(57)【要約】本発明は、患者の眼の緑内障および高い眼圧に伴う他の症状の治療における、強力なカリウムチャネルブロッカーまたはその製剤の使用に関する。本発明は、哺乳類、特にヒトの眼に対する神経保護作用をもたらすための、これら化合物の使用にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療を必要とする患者に、表１の化合物またはその薬剤として許容される塩、鏡像異性体、ジアステレオマー、互変異性体または混合物を、治療有効量投与することを含む高眼圧症または緑内障の治療方法。
【表１】
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【請求項２】
式Ｉの化合物が局所製剤として適用される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
局所製剤が液剤または懸濁剤である請求項３に記載の方法。
【請求項４】
第２有効成分がβ−アドレナリン遮断薬、アドレナリン作動薬、副交感神経作動薬、炭酸脱水素酵素阻害剤、ＥＰ４作動薬およびプロスタグランジンまたはプロスタグランジン誘導体から選択される降圧薬であり、第２有効成分を同時にまたは続けて投与することを含む請求項３に記載の方法。
【請求項５】
β−アドレナリン遮断薬が、チモロール、レボブノロール、カルテオロール、オプティプラノロール、メタプラノロールまたはベタキソロールであり、副交感神経作動薬がピロカルピン、カルバコールまたはヨウ化ホスホリンであり、アドレナリン作動薬がアイオピジン、ブリモニジン、エピネフリン、またはジピベフリンであり、炭酸脱水素酵素阻害剤がドルゾラミド、アセタゾラミド、メタゾラミドまたはブリンゾラミドであり、プロスタグランジンがラタノプロストまたはレスキュラであり、プロスタグランジン誘導体がＰＧＦ２αプロスタグランジンから誘導した降圧性脂質である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
局所製剤がキサンタンガムまたはジェランガムを含む請求項２に記載の方法。
【請求項７】
治療を必要とする患者に請求項１に記載の化合物を薬剤として有効量投与することを含む、神経保護作用をもたらし、網膜および視神経乳頭の血流を速め、網膜および視神経の酸素圧を高める、黄班浮腫、黄班変性の治療方法。
【請求項８】
式Ｉの化合物が液剤または懸濁剤の形態で局所製剤として適用される請求項７に記載の方法。
【請求項９】
第２有効成分がβ−アドレナリン遮断薬、アドレナリン作動薬、副交感神経作動薬、炭酸脱水素酵素阻害剤、ＥＰ４作動薬ならびにプロスタグランジンまたはプロスタグランジン誘導体から選択される降圧薬であり、第２有効成分を同時にまたは続けて投与することを含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
β−アドレナリン遮断薬がチモロール、レボブノロール、カルテオロール、オプティプラノロール、メタプラノロールまたはベタキソロールであり、副交感神経作動薬がピロカルピン、カルバコール、またはヨウ化ホスホリンであり、アドレナリン作動薬がアイオピジン、ブリモニジン、エピネフリンまたはジピベフリンであり、炭酸脱水素酵素阻害剤がドルゾラミド、アセタゾラミド、メタゾラミド、またはブリンゾラミドであり、プロスタグランジンがラタノプロストまたはレスキュラであり、プロスタグランジンン誘導体がＰＧＦ２αプロスタグランジンから誘導した降圧性脂質である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
局所製剤がキサンタンガムまたはジェランガムを含む請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００２年６月１７日出願の米国特許出願第６０／３８９２０５号の仮出願の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
緑内障は、眼圧が高すぎて正常な眼の機能が働かなくなる眼の退行性疾患である。障害は最終的に視神経乳頭に現れて、物を見る機能が失われ回復不能となる。治療しなければ、緑内障は最終的に失明に至るであろう。高い眼圧または高眼圧症は緑内障発症の最初期の段階を示しているものと、今日、大多数の眼科医は考えている。
【０００３】
緑内障治療のためにかつて使用された薬剤の多くは不満足なものであった。緑内障を治療する初期の方法ではピロカルピンが使用されていたが、この薬剤は望ましくない局所作用を起こし、高価であっても、最重要性薬剤として満足のいくものでなかった。より近年になって、数多くのβ−アドレナリン拮抗薬が眼圧を低下させるのに有効であると、臨床医が注目してきた。こうした薬剤の多くはこの目的に対して有効であるものの、この治療が有効でないまたは十分に有効ではない患者が存在する。これら薬剤の多くは他の特性、例えば、膜安定化活性を有しており、これは用量が増えるとより明瞭となって、眼への長期使用が許容されなくなり、心血管に影響を及ぼす可能性もある。
