(57)【要約】候補薬剤が酸化的薬剤代謝酵素(DME)によって代謝するかを求めるために電気化学分析に用いられる電極が記載される。第一タイプの電極においては、DMEが電極の表面に固定化されている。第二タイプの電極においては、電極の表面が化学基の共有結合付加又は非共有結合付加によって修飾され、電子の電極から溶液中のDMEへの効率的な移動を可能にする。電気化学分析における電極の使用、及び電極を含む電気化学反応チャンバが記載される。
2005531764.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電極の表面に固定化された酸化的薬剤代謝酵素(DME)を含み、電子の電極からDME内の触媒部位への効率的な移動を可能にする電極。
【請求項２】
DMEがリンカーによって電極の表面に固定化されている、請求項1記載の電極。
【請求項３】
DMEが電極の表面に共有結合で固定化されている、請求項1又は2記載の電極。
【請求項４】
DMEが電極の表面に非共有結合で固定化されている、請求項1又は2記載の電極。
【請求項５】
電極の表面が化学基の共有結合付加又は非共有結合付加によって修飾されている、請求項1〜4のいずれか1項に記載の電極。
【請求項６】
電極が金電極であり、化学基がオルガノチオレート化合物である、請求項5記載の電極。
【請求項７】
電極表面がイオン導電率の高い機械的且つ化学的に安定な高分子ゲルで被覆され、DMEが高分子ゲルマトリックス内にトラップされている、請求項1、2又は4記載の電極。
【請求項８】
DMEが多くの正に荷電した表面残基をもつ場合には、高分子ゲルが高割合のカルボン酸基を有するポリマーを含んでいる、請求項７記載の電極。
【請求項９】
DMEが表面に多くの負電荷をもつ場合には、高分子ゲルが高割合のアミン基を有するポリマーを含んでいる、請求項7記載の電極。
【請求項１０】
DMEが主に疎水性表面をもつ場合には、高分子ゲルが高割合の脂肪族基を有するポリマーを含んでいる、請求項７記載の電極。
【請求項１１】
DMEが、脂質膜によって電極の表面で固定されているCYPである、請求項1、2、又は4記載の電極。
【請求項１２】
膜が、電極の表面に付着した、長鎖脂肪酸、脂質、又は類似分子を含んでいる、請求項11記載の電極。
【請求項１３】
リンカーが非局在電子系を含んでいる、請求項2記載の電極。
【請求項１４】
リンカーが、ヒドロキシル基、アミド、アミン、カルボン酸基、芳香族基、環式基、複素環基、例えば、チオフェン、又は窒素含有複素環基、例えば、ピリジン、プリン、又はピリミジン、エノール、エーテル、ケトン、アルデヒド、チオール、チオエーテル、ハロ-、ニトロ-、ホスホ-、又はスルフェート基を含む、請求項2、3、4、又は13記載の電極。
【請求項１５】
リンカーがメタロセン、フラビン、キノン、又はNADHを含んでいる、請求項2、3、4、13、又は14記載の電極。
【請求項１６】
リンカーがフェロセンを含んでいる、請求項15記載の電極。
【請求項１７】
フェロセンが下記式の化合物である、請求項15記載の電極。
【化１】
2005531764.tif 000014
(式中、R1は、次の基: チオール、チオエーテル、アミド、アミン、カルボン酸、複素環基、例えば、チオフェン、又は窒素含有複素環基、例えば、ピリジン、プリン、又はピリミジンのいずれかであり;
R2-10は、独立して次の基: ヒドロキシル基、アミド、アミン、カルボン酸基、芳香族基、環式基、複素環基、例えば、チオフェン、又は窒素含有複素環基、例えば、ピリジン、プリン、又はピリミジン、エノール、エーテル、ケトン、アルデヒド、チオール、チオエーテル、ハロ-、ニトロ-、ホスホ-、又はスルフェート基のいずれかである。)
【請求項１８】
化学基の共有結合付加又は非共有結合付加によって修飾された表面をもち、電子の電極から可溶化されたDME内の触媒部位への効率的な移動を可能にする電極。
【請求項１９】
電極が金電極であり、化学基が、電極の表面に強い結合を形成するSH基と、可溶化されたDMEと相互作用するのに適した官能基をもつオルガノチオレート化合物である、請求項18記載の電極。
【請求項２０】
化学基が非局在電子系を含んでいる、請求項18記載の電極。
【請求項２１】
化学基が、ヒドロキシル基、アミド、アミン、カルボン酸基、芳香族基、環式基、複素環基、例えば、チオフェン、又は窒素含有複素環基、例えば、ピリジン、プリン、又はピリミジン、エノール、エーテル、ケトン、アルデヒド、チオール、チオエーテル、ハロ-、ニトロ-、ホスホ-、又はスルフェート基を含んでいる、請求項18又は20記載の電極。
【請求項２２】
化学基がメタロセン、フラビン、キノン又はNADHを含んでいる、請求項18、20、又は21記載の電極。
【請求項２３】
化学基がフェロセンを含んでいる、請求項22記載の電極。
【請求項２４】
フェロセンが下記式の化合物である、請求項23記載の電極。
【化２】
2005531764.tif 000015
(式中、R1は、次の基: チオール、チオエーテル、アミド、アミン、カルボン酸、複素環基、例えば、チオフェン、又は窒素含有複素環基、例えば、ピリジン、プリン、又はピリミジンのいずれかであり;
R2-10は、独立して次の基: ヒドロキシル基、アミド、アミン、カルボン酸基、芳香族基、環式基、複素環基、例えば、チオフェン、又は窒素含有複素環基、例えば、ピリジン、プリン、又はピリミジン、エノール、エーテル、ケトン、アルデヒド、チオール、チオエーテル、ハロ-、ニトロ-、ホスホ-、又はスルフェート基のいずれかである。)
【請求項２５】
請求項1〜17のいずれか1項に記載の第一電極と、第二電極を含む、電気化学反応チャンバ。
【請求項２６】
請求項25記載の複数の電気化学反応チャンバを含むデバイスであって、各電気化学反応チャンバの第一電極が異なるDMEを含んでいる、前記デバイス。
【請求項２７】
請求項18〜24のいずれか1項に記載の第一電極、第二電極、DMEを含む、電気化学反応チャンバ。
【請求項２８】
請求項27記載の複数の電気化学反応チャンバを含むデバイスであって、各電気化学反応チャンバの第一電極が異なるDMEを含んでいる、前記デバイス。
【請求項２９】
電気化学センシングのための請求項1〜28のいずれか1項に記載の電極、電気化学反応チャンバ、又はデバイスの使用。
【請求項３０】
薬物代謝を予測するための、請求項29記載の使用。
【請求項３１】
下記ステップを含む分析における請求項30記載の使用。
i)請求項1〜17のいずれか1項に記載の電極と、溶液中の候補薬剤を含む、電気化学反応チャンバを準備するステップ;
ii)変更電圧を該電気化学反応チャンバに印加するステップ;
iii)該電気化学反応チャンバに流れ込む電流を測定するステップ; 及び
iv)該候補薬剤がDMEによって代謝するかを測定された電流から求めるステップ。
【請求項３２】
下記ステップを含む分析における請求項30記載の使用。
i)請求項18〜24のいずれか1項に記載の電極、DME、溶液中の候補薬剤を含む電気化学反応チャンバを準備するステップ;
ii)変更電圧を該電気化学反応チャンバに印加するステップ;
iii)該電気化学反応チャンバに流れ込む電流を測定するステップ; 及び
