(57)【要約】本発明は、新規の哺乳動物ＤＮＡ−Ｒタンパク質、およびこのようなタンパク質をコードする遺伝子に関する。本発明は、哺乳動物ＤＮＡ−Ｒタンパク質の単離および特徴付けに関する。本発明は、特に、哺乳動物ＤＮＡ−Ｒ遺伝子のラットホモログおよびヒトホモログに対応するｍＲＮＡの単離された相補的ＤＮＡコピーを提供する。また、形質転換される原核生物細胞および真核生物細胞の培養物において、本発明の哺乳動物ＤＮＡ−Ｒ遺伝子を発現し得る組換え発現構造体、ならびにそこにコードされる哺乳動物カテコールアミンレセプタータンパク質を合成する形質転換細胞のこのような培養物が提供される。本発明はまた、本発明の哺乳動物ＤＮＡ−Ｒタンパク質に結合し得る化合物のスクリーニング（インビトロ）についての方法、ならびに既知のＤＮＡ−Ｒアゴニストおよびアンタゴニストと比較した、このような化合物の結合性質のさらなる特徴付けについての方法を提供する。薬理学的スクリーニングの改善された方法が、これによって提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞表面ＤＮＡレセプター（ＤＮＡ−Ｒ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項２】
前記哺乳動物ＤＮＡ−ＲがヒトＤＮＡ−Ｒであることと、前記核酸のヌクレオチド配列が配列番号２によって同定されるアミノ酸配列をコードすることと、を特徴とする請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
哺乳動物ＤＮＡ−ＲのＤＮＡ結合フラグメントをコードする核酸。
【請求項４】
前記哺乳動物ＤＮＡ−ＲがヒトＤＮＡ−Ｒであることと、前記ＤＮＡ結合フラグメントが配列番号２によって同定されるアミノ酸配列１〜５７５番のアミノ酸を含むことと、を特徴とする請求項３に記載の核酸。
【請求項５】
可溶性の哺乳動物ＤＮＡ−Ｒをコードする核酸。
【請求項６】
前記哺乳動物ＤＮＡ−Ｒが、アミノ酸配列１１３３〜１１７１番のアミノ酸が欠失される配列番号２によって同定されるアミノ酸配列を有するヒトＤＮＡ−Ｒであること、を特徴とする請求項５に記載の核酸。
【請求項７】
およそ１５０キロダルトンの分子量を有し、かつ、配列番号２によって同定されるアミノ酸配列を有する、哺乳動物ＤＮＡ−Ｒまたはその誘導体、の相同組成物。
【請求項８】
およそ６３キロダルトンの分子量を有し、かつ、配列番号２の１〜５７５番のアミノ酸によって同定されるアミノ酸配列を有する、哺乳動物ＤＮＡ−Ｒまたはその誘導体、のＤＮＡ結合フラグメントの相同組成物。
【請求項９】
およそ１４５キロダルトンの分子量を有し、かつ、該アミノ酸配列の１１３３〜１１７１番のアミノ酸が欠失される配列番号２によって同定されるアミノ酸配列を有する、可溶性の哺乳動物ＤＮＡ−Ｒまたはその誘導体、の相同組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載の哺乳動物ＤＮＡ−Ｒをコードするヌクレオチド配列を有する核酸を含む組換え発現構造体であって、該構造体が真核生物細胞または原核生物細胞の形質転換培養細胞において、該レセプターを発現し得る組換え発現構造体。
【請求項１１】
前記哺乳動物ＤＮＡ−ＲがヒトＤＮＡ−Ｒであることと、前記核酸のヌクレオチド配列が配列番号２によって同定されるアミノ酸配列をコードすることと、を特徴とする請求項１０に記載の組換え発現構造体。
【請求項１２】
請求項３に記載の哺乳動物ＤＮＡ−ＲのＤＮＡ結合フラグメントをコードするヌクレオチド配列を有する核酸を含む組換え発現構造体であって、該構造体が真核生物細胞または原核生物細胞の形質転換培養細胞において該レセプターを発現し得る組換え発現構造体。
【請求項１３】
前記哺乳動物ＤＮＡ−ＲがヒトＤＮＡ−Ｒであることと、前記ＤＮＡ−ＲのＤＮＡ結合フラグメントが配列番号２によって同定されるアミノ酸配列１〜５７５番のアミノ酸をコードする核酸によってコードされることと、を特徴とする請求項１２に記載の組換え発現構造体。
【請求項１４】
請求項５に記載の可溶性の哺乳動物ＤＮＡ−Ｒをコードするヌクレオチド配列を有する核酸を含む組換え発現構造体であって、該構造体が真核生物細胞または原核生物細胞の形質転換培養細胞において該レセプターを発現し得る組換え発現構造体。
【請求項１５】
前記哺乳動物ＤＮＡ−ＲがヒトＤＮＡ−Ｒであることと、前記核酸のヌクレオチド配列が、該アミノ酸配列の１１３３〜１１７１番のアミノ酸が欠失される配列番号２によって同定されるアミノ酸配列をコードすることと、を特徴とする請求項１４に記載の組換え発現構造体。
【請求項１６】
請求項１０に記載の組換え発現構造体で形質転換される細胞培養物であって、該形質転換細胞培養物が前記哺乳動物ＤＮＡ−Ｒを発現する細胞培養物。
【請求項１７】
請求項１１に記載の組換え発現構造体で形質転換される細胞培養物であって、該形質転換細胞培養物が前記ヒトＤＮＡ−Ｒを発現する細胞培養物。
【請求項１８】
請求項１２に記載の組換え発現構造体で形質転換される細胞培養物であって、該形質転換細胞培養物が前記哺乳動物ＤＮＡ−ＲのＤＮＡ結合フラグメントを発現する細胞培養物。
【請求項１９】
請求項１３に記載の組換え発現構造体で形質転換される細胞培養物であって、該形質転換細胞培養物が前記ヒトＤＮＡ−ＲのＤＮＡ結合フラグメントを発現する細胞培養物。
【請求項２０】
請求項１４に記載の組換え発現構造体で形質転換される細胞培養物であって、該形質転換細胞培養物が前記可溶性の哺乳動物ＤＮＡ−Ｒを発現する細胞培養物。
【請求項２１】
請求項１５に記載の組換え発現構造体で形質転換される細胞培養物であって、該形質転換細胞培養物が前記可溶性のヒトＤＮＡ−Ｒを発現する細胞培養物。
【請求項２２】
哺乳動物ＤＮＡ−Ｒを発現する細胞における細胞外ＤＮＡ結合を調節するための化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）哺乳動物ＤＮＡ−Ｒを発現する宿主細胞を選択するステップと、
（ｂ）該化合物の存在環境下および非存在環境下において、検出可能に標識される細胞外ＤＮＡと該細胞とを接触させるステップと、
（ｃ）検出可能に標識されるＤＮＡ結合について、該細胞をアッセイするステップと、
（ｄ）該化合物の非存在環境下に対し、該化合物の存在環境下において該細胞に結合した検出可能な標識の異なる量を検出することによって、細胞外ＤＮＡ結合を調節する化合物を同定するステップと、
からなる方法。
【請求項２３】
前記宿主細胞が内因性ＤＮＡ−Ｒを発現することを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記宿主細胞が外因性ＤＮＡ−Ｒを発現することを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
検出可能な標識が蛍光標識または放射能標識であることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記化合物が前記細胞に対する細胞外ＤＮＡの結合を阻害することで、該化合物の非存在環境下より、該化合物の存在環境下において、該細胞に結合する細胞外ＤＮＡの量を減少させたことを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記化合物が前記細胞に対する細胞外ＤＮＡの結合を増強することで、該化合物の非存在環境下より、該化合物の存在環境下において、該細胞に結合する細胞外ＤＮＡの量を増大させたことを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記化合物が抗体またはその抗原結合フラグメントである請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
細胞外ＤＮＡの細胞内への取り込みを調節するための化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）哺乳動物ＤＮＡ−Ｒを発現する宿主細胞を選択するステップと、
（ｂ）該化合物の存在および非存在環境下において、検出可能に標識される細胞外ＤＮＡと該細胞を接触させるステップと、
（ｃ）該検出可能な標識の細胞内への取り込みについて、該細胞をアッセイするステップと、
（ｄ）該細胞内部の検出可能な標識の量と比較した場合に、該化合物の非存在環境下より該化合物の存在環境下の方が、該細胞内部からより多量の検出可能な標識を検出することによって、細胞外ＤＮＡの細胞内への取り込みを増大させる化合物を同定するステップと、
からなる方法。
【請求項３０】
前記宿主細胞が内因性ＤＮＡ−Ｒを発現することを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記宿主細胞が外因性ＤＮＡ−Ｒを発現することを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
検出可能な標識が蛍光標識または放射能標識であることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記化合物が前記細胞に対する細胞外ＤＮＡの取り込みを阻害することと、該化合物の非存在環境下よりも該化合物の存在環境下、細胞内において細胞外ＤＮＡの減少した量が検出されることと、を特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記化合物が前記細胞に対する細胞外ＤＮＡの取り込みを増強することと、該化合物の非存在環境下よりも該化合物の存在環境下、細胞内において細胞外ＤＮＡの増大した量が検出されることと、を特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記化合物が抗体またはその抗原結合フラグメントであることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
細胞外ＤＮＡの取り込みまたは発現の調節をするための化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）哺乳動物ＤＮＡ−Ｒを発現する宿主細胞を選択するステップと、
（ｂ）該化合物の存在環境下および非存在環境下において、発現が検出され得る遺伝子をコードする細胞外ＤＮＡと該細胞とを接触させるステップと、
（ｃ）該細胞外ＤＮＡによってコードされる遺伝子の発現について、該細胞をアッセイするステップと、
（ｄ）該遺伝子の発現と比較した場合に、該化合物の非存在環境下より該化合物の存在環境下の方が、該遺伝子の発現の増大を検出することによって、細胞外ＤＮＡの取り込みまたは発現を増大させる化合物を同定するステップと、
からなる方法。
【請求項３７】
前記宿主細胞が内因性ＤＮＡ−Ｒを発現することを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記宿主細胞が外因性ＤＮＡ−Ｒを発現することを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
検出可能な標識が蛍光標識または放射能標識であることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記化合物が前記細胞に対する細胞外ＤＮＡの取り込みを阻害することと、該化合物の非存在環境下よりも該化合物の存在環境下の方が、細胞内において細胞外ＤＮＡの減少した量が検出されることと、を特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記化合物が前記細胞への細胞外ＤＮＡの取り込みを増強することと、該化合物の非存在環境下よりも該化合物の存在環境下の法が細胞内において、細胞外ＤＮＡの増大した量が検出されることと、を特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
前記化合物が前記細胞外ＤＮＡによってコードされる遺伝子の発現を阻害することと、該化合物の非存在環境下よりも該化合物の存在環境下の方が細胞内において、細胞外ＤＮＡによってコードされる遺伝子産物の減少した量が検出されることと、を特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
前記化合物が前記細胞への細胞外ＤＮＡの取り込みを増強することと、該化合物の非存在環境下よりも該化合物の存在環境下の方が細胞において、細胞外ＤＮＡによってコードされる遺伝子産物の増大した量が検出されることと、を特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項４４】
前記化合物が抗体またはその抗原結合フラグメントであることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項４５】
前記細胞が哺乳動物ＤＮＡ−Ｒをコードする組換え発現構造体に形質転換されることと、該形質転換細胞培養物の細胞が該レセプターを発現させることと、を特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項４６】
前記細胞が哺乳動物ＤＮＡ−Ｒをコードする組換え発現構造体に形質転換されることと、該形質転換細胞培養物の細胞が該レセプターを発現させることと、を特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項４７】
前記細胞が哺乳動物ＤＮＡ−Ｒをコードする組換え発現構造体に形質転換されることと、該形質転換細胞培養物の細胞が該レセプターを発現させることと、を特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項４８】
およそ１５０キロダルトンの分子量を有する、哺乳動物ＤＮＡ−Ｒまたはその誘導体を含んでなる細胞膜調製物。
【請求項４９】
前記哺乳動物ＤＮＡ−Ｒが配列番号２によって同定されるアミノ酸配列を有するヒトＤＮＡ−Ｒであることを特徴とする請求項４８に記載の細胞膜調製物。
【請求項５０】
哺乳動物ＤＮＡ−Ｒを発現させる真核生物細胞に対する細胞外ＤＮＡ結合の阻害についての方法であって、可溶性の哺乳動物ＤＮＡ−Ｒと該細胞を接触させるステップを包含することを特徴とする方法。
【請求項５１】
前記真核生物細胞が配列番号２として同定されるアミノ酸配列を有するヒトＤＮＡ−Ｒを発現することを特徴とする請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記可溶性のＤＮＡ−Ｒが、アミノ酸配列１１３３〜１１７１番のアミノ酸が欠失される配列番号２によって同定されるアミノ酸配列を有するヒトＤＮＡ−Ｒであることを特徴とする請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
哺乳動物ＤＮＡ−Ｒを発現する真核生物細胞に対する細胞外ＤＮＡ結合の阻害についての方法であって、哺乳動物ＤＮＡ−ＲのＤＮＡ結合フラグメントと該細胞を接触させるステップを包含することを特徴とする方法。
【請求項５４】
前記真核生物細胞が配列番号２として同定されるアミノ酸配列を有するヒトＤＮＡ−Ｒを発現することを特徴とする請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記ＤＮＡ−ＲのＤＮＡ結合フラグメントが、配列番号２によって同定されるアミノ酸配列のアミノ酸１〜５７５を含むヒトＤＮＡ−Ｒのフラグメントであることを特徴とする請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
哺乳動物ＤＮＡ−Ｒを含むエピトープに対し免疫学的に特異的である、抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５７】
前記哺乳動物ＤＮＡ−Ｒが配列番号２として同定されるアミノ酸配列を有するヒトＤＮＡ−Ｒであることを特徴とする請求項５６に記載の抗体。
【請求項５８】
ポリクローナル抗血清を含むことを特徴とする請求項５６に記載の抗体。
【請求項５９】
前記抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項５６に記載の抗体。
【請求項６０】
請求項５９に記載の抗体を産生するハイブリドーマ細胞株。
【請求項６１】
前記エピトープが、配列番号２の１〜５７５番のアミノ酸によって同定されるＤＮＡ結合ドメインを含むことを特徴とする請求項５６に記載の抗体。
【請求項６２】
