(57)【要約】  内部の非環式リンカー残基を有するオリゴヌクレオチド及び、その製造及び用途を開示する。そのような用途は、非環式リンカー含有アンチセンスオリゴヌクレオチドの製造、及び系における興味のある標的核酸、例えばＲＮＡの機能の阻止又は減耗のためのそれらの使用を含む。機能のそのような阻止又は減耗は、例えば、標的核酸の発現、逆転写及び／又は複製の阻止又は減耗、並びに標的核酸の分割／分解を含む。従って、発明のオリゴヌクレオチドは、標的核酸の機能が関係する分析及び治療の方法及び使用、並びにそのような方法及び使用に対応する市販のパッケージの成分のために有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造：
【化１】
2005508634.tif 000018
を有するオリゴヌクレオチドであって、
式中、ａは１より大きいか又は１に等しく；
Ｒ１とＲ２の各々は別個に少なくとも一つのヌクレオチドであり；
Ｘは非環式リンカーであり、そして
上記オリゴヌクレオチドは、少なくとも一つの修飾されたデオキシリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
修飾されたデオキシリボヌクレオチドが、ＡＮＡ，ＰＳ−ＡＮＡ，ＰＳ−ＤＮＡ，ＲＮＡ−ＤＮＡ及びＤＮＡ−ＲＮＡキメラ、ＰＳ−［ＲＮＡ−ＤＮＡ］及びＰＳ−［ＤＮＡ−ＲＮＡ］キメラ、ＰＳ［ＡＮＡ−ＤＮＡ］及びＰＳ−［ＤＮＡ−ＡＮＡ］キメラ、ＲＮＡ，ＰＳ−ＲＮＡ，ＰＤＥ−又はＰＳ−ＲＮＡアナログ、ロックされた核酸（ＬＮＡ），ホスホロアミデートモルフォリノ核酸、Ｎ３’−Ｐ５’ホスホロアミデートＤＮＡ、シクロヘキサン核酸、アルファ−Ｌ−ＬＮＡ，ボラノホスフェートＤＮＡ、メチルホスフォネートＤＮＡ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
ＡＮＡがＦＡＮＡである、請求項２記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
ＦＡＮＡがＰＤＥ−ＦＡＮＡ及びＰＳ−ＦＡＮＡからなる群から選択される、請求項３記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
ＰＤＥ−又はＰＳ−ＲＮＡアナログが、２’−修飾されたＲＮＡからなる群から選択され、但し、２’−置換体はアルキルアルコキシ、アルキルアルコキシ、Ｆ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
非環式リンカーが、非環式ヌクレオシド及び非ヌクレオチドリンカーからなる群から選択される、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
非環式ヌクレオシドが、プリン及びピリミジンセコヌクレオシド（seconucleoside）からなる群から選択される、請求項６記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
プリンセコヌクレオシドが、セコアデノシン及びセコグアノシンからなる群から選択される、請求項７記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
ピリミジンセコヌクレオシドが、セコチミジン、セコシチジン及びセコウリジンからなる群から選択される、請求項７記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
非ヌクレオチドリンカーが、アミノ酸及びアミノ酸誘導体からなる群から選択されるリンカーを含む、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
アミノ酸誘導体が、（ａ）複素環式塩基がメチレンカルボニルリンカーを通して連結したＮ−（２−アミノエチル）グリシンユニット（ＰＮＡモノマー）；及び（ｂ）Ｏ−ＰＮＡユニットからなる群から選択される、請求項１０記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
構造：
【化２】
2005508634.tif 000019
を有し、
式中、ｍ，ｎ，ｑ及びａの各々は別個に１より大きい整数か又は１に等しく；
式中、Ｒ１及びＲ２は別個に少なくとも一つのヌクレオチドであり；
式中、Ｚ１及びＺ２の各々は別個に酸素原子、硫黄原子、アミノ基及びアルキルアミノ基からなる群から選択され；
式中、Ｙ１及びＹ２の各々は別個に酸素、硫黄及びＮＨからなる群から選択され；そして
式中、Ｒ３はＨ，アルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、プリン、ピリミジン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、
請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
プリンが、アデニン、グアニン、及びそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項１２記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
ピリミジンが、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、ウラシル及びそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項１２記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
Ｒ１及びＲ２が、別個に、ヌクレオチド内部結合により連結した少なくとも２つのヌクレオチドを含み、但し、ヌクレオチド内部結合は、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、メチルホスフォネート、ホスホロアミデート（５’Ｎ−３’Ｐ及び５’Ｐ−３’Ｎ）基からなる群から選択される、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
Ｒ１及びＲ２の各々が、別個にＡＮＡを含む、請求項１２記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
ＡＮＡが、フッ素、水酸基、アミノ、アジド、アルキル、アルケニル、アルキニル及びアルコキシ基からなる群から選択される２’−置換基を含む、請求項１６記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
２’−置換基がフッ素であり、そしてＡＮＡがＦＡＮＡである、請求項１７記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
アルキル基が、メチル、エチル、プロピル及びブチル基からなる群から選択される、請求項１７記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
アルコキシ基が、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、及びメトキシエトキシ基からなる群から選択される、請求項１７記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
オリゴヌクレオチドが、
【化３】
2005508634.tif 000020
からなる群から選択され、
式中、Ｒ１，Ｒ２，ｎ，ａ，Ｚ１，Ｚ２，Ｙ１及びＹ２は請求項１２において定義されたとおりであり、そして
式中、Ｒ４及びＲ５の各々は別個にプリン及びピリミジンからなる群から選択される、
請求項１２記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
プリンが、アデニン、グアニン、及びそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項２１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
ピリミジンが、チミン、シトシン、ウラシル及びそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項２１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２４】
Ｒ１及びＲ２がＦＡＮＡであり；そしてａ＝１である、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２５】
Ｒ１及びＲ２がＰＳ−ＦＡＮＡであり；そしてａ＝１である、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２６】
Ｒ１が［ＦＡＮＡ−ＤＮＡ］であり、Ｒ２が［ＤＮＡ−ＦＡＮＡ］であり；そしてａ＝１である、請求項１から記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２７】
Ｒ１が［ＦＡＮＡ−ＤＮＡ］であり、Ｒ２がＦＡＮＡであり；そしてａ＝１である、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２８】
Ｒ１がＦＡＮＡであり、Ｒ２が［ＤＮＡ−ＦＡＮＡ］であり；そしてａ＝１である、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２９】
Ｒ１がＰＤＥ−［ＲＮＡ−ＤＮＡ］であり、Ｒ２が［ＤＮＡ−ＲＮＡ］であり；そしてａ＝１である、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３０】
Ｒ１が［ＲＮＡ−ＤＮＡ］であり、Ｒ２がＲＮＡであり；そしてａ＝１である、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３１】
Ｒ１がＲＮＡであり、Ｒ２が［ＤＮＡ−ＲＮＡ］であり；そしてａ＝１である、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３２】
Ｒ１がＳ−［（２’Ｏ−アルキル）ＲＮＡ−ＤＮＡ］であり、Ｒ２がＳ−［ＤＮＡ−（２’Ｏ−アルキル）ＲＮＡ］であり；そしてａ＝１である、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３３】
Ｒ１がＳ−［（２’Ｏ−アルキル）ＲＮＡ−ＤＮＡ］であり、Ｒ２がＳ−［（２’Ｏ−アルキル）ＲＮＡ］であり；そしてａ＝１である、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３４】
Ｒ１がＳ−［（２’Ｏ−アルキル）ＲＮＡ］であり、Ｒ２がＳ−［ＤＮＡ−（２’Ｏ−アルキル）ＲＮＡ］であり；そしてａ＝１である、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３５】
Ｒ１がＳ−［（２’Ｏ−アルコキシアルキル）ＲＮＡ−ＤＮＡ］であり、Ｒ２がＳ−［ＤＮＡ−（２’Ｏ−アルコキシアルキル）ＲＮＡ］であり；そしてａ＝１である、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３６】
Ｒ１がＳ−［（２’Ｏ−アルコキシアルキル）ＲＮＡ−ＤＮＡ］であり、Ｒ２がＳ−［（２’Ｏ−アルコキシアルキル）ＲＮＡ］であり；そしてａ＝１である、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３７】
Ｒ１がＳ−［（２’Ｏ−アルコキシアルキル）ＲＮＡ］であり、Ｒ２がＳ−［ＤＮＡ−（２’Ｏ−アルコキシアルキル）ＲＮＡ］であり；そしてａ＝１である、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３８】
Ｒ１がＦＡＮＡであり；Ｒ２がＰＳ−ＦＡＮＡであり；ａ＝１であり；そしてオリゴヌクレオチドがＩＩｂの構造を有し、式中、Ｙ１，Ｙ２，Ｚ１及びＺ２は酸素であり、そしてｎ＝４である、請求項２０記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３９】
Ｒ１がＰＳ−ＦＡＮＡであり；Ｒ２がＦＡＮＡであり；ａ＝１であり；そしてオリゴヌクレオチドがＩＩｂの構造を有し、式中、Ｙ１，Ｙ２は酸素であり；Ｚ１，Ｚ２は共に酸素又は硫黄であり、そしてｎ＝４である、請求項２０記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４０】
Ｒ１がＰＳ−ＤＮＡであり；Ｒ２がＤＮＡであり；ａ＝１であり；そしてオリゴヌクレオチドがＩＩｂの構造を有し、式中、Ｙ１，Ｙ２は酸素であり；Ｚ１，Ｚ２は共に酸素又は硫黄であり、そしてｎ＝４である、請求項２０記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４１】
Ｒ１がＤＮＡであり；Ｒ２がＰＳ−ＤＮＡであり；ａ＝１であり；そしてオリゴヌクレオチドがＩＩｂの構造を有し、式中、Ｙ１，Ｙ２は酸素であり；Ｚ１，Ｚ２は共に酸素又は硫黄であり、そしてｎ＝４である、請求項２０記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４２】
Ｒ１がＰＳ−ＦＡＮＡであり；Ｒ２がＦＡＮＡであり；ａ＝１であり；そしてオリゴヌクレオチドがＩＩｃの構造を有する、請求項２０記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４３】
Ｒ１がＰＳ−ＦＡＮＡであり；Ｒ２がＰＳ−ＦＡＮＡであり；ａ＝１であり；そしてオリゴヌクレオチドがＩＩｃの構造を有する、請求項２０記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４４】
Ｒ１がＰＳ−ＤＮＡであり；Ｒ２がＰＳ−ＤＮＡであり；ａ＝１であり；そしてオリゴヌクレオチドがＩＩｃの構造を有する、請求項２０記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４５】
Ｒ１がＤＮＡであり；Ｒ２がＰＳ−ＤＮＡであり；ａ＝１であり；そしてオリゴヌクレオチドがＩＩｃの構造を有する、請求項２０記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４６】
ａ＝２であり、そしてＲ１及びＲ２の各々が別個に少なくとも３ヌクレオチドからなる、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４７】
Ｒ１及びＲ２の各々が別個に３−８ヌクレオチドからなる、請求項４６記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４８】
ａ＝３であり、そしてＲ１及びＲ２の各々が別個に少なくとも２ヌクレオチドからなる、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４９】
Ｒ１及びＲ２の各々が別個に２−６ヌクレオチドからなる、請求項４８記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５０】
オリゴヌクレオチドが標的ＲＮＡに対してアンチセンスである、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５１】
系中の、翻訳、逆転写及び／又は標的ＲＮＡの複製を阻止するか又は低下させる方法であって、請求項５０記載のオリゴヌクレオチドに標的ＲＮＡを接触させることを含む、方法。
【請求項５２】
系中の、翻訳、逆転写及び／又は標的ＲＮＡの複製を阻止するか又は低下させる方法であって、
ａ）標的ＲＮＡを請求項５０記載のオリゴヌクレオチドに接触させ；そして
ｂ）標的ＲＮＡのＲＮａｓｅ分割を許容する
ことを含む、方法。
【請求項５３】
系中の、翻訳、逆転写及び／又は標的ＲＮＡの複製を阻止するか又は低下させるための、請求項５０記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項５４】
系中の、翻訳、逆転写及び／又は標的ＲＮＡの複製を阻止するか又は低下させることにおけるその使用のための指示書と共に請求項５０記載のオリゴヌクレオチドを含む市販のパッケージ。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
発明の分野
本発明は、修飾されたオリゴヌクレオチド及びその用途に関し、そして特定すれば、内部の位置に一つ又は複数の非環式残基を有するオリゴヌクレオチド及びその用途に関する。
【０００２】
発明の背景
オリゴヌクレオチドは様々な生物工学の応用のために利用され、プライマー、プローブ、リンカー、目的の部位又は領域を付与するためのセグメント（例えば、ヌクレアーゼによる分割のための部位；コーディングセグメント）、変異導入、又は特定の目的又は機能を満たすように特定の標的領域又は分子を標的化するためのセグメントを含む。それらの配列組成により特異性を付与するそれらの能力は、生物工学における多数の応用におけるそれらの用途をもたらしたが、特に、それらを特定の応用に従わせるための様々な適用及び修飾の場合である。そのような修飾は、様々な基の付加（attachment）、個々のヌクレオシド基又はその一部（即ち、糖及び／又は塩基部分）に対する修飾、又はオリゴヌクレオチド分子のバックボーンに対する修飾を必然的に伴ってよい。例えば、蛋白質をコードする分子、例えばＲＮＡを標的化するようにデザインされる能力を仮定すれば、オリゴヌクレオチドの特定の用途は、アンチセンス技術においては、蛋白質のレベル又は特徴を変調させ、そして次にその蛋白質に帰する機能を変調させることである。
【０００３】
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮｓ）は生物工学のセクターにおいて相当な興味を引き付け、そして癌及び感染疾患を含む一連のヒトの疾患に対しての治療上の戦略における使用のためのひときわ優れた可能性を有する（Ｕｈｌｍａｎｎ，Ｅ．＆  Ｐｅｙｍａｎ，Ａ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９０，９０，５４３）。有力な臨床上の用途のためにＡＯＮに必要な基準は、血清及び細胞ヌクレアーゼに対する安定性、細胞膜透過性、及びその細胞内標的（通常はメッセンジャーＲＮＡ［ｍＲＮＡ］）に対するＡＯＮの安定且つ特異的な結合を含む。ＡＯＮと標的ＲＮＡ上のその相補配列の間の二重鎖の形成は、一部には、「翻訳の阻止」（ＡＯＮと標的ＲＮＡの間の二重鎖形成により、即ち、物理的又は立体構造上翻訳機構をブロックすることにより全翻訳を阻害（inhibiting）／阻止する（preventing））によるが、より重要なのは、ＡＯＮ／ＲＮＡ二重鎖中のＲＮＡ鎖を特異的に分解する、偏在する内在性細胞内酵素であるリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）の作用を通して標的化されたＲＮＡの分解を導き出すことにより、そのようなＲＮＡの翻訳を阻止する（Ｗａｌｄｅｒ，Ｒ．Ｔ．；Ｗａｌｄｅｒ，Ｊ．Ａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９８８，８５，５０１１）。
