(57)【要約】本発明は、患者において天然痘を予防または治療するための方法において使用することができる弱毒化ワクシニアウイルスワクチン、およびこのようなワクチンを得る方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Dryvax（登録商標）が培養された培養細胞から単離された弱毒化ワクシニアウイルスのクローン株であって、ヒトにおける痘瘡ウイルスに対する防御的なまたは治療的な免疫反応を誘導するのに有効な量でヒトに投与された場合、該ヒトにおいて許容可能に弱毒化される、弱毒化ワクシニアウイルスのクローン株。
【請求項２】
ワクシニアウイルスがDryvax（登録商標）と実質的に同じ毒性を有する、請求項1記載のワクシニアウイルスのクローン株。
【請求項３】
ワクシニアウイルスがDryvax（登録商標）と実質的に同じ免疫原性を有する、請求項1記載のワクシニアウイルスのクローン株。
【請求項４】
細胞培養物に接種された場合、Dryvax（登録商標）と実質的に同じ量のまたはそれより多い量のワクシニアウイルスが産出される、請求項1記載のワクシニアウイルスのクローン株。
【請求項５】
制限エンドヌクレアーゼで消化された場合、ワクシニアウイルスがDryvax（登録商標）と実質的に同じ消化パターンを有する、請求項1記載のワクシニアウイルスのクローン株。
【請求項６】
ワクシニアウイルスがワクシニアウイルス株ACAM1000（ATCC寄託番号PTA-3321）と実質的に同じ毒性を有する、請求項1記載のワクシニアウイルスのクローン株。
【請求項７】
ワクシニアウイルスがワクシニアウイルス株ACAM1000（ATCC寄託番号PTA-3321）と実質的に同じ免疫原性を有する、請求項1記載のワクシニアウイルスのクローン株。
【請求項８】
細胞培養物に接種された場合、ワクシニアウイルス株ACAM1000（ATCC寄託番号PTA-3321）と実質的に同じ量のまたはそれより多い量のワクシニアウイルスが産出される、請求項1記載のワクシニアウイルスのクローン株。
【請求項９】
制限エンドヌクレアーゼで消化された場合、ワクシニアウイルスがワクシニアウイルス株ACAM1000（ATCC寄託番号PTA-3321）と実質的に同じ消化パターンを有する、請求項1記載のワクシニアウイルスのクローン株。
【請求項１０】
ワクシニアウイルスがACAM1000（ATCC寄託番号PTA-3321）である、請求項1記載のワクシニアウイルスのクローン株。
【請求項１１】
請求項1記載のワクシニアウイルスのクローン株、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む、薬学的組成物。
【請求項１２】
薬学的組成物を患者に投与することによる、患者における痘瘡ウイルス感染の予防または治療における、使用法請求項11記載の薬学的組成物の使用。
【請求項１３】
乱切法によって薬学的組成物を患者に投与する、請求項12記載の使用。
【請求項１４】
1×104プラーク形成単位〜1×106プラーク形成単位の量の薬学的組成物を患者に投与する、請求項12記載の使用。
【請求項１５】
ワクシニアウイルスのクローン株がACAM1000（ATCC寄託番号PTA-3321）である、請求項12記載の使用。
【請求項１６】
ワクチンとして使用するために弱毒化ワクシニアウイルスのクローン株を得る方法であって、以下の段階を含む方法：
(i)細胞培養系においてDryvax（登録商標）を増殖させる段階；および
(ii)Dryvax（登録商標）またはワクシニアウイルス株ACAM1000（ATCC寄託番号PTA-3321）と、毒性、免疫原性、培養時の増殖の特徴、または制限エンドヌクレアーゼによる消化パターンが実質的に同じであるワクシニアウイルスのクローン株を、細胞培養系から単離する段階。
【請求項１７】
ワクシニアウイルスの毒性がウサギの皮膚試験によって決定される、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
ワクシニアウイルスの毒性が乳飲みマウスの神経毒性試験によって決定される、請求項16記載の方法。
【請求項１９】
