(57)【要約】本発明は、P2X3の発現を調節するのに有用なアンチセンスオリゴヌクレオチド、組成物及び方法に関する。この組成物はアンチセンスオリゴヌクレオチド、特にP2X3をコードする核酸に標的指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
本質的に10〜50個のヌクレオチドからなる単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドは接近可能領域内に特異的にハイブリダイズし、該領域は配列番号1のヌクレオチド68〜88、209〜230、235〜247、285〜296、346〜355、383〜406、490〜512、530〜543、553〜565、649〜658、665〜679、727〜739、756〜779、817〜856、874〜912、959〜991、1028〜1050、1087〜1116、1145〜1177、1237〜1256、1266〜1281、1297〜1307、1314〜1334、1339〜1359、1434〜1463、1523〜1535、1630〜1646、1677〜1688、又は1729〜1741により定義され；かつ該ヌクレオチドはP2X3の産生を阻害する、前記アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドが配列番号1のヌクレオチド383〜406、756〜779、490〜512、又は727〜739により定義される接近可能領域内に特異的にハイブリダイズする、請求項１に記載の単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドが配列番号1のヌクレオチド384〜397、766〜775、495〜510、又は732〜736により定義される接近可能領域内に特異的にハイブリダイズする、請求項２に記載の単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチドが配列番号1のヌクレオチド1434〜1463、1237〜1256、959〜991、又は1028〜1050により定義される接近可能領域内に特異的にハイブリダイズする、請求項１に記載の単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドが配列番号1のヌクレオチド817〜856、553〜565、285〜296、209〜230、又は1145〜1177により定義される接近可能領域内に特異的にハイブリダイズする、請求項１に記載の単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドが配列番号1のヌクレオチド383〜404、721〜744、747〜770、又は1314〜1344により定義される接近可能領域内に特異的にハイブリダイズする、請求項１に記載の単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
請求項１に記載の単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物。
【請求項８】
前記組成物が複数の単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、各アンチセンスオリゴヌクレオチドが異なる接近可能領域内に特異的にハイブリダイズする、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
本質的に10〜50個のヌクレオチドからなる単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドは接近可能領域内に特異的にハイブリダイズし、該領域は配列番号２のヌクレオチド7〜29、95〜105、207〜217、221〜240、248〜258、278〜293、338〜365、471〜482、486〜502、544〜562、747〜761、784〜796、815〜850、865〜879、883〜905、922〜932、953〜968、985〜1000、1033〜1044、1156〜1170、1239〜1261、1297〜1314、又は1411〜1439により定義され；かつ前記単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチドがP2X3の産生を阻害する、前記アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが配列番号２のヌクレオチド953〜968、1297〜1314、又は815〜850により定義される接近可能領域内に特異的にハイブリダイズする、請求項９に記載の単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが配列番号２のヌクレオチド957〜967、1297〜1301、又は817〜823により定義される接近可能領域内に特異的にハイブリダイズする、請求項１０に記載の単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが配列番号２のヌクレオチド747〜761、985〜1000、又は486〜502により定義される接近可能領域内に特異的にハイブリダイズする、請求項９に記載の単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが配列番号２のヌクレオチド338〜365、278〜293、544〜562、又は221〜240により定義される接近可能領域内に特異的にハイブリダイズする、請求項９に記載の単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが配列番号２のヌクレオチド484〜501又は742〜762により定義される接近可能領域内に特異的にハイブリダイズする、請求項９に記載の単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項９に記載の単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物。
【請求項１６】
前記組成物が複数の単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、各アンチセンスオリゴヌクレオチドが異なる接近可能領域内に特異的にハイブリダイズする、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
本質的に配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、又は配列番号8の配列からなる単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
細胞又は組織中のP2X3の産生を減少させる方法であって、該細胞又は組織と、配列番号2のヌクレオチド1279〜1296又は1315〜1334により定義される領域ではないP2X3の接近可能領域内に特異的にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドとを接触させることを含む、前記方法。
【請求項１９】
前記接触工程が疼痛感覚ニューロンの阻害をもたらす、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記接触工程が膀胱容量の増加をもたらす、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
天然の形態でP2X3 mRNAの1つ以上の接近可能領域内に特異的にハイブリダイズする転写体をコードする核酸に機能し得る形で連結された調節エレメントを含む核酸構築物。
【請求項２２】
請求項２１に記載の核酸構築物を含む宿主細胞。
【請求項２３】
配列番号2のヌクレオチド1279〜1296又は1315〜1334により定義される領域ではないP2X3 mRNAの接近可能領域内に天然の形態で特異的にハイブリダイズし、かつP2X3の産生を阻害する、単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本特許出願は2001年11月9日に提出された米国出願第60/337,338号に対する優先権を主張するものである。
【０００２】
技術分野
本発明は特定のヌクレオチド配列に標的指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。特に、本発明はP2X3プリノレセプターをコードする核酸に標的指向するアンチセンスオリゴヌクレオチド、及びP2X3の細胞レベルを低下させるためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
P2Xプリノレセプターは細胞外アデノシン三リン酸(ATP)により活性化されるイオンチャンネルのファミリーである。プリノレセプターは様々な生物学的機能に関与し、特に疼痛の感受性に関連してきた。P2X3レセプターサブユニットは、元々はラット神経根ガングリオンからクローニングされたこのファミリーのメンバーである(Chenら、(1995) Nature 377:428-431)。ラット及びヒトのP2X3のヌクレオチド及びアミノ酸配列は公知である(Lewisら、(1995) Nature 377:432-435;及びGarcia-Guzmanら、(1997) Brain Res. Mol. Brain Res. 47:59-66)。P2X3は膀胱容積反射を制御する末梢経路に関与する。従って、P2X3の阻害は、過活動の膀胱などの尿の貯蔵及び排出の障害の治療における治療的可能性を有し得る(Cockayneら、(2000) Nature, 407:1011-5)。P2X3はまた、傷害性の、小径感覚ニューロン(すなわち、疼痛又は傷害により刺激されるニューロン)上で選択的に発現され、疼痛の感受性における役割と一致している。従って、P2X3のレベル又は活性を低下させる方法は、慢性疼痛を患っている被験体における疼痛知覚を調節するのに有用である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の概要
