクレオチドのスタッガードカットを持つため、他のメガヌクレアーゼとは際立っている（大半のメガヌクレアーゼは、二重鎖ＤＮＡの２の鎖を開裂し、４の塩基対３’突出末端を残す）。
【００８７】
異なるクラスをまとめる：
１のドデカペプチドモチーフ（Ｄ１、ＬＡＧＬ１、Ｐ１）または２のドデカペプチドモチーフ（Ｄ１−Ｄ２、ＬＡＧＬＩ−ＧＤＡＧ、Ｐ１−Ｐ２）、および３’ＯＨオーバーハングを持つ４ｎｔスタッガードカットを残す、認識部位内の開裂によって特徴付けられる、クラスＩ。以下を含む８のサブファミリーがある。
１のドデカペプチドモチーフ：一部の例はＩ−Ｃｅｕ  Ｉ、Ｉ−Ｃｒｅ  Ｉであり、
２のドデカペプチドモチーフ：一部の例は、
【００８８】
【表８】
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である。
【００８９】
少なくとも１の特異性モチーフ（ＧＩＹ−Ｎ10/11−ＹＩＧ）、および３’ＯＨオーバーハングを持つ２ｎｔスタッガードカットを残す、認識部位外の開裂によって特徴付けられる、クラスII。一部の例は、Ｉ−Ｎｃｒ  Ｉ、Ｉ−Ｎｃｒ  II、Ｉ−Ｐａｎ  II、Ｉ−Ｔｅｖ  Ｉである。
【００９０】
Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックス（ＳＨＬＣ−Ｇ−Ｈ−Ｃ）または定義なしモチーフ、および３’ＯＨオーバーハングを持つ４ｎｔスタッガードカットを残す、認識部位内の開裂（１つの例は、Ｉ−Ｐｐｏ  Ｉ）、または少なくとも１０のヌクレオチドの長いサイズのスタッガードカットの開裂（一部の例はＩ−Ｄｉｒ  Ｉ、Ｉ−Ｈｍｕ  Ｉ、Ｉ−Ｈｍｕ  II）のどちらかによって特徴づけられる、クラスIII。
【００９１】
半分の特異性モチーフ（ＧＩＹ−Ｎ10/11−ＹＩＧ）、および３’ＯＨオーバーハングを持つ２ｎｔスタッガードカットを残す、認識部位外の開裂によって特徴付けられる、クラスIV。１つの例は、Ｉ−Ｔｅｖ  IIである。
【００９２】
ＨＮＨモチーフ（ＨＨ−Ｇ−Ｎ−ＣＨ−Ｈ）および５’ＯＨオーバーハングを持つ２ｎｔスタッガードカットを残す、認識部位内の開裂によって特徴付けられる、クラスＶ。１つの例は、Ｉ−Ｔｅｖ  IIIである。
【００９３】
メガヌクレアーゼは、「遊離」遺伝子によってコードすることもできる。これまで、特徴付けられた５の遺伝子（Ｆ−Ｓｃｅ  Ｉ、Ｆ−Ｓｃｅ  II（ＨＯ）、Ｆ−Ｓｕｖ  Ｉ、Ｆ−Ｔｅｖ  Ｉ、Ｆ−Ｔｅｖ  II）が、酵母およびバクテリオファージで既知である。
【００９４】
メガヌクレアーゼは、インテインでもよい。これまで、４６の異なる種および株（真核細胞７、細菌２３、古細菌１６）において、１２０のタンパク質配列が、特徴付けられている（実験による証明３５、理論７５）。２００を超える潜在的配列がある。
【００９５】
本発明のプロセスのエンドヌクレアーゼは、制限なく、以下を含む群において選択できる。
【００９６】
【表９】
2005503161.tif 000009
【００９７】
好ましくは、上記エンドヌクレアーゼは、Ｉ−Ｃｅｕ  Ｉ、Ｉ−Ｃｒｅ  Ｉ、Ｉ−Ｓｃｅ  Ｉから成る群より選択される。更に好ましくは、上記エンドヌクレアーゼは、Ｉ−Ｓｃｅ  Ｉである。
【００９８】
Ｉ−Ｓｃｅ  Ｉエンドヌクレアーゼなどの一部のエンドヌクレアーゼは、開裂の後に半分の開裂部位に非共有的に結合されたままである（Ｉ−Ｓｃｅ  Ｉの大きな部位）。この特性は、エンドヌクレアーゼ分解に対して切除されたポリヌクレオチドの遊離末端を保護するために使用できる。確かに開裂部位は、結合能力を持つ半部位がポリヌクレオチドの末端に配置されるように配向されている。その上、Ｉ−Ｓｃｅ  Ｉエンドヌクレアーゼなどの一部の制限エンドヌクレアーゼは更に、核標的化を可能にするＮＬＳ状の配列（核局在化配列）を更に示す。この更なる特性は、直鎖化または切除が細胞質で発生する場合、直鎖化または切除されたポリヌクレオチドの核局在化を促進するために使用できる
【００９９】
したがって本発明の１つ態様において、隣接部位は、エンドヌクレアーゼ結合能力を持つ半部位が直鎖化または切除されるポリヌクレオチドに向かって配置されるように配向される。本態様において、切除されたポリヌクレオチドの遊離末端は、エンドヌクレアーゼ分解に対して保護され、および／または切除されたポリヌクレオチドの核への運搬が促進される。
【０１００】
あるいは、切除されたまたは直鎖化ポリヌクレオチドの半開裂部位に対するエンドヌクレアーゼの存在は、遊離末端をマスキングし、そしてこれらの末端を宿主細胞ゲノムとの組換えにあまり利用できないようにする。
【０１０１】
したがって本発明の別の態様において、隣接部位は、エンドヌクレアーゼ結合能力を持つ半部位がベクトルに向かって配置されるように配向される。
【０１０２】
合成エンドヌクレアーゼも本発明で考慮される。これらの合成エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ認識ドメインおよびＤＮＡ開裂ドメインを含む。
【０１０３】
ＤＮＡ認識ドメインは、タイプIIＳ制限エンドヌクレアーゼの認識ドメインなどのＤＮＡ認識ドメインを示す天然型タンパク質に由来することが可能である（例えばＦｏｋＩのアミノ酸１−３８２、米国特許第５，３５６，８０２号、その開示は、参照として本明細書に組み入れられる）。適切な認識ドメインは、これに限定されるわけではないが、ジンクフィンガーモチーフの認識ドメイン、ホメオドメインモチーフ、ＰＯＵドメイン、ラムダリプレッサ、ｌａｃリプレッサ、ｃｒｏ、ｇａ１４などの、リプレッサの他のＤＮＡ結合タンパク質ドメイン、ｍｙｃ、ｊｕｎなどの発癌遺伝子のＤＮＡ結合タンパク質ドメイン、および６を超える塩基対を認識する他の天然型配列特異性ＤＮＡ結合タンパク質を含む。ＤＮＡ認識ドメインは、以下のモチーフを含むことができる。ヘリックス・ターン・ヘリックス、ジンクフィンガー、ステロイド受容体、ヘリックス・ループ・ヘリックス、またはロイシンジッパーのような他のらせん状モチーフ。ＤＮＡ認識ドメインは、好ましくは、その認識部位が、１０未満のヌクレオチドである（国際公開公報第９６／２０９５１号、その開示は、参照として本明細書に組み入れられる）、例えば少なくとも３のジンクフィンガーの組合せである場合（国際公開公報第６，０１３，４５３号；米国特許第６，９９７，９０８号、その開示は、参照として本明細書に組み入れられる）、既存ＤＮＡ認識ドメインの組合せである。既存ＤＮＡ認識ドメインは、修飾されていても、天然型でもよい。しかしそのようなＤＮＡ認識ドメインは、合成でもよい。ＤＮＡ認識ドメインは、天然または修飾ポリヌクレオチドでもよい。
【０１０４】
ＤＮＡ開裂ドメインは、タイプII制限エンドヌクレアーゼの開裂ドメインなどのＤＮＡ開裂ドメインを含むタンパク質に由来することができる（例えば、ＦｏｋＩのアミノ酸３８３−５７８、米国特許第５，３５６，８０２号、その開示は、参照として本明細書に組み入れられる）。
【０１０５】
開裂剤、好ましくは、エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含むベクター
宿主細胞に対する開裂剤の作用は、宿主細胞への開裂剤、好ましくは、エンドヌクレアーゼの投与によるか、または開裂剤、好ましくは、エンドヌクレアーゼの発現によって得ることができる。この最後の場合では、本発明のプロセスは、制御配列、特に宿主細胞に適したプロモーターの制御下にて、開裂剤、好ましくは、エンドヌクレアーゼをコードする核酸によって宿主細胞を形質転換することによって実現することができる。開裂剤の発現のための他の代替方法は、開裂剤をコードするｍＲＮＡの宿主細胞への導入である。本発明において、開裂剤をコードする核酸を含むベクターは、開裂剤をコードするｍＲＮＡも示す。
【０１０６】
本発明は、開裂剤を発現する遺伝子導入動物または植物からの宿主細胞の使用も考慮する。この場合、開裂剤または開裂剤をコードする核酸の導入は、もはや必要ない。開裂剤をコードする核酸は、好ましくは、ＶＡＳＡ、卵細胞中のタンパク質合成のプロモーター、ステージIIで即時の発現を伴う強力なプロモーターなどの生殖系列に特異性のプロモーターに作動可能による結合される。
【０１０７】
開裂剤、好ましくは、エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含むベクターは、１またはそれ以上の発現制御配列に作動可能による結合されたエンドヌクレアーゼのコード配列の全部または一部を含有し、それによってコード配列は、エンドヌクレアーゼの生成または合成を可能にする転写信号の制御下となる。したがって上記エンドヌクレアーゼをコードする上記核酸は、発現カセットに含まれる。更に詳細には、ベクターは複製起点、上記コード核酸に作動可能による結合されたプロモーター、リボゾーム結合部位、ＲＮＡスプライシング部位（ゲノムＤＮＡが使用される場合）、ポリアデニル化部位、および転写終止部位を含む。プロモーターの選択は、エンドヌクレアーゼを発現するための所望の経路によって変わる。
【０１０８】
確かに真核生物宿主の場合、プロモーターは、メタロチオネインプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルス性プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターなどの強力プロモーター、ビリン、またはアクチンプロモーターなどの遍在性プロモーター、構成、または誘発性プロモーター、α−フェトタンパク質プロモーター、アミラーゼプロモーター（特にネズミアミラーゼプロモーター）、カテプシンＥプロモーター、Ｍ１ムスカリン受容体プロモーター、またはγ−グルタミルトランスフェラーゼプロモーターなどの組織特異性プロモーター、または腫瘍特異性プロモーターでもよい。場合により、ベクターは、更にエンハンサーおよびインスレータ（Kafferら、Genes Dev.2000, 14, 1908-19，欧州特許第８５９，０５９号；国際公開公報第９６／０４３９０号、その開示は、参照として本明細書に組み入れられる）。宿主細胞が、受精卵または胞胚である場合、開裂剤、好ましくは、エンドヌクレアーゼは、早期に発現される必要がある。
【０１０９】
エンドヌクレアーゼの生成または合成を可能にする要素は、天然要素に由来する天然性でも新規に製造されてもよい。次に要素は、適合性クローニングおよび制限部位の使用などの当業界で既知の方法によって、分離および共に融着することができる。本発明の方法による１つの利点は、宿主細胞ゲノムに組込まれる直鎖ポリヌクレオチドを切除するためには、適切なエンドヌクレアーゼの一過的発現のみが必要であることである。
【０１１０】
宿主細胞が、原核細胞である場合、ゆえに本発明のベクターは少なくとも１のプロモーターであって、原核ＲＮＡポリメラーゼによって認識され、ゆえにそのプロモーターに作動可能による結合されるポリヌクレオチドの転写を可能にすることができるプロモーターを含有する。ベクターは、所望の場合、複数の原核プロモーターを持つことができる。利用される特異性原核プロモーターは、ベクターの宿主となる原核細胞によって変わる。適切なプロモーターの例は、λｐＬまたはλｐＲプロモーター、Ｔ６ポリメラーゼプロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターなどの構成もしくは誘発性プロモーター、または他のよく特徴付けられたプロモーター（例えばｌａｃ、ｒｅｃＡ、ｇａｌ、ｔｒｐ、ａｒａ、ｈｕｔなど）を含む。最も好ましくは、原核細胞での発現に使用されるプロモーターは、誘発性となる。
【０１１１】
好ましい真核発現ベクターは、細菌内でのベクターの増殖を促進するための原核配列、および真核細胞内で発現される１またはそれ以上の真核転写ユニットの両方を含有する。プラスミドの調製および宿主生物の形質転換で利用される各種の方法は、当業界で周知である。一般的な組換え手順とともに、原核および真核細胞の両方に適切な他の発現系については、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed.by Sambrook, Fitsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989) Chapters 16 and 17を参照のこと。その教示は、参照として本明細書に組み入れられる。
【０１１２】
宿主細胞内へ直鎖化または切除されるポリヌクレオチド
本発明のプロセスによって直鎖化または切除されるポリヌクレオチドは、任意の天然または合成ヌクレオチドでもよい。上記ポリヌクレオチドは好ましくは、宿主細胞にとって外来性である。更に好ましくは、上記ポリヌクレオチドは、宿主細胞染色体配列に類似性ではない。それは遺伝子配列または遺伝子間配列を含むことができる。それはコードまたは非コード配列を含むことができる。上記コード配列は、ペプチド、タンパク質、およびＲＮＡを含む、どの所望の生成物もコードすることができる。ポリヌクレオチドは、レポーター遺伝子をコードすることができる。それは、ポリペプチドまたはアンチセンス用のコード配列、またはプロモーター、エンハンサー、サイレンサーなどの制御配列を含むことができる。それは、ホルモン、転写因子、エンドヌクレアーゼ、ポリヌクレオチドなどの分子の認識配列を含むことができる。
【０１１３】
組込まれるポリヌクレオチドは、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスフェターゼ、緑色蛍光タンパク質、チロシナーゼ、ＤｓＲｅｄタンパク質などのレポーター遺伝子を含むことができる。レポーター遺伝子とは、容易にアッセイされる生成物をコードする核酸を意味する。好ましくは、レポーター遺伝子は、強力プロモーターまたは組織特異性プロモーターの制御下にある。
