(57)【要約】  本発明は、酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼ（ＨＡＳ）をコードするコード領域セグメントを有する核酸セグメントなどの組換えベクター組換えBacillus宿主細胞に関する。組換えBacillus宿主細胞は、ヒアルロン酸（ＨＡ）の製造方法に利用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え宿主細胞であって、配列番号：１４の酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントを含んでなる組換えベクターを含んでなるBacillus細胞であり、コード領域がプロモーターによって制御されていることを特徴とする、組換え宿主細胞。
【請求項２】
組換え宿主細胞がBacillus subtilisまたはBacillus licheniformis細胞である、請求項１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項３】
精製した核酸セグメントが配列番号：１３のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項４】
宿主細胞がヒアルロン酸を産生する、請求項３に記載の組換え宿主細胞。
【請求項５】
精製した核酸セグメントの酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域がグラム陽性菌適合性プロモーターによって制御されている、請求項１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項６】
プロモーターがBacillus適合性プロモーターである、請求項５に記載の組換え宿主細胞。
【請求項７】
Bacillus subtilis細胞が酵素活性を有するＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ生合成経路酵素をコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントを含んでなる組換えベクターをも含んでなり、酵素活性を有するＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ生合成経路酵素がＵＤＰグルコースデヒドロゲナーゼ、ＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項８】
組換えベクターが酵素活性を有するＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをも含んでなる、請求項１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項９】
酵素活性を有するＨＡＳをコードするコード領域と酵素活性を有するＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域が、少なくとも１種類のプロモーターの少なくとも１個のコピーによって制御されている、請求項８に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１０】
酵素活性を有するＨＡＳをコードするコード領域と酵素活性を有するＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域が、異なるプロモーターによって制御されている、請求項８に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１１】
配列番号：１４の酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入し、コード領域がプロモーターによって制御されており、
宿主を培地で増殖させて、ヒアルロン酸を分泌させ、
分泌されたヒアルロン酸を回収する
段階を含んでなる、ヒアルロン酸の製造方法。
【請求項１２】
Bacillus宿主がBacillus subtilisまたはBacillus licheniformisである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ヒアルロン酸を回収する段階が、分泌されたヒアルロン酸を培地から抽出することを含んでなる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
抽出したヒアルロン酸を精製する段階をも含んでなる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
酵素活性を有するＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントを導入する段階をも含んでなる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域と酵素活性を有するＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域が、同一プロモーターによって制御されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域と酵素活性を有するＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域が、異なるプロモーターによって制御されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントを導入する段階において、精製した核酸セグメントが配列番号：１３のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入する段階において、精製した核酸セグメントの酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域が、グラム陽性菌適合性プロモーターによって制御されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
プロモーターがBacillus適合性プロモーターである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
配列番号：１４の酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入し、コード領域がプロモーターによって制御されており、
酵素活性を有するＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入し、
Bacillus宿主を培地で増殖させて、ヒアルロン酸を分泌させ、
分泌されたヒアルロン酸を回収する
段階を含んでなる、ヒアルロン酸の製造方法。
【請求項２２】
酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントを導入する段階において、精製した核酸セグメントが配列番号：１３のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域と酵素活性を有するＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域が、どういつプロモーターによって制御されている、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域と酵素活性を有するＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域が、異なるプロモーターによって制御されている、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
Bacillus宿主がBacillus subtilisまたはBacillis licheniformisである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
ヒアルロン酸を回収する段階が、分泌されたヒアルロン酸を培地から抽出することを含んでなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
抽出したヒアルロン酸を精製する段階をも含んでなる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入する段階において、精製した核酸セグメントの酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域がグラム陽性菌適合性プロモーターによって制御されている、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
プロモーターがBacillus適合性プロモーターである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
組換え宿主細胞であって、
配列番号：１４の酵素活性を有するStreptococcus pyogenesヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントを含んでなる組換えベクターと、
酵素活性を有するＵＤＰグルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントを含んでなる組換えベクター
を含んでなるBacillus細胞である、組換え宿主細胞。
【請求項３１】
組換え宿主細胞がBacillus subtilisまたはBacillus licheniformis細胞である、請求項３０に記載の組換え宿主細胞。
【請求項３２】
宿主細胞がヒアルロン酸を産生する、請求項３０に記載の組換え宿主細胞。
【請求項３３】
精製した核酸セグメントの配列番号：１４の酵素活性を有するStreptococcus pyogenesヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域が、グラム陽性菌適合性プロモーターによって制御されている、請求項３０に記載の組換え宿主細胞。
【請求項３４】
プロモーターがBacillus適合性プロモーターである、請求項３３に記載の組換え宿主細胞。
【請求項３５】
精製した核酸セグメントが配列番号：１３のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項３０に記載の組換え宿主細胞。
【請求項３６】
組換え宿主細胞であって、組換えベクターを導入したBacillus細胞であり、組換えベクターが
配列番号：１４の酵素活性を有するStreptococcus pyogenesヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントと、
酵素活性を有するＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域を含んでなる、組換え宿主細胞。
【請求項３７】
精製した核酸セグメントが配列番号：１３のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項３６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項３８】
酵素活性を有するStreptococcus pyogenesヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域と、酵素活性を有するＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域が、同一プロモーターによって制御されている、請求項３６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項３９】
酵素活性を有するStreptococcus pyogenesヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域と、酵素活性を有するＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域が、異なるプロモーターによって制御されている、請求項３６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項４０】
組換え宿主細胞がBacillus subtilisまたはBacillus licheniformis細胞である、請求項３６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項４１】
宿主細胞がヒアルロン酸を産生する、請求項３６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項４２】
精製した核酸セグメントの配列番号：１４の酵素活性を有するStreptococcus pyogenesヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域が、グラム陽性菌適合性プロモーターによって制御されている、請求項３６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項４３】
プロモーターがBacillus適合性プロモーターである、請求項４２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項４４】
配列番号：１４の酵素活性を有するStreptococcus pyogenesヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入し、コード領域がプロモーターによって制御されており、
宿主を培地で増殖させて、ヒアルロン酸を分泌させ、
分泌されたヒアルロン酸を回収する
段階を含んでなる方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項４５】
精製した核酸セグメントが配列番号：３のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項４４に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項４６】
Bacillus宿主がBacillus subtilisまたはBacillus licheniformisである、請求項４４に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項４７】
Bacillus宿主を培地で増殖させてヒアルロン酸を分泌する段階が、Bacillus宿主を約２５℃〜約４２℃にて複合培地化学的に定義された培地で増殖させてヒアルロン酸を分泌すると更に定義される、請求項４４に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項４８】
Bacillus宿主を培地で増殖させてヒアルロン酸を分泌する段階が、Bacillus宿主を約２５℃〜約４２℃にて複合培地で増殖させてヒアルロン酸を分泌すると更に定義される、請求項４４に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項４９】
Bacillus宿主を培地で増殖させてヒアルロン酸を分泌する段階が、Bacillus宿主をグルコースと、Ｎ−アセチルグルコサミンとグルコサミンの少なくとも一方を含む培地で増殖させてヒアルロン酸を分泌すると更に定義される、請求項４４に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項５０】
分泌されたヒアルロン酸を回収する段階が、
ヒアルロン酸を細胞および砕片から濾過、遠心分離、および凝集の少なくとも一つによって分離し、
分離したヒアルロン酸を濃縮し、
濃縮したヒアルロン酸を沈澱、限外濾過、および透析からなる群から選択される方法の少なくとも一つによって培地から分離する
ことと更に定義される、請求項４４に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項５１】
ヒアルロン酸を濾過、遠心分離、および凝集の少なくとも一つによって細胞および砕片から分離する段階が、トリクロロ酢酸を添加して、細胞および砕片のヒアルロン酸からの分離を促進することを更に包含する、請求項５０に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項５２】
沈澱剤がアルコール、有機溶媒または化合物、および脂肪族の正に帯電した塩の少なくとも一つである、請求項５０に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項５３】
沈澱剤がエタノール、イソプロパノール、アセトン、臭化セチルトリアンモニウムまたは塩化セチルピリジニウムからなる群から選択される、請求項５２に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項５４】
抽出したヒアルロン酸を精製する段階をも含んでなる、請求項４４に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項５５】
請求項４４に記載の方法が酵素活性を有するＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントを導入する段階をも包含する、上記方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項５６】
酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域と酵素活性を有するＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域がが、同一プロモーターによって制御されている、請求項５５に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項５７】
酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域と酵素活性を有するＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域が、異なるプロモーターによって制御されている、請求項５５に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項５８】
配列番号：１４の酵素活性を有するStreptococcus pyogenesヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入する段階において、精製した核酸セグメントの配列番号：１４の酵素活性を有するStreptococcus pyogenesヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域が、グラム陽性菌適合性プロモーター由来のプロモーターによって制御されている、請求項４４に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項５９】
配列番号：１４の酵素活性を有するStreptococcus pyogenesヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントBacillus宿主に導入する段階において、精製した核酸セグメントを形質転換、トランスフェクション、形質導入、および電気穿孔の少なくとも一つによってBacillus宿主に導入する、請求項４４に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項６０】
組換え宿主細胞であって、ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡとＵＤＰＧｌｃＮＡｃの少なくとも一方の産生を増進するBacillus細胞であり、配列番号：１４の酵素活性を有するStreptococcus pyogenesヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を導入した精製した核酸セグメントを含んでなる組換えベクターをも有することを特徴とする、組換え宿主細胞。
【請求項６１】
精製した核酸セグメントが配列番号：１３のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項６０に記載の組換え宿主細胞。
【請求項６２】
組換え宿主細胞がBacillus subtilisまたはBacillus licheniformis細胞である、請求項６０に記載の組換え宿主細胞。
【請求項６３】
組換え宿主細胞が少なくとも１個の改質ＲＮＡポリメラーゼプロモーターをも包含し、改質ＲＮＡポリメラーゼプロモーターがＲＮＡポリメラーゼによって認識されるとき、ＲＮＡポリメラーゼは内在性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターより多量にＲＮＡを発現することができる、請求項６０に記載の組換え宿主細胞。
【請求項６４】
改質が突然変異である、請求項６３に記載の組換え宿主細胞。
【請求項６５】
改質がタンデムプロモーター要素である、請求項６３に記載の組換え宿主細胞。
【請求項６６】
組換え宿主細胞がＵＤＰ−糖前駆体生合成経路において機能的に活性な酵素をコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントを含んでなる組換えベクターで形質転換される、請求項６０に記載の組換え宿主細胞。
【請求項６７】
ＵＤＰ−糖前駆体生合成経路酵素がＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼである、請求項６６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項６８】
ＵＤＰ−糖前駆体生合成経路酵素がＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼである、請求項６６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項６９】
組換え宿主細胞が天然のBacillus細胞に見出されるより少なくとも１つ多い追加メッセンジャーＲＮＡ安定化要素を更に包含する、請求項６０に記載の組換え宿主細胞。
【請求項７０】
組換え宿主細胞が天然のBacillus細胞に見出されるより少なくとも１つ少ないメッセンジャーＲＮＡ脱安定化要素を更に包含する、請求項６０に記載の組換え宿主細胞。
【請求項７１】
組換え宿主細胞がＵＤＰ−糖前駆体生合成経路において機能活性を有する酵素をコードするコード領域を有する少なくとも１個の核酸セグメントを更に包含して、組換え宿主細胞が内在性ＵＤＰ−糖前駆体生合成経路酵素を発現する天然の宿主細胞より大きな活性を有するようにする、請求項６０に記載の組換え宿主細胞。
【請求項７２】
組換え宿主細胞が少なくとも１個の突然変異したＵＤＰ−糖前駆体生合成遺伝子を更に包含し、突然変異したＵＤＰ−糖前駆体遺伝子が転写したメッセンジャーＲＮＡの半減期を増加する、請求項６０に記載の組換え宿主細胞。
【請求項７３】
組換え宿主細胞が翻訳効率の増加したメッセンジャーＲＮＡをコードする少なくとも１個の突然変異したＵＤＰ−糖前駆体生合成遺伝子を更に包含する、請求項６０に記載の組換え宿主細胞。
【請求項７４】
ＵＤＰ−糖前駆体生合成遺伝子における突然変異がＵＤＰ−糖前駆体生合成遺伝子のリボソーム結合部位で起こり、リボソームのリボソーム結合部位に対する結合親和性が増加するようになる、請求項６０に記載の組換え宿主細胞。
【請求項７５】
ヒアルロン酸の製造方法であって、
配列番号：１４の酵素活性を有するStreptococcus pyogenes ヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入し、Bacillus宿主でＵＤＰ−ＧｌｃＵＡとＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの少なくとも一方の産生が増進し、
Bacillus宿主を培地で増殖させて、ヒアルロン酸を分泌させ、
分泌されたヒアルロン酸を回収する
段階を含んでなる、方法。
【請求項７６】
配列番号：１４の酵素活性を有するStreptococcus pyogenesヒアルロナンシンターゼをコードする精製した核酸セグメントを導入する段階において、精製した核酸セグメントが配列番号：１３のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
Bacillus宿主がBacillus subtilisまたはBacillus licheniformisである、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
配列番号：１４の酵素活性を有するStreptococcus pyogenesヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入する段階において、Bacillus宿主がプロモーター活性の増加した少なくとも１個の改質ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを更に包含する、請求項７５に記載の方法。
【請求項７９】
ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの改質が突然変異である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの改質がタンデムプロモーター要素である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
配列番号：１４の酵素活性を有するStreptococcus pyogenesヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入する段階において、Bacillus宿主がＵＤＰ−糖前駆体生合成経路酵素をコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントを含んでなるベクターで形質転換される、請求項７５に記載の方法。
【請求項８２】
ＵＤＰ−糖前駆体生合成経路酵素がＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼである、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
ＵＤＰ−糖前駆体生合成経路酵素がＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼである、請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
配列番号：１４の酵素活性を有するStreptococcus pyogenesヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主において、Bacillus宿主が天然のBacillus細胞に見出されるより少なくとも１つ多い追加メッセンジャーＲＮＡ安定化要素を更に包含する、請求項７５に記載の方法。
【請求項８５】
配列番号：１４の酵素活性を有するStreptococcus pyogenesヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主において、Bacillus宿主が天然のBacillus細胞に見出されるより少なくとも１つ少ないメッセンジャーＲＮＡ脱安定化要素を更に包含する、請求項７５に記載の方法。
【請求項８６】
配列番号：１４の酵素活性を有するStreptococcus pyogenesヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主において、Bacillus宿主がＵＤＰ−糖前駆体生合成経路酵素をコードするコード領域を有する少なくとも１個の核酸セグメントを更に包含し、組換え宿主細胞が内在性ＵＤＰ−糖前駆体生合成経路酵素を発現する天然の宿主細胞より大きな活性を有するようにする、請求項７５に記載の方法。
【請求項８７】
配列番号：１４の酵素活性を有するStreptococcus pyogenesヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入する段階において、Bacillus宿主が少なくとも１個の突然変異した内在性ＵＤＰ−糖前駆体生合成遺伝子を含んでなり、突然変異により、突然変異したＵＤＰ−糖前駆体遺伝子から転写したメッセンジャーＲＮＡの半減期が増加する、請求項７５に記載の方法。
【請求項８８】
配列番号：１４の酵素活性を有するStreptococcus pyogenesヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入する段階において、Bacillus宿主が翻訳効率の増加したメッセンジャーＲＮＡをコードする少なくとも１個の突然変異したＵＤＰ−糖前駆体生合成遺伝子を包含する、請求項７５に記載の方法。
【請求項８９】
ＵＤＰ糖前駆体生合成遺伝子での突然変異が ＵＤＰ−糖前駆体生合成遺伝子のリボソーム結合部位で起こり、リボソームのリボソーム結合部位に対する結合親和性が増加するようになる、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
配列番号：１４の酵素活性を有するStreptococcus pyogenesヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入し、Bacillus宿主でＵＤＰ−ＧｌｃＵＡとＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの少なくとも一方の産生が増進し、
Bacillus宿主を培地で増殖させて、ヒアルロン酸を分泌させ、
分泌されたヒアルロン酸を回収する
段階を含んでなる方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項９１】
精製した核酸セグメントが配列番号：１３のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項９０に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項９２】
配列番号：１４の酵素活性を有するStreptococcus pyogenesヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入する段階において、Bacillus宿主が内在性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターより大きなプロモーター活性を有する少なくとも１個の改質ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを更に包含する、請求項９０に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項９３】
ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの改質が突然変異である、請求項９２に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項９４】
ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの改質がタンデムプロモーター要素である、請求項９２に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項９５】
配列番号：１４を酵素活性を有するStreptococcus pyogenesヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入する段階において、Bacillus宿主がＵＤＰ−糖前駆体生合成経路酵素をコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントを含んでなる組換えベクターで形質転換される、請求項９２に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項９６】
ＵＰＣ−糖前駆体生合成経路酵素がＵＤＰグルコースデヒドロゲナーゼである、請求項９５に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項９７】
ＵＰＣ−糖前駆体生合成経路酵素がＵＤＰグルコースピロホスホリラーゼである、請求項９５に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項９８】
配列番号：１４の酵素活性を有するStreptococcus pyogenesヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入する段階において、Bacillus宿主が組換え宿主細胞の形成に用いられるBacillus宿主細胞で見られるより少なくとも１個多いメッセンジャーＲＮＡ安定化要素を更に包含する、請求項９０に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項９９】
配列番号：１４の酵素活性を有するStreptococcus pyogenesヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入する段階において、Bacillus宿主が組換え宿主細胞の形成に用いられるBacillus宿主細胞に見出されるより少なくとも１つ少ないメッセンジャーＲＮＡ脱安定化要素を更に包含する、請求項９０に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項１００】
配列番号：１４の酵素活性を有するStreptococcus pyogenesヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入する段階において、Bacillus宿主がＵＤＰ−糖前駆体生合成経路の機能活性を有する酵素をコードするコード領域を有する少なくとも１つの核酸セグメントを更に包含し、組換え宿主細胞が内在性ＵＤＰ−糖前駆体生合成経路酵素を発現する天然の宿主細胞より大きな活性を有する、請求項９０に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項１０１】
配列番号：１４の酵素活性を有するStreptococcus pyogenesヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入する段階において、Bacillus subtilis株が少なくとも１個の突然変異したＵＤＰ−糖前駆体生合成遺伝子を含んでなり、突然変異により、突然変異したＵＤＰ−糖前駆体遺伝子から転写したメッセンジャーＲＮＡの半減期が増加する、請求項９０に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項１０２】
配列番号：１４の酵素活性を有するStreptococcus pyogenesヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入する段階において、Bacillus subtilis株が翻訳効率の増加したメッセンジャーＲＮＡをコードする少なくとも１個の突然変異したＵＤＰ−糖前駆体生合成遺伝子を含んでなる、請求項９０に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項１０３】
ＵＤＰ−糖前駆体生合成遺伝子での突然変異がＵＤＰ−糖前駆体生合成遺伝子のリボソーム結合部位で起こり、リボソームのリボソーム結合部位に対する結合親和性が増加するようになる、請求項１０２に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項１０４】
組換え宿主細胞であって、配列番号：１０の酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントを含んでなる組換えベクターを含んでなるBacillus細胞であり、コード領域がプロモーターによって制御されている、組換え宿主細胞。
【請求項１０５】
組換え宿主細胞がBacillus subtilisまたはBacillus licheniformis細胞である、請求項１０４に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１０６】
精製した核酸セグメントが配列番号：９のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１０４に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１０７】
宿主細胞がヒアルロン酸を産生する、請求項１０６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１０８】
精製した核酸セグメントの酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域がグラム陽性菌適合性プロモーターによって制御されている、請求項１０４に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１０９】
プロモーターがBacillus適合性プロモーターである、請求項１０８に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１１０】
組換え宿主細胞がBacillus subtilis細胞であり、宿主細胞が更に酵素活性を有するＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ生合成経路酵素をコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントを含んでなる組換えベクターを含んでなり、酵素活性を有するＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ生合成経路酵素がＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ、ＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１０４に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１１１】
組換えベクターが更に酵素活性を有するＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントを含んでなる、請求項１０４に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１１２】
酵素活性を有するＨＡＳをコードするコード領域と酵素活性を有するＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域が、少なくとも１種類のプロモーターの少なくとも１個のコピーによって制御されている、請求項１１１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１１３】
酵素活性を有するＨＡＳをコードするコード領域と酵素活性を有するＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域が、異なるプロモーターによって制御されている、請求項１１１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１１４】
配列番号：１０の酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入し、コード領域がプロモーターによって制御されており、
宿主を培地で増殖させて、ヒアルロン酸を分泌させ、
分泌されたヒアルロン酸を回収する
段階を含んでなる、ヒアルロン酸の製造方法。
【請求項１１５】
Bacillus宿主がBacillus subtilisまたはBacillus licheniformisである、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
ヒアルロン酸を回収する段階が、分泌されたヒアルロン酸を培地からから抽出することを含んでなる、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１７】
抽出したヒアルロン酸を精製する段階をも含んでなる、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
酵素活性を有するＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントを導入する段階をも含んでなる、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１９】
酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域および酵素活性を有するＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域が、同一プロモーターによって制御されている、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２０】
酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域と酵素活性を有するＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域が、異なるプロモーターによって制御されている、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２１】
酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントを導入する段階において、精製した核酸セグメントが配列番号：９のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２２】
酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入する段階において、精製した核酸セグメントの酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域がグラム陽性菌適合性プロモーターによって制御されている、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２３】
プロモーターがBacillus適合性プロモーターである、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
配列番号：１０の酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入し、コード領域がプロモーターによって制御されており、
酵素活性を有するＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入し、
Bacillus宿主を培地で増殖させて、ヒアルロン酸を分泌させ、
分泌されたヒアルロン酸を回収する
段階を含んでなる、ヒアルロン酸の製造方法。
【請求項１２５】
酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントを導入する段階において、精製した核酸セグメントが配列番号：９のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１２５４に記載の方法。
【請求項１２６】
酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域と酵素活性を有するＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域が同一プロモーターによって制御されている、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２７】
酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域と酵素活性を有するＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域が異なるプロモーターによって制御されている、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２８】
Bacillus宿主がBacillus subtilisまたはBacillis licheniformisである、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２９】
ヒアルロン酸を回収する段階が分泌されたヒアルロン酸を培地から抽出することを含んでなる、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１３０】
抽出したヒアルロン酸を精製する段階をも含んでなる、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する核酸セグメントをBacillus宿主に導入する段階において、精製した核酸セグメントの酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域がグラム陽性菌適合性プロモーターによって制御されている、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１３２】
プロモーターがBacillus適合性プロモーターである、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
組換え宿主細胞であって、
配列番号：１０の酵素活性を有するPasturella multocidaヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントを含んでなる組換えベクターと、
酵素活性を有するＵＤＰグルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントを含んでなる組換えベクター
を含んでなるBacillus細胞であることを特徴とする、組換え宿主細胞。
【請求項１３４】
組換え宿主細胞がBacillus subtilisまたはBacillus licheniformis細胞である、請求項１３３に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１３５】
宿主細胞がヒアルロン酸を産生する、請求項１３３に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１３６】
精製した核酸セグメントの配列番号：１０の酵素活性を有するPasturella multocidaヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域がグラム陽性菌適合性プロモーターによって制御されている、請求項１３３に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１３７】
プロモーターがBacillus適合性プロモーターである、請求項１３６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１３８】
精製した核酸セグメントが配列番号：９のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１３３に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１３９】
組換え宿主細胞が組換えベクターを導入したBacillus細胞であり、組換えベクターが
配列番号：１０の酵素活性を有するPasturella multocidaヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントと、
酵素活性を有するＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域を含んでなる、組換え宿主細胞。
【請求項１４０】
精製した核酸セグメントが配列番号：９のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１３９に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１４１】
酵素活性を有するPasturella multocidaヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域と酵素活性を有するＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域が、同一プロモーターによって制御されている、請求項１３９に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１４２】
酵素活性を有するPasturella multocidaヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域と酵素活性を有するＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域が、異なるプロモーターによって制御されている、請求項１３９に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１４３】
組換え宿主細胞がBacillus subtilisまたはBacillus licheniformis細胞である、請求項１３９に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１４４】
宿主細胞がヒアルロン酸を産生する、請求項１３９に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１４５】
精製した核酸セグメントの配列番号：１０の酵素活性を有するPasturella multocidaヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域がグラム陽性菌適合性プロモーターによって制御されている、請求項１３９に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１４６】
プロモーターがBacillus-適合性プロモーターである、請求項１４５に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１４７】
配列番号：１０の酵素活性を有するPasturella multocidaヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入し、コード領域がプロモーターによって制御されており、
Bacillus宿主を培地で増殖させて、ヒアルロン酸を分泌させ、
分泌されたヒアルロン酸を回収する
段階を含んでなる方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項１４８】
精製した核酸セグメントが配列番号：３のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１４７に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項１４９】
Bacillus宿主がBacillus subtilisまたはBacillus licheniformisである、請求項１４７に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項１５０】
Bacillus宿主を培地で増殖させてヒアルロン酸を分泌させる段階が、更にBacillus宿主を約25℃〜約42℃の化学的に定義された培地で増殖させて、ヒアルロン酸を分泌させることと定義される、請求項１４７に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項１５１】
Bacillus宿主を培地で増殖させてヒアルロン酸を分泌させる段階が、更にBacillus宿主を約25℃〜約42℃の複合培地で増殖させて、ヒアルロン酸を分泌させることと定義される、請求項１４７に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項１５２】
Bacillus宿主を培地で増殖させてヒアルロン酸を分泌させる段階が、更にBacillus宿主をグルコースとＮ−アセチルグルコサミンおよびグルコサミンの少なくとも一方を含む培地で増殖させてヒアルロン酸を分泌させることと定義される、請求項１４７に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項１５３】
分泌されたヒアルロン酸を回収する段階が、
ヒアルロン酸を濾過、遠心分離、および凝集の少なくとも１つによって細胞および砕片から分離し、
分離したヒアルロン酸を濃縮し、
濃縮したヒアルロン酸を沈澱、限外濾過、および透析からなる群から選択される少なくとも１種類の方法によって培地から分離する
ことと定義される、請求項１４７に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項１５４】
ヒアルロン酸を濾過、遠心分離、および凝集の少なくとも１つによって細胞および砕片から分離する段階が、トリクロロ酢酸を添加することによってヒアルロン酸から細胞および砕片の分離を促進することをも包含する、請求項１５３に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項１５５】
沈澱剤がアルコール、有機溶媒または化合物、および脂肪族の正に帯電した塩の少なくとも１つである、請求項１５３に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項１５６】
沈澱剤がエタノール、イソプロパノール、アセトン、臭化セチルトリアンモニウムまたは塩化セチルピリジニウムからなる群から選択される、請求項１５５に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項１５７】
抽出したヒアルロン酸を精製する段階をも含んでなる、請求項１４７に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項１５８】
請求項１４７に記載の方法が酵素活性を有するＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントを導入する段階を更に包含する、上記方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項１５９】
酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域と酵素活性を有するＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域が、同一プロモーターによって制御されている、請求項１５８に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項１６０】
酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域と酵素活性を有するＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域が、異なるプロモーターによって制御されている、請求項１５８に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項１６１】
配列番号：１０の酵素活性を有するPasturella multocidaヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入する段階において、精製した核酸セグメントの配列番号：１０の酵素活性を有するPasturella multocidaヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域がグラム陽性菌適合性プロモーター由来のプロモーターによって制御されている、請求項１４７に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項１６２】
配列番号：１０の酵素活性を有するPasturella multocidaヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入する段階において、精製した核酸セグメントを形質転換、トランスフェクション、形質導入、および電気穿孔の少なくとも１つによってBacillus宿主に導入する、請求項１４７に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項１６３】
組換え宿主細胞であって、ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡとＵＤＰＧｌｃＮＡｃの少なくとも一方の産生を高めるBacillus細胞であり、更に配列番号：１０の酵素活性を有するPasturella multocidaヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を導入した精製した核酸セグメントを含んでなる組換えベクターをも有する、組換え宿主細胞。
【請求項１６４】
精製した核酸セグメントが配列番号：９のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１６３に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１６５】
組換え宿主細胞がBacillus subtilisまたはBacillus licheniformis細胞である、請求項１６３に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１６６】
組換え宿主細胞が少なくとも１個の改質ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを更に包含し、改質ＲＮＡポリメラーゼプロモーターがＲＮＡポリメラーゼによって認識され、ＲＮＡポリメラーゼが内在性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターより多量にＲＮＡを発現することができる、請求項１６３に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１６７】
改質が突然変異である、請求項１６６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１６８】
改質がタンデムプロモーター要素である、請求項１６６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１６９】
組換え宿主細胞がＵＤＰ−糖前駆体生合成経路における機能活性を有する酵素をコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントを含んでなる組換えベクターで形質転換される、請求項１６３に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１７０】