アンチセンスオリゴヌクレオチドを特定の核酸分子に標的指向させて、標的核酸分子の発現を低下させることができる。例えば、P2X3 mRNAに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを治療に用いて、慢性疼痛を患っている患者におけるP2X3レセプターのレベルを低下させることができた。しかしながら、アンチセンスオリゴヌクレオチドの作製の本来の目標は、アンチセンス分子にとって有用な標的である核酸配列を同定することである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、配列(例えば、翻訳開始部位、コード配列など)の機能に基づいて、標的mRNA内の配列に標的指向されることが多い。そのような手法は、その天然の状態において、mRNAは一般的には線状のコンフォメーションにないため、失敗することが多い。典型的には、mRNAは二次及び三次構造の複合体中に折り畳まれ、そのような折り畳まれた分子の内部上の配列はアンチセンスオリゴヌクレオチドに接近できないようになる。mRNAの接近可能な部分に対するアンチセンス分子のみが、そのmRNAに効率的に接触することができ、所望の結果をもたらし得る。従って、P2X3のレベルを低下させ、疼痛を軽減するのに有用なP2X3アンチセンス分子は、接近可能なmRNA配列を指向しなければならない。本明細書に記載の発明は、P2X3 mRNAの接近可能な部分を指向するP2X3アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、P2X3レベルを低下させるのに治療上有用である。
【０００５】
本発明は、本質的に10〜50個のヌクレオチドからなる単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチド及びそのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物を特徴とする。このオリゴヌクレオチドは、天然の状態においてラットP2X3 mRNAの接近可能領域内で特異的にハイブリダイズすることができ、ここで該接近可能領域はヌクレオチド68〜88、209〜230、235〜247、285〜296、346〜355、383〜406、490〜512、530〜543、553〜565、649〜658、665〜679、727〜739、756〜779、817〜856、874〜912、959〜991、1028〜1050、1087〜1116、1145〜1177、1237〜1256、1266〜1281、1297〜1307、1314〜1334、1339〜1359、1434〜1463、1523〜1535、1630〜1646、1677〜1688、又は1729〜1741により定義される。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、P2X3の産生を阻害することもできる。
【０００６】
前記単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号1のヌクレオチド383〜406、756〜779、490〜512、又は727〜739により定義される接近可能領域内に特異的にハイブリダイズすることができる。この単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号1のヌクレオチド384〜397、766〜775、495〜510、又は732〜736により定義される接近可能領域内に特異的にハイブリダイズすることができる。この単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号1のヌクレオチド1434〜1463、1237〜1256、959〜991、又は1028〜1050により定義される接近可能領域内に特異的にハイブリダイズすることができる。この単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号1のヌクレオチド817〜856、553〜565、285〜296、209〜230、又は1145〜1177により定義される接近可能領域内に特異的にハイブリダイズすることができる。この単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号1のヌクレオチド383〜404、721〜744、747〜770、又は1314〜1344により定義される接近可能領域内に特異的にハイブリダイズすることができる。
【０００７】
いくつかの実施形態においては、組成物は複数の単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、各アンチセンスオリゴヌクレオチドは異なる接近可能領域内に特異的にハイブリダイズする。
【０００８】
本発明はまた、本質的に10〜50個のヌクレオチドからなる単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを特徴とし、ここで、該オリゴヌクレオチドは接近可能領域内に特異的にハイブリダイズし、該領域は配列番号2のヌクレオチド7〜29、95〜105、207〜217、221〜240、248〜258、278〜293、338〜365、471〜482、486〜502、544〜562、747〜761、784〜796、815〜850、865〜879、883〜905、922〜932、953〜968、985〜1000、1033〜1044、1156〜1170、1239〜1261、1297〜1314、又は1411〜1439により定義され、かつ該単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチドはP2X3の産生を阻害する。前記単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号2のヌクレオチド953〜968、1297〜1314、もしくは815〜850により定義される接近可能領域；配列番号2のヌクレオチド957〜967、1297〜1301、もしくは817〜823により定義される接近可能領域；配列番号2のヌクレオチド747〜761、985〜1000、もしくは486〜502により定義される接近可能領域；配列番号2のヌクレオチド338〜365、278〜293、544〜562、もしくは221〜240により定義される接近可能領域；又は配列番号2のヌクレオチド484〜501もしくは742〜762により定義される接近可能領域内に特異的にハイブリダイズすることができる。
【０００９】
本発明はまた、そのような単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物を特徴とする。この組成物は複数の単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、各アンチセンスオリゴヌクレオチドは異なる接近可能領域内に特異的にハイブリダイズし得る。
【００１０】
別の態様において、本発明は、本質的に配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、又は配列番号8の配列からなる単離されたオリゴヌクレオチドを特徴とする。
【００１１】
さらに別の態様において、本発明は、細胞又は組織中でのP2X3の産生を減少させる方法を特徴とする。この方法は、細胞又は組織と、P2X3の接近可能領域内に特異的にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドとを接触させることを含むが、ここで該接近可能領域は配列番号2のヌクレオチド1279〜1296もしくは1315〜1334により定義される領域ではない。この接触工程は疼痛感覚ニューロンの阻害をもたらすか、又は膀胱容量の増加をもたらし得る。
【００１２】
本発明はまた、天然の形態でP2X3 mRNAの1つ以上の接近可能領域内に特異的にハイブリダイズする転写体をコードする核酸に機能し得る形で連結された調節エレメントを含む核酸構築物、及びそのような核酸構築物を含む宿主細胞を特徴とする。
【００１３】
さらに別の態様において、本発明は天然の形態でP2X3 mRNAの接近可能領域内に特異的にハイブリダイズする単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを特徴とするが、ただし、該接近可能領域は配列番号2のヌクレオチド1279〜1296又は1315〜1334により定義される領域ではなく、また、該アンチセンスオリゴヌクレオチドはP2X3の産生を阻害する。
【００１４】
特に定義しない限り、本明細書で用いられる全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する業界で通常の知識を有する者により一般的に理解されるものと同じ意味を有するものとする。本明細書に記載のものと類似した、又は等価な方法及び材料を用いて本発明を実施することができるが、好適な方法及び材料を以下に説明する。本明細書に記載の全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献はその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。競合する場合、定義を含む、本明細書が管理するものとする。さらに、材料、方法、及び実施例は単に例示的なものであり、本発明を限定する意図のものではない。
【００１５】
本発明の他の特徴及び利点は以下の詳細な説明、及び特許請求の範囲から明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
詳細な説明
本発明は標的核酸分子の機能を調節するために、アンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドを用いる。本明細書で用いる用語「標的核酸」とは、RNA並びにcDNA、ゲノムDNA、及び合成(例えば、化学的に合成された)DNAを含むDNAの両方を指す。標的核酸は二本鎖でも一本鎖(すなわち、センス又はアンチセンス一本鎖)であってもよい。いくつかの実施形態においては、前記標的核酸はP2X3ポリペプチドをコードする。かくして、「標的核酸」はP2X3をコードするDNA、そのようなDNAから転写されるRNA(プレmRNA及びmRNAを含む)、及びそのようなRNAから誘導されるcDNAをも包含する。図1及び2はそれぞれラット及びヒトP2X3ポリペプチド(それぞれ、配列番号1及び配列番号2)をコードする核酸配列を提供する。「アンチセンス」化合物は、標的核酸に特異的にハイブリダイズすることができる核酸又は核酸類似体を含む化合物であり、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる標的核酸の発現の調節を一般的に「アンチセンス技術」と呼ぶ。
【００１７】