【０００４】
現在のＡＯＮ技術は、臨床上の利用のために必要な一つ又は複数の基準において欠陥がある。ＲＮａｓｅ  Ｈの天然基質はＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二重鎖であるから、ＤＮＡがアンチセンス技術のために利用されてきた。しかしながら、血清及び細胞内のヌクレアーゼはホスホジエステル（ＰＤＥ）結合を有するＡＯＮｓを迅速に分解するため、ＰＤＥ−ＤＮＡからなるＡＯＮｓはそのような系においては限られた利用性しか有さなかった。ホスホロチオエート結合（ＰＳ−ＤＮＡ）のＤＮＡ鎖は、遺伝子発現をダウン制御するようにデザインされた大多数の実験における使用に成功し、そしていくつかの臨床上の治療の試行において使用されたか、及び／又は使用されている（Ａｋｈｔａｒ，Ｓ．＆  Ａｇｒａｗａｌ，Ｓ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１９９７，１８，１２）。ＰＳ−ＤＮＡは標的化されたＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ分解を誘導し、そして血清及び細胞のヌクレアーゼによる分解に耐性であるが、しかしながら、ＰＤＥ−ＤＮＡに比較して、標的ＲＮＡとは弱い二重鎖を形成する。さらに、ＰＳ−ＤＮＡは血清及び細胞の蛋白質への広範囲の「非特異的」結合を示す（Ｂｒａｃｈ，Ａ．Ｄ．ＴＩＢＳ，１９９８，２３，４５）。これは、好ましくない毒性を導き得て、特にインビボの作用を発揮するのに必要な高濃度のＰＳ−ＤＮＡの場合である。標的ＲＮＡに対して強固且つ特異的に結合でき、そしてそのＲＮＡの有効なＲＮａｓｅ  Ｈ分解を導き出すことができる新規のＡＯＮ構造の同定は、アンチセンスの開発において重要度が高い。
【０００５】
ＡＯＮの構造は、ＲＮａｓｅ  ＨがＡＯＮ／ＲＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を分解できるか否かを決定する。そうして、様々な戦略が、ＲＮＡ標的への結合を改善するため、二重鎖の形成及び安定性を改善するために利用されてきた。例えば、２’−Ｏ−メチルリボース（又はリボース２’−位におけるあらゆる置換）又はＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合の何れかを独占的に含むＡＯＮ、及び、例えばメチルホスホネート又はアミド結合からなる不変のヌクレオチド間結合を含むＤＮＡ分子は記載されたが、しかしながら、そのようなＡＯＮはＲＮａｓｅ  Ｈ活性を導かない（総説として、Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９９，１４８９，１１７を参照）。他のアナログ、例えばホスホロアミデートモルフォリノ核酸もＲＮａｓｅ  Ｈ活性を導く能力を欠く（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｗｅｌｌｅｒ，Ｄ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．，１９９７，７，１８７）。ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、顕著なハイブリダイゼーション特性、一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ及び二重鎖ＤＮＡへの高い親和性での結合を示す（Ｅｇｈｏｌｍ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９９３，３６５，５６６；Ｋｎｕｄｓｅｎ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９７，２５，２１６７）。しかしながら、ＰＮＡ：ＲＮＡハイブリッドはＲＮａｓｅ  Ｈの基質ではない。事実、１９７８−１９９８の期間に製造された数ダースの修飾ＡＯＮのうち、ＰＳ−ＤＮＡ、ホスホロジチオエートＤＮＡ（ＰＳ２−ＤＮＡ）、及びボラノホスフェートＤＮＡのみが、標的ＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ分解を導いたと報告された（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．＆  Ｃｏｏｋ，Ｐ．Ｄ．”Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ”ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ，ｖｏｌ．５８０．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ，１９９４）。ＰＳ−ＤＮＡにおける場合のように、アナログのＰＳ２−ＤＮＡ及びボラノホスフェートＤＮＡは、未修飾のＰＤＥ−ＤＮＡに比較して、標的ＲＮＡに対して弱い結合を呈する。よって、上記の戦略は標的への増加した結合を提供することが可能であるが、そのようなＡＯＮはＲＮａｓｅ  Ｈ活性を誘導することができない。
【０００６】
この制限を克服する試みは、アラビノ核酸（ＡＮＡ）及び２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノ核酸（ＦＡＮＡ）の開発を含む。これらの化合物は、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を導くとかつて報告された最初の糖−修飾オリゴヌクレオチドである［Ｄａｍｈａ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，”Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｂｅｔａ−ａｒａｂｉｎｏｓｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ”．ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ  ９９／６７３７８；Ｄａｍｈａ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９８，１２０，１２９７６；Ｎｏｒｏｎｈａ，Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０００，３９，７０５０］。これらのオリゴヌクレオチドは、β−Ｄ−フラノース環を保持しており、そしてＤＮＡ鎖のコンフォメーションを模倣する（Ｔｒｅｍｐｅ，Ｊ．−Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００１，１２４，４８９６）。ＦＡＮＡはＰＳ−ＤＮＡよりもはるかに安定度の高い二重鎖を標的ＲＮＡと形成する；事実、ＦＡＮＡ／ＲＮＡ二重鎖の安定性は、一般に、ＲＮＡ／ＲＮＡ二重鎖の安定性より優れている（Ｄａｍｈａ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９８，１２０，１２９７６；Ｗｉｌｄｓ，Ｃ．Ｊ．＆  Ｄａｍｈａ，Ｍ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０００，２８，３６２５）。
【０００７】
アンチセンスエリアにおける他の注目すべき開発は、糖−修飾オリゴヌクレオチドセグメント、例えばＰＳ−［２’−ＯＭｅ  ＲＮＡ−（ＤＮＡ）−２’ＯＭｅ  ＲＮＡ］により両サイド上で外側に位置するＰＳ−ＤＮＡオリゴデオキシヌクレオチドセグメントからなる混合バックボーンオリゴヌクレオチド（ＭＢＯ）である（例えばＣｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９９５，３１２（Ｐｔ２），５９９を参照）。これらのＭＢＯｓは「ギャップマー」としても知られる。外側の２’−Ｏ−メチルＲＮＡの「ウイング」は、ＭＢＯの標的ＲＮＡに関しての結合親和性を増加させるが、一方ＡＯＮの中央（middle）のＰＳ−ＤＮＡセグメントは標的ＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ分解を指示する（Ｚｈａｏ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９６，５１，１７３；Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．１９９６，２７７，９２３）。ＭＢＯｓはインビボにおいて安定性を増加させ（即ち、ヌクレアーゼ分解に耐性）、そして対応する全てのＰＳ−ＤＮＡ  ＡＯＮに比較して、インビトロ及びインビボの両方において改善された生物活性を示す。オリゴヌクレオチドの側方（flanking）領域に２’−ＯＭｅや他のアルコキシ置換体を取り込むこのアプローチの例は、Ｍｏｎｉａらにより、インビボの増強された抗腫瘍活性により証明された（Ｍｏｎｉａ，Ｐ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．１９９６，２，６６８）。これらのアナログを用いたいくつかの前臨床試行は進行中である（Ａｋｈｔａｒ，Ｓ．；Ａｇｒａｗａｌ，Ｓ．ＴｉＰＳ  １９９７，１８，１２）。
【０００８】
ＦＡＮＡ側方（flanking）の内部ＤＮＡセグメントからなるＭＢＯアンチセンスは、細胞培養アッセイにおいて試験された場合に、遺伝子発現の例外的に有力な標的−特異性阻害を示し（ＥＣ５０＜５ｎＭ）、そして２’−ＯＭｅ  ＲＮＡ／ＤＮＡ  ＭＢＯとは違い、それらの生物活性は内部のＤＮＡギャップの長さに対して顕著に依存性が低い（Ｄａｍｈａ  ｅｔ  ａｌ；２００２年３月１４日に公開された、ＰＣＴ国際公開ＷＯ  ０２／２０７７３）。
【０００９】
ＡＯＮｓによる標的ＲＮＡの細胞ＲＮａｓｅ  Ｈ分解の誘導
ＲＮａｓｅ  Ｈは選択的にＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二重鎖のＲＮＡ鎖を分解する（Ｈａｕｓｅｎ，Ｐ．；Ｓｔｅｉｎ，Ｈ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９７０，１４，２７９）。遺伝子発現のアンチセンスオリゴヌクレオチド指向性阻害のための最も重要な機構の一つは、標的ＲＮＡと二重鎖を形成した場合に、細胞のＲＮａｓｅ  Ｈにより認識され得る構造を形成する、これらアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力である。これは、アンチセンスオリゴヌクレオチド−ＲＮＡの塩基対合した二重鎖の領域内で、ＲＮＡ標的のＲＮａｓｅ  Ｈ−媒介性の分解を可能にさせる（Ｗａｌｄｅｒ，Ｒ．Ｔ．；Ｗａｌｄｅｒ，Ｊ．Ａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９８８，８５，５０１１）。
【００１０】
細菌エシェリヒアコリ由来のＲＮａｓｅ  Ｈ１は、もっとも容易に利用可能であって、最大に特性決定された酵素である。ＲＮａｓｅ  Ｈを含む真核細胞抽出物の研究は、原核酵素及び真核酵素が共に類似のＲＮＡ−分割特性を呈することを示唆する（Ｍｏｎｉａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９３，２６８，１４５１４；Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．１９９５，３１２，５９９；Ｌｉｍａ，Ｗ．Ｆ．；Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９７，３６，３９０）。エシェリヒアコリのＲＮａｓｅ  Ｈ１は、ＤＮＡ／ＲＮＡ二重ヘリックスのマイナーな溝に結合して、エンドヌクレアーゼ活性及びプロセッシブな３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性の両方によりＲＮＡを分解すると考えられる（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９１，８８，１１５３５；Ｆｅｄｏｒｏｆｆ，Ｏ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９３，２３３，５０９）。ＲＮａｓｅ  Ｈ分解の効率は、最小限の配列依存性を示し、そして上記のとおり、アンチセンスオリゴヌクレオチド内の化学変化に対して実に感受性である。
【００１１】
２’−ＯＭｅ  ＲＮＡはＲＮａｓｅ  Ｈ活性を導き得ないため、ＰＳ−［２’−ＯＭｅ  ＲＮＡ−（ＤＮＡ）−２’ＯＭｅ  ＲＮＡ］キメラオリゴヌクレオチドのＤＮＡギャップサイズを注意深く限定しなければならない。即ち、エシェリヒアコリのＲＮａｓｅ  Ｈは４ＤＮＡヌクレオチドほどの短いＤＮＡギャップを有する２’−ＯＭｅ  ＲＮＡ  ＭＢＯを認識して使用することができるが（Ｓｈｅｎ，Ｌ．Ｘ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９８，６，１６９５）、真核生物のＲＮａｓｅ  Ｈ（例えばヒトＲＮａｓｅ  ＨＩＩ）は、最適な分割活性のために、より大きなＤＮＡギャップを必要とする（７ＤＮＡヌクレオチドまたはそれより長い）（Ｍｏｎｉａ，Ｂ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９３，２６８，１４５１４）。一般に、ＰＳ−［２’−ＯＭｅ  ＲＮＡ−（ＤＮＡ）−２’ＯＭｅ  ＲＮＡ］キメラオリゴヌクレオチドを用いると、真核生物のＲＮａｓｅ  Ｈ−媒介性標的ＲＮＡ分割効率は、ＤＮＡギャップの長さの低下に伴い低下し、そして６ＤＮＡヌクレオチド未満のＤＮＡギャップのサイズではほとんど無視してよくなる。即ち、ＰＳ−［２’−ＯＭｅ  ＲＮＡ−（ＤＮＡ）−２’ＯＭｅ  ＲＮＡ］キメラオリゴヌクレオチドのアンチセンス活性は、ＤＮＡギャップのサイズに高く依存する（Ｍｏｎｉａ，Ｂ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９３，２６８，１４５１４；Ａｇｒａｗａｌ，Ｓ．ａｎｄ  Ｋａｎｄｉｍａｌｌａ，Ｅ．Ｒ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ  ２０００，６，７２）。これは、１デオキシヌクレオチド残基ほどの短いＤＮＡギャップにより顕著な生物活性を示すＰＳ−［ＦＡＮＡ−ＤＮＡ−ＦＡＮＡ］キメラに関しては真実でない（Ｄａｍｈａ  ｅｔ  ａｌ；２００２年３月１４日に公開されたＰＣＴ国際公開ＷＯ  ０２／２０７７３）。
【００１２】
最近、完全に変化させられたバックボーンを含むオリゴヌクレオチドが合成された。注目すべき例は、非環式のバックボーンを有するペプチド核酸（「ＰＮＡ」）である（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．「Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｄｅｓｉｇｎ」、ｖｏｌ．４，ｐｐ．７６，Ｔｒａｉｎｏｒ，Ｇ．Ｌ．（編纂），ＥＳＣＯＭ，Ｌｅｉｄｅｎ，１９９６中）。これらの化合物は、例外的なハイブリダイゼーション特性、及びヌクレアーゼ及びプロテアーゼに対して安定性を有する。しかしながら、アンチセンス構築物としてＰＮＡオリゴマーを使用する努力は、細胞取り込みの乏しさ及びＲＮａｓｅ  Ｈを活性化することの不可能さゆえに妨げられてきた。極めて最近、キメラのＤＮＡ部分によりＲＮａｓｅ  Ｈ媒介性分割を保持するように、ＰＮＡ−［ＤＮＡ］−ＰＮＡキメラがデザインされた（Ｂｅｒｇｍａｎ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９５，３６，６８２３；Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌａａｎ，Ａ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｖ．Ｃｈｉｍ．Ｐａｙｓ−Ｂａｓ  １９９５，１１４，２９５）。５’−及び３’−末端に位置するＰＮＡセグメントは、標的の核酸（ＲＮＡ）への結合を促進して、エキソヌクレアーゼ酵素による分解に対しての耐性を増強させるように作用する。しかしながら、ＤＮＡの存在に基づき、そのような構築物は、上記のように、生物学上の系において、より分解しやすい傾向があるかもしれない。
【００１３】
よって、そのようなアンチセンスのアプローチに関して、上記の制限に接近するために試みる事について、改善されたオリゴヌクレオチドに関する要求が存在する（例えば、結合、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性の誘導、分解に対する耐性）。
【００１４】
発明の概要
発明の一つの側面によれば、構造：
【００１５】
【化４】
2005508634.tif 000002
【００１６】
を有するオリゴヌクレオチドが提供されるが、
式中、ａは１より大きいか又は１に等しく；Ｒ１とＲ２の各々は別個に少なくとも一つのヌクレオチドであり；そしてＸは非環式リンカーである。一つの態様において、上記オリゴヌクレオチドは、少なくとも一つの修飾されたデオキシリボヌクレオチドを含み、即ち、Ｒ１，Ｒ２又は両方が少なくとも一つの修飾されたデオキシリボヌクレオチドを含んでよい。
【００１７】
一つの態様において、上記の修飾されたデオキシリボヌクレオチドは、ＡＮＡ，ＰＳ−ＡＮＡ，ＰＳ−ＤＮＡ，ＲＮＡ−ＤＮＡ及びＤＮＡ−ＲＮＡキメラ、ＰＳ−［ＲＮＡ−ＤＮＡ］及びＰＳ−［ＤＮＡ−ＲＮＡ］キメラ、ＰＳ［ＡＮＡ−ＤＮＡ］及びＰＳ−［ＤＮＡ−ＡＮＡ］キメラ、ＲＮＡ，ＰＳ−ＲＮＡ，ＰＤＥ−又はＰＳ−ＲＮＡアナログ、ロックされた核酸（ＬＮＡ），ホスホロアミデートモルフォリノ核酸、Ｎ３’−Ｐ５’ホスホロアミデートＤＮＡ、シクロヘキサン核酸、アルファ−Ｌ−ＬＮＡ，ボラノホスフェートＤＮＡ、メチルホスフォネートＤＮＡ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。一つの態様において、上記ＡＮＡはＦＡＮＡ（例えば、ＰＤＥ−又はＰＳ−ＦＡＮＡ）である。
