(57)【要約】本発明は、患者における脈管組織または血管の過形成に関連する疾患または障害を治療または予防する方法であって、該患者にＮＰＹ Ｙ２受容体に影響を及ぼす薬剤を投与することを含む方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における脈管組織または血管の過形成に関連する疾患または障害を治療または予防するために有用な医薬の製造のための、ＮＰＹ Ｙ２受容体に影響を及ぼす薬剤の使用。
【請求項２】
前記疾患または障害が、血管新生緑内障などの新脈管形成が関与する任意の形態、網膜症の任意の形態、増殖性糖尿病網膜症などのすべての増殖性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性症、黄斑症、糖尿病により引き起こされる微小血管または巨大血管の目の合併症、ネフロパシー、糖尿病ネフロパシー、虹彩ルベオーシス、血管腫、血管線維腫、乾癬、網膜症の結果である視覚喪失および失明に対する素因、代謝病、心臓血管病または癌性疾患である請求項１記載の使用。
【請求項３】
癌性疾患が、悪性の腫瘍および新生物、芽細胞腫、癌または肉腫、高度な脈管の腫瘍および新生物、類表皮の腫瘍、肉腫の腫瘍、頭および首の腫瘍、結腸直腸の腫瘍、前立腺の腫瘍、乳房の腫瘍、小細胞および非小細胞肺腫瘍などの肺の腫瘍、膵臓の腫瘍、甲状腺の腫瘍、卵巣の腫瘍、および肝臓の腫瘍などの腫瘍および新生物、鱗状の細胞癌、基底細胞癌、および新生血管の成長を抑制することにより治療できる皮膚癌などの血管化皮膚癌、カポージ肉腫、神経芽細胞腫、毛細血管芽細胞腫、髄膜腫および大脳の転移などのＣＮＳ新生物、メラノーマ、胃腸および腎の癌および肉腫、横紋筋肉種、グリア芽細胞腫、多形性グリア芽細胞腫、および平滑筋肉腫である請求項２記載の使用。
【請求項４】
前記薬剤がＮＰＹ Ｙ２受容体アンタゴニストである請求項１記載の使用。
【請求項５】
ｉ）前記薬剤がＹ１−受容体アゴニストまたはアンタゴニストでもある、および／またはii）前記薬剤がＹ５−受容体アゴニストまたはアンタゴニストでもある請求項４記載の使用。
【請求項６】
前記薬剤が、ヒトＮＰＹ Ｙ２受容体ｍＲＮＡの任意の配列に相補的なＮＰＹ Ｙ２受容体アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、該オリゴヌクレオチドが７から４０までのヌクレオチド長を有する請求項１記載の使用。
【請求項７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが１５〜２５ヌクレオチドを含有し、アンチセンスオリゴヌクレオチドが任意に１つ以上のオリゴヌクレオチドの化学的修飾を含む請求項６記載の使用。
【請求項８】
１つ以上のヌクレオチド間結合が修飾され、および／またはオリゴヌクレオチドがロックされた核酸（ＬＮＡ）修飾を含み、および／またはオリゴヌクレオチドがペプチド核酸（ＰＮＡ）修飾を含む請求項７記載の使用。
【請求項９】
１つ以上の糖単位が修飾され、および／または１つ以上のヌクレオチド間結合が修飾され、および／または１つ以上の塩基が修飾され、および／またはオリゴヌクレオチドが反転デオキシアベーシック糖によって末端保護されている請求項７記載の使用。
【請求項１０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドのいくつかの糖単位またはすべての糖単位が２′−デオキシリボースであり、および／またはヌクレオチド間ホスホジエステル結合がホスホロチオエート結合によって置き換えられている請求項９記載の使用。
【請求項１１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが、
５′−ＣＣＴＣＴＧＣＡＣＣＴＡＴＴＧＧＡＣＣＣ−３′（配列番号２）；
５′−ＧＴＴＴＧＴＧＧＣＣＣＧＴＡＴＴＧＴＴＣＣ−３′（配列番号３）；
５′−ＧＧＣＣＡＣＴＧＴＴＣＴＴＴＣＴＧＡＣＣ−３′（配列番号４）；
５′−ＣＴＧＣＡＣＣＴＡＴＴＧＧＡＣＣＣＡＴＴ−３′（配列番号７）；
５′−ＣＴＣＴＧＣＡＣＣＴＡＴＴＧＧＡＣＣＣＡ−３′（配列番号８）；
５′−ＧＣＣＴＣＴＧＣＡＣＣＴＡＴＴＧＧＡＣＣ−３′（配列番号９）；
５′−ＣＡＧＣＣＴＣＴＧＣＡＣＣＴＡＴＴＧＧＡ−３′（配列番号１０）；
５′−ＣＧＴＡＴＴＧＴＴＣＣＡＣＣＴＴＣＡＴＴ−３′（配列番号１１）；
５′−ＣＣＧＴＡＴＴＧＴＴＣＣＡＣＣＴＴＣＡＴ−３′（配列番号１２）；
５′−ＣＣＣＧＴＡＴＴＧＴＴＣＣＡＣＣＴＴＣＡ−３′（配列番号１３）；
５′−ＧＣＣＣＧＴＡＴＴＧＴＴＣＣＡＣＣＴＴＣ−３′（配列番号１４）；
５′−ＧＧＣＣＣＧＴＡＴＴＧＴＴＣＣＡＣＣＴＴ−３′（配列番号１５）；
５′−ＴＴＴＴＣＣＡＣＴＣＣＣＣＣＡＴＴＡＡＧ−３′（配列番号１６）；
５′−ＡＴＴＴＴＣＣＡＣＴＣＣＣＣＣＡＴＴＡＡ−３′（配列番号１７）；
５′−ＣＡＴＴＴＴＣＣＡＣＴＣＣＣＣＣＡＴＴＡ−３′（配列番号１８）；
５′−ＣＣＡＴＴＴＴＣＣＡＣＴＣＣＣＣＣＡＴＴ−３′（配列番号１９）；
５′−ＣＣＣＡＴＴＴＴＣＣＡＣＴＣＣＣＣＣＡＴ−３′（配列番号２０）；
５′−ＣＴＣＡＡＴＣＡＧＣＧＡＡＴＡＣＴＣＣＣ−３′（配列番号２１）；
５′−ＧＡＴＣＴＣＡＡＴＣＡＧＣＧＡＡＴＡＣＴ−３′（配列番号２２）；
５′−ＧＣＣＡＣＡＡＴＣＴＣＡＡＡＧＴＣＣＧＧ−３′（配列番号２３）；
５′−ＧＧＣＣＡＣＡＡＴＣＴＣＡＡＡＧＴＣＣＧ−３′（配列番号２４）；
５′−ＧＣＡＴＴＴＴＧＧＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＣ−３′（配列番号２５）；
５′−ＣＣＡＧＣＡＴＴＴＴＧＧＴＧＧＴＴＴＴＴ−３′（配列番号２６）；
５′−ＣＣＡＣＡＣＡＣＡＣＣＡＧＣＡＴＴＴＴＧ−３′（配列番号２７）；
５′−ＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＡＣＡＣＡＣＣＡＧＣ−３′（配列番号２８）；
５′−ＣＧＣＡＡＡＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＡＣ−３′（配列番号２９）；
５′−ＧＣＣＡＧＣＴＧＡＣＣＧＣＡＡＡＣＡＣＣ−３′（配列番号３０）；
５′−ＧＣＣＴＴＴＣＴＧＴＡＧＴＴＧＣＴＧＴＴ−３′（配列番号３１）；
５′−ＧＧＡＡＡＧＣＣＴＴＴＣＴＧＴＡＧＴＴＧ−３′（配列番号３２）；
５′−ＧＧＣＣＧＡＧＡＧＧＡＡＡＧＣＣＴＴＴＣ−３′（配列番号３３）；
５′−ＣＣＡＣＴＧＴＴＣＴＴＴＣＴＧＡＣＣＴＣ−３′（配列番号３４）；
５′−ＧＣＣＡＣＴＧＴＴＣＴＴＴＣＴＧＡＣＣＴ−３′（配列番号３５）；
５′−ＧＧＧＣＣＡＣＴＧＴＴＣＴＴＴＣＴＧＡＣ−３′（配列番号３６）；
５′−ＧＧＧＧＣＣＡＣＴＧＴＴＣＴＴＴＣＴＧＡ−３′（配列番号３７）；
前記配列の任意の２つ以上の組み合せ、または前記配列のいずれかとヒト血管内皮細胞成長因子アンチセンスＶＥＧＦ−ＡＳ、すなわち５′−ＧＣＣＴＣＧＧＣＴＴＧＴＣＡＣＡＴＣＴＧＣ−３′（配列番号４１）などの他のアンチセンスオリゴヌクレオチドとの組み合わせ
からなる群より選択される請求項６記載の使用。
【請求項１２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの糖単位が２′−デオキシリボースであり、ヌクレオチド間結合がホスホロチオエート結合である請求項１１記載の使用。
【請求項１３】
前記薬剤が、
ペプチド、
Ｙ２受容体に対して作出された抗体またはＮＰＹペプチド上のＹ２特異的エピトープに対して作製された抗体、
Ｙ２受容体またはＹ２特異的ＮＰＹ立体配置コンフォメーションに影響を及ぼすアプタマー、
小さな干渉ＲＮＡ分子、または
リボザイム
からなる群より選択される請求項１記載の使用。
【請求項１４】
前記薬剤がジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤、またはジペプチジルペプチダーゼＩＶに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマーもしくは抗体である請求項１記載の使用。
【請求項１５】
前記薬剤がＮＰＹ Ｙ２受容体の作用に影響を及ぼす能力を有する薬剤の組み合せである請求項１記載の使用。
【請求項１６】
７から４０までのヌクレオチド長を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、該アンチセンスオリゴヌクレオチドが５′−ＣＴＧＧＣＴＧＴＣＡＡＴＧＴＣＡＡＣ−３′（配列番号５）でない場合、該アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ヒトＮＰＹ Ｙ２受容体ｍＲＮＡの任意の配列に相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
ヒトＮＰＹ Ｙ２受容体ｍＲＮＡ標的領域１．．．２１００ヌクレオチドおよび２２００．．．２５００ヌクレオチドにおいて相補的である請求項１６記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが１５から２５ヌクレオチドを含む請求項１６記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが１つ以上の修飾を含む請求項１６記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
１つ以上のヌクレオチド間結合が修飾され、および／またはオリゴヌクレオチドがロックされた核酸（ＬＮＡ）修飾を含み、および／またはオリゴヌクレオチドがペプチド核酸（ＰＮＡ）修飾を含む請求項１９記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
１つ以上の糖単位が修飾され、および／または１つ以上のヌクレオチド間結合が修飾され、および／または１つ以上の塩基が修飾され、および／またはオリゴヌクレオチドが反転デオキシアベーシック糖によって末端保護されている請求項１９記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドのいくつかの糖単位またはすべての糖単位が２′−デオキシリボースであり、および／またはヌクレオチド間ホスホジエステル結合がホスホロチオエート結合によって置き換えられている請求項２１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
アンチセンスヌクレオチドが
５′−ＣＣＴＣＴＧＣＡＣＣＴＡＴＴＧＧＡＣＣＣ−３′（配列番号２）；
５′−ＧＴＴＴＧＴＧＧＣＣＣＧＴＡＴＴＧＴＴＣＣ−３′（配列番号３）；
５′−ＧＧＣＣＡＣＴＧＴＴＣＴＴＴＣＴＧＡＣＣ−３′（配列番号４）；