本明細書で用いる用語「ハイブリダイゼーション」は、相補的ヌクレオシド又はヌクレオチド塩基間の、Watson-Crick、Hoogsteen又は逆Hoogsteen水素結合であってもよい水素結合を意味する。例えば、アデニンとチミン、及びグアニンとシトシンは、それぞれ、水素結合の形成を介して対をなす相補的なヌクレオ塩基(当業界では単に「塩基」と呼ぶことが多い)である。本明細書で用いる「相補的」とは、2つのヌクレオチド間の正確な対形成の能力を指す。例えば、オリゴヌクレオチドの特定部分のヌクレオチドが標的核酸分子中のヌクレオチドと水素結合し得る場合、このオリゴヌクレオチド及び標的核酸はその位置において互いに相補的であると考えられる。このオリゴヌクレオチド及び標的核酸は、各分子中の十分な数の対応位置が互いに水素結合することができるヌクレオチドにより占有される場合、互いに相補的である。かくして、「特異的にハイブリダイズ可能」は、安定かつ特異的な結合がオリゴヌクレオチドと標的核酸との間で生じるような十分な相補度又は正確な対形成を指すために用いられる。
【００１８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるためにはその標的核酸の配列と100％相補的である必要はないと当業界では理解されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、(a)標的核酸へのオリゴヌクレオチドの結合が該標的核酸の正常な機能を妨害する場合、及び(b)特異的な結合が望まれる条件下、すなわち、in vitroアッセイを行う条件下又はin vivoアッセイもしくは治療使用のための生理学的条件下で、非標的配列へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの非特異的結合を回避するのに十分な相補性がある場合に、特異的にハイブリダイズ可能である。
【００１９】
in vitroでのストリンジェンシー条件は、温度、時間及び塩濃度に依存する(例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1989)を参照)。典型的には、ハイブリダイゼーションが実質的に類似した核酸間では起こるが、類似していない核酸間では起こらないような、in vitroでの特異的ハイブリダイゼーションには高〜中程度のストリンジェンシー条件を用いる。特異的ハイブリダイゼーション条件は、振とうしながら40℃にて1時間、5X SSC(0.75 M塩化ナトリウム／0.075 Mクエン酸ナトリウム)中でのハイブリダイゼーション、次いで40℃にて1X SSC中で10回、及び室温にて1X SSC中で5回の洗浄である。標的核酸に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチド／標的ハイブリダイゼーション二本鎖から該オリゴヌクレオチドを (例えば、煮沸することにより) 回収し、回収されたオリゴヌクレオチドを配列決定することにより同定することができる。
【００２０】
in vivoでのハイブリダイゼーション条件は、アンチセンスオリゴヌクレオチドと標的配列とのハイブリダイゼーションを制御する細胞内条件(例えば、生理的pH及び細胞内イオン条件)からなる。in vivo条件を、以下に記載のRiboTAG(登録商標)技術で用いられるような比較的低いストリンジェンシー条件によりin vitroで模倣することができる。例えば、37℃にて2X SSC(0.3 M塩化ナトリウム／0.03 Mクエン酸ナトリウム)、0.1％ SDS中、in vitroでハイブリダイゼーションを行うことができる。4X SSC、0.1％ SDSを含む洗浄溶液を37℃で用いて、45℃にて1X SSC中で最終洗浄を行うことができる。
【００２１】
アンチセンス分子とその標的核酸との特異的ハイブリダイゼーションを、該標的核酸の正常な機能を用いて妨害することができる。標的DNA核酸については、アンチセンス技術は複製及び転写を中断することができる。標的RNA核酸については、アンチセンス技術は、例えば、タンパク質翻訳部位へのRNAの転位、該RNAからのタンパク質の翻訳、1種以上のmRNA種を得るための該RNAのスプライシング、及び該RNAの触媒活性を中断することができる。標的核酸機能のそのような妨害の全体的な効果は、P2X3をコードする核酸の場合、P2X3の発現の調節である。本発明の文脈においては、「調節(modulation)」とは遺伝子の発現の減少(例えば、転写の阻害による)及び／又はタンパク質の細胞レベルの減少(例えば、翻訳の阻害による)を意味する。
【００２２】
P2X3アンチセンスオリゴヌクレオチドのための標的配列の同定
アンチセンスオリゴヌクレオチドは核酸分子内の特定の標的に指向するのが好ましい。アンチセンスオリゴヌクレオチドを特定の核酸に「標的指向」する過程は通常、その機能が調節されるべきである核酸配列の同定から始まる。この核酸配列は、例えば、発現が特定の障害又は疾患状態と関連している遺伝子(又は該遺伝子から転写されるmRNA)であってもよい。
【００２３】
この標的指向過程はまた、所望の効果、例えば、P2X3 mRNAの検出又はP2X3発現の調節が得られるようにアンチセンス相互作用が生じる標的核酸分子内の部位を同定することを含む。伝統的には、アンチセンスオリゴヌクレオチドのための好ましい標的部位は、遺伝子のオープンリーディングフレーム(ORF)の翻訳開始コドン又は終止コドンを包含する領域を含んでいる。さらに、このORFは5'及び3'非翻訳領域を有しているので、アンチセンス技術において効率的に標的にされてきた。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドはイントロン領域及びイントロン-エキソン接合領域に成功裏に指向されてきた。
【００２４】
しかしながら、標的核酸の配列及びドメイン構造(例えば、翻訳開始コドン、エキソン、又はイントロンの位置)の単純な知識は、一般的には、特定の領域に指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドが標的核酸に効率よく結合し、その機能を調節することを確実にするのに十分ではない。その天然の状態において、mRNA分子は複雑な二次及び三次構造の中に折り畳まれ、そのような構造の内部にある配列はアンチセンスオリゴヌクレオチドに接近できない。最大の効率のために、アンチセンスオリゴヌクレオチドを、最も接近可能である標的mRNAの領域、すなわち、折り畳まれたmRNA分子の表面の領域又はその近くの領域に指向させることができる。
【００２５】
mRNA分子の接近可能領域を、RiboTAG(登録商標)技術の使用などの当業界で公知の方法により同定することができる。この技術はPCT国際出願番号第SE01/02054号に開示されている。mRNA Accessible Site Tagging(MAST)としても知られるRiboTAG(登録商標)法では、天然の状態で(すなわち、生理的条件下で)試験mRNAと相互作用することができるオリゴヌクレオチドを選択及び配列決定し、かくしてアンチセンス分子に接近可能な試験mRNA内の領域を同定する。RiboTAG(登録商標)プロトコルのあるバージョンにおいては、試験mRNAをin vitro転写により作製した後、例えば、ビーズ又は表面(例えば、磁気ビーズ)への共有結合又は非共有結合により固定する。次いで、この固定した試験mRNAを、各オリゴヌクレオチドの一部が異なるランダムな配列を含むオリゴヌクレオチドの集団と接触させる。低ストリンジェンシーの条件下で試験mRNAにハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを、前記集団の残余から (例えば、磁気ビーズの沈降によって) 分離する。次いで、選択されたオリゴヌクレオチドを増幅し、配列決定することができる；各オリゴヌクレオチド内のランダムな配列が、PCR増幅のためのプライマー結合部位として働くことができる公知の配列の片側又は両側に隣接している場合には、このプロトコルのこれらの工程は容易になる。
【００２６】
一般的には、RiboTAG(登録商標)技術において有用であるオリゴヌクレオチドは、その片側に公知の配列が隣接する15〜18個のランダムな塩基を含む。これらのオリゴヌクレオチドを、試験mRNAの天然構造を破壊しない条件下(例えば、アニーリングを調節する中程度のpH緩衝剤、塩、並びに非特異的相互作用を最小化する界面活性剤及び／又は担体分子の存在下)で、該mRNAと接触させる。典型的には、ハイブリダイゼーションを、1x〜5x SSC及び約0.1％ SDSを含む溶液中、37〜40℃にて行う。選択されたオリゴヌクレオチドのPCR増幅に用いられるプライマーを用いて各オリゴヌクレオチド中の公知の配列をブロックすることにより、非特異的相互作用をさらに最小化することができる。
【００２７】
本明細書に記載するように、ヒト及びラットのP2X3をコードする核酸の接近可能領域を地図化した。かくして、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号1のヌクレオチド68〜88、209〜230、235〜247、285〜296、346〜355、383〜406、490〜512、530〜543、553〜565、649〜658、665〜679、727〜739、756〜779、817〜856、874〜912、959〜991、1028〜1050、1087〜1116、1145〜1177、1237〜1256、1266〜1281、1297〜1307、1314〜1334、1339〜1359、1434〜1463、1523〜1535、1630〜1646、1677〜1688、又は1729〜1741により定義される1つ以上の接近可能領域内に特異的にハイブリダイズすることができる。特に有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、配列番号1のヌクレオチド383〜406(例えば、384〜397)、756〜779(例えば、766〜775)、490〜512(例えば、495〜510)、727〜739(例えば、732〜736)、1434〜1463、1237〜1256、959〜991、1028〜1050、817〜856、553〜565、285〜296、209〜230、又は1145〜1177により定義される接近可能領域内に特異的にハイブリダイズするものが含まれる。
【００２８】
