(57)【要約】バチルスのゲノムにおいてさまざまな代謝条件および増殖周期の変化に応答性である遺伝子を同定した。これらの遺伝子の新規の応答性により、バチルス種における調節された遺伝子発現にそれらの遺伝子を使用し、そしてバイオリアクターの健全性のモニタリングが可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）において発現可能な目的のコーディング領域に操作可能に連結されたバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）遺伝子のプロモーター領域を含む核酸フラグメントを含むキメラ遺伝子を有する形質転換されたバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）細胞を提供する工程であって、ここで、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）遺伝子のプロモーター領域を含む核酸フラグメントは、ｎａｒＧＨＪＩ、ｃｓｎ、ｙｎｃＭ、ｙｖｙＤ、ｙｖａＷＸＹ、ｙｄｊＬ、ｓｕｎＡ、およびｙｏｌＩＪＫならびにそれらの相同物から成る群より選択される工程；ならびに
（ｂ）工程（ａ）の形質転換されたバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）細胞を酸素の非存在下で増殖させる工程であって、ここで、工程（ａ）のキメラ遺伝子が発現される工程を含む、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）において目的のコーディング領域を発現させる方法。
【請求項２】
（ａ）バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）において発現可能な目的のコーディング領域に操作可能に連結されたバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）遺伝子のプロモーター領域を含む核酸フラグメントを含むキメラ遺伝子を有する形質転換されたバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）細胞を提供する工程であって、ここで、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）遺伝子のプロモーター領域を含む核酸フラグメントは、ｎａｒＧＨＪＩ、ｃｓｎ、ｙｎｃＭ、ｙｖｙＤ、ｙｖａＷＸＹ、ｙｄｊＬ、ｓｕｎＡ、およびｙｏｌＩＪＫならびにそれらの相同物から成る群より選択される工程；
（ｂ）工程（ａ）の形質転換されたバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）細胞を酸素の存在下で増殖させる工程であって、ここで、細胞密度が増大する、工程；ならびに
（ｃ）形質転換されたバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）細胞または工程（ｂ）から酸素を除去する工程であって、ここで、キメラ遺伝子が発現される、工程を含む、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）において目的のコーディング領域を発現させる方法。
【請求項３】
工程（ｃ）の後に、形質転換されたバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）細胞に酸素を供給する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）遺伝子のプロモーター領域を含む核酸フラグメントは、配列番号１〜１５から成る群より選択される、請求項１または２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
（ａ）バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）において発現可能な目的のコーディング領域に操作可能に連結されたバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）遺伝子のプロモーター領域を含む核酸フラグメントを含むキメラ遺伝子を有する形質転換されたバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）細胞を提供する工程であって、ここで、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）遺伝子のプロモーター領域を含む核酸フラグメントは、ｆｅｕＡＢＣ、ｙｋｕＮＯＰ、およびｄｈｂＡＢＣならびにそれらの相同物から成る群より選択される工程；ならびに
（ｂ）工程（ａ）の形質転換されたバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）細胞を酸素の非存在下および亜硝酸塩の存在下で増殖させる工程であって、ここで、工程（ａ）のキメラ遺伝子が発現される工程を含む、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）において目的のコーディング領域を発現させる方法。
【請求項６】
バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）遺伝子のプロモーター領域を含む核酸フラグメントは、配列番号１６〜２４から成る群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
亜硝酸塩の濃度は約１ｍＭ〜約１０ｍＭである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
（ａ）バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）において発現可能な目的のコーディング領域に操作可能に連結されたバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）遺伝子のプロモーター領域を含む核酸フラグメントを含むキメラ遺伝子を有する形質転換されたバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）細胞を提供する工程であって、ここで、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）遺伝子のプロモーター領域を含む核酸フラグメントは、ｙｃｇＭＮ、ｄｈａＳ、ｒａｐＦ、ｒａｐＧ、ｒａｐＨ、ｒａｐＫ、ｙｑｈＩＪ、ｙｖｅＫＬＭＮＯＰＱＳＴ、ｙｈｆＲＳＴＵＶ、ｃｓｎ、ｙｎｃＭ、ｙｖｙＤ、ｙｖａＷＸＹ、ｙｄｊＬ、ｓｕｎＡ、およびｙｏｌＩＪＫならびにそれらの相同物から成る群より選択される工程；ならびに
（ｂ）工程（ａ）の形質転換されたバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）細胞を酸素の下で、細胞が定常期の約Ｔ０に達するまで増殖させる工程であって、ここで、工程（ａ）のキメラ遺伝子が発現される工程を含む、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）において目的のコーディング領域を発現させる方法。
【請求項９】
バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）遺伝子のプロモーター領域を含む核酸フラグメントは、配列番号７５、７６、２５〜４９、および５〜１５から成る群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
（ａ）バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）において発現可能な目的のコーディング領域に操作可能に連結されたバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）遺伝子のプロモーター領域を含む核酸フラグメントを含むキメラ遺伝子を有する形質転換されたバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）細胞を提供する工程であって、ここで、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）遺伝子のプロモーター領域を含む核酸フラグメントは、ａｃｏＡＢＣＬ、およびｇｌｖＡＣ、ならびにそれらの相同物から成る群より選択される工程；ならびに
（ｂ）工程（ａ）の形質転換されたバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）細胞を酸素の下で、細胞が定常期の約Ｔ１に達するまで増殖させる工程であって、ここで、工程（ａ）のキメラ遺伝子が発現される工程を含む、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）において目的のコーディング領域を発現させる方法。
【請求項１１】
バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）遺伝子のプロモーター領域を含む核酸フラグメントは、配列番号４１〜４４および５０〜５１から成る群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
（ａ）バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）において発現可能な目的のコーディング領域に操作可能に連結されたバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）遺伝子のプロモーター領域を含む核酸フラグメントを含むキメラ遺伝子を有する形質転換されたバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）細胞を提供する工程であって、ここで、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）遺伝子のプロモーター領域を含む核酸フラグメントは、ｙｘｊＣＤＥＦ、ｙｎｇＥＦＧＨＩ、ｙｊｍＣＤＥＦＧ、ｙｋｆＡＢＣＤ、およびｙｏｄＯＰＲＳＴ；ならびにそれらの相同物から成る群より選択される、工程；ならびに
（ｂ）工程（ａ）の形質転換されたバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）細胞を酸素の下で、細胞が定常期の約Ｔ３に達するまで増殖させる工程であって、ここで、工程（ａ）のキメラ遺伝子が発現される工程を含む、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）において目的のコーディング領域を発現させる方法。
【請求項１３】
バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）遺伝子のプロモーター領域を含む核酸フラグメントは、配列番号５２〜７４から成る群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
キメラ遺伝子の発現は、定常期のＴ０でダウンレギュレーションされる、請求項１、２または３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）細胞は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｕｓ）、バチルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、バチルスセレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バチルスブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、巨大菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルスインターメジウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、バチルスサーモアミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルスアミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルスサーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルスリヘニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルスマセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ）、バチルススファエリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、バチルスステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルスラテロスポルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、バチルスアシドカルダリウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、バチルスパミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、およびバチルスシュードファーマス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ）から成る種から選択される、請求項１、２、３、４、８、１０および１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
目的のコーディング領域は、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｐｄｓ、ｃｒｔＤ、ｃｒｔＬ、ｃｒｔＺ、ｃｒｔＸ、ｃｒｔＯ、ｐｈａＣ、ｐｈａＥ、ｅｆｅ、ｐｄｃ、ａｄｈ、リモネンシンターゼ、ピネンシンターゼ、ボルニルシンターゼ、フェランドレンシンターゼ、シネオールシンターゼ、サビネンシンターゼおよびタキサジエンシンターゼをコードする遺伝子から成る群より選択される、請求項１、２、３、４、８、１０および１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
（ａ）活発に増殖するバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞の培養物を提供する工程；ならびに
（ｂ）工程（ａ）のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞から単離された遺伝子のプールの発現レベルを測定する工程であって、遺伝子のプールは、ｎａｒＧＨＪＩ、ｆｅｕＡＢＣ、ｙｋｕＮＯＰ、ｄｈｂＡＢＣ、ｙｄｊＬ、ｓｕｎＡ、ｙｏｌＩＪＫ、ｃｓｎ、ｙｎｃＭ、ｙｖｙＤ、ｙｖａＷＸＹ、ｙｈｆＲＳＴＵＶ、ｙｖｅＫＬＭＮＯＰＱＳＴ、ｄｈａＳ、ｒａｐＦ、ｒａｐＧ、ｒａｐＨ、ｒａｐＫ、ｙｃｇＭＮ、ｙｑｈＩＪ、ｇｌｖＡＣ、ａｃｏＡＢＣＬ、ｙｘｊＣＤＥＦ、ｙｎｇＥＦＧＨＩ、ｙｊｍＣＤＥＦＧ、ｙｋｆＡＢＣＤ、ｙｏｄＯＰＲＳＴ、ａｌｓＴ、およびｙｘｅＫＬＭＮ、ならびにそれらの相同物を含む工程を含む、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）培養物の細胞代謝の状態のモニタリングのための方法。
【請求項１８】
バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞から単離される遺伝子のプールは、配列番号１〜８１から成る群より選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
遺伝子発現レベルの測定は、ノーザンブロット、ヌクレアーゼ保護アッセイまたはプライマー伸長アッセイから成る群より選択される方式を使用して達成される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