【００１８】
一つの態様において、上記のＰＤＥ−又はＰＳ−ＲＮＡアナログは、２’−修飾されたＲＮＡからなる群から選択され、但し、２’−置換体はアルキルアルコキシ、アルキルアルコキシ、Ｆ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００１９】
一つの態様において、上記非環式リンカーは、非環式ヌクレオシド及び非ヌクレオチドリンカーからなる群から選択される。複数の態様において、上記非環式ヌクレオシドは、プリン及びピリミジンセコヌクレオシド（seconucleoside）からなる群から選択される。複数の態様において、プリンセコヌクレオシドは、セコアデノシン及びセコグアノシンからなる群から選択される。複数の態様において、ピリミジンセコヌクレオシドはセコチミジン、セコシチジン及びセコウリジンからなる群から選択される。
【００２０】
一つの態様において、非ヌクレオチドリンカーは、アミノ酸及びアミノ酸誘導体からなる群から選択されるリンカーを含む。複数の態様において、アミノ酸誘導体は、（ａ）複素環式塩基がメチレンカルボニルリンカーを通して連結したＮ−（２−アミノエチル）グリシンユニット（ＰＮＡモノマー）；及び（ｂ）Ｏ−ＰＮＡユニットからなる群から選択される。
【００２１】
発明の別の側面によれば、一般構造Ｉｂ：
【００２２】
【化５】
2005508634.tif 000003
【００２３】
のＡＯＮキメラが提供され、
式中、ｎは１より大きいか又は１に等しい。上記構造Ｉｂに関して、「ＡＯＮ１」はオリゴヌクレオチド鎖であって、複数の態様においては、ＡＮＡ（例えば、ＦＡＮＡ），ＤＮＡ，ＰＳ−ＤＮＡ，５’−ＲＮＡ−ＤＮＡ−３’キメラ、並びに他のＲＮａｓｅ  Ｈ−競合オリゴヌクレオチド、例えば、アラビノ核酸（２’−ＯＨ置換されたＡＮＡ）（Ｄａｍｈａ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９８，１２０，１２９７６）、シクロヘキサン核酸（Ｗａｎｇ  ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０００，１２２，８５９５），ボラノホスフェート結合したＤＮＡ（Ｒａｉｔ，Ｖ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．１９９９，９，５３），及びアルファ−Ｌ−ロックされた核酸（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００２，１２４，２１６４）又はそれらの組み合わせからなる群から選択される；そして「ＡＯＮ２」はオリゴヌクレオチド鎖であって、複数の態様において、ＦＡＮＡ，ＤＮＡ，ＰＳ−ＤＮＡ，５’−ＤＮＡ−ＲＮＡ−３’キメラ、並びに他のＲＮａｓｅ  Ｈ−競合オリゴヌクレオチド、例えば上記のもの、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。ＡＯＮ１及びＡＯＮ２のヌクレオチド内部の結合は、必ずしも限定ではないが、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、メチルホスフォネート、ホスホロアミデート（５’Ｎ−３’Ｐ及び５’Ｐ−３’Ｎ）基からなる群から選択される。ＡＮＡ−Ｘ−ＡＮＡキメラ構築物中のアラビノース糖のＣ２’−原子に直接結合した置換基は、限定ではないが、フッ素、水酸基、アミノ、アジド、アルキル（例えば、２’−メチル、エチル、プロピル、ブチル等）、及びアルコキシ基（例えば、２’−ＯＭｅ，２’−ＯＥｔ，２’−ＯＰｒ，２’−ＯＢｕ，２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＭｅ，等）を含む。
【００２４】
一つの態様において、発明のオリゴヌクレオチドは、構造：
【００２５】
【化６】
2005508634.tif 000004
【００２６】
を有し、
式中、ｍ，ｎ，ｑ及びａの各々は別個に１より大きい整数又は１に等しく；Ｒ１及びＲ２は別個に少なくとも一つのヌクレオチドであり、式中、Ｚ１及びＺ２の各々は別個に酸素原子、硫黄原子、アミノ基及びアルキルアミノ基からなる群から選択され；
式中、Ｙ１及びＹ２の各々は別個に酸素、硫黄及びＮＨからなる群から選択され；そして式中、Ｒ３はＨ，アルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、プリン、ピリミジン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００２７】
複数の態様において、Ｒ３は、アデニン又はグアニン、又はそれらの誘導体である。
複数の態様において、Ｒ３は、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、ウラシル又はそれらの誘導体である。
【００２８】
複数の態様において、Ｒ１及びＲ２の各々は、上記のとおり、別個に、ＡＮＡ，ＰＳ−ＤＮＡ，ＲＮＡ−ＤＮＡ及びＤＮＡ−ＲＮＡキメラ、ＰＳ−［ＲＮＡ−ＤＮＡ］及びＰＳ−［ＤＮＡ−ＲＮＡ］キメラ、ＰＳ［ＡＮＡ−ＤＮＡ］及びＰＳ−［ＤＮＡ−ＡＮＡ］キメラ、ＲＮＡ，ＰＳ−ＲＮＡ，ＰＤＥ−又はＰＳ−ＲＮＡアナログ、ロックされた核酸（ＬＮＡ），ホスホロアミデートモルフォリノ核酸、Ｎ３’−Ｐ５’ホスホロアミデートＤＮＡ、シクロヘキサン核酸、アルファ−Ｌ−ＬＮＡ，ボラノホスフェートＤＮＡ、メチルホスフォネートＤＮＡ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００２９】
複数の態様において、Ｒ１及びＲ２の各々は、上記のとおり、ヌクレオチド内部結合により連結した少なくとも２つのヌクレオチドを含んでよく、但し、ヌクレオチド内部結合は、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、メチルホスフォネート、ホスホロアミデート（５’Ｎ−３’Ｐ及び５’Ｐ−３’Ｎ）基からなる群から選択される。
【００３０】
複数の態様において、Ｒ１及びＲ２の各々は、上記のとおり、別個にＡＮＡを含む。
複数の態様において、上記のＡＮＡは、フッ素、水酸基、アミノ、アジド、アルキル（例えば、２’−メチル、エチル、プロピル及びブチル）、及びアルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ及びメトキシエトキシ）基からなる群から選択される２’−置換基を含む。
【００３１】
一つの態様において、２’−置換基はフッ素であり、そしてＡＮＡはＦＡＮＡである。
複数の態様において、アルキル基は、メチル、エチル、プロピル及びブチル基からなる群から選択される。複数の態様において、アルコキシ基は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、及びメトキシエトキシ基からなる群から選択される。
【００３２】
複数の態様において、発明のオリゴヌクレオチドは、
【００３３】
【化７】
2005508634.tif 000005
【００３４】
からなる群から選択され、
式中、Ｒ１，Ｒ２，ｎ，ａ，Ｚ１，Ｚ２，Ｙ１及びＹ２は上記の定義のとおりであり、そしてＲ４及びＲ５の各々は別個にプリン（例えば、アデニン及びグアニン又はそれらの誘導体）及びピリミジン（例えば、チミン、シトシン、ウラシル、又はそれらの誘導体）からなる群から選択される。
【００３５】
一つの態様において、Ｒ１及びＲ２はＰＤＥ−ＦＡＮＡであり；そしてａ＝１である。
一つの態様において、Ｒ１及びＲ２はＰＳ−ＦＡＮＡであり；そしてａ＝１である。
一つの態様において、Ｒ１は［ＦＡＮＡ−ＤＮＡ］であり、Ｒ２は［ＤＮＡ−ＦＡＮＡ］であり；そしてａ＝１である。
【００３６】
一つの態様において、Ｒ１は［ＦＡＮＡ−ＤＮＡ］であり、Ｒ２はＦＡＮＡであり；そしてａ＝１である。
一つの態様において、Ｒ１はＦＡＮＡであり、Ｒ２は［ＤＮＡ−ＦＡＮＡ］であり；そしてａ＝１である。
【００３７】
一つの態様において、Ｒ１及びＲ２はＰＳ−ＦＡＮＡであり；そしてａ＝１である。
一つの態様において、Ｒ１はＰＤＥ−［ＲＮＡ−ＤＮＡ］であり、Ｒ２はＰＤＥ−［ＤＮＡ−ＲＮＡ］であり；そしてａ＝１である。
【００３８】
一つの態様において、Ｒ１はＲＮＡであり、Ｒ２は［ＤＮＡ−ＲＮＡ］であり；そしてａ＝１である。
一つの態様において、Ｒ１はＳ−［（２’Ｏ−アルキル）ＲＮＡ−ＤＮＡ］であり、Ｒ２はＳ−［ＤＮＡ−（２’Ｏ−アルキル）ＲＮＡ］であり；そしてａ＝１である。
【００３９】
一つの態様において、Ｒ１はＳ−［（２’Ｏ−アルキル）ＲＮＡ−ＤＮＡ］であり、Ｒ２はＳ−［（２’Ｏ−アルキル）ＲＮＡ］であり；そしてａ＝１である。
一つの態様において、Ｒ１はＳ−［（２’Ｏ−アルキル）ＲＮＡ］であり、Ｒ２はＳ−［ＤＮＡ−（２’Ｏ−アルキル）ＲＮＡ］であり；そしてａ＝１である。
【００４０】
一つの態様において、Ｒ１はＳ−［（２’Ｏ−アルコキシアルキル）ＲＮＡ−ＤＮＡ］であり、Ｒ２はＳ−［ＤＮＡ−（２’Ｏ−アルコキシアルキル）ＲＮＡ］であり；そしてａ＝１である。
【００４１】
一つの態様において、Ｒ１はＳ−［（２’Ｏ−アルコキシアルキル）ＲＮＡ−ＤＮＡ］であり、Ｒ２はＳ−［（２’Ｏ−アルコキシアルキル）ＲＮＡ］であり；そしてａ＝１である。
【００４２】
一つの態様において、Ｒ１はＳ−［（２’Ｏ−アルコキシアルキル）ＲＮＡ］であり、Ｒ２はＳ−［ＤＮＡ−（２’Ｏ−アルコキシアルキル）ＲＮＡ］であり；そしてａ＝１である。
【００４３】
一つの態様において、Ｒ１はＰＤＥ−［（２’Ｏ−アルキル−ＲＮＡ）−ＤＮＡ］であり、Ｒ２はＰＤＥ−［ＤＮＡ−（２’Ｏ−アルキル）ＲＮＡ］であり；そしてａ＝１である。
【００４４】
一つの態様において、Ｒ１はＰＳ−［（２’Ｏ−アルキル−ＲＮＡ）−ＤＮＡ］であり、Ｒ２はＰＳ−［（２’Ｏ−アルキル）ＲＮＡ］であり；そしてａ＝１である。
一つの態様において、Ｒ１はＰＤＥ−［（２’Ｏ−アルコキシアルキル−ＲＮＡ）−ＤＮＡ］であり、Ｒ２はＰＤＥ−［ＤＮＡ−（２’Ｏ−アルコキシアルキル）ＲＮＡ］であり；そしてａ＝１である。
【００４５】
一つの態様において、Ｒ１はＰＳ−［（２’Ｏ−アルコキシアルキル−ＲＮＡ）−ＤＮＡ］であり、Ｒ２はＰＳ−［ＤＮＡ−（２’Ｏ−アルコキシアルキル）ＲＮＡ］であり；そしてａ＝１である。
【００４６】
一つの態様において、Ｒ１及びＲ２はＰＤＥ−［ＦＡＮＡ］であり；ａ＝１であり；そしてオリゴヌクレオチドはＩＩｂの構造を有し、式中、Ｙ１，Ｙ２は酸素であり；Ｚ１，Ｚ２は共に酸素又は硫黄であり、そしてｎ＝４である。
【００４７】
一つの態様において、Ｒ１はＰＳ−［ＦＡＮＡ］であり；Ｒ２はＰＤＥ−［ＦＡＮＡ］であり；ａ＝１であり；そしてオリゴヌクレオチドはＩＩｂの構造を有し、式中、Ｙ１，Ｙ２は酸素
であり；Ｚ１，Ｚ２は共に酸素又は硫黄であり、そしてｎ＝４である。
【００４８】
一つの態様において、Ｒ１はＦＡＮＡであり；Ｒ２はＰＳ−ＦＡＮＡであり；ａ＝１であり；そしてオリゴヌクレオチドはＩＩｂの構造を有し、式中、Ｙ１，Ｙ２，Ｚ１及びＺ２は酸素であり、そしてｎ＝４である。
【００４９】
一つの態様において、Ｒ１及びＲ２はＰＳ−［ＦＡＮＡ］であり；ａ＝１であり；そしてオリゴヌクレオチドはＩＩｂの構造を有し、式中、Ｙ１，Ｙ２は酸素であり；Ｚ１，Ｚ２は共に酸素又は硫黄であり、そしてｎ＝４である。
【００５０】
一つの態様において、Ｒ１はＰＳ−［ＤＮＡ］であり；Ｒ２はＰＤＥ−［ＤＮＡ］であり；ａ＝１であり；そしてオリゴヌクレオチドはＩＩｂの構造を有し、式中、Ｙ１，Ｙ２は酸素であり；Ｚ１，Ｚ２は共に酸素又は硫黄であり、そしてｎ＝４である。
【００５１】
一つの態様において、Ｒ１はＰＤＥ−［ＤＮＡ］であり；Ｒ２はＰＳ−［ＤＮＡ］であり；ａ＝１であり；そしてオリゴヌクレオチドはＩＩｂの構造を有し、式中、Ｙ１，Ｙ２は酸素であり；Ｚ１，Ｚ２は共に酸素又は硫黄であり、そしてｎ＝４である。
【００５２】
一つの態様において、Ｒ１及びＲ２はＰＳ−［ＤＮＡ］であり；ａ＝１であり；そしてオリゴヌクレオチドはＩＩｂの構造を有し、式中、Ｙ１，Ｙ２は酸素であり；Ｚ１，Ｚ２は共に酸素又は硫黄であり、そしてｎ＝４である。
【００５３】
一つの態様において、Ｒ１及びＲ２はＰＤＥ−［ＦＡＮＡ］であり；ａ＝１であり；そしてオリゴヌクレオチドはＩＩｃの構造を有し、式中、Ｙ１，Ｙ２は酸素であり；Ｚ１，Ｚ２は共に酸素又は硫黄である。
【００５４】
一つの態様において、Ｒ１はＰＳ−［ＦＡＮＡ］であり；Ｒ２はＰＤＥ−［ＦＡＮＡ］であり；ａ＝１であり；そしてオリゴヌクレオチドはＩＩｃの構造を有し、式中、Ｙ１，Ｙ２は酸素であり；Ｚ１，Ｚ２は共に酸素又は硫黄である。
【００５５】
一つの態様において、Ｒ１はＰＤＥ−［ＦＡＮＡ］であり；Ｒ２はＰＳ−［ＦＡＮＡ］であり；ａ＝１であり；そしてオリゴヌクレオチドはＩＩｂの構造を有し、式中、Ｙ１，Ｙ２は酸素であり；Ｚ１，Ｚ２は共に酸素又は硫黄であり、そしてｎ＝４である。
【００５６】
一つの態様において、Ｒ１及びＲ２はＰＳ−［ＦＡＮＡ］であり；ａ＝１であり；そしてオリゴヌクレオチドはＩＩｃの構造を有し、式中、Ｙ１，Ｙ２は酸素であり；Ｚ１，Ｚ２は共に酸素又は硫黄である。
【００５７】
一つの態様において、Ｒ１はＰＳ−［ＤＮＡ］であり；Ｒ２はＰＤＥ−［ＤＮＡ］であり；ａ＝１であり；そしてオリゴヌクレオチドはＩＩｃの構造を有し、式中、Ｙ１，Ｙ２は酸素であり；Ｚ１，Ｚ２は共に酸素又は硫黄である。
【００５８】
一つの態様において、Ｒ１はＤＮＡであり；Ｒ２はＰＳ−ＤＮＡであり；ａ＝１であり；そしてオリゴヌクレオチドはＩＩｃの構造を有する。
一つの態様において、Ｒ１及びＲ２はＰＳ−［ＤＮＡ］であり；ａ＝１であり；そしてオリゴヌクレオチドはＩＩｃの構造を有し、式中、Ｙ１，Ｙ２は酸素であり；Ｚ１，Ｚ２は共に酸素又は硫黄である。
【００５９】
一つの態様において、ａ＝２であり、そしてＲ１及びＲ２の各々は別個に少なくとも３ヌクレオチドからなり、さらなる態様においては、３−８ヌクレオチドからなる。
一つの態様において、ａ＝３であり、そしてＲ１及びＲ２の各々は別個に少なくとも２ヌクレオチドからなり、さらなる態様においては、Ｒ１及びＲ２の各々は別個に２−６ヌクレオチドからなる。
【００６０】
一つの態様において、オリゴヌクレオチドは標的ＲＮＡに対するアンチセンスである。
発明は、さらに、系中の、翻訳、逆転写及び／又は標的ＲＮＡの複製を阻止する（preventing）か又は低下させる方法を提供し、当該方法は、標的ＲＮＡを上で定義したとおりにオリゴヌクレオチドに接触させることを含む。
【００６１】
発明は、さらに、系中の、翻訳、逆転写及び／又は標的ＲＮＡの複製を阻止するか又は低下させる方法を提供し、当該方法は、
ａ）標的ＲＮＡを上で定義したとおりにオリゴヌクレオチドに接触させ；そして
ｂ）標的ＲＮＡのＲＮａｓｅ分割を許容する
ことを含む。
【００６２】
発明は、さらに、系中の、翻訳、逆転写及び／又は標的ＲＮＡの複製を阻止するか又は低下させるための、上で定義されたオリゴヌクレオチドの使用を提供する。
発明は、さらに、系中の、翻訳、逆転写及び／又は標的ＲＮＡの複製を阻止するか又は低下させることにおけるその使用のための指示書と共に市販のパッケージのオリゴヌクレオチドを提供する。
【００６３】
発明の詳細な説明
発明は、一つの態様において、配列特異的様式にて遺伝子発現を選択的に阻止する（preventing）ことのできる、修飾されたオリゴヌクレオチドに関する。特定すれば、発明は、短い鎖の、例えば修飾されたヌクレオチド、例えば内部の位置に一つ又は複数の非環式残基を含む、修飾されたＤＮＡ及び修飾されたアラビノ核酸を用いた、アンチセンス戦略による蛋白質の合成の選択的阻害（inhibition）に関する。好ましい態様において、発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも一つの修飾されたヌクレオシド又はヌクレオチドを含む（天然ＤＮＡと比較して）。非環式残基の例は、非環式ヌクレオシド［例えば、セコヌクレオシド、ＰＮＡモノマー（Ｎ−（２−アミノエチル）グリシンユニット（但し、非環式残基がメチレンカルボニルリンカーを介して結合している）、Ｏ−ＰＮＡモノマー［−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２−ＣＨ２−塩基）−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−］及び非ヌクレオチド性リンカー（例えば、アルキルジオールリンカー、アミノ酸、ジペプチド及びジペプチド誘導体）を含む。複数の態様において、発明は、相補ＲＮＡ、例えば細胞メッセンジャーＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ等にハイブリダイズさせるための、一つ又は複数の非環式残基を含む修飾されたデオキシリボヌクレオチド及び修飾されたアラビノヌクレオチド残基から主として構築された修飾されたオリゴヌクレオチドの使用に関する。さらなる態様において、発明は、相補ＲＮＡにハイブリダイズしてＲＮａｓｅ  Ｈ活性化により分割を誘導するための、一つ又は複数の非環式残基を含む修飾されたＤＮＡ及び修飾されたＡＮＡ残基から構築された修飾されたオリゴヌクレオチドの使用に関する。
【００６４】
一つの態様において、発明は、その標的ＲＮＡ配列と二重鎖を形成する、非環式ヌクレオチド（acyclonucleotide）を側方（flanking）に有する修飾されたデオキシリボヌクレオチド又は修飾されたアラビノヌクレオチド残基又は修飾されたハイドロカーボン鎖の何れかから構築された、アンチセンスオリゴヌクレオチドキメラに関する。結果として生じるＡＯＮ／ＲＮＡ二重鎖は、この二重鎖を認識してＲＮＡ標的部分を分解する酵素であるＲＮａｓｅ  Ｈのための優秀な基質である。ＲＮＡ標的のＲＮａｓｅ  Ｈ−媒介性分割は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの作用の主要な機構であると考えられる。
【００６５】
本発明は、修飾されたヌクレオチド（例えば、２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオチド［ＦＡＮＡ］）及び内部の非環式ヌクレオチド残基（例えば、セコヌクレオチド）、又は内部の修飾されたハイドロカーボン鎖が、均一の修飾されたＦＡＮＡオリゴマーに比べて、インビトロにおいて真核生物のＲＮａｓｅ  Ｈ活性を導き出すことにおいて優秀であるとの、予測されなかった驚くべき発見に関する。従って、修飾されたヌクレオチド、例えば、２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオチド［ＦＡＮＡ］を含み、そのようなＲＮａｓｅ  Ｈ−誘導性非環式残基を含む、アンチセンスハイブリッドキメラは、細胞及び生物における特異的な遺伝子発現の研究及び制御のための治療剤及び／又は手段として有用であるかもしれない。この「非環式リンカー戦略」は、インビボにおけるそれらのアンチセンス特性を改善するために、他の修飾されたＡＯＮｓに適用されるかもしれない。