iv)該候補薬剤が該DMEによって代謝するかを測定された電流から求めるステップ。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、例えば、候補薬剤が酸化的薬剤代謝酵素(DME)によって代謝するかを求める電気化学分析に用いられる電極及びその分析における電極の使用に関する。
【０００２】
概要
医薬産業の鍵となる関心領域は、薬剤が体内でどのように代謝するかという予測である。主な薬物代謝過程の1つ、第一相酸化は、酵素のシトクロムP450 [CYP]か又はフラビンモノオキシゲナーゼ(FMO)ファミリーによって仲介される。これらの酵素によって触媒される反応は、電気化学的に進むことができ、反応の進行は、単純電極系を用いてモニタすることができる。これにより、CYPや機能的に関連したFMOが電気化学センシングの理想的な候補物質になる。
【０００３】
背景
研究プログラムの間に確認されるリード化合物のどれを開発パイプラインに移すべきかを選ぶ場合に薬剤設計プロセスにおいて唯一の最重要な決定がなされる。種々の理由で(図1を参照のこと)、約90%の開発候補物質が市場に出される薬剤にならない。開発プログラムのコストは極めて高い(典型的には1分子につき£50M)ので、誤ってなされた場合には、開発候補物質の選択の財政的な不利益が大きい。このために、莫大な経費を負う前に市場にだされそうにない化合物を確認して‘早期に薬剤を落とす’有効な手段について医薬産業内での関心が強い。
開発の間に落とす候補薬剤の最も大きな一つの理由は、生きている動物又はヒトに導入される場合、それが容認できない特性を示すことである。これらの特性の集合名は、どのようにうまく分子が体内に入るか、種々の組織の中に配分されるか、生化学的に処理され、次に、胆汁又は尿中に排除されるかを包含するADME/Tox(吸収、分布、代謝、排出、毒性)、及び開発と臨床試験プログラムの間に見出すことができる予想外のあらゆる毒物的作用である。ADME/Tox予測は、現在の強い研究領域であり、次の3-5年にわたって拡大する市場である。
薬物代謝過程の多くがレドックス電位の変化を含んでいるので、電気化学センシングはADME/Tox領域内のいくつかの領域において果たす役割がある。それ故、全組織又は体液試料に関連して、薬剤分子と、それらの代謝作用を定量化する手段を与える。特に、単一酵素又は全器官レベルのどちらでも薬剤の代謝処理に従って行われる高感度で費用効果的な手段を与える。
【０００４】
薬剤代謝酵素[DME]は、薬剤、殺虫剤及び環境汚染物質を含む生体異物化合物(‘異種分子')の莫大な配列を解毒することに関与するタンパク質の多様なグループである。ほとんどが極めて広い基質特異性を有する: シトクロムP450 [CYP]とフラビンモノオキシゲナーゼ[FMO]ファミリーの個々の一部が50を超える構造的に多様な化合物を代謝させることは既知である。DME及びそれらの基質のための構造活性相関を理解することは、薬理学、毒物学、及び基本的な酵素学に影響を与える研究の重要な領域である。特に、分子が体内のCYPによって処理されやすいかを予測する能力は、医薬開発のために薬剤分子候補を選ぶ際に決定的に重要である。
概念的には、DMEは、2つのグループに分けられる。CYPやFMOを含む酸化的薬剤代謝酵素は、酸素原子の基質分子への導入を触媒し、一般には、ヒドロキシル化又は脱メチル化が生じる。これらの酵素は、レドックスによって進められ、それらが触媒する反応は、電気化学的に容易に行うことができる。UDP-グリコシルトランスフェラーゼ、グルタチオントランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、N-アセチルトランスフェラーゼを含む結合酵素ファミリーは、内在性小分子の生体異物へのカップリングを触媒する。これにより、通常は、より容易に排出される可溶性化合物が形成される。結合酵素は、レドックスによって進められないので、特に電気化学センシングに適していない。他の、まだ未確認のDMEもヒトゲノム計画の結果として見出だすことができる。例えば、最近発見されたCYP3A34は、現在、ある体組織において発現されることが示されたが、その正確な機能は現在不明である。それ故、ここでの考察は、本文に明確に言及される酵素に限定されていない。
CYPやFMOの酸化的薬剤代謝酵素は、反応を進めるのに必要とする電子をバイオリアクタチャンバ内で電極から直接電荷移動によって供給することができるので、電気化学デバイスのバイオセンサ成分として特に興味深い。実際、そのようなデバイスでは、追加の生物学的又は化学的成分、例えば、従来の試験管内分析において反応を進めるために必要であるコファクタや酸化還元酵素の補助的酵素が必要でない。
【０００５】
提唱されたバイオセンサ成分
シトクロームP450
CYP酵素は、大部分の薬剤を含む生体異物化合物の生体内変換の初期段階を触媒する(初回通過又は第一相代謝と呼ばれる過程)。これらの酵素は、典型的には酸素原子を基質分子へ導入する混合機能オキシダーゼの大ファミリーの一種であるので、更に化合物を分解する代謝処理が容易になる。50を超えるCYPアイソザイムがヒトにおいて存在することは既知であり、それらは17のファミリーと39のサブファミリーに分類されている。標準の命名においては、ファミリーは、数字、サブファミリーのための文字呼称、そのサブファミリの個々の部分を確認する第二の数字によって示される。
ヘム基、活性部位の鉄原子、結合した基質を示すCYP2C9の3D分子構造を図2に示す。
ヒトや動物においては、薬物代謝の大半はちょうどCYP1、2、3ファミリーのわずかな部分によって行われ、体内で最高濃度のCYPを含有している肝臓に主に起こる。図3は、異なるCYPファミリーによって代謝させた薬剤のパーセントを示す図である。CYP3A4、2D6、1A2、2C9は、ヒトにおいてCYPによる薬物代謝の大部分に関与するので、薬剤スクリーニングの観点から最も興味深いとみなされる。
CYPによる有機分子の酸化は非常に複雑であるが、全体の反応は次式に単純化され得る。
RH + O2 + NADPH + H+→ ROH + H2O + NADP+
コファクタNADPH(一般の電子伝達分子)からの電子はCYP内のヘム基に移され、ここで、分子酸素の活性化が起こる。基質(上記式においてはRとして示されている)は酸素原子の1つと反応し、その他は水に還元し、第二電子を必要とする。いくつかの研究から、この反応を進めるのに必要な電子を電気化学的に供給することができ、直接の電荷移動が嫌気的バイオリアクタ内の電極から生じることが示された。この場合、NADPHコファクタを必要としない。それ故、CYP酵素は、薬物代謝を予測するために電気化学センサへ組込む理想的な候補物質である。
【０００６】