遺伝子発現レベルの測定は、遺伝子ｎａｒＧＨＪＩ、ｆｅｕＡＢＣ、ｙｋｕＮＯＰ、ｄｈｂＡＢＣ、ｙｄｊＬ、ｓｕｎＡ、ｙｏｌＩＪＫ、ｃｓｎ、ｙｎｃＭ、ｙｖｙＤ、ｙｖａＷＸＹ、ｙｈｆＲＳＴＵＶ、ｙｖｅＫＬＭＮＯＰＱＳＴ、ｄｈａＳ、ｒａｐＦ、ｒａｐＧ、ｒａｐＨ、ｒａｐＫ、ｙｑｈＩＪ、ｇｌｖＡＣ、ａｃｏＡＢＣＬ、ｙｘｊＣＤＥＦ、ｙｎｇＥＦＧＨＩ、ｙｊｍＣＤＥＦＧ、ｙｋｆＡＢＣＤ、ｙｏｄＯＰＲＳＴ、ａｌｓＴ、およびｙｘｅＫＬＭＮ、ならびに本明細書に含有されるそれらの相同物を有する核酸マイクロアッセイを使用して達成される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）細胞は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｕｓ）、バチルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、バチルスセレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バチルスブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、巨大菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルスインターメジウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、バチルスサーモアミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルスアミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルスサーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルスリヘニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルスマセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ）、バチルススファエリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、バチルスステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルスラテロスポルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、バチルスアシドカルダリウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、バチルスパミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、およびバチルスシュードファーマス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ）から成る種から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
活発に増殖する培養物を酸素の非存在下で増殖させ、そして対数期において遺伝子ｎａｒＧＨＪＩ、ｙｄｊＬ、ｓｕｎＡ、ｙｏｌＩＪＫ、ｃｓｎ、ｙｎｃＭ、ｙｖｙＤ、およびｙｖａＷＸＹの発現をアップレギュレーションさせる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
活発に増殖する培養物を酸素の非存在下および亜硝酸塩の存在下で増殖させ、そして対数期において遺伝子ｆｅｕＡＢＣ、ｙｋｕＮＯＰ、およびｄｈｂＡＢＣの発現をアップレギュレーションさせる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
遺伝子ｎａｒＧＨＪＩの発現を定常期の約Ｔ０でダウンレギュレーションさせる、請求項２２または２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
活発に増殖する培養物を酸素の存在下で増殖させ、そして定常期の約Ｔ０で遺伝子ｙｃｇＭＮ、ｙｑｈＩＪ、ｙｄｊＬ、ｓｕｎＡ、ｙｏｌＩＪＫ、ｃｓｎ、ｙｎｃＭ、ｙｖｙＤ、ｙｖａＷＸＹ、ｙｈｆＲＳＴＵＶ、ｙｖｅＫＬＭＮＯＰＱＳＴ、ｄｈａＳ、ｒａｐＦ、ｒａｐＧ、ｒａｐＨ、ｒａｐＫの発現をアップレギュレーションさせる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】
活発に増殖する培養物を酸素の存在下で増殖させ、そして定常期の約Ｔ１で遺伝子ａｃｏＡＢＣＬおよびｇｌｖＡＣの発現をアップレギュレーションさせる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２７】
活発に増殖する培養物を酸素の存在下で増殖させ、そして定常期の約Ｔ３で遺伝子ｙｘｊＣＤＥＦ、ｙｎｇＥＦＧＨＩ、ｙｊｍＣＤＥＦＧ、ｙｋｆＡＢＣＤ、およびｙｏｄＯＰＲＳＴの発現をアップレギュレーションさせる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２８】
活発に増殖する培養物を酸素の存在下で増殖させ、そして定常期または栄養制限条件下で遺伝子ａｌｓＴおよびｙｘｅＫＬＭＮの発現をダウンレギュレーションさせる、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本出願は、２０００年６月２９日に出願された米国仮出願第６０／２１４，９６７号および２００１年２月１３日に出願された米国仮出願第６０／２６８，３２０号の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、最近の遺伝子発現および醗酵モニタリングの分野にある。より具体的には、本発明は、調節された遺伝子発現および醗酵培養のプロセス制御モニタリングのためのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種から単離されたプロモーターの使用に関する。
【０００３】
（背景に関する情報）
バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は、酵素、抗体および他の薬学的に有効な生成物を含むさまざまな生物学的物質に有用な産生宿主である。生体材料の産生ためのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種の使用は、他の微生物産生宿主、特にグラム陰性生物体と比較して特に有利である。例えば、産業微生物学的に使用される最も一般的なグラム陰性生物体である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、ヒトにおいて病原性であり、所望されない産物であるエンドトキシンが存在することが欠点である。さらに、グラム陰性宿主は、しばしば、高価な再活性化および精製スキームを必要とする不活または不溶な形態のタンパク質を産生する。対照的に、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は、活性タンパク質の発現および増殖培地への輸送のための高度に発達した分泌システムを有し、それによって精製を容易にし、そしてコストの掛かる再活性化手順を排除している。従って、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は、多くの産業用途に最上の産生宿主である。遺伝子発現を増強するかまたはこれらの生物体の培養健全状態およびバイオマスの生産をモニターするための方法が所望される。
【０００４】
バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）および特に枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）は、その定常代謝が周知である（スタギアーら（Ｓｔｒａｇｉｅｒ，Ｐ．  ａｎｄ  Ｌｏｓｉｃｋ，  Ｒ．）１９９６．  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔ．  ３０：２９７−３４１、ラザッセラ（Ｌａｚａｚｚｅｒａ，  Ｂ．Ａ．）２０００．  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３：１７７−１８２、ムサデック（Ｍｓａｄｅｋ，  Ｔ．）１９９９．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ７：２０１−２０７）。異化、アミノ酸生合成、抗体産生、細胞間連絡、受容能、および胞子形成に関与する遺伝子などの広範な遺伝子が定常期に誘導される。枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）はまた、酸素の存在下または非存在下で増殖することが可能な通性細菌である。酸素の非存在下では、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）は別の電子受容体として硝酸塩または亜硝酸塩を使用し、そしてピルビン酸塩の存在下で増殖する（ナカノら（Ｎａｋａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．）１９９８．  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ５２：１６５−１９０）。硝酸呼吸および亜硝酸呼吸に関与する遺伝子の発現を制御するプロモーターは、二成分シグナル伝達系ＲｅｓＤＥの制御下にあることが明らかにされている（サンら（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．）１９９６．  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７８：１３７４−１３８５）。
【０００５】
一般に、原核生物体のプロモーターは、特に活性形態および原核宿主において大量に産物が作製され得る遺伝子を発現させるバイオテクノロジーにおいて重要な役割を果たすことができる。細胞が特定の密度に達するときに定常期増殖中に調節されるプロモーターを同定することは、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を産生宿主として使用する場合に価値がある。同様に、酸素レベルは容易に調整することができるため、酸素制限条件によって誘導されるプロモーターは産業施設において応用価値が極めて高い。
【０００６】
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）または他の任意の細菌においてプロモーター活性を調べるには、ノーザンまたはサザンブロット、酵素アッセイ、またはレポーティング遺伝子を用いる。これらの方法では、限られた数の遺伝子の発現レベルを比較することによって、遺伝子発現に対する環境の変化の影響をモニタリングすることが可能である。さらに、それらは、しばしば、生理学的事象のうちの１つまたは部分集合を調べることを可能であるが、信頼できかつ有用な様式で生物体のゲノムの優勢な個々の遺伝子の包括的な応答をモニターすることはできない。
【０００７】
ゲノム調査の進歩による、プロモーターを同定するための強力な方法はＤＮＡマイクロアレイの使用である。ＤＮＡマイクロアレイは、ゲノム単位の広範な規模で遺伝子発現プロフィールを探査するために使用される技術である（デリシら（ＤｅＲｉｓｉ，Ｊ．Ｌ．，Ｖ．Ｒ．  Ｉｙｅｒ，ａｎｄＰ．Ｏ．  Ｂｒｏｗｎ）１９９７．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２７８：６８０−６８６）。これにより、異なる増殖段階または環境条件で発現される遺伝子の同定が可能である。これは特に産業環境に価値があり、ここで、プロモーターの誘導に関する条件は簡便、費用効果、および特定のバイオ製造プロセスに適合しなければならない。当該分野における顕著な進歩は、産生に関与するほとんどの遺伝子の誘導のタイミングおよび程度の分析を可能にし、そしてバイオマスの状態および増殖条件に対する細胞応答に関する包括的な情報を提供するプロセスである。
【０００８】
従って、解決すべき問題は、代謝条件または増殖周期の変化によって調節されるバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ゲノム内の遺伝子を同定し、そして遺伝子発現のためのこれらの遺伝子およびバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）培養のバイオリアクターモニタリングを提供することである。出願人は、酸素涸渇、亜硝酸塩の存在に応答性であるか、または定常増殖期のさまざまな段階に感受性である遺伝子を同定するためのマイクロアレイ技術を使用することによって、上記の問題を解決した。
【０００９】
（発明の概要）
本発明は、ａ）バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）において発現可能な目的のコーディング領域に操作可能に連結されたバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）遺伝子のプロモーター領域から成る核酸フラグメントを含むキメラ遺伝子を含有する形質転換されたバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）細胞を提供する工程であって、ここで、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）遺伝子のプロモーター領域を含む核酸フラグメントは、ｎａｒＧＨＪＩ、ｃｓｎ、ｙｎｃＭ、ｙｖｙＤ、ｙｖａＷＸＹ、ｙｄｊＬ、ｓｕｎＡ、およびｙｏｌＩＪＫならびにそれらの相同物から成る群より選択される、工程；ならびにｂ）工程（ａ）の形質転換されたバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）細胞を酸素の非存在下で増殖させる工程であって、ここで、工程（ａ）のキメラ遺伝子が発現される、工程、を含む、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）において目的のコーディング領域を発現させる方法を提供する。
【００１０】
必要に応じて、細胞バイオマスを増大させるために酸素の存在下で細胞を増殖させ、次いで、酸素レベルを減少させてキメラ遺伝子の誘導および発現を可能にしてもよい。続いて、酸素レベルを回復させ、発現されたコーディング領域の産物を利用して、生物変換を可能にしてもよい。
【００１１】
同様に、本発明は、ａ）バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）において発現可能な目的のコーディング領域に操作可能に連結されたバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）遺伝子のプロモーター領域から成る核酸フラグメントを含むキメラ遺伝子を含有する形質転換されたバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）細胞を提供する工程であって、ここで、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）遺伝子のプロモーター領域を含む核酸フラグメントは、ｆｅｕＡＢＣ、ｙｋｕＮＯＰ、およびｄｈｂＡＢＣならびにそれらの相同物から成る群より選択される、工程；ならびにｂ）工程（ａ）の形質転換されたバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）細胞を酸素の非存在下および亜硝酸塩の存在下で増殖させる工程であって、ここで、工程（ａ）のキメラ遺伝子が発現される、工程、を含む、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）において目的のコーディング領域を発現させる方法を提供する。
【００１２】
もう１つの実施態様では、本発明は、ａ）バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）において発現可能な目的のコーディング領域に操作可能に連結されたバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）遺伝子のプロモーター領域から成る核酸フラグメントを含むキメラ遺伝子を含有する形質転換されたバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）細胞を提供する工程であって、ここで、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）遺伝子のプロモーター領域を含む核酸フラグメントは、ｙｃｇＭＮ、ｄｈａＳ、ｒａｐＦ、ｒａｐＧ、ｒａｐＨ、ｒａｐＫ、ｙｑｈＩＪ、ｙｖｅＫＬＭＮＯＰＱＳＴ、ｙｈｆＲＳＴＵＶ、ｃｓｎ、ｙｎｃＭ、ｙｖｙＤ、ｙｖａＷＸＹ、ｙｄｊＬ、ｓｕｎＡ、およびｙｏｌＩＪＫならびにそれらの相同物から成る群より選択される、工程；ならびにｂ）工程（ａ）の形質転換されたバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）細胞を酸素の下で、細胞が定常期の約Ｔ０に達するまで増殖させる工程であって、ここで、工程（ａ）のキメラ遺伝子が発現される、工程、を含む、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）において目的のコーディング領域を発現させる方法を提供する。
