(57)【要約】リン脂質転移蛋白質（PLTP）の活性を測定するための改善した方法は、適度な浸透圧存在下で、水性核を有する供与体粒子により信号対雑音比を高める。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のリン脂質転移蛋白質（PLTP）の活性を測定するための方法であって、
標識リン脂質転移蛋白質基質及び水性核を含む供与体粒子を含有する緩衝媒体；受容体エマルジョンであって、基質がこれに対して転移してもよいもの、及び前記供与体粒子の崩壊をもたらすために十分な濃度の塩、を含む反応混合物中の前記試料を、供与体粒子から受容体への前記基質の転移をもたらすために十分な時間、保温すること、及び
前記受容体中に組み込まれた標識の量を測定すること、を含み、
それによって試料中のリン脂質転移蛋白質の活性が測定される方法。
【請求項２】
前記受容体中に組み込まれた標識の量の測定は、反応混合物について行われ、前記反応混合物から受容体を分離することなく行われる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標識は、自己消光蛍光分子である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記標識は、Ｎ-（7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イル）、フルオレセイン、ダンシル、BODIPY、又はローダミンである請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記標識は、Ｎ-（7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イル）である請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記受容体エマルジョンは、高密度リポ蛋白質である又はトリグリセリドを含むエマルジョンである請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記受容体エマルジョンは、コレステロール、蛋白質、リン脂質及びトリグリセリドを含むエマルジョンである請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記塩の濃度は、1.05〜1.15g/mlのNaBrによって与えられる浸透圧と同等の浸透圧を与える濃度である請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記塩の濃度は、1.1g/mlのNaBrによって与えられる浸透圧と同等の浸透圧を与える濃度である請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
更に、受容体へ転移した標識の量を、既知の濃度のリン脂質転移蛋白質により組み込まれる標識の量と比較することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
更に、標準品から、転移した基質の量を算出することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
リン脂質転移蛋白質の活性を調節する化合物を同定する方法であって、
前記化合物の存在下及び非存在下において請求項１の方法を行うこと；
前記化合物の非存在下に対して、前記化合物の存在下において測定されたリン脂質転移蛋白質の活性を比較すること、を含み、
前記化合物の非存在下と比較して、存在下において測定された活性の差によって前記化合物をリン脂質転移蛋白質活性のモジュレーターと同定する方法。
【請求項１３】
試験被検体におけるリン脂質転移蛋白質の異常なレベルによって特徴付けられる状態の存在を測定する方法であって、前記試料におけるリン脂質転移蛋白質の活性を測定するために前記試料として前記試験被検体からの生物学的流体を使用して請求項１の方法を行うこと；及び
正常な被検体に特有な活性のレベルと前記測定から得られたレベルを比較することを含み、
それによって、前記正常な被検体と比較して、前記試験被検体におけるレベルの差が前記試験被検体における異常なリン脂質転移蛋白質レベルによって特徴付けられた状態を示す方法。
【請求項１４】
被検体のリン脂質転移蛋白質の測定のためのキットであって、