【０１１４】
更に詳細には、本発明のプロセスによって組込まれるポリヌクレオチドは、制限なく以下を含む群において選択することができる。
遺伝子コードタンパク質：エリスロポエチン、アルブミン、成長ホルモン、α１−アンチトリプシンなどの分泌タンパク質；表面タンパク質；あるいは、ヘモグロビン（α、β、γ、ε）、コラーゲン（タイプＩ、II、III、IV、α１〜５）、ケモカイン受容体、インターフェロン（α、β、γ）、カスパーゼ、ｐ５３などのタンパク質
転移ＲＮＡをコードする配列：異常なコドンのｔＲＮＡ（ミトコンドリアまたは合成ｔＲＮＡ）、
ワクチン化遺伝子α、スーパー抗原、アジュバント（Ｃ３ｄ）をコードする配列；
還元ＣＭＨペプチドなどのペプチドをコードする配列；
ＨＬＡ鎖をコードする配列；
チトクロームｐ４５０組合せをコードする配列；
代謝経路をコードする配列（リシンまたはフェニルアラニン）。
染色体Ｘ不活性化の遺伝子＜ｇｅｎｅ  ｘｉｓｔ＞、母性効果を持つ遺伝子（ｄｄｋ遺伝子）、クロマチンオープニング配列（ＨＮＦ４）、多数または少数のＳＰ１部位を持つリッチＣｐＧ配列（ＣＣＣＧＣＣ／ＧまたはＣ／ＧＧＣＧＧＧ）、ＭＡＲまたはＳＡＲ配列、真核、細菌、またはウイルス性染色体複製起点などの、クロマチン制御配列；
転写のための染色体オープニングを制御する配列（遺伝子座調節領域ＬＣＲ、優性調節領域ＤＣＲ）、真核構成、または組織特性プロモーター、誘発性プロモーター（メタロタンパク質、細菌性オペレータ、Ｔ７プロモーター、テトラサイクリン誘発性プロモーター（ｔｅｔ−ＯＮおよびｔｅｔ−ＯＦＦ）、エンハンサー、サイレンサー、ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７またはウイルス性ポリメラーゼ）、興味のある遺伝子に続く内部リボゾームエントリ部位ＩＲＥＳなどの、転写制御配列；
メガヌクレアーゼの部位（例えばＩ−Ｓｃｅ  Ｉ、Ｉ−Ｔｅｖ  III、Ｆ−Ｓｃｅ  Ｉ、Ｆ−Ｓｃｅ  II、Ｉ−Ｃｅｕ  Ｉ、Ｉ−Ｄｍｏ  Ｉ、Ｉ−Ｃｈｕ  Ｉ、ＰＩ−Ｓｃｅ  Ｉ、ＰＩ−ＰＳｐＩまたは合成メガヌクレアーゼの部位）；反復配列（ＡＬＵ、ＳＩＮＥＳ、ＬＩＮＥＳ）；マイクロまたはミニサテライト；ＲＡＧ、ｌｏｘＰ、ＦＲＴまたはβ−レゾルベース部位；トランスポゾンの逆反復配列；トランスポゾン；プロウイルス；トランスポゾンおよびウイルスのＬＴＲなどの、ゲノム工学にとって興味のある配列；
アンチセンス配列およびリボザイム：ｍＲＮＡ、更に詳細にはｐ５３、Ｒｂ、ｐ１６、ｐ２１ｍＲＮＡ、メガヌクレアーゼ、ＲＡＧ、トランスクリプターゼ、ウイルス性ｍＲＮＡなどのゲノム工学に関与するタンパク質のｍＲＮＡの、アンチセンス。
【０１１５】
遺伝子の場合、ポリヌクレオチドは、好ましくは、遺伝子の発現に必要なすべての要素を含む。したがってコードポリヌクレオチドは、１またはそれ以上の発現調節配列に作動可能に結合され、それによってコード配列は、コード生成物の生成または合成を可能にするために転写信号の制御下となる。上記コードポリヌクレオチドは、発現カセットに含まれる。更に詳細には、ベクターは複製原点、上記コード核酸に作動可能による結合されるプロモーター、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライシング部位（ゲノムＤＮＡが使用される場合）、ポリアデニル化部位および転写終止部位を含む。プロモーターの選択は、コード生成物を発現するための所望の経路によって変わる。確かにプロモーターは、メタロチオネインプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルス性プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ビリンまたはアクチンプロモーターなどの遍在性プロモーター、構成、または誘発性プロモーター、α−フェトタンパク質プロモーター、アミラーゼプロモーター（特にネズミアミラーゼプロモーター）、カテプシンＥプロモーター、Ｍ１ムスカリン受容体プロモーター、またはγ−グルタミルトランスフェラーゼプロモーターなどの組織特異性プロモーター（国際公開公報第９８／５６９０２号、表１を参照のこと。その開示は、参照として本明細書に組み入れられる）または腫瘍特異性プロモーターでもよい。場合により、ベクターは、更にエンハンサーおよびインシュレーター（Kafferら、Genes Dev.2000, 14, 1908-19，欧州特許第８５９，０５９号；国際公開公報第９６／０４３９０号、その開示は、参照として本明細書に組み入れられる）を含有することができる。
【０１１６】
エンドヌクレアーゼの生成または合成を可能にする要素は、天然要素に由来する天然性でも新規に製造されてもよい。次に要素は、適合性クローニングおよび制限部位の使用などの当業界で既知の方法によって、分離および共に融合することができる。
【０１１７】
直鎖化または切除されるポリヌクレオチドを含むベクター
好ましい真核発現ベクターは、細菌内でのベクターの増殖を促進するための原核配列、および真核細胞内で発現される１またはそれ以上の真核転写ユニットの両方を含有する。プラスミドの調製および宿主生物の形質転換で利用される各種の方法は、当業界で周知である。一般的な組換え手順とともに、原核および真核細胞の両方に適切な他の発現系については、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed.by Sambrook, Fitsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989) Chapters 16 and 17を参照のこと。その教示は参照により本明細書に組み入れられている。
【０１１８】
本発明の好ましい態様において、直鎖化または切除されるポリヌクレオチドを含むベクターは、隣接部位に対応する、開裂剤、好ましくは、エンドヌクレアーゼをコードする配列も含む。この実に好ましい態様において、開裂剤、好ましくは、エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子は、調節のその独自の配列を含有し、そしてゆえに直鎖化または切除されるポリヌクレオチドと同じ読取枠内に配置されない。
【０１１９】
開裂部位に隣接された宿主細胞ゲノム中に直鎖化または切除されるポリヌクレオチドを含むベクターは、当業界で一般に既知の方法によって製造することができる。例えば本ベクターは、化学合成、組換えＤＮＡ／ＲＮＡ技術またはその両方の組合せによって製造することができる（Sambrookら、Eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor University Press, New York (1989); およびAusubelら、Eds., Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1997) ；その開示は、参照として本明細書に組み入れられる）。
【０１２０】
本発明による直鎖化または切除されるポリヌクレオチドを含むベクターは、遊離５’および３’末端を示さない。ベクターは好都合には、プラスミドなどの環状ＤＮＡ分子であるが、エキソヌクレアーゼに到達できない末端を持つ直鎖分子でもよい。第一の実施例において末端は、エキソヌクレアーゼを末端から保護する、ヘアピンのような二次構造を採る。第二の実施例において、エキソヌクレアーゼ作用を阻害するために、末端を化学修飾することができる。そのような修飾は例えば、エキソヌクレアーゼに耐性であるホスホチオアートの使用でもよい（Putney 1981; Olsen and Ecktein 1990）。第三の実施例において、末端を、エキソヌクレアーゼへの到達を妨げる立体阻害分子に結合することができる。そのような分子は例えば、タンパク質またはポリアミドでもよい。このタンパク質は多少の核親和性を持ち、そしてベクターを核に対して反応させる。好ましくは、阻害置換基は、１ｋＤ以下の分子量を持つ。各種のビオチン、コレステロール、または他のステロイド非毒性置換基、あるいは非間在カチオン性蛍光色素を使用することができる。
【０１２１】
図３は、本発明による直鎖ベクターの一部の例を開示する。図３Ａにおいて、直鎖ベクターは、それら自体はＦ−Ｔｅｖ  Ｉ部位などの他のエンドヌクレアーゼによって隣接されるＩ−Ｔｅｖ  III部位などの２のエンドヌクレアーゼ部位によって隣接された、直鎖化または切除されるポリヌクレオチドを含むプラスミドより得られる。Ｆ−Ｔｅｖ  Ｉエンドヌクレアーゼは、インビトロでは、Ｆ−Ｔｅｖ  Ｉ部位を開裂させ、そしてこの開裂は、ヘアピン構造を採ることのできる突出末端を生成する。場合により、ループを共有結合的に閉じるために、リガーゼを使用することができる。宿主細胞は、末端にヘアピンを持つこの直鎖作成物によって形質転換することができ、直鎖化または切除されるポリヌクレオチドは、Ｉ−ｔｅｖ  III部位などの２のエンドヌクレアーゼ部位によって隣接される。
【０１２２】
同様に図３Ｂにおいて、両末端にヘアピンを持つ直鎖ベクターは、以下のように作成することができる。直鎖化または切除されるポリヌクレオチドは、インビトロで、平滑末端または付着末端によって調製される。このポリヌクレオチドは、ヘアピンを形成するオリゴヌクレオチドと混合され、そのようなヘアピンはその尾部に開裂部位、好ましくは、エンドヌクレアーゼ部位を示す。ヘアピン尾部の末端は、平滑または凝集性である。ヘアピンと直鎖化または切除されるポリヌクレオチを共有結合するために、連結が行われる（Perrinら、EMBO J 1993, 12, 2939-2947；その教示は参照により本明細書に組み入れられている）。
【０１２３】
開裂部位によって隣接される直鎖化または切除されるポリヌクレオチドおよび／または、開裂剤、好ましくは、エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含むベクターは、各種の方法によって細胞内に導入することができる（例えば形質転換、形質移入、直接摂取、噴出照射、リポソームの使用など）。細胞を形質移入または形質転換する適切な方法の例は、リン酸カルシウム沈殿、電気穿孔、微量注入、感染、リポフェクション、および直接摂取を含む。そのような方法は更に詳細に、例えばSambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor University Press, New York (1989); およびAusubelら、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1998）で述べられており、その教示は参照により本明細書に組み入れられている。他の適切な方法も当業界で述べられている。本発明の１つの態様において、ベクターは、宿主細胞の形質転換を許可する、または促進することが可能な物質に結合される。開裂部位によって隣接される直鎖化または切除されるポリヌクレオチドおよび／または開裂剤、好ましくは、エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含むベクターは、ベクターを細胞膜リン脂質に標的化することによって、宿主細胞に導入することもできる。例えばベクターをＶＳＶ−Ｇ、すべての細胞膜リン脂質に対する親和性を持つウイルス性タンパク質への標的化である。そのような作成物は、当業者に周知の方法を使用して生成することができる。
【０１２４】
開裂剤、好ましくは、エンドヌクレアーゼは、特定のエンドヌクレアーゼおよび細胞タイプに適切な、当業界で一般に既知である方法により、細胞内に導入することができる。例えばエンドヌクレアーゼは、直接摂取、微量注入、リン酸カルシウム沈殿、電気穿孔、感染、およびリポフェクションによって細胞内に導入することができる。そのような方法は、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second edition, Cold Spring Harbor University Press, New York (1989); およびAusubelら、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1998）で述べられており、その教示は、参照として本明細書に組み入れられる。他の適切な方法も当業界で述べられている。エンドヌクレアーゼは、細胞への酵素の導入を促進するための、タンパク質侵入の促進因子に連結することができる。タンパク質侵入の促進因子の例は、ｔａｔ、ＨＳＶ  ＶＰ２２、および炭疽毒素を含む。タンパク質侵入の促進剤へのタンパク質の連結は、当業者に周知の方法を用いて実施することができる。タンパク質送達方法（例えばＨＳＶ  ＶＰ２２、炭疽毒素）は、本明細書で述べる方法に従って評価することができる。
【０１２５】
いったん細胞に入ると、開裂部位によって隣接される直鎖化もしくは切除されるポリヌクレオチドおよび、必要であれば開裂剤、好ましくは、エンドヌクレアーゼをコードする核酸を、または開裂剤自体、好ましくは、エンドヌクレアーゼを含むベクターは、細胞によって細胞質から核へ移入または転位される。
【０１２６】
宿主細胞および多細胞生物