【００１３】
代替的実施態様では、本発明は、ａ）バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）において発現可能な目的のコーディング領域に操作可能に連結されたバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）遺伝子のプロモーター領域から成る核酸フラグメントを含むキメラ遺伝子を含有する形質転換されたバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）細胞を提供する工程であって、ここで、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）遺伝子のプロモーター領域を含む核酸フラグメントは、ａｃｏＡＢＣＬ、およびｇｌｖＡＣ、ならびにそれらの相同物から成る群より選択される、工程；ならびにｂ）工程（ａ）の形質転換されたバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）細胞を酸素の下で、細胞が定常期の約Ｔ１に達するまで増殖させる工程であって、ここで、工程（ａ）のキメラ遺伝子が発現される、工程、を含む、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）において目的のコーディング領域を発現させる方法を提供する。
【００１４】
さらなるもう１つの実施態様では、本発明は、ａ）バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）において発現可能な目的のコーディング領域に操作可能に連結されたバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）遺伝子のプロモーター領域から成る核酸フラグメントを含むキメラ遺伝子を含有する形質転換されたバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）細胞を提供する工程であって、ここで、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）遺伝子のプロモーター領域を含む核酸フラグメントは、ｙｘｊＣＤＥＦ、ｙｎｇＥＦＧＨＩ、ｙｊｍＣＤＥＦＧ、ｙｋｆＡＢＣＤ、およびｙｏｄＯＰＲＳＴ；ならびにそれらの相同物から成る群より選択される、工程；ならびにｂ）工程（ａ）の形質転換されたバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）細胞を酸素の下で、細胞が定常期の約Ｔ３に達するまで増殖させる工程であって、ここで、工程（ａ）のキメラ遺伝子が発現される、工程、を含む、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）において目的のコーディング領域を発現させる方法を提供する。
【００１５】
本発明に関して、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）細胞は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｕｓ）、バチルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、バチルスセレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バチルスブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、巨大菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルスインターメジウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、バチルスサーモアミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルスアミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルスサーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルスリヘニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルスマセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ）、バチルススファエリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、バチルスステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルスラテロスポルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、バチルスアシドカルダリウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、バチルスパミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、およびバチルスシュードファーマス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ）から成る種から選択される。
【００１６】
さらに、本発明に関して、目的のコーディング領域は、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｐｄｓ、ｃｒｔＤ、ｃｒｔＬ、ｃｒｔＺ、ｃｒｔＸ、ｃｒｔＯ、ｐｈａＣ、ｐｈａＥ、ｅｆｅ、ｐｄｃ、ａｄｈ、リモネンシンターゼ、ピネンシンターゼ、ボルニルシンターゼ、フェランドレンシンターゼ、シネオールシンターゼ、サビネンシンターゼおよびタキサジエンシンターゼをコードする遺伝子から成る群より選択される。
【００１７】
さらに、本発明は、ａ）活発に増殖するバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）細胞の培養物を提供する工程；ならびにｂ）工程（ａ）のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞から単離された遺伝子のプールの発現レベルを測定する工程であって、遺伝子のプールは、ｎａｒＧＨＪＩ、ｆｅｕＡＢＣ、ｙｋｕＮＯＰ、ｄｈｂＡＢＣ、ｙｄｊＬ、ｓｕｎＡ、ｙｏｌＩＪＫ、ｃｓｎ、ｙｎｃＭ、ｙｖｙＤ、ｙｖａＷＸＹ、ｙｈｆＲＳＴＵＶ、ｙｖｅＫＬＭＮＯＰＱＳＴ、ｄｈａＳ、ｒａｐＦ、ｒａｐＧ、ｒａｐＨ、ｒａｐＫ、ｙｃｇＭＮ、ｙｑｈＩＪ、ｇｌｖＡＣ、ａｃｏＡＢＣＬ、ｙｘｊＣＤＥＦ、ｙｎｇＥＦＧＨＩ、ｙｊｍＣＤＥＦＧ、ｙｋｆＡＢＣＤ、ｙｏｄＯＰＲＳＴ、ａｌｓＴ、およびｙｘｅＫＬＭＮ、ならびにそれらの相同物を含む、工程、を含む、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）培養物の細胞代謝の状態のモニタリングのための方法を提供する。
【００１８】
好適な実施態様では、本発明は、活発に増殖する培養物を酸素の非存在下で増殖させ、そして対数期において遺伝子ｎａｒＧＨＪＩ、ｙｄｊＬ、ｓｕｎＡ、ｙｏｌＩＪＫ、ｃｓｎ、ｙｎｃＭ、ｙｖｙＤ、およびｙｖａＷＸＹの発現をアップレギュレーションさせることを特徴とする、モニタリング方法を提供する。
【００１９】
もう１つの好適な実施態様では、本発明は、活発に増殖する培養物を酸素の非存在下および亜硝酸塩の存在下で増殖させ、そして対数期において遺伝子ｆｅｕＡＢＣ、ｙｋｕＮＯＰ、およびｄｈｂＡＢＣの発現をアップレギュレーションさせることを特徴とする、モニタリング方法を提供する。
【００２０】
同様に、本発明は、遺伝子ｎａｒＧＨＪＩの発現を定常期の約Ｔ０でダウンレギュレーションさせることを特徴とする、モニタリング方法を提供する。
【００２１】
さらに、本発明は、モニタリング方法、ここで、活発に増殖する培養物を酸素の存在下で増殖させ、そして定常期の約Ｔ０で遺伝子ｙｃｇＭＮ、ｙｑｈＩＪ、ｙｄｊＬ、ｓｕｎＡ、ｙｏｌＩＪＫ、ｃｓｎ、ｙｎｃＭ、ｙｖｙＤ、ｙｖａＷＸＹ、ｙｈｆＲＳＴＵＶ、ｙｖｅＫＬＭＮＯＰＱＳＴ、ｄｈａＳ、ｒａｐＦ、ｒａｐＧ、ｒａｐＨ、ｒａｐＫの発現をアップレギュレーションさせる、を提供する。
【００２２】
同様に、本発明は、活発に増殖する培養物を酸素の存在下で増殖させ、そして定常期の約Ｔ１で遺伝子ａｃｏＡＢＣＬおよびｇｌｖＡＣの発現をアップレギュレーションさせることを特徴とする、モニタリング方法を提供する。
【００２３】
代替的実施態様では、本発明は、活発に増殖する培養物を酸素の存在下で増殖させ、そして定常期の約Ｔ３で遺伝子ｙｘｊＣＤＥＦ、ｙｎｇＥＦＧＨＩ、ｙｊｍＣＤＥＦＧ、ｙｋｆＡＢＣＤ、およびｙｏｄＯＰＲＳＴの発現をアップレギュレーションさせることを特徴とする、モニタリング方法を提供する。
【００２４】
もう１つの実施態様では、本発明は、活発に増殖する培養物を酸素の存在下で増殖させ、そして定常期または栄養制限条件下で遺伝子ａｌｓＴおよびｙｘｅＫＬＭＮの発現をダウンレギュレーションさせることを特徴とする、モニタリング方法を提供する。
【００２５】
（配列の簡単な説明）
本発明は、本出願の一部を形成する下記の詳細な説明および添付の配列の説明からさらに完全に理解できる。
【００２６】
以下の配列は、米国特許法施行規則第１．８２１〜１．８２５条（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示を含む特許出願の要件−配列規則」）に従い、そして世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列表の要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、ならびに実施細則第２０８号および付属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データに使用した記号および形式は、米国特許法施行規則第１．８２２に記載の規則に従う。
【００２７】
【表１】
2005503752.tif 000002
【００２８】
【表２】
2005503752.tif 000003
【００２９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、（ｉ）枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｕｓ）由来のすべてのオープンリーディングフレームのうちの７５％を超えるオープンリーディングフレームを含み、高濃度の内因性ＲＮＡアーゼおよびリボソームＲＮＡの問題を克服するマイクロアレイによる内因性プロモーターおよび代謝マーカーの包括的調査の第１の例；
（ｉｉ）嫌気性増殖中または酸素制限条件によって誘導されるバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）における目的のコーディング領域の発現方法；
（ｉｉｉ）定常増殖期中のバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）における目的のコーディング領域の発現方法；
（ｉｖ）ＤＮＡマイクロアッセイによって作製される遺伝子発現パターンによってバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）の代謝状態のモニタリングのための方法；
を提供することによって、当該分野を発展させる。
【００３０】
本発明は、多くの異なる分野において有用性を有する。遺伝子発現プロフィールは、株間の遺伝子型の変化を検出するために使用することができる。本発明は、増殖条件の変更が生じる場合の発現プロフィールのモニタリングを可能にする。本発明の遺伝子は、高収量のバイオプロセス産生のための要件を決定する醗酵プロセス条件における摂動を検出するためのモデリングシステムにおいて使用することができる。さらに、所望される標的遺伝子産物に影響を与える既知の化合物と遺伝子発現プロフィールを比較することによって、多くの発見化合物をスクリーニングすることができる。
【００３１】
本開示では、多数の用語および略語が使用される。以下の定義が提供される。
【００３２】
「核酸」は、ヌクレオチドと呼ばれる共有結合したサブユニットから成る高分子化合物である。核酸は、ポリリボ核酸（ＲＮＡ）およびポリデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）（両方とも一本鎖であってもまたは二本鎖であってもよい）を含む。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、および半合成ＤＮＡが含まれる。
【００３３】
本明細書において使用される「単離された核酸フラグメント」は、一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーであり、必要に応じて、合成、非天然または改変されたヌクレオチド塩基を含有する。ＤＮＡの高分子の形態である単離された核酸フラグメントは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つ以上のセグメントからなり得る。
【００３４】
核酸フラグメントは、温度および溶液イオン強度の適切な条件下で核酸フラグメントの一本鎖形態が他の核酸フラグメントにアニールすることができる場合に、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡなどのもう１つの核酸フラグメントに「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は周知であり、サンブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  Ｆｒｉｔｓｃｈ，  Ｅ．  Ｆ．  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：    Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  （１９８９）、特に第１１章および該第１１章に掲載の表１１．１（全体が参考として本明細書に援用される）において例示されている。温度およびイオン強度の条件はハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。ストリンジェンシーな条件を調整して、遠い関係の生物体由来の相同配列などの中等度に類似のフラグメントから近い関係の生物体由来の機能的酵素を複製する遺伝子などの高度に類似のフラグメントをスクリーニングすることができる。ハイブリダイゼーション後洗浄はストリンジェンシー条件を決定する。１組の好適な条件は、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、室温、１５分間で開始し、次いで、２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、４５℃、３０分間で反復し、次いで、２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５０℃、３０分間を反復する一連の洗浄を使用する。より好適な組のストリンジェントな条件はより高い温度を使用し、ここで、洗浄は、２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳによる最後の２回の３０分間の洗浄の温度を６０℃にまで上昇させたことを除いて、上記の洗浄と同一である。もう１つの好適な組の高度にストリンジェントな条件は、０．１２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃で最後の２つの洗浄を行う。ハイブリダイゼーションは２つの核酸が相補的な配列を含有することを必要とするが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに依存して、塩基間にミスマッチの可能性が存在する。核酸にハイブリダイズするのに適切なストリンジェンシーは、核酸の長さおよび相補性の程度（当業者に周知の変数）に依存する。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相補性の程度が大きいほど、これらの配列を有する核酸のハイブリダイズに対するＴｍの値は大きい。核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性（より高いＴｍに相当する）は、次の順で減少する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さが１００ヌクレオチドを超えるハイブリダイズについては、Ｔｍを算出するための式が誘導されている（サンブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．）、上掲、１１．７−１１．８を参照のこと）。より短い核酸、即ちオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションについては、ミスマッチの位置がより重要であり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（サンブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．）、上掲、１１．７−１１．８を参照のこと）。１つの実施態様において、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは少なくとも約１０ヌクレオチドである。好ましくは、ハイブリダイズ可能��核酸の最小の長さは少なくとも約１５ヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも約２０ヌクレオチドであり、および最も好ましくは、長さは少なくとも３０ヌクレオチドである。さらに、当業者は、必要であれば、プローブの長さなどの因子に従って、温度および洗浄溶液の塩濃度を調整することができることを認識するであろう。
