(57)【要約】  本発明は、臨床診断アッセイ、光バイオディスクおよびディスク読み取り装置に関する。本発明は、光バイオディスク分析システムを用いて免疫血液学アッセイを行う方法および装置を対象とする。本発明はさらに、符号化情報が関連付けられた基板を含む、免疫血液学的アッセイを行う光バイオディスクを対象とする。符号化情報は、ディスクの回転を制御するディスクドライブアセンブリにより読み取り可能であってもよい。ディスクは、基板に関連する少なくとも１つの標的領域または捕捉領域を含んでいてもよい。標的領域は、基板の中心に対して所定の位置に位置付けられる。ディスクはさらに、標的領域に固定された捕捉抗体、フローチャネルと、流体回路、または標的領域に関連する分析チャンバ、および分析チャンバと流体連通している流入部位を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
光バイオディスクでの直接タイピングにより個体の血液型を判定する方法であって、
前記光バイオディスクの少なくとも１つのチャンバであって、捕捉抗体を含む少なくとも１つの捕捉フィールド、少なくとも１つの陽性対照フィールド、および少なくとも１つの陰性対照フィールドを表面に含むチャンバに赤血球を加えること、
抗原−抗体相互作用を促進させるために、前記ディスクにおいてサンプルをインキュベートすること、
第１の面上で前記ディスクを支持する光学式読み取り装置に前記ディスクを配置すること、
前記チャンバ表面上に捕捉された細胞から捕捉されていない細胞を分離するために、前記第１の面に対してほぼ垂直な軸を中心に前記ディスクを回転させること、
前記試験フィールド、前記陽性対照フィールド、および前記陰性対照フィールドの測定値を得ること、および
個体の血液型を判定するために、前記試験フィールド、前記陽性対照フィールド、および前記陰性対照フィールドの測定値を分析すること、
を含む方法。
【請求項２】
光バイオディスクでの裏タイピングにより、個体の血液サンプルのＡＢＯ血液型に対する抗体の存在を判定する方法であって、
血液サンプルからの血清を精製すること、
血清を既知のＡＢＯ血液型の細胞と混合することにより試験サンプルを作製すること、
前記光バイオディスクの少なくとも１つの流路に試験サンプルを注入し、細胞結合分子を含む捕捉フィールド上に試験サンプルを送出すること、
凝集細胞および非凝集細胞を前記細胞結合分子に結合させるため、前記捕捉フィールド上で試験サンプルをインキュベートすること、
第１の面上で前記ディスクを支持する光学式読み取り装置に、前記ディスクを配置すること、
前記第１の面に対してほぼ垂直な軸を中心に前記ディスクを回転させること、
前記第１の面に対してほぼ垂直な軸を中心に前記ディスクを回転させ、かつ前記軸に対して半径方向に電磁放射入射ビームを移動させることにより、該入射ビームでチャンバを走査すること、
前記ディスクと相互作用した後の前記入射ビームの少なくとも一部により形成される電磁放射反射ビームを検出すること、
前記反射ビームを出力信号に変換すること、
前記捕捉フィールドに結合した凝集細胞の存在を判定するため、前記出力信号を分析すること、および
血清中の抗体の存在を判定すること
を含む方法。
【請求項３】
光バイオディスクでの裏タイピングにより、個体の血液サンプル中のＡＢＯ血液型に対する抗体の存在を判定する方法であって、
少なくとも１つのマイクロフィルタ、少なくとも１つの混合チャンバ、および少なくとも１つの捕捉チャンバを有する分離チャンバを含む前記光バイオディスクの、少なくとも１つのマイクロ流体流路に、血液サンプルを加えること、
前記分離チャンバにおいて血液サンプルを細胞と血清に分離するため、第１の速度で第１の時間、前記光バイオディスクをスピンさせること、
前記マイクロ流体流路を通って混合チャンバに血清を移動させるため、第１の速度よりも速い第２の速度で、第２の時間、前記光バイオディスクをスピンさせること、
既知のＡＢＯ血液型細胞を、血清を含む前記混合チャンバに添加すること、
前記血清と前記細胞を混合させるため、一方向と別の方向とに交互に、少なくとも１回、第３の時間、前記光バイオディスクをスピンさせること、
抗体−抗原結合させるのに十分な期間、前記血清中で前記細胞をインキュベートすること、
細胞と結合する分子を表面に有する捕捉チャンバに細胞を移動させるため、第２の速度よりも速い第３の速度で、第４の時間、前記光バイオディスクをスピンさせること、
前記チャンバの表面への細胞の結合を促進させるため、前記捕捉チャンバ内でサンプルをインキュベートすること、
前記捕捉フィールドから未結合細胞を除去するため、第５の時間、前記ディスクをスピンさせること、
第１の面に対してほぼ垂直な軸を中心に前記ディスクを回転させ、かつ前記軸に対して半径方向に電磁放射入射ビームを移動させることにより、該入射ビームで前記チャンバを走査すること、
前記ディスクと相互作用した後の前記入射ビームの少なくとも一部により形成される電磁放射反射ビームを検出すること、
前記反射ビームを出力信号に変換すること、
凝集細胞の存在を判定するために、前記出力信号を分析すること、および
サンプル中の抗体の存在を判定すること
を含む方法。
【請求項４】
光バイオディスクでの抗体タイピングにより個体の血液型に対する抗体の存在を判定する方法であって、
血液サンプルから血清を精製すること、
血清を既知の血液型群表現型の細胞と混合することにより、少なくとも１つのサンプルを作製すること、
前記光バイオディスクの少なくとも１つの流路に少なくとも１つのサンプルを注入することにより、細胞結合分子を含む捕捉フィールド上にサンプルを送出すること、
第１の面上で前記ディスクを支持する光学式読み取り装置に、前記ディスクを配置すること、
前記第１の面に対してほぼ垂直な軸を中心に前記ディスクを回転させること、
前記第１の面に対してほぼ垂直な軸を中心に前記ディスクを回転させ、かつ前記軸に対して半径方向に電磁放射入射ビームを移動させることにより、該入射ビームでチャンバを走査すること、
前記ディスクと相互作用した後の前記入射ビームの少なくとも一部により形成される電磁放射反射ビームを検出すること、
前記反射ビームを出力信号に変換すること、
前記捕捉フィールドに結合した細胞の存在を判定するため、前記出力信号を分析すること、および
血液型抗体の存在を判定すること
を含む方法。
【請求項５】
光バイオディスクでの抗体タイピングにより個体の血液型に対する抗体の存在を判定する方法であって、
少なくとも１つのマイクロフィルタ、少なくとも１つの混合チャンバ、および少なくとも１つの捕捉チャンバを有する分離チャンバを含む前記光バイオディスクの、少なくとも１つのマイクロ流体流路に、血液サンプルを加えること、
前記分離チャンバにおいて血液サンプルを細胞と血清に分離するため、第１の速度で第１の時間、前記光バイオディスクをスピンさせること、
前記マイクロ流体流路を通して混合チャンバに血清を移動させるため、第１の速度よりも速い第２の速度で、第２の時間、光バイオディスクをスピンさせること、
既知の血液型群表現型の細胞を、血清を含む前記混合チャンバに添加すること、
前記血清と前記既知の血液型群表現型の細胞とを混合させるため、一方向と別の方向とに交互に、少なくとも１回、第３の時間、前記光バイオディスクをスピンさせること、
抗体−抗原結合させるのに十分な期間、前記血清中で既知の血液型群表現型の細胞をインキュベートすること、
抗ヒト免疫グロブリン分子を表面に有する前記捕捉チャンバに、前記既知の血液型群表現型の細胞を移動させるため、第２の速度よりも速い第３の速度で、第４の時間、前記光バイオディスクをスピンさせること、
前記チャンバの表面への、既知の血液型群表現型の細胞の結合を促進させるため、前記捕捉チャンバ内でサンプルをインキュベートすること、
既知の血液型群表現型の未結合細胞を除去するため、第５の時間、前記光バイオディスクをスピンさせること
第１の面に対してほぼ垂直な軸を中心に前記ディスクを回転させ、かつ前記軸に対して半径方向に電磁放射入射ビームを移動させることにより、該入射ビームで前記チャンバを走査すること、
前記ディスクと相互作用した後の前記入射ビームの少なくとも一部により形成される電磁放射反射ビームを検出すること、
該反射ビームを出力信号に変換すること、
既知の血液型群表現型の細胞が捕捉されているか否かを判定するため、前記出力信号を分析すること、および
血液型抗体の存在を判定すること
を含む方法。
【請求項６】
個体の血液型を判定する装置であって、
第１の捕捉抗体を含む層、および該第１の捕捉抗体により結合される、ある血液型抗原に特異的である第２の捕捉抗体を含む層を有する、少なくとも一つの捕捉チャンバを含む光バイオディスク、
ディスクドライブアセンブリ、
光学式読み取り装置、及び
血液型分析のためのソフトウェア
を備える装置。
【請求項７】
血液タイピングアッセイを行う光バイオディスクであって、
基板、
該基板に関連し、かつ第１の注入ポートを含む分離チャンバ、
該分離チャンバに関連するフィルタ手段、
前記分離チャンバと流体連通しており、かつ第２の注入ポートを含む第１の混合チャンバ、
前記分離チャンバに流体連通しており、かつ第３の注入ポートを含む第２の混合チャンバ、
前記第１の混合チャンバと流体連通しており、かつ捕捉フィールドを含む第１の分析チャンバ、および
前記第２の混合チャンバと流体連通しており、かつ捕捉フィールドを含む第２の分析チャンバ
を含む光バイオディスク。
【請求項８】
光バイオディスクでの直接タイピングにより個体の血液型を判定する方法であって、
前記光バイオディスクの少なくとも１つのチャンバであって、バイオマトリックスが充填されており、その充填密度は、単独細胞を通過させ、凝集細胞が入ることを防ぐような密度であるチャンバに試薬抗体をロードすること、
前記試薬抗体および赤血球を含む検定溶液を作製するため、前記光バイオディスクの少なくとも１つのチャンバに、赤血球をロードすること、
抗原−抗体相互作用および赤血球凝集を促進させるため、前記ディスクにおいて前記検定溶液をインキュベートすること、
前記ディスクを内部で支持する光学式読み取り装置に、前記ディスクを配置すること、
前記バイオマトリックスを通して前記検定溶液を送り、凝集赤血球から非凝集赤血球を分離するために、前記ディスクの基板層に対してほぼ垂直な軸を中心に前記ディスクを回転させること、
前記少なくとも１つのチャンバを走査するために、電磁放射ビームを照射すること、および
赤血球凝集の程度を判定して、個体の血液型を判定するため、前記ビームからの反射信号を分析すること
を含む方法。
【請求項９】
光バイオディスクでの裏タイピングにより、個体の血液サンプル中のＡＢＯ血液型に対する抗体の存在を判定する方法であって、
少なくとも１つのマイクロフィルタ、少なくとも１つの混合チャンバ、および少なくとも１つの分離チャンバであって、バイオマトリックスが充填されており、その充填密度が、単独細胞を通過させ、凝集細胞が入ることを防ぐような密度である分離チャンバを有する調製チャンバを含む前記光バイオディスクの、少なくとも１つのマイクロ流体流路に血液サンプルをロードすること、および
前記調製チャンバにおいて血液サンプルを細胞と血清に分離するため、第１の速度で第１の時間、前記光ディスクをスピンさせること
を含む方法。
【請求項１０】
前記マイクロ流体流路を通して前記混合チャンバに血清を移動させるため、第１の速度よりも速い第２の速度で、第２の時間、前記光ディスクをスピンさせるステップをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
既知のＡＢＯ血液型の細胞を、血清を含む前記混合チャンバに添加するステップをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
血清と既知のＡＢＯ血液型の細胞とを混合させるため、一方向と別の方向とに交互に、少なくとも１回、第３の速度で、第３の時間、前記光ディスクをスピンさせるステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
抗体−抗原結合および細胞凝集を可能にするのに十分な期間、既知のＡＢＯ血液型の細胞を前記血清と共にインキュベートするステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記既知のＡＢＯ血液型の細胞を、前記分離チャンバ及び前記バイオマトリックスに移動させて、凝集細胞を非凝集細胞から分離するため、第２の速度よりも速い第４の速度で、第４の時間、前記ディスクをスピンさせるステップをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ディスクの基板部に対してほぼ垂直な軸を中心に前記ディスクを回転させ、かつ前記軸に対して半径方向に電磁放射入射ビームを移動させることにより、該入射ビームで前記チャンバを走査するステップをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ディスクと相互作用した後の前記入射ビームの少なくとも一部により形成される電
磁放射反射ビームを検出するステップをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記反射ビームを出力信号に変換するステップをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
凝集細胞の存在を判定し、それによりサンプル中の抗体の存在を判定するため、前記出力信号を分析するステップをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
光バイオディスクでの抗体タイピングにより個体の血液型の抗体の存在を判定する方法であって、
血液サンプルから血清を精製すること、
前記精製した血清を、既知の血液型群表現型の細胞と混合することにより、少なくとも１つのアッセイ溶液を作製すること、
前記光バイオディスクの少なくとも１つの流路であって、バイオマトリックスが充填されており、その充填密度が、単独細胞を通過させるが、凝集細胞を通過させることを防ぐような密度である流路に前記検定溶液をロードすること、
抗体−抗原結合および凝集を可能にするのに十分な期間、前記アッセイ溶液をインキュベートすること、
前記ディスクを内部で支持する光学式読み取り装置に、前記ディスクを配置すること、
前記バイオマトリックスを通して前記アッセイ溶液を送り、凝集細胞から非凝集細胞を分離するため、前記ディスクの基板層に対してほぼ垂直な軸を中心に前記ディスクを回転させること、
前記軸を中心に前記ディスクを回転させ、かつ前記軸に対して半径方向に電磁放射入射ビームを移動させることにより、該入射ビームでチャンバを走査すること、
前記ディスクと相互作用した後の前記入射ビームの少なくとも一部により形成される電磁放射反射ビームを検出すること、
前記反射ビームを出力信号に変換すること、および
凝集の存在および程度を判定し、それにより血液型抗体の存在を判定するため、前記出力信号を分析すること
を含む方法。
【請求項２０】
免疫血液学的アッセイを行うための光バイオディスクであって、
前記ディスクの回転を制御するディスクドライブアセンブリにより読み取られ得る符号化情報が関連付けられた基板、
前記基板に関連し、第１の注入ポートを有する分離チャンバ、
前記分離チャンバに関連するフィルタ手段、
前記分離チャンバと流体連通している、第２の注入ポートを含む第１の混合チャンバ、
前記分離チャンバに流体連通している、第３の注入ポートを含む第２の混合チャンバ、
前記第１の混合チャンバと流体連通している、バイオマトリックスを含む第１の分析チャンバ、および
前記第２の混合チャンバと流体連通している、バイオマトリックスを含む第２の分析チャンバ
を含む光バイオディスク。
【請求項２１】
免疫血液学的アッセイを行うための光バイオディスクであって、
前記ディスクの回転を制御するディスクドライブアセンブリにより読み取られ得る符号化情報が関連付けられた基板、
前記基板に関連し、かつ該基板の中心に対して所定の位置に配置される、少なくとも１つの捕捉フィールド、
前記捕捉フィールドに固定されている複数の捕捉抗体、
前記捕捉フィールドに関連するフロー流路、および
前記フロー流路と流体連通している流入部位
を備える光バイオディスク。
【請求項２２】
前記流入部位は、緩衝液、Ａ型試薬細胞、Ｂ型試薬細胞、および血清サンプルを含むアッセイ溶液を受け入れることができ、前記アッセイ溶液が前記フロー流路に流入すると、前記Ａ型試薬細胞およびＢ型試薬細胞が前記捕捉フィールドに移動し、前記Ａ型細胞またはＢ型細胞の表面抗原とそれらそれぞれの捕捉抗体との間に結合が起こり、前記Ａ型細胞およびＢ型細胞がそれらそれぞれの捕捉フィールドに配置される、請求項２１に記載の光バイオディスク。
【請求項２３】
電磁放射ビームが前記捕捉フィールドに照射されると、前記ビームからの反射信号により凝集の存在および程度を判定することができる、請求項２２に記載の光バイオディスク。
【請求項２４】
光バイオディスクでの裏タイピングにより、個体の血液サンプル中のＡＢＯ血液型に対する抗体の存在を判定する方法であって、
少なくとも１つのマイクロフィルタ、少なくとも１つの混合チャンバ、および少なくとも１つの捕捉チャンバを有する分離チャンバを含む前記光バイオディスクの、少なくとも１つのマイクロ流体流路に、血液サンプルをロードすること、および
前記分離チャンバにおいて、血液サンプルを血液細胞と血清に分離するため、第１の速度で、第１の時間、前記ディスクをスピンさせること
を含む方法。
【請求項２５】
前記マイクロ流体流路を通して前記混合チャンバに血清を移動させるため、第１の速度よりも速い第２の速度で、第２の時間、前記ディスクをスピンさせるステップをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
Ａ型試薬細胞およびＢ型試薬細胞を、血清を含む前記混合チャンバに添加するステップをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記血清と前記試薬細胞とを混合させるため、一方向と別の方向とに交互に、少なくとも１回、第３の速度で第３の時間、前記ディスクをスピンさせるステップをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
抗体−抗原結合および細胞凝集を可能にするのに十分な期間、血清中で試薬細胞をインキュベートするステップをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
捕捉剤を有する表面を含む前記捕捉チャンバに前記試薬細胞を移動させるため、第２の速度よりも速い第４の速度で、第４の時間、前記光バイオディスクをスピンさせるステップをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記捕捉剤は、Ａ型試薬細胞に対する抗体およびＢ型試薬細胞に対する抗体からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記捕捉剤への細胞の結合を促進させるため、前記捕捉チャンバにおいてサンプルをインキュベートするステップをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記捕捉フィールドから未結合試薬細胞を除去するため、第５の時間、前記ディスクをスピンさせるステップをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記基板に対してほぼ垂直な軸を中心に前記ディスクを回転させ、かつ前記軸に対して半径方向に電磁放射入射ビームを移動させることにより、該入射ビームで前記チャンバを走査するステップをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ディスクと相互作用した後の前記入射ビームの少なくとも一部により形成される電磁放射反射ビームを検出するステップをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記反射ビームを出力信号に変換するステップをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
凝集試薬細胞および非凝集試薬細胞の存在および量を判定し、サンプル中の抗体の存在を判定するため、前記出力信号を分析するステップをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
光バイオディスクでの抗体タイピングにより個体の血液型の抗体の存在を判定する方法であって、
血液サンプルから血清を精製すること、
血清を、任意の副次的な血液型の抗原を発現する試薬細胞および抗ヒトグロブリンと混合することにより、少なくとも１つのアッセイ溶液を作製すること、
少なくとも１つの捕捉抗体を含む捕捉フィールドに前記アッセイ溶液を送出するため、前記光バイオディスクの少なくとも１つの流路に、前記アッセイ溶液をロードすること、
抗体−抗原結合および凝集を可能にするのに十分な期間、前記血清中で前記細胞をインキュベートすること、
前記細胞を前記捕捉フィールドの、それぞれの捕捉抗体に結合させるため、前記捕捉フィールドでサンプルをインキュベートすること、
未結合細胞を前記捕捉フィールドに結合された細胞から分離するため、前記ディスクをスピンさせること、
光学式読み取り装置に前記ディスクを配置すること、
前記ディスクの基板層に対してほぼ垂直な軸を中心に前記ディスクを回転させること、
前記軸を中心に前記ディスクを回転させ、かつ前記軸に対して半径方向に電磁放射入射ビームを移動させることにより、該入射ビームでチャンバを走査すること、
前記ディスクと相互作用した後の前記入射ビームの少なくとも一部により形成される電磁放射反射ビームを検出すること、
前記反射ビームを出力信号に変換すること、および
凝集の存在および量を判定し、それにより血液型抗体の存在を判定するため、前記出力信号を分析すること
を含む方法。
【請求項３８】
免疫血液学的アッセイを行うための光バイオディスクであって、
中心および外縁を有するほぼ円形の基板、
内部に流体回路が形成され、かつ前記基板に関連する流路層、
前記流路層に関連するキャップ部、
前記基板に関連し、かつ前記流体回路内の所定の位置に配置される、少なくとも１つの捕捉フィールド、および
前記捕捉フィールドに固定される複数の捕捉抗体
を備える光バイオディスク。
【請求項３９】
前記基板に関連する半反射層をさらに備える、請求項３８に記載の光バイオディスク。
【請求項４０】
前記基板は該基板に関連する符号化情報を含み、該符号化情報は、前記ディスクの回転を制御するディスクドライブアセンブリにより読み取られ得る、請求項３９に記載の光バイオディスク。
【請求項４１】