５′−ＣＴＧＣＡＣＣＴＡＴＴＧＧＡＣＣＣＡＴＴ−３′（配列番号７）；
５′−ＣＴＣＴＧＣＡＣＣＴＡＴＴＧＧＡＣＣＣＡ−３′（配列番号８）；
５′−ＧＣＣＴＣＴＧＣＡＣＣＴＡＴＴＧＧＡＣＣ−３′（配列番号９）；
５′−ＣＡＧＣＣＴＣＴＧＣＡＣＣＴＡＴＴＧＧＡ−３′（配列番号１０）；
５′−ＣＧＴＡＴＴＧＴＴＣＣＡＣＣＴＴＣＡＴＴ−３′（配列番号１１）；
５′−ＣＣＧＴＡＴＴＧＴＴＣＣＡＣＣＴＴＣＡＴ−３′（配列番号１２）；
５′−ＣＣＣＧＴＡＴＴＧＴＴＣＣＡＣＣＴＴＣＡ−３′（配列番号１３）；
５′−ＧＣＣＣＧＴＡＴＴＧＴＴＣＣＡＣＣＴＴＣ−３′（配列番号１４）；
５′−ＧＧＣＣＣＧＴＡＴＴＧＴＴＣＣＡＣＣＴＴ−３′（配列番号１５）；
５′−ＴＴＴＴＣＣＡＣＴＣＣＣＣＣＡＴＴＡＡＧ−３′（配列番号１６）；
５′−ＡＴＴＴＴＣＣＡＣＴＣＣＣＣＣＡＴＴＡＡ−３′（配列番号１７）；
５′−ＣＡＴＴＴＴＣＣＡＣＴＣＣＣＣＣＡＴＴＡ−３′（配列番号１８）；
５′−ＣＣＡＴＴＴＴＣＣＡＣＴＣＣＣＣＣＡＴＴ−３′（配列番号１９）；
５′−ＣＣＣＡＴＴＴＴＣＣＡＣＴＣＣＣＣＣＡＴ−３′（配列番号２０）；
５′−ＣＴＣＡＡＴＣＡＧＣＧＡＡＴＡＣＴＣＣＣ−３′（配列番号２１）；
５′−ＧＡＴＣＴＣＡＡＴＣＡＧＣＧＡＡＴＡＣＴ−３′（配列番号２２）；
５′−ＧＣＣＡＣＡＡＴＣＴＣＡＡＡＧＴＣＣＧＧ−３′（配列番号２３）；
５′−ＧＧＣＣＡＣＡＡＴＣＴＣＡＡＡＧＴＣＣＧ−３′（配列番号２４）；
５′−ＧＣＡＴＴＴＴＧＧＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＣ−３′（配列番号２５）；
５′−ＣＣＡＧＣＡＴＴＴＴＧＧＴＧＧＴＴＴＴＴ−３′（配列番号２６）；
５′−ＣＣＡＣＡＣＡＣＡＣＣＡＧＣＡＴＴＴＴＧ−３′（配列番号２７）；
５′−ＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＡＣＡＣＡＣＣＡＧＣ−３′（配列番号２８）；
５′−ＣＧＣＡＡＡＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＡＣ−３′（配列番号２９）；
５′−ＧＣＣＡＧＣＴＧＡＣＣＧＣＡＡＡＣＡＣＣ−３′（配列番号３０）；
５′−ＧＣＣＴＴＴＣＴＧＴＡＧＴＴＧＣＴＧＴＴ−３′（配列番号３１）；
５′−ＧＧＡＡＡＧＣＣＴＴＴＣＴＧＴＡＧＴＴＧ−３′（配列番号３２）；
５′−ＧＧＣＣＧＡＧＡＧＧＡＡＡＧＣＣＴＴＴＣ−３′（配列番号３３）；
５′−ＣＣＡＣＴＧＴＴＣＴＴＴＣＴＧＡＣＣＴＣ−３′（配列番号３４）；
５′−ＧＣＣＡＣＴＧＴＴＣＴＴＴＣＴＧＡＣＣＴ−３′（配列番号３５）；
５′−ＧＧＧＣＣＡＣＴＧＴＴＣＴＴＴＣＴＧＡＣ−３′（配列番号３６）；および
５′−ＧＧＧＧＣＣＡＣＴＧＴＴＣＴＴＴＣＴＧＡ−３′（配列番号３７）
からなる群より選択される請求項１６記載のアンチセンスヌクレオチド。
【請求項２４】
アンチセンスヌクレオチドの糖単位が２′−デオキシリボースであり、ヌクレオチド間結合がホスホロチオエート結合である請求項２３記載のアンチセンスヌクレオチド。
【請求項２５】
７から４０までのヌクレオチド長を有し、動物のＮＰＹ Ｙ２受容体ｍＲＮＡの任意の配列に相補的であるアンチセンスヌクレオチド。
【請求項２６】
５′−ＣＣＴＣＴＧＣＡＣＣＴＡＡＴＧＧＧＣＣＣ−３′（配列番号３８、ラットＮＰＹ  Ｙ２ｍＲＮＡに相当）である請求項２５記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２７】
オリゴヌクレオチドが１つ以上の修飾を含む請求項２５記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２８】
オリゴヌクレオチドが１つ以上の修飾を含む請求項２６記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２９】
請求項２５記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して実験動物において脈管組織または血管の過形成に関連する疾患または障害の発症を研究する方法。
【請求項３０】
前記疾患または障害が網膜症の任意の形態である請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
請求項２６、２７または２８記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して実験動物において脈管組織または血管の過形成に関連する疾患または障害の発症を研究する方法。
【請求項３２】
薬学的に許容し得る担体に、請求項１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドの組み合わせの治療に有効な量を含有する医薬組成物。
【請求項３３】
請求項１６、１７、１８、２３、２５または２６記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードするヌクレオチド配列を、哺乳類細胞において該アンチセンスオリゴヌクレオチドの発現を可能とする方法で含有する発現ベクター。
【請求項３４】
患者の脈管組織または血管の過形成に関連する疾患または障害の治療または予防方法であって、該患者にＮＰＹ Ｙ２受容体に影響を及ぼす薬剤を投与することを含む方法。
【請求項３５】
前記疾患または障害が、血管新生緑内障などの新脈管形成が関与する任意の形態、網膜症の任意の形態、増殖性糖尿病網膜症などのすべての増殖性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性症、黄斑症、糖尿病により引き起こされる微小血管または巨大血管の目の合併症、ネフロパシー、糖尿病ネフロパシー、虹彩ルベオーシス、血管腫、血管線維腫、乾癬、網膜症の結果である視覚喪失および失明に対する素因、代謝病、心臓血管病または癌性疾患である請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
癌性疾患が、悪性の腫瘍および新生物、芽細胞腫、癌または肉腫、高度な脈管の腫瘍および新生物、類表皮の腫瘍、肉腫の腫瘍、頭および首の腫瘍、結腸直腸の腫瘍、前立腺の腫瘍、乳房の腫瘍、小細胞および非小細胞肺腫瘍などの肺の腫瘍、膵臓の腫瘍、甲状腺の腫瘍、卵巣の腫瘍、および肝臓の腫瘍などの腫瘍および新生物、鱗状の細胞癌、基底細胞癌、および新生血管の成長を抑制することにより治療できる皮膚癌などの血管化皮膚癌、カポージ肉腫、神経芽細胞腫、毛細血管芽細胞腫、髄膜腫および大脳の転移などのＣＮＳ新生物、メラノーマ、胃腸および腎の癌および肉腫、横紋筋肉種、グリア芽細胞腫、多形性グリア芽細胞腫、および平滑筋肉腫である請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
前記薬剤がＮＰＹ Ｙ２受容体アンタゴニストである請求項３４記載の方法。
【請求項３８】
ｉ）前記薬剤がＹ１−受容体アゴニストまたはアンタゴニストでもある、および／またはii）前記薬剤がＹ５−受容体アゴニストまたはアンタゴニストでもある請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
前記薬剤が、ヒトＮＰＹ Ｙ２受容体ｍＲＮＡの任意の配列に相補的なＮＰＹ  Ｙ２受容体アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、該オリゴヌクレオチドが７から４０までのヌクレオチド長を有する請求項３４記載の方法。
【請求項４０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが１５〜２５ヌクレオチドを含有し、アンチセンスオリゴヌクレオチドが任意に１つ以上のオリゴヌクレオチドの化学的修飾を含む請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
１つ以上のヌクレオチド間結合が修飾され、および／またはオリゴヌクレオチドがロックされた核酸（ＬＮＡ）修飾を含み、および／またはオリゴヌクレオチドがペプチド核酸（ＰＮＡ）修飾を含む請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
１つ以上の糖単位が修飾され、および／または１つ以上のヌクレオチド間結合が修飾され、および／または１つ以上の塩基が修飾され、および／またはオリゴヌクレオチドが反転デオキシアベーシック糖によって末端保護されている請求項４０記載の方法。
【請求項４３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドのいくつかの糖単位またはすべての糖単位が２′−デオキシリボースであり、および／またはヌクレオチド間ホスホジエステル結合がホスホロチオエート結合によって置き換えられている請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが、
５′−ＣＣＴＣＴＧＣＡＣＣＴＡＴＴＧＧＡＣＣＣ−３′（配列番号２）；
５′−ＧＴＴＴＧＴＧＧＣＣＣＧＴＡＴＴＧＴＴＣＣ−３′（配列番号３）；
５′−ＧＧＣＣＡＣＴＧＴＴＣＴＴＴＣＴＧＡＣＣ−３′（配列番号４）；
５′−ＣＴＧＣＡＣＣＴＡＴＴＧＧＡＣＣＣＡＴＴ−３′（配列番号７）；
５′−ＣＴＣＴＧＣＡＣＣＴＡＴＴＧＧＡＣＣＣＡ−３′（配列番号８）；
５′−ＧＣＣＴＣＴＧＣＡＣＣＴＡＴＴＧＧＡＣＣ−３′（配列番号９）；
５′−ＣＡＧＣＣＴＣＴＧＣＡＣＣＴＡＴＴＧＧＡ−３′（配列番号１０）；
５′−ＣＧＴＡＴＴＧＴＴＣＣＡＣＣＴＴＣＡＴＴ−３′（配列番号１１）；
５′−ＣＣＧＴＡＴＴＧＴＴＣＣＡＣＣＴＴＣＡＴ−３′（配列番号１２）；
５′−ＣＣＣＧＴＡＴＴＧＴＴＣＣＡＣＣＴＴＣＡ−３′（配列番号１３）；
５′−ＧＣＣＣＧＴＡＴＴＧＴＴＣＣＡＣＣＴＴＣ−３′（配列番号１４）；
５′−ＧＧＣＣＣＧＴＡＴＴＧＴＴＣＣＡＣＣＴＴ−３′（配列番号１５）；
５′−ＴＴＴＴＣＣＡＣＴＣＣＣＣＣＡＴＴＡＡＧ−３′（配列番号１６）；
５′−ＡＴＴＴＴＣＣＡＣＴＣＣＣＣＣＡＴＴＡＡ−３′（配列番号１７）；
５′−ＣＡＴＴＴＴＣＣＡＣＴＣＣＣＣＣＡＴＴＡ−３′（配列番号１８）；
５′−ＣＣＡＴＴＴＴＣＣＡＣＴＣＣＣＣＣＡＴＴ−３′（配列番号１９）；
５′−ＣＣＣＡＴＴＴＴＣＣＡＣＴＣＣＣＣＣＡＴ−３′（配列番号２０）；
５′−ＣＴＣＡＡＴＣＡＧＣＧＡＡＴＡＣＴＣＣＣ−３′（配列番号２１）；
５′−ＧＡＴＣＴＣＡＡＴＣＡＧＣＧＡＡＴＡＣＴ−３′（配列番号２２）；
５′−ＧＣＣＡＣＡＡＴＣＴＣＡＡＡＧＴＣＣＧＧ−３′（配列番号２３）；
５′−ＧＧＣＣＡＣＡＡＴＣＴＣＡＡＡＧＴＣＣＧ−３′（配列番号２４）；
５′−ＧＣＡＴＴＴＴＧＧＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＣ−３′（配列番号２５）；
