(57)【要約】本発明は、免疫原性生弱毒化西ナイルウイルスワクチンの製造のためにデングウイルスバックボーン上に構築された弱毒化免疫原性西ナイルウイルスキメラに関する。
2005521384.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
西ナイルウイルスの少なくとも１つの構造タンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列およびデングウイルスの野生型株の非構造タンパク質をコードする第二のヌクレオチド配列を含む核酸キメラ。
【請求項２】
前記デングウイルスがデング１型ウイルスである、請求項１に記載の核酸キメラ。
【請求項３】
前記デングウイルスがデング２型ウイルスである、請求項１に記載の核酸キメラ。
【請求項４】
前記デングウイルスがデング３型ウイルスである、請求項１に記載の核酸キメラ。
【請求項５】
前記デングウイルスがデング４型ウイルスである、請求項１に記載の核酸キメラ。
【請求項６】
前記デングウイルスが弱毒化ウイルスまたはベロ細胞における増殖増大に適合されたウイルスである、請求項１に記載の核酸キメラ。
【請求項７】
前記デングウイルスがデング４型ウイルスであり、該ウイルスがヌクレオチド約１０４７８〜１０５０７間のＴＬ２ステムループ構造に対応する前記デング４型ゲノムの３’非翻訳化領域の約３０ヌクレオチドの欠失により弱毒化される、請求項６に記載の核酸キメラ。
【請求項８】
前記デングウイルスがデング１型ウイルスであり、該ウイルスがヌクレオチド約１０５６２〜１０５９１間のＴＬ２ステムループ構造に対応する前記デング１型ゲノムの３’非翻訳化領域の約３０ヌクレオチドの欠失により弱毒化される、請求項６に記載の核酸キメラ。
【請求項９】
前記デングウイルスがデング２型ウイルスであり、該ウイルスがヌクレオチド約１０５４１〜１０５７０間のＴＬ２ステムループ構造に対応する前記デング２型ゲノムの３’非翻訳化領域の約３０ヌクレオチドの欠失により弱毒化される、請求項６に記載の核酸キメラ。
【請求項１０】
前記デングウイルスがデング３型ウイルスであり、該ウイルスがヌクレオチド約１０５３５〜１０５６５間のＴＬ２ステムループ構造に対応する前記デング３型ゲノムの３’非翻訳化領域の約３０ヌクレオチドの欠失により弱毒化される、請求項６に記載の核酸キメラ。
【請求項１１】
前記第一のヌクレオチド配列が西ナイルウイルスの少なくとも２つの構造タンパク質をコードする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸キメラ。
【請求項１２】
前記構造タンパク質がｐｒＭおよびＥタンパク質である、請求項１１に記載の核酸キメラ。
【請求項１３】
前記デングウイルスがデング４型ウイルスであり、切断部位がデングウイルスキャプシドタンパク質および西ナイルウイルスｐｒＭタンパク質を連結するために利用され、そして該西ナイルウイルスｐｒＭタンパク質が前記切断部位の下流の３位アミノ酸にアスパラギン酸（Ａｓｐ）を含有し、前記切断部位の下流の６位アミノ酸にトレオニン（Ｔｈｒ）を含有する、請求項１２に記載の核酸キメラ。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の１つまたはそれ以上の核酸キメラを含むウイル
スキメラ。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の１つもしくはそれ以上の核酸キメラまたは請求項１４に記載の１つもしくはそれ以上のウイルスキメラおよび薬学的に許容可能な担体を含む免疫原性組成物。
【請求項１６】
免疫応答の誘導に用いるための請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記被験者における免疫応答の誘導方法であって、有効量の請求項１５に記載の組成物を被験者に投与することを包含する、免疫応答の誘導方法。
【請求項１８】
前記被験者が非ヒト霊長類である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記被験者がヒトである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記被験者がウマまたはトリである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の１つもしくはそれ以上の核酸キメラまたは請求項１４に記載の１つもしくはそれ以上のウイルスキメラおよび薬学的に許容可能な担体を含むワクチン組成物。
【請求項２２】
西ナイルウイルスにより引き起こされる疾患の予防に用いるための、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
被験者における西ナイルウイルスにより引き起こされる疾患の予防方法であって、有効量の請求項２１に記載の組成物を前記被験者に投与することを包含する、疾患の予防方法。
【請求項２４】
前記被験者が非ヒト霊長類である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記被験者がヒトである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記被験者がウマまたはトリである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１２に記載の核酸キメラの前記キャプシドタンパク質および前記前膜タンパク質を分離する切断部位をコードする核酸と相補的な少なくとも５つのヌクレオチド、または該核酸の相補的鎖と選択的にハイブリダイズし、保有する、単離された核酸プローブまたはプライマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、免疫原性生弱毒化西ナイルウイルスワクチンの製造のためにデングウイルスバックボーン（backbone）上に構築された弱毒化免疫原性西ナイルウイルスキメラに関する。
【背景技術】
【０００２】
［発明の背景］
先ず図１Ａから説明すると、フラビウイルスゲノムは、５’非翻訳化領域（５’ＵＴＲ）、３つのウイルス構造タンパク質、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５と呼ばれる７つの非構造タンパク質をコードするコード領域、ならびに３’非翻訳化領域（３’ＵＴＲ）を含有する、約１１ｋｂ長の一本鎖プラスセンスＲＮＡである。ウイルス構造タンパク質は、キャプシド（Ｃ）、前膜／膜（ｐｒＭ）およびエンベロープ（Ｅ）タンパク質を含む。構造および非構造タンパク質は、シングルポリタンパク質として翻訳される。ポリタンパク質は次に、細胞およびウイルスプロテアーゼによりプロセシングされる。
【０００３】
西ナイルウイルス（ＷＮ）は、その多くが重要なヒト病原体である６０より多いウイルスを含むフラビウイルス科に属する。ＷＮは、セントルイス脳炎、日本脳炎ウイルス（ＪＥ）およびマレー渓谷脳炎ウイルスを含む蚊媒介性フラビウイルスの日本脳炎ウイルス（ＪＥ）血清型群の一成員である（Calisher, C.H. et al. 1989 J Gen Virol 70: 27-43; Burke, D.S. & Monath, T.P. 2001 in : Fields Virology, eds. Knipe, D.M. & Howley,
P.M. Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia, 4-th ed., pp. 1043-1125）。ＪＥ抗原性複合体のその他の成員と同様に、ＷＮは蚊媒介動物および鳥類を包含する天然サイクル中に保持されるが、一方、ヒトおよびウマは通常は偶発的宿主である。長年ＷＮは、アフリカ、オーストラリア、ヨーロッパ、中東および西アジアを含めた地理的範囲を有する最も広範に分布するフラビウイルスの１つと認識されてきた（Burke, D.S. & Monath, T.P. 2001 in : Fields Virology, eds. Knipe, D.M. & Howley, P.M. Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia, 4-th ed., pp. 1043-1125; Hayes, C.G. 1989 in:
The Arboviruses: Epidemiology and Ecology, ed. Monath T.P. Boca Raton, FL CRC Press, Volume V, pp. 59-88）。１９９９年の間に、ＷＮは先ず、米国において北東および中央大西洋沿岸州で定着し、さらに近年、このウイルスはその範囲を拡大して、南東および西の洲を含むに至った（Anderson, J.F. et al. 1999 Science 286: 2331-2333; Lanciotti, R.S. et al. 1999 Science 286: 2333-2337; Campbell, G.L. et al. 2002 Lancet 2: 519-529）。風土病地域では、ほとんどのヒトＷＮ感染は無症候性であるか、あるいは低度の発熱、頭痛、身体痛、発疹、筋肉痛および多発性関節炎の症候を伴う軽症疾病を引き起こす。しかしながら重症疾患を伴うヒト流行病は、イスラエル、フランス、ルーマニアおよびロシアで報告されている。急性重症疾病では、このウイルスは肝炎、髄膜炎および脳炎を引き起こして、麻痺および昏睡をもたらして、死に至らしめる。神経病理学的病変はＪＥの場合と同様で、び慢性ＣＮＳ炎症およびニューロン変性を伴う。ウイルスは、感染個体の脾臓、肝臓、リンパ節および肺にも見出される。米国におけるＷＮの１９９９年の大発生中に、６０名以上が発症し、７名が死亡したが、一方、２００２年中は、罹患率は３８７３例で、死亡は２４６例であった（CDC Report: West Nile Update Current case Count, Jan. 2, 2003）。米国の北東から南東および西へのＷＮの近年の且つ予期せぬ蔓延のために、このウイルスは、国内のかなりの領域にわたってそれ自体が広がってきており（embedded itself）有意な緊急疾患脅迫と考えられる。現在、公認ヒトワク
チンはＷＮ病の予防のために利用可能でない。蚊の制御が疾患の蔓延と戦うための唯一の実際的戦略であるが、しかし有効な噴霧は都市圏においては実行が難しい。危険に曝された集団を防御するためには、有効なワクチンが必要とされていることは明らかである。
【０００４】
デングウイルスは、フラビウイルス属（フラビウイルス科）の蚊媒介性病原体である。デングウイルス（ＤＥＮ）の４つの血清型、例えばデング１型ウイルス（ＤＥＮ１）、デング２型ウイルス（ＤＥＮ２）、デング３型ウイルス（ＤＥＮ３）およびデング４型ウイルス（ＤＥＮ４）が同定されている。４つ全ての血清型の生弱毒化デングウイルスが、初代イヌ腎細胞培養中で野生型ウイルスを継代することにより、タイのＭａｈｉｄｏｌ大学で開発された（Sabchareon, A. et al. 2002 Am J Trop Med Hyg 66: 264-272）。これらは一般に、弱毒化の実際的メカニズムに対する弱毒化関連変異の相対的関与に関して、あるいはワクチン候補のいずれかを野生型デングウイルスのビルレント生物学的表現型に戻す復帰変異の可能性に関しても十分に特性化されているわけではないため、デングウイルス感染および／または疾患に対する免疫感作のための少なくとも有望な生弱毒化ワクチン候補である。これらのワクチン候補は、それらのデング血清型、それらが継代された細胞株、ならびにそれらが継代された回数の組合せにより命名されてきた。したがって初代イヌ腎臓（ＰＤＫ）細胞中で１３回継代されたデング血清型１野生型ウイルスは、ＤＥＮ１
ＰＤＫ１３ウイルスと呼ばれる。その他のワクチン候補は、ＤＥＮ２  ＰＤＫ５３、ＤＥＮ３  ＰＧＭＫ３０／ＦＲｈＬ３（初代ミドリザル腎臓細胞中で３０回の継代、その後、アカゲザル胎児肺細胞中で３回の継代）およびＤＥＮ４  ＰＤＫ４８である。これら４つの候補ワクチンウイルスは、それぞれ野生型親ＤＥＮ１  １６００７、ＤＥＮ２  １６６８１、ＤＥＮ３  １６５６２およびＤＥＮ４  １０３６ウイルスの組織培養継代により得られた。