組織における炎症の抑制についての方法であって、該組織を含む細胞への細胞外ＤＮＡ結合によって引き起こされることと、治療有効量の可溶性の哺乳動物ＤＮＡ−Ｒと該組織を接触させるステップを含んでなることと、を特徴とする方法。
【請求項６３】
前記組織が肺組織であることを特徴とする請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記肺組織の細胞が上皮細胞またはマクロファージであることを特徴とする請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記可溶性の哺乳動物ＤＮＡ−Ｒが、アミノ酸配列１１３３〜１１７１番のアミノ酸が欠失される配列番号２として同定されるアミノ酸配列を有するヒトＤＮＡ−Ｒであることを特徴とする請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】
組織における炎症の抑制についての方法であって、該組織を含む細胞への細胞外ＤＮＡ結合によって引き起こされることと、治療有効量の哺乳動物ＤＮＡ−ＲのＤＮＡ結合フラグメントと該組織を接触させるステップを含んでなることと、を特徴とする方法。
【請求項６７】
前記組織が肺組織であることを特徴とする請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記肺組織の細胞が上皮細胞またはマクロファージであることを特徴とする請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記哺乳動物ＤＮＡ−ＲのＤＮＡ結合フラグメントが、配列番号２として同定されるアミノ酸配列１〜５７５番のアミノ酸を含むヒトＤＮＡ−Ｒであることを特徴とする請求項６６に記載の方法。
【請求項７０】
組織における炎症の抑制についての方法であって、該組織を含む細胞への細胞外ＤＮＡ結合によって引き起こされることと、哺乳動物ＤＮＡ−Ｒに対し免疫学的に特異的な、治療有効量の抗体またはその抗原結合フラグメントと該組織を接触させるステップを含んでなることと、を特徴とする方法。
【請求項６７】
前記組織が肺組織であることを特徴とする請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記肺組織の細胞が上皮細胞またはマクロファージであることを特徴とする請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記抗体が、配列番号２として同定されるアミノ酸配列１〜５７５番のアミノ酸を含むヒトＤＮＡ−Ｒである、哺乳動物ＤＮＡ−ＲのＤＮＡ結合フラグメントに対し免疫学的に特異的なモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項６６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、２０００年８月１日に出願された、米国仮出願番号６０／２２２，６２４による利益を主張し、この全体は、参考として援用される。
【０００２】
（発明の背景）
（１．発明の分野）
本発明は、哺乳動物種由来の細胞膜結合ＤＮＡ結合タンパク質（本明細書中で、ＤＮＡ−Ｒと称する）、およびこのようなレセプターに対応する遺伝子に関する。特に、本発明は、新規の哺乳動物ＤＮＡ−Ｒ遺伝子をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）コピーの単離、クローニングおよび配列決定に関する。本発明はまた、この新規のＤＮＡ−Ｒ遺伝子のｃＤＮＡを含む組換え発現構造体（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）の構成に関し、この組換え発現構造体は、形質転換される原核生物細胞および真核生物細胞の培養物において、ＤＮＡ−Ｒタンパク質を発現し得る。このような培養物におけるレセプタータンパク質の産生がまた提供され、ならびに生物学的活性を有するそのフラグメントの産生も提供される。本発明は、新規のＤＮＡ−Ｒタンパク質の相同組成物を産生するためのこのような形質転換細胞のこのような培養物の使用に関する。本発明はまた、新規かつ有用な薬物の特徴付けについて、このＤＮＡ−Ｒタンパク質を産生するこのような細胞の培養物を提供する。この新規のＤＮＡ−Ｒタンパク質に対する抗体、およびこの新規のＤＮＡ−Ｒタンパク質のエピトープがまた、本発明によって提供される。
【０００３】
（２．発明の背景）
細胞外ＤＮＡは、インビボおよびインビトロで、広範な免疫応答を開始し得る強力な生物学的シグナルであり、これは、サイトカイン産生、好中球の流入、ＩｇＭ分泌、Ｂ細胞増殖およびナチュラルキラー活性の増強を含む。細胞外ＤＮＡのこれらの性質は、裸のＤＮＡが、いくつかの場合において、ワクチンとして使用されることを可能にする。さらに、細胞外ＤＮＡは、インビボおよびインビトロの両方で、細胞に新規の遺伝情報を導入するために使用されている。
【０００４】
哺乳動物細胞への細胞外ＤＮＡ移入の１つの重要な局面は、遺伝子治療である。遺伝子移入治療は、種々の疾患の処置についての可能性を提供する。安全、有効かつ選択的なインビボ遺伝子送達を提供する能力は、将来のプロトコルの重大部門である。プラスミドＤＮＡまたはＤＮＡ／リポソーム複合体のいずれかの注入による遺伝子移入は、安全であることが実証されており、そして遺伝子産物の発現を可能にする。ＤＮＡ／リポソーム複合体の取り込みは、特定の細胞表面レセプターに依存しないが、一方、細胞によるプラスミドＤＮＡの取り込みを媒介する機構は、未知のままである。
【０００５】
この技術の十分な可能性を実現するために、選択される組織および細胞における、ＤＮＡの安全な送達およびＤＮＡの有効な導入遺伝子発現が達成されなければならない。組織への標的ＤＮＡに対する１つのアプローチは、ＤＮＡの結合およびインターナリゼーションについてのレセプター媒介機構の使用である。細胞へのＤＮＡのウイルス（レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス）送達は、レセプター媒介機構を介するが、しかし、この技術は、インビボ臨床適用に限定されている。ウイルスベクターは、エキソビボ遺伝子治療について最も頻繁に使用されているが、形質導入細胞の移植に関連した技術的問題が、重大な障害のままである。さらに、ウイルスベクターは、ウイルス感染を導く可能性、または抗原性ウイルスコートタンパク質に対する免疫応答を誘導する可能性を有する。
【０００６】
遺伝子送達の非ウイルス性方法としては、リポソーム、いわゆる「遺伝子銃」および直接注入が挙げられる。リポソームを用いた遺伝子移入は、ＤＮＡの取り込みおよび発現をもたらすことが示されている。ＤＮＡ／リポソームは、有効に取り上げられ、そしてプラスミド上のｃＤＮＡが発現されるが、このプロセスは、非特異的と考えられ、選択組織の標的化の可能性は限定される。代案は、送達系を伴わないプラスミドＤＮＡの直接投与である。組織培養における細胞株は、プラスミドＤＮＡのインビトロ取り込み、およびプラスミド上の導入遺伝子の発現を実証した。インビボで直接注入されるＤＮＡが取り上げられ、そしてコード遺伝子が発現していたことがまた示された。このアプローチは、安全かつウイルスによるＤＮＡ送達に関連する問題を含まないことが示されているが、このテクノロジーの治療可能性は、しばしば、多くの組織におけるプラスミドＤＮＡ由来の乏しい導入遺伝子発現によって限定される。さらに、プラスミドＤＮＡが、細胞に結合され、そして細胞にインターナライズされる機構は、良好に確立されていない。細胞表面へのプラスミドＤＮＡ結合の機構についての知識、およびＤＮＡがインターナライズされ、そして発現される方法が、選択組織を標的化する可能性をまた有する導入遺伝子方法の増強に重要である。
【０００７】
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）は、極めて重要な細胞外ＤＮＡの別の形態である。ＯＤＮは、遺伝子発現を特異的に阻害する能力に起因して、種々の病原体および癌遺伝子に対する潜在的な治療因子であると考えられる。組織に注入される場合において、ＯＤＮは、細胞によってインターナライズされ、そしてｍＲＮＡの相補的領域に結合して、極めて特異的な様式でタンパク質の翻訳を阻害する。ＨＩＶ  ＲＮＡに対する異なるアンチセンスＯＤＮは、培養ヒト白血病細胞において、ウイルスの感染力を阻害することが示されている。ＡＩＤＳおよび他の疾患を処置するためのＯＤＮを用いたヒト臨床試験が進行中であるが、遺伝子発現がもたらされる場所および方法の明確な理解の欠如が、この技術の最適化を妨げる。
【０００８】
細胞外ＤＮＡはまた、ヒト疾患（例えば、嚢胞性線維症）に関連する。嚢胞性線維症（ＣＦ）は、北アメリカにおいて、最も一般的な致死的遺伝病である。これは、２５００人の生児出生のうち１人を冒し、そして冒された個体は、２８年の中間の平均余命を有する（Ｄａｖｉｓら、１９９６、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１５７：１２３４〜１２３９）。炎症（特に、好中球の有害な産物）が、肺損傷の原因であり得ることを示す増大する一連の証拠が存在する（Ｄｏｒｉｎｇ、１９９７、Ｐｅｄ．Ｐｕｌｍｏｎｏｌ．Ｓｕｐｐ．１６：２７１〜２７２）；大半の罹患率および９０％を超える死亡率は、肺の慢性の進行性炎症に由来することが現在認識される。コルチコステロイドは、広範な抗炎症効果（特に、好中球に対する）を有する。複数の研究機関にまたがった試験は、肺機能に対する経口コルチコステロイドの有益な効果を示した。しかし、悪影響（例えば、増殖遅延、グルコース異常および白内障）が、長期選定としてのこの処置の前兆となる（Ｅｉｇｅｎら、１９９５、Ｊ．Ｐｅｄ．１２６：５１５〜５２３）。非ステロイド性抗炎症薬であるイブプロフェンがまた研究されている（Ｋｏｎｓｔａｎら、１９９５、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３２：８４８〜８５４）。この薬物は有益であるが、連続したモニタリングが、長期の高用量治療の安全性を決定するために必要である。好中球の有害な産物を処置する他の治療（例えば、抗プロテアーゼおよび抗酸化剤）が、現在研究中である（Ｋｏｎｓｔａｎ、１９９８、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｓｔ  Ｍｅｄ．１９：５０５〜５１３）。
【０００９】
ＣＦの悪性の気道流体特性は、気流を遮断し得、そして病原性細菌についての生存可能な増殖媒体を提供し、そしてこれらの細菌の細胞溶解は、炎症を引き起こす細胞外ＤＮＡを産生し得る。組換えヒトＤｎａｓｅ（ｒｈＤＮａｓｅ）は、１９９４年から臨床使用となっている（Ｋｏｎｓｔａｎ、１９９８、同書）。吸入によって投与されるｒｈＤＮａｓｅが、細胞外気道ＤＮＡをはがし、そして気道流体の粘性を減少するために使用されている。ｒｈＤＮａｓｅを用いた処置は、肺機能においてわずかな改善を生ずる（ＣｒａｍｅｒおよびＢｏｓｓｏ、１９９６、Ａｎｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３０：６５６〜６６１）。しかし、処置が停止する場合、患者は、患者の以前の基準を下回る地点に悪化し得る（Ｂｕｓｈ、１９９８、Ｐｅｄ．Ｐｕｌｍｏｎｏｌ．２５：７９〜８２）。さらに、最近の報告は、肺機能の改善にもかかわらず、気道炎症において変化がないことを示した（Ｈｅｎｒｙら、１９９８、Ｐｅｄ．Ｐｕｌｍｏｎｏｌ．２６：９７〜１００）。ＤＮＡは、Ｄｎａｓｅによって分解されるが、完全には分解されず、そして加水分解される（ｈｙｄｒｏｌｉｚｅｄ）フラグメントは、なお潜在的に免疫刺激性であり、そして炎症に貢献し得る。従って、ｒｈＤＮａｓｅは、進行中の肺破壊の過程を遮断し得る。
【００１０】
ＣＦについての種々の従来の処置（物理療法、栄養補助および薬物を含む）がまた存在する（ＢｉｌｔｏｎおよびＭａｈａｄｅｖａ、１９９７、Ｊ．Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃ．Ｍｅｄ．９０：補遺３１、２〜５）。
【００１１】
ＣＦを有する患者において、炎症を引き起こし、そして維持する事象が、はっきりと理解されていないので、種々のアプローチが、異なる成分の疾患を処置するために開発されている。気道流体の粘性を減少させるための抗生物質、抗炎症剤および治療が、使用され、そして研究されているすべてのアプローチである。攻撃的な抗生物質治療は、感染の短時間の制御を助けたが、ＣＦを有する患者の気道における細菌は、完全に根絶されことは滅多にない。これらの病原性細菌は、炎症を慢性的に刺激し、そして悪化させる。いくつかの現在利用可能な処置が、症状の緩和、および疾患進行の遅延を助け得るが、現行の処置は、どれも最終的な呼吸不全を妨げることができない。
【００１２】
１つの重要な臨床観察は、極めて増大した量の細胞外ＤＮＡ、宿主および細菌起源が、嚢胞性線維症を有する患者の気道に存在することである。最近の研究は、ＣＦを有する患者の痰から精製される細胞外ＤＮＡが、マウス肺において、炎症を直接誘導することを実証した（Ｓｃｈｗａｒｔｚら、１９９７、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：６８〜７３）。嚢胞性線維症を有する患者の痰から精製されるＤＮＡは、主に宿主由来のＤＮＡから構成されることが示されており、そしてわずかな画分のみが、細菌ＤＮＡのようである（Ｓｃｈｗａｒｔｚら、１９９７、同書）。１つの可能な説明は、細胞外ＤＮＡが、肺における免疫性肺細胞に結合し、そして炎症前サイトカインの分泌および肺への好中球移動を誘導し、重篤な気道炎症を導くことである。肺における免疫細胞（例えば、肺胞マクロファージ）への細胞外ＤＮＡ結合が刺激されて、炎症前サイトカインを産生し、このサイトカインは、炎症を導く好中球を補充し、そして活性化する。これらの好中球がアポトーシスを受け、そしてそのＤＮＡを放出する場合、このサイクルが繰り返され、そして炎症が維持または増大される。従って、サイトカイン産生細胞へのＤＮＡ結合をブロックする方法および試薬が、現在利用可能な処置よりも優れたＣＦ患者の処置を提供し得る。
【００１３】
当該分野において、ＤＮＡが細胞表面に結合し得るといういくつかの報告が存在しているが（Ｂｅｎｎｅｔｔ、１９９３、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．３：２３５〜２４１；Ｂｅｎｎｅｔｔら、１９８６、Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１３：６７９〜６８５；ＧａｂｏｒおよびＢｅｎｎｅｔｔ、１９８４、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２２：１０３４〜１０３９；Ｈｅｆｅｎｅｉｄｅｒら、１９９０、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．９４：７９Ｓ〜８４Ｓ；Ｂｅｎｎｅｔｔら、１９８７、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：８５０〜８６３；Ｂｅｎｎｅｔｔら、１９９１、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８６：３７４〜３７９；Ｂｅｎｎｅｔｔら、１９９２、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９０：４２８〜４３３；Ｂｅｎｎｅｔｔら、１９８５、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７６：２１８２〜２１９０；Ｈｅｆｅｎｅｉｄｅｒら、１９９２、Ｌｕｐｕｓ  １：１６７〜１７３；Ｈｅｆｅｎｅｉｄｅｒら、１９９２、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ．６３：２４５〜２５１；ＲｅｉｄおよびＣｈａｌｓｏｎ、１９７９、Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．６０：２７〜５２；Ｌｅｒｎｅｒら、１９７１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６８：１２１２〜１２１６；Ｐａｎｃｅｒら、１９８１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７：９８〜１０４；ＭｅｉｎｋｅおよびＧｏｌｄｓｔｅｉｎ、１９７４、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．８６：７５７〜７７３；Ｓｕｄａｒら、１９８６、Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．３２：８７〜９１；Ｇａｓｐａｒｒｏら、１９９０、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ＆Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．５２：３１５〜３２１；Ｅｍｌｅｎら、１９８８、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３３：５４〜６０）、当該分野は、細胞が細胞外ＤＮＡ結合を媒介する方法についての理解を欠如する。従って、真核生物細胞（特に、哺乳動物細胞）が、細胞外ＤＮＡを取り上げる機構についての理解が、種々の生物学的プロセスの改善に重要である。