【０００４】
ピロカルピンおよびβ−アドレナリン拮抗薬が眼圧は低下させるものの、これらの薬剤は炭酸脱水素酵素阻害による作用を示さず、したがって、炭酸脱水素酵素経路が表す眼房水生成に対する寄与の低減を利用していない。
【０００５】
炭酸脱水素酵素阻害剤といわれる薬剤は、炭酸脱水素酵素を阻害して眼房水の生成を低下させる。今日、このような炭酸脱水素阻害剤は、全身経路あるいは局所経路で眼圧を治療するために使用されているものの、これら薬剤を使用する現在の治療、特に全身経路を使用する治療は、依然として望ましくない作用を有している。炭酸脱水素酵素阻害剤は、基本的な生理プロセスを変更するのに大きな作用を有するので、全身経路での投与を回避できれば、代謝性アシドーシス、嘔吐、麻痺、刺痛、全身の倦怠感などの炭酸脱水素酵素の阻害によって引き起こされる副作用を、完全に排除できないにしても低減できる。局所的に有効な炭酸脱水素酵素阻害剤は、米国特許第４，３８６，０９８号、第４，４１６，８９０号、第４，４２６，３８８号、第４，６６８，６９７号、第４，８６３，９２２号、第４，７９７，４１３号、第５，３７８，７０３号、第５，２４０，９２３号および第５，１５３，１９２号に開示されている。
【０００６】
プロスタグランジンおよびプロスタグランジン誘導体も、眼圧を低下させることが知られている。Ｂｉｔｏの米国特許第４，８８３，８１９号は、眼圧を低下させる際の、ＰＧＡ、ＰＧＢおよびＰＧＣの使用および合成について記載している。Ｇｏｈらの米国特許第４，８２４，８５７号は、眼圧を低下させる際の、ＰＧＤ２、およびＣ−１０を窒素で置換した誘導体を含めたその誘導体の使用および合成を記載している。Ｕｅｎｏらの米国特許第５，００１，１５３号は、眼圧を低下させる際の、１３，１４−ジヒドロ−１５−ケトプロスタグランジンおよびプロシタグランジン誘導体の使用および合成を記載している。米国特許第４，５９９，３５３号は、眼圧を低下させる際の、プロスタグランジンおよびプロスタグランジン阻害剤を含む、エイコサノイドおよびエイコサノイド誘導体の使用を記載している。
【０００７】
プロスタグランジンおよびプロスタグランジン誘導体は、ブドウ膜強膜流出を高めることにより眼圧を低下させる。このことは、ＰｇのＦタイプとＡタイプの双方に当てはまり、したがっておそらくプロスタグランジンＢ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＪタイプならびにこれらの誘導体にも当てはまる。眼圧を低下させるためのプロスタグランジン誘導体の使用に関する問題点は、これらの化合物が、しばしば眼圧の初期増加をもたらし、眼の色素に色変化を起こし、眼の周辺の一部組織の増殖を起こしうることである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
わかるように、緑内障および高い眼圧を治療するための治療法が現在いくつかあるが、これら薬剤の有効性および副作用のプロフィールは、申し分ないとは言いがたい。最近、カリウムチャネルブロッカーが眼の眼圧を低下させることが見出され、したがって高眼圧症およびそれに伴う退行性眼症状を治療するもう１つのアプローチがもたらされた。カリウムチャネルの封鎖は液体分泌を減少させ、状況によっては平滑筋の収縮を増加させ、ＩＯＰを下げて、眼内で神経保護作用を有することが予想される。（米国特許第５，５７３，７５８号、第５，９２５，３４２号、Ｍｏｏｒｅら、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３８，１９９７、国際公開第８９／１０７５７号、国際公開第９４／２８９００号、および国際公開第９６／３３７１９号を参照）
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、患者の緑内障および高い眼圧に伴う他の症状の治療における、強力なカリウムチャネルブロッカーとしての、下記の表１の化合物
【００１０】
【表２】
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【００１１】
またはその薬剤として許容される塩、鏡像異性体、ジアステレオマー、互変異性体または混合物の使用に関する。哺乳動物、特にヒトの眼の神経保護作用をもたらすために、このような化合物を使用することも、本発明に含まれる。より詳細には、本発明は、上述のインドールジテルペン化合物を使用する緑内障および高眼圧症（高い眼圧）の治療に関する。
【００１２】
本明細書を全体として再検討すれば、本発明の様々な態様も理解されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
さらに、本明細書に開示した化合物は互変異性体として存在しうるので、たとえ一方の互変異性体構造のみが記載されていても、互変異性体の双方の形態が本発明の範囲に含まれるものとする。例えば、下記化合物Ａの任意のクレームは、互変異性構造体Ｂを含み、逆もまた同様であり、その混合物を含むものと理解される。