【０００５】
ＤＥＮ２  ＰＤＫ５３ウイルスを除いて、細胞培養中での多数回の継代中に生じた、そしてワクチン候補の弱毒化表現型に関連する遺伝子変異の数および同一性は未知である。弱毒化の実際的メカニズムに対するこのような弱毒化関連変異の関与も、野生型デングウイルスのビルレント生物学的表現型にワクチン候補のいずれかが戻る復帰変異の可能性も、これら４つのワクチン候補のいずれに関して分かっていない。ワクチン候補の特徴を理解することは、その安定性および安全性の予測のために重要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがってフラビウイルスに対する防御を付与するフラビウイルスワクチンの開発において用いられる弱毒化されたが、依然として免疫原性のフラビウイルスが必要とされている。理想的なのは、同時的に、フラビウイルス疾患に対して個体を防御し、そして安定性および安全性が予測可能であるよう十分に特性化されるワクチンである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
［発明の要約］
弱毒化され且つ免疫原性であるキメラフラビウイルスが提供される。デングウイルスの非構造タンパク質遺伝子を含有するキメラウイルスは、西ナイルウイルスの構造タンパク質遺伝子が置換されるバックボーンとして用いられる。これらのキメラウイルスは、ウイルス性疾患の随伴臨床症候の非存在下で顕著な免疫原性を示す。弱毒化キメラウイルスは、免疫原またはワクチンとして有効であり、西ナイルウイルスに対する免疫を付与するために薬物学的組成物中に混入され得る。
【発明の効果】
【０００８】
［好ましい実施形態の詳細な説明］
免疫原性ＷＮ／ＤＥＮフラビウイルスキメラおよびＷＮ／ＤＥＮフラビウイルスキメラ
の調製方法が、本明細書中で提供される。免疫原性ＷＮ／ＤＥＮフラビウイルスキメラは、西ナイルウイルスによる感染に対して個体および動物を免疫感作し、防御するために、単独でまたは免疫原性組成物として薬学的に許容可能な担体と組合せて、有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明のキメラは、西ナイルウイルスの免疫原性構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列、ならびにさらに、デングウイルスのバックボーンから選択されるヌクレオチド配列を含む。ヌクレオチド配列に由来するキメラウイルスを用いて、西ナイルウイルスに対する免疫原性応答を誘導し得る。
【００１０】
別の実施形態では、好ましいキメラは、西ナイルウイルスの少なくとも１つの構造タンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列、ならびにデングウイルスの非構造タンパク質をコードする第二のヌクレオチド配列を含む核酸キメラである。別の実施形態では、デングウイルスは弱毒化される。別の実施形態では、デングウイルスはＤＥＮ４である。別の実施形態では、構造タンパク質は西ナイルウイルスのＣタンパク質、西ナイルウイルスのｐｒＭタンパク質、西ナイルウイルスのＥタンパク質またはそれらの任意の組合せであり得る。
【００１１】
「残基」という用語は、アミノ酸（ＤまたはＬ）あるいはアミド結合によりペプチド中に組入れられるアミノ酸模倣物を指すために本明細書中で用いられる。このようなものとして、アミノ酸は、天然アミノ酸であり得るし、あるいは特に限定されることがない限り、天然アミノ酸と同様の方式で機能する天然アミノ酸の既知の類似体（即ちアミノ酸模倣物）を包含し得る。さらにアミド結合模倣物は、当業者に既知のペプチドバックボーン修飾を含む。
【００１２】
さらに、単一アミノ酸、あるいはコード配列中の数パーセントのアミノ酸（典型的には５％未満、さらに典型的には１％未満）を変更、付加または欠失するアミノ酸配列中の、またはアミノ酸をコードするヌクレオチド配列中の個々の置換、欠失または付加は、保存的修飾変更であって、この場合、変更は化学的類似アミノ酸による一アミノ酸の置換を生じる、と当業者は認識する。機能的類似アミノ酸を提示する保存的置換表は、当該技術分野で既知である．以下の６群は各々、互いに対する保存的置換であるアミノ酸を含有する。
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【００１３】
本明細書中で用いる場合、「ウイルスキメラ」、「キメラウイルス」、「フラビウイルスキメラ」および「キメラフラビウイルス」という用語は、西ナイルウイルスの免疫原性をコードするヌクレオチド配列ならびにさらにデングウイルスのバックボーンに由来するヌクレオチド配列を含む本発明の感染性構築物を意味する。
【００１４】
本明細書中で用いる場合、「感染性構築物」とは、細胞を感染させるために用いられ得るウイルス、ウイルス構築物、ウイルスキメラ、ウイルスまたはその任意の部分に由来する核酸を示す。
【００１５】
本明細書中で用いる場合、「核酸キメラ」とは、西ナイルウイルスの免疫原性をコード
するヌクレオチド配列およびさらにデングウイルスのバックボーンに由来するヌクレオチド配列を含む核酸を含む本発明の構築物を意味する。それに対応して、本発明の任意のキメラフラビウイルスまたはフラビウイルスキメラは、核酸キメラの一例として認識されるべきものである。
【００１６】
本発明の構造および非構造タンパク質は、完全タンパク質、タンパク質のエピトープまたは例えばその３つ以上のアミノ酸残基を含む任意の断片の配列を含む任意のタンパク質あるいはそれらをコードする任意の遺伝子を包含すると理解されるべきである。
【００１７】
フラビウイルスキメラ
西ナイルウイルスおよびデングウイルスは、蚊媒介性フラビウイルス病原体である。フラビウイルスゲノムは、５’非翻訳化領域（５’ＵＴＲ）を、その後にキャプシドタンパク質（Ｃ）コード領域、その後に前膜／膜タンパク質（ｐｒＭ）コード領域、その後にエンベロープタンパク質（Ｅ）コード領域、その後に非構造タンパク質をコードする領域（ＮＳ１−ＮＳ２Ａ−ＮＳ２Ｂ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５）を、最後に３’非翻訳化領域（３’ＵＴＲ）を含有する。ウイルス構造タンパク質は、Ｃ、ｐｒＭおよびＥであり、そして非構造タンパク質はＮＳ１〜ＮＳ５である。構造および非構造タンパク質は、単一ポリタンパク質として翻訳され、細胞およびウイルスプロテアーゼによりプロセシングされる。
【００１８】
本発明のフラビウイルスキメラは、西ナイルウイルスの構造タンパク質遺伝子をデングウイルス、例えばＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３またはＤＥＮ４の非構造タンパク質遺伝子と融合することにより形成される構築物である。
【００１９】
本明細書中で提供される弱毒化免疫原性フラビウイルスキメラは、それに対する免疫原性が付与される西ナイルウイルスの１つもしくは複数の構造タンパク質遺伝子またはその抗原性部分、ならびにデングウイルスの非構造タンパク質遺伝子を含有する。
【００２０】
本発明のキメラは、デングウイルスゲノムのＣ、ｐｒＭもしくはＥタンパク質（単数または複数）をコードする構造タンパク質遺伝子（単数または複数）またはそれらの組合せが防御されるべき西ナイルウイルスの対応する構造タンパク質遺伝子（単数または複数）で置換されるバックボーンとしてのデングウイルスゲノムを含有する。その結果生じるキメラウイルスは、デングウイルスによりキメラ化されるおかげで、弱毒性という特性を有し、したがってビルレンスが低減されるが、しかしＷＮ構造遺伝子産物の抗原性エピトープを発現し、したがって免疫原性である。
【００２１】
任意のデングウイルスのゲノムは、本明細書中に記載された弱毒化キメラ中でバックボーンとして用いられ得る。バックボーンは、デングウイルスの弱毒性表現型に関与するかあるいは例えばベロ細胞を製造するために用いられる細胞基質中における複製を促す突然変異を含有し得る。突然変異は、非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列、５’非翻訳化領域または３’非翻訳化領域中に存在し得る。バックボーンは、弱毒性表現型の安定性を保持し、そして弱毒化ウイルスまたはキメラがビルレント野生型ウイルスに逆戻りし得る可能性を低減するためのさらなる突然変異も含有し得る。例えば３’非翻訳化領域中の第一の変異および５’非翻訳化領域中の第二の変異は、所望により、付加的弱毒性表現型安定性を提供する。特に、ｎｔｓ１０４７８〜１０５０７間のＤＥＮ４ゲノムの３’非翻訳化領域の３０ｎｔｓの欠失である突然変異は、ＤＥＮ４ウイルスの弱毒性を生じる（Men et al. 1996 J Virol 70: 3930-3933; Durbin et al. 2001 Am J Trop Med 65: 405-413）。したがってこの遺伝子座にこのような突然変異を含有する任意のデング４型ウイルスのゲノムは、本明細書中に記載された弱毒化キメラ中のバックボーンとして用いられ得る。さらに、その他のデングウイルス血清型のゲノムの３’非翻訳化領域中の類似
の欠失変異を含有するその他のデングウイルスゲノムも、本発明のバックボーン構造として用いられ得る。
【００２２】
このような突然変異は、当業者に既知の技法を用いて、部位特異的変異法により達成され得る。本明細書中に記載され、そして当該技術分野で既知である毒性スクリーニング検定を用いて、ビルレントおよび弱毒化バックボーン構造の間を区別し得る、と当業者に理解される。
【００２３】
フラビウイルスキメラの構築
本明細書中に記載されたフラビウイルスキメラは、当業者に既知の組換え工学処理技法を用いて、デングウイルスゲノムバックボーン中で、それに対する免疫が所望される西ナイルウイルスの構造タンパク質遺伝子の少なくとも１つを置換することにより、即ち指定デングウイルス遺伝子を取り出し、そしてそれを西ナイルウイルスの所望の対応する遺伝子と置き換えることにより、産生され得る。あるいは、ＧｅｎＢａｎｋで提供される配列を用いて、フラビウイルスタンパク質をコードする核酸分子は、既知の核酸合成技法を用いて合成され、適切なベクター中に挿入され得る。したがって弱毒化免疫原性ウイルスは、当業者に既知の組換え工学処理技法を用いて産生される。
【００２４】
上記のように、バックボーンに挿入される遺伝子は、西ナイルウイルス構造タンパク質をコードする。好ましくは挿入される西ナイルウイルス遺伝子は、Ｃタンパク質、ｐｒＭタンパク質および／またはＥタンパク質をコードする遺伝子である。デングウイルスバックボーン中に挿入される配列は、ｐｒＭおよびＥ構造タンパク質の両方をコードし得る。デングウイルスバックボーン中に挿入される配列は、Ｃ、ｐｒＭおよびＥ構造タンパク質をコードし得る。デングウイルスバックボーンは、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３またはＤＥＮ４ウイルスゲノムあるいはこれらの血清型のいずれかの弱毒化デングウイルスゲノムであり、そして西ナイルウイルスのＣ、ｐｒＭおよび／またはＥ構造タンパク質（単数または複数）をコードする置換遺伝子（単数または複数）あるいは西ナイルウイルスのｐｒＭおよび／またはＥ構造タンパク質（単数または複数）をコードする置換遺伝子（単数または複数）を包含する。本発明の特定の実施形態では、西ナイルウイルスの構造タンパク質をコードする置換遺伝子は、ＤＥＮのキャプシドタンパク質および西ナイルウイルスの前膜タンパク質を分離する切断部位の下流の３位および６位アミノ酸に、それぞれＡｓｐおよびＴｈｒを含有するｐｒＭタンパク質の合成を指図する。
【００２５】