本明細書で使用されるように、細胞は、細菌細胞などの原核細胞または動物、植物または酵素細胞などの真核細胞を指す。更に好ましくは、細胞は真核細胞である。細胞は、幹細胞（好ましくは、胚幹細胞）、体細胞、配偶子、割球、または卵（好ましくは、受精卵）でもよい。宿主細胞は、魚類、鳥類、非ヒト哺乳類、昆虫、両生類、爬虫類、好ましくは、メダカ、ゼブラフィッシュ、マウス、ニワトリ、アフリカツメガエル、ヒツジ、雌ウシ、ウサギ、更に好ましくは、魚類、ニワトリ、およびマウスに由来することができる。宿主細胞は、分化全能性から分化細胞まで、分化の全期を持つことができる。哺乳類細胞の例は、ヒト（ＨｅＬａ細胞など）、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネズミ（胚幹細胞など）、ウサギ、およびサル（ＣＯＳ１細胞など）細胞を含む。細胞は、胚細胞、骨髄幹細胞、または他の前駆細胞でもよい。細胞が体細胞である場合、細胞は、例えば上皮細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、血球（造血細胞、赤血球、Ｔ細胞、Ｂ細胞など）、腫瘍細胞、心筋細胞、マクロファージ、樹状細胞、神経細胞（例えばグリア細胞または星状細胞、または病原菌感染細胞、例えば細菌、ウイルス、ウィルソイド、寄生虫、またはプリオンに感染した細胞）でもよい。確かに、本発明による宿主細胞ゲノムにポリヌクレオチドを組込むための方法は、安定形質転換にうまく適している。
【０１２７】
ゆえに本発明のプロセスは、遺伝子治療、動物、または植物中での組換えタンパク質の生成、モデルとしての遺伝子導入動物の生成に特に有用である。結果として、本発明は目的として、上で定義したように、上記ベクターによって上記生物の１または複数の細胞タイプの形質転換を可能にしまたは促進し、次に、開裂の作用を上記細胞に受けさせることによって組込まれる準備のできた直鎖分子を上記細胞中に産生することを可能にする物質に恐らく結合される、切除または直鎖化されるポリヌクレオチド、および場合により開裂剤を含む１またはそれ以上のベクターを含む組成物を、上記生物に投与することに存する、多細胞生物の形質転換の方法を持つ。
【０１２８】
本発明のプロセスは、培養中の細胞などの細胞中でインオボもしくはインビボで、または多細胞組織、器官、もしくは生物にて直接、その場で実現される。
【０１２９】
本発明による形質転換のプロセスは極めて特に、これに限定されるわけではないが、畜牛（雌ウシ）、ヤギ、ウサギ、げっ歯類、マーモット、サル、昆虫（クモ、チョウ、ハエ）、魚類、イカ、ナメクジウオ、アフリカツメガエル、鳥類、ニワトリ、ホヤ類、およびヒツジ種（ヒツジ）を含む群にて選択される動物のためのものである。
【０１３０】
遺伝子導入魚は、本発明によるベクターを魚の細胞、精子または胚細胞、好ましくは、胚細胞、および更に好ましくは、単細胞胚に導入することによって生成される。ベクターが、胚細胞に導入される場合、遺伝子導入魚は、胚細胞または複数の胚細胞を魚内で発生させることによって得られる。魚胚細胞へのベクターの導入、およびそれに続く魚の発生は、胚が親魚の外部で発生するという事実により単純化される。あるいは、ベクターが、精子に導入される場合、卵母細胞の受精は、形質移入精子によって行われ、そして胚は魚内で発生させることができる。好ましくは、精子は、導入遺伝子を開裂剤とともに含むベクターによって形質移入される。
【０１３１】
遺伝子導入魚は、サケ、マス、マグロ、オヒョウ、ナマズ、ゼブラフィッシュ、メダカ、コイ、トゲウオ、アスティアナックス、ティラピア、キンギョ、スズキ、トゲウオ、アスティアナックス、チョウザメ、およびドジョウから成る群において選択される。最も好ましいのはメダカとゼブラフィッシュである。しかし本発明による方法は、アフリカツメガエル、小エビ、ウニなどの水生遺伝子導入種を生成するためにも利用できる。
【０１３２】
本発明のプロセスにおける宿主細胞は、これに限定されるわけではないが、
微生物：
工業生産目的：
K.lactis、P.pastoris、S.cerevisiae、S.pombe、A.immersus、P.limus、E.coli
２）細菌性または真核ワクチン：
Listeria monocytognese、bacille Calmette Guerin
S.cerevisiae、S.pombe、C.albicans、Plasmodium falciparum、Amoebas
植物：
１）生体分子生産
ダイズ、ナタネ、コムギ、トウモロコシ、コメ
２）遺伝子導入植物
トマト、イチゴ、リンゴ、柑橘果実、タバコ
３）食品薬品、およびワクチン植物
ホウレンソウ、穀物
４）生体材料の生産
ゴム、紙、木材
動物：
１）生体分子およびワクチン生産
雌ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、げっ歯類、マーモット、サル、昆虫
２）遺伝子導入動物
魚類、イカ、ナメクジウオ、アフリカツメガエル、鳥類、ニワトリ、畜牛、ヒツジ種
３）生体材料生産
カイコ、クモ、チョウ、ハエ、ヒツジ、ウシ、ヒツジ、ヒツジ種
を含む群において選択することができる。
【０１３３】
本発明は、例えばタンパク質もしくは他の遺伝子、生体分子、生体材料、遺伝子導入植物、ワクチン、遺伝子導入動物の生産のための、または遺伝子欠陥の結果として生じる個体（例えばヒトもしくは他の哺乳脊椎動物）における症状もしくは障害の治療もしくは予防のための、生じた細胞およびその使用にも関する。例えば細胞は、本明細書で述べる方法によって生成する（例えばエクスビボ）ことが可能であり、次に既知の方法を用いて個体内に導入される。あるいは細胞は、（個体から除去することなく）個体内で修飾することができる。
【０１３４】
したがって、本発明は更に、タンパク質、生体分子、生体材料、遺伝子導入植物、ワクチン、遺伝子導入動物の作成の方法に、またはその必要のある個体における遺伝病の治療または予防の方法に関し、そのような方法は、本発明によるインビボ直鎖化または切除のプロセスを含む。
【０１３５】
本発明は、胚幹細胞が、本発明による方法によって形質移入され、そして場合によりランダム組込事象についてスクリーニングされ、細胞が遺伝子導入細胞を組込むことができる期、例えば胚盤胞期にて胚に細胞が注入され、次に胚が代理母に再移植され、そして妊娠期間の終わりに得られる、そして生殖系列の胚幹細胞によるコロニー形成が見られたキメラ個体は、遺伝子導入動物を得るために交配される、非ヒト遺伝子導入動物を作成するための方法に関する。
【０１３６】
更に本発明は、受精卵が、本発明による方法によって形質移入される、非ヒト遺伝子導入動物を作成するための方法に関する。必要な場合、卵は、代理母に再移植され、遺伝子導入個体が、妊娠期間の終わりに得られる。場合により、卵は、代理母への再移植の前に、ランダム組込事象についてスクリーニングすることができる。あるいは卵は、胚の成長および遺伝子導入動物の発生を可能にする条件でインキュベートされる。
【０１３７】
例えば、魚胚または胚細胞は、一般に、卵が生まれた直後に収集することによって得ることができる。魚の種類によって、一般に収集の前または収集時に卵を受精させることが好ましい。これは、好ましくは、オスおよびメスの魚を共に、交配を刺激する条件下で、卵収集が可能な水槽に入れることによって実施される。卵を収集した後、ベクターを導入するために、胚暴露前に胚から漿膜を除去することが好ましい。このことは手動で、または好ましくは、プロナーゼなどのプロテアーゼによって行うことができる。最初の細胞分割前の受精卵は、単細胞胚と見なされる。したがって受精卵は胚細胞と見なされる。好ましくは、本発明による宿主細胞は、魚の胚細胞、好ましくは、受精卵または胞胚期における胚からの割球である。最も好ましくは、宿主細胞は、受精卵である。
【０１３８】
本発明により直鎖化または切除されるポリヌクレオチドを含むベクターは、適切な技法（例えば形質転換、形質移入、直接摂取、噴射照射、リポソームの使用）を用いて魚胚細胞に導入することができる。外来性遺伝物質の導入などの多くの技法は、魚および他の動物で証明されてきた。これらは微量注入（Culp, 1991, supra）、電気穿孔（Inoueら、1990, Cell.Differ.Develop.29, 123-128; Mullerら 1993, FEBS Lett.324, 27-32; Murakamiら J.Biotechnol.34, 35-42; Mullerら 1992, Mol.Mar.Biol.Biotechnol.1, 276-281; Symondsら 1994, Aquaculture 1994 119, 313-327) 、粒子銃照射（Zelenninら、1991 FEBS Lett.287, 118-120）、およびリポソームの使用（Szeleiら、1994, Transgenic Res.3, 116-119）（これらの文書の教示は、参照により本明細書に組み入れられる）。好ましくは、ベクターは、微量注入により導入される。
【０１３９】
開裂剤、好ましくは、エンドヌクレアーゼは、特定のエンドヌクレアーゼおよび細胞タイプに適切である当業界で一般に既知の方法に従って、魚胚細胞に導入することができる。好ましくは、開裂剤は、導入遺伝子を含むベクターと共に同時注入される。
【０１４０】
本発明によるベクターの導入後、胚は、魚内に導入される。これは一般に、卵をインキュベートするために使用されるのと同じ条件下で、胚をインキュベートすることを含むにすぎない。しかしながら、胚細胞は、等張緩衝液中でも短時間インキュベートされる。適切な場合、導入遺伝子の発現は、胚発生中に見ることができる。
【０１４１】
導入遺伝子を収容している魚または魚胚は、どの適切な手段によっても識別することができる。例えば魚ゲノムは、サザンまたはノザンブロッティングによって導入遺伝子の存在について調べることができる。導入遺伝子の存在は、ＰＣＲまたは他の配列特異性核酸増幅技法を用いて検出することもできる。導入遺伝子の発現生成物を確認するために、本生成物の存在をアッセイすることができる。
【０１４２】
遺伝子導入魚は、魚または魚の子孫がその望ましい特性を持つように、魚に望ましい特性を与えることができる。望ましい特性の例は、向上したおよび／または新規の栄養価、耐病性、成長増強（より速い成長、体サイズの増大もしくは産仔数の増大）または所望のタンパク質の生成を含む。所望のタンパク質とは、生成されるときに所望の特性を魚に付与するタンパク質または魚から分離されるときに魚の外部で使用されることが望ましいタンパク質を意味する。所望のタンパク質は、特定の組織、組織のサブセットにおいて、または広範囲の組織において生成することができる。所望のタンパク質の例は、魚の異常状態を修正するタンパク質または魚もしくは別の動物の治療用タンパク質を含む。
【０１４３】
遺伝子導入魚は、研究モデルとして使用することができる。遺伝子の発現のパターン、更に詳細には魚遺伝子は、そのような遺伝子導入魚を用いて、異なる組織（組織特異性発現）での、発生中の異なる時期（発生調節発現または発生期特異性発現）における、異なる細胞系統（細胞系統特異性発現）の導入遺伝子の発現を測定または識別することによって研究することができる。遺伝子導入魚は、形質転換によって導入された遺伝子、の発現に影響を与える化合物または遺伝子、好ましくは、魚遺伝子を識別するのにも有用である。異なる魚組織における発現を分析する１つの方法は、魚を切開し、そして別個の組織サンプルでアッセイすることである。ＲＮＡは、多数の核酸検出技法のどれを用いても検出することができる。これらのタンパク質は、容易に検出されるので、レポータータンパク質の使用が、好ましい。発生中の導入遺伝子の発現パターンをアッセイする好ましい方法は、ＧＦＰまたはＤｓＲｅｄなどの、生存している胚または動物で検出できる発現生成物を使用することである。
【０１４４】
本発明の１つの用途において、導入遺伝子の導入は、魚に挿入性突然変を作成することができる。そのような突然変異遺伝子は、挿入された導入遺伝子がクローニングのタグとして作用するため、容易にクローニングされる。検出可能である、興味のあるプロセスに影響を及ぼす遺伝子は、そのような挿入性突然変異によって同定することができる。その上、別の用途において、導入遺伝子は、遺伝子トラップ作成物で使用されるレポーター遺伝子である。遺伝子トラップとは、ＤＮＡが宿主細胞中の、この場合は魚細胞中の活性遺伝子に組込まれた後のみに発現させることができるレポーター遺伝子を意味する。遺伝子トラップベクターは、活性遺伝子内への挿入物を識別するために特に有用である（Kitajimaら、Biochem Cell Biol 1998 76: 1029-37; Zombrowiczら Int J Dev Biol 1998 42 1025-36; Cecconiら、FEBS Lett.2000 480 63-71；これらの文書の教示は、参照により本明細書に組み入れられる）。
【０１４５】
本発明のプロセスはゆえに、組換えタンパク質魚の生成、モデルとしての遺伝子導入魚の生成に極めて特に有用である。結果として、本発明は目的として、上で定義したように、上記ベクターによって上記生物の１もしくは複数の細胞タイプの形質転換を許可または促進し、次に、開裂の作用を上記細胞に受けさせることによって組込まれる準備のできた直鎖分子を上記細胞中に産生することを可能にする物質に恐らく結合される、切除されるポリヌクレオチド、および場合により開裂剤を含む１もしくはそれ以上のベクターを含む組成物を、上記魚胚細胞に投与することに存する、魚形質転換の方法を持つ。
【０１４６】
本発明は、例えばモデルまたは食品としての遺伝子導入魚の生成のための、またはタンパク質もしくは他の遺伝子、生体分子、生体材料、およびワクチンの生成のための、生じた細胞、あるいはその使用にも関する。
【０１４７】
したがって本発明は更に、タンパク質、生体分子、生体材料、遺伝子導入植物、ワクチン、遺伝子導入魚の生成の方法に関し、そのような方法は、本発明によるインビボもしくはインオボ直鎖化または切除のプロセスを含む。
【０１４８】