５′−ＣＣＡＧＣＡＴＴＴＴＧＧＴＧＧＴＴＴＴＴ−３′（配列番号２６）；
５′−ＣＣＡＣＡＣＡＣＡＣＣＡＧＣＡＴＴＴＴＧ−３′（配列番号２７）；
５′−ＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＡＣＡＣＡＣＣＡＧＣ−３′（配列番号２８）；
５′−ＣＧＣＡＡＡＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＡＣ−３′（配列番号２９）；
５′−ＧＣＣＡＧＣＴＧＡＣＣＧＣＡＡＡＣＡＣＣ−３′（配列番号３０）；
５′−ＧＣＣＴＴＴＣＴＧＴＡＧＴＴＧＣＴＧＴＴ−３′（配列番号３１）；
５′−ＧＧＡＡＡＧＣＣＴＴＴＣＴＧＴＡＧＴＴＧ−３′（配列番号３２）；
５′−ＧＧＣＣＧＡＧＡＧＧＡＡＡＧＣＣＴＴＴＣ−３′（配列番号３３）；
５′−ＣＣＡＣＴＧＴＴＣＴＴＴＣＴＧＡＣＣＴＣ−３′（配列番号３４）；
５′−ＧＣＣＡＣＴＧＴＴＣＴＴＴＣＴＧＡＣＣＴ−３′（配列番号３５）；
５′−ＧＧＧＣＣＡＣＴＧＴＴＣＴＴＴＣＴＧＡＣ−３′（配列番号３６）；
５′−ＧＧＧＧＣＣＡＣＴＧＴＴＣＴＴＴＣＴＧＡ−３′（配列番号３７）；
前記配列の２つ以上の組み合せ、または前記配列のいずれかとヒト血管内皮細胞増殖因子アンチセンスＶＥＧＦ−ＡＳ、５′−ＧＣＣＴＣＧＧＣＴＴＧＴＣＡＣＡＴＣＴＧＣ−３′（配列番号４１）などの他のアンチセンスオリゴヌクレオチドとの組み合わせ
からなる群より選択される請求項３９記載の方法。
【請求項４５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの糖単位が２′−デオキシリボースであり、ヌクレオチド間結合がホスホロチオエート結合である請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
前記薬剤が、
ペプチド、
Ｙ２受容体に対して作出された抗体またはＮＰＹペプチド上のＹ２特異的エピトープに対して作製された抗体、
Ｙ２受容体またはＹ２特異的ＮＰＹ立体配置に影響を及ぼすアプタマー、
小さな干渉ＲＮＡ分子、または
リボザイム
からなる群より選択される請求項３４記載の方法。
【請求項４７】
前記薬剤がジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤、またはジペプチジルペプチダーゼＩＶに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマーもしくは抗体である請求項４記載の方法。
【請求項４８】
前記薬剤がＮＰＹ Ｙ２受容体の作用に影響を及ぼす能力を有する薬剤の組み合せである請求項３４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脈管組織または血管の過形成に関連する疾患または障害、すなわち、新脈管形成が関与する任意の疾患または障害の予防または治療方法に関する。その方法は、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）Ｙ２受容体介在性作用の標的阻害（または遮断）の使用に基づく。本発明はまた、新規なアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび前記方法におけるそれらの使用、ならびに新規なアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび実験動物における該疾患または障害の発症の研究におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景を説明するために、特に実施に関する追加的な詳細を提供するために本明細書に使用される刊行物およびほかの文献は参考文献として組み込まれる。
【０００３】
ＮＰＹは、交感神経系のニューロトランスミッターであり、末梢交感神経末端においてノルアドレナリンと共貯蔵され、活発な交感神経刺激に応答して放出される（Lundberg, Fried, et al. 1986(1)）。末梢神経末端から動脈の外膜の周囲（periadventitia）に放出されると、ＮＰＹは、血管平滑筋細胞の受容体の刺激を介して直接的な内皮細胞非依存性血管収縮を引き起こす（Edvinsson, Emson, et al. 1983(2); Edvinsson 1985(3); Abounader, Villemure, et al. 1995(4)）。
【０００４】
ＮＰＹは、中枢および末梢神経系において広く発現され、代謝や内分泌機能の制御や心臓血管の恒常性の調節などにおいて多くの生理学的機能を有する。
【０００５】
末梢神経末端から動脈の外膜の周囲への放出に加えて、ＮＰＹおよびＮＰＹｍＲＮＡは、末梢血管の内皮細胞においても神経系とは無関係に（extraneuronally）発現される（Loesch, Maynard, et al. 1992(5); Zukowska-Grojec, Karwatowska-Prokopczuk, et al. 1998(6)）。内皮細胞に由来する循環ＮＰＹ濃度の少ない部分は、自己分泌および傍分泌メディエーターとして作用し、内皮細胞に見出されるその受容体Ｙ１およびＹ２を刺激することが暗示されている（Sanabria and Silva 1994 (7); Jackerott and Larsson 1997 (8); Zukowska-Grojec, Karwatowska-Prokopczuk, et al. 1998 (6)）。ＮＰＹに加えて、内皮細胞はＮＰＹ［３−３６］、つまりより特異的なＹ２アゴニストも循環型天然ＮＰＹからセリンプロテアーゼジペプチジルペプチダーゼＩＶにより産生できる（Mentlein, Dahms, et al. 1993(9)）。最近の研究では、内皮ＮＰＹ受容体の刺激が血管拡張を（Kobari, Fukuuchi, et al. 1993 (10); Torffvit & Edvinsson 1997 (11)）、主にＹ２受容体の活性化を介して（You, Edvinsson, et al. 2001 (12)）誘導するということが証明されている。実験的研究条件において、ＮＰＹは平滑筋に対するマイトジェン作用および脈管成長促進特性を示した。グラントとズコースカとは、ＮＰＹが、虚血組織の血管再生（revascularization）につながる可能性を助長する強力な脈管形成因子（angiogenic factor）であることを証明した（Grant and Zukowska 2000 (13)）。ＮＰＹのマイトジェン作用は、Ｙ１またはＹ２受容体を介して媒介されると推測されており（Zukowska-Grojec, Pruszczyk et al. 1993 (14); Nilsson and Edvinsson 2000 (15)）、そして脈管成長の促進は、誘導性Ｙ１、Ｙ２またはＹ５受容体によって媒介される（Zukowska-Grojec Z, Karwatowska-Prokopczuk et al.1998 (6)）。
【０００６】
新脈管形成は、ヒトの多様な疾患に関与している。ＮＰＹ系とＹ２受容体は、血管形成の制御に関与していることや、網膜症の発症中に活性化されていることが明らかにされている（Zukowska-Grojec Z, et. al. 1998 (6); Lee EW, et al. 2003 (16); Ekstrand AJ et al. 2003 (17)）。したがって、Ｙ２受容体を介したＮＰＹ媒介作用を遮断する薬剤の同定が、ヒトの多様な疾患の治療における潜在的な適用となる可能性がある。
【０００７】
プレプロ−ＮＰＹのシグナルペプチドに存在する、より一般的なＬｅｕ７Ｐｒｏ多形が、２型糖尿病患者の糖尿病網膜症への高い罹患率に関係しているということが、近年報告された（Niskanen, Voutilainen-Kaunisto et al. 2000 (18)）。この研究は、糖尿病網膜症の発症とＮＰＹ系とを結び付けた。しかしながら、ＮＰＹ Ｙ２受容体に影響を及ぼすことによりそのような疾患を治療または予防することまで示唆されていなかった。
【発明の開示】
【０００８】
ある側面によると、本発明は、患者における脈管組織または血管の過形成に関連する疾患または障害を治療または予防するための方法であって、ＮＰＹ Ｙ２受容体に影響を及ぼす薬剤を該患者に投与することを含む方法に関する。
【０００９】
もう１つの側面によると、本発明は、７から４０までのヌクレオチド長を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、ヒトＮＰＹ Ｙ２受容体ｍＲＮＡの任意の配列に相補的であるアンチセンスヌクレオチドに関する。
【００１０】
第３の側面によると、本発明は、７から４０までのヌクレオチド長を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、動物ＮＰＹ Ｙ２受容体ｍＲＮＡの任意の配列に相補的であるアンチセンスヌクレオチドに関する。
【００１１】
第４の側面によると、本発明は、７から４０までのヌクレオチド長を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、動物ＮＰＹ Ｙ２受容体ｍＲＮＡの任意の配列に相補的であるアンチセンスヌクレオチドを使用して、実験動物において脈管組織または血管の過形成に関連する疾患または障害の発症を研究する方法に関する。
【００１２】
第５の側面によると、本発明は、薬学的に許容し得る担体に、治療に有効な量のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドの混合物を含有する医薬組成物であって、該オリゴヌクレオチドが７から４０までのヌクレオチド長を有し、ヒトＮＰＹ Ｙ２受容体ｍＲＮＡの任意の配列に相補的である医薬組成物に関する。
【００１３】
第６の側面によると、本発明は、７から４０までのヌクレオチド長を有し、ヒトまたは動物ＮＰＹ Ｙ２受容体ｍＲＮＡの任意の配列に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードするヌクレオチド配列を、哺乳類の細胞においてそのアンチセンスオリゴヌクレオチドが発現可能な方法で含有する発現ベクターに関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
ヒト由来の生細胞を用いて行なった我々の最新の結果は、ヒトＮＰＹ Ｙ２受容体ｍＲＮＡに対するアンチセンス分子が新脈管形成の効果的な阻害剤であるということを証明している。したがって、ＮＰＹ Ｙ２受容体伝達を妨げる任意の化合物は、腫瘍性新脈管形成の強力な阻害剤となり得、そして新脈管形成が関与しているすべての疾患により一般的な関心を持ち得る。