ヒトにおける痘瘡ウイルスに対する防御的なまたは治療的な免疫反応を誘導するのに有効な量でヒトに投与された場合、該ヒトにおいてワクシニアウイルスが許容可能に弱毒化される、請求項16記載の方法。
【請求項２０】
ワクシニアウイルスの培養時の増殖の特徴をMRC-5を用いて判断する、請求項16記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は天然痘のワクチン接種（vaccination）の使用のための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
天然痘の原因物質である痘瘡（variola）ウイルスはオルソポックスウイルス属の一員であり、これには猿痘、牛痘、およびワクシニアウイルスも含まれる。大痘瘡株（variola major strain）によって引き起こされる疾患は、少ない感染量（10ビリオン〜100ビリオン）で、長い潜伏期間（平均12日間）、発熱、持続的な症状、全身的な症状、膿疱段階への急速な進行、感染者の致死率最大30％、および生存者における顔の傷を特徴とする。この疾患は、接触（飛沫）により、およびおそらく浮遊粒子（aerosol）により、呼吸器経路を通して人から人へ広まる。
【０００３】
天然痘は20世紀前半、世界中の罹患率および死亡率の最も重大な原因のひとつであった。しかしながら、このウイルスに対する動物レザバー（reservoir）が不足していたことが一因となって、この疾患との闘いにおいてワクチン（生きている、弱毒化ワクシニアウイルス）の計画的な使用が非常に効果的であった。実際、1967年〜1977年の間に、天然痘根絶の世界的計画によってその天然疾患の絶滅がもたらされた（Fennerら、WHO、Geneva、p1460、1988）。天然痘の消滅により、およびワクチンに関連する副作用の危険性により、子供、病院職員、および軍関係者への日常的なワクチン接種は中止され、実験室において仕事でワクシニアおよび関連ウイルスを扱う人々のみが、現在も予防接種を受けている。したがって、世界人口の大部分は天然痘に対する免疫がない。ワクチン免疫性は最初のワクチン接種から5年、ワクチンの再接種から20年未満しか持続しないので、残りの人々にも免疫性はほどんど残っていない。したがって、天然痘の根絶およびワクチン接種の中止により、痘瘡ウイルスを用いたひそかな攻撃または生物戦争に対して人々は抵抗力を無くした。万一このような事象が起きれば、流行の広がりは、人々の免疫障壁（immune barrier）によって阻止されることがないと考えられる（Anon.編、Lancet 353:1539、1999; Henderson、Science 283: 1279-1282、1999; Hendersonら、J.A.M.A. 281: 2127-2137、1999）。
【０００４】
天然痘根絶を取り巻くこの不確実性により、緊急使用のためにワクチンが備蓄された。たとえば、米国では、当初、Wyeth Laboratory社によって産生された155,000本のワクチンバイアル（わずか15,500,000用量）が、米国ジョージア州アトランタにある米国疾病管理センター（Centers for Disease Control and Prevention）（CDC）の管理下で備蓄された。1999年1月に開かれた国家ワクチン諮問委員会（National Vaccines Advisory Committee）の会合で、国のワクチン貯蔵所の現状についてCDCにより報告がなされた。その時点で、Wyeth社が保有する15,500,000用量のうち、3,400,000用量が品質管理試験で不合格となり、かつ10,300,000用量が、日付の延長のための最後の管理試験により規定された有効期限を超過しており、残りの1,700,000用量が放出規格（release specification）に適合した（LeDuc、Presentation to the National Vaccines Advisory Committee、Washington D.C.、Jan. 11-12、1999）。不十分な蓄えであることに加えて、ワクチンは100用量のバイアルに封入されているために、配給が制限され、かつ緊急の際の損失量が増大する。