【００６６】
本明細書において記載された結果が当業界における現在の知恵に基づけば本当に驚くべきことであるのは、アンチセンス技術の一致した克服すべき到達点が、常に二重鎖の安定性を増加させる修飾を導入してきたことであったためである。そのような修飾は、多くの場合、アンチセンス分子の「前組織化（pre-organization）」の種類をもたらし、それにより、二重鎖形成が起こる前でさえも「結合」コンフォメーションに似せてデザインされ、即ち、結合に付随したエントロピーを低下させる。そうして、柔軟な構造上の要素、例えば非環式リンカー（非環式構造の環の圧力がない）の導入は、それが二重鎖の安定性を低下させるはずであるから、ＲＮａｓｅ  Ｈ誘導に有害であると考えられる。事実、そのような非環状式要素の導入は、本明細書に提示された結果において概説されたとおり、低い融点温度をもたらす。この原理に一致して、オリゴメチレンジオール又はオリゴエチレングリコールリンカーにより架橋された天然ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、低下した二重鎖安定性及び欠陥を有するＲＮａｓｅ  Ｈ活性を呈するものとして記載された（Ｖｏｒｏｊｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．，２００１，１１，７７）。
【００６７】
逆に、本明細書にて記載される出願人の研究は、柔軟な構造、例えば非環式リンカーの、例えば２’Ｆ−ＡＮＡ  ＡＯＮ要素内での導入は、効率よいＲＮａｓｅ−媒介性標的分割をもたらすことを証明する。本明細書では、例えばＡＯＮ／ＲＮＡ二重鎖の２’Ｆ−ＡＮＡ鎖内の鍵となる部位における柔軟ユニットの系統的な配置により、酵素活性が変調されることが示される。本明細書で記載された修飾ヌクレオチドを含むＡＯＮを用いたＲＮａｓｅ  Ｈの改善された導入に基づき、アンチセンス鎖の中の、一定の量の前組織化（例えば、オリゴヌクレオチド内に一つ又は複数の修飾オリゴヌクレオチドを導入することにより授与される）が相補ＲＮＡに関して高い結合性及び／又は特異性を保持するのに役割を担うことが想像される。それら自身の前組織化及び柔軟性は酵素の導き出しに対して有害であるが、出願人は本明細書において、それらの組み合わせが、標的ｍＲＮＡの相乗阻害を提供し、そしてこれらの増強を生じさせる様々なコンフォメーション上の特性に接近するとの驚くべき発見を提唱する。そうして、出願人は、本明細書において、ＤＮＡを欠く化合物でさえ、導入された非環式リンカーのおかげで天然（ＤＮＡ）系に対するのに匹敵する効率をもって、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を導くことができる。さらに、そのような非環式リンカーにより授与されるＲＮａｓｅ  Ｈの改善された誘導は、本明細書にて記載されるとおり、長い（即ち、より生理学上関連した）ＲＮＡｓを標的とする場合に、いっそう断言される。よって、そのような非環式リンカー戦略が公知のアンチセンス方法論及び構造に導入されて、ＲＮａｓｅ  Ｈ誘導を改善して、標的阻害もまた改善することが想像される。
【００６８】
本明細書にて使用される「柔軟な」又は「柔軟性」は、分子の目的の特定領域にて利用可能な許容できる移動（motion）又はコンフォメーションに関しての自由度を意味し、即ち、分子全体の「柔軟性」に寄与する、関連する用語である。そうして、柔軟な要素は、その付加の前に、より堅い要素が存在した領域に導入される要素である。複数の態様において、オリゴヌクレオチド中の柔軟な要素は、環式構造に比較して環の圧力が無いために環のバックボーン構造よりも柔軟な、非環式リンカーである。
【００６９】
発明の一つの側面によれば、構造：
【００７０】
【化８】
2005508634.tif 000006
【００７１】
を有するオリゴヌクレオチドが提供されるが、
式中、ａは１より大きいか又は１に等しく；Ｒ１とＲ２の各々は別個に少なくとも一つのヌクレオチドであり；そしてＸは非環式リンカーである。
【００７２】
発明の別の側面によれば、一般構造Ｉｂ：
【００７３】
【化９】
2005508634.tif 000007
【００７４】
のＡＯＮキメラが提供され、
式中、ｎは１より大きいか又は１に等しい。上記構造Ｉｂに関して、「ＡＯＮ１」はオリゴヌクレオチド鎖であって、複数の態様においては、ＦＡＮＡ，ＤＮＡ，Ｓ−ＤＮＡ，及び５’−ＲＮＡ−ＤＮＡ−３’キメラ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される；そして「ＡＯＮ２」はオリゴヌクレオチド鎖であって、複数の態様において、ＦＡＮＡ，ＤＮＡ，ＰＳ−ＤＮＡ，５’−ＤＮＡ−ＲＮＡ−３’キメラ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。ＡＯＮ１及びＡＯＮ２のヌクレオチド内部の結合は、必ずしも限定ではないが、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、メチルホスフォネート、ホスホロアミデート（５’Ｎ−３’Ｐ及び５’Ｐ−３’Ｎ）基からなる群から選択される。ＡＮＡ−含有構築物中のアラビノース糖の２’−原子に直接結合した置換基は、限定ではないが、フッ素、水酸基、アミノ、アジド、メチル、メトキシ及び他のアルコキシ基（例えば、エトキシ、プロポキシ、メトキシエトキシ、等）を含む。
【００７５】
Ｉａ及びＩｂの一般構造の例は、ホスホジエステル結合したＦＡＮＡ−Ｘ−ＦＡＮＡ，ＲＮＡ−ＤＮＡ−Ｘ−ＤＮＡ−ＲＮＡ，（２’Ｏ−アルキル−）ＲＮＡ−ＤＮＡ−Ｘ−ＤＮＡ−（２’Ｏ−アルキル）ＲＮＡ，（２’Ｏ−アルキルアルコキシ）ＲＮＡ−ＤＮＡ−Ｘ−ＤＮＡ−（２’Ｏ−アルキルアルコキシ）ＲＮＡ，及び対応するホスホロチオエート結合誘導体を含む。上記の構造の何れもＤＮＡを含んでよい。好ましい態様において、発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも一つの修飾されたヌクレオチド、一つの態様においては修飾されたデオキシリボヌクレオチドを含む。
【００７６】
本明細書にて使用される「非環式」は、リンカーに関しては、環式部分を有さない結合バックボーン構造を意味する。この特徴はバックボーン構造のみに関し、例えば、非環式リンカーのバックボーン構造は環状基を含んでそれから広がる分枝又は置換基を有してよい。２つのヌクレオチドを結合させる非環式リンカーは、２つのヌクレオチドを連結する非−環式のバックボーン構造を有するリンカーを意味する。
【００７７】
本明細書にて使用される「修飾されたヌクレオチド／ヌクレオシド」は、規定された天然形態とは異なり即ち規定された天然形態を除外するヌクレオチド／ヌクレオシドを意味する。例えば、修飾されたデオキシリボヌクレオチドは、天然ＤＮＡ以外の分子である。さらに、そのような定義により、修飾されたデオキシリボヌクレオチドは、天然ＲＮＡを包含する。修飾は、例えば、塩基、糖リン酸及び／又はバックボーン部分において、分子の一部分又は複数部分においての付加、欠失又は置換を含んでよい。
【００７８】
「ヌクレオシド」は、糖（例えば、［デオキシ］リボース、アラビノース及び誘導体）と組合わさった、塩基（例えば、プリン［例えば、Ａ及びＧ］又はピリミジン［例えば、Ｃ，５−メチル−Ｃ，Ｔ及びＵ］）を意味する。「ヌクレオチド」は、その糖部分に連結されたリン酸基を有するヌクレオシドを意味する。複数の態様において、これらの構造は、様々な修飾、例えば塩基、糖及び／又はリン酸部分の何れかを含んでよい。本明細書にて使用される「オリゴヌクレオチド」は、共に結合した複数のヌクレオチドを含む配列を意味する。オリゴヌクレオチドは、そのバックボーン構造中及び／又は一つ又は複数のその成分のヌクレオチドの中に修飾構造を含んでよい。複数の態様において、発明のオリゴヌクレオチドは、約１から約２００塩基の長さ、さらなる態様においては約５から約５０塩基約８から約４０塩基、そして別のさらなる態様においては、約１２から約２５塩基の長さである。
【００７９】
「アルキル」は、直鎖又は分枝鎖で飽和したハイドロカーボン基（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル等）である。「アルケニル」及び「アルキニル」は、それぞれ、少なくとも一つのＣ−Ｃ二重結合及び一つのＣ−Ｃ三重結合を有するハイドロカーボン基を意味する。「アルコキシ」は、−Ｏ−アルキル構造を意味する。「アルキルアミノ」は、−ＮＨ（アルキル）又は−Ｎ（アルキル）２構造を意味する。「アリール」は、置換された芳香族環構造及び未置換の芳香族環構造を意味する（例えば、フェニル、ナフチル、アンスラシル、フェナンスリル、ピレニル、及びキシリル基）。「ヘテロ」は、Ｃ以外の原子を意味し；限定ではないが、Ｎ，Ｏ，又はＳを含む。複数の態様において、上記の基は置換されてよい。
【００８０】
複数の態様において、発明のオリゴヌクレオチドは、構造ＩＩ：
【００８１】
【化１０】
2005508634.tif 000008
【００８２】
を有し、
式中、ｍ，ｎ，及びｑは１より大きいか又は１に等しく；Ｐ１及びＰ２はそれぞれＲ１及びＲ２に結合したリン酸基のリン原子であり、Ｚ１及びＺ２の各々は別個に酸素原子、硫黄原子、アミノ基及びアルキルアミノ基からなる群から選択され、Ｙ１及びＹ２の各々は別個に酸素、硫黄及びＮＨからなる群から選択され；そしてＲ３はＨ，アルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、「塩基」（限定ではないが、プリン又はピリミジンを含む）及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。複数の態様において、上で定義されたプリンはアデニン及びグアニンを含み、そして上で定義されたピリミジンはチミン、シトシン及びウラシルを含む。複数の態様において、上で定義されたＲ１及びＲ２は、ＡＮＡ，ＤＮＡ，Ｓ−ＤＮＡ，及び５’−ＤＮＡ−ＲＮＡ−３’キメラ又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。複数の態様において、上で定義されたＡＮＡは、フッ素、ヒドロキシル、アミノ、アジド、アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル及びブチル）、アルキルアミノ（例えば、プロピルアミノ）、アルケニル（例えば、−ＣＨ＝ＣＨ２）、アルキニル（例えば、−Ｃ≡ＣＨ），及びアルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、及びメトキシエトキシ）基からなる群から選択される２’−置換基を含む。２’−置換基がフッ素の場合、ＡＮＡはＦＡＮＡである。複数の態様において、Ｒ１及び／又はＲ２は、少なくとも一つの内部ヌクレオチド結合を有する少なくとも２つのヌクレオチドを含む。複数の態様において、内部ヌクレオチド結合は、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、メチルホスフォネート、ホスホルアミデート（５’Ｎ−３’Ｐ及び５’Ｐ−３’Ｎ）基及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００８３】
複数の態様において、発明のオリゴヌクレオチドは、以下に示す構造ＩＩａ，ＩＩｂ，ＩＩｃ及びＩＩｄ：
【００８４】
【化１１】
2005508634.tif 000009
【００８５】
の前に記載された化合物からなる群から選択され、
式中、Ｒ１，Ｒ２，ｎ，ａ，Ｚ１，Ｚ２，Ｙ１及びＹ２は上記の定義のとおりである。複数の態様において、Ｒ４及びＲ５の各々は別個に「塩基」、限定ではないが複数の態様において、プリン又はピリミジンからなる群から選択され、それらの例は前で定義された。
【００８６】
複数の態様において、発明のオリゴヌクレオチドは構造ＦＡＮＡ−Ｘ−ＦＡＮＡを有するオリゴヌクレオチドであって、複数の態様において、Ｘはオリゴヌクレオチド配列の中部に位置するか又は中部近傍に位置し、そして当該オリゴヌクレオチドは構造ＩＩｂ（Ｙ１＝Ｙ２＝Ｚ１＝Ｚ２＝酸素、そしてｎ＝４）又は構造ＩＩｃ（Ｙ１＝Ｙ２＝Ｚ１＝Ｚ２＝酸素、そしてａ＝１）を有する。
【００８７】
発明の別の側面によれば、一般式Ｖ：
【００８８】
【化１２】
2005508634.tif 000010
【００８９】
のオリゴヌクレオチドが提供される。
上記の構造ＩＩＩに関して、ｙ及びｎの各々は別個に１より大きい整数か又は１に等しく；リンカーＸは前で記載されたとおりに定義される。複数の態様において、ＡＯＮの定義の中のオリゴヌクレオチドバックボーンは、ＡＮＡ（例えば、ＦＡＮＡ），ＤＮＡ，及びＰＳ−ＤＮＡ、及び他のＲＮａｓｅ  Ｈ競合バックボーン、例えばアルファ−Ｌ−ＬＮＡ，シクロヘキサン核酸、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。複数の態様において、ＡＯＮの内部ヌクレオチド結合は、必ずしも限定ではないが、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、メチルホスフォネート、ホスホルアミデート（５’Ｎ−３’Ｐ及び５’Ｐ−３’Ｎ）基及びそれらの組み合わせを含む。ＡＯＮセグメントがＡＮＡの場合のアラビノース糖の２’−置換基は、限定ではないが、フッ素（例えば、ＦＡＮＡ）、ヒドロキシル、アミノ、アジド、アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、等）、アルキルアミノ（例えば、プロピルアミノ）、アルケニル（例えば、−ＣＨ＝ＣＨ２）、アルキニル（例えば、−Ｃ≡ＣＨ）、メトキシ及び他のアルコキシ基（例えば、エトキシ、プロポキシ、メトキシエトキシ等）を含む。複数の態様において、ＡＯＮは、必ずしも限定ではないが、ＰＳ−ＲＮＡ，ＰＤＥ−又はＰＳ−ＲＮＡアナログ（例えば、２’−置換基がアルキル、２’−アルコキシ、２’−アルキルアルコキシ、又は２’−Ｆである、２’−修飾されたＲＮＡ）、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、ホスホルアミデートモルフォリノ核酸、Ｎ３’−Ｐ５’ホスホルアミデートＤＮＡ、メチルホスフォネートＤＮＡ、及びそれらの組み合わせを含む。特定の複数の態様において、これらのオリゴヌクレオチドの例は、
【００９０】
【化１３】
2005508634.tif 000011
【００９１】
（式中、一つの態様においては、ＡＯＮは３−８ｎｔの長さである）；及び
【００９２】
【化１４】
2005508634.tif 000012
【００９３】
（式中、一つの態様においては、ＡＯＮは２−６ｎｔの長さである）
を含む。
Ｘリンカーの他の構造は、例えば、生物分解可能な非環式残基、及び、例えばペプチド結合により互いが結合した２種のモノマーを含む非環式残基と考えることができる。例は、限定ではないが、ジペプチドのグリシン−グリシン、及び天然に生じるアミノ酸又はそれらの誘導体のあらゆる組み合わせを含む。複数の態様において、ＸはＮ（２−アミノエチル）グリシンユニットであって、複素環塩基がメチレンカルボニルリンカーを通して結合している。他の関連する非環式ペプチドモノマーは、例えば、Ｋｕｗａｈａｒａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００１，１２３，４３５６により記載されたＯ−ＰＮＡモノマー［−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２−ＣＨ２−塩基）−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−］であってよい。
【００９４】
ＰＮＡに基づく非環式リンカーの場合、３’外部側方（flanking）基は、その５’末端にアミノ基を有してよく、アミド結合を介して非環式（Ｘ）リンカーに結合する。他の非環式リンカー、例えばスペルミン及び誘導体、並びにエチレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール又はＰＥＧ）及び誘導体が考え得る。
【００９５】
様々な態様において、上記オリゴヌクレオチドは、当該オリゴヌクレオチドがその標的分子と二重鎖を形成するときに、非環式リンカーが「ループアウト」してもしなくてもよいようにデザインしてよい。本明細書にて使用される「ループアウト」は、標的分子内の位置に対応するオリゴヌクレオチド内の位置を、当該リンカーそれ自身がふさぐ（occupy）ことなく、一度形成された二重鎖からループを有効に形成させるケースを意味する。リンカーが「ループアウト」しない場合、それは、結合した標的分子内の位置に対応する二重鎖内の位置をふさぐ（occupy）。
【００９６】