【００１５】
「患者における脈管組織または血管の過形成に関連する疾患または障害」という言い回しは、ＮＰＹ Ｙ２受容体の作用を拮抗またはブロックまたは予防または改変する薬剤によって治療または予防できるような任意の疾患または障害に及ぶものと理解されるべきである。
【００１６】
Ｙ２受容体のダウンレギュレーションまたは遮断、または天然ＮＰＹまたはＮＰＹの断片（たとえば、ＮＰＹ３／３６または１３−１６、内因性）のＹ２受容体に対する作用の予防から臨床的に甚大な恩恵を受け得る疾患の例は、過剰な新脈管形成により特徴付けられる非新生物の病気による状態（血管新生緑内障、網膜症の任意の形態、増殖性糖尿病網膜症などのすべての増殖性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性症、黄斑症、糖尿病により引き起こされる微小血管または巨大血管の目の合併症、ネフロパシー、糖尿病ネフロパシー、虹彩ルベオーシス、血管腫、血管線維腫および乾癬など）である。この方法はまた、腫瘍および新生物（たとえば悪性の腫瘍および新生物、芽細胞腫、癌または肉腫などの腫瘍および新生物、高度な脈管の腫瘍および新生物）の患者の治療に有効である。本発明により治療できる腫瘍のいくつかの例としては、類表皮の腫瘍、肉腫の腫瘍、頭および首の腫瘍、結腸直腸の腫瘍、前立腺の腫瘍、乳房の腫瘍、小細胞および非小細胞肺腫瘍などの肺の腫瘍、膵臓の腫瘍、甲状腺の腫瘍、卵巣の腫瘍、および肝臓の腫瘍、鱗状の細胞癌、基底細胞癌、および新生血管の成長を抑制することにより治療できる皮膚癌などの血管化皮膚癌があげられる。本発明の方法により治療され得る他の癌としては、カポージ肉腫、ＣＮＳ新生物（神経芽細胞腫、毛細血管芽細胞腫、髄膜腫および大脳の転移）、メラノーマ、胃腸および腎の癌および肉腫、横紋筋肉種、グリア芽細胞腫、多形性グリア芽細胞腫、および平滑筋肉腫などがあげられる。
【００１７】
しかしながら、その疾患または障害は、前記リストに制限されるものではない。さらに、「患者における脈管組織または血管の過形成に関連する疾患または障害」という言い回しは、さらに前記状態から直接誘導される疾患または障害の予防も含む。したがって、たとえば、この言い回しは、網膜症の結果である視覚喪失および失明に対する素因の予防も含む。また、代謝性疾患および心臓血管疾患も含まれる。
【００１８】
本発明の方法により予防または治療される疾患または障害は、特に、Ｉ型またはＩＩ型糖尿病などの糖尿病における網膜症または網膜の新生血管形成過程（retinal neovascularization processes）、その他の代謝性疾患または心臓血管疾患である。
【００１９】
用語「ＮＰＹ Ｙ２受容体」は、ＮＰＹ Ｙ２受容体遺伝子およびｍＲＮＡによってコードされる受容体（Gehlert, Beavers et al. 1996 (19); Rose PM, Fernandes et al. 1995 (20)）またはＮＰＹに対する活性、またはＮＰＹのペプチド断片を意味することが理解されるべきである。そのような断片は、たとえばＮＰＹ3-36、ＮＰＹ13-36（Wimalawansa 1995 (21), Grandt et al. 1996 (22)）またはＮ−アシル［Ｌｅｕ（２８、３１）］ＮＰＹ２４−３６（Smith-white and Potter 1999 (23)）などのペプチド断片であり得る。
【００２０】
用語「薬剤」は、化合物自体（異性体と同様にラセミ体も）、塩またはエステルなどのそれらの任意の薬学的に許容し得る誘導体、および鋳型を含むということが理解されるべきである。それはまた、ＮＰＹ Ｙ２受容体に拮抗するペプチド化合物および誘導体を含むことも理解されるべきである。それらはまた、内因性ＮＰＹ Ｙ２受容体アゴニストの作用を導き、リガンドがＮＰＹ Ｙ２受容体から離れ、それによりＮＰＹ Ｙ２受容体作用を軽減する薬剤を含むということが理解されるべきである。それはまた、ＮＰＹ Ｙ２受容体の転写および翻訳過程の任意の段階に影響を及ぼすことを目的とする任意の薬剤、および当該作用に必要とされる任意のドライブまたは道具（遺伝的または他の）を含むことが理解されるべきである。
【００２１】
投与される活性薬剤は、原則的に、ＮＰＹ Ｙ２アンタゴニストまたは該ＮＰＹ Ｙ２受容体におけるアンタゴニストと他の受容体（たとえばＮＰＹ Ｙ５受容体）におけるアゴニストもしくはアンタゴニストとの組み合わせのいずれかであり得る。したがって、同じ薬剤が該ＮＰＹ Ｙ２受容体におけるアンタゴニストおよび他の受容体におけるアゴニストまたはアンタゴニストであり得る。したがって、同じ薬剤が部分的アゴニストでもあり得る。
【００２２】
本発明の好ましい態様によれば、薬剤は、ＮＰＹ受容体アンタゴニストである。Ｙ２受容体アンタゴニストは、以前に文献に記載されている。一例としてＢＩＩＥ０２４６を記載することができる（Doods, Gaida et al 1998 (24)）。しかしながら、適切な薬剤は前記の例に制限されるものではない。Ｙ２受容体アンタゴニストとして作用する任意の化合物が本発明の方法において有用である。
【００２３】
ジペプチジルペプチダーゼＩＶの作用を遮断または影響／阻害し、ゆえにＮＰＹのＮＰＹ3-36への異化作用、およびＮＰＹ Ｙ２受容体へのＮＰＹ3-36および天然ＮＰＹの作用の予防が有用であるとも考えられている。一例として、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤Ｐ３２／９８（Pospisilik, Stafford et al. 2002 (25)）およびジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤イソロイシンチアゾリジド（thiazolidide）（Rahfeld J, Schierhorn et al 1991 (26)）を記載することができる。しかしながら、適切な薬剤は前記例示に制限されるものではない。あるいは、ジペプチジルペプチダーゼＩＶのアンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマーまたは抗体も有用であろう。
【００２４】
Ｙ２の拮抗に加えてＹ１およびＹ５受容体への作用の組み合わせが有効であり得るとも考えられている。
【００２５】
Ｙ１−および／またはＹ５−受容体に対する活性を刺激する内在ＮＰＹ受容体の性質を有するＹ２−受容体拮抗分子は、ＮＰＹ Ｙ２および／またはＹ１および／またはＹ５−受容体に影響を及ぼすことによって、網膜症やネフロパシーの発症や進行を予防し、内因性ＮＰＹや成長因子−Ｉなどの成長ホルモンおよびインスリンの不適切な（過剰な）脈管増殖性作用（過剰な内因性ＮＰＹの潜在的な網膜症およびネフロパシーおよび関連状態を促進する効果）を阻害する。したがって、拮抗するＮＰＹ Ｙ２作用が、成長因子−Ｉなどの成長ホルモンやインスリンを低減することにより網膜症やネフロパシーの発症や進行を予防するとも考えられている。
【００２６】
したがって、本発明のもう１つの態様によると、Ｙ２受容体アンタゴニストはＹ１または／およびＹ５−受容体アゴニストまたはアンタゴニストでもある。
【００２７】
さらなる態様によると、個別のＹ１および／またはＹ５受容体アゴニストまたはアンタゴニストは、Ｙ２受容体アゴニストと組み合せて投与される。
【００２８】
さらなる態様によれば、本発明はまた、ＮＰＹ Ｙ２受容体の作用の予防またはダウンレギュレーションを、アンチセンスオリゴヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、異なる種類のヌクレオチドの組み合せの配列、またはＮＰＹ Ｙ２受容体の作用を拮抗するかまたはＮＰＹ Ｙ２受容体の合成、修飾、活性、リガンド結合、代謝または分解を予防または改変することのできる任意の他の配列の使用により可能とする任意の方法に関する。アンチセンスオリゴヌクレオチドはＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子であり得る。リボザイム切断ＮＰＹ Ｙ２受容体ｍＲＮＡも含まれる。
【００２９】
リボザイム技術は、たとえば以下の刊行物に説明されている（Ribozyme protocols: Turner, Philip C (editor) (27); Rossi JJ. 1999 (28); and Ellington AD, Robertson MP, Bull J. 1997 (29)）。
【００３０】
また、小さな干渉ＲＮＡ分子も有用である（30）。
【００３１】
さらなる代案によれば、ＮＰＹ Ｙ２受容体に影響を及ぼす薬剤は、該受容体に対して作出された抗体またはＮＰＹペプチド上のＹ２−特異的エピトープに対して作出された抗体であり得る。ＮＰＹ受容体特異的抗体がこの分野で知られているが、それらはもっぱらＹ２−受容体および他のＮＰＹ受容体の分布を研究するためにのみ使用されている。
【００３２】
さらに他の代案によれば、ＮＰＹ Ｙ２受容体に影響を及ぼす薬剤は、Ｙ２受容体またはＹ２−特異的ＮＰＹ−立体配座に影響を及ぼすアプタマーであり得る。アプタマーは、タンパク質に影響を及ぼすオリゴヌクレオチドである。多くのアンチセンスオリゴヌクレオチドもペプチドと相互作用する能力を有する。Ｙ２−特異的ＮＰＹ−立体配座に影響を及ぼし、それによりＮＰＹがＹ２受容体に結合するのを妨げる既知のＮＰＹアプタマーが存在する。また、ＮＰＹ受容体に影響を及ぼすアプタマーも知られている。アプタマーに関する刊行物については、参考文献の31〜33参照。
【００３３】
広義にはヒトまたは動物のＮＰＹ Ｙ２受容体ｍＲＮＡの任意の配列に相補的な新規なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、７から４０までのヌクレオチド長を有してもよく、好ましくは１５から２５までのヌクレオチド長、最も好ましくは約２０ヌクレオチド長を有する。
【００３４】
用語「相補的」とは、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列が標的ｍＲＮＡ配列とワトソンクリックまたは他の塩基対相互作用により水素結合を形成できることを意味する。その用語は、１００％相補的でない配列をも包含することが理解されるべきである。低い相補性（低くても５０％以上）が使える可能性があると考えられる。しかしながら、１００％の相補性が好ましい。
【００３５】