【０００５】
米国での備蓄のほかに、オランダ、ブリスベンにある国立公衆衛生院に保管されたワクチンの蓄えがあり、かついくつかの他の国々は、根絶時には最大300,000,000用量を含んでいた可能性のある天然痘ワクチンの蓄えを有する。しかしながら、保管時の安定性という同様の問題により、この蓄えは50,000,000用量未満まで減少した（Henderson、Science 283: 1279-1282、1999）。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
本発明は、Dryvax（登録商標）が増殖している培養細胞から単離されたワクシニアウイルス安定株を供給するが、これは、天然痘に対するヒトのワクチンとしての使用にワクシニアウイルスを適合化させるという特徴を有する。本発明はまた、これらの株を作製する方法、および天然痘の感染および疾患を予防するためにそれらを用いる方法にも関する。
【０００７】
したがって、最初の局面において、本発明は、Dryvax（登録商標）が培養された培養細胞から単離された弱毒化ワクシニアウイルスのクローン株であって、ヒトにおける痘瘡ウイルスに対する防御的なまたは治療的な免疫反応を誘導するのに有効な量でヒトに投与された場合、ヒトにおいて許容可能に弱毒化される、弱毒化ワクシニアウイルスのクローン株を提供する。
【０００８】
クローン株は、たとえば、Dryvax（登録商標）と実質的に同じ毒性および/または免疫原性を有してもよい。好ましくは、細胞培養物に接種された場合、Dryvax（登録商標）と実質的に同じ量のまたはそれより多い量のワクシニアウイルスが産出され、かつ/または、制限エンドヌクレアーゼで消化された場合、ワクシニアウイルスはDryvax（登録商標）と実質的に同じ消化パターンを有する。
【０００９】
クローン株はまた、たとえば、適当な動物モデルまたはヒトにおいて試験された場合に、ワクシニアウイルス株ACAM1000（2001年4月19日にATCC寄託番号PTA-3321として寄託された；以下のクローン2を参照されたい）と実質的に同じ毒性および/または免疫原性を有してもよい。好ましくは、細胞培養物に接種された場合、ワクシニアウイルス株ACAM1000と実質的に同じ量のもしくはそれより多い量のこのようなワクシニアウイルスが産出され、かつ/または制限エンドヌクレアーゼで消化された場合、このようなワクシニアウイルスはワクシニアウイルス株ACAM1000と実質的に同じ消化パターンを有する。本発明に含まれるワクシニアウイルスの一例はACAM1000（ATCC寄託番号PTA-3321）である。
【００１０】
第二の局面において、本発明は、上記および本明細書の他の箇所に記載されたワクシニアウイルスのクローン株、ならびに薬学的に許容される担体または希釈剤を含む、薬学的組成物を提供する。
【００１１】
第三の局面において、本発明は、このような薬学的組成物を患者に投与することによって患者における痘瘡ウイルス感染を予防または治療する方法、ならびに、この目的のためのこのような組成物の使用、およびこの目的のための医薬品の製剤化におけるこのような組成物の使用を提供する。たとえば乱切法によって、たとえば1×104プラーク形成単位〜1×106プラーク形成単位の薬学的組成物を患者に投与することができる。
【００１２】
第四の局面において、本発明はワクチンとして用いるための弱毒化ワクシニアウイルスのクローン株を得る方法を提供する。本方法は、(i)細胞培養系においてDryvax（登録商標）を増殖させる段階、および(ii)Dryvax（登録商標）またはワクシニアウイルス株ACAM1000と実質的に同じ毒性、免疫原性、培養時の増殖の特徴、または制限エンドヌクレアーゼによる消化パターンを有するワクシニアウイルスのクローン株を細胞培養系から単離する段階を含む。本発明の方法において、例えばウサギの皮膚試験または乳飲みマウスの神経毒性試験によって、ワクシニアウイルスの毒性を決定することができる。培養時の増殖の特徴は、たとえばヒト2倍体（MRC-5）細胞を用いて決定されうる。好ましくは、本発明を用いて同定されるワクシニアウイルスは、ヒトにおける痘瘡ウイルスに対する防御的なまたは治療的な免疫反応を誘導するのに有効な量でヒトに投与された場合、ヒトにおいて許容可能に弱毒性である。