更に本発明は、受精卵が、本発明による方法によって形質移入され、そして卵が、遺伝子導入魚の発生を可能にする条件においてインキュベートされる、遺伝子導入魚を生成する方法にも関する。場合により、卵は、そのインキュベーション前に、ランダム組込事象についてスクリーニングすることができる。
【０１４９】
魚の詳細な情報は、アフリカツメガエル、小エビ、ウニ、ホヤ類、鳥類、ニワトリ、ナメクジウオなどの非哺乳類種に適用できる。
【０１５０】
本発明は、完全な遺伝物質（核に含有されるＤＮＡ）が、宿主ゲノムに組込まれるポリヌクレオチドを含むベクターおよび開裂剤と共に、それ自体の核が除去された未受精卵中に移植される、形質転換の方法も考慮する。
【０１５１】
ゆえに本発明はなお、目的として、上記ベクターによって１もしくは複数の細胞タイプの形質転換を許可または促進することを可能にする物質に薬学的組成物中で恐らく結合される、本発明により直鎖化または切除されるポリヌクレオチドを含むベクターを活性剤として含む薬学的組成物を持つ。本発明による薬学的組成物の１つの態様は、形質転換キットにおいて、上記組成物を開裂剤、好ましくは、制限エンドヌクレアーゼを含有する組成物と結合させることに存する。
【０１５２】
本発明は最後に、目的として、上記組成物が投与され、上記細胞が形質転換の後に開裂剤、好ましくは、制限エンドヌクレアーゼの作用に暴露される、対象の１もしくは複数の細胞タイプを形質転換するための薬学的組成物の調製のための、本発明により直鎖化または切除されるポリヌクレオチドを含むベクターの使用を持つ。上で示したように、上記ベクターは、上記分子による１もしくは複数の細胞タイプの形質転換を許可または促進することを可能にする物質に本発明による薬学的組成物中で恐らく結合される。
【０１５３】
本発明は、本発明による個体ゲノムへのポリヌクレオチドのランダム組込による、その必要のある個体のにおける遺伝病の治療または予防の方法に関する。遺伝病は、遺伝子の低い発現に、または機能性でない突然変異遺伝子の発現によることが多い。例えばその発現のために適切な要素を持つ正しい遺伝子の組み込みによって、遺伝子を発現させることが可能であり、遺伝的欠陥を補正することができる。遺伝子の過剰発現による遺伝病の場合では、例えばアンチセンスの発現を可能にするポリヌクレオチドの組込は、この遺伝子の発現を妨げ、過剰発現による遺伝的欠陥を補正することができる。本発明による方法は、考慮された遺伝子治療のどれにでも利用することができる。
【０１５４】
本発明の他の利点および特性は、以下の実施例で明らかになるであろう。
【実施例】
【０１５５】
実施例１
ヒト細胞のインビボ直鎖化の方法
（図４および図５を参照）
ｐＶｉｒｔｋＵ3□ｇｅｏの作成（図４を参照）
ｐＵ3Ｒプラスミドは、Ｒ配列が続く３’逆反復配列からのＵ3配列を含む、ネズミ白血病モロニーウイルス（ＭｏＭＵＬＶ）の断片７８４０−８３３０からの９９０bp断片のｐＢＳ  ＫＳ＋プラスミド（Stratagene、#X52328）での挿入によって得た。Ｕ3Ｒ断片は、ＭｏＭＵＬＶのエンハンサーおよびプロモーターならびにＲ配列に含有されるポリアデニル化信号ＡＡＴＡＡＡを含む。ｐＶｉｒＵ3Ｒプラスミドは、２つの工程で得た。最初に、ＭｏＭＵＬＶウイルスの逆反復が続くＩ−Ｓｃｅ  Ｉエンドヌクレアーゼの認識および開裂部位を含む配列５’−ＡＴＴＡＣＣＣＴＧＴＴＡＴＣＣＣＴＡＡＴＧＡＡＡＧＡ−３’を、ｐＵ3ＲプラスミドのＵ3Ｒ配列の上流に挿入した。このＩ−Ｓｃｅ  Ｉエンドヌクレアーゼ部位は、本実施例において、「５’Ｉ−Ｓｃｅ  Ｉエンドヌクレアーゼ部位」と呼ぶ。第二に、Ｉ−Ｓｃｅ  Ｉエンドヌクレアーゼの認識および開裂部位が続く、ＭｏＭＵＬＶウイルスの逆反復を含む配列５’−ＴＡＧＧＧＡＴＡＡＣＡＧＧＧＴＡＡＴＴＴＡＣＴＴＴＣＡ−３’を、中間プラスミドのＵ3Ｒ配列の下流に挿入した。本Ｉ−Ｓｃｅ  Ｉエンドヌクレアーゼ部位は、本実施例において、「３’Ｉ−Ｓｃｅ  Ｉエンドヌクレアーゼ部位」と呼ぶ。Ｉ−Ｓｃｅ  Ｉエンドヌクレアーゼ部位の配向は、Ｕ3Ｒ配列に向かって小型部位（ＴＡＧＧＧＡＴまたはＡＴＣＣＣＡＴ）を維持するために行う。したがって部位配向は、付着末端の産生を回避するために逆である。本配向を「挿入中心に対する小型部位」と呼ぶ。ｐＶｉｒＵ3Ｒβｇｅｏプラスミドは、Ｒ配列と「３’Ｉ−Ｓｃｅ  Ｉエンドヌクレアーゼ部位」の逆反復との間に位置するＸｈｏ  Ｉ部位におけるＳＶ４０ウイルスのポリアデニル化部位が続く、ｐＲＳＶβｇｅｏプラスミドからの融合遺伝子β−ｇｅｏを含む５．３kb  Ｘｈｏ  Ｉ制限断片のプラスミドｐＶｉｒＵ3Ｒでの挿入によって得た（Friedrich and Soriano, 1991, Genes Dev, 5, 1513-1523；その開示は、参照として本明細書に組み入れられる）（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードするネオ耐性遺伝子を用いて、その３’末端にて相内に融合される細菌性β−ガラクトシダーゼ遺伝子をコードする、ｌａｃＺ遺伝子融合）。ｐＶｉｒＵ3Ｒβｇｅｏプラスミドにおいて、βｇｅｏ発現は、ＭｏＭＵＬＶのＵ3プロモーターによって制御される。ＳＶ４０ポリアデニル化部位は、「３’Ｉ−Ｓｃｅ  Ｉエンドヌクレアーゼ部位」に向かって配向させた。ｐＶｉｒｔｋＵ3Ｒβｇｅｏプラスミドは、そのプロモーターの制御下で、およびそのポリアデニル化部位なしで単純ヘルペスウイルスＨＨＶ１のチミジンキナーゼ（ｔｋ）をコードする遺伝子を含む、pHＳＶＴＫプラスミドの２．５kb  ＢａｍＨＩ−Ｎｓｉｌ制限断片の「５’Ｉ−Ｓｃｅ  Ｉエンドヌクレアーゼ部位」の上流でのｐＶｉｒＵ3Ｒβｇｅｏへの挿入によって得た（Mansourら、1988, Nature, 336, 348-352；その開示は、参照として本明細書に組み入れられる）。ｔｋ遺伝子の発現は、ＭｏＭＵＬＶウイルスＲ配列のポリアデニル化部位を使用した。図４を参照。
【０１５６】
インビボ直鎖化方法の検証のためのｐＶｉｒｔｋＵ3Ｒβｇｅｏ系の使用
ｐＶｉｒｔｋＵ3Ｒβｇｅｏは、Ｉ−Ｓｃｅ  Ｉエンドヌクレアーゼ発現ベクターｐＣＭＶ−Ｉ  Ｓｃｅ  Ｉ＋またはｐＣＭＶ−Ｉ  Ｓｃｅ  Ｉ−と共に、標的生物に同時形質移入した（Choulikaら、1995 Mol Cel Biol, 15, 1968-1973；その開示は、参照として本明細書に組み入れられる）。ｐＣＭＶ−Ｉ  Ｓｃｅ  Ｉ＋は、エンドヌクレアーゼをコードするＯＲＦが、Ｉ−Ｓｃｅ  Ｉエンドヌクレアーゼの発現のためのＣＭＶプロモーターに対して良好な配向を持つベクターである。ｐＣＭＶ−Ｉ  Ｓｃｅ  Ｉ−は、エンドヌクレアーゼをコードするＯＲＦがＣＭＶプロモーターに対して逆配向を持ち、したがってエンドヌクレアーゼ発現を引き起こさないプラスミド作成物を指す。
【０１５７】
ｐＶｉｒｔｋＵ3Ｒβｇｅｏプラスミドが、Ｉ  Ｓｃｅ  Ｉエンドヌクレアーゼによってインビボで開裂した場合、開裂は、逆反復部位の上流および下流、すなわちＩ−Ｓｃｅ  Ｉエンドヌクレアーゼの認識および開裂部位にて発生した。ｐＶｉｒｔｋＵ3Ｒβｇｅｏプラスミドが、Ｉ−Ｓｃｅ  Ｉインビボで開裂した場合、Ｕ3に含まれるＭｏＭＵＬＶプロモーターが、βｇｅｏ遺伝子転写を活性化した。ｐＶｉｒｔｋＵ3Ｒβｇｅｏプラスミドが、開裂しなかった場合、Ｒ配列中のポリアデニル化によって終端されたｔｋ遺伝子を発現するシストロンの転写がＵ３の下流に位置し、そしてβｅｇｏ発現を防止した。インビボ直鎖化断片の組込選択は、２工程または１工程のみによって行われる。２工程選択において；第一に、プラスミド全体の組込を示すクローンを除去するためのガンシクロビル１μMによる選択；および第二に、βｇｅｏを発現するクローンを選択するための、Ｇ４１８  ５０μg/mlによる選択。１工程選択において、βｇｅｏを発現するクローンを選択するための、Ｇ４１８  ５０μg/mlによる選択。図５を参照。
【０１５８】
ｐＵ3Ｒβｇｅｏ対照プラスミドの構成
ｐＵ3Ｒβｇｅｏプラスミドは、Ｒ配列の下流に位置するＸｈｏ  Ｉ部位におけるＳＶ４０ウイルスのポリアデニル化部位が続く、ｐＲＳＶβｇｅｏプラスミドからの融合遺伝子β−ｇｅｏを含む、５．３kb  Ｘｈｏ  Ｉ制限断片のｐＵ3Ｒでの挿入によって得た（Friedrich and Soriano, supra）。ｐＵ3Ｒβｇｅｏプラスミドにおいて、βｇｅｏ発現は、ＭｏＭＵＬＶのＵ3プロモーターによって制御される。ＳＶ４０ポリアデニル化部位は、３’Ｉ−Ｓｃｅ  Ｉエンドヌクレアーゼ部位のほうへ向けられる。図４を参照。
【０１５９】
直鎖制御としての直鎖Ｕ3Ｒβｇｅｏ断片の調製
直鎖Ｕ3Ｒβｇｅｏ断片は、ＴＡＥ１Ｘによる０．８％アガロースゲルでの電気泳動により、Ｘｂａ  ＩおよびＮｏｔ  ＩによるｐｔｋＵ3Ｒβｇｅｏプラスミド１０μgの消化の後に分離した。９．７kb断片を分離して、そしてＧｅｎｅ−Ｃｌｅａｎ  IIのプロトコールを用いてガラスビーズ上で精製した。精製したＵ3Ｒβｇｅｏは、形質移入のために、pH７のＨ2Ｏ中で再懸濁した。図４を参照。
【０１６０】
ヒト２９３Ｔ細胞の形質移入プロトコール
形質移入の２０時間前に、２９３Ｔ細胞を３５mm皿に付き５×１０4細胞の濃度で、１０％不活性化ウシ胎仔血清（ＳＶＦｉ）を含むＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）培地に播種した。細胞は、１気圧、５％ＣＯ2、１００％湿度、３７℃のインキュベータでインキュベートした。形質移入は、ＤＮＡ２μgの存在下で２５℃にて、pH７．１２で、１２５mM  ＣａＣｌ2、ＮａＣｌ  ８．１８％（Ｗ／Ｖ）、ＨＥＰＥＳ  ５．９４％、Ｎａ2ＨＰＯ4  ０．２％の混合物によるリン酸カルシウム沈殿によって実施した。沈殿物は、細胞上で１６時間維持した。次に沈殿物と共に培地を新しいＤＭＥＭ１０％ＳＶＦｉ培地と交換した。
【０１６１】
形質移入の４８時間後、細胞をパラホルムアルデヒド４％溶液中で５分間、２５℃にて固定した。細胞をＰＢＳｘ１（リン酸緩衝生理的食塩水）中で２回洗浄した。次に細胞は、βｇｅｏ遺伝子のβ−ガラクトシダーゼ発現による組織化学染色のために、Ｘ  Ｇａｌ着色培地中に、３７℃にて２４時間置いた。あるいは細胞は、Ｇ４１８  ６０μg/mlを含む選択培地ＤＭＥＭ１０％ＳＶＦｉ中に置いた。選択培地は、４８時間ごとに新しいものと交換した。選択は、分離された細胞クローンが出現するまで、１５日間維持した。これらのクローンを直径１cmの２４ウェルプレート上で分離し、そして凍結および分析するために増幅した。
【０１６２】
ｐＶｉｒｔｋＵ3Ｒβｇｅｏによる２９３Ｔ細胞の形質移入の結果
ＤＮＡ混合物（ｐＶｉｒｔｋＵ3Ｒβｇｅｏ＋ｐＣＭＶ−Ｉ  Ｓｃｅ  Ｉ）２μgを、以下の比を用いて、表１に開示する以下の形質移入対照の存在下で、３５mm皿に付き５×１０4細胞の濃度で形質移入した。
【０１６３】
【表１０】
2005503161.tif 000010
【０１６４】
表１：３５mm皿は、表によるＤＮＡ濃度および混合物によって形質移入した。各アッセイは、組織化学染色２回およびクローン選択２回の、４回実施した。各＃番号は、形質移入混合物、列は、混合物で使用したプラスミド作成物を示す。
【０１６５】
形質移入の４８時間後、細胞を固定し、そして組織化学染色によってβ−ガラクトシダーゼ発現を明らかにした。β−ガラクトシダーゼ発現を示すクローンをカウントした（表２を参照）。更に、Ｇ４１８  ６０μg/mlを含む培地で細胞を選択した。細胞培地は、インキュベーション４８時間ごとに新しい培地と交換した。形質移入の１５日後、Ｇ４１８に対して耐性のクローンを分離および増幅した（表２を参照）。
【０１６６】
【表１１】
2005503161.tif 000011
【０１６７】
表２：表１による混合物による２９３Ｔ形質移入の結果。
【０１６８】
結果は、形質移入番号１．０の作成物組込の著しい上昇を示す。本形質移入番号は、Ｉ−Ｓｃｅ  Ｉエンドヌクレアーゼの発現カセットを含むプラスミドを持つ２のＩ−Ｓｃｅ  Ｉエンドヌクレアーゼ部位によって隣接された、組込まれるポリヌクレオチドを含むプラスミド、すなわちＵ3Ｒ−βｇｅｏ−ｐｏｌｙＡＳＶ40の形質移入に相当する。インビボ直鎖化によるプラスミドの組込は、直鎖断片Ｕ3Ｒβｇｅｏよりも約４〜１０倍効果的であった。
【０１６９】
分離クローンのゲノムＤＮＡは、プラスミドｐＧｅｍｎｌｓｌａｃＺ（ｌａｃＺ遺伝子および核局在化配列が挿入された、ＰｒｏｍｅｇａによるｐＧｅｍベクター）からのｌａｃＺ遺伝子を含有する３kbの制限断片ＥｃｏＲＩを含むプローブを用いた、サザンハイブリダイゼーション（ＥｃｏＲ  ＶによるゲノムＤＮＡの消化）によって抽出および分析した。図６を参照。サザン分析は、組込がユニークであり、直列でないことを示した。確かに、直列組込は、見られなかった２．６kbバンドを示す。時に、ライン１２のように複数の組込事象が発生した。したがってインビボ直鎖化方法が、組込をユニークにする。
【０１７０】
一部の実験は、インテグラーゼ（＋ＩＮ）を発現するプラスミドとの同時形質移入によって実施した。本実験で使用したインテグラーゼは、ＭｏＭＵＬＶウイルスの活性断片である。確かに活性断片をコードする核酸は、発現ベクター中でクローニングされている。組込は、インテグラーゼなしで、インビボ直鎖化方法と比較して約６倍の上昇を示した。したがって場合により、ポリヌクレオチドを本発明による宿主細胞ゲノムに組込むための方法は、インテグラーゼ自体またはインテグラーゼをコードする核酸の宿主細胞への導入も含む。
【０１７１】
２４の異なる分離クローンにおける組込作成物の組込部位は、逆ＰＣＲによってクローニングし、そして配列決定により分析した。組込作成物とゲノムＤＮＡとの接合部を特徴付けた。これらの接合部は、組込まれるポリヌクレオチドの完全性が保存されていることおよび挿入がユニークであることを示した。
【０１７２】
実施例２
ＣＯＳ細胞におけるインビボ直鎖化の方法