前記流体回路は、注入ポート、分析チャンバ、および排出ポートを含む、請求項４０に記載の光バイオディスク。
【請求項４２】
前記捕捉フィールドは前記分析チャンバにある、請求項４１に記載の光バイオディスク。
【請求項４３】
前記分析チャンバは、実質的に、前記基板の中心および外縁内の環状リングの弓状部分に沿って向けられている、請求項４２に記載の光バイオディスク。
【請求項４４】
前記分析チャンバは、実質的に、前記ディスクの所定の半径に沿って向けられている、請求項４２に記載の光バイオディスク。
【請求項４５】
前記注入ポートは、緩衝液、Ａ型試薬細胞、Ｂ型試薬細胞、および血清サンプルを含むアッセイ溶液を受け入れることができ、前記アッセイ溶液が前記流体回路に流入すると、前記Ａ型試薬細胞およびＢ型試薬細胞が前記分析チャンバおよび前記捕捉フィールドに移動し、前記Ａ型細胞またはＢ型細胞の表面抗原とそれぞれの捕捉抗体との間に結合が起こり、それにより、前記Ａ型細胞およびＢ型細胞がそれぞれの捕捉フィールドに配置される、請求項４３または４４に記載の光バイオディスク。
【請求項４６】
電磁放射ビームが前記捕捉フィールドに照射されると、前記ビームからの反射信号により試薬細胞凝集の存在および程度が判定される、請求項４５に記載の光バイオディスク。
【請求項４７】
免疫血液学的試験のための光バイオディスクを製造する方法であって、
中心および外縁を有する基板を準備するステップ、
基板に関連する情報層に、前記ディスクの回転を制御するディスクドライブアセンブリにより読み取られ得る情報を符号化するステップ、
前記基板の前記中心に対して所定の位置に、前記基板に関連する捕捉フィールドを形成するステップ、
前記捕捉フィールド内に、１つまたは複数の捕捉剤を付着させるステップ、
前記捕捉フィールドに流体連通している分析チャンバを形成するステップ、
血液型を試験すべきサンプルを受け入れることができる、前記分析チャンバに関連する流入部位であって、サンプルが前記分析チャンバに入れられて前記ディスクが回転すると、サンプルが前記捕捉フィールドに移動して、サンプル中の検体と前記１つまたは複数の捕捉剤との間に結合が起こり、それにより前記捕捉フィールドに検体を配置させるための流入部位を設定するステップ、
を含む方法。
【請求項４８】
前記検体は、赤血球およびタイピングされた試薬細胞からなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記分析チャンバは、実質的に、前記基板の中心および外縁内の環状リングの弓状部分に沿って向けられている、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
請求項４９に従って製造される光バイオディスク。
【請求項５１】
請求項４９に従って製造される光ディスクを用いる方法であって、
血液サンプルから血清を精製すること、
血清を、任意の副次的な血液型の抗原を発現するタイピングされた試薬細胞および抗ヒトグロブリンと混合することにより、少なくとも１つのアッセイ溶液を作製すること、
前記捕捉フィールドに前記アッセイ溶液を送出するため、前記光バイオディスクの分析チャンバに前記アッセイ溶液をロードすること、
抗体−抗原結合および細胞凝集を可能にするのに十分な期間、血清中で前記タイピングされた試薬細胞をインキュベートすること、
前記細胞を前記捕捉フィールドの１つまたは複数の捕捉剤に結合させるため、前記捕捉フィールド上で前記サンプルをインキュベートすること、
前記捕捉フィールドに結合された前記タイピングされた試薬細胞から、未結合のタイピングされた細胞を分離するため、前記ディスクをスピンさせること、
光学式読み取り装置に前記ディスクを配置すること、
基板に対してほぼ垂直な軸を中心に前記ディスクを回転させること、
前記軸を中心に前記ディスクを回転させ、かつ前記軸に対して半径方向に電磁放射入射ビームを移動させることにより、該入射ビームで前記分析チャンバを走査すること、
前記ディスクと相互作用した後の前記入射ビームの少なくとも一部により形成される電磁放射反射ビームを検出すること、
前記反射ビームを出力信号に変換すること、および
凝集の存在および程度を判定し、それにより血液型抗体の存在を判定するため、前記出力信号を分析すること
を含む方法。
【請求項５２】
請求項４９に従って製造される光ディスクを用いる方法であって、
血液サンプルを分析チャンバに加えること、
捕捉領域の１つまたは複数の捕捉剤への前記血液サンプル中の赤血球の結合を可能にするのに十分な時間、前記分析チャンバにおいて前記血液サンプルをインキュベートすること、
光ディスク読み取り装置に前記ディスクを配置すること、
前記捕捉フィールドに結合した細胞から未結合細胞を分離するために、前記光ディスク読み取り装置を用いて、基板に対してほぼ垂直な軸を中心に所定の速度および時間で前記ディスクを回転させること、
前記軸を中心に前記ディスクを回転させ、かつ前記軸に対して半径方向に電磁放射入射ビームを移動させることにより、該入射ビームで前記分析チャンバを走査すること、
前記ディスクと相互作用した後の前記入射ビームの少なくとも一部により形成される電磁放射反射ビームを検出すること、
前記反射ビームを出力信号に変換すること、および
前記捕捉フィールドにある血液細胞の存在を判定し、それにより前記血液サンプルの血液型の存在を判定するため、前記出力信号を分析すること
を含む方法。
【請求項５３】
前記捕捉剤は、レクチン、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、およびオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項５１または５２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、診断アッセイおよび生物学的アッセイの分野と、生体サンプル中に存在する細胞型および抗体の同定、およびそれに関連する分析に関する。本発明はさらに、生物学的アッセイのための光学的に読み取り可能なディスクの製造および使用に関する。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０００年１１月１７日に出願された米国仮出願第６０／２４９，４７７号および２０００年１１月２２日に出願された米国仮出願第６０／２５２，７２６号からの優先権の利益を主張する、２００１年１１月１９日に出願された米国特許出願第０９／９８８，８５０号の一部継続出願である。
【０００３】
本出願は、２００２年１月２９日に出願された米国仮出願第６０／３５３，０１４号、２００２年１月３１日に出願された米国仮出願第６０／３５３，７７３号、２００２年４月２５日に出願された米国仮出願第６０／３７５，５６８号、および２００２年５月９日に出願された米国仮出願第６０／３７９，０４５号からの優先権の利益も主張する。上記出願はすべて、その内容のすべてが参照により本明細書に援用される。
【０００４】
［発明の背景］
医療診断アッセイは、疾患の診断および治療、ならびに良好な健康状態を一般的に維持するのに重要である。特に有用なのは、全血またはその成分に対して実施される生物学的および化学的アッセイである。当該分野における１つの初期の開発範囲は、輸血のための血液タイピングに関する。１９０１年に、Karl Landsteinerは、ある人間の血液に別の人間の血液を輸血すると、両者の血液の相違が、ショック、黄疸、および以前の輸血により生じた血液疾患である血色素尿症の原因となる可能性があることを発見した。Landsteinerは、人間の血液をＡ、Ｂ、およびＯの群に分類し、同じ血液型群の人間の間で輸血を行っても新たな血液細胞が破壊されないこと、およびある人物が異なる群に属する人物からの血液を輸血された場合にのみこの惨事が起こることを実証した。第４の主な血液型であるＡＢ型は、１９０２年にA. DecastrelloおよびA. Sturliにより発見された。
【０００５】
それ以来、種々の血液タイピングシステムが考案されてきた。歴史上、血液型分類システムの命名は無秩序であった。優性形質が大文字で示され、劣性形質が小文字で示されると規定する一般的な規則は従われていなかった。また、伝統的に、赤血球抗原はアルファベット表示で示されるか、または抗原産生細胞（producer）のファミリーにちなんで命名された。
【０００６】
国際輸血学会（ＩＳＢＴ）（National Blood Service/Lancaster, PO Box 111, Royal Lancaster Infirmary, Ashton Road, Lancaster LA1 4GT, England）は、赤血球血液型の用語の標準化を促進するために、番号方式の命名法を制定した。この規則は、各システムおよびコレクションを所定の数および文字の表示で示すこと、およびシステム内の各抗原に、発見順に順次番号を付けることを義務付けた。この文献には、２０を超える血液型システムおよび７つの抗原コレクションが規定されている。
【０００７】
ＡＢＯ血液タイピングシステムに関する抗原決定基の構造は、１９５０年代にWatkins およびMorgan（Nature 180:1038-1040, 1957）およびKabat et al.（Blood Group Substrates; Their Chemistry and Immuno-Chemistry, 1956, Academics Press, New York）に
より確立された。多くの血清および単離抗原が、ＡＢＯ式血液タイピングのために用いられている。例えば、「Human Monoclonal Antibody Against Group A Red Blood Cells」と題する、Foung et al. (1988)に付与された米国特許第４，７６４，４６５号は、Ａ型ヒト赤血球を直接凝集させるヒトモノクローナル抗体を対象としている。ここで例示された抗体は、ＩｇＭであり、雑種細胞株Ｓ−Ｈ２２およびＨＨＡ１により産生される。
【０００８】
より最近では、抗原決定基をコードする遺伝子も同定されている。例えば、ＡＢＯ組織血液型を規定する遺伝子および組織血液型ＡＢＯの状態を同定する方法を開示している「ABO Genotyping」と題する、Yamamoto et al. (1994)に付与された米国特許第５，３２６，８５７号を参照されたい。ここに記載されている方法は、ある血液型の状態に特有のＤＮＡ断片のＤＮＡプローブまたはサイズ分離の使用、ＤＮＡコンストラクト、組織血液のグリコシルトランスフェラーゼを提供する組換え方法、腫瘍抑制方法、精製された組織血液型のグリコシルトランスフェラーゼ、およびこのグリコシルトランスフェラーゼから産生された、タンパク質エピトープに結合する抗体を含む。
【０００９】
ＡＢＯ血液タイピング分析を実施するために、種々の装置が利用されている。例えば、「Portable Blood Typing Apparatus and Method」と題する、Goldfinger et al. (1987)に付与された米国特許第４，６５０，６６２号は、個体のＡＢＯ血液型およびＲｈ血液型の迅速な判定を可能にするポータブル装置と、かかる装置を用いる方法とを開示している。この装置は、個体から採取した血液を含む、連結された複数のマイクロチューブを有する。マイクロチューブのアセンブリは、使用中は、血液タイピング試薬を含む反応チャンバのアセンブリに接続される。この装置は、反応チャンバ内での試験反応を迅速に可視化させ、個体のＡＢＯ血液型およびＲｈ血液型を判定するために、実験室以外の場所で用いられることができる。
【００１０】
「Analyzer for the Determination of the Phenotype and the ABO Blood Group」と題される、Naldoni et al. (1994)に付与された米国特許第５，３２４，４７９号は、患者のＡＢＯ血液型の判定のための分析装置を開示している。この分析装置は、同心円周に沿って配置されたサンプル含有試験管および希釈試験管を保持する回転可能プレート；洗浄位置、サンプルを抜き取る位置、サンプルを希釈する位置、およびサンプルを読み取りウェル（reading well）に導入する位置の間を機械的手段により移動可能な分配針（dispensing needle）；１２個の反応ウェルが設けられたキャリア部材を、希釈済みまたは未希釈のサンプルを該分配針から受け取る位置に搬送するコンベヤユニット;該コンベヤユニットに沿って前進している際に、ウェルのそれぞれに小球（small balls）を供給する自動フィーダ；キャリア部材を読み取り領域に運ぶ機械的手段；特定の抗血清または赤血球をウェルのそれぞれに計量供給するユニット；ウェルのそれぞれの透過率を、抗血清または赤血球が導入される瞬間から開始して、水平に読み取る光学式読み取り装置；分析装置を機能的に制御して、分析結果の概算を出すプロセッサとを備える。
【００１１】
「Laboratory In A Disc」と題する米国特許第６，０３０，５８１号は、サンプル中にあると考えられる検体と結合する実質的に独立式のアッセイ手段を有する光ディスクを含む装置を開示している。「Apparatus and Method for Carrying Out Analysis of Samples」と題する米国特許第５，８９２，５７７号は、光透過ディスクにより支持された生物学的、化学的、生化学的サンプルの光学的検査を行うシステムおよび方法を記載している
【００１２】
「Measuring Method Using Whole Blood Sample」と題する米国特許第６，１４３，５１０号は、サンプル中の検体に結合する結合パートナーで被覆された磁気粒子とサンプルとを接触させることにより、未希釈の全血サンプル中の検体を定量的に測定する方法を記載している。このアッセイを光バイオディスクで行うことは記載されていない。さらに、「Quantitative Cell Analysis Methods Employing Magnetic Separation」と題する米国
特許第５，９９３，６６５号は、自動手段による分析が可能であるように、収集チャンバの規定領域に微視的エンティティを固定することを記載している。該’６６５号特許は、磁気的に標識した標的エンティティの定量的な収集を開示している。
【００１３】
医療診断の技術分野では、より効率的でより安価な診断技法が必要とされている。従来の方法およびシステムと比較して、本発明者らは、細胞およびその成分を画像化および分析するための、簡単で小型化された、超高感度で安価なシステムを開発した。このシステムは、光バイオディスクと、関連する検出アセンブリと、情報および信号処理方法およびソフトウェアとを用いる。
【００１４】
［発明の概要］
第１の態様では、本発明は、光バイオディスクでの直接タイピングにより個体の血液型を判定する方法を提供する。この方法は、１）赤血球細胞を、光バイオディスクの少なくとも１つのチャンバ、流路、マイクロ流体流路、またはマイクロ流路に加えること（チャンバの表面は、捕捉抗体を含む少なくとも１つの捕捉フィールドと、少なくとも１つの陽性対照フィールドと、少なくとも１つの陰性対照フィールドとを含む）、２）ディスク内のサンプルをインキュベートすること（それにより、抗原−抗体相互作用を促進させる）、３）第１の面上にディスクを支持する光学式読取装置にディスクを配置すること、４）第１の面に対してほぼ垂直な軸を中心にディスクを回転させること（それにより、チャンバ表面上にある捕捉された細胞から捕捉されていない細胞を分離する）、５）試験フィールド、陽性対照フィールド、および陰性対照フィールドの測定値を得ること、および６）試験フィールド、陽性対照フィールド、および陰性対照フィールドの測定値を分析すること（それにより個体の血液型を判定する）を含む。第１の態様のいくつかの実施形態では、捕捉抗体はＩｇＧ抗体であるか、または捕捉抗体はＩｇＭ抗体である。
【００１５】
第１の態様のいくつかの実施形態では、捕捉抗体は、赤血球抗原に特異的な抗体である。この実施形態のいくつかの実施形態では、赤血球抗原はＡＢＯ式血液型抗原であり、赤血球抗原はＲｈ式血液型抗原であり、赤血球抗原はＭＮＳ式血液型抗原であり、赤血球抗原はＰ式血液型抗原であり、赤血球抗原はルセラン式血液型抗原であり、赤血球抗原はケル式血液型抗原であり、赤血球抗原はルイス式血液型抗原であり、赤血球抗原はダフィ式血液型抗原であり、赤血球抗原はキッド式血液型抗原であり、赤血球抗原はフィッシャー式血液型抗原であるか、または赤血球抗原は任意の他の血液型からの血液型抗原である。
【００１６】
他のいくつかの実施形態では、光バイオディスクは反射型ディスクであるか、または光バイオディスクは透過型ディスクである。第１の態様の他の実施形態では、光バイオディスクは、ＣＤ、ＣＤ−Ｒ、ＤＶＤ、またはＤＶＤ−Ｒを含む。
【００１７】
この態様のいくつかの実施形態では、光バイオディスクには、ソフトウェアが記録されており、測定プロファイルの分析がソフトウェアにより制御され、個体の血液型を表示するバーコードとなる。
【００１８】
第１の態様のいくつかの実施形態では、捕捉抗体はビオチン化され、試験フィールドに結合したストレプトアビジンにより試験フィールドに結合されるか、または、捕捉抗体は試験フィールドに結合した第２の抗体により試験フィールドに結合されるか、または捕捉抗体は、ビオチン化され、かつ試験フィールドに結合したストレプトアビジンにより試験フィールドに結合される第２の抗体に結合する。
【００１９】
第１の態様の他の実施形態では、陽性対照フィールドは、その表面上に、全細胞と結合する分子を有する。この態様の実施形態では、分子はレクチンである。この態様の別の実施形態では、分子は金である。
【００２０】
第２の態様では、本発明は、光バイオディスクでの裏タイピングにより、個体の血液サンプル中のＡＢＯ血液型に対する抗体の存在を判定する方法を提供する。この方法は、１）血液サンプルから血清を精製すること、２）血清を既知のＡＢＯ血液型の細胞と混合することにより少なくとも１つのサンプルを作製すること、３）光バイオディスクの少なくとも１つの流路に少なくとも１つのサンプルを注入すること（それにより、細胞結合分子を含む捕捉フィールド上にサンプルを送出する）、４）捕捉フィールド上でサンプルをインキュベートすること（それにより細胞を細胞結合分子に結合させる）、５）第１の面上にディスクを支持する光学式読取装置にディスクを配置すること、６）第１の面にほぼ垂直な軸を中心にディスクを回転させること、７）第１の面に対してほぼ垂直な軸を中心にディスクを回転させ、かつこの軸に対して半径方向に電磁放射入射ビームを移動させることにより、この入射ビームでチャンバを走査すること、８）ディスクと相互作用した後の入射ビームの少なくとも一部により形成される電磁放射反射ビームを検出すること、８）反射ビームを出力信号に変換すること、９）出力信号を分析すること（それにより、捕捉フィールドに結合した凝集または非凝集細胞の存在を判定する）、および９）サンプル中の抗体の存在を判定することを含む。
【００２１】
第２の態様のいくつかの実施形態では、サンプル作製ステップは、２つのサンプルを作製することを含み、第１のサンプルはＡ１型細胞を利用し、第２のサンプルはＢ型細胞を利用する。第２の態様のいくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）はさらに、ＡＢ型細胞を用いてサンプルを作製することを含む。第２の態様のいくつかの実施形態では、細胞結合分子は抗ヒト免疫グロブリンである。第２の態様のいくつかの実施形態では、細胞結合分子はレクチンであるか、または細胞結合分子は金である。
【００２２】
本発明の第２の態様の別の実施形態では、サンプル作製ステップは、Ａ型およびＢ型試薬細胞を混合することを含み、それにより細胞混合物を生成させる。次に、血清または血漿サンプルが細胞混合物に添加される。得られる血清細胞混合物は、光バイオディスクのチャンバに添加され、血清中の抗体と試薬細胞は、十分に相互作用しうる所定温度で所定時間インキュベートされ、適当な抗体が血清サンプル中に存在する場合にはタイピングされた試薬細胞の凝集が起こる。光バイオディスクのチャンバは、「Ａ」抗原に特異的な抗体および「Ｂ」抗原に特異的な抗体を含む捕捉フィールドを含む。これらの特異的な抗体または細胞結合タンパク質は、ＩｇＧまたはＩｇＭであり得る。Ａ型試薬細胞は抗Ａ抗原捕捉フィールドに結合し、Ｂ型試薬細胞は抗Ｂ抗原捕捉フィールドに結合する。溶液中で未結合細胞をスピン除去した後、捕捉フィールドを分析し、次に、ソフトウェアを用いて、捕捉された細胞が凝集しているか単独であるかを判定し、それにより、Ａおよび／またはＢ抗原に対する抗体の存非を判定することができる。
【００２３】
第２の態様のいくつかの実施形態では、光バイオディスクは反射型ディスクであるか、または光バイオディスクは透過型（transmissive）ディスクである。第２の態様のいくつかの実施形態では、光バイオディスクは、ＣＤ、ＣＤ−Ｒ、ＤＶＤ−Ｒ、またはＤＶＤを含む。
【００２４】
第３の態様では、本発明は、光バイオディスク上での裏タイピングにより、個体の血液サンプル中のＡＢＯ血液型に対する抗体の存在を判定する方法を提供する。この方法は、１）少なくとも１つのマイクロフィルタ、少なくとも１つの混合チャンバ、および少なくとも１つの捕捉チャンバまたは分析チャンバを有する分離チャンバを含む光バイオディスクの、少なくとも１つのマイクロ流体流路または回路に、血液サンプルを添加すること、２）分離チャンバにおいて血液サンプルを細胞および血清に分離するため、第１の速度で第１の時間、光バイオディスクをスピンさせること、３）マイクロ流体流路または回路を通って混合チャンバに血清を移動させるため、第１の速度よりも速い第２の速度で、第２
の時間、光バイオディスクをスピンさせること、４）タイピングされた既知のＡＢＯ血液型の試薬細胞を、血清を含む混合チャンバに添加すること、５）一方向と別の方向とに交互に、少なくとも１回、第３の時間、光バイオディスクをスピンさせること（それにより、血清と細胞とを混合させる）、６）抗体−抗原結合を可能にするのに十分な期間、血清中で細胞をインキュベートすること、７）細胞と結合する分子を有する表面を含む捕捉チャンバに細胞を移動させるため、第２の速度よりも速い第３の速度で、第４の時間、光バイオディスクをスピンさせること、８）捕捉チャンバ内でサンプルをインキュベートすること（それにより、チャンバ表面への細胞の結合を促進させる）、９）捕捉フィールドから未結合細胞を除去するため、第５の時間、ディスクをスピンさせること、１０）第１の面に対してほぼ垂直な軸を中心にディスクを回転させ、かつこの軸に対して半径方向に電磁放射入射ビームを移動させることにより、この入射ビームでチャンバを走査すること、１１）ディスクと相互作用した後の入射ビームの少なくとも一部により形成される電磁放射反射ビームを検出すること、１２）反射ビームを出力信号に変換すること、１３）凝集細胞の存在を判定するため、出力信号を分析すること、および１３）サンプル中に、ある血液型に対する抗体が存在するかどうかを判定することを含む。
