(57)【要約】  ＴＬＰペプチドとインターロイキン-２(ＩＬ-２)の組合せから得られた融合タンパク質および癌免疫療法でのその使用が開示されている。
2005513040.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端の最初の90個のアミノ酸を含むＩＬ-２断片と
GPPEVQNAN
RTKNEASI
NQRNRD
GPPEVQNAN
TNKEASICPSVYLSTLPSIHSFTNSSIYYPCIHL
SISLSVHPPLIHPSIYPSYSSIHSSSHHPCTHLSTHSVINPVKNFEHLLPIRPCTWTLG
からなる群から選択されるＴＬＰペプチドとの間の融合タンパク質。
【請求項２】
前記ＩＬ-２断片がヒトＩＬ-２配列のアミノ酸１〜100個を含む請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記ＩＬ-２断片が配列RTNKEASIのＴＬＰペプチドに融合した請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
ＩＬ-２断片およびＴＬＰペプチドが、それぞれＮ末端およびカルボキシ末端にある請求項１から３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
配列番号１を有する請求項３および４に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
断片ＩＬ-２およびＴＬＰペプチドが10から30個のアミノ酸のスペーサーで隔てられている請求項１から５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記アミノ酸がGlyおよびSerから選択される請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
請求項１から７に記載の融合タンパク質の有効量を含む薬剤組成物。
【請求項９】
ワクチンの形態の請求項８に記載の薬剤組成物。
【請求項１０】
肺、結腸/直腸、腎臓、膀胱、精巣、卵巣、前立腺、乳腺、および子宮頚部の腫瘍の予防または治療に使用する請求項８から９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＴＬＰペプチドとインターロイキン-２(ＩＬ-２)の組合せから得られた融合タンパク質および癌免疫療法でのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
略語ＴＬＰ(「腫瘍解離粒子(Tumour Liberated Particles)」)は、ＥＰ283433で最初に記載された手順に従って腫瘍組織から分離したタンパク質複合体を特定する。ＴＬＰ複合体を形成する種々のペプチドおよびタンパク質は特性決定されている。肺癌で主に発現する214kＤaのＴＬＰタンパク質は、Oncology、1983年(40:248〜253頁)に記載されている。上記タンパク質のエピトープおよびそれに対する抗体はＷＯ98/01462に記載されている。ＥＰ649433は、肺癌から分離した100kＤaのＴＬＰタンパク質およびそれから誘導された免疫原性ペプチドを記載している。これらのペプチドを使用して、種々の由来の組織内でのＴＬＰ発現パターンの特性を決定し、ＴＬＰタンパク質を腫瘍抗原として有効にするために使用するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を作製した(ＷＯ94/01458およびＷＯ98/15282)。
【０００３】
特許出願ＭＩ2001Ａ001380は、腫瘍の早期診断で使用することができるＴＬＰの調製方法を記載している。
【０００４】
公開特許ＷＯ01/62786は、ＴＬＰの100kＤa複合体のペプチドをコードするcＤＮＡの単離および腫瘍免疫療法でのその使用を記載している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＴＬＰペプチドによって引き起こされる免疫応答は、インターロイキン２(ＩＬ-２)の活性断片と組み合わせることにより増大できることが今回見出された。特に、ＴＬＰペプチドとＩＬ-２のアミノ酸配列を結合させた融合タンパク質は、ＴＬＰペプチド単独で認められたものよりも優れた腫瘍細胞に対する細胞毒性反応を誘発することが見出された。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって、本発明は、ＴＬＰペプチドのアミノ酸配列をＩＬ-２の活性断片のアミノ酸配列と結合させることによって得られた融合タンパク質またはポリペプチドに関する。