【００１４】
【化１】
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先に列挙した化合物に塩基性または酸性の基が存在する場合、薬剤として許容される塩またはエステルもまた、本発明の範囲に含まれる。
【００１５】
本発明の一実施形態は、治療を必要とする患者に、上記表１の化合物を治療有効量投与することを含む、高眼圧症および／または緑内障の治療方法である。
【００１６】
別の実施形態では、化合物が局所製剤として適用される上記方法が企図されている。
【００１７】
さらに別の実施形態では、局所製剤が液剤または懸濁剤である上記方法が企図されている。
【００１８】
さらに別の実施形態は、第２有効成分を一緒にまたは続けて投与することを含む上記の方法であり、その第２有効成分は、すべて参照により本明細書に組み込まれている、米国特許出願第６０／３８６，６４１号、２００２年６月６日出願（弁理士Ｄｏｃｋｅｔ  ＭＣ０５９ＰＶ）、第６０／４２１，４０２号、２００２年１０月２５日出願（弁理士Ｄｏｃｋｅｔ  ＭＣ０６７ＰＶ）、第６０／４５７，７００号、２００３年３月２６日出願（弁理士Ｄｏｃｋｅｔ  ＭＣ０８０ＰＶ）、第６０／４０６，５３０号、２００２年８月２８日出願（弁理士Ｄｏｃｋｅｔ  ＭＣ０６０ＰＶ）、ならびにＰＣＴ出願のＰＣＴ第０２／３８０３９号、２００２年１１月２７日出願およびＰＣＴ第０２／３８０４０号、２００２年１１月２７日出願で開示され、β−アドレナリン遮断薬、アドレナリン作動薬、副交感神経作動薬、炭酸脱水素酵素阻害剤、ＥＰ４作動薬から選択された眼圧降下剤、ならびにプロスタグランジンまたはプロスタグランジン誘導体である。
【００１９】
さらに別の実施形態は、β−アドレナリン遮断薬がチモロール、レボブノロール、カルテオロール、オプティプラノロール、メタプラノロールまたはベタキソロールであり、副交感神経作動薬がピロカルピン、カルバコール、またはヨウ化ホスホリンであり、アドレナリン作動薬がアイオピジン、ブリモニジン、エピネフリン、またはジピベフリンであり、炭酸脱水素酵素阻害剤がドルゾラミド、アセタゾラミド、メタゾラミドまたはブリンゾラミドであり、プロスタグランジンがラタノプロストまたはレスキュラであり、プロスタグランジン誘導体がＰＧＦ２αプロスタグランジンから誘導した降圧性脂質である上記の方法である。
【００２０】
別の実施形態は、治療を必要とする患者に、上記表１の化合物を治療有効量投与することを含む、黄班浮腫または黄班変性を治療する方法である。
【００２１】
もう１つの実施形態は、表１の化合物が局所製剤として適用される上記方法である。
【００２２】
さらにもう１つの実施形態は、第２有効成分を同時にまたは続けて投与することを含み、この第２有効成分はβ−アドレナリン遮断薬、アドレナリン作動薬、副交感神経作動薬、炭酸脱水素酵素阻害剤、ならびにプロスタグランジンまたはプロスタグランジンン誘導体から選択された眼圧降下剤である。
【００２３】
さらに別の実施形態は、β−アドレナリン遮断薬が、チモロール、レボブノロール、カルテオロール、オプティプラノロール、メタプラノロールまたはベタキソロールであり、副交感神経作動薬がピロカルピン、カルバコールまたはヨウ化ホスホリンであり、アドレナリン作動薬がアイオピジン、ブリモニジン、エピネフリン、またはジピベフリンであり、炭酸脱水素酵素阻害剤がドルゾラミド、アセタゾラミド、メタゾラミドまたはブリンゾラミドであり、プロスタグランジンがラタノプロストまたはレスキュラであり、プロスタグランジン誘導体がＰＧＦ２αプロスタグランジンから誘導した降圧性脂質である上記の方法である。
【００２４】
別の実施形態は、治療を必要とする患者に、上記表１の化合物を治療有効量投与することを含む、網膜および視神経乳頭の血流速度を高める、あるいは網膜および視神経酸素圧を高める方法によって例示される。
【００２５】
もう１つの実施形態は、表１の化合物が局所製剤として適用される上記方法である。
【００２６】
さらにもう１つの実施形態は、第２有効成分を同時にまたは続けて投与することを含み、この第２有効成分がβ−アドレナリン遮断薬、アドレナリン作動薬、副交感神経作動薬、炭酸脱水素酵素阻害剤、ならびにプロスタグランジンまたはプロスタグランジン誘導体から選択された眼圧降下薬である。
【００２７】
さらに別の実施形態は、β−アドレナリン遮断薬がチモロール、レボブノロール、カルテオロール、オプティプラノロール、メタプラノロールまたはベタキソロールであり、副交感神経作動薬がピロカルピン、カルバコール、またはヨウ化ホスホリンであり、アドレナリン作動薬がアイオピジン、ブリモニジン、エピネフリン、またはジピベフリンであり、炭酸脱水素酵素阻害剤がドルゾラミド、アセタゾラミド、メタゾラミドまたはブリンゾラミドであり、プロスタグランジンがラタノプロストまたはレスキュラであり、プロスタグランジン誘導体がＰＧＦ２αプロスタグランジンから誘導した降圧性脂質である上記の方法である。
【００２８】