標識された基質と水性核とを含む供与体粒子の懸濁液を含む第一のコンテナと、
請求項１の測定法を行うための指示書と、を含み、
更に、任意に、第二のコンテナ中に塩と任意に混合された受容体エマルジョン
を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の説明】
【０００１】
本出願は、２００１年１０月２３日に出願した米国仮特許出願第60/348,722号に基づく優先権を主張する。この出願の内容は参照により本出願に組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、リン脂質転移蛋白質（phospholipid transfer protein；PLTP）の活性の測定について改善した方法に関する。そのような測定は、PLTP活性を阻害する化合物を同定し、及び異常なPLTP活性に関連した状態を評価することにおいて有用である。
【背景技術】
【０００３】
PLTPは、主として血漿（plasma）、胎盤、及び膵臓において発見される４７６のアミノ酸残基を含む51ｋD蛋白質であるが、肺、腎臓、心臓、肝臓、骨格筋、小腸及び脳にもまた存在する。特許文献１において開示されたように、この蛋白質をコード化する塩基配列は、クローン化され、配列決定されている（特許文献１参照）。その内容は参照によりここに組み込まれる。この蛋白質の活性は、非特許文献１において、Tallにより検討されている（非特許文献１参照）。PLTPは、供与体単層管又はリポ蛋白質から高密度リポ蛋白質（high density lipoprotein；HDL）又は他のリポ蛋白質中への、リン脂質、ジグリセリド及びビタミンＥを含む基質の転移を促進する。PLTPは、HDLを形成し、及びApo-Bを含むリポ蛋白質の分泌を調節する役割を果たすことも知られている。アテローム性動脈硬化症の発生の役割をも果たす。コレステリルエステル転移蛋白質（Cholesteryl ester transfer protein；CETP）活性もまたPLTPにより高められる。
【０００４】
PLTP活性の測定に関し、上記参照した特許文献１は、受容体がビオチン化したHDLである不均一な測定法を開示している。PLTPの基質特異性を評価することを含む検討、特にPLTPがLPSと反応するかどうかを研究することに関し、非特許文献２は蛍光体ホウ素ジピロメタンジフルオリド（boron dipyrromethane difluoride；BODIPY）と標識付けされたリポ多糖類（lipopolysaccharides；LPS）が自己会合したミセルから種々の受容体へ転移される測定法を記載する。著者は、PLTPがHDL粒子との交換を媒介とすることができるが、CD14とではできないということを見出した。
【０００５】
非特許文献３は、リン脂質と結合したチミジンのピレン接合体（conjugate）を用い、小胞から受容体へのチミジンの自然転移をモニターし、；高レベルの自然転移が観察された。
【０００６】
ピレンは、非特許文献４により標識としても使用された。この著者らは、ピレン−標識リン脂質を使用して、消光した供与体リン脂質管からHDL3粒子へのピレン−標識リン脂質の転移をモニターして本酵素の特異性を検討した。
【０００７】
非特許文献５もまた、ジアシルグリセロールによるリン脂質の転移の調節を検討することに関し、ピレン−標識ホスファチジルコリンを用い、種々のタイプの小胞からHDLへの転移を測定した。
【０００８】
ピレンはしばしば自己消光すると言及される一方、実際にはそうではない。ピレンは、モノマー／エキシマー発光断面を有し、それによって低濃度でモノマーが390nmで蛍光を発するが、より高い濃度で発光は470nmにシフトする。390/470の強度の比が測定される；しかしながら、この比もまた粘度と温度に依存する。それゆえ、ピレンは、厳密には、自己消光発光体ではない。
【０００９】
最後に、非特許文献６は、N-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イル（N-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl；NBD）を標識として使用してリン脂質の往来を測定した。この論文はPLTPのレベルの測定法とは関係がない；むしろ、種々の情況におけるリン脂質の移動を測定する。
【００１０】