【００１４】
（発明の要旨）
本発明は、哺乳動物ＤＮＡ−Ｒ遺伝子のクローニング、発現および機能的特徴付けに関する。本発明は、新規の哺乳動物ＤＮＡ−Ｒ遺伝子のヌクレオチド配列を有する核酸を含む。本発明によって提供される核酸は、本発明のＤＮＡ−Ｒ遺伝子からインビボで転写される対応するｍＲＮＡの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）コピーを含む。好ましい実施形態において、哺乳動物ＤＮＡ−Ｒは、ヒトＤＮＡ−Ｒである。また、本発明によって提供されるｃＤＮＡの同族タンパク質の推定アミノ酸配列、上記のｃＤＮＡを含む組換え発現構造体で形質転換される細胞においてｃＤＮＡを発現することによって、上記の同族タンパク質を作製する方法、ならびにそれによって形質転換される上記の組換え発現構造体および細胞が提供される。
【００１５】
第一の局面における本発明は、核酸、核酸ハイブリダイゼーションプローブ、形質転換細胞の培養物において、本発明のＤＮＡ−Ｒを発現し得る組換え真核生物発現構造体、および本発明のＤＮＡ−Ｒを合成する形質転換される真核生物細胞のこのような培養物を提供する。別の局面において、本発明は、本発明のＤＮＡ−Ｒタンパク質の相同組成物、上記のＤＮＡ−Ｒのフラグメント（最も好ましくは、ＤＮＡ−Ｒのアミノ酸１〜５７５を含むフラグメント）の相同組成物、ならびにＤＮＡ−Ｒまたはそのフラグメントと、とりわけエピトープマーカーとの間の融合タンパク質、および本発明のＤＮＡ−Ｒタンパク質を発現する細胞由来の膜調製物、ならびにまた、本発明のＤＮＡ−Ｒタンパク質またはそのフラグメントに対する抗体、および本発明のＤＮＡ−Ｒタンパク質またはそのフラグメントのエピトープを提供する。別の局面における本発明は、本発明の組換え発現構造体で形質転換される細胞を用いた、上記の相同調製物および膜調製物の作製についての方法、ならびにそれによる上記のＤＮＡ−Ｒタンパク質の発現についての方法を提供する。レセプター、およびこれらのレセプタータンパク質の生化学的性質の特徴付けについての方法、ならびに本発明のＤＮＡ−Ｒに関連する薬理学的用途を有する因子の開発におけるこれらのタンパク質の使用についての方法がまた提供される。
【００１６】
第一の局面において、本発明は、哺乳動物ＤＮＡ−Ｒをコードするヌクレオチド配列を有する核酸を提供する。第一の好ましい実施形態において、核酸は、ヒトＤＮＡ−Ｒをコードする。本発明のこの実施形態において、ヌクレオチド配列は、コード配列の３５７６ヌクレオチド、５’非翻訳配列の６０１ヌクレオチドおよび３’非翻訳配列の１１７ヌクレオチドを含むヒトＤＮＡ−Ｒ  ｃＤＮＡの４３５１ヌクレオチドを含む。本発明のこの実施形態において、ＤＮＡ−Ｒのヌクレオチド配列は、図１に示されるヌクレオチド配列（配列番号１）である。図１に示される配列は、本発明の１１９２アミノ酸（配列番号２）のヒトＤＮＡ−Ｒアミノ酸配列をコードする多数のヌクレオチド配列の１つの特異的な実施形態を示すことが理解され、そしてこれらの異なるヌクレオチド配列が、機能的に等価であり、そして本発明によって包含されることが意図されることが理解される。さらに、それに由来する異なる生物および細胞が、天然に存在するアミノ酸のいくらかをコードし得る転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）の縮重収集物の部分集合に対応する、特定のｔＲＮＡを優先的に発現することが理解され、そして特定の原核生物および真核生物における発現について最適化される、本発明のヒトＤＮＡ−Ｒタンパク質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の多様性の実施形態がまた、本発明によって包含されることが理解される。ヒトゲノムＤＮＡ由来の単離核酸、および本発明によって提供されるヒトｃＤＮＡを用いた従来方法によって単離される核酸がまた、本発明の範囲内である。最終的に、ヒトＤＮＡ−Ｒの対立遺伝子変異（天然に存在する修飾およびそのインビトロ修飾を含む）が、本発明の範囲内であることが理解される。各々のこのような改変体は、本明細書中で開示されるヒトＤＮＡ−Ｒの配列と本質的に同じアミノ酸配列を有することが理解される。
【００１７】
本発明のヒトｃＤＮＡに対応する哺乳動物ＤＮＡ−Ｒタンパク質が、本発明の第二の局面である。第一の実施形態において、哺乳動物ＤＮＡ−Ｒタンパク質は、図１に示される推定アミノ酸配列（配列番号２）を有するヒトＤＮＡ−Ｒである。第二の実施形態において、本発明のヒトＤＮＡ−Ｒをコードする核酸を発現する細胞（最も好ましくは、組換え細胞）由来の膜調製物を含む、このヒトＤＮＡ−Ｒタンパク質が提供される。
【００１８】
本発明のこの局面において、およそ１５０ｋＤの分子量を有する哺乳動物ＤＮＡ−Ｒまたはその誘導体の相同組成物が提供され、これは、図１に示され、そして配列番号２によって同定されるアミノ酸配列を有するヒトＤＮＡ−Ｒであり、このサイズは、その任意の翻訳後修飾前のタンパク質の推定サイズであることが理解される。また、配列番号２として同定される配列のアミノ酸残基１〜５７５を含むヒトＤＮＡ−Ｒのアミノ末端フラグメントの相同組成物が提供される。本明細書中に記載されるように、ＤＮＡ−Ｒの膜貫通領域を欠如するように遺伝子操作されるタンパク質の種、およびそれによって提供する本発明のＤＮＡ−Ｒの可溶性形態がまた、本発明のこの局面の範囲内であり、そして本明細書中に提供される。
【００１９】
本発明は、本明細書中に提供される配列由来のヌクレオチドおよびアミノ酸プローブの両方を提供する。本発明は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのいずれかから単離されるプローブ、ならびにそれに由来する配列情報を用いて合成によって作製されるプローブを含む。本発明は、特に、哺乳動物ＤＮＡ−Ｒまたはそのフラグメントをコードする本発明のｃＤＮＡクローンまたはゲノムクローンを用いて作製される、オリゴヌクレオチドプローブ、ニックトランスレーションプローブ、ランダムプライムプローブ、またはインビトロ増幅プローブ、ならびに本発明のｃＤＮＡクローン実施形態またはゲノムクローン実施形態のヌクレオチド配列情報を用いて化学合成される、オリゴヌクレオチドプローブおよび他の合成プローブを含むが、これらに限定されない。
【００２０】
このような核酸ハイブリダイゼーションプローブを提供して、哺乳動物（ヒトを含む）の種々の組織におけるＤＮＡ−Ｒ遺伝子の発現パターン、発現量および発現程度を決定することが、本発明のさらなる目的である。本発明の哺乳動物ＤＮＡ−Ｒ遺伝子の配列に由来する核酸ハイブリダイゼーションプローブを提供して、遺伝子疾患の検出および診断について使用されることがまた、本発明の目的である。本明細書中で開示される哺乳動物ＤＮＡ−Ｒ遺伝子の核酸配列に由来する核酸ハイブリダイゼーションプローブを提供して、新規の関連レセプター遺伝子の検出について使用されることが、本発明の目的である。
【００２１】
本発明はまた、本発明のｃＤＮＡ実施形態を含むヌクレオチド配列情報を用いて作製される合成ペプチドを含む。本発明は、天然に存在するペプチドまたは合成ペプチドのいずれかを含み、これらは、ＤＮＡ−Ｒ特異的抗体の産生についての抗原として使用され得るか、または核酸結合についてのＤＮＡ−Ｒ分子の競争者として有用であり得るか、あるいは、このようなＤＮＡ−Ｒ分子への核酸結合のインヒビターの産生について使用され得る。
【００２２】
本発明はまた、本発明の哺乳動物ＤＮＡ−Ｒ分子に対する抗体および本発明の哺乳動物ＤＮＡ−Ｒ分子のエピトープを提供する。本発明のＤＮＡ−Ｒに免疫学的に反応性である抗体を提供することが、本発明の目的である。これらのＤＮＡ−Ｒに対するモノクローナル抗体を提供することが、特定の目的である。このような抗体を産生するハイブリドーマ細胞株がまた、本発明の目的である。このようなハイブリドーマ細胞株が、非免疫グロブリン産生マウス骨髄腫細胞株と、本発明の哺乳動物ＤＮＡ−Ｒの抗原またはエピトープを発現する細胞株で免疫されるマウス由来の脾臓細胞との間の融合の結果として産生され得ることが予見される。本発明はまた、このような抗体を産生し、そして生存マウスに注入されて、このような抗体から構成されるマウス由来の腹水流体を提供し得るハイブリドーマ細胞株を提供する。本発明の哺乳動物ＤＮＡ−Ｒタンパク質の免疫学的に活性なエピトープを提供することが、本発明のさらなる目的である。本発明のＤＮＡ−Ｒタンパク質に対して免疫学的に反応性のキメラ抗体がまた、本発明の範囲内である。
【００２３】
本発明は、本発明の哺乳動物ＤＮＡ−Ｒをコードする核酸を含む組換え発現構造体を提供し、ここで、この構造体は、この構造体で形質転換される細胞の培養物において、コードＤＮＡ−Ｒを発現し得る。このような構造体の好まし実施形態は、図１に示されるヒトＤＮＡ−Ｒ  ｃＤＮＡ（配列番号１）を含み、このような構造体は、この構造体で形質転換される細胞において、その中にコードされるヒトＤＮＡ−Ｒを発現し得る。また、上記のＤＮＡ−Ｒのフラグメント（最も好ましくは、アミノ酸残基１〜５７５を含むアミノ末端フラグメント、および上記のＤＮＡ−Ｒの膜貫通ドメインを欠失するように遺伝子操作されるフラグメント）をコードする組換え発現構造体が提供され、それによって、ＤＮＡ−Ｒの可溶性形態の産生に備える。別の実施形態において、組換え発現構造体は、当該分野で公知の従来の抗体によって認識されるエピトープ配列に融合したＤＮＡ−Ｒをコードする。各々の場合において、本発明の組換え発現構造体は、この構造体で形質転換される細胞において、その中にコードされるヒトＤＮＡ−Ｒまたはそのフラグメントを発現し得る。
【００２４】
本発明はまた、本発明の組換え発現構造体で形質転換される原核生物細胞およびより好ましくは、真核生物細胞（各々のこのような細胞は、形質転換構造体においてコードされる哺乳動物ＤＮＡ−Ｒまたはフラグメントまたはエピトープ改変種を発現し得、そして実際に発現する）、ならびに上記の形質転換細胞を用いた、哺乳動物ＤＮＡ−Ｒタンパク質の調製についての方法を提供する。
【００２５】
本発明はまた、本発明の組換え発現構造体で形質転換される、それぞれ原核生物細胞または真核生物細胞の培養物に由来する、本発明のＤＮＡ−Ｒタンパク質、あるいはそのフラグメントまたはエピトープ改変種を含む、原核生物細胞膜および真核生物細胞膜のタンパク質調製物をその範囲内に含む。
【００２６】
本発明はまた、本発明の哺乳動物ＤＮＡ−Ｒ分子（特に、それに結合する核酸）の生化学的活性を阻害、促進または調節する能力についての化合物のスクリーニングについての方法を提供する。好ましい実施形態において、本発明の方法は、ＤＮＡ（特に、二本鎖ＤＮＡおよびオリゴヌクレオチド）の結合に関する。本発明の方法は、ＤＮＡ−Ｒを発現する細胞へのＤＮＡ取り込みまたはオリゴヌクレオチド取り込みに影響を与える化合物の同定に特に関する。好ましい実施形態において、本発明の方法によって同定される化合物は、ピノサイトーシスまたはエンドサイトーシスによって、ＤＮＡ取り込みまたはオリゴヌクレオチド取り込みに影響を与える。好ましい実施形態において、この化合物は、そこに発現され得る形態で、細胞の核に到達するＤＮＡ量またはオリゴヌクレオチド量を増大させることによって、ＤＮＡ取り込みまたはオリゴヌクレオチド取り込みに影響を与える。本発明の好ましい化合物は、上記のＤＮＡによってコードされる遺伝子（最も好ましくは、レポーター遺伝子）の取り込みの増大または発現の増大を検出することによって同定される。好ましい実施形態において、本発明の組換え発現構造体で形質転換される細胞は、このような化合物と接触され、そして細胞によって取り上げられるＤＮＡ量またはオリゴヌクレオチド量、あるいは細胞における遺伝子発現（最も好ましくは、レポーター遺伝子発現）の頻度または量がアッセイされる。
【００２７】
本発明の特定の好ましい実施形態は、以下の特定の好ましい実施形態のより詳細な説明および上記の特許請求の範囲から明らかになる。
【００２８】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本明細書中で使用されるような用語「哺乳動物ＤＮＡ−Ｒ」は、図１に示されるアミノ酸（配列番号２）によってコードされるタンパク質から本質的になり、そして図１に示されるアミノ酸（配列番号２）によってコードされるタンパク質と実質的に同じ生物学的活性を有するタンパク質をいう。この定義は、開示されるＤＮＡ−Ｒにおいて、天然の対立遺伝子変異を包含することが意図される。本発明によって提供されるクローニングされる核酸は、任意の種の起源（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ネコおよびヒトを含む）のＤＮＡ−Ｒタンパク質をコードし得るが、好ましくは、本発明によって提供される核酸は、哺乳動物起源（最も好ましくは、ヒト起源）のＤＮＡ−Ｒをコードする。
【００２９】
本発明によって提供される核酸は、哺乳動物ＤＮＡ−Ｒをコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡまたはＲＮＡを含む。この核酸の特定の実施形態は、図１に示され（配列番号１）、そして図１に示されるようなアミノ酸配列（配列番号２）を有する哺乳動物ＤＮＡ−Ｒをコードする任意のヌクレオチド配列を含む。本発明によって提供されるような核酸ハイブリダイゼーションプローブは、特定のハイブリダイゼーションに十分なストリンジェンシー条件下で、核酸ハイブリダイゼーションにおいて有効な本発明の核酸の任意の部分を含む。このような核酸ハイブリダイゼーションプローブの混合物はまた、本発明のこの実施形態の範囲内である。本明細書中で提供されるような核酸プローブは、本発明によって提供される核酸の特定の実施形態の哺乳動物種アナログの単離に有用である。本明細書中で提供されるような核酸プローブはまた、当該分野の周知技術（ノーザンブロットハイブリダイゼーション、インサイチュハイブリダイゼーションおよび逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応産物のＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーションを含むが、これらに限定されない）を用いて、細胞および組織における哺乳動物ＤＮＡ−Ｒ遺伝子発現の検出に有用である。本発明によって提供されるプローブ（それに由来するオリゴヌクレオチドプローブを含む）がまた、特定の遺伝的障害に関連する制限断片長多型（ＲＦＬＰ）に対するスクリーニングについての哺乳動物（好ましくは、ヒト）のゲノムＤＮＡのサザンハイブリダイゼーションに有用である。
【００３０】
遺伝子操作手段によってクローニングされる遺伝子由来のタンパク質（例えば、哺乳動物ＤＮＡ−Ｒ）の産生は、当該分野で周知である。従って、続く議論は、当該分野の概観として意図され、そして当該分野の完全な状態を反映することは意図されない。
【００３１】