【００２５】
第３の態様のいくつかの実施形態では、第１の捕捉チャンバに接続された第１の混合チャンバ、および第２の捕捉チャンバに接続された第２の混合チャンバがある。第３の態様のいくつかの実施形態では、Ａ１型細胞が第１の混合チャンバに入れられ、Ｂ型細胞が第２の混合チャンバに入れられる。この実施形態のいくつかの形態では、第３の捕捉チャンバに接続された第３の混合チャンバを含み、ＡＢ細胞が第３の混合チャンバに添加される。
【００２６】
本発明の第３の態様の別の実施形態では、Ａ１型およびＢ型細胞が混合されて細胞混合物が生成される。次に、細胞混合物は、血清または血漿を含む混合チャンバに添加されてインキュベートされ、それぞれの抗体が血清サンプル中に存在する場合には、任意のタイピングされた試薬細胞を凝集させる。光バイオディスクの混合チャンバは、Ａ抗原およびＢ抗原に特異的な抗体を含んだ捕捉フィールドを含む分析チャンバと、流体連通している。これらの特異的抗体または細胞結合タンパク質は、ＩｇＧまたはＩｇＭであり得る。ディスクが回転すると、混合チャンバ内の細胞は分析チャンバに移動し、分析チャンバにおいて細胞はそれぞれの捕捉フィールドに捕捉される。溶液中の未結合細胞をスピンにより除去した後、捕捉フィールドが分析され、次にソフトウェアを用いて、捕捉された細胞が凝集しているか単独であるかを判定し、それによりＡおよび／またはＢ抗原に対する抗体が存在するかどうかを判定することができる。
【００２７】
第３の態様のいくつかの実施形態では、細胞結合分子は抗ヒト免疫グロブリンであり、細胞結合分子はレクチンであり、または細胞結合分子は金である。第３の態様のいくつかの実施形態では、光バイオディスクは反射型ディスクであるか、または光バイオディスクは透過型ディスクである。第３の態様のいくつかの実施形態では、光バイオディスクは、ＣＤ、ＤＶＤ、ＣＤ−Ｒ、またはＤＶＤ−Ｒを含む。第３の態様のいくつかの実施形態では、第１の速度は約１Ｘ〜約３Ｘであり、第２の速度は３Ｘよりも速いが約５Ｘ未満であり、第３の速度は約５Ｘよりも速い（１Ｘとは、速度に関するオーディオ規格（audio standard for speed）を指す）。
【００２８】
本発明の第４の態様では、バイオマトリックスを用いた直接的および間接的な血液タイピング、および血清または血漿抗体検出を含む、免疫血液学アッセイを行う方法が提供される。バイオマトリックスは、限定はされないが、ポリアクリルアミドゲル、アガロース、ポリデキストランを含む架橋分子構造、および微小球（デキストランアクリルアミド（Dextran acrylamide）球体、ポリスチレン微小球、およびガラスビーズなど）から形成され得る。架橋分子構造または微小球は、光バイオディスクのマイクロ流路に充填されるか
または形成され、バイオマトリックスは、その孔径が単独の細胞を通過させるほど十分に大きく、凝集細胞を遅滞させて保持するほど十分に小さいように形成されることができる。流路には、所望の反応を実施するのに必要な、緩衝液、特異的抗体、および／または抗ヒトグロブリンを含むアッセイ溶液が充填され得る。光バイオディスクのバイオマトリックスの作製およびアッセイ溶液の調製は、例えば、１９９６年４月３０日にLapierre, et
al.に付与された「Method Detecting Antigens and/or Antibodies」と題する米国特許第５，５１２，４３２号に記載されるように準備および使用されることができ、当該特許はその内容のすべてが参照により本明細書に援用される。本発明の第４の態様は、米国特許第５，５１２，４３２号に記載されるものを含む、現在用いられているゲル試験法のための改良型プラットフォームを提供する。現在主に用いられているゲル試験法とは、１９８０年代初期にLapierreおよび共同者により開発されたものである（Lapierre, Y., et al., The Gel Test: A New Way to Detect Red Cell Antigen-Antibody Reactions, Transfusion (1990); 30:109）。
【００２９】
本発明の血液タイピング法の特徴的な態様の１つは、小さいチャンバ内で細胞間の凝集度を定量化できることである。後述する図３７Ａ、図３７Ｂ、および図３７Ｃにおいて説明するように、遠心分離時に、単独の細胞はマトリックス物質を通過して流体回路または分析チャンバの底部でペレット化されるが、凝集細胞はマトリックス物質の上方に完全に完全に遅滞させられるか（強反応）、マトリックス物質中に分散（弱反応）される。
【００３０】
凝集度の定量化は、目視検査により、またはレーザ走査機構により個々の光ディスクチャンバで実行される。この定量化は、表および裏の両方の血液タイピングアッセイ、ならびに血清または血漿抗体検出および試験をサポートする。光バイオディスクを用いてこの方法を実施する主な利点は、以前は必要とされていた時間のかかる洗浄ステップを不要とし、光ディスク読み取り装置およびそれに付属するソフトウェアを用いたアッセイの分析の自動化が可能になることである。
【００３１】
本発明の第４の態様の利点の１つは、マトリックスベースの方法を多チャンバ光バイオディスクに変えることにより、表血液タイピングおよび裏血液タイピング、血清または血漿抗体検出および試験、および他の免疫血液学アッセイを、１つの好適な多チャンババイオディスクで行うことができることである。これ自体が、例えば血液バンクおよび輸血の使用分野において、複数のサンプルのスクリーニングおよび血清抗体パネル試験の効率を高める。さらに、光バイオディスクドライブの画像化機能を利用することにより、より高い精度で凝集度を判定することができる。この機能は、非常に弱い陽性反応を検出する際に大きい価値がある。このような光バイオディスクドライブは、例えば、２００２年１月１０日に出願された「Optical Disc Analysis System Including Related Methods for Biological and Medical Imaging」と題する米国特許出願第１０／０４３，６８８号に記載されており、この出願はその内容のすべてが参照により本明細書に援用される。
【００３２】
第５の態様では、本発明は、光バイオディスクでの抗体タイピングにより個体の血液型に対する抗体の存在を判定する方法を提供する。この方法は、１）血液サンプルから血清を精製すること、２）血清を既知の血液型群表現型の細胞またはタイピングされた試薬細胞と混合することにより、少なくとも１つのサンプルを作成すること、３）光バイオディスクの少なくとも１つの流路に少なくとも１つのサンプルを注入すること（それにより、細胞結合分子を含む捕捉フィールド上にサンプルを送出する）、４）捕捉フィールド上でサンプルをインキュベートすること（それにより細胞を細胞結合分子に結合させる）、５）ディスクを支持する光学式読取装置の第１の面上にディスクを配置すること、６）第１の面に対してほぼ垂直な軸を中心にディスクを回転させること、７）第１の面に対してほぼ垂直な軸を中心にディスクを回転させ、かつこの軸に対して半径方向に電磁放射入射ビームを移動させることにより、この入射ビームでチャンバを走査すること、８）ディスク
と相互作用した後の入射ビームの少なくとも一部により形成される電磁放射反射ビームを検出すること、９）反射ビームを出力信号に変換すること、１０）捕捉フィールドに結合した細胞の存在を判定するため、出力信号を分析すること、および１１）血液型抗体の存在を判定することを含む。
【００３３】
第５の態様のいくつかの実施形態では、細胞結合分子はヒト免疫グロブリンである。この態様の他の実施形態では、光バイオディスクは反射型および／または透過型ディスクである。この態様のいくつかの実施形態では、光バイオディスクは、ＣＤ、ＤＶＤ、ＣＤ−Ｒ、またはＤＶＤ−Ｒである。
【００３４】
第５の態様のいくつかの実施形態では、添加される細胞は、以下の：ＡＢＯ式血液型細胞表現型、Ｒｈ式血液型細胞表現型、ＭＮＳ式血液型細胞表現型、Ｐ式血液型細胞表現型、ルセラン式血液型細胞表現型、ケル式血液型細胞表現型、ルイス式血液型細胞表現型、ダフィ式血液型細胞表現型、キッド式血液型細胞表現型、フィッシャー式血液型抗原、または任意の他の群からの赤血球型抗原の少なくとも１つを有することを特徴とする。
【００３５】
第６の態様では、本発明は、光バイオディスクでの抗体タイピングにより個体の血液型に対する抗体の存在を判定する方法を提供する。この方法は、１）少なくとも１つのマイクロフィルタ、少なくとも１つの混合チャンバ、および少なくとも１つの捕捉チャンバを有する分離チャンバを含む光バイオディスクの、少なくとも１つのマイクロ流体流路に、血液サンプルを加えること、２）分離チャンバにおいて血液サンプルを細胞および血清に分離するため、第１の速度で第１の時間、光バイオディスクをスピンさせること、３）血清を、マイクロ流体流路を通して混合チャンバに移動させるため、第１の速度よりも速い第２の速度で、第２の時間、光バイオディスクをスピンさせること、４）既知の血液型細胞表現型の細胞を、血清を含む混合チャンバに添加すること、５）一方向と別の方向とに交互に、少なくとも１回、第３の時間、光バイオディスクをスピンさせること（それにより血清と細胞とを混合させる）、６）抗体−抗原結合を可能にするのに十分な期間、血清中で細胞をインキュベートすること、７）抗ヒト免疫グロブリン分子を有する表面を含む捕捉チャンバに細胞を移動させるため、第２の速度よりも速い第３の速度で、第４の時間、光バイオディスクをスピンさせること、８）捕捉チャンバ内でサンプルをインキュベートすること（それにより、チャンバ表面への細胞の結合を促進させる）、９）未結合細胞を除去するため、第５の時間、ディスクをスピンさせること、１０）第１の面に対してほぼ垂直な軸を中心にディスクを回転させ、かつこの軸に対して半径方向に電磁放射入射ビームを移動させることにより、この入射ビームでチャンバを走査すること、１１）ディスクと相互作用した後の入射ビームの少なくとも一部により形成される電磁放射反射ビームを検出すること、１２）反射ビームを出力信号に変換すること、１３）細胞が結合しているか否かを判定するため、出力信号を分析すること、および１４）サンプル中の血液型抗体の存在を判定することを含む。
【００３６】
この態様のいくつかの実施形態では、細胞結合分子はレクチンであるか、または細胞結合分子は金である。第５の態様の他のいくつかの実施形態では、光バイオディスクは反射型ディスクであり、光バイオディスクは透過型ディスクである。この実施形態のいくつかの実施形態では、第１の速度は約１Ｘ〜約３Ｘであり、第２の速度は３Ｘよりも速いが約５Ｘ未満であり、第３の速度は約５Ｘよりも速い。
【００３７】
第６の態様のいくつかの実施形態では、添加される細胞は、以下の：ＡＢＯ式血液型細胞表現型、Ｒｈ式血液型細胞表現型、ＭＮＳ式血液型細胞表現型、Ｐ式血液型細胞表現型、ルセラン式血液型細胞表現型、ケル式血液型細胞表現型、ルイス式血液型細胞表現型、ダフィ式血液型細胞表現型、キッド式血液型細胞表現型、フィッシャー式血液型抗原、または任意の他の群からの赤血球型抗原の少なくとも１つを有することを特徴とする。
【００３８】
第７の態様では、本発明は、個体の血液型を判定する装置を提供する。この装置は、第１の捕捉抗体を含む層および第１の捕捉抗体により結合される第２の捕捉抗体を含む層を含み、ここで第２の捕捉抗体はある血液型抗原に特異的である、少なくとも１つの捕捉チャンバ；ディスクドライブアセンブリ；光学式読み取り装置；血液型分析のためのソフトウェアを含む。
【００３９】
第７の態様のいくつかの実施形態では、捕捉抗体は抗ＩｇＧ抗体であるか、または捕捉抗体は抗ＩｇＭ抗体である。第６の態様のいくつかの実施形態では、捕捉抗体は赤血球抗原に特異的な抗体である。後者の実施形態のいくつかの実施形態では、赤血球抗原はＡＢＯ式血液型抗原であるか、赤血球抗原はＲｈ式血液型抗原であるか、赤血球抗原はＭＮＳ式血液型抗原であるか、赤血球抗原はＰ式血液型抗原であるか、赤血球抗原はルセラン式血液型抗原であるか、赤血球抗原はケル式血液型抗原であるか、赤血球抗原はルイス式血液型抗原であるか、赤血球抗原はダフィ式血液型抗原であるか、赤血球抗原はキッド式血液型抗原であるか、赤血球抗原はフィッシャー式血液型抗原であるか、または任意の他の群からの赤血球型抗原である。第６の態様のいくつかの実施形態では、光バイオディスクは反射型ディスクであるか、または光バイオディスクは透過型ディスクであるか、または光バイオディスクはＣＤまたはＤＶＤを含む。
【００４０】
第８の態様では、本発明は、免疫血液学アッセイを行う光バイオディスクを提供する。バイオディスクは、基板；基板に関連し、かつ第１の注入ポートを含む分離チャンバ；分離チャンバに関連するフィルタ手段；分離チャンバに流体連通しており、かつ第２の注入ポートを含む第１の混合チャンバ；分離チャンバに流体連通しており、かつ第３の注入ポートを含む第２の混合チャンバ；第１の混合チャンバと流体連通しており、捕捉フィールドを含む第１の分析または検出チャンバ；第２の混合チャンバと流体連通しており、かつ捕捉フィールドを含む第２の分析または検出チャンバを含む。第８の態様のいくつかの実施形態では、光バイオディスクは、混合チャンバにつながる第２の注入ポートを有さない（例えば、第２の注入ポートがあれば第２の注入ポートを介して送出されるべき物質は、凍結乾燥形態または他の形態で混合チャンバに予め供給される）。
【００４１】
第８の態様のいくつかの実施形態では、血液サンプルが注入ポートを通して分離チャンバに送られ、ディスクが第１の速度で回転すると、フィルタ手段が、白血球、赤血球、および血小板を血液サンプルから分離させ、血清サンプルを提供する。さらなる実施形態では、ディスクが第２の速度で回転すると、血清サンプルが第１および第２の混合チャンバに送られる。別の実施形態では、第１の混合チャンバの注入ポートを用いて、第１の型の細胞が第１の混合チャンバに送られ、第２の混合チャンバの注入ポートを用いて、第２の型の細胞が第２の混合チャンバに送られる。他のいくつかの実施形態では、ディスクが第３の速度で回転すると、血清と第１の型の細胞との混合物が第１の分析または検出チャンバに送られ、血清と第２の型の細胞との混合物が第２の分析または検出チャンバに送られる。
【００４２】
第８の態様のいくつかの実施形態は、第１の混合チャンバにおいて第１の型の細胞を血清と混合し、第２の混合チャンバにおいて第２の型の細胞を血清と混合するための、所定の様式のディスク回転を提供する。いくつかの実施形態では、ディスクを回転させる所定の様式とは、ディスクを一方向に、次に逆方向に交互に回転させることであって、それにより、血清と細胞との混合を促進する攪拌作用を生じさせることを含む。
【００４３】
第８のいくつかの実施形態では、第１の分析または検出チャンバの捕捉フィールドは、親和性を有する特異的細胞を捕捉する第１のタイプの捕捉剤を含む。他のいくつかの実施形態では、第２の分析または検出チャンバの捕捉フィールドは、親和性を有する特異的細
胞を捕捉する第２のタイプの捕捉剤を含む。
【００４４】
第８の態様のいくつかの実施形態では、放射エネルギー入射ビームが第１の分析または検出チャンバに送られて、細胞が第１のタイプの捕捉剤により捕捉されたか否かが判定される。他の実施形態では、放射エネルギー入射ビームが第２の分析または検出チャンバに送られて、細胞が第２のタイプの捕捉剤により捕捉されたか否かが判定される。
【００４５】
第８の態様のいくつかの実施形態では、第１のタイプの捕捉剤は、細胞に結合する抗体または赤血球表面上の分子と結合する非細胞特異的分子に対して、親和性を有する抗ヒト免疫グロブリンである。第８の態様のいくつかの実施形態では、第２のタイプの捕捉剤は、細胞に結合する抗体または赤血球表面上の分子と結合する非細胞特異的分子に対して、親和性を有する抗ヒト免疫グロブリンである。
【００４６】
第８の態様のいくつかの実施形態では、分離チャンバ；第１および第２の混合チャンバ；第１および第２の分析または検出チャンバが基板に形成される。第７の態様の他のいくつかの実施形態では、分離チャンバ；第１および第２の混合チャンバ；第１および第２の分析または検出チャンバが基板に接着されたキャップに形成される。第８の態様のさらに他のいくつかの実施形態では、分離チャンバ；第１および第２の混合チャンバ；第１および第２の分析または検出チャンバがキャップ部と基板との間に接着された流路層に形成される。第７の態様のいくつかの実施形態では、分離チャンバ；第１および第２の混合チャンバ；第１および第２の分析または検出チャンバがキャップ部に部分的に形成され、かつ基板に部分的に形成され、キャップ部および基板は、位置合わせされて共に接着され、それによりチャンバを完全に形成する。
【００４７】
第８の態様のいくつかの実施形態では、光バイオディスクはさらに、ディスクドライブにより読み取り可能な情報層に符号化された情報を含む。第８の態様のいくつかの実施形態では、符号化情報は、規定の様式でディスクを回転させるために用いられる。第８の態様のいくつかの実施形態では、情報層は反射型である。この態様のさらに他の実施形態では、情報層は半反射型である。
【００４８】
第９の態様では、本発明は、免疫血液学アッセイを行うための光バイオディスクを提供する。バイオディスクは、基板；基板に関連し、かつ第１の注入ポートを含む分離チャンバ；分離チャンバに関連するフィルタ手段；分離チャンバに流体連通しており、かつ第２の注入ポートを含む第１の混合チャンバ；分離チャンバに流体連通しており、かつ第３の注入ポートを含む第２の混合チャンバ；第１の混合チャンバと流体連通しており、バイオマトリックスを含む第１の分析または検出チャンバ；第２の混合チャンバと流体連通しており、バイオマトリックスを含む第２の分析または検出チャンバを含む。第９の態様のいくつかの実施形態では、光バイオディスクは、混合チャンバにつながる第２の注入ポートを含まない（例えば、第２の注入ポートがあれば第２の注入ポートを介して送出されるべき物質は、凍結乾燥形態または他の形態で混合チャンバに予め供給される）。
【００４９】
第９の態様のいくつかの実施形態では、血液サンプルが注入ポートを通して分離チャンバに送られ、ディスクが第１の速度で回転すると、フィルタ手段が、白血球、赤血球、および血小板を血液サンプルから分離させ、血清サンプルを提供する。さらなる実施形態では、ディスクが第２の速度で回転すると、血清サンプルが第１および第２の混合チャンバに送られる。別の実施形態では、第１の混合チャンバの注入ポートを用いて、第１の型の細胞が第１の混合チャンバに送られ、第２の混合チャンバの注入ポートを用いて、第２の型の細胞が第２の混合チャンバに送られる。他のいくつかの実施形態では、ディスクが第３の速度で回転すると、血清と第１の型の細胞との混合物が第１の分析または検出チャンバに送られ、血清と第２の型の細胞との混合物が第２の分析または検出チャンバに送られ
る。
【００５０】
第９の態様のいくつかの実施形態は、第１の混合チャンバにおいて第１の型の細胞を血清と混合し、第２の混合チャンバにおいて第２の型の細胞を血清と混合するための、所定の様式のディスク回転を提供する。いくつかの実施形態では、ディスクを回転させる所定の様式とは、ディスクを一方向に、次に逆方向に交互に回転させることであって、それにより、血清と細胞との混合を促進する攪拌作用を生じさせることを含む。
【００５１】
第９の態様のいくつかの実施形態では、放射エネルギー入射ビームが第１の分析または検出チャンバに送られて、第１の分析または検出チャンバ内の細胞の部位および凝集量が判定される。他の実施形態では、放射エネルギー入射ビームが第２の分析または検出チャンバに送られて、第２の分析または検出チャンバ内の細胞の部位および凝集量が判定される。
【００５２】
第９の態様のいくつかの実施形態では、第１および第２の分析または検出チャンバは、細胞に結合する抗体または赤血球表面上の分子と結合する非細胞特異的分子に対して,
親和性を有する抗ヒト免疫グロブリンを含んでいてもよい。
【００５３】
第９の態様のいくつかの実施形態では、分離チャンバ；第１および第２の混合チャンバ;第１および第２の分析または検出チャンバが基板に形成される。第７の態様の他のいくつかの実施形態では、分離チャンバ；第１および第２の混合チャンバ；第１および第２の分析または検出チャンバが基板に接着されたキャップに形成される。第９の態様のさらに他のいくつかの実施形態では、分離チャンバ；第１および第２の混合チャンバ；第１および第２の分析または検出チャンバがキャップ部と基板との間に接着された流路層に形成される。第９の態様のいくつかの実施形態では、分離チャンバ；第１および第２の混合チャンバ；第１および第２の分析または検出チャンバがキャップ部に部分的に形成され、基板に部分的に形成され、キャップ部および基板は、位置合わせされて共に接着され、それによりチャンバが完全に形成される。
【００５４】
第９の態様のいくつかの実施形態では、光バイオディスクはさらに、ディスクドライブにより読み取り可能な情報層に符号化された情報を含む。第９の態様のいくつかの実施形態では、符号化情報は、規定の様式でディスクを回転させるために用いられる。第９の態様のいくつかの実施形態では、情報層は反射型である。この態様のさらに他の実施形態では、情報層は半反射型である。
【００５５】
第１０の態様では、本発明は、ディスクを製造する方法を提供する。この方法は、ディスクの基板上に符号化情報層を設けること；標的区域を形成すること；標的区域に捕捉層を設けること；および少なくとも１つの捕捉剤を付着させることを含む。いくつかの実施形態では、符号化情報層は反射層であり、標的区域は反射層からエッチングされた領域である。いくつかの実施形態では、符号化情報層は部分反射層または部分透過層であり、標的区域は情報層に隣接する領域である。
【００５６】
第１１の態様では、本発明は、ディスクを製造する方法を提供する。この方法は、ディスクの基板上に符号化情報層を設けること；カバーディスクを設けること；カバーディスクと基板との間に流体回路を形成すること；および前記流体回路内に所定の孔径を有するバイオマトリックスを形成することを含む。いくつかの実施形態では、符号化情報層は反射層であり、標的区域は反射層からエッチングされた領域である。いくつかの実施形態では、符号化情報層は部分反射層または部分透過層であり、標的区域は情報層に隣接する領域である。
【００５７】
本発明の上述のおよび多くの他の特徴および利点は、以下の詳細な説明を添付図面の図および実験例と共に参照することにより、より良く理解される。
【００５８】