ＵＤＰ−糖前駆体生合成経路酵素がＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼである、請求項１６９に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１７１】
ＵＤＰ−糖前駆体生合成経路酵素がＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼである、請求項１６９に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１７２】
組換え宿主細胞が天然のBacillus細胞に見出されるより少なくとも１個多いメッセンジャーＲＮＡ安定化要素を更に包含する、請求項１６３に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１７３】
組換え宿主細胞が天然のBacillus細胞に見出されるより少なくとも１個少ないメッセンジャーＲＮＡ脱安定化要素を更に包含する、請求項１６３に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１７４】
組換え宿主細胞がＵＤＰ−糖前駆体生合成経路において機能活性を有する酵素をコードするコード領域を有する少なくとも１つの核酸セグメントを更に包含し、組換え宿主細胞内在性ＵＤＰ糖前駆体生合成経路酵素を発現する天然の宿主細胞より大きな活性を有するようにする、請求項１６３に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１７５】
組換え宿主細胞が少なくとも１個の突然変異したＵＤＰ−糖前駆体生合成遺伝子を更に包含し、突然変異したＵＤＰ−糖前駆体遺伝子が転写したメッセンジャーＲＮＡの半減期を増加する、請求項１６３に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１７６】
組換え宿主細胞が翻訳効率の増加したメッセンジャーＲＮＡをコードする少なくとも１個の突然変異したＵＤＰ−糖前駆体生合成遺伝子を更に包含する、請求項１６３に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１７７】
ＵＤＰ−糖前駆体生合成遺伝子における突然変異がＵＤＰ−糖前駆体生合成遺伝子のリボソーム結合部位で起こり、リボソームのリボソーム結合部位に対する結合親和性が増加するようになる、請求項１６３に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１７８】
ヒアルロン酸の製造方法であって、
配列番号：１０の酵素活性を有するPasturella multocidaヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入し、Bacillus宿主でＵＤＰ−ＧｌｃＵＡとＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの少なくとも一方の産生が増進し、
Bacillus宿主を培地で増殖させて、ヒアルロン酸を分泌させ、
分泌されたヒアルロン酸を回収する
段階を含んでなる、方法。
【請求項１７９】
配列番号：１０の酵素活性を有するPasturella multocidaヒアルロナンシンターゼをコードする精製した核酸セグメントを導入する段階において、精製した核酸セグメントが配列番号：９のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１７８に記載の方法。
【請求項１８０】
Bacillus宿主がBacillus subtilisまたはBacillus licheniformisである、請求項１７８に記載の方法。
【請求項１８１】
配列番号：１０の酵素活性を有するPasturella multocidaヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入する段階において、Bacillus宿主がプロモーター活性の増加した少なくとも１個の改質ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを更に包含する、請求項１７８に記載の方法。
【請求項１８２】
ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの改質が突然変異である、請求項１８１に記載の方法。
【請求項１８３】
ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの改質がタンデムプロモーター要素である、請求項１８１に記載の方法。
【請求項１８４】
配列番号：１０の酵素活性を有するPasturella multocidaヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入する段階において、Bacillus宿主がＵＤＰ−糖前駆体生合成経路酵素をコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントを含んでなるベクターで形質転換される、請求項１７８に記載の方法。
【請求項１８５】
ＵＤＰ−糖前駆体生合成経路酵素がＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼである、請求項１８４に記載の方法。
【請求項１８６】
ＵＤＰ−糖前駆体生合成経路酵素がＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼである、請求項１８４に記載の方法。
【請求項１８７】
配列番号：１０の酵素活性を有するPasturella multocidaヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入する段階において、Bacillus宿主が天然のBacillus宿主で見られるより少なくとも１個多いメッセンジャーＲＮＡ安定化要素を更に包含する、請求項１７８に記載の方法。
【請求項１８８】
配列番号：１０の酵素活性を有するPasturella multocidaヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入する段階において、Bacillus宿主が天然のBacillus宿主で見られるより少なくとも１個少ないメッセンジャーＲＮＡ脱安定化要素を更に包含する、請求項１７８に記載の方法。
【請求項１８９】
配列番号：１０の酵素活性を有するPasturella multocidaヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入する段階において、Bacillus宿主がＵＤＰ−糖前駆体生合成経路酵素をコードするコード領域を有する少なくとも１個の核酸セグメントを更に包含して、組換え宿主細胞が内在性ＵＤＰ−糖前駆体生合成経路酵素を発現する天然の宿主細胞より大きな活性を有するようにする、請求項１７８に記載の方法。
【請求項１９０】
配列番号：１０の酵素活性を有するPasturella multocidaヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入する段階において、Bacillus宿主が少なくとも１個の突然変異した内在性ＵＤＰ−糖前駆体生合成遺伝子を含んでなり、突然変異により、突然変異したＵＤＰ−糖前駆体遺伝子から転写したメッセンジャーＲＮＡの半減期が増加する、請求項１７８に記載の方法。
【請求項１９１】
配列番号：１０の酵素活性を有するPasturella multocidaヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入する段階において、Bacillus宿主が翻訳効率の増加したメッセンジャーＲＮＡをコードする少なくとも１個の突然変異したＵＤＰ−糖前駆体生合成遺伝子を含んでなる、請求項１７８に記載の方法。
【請求項１９２】
ＵＤＰ−糖前駆体生合成遺伝子における突然変異がＵＤＰ−糖前駆体生合成遺伝子のリボソーム結合部位で起こり、リボソームのリボソーム結合部位に対する結合親和性が増加するようになる、請求項１９１に記載の方法。
【請求項１９３】
配列番号：１０酵素活性を有するPasturella multocidaヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入し、Bacillus宿主でのＵＤＰ−ＧｌｃＵＡおよびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの少なくとも一方の産生が高まり、
Bacillus宿主を培地で増殖させて、ヒアルロン酸を分泌させ、
分泌されたヒアルロン酸を回収する
段階を含んでなる方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項１９４】
精製した核酸セグメントが配列番号：９のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１９３に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項１９５】
配列番号：１０酵素活性を有するPasturella multocidaヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入する段階において、Bacillus宿主が内在性ＲＮＡポリメラーゼより大きなプロモーター活性を有する少なくとも１個の改質ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを更に包含する、請求項１９３に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項１９６】
ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの改質が突然変異である、請求項１９５に記載の方法によって製造される、ヒアルロン酸。
【請求項１９７】
ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの改質がタンデムプロモーター要素である、請求項１９５に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項１９８】
配列番号：１０の酵素活性を有するPasturella multocidaヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入する段階において、Bacillus宿主がＵＤＰ−糖前駆体生合成経路酵素をコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントを含んでなる組換えベクターで形質転換される、請求項１９５に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項１９９】
ＵＰＣ−糖前駆体生合成経路酵素がＵＤＰグルコースデヒドロゲナーゼである、請求項１９８に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項２００】
ＵＰＣ−糖前駆体生合成経路酵素がＵＤＰグルコースピロホスホリラーゼである、請求項１９８に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項２０１】
配列番号：１０の酵素活性を有するPasturella multocidaヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入する段階において、Bacillus宿主が組換え宿主細胞を形成するのに用いられるBacillus宿主細胞で見られるより少なくとも１個多いメッセンジャーＲＮＡ安定化要素を更に包含する、請求項１９３に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項２０２】
配列番号：１０の酵素活性を有するPasturella multocidaヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入する段階において、Bacillus宿主が組換え宿主細胞を形成するのに用いられるBacillus宿主細胞で見られるより少なくとも１個少ないメッセンジャーＲＮＡ脱安定化要素を更に包含する、請求項１９３に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項２０３】
配列番号：１０の酵素活性を有するPasturella multocidaヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入する段階において、Bacillus宿主がＵＤＰ−糖前駆体生合成経路の機能活性を有する酵素をコードするコード領域を有する少なくとも１つの核酸セグメントを更に包含し、組換え宿主細胞が内在性ＵＤＰ−糖前駆体生合成経路酵素を発現する天然の宿主細胞より大きな活性を有する、請求項１９３に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項２０４】
配列番号：１０の酵素活性を有するPasturella multocidaヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入する段階において、Bacillus subtilis株が少なくとも１個の突然変異したＵＤＰ−糖前駆体生合成遺伝子を含んでなり、突然変異により突然変異したＵＤＰ−糖前駆体遺伝子から転写したメッセンジャーＲＮＡの半減期が増加する、請求項１９３に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項２０５】
配列番号：１０の酵素活性を有するPasturella multocidaヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入する段階において、Bacillus subtilis株が翻訳効率の増加したメッセンジャーＲＮＡをコードする少なくとも１個の突然変異したＵＤＰ−糖前駆体生合成遺伝子を含んでなる、請求項１９３に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項２０６】
ＵＤＰ−糖前駆体生合成遺伝子における突然変異がＵＤＰ−糖前駆体生合成遺伝子におけるリボソーム結合部位で起こり、リボソームのリボソーム結合部位に対する結合親和性が増加するようになる、請求項２０５に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項２０７】
組換え宿主細胞であって、Bacillus細胞comprising配列番号：１２の酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントを含んでなる組換えベクターを含んでなり、コード領域がプロモーターによって制御されている、組換え宿主細胞。
【請求項２０８】
組換え宿主細胞がBacillus subtilisまたはBacillus licheniformis細胞である、請求項２０７に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２０９】
精製した核酸セグメントが配列番号：１１のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項２０７に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２１０】
宿主細胞がヒアルロン酸を産生する、請求項２０９に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２１１】
精製した核酸セグメント酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域がグラム陽性菌適合性プロモーターによって制御されている、請求項２０７に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２１２】
プロモーターがBacillus適合性プロモーターである、請求項２１１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２１３】
Bacillus subtilis細胞が更に酵素活性を有するＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ生合成経路酵素をコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントを含んでなる組換えベクターを含んでなり、酵素活性を有するＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ生合成経路酵素ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ、ＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２０７に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２１４】
組換えベクターが更に酵素活性を有するＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントを含んでなる、請求項２０７に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２１５】
酵素活性を有するＨＡＳをコードするコード領域と酵素活性を有するＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域が少なくとも１種類のプロモーターの少なくとも１個のコピーによって制御されている、請求項２１４に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２１６】
酵素活性を有するＨＡＳをコードするコード領域と酵素活性を有するＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域が異なるプロモーターによって制御されている、請求項２１４に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２１７】
ヒアルロン酸の製造方法であって、
配列番号：１２の酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入し、コード領域がプロモーターによって制御されており、
宿主を培地で増殖させて、ヒアルロン酸を分泌させ、
分泌されたヒアルロン酸を回収する
段階を含んでなる、方法。
【請求項２１８】
Bacillus宿主がBacillus subtilisまたはBacillus licheniformisである、請求項２１７に記載の方法。
【請求項２１９】
ヒアルロン酸を回収する段階が分泌されたヒアルロン酸を培地から抽出することを含んでなる、請求項２１７に記載の方法。
【請求項２２０】
抽出したヒアルロン酸を精製する段階を更に含んでなる、請求項２１９に記載の方法。
【請求項２２１】
酵素活性を有するＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントを導入する段階を更に含んでなる、請求項２１７に記載の方法。
【請求項２２２】
酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域と酵素活性を有するＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域が同一プロモーターによって制御されている、請求項２１７に記載の方法。
【請求項２２３】
酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域と酵素活性を有するＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域が異なるプロモーターによって制御されている、請求項２１７に記載の方法。
【請求項２２４】
酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントを導入する段階において、精製した核酸セグメントが配列番号：１１のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項２１７に記載の方法。
【請求項２２５】
酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入する段階において、精製した核酸セグメントの酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域がグラム陽性菌適合性プロモーターによって制御されている、請求項２１７に記載の方法。
【請求項２２６】
プロモーターがBacillus適合性プロモーターである、請求項２２５に記載の方法。
【請求項２２７】
ヒアルロン酸を製造する方法であって、
配列番号：１２の酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントBacillus宿主に導入し、コード領域がプロモーターによって制御されており、
酵素活性を有するＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入し、
Bacillus宿主を培地で増殖させて、ヒアルロン酸を分泌させ、
分泌されたヒアルロン酸を回収する
段階を含んでなる、方法。
【請求項２２８】
酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントを導入する段階において、精製した核酸セグメントが配列番号：１１のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項２２７に記載の方法。
【請求項２２９】
酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域と酵素活性を有するＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域が同一プロモーターによって制御されている、請求項２２７に記載の方法。
【請求項２３０】
酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域とＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域が異なるプロモーターによって制御されている、請求項２２７に記載の方法。
【請求項２３１】
Bacillus宿主がBacillus subtilisまたはBacillis licheniformisである、請求項２２７に記載の方法。
【請求項２３２】
ヒアルロン酸を回収する段階が分泌されたヒアルロン酸を培地から抽出することを含んでなる、請求項２２７に記載の方法。
【請求項２３３】
抽出したヒアルロン酸を精製する段階を更に含んでなる、請求項２３２に記載の方法。
【請求項２３４】
酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入する段階において、精製した核酸セグメントの酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域がグラム陽性菌適合性プロモーターによって制御されている、請求項２２７に記載の方法。
【請求項２３５】
プロモーターがBacillus適合性プロモーターである、請求項２３４に記載の方法。
【請求項２３６】
組換え宿主細胞であって、組換え宿主細胞が
配列番号：１２の酵素活性を有するStreptococcus uberisヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントを含んでなる組換えベクターと、
酵素活性を有するＵＤＰグルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントを含んでなる組換えベクター
を含んでなるBacillus細胞である、組換え宿主細胞。
【請求項２３７】
組換え宿主細胞がBacillus subtilisまたはBacillus licheniformis細胞である、請求項２３６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２３８】
宿主細胞がヒアルロン酸を産生する、請求項２３６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２３９】
精製した核酸セグメントの配列番号：１２の酵素活性を有するStreptococcus uberisヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域がグラム陽性菌適合性プロモーターによって制御されている、請求項２３６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２４０】
プロモーターがBacillus適合性プロモーターである、請求項２３９に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２４１】
精製した核酸セグメントが配列番号：１１のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項２３６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２４２】
組換え宿主細胞であって、組換えベクターを導入したBacillus細胞であり、組換えベクターが
配列番号：１２の酵素活性を有するStreptococcus uberisヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントと、
酵素活性を有するＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域
を含んでなる、組換え宿主細胞。
【請求項２４３】
精製した核酸セグメントが配列番号：１１のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項２４２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２４４】
酵素活性を有するStreptococcus uberisヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域と酵素活性を有するＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域が、同一プロモーターによって制御されている、請求項２４２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２４５】
酵素活性を有するStreptococcus uberisヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域と酵素活性を有するＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域が、異なるプロモーターによって制御されている、請求項２４２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２４６】
組換え宿主細胞がBacillus subtilisまたはBacillus licheniformis細胞である、請求項２４２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２４７】
宿主細胞がヒアルロン酸を産生する、請求項２４２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２４８】
精製した核酸セグメントの配列番号：１２の酵素活性を有するStreptococcus uberisヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域がグラム陽性菌適合性プロモーターによって制御されている、請求項２４２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２４９】
プロモーターがBacillus適合性プロモーターである、請求項２４８に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２５０】
配列番号：１２の酵素活性を有するStreptococcus uberisヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入し、コード領域がプロモーターによって制御されており、
Bacillus宿主を培地で増殖させて、ヒアルロン酸を分泌させ、
分泌されたヒアルロン酸を回収する
段階を含んでなる方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項２５１】
精製した核酸セグメントが配列番号：３のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項２５０に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項２５２】
Bacillus宿主がBacillus subtilisまたはBacillus licheniformisである、請求項２５０に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項２５３】
Bacillus宿主を培地で増殖させてヒアルロン酸を分泌させる段階が、Bacillus宿主を２５℃〜４２℃の化学的に定義された培地で増殖させてヒアルロン酸を分泌させることと更に定義される、請求項２５０に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項２５４】
Bacillus宿主を培地で増殖させてヒアルロン酸を分泌させる段階が、Bacillus宿主を２５℃〜４２℃の複合培地で増殖させてヒアルロン酸を分泌させることと更に定義される、請求項２５０に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項２５５】
Bacillus宿主を培地で増殖してヒアルロン酸を分泌させる段階が、Bacillus宿主をグルコースとＮ−アセチルグルコサミンとグルコサミンの少なくとも一方を含む培地で増殖させてヒアルロン酸を分泌させることと更に定義される、請求項２５０に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項２５６】
分泌されたヒアルロン酸を回収する段階が、
ヒアルロン酸を濾過、遠心分離、および凝集の少なくとも１つによって細胞および砕片から分離し、
分離したヒアルロン酸を濃縮し、
濃縮したヒアルロン酸を沈澱、限外濾過および透析からなる群から選択される方法の少なくとも１つによって培地から分離する
ことと更に定義される、請求項２５０に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項２５７】
ヒアルロン酸を濾過、遠心分離、および凝集の少なくとも１つによって細胞および砕片から分離する段階が、トリクロロ酢酸を添加して、ヒアルロン酸からの細胞および砕片の分離の促進を更に包含する、請求項２５６に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項２５８】
沈澱剤がアルコール、有機溶媒または化合物、および脂肪族の正に帯電した塩の少なくとも１つである、請求項２５６に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項２５９】
沈澱剤がエタノール、 イソプロパノール、アセトン、臭化セチルトリアンモニウム、または塩化セチルピリジニウムからなる群から選択される、請求項２５８に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項２６０】
抽出したヒアルロン酸を精製する段階を更に含んでなる、請求項２５０に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項２６１】
酵素活性を有するＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントを導入する段階を更に包含する、請求項２５０に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項２６２】
酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域と酵素活性を有するＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域が同一プロモーターによって制御されている、請求項２６１に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項２６３】
酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域と酵素活性を有するＵＤＰグルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域が異なるプロモーターによって制御されている、請求項２６１に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項２６４】
配列番号：１２の酵素活性を有するStreptococcus uberisヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントBacillus宿主に導入する段階において、精製した核酸セグメントの配列番号：１２の酵素活性を有するStreptococcus uberisヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域がグラム陽性菌適合性プロモーター由来のプロモーターによって制御されている、請求項２５０に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項２６５】
配列番号：１２の酵素活性を有するStreptococcus uberisヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有するBacillus宿主に導入する段階において、精製した核酸セグメントを形質転換、トランスフェクション、形質導入、および電気穿孔の少なくとも１つによってBacillus宿主に導入する、請求項２５０に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項２６６】
組換え宿主細胞であって、ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡとＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの少なくとも一方の産生を高めるBacillus細胞であり、更に配列番号：１２の酵素活性を有するStreptococcus uberisヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を導入した精製した核酸セグメントを含んでなる組換えベクターをも有する、組換え宿主細胞。
【請求項２６７】
精製した核酸セグメントが配列番号：１１のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項２６６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２６８】
組換え宿主細胞がBacillus subtilisまたはBacillus licheniformis細胞である、請求項２６６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２６９】
組換え宿主細胞が更に少なくとも１個の改質ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを包含し、改質ＲＮＡポリメラーゼプロモーターがＲＮＡポリメラーゼによって認識されるとき、ＲＮＡポリメラーゼが内在性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターより多量にＲＮＡを発現することができる、請求項２６６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２７０】
改質が突然変異である、請求項２６９に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２７１】
改質がタンデムプロモーター要素である、請求項２６９に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２７２】
組換え宿主細胞がＵＤＰ−糖前駆体生合成経路において機能活性を有する酵素 をコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントを含んでなる組換えベクターで形質転換される、請求項２６６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２７３】
ＵＤＰ−糖前駆体生合成経路酵素がＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼである、請求項２７２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２７４】
ＵＤＰ−糖前駆体生合成経路酵素がＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼである、請求項２７２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２７５】
組換え宿主細胞が更に天然のBacillus細胞に見出されるより少なくとも１個多いメッセンジャーＲＮＡ安定化要素を包含する、請求項２６６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２７６】
組換え宿主細胞が更に天然のBacillus細胞に見出されるより少なくとも１個少ないメッセンジャーＲＮＡ脱安定化要素を包含する、請求項２６６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２７７】
組換え宿主細胞がＵＤＰ−糖前駆体生合成経路において機能活性を有する酵素をコードするコード領域を有する少なくとも１つの核酸セグメントを更に包含し、組換え宿主細胞が内在性ＵＤＰ−糖前駆体生合成経路酵素を発現する天然の宿主細胞より大きな活性を有するようにする、請求項２６６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２７８】
組換え宿主細胞が少なくとも１個の突然変異したＵＤＰ−糖前駆体生合成遺伝子を更に包含し、突然変異したＵＤＰ−糖前駆体遺伝子転写したメッセンジャーＲＮＡの半減期を増加する、請求項２６６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２７９】
組換え宿主細胞が
翻訳効率が増加したメッセンジャーＲＮＡをコードする少なくとも１個の突然変異したＵＤＰ−糖前駆体生合成遺伝子を更に包含する、請求項２６６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２８０】
ＵＤＰ−糖前駆体生合成遺伝子における突然変異がＵＤＰ−糖前駆体生合成遺伝子におけるリボソーム結合部位で起こり、リボソームのリボソーム結合部位に対する結合親和性が増加するようになる、請求項２６６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２８１】
ヒアルロン酸の製造方法であって、
配列番号：１２の酵素活性を有するStreptococcus uberisヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入し、Bacillus宿主でＵＤＰ−ＧｌｃＵＡとＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの少なくとも一方の産生が増進し、
Bacillus宿主を培地で増殖させて、ヒアルロン酸を分泌させ、
分泌されたヒアルロン酸を回収する
段階を含んでなる、方法。
【請求項２８２】
配列番号：１２の酵素活性を有するStreptococcus uberisヒアルロナンシンターゼをコードする精製した核酸セグメントを導入する段階において、精製した核酸セグメントが配列番号：１１のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項２８１に記載の方法。
【請求項２８３】
Bacillus宿主がBacillus subtilisまたはBacillus licheniformisである、請求項２８１に記載の方法。
【請求項２８４】
配列番号：１２の酵素活性を有するStreptococcus uberisヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入する段階において、Bacillus宿主ががプロモーター活性の増加した少なくとも１個の改質ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを更に包含する、請求項２８１に記載の方法。
【請求項２８５】
ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの改質が突然変異である、請求項２８４に記載の方法。
【請求項２８６】
ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの改質がタンデムプロモーター要素である、請求項２８４に記載の方法。
【請求項２８７】
配列番号：１２の酵素活性を有するStreptococcus uberisヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入する段階において、Bacillus宿主がＵＤＰ−糖前駆体生合成経路酵素をコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントを含んでなるベクターで形質転換される、請求項２８１に記載の方法。
【請求項２８８】
ＵＤＰ−糖前駆体生合成経路酵素がＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼである、請求項２８７に記載の方法。
【請求項２８９】
ＵＤＰ−糖前駆体生合成経路酵素がＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼである、請求項２８７に記載の方法。
【請求項２９０】
配列番号：１２の酵素活性を有するStreptococcus uberisヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入する段階において、Bacillus宿主が天然のBacillus宿主で見られるより少なくとも１個多いメッセンジャーＲＮＡ安定化要素を更に包含する、請求項２８１に記載の方法。
【請求項２９１】
配列番号：１２の酵素活性を有するStreptococcus uberisヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入する段階において、Bacillus宿主が天然のBacillus宿主で見られるより少なくとも１個少ないメッセンジャーＲＮＡ脱安定化要素を更に包含する、請求項２８１に記載の方法。
【請求項２９２】
配列番号：１２の酵素活性を有するStreptococcus uberisヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入する段階において、Bacillus宿主がＵＤＰ−糖前駆体生合成経路酵素をコードするコード領域を有する少なくとも１つの核酸セグメントを更に包含し、組換え宿主細胞が内在性ＵＤＰ−糖前駆体生合成経路酵素を発現する天然の宿主細胞より大きな活性を有するようにする、請求項２８１に記載の方法。
【請求項２９３】
配列番号：１２の酵素活性を有するStreptococcus uberisヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入する段階において、Bacillus宿主が少なくとも１個の突然変異した内在性ＵＤＰ−糖前駆体生合成遺伝子を含んでなり、突然変異により、突然変異したＵＤＰ−糖前駆体遺伝子から転写したメッセンジャーＲＮＡの半減期が増加する、請求項２８１に記載の方法。
【請求項２９４】
配列番号：１２の酵素活性を有するStreptococcus uberisヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入する段階において、Bacillus宿主が翻訳効率の増加したメッセンジャーＲＮＡをコードする少なくとも１個の突然変異したＵＤＰ−糖前駆体生合成遺伝子を含んでなる、請求項２８１に記載の方法。
【請求項２９５】
ＵＤＰ−糖前駆体生合成遺伝子における突然変異がＵＤＰ−糖前駆体生合成遺伝子のリボソーム結合部位で起こり、リボソームのリボソーム結合部位に対する結合親和性が増加するようになる、請求項２９４に記載の方法。
【請求項２９６】
配列番号：１２の酵素活性を有するStreptococcus uberisヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入し、Bacillus宿主でのＵＤＰ−ＧｌｃＵＡとＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの少なくとも一方の産生が増加し、
Bacillus宿主を培地で増殖させてヒアルロン酸を分泌させ、
分泌されたヒアルロン酸を回収する
段階を含んでなる方法によって製造される、ヒアルロン酸。
【請求項２９７】
精製した核酸セグメントが配列番号：１１のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項２９６に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項２９８】
配列番号：１２の酵素活性を有するStreptococcus uberisヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入する段階において、Bacillus宿主が内在性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターより大きなプロモーター活性を有する少なくとも１個の改質ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを更に包含する、請求項２９６に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項２９９】
ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの改質が突然変異である、請求項２９８に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項３００】
ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの改質がタンデムプロモーター要素である、請求項２９８に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項３０１】
配列番号：１２の酵素活性を有するStreptococcus uberisヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントBacillus宿主に導入する段階において、Bacillus宿主がＵＤＰ−糖前駆体生合成経路酵素をコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントを含んでなる組換えベクターで形質転換される、請求項２９８に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項３０２】
ＵＰＣ−糖前駆体生合成経路酵素がＵＤＰグルコースデヒドロゲナーゼである、請求項３００に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項３０３】
ＵＰＣ−糖前駆体生合成経路酵素がＵＤＰグルコースピロホスホリラーゼである、請求項３００に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項３０４】
配列番号：１２の酵素活性を有するStreptococcus uberisヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入する段階において、Bacillus宿主が組換え宿主細胞の形成に用いるBacillus宿主細胞で見られるより少なくとも１個多いメッセンジャーＲＮＡ安定化要素を更に包含する、請求項２９６に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項３０５】
配列番号：１２の酵素活性を有するStreptococcus uberisヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入する段階において、Bacillus宿主が組換え宿主細胞の形成に用いるBacillus宿主細胞で見られるより少なくとも１個少ないメッセンジャーＲＮＡ脱安定化要素を更に包含する、請求項２９６に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項３０６】
配列番号：１２の酵素活性を有するStreptococcus uberisヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入する段階において、Bacillus宿主が further includesＵＤＰ−糖前駆体生合成経路において機能活性を有する酵素をコードするコード領域を有する少なくとも１つの核酸セグメントを更に包含し、組換え宿主細胞が内在性ＵＤＰ−糖前駆体生合成経路酵素を発現する天然の宿主細胞より大きな活性を有するようにする、請求項２９６に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項３０７】
配列番号：１２の酵素活性を有するStreptococcus uberisヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入する段階において、Bacillus subtilis株が少なくとも１個の突然変異したＵＤＰ−糖前駆体生合成遺伝子を含んでなり、突然変異により、突然変異したＵＤＰ−糖前駆体遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡの半減期が増加する、請求項２９６に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項３０８】
配列番号：１２の酵素活性を有するStreptococcus uberisヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントをBacillus宿主に導入する段階において、Bacillus subtilis株が翻訳効率の増加したメッセンジャーＲＮＡをコードする少なくとも１個の突然変異したＵＤＰ−糖前駆体生合成遺伝子を含んでなる、請求項２９６に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項３０９】
ＵＤＰ−糖前駆体生合成遺伝子における突然変異が、ＵＤＰ−糖前駆体生合成遺伝子のリボソーム結合部位で起こり、リボソームのリボソーム結合部位に対する結合親和性が増加する、請求項３０７に記載の方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項３１０】
宿主細胞であって、配列番号：１４のヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する核酸セグメントを含んでなるベクターを含んでなる、宿主細胞。
【請求項３１１】
ヒアルロン酸の製造方法であって、
配列番号：１４のヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する核酸セグメントを宿主生物に導入し、
宿主生物を増殖させて、ヒアルロン酸を分泌させる
段階を含んでなる、方法。
【請求項３１２】
ヒアルロン酸の製造方法であって、
配列番号：１４のヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する核酸セグメントを宿主に導入し、
ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域を有する核酸セグメント宿主に導入し、
宿主を増殖させて、ヒアルロン酸を分泌させる
段階を含んでなる、方法。
【請求項３１３】
宿主細胞であって、
配列番号：１４のヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する核酸セグメントを含んでなるベクターと、
ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域を有する核酸セグメントを含んでなるベクター
を含んでなる、宿主細胞。
【請求項３１４】
宿主細胞であって、ベクターを導入し、ベクターが
配列番号：１４のヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する核酸セグメントと、
ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域
を含んでなる、宿主細胞。
【請求項３１５】
配列番号：１４のヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する核酸セグメントを宿主に導入し、
宿主を増殖させて、ヒアルロン酸を分泌させる
段階を含んでなる方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項３１６】
宿主細胞であって、ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡとＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの少なくとも一方の産生が増加し、,配列番号：１４のヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を導入した核酸セグメントを含んでなるベクターを更に有する、組換え宿主細胞。
【請求項３１７】
ヒアルロン酸の製造方法であって、
配列番号：１４のヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する核酸セグメントを宿主に導入し、宿主でＵＤＰ−ＧｌｃＵＡとＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの少なくとも一方の産生が増加し、
宿主を増殖させて、ヒアルロン酸を分泌させる
段階を含んでなる方法。
【請求項３１８】
配列番号：１４のヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する核酸セグメントを宿主に導入し、宿主でＵＤＰ−ＧｌｃＵＡとＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの少なくとも一方の産生が増加し、
宿主を増殖させて、ヒアルロン酸を分泌させる
段階を含んでなる方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項３１９】
宿主細胞であって、配列番号：１０のヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する核酸セグメントを含んでなるベクターを含んでなる、宿主細胞。
【請求項３２０】
ヒアルロン酸の製造方法であって、
配列番号：１０のヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する核酸セグメントを宿主生物に導入し、
宿主生物を増殖させて、ヒアルロン酸を分泌させる
段階を含んでなる、方法。
【請求項３２１】
ヒアルロン酸の製造方法であって、
配列番号：１０のヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する核酸セグメントを宿主に導入し、
ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域を有する核酸セグメントを宿主に導入し、
宿主を増殖させて、ヒアルロン酸を分泌させる
段階を含んでなる、方法。
【請求項３２２】
宿主細胞であって、
配列番号：１０のヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する核酸セグメントを含んでなるベクターと、
ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域を有する核酸セグメントを含んでなるベクター
を含んでなる、宿主細胞。
【請求項３２３】
宿主細胞であって、ベクターであって、
配列番号：１０のヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する核酸セグメントと、
ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域
を含んでなるベクターを導入した、宿主細胞。
【請求項３２４】
配列番号：１０のヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する核酸セグメントを宿主に導入し、
宿主を増殖させて、ヒアルロン酸を分泌させる
段階を含んでなる方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項３２５】
宿主細胞であって、ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡとＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの少なくとも一方の産生が増加し、配列番号：１０のヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を導入した核酸セグメントを含んでなるベクターを更に有する宿主細胞。
【請求項３２６】
ヒアルロン酸の製造方法であって、
配列番号：１０のヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する核酸セグメントを宿主に導入し、宿主でのＵＤＰ−ＧｌｃＵＡとＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの少なくとも一方の産生が増加し、
宿主を増殖させて、ヒアルロン酸を分泌させる
段階を含んでなる、方法。
【請求項３２７】
配列番号：１０のヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する核酸セグメントを宿主に導入し、宿主でのＵＤＰ−ＧｌｃＵＡとＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの少なくとも一方の産生が増加し、