また、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号2のヌクレオチド7〜29、95〜105、207〜217、221〜240、248〜258、278〜293、338〜365、471〜482、486〜502、544〜562、747〜761、784〜796、815〜850、865〜879、883〜905、922〜932、953〜968、985〜1000、1033〜1044、1156〜1170、1239〜1261、1297〜1314、又は1411〜1439により定義される接近可能領域内に特異的にハイブリダイズすることもできる。特に有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、配列番号2のヌクレオチド953〜968(例えば、957〜967)、1297〜1315(例えば、1297〜1301)、815〜850(例えば、817〜823)、747〜761、985〜1000、486〜502、338〜365、278〜293、544〜562、又は221〜240により定義される接近可能領域内に特異的にハイブリダイズするものが含まれる。
【００２９】
そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドの非限定的な例としては、以下のヌクレオチド配列が挙げられる：5’-GAC ACG TCC ATG ACT CTG TTG G-3’ (配列番号3); 5’-GAG GTT TCC CTT CTC AAA-3’ (配列番号4); 5’-TGT CCT TGT CGG TGA GGT TAG-3’ (配列番号5); 5’-GTA GAC TGC TTC TCC ACA GTG-3’ (配列番号6); 5’-CTC CTC ACT CTC TGG GCA-3’ (配列番号7);及び5’-GTC CCT GGC TGT CAG GTT GGG A-3’ (配列番号8)。
【００３０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本質的には上記の接近可能領域に特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列からなっていてよいことに留意するべきである。しかしながら、そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、片方の末端に5〜10ヌクレオチドの追加的フランキング配列を含んでもよい。フランキング配列としては、例えば、標的核酸の追加配列又はプライマー配列が挙げられる。
【００３１】
最大の効率のために、アンチセンスオリゴヌクレオチドの設計にさらなる基準を適用することができる。そのような基準は当業界で公知であり、例えば、オリゴヌクレオチドプライマーの設計において広く用いられている。これらの基準としては、潜在的アンチセンスオリゴヌクレオチドの予測された二次構造の欠如、好適なG及びCヌクレオチド含量(例えば、約50％)、並びに単一ヌクレオチド反復(例えば、GGGGラン)などの配列モチーフの欠如が含まれる。
【００３２】
P2X3アンチセンスオリゴヌクレオチド
1つ以上の標的部位を同定すれば、その標的に対して十分に相補的な(すなわち、所望の効果を得るのに十分な強度及び特異性でハイブリダイズする)アンチセンスオリゴヌクレオチドを合成することができる。本発明の文脈においては、この所望の効果は細胞のP2X3レベルが低下するようなP2X3発現の調節である。標的核酸の発現を調節するアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を、標的核酸のmRNA又はタンパク質産物のレベルを測定すること(例えば、ノーザンブロッティング、RT-PCR、ウェスタンブロッティング、ELISA、又は免疫組織化学染色)により評価することができる。
【００３３】
いくつかの実施形態において、標的核酸の複数の接近可能領域を標的化することが有用であり得る。そのような実施形態においては、異なる接近可能領域に各々特異的にハイブリダイズする複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることができる。複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドは一緒に用いてもよいし、連続的に用いてもよい。
【００３４】
本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは長さ約10〜約50ヌクレオチド(例えば、長さ12〜40、14〜30、又は15〜25ヌクレオチド)のものであってよい。長さ15〜23ヌクレオチドであるアンチセンスオリゴヌクレオチドが特に有用である。しかしながら、10ヌクレオチド未満を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド(例えば、好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドの1つの一部)は、それがP2X3プリノレセプターの発現を阻害する所望の活性を示す限り、本発明の範囲内に含まれると理解される。
【００３５】
「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は本明細書に記載されるようなオリゴヌクレオチドであってよい。用語「オリゴヌクレオチド」とは、リボ核酸(RNA)もしくはデオキシリボ核酸(DNA)又はその類似体のオリゴマー又はポリマーを指す。この用語は天然のヌクレオ塩基、糖及び共有ヌクレオシド間(主鎖)結合から構成されるオリゴヌクレオチド、並びに同様に機能する非天然部分を有するオリゴヌクレオチドを含む。そのような修飾又は置換されたオリゴヌクレオチドは、例えば、細胞の取込み率の増強、核酸標的に対する親和性の増強、ヌクレアーゼの存在下での安定性の増加などの望ましい特性のため、天然の形態のものよりも好ましいことが多い。
【００３６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドはアンチセンス化合物の好ましい形態であるが、本発明は、限定されるものではないが、以下に記載するようなオリゴヌクレオチド類似体などの他のオリゴマーアンチセンス化合物を含む。当業界で公知のように、ヌクレオシドは塩基-糖結合体であり、この塩基部分は通常ヘテロ環塩基である。そのようなヘテロ環塩基の2つの最も一般的な種類はプリン及びピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むこれらのヌクレオシドについては、リン酸基は糖の2'、3'又は5'ヒドロキシル部分のいずれかに連結されていてもよい。オリゴヌクレオチドの形成においては、リン酸基は隣接したヌクレオシドを互いに共有結合させて線状のポリマー化合物を形成する。この線状ポリマー構造の各々の末端はさらに連結されて、環状構造を形成してもよいが、線状構造が一般的には好ましい。オリゴヌクレオチド構造内では、リン酸基は一般的には該オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間主鎖を形成するものとして呼ばれる。RNA及びDNAの通常の結合又は主鎖は3'-5'ホスホジエステル結合である。
【００３７】
本発明において有用であるP2X3アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、修飾された主鎖又は非天然のヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドが含まれる。本明細書に定義されるように、修飾された主鎖を有するオリゴヌクレオチドとしては、主鎖中にリン原子を有するもの及び主鎖中にリン原子を有さないものが挙げられる。本明細書の目的のために、及び時には当業界で参照されるように、そのヌクレオシド間主鎖中にリン原子を有さない修飾されたオリゴヌクレオチドもオリゴヌクレオチドであると考えられる。
【００３８】
修飾されたオリゴヌクレオチド主鎖としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル及び他のアルキルホスホナート(例えば、3'-アルキレンホスホナート及びキラルホスホナート)、ホスフィネート、ホスホルアミダート(例えば、3'-アミノホスホルアミダート及びアミノアルキルホスホルアミダート)、チオノホスホルアミダート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル、並びに通常の3'-5'結合を有するボラノホスフェート、並びにこれらの2'-5'結合類似体、並びにヌクレオシド単位の隣接した対が3'-5'から5'-3'又は2'-5'から5'-2'結合した逆転した極性を有するものが挙げられる。種々の塩、混合塩及び遊離酸形態も含まれる。そのような修飾主鎖オリゴヌクレオチドの調製を教示する参考文献は、例えば、米国特許第4,469,863号及び同第5,750,666号に提供されている。
【００３９】
リン原子を中に含まない修飾されたオリゴヌクレオチド主鎖を有するP2X3アンチセンス分子は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合へテロ原子及びアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、又は1個以上の短鎖ヘテロ原子もしくはヘテロ環式ヌクレオシド間結合により形成される主鎖を有してもよい。これらのものとしては、モルホリノ結合(部分的にヌクレオシドの糖部分から形成される)；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシド及びスルホン主鎖；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ主鎖；スルホナート及びスルホンアミド主鎖；アミド主鎖を有するもの；並びに混合N、O、S及びCH2構成部分を有する他のものが挙げられる。そのような修飾主鎖オリゴヌクレオチドの製造を教示する参考文献は、例えば、米国特許第5,235,033号及び同第5,596,086号に提供されている。
【００４０】
別の実施形態においては、P2X3アンチセンス化合物は、糖及びヌクレチシド単位のヌクレオシド間結合(すなわち、主鎖)は共に新規の基で置換されているが、塩基単位は好適な核酸標的とのハイブリダイゼーションのために維持されているオリゴヌクレオチド類似体であってもよい。優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されたそのようなオリゴヌクレオチド類似体の1つは、ペプチド核酸(PNA)と呼ばれるものである。PNA化合物においては、オリゴヌクレオチドの糖-主鎖はアミド含有主鎖(例えば、アミノエチルグリシン主鎖)で置換されている。このヌクレオ塩基は保持されており、該主鎖のアミド部分のアザ窒素原子に直接又は間接的に結合している。そのような修飾主鎖オリゴヌクレオチドの製造を教示する参考文献は、例えば、Nielsenら、Science 254: 1497-1500(1991)、及び米国特許第5,539,082号に提供されている。