PLTP活性の測定は、極めて高い供与体から受容体への自然転移のバックグラウンドにより不利益となる。加えて、多くの先行技術の測定法は不均一な測定法であり、それゆえ測定がされる前に受容体からの供与体の分離が要求される。本発明は、自然転移のバックグラウンドを最小限にし；一つの形態において、測定が、均一な測定として行われ、それゆえ簡便である。
【００１１】
【特許文献１】米国特許第5,610,019号公報
【非特許文献１】Tall, An.Rev.Biochem. (1995) 64:235-237
【非特許文献２】Hailman,E.,et al., J.Biol.Chem. (1996) 271:12172-12178
【非特許文献３】Oskolkova,O.V.,et al., Chem.Phys.Lipids (1999) 99:73-86
【非特許文献４】Huuskonen,J.,et al., Biochem/Biophys.Acta (1996) 1303:207-214
【非特許文献５】Lalanne,F.,et al., J.Lipid Res. (2001) 42:142-149
【非特許文献６】Nichols,J.W., Seminars in Cell and Developmental Biology (2002) 13:190-184
【発明の開示】
【００１２】
本発明は、信号対雑音比を改善したPLTP活性の測定法に関する。一つの形態において、この測定法は、操作をより少なくし、かつ測定を容易にする均一な測定法である。
【００１３】
したがって、一つの視点において、本発明は、試料中のPLTP活性を測定するための方法に関する。そしてその方法は、標識PLTP基質を含む供与体粒子であって、水性核を有する供与体粒子と、受容体エマルジョン（乳濁液）とともに供与体粒子が破壊される（崩壊する）浸透圧条件下において前記試料を含む反応混合物を保温すること、及び当該受容体中に組み込まれる標識の量を測定すること、並びにこのようにしてPLTP活性を測定することを含む。
【００１４】
一つの形態において、前記受容体中に組み込まれた標識の量の測定が混合物自体において、均一な測定法で、行われる。
【００１５】
別の視点において、本発明は、前記方法を行うためのキットであって、標識PLTP基質と水性核とを含む供与体粒子を含むキットに関する。当該キットは、受容体エマルジョンと供与体粒子における浸透圧を高めるための溶質とをまた含んでもよい。本キットは測定を行うための指示書を含むであろう。
【００１６】
他の視点において、本発明は、PLTPをコード化する遺伝子における欠損のスクリーニング、PLTP活性を調節する化合物を同定すること、冠状動脈疾患危険度を測定することを含むPLTP活性と相互に関係する医学的状態を評価することに関する。これらの適用のすべてにおいて、本発明の測定方法が用いられる。医学的状態又は遺伝子欠損の評価のため、検査されるべき被検体（被験者）からの試料（サンプル）中のPLTP活性を、正常な被検体に由来する試料の活性と比較する。この値を、予め記録しておいてもよい。この酵素の活性を調節する化合物を同定する方法において、その化合物の存在下及び非存在下において該酵素活性が比較される。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
異常なPLTP活性は、高脂血症、Apo-Bを含むリポ蛋白質のレベルで増加した分泌、及び心臓病を含む多数の状態と関連付けられている。異常なPLTP作用は、規定食、処方薬、及び運動養生法により容易に対処できる。それゆえ、正確で、かつ結果の解釈を困難又は不正確にするバックグラウンドレベルの障害のないPLTP活性の測定法を提供することは重要である。
【００１８】
本発明は、信号と比較してバックグラウンド読み取りの低減をもたらす測定法を提供する。その測定法は、供与体粒子の崩壊を引き起こすために十分な浸透圧を与えることによって水性核を含む供与体粒子を崩壊することに基づいている。この方法において供与体粒子を改良することによって、受容体への基質の自然転移が顕著に低減される。
【００１９】
その測定に関与するものは、転移されるべき部分に相当する標識基質、基質がもともと存在する供与体粒子、及び基質が転移される部分である受容体エマルジョン、である。
【００２０】