宿主を増殖させて、ヒアルロン酸を分泌させる
段階を含んでなる方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項３２８】
宿主細胞であって、配列番号：１２のヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する核酸セグメントを含んでなる、宿主細胞。
【請求項３２９】
ヒアルロン酸の製造方法であって、
配列番号：１２のヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する核酸セグメントを宿主生物に導入し、
宿主生物を増殖させて、ヒアルロン酸を分泌させる
段階を含んでなる、方法。
【請求項３３０】
ヒアルロン酸の製造方法であって、
配列番号：１２のヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する核酸セグメントを宿主に導入し、
ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域を有する核酸セグメントを宿主に導入し、
宿主を増殖させて、ヒアルロン酸を分泌させる
段階を含んでなる、方法。
【請求項３３１】
宿主細胞であって、
配列番号：１２のヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する核酸セグメントを含んでなるベクターと、
ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域を有する核酸セグメントを含んでなるベクター
を含んでなる、宿主細胞。
【請求項３３２】
宿主細胞であって、ベクターを導入し、
ベクターが、
配列番号：１２のヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する核酸セグメントと、
ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域
を含んでなる、宿主細胞。
【請求項３３３】
配列番号：１２のヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する核酸セグメントを宿主に導入し、
宿主を増殖させて、ヒアルロン酸を分泌させる
段階を含んでなる方法によって製造されるヒアルロン酸。
【請求項３３４】
宿主細胞であって、ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡとＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの少なくとも一方の産生が増加し、
配列番号：１２のヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を導入した核酸セグメントを含んでなるベクターを更に有する、宿主細胞。
【請求項３３５】
ヒアルロン酸の製造方法であって、
配列番号：１２のヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する核酸セグメントを宿主に導入し、宿主でのＵＤＰ−ＧｌｃＵＡとＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの少なくとも一方の産生が増加し、
宿主を増殖させて、ヒアルロン酸を分泌させる
段階を含んでなる方法。
【請求項３３６】
配列番号：１２のヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する核酸セグメントを宿主に導入し、宿主でのＵＤＰ−ＧｌｃＵＡとＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの少なくとも一方の産生が増加し、
宿主を増殖させて、ヒアルロン酸を分泌させる
段階を含んでなる方法によって製造されるヒアルロン酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願についてのクロス・リファレンス
本出願は、米国特許出願第６０／０６４，４３５号明細書（１９９７年１０月３１日に出願され、「グループＣヒアルロナンシンターゼ遺伝子およびその使用」という名称）の合衆国法典第３５巻１１９(ｅ）条による利益を主張する米国特許出願第９／１７８，８５１号明細書（１９９８年２６日に出願され、「ヒアルロネートシンターゼ遺伝子およびその使用」という名称）の米国継続出願である米国特許出願第０９／４６９，２００号明細書（１９９９年１２月２１日に出願され、「ヒアルロネートシンターゼ遺伝子およびその使用」という名称）の米国一部継続出願である。
【０００２】
本出願は、(1) 米国特許出願第６０／２９７，７８８号明細書（２００１年６月１３日に出願され、「ヒアルロナンシンターゼ遺伝子およびBACILLUS SUBTILISでの発現方法」という名称）、および(2) 米国特許出願第６０／２９７，７４４号明細書（２００１年６月１３日に出願され、「ヒアルロナンシンターゼ遺伝子およびこの発現方法」という名称）に対して、特許協力条約による優先権および合衆国法典第３５巻１１９(ｅ）条による利益を主張する。米国特許出願第９／４６９，２００号、第０９／１７８，８５１号、第６０／６４，４３５号、第６０／２９７，７８８号および第６０／２９７，７４４号明細書の内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている。
【０００３】
合衆国助成研究または開発に関する説明
合衆国政府は、国立衛生研究所の承認番号ＧＭ３５９７８による本発明に一定の権利を有する。
【０００４】
発明の背景
１．発明の分野
本発明は、酵素活性を有するヒアルロネートシンターゼ（ＨＡＳ）をコードするコード領域を有する核酸セグメント、およびこの核酸セグメントのヒアルロネートシンターゼおよびそのヒアルロン酸生成物を産生する組換え細胞の調製における使用に関する。ヒアルロネートは、ヒアルロン酸またはヒアルロナンとしても知られている。
【０００５】
２．関連技術の簡単な説明
連鎖球菌感染症の発生は、世界的な、特に発展途上国における主要な健康および経済的問題である。この一つの理由は、連鎖球菌が体内の食細胞、すなわちマクロファージおよび多形核細胞（ＰＭＮ）によって感知されることなく増殖することができることによるものである。これらの細胞は、異種微生物の認識および包込みに関与している。細菌が監視の網をくぐり抜ける一つの効果的な方法は、ヒアルロン酸（ＨＡ）カプセルのような多糖カプセルでそれ自身をコーティングすることによる。ＨＡの構造は、原核生物および真核生物のいずれでも同じである。
【０００６】
ＨＡは一般的には非免疫原性であるので、カプセル封入した細菌は免疫応答を誘発せず、従って破壊の標的とはならない。更に、カプセルはイン・ビトロではＰＭＮに対して食細胞作用を発揮し、連鎖球菌のマクロファージへの付着を防止する。正にこのことにより、群Ａおよび群Ｃの連鎖球菌では、ＨＡカプセルは天然および実験的感染症における主要な毒性因子である。群Ａの連鎖球菌は、咽頭炎、膿痂疹、深部組織感染症、リウマチ熱、および毒性ショック様症候群などの多数のヒト疾患に関与している。群ＣのStreptococcus equisimilisは、骨髄炎、咽頭炎、脳膿瘍、および肺炎に関与している。
【０００７】
構造的には、ＨＡは、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）とグルクロン酸（ＧｌｃＵＡ）からなる反復二糖単位の高分子量の線状多糖類である。ＨＡ分子における反復二糖類の数は３０，０００を上回る可能性があり、Mr＞１０７である。ＨＡは、哺乳類および細菌細胞、特に群ＡおよびＣの連鎖球菌およびＡ型のPasteurella multocidaによって合成される唯一のグリコサミノグリカンである。これらの株が培地に分泌されるＨＡ並びにＨＡカプセルを作製する。これらの細菌がＨＡを合成する機構は、ＨＡカプセルの産生が連鎖球菌が免疫系による監視をくぐり抜けるために用いる効率的且つ賢明な方法であるので、医薬として極めて興味深いものである。更に、ＨＡでコーティングした有機または無機分子は、宿主の免疫系による検出および破壊を免れることができる特性を有している。
【０００８】
ＨＡは、哺乳類および細菌細胞によって、血漿膜に局在化していた酵素ヒアルロネートシンターゼによって合成される。これらの生物におけるＨＡの合成は、多段階工程であると思われる。開始には、開始前駆体ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃまたはＵＤＰ−ＧｌｃＵＡの結合を伴う。この後に、生長するオリゴ糖鎖への２種類の糖の交互付加を伴う伸長が続く。生長するポリマーは、細胞の血漿膜領域から細胞外空間に突出する。ＨＡ生合成系は検討が行われた第一の膜ヘテロ多糖類合成経路の一つであるが、ＨＡ合成の機構は未だ十分には理解されていない。これは、これまでに開発されたイン・ビトロ系は、ＨＡのデ・ノボ生合成が完成されていないという点において不適当であるからと思われる。
【０００９】
ＨＡポリマー生長の方向は、当業者の間で未だ一致を見ていない問題である。単糖類は、生長するＨＡ鎖の還元または非還元末端へ付加することができた。更に、(i) 発生期の鎖がタンパク質、ＵＤＰまたは脂質中間体に共有結合するかどうか、(ii) 連鎖がプライマーを用いて開始するかどうか、および(iii) 成熟ポリマーが連鎖球菌の血漿膜から突出する機構に関して、疑問が残っている。ＨＡ生合成の機構を理解することによって、工程を妨害することによる連鎖球菌およびパスツレラ感染症を制御するための代替方法を開発することができる。
【００１０】
ＨＡは脊椎動物の実質的に総ての組織で同定されており、特に且つ適切には関節内マトリックス栄養補給物として、様々な臨床用途や眼の手術で広く用いられてきている。科学文献には、ＨＡが主として少数の結合組織のマトリックスおよび細菌のある種の株における受動的構造成分であるという本来の概念からこの遍在する高分子が多くの生物学的過程に動的に関与しているという認識への変遷、すなわち胚形成の際の細胞移動および分化の調節から転移、創傷治癒および炎症の複雑な工程における重要な役割に対する細胞外マトリックス構成および代謝の調節への変遷も示されている。更に、ＨＡは代謝活性が高く且つ細胞はその合成および異化の工程に多くの注目を集めていることが明らかになってきている。例えば、組織でのＨＡの半減期は、軟骨での１〜３週間から表皮での＜１日までの範囲にわたっている。ＨＡは、多数の技術的用途（例えば、滑沢化合物）、化粧品およびニュートラスューティカル(neutraceuticals)にも用いられる。
【００１１】
単一のタンパク質が両糖基質を利用してＨＡを合成すること、すなわち、ＨＡシンターゼは二重触媒特性を有する単一酵素であることが明らかになっている。ＨＡシンターゼに対する略号ＨＡＳは、このクラスの酵素を表すのに広い支持を得ている。Markovitz et al.は、Streptococcus pyogenes由来のＨＡＳ活性の特性決定に成功し、これらの酵素が膜に局在化しており且つ糖ヌクレオチド前駆体およびＭｇ２＋についてのその要件を見出した。Prehmは、Ｂ６細胞によって作製された伸長性ＨＡは培地に添加されたヒアルロニダーゼによって消化されることを見出し、ＨＡＳは血漿膜に存在することを提案した。Philipson and Schwartzも、ＨＡＳ活性がマウス乏突起神経膠腫細胞の血漿膜とコフラクショネートする(cofractionated)ことを示した。
【００１２】
ＨＡＳは、グリコサミノグリカン合成が進行するのと同時に膜を通って細胞外空間に押出される（または細菌の場合には細胞カプセルを作製する）高MrＨＡを組み立てる。核酸、タンパク質、および脂質は核、小胞体／ゴルジ体、細胞質、またはミトコンドリアで合成されるので、この様式の生合成は高分子では独特なものである。生長する鎖が細胞外空間に突出することによっても自発的にポリマーが生長できるので、異例な大きさのＨＡが得られ、ゴルジ体またはゴルジ体後区画内の合成に限定されると、形成されるポリマーの全般的量または長さが限定される。局限された管腔内のＨＡの濃度が高いと、他の細胞小器官の機能にとって有害となることがある高粘度環境も生じることがある。
【００１３】
幾つかの研究では、ＨＡのカプセルコーティングを作製する連鎖球菌の株並びに真核生物細胞由来のＨＡＳを可溶化、同定、および精製が試みられてきた。連鎖球菌およびネズミの乏突起神経膠腫酵素は洗剤での可溶化に成功し、研究されたが、更に研究を行いまたは分子クローニングのために活性ＨＡＳを精製する努力は何十年にもわたって成功していない。Prehm and Mausolfは、過ヨウ素酸で酸化したＵＤＰ−ＧｌｃＵＡまたはＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを用いて、ＨＡＳと同時精製した連鎖球菌膜の約５２kDaのタンパク質をアフィニティーラベリングした。これにより、群Ｃの連鎖球菌ＨＡＳがクローニングされたと主張する報告がなされたが、これは不運なことに誤りであった。この研究では、活性シンターゼの発現の立証に失敗し、実際にはペプチドペプチド輸送体をクローニングした可能性がある。Triscott and van de Rijnはジギトニンを用いて、連鎖球菌膜由来のＨＡＳ活性形態で可溶化した。Van de Rijn and Drakeは、４２、３３、および２７kDaの３種類の連鎖球菌膜タンパク質を５−アジド−ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡで選択的に放射能標識し、３３kDaタンパク質がＨＡＳであることを示唆した。しかしながら、後で示すように、ＨＡＳは実際には４２kDaタンパク質であることが明らかになった。
【００１４】
これらの努力にも拘わらず、ＨＡＳｍＲＮＡまたはＨＡＳタンパク質についての分子プローブがなかったので、ＨＡ合成の調節および機構は本質的に立往生していた。主要な進展は、１９９３年にDeAngelis et al.がタンパク質ＨａｓＡをコードする群Ａの連鎖球菌遺伝子の分子クローニングおよび特性決定を報告したときに起きた。この遺伝子は細菌性ＨＡ合成に必要なオペロンの一部であることが知られているが、現在ｓｐＨＡＳ（S. pyogenesＨＡＳ）と呼ばれているこのタンパク質の機能は知られていない。ｓｐＨＡＳは、その後ＨＡの伸長に関与していることが明らかにされ、同定され、クローニングされた後、発現に成功した最初のグリコサミノグリカンシンターゼであった。S. pyogenesＨＡ合成オペロンは、２個の他のタンパク質をコードする。ＨａｓＢはＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼであり、これはＵＤＰ−グルコースをＨＡ合成の基質の一つであるＵＤＰ−ＧｌｃＵＡに転換するのに必要とされる。ＨａｓＣはＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼであり、これはグルコース＝１−ホスフェートおよびＵＴＰをＵＤＰ−グルコースに転換するのに必要とされる。ｈａｓＡおよびｈａｓＢ遺伝子をカプセルのない連鎖球菌株またはEnteroccus faecalisに同時トランスフェクションすることにより、ＨＡを合成し、カプセルを形成する能力がそれらに付与された。これにより、ｓｐＨＡＳ（ｈａｓＡ）がＨＡシンターゼであることの最初の強力な証拠が提供された。
【００１５】
定義の難しいＨＡシンターゼ遺伝子は、最終的にトランスポゾン突然変異誘発法によってクローニングされ、ＨＡ合成オペロンのトランスポゾン中断を含むカプセルのない突然変異体の群Ａ株が生成した。トランスポゾンの既知配列により、連鎖球菌ＤＮＡとの接合領域を同定した後、野生型細胞からクローニングすることができた。コードしたｓｐＨＡＳは、酵母キチンシンターゼのファミリーと５〜１０%同一であり、Xenopus laevisタンパク質ＤＧ４２（原腸形成の際に発生的に発現）と３０%同一であったが、その機能はその時点では知られていなかった。DeAngelis and Weigelは、活性組換えｓｐＨＡＳをEscherichia coliで発現させ、この単一の精製遺伝子生成物がＵＤＰ−ＧｌｃＵＡとＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃとイン・ビトロでインキュベーションすると高MrＨＡを合成することを示し、これによってＨＡ合成に必要な両グリコシルトランスフェラーゼ活性は、１９５９年に最初に提案されたように、同一タンパク質によって触媒されることを示した。(i) ｓｐＨＡＳ二重作用を有する単一酵素であり、(ii) ｓｐＨＡＳ、キチンシンターゼ、およびＤＧ４２の間の配列相同性の範囲の知見を用いて、４箇所の実験室によって１９９６年に真核生物のＨＡＳｃＤＮＡがほぼ同時に同定されたことにより、ＨＡＳは別個なアイソザイムをコードする多遺伝子ファミリーであるという本発明者のタンパク質仮説が更に補強された。２個の遺伝子（ＨＡＳ１およびＨＡＳ２）は哺乳類で直ぐに発見され、第三の遺伝子ＨＡＳ３は後になって発見された。第二の連鎖球菌ｓｅＨＡＳまたはStreptococcus equisimilisヒアルロネートシンターゼは同定され、１９９９年１２月２１日出願の米国特許出願連続番号第０９／４６９，２００号明細書に詳細に開示されており、その内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている。ｓｅＨＡＳタンパク質は、ｓｐＨＡＳ酵素に対して高水準（約７０%）の同一性を有する。しかしながら、この同一性は興味深いものであり、ｓｅＨＡＳ遺伝子がｓｐＨＡＳ遺伝子に対して交差ハイブリダイズしないからである。
【００１６】
両基質が提供されるときには、組換えｓｅＨＡＳを発現するE. coliから調製される膜は、ＨＡを合成する。この結果により、群ＣのＨＡＳをクローニングしたと主張するLansing et al.の初期の報告が誤りであることが確かめられた。不運なことには、幾つかの研究では、この特性決定されていない５２kDaの連鎖球菌タンパク質に対して抗体を用いて、真核生物ＨＡＳであると考えられるものを検討していた。
【００１７】
Itano and Kimataは、ＨＡを合成することができない突然変異体マウス乳癌細胞系での発現クローニングを用いて、第一の哺乳類ＨＡＳｃＤＮＡ（ｍｍＨＡＳ１）と推定されるものをクローニングした。ＨＡ合成を欠くサブクローンは、体細胞融合実験でのＨＡ合成に相補的な３種類の別々のクラスに分離され、少なくとも３個のタンパク質が必要であることを示唆していた。これらのクラスの二つは幾らかのＨＡ合成活性を保持していたが、一つは活性を全く示さなかった。後者の細胞系を親細胞から調製したｃＤＮＡを用いる一過性トランスフェクション実験に用いて、ＨＡ合成活性を回復する単一タンパク質を同定した。配列分析により、ｓｐＨＡＳと同様な膜トポロジーを有する約６５kDaのタンパク質の推定一次構造が明らかになった。ｍｍＨＡＳ１はｓｐＨＡＳに対して３０%の同一性を有し、ＤＧ４２に対しては５５%の同一性を有した。この報告が公表された同月に、他の３グループが同一のマウスおよびヒト酵素であると当初考えられていたものをコードするｃＤＮＡを記載した論文を提出した。しかしながら、異常な環境のために、４箇所の実験室のそれぞれは両種において異なるＨＡＳアイソザイムを発見したのである。
【００１８】
Itano and Kimataの方法と同様な機能的クローニング法を用いて、Shyjan et al.はＨＡＳ１のヒト相同体を同定した。腸間膜リンパ節ｃＤＮＡライブラリーを用いてネズミ粘膜Ｔリンパ球をトランスフェクションした後、これをロゼットアッセイで接着する能力についてスクリーニングした。一つのトランスフェクタントの接着は既知の細胞表面ＨＡ結合タンパク質であるＣＤ４４に対する抗血清によって阻害され、ヒアルロニダーゼによる前処理によって直接廃棄される。従って、このトランスフェクタントによるロゼッティングには、ＨＡの合成が必要であった。信頼できるｃＤＮＡのクローニングおよび配列決定により、ｈｓＨＡＳ１を同定した。Itano and Kimataも、胎児脳ライブラリーから単離したヒトＨＡＳ１ｃＤＮＡを報告した。しかしながら、２グループによって報告されたｈｓＨＡＳ１ｃＤＮＡは長さが異なっており、それらは５７８または５４３アミノ酸タンパク質をコードする。ＨＡＳ活性は、長い方の形態についてのみ立証された。
【００１９】
真正のＨＡシンターゼとしてのｓｐＨＡＳの分子同定、およびＤＧ４２、ｓｐＨＡＳおよびＮｏｄＣ（RhizobiumのＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ結節形成因子）の間の近同一性に基づいて、Spicer et al.は縮重ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて、ｍｍＨＡＳ２と呼ばれる第二の異なる酵素をコードするマウス胎児ｃＤＮＡをクローニングした。ｍｍＨＡＳ２ｃＤＮＡのＣＯＳ細胞へのトランスフェクションにより粒子排除アッセイによって検出されたＨＡ細胞コートのデ・ノボ産生が支持されることによって、ＨＡＳ２タンパク質がＨＡを合成することができる有力な証拠が提供された。同様な方法を用いて、Watanabe and Yamaguchiはヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、ｈｓＨＡＳ２を同定した。Fulop et al.は、独立に同様な方法を用いて、排卵前濾胞での正常な卵丘膨張に不可欠な工程である積極的にＨＡを合成する卵丘細胞から単離されたＲＮＡにおいてｍｍＨＡＳ２を同定した。卵丘細胞−卵母細胞複合体を、排卵サイクルが開始する直前、ＨＡ合成が始まる前、および後でＨＡ合成が始まっている（３時間）または既に明らかになっている（４時間）ときにマウスから単離した。ＲＴ−ＰＣＲは、ＨＡＳ２ｍＲＮＡが当初は見られないが、３〜４時間後には高レベルで発現されることを示し、ＨＡＳ２の転写はこの工程においてＨＡ合成を調節することを示唆していた。いずれのｈｓＨＡＳ２も長さが５５２アミノ酸であり、９８%同一である。ｍｍＨＡＳ１は長さが５８３アミノ酸であり、長さが５７８アミノ酸であるｈｓＨＡＳ１に対して９５%同一性を有する。
【００２０】
最近では、Spicer et al.がＰＣＲ法を用いて、哺乳類の第三のＨＡＳ遺伝子を同定した。ｍｍＨＡＳ３タンパク質は長さが５５４アミノ酸であり、それぞれｍｍＨＡＳ１、ｍｍＨＡＳ２、ＤＧ４２、およびｓｐＨＡＳに対して７１、５６、および２８%の同一性を有する。Spicer et al.は、３種類のヒトおよびマウス遺伝子を３種類の異なる染色体の局在化も行った（ｈｓＣｈｒ１９／ｍｍＣｈｒ１７に対してＨＡＳ１；ｈｓＣｈｒ８／ｍｍＣｈｒ１５に対してＨＡＳ２；ｈｓＣｈｒ１６／ｍｍＣｈｒ８に対してＨＡＳ３）。３種類のＨＡＳ遺伝子の異なる染色体での局在化および脊椎動物綱中のＨＡの出現は、この遺伝子ファミリーが篩ものであり、アイソザイムは脊椎動物の進化の初期に重複によって出現したことを示唆している。細菌および真核生物ＨＡＳの同一性が高い（約３０%）ことも、これら２種類は共通の先祖の遺伝子を有することを示唆している。恐らく、原始的細菌は、真核生物遺伝子生成物が大きくなり且つ更に複雑になる前に初期の脊椎動物の祖先からＨＡＳ遺伝子を奪い取ったものと思われる。あるいは、細菌は、一層大きな脊椎動物ＨＡＳ遺伝子を獲得し、酵素活性に本質的でない調節配列を欠失することができたと思われる。
【００２１】
Dawidと共同研究者によるX. laevisＤＧ４２の発見は、このタンパク質がＨＡシンターゼであること走られていなかったにも拘わらず、これらの最近の進展において重要な役割を果たした。それにも拘わらず、ＤＧ４２とｓｐＨＡＳの同一性が３０%であることは、哺乳類ＨＡＳ２を同定するオリゴヌクレオチドをデザインする上で不可欠であった。皮肉なことには、ＤＧ４２がbona fideＨＡシンターゼであるという明確な証拠は、哺乳類のアイソザイムが発見された後に初めて報告されたのであり、DeAngelis and Achyuthanは酵母（ＨＡを合成することができない生物）で組換えタンパク質を発現させ、これがＨＡを合成し、単離したときに、膜は２種類の基質を備えていることを示した。Meyer and Kreilも、ＤＧ４２についてｃＤＮＡでトランスフェクションした細胞由来の溶解物が高レベルのＨＡを合成することを示した。今や、ＤＧ４２はその機能が知られているので、ＸｌＨＡＳと呼ぶことができる。
【００２２】
１個の大きな中心ドメインとタンパク質のアミノおよびカルボキシル末端における２〜３個の膜貫通または膜結合ドメインのクラスターを包含する総てのＨＡＳタンパク質が共有する共通の予想された構造的特徴がある。中心ドメインは、予想された細胞内ＨＡＳタンパク質配列の約８８%までを含んでなり、酵素の触媒領域を含むと思われる。この予想された中心ドメインは長さがｓｐＨＡＳでは２６４アミノ酸（総タンパク質の６３%）であり、真核生物ＨＡＳ部分では長さが３０７〜３２８残基（総タンパク質の５４〜５６%）である。膜ドメインの正確な数および配向、および細胞外および細胞内ループのトポロジー構成は、いずれのＨＡＳについても実験的に決定されていない。
【００２３】
ｓｐＨＡＳは、精製されており且つ部分的に特性決定されたＨＡＳファミリーの一部である。ｓｐＨＡＳ／アルカリホスファターゼ融合タンパク質を用いる初期の研究は、ｓｐＨＡＳのＮ末端、Ｃ末端、および大きな中心ドメインは実際には細胞の内部にあることを示している。ｓｐＨＡＳは６個のシステインを有し、一方、ＨＡＳ１、ＨＡＳ２、およびＨＡＳ３はそれぞれ１３、１４および１４Ｃｙｓ残基を有する。ｓｐＨＡＳにおける６個のＣｙｓ残基の２個は、ＨＡＳ１とＨＡＳ２では保存され、同一である。１個のみの保存されたＣｙｓ残基が、総てのＨＡＳファミリーメンバーで同じ位置に見出される（ｓｐＨＡＳではＣｙｓ−２２５）。これは本質的なＣｙｓであり、スルフヒドリル毒によるその修飾により酵素活性が部分的に阻害されることがある。ジスルフィド結合の存在の可能性または下記の多様なＨＡＳ機能のいずれかに必要な不可欠なＣｙｓ残基の同定は、ＨＡＳファミリーのいずれのメンバーについても解明されていない。
【００２４】
血漿膜での合成に提案された独特な様式に加えて、ＨＡＳ酵素ファミリーは、ＨＡの全般的重合に要する多数の機能では極めて珍しいものである。少なくとも６個の別々の活性、すなわち２個の異なる糖ヌクレオチド前駆体（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃおよびＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ）のそれぞれについての結合部位、２個の異なるグリコシルトランスフェラーゼ活性、生長するＨＡポリマーを酵素（Ｂ−Ｘ７−Ｂモティーフに関係すると思われる）に固定する１個以上の結合部位、および生長するポリマーを一度に１または２個の糖移動するツメ車様移動機構がＨＡＳ酵素中に存在する。この後者の活性は、膜中でのポリマーの段階的前進と一致していると思われる。これらの機能の総て、および恐らくは未だ知られていない他のものは、４１９（ｓｐＨＡＳ）〜５８８（ｘＨＡＳ）アミノ酸のサイズの比較的小さなタンパク質に含まれている。
【００２５】
総ての利用可能な証拠が、ｓｐＨＡＳタンパク質のみが細菌またはイン・ビトロでのＨＡ生合成に必要とされるという結論を支持しているが、一層大きな真核生物ＨＡＳファミリーメンバーが多成分複合体の一部であることが可能である。真核生物ＨＡＳタンパク質はｓｐＨＡＳより約４０%大きいので、それらの追加タンパク質ドメインは細胞内通行および局在化、酵素活性の調節、および他細胞成分との相互作用の媒介など一層精巧な機能に関与している可能性がある。
【００２６】
異なるシンターゼをコードする複数の脊椎動物ＨＡＳ遺伝子があるという予想外の知見は、ＨＡは細胞挙動の重要な調節因子であり、単なる組織の構造成分ではないという新たなコンセンサスを強力に支持している。従って、６ヶ月未満で、この分野は、一つの既知のクローニングしたＨＡＳ（ｓｐＨＡＳ）から、ＨＡの合成および生物学の理解における速やかで数多くの刺激的な将来の進歩を約束する多遺伝子ファミリーの認識へと移動した。
【００２７】
例えば、以下に、Pasteurella multocida、Paramecium bursaria クロレラウイルス（ＰＢＣＶ−１）、Streptococcus pyogenes、Streptococcus uberis、Sulfolobus solfataricus、Bacillus anthracisプラスミドｐＸＯ１、およびEctocarpus sillculosusウイルス由来のＨＡＳ遺伝子の配列を開示する。これらの系にヒアルロナンシンターゼが存在し、これらの様々な系からのヒアルロナンシンターゼの精製および使用は、多くの様々な原核生物およびウイルス供給源において、実際には、一般に微生物供給源から酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコードする核酸配列を精製して単離する能力を示している。
【００２８】
群ＣのStreptococcus equisimilis株Ｄ１８１は、ヒアルロン酸（ＨＡ）を合成して、分泌する。研究者らはこの株と群ＡのStreptococcus pyogenes株、例えばＳ４３およびＡ１１１を用いて、ＨＡの生合成を検討し、その二価カチオン要件、前駆体（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃおよびＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ）の利用、および最適pHに関するＨＡ合成活性を特性決定した。
【００２９】
伝統的には、ＨＡは、雄鶏の鶏冠または連鎖球菌培養物由来の細胞外培地から単離することによって商業的に調製されている。ＨＡの製造のために開発された一つの方法は、ＨＡ産生連鎖球菌の培養物を用いることによる。米国特許第４，５１７，２９５号明細書（その内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている）には、ＨＡ産生連鎖球菌をＣＯ２濃度を高めた生長培地で嫌気条件下で培養する手続きが記載されている。これらの条件下で、ＨＡが産生し、ブロスから抽出することができる。雄鶏の鶏冠からのＨＡの単離は、純度の低い状態のＨＡから出発するので、労力がかかり困難であると一般に考えられている。雄鶏の鶏冠から単離することの利点は、産生するＨＡの分子量が一層大きいことである。しかしながら、細菌醗酵によるＨＡの調製の方が、ＨＡの出発純度が高くなるので、容易である。しかしながら、通常は、この方法で製造したＨＡの分子量は、雄鶏の鶏冠から得たものより小さい。更に、連鎖球菌醗酵によって調製したＨＡは、雄鶏の鶏冠から得たＨＡと同様に免疫応答を誘発することが多い。従って、細菌性醗酵によって高分子量ＨＡを産生する技術は、現在行われている手続きと比較して明らかに改良されている。
【００３０】
上記のように、高分子量ＨＡは、化粧品から眼の手術に至る多種多様な有用な用途を有する。ＨＡは、高粘度および高生体適合性の可能性があるため、特にガラス質流体の代替品として眼の手術に用いられる。ＨＡは、ＨＡの関節内注射による競走馬の外傷性関節炎の治療、潤滑剤としてのシェービングクリーム、および高粘度の物理化学的特性および長時間水分を保持する能力により様々な化粧品にも用いられてきた。実際には、１９９７年８月に合衆国食品医薬品局は、高分子量ＨＡを冒された関節に直接注射することによる重症関節炎の治療における高分子量ＨＡの使用を承認した。一般に、用いられるＨＡの分子量は、大きい方がよい。これは、ＨＡ溶液の粘度は、溶液中の個々のＨＡポリマー分子の平均分子量と共に増加するからである。不運なことには、１０７までのような極めて高分子量のＨＡは、現在利用できる単離手続きによって得ることは困難である。しかしながら、本明細書に開示されている組換え製造法では、１０７以上までの分子量を有するＨＡが製造される。
【００３１】
これらおよび他の問題点を処理するには、純度が一層高くまたは調製が容易であるなどの１個以上の改良された特性を有するＨＡを製造するのに用いることができる新たな方法および構造体が必要である。特に、現在商業的に入手可能なＨＡより比較的高分子量で且つ比較的純粋なＨＡを一層多量に製造するための方法を開発する必要がある。更に、改質された分子の大きさの分布（ＨＡΔサイズ）を有するＨＡ、並びに改質された構造（ＨＡΔ改質）を有するＨＡを製造するための方法を開発する必要もある。
【００３２】
工業用酵素の生産は年商の１５億ドルであり、これらの生成物の７０%はBacillus種から製造される。Bacillus株で有効な発現系を用いることの利点は、Bacillusがタンパク質の有効な分泌型であるので、遺伝子工学処理を施したタンパク質を製造する工程においてE. coliまたは酵母の代わりにBacillusを用いると、当該タンパク質の分泌が高まる。Bacillus株は、E. coliのような他の普通に用いられる細菌株とは異なり、「一般に安全と認められている」または「ＧＲＡＳ」微生物でもある。Bacillusは、食品および飲料産業、および抗生物質の製造に長く用いられてきた。Bacillusの一つの利点は、発熱物質を含んだり毒素を産生しないことである。洗剤プロテアーゼおよびα−アミラーゼの製造など醗酵におけるBacillusの使用に広汎な工業的経験がある。
【００３３】
本発明では、当該技術分野における１以上の欠点を検討する。 組換えＤＮＡ技術を用いて、酵素活性を有するＨＡＳをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントを導入したBacillus細胞で酵素活性を有するＨＡＳを産生する方法を開示し、ＨＡＳおよびそのヒアルロン酸生成物を産生する組換えBacillus細胞の調製と共に特許請求を行う。
【００３４】
発明の簡単な概要
本発明は、ヒアルロン酸（ＨＡ）調製の技術における１以上の問題点を解決するための組換えＤＮＡ技術の応用に関する。これらの問題は、ＨＡ鎖生合成に関与する遺伝子である酵素活性を有するヒアルロネートシンターゼ（ＨＡＳ）遺伝子、例えば群ＡまたはＣのStreptococcus、Pasteurella multocida、Sulfolobus solfataricus、およびEctocarpus siliculosusウイルス由来のＨＡＳ遺伝子をコードするコード領域を有する核酸セグメントの単離および使用により、処理される。本明細書に開示されるＨＡＳ遺伝子は、適当な微生物供給源のＤＮＡからクローニングし、遺伝子工学処理により有用な組換え構造体とし、Bacillus細胞に導入して、ＨＡを調製し、ＨＡＳ酵素自身を多量に調製する。
【００３５】
「ヒアルロン酸シンターゼ」、「ヒアルロネートシンターゼ」、「ヒアルロナンシンターゼ」、および「ＨＡシンターゼ」という用語は、an酵素 thatポリマーizes aグルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミン糖が交互にβ１，３およびβ１，４結合してなるグリコサミノグリカン多糖鎖を重合する酵素を互換的に記載するのに用いられる。「ｓｅＨＡＳ」という用語は、例えばStreptococcus equisimilis由来のＨＡＳ酵素を表し、ｓｅＨＡＳ酵素をコードする遺伝子の発現は、食作用および免疫監視を免れる手段を提供することによる連鎖球菌の群Ａおよび群Ｃ株の毒性と相関している。
【００３６】
本発明は、グルクロン酸およびＮ−アセチルグルコサミンを重合してグリコサミノグリカンヒアルロン酸とするのに用いられることがあるヒアルロネートまたはヒアルロン酸シンターゼ遺伝子、ｃＤＮＡ、および遺伝子生成物（ＨＡＳ）の単離および特性決定に関する。本発明は、ＨＡＳ座を同定し、Streptococcus equisimilis、Streptococcus pyogenes、Streptococcus uberis、Pasteurella multocida、Sulfolobus solfactaricus、Bacillus anthracisｐＸＯ１、およびEctocarpus sificulosusウイルス由来の酵素活性を有するＨＡＳ遺伝子をコードする核酸配列を開示する。ＨＡＳ遺伝子は、新規なプローブを提供して、ヒアルロン酸を産生する細菌標本の可能性も評価する。
【００３７】
本明細書で上記した技術および知識を応用することによって、当業者はＨＡＳ遺伝子をコードする追加の核酸セグメントを得ることができる。当業者は、本開示を考慮して、これらの利点は、ＨＡＳ遺伝子の発現を制御し且つ産生されるＨＡＳ遺伝子生成物であるＨＡＳ酵素の性質を制御することができる点において重要な有用性を提供する。
【００３８】
従って、本発明は、原核生物または真核生物供給源由来のいずれにせよ酵素活性を有するＨＡＳをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントの単離に関するものである。これは可能であり、酵素および実際には遺伝子が真核生物および幾つかの原核生物のいずれでも見出されるものであるからである。真核生物はＨＡを産生し、従って、本発明に関連して用いることができるＨＡシンターゼ遺伝子を有することも知られている。
【００３９】
本発明のＨＡシンターゼをコードする核酸セグメントは、総染色体またはゲノムＤＮＡを含まずに単離され、組換えＤＮＡ技術によって容易に操作することができるようにするものと定義される。従って、本明細書で用いられる「精製した核酸セグメント」という用語は、関連のない染色体またはゲノムＤＮＡを含まずに単離され、組換え技術の実施に用いることができる状態に保持されたＤＮＡセグメント、例えば別個の単離されたＤＮＡ断片、またはこのような断片を組込むベクター（例えば、プラスミド、ファージまたはウイルス）の形態のＤＮＡを表す。
【００４０】
本発明は、組換え宿主細胞であって、配列番号：２、１０、１２、１４、１６、１８または２０の酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントを含んでなる組換えベクターBacillus細胞である、組換え宿主細胞を含んでなる。精製した核酸セグメントは、配列番号：１、９、１１、１３、１５、１７または１９のヌクレオチド配列を含んでなることができる。組換えベクターは、形質転換、トランスフェクション、形質導入、および電気穿孔の少なくとも一つによってBacillus細胞に導入することができる。
【００４１】
本明細書で上記したコード領域は、グラム陽性菌適合性プロモーターまたはBacillus適合性プロモーターのようなプロモーターによって制御することができる。組換え宿主細胞は、少なくとも１個の改質ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを包含することができ、改質ＲＮＡポリメラーゼプロモーターがＲＮＡポリメラーゼによって認識されると、ＲＮＡポリメラーゼは内在性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターより多量にＲＮＡを発現することができる。このような改質は突然変異であるか、またはタンデムプロモーター要素の存在であることができ、これらは同一または異なるプロモーター要素であることができる。更に、組換え宿主細胞は、天然のBacillus細胞でみられるより少なくとも１個多いｍＲＮＡ安定化または脱安定化要素を包含することもできる。
【００４２】
Bacillus細胞は、ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡおよびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの少なくとも一方の産生を高めることができる。場合によっては、組換え宿主細胞は、ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ、ＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ、およびそれらの組合せからなる群から選択される酵素活性を有するＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ生合成経路酵素のようなＵＤＰ−糖前駆体経路酵素において、機能活性を有する酵素をコードするコード領域を有する少なくとも１個の精製した核酸セグメントを有することもできる。このような精製した核酸セグメントは、上記の組換えベクター上に提供することができ、または異なる組換えベクター上に提供することができる。同一ベクター上に提供するときには、２個のコード領域は、少なくとも１種類のプロモーターの少なくとも１個のコピーによって制御することもまたは異なるプロモーターによって制御することもできる。ＵＤＰ−糖前駆体生合成経路酵素をコードする少なくとも１つの核酸セグメントが存在すると、内在性ＵＤＰ糖前駆体生合成経路酵素を発現する天然の宿主細胞より大きい活性を有する組換え宿主細胞が提供される。
【００４３】
もう一つの代替法では、組換え宿主細胞は少なくとも１個の突然変異したＵＤＰ−糖前駆体生合成遺伝子を包含することができ、突然変異はそこから転写されるｍＲＮＡの半減期を増加し、翻訳効率の増加したｍＲＮＡをコードし、またはＵＤＰ−糖前駆体生合成遺伝子のリボソーム結合部位にあり、リボソームのリボソーム結合部位に対する結合親和性が増加するようになる。
【００４４】
本発明は、ヒアルロン酸の製造方法であって、本明細書で上記した（複数の）精製した核酸セグメントを導入し、組換え宿主細胞を培地で増殖させてヒアルロン酸を分泌させることによって本明細書で上記した組換え宿主細胞を構築することを含んでなる、方法も含んでなる。Bacillus宿主は、化学的に画定した培地、複合培地、またはグルコースとＮ−アセチルグルコサミンおよびグルコサミンの少なくとも一方を含む培地で約２５℃〜約４２節真空濃縮範囲の温度で増殖させることができる。次に、分泌されたヒアルロン酸を回収し、回収したヒアルロン酸を更に培地から抽出した後、精製することもできる。例えば、ヒアルロン酸を細胞および砕片から濾過、遠心分離および凝集の少なくとも一つによって分離した後、ヒアルロン酸を濃縮した後、濃縮したヒアルロン酸を培地から沈澱、限外濾過および透析からなる群から選択される少なくとも１つの方法によって分離することもできる。この分離は、更にトリクロロ酢酸の添加を包含し、これによって細胞および砕片をヒアルロン酸から分離することを容易にすることもできる。沈澱剤は、アルコール、有機溶媒または化合物、および脂肪族の正に帯電した塩の少なくとも一つであることができ、エタノール、イソプロパノール、アセトン、臭化セチルトリアンモニウムまたは塩化セチルピリジニウムからなる群から選択することができる。
【００４５】
本発明は、本明細書で上記した方法によって調製したヒアルロン酸も含んでなる。
【００４６】
発明の具体的説明
本発明の少なくとも１個の態様を詳細に説明する前に、本発明は、下記の説明に記載されまたは図面に図解された構造の詳細および成分の配置にその応用が限定されないことを理解すべきである。本発明は、他の態様が可能であり、または様々な方法で実施しまたは実行することができる。また、本明細書で用いられる表現および用語は、説明のためのものであり、制限と考えるべきではないことを理解すべきである。
【００４７】
本明細書で用いられる「核酸セグメント」および「ＤＮＡセグメント」という用語は互換的に用いられ、特定の種の総ゲノムＤＮＡを含まないで単離されたＤＮＡ分子を表す。従って、本明細書で用いられる「精製した」ＤＮＡまたは核酸セグメントは、ヒアルロネートシンターゼ（「ＨＡＳ」）コード配列であって、供給源細胞の関連のないゲノムＤＮＡから単離されまたは精製してこれを含まないものを含むＤＮＡセグメントを表す。「ＤＮＡセグメント」という用語には、ＤＮＡセグメントおよびこれらのセグメントより小さな断片、および組換えベクター、例えば、プラスミドコスミド、ファージ、ウイルスなども包含される。
【００４８】
同様に、単離したまたは精製したＨＡＳ遺伝子を含んでなるＤＮＡセグメントは、他の天然に存在する遺伝子またはタンパク質コード配列から実質的に離れて隔離されたＨＡＳコード配列などのＤＮＡセグメントを表す。これに関して、「遺伝子」という用語は、機能性タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドコード単位を簡単に表すのに用いられる。当業者であれば理解されるように、この機能的用語は、ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列、またはそれらの組合せを包含する。「他のコード配列から実質的に離れて隔離された」とは、目的の遺伝子、この場合にはＨＡＳがＤＮＡセグメントのコード領域の重要な部分を形成し、このＤＮＡセグメントが天然に存在するコードＤＮＡの大きな部分、例えば、大きな染色体断片、または他の機能性遺伝子またはＤＮＡコード領域を含まないことを意味する。これは、本来単離されるものとしてのＤＮＡセグメントを表し、後で加えられるまたは人の手によって意図的にセグメントに残された遺伝子またはコード領域を除外しないことは勿論である。
【００４９】
原核生物供給源の使用に関連したある種の利点により、原核生物からＨＡＳ遺伝子の単離が極めて有利になると思われる。特に、クラスIまたはクラスIIのＨＡＳ、例えば、S. equisimilisまたはS. pyogenes由来のクラスIのＨＡＳ、またはP. multocida由来のクラスIIのＨＡＳを選択して利用することができる。
【００５０】
連鎖球菌は、様々な細胞壁炭水化物抗原に基づいてLancefield群に分類学的に再分される。１８の異なる群があるが、最も普通の病原体はＡ、Ｂ、ＣおよびＤである。歴史的には、最も普通の病原体には、特定の種の名称が付けられることが多いが、統一Lancefield試験法がタイピングの明確な方法であり、従って有用な分類機構として認められている。ＨＡＳ遺伝子の供給源として利用できるStreptococcus種としては、群Ａの連鎖球菌、例えば、S. pyogenesおよびS. haemolyticus、および群Ｃの連鎖球菌、例えば、S. equi、S. equisimilis、S. zooepidemicus、S. uberisおよびS. dysgalactiaeが挙げられる。
【００５１】
原核生物からＨＡＳ遺伝子を単離することの一つの利点は、典型的には真核生物酵素が真核生物宿主でのみ達成することができる重要な翻訳後修飾を必要とすることがあることである。これは、得られる任意の真核生物ＨＡシンターゼ遺伝子の応用可能性を限定するのに役立つ。更に、当業者であれば、用いられる原核生物酵素遺伝子を探索する遺伝子操作の時間および容易さに関して更に有利になると思われる。これらの追加の利点としては、(a)ゲノムの大きさが比較的小さく、従って相当するゲノムライブラリースクリーニングの量が少ないことにより原核生物遺伝子の単離が容易であり、(b) 原核生物遺伝子のコード領域の全般的大きさがイントロンがないためかなり小さいので、操作が容易であることが挙げられる。更に、ＨＡＳ遺伝子の生成物（すなわち、酵素）が翻訳後修飾を必要とするときには、, これらは遺伝子が誘導される同様な原核生物細胞環境（宿主）で最もよく達成される。
【００５２】
好ましくは、本発明のＤＮＡ配列は、選択された組換え宿主で配列を発現させる遺伝子制御領域も包含する。用いる制御領域の性質が一般的には構想した特定の用途（例えば、クローニング宿主）によって変化することは勿論である。
特定の態様では、本発明は、単離したＤＮＡセグメントおよびＤＮＡ配列を組込み且つそのアミノ酸配列中に配列番号：２、１０、１２、１４、１６、１８および２０の少なくとも１つのアミノ酸配列を包含するＨＡＳ遺伝子をコードする組換えベクターに関する。更に、他の特定の態様では、本発明は、単離したＤＮＡセグメントおよびＤＮＡ配列を組込み且つそのアミノ酸配列中にＨＡＳ遺伝子またはＤＮＡのアミノ酸配列を包含する遺伝子をコードする組換えベクター、および特にStreptococcus equisimilisＨＡＳ、Streptococcus pyogenesＨＡＳ、Streptococcus uberisＨＡＳ、Pasteurella multocidaＨＡＳ、Sulfolobus solfataricusＨＡＳ、Ectocarpus siticulosusウイルスＨＡＳ、およびBacillus anthracisプラスミドｐＸＯ１ＨＡＳの少なくとも１つに相当するＨＡＳ遺伝子またはｃＤＮＡに関する。例えば、ＤＮＡセグメントまたはベクターが完全長のＨＡＳタンパク質をコードするかまたはＨＡＳタンパク質の発現に使用しようとする場合には、好ましい配列は、本質的に配列番号：２、１０、１２、１４、１６、１８および２０の少なくとも１つに記載されている通りのものである。
【００５３】
ＨＡシンターゼ活性を有する核酸セグメントは、本明細書に記載の方法によって単離することができる。「本質的に配列番号：Ｘに記載されている通りの配列」という用語は、この配列が実質的に配列番号：Ｘの一部に相当し、配列番号：Ｘのアミノ酸とは同一でない比較的少数のアミノ酸または配列番号：Ｘのアミノ酸と生物学的機能が同等のものを有することを意味する。「生物学的機能が同等のもの」という用語は当該技術分野では十分に理解されており、更に本明細書で、本質的に配列番号：Ｘに記載されている通りの配列を有し且つ原核生物がＨＡまたはヒアルロン酸コートを産生する能力に関連している遺伝子として詳細に定義される。
【００５４】
例えば、ｓｅＨＡＳおよびｓｐＨＡＳコード配列は約７０%同一であり、塩基アデニン（Ａ）およびチミン（Ｔ）含量が高い。ｓｅＨＡＳ塩基含量は、Ａ−２６．７１%、Ｃ−１９．１３%、Ｇ−２０．８１%、およびＴ−３３%（Ａ／Ｔ６０%）であり、一方、ｓｐＨＡＳではＡ−３４%、Ｃ−１６．４２%、Ｇ−１６．３４%、およびＴ−３５．８%（Ａ／Ｔ＝６７%）である。ｓｅＨＡＳコード配列は、ｓｐＨＡＳ遺伝子と７０%同一であるにも拘わらず、これとハイブリダイズせず、またその逆も言えることに当業者は驚くであろう。この予期しないクロス−ハイブリダイズが不可能であることは、オープンリーディングフレーム中のミスマッチした塩基の短い中断による可能性がある。ｓｐＨＡＳとｓｅＨＡＳとがクロス−ハイブリダイズできないことを、図１に示す。ｓｅＨＡＳとｓｐＨＡＳコード配列の両方に共通の同一ヌクレオチドの最長伸長は、２０ヌクレオチドに過ぎない。更に、非常にＡ−Ｔリッチな配列は、Ｇ−Ｃリッチな配列よりも安定性の低いハイブリダイゼーション複合体を形成する。もう一つの可能な説明は、いずれの配列にもＡまたはＴの幾つかの伸長があり、生前とならば図に且つ不安定なやり方でハイブリダイズする可能性があることである。これにより、ｓｅＨＡＳとｓｐＨＡＳ遺伝子配列が、互いにフレームの外におかれることによって、生産的なハイブリダイゼーションの確率が減少する。
【００５５】
７０%同一であるタンパク質をコードする２種類の遺伝子が互いにクロス−ハイブリダイズすることができないというこの独特な現象のために、特許請求した核酸セグメントをその機能の点から、すなわち酵素活性を有するヒアルロネートシンターゼをコードする核酸セグメントを考察するのが有益である。当業者であれば、酵素活性を有するヒアルロネートシンターゼをコードする核酸セグメントは、配列番号：１、２、および９〜２０に記載の配列に対して保存または半保存置換を含むことができることを理解されるであろう。
【００５６】
特に、当該技術分野には、従業者が核酸セグメントに対して構造を変化させ（すなわち、保存または半保存アミノ酸置換をコードし）、その酵素的または機能活性を保存することができることの例が数多く見られる。例えば、(1) Risler et al.「構造的に関連したタンパク質におけるアミノ酸置換。パターン認識法(Amino Acid Substitutions in Structurally Related Proteins, A Pattern Recognition Approach)」 J. Moi, Blol. 204:1019-1029 (1988)［・・・アミノ酸鎖が交換可能であることが観察されたことにより、(i)ＩｌｅおよびＶａｌ；(ji)ＬｅｕおよびＭｅｔ、(iii)Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＧｌｎ、および(iv)ＴｙｒおよびＰｈｅの４群のみを詳述することができた］；(2) Niefind et al.「主鎖フォールディングアノールから誘導されたタンパク質モデリングおよび配列整列のアミノ酸類似性係数(Amino Acid Similarity Coefficients for Protein Modeling and Sequence Alignment Derived from Main-Chain Folding Anoles)」Mol. Biol. 219: 481-497 (1991)［類似性パラメーターにより、アミノ酸置換をデザインすることができた］；および(3) Overington et al.「環境に特異的なアミノ酸置換表：第三の鋳型およびタンパク質フォールディングの予測(Environment-SpecificAminoAcidSubstitutionTables: Tertiary Templates and Prediction of Protein Folds)」 Protein Science 1:216-226 (1992) ［「局部環境の関数としての観察された置換のパターンを分析することにより、異なるパターンがあることが示される・・・。」適合性のある変化を行うことができる。］を参照されたい。上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている。
【００５７】
これらの文献および数え切れない他の文献は、当業者が、核酸配列を考慮すれば、その機能性を変化させることなく核酸配列に置換および変化を行うことができることを示唆している。また、置換核酸セグメントは同一性が高く且つその純粋な親の酵素活性を保持しており、しかも親へのハイブリダイゼーションを行うことができないことがある。
【００５８】
本発明は、ｓｅＨＡＳ、ｓｐＨＡＳ、ｓｕＨＡＳおよびｐｍＨＡＳのような酵素活性を有するヒアルロネートシンターゼをコードする核酸セグメントを開示する。ｓｅＨＡＳおよびｓｐＨＡＳは７０%同一であり、いずれも酵素活性を有するヒアルロネートシンターゼをコードするが、クロスハイブリダイゼーションを行わない。従って、当業者であれば、本発明の範囲および特許請求の範囲から離反することなく配列番号：１に示すｓｅＨＡＳ核酸セグメントに置換を行うことができることを理解されるであろう。標準化され且つ容認された機能が同等なアミノ酸置換を、表Ｉに示す。
【００５９】
【表１】
2005514059.tif 000002
【００６０】
本発明のもう一つの好ましい態様は、組換えベクターとして更に定義される配列番号：２、１０、１２、１４、１６、１８または２０に記載のタンパク質をコードする精製した核酸セグメントである。本明細書で用いられる「組換えベクター」という用語は、ＨＡＳタンパク質をコードする核酸セグメントまたはその断片を含むように改質されたベクターを表す。組換えベクターは、上記のＨＡＳコード核酸セグメントに操作結合したプロモーターを含んでなる発現ベクターとしても定義されることがある。
【００６１】
本発明の更に好ましい態様は、ＨＡＳ遺伝子を含んでなる組換えベクターで組換え体とした宿主である。好ましい組換え宿主細胞は、原核生物細胞である。もう一つの態様では、組換え宿主細胞は、真核生物細胞である。本明細書で用いられる「工学処理した」または「組換え」細胞という用語は、ＨＡＳをコードする遺伝子のような組換え遺伝子を導入した細胞を表そうとするものである。従って、工学処理した細胞は、組換え導入した遺伝子を含まない天然に存在する細胞と区別することができる。従って、工学処理した細胞は、人の手によって導入された１個の遺伝子または複数の遺伝子を有する細胞である。組換えにより導入された遺伝子はゲノム遺伝子のコピーであるｃＤＮＡ遺伝子の形態であるか、または特定の導入遺伝子と天然では関連しないプロモーターの隣接位置の遺伝子を包含する。
【００６２】
組換えＨＡシンターゼを産生するのに用いることができるような連鎖球菌以外の宿主を用いようとする場合には、E. coli、Bacillus株、Lactococcus種のような原核生物系、または酵母、またはチャイニーズハムスター卵巣、アフリカングリーンモンキー腎臓細胞、ＶＥＲＯ細胞などの真核生物系を用いるのが有利であることがある。勿論、これを行おうとするときには、一般的にはＨＡシンターゼ遺伝子を選択された代替宿主で機能する配列によって制御するのが望ましい。適当なＤＮＡは、配列並びにそれらの構築および使用を制御し、一般に当該技術分野では以下に更に詳細に記載されるように周知である。例えば、好ましい態様では、宿主細胞は、Bacillus subtilisまたはBacillus licheniformis細胞のようなBacillus細胞であることができ、それに導入されるベクターはｈａｓ遺伝子が操作結合するBacillus適合性プロモーターを含む。
更に好ましい態様では、宿主細胞は、Bacillus alkalophilus、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus brevis、Bacillus circulans、Bacillus clausii<
Bacillus coagulans、Bacillus firmus、Bacillus lautus、Bacillus lentus、Bacillus licheniformis、Bacillus metaterium、Bacillus pumilus、Bacillus stearothermophilus、Bacillus subtilisおよびBacillus thuringienisisのようなBacillus細胞である。
【００６３】
好ましい態様では、ＨＡシンターゼコードＤＮＡセグメントは、特定の宿主により連続配列の複製を可能にする複製の起点またはレプリコンとして機能することが当該技術分野で知られているＤＮＡ配列も包含する。このような起点では、ＨＡシンターゼＤＮＡ配列が連結している染色体外に局在している複製用キメラセグメントまたはプラスミドを調製することができる。更に好ましい例では、用いる起点は、バイオテクノロジーによる応用に適する細菌宿主で複製することができるものである。しかしながら、クローニングしたＤＮＡセグメントの用途を更に広くするには、（シャトルベクターでのような）使用が考えられる他の宿主系によって認められた起点を代替的にまたは追加的に用いることが望ましいことがある。
【００６４】
多数の高等生物のクローニングや発現に用いることができるＳＶ４０、ポリオーマまたはウシ乳頭腫ウイルス起源のような他の複製起源の単離および使用は、当業者には周知である。従って、ある態様では、本発明は、 may thus be defined in terms of a適当な複製起源と共に選択された制御領域によって制御されているＨＡシンターゼコード遺伝子配列を包含する組換え形質転換ベクターに関して定義することができる。
【００６５】
従って、当業者であれば、他の手段を用いて、本発明の開示内容の観点からＨＡＳ遺伝子またはｃＤＮＡを得ることができることを理解されるであろう。例えば、連鎖球菌の他の株などの多数の供給源、またはｃＤＮＡライブラリーのような真核生物供給源由来の遺伝子またはｃＤＮＡの完全な補体を含むポリメラーゼ連鎖反応またはＲＴ−ＰＣＲによって産生されたＤＮＡ断片を得ることができる。実際には、任意の分子クローニング法を用いて、本発明のＤＮＡ断片を生成させることができる。従って、一般にＤＮＡ単離に用いる特定の方法についての唯一の制限は、単離された核酸が生物学的に機能が同等なＨＡシンターゼをコードすることである。
【００６６】