【００４１】
他の有用なP2X3アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート主鎖、及びヘテロ原子主鎖、特に米国特許第5,489,677号に教示されるCH2NHOCH2、CH2N(CH3)OCH2、CH2ON(CH3)CH2、CH2N(CH3)N(CH3)CH2、及びON(CH3)CH2CH2 (天然のホスホジエステル主鎖はOPOCH2と表される)及び米国特許第5,602,240号に開示されるアミド主鎖を有するオリゴヌクレオシドを有していてもよい。
【００４２】
修飾されたオリゴヌクレオチドには置換された糖部分が含まれていてもよい。本発明のP2X3アンチセンスオリゴヌクレオチドは2'位に以下のもののうちの1つ以上を含んでもよい：OH; F; O-、S-、もしくはN-アルキル; O-、S-、もしくはN-アルケニル; O-、S-、もしくはN-アルキニル;又はO-アルキル-O-アルキル(式中、アルキル、アルケニル及びアルキニルは置換もしくは未置換C1〜C10アルキル又はC2〜C10アルケニル及びアルキニルである)。また、有用な修飾物としては、n及びmが1〜約10であるO[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、及びO(CH2)nON[(C2)nCH3]]2が挙げられる。さらに、オリゴヌクレオチドは2'位に以下のもののうちの1つを含んでもよい：C1〜C10低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アルアルキル、O-アルカリールもしくはO-アルアルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、RNA切断基、リポーター基、介入因子、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的もしくは薬力学的特性を改善するための基、及び同様の特性を有する他の置換基。他の有用な修飾物としては、アルコキシアルコキシ基、例えば、2'-メトキシエトキシ(2'-OCH2CH2OCH3)、ジメチルアミノオキシエトキシ基(2'-O(CH2)2ON(CH3)2)、又はジメチルアミノ-エトキシエトキシ基(2'-OCH2OCH2N(CH2)2)が挙げられる。他の修飾物としては、2'-メトキシ(2'-OCH3)、2'-アミノプロポキシ(2'-OCH2CH2CH2NH2)、又は2'-フルオロ(2'-F)が挙げられる。同様の修飾を、3'末端ヌクレオチド上又は2'-5'結合オリゴヌクレオチド中の糖の3'位、及び5'末端ヌクレオチドの5'位などの、前記オリゴヌクレオチド内の他の位置で作製することもできる。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル基の箇所におけるシクロブチル部分などの糖擬似体を有していてもよい。そのような置換糖部分の製造を教示する参考文献としては、米国特許第4,981,957号及び同第5,359,044号が挙げられる。
【００４３】
有用なP2X3アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、ヌクレオ塩基修飾物又は置換体を含んでもよい。本明細書で用いる「未修飾」又は「天然」ヌクレオ塩基はプリン塩基アデニン(A)及びグアニン(G)、並びにピリミジン塩基チミン(T)、シトシン(C)、及びウラシル(U)を含む。修飾ヌクレオ塩基としては、5-メチルシトシン(5-me-C)、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデノシン、アデノシン及びグアニンの6-メチル及び他のアルキル誘導体、アデノシン及びグアニンの2-プロピル及び他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミン及び2-チオシトシン、5-ハロウラシル及びシトシン、5-プロピニルウラシル及びシトシン、6-アゾウラシル、シトシン及びチミン、5-ウラシル(擬ウラシル)、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシル及び他の8-置換アデニン及びグアニン、5-ハロ、特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチル及び他の5-置換ウラシル及びシトシン、7-メチルグアニン及び7-メチルアデニン、8-アザグアニン及び8-アザアデニン、7-デアザグアニン及び7-デアザアデニン及び3-デアザグアニン及び3-デアザアデニンなどの他の合成及び天然ヌクレオ塩基が含まれる。他の有用なヌクレオ塩基としては、例えば、米国特許第3,687,808号に開示されるものが含まれる。
【００４４】
特定のヌクレオ塩基置換体は本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの結合親和性を増加させるのに特に有用であり得る。例えば、5-メチルシトシン置換体は0.6〜1.2℃だけ核酸二本鎖の安定性を増加させることが示された(Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T.及びLebleu, B.編, Antisense Research and Applications, pp. 276-278, CRC Press, Boca Raton, FL (1993))。他の有用なヌクレオ塩基置換体としては、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジン並びに2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシル及び5-プロピニルシトシンなどのN-2、N-6及びO-6置換プリンが含まれる。
【００４５】
また、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、該オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布又は細胞取込みを増強する1つ以上の部分又はコンジュゲートへの化学的結合により修飾することもできる。そのような部分としては、限定されるものではないが、脂質部分(例えば、コレステロール部分)；コール酸；チオエーテル部分(例えば、ヘキシル-S-トリチルチオール)；チオコレステロール部分；脂肪鎖(例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基)；リン脂質部分(例えば、ジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホナート)；ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖；アダマンタン酢酸；パルミチル部分；又はオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分が含まれる。そのようなオリゴヌクレオチドコンジュゲートの製造は、例えば、米国特許第5,218,105号及び同第5,214,136号に開示されている。
【００４６】
所与のアンチセンスオリゴヌクレオチド中の全てのヌクレオ塩基位置を均質に修飾する必要はない。2個以上の前記修飾物を、単一のオリゴヌクレオチド中に、又はオリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシドにさえ組み入れることができる。本発明はまた、キメラオリゴヌクレオチドであるアンチセンスオリゴヌクレオチドをも含む。「キメラ」アンチセンスオリゴヌクレオチドは2個以上の化学的に異なる領域を含み、その各々は少なくとも1個のモノマー単位(例えば、オリゴヌクレオチドの場合ヌクレオチド)から作られる。キメラオリゴヌクレオチドは典型的には、該オリゴヌクレオチドが、例えば、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増加、細胞による取込みの増加、及び／又は標的核酸への親和性の増加を与えるように修飾されている少なくとも1個の領域を含む。例えば、キメラオリゴヌクレオチドのある領域は、標的mRNAとアンチセンスオリゴヌクレオチドとの間で形成されるものなどのRNA:DNA二本鎖のRNA鎖を切断することができるRNアーゼHなどの酵素のための基質として働くことができる。RNアーゼHによるそのような二本鎖の切断は、従って、アンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性を大きく増強することができる。
【００４７】
本発明のP2X3アンチセンスオリゴヌクレオチドはin vitroで合成され、被験体のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド及び生物材料から精製又は単離されたオリゴヌクレオチド以外に、生物起源のアンチセンス組成物を含まない。本発明に従って用いられるアンチセンスオリゴヌクレオチドを、固相合成の公知の技術を介して都合よく製造することができる。そのような合成の装置は、例えば、Applied Biosystems (Foster City, CA)などのいくつかの業者から商業的に入手可能である。当業界で公知のそのような合成のための任意の他の手段を追加的又は代替的に用いることができる。同様の技術を用いて、ホスホロチオエート又はアルキル化誘導体などの修飾オリゴヌクレオチドを製造することもできる。
【００４８】
アンチセンスの製造及び使用方法
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは研究及び診断、並びに治療用途に有用である。例えば、P2X3をコードする核酸へのアンチセンスオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに基づくアッセイを用いて、組織サンプル中のP2X3のレベルを評価することができる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドとP2X3をコードする核酸とのハイブリダイゼーションを、当業界で公知の手段により検出することができる。そのような手段としては、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドへの酵素のコンジュゲーション、該アンチセンスオリゴヌクレオチドの放射能標識、又は任意の他の好適な検出手段が含まれる。