ＤＮＡ−Ｒをコードする核酸は、即時の開示を考慮して、以下に例示されるような既知の手順に従って、化学合成によって、適切な細胞培養物（ｃｅｌｌ（ｓ） ｃｕｌｔｕｒｅ）または細胞株培養物からのｍＲＮＡの逆転写物のスクリーニングによって、適切な細胞からのゲノムライブラリのスクリーニングによって、あるいはこれらの手順の組み合わせによって得られ得る。ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡのスクリーニングは、本明細書中で開示されるような哺乳動物ＤＮＡ−Ｒ核酸由来の核酸配列情報から作製されるオリゴヌクレオチドプローブを用いて行われ得る。プローブは、既知の手順に従って、検出可能な基（例えば、蛍光基、放射性原子または化学発光基）を用いて標識され得、そして以下の実施例においてより詳細に記載されるような従来型のハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用され得る。あるいは、哺乳動物ＤＮＡ−Ｒ核酸配列は、本明細書中で提供されるようなＤＮＡ−Ｒ由来の核酸配列情報に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）手順の使用によって得られ得る。Ｍｕｌｌｉｓらに対する米国特許第４，６８３，１９５号、およびＭｕｌｌｉｓに対する同第４，６８３，２０２号を参照のこと。
【００３２】
哺乳動物ＤＮＡ−Ｒタンパク質は、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含むＤＮＡ−Ｒ核酸をコードする核酸を含む組換え発現構造体を用いて形質転換される宿主細胞において合成され得る。このような組換え発現構造体はまた、複製可能なＤＮＡ構造体であるベクターから構成され得る。ベクターは、ＤＮＡ−ＲをコードするＤＮＡの増幅および／またはＤＮＡ−Ｒ遺伝子をコードするＤＮＡの発現のいずれかについて、本明細書中で使用される。本発明の目的について、組換え発現構造体は、複製可能なＤＮＡ構造体であり、これにおいて、ＤＮＡ−Ｒをコードする核酸は、適切な宿主においてＤＮＡ−Ｒの発現を果たし得る適切な制御配列に作動可能に結合される。
【００３３】
このような制御配列についての必要性は、選択される宿主および選択される形質転換方法に依存して変化する。一般的に、制御配列は、転写を制御するための転写プロモーター配列、任意のオペレーター配列またはエンハンサー配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列を含む。増幅ベクターは、発現制御ドメインを必要としない。通常、複製起点によって与えられる宿主における複製能、および形質転換体の認識を容易にするための選択遺伝子のみが必要とされる。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照のこと。
【００３４】
本発明の実行に有用なベクターとしては、プラスミド、ウイルス（ファージおよび哺乳動物のＤＮＡおよびＲＮＡウイルスを含む）、レトロウイルスならびに組込み可能なＤＮＡフラグメント（すなわち、相同組換えによって、宿主ゲノムに組込まれ得るフラグメント）が挙げられる。ベクターは、目的の遺伝子を複製し得、そして宿主ゲノムから独立して機能し得るか、または、いくつかの場合、ゲノム自身に組込み得る。適切なベクターは、レプリコンおよび制御配列を含み、これらは、意図される発現宿主に適合した種由来である。形質転換宿主細胞は、組換えＤＮＡ技術を用いて作製され、そしてＤＮＡ−Ｒタンパク質をコードする核酸を含む組換え発現構造体で形質転換またはトランスフェクトされている細胞である。好ましい宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ−７細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ、１９８１、Ｃｅｌｌ  ２３：１７５〜１８２）およびＬｔｋ−細胞である。形質転換宿主細胞は、ＤＮＡ−Ｒタンパク質を発現し得るが、核酸ハイブリダイゼーションプローブＤＮＡのクローニングまたは増幅の目的について形質転換される宿主細胞は、レセプターを発現する必要がない。発現される場合、本発明のＤＮＡ−Ｒは、代表的には、宿主細胞膜に局在する。従って、本発明は、本発明のＤＮＡ−Ｒタンパク質を含む上記の細胞膜の調製物、ならびにレセプタータンパク質自身の精製された相同調製物を提供する。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、同書を参照のこと。
【００３５】
多細胞生物由来の細胞の培養物が、組換えＤＮＡ−Ｒタンパク質合成についての望ましい宿主である。原則として、脊椎動物培養物由来または無脊椎動物培養物由来にかかわらず、任意の高等真核生物細胞培養物が有用である。しかし、実施例に例示されるように、哺乳動物細胞が好ましい。細胞培養物におけるこのような細胞の増殖は、慣用的手順になっている。Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ＫｒｕｓｅおよびＰａｔｔｅｒｓｏｎ、編（１９７３）。有用な宿主細胞株の例は、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞、ＶＥＲＯ細胞およびＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、マウスＬｔｋ−細胞株、ならびにＷＩ１３８細胞株、ＢＨＫ細胞株、ＣＯＳ−７細胞株、ＣＶ細胞株およびＭＤＣＫ細胞株である。ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ−７細胞およびＬｔｋ−細胞が好ましい。
【００３６】
本発明は、本明細書中に提供されるように、形質転換される真核生物細胞によって産生される哺乳動物ＤＮＡ−Ｒタンパク質の相同組成物を提供する。各々のこのような相同組成物は、ＤＮＡ−Ｒタンパク質から構成されることが意図され、これは、このような相同組成物において、このタンパク質の少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、そして最も好ましくは少なくとも９０％を含む；上記の相同調製物において、個々の汚染タンパク質種は、この調製物の５％未満、より好ましくは２％未満、そして最も好ましくは１％未満を含むことが予想される。本発明はまた、本明細書中に記載されるように、組換え発現構造体を用いた形質転換の結果として、哺乳動物ＤＮＡ−Ｒタンパク質を発現する細胞由来の膜調製物を提供する。また具体的には、本発明によって、本発明のＤＮＡ−Ｒのフラグメント、最も好ましくは、そのＤＮＡ結合フラグメントが提供される。好ましい実施形態において、上記のフラグメントは、膜貫通ドメイン、および当該分野において、ＤＮＡ−タンパク質結合に関連することが知られているジンクフィンガーモチーフおよびＲＩＮＧ配列モチーフを含むアミノ末端フラグメント（最も好ましくは、アミノ酸１〜５７５）を欠失するレセプターの可溶性形態を含む。
【００３７】
本発明に従ってクローニングされる遺伝子から作製される哺乳動物ＤＮＡ−Ｒタンパク質は、本明細書中により完全に記載されるように、インビボおよびインビトロでの細胞へのＤＮＡ結合をもたらし、そしてそれによってコードされる遺伝子のＤＮＡ取り込みおよび発現に影響を及ぼす化合物のスクリーニングについて使用され得る。例えば、宿主細胞は、本発明の組換え発現構造体で形質転換され得、哺乳動物ＤＮＡ−Ｒは、これらの宿主細胞内で発現され得、そしてその細胞または膜が使用されて、ＤＮＡ結合に対するその効果について、化合物をスクリーニングし得る。通常程度にＤＮＡ−Ｒを発現しない宿主細胞の選択によって、レセプターを含む膜の純粋な調製物が得られ得る。
【００３８】
本発明の組換え発現構造体は、通常程度にＤＮＡ−Ｒを発現せず、その後、このレセプターを発現する細胞を形質転換する分子生物学において有用である。このような細胞は、レセプター結合活性アッセイに有用な細胞膜調製物（Ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）の作製についての中間体として有用であり、これは、同様に、薬物スクリーニングに有用である。従って、本発明の組換え発現構造体は、従来の動物スクリーニングプロトコルよりも有意に低いコストで、潜在的に有用な薬物のスクリーニングについての方法を提供する。最終的なインビボ活性および毒物学アッセイについての必要性を完全には排除しないが、本発明の構造体および培養物は、年々、天然の供給源から合成、発見または抽出されるおびただしい数の潜在的に有用な薬物についての重要な第一のスクリーニング段階を提供する。それによって、この有用性は、現在利用可能な技術を用いて、新規の治療的に活性な薬物の合理的な薬物設計を可能にする（Ｗａｌｔｅｒｓ、「Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ」、ＫｌｅｇｅｒｍａｎおよびＧｒｏｖｅｓ、編、１９９３、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ  Ｐｒｅｓｓ：Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｇｒｏｖｅ、ＩＬ、１６５〜１７４頁を参照のこと）。
【００３９】
本発明の組換え発現構造体はまた、遺伝子治療に有用であり得る。本発明のクローニングされる遺伝子またはそのフラグメントはまた、相同組換えまたは部位特異的突然変異誘発が行われる遺伝子治療に用いられ得る。一般的に、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ、１９８７、Ｃｅｌｌ  ５１：５０３〜５１２；Ｂｅｒｔｌｉｎｇ、１９８７、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ７：１０７〜１１２；Ｓｍｉｔｈｉｅｓら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ  ３１７：２３０〜２３４を参照のこと。
【００４０】
本発明によって提供されるような核酸およびオリゴヌクレオチドプローブは、ヒトおよび他の動物の組織におけるＤＮＡ−Ｒ遺伝子発現のプローブ化についての診断手段として有用である。例えば、組織が、従来のオートラジオグラフィー技術または他の検出技術によって検出可能な基を保有するオリゴヌクレオチドプローブとインサイチュでプローブ化されて、このレセプターのネイティブ発現またはそれに関連する病理学的状態を研究する。さらに、染色体がプローブ化されて、対応するＤＮＡ−Ｒ遺伝子の存在または非存在、およびそれに関連する潜在的な病理学的状態を研究し得る。オリゴヌクレオチド（特に、アンチセンスオリゴヌクレオチド）はまた、レセプターを過剰発現する細胞、あるいはその発現が、一般的にまたは特定の組織においてのいずれかで、宿主生物において不利である細胞において、ＤＮＡ−Ｒの発現の減少に有用である。後者の場合の例は、本明細書中により完全に示されるように、嚢胞性線維症患者における気道の上皮細胞および肺組織におけるマクロファージである。
【００４１】
本発明はまた、本発明によって提供されるＤＮＡ−Ｒタンパク質またはそのエピトープに免疫学的に反応性である抗体を提供する。本発明によって提供される抗体は、当該分野で周知の方法を用いて、ＤＮＡ−Ｒまたはそのエピトープを発現する細胞、このような細胞由来の細胞膜（粗膜調製物または当該分野で周知の方法を用いて精製される膜のいずれか）、あるいはタンパク質の精製調製物（タンパク質フラグメントおよび融合タンパク質を含み、特に、融合タンパク質は、異種タンパク質に融合され、そして細菌細胞、酵母細胞または真核生物細胞における遺伝子操作手段を用いて発現される本発明のＤＮＡ−Ｒタンパク質のエピトープを含み、上記のタンパク質は、従来の生化学的方法を用いて、種々の程度の相同性までこのような細胞から単離される）を用いた接種によって、動物において惹起され得る。確立されたインビトロの合成方法を用いて作製され、そしてアミノ酸の異種配列と必要に応じて結合体化される合成ペプチドがまた、これらの方法に包含されて、本発明の抗体を産生する。このような接種に有用な動物としては、ウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ヤギおよび霊長類を含む種由来の個体が挙げられる。接種に好ましい動物は、齧歯類（マウス、ラット、ハムスターを含む）およびウサギである。最も好ましい動物は、マウスである。
【００４２】
このような接種、または本発明において使用される任意の他の手段について使用され得る細胞は、本発明によって提供されるＤＮＡ−Ｒを本来発現する任意の細胞株、あるいはより好ましくは、分子操作または遺伝子操作の結果として、本発明のＤＮＡ−Ｒまたはその任意のエピトープを発現するか、または物理学的、生化学的もしくは遺伝学的手段によって、内因性ＤＮＡ−Ｒタンパク質または異種ＤＮＡ−Ｒタンパク質の発現を増大するように処理されている任意の細胞または細胞株を含む。好ましい細胞は、哺乳動物細胞であり、最も好ましい細胞は、ＤＮＡ−Ｒタンパク質をコードする本発明の組換え発現構造体で形質転換されており、そしてそこからこのレセプターを発現する齧歯類（最も好ましくは、マウス宿主）に同質遺伝子的な細胞である。
【００４３】
本発明はまた、このような細胞の表面上、またはその膜調製物において存在するか、あるいは種々の程度の生化学的精製後に使用される本発明のＤＮＡ−Ｒまたはそのフラグメントに由来するエピトープと免疫学的に反応性であるモノクローナル抗体を提供する。本発明のＤＮＡ−Ｒの可溶性フラグメント（例えば、レセプターの膜貫通ドメイン、およびアミノ末端フラグメント（最も好ましくは、ＤＮＡ結合フラグメント）を除去するように遺伝子操作されるレセプターの種を含む）が、特に有用である。このような抗体は、当業者に周知の方法および技術を用いて作製される。本発明によって提供されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞株によって産生され、この細胞株はまた、本発明によって提供され、そして当該分野で周知の方法によって作製される。
【００４４】
ハイブリドーマ細胞株は、上記のように、骨髄腫細胞株の個々の細胞と、本発明のＤＮＡ−Ｒを発現する細胞で免疫される動物由来の脾臓細胞との融合によって作製される。本発明において使用される骨髄腫細胞株は、マウス、ラット、ハムスター、霊長類およびヒトの骨髄腫由来の株を含む。好ましい骨髄腫細胞株は、マウス由来であり、そして最も好ましいマウス骨髄腫細胞株は、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３である。脾臓が免疫後に得られる動物は、ラット、マウスおよびハムスターであり、好ましくは、マウスであり、最も好ましくは、Ｂａｌｂ／ｃマウスである。脾臓細胞および骨髄腫細胞は、当該分野で周知の多くの方法（不活性なセンダイウイルスとのインキュベーションおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の存在下でのインキュベーションを含むが、これらに限定されない）を用いて融合される。細胞融合についての最も好ましい方法は、４５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ−１４５０の溶液の存在下でのインキュベーションである。ハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体は、インビトロ細胞増殖からの細胞培養物の上清流体から収集され得る；あるいは、ハイブリドーマ細胞は、皮下および／または動物（最も好ましくは、マウス）の腹膜腔に注入され得、そしてモノクローナル抗体は、血液および／または腹水流体から得られ得る。
【００４５】
本発明によって提供されるモノクローナル抗体はまた、当業者に周知の組換え遺伝子方法によって産生され、そして本発明は、このような方法によって作製される抗体（これは、本発明のアミノ酸レセプターのエピトープと免疫学的に反応性である）を包含する。本発明はまた、このような抗体の抗原結合フラグメント（Ｆｖフラグメント、Ｆ（ａｂ）  フラグメントおよびＦ（ａｂ）２フラグメントを含むがこれらに限定されない）を包含する。フラグメントは、任意の数の方法（タンパク質分解開裂または化学的開裂、化学合成あるいは遺伝子操作テクノロジーの手段によるこのようなフラグメントの調製を含むがこれらに限定されない）によって産生される。本発明はまた、当業者に公知の方法によって作製されるＤＮＡ−Ｒのエピトープに免疫学的に反応性である１本鎖抗体を包含する。
【００４６】