西ナイルウイルスの構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する適切なキメラウイルスまたは核酸キメラは、免疫原性の保持を伴うビルレンスの低減を示す弱毒化の表現型マーカーに関してそれらをスクリーニングすることにより、ワクチンとしての有用性に関して評価され得る。抗原性および免疫原性は、当業者に既知のルーチンスクリーニング手法を用いて、西ナイルウイルス抗体とのｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏ反応性、または免疫反応性血清を用いて評価され得る。
【００２６】
フラビウイルスワクチン
好ましいキメラウイルスおよび核酸キメラは、免疫原またはワクチンとして有用な生弱毒化ウイルスを提供する。好ましい実施形態では、キメラは高免疫原性を示し、一方、同時に危険な病原性または致死作用を生じない。
【００２７】
本発明のキメラウイルスまたは核酸キメラは、野生型または弱毒化デングウイルスバックボーン中に西ナイルウイルスの構造遺伝子を含み得る。例えばキメラは、デングウイルスまたは弱毒化デングウイルスバックグラウンドのいずれかにおいて西ナイルウイルスの構造タンパク質遺伝子を発現し得る。
【００２８】
デングウイルスゲノムの非構造領域を含有する遺伝子バックグラウンドを用いることについて本明細書中に記載された、そして西ナイルウイルスの構造タンパク質遺伝子を発現するための、弱毒化の特性である、キメラ化による戦略は、所望の免疫原性を有する構造タンパク質遺伝子を発現する生弱毒化フラビウイルスワクチン候補の開発をもたらした。したがって西ナイルウイルス病原体の制御のためのワクチン候補が意図され得る。
【００２９】
本明細書中に記載されたキメラに用いられるウイルスは、典型的には当該技術分野で既知の技法を用いて増殖される。次に細胞培養中で増殖されるウイルスの生育可能性、力価および表現型特徴を査定するために、ウイルスプラークまたはフォーカス形成単位（ＦＦＵ）滴定が実施され、プラークまたはＦＦＵが計数される。野生型ウイルスは、弱毒化候補出発物質を得るために変異化される。
【００３０】
キメラ感染性クローンは、種々のフラビウイルス株から構築される。ウイルス特異的ｃＤＮＡ断片のクローニングも、所望により成し遂げられ得る。構造タンパク質または非構造タンパク質遺伝子を含有するｃＤＮＡ断片は、種々のプライマーを用いて、フラビウイルスＲＮＡから逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により増幅される。増幅断片は、他の中間クローンの切断部位にクローン化される。次に中間キメラフラビウイルスクローンはシーケンシングされて、挿入フラビウイルス特異的ｃＤＮＡの配列を立証する。
【００３１】
ベクター中にフラビウイルスの構造または非構造タンパク質遺伝子領域を挿入することにより構築される全ゲノム長キメラプラスミドは、当業者に既知の組換え技法を用いて生成可能である。
【００３２】
投与方法
本明細書中に記載されたウイルスキメラは、ヒトまたは動物への免疫原またはワクチンとしての投与のために、薬学的に許容可能な担体またはビヒクルと個別にまたは一緒に組合される。「薬学的に許容可能な担体」または「薬学的に許容可能なビヒクル」という用語は、有害な生理学的応答を引き起こすことなく生体動物またはヒト組織と接触して用いるのに適しており、そして有害な様式で組成物の他の構成成分と相互作用しない例えば水または生理食塩水、ゲル、膏薬、溶媒、希釈剤、流体軟膏基剤、リポソーム、ミセル、巨大ミセル等（これらに限定されない）を含む任意の組成物または化合物を意味するために本明細書中で用いられる。
【００３３】
免疫原性またはワクチン処方物は、ウイルスプラーク形成単位（ＰＦＵ）またはフォーカス形成単位（ＦＦＵ）剤形中に存在するのが便利であり、慣用的薬学的技法を用いて調製され得る。このような技法としては、活性成分と薬学的担体（単数または複数）または賦形剤（単数または複数）とを会合させる工程が挙げられる。概して処方物は、活性成分を液体担体と均一に且つ密接に会合させることにより調製される。非経口投与に適した処方物としては、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤および処方物を意図されたレシピエントの血液と等張にさせる溶質を含有し得る水性および非水性滅菌注射溶液、ならびに沈殿防止剤および増粘剤を含み得る水性および非水性滅菌懸濁液が挙げられる。処方物は、単位用量または多用量容器中に、例えば密封アンプルおよびバイアル中に存在し、そして使用直前に滅菌液体担体、例えば注射用水の付加のみを要する凍結乾燥（凍結乾燥化）状態で保存され得る。即時調合注射溶液および懸濁液は、当業者に一般的に用いられる滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製され得る。
【００３４】
好ましい単位投薬処方物は、投与成分の一用量または単位あるいはその適切な分画を含有するものである。特に上記された成分のほかに、本発明の処方物は、当業者により一般的に用いられるその他の作用物質を含み得る、と理解されるべきである。
【００３５】
免疫原性またはワクチン組成物は、異なる経路により、例えば経口的または非経口的に、例えば頬および舌下、直腸、エアロゾル、鼻腔、筋肉内、皮下、皮内および局所的に（これらに限定されない）投与され得る。組成物は、異なる形態で、例えば溶液、乳濁液および懸濁液、微小球、粒子、マイクロ粒子、ナノ粒子およびリポソーム（これらに限定されない）で投与され得る。免疫感作スケジュール当たり約１〜約５用量が必要とされ得る、と予測される。初回用量は、約１００〜約１００，０００ＰＦＵまたはＦＦＵの範囲であり、好ましい投薬量範囲は約５００〜約２０，０００ＰＦＵまたはＦＦＵ、さらに好ましい投薬量範囲は約１０００〜約１２，０００ＰＦＵまたはＦＦＵ、最も好ましい投薬量範囲は約１０００〜約４０００ＰＦＵまたはＦＦＵである。追加免疫注射は、約１００〜約２０，０００ＰＦＵまたはＦＦＵの投薬量の範囲であり、好ましい投薬量範囲は約５００〜約１５，０００、さらに好ましい投薬量範囲は約５００〜約１０，０００ＰＦＵまたはＦＦＵ、最も好ましい投薬量範囲は約１０００〜約５０００ＰＦＵまたはＦＦＵである。例えば投与容積は、投与経路によって変わる。筋内注射は、約０．１ｍｌ〜１．０ｍｌの容積の範囲であり得る。
【００３６】
組成物は、約−１００℃〜約４℃の温度で保存され得る。組成物は、室温を含めた異なる温度で、凍結乾燥状態でも保存され得る。組成物は、当業者に既知の慣用的手段により滅菌され得る。このような手段としては、例えば濾過が挙げられるが、これに限定されない。組成物は、細菌増殖を抑制するために静菌剤とも組合され得る。
【００３７】
投与スケジュール
本明細書中に記載された免疫原性またはワクチン組成物は、ヒトまたは家畜動物、例えばウマまたはトリに、特に西ナイルウイルス感染が存在する地域に旅行する個体に、そしてそれらの地域の居住者にも投与され得る。組成物の最適投与時期は、西ナイルウイルスへの初回曝露の約１〜３ヶ月前である。しかしながら組成物は、疾患進行を改善するために初回感染後に、すなわち疾患を治療するために初回感染後にも投与され得る。
【００３８】
アジュバント
当業者に既知の種々のアジュバントが、本発明の免疫原性またはワクチン組成物中でキメラウイルスと一緒に投与され得る。このようなアジュバントとしては以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：ポリマー、コポリマー、例えばポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー、例えばブロックコポリマー、ポリマーｐ１００５、フロイント完全アジュバント（動物用）、フロイント不完全アジュバント；モノオレイン酸ソルビタン、スクアレン、ＣＲＬ−８３００アジュバント、明礬、ＱＳ２１、ムラミルジペプチド、ＣｐＧオリゴヌクレオチドモチーフおよびＣｐＧオリゴヌクレオチドモチーフの組合せ、トレハロース、細菌抽出物、例えばマイコバクテリア抽出物、解毒化内毒素、膜脂質あるいはそれらの組合せ。
【００３９】
核酸配列
西ナイルウイルスおよびデングウイルスの核酸配列は、高感受性および特異性を有する試料または検体中の西ナイルウイルスおよびデングウイルスキメラの検出のための核酸プローブおよびプライマーを設計するために有用である。西ナイルウイルスおよびデングウイルスに対応するプローブまたはプライマーは、ワクチンウイルスの存在を検出するために用いられ得る。核酸および対応するアミノ酸配列は、生物体および疾患を試験するための、そして疾患の療法および治療を開発するための実験室ツールとして有用である。
【００４０】
核酸プローブおよびプライマーは、西ナイルウイルスおよびデングウイルスをコードする核酸分子、あるいはその相補的配列と選択的にハイブリダイズする。「選択的な」または「選択的に」とは、西ナイルウイルス配列およびデングウイルス配列の適切な検出を防
止するために他の核酸とハイブリダイズしない配列を意味する。したがって核酸をハイブリダイズするという意図において、選択性は、試料中に存在する他の構成成分によっている。ハイブリダイズする核酸は、それがハイブリダイズする核酸のセグメントと少なくとも約７０％の相補性を有する必要がある。核酸を説明するために本明細書中で用いる場合、「選択的にハイブリダイズする」という用語は、時折ランダムにハイブリダイズする核酸を排除し、したがって「特異的にハイブリダイズする」と同一の意味を有する。本発明の選択的にハイブリダイズする核酸プローブおよびプライマーは、それがハイブリダイズする配列のセグメントと、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％および９９％の相補性を有し、好ましくは８５％以上の相補性を有し得る。
【００４１】
本発明は、コード核酸またはその核酸の相補的または反対の鎖と選択的にハイブリダイズする配列、プローブおよびプライマーも意図する。核酸との特異的ハイブリダイゼーションは、機能的種−種ハイブリダイゼーション可能性が保持される限り、核酸中で最小修飾または置換で起こり得る。「プローブ」または「プライマー」とは、それらの検出または増幅のために相補的核酸配列との選択的ハイブリダイゼーションのためのプローブまたはプライマーとして用いられ得る核酸配列を意味し、このプローブまたはプライマーは、約５〜１００ヌクレオチド、好ましくは約１０〜５０ヌクレオチド、最も好ましくは約１８〜２４ヌクレオチドで長さが変わり得る。ストリンジェントな条件下で種特異的核酸と選択的にハイブリダイズし、そしてMolecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd ed., Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載されたように当該配列と相補的な少なくとも５つのヌクレオチドを有する単離核酸が本明細書中で提供される。
【００４２】
プライマーとして用いられる場合、組成物は好ましくは、所望の領域を増幅するために、標的分子の異なる領域とハイブリダイズする少なくとも２つの核酸分子を含む。プローブまたはプライマーの長さに応じて、標的領域は、７０％相補的塩基および全相補性間の範囲に及び、そして依然としてストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。例えば西ナイルウイルスおよびデングウイルスの存在を検出する目的のためには、ハイブリダイズする核酸（プローブまたはプライマー）とそれがハイブリダイズする配列との間の相補性の程度は、他の生物体の核酸とのハイブリダイゼーションを区別するのに少なくとも十分なものである。
【００４３】
西ナイルウイルスおよびデングウイルスをコードする核酸配列は、ベクター、例えばプラスミド中に挿入され、生体生物体（living organism）中で組換え的に発現されて、組換え西ナイルウイルスおよびデングウイルスペプチドおよび／またはポリペプチドを産生し得る。
【００４４】