ＤＮＡを単離したならば、これを選択したベクターと連結させる。事実上任意のクローニングベクターを用いて本発明の利点を実現することができる。典型的な有用なベクターとしては、原核生物に用いるプラスミドおよびファージ、および真核生物に用いるウイルスベクターが挙げられる。例としては、ｐＫＫ２２３−３、ｐＳＡ３、組換え体λ、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、およびレトロウイルスが挙げられる。しかしながら、LactococcusまたはBacillus株およびE. coliのいずれでも複製が可能なベクターを用いる場合に、特にこの利点が実現されると思われる。
【００６７】
これらのようなベクター、例えば、Dao and FerrettiのｐＳＡ３ベクターまたはTrieu-Cuot, et al.のｐＡＴ１９ベクターにより、クローンコロニー選択をE. coliのような容易に操作される宿主で行った後、食品級のLactococcusまたはBacillus株に再導入してＨＡを産生することができる。これらは、ある種の食品およびバイオテクノロジー製品の製造に用いられる良性であり且つ詳細に研究された生物である。これらは、遺伝子添加（すなわち、増幅によるＨＡシンターゼ遺伝子の余剰コピーの提供）および／または追加遺伝子を包含することによりＨＡを合成するLactococcusまたはBacillus株を増加させ、ＨＡ前駆体の利用可能性を増加する点で有利である。細菌がＨＡを合成する固有の能力を、ＨＡシンターゼ遺伝子を有するプラスミドの余剰コピーの形成または増幅によって増加させることもできる。この増幅は、プラスミドコピー数、従ってＨＡシンターゼ遺伝子コピー数で１０倍までの増加を計上することができる。
【００６８】
ＨＡシンターゼ遺伝子コピー数を更に増加させるもう一つの手続きは、遺伝子の複合コピーをプラスミドに挿入することである。もう一つの手法としては、ＨＡＳ遺伝子の染色体ＤＮＡへの組込みが挙げられる。この余剰増幅は、細菌性ＨＡシンターゼ遺伝子のサイズが小さいので、特に実行可能である。幾つかの場合には、染色体ＤＮＡが連結したベクターを用いて、E. coliのようなクローンスクリーニング目的に選択される宿主を、選択した宿主で挿入したＤＮＡを発現することができるベクターを用いることによって、トランスフェクションする。
【００６９】
もう一つの好ましい態様では、ＨＡシンターゼ遺伝子を相同的または非相同的組換えにより宿主細胞染色体に導入する。ｈａｓ遺伝子は、特に薬剤選択のないこの配置では一層安定であることがある。様々なベクターを用いて、ｈａｓ遺伝子をｐＴＬＨまたはｐＫＳＶ７のようにBacillusに、またはＹＩｐ２１１のように酵母に、、またはｐｃＤＮＡ／ＦＲＴのように動物細胞に導入することができる。ＤＮＡを、最初に形質転換、形質導入または電気穿孔によって宿主細胞に導入する。ｈａｓ遺伝子を有するＤＮＡセグメントを、次に宿主染色体に安定的に組込む。例えば、ｓｐＨＡＳ遺伝子を用いて、突然変異体Streptococcus染色体を形質導入および組込みによって修復し、この操作により、ＨＡが産生される(DeAngelis et al., 1993)。
【００７０】
表皮または滑液繊維芽細胞、または雄鶏の鶏冠細胞のような真核生物供給源を用いる場合には、最初にｃＤＮＡライブラリーを調製することによって進もうとする。これは、最初に上記細胞からｍＲＮＡを単離した後に、逆転写酵素活性を有する酵素を用いて二本鎖ｃＤＮＡを調製し、選択されたベクターと連結することによって行われる。二本鎖ｃＤＮＡの調製については、多くの可能性が利用することがで飢渇当該技術分野で知られており、総てのこのような技術が応用可能であると考えられる。好ましい手法は、逆転写を伴う。二本鎖ｃＤＮＡの個体群が得られたならば、適当なベクターへの連結および適当な宿主での増幅などの一般に認められている手法によってｃＤＮＡライブラリーが選択された宿主で調製される。得られるクローンの数が多く且つ本明細書に記載の手法による多数のクローンのスクリーニングが比較的容易であるため、ｃＤＮＡクローンのクローニングおよび発現スクリーニングについてλｇｔ１１、λｇｔ１２、λＧｅｍ１１および／またはλＺＡＰのようなファージ発現ベクターを用いようとすることがある。
【００７１】
ある種の他の態様では、本発明は、配列番号：１、９、１１、１３、１５、１７および１９の少なくとも１個に本質的に記載された核酸配列をその配列中に含む単離されたＤＮＡセグメントおよび組換えベクターに関する。例えば、「配列番号：１に本質的に記載された」という用語は上記と同じ意味で用いられ、核酸配列が実質的に配列番号：1の一部に相当し且つ配列番号：１のコドンに同一でないまたは機能的に同等な比較的少数のコドンを有することを意味する。「機能的に同等なコドン」という用語は、本明細書ではアルギニンまたはセリンについての６個のコドンのような同一アミノ酸をコードするコドンを表し、且つまた表Ｉに記載の生物学的に同等なアミノ酸をコードするコドンをも表すのに用いられる。
【００７２】
アミノ酸および核酸配列は追加のＮ−またはＣ−末端アミノ酸または追加の５′または３′核酸配列のような追加残基を包含し、且つ配列がタンパク質発現および酵素活性が関係する生物学的タンパク質活性の保持などの上記の基準に合う限り、本質的に本明細書に開示された配列の一つに記載された通りでもあることも理解されるであろう。末端配列の付加は、特に例えば、コード領域の５′または３′部分のいずれかに隣接する様々な非コード配列を包含することがあり、または様々な内部配列を包含することがある核酸配列に適用され、これは遺伝子中で起こることが知られている。特に、真核生物でのHａｓ遺伝子生成物のアミノ酸配列は、原核生物で見られるものより４０%大きいと思われる。
【００７３】
遺伝子コードの縮重並びに保存および半保存置換を考慮すれば、配列番号：１、９、１１、１３、１５、１７、または１９のヌクレオチドに同一であるヌクレオチドの約４０%〜約８０%、または更に好ましくは約８０%〜約９０%、または更に好ましくは約９０%〜約９９%を有する配列は、「本質的に配列番号：１、９、１１、１３、１５、１７、または１９に記載されている通りである」配列である。配列番号：１、９、１１、１３、１５、１７、または１９に記載されているものと本質的に同一の配列は、標準的または余り緊縮的でないハイブリダイゼーション条件下で配列番号：１、９、１１、１３、１５、１７、または１９の補体を含む核酸セグメントにハイブリダイズすることができる配列と機能的に定義することもできる。適当な標準的ハイブリダイゼーション条件は、当業者には周知であり且つ本明細書に明確に記載されている。
【００７４】
本明細書で用いられる「標準的ハイブリダイゼーション条件」という用語は、実質的に相補的核酸セグメントが標準的Watson-Crick塩基対を形成する条件を表すのに用いられる。pH、温度、塩濃度、ホルムアミドおよびジメチルスルホキシドのような薬剤の存在、ハイブリダイズするセグメントの長さなど結合またはハイブリダイゼーションの特異性を決定する多数の因子が知られている。約１４〜約１００ヌクレオチドの断片のような短めの核酸セグメントをハイブリダイゼーションに用いようとするときには、ハイブリダイゼーションの塩および温度の好ましい条件は４０〜５０℃の１．２〜１．８×高リン酸緩衝液（ＨＰＢ）を包含する。
【００７５】
当然のことであるが、本発明は、配列番号：１、９、１１、１３、１５、１７または１９に記載の配列に相補的または本質的に相補的なＤＮＡ配列も包含する。「相補的」な核酸配列は、標準的Watson-Crick相補性則による塩基対を形成することができるものである。本明細書で用いられる、「相補的配列」という用語は、上記の同一ヌクレオチドの比較によって評価することができるまたは配列番号：１、９、１１、１３、１５、１７または１９の核酸配列にハイブリダイズすることができると定義されている実質的に相補的な核酸配列を意味する。
【００７６】
本発明の核酸セグメントコード配列自身の長さとは関係なく、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、追加の制限酵素部位、複合クローニング部位、エピトープタグ、ポリヒスチジン領域、他のコードセグメントなど他のＤＮＡ配列と結合し、それらの全体的長さがかなり変化するようにすることができる。従って、ほとんどあらゆる長さの核酸断片を用いることができるが、目的とする組換えＤＮＡプロトコールでの調製および使用が容易であることにより全体の長さを制限するのが好ましいと思われる。
【００７７】
当然のことであるが、本発明は、それぞれ配列番号：１、９、１１、１３、１５、１７または１９および配列番号：２、１０、１２、１４、１６、１８および２０の特定の核酸およびアミノ酸配列には限定されないことも理解されるであろう。従って、組換えベクターおよび単離したＤＮＡセグメントは、 variously
include theＨＡＳコード領域自身、選択された変更または修飾を基本コード領域に有するコード領域を様々に包含することができ、またはやはりＨＡＳ−コード領域を含む大きめのポリペプチドをコードするか、または様々なアミノ酸配列を有する生物学的機能が同等なタンパク質またはペプチドをコードすることができる。
【００７８】
CarterＡ型のP. multocidaのカプセルは、ヒアルロン酸（ＨＡ）を含むのではないかと長い間考えられていた。P. multocidaのＨＡシンターゼの特性決定により、それとｓｅＨＡＳおよびｓｐＨＡＳタンパク質との間の興味深い酵素学的差が明らかになった。
【００７９】
P. multocida細胞は容易に視認し得る細胞外ＨＡカプセルを産生し、２個の連鎖球菌ＨＡＳは膜タンパク質であるので、ニワトリコレラ病原体の膜調製物を試験した。初期の試験では、超音波処理のみから誘導される粗製膜画分は連鎖球菌ＨＡＳ活性の測定と同様な条件下で分析を行ったときには、ＨＡへのＵＤＰ−ＧｌｃＡｃ−依存的ＵＤＰ−［１４Ｃ］ＧｌｃＵＡの組込みは極めて低水準であった［ＧｌｃＵＡ導入約０．２pmol（タンパク質のμg）−１ｈ−１］。組換えｈａｓＡプラスミドを有するE. coli由来の酵素も、当初は単離が面倒なものであった。これらの結果は、同様の方法によってStreptococcusから得られる容易に検出可能な量と対照的である。
【００８０】
超音波処理と共にプロテアーゼ阻害薬の存在下での氷冷リゾチーム処理を用いる代替調製プロトコールにより、グラム陰性菌のいずれの種からもＨＡＳ活性を実質的に回収することができる。導入されたＧｌｃＵＡ５〜１pmol（μgタンパク質）−１ｈ−１のＨＡＳに対する特異活性は、野生型 P. multocidaの粗製膜について新規な方法でごく普通に得られた。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの非存在下では、ＵＤＰ−［１４Ｃ］ＧｌｃＵＡからの放射能は高分子量材料にほとんど組込まれなかった（両糖前駆体を用いる同一アッセイの＜１%）。カプセルのない突然変異体、ＴｎＡ、から調製した膜は、両糖ヌクレオチド前駆体を補足したときには、検出可能なＨＡＳ活性を持たなかった（データーは示さず）。Sephacryl S-200カラムを用いるゲル濾過分析は、イン・ビトロで合成した１４Ｃで標識した生成物の大部分の分子質量は、材料が空隙率で溶出するので≧８×１０４Daであり、このような値は少なくとも４００のモノマーから構成されるＨＡ分子に相当することを示している。この生成物はStreptomycesヒアルロニダーゼ消化に感受性であるが、プロテアーゼ処理には耐性である。
【００８１】
ＨＡＳアッセイのパラメーターを変化させて、ＵＤＰ−糖のP. multocida膜による多糖類への組込みを最大にした。連鎖球菌ｓｐＨＡＳは、Ｍｇ２＋を必要とするので、この金属イオンはP. multodda膜の開始アッセイに包含された。P. multocidaＨＡＳ（ｐｍＨＡＳ）はＴｒｉｓ型緩衝液中でpH６．５〜８．６で比較的活性であり、pH７で最適となる。ＨＡＳ活性は、中性pHではインキュベーション時間に関して少なくとも１時間線形であった。ｐｍＨＡＳは高めのイオン強度では明らかに活性が低かったが、１００mMのＮａＣｌを５０mM Ｔｒｉｓ，pH７および２０mM ＭｇＣｌ２を含む反応に加えることによって糖の組込みが約５０%まで減少するからであった。
【００８２】
ｐｍＨＡＳの金属イオン特異性は、pH７で評価した。ＥＤＴＡの存在下での無金属条件下では、放射性標識した前駆体の多糖類への組込みは検出されなかった（最大シグナル＜０．５%）。Ｍｎ２＋は、試験金属（Ｍｇ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｃｕ、およびＮｉ）について最低イオン濃度において最高の組込み率を示した。Ｍｇ２＋は、Ｍｎ２＋の約５０%の刺激を与えたが、１０倍高濃度であった。Ｃｏ２＋またはＮｉ２＋は、１０mMでは低レベルの活性を維持したが（それぞれ、１mMのＭｎ２＋のアッセイの２０%または９%）、１０mMのCｕ２＋を供給した膜は不活性であった。実際に、１０mM Ｃｕ２＋と２０mM Ｍｇ２＋を膜調製物と混合すると、標識の多糖類への組込みはほとんど見られなかった（Ｍｇのみでの値の＜０．８%）。
【００８３】
ｐｍＨＡＳの最初の特性決定は、Ｍｇ２＋の存在下で行った。糖ヌクレオチド前駆体に対する酵素の結合親和性は、見かけのＫＭ値を測定することによって評価した。［１４Ｃ］ＧｌｃＵＡまたは［３Ｈ］ＧｌｃＮＡｃの多糖類への組込みは、それぞれ様々な濃度のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃまたはＵＤＰ−ＧｌｃＵＡで観察した。Ｍｇ２＋含有緩衝液では、ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡに対する約２０μMおよびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに対する約75μMの見かけのＫＭ値は、滴定データーのHanes-Woolfプロット（［Ｓ］／ｖ対［Ｓ］）を用いて決定した。いずれの糖に対するＶｍａｘ値も同じであったが、Hanes-Woolfプロットの１／Ｖｍａｘに相当する傾きが同等であったからである。Ｍｇ２＋を用いるアッセイからの結果と比較して、ＵＤＰ−ＧｌｃＡｃに対するＫＭ値は約２５〜５０%だけ増加して約１０５μMとなり、ＶｍａｘはＭｎ２＋の存在下で２〜３倍だけ増加した。
【００８４】
P. multocida、S. equisimilis、またはS. pyogenes由来のＨＡシンターゼ酵素ＵＤＰ−糖を利用するが、それらはpHおよび金属イオン依存性、およびＫＭ値に関して幾分異なる動力学的最適条件を有する。酵素はpH７で最も活性であったが、ｐｍＨＡＳは弱酸性pHで一層の活性を示し且つpH７．４より上では比較的不活性であるといわれている。ｐｍＨＡＳは、イン・ビトロアッセイ条件下ではＭｎ２＋をＭｇ２＋より効率的に利用するが、細菌細胞での生理学的金属補助因子の正体は知られていない。比較すると、連鎖球菌酵素を用いる以前の研究では、Ｍｇ２＋はＭｎ２＋より遙かに良好であるが、小さいとはいえの約１０分の1の濃度で最大となった。ｐｍＨＡＳは、ｓｐＨＡＳより強固にＵＤＰ−糖と結合すると思われる。粗製膜でのｐｍＨＡＳについて測定したＫＭ値は、連鎖球菌膜で見られるＨＡＳから得られた値よりそれぞれの基質について約２〜３分の１であり、それぞれＵＤＰ−ＧｌｃＵＡについては５０または３９μMであり、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃについては５００または１５０μMである。
【００８５】
動力学的分析により、ｐｍＨＡＳのＶｍａｘはＭｎ２＋の存在下ではＭｇ２＋より２〜３倍高かったが、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃＫＭ値は前者のイオンを用いるアッセイでは若干増加した。この明らかな親和性の低下の観察は、重合速度の増加は、Ｍｎ２＋イオン／糖ヌクレオチド複合体の（複数の）酵素活性部位への良好な結合によるものではないことを示唆している。従って、Ｍｎ２＋が幾らかの他の反応工程を高め、酵素の他の部位／構造を変更し、またはリン脂質膜環境を改質することが可能である。ｐｍＨＡＳの遺伝子配列およびタンパク質配列は、それぞれ配列番号：９および１０に示す。
【００８６】
クロレラウイルスＰＢＣＶ−１は、ヒアルロナンを合成することができる機能的グリコシルトランスフェラーゼをコードする。この知見は、ウイルスが(a)宿主細胞グリコシルトランスフェラーゼを利用して新規な炭水化物構造を作り上げるか、または(b)ビリオン成熟の際に宿主細胞複合糖質を蓄積するという一般的観察と相容れないものである。更に、ＨＡは、一般的には動物および少数のそれらの悪性の細菌性病原体に限定されると考えられてきた。多数の植物炭水化物が特性決定されてきてはいるが、ＨＡや関連類似体はこれまでのところ植物や原生動物の細胞に検出されたことはなかった。
【００８７】
脊椎動物、細菌およびウイルスのＨＡＳ酵素は、配列が類似した幾つかの領域を有している。ウイルスＰＢＣＶ−１［Paramecium bursaria クロレラウイルス］の二本鎖ＤＮＡゲノムの配列決定中に、様々なＨＡＳに対して２８〜３３%のアミノ酸同一性を有する５６７残基のタンパク質をコードするＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）、Ａ９８Ｒ（受入番号４４２５８０）を見出した。このタンパク質は、ｃｖＨＡＳ（クロレラウイルスＨＡシンターゼ）と呼ばれている。ＰＢＣＶ−１をコードする遺伝子配列およびこれがコードするタンパク質配列は、それぞれ配列番号：７および８に示されている。
【００８８】
ＰＢＣＶ−１は、ある種の単細胞性真核生物のクロレラに似た緑藻で複製する大型（直径１７５〜１９０nm）の多面体状のプラーク形成ウイルスの科(Phycodnarviridae)の原型である。ＰＢＣＶ−１ビリオンは、外側の糖タンパク質キャプシドの内側にある少なくとも５０種類のタンパク質および１個の脂質成分を含む。ＰＢＣＶ−１ゲノムは、共有結合により接近したヘアピン末端を有する線状の非置換(nonpermuted)の３３０kbのｄｓＤＮＡ分子である。
【００８９】
推定アミノ酸配列に基づけば、Ａ９８Ｒ遺伝子生成物は完全な膜タンパク質であるべきである。この仮定を試験するため、組換えＡ９８ＲをEscherichia coliで産生させ、膜画分をＨＡＳ活性について分析した。ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡおよびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを、コントロール細胞（＜０．００１pmolＧｌｃＵＡ導入/mgタンパク質/分)由来の試料によってではなく、プラスミドｐＣＶＨＡＳ上にＡ９８Ｒ遺伝子を含む細胞から誘導された膜画分（平均特異活性２．５pmolＧｌｃＵＡ導入/mgタンパク質/分）によって多糖類に組込んだ。ｐＣＶＨＡＳで形質転換した細胞の可溶性画分では、活性は検出されなかった。重合には、ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡとＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃが同時に必要とされた。活性は、１０mM ＭｎＣ１２の存在下においてpH７．２のＨｅｐｅｓ緩衝液で最適であったが、金属イオンを省いた場合には、活性は認められなかった。Ｍｇ２＋およびＣｏ２＋の効果は、同じ濃度ではＭｎ２＋の約２０%であった。ｐｍＨＡＳは同様の金属を必要とするが、他のＨＡＳではＭｇ２＋が好ましい。
【００９０】
組換えＡ９８Ｒ酵素は、組換えｓｐＨＡＳまたはＤＧ４２ｘｌＨＡＳによってイン・ビトロで合成したＨＡの平均分子量（それぞれ、約１０７Daおよび約５〜８×１０６Da）より小さな平均分子量３〜６×１０６Daを有する多糖類を合成した。この多糖は、ＨＡを脱重合するが、ヘパリンやコンドロイチンのような構造的に関連したグリコサミノグリカンは脱重合しない酵素であるStreptomyces hyaluroniticusＨＡリアーゼによって完全に分解された。
【００９１】
ＰＢＣＶ−１に感染したクロレラ細胞をＡ９８Ｒ遺伝子発現について検討した。約１，７００ヌクレオチドのＡ９８Ｒ転写体は、感染後約１５分後に現れ感染後６０分までに消失し、Ａ９８Ｒが初期遺伝子であることを示していた。従って、未感染およびＰＢＣＶ−１に感染したクロレラ細胞を、感染から５０および９０分後にＨＡＳ活性について分析した。感染細胞は活性を有したが、未感染細胞は活性を持たなかった。細菌から誘導された組換えＡ９８Ｒ酵素のように、放射性標識のＵＤＰ−［１４Ｃ］ＧｌｃＵＡから多糖類への組込みは、Ｍｎ２＋およびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの両者によって変化した。この放射性標識した生成物も、ＨＡリアーゼによって分解された。崩壊したＰＢＣＶ−１ビリオンは、ＨＡＳ活性を持たなかった。
【００９２】
ＰＢＣＶ−１に感染したクロレラ細胞を、高特異的１２５Ｉで標識したＨＡ結合タンパク質を用いてＨＡ多糖類について分析した。感染から５０および９０分後の細胞抽出物では、実質的な量のＨＡが含まれていたが、未感染藻類または崩壊したＰＢＣＶ−１ビリオンからの抽出物には含まれていなかった。標識したＨＡ結合タンパク質は、感染から５０および９０分後には損なわれていない感染細胞と相互作用を示したが、健康な細胞とは相互作用を示さなかった。従って、新たに合成されたＨＡ多糖類のかなりの部分は、感染した藻類の外部細胞表面に固定されていた。細胞外ＨＡはウイルスとその藻類宿主との相互作用に何ら明らかな役割を果たしていないが、プラークの大きさまたはプラーク数が、ＰＢＣＶ−１プラークアッセイのトップアーガーに精巣ヒアルロニダーゼ（４６５単位/ml）または遊離ＨＡ多糖類（１００μg/ml）のいずれかを包含することによって変化しなかったからである。
【００９３】
ＰＢＣＶ−１ゲノム も、ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ（ＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ）およびグルタミン：フルクトースホスフェートアミノトランスフェラーゼ（ＧＦＡＴ）をコードする追加遺伝子を有する。ＵＤＰ−ＧｌｃＤＨは、ＵＤＰ−ＧｌｃをＨＡ生合成に必要な前駆体であるＵＤＰ−ＧｌｃＵＡに転換する。ＧＦＡＴは、フルクトースホスフェートをＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ代謝経路の中間体であるグルコサミン−６−ホスフェートに転換する。これらのＰＢＣＶ−１遺伝子はいずれも、Ａ９８ＲＨＡＳと同様に、感染の初期に発現され、酵素活性を有するタンパク質をコードする。ＨＡ生合成経路に複合酵素が存在することは、ＨＡ産生がクロレラウイルスのライフサイクルに重要な機能を果たしているに違いないことを示している。
【００９４】
Streptococcus、脊椎動物、およびＰＢＣＶ−１のＨＡシンターゼは、同じ相対的順序で存在する少なくとも２〜４個の同一残基のパターンの多くのモティーフを有している。これらの保存モティーフは、図２に示されるようにＨＡ生合成に極めて重要なドメインを表していると思われる。図２は、それぞれS. equisimilisおよびS. uberis由来の群ＣのｓｅＨＡＳおよびｓｕＨＡＳ；S. pyogenes由来の群ＡのｓｐＨＡＳ；マウスアイソザイムｍＨＡＳ１、ｍＨＡＳ２およびｍＨＡＳ３；ヒトアイソザイムｈＨＡＳ１、ｈＡＳ２およびｈＨＡＳ３；カエルアイソザイムｘ１ＨＡＳ１およびｘ１ＨＡＳ２；本来のＰＢＣＶ−１ウイルスＨＡＳ、ｃｖＨＡＳ、並びにより新しいウイルスＨＡＳ ｖＮＣ、ｖＭＡ、ｖＡＬおよびｖＣＡ；ラットｒｎＨＡＳ２；ヒナｇｇＨＡＳ２；ウシｂｔＨＡＳ２；およびウサギアイソザイムｏｃＨＡＳ２およびｏｃＨＡＳ３のタンパク質配列を整列したものである。図２の整列は、Mutalin 5.4.1版 多重整列プログラム（版権I.N.R.A. フランス 1989, 1991, 1994, 1996; 階層クラスターリングによる多重配列整列(Multiple sequence整列 with hierarchical clustering), Corpet, Nucl, Acids Res., 16:10881 (1988))を用いて行った。コンセンサスラインを、整列の下部ライン上に設けている。コンセンサスラインの大文字は記載した総てのＨＡＳタンパク質で同一残基を表し、小文字は総ての場合に同一とは限らないコンセンサス残基を表している。コンセンサスラインは、下記の記号も含んでおり、！はＩ、Ｖのいずれかであり、＄はＬ、Ｍのいずれかであり、%はＦ、Ｙのいずれかであり、#はＮ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｂ、Ｚのいずれかである。記号比較表はblosum62であり、ギャップ重量は１２であり、ギャップ長さ重量は２であった。
【００９５】
ＨＡＳとＵＤＰ−糖前駆体からβ結合多糖類を合成する他の酵素との類似性の領域はまた、グリコシルトランスフェラーゼがより一層配列決定されるので、発見されている。例としては、細菌性セルロースシンターゼ、真菌および細菌性キチンシンターゼ、および各種ＨＡＳが挙げられる。これらの類似構造モティーフの重要性は、グリコシルトランスフェラーゼの三次元構造が集積するに従って一層明らかになるであろう。
【００９６】
図３は、既知のヒアルロナンシンターゼの可能な進化の関連性を表している。 図３の系統発生樹は、ＤＮＡシス(DNAsis)複合整列プログラムを用いるHiggins-Sharpアルゴリズムによって生成した。計算マッチング率は、系統樹のそれぞれの枝に示している。
【００９７】
本発明のＤＮＡセグメントは、生物学的に機能が同等なＨＡＳタンパク質およびペプチドを包含する。このような配列は、天然において核酸配列およびこのようにしてコードされたタンパク質中で起こることが知られているコドン過剰および機能的同等性の結果として生じる可能性がある。あるいは、機能的に同等なタンパク質またはペプチドは、交換されるアミノ酸の特性の考察に基づいてタンパク質構造の変化を工学処理することができる組換えＤＮＡ技術を応用することによって作製することができる。ヒトによってデザインされた変化を、位置指定突然変異誘発技術を応用することによって導入し、例えば、酵素活性またはＨＡＳタンパク質の抗原性に対する改良を導入し、または分子レベルでのＨＡシンターゼ活性を検討する目的でＨＡＳ突然変異体を試験することができる。
【００９８】
また、ＨＡＳコード配列の特異的変化により、サイズ分布または構造的配置が変更されたＨＡを生じることができる。当業者であれば、ＨＡＳコード配列を、変更されたヒアルロネートシンターゼを産生する方法で操作することができ、次に、様々なポリマーサイズおよび／または機能上の性能を有するヒアルロン酸を産生することができることを理解するであろう。例えば、ＨＡＳコード配列をヒアルロネートシンターゼの糖基質特異性が変更されるようなやり方で変更して、ヒアルロネートシンターゼがこれまでは組込まれなかった糖または糖誘導体のような異なる構造を組込む新規なヒアルロン酸様ポリマーを生じるようにすることができる。この新たに組込まれた糖は様々な機能特性を有する改質ヒアルロン酸であるより小さなまたはより大きなポリマーサイズ／分子量または両方を有するヒアルロン酸を生じることができた。ＨＡＳコード配列を考慮すれば当業者によって理解されるように、変化および／または置換をＨＡＳコード配列に行い、これらの所望な特性および／またはサイズを変更することができる。表IIに、組換えｓｅＨＡＳの糖ヌクレオチド特異性およびマグネシウムイオン要件を示す。
【００９９】
【表２】
2005514059.tif 000003
【０１００】
本明細書で用いられる「変更された構造」という用語は、天然に存在するＨＡ多糖類では通常は見られない糖または誘導体を含むヒアルロン酸ポリマーを表す。「変更されたサイズ分布」という用語は、天然の酵素では通常は見られないサイズ分布のヒアルロン酸分子の合成を表し、工学処理したサイズは正常よりもずっと小さくまたは大きくすることができた。
【０１０１】
異なるサイズの様々なヒアルロン酸生成物は、薬剤送達など様々な分野で応用される。血管新生および外傷治癒での応用は、約４〜約２０の単糖類のヒアルロン酸ポリマーを良好な量で作製することができる場合には、大きい可能性がある。小さなヒアルロン酸オリゴ糖に付いてのもう一つの特別な応用は、医薬用に用いる組換えヒトタンパク質の安定化におけるものである。このようなタンパク質の主要な問題点は、血液からのそれらのクリアランスおよび生物学的半減期が短いことである。この問題に対する一つの現在の解決法は、タンパク質が循環から余り速やかに除去されるのを防止する小分子シールドを結合することである。分子量が極めて小さなヒアルロン酸が、この役割に十分適しており、また非免疫原性且つ生体適合性である。大きめの分子量のヒアルロン酸を薬剤やタンパク質に結合したものを用いて、ヒアルロン酸のエンドサイトーシス受容体を有する網内細胞系にターゲッティングすることができる。
【０１０２】
本明細書の開示内容を考慮すれば、当業者であれば、ヒアルロネートシンターゼによって作製されたヒアルロン酸ポリマーのサイズ分布を調整して異なるサイズを得ることができる幾つかの方法があることを理解されるであろう。第一に、生成物サイズの動力学的制御を、温度を減少させ、酵素作用時間を減少させ、および糖ヌクレオチド基質の一方または両方の濃度を減少させることによって変更することができる。これらの変量のいずれかまたは総てを減少させると、一層少量および一層小さなサイズのヒアルロン酸生成物が得られる。これらの方法の不都合な点は、生成物の収率も減少しまた日毎のまたはバッチ毎の再現性を得ることが困難なことがあることである。
【０１０３】
第二に、ＨＡポリマーのサイズ分布は、酵素が大きなヒアルロン酸生成物を合成する固有の能力を変更することによって調節することができる。タンパク質の変化は、特異的アミノ酸の置換、欠失および付加（または代謝過程中の置換基の導入）などの組換えＤＮＡ技術によって遺伝子工学処理を行うことができる。本質的に一層遅い酵素を生じるこのような変化により、次に動力学的手段によってヒアルロン酸サイズの制御が一層再現性のあるものとなる。最終的なヒアルロン酸サイズ分布は、配列中の特定のアミノ酸に依存している酵素のある種の特徴によって決定される。連鎖球菌酵素と真核生物ヒアルロネートシンターゼとの間に絶対的に保存される残基の２０%には、酵素が作製することができるヒアルロン酸ポリマーのサイズを制御しまたはこれに大きな影響を与えるユニークな位置におけるアミノ酸の組がある。これらの残基のいずれかにおける特異的変化は、サイズ分布が変更したＨＡ生成物を生成する改質ＨＡＳを生成することができる。ヒアルロン酸が放出される前に酵素が作製することができるヒアルロン酸の固有サイズを増加させるｓｅＨＡＳ、ｓｐＨＡＳ、ｓｕＨＡＳ、ｐｍＨＡＳ、またはｃｖＨＡＳに対する遺伝子工学処理を施した変化により、天然の酵素より小さなまたは潜在的に大きなサイズのヒアルロン酸を生成する強力な手段が提供される。
【０１０４】
最後に、大きめの分子量のヒアルロン酸を特異的ヒアルロニダーゼで分解して、小さめの分子量のヒアルロン酸を作製することができる。しかしながら、この実施は再現性を得ることが極めて難しく、ヒアルロン酸を細心の注意で再精製してヒアルロニダーゼや望ましくない消化生成物を除去しなければならない。
【０１０５】
図４に示されるように、ヒアルロナンシンターゼを遺伝子工学処理して、異なるサイズの、特に通常の野生型酵素より小さなヒアルロン酸ポリマーを生成させることができる。図は、一連のｓｐＨＡＳ酵素であって、それらのそれぞれが天然の酵素から単一アミノ酸変化を有するように位置指定突然変異誘発によって遺伝子工学処理したもののＨＡサイズの分布を示す（数百万ダルトン）。それぞれは、アラニンに置換した異なるシステイン残基を有する。白抜き記号を有する５本の曲線のクラスターは、下記のｓｐＨＡＳタンパク質：野生型、Ｃ１２４Ａ、Ｃ２６１Ａ、Ｃ３６６ＡおよびＣ４０２Ａを表している。黒塗り丸は、部分的にしか活性を持たない余り発現しなかったＣ２２５Ａタンパク質を表す。
【０１０６】
黒塗り三角形はＣ２８０Ａ ｓｐＨＡＳタンパク質を表し、通常の酵素または示されている他の変異体よりずっと小さな範囲のＨＡポリマーを合成することが見出されている。この実施の減少は、ヒアルロネートシンターゼ酵素を遺伝子工学処理を施して所望な範囲のＨＡ生成物サイズを合成することが可能なことを示している。本明細書に開示されたヒアルロネートシンターゼをコードするＨＡＳ遺伝子のいずれかを位置指定突然変異誘発によって処理して、所望な範囲のＨＡ生成物サイズを合成する酵素を生成することもできる。
【０１０７】
構造的に変更したヒアルロン酸は、所望なＨＡＳまたはｓｐＨＡＳの特定のアミノ酸を変化させることによるヒアルロン酸のサイズ分布の変更と概念的には異なるところがない。Ｎ−アセチル基が欠けているＵＤＰ−ＧｌｃＮであるかまたは別の化学的に有用な基に代わっているＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃが、特に有用であると予想される。強力な基質特異性は、保存されている２０%の中のアミノ酸の特定のサブセットに依存しているに違いない。コレラの残基の１個以上に対する特異的変化により、天然の酵素と比較して基質の１以上と余り特異的に相互作用しない機能的シンターゼが生成する。次に、この変更された酵素は、交替の天然または特別の糖ヌクレオチドを利用して、下記の(i)特定薬剤、タンパク質、または毒素を構造的に変更されたヒアルロン酸に共有カップリングして、一般的またはターゲッティングした薬剤送達、放射線学的手続きなどを行う、(ii)ヒアルロン酸自身または他の支持体に共有的に架橋して、一層強力な物性を有するゲルまたは他の三次元的生体材料を得る、および(iii)ヒアルロン酸を表面に共有結合させて生体適合性フィルムまたは単層を生成させる目的に様々な化学を用いることができるようにデザインされた糖誘導体を組込むことができた。
【０１０８】
細菌を遺伝子工学処理することによって、ヒアルロン酸を産生させることもできる。例えば、本発明者らは、糖ヌクレオチド前駆体の一つに対する遺伝子と同時にＨＡＳ遺伝子を含むB. subtilisの株を作製した。本発明者らは、この細菌はヒトで使用する生成物を産生する目的でバイオテクノロジー産業で頻繁に用いられているので、これを選択した。これらの細菌は、野生型の天然株を用いて現在入手し得るより多量にヒアルロン酸を産生することができる細菌の産生のための第一世代のプロトタイプとして用いようとするものであった。
【０１０９】
例えば、３株のBacillus subtilisをヒアルロナンシンターゼ （ｓｐＨＡＳ）およびＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ（ｈａｓＢ）についてのStreptococcus pyogenes遺伝子の一方または両方を含むように構築し、その結果を表IIIに示してある。 ＨＡを検出して定量するための高感度の市販放射能測定分析法に基づいて、両遺伝子を有する株（株番号３）はＨＡを産生して培地に分泌すると決定した。親株またはデヒドロゲナーゼ遺伝子のみを有する株（株番号１）はＨＡを産生しない。ｓｐＨＡＳ遺伝子のみを含む株番号２はＨＡを産生するが、株番号３の約１０%に過ぎない。アガロースゲル電気泳動は、株番号３によって培地に分泌されたＨＡは極めて高分子量であることを示した。
【０１１０】
表IIIのデーターは、B. subtills 168を遺伝子工学処理を行って、ｓｐＨＡＳ遺伝子およびｈａｓＢ遺伝子の組換えＤＮＡ技術による導入によってＨＡを産生して分泌することができることを表している。ＨＡは、後者の遺伝子が包含されなくともこの変更された株によって産生されるが、これを用いて産生したＨＡのレベルは非常に高められる。B. subtilis 168は、ＨＡ合成に必要な両糖ヌクレオチドのレベルを増加させる２種類の遺伝子（ｔａｕＤおよびｇｔａＢ）を含む。表IVは、B. subtilis 168がまた、ｈａｓＢ遺伝子の非存在下であっても、遺伝子工学処理を施してｓｅＨＡＳ並びに野生型とは異なるサイズのＨＡを産生するように遺伝子工学処理した特異的ｓｅＨＡＳ変異体を含み且つ（プラスミドｐＳＭ１４３，ＡＴＣＣ上で）発現するときに、ＨＡを産生することを表している。特に、変異体ｓｅＨＡＳ（Ｃ２２６Ａ）およびｓｅＨＡＳ（Ｃ２８１Ａ）は、B. subtilis 168生細胞でのＨＡ合成を支持した。コレラの後者の場合におけるＨＡ合成のレベルは、ＨＡ合成に必要な２種類の前駆体の内在性レベルが低いためｓｐＨＡＳおよびｈａｓＢ遺伝子を発現する細胞で見られるものより低かった。
【０１１１】
ｈａｓＢおよびｓｅＨＡＳ（Ｃ２２６Ａ）またはｓｅＨＡＳ（Ｃ２８１Ａ）変異体を含むプラスミドで形質転換したB. subtilis 168細胞から単離した膜を用いるイン・ビトロ実験は、これらの変更されたＨＡＳ酵素によって産生されたＨＡサイズ分布は、野生型ｓｅＨＡＳによって作製されたものよりそれぞれ大きいまたは小さいことを表していた。野生型ｓｅＨＡＳからB. subtilisで産生されたＨＡの近似的サイズは、１．５MDaである。
【０１１２】
ｓｐＨＡＳ遺伝子からの組換えＨＡの産生は、Bacillus licheniformisおよびEnterococcus faecalisでも明らかにされている。図６は、ＨＡについて染色したアガロースゲルのデジタルイメージである。ＨＡ産生は、ｓｐＨＡＳをコードするプラスミド（ｐＰＤ４１Δ５）を組込んだB. subtilis、B. 1icheniformisおよびE. faecalis株で見ることができる。ネガティブコントロールとして、非官能性ｈａｓＡ遺伝子を含むプラスミド（ｐＰＤ４１ΔＥｃｏＲＶ）をそれぞれの株に導入したが、これらの株はいずれもＨＡを産生することができなかった。
【０１１３】
【表３】
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【０１１４】
【表４】
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【０１１５】
これらの実験では、これらの遺伝子を用いてタンパク質発現を行うのに通常見られる連鎖球菌プロモーターを用いた。グラム陽性またはBacillus適合性プロモーターの制御下でｓｐＨＡＳまたはｓｅＨＡＳリーディングフレームを有する株の構築により更に一層優れた結果を生じることが予想される。用いたベクターは、B. subtilisで中程度のコピー数とエリトロマイシン耐性の遺伝子（B. subtilis中で８μg/mlまたはE. coli中で１７５μg/mlに対する耐性を可能とする）を有するグラム陽性／E. coliシャトルベクターである。用いたB. subtilis宿主株は、BGSC製の1A1であり、これはトリプトファン要求を有するがそれ以外は野生型であり、胞子形成をすることができる。細胞増殖とＨＡ産生は、Spizizens最小培地にトリプトファン、グルコース、微量元素、およびエリトロマイシン（８μg/ml）を加えたもので行った。増殖は、培地が消費されるまで（約３６時間）激しく攪拌しながら３２℃で行った。
【０１１６】
表IIIおよびIVは、通常はヒアルロン酸を産生しないこれらの生物工学処理した細胞が、それらをｓｐＨＡＳまたはｓｅＨＡＳ遺伝子で形質転換すると、ヒアルロン酸を産生する能力を有するようになったことを表している。本明細書に記載のＨＡＳ遺伝子のいずれか一つを非ヒアルロン酸産生細菌に導入して、ヒアルロン酸を産生することができる生物工学処理した細菌株を生じることもできる。
【０１１７】
ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ由来の本明細書に記載のＨＡＳ遺伝子の一つの発現については、ＨＡＳタンパク質の組換え調製のための発現系の調製に写ることができる。原核生物または真核生物系での発現のためのＤＮＡ切片の遺伝子工学処理は、組換え発現に熟練した者に一般に知られている技術によって行うことができる。
【０１１８】
ＨＡＳは真核生物系で良好に発現させることができるが、本発明者らは細菌発現系を総ての目的のためのＨＡＳの調製に用いることができることを断言する。細菌での発現は、究極的には、使用の容易さ、生産コスト、およびそれによって得られる材料の品質に関して真核生物での発現より遊離であると考えられる。
【０１１９】
連鎖球菌のヒアルロナンシンターゼ（ｓｅＨＡＳ）の精製を、表Ｖおよび図７に示す。精製工程図の様々な段階からの画分を１２．５%ゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した後、これをCoomassie Brilliant Blue R-250で染色した。レーン：分子量マーカー；１，組換えｓｅＨＡＳ−Ｈ６を含む全E. coli膜；２，膜の洗剤可溶化の後の不溶性画分；３，洗剤で可溶化した画分；４，Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィー樹脂からのフロー−スルー；５〜９，カラムの５回連続洗浄（それぞれ２カラム容量）；１０，単一バンドである純粋なＨＡシンターゼの溶出分。ｓｐＨＡＳの精製は、ｓｅＨＡＳについて示したもの(Tlapak-Simmons, 1999)と同じであった。
【０１２０】
【表５】
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【０１２１】
ＨＡＳをコードするＤＮＡセグメントによる宿主細胞の形質転換により、ＨＡＳを得るための好都合な手段が提供されることが提案されている。宿主細胞は、当然のことであるが、ゲノム転写体を処理してタンパク質への翻訳のための機能的ｍＲＮＡを生成するので、ｃＤＮＡ、ゲノム配列およびそれらの組合せが真核生物での発現に適することも提案されている。
【０１２２】
本発明のもう一つの態様は、配列番号：２、１０、１４、１６、１８または２０に記載のアミノ酸配列、または保存または半保存アミノ酸変化を有する機能的に同様なものを含むタンパク質をコードするベクターを含んでなる組換え宿主細胞の増殖を含んでなるタンパク質組成物の製造方法である。宿主細胞は、核酸発現およびタンパク質産生の後、このようにして生成したタンパク質の回収を可能にする条件下で増殖される。宿主細胞、核酸発現、タンパク質産生および回収を可能にする条件を包含するＨＡＳおよび究極的にはＨＡの産生は、本発明の開示内容および本明細書に記載の方法を考慮すれば、当業者には明らかになるであろう。
【０１２３】
ヒアルロン酸の発現に好ましい宿主は、S. equisimilis、およびStreptococcus種の他の適当な細菌のような原核生物である。しかしながら、ＨＡは、Bacillus、Enterococcus、またはEscherichia属の種の細菌などの組換えＨＡシンターゼを発現する異種宿主細胞によって合成することができることも知られている。本発明のＨＡシンターゼの発現に最も好ましい宿主は、Lactococcus種、Bacillus subtilisまたはE. coliなどの本発明のＨＡＳ遺伝子で形質転換した細菌である。
【０１２４】
本発明のＨＡの発現方法に用いられる最も好ましい宿主としては、Bacillus種が挙げられるが、これらの細胞は有効な工業用分泌体であるからであり、幾つかの種はＧＲＡＳ生物と呼ばれている。本発明の方法に利用できるBacillus細胞の例としては、Bacillus alkalophilus、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus brevis、Bacillus circulans、Bacillus clausii、Bacillus coagulans、Bacillus firnus、Bacillus lautus、Bacillus lentus、Bacillus licheniformis、Bacillus metaterium、Bacillus pumilus、Bacillus stearothermophilus、Bacillus subtilis、およびBacillus thuringienisisが挙げられるが、これらに限定されない。最も好ましい宿主は、Bacillus subtilisである。
【０１２５】
同様に、ほとんどあらゆる真核生物発現系をＨＡＳの発現に用いることができる考えられており、例えば、バキュロウイルス由来、グルタミン由来、ジヒドロホレートレダクターゼ由来の系、ＳＶ−４０由来、アデノウイルス由来、サイトメガロウイルス由来、酵母由来などの系を用いることができる。このやり方で発現を行うため、コード配列をプロモーターに隣接し且つこれの制御下に置く。当該技術分野では、コード配列をこのようなプロモーターの制御下に置くには、タンパク質の転写リーディングフレームの転写開始部位の５′末端を選択したプロモーターの約１〜約５０ヌクレオチド「下流」（すなわち、３′）に配置する、と理解されている。また、ｐＹＥＳ２のようなSaccharomyces cerevisiae発現ベクター系も、図８に示されるように、ＧＡＬプロモーターの制御下でＨＡＳを産生する。図８は、ｓｐＨＡＳまたはｘ１ＨＡＳ酵素がｐＹＥＳ２プラスミドを用いて組換え酵素で産生したことを示している。ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡおよびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを供給すると、これらのゲル濾過クロマトグラフィープロフィールで観察されるように（ＨＡピークは約１３ml〜約２５ml）、いずれの酵素も高分子量ＨＡを生成する。
【０１２６】
図８は、酵母膜で発現した組換えＨＡＳによって合成されたヒアルロン酸のゲル濾過分析を示している。(a)（元のＶａｌコドンをＭｅｔに代えた）ｓｐＨＡＳに相当する４１９アミノ酸残基のオープンリーディングフレームまたは(b)ｘ１ＨＡＳタンパク質をコードするＤＮＡ断片を、ｐＹＥＳ２酵母発現ベクター（Invitrogen製）中で標準的方法によってサブクローニングして、ｐＹＥＳ／ＨＡを産生した。この構築物を有する細胞由来の膜を、ガラスビーズと共に攪拌することによって調製した。ｐＹＥＳ／ＨＡから誘導された試料は実質的なＨＡシンターゼ活性を含み、「４２kDa」のＨＡＳタンパク質を特異抗体を用いるウェスタンブロット分析によって検出し、ベクターのみを有する細胞由来の膜は活性も免疫反応性バンドも持たなかった（図示せず）。膜（３１５μgタンパク質）を、最初にキャリヤーを持たないＵＤＰ−［１４Ｃ］ＧｌｃＵＡ（１μCi１４Ｃ）および９００μMの未標識ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃと共に５０mMＴｒｉｓ，pH７、２０mMＭｇＣｌ２、１mMＤＴＴ、および０．０５MＮａＣｌ（４５０μl反応容積）中で３０℃にて１．５分間インキュベーションした。このパルス標識期間の後、非放射能標識したＵＤＰ−ＧｌｃＵＡを最終濃度が９００μMまで加えた。試料（１００μl）を、１．５分（黒丸）および１５分（黒四角）のパルスの後および「チェース」後４５分（黒三角）に採取した。反応を、ＳＤＳを２%まで加え、９５℃で１分間加熱することによって停止した。試料を遠心分離によって不純物を取り除いた後、試料の半量を０．２MＮａＣｌ，５mMＴｒｉｓ，pH８で平衡にしたSepacryl S-500HRゲル濾過カラム（Pharmacia; １×５０cm）に注入した。
【０１２７】
カラムを０．５ml／分で溶出し、BioSafeIIカクテル（４．５ml，Research Products Intl.）を加えた後、画分（１ml）中の放射能を液体シンチレーション計数法によって定量した。ボイド容積および完全に包含された容積（totally included volumes）は、それぞれ１４mlおよび３５．５mlの溶出容積であった。ブルーデキストラン（平均２×１０６Da）のピークは、２５−２７mlで溶出した。真核生物の酵母細胞で発現した組換えＨＡＳは、イン・ビトロで高分子量のヒアルロン酸を生成する。
【０１２８】
真核生物発現を考察する場合には、典型的には、元のクローニングされたセグメントに含まれていないときには、ＨＡＳ遺伝子またはＤＮＡを含む転写単位に適当なポリアデニル化部位（例えば、５′−ＡＡＴＡＡＡ−３′）をＨＡＳ遺伝子またはＤＮＡを含む転写単位に組込もうとする。典型的には、ポリＡ付加部位は、転写停止前の位置ではタンパク質の停止部位の「下流」約３０〜２０００ヌクレオチドに配置される。
【０１２９】
通常用いられる真核生物宿主細胞の実質的にあらゆるものを、本発明に記載のＨＡＳの発現に関連して用いることができる。本発明のＨＡＳｃＤＮＡを発現するための好ましい細胞系の例としては、２９３、ＡｔＴ−２０、ＨｅｐＧ２、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、ＷＩ３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、ＲＩＮ、およびＭＤＣＫ細胞系など真核生物での発現に典型的に用いられる細胞系が挙げられる。これは、一般にＨＡＳ酵素をコードし且つこの酵素を発現することができる組換えＤＮＡセグメントを有する組換え宿主を提供し、クローニングしたＨＡＳ遺伝子またはｃＤＮＡの転写の余裕があり且つヒアルロン酸の産生に適した条件下にて培地中で組換え宿主を培養し、ＨＡＳ酵素または組換え宿主から分泌されたヒアルロン酸を分離して精製する工程を含む。
【０１３０】
一般に、クローニングしたＨＡＳ遺伝子またはｃＤＮＡの発現に適当な条件は、プロモーター、ベクターおよび用いられる宿主系によって変化する。例えば、Ｌａｃプロモーターを用いる場合には、イソプロピルチオガラクトシドのようなＬａｃ転写を刺激する材料を包含することによって転写を誘発させようとする。例えば、クローニングしたｓｅＨＡＳおよびｓｐＨＡＳ遺伝子は、図５に示されるように、ＨＡＳの精製のためのE. coli中でＨＩＳ６含有タンパク質として発現される。他のプロモーターを用いる場合には、様々な材料が転写を誘発しあるいはアップレギュレーションするのに必要なことがある。
【０１３１】
図５は、E. coliにおける組換えｓｅＨＡＳおよびｓｐＨＡＳの過剰発現を表している。膜タンパク質（レーン当たり５μg）を、還元条件下で１０%(w/v)ゲルを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画した。ゲルをクマシブルーR-250で染色し、写真撮影し、走査し、モレキュラーダイナミックスパーソナルデンシトメーター（PDSI P60型）を用いて定量した。ＨＡシンターゼの位置を、矢印で示す。レーンＡは天然のｓｐＨＡＳ（群Ａ）であり、レーンＣは天然のｓｅＨＡＳであり、レーンＥは組換えｓｅＨＡＳであり、レーンＰは組換えｓｐＨＡＳであり、レーンＶはベクターのみである。用いた標準品はBio-rad製低Mrであり、kDaで示した。
【０１３２】
シンターゼの発現を行う他に、好ましくは、糖ヌクレオチド前駆体の生合成に必要な酵素をコードする適当な遺伝子を包含することによって、またはＮ−アセチルグルコサミンまたはグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃまたはＧｌｃＮＨ２）のような前駆体供給酵素に対する基質およびグルコース（Ｇｌｃ）を含む増殖培地を用いることによって、ＨＡ合成に伝導性環境を提供しようとする。
【０１３３】
更に、酵素ヒアルロニダーゼを欠いている宿主に遺伝子を組込み、この酵素によって合成された生成物が培地中で分解されないようにしようとすることがある。更に、宿主は、ＨＡの産生が最適になるように選択される。例えば、適当な宿主は、ＨＡＳ酵素を支持するための糖ヌクレオチド前駆体を多量に産生し且つＨＡを多量に産生することができるものである。このような宿主は天然に見出すことができ、または突然変異誘発または組換えＤＮＡ技術など様々な手法によって作製することができる。糖ヌクレオチド合成酵素の遺伝子、特にＵＤＰ−ＧｌｃＵＡを産生するのに要するＵＤＰ−Ｇｌｃデヒドロゲナーゼを単離して、ＨＡＳ遺伝子またはｃＤＮＡと共にベクターに組込むこともできる。本発明の好ましい態様は、これらの補助的組換え遺伝子またはｃＤＮＡを含む宿主であって、これにより糖ヌクレオチド、従って、ＨＡの産生を増加することができるものである。
【０１３４】
宿主細胞の培養に用いる手段は、特に決定的であるとは思われない。有用な詳細については、米国特許第４，５１７，２９５号、第４，８０１，５３９号、第４，７８４，９９０号、または第４，７８０，４１４号明細書の開示を参照してもよく、上記開示内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている。S. equisimilisのような原核生物宿主を用いる場合には、ＣＯ２濃度を高めたブロス増殖培地中嫌気的条件下での細菌の醗酵を用いることができる。これにより、好気的条件下でより多量にＨＡを産生することができる。もう一つの考察は、嫌気的に増殖した連鎖球菌細胞は発熱性外毒素を産生しないことである。適当な増殖条件を、本発明に鑑みて当業者に知られているように、他の原核生物宿主について変更することができる。
【０１３５】
適当な宿主を構築し、ＨＡの産生に適する条件下で培養したならば、このようにして産生されたＨＡを分離する。典型的には、ＨＡは、組換え生物によって周りの培地に分泌されあるいは注がれ、既知の手法によって培地からＨＡを容易に単離することができる。例えば、ＨＡは、濾過、遠心分離および凝集の少なくとも一つによって細胞および断片から分離することができ、トリクロロ酢酸を加えることによってヒアルロン酸から細胞および断片の分離を一層容易にすることができる。次に、ＨＡを、沈澱、限外濾過および透析の少なくとも一つによって培地から分離する。沈澱剤としては、エタノールおよびイソプロパノールのようなアルコール、アセトンのような有機溶媒または化合物、または塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）または臭化セチルトリアンモニウム（ＣＴＢ）のような第四有機アンモニウム（脂肪族の正に帯電した）塩が挙げられる。
【０１３６】
ＨＡの単離に好ましい手法は、米国特許第４，５１７，２９５号明細書に記載されており、その内容は、その開示の一部として本明細書に引用されており、有機カルボン酸であるトリクロロ酢酸を醗酵の終了時に細菌懸濁液に加えるのである。トリクロロ酢酸により、細菌細胞が凝集して死滅し、これらの細胞および関連断片を所望な生成物であるＨＡから一層容易に分離することができる。不純物を除いた上清を濃縮して、透析し、有機酸を含む低分子量混入物を除去する。上記の手続きは、０．２２μm細孔径のフィルターを含むものなどのフィルターカセットによる濾過を用いている。透析濾過(diafiltration)を、溶液の伝導率が約０．５メガオームまで減少するまで継続する。
【０１３７】
濃縮したＨＡに過剰量の試薬級エタノールまたは他の有機溶媒を加えることによって沈澱させた後、沈澱したＨＡをエタノールで洗浄することによって乾燥させ、真空乾燥し、凍結乾燥してアルコールを除去する。次に、ＨＡをホウ酸緩衝液，pH８に再溶解させ、ＣＰＣ、または臭化トリメチルアンモニウム混合溶液であるＣＥＴＡＢのようなある種の他の有機アンモニウム塩で４℃で沈澱させることができる。沈澱したＨＡを、上記で参照した特許明細書に更に記載されている方法で、大ざっぱな濾過によって回収し、１MＮａＣｌに再懸濁し、透析濾過して、濃縮する。生成するＨＡをフィルター除菌し、所望な最終用途によって適当な塩、乾燥粉末または滅菌溶液に転換することができる。
【０１３８】
A. 用いることができる典型的な遺伝子工学処理法
膨大な細胞膜バリヤーのない細胞を宿主細胞として用いるときには、トランスフェクションは当業者に周知のリン酸カルシウム沈澱法によって行う。しかしながら、核注入、カチオン性脂質、電気穿孔、プロトプラスト融合、またはDuPontによって開発されたBIOLISTIC（商品名）生体粒子送達系によるなど他の方法を用いてＤＮＡを細胞に導入することもできる。DuPont系を用いることの利点は、形質転換効率が高いことである。原核生物細胞または実質的な細胞壁構造を含む細胞を用いるときには、トランスフェクションの好ましい方法は、コンピテンスまたは電気穿孔を誘発する目的で塩化カルシウムを用いるカルシウム処理である。
【０１３９】
所望なコード配列およびコントロール配列を含む適当なベクターの構築には、標準的連結手法を用いる。単離したプラスミドまたはＤＮＡ断片を、要求されたプラスミドを構築する上で所望な形態に開裂させ、調整し、再連結する。開裂は、適当な緩衝液中で（複数の）制限酵素で処理することによって行う。一般的には、約１μgのプラスミドまたはＤＮＡ断片を、緩衝液約２０枚履中で酵素約１単位と共に用いる。特定の制限酵素に適当な緩衝液および基質量は、製造業者によって指定されている。３７℃で約１時間のインキュベーション時間が、実行可能である。
【０１４０】
インキュベーションの後、タンパク質をフェノールとクロロホルムで抽出することによって除去し、核酸を水性画分からエタノールで沈澱することによって回収する。平滑末端が必要なときには、調製物をPolymerase I (Klenow)１０単位で１５℃で１５分間処理し、フェノール−クロロホルム抽出を行い、エタノールで沈澱させる。連結には、ほぼ等モル量の所望な成分であって、正確なマッチングを提供するように調整されたものを、０．５μgＤＮＡ当たりＴ４ＤＮＡリガーゼ約１０単位で処理する。開裂したベクターヲ成分として用いるときには、細菌性アルカリホスファターゼで前処理することによって開裂したベクターの再連結を防止することが有用であることがある。
【０１４１】
構築したプラスミドで機能的配列を確かめるための分析には、第一段階は、３０〜３２℃での形質転換により特異的にコンピテントなE. coli SURE細胞(Stratagene)へのクローニングによってプラスミドＤＮＡを増幅することであった。第二に、組換えプラスミドを用いて、ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ前駆体を産生することができるE. coli KS株Bi8337-41を形質転換し、良好な形質転換体を適宜抗生物質耐性によって選択する。次に、形質転換体のライブラリーからのプラスミドを、ＨＡ産生を示す細菌コロニーについてスクリーニングする。これらのコロニーを採取して、増幅し、プラスミドを精製して、制限マッピングによって分析する。次に、機能的ＨＡＳ遺伝子のプラスミドを示す兆候を、当業者によって知られている任意の数の配列分析手法によって更に特性決定する。
【０１４２】
B. 供給源および宿主細胞培養物およびベクター
一般に、原核生物を用いて、本発明に有用なベクターのＤＮＡ配列および構造の初期クローニングを行った。適当な供給源はグラム陽性細胞、特に群Ｃの連鎖球菌株から誘導されたものであると考えられている。単一膜であるが厚い細胞壁を有する細菌、例えば、StaphylococciおよびStreptococciは、グラム陽性菌である。E. coliのようなグラム陰性菌は、細胞を取り巻く膜以外に２個の異なる膜を含む。グラム陰性生物の細胞壁は、一層薄くなる蛍光がある。グラム陽性生物の単一膜は、グラム陰性菌の内部の血漿膜に類似している。
【０１４３】
一般に、宿主細胞と適合性の種から誘導される複製および制御配列の起点を含むプラスミドベクターを、これらの宿主に関して用いる。ベクターは、通常は複製の起点並びに形質転換した細胞で表現型の選択を提供することができるマーキング配列を有する。例えば、E. coliは、典型的にはE. coli種から誘導されたプラスミドであるｐＢＲ３２２を用いて形質転換される。ｐＢＲ３２２はアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性の遺伝子を含み、従って、形質転換細胞を同定するための簡単な手段を提供する。ｐＢＲプラスミドまたはｐＵＣプラスミド、または他の微生物プラスミドまたはファージも、微生物自身のタンパク質を発現するために微生物が用いることができるプロモーターを含み、または含むように改質しなければならない。このようなプロモーターは、宿主細胞と適合性である、すなわち宿主細胞のＲＮＡポリメラーゼで認識され、ＲＮＡポリメラーゼが、宿主適合性プロモーターが付着する遺伝子を転写するようになる限り、非相同プロモーター、すなわち別の生物由来のプロモーターでよい。