【００３５】
本明細書において使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、ゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、またはｍＲＮＡ分子にハイブリダイズ可能な一般に少なくとも１８ヌクレオチドの核酸を指す。オリゴヌクレオチドは、例えば、３２Ｐヌクレオチドまたはビオチンなどの標識が共有結合しているヌクレオチドで標識することができる。１つの実施態様では、標識されたオリゴヌクレオチドをプローブとして使用し、本発明のヌクレオチドの存在を検出することができる。もう１つの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドの全長またはフラグメントをクローン化するためかまたは本発明の核酸の存在を検出するために、オリゴヌクレオチド（そのうち一方または両方を標識することができる）をＰＣＲプライマーとして使用することができる。さらなる実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ分子によって三重らせん構造を形成することができる。一般に、オリゴヌクレオチドは合成的に、好ましくは核酸合成機で調製される。従って、オリゴヌクレオチドは、チオエステル結合などの天然には存在しないリン酸エステル類似体結合で調製することができる。
【００３６】
「遺伝子」は、ポリペプチドをコードするヌクレオチドの集成体を指し、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ核酸を含む。「遺伝子」はまた、コーディング配列の前（５’非コーディング配列）および後（３’非コーディング配列）に調節配列を含む特定のタンパク質を発現する核酸フラグメントを指す。「生来の遺伝子」は、それ自体の調節配列と共に天然に見出されるような遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、天然には一緒に見出されない調節およびコーディング配列を含んでいる、生来の遺伝子ではないあらゆる遺伝子を指す。従って、キメラ遺伝子は、異なる起源に由来する調節配列およびコーディング配列、または同じ起源に由来するが、しかし天然に見出されるものとは異なる様式で配列される調節配列およびコーディング配列を含んでいてもよい。本発明のキメラ遺伝子は、典型的に目的のコーディング領域に操作可能に連結された誘導性プロモーターを含む。「内因性遺伝子」は、生物体のゲノム内の天然の位置にある生来の遺伝子を指す。「外来」遺伝子は、宿主生物体内に通常は見出されない遺伝子を指すが、しかしこれは遺伝子導入により宿主生物体内に導入される。外来遺伝子は、非生来の生物体内に挿入された生来の遺伝子、またはキメラ遺伝子を含むことができる。「導入遺伝子」は、形質転換操作によりゲノム中に導入された遺伝子である。
【００３７】
用語「誘導性遺伝子」とは、特定のストレスまたは刺激に応答して発現がアップレギュレーションされるあらゆるバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）遺伝子を意味する。本発明の誘導性遺伝子は、ｎａｒＧＨＪＩ、ｆｅｕＡＢＣ、ｙｋｕＮＯＰ、ｄｈｂＡＢＣ、ｙｄｊＬ、ｓｕｎＡ、ｙｏｌＩＪＫ、ｃｓｎ、ｙｎｃＭ、ｙｖｙＤ、ｙｖａＷＸＹ、ｙｈｆＲＳＴＵＶ、ｙｖｅＫＬＭＮＯＰＱＳＴ、ｄｈａＳ、ｒａｐＦ、ｒａｐＧ、ｒａｐＨ、ｒａｐＫ、ｙｑｈＩＪ、ｙｃｇＭＮ、ｇｌｖＡＣ、ａｃｏＡＢＣＬ、ｙｘｊＣＤＥＦ、ｙｎｇＥＦＧＨＩ、ｙｊｍＣＤＥＦＧ、ｙｋｆＡＢＣＤ、ｙｏｄＯＰＲＳＴ、ａｌｓＴ、およびｙｘｅＫＬＭＮとして同定される遺伝子を含む。
【００３８】
「コーディング配列」または「オープンリーディングフレーム」（ＯＲＦ）は、特定のアミノ配列をコードするＤＮＡ配列を指す。ＲＮＡポリメラーゼがコーディング配列をｍＲＮＡに転写し、次いで、該ｍＲＮＡがトランス−ＲＮＡスプライシングを受け（コーディング配列がイントロンを含有する場合）、そしてコーディング配列によってコードされるタンパク質に翻訳される場合、コーディング配列は細胞内の転写および翻訳制御配列の「制御下」にある。用語「目的のコーディング領域」は、所望される宿主において翻訳可能なあらゆるコーディング領域またはオープンリーディングフレームを指し、本発明の誘導性遺伝子のプロモーターによって調節され得る。
【００３９】
「プロモーター」は、コーディング配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することが可能なＤＮＡ配列を指す。一般に、コーディング配列は、プロモーター配列の３’側に位置する。プロモーターは、それらの全体が生来の遺伝子から誘導することができるか、または天然に見いだされる多様なプロモーターから誘導される多様なエレメントから成るか、または合成ＤＮＡセグメントを含み得る。当業者であれば、多様なプロモーターは多様な組織もしくは細胞タイプ、または多様な発生段階において、あるいは多様な環境または生理学的条件に応答して遺伝子の発現を指令することができることを理解している。ほとんどの時期におけるほとんどの細胞タイプにおいて遺伝子を発現させるプロモーターを、通常、「構成プロモーター」と呼ぶ。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界は完全には規定されていないため、多様な長さのＤＮＡフラグメントが同一のプロモーター活性を有することができることがさらに理解される。「誘導性プロモーター」とは、特定の刺激に応答性である任意のプロモーターを意味する。本発明の誘導性プロモーターは、典型的に、「誘導性遺伝子」に由来し、そしてさまざまな代謝条件（酸素入力、栄養組成、ｐＨおよび温度変化などの環境ストレス、または特定の産物の過剰産生もしくは外来遺伝子産物）あるいは細胞増殖周期の段階に応答性である。
【００４０】
本明細書で使用される用語「発現」は、本発明の核酸フラグメントに由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を指す。また、発現はｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指すことができる。
【００４１】
遺伝子発現に適用される用語「アップレギュレーションされる」とは、試験条件にある特定の遺伝子または領域のｍＲＮＡ転写レベルが、コントロール条件と比較して上昇していることを意味する。
【００４２】
遺伝子発現に適用される用語「ダウンレギュレーションされる」とは、試験条件にある特定の遺伝子または領域のｍＲＮＡ転写レベルが、コントロール条件と比較して減少していることを意味する。
【００４３】
遺伝子に適用される用語「相同物」とは、同じ機能を有する同じまたは異なる微生物を意味し、有意な配列類似性を有してもよい。
【００４４】
「転写および翻訳制御配列」は、宿主細胞におけるコーディング配列の発現を提供するプロモーター、エンハンさー、ターミネーターなどのＤＮＡ調節配列である。真核細胞では、ポリアデニル化シグナルは制御配列である。
【００４５】
用語「操作可能に連結される」は、一方の機能が他方の機能の影響を受けるような単一の核酸フラグメントに対する核酸配列の関連を指す。例えば、プロモーターがコーディング配列の発現に影響することが可能である（即ち、コーディング配列はプロモーターの転写制御下にある）場合、プロモーターはコーディング配列に操作可能に連結される。コーディング配列は、センスまたはアンチセンスの配向で調節配列に操作可能に連結されることができる。
【００４６】
用語「ゲノムＤＮＡ」は、生物体由来の全ＤＮＡを指す。
【００４７】
用語「全ＲＮＡ」は、生物体由来の非画分化されたＲＮＡを指す。
【００４８】
用語「プローブ」は、相補的な一本鎖標的核酸と塩基対を形成し、二本鎖分子を形成することができる一本鎖核酸分子を指す。
【００４９】
用語「標識」は、ｍＲＮＡまたはＤＮＡに容易に付着することができ、そして検出可能なシグナルを生成することができる任意の従来の分子を指し、該シグナルの強度は、ＤＮＡフラグメントに対する標識されたプローブのハイブリダイゼーションの相対量を示す。好適な標識は蛍光分子または放射性分子である。多様な周知の標識を使用することができる。
【００５０】
用語「相補的」は、相互にハイブリダイズすることが可能なヌクレオチド塩基間の関係を記述するために使用される。例えば、ＤＮＡについて、アデノシンはチミンに相補的であり、そしてシトシンはグアニンに相補的である。従って、本発明はまた、付随する配列表で報告されるような完全な配列ならびにそれらの実質的に類似の配列に相補的である単離された核酸フラグメントを含む。
【００５１】
細胞に適用される用語「増殖周期」は、細胞が培養条件において移行する代謝周期を指す。該周期は、指数期、指数期の終了、および定常期として知られるさまざまな段階に分割することができる。
【００５２】
用語「指数増殖」、「指数期増殖」、「対数期」または「対数増殖期」は、微生物が増殖し、そして分裂する速度を指す。対数期において増殖する場合、それらの遺伝子能力、培地の性質、および微生物が増殖する条件が最大限与えられると、微生物は最大速度で増殖する。指数期中の微生物の増殖速度は一定であり、微生物は規則的な間隔で分裂し、そして倍加する。「活発に増殖する」細胞は対数期で増殖している細胞である。
【００５３】
用語「定常期」は、培養中の細胞増殖が遅くなるかまたは停止する増殖周期の期を指す。枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｕｓ）では、Ｔ０は指数増殖期の終了または定常期の開始を表す。Ｔ１は、Ｔ０の１時間後かまたは定常期に入って１時間目を意味する。Ｔ３は、Ｔ０から３時間目かまたは定常期に入って３時間目を意味する。
【００５４】
用語「増殖を変更する環境」は、細胞の増殖を阻害するかまたは細胞を死滅させる能力を有するエネルギー、化学物質、または生体物を指す。阻害剤としては、変異剤、抗生物質、ＵＶ光、γ線、Ｘ線、極端な温度、ファージ、マクロファージ、有機化学物質および無機化学物質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
「細胞の状態」は、多様な条件下で増殖する場合の生物体の代謝状態を指す。
【００５６】
用語「アルキル」は、任意の炭素原子から水素原子を取り出すことによってアルカンから誘導される１価の基：ＣｎＨ２ｎ＋１−を意味する。分岐していないアルカンの末端の炭素原子から水素原子を取り出すことによって誘導される基は、ノルマルアルキル（ｎ−アルキル）基のサブクラス：Ｈ［ＣＨ２］ｎ−を形成する。ＲＣＨ２−、Ｒ２ＣＨ−（ＲはＨではない）、およびＲ３Ｃ−（ＲはＨではない）基は、それぞれ１級、２級および３級の基である。
【００５７】
用語「アルケニル」とは、１つの炭素−炭素二重結合および一般式ＣｎＨ２ｎを有する非環式分岐または非分岐炭化水素を意味する。１を超える二重結合を有する非環式分岐または非分岐炭化水素には、アルカジエン、アルカトリエンなどがある。
【００５８】
用語「アルキリデン」とは、同じ炭素原子から２つの水素原子を取り出すことによってアルカンから形成され、その自由原子価は二重結合の部分である２価の基を意味する（例えば、（ＣＨ３）２Ｃ＝プロパン−２−イリデン）。
【００５９】
用語「ＤＮＡマイクロアレイ」または「ＤＮＡチップ」とは、固相表面上のゲノム内の１群の遺伝子またはすべての遺伝子のＰＣＲ産物の高密度形式またはアレイの組立体を意味する。アレイの構築および使用のための一般的方法は、利用することが可能である（スキーナら（Ｓｃｈｅｎａ  Ｍ．，  Ｓｈａｌｏｎ  Ｄ．，  Ｄａｖｉｓ  Ｒ．Ｗ．，  Ｂｒｏｗｎ  Ｐ．Ｏ．）相補的ＤＮＡマイクロアッセイによる遺伝子発現パターンの定量的モニタリングＳｃｉｅｎｃｅ．  １９９５  Ｏｃｔ  ２０；  ２７０（５２３５）：  ４６７−７０およびｈｔｔｐ：／／ｃｍｇｍ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｐｂｒｏｗｎ／ｍｇｕｉｄｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌを参照のこと）。ＤＮＡマイクロアレイは、遺伝子またはこれらの遺伝子のＰＣＲ産物を含むＤＮＡマイクロアレイと分析しようとするサンプルから調製されるｃＤＮＡプローブとを同時にハイブリダイズさせることによって、実施しようとする多くの遺伝子の遺伝子発現パターンまたはプロフィールの分析を可能にする。ＤＮＡマイクロアレイまたは「チップ」技術は、ゲノム規模に対する遺伝子発現の調査を可能にし、多くの遺伝子の転写レベルを同時に測定することが可能である。簡単に説明すると、ＤＮＡマイクロアレイまたはチップ技術は、規定された位置で固相表面上の目的の遺伝子またはオープンリーディングフレームに相補的な顕微鏡的量のＤＮＡを整列することを含む。この固相表面は、一般にガラス表面化、または膜（ナイロン膜など）である。ＤＮＡ配列は、スポットするかまたはフォトリソグラフィによって整列してもよい（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｏｍ／を参照のこと）。比較しようとする２つのサンプルから調製される２つの個別の蛍光標識プローブ混合物をマイクロアレイにハイブリダイズさせ、そして走査型共焦点顕微鏡を使用して、レーザー励起後の蛍光によって結合プローブの存在および量を検出し、そしてレーザースキャナおよび適切なアレイ分析ソフトウェアパッケージを使用して定量する。Ｃｙ３（緑色）およびＣｙ５（赤色）蛍光標識が日常的に当該分野において使用されるが、しかし、他の類似の蛍光標識を用いてもよい。２つの比較されたサンプル間の遺伝子発現プロフィールまたはパターンを入手し、そして定量するために、２つのチャンネルにおけるシグナル間の比（赤：緑）を、Ｃｙ５／Ｃｙ３プローブの相対的強度により算出され、これは、各サンプルにおける特異的ｍＲＮＡの相対存在比の信頼し得る測定値とみなされる。ＤＮＡマイクロアレイの構築のための材料は市販されている（アフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ  ＣＡ）、シグマケミカルカンパニー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）、ゲノシス（Ｇｅｎｏｓｙｓ）（Ｔｈｅ  Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，  ＴＸ）  、コーンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ  ＣＡ）およびコーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＮＹ））。さらに、アフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）、コーンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、およびコーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）などの業者によりカスタムＤＮＡマイクロアレイを調製することができる