ヒトＮＰＹ Ｙ２受容体ｍＲＮＡを開示している図１（ｃＤＮＡとして表示；配列番号１）において、２０〜２１ヌクレオチドの３つの好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドが太字で挿入されている。適切なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、４３９０個のヌクレオチドを含む示されたｍＲＮＡにおける任意の７〜４０個のヌクレオチドの列に作出され得るが、ｍＲＮＡにおける最も良い標的領域はｍＲＮＡ配列の先頭、特に配列番号１の１〜２１００番目のヌクレオチドの領域および２２００〜２５００番目のヌクレオチド領域、より好ましくは配列番号１の１２００〜２１００番目のヌクレオチド領域および２２００〜２４００番目のヌクレオチド領域、ならびに最も好ましくは本明細書中に示した特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドによって規定される標的領域に見出される。また、領域内に結合ヌクレオチドを有する領域（ヘアピンなど）は回避されるべきである。刊行物J Tajti et al., 1999 (34)は、図１に同定されているヒトＮＰＹ Ｙ２受容体ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡとして示される）に相補的なＰＣＲプライマー、すなわち５′−ＣＴＧＧＣＴＧＴＣＡＡＴＧＴＣＡＡＣ−３′（配列番号５）を開示している。しかしながら、この配列は有用なアンチセンスとして記載されているものではない。ヒトＮＰＹ Ｙ２受容体ｍＲＮＡに対する逆配列は、ジーンバンクにおいて入手可能であり、配列番号４２に示されている。配列番号１と配列番号４２のコーディング領域は、配列番号１のヌクレオチド番号２１８７のＣと、配列番号４２の対応するヌクレオチド番号１４３１のＴ以外は同一である。本明細書に開示されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、両配列の中で同一である。
【００３６】
正常な、修飾されていないアンチセンスオリゴヌクレオチドは、生細胞に存在する酵素により分解されるため、生理的条件下では安定性が低い。したがって、化学および酵素分解に対する安定性を高めることができるよう、既知の方法によりアンチセンスオリゴヌクレオチドを修飾することが強く望まれている。
【００３７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの修飾は、従来技術において広く開示されている。参考文献は、ドラパー（Draper）ら、米国特許５，６１２，２１５号明細書に作成されており、言い換えるとこの技術に関するいくらかの特許および科学文献を載せている。リボース単位からの２′−ＯＨ基の除去または交換は、より良い安定性を与えるということが知られている。エクスタイン（Eckstein）ら、国際公開第９２／０７０６５号パンフレットおよび、米国特許５，６７２，６９５号明細書は、リボース２′−ＯＨのハロ、アミノ、アジドまたはスルフィジル基への置換を開示している。スプロート（Sproat）ら、米国特許５，３３４，７１１号明細書は、２′−ＯＨ基の水素のアルキルまたはアルケニル、好ましくはメチルまたはアリル基による置換を開示している。さらに、ヌクレオチド間ホスホジエステル結合を、たとえば１つ以上の酸素が硫黄、アミノ、アルキルまたはアルコキシ基によって置換されるように修飾することもできる。ヌクレオチド間ホスホジエステル結合における好ましい修飾は、ホスホロチオエート結合である。また、ヌクレオチドの塩基も修飾できる。Usman and Blatt, 2000 (35)は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの３′末端が逆３′−３′デオキシアベーシック糖の不可により保護される新しい種類のヌクレアーゼ耐性リボザイムを開示している。
【００３８】
好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ以上のヌクレオチド間結合が修飾されている、および／またはオリゴヌクレオチドがロックされた核酸（locked nucleic acid）（ＬＮＡ）修飾を含み、および／またはオリゴヌクレオチドがペプチド核酸（ＰＮＡ）修飾を含むヌクレオチド鎖である。マーガレット  エフ  テーラー（Margaret F Taylor）、2001（36）は、非常に多様な修飾を開示している。この刊行物によれば、糖単位を、たとえばモルホリノ基によって置換することもできる。この刊行物はさらに、種々の修飾が異なる方法でｍＲＮＡの翻訳を阻害するということを開示している。この文献に記載されているすべての種類の修飾が参考文献として本明細書に組み込まれる。
【００３９】
ＰＮＡ技術は、Ray A and Norden, 2000 (37)に記載されている。
【００４０】
もう１つの好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ以上の糖単位が修飾されている、および／または１つ以上のヌクレオチド間結合が修飾されている、および／または１つ以上の塩基が修飾されているおよび／またはオリゴヌクレオチドが反転デオキシアベーシック（inverted deoxyabsic）糖によって末端保護されているヌクレオチド鎖である。
【００４１】
好ましい態様の例としては、アンチセンスデオキシヌクレオチドホスホロチオエートまたはロックされた核酸もしくはペプチド核酸を含有するオリゴヌクレオチドの任意のＮＰＹ Ｙ２受容体標的配列またはリボザイムがあげられる。好ましい具体例は、ＡＳ−１（５′−ＣＣＴＣＴＧＣＡＣＣＴＡＴＴＧＧＡＣＣＣ−３′（配列番号２））、ＡＳ−２（５′−ＧＴＴＴＧＴＧＧＣＣＣＧＴＡＴＴＧＴＴＣＣ−３′（配列番号３））およびＡＳ−３（５′−ＧＧＣＣＡＣＴＧＴＴＣＴＴＴＣＴＧＡＣＣ−３′（配列番号４））、またはこれらのヌクレオチド鎖を有するより長い配列である。ヒトＮＰＹ Ｙ２受容体遺伝子における多形により生じるすべての変異体などのヒトＮＰＹ Ｙ２受容体ｍＲＮＡ配列の任意の部分を認識し結合できるアンチセンス配列も全て関係する。
【００４２】
有用なアンチセンスのさらなる例としては、以下に列挙される配列（配列番号７〜配列番号３７）をあげることができる。
【００４３】
５′−ＣＴＧＣＡＣＣＴＡＴＴＧＧＡＣＣＣＡＴＴ−３′（配列番号７）
５′−ＣＴＣＴＧＣＡＣＣＴＡＴＴＧＧＡＣＣＣＡ−３′（配列番号８）
５′−ＧＣＣＴＣＴＧＣＡＣＣＴＡＴＴＧＧＡＣＣ−３′（配列番号９）
５′−ＣＡＧＣＣＴＣＴＧＣＡＣＣＴＡＴＴＧＧＡ−３′（配列番号１０）
５′−ＣＧＴＡＴＴＧＴＴＣＣＡＣＣＴＴＣＡＴＴ−３′（配列番号１１）
５′−ＣＣＧＴＡＴＴＧＴＴＣＣＡＣＣＴＴＣＡＴ−３′（配列番号１２）
５′−ＣＣＣＧＴＡＴＴＧＴＴＣＣＡＣＣＴＴＣＡ−３′（配列番号１３）
５′−ＧＣＣＣＧＴＡＴＴＧＴＴＣＣＡＣＣＴＴＣ−３′（配列番号１４）
５′−ＧＧＣＣＣＧＴＡＴＴＧＴＴＣＣＡＣＣＴＴ−３′（配列番号１５）
５′−ＴＴＴＴＣＣＡＣＴＣＣＣＣＣＡＴＴＡＡＧ−３′（配列番号１６）
５′−ＡＴＴＴＴＣＣＡＣＴＣＣＣＣＣＡＴＴＡＡ−３′（配列番号１７）
５′−ＣＡＴＴＴＴＣＣＡＣＴＣＣＣＣＣＡＴＴＡ−３′（配列番号１８）
５′−ＣＣＡＴＴＴＴＣＣＡＣＴＣＣＣＣＣＡＴＴ−３′（配列番号１９）
５′−ＣＣＣＡＴＴＴＴＣＣＡＣＴＣＣＣＣＣＡＴ−３′（配列番号２０）
５′−ＣＴＣＡＡＴＣＡＧＣＧＡＡＴＡＣＴＣＣＣ−３′（配列番号２１）
５′−ＧＡＴＣＴＣＡＡＴＣＡＧＣＧＡＡＴＡＣＴ−３′（配列番号２２）
５′−ＧＣＣＡＣＡＡＴＣＴＣＡＡＡＧＴＣＣＧＧ−３′（配列番号２３）
５′−ＧＧＣＣＡＣＡＡＴＣＴＣＡＡＡＧＴＣＣＧ−３′（配列番号２４）
５′−ＧＣＡＴＴＴＴＧＧＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＣ−３′（配列番号２５）
５′−ＣＣＡＧＣＡＴＴＴＴＧＧＴＧＧＴＴＴＴＴ−３′（配列番号２６）
５′−ＣＣＡＣＡＣＡＣＡＣＣＡＧＣＡＴＴＴＴＧ−３′（配列番号２７）
５′−ＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＡＣＡＣＡＣＣＡＧＣ−３′（配列番号２８）
５′−ＣＧＣＡＡＡＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＡＣ−３′（配列番号２９）
５′−ＧＣＣＡＧＣＴＧＡＣＣＧＣＡＡＡＣＡＣＣ−３′（配列番号３０）
５′−ＧＣＣＴＴＴＣＴＧＴＡＧＴＴＧＣＴＧＴＴ−３′（配列番号３１）
５′−ＧＧＡＡＡＧＣＣＴＴＴＣＴＧＴＡＧＴＴＧ−３′（配列番号３２）
５′−ＧＧＣＣＧＡＧＡＧＧＡＡＡＧＣＣＴＴＴＣ−３′（配列番号３３）
５′−ＣＣＡＣＴＧＴＴＣＴＴＴＣＴＧＡＣＣＴＣ−３′（配列番号３４）
５′−ＧＣＣＡＣＴＧＴＴＣＴＴＴＣＴＧＡＣＣＴ−３′（配列番号３５）
５′−ＧＧＧＣＣＡＣＴＧＴＴＣＴＴＴＣＴＧＡＣ−３′（配列番号３６）
５′−ＧＧＧＧＣＣＡＣＴＧＴＴＣＴＴＴＣＴＧＡ−３′（配列番号３７）
【００４４】
アンチセンスの組み合せも有用である。アンチセンス配列、配列番号２〜４または配列番号７〜３７の２つ以上が使用できるか、またはこれらの配列のうちの任意の配列は、ヒト血管内皮細胞成長因子アンチセンス（ＶＥＧＦ−ＡＳ、５′−ＧＣＣＴＣＧＧＣＴＴＧＴＣＡＣＡＴＣＴＧＣ−３′（配列番号４１））などの他のアンチセンスオリゴヌクレオチドと組み合せて使用することができる。
【００４５】
しかしながら、適切な薬剤は前記の例に制限されるものではない。Ｙ２受容体アンタゴニストとして作用するかまたはＹ２受容体の作用を低減する任意の化合物が、本発明による方法において有用である。
【００４６】
さらなる態様によれば、この発明は、７〜４０ヌクレオチド長を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、該アンチセンスオリゴヌクレオチドがＮＰＹ Ｙ２受容体ｍＲＮＡの任意の配列に相補的である新規のアンチセンスオリゴヌクレオチドにも関する。実験動物は、ラットまたはマウスなどのげっ歯類が好ましい。用語「相補的」は、当然ヒト配列に関して前述したのと同じ意味を有する。
【００４７】
これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、１つ以上の前記のような修飾を含む。
【００４８】
本発明は、動物ＮＰＹ Ｙ２受容体ｍＲＮＡに相補的なそのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、実験動物において脈管組織または血管の過形成に関連する疾患または障害、とりわけ網膜症の任意の形態の発症を研究する方法に関する。
【００４９】
一例としては、アンチセンスデオキシヌクレオチドホスホロチオエートまたはロックされた核酸もしくはペプチド核酸オリゴヌクレオチドまたはリボザイムの任意のＮＰＹ Ｙ２受容体標的配列があげられる。その配列の例としては、ラットＮＰＹ Ｙ２ｍＲＮＡに相補的な５′−ＣＣＴＣＴＧＣＡＣＣＴＡＡＴＧＧＧＣＣＣ−３′（配列番号３８）を含有する配列がある。しかしながら、適切な薬剤は前記の例に制限されるものではない。