本発明はまた、レセプター分子に存在する配列および／または配列の配座から構成される本発明のＤＮＡ−Ｒのエピトープを包含する。このエピトープは、天然に存在し得るか、またはレセプター分子の化学的開裂もしくはタンパク質分解的開裂、およびエピトープ含有ペプチドの単離の結果であり得るか、あるいは当業者に周知の方法を用いて、エピトープ含有ペプチドの化学合成またはインビトロ合成によって得られ得る。本発明はまた、遺伝子操作テクノロジーの結果として産生されるエピトープペプチド、および遺伝子操作される原核生物細胞または真核生物細胞によって合成されるエピトープペプチドを包含する。
【００４７】
本発明はまた、ＤＮＡ−Ｒ由来ペプチドに免疫学的に反応性の軽鎖および重鎖ペプチドから構成されるキメラ抗体を含む。本発明において具現化されるこのキメラ抗体は、天然に存在する抗体、ならびに当業者に周知の遺伝子操作テクノロジーの手段によって作製されるキメラ抗体に由来する抗体を含む。
【００４８】
レセプター、ＤＮＡ−ＲおよびそのＤＮＡ結合フラグメントをコードする核酸は、有利に使用されて、インビボおよびインビトロで、細胞におけるレセプターの発現または活性を調節する。本明細書中で提供されるように、本発明のＤＮＡ−Ｒ、特に、その可溶性実施形態は、競合してＤＮＡを結合して、ＤＮＡ−Ｒを発現する細胞へのその結合を減少し得る。特定の細胞（例えば、気道上皮細胞および肺におけるマクロファージ）におけるＤＮＡ−ＲへのＤＮＡ結合は、炎症プロセスの活性化に関連し、このプロセスは、嚢胞性線維症、慢性気管支炎および他の慢性肺疾患に関連した有意な罹患率および死亡率の産生を引き起こす。従って、本発明は、肺における細胞へのＤＮＡ結合の妨害による上記の罹患率および死亡率の減少についての種々の方法を提供する。１つの実施形態において、可溶性ＤＮＡ−Ｒ種は、最も好ましくは、当該分野で周知の処方物、賦形剤およびビヒクルを用いて、肺組織に直接エーロゾル投与によって投与され得、そしてそれによって、競合ＤＮＡ結合が達成され得る。別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、最も好ましくは、エーロゾル投与によって肺組織に送達され得、そして肺の標的細胞におけるＤＮＡ−Ｒの発現が、それによって抑制され得る。さらなる代案において、本発明のＤＮＡ−ＲへのＤＮＡ結合を特異的に阻害する抗体（最も好ましくは、モノクローナル抗体）が使用されて、上記の肺細胞へのＤＮＡ結合を阻害し得る。
【００４９】
本発明のＤＮＡ−Ｒ、特に、その可溶性実施形態およびＤＮＡ結合フラグメントはまた、ＤＮＡ−Ｒとの相互作用によって炎症を引き起こす他の炎症関連疾患および状態（中耳炎、化膿性関節炎および任意の細菌感染またはウイルス感染を含む）の処置において有用である。
【００５０】
さらに、本発明のＤＮＡ−Ｒが使用されて、ＤＮＡ結合、ＤＮＡ取り込みおよびＤＮＡ発現を調節する化合物をスクリーニングし得る。ＤＮＡ（特に、所望の遺伝子をコードするＤＮＡ）の導入は、当該分野で周知の方法論である。しかし、ＤＮＡ導入方法は、経験的に、そしてＤＮＡ取り込みの分子ベースの理解を少しも伴わずに開発されてきている。特に、これまで、本明細書中で開示されるようなＤＮＡ−Ｒへの特異的ＤＮＡ結合、およびエンドサイトーシスによるそれによる取り込みが、当該分野で認識されなかった。従って、本発明のＤＮＡ−Ｒの同定は、それによってコードされる遺伝子のＤＮＡ取り込みおよび発現の有効性の増大についての化合物および方法の開発についての新規の標的を提供する。
【００５１】
本発明によって提供される別の有利な方法は、腫瘍細胞において発現されるＤＮＡ−Ｒの使用であり、腫瘍細胞へのＤＮＡ結合抗癌薬物の送達を容易にする。薬物（例えば、アドリアマイシン（ドキソルビシン））は、癌患者の処置について臨床使用される。本発明のＤＮＡ−Ｒを発現する腫瘍細胞における細胞外ＤＮＡ取り込みの増強は、細胞への薬物のキャリアとして、細胞外ＤＮＡの使用によるこのようなＤＮＡ結合抗癌薬物の取り込みを容易にする。細胞外ＤＮＡとのこの薬物の結合は、とりわけ、薬物が、薬物耐性メディエータ（例えば、Ｐ−糖タンパク質）によって、腫瘍細胞において産生される活発な流出を回避することを可能にし得る。遺伝子移入に関して同じ原理を利用して、腫瘍細胞に対するＤＮＡ結合レセプターの選択的増強は、ＤＮＡ結合薬物の取り込みを増強し、そして治療効果の増大をもたらす。別の実施形態において、他の疾患（例えば、マラリア）は、マラリア寄生虫、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍで寄生される赤血球における細胞表面のＤＮＡ結合の開発に基づく類似の様式で処置され得る。
【００５２】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態およびその種々の使用を例示する。これは、例示の目的のみについて示され、そして本発明を制限するように考慮されない。
【００５３】
（実施例１）
（ヒト膜結合ＤＮＡレセプター（ＤＮＡ−Ｒ）の単離）
上記の明細書において記載されるように、細胞へのＤＮＡ結合は、当該分野で観察されており、そして上記の結合の性質は、細胞表面で発現されるＤＮＡ結合タンパク質の存在を示唆した。ヒト細胞から新規のＤＮＡ結合タンパク質を単離するために、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を有する患者由来の血清（ＤＮＡセファロースカラムにわたる複数回の（６×）通過によって、抗ＤＮＡ抗体の血清を枯渇するように処理される）を用いて、リポサッカリドで刺激されるヒト単球から作製されるλｇｔ１１  ｃＤＮＡ発現ライブラリをスクリーニングした。この血清は、抗ＤＮＡレセプター活性（細胞へのＤＮＡ結合のブロッキングによって規定される；Ｂｅｎｎｅｔら、１９９２．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７６：２１８２〜２１９０）を有することが示されている。
【００５４】
この血清を用いてスクリーニングされるおよそ１００万のプラークから、１０のポジティブファージクローンを、ＹｏｕｎｇおよびＤａｖｉｓの技術に従って（１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：１１９４〜１１９８）、同定および単離した。このクローンを、溶出される抗体を用いて、サザンブロット分析およびウェスタンブロット分析に基づいて、２つのクラスに分類した。１つのクローン（クローン８８）の１．４キロベース（ｋｂ）挿入物の配列分析（これは、ＳＬＥ血清を用いたウェスタンブロットに対して高度に反応性であった）は、クローンの５’末端で開いており、そして３’末端に翻訳停止コドンを含んだオープンリーディングフレームを明らかにした。このオープンリーディングフレームは、４６．７キロダルトン（ｋＤａ）のタンパク質フラグメントをコードした。
【００５５】
推定ＤＮＡ−Ｒの全長ｃＤＮＡを、末梢血単核細胞である、ヒトバーキットリンパ腫細胞（Ｒａｊｉ；登録番号ＣＣＬ  ８６、米国菌培養収集所、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ；ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ  ２）およびヒトリンパ芽球性白血病細胞（ＭＯＬＴ−４；ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ  １５８２）由来のセグメントにおいて得られた。クローン８８由来の７３１塩基対（ｂｐ）のＤＮＡプローブを用いて、Ｒａｊｉ細胞株由来のλｇｔ１１ファージライブラリ（このライブラリを、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ  Ｌａｂｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡから得た）をスクリーニングした。５’オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列のさらなる４６２ｂｐを含んだ２４０９ｂｐのクローンを、このスクリーニングから得た。ｃＤＮＡの５’範囲由来のさらなる配列を、５’ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の急速増幅）方法の２つの変形を用いて単離した。第一の５’ＲＡＣＥ方法において、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を、ポリＴプライマーおよび逆転写酵素を用いて、ＨｅＬａ細胞ｍＲＮＡから合成した。ポリＡテイルを、ターミナルトランスフェラーゼによって、ｓｓＤＮＡの５’末端に付加した。この一本鎖ｃＤＮＡを、遺伝子特異的プライマーおよびポリＴプライマーを用いて増幅した。このクローンは、７５３ｂｐのさらなる配列を以前に得られた配列の５’に含んだ。このｃＤＮＡの５’配列の残りを、製造業者の指示に従って、Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ｒａｃｅ  ｃＤＮＡ増幅（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ  Ｌａｂｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）によって、ＭＯＬＴ−４  ｃＤＮＡから得た。この手順は、３４０ｂｐのＯＲＦおよび９５０ｂｐの５’非翻訳領域からなるさらなる１２９０ｂｐクローンを産生した。これらのスクリーニングおよび増幅実験由来の結果の組み合わせは、本発明のＤＮＡ−Ｒをコードする推定全長ｃＤＮＡを産生した。
【００５６】
推定ＤＮＡレセプターについての完全な全長ｃＤＮＡを、以下の配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＭＯＬＴ−４  ｍＲＮＡ由来の１つのＲＴ−ＰＣＲ産物としてクローニングした：
プライマー５’：ＡＣＣＣＧＡＧＣＡＴＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＧＴＧＣＡＧＧＣＡＧＣ（配列番号５）および
プライマー３’：ＧＧＴＡＴＣＴＡＧＡＴＣＣＡＴＧＧＴＧＴＧＧＴＣＡＣ（配列番号６）
この完全配列は、１１９２アミノ酸（配列番号２）のタンパク質をコードする３５７６ヌクレオチドの規定されるオープンリーディングフレームを有する４３５１ヌクレオチド（配列番号１）長であった。この単離プロトコルは、図１に概略的に例示される。
【００５７】
（実施例２）
（ＤＮＡレセプター遺伝子発現およびタンパク質配列分析）
種々のヒト組織におけるその対応するｍＲＮＡの組織特異的発現パターンおよび細胞株特異的発現パターンを、種々の組織および癌細胞株から単離されるＲＮＡに対するノーザンブロット分析によって分析した。これらの実験結果を、図２に示す。
【００５８】
組織サンプルのパネルを、低いストリンジェンシー条件下（４２℃での、５×ＳＳＰＥ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）、１０×デンハルト溶液（０．２％  フィコール、０．２％  ポリビニルピロリドン、０．２％  ウシ血清アルブミン）、１００μｇ／ｍＬ  サケ精子ＤＮＡ、２％  ＳＤＳおよび５０％  脱イオンホルムアミドならびに１〜２×１０６ｃｐｍのランダムプライムされる３２Ｐ標識プローブにおけるハイブリダイゼーション、その後の０．１×ＳＳＣ（１５ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム、０．１％  ＳＤＳ）における洗浄として規定される）で行われるノーザンハイブリダイゼーション分析によって試験した。このブロットを、ＤＮＡ−Ｒ遺伝子由来のコード配列の３’末端由来の４４２ｂｐの配列からなるプローブとハイブリダイズさせて、レセプターｍＲＮＡの分布を決定した。この分析は、試験されるすべてのヒト組織および癌細胞株において、９．５ｋｂおよび６．８ｋｂの２つの主要な転写物を明らかにした。転写発現は、脾臓、精巣、卵巣および小腸において比較的豊富であった。いくつかのより小さな転写サイズがまた、試験されるいくつかの組織および細胞株において観察された（図２）。
【００５９】
ヒトゲノム配列に対する相同性検索は、染色体９ｑ３４上に、このＤＮＡレセプターを配置した（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＣ００７０６６、コンティグＣＨＲ９．ＳＬ２７上のマーカーＨＩＭ９．８９）。このゲノム配列（これは、５’末端から始まるｃＤＮＡの８５％を含んだ）は、１６の完全なエキソンの位置および１７番目のエキソンの冒頭を明らかにした。発現されるタグ配列（ＥＳＴ）データベースのＢＬＡＳＴ検索は、正常なヒト組織（肝臓／脾臓、前立腺上皮、胚Ｂ細胞、白色脂肪、妊娠した子宮、胎児心臓／肝臓および脾臓）ならびに腫瘍細胞および形質転換ヒト細胞（Ｊｕｒｋａｔ、ＨＬ６０、２９３、Ｇ３６１、Ｂ細胞リンパ性白血病、結腸腫瘍、黒色腫および副甲状腺腫瘍）において、この遺伝子の広範な発現を示した。
【００６０】
図３は、配列番号１によってコードされるＤＮＡ−Ｒタンパク質の構造の概略図を提供する。ヒドロパシー分析は、潜在的膜貫通ドメインである、タンパク質のカルボキシ末端近傍の３８アミノ酸の疎水性領域（アミノ酸１１３３〜１１７１）を同定した。これらのアミノ酸の欠失によるこのレセプターの可溶性種の発現は、膜貫通ドメインとしてのこの領域の同定を支持した。さらに、−結合型グリコシル化についての７つの共通部位が同定されており（アミノ酸、１２２位、３９４位、４３０位、４５１位、４６６位、４６８位および１１５０位）、そしてアミノ酸５４９〜８０９にわたるプロリンリッチ（残基の２０％が、プロリンである）領域が存在する（図３）。このＤＮＡレセプタータンパク質の計算される等電点は、６．４である。ＢＬＡＳＴ検索はまた、ＤＮＡ−Ｒ配列において、２つの当該分野に認識されるアミノ酸配列モチーフを同定した：アミノ末端近傍に位置するＣ３ＨＣ３Ｄ  Ｒｉｎｇフィンガーサブタイプ（アミノ酸１４〜５０）、およびこのタンパク質配列の中央付近に位置するＣ３Ｈジンクフィンガー（アミノ酸４１６〜４３５）。いくつかのリングフィンガーモチーフの整列を、図４Ａに示す；ＤＮＡ−Ｒは、本来同定されるＣ３ＨＣ４  Ｒｉｎｇフィンガーモチーフと、最後のシステインのアスパラギン酸での置換だけ異なる。Ｃ３Ｈジンクフィンガーモチーフの保存システインおよびヒスチジンの整列を、図４Ｂに示す。
【００６１】
（実施例３）
（ＤＮＡレセプター発現およびタンパク質発現分析）
本発明のＤＮＡ−Ｒを、以下の通りに組換え的に産生した。本発明のＤＮＡ−Ｒのアミノ酸１〜１１９０（すなわち、２つの最もカルボキシ末端のアミノ酸を欠失する）についてのコード配列を含むＢａｍＨＩ−ＨｐａＩ  ｃＤＮＡフラグメントを、ｐＴｒｉｐｌＦｌｕ（Ｊ．Ｅｐｓｔｅｉｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡから得た）にクローニングした。このベクターは、親ベクター、ｐｃＤＮＡ３の複数のクローニング部位の３’にすぐ接して挿入される三つ組において、インフルエンザ赤血球凝集素遺伝子由来のエピトープタグをコードする配列を含み、そしてこれは、挿入されるＤＮＡ−Ｒ  ｃＤＮＡ配列とインフレームである。このベクターを、製造業者の指示に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いたトランスフェクションによって、ヒト２９３細胞に導入された。トランスフェクト細胞（２９３−ＤＮＡ−Ｒ／ｆｌｕ）を、５００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８を補充した増殖培地（１０％  ウシ胎仔血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ）における培養によって選択した。
【００６２】
哺乳動物細胞におけるＤＮＡ−Ｒタンパク質発現を特徴付けるために、免疫沈降法およびウェスタンブロット実験を、アミノ酸残基１〜５７５を含む、本発明のＤＮＡ−Ｒのアミノ末端フラグメントに対して惹起されるポリクローナル抗血清を用いて、いくつかの細胞株から単離されるタンパク質抽出物を用いて行った。
【００６３】