ｐｐＳＶ４０ＮｅｏＩＲＥＳｅｇｆｐプラスミドの作成
ｐｐＳＶ４０ＮｅｏＩＲＥＳｅｇｆｐ中間プラスミドは、２工程で得た。第一に、サルウイルス４０プロモーター（ｐＳＶ４０）およびネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードするｎｅｏ耐性遺伝子含有するカセットをｐｃＤＮＡ３．１＋プラスミド（Clonetech，パロアルト，カリフォルニア州，米国）から切除して、そしてｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰプラスミド（Clonetech，パロアルト，カリフォルニア州，米国）のＳｍａＩ部位にてクローニングし、ＩＲＥＳバイシストロン要素およびＥＧＦＰ遺伝子の上流にｐＳＶ４０−Ｎｅｏカセットの挿入を生じさせた。第二に、PytknislaczプラスミドからのPyTknlslaczカセット（Henryら、C.R.Acad.Sci.III, 322 (12): 1061-1070 (1999) ）を切除し、そしてｐＳＶ４０−Ｎｅｏ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（ｐｐＳＮＩＥ）カセット全体と置換して、そしてＳＶ４０ｐｏｌｙＡ部位の前に挿入した。
【０１７３】
この最初の作成物から、Ｉ−ＳｃｅＩ開裂部位に対応する配列をＳＶ４０プロモーター（５’）の上流およびＳＶ４０  ｐｏｌｙＡ部位  （３’）の下流の両方に挿入することによってプラスミドを得た。図７Ａを参照。
【０１７４】
ＣＯＳ細胞の形質移入プロトコール
形質移入の前日に、５×１０4のＣＯＳ細胞を６ウェルプレートの、１０％ウシ胎仔血清、２mM  Ｌ−グルタミンを添加したＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）培地を播種し、そして３７℃にて７％ＣＯ2雰囲気中でインキュベートした。形質移入は、Effectene法（Qiagen，チャッツワース，カリフォルニア州，米国）によって実施した。形質移入プロトコールは、メーカーの勧告に従って準備した。簡潔には、プラスミドＤＮＡ１μgを、エンハンサー試薬の存在下で（ＤＮＡ／エンハンサー比は１／８である）ＤＮＡ濃縮緩衝液１００μl中で希釈した。５分間のインキュベーション時間の後、Effectene  １０μlをＤＮＡに添加した（ＤＮＡ／Effectene比は１／１０である）。混合物をボルテックスにかけ、そして室温にて１０分間インキュベートした。次に完全培地６００μlをＤＮＡ／Effectene複合体に添加し、混合して、そして細胞に散布した。翌日、細胞を洗浄し、３７℃にて７％ＣＯ2雰囲気中で、全４８時間インキュベートした。
【０１７５】
ＦＡＣｓｃａｎフローサイトメトリーおよびCellQuestソフトウェア（Becton-Dickinson，フランクリンレークス，ニュージャージー州，米国）を用い、形質移入細胞の分割量に対して、ＦＡＣＳ（商標）分析を実施した。残りの細胞を１０cm皿に蒔き、そしてＧ４１８（Life Technologies）を４００μg/mlの濃度で含有する選択培地を添加した。あるいは、細胞を２０００細胞／mlの濃度で再懸濁させ、そして懸濁液１００μlを９６ウェルプレートに播種した。３週間後、耐性クローンを分離し、そして更なる分析のために２４ウェルプレートで増幅した。
【０１７６】
ゲノムＤＮＡ抽出、定量化、およびサザンブロットハイブリダイゼーション
ゲノムＤＮＡは、High Pure DNA Prepキット（Roche，マンハイム，ドイツ）を用いて培養細胞から抽出し、そしてメーカーのプロトコールに従って、Picogreen（商標）ｄｓＤＮＡ定量化キット（Molecular Probes，ユージーン，オンタリオ州，米国）を用いて定量した。
【０１７７】
独立したクローンからのゲノムＤＮＡ１μgを、ＨｉｎｄIII制限酵素（NEB，ビバリー，マサチューセッツ州，米国）によって消化した。ＤＮＡ電気泳動およびＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋膜（Amersham，ピスカタウェイ，ニュージャージー州，米国）でのブロッティングの後、ブロットは、非放射性ＤＩＧベース核酸検出プロトコール（Roche，マンハイム，ドイツ）を用いて、ＮＥＯプローブによって探査した。
【０１７８】
ｐｐＳＮＩＥプラスミドによるＣＯＳ細胞の形質移入の結果
ｐｐＳＮＩＥプラスミドは、Ｉ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼ発現ベクターｐＣＭＶ−Ｉ−Ｓｃｅｌ＋（Choulikaら、1995 Mol Cel Biol, 15, 1968-1973）によって同時形質移入した。陰性対照として、ｐｐＳＮＩＥプラスミドを、エンドヌクレアーゼをコードするＯＲＦが逆配向を持つ、そしてしたがってＩ−ＳｃｅＩを発現させない、ｐＣＭＶ−Ｉ−ＳｃｅＩ−と同時形質移入した。ＤＮＡ混合物１μg（ｐｐＳＮＩＥプラスミド０．５μg＋ｐＣＭＶ−Ｉ−ＳｃｅＩ−０．５μg）またはｐｐＳＮＩＥプラスミド０．５μg＋ｐＣＭＶ−Ｉ−ＳｃｅＩ＋０．５μg）を用いて、５×１０4の細胞を６ウェルプレートで形質移入した。形質移入の４８時間後、細胞を収集し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。ＣＯＳの形質移入率は再現的に、ＧＦＰ＋細胞の３５〜４５％であった。ゆえにｐｐＳＮＩＥプラスミドの、Ｉ−ＳｃｅＩ発現（ｐＣＭＶ−Ｉ−ＳｃｅＩ＋）または対照（ｐＣＭＶ−Ｉ−ＳｃｅＩ−）ベクターとの同時形質移入は、ＥＧＦＰレポーターの一過的発現に影響を与えなかった。
【０１７９】
残りの細胞を１０cm皿にプレートし、そして選択培地を添加した。３週間後、耐性クローンを分離および増幅した。独立したクローンからのゲノムＤＮＡを抽出し、サザンハイブリダイゼーションによって分析した。ゲノムＤＮＡ０．５μgをアガロースゲル上で分離したＨｉｎｄIII制限酵素によって消化し、そしてナイロン膜上に移動した。次にブロットをＮｅｏプローブによって探査した。
【０１８０】
結果を図７Ｂに示す。予想したとおり、クローン＃３および＃２６を除くすべてが、ｐｐＳＮＩＥカセット内のＨｉｎｄIII断片に対応する１．５kbバンドを示した。１．５kbバンドの強度は、巨大コンカテマーの存在下でのＩ−ＳｃｅＩ−同時形質移入からのクローンにおいて高度に可変性である（クローン＃５、６、８およびより少ない量のクローン＃１１、１５、１６を参照）。これに対して、Ｉ−ＳｃｅＩ＋同時形質移入からのクローンにおけるバンドは、より強度が低く、少ないコピー数の存在を示唆する。
【０１８１】
実施例３
魚卵への導入遺伝子組込を上昇させるＩ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼによるインオボ直鎖化
ＧＦＰレポーター遺伝子が続き、そしてＩ−Ｓｃｅ  Ｉ認識部位によって隣接された筋肉特異性プロモーターを持つ、環状プラスミド性ＤＮＡを１細胞期魚胚に注入した。本構築物を（酵素が、細胞外で不活性を維持するように）マグネシウムを含まない緩衝液中のＩ−Ｓｃｅ  Ｉメガヌクレアーゼと同時注入した場合、予想ＧＦＰ筋肉発現は、目覚しく向上する（メガヌクレアーゼなしで注入を実施したときの２０％と比較して、胚の８０％が体幹筋系において強い蛍光を示した）。更になお顕著なのは、生殖細胞伝達の劇的な上昇であった。古典的な卵注入実験においては、大半の場合で遅いキメラ組込によって２、３パーセントを超えないのに対して、メガヌクレアーゼと同時注入された魚での生殖細胞伝達の頻度は５０％に上昇し、単一の挿入が創始魚の１細胞期にて発生することが示唆された。更なるサザン分析は、単一の少ないコピー組込が大半の場合に発生することを確認した。早期組込事象が、メガヌクレアーゼによる核への標的化によってではなく、ＤＮＡのインビボ開裂によるか否かをアッセイするために、（Ｉ−Ｓｃｅ  Ｉメガヌクレアーゼによって開裂されず、結合された）欠失または突然変異認識部位を持つ対照作成物をメガヌクレアーゼと共に注入した。本発明者らは、メガヌクレアーゼ誘発性インオボ直鎖化が、組込前ＤＮＡ遊離末端の分解を制限することによって、卵注入による形質転換を向上させるための簡単および有効なプロセスであることを示唆する。
【０１８２】
本実施例は、メガヌクレアーゼ仲介形質転換が確かに、現在、魚で報告されている他の方法よりも目覚しくより効果的な、非常に簡単な技法であることを示す。
【０１８３】
材料および方法
プラスミド構築物
ｐαａｃｔ−ＧＦＰＭ２は、α−アクチン筋肉特異性プロモーターによって作動されるＥＧＦＰレポーター遺伝子を持つ７．８kbプラスミド内に２のＩ−ＳｃｅＩ認識配列を用いて作成した（ｐαａｃｔ−ＧＦＰ、ヒガシジマ博士より寄贈、［Higashijima, 1997#698］）。簡潔には、２つのサブクローニング工程を使用して、Bluescriptポリリンカ中のα−アクチン／ＧＦＰ／ｐｏｌｙＡカセットの両端に位置する、Ｅｃｏ  ＲＩおよびＫｐｎｌ部位に＜＜メガリンカ＞＞を挿入した。メガリンカは、ＥｃｏＲｌまたはＫｐｎｌ消化生成物のどちらかと適合性である遊離末端に隣接されるＩ−ＳｃｅＩ認識部位（ＣＣＧＣＴＡＧＧＧＡＴＡＡＣＡＧＧＧＴＡＡＴＡＴＡ）を含有する、相補性オリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって産生した。メガリンカと直鎖化プラスミドとの連結の後、プラスミドを直鎖化するために使用する酵素によって、ＤＮＡを再度消化し、そして熱パルスによってXL1 Blue ultra-competent E.coli (Stratagene）に変換された。クローンは、非パリンドローム性Ｉ−ＳｃｅＩ部位の配向を決定するために配列決定した。
【０１８４】
複数の他の作成物は、異なるリンカをＫｐｎｌ部位に挿入することによって得た。１のみのＩ−ＳｃｅＩ認識部位を含むｐαａｃｔ−ＧＦＰＭ、短縮された認識部位（ＧＧＧＴＡＡＴＡＴＡ）を含むｐαａｃｔ−ＧＦＰＤＭ、およびＩ−ＳｃｅＩ部位の突然変異（ＴＡＧＧＧｔＴＡＡＣＡＧＧＧＴＡＡＴ）版を含有するｐαａｃｔ−ＧＦＰＭＭ。これらの後者の２の部位は、メガヌクレアーゼを結合するが、効率的に開裂されない［Colleaux, 1986; Colleaux, 1988］。
【０１８５】
プラスミドＤＮＡとメガヌクレアーゼとの微量注入
メダカ胚およびオレンジレッド系統の成魚（日本、東京大学のA.Shimaおよび日本、千葉のY.Ishikawaより寄贈）をすべての実験で使用した。魚は２６℃にて２０リットル水槽で飼育した。成魚は、繁殖条件（明期１４時間／暗期１０時間）に置いた。卵は、産卵後、ただちに収集し（明期の開始時）、洗浄し、そしてヤマモトの胚飼育培地に［Yamamoto, 1975］に入れた。注入の場合、最近形成された胚盤を持つ１細胞期胚を選択し［Iwamatsu; 1994］、そして４℃に移して発生を停止させた。１回に約１０個の胚を、細胞質盤を上にして、［Westerfield; 1993］で述べられたようにプラスチック型を用いて作成したアガローススロットに配置した。すべての実験において、超微操作装置ＭＭ３（Fine Science Tools，ドイツ）および圧力注入器（FemtoJet，エッペンドルフ，ドイツ）を装備したOlympus ＳＺＸ１２立体顕微鏡を使用した。ホウケイ酸ガラス毛細管（外径１mm、ＧＣ１００Ｔ，Clark Electromedical Instruments，英国）は、垂直引張機（ＰＣ−１０，Narashige，日本）を用いて引いた。毛細管には、滅菌マイクロローダー（Femtotips，エッペンドルフ，ドイツ）を用いて、注入溶液（ＤＮＡ：１０μg/ml；メガヌクレアーゼ緩衝液（Roche Diagnostic，ドイツ）：０．５ｘ；メガヌクレアーゼＩ−ＳｃｅＩ：１ユニット／μl；０．１％フェノールレッド）を充填した。注入の直前に、マイクロピペット先端を細い鉗子で直径約１マイクロメートルまで割った。薄い胚盤に直接ピペットを挿入することによって、漿膜を通じてＤＮＡを注入した。１回の圧力パルスが、フェノールレッドによって視覚化された溶滴（見積体積３００pl）の注入を引き起こした。次に胚をアガロースから除去し、そして２６℃にてペトリ皿に置いた。注入の３日後に、ＧＦＰの発現が最初にスクリーニングされた。次に胚を成熟期まで飼育し、魚が導入遺伝子をその子孫に伝達したことを確認するために、対交配を実施した。
【０１８６】
サザンブロット分析
サザンブロッティングでは、Ｆ１魚からのゲノムＤＮＡをプロテイナーゼＫおよびフェノールを用いて抽出した［Sambrook and Russel; 2001］。十分なＤＮＡを得るために、満１ヶ月の全魚を使用した。ＤＮＡｓｅを避けるため、より高齢の魚からの筋肉をＤＮＡ抽出のために切開した。ＤＮＡは、ＢａｍＨｌ、ＥｃｏＲｌ、Ｘｂａｌ、Ｘｈｏｌを用いて完了するまで消化した。ＤＮＡ標準物質は、対応する酵素を用いてｐαａｃｔ−ＧＦＰプラスミドを消化することによって調製した。一倍体ゲノム当たり１０9bpの見積ＤＮＡ含有量を使用して、消化されたｐαａｃｔ−ＧＦＰプラスミド５０ｐｇを装填した。サンプル（レーン当たり１００□ｇ）１ｘＴＢＥ中の０．９％アガロースで電気泳動させ、Zetaprobeメーカーが推奨するように毛細管上方移動によって、ナイロンZetaprobe膜 (Biorad）へブロットした。フィルターは６５℃にて、αアクチン／ＧＦＰ／ｐｏｌｙＡに対応するランダム初回刺激放射標識プローブ（Ｘｈｏｌ／ＥｃｏＲＶ断片）を用いて、ローラーボトル中で一晩ハイブリダイズした。
【０１８７】
エピ蛍光顕微鏡