本発明のさらに別の目的は、当該目的に寄与する別の特徴および当該目的から生じる利点と共に、以下の本発明の好ましい実施形態の説明から明らかになる。この好ましい実施形態は、添付図面に示される。添付図面では、全体を通して、同じ参照番号は同じ構成要素を示す。
【００５９】
［発明の詳細な説明］
本明細書で引用される特許および出願は、当該技術分野の知識レベルを反映しており、したがってその内容のすべてが参照により本明細書に援用される。これら参考文献と本明細書の教示の間に矛盾がある場合、そのような矛盾点に関しては本明細書の教示が優先するものとする。
【００６０】
本明細書に記載された発明は、光バイオディスクに応用された細胞捕捉および／または細胞分離技術に基づいた診断アッセイと、それに関連する方法および組成物とを提供する。
【００６１】
ドライブシステムおよび関連したディスク
図１は、本明細書で開示される細胞計数および分画細胞計数（difference cell counts）を行うために実施される本発明による光バイオディスク１１０の斜視図である。該光バイオディスク１１０が、光ディスクドライブ１１２および表示モニタ１１４と共に示されている。このタイプのディスクドライブおよびディスク分析システムに関するさらなる詳細は、本発明の譲受人に譲渡されて同時係属中である、２００１年１１月９日に出願された「Disc Drive System and Methods for Use with Bio-discs」と題する米国特許出願第１０／００８，１５６号および２００２年１月１０日に出願された「Optical Disc Analysis System Including Related Methods For Biological and Medical Imaging」と題する米国特許出願第１０／０４３，６８８号に開示されている。これらの両出願は、参照により本明細書に援用される。
【００６２】
図２は、光バイオディスク１１０の一実施形態の主要な構造要素の分解斜視図である。図２は、本発明で使用することができる反射領域の光バイオディスク１１０（以下「反射型ディスク」という）の例である。主要な構造要素には、キャップ部１１６、接着部材または流路層１１８、基板１２０が含まれる。キャップ部１１６は、１つまたは複数の注入ポート１２２および１つまたは複数の排出ポート１２４を備える。キャップ部１１６は、ポリカーボネートから形成することができ、図２の斜視図から見られるように、その底部は、反射面１４６（図４）で被覆されていることが好ましい。好ましい実施形態では、トリガ（trigger）マークまたはトリガマーキング１２６が、反射層１４２（図４）の表面上に備えられる。トリガマーキング１２６には、バイオディスクの３つの層すべての透明窓、不透明区域、または反射区域もしくは半反射区域が含まれ得る。これらの透明窓、不透明区域、または反射区域もしくは半反射区域は、情報により符号化されている。この情報は、図１０に示すように、プロセッサ１６６にデータを送信し、次に、図６および図１０に示すように、呼びかけビームまたは入射ビーム１５２の操作機能とやり取りを行う。
【００６３】
図２に示す第２の要素は、流体回路１２８、すなわちＵ字型流路が形成された接着部材または流路層１１８である。この流体回路１２８は、膜に刻印するか、または、膜を切り取ってプラスチック薄膜を除去し、図示するような形状を形成することにより形成される。流体回路１２８のそれぞれは、フロー流路１３０および帰還流路１３２を備える。図２に示す流体回路１２８のいくつかは、混合チャンバ１３４を備える。２つの異なる型の混合チャンバ１３４が示されている。第１のものは、フロー流路１３０に対して対称に形成
される対称混合チャンバ１３６である。第２のものは、オフセット混合チャンバ１３８である。このオフセット混合チャンバ１３８は、図示するように、フロー流路１３０の一方の側に形成される。
【００６４】
図２に示す第３の要素は、標的フィールドまたは捕捉フィールド１４０を備えた基板１２０である。基板１２０は、ポリカーボネート製であることが好ましく、図４に示すように、その最上部には反射層１４２が堆積（deposited）されている。標的領域１４０は、図示した形状、あるいは、任意の所望の形状に反射層１４２を除去することにより形成される。あるいは、標的領域１４０は、反射層１４２を形成する前に、標的領域１４０区域をマスクすることを含むマスク技法によって形成することもできる。反射層１４２は、例えばアルミニウムまたは金といった金属から形成することができる。
【００６５】
図３は、図２に示す光バイオディスク１１０の平面図であり、ディスク内に位置する流体回路、標的領域１４０、およびトリガマーキング１２６が見えるように、反射層１４２が、透明に示されたキャップ部１１６上に示されている。
【００６６】
図４は、本発明の一実施形態による反射領域型の光バイオディスク１１０の拡大斜視図である。この図は、光バイオディスク１１０のさまざまな層の一部を含み、この一部は、それぞれの主要な層、基板、コーティング、または膜の部分断面図を示すために切り取られている。図４は、反射層１４２で被覆された基板１２０を示す。反射層１４２上には、活性層１４４が形成される。好ましい実施形態では、活性層１４４は、ポリスチレンから形成することができる。あるいは、ポリカーボネート、金、活性ガラス（activated glass）、変性ガラス（modified glass）、または変性ポリスチレン、例えばポリスチレン無水マレイン酸（polystyrene-co-maleic anhydride）を使用することができる。さらに、ヒドロゲルを使用することもできる。あるいは、この実施形態に示されるように、活性層１４４上に、プラスチック接着部材１１８が施される。プラスチック接着部材１１８の露出部分は、Ｕ字型に切り取られているか、刻印されており、このＵ字型が流体回路１２８を生成する。本バイオディスクのこの反射領域の実施形態の最後の主要な構造上の層は、キャップ部１１６である。キャップ部１１６は、その底部に反射面１４６を備える。反射面１４６は、アルミニウムまたは金といった金属から作製することができる。
【００６７】
次に図５を参照して、本発明の透過型の光バイオディスク１１０の主要な構造要素の分解斜視図を示す。この透過型の光バイオディスク１１０の主要な構造要素も、同様に、キャップ部１１６、接着部材または流路部材１１８、基板１２０の層を備える。キャップ部１１６は、１つまたは複数の注入ポート１２２および１つまたは複数の排出ポート１２４を備える。キャップ部１１６は、ポリカーボネート層から形成することができる。図６および図９に最もよく示されるように、オプションのトリガマーキング１２６を、半反射薄層１４３の表面に備えることができる。トリガマーキング１２６には、バイオディスクの３つの層すべての透明窓、不透明区域、または反射区域もしくは半反射区域が含まれ得る。これらの透明窓、不透明区域、または反射区域もしくは半反射区域は、情報により符号化される。この情報は、図１０に示されるように、プロセッサ１６６にデータを送信し、次に、図６および図１０に示すように、呼びかけビーム１５２の操作機能とやり取りを行う。
【００６８】
図５に示される第２の要素は、流体回路１２８すなわちＵ字型流路が形成された接着部材または流路層１１８である。この流体回路１２８は、膜に刻印するか、または、膜を切り取ってプラスチック薄膜を除去し、図示するような形状を形成することにより形成される。流体回路１２８のそれぞれは、フロー流路１３０および帰還流路１３２を備える。図５に示される流体回路１２８のいくつかは、混合チャンバ１３４を備える。２つの異なる型の混合チャンバ１３４が示されている。第１のものは、フロー流路１３０に対して対称
に形成される対称混合チャンバ１３６である。第２のものは、オフセット混合チャンバ１３８である。このオフセット混合チャンバ１３８は、図示するように、フロー流路１３０の一方の側に形成される。
【００６９】
図５に示される第３の要素は、標的フィールドまたは捕捉フィールド１４０を備えることができる基板１２０である。基板１２０は、ポリカーボネート製であることが好ましく、図６に示されるように、その最上部には半反射薄層１４３が形成されている。図５および図６に示されるディスク１１０の基板１２０に関連した半反射層１４３は、図２、図３、および図４に示される反射型ディスク１１０の基板１２０上の反射層１４２よりも、有意に薄くなっている。この半反射薄層１４３により、呼びかけビーム１５２の一部は、図６および図１２に示されるように、透過型ディスクの構造上の層を透過することができる。半反射薄層１４３は、例えばアルミニウムまたは金といった金属から形成することができる。
【００７０】
図６は、図５に示す光バイオディスク１１０の透過型の実施形態の基板１２０および半反射層１４３の拡大斜視図である。半反射薄層１４３は、例えばアルミニウムまたは金といった金属から作製することができる。好ましい実施形態では、図５および図６に示される透過型ディスクの半反射薄層１４３は、約１０〜３００Åの厚さであり、４００Åを越えない。この半反射薄層１４３により、入射ビームまたは呼びかけビーム１５２の一部は、半反射層１４３を貫通して通過することが可能になり、それによって、図１０および図１２に示す上部検出器１５８によって検出される。一方、その光の一部は反射されて、すなわち入射経路に沿って戻される。以下に示す表１は、膜厚に対する金の薄膜の反射特性および透過特性を示している。金の薄膜層は、８００Åよりも厚くなると、完全反射となる。一方、光が金の薄膜を透過する閾値不透明度（threshold density）は、約４００Åである。
【００７１】
表１に加えて、図７は、金の厚さに基づく半反射薄層１４３の反射特性および透過特性の逆関係をグラフで表示する。図７に示されるグラフで使用される反射値および透過値は、絶対値である。
【００７２】
【表１】
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【００７３】
次に図８を参照して、図５および図６に示される透過型光バイオディスク１１０の平面図を示す。キャップ部１１６を透明に示すことで、ディスク内に位置する流体流路、トリガマーキング１２６、および標的領域１４０が示されている。
【００７４】
図９は、本発明の透過型ディスクの実施形態による光バイオディスク１１０の拡大斜視図である。このディスク１１０は、そのさまざまな層の一部が、それぞれの主要な層、基板、コーティング、または膜の部分断面図を示すために切り取られて示されている。図９は、透明なキャップ部１１６、基板１２０上の半反射薄層１４３、トリガマーキング１２６を有する透過型ディスクフォーマットを示している。この実施形態では、トリガマーキング１２６は、キャップの上部に配置された不透明材を備える。あるいは、トリガマーキング１２６は、ディスクの反射薄層１４３にエッチングされた透明な非反射窓、または、図１０に示されるトリガ検出器１６０からの信号を吸収する（すなわち反射しない）任意のマークによって形成することができる。また、図９は、図示した形状、あるいは、任意の所望の形状で、指定した区域をマーキングすることにより形成される標的領域１４０も示している。標的領域１４０を示すマーキングは、基板１２０上の半反射薄層１４３または（ディスクの下の）基板１２０の底部に作製することができる。あるいは、標的領域１４０は、標的領域１４０を除く半反射薄層１４３全体をマスクすることを含むマスク技法によって、形成することもできる。この実施形態では、標的領域１４０は、半反射薄層１４３上のシルクスクリーンインクによって作製することができる。図５、図８、および図９に示す透過型ディスクフォーマットでは、別の方法として、標的領域１４０を、ディスクに符号化されたアドレス情報によって規定することができる。この実施形態では、標的領域１４０は、物理的に識別可能な境界を含まない。
【００７５】
基板層には、ディスクの最も内側の読み取り可能部分から、ディスクの最も外側の読み取り可能部分まで螺旋状になっている螺旋状トラックを刻むことができる。記録不可能のＣＤでは、このトラックは種々の長さの一連のエンボスピットでできており、各エンボスピットは通常、ディスクを読み取るために用いられる光の波長の約１／４の深さを有する
。ピット間の異なる長さおよび間隔が、動作データを符号化する。記録可能なＣＤのようなディスクの螺旋溝は、ピットではなく検出可能な染料を有する。これは、回転速度などの動作情報が記録される部位である。試験、アッセイ、または検査プロトコルに応じて、介在的または連続的な加速、定速、および減速期間を設けることで、回転速度を可変にすることができる。この期間は、例えば、薬剤、試薬、抗体、またはその他の物質と流体および懸濁液を混合、攪拌、または分離するために、回転速度および回転時間の双方に関して厳密に制御することができる。
【００７６】
さらに図９を参照して、半反射薄層１４３上に形成された活性層１４４を説明する。好ましい実施形態では、活性層１４４は、２％のポリスチレンからなる４０〜２００μｍの厚さの層である。あるいは、ポリカーボネート、金、活性ガラス、変性ガラス、または変性ポリスチレン、例えばポリスチレン無水マレイン酸を使用することができる。さらに、ヒドロゲルを使用することができる。この実施形態に示すように、活性層１４４上には、プラスチック接着部材１１８が形成される。プラスチック接着部材１１８の露出部分は、切り取られたか、または、刻印されたＵ字型を示し、このＵ字型が流体回路１２８となる。
【００７７】
本バイオディスク１１０のこの透過型の実施形態の最後の主要な構造上の層は、透明な非反射キャップ部１１６である。このキャップ部１１６は、注入ポート１２２および排出ポート１２４を備える。
【００７８】
次に図１０を参照して、光ディスク読み取りシステムを示す。このシステムは、ＣＤ、ＣＤ−Ｒ、ＤＶＤ、ＤＶＤ−Ｒ、またはその他の既知の類似の光ディスクフォーマット用の従来の読み取り装置、このようなドライブの修正バージョン、または完全に異なる専用デバイスであってもよい。基本的なコンポーネントは、ディスクを回転させるモータ、光を供給する光システム、および光を検出する検出システムである。
【００７９】
次に図１０を参照して、光コンポーネント１４８、入射ビームまたは呼びかけビーム１５２を生成する光源１５０、反射ビーム１５４、および透過ビーム１５６を示す、光ディスク読み取りのブロック斜視図を表示する。図４に示される反射型バイオディスクの場合、反射ビーム１５４は、光バイオディスク１１０のキャップ部１１６の反射面１４６から反射される。本光バイオディスク１１０のこの反射型の実施形態では、反射ビーム１５４は、底部検出器１５７によって検出され、信号要素の存在に関して分析される。他方、透過型バイオディスクフォーマットでは、透過ビーム１５６が、上部検出器１５８によって検出され、信号要素の存在に関する分析も行われる。透過型の実施形態では、上部検出器１５８として、光検出器を使用することができる。
【００８０】
また、図１０は、ディスク上のトリガマーキング１２６とトリガ検出器１６０とを含むハードウェアトリガメカニズムも示している。このハードウェアトリガメカニズムは、反射型バイオディスク（図４）および透過型バイオディスク（図９）の双方で使用される。トリガメカニズムにより、プロセッサ１６６は、呼びかけビーム１５２がそれぞれの標的領域１４０にある場合にのみデータを収集することが可能になる。さらに、透過型バイオディスクシステムでは、ソフトウェアトリガも使用することができる。このソフトウェアトリガは、呼びかけビーム１５２が、それぞれの標的領域１４０の端部に当たるとすぐに、底部検出器を使用して、プロセッサ１６６に信号を送り、データを収集する。さらに、図１０は、駆動モータ１６２、光バイオディスク１１０の回転を制御するコントローラ１６４を示している。また、図１０は、別の場合に実施されるプロセッサ１６６および分析装置１６８を示しており、これらは、透過型光バイオディスクに関連する反射ビーム１５４と、透過ビーム１５６とを処理する。
【００８１】
光ピックアップおよび関連する電子機器の多くの設計および構成を、本発明の実施形態において用いることができる。コンパクトディスクおよび読み取り装置のさらなる詳細および代替的な設計は、Compact Disc Technology, by Nakajima and Ogawa, IOS Press, Inc. (1992); The Compact Disc Handbook, Digital Audio and Compact Disc Technology, by Baert et al. (eds.), Books Britain (1995); and CD-ROM Professional's CD-Recordable Handbook: The Complete Guide to Practical Desktop CD, Starrett et al. (eds.), ISBN:0910965188 (1996)で説明されており、これらのすべては、その内容のすべてが参照により本明細書に援用される。
【００８２】
したがって、ディスクドライブアセンブリを用いて、ディスクを回転させ、ディスクに記憶されている任意の符号化動作情報を読み取って処理し、ディスクのアッセイ領域にある液体の化学的、生物学的、または生化学的検査特徴（investigational feature）を分析して、アッセイ領域にある物質がドライブの読み取りビームにより分析される前または後に、ディスクに情報を書込み、またはさまざまな利用可能なインタフェース（イーサネット(登録商標）など）を介して、ユーザ、データベース、または情報が利用され得る任意の場所に情報を送る。
【００８３】
図１１には、本発明による光バイオディスク１１０の反射型ディスクの実施形態の部分断面図が示されている。図１１は、基板１２０および反射層１４２を示している。上述したように、反射層１４２は、例えば、アルミニウム、金、またはその他の適切な反射材といった材料から作製することができる。この実施形態では、基板１２０の上面は滑らかになっている。また、図１１は、反射層１４２上に形成された活性層１４４も示している。また、図１１に示されたように、標的領域１４０は、所望の部位の反射層１４２の区域または一部を除去することによるか、あるいは、反射層１４２を形成する前に所望の区域をマスクすることにより形成される。図１１にさらに示されるように、プラスチック接着部材１１８が活性層１４４上に形成される。また、図１１は、キャップ部１１６、および当該キャップ１１６に関連した反射面１４６も示している。したがって、キャップ部１１６が、所望の切り取り形状を備えたプラスチック接着部材１１８に形成されると、それによって、フロー流路１３０が形成される。図１１の矢印により示されるように、入射ビーム１５２の経路は、最初はディスク１１０の下から基板１２０の方向に向けられている。次いで、この入射ビームは、反射層１４２付近の一点に合焦する。反射層１４２が存在しない部位では、標的領域１４０で合焦が起こるので、活性層１４４を通ってフロー流路１３０内に入る経路に沿って入射はする。その後、入射ビーム１５２は、上方に進み続けてフロー流路を横切り、最終的には反射面１４６にまで入射する。この時点で、入射ビーム１５２は、入射経路に沿って戻され、すなわち反射されて反射ビーム１５４を形成する。
【００８４】
図１２は、本発明によるバイオディスク１１０の透過型の実施形態の部分断面図である。図１２は、透明キャップ部１１６と、基板１２０上の半反射薄層１４３とを有する透過型ディスクフォーマットを示している。また、図１２は、半反射薄層１４３上に形成された活性層１４４も示している。好ましい実施形態では、この透過型ディスクは、約１００〜３００オングストロームの厚さの金属（例えばアルミニウムまたは金）から作製された半反射薄層１４３を有し、厚さは４００オングストロームを越えない。この半反射薄層１４３により、図１０に示す光源１５０からの入射ビームまたは呼びかけビーム１５２の一部は、ディスクを貫通して上方に通過することが可能になり、上部検出器１５８によって検出される。一方、光の一部は反射され、入射ビームと同じ経路に沿って逆方向に戻る。この配置では、帰還ビームまたは反射ビーム１５４は、半反射層１４３から反射される。したがって、反射ビーム１５４はフロー流路１３０に入ることはない。反射光または反射ビーム１５４は、図１３および図１４でより詳細に説明されるように、半反射層１４３の内部または半反射層１４３の上部に形成されている、事前に記録された情報トラック上の入射ビーム１５２を追跡するために使用することができる。図１２に示されるディスクの
実施形態では、物理的に規定された標的領域１４０が存在してもよいし、存在しなくてもよい。標的領域１４０は、基板１２０上の半反射薄層１４３上に作製される直接マーキングによって形成することができる。これらのマーキングは、シルクスクリーニングまたは任意の同等の方法を使用して形成することができる。標的領域を規定するのに物理的な印が使用されない（例えば、符号化されたソフトウェアアドレス指定が利用される場合）他の実施形態では、フロー流路１３０は、実際には、調査すべき特徴の検査が行われる限られた標的区域として使用されてもよい。
【００８５】
図１３は、本発明によるバイオディスク１１０の反射型ディスクの実施形態のトラックを横切った断面図である。この図は、ディスクの半径方向およびフロー流路に沿って縦方向に描かれている。図１３は、基板１２０および反射層１４２を含む。この実施形態では、基板１２０は一連の溝１７０を備える。これらの溝１７０は、ディスクの中心近くから外側端部に向かって伸びる螺旋形状をしている。溝１７０は、呼びかけビーム１５２がディスクの螺旋溝１７０に沿って追従できるように実施される。この型の溝１７０は、「ウォブル溝」として知られている。波状の、または、波動状の側壁を有する底部は、溝１７０を形成する一方、高くなったまたは立ち上がった部位が、隣接する溝１７０を螺旋状に分離する。この実施形態で溝１７０上に形成された反射層１４２は、図示するように、実質的に等角（conformal）である。また、図１３は、反射層１４２上に形成された活性層１４４も示している。図１３に示されるように、標的領域１４０は、所望の部位の反射層１４２の区域または一部を除去することによるか、あるいは、反射層１４２を形成する前に所望の区域をマスクすることにより形成される。図１３にさらに示されるように、プラスチック接着部材１１８が活性層１４４上に形成される。また、図１３は、キャップ部１１６、および、当該キャップ部１１６に関連した反射面１４６も示している。したがって、キャップ部１１６が、所望の切り取り形状を備えたプラスチック接着部材１１８に形成されると、それによって、フロー流路１３０が形成される。
【００８６】