【０００７】
本発明に従って使用することができるＴＬＰペプチドは、ＷＯ98/01462、ＷＯ98/1458、ＷＯ98/15282、ＥＰ649433、およびＷＯ01/62786に記載されており、これらの全体を参照により本明細書に援用する。このペプチドは以下のアミノ酸配列を有する(本明細書にわたって同じペプチド参照番号を使用する)。
【０００８】
1.GPPEVQNAN
2.RTKNEASI
3.NQRNRD
4.GPPEVQNAN
5.TNKEASICPSVYLSTLPSIHSFTNSSIYYPCIHLSISLSVHPPLIHPSIYPSYSSIHSSSHHPCTHLSTHSVINPVKNFEHLLPIRPCTWTLG。
【０００９】
開始ペプチドとしての同じ免疫原性を保持する１種または複数のアミノ酸の欠失、挿入、または置換によって得た前述のペプチドの誘導体も本発明の範囲に含まれる。
【００１０】
「ＩＬ-２の活性断片」とは、アミノ末端残基から開始して最初の90個、好ましくは最初の100個のアミノ酸を含む分子の領域を意味する。
【００１１】
ＩＬ-２はヒトまたは動物由来であることができ、天然または組換えであることができる。GenBankにアクセッション番号ＮＰ#000577で配列が寄託されているヒト型が好ましい。さらに、ＩＬ-２配列のバリアント(Cytokine(1997年)７:488〜498頁)を使用することが可能である。これはその活性を保持しており、例えば、Ｔリンパ球の増殖を誘発し、Ｔヘルパーリンパ球の活性を調節し、細胞毒性Ｔ ＣＤ８細胞およびＮＫ細胞を刺激する(Thezeら、1996年、Immunol.Today、17:481〜486頁)。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明における用語「融合タンパク質またはポリペプチド」とは、一部がＩＬ-２の活性断片のアミノ酸配列で構成され、残りが上記で特定したＴＬＰペプチド配列で構成された(ポリ)ペプチド分子を意味する。この２つの配列は任意の相互配向で結合することができるが、アミノ末端領域およびカルボキシ末端領域は、それぞれＩＬ-２およびＴＬＰペプチドで占められていることが好ましい。この２つのサブユニットの正しい折りたたみを可能にする配列長を有するリンカーを、この２つの配列の間に挿入することもできる。このリンカーは、立体障害性の側鎖のない10から30個の中性アミノ酸、より好ましくはGlyおよびSer残基を含むことが好ましい。
【００１３】
好ましい実施形態によれば、融合タンパク質はＩＬ-２の活性断片と融合した２および５から選択されたＴＬＰペプチドを含む。ＩＬ-２の配列１〜100がＴＬＰペプチド２と融合した配列番号１(図１)を有する融合タンパク質がさらにより好ましい。
【００１４】
この２つのペプチド性部分は化学的方法または組換えＤＮＡ技術で融合させることができる。この場合、ＩＬ-２をコードするcＤＮＡはＴＬＰペプチドをコードするcＤＮＡに「インフレームで」融合し；組換えcＤＮＡを適切なベクターに挿入した後、融合タンパク質を真核生物または原核生物の発現系内で発現させる。別法として、融合産物をコードするcＤＮＡは適切な増幅プライマーを使用するＰＣＲで調製することができる。
【００１５】
融合タンパク質はまた、溶液または固相中での合成により(Merrifield、1986年、Science 232:341〜347頁ならびにBaranyおよびMerrifield、The Peptides、GrossおよびMeiehnhofer編、N.Y.Academic Press、1989年、１〜284頁)、または自動合成機で(StewartおよびYoung、Solid Phase Peptide Synthesis、第２版、Rockford I11.、Pierce Chemical Co.、1984年)調製することができる。
【００１６】