【０１４４】
極めて一般的には、組換えＤＮＡ構築に用いられるこれらのプロモーターとしては、ＬａｃＺプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７バクテリオファージプロモーター、およびトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系が挙げられる。これらは最も一般的に用いられるものであるが、他の微生物プロモーターが発見されて、利用されており、そのヌクレオチド配列に関する詳細は公表されており、熟練者であれば、それらをプラスミドベクターと機能的に連結させることができる。
【０１４５】
また、このプロモーターは、プロモーター活性を増加させた改質ＲＮＡポリメラーゼプロモーターであってもよい。プロモーターの改質は、突然変異、または２個以上のプロモーター要素がタンデムに付加したものであってもよい。２個以上のプロモーター要素をタンデムに提供するときには、２個以上のタンデムプロモーター要素は同一プロモーター要素であってもまたは２種類以上の異なるプロモーター要素であってもよい。本明細書で用いられる「タンデムプロモーター要素」という用語は、それぞれがコード配列に操作可能に連結して、プロモーター配列がコード配列のｍＲＮＡへの転写を媒介することによってここと配列によってコードされたポリペプチドの産生を指示するようにする２個以上ののプロモーター配列を意味するものと理解される。タンデムプロモーター並びにBacillus細胞での発現においてそれを使用するための構築物および方法は、それぞれ１９９９年９月２１日および２００１年７階３日にWidner et al.に発行された米国特許第５，９５５，３１０号および第６，２５５，０７６号明細書に詳細に記載されており、その内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている。
【０１４６】
また、本発明の組換えベクターが２個以上の核酸セグメントであって、それぞれがタンパク質をコードするコード領域を有するもの、例えば、酵素活性を有するヒアルロン酸シンターゼをコードするコード領域を有する核酸セグメント、および酵素活性を有するＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域を有する核酸セグメントを含むときには、核酸セグメントのそれぞれはプロモーターに操作可能に連結する。２個以上の核酸セグメントを同一プロモーターに連結させることができ、この単一プロモーターが両遺伝子の発現を引き起こすことができ、または２個以上の核酸セグメントを異なるプロモーターに連結することもできる。
【０１４７】
原核生物の他に、酵母培養物のような真核生物の微生物を用いることもできる。Saccharomyces cerevisiae、または一般のパン酵母は、真核微生物の中で最も一般的に用いられるものであるが、数多くの他の株も通常は利用可能である。Saccharomycesで発現するには、例えば、プラスミドＹＲｐ７が一般に用いられる。このプラスミドは既にｔｒｐ１遺伝子を含んでおり、例えば、ＡＴＣＣ第４４０７６号またはＰＥＰ４−１のようなトリプトファンなしで増殖する能力を欠いている酵母の突然変異株の選択マーカーを提供する。次に、酵母細胞ゲノムの特徴としてのｔｒｐ１損傷の存在により、トリプトファンの非存在下で増殖することにより形質転換を検出するための効果的な環境を提供する。酵母ベクターにおける適当な促進配列としては、ガラクトース利用遺伝子のプロモーターである３−ホスホグリセレートキナーゼ、またはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼのような他の糖分解酵素が挙げられる。
【０１４８】
適当な発現プラスミドの構築において、これらの遺伝子と結合した終結配列を発現することが所望な配列の３′の発現ベクターにも連結させ、ｍＲＮＡのポリアデニル化および終結を提供する。増殖条件によって制御される転写の追加の利点を有する他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、チトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連した分解酵素、および上記のグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、およびマルトースおよびガラクトース利用に関する酵素のプロモーター領域である。酵母適合性プロモーター、複製の起点および終結配列を含む任意のプラスミドベクターが適当である。
【０１４９】
微生物の他に、多細胞生物由来の細胞の培養物を宿主として用いることもできる。原則的には、脊椎動物または無脊椎動物の培養物由来の任意のこのような細胞培養物が利用可能である。しかしながら、脊椎動物細胞での興味が極めて大きくなっており、培養物中の脊椎動物細胞の増殖は近年における日常的手順になってきている。このような有用な宿主細胞系の例は、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系、およびＷＩ３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ、およびＭＤＣＫ細胞系である。
【０１５０】
哺乳類細胞での使用については、発現ベクターに対する制御機能はウイルス材料によって提供されることが多い。例えば、一般に用いられるプロモーターは、ポリオーマ、Adenovirus 2、ウシパピローマウイルス、および最も頻繁にはSimian Virus 40（ＳＶ４０）から誘導される。ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターが特に有用であり、いずれも複製のＳＶ４０ウイルス起点をも含む断片としてのウイルスから容易に得られるからである。複製のウイルス起点に配置されたＨｉｎｄＩＩＩ部位からＢｇＬＩ部位に伸びる約２５０bpの配列を含む場合には、小さめまたは大きめのＳＶ４０断片を用いることもできる。
【０１５１】
更に、制御配列が宿主細胞系と適合性である場合には、通常は所望な遺伝子配列と結合しているプロモーターまたは制御配列を用いることもでき、且つ所望な場合が多い。複製の起点は、ベクターを外来起点を含むように構築することによって提供することができ、例えば、ＳＶ４０または他のウイルス（例えば、ポリオーマ、アデノ、ＢＰＶ）供給源から誘導することができ、または宿主細胞の染色体複製機構によって提供することもできる。ベクターが宿主細胞染色体に連結されているときには、後者の機構で十分なことが多い。
【０１５２】
C. 群ＣのStreptococcus equisimilisの高度にカプセル化した株からのbona fide HAシンターゼの単離
ｓｅＨＡＳと呼ばれるコードしたタンパク質は４１７アミノ酸（計算分子量４７，７７８およびpI９．１）であり、これまでに同定されたＨＡＳファミリーの中で最も小さなものである（図２）。ｓｅＨＡＳはまた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて変則的速やかに移動する（Mr 約４２kDa）（図５および９）。
【０１５３】
図９は、特異抗体を用いる組換えｓｅＨＡＳのウェスタンブロット分析をグラフに表したものである。組換えｓｅＨＡＳ（Ｅ；レーン２、７および９）またはｓｐＨＡＳ（Ｐ；レーン３、６、８および１０）を含む群Ｃ（Ｃ；レーン１）または群Ａ（Ａ；レーン４）の連鎖球菌膜、およびE. coli膜を還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画化し、ニトロセルロースにエレクトロトランスファーした。ニトロセルロースのストリップを、下記のｓｐＨＡＳの領域：中央ドメインペプチドＥ１４７−Ｔ１６１（レーン１〜４）；Ｃ末端ペプチド（レーン５〜６）；完全なタンパク質（レーン７および８）；組換え中央ドメイン（レーン９および１０）に対して生じた精製したＩｇＧ画分を用いる応用に記載されている方法でプローブし、展開した。非免疫ＩｇＧまたはベクターのみで形質転換した細胞由来の膜は、レーン５のように染色は生じなかった。
【０１５４】
ｓｅＨＡＳおよびｓｐＨＡＳタンパク質コード配列（それぞれ、配列番号：１および１３）は、７２%同一である。ｓｅＨＡＳの推定タンパク質配列は、合成ペプチド抗体との反応性によって確かめた（図９）。E. coliで発現した組換えｓｅＨＡＳを膜において主タンパク質として回収し（図５）、イン・ビトロでＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃおよびＵＤＰ−ＧｌｃＵＡの存在下にて極めて高分子量のＨＡを合成した（図１０）。
【０１５５】
図１０は、ｓｅＨＡＳおよびｓｐＨＡＳによって産生したＨＡサイズ分布の動力学的分析を示す。等量のｓｅＨＡＳまたはｓｐＨＡＳを含むE. coli膜を、応用に記載されているように、１．３５mMＵＤＰ−［１４Ｃ］ＧｌｃＵＡ（１．３×１０３dpm/nM）および３．０mMＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃと共に３７℃でインキュベーションした。これらの基質濃度は、それぞれのＫｍ値の１５倍を上回るものである。０．５、１．０および６０分後に採取した試料をＳＤＳで処理し、Sephacryl S400 HR上でクロマトグラフィー処理を行った。カラムの分画範囲におけるＨＡプロフィール（画分１２〜２４）を、それぞれの画分における総ＨＡの百分率に規格化する。最上部のパネルの矢印の上部の値は、Dawnマルチアングルレーザー光散乱装置（Wyatt Technology Corp.）を用いる別の実験で直接測定したＨＡのＭＷ（百万）である。０．５分（○、●）、１．０分（□、黒四角）および６０分後（△、▲）にｓｅＨＡＳ（●、黒四角、▲）およびｓｐＨＡＳ（○、□、△）によって合成されたＨＡのサイズ分布は、記載のように示される。分析は、ｓｅＨＡＳおよびｓｐＨＡＳは、それらが合成するＨＡ差のサイズ分布において本質的に同一であることを示していた（図１０）。ｓｅＨＡＳは、ＨＡを産生する能力がｓｐＨＡＳの２倍である。
【０１５６】
C.1 細菌株およびベクター
ムコイド群Ｃの株D181 (Streptococcus equisimilis)は、Rockefeller University Collectionから得た。E. coli宿主株のSureおよびXL1-Blue MRF'はStratagene製であり、株Top10 F'はInvitrogen製であった。特に断らない限り、連鎖球菌はＴＨＹで増殖させ、E. coli株はＬＢ培地で増殖させた。ｐＫＫ−２２３発現ベクターはPharmacia製であり、PCR 2.1クローニングベクターはInvitrogen製であり、予備消化したλZap Express TM Bam HI/CIAP VectorはStratagene製であった。
【０１５７】
（当業者には知られている）Caparon and Scottの方法によって単離されたStreptococcus equisimilis由来の高分子質量のゲノムＤＮＡをＳａｕ３Ａ１で部分消化して、平均サイズを２〜１２kbとした。消化したＤＮＡをエタノールで沈澱させ、洗浄して、Bam HI/CIAPλZap Expressベクターに連結した。連結したＤＮＡを、Promegaから得たPackagene（商品名）抽出物でファージに包装した。包装ファージライブラリーの力価を、XL1-Blue MRF' E. coliを宿主として用いてチェックした。
【０１５８】
C.3 縮重ＰＣＲ増幅
縮重(degenerate)オリゴヌクレオチドを、ｓｐＨＡＳ（Streptococcus pyogenes）、ＤＧ４２（Xenopus laevis HAS; 19）、およびｎｏｄＣ（Rhizobium meliloti根粒形成因子; 20）中の保存配列に基づいてデザインし、D181ゲノムＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲ増幅を行った。増幅条件は、９４℃で１分、４４℃で１分、７２℃で１．５分での３４サイクルの後、７２℃で１０分間の最終伸長であった。オリゴヌクレオチドHADRF1. 5'-GAY MGA YRT YTX ACX AAT TAY GCT ATH GAY TTR GG-3'（センス鎖）は、配列D259RCLTNYAIDL（ｓｐＨＡＳ）に相当する。オリゴヌクレオチドHACTR1, 5'-ACG WGT WCC CCA NTC XGY ATT TTT NAD XGT RCA-3'（アンチセンス鎖）は、領域C404TIKNTEWGTR（ｓｐＨＡＳ）に相当する。幾つかの位置における塩基の縮重度を、表ＶＩに示す縮重塩基についてのコードにおいてＩＵＰＡＣによって採用された命名法によって表している。
【０１５９】
【表６】
2005514059.tif 000007
【０１６０】
これらの２個のオリゴヌクレオチドは４５９bpのＰＣＲ生成物を生じ、これをアガロースゲル上で分離し、BIO-101 Genecleanキットを用いて精製した。次に、この断片を、TOP 10 F'細胞を宿主として用いて、製造業者の指示に従ってPCR2.1ベクターにクローニングした。二本鎖のプラスミドＤＮＡを、QIAfilter Plasmid Midi Kit (Qiagen)を用いてE. coli (Top 10 F')から精製した。２個の他の縮重センスプライマーであるHAVAF1, 5'-GTN GCT GCT GTW RTX CCW WSX TWT AAY GAR GA-3'（ｓｐＨＡＳの領域V66AAVIPSYNEに相当する）、およびHAVDF1, 5'-GTX RWT GAY GGN WSX WSN RAX GAT GAX GC-3'（ｓｐＨＡＳのV100DDGSSNTDに基づく）も合成した。２個のユニークなアンチセンスプライマーを４５９bpＰＣＲ生成物の配列に基づいて合成した。これらは、D181.2, 5'-GAA GGA CTT GTT CCA GCG GT-3'およびD181.4, 5'-TGA ATG TTC CGA CAC AGG GC-3'であった。２本の縮重したセンスプライマーのそれぞれは、D181.2またはD181.4と共に用いてD181ゲノムＤＮＡを増幅したときには、予想されたサイズのＰＣＲ生成物を得た。４個のＰＣＲ生成物を、上記と同じ方法を用いてクローニングして、配列決定した。それぞれのＰＣＲ生成物について、６個の異なるクローンから得た配列を比較して、コンセンサス配列を誘導した。このようにして、ｓｐＨＡＳと相同性の高い連続ｏＲＦを有する１０４２bpの配列を得た。
【０１６１】
C. ライブラリーのスクリーニング
２個の分子プローブである、クローニングした４５９bpのＰＣＲ生成物およびオリゴヌクレオチドD181.5 (5'-gcttgataggtcaccagtgtcacg-3'; １０４２bpの配列から誘導)を用いて、ライブラリーをスクリーニングした。４５９bpのＰＣＲ生成物を、Prome-It 11ランダムプライマー標識キット（Stratagene）を用いて、製造業者の指示に従って放射能標識した。オリゴヌクレオチドを、［γ３２Ｐ］ＡＴＰを用いてKnace-It Kinasing Kit (Stratagene)によって標識した。放射能標識生成物を、NucTrap Push カラム(Stratagene)上で非標識材料から分離した。オリゴプローブは、サザンブロット分析でD181ゲノム消化物と特異的にハイブリダイズした。λファージライブラリーをスクリーニングするため、XLBLUE MRF'を吸着したファージを含むニトロセルロース膜上で宿主（３０００プラーク／プレート）として用いて、６０℃で予備ハイブリダイズし、QuikHyb Hybridization溶液（Stratagene）中で指示に従って８０℃で５′末端を標識したオリゴヌクレオチドD181.5とハイブリダイズした。
【０１６２】
次に、膜を２×ＳＳＣ緩衝液および０．１%(w/v)ＳＤＳで室温にて１５分間、６０℃で０．１×ＳＳＣ緩衝液および０．１%(w/v)ＳＤＳで３０分間洗浄して、乾燥した後、−７０℃でBio-Max MSフィルムに一晩露出した。陽性のプラークを再培養し、２回再スクリーニングした。純粋な陽性ファージを、クロロホルムでＳＭ緩衝液に採った。ベクタープライマーを用いるこれらのファージでのＰＣＲにより、３種類の異なるインサートサイズが明らかになった。
【０１６３】
ベクタープライマーとクローニングした１０４２bpの配列の異なる領域からのプライマーとの組合せを用いるＰＣＲにより、３種類の異なるファージの１個のみが完全なＨＡＳ遺伝子を有することが明らかになった。このファージでのインサートサイズは６．５kbであった。選択したファージライブラリークローンからの自動切除によりこのインサートをプラスミド形態にサブクローニングする試みは、失敗した。従って、ＰＣＲ法を純粋な陽性ファージＤＮＡに再度適用して、ｏＲＦの５′および３′末端を得た。オリゴヌクレオチドプライマーD181.3 (5'-GCCCTGTGTCGGAACATTCA-3')およびT3 (ベクタープライマー)は３kbの生成物を増幅し、オリゴヌクレオチドD181.5およびT7 (ベクタープライマー)は２．５kbの生成物を増幅した。ＯＲＦの５′および３′末端配列は、これら２個の上記生成物を配列決定することによって得た。総てのＰＣＲ生成物の配列を分析することによって、１２５４bpのｓｅＨＡＳ遺伝子のＯＲＦを再構築することができた。
【０１６４】
C.5 ｓｅＨＡＳの発現クローニング
プライマーを、ｓｅＨＡＳの出発および停止コドン領域において、センスオリゴヌクレオチド（5'-AGGATCCGAATTCATGAGAACATTAAAAAACCTC-3'）にＥｃｏＲ１制限部位およびアンチセンスオリゴヌクレオチド（5'-AGAATTCTGCAGTTATAATAATTTTTTACGTGT-3'）にＰｓｔ１部位を含むようにデザインした。これらのプライマーは、D181ゲノムＤＮＡ由来並びに純粋なハイブリダイゼーション陽性ファージ由来の１．２kbＰＣＲ生成物を増幅した。１．２kb生成物をアガロースゲル電気泳動によって精製し、Ｐｓｔ１およびＥｃｏＲ１で消化し、Ｐｓｔ１およびＥｃｏＲ１で消化したｐＫＫ２２３ベクターに指向的クローニングした。連結したベクターをE. coli SURE細胞に形質転換し、次にこれを３０℃で増殖した。この段階は、他の宿主細胞またはより高温はクローニングしたインサートの欠失を生じるので、実際的に重要である。コロニーを単離し、それらのｐＤＮＡを精製した。６個のコロニー（ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆと命名した）の中、５個は正確なサイズインサートを有したが、１個はインサートを持たなかった。
【０１６５】
C.6 ＨＡシンターゼ活性
ＨＡシンターゼ活性を、５個の上記インサートから調整した膜で分析した。新鮮な対数相の細胞を３０００gで回収し、４℃でＰＢＳで洗浄し、膜を当業者に知られているプロトプラスト法の変法によって単離した。Streptococcus pyogenesおよびStreptococcus equisimilisからの膜調製物も、異なるプロトプラスト処理手順の変法によって得た。膜を、２０mMＭｇＣｌ２、１mMＤＴＥ、１２０μMＵＤＰ−ＧｌｃＵＡおよび３００μMＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを含む５０mMリン酸ナトリウムおよびカリウム, pH７．０中で３７℃でインキュベーションした。糖の組込みは、ＵＤＰ−［１４Ｃ］ＧｌｃＵＡ（３１８mCi/mM; ＩＣＮ）および／またはＵＤＰ−［３Ｈ］ＧｌｃＮＡｃ（２９．２Ci/mMＮＥＮ）を用いることによって観察した。反応を、ＳＤＳを２%(w/v)の最終濃度まで添加することによって停止した。生成物ＨＡを降下式ペーパークロマトグラフィーによって前駆体から分離し、原点における組込まれた放射能を測定することによって測定した。
【０１６６】
C.7 ゲル濾過分析
組換えｓｅＨＡＳまたはｓｐＨＡＳを含む膜によってイン・ビトロで産生される放射能標識したＨＡを、Sephacryl S500 HR (Pharmacia Biotech Inc.)のカラム上でクロマトグラフィーによって分析した。試料（２００mMＮａＣｌ、５mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ，pH８．０、および０．５%ＳＤＳ中０．４ml）を２００mMＮａＣｌ、５mMＴｒｉｓ−ＨＣｌおよびpH８．０で溶出し、０．５ml画分を１４Ｃおよび／または３Ｈ放射能について評価した。ＨＡ多糖類が真正のものであることを、Streptococcus hyaluroliticus (EC 4.2.2.1)のＨＡ特異的ヒアルロネートリアーゼで別個な同一試料を３７℃で３時間処理することによって評価した。次に、消化物に、ゲル濾過を行った。
【０１６７】
C.8 ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、Laemmliの方法に準じて行った。ニトロセルロースへのエレクトロトランスファーは、２０%メタノールを含む標準的ブロッティング緩衝液中で、Bio-Rad mini Transblot装置を用いて行った。ブロットを、ＴＢＳ中２%ＢＳＡでブロックした。タンパク質Ａ／Ｇアルカリホスファターゼ接合体(Pierce)およびｐ−ニトロブルーテトラゾリウム／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートｐ−トルイジン塩を用いて検出した。
【０１６８】
C.9 ＤＮＡ配列および分析
プラスミドを、蛍光標識したベクタープライマーを用いて両鎖について配列決定した。シークエンシング反応は、蛍光標識したプライマー（７−デアザＧを有する）についてThermosequenase（商品名）キットを用いて行った。試料をPharmacia ALF Express DNA Sequencer上で電気泳動を行い、データーをALF Manager Software v3.02によって分析した。インサートの内部領域を、ABI Prism 377 (Software v2.1.1)を用いる内部プライマーで配列決定した。曖昧な領域は、Sequenase（商品名）７−デアザ−ＤＮＡポリメラーゼ、７−デアザＧＴＰマスターミックス（USB）および［α−３５Ｓ］ｄＡＴＰ(Amersham Life Sciences)を用いて手で配列決定した。得られた配列を、DNASIS, v2.1 (Hitachi Software Engineering Co., Ltd.)を用いて編集して、分析した。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、Genbankおよび他のデーターベースの配列と比較した。
【０１６９】
C.10 ｓｅＨＡＳの同定
ｓｅＨＡＳの同定は、ｓｐＨＡＳ、ＤＧ４２（実験用に調整されたX. laevisＨＡＳであることが知られており、ｘｌＨＡＳと呼ばれる）、およびＮＯｄＣ（Rhizobiumβ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ）の中の高同一性の幾つかの領域に基づくオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲ法を用いて行った。ｘｌＨＡＳおよびＮＯｄＣタンパク質は、ｓｐＨＡＳとそれぞれ約５０%および約１０%の同一性を有する。この方法により、ｓｐＨＡＳに対する同一性が６６．４%である４５９bpＰＣＲ生成物を生じ、群Ａ（ｓｐＨＡＳ）ＨＡシンターゼ遺伝子の群Ｃの相同体（ｓｅＨＡＳ）が同定されたことを示していた。次に、この遺伝子の完全コード領域を、同様なＰＣＲに基づく方法を用いて再構築した。ＰＣＲプライマーの最終的組を用いて、ゲノムＤＮＡからの完全なＯＲＦを増幅した。この１．２kbのＰＣＲ断片を発現ベクターｐＫＫ２２３に組込み、E. coli SURE細胞で形質転換したところ、ＨＡ合成活性が試験した５個のコロニーの５個から単離した膜で認められた。
【０１７０】
再構築した遺伝子のＯＲＦは、データーベースにはなかった４１７アミノ酸の新規な予想されたタンパク質をコードし、これはｓｐＨＡＳより２アミノ酸短い。２種類の細菌タンパク質は７２%同一であり、核酸配列は７０%同一である。ｓｅＨＡＳの予想分子量は４７，７７８であり、予想等電点はpH９．１である。マウスおよびヒトアイソザイムのような最近同定された方法にＨＡＳ（それぞれｍＨＡＳ１，２，３およびｈＨＡＳ１，２，３、図２）は、最近タンパク質に類似している。２群の間の相対的同一性は約２８〜３１%であり、またｓｅＨＡＳの多くのアミノ酸は真核生物ＨＡＳのアミノ酸で高度に保存されている（例えば、Ｋ／ＲまたはＤ／Ｅ置換）。Ａ９８ＲであるＰＢＣＹ−１ＨＡＳは哺乳類ＨＡＳに２８〜３３%同一であり、脂質膜で同様なトポロジーを有することが予想される。哺乳動物種では、同じ科のものはほぼ完全に同一である（例えば、ｍｕＨＡＳ１およびｈｕＨＡＳ１は９５%同一であり、ｍｕＨＡＳ２およびｈｕＨＡＳ２は９８%同一である）。しかしながら、図３に示されるように、同一種内であっても、異なるＨＡＳ科のものは一層異なる（例えば、ｍｕＨＡＳ１およびｍｕＨＡＳ２は５３%同一であり、ｍｕＨＡＳ１およびｍｕＨＡＳ３は５７%同一であり、ｍｕＨＡＳ２およびｍｕＨＡＳ３は７１%同一である）。
【０１７１】
図１１は、ｓｅＨＡＳに対するヒドロパシープロットと予想膜トポロジーを示す。連鎖球菌の群ＣのＨＡＳに対する親水性プロットは、DNASISを用いるKyte and Doolittleの方法によって生成した。タンパク質は、完全な膜タンパク質であると予想される。
【０１７２】
図１２は、膜におけるｓｅＨＡＳのトポロジー構成のモデルを示す。タンパク質についての提案されたトポロジーはチャージ−インルール(charge-in rule)に従い、大きな中央ドメインを内側に置く。このドメインは、ほとんどの基質結合と酵素の触媒機能を含むと思われる。総てのＨＡＳファミリーのもので保存されるｓｅＨＡＳにおけるＣｙｓ２２６、並びに３個のシステインは、中央ドメインに示される。Ｃｙｓ２８１は、この変更が酵素によって合成されるＨＡ生成物のサイズ分布を劇的に変化させる可能性がある非常に重要な残基である。
【０１７３】
ｓｅＨＡＳについて予想される全般的膜トポロジーは、ｓｐＨＡＳおよびこれまでに報告された真核生物のＨＡＳについてのものと同一である。タンパク質は、アミノ末端における２個の推定的膜貫通ドメインと、カルボキシル末端における２〜３個の膜関連または膜貫通ドメインを有する。２種類の連鎖球菌酵素についてのヒドロパシープロットは実質的に同一であり、ｓｅＨＡＳにおけるＫ３１３〜Ｒ４０６（ｓｐＨＡＳではＫ３１３〜Ｋ４０５）の約９０残基の極端に疎水性の領域のトポロジーを予測することが困難なことを示している。
【０１７４】
ｓｅＨＡＳは、E. coli細胞で効率的に発現した。総膜タンパク質の約１０%は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの染色によって評価したところ、ｓｅＨＡＳであった（図５）。４２kDの顕著なｓｅＨＡＳバンドは、ベクターのみのコントロールレーンでは定量的に紛失している。膜タンパク質についてのこの異常に高レベルの発現は、SURE細胞で同じベクターを用いるｓｐＨＡＳについても見られる。膜タンパク質の約８%は、E. coli SURE細胞ではｓｐＨＡＳである。対照的に、群Ｃの膜におけるｓｅＨＡＳの量は、総膜タンパク質のせいぜい１%である。群Ａの膜におけるｓｐＨＡＳは、ほとんど検出されない。E. coli SURE細胞で発現した組換えｓｅＨＡＳは、必要な基質の一つであるＵＤＰ−ＧｌｃＵＡを欠いているので、イン・ビボではＨＡを合成しない。しかしながら、組換えｓｅＨＡＳタンパク質を含む膜は、基質ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃおよびＵＤＰ−ＧｌｃＵＡと共に供給すると、ＨＡを合成する。
【０１７５】
図１３は、組換えｓｅＨＡＳによる真正のＨＡの合成を示す。組換えｓｅＨＡＳまたはベクターのみを含む細胞から調製したE. coli膜（６９μg）を、本明細書に記載されているように最終容積が２００μl中で７００μMＵＤＰ−［３Ｈ］ＧｌｃＮＡｃ（２．７８×１０３dpm/nM; □, 黒四角)および３００μMＵＤＰ−［１４Ｃ］ＧｌｃＵＡ（３．８３×１０３dpm/nM; ○，●）と共に３７℃で１時間インキュベーションした。酵素反応を、ＥＤＴＡを２５mMの最終濃度まで添加することによって停止した。反応混合物の半量を、Streptomycesヒアルロニダーゼで３７℃で３時間処理した。ＳＤＳ（２%, w/v）をヒアルロニダーゼで処理した試料（○，□）および未処理試料（●，黒四角）に加え、９０℃で１分間加熱した。試料をカラム緩衝液（５mMＴｒｉｓ，０．２MＮａＣｌ，pH８．０）で５００μlまで希釈し、遠心分離によって透明にし、２００μlをSephacryl S-500 HRカラムに注入した。画分（１ml）を集め、放射能を測定した。ＢＤは、ブルーデキストラン（約２×１０６DA; Pharmacia）のピーク溶出位置である。Ｖ０は排除体積を示し、Ｖｉは包含された容積を表す。カラム上で分画されたＨＡの総量に組込まれた［１４Ｃ］ＧｌｃＵＡ：［３Ｈ］ＧｌｃＮＡｃの比は１．４であり、２種類の基質の特異活性の比と同一である。従って、生成物に組込まれた等のモル比は、真正のＨＡについて予測された通り１：１である。ベクターのみで形質転換した細胞からの膜は、ＨＡを合成しなかった。
【０１７６】
１２０μMのＵＤＰ−ＧｌｃＵＡおよび３００μMのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを用いると、ＨＡ合成は、膜タンパク質（≦０．２μg）とは少なくとも１時間線状であった。また、非形質転換細胞またはベクターのみで形質転換した細胞から調製した膜では、ＨＡＳ活性が検出されなかった。ＨＡ合成は、Ｍｇ＋２がＥＤＴＡとキレートしているか（コントロールの＜５%）、または２種類の基質のいずれかを省くと（コントロール約２%）、無視し得る程度である。組換えｓｅＨＡＳはまた、糖ヌクレオチド基質に対して予想された特異性を示し、ＵＤＰ−ＧａｌＡ、ＵＤＰ−ＧｌｃまたはＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを２種類の通常の基質のいずれかと共重合させることはできなかった（表II）。
【０１７７】
ゲル濾過分析に基づけば、ｓｅＨＡＳによって合成したＨＡの平均質量は５〜１０×１０６Daである。組換えｓｅＨＡＳの生成物は、両糖の等モル組込みおよび特異的Streptomycesヒアルロニダーゼによる分解に対するその感受性に基づいて真正のＨＡと判定される（図１３）。総ＨＡ合成の条件は（一方の基質の約９０%は生成物に組込まれたので）最適ではなかったが、この酵素は広汎な分布のＨＡ鎖長を産生した。ピーク画分は、約３６，０００のモノマー性糖を含むポリマーである７．５×１０６DaのＨＡ質量に相当する。このカラム上で分割されたＨＡサイズの分布は、２〜２０×１０６Daの範囲であった。
【０１７８】
ｓｅＨＡＳの推定タンパク質配列は、ｓｐＨＡＳタンパク質に対する抗体の群Ｃのタンパク質と交差反応する能力によって確認された（図９）。全ｓｐＨＡＳまたはｓｐＨＡＳの調度中央ドメインに対するポリクローナル抗体も、ｓｅＨＡＳタンパク質と反応した。ｓｐＨＡＳのＣ末端に対する抗ペプチド抗体は、ｓｅＨＡＳタンパク質におけるこの幾分異なる領域と交差反応しなかった。しかしながら、ｓｐＨＡＳ配列Ｅ１４７〜Ｔ１６１に対して指定した抗ペプチド抗体は、ｓｅＨＡＳにおける同じ予想配列を認識した。この抗ペプチド抗体は、連鎖球菌膜の天然のｓｅＨＡＳおよびｓｐＨＡＳとも反応し、両種からの天然および組換え酵素は同一サイズのものであることが確かめられる。ｓｐＨＡＳタンパク質と同様に、ｓｅＨＡＳはＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で異常に速く移動する。計算質量は４７，７７８Daであるにも拘わらず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるMrは一貫して約４２kDaである。
【０１７９】
中央ドメイン領域内での配列同一性および２種類の最近酵素について予測された全般的に同一構造であるので、領域Ｅ１４７〜Ｔ１６１に対するペプチド特異抗体を用いて、２種類のことなる酵素についての遺伝子で形質転換した細胞から調製した膜でのＨＡＳタンパク質発現を規格化することができる。この方法を用いて、本質的に同一量の組換えｓｐＨＡＳまたはｓｅＨＡＳを有する膜を、ＨＡ合成の諸規則度およびＨＡ生成物サイズの分布に関して比較した。
【０１８０】
ｓｐＨＡＳについて示されるように、ｓｅＨＡＳによるＨＡ鎖の合成は発展的である。この酵素は、最終生成物として放出されるまで増殖するＨＡ鎖と結合したままであると思われる。従って、ＨＡ鎖合成の最初のラウンド中に初期に産生したＨＡ鎖のサイズ分布を観察することによってｓｅＨＡＳおよびｓｐＨＡＳによるＨＡ伸長の速度を比較することができる。様々な時点でのＨＡ生成物のサイズのゲル濾過分析に基づいて、ｓｅＨＡＳによる平均速度伸長が３７℃で約９，０００単糖類／分であると推定した。５分間では、酵素は５〜１０×１０６DaのＨＡ鎖を重合することができる。従って、６０分間のインキュベーションでは、それぞれの酵素分子は５〜８のこのような大きなＨＡ分子のオーダーで潜在的に開始し、完結し、放出することができた。初期（例えば、≦１分）では、最初のＨＡ鎖の伸長を反映して、ｓｅＨＡＳによって産生したＨＡのサイズ分布はｓｐＨＡＳと比較してより大きな種に移動した。６０分までに、ＨＡ生成物サイズの２種類の分布は、見分けがつかなくなる。
【０１８１】
クローニングしたｓｅＨＡＳは、真正の群ＣのＨＡシンターゼを表す。従って、以前に報告されたまたは開示された「群Ｃ」のタンパク質は、真の群ＣのＨＡＳではない。ｓｅＨＡＳは、細菌、脊椎動物およびウイルスに由来するこの速やかに増殖するＨＡシンターゼファミリーを含んでなる現在知られているＨＡシンターゼの９個と相同である。この相同性を、具体的に図２に示す。哺乳類では、ＨＡＳ１、ＨＡＳ２およびＨＡＳ３と呼ばれる３個の遺伝子が同定されて、ヒトおよびマウスの３種類の異なる染色体に対してマッピングされている。両生類では、これまでに同定された唯一のＨＡＳタンパク質は実験用に調節されたＤＧ４２であり、これは１，９８８年にクローニングされ、酵母膜の組換えタンパク質の分析によってＨＡシンターゼ活性をコードすることが最近になって示された。恐らくは、他のX. laevisＨＡＳ遺伝子が間もなく同定されるであろう。
【０１８２】
分岐した進化モデルは、原始的な細菌ＨＡＳ前駆体が脊椎動物の発生の際に初期に奪われてしまった可能性があり、または原始的細菌が原始的ＨＡＳを取り込むときＨＡカプセルのを作製する細菌病原体法が発達したことを示唆している。細菌および真核生物ＨＡＳ酵素の通常の構造溶液への収束性進化は起こりそうもないが、起こる可能性はある。
【０１８３】
少なくとも１０個の同定したＨＡＳタンパク質は、同様なトポロジーを有する膜タンパク質であることが予想されている。ＨＡ合成は血漿膜で起こり、ＨＡは培地に注がれまたは細胞に結合したままであり、細菌カプセルまたは真核生物の細胞周辺コートを形成する。細胞質における糖ヌクレオチド基質を利用して、膜を通って外部空間に突出しているＨＡ鎖を組み立てる。
【０１８４】
ＨＡＳタンパク質の疎水性の高いカルボキシル部分におけるタンパク質トポロジーは、増殖するＨＡ鎖が同時に膜を通って突き出るので、酵素がこれを延ばす方法を理解する上で極めて重要であると思われる。例えば、前例のない酵素活性には、タンパク質の脂質二重層との異常で複雑な相互作用を必要とすることがある。ｓｐＨＡＳ−アルカリホスファターゼ融合タンパク質の分析に基づく予備的結果は、アミノおよびカルボキシル末端および大きなセントラルドメインが図１１および１２に示されるように総て細胞内にあることを示している。ｓｅＨＡＳタンパク質は、２個の基質結合部位とＨＡシンターゼに必要な２個のグリコシルトランスフェラーゼ活性とを含むと思われる大きなセントラルドメイン（総タンパク質の約６３%）も含む。最新のソフトウェアプログラムは、長いＣ末端の疎水性伸長内の膜結合ドメインの数または性状を確実に予測することはできないが、提案されたトポロジー配置は現在の証拠と一致しており、真核生物の酵素にも適用され、主として２個の追加的な予測された膜貫通ドメインを有するタンパク質のＣ末端の伸長により約４０%長い。
【０１８５】
ｓｐＨＡＳにおける６個のＣｙｓ残基の４個は、ｓｅＨＡＳで保存される。ｓｐＨＡＳのＣｙｓ２２５とｓｅＨＡＳのＣｙｓ２２４のみが、ＨＡＳファミリーの総てにおいて保存される。ｐ−メルキュロベンゾエートまたはＮＥＭのようなスルフヒドリル反応性化合物はＨＡＳ活性を著しく阻害するので、この保存されたＣｙｓは酵素活性に必要または重要であると思われる。しかしながら、位置指定突然変異誘発の検討からの初期の結果は、ｓｐＨＡＳのＣ２２５Ｓ突然変異体は不活性であり、野生型の活性の５〜１０%を保持することを示している。
【０１８６】
特異的オリゴヌクレオチドを用いるｓｅＨＡＳのみ、ｓｐＨＡＳのみ、またはｓｅＨＡＳとｓｐＨＡＳの両方をコードする核酸配列の認識は、図１４に示されている。センス−アンチセンスオリゴヌクレオチドの３個の対を、配列番号：１とｓｐＨＡＳのコード配列に基づいてデザインした。ｓｅＨＡＳをベースとした核酸セグメント（それぞれ、ｓｅ１〜ｓｅ２およびｓｅｓｐ１〜ｓｅｓｐ２，配列番号：３〜６）を、図１５に示す。これらの３個のオリゴヌクレオチド対を、典型的なＰＣＲ反応条件下で群Ｃ（ｓｅＨＡＳ）（レーン２、４および６）または群Ａ（ｓｐＨＡＳ）（レーン３、５および７）の連鎖球菌由来のゲノムＤＮＡとハイブリダイゼーションした。レーン１および８は、ＭＷ標準の位置をkb（キロベース）で示す。ＰＣＲ反応は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Promega製）を用いて、ＤＮＡ変性を行うため９４℃で１分間、ハイブリダイゼーションを行うための４８℃（小さめの普通のｓｅｓｐプライマーについては、４２℃）で１分間、およびＤＮＡ合成のため７２℃で１．５分間のように２５サイクル行った。次に、ＰＣＲ反応混合物を、１%アガロースゲル上で電気泳動によって分離した。
【０１８７】
ｓｅ１〜ｓｅ２プライマーを、群ＣのＨＡＳ（ｓｅＨＡＳ）に唯一特異的であるようにデザインした。ｓｐ１〜ｓｐ２プライマー対は、群ＡのＨＡＳ（ｓｐＨＡＳ）に唯一特異的であるようにデザインした。ｓｅｓｐ１〜ｓｅｓｐ２プライマー対は、群Ａおよび群ＣのＨＡＳ核酸配列のいずれにもハイブリダイズするようにデザインした。３種類のプライマー対は総て予想通りの挙動を示し、交差ハイブリダイズし、特異的および／またはユニークであるＰＣＲ生成物の生成を支持する適当な能力を示した。
【０１８８】
特異的ＰＣＲまたはハイブリダイゼーションに用いるオリゴヌクレオチドを、図１５に示す。配列番号：1の相当する領域を、配列番号：３、４、５および６の合成オリゴヌクレオチドのそれぞれについて示す。４個のオリゴヌクレオチドのそれぞれはｓｅＨＡＳ配列と特異的にハイブリダイズし、センス／アンチセンスプライマーの適当な対は、図１４に示されるポリメラーゼ連鎖反応に用いるのに適している。
【０１８９】
Bacillus subtilisにおけるｓｅＨＡＳの発現
図１６Ａおよび１６Ｂは、ゲル濾過クロマトグラフィーによって明らかにされるように、Bacillus subtilis株であるB. subtilis 168におけるｓｅＨＡＳから組換えＨＡの産生を示す。図１６Ａは、ｓｅＨＡＳを含むｐＳＭ１４３で形質転換したBacillus subtilis 168に対して、ｐＳＭ１４３のみで形質転換したBacillus subtilis 168でのＨＡの産生を比較したプロットである。ＨＡの産生は、約１３．５分から約１６分の間のピークによって視認することができる。図１６Ｂは、このピークを拡大して、ＨＡに組込まれなかった放射能標識したタンパク質および糖によって生じる大きなピークであって、図１６Ａで約１６．５分から約２０分までの間に見られるものを省いたものである。
【０１９０】
Bacillus subtilisにおけるｓｐＨＡＳによる組換えＨＡ産生のゲル濾過分析
図１７Ａは、Bacillus subtilisにおけるｓｐＨＡＳによって産生した組換えＨＡのサイズ分布の栄養制御を示している。ｓｐＨＡＳ酵素をコードするBacillus subtilis 168（ｐＰＤ４１Δ５）をLuria Bertaniブロス（ＬＢ）で培養し、ＨＡを産生したが、これはSpizzizens培地（Ｓｐ）で培養した同じ株（約１４．４３分がピーク）より早い時点（１３．４８分がピーク）でゲル濾過カラムから溶出した。これら２種類の培養物を平行して増殖させたが、大きなＨＡはＬＢで増殖した細菌によって産生される。トリチウム化したＨＡの放射能を、崩壊／秒（DPS）によって定量する。このネガティブコントロールは、通常は、B. subtilisはＨＡを産生しないことを示している。ｓｐＨＡＳで形質転換したB. subtilisによって作製されたＨＡピークは、特異的ＨＡリアーゼに感受性であるが、プロテアーゼには感受性でない。
【０１９１】
従って、宿主細胞を増殖する培地を変化させることによって、組換え宿主細胞で産生されるＨＡの分子量を変化させることができる。例えば、ＬＢ（Luria-Bertani）、Terrific Broth、ＮＺＣＹＭ、ＳＯＢ、ＳＯＣまたは２ｘＹＴ培地のような複合培地で組換え宿主細胞を増殖させることによって、Spizzizens培地またはＭ９最小培地のような化学的に定義された培地で増殖した組換え宿主細胞によって産生したＨＡと比較して一層大きな分子量のＨＡ分子が産生する。ＨＡのサイズを、グルコースのような供給される炭素供給源によって変化させることもできる。
【０１９２】
図１７Ｂは、ｓｐＨＡＳを含むBacillus subtilis 168およびベクターのみを含むBacillus subtilisを用いるとき、ピーク外観に生じる差を示している。
【０１９３】
Bacillus subtilisに３Ｈグルコサミンをイン・ビボ標識した後に得られた培地試料を、ゲル濾過分析によって分析した。この方法を用いることによって、細菌によって産生されるヒアルロン酸（ＨＡ）の相対的サイズおよび量を決定することができる。総ての試料を１６，０００×gで５分間遠心分離することによって不純物を除いた後、ゲル濾過を行った。放射性成分は、LB508 Radioflow Detector (EG & G Berthold)およびZinsserカクテル(1.8 ml/分)を用いて検出した。
【０１９４】
ＨＡポリマーのサイズを、Waters 600E装置上で、Phenomenex Po]ySep-GFC-P 5000または6000カラム（３００×７．８mm）上で０．２M硝酸ナトリウムで０．６ml/分で溶出することによって分析した。カラムを、様々なサイズのデキストラン（５８０、１４５、５０および２０kDa）またはＭＡＬＬＳによる６００および８０kDaの平均分子量を有するＭＡＮＴを標識したＨＡ（DeAngelis, 2001）で標準化した。ＭＡＬＬＳについては、ＨＡポリマー（１００μg）を最初に２本のタンデムToso Biosep TSK-GELカラム（6000PWXLの後に4000PWXL; それぞれ７．８mm×３０cm; 日本）に装填して、５０mMリン酸ナトリウム、１５０mMＮａＣｌ, pH７で０．５ml/分で溶出した。溶離液は、Optilab DSP干渉型屈折計中を流れ、次に多角モードのDawn DSFレーザー光度計（６３２．８nm; Wyatt Technology,サンタ・バーバラ,カリフォルニア）を流れた。製造業者のソフトウェアパッケージを用いて、ｄｎ／ｄＣ係数０．１５３を用いて絶対平均分子量を決定した。
【０１９５】
ＨＡ標準品は、連鎖球菌ＨＡ多糖類上のヒドロキシル基を無水Ｎ−メチルイサト酸で半化学量論的標識（１ＭＡＮＴ／約５０単糖類）によって作製した。６００kDa標準品を、調製用ＨＰＬＣを用いるバルク状ＨＡのサブ分画化によって得た。マイクロチップ（出力設定４）を備えたHeat Systems-Ultrasonic W-380超音波処理装置を用いるバルクＨＡの長時間の超音波処理（２分間隔で全部で３０分間、１%アセトン／水、氷上）を用いて、８０kDaの標準品を製造した。
【０１９６】
P. multocidaＨＡＳの非相同発現
ｐＰｍ７ＡインサートのＰｍＨＡＳＯＲＦを、Ｔａｑポリメラーゼ(Fisher)と推定アミノおよびカルボキシル末端附近の配列に相当するプライマー（コドンは大文字：センス、5'-gcgaattcaaaggacagaaaATGAAcACATTATCACAAG-3'およびアンチセンス、5'-gggaattctgcagttaTAGAGTTATACTATTAATAATGAAC-3'; 出発および停止コドンはそれぞれ太字）を用いて１３サイクルのＰＣＲによって増幅した。コドン２（T-Q）を変更し（斜体小文字）E. coliでのタンパク質産生を増加させた。プライマーはＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩ制限部位（下線部）も含み、発現プラスミドｐＫＫ２２３−３（ｔａｃプロモーター; Pharmacia）へのクローニングを促進した。生成する組換え構築体ｐＰｍＨＡＳをE. coli SURE細胞(Stratagene)に形質転換し、この株をイン・ビトロＨＡＳアッセイのための膜調製物の供給源として用いた。対数期培養物（ＬＢブロス，３０℃）を０．５mMイソプロピルチオガラクトシドで３時間誘導した後、回収した。プラスミドをE. coli KSにも形質転換し、生成する株を光学顕微鏡法および浮遊密度遠心分離法によってカプセルの存在について検討した。K5細菌培養物は、ＩＰＴＧの添加がＬＢまたは画定培地でのＨＡ濃度を有意に増加させなかったので、日常的には誘導されなかった。K5細菌は、ＨＡ合成の際にｐｍＨＡＳと相互作用する多糖類輸送タンパク質および機構を有し、これらのタンパク質が細胞からのＨＡ輸送を促進するので、有用な外来宿主である。
【０１９７】
ベクターｐＫＫ２２３−３のみを有する細胞からの試料ではなくｐＰｍＨＡＳプラスミドを含むE. coli SURE細胞由来の膜は、ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡおよびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを両方とも供給したところ（それぞれ、２５対*１．５pMＧｌｃＵＡ導入［タンパク質mg数］−１［時］−１）、イン・ビトロでＨＡを合成した。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを省きまたは二価金属イオンをＥＤＴＡとキレートさせると、［１４Ｃ］ＧｌｃＡの組込みは観察されなかった。組換えＨＡＳ由来のＨＡＳ活性は、Ｍｎ２＋はＭｇ２＋ より少なくとも１０倍活性を刺激したので、野生型P. multocida 膜から得た酵素に類似していた。
【０１９８】
組換えE. coliの培養物を、標識したＨＡ結合タンパク質を用いる放射能測定法でＨＡ多糖類の存在についても試験した。ｐＰｍＨＡＳを有するE. coli K5は、A600当たり４６０μg/mlのＨＡを産生した。K5細胞 with
ｐＫＫ２２３−３ベクターのみを有するK5細胞は、ＨＡを産生しなかった（* A600当たり０．０１μg/mlＨＡ）。比較のため、同じ培地で増殖させた野生型のP. multocida P-1059は、A600当たり１，１００μg/mlＨＡを産生した。ｐＰｍＨＡＳを有するE. coli K5は、ＨＡを高レベルで産生し、細胞がカプセル化された（図１８Ａ）。組換え株のカプセルの半径は約０．２−０．５μmであった（細菌細胞の幅を０．５μmと仮定）。このカプセルを、ヒツジ精巣ヒアルロニダーゼまたはStreptomycesＨＡリアーゼを用いる処理によって除去することができた（図１８Ｂ）。天然のK5宿主株もｐＫＫ２２３−３ベクターを含む形質転換体も、光学顕微鏡法によって測定したところ、容易に観察可能なカプセルを持たなかった。ｐＰｍＨＡＳを有するK5細胞も、浮遊密度遠心分離によってカプセル化されると思われた。組換え細胞は５８%Percollクッションの最上部に浮遊し、ベクター制御細胞またはヒアルロニダーゼで処理した組換え細胞は、Percollクッション中でペレット化した（図示せず）。
【０１９９】
カプセル生合成の際の輸送体におけるグリコシルトランスフェラーゼの役割
グリコシルトランスフェラーゼは反復ＧＡＧ主鎖の形成を触媒するが、場合によっては、これらの同一ポリペプチドが細胞膜を通ってポリマーを輸送する役割を果たすこともある。グラム陽性菌の群ＡおよびＣの連鎖球菌は１個のみの脂質膜を有し、カプセルオペロンがシンターゼ、およびＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ産生用の２種類の酵素ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼおよびＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ（約４キロ塩基のＤＮＡ; Crater and van de Rijn, 1995）。レポーター酵素を含む一連の連鎖球菌ｓｐＨＡＳ融合タンパク質のトポロジー分析では、このシンターゼが二重層の少なくとも４倍にわたり、膜と緊密に結合していることを示している(Heldermon et al. 2001)（図１９）。生化学および生物物理学的分析から、ｓｐＨＡＳまたはｓｅＨＡＳポリペプチドのモノマーと約１６個の脂質分子から構成される複合体は、両ＵＤＰ−糖の発生期のＨＡ鎖への導入を触媒すると思われる(Tlapak-Simmons et al. 1998)。小さな完全な膜ポリペプチドであるｓｐＨＡＳまたはｓｅＨＡＳは、タンパク質/脂質細孔を生成することにより二重層の疎水性コアを通る増殖するＨＡポリマー鎖の輸送を促進するには、脂質の補助を必要とすると思われる。
【０２００】
一方、ＧＡＧ生合成が可能なグラム陰性菌であるEscherichia coliおよびPasteurella multocidaは２個の脂質膜を有し、そのカプセル座がグリコシルトランスフェラーゼおよびＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ形成酵素（約１０−１８キロ塩基；Roberts, 1996; Townsend et al. 2001)の他に、多くの輸送体結合タンパク質をコードする。多くの詳細は十分には理解されていないが、最も詳細に研究されたモデルであるE. coli群IIのカプセル系では、発生期のポリマー鎖の輸送体は少なくとも７個の別個なポリペプチド種を必要とすると思われる(Whitfield and Roberts, 1999; Silver et al. 2001)。簡単には、ＫｐｓＣ、Ｍ、Ｓ、Ｔを含む複合体が内膜上に集まり、ＫｆｉＡ、Ｂ、Ｃ触媒複合体と相互作用する。ＫｐｓＭおよびＴは、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）輸送体を形成する。ペリプラズムタンパク質ＫｐｓＤおよびもう一つの内膜タンパク質の二量体ＫｐｓＥは、ペリプラズムを横切るポリマーの輸送を補助する(Arrecubieta, 2001)。外膜のポーリン複合体を補充して、細胞からの増殖する多糖類鎖を輸送する。
【０２０１】
ある種のＫｐｓ突然変異体は多糖類鎖を重合するが、不完全トランスロケーションを有しており、細胞質またはペリプラズムにポリマーが蓄積する。P. multocidaも、その推定輸送タンパク質のE. coliタンパク質との配列類似性および遺伝子配置に基づく群II様輸送系を有すると考えられる。
【０２０２】
ｐｍＨＡＳおよびｐｍＣＳの場合には、カルボキシル末端の尾が輸送機構と相互作用するドッキングセグメントを有すると思われる(Jing and DeAngelis, 2000)（図１９）。上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている。
【０２０３】
Streptococcus uberisＨＡＳ
図２１は、S. uberisk の４個の別々のムコイドコロニーからのＨＡＳ遺伝子のＰＣＲ増幅を表している。それぞれの試料について、バンドは約１．２５kbの予想サイズで明らかであり、ＰＣＲ増幅によって加えられたｓｕＨＡＳと制限部位の完全なリーディングフレームに相当する。
【０２０４】
図２２は、S. pyogenes、S. equisimilisおよびS. uberis由来のＨＡシンターゼ活性を表している。
【０２０５】
他の同定したＨＡＳ配列
本明細書に開示され且つ図２の配列に示されたＨＡＳ配列の他に、本発明のBacillus種でのＨＡの産生方法に用いることができる他のＨＡＳ配列が同定されている。例えば、配列番号：１５および１６は、それぞれ古細菌であるSulfolobus solfactaricusについてのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を開示している。エクストレモファイル(extremophile)からこのＨＡシンターゼの単離により、高温、すなわち約７５℃で機能できることにより本明細書に記載されたＨＡシンターゼより良好な安定性および一層速い反応速度を有するＨＡＳが提供される。
【０２０６】
連鎖球菌ｈａｓＡＢＣオペロンに類似の遺伝子の群は、Bacillus anthracisプラスミドｐＸＯ１で同定されており、これは炭疽菌毒素遺伝子を含む。しかしながら、ｐＸＯ１における遺伝子の順序はＡ、Ｃ、Ｂである。ｐＸＯ１プラスミドに対する完全配列は、受入番号ＡＦ０６５４０４を有し、ｈａｓＡに類似の配列はこの配列のＯＲＦ９３であり、１１１３７４で出発し、１１２４７４で停止する。配列番号：１７および１８は、それぞれB. anthracisのｐＸＯ１で同定されたｈａｓＡに類似の遺伝子のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を表す。B. anthracisには多糖類カプセルは報告されておらず、従って、これらの遺伝子を同定したグループのOkinaka et al.は、ｐＸＯ１ＯＲＦ９３、９４および９５は消失してしまわなければならない非機能的遺伝子の例であると考えている(J. Bacteriol. 181:6509 (1999))。
【０２０７】
第三の推定的ＨＡＳは、褐藻類Ectocarpus siliculosusに感染するウイルスで同定されている。アミノ酸およびヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号：１９および２０に見出すことができる。この例は、ＰＢＣＶ−１ウイルスのｃｖＨＡＳに類似していると思われる。
【０２０８】
任意の推定的ＨＡシンターゼについてＨＡシンターゼ活性（天然または組換え体）を示す一つの方法は、細菌を液体培地で増殖させ、多糖類画分を抽出し（すなわち、カチオン性洗剤による沈澱／高塩抽出／アルコール沈澱／水に再溶解／溶媒抽出／アルコール沈澱）、酸加水分解の後に単糖類の組成の分析を伴う。他の分析としては、完全なポリマーおよび酵素処理した試料（ＨＡリアーゼ、コンドロイチナーゼなど）のアガロースゲル電気泳動が挙げられる。また、ＥＬＩＳＡまたは競合フォーマットで特異的ＨＡ結合タンパク質を用いる生物学的分析法も有用である。酵素について試験するには、膜を細胞から調製し、各種のＵＤＰ−糖基質を提供した後、ポリマーへの組込みを分析した後、クロマトグラフィーおよび／または電気泳動を行う。プライマーと発現ベクターへＯＲＦをクローニングすることができるゲノムＤＮＡを有するＰＣＲを用いて遺伝子カセットを調製することによって、非相同発現が観察される。様々な宿主をこのようなベクターで形質転換することができ、生成する組換え細胞を本明細書に記載した多糖類および／または酵素について分析することができる。
【０２０９】
従って、本発明によれば、酵素活性を有するＨＡＳをコードするコード領域を導入した精製した核酸セグメントを有する組換え宿主細胞、並びにこの組換え宿主細胞からヒアルロン酸を製造する方法であって、上記の目的および利点を完全に満足するものが提供されることは明らかである。本発明を特定の態様について記載してきたが、多くの変更、改質および変形は当業者に明らかになることは、明白である。従って、本発明は、特許請求の範囲の精神および広汎な範囲内にある総ての変更、改質および変形を包含するものと考えられる。
【０２１０】
本願明細書（例および特許請求の範囲を含む）に記載の総ての数値および量の測定値は、近似的なものである。
【０２１１】
本明細書に例示的に開示または主張した本発明は、具体的には本明細書に開示または主張されていないあらゆる要素の非存在下で良好に実施することができる。従って、本発明は、本明細書に開示または主張した要素を含んでなり、からなり、またはから本質的になることができる。
【０２１２】
下記の特許請求の範囲は、この出願明細書と矛盾しない最も広汎な可能な範囲に権利が付与される。特許請求の範囲は、好ましい態様または例に示されている態様に必ずしも限定されるものではない。
【０２１３】
【配列表】
2005514059.tif 000008
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【図面の簡単な説明】
【０２１４】
【図１】ｓｅＨＡＳとｓｐＨＡＳ遺伝子の間で交差ハイブリダイゼーションが起こらないことを示す。レーン１および２のみで用いる群Ａのプローブは群ＡのＤＮＡとハイブリダイズし（レーン２）、レーン３および４のみで用いる群Ｃのプローブはレーン３とハイブリダイズする。
【図２】ｓｅＨＡＳの細菌性、ウイルスおよび真核生物ＨＡＳタンパク質への関連性を象徴的に表したもの。
【図３】既知のヒアルロナンシンターゼの幾つかでの可能な進化の関連性および類似性を象徴的に表したもの。
【図４】様々な遺伝子工学処理を施した連鎖球菌ＨＡＳ酵素によって産生されるＨＡサイズ分布。
【図５】E. coliにおける組換えｓｅＨＡＳおよびｓｐＨＡＳの過剰発現。
【図６】Bacillus subtilisおよびBacillus licheniformisにおける組換えＨＡの産生。
【図７】連鎖球菌ＨＡシンターゼの精製。
【図８】酵母膜で発現した組換え連鎖球菌のＨＡＳによって合成されるＨＡのゲル濾過分析。
【図９】特異抗体を用いる組換えｓｅＨＡＳのウェスタンブロット分析。
【図１０】組換えｓｅＨＡＳおよびｓｐＨＡＳによって産生されるＨＡサイズ分布の動力学的分析。
【図１１】ｓｅＨＡＳおよび予想膜結合領域についてのヒドロパシープロット。
【図１２】膜におけるｓｅＨＡＳのトポロジー構成を図に表したもの。
【図１３】組換えｓｅＨＡＳによる真正のＨＡの合成。
【図１４】特異的オリゴヌクレオチドとＰＣＲを用いるｓｅＨＡＳをコードする、ｓｐＨＡＳをコードする、またはｓｅＨＡＳとｓｐＨＡＳを両方ともコードする核酸配列の認識。
【図１５】特異的ＰＣＲハイブリダイゼーションに用いるオリゴヌクレオチド。
【図１６】図１６ＡはBacillus subtilis 168（ｐＳＭ１４３ベクターのみ）とBacillus subtilis 168（ｓｅＨＡＳを含むｐＳＭ１４３）によるＨＡ産生を比較することによる生Bacillus subtilisでの組換えＨＡ産生を表すプロット。図１６Ｂは図１６Ａのプロットの一断面の拡大。
【図１７Ａ】生Bacillus subtilisにおけるｓｐＨＡＳによって産生される組換えＨＡのサイズ分布の栄養制御を表すプロット。
【図１７Ｂ】ベクターのみを含むBacillus subtilisと比較した生Bacillus subtilis 168での組換えＨＡ産生を表すプロット。