ポリクローナル抗体を、従来技術を用いて、ＤＮＡ−Ｒの精製フラグメント（アミノ酸１〜５７５を含む）に対して産生した。３匹の雌性Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｗｈｉｔｅウサギ（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｏｒｅｇｏｎ  Ｒａｂｂｉｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ）（体重２．３〜３．０ｋｇ）を、ＧＳＴ融合タンパク質として細菌において産生された（実施例４に記載される）５０μｇのＤＮＡ−Ｒペプチドを用いて皮下注入し、そしてその融合パートナーから精製した。この抗原を、０．５ｍＬの最終用量において、Ｔｉｔｒｅ−Ｍａｘ（ＣｙｔＲｘ  Ｃｏｒｐ．、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、ＧＡ）を用いて乳化した。このウサギを、１５μｇの抗原／Ｔｉｔｒｅ−Ｍａｘ混合物を用いて、４週間後、再び２週間後にブーストし、そしてその後１ヶ月に１度のブースタースケジュールに対して維持した。このウサギを、抗原を用いた各々のブーストから７〜１０日後に血液採取し、そして血清を、免疫化抗原に対する反応性について分析した。
【００６４】
接種されるウサギから得られるポリクローナル抗血清を、ウェスタンブロット分析に使用した。Ｍｒ約１．５×１０５のタンパク質を、試験される大半の細胞において（２９３、ＣＯＳ７、Ｇ３６１、ＨｅＬａ、ＨＲＥ６０５、ＭＯＬＴ−４、Ｒａｊｉ、Ａ５４９、Ｂ１６を含む）、抗ＤＮＡ−Ｒ抗体によって同定した。類似の可動性を有するタンパク質を、遺伝子操作されるヒト２９３細胞（２９３−ＤＮＡ−Ｒ／ｆｌｕ）の溶解物において検出し、この細胞は、カルボキシ末端ＨＡタグ化ＤＮＡ−Ｒについての発現ベクターを用いて安定にトランスフェクトされた（ｐＤＮＡ−Ｒ／ｆｌｕ）。図５に示されるように、このタンパク質を、上記のウサギポリクローナル抗ＤＮＡ−Ｒ（１〜５７５）抗血清、または組換え産生されるタンパク質におけるカルボキシ末端ＨＡタグに特異的なマウスモノクローナル抗体（抗ＨＡ）のいずれかを用いた免疫沈降法および／またはウェスタンブロット分析によって検出した。
【００６５】
ＤＮＡ−Ｒタンパク質の細胞局在を決定するために、組換え２９３−ＤＮＡ−Ｒ／ｆｌｕ細胞由来の粗膜画分を、抗ＤＮＡ−Ｒ抗体または抗ＨＡ抗体のいずれかを用いたウェスタンブロット分析によって試験した。図６に示される結果は、これらの細胞における本質的にすべてのＤＮＡ−Ｒタンパク質が、膜画分に結合したことを示した。固定されて浸透される細胞に対する間接的免疫蛍光は、抗ＤＮＡ−Ｒ染色が、細胞の核周辺領域に顕著に局在したが、核染色は観察されなかったことを示した（図７）。抗ＤＮＡ−Ｒおよび抗トランスフェリンレセプター抗体を用いた二重染色は、ＤＮＡ−Ｒおよびトランスフェリンレセプターの部分的な共局在を示したが、ＤＮＡ−Ｒは、末梢エンドソームにおいて、トランスフェリンレセプターと共局在しなかった（図７）。これらの結果は、細胞外ＤＮＡが、エンドサイトーシスによって、本発明のＤＮＡ−Ｒを発現する細胞によって取り上げられることを示し、そしてエンドサイトーシスによって取り上げられる分子の細胞内輸送に影響を与える化合物が、細胞外ＤＮＡの細胞内運命（例えば、リソソームにおける分解、または細胞核への輸送）の調節に有用であることを示唆する。
【００６６】
ＤＮＡ−Ｒが、細胞表面上に位置するか否かを決定するために、細胞を、抗ＤＮＡ−Ｒ（１〜５７５）免疫ウサギ血清とともにインキュベートした。抗体結合を、ウサギＩｇＧに対するＦＩＴＣ標識される二次抗体を用いたフローサイトメトリーによって検出した。すべての血清希釈で、免疫血清とともにインキュベートされる細胞の蛍光強度は、免疫前血清（ｐは、０．００３未満である）とともにインキュベートされる細胞の強度よりも有意により高く、これは、ＤＮＡ−Ｒが、細胞表面上で発現されることを示唆する（図８）。
【００６７】
これらの結果は、ネイティブ発現されるか、または本発明のクローニングされるｃＤＮＡから発現されるかのいずれかのＤＮＡ−Ｒタンパク質、またはその遺伝子操作される実施形態が、カルボキシ末端のヒドロパシープロットによって推定されるように、細胞膜に局在したことを実証した。
【００６８】
（実施例４）
（可溶性ＤＮＡ−Ｒ融合タンパク質は、高い親和性でＤＮＡを結合する）
本発明のＤＮＡ−ＲのＤＮＡを結合する能力、および特に、ＤＮＡ−Ｒタンパク質の可溶性形態のＤＮＡを結合する能力（これは、以下により具体的に記載されるように、治療因子の開発について有用である）を決定した。これらの実験について、ＤＮＡレセプターのアミノ末端部分（アミノ酸１〜５７５）（膜貫通領域を欠失するが、ＲＩＮＧフィンガードメインおよびジンクフィンガードメインの両方を含む）との間の融合タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質の発現について、ｐＧＥＸベクター系（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｋａｌａｍａｚｏｏ、ＭＩ）を用いて産生し、そしてＧＳＴ／ＤＮＡ−Ｒ（１〜５７５）と名付けた。このタンパク質フラグメントの産生、および本発明の全長ＤＮＡ−Ｒに関するその構造の概略図を、図９Ａに示す。組換えＤＮＡ−Ｒペプチドの産生、タンパク質分解および精製のポリアクリルアミドゲル分析を、図９Ｂに示す。ＧＳＴ／ＤＮＡ−Ｒ融合タンパク質およびＤＮＡ−Ｒペプチドの計算分子量は、それぞれ、９０ｋＤａおよび６３ｋＤａである。
【００６９】
次いで、精製ＧＳＴ／ＤＮＡ−Ｒ融合タンパク質を、プラスミドＤＮＡを結合するその能力について試験した。３つの独立のインビトロアッセイを用いて、この融合タンパク質によるＤＮＡ結合を評価した。第一に、グルタチオンセファロースビーズに結合したＧＳＴ／ＤＮＡ−Ｒの、ＹＯＹＯ標識されるプラスミドＤＮＡを結合する能力を、０．５ｍＬの培地において、０．９μｇ  ＹＯＹＯ／ＤＮＡとのインキュベーションによって決定した。（ＹＯＹＯ−１は、ＤＮＡに結合したときにのみ蛍光性である挿入蛍光色素であり、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲから得られる。）ビーズ（３．５×１０５）およびＹＯＹＯ／ＤＮＡを、４℃で３０分間インキュベートし、１回洗浄し、次いで蛍光強度を、ＦＡＣＳによって分析した。図１０に見られるように、ＧＳＴ／ＤＮＡ−Ｒ融合タンパク質は、ＤＮＡの結合に極めて有効であったが、一方、精製ＧＳＴタンパク質単独および２つのさらなる無関係のＧＳＴ融合タンパク質（ＧＳＴ−ＣＢＤおよびＧＳＴ−ＨＳＴ．１、Ｄｒ．Ｒｏｌａｎｄ  Ｋｗｏｋ、Ｖｏｌｌｕｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ  ＯＲからの贈与物）は、いかなるＤＮＡ結合能力も示さなかった。ＦＡＣＳ分析後、ＤＮＡ結合アッセイにおいて使用される各々のサンプル由来のグルタチオンセファロースに結合したタンパク質のアリコートを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、その後、クーマシーブルー染色した。ほぼ等量の各ＧＳＴ融合タンパク質は、各々のサンプルに存在することが示された。
【００７０】
ＧＳＴ／ＤＮＡ−Ｒ融合タンパク質が、ＤＮＡ結合分子であるか否かをさらに評価するために、サザンウェスタンブロットを行った。精製ＧＳＴ／ＤＮＡ−Ｒ融合タンパク質およびＧＳＴタンパク質単独を、ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、ニトロセルロースに電気泳動的に転移し、次いで、ビオチン化（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）ＤＮＡとプローブ化した。ＤＮＡ結合を、従来方法を用いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合体化したストレプトアビジンの添加によって視覚化した。図１１に見られるように、精製ＧＳＴ／ＤＮＡ−Ｒ融合タンパク質（図１１Ｂ、レーン１）は、ビオチン化プラスミドＤＮＡを結合したが、ＧＳＴタンパク質単独（図１１Ｂ、レーン２）は、このＤＮＡを結合しなかった。ＧＳＴ／ＤＮＡ−Ｒサンプルにおいて、ビオチン化ＤＮＡ／ストレプトアビジン−ＨＲＰとの反応が見られた他のペプチド（図１１Ｂ、レーン１）は、おそらく、部分分解されるＧＳＴ／ＤＮＡ−Ｒペプチドおよび／または汚染細菌タンパク質のトレースを示す。図１１Ａにおけるレーンは、ＤＮＡを添加されないサンプルを示す。
【００７１】
第三に、精製ＤＮＡレセプターフラグメント（アミノ酸１〜５７５）のＤＮＡ結合能力の最終評価として、精製ペプチドのプラスミドＤＮＡでコーティングされるＥＬＩＳＡプレート（ＶＡＲＥＬＩＳＡ  ｄｓＤＮＡキット、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に結合する能力を決定した。ＤＮＡレセプターペプチドの結合を、実施例３に記載されるウサギ抗ＤＮＡ−Ｒポリクローナル抗血清を用いて検出した。図１２に示されるように、精製ＤＮＡ−Ｒペプチドは、１μｇ／ｍＬおよび１０μｇ／ｍＬの両方で試験される場合、ＤＮＡでコーティングされるプレートに結合した。ＤＮＡ−Ｒフラグメントを含まないネガティブコントロールは、反応性を示さなかった。
【００７２】
これらの結果は、本発明のＤＮＡレセプター遺伝子が、特異的にＤＮＡを結合するタンパク質をコードし、そしてこの分子のＤＮＡ結合部分は、ネイティブタンパク質のアミノ酸配列１〜５７５を有するタンパク質フラグメントに存在したことを実証する。
【００７３】
本発明のクローニングされるｃＤＮＡによってコードされるタンパク質が、ＤＮＡを結合することが実証されて、ＤＮＡについての可溶性ＧＳＴ／ＤＮＡ−Ｒの親和性を、ニトロセルロースフィルター結合アッセイを用いて概算した。このアッセイを、冷ＤＮＡ競合物を用いて行い、ここで、既知量のＧＳＴ／ＤＮＡ−Ｒ（２ｎＭ）および標識ＤＮＡ（２００ｐＭ）を、漸増量の未標識仔ウシ胸腺ＤＮＡを用いて滴定した。これらの結果は、本発明のＤＮＡ−ＲへのＤＮＡ結合が、特異的レセプターとしてのその同定と一致して、可飽和であったことを実証した。このデータのスキャッチャード変換は、約４ｎＭのＫＤを生じた（図１４）。
【００７４】
ＤＮＡ−Ｒの可溶性形態（アミノ酸１〜５７５）によるＤＮＡの結合が、単一特異性の電荷関連相互作用に起因しなかったことを実証するために、アミノ酸４１６〜４３５におけるジンクフィンガードメインのＤＮＡ結合における役割を試験した。部位特異的突然変異誘発を用いて、アミノ酸４１６または４３１のいずれかの保存されたジンクフィンガーのシステインについてのコドンを、アラニンまたはセリンのいずれかについてのコドンに変更した。突然変異誘発されたＧＳＴ／ＤＮＡ−Ｒ融合タンパク質を、すべて実質的に上記のように、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてグルタチオンセファロース上でアフィニティー精製し、次いで、ＥＬＩＳＡによって、固定されるＤＮＡへの結合能を試験した。ＥＬＩＳＡプレートに結合した精製ＧＳＴ／ＤＮＡ−Ｒ（１〜５７５）融合タンパク質を、図１３に示されるように、仔ウシ胸腺ＤＮＡ（Ｍａｇｉｗｅｌ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を用いてコーティングした。システイン４１６または４３１のいずれかの突然変異誘発は、野生型ＧＳＴ／ＤＮＡ−Ｒ融合タンパク質について観察されるレベルの約５０％までＤＮＡ結合を減少し、これは、このジンクフィンガードメインが、特異的ＤＮＡ結合に関与することを強く示唆する（図１３）。
【００７５】
これらの結果は、可溶性ＤＮＡ−ＲフラグメントによるＤＮＡ結合が、単に非特異的電荷関連相互作用のみではなく、むしろ、タンパク質における特異的ＤＮＡ結合モチーフ（少なくともジンクフィンガーモチーフを含む）によって媒介されることを実証した。
【００７６】
（実施例５）
（可溶性ＤＮＡ−Ｒタンパク質は、ＤＮＡ誘導性サイトカイン分泌を阻害し、そして細胞へのＤＮＡの結合をブロックする）
いくつかの慢性肺疾患（嚢胞性線維症、慢性気管支炎および気管支拡張症を含む）の肺組織における細胞外ＤＮＡの存在は、長期の病理学的結果を伴う肺組織の慢性的炎症を引き起こすかまたはこの炎症に寄与する。細胞外ＤＮＡは、当該分野で公知であり、肺のマクロファージおよび他の細胞の、サイトカインの放出を引き起こし、このサイトカインは、嚢胞性線維症患者の慢性の総合的症状の一部としての炎症を媒介する。実施例２に記載されるように、本発明のＤＮＡ−Ｒタンパク質は、肺組織（特に、肺の上皮細胞）において発現される。これは、本発明のＤＮＡ−Ｒレセプタータンパク質が、炎症を引き起こすサイトカインの放出の誘発によって、炎症に関与することを示唆する。従って、ＤＮＡを結合するＤＮＡ−Ｒの可溶性形態の能力は、このタンパク質フラグメントが、嚢胞性線維症患者において、細胞外ＤＮＡの結合を競争し得、そしてそれによって、治療因子として有用であることを示唆した。
【００７７】
本発明の可溶性ＤＮＡ−Ｒフラグメントが、ＤＮＡ誘導性のサイトカイン分泌を阻害するか否かを決定するために、可溶性ＤＮＡ−Ｒタンパク質を、培養物において、Ｊ７７４マウス単球／マクロファージ細胞からのＣＦ−ＤＮＡ誘導性のＩＬ−６放出の阻害について試験した。刺激化ＤＮＡの非存在下において、ＤＮＡ−Ｒは、ＩＬ−６分泌を誘導しなかった（表Ｉにおいて示される）。嚢胞性線維症を有する患者から単離および精製されるＤＮＡ（ＣＦ  ＤＮＡ）は、Ｊ７７４細胞から、６１１ｐｇ／ｍＬのＩＬ−６を誘導した。ＣＦ  ＤＮＡを、第一に、ＤＮＡ−Ｒタンパク質（１０ｎｇ／ｍＬ）とインキュベートし、次いでＪ７７４細胞に添加した場合、ＩＬ−６の量は、可溶性ＤＮＡ−Ｒタンパク質（１０ｎｇ／ｍＬ）の存在下において、３６％減少した。ネガティブコントロールとして、仔ウシ胸腺ＤＮＡは、検出可能なＩＬ−６を誘導できなかった。サイトカイン放出が、汚染内毒素の存在によって引き起こされた可能性を排除するために、カブトガニのアメーバ細胞アッセイを行い、そしてＣＦ  ＤＮＡは、０．２５ｎｇ／ｍＬ未満の汚染内毒素を有した。コントロール実験において、このＬＰＳ量は、ただ４ｐｇ／ｍＬのＩＬ−６を誘導した。第二の実験において（また、表Ｉに示される）、汚染内毒素を、可溶性ＤＮＡ−Ｒから除去し、増大したＤＮＡ−Ｒ濃度の使用を可能にした。可溶性ＤＮＡ−Ｒタンパク質（１０ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの範囲において用いられる）を、Ｊ７７４細胞および５０μｇ／ｍＬのＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡとともにインキュベートした。細胞を含まない上清を収集し、そしてＩＬ−６を、ＥＬＩＳＡによって定量した。細菌ＤＮＡの非存在下において、可溶性ＤＮＡ−Ｒは、ＩＬ−６分泌を誘導しなかった。しかし、細菌ＤＮＡが、この系に添加された場合、可溶性ＤＮＡレセプタータンパク質は、用量依存性様式で、ＩＬ−６分泌を阻害した（表Ｉ）。
【００７８】
【表１】
2005503101.tif 000002
可溶性ＤＮＡ−Ｒタンパク質フラグメントが、細胞へのＤＮＡ結合を妨げ得たか否かを決定するために、Ｊ７７４細胞（５×１０５細胞）およびＹＯＹＯ標識されるｐＧＥＭ−ＤＮＡを、可溶性ＤＮＡ−Ｒタンパク質フラグメントまたはコントロールのＧＳＴタンパク質のいずれかとともにインキュベートした。細胞を、４℃で３０分間インキュベートし、遠心分離し、そしてアッセイ培地を用いて２回洗浄し、生存能力を評価するために、氷上で２０分間、７−アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）を用いて再懸濁およびインキュベートした。このサンプルを、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｎｅｓ、ＮＪ）によって、ＤＮＡ結合について評価した。結果は、Ｊ７７４細胞へのＤＮＡ結合の用量依存性阻害を示した（図１５）。類似の結果は、ヒト２９３細胞を用いて観察された。さらに、可溶性ＤＮＡ−Ｒタンパク質／ＤＮＡ複合体は、細胞表面に結合しない。可溶性ＤＮＡ−Ｒタンパク質は、ＤＮＡに結合し、そして細胞表面とのＤＮＡの結合の妨害に有効である。
【００７９】
これらの結果は、本発明によって提供される可溶性ＤＮＡ−Ｒフラグメントが、細菌または哺乳動物の細胞外ＤＮＡのいずれかを競合的に結合することによって、そして本発明のＤＮＡ−Ｒを発現するサイトカイン産生細胞によって結合されるこのようなＤＮＡの量の減少によって、サイトカイン放出およびそれに引き続く炎症の阻害に有用であることを示す。