図１４は、例えば図１２に示されるような本発明によるバイオディスク１１０の透過型ディスクの実施形態のトラックを横切った断面図である。この図は、ディスクの半径およびフロー流路に沿って縦方向に描かれている。図１４は、基板１２０および半反射薄層１４３を示している。この半反射薄層１４３により、光源１５０からの入射ビームまたは呼びかけビーム１５２は、ディスクを貫通して通過することが可能になり、上部検出器１５８によって検出される。一方、光の一部は反射され、反射ビーム１５４のように戻る。半反射薄層１４３の厚さは、ディスク読み取り装置がその追跡能力を維持するのに必要とされる反射光の最小量によって決定される。この実施形態の基板１２０は、図１３で論考した基板と同様に、一連の溝１７０を備える。この実施形態の溝１７０も、ディスクの中心付近から外側端部に向かって伸びる螺旋形状であることが好ましい。溝１７０は、呼びかけビーム１５２がこの螺旋に沿って追従することができるように形成される。また、図１４は、半反射薄層１４３上に形成された活性層１４４も示している。図１４にさらに示されるように、プラスチック接着部材または流路層１１８が、活性層１４４上に形成される。また、図１４は、反射面１４６を有さないキャップ部１１６も示している。したがって、キャップ部が、所望の切り取り形状を備えたプラスチック接着部材１１８に形成されると、それによって、フロー流路１３０が形成され、入射ビーム１５２の一部は、ほぼ反射されることなく、フロー流路１３０を通過することができる。
【００８７】
図１５は、反射型ディスクの全ての層と、反射型ディスクの最初の屈折特性とを示す図１１と同様の図である。図１６は、透過型ディスクの全ての層と、透過型ディスクの最初の屈折特性とを示す図１２と同様の図である。これらの切断面は、溝１７０に沿って切断されたものであるので、図１５および図１６に溝１７０は見えない。図１５および図１６は、これらの実施形態において溝１７０に対して垂直に位置する狭いフロー流路１３０が存在することを示している。図１３、図１４、図１５、および図１６は、それぞれの反射
型ディスクおよび透過型ディスクの全ての層を示している。これらの図では、入射ビーム１５２が、最初に、基板１２０と相互作用することが示されている。基板１２０は、図示されるように、入射ビームの経路を変更させ、反射層１４２または半反射薄層１４３上にビーム１５２を合焦させる屈折特性を有する。
【００８８】
本発明を、本明細書で説明される光バイオディスクで用いられるような、細胞捕捉および／または細胞分離技術に基づいた臨床診断アッセイに関連するものとして、以下で説明する。本発明のこの態様の種々の実施形態は、血液タイピングおよび抗体タイピング診断アッセイを対象とする。
【００８９】
血液タイピングアッセイ
図１７を参照して、血液タイピングまたは特定の血液型に対する抗体の検出のためのシステムを示す。このシステムは、診断のための血液の採取および処理の方法を含む。提示される実施形態では、標準的な指採血により全血が採取され得る。次に、１０マイクロリットルのサンプルを、８０マイクロリットルのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）および１０マイクロリットルの抗凝血剤（例えば、ヘパリンまたはＡＣＤ）で希釈する。次に、希釈したサンプルを、注入ポート１２２を通して光バイオディスク１１０に導入する。光バイオディスクは、反射型ディスク（図４）であってもよく、透過型ディスク（図９）であってもよい。光バイオディスクは、標的領域１４０および捕捉フィールドを内部に含む少なくとも１つのチャンバを有する。十分なインキュベーション期間（例えば５分間）の後、光バイオディスクを光ディスク読み取り装置１１２にロードし、ディスクを約５分間スピンさせる。スピンが終了したら、ディスクが分析され、情報が収集されてデータ処理のためにシステムに転送される。収集データの処理後、診断アッセイの結果がモニタ１１４に転送されて出力結果が表示される。さらなる詳細を実施例２に示す。本発明のシステムの利点は、例えば、光バイオディスクおよびディスク読み取り装置アセンブリにより、その場で（すなわち臨床環境外で）血液タイピング分析を実施できることである。
【００９０】
本発明の種々の形態では、サンプルを、光バイオディスク内の、１つまたは複数の生体活性捕捉剤が付着した捕捉フィールドを有するチャンバにロードする。次に、バイオディスクを細胞結合に適した環境にさらす。次に、バイオディスクをＣＤドライブアセンブリに配置し、結合細胞から未結合細胞を分離するのに十分な速度、例えば約１０００ｒｐｍ〜約４０００ｒｐｍで約１〜５分間の間、放射状に（radially）スピンさせる。このスピンにより、捕捉剤により結合されていない細胞は捕捉フィールドから除去され、チャンバの別の部分（例えば、チャンバの廃液容器）に収集される。
【００９１】
本明細書で用いられる場合、用語「捕捉フィールド」は、光バイオディスクの、捕捉剤が直接的または間接的に付着している標的領域または捕捉領域１４０を含む。捕捉フィールドは、限界、境界、および範囲（limits, metes and bounds）が規定された、表面上の独立した部位である。
【００９２】
本明細書で用いられる場合、用語「捕捉剤」は、捕捉フィールドの表面に位置する、任意の分子Ｂを識別して、それに特異的に結合する任意の分子Ａを指す。本明細書において「特異的に結合」という語句は、生体サンプルに存在する可能性がある他の分子と比較した場合、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも１０，０００倍またはそれ以上の、分子Ｂに対する分子Ａの結合を指すように意図される。非限定的な例として、他の分子を特異的に認識してそれと結合する分子としては、抗体、リガンド、受容体、酵素、基質、ビオチン、アビジン、およびレクチンが挙げられる。本発明の生体活性剤は、限定はされないが、ウイルス、細菌、真菌、植物、動物、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでまたは合成的に産生された物質を含む任意の供給源から得ることができる。
【００９３】
本発明のいくつかの実施形態では、捕捉剤は捕捉抗体であり、捕捉フィールドには少なくとも１つの捕捉抗体が結合している。本明細書で用いられる場合、用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および組換え抗体を含む。本発明の抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生されることができる。抗体を産生する方法は、当業者に既知である。例えば、Antibody Production: Essential Techniques, Peter Delves (Ed.), John Wiley & Son Ltd, ISBN:0471970107 (1997)を参照されたい。あるいは、抗体は市販の供給源（例えば、Research Diagnostics Inc.（Pleasant Hill Road, Flanders, NJ 07836）およびOrtho Diagnostic Systems）から得てもよい。
【００９４】
捕捉フィールドに結合させる捕捉剤の選択は、当業者の技術常識の範囲内である。非限定的な例として、リガンドまたは捕捉フィールドにより認識される受容体を発現する細胞と結合するために、受容体特異的リガンドを捕捉フィールドに結合させてもよく、または細胞と結合するために、選択された細胞集団の表面上に発現する糖部分と特異的に結合するレクチンにより、捕捉フィールドが結合されてもよい。別法として、捕捉フィールドは、細胞の表面上の受容体に特異的な捕捉抗体により結合されてもよい。このように、本明細書中で提供される発明は、多くの生物学的アッセイに容易に適合する。光ディスク基板などの固体支持体への捕捉剤の結合に関する態様は、例えば、本発明の譲受人に譲渡された、２００２年７月１２日に出願された「Multi-Purpose Optical Analysis Disc For Conducting Assays And Various Reporting Agents For Use Therewith」と題する米国特許出願第１０／１９４，３９６号に開示されており、当該出願は、その内容のすべてが参照により本明細書に援用される。
【００９５】
用語「抗体」は、任意の１つの特定の種の抗体に限定されることが意図されているわけではなく、例えば、ヒト、マウス、ラット、およびヤギなどの抗体のすべてが、本発明によって意図される。凝集反応を引き起こすためにすべての抗体型を用いることができるため、用語「抗体」は、抗体の任意のクラスまたは任意のサブクラスをも含む。非限定的な例として、ＩｇＧ抗体クラスを凝集のために用いてもよく、または、より高い抗体の多価性が望まれる場合、ＩｇＭクラスの抗体を同じ目的で利用してもよい。細胞に特異的に結合する他の型の免疫グロブリンもまた、本発明の範囲内である。抗体断片を、本発明の捕捉剤として利用することもできる。医療診断の技術分野における抗体の使用は、当業者には既知である。例えば、Diagnostic and Therapeutic Antibodies (Methods in Molecular Medicine), Andrew J. T. George and Catherine E. Urch (Eds.), Humana Press; ISBN:0896037983 (2000)およびAntibodies in Diagnosis and Therapy: Technologies, Mechanisms and Clinical Data (Studies in Chemistry Series), Siegfried Matzku and Rolf A. Stahel (Eds.), Harwood Academic Pub.; ISBM: 9057023105 (1999)を参照されたい。これらはその内容のすべてが参照により本明細書に援用される。
【００９６】
捕捉剤が結合されている捕捉フィールドは、細胞と結合するのに適した任意の方法で組織化される。本発明のいくつかの実施形態では、１つまたは複数の捕捉剤を、捕捉フィールドに直接連結させることができる。したがって、捕捉フィールドは、１つの捕捉剤の複数の複製物と一様に結合してもよく、別法として、捕捉フィールドは、２つ以上の捕捉剤の複数の複製物と結合して、結合反応の特異性を増大させてもよい。他の実施形態では、捕捉剤は、捕捉フィールドに間接的に連結され得る。非限定的な例として、捕捉フィールドは、ストレプトアビジンなどのタンパク質で被覆されていてもよく、抗体などの捕捉剤は、抗体に付着したビオチン部分によりストレプトアビジンに連結されることができる。
【００９７】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明の捕捉フィールドには第１の捕捉剤が結合しており、第１の捕捉剤は第２の捕捉剤と結合している。非限定的な例として、抗ＩｇＭ  ＩｇＧ抗体は、捕捉フィールドに結合する第１の捕捉剤としての役割を果たすことができ
、それ自体は第２の捕捉剤であるＩｇＭ抗体と結合する。したがって、捕捉フィールドに結合した捕捉剤は、いくつかの実施形態では、互いにタンデムに連結する複数の捕捉剤を含む。
【００９８】
本発明の種々の態様では、捕捉剤は異なる方法で捕捉フィールドに付着され得る。非限定的な例として、種々の構成を表２に示す。表２は、異なる標的領域またはフィールド（すなわち窓）が、同一または異なる光バイオディスク上に異なる捕捉剤を用いて作製され得ることも示している。一実施形態では、捕捉抗体は、バイオディスクに直接付着させることができる。他の実施形態では、１つまたは複数のさらなる薬剤が、光バイオディスクとそこから最も遠位にある捕捉剤との中間結合剤として利用される。この中間結合剤の設計により立体障害が低減され、それにより、捕捉剤が十分に機能する可能性が高くなる。
【００９９】
表２に示すいくつかの実施形態は、ストレプトアビジンまたはその変異体と、ビオチンとの間の既知の強い分子相互作用を利用する。非限定的な例として、ストレプトアビジンは、捕捉フィールドの最初の層として利用することができる。ビオチン化捕捉抗体を用いることにより、ストレプトアビジンとビオチンとの間の分子認識およびそれにより生じる強い結合を利用して、ストレプトアビジン層への特異的な結合を達成することができる。立体障害をさらに緩和することが有利である場合、ビオチン化第１捕捉抗体をストレプトアビジン層に結合させてもよく、ビオチン化第１抗体により特異的に認識されて結合される第２捕捉抗体を適用してもよい。
【０１００】
【表２】
2005509865.tif 000003
【０１０１】
次に図１８を参照して、ストレプトアビジン／ビオチン相互作用に依存しない本発明の代替的な捕捉技術が提示される。図１８の下行に示すように、最も単純な実施形態では、捕捉剤は光バイオディスクの捕捉フィールドに直接付着させられる。捕捉剤は、限定はされないが、ＩｇＧ、ＩｇＭ、レクチン、またはその他の分子などを含む。光バイオディスクに直接連結している捕捉剤は、立体傷害により最適に機能することが妨げられるため、代替的な実施形態は、中間リンカ分子（すなわちクロスリンカ）により捕捉剤をバイオディスクに付着させることである。このようなクロスリンカは当該技術分野において既知である。非限定的な例として、立体障害に関連する問題を最小にするかまたは排除するために必要な長さを与える十分な炭素原子数を有する任意の炭素化合物であれば十分である。
【０１０２】
クロスリンクシステムには、１つまたは複数の高分子部位（macromolecular moiety）を別の高分子部位にクロスリンクする１つまたは複数のクロスリンク剤、すなわち接合剤が含まれることが理解されるべきである。クロスリンクは、２つの高分子部位間の共有結合による相互作用であってもよいし、非共有結合による相互作用であってもよく、通常、２つの高分子のフリーラジカルが結合するときに形成され得る。クロスリンクを実現する化学修飾または結合プロセスは、ある官能基と他の官能基との反応を伴い、その結果、化学結合が形成される。反応性官能基または選択的反応性官能基を有するバイオ結合試薬を生成することにより、標的分子の簡単で再現可能なクロスリンクまたはタグ付けの基礎が形成される（「Bioconjugate Techniques」, Greg T. Hermanson, Academic Press, San Diego, CA, (1996)）。
【０１０３】
クロスリンク剤には、ホモ二官能性リンカ（homobifunctional linker）、ヘテロ二官能性リンカ（heterobifunctional linker）、およびゼロレングスクロスリンカ（zero-length cross-linker）が含まれるが、これらに限定されるものではない。ホモ二官能性リンカは、同じ官能基である２つの反応部位を有するリンカであり、例えばグルタルアルデヒドなどがある。これらの試薬は、あるタンパク質と別のタンパク質双方に共通する基と反応して共有結合することにより、両者を結合することができる。ヘテロ二官能性接合試薬は、タンパク質および他の高分子が有する異なる２つの官能標的に結合することができる、異なる２つの反応基を含む。例えば、クロスリンカのある部分は、アミン反応基を含み、別の部分は、スルフヒドリル反応基を構成することができる。その結果、標的分子の選択部分でクロスリンク反応をさせることができ、したがって、結合プロセス全体をより適切に制御することができる。ゼロレングスクロスリンカは、原子を増やすことなく化学結合を形成することにより、２つの分子を結合する。したがって、第一の分子の１の原子は、リンカまたはスペーサを介在させることなく、第２の分子の原子に共有結合する。当業者は、クロスリンク剤の詳細な知見を得るために、「Bioconjugate Techniques」, Greg T. Hermanson, Academic Press, San Diego, CA, (1996)を参照することができる。
【０１０４】
本発明では、クロスリンク剤をバイオディスクの表面に結合させて、標的領域内に捕捉剤を固定する。好ましいクロスリンクシステムは、ビオチン−ストレプトアビジンを含むヘテロ二官能基、すなわち、アビジン結合基質に結合したビオチン化捕捉剤である。
【０１０５】
立体障害を低減または排除するように設計された捕捉技術の他の実施形態を、図１８の中段および上段に示す。これらの方法は、光バイオディスクと捕捉剤との間の中間結合分子としてＩｇＭまたはＩｇＧを利用する。捕捉剤は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、レクチン、または細胞と結合して捕捉する任意の他の分子を含む。
【０１０６】
図１９を参照すると、ストレプトアビジン分子（またはその変異体）およびビオチン分子の、強い認識および結合に基づく本発明の細胞捕捉技術が提示されている。前述の表２で詳述したように、生体活性剤であるストレプトアビジンは、捕捉フィールドに最初に適用されて、種々の捕捉剤、例えば、ビオチン化ＩｇＧ、またはビオチン化ＩｇＭ、または
ビオチン化レクチン、またはビオチン化された任意の他の細胞結合分子と結合して保持するために用いられ得る。この設計に従った種々の実施形態が、図１９の上段にイラストで提示されている。代替の実施形態は、図１９の下段にイラストで提示されており、ＩｇＧまたはＩｇＭなどの分子が、前述の捕捉剤を結合するための媒介機能を果たす薬剤として、光バイオディスク上のストレプトアビジン層上で用いられる。これらの実施形態では、ＩｇＧおよびＩｇＭにより果たされる媒介機能は、立体障害に関連する問題を低減または排除することであり、これは、図１８に提示した捕捉技術に関して説明した、リンカ分子により果たされる機能と類似している。
【０１０７】
本発明の光バイオディスクは、１つのチャンバ内に複数の捕捉フィールドを有することができる。いくつかの捕捉フィールドの分類は「バーコード」と称されるが、これは、特定の捕捉フィールドに結合している細胞から得られるデータが、バーコードとして知られる明暗の縞状パターンに似ているからである。別の例では、規定された陰性対照区域および陽性対照区域もそのようなバーコードに組み込まれる。
【０１０８】
次に図２０を参照して、表血液タイピングのための、本発明の例示的なアッセイ方法の結果を示す。本方法は、サンプル試験およびデータ提示のために「バーコード」フォーマットに便宜上設計されている複数の捕捉フィールドを利用する。図２０に提示される実施形態では、光バイオディスクはいくつかの捕捉フィールドを含み、捕捉フィールドのそれぞれには捕捉剤、例えば抗体が付着しており、捕捉剤は、赤血球の表面上の特定のＡＢＯ抗原決定基に特異的である（抗Ａ抗体および抗Ｂ抗体は、Fisher Scientific（Los Angeles, CA）のカタログ番号２３２８７２４７および２３２８７２４８からそれぞれ入手することができる）。さらに、特定の捕捉フィールドが陽性対照（ＰＯＳ）および陰性対照（ＮＥＧ）として設計される。試験のための陽性対照および陰性対照は、捕捉剤が全細胞と結合する分子、例えばβ−Ｄ−グルコサミンオリゴマーと結合する、トマト（Lycopersicon esculentum）から単離したレクチン（Sigma Aldrich Chemical、カタログ番号Ｌ−０６５１）である陽性対照捕捉フィールド、および捕捉剤が結合していないか、またはサンプル中に存在しない別の分子に特異的な捕捉剤を有する陰性対照捕捉フィールドを含み得る。
【０１０９】
図２０にイラストにより提示されるバーコード結果は、標準的な顕微鏡分析により収集されるデータ出力と、本明細書に記載の本発明のＣＤ画像化技術を用いて収集されるデータ出力とが区別できない（同様である）ことを示している。
【０１１０】
このタイプの手法の直接的な利点は、被験体の血液型を迅速に判定するために、該被験体からの血液サンプルの分析を既知のバーコード結果と比較できることである。提示される例では、Ｂ捕捉フィールドのＢ型赤血球よりもＡ捕捉フィールドのＡ型赤血球の方がより多く結合しており、これは、試験されている個体がＡ赤血球表現型を有することを示す。
【０１１１】
本発明のこの方法の種々の実施形態は、任意の他の血液型（例えば、Ｒｈ式血液型、ＭＮＳ式血液型、ルセラン式血液型、ケル式血液型、ルイス式血液型、ダフィ式血液型、キッド式血液型、フィッシャー式血液型、または任意の他の血液型）タイピングのために、同様に設計することができる。当業者には理解されるように、１つまたは複数の血液型システムを、１つのバイオディスクで同時に試験することができる。
【０１１２】
抗原決定基
本発明の種々の態様が、血液タイピングの方法に利用される。赤血球の表面は、血液型によって類別される多くの抗原決定基を含む。これらの抗原決定基は、タンパク質部分および／または炭水化物部分からなる赤血球表面マーカーを提示する。人間には少なくとも
２３の血液型がある（The Blood Group Antigen Factsbook (Factsbooks Series) by Marion E. Reid (Editor) and Christine Lomas-Francis (Editor) (January 1997) Academic Press; ISBN: 0125859651）。ＡＢＯ血液型分類は、おそらく最も重要であり、輸血適合性を決定する基礎となる。赤血球血液型分類による別の分類は、Ｒｈｅｓｕｓ（Ｒｈ）血液型分類であり、これは妊娠中における重要な試験である。
【０１１３】
さまざまな他の血液タイピング方式が、本発明の方法に適応する。これらのうち最も重要なものとしては、限定はされないが、ＭＮＳ式、ルセラン式、ケル式、ルイス式、ダフィ式、およびキッド式、フィッシャー型、または別の型が挙げられる。輸血技法および血液タイピングの基礎の詳細な論考に関しては、以下の参考文献を推薦する：Transfusion Medicine by Jeffrey McCullough (December 1997), McGraw-Hill Professional Publishing; ISBN 0070451133; Modern Blood Banking and Transfusion Practices by Denise Harmening (Editor) (March 1999), F.A. Davis Co; ISBN: 080360419X; Immunohematology: Principles and Practice by Eva D. Quinley (Editor) (January 1998), Lippincott
Williams & Wilkins Publishers; ISBN: 0397554699; and The Principles and Practice of Blood Grouping by Addine G. Erskine, ASIN: 0801615305。