一般に容認されたCyp触媒回路を図4に示す。基質が活性部位(1)に結合したときに反応が開始する。反応が更に進行する場合、基質は結合していないCypのヘム鉄原子に通常配位結合する水分子を置き換えるにちがいない。これは、5つの3dの電子が最大限に対にされる低スピン(1/2)状態から電子が最大限に不対である高スピン(5/2)状態へFe3+イオンのスピンの変化を伴う。これは、また、約100mVの鉄のレドックス電位の変化を引き起こし、熱力学的に有利であるCypのレドックス-パートナーによって鉄の還元をするのに十分である(通常はNADPH又はNADH)(2)。続いて、還元ステップによって、O2分子がFe3+イオンに隣接した別々の部位に結合する(3)。この状態は、安定せず、O2-を放出して容易に自己酸化する。しかしながら、第二電子の移動が起こる(4)場合には、触媒反応は続く。O22-は、周囲の溶媒からのプロトンと反応してH2Oを形成し(放出され)、活性酸素原子(5)が残る。次に、これは基質分子と反応することができ(6)、基質のヒドロキシル化形態を生成し(7)、次に、活性部位から放出される。
この反応サイクルを進める電子は、適当な酸化還元酵素によってレドックスパートナーから生体内で通常供給される。DMEの場合、レドックスパートナーは、通常は、酸化状態(NADP+)と還元状態間で切り替わるニコチンアミドアデノシンジヌクレオチドリン酸(NADPH)である。現在の試験管内DME分析は、適当な酸化状態のレドックスパートナーを再生させることができるかなり複雑な反応混合物を必要とする。
【０００７】
フラビンモノオキシゲナーゼ
CYP酵素のようなフラビンモノオキシゲナーゼは、酸素原子の1つの還元のための電子の供給源として分子酸素とNADPHを用いて有機化合物の酸化を触媒する。しかしながら、基質の非存在下で酸素とNADPHと反応して細胞内で活性化状態をとるという点でCYPと力学的に異なり、アミン、チオール、又はホスフェートのような求核基との相互作用は、触媒回路の完成に必要なものだけである。
活性化状態で平衡を保ちつつ安定したままの能力は、FMOアイソザイムの極めて広い基質特異性にありうる説明である。触媒作用に必要なエネルギーの本質的には全てが酸素-活性化中間体において捕獲されることと、大部分の他の酵素とは異なり、基質分子のアラインメント又はねじれは必要でないことが提唱された。結果として、FMOの活性部位は他の酵素より立体配置的に定義されず、様々な分子が基質として作用することできる。FMO3は、ヒト肝臓において最も多量の形であり、全体の薬物代謝の点でこの酵素ファミリーの優位な部分であると考えられる。
CYPに関しては、電気化学的に電子を供給することによってFMO仲介反応を進めることが可能であるので、これらも薬剤代謝を予測するために電気化学センサデバイスへ組込む理想的な候補物質である。
薬物代謝を予測するために電気化学センサへ組込む酸化的DMEの適合性にもかかわらず、それらは、電気化学的にまだ完全に利用されていなかった。酸化的DME仲介反応の速度論を電気化学的に研究するために、律速段階は酸化的DME触媒反応でなければならず、酵素への電子の移動であってはならない。大きな酸化的DME分子の比較的小さな拡散速度によって生じる電極表面での質量移行が遅いために、正確な運動データを得ることは可能でなかった。
酵素触媒反応を電気化学的に進める最も重要な態様の1つは、電子の電極から酵素内の触媒部位への効率的な移動である。この移動を最大にする1つの方法は、電極の表層で酵素を固定化することである。
本発明の第1態様によれば、電極の表面に固定化された酸化的薬剤代謝酵素(DME)を含み、電子の電極から酸化的DME内の触媒部位への効率的な移動を可能にする電極が提供される。
候補薬剤を代謝させるときに移動速度がDMEによる電子の消費率と少なくとも同程度に急速な場合には、電子の電極からDME内の触媒部位への効率的な移動が起こる。候補薬剤の代謝が電子の移動によって制限される場合には、DMEによる候補薬剤の代謝回転速度の正確な測定値は、DMEへの電子移動が律速段階になったときから可能でない。
【０００８】
典型的には、DME分子は毎秒約10-100基質分子を代謝回転する。Cyp触媒機序によれば、代謝回転する基質の各々の分子について2つの電子が消費される。従って、電極は、毎秒少なくとも20電子、更に好ましくは毎秒少なくとも40電子、最も好ましくは毎秒少なくとも200電子の速度で電子をDMEに移すことができなければならない。
電極は、あらゆる適切な電気導電材料、好ましくはグラファイト又は金属、最も好ましくは金であってもよい。
DMEは、電極の表面に、共有結合又は非共有結合で固定化することができる。
DMEは、リンカーによって電極に固定化することができる。リンカーは、電極に共有結合又は非共有結合で固定化することができ、DMEに共有結合又は非共有結合で結合することができる。
リンカーは、電子の電極からDME内の触媒部位への効率的な移動を可能にしなければならない。好ましくは、リンカーは非局在化電子系を含んでいる。
好ましくは、リンカーは、DMEを電極に固定化する1つ以上の電極結合基を含んでいる。結合基は、電極の動作電圧で電極との安定な結合を形成することができなければならない。金属電極に結合するための好ましい金属結合基としては、アミド、アミン、カルボン酸、複素環基、例えば、チオフェン、又は窒素含有複素環基、例えば、ピリジン、プリン、又はピリミジンが含まれる。金電極の場合、適切な官能基としては、チオール、チオエーテル、チオフェン、ピリジン、窒素含有複素環、カルボン酸、ほとんどの負に荷電した部分が含まれる(がこれらに限定されない)。
リンカーの物理化学的性質は、電極に固定化されたDMEの性質に釣り合わなければならない。特に、リンカーとDMEとの相互作用のギブズ自由エネルギーは有利でなければならない。結合に関するエンタルピーとエントロピーの変化は重要である。
結合のエンタルピーに関与する好ましい官能基としては、水素結合供与体及び受容体、例えば、ヒドロキシル、アミン、アミド、カルボン酸、芳香族系、複素環、エノール、エーテル、ケトン、アルデヒド、チオール、チオエーテル、更にハロ-、ニトロ-、ホスホ-、スルフェート基、又はこれらの基のチオール等価物が含まれる。好ましくは、リンカーは、これらの基の少なくとも2つ又は3つを含んでいる。
結合のエントロピーに関与する好ましい官能基としては、アミン、アミド、カルボン酸、芳香族系、環式基、特に複素環、エノール、エーテル、ケトン、アルデヒド、チオール、チオエーテル、ハロ-、ニトロ-、ホスホ-、スルフェート基が含まれる。
有機分子の多くの種類は、適切なリンカーを与える。これらは、メタロセン、フラビン、キノン及びNADHを含む(がこれらに限定されない)。
好ましいリンカーは、メタロセン、特にフェロセンを含んでいる。コバルトメタロセンやバナジウムメタロセンが好ましい。
遷移金属イオンが2つの芳香環、例えば、負に荷電したシクロペンタジエニルイオンにはさまれているという点でメタロセンは変わった構造を有する。
【０００９】
【化１】
2005531764.tif 000003
【００１０】
2つのシクロペンタジエニル環は、酸化又は還元状態で存在することができるフェロセンを形成するためにFe2+イオンに配位結合することができ、それによりDMEヘム基の活性部位に鉄の特性が反映している。
【００１１】
【化２】
2005531764.tif 000004
【００１２】
フェロセンは、特に、DMEの電荷の効率的な転送体である適当なレドックス電位を有する。それらは、酵素に対する結合特性を最適化するために使用し得る置換基をもつことができ、更に、電極の表面に強固に結合することができるように適当な化学基で官能基化することができる。