【図１８】図１８Ａおよび図１８Ｂは組換えE. coliの顕微鏡写真。図１８Ａにおいて、インドインク染色（１，０００倍）により、ｐＰｍＨＡＳを有するE. coli KS細胞は細胞の周囲に白色ハローとして現れる実質的なカプセルを産生することが示される。図１８Ｂにおいて、StreptomycesＨＡリアーゼで簡単に処理することによりE. coli K5（ｐＰｍＨＡＳ）細胞からカプセル材料を除去することができる。ｐｍＨＡＳは、ＨＡ多糖類の重合を指示する。
【図１９】グラム陽性菌およびグラム陰性菌におけるＧＡＧ生合成の図解モデル。
【図２０】Streptococcus uberis由来のＨＡＳ遺伝子のＰＣＲ増幅を示すアガロースゲル。
【図２１】Streptococcus pyogenes、Streptococcus equisimilis、およびStreptococcus uberis由来のＨＡシンターゼ活性。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年1月10日(2003.1.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願についてのクロス・リファレンス
本出願は、米国特許出願第６０／０６４，４３５号明細書（１９９７年１０月３１日に出願され、「グループＣヒアルロナンシンターゼ遺伝子およびその使用」という名称）の合衆国法典第３５巻１１９(ｅ）条による利益を主張する米国特許出願第９／１７８，８５１号明細書（１９９８年２６日に出願され、「ヒアルロネートシンターゼ遺伝子およびその使用」という名称）の米国継続出願である米国特許出願第０９／４６９，２００号明細書（１９９９年１２月２１日に出願され、「ヒアルロネートシンターゼ遺伝子およびその使用」という名称）の米国一部継続出願である。
【０００２】
本出願は、(1) 米国特許出願第６０／２９７，７８８号明細書（２００１年６月１３日に出願され、「ヒアルロナンシンターゼ遺伝子およびBACILLUS SUBTILISでの発現方法」という名称）、および(2) 米国特許出願第６０／２９７，７４４号明細書（２００１年６月１３日に出願され、「ヒアルロナンシンターゼ遺伝子およびこの発現方法」という名称）に対して、特許協力条約による優先権および合衆国法典第３５巻１１９(ｅ）条による利益を主張する。米国特許出願第９／４６９，２００号、第０９／１７８，８５１号、第６０／６４，４３５号、第６０／２９７，７８８号および第６０／２９７，７４４号明細書の内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている。
【０００３】
合衆国助成研究または開発に関する説明
合衆国政府は、国立衛生研究所の承認番号ＧＭ３５９７８による本発明に一定の権利を有する。
【０００４】
発明の背景
１．発明の分野
本発明は、酵素活性を有するヒアルロネートシンターゼ（ＨＡＳ）をコードするコード領域を有する核酸セグメント、およびこの核酸セグメントのヒアルロネートシンターゼおよびそのヒアルロン酸生成物を産生する組換え細胞の調製における使用に関する。ヒアルロネートは、ヒアルロン酸またはヒアルロナンとしても知られている。
【０００５】
２．関連技術の簡単な説明
連鎖球菌感染症の発生は、世界的な、特に発展途上国における主要な健康および経済的問題である。この一つの理由は、連鎖球菌が体内の食細胞、すなわちマクロファージおよび多形核細胞（ＰＭＮ）によって感知されることなく増殖することができることによるものである。これらの細胞は、異種微生物の認識および包込みに関与している。細菌が監視の網をくぐり抜ける一つの効果的な方法は、ヒアルロン酸（ＨＡ）カプセルのような多糖カプセルでそれ自身をコーティングすることによる。ＨＡの構造は、原核生物および真核生物のいずれでも同じである。
【０００６】
ＨＡは一般的には非免疫原性であるので、カプセル封入した細菌は免疫応答を誘発せず、従って破壊の標的とはならない。更に、カプセルはイン・ビトロではＰＭＮに対して食細胞作用を発揮し、連鎖球菌のマクロファージへの付着を防止する。正にこのことにより、群Ａおよび群Ｃの連鎖球菌では、ＨＡカプセルは天然および実験的感染症における主要な毒性因子である。群Ａの連鎖球菌は、咽頭炎、膿痂疹、深部組織感染症、リウマチ熱、および毒性ショック様症候群などの多数のヒト疾患に関与している。群ＣのStreptococcus equisimilisは、骨髄炎、咽頭炎、脳膿瘍、および肺炎に関与している。
【０００７】
構造的には、ＨＡは、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）とグルクロン酸（ＧｌｃＵＡ）からなる反復二糖単位の高分子量の線状多糖類である。ＨＡ分子における反復二糖類の数は３０，０００を上回る可能性があり、Mr＞１０７である。ＨＡは、哺乳類および細菌細胞、特に群ＡおよびＣの連鎖球菌およびＡ型のPasteurella multocidaによって合成される唯一のグリコサミノグリカンである。これらの株が培地に分泌されるＨＡ並びにＨＡカプセルを作製する。これらの細菌がＨＡを合成する機構は、ＨＡカプセルの産生が連鎖球菌が免疫系による監視をくぐり抜けるために用いる効率的且つ賢明な方法であるので、医薬として極めて興味深いものである。更に、ＨＡでコーティングした有機または無機分子は、宿主の免疫系による検出および破壊を免れることができる特性を有している。
【０００８】
ＨＡは、哺乳類および細菌細胞によって、血漿膜に局在化していた酵素ヒアルロネートシンターゼによって合成される。これらの生物におけるＨＡの合成は、多段階工程であると思われる。開始には、開始前駆体ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃまたはＵＤＰ−ＧｌｃＵＡの結合を伴う。この後に、生長するオリゴ糖鎖への２種類の糖の交互付加を伴う伸長が続く。生長するポリマーは、細胞の血漿膜領域から細胞外空間に突出する。ＨＡ生合成系は検討が行われた第一の膜ヘテロ多糖類合成経路の一つであるが、ＨＡ合成の機構は未だ十分には理解されていない。これは、これまでに開発されたイン・ビトロ系は、ＨＡのデ・ノボ生合成が完成されていないという点において不適当であるからと思われる。
【０００９】
ＨＡポリマー生長の方向は、当業者の間で未だ一致を見ていない問題である。単糖類は、生長するＨＡ鎖の還元または非還元末端へ付加することができた。更に、(i) 発生期の鎖がタンパク質、ＵＤＰまたは脂質中間体に共有結合するかどうか、(ii) 連鎖がプライマーを用いて開始するかどうか、および(iii) 成熟ポリマーが連鎖球菌の血漿膜から突出する機構に関して、疑問が残っている。ＨＡ生合成の機構を理解することによって、工程を妨害することによる連鎖球菌およびパスツレラ感染症を制御するための代替方法を開発することができる。
【００１０】
ＨＡは脊椎動物の実質的に総ての組織で同定されており、特に且つ適切には関節内マトリックス栄養補給物として、様々な臨床用途や眼の手術で広く用いられてきている。科学文献には、ＨＡが主として少数の結合組織のマトリックスおよび細菌のある種の株における受動的構造成分であるという本来の概念からこの遍在する高分子が多くの生物学的過程に動的に関与しているという認識への変遷、すなわち胚形成の際の細胞移動および分化の調節から転移、創傷治癒および炎症の複雑な工程における重要な役割に対する細胞外マトリックス構成および代謝の調節への変遷も示されている。更に、ＨＡは代謝活性が高く且つ細胞はその合成および異化の工程に多くの注目を集めていることが明らかになってきている。例えば、組織でのＨＡの半減期は、軟骨での１〜３週間から表皮での＜１日までの範囲にわたっている。ＨＡは、多数の技術的用途（例えば、滑沢化合物）、化粧品およびニュートラスューティカル(neutraceuticals)にも用いられる。
【００１１】
単一のタンパク質が両糖基質を利用してＨＡを合成すること、すなわち、ＨＡシンターゼは二重触媒特性を有する単一酵素であることが明らかになっている。ＨＡシンターゼに対する略号ＨＡＳは、このクラスの酵素を表すのに広い支持を得ている。Markovitz et al.は、Streptococcus pyogenes由来のＨＡＳ活性の特性決定に成功し、これらの酵素が膜に局在化しており且つ糖ヌクレオチド前駆体およびＭｇ２＋についてのその要件を見出した。Prehmは、Ｂ６細胞によって作製された伸長性ＨＡは培地に添加されたヒアルロニダーゼによって消化されることを見出し、ＨＡＳは血漿膜に存在することを提案した。Philipson and Schwartzも、ＨＡＳ活性がマウス乏突起神経膠腫細胞の血漿膜とコフラクショネートする(cofractionated)ことを示した。
【００１２】
ＨＡＳは、グリコサミノグリカン合成が進行するのと同時に膜を通って細胞外空間に押出される（または細菌の場合には細胞カプセルを作製する）高MrＨＡを組み立てる。核酸、タンパク質、および脂質は核、小胞体／ゴルジ体、細胞質、またはミトコンドリアで合成されるので、この様式の生合成は高分子では独特なものである。生長する鎖が細胞外空間に突出することによっても自発的にポリマーが生長できるので、異例な大きさのＨＡが得られ、ゴルジ体またはゴルジ体後区画内の合成に限定されると、形成されるポリマーの全般的量または長さが限定される。局限された管腔内のＨＡの濃度が高いと、他の細胞小器官の機能にとって有害となることがある高粘度環境も生じることがある。
【００１３】
幾つかの研究では、ＨＡのカプセルコーティングを作製する連鎖球菌の株並びに真核生物細胞由来のＨＡＳを可溶化、同定、および精製が試みられてきた。連鎖球菌およびネズミの乏突起神経膠腫酵素は洗剤での可溶化に成功し、研究されたが、更に研究を行いまたは分子クローニングのために活性ＨＡＳを精製する努力は何十年にもわたって成功していない。Prehm and Mausolfは、過ヨウ素酸で酸化したＵＤＰ−ＧｌｃＵＡまたはＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを用いて、ＨＡＳと同時精製した連鎖球菌膜の約５２kDaのタンパク質をアフィニティーラベリングした。これにより、群Ｃの連鎖球菌ＨＡＳがクローニングされたと主張する報告がなされたが、これは不運なことに誤りであった。この研究では、活性シンターゼの発現の立証に失敗し、実際にはペプチドペプチド輸送体をクローニングした可能性がある。Triscott and van de Rijnはジギトニンを用いて、連鎖球菌膜由来のＨＡＳ活性形態で可溶化した。Van de Rijn and Drakeは、４２、３３、および２７kDaの３種類の連鎖球菌膜タンパク質を５−アジド−ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡで選択的に放射能標識し、３３kDaタンパク質がＨＡＳであることを示唆した。しかしながら、後で示すように、ＨＡＳは実際には４２kDaタンパク質であることが明らかになった。
【００１４】
これらの努力にも拘わらず、ＨＡＳｍＲＮＡまたはＨＡＳタンパク質についての分子プローブがなかったので、ＨＡ合成の調節および機構は本質的に立往生していた。主要な進展は、１９９３年にDeAngelis et al.がタンパク質ＨａｓＡをコードする群Ａの連鎖球菌遺伝子の分子クローニングおよび特性決定を報告したときに起きた。この遺伝子は細菌性ＨＡ合成に必要なオペロンの一部であることが知られているが、現在ｓｐＨＡＳ（S. pyogenesＨＡＳ）と呼ばれているこのタンパク質の機能は知られていない。ｓｐＨＡＳは、その後ＨＡの伸長に関与していることが明らかにされ、同定され、クローニングされた後、発現に成功した最初のグリコサミノグリカンシンターゼであった。S. pyogenesＨＡ合成オペロンは、２個の他のタンパク質をコードする。ＨａｓＢはＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼであり、これはＵＤＰ−グルコースをＨＡ合成の基質の一つであるＵＤＰ−ＧｌｃＵＡに転換するのに必要とされる。ＨａｓＣはＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼであり、これはグルコース＝１−ホスフェートおよびＵＴＰをＵＤＰ−グルコースに転換するのに必要とされる。ｈａｓＡおよびｈａｓＢ遺伝子をカプセルのない連鎖球菌株またはEnteroccus faecalisに同時トランスフェクションすることにより、ＨＡを合成し、カプセルを形成する能力がそれらに付与された。これにより、ｓｐＨＡＳ（ｈａｓＡ）がＨＡシンターゼであることの最初の強力な証拠が提供された。
【００１５】
定義の難しいＨＡシンターゼ遺伝子は、最終的にトランスポゾン突然変異誘発法によってクローニングされ、ＨＡ合成オペロンのトランスポゾン中断を含むカプセルのない突然変異体の群Ａ株が生成した。トランスポゾンの既知配列により、連鎖球菌ＤＮＡとの接合領域を同定した後、野生型細胞からクローニングすることができた。コードしたｓｐＨＡＳは、酵母キチンシンターゼのファミリーと５〜１０%同一であり、Xenopus laevisタンパク質ＤＧ４２（原腸形成の際に発生的に発現）と３０%同一であったが、その機能はその時点では知られていなかった。DeAngelis and Weigelは、活性組換えｓｐＨＡＳをEscherichia coliで発現させ、この単一の精製遺伝子生成物がＵＤＰ−ＧｌｃＵＡとＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃとイン・ビトロでインキュベーションすると高MrＨＡを合成することを示し、これによってＨＡ合成に必要な両グリコシルトランスフェラーゼ活性は、１９５９年に最初に提案されたように、同一タンパク質によって触媒されることを示した。(i) ｓｐＨＡＳ二重作用を有する単一酵素であり、(ii) ｓｐＨＡＳ、キチンシンターゼ、およびＤＧ４２の間の配列相同性の範囲の知見を用いて、４箇所の実験室によって１９９６年に真核生物のＨＡＳｃＤＮＡがほぼ同時に同定されたことにより、ＨＡＳは別個なアイソザイムをコードする多遺伝子ファミリーであるという本発明者のタンパク質仮説が更に補強された。２個の遺伝子（ＨＡＳ１およびＨＡＳ２）は哺乳類で直ぐに発見され、第三の遺伝子ＨＡＳ３は後になって発見された。第二の連鎖球菌ｓｅＨＡＳまたはStreptococcus equisimilisヒアルロネートシンターゼは同定され、１９９９年１２月２１日出願の米国特許出願連続番号第０９／４６９，２００号明細書に詳細に開示されており、その内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている。ｓｅＨＡＳタンパク質は、ｓｐＨＡＳ酵素に対して高水準（約７０%）の同一性を有する。しかしながら、この同一性は興味深いものであり、ｓｅＨＡＳ遺伝子がｓｐＨＡＳ遺伝子に対して交差ハイブリダイズしないからである。
【００１６】
両基質が提供されるときには、組換えｓｅＨＡＳを発現するE. coliから調製される膜は、ＨＡを合成する。この結果により、群ＣのＨＡＳをクローニングしたと主張するLansing et al.の初期の報告が誤りであることが確かめられた。不運なことには、幾つかの研究では、この特性決定されていない５２kDaの連鎖球菌タンパク質に対して抗体を用いて、真核生物ＨＡＳであると考えられるものを検討していた。
【００１７】
Itano and Kimataは、ＨＡを合成することができない突然変異体マウス乳癌細胞系での発現クローニングを用いて、第一の哺乳類ＨＡＳｃＤＮＡ（ｍｍＨＡＳ１）と推定されるものをクローニングした。ＨＡ合成を欠くサブクローンは、体細胞融合実験でのＨＡ合成に相補的な３種類の別々のクラスに分離され、少なくとも３個のタンパク質が必要であることを示唆していた。これらのクラスの二つは幾らかのＨＡ合成活性を保持していたが、一つは活性を全く示さなかった。後者の細胞系を親細胞から調製したｃＤＮＡを用いる一過性トランスフェクション実験に用いて、ＨＡ合成活性を回復する単一タンパク質を同定した。配列分析により、ｓｐＨＡＳと同様な膜トポロジーを有する約６５kDaのタンパク質の推定一次構造が明らかになった。ｍｍＨＡＳ１はｓｐＨＡＳに対して３０%の同一性を有し、ＤＧ４２に対しては５５%の同一性を有した。この報告が公表された同月に、他の３グループが同一のマウスおよびヒト酵素であると当初考えられていたものをコードするｃＤＮＡを記載した論文を提出した。しかしながら、異常な環境のために、４箇所の実験室のそれぞれは両種において異なるＨＡＳアイソザイムを発見したのである。
【００１８】
Itano and Kimataの方法と同様な機能的クローニング法を用いて、Shyjan et al.はＨＡＳ１のヒト相同体を同定した。腸間膜リンパ節ｃＤＮＡライブラリーを用いてネズミ粘膜Ｔリンパ球をトランスフェクションした後、これをロゼットアッセイで接着する能力についてスクリーニングした。一つのトランスフェクタントの接着は既知の細胞表面ＨＡ結合タンパク質であるＣＤ４４に対する抗血清によって阻害され、ヒアルロニダーゼによる前処理によって直接廃棄される。従って、このトランスフェクタントによるロゼッティングには、ＨＡの合成が必要であった。信頼できるｃＤＮＡのクローニングおよび配列決定により、ｈｓＨＡＳ１を同定した。Itano and Kimataも、胎児脳ライブラリーから単離したヒトＨＡＳ１ｃＤＮＡを報告した。しかしながら、２グループによって報告されたｈｓＨＡＳ１ｃＤＮＡは長さが異なっており、それらは５７８または５４３アミノ酸タンパク質をコードする。ＨＡＳ活性は、長い方の形態についてのみ立証された。
【００１９】
真正のＨＡシンターゼとしてのｓｐＨＡＳの分子同定、およびＤＧ４２、ｓｐＨＡＳおよびＮｏｄＣ（RhizobiumのＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ結節形成因子）の間の近同一性に基づいて、Spicer et al.は縮重ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて、ｍｍＨＡＳ２と呼ばれる第二の異なる酵素をコードするマウス胎児ｃＤＮＡをクローニングした。ｍｍＨＡＳ２ｃＤＮＡのＣＯＳ細胞へのトランスフェクションにより粒子排除アッセイによって検出されたＨＡ細胞コートのデ・ノボ産生が支持されることによって、ＨＡＳ２タンパク質がＨＡを合成することができる有力な証拠が提供された。同様な方法を用いて、Watanabe and Yamaguchiはヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、ｈｓＨＡＳ２を同定した。Fulop et al.は、独立に同様な方法を用いて、排卵前濾胞での正常な卵丘膨張に不可欠な工程である積極的にＨＡを合成する卵丘細胞から単離されたＲＮＡにおいてｍｍＨＡＳ２を同定した。卵丘細胞−卵母細胞複合体を、排卵サイクルが開始する直前、ＨＡ合成が始まる前、および後でＨＡ合成が始まっている（３時間）または既に明らかになっている（４時間）ときにマウスから単離した。ＲＴ−ＰＣＲは、ＨＡＳ２ｍＲＮＡが当初は見られないが、３〜４時間後には高レベルで発現されることを示し、ＨＡＳ２の転写はこの工程においてＨＡ合成を調節することを示唆していた。いずれのｈｓＨＡＳ２も長さが５５２アミノ酸であり、９８%同一である。ｍｍＨＡＳ１は長さが５８３アミノ酸であり、長さが５７８アミノ酸であるｈｓＨＡＳ１に対して９５%同一性を有する。
【００２０】
最近では、Spicer et al.がＰＣＲ法を用いて、哺乳類の第三のＨＡＳ遺伝子を同定した。ｍｍＨＡＳ３タンパク質は長さが５５４アミノ酸であり、それぞれｍｍＨＡＳ１、ｍｍＨＡＳ２、ＤＧ４２、およびｓｐＨＡＳに対して７１、５６、および２８%の同一性を有する。Spicer et al.は、３種類のヒトおよびマウス遺伝子を３種類の異なる染色体の局在化も行った（ｈｓＣｈｒ１９／ｍｍＣｈｒ１７に対してＨＡＳ１；ｈｓＣｈｒ８／ｍｍＣｈｒ１５に対してＨＡＳ２；ｈｓＣｈｒ１６／ｍｍＣｈｒ８に対してＨＡＳ３）。３種類のＨＡＳ遺伝子の異なる染色体での局在化および脊椎動物綱中のＨＡの出現は、この遺伝子ファミリーが篩ものであり、アイソザイムは脊椎動物の進化の初期に重複によって出現したことを示唆している。細菌および真核生物ＨＡＳの同一性が高い（約３０%）ことも、これら２種類は共通の先祖の遺伝子を有することを示唆している。恐らく、原始的細菌は、真核生物遺伝子生成物が大きくなり且つ更に複雑になる前に初期の脊椎動物の祖先からＨＡＳ遺伝子を奪い取ったものと思われる。あるいは、細菌は、一層大きな脊椎動物ＨＡＳ遺伝子を獲得し、酵素活性に本質的でない調節配列を欠失することができたと思われる。
【００２１】
Dawidと共同研究者によるX. laevisＤＧ４２の発見は、このタンパク質がＨＡシンターゼであること走られていなかったにも拘わらず、これらの最近の進展において重要な役割を果たした。それにも拘わらず、ＤＧ４２とｓｐＨＡＳの同一性が３０%であることは、哺乳類ＨＡＳ２を同定するオリゴヌクレオチドをデザインする上で不可欠であった。皮肉なことには、ＤＧ４２がbona fideＨＡシンターゼであるという明確な証拠は、哺乳類のアイソザイムが発見された後に初めて報告されたのであり、DeAngelis and Achyuthanは酵母（ＨＡを合成することができない生物）で組換えタンパク質を発現させ、これがＨＡを合成し、単離したときに、膜は２種類の基質を備えていることを示した。Meyer and Kreilも、ＤＧ４２についてｃＤＮＡでトランスフェクションした細胞由来の溶解物が高レベルのＨＡを合成することを示した。今や、ＤＧ４２はその機能が知られているので、ＸｌＨＡＳと呼ぶことができる。
【００２２】
１個の大きな中心ドメインとタンパク質のアミノおよびカルボキシル末端における２〜３個の膜貫通または膜結合ドメインのクラスターを包含する総てのＨＡＳタンパク質が共有する共通の予想された構造的特徴がある。中心ドメインは、予想された細胞内ＨＡＳタンパク質配列の約８８%までを含んでなり、酵素の触媒領域を含むと思われる。この予想された中心ドメインは長さがｓｐＨＡＳでは２６４アミノ酸（総タンパク質の６３%）であり、真核生物ＨＡＳ部分では長さが３０７〜３２８残基（総タンパク質の５４〜５６%）である。膜ドメインの正確な数および配向、および細胞外および細胞内ループのトポロジー構成は、いずれのＨＡＳについても実験的に決定されていない。
【００２３】
ｓｐＨＡＳは、精製されており且つ部分的に特性決定されたＨＡＳファミリーの一部である。ｓｐＨＡＳ／アルカリホスファターゼ融合タンパク質を用いる初期の研究は、ｓｐＨＡＳのＮ末端、Ｃ末端、および大きな中心ドメインは実際には細胞の内部にあることを示している。ｓｐＨＡＳは６個のシステインを有し（配列番号：４４）、一方、ＨＡＳ１、ＨＡＳ２、およびＨＡＳ３はそれぞれ１３、１４および１４Ｃｙｓ残基を有する。ｓｐＨＡＳにおける６個のＣｙｓ残基（配列番号：４４）の２個は、ＨＡＳ１とＨＡＳ２では保存され、同一である。１個のみの保存されたＣｙｓ残基が、総てのＨＡＳファミリーメンバーで同じ位置に見出される（ｓｐＨＡＳではＣｙｓ−２２５）。これは本質的なＣｙｓであり、スルフヒドリル毒によるその修飾により酵素活性が部分的に阻害されることがある。ジスルフィド結合の存在の可能性または下記の多様なＨＡＳ機能のいずれかに必要な不可欠なＣｙｓ残基の同定は、ＨＡＳファミリーのいずれのメンバーについても解明されていない。
【００２４】
血漿膜での合成に提案された独特な様式に加えて、ＨＡＳ酵素ファミリーは、ＨＡの全般的重合に要する多数の機能では極めて珍しいものである。少なくとも６個の別々の活性、すなわち２個の異なる糖ヌクレオチド前駆体（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃおよびＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ）のそれぞれについての結合部位、２個の異なるグリコシルトランスフェラーゼ活性、生長するＨＡポリマーを酵素（Ｂ−Ｘ７−Ｂモティーフに関係すると思われる）に固定する１個以上の結合部位、および生長するポリマーを一度に１または２個の糖移動するツメ車様移動機構がＨＡＳ酵素中に存在する。この後者の活性は、膜中でのポリマーの段階的前進と一致していると思われる。これらの機能の総て、および恐らくは未だ知られていない他のものは、４１９（ｓｐＨＡＳ）〜５８８（ｘＨＡＳ）アミノ酸のサイズの比較的小さなタンパク質に含まれている。
【００２５】
総ての利用可能な証拠が、ｓｐＨＡＳタンパク質のみが細菌またはイン・ビトロでのＨＡ生合成に必要とされるという結論を支持しているが、一層大きな真核生物ＨＡＳファミリーメンバーが多成分複合体の一部であることが可能である。真核生物ＨＡＳタンパク質はｓｐＨＡＳより約４０%大きいので、それらの追加タンパク質ドメインは細胞内通行および局在化、酵素活性の調節、および他細胞成分との相互作用の媒介など一層精巧な機能に関与している可能性がある。
【００２６】
異なるシンターゼをコードする複数の脊椎動物ＨＡＳ遺伝子があるという予想外の知見は、ＨＡは細胞挙動の重要な調節因子であり、単なる組織の構造成分ではないという新たなコンセンサスを強力に支持している。従って、６ヶ月未満で、この分野は、一つの既知のクローニングしたＨＡＳ（ｓｐＨＡＳ）から、ＨＡの合成および生物学の理解における速やかで数多くの刺激的な将来の進歩を約束する多遺伝子ファミリーの認識へと移動した。
【００２７】
例えば、以下に、Pasteurella multocida、Paramecium bursaria クロレラウイルス（ＰＢＣＶ−１）、Streptococcus pyogenes、Streptococcus uberis、Sulfolobus solfataricus、Bacillus anthracisプラスミドｐＸＯ１、およびEctocarpus sillculosusウイルス由来のＨＡＳ遺伝子の配列を開示する。これらの系にヒアルロナンシンターゼが存在し、これらの様々な系からのヒアルロナンシンターゼの精製および使用は、多くの様々な原核生物およびウイルス供給源において、実際には、一般に微生物供給源から酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコードする核酸配列を精製して単離する能力を示している。
【００２８】
群ＣのStreptococcus equisimilis株Ｄ１８１は、ヒアルロン酸（ＨＡ）を合成して、分泌する。研究者らはこの株と群ＡのStreptococcus pyogenes株、例えばＳ４３およびＡ１１１を用いて、ＨＡの生合成を検討し、その二価カチオン要件、前駆体（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃおよびＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ）の利用、および最適pHに関するＨＡ合成活性を特性決定した。
【００２９】
伝統的には、ＨＡは、雄鶏の鶏冠または連鎖球菌培養物由来の細胞外培地から単離することによって商業的に調製されている。ＨＡの製造のために開発された一つの方法は、ＨＡ産生連鎖球菌の培養物を用いることによる。米国特許第４，５１７，２９５号明細書（その内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている）には、ＨＡ産生連鎖球菌をＣＯ２濃度を高めた生長培地で嫌気条件下で培養する手続きが記載されている。これらの条件下で、ＨＡが産生し、ブロスから抽出することができる。雄鶏の鶏冠からのＨＡの単離は、純度の低い状態のＨＡから出発するので、労力がかかり困難であると一般に考えられている。雄鶏の鶏冠から単離することの利点は、産生するＨＡの分子量が一層大きいことである。しかしながら、細菌醗酵によるＨＡの調製の方が、ＨＡの出発純度が高くなるので、容易である。しかしながら、通常は、この方法で製造したＨＡの分子量は、雄鶏の鶏冠から得たものより小さい。更に、連鎖球菌醗酵によって調製したＨＡは、雄鶏の鶏冠から得たＨＡと同様に免疫応答を誘発することが多い。従って、細菌性醗酵によって高分子量ＨＡを産生する技術は、現在行われている手続きと比較して明らかに改良されている。
【００３０】
上記のように、高分子量ＨＡは、化粧品から眼の手術に至る多種多様な有用な用途を有する。ＨＡは、高粘度および高生体適合性の可能性があるため、特にガラス質流体の代替品として眼の手術に用いられる。ＨＡは、ＨＡの関節内注射による競走馬の外傷性関節炎の治療、潤滑剤としてのシェービングクリーム、および高粘度の物理化学的特性および長時間水分を保持する能力により様々な化粧品にも用いられてきた。実際には、１９９７年８月に合衆国食品医薬品局は、高分子量ＨＡを冒された関節に直接注射することによる重症関節炎の治療における高分子量ＨＡの使用を承認した。一般に、用いられるＨＡの分子量は、大きい方がよい。これは、ＨＡ溶液の粘度は、溶液中の個々のＨＡポリマー分子の平均分子量と共に増加するからである。不運なことには、１０７までのような極めて高分子量のＨＡは、現在利用できる単離手続きによって得ることは困難である。しかしながら、本明細書に開示されている組換え製造法では、１０７以上までの分子量を有するＨＡが製造される。
【００３１】
これらおよび他の問題点を処理するには、純度が一層高くまたは調製が容易であるなどの１個以上の改良された特性を有するＨＡを製造するのに用いることができる新たな方法および構造体が必要である。特に、現在商業的に入手可能なＨＡより比較的高分子量で且つ比較的純粋なＨＡを一層多量に製造するための方法を開発する必要がある。更に、改質された分子の大きさの分布（ＨＡΔサイズ）を有するＨＡ、並びに改質された構造（ＨＡΔ改質）を有するＨＡを製造するための方法を開発する必要もある。
【００３２】
工業用酵素の生産は年商の１５億ドルであり、これらの生成物の７０%はBacillus種から製造される。Bacillus株で有効な発現系を用いることの利点は、Bacillusがタンパク質の有効な分泌型であるので、遺伝子工学処理を施したタンパク質を製造する工程においてE. coliまたは酵母の代わりにBacillusを用いると、当該タンパク質の分泌が高まる。Bacillus株は、E. coliのような他の普通に用いられる細菌株とは異なり、「一般に安全と認められている」または「ＧＲＡＳ」微生物でもある。Bacillusは、食品および飲料産業、および抗生物質の製造に長く用いられてきた。Bacillusの一つの利点は、発熱物質を含んだり毒素を産生しないことである。洗剤プロテアーゼおよびα−アミラーゼの製造など醗酵におけるBacillusの使用に広汎な工業的経験がある。
【００３３】
本発明では、当該技術分野における１以上の欠点を検討する。 組換えＤＮＡ技術を用いて、酵素活性を有するＨＡＳをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントを導入したBacillus細胞で酵素活性を有するＨＡＳを産生する方法を開示し、ＨＡＳおよびそのヒアルロン酸生成物を産生する組換えBacillus細胞の調製と共に特許請求を行う。
【００３４】
発明の簡単な概要
本発明は、ヒアルロン酸（ＨＡ）調製の技術における１以上の問題点を解決するための組換えＤＮＡ技術の応用に関する。これらの問題は、ＨＡ鎖生合成に関与する遺伝子である酵素活性を有するヒアルロネートシンターゼ（ＨＡＳ）遺伝子、例えば群ＡまたはＣのStreptococcus、Pasteurella multocida、Sulfolobus solfataricus、およびEctocarpus siliculosusウイルス由来のＨＡＳ遺伝子をコードするコード領域を有する核酸セグメントの単離および使用により、処理される。本明細書に開示されるＨＡＳ遺伝子は、適当な微生物供給源のＤＮＡからクローニングし、遺伝子工学処理により有用な組換え構造体とし、Bacillus細胞に導入して、ＨＡを調製し、ＨＡＳ酵素自身を多量に調製する。
【００３５】
「ヒアルロン酸シンターゼ」、「ヒアルロネートシンターゼ」、「ヒアルロナンシンターゼ」、および「ＨＡシンターゼ」という用語は、an酵素 thatポリマーizes aグルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミン糖が交互にβ１，３およびβ１，４結合してなるグリコサミノグリカン多糖鎖を重合する酵素を互換的に記載するのに用いられる。「ｓｅＨＡＳ」という用語は、例えばStreptococcus equisimilis由来のＨＡＳ酵素を表し、ｓｅＨＡＳ酵素をコードする遺伝子の発現は、食作用および免疫監視を免れる手段を提供することによる連鎖球菌の群Ａおよび群Ｃ株の毒性と相関している。
【００３６】
本発明は、グルクロン酸およびＮ−アセチルグルコサミンを重合してグリコサミノグリカンヒアルロン酸とするのに用いられることがあるヒアルロネートまたはヒアルロン酸シンターゼ遺伝子、ｃＤＮＡ、および遺伝子生成物（ＨＡＳ）の単離および特性決定に関する。本発明は、ＨＡＳ座を同定し、Streptococcus equisimilis、Streptococcus pyogenes、Streptococcus uberis、Pasteurella multocida、Sulfolobus solfactaricus、Bacillus anthracisｐＸＯ１、およびEctocarpus sificulosusウイルス由来の酵素活性を有するＨＡＳ遺伝子をコードする核酸配列を開示する。ＨＡＳ遺伝子は、新規なプローブを提供して、ヒアルロン酸を産生する細菌標本の可能性も評価する。
【００３７】
本明細書で上記した技術および知識を応用することによって、当業者はＨＡＳ遺伝子をコードする追加の核酸セグメントを得ることができる。当業者は、本開示を考慮して、これらの利点は、ＨＡＳ遺伝子の発現を制御し且つ産生されるＨＡＳ遺伝子生成物であるＨＡＳ酵素の性質を制御することができる点において重要な有用性を提供する。
【００３８】
従って、本発明は、原核生物または真核生物供給源由来のいずれにせよ酵素活性を有するＨＡＳをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントの単離に関するものである。これは可能であり、酵素および実際には遺伝子が真核生物および幾つかの原核生物のいずれでも見出されるものであるからである。真核生物はＨＡを産生し、従って、本発明に関連して用いることができるＨＡシンターゼ遺伝子を有することも知られている。
【００３９】
本発明のＨＡシンターゼをコードする核酸セグメントは、総染色体またはゲノムＤＮＡを含まずに単離され、組換えＤＮＡ技術によって容易に操作することができるようにするものと定義される。従って、本明細書で用いられる「精製した核酸セグメント」という用語は、関連のない染色体またはゲノムＤＮＡを含まずに単離され、組換え技術の実施に用いることができる状態に保持されたＤＮＡセグメント、例えば別個の単離されたＤＮＡ断片、またはこのような断片を組込むベクター（例えば、プラスミド、ファージまたはウイルス）の形態のＤＮＡを表す。
【００４０】
本発明は、組換え宿主細胞であって、配列番号：２、１０、１２、１４、１６、１８または２０の酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製した核酸セグメントを含んでなる組換えベクターBacillus細胞である、組換え宿主細胞を含んでなる。精製した核酸セグメントは、配列番号：１、９、１１、１３、１５、１７または１９のヌクレオチド配列を含んでなることができる。組換えベクターは、形質転換、トランスフェクション、形質導入、および電気穿孔の少なくとも一つによってBacillus細胞に導入することができる。
【００４１】
本明細書で上記したコード領域は、グラム陽性菌適合性プロモーターまたはBacillus適合性プロモーターのようなプロモーターによって制御することができる。組換え宿主細胞は、少なくとも１個の改質ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを包含することができ、改質ＲＮＡポリメラーゼプロモーターがＲＮＡポリメラーゼによって認識されると、ＲＮＡポリメラーゼは内在性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターより多量にＲＮＡを発現することができる。このような改質は突然変異であるか、またはタンデムプロモーター要素の存在であることができ、これらは同一または異なるプロモーター要素であることができる。更に、組換え宿主細胞は、天然のBacillus細胞でみられるより少なくとも１個多いｍＲＮＡ安定化または脱安定化要素を包含することもできる。
【００４２】
Bacillus細胞は、ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡおよびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの少なくとも一方の産生を高めることができる。場合によっては、組換え宿主細胞は、ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ、ＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ、およびそれらの組合せからなる群から選択される酵素活性を有するＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ生合成経路酵素のようなＵＤＰ−糖前駆体経路酵素において、機能活性を有する酵素をコードするコード領域を有する少なくとも１個の精製した核酸セグメントを有することもできる。このような精製した核酸セグメントは、上記の組換えベクター上に提供することができ、または異なる組換えベクター上に提供することができる。同一ベクター上に提供するときには、２個のコード領域は、少なくとも１種類のプロモーターの少なくとも１個のコピーによって制御することもまたは異なるプロモーターによって制御することもできる。ＵＤＰ−糖前駆体生合成経路酵素をコードする少なくとも１つの核酸セグメントが存在すると、内在性ＵＤＰ糖前駆体生合成経路酵素を発現する天然の宿主細胞より大きい活性を有する組換え宿主細胞が提供される。
【００４３】
もう一つの代替法では、組換え宿主細胞は少なくとも１個の突然変異したＵＤＰ−糖前駆体生合成遺伝子を包含することができ、突然変異はそこから転写されるｍＲＮＡの半減期を増加し、翻訳効率の増加したｍＲＮＡをコードし、またはＵＤＰ−糖前駆体生合成遺伝子のリボソーム結合部位にあり、リボソームのリボソーム結合部位に対する結合親和性が増加するようになる。
【００４４】
本発明は、ヒアルロン酸の製造方法であって、本明細書で上記した（複数の）精製した核酸セグメントを導入し、組換え宿主細胞を培地で増殖させてヒアルロン酸を分泌させることによって本明細書で上記した組換え宿主細胞を構築することを含んでなる、方法も含んでなる。Bacillus宿主は、化学的に画定した培地、複合培地、またはグルコースとＮ−アセチルグルコサミンおよびグルコサミンの少なくとも一方を含む培地で約２５℃〜約４２節真空濃縮範囲の温度で増殖させることができる。次に、分泌されたヒアルロン酸を回収し、回収したヒアルロン酸を更に培地から抽出した後、精製することもできる。例えば、ヒアルロン酸を細胞および砕片から濾過、遠心分離および凝集の少なくとも一つによって分離した後、ヒアルロン酸を濃縮した後、濃縮したヒアルロン酸を培地から沈澱、限外濾過および透析からなる群から選択される少なくとも１つの方法によって分離することもできる。この分離は、更にトリクロロ酢酸の添加を包含し、これによって細胞および砕片をヒアルロン酸から分離することを容易にすることもできる。沈澱剤は、アルコール、有機溶媒または化合物、および脂肪族の正に帯電した塩の少なくとも一つであることができ、エタノール、イソプロパノール、アセトン、臭化セチルトリアンモニウムまたは塩化セチルピリジニウムからなる群から選択することができる。
【００４５】
本発明は、本明細書で上記した方法によって調製したヒアルロン酸も含んでなる。
【００４６】
発明の具体的説明
本発明の少なくとも１個の態様を詳細に説明する前に、本発明は、下記の説明に記載されまたは図面に図解された構造の詳細および成分の配置にその応用が限定されないことを理解すべきである。本発明は、他の態様が可能であり、または様々な方法で実施しまたは実行することができる。また、本明細書で用いられる表現および用語は、説明のためのものであり、制限と考えるべきではないことを理解すべきである。
【００４７】
本明細書で用いられる「核酸セグメント」および「ＤＮＡセグメント」という用語は互換的に用いられ、特定の種の総ゲノムＤＮＡを含まないで単離されたＤＮＡ分子を表す。従って、本明細書で用いられる「精製した」ＤＮＡまたは核酸セグメントは、ヒアルロネートシンターゼ（「ＨＡＳ」）コード配列であって、供給源細胞の関連のないゲノムＤＮＡから単離されまたは精製してこれを含まないものを含むＤＮＡセグメントを表す。「ＤＮＡセグメント」という用語には、ＤＮＡセグメントおよびこれらのセグメントより小さな断片、および組換えベクター、例えば、プラスミドコスミド、ファージ、ウイルスなども包含される。
【００４８】
同様に、単離したまたは精製したＨＡＳ遺伝子を含んでなるＤＮＡセグメントは、他の天然に存在する遺伝子またはタンパク質コード配列から実質的に離れて隔離されたＨＡＳコード配列などのＤＮＡセグメントを表す。これに関して、「遺伝子」という用語は、機能性タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドコード単位を簡単に表すのに用いられる。当業者であれば理解されるように、この機能的用語は、ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列、またはそれらの組合せを包含する。「他のコード配列から実質的に離れて隔離された」とは、目的の遺伝子、この場合にはＨＡＳがＤＮＡセグメントのコード領域の重要な部分を形成し、このＤＮＡセグメントが天然に存在するコードＤＮＡの大きな部分、例えば、大きな染色体断片、または他の機能性遺伝子またはＤＮＡコード領域を含まないことを意味する。これは、本来単離されるものとしてのＤＮＡセグメントを表し、後で加えられるまたは人の手によって意図的にセグメントに残された遺伝子またはコード領域を除外しないことは勿論である。
【００４９】
原核生物供給源の使用に関連したある種の利点により、原核生物からＨＡＳ遺伝子の単離が極めて有利になると思われる。特に、クラスIまたはクラスIIのＨＡＳ、例えば、S. equisimilisまたはS. pyogenes由来のクラスIのＨＡＳ、またはP. multocida由来のクラスIIのＨＡＳを選択して利用することができる。
【００５０】
連鎖球菌は、様々な細胞壁炭水化物抗原に基づいてLancefield群に分類学的に再分される。１８の異なる群があるが、最も普通の病原体はＡ、Ｂ、ＣおよびＤである。歴史的には、最も普通の病原体には、特定の種の名称が付けられることが多いが、統一Lancefield試験法がタイピングの明確な方法であり、従って有用な分類機構として認められている。ＨＡＳ遺伝子の供給源として利用できるStreptococcus種としては、群Ａの連鎖球菌、例えば、S. pyogenesおよびS. haemolyticus、および群Ｃの連鎖球菌、例えば、S. equi、S. equisimilis、S. zooepidemicus、S. uberisおよびS. dysgalactiaeが挙げられる。
【００５１】
原核生物からＨＡＳ遺伝子を単離することの一つの利点は、典型的には真核生物酵素が真核生物宿主でのみ達成することができる重要な翻訳後修飾を必要とすることがあることである。これは、得られる任意の真核生物ＨＡシンターゼ遺伝子の応用可能性を限定するのに役立つ。更に、当業者であれば、用いられる原核生物酵素遺伝子を探索する遺伝子操作の時間および容易さに関して更に有利になると思われる。これらの追加の利点としては、(a)ゲノムの大きさが比較的小さく、従って相当するゲノムライブラリースクリーニングの量が少ないことにより原核生物遺伝子の単離が容易であり、(b) 原核生物遺伝子のコード領域の全般的大きさがイントロンがないためかなり小さいので、操作が容易であることが挙げられる。更に、ＨＡＳ遺伝子の生成物（すなわち、酵素）が翻訳後修飾を必要とするときには、, これらは遺伝子が誘導される同様な原核生物細胞環境（宿主）で最もよく達成される。
【００５２】
好ましくは、本発明のＤＮＡ配列は、選択された組換え宿主で配列を発現させる遺伝子制御領域も包含する。用いる制御領域の性質が一般的には構想した特定の用途（例えば、クローニング宿主）によって変化することは勿論である。
特定の態様では、本発明は、単離したＤＮＡセグメントおよびＤＮＡ配列を組込み且つそのアミノ酸配列中に配列番号：２、１０、１２、１４、１６、１８および２０の少なくとも１つのアミノ酸配列を包含するＨＡＳ遺伝子をコードする組換えベクターに関する。更に、他の特定の態様では、本発明は、単離したＤＮＡセグメントおよびＤＮＡ配列を組込み且つそのアミノ酸配列中にＨＡＳ遺伝子またはＤＮＡのアミノ酸配列を包含する遺伝子をコードする組換えベクター、および特にStreptococcus equisimilisＨＡＳ、Streptococcus pyogenesＨＡＳ、Streptococcus uberisＨＡＳ、Pasteurella multocidaＨＡＳ、Sulfolobus solfataricusＨＡＳ、Ectocarpus siticulosusウイルスＨＡＳ、およびBacillus anthracisプラスミドｐＸＯ１ＨＡＳの少なくとも１つに相当するＨＡＳ遺伝子またはｃＤＮＡに関する。例えば、ＤＮＡセグメントまたはベクターが完全長のＨＡＳタンパク質をコードするかまたはＨＡＳタンパク質の発現に使用しようとする場合には、好ましい配列は、本質的に配列番号：２、１０、１２、１４、１６、１８および２０の少なくとも１つに記載されている通りのものである。
【００５３】
ＨＡシンターゼ活性を有する核酸セグメントは、本明細書に記載の方法によって単離することができる。「本質的に配列番号：Ｘに記載されている通りの配列」という用語は、この配列が実質的に配列番号：Ｘの一部に相当し、配列番号：Ｘのアミノ酸とは同一でない比較的少数のアミノ酸または配列番号：Ｘのアミノ酸と生物学的機能が同等のものを有することを意味する。「生物学的機能が同等のもの」という用語は当該技術分野では十分に理解されており、更に本明細書で、本質的に配列番号：Ｘに記載されている通りの配列を有し且つ原核生物がＨＡまたはヒアルロン酸コートを産生する能力に関連している遺伝子として詳細に定義される。
【００５４】
例えば、ｓｅＨＡＳおよびｓｐＨＡＳコード配列は約７０%同一であり、塩基アデニン（Ａ）およびチミン（Ｔ）含量が高い。ｓｅＨＡＳ塩基含量は、Ａ−２６．７１%、Ｃ−１９．１３%、Ｇ−２０．８１%、およびＴ−３３%（Ａ／Ｔ６０%）であり、一方、ｓｐＨＡＳではＡ−３４%、Ｃ−１６．４２%、Ｇ−１６．３４%、およびＴ−３５．８%（Ａ／Ｔ＝６７%）である。ｓｅＨＡＳコード配列は、ｓｐＨＡＳ遺伝子と７０%同一であるにも拘わらず、これとハイブリダイズせず、またその逆も言えることに当業者は驚くであろう。この予期しないクロス−ハイブリダイズが不可能であることは、オープンリーディングフレーム中のミスマッチした塩基の短い中断による可能性がある。ｓｐＨＡＳとｓｅＨＡＳとがクロス−ハイブリダイズできないことを、図１に示す。ｓｅＨＡＳとｓｐＨＡＳコード配列の両方に共通の同一ヌクレオチドの最長伸長は、２０ヌクレオチドに過ぎない。更に、非常にＡ−Ｔリッチな配列は、Ｇ−Ｃリッチな配列よりも安定性の低いハイブリダイゼーション複合体を形成する。もう一つの可能な説明は、いずれの配列にもＡまたはＴの幾つかの伸長があり、生前とならば図に且つ不安定なやり方でハイブリダイズする可能性があることである。これにより、ｓｅＨＡＳとｓｐＨＡＳ遺伝子配列が、互いにフレームの外におかれることによって、生産的なハイブリダイゼーションの確率が減少する。
【００５５】
７０%同一であるタンパク質をコードする２種類の遺伝子が互いにクロス−ハイブリダイズすることができないというこの独特な現象のために、特許請求した核酸セグメントをその機能の点から、すなわち酵素活性を有するヒアルロネートシンターゼをコードする核酸セグメントを考察するのが有益である。当業者であれば、酵素活性を有するヒアルロネートシンターゼをコードする核酸セグメントは、配列番号：１、２、および９〜２０に記載の配列に対して保存または半保存置換を含むことができることを理解されるであろう。
【００５６】
特に、当該技術分野には、従業者が核酸セグメントに対して構造を変化させ（すなわち、保存または半保存アミノ酸置換をコードし）、その酵素的または機能活性を保存することができることの例が数多く見られる。例えば、(1) Risler et al.「構造的に関連したタンパク質におけるアミノ酸置換。パターン認識法(Amino Acid Substitutions in Structurally Related Proteins, A Pattern Recognition Approach)」 J. Moi, Blol. 204:1019-1029 (1988)［・・・アミノ酸鎖が交換可能であることが観察されたことにより、(i)ＩｌｅおよびＶａｌ；(ji)ＬｅｕおよびＭｅｔ、(iii)Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＧｌｎ、および(iv)ＴｙｒおよびＰｈｅの４群のみを詳述することができた］；(2) Niefind et al.「主鎖フォールディングアノールから誘導されたタンパク質モデリングおよび配列整列のアミノ酸類似性係数(Amino Acid Similarity Coefficients for Protein Modeling and Sequence Alignment Derived from Main-Chain Folding Anoles)」Mol. Biol. 219: 481-497 (1991)［類似性パラメーターにより、アミノ酸置換をデザインすることができた］；および(3) Overington et al.「環境に特異的なアミノ酸置換表：第三の鋳型およびタンパク質フォールディングの予測(Environment-SpecificAminoAcidSubstitutionTables: Tertiary Templates and Prediction of Protein Folds)」 Protein Science 1:216-226 (1992) ［「局部環境の関数としての観察された置換のパターンを分析することにより、異なるパターンがあることが示される・・・。」適合性のある変化を行うことができる。］を参照されたい。上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている。
【００５７】
これらの文献および数え切れない他の文献は、当業者が、核酸配列を考慮すれば、その機能性を変化させることなく核酸配列に置換および変化を行うことができることを示唆している。また、置換核酸セグメントは同一性が高く且つその純粋な親の酵素活性を保持しており、しかも親へのハイブリダイゼーションを行うことができないことがある。
【００５８】
本発明は、ｓｅＨＡＳ、ｓｐＨＡＳ、ｓｕＨＡＳおよびｐｍＨＡＳのような酵素活性を有するヒアルロネートシンターゼをコードする核酸セグメントを開示する。ｓｅＨＡＳおよびｓｐＨＡＳは７０%同一であり、いずれも酵素活性を有するヒアルロネートシンターゼをコードするが、クロスハイブリダイゼーションを行わない。従って、当業者であれば、本発明の範囲および特許請求の範囲から離反することなく配列番号：１に示すｓｅＨＡＳ核酸セグメントに置換を行うことができることを理解されるであろう。標準化され且つ容認された機能が同等なアミノ酸置換を、表Ｉに示す。
【００５９】
【表１】
2005514059.tif 000071
【００６０】
本発明のもう一つの好ましい態様は、組換えベクターとして更に定義される配列番号：２、１０、１２、１４、１６、１８または２０に記載のタンパク質をコードする精製した核酸セグメントである。本明細書で用いられる「組換えベクター」という用語は、ＨＡＳタンパク質をコードする核酸セグメントまたはその断片を含むように改質されたベクターを表す。組換えベクターは、上記のＨＡＳコード核酸セグメントに操作結合したプロモーターを含んでなる発現ベクターとしても定義されることがある。
【００６１】
本発明の更に好ましい態様は、ＨＡＳ遺伝子を含んでなる組換えベクターで組換え体とした宿主である。好ましい組換え宿主細胞は、原核生物細胞である。もう一つの態様では、組換え宿主細胞は、真核生物細胞である。本明細書で用いられる「工学処理した」または「組換え」細胞という用語は、ＨＡＳをコードする遺伝子のような組換え遺伝子を導入した細胞を表そうとするものである。従って、工学処理した細胞は、組換え導入した遺伝子を含まない天然に存在する細胞と区別することができる。従って、工学処理した細胞は、人の手によって導入された１個の遺伝子または複数の遺伝子を有する細胞である。組換えにより導入された遺伝子はゲノム遺伝子のコピーであるｃＤＮＡ遺伝子の形態であるか、または特定の導入遺伝子と天然では関連しないプロモーターの隣接位置の遺伝子を包含する。
【００６２】
組換えＨＡシンターゼを産生するのに用いることができるような連鎖球菌以外の宿主を用いようとする場合には、E. coli、Bacillus株、Lactococcus種のような原核生物系、または酵母、またはチャイニーズハムスター卵巣、アフリカングリーンモンキー腎臓細胞、ＶＥＲＯ細胞などの真核生物系を用いるのが有利であることがある。勿論、これを行おうとするときには、一般的にはＨＡシンターゼ遺伝子を選択された代替宿主で機能する配列によって制御するのが望ましい。適当なＤＮＡは、配列並びにそれらの構築および使用を制御し、一般に当該技術分野では以下に更に詳細に記載されるように周知である。例えば、好ましい態様では、宿主細胞は、Bacillus subtilisまたはBacillus licheniformis細胞のようなBacillus細胞であることができ、それに導入されるベクターはｈａｓ遺伝子が操作結合するBacillus適合性プロモーターを含む。
更に好ましい態様では、宿主細胞は、Bacillus alkalophilus、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus brevis、Bacillus circulans、Bacillus clausii<
Bacillus coagulans、Bacillus firmus、Bacillus lautus、Bacillus lentus、Bacillus licheniformis、Bacillus metaterium、Bacillus pumilus、Bacillus stearothermophilus、Bacillus subtilisおよびBacillus thuringienisisのようなBacillus細胞である。
【００６３】
好ましい態様では、ＨＡシンターゼコードＤＮＡセグメントは、特定の宿主により連続配列の複製を可能にする複製の起点またはレプリコンとして機能することが当該技術分野で知られているＤＮＡ配列も包含する。このような起点では、ＨＡシンターゼＤＮＡ配列が連結している染色体外に局在している複製用キメラセグメントまたはプラスミドを調製することができる。更に好ましい例では、用いる起点は、バイオテクノロジーによる応用に適する細菌宿主で複製することができるものである。しかしながら、クローニングしたＤＮＡセグメントの用途を更に広くするには、（シャトルベクターでのような）使用が考えられる他の宿主系によって認められた起点を代替的にまたは追加的に用いることが望ましいことがある。
【００６４】
多数の高等生物のクローニングや発現に用いることができるＳＶ４０、ポリオーマまたはウシ乳頭腫ウイルス起源のような他の複製起源の単離および使用は、当業者には周知である。従って、ある態様では、本発明は、 may thus be defined in terms of a適当な複製起源と共に選択された制御領域によって制御されているＨＡシンターゼコード遺伝子配列を包含する組換え形質転換ベクターに関して定義することができる。
【００６５】
従って、当業者であれば、他の手段を用いて、本発明の開示内容の観点からＨＡＳ遺伝子またはｃＤＮＡを得ることができることを理解されるであろう。例えば、連鎖球菌の他の株などの多数の供給源、またはｃＤＮＡライブラリーのような真核生物供給源由来の遺伝子またはｃＤＮＡの完全な補体を含むポリメラーゼ連鎖反応またはＲＴ−ＰＣＲによって産生されたＤＮＡ断片を得ることができる。実際には、任意の分子クローニング法を用いて、本発明のＤＮＡ断片を生成させることができる。従って、一般にＤＮＡ単離に用いる特定の方法についての唯一の制限は、単離された核酸が生物学的に機能が同等なＨＡシンターゼをコードすることである。
【００６６】
ＤＮＡを単離したならば、これを選択したベクターと連結させる。事実上任意のクローニングベクターを用いて本発明の利点を実現することができる。典型的な有用なベクターとしては、原核生物に用いるプラスミドおよびファージ、および真核生物に用いるウイルスベクターが挙げられる。例としては、ｐＫＫ２２３−３、ｐＳＡ３、組換え体λ、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、およびレトロウイルスが挙げられる。しかしながら、LactococcusまたはBacillus株およびE. coliのいずれでも複製が可能なベクターを用いる場合に、特にこの利点が実現されると思われる。
【００６７】
これらのようなベクター、例えば、Dao and FerrettiのｐＳＡ３ベクターまたはTrieu-Cuot, et al.のｐＡＴ１９ベクターにより、クローンコロニー選択をE. coliのような容易に操作される宿主で行った後、食品級のLactococcusまたはBacillus株に再導入してＨＡを産生することができる。これらは、ある種の食品およびバイオテクノロジー製品の製造に用いられる良性であり且つ詳細に研究された生物である。これらは、遺伝子添加（すなわち、増幅によるＨＡシンターゼ遺伝子の余剰コピーの提供）および／または追加遺伝子を包含することによりＨＡを合成するLactococcusまたはBacillus株を増加させ、ＨＡ前駆体の利用可能性を増加する点で有利である。細菌がＨＡを合成する固有の能力を、ＨＡシンターゼ遺伝子を有するプラスミドの余剰コピーの形成または増幅によって増加させることもできる。この増幅は、プラスミドコピー数、従ってＨＡシンターゼ遺伝子コピー数で１０倍までの増加を計上することができる。
【００６８】
ＨＡシンターゼ遺伝子コピー数を更に増加させるもう一つの手続きは、遺伝子の複合コピーをプラスミドに挿入することである。もう一つの手法としては、ＨＡＳ遺伝子の染色体ＤＮＡへの組込みが挙げられる。この余剰増幅は、細菌性ＨＡシンターゼ遺伝子のサイズが小さいので、特に実行可能である。幾つかの場合には、染色体ＤＮＡが連結したベクターを用いて、E. coliのようなクローンスクリーニング目的に選択される宿主を、選択した宿主で挿入したＤＮＡを発現することができるベクターを用いることによって、トランスフェクションする。
【００６９】
もう一つの好ましい態様では、ＨＡシンターゼ遺伝子を相同的または非相同的組換えにより宿主細胞染色体に導入する。ｈａｓ遺伝子は、特に薬剤選択のないこの配置では一層安定であることがある。様々なベクターを用いて、ｈａｓ遺伝子をｐＴＬＨまたはｐＫＳＶ７のようにBacillusに、またはＹＩｐ２１１のように酵母に、、またはｐｃＤＮＡ／ＦＲＴのように動物細胞に導入することができる。ＤＮＡを、最初に形質転換、形質導入または電気穿孔によって宿主細胞に導入する。ｈａｓ遺伝子を有するＤＮＡセグメントを、次に宿主染色体に安定的に組込む。例えば、ｓｐＨＡＳ遺伝子を用いて、突然変異体Streptococcus染色体を形質導入および組込みによって修復し、この操作により、ＨＡが産生される(DeAngelis et al., 1993)。