この発明のＡＯＮｓは、ハイブリダイゼーションに基づいて、「標的ＲＮＡ」に相補な（特定の態様においては、部分的に相補、そして別の態様においては完全相補）配列を含む。本明細書にて使用される「ハイブリダイゼーション」は、相補配列間の水素結合を意味する。ＡＯＮとその標的配列の間の相補の程度は可変であってよく、そして複数の態様においては、ＡＯＮは上記のとおりその標的配列に完全に相補である。十分な特異性を達成するため、即ち、使用される特定の結合条件下での非標的配列へのオリゴヌクレオチドの非特異的結合を最小にするためには、ＡＯＮがその標的配列に完全相補であることは必須でないことが理解される（例えば、インビボ生理学的条件又はインビトロアッセイ条件）。「標的ＲＮＡ」は、例えばＲＮＡの翻訳、逆転写及び又は複製を防止するか又は低下させるための、発明のオリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーション／発明のオリゴヌクレオチドとの結合のための標的である目的のＲＮＡ分子を意味する。複数の態様において、そのような阻止（prevention）及び阻害（inhibition）は、標的ＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ−媒介性分割の誘導によるので、複数の態様において、本発明は、標的ＲＮＡを分割する方法を提供し、当該方法は、ＲＮＡを発明のオリゴヌクレオチドと接触させることを含む。複数の態様において、そのような分割は、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性の助けとなる条件、例えば、バッファー手段（例えば、ｐＨ及びイオン強度を制御するため）、温度制御手段、及びＲＮａｓｅ  Ｈ活性の誘導に寄与するかもしれないあらゆる他の成分を付加的に提供することにより、さらに促進してよい。特定の態様において、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性はＲＮａｓｅ  Ｈ酵素のもの及びＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する多機能酵素のものである。特定の態様において、そのようなＲＮａｓｅ  Ｈ活性は、限定ではないが、ヒト病原ウイルス、例えばＨＩＶ（例えば、レトロウイルスＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２）及びＢ型肝炎ウイルスの逆転写酵素に付随したＲＮａｓｅ  Ｈ活性を含む。別の態様において、そのようなＲＮａｓｅ  Ｈ活性は、限定ではないが、原核又は真核起源、一つの態様においては哺乳類起源、一つの態様においてはヒト起源のＲＮａｓｅ  Ｈ酵素に付随したＲＮａｓｅ  Ｈ活性を含む。別の態様においては、そのようなＲＮａｓｅ  Ｈ活性は、限定ではないが、原核又は真核起源のＲＮａｓｅ  Ｈ１及びＲＮａｓｅ  Ｈ２に付随したＲＮａｓｅ  Ｈ活性を含む。
【００９７】
複数の態様において、上で定義されたＲＮＡは、オリゴヌクレオチドがそれぞれｍＲＮＡによりコードされる蛋白質の生合成を特異的に阻害できるか又はウイルスの複製を特異的に阻害できるような、メッセンジャーＲＮＡ、又はウイルスゲノミックＲＮＡを含む。それらのアンチセンス特性を増強するための、５’及び／又は３’−末端、又はリン酸バックボーン又は糖残基に向けられたオリゴヌクレオチドへの部分的な修飾は（例えば、ヌクレアーゼ耐性）、発明の範囲内である。この発明において証明されたとおり（下記参照）、これらのオリゴヌクレオチドはアンチセンスの治療剤に関する最も重要な要求の一つを満たし、即ち、それらは標的ＲＮＡに結合して、ヒトＲＮａｓｅ  Ｈにより認識されて分解されるＡＯＮ／ＡＮＡ二重鎖を形成する。さらに、以下に示すとおり、ＡＯＮ−Ｘ−ＡＯＮキメラがＲＮＡ分割を促進する効率は、非環式修飾を欠くＡＯＮｓ（Ｘ又はＸｎリンカー）を用いて観察されるのよりも優れている。
【００９８】
よって、本明細書に提示された出願人の結果は、［Ｒ１−Ｘ］ａ−Ｒ２，ＡＯＮ−Ｘ−ＡＯＮ及びＡＯＮ−Ｘｎ−ＡＯＮキメラ類がアンチセンス剤の優れたモデルであること、そして治療剤として、及び／又は細胞及び生物において遺伝子発現を研究及び制御するための貴重な手段として作用するべきであることを確証する。
【００９９】
そういうものとして、別の態様において、発明は、標的ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に結合し、標的ＲＮＡの分解を誘導し、及び／又は標的ＲＮＡの翻訳を阻害するアンチセンス分子を提供する。引用により本明細書に編入される治療用アンチセンスオリゴヌクレオチドの例は、１９９２年８月４日に発行された米国特許第５，１３５，９１７号；１９９２年５月２４日に発行された米国特許第５，０９８，８９０号；１９９２年２月１１日に発行された米国特許第５，０８７，６１７号；１９９２年１１月２４日に発行された米国特許第５，１６６，１９５号；１９９１年４月２日に発行された米国特許第５，００４，８１０号；１９９３年３月１６日に発行された米国特許第５，１９４，４２８号；１９８９年２月２１日に発行された米国特許第４，８０６，４６３号；１９９４年２月１５日に発行された米国特許第５，２８６，７１７号；米国特許第５，２７６，０１９号及び米国特許第５，２６４，４２３号；ＢｉｏＷｏｒｌｄ  Ｔｏｄａｙ，Ａｐｒ．２９，１９９４，ｐ．３を含む。
【０１００】
好ましくは、アンチセンス分子においては、特異的結合が望まれる条件、例えば、インビボアッセイ又は治療用処置の場合の生理条件、又はインビトロアッセイにおけるアッセイが実施される条件下で、非標的配列への当該アンチセンス分子の非特異的結合を回避するのに十分な、標的ＲＮＡに対する相補の十分な程度が存在する。アンチセンス結合のための標的ＲＮＡは、蛋白質をコードする情報のみならず、例えば５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域、５’キャップ領域及びイントロン／エクソン結合部のリボヌクレオチドを形成する関連するリボヌクレオチドの情報も含んでよい。発明のＰＬＡ２阻害剤のような分子を提供するために使用してよいアンチセンス及びリボザイム核酸をスクリーニングする方法は、米国特許第５，９３２，４３５号に記載されている。
【０１０１】
発明のアンチセンス分子（オリゴヌクレオチド）は、糖間のバックボーン結合、例えばホスホトリエステル、メチルホスフォネート、短鎖アルキル又はシクロアルキル糖間結合又は短鎖複素環式芳香族又は複素環の糖間結合、ホスホロチオエート及びＣＨ２−−ＮＨ−−Ｏ−−ＣＨ２，ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｏ−−ＣＨ２（メチレン（メチルイミノ）又はＭＭＩバックボーンとして知られる），ＣＨ２−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２，ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２及びＯ−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−ＣＨ２バックボーン（ホスホジエステルはＯ−Ｐ（Ｏ）２−−Ｏ−−ＣＨ２）を含むものであってよい。モルフォリノバックボーン構造を有するオリゴヌクレオチドも使用してよい（米国特許第５，０３４，５０６号）。別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドのホスホジエステルバックボーンがポリアミドバックボーンに置換されてよく、但し、ヌクレオシドの塩基が直接又は間接にポリアミドバックボーン中のアザ窒素原子又はメチレン基に結合している、ペプチド核酸（ＰＮＡ、ときには「蛋白質」又は「ペプチド」核酸と呼ばれる）バックボーンであってよい（Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７及び米国特許第５，５３９，０８２号）。ホスホジエステル結合は、キラルであって且つ鏡像上特異的な構造により置換されてよい。当業者は、発明の実施における使用のために別の結合を選択することもできる。
【０１０２】
前で記載されたとおり、オリゴヌクレオチドは、少なくとも一つの修飾されたヌクレオチド塩基を含む種を含んでもよい。即ち、天然で普通に見いだされる以外のプリン及びピリミジンを使用してよい。同様に、ヌクレオチドサブユニットのペントフラノシル部分上の修飾をもたらしてもよい。そのような修飾の例は、２’−Ｏ−アルキル及び２’−ハロゲン−置換ヌクレオチドである。本発明において有用な糖部分の２’位の修飾のいくつかの例は、ＯＨ，ＳＨ，ＳＣＨ３，Ｆ，ＯＣＮ，Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２又はＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３（式中、ｎは１から約１０である）；Ｃ１からＣ１０の低級アルキル、置換された低級アルキル、アルカリル又はアラルキル；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ３；ＯＣＦ３；Ｏ−，Ｓ−，又はＮ−アルキル；Ｏ−，Ｓ−，又はＮ−アルケニル；ＳＯＣＨ３；ＳＯ２ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２；Ｎ３；ＮＨ２；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリル；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換されたシリル；ＲＮＡ分割基；レポーター基；インターカレーター；オリゴヌクレオチドの薬力学特性を改善するための基；又はオリゴヌクレオチド及び類似の特性を有する他の置換基の薬力学特性を改善するための基である。一つ又は複数のペントフラノシル基は、別の糖によるか、シクロブチルのような糖模倣物によるか、又は糖に代わる別の部分（moiety）により置き換わってよい。
【０１０３】
従って、様々な態様において、発明の修飾されたオリゴヌクレオチドは、特定の標的ＲＮＡの発現により特徴付けられた疾患を予防又は治療するための製剤又は医薬において治療に使用されてよい。特定の態様において、そのような標的核酸は、感染病原体に含まれるか又は感染病原体に由来してよく、及び／又は感染病原体の機能及び／又は生存性及び／又は複製／増殖に必要なものである。特定の態様において、そのような感染病原体はウイルスであり、特定の態様においては、レトロウイルスであり、さらなる態様においては、ＨＩＶである。さらなる態様において、そのような標的核酸の発現は、限定ではないが、炎症性疾患、糖尿病、心臓血管疾患（例えば、再狭窄）及び癌を含む疾患に付随する。発明は、治療用量の発明の修飾オリゴヌクレオチドを薬学上受容可能な製剤中で投与する、医学処置の対応する方法を提供する。複数の態様において、オリゴヌクレオチドはプロドラッグとして投与してもよく、その作用部位にてより活性な形態に修飾される。従って、発明は、発明の修飾されたオリゴヌクレオチド、及び薬学上受容可能な賦形剤又は担体を含む治療用組成物も提供する。当該治療用組成物は、生理学上受容可能なｐＨにおいて水溶性であってよい。
【０１０４】
一つの態様において、そのような組成物は、特定の標的核酸の発現により特徴付けされる疾患を治療又は予防するのに十分な治療上又は予防上有効な量の本発明のオリゴヌクレオチド、及び薬学上受容可能な担体を含む。
【０１０５】
「治療上有効な量」は、所望の治療上の結果、例えば特定の標的核酸の発現の低下又は阻害を達成するのに必要な用量及び時間、有効な量を意味する。治療上有効な量の発明の修飾核酸は、個々の疾患状態、年齢、性別、及び体重、そして個々の所望の応答を導き出す修飾核酸の能力等の因子により、変更してよい。用量の管理は最適な治療上の応答を提供するように調節してよい。治療上有効な量は、化合物のあらゆる毒性（toxic）又は有害性（detrimental）の作用が治療上の有益な作用により値打ちがあるようなものでもある。「予防上有効な量」は、特定の標的核酸の発現により特徴付けされる疾患を治療又は予防するような所望の予防上の結果に必要な用量及び時間、有効な量である。予防上有効な量は、治療上有効な量に関して前に記載されたとおりに決定することができる。何れかの特定の被験者に関しては、個々の要求、及び特定の用量の管理を、組成物の投与を執行するか（administering）又は管理する（supervising）人の専門的判断に従い、時間をかけて調節してよい。
【０１０６】
本明細書にて使用される「薬学上受容可能な担体」又は「賦形剤」は、何れか及び全ての溶剤、分散媒体、コーティング、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張性の吸収遅延剤及び生理学上適合性のもの等を含む。一つの態様において、上記担体は非経口投与に適している。あるいは、上記担体は、静脈内、腸管内、筋肉内、舌下又は経口投与に適し得る。薬学上受容可能な担体は、無菌の注射可能な溶液又は分散液の即席の調製物のための無菌水溶液又は分散液及び粉末を含む。薬学上活性な物質のためのそのような媒体及び薬剤の使用は、当業界においてよく知られている。あらゆる慣用の媒体又は薬剤が活性化合物と不適合である範囲を除いては、発明の薬学上の組成物におけるその使用は、意図される。追加の活性化合物も、上記組成物中に取り込むことができる。
【０１０７】
治療用組成物は、典型的には、製造及び保存の条件下で無菌且つ安定でなければならない。上記組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は高い濃度の薬剤に適した他の定められた（ordered）構造として製剤化できる。上記担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール、等）、及びそれらの適切な混合物を含む溶液又は分散媒体であり得る。適当な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングにより、分散の場合には必要な粒子サイズの保持により、そして界面活性剤の使用により、保持することができる。多くの場合、上記組成物中に、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マニトール、ソルビトール、又は塩化ナトリウムを含むことが好ましくなる。注射可能な組成物の延期された吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩及びゼラチンを上記組成物中に含ませることにより、もたらすことができる。さらに、発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、スローリリースなポリマーを含む組成物中にて、タイムリリースな製剤にて投与することができる。修飾されたオリゴヌクレオチドは、素早い放出に対して修飾されたオリゴヌクレオチドを保護する担体、例えば、放出を制御された製剤と共に製造することができ、移植物及びマイクロカプセル化された送達システムを含む。生物分解性、生物的合成ポリマーを使用することができ、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸及びポリ乳酸、ポリグリコール酸コポリマー（ＰＬＧ）である。そのような製剤の製造のための多くの方法が特許されているか、又は当業者には一般に知られている。
【０１０８】
無菌の注射可能な溶液は、活性な化合物、例えば本発明のオリゴヌクレオチドを、必要なだけ、上記の列挙された成分の一つ又は組み合わせにより適切な溶剤中で取り込み、次にフィルターを通した滅菌により製造することができる。一般に、塩基性分散媒体及び上記列挙されたものからの必要な他の成分を含む無菌媒体へ上記活性化合物を取り込むことにより、分散液を製造する。無菌の注射可能な溶液の製造のための無菌注射可能な粉末の場合、製造のための好ましい方法は、活性成分プラス以前に滅菌濾過されたその溶液からのあらゆる追加の所望の成分を生じさせる、真空乾燥及び凍結乾燥である。発明の別の側面によれば、発明のオリゴヌクレオチドは、その溶解性を増強する一つ又は複数の追加の化合物と共に製剤化してよい。
【０１０９】
発明のオリゴヌクレオチドは標的ＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ−媒介性分割を誘導することができ、即ち、標的ＲＮＡによりコードされる蛋白質の製造を低下させるため、発明の修飾されたオリゴヌクレオチドは、特定の標的ＲＮＡの選択的不活性化又は阻害が望まれるあらゆる系において使用してよい。上で示したとおり、そのような使用の例はアンチセンス治療を含み、標的ＲＮＡの発現が病気又は疾患に付随する。
【０１１０】
そのような使用の別の例は、系における特定の標的遺伝子産物の選択的消耗による、系におけるそのような消耗の表現型の効果の研究のためである。そのような消耗によりなされる観察は、即ち、標的遺伝子産物の機能の決定を可能にさせるかもしれない。特定の態様において、そのような使用は、「標的の確認（validation）」であり、上記の戦略は、特定の標的核酸が特定の表現型に付随するのか又は活性に付随するのかに関しての確認を可能にし、即ち、標的の「確認」を可能にする。上で示した系は、細胞又は細胞不含；インビトロ又はインビボ；原核又は真核であってよい。
【０１１１】
発明は、さらに、発明のオリゴヌクレオチドを含む市販のパッケージを提供する。特定の態様において、そのような市販のパッケージは、さらに、（ａ）標的ＲＮＡ配列の発現を低下させること；（ｂ）標的ＲＮＡ配列のＲＮａｓｅ  Ｈ分割を誘導すること；（ｃ）特定のＲＮＡ標的の発現により特徴付けされる疾患を予防又は治療すること；及び（ｄ）特定の遺伝子標的を確認すること、のための使用のための指示書少なくとも一つを含む。
【０１１２】
発明の様々な態様が本明細書にて開示されるが、多くの適合及び修飾が、発明の範囲内で、当業者の共通の一般的知見に従いなされてよい。そのような修飾は、実質上同じ様式において同じ結果を達成するために発明のあらゆる側面に関しての公知の均等物の置換を含む。莫大な範囲が範囲を定義する数の指標である。特許請求の範囲において、用語「含む（comprising）」はオープンエンドの用語であり、実質上「含む（including）」なる句に等しいが、限定されない。以下の実施例は、発明の様々な側面の例示であり、そして本明細書に開示された発明の広い側面を限定するものではない。
【０１１３】
実施例
実施例１
非環式前駆体のオリゴヌクレオチドへの取り込みに適したそれらの合成
非環式残基ＩＩｂの前駆体
ジメトキシトリチル−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−Ｐ（Ｎｉ−Ｐｒ２）ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ（１）をＣｈｅｍＧｅｎｅｓ社（アッシュランド、ＭＡ）から購入し、そしてＡＯＮ−Ｘ−ＡＯＮキメラの合成に関して容認される（received）ように使用した（実施例３を参照）。
【０１１４】
非環式残基ＩＩｃ及びＩＩｄの前駆体
非環式ヌクレオシド残基（本明細書では２’，３’−セコヌクレオチドと呼ぶ）は、以下に記載のとおり、適切に保護されて、オリゴヌクレオチド取り込みのために官能基を付加された、１−［１，５−ジヒドロキシ−４（Ｓ）−ヒドロキシメチル−３−オキサペント−２（Ｒ）−イル］−ウラシルユニットからなる。
【０１１５】
工程Ａ  ５’−モノメトキシトリチル−２’，３’−セコ−β−Ｄ−リボウラシル（２）の合成
【０１１６】
【化１５】
2005508634.tif 000013
【０１１７】