PLTPの基質は、酵素が転移を可能とする部分であろう。そのような部分は、ジアシルグリセロール類（diacylglycerols；DG）、スフィンゴミエリン（sphingomyelin；SM）、リポ多糖類（lipopolysaccharides；LPS）及びビタミンＥと同様に、ホスファチジルコリン（phosphatidylcholine；PC）、ホスファチジルエタノールアミン（phosphatidylethanolamine；PE）、ホスファチジルイノシトール（phosphatidylinositol；PI）、及びホスファチジルセリン（phosphatidylserine；PS）等のリン脂質を含む。他の可能性ある基質は、それらのこの酵素によって転移される能力を確かめるために、本発明の測定法において試験されてもよい。
【００２１】
供与体粒子は、１又はそれ以上の水性核を取り巻く、脂質被膜を含む。そのような部分は、一般にリポソームとして知られ、単一層状又は多重層状であり得る。基質自体が供与体粒子の構造を構成する疎水性層の要素であるかもしれない。実際に、供与体粒子は、もっぱらPLTP酵素のための基質からなるかもしれない。一又は他の構成成分を基質として指定することは標識化により行われる。
【００２２】
したがって、供与体粒子として作用するリポソームは通常、上述した基質等のリン脂質を含むであろうが、トリグリセリド及びコレステロール等の天然の脂質等の他の成分をも含んでもよい。リポソームの成分は、正荷電した脂質、負荷電した脂質、及び中性の脂質を含んでもよい。自己消光蛍光体が標識として使用される場合には、その成分の比は、基質として指定される成分を過剰に用いる；標識として使用しなければその比はより変化してもよい。一般的には、リポソームの添加成分に対する基質の比は、自己消光標識の場合において、ほぼ5：1から2：1程度である；他の許容比はありふれた最適化により見出されるだろう。供与体粒子として作用するリポソームの一般的な成分は、ジパルミトイルホスファチジルセリン（dipalmitoyl phosphatidylserine；DPPS）、ジステアロイルホスファチジルセリン（distearoyl phosphatidylserine；DSPS）、ジラウロイルホスファチジルセリン（dilauroyl phosphatidylserine；DOPS）、ジミリスチルホスファチジルセリン（dimyristyl phosphatidylserine；DMPS）、及びリン酸塩部分がエタノール、コリン、イノシトール等と結合された対応するリン脂質を含む。このリストは単に例示的なものであり、包括的なものではない。
【００２３】
受容体は、典型的には、脂質ベースの粒子を含むエマルジョンであり前記粒子は水性核を欠き又は、理論上、高浸透圧の水性核を含む。一般的なエマルジョンは、例えば、高密度リポ蛋白質粒子を含み、又はトリグリセリドから形成されたミセルを含む。受容体エマルジョンはまた安定性のため蛋白質を含んでもよい。しかしながら、受容体を特徴づけているものは、乳化した脂質が水性核を含まないエマルジョンであるということである。
【００２４】
供与体粒子の調製は、A.S.Janoff,ed., “Liposomes: Rational Design”, Marcel Dekker, Inc., NY、に記載されたような技術において公知の一般的な方法を使用して、又は技術において一般的に公知の代替技術によってもなされる。一般的に、脂肪親和性の成分は有機溶媒中に溶解され、及び水性緩衝液中で超音波処理又は微流体化される。基質はリポソームの構造成分であるので、被包のための特定の操作を行うこと、又は未被包性材料の除去のための操作を施すことは不必要である。
【００２５】
受容体成分は、多数の中性の脂質でエマルジョンとして調製され、好ましくは、安定剤としていくつかの蛋白質を含む。その他の受容体は、リポ蛋白質（例えば、HDL、LDL、及びVLDL）と、例えば、コレステロール25mg/dL、蛋白質（カゼイン又はApo-AI）1〜15mg/ml、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジル−Ｌ−セリン、ホスファチジル−ＤＬ−グリセロール、リソホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン及びカルジオリピンから選択されるリン脂質10〜200mg/ml、並びにトリグリセリドを含むリポ蛋白質と同様の合成エマルジョンとを含む。これらの脂質は、リポ蛋白質において見出されるのと同様の範囲での質量で存在してもよい。これらのエマルジョンは、同様に超音波処理又は微流体化により調製される。一方、懸濁液の乳状又は固体状の形態等、市販の利用可能な懸濁液を適当な希釈溶液として使用してもよい。