【０１１４】
ほとんどの血液タイピング試験は血球凝集に基づいており、種々の表面抗原と反応して細胞を凝集させるタイピング試薬のパネルと、血液サンプルを混合することを含む。凝集の存非が特定の血液型の指標となる。本明細書に記載する本発明は、バイオディスクフォーマットに独自に適合する細胞捕捉技術を利用する。本発明の生物学的アッセイは、細胞凝集および／または細胞結合を検出するように設計される。本発明のいくつかの実施形態では、血液型を判定される被験体（個体）は、哺乳類、例えばマウスまたはヒトである。別の例では、被験体は非ヒト哺乳類または非ヒト霊長類である。
【０１１５】
本発明のいくつかの実施形態では、ＡＢＯ式および／またはＲｈ血液タイピングのための方法が提供される。ＡＢＯ血液タイピング方式に適した特異的抗体および抗原を表３に提示する。
【０１１６】
したがって、赤血球がＡ抗原を保持している個体は、Ｂ抗原に対する抗体を体内に有し、赤血球がＢ抗原を保持している個体は、Ａ抗原に対する抗体を体内に有する。赤血球にＡ抗原およびＢ抗原の双方を有する個体は、これらの抗原に対する抗体を全く産生せず、赤血球にいずれの抗原も有さない個体は、両抗原に対する抗体を体内に有する。
【０１１７】
【表３】
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【０１１８】
Ｒｈ血液タイピング方式に関するＲｈ抗原を構成する３つの遺伝子Ｃ、ＤおよびＥがあり、すべて第１染色体上に見られる。個体のＲｈ遺伝子型が、Ｃ、Ｄ、Ｅ抗原のうちの少なくとも１つを含む場合、個体はＲｈ陽性である。遺伝子型ｃｄｅ／ｃｄｅ（ｒｒ）を有する個体のみがＲｈ陰性である。
【０１１９】
さらに副次的な血液型により血液タイピングは複雑になり得るが、これらはそれほど重要ではない。個体において、赤血球に発現しない抗原に対する抗体は、血液型抗原構造と環境作用物質（environmental agents）との相同性により、非赤血球刺激性（non-red-cell stimulated）である（または天然に発生する）。抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＡ、またはＩｇＧクラスであり得る。ＩｇＭ抗体は、該抗体に対する抗原を保有する細胞と混合されると、直接凝集を導く。個体が、輸血中または妊娠中に、自身の血液型と不適合の赤血球に曝されると、該個体の免疫系が、導入された異種血液型に対する抗体を産生する。このプロセスにより産生された抗体は、主にＩｇＧクラスである。ＩｇＧ抗体は、胎盤を通過し、その後の妊娠で新生児溶血性疾患を引き起こす可能性がある。
【０１２０】
上述のように、ＡＢＯおよびＲｈ血液型は、輸血医学において最も重要な血液型である。ＡＢＯおよびＲｈ抗原に対する天然型抗体は、ＩｇＭクラスである。ＡＢＯおよびＲｈ抗原に対する抗体は容易に入手可能であり、赤血球サンプルについて直接凝集試験を行うことができる。本発明のシステムでは、表タイピングアッセイに関しては、赤血球の凝集は試験しない。この場合の試験は、抗原−抗体相互作用に基づく細胞捕捉である。相互作用は特異的かつ正確であり、どの抗原が赤血球細胞表面に存在するかを示す。ＡＢＯ抗体の裏タイピングに関しては、光ディスク上で捕捉された細胞の凝集を、ソフトウェアアルゴリズム（複数可）により調査して分析する。
【０１２１】
概して、本明細書に記載する発明は、３つのタイプの血液細胞タイピングを包含する。ＡＢＯおよびＲｈ血液型システムに関しては、アッセイは、赤血球の表面上に存在する抗原を細胞捕捉アッセイにより検出する「表」タイピングと、患者の血清中に存在するＡＢＯまたはＲｈ表現型に対する抗体を細胞凝集アッセイにより検出する「裏」タイピングを含む。第３のタイプの血液細胞タイピングアッセイは、「抗体」血液タイピングと呼ばれる。これは、患者の血清中の、他の副次的な血液型表現型（例えば、ケル、ダフィ、キッドなど）に対する抗体の存在を検出するように設計された診断アッセイである。さらに、個体のＲｈ血液型は、このタイプのアッセイを用いて判定されることができる。抗体タイピングでは、診断試験は細胞捕捉および／または細胞凝集に基づく。
【０１２２】
表タイピングアッセイ
図２１Ａ〜図２１Ｆは、反射領域ディスクでの表タイピングアッセイの一実施形態の捕捉化学現象の表現の一例である。より詳細には、図２１Ａは、反射層１４２および反射層が除去された捕捉領域１４０で被覆された基板１２０を示す。反射層は、例えばリソグラフィ（lithography）により除去することができる。図２１Ｂは、捕捉領域１４０に受動的に吸着したストレプトアビジンの層２７０を示す。図２１Ｃは、捕捉領域１４０のストレプトアビジン２７０に結合したビオチン化第１捕捉抗体２７２を示す。図２１Ｄは、ビオチン化第１捕捉抗体２７２に結合し、それぞれ異なる特異性を有する第２捕捉抗体２７４、２７６、および２７８を示す。図２１Ｅは、キャップ部１１６、反射表面１４６および注入ポート１２２、接着部材１１８、流路１２８、ならびに以下の捕捉化学物質：ストレプトアビジン２７０、第１捕捉抗体２７２、および３つの異なる第２捕捉抗体２７４、２７６、および２７８を基板１２０の捕捉領域１４０に備える、組み立てられたバイオディスクを示す。図２１Ｆは、細胞の表面に発現する抗原に基づいた、捕捉抗体２７４による特異的細胞捕捉を示す。捕捉抗体２７６および２７８は、示された実験で試験されている細胞に関して結合特異性を有さない。図２１Ｆは、捕捉領域１４０を通過して反射層に衝突する電磁放射入射ビーム１５２を合焦し、それにより、検出器システム１５７に送られる電磁放射反射ビーム１５４を形成することによる検出方法も示している。
【０１２３】
本明細書で用いられる場合、用語「チャンバ」は、光バイオディスクに付着しているかまたは光バイオディスクの一部である少なくとも１つの物質により規定される、任意の三次元空間を含む。一実施形態では、液体サンプルがチャンバにロードされて、特定の反応
条件（抗体結合条件など）および検出方法（ビーム呼びかけなど）に対応するように、チャンバは密閉されている。チャンバは、プラスチック製、金属製、ガラス製、または光バイオディスクが用いられる生物学的アッセイに適した任意のその他の材料製であってよい。非限定的な一例では、チャンバは約４μｌ〜約５０μｌを収容することができる。別の例では、チャンバは、生物学的アッセイ後に廃液貯蔵部（waste repository）として利用され得る第２のチャンバと流体連通している。
【０１２４】
本明細書で用いられる場合、「特異的に結合する」抗体は、ペプチド配列を含むエピトープ、または炭化水素部分、または脂質部分、またはオリゴヌクレオチドの特異的配列、あるいはそれらの組み合わせと結合する抗体を意味する。そのような抗体は、特異的なエピトープを有さないその他の分子に無差別に結合することはない。そのような特異的に結合する抗体は、そのようなエピトープを欠いた他の分子または化合物とは結合しない（すなわち交差反応しない）。
【０１２５】
アッセイは、チャンバ（「フローチャンバ」ともいう）を含む光バイオディスク内で行われ、チャンバは、そのチャンバに関連する固相に付着した特異的抗体または他の捕捉分子を有する。本発明の非限定的な一例では、捕捉フィールド（複数可）に付着した特異的抗体により捕捉された細胞特異的表面抗原（例えば、Ａ抗原またはＢ抗原）を発現する特定の細胞型（例えば、特定の型の赤血球）の出現を判定する方法が記載される。
【０１２６】
光バイオディスクドライブアセンブリは、ディスクの回転、ディスクに記憶された任意の符号化情報の読み出しおよび処理、ならびにバイオディスクのフローチャンバの細胞捕捉フィールドの分析に使用される。バイオディスクドライブには、バイオディスクを回転させるモータと、ディスクの回転速度を制御するコントローラと、ディスクからの反射信号を処理するプロセッサと、処理された信号を分析する分析装置とが設けられる。回転速度は可変であり、回転速度および回転時間に応じて厳密に制御されることができる。また、バイオディスクは、アッセイの前、その最中、またはその後のいずれかにおいて、当該バイオディスクに情報を書き込むために利用されることもできる。フローチャンバおよび捕捉フィールドの試験物質が、ドライブの読み取りビームによって呼びかけを受け（interrogated）、分析装置によって分析される。バイオディスクは、ディスクの回転を制御する符号化情報と、行われる免疫型（immunotyping）アッセイ型に特有の情報の処理を提供する符号化情報と、その結果をバイオドライブに関連したモニタに表示する符号化情報とを含むことができる。
【０１２７】
本方法は、ＣＤ、ＣＤ−Ｒ、ＤＶＤ、または任意の等価な光ディスクフォーマットでの評価試験を含む。本発明による評価試験の変形形態または代替的形態は、光バイオディスク上に安定化された強力な捕捉化学物質を含む。未結合の非特異的細胞は、バイオディスクの捕捉フィールドに特異的に結合している、血液サンプルからの特異的標的細胞を残してスピン除去される。ドライブの読み取りまたは呼びかけビームは、捕捉細胞を検出して画像を生成し、この画像は分析されることができる。
【０１２８】
裏タイピングアッセイ
本発明は、ＡＢＯ／Ｒｈ血液型抗原に対する特異的抗体を検出する方法、例えば、抗Ａ抗体または抗Ｂ抗体の存在に関する患者の血清のアッセイも提供する。一実施形態では、本発明は、サンプルがバイオディスクにロードされる前に処理される裏タイピングの方法（図２２、図２３、図２４Ａ、図２４Ｂ、図２４Ｃ、図２５Ａ、図２５Ｂ、図２５Ｃ、図２６Ａ、図２６Ｂ、および図２６Ｃ）を提供する。別の実施形態では、本発明は、サンプルが有意の処理をされることなく、バイオディスクにロードされる裏タイピングの方法（図２７）を提供する。
【０１２９】
図２２を参照して、裏タイピングの第１の実施形態では、まず全血を、例えば指から採血し、バイオディスク血液型分類アッセイにおいて血清を利用する前に、細胞を血清から分離する。全血は、例えば軽く遠心分離することにより血清と細胞とに分離され得る。次に、患者の抗体を含む血清を、ＡＢＯ細胞表現型を有する１つまたは複数の細胞型と混合する。例えば、図２２の細胞１はＡ型細胞であり、図２２の細胞２はＢ型細胞であり、図２２の細胞３はＡＢ型細胞であり得る。次に、サンプルを一定期間、例えば約１〜５分間、室温でインキュベートし、患者の抗体をこれらの細胞と相互作用させる。インキュベートした後、ヒトの抗体を捕捉剤として用いる場合、細胞を数回洗浄し、バイオディスクの１つまたは複数のチャンバにロードする。レクチン捕捉剤を用いる場合、洗浄は不要である。
【０１３０】
適切な特異性を有する抗体が患者の血清中に見られる場合、赤血球に抗体が結合する結果として赤血球が凝集する。次に、これらの凝集細胞を、適切な捕捉剤、例えば全細胞と結合するレクチンにより、捕捉フィールドで捕捉することができる。ディスクを短時間スピン（例えば４００ｒｐｍ〜４０００ｒｐｍ）させて、未結合細胞を除去した後、凝集細胞の存在に関して捕捉フィールドを調べる。次に、捕捉フィールドを光学式読み取り装置で調べて、試験されている細胞が凝集しているか否かを判定し、それにより、ＡＢＯ／Ｒｈ血液型抗原に対する抗体が個体の血液中に存在するか否かを判定することができる。
【０１３１】
図２３では、裏タイピングの第２の実施形態が示されており、まず全血を、例えば指から採血し、バイオディスク血液型分類アッセイにおいて血清を利用する前に、細胞を血清から分離する。全血は、例えば軽く遠心分離することにより血清と細胞とに分離され得る。Ａ型試薬細胞とＢ型試薬細胞とを混合する。次に、患者の抗体を含む血清を細胞混合物に添加し、それによりサンプル混合物を作製する。次に、サンプル混合物を一定期間、例えば約１〜５分間、室温でインキュベートし、患者の抗体をこれらの細胞と相互作用させる。インキュベートした後、アッセイ混合物を少なくとも１つの抗Ａ捕捉領域および１つの抗Ｂ捕捉領域を有する１つのチャンバにロードする。凝集細胞および非凝集細胞の捕捉は、図２６Ａ、図２６Ｂ、および図２６Ｃに関連して、以下で図示および説明する。
【０１３２】
適切な特異性を有する抗体が患者の血清中に見られる場合、赤血球に抗体が結合する結果として赤血球が凝集する。例えば、抗Ａ抗体が血清サンプル中に存在する場合、Ａ型細胞の凝集が起こる。次に、凝集細胞または未反応の単独細胞が特異的な捕捉領域で捕捉される。ディスクをしばらく回転（例えば４００ｒｐｍ〜４０００ｒｐｍ）させて、未結合細胞を除去した後、凝集細胞の存在に関して捕捉フィールドを調べる。次に、捕捉領域を光学式読み取り装置で調べて、試験されている細胞が凝集しているか単独であるかを判定し、それにより、ＡＢＯ／Ｒｈ血液型抗原に対する抗体が個体の血液中に存在するか否かを判定することができる。
【０１３３】
次に図２４Ａには、患者の血清と予め混合され、患者の抗体により凝集し、特異的な捕捉フィールドを有するバイオディスクの注入ポート１２２にロードされた、試験細胞またはタイピングされた試薬細胞が示されている。図に見られるように、この段階では、細胞は凝集しているが捕捉フィールドの捕捉剤に結合していない。図２４Ｂでは、所定のインキュベーション期間後、凝集した試験細胞は特異的に認識され、捕捉フィールドに固定された捕捉剤により捕捉されている。捕捉されるのに十分な時間（インキュベーション時間）の後、光バイオディスクをスピンさせて、捕捉剤により結合されていない細胞すべてを捕捉フィールドから除去する（図２４Ｃ）。未結合細胞が除去されると、捕捉フィールドを通過して反射層にあたる電磁放射入射ビーム１５２を合焦し、それにより、検出器システム１５７に送られる電磁放射反射ビーム１５４を形成することにより、データ検出が行われる。データの分析により、捕捉剤に結合した細胞が凝集したかどうかに関する情報が提供される。
【０１３４】
対照的に、患者の血清に反応しない試験細胞は凝集しない。図２５Ａは、捕捉フィールドを有する光バイオディスクの注入ポート１２２にロードされた患者の血清により凝集しない試験細胞を示す。十分なインキュベーション期間後、これらの細胞は、捕捉フィールドに結合した捕捉剤により捕捉される（図２５Ｂ）。未結合細胞を遠心分離により除去したら（図２５Ｃ）、図２４Ｃに関して説明したようなデータ収集および分析を行う。本発明の分析ソフトウェアは、捕捉フィールドに結合した単独細胞と凝集細胞とを区別することができる。
【０１３５】
次に図２６Ａには、凝集細胞および単独細胞を含むアッセイ溶液がチャンバに添加されている様子が示されている。アッセイ溶液は、図２３で上述したように調製され得る。図２６Ｂに示すように、十分なインキュベーション期間後、凝集試薬細胞および非凝集飛躍細胞は、捕捉領域に結合したそれぞれの捕捉剤により捕捉される。さらに、図２６Ｂは、凝集細胞を含む捕捉領域と、単独細胞を含む別個の捕捉領域とを示す。図２６Ｃに示すように未結合細胞を除去すると、図２４Ｃに関して説明したようなデータ収集および分析を行う。本発明の分析ソフトウェアは、捕捉フィールドに結合した単独細胞と凝集細胞とを区別することができる。
【０１３６】
裏タイピングの第３の実施形態では、全血またはその希釈サンプルを、図２７に示すように、バイオディスクのマイクロ流体回路、マイクロ流体流路、またはフロー流路に直接ロードする。本方法では、光バイオディスク内の分離チャンバ２５０を通過させることにより、血液細胞と血清とを分離する。全血の流体成分と細胞成分との分離は、ディスクを第１の速度でスピンさせ、赤血球、白血球および血小板を、血清から分離するように設計された少なくとも１つのマイクロフィルタを通してサンプルを移動させることにより行われる。次に、ディスクを第１の速度よりも速い第２の速度でスピンさせることにより、血清を少なくとも１つの混合チャンバ２５２に移動させる。次に、特定のＡＢＯ型表現型を有する細胞を、別個の入口ポート２５６を通して、少なくとも１つの混合チャンバ２５２に添加する。血清と細胞との混合は、ディスクを少なくとも１回、反時計回りに半回転させ、続いて時計回りに半回転スピンさせることにより行われる。次に、抗体−抗原相互作用させるのに十分な時間、サンプルを混合チャンバ２５２内でインキュベートする。次に、ディスクを第２の速度よりも速い第３の速度でスピンさせることにより、捕捉フィールドを有する捕捉チャンバまたは分析チャンバ２５４に細胞を移動させる。捕捉剤を細胞と相互作用させるのに十分な時間、抗ヒト免疫グロブリンまたは別の捕捉剤が結合している捕捉フィールドと細胞とを相互作用させる。次に、ディスクを再び、例えば４００ｒｐｍ〜４０００ｒｐｍでスピンさせて、未結合細胞を除去する。次に、捕捉フィールドからデータを収集して、捕捉フィールドに結合している細胞が凝集しているか否かを判定する。捕捉フィールドでの凝集細胞の存在は、個体の血清が、試験されている特定の赤血球血液型表現型の表面上の抗原に対する抗体を有することを示す。別法として、捕捉チャンバ２５４に、非凝集細胞から凝集細胞を分離するバイオマトリックスを充填してもよい。本発明のこの態様に関する詳細は、図３５、図３６Ａ、図３６Ｂ、図３７Ａ、図３７Ｂ、および図３７Ｃに関連して以下で説明する。
【０１３７】
直接タイピングアッセイ
別の態様では、本発明は、血液サンプルの抗体タイピング（すなわち直接タイピング）の方法、すなわち、ＡＢＯ式の血液型以外の血液型の抗原に対する抗体の存在に関して患者の血清を試験する方法を提供する。この態様の一実施形態では、サンプルがバイオディスクにロードされる前に処理される（図２８、図２９Ａ、図２９Ｂ、図２９Ｃ、図３０Ａ、図３０Ｂ、および図３０Ｃ）抗体タイピングの方法を提供する。この態様の別の実施形態では、本発明は、サンプルが有意の処理をされることなくバイオディスクにロードされる（図３１）抗体タイピングの方法を提供する。ＡＢＯ式の血液型表現型以外の既知の血
液型表現型（例えば、ケル、ダフィ、キッドなど）の細胞は、試験用に市販されている（Immucor, Inc. Norcross, GA, PANOSCREEN）。
【０１３８】
図２８を参照して、抗体タイピングのさらに別の実施形態では、バイオディスク血液型分類アッセイにおいて血清を利用する前に、まず全血を血清から分離する。全血は、軽く遠心分離することにより血清と細胞とに分離され得る。次に、患者の抗体を含む血清を、ＡＢＯ血液型以外の血液型の既知の表現型を有する、１つまたは複数のＯ型ＡＢＯ試験細胞と混合する。次に、サンプルを一定期間、例えば約１５〜３０分間、３７℃でインキュベートし、患者の抗体をこれらの細胞と相互作用させる。インキュベートした後、細胞を数回洗浄し、バイオディスクの１つまたは複数のチャンバにロードする。適切な特異性を有する抗体が患者の血清中に見られる場合、赤血球に抗体が結合する。次に、これらの抗体結合細胞を、適当な捕捉剤、例えば抗ヒトＩｇＧにより捕捉フィールドに捕捉することができる。ディスクをしばらく（例えば４００ｒｐｍ〜４０００ｒｐｍ）スピンさせて、未結合細胞を除去した後、細胞の存在に関して捕捉フィールドを調べる。次に、捕捉フィールドを光学式読み取り装置で調べて、試験されている細胞が捕捉フィールドに存在するか否かを判定し、それにより、個体の抗体の状態（status）を判定することができる。
【０１３９】
アッセイ中に生じる分子認識事象を図２９および図３０に示す。図２９Ａでは、患者の血清と予め混合されて、該血清に含まれる抗体により結合された試験細胞を、捕捉フィールドを有する光バイオディスクの注入ポート１２２にロードする。図２９Ｂでは、必要とされるインキュベーション期間後に、患者の抗体により結合された試験細胞は特異的に認識され、捕捉フィールド１４０に固定された抗免疫グロブリン抗体（すなわち捕捉剤）により捕捉される。十分な捕捉時間後、光バイオディスクをスピンさせて、捕捉剤により捕捉されていない細胞すべてを捕捉フィールドから除去する（図２９Ｃ）。未結合細胞が除去されると、捕捉フィールドを通過して反射層にあたる電磁放射入射ビーム１５２を合焦し、それにより、検出器システム１５７に送られる電磁放射反射ビーム１５４を形成することにより、データ検出が行われる。
【０１４０】
対照的に、患者の血清と反応しない試験細胞は捕捉フィールドに結合しない。図３０Ａは、光バイオディスクの注入ポート１２２への、患者の血清の抗体により結合されない試験細胞のロードを示す。十分なインキュベーション期間後でさえも、これらの細胞は、捕捉フィールドに結合している捕捉剤により捕捉されない（図３０Ｂ）。短時間の低速スピン（図３０Ｃ）の後に細胞は捕捉フィールドから除去され、上記のようにデータ検出が行われる。
【０１４１】
本発明の抗体タイピング法の別の実施形態は、少なくとも１つのマイクロ流体回路を有する光バイオディスクの使用を含む。図３１は、この方法に含まれるステップを示すイラストによる流れ図である。図２８で説明したように、血液を回収し、アッセイの準備のために適宜希釈する。試験サンプルを、光バイオディスクの注入ポートにロードするために、アプリケータにロードする。最初に、細胞および血清を含むサンプルが、血清から細胞を分離するマイクロフィルタを有する分離チャンバ２５０に入れられる。次に、遠心分離により血清を混合チャンバに移動させ、そこにタイピングされた試薬試験細胞（type reagent test cells）を添加する。次に、十分な期間の後、サンプルを捕捉チャンバに移動させ、続いて分析が行われる。
【０１４２】
図３２は、上述のマイクロ流体回路のより詳細な実施形態を提示する。まずサンプルが注入ポート２５１にロードされ、光バイオディスクの分離チャンバ２５０に入れられる。ディスクを第１の速度でスピンさせることにより、赤血球、白血球、および血小板を血清から分離させるように設計された少なくとも１つのマイクロフィルタを通してサンプルを移動させ、全血の流体成分と細胞成分とを効果的に分離する。次に、ディスクを第１の速
度よりも速い第２の速度でスピンさせることにより、血清を少なくとも１つの混合チャンバ２５２に移動させる。次に、既知の血液型表現型の試薬細胞を、バイオディスクの別個の入口ポート２５６を通して、少なくとも１つの混合チャンバ２５２に添加する。
【０１４３】
本発明の種々の態様および実施形態では、マイクロ流体回路は、混合チャンバ（複数可）に既知の血液型表現型の細胞（タイピングされた試薬細胞）を添加するための、１つまたは複数の注入ポート２５６を有する。本発明の他の種々の態様および実施形態では、マイクロ流体回路は、１つの捕捉チャンバ２５４をフィードする（feed）１つの混合チャンバを有する。本発明のさらに他の種々の態様および実施形態では、注入ポート（複数可）２５６は必要でない。これは、混合チャンバに、赤血球血液型の特異的抗原（例えば、Ｍ抗原またはＮ抗原）で被覆された微粒子が、予めロードされているからである。このような抗原は、赤血球抗原を精製することにより、例えば、組換え遺伝子発現、続く生化学的単離、およびそれを粒子に吸着させることにより、都合よく調製することができる。次に、これらの粒子を、バイオディスクを作製するときに、例えば凍結形態で混合チャンバにロードすることができる。この構成のバイオディスクは、既知の血液型表現型の赤血球の入手が困難な国および地域において特に有用であろう。