本発明による融合タンパク質の活性は細胞毒性アッセイで評価した。具体的には、ヒトＴＬＰを天然に発現するシンジェニックな腫瘍細胞系に対する細胞毒性Ｔリンパ球(ＣＴＬ)の活性、および別個に、種々のヒト腫瘍系に対する抗ヒトＴＬＰ免疫ウサギ血清の反応性を試験した。実験の詳細は実施例に示す。結果は明らかに、ＩＬ-２/ＴＬＰ融合タンパク質は単独のＴＬＰペプチドよりも効果的に腫瘍細胞に対する抗原特異的細胞毒性免疫反応を引き起こすことを示している。
【００１７】
したがって、別の態様によれば、本発明は腫瘍の予防または治療に有用な薬剤組成物を調製するためのＩＬ-２/ＴＬＰ融合ポリペプチドの使用に関する。本発明による薬剤組成物は有効量の融合タンパク質を薬剤として許容できる溶剤および賦形剤と共に含む。「有効量」とは、リンパ球を活性化し、腫瘍に対する細胞毒性反応を引き起こすのに十分な量を意味する。好ましい実施形態によれば、上記の組成物は、腫瘍を患う危険のあるヒトの予防的ワクチン接種または腫瘍患者の治療的ワクチン接種に指示される。ワクチンの調製および使用の技術は当業者に知られており、例えば、Paul、Fundamental Immunology、Raven Press、New York(1989年)またはCryz,S.J.、Immunotherapy and Vaccines、VCH Verlagsgesselshaft(1991年)に記載されている。ワクチンは通常、注射剤、懸濁剤、または液剤の形態であるが、固体またはリポソームをベースとする製剤の形態にもすることができる。活性成分は、乳化剤、緩衝剤、および佐剤などの賦形剤と混合することができ、これによりワクチンの効力を増大させる。
【００１８】
本発明による薬剤組成物は具体的には、肺、結腸/直腸、膀胱、精巣、卵巣、前立腺、乳腺、および子宮頚部の腫瘍の予防および治療に指示される。
【実施例】
【００１９】
実施例１  融合ポリペプチドＩＬ２の調製(アミノ酸１〜100)/ＴＬＰ(アミノ酸RTNKEASI)
cＤＮＡの単離およびクローニング
ＲＴ-ＰＣＲ
総ＲＮＡを種々の細胞系:Ａ549(肺癌)ＨＧＣ-27(胃癌)；ＤＵ-145(前立腺癌)ＰＡ-１(卵巣奇形癌)ＨＴ29(結腸の腺癌)からＲＮＡzol Ｂ試薬(TEL-TEST,Inc.)で抽出し、上流側の縮重オリゴヌクレオチド(アミノ酸配列TNKEASIに相当するACN AAY AAR GAR GCN TCN ATH TC)および下流プライマーとしてランダムヘキサマーを使用して、35サイクル(95℃で１分間、40℃で２分間、および72℃で１分間)で逆転写した。ＰＣＲ産物を、臭化エチジウムを含む１％アガロースゲル電気泳動にかけた。ＰＣＲ産物はpＧＥＭ-Ｔ casy vector(Promega)でクローニングした。
【００２０】
Applied Biosystemsのシーケンサー、373Ａ型を使用して、得られたプラスミドクローンをチェーンターミネーション法で配列決定した。配列番号１に相当するオープンリーディングフレームをこのように決定した。
【００２１】
実施例２  細胞毒性試験１
ヒトＴＬＰを天然に発現するＢＤＨ/Ｋ12細胞系にシンジェニックなＢＤＩＸラットをこの研究に使用した。系ＢＤＨ/Ｋ12はラット結腸/直腸腫瘍細胞で構成されている。
【００２２】
この実験の目的は、細胞毒性試験を使用し、所定用量のＴＬＰ/ＩＬ-２を慣用の手順に従って接種することによってワクチン接種した後、ＢＤＩＸラット中における細胞毒性Ｔリンパ球(ＣＴＬ)の産生を実験的に検出することであった。
【００２３】
方法の説明
試験産物をワクチン接種した動物は、特異抗原に対して細胞毒性リンパ球(ＣＴＬ)を産生した。
【００２４】
ワクチン接種した動物を屠殺し、ＣＴＬを含む脾臓を取り出した。
【００２５】
ワクチン接種した動物の脾臓細胞(エフェクター細胞)を、表面にＴＡＡを発現する放射能標識した標的細胞と共に培養した。ＣＴＬ/細胞接触の結果として細胞溶解が起こり、その結果、放射能が培地に放出された。
【００２６】
γカウンターで検出した培地の放射能はＣＴＬの活性に正比例しているので、試験物質の種苗原効力に正比例している。
【００２７】
手順
この試験は免疫感作の４つの分離サイクルに基づいた。各免疫感作サイクルは、各約250gの８週齢ＢＤＩＸラット４匹の群で実施した。実施例１に記載した産物を使用した。
【００２８】
０日目(ゼロ):
-  ラット１:生理食塩水0.5ｍlを皮下接種(対照)