【００２６】
一般的に、望ましい重量オスモル濃度（osmolality）を生ずるために効果的な溶質の濃度をもつ溶液が、供与体粒子の懸濁液と混合するより前に、受容体エマルジョンに加えられる；しかしながらその溶質溶液は、測定のときに、加えられてもよい。
【００２７】
供与体粒子中に含まれる基質は、供与体粒子から受容体への基質の進行を追跡するであろう標識を含む。測定が不均一な系で行われる場合には、受容体及び供与体粒子は最終的に分離されるので、実質的にいかなる標識をも使用することができる。例えば、受容体自体は、抗体又はその断片又はビオチンのような特定の結合対の要素と結合され、反応混合物から種々の時間で除去され標識量が測定される。したがって、この場合、基質は、放射性同位元素、蛍光を発する部分、酵素（そのとき標準の酵素をベースとする測定を使用して測定されうる）又は他のどれよりも適した、技術において公知の標識と標識付けされてもよい。それゆえ、例えば、特許文献１に記載された不均一な測定法を、標識供与体VLDL又はLDLの代わりに、本発明の供与体粒子を用い、浸透圧を調整することによって本発明の方法に適合させることができる。特許文献１に記載された測定において、受容体はビオチン化したHDLであり、基質はトリチウム化したホスファチジルコリンである。ストレプトアビジン共役ビーズ（streptavidin coupled beads）を使用して分離された受容体へのトリチウム化した基質の転移は、シンチレーションカウントによって測定される。本発明の供与体粒子及び浸透圧を使用してそのような測定を行うときは、自然転移のレベルを低下させることよる優れた結果を与える。
【００２８】
しかしながら、好ましい方法において、測定は、環境に依存する特性を変えるべく標識の能力を利用することによって均一な系で行われる。特に好ましい標識は、濃厚な環境から移したときに蛍光分子が近くにないために高められた（向上した）蛍光性を示す、自己消光蛍光分子である。あるいは、蛍光の強度は、単純に環境に依存して本質的に変わる。例えば、抗体と結合したときに、ルビジウム複合体、ｐ-アゾフェニルアルソン酸、及びフルオレセインは消光される一方、ε-ダンシルリジンに対して生じた抗体は、その抗体と結合したときこの化合物の蛍光性を高めるということが知られる。受容体エマルジョンは、蛋白質を含んでもよいので、標識又は基質に対して特異的である抗体を含んでもよく、それゆえ標識の蛍光特性に影響を及ぼす。その信号が環境によって影響を及ぼされる部分（moiety）の他の例は、「量子点（quantum dots）」として知られる金属原子のクラスターであって、それらの蛍光特性がこれらが見出される環境の作用であるものを含む。例えば、参照によりここに組み込まれる米国特許第6,207,392号公報を見よ。
【００２９】
他の標識であって、その信号が環境によって影響を及ぼされるものは、水性環境への暴露が、生じた信号に顕著に影響を及ぼす核磁気共鳴を示す材料を含む。
【００３０】
したがって、均一な測定において使用するため、基質と結合する標識は、供与体粒子から受容体エマルジョンへ転移するとき、その信号が変化するようなものであろう。好ましくは、ダンシル、ローダミン、フルオレセイン、BODIPY等の自己消光蛍光標識である。
【００３１】
特に好ましい標識は、ホスファチジルエタノールアミン等のリン脂質と容易に結合して基質NBD-PEを与えることのできる蛍光性自己消光部分ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イル（NBD）である。
【００３２】
測定を行うために、緩衝液中の供与体粒子の懸濁液は、受容体エマルジョンと、及び1.05〜1.15ｇ/mlの範囲内の密度（濃度）で臭化ナトリウムを含む溶液によって与えられる重量オスモル濃度と同等の重量オスモル濃度を与える溶質の溶液と、接触される。この浸透圧のレベルで最適な結果が得られるということは明らかである。1.1g/mlの臭化ナトリウム溶液によって発揮される浸透圧と同等の浸透圧が特に好ましい。それゆえ、2.5〜2.7の重量オスモル濃度が好ましい。