【００６０】
用語「発現プロフィール」は、所定の条件下における遺伝子群の発現を指す。
【００６１】
用語「遺伝子発現プロフィール」は、個々の遺伝子および個々の遺伝子の組の発現を指す。
【００６２】
ここで使用する標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローン化技術は当該分野において周知であり、そしてサンブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  Ｆｒｉｔｓｃｈ，  Ｅ．  Ｆ．  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：    Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ  （１９８９）（以後、「マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）」）；およびシルハビーら（Ｓｉｌｈａｖｙ，  Ｔ．  Ｊ．，  Ｂｅｎｎａｎ，  Ｍ．  Ｌ．  ａｎｄ  Ｅｎｑｕｉｓｔ，  Ｌ．  Ｗ．）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｌｄ  Ｐｒｅｓｓ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ  （１９８４）；およびオズベルら（Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ出版（１９８７）により説明されている。
【００６３】
本発明は、さまざまな代謝条件または増殖周期条件に応答性である枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｕｓ）のゲノム内に含有される多くの遺伝子を同定する。これらの遺伝子がこれらの条件に応答して調節されることを発見したことにより、遺伝子発現ならびにバイオリアクターの健全状態のモニタリングおよび調節にそれらを使用することが可能である。
【００６４】
マイクロアレイの作製
本発明は、これまで理解されていなかったさまざまな条件に応答性である当該分野において既知の多くの遺伝子を同定する。ＤＮＡマイクロアレイ技術を枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｕｓ）のゲノムに適用することによって、これらの新規の誘導条件が同定された。任意のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種を使用してもよいが、しかし、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）遺伝子貯蔵センター（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ）（Ｏｈｉｏ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，  Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，  ＯＨ）より入手される枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｕｓ）株が好ましい。
【００６５】
ＤＮＡマイクロアレイの作製は一般的であり、当該分野において周知である（例えば、ブラウンら（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．）米国特許第６，１１０，４２６号を参照のこと）。典型的に、マイクロアレイの作製は、１つの遺伝子または複数の遺伝子のｍＲＮＡ転写物を含む核酸サンプルか、またはアレイに含まれるべきｍＲＮＡ転写物から誘導される核酸を提供することから始まる。本明細書に記載のように、ｍＲＮＡ転写物から誘導される核酸は、合成でｍＲＮＡ転写物またはその部分配列が究極的にテンプレートとしての役割を果たす核酸を指す。従って、ｍＲＮＡから逆転写されるｃＤＮＡ、そのｃＤＮＡから転写されるｍＲＮＡ、ｃＤＮＡから増幅されるＤＮＡ、増幅されたＤＮＡから転写されるＲＮＡなどは、すべてｍＲＮＡ転写物から誘導され、そのように誘導された産物の検出によりサンプル内の本来の転写物の存在および／または存在比が示される。従って、適切なサンプルとしては、１つの遺伝子または複数の遺伝子のｍＲＮＡ転写物、ｍＲＮＡから逆転写されるｃＤＮＡ、ｃＤＮＡから転写されるｃＲＮＡ、遺伝子から増幅されるＤＮＡ、増幅されたＤＮＡから転写されるＲＮＡなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
典型的に、遺伝子は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（米国特許第４，６８３，２０２号（１９８７、ムリスら（Ｍｕｌｌｉｓ，  ｅｔ  ａｌ．）））およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（タボルら（Ｔａｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．）Ｐｒｏｃ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ８２，  １０７４−１０７８  （１９８５））または標準置換増幅（ウォーカーら（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ８９，  ３９２，  （１９９２））などのプライマー指向性増幅の方法によって増幅される。
【００６７】
次いで、増幅されたＯＲＦは、マイクロアレイを形成するために当該分野において周知の方法により、ガラスまたは他の固体物質から成るスライド上にスポットされる。最小数の合成工程で高密度のオリゴヌクレオチドのアレイを形成する方法については、公知である（例えば、ブラウンら（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．）米国特許第６，１１０，４２６号を参照のこと）。光指向性化学カップリング、および機械的指向性カップリングを含むが、これらに限定されないさまざまな方法によって、固体物質上にオリゴヌクレオチド類似体アレイを合成することができる。例えば、光指向性合成技術を使用して、ペプチド、オリゴヌクレオチドおよび他の分子の巨大アレイを形成する方法を開示しているピルングら（Ｐｉｒｒｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）米国特許第５，１４３，８５４号（ＰＣＴ出願ＷＯ９０／１５０７０号も参照のこと）およびフォーダーら（Ｆｏｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．）ＰＣＴ出願ＷＯ９０／１００９２号および同第ＷＯ９３／０９６６８号を参照のこと。フォーダーら（Ｆｏｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．）Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２５１，  ７６７−７７  （１９９１）も参照のこと。
【００６８】
ＯＲＦは、少なくとも１つの顕微鏡ガラススライド上に高密度で整列される。一旦、ゲノム由来のＯＲＦのすべての遺伝子が増幅され、単離され、そして整列されると、シグナル発生標識を有する１組のプローブが合成される。プローブは無作為に合成しても、または特定のオープンリーディングフレームの配列に基づいて合成してもよい。プローブは、典型的に、検出しようとする核酸配列に相補的な一本鎖核酸配列である。プローブは、ＯＲＦに「ハイブリダイズ可能」である。プローブの長さは５塩基〜１万塩基に変動することができ、実施しようとする特定の試験に依存する。典型的に、約１５塩基〜約３０塩基のプローブの長さが適切である。プローブ分子のただ一部のみが検出しようとする核酸配列に相補的である必要がある。さらに、プローブと標的配列との間の相補性は完全である必要はない。ハイブリダイゼーションは不完全な相補的分子の間でも生じ、その結果、ハイブリダイズされた領域内の塩基の特定の画分は、適切な相補的塩基と対を形成しない。
【００６９】
プローブに組み入れることができるシグナル発生標識は、当該分野において周知である。標識としては、例えば、蛍光部分、化学発光部分、粒子、酵素、放射性タグ、もしくは発光部分または分子が挙げられるが、これらに限定されず、ここで、蛍光部分が好ましい。核酸に付着し、そして蛍光シグナルを放射することが可能な蛍光染料が最も好ましい。フルオレセイン、テキサスレッド、およびローダミンなどのさまざまな染料が当該分野において公知である。１反応性染料ｃｙ３（１４６３６８−１６−３）およびｃｙ５（１４６３６８−１４−１）は、両方とも市販されている（即ち、アマシャムファルマシアバイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，  ＩＬ）。適切な染料については、米国特許第５，８１４，４５４号（本明細書において参考として援用される）において考察されている。
【００７０】
標識は、当業者に周知の多くの手段のいずれかに組み入れることができる。しかし、好適な実施態様では、標識は、プローブ核酸の調製の増幅工程中に同時に組み入れられる。従って、例えば、標識されたプライマーまたは標識されたヌクレオチドによるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、標識された増幅産物を提供する。好適な実施態様では、標識されたヌクレオチド（例えば、染料標識ＵＴＰおよび／またはＣＴＰ）を使用する逆転写または複製により、転写された核酸に標識が組み入れられる。
【００７１】
あるいは、本来の核酸サンプル（例えば、ｍＲＮＡ、ポリＡｍＲＮＡ、ｃＤＮＡなど）に直接かまたは合成完了後の増幅産物に標識を添加してもよい。核酸に標識を付着させる手段は当業者に周知であり、例えば、核酸のキナーゼ処理、それに続くサンプル核酸に接続している核酸リンカーの標識（例えば、蛍光団）への付着（連結反応）によるニックトランスレーションまたは（例えば、標識されたＲＮＡでの）末端標識化が挙げられる。
【００７２】
標識をプローブに組み入れた後、次いで、標準的な条件を使用して、プローブをマイクロアレイにハイブリダイズさせる、ここで、ハイブリダイゼーションの結果、二本鎖の核酸が生じ、表面に対する捕獲試薬の付着部位における標識から検出可能なシグナルが発生する。典型的に、プローブおよびアレイは、核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で相互に混合されなければならない。これには、適切な濃度および温度条件下、無機または有機塩の存在下でプローブとアレイとを接触させることを要する。プローブおよびアレイ核酸は、プローブとサンプル核酸との間に可能な任意のハイブリダイゼーションが生じ得るのに十分に長い時間だけ接触させなければならない。混合物中のプローブまたはアレイの濃度は、ハイブリダイゼーションが生じるのに必要な時間を決定する。プローブまたはアレイ濃度が高いほど、ハイブリダイゼーションのインキュベーションに必要な時間は短い。必要に応じて、カオトロピック剤を添加してもよい。カオトロピック剤は、ヌクレアーゼ活性を阻害することによって核酸を安定化する。さらに、カオトロピック剤は、室温で短いオリゴヌクレオチドプローブの高感度かつストリンジェントなハイブリダイゼーションを可能にする。［バンネスら（Ｖａｎ  Ｎｅｓｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｎ）（１９９１）  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９：５１４３−５１５１］。適切なカオトロピック剤としては、特に、塩化グアニジニウム、チオシアン酸グアニジニウム、チオシアン酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸リチウム、過塩素酸ナトリウム、テトラ酢酸ルビジウム、ヨウ化カリウム、およびトリフルオロ酢酸セシウムが挙げられる。典型的に、カオトロピック剤は、約３Ｍの最終濃度で存在する。所望であれば、ハイブリダイゼーション混合物に典型的に３０〜５０％（ｖ／ｖ）でホルムアミドを添加することができる。
【００７３】
さまざまなハイブリダイゼーション溶液を用いることができる。典型的に、これらは、約２０〜６０％容量、好ましくは３０％の極性有機溶媒を含む。一般的なハイブリダイゼーション溶液は、約３０〜５０％ｖ／ｖホルムアルデヒド、約０．１５〜１Ｍ塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳ（約６〜９のｐＨ範囲）などの約０．０５〜０．１Ｍ緩衝液、ドデシル硫酸ナトリウムなどの約０．０５〜０．２％界面活性剤、または０．５〜２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、フィコール（ＦＩＣＯＬＬ）（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｉｎｃ．））（約３００〜５００キロダルトン）、ポリビリルピロリドン（約２５０〜５００ｋｄａｌ）、血清アルブミンを用いる。また、典型的なハイブリダイゼーション溶液には、約０．１〜５ｍｇ／ｍＬの非標識キャリア核酸、フラグメント化した核酸ＤＮＡ、例えば、ウシ胸腺もしくはサケ精子ＤＮＡ、または酵母ＲＮＡ、および必要に応じて約０．５〜２％ｗｔ．／ｖｏｌ．グリシンが含まれる。また、ポリエチレングリコールなどのさまざまな極性水溶性または膨潤剤、ポリアクリレートまたはポリメタクリレートなどのアニオン性ポリマー、および硫酸デキストランなどのアニオン性多糖性ポリマーを含む排除体積剤などの他の添加物も含まれ得る。ハイブリダイゼーション条件を最適化する方法は当業者に周知である（例えば、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  ２４：核酸プローブによるハイブリダイゼーション、ティッセン編（Ｐ．  Ｔｉｊｓｓｅｎ，  ｅｄ．）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  Ｎ．Ｙ．，  （１９９３）を参照のこと）およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、上掲。
【００７４】
応答性遺伝子の同定
遺伝子発現のプロフィール決定対マイクロアレイ技術の偏りは、さまざまな条件下で生物体を比較することに依存し、その結果、発現される遺伝子に変化が生じる。本発明では、単一集団の細胞をさまざまなストレスに暴露した結果、遺伝子発現に変化が生じた。分析されたストレスまたは誘導条件には、１）酸素の涸渇、２）酸素の涸渇と亜硝酸塩の存在との組み合わせ、および３）定常増殖期に到達することが含まれる。「コントロール」アレイの作製のためにストレスを受けていない細胞を使用し、そして「実験」、「ストレス化」または「誘導された」アレイを作製するためにストレスを受けた細胞を使用する。
【００７５】
上記のＤＮＡマイクロアレイ技術を使用し、そして誘導された培養物と誘導されていない培養物とを比較して、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の細胞周期の対数または指数期において酸素の非存在下で、遺伝子ｎａｒＧＨＪＩ、ｃｓｎ、ｙｎｃＭ、ｙｖｙＤ、ｙｖａＷＸＹ、ｙｄｊＬ、ｓｕｎＡ、およびｙｏｌＩＪＫが誘導性であることを決定した。同様に、酸素の非存在と亜硝酸塩の存在との組み合わせは、遺伝子ｆｅｕＡＢＣ、ｙｋｕＮＯＰ、およびｄｈｂＡＢＣをアップレギュレーションレギュレーションするかまたは誘導するのに十分であった。典型的に、亜硝酸塩の濃度は、培地中に約１ｍＭ〜約１０ｍＭである。これらの場合、誘導に必要な要素には、酸素の欠如および対数期における増殖の両方が含まれる。酸素の添加かまたは対数増殖期に到達することのいずれによっても、これらの遺伝子のダウンレギュレーションが生じる。
【００７６】