分子のレドックス電位と他の物理化学特性、例えば、形状、サイズ、疎水性、電荷等をモジュレートするために、化学基の付加によって官能基化することができるいくつかの位置がフェロセン骨格にある。これらの位置は、下記のマーカッシュ構造の標識R1〜R10によって示される。
【００１３】
【化３】
2005531764.tif 000005
【００１４】
フェロセン自体においては、全10の置換基位置が一つの水素原子によって占有されている。置換基は独立していない位置を必要とする。例えば、R1及びR2は、環構造によって共に結合されてもよい。それ故、R位置は、単に指標であり、フェロセンコア周辺で化学を変化させることが可能である。
R基の少なくとも1つは、電極に結合するための適切な官能基をもっていてもよい。例えば、金属の金がチオールのようなイオウ含有基に対する親和性が特に強いことは周知である。それ故、R基の1つがチオールをもっている場合には、分子に強い金結合能力を与えるにちがいない。この結合基がサンドイッチ構造の中心で電子の金属結合の部位から配位結合した遷移金属イオンへのすばやい移動を支持することができるならば(例えば、非局在電子系を含有することにより)、リンカーは、電子をDMEに供給する能力をなお有するにちがいない。金電極に結合するためのチオール基の多くの代替物及び電極材料としての金の多くの代替物がある。
リンカーのためにチオール含有基の使用が好ましく、その場合のDMEはフラビンモノオキシゲナーゼ、又はシトクロムP450以外の酸化的DMEである。
本発明に従ってDMEを電極の表面に固定化する適切な方法の他の例を次に記載する。
【００１５】
タンパク質-電極相互作用
固定化したタンパク質
電気化学的に酵素触媒反応を進める最も重要な態様の1つは、電子の電極から酵素内の触媒部位への効率的な移動である。この移動を最大にする1つの方法は、電極の表面に酵素を固定化することである。可溶化酵素を含む系を設計することができるが、早い段階の成功はおそらく表面固定化酵素を用いることによる。
【００１６】
共有結合で修飾した電極
例えば、金属(典型的には金のみでないが)又はグラファイトの電極の表面は、電子のタンパク質への移動をより受けやすくするするために、化学基の共有結合的付加によって修飾することができる。1つの手法は、金電極と共にオルガノチオレート化合物(SH基を有する)の使用を含むものである。チオール基は、金属表面に強い結合を形成し、分子の残りがタンパク質と相互作用する官能基に適している。
【００１７】
微孔性電解質膜
これらは高いイオン導電率を有する機械的且つ化学的に安定な高分子ゲルであり、薄層の形で電極の表面を被覆する。ゲルを含むポリマーはそれらのマトリックス内にタンパク質をトラップするのに適した環境、例えば、高割合の(典型的には少なくとも5O%)のカルボン酸基(多くの正に荷電した表面残基を有するタンパク質の場合)、アミン基(表面に多くの負電荷を有するタンパク質の場合)、又は脂肪族基(主に疎水性表面、例えば、CYPを有するタンパク質の場合)を与えるように選ばれなければならない。
膜は、少なくとも電極が用いられる実験の間、物理的に無傷で化学的に修飾されないままであるのに十分機械的且つ化学的に安定でなければならない。
高分子ゲルのイオン導電率は、候補薬剤を代謝させているときのDMEによる電子の消費率と少なくとも同程度の速い速度で、電子を電極からDMEへ移動することができるほど十分大きくなければならない。
適切な高分子ゲルには、非局在化電子を有するあらゆる大きなポリマー系が含まれる。
好ましい高分子ゲルとしては、炭水化物ゲル、例えば、多糖類ゲル、ポリピリジンゲル、セキシチオフェン含有ゲル、ポリ芳香族ゲルが含まれる。
高分子ゲルの孔サイズは、DME分子がゲルマトリックス内にトラップすることができるほど十分大きくなければならない。適切な孔サイズは、20-50nmである。
好ましくは、高分子ゲルは、電極の動作電圧でゲルの電極への安定な結合を可能にする金属結合基を含んでいる。適切な基としては、チオール、アミド、アミン、カルボン酸、複素環基、特に窒素含有複素環基、例えば、ピリジン、プリン、ピリミジン又はチオフェンが含まれる。
【００１８】
脂質膜
天然のCYP酵素は、通常は、リン脂質二重層内のアンカーとして作用する領域をほぼ独占的に含有するので、生体膜に結合して見られる。実際に、分析実験室において用いられるCYPは、通常は、このアンカードメインを取り出すために修飾されるので、酵素を可溶化することができる。脂質二重層膜に対するCYPの親和性は、電極の表面でそれらを固定する手段を与える。適切な膜は、表面に付着した、長鎖脂肪酸、脂質、又は類似分子を用いて構築することができる。
適切な鎖長は、C5-30、好ましくはC14-22である。分枝鎖は有利なものである。
界面活性剤は、適切な膜を与えると考えられる。
好ましくは、膜は、電極の動作電圧で電極への膜の安定な結合を可能にする金属結合基を含んでいる。適切な金属を結合している基としては、チオール、アミド、アミン、カルボン酸、複素環基、特に窒素含有複素環基、例えば、ピリジン、プリン、ピリミジン、又はチオフェンが含まれる。
金属結合基は、脂肪鎖に沿って又は端に組み込まれてもよい。
本発明によれば、例えば、候補薬剤、適切には生体異物が電極に固定化されたDMEによって代謝するかを求めるために、電気化学分析における本発明の電極の使用が提供される。
候補薬剤がDMEのための基質として作用する場合には、DMEによる候補薬剤の代謝回転が電子を消費する(例えば、反応が図4に示されるCyp触媒回路によって進行する場合、Cyp酵素は候補薬剤分子につき2つの電子を消費すると考えられる)。DMEによる電子の消費率は、電気化学反応チャンバの電極がDMEによって消費される速度と少なくとも同程度の速い速度で電子をDMEに供給するならば、電気化学反応チャンバを用いて測定することができる(そうでなければ律速段階が電子の移動であるので電子の消費率の正確な測定は可能でない)。オームの法則により、電圧増加が電気化学反応チャンバに加えられる場合には、電流の一定の直線的上昇が抵抗が一定である場合に起こることが予想される。しかしながら、候補薬剤がDMEのための基質として作用する場合、電子が反応によって消費されるにつれて、電流の一定の直線的上昇からの偏差がわかる。この偏差は、DMEによる電子の消費率、それ故、DMEによる候補薬剤の代謝回転の速度を算出するために用いることができる。この分析が候補薬剤の異なる濃度について行われる場合には、VmaxとKmを算出することができる。
【００１９】
適切な分析は、次のステップを含んでいる。
i) 本発明の電極と、候補薬剤を含む電気化学反応チャンバを準備するステップ;
ii) 変更電圧を電気化学的反応チャンバに印加するステップ;
iii)電気化学反応チャンバに流れ込む電流を測定するステップ; 及び
iv) 測定した電流から候補薬剤がDMEによって代謝するかを求めるステップ。
本発明によれば、また、電極と本発明の電極を含む本発明の分析を行うための電気化学反応チャンバが提供される。