本発明のもう１つの実施形態は、治療を必要とする患者に、上記表１の化合物を治療有効量投与することを含む、哺乳動物の眼の神経保護作用を提供する方法である。
【００２９】
表１の化合物が局所製剤として適用される上記方法も、本発明の範囲内に含まれる。
【００３０】
さらにもう１つの実施形態は、第２有効成分を同時にまたは続けて投与することを含み、この第２有効成分がβ−アドレナリン遮断薬、アドレナリン作動薬、副交感神経作動薬、炭酸脱水素酵素阻害剤、ならびにプロスタグランジンまたはプロスタグランジン誘導体から選択された眼圧降下剤である。
【００３１】
さらに別の実施形態は、β−アドレナリン遮断薬がチモロール、レボブノロール、カルテオロール、オプティプラノロール、メタプラノロールまたはベタキソロールであり、副交感神経作動薬がピロカルピン、カルバコール、またはヨウ化ホスホリンであり、アドレナリン作動薬がアイオピジン、ブリモニジン、エピネフリン、またはジピベフリンであり、炭酸脱水素酵素阻害剤がドルゾラミド、アセタゾラミド、メタゾラミドまたはブリンゾラミドであり、プロスタグランジンがラタノプロストまたはレスキュラであり、プロスタグランジン誘導体がＰＧＦ２αプロスタグランジンから誘導した降圧性脂質である上記の方法である。
【００３２】
局所製剤がキサンタンガムまたはジェランガムをも含む、上述した表１の化合物の局所製剤も、本発明の範囲に含まれると考えられる。
【００３３】
本発明は、別段の指示がない場合は、以下に定義された用語を使用して、本明細書に詳細に記述されている。
【００３４】
表１の化合物に塩基性または酸性の基が存在する場合、薬剤として許容される塩またはエステルも、本発明の範囲に含まれる。
【００３５】
本発明は、治療を必要とする患者に、チモロール、オプティプラノロール、レボブノロール、メタプラノロール、カルテオロール、ベタキソロールなどのβ−アドレナリン遮断薬、ピロカルピン、カルバコール、ヨウ化ホスホリンなどの副交感神経作動薬、アイオピジン、ブリモジン、エピネフリン、またはジピベフリンなどのアドレナリン作動薬、ドルゾラミド、アセタゾラミド、メタゾラミドまたはブリンゾラミドなどの炭酸脱水素酵素阻害剤、ラタノプロスト、レスキュラ、Ｓ１０３３などのプロスタグランジンあるいはＰＧＦ２αプロスタグランジンから誘導された降圧性脂質などのプロスタグランジン誘導体から選択された眼圧降下剤と組み合わせて、上記表１の化合物を治療有効量投与することを含む、高眼圧症または緑内障の治療方法に関する。降圧性脂質（プロスタグランジン基本構造のα鎖結合上のカルボン酸基が、電気化学的に中性の置換基で置換されている）の例には、カルボン酸基がＯＣＨ３などのＣ１〜６アルコキシ基で置換されたもの（ＰＧＦ２ａ  １−ＯＣＨ３）、またはヒドロキシ基で置換されたもの（ＰＧＦ２ａ  １−ＯＨ）がある。
【００３６】
カリウムチャネルブロッカーは、カルシウム活性化カリウムチャネルブロッカーが好ましい。カリウムチャネルブロッカーは、高伝導度カルシウム活性化カリウム（ｍａｘｉ−Ｋ）チャネルブロッカーがより好ましい。ｍａｘｉ−Ｋチャネルは、ニューロン、平滑筋および上皮組織に広く存在し、膜電位および細胞内Ｃａ２＋によって開閉する、イオンチャネルのファミリーである。
【００３７】
眼内圧（ＩＯＰ）は、眼房水の動力学によって制御されている。眼房水は、非着色毛様体上皮部位で産生され、おもに小柱網を通る排出路から排出される。眼房水の流入は、イオン輸送プロセスで制御されている。非着色毛様体上皮細胞内のｍａｘｉ−Ｋチャネルは、塩素イオンの分泌を次の２つのメカニズムで間接制御している。これらのチャネルは過分極化した膜電位（内部が負）を維持しており、この膜電位が細胞からの塩素イオン流出の推進力を提供し、また塩素イオンの移動のための対イオン（Ｋ＋）をも提供している。水分はＫＣｌと共に受動的に移動し、眼房水の生成を可能にする。この組織におけるｍａｘｉ−Ｋチャネルを阻害すると、流入が低下するはずである。ｍａｘｉ−Ｋチャネルはある種の平滑筋組織の収縮性をも制御し、場合によっては、チャネルブロッカーが静止している筋肉を収縮させ、または自発的に活性化した組織の筋原性活動を高めることができる。ピロカルピンで起きるように、毛様体筋肉の収縮は小柱網を開き、眼房水の流出を刺激する。したがって、ｍａｘｉ−Ｋチャネルはいくつかの方法によって眼房水の動力学に多大な影響を与えることができる。このチャネルを封鎖すれば、流入または流出のプロセスに影響を与えることにより、あるいは流入／流出プロセスの双方への影響を組み合わせることにより、ＩＯＰを低下させるはずである。
【００３８】
本発明は、ｍａｘｉ−Ｋチャネルがブロックされた場合、正味の溶質とＨ２Ｏの流出を抑制することによって眼房水の生成を阻害し、したがってＩＯＰを低下させることを発見したことに基づくものである。この発見は、ｍａｘｉ−Ｋチャネルブロッカーが、黄班浮腫や黄班変性など、他の眼機能不全の治療にも有用であることを示唆する。ＩＯＰを低下させると、網膜や視神経への血流の増大を促すことが知られている。したがって、本発明は、黄班浮腫、黄班変性またはその合併症を治療する方法に関する。