【００５０】
本発明において、ＮＰＹ受容体活性薬剤は、種々の経路で投与することができる。適切な投与形態としては、たとえば、経口もしくは局所製剤；眼内、硝子体内、筋肉内、腹腔内、皮内および皮下注射剤などの非経口注射剤；および経皮、尿道内または直腸製剤；および吸入および鼻処方などがあげられる。好適な経口製剤としては、たとえば従来の錠剤または徐放性錠剤およびゼラチンカプセルがあげられる。
【００５１】
本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、様々な方法により、個人に投与することができる。ある方法によれば、配列は、それ自体で、陽イオン性脂質と複合化され、リポソームに封入されて、徐放投与のためにシクロデキストリン、生吸収性ポリマーもしくは他の好適な担体に組み込まれて、生分解性ナノ粒子またはハイドロゲルとして投与され得る。いくつかの適応に対しては、アンチセンスオリゴヌクレオチドを直接生体外で細胞または組織に前記ビヒクルと共に、または前期ビヒクルなしで送達してもよい。
【００５２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの直接送達に加えて、アンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする配列を、発現ベクターに組み込み、患者に投与することができる。発現ベクターは、真核生物発現可能なＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターなどのＤＮＡ配列であり得る。そのようなウイルスベクターは、好ましくは、アデノウイルス、アルファウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスまたはヘルペスウイルスにもとづくものである。好ましくは、ベクターは、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドと同様の方法で患者に送達される。発現ベクターの送達は、静脈内、筋肉内または腹腔内投与などの全身的であり得、または標的組織への局所送達であってもよい。
【００５３】
ＮＰＹ受容体活性薬剤の所要の投与量は、治療される特定の症状、症状の重篤度、治療持続期間、投与経路および使用される特定の化合物により変化し得る。
【００５４】
本発明は、以下の非制限的な実験部によって例示的に説明されるであろう。
【実施例】
【００５５】
［実験項］
本研究は、新血管形成および網膜症の発症に対するＮＰＹ Ｙ２受容体標的介入の影響を決定するために行なわれた。網膜症の発症は、高酸素の循環とそれに続く相対的虚血（網膜新生血管形成を誘導）により生まれたばかりのラットに誘導された。高酸素血は、網膜の血管の成長に有害であり、網膜の損傷と低酸素症を引き起こす。通常の空気に移行すると、相対的低酸素症がさらに網膜の新生血管形成を促進する。
【００５６】
ラットパピーの３つの群に種々の処置を施した。１）ビヒクル、２）ＮＰＹ Ｙ２受容体標的アンチセンスオリゴヌクレオチド配列、および３）ＮＰＹ Ｙ２受容体標的アンチセンスオリゴヌクレオチド配列と同じオリゴヌクレオチドを含有するスクランブルオリゴヌクレオチド配列。処置は腹腔内投与で行なった。網膜血管を調べ、網膜症の変化を治療群間で比較した。
【００５７】
網膜症は、蛍光ラベルデキストランを血液の循環に注射してから評価した。目をスライドの上にマウントし、網膜血管を視覚化し、蛍光顕微鏡により調べた。統計的差異を試験群間で計算した。
【００５８】
網膜新生血管形成プロトコール
試験手順は、ツルク大学の共同倫理委員会（Joint Ethics Committee of Turku University）によって承認された。網膜症の発症を生まれたばかりのラット（スプラーク  ダウレイ（Sprague Dawley））に、循環高酸素とそれに続く相対的虚血により誘導した。高酸素は、網膜における損傷と低酸素症を引き起こす網膜血管を進展させる毒であり、新生血管形成を誘導する。正常な空気に移したのち、相対的な低酸素がさらに網膜の新生血管形成を促進する。低酸素症は、ヒト網膜症における網膜の新生血管形成の主な原因の１つでもある。生まれたばかりのラットは、それらの母親と一緒に高酸素インキュベーターに保たれた。網膜の新生血管形成が、３つの群のパピーすべてに同時に誘導された。初め７匹のパピーからなる１つの処置群は、３日齢で循環高酸素を受け、１４日齢まで続けられ、１４〜１７日齢まで正常な室内空気に留められた。インキュベーター内の酸素の量は、１０日間（３日から１３日まで）、１２時間サイクルで４０％および８０％に保たれた。
【００５９】
処置
３群のパピーに異なる処置を受けさせた（１）ビヒクルそのまま、２）ビヒクルに希釈したＮＰＹ Ｙ２受容体標的アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド配列（２０個のチオエート修飾塩基を含有する５′−ＣＣＴＣＴＧＣＡＣＣＴＡＡＴＧＧＧＣＣＣ−３′（配列番号３８））、および３）ビヒクルに希釈したＮＰＹ Ｙ２受容体標的アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド配列と同じで無作為の順序のデオキシリボヌクレオチド（２０個のチオエート修飾塩基を含有する５′−ＣＣＡＴＧＧＴＡＡＴＣＣＧＣＣＧＣＴＣＣ−３′（配列番号３９））を含有するスクランブルオリゴデオキシヌクレオチド配列）。処置は腹腔内に投与された。網膜の血管を調べ、網膜症の変化を処置群間で比較した。使用したＮＰＹ Ｙ２受容体標的アンチセンスデオキシヌクレオチド配列は、ＮＰＹ Ｙ２遺伝子の転写開始コドン（ＡＴＧ）からの２０塩基に相補的に設計された。
【００６０】
網膜症および網膜の新生血管形成の評価
２０日齢でラットを断頭し、目を回収した。網膜症と網膜の新生血管形成を蛍光ラベルしたデキストランを心臓穿刺により血液循環に注射したのちに評価した。各パピーから片目ずつを網膜の血管の視覚化に使用した。目をスライドの上に平らにのせ、網膜の血管を蛍光顕微鏡により視覚化して調べた。網膜の写真は、ライカ（Leica）ＤＭＲ／ＤＣ１００顕微鏡およびライカＤＣウィーバー（Wiever）ソフトウェアを用いて得た。
【００６１】
統計方法
網膜の毛細管の量は、プロットプロファイル分析（イメージ−Ｊ２．６プログラム）を使用して一定の長さの線に交差した血管の量を計測することにより分析された。各網膜を３〜５つの代表的な区域で分析し、平均値を次の統計学的分析に用いた。新生血管形成の人為的な像を回避するために、折りたたまれていない網膜の調製物のみを使用した。試験群１由来の５つの目ならびに試験群２および３由来の４つの目が折りたたまれていないことがわかり、蛍光顕微鏡および統計学的分析に使用した。試験集団間の相違は、一元分散分析（ANOVA）とそれに続く事後検定（post hoc test）（チューキーＨＳＤ）を用いて計算た。０．０５より小さいＰ値を統計学的有意差とみなした。結果を平均±ＳＤおよび範囲として表現した。
【００６２】
結果
網膜の新生血管形成および網膜症は、処置群間で統計学的に有意であった（ｐ＜０．００１、一元分散分析）。ビヒクルおよびスクランブル処置群において、蛍光画像は、明らかに不規則で乱れた網膜の毛細血管形成を示し、不鮮明な蛍光発光区域を伴った（図３）。Ｙ２−アンチセンス処置群において、毛細血管形成は、規則正しく連続的であり、観測される病的な状態の変化のない健全な網膜の印象を与える。事後検定では、Ｙ２−アンチセンス処置群は、ビヒクル処置群（ｐ＜０．００１、平均差５．４０、その差に対する９５％の信頼区間（confidence interval）２．４８〜８．３３）およびスクランブル処置群（ｐ＜０．００１、平均差６．５３、その差に対する９５％の信頼区間３．７６〜９．３１）の両方と比較して、統計学的に有意に少ない新生血管形成を示した。ビヒクルとスクランブル処置群との間で網膜の新生血管形成に違いはなかった。
【００６３】
以下の表１は、３つの異なる試験群における、網膜症を意味する定量化された新脈管形成の平均値示す。網膜症の発症は、パピーのビヒクルおよびスクランブル処置群において明らかであるのに対して、ＮＰＹ Ｙ２アンチセンス処置群においては予防された。
【００６４】
【表１】
2005531624.tif 000002
【００６５】
この試験は、網膜症の発症および網膜の新脈管形成がＮＰＹ Ｙ２−受容体標的オリゴヌクレオチドアンチセンス療法により予防できるということを証明し、空のビヒクルおよび対照（非Ｙ２−アンチセンスデオキシオリゴヌクレオチド配列）との比較により明らかにされた。この試験の結果は、ＮＰＹ Ｙ２−受容体の網膜症および網膜の新脈管形成の治療および予防における役割を初めて強調する。
【００６６】
ＮＰＹ Ｙ２受容体標的アンチセンス療法による網膜症と不適切な脈管増殖の予防という我々の知見は新規なものである。これまでのただ１つの研究は、ＮＰＹ−系と、糖尿病性網膜症により潜在的に変化したＮＰＹ作用とを関連付けるものである（Niskanen, Voutilainen-Kaunisto et al, 2000 (18)）。この知見は、糖尿病性網膜症の予防および治療に関する治療的可能性であり、不適切な脈管増殖による疾患と近接している。したがって、糖尿病性ネフロパシーもまた適切な脈管成長や脈管組織の有糸分裂生起と関係付けられる（Del Prete, Anglani et al. 1998 (38)）ため、糖尿病性ネフロパシーもまた、ＮＰＹ Ｙ２受容体標的療法によって予防および治療できる可能性がある。さらに、免疫反応性ＮＰＹ濃度の上昇は、糖尿病性ネフロパシーに関係付けられている（Satoh, Satoh et al. 1999 (39)）。
【００６７】
低酸素誘導脈管増殖は、網膜症の病理生理学などの機序や、網膜症を治療および予防するための新規な治療の効果を研究するための実験モデルとして一般的に使用されるものである（Smith, Shen et al. 1999 (40); Smith, Kopchick et al. 1997 (41); Ozaki, Seo et al. 2000 (42)）。用いた網膜症モデルはその制限を有するが、脈管の損傷や虚血は、すべての網膜症において網膜の新生血管形成の展開に必ず関係するので、多様な網膜症の病理生理を導くおよび関係する受容体レベルの機序を明らかにするために充分でありまた有用であるとみなすことができる。ＮＰＹ Ｙ２受容体作用の抑制は、網膜の新生血管形成を遮断し、したがって、糖尿病関連網膜症、未熟児網膜症などの他の増殖性網膜症、および他の虚血性網膜症（ischemic retinopathies）の治療に対する優れた標的である。