本発明の核酸配列は、逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ならびにｃＤＮＡアンプリコンを増幅するよう意図される正および逆アンプライマーを用いることにより、ウイルスゲノムＲＮＡ鋳型から増幅されるｃＤＮＡアンプリコンの検出を報告するのに役立つ診断用プローブを含む。ある場合には、アンプライマーの１つは、アンプライマーの３’末端にワクチンウイルス特異的変異を含有するよう意図され、これは、標的部位でのプライマーの延長と、その結果としての増幅が、ウイルスＲＮＡ鋳型がその特異的変異を含有する場合にのみ起こるため、ワクチン株に対して試験をより特異的にするのに有効である。
【００４５】
自動ＰＣＲベースの核酸配列検出システムが、近年開発された。ＴａｑＭａｎ検定（Applied Biosystems）が広範に用いられる。診断用遺伝子検定のためにさらに近年開発された戦略は、分子ビーコンを使用する（Tyagi and Kramer 1996 Nature Biotechnology 14:
303-308）。分子ビーコン検定は、ＴａｑＭａｎ検定に用いられるものとは異なるクエン
チャーおよびレポーターダイを用いる。これらのそしてその他の検出システムが、当業者に用いられ得る。
【００４６】
免疫原性または防御効力を損失することなく神経毒性および末梢毒性を低減される西ナイルウイルス／デング４型ウイルスキメラ
米国で近年出現した向神経性フラビウイルスである西ナイルウイルス（ＷＮ）に関して、候補生弱毒化ワクチン株が構築された。デング４型ウイルス（ＤＥＮ４）とのキメラ化により、マウスに関してかなりの弱毒化が達成された。全長感染性ｃＤＮＡクローン中に存在するＤＥＮ４の構造前膜（ｐｒＭ）およびエンベロープ（Ｅ）タンパク質が、ＷＮ  ＮＹ９９株の対応する遺伝子により置き換えられた。ＷＮ／ＤＥＮ４キメラの１８の全長ｃＤＮＡクローンのうちの２つが、感受性細胞中でトランスフェクトされた場合に感染性である全長ＲＮＡ転写体を産生した。２つの感染性クローンは、キメラのＤＥＮ４キャプシドタンパク質とＷＮ前膜タンパク質を分離するＮＳ２Ｂ−ＮＳ３プロテアーゼ切断部位の直下流に位置する膜貫通シグナルドメイン中のモチーフを共有した。このモチーフ、即ち、それぞれ切断部位の下流３位および６位アミノ酸のＡｓｐおよびＴｈｒは、１６の非感染性ｃＤＮＡクローン中には存在しなかった。ＷＮ／ＤＥＮ４キメラは、そのＷＮ親と比較して、マウスにおいて高度に弱毒化された。キメラは、脳内接種された乳児マウスにおいては少なくとも２８，５００分の１の神経毒性、ならびに腹腔内接種された成体マウスにおいては少なくとも１０，０００分の１のビルレントであった。それにもかかわらず、ＷＮ／ＤＥＮ４キメラおよびそれに由来する欠失変異体は免疫原性で、致死性ＷＮ曝露に対して完全防御を提供した。これらの観察は、生弱毒化ＷＮワクチンの開発を遂行するための基礎を提供する。
【００４７】
組換えＤＮＡ技術における近年の進歩は、生弱毒化フラビウイルスワクチンを構築するための新規のアプローチをわれわれが開発するのを可能にした（Pletnev, A.G. et al. 1992 PNAS USA 89: 10532-10536; Pletnev, A.G. & Men, R. 1998 PNAS USA 95: 1746-1751; Pletnev, A.G. et al. 2000 Virology 274: 26-31; Pletnev, A.G. et al. 2001 J Virol 75: 8259- 8267）。ゲノム構成、ウイルスタンパク質の数、反復可能な戦略、遺伝子発現、ビリオン構造および形態形成のフラビウイルス間での保存により、われわれのアプローチは可能になった（Lindenbach, B.D. & Rice, C.M. 2001 in: Fields Virology, eds. Knipe, D.M. & Howley, P.M. Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia, 4-th ed., pp. 1043-1125）。全てのフラビウイルスが、キャプシド（Ｃ）、前膜（ｐｒＭ）およびエンベロープ糖タンパク質（Ｅ）構造タンパク質を、その後、非構造タンパク質ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４ＢおよびＮＳ５をその順序で産生するようプロセシングされる単一の長いポリタンパク質をコードするプラスセンス非セグメント化ＲＮＡゲノムを有する。これらの共有特性は、フラビウイルスの全長感染性ｃＤＮＡクローン中のウイルス構造タンパク質に関する遺伝子を、別のフラビウイルスの対応するウイルス遺伝子（ｃＤＮＡ形態の）で置き換えることにより、生育可能なキメラウイルスが産生され得ることを示唆した。試験した場合、この戦略は、ダニ媒介脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）またはダニ媒介ランガットウイルス（ＬＧＴ）のウイルス構造タンパク質ｐｒＭおよびＥに関する配列を含有するキメラに関しては首尾よく言ったが、一方、他の配列は全て、蚊媒介性デング４型ウイルス（ＤＥＮ４）の全長感染性ｃＤＮＡに由来した。これは、不同性フラビウイルスＴＢＥＶまたはＬＧＴのウイルス構造タンパク質が、シス作用性５’および３’配列およびＤＥＮ４の非構造タンパク質の情況で機能し得る、ということを示した。両キメラが末梢毒性に関して、即ち接種の末梢部位からＣＮＳに蔓延し、脳炎を引き起こすウイルスの能力に関して、マウスにおいて高度に弱毒化されることを立証したことは有意であった。それにもかかわらず、キメラは、免疫原性であり、そしてＴＢＥＶまたはＬＧＴによる曝露に対してマウスにおける耐性を誘導可能であることを立証した（Pletnev, A.G. et al. 1992 PNAS USA 89: 10532-10536; Pletnev, A.G. & Men,
R. 1998 PNAS USA 95: 1746-1751; Pletnev, A.G. et al. 2000 Virology 274: 26-31）
。ｉｎ  ｖｉｖｏでのウイルス複製の低減（弱毒化）と防御的免疫の誘導との間の好ましい平衡が達成されていた、ということは明らかであった。われわれはこれを、感染性および免疫の誘導に十分な、しかしｉｎ  ｖｉｖｏでの高レベルの複製およびＣＮＳに蔓延する能力を要するビルレンスの完全発現には不十分なレベルでのＤＥＮ４非構造タンパク質ならびにシス作用性５’および３’配列の情況で、ダニ媒介性フラビウイルスｐｒＭおよびＥが相互作用し得ることを意味すると解釈する。
【００４８】
この戦略の論理的延長はＷＮ／ＤＥＮ４キメラを構築することであったが、しかしいくつかのフラビウイルス組合せ、例えばいくつかのランガットウイルス（ｐｒＭおよびＥ）／デングウイルスキメラ、ならびにデングウイルス（ｐｒＭおよびＥ）／ランガットデングウイルスキメラは生育可能であることを立証していないために、生育可能性は予め予測できない、とわれわれは了解した。それにもかかわらず、遠縁の蚊媒介性ＷＮの構造ｐｒＭおよびＥタンパク質遺伝子がＤＥＮ４の対応する遺伝子に代わって置換された生育可能なＷＮ／ＤＥＮ４キメラを構築することに、われわれは意外にも成功した。ＤＥＮ４を安全にさせるが、しかし成人ボランティアにおいて依然として免疫原性であることが前に示されていた３’非翻訳化領域（３’ＵＴＲ）における３０のヌクレオチド欠失を伴うＷＮ／ＤＥＮ４キメラも、われわれは生成した（Durbin, A.P. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65: 405-413）。マウスにおける試験を先ず実施して、新規構築ＷＮ／ＤＥＮ４キメラウイルスの神経毒性、末梢毒性、免疫原性および防御効力を評価した。
【００４９】
材料および方法
細胞およびウイルス
サルベロ細胞（ＷＨＯ種子継代１４３）および蚊Ｃ６／３６細胞は、L. Potash博士（Novavax Inc., Rockville, MD）から入手した。これらのベロ細胞は、候補ヒトワクチンの製造に用いるために認定されている。サルＬＬＣＭＫ2細胞は、アメリカ培養細胞コレクション（American Type Culture Collection）（Manassas, VA）から購入した。西ナイルウイルスを用いて開始し、この試験に用いたＷＮ野生型ＮＹ９９−３５２６２株は、R. Lanciotti博士（Centers for Disease Control and Prevention, Fort Collins, CO）の御厚意により提供いただいた。それは、１９９９年にブロンクス動物園（ニューヨーク）のチリフラミンゴから最初に単離された（Lanciotti, R.S. et al. 1999 Science 286: 2333-2337）。ＷＮ  ＮＹ９９ゲノムの配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ１９６８３５（表１による）として入手可能であり、そしてＷＮのその他の株は、ＷＮ  ＮＹ９９ゲノムの配列の代わりに用いられ得る。ベロ細胞で調製されるウイルス懸濁液は、免疫染色フォーカス形成検定（Pletnev, A.G. 2001 Virology 282: 288-300）およびＷＮ−特異的マウス抗体を用いてベロ細胞で決定した場合、２．６×１０7フォーカス形成単位／ミリリットル（ＦＦＵ／ｍｌ）の力価を有した。デングウイルスに目を向けると、野生型ＤＥＮ４カリブ株８１４６６９（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ３２６５７３）が用いられ、これはベロ細胞中で複製され、力価は１．１×１０8ＦＦＵ／ｍｌであった。組換えＤＥＮ４ゲノムの配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ３２６８２５（表１による）として入手可能であり、そしてＤＥＮ４のその他の株は、ＤＥＮ４ゲノムの配列の代わりに用いられ得る。ＤＥＮ１ゲノムの配列はＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｕ８８５３６として入手可能であり、ＤＥＮ２ゲノムの配列はＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍ１９１９７として入手可能であり、そしてＤＥＮ３ゲノムの配列はＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍ９３１３０として入手可能であり、ならびにこれらの配列のいずれかはＤＥＮ４ゲノムの配列の代わりに用いられ得る。
【００５０】
キメラＷＮ／ＤＥＮ４  ｃＤＮＡおよび感染性ウイルスの回収
キメラＴＢＥＶ／ＤＥＮ４およびＬＧＴ／ＤＥＮ４ウイルス（Pletnev, A.G. et al. 1992 PNAS USA 89: 10532-10536; Pletnev, A.G. & Men, R. 1998 PNAS. USA 95: 1746-1751）の回収のために前に用いたＤＥＮ４全長感染性ｃＤＮＡを含有するプラスミドｐ２Ａ（ＸｈｏＩ）（Bray, M. & Lai, C.-J. 1991 PNAS USA 88: 10342-10346）を、ＷＮ／Ｄ
ＥＮ４  ｃＤＮＡの構築のために用いた。これは、ＷＮｐｒＭおよびＥタンパク質遺伝子のｃＤＮＡを対応するＤＥＮ４遺伝子のｃＤＮＡの代わりに用いることにより達成した（図１Ｂ）。ＷＮ  ｃＤＮＡの供給源は、ＷＮ  ＮＹ９９株ゲノムのヌクレオチド（ｎｔｓ）２３３〜２７５８を含むＰＣＲ産物であった。これは、R. Lanciotti博士（CDC）の御厚意により提供いただいた。このＰＣＲ断片中の構造タンパク質遺伝子のヌクレオチド配列を確定し、ＷＮ  ＮＹ９９の発表済み配列と比較した（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ１９６８３５）。３つのヌクレオチド差（Ｃ1893→Ｕ、Ｃ2370→ＵおよびＣ2385→Ａ）がＥタンパク質配列中に同定されたが、こらはいずれもアミノ酸置換を生じなかった。
【００５１】