【００３３】
溶液の重量オスモル濃度が臭化ナトリウム溶液の密度によって記述される一方、どのようなイオン塩もほぼ同等の浸透圧を発生させるために使用してもよい。したがって、溶性硫酸塩又はリン酸塩と同様に臭化カリウム、塩化ナトリウム、臭化ナトリウム及び他のハロゲン化物もまた使用することができる。臭化ナトリウム及び臭化カリウムが好ましい。
【００３４】
それゆえ、塩化ナトリウム、臭化ナトリウム、又はほぼ同等の浸透圧を与えることが可能な他の塩が、試料の反応混合物、供与体粒子、及び必要な浸透圧を与えるために十分な量で緩衝液中に懸濁された受容体エマルジョンに加えられる；一方、塩溶液は、受容体組成物中に含まれてもよい。供与体粒子及び受容体エマルジョン、緩衝溶液中の全て、は適当な浸透圧で、転移をもたらすために十分な時間、一般的には約5〜30分、好ましくは8〜20分、約30〜37℃で維持される。その転移を、混合後、種々の時間で上記の標識の転移によって観察することができる。その信号は、標識の選択のために適した方法で観察される；好ましい形態において、自己消光標識の蛍光性の増加が、均一な測定法で測定される。
【００３５】
標識の転移を、PLTP活性を調節すること；モジュレーターとしてそれを確認するような化合物の非存在の場合と比較して存在する場合の転移の減少又は増加、をなしそうなものである化合物の存在下及び非存在下において、比較することができる。同様に、試験試料におけるPLTP活性の減少又は増加は、標準品と比較して、標準品と試験試料との間の差違を示す。もしも標準品が、正常な被検体（被験者）又は被検体の母集団からの生物学的な試料中に存在する活性を含む場合には、その試験試料における偏差は、試料が採取された被検体における異常性を示す。
【００３６】
測定の一つの形態の一般的な原理を、図１及び２に示す。図１は、脂質二重層の基質成分が標識と結合されるということを示すリポソームを単純に模式化したものである。図２は、PLTPの存在下の受容体エマルジョンへの標識基質の転移を示す。認識されるように、供与体粒子及びレセプターが存する緩衝液に対して浸透圧を与える際に、標識基質が、蛍光性の増加をもたらす受容体エマルジョンへPLTPによる触媒作用を及ぼされる反応において転移される。
【００３７】
本発明において有用な成分は、少なくとも緩衝液中に懸濁されたか又は凍結乾燥された標識供与体粒子を備えるコンテナ及び、任意に、反応混合物において供与体粒子と混ぜたときに適当な浸透圧を与えるであろう張性で受容体の緩衝溶液を含むコンテナを含むキットの形態でも提供される。また、含まれるものは、一連の測定を行うための指示書である。もしも望むならば、ただ標識供与体粒子のコンテナのみが、受容体エマルジョン及び浸透圧付与材料の調製のための指示書といっしょに、備えられてもよい。受容体懸濁液を乳状液等の簡単な材料から調製してもよいし、適当な浸透圧を得るための塩を容易に入手できるので、使用者に簡単にこれらの化合物の添加のための指示を与えることで十分であろう。
【００３８】
（適用）
本発明の測定法は、医学的な状態を評価するために適用されてもよい；これらの状態は、高脂血症、ApoBを含有するリポ蛋白質の増加した分泌及びレベル、並びに冠状動脈疾患に対する危険因子を含むがこれらに限定されない。これらの状態は、PLTP活性に作用する薬剤で治療されてもよい。
【００３９】
その測定は、試験被検体に由来する生物学的流体（biological fluid）について行われる。ここに使用されるように、「生物学的流体」は、PLTPを含むことが期待される被検体に由来する流体をいい、又はPLTPを含むことが期待されるであろう生検実施した器官からの抽出物である流体である。最も好都合には、測定が血漿又は漿液（serum）について行われる。しかしながら、実験者の関心に依存して、他の生物学的流体を使用してもよい。関心のある、いかなる脊椎動物門に属する被検体（被験者）も、生物学的流体の源（原料）として使用してよい；最も一般的には、測定は、ヒト試料について行われるだろう。しかしながら、測定はまた、獣医学治療のために、家畜、コンパニオンアニマル（ペット）、動物園動物及び獣医学的処置の対象となる他の種の動物におけるこれらのレベルを測定することにおいて有用である。
【００４０】