本発明によれば、複数の電気化学反応チャンバを含むデバイスが提供され、各電気化学反応チャンバは電極と本発明の電極を含み、ここで、各々の電気化学反応チャンバ用の本発明の電極は、異なるDMEを含んでいる。
好ましくは、電極と本発明の電極は、例えば、グラファイト又は金属、好ましくは金の同一材料でできている。電極は、本発明の電極であってもよい。
その、又は各々の電気化学反応チャンバは、好ましくはマイクロ電気化学反応チャンバである。
また、電極からDME内の触媒部位への電子の効率的な移動が可溶化DMEを含む系において達成することができることが認められた。
本発明の第二態様によれば、電極から可溶化DME内の触媒部位へ電子の効率的な移動を可能にするために化学基の共有又は非共有付加によって修飾される表面を有する電極が提供される。
好ましくは、化学基は非局在電子系を含んでいる。
化学基は、好ましくは、電極の表面に強い結合を形成する官能基と可溶化DMEと相互作用するための官能基を含んでいる。
電極結合基は、電極の動作電圧で電極と安定な結合の形成が可能でなければならない。金属電極に結合するのに好ましい金属結合基としては、アミド、アミン、カルボン酸、複素環基、例えば、チオフェン、又は窒素含有複素環基、例えば、ピリジン、プリン、又はピリミジンが含まれる。
【００２０】
本発明の第一態様と同様に、化学基としては、イオウ含有基、例えば、金属の金に対して特に強い親和性を有するチオールが含まれてもよい。DMEがFMO、又はCYP以外の酸化的DMEであるそのような基が好ましい。
好ましい実施態様においては電極は金電極であり、化学基は電極の表面に強い結合を形成するSH基を有するオルガノチオレート化合物と、可溶化DMEと相互作用するのに適した官能基である。
有機分子の多くの種類は、適切な化学基を与える。これらには、メタロセン、フラビン、キノン、NADHが含まれる(がこれらに限定されない)。
本発明の第一態様に記載されているように、好ましい化学基は、メタロセン、特にフェロセンを含んでいる。コバルメタロセンやバナジウムメタロセンも好ましい。
化学基は基質又はDMEの阻害剤として作用してはならず、さもないと、DMEによる候補薬剤の代謝回転の速度の正確な測定が可能でないことが理解される。
本発明の電極に用いられる化学基は、酵素触媒反応を進めるために適切なレドックス電位を有しなければならない。化学基のレドックス電位と化学基に電子を供給する電気化学反応チャンバの電極の動作電圧の重要性を次に説明する。好ましくは、電気化学反応チャンバ内に電子を供給する電極の使用電圧は、DMEのレドックス電位より電気陰性であり、化学基のレドックス電位は、電極の使用電圧より電気陰性でないが、DMEのレドックス電位より電気陰性である。
酸化還元(レドックス)反応は、一方の化学種が電子を失い、もう一方がそれらを得るものである。化学種が電子を得る場合、それは還元されている。化学種が電子を失う場合、それは酸化している。全てのレドックス反応においては、還元と酸化は一緒に起こる: 一方は、もう一方なしで起こることができない。電子は、一方の化学種からのもう一方の化学種に流れる: 実効電荷利得又は消失がない。
電気化学セルによって生じる電気力はセル電圧で測定され、電気化学セル電圧はセル内で生じるレドックス反応や反応物の濃度に左右されるが、セルを通過する電子の数には左右されない。
【００２１】
我々はレドックス反応を2つの部分に分けることができるので、我々はまた、反応の酸化部分と還元部分双方の標準電圧を定義することができる、Eox0及びEred0。我々は、水素還元半反応を任意に選ぶことができる。
2H+(aq) + 2e- → H2(g)
Ered0 = 0であり、それに関係しているすべての他の半反応電圧が測定される。レドックス電位は、そのような基準反応と関連して常に示される。上に示された水素‘電極'に加えて、銀/塩化銀基準も一般に用いられ、標準電極系に関して半反応のための標準還元電圧値によって発表された大きな表がある。酸化半反応は単に逆に進む反応であり、半セル酸化電圧は還元電圧の負のものである。この意味での基準電極はレドックス差が定量化されることを可能にする‘ベースライン'レドックス電位を定義するために用いられる点に留意すること。例えば、レドックス電位が100mVだけ異なる化合物は、いかなる材料が実験電気化学セルにおいて基準電極に用いられても、この同じ違いを示す。
セル(E0)の標準電圧は、酸化還元半反応の標準電圧の合計である。すべての反応物が25℃で1M 濃度又は1気圧である場合、E0が測定される。‘0'上付き文字の使用は、値が標準状態の下で測定されることを示している。アポストロフィ(E0')の追加は、値が研究されている系に基準の条件下で測定されることを示している。生物系の場合、これは、pH、イオン濃度、温度の関連した生理的状態にある。レドックス反応が自然発生的かを求めるために、反応の電圧を計算しなければならない。電圧が正の場合には、反応は自然発生的であり、電圧が負の場合、反応は自然発生的でない。
一般反応の場合
2005531764.tif 000006
平衡定数の表現の形は下記の通りである。
K = [C]c[D]d/[A]a[B]b
ここで、Kは反応の平衡定数であり、[X]は化学種Xの濃度を示す。
反応指数、Qは下記のように表される。
Q = [C]c[D]d/[A]a[B]b
【００２２】
反応の反応指数の表現の式は、その反応の平衡定数表現と同じ式であるが、反応指数は、太字体の使用によって示されるように、電流濃度、平衡でないものを用いて計算される。平衡では、Q = Kである。Qの一使用は、現在の圧力又は濃度を用いてQを計算し、反応についてそれをKと比較することにより、反応が行う方法を求めることである。Q < Kである場合には、反応は右へ移動し、Q > Kである場合には、反応は左へ移動する。
セル電圧E0が、セル内の反応が自然発生的か否かを決定するので、ΔG、ギブズ自由エネルギーの変化に関連がなければならないことは明らかである。関係は次の通りである。
ΔG = -nFE
ここで、nはバランスのよいレドックス反応の間、交換される電子の数であり、Fはファラデー定数、9.648 × 104 C/molである。25℃の標準の濃度において、この式は次のように記述することができる。
ΔG0 = -nFE0
全ての他のようなレドックス反応は、平衡状態に達することができる。我々にはE0とΔG0の関係やΔG0とK間の関係があるので、我々は、セル電圧と平衡定数の関係を誘導することができる。
我々は、
ΔG0 = -nFE0
と
ΔG0 = -RT.ln(K)
があるので、2つの式を1つに合わせることができる。
E0 = (RT/nF).ln(K)
標準条件下に、RT/F項の値は0.0257Vであるので、我々は上記式を単純化することができる。
E0 = (0.0257/n).ln(K)
上記の式については、我々は、平衡定数からセル電圧の値を又はその逆に誘導することができる。
【００２３】
我々が平衡でKとEを関連させることができるのと全く同じ方法で、2つの関係を得るために非平衡性状態でΔGとEの関係をあわせることができる。我々には、次の関係がある
ΔG = ΔG0 + RT.ln(Q)
ΔG = -nFE
ΔG0 = -nFE0