胚は、３７０〜４２０nm励起フィルターおよび４５５nm  ＬＰ発光フィルターを用いて、ＭＺＦＬIII  Leica解剖顕微鏡を使用して観察および評価した。写真は、Nikon ＤＸＭ１２００デジタルカメラを用いて撮影した。写真のために、胚は［Wakamatsu; 1993］で述べられた手順に続いて、孵化酵素によって漿膜除去し［Yasumasu; 1994］、そしてＰＢＳ中の８０％グリセロールまたはVectashield封入剤に入れた。
【０１８８】
結果
注入胚の筋肉におけるＧＦＰの一過的発現は、メガヌクレアーゼは、作成物と同時注入されたときに向上する。
【０１８９】
２のＩ−ＳｃｅＩ認識部位（ｐαａｃｔ−ＧＦＰＭ２）に隣接されたｐαａｃｔ−ＧＦＰＭ２アクチンプロモーター続いてＧＦＰレポーター遺伝子を持つ環状プラスミドＤＮＡは、１細胞期胚（期２ａ，［Iwamatsu; 1994］）に注入することによって、発現について試験を行った。ＤＮＡ濃度（１３ng／１μl）は、注入卵の有意な死亡率を引き起こさない最も高い濃度を選択した。
【０１９０】
胚でのＧＦＰレポーター遺伝子発現は、蛍光双眼顕微鏡法を用いて、多数の別個の発生期にて検査した。ＧＦＰ発現の開始は、２日後（ｘ期）に２，３の胚で最初に観察された。
【０１９１】
一般に胚は、筋肉α−アクチンＧＦＰ発現が十分進行中である、発生３日後に評価した。胚は、各実験における導入遺伝子発現のレベルおよび分布を定量的に評価するために、蛍光強度に従ってグループ化した。
【０１９２】
胚の約５０％は、筋肉蛍光を示さず、そして陰性（Ｎ）として分類された（図８Ｂ）。残りの胚では、ＧＦＰ陽性細胞の数は、２，３の細胞（弱、Ｗとして分類）からほぼ遍在的筋肉細胞標識化（強、Ｓ）までの範囲であった。発現が尾部の大きなドメインで検出されたが、他では検出されなかった場合、発現は中程度（Ｍ）と見なした。別個の筋肉細胞における発現は常に、容易に検出できるのに十分な強さであり、そして異所性発現は、観察されなかった。
【０１９３】
ｐαａｃｔ−ＧＦＰＭ２を、アガロースゲルから精製し、そして上で報告されたように同じ条件で注入されたＩ−ＳｃｅＩによってインビトロで直鎖化した場合、結果は、環状ｐαａｃｔ−ＧＦＰＭ２で得られた結果と同様であった（図８Ｂ）。
【０１９４】
ｐαａｃｔ−ＧＦＰＭ２を、（酵素が、細胞外で不活性のままであるようにするために）マグネシウムを含まない緩衝液中の市販Ｉ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼと同時注入すると、ＧＦＰ筋肉発現は、目覚しく向上した。酵素なしで注入を行った場合の２０％と比較して、胚の約８０％が、体幹筋系における中程度または強力な発現を示した。
【０１９５】
ゆえにＦ０魚における一過的な導入遺伝子発現は、メガヌクレアーゼプロトコールによる、注入された環状プラスミドのインビボ直鎖化工程を恐らく含む機構によって、ただちにおよび効率的に向上した。
【０１９６】
Ｆ０導入遺伝子発現の向上は、インオボ直鎖化に関連している
Ｉ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼは、あるＮＬＳ活性を持つことが既知である。早期組込事象が、メガヌクレアーゼによる核への標的化によってではなく、確かにＤＮＡのインビボ開裂によるものか否かを評価するために、（メガヌクレアーゼによって開裂されず、結合された）欠失（ｐαａｃｔ−ＧＦＰＤＭ）または突然変異（ｐαａｃｔ−ＧＦＰＭＭ）認識部位を持つ対照構築物をメガヌクレアーゼと共に注入した。
【０１９７】
注入の後、上で述べた基準に従って胚をグループ化した（図８Ｂ）。ｐαａｃｔ−ＧＦＰＤＭまたはｐαａｃｔ−ＧＦＰＭＭＦおよびメガヌクレアーゼのＦ０胚同時注入における一過的ＧＦＰ発現の分布は、酵素なしのｐαａｃｔ−ＧＦＰＭ２作成物の注入を包含する実験で得られた分布と同様であった。したがって、メガヌクレアーゼインオボ直鎖化は、注入された１細胞期魚胚における一過的発現を向上させる主要なプロセスである。
【０１９８】
メガヌクレアーゼを使用する生殖細胞伝達魚の産生
ＧＦＰ筋肉発現は、注入実験から生じた一部の成魚において持続した。したがって重要な点は、導入遺伝子が、次世代に伝達されるか否かおよび伝達される方法、および特に、成魚筋肉における発現レベルおよび生殖細胞伝達の頻度との間に何らかの相関があるか否かを調査することである。
【０１９９】
３０の注入成魚に対するスクリーニングにおいて、筋肉におけるＧＦＰ発現を示さない成魚はすべて、生殖細胞導入遺伝子の伝達では陰性であることが判明した。ゆえにＧＦＰ陰性成魚は、経験的に陰性と見なされ、続いてＦ０交配手順から廃棄した。ゆえに成魚Ｆ０におけるＧＦＰ発現の観察は、伝達魚のスクリーニングを大幅に容易にした。
【０２００】
生殖細胞伝達創始魚の出現頻度に対するメガヌクレアーゼの効果を調査するために、注入魚を成熟期まで飼育し、そして野生種パートナーと交配した。次にその３日齢子孫における筋肉蛍光のレベルを、上述のように評価した（結果を図９Ａにまとめる）。
【０２０１】
メガヌクレアーゼなしの注入から生じた創始魚は予想通りに、モザイク生殖細胞を持ち、そして大半の系統において、（ＧＦＰ発現によってアッセイした）Ｆ１遺伝率は、劇的に低かった（同胞の２，３パーセントのみに伝達）。２，３の系統において（多いコピー数の挿入を伴う。以下を参照）、導入遺伝子は、中程度の率で伝達された（３０〜５０パーセント）。
【０２０２】
著しく対照的に、環状プラスミドおよびメガヌクレアーゼを同時注入された創始魚の生殖細胞伝達の頻度は大半の系列で、子孫における陽性胚の平均頻度の５〜１５倍の上昇に相当する、５０％まで上昇した（図２Ａ）。
【０２０３】
更なるサザン分析は、少ないコピー数での単一組込が大半の場合に起こることを示した（図９Ｂ）。
【０２０４】
ＤＮＡは最初に、それぞれプラスミド作成物に切込まないか、または１回切込む酵素である、ＥｃｏＲＩまたはＸｈｏｌによって消化される（図示せず）。分析したすべての動物は、単一組込事象を示唆する、挿入プローブとハイブリダイズする大型の単一の断片を含有していた。しかしながら、本発明者らは、ＢａｍＨＩまたはＸｂａｌ消化が、複数の接合断片を生じるため、複数のそのような事象の存在を除外できない。図９Ｂに示すようにＢａｍＨ消化によって、挿入物に対応するプローブとハイブリダイズする２（１および２kb）の断片が、メガヌクレアーゼが注入された魚からのＤＮＡが装填された、レーン１および４にて観察された。これらの断片は、それぞれ、ＧＦＰ／ｐＡおよびアクチンプロモーターの下流領域（３’αｐ）に相当した。プラスミド配列（５’ａｐ＋ｐＢｌｕＳＫ）と連結したプロモーターの上流領域に特徴的な４．８kbバンドの存在は、一部の導入遺伝子がプラスミドを含む直接直列反復として組込まれることを示唆した。このタイプの組込は、２のＩ−ＳｃｅＩ認識部位のうちの一方のみが切断され、そして（更なる切断なしに）挿入物がただちに組込まれる場合に発生すると予想される。
【０２０５】
考察
本実施例は、複数のレベルでの魚形質転換における目覚しい改良につながるメガヌクレアーゼ仲介技術を報告する。
【０２０６】
第一に、（Ｆ０における）注入ＤＮＡ作成物の一過的発現は、発現細胞数の大幅な増加により向上する。ゆえに注入胚におけるレポーター遺伝子のモザイク発現は大きく減少し、魚での形質転換の主な落とし穴の１つが部分的に克服される。この結果は例えば、微量注入による予備過渡導入を包含することが多いタスクである、魚種におけるプロモーター作成物の容易で信頼性の高い分析を可能にする。
【０２０７】
第二に、メガヌクレアーゼ仲介技術は、魚での生殖細胞伝達率を著しく向上させる。その上、使用した筋肉特異性プロモーターによって、注入成魚におけるレポーター発現の維持および遺伝子導入子孫を生成する能力との間に良好な相関があった。したがって本実施例で示したツールは、遺伝子導入ファミリーの基礎を築くことのできるＦ０個体を選択する、非常に時間のかかるタスクを大幅に容易にする。
【０２０８】
第三に、そして恐らく最も目覚しくは、各伝達ファミリーの伝達率がこれらの実験で劇的に上昇した。実際にそのことは、大規模なＦ１ファミリーが、合理的な数の卵から産生できることを意味する。重要なのは、伝達Ｆ０および野生種魚の間の大半の交雑で観察された５０％の伝達率は、単一挿入事象が、Ｆ０における非モザイク方法で起こることを強力に示唆する。
【０２０９】
対照実験によって、本発明者らは、インビボ直鎖化が、必ずしも唯一の因子ではないが、組込率の上昇において役立つことを提唱することができる。例えばＩ−ＳｃｅＩ酵素の核標的化効果は、これらの実験で効果を表している。本発明者らは、第一の工程において、環状プラスミド中での遊離ＤＮＡ末端の不在が、注入ＤＮＡの細胞質分解率を低下させることを提唱する。次に組込前遊離末端の遅い遊離が、直鎖プラスミドに典型的である組込の効率につながる。
【０２１０】
最後に、魚でよく見られる特徴である、長いコンカテマーへの導入遺伝子組込は、これらの実験では決して起こらなかった。代わりに本発明者らは、ＧＦＰ発現レベルの目覚しい上昇の原因となりがちである有利な効果である、導入遺伝子が、短い直接直接反復として組込まれることを発見した。
【０２１１】
プラスミド作成物においては２のＩＳｃｅ−Ｉ部位が同じ配向であるため、この種の挿入が予想される。サザンブロットデータも、同様の直列反復要素の組込が発生し、そして一部のプラスミド配列を含むことを示唆している。このことは、これらの直列が、１部位のみにおける複数のプラスミド切断で構成されることを示す。ＩＳｃｅ−Ｉはインビトロでその部位の両方にて同様の運動性で切断するため、その現象の考えられる１つの説明は、Ｉ−ＳｃｅＩ酵素量が、ＤＮＡ濃度に関して制限されていること、そして組込が、第一の切断に付随して発生することである。
【０２１２】
組込の品質を更に向上させるために、Ｉ−ＳｃｅＩ部位の配向を変化させることを提案できる。
【０２１３】
第一に複数の魚種において、しかし一般的にも、本技法の用途は、多数である。例えば、早期胚または卵母細胞へのＤＮＡ注入によるノックアウト実験などの、更に高度な実験への未知を開く。
【０２１４】
実施例４
マウスにおけるＩ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼによるインオボ直鎖化
形質転換効率を向上させるために、本発明者らはメガヌクレアーゼによるスーパーコイルプラスミドのインオボ直鎖化に基づく新規な方法を開発した。
【０２１５】
プラスミド作成物は、組込まれる所望の導入遺伝子に隣接するメガヌクレアーゼのための、１または２の認識／開裂部位を含むように設計されている。メガヌクレアーゼ源は、精製タンパク質またはメガヌクレアーゼ発現ベクターからのインオボ生成のどちらかによって供給される。形質転換の改良（定量的および定性的）は、「古典的な」形質転換（すなわち予備直鎖化および精製導入遺伝子断片の注入）の実験と比較された。陰性対照は、メガヌクレアーゼ源を一切含まない導入遺伝子ＤＮＡの、同一のスーパーコイル調製物を用いて実施した。
【０２１６】
Ｉ−ＳｃｅＩ発現ベクターによって仲介されるインオボ直鎖化
注入は、Ｂ６ＳＪＬマウス卵からのオス前核にて、１細胞期に実施した。Ｉ−ＳｃｅＩ発現ベクターは、Ｂ６ＳＪＬマウス卵からのオス前核にて１細胞期に、ｐＳｃｅｌ／ＥＧＦＰプラスミドを微量注入することによってインオボで確認した。ＥＧＦＰ蛍光は、ＥＧＦＰフィルターを備えた倒立顕微で、注入胚の２細胞期にて既に視覚化された。２のＩ−ＳｃｅＩおよびＥＧＦＰ  ＯＲＦの間にＩＲＥＳを持つ作成物の性質により、本発明者らは、約９５％の場合で、ＥＧＦＰ蛍光が視覚化されたときに、Ｉ−ＳｃｅＩは、調和的に生成されることを確信した。Megafluo（図１０Ａ）およびｐＩ−ＳｃｅＩ／ＥＧＦＰ（図１０Ｂ）プラスミドは、５００コピー／plで同時注入した。注入卵をＢ６ＣＢＡ育成メスマウスに移植した。出生を点検し、死産動物を回収し、そして注入導入遺伝子の推定上の組込について、遺伝子型を同定するために、そのＤＮＡを抽出した。新生マウスは、尾の小片を切断することによって３週目に分類した。次にＤＮＡ抽出を実施し、続いてＰＣＲおよび／またはサザン実験によって遺伝子型を同定した。本実験より、新生仔５および死産仔２を回収した。ＤＮＡ抽出の後、ＤＮＡ回収をアガロースゲル上で点検した（図１１Ａ）。抽出されたゲノムＤＮＡの品質を点検するために、β−グロビン遺伝子の４９４bpサブ断片を増幅するＰＣＲを実施した（図１１Ｂの右パネル）。予想されたＰＣＲβ−グロビン生成物が、試験を行ったすべてのＤＮＡサンプルから視覚化されたため、すべてのＤＮＡサンプルは定性的に正しいと思われる。導入遺伝子の組込について試験を行うために、レポーター遺伝子（ＤＳＲｅｄ１−Ｅ５）の４８４bpを増幅するＰＣＲを実施した（図１１Ｂの左パネル）。３週齢のマウス子孫３および死産仔２のうち、それらの２（番号１および２５）ならびに１（番号Ａ）はそれぞれ遺伝子導入であった。これらの結果はひとまとめにして、これらの結果は、生存動物を考慮した場合に子孫の４０％が遺伝子導入であり、そして生存および死産の注入マウスをまとめて考慮した場合には４３％が遺伝子導入であることを示した。
【０２１７】
通常、プラスミドの同時注入がマウス１細胞期卵に実施される場合、両方のプラスミドの同時組込が注入動物にて、多くは同じ位置で検出される。Ｉ−ＳｃｅＩ発現ベクター（ｐＩ−ＳｃｅＩ／ＥＧＦＰ）の組込について試験を行うために、本プラスミドのサブ断片を増幅するＰＣＲも同様に実施した。回収したすべての動物（Megafluoの遺伝子導入動物および非遺伝子導入動物にかかわらず）は、Ｉ−ＳｃｅＩ発現ベクターの存在について陰性であった（図１１Ｃ）。
【０２１８】