ジオキサン中の、５’−モノメトキシトリチルウリジン（５’−ＭＭＴ−ｒＵ，５．１６ｇ，１０  ｍｍｏｌ；Ｔ．Ｗｕ，Ｋ．Ｋ．Ｏｇｉｌｖｉｅ，Ｒ．Ｔ．Ｐｏｎ．１９８９．”Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈａｉｎ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ２’−Ｓｉｌｙｌａｔｅｄ  Ｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３５０１−１７に記載されたとおりに調製した）に、Ｈ２Ｏ中のＮａＩＯ４（２．２６ｇ，１０．６  ｍｍｏｌ，１．０６当量）の飽和溶液を加え、そしてＴＬＣ視覚化によりジアルデヒドへの完全な変換まで、室温において２−３時間反応を進行させた（Ｒｆ  ０．５２、ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ，９：１中）。反応物をジオキサン（１００ｍＬ）で希釈して、濾過することによりＮａＩＯ３塩を除去し、そしてＮａＢＨ４（０．３７８ｇ，１０ｍｍｏｌ，１．０当量）による室温での１０−２０分間の処理によりジアルデヒドのインサイチュ還元へと続いた。反応混合物をアセトンによりクエンチして、２０％酢酸により中和して、減圧下でオイルに濃縮した。残渣を次にＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍＬ）により希釈し、そしてＨ２Ｏで洗浄した（２ｘ７５ｍＬ）。水性層を逆抽出し（back-extracted）、化合した有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４を用いて乾燥させ、濾過し、そして蒸発させることにより、９８％単離された収量として、純粋な白色のフォームとしての生成物を生じた（５．０８ｇ；９．８ｍｍｏｌ）。Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ，９：１）０．１８；ＦＡＢ−ＭＳ（ＮＢＡ）：５１９．６：計算値：５１８．５７。
【０１１８】
工程Ｂ  ５’−Ｏ−ＭＭＴ−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチシリル−２’，３’−セコウリジン（３ａ）及び５’−Ｏ−ＭＭＴ−３’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチシリル−２’，３’−セコウリジン（３ｂ）の合成
【０１１９】
【化１６】
2005508634.tif 000014
【０１２０】
Ｓｉ＝ｔ−ブチルジメチルシリル
２の遊離ヒドロキシル官能基の何れかの単一の保護（monoprotection）を、ｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（０．８１ｇ，５．０ｍｍｏｌ，１．１当量）を、乾燥ＴＨＦ中の２の撹拌した０．１Ｍ溶液（２．５５ｇ，４．９ｍｍｏｌ）に、ＡｇＮＯ３（０．９２ｇ，５．３９ｍｍｏｌ，１．１当量）の懸濁液を含ませて、０℃において添加することにより非選択的に達成した。反応温度を２０分後に室温に戻して、２４時間保持した。精密検査（workup）を、５％  ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）の水溶液へ上記混合物を直接濾過して、水性層のＣＨ２Ｃｌ２による２回の抽出により、開始した。化合した有機層を乾燥し（無水Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、そして減圧下で蒸発させることにより、黄色のオイルとして粗生成物を生じた。残渣を、フラッシュゲルカラムクロマトグラフィーにより、ＣＨ２Ｃｌ２中で０−２５％アセトン勾配を用いて精製することにより、両モノシリルアイソマーを純粋な白色のフォームとして回収した。３ａと３ｂの単離された収量はそれぞれ２２％と１４％であった。Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２：Ｅｔ２Ｏ，３：１）３ａ，０．１８；３ｂ，０．０５。ＦＡＢ−ＭＳ（ＮＢＡ）：６３３．４；計算値：６３２．３８。
【０１２１】
レジオシアイソマーは、アシクロシュガー中のプロトンの結合性（connectivity）を示すために使用されるＣＯＳＹ−ＮＭＲクロス−ピーク相関を基にして区別される。両スペクトル中で、Ｈ１’プロトンは非等価なＨ２’により分離され、そしてＨ２”プロトンはＣ１’−Ｃ２’結合周囲のある程度の構造上の剛性を示唆する複数のダブレットのうちの一つのダブレットへ分離する。より重要なことに、単一のよく解析されたヒドロキシルピークはＤＭＳＯ−ｄ６中の両３ａと３ｂに関して観察され、これらの部分（moiety）の迅速な化学的交換を打ち消す。結果として、３ｂのＣ２’におけるプロトンの効果が２’−ヒドロキシルプロトンへ伝達されて、今度は、複数のダブレットのうちの一つのオーバーラップするダブレットとして出現する。３ａにおいては、ヒドロキシルピークの分離も観察されるが、しかしながら、それはＨ４’とＨ４”の相関を示し、よって、３’−位のシリル基の存在を除外する。まとめると、これらのデータは、３ａと３ｂのそれぞれ２’−と３’−モノシリル化モノマーとしての割り当てを確証させる。
【０１２２】
工程Ｃ  （ａ）５’−Ｏ−ＭＭＴ−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチシリル−２’，３’−セコウリジン−３’−Ｏ−［Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−（２−シアノエチル）］ホスホルアミデート（４ａ）の合成
【０１２３】
【化１７】
2005508634.tif 000015
【０１２４】
Ｓｉ＝ｔ−ブチルジメチルシリル；Ｐ＝Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−Ｏ−（２−シアノエチル）ホスホルアミデート
０℃のＴＨＦ（０．２Ｍ）中の、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ；１２ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ，０．１当量）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ；０．６８ｍＬ，３．９ｍｍｏｌ，４当量）及び３ａ（６２０ｍｇ，０．９８ｍｍｏｌ）の窒素パージ溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−β−シアノエチルホスフォンアミディッククロリド（０．２４ｍＬ，１．１ｍｍｏｌ，１．１当量）を５分間かけて滴下により添加した。ジイソプロピルエチルアンモニウムヒドロクロリドの迅速な形成による白色沈殿物の直後の出願は十分な無水条件を象徴し、そして反応物を室温まで温めて反応を精密検査する前まで２．５時間撹拌した。簡単に言えば、反応混合物をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ，ＮａＨＣＯ３で予め洗浄）により希釈し、そして飽和ブライン（２ｘ２０ｍＬ）により洗浄した。回収された有機槽を乾燥し（無水Ｎａ２ＳＯ４），濾過し、そして溶剤を減圧により除去したところ、粗黄色オイルを生じた。当該粗生成物のＥｔ２Ｏによる同時蒸発は、パールイエローのフォームを提供した。フラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィーによる、ＣＨ２Ｃｌ２：ヘキサン：ＴＥＡ勾配系（５０：４９：１を２５：７４：１に調節）を用いた当該生成物の精製は、９７％の単離された収量にて白色フォームを提供した。Ｒｆ（ＥｔＯＡｃ：Ｔｏｌ，４：１）０．８６，０．７２。ＦＡＢ−ＭＳ（ＮＢＡ）：８３３．４；計算値：８３３．０５。
【０１２５】
（ｂ）５’−Ｏ−ＭＭＴ−３’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチシリル−２’，３’−セコウリジン−２’−Ｏ−［Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−（２−シアノエチル）］ホスホルアミデート（４ｂ）の合成
【０１２６】
【化１８】
2005508634.tif 000016
【０１２７】
Ｓｉ＝ｔ−ブチルジメチルシリル；Ｐ＝Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−Ｏ−（２−シアノエチル）ホスホルアミデート
３’−ホスホルアミデート（４ｂ）の調製において使用された全ての条件は、そのレジオシアイソマーの片われである４ａに実施された条件と同一であった（工程Ｂを参照）。このアイソマーのフラッシュカラム精製は、９９％の単離された収量にて白色フォームを提供した。Ｒｆ（ＥｔＯＡｃ：Ｔｏｌ，４：１）０．７７，０．６５。ＦＡＢ−ＭＳ（ＮＢＡ）：８３３．３；計算値：８３３．０５。
【０１２８】
実施例２
側方に非環式のブタンジオール又はセコウリジン残基を有する２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオチド（ＦＡＮＡ）から構築されたＡＯＮｓの調製
１．ＦＡＮＡ−Ｘ−ＦＡＮＡキメラ（式中、Ｘ＝ブタンジオールリンカー＝ＩＩｂ（Ｙ＝Ｚ＝酸素；ｎ＝４））の合成
ＰＤＥ−ＦＡＮＡオリゴマーの合成を前記のとおりに実施した（Ｄａｍｈａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９８，１２０，１２９７６；Ｗｉｌｄｓ，Ｃ．Ｊ．＆  Ｄａｍｈａ，Ｍ．Ｊ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０００，２８，３６２５）。それらの構造はＭａｌｄｉ−ＴＯＦ質量分析により確認された。
【０１２９】
ＰＤＥ−（ＦＡＮＡ−Ｂｕｔ−ＦＡＮＡ）キメラの合成は、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  ８９０９  ＤＮＡ−合成機を用いて、１マイクロスケールにて実施した。長鎖のアルキルアミン−制御された孔性ガラス（ＬＣＡＡ−ＣＰＧ）を固相支持体として使用した。合成サイクルは以下の工程からなった：
１）ＣＰＧに結合したヌクレオシド／ヌクレオチドの脱トリチル化（detritylation）（３％トリクロロ酢酸／ジクロロエタン）：ＭＭＴに関して１５０秒間；ＤＭＴ除去に関して６０秒間。
２）２’−Ｆ−アラビノヌクレオシド又はジメトキシトリチル−ブタンジオールホスホルアミダイトモノマーのカップリング：１５分間。用いたモノマーの濃度は、ａｒａＦ−Ｔ，ａｒａＦ−Ｃに関して５０ｍｇ／ｍＬ、そしてａｒａＦ−Ａ及びブタンジオールモノマーに関して６０ｍｇ／ｍＬであった（アセトニトリルを溶剤として）。
３）標準キャッピング工程を用いたアセチル化：２０秒間。キャッピング溶液は１：１（ｖ／ｖ）の「ｃａｐＡ」及び「ｃａｐＢ」試薬からなった。ｃａｐＡ：無水酢酸／コリジン／ＴＨＦ（１：１：８ｍｌ）；ｃａｐＢ：Ｎ−メチルイミダゾール／ＴＨＦ（４：２１ｍｌ）。
４）アセトニトリルを用いた大規模な洗浄（５０パルス）。
５）Ｉ２：：ＴＨＦの新鮮な溶液の酸化：５秒間。
６）アセトニトリルによる洗浄：２０パルス。
７）キャッピング試薬の添加による固相支持体の乾燥（工程３を参照）：５秒間。
８）アセトニトリルによる洗浄（２０パルス）。
【０１３０】
鎖の集合の後に、以前に記載されたとおりに（Ｎｏｒｏｎｈａ，Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０００，３９，７０５０）、オリゴヌクレオチドを固相支持体から切り離して、脱保護した。粗オリゴマーをアニオン交換クロマトグラフィーＨＰＬＣ、続いて脱塩により精製した（セファデックスＧ−２５又はセップパック（SepPak）カートリッジ）。収量：１０−１５  Ａ２６０ユニット。
【０１３１】
ＨＰＬＣ精製の条件：
カラム：プロテインパックＤＥＡＥ−５ＰＷ（７．５ｃｍ  Ｘ  ７．５ｃｍ，水）、
溶剤：バッファーＡ：Ｈ２Ｏ；バッファーＢ：１Ｍ  ＬｉＣｌＯ４（又はＮａＣｌＯ４）、
勾配：０−２０％  Ｂ、６０分間かけて直線。
負荷は、分析に関して０．５−１  Ａ２６０ユニット、そして予備の分離に関して５０−８０  Ａ２６０であった。流速は１ｍＬ／分に設定し、そして温度は５０℃に調節した。検出機は、分析クロマトグラフィーに関して２６０ｎｍに設定し、そして予備のクロマトグラフィーに関しては２９０ｎｍに設定した。これらの条件下で、所望の完全長のオリゴマーを最後に溶出した。
合成されたオリゴヌクレオチドの塩基配列及びハイブリダイゼーション特性を表１に示す。
【０１３２】
２．ＦＡＮＡ−Ｘ−ＦＡＮＡキメラの合成（式中、ＸはＩＩｃのようにセコウリジン（ＳＥＣ））。
ホスホジエステルＦＡＮＡ−ＳＥＣ−ＦＡＮＡ及びＦＡＮＡ−ＳＥＣ−ＳＥＣ−ＦＡＮＡキメラを、ブタンジオールキメラ構築物と同様に（上記参照）、カップリング工程に関して５０ｍｇ／ｍＬの濃度の２’，３’−セコウリジンモノマーを用いて、合成した。それらの上記の固相支持体からの切り離し、脱保護、精製（ＨＰＬＣ）及び脱塩（セップパックカートリッジ）の後のオリゴヌクレオチドの収量は、１０  Ａ２６０ユニットであった。それらの構造はＭａｌｄｉ−ＴＯＦ質量分析により確認した。
合成されたオリゴヌクレオチドの塩基配列及びハイブリダイゼーション特性を表１に示す。
【０１３３】
３．ＤＮＡ−Ｘ−ＤＮＡキメラの合成（式中、Ｘ＝ブタンジオールリンカー＝ＩＩｂ（Ｙ＝Ｚ＝酸素、ｎ＝４））。
ホスホジエステルＤＮＡ−Ｂｕｔ−ＤＮＡキメラの合成及び精製は、マイナーな例外を除いてホスホジエステルＦＡＮＡ−Ｂｕｔ−ＦＡＮＡオリゴマーに関しての上記の様式と同じく進行させた。用いた２’−デオキシリボヌクレオシドモノマー及びブタンジオールホスホルアミダイトの濃度は、各種類のモノマーの添加あたり、短いカップリング時間（２分間）に関して、それぞれ、５０及び６０ｍｇ／ｍＬであった。精製（ＨＰＬＣ）及び脱塩（セファデックスＧ−２５）の後の収量：２２  Ａ２６０ユニット。それらの構造はＭａｌｄｉ−ＴＯＦ質量分析により確認した。
合成されたオリゴヌクレオチドの塩基配列及びハイブリダイゼーション特性を表１に示す。
【０１３４】
４．ホスホロチオエートＦＡＮＡ−Ｘ−ＦＡＮＡ及びホスホロチオエートＤＮＡ−Ｘ−ＤＮＡキメラの合成（式中、Ｘ＝ブタンジオールリンカー＝ＩＩｂ（Ｙ＝酸素、Ｚ＝硫黄、そしてｎ＝４））。
【０１３５】
ホスホロチオエートＦＡＮＡ−Ｂｕｔ−ＦＡＮＡ及びホスホロチオエートＤＮＡ−Ｂｕｔ−ＤＮＡオリゴマーの合成は、ホスホジエステル（ＰＤＥ）オリゴヌクレオチドに関する上記のとおりに実施した。主な違いは、ヨウ素／水酸化試薬を、ピリジン／アセトニトリル（１／１，ｖ／ｖ）中の３−アミノー１，２，４−ジチアゾリン−５−チオン（ＡＤＴＴ）の０．１Ｍ溶液に代えたことであった。特に、上記ホスホロチオエート化合物は、１マイクロモルスケール上で、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  ８９０９  ＤＮＡ−合成機を用いて合成した。長鎖のアルキルアミン制御された孔性ガラス（ＬＣＡＡ−ＣＰＧ）を固相支持体として用いた。合成サイクルは、以下の工程からなった：（ａ）ＣＰＧへのヌクレオシド／ヌクレオチドの脱トリチル化（３％トリクロロ酢酸／ジクロロメタン）：１５秒間；（ｂ）２’−Ｆ−アラビノヌクレオシド又は３’−ホスホルアミダイトモノマーのカップリング：それぞれ１５分間又は１．５分間。用いたモノマーの濃度は、ａｒａＦ−Ｔ，ａｒａＦ−Ｃ，ＤＮＡ及びブタンジオールリンカーモノマーに関して５０ｍｇ／ｍＬ、そしてａｒａＦ−Ａ及びａｒａＦ−Ｇに関して６０ｍｇ／ｍＬであった（アセトニトリルを溶剤として）；（ｃ）標準キャッピング工程を用いたアセチル化：２０秒間。キャッピング溶液は１：１（ｖ／ｖ）の「ｃａｐＡ」及び「ｃａｐＢ」試薬からなった。ｃａｐＡ：無水酢酸／コリジン／ＴＨＦ（１：１：８ｍｌ）；ｃａｐＢ：Ｎ−メチルイミダゾール／ＴＨＦ（４：２１ｍｌ）；（ｄ）アセトニトリルを用いた大規模な洗浄（５０パルス）；（ｅ）ピリジン／アセトニトリル（１／１，ｖ／ｖ）中の０．１Ｍ  ３−アミノ−１，２，４−ジチアゾリン−５−チオン（ＡＤＴＴ）の溶液による硫酸化、１０分間。（ｆ）アセトニトリルによる洗浄：２０パルス；（ｇ）キャッピング試薬の添加による固相支持体の乾燥（工程３を参照）：５秒間；（ｈ）アセトニトリルによる洗浄（２０パルス）。
【０１３６】
鎖の集合の後に、オリゴヌクレオチドを固相支持体から切り離して、濃縮水性アンモニアにより脱保護した（室温、１６時間）。粗オリゴマーを、（ａ）予備のゲル電気泳動（２４％  アクリルアミド、７Ｍ  尿素）、続く脱塩（セファデックスＧ−２５）によるか、又は（ｂ）アニオン交換クロマトグラフィーＨＰＬＣ、続く脱塩（セップパックカートリッジ）の何れかにより、精製した。収量：３０−７０  Ａ２６０ユニット。ＨＰＬＣ精製の条件：カラム：プロテインパックＤＥＡＥ−５ＰＷ（７．５ｃｍ  Ｘ  ７．５ｃｍ，水）、溶剤：バッファーＡ：Ｈ２Ｏ；バッファーＢ：１Ｍ  ＮａＣｌＯ４、勾配：１００％バッファーＡ  均一濃度（isocratic）１２分間、１００％Ａ−１５％Ｂ，直線（５分かけて）、１５％Ｂ−５５％Ｂ，直線（６０分かけて）；流速は１ｍｌ／分に設定し、そして温度は５０℃に調節した。検出機は、分析クロマトグラフィーに関して２６０ｎｍに設定し、そして予備のクロマトグラフィーに関しては２９０ｎｍに設定した。これらの条件下で、所望の完全長のオリゴマーを最後に溶出した。オリゴヌクレオチドの構造は、Ｍａｌｄｉ−ＴＯＦ質量分析により確認した。
【０１３７】
【表１】
2005508634.tif 000017
【０１３８】
実施例３
ヒトＲＮａｓｅ  ＨＩＩの発現及び精製
ヒトＲＮａｓｅ  ＨＩＩの発現
ｐｃＤＮＡ／ＧＳ／ｈｒｎｈ（インビトロジェン）からのｈｒｎｈ遺伝子断片を、ＰＣＲにより、プライマー：ＡＧＣ  ＴＡＴ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＡＴＧ  ＡＧＣ  ＴＧＧ  ＣＴＴ  ＣＴＧ  ＴＴＣ  ＣＴＧ  ＧＣＣ（ＸｈｏＩ）（配列番号：３０）及びＧＧＣ  ＣＧＣ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＴＣＡ  ＧＴＣ  ＴＴＣ  ＣＧＡ  ＴＴＧ  ＴＴＴ  ＡＧＣ  ＴＣＣ（ＨｉｎｄＩＩＩ）（配列番号：３１）を用いて得た。この断片を、細菌の発現ベクターｐＢＡＤ／Ｈｉｓ（インビトロジェン）のＸｈｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローン化した。ｐＢＡＤ／Ｈｉｓ／ｈｒｎｈ発現プラスミドからの組換えヒトＲＮａｓｅ  ＨＩＩを以下のとおりに精製した。エシェリヒアコリにおけるコドンのバイアスを克服するため、我々は、エシェリヒアコリＢＬ２１コドンプラス（ストラタジーン）内に上記発現ベクターを形質転換し、そして、ＯＤ６００が０．５−０．６に到達するまで、３７℃において１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢブロス内で培養した。次に、上記組換え蛋白質を０．００２％アラビノースにより４時間誘導した。