【００７０】
表皮または滑液繊維芽細胞、または雄鶏の鶏冠細胞のような真核生物供給源を用いる場合には、最初にｃＤＮＡライブラリーを調製することによって進もうとする。これは、最初に上記細胞からｍＲＮＡを単離した後に、逆転写酵素活性を有する酵素を用いて二本鎖ｃＤＮＡを調製し、選択されたベクターと連結することによって行われる。二本鎖ｃＤＮＡの調製については、多くの可能性が利用することがで飢渇当該技術分野で知られており、総てのこのような技術が応用可能であると考えられる。好ましい手法は、逆転写を伴う。二本鎖ｃＤＮＡの個体群が得られたならば、適当なベクターへの連結および適当な宿主での増幅などの一般に認められている手法によってｃＤＮＡライブラリーが選択された宿主で調製される。得られるクローンの数が多く且つ本明細書に記載の手法による多数のクローンのスクリーニングが比較的容易であるため、ｃＤＮＡクローンのクローニングおよび発現スクリーニングについてλｇｔ１１、λｇｔ１２、λＧｅｍ１１および／またはλＺＡＰのようなファージ発現ベクターを用いようとすることがある。
【００７１】
ある種の他の態様では、本発明は、配列番号：１、９、１１、１３、１５、１７および１９の少なくとも１個に本質的に記載された核酸配列をその配列中に含む単離されたＤＮＡセグメントおよび組換えベクターに関する。例えば、「配列番号：１に本質的に記載された」という用語は上記と同じ意味で用いられ、核酸配列が実質的に配列番号：1の一部に相当し且つ配列番号：１のコドンに同一でないまたは機能的に同等な比較的少数のコドンを有することを意味する。「機能的に同等なコドン」という用語は、本明細書ではアルギニンまたはセリンについての６個のコドンのような同一アミノ酸をコードするコドンを表し、且つまた表Ｉに記載の生物学的に同等なアミノ酸をコードするコドンをも表すのに用いられる。
【００７２】
アミノ酸および核酸配列は追加のＮ−またはＣ−末端アミノ酸または追加の５′または３′核酸配列のような追加残基を包含し、且つ配列がタンパク質発現および酵素活性が関係する生物学的タンパク質活性の保持などの上記の基準に合う限り、本質的に本明細書に開示された配列の一つに記載された通りでもあることも理解されるであろう。末端配列の付加は、特に例えば、コード領域の５′または３′部分のいずれかに隣接する様々な非コード配列を包含することがあり、または様々な内部配列を包含することがある核酸配列に適用され、これは遺伝子中で起こることが知られている。特に、真核生物でのHａｓ遺伝子生成物のアミノ酸配列は、原核生物で見られるものより４０%大きいと思われる。
【００７３】
遺伝子コードの縮重並びに保存および半保存置換を考慮すれば、配列番号：１、９、１１、１３、１５、１７、または１９のヌクレオチドに同一であるヌクレオチドの約４０%〜約８０%、または更に好ましくは約８０%〜約９０%、または更に好ましくは約９０%〜約９９%を有する配列は、「本質的に配列番号：１、９、１１、１３、１５、１７、または１９に記載されている通りである」配列である。配列番号：１、９、１１、１３、１５、１７、または１９に記載されているものと本質的に同一の配列は、標準的または余り緊縮的でないハイブリダイゼーション条件下で配列番号：１、９、１１、１３、１５、１７、または１９の補体を含む核酸セグメントにハイブリダイズすることができる配列と機能的に定義することもできる。適当な標準的ハイブリダイゼーション条件は、当業者には周知であり且つ本明細書に明確に記載されている。
【００７４】
本明細書で用いられる「標準的ハイブリダイゼーション条件」という用語は、実質的に相補的核酸セグメントが標準的Watson-Crick塩基対を形成する条件を表すのに用いられる。pH、温度、塩濃度、ホルムアミドおよびジメチルスルホキシドのような薬剤の存在、ハイブリダイズするセグメントの長さなど結合またはハイブリダイゼーションの特異性を決定する多数の因子が知られている。約１４〜約１００ヌクレオチドの断片のような短めの核酸セグメントをハイブリダイゼーションに用いようとするときには、ハイブリダイゼーションの塩および温度の好ましい条件は４０〜５０℃の１．２〜１．８×高リン酸緩衝液（ＨＰＢ）を包含する。
【００７５】
当然のことであるが、本発明は、配列番号：１、９、１１、１３、１５、１７または１９に記載の配列に相補的または本質的に相補的なＤＮＡ配列も包含する。「相補的」な核酸配列は、標準的Watson-Crick相補性則による塩基対を形成することができるものである。本明細書で用いられる、「相補的配列」という用語は、上記の同一ヌクレオチドの比較によって評価することができるまたは配列番号：１、９、１１、１３、１５、１７または１９の核酸配列にハイブリダイズすることができると定義されている実質的に相補的な核酸配列を意味する。
【００７６】
本発明の核酸セグメントコード配列自身の長さとは関係なく、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、追加の制限酵素部位、複合クローニング部位、エピトープタグ、ポリヒスチジン領域、他のコードセグメントなど他のＤＮＡ配列と結合し、それらの全体的長さがかなり変化するようにすることができる。従って、ほとんどあらゆる長さの核酸断片を用いることができるが、目的とする組換えＤＮＡプロトコールでの調製および使用が容易であることにより全体の長さを制限するのが好ましいと思われる。
【００７７】
当然のことであるが、本発明は、それぞれ配列番号：１、９、１１、１３、１５、１７または１９および配列番号：２、１０、１２、１４、１６、１８および２０の特定の核酸およびアミノ酸配列には限定されないことも理解されるであろう。従って、組換えベクターおよび単離したＤＮＡセグメントは、 variously
include theＨＡＳコード領域自身、選択された変更または修飾を基本コード領域に有するコード領域を様々に包含することができ、またはやはりＨＡＳ−コード領域を含む大きめのポリペプチドをコードするか、または様々なアミノ酸配列を有する生物学的機能が同等なタンパク質またはペプチドをコードすることができる。
【００７８】
CarterＡ型のP. multocidaのカプセルは、ヒアルロン酸（ＨＡ）を含むのではないかと長い間考えられていた。P. multocidaのＨＡシンターゼの特性決定により、それとｓｅＨＡＳおよびｓｐＨＡＳタンパク質との間の興味深い酵素学的差が明らかになった。
【００７９】
P. multocida細胞は容易に視認し得る細胞外ＨＡカプセルを産生し、２個の連鎖球菌ＨＡＳは膜タンパク質であるので、ニワトリコレラ病原体の膜調製物を試験した。初期の試験では、超音波処理のみから誘導される粗製膜画分は連鎖球菌ＨＡＳ活性の測定と同様な条件下で分析を行ったときには、ＨＡへのＵＤＰ−ＧｌｃＡｃ−依存的ＵＤＰ−［１４Ｃ］ＧｌｃＵＡの組込みは極めて低水準であった［ＧｌｃＵＡ導入約０．２pmol（タンパク質のμg）−１ｈ−１］。組換えｈａｓＡプラスミドを有するE. coli由来の酵素も、当初は単離が面倒なものであった。これらの結果は、同様の方法によってStreptococcusから得られる容易に検出可能な量と対照的である。
【００８０】
超音波処理と共にプロテアーゼ阻害薬の存在下での氷冷リゾチーム処理を用いる代替調製プロトコールにより、グラム陰性菌のいずれの種からもＨＡＳ活性を実質的に回収することができる。導入されたＧｌｃＵＡ５〜１pmol（μgタンパク質）−１ｈ−１のＨＡＳに対する特異活性は、野生型 P. multocidaの粗製膜について新規な方法でごく普通に得られた。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの非存在下では、ＵＤＰ−［１４Ｃ］ＧｌｃＵＡからの放射能は高分子量材料にほとんど組込まれなかった（両糖前駆体を用いる同一アッセイの＜１%）。カプセルのない突然変異体、ＴｎＡ、から調製した膜は、両糖ヌクレオチド前駆体を補足したときには、検出可能なＨＡＳ活性を持たなかった（データーは示さず）。Sephacryl S-200カラムを用いるゲル濾過分析は、イン・ビトロで合成した１４Ｃで標識した生成物の大部分の分子質量は、材料が空隙率で溶出するので≧８×１０４Daであり、このような値は少なくとも４００のモノマーから構成されるＨＡ分子に相当することを示している。この生成物はStreptomycesヒアルロニダーゼ消化に感受性であるが、プロテアーゼ処理には耐性である。
【００８１】
ＨＡＳアッセイのパラメーターを変化させて、ＵＤＰ−糖のP. multocida膜による多糖類への組込みを最大にした。連鎖球菌ｓｐＨＡＳは、Ｍｇ２＋を必要とするので、この金属イオンはP. multodda膜の開始アッセイに包含された。P. multocidaＨＡＳ（ｐｍＨＡＳ）はＴｒｉｓ型緩衝液中でpH６．５〜８．６で比較的活性であり、pH７で最適となる。ＨＡＳ活性は、中性pHではインキュベーション時間に関して少なくとも１時間線形であった。ｐｍＨＡＳは高めのイオン強度では明らかに活性が低かったが、１００mMのＮａＣｌを５０mM Ｔｒｉｓ，pH７および２０mM ＭｇＣｌ２を含む反応に加えることによって糖の組込みが約５０%まで減少するからであった。
【００８２】
ｐｍＨＡＳの金属イオン特異性は、pH７で評価した。ＥＤＴＡの存在下での無金属条件下では、放射性標識した前駆体の多糖類への組込みは検出されなかった（最大シグナル＜０．５%）。Ｍｎ２＋は、試験金属（Ｍｇ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｃｕ、およびＮｉ）について最低イオン濃度において最高の組込み率を示した。Ｍｇ２＋は、Ｍｎ２＋の約５０%の刺激を与えたが、１０倍高濃度であった。Ｃｏ２＋またはＮｉ２＋は、１０mMでは低レベルの活性を維持したが（それぞれ、１mMのＭｎ２＋のアッセイの２０%または９%）、１０mMのCｕ２＋を供給した膜は不活性であった。実際に、１０mM Ｃｕ２＋と２０mM Ｍｇ２＋を膜調製物と混合すると、標識の多糖類への組込みはほとんど見られなかった（Ｍｇのみでの値の＜０．８%）。
【００８３】
ｐｍＨＡＳの最初の特性決定は、Ｍｇ２＋の存在下で行った。糖ヌクレオチド前駆体に対する酵素の結合親和性は、見かけのＫＭ値を測定することによって評価した。［１４Ｃ］ＧｌｃＵＡまたは［３Ｈ］ＧｌｃＮＡｃの多糖類への組込みは、それぞれ様々な濃度のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃまたはＵＤＰ−ＧｌｃＵＡで観察した。Ｍｇ２＋含有緩衝液では、ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡに対する約２０μMおよびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに対する約75μMの見かけのＫＭ値は、滴定データーのHanes-Woolfプロット（［Ｓ］／ｖ対［Ｓ］）を用いて決定した。いずれの糖に対するＶｍａｘ値も同じであったが、Hanes-Woolfプロットの１／Ｖｍａｘに相当する傾きが同等であったからである。Ｍｇ２＋を用いるアッセイからの結果と比較して、ＵＤＰ−ＧｌｃＡｃに対するＫＭ値は約２５〜５０%だけ増加して約１０５μMとなり、ＶｍａｘはＭｎ２＋の存在下で２〜３倍だけ増加した。
【００８４】
P. multocida、S. equisimilis、またはS. pyogenes由来のＨＡシンターゼ酵素ＵＤＰ−糖を利用するが、それらはpHおよび金属イオン依存性、およびＫＭ値に関して幾分異なる動力学的最適条件を有する。酵素はpH７で最も活性であったが、ｐｍＨＡＳは弱酸性pHで一層の活性を示し且つpH７．４より上では比較的不活性であるといわれている。ｐｍＨＡＳは、イン・ビトロアッセイ条件下ではＭｎ２＋をＭｇ２＋より効率的に利用するが、細菌細胞での生理学的金属補助因子の正体は知られていない。比較すると、連鎖球菌酵素を用いる以前の研究では、Ｍｇ２＋はＭｎ２＋より遙かに良好であるが、小さいとはいえの約１０分の1の濃度で最大となった。ｐｍＨＡＳは、ｓｐＨＡＳより強固にＵＤＰ−糖と結合すると思われる。粗製膜でのｐｍＨＡＳについて測定したＫＭ値は、連鎖球菌膜で見られるＨＡＳから得られた値よりそれぞれの基質について約２〜３分の１であり、それぞれＵＤＰ−ＧｌｃＵＡについては５０または３９μMであり、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃについては５００または１５０μMである。
【００８５】
動力学的分析により、ｐｍＨＡＳのＶｍａｘはＭｎ２＋の存在下ではＭｇ２＋より２〜３倍高かったが、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃＫＭ値は前者のイオンを用いるアッセイでは若干増加した。この明らかな親和性の低下の観察は、重合速度の増加は、Ｍｎ２＋イオン／糖ヌクレオチド複合体の（複数の）酵素活性部位への良好な結合によるものではないことを示唆している。従って、Ｍｎ２＋が幾らかの他の反応工程を高め、酵素の他の部位／構造を変更し、またはリン脂質膜環境を改質することが可能である。ｐｍＨＡＳの遺伝子配列およびタンパク質配列は、それぞれ配列番号：９および１０に示す。
【００８６】
クロレラウイルスＰＢＣＶ−１は、ヒアルロナンを合成することができる機能的グリコシルトランスフェラーゼをコードする。この知見は、ウイルスが(a)宿主細胞グリコシルトランスフェラーゼを利用して新規な炭水化物構造を作り上げるか、または(b)ビリオン成熟の際に宿主細胞複合糖質を蓄積するという一般的観察と相容れないものである。更に、ＨＡは、一般的には動物および少数のそれらの悪性の細菌性病原体に限定されると考えられてきた。多数の植物炭水化物が特性決定されてきてはいるが、ＨＡや関連類似体はこれまでのところ植物や原生動物の細胞に検出されたことはなかった。
【００８７】
脊椎動物、細菌およびウイルスのＨＡＳ酵素は、配列が類似した幾つかの領域を有している。ウイルスＰＢＣＶ−１［Paramecium bursaria クロレラウイルス］の二本鎖ＤＮＡゲノムの配列決定中に、様々なＨＡＳに対して２８〜３３%のアミノ酸同一性を有する５６７残基のタンパク質をコードするＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）、Ａ９８Ｒ（受入番号４４２５８０）を見出した。このタンパク質は、ｃｖＨＡＳ（クロレラウイルスＨＡシンターゼ）と呼ばれている。ＰＢＣＶ−１をコードする遺伝子配列およびこれがコードするタンパク質配列は、それぞれ配列番号：７および８に示されている。
【００８８】
ＰＢＣＶ−１は、ある種の単細胞性真核生物のクロレラに似た緑藻で複製する大型（直径１７５〜１９０nm）の多面体状のプラーク形成ウイルスの科(Phycodnarviridae)の原型である。ＰＢＣＶ−１ビリオンは、外側の糖タンパク質キャプシドの内側にある少なくとも５０種類のタンパク質および１個の脂質成分を含む。ＰＢＣＶ−１ゲノムは、共有結合により接近したヘアピン末端を有する線状の非置換(nonpermuted)の３３０kbのｄｓＤＮＡ分子である。
【００８９】
推定アミノ酸配列に基づけば、Ａ９８Ｒ遺伝子生成物は完全な膜タンパク質であるべきである。この仮定を試験するため、組換えＡ９８ＲをEscherichia coliで産生させ、膜画分をＨＡＳ活性について分析した。ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡおよびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを、コントロール細胞（＜０．００１pmolＧｌｃＵＡ導入/mgタンパク質/分)由来の試料によってではなく、プラスミドｐＣＶＨＡＳ上にＡ９８Ｒ遺伝子を含む細胞から誘導された膜画分（平均特異活性２．５pmolＧｌｃＵＡ導入/mgタンパク質/分）によって多糖類に組込んだ。ｐＣＶＨＡＳで形質転換した細胞の可溶性画分では、活性は検出されなかった。重合には、ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡとＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃが同時に必要とされた。活性は、１０mM ＭｎＣ１２の存在下においてpH７．２のＨｅｐｅｓ緩衝液で最適であったが、金属イオンを省いた場合には、活性は認められなかった。Ｍｇ２＋およびＣｏ２＋の効果は、同じ濃度ではＭｎ２＋の約２０%であった。ｐｍＨＡＳは同様の金属を必要とするが、他のＨＡＳではＭｇ２＋が好ましい。
【００９０】
組換えＡ９８Ｒ酵素は、組換えｓｐＨＡＳまたはＤＧ４２ｘｌＨＡＳによってイン・ビトロで合成したＨＡの平均分子量（それぞれ、約１０７Daおよび約５〜８×１０６Da）より小さな平均分子量３〜６×１０６Daを有する多糖類を合成した。この多糖は、ＨＡを脱重合するが、ヘパリンやコンドロイチンのような構造的に関連したグリコサミノグリカンは脱重合しない酵素であるStreptomyces hyaluroniticusＨＡリアーゼによって完全に分解された。
【００９１】
ＰＢＣＶ−１に感染したクロレラ細胞をＡ９８Ｒ遺伝子発現について検討した。約１，７００ヌクレオチドのＡ９８Ｒ転写体は、感染後約１５分後に現れ感染後６０分までに消失し、Ａ９８Ｒが初期遺伝子であることを示していた。従って、未感染およびＰＢＣＶ−１に感染したクロレラ細胞を、感染から５０および９０分後にＨＡＳ活性について分析した。感染細胞は活性を有したが、未感染細胞は活性を持たなかった。細菌から誘導された組換えＡ９８Ｒ酵素のように、放射性標識のＵＤＰ−［１４Ｃ］ＧｌｃＵＡから多糖類への組込みは、Ｍｎ２＋およびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの両者によって変化した。この放射性標識した生成物も、ＨＡリアーゼによって分解された。崩壊したＰＢＣＶ−１ビリオンは、ＨＡＳ活性を持たなかった。
【００９２】
ＰＢＣＶ−１に感染したクロレラ細胞を、高特異的１２５Ｉで標識したＨＡ結合タンパク質を用いてＨＡ多糖類について分析した。感染から５０および９０分後の細胞抽出物では、実質的な量のＨＡが含まれていたが、未感染藻類または崩壊したＰＢＣＶ−１ビリオンからの抽出物には含まれていなかった。標識したＨＡ結合タンパク質は、感染から５０および９０分後には損なわれていない感染細胞と相互作用を示したが、健康な細胞とは相互作用を示さなかった。従って、新たに合成されたＨＡ多糖類のかなりの部分は、感染した藻類の外部細胞表面に固定されていた。細胞外ＨＡはウイルスとその藻類宿主との相互作用に何ら明らかな役割を果たしていないが、プラークの大きさまたはプラーク数が、ＰＢＣＶ−１プラークアッセイのトップアーガーに精巣ヒアルロニダーゼ（４６５単位/ml）または遊離ＨＡ多糖類（１００μg/ml）のいずれかを包含することによって変化しなかったからである。
【００９３】
ＰＢＣＶ−１ゲノム も、ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ（ＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ）およびグルタミン：フルクトースホスフェートアミノトランスフェラーゼ（ＧＦＡＴ）をコードする追加遺伝子を有する。ＵＤＰ−ＧｌｃＤＨは、ＵＤＰ−ＧｌｃをＨＡ生合成に必要な前駆体であるＵＤＰ−ＧｌｃＵＡに転換する。ＧＦＡＴは、フルクトースホスフェートをＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ代謝経路の中間体であるグルコサミン−６−ホスフェートに転換する。これらのＰＢＣＶ−１遺伝子はいずれも、Ａ９８ＲＨＡＳと同様に、感染の初期に発現され、酵素活性を有するタンパク質をコードする。ＨＡ生合成経路に複合酵素が存在することは、ＨＡ産生がクロレラウイルスのライフサイクルに重要な機能を果たしているに違いないことを示している。
【００９４】
Streptococcus、脊椎動物、およびＰＢＣＶ−１のＨＡシンターゼは、同じ相対的順序で存在する少なくとも２〜４個の同一残基のパターンの多くのモティーフを有している。これらの保存モティーフは、図２に示されるようにＨＡ生合成に極めて重要なドメインを表していると思われる。図２は、それぞれS. equisimilisおよびS. uberis由来の群ＣのｓｅＨＡＳおよびｓｕＨＡＳ；S. pyogenes由来の群ＡのｓｐＨＡＳ；マウスアイソザイムｍＨＡＳ１、ｍＨＡＳ２およびｍＨＡＳ３；ヒトアイソザイムｈＨＡＳ１、ｈＡＳ２およびｈＨＡＳ３；カエルアイソザイムｘ１ＨＡＳ１およびｘ１ＨＡＳ２；本来のＰＢＣＶ−１ウイルスＨＡＳ、ｃｖＨＡＳ、並びにより新しいウイルスＨＡＳ ｖＮＣ、ｖＭＡ、ｖＡＬおよびｖＣＡ；ラットｒｎＨＡＳ２；ヒナｇｇＨＡＳ２；ウシｂｔＨＡＳ２；およびウサギアイソザイムｏｃＨＡＳ２およびｏｃＨＡＳ３のタンパク質配列を整列したものである。図２の整列は、Mutalin 5.4.1版 多重整列プログラム（版権I.N.R.A. フランス 1989, 1991, 1994, 1996; 階層クラスターリングによる多重配列整列(Multiple sequence整列 with hierarchical clustering), Corpet, Nucl, Acids Res., 16:10881 (1988))を用いて行った。コンセンサスラインを、整列の下部ライン上に設けている。コンセンサスラインの大文字は記載した総てのＨＡＳタンパク質で同一残基を表し、小文字は総ての場合に同一とは限らないコンセンサス残基を表している。コンセンサスラインは、下記の記号も含んでおり、！はＩ、Ｖのいずれかであり、＄はＬ、Ｍのいずれかであり、%はＦ、Ｙのいずれかであり、#はＮ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｂ、Ｚのいずれかである。記号比較表はblosum62であり、ギャップ重量は１２であり、ギャップ長さ重量は２であった。
【００９５】
ＨＡＳとＵＤＰ−糖前駆体からβ結合多糖類を合成する他の酵素との類似性の領域はまた、グリコシルトランスフェラーゼがより一層配列決定されるので、発見されている。例としては、細菌性セルロースシンターゼ、真菌および細菌性キチンシンターゼ、および各種ＨＡＳが挙げられる。これらの類似構造モティーフの重要性は、グリコシルトランスフェラーゼの三次元構造が集積するに従って一層明らかになるであろう。
【００９６】
図３は、既知のヒアルロナンシンターゼの可能な進化の関連性を表している。 図３の系統発生樹は、ＤＮＡシス(DNAsis)複合整列プログラムを用いるHiggins-Sharpアルゴリズムによって生成した。計算マッチング率は、系統樹のそれぞれの枝に示している。
【００９７】
本発明のＤＮＡセグメントは、生物学的に機能が同等なＨＡＳタンパク質およびペプチドを包含する。このような配列は、天然において核酸配列およびこのようにしてコードされたタンパク質中で起こることが知られているコドン過剰および機能的同等性の結果として生じる可能性がある。あるいは、機能的に同等なタンパク質またはペプチドは、交換されるアミノ酸の特性の考察に基づいてタンパク質構造の変化を工学処理することができる組換えＤＮＡ技術を応用することによって作製することができる。ヒトによってデザインされた変化を、位置指定突然変異誘発技術を応用することによって導入し、例えば、酵素活性またはＨＡＳタンパク質の抗原性に対する改良を導入し、または分子レベルでのＨＡシンターゼ活性を検討する目的でＨＡＳ突然変異体を試験することができる。
【００９８】
また、ＨＡＳコード配列の特異的変化により、サイズ分布または構造的配置が変更されたＨＡを生じることができる。当業者であれば、ＨＡＳコード配列を、変更されたヒアルロネートシンターゼを産生する方法で操作することができ、次に、様々なポリマーサイズおよび／または機能上の性能を有するヒアルロン酸を産生することができることを理解するであろう。例えば、ＨＡＳコード配列をヒアルロネートシンターゼの糖基質特異性が変更されるようなやり方で変更して、ヒアルロネートシンターゼがこれまでは組込まれなかった糖または糖誘導体のような異なる構造を組込む新規なヒアルロン酸様ポリマーを生じるようにすることができる。この新たに組込まれた糖は様々な機能特性を有する改質ヒアルロン酸であるより小さなまたはより大きなポリマーサイズ／分子量または両方を有するヒアルロン酸を生じることができた。ＨＡＳコード配列を考慮すれば当業者によって理解されるように、変化および／または置換をＨＡＳコード配列に行い、これらの所望な特性および／またはサイズを変更することができる。表IIに、組換えｓｅＨＡＳの糖ヌクレオチド特異性およびマグネシウムイオン要件を示す。
【００９９】
【表２】
2005514059.tif 000072
【０１００】
本明細書で用いられる「変更された構造」という用語は、天然に存在するＨＡ多糖類では通常は見られない糖または誘導体を含むヒアルロン酸ポリマーを表す。「変更されたサイズ分布」という用語は、天然の酵素では通常は見られないサイズ分布のヒアルロン酸分子の合成を表し、工学処理したサイズは正常よりもずっと小さくまたは大きくすることができた。
【０１０１】
異なるサイズの様々なヒアルロン酸生成物は、薬剤送達など様々な分野で応用される。血管新生および外傷治癒での応用は、約４〜約２０の単糖類のヒアルロン酸ポリマーを良好な量で作製することができる場合には、大きい可能性がある。小さなヒアルロン酸オリゴ糖に付いてのもう一つの特別な応用は、医薬用に用いる組換えヒトタンパク質の安定化におけるものである。このようなタンパク質の主要な問題点は、血液からのそれらのクリアランスおよび生物学的半減期が短いことである。この問題に対する一つの現在の解決法は、タンパク質が循環から余り速やかに除去されるのを防止する小分子シールドを結合することである。分子量が極めて小さなヒアルロン酸が、この役割に十分適しており、また非免疫原性且つ生体適合性である。大きめの分子量のヒアルロン酸を薬剤やタンパク質に結合したものを用いて、ヒアルロン酸のエンドサイトーシス受容体を有する網内細胞系にターゲッティングすることができる。
【０１０２】
本明細書の開示内容を考慮すれば、当業者であれば、ヒアルロネートシンターゼによって作製されたヒアルロン酸ポリマーのサイズ分布を調整して異なるサイズを得ることができる幾つかの方法があることを理解されるであろう。第一に、生成物サイズの動力学的制御を、温度を減少させ、酵素作用時間を減少させ、および糖ヌクレオチド基質の一方または両方の濃度を減少させることによって変更することができる。これらの変量のいずれかまたは総てを減少させると、一層少量および一層小さなサイズのヒアルロン酸生成物が得られる。これらの方法の不都合な点は、生成物の収率も減少しまた日毎のまたはバッチ毎の再現性を得ることが困難なことがあることである。
【０１０３】
第二に、ＨＡポリマーのサイズ分布は、酵素が大きなヒアルロン酸生成物を合成する固有の能力を変更することによって調節することができる。タンパク質の変化は、特異的アミノ酸の置換、欠失および付加（または代謝過程中の置換基の導入）などの組換えＤＮＡ技術によって遺伝子工学処理を行うことができる。本質的に一層遅い酵素を生じるこのような変化により、次に動力学的手段によってヒアルロン酸サイズの制御が一層再現性のあるものとなる。最終的なヒアルロン酸サイズ分布は、配列中の特定のアミノ酸に依存している酵素のある種の特徴によって決定される。連鎖球菌酵素と真核生物ヒアルロネートシンターゼとの間に絶対的に保存される残基の２０%には、酵素が作製することができるヒアルロン酸ポリマーのサイズを制御しまたはこれに大きな影響を与えるユニークな位置におけるアミノ酸の組がある。これらの残基のいずれかにおける特異的変化は、サイズ分布が変更したＨＡ生成物を生成する改質ＨＡＳを生成することができる。ヒアルロン酸が放出される前に酵素が作製することができるヒアルロン酸の固有サイズを増加させるｓｅＨＡＳ、ｓｐＨＡＳ、ｓｕＨＡＳ、ｐｍＨＡＳ、またはｃｖＨＡＳに対する遺伝子工学処理を施した変化により、天然の酵素より小さなまたは潜在的に大きなサイズのヒアルロン酸を生成する強力な手段が提供される。
【０１０４】
最後に、大きめの分子量のヒアルロン酸を特異的ヒアルロニダーゼで分解して、小さめの分子量のヒアルロン酸を作製することができる。しかしながら、この実施は再現性を得ることが極めて難しく、ヒアルロン酸を細心の注意で再精製してヒアルロニダーゼや望ましくない消化生成物を除去しなければならない。
【０１０５】
図４に示されるように、ヒアルロナンシンターゼを遺伝子工学処理して、異なるサイズの、特に通常の野生型酵素より小さなヒアルロン酸ポリマーを生成させることができる。図は、一連のｓｐＨＡＳ酵素であって、それらのそれぞれが天然の酵素から単一アミノ酸変化を有するように位置指定突然変異誘発によって遺伝子工学処理したもののＨＡサイズの分布を示す（数百万ダルトン）。それぞれは、アラニンに置換した異なるシステイン残基を有する。白抜き記号を有する５本の曲線のクラスターは、下記のｓｐＨＡＳタンパク質：野生型、Ｃ１２４Ａ、Ｃ２６１Ａ、Ｃ３６６ＡおよびＣ４０２Ａを表している。黒塗り丸は、部分的にしか活性を持たない余り発現しなかったＣ２２５Ａタンパク質を表す。
【０１０６】
黒塗り三角形はＣ２８０Ａ ｓｐＨＡＳタンパク質を表し、通常の酵素または示されている他の変異体よりずっと小さな範囲のＨＡポリマーを合成することが見出されている。この実施の減少は、ヒアルロネートシンターゼ酵素を遺伝子工学処理を施して所望な範囲のＨＡ生成物サイズを合成することが可能なことを示している。本明細書に開示されたヒアルロネートシンターゼをコードするＨＡＳ遺伝子のいずれかを位置指定突然変異誘発によって処理して、所望な範囲のＨＡ生成物サイズを合成する酵素を生成することもできる。
【０１０７】
構造的に変更したヒアルロン酸は、所望なＨＡＳまたはｓｐＨＡＳの特定のアミノ酸を変化させることによるヒアルロン酸のサイズ分布の変更と概念的には異なるところがない。Ｎ−アセチル基が欠けているＵＤＰ−ＧｌｃＮであるかまたは別の化学的に有用な基に代わっているＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃが、特に有用であると予想される。強力な基質特異性は、保存されている２０%の中のアミノ酸の特定のサブセットに依存しているに違いない。コレラの残基の１個以上に対する特異的変化により、天然の酵素と比較して基質の１以上と余り特異的に相互作用しない機能的シンターゼが生成する。次に、この変更された酵素は、交替の天然または特別の糖ヌクレオチドを利用して、下記の(i)特定薬剤、タンパク質、または毒素を構造的に変更されたヒアルロン酸に共有カップリングして、一般的またはターゲッティングした薬剤送達、放射線学的手続きなどを行う、(ii)ヒアルロン酸自身または他の支持体に共有的に架橋して、一層強力な物性を有するゲルまたは他の三次元的生体材料を得る、および(iii)ヒアルロン酸を表面に共有結合させて生体適合性フィルムまたは単層を生成させる目的に様々な化学を用いることができるようにデザインされた糖誘導体を組込むことができた。
【０１０８】
細菌を遺伝子工学処理することによって、ヒアルロン酸を産生させることもできる。例えば、本発明者らは、糖ヌクレオチド前駆体の一つに対する遺伝子と同時にＨＡＳ遺伝子を含むB. subtilisの株を作製した。本発明者らは、この細菌はヒトで使用する生成物を産生する目的でバイオテクノロジー産業で頻繁に用いられているので、これを選択した。これらの細菌は、野生型の天然株を用いて現在入手し得るより多量にヒアルロン酸を産生することができる細菌の産生のための第一世代のプロトタイプとして用いようとするものであった。
【０１０９】
例えば、３株のBacillus subtilisをヒアルロナンシンターゼ （ｓｐＨＡＳ）およびＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ（ｈａｓＢ）についてのStreptococcus pyogenes遺伝子の一方または両方を含むように構築し、その結果を表IIIに示してある。 ＨＡを検出して定量するための高感度の市販放射能測定分析法に基づいて、両遺伝子を有する株（株番号３）はＨＡを産生して培地に分泌すると決定した。親株またはデヒドロゲナーゼ遺伝子のみを有する株（株番号１）はＨＡを産生しない。ｓｐＨＡＳ遺伝子のみを含む株番号２はＨＡを産生するが、株番号３の約１０%に過ぎない。アガロースゲル電気泳動は、株番号３によって培地に分泌されたＨＡは極めて高分子量であることを示した。
【０１１０】
表IIIのデーターは、B. subtills 168を遺伝子工学処理を行って、ｓｐＨＡＳ遺伝子およびｈａｓＢ遺伝子の組換えＤＮＡ技術による導入によってＨＡを産生して分泌することができることを表している。ＨＡは、後者の遺伝子が包含されなくともこの変更された株によって産生されるが、これを用いて産生したＨＡのレベルは非常に高められる。B. subtilis 168は、ＨＡ合成に必要な両糖ヌクレオチドのレベルを増加させる２種類の遺伝子（ｔａｕＤおよびｇｔａＢ）を含む。表IVは、B. subtilis 168がまた、ｈａｓＢ遺伝子の非存在下であっても、遺伝子工学処理を施してｓｅＨＡＳ並びに野生型とは異なるサイズのＨＡを産生するように遺伝子工学処理した特異的ｓｅＨＡＳ変異体を含み且つ（プラスミドｐＳＭ１４３，ＡＴＣＣ上で）発現するときに、ＨＡを産生することを表している。特に、変異体ｓｅＨＡＳ（Ｃ２２６Ａ）およびｓｅＨＡＳ（Ｃ２８１Ａ）は、B. subtilis 168生細胞でのＨＡ合成を支持した。コレラの後者の場合におけるＨＡ合成のレベルは、ＨＡ合成に必要な２種類の前駆体の内在性レベルが低いためｓｐＨＡＳおよびｈａｓＢ遺伝子を発現する細胞で見られるものより低かった。
【０１１１】
ｈａｓＢおよびｓｅＨＡＳ（Ｃ２２６Ａ）またはｓｅＨＡＳ（Ｃ２８１Ａ）変異体を含むプラスミドで形質転換したB. subtilis 168細胞から単離した膜を用いるイン・ビトロ実験は、これらの変更されたＨＡＳ酵素によって産生されたＨＡサイズ分布は、野生型ｓｅＨＡＳによって作製されたものよりそれぞれ大きいまたは小さいことを表していた。野生型ｓｅＨＡＳからB. subtilisで産生されたＨＡの近似的サイズは、１．５MDaである。
【０１１２】
ｓｐＨＡＳ遺伝子からの組換えＨＡの産生は、Bacillus licheniformisおよびEnterococcus faecalisでも明らかにされている。図６は、ＨＡについて染色したアガロースゲルのデジタルイメージである。ＨＡ産生は、ｓｐＨＡＳをコードするプラスミド（ｐＰＤ４１Δ５）を組込んだB. subtilis、B. 1icheniformisおよびE. faecalis株で見ることができる。ネガティブコントロールとして、非官能性ｈａｓＡ遺伝子を含むプラスミド（ｐＰＤ４１ΔＥｃｏＲＶ）をそれぞれの株に導入したが、これらの株はいずれもＨＡを産生することができなかった。
【０１１３】
【表３】
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【０１１４】
【表４】
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【０１１５】
これらの実験では、これらの遺伝子を用いてタンパク質発現を行うのに通常見られる連鎖球菌プロモーターを用いた。グラム陽性またはBacillus適合性プロモーターの制御下でｓｐＨＡＳまたはｓｅＨＡＳリーディングフレームを有する株の構築により更に一層優れた結果を生じることが予想される。用いたベクターは、B. subtilisで中程度のコピー数とエリトロマイシン耐性の遺伝子（B. subtilis中で８μg/mlまたはE. coli中で１７５μg/mlに対する耐性を可能とする）を有するグラム陽性／E. coliシャトルベクターである。用いたB. subtilis宿主株は、BGSC製の1A1であり、これはトリプトファン要求を有するがそれ以外は野生型であり、胞子形成をすることができる。細胞増殖とＨＡ産生は、Spizizens最小培地にトリプトファン、グルコース、微量元素、およびエリトロマイシン（８μg/ml）を加えたもので行った。増殖は、培地が消費されるまで（約３６時間）激しく攪拌しながら３２℃で行った。
【０１１６】
表IIIおよびIVは、通常はヒアルロン酸を産生しないこれらの生物工学処理した細胞が、それらをｓｐＨＡＳまたはｓｅＨＡＳ遺伝子で形質転換すると、ヒアルロン酸を産生する能力を有するようになったことを表している。本明細書に記載のＨＡＳ遺伝子のいずれか一つを非ヒアルロン酸産生細菌に導入して、ヒアルロン酸を産生することができる生物工学処理した細菌株を生じることもできる。
【０１１７】
ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ由来の本明細書に記載のＨＡＳ遺伝子の一つの発現については、ＨＡＳタンパク質の組換え調製のための発現系の調製に写ることができる。原核生物または真核生物系での発現のためのＤＮＡ切片の遺伝子工学処理は、組換え発現に熟練した者に一般に知られている技術によって行うことができる。
【０１１８】
ＨＡＳは真核生物系で良好に発現させることができるが、本発明者らは細菌発現系を総ての目的のためのＨＡＳの調製に用いることができることを断言する。細菌での発現は、究極的には、使用の容易さ、生産コスト、およびそれによって得られる材料の品質に関して真核生物での発現より遊離であると考えられる。
【０１１９】
連鎖球菌のヒアルロナンシンターゼ（ｓｅＨＡＳ）の精製を、表Ｖおよび図７に示す。精製工程図の様々な段階からの画分を１２．５%ゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した後、これをCoomassie Brilliant Blue R-250で染色した。レーン：分子量マーカー；１，組換えｓｅＨＡＳ−Ｈ６を含む全E. coli膜；２，膜の洗剤可溶化の後の不溶性画分；３，洗剤で可溶化した画分；４，Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィー樹脂からのフロー−スルー；５〜９，カラムの５回連続洗浄（それぞれ２カラム容量）；１０，単一バンドである純粋なＨＡシンターゼの溶出分。ｓｐＨＡＳの精製は、ｓｅＨＡＳについて示したもの(Tlapak-Simmons, 1999)と同じであった。
【０１２０】
【表５】
2005514059.tif 000075
【０１２１】
ＨＡＳをコードするＤＮＡセグメントによる宿主細胞の形質転換により、ＨＡＳを得るための好都合な手段が提供されることが提案されている。宿主細胞は、当然のことであるが、ゲノム転写体を処理してタンパク質への翻訳のための機能的ｍＲＮＡを生成するので、ｃＤＮＡ、ゲノム配列およびそれらの組合せが真核生物での発現に適することも提案されている。
【０１２２】
本発明のもう一つの態様は、配列番号：２、１０、１４、１６、１８または２０に記載のアミノ酸配列、または保存または半保存アミノ酸変化を有する機能的に同様なものを含むタンパク質をコードするベクターを含んでなる組換え宿主細胞の増殖を含んでなるタンパク質組成物の製造方法である。宿主細胞は、核酸発現およびタンパク質産生の後、このようにして生成したタンパク質の回収を可能にする条件下で増殖される。宿主細胞、核酸発現、タンパク質産生および回収を可能にする条件を包含するＨＡＳおよび究極的にはＨＡの産生は、本発明の開示内容および本明細書に記載の方法を考慮すれば、当業者には明らかになるであろう。
【０１２３】
ヒアルロン酸の発現に好ましい宿主は、S. equisimilis、およびStreptococcus種の他の適当な細菌のような原核生物である。しかしながら、ＨＡは、Bacillus、Enterococcus、またはEscherichia属の種の細菌などの組換えＨＡシンターゼを発現する異種宿主細胞によって合成することができることも知られている。本発明のＨＡシンターゼの発現に最も好ましい宿主は、Lactococcus種、Bacillus subtilisまたはE. coliなどの本発明のＨＡＳ遺伝子で形質転換した細菌である。
【０１２４】
本発明のＨＡの発現方法に用いられる最も好ましい宿主としては、Bacillus種が挙げられるが、これらの細胞は有効な工業用分泌体であるからであり、幾つかの種はＧＲＡＳ生物と呼ばれている。本発明の方法に利用できるBacillus細胞の例としては、Bacillus alkalophilus、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus brevis、Bacillus circulans、Bacillus clausii、Bacillus coagulans、Bacillus firnus、Bacillus lautus、Bacillus lentus、Bacillus licheniformis、Bacillus metaterium、Bacillus pumilus、Bacillus stearothermophilus、Bacillus subtilis、およびBacillus thuringienisisが挙げられるが、これらに限定されない。最も好ましい宿主は、Bacillus subtilisである。
【０１２５】
同様に、ほとんどあらゆる真核生物発現系をＨＡＳの発現に用いることができる考えられており、例えば、バキュロウイルス由来、グルタミン由来、ジヒドロホレートレダクターゼ由来の系、ＳＶ−４０由来、アデノウイルス由来、サイトメガロウイルス由来、酵母由来などの系を用いることができる。このやり方で発現を行うため、コード配列をプロモーターに隣接し且つこれの制御下に置く。当該技術分野では、コード配列をこのようなプロモーターの制御下に置くには、タンパク質の転写リーディングフレームの転写開始部位の５′末端を選択したプロモーターの約１〜約５０ヌクレオチド「下流」（すなわち、３′）に配置する、と理解されている。また、ｐＹＥＳ２のようなSaccharomyces cerevisiae発現ベクター系も、図８に示されるように、ＧＡＬプロモーターの制御下でＨＡＳを産生する。図８は、ｓｐＨＡＳまたはｘ１ＨＡＳ酵素がｐＹＥＳ２プラスミドを用いて組換え酵素で産生したことを示している。ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡおよびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを供給すると、これらのゲル濾過クロマトグラフィープロフィールで観察されるように（ＨＡピークは約１３ml〜約２５ml）、いずれの酵素も高分子量ＨＡを生成する。
【０１２６】
図８は、酵母膜で発現した組換えＨＡＳによって合成されたヒアルロン酸のゲル濾過分析を示している。(a)（元のＶａｌコドンをＭｅｔに代えた）ｓｐＨＡＳに相当する４１９アミノ酸残基のオープンリーディングフレームまたは(b)ｘ１ＨＡＳタンパク質をコードするＤＮＡ断片を、ｐＹＥＳ２酵母発現ベクター（Invitrogen製）中で標準的方法によってサブクローニングして、ｐＹＥＳ／ＨＡを産生した。この構築物を有する細胞由来の膜を、ガラスビーズと共に攪拌することによって調製した。ｐＹＥＳ／ＨＡから誘導された試料は実質的なＨＡシンターゼ活性を含み、「４２kDa」のＨＡＳタンパク質を特異抗体を用いるウェスタンブロット分析によって検出し、ベクターのみを有する細胞由来の膜は活性も免疫反応性バンドも持たなかった（図示せず）。膜（３１５μgタンパク質）を、最初にキャリヤーを持たないＵＤＰ−［１４Ｃ］ＧｌｃＵＡ（１μCi１４Ｃ）および９００μMの未標識ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃと共に５０mMＴｒｉｓ，pH７、２０mMＭｇＣｌ２、１mMＤＴＴ、および０．０５MＮａＣｌ（４５０μl反応容積）中で３０℃にて１．５分間インキュベーションした。このパルス標識期間の後、非放射能標識したＵＤＰ−ＧｌｃＵＡを最終濃度が９００μMまで加えた。試料（１００μl）を、１．５分（黒丸）および１５分（黒四角）のパルスの後および「チェース」後４５分（黒三角）に採取した。反応を、ＳＤＳを２%まで加え、９５℃で１分間加熱することによって停止した。試料を遠心分離によって不純物を取り除いた後、試料の半量を０．２MＮａＣｌ，５mMＴｒｉｓ，pH８で平衡にしたSepacryl S-500HRゲル濾過カラム（Pharmacia; １×５０cm）に注入した。
【０１２７】
カラムを０．５ml／分で溶出し、BioSafeIIカクテル（４．５ml，Research Products Intl.）を加えた後、画分（１ml）中の放射能を液体シンチレーション計数法によって定量した。ボイド容積および完全に包含された容積（totally included volumes）は、それぞれ１４mlおよび３５．５mlの溶出容積であった。ブルーデキストラン（平均２×１０６Da）のピークは、２５−２７mlで溶出した。真核生物の酵母細胞で発現した組換えＨＡＳは、イン・ビトロで高分子量のヒアルロン酸を生成する。
【０１２８】
真核生物発現を考察する場合には、典型的には、元のクローニングされたセグメントに含まれていないときには、ＨＡＳ遺伝子またはＤＮＡを含む転写単位に適当なポリアデニル化部位（例えば、５′−ＡＡＴＡＡＡ−３′）をＨＡＳ遺伝子またはＤＮＡを含む転写単位に組込もうとする。典型的には、ポリＡ付加部位は、転写停止前の位置ではタンパク質の停止部位の「下流」約３０〜２０００ヌクレオチドに配置される。
【０１２９】
通常用いられる真核生物宿主細胞の実質的にあらゆるものを、本発明に記載のＨＡＳの発現に関連して用いることができる。本発明のＨＡＳｃＤＮＡを発現するための好ましい細胞系の例としては、２９３、ＡｔＴ−２０、ＨｅｐＧ２、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、ＷＩ３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、ＲＩＮ、およびＭＤＣＫ細胞系など真核生物での発現に典型的に用いられる細胞系が挙げられる。これは、一般にＨＡＳ酵素をコードし且つこの酵素を発現することができる組換えＤＮＡセグメントを有する組換え宿主を提供し、クローニングしたＨＡＳ遺伝子またはｃＤＮＡの転写の余裕があり且つヒアルロン酸の産生に適した条件下にて培地中で組換え宿主を培養し、ＨＡＳ酵素または組換え宿主から分泌されたヒアルロン酸を分離して精製する工程を含む。
【０１３０】
一般に、クローニングしたＨＡＳ遺伝子またはｃＤＮＡの発現に適当な条件は、プロモーター、ベクターおよび用いられる宿主系によって変化する。例えば、Ｌａｃプロモーターを用いる場合には、イソプロピルチオガラクトシドのようなＬａｃ転写を刺激する材料を包含することによって転写を誘発させようとする。例えば、クローニングしたｓｅＨＡＳおよびｓｐＨＡＳ遺伝子は、図５に示されるように、ＨＡＳの精製のためのE. coli中でＨＩＳ６含有タンパク質として発現される。他のプロモーターを用いる場合には、様々な材料が転写を誘発しあるいはアップレギュレーションするのに必要なことがある。
【０１３１】
図５は、E. coliにおける組換えｓｅＨＡＳおよびｓｐＨＡＳの過剰発現を表している。膜タンパク質（レーン当たり５μg）を、還元条件下で１０%(w/v)ゲルを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画した。ゲルをクマシブルーR-250で染色し、写真撮影し、走査し、モレキュラーダイナミックスパーソナルデンシトメーター（PDSI P60型）を用いて定量した。ＨＡシンターゼの位置を、矢印で示す。レーンＡは天然のｓｐＨＡＳ（群Ａ）であり、レーンＣは天然のｓｅＨＡＳであり、レーンＥは組換えｓｅＨＡＳであり、レーンＰは組換えｓｐＨＡＳであり、レーンＶはベクターのみである。用いた標準品はBio-rad製低Mrであり、kDaで示した。
【０１３２】
シンターゼの発現を行う他に、好ましくは、糖ヌクレオチド前駆体の生合成に必要な酵素をコードする適当な遺伝子を包含することによって、またはＮ−アセチルグルコサミンまたはグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃまたはＧｌｃＮＨ２）のような前駆体供給酵素に対する基質およびグルコース（Ｇｌｃ）を含む増殖培地を用いることによって、ＨＡ合成に伝導性環境を提供しようとする。
【０１３３】
更に、酵素ヒアルロニダーゼを欠いている宿主に遺伝子を組込み、この酵素によって合成された生成物が培地中で分解されないようにしようとすることがある。更に、宿主は、ＨＡの産生が最適になるように選択される。例えば、適当な宿主は、ＨＡＳ酵素を支持するための糖ヌクレオチド前駆体を多量に産生し且つＨＡを多量に産生することができるものである。このような宿主は天然に見出すことができ、または突然変異誘発または組換えＤＮＡ技術など様々な手法によって作製することができる。糖ヌクレオチド合成酵素の遺伝子、特にＵＤＰ−ＧｌｃＵＡを産生するのに要するＵＤＰ−Ｇｌｃデヒドロゲナーゼを単離して、ＨＡＳ遺伝子またはｃＤＮＡと共にベクターに組込むこともできる。本発明の好ましい態様は、これらの補助的組換え遺伝子またはｃＤＮＡを含む宿主であって、これにより糖ヌクレオチド、従って、ＨＡの産生を増加することができるものである。
【０１３４】
宿主細胞の培養に用いる手段は、特に決定的であるとは思われない。有用な詳細については、米国特許第４，５１７，２９５号、第４，８０１，５３９号、第４，７８４，９９０号、または第４，７８０，４１４号明細書の開示を参照してもよく、上記開示内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている。S. equisimilisのような原核生物宿主を用いる場合には、ＣＯ２濃度を高めたブロス増殖培地中嫌気的条件下での細菌の醗酵を用いることができる。これにより、好気的条件下でより多量にＨＡを産生することができる。もう一つの考察は、嫌気的に増殖した連鎖球菌細胞は発熱性外毒素を産生しないことである。適当な増殖条件を、本発明に鑑みて当業者に知られているように、他の原核生物宿主について変更することができる。
【０１３５】
適当な宿主を構築し、ＨＡの産生に適する条件下で培養したならば、このようにして産生されたＨＡを分離する。典型的には、ＨＡは、組換え生物によって周りの培地に分泌されあるいは注がれ、既知の手法によって培地からＨＡを容易に単離することができる。例えば、ＨＡは、濾過、遠心分離および凝集の少なくとも一つによって細胞および断片から分離することができ、トリクロロ酢酸を加えることによってヒアルロン酸から細胞および断片の分離を一層容易にすることができる。次に、ＨＡを、沈澱、限外濾過および透析の少なくとも一つによって培地から分離する。沈澱剤としては、エタノールおよびイソプロパノールのようなアルコール、アセトンのような有機溶媒または化合物、または塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）または臭化セチルトリアンモニウム（ＣＴＢ）のような第四有機アンモニウム（脂肪族の正に帯電した）塩が挙げられる。
【０１３６】
ＨＡの単離に好ましい手法は、米国特許第４，５１７，２９５号明細書に記載されており、その内容は、その開示の一部として本明細書に引用されており、有機カルボン酸であるトリクロロ酢酸を醗酵の終了時に細菌懸濁液に加えるのである。トリクロロ酢酸により、細菌細胞が凝集して死滅し、これらの細胞および関連断片を所望な生成物であるＨＡから一層容易に分離することができる。不純物を除いた上清を濃縮して、透析し、有機酸を含む低分子量混入物を除去する。上記の手続きは、０．２２μm細孔径のフィルターを含むものなどのフィルターカセットによる濾過を用いている。透析濾過(diafiltration)を、溶液の伝導率が約０．５メガオームまで減少するまで継続する。
【０１３７】
濃縮したＨＡに過剰量の試薬級エタノールまたは他の有機溶媒を加えることによって沈澱させた後、沈澱したＨＡをエタノールで洗浄することによって乾燥させ、真空乾燥し、凍結乾燥してアルコールを除去する。次に、ＨＡをホウ酸緩衝液，pH８に再溶解させ、ＣＰＣ、または臭化トリメチルアンモニウム混合溶液であるＣＥＴＡＢのようなある種の他の有機アンモニウム塩で４℃で沈澱させることができる。沈澱したＨＡを、上記で参照した特許明細書に更に記載されている方法で、大ざっぱな濾過によって回収し、１MＮａＣｌに再懸濁し、透析濾過して、濃縮する。生成するＨＡをフィルター除菌し、所望な最終用途によって適当な塩、乾燥粉末または滅菌溶液に転換することができる。
【０１３８】
A. 用いることができる典型的な遺伝子工学処理法
膨大な細胞膜バリヤーのない細胞を宿主細胞として用いるときには、トランスフェクションは当業者に周知のリン酸カルシウム沈澱法によって行う。しかしながら、核注入、カチオン性脂質、電気穿孔、プロトプラスト融合、またはDuPontによって開発されたBIOLISTIC（商品名）生体粒子送達系によるなど他の方法を用いてＤＮＡを細胞に導入することもできる。DuPont系を用いることの利点は、形質転換効率が高いことである。原核生物細胞または実質的な細胞壁構造を含む細胞を用いるときには、トランスフェクションの好ましい方法は、コンピテンスまたは電気穿孔を誘発する目的で塩化カルシウムを用いるカルシウム処理である。
【０１３９】
所望なコード配列およびコントロール配列を含む適当なベクターの構築には、標準的連結手法を用いる。単離したプラスミドまたはＤＮＡ断片を、要求されたプラスミドを構築する上で所望な形態に開裂させ、調整し、再連結する。開裂は、適当な緩衝液中で（複数の）制限酵素で処理することによって行う。一般的には、約１μgのプラスミドまたはＤＮＡ断片を、緩衝液約２０枚履中で酵素約１単位と共に用いる。特定の制限酵素に適当な緩衝液および基質量は、製造業者によって指定されている。３７℃で約１時間のインキュベーション時間が、実行可能である。
【０１４０】
インキュベーションの後、タンパク質をフェノールとクロロホルムで抽出することによって除去し、核酸を水性画分からエタノールで沈澱することによって回収する。平滑末端が必要なときには、調製物をPolymerase I (Klenow)１０単位で１５℃で１５分間処理し、フェノール−クロロホルム抽出を行い、エタノールで沈澱させる。連結には、ほぼ等モル量の所望な成分であって、正確なマッチングを提供するように調整されたものを、０．５μgＤＮＡ当たりＴ４ＤＮＡリガーゼ約１０単位で処理する。開裂したベクターヲ成分として用いるときには、細菌性アルカリホスファターゼで前処理することによって開裂したベクターの再連結を防止することが有用であることがある。
【０１４１】
構築したプラスミドで機能的配列を確かめるための分析には、第一段階は、３０〜３２℃での形質転換により特異的にコンピテントなE. coli SURE細胞(Stratagene)へのクローニングによってプラスミドＤＮＡを増幅することであった。第二に、組換えプラスミドを用いて、ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ前駆体を産生することができるE. coli KS株Bi8337-41を形質転換し、良好な形質転換体を適宜抗生物質耐性によって選択する。次に、形質転換体のライブラリーからのプラスミドを、ＨＡ産生を示す細菌コロニーについてスクリーニングする。これらのコロニーを採取して、増幅し、プラスミドを精製して、制限マッピングによって分析する。次に、機能的ＨＡＳ遺伝子のプラスミドを示す兆候を、当業者によって知られている任意の数の配列分析手法によって更に特性決定する。
【０１４２】
B. 供給源および宿主細胞培養物およびベクター
一般に、原核生物を用いて、本発明に有用なベクターのＤＮＡ配列および構造の初期クローニングを行った。適当な供給源はグラム陽性細胞、特に群Ｃの連鎖球菌株から誘導されたものであると考えられている。単一膜であるが厚い細胞壁を有する細菌、例えば、StaphylococciおよびStreptococciは、グラム陽性菌である。E. coliのようなグラム陰性菌は、細胞を取り巻く膜以外に２個の異なる膜を含む。グラム陰性生物の細胞壁は、一層薄くなる蛍光がある。グラム陽性生物の単一膜は、グラム陰性菌の内部の血漿膜に類似している。
【０１４３】
一般に、宿主細胞と適合性の種から誘導される複製および制御配列の起点を含むプラスミドベクターを、これらの宿主に関して用いる。ベクターは、通常は複製の起点並びに形質転換した細胞で表現型の選択を提供することができるマーキング配列を有する。例えば、E. coliは、典型的にはE. coli種から誘導されたプラスミドであるｐＢＲ３２２を用いて形質転換される。ｐＢＲ３２２はアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性の遺伝子を含み、従って、形質転換細胞を同定するための簡単な手段を提供する。ｐＢＲプラスミドまたはｐＵＣプラスミド、または他の微生物プラスミドまたはファージも、微生物自身のタンパク質を発現するために微生物が用いることができるプロモーターを含み、または含むように改質しなければならない。このようなプロモーターは、宿主細胞と適合性である、すなわち宿主細胞のＲＮＡポリメラーゼで認識され、ＲＮＡポリメラーゼが、宿主適合性プロモーターが付着する遺伝子を転写するようになる限り、非相同プロモーター、すなわち別の生物由来のプロモーターでよい。
【０１４４】
極めて一般的には、組換えＤＮＡ構築に用いられるこれらのプロモーターとしては、ＬａｃＺプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７バクテリオファージプロモーター、およびトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系が挙げられる。これらは最も一般的に用いられるものであるが、他の微生物プロモーターが発見されて、利用されており、そのヌクレオチド配列に関する詳細は公表されており、熟練者であれば、それらをプラスミドベクターと機能的に連結させることができる。
【０１４５】
また、このプロモーターは、プロモーター活性を増加させた改質ＲＮＡポリメラーゼプロモーターであってもよい。プロモーターの改質は、突然変異、または２個以上のプロモーター要素がタンデムに付加したものであってもよい。２個以上のプロモーター要素をタンデムに提供するときには、２個以上のタンデムプロモーター要素は同一プロモーター要素であってもまたは２種類以上の異なるプロモーター要素であってもよい。本明細書で用いられる「タンデムプロモーター要素」という用語は、それぞれがコード配列に操作可能に連結して、プロモーター配列がコード配列のｍＲＮＡへの転写を媒介することによってここと配列によってコードされたポリペプチドの産生を指示するようにする２個以上ののプロモーター配列を意味するものと理解される。タンデムプロモーター並びにBacillus細胞での発現においてそれを使用するための構築物および方法は、それぞれ１９９９年９月２１日および２００１年７階３日にWidner et al.に発行された米国特許第５，９５５，３１０号および第６，２５５，０７６号明細書に詳細に記載されており、その内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている。
【０１４６】
また、本発明の組換えベクターが２個以上の核酸セグメントであって、それぞれがタンパク質をコードするコード領域を有するもの、例えば、酵素活性を有するヒアルロン酸シンターゼをコードするコード領域を有する核酸セグメント、および酵素活性を有するＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするコード領域を有する核酸セグメントを含むときには、核酸セグメントのそれぞれはプロモーターに操作可能に連結する。２個以上の核酸セグメントを同一プロモーターに連結させることができ、この単一プロモーターが両遺伝子の発現を引き起こすことができ、または２個以上の核酸セグメントを異なるプロモーターに連結することもできる。