【００３９】
さらに、黄班は、網膜中の、眼の後極にあり、決定的に重要な中央視覚領域内で膨張する。網膜内に液体が溜まると、神経エレメントが互いに離れ、また局所血流供給源から離れて、その部分の視覚機能を停止させる。
【００４０】
緑内障は、視神経の進行性萎縮によって特徴付けられ、しばしば高い眼圧（ＩＯＰ）を伴う。しかし、神経保護作用を示す薬剤を使用することにより、必ずしもＩＯＰに影響を及ぼさずに、緑内障を治療することが可能である。Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｏｌ．１１２、Ｊａｎ  １９９４、ｐ．３７〜４４；Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｍｏｌ．＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２、５、Ａｐｒｉｌ  １９９１、ｐ．１５９３〜９９を参照のこと。ＩＯＰを低下させるｍａｘｉ−Ｋチャネルブロッカーは、神経保護作用をもたらすのに有用であると考えられている。またそれらは、ＩＯＰを低下させることによって、網膜および視神経乳頭の血流速度を高め、網膜および視神経の酸素を増加させるのに効果的であり、それらがあいまって視神経の健康に益すると考えられる。結果として、本発明はさらに、網膜および視神経乳頭の血流速度を高め、網膜および視神経の酸素圧を高め、神経保護作用あるいはこれらの組合せを提供する方法に関する。
【００４１】
使用するｍａｘｉ−Ｋチャネルブロッカーは、液剤、軟膏、クリーム、または固形インサート剤など眼の局所投与に向くようになされた眼科用薬物組成物の形態で投与することが好ましい。この化合物の製剤は、０．０１〜５％、特に０．５〜２％の薬剤を含んでもよい。例えば約１０％の高い用量、またはより低い用量も、眼内圧の低下、緑内障の治療、血流速度または酸素圧の上昇、神経保護作用の実現に有効であれば、採用することができる。化合物０．００１〜５．０ｍｇ、好ましくは０．００５〜２．０ｍｇ特に０．００５〜１．０ｍｇを１回分の用量として、ヒトの眼に適用できる。
【００４２】
この化合物を含む薬剤製剤は、非毒性の医薬品有機担体、あるいは非毒性の医薬品無機担体と混合するのが好都合である。製薬上許容される担体の代表的なものは、例えば、水、水と低級アルカノールやアラルカノールなど水と混和性のある溶媒の混合物、植物油、ポリアルキレングリコール、石油をベースとするゼリー、エチルセルロース、オレイン酸エチル、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ミリスチン酸およびこの他の通常使用されている許容される担体がある。医薬品組成物は、例えばポリエチレングリコール２００、３００、４００および６００、カルボワックス１，０００、１，５００、４，０００、６，０００、１０，０００などの乳化剤、保存剤、湿潤剤、増粘剤、第四級アンモニウム塩、冷滅菌特性をもち使用しても害のないフェニル水銀塩、チメロサール、メチルおよびプロピルパラベン、ベンジルアルコール、フェニルエタノールなどの抗菌成分、ホウ酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、グルコン酸塩バッファーなどの緩衝用成分、ソルビタンモノラウリン酸エステル、トリエタノールアミン、オレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミチン酸エステル、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム、モノチオグリセロール、チオソルビトール、エチレンジアミン四酢酸などの他の通常使用される成分、など非毒性の補助剤を含んでもよい。さらに、通常のリン酸塩緩衝ビヒクル、等張性ホウ酸ビヒクル、等張性塩化ナトリウムビヒクル、等張性ホウ酸ナトリウムビヒクルなどを含めて、適切な眼科用ビヒクルも本目的にかなう担体用媒体として使用できる。薬剤製剤は、ミクロ粒子組成物の形態でもよい。薬剤製剤は、固体のインサート剤の形態でもよい。例えば、薬剤のキャリアーとして固体の水溶性ポリマーを使ってもよい。インサート剤の形状にするために使用するポリマーは、任意の水溶性非毒性ポリマーでよく、例えば、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、（ヒドロキシ低級アルキルセルロース）、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのセルロース誘導体；ポリアクリル酸塩、アクリル酸エチル、ポリアクチルアミドなどのアクリレート；ゼラチン、アルギン酸塩、ペクチン、トラガカント、梧桐、ツノマタ、寒天、アカシアゴムなどの天然産物；酢酸デンプン、ヒドロキシメチルデンプンエーテル、ヒドロキシプロオピルデンプンなどのデンプン誘導体があり、またポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリエチレンオキシド、中和カルボポールおよびキサンタンガム、ジェランガム、およびこれらポリマーの混合物など他の合成誘導体がある。