ダニ媒介性／ＤＥＮ４キメラの構築および分析を伴う従来の経験は、生育可能性のために必要とされるＤＥＮ４  Ｃタンパク質／ダニ媒介性フラビウイルスｐｒＭタンパク質接合部の配列を先験的に予測できない、ということを示した（Pletnev, A.G. et al. 1992 PNAS USA 89: 10532-10536; Pletnev, A.G. & Men, R. 1998 PNAS USA 95: 1746-1751）。この理由のために、われわれは経験的アプローチを採用し、いくつかの異なるＣ／ｐｒＭ接合部配列を試験した（図２）。これは、ＷＮ  ＥのＣＯＯＨ末端領域内に位置したため、下流接合部に必要でなかった。最初に、３組のＣ／ｐｒＭ接合部を試験したが、しかし生育可能なＷＮ／ＤＥＮ４キメラを生じたのは１組だけであった（図２）。ＰＣＲによるキメラの構築のために用いられたプライマーは、オリゴヌクレオチド５’−ＴＣＡＡＡＡＣＡＡＡＡＧＡＡＡＡＧＡＴＣＴＧＣＡＧＴＧＡＣＣＧＧＡＡＴＴＧＣＡＧＴＣＡＴＧＡＴＴＧＧＣ−３’（配列番号３４）または５’−ＴＣＡＡＡＡＣＡＡＡＡＧＡＡＡＡＧＡＴＣＴＧＣＡＧＧＧＡＣＣＧＧＡＡＴＴＧＣＡＧＴＣＡＴＧＡＴＴＧＧＣ−３’（配列番号３５）または５’−ＴＣＡＡＡＡＣＡＡＡＡＧＡＡＡＡＧＡＴＣＴＧＣＡＧＡＣＡＣＣＧＧＡＡＴＴＧＣＡＧＴＣＡＴＧＡＴＴＧＧＣ−３’（配列番号３６）を正プライマーとして、ならびにオリゴヌクレオチド５’−ＣＣＧＣＡＡＧＡＡＡＣＧＴＣＡＴＡＧＣＡＡＴＴＧＡＣＣＴＧＴＣＡＣＴＣＧＡＧＴＴＧＡＴＴＣＣＣＡＴＣＣＡＣＡＡＣＡＧＡＡＧＡＧＣ−３’（配列番号３７）を逆プライマーとして用いた。その両方がＰｓｔＩおよびＸｈｏＩにより消化されるＰＣＲ産物およびベクターを含有するライゲーション混合物を用いた大腸菌ＢＤ１５２８の形質転換後、安定全長ＷＮ／ＤＥＮ４  ｃＤＮＡクローンを同定した（図２）。各キメラプラスミド中のＷＮおよびＤＥＮ４遺伝子間の接合部の配列を立証した。
【００５２】
全長ＷＮ／ＤＥＮ４  ｃＤＮＡを含有するプラスミドＤＮＡを、Ａｓｐ７１８でリニアライズした。ｉｎ  ｖｉｔｒｏＲＮＡ合成ならびにそのＲＮＡ転写体による細胞のトランスフェクションを前述したように実施した（Pletnev, A.G. 2001 Virology 282: 288-300）。簡潔には、図２に列挙した全長ＷＮ／ＤＥＮ４構築物のＲＮＡ転写体を用いて、L. Markoff博士（CBER, FDA）の御厚意で提供されたＢＳＬ−３実験室でリポフェクトアミン２０００（Lipofect Amine 2000）試薬（GIBCO, BRL, Gaithersburg, MD）の存在下で、サルＬＬＣＭＫ2、サルベロ細胞または蚊Ｃ６／３６細胞をトランスフェクトした。ＷＮまたはＤＥＮ４特異的高度免疫マウス腹水（ＨＭＡＦ）を用いて、ＷＮまたはＤＥＮ４タンパク質の存在に関して、免疫蛍光検定（ＩＦＡ）によりトランスフェクト細胞を検査した。ＷＮ／ＤＥＮ４群４接合部を含有する２つの感染性キメラウイルス（図２）、即ちＷＮ／ＤＥＮ４クローン１８および５５を単離した。回収キメラをサルベロまたは蚊Ｃ６／３６細胞中で一旦増幅し、ウイルスＲＮＡを単離して、次に配列分析のために用いるｃＤＮＡ中に逆転写した（表１）。同様にして、２回の限界希釈による付加的精製および０．０１の多重度で感染させたベロ細胞中での増幅後、ベロ細胞由来ＷＮ／ＤＥＮ４クローン１８の配列を確定した。その結果生じたウイルス懸濁液は、１．７×１０6ＦＦＵ／ｍｌの力価を有した。
【００５３】
ＷＮ／ＤＥＮ４ゲノムの３’非翻訳化領域（ＵＴＲ）中に欠失を導入するために、ＸｈｏＩ部位（ＤＥＮ４ゲノムのｎｔ  ２３４５；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ３２６８２７
）およびプラスミドＷＮ／ＤＥＮ４−１８ＤＮＡの３’末端のＡｓｐ７１８部位間のＤＮＡ断片を、ＤＥＮ４変異体、クローンｐ４Δ３０の全長ｃＤＮＡの対応するＸｈｏＩ−Ａｓｐ７１８断片により置換した（Durbin et al. 2001 Am J Trop Med. Hyg 65: 405-413）。この変異体は、ｎｔｓ  １０４７８〜１０５０７間にゲノムの３’非翻訳化領域（ＵＴＲ）から欠失された３０ｎｔｓを有した。１０の異なるプラスミドからＳＰ６ポリメラーゼにより生成された全長ＲＮＡを、サルベロ細胞のトランスフェクションにより感染性に関して試験した。２つの個々のＷＮ／ＤＥＮ４−３’Δ３０  ｃＤＮＡクローンは感染性であった。救出欠失変異型ＷＮ／ＤＥＮ４−３’Δ３０クローン１および７８を、限界希釈により２回精製し、ベロ細胞においてそれぞれ１．４×１０5および６×１０4ＦＦＵ／ｍｌの力価に増幅した。ウイルスＲＮＡを単離し、３’欠失変異型ゲノムの完全配列を確定した（表１）。
【００５４】
マウスにおける親およびキメラウイルスの評価
ベロ細胞培養−増殖化親ＷＮ（ＮＹ９９株）、親ＤＥＮ４（８１４６６９株）、キメラＷＮ／ＤＥＮ４（クローン１８）およびその欠失変異体（クローン１）の神経毒性を、ＢＳＬ−３施設で評価した。９〜１２の群中の３日齢スイスウェブスターマウス（Taconic Farms）を、０．０３ｍｌのＭＥＭ／０．２５％ヒト血清アルブミン中の０．１〜１０5ＦＦＵのウイルスの範囲の十倍ごとの希釈で、脳内（ＩＣ）経路により接種した。致死的脳炎の発症に関して、マウスを２１日間観察した。Reed and Muench（Reed, L.J. & Muench, H. 1938 Am. J Hyg 27: 493-497）の方法により、各ウイルスの５０％致死用量（ＬＤ50）を確定した。１０の群中での３週齢スイス雌マウスの腹腔内（ＩＰ）接種による末梢毒性に関しても、親およびキメラウイルスを分析した。マウスを０．１〜１０5ＦＦＵの範囲のウイルスの十倍ごとの希釈で接種し、致死的脳炎に関して２８日間観察した。瀕死マウスは、慈悲深く安楽死させた。
【００５５】
ＩＰ接種を生き残ったマウスを２８日目に採血し、ＷＮ特異的中和抗体応答を評価した。各群のマウスからの血清をプールし、血清プールのＷＮウイルス−中和抗体力価を、前述のようにベロ細胞中でのＦＦＵ低減検定により確定した（Pletnev, A.G. et al. 2001 J Virol 75: 8259- 8267; Pletnev, A.G. 2001 Virology 282: 288-300）。簡潔には、プール血清の１：１０希釈液を、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＭＥＭ中に調製し、次に５６℃で３０分間加熱不活性化した。不活性化プール血清の連続２倍希釈液を、約５０ＦＦＵのＷＮを含有する等容積のウイルス懸濁液と混合した。混合物を３７℃で３０分間インキュベートし、次に０．４ｍｌを６ウエルプレート中のベロ細胞の二重反復実験ウエルに付加した。３７℃で１時間の吸収後、接種物を除去し、２％ＦＢＳ、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、０．２５μｇ／ｍｌフンギゾンおよび１％トラガカントゴムを含有するＭＥＭで細胞を覆った。ＷＮ特異的ＨＭＡＦを用いた免疫染色フォーカス形成検定（Pletnev, A.G. 2001 Virology 282: 288-300）により、インキュベーションの２日後に抗体力価を確定した。中和抗体力価は、非免疫感作マウスから収集した血清と比較してフォーカス形成を５０％低減したプール血清の最高希釈液であった。
【００５６】
親ＷＮウイルスの１００ＩＰ  ＬＤ50（１０3ＦＦＵ）を用いて２９日目に生存マウスをＩＰ曝露し、２１日間、致死的脳炎に関して観察した。瀕死マウスは慈悲深く安楽死させた。
【００５７】
結果
キメラＷＮ／ＤＥＮ４ウイルスの構築および回収
全体で、ＤＥＮ４の他の全ての配列とともにＷＮ  ＮＹ９９株の構造ｐｒＭおよびＥタンパク質遺伝子を含む全長キメラＷＮ／ＤＥＮ４  ｃＤＮＡを含有する１８のプラスミドを、われわれは構築した（図２）。１８のキメラｃＤＮＡのうちの２つのみからＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼにより生成された全長ＲＮＡは、蚊Ｃ６／３６またはサルベロ細胞中
にトランスフェクトされた場合、感染性であった。ウイルス感染性に関する証拠を、ＩＦＡにより検出した。２つの生育可能なキメラウイルスの場合、トランスフェクト細胞の８０〜１００％が、ＷＮ特異的ＨＭＡＦを用いてＩＦＡにより指示通りに５日目までに感染された。２つの生育可能なキメラウイルス（ＷＮ／ＤＥＮ４クローン１８および５５）は、図２に示した、即ちそれぞれ切断部位の＋３Ａｓｐおよび＋６Ｔｈｒアミノ酸下流に、群４キメラのＣ／ｐｒＭ遺伝子間接合配列を有した。この接合部の存在を、回収キメラの配列分析により確証した。さらにまた、ベロ細胞中のｃＤＮＡから救出された２つのキメラの完全遺伝子配列を確定し、それらの親ＷＮ  ＮＹ９９およびＤＥＮ４ウイルスのコンセンサス配列と、ならびに感染性ＲＮＡ転写体が由来するプラスミドＤＮＡ中のＷＮ／ＤＥＮ４ウイルスキメラ挿入物のヌクレオチド配列と比較した（表１）。プラスミドＤＮＡの分析は、ＷＮ  ＮＹ９９株の高力価懸濁液のＲＴ−ＰＣＲにより確定されたコンセンサスＷＮ配列のヌクレオチド配列中の４つの差を明示した。これらの差異のうちの３つは、ｐｒＭ（Ｉｌｅ6→ＴｈｒおよびＩｌｅ146→Ｖａｌ）およびＥ（Ｔｈｒ282→Ａｌａ）におけるアミノ酸置換を生じた。さらに（ｉ）Ｇｌｕ92およびＡｓｐならびに（ｉｉ）Ｌｅｕ112およびＳｅｒ間の生育可能性を、ＷＮ／ＤＥＮ４クローン５５のＤＥＮ４ＮＳ３およびＮＳ４Ｂ非構造タンパク質で同定した。さらにまた、ベロ細胞増殖ＷＮ／ＤＥＮ４クローン１８の配列は、ＤＥＮ４  ＮＳ４Ｂ遺伝子中のその先祖プラスミドｃＤＮＡ配列とは異なった。置換Ｌｅｕ112→Ｓｅｒを引き起こす変化Ｕ7162→Ｃを同定したが、これは前に観察された（Blaney, J.E. et al. 2001 J Virol 75: 9731-9740）。興味深いことに、この遺伝子座での異なる置換Ｌｅｕ112→Ｐｈｅも、ベロ細胞中での野生型ＤＥＮ４の継代時にBlaney等により前に観察された。
【００５８】
全長感染性ＷＮ／ＤＥＮ４  ｃＤＮＡの構築にわれわれが成功した後、それらの３’非翻訳化領域（ＵＴＲ）中の３０ヌクレオチド欠失を伴うキメラウイルス変異体をわれわれは構築した。２つの変異型ＷＮ／ＤＥＮ４−３’Δ３０クローン１およびクローン７８を、トランスフェクト化ベロ細胞から回収した。これら両クローンの完全配列を分析した（表１）。クローン７８の配列は、その感染性ＲＮＡ転写体が由来するプラスミドＤＮＡの配列と異なった。Ｃ7141→Ｕの変化は、ＮＳ４Ｂタンパク質中のアミノ酸置換Ｔｈｒ105→Ｉｌｅを生じた。ＷＮ／ＤＥＮ４−３’Δ３０クローン１は、プラスミドｃＤＮＡ配列と１つだけのヌクレオチド差も示した。これは、ＷＮ／ＤＥＮ４クローン１８で観察された同一ＮＳ４Ｂアミノ酸変化（Ｌｅｕ112→Ｓｅｒ）を生じた。
【００５９】
ＷＮ／ＤＥＮ４キメラは、ＷＮ／ＤＥＮ４−３’Δ３０の場合と比べてベロ細胞中でより効率的に複製した。非修飾ＷＮ／ＤＥＮ４キメラは、０．０１の感染多重度で感染させた細胞中で６日目に１０6ＦＦＵ／ｍｌの力価に達した。これは６日までに欠失変異体が達成した力価より約１０倍高かった。非修飾キメラの力価は、同一条件下で親ＤＥＮ４により達成されたものとほぼ同一であった。
【００６０】
マウス神経毒性
マウスにおけるビルレンスに関するキメラウイルスの評価の前に、ベロ細胞救出キメラＷＮ／ＤＥＮ４ウイルスおよびその３’欠失変異体を、限界希釈により生物学的に２倍にクローン化し、次に適格ベロ細胞中で増幅した。ベロ細胞適合ＷＮ／ＤＥＮ４クローン１８およびＷＮ／ＤＥＮ４−３’Δ３０クローン１が達成した力価は、それぞれ１．７×１０6ＦＦＵ／ｍｌおよび１．４×１０5ＦＦＵ／ｍｌであった。
【００６１】
キメラＷＮ／ＤＥＮ４ウイルスおよび欠失変異型ＷＮ／ＤＥＮ４−３’Δ３０、ならびに親ＷＮ  ＮＹ９９株およびＤＥＮ４  ８１４６６９株ウイルスを、直接ＩＣ接種により、神経毒性に関して３日齢スイスマウスで評価した（表２）。ベロ細胞中で増殖させた野生型ＷＮ  ＮＹ９９は高神経毒性で、乳児スイスマウスにおいて０．３５ＦＦＵの脳内ＬＤ50を有した。これもまたベロ細胞中で増殖させた野生型ＤＥＮ４は低神経毒性で、ＩＣ