【００１３】
本発明はいくつかの利点を有する。たとえば、以前は、ワクシニアウイルスを仔ウシの皮膚に接種することにより天然痘ワクチンを産生させ、その後ウシの皮膚を断片化して（scrap）生きたウイルスを回収した。得られた粗ウイルス調製物は、ヒトレシピエントのワクチン接種における使用の前に最小限精製されたが、公知のように病原体混入の可能性が残っていた。本発明のワクチンは、ワクチン製造用の現代標準によって許容される細胞培養系において産出されかつ高度に精製されるため、このような問題は消失する。本発明のウイルスのようなクローンニングウイルスを用いることのさらなる利点とは、増殖およびワクチン製造の間に、ウイルスの混合群と比べて、このようなウイルスの特徴が変化する可能性が低いことである。実際、本発明に記載されたウイルスが、継代の繰り返し、および細胞培養時の増殖下でその表現型を維持すること、雑菌混入（contamination）がないこと、および大規模なワクチン製造に適した量の細胞培養物中で産出されうることが、本発明により示された。
【００１４】
本発明のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、添付の図面、および添付の特許請求の範囲から明らかになると思われる。
【００１５】
詳細な説明
本発明は、天然痘（すなわち痘瘡ウイルス）に対するワクチン接種法ににおいて使用されうる、弱毒化ワクシニアウイルスのクローン株を提供する。以下にさらに記載されているように、本発明の弱毒化ワクシニア株は、Dryvax（登録商標）が増殖している細胞培養物からワクシニアクローンを単離することによって得られる。本発明はまた、天然痘の予防におけるこれらのワクシニアウイルスを含むワクチンの使用法、およびこのようなワクシニアウイルスクローン株を得る方法を提供する。
【００１６】
本発明のワクチンは、米国食品医薬品局（FDA）によって現在認可されておりかつ仔ウシの皮膚から作製されたワクシニアウイルスの混合群からなる、Dryvax（登録商標）（New York City Board of Health strain、Wyeth Laboratories）に由来し、これと同様の特徴を有する。本ワクチンを接種されたヒトに対して、本ワクチンの毒性は許容可能に弱毒化されねばならない。許容可能なレベルの弱毒化とは、たとえば、Dryvax（登録商標）を用いて観察されるのと同様の（例えば、統計上有意な様式で相違の無い）レベルでよく、以下に記載されたインビボ試験またはインビトロ試験のいずれかを用いて決定されうる。ワクシニアウイルスの特性とは、その向神経性（neurotropism）、または中枢神経系の細胞内における複製能であり、これは炎症（すなわち脳炎）を引き起こす。本発明のワクチンの向神経性はDryvax（登録商標）を上回るものではなく、処置後の患者においてワクチン接種後脳炎を引き起こさないことが好ましい。
【００１７】
本発明のワクチンおよび方法を、以下でさらに説明する。
【００１８】
使用の効能（indication）
本発明のワクチンの使用に関する主な効能とは、生物テロ行為または細菌戦争のあとに天然痘に曝露された、または曝露された可能性のある集団における天然痘の予防である。本発明のワクチンの効率は有利に高く（>95％）、かつ本ワクチンは人から人に広まるウイルスおよび高用量浮遊分子への一次曝露や、生物兵器への曝露の両方に対して防御する。この主な効能によって、本発明のワクチンを、例えば国家的な新しい天然痘（ワクシニア）ワクチン備蓄の作製に用いることができ、かつ製造を毎年続けて、長期間、最新のワクチンの備蓄を継続的に維持することができる。
【００１９】
痘疹、牛痘、猿痘、痘瘡、または他のオルソポックスウイルス種に曝露される研究者を除いて、本ワクチンの日常的な使用は意図されていない。さもなくば本ワクチンは、緊急状態下で、国家保安局および公衆衛生局の決定にしたがって放出されるべきである。このような緊急状況下では、天然痘に対して個人を守るおよびこの疾患の広がりから社会を守るという潜在的恩典の方が、痘疹に関連する有害事象の危険性よりも重要であると考えられる。ワクチンの緊急使用は、ワクチン接種後脳炎の危険性が高い乳児がワクチンを受けると考えられること、ならびに、基礎条件（例えば、湿疹歴、妊娠、および免疫抑制）を有する人に使用するための予防措置および禁忌が無視されうるということを管理するのが困難であり得ると、認識される。これらの理由により、本発明の細胞培養物由来のワクチンの毒性が、現在認可されている製品の毒性を上回らないということが重要である。