【００４３】
本発明の製剤の投与に適する対象は、霊長類、ヒトおよびその他の動物、特にヒトと猫や犬などの飼育動物である。
【００４４】
薬剤調製は、例えばチメロサール、塩化ベンザルコニウム、メチルまたはプロピルパラベン、臭化ベンジルドデシニウム、ベンジルアルコールまたはフェニルエタノールなど使用して無害な抗菌成分；塩化ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、グルコン酸緩衝剤などの緩衝用成分；ソルビタンモノラウリン酸エステル、トリエタノールアミン、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミチン酸エステル、エチレンジアミン四酢酸など、他の通常使用される成分など、非毒性の補助物質を含んでもよい。
【００４５】
眼科用液剤または懸濁剤は、眼の許容できるＩＯＰレベルを維持するために必要とする頻度で投与してよい。哺乳類の眼への投与は、１日当たり約１〜２回となると考えられる。
【００４６】
局所的に眼に投与するには、本発明の新規な製剤が、液剤、ゲル剤、軟膏、懸濁剤または固体インサート剤の形態をとってもよく、１回の投薬量が、有効成分を治療有効量、またはコンビネーション治療の場合にはその数倍を含むように処方される。
【００４７】
表１の化合物のｍａｘｉ−Ｋチャネルブロッカーは、知られていて、市販されている、参照により本明細書に組み込まれる下記の別表ＡおよびＢに引用されている参考文献１〜３２に記載されているように調製することができる。
【００４８】
【表３】
2005538061.tif 000015
2005538061.tif 000016
【００４９】
【表４】
2005538061.tif 000017
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2005538061.tif 000019
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【００５０】
以下の実施例は、本発明を例示するために使用するもので、本発明の範囲を限定するためのものと解釈してはならない。
【実施例１】
【００５１】
高伝導率カルシウム活性化カリウムチャネルに及ぼす化合物の効果の電気生理学的アッセイ
方法：
ｍａｘｉ−Ｋチャネルのαサブユニットを構成的に発現させているＣＨＯ細胞から取り出し、あるいはαとβ１のサブユニット双方を構成的に発現しているＨＥＫ２９３細胞から取り出した、膜片の高伝導率カルシウム活性化カリウム（ｍａｘｉ−Ｋ）チャネルを流れる電流を、通常の技法（Ｈａｍｉｌｌら、１９８１、Ｐｆｌｕｇｅｒｓ  Ａｒｃｈｉｖ．３９１、８５〜１００）を用いて室温でパッチクランプ記録を行った。ガラスのキャピラリー管（Ｇａｒｎｅｒ＃７０５２）を２段階で引っ張って、チップの直径が約１〜２ミクロンのマイクロピペットにした。一般的には、ＫＣｌ  １５０ｍＭ、Ｈｅｐｅｓ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンメタンスルホン酸）１０ｍＭ、Ｍｇ  １ｍＭ、Ｃａ  ０．０１ｍＭを含み、３．７ｍＭのＫＯＨでｐＨ７．２０に調整した溶液でピペットを満たした。高い抵抗（＞１０９オーム）のシールを原形質膜とピペットの間に形成した後、ピペットを細胞から引き離し、切り出した裏返しの膜片を作成した。膜片を切り出して、ＫＣｌ  １５０ｍＭ、Ｈｅｐｅｓ１０、ＥＧＴＡ（エチレングリコールビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−４酢酸）１０ｍＭ、１〜５μＭの遊離Ｃａ濃度になるのに十分なＣａを含む溶液に入れ、ｐＨをＫＯＨで７．２に調節した。例えば、２２℃で１μＭの遊離濃度を得るために、Ｃａ  ４．１９３ｍＭを加えた。ＥＰＣ９アンプ（ＨＥＫＡ  Ｅｌｅｋｔｒｏｎｉｃ、Ｌａｍｂｒｅｃｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して電圧を制御し、膜片を通って流れる電流を測定した。ヘッドステージ（ｈｅａｄｓｔａｇｅ）への入力をＡｇ／ＡｇＣｌワイヤでピペット溶液に接続し、アンプのアースは、ＫＣｌ  ０．２Ｍに溶解した寒天を充填したチューブで覆ったＡｇ／ＡｇＣｌワイヤで、浴液に接続した。ｍａｘｉ−Ｋ電流の同定は、膜電位および細胞内カルシウム濃度に対するチャネル開確率の感度によって確認した。
【００５２】
データの取得はＰＵＬＳＥソフトウェア（ＨＥＫＡ  Ｅｌｅｋｔｒｏｎｉｃ）によって制御し、後でＰＵＬＳＥＦＩＴ（ＨＥＫＡ  Ｅｌｅｋｔｒｏｎｉｃ）およびＩｇｏｒ（Ｗａｖｅｍｅｔｒｉｃｓ、Ｏｓｗｅｇｏ、ＯＲ）ソフトウェアを使用して分析するために、マッキントッシュコンピュータ（Ａｐｐｌｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ）のハードドライブに保存した。