【０１４４】
血清と細胞の混合は、ディスクを少なくとも１回、反時計回りに半回転させ、続いて時計回りに半回転スピンさせることにより行われる。次に、抗体−抗原相互作用をさせるのに十分な時間（例えば１５〜３０分間）、サンプルを混合チャンバ２５２内でインキュベートする。次に、ディスクを第２の速度よりも速い第３の速度でスピンさせることにより、捕捉フィールドを有する捕捉チャンバ２５４に細胞を移動させる。抗体−抗原相互作用をさせるのに十分な時間（例えば３０秒間〜１５分間）、抗ヒトＩｇＧが結合している捕捉フィールドと細胞とを相互作用させる。次に、ディスクを（例えば４００ｒｐｍ〜４０００ｒｐｍで）スピンさせて、未結合細胞を除去する。次に、捕捉フィールドからデータを収集して、捕捉フィールドに細胞が結合している否かを判定する。捕捉フィールドでの細胞の存在は、個体の血清が、試験されている特定の赤血球の表面の抗原に対する抗体を有することを示す。バイオマトリックス細胞または粒子分離を用いる上述の抗体タイピングの代替の実施形態は、図３５、図３６Ａ、図３６Ｂ、図３７Ａ、図３７Ｂ、および図３７Ｃに関連して以下で説明する。
【０１４５】
ソフトウェアおよび関連の処理方法
血液型の判定ではコンピュータベースの分析が行われる。光バイオディスクに関連する手順の実行結果は、ソフトウェアにより分析されて、ディスクに供給された血液サンプルの血液型および／または抗体型が判定される。
【０１４６】
１つまたは複数の特定の実施態様では、バイオディスクに関連する手順は、ソフトウェアの制御下で実行され得る。例えば、ソフトウェアは、ユーザにバイオディスクの準備（例えば、血液サンプルをバイオディスクにロードし、バイオディスクを読み取り装置に挿入すること）をさせ、バイオディスクを１または複数の回転速度で、１または複数の時間、スピンさせる。特定の実施態様では、手順には洗浄および／またはインキュベーションが含まれていてもよい。
【０１４７】
１または複数の実施態様では、ソフトウェアは、ユーザからの入力または手順実行の中間結果、あるいはその両方に応じて、手順を実行させることができる。例えば、ソフトウェアは、ユーザがバイオディスクに物質を添加したことを報告する信号（例えば、キーボードまたはマウスによる）が入力されるまで、手順の実行を停止させることができる。別の例では、ソフトウェアは、バイオディスクの状態（例えば、特定の場所での物質の存非）が検出されたことを判定することができ、検出に応じて特定の方法で手順を実行させることができる。特定の実施態様では、ソフトウェアは、血液型に関する判定の信頼レベル
（例えば、許容誤差に基づく）を判定し、その信頼レベルに基づいて、別の血液タイピングをするために、血液サンプルの全部または一部をマイクロ流体回路またはアッセイ領域に送出するための速度および時間で、バイオディスクをスピンさせることができる。
【０１４８】
１つまたは複数の実施態様では、バイオディスクは書き込み互換性（例えば、ＣＤ−ＲまたはＣＤ−ＲＷの書き込み特性）を有していてもよく、ソフトウェアは、情報（例えば、手順の中間結果または最終結果を表す情報、またはそれらから得られる情報）をバイオディスクに書き込ませることにより、その後、そのソフトウェアまたは別のプログラムによる検索を可能にすることができる。１回または複数回行われる可能性がある検索は、手順の実行の同じインスタンス（instance）において行うことができるので、現在のインスタンスの残りの実行に影響を与えることもできるし、現在のインスタンスの後または最後に行ってもよい。例えば、ソフトウェアがサンプルの血液型を判定すると、血液型の識別および任意にその基礎をなすデータを含む情報が、バイオディスクに記録され得る。このような場合、少なくともいくつかの状況では、ソフトウェアの判定が、血液タイピングの対象となった実際のサンプルに物理的に関連する固定形態（fixed form）で利用可能となるように、バイオディスクが（例えば、法的手続きにおける証拠または立証の目的で）アーカイブ（archive）される。したがって、バイオディスクは、血液タイピングの改良型医療記録としての役割を果たすことができ、その後、さらなる分析（例えば、ソフトウェア制御下のＤＮＡ試験、あるいは直接的な前年比較または累積分析または履歴分析）のために検索されることができる。
【０１４９】
したがって、相互作用性は、ユーザとの相互作用およびバイオディスクとの相互作用という少なくとも２つの形態の１つまたは複数の形態で提供され得る。ソフトウェアとユーザとの相互作用には、ユーザへの出力の形態（例えば、電子ディスプレイ上の出力、音声または他のオーディオによる出力、あるいは嗅覚または触覚などの人間の感覚により検出可能な別の機構による出力）を採用してもよく、またはユーザからの入力の形態（例えば、キーボード、マウス、ジョイスティック、マイクロフォン、光センサ、またはコンピュータに物理的変化を検出させる別の機構による入力）を採用してもよい。
【０１５０】
１つまたは複数の特定の実施態様では、手順の結果は、１つまたは複数のトラックを有する光バイオディスクに適用される、トラックごとの信号情報生成を行う移動レーザヘッドおよび移動光検出器の一方または双方を用いて生成され得る、１つまたは複数の電子信号の形態で通信されることができる。例えば、光バイオディスクからの反射光または透過光の読み取りを表すアナログ信号が受け取られ、デジタル信号に変換され、これが血液型または抗体タイピングにおいて分析される。以下でより詳細に説明されるように、ソフトウェアは、電子信号を分析し、手順の実行から得られる物質の境界を表す（たとえば、暗いスポットを生成する）光強度の変化を同定、位置の特定、および／または定量化し、物質の存在／非存在、位置、および／または量に基づいて、血液型または抗体型に関する結論を導き出すことができる。
【０１５１】
ソフトウェアおよび手順は、ＡＢＯ技法もしくはＡＢＯ細胞計数技法を含むか、またはそれに依存してもよく、あるいはマイクロ流体回路での洗浄および／または調製ステップと、検出（例えば光強度および／または光学濃度技法による検出）のための試験区域および／または廃液区域への物質の移動とを含み得る抗体タイピングプロセスを含むか、またはそれに依存してもよい。
【０１５２】
図３２を再び参照して、ソフトウェアおよび／または手順において用いられ得るマイクロ流体回路の一例が示されている。ソフトウェアは、区域２５０、２５２、２５４の使用のタイミングを制御することができ、中間結果などの情報を回路のバイオディスクに記録させることができ、区域２５０、２５２、２５４の１つまたは複数に関する結果または状
態に応じて手順を実行させることができる。例えば、ソフトウェアは、状態Ｘが区域２５０で見られる場合はバイオディスクにＡという行動をさせ、状態Ｙが区域２５０で見られる場合はバイオディスクにＢという行動をさせることができる。付加的または代替的に、バイオディスクの他の区域に関して、同様の試験および措置を実行させてもよい。ソフトウェアは、得られた中間結果または状態に応じて分岐プロセスまたはフローチャートを実行させることができる。したがって、血液タイピング試験の種々の変形形態または種々の血液タイピング試験を、ソフトウェアをそれに対応する形態または構成に変更して、同じバイオディスク装置を用いて実施することができる。実施される試験の変形形態または試験に応じて、ソフトウェアは、バイオディスクのスピンの速度を増減させて、スピンの回数を調整して、かつスピンの休止時間を変更することができ、区域によって異なる量の光に曝されるようにドライブのレーザの方向を調整して、試験の変形形態または試験に適した手順環境を得ることができる。
【０１５３】
概して、ソフトウェアは、バイオディスクによる対話式のマルチルート処理を実施してもよい。例えば、マイクロ流体回路は５〜６段階を有することができ、ソフトウェアは、第１段階の結果に応じて特定の措置を採用することができ、続いて、第２段階の結果に応じて他の措置を採用することができ、残りの段階でも同様に続けることができる。このように、バイオディスクおよび他のハードウェアの機能は、ソフトウェアおよび結果により管理される。
【０１５４】
ソフトウェアは、バイオディスクで観察される状態を、イベント捕捉タイプ（Event Capture type）などの抽象概念として扱ってもよい。例えば、グルコースの発見はイベント捕捉１として扱われてよく、遺伝子組換え生物（ＧＭＯ）試験はイベント捕捉３として扱われてよい。ソフトウェアコードが指示されている１つまたは複数のパラメータテーブル、または特定の試験が（任意選択で対話による命令に沿って）実施される１つまたは複数のパラメータテーブルを用いてもよい。試験の開発において、このようなテーブルは製品化までの時間を早め、ソフトウェアコード保守の費用を低減する。このようなテーブルにおける１つのパラメータは、以下で述べるイベント計数に関係する。図３４に示されるように、他のパラメータは、血液型試験を表すフローチャートの決定ブロックを実施し、例えば、領域Ａに関してなされた決定により、領域Ｃではなく領域Ｂで措置が取られるようにする。
【０１５５】
以下で説明されるように、ソフトウェアおよびバイオディスクシステムは、定量的かつ定性的な血液タイピング結果を与えてもよい。例えば、Ａ型血液を示すだけではなく、強いＡ型血液と弱いＡ型血液（例えば、８５％対１５％のＡ型）を区別することができる数値結果を得ることができる。感受性、選択性、および非特異的結合を提供することにより、量的に向上した結果を得ることが可能である。
【０１５６】
図３３を参照して、本発明の方法および装置を用いて行われる血液タイピングアッセイの結果を示す、サンプル表示画像が示されている。棒グラフおよびそれに対応する捕捉された赤血球の実際の物理的総数（counts）により示されるように、血液サンプルは強いＡ型である。また、アッセイの信頼性を高めるために、陽性対照結果および陰性対照結果も示される。弱いＡ型の場合、対応する棒はかなり低い（例えば、Ａ型の閾値よりわずかに上である）。このように、ソフトウェアは、血液タイピングの強度を定量的に検出することができ、ある特定の状況では、エラー検査および／または重複検査機能を実行することができる。このような機能としては、限定はされないが、判定が弱い場合の再試験、血液タイピングの閾値の変更、異なる試験の適用、異なるサンプルサイズの使用、およびユーザによる操作の要求が挙げられる。したがって、ソフトウェアの出力は、ソフトウェアが十分な信頼レベルの血液型結果を判定した後にのみ提供される。
【０１５７】
ソフトウェアの制御下で、バイオディスクはこのようにして、比較的少量の血液サンプルに対して高性能の対話式血液型分析を行うことができ、困難または不可能であるか、あるいは健康に悪影響を及ぼす可能性がある、患者の血液のさらなる検索をする必要がない。
【０１５８】
他の情報技術資源を、血液タイピング技法においてバイオディスクに適用してもよい。例えば、ソフトウェアの分析結果は、記憶またはさらなる分析のために、インターネットなどのネットワークを介して伝送（例えば保護形態（secure form）で）することができる。ソフトウェアは、インターネットなどのネットワークを介して、実行、更新および／または保守されることができる。例えば、血液タイピングにおいて特定の結果が得られた場合は常に、例えば保健機関または人口統計学関連機関へ連絡することにより、自動的に報告を行うことができる。
【０１５９】
特定の実施態様では、イベント計数技法を用いてバイオディスク上の物質が検出および定量化され、イベント計数技法の実行結果の分析に基づいて、血液タイピング結果が提供される。事実上、トラックごとの走査はバイオディスクの一部からなり、物質のスポットが走査で検出され、血液サンプルの血液型が判定され、検出されたスポットの量に基づいて報告される。
【０１６０】
この技法では、サンプリングレートおよび任意選択でバイオディスク回転速度は、予測または検出されたスポットのサイズに応じて調整され、それにより、スポットは、従来の実用的な計算資源を用いてリアルタイムで確実に計数することができる。例えば、７ミクロンサイズの赤血球が検出されている場合、４倍速の回転速度で６６７キロヘルツのサンプリングレートを用いて、７ミクロンのスポットを検出することができる一方、著しく異なるサイズのスポットはフィルタリング処理により除去される。
【０１６１】
イベント計数は、トラックごとまたはトラックのセットごとに、必要に応じてリアルタイムで行うことができる。特定の実施態様では、光ドライブ機構の読み取りヘッドは、指定されたトラックに位置付けられ、サンプルのセット（例えば、トラックまたはブロックに相当する）がメモリに読み込まれる。捕捉領域では、読み取りが所定のプロファイル（例えば、指定数の低強度サンプルとそれに続く指定数の高強度サンプル）と一致した場合に、イベントが記録される。低強度および高強度は、サンプル間相対強度（relative sample-to-sample）として扱われ得る。イベントは、トラックに沿った捕捉領域の幅に対応する全サンプルについて記録される。捕捉領域の残りの部分は、現在のトラックと交わらないスポットを見つけるために、現在のトラックの上方および／または下方の他のトラック上で同様に走査される。イベントがスポットを表し、捕捉領域でのイベントの計数により、捕捉領域のスポットの数が効果的に提供される。
【０１６２】
他の実施形態では、デジタル信号処理などの信号分析を行って（例えば、ローパス（low pass）またはバンドパス（band pass）フィルタリングを実施して）、計数される指定サイズのスポットなどの、重要な特徴を明らかにすることができる。レーザ波長および／またはレーザスポットサイズは、特徴をより明白にさせるために変更されてもよい。
【０１６３】
ソフトウェアにより行われる血液タイピングアッセイは、標的領域１４０などの１つまたは複数の捕捉領域で見られるスポットの数（例えば、赤血球を表す）に依存してもよい。
【０１６４】
特定の実施態様では、イベント計数は、トラックデータがバイオディスクから検出されている場合にリアルタイムで行われ、ソフトウェアに保持されているすべてのものはほとんどメモリを必要としないイベント計数自体であるため、少量かつ安価なメモリで分析を
行うことを可能にする。
【０１６５】
特定の実施態様では、位置合わせマークがバイオディスク上に予め配置されており、これは特に、ソフトウェアが、対象となる捕捉領域のオフセット点を判定するためのトラック上の開始点を決定することを可能にする。位置合わせ記号は、捕捉領域の開始部付近に位置付けられた真黒の墨のドット（a solid black India ink dot）であり得る。
【０１６６】
サンプルは、バイオディスクにおいて検出器で測定された光強度に対応する電圧レベルを表すことができる。例えば、特定の１４ビットサンプル（または１４ビットサンプルの上８ビット（upper 8 bits））は、赤血球などの対象となる特徴が存在していなことを表す、遮断されていない（undisturbed）反射光または透過光に対応し、別のサンプルは、特徴が存在していることを表す、部分的または完全に遮断された光に対応し得る。
【０１６７】
ドライブ機構が従来のＣＤ−ＲＯＭドライブから得られるものである場合、ソフトウェアは、論理ブロックアドレス（logical block address:ＬＢＡ）コマンドを用いて、バイオディスクの特定のトラックからデータを読み取ることができるような位置に読み取りヘッドを位置付けるように、ドライブ機構に指示することができる。特定のトラックを指定するために、トラック番号には７５が乗算されて論理ブロック番号が与えられ、ドライブは論理ブロック番号に向かうように命令される。採用されるサンプルからの電子信号は、従来のＣＤ−ＲＯＭアナログ信号である、Ａ−Ｄ、ＨＦ１−ＨＦ２、フォーカス、およびトラッキングのうちの１つまたは複数を含み得る。サンプルは、４００キロヘルツ〜８０キロヘルツの範囲でサンプリングすることができるAlterView製のＥｕｌｔｒａｄ  ＥＤＤＡ１２８０Ａ／Ｄデバイスにより、アナログ信号から得ることができる。
【０１６８】
ソフトウェアにより用いられ得る他の従来のＣＤ−ＲＯＭコマンドとしては、ドライブ初期化、ドライブ速度設定、ロケーションへのトラックアウト（track out to location）、ロケーションへのトラックアウトまたはＬＶ位置決め、空試験（test burn）モード、およびドライブリセットが挙げられる。
【０１６９】
ソフトウェアは、中止する前に所定回数（例えば１２回）まで位置合わせ記号の発見を試みてもよい。複数の捕捉領域が、特定のトラックに沿って、位置合わせ記号の終わりから異なるオフセット点で位置付けられている。位置合わせ記号がデータのブロックの終わりに見られた場合、そのデータは破棄され、別のブロックを読み取ることができ、それにより、ブロックの開始点に近い点において、位置合わせ記号の終わりからオフセットを正しく計算することができる。
【０１７０】
図３３に示されるように、出力は棒グラフおよび棒に対応する総数を含む。総数の下にはスポットを示すボックスがあり、これは捕捉区域の一部を効果的に画像化したものである。この画像は、捕捉区域をカバーするトラックに対してイベント計数が行われると、ラインごとに形成される。血液型は、種々の捕捉区域の総数の比率を計算することにより判定される。
【０１７１】
サンプルレートの選択は重要である。サンプリングレートが低すぎると、ソフトウェアは目的物を見落とす場合がある。サンプリングレートが高すぎると、あまり関係のない、または全く関係のない小さい目的物が、対象となる目的物と共に誤って計数される場合があり、データレートが計算プラットフォームの負担となる場合がある。
【０１７２】
計算プラットフォームは、限定はされないが４３３メガヘルツＰｅｎｔｉｕｍ（登録商標）互換性マイクロプロセッサを含み、マイクロソフトウィンドウズ９８（登録商標）を実行する従来のパーソナルコンピュータを含み、ソフトウェアは、実行速度が（例えば、
サンプルをリアルタイム分析する場合に）著しく異なるアセンブリ言語コンポーネントを用いて、マイクロソフトＶｉｓｕａｌ  Ｃ＋＋またはＶｉｓｕａｌ  Ｂａｓｉｃなどの高レベル言語で実施されてもよい。
【０１７３】
画像解析は、捕捉区域の画像に対して行われ、目的物の位置的構成配置ならびに目的物の局所密度および全体密度などの、総数以外のさらなる特徴を明らかにすることができる。
【０１７４】
上述の技法の少なくともいくつかは、バイオディスク上のマイクロ流体回路のもの以外のプラットフォームに適用可能である。
【０１７５】
図３４は、ソフトウェアの実施により実行される高レベル手順を示す。この手順により、バイオディスクに適用された血液型試験などの試験で用いるためにパラメータを規定することができる。
【０１７６】
バイオマトリックス分離を用いた血液分析
図１〜図３４に関連して上述した、血液学的および免疫血液学的アッセイ方法および装置は、バイオマトリックス法を用いて実施されてもよい。バイオマトリックス法は、本発明の第４の態様に関連して詳細に上述されている。この方法では、バイオマトリックスが、光バイオディスクのマイクロ流体流路または回路内に形成される。バイオマトリックスは、ポリアクリルアミド、アガロース、およびポリスチレン、または液体クロマトグラフィで用いられるようなガラスビーズを含む、架橋ポリマーまたは微粒子から形成されることができる。図３５は、形成されたバイオマトリックス３００を内部に含む、光バイオディスクのマイクロ流体回路３０４を示す。流体回路３０４はアッセイ溶液３０２も含む。アッセイ溶液３０２は、緩衝液、試薬抗体、またはタイピングされた試薬細胞を含んでもよい。
【０１７７】
図３６Ａおよび図３６Ｂを参照して、流路またはマイクロ流体回路内の、粒子または細胞の添加および反応が示されている。より詳細には、図３６Ａは、バイオマトリックスマイクロ流体回路への粒子または細胞の添加を示す。細胞は、タイピングされた試薬細胞３０６またはサンプル赤血球３０８を含み得る。次に、粒子がアッセイ溶液中で試薬と反応し、図３６Ｂに示す凝集体３１０を形成する。凝集反応が終了すると、ディスクを所定の速度および時間でスピンさせて、バイオマトリックス３００を用いて非凝集細胞３１２から凝集細胞３１０を分離する。その結果は、図３７Ａ、図３７Ｂ、または図３７Ｃに示すパターンのいずれかであり得る。図３７Ａは、粒子または細胞すべてが凝集体３１０を形成する、強凝集反応の結果を示す。マトリックスの孔は小さいため凝集体３１０を通過させず、これらの凝集体３１０はバイオマトリックスに入ることはできない。場合によっては、凝集反応は弱い反応であり、形成された凝集体３１０は、図３７Ｂに示すようにマトリックスに入り、マトリックス内部で捕獲されるほどに小さい。対象となる検体がサンプル中に存在しない場合、凝集は起こらず、単独の非凝集粒子または細胞３１２は、すべてマトリックスを通過して、図３７Ｃに示すようにマイクロ流体回路の底部または遠位端でペレットを形成する。次に、凝集体３１０および／または非凝集細胞３１２の位置および量を、光ディスク読み取り装置を用いて分析することができ、このような光ディスク読み取り装置は、上記で参照および援用された米国特許出願第１０／０４３，６８８号に記載されている。次に、これらの検体からのデータを、付属のコンピュータソフトウェア、ならびにディスクおよび／またはドライブソフトウェアに組み込まれた適当な抗原記号を用いて解釈し、血液型パネル、および／または抗体パネルまたはプロファイルを与えることができる。この方法により、血液タイピングおよび抗体スクリーニングプロセスが自動化され、血液学的および免疫血液学的試験のターンアラウンドタイムが短縮される。
【０１７８】
本発明の一実施形態では、個別のマイクロ流体流路に、抗Ａ抗体、抗Ｂ抗体、または抗ＡＢ抗体を含む試薬抗体を予めロードする。次に、図３６Ａに示すように、希釈または洗浄された患者またはサンプルの赤血球を、チャンバのそれぞれに添加してアッセイ溶液を作製する。所定のインキュベーション時間後、図３６Ｂに示されるように、赤血球の特異的抗原（Ａ抗原、Ｂ抗原、またはＡＢ抗原）に結合する抗体を含む流路内で赤血球の凝集が起こる。例えば、サンプル赤血球がＡ型である場合、抗Ａ抗体を含む流路で凝集が起こる。凝集反応の終了後、ディスクを所定の速度および時間でスピンさせて、非凝集細胞から凝集細胞を分離する。その結果は、図３７Ａ、図３７Ｂ、または図３７Ｃに示すパターンのいずれかであり得る。この実施形態を用いた最も一般的な結果は、図３７Ａおよび図３７Ｃに提示されるものであり、これらはそれぞれ、適当な試薬抗体に対する強い反応と、他の抗体に対する無反応とを示す。図３７Ｂは、あまり一般的ではない、弱陽性の試験結果を示す。