【００４９】
当業者であれば、治療用途のためにアンチセンス技術の特異性及び感度を利用することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトを含む動物における疾患状態の治療において治療部分として用いられてきた。治療方法については、典型的には、細胞又は組織は脊椎動物(例えば、ヒトなどの哺乳動物)内にあるものである。
【００５０】
本発明は、P2X3プリノレセプターの異常な発現(例えば、過剰産生)から生じる症状を治療するための治療方法を提供する。これらの方法により、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドを、疾患又は障害(例えば、慢性疼痛、膀胱過活動、又は過敏性腸症候群)を有することが疑われる被験体(例えば、ヒト)に投与し、P2X3の発現を調節することによりこれを軽減することができる。典型的には、1つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、P2X3の発現と関連する疾患又は症状を有することが疑われる被験体に投与することができる。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは製薬上許容し得る担体又は希釈剤中にあってもよく、特定の疾患の性質、その重篤度、及び被験体の症状全体に依存して変化するであろう量及び期間で投与することができる。典型的には、このアンチセンスオリゴヌクレオチドを阻害量(すなわち、該アンチセンスオリゴヌクレオチドが接触した細胞又は組織においてP2X3の産生を阻害するのに有効である量)で投与する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び方法を、例えば、高いレベルのP2X3を有することが知られている被験体において疼痛を最小化するために、予防的に使用することもできる。
【００５１】
P2X3の発現及び／又は産生を阻害するP2X3アンチセンスオリゴヌクレオチドの能力を、例えば、治療の前後に被験体中のP2X3 mRNA又はタンパク質のレベルを測定することにより評価することができる。組織又は生物学的サンプル中のmRNA及びタンパク質レベルを測定する方法は当業界で周知である。被験体が研究用動物である場合、例えば、脳におけるP2X3レベルを、安楽死後のin situハイブリダイゼーション又は免疫染色により評価することができる。間接的な方法を用いて、生きた被験体におけるP2X3アンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性を評価することができる、例えば、P2X3の発現の低下を、疼痛刺激に対する感受性の低下から推量することができる。以下の実施例で説明するように、動物モデルを用いて、慢性神経障害又は炎症性疼痛の発症、維持、及び緩和について研究することができる。これらのモデルに向けられた動物は、一般的には温度痛覚過敏(すなわち、通常は疼痛を伴う刺激に対する反応の増加)及び／又は異痛(allodynia)(すなわち、通常は疼痛を伴わない刺激に起因する疼痛)を生じる。機械及び温度的刺激に対する感受性を評価して(Bennett, Methods in Pain Research, pp. 67-91, Kruger編(2001)を参照)、P2X3アンチセンス治療の有効性について評価することができる。
【００５２】
治療用組成物を製剤化し、続いてそれを投与する方法は当業者には周知である。例えば、Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 第20版,Gennaro & Gennaro編, Lippincott, Williams & Wilkins (2000)を参照されたい。投薬量は、一般的には治療しようとする疾患状態の重篤度及び反応性に依存し、その治療経過は数日〜数ヶ月に及び、又は治癒が達成されるか、もしくは該疾患状態の軽減が達成されるまで行われる。当業者であれば、最適な用量、投与方法および反復速度を日常的に決定できる。最適な用量は個々のオリゴヌクレオチドの相対的な効力に応じて変化し、一般的にはin vitro及びin vivoのモデル動物において有効であると認められるEC50に基づいて見積もることができる。典型的には、用量は体重kgあたり0.01μg〜100 gであり、1日、1週間に1回以上、又はそれ以下の頻度で与えてもよい。治療の成功後、疾患状態の再発を防止するために管理治療を患者に受けさせるのが望ましい。
【００５３】
本発明は、本発明のP2X3アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物及び製剤を提供する。従って、P2X3アンチセンスオリゴヌクレオチドを、取込み、分布及び／又は吸収を助けるための他の分子、分子構造物、あるいはオリゴヌクレオチドの混合物、例えば、リポソーム、受容体標的指向性分子、又は経口、直腸、局所もしくは他の製剤など、と混合、カプセル化、コンジュゲート化、又はさもなくば結合させることができる。
【００５４】
「製薬上許容し得る担体」(本明細書においては「賦形剤」と呼ぶ)は、被験体に1種以上の治療用化合物(例えば、P2X3アンチセンスオリゴヌクレオチド)を送達するための製薬上許容し得る溶媒、懸濁剤、又は任意の他の薬学上不活性なビヒクルである。製薬上許容し得る担体は液体でも固体であってもよく、1種以上の治療用化合物及び所与の医薬組成物の任意の他の成分と組み合わせる場合、所望の嵩高さ、緻密度、及び他の適切な輸送及び化学的特性を提供するように、考えられる計画された投与様式に応じて選択することができる。典型的には、核酸と有害反応しない製薬上許容し得る担体としては、限定されるものではないが、水；生理食塩溶液；結合剤(例えば、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース)；充填剤(例えば、ラクトース及び他の糖、ゼラチン、又は硫酸カルシウム)；滑沢剤(例えば、でんぷん、ポリエチレングリコール、又は酢酸ナトリウム)；崩壊剤(例えば、でんぷん又はデンプングリコール酸ナトリウム)；並びに湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム)が挙げられる。
【００５５】
本発明の医薬組成物を、局所的又は全身的治療が望まれるかどうか、及び治療しようとする領域に応じていくつかの方法により投与することができる。投与は、例えば、局所(例えば、経皮、点眼、又は鼻腔内)；経肺(例えば、粉末剤もしくはエアロゾルの吸入又は通気による)；経口；又は非経口(例えば、皮下、鞘内、心室内、筋肉内もしくは腹腔内注入、又は静脈内点滴による)であってもよい。投与は迅速なもの(例えば、注入による)であってもよし、又は一定時間をかけて行ってもよい(例えば、ゆっくりした点滴又は遅延放出製剤の投与による)。中枢神経系内の組織を治療するために、アンチセンスオリゴヌクレオチドを、好ましくは、該アンチセンスオリゴヌクレオチドが血液-脳関門を通過し浸透するのを促進することができる1種以上の薬剤と共に、脳脊髄液への注射又は点滴により投与することができる。
【００５６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの局所投与のための製剤としては、例えば、滅菌及び非滅菌水性溶液、アルコールなどの一般的溶媒中の非水性溶液、又は液体もしくは固体油基剤中の溶液が含まれる。そのような溶液はまた、緩衝剤、希釈剤及び他の好適な添加剤を含んでもよい。局所投与のための医薬組成物及び製剤としては、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム剤、ゲル剤、ドロップ剤、坐剤、スプレー、液剤、及び粉末剤が挙げられる。コーティングされたコンドーム、袋なども有用である。従来の製薬上の担体、水性、粉末状又は油性基剤、増量剤なども必要であるし又は望ましい。
【００５７】
経口投与のための組成物及び製剤としては、例えば、粉末剤又は顆粒剤、水中もしくは非水性媒質中の懸濁剤又は溶液剤、カプセル剤、サシェ剤、又は錠剤が含まれる。そのような組成物はまた、増量剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤、又は結合剤を含んでもよい。少なくとも1個の2'-O-メトキシエチル修飾(上記)を有するオリゴヌクレオチドは経口投与に特に有用である。
【００５８】
非経口、鞘内又は心室内投与のための組成物及び製剤としては、緩衝剤、希釈剤及び他の好適な添加剤(例えば、浸透増強剤、担体化合物及び他の製薬上許容し得る担体)をさらに含んでもよい滅菌水性溶液が含まれる。
【００５９】
本発明の医薬組成物としては、限定されるものではないが、溶液、乳液、水性懸濁液、及びリポソーム含有製剤が挙げられる。これらの組成物を、例えば、予め形成した液体、自己乳化固体及び自己乳化半固体を含む様々な成分から製造することができる。乳液は、互いに密接に混合及び分散された2つの混和しない液相から構成される二相系であることが多い；一般的には、乳液は油中水(w/o)種又は水中油(o/w)種のいずれかである。乳液製剤は、その製剤化の容易性、並びに可溶化、吸収、及び生物学的利用率の効力のため、治療剤の経口送達に広く利用されてきた。
【００６０】
リポソームは、送達しようとするアンチセンス組成物を含むことができる親油性物質及び水性内部物質から形成される膜を有する小胞である。リポソームは、その特異性及びそれらがもたらす作用の持続期間のため、薬剤送達の視点から特に有用である。リポソーム組成物を、例えば、ホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、又はジオレオイルホスファチジルエタノールアミンから形成することができる。Lipofectin(登録商標)(Invitrogen/Life Technologies, Carlsbad, CA)及びEffectene(登録商標)(Qiagen, Valencia, CA)などのいくつかの親油性剤が市販されている。
【００６１】