3つの関係を合わせると、ネルンストの式が得られる。
E = E0 -(RT/nF).ln(Q)
この式は、セル電圧を反応物と生成物のあらゆる濃度で、また、あらゆる温度で我々が計算することを可能にする。我々は、前の通り結合定数によって式を僅かに単純化することができる。
E = E0-(0.0257/n).ln(Q)
本発明においては、化学基は、電極から電子を受け入れるので、還元されている。これが起こる程度は、上記の式を用いて算出することができ、電極電圧とレドックス電位の違いが電気化学反応チャンバの酸化還元した化学基の相対的な比率を決定することは明らかでなければならない。従って、化学基のレドックス電位と電極の動作電圧は、必要な方向で化学反応を進める際に決定的に重要である。類似した方法においては、化学基は、その後DME分子に電子を通過させるので、酸化されている。更にまた、2つの分子のレドックス電位の違いは、化学反応が起こる方向と、それに対する程度を求めるのに重要である。
典型的なCypのレドックス電位は-450mV(標準条件(E0')下のAg/AgCl基準電極に対して)であるので、この値は、適切な化学基に好ましいレドックス電位を決定するために用いることができる。標準Cyp触媒機序によれば、レドックス電位は、基質結合時に更に100mVほど低下する。各DMEは、特徴的なレドックス電位があるが、好ましい化学基の電位はAg/AgCl電極に対して範囲+/- 750 mVに包含されるようである。
化学基は、2つの電気化学反応に関与する:
2005531764.tif 000007
これらの反応のどちらも、DMEによって触媒される反応の速度より速い速度で、左から右の方向に移動しなければならない。次のように纏められる。
RH + 02 + 2H+ + 2e-→ H2O + ROH
ここで、Rは薬剤である。
【００２４】
記載してきたように、電気化学反応の方向はギブズ自由エネルギーの変化で求められ、次の式によって化学エンタルピーとエントロピーに関連がある。
ΔG = ΔH - T.ΔS
ここで、ΔHはエンタルピーの変化であり、ΔSはエントロピーの変化であり、Tは反応温度である。
ΔHは、主に相互作用、例えば、2つの相互作用分子間だけでなく、各相互作用分子と溶媒間の、化学(共有)結合、静電的相互作用、水素結合及びファンデルワールス相互作用で求められる。それ故、この成分に大きな影響がある官能基は、前記種類の強い相互作用を生じるものである。これらには、アミン、アミド、カルボン酸、芳香族系、複素環、エノール、エーテル、ケトン、アルデヒド、チオール、チオエーテル、更に、ハロ-、ニトロ-、ホスホ-又はスルフェート基が含まれる(がこれらに限定されない)。
ΔSは、主に系の自由度、例えば、各分子が移動又は回転することができる軸の合計数、回転可能結合の数、鎖状基の分枝鎖度、又は系内の合計原子数で求められる。更にまた、この成分は、相互作用分子間だけでなく、各相互作用分子と溶媒間で考えられることを必要とする。それ故、この成分に大きな影響がある官能基は、前記特徴に貢献するものである。前のように、これらには、アミン、アミド、カルボン酸、芳香族系、複素環、エノール、エーテル、ケトン、アルデヒド、チオール、チオエーテル、更に、ハロ-、ニトロ-、ホスホ-又はスルフェート基が含まれる(がこれらに限定されない)。
上記相互作用の多くは、ΔGの‘疎水的相互作用'成分に貢献し、芳香族系、水素結合受容体及び/又は供与体のような官能基と、荷電した基によって特に影響されることがある。
候補薬剤がDMEによって代謝する場合、DMEによる電子の消費率と少なくとも同程度速い速度で、好ましくは少なくとも2倍の速度で、化学基が電子を電極からDMEに移すことが可能でなければならないことが理解される。候補薬剤の代謝が電子の移動によって制限される場合には、DMEへの電子移動は律速段階になるので、DMEによる候補薬剤の代謝回転の速度の正確な測定が可能でない。
典型的には、DME分子は毎秒約10-100基質分子を代謝回転する。Cyp触媒機序によれば、代謝回転する各基質分子について2つの電子が消費される。従って、化学基は、毎秒少なくとも20電子、更に好ましくは毎秒少なくとも40電子、最も好ましくは毎秒少なくとも200電子の速度で電子を電極からDMEに移動することが可能でなければならない。
【００２５】
本発明の第二態様の電極は、例えば、候補薬剤、適切には生体異物が電極に固定化されるDMEによって代謝するかを求める電気化学分析で用いることができる。
適切な分析は、次を含んでいる。
i) 本発明の第二態様の電極、DME、溶液での候補薬剤を含む電気化学反応チャンバを準備すること;
ii) 変更電圧を電気化学反応チャンバに印加すること;
iii) 電気化学反応チャンバに流れ込む電流を測定すること; 及び
iv) 候補薬剤がDMEによって代謝するかを測定された電流から求めること。
本発明の第一又は第二態様の分析を行う際に用いるのに適した多くの考えられる実験方法の2つをここで添付図面に関して記載する。
反応は、本発明の電極を含む電気化学反応チャンバにおいて行われる。候補薬剤を水溶液に、好ましくは標準生理条件に密接に合致したpH、温度、イオン濃度で溶解する。増加電圧を電気化学反応チャンバに印加し、電流は測定する。抵抗が一定である場合にオームの法則で予測した電流の一定の直線的上昇から電流の偏差を、候補薬剤の異なる濃度について反応速度を算出するために用いる。次に、異なる反応速度を、DMEによる候補薬剤の代謝回転の最大速度(Vmax)と、Vmaxの半分を得る候補薬剤の濃度(Km)算出するために用いる。
電気化学反応チャンバは、適切ないかなるサイズであってもよい。数ミリリットル容量のベンチスケール容器が一般であるが、我々の好ましい反応チャンバは、数十又は何百ものナノリットルのマイクロフルイディクススケールデバイスに組み込まれる。電極はあらゆる適切な材料であってもよいが、金が好ましい。
種々の成分の典型的な濃度は1-100mMの範囲に入ると思われるが、より希釈状態が好ましい。
【００２６】
直線的掃引ボルタンメトリ(LSV)
線形掃引ボルタンメトリにおいては、図5に示されるように下限から上限まで電極電圧が走査される。電圧走査速度(ν)は、線の勾配から算出される。範囲を掃引するためにかかる時間を変えることにより、走査速度が変わることは明らかである。
ボルタモグラムが記録した線形掃引の特徴は、下記を含む多くの因子に左右される。
*電子伝達反応の速度
*電気活性化学種の化学反応性
*電圧走査速度
LSV測定においては、電流応答は、潜在的ステップ測定と異なり、時間よりむしろ電圧の関数としてプロットされる。
例えば、我々がFe3+/Fe2+系を考慮する場合には、
2005531764.tif 000008
図6に示されるボルタモグラムは電圧掃引から得られたFe3+のみを含有する電解質溶液を用いた単一電圧走査に見られる。
走査は、電流が流れない電流／電圧プロットの左側から開始する。電圧が更に右(より縮小する値まで)に掃引されるにつれて、電流は流れ始めて、最終的にはピークに達した後に低下する。この挙動を合理化するために、我々は、電極表面で確立された平衡に対する電圧の影響力を考慮することを必要とする。我々がFe2+へのFe3+の電気化学的還元を考慮する場合、電子移動の速度は電圧掃引速度に比べて速い。それ故、電極表面での平衡は、熱力学によって予測されたものと同じに確立される。ネルンストの式によって濃度と電圧(電位差)の関係が予測される。