さらに、多くの遺伝子は、細胞増殖周期の定常期のさまざまな時期で高度に誘導されることを発見した。例えば、好気的条件下で定常期のＴ０に到達することは、遺伝子ｙｃｇＭＮ、ｄｈａＳ、ｒａｐＦ、ｒａｐＧ、ｒａｐＨ、ｒａｐＫ、ｙｑｈＩＪ、ｙｖｅＫＬＭＮＯＰＱＳＴ、ｙｈｆＲＳＴＵＶ、ｃｓｎ、ｙｎｃＭ、ｙｖｙＤ、ｙｖａＷＸＹ、ｙｄｊＬ、ｓｕｎＡ、およびｙｏｌＩＪＫをアップレギュレーションさせるのに十分であった。同様に、好気的条件下で定常期のＴ１に到達することは、遺伝子ａｃｏＡＢＣＬ、およびｇｌｖＡＣをアップレギュレーションさせるのに十分であった。好気的条件下で定常期のＴ３に到達することは、遺伝子ｙｘｊＣＤＥＦ、ｙｎｇＥＦＧＨＩ、ｙｊｍＣＤＥＦＧ、ｙｋｆＡＢＣＤ、およびｙｏｄＯＰＲＳＴをアップレギュレーションさせるのに十分であった。
【００７７】
上記の遺伝子に対する誘導条件の発見に加えて、多くの遺伝子は、増殖周期中の極めて特定の時期にダウンレギュレーションされることを発見した。例えば、ａｌｓＴおよびｙｘｅＫＬＭＮ領域は、定常期に入るときにダウンレギュレーションさせる。
【００７８】
当業者であれば、本発明の遺伝子がさまざまなバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種の相同物を有し、そして異種遺伝子発現の使用ならびにバイオリアクターの健全状態および生産のモニタリングは枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｕｓ）から誘導される遺伝子には限定されることなく、存在するのであれば、あらゆるバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種の相同物にまで及ぶことを理解するであろう。例えば、本発明は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｕｓ）、バチルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、バチルスセレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バチルスブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、巨大菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルスインターメジウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、バチルスサーモアミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルスアミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルスサーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルスリヘニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルスマセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ）、バチルススファエリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、バチルスステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルスラテロスポルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、バチルスアシドカルダリウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、バチルスパミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、およびバチルスシュードファーマス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ）を含むが、それらに限定されない種から誘導される相同物を包含する。本発明のすべての遺伝子は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｕｓ）ゲノムにおいて同定されている（クンストら（Ｋｕｎｓｔ  ｅｔ  ａｌ．）Ｎａｔｕｒｅ  ３９０  （６６５７），  ２４９−２５６  （１９９７））が、例えば、ｃｓｎの相同物が、バチルスサーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、およびバチルスエヒメンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｅｈｉｍｅｎｓｉｓ）（シモサカら（Ｓｈｉｍｏｓａｋａ  ｅｔ  ａｌ．）Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  （２０００），  ５４（３），  ３５４−３６０；  Ｍａｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  （１９９４），  １４０（１），  １０３−７）ならびにバチルスアミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）（セキら（Ｓｅｋｉ  ｅｔ．）Ａｄｖ．  Ｃｈｉｔｉｎ  Ｓｃｉ．  （１９９７），  ２，  ２８４−２８９）において同定されている。
【００７９】
本発明の遺伝子の機能および該遺伝子がアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされる条件を以下の表１に示す。
【００８０】
【表３】
2005503752.tif 000004
【００８１】
【表４】
2005503752.tif 000005
【００８２】
ｎａｒＧＨＪＩおよびａｃｏＡＢＣＬについては、ＤＮＡマイクロアレイ技術を使用して予め特徴付けされているが、本出願人らは、遺伝子の相対的比率誘導とゲノム中の４，０００を超える他のゲノムとを比較して、新規の機能情報を導き出す能力を有している。例えば、ｎａｒＧＨＪＩは、対数期の好気的条件下で最も高度に誘導される領域であることが認められた。ａｃｏＡＢＣＬは、定常期に入って１時間後に最も高度に誘導される領域である。これらの知見より、これらの遺伝子由来のプロモーター領域を使用して遺伝子発現を調節することができるか、またはそれらは診断マーカーとして機能し得ることが実証される。
【００８３】
バイオマスをモニターするための発現プロフィール
本発明の遺伝子は、リアクターのバイオマスの状態のモニタリングのためにさまざまな形式で使用することができる。
【００８４】
遺伝子発現プロフィールは、特定の時期に細胞が増殖している環境条件を反映している。その結果、これらのプロフィールまたはパターンをマーカーとして使用して、細胞の代謝状態を表現することができる。例えば、ｙｃｇＭＮ、ｒａｐＦ、ｒａｐＫ、ｒａｐＨ、ｒａｐＧ、ｙｖｙＤ、ｙｖａＷＸＹ、ｓｕｎＡ、ｙｎｃＭ、ｙｄｊＬ、ｙｈｆＲＳＴＵＶ遺伝子のｍＲＮＡレベルの上昇ならびにａｌｓＴおよびｙｘｅＫＬＭＮの減少であれば、それらの発現レベルは指数期の終了時に変化し始めるため、それは細胞が栄養制限を経験していることを示す。ＤＮＡ領域ｙｊｍＣＤＥＦＧ、ｙｋｆＡＢＣＤ、ｙｎｇＥＦＧＨＩ、およびｙｘｊＤＤＥＦがｍＲＮＡレベルの上昇を示す場合、それらの領域は、通常、定常期に入って３時間目に発現されるため、このことは栄養制限がより過酷な状態であることを示唆する。同様に、ｓｕｎＡ、ｙｏｌＩＪＫ、ｙｖａＷＸＹ、ｙｄｊＬ、ｙｖｙＤ、ｃｓｎ、およびｙｎｃＭの転写が上昇し、それ以外の定常期遺伝子は上昇しなかった場合、それは、細胞への酸素の供給に制限があることを示す。
【００８５】
バイオマスモニタリングのためのこれらの遺伝子を使用するための形式は、モニターしようとする醗酵のタイプに依存して変動し、該形式としては、ＤＮＡマイクロアレイ分析、ノーザンブロット［クルムラウフ，ロブ（Ｋｒｕｍｌａｕｆ，  Ｒｏｂｂ）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  （Ｔｏｔｏｗａ，  ＮＪ）  （１９９１），  ７（遺伝子導入発現プロトコル）３０７−２３］、プライマー伸長、およびヌクレアーゼ保護アッセイ［ワルムスレーら（Ｗａｌｍｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  （Ｔｏｔｏｗａ，  ＮＪ）  （１９９１），  ７（遺伝子導入発現プロトコル）２７１−８１］または他のｍＲＮＡ定量手順が挙げられるが、これらに限定されない。ＤＮＡマイクロアッセイによる遺伝子発現モニタリングの方法は、典型的に、（１）枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｕｓ）のためのＤＮＡマイクロアッセイの構築、（２）ＲＮＡの単離、標識化および核酸プローブの高密度アレイに対する核酸標的サンプルのスライドハイブリダイゼーション、ならびに（３）アレイにおいて各プローブにハイブリダイズした標的核酸の検出および量の定量および相対的発現の算出を要する。これらのアレイによるハイブリダイゼーションは、遺伝子ファミリーのさまざまなメンバーの同時モニタリングを可能にし、続いて、バイオマスの状態のモニタリングによって、バイオリアクターにおける産生収量を最適化することができる。
【００８６】
さらに、本発明の発現モニタリング方法により、遺伝子の機能および他の遺伝子との相互作用を規定する「動的」遺伝子データベースの開発が可能である。同定された遺伝子を使用して、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｕｓ）ゲノムの多様な領域において分析されていない遺伝子の不活化および発現分析の起因となる遺伝子を研究することができる。この種の分析の結果は、異なる条件での増殖において不活化されている遺伝子およびそれらの発現パターンの必然性に関する重要な情報を提供する。
【００８７】
さらに、本発明によって同定されている遺伝子をプロモーター候補ならびに生物体の代謝状態および潜在的ストレス因子または増殖中における栄養制限に対する診断マーカーとして用いることができる。例えば、本発明のプロモーターおよび遺伝子発現パターンによって、特定の生体基本材料の産生のために最適化されたプロセスを開発することができる。そのようなプロセスには、培養培地の変更、酸素入力、栄養組成、（ｐＨおよび温度変化などの）環境ストレス、特定の産物の過剰産生または外来遺伝子産物の発現を要し得る。従って、そのような方法を使用することによって、本発明を使用して、細胞の状態を反映する包括的な発現プロフィールをモニターすることができる。
【００８８】
調節された遺伝子発現
本発明の遺伝子を使用して、特定の誘導条件下または細胞増殖周期の特定の時点でさまざまなバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）におけるキメラ遺伝子の調節された発現を生じさせることができる。有用なキメラ遺伝子は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種において発現させようとする目的のコーディング領域に操作可能に連結された本明細書で規定された誘導性遺伝子のいずれか１つのプロモーター領域を含む。枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｕｓ）、バチルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、バチルスセレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バチルスブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、巨大菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルスインターメジウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、バチルスサーモアミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルスアミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルスサーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルスリヘニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルスマセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ）、バチルススファエリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、バチルスステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルスラテロスポルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、バチルスアシドカルダリウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、バチルスパミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、およびバチルスシュードファーマス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ）を含むが、これらに限定されない、プロモーター領域を収容可能なあらゆる宿主が適切である。
【００８９】
組換えバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主において発現させようとする目的のコーディング領域は、宿主に対して内因性であってもまたは異種であってもよいが、宿主生物体に適合可能でなければならない。商業的価値のあるタンパク質をコードする遺伝子は、発現に特に適切である。例えば、目的のコーディング領域としては、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫または哺乳動物を含む脊椎動物のポリペプチドをコードするコーディング領域を含むがそれらに限定されず、例えば、構造タンパク質、酵素、またはペプチドであってもよい。特に好適であるが限定されないリストには、イソプレノイド分子の産生に関与する酵素をコードする遺伝子、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）または他の細菌由来のポリヒドロキシアルカノン酸（ＰＨＡ）シンターゼ（ｐｈａＥ；ジーンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）受託番号ＧＩ１６５２５０８、ｐｈａＣ；ジーンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）受託番号ＧＩ１６５２５０９）をコードする遺伝子、フィトエンシンターゼ（ｃｒｔＢ；ジーンバンク（ジーンバンクＧｅｎｂａｎｋ）受託番号ＧＩ１６５２９３０）、フェイトエンデサチュラーゼ（ｃｒｔＤ；ジーンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）受託番号ＧＩ１６５２９２９）、βカロチンケトラーゼ（ｃｒｔＯ；ジーンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）受託番号ＧＩ１００１７２４）などのカロテノイド経路遺伝子をコードする遺伝子、エチレン産生のためのエチレン形成酵素（ｅｆｅ）、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ｐｄｃ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈ）、テルペノイド産生のための環状テルペノイドシンターゼ（即ち、リモネンシンターゼ、ピネンシンターゼ、ボルニルシンターゼ、フェランドレンシンターゼ、シネオールシンターゼ、およびサビネンシンターゼ）、ならびにタキソール産生のためのタキサジエンシンターゼなどが含まれる。イソプレノイド分子の産生に関与する酵素をコードする遺伝子としては、例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）において発現させることができ、この生物体におけるイソプレノイド経路に対し高い流動を利用するためのゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ（ｃｒｔＥ；ジーンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）受託番号ＧＩ１６５１７６２）、ソラネシル二リン酸シンターゼ（ｓｄｓ；ジーンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）受託番号ＧＩ１６５１６５１）が挙げられる。ポリヒドロキシアルカノン酸（ＰＨＡ）シンターゼ（ｐｈａＥ、ｐｈａＣ）をコードする遺伝子は、生分解性プラスチックの産生のために使用してもよい。