【００５３】
結果：
ｍａｘｉ−Ｋチャネルに及ぼす本発明の化合物の効果を、取り出した裏返し膜片で調べた。膜電位を−８０ｍＶに保持し、ｍａｘｉ−Ｋチャネルを一時的に開くために、膜の正電位（通常＋５０ｍＶ）に短い電圧ステップを１５秒間に１度加えた。各実験で遮断されたチャネルの割合を、膜片の内側に指定された化合物を塗布することによって生じるピーク電流の減少から計算した。各実験での正対照として、カルシウムを加えない標準浴溶液にＥＧＴＡ  １ｍＭを加えて作成したカルシウムの低濃度液（＜１０ｎＭ）に膜片を一時的にさらした後に、パルス電位におけるｍａｘｉ−Ｋ電流を消去した。表１の化合物によるｍａｘｉ−Ｋチャネル電流の遮断活性は、１００ｎＭ以下であった。
【実施例２】
【００５４】
化合物の活性は以下のアッセイによっても定量できる。
【００５５】
ｍａｘｉ−Ｋチャネルの阻害剤の同定は、ＨＥＫ−２９３細胞内のチャネルのアルファおよびベータ１サブユニットの双方をトランスフェクトした後、およびＨＥＫ−２９３細胞の内因性カリウム伝導度を選択的に消去するチャネルブロッカーと一緒にインキュベートした後に、発現ｍａｘｉ−Ｋチャネルの細胞静止電位を設定する能力に基づいて行う。ｍａｘｉ−Ｋチャネル阻害剤のない場合、トランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞は、ｍａｘｉ−Ｋチャネルの活性の結果である、過分極した内側が負であるＥＫ（−８０ｍＶ）に近い膜電位を示す。ｍａｘｉ−Ｋチャネルブロッカーと一緒にインキュベートすることによってｍａｘｉ−Ｋチャネルを遮断すると、細胞の脱分極が生じることになる。膜電位の変化は、ドナーのクマリン（ＣＣ２ＤＭＰＥ）とアクセプターのオキサノール（ＤｉＳＢＡＣ２（３））の２成分を使用する、電圧に敏感な蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）色素対を用いて決定することができる。
【００５６】
オキサノールは親油性アニオンであり、膜電位に従い膜を貫通して分布する。細胞の内側が外部に対して負である通常の状態では、オキサノールは膜の外部の小葉に蓄積し、クマリンの励起でＦＲＥＴが生じる。膜の脱分極をもたらす条件では、オキサノールが細胞の内部に向かって再分布し、その結果ＦＲＥＴが減少する。したがって、膜脱分極後の比の変化（ドナー／アクセプター）は増大し、このことから試験化合物がｍａｘｉ−Ｋチャネルを積極的に遮断するかどうかが決まる。
【００５７】
ＨＥＫ−２９３細胞は、ＡＴＴＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国基準菌株保存機構）１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、２０８５２から、寄託番号ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３で入手した。この細胞株への公共アクセスに関する如何なる制限も、特許の発行時に取消し不能な形で撤廃されるものとする。
【００５８】
ＨＥＫ−２９３細胞のｍａｘｉ−Ｋチャネルのアルファおよびベータ１サブユニットのトランスフェクションは、以下のように行った。１００ｍｍの組織培地処理皿に、皿１枚当たり３×１０６の密度でＨＥＫ−２９３細胞を播き、合計５枚の皿を調製した。１０％胎仔ウシ血清、１×Ｌ−グルタミン、および１×ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したダルベッコの修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）からなる培地中、３７℃、１０％ＣＯ２で細胞を増殖させた。ｍａｘｉ−Ｋ  ｈα（ｐＣＩｎｅｏ）およびｍａｘｉ−Ｋ  ｈβ１（ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ）のＤＮＡでトランスフェクトするために、ＦｕＧＥＮＥ６（登録商標）１５０μＬを、血清を含まず／フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ  １０ｍＬに滴下し、室温で５分間インキュベートした。次に、このＦｕＧＥＮＥ６（登録商標）溶液を、各プラスミドＤＮＡを２５μｇ含むＤＮＡ溶液に滴下し、室温で３０分インキュベートした。インキュベーション期間の後、ＦｕＧＥＮＥ６（登録商標）／ＤＮＡ溶液２ｍＬを各皿の細胞に滴下し、上述と同じ条件で細胞を２日間増殖させた。第２日目の終わりに、６００μｇ／ｍＬのＧ４１８と０．７５μｇ／ｍＬのプロマイシンを補充したＤＭＥＭからなる選択培地に細胞を入れた。分離したコロニーが形成されるまで、細胞を増殖させた。５つのコロニーを集めて、６穴の組織培地処理皿に移した。合計７５個のコロニーを集めた。細胞は、全面単一層が得られるまで増殖させた。