【００２０】
正確に予想することができない事象に応じて、軍職員、民間医療職員、およびいわゆる「第一応答者（first responder）」を含む特定の群の予備曝露予防（pre-exposure prophylaxis）を実施することが決定される可能性もある。これらの群におけるワクチン固有の安全性プロファイルが非常に重要である一方、これは、産物を慎重に適用することおよび有害事象に関する危険因子を有する個体における使用を回避することによって増大する。これらの状況下では、自己接種、眼性痘疹、および不慮の感染が重大な危険となるが、それらはすべて自己限定的な有害事象である。基礎危険因子を有する他者への不慮の感染という小さな危険もある。
【００２１】
さらなる人々（例えば子供）に、または全人口にさえも日常的なワクチン接種が望ましいと考えられるような、国家的または世界的な状況の変化が万一起こった場合、本発明のワクチンをさらにこれらの目的のために用いることは当然可能である。
【００２２】
投与形態および投与量
本発明のワクチンは、所望のワクシニアウイルス株（例えば、ACAM1000株；ATCC寄託番号PTA-3321；以下参照）を細胞培養系において増殖させ、培養された株を系から標準的な方法を用いて精製することによって調製される。例えば、2倍体のヒト肺繊維芽細胞（例えばMRC-5細胞）、初代ニワトリ胚繊維芽細胞、または、同業者であれば決定できるようなその他の任意の細胞中で、株を培養することができる。培養は、例えばNunc Cell Factory（登録商標）のような任意の適当な系を用いて実施されうる。
【００２３】
精製ウイルスを、後の使用のために凍結乾燥させてもよく、または薬学的溶液中ですぐに調製してもよい。ワクチン調製の際に使用するための多数の薬学的に許容される溶液は当技術分野において周知であり、当業者は本発明における使用のためにそれらを容易に適合化させることができる（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、第18版、A. Gennaro編、1990、Mack Publishing Co.、Easton、PA.）。しかし、アジュバントまたは担体を含むまたは含まない、生理学的に許容される溶液（たとえば滅菌生理食塩水または滅菌緩衝生理食塩水）中で、ウイルスを単に希釈するだけでもよい。任意選択的に、薬学的溶液は、粘着性を提供する成分（例えば、グリセロール）および/または殺菌特性を提供する成分（例えば、フェノール）を含むことができる。ワクチンは、107〜109プラーク形成単位（PFU）/ml、例えば108PFU/mlの濃度で保存されうる。
【００２４】
本発明のワクチンを標準的な方法（例えば乱切法）を用いることによって患者に投与することができる。例えば、このような方法において二股針（bifurcated needle）を用いることができる。または、当業者によって許容されることがわかっている、他の任意の標準的な経路を用いて、ワクチンを投与することができる。例えばワクチンは、皮下注射もしくは皮内注射によって、または別の非経口経路によって（例えば筋肉注射によって）投与されうる。平均的体型の成人に投与されるワクチンの量は、例えば1×104プラーク形成単位〜1×106プラーク形成単位であってよい。特定の例としては、2.5×105プラーク形成単位が使用される。
【００２５】
痘瘡に少しでも曝露される前にワクチン接種を実施することが好ましいが、痘瘡に曝露された患者にも、好ましくは曝露後2、3日以内に、ワクチン接種を実施することができる。ワクチン接種は、一生に一回だけ実施することもでき、または、適切であるとの当業者の判断に従って、数年（例えば5年〜10年）など一定期間をおいて繰り返し実施することもできる。