-  ラット２:70μgのＴＬＰ/ＩＬ-２を含む生理食塩水0.5ｍlを皮下接種
-  ラット３:70μgのＩＬ-２を含む生理食塩水0.5ｍlを皮下接種(対照)
-  ラット４:70μgのＴＬＰペプチドを含む生理食塩水0.5ｍlを皮下接種(対照)
第１の免疫感作14日後に、同じ手順でラットに再び接種した(第１の追加免疫)。
【００２９】
その後の追加免疫(第２および第３)をそれぞれ21および28日目に実施した。最後の免疫感作１週間後(35日目)に動物を屠殺し、脾臓を取り出し、特異的な抗ＴＬＰ Ｔリンパ球(ＣＴＬ)の溶菌活性を検出するのに必要な細胞毒性試験に使用して、ＴＬＰを発現するＤＨＤ/Ｋ12細胞による培地へのクロム51の放出を測定した。
【００３０】
試験の第１段階でＤＨＤ/Ｋ12細胞を計数し、放射能標識した。
【００３１】
次に、予めワクチン接種した動物由来の脾臓細胞(エフェクター細胞)を計数し、100:１、50:１、および25:１の割合で、標識した標的細胞と接触させた。各培養物に10000ＤＨＤ/Ｋ12標的細胞を播種した。
【００３２】
最後に、結果的にクロム51を放出する溶菌活性をγカウンターにより培地中で検出した。
【００３３】
ラット１の試験培養物中で測定した細胞毒性を０とし、培養した標的細胞を放射能標識するのに使用した細胞毒性を100として、測定した放射能は、特異的なＣＴＬの細胞毒性の指標(毒性パーセントとして示される)を表わす。
【００３４】
実験の結果を以下に示す。
【００３５】
【表１】
2005513040.tif 000003
【００３６】
実施例３  細胞毒性試験２
この研究では、２匹のウサギに以下の通りＴＬＰ/ＩＬ-２抗体(実施例１)をワクチン接種した。
【００３７】
０日目:a)動物から血清試料を採取した(免疫前血清)
b)0.5ｍgのＤ.ＴＬＰ//ＩＬ-２を含む生理食塩水総量0.6ｍlを動物の背中の６箇所に皮下接種することにより第１の免疫感作を実施した。
【００３８】
14日目:第１の追加免疫
21日目:第２の追加免疫
28日目:第３の追加免疫
35日目:動物の耳の静脈から出血、免疫血清を採集。
【００３９】
免疫血清をＴＬＰ//ＩＬ-２およびＴＬＰについて特性決定した。
【００４０】
【表２】
2005513040.tif 000004
【００４１】
次いで、上記の通り調製した免疫血清を種々のヒト腫瘍細胞系のin vitro細胞毒性試験で使用した。
【００４２】
方法:
１)96ウェルマイクロディッシュのウェルに補体を除去した免疫試験血清10μlを播種する
２)細胞を完全培地100μlに加える(ウェルあたりに播種した細胞数は、35000であるJurkatを除き、すべての系で5000である)
３)ディッシュを37℃で終夜インキュベートする
４)ＭＴＴ140μlを各ウェルに加える
５)ディッシュを37℃で４時間インキュベートする
６)上清を吸引し、その顆粒をＳＤＳ2溶液100μlで溶解させる
７)ディッシュを37℃で１時間インキュベートする
８)540nｍでディッシュを読む。
【００４３】
次いで、細胞毒性パーセントを計算する:
細胞毒性＝(試験試料の光学密度-ブランクの光学密度)/(対照細胞の光学密度-ブランクの光学密度)
注:
１)ＭＩＴＴ溶液は以下の通り調製する:ＰＢＳ100ｍl中チアゾリルブルー0.5g。0.45uで濾過し、暗所において４℃で貯蔵する。
【００４４】
２)ＳＤＳ溶液は以下の通り調製する:攪拌下、加熱板上、50ｍlのジメチルホルムアミド＋50ｍlのＨ2Ｏ＋20gのＳＤＳ。pＨが7.4を超えた場合は、49ｍlのＨ2Ｏ＋１ｍlの酢酸＋0.125ｍlの塩酸を含む緩衝液で処理する。
【００４５】
結果
研究の結果を次表および図２および３で報告する。
【００４６】
【表３】
2005513040.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】ＩＬ−２の配列１〜１００がＴＬＰペプチドと融合した配列番号を示す図
【図２】研究の結果を示す図
【図３】研究の結果を示す図
【図１】
2005513040.tif 000006
【図２】
2005513040.tif 000007
【図３】
2005513040.tif 000008
【配列表】
2005513040000001.app
【国際調査報告】
2005513040.tif 000009
2005513040.tif 000010