次いで、１２５Ｉ−イベリオトキシン−Ｄ１９Ｙ／Ｙ３６Ｆのチャネルへの結合を観察するアッセイを使用して、ｍａｘｉ−Ｋチャネルのアルファおよびベータ１のサブユニットが存在するかどうか細胞を検査した。次に、１２５Ｉ−イベリオトキシン−Ｄ１９Ｙ／Ｙ３６Ｆ結合活性を示す細胞について、ＶＩＰＲの装置で蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）オーロラバイオサイエンス技法を使用して、トランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞の膜電位を制御するｍａｘｉ−Ｋチャネルの能力をモニターする機能アッセイで評価した。最も大きい信号対ノイズ比を示したコロニーを限界稀釈した。そのために、細胞をおよそ５細胞／ｍＬで再懸濁させ、９６穴組織培地処理プレートの各ウェルに２００μＬを播いて、各ウェル当たりおよそ細胞１個を加えた。合計２枚の９６穴プレートを作成した。コンフルエントな単一層が形成されると、細胞を６穴組織培地処理プレートに移した。合計で６２穴分を移した。コンフルエントな単一層が得られると、ＦＲＥＴ機能アッセイを使用して細胞を試験した。最良の信号対ノイズ比を示すトランスフェクトされた細胞を同定し、後続の機能アッセイで使用した。
【００５９】
機能アッセイのために：
トランスフェクトされた細胞（２Ｅ＋０６細胞／ｍＬ）を、９６穴のポリ−Ｄ−リジンのプレートに約１００，０００細胞／穴の密度で播き約１６〜約２４時間インキュベートする。細胞から培地を吸引除去し、細胞をダルベッコのリン酸緩衝食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）１００μＬで１回洗浄する。Ｄ−ＰＢＳ中約９μＭのクマリン（ＣＣ２ＤＭＰＥ）と０．０２％のプルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）１２７を、各穴当たり１００μＬ加え、暗所で約３０分インキュベートする。細胞を、ダルベッコのリン酸緩衝食塩水１００μＬで２回洗浄し、ＮａＣｌ  １４０ｍＭ、ＫＣｌ  ０．１ｍＭ、ＣａＣｌ２  ２ｍＭ、ＭｇＣｌ２  １ｍＭ、Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ  ２０ｍＭ、ｐＨ７．４、グルコース１０ｍＭ中約４．５μＭのオキサノール（ＤｉＳＢＡＣ２（３））を１００μＬ加える。ＨＥＫ−２９３細胞の内因性カリウム伝導の阻害剤３μモルを加える。ｍａｘｉ−Ｋチャネルブロッカーを加え（約１０マイクロモルに対して約０．０１マイクロモル）、細胞を暗所で約３０分室温でインキュベートする。
【００６０】
このプレートを電圧／イオンプローブリーダー（ＶＩＰＲ）に入れ、ＣＣ２ＤＭＰＥとＤｉＳＢＡＣ２（３）の双方の蛍光発光を１０秒間記録する。この時点で、ＫＣｌ  １４０ｍＭ、ＣａＣｌ２  ２ｍＭ、ＭｇＣｌ２  １ｍＭ、Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ  ２０ｍＭ、ｐＨ７．４、グルコース１０ｍＭの高カリウム溶液１００μＬを加え、双方の色素の蛍光発光をさらに１０秒間記録する。ＣＣ２ＤＭＰＥ／ＤｉＳＢＡＣ２（３）の比は、高カリウム溶液を添加する前は１に等しい。ｍａｘｉ−Ｋチャネル阻害剤がない場合、高カリウム溶液を添加した後の比は、１．６５〜２．０の間である。知られている標準化合物または試験化合物のいずれかによって、ｍａｘｉ−Ｋチャネルが完全に阻害された場合は、この比は１のままである。したがって、蛍光比の濃度依存変化をモニターすることで、ｍａｘｉ−Ｋチャネル阻害剤の活性を測定することが可能である。表１の化合物によるｍａｘｉ−Ｋチャネルの遮断活性は、１μＭ以下である。
【実施例３】
【００６１】
ウサギの眼圧（ＩＯＰ）測定
両方の性の正常血圧ダッチベルテッド種のウサギ（２．３ｋｇ）を、この実験中１２時間の明暗サイクルで飼育する。眼内圧（ＩＯＰ）は、較正した空気眼圧計（Ａｌｃｏｎ  Ａｐｐｌａｎａｔｉｏｎ  Ｐｎｅｕｍａｔｏｎｏｇｒａｐｈ）を使って測定し、結果はミリメートル水銀（ｍｍＨｇ）で表す。眼圧測定の前に、動物の苦痛を最小限に抑えるため０．０５％プロパラカイン１滴を角膜に適用する。（−０．５および０時間に）２本のベースライン（対照）の読み取りを行い、その後、表１の化合物を容積２５μＬで局所投与し（結膜嚢の片方にのみ適用し）、反対側の（片方の）眼には同量のビヒクルを投与する。薬剤投与およびＩＯＰ測定に関わる人に液剤の内容を知らせないという、マスクデザインを使用する。続いて、薬剤を局所投与してから、０．５、１、２、３、４、５および６時間後にＩＯＰ測定を行う。各測定日の終わりに、較正装置（ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ）／検定装置（ｖｅｒｉｆｉｅｒ）を使って眼圧計の安定性を判定した。
【国際調査報告】
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