【００９０】
発現させようとするキメラの構築のための開始領域またはプロモーターは、本明細書において同定された誘導性遺伝子に由来する。プロモーター領域は、誘導性遺伝子およびそれらの相同物（表１）の配列から同定し、一般的な方法に従って単離することができる（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、上掲）。一旦、プロモーター領域が同定され、そして単離されれば、それらを目的のコーディング領域に操作可能に連結させて、適切な発現ベクターで発現させることができる。
【００９１】
相同物の同定のための配列依存性プロトコルの例としては、核酸ハイブリダイゼーションの方法、ならびに核酸酸増幅技術［例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、マリスら（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．）米国特許第４，６８３，２０２号；リガーゼ連鎖反応、タボルら（Ｔａｂｏｒ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．）Ｐｒｏｃ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２，  １０７４，  （１９８５）］または鎖置換増幅［ＳＤＡ、ウォーカーら（Ｗａｌｋｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ８９，  ３９２，  （１９９２）］を多様に使用して例示されるＤＮＡおよびＲＮＡ増幅の方法が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９２】
一般に、本発明の配列の２つの短いセグメントは、ポリメラーゼ連鎖反応プロトコルに使用して、ＤＮＡまたはＲＮＡ由来の相同遺伝子をコードするコードするより長い核酸フラグメントを増幅することができる。また、ポリメラーゼ連鎖反応をクローン化核酸フラグメントのライブラリー上で実施してもよく、ここで、一方のプライマーの配列は本発明の各フラグメントに由来し、他方のプライマーの配列は、微生物の遺伝子をコードするｍＲＮＡ前駆体の３’末端側にポリアデニル酸区域が存在することを利点とする。
【００９３】
あるいは、本発明の配列は、相同物の同定のためのハイブリダイゼーション試薬として用いることもできる。核酸ハイブリダイゼーション試験の塩基組成には、プローブ、目的の遺伝子または複数の遺伝子を含有することが疑われるサンプル、および特異的ハイブリダイゼーション方法が含まれる。本発明のプローブは、典型的に、検出しようとする核酸配列に相補的な一本鎖核酸配列である。プローブは、検出しようとする核酸配列に「ハイブリダイズ可能」である。
【００９４】
適切なバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞の形質転換に有用なベクターまたはカセットは、当該分野において周知である。典型的に、ベクターまたはカセットは、関連遺伝子の転写および翻訳を指令する配列、選択マーカー、および自己複製または染色体組込みを可能にする配列を含有する。適切なベクターは、転写の開始を制御を有する遺伝子の５’側領域および転写の終了を制御するＤＮＡフラグメントの３’側領域を含む。両方の制御領域が形質転換された宿細胞に相同な遺伝子に由来することが最も好ましいが、そのような制御領域は、産生宿主として選択される特定種に生来である遺伝子に由来する必要はないことを理解すべきである。また、終了を制御する領域は、好適な宿主に生来であるさまざまな遺伝子に由来するものであってもよい。必要に応じて、終止部位は必ずしも必要ではないが、含まれているのであればそれが最も好ましい。
【００９５】
遺伝子操作のための組込みベクターのアプリケーションは、極めて良好に確立されており、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｕｓ）において広範に使用される（ペレゴ（Ｍ．  Ｐｅｒｅｇｏ）１９９３，  Ｉｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｇｒａｍ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ，  ｐ．６１５−６２４）。あるいは、使用すべきプロモーターは、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｕｓ）を形質転換し、そして枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｕｓ）内で自体を複製することが可能であるプラスミドにクローン化することができる（ジャニーレら（Ｌ．  Ｊａｎｎｉｅｒｅ，  ｅｔ  ａｌ）Ｉｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｇｒａｍ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ，  ｐ．  ６２５−６４４；ナガラジャンら（Ｎａｇａｒａｊａｎ  ｅｔ  ａｌ）１９８７，  ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ４，８０１，５３７）。次いで、発現させようとする遺伝子をプロモーターの下流にクローン化することができる。一旦、組換えバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）種が確立されると、酸素制限、亜硝酸塩の添加などによって、遺伝子発現を達成することができる。
【００９６】
必要に応じて、本発明の産物を形質転換された宿主の分泌産物として産生することを所望してもよい。増殖培地への所望されるタンパク質の分泌は、単純化された低コストの生成手順を利点とする。当該分野においては、分泌シグナル配列は、しばしば、細胞膜を横切る分泌可能なタンパク質の能動輸送を容易にする点で有用である。分泌が可能である形質転換された宿主の作製は、宿主産生宿主において機能的である分泌シグナルをコードするＤＮＡ配列の組み入れによって、達成することができる。適切なシグナル配列を選択する方法は当該分野において周知である（例えば、欧州特許第５４６０４９号；ＷＯ９３２４６３１）。分泌シグナルＤＮＡまたは促進因子は、発現制御ＤＮＡと本発明の遺伝子または遺伝子フラグメントとの間であって、後者と同じリーディングフレーム内に位置することができる。
【００９７】
（実施例）
実施例
以下の実施例において本発明をさらに説明する。これらの実施例は本発明の好適な実施態様を示すと同時に例示のみの方法によって与えられることを理解すべきである。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者であれば、本発明の本質的特徴を確かめることができ、そして本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明にさまざまな変更および改変を加えて、さまざまな用途および条件に適応することができる。
【００９８】
一般的方法
実施例で使用した標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローン化技術は当該分野において周知であり、サンブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  Ｆｒｉｔｓｃｈ，  Ｅ．Ｆ．  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ）Ｔ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：    Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：    Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  （１９８９）  （Ｍａｎｉａｔｉｓ）およびシルハビーら（Ｔ．  Ｊ．  Ｓｉｌｈａｖｙ，  Ｍ．  Ｌ．  Ｂｅｎｎａｎ，  ａｎｄ  Ｌ．  Ｗ．  Ｅｎｑｕｉｓｔ）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ  （１９８４）およびアスベルら（Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅより出版  （１９８７）により記載されている。
【００９９】
略語の意味は次のようである：「ｈｒ」は時間（単数および複数）を意味し、「ｍｉｎ」は分（単数および複数）を意味し、「ｓｅｃ」は秒（単数および複数）を意味し、「ｄ」は日（単数および複数）を意味し、「ｍＬ」はミリリットル（単数および複数）を意味し、「μＬ」はマイクロリットル（単数および複数）を意味し、「ｎＬ」はナノリットル（単数および複数）を意味し、「μｇ」はマイクログラム（単数および複数）を意味し、「ｎｇ」はナノグラム（単数および複数）を意味し、「ｍＭ」はミリモル（単数および複数）を意味し、「μＭ」はマイクロモル（単数および複数）を意味する。
【０１００】
培地および培養条件
細菌培養の維持および増殖に適切な材料ならびに方法は、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  （ジェフェリーＨ．ミラー（Ｊｅｆｆｒｅｙ  Ｈ．  Ｍｉｌｌｅｒ））、Ｃｏｌｄ  ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９７２），  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  （フィリップゲルハルトら編（Ｐｈｉｌｌｉｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ，  Ｒ．Ｇ．Ｅ．  Ｍｕｒｒａｙ，  Ｒａｌｐｈ  Ｎ．  Ｃｏｓｔｉｌｏｗ，  Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．  Ｎｅｓｔｅｒ，  Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．  Ｗｏｏｄ，  Ｎｏｅｌ  Ｒ．  Ｋｒｉｅｇ  ａｎｄ  Ｇ．  Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，  ｅｄｓ）），  ｐｐ．  ２１０−２１３，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  ＤＣ．またはトーマスＤ．ブロック（Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．  Ｂｒｏｃｋ）  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：    Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （１９８９）  Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ  ＭＡにおいて見出された。細菌細胞の増殖および維持に使用したすべての試薬および材料は、特に断りがない限り、アルドリッヒケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，  ＷＩ）、ディフコラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｏｔｉｅｓ）（Ｄｅｔｒｏｉｔ，  ＭＩ）、ギブコ／ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ）、またはシグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）より入手した。
【０１０１】
分子生物学技術：
アガロースゲル電気泳動技術は、サンブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：    Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）に記載の通りに実施した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術は、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ，  Ｂ．）ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：    Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｖｏｌｕｍｅ  １５（１９９３）  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．において見出された。
【０１０２】
実施例１
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｕｓ）におけるＤＮＡマイクロアッセイ技術の適用
実施例１では、異なる増殖培地における細胞の増殖に従った枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｕｓ）におけるＤＮＡマイクロアッセイの使用手順について説明する。アレイにおける各スポットのシグナルの強度を使用して、この生物体のゲノム規模の遺伝子発現パターンを決定した。
【０１０３】
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｕｓ）株および培養培地
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｕｓ）株１６８（誘導株ＪＨ６４２）は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）遺伝子貯蔵センター（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ）（Ｏｈｉｏ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，  Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，  ＯＨ）より入手した。細胞は、次の培地：２×ＹＴ培地（ギブコＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ）またはシェファー（Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ’ｓ）の胞子形成培地で日常的に３７℃で増殖させた。１リットルのシェファー（Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ’ｓ）の胞子形成培地は、次の成分を含有した：８ｇバクト（Ｂａｃｔｏ）−栄養ブロス、１ｇのＫＣｌ、０．１２ｇのＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、０．５ｍｌの１．０Ｍ  ＮａＯＨ、１ｍｌの１．０Ｍ  Ｃａ（ＮＯ３）４、１ｍｌの０．０１Ｍ  ＭｎＣｌ２、および１ｍｌの１．０ｍＭ  ＦｅＳＯ４。
【０１０４】
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｕｓ）のためのＤＮＡマイクロアレイの構築