【００８０】
（実施例６）
（ＤＮＡ−Ｒによって媒介される細胞へのＤＮＡ結合）
上記に開示される実験結果は、本発明のＤＮＡ−Ｒのアミノ酸１〜５７５を含む可溶性ＤＮＡ−Ｒフラグメントが、ＤＮＡを結合し得たことを確立した。さらなる実験が行われて、レセプターへのＤＮＡ結合、特に、ネイティブレセプタータンパク質が、細胞表面で細胞外ＤＮＡを結合し得るか否か、および結合が、レセプター媒介性プロセスに一致するか否かを特徴付けた。
【００８１】
これらの実験において、Ａ５４９ヒト肺癌腫細胞を、対数期の培養物から収集し、そしてＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅで処理して、外因性の細胞表面に結合した核酸を除去した。処理後、この細胞を、１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよびリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて洗浄して、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅの作用を停止した。次いで、この細胞を、１％  ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）および１ｍＭ  Ｃａ＋＋Ｍｇ＋＋を含むＰＢＳにおいて、１０６細胞／ウェルで、Ｖ底の９６ウェルプレートにプレーティングした。ＹＯＹＯ標識されるｐＧＥＭ４ＺプラスミドＤＮＡを、１％  ＦＣＳおよび１ｍＭ  Ｃａ＋＋Ｍｇ＋＋を含む０．２ｍＬの培地において、０〜２５μｇ／ｍＬの濃度で添加した。この細胞および標識プラスミドを、４℃で３０分間インキュベートして、プラスミドＤＮＡのインターナリゼーションを最小化した。３０分間のインキュベーションの完了の際に、この細胞を、１％  ＦＣＳおよび１ｍＭ  Ｃａ＋＋Ｍｇ＋＋を含む２×ＰＢＳにおいて洗浄し、そして０．３ｍＬのＰＢＳにおいて再懸濁した。次いで、細胞を、１％  ホルムアルデヒドに固定し、そしてプラスミドＤＮＡの細胞表面結合を、ＦＡＣＳによって定量した。
【００８２】
これらの実験結果を、図１６に示す。この代表的なＦＡＣＳヒストグラムは、いずれかの培地とインキュベートされる細胞を比較する場合に見られるＡ５４９細胞プロフィール（図１６、左の曲線）、または５μｇ／ｍＬのＹＯＹＯ／ｐＧｅｍ４Ｚプラスミドとインキュベートされる細胞（図１６、右にシフトした曲線）を示す。強度の相乗平均を用いて、細胞集団を記述する。本実施例において、培地のみで処理されるＡ５４９細胞集団の相乗平均は１３であり、そしてＹＯＹＯ標識されるプラスミドＤＮＡとインキュベートされる場合に、３４まで増大した。
【００８３】
次いで、Ａ５４９細胞についての結合曲線を、０〜２５μｇ／ｍＬのプラスミドＤＮＡ範囲を用いて作製した（図１７Ａおよび１７Ｂ）。図１７ＡにおけるグラフのＹ軸は、グラフにおける細胞集団の蛍光強度の相乗平均を示す。Ａ５４９細胞へのプラスミドＤＮＡの細胞表面結合は、およそ１０μｇ／ｍＬのＤＮＡで飽和を示し始めた。２５〜１００倍過剰の未標識ＤＮＡを用いた細胞の処理は、細胞表面へのＹＯＹＯ／ＤＮＡの結合を有意にブロックした（図１７Ａ）。Ａ５４９細胞への特異的細胞表面結合（過剰の未標識ＤＮＡを用いて見られる合計の結合間の差異として示される）は、特徴的な飽和プロフィールを有する結合曲線を示す（図１７Ｂ）。
【００８４】
また、種々の腫瘍細胞株（Ｂ１６マウス黒色腫細胞、ＭＯＬＴ−４ヒトリンパ芽球性白血病細胞およびヒトＲａｊｉバーキットリンパ腫細胞を含む）についての細胞表面プラスミドＤＮＡ結合プロフィールが試験された。試験されるすべての細胞において、結合のレセプター媒介性機構に一致して、細胞表面ＤＮＡの可飽和結合プロフィールを獲得した。最適のＤＮＡ結合条件下において、ＦＡＣＳによって検出されるように、バックグラウンドレベルを超えてＤＮＡを結合し得る集団における細胞のパーセントは、７０％を超える範囲（Ｓ４９、ＤＨＬ−６、ＭＯＬＴ−４）〜１０％未満（Ｄ１０．Ｓ、ＨＵＴ−７８、Ｋ５６２およびＧ３６１）にわたった。
【００８５】
【表２】
2005503101.tif 000003
ＤＮＡ結合が、細胞表面タンパク質によって媒介されるか否かを決定するために、細胞をトリプシンで処理した後に、実験を、記載されるように実質的に行った。Ａ５４９細胞に対するプラスミドＤＮＡの細胞表面ＤＮＡ結合は、４℃でのＹＯＹＯ標識されるＤＮＡとの結合後に、トリプシンを用いた細胞の処理によって有意に阻害された（図１８）。
【００８６】
最終的に、細胞表面ＤＮＡ結合に対する二価の陽イオンの効果を、Ｂ１６黒色腫細胞を用いて試験した。これらの研究は、Ｃａ＋＋が結合媒体に添加される場合に、蛍光強度の４倍の増大を実証した（図１９）。
【００８７】
これらの結果は、本発明のＤＮＡ−Ｒタンパク質が、哺乳動物細胞において、細胞外ＤＮＡの細胞表面結合を媒介することを示す。
【００８８】
（実施例７）
（ＤＮＡ−Ｒを発現する細胞への細胞外ＤＮＡのインターナリゼーション）
実施例６に記載される実験は、細胞外ＤＮＡが、本発明のＤＮＡ−Ｒに特異的に結合したことを確立した。レセプターによる細胞へのＤＮＡのインターナリゼーションを、以下のアッセイを用いて特徴付けた。
【００８９】
ＹＯＹＯ標識されるプラスミドＤＮＡを用いて、プラスミドＤＮＡインターナリゼーションの動力学を試験した。これらのアッセイにおいて使用されるプラスミドは、グリーン蛍光タンパク質をコードするｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）であった。このアッセイは、標識ＤＮＡの細胞表面結合が、インターナライズされるプラスミドＤＮＡと区別されることを必要とした。これは、トリプシンを用いた細胞の処理によって果たされて、プラスミドＤＮＡとのインキュベーション後に、細胞表面タンパク質を除去した。この手順は、細胞表面に結合したプラスミドＤＮＡが、インターナライズされるプラスミドＤＮＡと区別されることを可能にした。なぜなら、トリプシン処理は、細胞表面に結合したＤＮＡを破壊するが、プラスミドＤＮＡをインターナライズしないからである。このアッセイにおいて、細胞を、２４ウェルプレートにプレーティングし、そして培養培地において、２４時間インキュベートした。次いで、培地を除去し、そして種々の濃度（０〜２５μｇ／ｍＬ）のＹＯＹＯ標識されるｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミドＤＮＡを添加した。この細胞およびプラスミドＤＮＡを、３７℃で種々の時間（０．５〜５時間）インキュベートした。その後、この培地を除去し、細胞をトリプシン処理し、洗浄し、次いで１％  ホルムアルデヒドを用いて固定した。ＦＡＣＳ分析を用いて、蛍光強度を定量した。
【００９０】
Ｂ１６マウス黒色腫細胞を、上記のプロトコルを用いて、１時間、３時間および５時間のインキュベーション後に、ＹＯＹＯ／ＤＮＡのインターナリゼーションについて試験した（図２０）。ｐＥＧＦＰ−Ｎ１のインターナリゼーションは、用量依存性および時間依存性の両方であることが見出された。漸増量のインターナライズされるプラスミドＤＮＡが、漸増用量のＤＮＡおよび漸増時間のインキュベーションを用いて観察された。Ａ５４９細胞によるプラスミドＤＮＡのインターナリゼーションを、未標識のＤＮＡを用いたあらかじめの処理を伴って、そしてその処理を伴わないの両方で評価した。このアッセイを、Ａ５４９細胞を用いて繰り返し、そして類似の結果を得た（図２１）。さらに、２５〜１００倍過剰の未標識仔ウシ胸腺ＤＮＡを用いたＡ５４９細胞のあらかじめの処理は、プラスミドＤＮＡの引き続くインターナリゼーションを有意に阻害した（図２１）。過剰の未標識ＤＮＡを用いた細胞のあらかじめの処理によるインターナリゼーションの類似の阻害を、多くの他の細胞株（Ｂ１６、ＲａｊｉおよびＭＯＬＴ−４を含む）を用いて観察した。可飽和ＤＮＡ結合およびインターナリゼーションのこの実証は、本発明の細胞表面ＤＮＡレセプターが、細胞外プラスミドＤＮＡのインターナリゼーションを媒介することを示す。
【００９１】
プラスミドＤＮＡのインターナリゼーションはまた、温度依存性プロセスであることが観察された。４℃でのＢ１６細胞の処理は、３７℃で維持された細胞と比較して、インターナライズされるプラスミドＤＮＡの量を有意に阻害した（図２２）。
【００９２】
細胞表面上で発現されるＤＮＡ−Ｒの量が、細胞外ＤＮＡ結合またはＤＮＡインターナリゼーションの程度に影響を及ぼすか否かを確認するために、プラスミドＤＮＡの結合およびインターナリゼーションを、以下の２つの細胞株において比較した：ヒト黒色腫Ｇ３６１細胞株および２９３ヒト細胞株。細胞表面ＤＮＡ結合アッセイによって評価されるように、Ｇ３６１細胞は、比較的低い量のＤＮＡを結合したが、一方、２９３細胞は、より多量のプラスミドＤＮＡを結合した（図２３）。結合結果に一致して、結果は、ＤＮＡインターナリゼーションについて、これらの細胞において得られ、これは、Ｇ３６１細胞が、２９３細胞よりも少ないプラスミドＤＮＡをインターナライズしたことを示した（図２３）。これらのデータは、細胞表面ＤＮＡレセプタータンパク質として、本発明のＤＮＡ−Ｒの同定に一致する。
【００９３】
（実施例８）
（ＤＮＡ−ＲによってインターナライズされるＤＮＡの遺伝子発現）
本発明のＤＮＡ−ＲによってインターナライズされるＤＮＡを用いた導入遺伝子発現についての条件を開発した。
【００９４】
上記の実験は、細胞表面結合を飽和したプラスミドＤＮＡ濃度を確立した。グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）についてコードするｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミドを用い、これは、ＧＦＰが、独占的に細胞内のままであるために使用された。ＦＡＣＳ分析を用いて、ＧＦＰ発現を定量した。このアッセイにおいて、細胞（１．２５×１０５／ウェル）を、２４ウェルプレートにおいてプレーティングし、そして哺乳動物細胞の培養条件下において、一晩インキュベートした。翌日、培地を除去し、そして細胞を、０．３ｍＬの増殖培地において、プラスミドＤＮＡとともに、５％  ＣＯ２において３７℃で３時間インキュベートした。次いで、ＤＮＡを除去し、そして新鮮な培地を、この細胞に添加した。いくつかの場合において、０．３ｍＬの増殖培地を、ＤＮＡの除去を伴わずに細胞に添加した。２４〜７２時間後、さらなるインキュベーション培地を除去し、そして細胞を１回洗浄し、次いでホルムアルデヒドを用いて固定した。固定された細胞における蛍光強度を、ＦＡＣＳによって決定した。しかし、ＧＦＰ発現は、いくつかの異なる濃度のｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミドおよびインキュベーション時間を用いた場合でさえ、検出されなかった。この結果は、種々の細胞株（Ａ５４９、Ｂ１６、Ｒａｊｉ）、インキュベーション時間（２４〜７２時間）およびプラスミドＤＮＡ濃度の範囲（０．１〜１００μｇ／ｍＬ）を用いて、一致して得られた。この結果は、その細胞表面上で、比較的より高いレベルのＤＮＡを結合し、そしてより低いレベルのＤＮＡを結合する細胞株を用いて得られた。ポジティブコントロールにおいて、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミドは、リポソーム（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）によって送達され、そして２４時間以内に、有意なＧＦＰ蛍光をもたらした。ｐＥＧＦＰ−Ｎ１単独またはリポソームによって送達されるｐＥＧＦＰ−Ｎ１のいずれかとともにインキュベートされるＢ１６細胞株を用いた代表的なデータは、これらの２つの技術間のＧＦＰ発現における差異を示す（図２４）。
【００９５】
これらの結果を考慮して、この実験を、ノコダゾール（微小管インヒビター）の存在下において、Ａ５４９細胞を用いて繰り返した。このインヒビターの使用が指示された。なぜなら、不首尾の実験の１つの可能な説明が、本発明のＤＮＡ−ＲによってインターナライズされるＤＮＡが分解されており、そしてノコダゾール処理が、このような分解の程度を減少することが期待されたことであるからである。ｐＥＧＦＰ−Ｎ１とのインキュベーションの前のノコダゾールでのＡ５４９細胞の処理は、ノコダゾールで処理されず、そしてｐＥＧＦＰ−Ｎ１とともにインキュベートされなかった細胞と比較して、ＧＦＰの発現における有意な増大をもたらした（図２５）。ノコダゾールを用いて処理されなかった細胞は、ＧＦＰの検出可能な発現を実証できなかった（図２５）。
【００９６】
これらの結果は、本発明のＤＮＡ−Ｒによって媒介される細胞外ＤＮＡの取り込みが、さらなる処理を必要として、そこにコードされる遺伝子の発現をもたらし、そして上記のアッセイが、このような化合物の同定についてのアッセイの原型を提供することを実証した。これらのアッセイにおいて、検出可能なＧＦＰ発現を確かに産生することが公知であるＧＦＰをコードするプラスミドＤＮＡの量を、細胞外ＤＮＡの有効な取り込みを媒介することが公知のレベルで、本発明のＤＮＡ−Ｒを発現する哺乳動物細胞と接触する。次いで、ＧＦＰ遺伝子発現を、試験化合物の存在下および非存在下においてアッセイして、この化合物の存在下における遺伝子発現の増大を検出する。
【００９７】
上述の開示が、本発明の特定の特異的な実施形態を強調し、そしてそれに等価のすべての改変または代案が、添付の特許請求の範囲に示されるような本発明の趣旨および範囲内であることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
本発明の理解は、図面を参照することによって容易になる。
【図１】
図１は、本発明のＤＮＡ−ＲについてのｃＤＮＡのクローニングを例示する概略図である。全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を有する患者由来であり、そして細胞表面のＤＮＡ結合を阻害する抗血清を用いて、末梢血単核細胞からλｇｔ１１ライブラリをスクリーニングした。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むポジティブクローン（クローン番号８８）を得た；このオープンリーディングフレームは、クローンの５’末端で開いたままであった。クローンのヌクレオチド配列の分析は、クローンの３’末端上に膜貫通領域を同定した。７３１ｂｐのプローブを用いて、Ｒａｊｉ細胞株（ヒトリンパ腫細胞株）から作製されるλｇｔ１１  ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングした。４６２ｂｐのさらなる５’ＯＲＦ配列を含んだクローン９７Ｄ４２を、このクローンから得た。ポリメラーゼ連鎖反応の改変（ｃＤＮＡ末端の５’ランダム増幅（ＲＡＣＥ−ＰＣＲ））を用いて、ＨｅＬａ（ヒト頸部癌腫）細胞株およびＭＯＬＴ−４（ヒトリンパ芽球性白血病）細胞株由来の５’配列の残りを得た。この配列を、計算上の分子量１３０．５ｋＤａを有するタンパク質をコードした３５４３ｂｐのＯＲＦを産生するように編集した。
【図２】
図２Ａおよび２Ｂは、ヒト癌細胞株（図２Ａ）およびヒト組織（図２Ｂ）のノーザン分析を示す。ＤＮＡ−Ｒについてコードする遺伝子の３’末端由来の４４２ｂｐのＤＮＡフラグメント（プローブ１１）を、各々のブロットについての放射能標識プローブとして用いた。
【図３】
図３は、ＲＩＮＧフィンガー、ジンクフィンガー、プロリンリッチ領域および疎水性領域の位置を示すレセプターのヒトＤＮＡ−Ｒの概略図である。＊は、アミノ酸１２２位、３９４位、４３０位、４５１位、４６６位、４６８位および１１５０位でのＮ結合型グリコシル化部位を示す。
【図４】