【０１３９】
ヒトＲＮａｓｅ  ＨＩＩの精製
誘導後に、エシェリヒアコリ細胞を遠心分離により回収し、冷やした洗浄バッファー（１００ｍＭ  リン酸、ｐＨ８．０，３００ｍＭ  ＮａＣｌ）中で洗浄し、冷やした溶解バッファー（１００ｍｍ  リン酸、ｐＨ８．０，１０ユニット／ｍｌのＤＮａｓｅ，２ｍＭ  フェニルメチルスルフォニルフルオリド、３００ｍＭ  ＮａＣｌ，２００μｇ／ｍｌリゾチーム）に懸濁し、そして０．５％  ＮＰ−４０により溶解した。上清を、遠心分離後にＮｉ２＋−ニトリロトリ酢酸−アガロースカラムにのせ、そして蛋白質を製造者の指示書（キアゲン）に従い精製した。溶出物を２ｍＭ  ＥＤＴＡにより処理することにより、あらゆる残りのＮｉ２＋イオンをキレートし、そして１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０に対して透析し、そして次に超遠心分離により濃縮した。上記蛋白質をエンテロキナーゼ（１ユニット／２０マイクログラムの蛋白質）により５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０，１ｍＭ  ＣａＣｌ２，０．１％ツイーン−２０中で一晩３７℃にて処理した。次に、消化したサンプルを、２０ｍＭ  リン酸バッファー（ｐＨ８．０）により予め平衡化したヘパリン−セファロースカラム（アマシャム−ファルマシア）に負荷した。０．１−０．５Ｍ  ＮａＣｌの勾配による溶出後に、所望のピークをプールし、透析し、そして濃縮した。
【０１４０】
実施例４
ＡＯＮ−Ｘ−ＡＯＮオリゴヌクレオチドによるヒトリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  ＨＩＩ）活性の誘導
ＰＤＥ−ＦＡＮＡ対ＰＤＥ−［ＦＡＮＡ−Ｘ−ＦＡＮＡ］（Ｘ＝ブタンジオールリンカー＝ＩＩｂ（Ｙ＝Ｚ＝酸素、そしてｎ＝４））
【０１４１】
Ａ．ホモポリマー配列。
規定された配列のオリゴヌクレオチド、１８ユニットの長さ、をこれらの実験において使用した：
５’−ａｒａＦ（ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ）−３’（配列番号：７）
Ｔシリーズ「ＦＡＮＡ」
５’−ａｒａＦ（ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＸＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ）−３’（配列番号：９）
Ｔシリーズ「ＦＡＮＡ−Ｂｕｔ」
【０１４２】
上記配列中の残基「Ｘ」は、非環式残基ＩＩｂに対応し、式中、Ｙ＝Ｚ＝酸素、そしてｎ＝４（又はブタンジオールリンカー）である。用いられた標的ＲＮＡは、上記のオリゴヌクレオチドの配列に相補なオクタデカリボアデニレート（ｒＡ１８）であった。上記のオリゴヌクレオチドが標的ＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ分解を導き出す能力を、２ｍＭ  ジチオスレイトール、６０ｍＭ  ＫＣｌ，及び２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２（ｐＨ７．８，２２℃）中に１ｐｍｏｌの５’−［３２Ｐ］−標的ＲＮＡ及び３ｐｍｏｌの試験オリゴヌクレオチドを含むアッセイ（１０μＬの最終容量）にて決定した。酵素の添加に先立ち、上記混合物を７５℃にて２分間加熱し、そして次に、ゆっくりと室温まで冷却することにより、二重鎖形成を許容した。反応は、室温におけるヒトＲＮａｓｅ  ＨＩＩの添加により開始した。反応は、１０μｌの負荷バッファー（１０ｍＭ  ＥＤＴＡ及び各１ｍｇ／ｍＬのブロムフェノールブルー及びキシレンシアノールを含む９８％イオン化したホルムアミド）の添加により停止し、そして１００℃において５分間加熱した。反応生成物を、電気泳動により、７Ｍ尿素を含む１６％ポリアクリルアミド配列決定用ゲルを用いて解析し、そしてオートラジオグラフィーにより可視化した。そのような実験の結果を図１に示す。
【０１４３】
結果は、「ＦＡＮＡ」及び「ＦＡＮＡ−ＢＵＴ」オリゴマー（Ｔシリーズ）の両者が標的ＲＮＡと二重鎖を形成してヒトＲＮａｓｅ  ＨＩＩの活性のための基質として機能することを示し、図１の標的ＲＮＡの分解生成物により示されるとおりである。ＦＡＮＡの場合、このＲＮａｓｅ  Ｈ分解は、ＲＮａｓｅ  ＨＩＩのエンドヌクレアーゼ活性により形成される早く移動するバンドの出現により示された。「ＦＡＮＡ−ＢＵＴ」オリゴマーの場合、分解の結果は、多量の小さなサイズのＲＮＡ分解生成物の出現により証明されるとおり、上記酵素のエンドー及びエキソヌクレアーゼ活性の両方からもたらされる。時間の函数として残るｒＡ１８の定量は、分割の速度が「ＦＡＮＡ」よりも「ＦＡＮＡ−ＢＵＴ」の方が８倍早いことを示す（表１及び図２）。
【０１４４】
同じトレンドは、混合した塩基のホスホジエステルオリゴヌクレオチドを相補のＲＮＡ配列に対して標的化した場合に観察された（実施例４Ｂ及び８）。実施例８においては、４つの天然に生じる複素環塩基（Ａ，Ｇ，Ｃ及びＴ）を含むオリゴヌクレオチドをデザインすることにより、４０−及び５０−ｎｔの長さのＲＮＡ標的を標的化した。これらの場合、観察されたＲＮａｓｅ  Ｈ−媒介性ＲＮＡ分割の率の増強は、劇的でもあり、ＦＡＮＡ化合物をしのいで、ＦＡＮＡ−Ｂｕｔ−ＦＡＮＡの方が２３倍に達した。
【０１４５】
Ｂ．混合された塩基の配列
規定された配列のオリゴヌクレオチド、１８ユニットの長さをこれらの実験において使用した。
５’−ａｒａＦ（ＴＴＡ  ＴＡＴ  ＴＴＴ  ＴＴＣ  ＴＴＴ  ＣＣＣ）−３’（配列番号：１３）
ＣＡＴ「ＦＡＮＡ」
５’−ａｒａＦ（ＴＴＡ  ＴＡＴ  ＴＴＴ  ＸＴＣ  ＴＴＴ  ＣＣＣ）−３’（配列番号：１４）
ＣＡＴ「ＦＡＮＡ−Ｂｕｔ」
５’−ａｒａＦ（ＴＴＡ  ＴＡＴ  ＴＴＴ  ＣＴＣ  ＴＴＴ  ＣＣＣ）−３’（配列番号：１５）
ＣＡＴ「ＦＡＮＡ−ミスマッチ」
【０１４６】
上記配列中の残基Ｘは、非環式残基ＩＩｂに対応し、式中、Ｙ＝Ｚ＝酸素、そしてｎ＝４（又はブタンジオールリンカー）である。用いられた標的ＲＮＡは、最初の２つのオリゴヌクレオチドの配列に完全に相補なｒ（ＧＧＧＡＡＡＧＡＡＡＡＡＡＵＡＵＡＡ）（配列番号：２８）であった。第３番目のオリゴヌクレオチド、ＣＡＴ「ＦＡＮＡ−ミスマッチ」は、１０位にａｒａＦ−Ｃミスマッチを含む。このオリゴマーは、「ＦＡＮＡ−Ｂｕｔ」配列と同じ結合親和性を呈し、そして、ブタンジオール「リンカー」対ａｒａＦ−Ｃミスマッチ「リンカー」の効果を評価するために試験された。よって、「ＦＡＮＡ」、「ＦＡＮＡ−Ｂｕｔ」及び「ＦＡＮＡ−ミスマッチ」（ＣＡＴ−シリーズ）が標的ＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ分解を導き出す能力を、２ｍＭ  ジチオスレイトール、６０ｍＭ  ＫＣｌ，及び２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２（ｐＨ７．８，２２℃）中に１ｐｍｏｌの５’−［３２Ｐ］−標的ＲＮＡ及び３ｐｍｏｌの試験オリゴヌクレオチドを含むアッセイにて（１０μＬの最終容量）決定した。アッセイは、ホモポリマー配列に関して記載されたとおりに実施した（実施例４Ａ）。そのような実験の結果を図３に示す。
【０１４７】
結果は、「ＦＡＮＡ」及び「ＦＡＮＡ−Ｂｕｔ」（ＣＡＴシリーズ）の両者が標的ＲＮＡと二重鎖を形成してヒトＲＮａｓｅ  ＨＩＩの活性のための基質として機能することを示し、多量の小さなサイズの分解生成物の出現により証明されるとおりであった。時間の函数として残るＲＮＡ標的の定量は、分割の速度が「ＦＡＮＡ」よりも「ＦＡＮＡ−Ｂｕｔ」の方が顕著に早いことを示す（図４）。
【０１４８】
データは、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性がＦＡＮＡ−ミスマッチオリゴマーにおいて低下することも示し、その際、より剛性のａｒａＦ−Ｃ「リンカー」が、より柔軟なブタンジオールリンカーに取って代わる（表１）。ａｒａＦ−Ｃミスマッチはブタンジオール挿入に比例して（relative to）二重鎖熱安定性において均等な低下（drop）も誘導するため（△Ｔｍ＝−９℃、表１）、増加した代謝回転（即ち、標的ＲＮＡからの解離の速度の増加）は、より柔軟なＢｕｔリンカーに対する選択的な酵素識別の唯一の根拠ではない。
【０１４９】
実施例５
ブタンジオールリンカーＩＩｂ（Ｙ＝Ｚ＝酸素、そしてｎ＝４）の位置の函数としてのヒトリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ  ＨＩＩ）活性
以下のオリゴヌクレオチド、１８−ユニットの長さをこれらの実験において使用した：
５’−ａｒａＦ（ＴＴＴ  ＴＸＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ）−３’（配列番号：８）
ＦＡＮＡ「ＢＵＴ５」
５’−ａｒａＦ（ＴＴＴ  ＴＸＴ  ＴＴＴ  ＸＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ）−３’（配列番号：９）
ＦＡＮＡ「ＢＵＴ  １０」
５’−ａｒａＦ（ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＸＴＴＣ  ＴＴＴ）−３’（配列番号：１０）
ＦＡＮＡ「ＢＵＴ  １３」
【０１５０】
上記Ｘリンカーは、最適な活性がリンカーの位置に依存するか否かを決定するために様々な位置に置かれる。Ｘは、非環式残基ＩＩｂに対応し、式中、Ｙ＝Ｚ＝酸素、そしてｎ＝４（又はブタンジオールリンカー）である。正確なパターン、及びＦＡＮＡバックボーンに沿ってリンカーの移動に付随する分割速度を決定するのも望まれた。第一の切断の正確な位置は、酵素の良質な基質であることが既に分かっているホモポリマーの周囲の温度のもとで測定することが困難である。最初の切断が生じた場所を観察することは興味があったので、この情報は、各基質に対する好ましい切断様式上での質的比較を可能にさせるのにほんとうに十分に酵素活性が妨害される（retarded）条件下で、低温において実施されたアッセイから代わりに抽出された（図５）。高温においては、それが酵素による単一の標的上での複数の分割の重ね合わせによりもたらされるとおり、パターンがより解釈不可能になる。
【０１５１】
使用された標的ＲＮＡはｒＡ１８であり、上記のオリゴヌクレオチドに相補であった。アッセイ（１０μＬの最終容量）は、６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８，２ｍＭ  ジチオスレイトール、６０ｍＭ  ＫＣｌ，及び１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む）中に１ｐｍｏｌの５’−［３２Ｐ］−標的ＲＮＡ及び３ｐｍｏｌの試験オリゴヌクレオチドを含んだ。反応は、ＲＮａｓｅ  Ｈの添加により開始して、１４−１５℃において２０分間実施した。そのような実験の結果を図５に示す。
【０１５２】
相対的な速度は：ＢＵＴ−１０＞ＢＵＴ−１３＞ＢＵＴ−５（表１及び図６）の順に従う。さらに、リンカー含有オリゴヌクレオチドの全ては、ＦＡＮＡ−ＢＵＴ５以外のＲＮＡの３’−末端において追加の主たる切断を誘導し、同時に、ＦＡＮＡ−ＢＵＴ５はリンカーを欠くＦＡＮＡオリゴマーにより速度において取って代わられる唯一のオリゴヌクレオチドである。そうして、それらの配列が実質上は同一であって等しい熱安定性であるという事実にも拘わらず、オリゴヌクレオチド内のブチルの位置に関しての反対の指向性（directionalities）により、ＦＡＮＡ−ＢＵＴ５とＦＡＮＡ−ＢＵＴ３基質は活性化の能力に関して大きな違いを示す。事実、これらの２つのオリゴマーの異なる活性は、もし−存在しなければ−代謝回転の効果に関してマイナーな役割を示唆する。或いは、ＦＡＮＡ−ＢＵＴ５に関して観察された速度増加の低下は、基質に沿ったＲＮａｓｅ  Ｈの遠隔配置（remote positioning）を反映するかもしれず、ハイブリッドの二重鎖内のアンチセンスオリゴヌクレオチドの３’−末端近傍に結合することが知られており、即ち、リンカーの挿入により影響されないかもしれない。
【０１５３】
実施例６
ＰＤＥ−ＦＡＮＡ対ＰＤＥ−［ＦＡＮＡ−Ｘ−ＦＡＮＡ］及びＰＤＥ−［ＦＡＮＡ−Ｘ−Ｘ−ＦＡＮＡ］（Ｘ＝セコヌクレオチドＩＩｃ）
規定された配列のオリゴヌクレオチド、１８ユニットの長さ、をこれらの実験において使用した：
５’−ａｒａＦ（ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ）−３’（配列番号：７）
「ＦＡＮＡ」
５’−ａｒａＦ（ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＸＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ）−３’（配列番号：１１）
「ＳＥＣｘ１」
５’−ａｒａＦ（ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＸ ＸＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ）−３’（配列番号：１２）
「ＳＥＣｘ２」
【０１５４】
上記配列中の残基「Ｘ」は、非環式残基ＩＩｃ（セコウリジン）に対応する。用いられた標的ＲＮＡは、上記のオリゴヌクレオチドの配列に相補なオクタデカリボアデニレート（ｒＡ１８）であった。上記のオリゴヌクレオチドが標的ＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ分解を導き出す能力を、２ｍＭ  ジチオスレイトール、６０ｍＭ  ＫＣｌ，及び２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２（ｐＨ７．８，２２℃）中に１ｐｍｏｌの５’−［３２Ｐ］−標的ＲＮＡ及び３ｐｍｏｌの試験オリゴヌクレオチドを含むアッセイ（１０μＬの最終容量）にて決定した。酵素の添加に先立ち、上記混合物を７５℃にて２分間加熱し、そして次に、ゆっくりと室温まで冷却することにより、二重鎖形成を許容した。反応は、室温におけるヒトＲＮａｓｅ  ＨＩＩの添加により開始した。反応は、１０μｌの負荷バッファー（１０ｍＭ  ＥＤＴＡ及び各１ｍｇ／ｍＬのブロムフェノールブルー及びキシレンシアノールを含む９８％イオン化したホルムアミド）の添加により停止し、そして１００℃において５分間加熱した。反応生成物を、電気泳動により、７Ｍ尿素を含む１６％ポリアクリルアミド配列決定用ゲルを用いて解析し、そしてオートラジオグラフィーにより可視化した。そのような実験の結果を図７に示す。
【０１５５】
結果は、「ＦＡＮＡ」、「ＳＥＣｘ１」及び「ＳＥＣｘ２」の全てが、標的ＲＮＡと二重鎖を形成してヒトＲＮａｓｅ  ＨＩＩの活性のための基質として機能することを示し、完全長の標的ＲＮＡに対応するバンドの不在（分解）により示されるとおりである（図７）。時間の函数として残るｒＡ１８の定量は、ハイブリダイズしたＡＯＮが「ＳＥＣｘ２」のときよりもＲＮＡ分割の速度が大きいことを示す（図８）。観察された順番は、「ＦＡＮＡ−ＳＥＣｘ２」＞「ＦＡＮＡ−ＳＥＣｘ１」＞「ＦＡＮＡ」であることから、標的化ＲＮＡ分割における前例のない増強が、セコヌクレオチドリンカー（ＩＩｃ）により親ＦＡＮＡ鎖へ授与されることを証明する。ブタンジオール挿入に関するように（実施例５）、同じトレンドが観察され、−即ち、全てのＦＡＮＡ相対物に関して低下した熱安定性、にも拘わらずＲＮａｓｅ  Ｈの活性の増強である。即ち、リンカー挿入に起因する融点温度の低下は、全てのＦＡＮＡ相対物に関しての標的ＲＮＡの観察された速度の増加により、重要である。
【０１５６】
実施例７
ＰＤＥ−ＤＮＡ対ＰＤＥ−［ＤＮＡ−Ｘ−ＤＮＡ］（Ｘはブタンジオールリンカー＝ＩＩｂ，Ｙ＝Ｚ＝酸素、そしてｎ＝４）
Ａ．ホモポリマー配列
規定された配列のオリゴヌクレオチド、１８ユニットの長さ、をこれらの実験において使用した：
５’−ｄ（ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ）−３’（配列番号：１）
「ＤＮＡ」
５’−ｄ（ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＸＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ）−３’（配列番号：２）
「ＤＮＡ−Ｂｕｔ」
【０１５７】
上記配列中の残基「Ｘ」は、非環式残基ＩＩｂに対応する（Ｙ＝Ｚ＝酸素、ｎ＝４（又はブタンジオールリンカー））。用いられた標的ＲＮＡは、上記のオリゴヌクレオチドの配列に相補なオクタデカリボアデニレート（ｒＡ１８）であった。上記のオリゴヌクレオチドが標的ＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ分解を導き出す能力を、２ｍＭ  ジチオスレイトール、６０ｍＭ  ＫＣｌ，及び２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２（ｐＨ７．８，１５℃）中に１ｐｍｏｌの５’−［３２Ｐ］−標的ＲＮＡ及び３ｐｍｏｌの試験オリゴヌクレオチドを含むアッセイ（１０μＬの最終容量）にて決定した。アッセイは実施例４Ａに関する前記のとおりに実施した。そのような実験の結果を図９に示す。
【０１５８】
結果は、「ＤＮＡ」、「ＤＮＡ−ＢＵＴ」の両方が、標的ＲＮＡと二重鎖を形成してヒトＲＮａｓｅ  ＨＩＩの活性のための基質として機能することを示し、図９において標的ＲＮＡの分解生成物により示されるとおりである。時間の函数として残るｒＡ１８の定量は、「ＤＮＡ」よりも「ＤＮＡ−ＢＵＴ」の方が顕著に分割の速度が大きい（計算値、３倍）ことを示す（図１０）。
【０１５９】
Ｂ．混合された塩基の配列