【００２６】
ワクチン候補の同定
本発明はまた、ワクシニアワクチン候補を同定する方法を含む。Dryvax（登録商標）が接種された細胞培養物からクローン株を単離する段階、および以下に記載されたインビボまたはインビトロの任意の方法を用いてこれらのクローンを特徴決定する段階により、これらの候補を同定できる。例えば、ワクチン株候補を、プラークの大きさ、（例えばMRC-5細胞を使用した）細胞培養物中の収量、ウサギの皮膚毒性、乳飲みマウスの神経毒性、サルの神経毒性、またはマウス投与（challenge）モデルにおける防御について、Dryvax（登録商標）と比較することができる。好ましい候補は、Dryvax（登録商標）と同等またはそれを下回る毒性を有し、Dryvax（登録商標）と同等またはそれを上回る防御免疫を誘導し、かつまた、Dryvax（登録商標）と同等またはそれを上回る増殖特性を有する。
【００２７】
本発明以前は、長い歴史にわたって痘疹が継代されてきたことに起因して、異なる生物学的特徴を有する可能性のある変種の複数の亜集団（すなわち、遺伝的大群（genetic swarm)）が多数生じたため、ワクチン候補としての申し分ない特徴を有するクローン株の単離を予測することは不可能であった。また、プラーク精製（すなわち生物学的クローニング）により単離された単一変種が、ウイルスの最初の混合集団における複数の変種の合計と同じ特徴の表現型を有していたかどうかは不確実であった。実際、本発明以前にもしこれが事実であったならば、驚くべきことである。
【００２８】
本発明のワクチンの開発および臨床前の特徴決定について、以下に詳細に記載する。
【００２９】
ワクシニアワクチンの開発および臨床前の特徴決定
上述したように、Dryvax（登録商標）は現在FDAによって認可されているワクシニアワクチンであり、ニューヨーク市保険局（New York City Board of Health （NYCBH)）株に由来し、仔ウシリンパ法（bovine calf lymph method）によって1982年までWyeth-Lederleによって製造された（ATCC寄託番号：VR-325も参照）。Dryvax（登録商標）は、生きている弱毒化ワクシニアウイルスからなり、細胞培養産物として存在しない。本発明者らは、現代技術を用いてワクチンを作製できるように、ワクシニアウイルスの天然痘ワクチン株を、実験室で増殖させたヒト肺繊維芽細胞培養物における管理条件下での増殖に適合化させた。細胞培養ワクチンを開発するために、本発明者らは終末希釈（terminal dilution）の際に継代によって起こりうる付随的な雑菌混入からDryvax（登録商標）を分離しなくてはならず、以下に記載するように、クローニングしてまたはクローニングせずに、本発明者らはこれをおこなった。本発明者らは、Dryvax（登録商標）中の変種混合物（遺伝的大群）から、動物において類似する生物学的特徴を有しかつ認可されたワクチンと遺伝子的に類似したワクチン候補を選択したが、これらは最初の仔ウシリンパ産物と同程度の臨床的効果を有することの確実性は非常に高かった。
【００３０】
適合化に用いられるひとつのストラテジーにおいて、仔ウシ皮膚由来の、汚染の可能性のある微生物からワクシニアウイルスを単離するために、ワクシニアウイルスがクローニングされた。このストラテジーを使用することによって、6個のクローンを単離した。クローニングされたウイルスは、Dryvax（登録商標）よりも強いまたは弱い毒性をもった様々な特徴を示した。驚いたことに、Dryvax（登録商標）に予想される変種混合物を与えると、3個のクローンは動物の毒性試験においてDryvax（登録商標）と同様であることが見出され、かつこれらは細胞培養中の増殖速度が本質的に異なっていた。任意のこれらの株、および同様の特徴をもったその他の株を、本発明の方法にしたがって、天然痘ワクチン接種法の際に用いることができる。
【００３１】