本発明のP2X3アンチセンスオリゴヌクレオチドはさらに、任意の製薬上許容し得る塩、エステル、もしくはそのようなエステルの塩、又はヒトを含む動物への投与に際して、生物学的に活性な代謝物もしくはその残渣を(直接的もしくは間接的に)提供することができる任意の他の化合物を包含する。従って、例えば、本発明はP2X3アンチセンスオリゴヌクレオチドの製薬上許容し得る塩、プロドラッグ及びそのようなプロドラッグの製薬上許容し得る塩、並びに他の生物等価物を提供する。用語「プロドラッグ」は、不活性な形態で調製され、内因性酵素又は他の化合物及び／もしくは条件の作用により、体内又は細胞内で活性な形態(すなわち、薬剤)に変換される治療剤を指す。用語「製薬上許容し得る塩」は、本発明のオリゴヌクレオチドの生理学的及び薬学的に許容し得る塩(すなわち、望ましくない毒性作用をもたらさずに、親オリゴヌクレオチドの所望の生物学的活性を保持する塩)を指す。オリゴヌクレオチドの薬学上許容し得る塩の例としては、限定されるものではないが、陽イオン(例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、又はスペルミンなどのポリアミンなど)を用いて形成された塩；無機酸(例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、又は硝酸など)を用いて形成された酸付加塩；有機酸(酢酸、クエン酸、シュウ酸、パルミチン酸、又はフマル酸など)を用いて形成された塩；及び元素陰イオン(例えば、塩素、臭素、及びヨウ素など)から形成された塩が挙げられる。
【００６２】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、動物の皮膚への、核酸、特にオリゴヌクレオチドの効率的な送達を促進する浸透増強剤をも含んでもよい。浸透増強剤は、細胞膜を横断する親油性及び非親油性薬剤の両方の拡散を増強し得る。浸透増強剤は、5つの広いカテゴリー、すなわち、界面活性剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテル及びポリオキシエチレン-20-セチルエーテル)；脂肪酸(例えば、オレイン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、及びステアリン酸)；胆汁酸(例えば、コール酸、デヒドロコール酸、及びデオキシコール酸)；キレート化剤(例えば、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム、クエン酸、及びサリチル酸)；並びに非キレート化非界面活性剤(例えば、不飽和環状尿素)の1つに属するものとして分類することができる。
【００６３】
本発明の特定の実施形態は、(a)1種以上のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び(b)非アンチセンス機構により機能する1種以上の他の薬剤を含む医薬組成物を提供する。例えば、限定されるものではないが、非ステロイド性抗炎症剤及びコルチコステロイドなどの抗炎症剤、並びに限定されるものではないが、リビビリン、ビダラビン、アシクロビル及びガンシクロビルなどの抗ウイルス剤を、本発明の組成物中に含有させてもよい。他の非アンチセンス薬剤(例えば、化学療法剤)も本発明の範囲内にある。そのような混合化合物を一緒に、又は連続的に用いることができる。
【００６４】
本発明のアンチセンス組成物はさらに、医薬組成物において通常認められる他の添加成分を含んでもよい。かくして、前記組成物は、例えば、止痒剤、収斂剤、局所麻酔剤もしくは抗炎症剤などの相容性の薬学的に活性な物質、又は染料、香味剤、保存剤、酸化防止剤、乳濁剤、増量剤及び安定化剤などの、本発明の組成物の様々な剤形を物理的に製剤化するのに有用な添加物質をも含んでよい。さらに、前記組成物を、例えば、滑沢剤、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に作用する塩、緩衝剤、着色剤、香料、及び芳香物質などの補助剤と混合してもよい。しかしながら、それらを添加する場合、そのような物質は本発明の組成物内のアンチセンス成分の生物学的活性を過度に妨害するべきではない。前記製剤を滅菌することができるし、また必要に応じてそれが該製剤の核酸と有害に相互作用しないように滅菌することができる。
【００６５】
単位投与形態で都合よく提供することができる本発明の医薬製剤を、製薬産業において周知の従来技術に従って製造することができる。そのような技術は、活性成分(例えば、本発明のP2X3アンチセンスオリゴヌクレオチド)と所望の製薬用の担体又は賦形剤とを組み合わせる工程を含む。典型的には、前記製剤を、前記活性成分を液体担体もしくは微細に分割した固体担体又はその両方と密接かつ均質に組み合わせた後、必要に応じて、生成物を形状化することにより製造することができる。滅菌方法が製剤中に含まれるアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性を妨害しない限り、必要に応じて該製剤を滅菌してもよい。
【００６６】
本発明の組成物を、限定されるものではないが、錠剤、カプセル剤、液体シロップ剤、軟質ゲル剤、坐剤、及び浣腸剤などの任意の多くの可能性のある投与剤形に製剤化することができる。本発明の組成物を、水性、非水性又は混合媒質中の懸濁液剤として製剤化することもできる。水性懸濁液剤はさらに、例えば、カルボキシメチルセルロース、ソルビトール、及び／又はデキストランなどの、懸濁液剤の粘度を増加させる物質を含んでもよい。懸濁液は安定化剤を含んでもよい。
【００６７】
核酸構築物
核酸構築物(例えば、プラスミドベクター)は、核酸を宿主細胞中に輸送することができる。好適な宿主細胞としては、原核又は真核細胞(例えば、大腸菌などの細菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞、及び哺乳動物細胞)が挙げられる。いくつかの構築物は、それらが導入される宿主細胞中で自己複製することができる(例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞への導入に際して該宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、宿主ゲノムと共に複製される。
【００６８】
核酸構築物は、例えば、プラスミドベクター又はウイルスベクター(例えば、複製欠損型レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ関連ウイルス)であってよい。核酸構築物は目的の核酸(例えば、天然の形態でP2X3 mRNAに特異的にハイブリダイズする転写体をコードする核酸)に機能し得る形で連結された1つ以上の調節配列を含む。調節エレメントに関して、「機能し得る形で連結された(operably linked)」とは、該調節配列と目的の核酸が、(例えば、前記ベクターを前記宿主細胞中に導入する場合)ヌクレオチド配列が転写されるように配置されることを意味する。
【００６９】
調節配列としては、プロモーター、エンハンサー及び他の発現制御エレメント(例えば、ポリアデニル化シグナル)が含まれる(例えば、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)を参照)。調節配列としては、多くの型の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的な発現を指令するもの及び特定の宿主細胞中でのみヌクレオチド配列の発現を指令するもの(例えば、細胞型又は組織特異的な調節配列)が挙げられる。
【００７０】
製造物
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、梱包材料と組合せ、P2X3発現を低下させるためのキットとして販売することができる。製造物の作製のための構成要素及び方法は公知である。前記製造物は上記の節で説明した1種以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでもよい。さらに、前記製造物は、緩衝剤、ハイブリダイゼーション用試薬、又はP2X3発現を低下させるか、もしくはそれをモニターするための他の制御試薬をさらに含んでもよい。前記アンチセンスオリゴヌクレオチドがP2X3発現を低下させるのにどのように有効であるかを記載する説明書をそのようなキット中に同梱してもよい。
【００７１】
本発明を、以下の実施例においてさらに詳細に説明するが、これは特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００７２】
実施例1-材料及び方法
P2X3 mRNA内の接近可能部位の決定とP2X3アンチセンスオリゴヌクレオチドの設計
アンチセンスオリゴヌクレオチドが、 (RiboTAG(登録商標)法により決定される) ラット又はヒトP2X3 mRNAの接近可能領域に標的指向されるように設計した。ラット及びヒトP2X3の接近可能領域を表1に示す。アンチセンスオリゴヌクレオチドを商業的に合成し(Midland Certified Reagent Company, Midland, TX)、注入前に精製した。
【表１】
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【００７３】
アンチセンスP2X3を用いて処理したラットにおいて疼痛を評価するための方法
慢性疼痛の2つの異なるモデルを用いて、アンチセンスオリゴヌクレオチドを鞘内投与することによりP2X3ノックダウンの効果を評価した。両モデルは以下の6つの工程(以下により詳細に説明する)を含んでいた：
(1)脊髄へのカテーテル導入；
(2)痛覚試験(基線)；
(3)慢性神経障害又は炎症性疼痛の誘導；
(4)痛覚試験(損傷後)；
(5)アンチセンス注入；及び
(6)痛覚試験(治療後)。
【００７４】
脊髄へのカテーテル導入：120〜150 gの体重の雄Sprague DawleyラットをHarlan (Indianapolis, IN)から入手した。ラットを、75 mg/kgケタミン(ketamine)、5 mg/kgキシラジン(xylazine)、及び1 mg/kgアセプロマジン(acepromazine)を含む混合物で深く麻酔し、カテーテル(8.5 cm; PE-10)を、環椎後頭骨関節上の硬膜中での切開を介して腰仙鞘内腔に通した。動物を3日間かけて回復させた後、慢性疼痛のモデルにかけた。
【００７５】
機械的痛覚試験：機械的感受性に関する基線、損傷後、及び治療後の値を、アップダウン法(Chaplanら、(1994) J. Neurosci. Methods 53:55-63)に従って、補正されたモノフィラメント(von Freyフィラメント)を用いて評価した。動物を金網カゴに入れ、最小10分間周囲の環境に順応させた後、試験した。次第に力を増しながらフィラメントを、足の足底表面のちょうど湾曲している点に連続的に押し当て3秒間保持した。 (刺激が十分な力の刺激である場合に達成される) 刺激の行動終点は、動物が足を舐める、引きずる、及び／又は振る点であった。足の引きずりを起こさせるのに必要な力又は圧力を、各後足への有害な機械的刺激に対する閾値の尺度として記録した。各治療群の各動物における各後足について、平均及び平均の標準誤差(SEM)を決定した。ANOVA、次いでBonferonni post-hoc試験の反復測定値を用いて有意差を決定した。この刺激は通常痛いとは考えられずラットは通常選択された範囲内でフィラメントに反応しないので、この試験における損傷誘導による反応性の有意な増加は機械的異痛(allodynia)の尺度として解釈された。