ＬＤ50は４０７ＦＦＵであった。ＷＮ／ＤＥＮ４およびＷＮ／ＤＥＮ４−３’Δ３０キメラウイルスはともに、それらのＷＮおよびＤＥＮ４親と比較して神経毒性の有意な低減を示した。１０3ＦＦＵのＷＮ／ＤＥＮ４またはその３’欠失変異体をＩＣ接種されたマウスは全て、２１日の観察期間中、生存した。１０4ＦＦＵというより高用量では、ＷＮ／ＤＥＮ４を接種された１１匹のマウスのうち死亡したのは４匹だけであった。したがって乳児マウスでは、ＷＮ／ＤＥＮ４キメラはそのＷＮ親の２８，５７１分の１より多い神経毒性であった。３０ｎｔ欠失を有するキメラも、そのＷＮ親より有意に低い神経毒性を有した。これらの観察は、ＤＥＮ４とのＴＢＥＶまたはＬＧＴのキメラ化がマウスに関するそれらの神経毒性を有意に低減したという初期の観察と一致する（Pletnev, A.G. et al. 1992 PNAS USA 89: 10532-10536; Pletnev, A.G. & Men, R. 1998 PNAS USA 95: 1746-1751; Pletnev, A.G., Bray, M. & Lai, C.-J. 1993 J Virol 67: 4956-4963）。
【００６２】
マウスにおける末梢毒性
その後、末梢毒性に関して、即ち末梢部位から中枢神経系に蔓延し、脳炎を引き起こすＩＰ経路により接種されたウイルスの能力に関して、キメラウイルスをわれわれは評価した。両キメラは、それらのＷＮ親と比較して高度に弱毒化された（表２および表３）。注目すべきは、１０4ＦＦＵの欠失変異型キメラまたは１０5ＦＦＵの非修飾キメラのＩＰ接種は、３週齢スイスマウスのいずれにおいても致死的脳炎を誘導しなかったが、一方、ＷＮ親に関するＩＰ  ＬＤ50は１０ＦＦＵであった。
【００６３】
ダニ媒介性フラビウイルスおよびそれらのＤＥＮ４キメラの過去の試験が、ＳＣＩＤマウスは免疫適格マウスよりも末梢毒性に関してより高い感受性検出体であることを示したため、成体ＳＣＩＤマウスにおいてもキメラを評価した。最大量のキメラ、即ちＷＮ／ＤＥＮ４に関しては１０5ＦＦＵおよびＷＮ／ＤＥＮ４−３’Δ３０に関しては１０4ＦＦＵの腹腔内接種は、いかなる場合にも脳炎を生じなかった（表２）。これに対比して、親ＷＮに関するＩＰ  ＬＤ50は６ＦＦＵであった。これらの観察は、ＷＮキメラの末梢毒性の除去が達成されていた、ということを確証した。
【００６４】
マウスにおけるキメラウイルスの免疫原性および防御効力
２つのキメラは免疫原性であった。１０2ＦＦＵのＷＮ／ＤＥＮ４キメラの１回ＩＰ接種は、中等度レベルの血清ＷＮ中和抗体（１：９３）を誘導し、一方、１０倍高い濃度（１０3ＦＦＵ）は、非常に高い力価のＷＮ中和抗体（１：１１８９）を誘導した（表３）。さらにまた、１０3ＦＦＵのキメラＷＮ／ＤＥＮ４−３’Δ３０欠失変異体は、高レベルのこのような抗体（１：２９２）を刺激した。親ＷＮの１００ＩＰ  ＬＤ50（１０3ＦＦＵ）による２９日目の免疫感作マウスの腹腔内曝露は、この高用量のＷＮ曝露に対して９０〜１００％防御をキメラが提供することを示した（表３）。免疫感作に応答して発現された血清ＷＮ中和抗体の力価と誘導された耐性の程度との間には良好な相関が認められた。非ワクチン接種対照マウスは全て、１００ＩＰ  ＬＤ50のＷＮによる曝露の７〜１３日後にＣＮＳ疾患の徴候を発症し、そしてこれらの動物はその直後に死亡した。ＷＮに対する年齢に関連する耐性が存在するか否かを確定するために、別の群の７週齢マウスも対照として供した。それらは曝露時点で免疫感作マウスと同一齢であった。この群のより高齢の対照マウスを、３週齢マウスにおいて確定された１回ＩＰ  ＬＤ50で曝露した。８匹のマウスのうち７匹は２１日の観察期間中に死亡した。これは、ＷＮに対するマウスの年齢依存性耐性が免疫感作の観察された防御作用における一因子でないことを示した。
【００６５】
【表１】
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【００６６】
【表２】
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【００６７】
【表３】
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【００６８】
【表４】
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【００６９】
【表５】
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【００７０】
アカゲザルにおける西ナイルウイルス／ＤＥＮ４キメラの弱毒化、免疫原性および防御
効力
いくつかの非ヒト霊長類は末梢経路により多数のフラビウイルスに容易に感染する、ということが確定されている（Simmons et al. 1931 Philipp J Sci 44: 1-247; Rosen, 1958 Am J Trop Med Hyg 7: 406-410）。したがってサルの感染は、ヒトのフラビウイルス感染に最も密接な実験系を表す。フラビウイルス感染に対するサルの応答は、４〜６日のウイルス血症が認められるという点でヒトの場合に類似するが、しかしより下等な霊長類は臨床的フラビウイルス症候を通常は発症しない。サルにおけるフラビウイルス試験の目的は、（１）種々の候補ワクチンの免疫原性を評価すること；（２）ウイルス血症の継続期間（日）およびピークウイルス力価（ＦＦＵ／ｍｌ）により測定した場合の候補ワクチンの感染性およびビルレンス（弱毒化表現型）を評価すること；ならびに（３）野生型フラビウイルスによる曝露に対する候補ワクチンの防御効力を評価することである。
【００７１】
（１）接種：ＳＰＧを含有するＬ１５培地中に希釈した合計１０5または１０6ＦＦＵのウイルスを各サルに接種する（Durbin, A. P. et al. 2001 Am J Trop Med Hyg 65: 405-413）。普通は、麻酔動物に皮下経路によりウイルスを接種する。
【００７２】
（２）血液採取：ウイルス接種後、２週間毎日３．０ｍｌの血液試料、そして３週目、４週目、５週目および６週目に５．０ｍｌの血液試料を採取する。
【００７３】
（３）親野生型フラビウイルスによる曝露：防御効力を評価するのにウイルス曝露が適切であると思われる場合、１．０ｍｌの容積中に１０5ＦＦＵ／用量で野生型ウイルスをサルの上腕域に皮下接種する。
【００７４】
（４）実験室検定：以下の（ａ）直接ウイルスプラークまたはＦＦＵ検定によるウイルス血症の持続期間およびレベル；ならびに（ｂ）ＦＦＵ低減中和試験により測定した場合に誘導される中和抗体の力価（試験は全て、ワクチン開発の技術分野の熟練者に既知である）を確定するために用いられる血清試料を採取する。
【００７５】
２０匹のアカゲザルにおいて、西ナイルウイルス／ＤＥＮ４キメラの弱毒化、免疫原性および防御効力を試験した（表４および表５）。８匹のサルにＷＮ／ＤＥＮ４（クローン１８）を皮下（ＳＣ）接種した；４匹は１０5ＦＦＵを摂取したが、一方他の４匹は１０6ＦＦＵを摂取した。４匹のサルに１０5ＦＦＵのＷＮ／ＤＥＮ４−３’Δ３０（クローン１）をＳＣ接種した。４匹の一群には親西ナイルウイルスをＳＣ接種した；２匹は１０5ＦＦＵを摂取したが、一方他の２匹は１０6ＦＦＵを摂取した。最後に、別の群の４匹に１０6のＤＥＮ４をＳＣ接種した（表４）。
【００７６】
１０5または１０6ＦＦＵの西ナイルウイルスをＳＣ接種されたサルは各々、５〜６日間存続するウイルス血症を発症し、２．６〜２．８ｌｏｇ10（ＦＦＵ／ｍｌ）の平均ピーク力価を達成した（図３、表４）。これに対比して、ＷＮ／ＤＥＮ４は、１０5または１０6ＦＦＵを接種された８匹のサルのうち５匹においてのみウイルス血症を誘導した。ウイルス血症は１〜２日のみ存続し、ＷＮ感染したサルに関して観察されたものの１００分の１以下のピーク力価を達成した。１０5ＦＦＵのＷＮ／ＤＥＮ４−３’Δ３０変異体をＳＣ接種されたサル４匹の各々が、検出可能なウイルス血症を発症し得なかったことは、有意である。
【００７７】
ＷＮ／ＤＥＮ４キメラおよびその欠失変異体はアカゲザルに関して有意に弱毒化されたが、しかしこれらのハイブリッドウイルスは中〜高レベルの血清ＷＮ中和抗体を各免疫感作動物において誘導した（表５）。２つのキメラは、免疫感作後４２日目に、１０5ＦＦＵの西ナイルウイルスによるＳＣ曝露に対する完全耐性も誘導した。ＷＮのウイルス血症は、ＷＮ／ＤＥＮ４またはその欠失変異体で免疫感作された１２匹のサルのいずれにおい
ても検出されなかった。西ナイル曝露ウイルスは、ＤＥＮ４ウイルスに予め感染させたサルにおいて効率的に複製した。これは、ＷＮ／ＤＥＮ４キメラウイルスを用いた感染によりもたらされるＷＮ曝露に対する高レベルの防御が、キメラにおけるＷＮ防御性抗原により特定され、キメラのＤＥＮ４構成成分によっては特定されない、ということを示す。
【００７８】
Δ３０突然変異は、ＤＥＮ４ウイルスにおいて先ず説明され、キャラクタライズされた（Men, R. et al. 1996 J Virol 70: 3930-7）。ＤＥＮ４において、突然変異は、ＴＬ２と呼ばれる推定ステムループ構造を形成する（Proutski, V. et al. 1997 Nucleic Acids
Res 25: 1194-202）３’ＵＴＲのヌクレオチド１０４７８〜１０５０７を含む３０連続ヌクレオチドの除去から成る（図４Ａ）。フラビウイルスの間では、ＵＴＲの大部分は高度保存二次構造を形成する（Hahn, C.S. et al. 1987 J Mol Biol 198: 33-41; Proutski, V. et al. 1997 Nucleic Acids Res 25: 1194-202）。個々のヌクレオチドはこの領域で必ずしも保存されないが、しかし適切な塩基対合は、各血清型中のステムループ構造を保存し、実際は、一次配列を考察するのみである場合には容易に認められない（図４Ｂ、Ｃ）。Δ３０突然変異は、他のＤＥＮ血清型、ＤＥＮ１（Whitehead, S.S. et al. 2003 J Virol 77: 1653-1657）およびＤＥＮ２（Ｔｏｎｇａ／７４）（米国特許仮出願第ＮＩＨ２３０．００２ＰＲとして２００２年１２月２３日提出）に輸送可能である弱毒化表現型を特定する、ということをわれわれは実証した。これは、Δ３０突然変異がＤＥＮ３野生型ウイルスに及ぼす対応する作用を有すると予測される、ということを示す。ウイルスのＴＬ２領域の欠失によりこの存続ウイルス、例えばＤＥＮ３（Ｓｌｅｍａｎ／７８）を構築することを、をわれわれは予見する（図４Ｃ）。これらの弱毒化または野生型ＤＥＮ１、ＤＥＮ２またはＤＥＮ３ウイルスは、これらの実施例において示されたＤＥＮ４野生型またはＤＥＮ４−３’Δ３０ウイルスに容易に置き換わり得る。
【００７９】
これらの知見は特に、２つの候補ＷＮ生弱毒化ウイルスワクチンを同定する。第一のＷＮ／ＤＥＮ４は、高度制限レベルのウイルス血症により示されるように、ＷＮ野生型ウイルスと比較して約１００倍弱毒化される。第二のウイルスＷＮ／ＤＥＮ４−３’Δ３０は、サル血清中のウイルス血症の非存在により、そして血清中和抗体応答の中等度の低減により示されるように、ＷＮ／ＤＥＮ４より弱毒化される。したがって教示された方法およびウイルスは、異なるレベルの弱毒化を示し、その各々が野生型ＷＮウイルス曝露に対して高度に防御的である生弱毒化ＷＮワクチンを提供する。ＤＥＮ１、ＤＥＮ２またはＤＥＮ３バックグラウンドに関する同様の弱毒化ＷＮ／ＤＥＮ４キメラウイルスが予見される。
【００８０】
これらのワクチン候補の構成成分として役立つＤＥＮ４の非構造タンパク質に関する遺伝子中の付加変異の導入によるＷＮ／ＤＥＮ４キメラのさらなる弱毒化。
必要な場合には、１つまたは複数の弱毒化変異をキメラのＤＥＮ４構成成分に付加することにより、候補ワクチンＷＮ／ＤＥＮ４またはＷＮ／ＤＥＮ４−３’Δ３０キメラの弱毒化のレベル増大を達成することを、をわれわれは意図する。マウスにおけるＤＥＮ４を弱毒化する大きな組の突然変異（Blaney, et al. 2001 J Virol 75: 9731-9740; Blaney,