別のストラテジーでは、本方法によって得られるウイルスが、そのウイルスの由来する株のようにはたらく可能性がより高いという予測のもとに、ウイルスをクローニングしなかった。しかし、驚いたことに、クローニングせずに作製された株は、インビトロ試験においてはDryvax（登録商標）と同様にはたらく一方で、ワクチン株の特徴を有してはいなかったが、実際は実験動物における試験においてより強い毒性を有していることが、本発明者らはにより見出された。したがって本発明者らは、Dryvax（登録商標）ワクチン株の特徴と似た特徴を有するクローニングウイルスの開発に的を絞って取り組んだ。本発明者らによる特徴決定の詳細を、以下に記載する。
【００３２】
Dryvax（登録商標）をMRC-5の培養物に接種し、プラーク精製によってワクシニアウイルスの6個のクローンを得た。汚染されていないことおよびクローン性を確実にするために、個々のクローンを2回再クローニングした。また、クローニングされていない（ポリクローナル）ウイルス調製物を得るために、Dryvax（登録商標）をMRC-5細胞培養物に感染効率（MOI）0.001 PFU/細胞で接種した。続いて、このウイルスを低いMOIでさらに2回、MRC-5細胞に通過させた。6個のクローン全ておよびポリクローナル調製物を、大規模な一連の比較分析において、インビボおよびインビトロの特徴についてDryvax（登録商標）と比較して試験した。特に、クローンおよびポリクローナル調製物それぞれを、プラーク形態、MRC-5における収量、制限エンドヌクレアーゼマッピングパターン、ウサギにおける皮膚の痘痕（pock）の形成、およびマウスの神経毒性について分析した。クローンのサブセットを、マウスにおける防御免疫の誘導についてさらに試験した。Dryvax（登録商標）と生物学的類似点を有するDryvax（登録商標）プール由来のワクチン株を選択することを目的とした。表1はこれらの試験結果をまとめたものである。
【００３３】
（表１）7個のワクシニアウイルス候補の特徴決定
2005503126.tif 000002
†pfu/ml×106
【００３４】
これらの研究から、クローン2およびクローン4が新規な天然痘ワクチンとして使用されるのに適していることを示す特徴を有することが明らかになった。クローン6も適した特徴を有するが、培養の際にクローン2またはクローン4と同じくらい良好には増殖しない。
【００３５】
乳飲みマウスの神経毒性
成体マウスは、非改変Dryvax（登録商標）の頭蓋内（IC）接種に対して影響を受けないと判定された。そのため、乳飲みマウスにおける試験が開発された。乳飲みマウス（3日齢〜4日齢）にウイルスの10倍希釈液を注射し、生存時間を測定した。実験は3回おこなわれ、それぞれにおいてDryvax（登録商標）を標準として試験された。Dryvax（登録商標）をIC接種された乳飲みマウスが、均一にLD50が約1.0 log10 PFUの致命的な脳炎を発症すること、および死に至る平均時間は7日であることが、本発明者らにより観察された。したがって、本試験はワクチン候補の神経毒性を、親Dryvax（登録商標）と比較するのに有用であることがわかった。これらの実験の結果を表2にまとめた。この分析で見出された生存マウスの数および平均生存時間を、図1A〜図1Dに示す。
【００３６】
（表２）乳飲みマウスの神経毒性、ワクシニアワクチン候補
2005503126.tif 000003
1感染後10日目における接種物0.02mlあたりの大脳内50%致死用量
1感染後10日目における接種物0.02mlあたりの大脳内90%致死用量
2約10 LD50〜100 LD50における平均生存時間（日数（標準偏差))
【００３７】
追加の試験によってワクチン候補の毒性を試験することができる。例えば、本発明者らはウサギの皮膚毒性試験を開発した。紅斑、硬結、およびいくつかの場合には中枢病変によって特徴付けられる用量依存的痘痕病変を産生する、継代されていないDryvax（登録商標）の皮内接種を使用することにより、本試験の開発を成功させた。別の例としては、サルの神経毒性試験を用いることができる。この試験において、クローニングされたDryvax（登録商標）由来の候補は、段階的ウイルス用量のIC接種によって、Dryvax（登録商標）に対して試験される。
【００３８】