図４Ａは、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＡＲＤ１  ＧＴＰ結合タンパク質（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ登録４２２７５６）、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  ＣＡＲＴ１タンパク質（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ登録番号＿）、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  ＳＢＢＩ０３  仮想タンパク質（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ登録５０３２０７１）、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ  ｃＤＮＡ  ＥＳＴ（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ登録３８７９２４６）、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ仮想２５．８ＫＤタンパク質（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ登録２４９６８２５）、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｃＤＮＡ  ＥＳＴ（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ登録３８７８７３９）におけるＣ３ＨＣ３Ｄ  ＲＩＮＧフィンガーの保存システイン、ヒスチジンおよびアスパラギン酸の整列である。図４Ｂは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＰＩＥ−１（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  Ｕ６２８９６）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ＤＴＩＳ  １１（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  Ｕ１３３９７）、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  ＴＩＳ１１Ｂ  Ｂｕｒｙｒａｔｅ応答因子（ＥＦＴ−応答因子）（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  Ｘ７９０６６）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＣＴＨ１ジンクフィンガータンパク質（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  Ｌ４２１３３）におけるＣ３Ｈ型ジンクフィンガーの保存システインおよびヒスチジンの整列である。
【図５】
図５は、哺乳動物細胞におけるＤＮＡ−Ｒタンパク質発現の分析である。ＤＮＡ−Ｒを、ネイティブ分子として、および安定にトランスフェクトされるヒト２９３細胞（ＤＮＡ−Ｒ／ｆｌｕ細胞）由来のＨＡタグ化実施形態においての両方で免疫沈降させた。レーン１、２９３細胞の溶解物；レーン２、２９３−ＤＮＡ−Ｒ／ｆｌｕ細胞の溶解物；レーン３〜６、以下との２９３−ＤＮＡ−Ｒ／ｆｌｕ細胞溶解物の免疫沈降：ウサギ免疫前血清（レーン３）または抗ＤＮＡ−Ｒ（レーン４）、コントロールマウスモノクローナル抗体（レーン５）または抗ＨＡ（レーン６）。免疫沈降するウサギＩｇＧ重鎖を、ウサギ抗ＤＮＡ−Ｒ  ＩｇＨを用いたウェスタンブロッティングによって検出した。
【図６】
図６は、抗ＨＡ（左半分）または抗ＤＮＡ−Ｒ（右半分）を用いたウェスタンブロッティングによって検出されるような、２９３−ＭＮＡＢ／ｆｌｕ細胞における細胞膜に結合した、ＤＮＡ−Ｒタンパク質の細胞内位置を示す。Ｔ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００全細胞溶解物；Ｍ、粗膜画分；Ｃ、サイトゾル画分。
【図７】
図７は、固定され、浸透されたＡ５４９細胞に対する抗ＤＮＡ−Ｒ抗体および抗トランスフェリン抗体を用いた免疫蛍光染色を例示する。Ａ、ウサギおよびヒツジの非免疫血清を用いた二重染色。Ｂ、抗ＤＮＡ−Ｒ。Ｃ、抗トランスフェリンレセプター。Ｄ、抗ＤＮＡ−Ｒ（赤）および抗トランスフェリンレセプター（緑）についての二重染色；共に局在する染色は、黄色に出現する。
【図８】
図８Ａは、本発明のＤＮＡ−Ｒのアミノ末端フラグメント（アミノ酸１〜５７５）に対して惹起されるポリクローナルウサギ抗血清を用いた、２９３細胞表面の抗体染色の結果を示す。２９３細胞を、免疫前血清（黒棒）または免疫血清（白棒）とともにインキュベートした。抗体結合を、フローサイトメトリーによって、ＦＩＴＣ結合体化ヤギ抗ウサギＩｇＧを用いて検出した。各々の棒は、相乗平均蛍光強度±ｓｄ（ｎ＝３、各々の分析において、１０，０００の生存可能細胞）を示す。二次抗体単独の相乗平均蛍光は、７．６±０．０８（ｎ＝３）であった。
図８Ｂは、アミノ末端フラグメント（１〜５７５）に対して惹起される抗体を用いた、Ｒａｊｉ細胞および２９３細胞の細胞表面への抗体結合を示す。細胞（Ｒａｊｉ、灰色の棒；２９３、白棒）を、ＤＮＡレセプターのアミノ末端部分（アミノ酸１〜５７５）に対して産生されるウサギ抗血清（番号４１、血液採取２）の系列希釈とともにインキュベートした。次いで、この細胞を、ＦＩＴＣ−ヤギ抗ウサギＩｇＧとともにインキュベートし、そしてＦＡＣＳによって蛍光強度を測定した。免疫前血清に起因する蛍光を減じた。
【図９】
図９Ａは、全長ＤＮＡ−Ｒからの可溶性ＤＮＡ−Ｒタンパク質の調製の概略図である。
図９Ｂは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と本発明のＤＮＡ−Ｒのアミノ末端フラグメント（１〜５７５）との間で作製される融合タンパク質（ＧＳＴ／ＤＮＡ−Ｒと称する）の発現、アフィニティー精製、およびタンパク質分解のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。レーン１、ＧＳＴ／ＤＮＡ−Ｒを発現するＥ．ｃｏｌｉの全細胞抽出物；レーン２、グルタチオン（ＧＳＨ）−セファロースに結合したＧＳＴ／ＤＮＡ−Ｒ；レーン３、ＧＳＨ−セファロースに結合すると同時のＧＳＴ／ＤＮＡ−Ｒの部位特異的タンパク質分解；レーン４、極めて精製されたＤＮＡ−Ｒ（１〜５７５）ペプチドを含むＧＳＴ／ＤＮＡ−Ｒのゲル上タンパク質分解後のＧＳＨ−セファロースからの溶出液。
【図１０】
図１０Ａ〜１０Ｅは、グルタチオンセファロース上に固定されるＧＳＴ／ＤＮＡ−Ｒが、蛍光標識されるプラスミドＤＮＡ（ＹＯＹＯ／ｐＧＥＭ４Ｚ）を結合するが、コントロールタンパク質は、これを結合しないことを示す。図示されるのは、ＹＯＹＯ／ｐＧＥＭ４Ｚとともに４℃で３０分間インキュベートされる、固定されるタンパク質を含まないグルタチオンセファロース（図１０Ａ）、または固定されるＧＳＴを含むグルタチオンセファロース（図１０Ｂ）、固定されるＧＳＴ／ＨＳＴ．１を含むグルタチオンセファロース（図１０Ｃ）、固定されるＧＳＴ／ＣＢＤを含むグルタチオンセファロース（図１０Ｄ）もしくは固体されるＧＳＴ／ＤＮＡ−Ｒを含むグルタチオンセファロース（図１０Ｅ）である。洗浄後、蛍光強度を、ＦＡＣＳによって測定した。
【図１１】
図１１Ａおよび１１Ｂは、ＤＮＡ−Ｒに結合する核酸の「サウスウェスタン」ブロットの結果である。実験を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、、ニトロセルロースへの転移によって行い、次いでビオチン化ＤＮＡとともにインキュベートするか（図１１Ａ）またはビオチン化ＤＮＡを伴わずにインキュベートし（図１１Ｂ）、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合体化したストレプトアビジンに結合させ、そして比色基質とともに反応させた。吸光度を、４５０ｎｍで測定した。これらの結果は、ＧＳＴ／ＤＮＡ−Ｒが、ビオチン化ＤＮＡを結合したが、ＧＳＴは、ビオチン化ＤＮＡを結合しなかったことを示した。
【図１２】
図１２は、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）の結果を示し、これにおいて、精製ＤＮＡ−Ｒフラグメント（１〜５７５）は、固定化ＤＮＡに結合した。ＤＮＡ−Ｒフラグメント（０、１および１０μ／ｍＬの濃度で）を、ＥＬＩＳＡプレートにおいて、固定化プラスミドＤＮＡとともにインキュベートした。次いで、このプレートを、１：１００希釈で抗ＤＮＡ抗体とともにインキュベートし、その後、二次抗体を、ＨＲＰに結合体化し、そして比色基質と反応させた。吸光度を、４５０ｎｍで測定した。
【図１３】
図１３は、ジンクフィンガードメイン（アミノ酸４１６〜４３５における）を含むＤＮＡ−Ｒフラグメントが、ＧＳＴ／ＤＮＡ−Ｒ（１〜５７５）によって、ＤＮＡ結合に関与することを示す。システイン残基（４１６位および４３１位）を、独立に、セリンに変更するか（そしてそれぞれ、Ｃ４１６ＳおよびＣ４３１Ｓと称する）、またはアラニンに変更し（そしてそれぞれ、Ｃ４１６ＡおよびＣ４３１Ａと称する）、そしてＥＬＩＳＡを行って、ＤＮＡ結合を評価した。４１６または４３１のいずれかにおけるジンクフィンガーのシステインを、セリン（Ｃ４１６Ｓ、Ｃ４３１Ｓ）、またはアラニン（Ｃ４１６Ａ、Ｃ４３１Ａ）のいずれかに変更した。野生型（ＧＳＴ／ＤＮＡ−Ｒ）タンパク質または変異体ＧＳＴ−融合タンパク質、あるいはＧＳＴ単独の固定化ＤＮＡへの結合（１ウェル当たり１００ｎｇ）を、ＥＬＩＳＡによって、抗ＧＳＴを用いて検出した。データは、三部決定の平均±ｓ．ｄ．である。
【図１４】
図１４は、本発明のＤＮＡ−Ｒの可溶性形態が、ニトロセルロースフィルター結合アッセイを用いて、高い親和性でＤＮＡを結合することを実証する実験結果を例示する。一定に保たれた、２ｎＭの濃度での可溶性ＤＮＡ−Ｒ（ｓＤＮＡ−Ｒ）および標識ＤＮＡ（２００ｐＭ、１×１０６ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）、ならびに漸増濃度の未標識ＤＮＡ。データは、三部決定の平均±ｓ．ｄ．である。結合データのインセット：スキャッチャード変換。
【図１５】
図１５は、可溶性ＤＮＡ−ＲとのプラスミドＤＮＡの競合結合を例示する。すべてのサンプルは、０．２５ｎＭ（ＹＯＹＯ標識される）ｐＧＥＭ−ＤＮＡを有する。斜線の棒は、ＤＮＡ結合をブロックするために添加される変化する量の可溶性ＤＮＡ−Ｒを有する。水平線の棒は、コントロールのＧＳＴタンパク質である。
【図１６】
図１６は、Ａ５４９細胞におけるＹＯＹＯ標識されるプラスミドＤＮＡの細胞表面結合を例示する蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）実験の結果である。細胞を、５μｇ／ｍＬのＹＯＹＯ標識されるｐＧＥＭ４Ｚ  ＤＮＡの存在下（破線）および非存在下（実線）でインキュベートした。未処理細胞および処理細胞の相乗平均蛍光は、それぞれ１３および３４である。２つの値間の差異（２１）は、ＹＯＹＯ／ｐＧＥＭ４Ｚに起因した蛍光強度の増大である。この分析方法は、引き続く図において、ＦＡＣＳによるすべてのＹＯＹＯ／ＤＮＡ結合分析について使用される。
【図１７】
図１７Ａおよび１７Ｂは、過剰の未標識ＤＮＡの存在下でのＡ５４９細胞へのＹＯＹＯ標識されるプラスミドＤＮＡ結合のＦＡＣＳ分析の結果である。Ａ５４９細胞へのＹＯＹＯ／ＤＮＡの細胞表面結合。図１７Ａ（左パネル）において、Ａ５４９細胞を、２５〜１００倍過剰の仔ウシ胸腺ＤＮＡの存在下（実線）および非存在下（破線）で、４℃で２時間、ＹＯＹＯ／ｐＧＥＭ４Ｚとともにインキュベートした。図１７Ｂ（右パネル）において、Ａ５４９細胞への特異的ＤＮＡ結合が、左パネルからのデータを用いて、細胞に結合したＹＯＹＯ／ｐＧＥＭ４Ｚの蛍光強度における差異として示される。データは、４〜９決定の平均±ＳＥＭである。
【図１８】
図１８は、Ａ５４９細胞へのＤＮＡ結合に対するトリプシン処理の効果を示す。Ａ５４９細胞を、ＹＯＹＯ／ｐＧＥＭ４Ｚ（０．５〜４μｇ／ｍｌ）とともに、４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、この細胞を、洗浄するか（白棒）、またはトリプシン処理および洗浄し（灰色の棒）次いで、蛍光強度を、ＦＡＣＳによって測定した。データは、三部決定の平均±ＳＤである。トリプシン処理は、大半の細胞表面ＤＮＡ結合を除去することが見出された。
【図１９】
図１９は、レセプターのＤＮＡ−ＲへのＤＮＡ結合が、カルシウム依存性であることを示す実験結果を示す。Ｂ１６細胞を、１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含むＰＢＳにおいて（白棒）または含まないＰＢＳにおいて（灰色の棒）、１μｇ／ｍＬのＹＯＹＯ／ｐＧＥＭ４Ｚとともにインキュベートし、次いで、蛍光強度を、ＦＡＣＳによって測定した。データは、三部測定の平均±ＳＤである。
【図２０】
図２０は、本発明のＤＮＡ−Ｒを発現する細胞によるプラスミドＤＮＡ取り込みのタイムコースを示す。Ｂ１６細胞を、ＹＯＹＯ／ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（０．６〜１２μｇ／ｍＬ）とともに３７℃で、１時間（黒丸）、３時間（白丸）または５時間（黒四角）インキュベートした。次いで、この細胞を、トリプシン処理して、細胞表面に結合したＤＮＡを除去し、そして蛍光強度を、ＦＡＣＳによって測定した。
【図２１】
図２１は、過剰の未標識ＤＮＡが、Ａ５４９細胞によるＹＯＹＯ／ＤＮＡのインターナリゼーションをブロックすることを示す。細胞を、２５〜１００倍過剰の仔ウシ胸腺ＤＮＡの存在下（実線）および非存在下（破線）で、ＹＯＹＯ／ｐＧＥＭ４Ｚ（１〜２５μｇ／ｍＬ）とともに、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、この細胞を洗浄し、そして蛍光を、ＦＡＣＳによって測定した。データは、５つの実験の平均±ＳＥＭである。
【図２２】
図２２は、本発明のＤＮＡ−Ｒを発現する細胞におけるプラスミドＤＮＡのインターナリゼーションが、温度依存性であることを例示する。Ｂ１６細胞を、指示時間の間、４℃（白棒）または３７℃（灰色の棒）で、ＹＯＹＯ／ｐＧＥＭ４Ｚ（１２μｇ／ｍＬ）とインキュベートした。次いで、この細胞を、トリプシン処理して、細胞表面に結合したプラスミドを除去し、洗浄し、そして蛍光を、ＦＡＣＳによって測定した。データは、三部決定の平均±ＳＤである。
【図２３】
図２３Ａおよび２３Ｂは、本発明のＤＮＡ−Ｒへの細胞表面ＤＮＡ結合が、ＤＮＡ取り込みに関連することを示す。２９３細胞（黒丸）およびＧ３６１細胞（白丸）を、ＹＯＹＯ／ｐＧＥＭ４Ｚ（０．３〜２．５μｇ／ｍＬの濃度で）とともに３．５時間、４℃で結合について（図２３Ａ、左パネル）、または３７℃で取り込みについて（図２３Ｂ、右パネル）インキュベートした。次いで、この細胞を、洗浄するか（結合）、またはトリプシン処理および洗浄し（取り込み）、そして蛍光を、ＦＡＣＳによって測定した。
【図２４】
図２４は、プラスミドＤＮＡ由来のグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）導入遺伝子のＢ１６細胞における発現を示す。細胞を、１２μｇ／ｍＬのｐＥＧＦＰ−Ｎ１とともに６時間インキュベートした。４８時間後、この細胞を、トリプシン処理し、そして蛍光を、ＦＡＣＳによって測定した。ＤＮＡを伴わずにインキュベートされるコントロール細胞、およびキャリアを有さないｐＥＧＦＰ−Ｎ１を用いて処理される細胞は、類似の蛍光を示したが、一方、リポフェクトアミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）と複合体化したｐＥＧＦＰ−Ｎ１とともにインキュベートされる細胞は、蛍光の増大を示した。
【図２５】
図２５は、ノコダゾール（ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）が、Ａ５４９細胞におけるプラスミドＤＮＡ由来のＧＦＰ導入遺伝子発現を増大することを示す。Ａ５４９細胞を、３３μＭ  ノコダゾールの存在下（破線）および非存在下（実線）で、２５μｇ／ｍＬのｐＥＧＦＰ−Ｎ１とともに３７℃で５時間インキュベートした。２４時間後、この細胞をトリプシン処理し、そして蛍光を、ＦＡＣＳによって測定した。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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