規定された配列のオリゴヌクレオチド、１８ユニットの長さをこれらの実験において使用した。
５’−ｄ（ＴＴＡ  ＴＡＴ  ＴＴＴ  ＴＴＣ  ＴＴＴ  ＣＣＣ）−３’（配列番号：３）
ＣＡＴ「ＤＮＡ」
５’−ｄ（ＴＴＡ  ＴＡＴ  ＴＴＴ  ＸＴＣ  ＴＴＴ  ＣＣＣ）−３’（配列番号：４）
ＣＡＴ「ＤＮＡ−Ｂｕｔ」
５’−ｄ（ＴＴＡ  ＴＡＴ  ＴＴＴ  ＣＴＣ  ＴＴＴ  ＣＣＣ）−３’（配列番号：５）
ＣＡＴ「ＤＮＡ−ミスマッチ」
【０１６０】
上記配列中の残基Ｘは、非環式残基ＩＩｂに対応し、式中、Ｙ＝Ｚ＝酸素、そしてｎ＝４（又はブタンジオールリンカー）である。用いられた標的ＲＮＡは、最初の２つのオリゴヌクレオチドの配列に完全に相補なｒ（ＧＧＧＡＡＡＧＡＡＡＡＡＡＵＡＵＡＡ）（配列番号：２８）であった。第３番目のオリゴヌクレオチド、ＣＡＴ「ＤＮＡ−ミスマッチ」は、１０位にｄＣミスマッチを含む。「ＤＮＡ」、「ＤＮＡ−Ｂｕｔ」及び「ＤＮＡ−ミスマッチ」（ＣＡＴ−シリーズ）が標的ＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ分解を導き出す能力を、２ｍＭ  ジチオスレイトール、６０ｍＭ  ＫＣｌ，及び２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２（ｐＨ７．８，１５℃）中に１ｐｍｏｌの５’−［３２Ｐ］−標的ＲＮＡ及び３ｐｍｏｌの試験オリゴヌクレオチドを含むアッセイにて（１０μＬの最終容量）決定した。アッセイは、実施例４Ａに関して記載されたとおりに実施した。
【０１６１】
表１に示したキネティックのデータは、全部のＤＮＡオリゴマーが標的ＲＮＡと二重鎖を形成してヒトＲＮａｓｅ  ＨＩＩの活性のための基質として機能することを示す。時間の函数として残るＲＮＡ標的の定量は、分割の速度が「ＤＮＡ」又は「ＤＮＡ−ミスマッチ」よりも「ＤＮＡ−Ｂｕｔ」の方が顕著に早いことを示す（それぞれ、３倍又は４倍、表４）。
【０１６２】
実施例８
高分子量のＲＮＡの標的化。ホスホジエステルＦＡＮＡ、ＦＡＮＡ−Ｘ−ＦＡＮＡ、ＤＮＡ、ミスマッチＤＮＡ及びＤＮＡ−Ｘ−ＤＮＡ（Ｘ＝ブタンジオールリンカー＝ＩＩｂ，Ｙ＝Ｚ＝酸素、そしてｎ＝４）の間の比較。
【０１６３】
以下のホスホジエステルオリゴヌクレオチド、１８ユニットの長さ、をこれらの実験において使用した：
５’−ｄ（ＡＴＴ  ＣＣＧ  ＴＣＡ  ＴＣＧ  ＣＴＣ  ＣＴＣ）−３’（配列番号：１８）Ｈａ−ＲＡＳ「ＰＤＥ−ＤＮＡ」
５’−ｄ（ＡＴＴ  ＣＣＧ  ＴＣＡ  ＸＣＧ  ＣＴＣ  ＣＴＣ）−３’（配列番号：１９）Ｈａ−ＲＡＳ「ＰＤＥ−ＤＮＡ−Ｂｕｔ」
５’−ｄ（ＡＴＴ  ＣＣＧ  ＴＣＡ  ＣＣＧ  ＣＴＣ  ＣＴＣ）−３’（配列番号：２０）Ｈａ−ＲＡＳ「ＰＤＥ−ＤＮＡ−ミスマッチ」
５’−ａｒａＦ（ＡＴＴ  ＣＣＧ  ＴＣＡ  ＴＣＧ  ＣＴＣ  ＣＴＣ）−３’（配列番号：２１）Ｈａ−ＲＡＳ「ＰＤＥ−ＦＡＮＡ」
５’−ａｒａＦ（ＡＴＴ  ＣＣＧ  ＴＣＡ  ＸＣＧ  ＣＴＣ  ＣＴＣ）−３’（配列番号：２２）Ｈａ−ＲＡＳ「ＰＤＥ−ＦＡＮＡ−Ｂｕｔ」
【０１６４】
上記配列中の残基Ｘは、非環式残基ＩＩｂに対応し、式中、Ｙ＝Ｚ＝酸素、そしてｎ＝４（又はブタンジオールリンカー）である。用いられた標的ＲＮＡは、４０ヌクレオチドユニットの長さのポリリボヌクレオチドである。それらの塩基配列は、天然に生じるＨａ−Ｒａｓ  ｍＲＮＡ配列に由来する（ｃ−ｒａｓプロトオンコジーンに由来する）。上記オリゴヌクレオチドの各々が標的ＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ分解を導き出す能力を、２ｍＭ  ジチオスレイトール、６０ｍＭ  ＫＣｌ，及び２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２（ｐＨ７．８）中に１ｐｍｏｌの５’−［３２Ｐ］−標的ＲＮＡ及び３ｐｍｏｌの試験オリゴヌクレオチドを含むアッセイにて（１０μＬの最終容量）決定した。反応はＲＮａｓｅ  Ｈの添加により開始して、３７℃において実施した。時間ごとのアリコートを各セットのインキュベーションから様々な時間間隔にて採取した。
【０１６５】
この特定の配列に関して、標的の分解の増加は、ブタンジオールリンカーに関して、ＤＮＡ中のデオキシヌクレオチド残基を交換する際には明らかではない（オリゴマーＸＶＩＩＩ及びＸＩＸ，表１、及び図１１）。しかしながら、これはＦＡＮＡ構築物に関して真実ではない。以前の例の全てにおいて証明されているとおり、ホスホジエステルＦＡＮＡ中のアラビノフルオロヌクレオシド残基の、より柔軟なブタンジオールリンカーによる置換は、ＲＮａｓｅ  ＨＩＩの活性を上昇させる。事実、そのような置換は、ＦＡＮＡ（ｋｒｅｌ２３．３）とＤＮＡ由来の（ｋｒｅｌ３３．８）アンチセンス化合物の間の有効性ギャップを、かなりふさぐ（表１）。
【０１６６】
実施例９
高分子量のＲＮＡの標的化。ＰＳ−ＦＡＮＡ、ＰＳ−［ＦＡＮＡ−Ｘ−ＦＡＮＡ］，ＰＳ−ＤＮＡ、及びＰＳ−［ＤＮＡ−Ｘ−ＤＮＡ］（Ｘ＝ブタンジオールリンカー＝ＩＩｂ，Ｙ＝酸素、Ｚ＝硫黄、そしてｎ＝４）の間の比較。
【０１６７】
以下のホスホジエステルオリゴヌクレオチド、１８ユニットの長さ、をこれらの実験において使用した：
５’−ｄ（ＡＴＴ  ＣＣＧ  ＴＣＡ  ＴＣＧ  ＣＴＣ  ＣＴＣ）−３’（配列番号：２３）Ｈａ−ＲＡＳ「ＰＳ−ＤＮＡ」
５’−ｄ（ＡＴＴ  ＣＣＧ  ＴＣＡ  ＸＣＧ  ＣＴＣ  ＣＴＣ）−３’（配列番号：２４）Ｈａ−ＲＡＳ「ＰＳ−ＤＮＡ−Ｂｕｔ」
５’−ａｒａＦ（ＡＴＴ  ＣＣＧ  ＴＣＡ  ＴＣＧ  ＣＴＣ  ＣＴＣ）−３’（配列番号：２５）Ｈａ−ＲＡＳ「ＰＳ−ＦＡＮＡ」
５’−ａｒａＦ（ＡＴＴ  ＣＣＧ  ＴＣＡ  ＸＣＧ  ＣＴＣ  ＣＴＣ）−３’（配列番号：２６）Ｈａ−ＲＡＳ「ＰＳ−ＤＮＡ−Ｂｕｔ」
【０１６８】
上記配列中の残基Ｘは、非環式残基ＩＩｂに対応し、式中、Ｙ＝酸素、Ｚ＝硫黄、そしてｎ＝４（ブタンジオールリンカー）である。用いられた標的ＲＮＡは、４０ヌクレオチドユニットの長さのポリリボヌクレオチドである。それらの塩基配列は、天然に生じるＨａ−Ｒａｓ  ｍＲＮＡ配列に由来する（ｃ−ｒａｓプロトオンコジーンに由来する）。上記オリゴヌクレオチドの各々が標的ＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ分解を導き出す能力を、２ｍＭ  ジチオスレイトール、６０ｍＭ  ＫＣｌ，及び２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２（ｐＨ７．８）中に１ｐｍｏｌの５’−［３２Ｐ］−標的ＲＮＡ及び３ｐｍｏｌの試験オリゴヌクレオチドを含むアッセイにて（１０μＬの最終容量）決定した。反応はＲＮａｓｅ  Ｈの添加により開始して、３７℃において実施した。時間ごとのアリコートを各セットのインキュベーションから様々な時間間隔にて採取した。
【０１６９】
この特定の配列に関して、標的の分解の低下は、ブタンジオールリンカーに関して、ＤＮＡ中のデオキシヌクレオチド残基を交換する際に明らかである（表１、及び図１２）。これはＦＡＮＡに基づく構築物に関して観察されたものと対照的である。この場合、ＰＳ−ＦＡＮＡ中のアラビノフルオロヌクレオシド残基の、より柔軟なブタンジオールリンカーによる置換は、ＲＮａｓｅ  ＨＩＩの活性を上昇させる（表１）。
【０１７０】
実施例１０
「ループアウト」非環式リンカーを含むオリゴヌクレオチド構築物。
５’−ａｒａＦ（ＴＴＡ  ＴＡＴ  ＴＴＴ  ＴＴＣ  ＴＴＴ  ＣＣＣ）−３’（配列番号：１３）
ＣＡＴ「ＦＡＮＡ」
５’−ａｒａＦ（ＴＴＡ  ＴＡＴ  ＴＴＴ  ＸＴＣ  ＴＴＴ  ＣＣＣ）−３’（配列番号：１４）
ＣＡＴ「ＦＡＮＡ−Ｂｕｔ」
５’−ａｒａＦ（ＴＴＡ  ＴＡＴ  ＴＴＴ  Ｘ  ＴＴＣ  ＴＴＴ  ＣＣＣ）−３’（配列番号：１７）
ＣＡＴ「ＦＡＮＡ−Ｂｕｔ−ループ」
【０１７１】
上記配列中の残基Ｘは、非環式残基ＩＩｂに対応し、式中、Ｙ＝Ｚ＝酸素、そしてｎ＝４（又はブタンジオールリンカー）である。用いられた標的ＲＮＡは、ｒ（ＧＧＧＡＡＡＧＡＡＡＡＡＡＵＡＵＡＡ）（配列番号：２８）であり、上記の各配列に完全に相補であった。ホスホジエステル結合させた「ＦＡＮＡ」、「ＦＡＮＡ−Ｂｕｔ」、及び「ＦＡＮＡ−Ｂｕｔ−ループ」（ＣＡＴシリーズ）が標的ＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ分解を導き出す能力を、２ｍＭ  ジチオスレイトール、６０ｍＭ  ＫＣｌ，及び２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２（ｐＨ７．８、１５℃）中に１ｐｍｏｌの５’−［３２Ｐ］−標的ＲＮＡ及び３ｐｍｏｌの試験オリゴヌクレオチドを含むアッセイにて（１０μＬの最終容量）決定した。アッセイは、実施例４Ａに関しての上記のとおりに実施した。
【０１７２】
上記の「ＦＡＮＡ−Ｂｕｔ−ループ」配列は、「ＦＡＮＡ」及び「ＦＡＮＡ−Ｂｕｔ」オリゴヌクレオチドの両者の単一化要素を含む。これらは、上記配列の中央の局在化された柔軟部位（「ＦＡＮＡ−Ｂｕｔ」に類似）からなり、並びに標的ＲＮＡと完全にハイブリダイズする能力からなる（「ＦＡＮＡ」に類似）。結果として、ルーピングリンカーは、この特定の配列と上記ＲＮＡの間に塩基対を形成する残基の数を最大化する二重鎖コアの遠くから伸長合成するらしい。この様式においてらせん（helix）の外のリンカーを押しやること（forcing）は、酵素と二重鎖のマイナーな溝の間の安定な接触の数を低下させることにより、ＲＮａｓｅ  Ｈと２つの鎖の間の相互作用のいくつかを破壊するかもしれない。驚くことに、この配列はＲＮＡの分解をなお十分に増強し（オリゴマーＸＩＩＩとＸＶＩＩを比較，表１）、上記に柔軟なリンカーがらせんの軸の中に直接に存在するか又は軸の遠くに存在するか否かに拘わらず、有効なＲＮａｓｅ  Ｈの誘導に、アンチセンス鎖の柔軟性が重要であることを示唆する。
【０１７３】
この出願を通して、様々な引用文献が、この発明の属する分野の状態を記載する。これらの引用文献の開示は本開示の中に引用により編入される。
略語
ＡＮＡ，アラビノ核酸誘導体（可変性２’−置換体）
ＡＯＮ，アンチオリゴヌクレオチド
ＢＵＴ，１，４−ヌクレオチドユニット
ＤＭＳＯ，ジメチルスルフォキシド
ＤＮＡ，デオキシリボ核酸
ＥＣ５０，有効濃度
ＥＤＴＡ，エチレンジアミンテトラ酢酸
Ｅｔ２Ｏ，ジエチルエーテル
ＥｔＯＡｃ，酢酸エチル
ＦＡＢ−ＭＳ，高速−原子砲撃質量分析
ＦＡＮＡ，２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノ核酸
ＨＰＬＣ，高速液体クロマトグラフィー
ＬＣＡＡ−ＣＰＧ，長鎖アルキルアミン制御された孔性ガラス
ＭＢＯ，混合された−バックボーンのオリゴヌクレオチド
ＭｅＯＨ，メタノール
ＮＢＡ，ｐ−ニトロベンジルアルコール
Ｏ−ＰＮＡモノマー、［ＮＨ２−ＣＨ（ＣＨ２−ＣＨ２−塩基）−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈ
ＰＤＥ−ＤＮＡ，ホスホジエステル結合したＤＮＡ
ＰＮＡ，ペプチド核酸
ＰＮＡモノマー、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシンユニットであって、但し、複素環塩基がメチレンカルボニルリンカーを通して結合している
ＰＳ−ＤＮＡ，ホスホロチオエート結合したＤＮＡ
Ｒｆ，残存因子
ＲＮＡ，リボ核酸
ＲＮａｓｅ  Ｈ、リボヌクレオチドＨ
ＳＥＣ，セコヌクレオチドユニット
ＴＥＡ，トリエチルアミン
ＴＨＦ，テトラヒドロフラン
Ｔｍ，融点温度
ＴＬＣ，薄層クロマトグラフィー
Ｔｏｌ，トルエン
発明は、添付の図面に関係して今詳細に記載される。
【図面の簡単な説明】
【０１７４】
【図１】図１は、ホモポリマーＰＤＥ−ＦＡＮＡ及びＦＡＮＡ−Ｘ−ＦＡＮＡにより二重鎖形成されたＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ媒介性の分割を例示する。計時されたアリコートは、各インキュベーションセットから０、５、１０、及び２０分にて採取された。実験条件は実施例４Ａに提供される。
【図２】図２は、ホモポリマーＰＤＥ−ＦＡＮＡ及びＰＤＥ−［ＦＡＮＡ−Ｘ−ＦＡＮＡ］により二重鎖形成されたＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ媒介性の分割を時間の函数として例示する。５’−標識された標的ＲＮＡの分解は図１に示したゲルのデンシトメトリーにより定量した。
【図３】図３は、混合された塩基のＰＤＥ−ＦＡＮＡ及びＰＤＥ−［ＦＡＮＡ−Ｘ−ＦＡＮＡ］により二重鎖形成されたＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ媒介性の分割を例示する。計時されたアリコートは、各インキュベーションセットから０、５、１０、及び２０分にて採取された。実験条件は実施例４Ｂに提供される。
【図４】図４は、混合された塩基のＰＤＥ−ＦＡＮＡ及びＰＤＥ−［ＦＡＮＡ−Ｘ−ＦＡＮＡ］により二重鎖形成されたＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ媒介性の分割を時間の函数として例示する。５’−標識された標的ＲＮＡの分解は図３に示したゲルのデンシトメトリーにより定量した。
【図５】図５は、ブタンジオールリンカーＸを５、１０及び１３位に含むホモポリマーＰＤＥ−ＦＡＮＡ−Ｘ−ＦＡＮＡにより二重鎖形成されたＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ媒介性の分割を例示する。アッセイ（１０μＬ最終容量）は、２ｍＭジチオスレイトール、６０ｍＭ  ＫＣｌ、及び１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）中に、１ｐｍｏｌの５’［３２Ｐ］−標的ＲＮＡ及び３ｐｍｏｌの試験オリゴヌクレオチドを含んでなった。反応はＲＮａｓｅ  Ｈの添加により開始して、１４−１５℃において２０分間実施した。計時されたアリコートは、各インキュベーションセットから０、５、１０、及び２０分にて採取された。実験条件は実施例４Ａに提供される。酵素切断により生成したＲＮＡ断片の長さ及びＡＯＮに沿った対応位置を示す。
【図６】図６は、ホモポリマーＦＡＮＡ−Ｘ−ＦＡＮＡ（Ｂｕｔ−５，１０及び１３）により二重鎖形成されたＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ媒介性の分割を時間の函数として例示する。５’−標識された標的ＲＮＡの分解は図３に示したゲルのデンシトメトリーにより定量した。
【図７】図７は、内部のセコウリジンリンカーを含むホモポリマーＰＤＥ−［ＦＡＮＡ−Ｘ−ＦＡＮＡ］及びＰＤＥ−［ＦＡＮＡ−Ｘ−Ｘ−ＦＡＮＡ］により二重鎖形成されたＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ媒介性の分割を例示する。計時されたアリコートは、各インキュベーションセットから０、５、１０、及び２０分にて採取された。実験条件は実施例６に提供される。
【図８】図８は、ホモポリマーＰＤＥ−［ＦＡＮＡ−Ｘ−ＦＡＮＡ］（ＳＥＣｘ１）、及びＰＤＥ−［ＦＡＮＡ−Ｘ−Ｘ−ＦＡＮＡ］（ＳＥＣｘ２）、及びＰＤＥ−ＦＡＮＡにより二重鎖形成されたＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ媒介性の分割を時間の函数として例示する。５’−標識された標的ＲＮＡの分解は図７に示したゲルのデンシトメトリーにより定量した。
【図９】図９は、ホモポリマーＰＤＥ−ＤＮＡ及びＰＤＥ−［ＤＮＡ−Ｘ−ＤＮＡ］（Ｘ＝ブタンジオールリンカー）により二重鎖形成されたＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ媒介性の分割を例示する。計時されたアリコートは、各インキュベーションセットから０、５、１０、及び２０分にて採取された。実験条件は実施例７に提供される。
【図１０】図１０は、ホモポリマーＰＤＥ−ＤＮＡ及びＰＤＥ−［ＤＮＡ−Ｘ−ＤＮＡ］（Ｘ＝ブタンジオールリンカー）により二重鎖形成されたＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ媒介性の分割を時間の函数として例示する。５’−標識された標的ＲＮＡの分解は図９に示したゲルのデンシトメトリーにより定量した。
【図１１】図１１は、ブタンジオールリンカーＸを１０位に含むホモポリマーＰＤＥ−ＦＡＮＡ，ＰＤＥ−［ＦＡＮＡ−Ｘ−ＦＡＮＡ］，ＰＤＥ−ＤＮＡ，ＰＤＥ−［ＤＮＡ−Ｘ−ＤＮＡ］，及びＰＤＥ−［ミスマッチのＤＮＡ］により二重鎖形成されたＨａ−Ｒａｓ  ＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ媒介性の分割を例示する。アッセイは、実施例８に記載されたとおりに実施した。酵素切断により生成したＲＮＡ断片の長さ及びＡＯＮに沿った対応位置を示す。ＲＮＡ分割のキネティックスのデータ（ｋ）を表１に示す。
【図１２】図１２は、ブタンジオールリンカーＸを１０位に含む混合された塩基のＰＳ−ＦＡＮＡ，ＰＳ−［ＦＡＮＡ−Ｘ−ＦＡＮＡ］，ＰＳ−ＤＮＡ，及びＰＳ−［ＤＮＡ−Ｘ−ＤＮＡ］により二重鎖形成されたＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ媒介性の分割を時間の函数として例示する。アッセイは、実施例９に記載されたとおりに実施した。ＲＮＡ分割のキネティックスのデータ（ｋ）を表１に示す。
【図２】
2005508634.tif 000021
【図４】
2005508634.tif 000022
【図６】
2005508634.tif 000023
【図８】
2005508634.tif 000024
【図１０】
2005508634.tif 000025
【図１】
2005508634.tif 000026
【図３】
2005508634.tif 000027
【図５】
2005508634.tif 000028
【図７】
2005508634.tif 000029
【図９】
2005508634.tif 000030
【図１１】
2005508634.tif 000031
【図１２】
2005508634.tif 000032
【配列表】
2005508634000001.app
【国際調査報告】
2005508634.tif 000033
2005508634.tif 000034
2005508634.tif 000035
2005508634.tif 000036