本発明者らはまた、防御試験用にマウス投与モデルを開発した。このモデルにおいて、ワクシニアWR株を用いて6週齢〜8週齢のマウスに経鼻（IN）経路により投与した。LD50が約4.5 log10 PFUおよび死に至るまでの平均時間が投与後6日〜7日である。本試験は、新規ワクチン候補を用いた臨床前防御研究に使用するのには十分頑強である。他のオルソポックスウイルス（例えば牛痘ウイルス）を用いる同様のモデルも使用することができる。
【００３９】
Dryvax（登録商標）、クローン2、およびクローン4が、マウスにおけるワクシニアWR投与に対する防御免疫を誘導する能力を試験した。クローン3についても、毒性のより高いクローンがより高い免疫応答を誘導できるかどうかを試験した。段階的用量の各ウイルス株により4週齢マウスの予防接種をおこなった。二股針を用いた乱切法により皮膚にウイルスを接種したが、これはヒトにDryvax（登録商標）を接種するために用いる方法である。予防接種の3週間後、6.5 log10 PFU（100LD50）のワクシニアWRをIN経路でマウスに投与した。投与後14日間にわたって生存率を測定した。全てのウイルス株について用量反応性防御がみられ、かつ全てのクローンは、マウスを少なくともDryvax（登録商標）と同程度に保護した。クローン間での防御活性に違いは無かった。異なる免疫用量における平均生存時間を表3にまとめ、50%防御用量（PD50）を表4に示した。
【００４０】
（表３）100 LD50のワクシニアWRを投与した後の免疫マウスの生存時間
2005503126.tif 000004
【００４１】
（表４）Dryvax（登録商標）およびワクチン候補の50%防御用量
2005503126.tif 000005
【００４２】
制限エンドヌクレアーゼ分析
Dryvax（登録商標）およびそれぞれのワクチン候補に由来するDNAを精製し、HindIIIによる制限エンドヌクレアーゼ消化に供して、株間で遺伝的な違いがあるかを判定した。図2に示したゲノムDNA消化物を用いた電気泳動分析に示されるように、違いは検出されなかった。
【００４３】
細胞基質の選択
Dryvax（登録商標）複製の研究ならびに、MRC-5細胞および初代ニワトリ胚繊維芽（CEF）細胞における収量の研究が実施され、MRC-5よりCEF細胞において収量が低いことが示された。したがって、MRC-5細胞がワクチン開発の基質として選択された。ワクチン収量を比較するために、CEFまたは他の細胞において候補物を試験することができる。
【００４４】
MRC-5細胞増殖のための増殖培地についても比較をおこなった。Williams E培地、基礎培地（MEM）、およびダルベッコMEMからは同等の結果が得られた。追加的なウシ胎仔血清（FBS）、非必須アミノ酸、ビタミン類、およびピルビン酸ナトリウムによる培地の栄養強化は、細胞生存率または細胞増殖の面で、10%FBS含有培地に対して利点を有さなかった。適切な細胞播種密度（cell seeding density）におけるMRC-5増殖速度は十分であった。細胞播種密度（cell plant density）は2×104細胞/cm2であると判断された。分裂時間は3日〜5日と測定され、個体群の倍増/分裂は1〜1.5と判断された。細胞銀行（cell bank）作製方法およびウイルス増殖のための細胞増殖方法が規定された。標準的なトリプシン処理方法が、細胞の解離に適していることが示された。微生物プロナーゼを使った別の方法が有用であることが示され、かつこれは製造時に動物由来の産物を回避するという利点を有しうる。
【００４５】
本発明の他の態様は添付の特許請求の範囲に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図1A〜図1Dは、乳飲みマウスを所与のワクチンクローン、ポリクローナルワクシニアウイルス調製物、またはDryvax（登録商標）に供した実験の結果を示す、一連のグラフである。これらの供与後の生存マウスの数、および生存日数を示す。
【図２】ポリクローナルウイルス調製物およびDryvax（登録商標）と比較した、本発明のワクチンクローンのHindIIIによる制限酵素消化分析を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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