導入遺伝子のＦ１子孫への伝達について試験を行うために、遺伝子導入動物１および２５は、Ｂ６ＳＪＬ非注入動物と戻し交配した。メス１およびオス２５にそれぞれ由来する１３Ｆ１および５４Ｆ１動物のうち、各戻し交配について１のみのＦ１動物が、プロモーターｐＧａｓ  ５にハイブリダイズするプローブを用いたサザンブロット実験によって証明されたように、遺伝子導入であった。これらの結果は、メガヌクレアーゼ仲介形質転換によって得られた遺伝子導入動物が繁殖性であり、そして導入遺伝子をその子孫に伝達できることを証明した。数値は伝達率が２％〜８％の範囲であることを示し、そして創始動物が組込についてモザイク性であることを示唆した。この結果は、その対応する発現ベクターからのＩ−ＳｃｅＩの生成が接合体転写を開始し、そしてＣＭＶプロモーターがマウス卵において活性になり始める場合に、マウス卵での２細胞期の前に開始しないことになっているため、驚くべきではない。
【０２１９】
Ｉ−ＳｃｅＩ精製タンパク質によって仲介されたインオボ直鎖化
プロトコールは、Ｉ−ＳｃｅＩが精製タンパク質として１：５  ＤＮＡ／タンパク質比で供給されたことを除いて、本実験と同じであった。Megafluoスーパーコイルプラスミド７５０コピー（図１０Ａ）をＩ−ＳｃｅＩ精製タンパク質（１８μM）と同時注入した。注入卵は、Ｂ６ＣＢＡ育成メスマウスに移植した。新生マウス９匹のうち、Ｇａｓ５プロモーターまたはプラスミド主鎖配列のどちらかに対応するプローブを使用したサザンブロット分析によって検出されたように、遺伝子導入であった。この結果は、遺伝子導入動物が本方法によって本実験において収率２２％で生成されることを示した。
【０２２０】
「古典的な形質転換」
同じプラスミド作成物、Megafluoをマウス形質転換の古典的なプロトコール、すなわち前直鎖化導入遺伝子の注入で使用した。２種類の実験を実施し、一方では１７９６bpのＮｄｅｌサブ断片を使用し、もう一方では１８２４bpのＩ−ＳｃｅＩサブ断片を使用し、サブ断片は両方ともプロモーターＧａｓ５およびレポーター蛍光遺伝子を持っていた。Ｉ−ＳｃｅＩ断片については、２シリーズの注入を実施した。ＤＮＡ断片５００コピー／plの注入に対応する第一のシリーズは、Ｒｅｄ５  ＰＣＲによって陰性であるマウス２匹の出生につながった。Ｉ−ＳｃｅＩ断片７５０コピー／plの注入に対応する第二のシリーズは、組込について陰性であるマウス８匹の出生につながった。Ｎｄｅｌ断片７５０コピー／plの注入は、８匹の出生につながった。新生仔８匹のうち、１匹のみが遺伝子導入であった（番号１８）（図１２）。本実験では、遺伝子導入の数は、１２．５％であった。３回の実験で、出生動物１８匹のうち遺伝子導入１匹が、メガヌクレアーゼ仲介形質転換から得られた数値と比較して、同じＤＮＡ配列を使用した場合に得られた遺伝子導入動物の数値を５．５％に低下させる。Ｆ１から遺伝子導入オス１８への伝達は、このオスをＢ６ＳＪＬメスと交雑させることによって試験した。Ｆ１動物２５匹のうち、プロモータープローブを使用したサザンブロット分析で検出されたように、得られた６匹のうち１匹および１９匹のうちが遺伝子導入であった。これらの結果は、＜＜古典的な形質転換＞＞を用いた伝達が約１６％であることを示した。
【０２２１】
対照実験
スーパーコイルMegafluoプラスミド７５０コピー／plの単独での組込も確認した。２つの別個の実験を実施した。マウス１０および１１がそれぞれ得られた。マウスの遺伝子型を同定するために、ＰＣＲおよびサザンブロット分析の両方を使用すると、遺伝子導入動物は検出されなかった。
【０２２２】
ＰＩ−ＳｃｅＩ精製タンパク質によって仲介されるインオボ直鎖化
他のメガヌクレアーゼによるメガヌクレアーゼ仲介形質転換の効率を試験するために、本発明者らは、精製ＰＩ−ＳｃｅＩタンパク質を用いて実験を実施した。遺伝子導入構築物、ＰＩＦＦＬａｇｏを図１３に示す。レポーター遺伝子ＬａｇｏＺ（ＣＰＧなしＬａｃＺ配列）の発現につながるＧａｓ５プロモーターは、ベクターの主鎖配列を分離する、同じ配向の２のＰＩ−ＳｃｅＩ認識／開裂部位と隣接している。プロモーターおよびレポーター遺伝子の間に、単一のＩ−ＳｃｅＩ部位が存在する。
【０２２３】
ＰＩＦＦＬＡｇｏ７５０コピー／plの、精製ＰＩ−ＳｃｅＩタンパク質との同時注入は、目標ＤＮＡ／タンパク質比  １：２５にて実施した。注入卵の移植の後、育成母は、妊娠期間１２日目に殺処分し、そして注入胚をレポーター遺伝子配列に対応するプローブを用いたＰＣＲ（Ｌａｇｏ）およびサザンブロット分析の両方によって、遺伝子型を同定した。遺伝子型同定を行った胚１０個のうち、３個が遺伝子導入であった（図１４、右パネル）。直列逆反復組込に対応するＬａｇｏプローブにより、これらの胚のゲノムＤＮＡにおいて、７kb断片が検出された。本結果は、ＰＩ−ＳｃｅＩ仲介形質転換効率は、約３０％であることを示した。
【０２２４】
同じ遺伝子導入作成物を用いて、ＰＩＦＦＬａｇｏ７５０コピー／plの、１：１６９のＩ−ＳｃｅＩ  ＤＮＡ標的／タンパク質分子との同時注入によって、Ｉ−ＳｃｅＩ仲介形質転換を試験した。注入卵の移植後、育成母は、妊娠期間１２日目に殺処分し、そして注入胚をレポーター遺伝子配列に対応するプローブを用いたＰＣＲ（Ｌａｇｏ）およびサザンブロット分析の両方によって、遺伝子型を同定した。得られた胚９個のうち、３個が遺伝子導入であった（図１４、左パネル、図１５）。本結果は、本実験における導入遺伝子のＩ−ＳｃｅＩ仲介直鎖化は、３分の１の遺伝子導入胚につながったことを示している。
【０２２５】
マウスのメガヌクレアーゼ仲介形質転換の詳細なプロトコール
注入用サンプル調製
プラスミドＤＮＡ（スーパーコイル）溶液をQiagen Endo-freeカラム内で作成した。沈殿後、次にプラスミドをBrinster緩衝液、１０mM  ＴＲＩＳ、０．２５mM  ＥＤＴＡ中で所望の濃度にて再懸濁させた。Ｉ−ＳｃｅＩ原液は、２５mM  ＨＥＰＥＳ、pH８、５％グリセロール中に１５０μg/ml（１０ユニット／μl）を含有していた。表３は、一連のタンパク質：ＤＮＡ比に対するＩ−ＳｃｅＩの量を示す。
【０２２６】
【表１２】
2005503161.tif 000012
【０２２７】
注入用サンプルは、グリセロールがＩ−ＳｃｅＩ原液中に存在することを考慮して調製した。使用したＩ−ＳｃｅＩ溶液の量によって、一部の量のグリセロール含有溶液（Ｘ緩衝液）はどの場合でも、ユニークな一定の最終グリセロールを濃度を持つよう添加した。注入の場合、本発明者らは、１％グリセロールおよびタンパク質：ＤＮＡ比  ５：１のサンプルを使用した。
（プラスミド５００コピーは、３．０１  １０-20molに相当する。Ｉ−ＳｃｅＩは、２９．３KDaである）
【０２２８】
ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＭＭ５１kDaによって仲介された形質転換には、同様のプロトコールを使用した。ＰＩ−ＳｃｅＩの活性の状態に基づいて、２０％グリセロールを含有する原液１．１５mg/mlを調製した。注入には２つの最終ＤＮＡ／比を使用した。５０ｘ（５．３５％グリセロールおよび７mM  ＨＥＰＥＳ中のＰＩ−ＳｃｅＩ  ３０７．３μg/ml）および９４ｘ（６．２５％グリセロール中のＰＩ−ＳｃｅＩ  ３０７．３μg/ml）。それらは、希釈緩衝液中のＰＩ−ＳｃｅＩ原液の希釈溶液から調製した。
希釈緩衝液：
２５mM  ＨＥＰＥＳ、５％グリセロール、２５℃にてpH８
【０２２９】
Ｉ−ＳｃｅＩ仲介形質転換
同じスーパーコイル作成を発現メガヌクレアーゼベクターまたは精製タンパク質のどちらかと共に注入した。同様に、同じ導入遺伝子の予備直鎖化および精製インビトロ形を使用して、「古典的な形質転換」をメガヌクレアーゼ仲介形質転換と比較した。
【０２３０】
スーパーコイルプラスミド調製物：
プラスミドの生成は、QIAgen Endo-freeキット（QIAGEN）を用いて実施した。回収したＤＮＡを酢酸ナトリウムで沈殿させ、７０％エタノールで洗浄し、そして、Brinster緩衝液（１０mM  ＴＲＩＳ−０．２５mM  ＥＤＴＡ）中で、注入用の所望の濃度で再懸濁させた。
【０２３１】
直鎖化導入遺伝子の調製：
１．Megafluoを消化して、プラスミドベクター配列から導入遺伝子を遊離した。その目的に２つの異なる酵素を使用した。それぞれ１７９６bpおよび１８２４bpにつながる、ＮｄｅｌまたはＩ−ＳｃｅＩ酵素。
２．制限消化生成物を、０．８％ＴＡＥを用いてアガロースゲル上で分離した。
３．ゲルをトランスイルミネータ上に置き、所望のバンドを切断し、そして次にQIAquickゲル抽出キット（QIAGEN）を用いて精製した。
４．Ｔｒｉｓ（pH７．６）中でのＤＮＡ溶出後、ＤＮＡを沈殿させ、７０％エタノールで洗浄し、Brinster緩衝液 Tampon Brinster中で濃度５００コピー／plにて再懸濁させた。
５．ＤＮＡを−２０℃で保存した。
【０２３２】
１細胞期マウス卵の回収
ａ）過剰排卵：
−注入３日前に、３週齢Ｂ６ＳＪＬメスへＰＭＳ（Intervetによるfolligon）を５ＵＩ／マウスにて腹腔内注入
−注入１日前に、３週齢Ｂ６ＳＪＬメスへＨＣＧ（IntervetによるChorulon）を５ＵＩ／マウスにて腹腔内注入、そしてそれらをＢ６ＳＪＬオスと交雑
−Ｂ６ＣＢＡメスをＢ６ＣＢＡ精管切除オスと交差育成。
ｂ）卵母細胞回収：
−Ｂ６ＳＪＬプラグドＢ６ＳＪＬメスを殺処分し、輸卵管を回収し、そしてそれらをＰＢＩ培地に入れた。
−アンプルを鉗子で切断することによって、０．５mg/mlのヒアルロニダーゼ１００μl中で卵母細胞を２分間、分離させた。
−卵をＰＢＩ中ですすいだ。
−卵をシリコン処理油で覆ったWhittenに写し、それらを３７℃、５％ＣＯ2で維持した。
ｃ）卵注入
−受精卵を、コンテンションおよび注入毛細管（PhymepによるＧＣ  １００−１０およびＧＣ１００Ｆ−１０）を用いて、Nikon倒立顕微鏡（ＴＥ２０００−Ｕ）上に微操作装置（transferman ＮＫ２  ５１８８）を備えたEppendorf微量注入器（Femtojet5247）を使用してＰＢＩ中に微量注入した。
ｄ）育成メスへの注入卵移植：
−Avertin１５０μg/mlの４００μl／マウスでの腹腔内注入によって、Ｂ６ＣＢＡメスに麻酔をかけた。
−注入卵を切開した輸卵管に移植した。
【０２３３】
ゲノムＤＮＡ抽出
１）尾部１cm当たり尾部緩衝液７５０μLおよびプロテイナーゼＫ４０μLまたは胚膜当たり尾部緩衝液５００μLおよびプロテイナーゼＫ３０μLを添加した。
２）５６℃で一晩インキュベートした。
３）Eppendorfミキサーで５分間混合した。
４）尾部当たり飽和塩化ナトリウム（≒６Ｍ）２５０μLまたは胚膜当たり飽和塩化ナトリウム（≒６Ｍ）１７０μLを添加した。
５）Eppendorfミキサーで５分間混合した。
６）１３０００rpmで１０分間遠心分離した。
７）新しいEppendorf管に、尾部当たり上澄み７５０μLまたは胚膜当たり上澄み５００μLを収集した。
８）尾部当たりイソプロパノール５００μLおよび胚膜当たりイソプロパノール３５０μLを添加した。
９）Eppendorfミキサーで２分間混合した。
１０）１３０００rpmで１分間遠心分離した。
１１）室温にて７０％のエタノール５００μLによって、ペレットを２回洗浄した。
【０２３４】
サザンブロット実験による遺伝子導入マウスの遺伝子型同定
ａ）RocheによるDig-labellingキットを用いた、精製プラスミドＤＮＡ配列  ｏ／ｎ  １μgの標識化。プローブは、G-50 sephadexで精製した。プローブの定量化は、RocheのキットによるDig-controlを用いて、ドットブロット反応について確認した。
ｂ）ゲノムＤＮＡ１〜７μgをＥｃｏＲＩ制限酵素（ＮＥＢ）で消化した  ｏ／ｎ。
ｃ）消化したＤＮＡを０．８％アガロースＴＡＥゲルに装填した。
ｄ）ゲルを変性溶液（ＮａＯＨ（０．５Ｍ）＋ＮａＣｌ（１．５Ｍ））中で３０’変性させ、次に中和溶液（Ｔｒｉｓ（pH７．４，０．５Ｍ）＋ＮａＣｌ（１．５Ｍ））中で中和した。
ｅ）ＤＮＡ転移は、ナイロンＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋膜（Amersham）上で１０ｘＳＳＣ  ｏ／ｎ  中で毛細管によって行った。
ｆ）ＤＮＡは、ＵＶ架橋（StratageneによるStratalinker）によって膜に固定して、そして８０℃のオーブンで２時間焼成した。
ｇ）膜は、ハイブリダイゼーション緩衝液中で１時間、回転炉内で６８℃にて予備ハイブリダイゼーションした。
ｈ）ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション緩衝液中で、回転炉内で６８℃にて予備変性Ｄｉｇ標識プローブ（１０ng/ml）  ｏ／ｎ  を用いて実施した。
ｉ）予熱した洗浄溶液によって、回転プラットフォーム上で室温にて５分間、２回洗浄した。
ｊ）緩衝液Ｉ（１ｘ）／０．３％ｔｗｅｅｎ中で室温にて５分間、１回洗浄した。
ｋ）２５０rpmで回転させる密閉ポリ袋内のブロッキング溶液中で３０分間、膜のブロッキング。
ｌ）ブロッキング溶液中における、抗ジゴキシゲニン−Ａｐ  Ｆａｂ断片（Roche）０．０３７５U/mlを３０分間インキュベーション。
ｍ）緩衝液（１ｘ）／０．３％ｔｗｅｅｎ中で２回、それぞれ３０分間洗浄。
ｎ）暴露緩衝液（緩衝液III）中で５分間。
ｏ）Rocheによる化学発光サブストレートＣＤＰ−Ｓｔａｒへの、膜の暴露。
【０２３５】
緩衝液組成物：
ハイブリダイゼーション緩衝液：０．５Ｍ  ＮａＰｉ、７％  ＳＤＳ、１mM  ＥＤＴＡ
洗浄溶液：４０mM  ＮａＰｉ、１％  ＳＤＳ
緩衝液Ｉ（１０ｘ）：１Ｍ  マレイン酸、１．５Ｍ  ＮａＣＩ、pH７．５
ブロッキング溶液：緩衝液Ｉ中、ブロッキング試薬（Roche）１０％ｗ／ｖ
緩衝液III（１ｘ）：１リットル当たり：１００mM  Ｔｒｉｓ（pH９．５）、１００mM  ＮａＣｌ、５０mM  ＭｇＣｌ2