【０１７９】
本発明の別の実施形態では、個別のマイクロ流体流路に、Ａ型試薬細胞、Ｂ型試薬細胞、またはＯ型試薬細胞を含むタイピングされた試薬細胞をロードする。次に、図３６Ａに示すように、患者の血清または血漿のアリコートを個々のチャンバに添加して、アッセイ溶液を作製する。所定のインキュベーション時間後、適当な型の試薬細胞を含むチャンバ内で図３６Ｂに示す試薬細胞の凝集が起こる。例えば、血清サンプルが、Ｂ型赤血球に対する抗体（Ａ型血液サンプルから）を含む場合、Ｂ型試薬細胞を含む流路で凝集が観察される。凝集反応の終了後、ディスクを所定の速度および時間でスピンさせ、非凝集細胞から凝集細胞を分離する。結果は、図３７Ａ、図３７Ｂ、または図３７Ｃに示すパターンのいずれかであり得る。この実施形態を用いた通常の一般的な結果は、図３７Ａおよび図３７Ｃに示されるものであり、これらはそれぞれ、適当な試薬細胞型に対する血清抗体の強い反応と、他の細胞型に対する無反応とを示す。図３７Ｂは、あまり一般的ではない、弱陽性の試験結果を示す。
【０１８０】
本発明のさらに別の実施形態では、個別のマイクロ流体流路に、補体を含むかまたは含まないクームス血清、すなわち抗ヒトグロブリンを予めロードする。血清サンプルを調製し、種々のパターンの副次的な抗原（限定はされないが、種々の型のケル抗原、ＭＮＳ抗原、ダフィ抗原、キッド抗原、ルイス抗原、およびルセラン抗原を含む）を発現する異なるＯ型試薬細胞と個別に混合し、異なるアッセイ溶液を作製する。図３６Ａに示すように、異なるアッセイ溶液は、光ディスクの異なるマイクロ流体流路にロードされ得る。別法として、血清サンプルのアリコートを複数のチャンバに添加して、続いて、異なるＯ型試薬細胞を、血清サンプルを含む異なるチャンバに添加してもよい。サンプルに存在する抗体は、試薬細胞膜上に発現するそれぞれの抗原に特異的に結合する。抗ヒトグロブリン（ＡＨＧ）すなわちクームス血清は、細胞に結合した抗体に結合し、アッセイ溶液中の他の細胞に結合した抗体と架橋することにより、抗体で被覆された赤血球の凝集を促進する。サンプル中に、試薬細胞の表面に発現した標的抗原に対する特異的親和性を有する抗体が存在しない場合、ＡＨＧは細胞表面に付着した抗体がなければ細胞を架橋することができないため、細胞の凝集は起こらない。所定のインキュベーション時間後、適当な型の試薬細胞を含むチャンバ内で、図３６Ｂに示す試薬細胞の凝集が起こる。例えば、血清サンプルがｋ型赤血球に対する抗体を含む場合、ｋ抗原を発現している試薬細胞を含む流路で凝集が観察される。凝集反応の終了後、ディスクを所定の速度および時間でスピンさせ、非凝集細胞から凝集細胞を分離する。結果は、図３７Ａ、図３７Ｂ、または図３７Ｃに示すパターンのいずれかであり得る。この実施形態を用いた予測される一般的な結果は、図３７Ａおよび図３７Ｃに示されるものであり、これらはそれぞれ、対象となる特異的抗原を発現している試薬細胞型に対する血清抗体の強い反応と、他の細胞型に対する無反応とを示す。図３７Ｂは、あまり一般的ではない、弱陽性の試験結果を示す。試薬細胞の抗原記号をコンピュータソフトウェア分析プログラムに組み込むことにより、患者の抗体発現パターンまたはサンプル中に存在する抗体を、陽性反応および陰性反応のパターンに基づい
て自動的に判定することができる。
【０１８１】
図３８を参照して、注入ポート１２２、排出ポート１２４、およびトリガマーク１２６を有する半円形、等半径（equi-radial）の流体回路３２０を示す、透過型光バイオディスク１１０の別の実施形態の平面図が示されている。等半径流体回路３２０は、実質的に、光バイオディスク１１０の基板１２０内の環状リングの弓状部分に沿って向けられている、半円形または弓形の分析チャンバを含む。捕捉領域１４０は、等半径流体回路３２０の半円形の分析チャンバ内に配置される。図３８には、トリガマーキング１２６も示されている。ディスクは、図５、図６、図７、図８、および図９に関連して上述したような透過型光バイオディスクの構成要素すべてを本質的に含む。
【０１８２】
次に図３９を参照して、図３８に示すディスクの等半径流体回路の一部の拡大詳細図が示されている。この特定の流体回路は、図２１Ａ〜図２１Ｆに関連して上述したような、表血液タイピングアッセイのための捕捉領域を含む。図３９に示すように、分析チャンバは、例えば、血液サンプルの主要血液型を試験または判定するための、抗Ａ対照捕捉領域、抗Ｂ対照捕捉領域、抗Ｃ対照捕捉領域、抗ｃ対照捕捉領域、抗Ｄ対照捕捉領域、抗Ｅ対照捕捉領域、抗ｅ対照捕捉領域、およびＲｈ対照捕捉領域（これらに限定はされない）を含む、いくつかの捕捉領域を有することができる。他の抗原に特異的な捕捉剤を含む他の捕捉領域を、上述の捕捉領域のいずれかと置き換えてもよい。
【０１８３】
次に図４０を参照して、近位の等半径流体回路３２４および遠位の等半径流体回路３２２を有する透過型ディスクのさらに別の実施形態の拡大詳細図が示されている。この実施形態では、遠位の等半径流体回路３２２は、上記の図３９で説明した表血液タイピングに用いられ、近位の等半径流体回路３２４は、裏血液タイピングに用いられる。裏血液タイピング試験は、表血液タイピングから得られた結果の確認試験としての役割を果たす。裏血液タイピングのためのサンプル調製およびアッセイ手順に関する詳細は、例えば、図２３、図２６Ａ、図２６Ｂ、および図２６Ｃに関連して上述されている。使用の際には、赤血球は以下の実施例２で説明するようにして処理される。その後、赤血球を、注入ポート１２２を通して遠位の等半径流体回路３２２にロードする。一方、血液サンプルは、図２３に関連して上述したような裏タイピングのためにも調製されることができ、この場合、血清または血漿を、Ａ型試薬細胞およびＢ型試薬細胞を共に混合およびインキュベートする。次に、細胞および血清の懸濁液を、注入ポート１２２を通して近位の等半径流体回路３２４にロードする。次に、注入ポートおよび排出ポートを密閉し、分析のためにディスクを光ディスクドライブ１２２（図１７）にロードする。分析中、ディスクを所定の速度および時間で回転させて、捕捉領域の捕捉剤により結合されていない細胞または凝集体を除去する。次に、遠位の流体回路３２２の捕捉領域を検査して、結合された細胞を含む領域を判定する。近位の流体回路３２４の捕捉領域もまた検査して、凝集細胞または非凝集細胞が結合している１つまたは複数の領域（図２６Ｃ）を判定する。表タイピングおよび裏タイピングを合わせて行えば、個体の血液型の判定をより正確に行うことができる。標準的な臨床血液タイピングにおいて、裏タイピングは、ＡＢＯ血液型分類の正確な表タイピングの確認としての役割を果たす。本発明は、サンプル容量を低減させ、およびユーザの介入を最少にして、表タイピングおよび裏タイピングの双方を同時に実行することを可能にする。さらに、本発明の表タイピング試験および裏タイピング試験は、適当なハードウェアおよびソフトウェアを用いて約２分間で行うことができる。本発明の光バイオディスクに関連して用いることができる光バイオディスクドライブ、検出システム、およびソフトウェアは、例えば、本発明の譲受人に譲渡されて同時係属中の、２００２年９月１１日に出願された「Methods for Differential Cell Counts Including Related Apparatus
and Software Performing Same」と題する米国特許出願第１０／２４１，５１２号、および２００２年１０月２４日に出願された「Segmented Area Detector for Biodrive and
Methods Relating Thereto」と題する米国特許出願第１０／２７９，６７７号に開示さ
れており、これらの両出願は、その内容のすべてが参照により本明細書に援用される。
【０１８４】
実験例
本発明を、図面を参照して詳細に説明してきたが、本発明の一定の例およびさらなる例示を以下に提供する。
【実施例１】
【０１８５】
バイオディスクおよび捕捉層の調製
一実施形態では、本発明のバイオディスクのトラッキング（tracking）は、６０ｎｍの金で被覆された、フォワードＷｏｂｂｌｅ  Ｓｅｔ  ＦＤＬ２１：１３７０７またはＦＤＬ２１：１２７０である。この反射型ディスク上には、リソグラフィ技術によって、２×１ｍｍのサイズの楕円のデータ窓（window）がエッチング除去されている。「Ｕ」字型流路を用いて、高さ２５μｍのチャンバを作製する。注入ポートおよび排出ポートを含むチャンバ全体を充填するには、約７μｌのサンプルが必要である。８つの窓／４つの流路のフォーマットを用いることが好ましい。本発明の好ましい実施形態では、リソグラフィを用いてデータ窓を形成せずに、透過型ディスクの表面全体を捕捉領域のために用いることができる半反射透過型ディスク（ＦＤＬ２０／２１：００７０８）が用いられる。Ｆｒａｙｌｏｃｋ「Ｕ」字型接着ＤＢＬ２０１Ｒｅｖ  Ｃ３Ｍ９４６６１または直線状流路を用いて、チャンバを作製する。利用されるカバーディスクは金ディスクであり、半径２６ｍｍで等距離に配置された直径０．０４０インチの４８個のサンプル注入口を有する完全な反射型であるか、上部検出器の使用を可能にする透明ディスクである。
【０１８６】
いくつかの化学層が、固体基板の第１の層に順次形成される。この第１の層は、ＣＤ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、またはＤＶＤ−ＲＯＭなどの光ディスクにおけるポリカーボネート層または金属化ポリカーボネート層であり得る。続く処理の前に、第１の層をイソプロパノールで清浄する。第２の層はポリスチレンまたはポリカーボネートからなる。この層は、バルクプラスチック（bulk plastic）の射出成形か、固体基板上への揮発性溶剤中のプラスチックのスピンコーティングまたはスプレーコーティングにより形成され得る。
【０１８７】
主要な捕捉層である第３の層は、第２の層上へのタンパク質ストレプトアビジン（Sigma, St. Louis, MO、カタログ番号Ｓ−４７６２）（またはその任意の変異体）の吸着により形成される。吸着プロセスは、第２の層を第１の溶液（５０〜２００ｍＭのイオン強度（ＮａＣｌ、ＫＣｌまたはＭｇＣｌ2の添加により変わる）のリン酸（ナトリウムまたはカリウム）緩衝液またはＴｒｉｓ緩衝液中、中性のｐＨ（＋／−０．５ｐＨ）の、１ｍｇ／ｍｌのストレプトアビジン（またはその任意の変異体）溶液）に曝露することにより行われる。曝露時間は、３０秒間〜１２時間の範囲であり得る。第２の層を第１の溶液に曝露した後、過剰なストレプトアビジン（またはその任意の変異体）を水で洗い流す。
【０１８８】
第２の捕捉層である第４の層は、特定の動物源（例えばマウスまたはヒト）からの他の抗体を認識してそれに結合するビオチン標識抗体（第１捕捉抗体）からなる（例えば、ビオチン化抗マウスＩｇＭ（ヒツジ由来）、Vector Laboratories、カタログ＃ＢＡ−２０２０）。第１捕捉抗体の溶液（第２の溶液）に、第３の層を１０分間〜３時間曝露させる。第２の溶液は、５０〜２００ｍＭのイオン強度（ＮａＣｌ、ＫＣｌまたはＭｇＣｌ2の添加により変わる）のリン酸（ナトリウムまたはカリウム）緩衝液またはＴｒｉｓ緩衝液中、中性のｐＨ（＋／−０．５ｐＨ）の、０．５ｍｇ／ｍｌの第１の捕捉抗体の溶液を含む。第１捕捉抗体の表面上のビオチン部分は、第３の層を構成するストレプトアビジン（またはその任意の変異体）により結合される。この層を第２の溶液に曝露した後、過剰な第１捕捉抗体を水で洗い流す。
【０１８９】
生理活性捕捉層である第５の層は、特定の型の生物細胞の表面の何らかの抗原に基づい
て、その細胞を認識してそれに結合する第２捕捉抗体からなる。第２捕捉抗体の動物源は、第１捕捉抗体の特異性と適合しなければならない。第２捕捉抗体の溶液に第４の層を、１０分間〜３時間曝露させる。この第３の溶液は、５０〜２００ｍＭのイオン強度（ＮａＣｌ、ＫＣｌまたはＭｇＣｌ2の添加により変わる）のリン酸（ナトリウムまたはカリウム）またはＴｒｉｓ緩衝液中、中性のｐＨ（＋／−０．５ｐＨ）の、第２捕捉抗体の溶液（おそらく１ｍｇ／ｍｌ）を含む。第４の層を第３の溶液に曝露した後、過剰な第２捕捉抗体を上述の緩衝液と同様の緩衝液で洗い流す。
【０１９０】
血液を分析するため、ｉｎ  ｓｉｔｕでサンプルを有するディスクをスピンさせるにあたってチャンバ漏れがないことを確認するために、本発明のディスクの漏れをチェックする。各流路に遮断剤を充填する。ブロックは少なくとも１時間行う。次に、ディスクを５０００ｒｐｍで５分間スピンさせて調べる。漏れをチェックして遮断溶液を除去した後、ディスクを真空チャンバに２〜４８時間入れる。真空処理後、ディスクを真空パウチに入れ、使用するまで２〜８℃で保管する。
【０１９１】
さらに、ディスクを熱接着または超音波接着して、チャンバからの流体の漏れがないことを確実にすることができる。
【実施例２】
【０１９２】
バイオディスクでの表血液タイピングアッセイ
以下の実施例では、バイオディスクで表血液タイピングアッセイを行う。バイオディスクは、（１）特定の捕捉領域の金を除去するようフォトリソグラフィで処理して、捕捉領域に適当な化学物質を施した、金反射ベースディスク、（２）厚さ２５μｍの流路層、および（３）金反射カバーディスク、を含み、これらが組み立てられて機能的バイオディスクとなる。
【０１９３】
指から得た１０μｌの全血を、９０μｌのリン酸緩衝生理食塩水／抗凝血剤で希釈して、１０％  ＲＢＣ溶液を調製する。この溶液（１４μｌ）を前記機能的バイオディスクに注入し、注入ポートおよび排出ポートをシールする。５分間の室温インキュベーションの後、ディスクをドライブに配置する。自社開発の自動イベント計数ソフトウェアを用いてディスクを遠心分離し、非特異的に捕捉された細胞を捕捉領域から除去させる。底部検出器を用いて、光ドライブの標準的な７８０ｎｍレーザでディスクを走査し、ソフトウェアが各捕捉領域におけるイベント数を記録する。プログラムアルゴリズムが、どの捕捉領域が陽性捕捉（positive capture）を有するかを判定し、血液サンプルにＡＢＯおよびＲｈ表現型を指定する。プロセス全体で、ドライブへのディスクの挿入から表血液タイピングの受け取りまで約１０〜１５分間を要する。診断プロトコルは、図８にイラストにより提示される。
【０１９４】
結果が図１９に示され、これは、ＡＢＯ血液タイピングのためのグラフィカルな出力の表現である。
【実施例３】
【０１９５】
オフディスクのサンプル調製を用いた、バイオディスクでの裏タイピングアッセイ
以下の実施例では、バイオディスクで裏血液タイピングアッセイを行う。バイオディスクは、（１）特定の捕捉領域の金を除去するようフォトリソグラフィで処理して、捕捉領域に適当な化学物質を施した、金反射ベースディスク、（２）厚さ２５μｍの流路層、および（３）金反射カバーディスク、を含み、これらが組み立てられて機能的バイオディスクとなる。
【０１９６】
全血を適当な速度および時間で遠心分離し、細胞ペレットおよび非溶血（non-hemolyze
d）血清または血漿とする。血清または血漿を、Ａ1型およびＢ型の試薬赤血球（Ortho Clinical Diagnostics）と個別に混合する。赤血球と血清または血漿の混合は、試験管中で行ってもよく、またはディスクの混合チャンバで直接行ってもよい。混合を試験管中で行う場合、各混合物はディスクの別個の流路に入れられる。短時間の室温インキュベーション（２〜５分間）で血清または血漿を試薬赤血球と相互作用させた後、ディスクをドライブに配置する。自社開発の自動凝集検出ソフトウェアを用いてディスクを遠心分離し、凝集細胞および／または非凝集細胞が捕捉領域を移動して非特異的に捕捉されるようにする。過剰な細胞をフロー流路の外縁まで遠心分離する。底部検出器を用いて、光ドライブの標準的な７８０ｎｍレーザでディスクを走査し、ソフトウェアが記録する。
【０１９７】
プログラムアルゴリズムが、どの試薬赤血球が凝集したかを判定し、裏タイピングに基づいて、血漿または血清サンプルにＡＢＯおよびＲｈ表現型を指定する。プロセス全体で、ドライブへのディスクの挿入から裏血液タイピングの受け取りまで約１０分間を要する。個体の表タイピングおよび裏タイピングは、同意の下で、その個体の正しいタイピングを示すべきである。
【０１９８】
結言
一定の好ましい実施形態を参照して、本発明を詳細に説明してきたが、本発明は、それらの正確な実施形態に限定されるものでないことが理解されるべきである。一方、本発明を実施する現在のベストモードを説明する本光バイオディスクを考慮すると、当業者は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、多くの変更および変形を想到し得るであろう。したがって、本発明の範囲は、前記説明ではなく、添付の特許請求の範囲によって示される。特許請求の範囲の意味するものおよび均等物の範囲内に入るすべての改変、変更、および変形は、特許請求の範囲の範囲内にあるとみなされる。
【０１９９】
さらに、当業者は、定型的に実験にすぎないものを使用するだけで、本明細書で説明した本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するか、または、把握することができる。このような均等物も、添付の特許請求の範囲によって包含されることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０２００】
【図１】本発明によるバイオディスクシステムのイラストである。
【図２】本発明で利用される反射型バイオディスクの分解斜視図である。
【図３】図２に示すディスクの平面図である。
【図４】切り取り部分がディスクのさまざまな層を示す、図２に示すディスクの斜視図である。
【図５】本発明で使用される透過型バイオディスクの一実施形態の分解斜視図である。
【図６】切り取り部分がディスクの半反射層の機能的態様を示す、図５に示すディスクの斜視図である。
【図７】金薄膜の厚さと透過率との関係を示すグラフである。
【図８】図５に示すディスクの平面図である。
【図９】切り取り部分が、図６に示す半反射層のタイプを含むディスクのさまざまな層を示す、図５に示すディスクの斜視図である。
【図１０】図１のシステムをより詳細に示すブロック斜視図である。
【図１１】図２、図３、および図４に示す反射型光バイオディスクに形成されたフロー流路を示す、当該反射型光バイオディスクの半径に対して垂直な部分断面図である。
【図１２】図５、図８、および図９に示す透過型光バイオディスクに形成されたフロー流路および上部検出器を示す、当該透過型光バイオディスクの半径に対して垂直な部分断面図である。
【図１３】図２、図３、および図４に示す反射型光バイオディスクに形成されたウォブル溝（wobble groove）を示す、当該反射型光バイオディスクの縦方向の部分断面図である。
【図１４】図５、図８、および図９に示す透過型光バイオディスクに形成されたウォブル溝（wobble groove）および上部検出器を示す、当該透過型光バイオディスクの縦方向の部分断面図である。
【図１５】反射型ディスクの全層と、反射型ディスクの最初の屈折特性を示す、図１１と同様の図である。
【図１６】透過型ディスクの全層と、透過型ディスクの最初の屈折特性とを示す、図１２と同様の図である。
【図１７】本発明の表ＡＢＯ／Ｒｈ血液タイピング法の一例を表す、イラストによる流れ図である。
【図１８】本発明の細胞捕捉技術の概略を表すイラストである。
【図１９】本発明のビオチン／ストレプトアビジンベースの細胞捕捉技術を表すイラストである。
【図２０】バーコードの形態のデータ出力を示す平面図である。
【図２１−１】本発明のバイオディスクの調製の一連の一例を説明する、断面を表す概略図である。
【図２１−２】本発明のバイオディスクの調製の一連の一例を説明する、断面を表す概略図である。
【図２２】オフディスクでのサンプル調製およびオンディスクでのサンプル分析による、ＡＢＯ／Ｒｈ血液型の裏タイピングの種々の方法を示す、イラストによる流れ図である。
【図２３】オフディスクでのサンプル調製およびオンディスクでのサンプル分析による、ＡＢＯ／Ｒｈ血液型の裏タイピングの種々の方法を示す、イラストによるもう一つの流れ図である。
【図２４】ＡＢＯ／Ｒｈ血液型抗原に対する抗体が存在する場合の、裏タイピング試験における細胞結合を示す光バイオディスクの側断面図である。
【図２５】ＡＢＯ／Ｒｈ血液型抗原に対する抗体が存在しない場合の、裏タイピング試験における細胞結合を示す光バイオディスクの側断面図である。
【図２６】Ａ型細胞およびＢ型細胞が混合され、特異的な抗Ａおよび抗Ｂ捕捉フィールドが存在する場合の、裏タイピング試験中の差次的細胞結合を示す光バイオディスクの側断面図である。
【図２７】サンプル調製および処理がすべて光バイオディスク上で行われる、裏ＡＢＯ／Ｒｈタイピングの方法を表す、イラストによる流れ図である。
【図２８】オフディスクでのサンプル調製およびオンディスクでのサンプル分析による、ＡＢＯ／Ｒｈ型以外の血液型の抗体タイピングの方法を説明する、イラストによる流れ図である。
【図２９】捕捉フィールドと接触して捕捉される抗体により結合された赤血球を含む、光バイオディスクの側断面図である。
【図３０】捕捉フィールドと接触しても捕捉されない、抗体により結合されていない赤血球を含む、光バイオディスクの側断面図である。
【図３１】サンプル調製および処理がすべて光バイオディスク上で行われる抗体タイピングの方法を表す、イラストによる流れ図である。
【図３２】注入ポート、分離チャンバ、混合チャンバ、捕捉または分析チャンバ、および排出ポートを含むマイクロ流体流路の一例を表す拡大平面図である。
【図３３】ＡＢＯ血液タイピング試験の出力を表すコンピュータモニタの画面ショットのイラストである。
【図３４】血液タイピング分析に用いる手順の流れ図を示す。
【図３５】アッセイ溶液を含むマイクロ流体流路または回路に充填されたバイオマトリックスを示す。
【図３６】予め形成されたバイオマトリックスを含むマイクロ流体流路内への粒子または細胞の添加、および凝集物の形成を示す。
【図３７】強反応、弱反応、陰性反応を示すバイオマトリックスを用いた粒子分離の３種類のパターンを示す。
【図３８】半円形で等半径の流体回路を示す透過型光バイオディスクの別の実施形態の平面図である。
【図３９】図３８に示すディスクの等半径の流体回路の一部の拡大詳細図である。
【図４０】近位および遠位の等半径流体回路を有する透過型ディスクのさらに別の実施形態の一部の拡大詳細図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【国際調査報告】
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