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｕｓ）ゲノムのすべての４，１００のＯＲＦに対するオリゴヌクレオチドは、ジェノシス（Ｇｅｎｏｓｙｓ）（Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，  ＴＸ）から購入した。キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）（Ｖａｌｅｎｃｉａ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）製ホットスタート（ＨｏｔＳｔａｒｔ）ＰＣＲキットをすべてのＰＣＲ反応に使用した。サイクル条件は、以下の通りである：５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で２分間の伸長、および９５℃で３０秒間の変性。ＰＣＲ産物は、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）製キアクイックマルチウェル（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ）ＰＣＲ精製キットで精製し、そして、ＰＣＲの量は、アガロースゲル（１％）上での電気泳動によって確認した。それぞれの像をデータベースに保存し、そしてＰＣＲの観察されたサイズは、予測された値と自動的に比較した。この情報はまた、対照として使用し、ハイブリダイゼーションの量をより大きな段階で確認した。ＰＣＲ反応の２ラウンド後、約９５％のＰＣＲ反応が成功し、残りのＯＲＦをもう１つの組のオリゴヌクレオチドで増幅した。ＯＲＦが３ｋｂより大きい場合、遺伝子（２ｋｂ未満）の一部のみを増幅した。４，０２０ＰＣＲ産物の全体を入手した。これらのＰＣＲ産物をチオシアン酸ナトリウムで最適化したタイプ６のスライド（アマシャムファルマシアバイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）上にＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ＩＩＩスポッター（サニーバレー（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ）ＣＡ）でスポットした。４，０２０ＰＣＲ産物のそれぞれを二連で単一のスライドにスポットした。
【０１０５】
各アレイスライドはまた、異なる１．０ｋｂλＤＮＡフラグメントから成る１０個の異なる内部コントロールを含有した。各コントロールのＰＣＲ産物をアレイの異なる位置にスポットした。すべてのコントロールフラグメントはまた、ＰＣＲ反応によって作製されたＴ７プロモーターを含有した。ＰＣＲ産物を直接使用し、インビトロ転写キット（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）Ａｕｓｔｉｎ，  ＴＸ）によりＲＮＡを作製した。等量のコントロールｍＲＮＡ混合物を、それぞれ標識化する前に、２つの全ＲＮＡサンプルにスパイクした。
【０１０６】
ＲＮＡ単離、標識化およびスライドハイブリダイゼーション
Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキットにより、全ＲＮＡを枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｕｓ）から単離した。細胞培養物を、ベックマン（Ｂｅｃｈｍａｎ）卓上遠心分離機（ベックマンインスツルメンツ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，  ＣＡ）により遠心分離で回収した。遠心分離機の速度は９，０００ｒｐｍまで上げ、次いで、直ちに停止した。細胞を直接ＲＬＴ緩衝液に懸濁し、ＦａｓｔＲＮＡキット（バイオ１０１（Ｂｉｏ１０１）、Ｖｉｓｔａ，  ＣＡ）のセラミックビーズを有する２ｍｌチューブに置いた。ビーズビター（ＦＰ１２０  ＦａｓｔＰｒｅｐ細胞破砕機、サーバントインスツルメンツ社（Ｓａｖａｎｔ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｉｎｃ．）Ｈｏｌｂｒｏｏｋ，  ＮＹ）中４．０の速度設定で４０秒間、チューブを振盪した。残渣ＤＮＡをキアゲンＲＮアーゼフリーＤＮアーゼ（Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ）でカラム上で取り出した。逆転写酵素を伴うｃＤＮＡプローブを作製するために、それぞれの標識化反応について１０〜１５μｇのＲＮＡを使用した。標識化のためのプロトコルは、酵母について先に記載のプロトコル（デリシら（ＤｅＲｉｓｉ，  Ｊ．  Ｌ．，  Ｖ．  Ｒ．  Ｉｙｅｒ，  ａｎｄ  Ｐ．  Ｏ．  Ｂｒｏｗｎ）１９９７，  Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｎ  ａ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｃａｌｅ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２７８：６８０−６８６）に類似したものであった。この研究では、プライミングのためにランダムヘキサマー（ギブコＢＧＬ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ））を使用し、そして蛍光団Ｃｙ３−ｄＣＴＰまたはＣｙ５−ｄＣＴＰ（アマシャムファルマシアバイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））を標識化に使用した。標識化後、ＮａＯＨ処理によりＲＮＡ取り出し、キアゲンＰＣＲミニ（Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲ  Ｍｉｎｉ）キットで直ちにＤＮＡを精製した。標識化の効率を（ＤＮＡ濃度に対する）２６０ｎｍ、（Ｃｙ５に対する）５５０ｎｍ、および（Ｃｙ３に対する）６５０ｎｍでの吸光度によって日常的にモニターした。
【０１０７】
全ＲＮＡ調製のそれぞれをＣｙ３−ｄＣＴＰおよびＣｙ５−ｄＣＴＰの両方で標識した。単一のガラススライドをハイブリダイズするために、１つの増殖状態由来のＣｙ３−標識プローブをもう１つのＣｙ５−標識プローブと混合させ、そしてその逆も行った。その結果、それぞれの実験で２つのスライドを必要とした。組み入れられた染料濃度に基づく等量のＣｙ３−およびＣｙ５−標識プローブをそれぞれのスライドに適用した。Ｃｙ３−およびＣｙ５−標識プローブの量は、（Ｃｙ５に対する）５５０ｎｍおよび６５０ｎｍ（Ｃｙ３）での吸光計数で決定した。３７℃で１晩、ホルムアミドを含有するマイクロアレイハイブリダイゼーション緩衝液（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ）（アマシャムファルマシアバイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））ハイブリダイゼーションを行った。スライドは１５分間間隔で、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを含有する溶液で３７℃で１回、０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを含有する溶液で室温で３回、洗浄した。次いで、スライドを０．１×ＳＳＣおよびｄＨ２Ｏで濯いだ。Ｎ２流下で乾燥した後、Ｃｙ５およびＣｙ３両方の蛍光の蛍光強度についてスライドをスキャンした。アレイのそれぞれのスポット由来のシグナルは、モレキュラーダイナミクス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）製のアレイビジョン（ＡｒｒａｙＶｉｓｉｏｎ）ソフトウェアを使用して定量した。
【０１０８】
データ分析および表示
各スポットのシグナル強度を算出するには２つの方法がある。１つの方法は正規化密度×面積（ｎＤ×Ａ）で、参照で除した蛍光単位（バックグランド値を減じた後）である。参照は、Ｄ×Ａ−アレイのすべてのエレメントのバックグランド値の平均である。第２のシグナル強度は、バックグランド値を減じた後のＤ×Ａである。正規化は、内部コントロールで行った。第１のケースでの正規化の目的は、スライド内で発生したデータおよび異なるスライド由来のデータを直接比較できるように、スライド間のばらつきならびにＣｙ５およびＣｙ３の組み入れ効率の差によって生じる誤差を補正することである。この方法は、アレイ内の全ｍＲＮＡに基づき、母集団の１０％未満が２つの条件間で変化したとみなされた。Ｄ×Ａおよび内部コントロールによる正規化を使用する目的は、１０％を超える全母集団が変化している場合のｍＲＮＡレベルの変化を測定することである。この方法は、全ＲＮＡレベルに基づく。
【０１０９】
それぞれの染料のスワップハイブリダイゼーションの２つのスライドから、Ｃｙ３／Ｃｙ５またはＣｙ５／Ｃｙ３についての強度の比を１つの独立した実験値として平均した。データは、少なくとも３つの独立した実験地から得た。スポット強度の比は、研究した条件下でのｍＲＮＡレベルの相対存在比を表す。ｍＲＮＡのレベルは、しばしば、特定のＤＮＡ領域の誘導または減少の比率に反映する。
【０１１０】
実施例２
指数期の枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｕｓ）において嫌気的に誘導されたＤＮＡ領域の同定
実施例１に記載の方法で調製した枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｕｓ）ＤＮＡマイクロアレイを使用して、本出願人らは、誘導条件として酸素制限環境を伴う枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｕｓ）および類似生物体での遺伝子発現の異なるレベルについて用いることができるプロモーターを同定した。本実施例では、２×ＹＴ培地で増殖させた場合の枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｕｓ）における嫌気的に誘導された遺伝子およびそれらの対応するプロモーターの同定について説明する。指数期で増殖させた細胞を使用した。
【０１１１】
具体的には、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｕｓ）株を３７℃、１％グルコースおよび２０ｍＭ  Ｋ３ＰＯ４（ｐＨ７．０）を補充した２×ＹＴ培地で増殖させた。好気的増殖では、２５０ｒｐｍの速度でロータリープラットフォーム上に配置した２５０ｍｌフラスコ中において、２０ｍｌの予め加温した培地に０．１ｍｌの１晩培養物を接種した（１：２００希釈）。嫌気的増殖では、１２０ｍｌの予め加温した培地を、１５０ｍｌ血清瓶に配置した。３種の嫌気的培養条件について試験した：別の電子受容体として硝酸塩を有する嫌気的増殖、別の電子受容体として亜硝酸を有する嫌気的増殖、および硝酸塩または亜硝酸塩の存在を伴わない醗酵増殖。使用する場合は、５ｍＭの濃度で硝酸カリウムまたは２．５ｍＭの濃度で亜硝酸カリウムを添加した。嫌気的条件を作製するために、血清瓶をテフロン（Ｔｅｆｌｏｎ）コートしたストッパーで蓋を閉め、そして気相にアルゴンガスを噴出し、充填した。
【０１１２】
指数培養からＲＮＡを単離するために、好気培養では６００ｎｍでの０．４Ｏ．Ｄ．で、硝酸塩上で増殖させた培養では０．２５Ｏ．Ｄ．で、亜硝酸塩で増殖された培養では０．１５Ｏ．Ｄ．で、変更なしで増殖させた培養では０．１２Ｏ．Ｄ．で、そして醗酵培養中にピルビン酸塩を添加した場合は０．３Ｏ．Ｄ．でサンプルを取り出した。全ＲＮＡを単離し、そして実施例１に記載の蛍光染料で標識した。それぞれのハイブリダイゼーションは、好気的プローブおよびさまざまな嫌気的プローブのうちの１つ（硝酸塩、亜硝酸塩または変更なしのいずれかを含有する）から成った。嫌気的サンプルと好気的サンプルとの間の比が高かった場合は、特定の遺伝子またはＤＮＡ領域が、嫌気的条件下で誘導されたことを示す。このＤＮＡマイクロアレイ技術では、４，０２０遺伝子のすべての発現パターンを調べたところ、すべての嫌気的条件で最も高く誘導された領域はｎａｒＧＨＪＩであった。ｎａｒＧＨＪＩ領域は、嫌気的条件下で誘導されることが明らかにされているが、このことを明らかにしたのは、誘導のレベルを他のすべての遺伝子と比較して決定することができるＤＮＡマイクロアレイ技術だけである。この技術によって同定された新規の嫌気的遺伝子は、ｙｄｊＬ、ｃｓｎ、ｙｖｙＤ、ｙｖａＷ、ｙｖａＸ、およびｙｖａＹであった。これらの遺伝子については特徴付けされておらず、これらのうちの多くが不明である。驚くべきことに、電子受容体として亜硝酸塩が使用される場合の増殖条件において、特異的に誘導された変化を示した３つのＤＮＡ領域がある。それらには、ｄｈｂ、ｙｋｕＮＯＰ、およびｆｅｕ領域が含まれる。亜硝酸による遺伝子誘導のこのような独特な特徴は、発現ベクターを設計するための手段として使用することができる。
【０１１３】
【表５】
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【０１１４】
実施例３
酸素の存在下で増殖させた細胞により定常期で誘導されたＤＮＡ領域の同定
実施例１に記載の方法で調製された枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｕｓ）ＤＮＡマイクロアッセイを使用して、本出願人らは、酸素の存在下で細胞が定常期に到達した場合の枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｕｓ）および類似生物体での遺伝子発現について用いることができるプロモーターを同定した。本実施例では、０．１％グルコースおよび２０ｍＭ  Ｋ３ＰＯ４（ｐＨ７．０）を補充したシェファー（Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ’ｓ）の培地において酸素の存在下で増殖させた場合に定常期の異なる段階で誘導された遺伝子およびそれらに対応するプロモーターの同定について説明する。
【０１１５】
具体的には、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｕｓ）株を３７℃で増殖させた。２５０ｒｐｍの速度でロータリープラットフォーム上に配置した２５０ｍｌフラスコ中において、０．０３〜０．０４のＯ．Ｄ．を与える１晩培養物を２０ｍｌの予め加温した培地のアリコートに接種した（１：２００希釈）。ＲＮＡ調製のために、指数培養を中間対数期で回収した。指数増殖の終了時に、定常期にはいて１時間および３時間目に回収した細胞を、それぞれＴ０、Ｔ１およびＴ３とした。ＲＮＡの単離、標識化、およびスライドハイブリダイゼーションを実施例１に記載のように行った。ハイブリダイゼーションでは、それぞれのスライドは、２つのプローブ、中間対数期のサンプルおよび定常期サンプルのうちの１つを含有した（Ｔ０、Ｔ１、またはＴ３）。
【０１１６】
酸素の存在下で定常期に誘導された遺伝子を同定するために、指数（対数）期サンプルと定常期サンプル（Ｔ０、Ｔ１、またはＴ３）のうちの１つとの間のｍＲＮＡシグナルを比較した。定常期サンプルと対数期サンプルとの間の比が高い場合は、それは、特定の遺伝子またはＤＮＡ領域が定常期でアップレギュレーションされたことを示す。このＤＮＡマイクロアレイ技術では、表３に示すように、多くの遺伝子が異なる段階でｍＲＮＡのレベルが上昇したことを示している。ｙｃｇＭＮ、ｃｓｎ、ｙｖａＷ、ｙｖａＸ、ｙｖａＹ、ｙｎｃＭ、ｙｖｙＤ、およびｙｑｈＩＪなどの遺伝子は、すべて３つのすべての段階で誘導された。ｙｏｌＩ、ｙｏｌＪ、ｙｏｌＫおよびｙｄｊＬなどの遺伝子は、段階Ｔ０およびＴ２でほとんどが誘導された。定常期でのこれらの遺伝子の発現パターンについては、これまで研究されていなかった。定常期でのアセトインの代謝に関与するａｃｏ領域については以前にも研究されていたが、該領域がこの増殖条件下でＴ１段階において最も高く誘導された領域であることが見出されたのは、ＤＮＡマイクロアレイ技術によってのみである。定常期に入って３時間目により高いｍＲＮＡレベルを示すが、特徴付けされていない遺伝子のクラスターは相当存在した。それらには、ｙｋｆＡＢＣＤ、ｙｊｍＣＤＥＦＧ、およびｙｏｄＬＰＯＲＳＴが含まれる。対照的に、ａｌｓＴおよびｙｘｅＫＬＭＮなどのＤＮＡ領域は、定常期に入るとｍＲＮＡレベルの減少を示した。このデータを表３にまとめて示す。表３は、酸素の存在下で０．１％グルコースを補充したシェファー（Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ’ｓ）の培地において増殖させた場合に枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｕｓ）の定常期でのｍＲＮＡ転写レベルの増加または減少（括弧内）を示す選択された遺伝子または遺伝子クラスターについて説明している。
【０１１７】
【表６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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