【００７６】
温度痛覚試験：基線、損傷後、及び治療後の温度感受性を、後足の足底表面に送達した放射熱刺激に応答した引きずり潜伏期を測定することにより決定した(Hargreavesら、(1988), Pain 32:77-88)。動物をプレキシガラスのカゴに入れ、最小10分間順応させた。放射熱源を足底表面に向け、引きずりまでの時間を測定した。各足について、引きずり潜伏期を、5分以上により分けられた3つの測定値を平均することにより決定した。加熱装置を、反応しない動物の皮膚に対する損傷を回避するために、プログラムされた時間の後自動的に切れるように設定した。ANOVA及びその後のBonferonni post-hoc試験の反復測定値を用いてデータを分析した。損傷誘導による温度応答潜伏期の有意な増加は、刺激は通常、有害な範囲にあるため、温度痛覚過敏の尺度であると考えられた。
【００７７】
慢性神経障害疼痛の誘導：脊髄神経結紮(SNL)モデル(Kim及びChung(1992) Pain 50: 355-363)を用いて、慢性神経障害疼痛を誘導した。ラットをイソフルランで麻酔し、L5(脊椎)横突起を除去し、L5及びL6脊髄神経を、6-0絹縫合糸を用いてきつく結紮した。次いで、傷を、内部縫合糸及び外部ステープルを用いて閉じた。手術後、動物を温かい毛布上に置き、定期的に回転させ、麻酔からの完全な回復が得られるまで注意深く観察した。擬手術は横突起を除去すること、及び結紮することなくL5脊髄神経を露出させることからなっていた。全ての操作は左側で行った。
【００７８】
慢性炎症の誘導：慢性末梢炎症の完全フロイントアジュバント(CFA)モデルを用いた(例えば、Hyldenら、(1989) Pain 37: 229-243)。イソフルラン麻酔下のラットに、滅菌した1.0 mlシリンジを用いて左後足にCFA(75μl)の注入を受けさせた。別の集団の対照ラットには生理食塩水を片側注入した。
【００７９】
アンチセンスの注入：オリゴヌクレオチドをdH2Oに溶解し、以前に記載されたように(例えば、Bilskyら、(1996) Neurosci. Lett., 220: 155-158; Bilskyら、(1996) J. Pharmacol. Exp. Ther., 277: 491-501;及びVanderahら、(1994) Neuroreport., 5: 2601-2605を参照)、１回注入あたり5μlの容量で鞘内腔に送った。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、損傷後(基線)痛覚試験の後の午後に開始して、1日2回、3〜4日間投与した。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号1の、それぞれヌクレオチド721〜744、747〜770、及び1478〜1495に特異的にハイブリダイズする配列5’-GAG GTT TCC CTT CTC AAA-3’、5’-ATG TCC TTG TCG GTG AGG TTA GG-3’、及び5’-CTA GTC TTT GGG GTG AAC-3’を含んでいた。ランダムオリゴヌクレオチドを対照として用いた。
【００８０】
P2X3の免疫局在化
脊髄組織を死亡後に入手し、4％パラホルムアルデヒド中で一晩、液浸固定した。固定後、組織をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で2〜3日間洗浄し、10％スクロース溶液中で保存した。脊髄を、低温維持装置を用いて14μmの切片にスライスした。スライドに固定した組織切片を室温にて1時間、ブロッキングバッファー中でインキュベートした後、4℃にて一晩、一次抗血清(モルモット抗P2X3、1:5000)と共にインキュベートした。以前に記載されたように(Vulchanovaら、(1997) Neuropharmacology 36: 1229-1242)、ビオチン化チラミン増幅を用いて、染色を可視化した。吸収の対照として、一次抗血清を、対応するペプチド抗原(10μg/ml)と共にインキュベートした後、組織切片に塗布した。
【００８１】
背根神経節を死亡後に入手し、液体窒素中で凍結させた。凍結組織を10μmの切片に切断し、冷却したゼラチン被覆スライド上に解凍固定した。切片を、免疫組織化学のための処理の直前に30分間、パラホルムアルデヒド-ピクリン酸固定液を用いて固定した。スライドに固定した組織切片を室温にて1時間、ブロッキングバッファー中でインキュベートした後、4℃にて一晩、一次抗血清(モルモット抗P2X3、1:500)と共にインキュベートした。スライドをPBS中で3回洗浄し、室温にて1時間、二次抗血清と共にインキュベートし、再度洗浄し、カバーグラスを載せた。吸収の対照として、一次抗血清を、対応するペプチド抗原(10μg/ml)と共にインキュベートした後、組織切片に塗布した。シアニン3.18-コンジュゲート二次抗血清(Jackson ImmunoResearch, West Grove, CA)を用いて染色を可視化した。
【００８２】
実施例2-ラット脊髄におけるP2X3のアンチセンスノックダウンは慢性神経障害性及び炎症性疼痛における役割を支持する
アンチセンスオリゴヌクレオチドを、RiboTAG(登録商標)法により設計し、これを用いて慢性疼痛におけるP2X3の役割を評価した。温度(放射熱)及び機械(von Frey)的疼痛の閾値を、慢性疼痛(上記の実施例1に記載のような神経障害性又は炎症性疼痛)の誘導の前後に取得した。アンチセンスオリゴヌクレオチド又はランダム化された対照を、1日2回、3〜4日間送達し、温度的及び機械的閾値を再評価した。
【００８３】
図3Aは、動物が脊髄神経結紮による神経損傷後の温度刺激に対して有意により感受性が高かったことを示している(予め損傷させた基線(BL)及び損傷されていない対照と比較した応答閾値の減少により証明された)。0〜3日目のP2X3アンチセンスオリゴヌクレオチドによる治療により、対照ビヒクルによる治療と比較して、温度刺激に対する感受性が有意に軽減された。3〜15日目の治療の中断により、最大感受性への逆行が引き起こされ、これは15〜18日目のアンチセンス治療の再開により再び軽減された。ビヒクルのみの反復注入は効果をもたらさなかった。
【００８４】
同様に、図3Bは、神経が損傷された動物が機械的刺激に対して有意により感受性が高く、P2X3アンチセンス治療は可逆的にこの感受性を軽減させたことを示している。
【００８５】
図4A及び図4Bは、別群の動物を用いた類似実験の結果を示す。以前の実験におけると同様、P2X3アンチセンスオリゴヌクレオチドによる慢性疼痛の治療は可逆的に温度及び機械的刺激に対する感受性を軽減した。
【００８６】
図5A及び図5Bに示されるように、炎症にかけられた動物も温度及び機械的刺激に対して有意により感受性が高かった(予め炎症をかけた基線(BL)及び炎症をかけていない対照と比較した応答閾値の減少により証明される)。
【００８７】
いくつかの実験からの動物を、P2X3のレベルを免疫染色により評価できるように、安楽死させた。P2X3アンチセンスオリゴヌクレオチドで治療したラットはランダム化されたオリゴヌクレオチドで治療した対照動物よりも背角脊髄組織において、より低いレベルのP2X3を示した。
【００８８】
実施例3-ヒトP2X3の免疫局在化
ヒト脊髄におけるP2X3免疫反応性は内側ラミナIIに対応するバンドに限られていた(図6A及び6A')。背根神経節においては、P2X3免疫反応性は小ニューロンのサブセット中に存在していた(図6B及び6B')。脊髄及び背根神経節における標識化の特異性はペプチド抗原を用いた吸収対照により証明された(それぞれA'及びB')。ヒトP2X3のこの局在化はラットP2X3の局在化と同一であったが、これは慢性疼痛の治療標的としてのP2X3の追求を支持している。
【００８９】
その他の実施形態
本発明をその詳細な説明と共に記載してきたが、上記説明は、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の範囲を説明するためのものであり、それを限定する意図はない。他の態様、利点、及び変更は特許請求の範囲の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】図1はラットP2X3のヌクレオチド配列(配列番号1)である。
【図２】図2はヒトP2X3のヌクレオチド配列(配列番号2)である。
【図３】図3A及び図3Bは、カテーテル導入の後であるが慢性神経障害疼痛の誘導の前、慢性神経障害疼痛の誘導の後であるがアンチセンス治療の前、及びアンチセンス治療の後、のラットにおける痛覚試験(nociceptive testing)の結果を示す線グラフである。図3Aは機械的刺激をかけたラットにおける結果を示し、図3Bは温度刺激をかけたラットにおける結果を示す。
【図４】図4A及び図4Bは、カテーテル導入の後であるが慢性神経障害疼痛の誘導の前、慢性神経障害疼痛の誘導の後であるがアンチセンス治療の前、及びアンチセンス治療の後、のラットにおける痛覚試験の結果を示す線グラフである。図4Aは機械的刺激をかけたラットにおける結果を示し、図4Bは温度刺激をかけたラットにおける結果を示す。
【図５】図5A及び図5Bは、カテーテル導入の後であるが慢性炎症性疼痛の誘導の前、慢性炎症性疼痛の誘導の後であるがアンチセンス治療の前、及びアンチセンス治療の後、のラットにおける痛覚試験の結果を示す線グラフである。図5Aは機械的刺激をかけたラットにおける結果を示し、図5Bは温度刺激をかけたラットにおける結果を示す。
【図６】図6A、図6A'、図6B、及び図6B'は、ヒト脊髄(図6A及び図6A')及びヒト背根神経節(図6B及び図6B')におけるP2X3の免疫局在化を示す写真である。対照実験(図6A'及び図6B'に示す)のために、P2X3抗体をペプチド抗原と共に予めインキュベートした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005508182.tif 000050
【国際調査報告】
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