2005531764.tif 000009
ここで、Eは印加電位差であり、E0は標準電極電位である。そのように、電圧がV1からV2へ掃引されるにつれて、平衡位置はV1の変換しない位置から電極表面の反応物のV2の完全な変換位置に移る。
【００２７】
ボルタモグラムの正確な形は、電圧や大量の運搬効果を考慮することによって合理化し得る。電圧が最初にV1から掃引されるにつれて、表面の平衡は変わり始め、電流が流れ始める。
2005531764.tif 000010
平衡位置が右側に更に移るので電圧が更にその初期値から掃引されるにつれて電流が上昇し、したがってより多くの反応物が変換される。ある点で、拡散層が電極より十分上に成長したのでピークが生じ、電極に対する反応物のフラックスがネルンストの式によって必要とされることを満たすほど速くない。この状況においては潜在的ステップ測定になったとたんに電流が低下し始める。
【００２８】
上記のボルタモグラムは、単一走査速度で記録された。走査速度が変えられる場合には、電流応答も変化する。図7は、Fe3+だけを含有する電解質溶液を異なる走査速度で記録した一連の線形掃引ボルタモグラムを示す図である。各曲線の形は同じであるが、走査速度の増加と共に総電流が増加することは明らかである。これは更にまた、拡散層のサイズや走査を記録するのにかかった時間を考慮することによって合理化することができる。走査速度が低下するにつれて線形掃引ボルタモグラムが記録により長くかかることは明らかである。それ故、電極表面より上の拡散層のサイズは、用いられる電圧走査速度によって異なる。遅い電圧走査においては、拡散層は、速い走査と比較して更に電極から非常に成長する。その結果として、電極表面に対するフラックスは、より速い速度より遅い走査速度でかなり小さい。電流が電極に向かうフラックスと比例しているので、電流の大きさは、低走査速度でより小さく、高速でより大きい。このことはLSV(と環式のボルタモグラム)を調べる場合の重要な点を強調しているが、電圧走査速度(従って、ボルタモグラムを記録するのにかかった時間)が見られた挙動に強く影響するグラフ上の時間軸はない。図7から認められる最後の点は最大電流の位置であり、ピークが同じ電圧で生じることは明らかであり、これは急速な電子移動速度論をもつ電極反応の特徴である。これらの急速過程は、可逆的電子伝達反応としばしば呼ばれる。
これにより、電子伝達プロセスが‘遅い' (電圧走査速度と相対して)場合に起こることに関して問題が残る。これらの場合、反応は、準可逆的又は不可逆的電子伝達反応と呼ばれる。図8は、還元速度定数(kred)の異なる値について単一電圧掃引速度で記録された一連のボルタモグラムを示す図である。
この状況においては、印加電圧により、ネルンストの式によって予測された電極表面の濃度が生じない。これは反応の速度論が‘遅い'ことから起こるので、平衡は急速に確立されない(電圧走査速度と比較して)。この状況においては、記録されたボルタモグラムの全体の形は、図8に示される図と類似しているが、可逆的反応と異なり、ここで最大電流の位置は還元速度定数(電圧走査速度も)によって移動する。これは、電流が可逆的場合より多くの印加電圧に応答するのに時間がかかることから生じる。
【００２９】
サイクリックボルタンメトリ
サイクリックボルタンメトリ(CV)は、LSVと非常に類似している。この場合、電圧は、固定比率において2つの値(図9を参照のこと)の間で掃引されるが、電圧がV2に達する場合、走査は逆転し、電圧はV1へ掃引される。
可逆的単一電極移動反応を記録した典型的な環式ボルタモグラムを図10に示す。更にまた、溶液は、単一の電気化学反応物のみを含有する。前方向掃引により、LSV実験に見られるものと同じ応答が得られる。走査が逆転する場合、我々は簡単に平衡位置に戻し、電気分解生成物(Fe2+)を反応物(Fe3+)へ段階的に変換させる。電流の流れは、ここで、溶液種から電極に戻るので、逆の意味で前方向ステップに生じるが、挙動は同じ方法で説明し得る。可逆的電気化学反応の場合、記録されたCVは、ある種のよく定義された特徴を持つ:
I) 電流ピーク間の電圧分離は、次の通りである。
2005531764.tif 000011
II) ピーク電圧の位置は電圧走査速度の関数として変化しない
III) ピーク電流の比は、1に等しい
2005531764.tif 000012
IV) ピーク電流は走査速度の二乗根に比例する
2005531764.tif 000013
可逆的電子移動の電流に対する電圧走査速度の影響は、図11に見ることができる。LSVと同様に、走査速度の影響は、拡散層の厚さの点から可逆的電子伝達反応が説明される。
電子移動が可逆的でない場合のCVは、それらの可逆的対応物からかなり異なる挙動を示す。図12は、還元、酸化速度定数の異なる値に対する準可逆的反応のボルタモグラムを示す図である。第1の曲線は、酸化、還元両速度定数がまだ速い場合を示すが、速度定数が低下するにつれて、曲線はより還元的電位に移動する。更にまた、このことは、表面での平衡がもはやそのように急速に確立しない点から合理化することができる。これらの場合、ピークの分離はもはや固定されないが、走査速度の関数として変動する。同様に、ピーク電流は、もはや走査速度の二乗根の関数として変動しない。走査速度の関数として、ピーク点の変動を分析することにより電子伝達速度定数の評価を得ることが可能である。
【００３０】
適用領域
理想的には、薬剤開発チームは、臨床試験を開始する前に、可能な副作用、例えば、CYP誘導/抑制や中毒性代謝産物の生成を含む経路の詳細な画像及びヒトにおける化合物の代謝の速度論をもつことを望む。できる限りこのデータを多く集めることは、通常は、著しく目標とされた分析系の組合せを含んでいる。すべての動物が最初の毒物的な評価にしばしば用いられ、これらの実験の結果は、あらゆる代謝作用がなされる前でさえ化合物が次の段階に入ることを防止することができる。そのような研究が、代謝プロファイル全体を求める多様性又は分析法と組み合わせて培養された肝細胞、生きている動物又は肝切片を用いて、現在調べられている。つい最近では、そのような分析はマイクロソームを用いて行われ、合成セルは人工膜中に保持された分離酵素を含んでいる。
ますます精巧な分析法の適用においてさえ、化合物の代謝を含む個々の生化学事象に関する情報を得るために動物、細胞、又は細胞画分を用いる際に明らかな問題点がある。DMEの分子遺伝学と生化学の進歩、及び薬剤発見過程のより大きな効率のための要求によって、分離されたDMEに基づいて新規な試験管内の方法の開発が進んでいる。これらの方法は、何千もの化合物をスクリーニングするために用いられ、薬剤発見過程の初期への組込みに受け入れられる。組換えCYPが試験管内の代謝研究及びこれらのための論理的根拠に用いられてきた方法の一部を次の項に記載する。同じ一般法はFMOのような他のDMEに適用することができるが、ほとんどの場合、それらの方法はCYPに対するのと同様にはほとんど開発されない。