一例として、食事改善養生法は、PLTPの誘導、活性、転写又は翻訳に直接作用する専門的な健康管理によって処方されてもよい。ベースラインのPLTP値は、ここに記載された方法又はキットを使用して被検体について測定される；これは、被検体の種、表現型、年齢、性及び／又は遺伝子型について、正常と考えられるあらかじめ測定された範囲の値と比較される。被検体のPLTP値が基準から外れる場合、食事改善養生法、PLTP活性を調節する化合物、PLTP遺伝子の転写／翻訳に影響を及ぼす化合物、運動養生法、又はこれらの組み合わせを含んでもよい、PLTP活性に作用する治療法に、委ねられる。
【００４１】
それゆえ、測定方法の適用は、被検体の治療の経過中、被検体におけるPLTPのレベル及び／又は活性を調節する治療の能力を評価する。その治療は、PLTPの活性の抑制又は増強を通じて、或いはこの酵素の生成の抑制又は増強により、有効であるかもしれない。もしも後者の場合には、その治療は、この蛋白質をコード化する遺伝子の転写若しくは結果としてのRNAの翻訳又はその両方を制御することを通じて、効果を現すかもしれない。
【００４２】
PLTPの活性を調節するための化合物又はプロトコルの能力はまた、前記記載の化合物の存在下及び非存在下において測定を行うことによって生体外で測定されてもよい。PLTPの既知のレベルの活性に対する化合物の効果は、活性の抑制因子又はエンハンサーとしてそれを同定するのに十分である。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、これらの実施例により本発明は制限されない。
【００４４】
［実施例１］標準試料におけるPLTPの測定
供与体粒子はホスファチジルコリン（PC）及びNBDと結合したホスファチジルエタノールアミン（PE）からなる。構造リン脂質、PC、の残渣に対する標識基質NBD-PEの比は、十分な自己消光をさせるために＞50％でなければならない。
【００４５】
二つの供与体粒子の組成物を調製した：
組成物Ａ：  10.458mmolのNBD-PE＋4.482mmolのPC；又は
組成物Ｂ：  10.458mmolのNBD-PE＋2.6145mmolのPC。
【００４６】
組成物Ａ又は組成物Ｂを含む混合物をクロロホルム中に溶解し、得られた混合物をアルゴンの存在下乾燥させた。極微量の溶媒を真空下で除去した。各組成物を含む容器に、10ml緩衝溶液（10mM  Trizma/150mM  食塩水/pH7.4＋1mM  EDTA）を加えた。その混合物を30℃で30分間超音波処理し、遠心分離して、粒子を除去し、懸濁した供与体粒子を4℃又は25℃で保存した。以下の測定においては、組成物Ｂに由来する供与体粒子を使用した。
【００４７】
第一の測定において、受容体エマルジョンは、1.006g/mlとなるように透析した高密度リポ蛋白質（HDL）を含み、1.4g/mlのNaBrと1:1で混合した。
【００４８】
反応混合物は、50μl受容体エマルジョン；2.5μlの供与体粒子試料、42.5μの測定緩衝液（10mM  Trizma/150mM  NaCl/1mM  EDTA）及びブランク、不活性化PLTP、又は2.5μg/ml  PLTPを含む5μlの試験溶液を含有する。不活性化PLTPは、37℃15分間、1/5容積の抗血清又は食塩水で保温することによって、調製した。
【００４９】
測定混合物を30℃で保温した。蛍光強度を、465nmの励起波長及び535nmの発光波長を使用して0、8分、及び16分の時間で読み取る。三つの独立した測定の平均として記録された蛍光強度単位（fluorescence intensity unit；FIU）を、表１に示す。
【００５０】
【表１】
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【００５１】
表１に示したように、ブランクは16分間において最小の転移を示す。同様に、不活性化PLTPを含む測定において小さい転移が引き起こされる。しかしながら、PLTPの添加は蛍光強度において劇的な増加をもたらす。
【００５２】
第二の測定を、受容体として、ここにトリグリセリドエマルジョン（triglyceride emulsion；TGE）として定義される混合物を用いて行った。この受容体は、1.4g/mlのNaBrとの1:1の混合物であって、25mg/dlコレステロール；5mg/mlカゼイン；140mg/dlリン脂質；及び700mg/dlトリグリセリドを含む超音波処理したエマルジョンである。
【００５３】