【０２３６】
ＰＣＲによる遺伝子導入マウスの遺伝子型同定
ＰＣＲ反応
ゲノムＤＮＡ１００ngまたはプラスミドＤＮＡ１ng
各プライマー１μM
ＲＥＤ  Ｔａｑ  Ｒｅａｄｙミックス（Sigma）  使用したプライマーによってＤＭＳＯ５〜１０％（ＰＣＲ条件を参照）
１０μlまでの、オートクレーブ処理水によるＱｓｐ
鉱油で覆って、サーマルサイクラーに入れる。
【０２３７】
ＰＣＲ条件：
変性  ９４℃にて３分、１サイクル
変性  ９４℃にて２０秒                              ───┐
アニーリング  プライマーＴｍによる可変温度にて３０秒      │  ３５サイクル
増幅  ７２℃にて２０秒                                    │
増幅の最終ラウンド  ７２℃にて３分                  ───┘
ＰＣＲ生成物は、２．５％  ＴＡＥアガロースゲルで分析
β−グロビンＰＣＲ
１０％ＤＭＳＯ、５１℃にてアニーリング
４９４bp断片の増幅を引き起こすマウスβ−グロビン遺伝子ＰＣＲ増幅に使用されるオリゴヌクレオチド
Ｒｅｄ  ＰＣＲ増幅
１０％ＤＭＳＯ、５５℃にてアニーリング
４８４bp断片の増幅を引き起こすｍｅｇａｆｌｕｏ配列のレポーターＰＣＲ増幅に使用されるオリゴヌクレオチド
Ｉ−ＳｃｅＩ  ＰＣＲ増幅
１０％ＤＭＳＯ、５５℃にてアニーリング
４００bp断片の増幅を引き起こすpl−ＳｃｅＩ／ＥＧＦＰ配列のサブ断片のＰＣＲ増幅に使用されるオリゴヌクレオチド
Ｌａｇｏ  ＰＣＲ増幅
５％ＤＭＳＯ、５１℃にてアニーリング
３７０bp断片の増幅を引き起こすＰＩＦＦＬａｇｏ配列のレポーターＰＣＲ増幅に使用されるオリゴヌクレオチド
ＰＣＲ対照：
汚染の対照：ＤＮＡを含まないが、水のみの（Ｃ）陽性対照を含むことを除いて、同一のＰＣＲ反応：ＤＮＡサンプルがマウスベータグロビンのプライマーの使用によって増幅できるようにし、単一コピー遺伝子が遺伝子型同定されるゲノムＤＮＡによって増幅できることを証明する、Ｂ６ＳＪＬマウスＤＮＡ（ｗｔ）。
陽性／陰性スーパーコイルプラスミドＤＮＡは、全ＰＣＲ実験において対照として体系的に使用した。
【図面の簡単な説明】
【０２３８】
【図１】スーパーコイルプラスミドベクターからインビボ放出される導入遺伝子を組込むための方法の１つの態様を表す概略図である。導入遺伝子は、２の開裂部位により隣接される。開裂剤が、添加され、そして２の開裂部位においてインビボで二重鎖切断を行う。直鎖導入遺伝子が、放出され、そして導入遺伝子の１のコピーがゲノム内に組込まれる。
【図２】既知のメガヌクレアーゼを開示する表である。Ｔｈは、理論値を示し、Ｅｘｐは、実験実証値、およびＰｏｔはポテンシャルを意味する。
【図３Ａ】本発明による直鎖ベクターの調製のためのある方法を表す概略図である。
【図３Ｂ】本発明による直鎖ベクターの調製のためのある方法を表す概略図である。
【図４】実施例１で述べるＤＮＡ作成物の概略図である。「Ｉ−Ｓｃｅ  Ｉ」は、Ｉ−Ｓｃｅ  Ｉエンドヌクレアーゼ認識および開裂部位を指す。「ＩＲ」は、逆反復を指す。「ｐＡsv40」は、ＳＶ４０のポリアデニル化信号を指す。
【図５】実施例１で用いる検証システムを開示する概略図である。「Ｉ−Ｓｃｅ  Ｉ」、
「ＩＲ」、「ｐＡsv40」は、それぞれ、Ｉ−Ｓｃｅ  Ｉエンドヌクレアーゼ認識および開裂部位、逆反復、ならびにＳＶ４０のポリアデニル化信号を指す。
【図６】ｐＶｉｒｔｋＵ３ＲβｇｅｏおよびｐＣＭＶ−Ｉ  Ｓｃｅｌの両方を持つ形質移入細胞ゲノムのＥｃｏＲ  Ｖ消化の後のサザン分析による電気泳動ゲルのハーフトーン複製ならびに得られた制限断片を示す図である。＋ＩＮは、細胞が、インテグラーゼをコードするプラスミドによっても形質移入されることを意味する。断片ΔＵ3ＲβｇｅｏＡsv40の１のコピーが、細胞ゲノムに組込まれる場合、サザン分析は、１．２kbにバンド１個および少なくとも２．５kbに別のバンドを示す。断片ΔＵ3ＲβｇｅｏＡsv40が、少なくとも２の連続コピーを持つ細胞ゲノムに組込まれる場合、サザン分析は１．２kbにおける少なくとも１個のバンドおよび２．５kbにおける１個のバンドを示す。
【図７Ａ】インビボ直鎖化法を用いたＣＯＳ細胞への安定形質移入の結果を示す。
ｐｐＳＮＩＥ作成物の構造を示す図である。ＨｉｎｄIIIおよびＩ−Ｓｃｅ  Ｉ開裂部位（Ｉ−ＳｃｅＩＣＳ）は、ＮＥＯプローブ（Probe）の位置と同様に示される。
【図７Ｂ】インビボ直鎖化法を用いたＣＯＳ細胞への安定形質移入の結果を示す。
サザンブロット分析のハーフトーン複製である。左のブロットは、プラスミドｐｐＳＮＩＥおよびｐＣＭＶ−Ｉ−Ｓｃｅｌ（−）による同時形質移入に相当する。右のブロットは、プラスミドｐｐＳＮＩＥおよびｐＣＭＶ−Ｉ−Ｓｃｅｌ（＋）による同時形質移入に相当する。
【図８Ａ】α−アクチン−ＧＦＰ注入胚におけるＧＦＰの一過的発現を示す。
メガヌクレアーゼが、注入緩衝液に添加されたときの、ＧＦＰ一過的発現の改良を示す図である。右パネル：各種レベルでＧＦＰを発現する脱塩素化胚。定期観測では、漿膜は、除去しない。Ｓ：強い；Ｍ：中程度；Ｗ：弱い。
【図８Ｂ】α−アクチン−ＧＦＰ注入胚におけるＧＦＰの一過的発現を示す。
図７Ａに示すようにグループ化されたＧＦＰ筋発現の各種のパターンの頻度をまとめた表である。Ｎ（陰性）、Ｗ（弱）、Ｍ（中程度）、および強（Ｓ）。
【図９Ａ】メダカにおける形質転換の効率を示す。
ｐ□ａｃｔ−ＧＦＰＭ２の注入後のメダカにおける形質転換の効率を示す表である。レーン１：インビトロＩ−Ｓｃｅｌ消化およびアガロースゲル精製によって得られた、α−アクチンプロモーターおよびＧＦＰレポーター遺伝子に相当する直鎖断片。
【図９Ｂ】メダカにおける形質転換の効率を示す。
メガヌクレアーゼを用いて（ライン１〜４）または用いずに（レーンＣ）注入されたｐ□ａｃｔ−ＧＦＰＭ２系における挿入作成物のサザンブロット分析のハーフトーン複製である。Ｐ：ＢａｍＨＩによって消化された対照ｐ□ａｃｔ−ＧＦＰＭ２。□−アクチンプロモーター：灰色ボックス。ＥＧＦＰ、ｐｏｌｙＡ：白色ボックス。示したフィルターで使用した制限酵素は、ＢａｍＨＩである。使用したプローブは、ＸｈｏｌおよびＥｃｏＲＶ消化物によって得られ、アクチンプロモーターおよびＧＦＰレポーター遺伝子に相当する。サザンではそれぞれＧＦＰ／ｐＡおよびアクチンプロモーター（３’□ｐ）の下流領域に相当する１および２kbの２個の断片は、レーン１〜４に観測される。５’□ｐ＋ｐＢｌｕＳＫ：プラスミド配列と連結されたプロモーターの上流領域を示す、４．８kbバンド。
【図１０Ａ】Ｉ−ＳｃｅＩ発現ベクターによる導入遺伝子のインオボ直鎖化によってメガヌクレアーゼ仲介形質転換に使用されるプラスミド作成物の概略図である。
Megafluoプラスミド作成物の図である。矢印Ｉ−Ｓｃｅ  Ｉは、Ｉ−Ｓｃｅ  Ｉ開裂部位の位置を示す。強力なプロモーター（マウスＧａｓ５遺伝子のプロモーター）は、蛍光レポーター（ＣｌｏｎｔｅｃｈによるＤＳＲｅｄ１−Ｅ５）の転写を指示している。同じ配向の２個のＩ−Ｓｃｅ  Ｉ認識／開裂部位は、ｐＵＣベクターの誘導体中でサブクローニングされた導入遺伝子によって隣接されている。
【図１０Ｂ】Ｉ−ＳｃｅＩ発現ベクターによる導入遺伝子のインオボ直鎖化によってメガヌクレアーゼ仲介形質転換に使用されるプラスミド作成物の概略図である。
Ｉ−Ｓｃｅ  Ｉ発現ベクター（ｐＩ−ＳｃｅＩ／ＥＧＦＰ）の図である。Ｉ−ＳｃｅＩタンパク質コード配列は、ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰのＭＣＳ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）内ににサブクローニングされた。ＣＭＶプロモーターは、バイシストロン発現が生成されるときに、Ｉ−ＳｃｅＩタンパク質およびＥＧＦＰ蛍光レポーターの両方の単一のＲＮＡからの転写を行わせる。
【図１１Ａ】Ｉ−Ｓｃｅ  Ｉ発現ベクターによる導入遺伝子のインオボ直鎖化によるメガヌクレアーゼ仲介形質転換の結果を示す。
ゲノムＤＮＡ抽出を示すアガロースゲルのハーフトーン複製である。ライン１、２５、２、３、４は、３週齢マウスのゲノムＤＮＡ抽出である。ラインＡおよびＢは、死産マウスのゲノムＤＮＡ抽出である。ＤＢＡの約５００ngを１％ＴＡＥアガロースゲルに装填した。死産動物からのゲノムＤＮＡ（ＡおよびＢ）は、死んだ動物から予想されるのと同様に低下するが、ＤＮＡはＰＣＲ分析になお使用することができる。
【図１１Ｂ】Ｉ−Ｓｃｅ  Ｉ発現ベクターによる導入遺伝子のインオボ直鎖化によるメガヌクレアーゼ仲介形質転換の結果を示す。
マウスβ−グロビン遺伝子断片およびMegafluo（Ｒｅｄ５）のレポーター配列のＰＣＲ増幅を示すアガロースゲルのハーフトーン複製である。左パネル：β−グロビン遺伝子に予想される４９４bp  ＰＣＲ生成物が検出されるため、すべてのゲノムＤＮＡサンプルは、ＰＣＲ増幅に適している。右パネル：動物１および２５および死産動物Ａは、Megafluoレポーター遺伝子（ＤＳＲｅｄＥ１−５）の４８４bp断片が検出されるため、遺伝子導入動物である。ライン１、２５、２、３、４は、３週齢マウスのゲノムＤＮＡ抽出である。ラインＡおよびＢは、死産マウスのゲノムＤＮＡ抽出である。陰性対照（−）は、ｐＩ−ＳｃｅＩ／ＥＧＦＰプラスミドに相当する。陽性対照（＋）は、ｍｅｇａｆｌｕｏプラスミドに相当する。Ｗｔは、Ｂ６ＳＪＬ非注入マウスから抽出したゲノムＤＮＡに相当する。Ｃは、ＤＮＡなしで実施したＰＣＲ汚染対照に相当する。
【図１１Ｃ】Ｉ−Ｓｃｅ  Ｉ発現ベクターによる導入遺伝子のインオボ直鎖化によるメガヌクレアーゼ仲介形質転換の結果を示す。
ｐＩ−Ｓｃｅ  Ｉ／ＥＧＦＰのサブ断片のＰＣＲ増幅を示すアガロースゲルのハーフトーン複製である。陽性対照（＋）は、ｐＩ−ＳｃｅＩ／ＥＧＦＰプラスミドに相当する。Ｗｔは、Ｂ６ＳＪＬ非注入マウスから抽出したゲノムＤＮＡに相当する。Ｃは、ＤＮＡなしで実施したＰＣＲ汚染対照に相当する。
【図１２】「古典的形質転換」の結果を示す。図１２は、Ｍｅｇａｆｌｕ（Ｒｅｄ５）のレポーター配列のＰＣＲ増幅を示すアガロースゲルのハーフトーン複製である。ライン１４〜２１は８の新生仔に相当する。
【図１３】ＰＩ−Ｓｃｅｌ発現ベクターによる導入遺伝子のインオボ直鎖化によってメガヌクレアーゼ仲介形質転換に使用されるプラスミド作成物の概略図である。Ｇａｓ５プロモーターが、レポーター遺伝子ＬａｇｏＺ（ほぼＣＰＧのないＬａｃＺ配列）の発現を行わせる。これらの２個の配列は、ベクターの主鎖配列を分離している同じ配向の、２個のＰＩ−Ｓｃｅｌ認識／開裂部位によって隣接される。プロモーターおよびレポーター遺伝子の間に、単一の認識／開裂Ｉ−Ｓｃｅｌ部位が存在する。
【図１４】ＰＩＦＦ−Ｌａｇｏ作成物を持つＩ−Ｓｃｅ  ＩまたはＰＩ−Ｓｃｅタンパク質による導入遺伝子のインオボ直鎖化によるメガヌクレアーゼ仲介形質転換の結果を示す。図１４は、レポーター遺伝子（ＬａｇｏＺ）の断片のＰＣＲ結果を示すアガロースゲルのハーフトーン複製である。陽性対照（＋）は、ＰＩＦＦＬａｇｏプラスミドに相当する。Ｗｔは、Ｂ６ＳＪＬ非注入マウスから抽出したゲノムＤＮＡに相当する。Ｃは、ＤＮＡなしで実施したＰＣＲ汚染対照に相当する。
左パネル：ＰＩＦＦＬａｇｏプラスミドおよびＩ−Ｓｃｅｌタンパク質を注入された１２ｄｐｉ胚９個のゲノムＤＮＡに対するＰＣＲゲノタイピングを実施する。Ｌａｇｏレポーターの３７０bp  ＰＣＲ生成物は、胚９個のうち４個で検出される（番号１０１、１０２、１０３、１０５）。
右パネル：ＰＩＦＦＬａｇｏプラスミドおよびＰＩ−ＳｃｅＩタンパク質を注入された１４ｄｐｉ胚９個のゲノムＤＮＡに対するＰＣＲゲノタイピングを実施する。Ｌａｇｏレポーターの３７０bp  ＰＣＲ生成物は、胚１０個のうち３個で検出される（番号１１１、１１２、１１４）。
【図１５】ＰＩＦＦ−Ｌａｇｏ作成物を持つＩ−Ｓｃｅ  Ｉタンパク質による導入遺伝子のインオボ直鎖化によるメガヌクレアーゼ仲介形質転換の結果を示す。図１４は、サザンブロット分析ののハーフトーン複製である。
ＰＩＦＦＬａｇｏプラスミドおよびＰＩ−ＳｃｅＩタンパク質を注入された１２ｄｐｉ胚９個のゲノタイピングをサザンブロット実験によって実施する。ゲノムＤＮＡは、ＥｃｏＲＩ制限酵素で消化した。２個の異なるジゴキシゲニン標識プローブを使用した。第一のプローブは、Ｇａｓ５配列にハイブリダイズし、第二のプローブはＬａｇｏレポーター遺伝子にハイブリダイズした。検出は、ハイパーフィルムＥＣＬフィルム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）上で化学発光ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（Roche）サブストレートを用いて実施した。３．１kbｐ断片はＧａｓ５プローブによって検出され、内因性マウスＧａｓ５遺伝子に相当する。動物１０５、１０３および１０１は、追加バンドが検出されたので、遺伝子導入動物である。この断片は、ブロットが脱ハイブリダイズされ、そしてＬａｒｇｏプローブによって再プローブされたときに（右パネル）も検出される。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図２−６】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005503161.tif 000122
2005503161.tif 000123
【国際調査報告】
2005503161.tif 000124
2005503161.tif 000125
2005503161.tif 000126
2005503161.tif 000127
2005503161.tif 000128