【０１４７】
原核生物の他に、酵母培養物のような真核生物の微生物を用いることもできる。Saccharomyces cerevisiae、または一般のパン酵母は、真核微生物の中で最も一般的に用いられるものであるが、数多くの他の株も通常は利用可能である。Saccharomycesで発現するには、例えば、プラスミドＹＲｐ７が一般に用いられる。このプラスミドは既にｔｒｐ１遺伝子を含んでおり、例えば、ＡＴＣＣ第４４０７６号またはＰＥＰ４−１のようなトリプトファンなしで増殖する能力を欠いている酵母の突然変異株の選択マーカーを提供する。次に、酵母細胞ゲノムの特徴としてのｔｒｐ１損傷の存在により、トリプトファンの非存在下で増殖することにより形質転換を検出するための効果的な環境を提供する。酵母ベクターにおける適当な促進配列としては、ガラクトース利用遺伝子のプロモーターである３−ホスホグリセレートキナーゼ、またはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼのような他の糖分解酵素が挙げられる。
【０１４８】
適当な発現プラスミドの構築において、これらの遺伝子と結合した終結配列を発現することが所望な配列の３′の発現ベクターにも連結させ、ｍＲＮＡのポリアデニル化および終結を提供する。増殖条件によって制御される転写の追加の利点を有する他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、チトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連した分解酵素、および上記のグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、およびマルトースおよびガラクトース利用に関する酵素のプロモーター領域である。酵母適合性プロモーター、複製の起点および終結配列を含む任意のプラスミドベクターが適当である。
【０１４９】
微生物の他に、多細胞生物由来の細胞の培養物を宿主として用いることもできる。原則的には、脊椎動物または無脊椎動物の培養物由来の任意のこのような細胞培養物が利用可能である。しかしながら、脊椎動物細胞での興味が極めて大きくなっており、培養物中の脊椎動物細胞の増殖は近年における日常的手順になってきている。このような有用な宿主細胞系の例は、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系、およびＷＩ３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ、およびＭＤＣＫ細胞系である。
【０１５０】
哺乳類細胞での使用については、発現ベクターに対する制御機能はウイルス材料によって提供されることが多い。例えば、一般に用いられるプロモーターは、ポリオーマ、Adenovirus 2、ウシパピローマウイルス、および最も頻繁にはSimian Virus 40（ＳＶ４０）から誘導される。ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターが特に有用であり、いずれも複製のＳＶ４０ウイルス起点をも含む断片としてのウイルスから容易に得られるからである。複製のウイルス起点に配置されたＨｉｎｄＩＩＩ部位からＢｇＬＩ部位に伸びる約２５０bpの配列を含む場合には、小さめまたは大きめのＳＶ４０断片を用いることもできる。
【０１５１】
更に、制御配列が宿主細胞系と適合性である場合には、通常は所望な遺伝子配列と結合しているプロモーターまたは制御配列を用いることもでき、且つ所望な場合が多い。複製の起点は、ベクターを外来起点を含むように構築することによって提供することができ、例えば、ＳＶ４０または他のウイルス（例えば、ポリオーマ、アデノ、ＢＰＶ）供給源から誘導することができ、または宿主細胞の染色体複製機構によって提供することもできる。ベクターが宿主細胞染色体に連結されているときには、後者の機構で十分なことが多い。
【０１５２】
C. 群ＣのStreptococcus equisimilisの高度にカプセル化した株からのbona fide HAシンターゼの単離
ｓｅＨＡＳと呼ばれるコードしたタンパク質は４１７アミノ酸（計算分子量４７，７７８およびpI９．１）であり、これまでに同定されたＨＡＳファミリーの中で最も小さなものである（図２）。ｓｅＨＡＳはまた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて変則的速やかに移動する（Mr 約４２kDa）（図５および９）。
【０１５３】
図９は、特異抗体を用いる組換えｓｅＨＡＳのウェスタンブロット分析をグラフに表したものである。組換えｓｅＨＡＳ（Ｅ；レーン２、７および９）またはｓｐＨＡＳ（Ｐ；レーン３、６、８および１０）を含む群Ｃ（Ｃ；レーン１）または群Ａ（Ａ；レーン４）の連鎖球菌膜、およびE. coli膜を還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画化し、ニトロセルロースにエレクトロトランスファーした。ニトロセルロースのストリップを、下記のｓｐＨＡＳの領域：中央ドメインペプチドＥ１４７−Ｔ１６１（レーン１〜４）；Ｃ末端ペプチド（レーン５〜６）；完全なタンパク質（レーン７および８）；組換え中央ドメイン（レーン９および１０）に対して生じた精製したＩｇＧ画分を用いる応用に記載されている方法でプローブし、展開した。非免疫ＩｇＧまたはベクターのみで形質転換した細胞由来の膜は、レーン５のように染色は生じなかった。
【０１５４】
ｓｅＨＡＳおよびｓｐＨＡＳタンパク質コード配列（それぞれ、配列番号：１および１３）は、７２%同一である。ｓｅＨＡＳの推定タンパク質配列は、合成ペプチド抗体との反応性によって確かめた（図９）。E. coliで発現した組換えｓｅＨＡＳを膜において主タンパク質として回収し（図５）、イン・ビトロでＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃおよびＵＤＰ−ＧｌｃＵＡの存在下にて極めて高分子量のＨＡを合成した（図１０）。
【０１５５】
図１０は、ｓｅＨＡＳおよびｓｐＨＡＳによって産生したＨＡサイズ分布の動力学的分析を示す。等量のｓｅＨＡＳまたはｓｐＨＡＳを含むE. coli膜を、応用に記載されているように、１．３５mMＵＤＰ−［１４Ｃ］ＧｌｃＵＡ（１．３×１０３dpm/nM）および３．０mMＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃと共に３７℃でインキュベーションした。これらの基質濃度は、それぞれのＫｍ値の１５倍を上回るものである。０．５、１．０および６０分後に採取した試料をＳＤＳで処理し、Sephacryl S400 HR上でクロマトグラフィー処理を行った。カラムの分画範囲におけるＨＡプロフィール（画分１２〜２４）を、それぞれの画分における総ＨＡの百分率に規格化する。最上部のパネルの矢印の上部の値は、Dawnマルチアングルレーザー光散乱装置（Wyatt Technology Corp.）を用いる別の実験で直接測定したＨＡのＭＷ（百万）である。０．５分（○、●）、１．０分（□、黒四角）および６０分後（△、▲）にｓｅＨＡＳ（●、黒四角、▲）およびｓｐＨＡＳ（○、□、△）によって合成されたＨＡのサイズ分布は、記載のように示される。分析は、ｓｅＨＡＳおよびｓｐＨＡＳは、それらが合成するＨＡ差のサイズ分布において本質的に同一であることを示していた（図１０）。ｓｅＨＡＳは、ＨＡを産生する能力がｓｐＨＡＳの２倍である。
【０１５６】
C.1 細菌株およびベクター
ムコイド群Ｃの株D181 (Streptococcus equisimilis)は、Rockefeller University Collectionから得た。E. coli宿主株のSureおよびXL1-Blue MRF'はStratagene製であり、株Top10 F'はInvitrogen製であった。特に断らない限り、連鎖球菌はＴＨＹで増殖させ、E. coli株はＬＢ培地で増殖させた。ｐＫＫ−２２３発現ベクターはPharmacia製であり、PCR 2.1クローニングベクターはInvitrogen製であり、予備消化したλZap Express TM Bam HI/CIAP VectorはStratagene製であった。
【０１５７】
（当業者には知られている）Caparon and Scottの方法によって単離されたStreptococcus equisimilis由来の高分子質量のゲノムＤＮＡをＳａｕ３Ａ１で部分消化して、平均サイズを２〜１２kbとした。消化したＤＮＡをエタノールで沈澱させ、洗浄して、Bam HI/CIAPλZap Expressベクターに連結した。連結したＤＮＡを、Promegaから得たPackagene（商品名）抽出物でファージに包装した。包装ファージライブラリーの力価を、XL1-Blue MRF' E. coliを宿主として用いてチェックした。
【０１５８】
C.3 縮重ＰＣＲ増幅
縮重(degenerate)オリゴヌクレオチドを、ｓｐＨＡＳ（Streptococcus pyogenes）、ＤＧ４２（Xenopus laevis HAS; 19）、およびｎｏｄＣ（Rhizobium meliloti根粒形成因子; 20）中の保存配列に基づいてデザインし、D181ゲノムＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲ増幅を行った。増幅条件は、９４℃で１分、４４℃で１分、７２℃で１．５分での３４サイクルの後、７２℃で１０分間の最終伸長であった。オリゴヌクレオチドHADRF1. 5'-GAY MGA YRT YTX ACX AAT TAY GCT ATH GAY TTR GG-3'（配列番号：４５）（センス鎖）は、配列D259RCLTNYAIDL（配列番号：４６）（ｓｐＨＡＳ）に相当する。オリゴヌクレオチドHACTR1, 5'-ACG WGT WCC CCA NTC XGY ATT TTT NAD XGT RCA-3'（配列番号：４７）（アンチセンス鎖）は、領域C404TIKNTEWGTR（配列番号：４８）（ｓｐＨＡＳ）に相当する。幾つかの位置における塩基の縮重度を、表ＶＩに示す縮重塩基についてのコードにおいてＩＵＰＡＣによって採用された命名法によって表している。
【０１５９】
【表６】
2005514059.tif 000076
【０１６０】
これらの２個のオリゴヌクレオチドは４５９bpのＰＣＲ生成物を生じ、これをアガロースゲル上で分離し、BIO-101 Genecleanキットを用いて精製した。次に、この断片を、TOP 10 F'細胞を宿主として用いて、製造業者の指示に従ってPCR2.1ベクターにクローニングした。二本鎖のプラスミドＤＮＡを、QIAfilter Plasmid Midi Kit (Qiagen)を用いてE. coli (Top 10 F')から精製した。２個の他の縮重センスプライマーであるHAVAF1, 5'-GTN GCT GCT GTW RTX CCW WSX TWT AAY GAR GA-3'（配列番号：４９）（ｓｐＨＡＳの領域V66AAVIPSYNE（配列番号：５０）に相当する）、およびHAVDF1, 5'-GTX RWT GAY GGN WSX WSN RAX GAT GAX GC-3'（配列番号：５１）（ｓｐＨＡＳのV100DDGSSNTD（配列番号：５２）に基づく）も合成した。２個のユニークなアンチセンスプライマーを４５９bpＰＣＲ生成物の配列に基づいて合成した。これらは、D181.2, 5'-GAA GGA CTT GTT CCA GCG GT-3'（配列番号：５３）およびD181.4, 5'-TGA ATG TTC CGA CAC AGG GC-3'（配列番号：５４）であった。２本の縮重したセンスプライマーのそれぞれは、D181.2またはD181.4と共に用いてD181ゲノムＤＮＡを増幅したときには、予想されたサイズのＰＣＲ生成物を得た。４個のＰＣＲ生成物を、上記と同じ方法を用いてクローニングして、配列決定した。それぞれのＰＣＲ生成物について、６個の異なるクローンから得た配列を比較して、コンセンサス配列を誘導した。このようにして、ｓｐＨＡＳと相同性の高い連続ｏＲＦを有する１０４２bpの配列を得た。
【０１６１】
C. ライブラリーのスクリーニング
２個の分子プローブである、クローニングした４５９bpのＰＣＲ生成物およびオリゴヌクレオチドD181.5 (5'-GCTTGATAGGTCACCAGTGTCACG-3'（配列番号：５５）; １０４２bpの配列から誘導)を用いて、ライブラリーをスクリーニングした。４５９bpのＰＣＲ生成物を、Prome-It 11ランダムプライマー標識キット（Stratagene）を用いて、製造業者の指示に従って放射能標識した。オリゴヌクレオチドを、［γ３２Ｐ］ＡＴＰを用いてKnace-It Kinasing Kit (Stratagene)によって標識した。放射能標識生成物を、NucTrap Push カラム(Stratagene)上で非標識材料から分離した。オリゴプローブは、サザンブロット分析でD181ゲノム消化物と特異的にハイブリダイズした。λファージライブラリーをスクリーニングするため、XLBLUE MRF'を吸着したファージを含むニトロセルロース膜上で宿主（３０００プラーク／プレート）として用いて、６０℃で予備ハイブリダイズし、QuikHyb Hybridization溶液（Stratagene）中で指示に従って８０℃で５′末端を標識したオリゴヌクレオチドD181.5とハイブリダイズした。
【０１６２】
次に、膜を２×ＳＳＣ緩衝液および０．１%(w/v)ＳＤＳで室温にて１５分間、６０℃で０．１×ＳＳＣ緩衝液および０．１%(w/v)ＳＤＳで３０分間洗浄して、乾燥した後、−７０℃でBio-Max MSフィルムに一晩露出した。陽性のプラークを再培養し、２回再スクリーニングした。純粋な陽性ファージを、クロロホルムでＳＭ緩衝液に採った。ベクタープライマーを用いるこれらのファージでのＰＣＲにより、３種類の異なるインサートサイズが明らかになった。
【０１６３】
ベクタープライマーとクローニングした１０４２bpの配列の異なる領域からのプライマーとの組合せを用いるＰＣＲにより、３種類の異なるファージの１個のみが完全なＨＡＳ遺伝子を有することが明らかになった。このファージでのインサートサイズは６．５kbであった。選択したファージライブラリークローンからの自動切除によりこのインサートをプラスミド形態にサブクローニングする試みは、失敗した。従って、ＰＣＲ法を純粋な陽性ファージＤＮＡに再度適用して、ｏＲＦの５′および３′末端を得た。オリゴヌクレオチドプライマーD181.3 (5'-GCCCTGTGTCGGAACATTCA-3')（配列番号：５６）およびT3 (ベクタープライマー)は３kbの生成物を増幅し、オリゴヌクレオチドD181.5およびT7 (ベクタープライマー)は２．５kbの生成物を増幅した。ＯＲＦの５′および３′末端配列は、これら２個の上記生成物を配列決定することによって得た。総てのＰＣＲ生成物の配列を分析することによって、１２５４bpのｓｅＨＡＳ遺伝子のＯＲＦを再構築することができた。
【０１６４】
C.5 ｓｅＨＡＳの発現クローニング
プライマーを、ｓｅＨＡＳの出発および停止コドン領域において、センスオリゴヌクレオチド（5'-AGGATCCGAATTCATGAGAACATTAAAAAACCTC-3'）（配列番号：５７）にＥｃｏＲ１制限部位およびアンチセンスオリゴヌクレオチド（5'-AGAATTCTGCAGTTATAATAATTTTTTACGTGT-3'）（配列番号：５８）にＰｓｔ１部位を含むようにデザインした。これらのプライマーは、D181ゲノムＤＮＡ由来並びに純粋なハイブリダイゼーション陽性ファージ由来の１．２kbＰＣＲ生成物を増幅した。１．２kb生成物をアガロースゲル電気泳動によって精製し、Ｐｓｔ１およびＥｃｏＲ１で消化し、Ｐｓｔ１およびＥｃｏＲ１で消化したｐＫＫ２２３ベクターに指向的クローニングした。連結したベクターをE. coli SURE細胞に形質転換し、次にこれを３０℃で増殖した。この段階は、他の宿主細胞またはより高温はクローニングしたインサートの欠失を生じるので、実際的に重要である。コロニーを単離し、それらのｐＤＮＡを精製した。６個のコロニー（ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆと命名した）の中、５個は正確なサイズインサートを有したが、１個はインサートを持たなかった。
【０１６５】
C.6 ＨＡシンターゼ活性
ＨＡシンターゼ活性を、５個の上記インサートから調整した膜で分析した。新鮮な対数相の細胞を３０００gで回収し、４℃でＰＢＳで洗浄し、膜を当業者に知られているプロトプラスト法の変法によって単離した。Streptococcus pyogenesおよびStreptococcus equisimilisからの膜調製物も、異なるプロトプラスト処理手順の変法によって得た。膜を、２０mMＭｇＣｌ２、１mMＤＴＥ、１２０μMＵＤＰ−ＧｌｃＵＡおよび３００μMＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを含む５０mMリン酸ナトリウムおよびカリウム, pH７．０中で３７℃でインキュベーションした。糖の組込みは、ＵＤＰ−［１４Ｃ］ＧｌｃＵＡ（３１８mCi/mM; ＩＣＮ）および／またはＵＤＰ−［３Ｈ］ＧｌｃＮＡｃ（２９．２Ci/mMＮＥＮ）を用いることによって観察した。反応を、ＳＤＳを２%(w/v)の最終濃度まで添加することによって停止した。生成物ＨＡを降下式ペーパークロマトグラフィーによって前駆体から分離し、原点における組込まれた放射能を測定することによって測定した。
【０１６６】
C.7 ゲル濾過分析
組換えｓｅＨＡＳまたはｓｐＨＡＳを含む膜によってイン・ビトロで産生される放射能標識したＨＡを、Sephacryl S500 HR (Pharmacia Biotech Inc.)のカラム上でクロマトグラフィーによって分析した。試料（２００mMＮａＣｌ、５mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ，pH８．０、および０．５%ＳＤＳ中０．４ml）を２００mMＮａＣｌ、５mMＴｒｉｓ−ＨＣｌおよびpH８．０で溶出し、０．５ml画分を１４Ｃおよび／または３Ｈ放射能について評価した。ＨＡ多糖類が真正のものであることを、Streptococcus hyaluroliticus (EC 4.2.2.1)のＨＡ特異的ヒアルロネートリアーゼで別個な同一試料を３７℃で３時間処理することによって評価した。次に、消化物に、ゲル濾過を行った。
【０１６７】
C.8 ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、Laemmliの方法に準じて行った。ニトロセルロースへのエレクトロトランスファーは、２０%メタノールを含む標準的ブロッティング緩衝液中で、Bio-Rad mini Transblot装置を用いて行った。ブロットを、ＴＢＳ中２%ＢＳＡでブロックした。タンパク質Ａ／Ｇアルカリホスファターゼ接合体(Pierce)およびｐ−ニトロブルーテトラゾリウム／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートｐ−トルイジン塩を用いて検出した。
【０１６８】
C.9 ＤＮＡ配列および分析
プラスミドを、蛍光標識したベクタープライマーを用いて両鎖について配列決定した。シークエンシング反応は、蛍光標識したプライマー（７−デアザＧを有する）についてThermosequenase（商品名）キットを用いて行った。試料をPharmacia ALF Express DNA Sequencer上で電気泳動を行い、データーをALF Manager Software v3.02によって分析した。インサートの内部領域を、ABI Prism 377 (Software v2.1.1)を用いる内部プライマーで配列決定した。曖昧な領域は、Sequenase（商品名）７−デアザ−ＤＮＡポリメラーゼ、７−デアザＧＴＰマスターミックス（USB）および［α−３５Ｓ］ｄＡＴＰ(Amersham Life Sciences)を用いて手で配列決定した。得られた配列を、DNASIS, v2.1 (Hitachi Software Engineering Co., Ltd.)を用いて編集して、分析した。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、Genbankおよび他のデーターベースの配列と比較した。
【０１６９】
C.10 ｓｅＨＡＳの同定
ｓｅＨＡＳの同定は、ｓｐＨＡＳ、ＤＧ４２（実験用に調整されたX. laevisＨＡＳであることが知られており、ｘｌＨＡＳと呼ばれる）、およびＮＯｄＣ（Rhizobiumβ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ）の中の高同一性の幾つかの領域に基づくオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲ法を用いて行った。ｘｌＨＡＳおよびＮＯｄＣタンパク質は、ｓｐＨＡＳとそれぞれ約５０%および約１０%の同一性を有する。この方法により、ｓｐＨＡＳに対する同一性が６６．４%である４５９bpＰＣＲ生成物を生じ、群Ａ（ｓｐＨＡＳ）ＨＡシンターゼ遺伝子の群Ｃの相同体（ｓｅＨＡＳ）が同定されたことを示していた。次に、この遺伝子の完全コード領域を、同様なＰＣＲに基づく方法を用いて再構築した。ＰＣＲプライマーの最終的組を用いて、ゲノムＤＮＡからの完全なＯＲＦを増幅した。この１．２kbのＰＣＲ断片を発現ベクターｐＫＫ２２３に組込み、E. coli SURE細胞で形質転換したところ、ＨＡ合成活性が試験した５個のコロニーの５個から単離した膜で認められた。
【０１７０】
再構築した遺伝子のＯＲＦは、データーベースにはなかった４１７アミノ酸の新規な予想されたタンパク質をコードし、これはｓｐＨＡＳより２アミノ酸短い。２種類の細菌タンパク質は７２%同一であり、核酸配列は７０%同一である。ｓｅＨＡＳの予想分子量は４７，７７８であり、予想等電点はpH９．１である。マウスおよびヒトアイソザイムのような最近同定された方法にＨＡＳ（それぞれｍＨＡＳ１，２，３およびｈＨＡＳ１，２，３、図２）は、最近タンパク質に類似している。２群の間の相対的同一性は約２８〜３１%であり、またｓｅＨＡＳの多くのアミノ酸は真核生物ＨＡＳのアミノ酸で高度に保存されている（例えば、Ｋ／ＲまたはＤ／Ｅ置換）。Ａ９８ＲであるＰＢＣＹ−１ＨＡＳは哺乳類ＨＡＳに２８〜３３%同一であり、脂質膜で同様なトポロジーを有することが予想される。哺乳動物種では、同じ科のものはほぼ完全に同一である（例えば、ｍｕＨＡＳ１およびｈｕＨＡＳ１は９５%同一であり、ｍｕＨＡＳ２およびｈｕＨＡＳ２は９８%同一である）。しかしながら、図３に示されるように、同一種内であっても、異なるＨＡＳ科のものは一層異なる（例えば、ｍｕＨＡＳ１およびｍｕＨＡＳ２は５３%同一であり、ｍｕＨＡＳ１およびｍｕＨＡＳ３は５７%同一であり、ｍｕＨＡＳ２およびｍｕＨＡＳ３は７１%同一である）。
【０１７１】
図１１は、ｓｅＨＡＳに対するヒドロパシープロットと予想膜トポロジーを示す。連鎖球菌の群ＣのＨＡＳに対する親水性プロットは、DNASISを用いるKyte and Doolittleの方法によって生成した。タンパク質は、完全な膜タンパク質であると予想される。
【０１７２】
図１２は、膜におけるｓｅＨＡＳのトポロジー構成のモデルを示す。タンパク質についての提案されたトポロジーはチャージ−インルール(charge-in rule)に従い、大きな中央ドメインを内側に置く。このドメインは、ほとんどの基質結合と酵素の触媒機能を含むと思われる。総てのＨＡＳファミリーのもので保存されるｓｅＨＡＳにおけるＣｙｓ２２６、並びに３個のシステインは、中央ドメインに示される。Ｃｙｓ２８１は、この変更が酵素によって合成されるＨＡ生成物のサイズ分布を劇的に変化させる可能性がある非常に重要な残基である。
【０１７３】
ｓｅＨＡＳについて予想される全般的膜トポロジーは、ｓｐＨＡＳおよびこれまでに報告された真核生物のＨＡＳについてのものと同一である。タンパク質は、アミノ末端における２個の推定的膜貫通ドメインと、カルボキシル末端における２〜３個の膜関連または膜貫通ドメインを有する。２種類の連鎖球菌酵素についてのヒドロパシープロットは実質的に同一であり、ｓｅＨＡＳにおけるＫ３１３〜Ｒ４０６（ｓｐＨＡＳではＫ３１３〜Ｋ４０５）の約９０残基の極端に疎水性の領域のトポロジーを予測することが困難なことを示している。
【０１７４】
ｓｅＨＡＳは、E. coli細胞で効率的に発現した。総膜タンパク質の約１０%は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの染色によって評価したところ、ｓｅＨＡＳであった（図５）。４２kDの顕著なｓｅＨＡＳバンドは、ベクターのみのコントロールレーンでは定量的に紛失している。膜タンパク質についてのこの異常に高レベルの発現は、SURE細胞で同じベクターを用いるｓｐＨＡＳについても見られる。膜タンパク質の約８%は、E. coli SURE細胞ではｓｐＨＡＳである。対照的に、群Ｃの膜におけるｓｅＨＡＳの量は、総膜タンパク質のせいぜい１%である。群Ａの膜におけるｓｐＨＡＳは、ほとんど検出されない。E. coli SURE細胞で発現した組換えｓｅＨＡＳは、必要な基質の一つであるＵＤＰ−ＧｌｃＵＡを欠いているので、イン・ビボではＨＡを合成しない。しかしながら、組換えｓｅＨＡＳタンパク質を含む膜は、基質ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃおよびＵＤＰ−ＧｌｃＵＡと共に供給すると、ＨＡを合成する。
【０１７５】
図１３は、組換えｓｅＨＡＳによる真正のＨＡの合成を示す。組換えｓｅＨＡＳまたはベクターのみを含む細胞から調製したE. coli膜（６９μg）を、本明細書に記載されているように最終容積が２００μl中で７００μMＵＤＰ−［３Ｈ］ＧｌｃＮＡｃ（２．７８×１０３dpm/nM; □, 黒四角)および３００μMＵＤＰ−［１４Ｃ］ＧｌｃＵＡ（３．８３×１０３dpm/nM; ○，●）と共に３７℃で１時間インキュベーションした。酵素反応を、ＥＤＴＡを２５mMの最終濃度まで添加することによって停止した。反応混合物の半量を、Streptomycesヒアルロニダーゼで３７℃で３時間処理した。ＳＤＳ（２%, w/v）をヒアルロニダーゼで処理した試料（○，□）および未処理試料（●，黒四角）に加え、９０℃で１分間加熱した。試料をカラム緩衝液（５mMＴｒｉｓ，０．２MＮａＣｌ，pH８．０）で５００μlまで希釈し、遠心分離によって透明にし、２００μlをSephacryl S-500 HRカラムに注入した。画分（１ml）を集め、放射能を測定した。ＢＤは、ブルーデキストラン（約２×１０６DA; Pharmacia）のピーク溶出位置である。Ｖ０は排除体積を示し、Ｖｉは包含された容積を表す。カラム上で分画されたＨＡの総量に組込まれた［１４Ｃ］ＧｌｃＵＡ：［３Ｈ］ＧｌｃＮＡｃの比は１．４であり、２種類の基質の特異活性の比と同一である。従って、生成物に組込まれた等のモル比は、真正のＨＡについて予測された通り１：１である。ベクターのみで形質転換した細胞からの膜は、ＨＡを合成しなかった。
【０１７６】
１２０μMのＵＤＰ−ＧｌｃＵＡおよび３００μMのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを用いると、ＨＡ合成は、膜タンパク質（≦０．２μg）とは少なくとも１時間線状であった。また、非形質転換細胞またはベクターのみで形質転換した細胞から調製した膜では、ＨＡＳ活性が検出されなかった。ＨＡ合成は、Ｍｇ＋２がＥＤＴＡとキレートしているか（コントロールの＜５%）、または２種類の基質のいずれかを省くと（コントロール約２%）、無視し得る程度である。組換えｓｅＨＡＳはまた、糖ヌクレオチド基質に対して予想された特異性を示し、ＵＤＰ−ＧａｌＡ、ＵＤＰ−ＧｌｃまたはＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを２種類の通常の基質のいずれかと共重合させることはできなかった（表II）。
【０１７７】
ゲル濾過分析に基づけば、ｓｅＨＡＳによって合成したＨＡの平均質量は５〜１０×１０６Daである。組換えｓｅＨＡＳの生成物は、両糖の等モル組込みおよび特異的Streptomycesヒアルロニダーゼによる分解に対するその感受性に基づいて真正のＨＡと判定される（図１３）。総ＨＡ合成の条件は（一方の基質の約９０%は生成物に組込まれたので）最適ではなかったが、この酵素は広汎な分布のＨＡ鎖長を産生した。ピーク画分は、約３６，０００のモノマー性糖を含むポリマーである７．５×１０６DaのＨＡ質量に相当する。このカラム上で分割されたＨＡサイズの分布は、２〜２０×１０６Daの範囲であった。
【０１７８】
ｓｅＨＡＳの推定タンパク質配列は、ｓｐＨＡＳタンパク質に対する抗体の群Ｃのタンパク質と交差反応する能力によって確認された（図９）。全ｓｐＨＡＳまたはｓｐＨＡＳの調度中央ドメインに対するポリクローナル抗体も、ｓｅＨＡＳタンパク質と反応した。ｓｐＨＡＳのＣ末端に対する抗ペプチド抗体は、ｓｅＨＡＳタンパク質におけるこの幾分異なる領域と交差反応しなかった。しかしながら、ｓｐＨＡＳ配列Ｅ１４７〜Ｔ１６１に対して指定した抗ペプチド抗体は、ｓｅＨＡＳにおける同じ予想配列を認識した。この抗ペプチド抗体は、連鎖球菌膜の天然のｓｅＨＡＳおよびｓｐＨＡＳとも反応し、両種からの天然および組換え酵素は同一サイズのものであることが確かめられる。ｓｐＨＡＳタンパク質と同様に、ｓｅＨＡＳはＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で異常に速く移動する。計算質量は４７，７７８Daであるにも拘わらず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるMrは一貫して約４２kDaである。
【０１７９】
中央ドメイン領域内での配列同一性および２種類の最近酵素について予測された全般的に同一構造であるので、領域Ｅ１４７〜Ｔ１６１に対するペプチド特異抗体を用いて、２種類のことなる酵素についての遺伝子で形質転換した細胞から調製した膜でのＨＡＳタンパク質発現を規格化することができる。この方法を用いて、本質的に同一量の組換えｓｐＨＡＳまたはｓｅＨＡＳを有する膜を、ＨＡ合成の諸規則度およびＨＡ生成物サイズの分布に関して比較した。
【０１８０】
ｓｐＨＡＳについて示されるように、ｓｅＨＡＳによるＨＡ鎖の合成は発展的である。この酵素は、最終生成物として放出されるまで増殖するＨＡ鎖と結合したままであると思われる。従って、ＨＡ鎖合成の最初のラウンド中に初期に産生したＨＡ鎖のサイズ分布を観察することによってｓｅＨＡＳおよびｓｐＨＡＳによるＨＡ伸長の速度を比較することができる。様々な時点でのＨＡ生成物のサイズのゲル濾過分析に基づいて、ｓｅＨＡＳによる平均速度伸長が３７℃で約９，０００単糖類／分であると推定した。５分間では、酵素は５〜１０×１０６DaのＨＡ鎖を重合することができる。従って、６０分間のインキュベーションでは、それぞれの酵素分子は５〜８のこのような大きなＨＡ分子のオーダーで潜在的に開始し、完結し、放出することができた。初期（例えば、≦１分）では、最初のＨＡ鎖の伸長を反映して、ｓｅＨＡＳによって産生したＨＡのサイズ分布はｓｐＨＡＳと比較してより大きな種に移動した。６０分までに、ＨＡ生成物サイズの２種類の分布は、見分けがつかなくなる。
【０１８１】
クローニングしたｓｅＨＡＳは、真正の群ＣのＨＡシンターゼを表す。従って、以前に報告されたまたは開示された「群Ｃ」のタンパク質は、真の群ＣのＨＡＳではない。ｓｅＨＡＳは、細菌、脊椎動物およびウイルスに由来するこの速やかに増殖するＨＡシンターゼファミリーを含んでなる現在知られているＨＡシンターゼの９個と相同である。この相同性を、具体的に図２に示す。哺乳類では、ＨＡＳ１、ＨＡＳ２およびＨＡＳ３と呼ばれる３個の遺伝子が同定されて、ヒトおよびマウスの３種類の異なる染色体に対してマッピングされている。両生類では、これまでに同定された唯一のＨＡＳタンパク質は実験用に調節されたＤＧ４２であり、これは１，９８８年にクローニングされ、酵母膜の組換えタンパク質の分析によってＨＡシンターゼ活性をコードすることが最近になって示された。恐らくは、他のX. laevisＨＡＳ遺伝子が間もなく同定されるであろう。
【０１８２】
分岐した進化モデルは、原始的な細菌ＨＡＳ前駆体が脊椎動物の発生の際に初期に奪われてしまった可能性があり、または原始的細菌が原始的ＨＡＳを取り込むときＨＡカプセルのを作製する細菌病原体法が発達したことを示唆している。細菌および真核生物ＨＡＳ酵素の通常の構造溶液への収束性進化は起こりそうもないが、起こる可能性はある。
【０１８３】
少なくとも１０個の同定したＨＡＳタンパク質は、同様なトポロジーを有する膜タンパク質であることが予想されている。ＨＡ合成は血漿膜で起こり、ＨＡは培地に注がれまたは細胞に結合したままであり、細菌カプセルまたは真核生物の細胞周辺コートを形成する。細胞質における糖ヌクレオチド基質を利用して、膜を通って外部空間に突出しているＨＡ鎖を組み立てる。
【０１８４】
ＨＡＳタンパク質の疎水性の高いカルボキシル部分におけるタンパク質トポロジーは、増殖するＨＡ鎖が同時に膜を通って突き出るので、酵素がこれを延ばす方法を理解する上で極めて重要であると思われる。例えば、前例のない酵素活性には、タンパク質の脂質二重層との異常で複雑な相互作用を必要とすることがある。ｓｐＨＡＳ−アルカリホスファターゼ融合タンパク質の分析に基づく予備的結果は、アミノおよびカルボキシル末端および大きなセントラルドメインが図１１および１２に示されるように総て細胞内にあることを示している。ｓｅＨＡＳタンパク質は、２個の基質結合部位とＨＡシンターゼに必要な２個のグリコシルトランスフェラーゼ活性とを含むと思われる大きなセントラルドメイン（総タンパク質の約６３%）も含む。最新のソフトウェアプログラムは、長いＣ末端の疎水性伸長内の膜結合ドメインの数または性状を確実に予測することはできないが、提案されたトポロジー配置は現在の証拠と一致しており、真核生物の酵素にも適用され、主として２個の追加的な予測された膜貫通ドメインを有するタンパク質のＣ末端の伸長により約４０%長い。
【０１８５】
ｓｐＨＡＳにおける６個のＣｙｓ残基の４個は、ｓｅＨＡＳで保存される。ｓｐＨＡＳのＣｙｓ２２５とｓｅＨＡＳのＣｙｓ２２４のみが、ＨＡＳファミリーの総てにおいて保存される。ｐ−メルキュロベンゾエートまたはＮＥＭのようなスルフヒドリル反応性化合物はＨＡＳ活性を著しく阻害するので、この保存されたＣｙｓは酵素活性に必要または重要であると思われる。しかしながら、位置指定突然変異誘発の検討からの初期の結果は、ｓｐＨＡＳのＣ２２５Ｓ突然変異体は不活性であり、野生型の活性の５〜１０%を保持することを示している。
【０１８６】
特異的オリゴヌクレオチドを用いるｓｅＨＡＳのみ、ｓｐＨＡＳのみ、またはｓｅＨＡＳとｓｐＨＡＳの両方をコードする核酸配列の認識は、図１４に示されている。センス−アンチセンスオリゴヌクレオチドの３個の対を、配列番号：１とｓｐＨＡＳのコード配列に基づいてデザインした。ｓｅＨＡＳをベースとした核酸セグメント（それぞれ、ｓｅ１〜ｓｅ２およびｓｅｓｐ１〜ｓｅｓｐ２，配列番号：３〜６）を、図１５に示す。これらの３個のオリゴヌクレオチド対を、典型的なＰＣＲ反応条件下で群Ｃ（ｓｅＨＡＳ）（レーン２、４および６）または群Ａ（ｓｐＨＡＳ）（レーン３、５および７）の連鎖球菌由来のゲノムＤＮＡとハイブリダイゼーションした。レーン１および８は、ＭＷ標準の位置をkb（キロベース）で示す。ＰＣＲ反応は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Promega製）を用いて、ＤＮＡ変性を行うため９４℃で１分間、ハイブリダイゼーションを行うための４８℃（小さめの普通のｓｅｓｐプライマーについては、４２℃）で１分間、およびＤＮＡ合成のため７２℃で１．５分間のように２５サイクル行った。次に、ＰＣＲ反応混合物を、１%アガロースゲル上で電気泳動によって分離した。
【０１８７】
ｓｅ１〜ｓｅ２プライマーを、群ＣのＨＡＳ（ｓｅＨＡＳ）に唯一特異的であるようにデザインした。ｓｐ１〜ｓｐ２プライマー対は、群ＡのＨＡＳ（ｓｐＨＡＳ）に唯一特異的であるようにデザインした。ｓｅｓｐ１〜ｓｅｓｐ２プライマー対は、群Ａおよび群ＣのＨＡＳ核酸配列のいずれにもハイブリダイズするようにデザインした。３種類のプライマー対は総て予想通りの挙動を示し、交差ハイブリダイズし、特異的および／またはユニークであるＰＣＲ生成物の生成を支持する適当な能力を示した。
【０１８８】
特異的ＰＣＲまたはハイブリダイゼーションに用いるオリゴヌクレオチドを、図１５に示す。配列番号：1の相当する領域を、配列番号：３、４、５および６の合成オリゴヌクレオチドのそれぞれについて示す。４個のオリゴヌクレオチドのそれぞれはｓｅＨＡＳ配列と特異的にハイブリダイズし、センス／アンチセンスプライマーの適当な対は、図１４に示されるポリメラーゼ連鎖反応に用いるのに適している。
【０１８９】
Bacillus subtilisにおけるｓｅＨＡＳの発現
図１６Ａおよび１６Ｂは、ゲル濾過クロマトグラフィーによって明らかにされるように、Bacillus subtilis株であるB. subtilis 168におけるｓｅＨＡＳから組換えＨＡの産生を示す。図１６Ａは、ｓｅＨＡＳを含むｐＳＭ１４３で形質転換したBacillus subtilis 168に対して、ｐＳＭ１４３のみで形質転換したBacillus subtilis 168でのＨＡの産生を比較したプロットである。ＨＡの産生は、約１３．５分から約１６分の間のピークによって視認することができる。図１６Ｂは、このピークを拡大して、ＨＡに組込まれなかった放射能標識したタンパク質および糖によって生じる大きなピークであって、図１６Ａで約１６．５分から約２０分までの間に見られるものを省いたものである。
【０１９０】
Bacillus subtilisにおけるｓｐＨＡＳによる組換えＨＡ産生のゲル濾過分析
図１７Ａは、Bacillus subtilisにおけるｓｐＨＡＳによって産生した組換えＨＡのサイズ分布の栄養制御を示している。ｓｐＨＡＳ酵素をコードするBacillus subtilis 168（ｐＰＤ４１Δ５）をLuria Bertaniブロス（ＬＢ）で培養し、ＨＡを産生したが、これはSpizzizens培地（Ｓｐ）で培養した同じ株（約１４．４３分がピーク）より早い時点（１３．４８分がピーク）でゲル濾過カラムから溶出した。これら２種類の培養物を平行して増殖させたが、大きなＨＡはＬＢで増殖した細菌によって産生される。トリチウム化したＨＡの放射能を、崩壊／秒（DPS）によって定量する。このネガティブコントロールは、通常は、B. subtilisはＨＡを産生しないことを示している。ｓｐＨＡＳで形質転換したB. subtilisによって作製されたＨＡピークは、特異的ＨＡリアーゼに感受性であるが、プロテアーゼには感受性でない。
【０１９１】
従って、宿主細胞を増殖する培地を変化させることによって、組換え宿主細胞で産生されるＨＡの分子量を変化させることができる。例えば、ＬＢ（Luria-Bertani）、Terrific Broth、ＮＺＣＹＭ、ＳＯＢ、ＳＯＣまたは２ｘＹＴ培地のような複合培地で組換え宿主細胞を増殖させることによって、Spizzizens培地またはＭ９最小培地のような化学的に定義された培地で増殖した組換え宿主細胞によって産生したＨＡと比較して一層大きな分子量のＨＡ分子が産生する。ＨＡのサイズを、グルコースのような供給される炭素供給源によって変化させることもできる。
【０１９２】
図１７Ｂは、ｓｐＨＡＳを含むBacillus subtilis 168およびベクターのみを含むBacillus subtilisを用いるとき、ピーク外観に生じる差を示している。
【０１９３】
Bacillus subtilisに３Ｈグルコサミンをイン・ビボ標識した後に得られた培地試料を、ゲル濾過分析によって分析した。この方法を用いることによって、細菌によって産生されるヒアルロン酸（ＨＡ）の相対的サイズおよび量を決定することができる。総ての試料を１６，０００×gで５分間遠心分離することによって不純物を除いた後、ゲル濾過を行った。放射性成分は、LB508 Radioflow Detector (EG & G Berthold)およびZinsserカクテル(1.8 ml/分)を用いて検出した。
【０１９４】
ＨＡポリマーのサイズを、Waters 600E装置上で、Phenomenex Po]ySep-GFC-P 5000または6000カラム（３００×７．８mm）上で０．２M硝酸ナトリウムで０．６ml/分で溶出することによって分析した。カラムを、様々なサイズのデキストラン（５８０、１４５、５０および２０kDa）またはＭＡＬＬＳによる６００および８０kDaの平均分子量を有するＭＡＮＴを標識したＨＡ（DeAngelis, 2001）で標準化した。ＭＡＬＬＳについては、ＨＡポリマー（１００μg）を最初に２本のタンデムToso Biosep TSK-GELカラム（6000PWXLの後に4000PWXL; それぞれ７．８mm×３０cm; 日本）に装填して、５０mMリン酸ナトリウム、１５０mMＮａＣｌ, pH７で０．５ml/分で溶出した。溶離液は、Optilab DSP干渉型屈折計中を流れ、次に多角モードのDawn DSFレーザー光度計（６３２．８nm; Wyatt Technology,サンタ・バーバラ,カリフォルニア）を流れた。製造業者のソフトウェアパッケージを用いて、ｄｎ／ｄＣ係数０．１５３を用いて絶対平均分子量を決定した。
【０１９５】
ＨＡ標準品は、連鎖球菌ＨＡ多糖類上のヒドロキシル基を無水Ｎ−メチルイサト酸で半化学量論的標識（１ＭＡＮＴ／約５０単糖類）によって作製した。６００kDa標準品を、調製用ＨＰＬＣを用いるバルク状ＨＡのサブ分画化によって得た。マイクロチップ（出力設定４）を備えたHeat Systems-Ultrasonic W-380超音波処理装置を用いるバルクＨＡの長時間の超音波処理（２分間隔で全部で３０分間、１%アセトン／水、氷上）を用いて、８０kDaの標準品を製造した。
【０１９６】
P. multocidaＨＡＳの非相同発現
ｐＰｍ７ＡインサートのＰｍＨＡＳＯＲＦを、Ｔａｑポリメラーゼ(Fisher)と推定アミノおよびカルボキシル末端附近の配列に相当するプライマー（コドンは大文字：センス、5'-gcgaattcaaaggacagaaaATGAAcACATTATCACAAG-3'（配列番号：５９）およびアンチセンス、5'-gggaattctgcagttaTAGAGTTATACTATTAATAATGAAC-3'（配列番号：６０）; 出発および停止コドンはそれぞれ太字）を用いて１３サイクルのＰＣＲによって増幅した。コドン２（T-Q）を変更し（斜体小文字）E. coliでのタンパク質産生を増加させた。プライマーはＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩ制限部位（下線部）も含み、発現プラスミドｐＫＫ２２３−３（ｔａｃプロモーター; Pharmacia）へのクローニングを促進した。生成する組換え構築体ｐＰｍＨＡＳをE. coli SURE細胞(Stratagene)に形質転換し、この株をイン・ビトロＨＡＳアッセイのための膜調製物の供給源として用いた。対数期培養物（ＬＢブロス，３０℃）を０．５mMイソプロピルチオガラクトシドで３時間誘導した後、回収した。プラスミドをE. coli KSにも形質転換し、生成する株を光学顕微鏡法および浮遊密度遠心分離法によってカプセルの存在について検討した。K5細菌培養物は、ＩＰＴＧの添加がＬＢまたは画定培地でのＨＡ濃度を有意に増加させなかったので、日常的には誘導されなかった。K5細菌は、ＨＡ合成の際にｐｍＨＡＳと相互作用する多糖類輸送タンパク質および機構を有し、これらのタンパク質が細胞からのＨＡ輸送を促進するので、有用な外来宿主である。
【０１９７】
ベクターｐＫＫ２２３−３のみを有する細胞からの試料ではなくｐＰｍＨＡＳプラスミドを含むE. coli SURE細胞由来の膜は、ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡおよびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを両方とも供給したところ（それぞれ、２５対*１．５pMＧｌｃＵＡ導入［タンパク質mg数］−１［時］−１）、イン・ビトロでＨＡを合成した。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを省きまたは二価金属イオンをＥＤＴＡとキレートさせると、［１４Ｃ］ＧｌｃＡの組込みは観察されなかった。組換えＨＡＳ由来のＨＡＳ活性は、Ｍｎ２＋はＭｇ２＋ より少なくとも１０倍活性を刺激したので、野生型P. multocida 膜から得た酵素に類似していた。
【０１９８】
組換えE. coliの培養物を、標識したＨＡ結合タンパク質を用いる放射能測定法でＨＡ多糖類の存在についても試験した。ｐＰｍＨＡＳを有するE. coli K5は、A600当たり４６０μg/mlのＨＡを産生した。K5細胞 with
ｐＫＫ２２３−３ベクターのみを有するK5細胞は、ＨＡを産生しなかった（* A600当たり０．０１μg/mlＨＡ）。比較のため、同じ培地で増殖させた野生型のP. multocida P-1059は、A600当たり１，１００μg/mlＨＡを産生した。ｐＰｍＨＡＳを有するE. coli K5は、ＨＡを高レベルで産生し、細胞がカプセル化された（図１８Ａ）。組換え株のカプセルの半径は約０．２−０．５μmであった（細菌細胞の幅を０．５μmと仮定）。このカプセルを、ヒツジ精巣ヒアルロニダーゼまたはStreptomycesＨＡリアーゼを用いる処理によって除去することができた（図１８Ｂ）。天然のK5宿主株もｐＫＫ２２３−３ベクターを含む形質転換体も、光学顕微鏡法によって測定したところ、容易に観察可能なカプセルを持たなかった。ｐＰｍＨＡＳを有するK5細胞も、浮遊密度遠心分離によってカプセル化されると思われた。組換え細胞は５８%Percollクッションの最上部に浮遊し、ベクター制御細胞またはヒアルロニダーゼで処理した組換え細胞は、Percollクッション中でペレット化した（図示せず）。
【０１９９】
カプセル生合成の際の輸送体におけるグリコシルトランスフェラーゼの役割
グリコシルトランスフェラーゼは反復ＧＡＧ主鎖の形成を触媒するが、場合によっては、これらの同一ポリペプチドが細胞膜を通ってポリマーを輸送する役割を果たすこともある。グラム陽性菌の群ＡおよびＣの連鎖球菌は１個のみの脂質膜を有し、カプセルオペロンがシンターゼ、およびＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ産生用の２種類の酵素ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼおよびＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ（約４キロ塩基のＤＮＡ; Crater and van de Rijn, 1995）。レポーター酵素を含む一連の連鎖球菌ｓｐＨＡＳ融合タンパク質のトポロジー分析では、このシンターゼが二重層の少なくとも４倍にわたり、膜と緊密に結合していることを示している(Heldermon et al. 2001)（図１９）。生化学および生物物理学的分析から、ｓｐＨＡＳまたはｓｅＨＡＳポリペプチドのモノマーと約１６個の脂質分子から構成される複合体は、両ＵＤＰ−糖の発生期のＨＡ鎖への導入を触媒すると思われる(Tlapak-Simmons et al. 1998)。小さな完全な膜ポリペプチドであるｓｐＨＡＳまたはｓｅＨＡＳは、タンパク質/脂質細孔を生成することにより二重層の疎水性コアを通る増殖するＨＡポリマー鎖の輸送を促進するには、脂質の補助を必要とすると思われる。
【０２００】
一方、ＧＡＧ生合成が可能なグラム陰性菌であるEscherichia coliおよびPasteurella multocidaは２個の脂質膜を有し、そのカプセル座がグリコシルトランスフェラーゼおよびＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ形成酵素（約１０−１８キロ塩基；Roberts, 1996; Townsend et al. 2001)の他に、多くの輸送体結合タンパク質をコードする。多くの詳細は十分には理解されていないが、最も詳細に研究されたモデルであるE. coli群IIのカプセル系では、発生期のポリマー鎖の輸送体は少なくとも７個の別個なポリペプチド種を必要とすると思われる(Whitfield and Roberts, 1999; Silver et al. 2001)。簡単には、ＫｐｓＣ、Ｍ、Ｓ、Ｔを含む複合体が内膜上に集まり、ＫｆｉＡ、Ｂ、Ｃ触媒複合体と相互作用する。ＫｐｓＭおよびＴは、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）輸送体を形成する。ペリプラズムタンパク質ＫｐｓＤおよびもう一つの内膜タンパク質の二量体ＫｐｓＥは、ペリプラズムを横切るポリマーの輸送を補助する(Arrecubieta, 2001)。外膜のポーリン複合体を補充して、細胞からの増殖する多糖類鎖を輸送する。
【０２０１】
ある種のＫｐｓ突然変異体は多糖類鎖を重合するが、不完全トランスロケーションを有しており、細胞質またはペリプラズムにポリマーが蓄積する。P. multocidaも、その推定輸送タンパク質のE. coliタンパク質との配列類似性および遺伝子配置に基づく群II様輸送系を有すると考えられる。
【０２０２】
ｐｍＨＡＳおよびｐｍＣＳの場合には、カルボキシル末端の尾が輸送機構と相互作用するドッキングセグメントを有すると思われる(Jing and DeAngelis, 2000)（図１９）。上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている。
【０２０３】
Streptococcus uberisＨＡＳ
図２１は、S. uberisk の４個の別々のムコイドコロニーからのＨＡＳ遺伝子のＰＣＲ増幅を表している。それぞれの試料について、バンドは約１．２５kbの予想サイズで明らかであり、ＰＣＲ増幅によって加えられたｓｕＨＡＳと制限部位の完全なリーディングフレームに相当する。
【０２０４】
図２２は、S. pyogenes、S. equisimilisおよびS. uberis由来のＨＡシンターゼ活性を表している。
【０２０５】
他の同定したＨＡＳ配列
本明細書に開示され且つ図２の配列に示されたＨＡＳ配列の他に、本発明のBacillus種でのＨＡの産生方法に用いることができる他のＨＡＳ配列が同定されている。例えば、配列番号：１５および１６は、それぞれ古細菌であるSulfolobus solfactaricusについてのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を開示している。エクストレモファイル(extremophile)からこのＨＡシンターゼの単離により、高温、すなわち約７５℃で機能できることにより本明細書に記載されたＨＡシンターゼより良好な安定性および一層速い反応速度を有するＨＡＳが提供される。
【０２０６】
連鎖球菌ｈａｓＡＢＣオペロンに類似の遺伝子の群は、Bacillus anthracisプラスミドｐＸＯ１で同定されており、これは炭疽菌毒素遺伝子を含む。しかしながら、ｐＸＯ１における遺伝子の順序はＡ、Ｃ、Ｂである。ｐＸＯ１プラスミドに対する完全配列は、受入番号ＡＦ０６５４０４を有し、ｈａｓＡに類似の配列はこの配列のＯＲＦ９３であり、１１１３７４で出発し、１１２４７４で停止する。配列番号：１７および１８は、それぞれB. anthracisのｐＸＯ１で同定されたｈａｓＡに類似の遺伝子のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を表す。B. anthracisには多糖類カプセルは報告されておらず、従って、これらの遺伝子を同定したグループのOkinaka et al.は、ｐＸＯ１ＯＲＦ９３、９４および９５は消失してしまわなければならない非機能的遺伝子の例であると考えている(J. Bacteriol. 181:6509 (1999))。
【０２０７】
第三の推定的ＨＡＳは、褐藻類Ectocarpus siliculosusに感染するウイルスで同定されている。アミノ酸およびヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号：１９および２０に見出すことができる。この例は、ＰＢＣＶ−１ウイルスのｃｖＨＡＳに類似していると思われる。
【０２０８】
任意の推定的ＨＡシンターゼについてＨＡシンターゼ活性（天然または組換え体）を示す一つの方法は、細菌を液体培地で増殖させ、多糖類画分を抽出し（すなわち、カチオン性洗剤による沈澱／高塩抽出／アルコール沈澱／水に再溶解／溶媒抽出／アルコール沈澱）、酸加水分解の後に単糖類の組成の分析を伴う。他の分析としては、完全なポリマーおよび酵素処理した試料（ＨＡリアーゼ、コンドロイチナーゼなど）のアガロースゲル電気泳動が挙げられる。また、ＥＬＩＳＡまたは競合フォーマットで特異的ＨＡ結合タンパク質を用いる生物学的分析法も有用である。酵素について試験するには、膜を細胞から調製し、各種のＵＤＰ−糖基質を提供した後、ポリマーへの組込みを分析した後、クロマトグラフィーおよび／または電気泳動を行う。プライマーと発現ベクターへＯＲＦをクローニングすることができるゲノムＤＮＡを有するＰＣＲを用いて遺伝子カセットを調製することによって、非相同発現が観察される。様々な宿主をこのようなベクターで形質転換することができ、生成する組換え細胞を本明細書に記載した多糖類および／または酵素について分析することができる。
【０２０９】
従って、本発明によれば、酵素活性を有するＨＡＳをコードするコード領域を導入した精製した核酸セグメントを有する組換え宿主細胞、並びにこの組換え宿主細胞からヒアルロン酸を製造する方法であって、上記の目的および利点を完全に満足するものが提供されることは明らかである。本発明を特定の態様について記載してきたが、多くの変更、改質および変形は当業者に明らかになることは、明白である。従って、本発明は、特許請求の範囲の精神および広汎な範囲内にある総ての変更、改質および変形を包含するものと考えられる。
【０２１０】
本願明細書（例および特許請求の範囲を含む）に記載の総ての数値および量の測定値は、近似的なものである。
【０２１１】
本明細書に例示的に開示または主張した本発明は、具体的には本明細書に開示または主張されていないあらゆる要素の非存在下で良好に実施することができる。従って、本発明は、本明細書に開示または主張した要素を含んでなり、からなり、またはから本質的になることができる。
【０２１２】
下記の特許請求の範囲は、この出願明細書と矛盾しない最も広汎な可能な範囲に権利が付与される。特許請求の範囲は、好ましい態様または例に示されている態様に必ずしも限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【０２１３】
【図１】ｓｅＨＡＳとｓｐＨＡＳ遺伝子の間で交差ハイブリダイゼーションが起こらないことを示す。レーン１および２のみで用いる群Ａのプローブは群ＡのＤＮＡとハイブリダイズし（レーン２）、レーン３および４のみで用いる群Ｃのプローブはレーン３とハイブリダイズする。
【図２】ｓｅＨＡＳの細菌性、ウイルスおよび真核生物ＨＡＳタンパク質への関連性を象徴的に表したもの。
【図３】既知のヒアルロナンシンターゼの幾つかでの可能な進化の関連性および類似性を象徴的に表したもの。
【図４】様々な遺伝子工学処理を施した連鎖球菌ＨＡＳ酵素によって産生されるＨＡサイズ分布。
【図５】E. coliにおける組換えｓｅＨＡＳおよびｓｐＨＡＳの過剰発現。
【図６】Bacillus subtilisおよびBacillus licheniformisにおける組換えＨＡの産生。
【図７】連鎖球菌ＨＡシンターゼの精製。
【図８】酵母膜で発現した組換え連鎖球菌のＨＡＳによって合成されるＨＡのゲル濾過分析。
【図９】特異抗体を用いる組換えｓｅＨＡＳのウェスタンブロット分析。
【図１０】組換えｓｅＨＡＳおよびｓｐＨＡＳによって産生されるＨＡサイズ分布の動力学的分析。
【図１１】ｓｅＨＡＳおよび予想膜結合領域についてのヒドロパシープロット。
【図１２】膜におけるｓｅＨＡＳのトポロジー構成を図に表したもの。
【図１３】組換えｓｅＨＡＳによる真正のＨＡの合成。
【図１４】特異的オリゴヌクレオチドとＰＣＲを用いるｓｅＨＡＳをコードする、ｓｐＨＡＳをコードする、またはｓｅＨＡＳとｓｐＨＡＳを両方ともコードする核酸配列の認識。
【図１５】特異的ＰＣＲハイブリダイゼーションに用いるオリゴヌクレオチド。
【図１６】図１６ＡはBacillus subtilis 168（ｐＳＭ１４３ベクターのみ）とBacillus subtilis 168（ｓｅＨＡＳを含むｐＳＭ１４３）によるＨＡ産生を比較することによる生Bacillus subtilisでの組換えＨＡ産生を表すプロット。図１６Ｂは図１６Ａのプロットの一断面の拡大。
【図１７Ａ】生Bacillus subtilisにおけるｓｐＨＡＳによって産生される組換えＨＡのサイズ分布の栄養制御を表すプロット。
【図１７Ｂ】ベクターのみを含むBacillus subtilisと比較した生Bacillus subtilis 168での組換えＨＡ産生を表すプロット。
【図１８】図１８Ａおよび図１８Ｂは組換えE. coliの顕微鏡写真。図１８Ａにおいて、インドインク染色（１，０００倍）により、ｐＰｍＨＡＳを有するE. coli KS細胞は細胞の周囲に白色ハローとして現れる実質的なカプセルを産生することが示される。図１８Ｂにおいて、StreptomycesＨＡリアーゼで簡単に処理することによりE. coli K5（ｐＰｍＨＡＳ）細胞からカプセル材料を除去することができる。ｐｍＨＡＳは、ＨＡ多糖類の重合を指示する。
【図１９】グラム陽性菌およびグラム陰性菌におけるＧＡＧ生合成の図解モデル。
【図２０】Streptococcus uberis由来のＨＡＳ遺伝子のＰＣＲ増幅を示すアガロースゲル。
【図２１】Streptococcus pyogenes、Streptococcus equisimilis、およびStreptococcus uberis由来のＨＡシンターゼ活性。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005514059000001.app
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2005514059.tif 000077
【図２】
2005514059.tif 000078
【図３】
2005514059.tif 000079
【図４】
2005514059.tif 000080
【図５】
2005514059.tif 000081
【図６】
2005514059.tif 000082
【図７】
2005514059.tif 000083
【図８】
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【図９】
2005514059.tif 000085
【図１０】
2005514059.tif 000086
【図１１】
2005514059.tif 000087
【図１２】
2005514059.tif 000088
【図１３】
2005514059.tif 000089
【図１４】
2005514059.tif 000090
【図１５】
2005514059.tif 000091
【図１６】
2005514059.tif 000092
【図１７】
2005514059.tif 000093
【図１８】
2005514059.tif 000094
【図１９】
2005514059.tif 000095
【図２０】
2005514059.tif 000096
【図２１】
2005514059.tif 000097
【国際調査報告】
2005514059.tif 000098
2005514059.tif 000099
2005514059.tif 000100