et al. 2002 Virology 300: 125-139; Hanley, et al. 2002 J Virol 76: 525-31）が、ＷＮ／ＤＥＮ４キメラウイルス中に含まれるＤＥＮ４ゲノムの一部で同定された。この組の弱毒化変異の成員は、これらのウイルスをさらに弱毒化するためにＷＮ／ＤＥＮ４キメラウイルス中に導入され得る。例えば、上記のような多少の残存神経毒性を保有するＷＮ／ＤＥＮ４ウイルスをさらに弱毒化することが必要であり得る。さらなる弱毒化を達成するためのこのアプローチの実現可能性は、乳児マウス脳における温度感受性表現型、ならびに増殖制限の表現型を特定する生育可能な突然変異を、ＷＮ／ＤＥＮ４キメラのＤＥＮ４構成成分の非構造タンパク質３（ＮＳ３）中に導入することにより例示される。突然変異４８９１（イソロイシン→トレオニン）は、ＤＥＮ４のＮＳ３遺伝子のヌクレオチド４８９１で以前に同定されていた（Blaney, et al. 2002 Virology 300: 125-139）。突然
変異４８９１は、２つの望ましい表現型、即ち脳組織における温度感受性および増殖制限を特定した。同様に突然変異４９９５（セリン→プロリン）も、ＮＳ３において、同一の２つの望ましい表現型を特定した（Blaney, et al. 2001 J Virology 75: 9731-9740, 2001）。４８９１および４９９５突然変異は、ベロ細胞中でのＤＥＮ４の複製適性も増大する。即ちそれらはベロ細胞適合変異である。ＤＥＮ４  ４８９１の野生型アミノ酸残基（イソロイシン）は、ＤＥＮ２  Ｔｏｎｇａ／７４およびＤＥＮ３  Ｓｌｅｍａｎ／７８においては保存されるが、しかしＤＥＮ１ＷｅｓｔＰａｃｉｆｉｃでは保存されない。ＤＥＮ４  ４９９５の野生型アミノ酸残基（セリン）は、ＤＥＮ１  ＷｅｓｔＰａｃｉｆｉｃ、ＤＥＮ２  Ｔｏｎｇａ／７４で保存されるが、しかしＤＥＮ３  Ｓｌｅｍａｎでは保存されない。これらの突然変異の一方または両方は、ＷＮ／ＤＥＮ１、２または３キメラ中にも含まれる。したがってＷＮ／ＤＥＮ４ウイルス中のそれらの含入は、ベロ細胞中のウイルスの複製増大またはベロ細胞で製造中の突然変異の遺伝子安定性を達成する場合に意図される。
【００８１】
考察
最初に、遠縁のダニ媒介性および蚊媒介性フラビウイルスのｐｒＭおよびＥタンパク質は高度分岐性であるが、しかしこれらのタンパク質は、ウイルス生育可能性を損失せずに、いくつかの場合には交換され得る、ということをわれわれは実証した（Pletnev, A.G. et al. 1992 PNAS USA 89: 10532-10536; Pletnev, A.G. & Men, R. 1998 PNAS USA 95: 1746-1751）。このアプローチは、新規のキメラフラビウイルスを作製するために用いられた（Bray, M., Men, R. & Lai, C.-J. 1996 J. Virol. 70: 4162-4166; Chambers, T.J. et al. 1999 J Virol 73: 3095-3101; Guirakhoo, F. et al. 2000 J Virol 74: 5477-5485; Huang, C.Y. et al. 2000 J Virol 74: 3020-3028; Van Der Most, R.G. et al. 2000 J Virol 74: 8094-8101; Caufour, P.S. et al. 2001 Virus Res 79: 1-14）。
【００８２】
生育可能なダニ媒介性／ＤＥＮ４キメラを構築し、回収することに、以前われわれは成功した（Pletnev, A.G. et al. 1992 PNAS USA 89: 10532-10536; Pletnev, A.G. & Men,
R. 1998 PNAS USA 95: 1746-1751; Pletnev, A.G., Bray, M. & Lai, C.-J. 1993 J Virol 67: 4956-4963）。これらの場合、ダニ媒介性フラビウイルス親は、ダニ媒介性脳炎ウイルス、高ビルレントウイルスまたはランガットウイルス、天然弱毒化ダニ媒介性ウイルスであった。したがってこれらのキメラの２つの構成成分は、不同性のベクター宿主を、即ちダニ、そしてＤＥＮ４の場合には蚊を有した。キメラにおける遺伝子産物相互作用の効率低減は、これらのハイブリッドウイルスにより示される顕著な弱毒化のための基礎であると考えられた。それにもかかわらず、マウスにおいて高度に弱毒化されるが、しかしＴＢＥＶ／ＤＥＮ４およびＬＧＴ／ＤＥＮ４キメラは免疫原性で、そしてそれらの親ダニ媒介性フラビウイルスに対するかなりの防御を提供した。本発明の場合には、ＷＮ／ＤＥＮ４キメラの両ウイルス親は、蚊により伝播される。しかしながらベクター選択性は異なり、ＤＥＮ４に関してはヤブカ属（Aedes）、ＷＮに関してはイエカ属（Culex）である（Burke, D.S. & Monath, T.P. 2001 in  Fields Virology, eds. Knipe, D.M. & Howley, P.M. Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia, 4-th ed., pp. 1043-1125; Hayes, C.G. 1989 in The Arboviruses: Epidemiology and Ecology, ed. Monath T.P. Boca
Raton, F. L.: CRC Press, Volume V, pp. 59-88）。
【００８３】
本発明の試験において、その遺伝子が構造ｐｒＭおよびＥタンパク質に関してＷＮ  ＮＹ９９株の対応する遺伝子により置換されたＤＥＮ４ゲノムを含有する生育可能なＷＮ／ＤＥＮ４キメラをわれわれは構築した。フラビウイルスの間では、ＣおよびｐｒＭ間の疎水性ドメイン（「膜貫通シグナルドメイン」）は配列中で変わり、長さも１４〜２０アミノ酸まで変わる（Stocks, C.E. & Lobigs, M. 1998 J Virol 72: 2141-2149）。それは、このタンパク質の翻訳後成熟が起こる小胞体管腔中へのｐｒＭタンパク質の移行のためのシグナル配列として作用する（Lindenbach, B.D. & Rice, C.M. 2001 in Fields Virolog
y, eds. Knipe, D.M. & Howley, P.M. Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia, 4-th ed., pp. 1043-1125）。このシグナルペプチドは、そのＮＨ2末端領域でウイルスプロテアーゼＮＳ２Ｂ−ＮＳ３切断部位により、そしてそのＣＯＯＨ末端領域で細胞シグナラーゼ切断部位により側面に並ばれる。ＤＥＮ４  ＣおよびＷＮ  ｐｒＭタンパク質間のプロテアーゼ切断部位での４つの異なる接合部を、キメラ構築物中に別々に導入した（図２）。キメラ中のウイルスプロテアーゼ切断部位（ＫＲ↓Ｓ）でのＣ／ｐｒＭ融合配列を、キメラポリタンパク質のプロセシングのためのそのＮＳ２Ｂ−ＮＳ３プロテアーゼを提供するＤＥＮ４親の場合と同様であるよう構築した。しかしながら群１および２キメラのキメラ構築物の各々は、プロテアーゼ切断部位の下流の３位アミノ酸の膜貫通シグナル配列中に独自の置換を含有し、一方、別の配列は群３および群４キメラに共有される（図１Ａ、図２）。したがって構築物の膜貫通シグナルは、長さは類似するが、群１、群２および群３に関して、そして群４と一緒に多型性を示す。これは、プロテアーゼ切断部位の下流の３位アミノ酸で起こる。構築物第４（図２）が用いられた場合のみ、生育可能なＷＮ／ＤＥＮ４ウイルスを回収して、トランスフェクションのためのＲＮＡ転写体を調製した。３＋アミノ酸位置でのＡｓｐをコードする５つの別個のクローンのうちの２つから、感染性ウイルスを回収した。ＩｌｅをＴｈｒに置換したプロテアーゼ切断部位の下流の６＋アミノ酸位置に第二部位突然変異も含有する２つのクローンのみが、感染性であった。この突然変異は、細菌中でのｃＤＮＡのクローニング中に起きた（図２、表１）。これに対比して、３＋アミノ酸位置のＧｌｙまたはＶａｌをコードする１３のクローンのうち、トランスフェクション後に感染性ウイルスを産生したものはなかった。これは、ＣおよびｐｒＭ間の膜貫通シグナル配列がＷＮ／ＤＥＮ４キメラの情況における生育可能性の決定因子である、ということを示唆する。これは、ＣおよびｐｒＭタンパク質間の膜貫通シグナル配列が生育可能性および神経毒性に一役を演じる、という黄熱病ウイルスを用いてなされた初期の観察と一致する（Lee, E. et al. 2000 J. Virol. 74: 24-32）。
【００８４】
キメラの生育可能性に必要とされるキャプシドタンパク質−preＭタンパク質切断部位での＋３および＋６ＡｓｐおよびＴｈｒモチーフは、いずれの親の配列からも予測され得なかった。即ち、ＤＥＮ４および西ナイルウイルスは、親がこの＋３および＋６モチーフを有さなかったためである。切断部位での多数の不同性の配列を試験することにより成功が達成され、これが生育可能性に必要とされる＋３および＋６ＡｓｐおよびＴｈｒモチーフの同定をもたらした。この理由のために、等しく生育可能であるキメラウイルスを産生する他のモチーフの同定のために、いくつかの異なるＣ／ｐｒＭ接合部配列を試験することを包含する経験的アプローチをわれわれは支持する。
【００８５】
ＷＮ  ＮＹ９９株は、スイスマウスにおいてかなりのビルレンスを示した。そのＩＣ  ＬＤ50は、乳児マウスに関しては０．３５ＦＦＵであり、そのＩＰ  ＬＤ50は３週齢スイスマウスに関して１０ＦＦＵであった（表２）。ほぼ同一レベルの神経毒性が、ＣＤ−１（ＩＣＲ）マウスにおいて評価されたイスラエルで単離されたＷＮの野生型株に関して観察された。ＩＣ  ＬＤ50およびＩＰ  ＬＤ50はそれぞれ、１．１および４．３ＰＦＵと概算された（Halevy, M. et al. 1994 Arch Virol 137: 355-370）。さらに、ＷＮ  ＮＹ９９およびＷＮ  Ｉｓｒａｅｌ−１９９８間の高度のゲノム類似性（＞９９．８％）が、配列分析により近年確証された（Lanciotti, R.S. et al. 1999 Science 286: 2333-2337）が、これは、北米および中東ウイルスを表すＷＮの高度病原性株がともに密接に関連する、ということを示す。野生型ＤＥＮ４カリブ株８１４６６９は乳児マウスに関して中等度に神経毒性で、４０７ＦＦＵというＩＣ  ＬＤ50を有し、そしてそれはそのｃＤＮＡクローン化ウイルスより約２０倍以上ビルレントであった（Pletnev, A.G. & Men, R. 1998 PNAS USA 95: 1746-1751）。これに対比して、ＷＮ／ＤＥＮ４キメラおよびその３’欠失変異体は、それらの野生型ＤＥＮ４またはＷＮ親より有意に低い神経毒性を示した。ＷＮ／ＤＥＮ４キメラをＩＣ接種されたマウスの少数が、１０4ＦＦＵという高用量でのみ死亡する。さらにまた、この用量でＩＣ接種されるＷＮ／ＤＥＮ４キメラは、乳児マウスの
死亡を親ＷＮウイルスより遅くさせる：野生型ＷＮに関しては感染の４〜５日後、これに比してキメラに関しては感染の９〜１３日後。マウスの脳に関してＤＥＮ４ウイルスを弱毒化することが既知である突然変異の導入により、ＷＮ／ＤＥＮ４キメラウイルスのＩＣビルレンスのさらなる弱毒化を可能にするというさらなる方法および手法が教示される。さらに、付加的弱毒化変異の組入れによりＷＮ／ＤＥＮ４−３’Δ３０のさらなる弱毒化を達成することも、われわれは意図する。
【００８６】
野生型ＷＮ  ＮＹ９９株の高末梢毒性（ＩＰ  ＬＤ50：１０ＦＦＵ）にもかかわらず、ＤＥＮ４によるＷＮのキメラ化は、そのＷＮ親のこの特性を完全に除去した。したがって３週齢スイスマウスは、１０4または１０5ＦＦＵのキメラウイルスのＩＰ接種を生き残った。われわれの観察は、ＴＢＥＶまたはＬＧＴの末梢神経毒性の同様に大きい低減が、ＤＥＮ４によるキメラ化後に起きる、という初期の知見と一致する（Pletnev, A.G. et al.