【００６８】
単一アンチセンス分子とそれらの組み合せの、不死化ヒト臍静脈内皮細胞（ｈＴＥＲＴ−ＨＵＶＥＣｓ）による内皮細胞の管形成の予防効果を研究するために、さらなる実験を行なった。
【００６９】
細胞培養
不死化ヒト臍静脈内皮細胞（ｈＴＥＲＴ−ＨＵＶＥＣｓ）は、ジェロンコーポレーション（Geron Corporation）（メンロパーク、ＣＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）から入手した。ｈＴＥＲＴ−ＨＵＶＥＣｓを、１５％（ｖ／ｖ）熱不活性化仔ウシ血清（ギブコ  ＢＲＬ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（ギブコ  ＢＲＬ）、１００単位／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン（ギブコ  ＢＲＬ）、１０単位／ｍｌヘパリン（シグマ）および２０μｇ／ｍｌ内皮細胞成長因子（ロッシュ  バイオモレキュルズ）を補足したＭ１９９培地（ギブコ、ペイスレー、スコットランド）中、ゼラチンコート１００ｍｍ皿（コーニング コスター、ＮＹ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）で、３７度、５％ＣＯ2雰囲気の加湿した（humified）インキュベーター中に置いた。実験は経過２０および２４の間の細胞で行なった。
【００７０】
オリゴヌクレオチド
以下のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを合成した。ヒトニューロペプチドＹ２−受容体ｍＲＮＡアンチセンス分子（ＡＳ−１、すなわち５′−ＣＣＴＣＴＧＣＡＣＣＴＡＴＴＧＧＡＣＣＣ−３′（配列番号２）；ＡＳ−２、すなわち５′−ＧＴＴＴＧＴＧＧＣＣＣＧＴＡＴＴＧＴＴＣＣ−３′（配列番号３）；ＡＳ−３、すなわち５′−ＧＧＣＣＡＣＴＧＴＴＣＴＴＴＣＴＧＡＣＣ−３′（配列番号４）；ＡＳ−１対照、配列：５′−ＣＣＣＡＧＧＴＴＡＴＣＣＡＣＧＴＣＴＣＣ−３′（配列番号４０）、およびヒト血管内皮細胞増殖因子アンチセンス（ＶＥＧＦ−ＡＳ、配列：５′−ＧＣＣＴＣＧＧＣＴＴＧＴＣＡＣＡＴＣＴＧＣ−３′（配列番号４１）））。
【００７１】
リポソーム
Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルフェート（ＤＯＴＡＰ）および１，２−ジオレイル−３−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）は、アヴァンティ  ポーラー  リッピッズ（Avanti Polar Lipids）から購入した。ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（モルで１：１）からなるカチオン性リポソームは、既に述べられているように調製した（Ruponen et al., 2001 (43)）。
【００７２】
トランスフェクションプロトコール
ｈＴＥＲＴ−ＨＵＶＥＣｓ（５×１０4細胞個／ウェル）をゼラチンコート４８マルチウェルプレート（コーニング  コスター、ＮＹ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）に播種し、一晩インキュベートした。トランスフェクションのために、成長培地を４００μｌのトランスフェクション用培地（２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび１００単位／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンを補足したＭ１９９培地）と入れ替えた。蒸留水に入れたオリゴヌクレオチド（最終濃度１μＭ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥリポソームを、ＭＥＳ−ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（５０ｍＭ ＭＥＳ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、７５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）に希釈し、ついで、荷電率（charge ratio）＋１で混合した。トランスフェクション混合物を室温で２０分間静置し、オリゴヌクレオチド／リポソーム複合体（１００μｌ）を各ウェルに滴下した。
【００７３】
内皮の管形成アッセイ
トランスフェクション４時間ののち、ｈＴＥＲＴ−ＨＵＶＥＣｓをトリプシン処理後回収し、成長培地（２００μｌ）に懸濁し、成長因子削減マトリゲル（Matrigel）（ＢＤ  バイオサイエンス）コート９６ウェルプレート（コーニング  コスター、ＮＹ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）に播種した。３時間のインキュベーションののち、細胞を４％パラホルムアルデヒドに固定した。各ウェル（７領域／ウェル）における管状構造の形成を、ニコンＦ−６０１デジタルカメラ（ニコン、東京、日本）を備えたニコン  イクリプス  ＴＥ３００  倒立顕微鏡（ニコン、東京、日本）を用いてデジタルで記録した。写真は倍率４×で撮影した。
【００７４】
合成アンチセンス分子の５つすべてのｈＴＥＲＴ−ＨＵＶＥＣｓによる管状構造の形成の阻害における有効性をお互いに単独および組合せで比較した。管状構造の数はアドベ  フォトショップ５．５（アドベ  システムズ社、サンジョーン、ＣＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて分析し、結果を、３つの独立した実験の平均±ＳＥＭで表わした。１セット３つの実験を繰り返した。
【００７５】
結果
図４ａ〜ｄは、ｈＴＥＲＴ−ＨＵＶＥＣｓによる管状構造の形成の阻害における被験アンチセンス分子の有効性を証明する。図４ａおよび４ｂは、３つの同一のアッセイの繰り返されたセットを表わし、図４ｃおよび４ｄは、他の３つの同一のアッセイの繰り返されたセットを表わす。ＡＳ−３アンチセンス分子が、ｈＴＥＲＴ−ＨＵＶＥＣｓによる管状構造の形成の阻害において最も高い有効性を示す。ＡＳ−１とＡＳ−３の組み合わせが最も強い代替物である。単一ヌクレオチドアッセイ４ａに対するそれぞれの平均±ＳＥＭ  管の数／ウェル値は、ＡＳ−１、４４．０±５．６；ＡＳ−２、７０．３±１１．３；ＡＳ−３、２８±７．１；ＡＳ−１対照、４９．３±８．２；および対照（未処置）、６０±１．８であった。アッセイ４ｂについては、ＡＳ−１、５４．３±１０．１；ＡＳ−２、７５．０±７．５；ＡＳ−３、２３．０±６．７；ＡＳ−１対照、５７．０±７．０；および対照（未処置）、５８．０±２．９であった。組み合せヌクレオチドアッセイ４ｃに対するそれぞれの平均±ＳＥＭ  管の数／ウェル値は、ＡＳ−１＋ＡＳ−３、１１．３±１．２；ＶＥＧＦ−ＡＳ＋ＡＳ−３、３４．３±４．５；および対照（未処置）、８５．７±３．４であった。アッセイ４ｄについては、ＡＳ−１＋ＡＳ−３、３２．３±４．３；ＶＥＧＦ−ＡＳ＋ＡＳ−３、５４．０±８．０；および対照（未処置）、１０２．０±８．９であった。
【００７６】
本発明の方法は、多様な実施態様の形態で具体化することができ、そのほんのわずかが本明細書に開示されているということが理解されるであろう。他の実施態様が存在し、本発明の精神を逸脱しないということが当該分野の当業者には明らかであろう。したがって、説明された実施態様は、例示的なものであり、制限として解釈されるべきものではない。
【００７７】
［参考文献］
1. Lundberg JM, Terenius L, Hokfelt T et al. Neuropeptide Y (NPY)-like immunoreactivity in peripheral noradrenergic neurons and effects of NPY on sympathetic function. Acta Physiol Scand 1982;116:477-80.
2. Edvinsson L, Emson P, McCulloch J, Tatemoto K, Uddman R. Neuropeptide Y: cerebrovascular innervation and vasomotor effects in the cat. Neurosci Lett 1983;43:79-84.
3. Edvinsson L. Characterization of the contractile effect of neuropeptide Y in feline cerebral arteries. Acta Physiol Scand 1985;125:33-41.
4. Abounader R, Villemure JG, Hamel E. Characterization of neuropeptide Y (NPY) receptors in human cerebral arteries with selective agonists and the new Y1 antagonist BIBP 3226. Br J Pharmacol 1995;116:2245-50. 
5. Loesch A, Maynard KI, Burnstock G. Calcitonin gene-related pep. Neuroscience 1992;48:723-6.
6. Zukowska-Grojec Z, Karwatowska-Prokopczuk E, Rose W et al. Neuropeptide Y: a novel angiogenic factor from the sympathetic nerves and endothelium. Circ Res 1998;83:187-95.
7. Sanabria P, Silva WI. Specific 125I neuropeptide Y binding to intact cultured bovine adrenal medulla capillary endothelial cells. Microcirculation 1994;1:267-73.
8. Jackerott M, Larsson LI. Immunocytochemical localization of the NPY/PYY Y1 receptor in enteric neurons, endothelial cells, and endocrine-like cells of the rat intestinal tract. J Histochem Cytochem 1997;45:1643-50.