【００３１】
アイソザイム同定
あなたの個々の薬剤の代謝に関与する主要酵素の同定は、おそらく初期の研究で最も重要な成分である。一旦このことが既知であると、薬物動態学的[PK]研究(下記参照)はKm(基質に対する酵素の親和性のおよその基準)やVmax(酵素が基質分子をどれくらい速く処理することができるか)を得るために行われる。共に、これらのパラメータは、生体内クリアランス率、治療効力の鍵となる決定基を推定するために用いられる。個々の酵素による代謝速度の知識は、薬剤発見チームを潜在的薬理遺伝学的課題又は薬剤-薬剤相互作用に対して警戒させることができる。
CYPレベルの遺伝子の違いは、治療に応答する個々の可変性の主な原因である。例えば、白色人種の人口のおよそ8%は、2D6基質のプアメタボライザーであり、このアイソザイムによって主に代謝する薬剤の正常な用量を投与した場合に、重大な副作用を受けることがある。更に、ある薬剤-薬剤相互作用によって、深刻な副作用又は致命的な状態、例えば、薬剤誘発性不整脈さえ生じることがあり得る。酵素が主に薬剤の代謝に関与する同定は、可能な薬物相互作用を評価するために用いられる効果的な臨床研究の設計を援助する。バイオセンサとして用いられるCYPやFMO酵素のパネルは、各々のアイソザイムによって新薬の処理の程度が正確に定量化されることを可能にする。このことは、本発明のデバイスを用いて達成されることができた。
【００３２】
速度論的パラメータの定量
望ましくないPK特性は、しばしば前臨床研究の化合物の失敗の要因である。試験管内研究の目標は、生体内クリアランス率全体の評価を得るために、各CYPアイソザイムを有する化合物について鍵となるPKパラメータ(KmとVmax)を求めることである。粗酵素製剤(例えば、マイクロソーム)から正確な運動データを得ることを試みることに関する課題としては、1を超えるアイソザイムによる基質の代謝、生成物(例えば、接合)の更なる修飾、レドックス酵素を汚染することによるNADPHの消費、細胞タンパク質又は他の巨大分子に基質又は生成物を結合することが含まれる。酵素学者の観点から、正確な運動データを得る唯一の方法は、分離した酵素系におけるものである。バイオセンサとして用いられる分離したCYP酵素は、この能力を与える。
【００３３】
高スループットスクリーニング
医薬研究開発の発見段階において合成された多数の薬理活性化合物は、既存の治療薬剤の代謝と相互作用することから、又は、急速な代謝によって生じる劣ったバイオアベイラビリティをもつことから拒絶される。多くの場合、これは化合物が1種以上のCYPアイソザイムの基質か又は阻害剤であるためである。CYPや他のDMEは、一般的には、親化合物から生じる代謝産物の分離や定量化によって分析される。ほとんどの場合には、クロマトグラフィー法(通常はHPLC)、場合によっては相分離を含んでいる。これらの分析法に対する重大な欠点が2つある。第一は、反応生成物を分離する要求があらゆる種類の量の多い分析に用いるのにあまりに扱いにくくて時間がかかる方法にし、連続運動データの収集を排除する。第二に、代謝産物の測定にはあらゆる基質に異なる分析法の使用を必要とし、多様な化合物について代謝をスクリーニングすることに対して明らかな技術的な障害が増大する。汎用分析法があらゆる基質の代謝速度の直接の定量化を可能にするという点で理想的であり、高スループットスクリーニング[HTS]形式で多様な化合物の鍵となる薬物動態学的パラメータ(Vmax/Kmとして算出される)の定量が可能である。これを達成する直感的方法は、NADPHの消費をモニタすることであり、理論的には基質代謝回転を有する化学量論組成でなければならない。しかしながら、これは、NADPHの消費と基質代謝回転間のカップリングが異なる基質間で可変であり、しばしば20-3O%の低さであることから実際的でないとわかった。酸素消費量の測定も、同じ欠点をもち; 消費される全酸素の有意なパーセントは、代謝産物と水よりむしろ反応性の酸素中間体に転換される。
【００３４】
これらの理由により、スクリーニングに現在用いられている主な方法は、競合的阻害分析であり、潜在的基質と阻害剤を確認するためにテスト化合物によるプローブ基質代謝回転の阻害が用いられる。これらの競合的阻害スクリーンからヒットは、示されたアイソザイムのための阻害剤又は基質であるかを求めるために更に評価されなければならない。多くの方法は、CYP阻害の高スループットスクリーニングに開発された。これらの手法としては、放射能標識CYP 2D6代謝産物を分離するための急速な相分離法、ロボット動作で制御される開発、CYP 3A4によってテストステロン代謝を分析するマルチカラムHPLC分離系、CYP依存性脱メチル化反応の間のホルムアルデヒド形成の定量化のための新規な色素生産性試薬の使用、代謝産物分析のための急速なLC/MS法が含まれる。しかしながら、これらの方法の全てには、HTS形式での有用性を制限する比較的扱いにくい反応後分離ステップが含まれている。薬物動態学的レベルでCYP仲介反応を行うことができるラボ・オン・チップスタイルバイオ検出器は、これらの分離ステップを必要としないことから、現在のHTS技術よりかなりの利点を与える。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】薬物開発の削減の原因を示す図である(データはKennedy, T. (1997) Drug Discovery Today 2,pp. 436-444から取られた開発段階で失敗した198の潜在的薬剤候補について示されている)。
【図２】CYP2C9の3Dに分子構造を示す図である。
【図３】異なるCYPファミリーによって代謝させた薬剤のパーセントを示す図である(データはParkinson, A (1996) Toxicology, McGraw-Hil1)から取られた既知のCYP酵素によって代謝する368の薬剤について示されている)。
【図４】一般に容認されたCyp触媒回路を示す図である。
【図５】線形掃引ボルタンメトリの電極電圧のスキャンを示す図である。
【図６】電圧掃引から得られたFe3+のみを含有する電解質溶液を用いて単一の電圧走査に見られたボルタモグラムを示す図である。
【図７】Fe3+のみを含有する電解質溶液について異なる走査速度で記録された一連の線形掃引ボルタモグラムを示す図である。
【図８】還元速度定数の異なる値について単一電圧掃引速度で記録された一連のボルタモグラムを示す図である。
【図９】サイクリックボルタンメトリにおいて用いられた固定比率で、V1からV2まで、次にV1への電圧掃引を示す図である。
【図１０】可逆的単一電極移動反応について記録された典型的な環式ボルタモグラムを示す図である。
【図１１】可逆的電子移動について電流に対する電圧走査速度の影響を示す図である。
【図１２】還元、酸化速度定数の異なる値について準可逆反応のためのボルタモグラムを示す図である。
【図１】
2005531764.tif 000016
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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