1992 PNAS USA 89: 10532-10536; Pletnev, A.G. & Men, R. 1998 PNAS. USA 95: 1746-1751; Pletnev, A.G., Bray, M. & Lai, C.-J. 1993 J Virol 67: 4956-4963）。ＷＮ／ＤＥＮ４キメラがＳＣＩＤマウスで末梢毒性に関して試験された場合に、同様の観察がなされた（表２）。
【００８７】
高度に弱毒化されるが、しかしＷＮ／ＤＥＮ４キメラは、ＷＮ  ＮＹ９９に対する中〜高レベルの血清中和抗体を刺激した（表３）。免疫感作により誘導されるＷＮに対する中和抗体のレベルとその後の致死的ＷＮ曝露に対する耐性との間には、強い相関が認められた。キメラを接種されたマウスの免疫応答は用量依存性であり、非修飾ＷＮ／ＤＥＮ４キメラが、対応する３’欠失変異体よりもわずかに高免疫原性であることを示した。しかしながら１回１０3ＦＦＵ用量のＷＮ／ＤＥＮ４キメラまたはその３’欠失変異体が免疫感作のために用いられた場合に、ＷＮ曝露に対する９０〜１００％防御が達成された。さらに高い用量（１０4ＦＦＵ）のいずれかのキメラは、ＷＮ曝露に対する完全防御を提供した。ＷＮ／ＤＥＮ４およびＷＮ／ＤＥＮ４−３’Δ３０は、非ヒト霊長類（アカゲザル）においても、高度に弱毒化され、免疫原性で、そしてＷＮウイルス曝露に対して防御的であった。したがってキメラウイルスのＷＮ  ｐｒＭおよびＥタンパク質は、マウスおよびサルの両方において、高ビルレントＷＮによる曝露に対する完全防御を誘導可能な有効な抗原を代表する。マウスおよびサルにおけるキメラＷＮ／ＤＥＮ４ワクチン候補の安全性、免疫原性および防御効力に関するわれわれの観察は、ワクチン候補のわれわれの評価を、高度の危険に直面しているヒトに、そして家畜動物に、例えばウマまたは鳥類に拡大するための基礎を提供する。このようにして、ワクチンとしてのＷＮ／ＤＥＮ４キメラの使用が、ヒトおよび家畜動物、例えばウマまたは鳥類に関して予見される。
【００８８】
本発明を、明快にし、理解するために多少詳しく説明してきたが、本発明の真の範囲を逸脱しない限り、形態および詳細の種々の変更がなされ得ると、当業者は理解する。上で言及された図、表、付録、特許、特許出願および出版物は全て、それらの記載内容が参照により本明細書中で援用される。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１Ａ】フラビウイルスポリタンパク質の翻訳およびプロセシングを示す。上段は構造および非構造タンパク質コード領域を有するウイルスゲノムを描いており、５’キャップ、ならびに５’および３’非翻訳化領域（ＵＴＲ）を示す。ゲノムの下のボックスは、タンパク質分解的プロセシングカスケードにより生成される前駆体および成熟タンパク質を示す。成熟構造タンパク質を陰影ボックスで、そして非構造タンパク質および構造タンパク質前駆体を中白ボックスで示す。非荷電アミノ酸の連続伸長は、黒棒で示す。星印は、Ｎ連結グリカンを有するタンパク質を意味するが、しかし必ずしも利用される部位の位置または数を示すわけではない。宿主シグナラーゼ（菱型）、ウイルスセリンプロテアーゼ（下向き矢印）、フリンまたはその他のゴルジ局在化プロテアーゼ（ハート型）または未知のプロテアーゼ（？）の切断部位が示されている（Field's Virology, 2001 Fourth Edition, B.D. Lindenbach and C.M. Rice, page 998, Chapter 32より引用）。
【図１Ｂ】ＤＥＮ４のｐｒＭおよびＥタンパク質に関する遺伝子を西ナイルウイルスの対応する遺伝子に置き換えて、候補弱毒化ワクチン株として役立つＷＮ／ＤＥＮ４キメラを産生するために用いられる戦略を示す。
【図２】キメラＷＮ／ＤＥＮ４  ｃＤＮＡの部分の構造を示す。上段は、ゲノムの５’末端からＮＳ１遺伝子の３’末端までのキメラウイルスｃＤＮＡゲノムを示す。中黒ボックスは、ポリタンパク質中の疎水性ドメインを表す。垂直実線矢印は、ＣおよびｐｒＭタンパク質間のポリタンパク質中の考え得るＮＳ２Ｂ−ＮＳ３プロテアーゼ切断部位の位置を示す（キメラゲノム中の第一の接合部）。細胞シグナラーゼに関する切断部位は、中白三角（▽）により示される。ＷＮ前膜（ｐｒＭ）およびエンベロープ糖タンパク質（Ｅ）構造タンパク質遺伝子に関する配列を保有する制限酵素切断ＷＮｃＤＮＡ断片を、ＰｓｔＩおよびＸｈｏＩ部位でＤＥＮ４  ｃＤＮＡ中に挿入した（下線を施す）。第二の接合部は、２つの疎水性ドメイン間のＷＮ  Ｅタンパク質のＣＯＯＨ末端に置かれる。ＷＮのアミノ酸およびヌクレオチド配列を太字で表し、ヌクレオチド番号系はＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ１９６８３５からである。サルベロまたはＣ６／３６蚊細胞をトランスフェクトし、免疫蛍光検定により感染の証拠に関して細胞培養を評価することにより、全長ｃＤＮＡ構築物からのＲＮＡ転写物の感染性を試験した。群４中の２つのクローンは、ｃＤＮＡのクローニング中に、切断部位から＋６下流のアミノ酸のＩ（イソロイシン）からＴ（トレオニン）への突然変異を維持した（図に示されている）。これら２つのクローンのみが生育可能で、全長ＲＮＡ転写体のトランスフェクション後に感染性ウイルスを生じた。  *プロテアーゼ切断部位の３＋位置下流で変化するキメラ構築物中のアミノ酸を示す。**適用可能でない。+２つの感染性キメラＷＮ／ＤＥＮ４ウイルス、即ち群４からのクローン１８および５５を単離した。
【表６】
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【図３】親ＷＮもしくはＤＥＮ４ウイルスまたはそれらのＷＮ／ＤＥＮ４キメラもしくはその３’欠失変異型ＷＮ／ＤＥＮ４−３’Δ３０を接種されたアカゲザルのウイルス血症を示す。４つの群の２０匹のアカゲザル（Maccaca mulatta）に、ＷＮ、ＤＥＮ４、ＷＮ／ＤＥＮ４クローン１８またはＷＮ／ＤＥＮ４−３’Δ３０クローン１を皮下（ＳＣ）接種した。免疫染色フォーカス形成検定を用いたベロ細胞中での直接滴定により、サル血清中のウイルスの量を確定した。個別に各サルに対して、接種後１２日間毎日、ウイルス血症を試験した。示された各サル群の血清中の平均ウイルス力価；ｎは群中のサルの数である。ウイルスの検出限界は１０0.7ＦＦＵ／ｍｌであった。そしてＷＮ／ＤＥＮ４およびＷＮ／ＤＥＮ４−３’Δ３０ウイルスは、血清中のウイルスの検出レベルまたはそれ以下であった。
【図４−１】Ａ．  Δ３０突然変異は、ＤＥＮ４の３’ＵＴＲから３０連続ヌクレオチド（陰影部）を除去する。ヌクレオチドは、３’末端から番号を付ける。Ｂ．  ＤＥＮ４およびＤＥＮ１ならびにそれらのΔ３０誘導体のＴＬ２領域のヌクレオチド配列アラインメント。４つのＤＥＮ血清型の各々に関する対応領域も示され、大文字は４つの血清型全ての間で相同である配列を示す。下線は、ステム構造を形成するために対合するヌクレオチドを示す。
【図４−２】Ｃ．  各ＤＥＮ血清型のＴＬ２領域の予測二次構造。すでに構築されたＤＥＮ１Δ３０、ＤＥＮ４Δ３０、ＤＥＮ２Δ３０ウイルスに関してΔ３０突然変異により除去されるヌクレオチドを左側に示し（まとめて示し（boxed））、提唱ＤＥＮ３Δ３０ウイルスを右側に示す（ＤＥＮ１−ｎｔｓ１０５６２〜１０５９１、ＤＥＮ２−Ｔｏｎｇａ／７４−ｎｔｓ１０５４１〜１０５７０、ＤＥＮ３  Ｓｌｅｍａｎ／７８−ｎｔｓ１０５３５〜１０５６５およびＤＥＮ４−ｎｔｓ１０４７８〜１０５０７）。
【表７】
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【表８】
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【表９−１】
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【表９−２】
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【表９−３】
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【表９−４】
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【表９−５】
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【表９−６】
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【表９−７】
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【表９−８】
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【表９−９】
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【表９−１０】
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【表９−１１】
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【表９−１２】
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【表９−１３】
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【表９−１４】
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【表９−１５】
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【表９−１６】
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【表９−１７】
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【表９−１８】
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【表９−１９】
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【表９−２０】
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【表９−２１】
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【表９−２２】
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【表９−２３】
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【表９−２４】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【国際調査報告】
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