測定を、HDL受容体に関して、前記同様に行った。その結果を、25分の30℃保温後の蛍光強度単位として表２に示す。HDLを受容体として使用することを除いては厳格に同一の方法で行った測定の結果を表３に示す。これらに示されるように、どちらの測定においてもブランクは、25分保温後も0分と同等な値を示したが、PLTP活性のレベルは、トリグリセリドエマルジョンを受容体として用いたとき、約２倍高くなった。したがって、信号対雑音比は、TGE受容体を使用することによってほぼ２桁高められる。
【００５４】
【表２】
2005538680.tif 000003
【００５５】
【表３】
2005538680.tif 000004
【００５６】
［実施例２］標準曲線の決定
標準曲線を、供与体粒子試料の段階希釈物を使用して、作成した。5μlのNBD-PE供与体粒子調製物（1mM  NBD-PE）を2mlの100％イソプロピルアルコール中に分散させ、この分散体をIPAで連続的に希釈することによって調製した。表４に示す結果を用いて、希釈試料の蛍光強度（465nm励起、535nm放出）を読み取った。このようにして、標準曲線を、NBD-PEの0ピコモルから500ピコモルまでの範囲で、作成した。
【００５７】
【表４】
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【００５８】
蛍光強度（Ｙ）を、ピコモル（Ｘ）に対してプロットして、標準曲線を得る。回帰分析はNBD-PEの濃度と蛍光強度単位との間の直線相関に対して高い相関を示す。標準曲線のＹ切片と勾配を計算し、このようにしてFIUから転移したピコモルの全数の計算をする。統計データの分析により312.9のＹ切片及び59.6の勾配が得られる。
【００５９】
［実施例３］標準曲線の実験データへの適用
測定を、TGE受容体及び3μl血漿試料をPLTP活性の原料として使用して、実施例１において記載したのと同様に行った。その結果を図３に示す。
【００６０】
実施例２の標準曲線をこれらの結果に適用して、試料中で転移したNBD-PEのピコモルを表す値を計算することができる。40分時点で、読み取るFIUは、約1900であり；読み取る平均ブランクは約600であり、このようにして、約1300の触媒作用を及ぼした転移によるFIUの値を得る。線形方程式を適用して、40分における3μl血漿により転移した約17ピコモルの値が得られる。
【００６１】
［実施例４］最適オスモル濃度の測定
測定を、1.006g/mlから1.2g/mlまでにおよぶ反応混合物の密度に帰着するようにNaBrの濃度を変化させることを除いてはTGE受容体を使用して実施例１に記載したのと同様に行った。その結果を、ブランクによって生じた蛍光に対する、試料を含むPLTPによって生じた信号の比として、図４に示す。示したように、最も高い比、3.5、は、1.1g/mlの密度で生ずる。
【００６２】
加えて、これらの結果は、これらの塩濃度で蛍光単位により測定されたように、自然転移のレベルに関してプロットされた。示したように、自然転移は1.1〜1.14g/mlのNaBrの密度レベルで最小限に抑えられる。
【００６３】
以上より理解されるように、塩濃度の特定の密度によって生ずる重量オスモル濃度は、塩の性質に依存する。NaBrの1.1g/ml溶液は、2.67重量モル単位の重量オスモル濃度を生ずる一方、KBrの1.1g/ml溶液によって生ずるそれは、2.52重量モル単位である。重量オスモル濃度に関して、最適値は2.5〜2.7重量モル単位の間である。したがって、MgCl2、NaCl等の他の塩の対応する濃度を計算することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】基質を含む典型的な供与体粒子を示す。
【図２】PLTP測定法を模式図化したものである。
【図３】PLTPの原料として血漿を使用する際の基質転移の時間経過を示すグラフである。
【図４】反応混合物の浸透圧の関数として、PLTPの非存在下と比較して、PLTPの存在下において観察した蛍光単位の比を示すグラフである。
【図５】浸透圧の関数として、受容体への基質の自然転移によって生じた蛍光単位を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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