9. Mentlein R, Dahms P, Grandt D, Kruger R. Proteolytic processing of neuropeptide Y and peptide YY by dipeptidyl peptidase IV. Regul Pept 1993;49:133-44.
10. Kobari M, Fukuuchi Y, Tomita M et al. Transient cerebral vasodilatory effect of neuropeptide Y mediated by nitric oxide. Brain Res Bull 1993;31:443-8.
11. Torffvit O, Edvinsson L. Blockade of nitric oxide decreases the renal vasodilatory effect of neuropeptide Y in the insulin-treated diabetic rat. Pflugers Arch 1997;434:445-50.
12. You J, Edvinsson L, Bryan RM, Jr. Neuropeptide Y-mediated constriction and dilation in rat middle cerebral arteries. J Cereb Blood Flow Metab 2001;21:77-84.
13. Grant DS, Zukowska Z. Revascularization of ischemic tissues with SIKVAV and neuropeptide Y (NPY). Adv Exp Med Biol 2000;476:139-54.
14. Zukowska-Grojec Z, Pruszczyk P, Colton C, Yao J, Shen GH, Myers AK, Wahlestedt C. Mitogenic effect of neuropeptide Y in rat vascular smooth muscle cells. Peptides 1993;14(2):263-8.
15. Nilsson T, Edvinsson L. Neuropeptide Y stimulates DNA synthesis in human vascular smooth muscle cells through neuropeptide Y Y1 receptors. Can J Physiol Pharmacol 2000 Mar;78(3):256-9.
16. Lee EW, Grant DS, Movafagh S, Zukowska Z. Impaired angiogenesis in neuropeptide Y (NPY)-Y2 receptor knockout mice. Peptides. 2003 Jan;24(1):99-106.
17. Ekstrand AJ, Cao R, Bjorndahl M, Nystrom S, Jonsson-Rylander AC, Hassani H, Hallberg B, Nordlander M, Cao Y. Deletion of neuropeptide Y (NPY) 2 receptor in mice results in blockage of NPY-induced angiogenesis and delayed wound healing. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 May 13;100(10):6033-8.
18. Niskanen L, Voutilainen-Kaunisto R, Terasvirta M, Karvonen MK, Valve R, Pesonen U, Laakso M, Uusitupa MI, Koulu M. Leucine 7 to proline 7 polymorphism in the neuropeptide y gene is associated with retinopathy in type 2 diabetes. Exp Clin Endocrinol Diabetes 2000;108(3):235-6.
19. Gehlert DR, Beavers LS, Johnson D, Gackenheimer SL, Schober DA, Gadski RA. Expression cloning of a human brain neuropeptide Y Y2 receptor. Mol Pharmacol 1996 Feb;49(2):224-8.
20. Rose PM, Fernandes P, Lynch JS, Frazier ST, Fisher SM, Kodukula K, Kienzle B, Seethala R. Cloning and functional expression of a cDNA encoding a human type 2 neuropeptide Y receptor. J Biol Chem 1995 Sep 29;270(39):22661-4.
21. Wimalawansa SJ. Purification and biochemical characterization of neuropeptide Y2 receptor. J Biol Chem 1995;270(31):18523-30.
22. Grandt D, Schimiczek M, Rascher W, Feth F, Shively J, Lee TD, Davis MT, Reeve JR Jr, Michel MC.Neuropeptide Y 3-36 is an endogenous ligand selective for Y2 receptors. Regul Pept 1996;67(1):33-7.
23. Smith-White MA, Potter EK. Structure-activity analysis of N-acetyl [Leu (28,31)] NPY 24-36: a potent neuropeptide Y Y(2) receptor agonist. Neuropeptides 1999 Dec;33(6):526-33.
24. Doods H, Gaida W, Wieland HA, Dollinger H, Schnorrenberg G, Esser F, Engel W, Eberlein W, Rudolf K. BIIE0246: a selective and high affinity neuropeptide Y Y(2) receptor antagonist. Eur J Pharmacol. 1999 Nov 19;384(2-3):R3-5.
25. Pospisilik JA, Stafford SG, Demuth HU, Brownsey R, Parkhouse W, Finegood DT, McIntosh CH, Pederson RA. Long-term treatment with the dipeptidyl peptidase IV inhibitor P32/98 causes sustained improvements in glucose tolerance, insulin sensitivity, hyperinsulinemia, and beta-cell glucose responsiveness in VDF (fa/fa) Zucker rats. Diabetes 2002 Apr;51(4):943-50.
26. Rahfeld J, Schierhorn M, Hartrodt B, Neubert K, Heins J. Are diprotin A (Ile-Pro-Ile) and diprotin B (Val-Pro-Leu) inhibitors or substrates of dipeptidyl peptidase IV? Biochim Biophys Acta 1991 Jan 29;1076(2):314-6.
27. Ribozyme protocols: Turner, Philip C (editor). Humana Press, ISBN 0-89603-389-9, 512 pp. 1997. 
28. Rossi JJ. Ribozymes, genomics and therapeutics. Chem Biol 6, R33-7, 1999.
29. Ellington AD, Robertson MP, Bull J. Ribozymes in wonderland. Science 276, 546-7, 1997.
30. McManus MT and Sharp PA. Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nat Rev Genet 2002 Oct; 3(19):737-47.
31. Brody EN and Gold L. Aptamers as therapeutic and diagnostic agents. J Biotechnol 2000 Mar;74(1):5-13.
32. Patel DJ. Structural analysis of nucleic acid aptamers. Curr Opin Chem Biol 1997 Jun;1(1):32-46.
33. Stull RA and Szoka FC Jr. Antigene, ribozyme and aptamer nucleic acid drugs: progress and prospects. Pharm Res 1995 Apr;12(4):465-83.
34. J Tajti et al. The human superior cervical ganglion: neuropeptides and peptide receptors. Neuroscience Letters 263 (1999) 121-124.
35. Usman, N., Blatt, L. M. (2000) Nuclease-resistant synthetic ribozymes: developing a new class of therapeutics. J. Clin. Invest. 106:1197-1202.
36. Margaret F Taylor. Emerging antisense technologies for gene functionalization and drug discovery. DDT Vol. 6, No. 15 (Suppl), 2001.
37. Ray A, Norden, B. Peptide nucleic acid (PNA): its medical and biotechnical applications and promise for the future. FASEB J 14, 1041-1066, 2000.
38. Del Prete D, Anglani F, Ceol M, D'Angelo A, Forino M, Vianello D, Baggio B, Gambaro G. Molecular biology of diabetic glomerulosclerosis. Nephrol Dial Transplant. 1998;13 Suppl 8:20-5. Review.
39. Satoh C, Satoh F, Takahashi K, Murakami O, Sone M, Totsune K, Yabe T, Ohneda M, Fukuda M, Sugimura K, Ogawa S, Nagakubo H, Sato T, Mouri T. Elevated plasma immunoreactive neuropeptide Y concentrations and its increased urinary excretion in patients with advanced diabetic nephropathy. Endocr J. 1999 Feb;46(1):139-46.
40. Smith LE, Kopchick JJ, Chen W, Knapp J, Kinose F, Daley D, Foley E, Smith RG, Schaeffer JM. Essential role of growth hormone in ischemia-induced retinal neovascularization. Science 1997 Jun 13;276(5319):1706-9.
41. Smith LE, Shen W, Perruzzi C, Soker S, Kinose F, Xu X, Robinson G, Driver S, Bischoff J, Zhang B, Schaeffer JM, Senger DR. Regulation of vascular endothelial growth factor-dependent retinal neovascularization by insulin-like growth factor-1 receptor. Nat Med. 1999 Dec;5(12):1390-5.
42. Ozaki H, Seo MS, Ozaki K, Yamada H, Yamada E, Okamoto N, Hofmann F, Wood JM, Campochiaro PA. Blockade of vascular endothelial cell growth factor receptor signaling is sufficient to completely prevent retinal neovascularization. Am J Pathol 2000 Feb;156(2):697-707.
43. Ruponen M, Roenkkoe S, Honkakoski P, Pelkonen J, Tammi M, Urtti A (2001): Extracellular glycosaminoglycans modify cellular trafficking of lipoplexes and polyplexes. J Biol Chem 276, 33875-33880.
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１−１】ｃＤＮＡ（配列番号１）として表わされるヒトニューロペプチドＹ２受容体ｍＲＮＡを示す。アンチセンスオリゴヌクレオチドの３つの例が太字で挿入される：ＡＳ−１（配列番号２）、ＡＳ−２（配列番号３）およびＡＳ−３（配列番号４）。また、ヒトＮＰＹ  Ｙ２受容体ｍＲＮＡに相補的な、公開されたＰＣＲプライマー、すなわち５′−ＣＴＧＧＣＴＧＴＣＡＡＴＧＴＣＡＡＣ−３′（配列番号５）が挿入される。
【図１−２】ｃＤＮＡ（配列番号１）として表わされるヒトニューロペプチドＹ２受容体ｍＲＮＡを示す。アンチセンスオリゴヌクレオチドの３つの例が太字で挿入される：ＡＳ−１（配列番号２）、ＡＳ−２（配列番号３）およびＡＳ−３（配列番号４）。また、ヒトＮＰＹ  Ｙ２受容体ｍＲＮＡに相補的な、公開されたＰＣＲプライマー、すなわち５′−ＣＴＧＧＣＴＧＴＣＡＡＴＧＴＣＡＡＣ−３′（配列番号５）が挿入される。
【図２】ｃＤＮＡ（配列番号６）として表わされるラットニューロペプチドＹ２受容体ｍＲＮＡのタンパク質コード領域を示す。ヌクレオチド番号１は開始コドンを示す。
【図３】ｉ）ビヒクル、ii）スクランブルオリゴヌクレオチド、またはiii）ＮＰＹ  Ｙ２受容体ｍＲＮＡに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドにより処置されたラットパピーにおける誘導された網膜症の発症を示す。
【図４】ａ〜ｄは、ｈＴＥＲＴ−ＨＵＶＥＣ細胞による管状構造の予防における被験アンチセンス分子およびそれらの組み合わせの有効性を示す。
【図５】ｈＴＥＲＴ−ＨＵＶＥＣ細胞による内皮細胞の管形成の予防における種々の単一アンチセンス分子およびそれらの組み合せの有効性を写真で示す。
【図１−１】
2005531624.tif 000003
【図１−２】
2005531624.tif 000004
【図２】
2005531624.tif 000005
【図３】
2005531624.tif 000006
【図４】
2005531624.tif 000007
【図５】
2005531624.tif 000008
【配列表】
2005531624000001.app
【国際調査報告】
2005531624.tif 000009
2005531624.tif 000010
2005531624.tif 000011
2005531624.tif 000012
2005531624.tif 000013
2005531624.tif 000014