(57)【要約】本発明は、内皮細胞管形成、腫瘍血管新生の最初の工程を阻害するための方法および組成物に関する。より具体的には、本発明は、血管新生実現過程の阻害を示すトリペプチドに関する。最も好ましいアミノ酸配列は、ＳＮＳおよびＳＱＳである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のアミノ酸（ａａ１）、第２のアミノ酸（ａａ２）および第３のアミノ酸（ａａ３）を有する、式ａａ１−ａａ２−ａａ３の血管新生阻害トリペプチドであって、
（ａ）前記第１のアミノ酸がセリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、Ａｌａ（アラニン）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リシン（Ｌｙｓ）、プロリン（Ｐｒｏ）、アルギニン（Ａｒｇ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、トリプトファン（Ｔｒｙ）、バリン（Ｖａｌ）、ジアミノプロピオン酸およびトランス−４−ヒドロキシプロリンからなる群から選択され、
（ｂ）前記第２のアミノ酸がアスパラギン（Ａｓｎ）、Ａｌａ（アラニン）、グリシン（Ｇｌｙ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、ジアミノプロピオン酸およびトランス−４−ヒドロキシプロリンからなる群から選択され、かつ
（ｃ）前記第３のアミノ酸がセリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、Ａｌａ（アラニン）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リシン（Ｌｙｓ）、プロリン（Ｐｒｏ）、アルギニン（Ａｒｇ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、トリプトファン（Ｔｒｙ）、バリン（Ｖａｌ）、ジアミノプロピオン酸およびトランス−４−ヒドロキシプロリンからなる群から選択される、トリペプチド。
【請求項２】
（ａ）前記第１のアミノ酸がセリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、およびジアミノプロピオン酸からなる群から選択され、
（ｂ）前記第２のアミノ酸がアスパラギン（Ａｓｎ）およびグルタミン（Ｇｌｎ）からなる群から選択され、かつ、
（ｃ）前記第３のアミノ酸がセリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、およびジアミノプロピオン酸からなる群から選択される、
請求項１に記載の血管新生阻害トリペプチド。
【請求項３】
（ａ）前記第１のアミノ酸がセリン（Ｓｅｒ）であり、
（ｂ）前記第２のアミノ酸がアスパラギン（Ａｓｎ）またはグルタミン（Ｇｌｎ）であり、
（ｃ）前記第３のアミノ酸がセリン（Ｓｅｒ）である、
請求項１に記載の血管新生阻害トリペプチド。
【請求項４】
トリペプチドがキャップされている、請求項１に記載の血管新生阻害トリペプチド。
【請求項５】
第１のアミノ酸がアミノ末端であり、かつ、第３のアミノ酸がカルボキシ末端であって、
（ａ）アミノ末端がアセチル、ベンゾイル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アルキルアミノアシル、アリールアミノアシル、ホルミル、ペプチドおよびポリマーからなる群から選択された化合物でキャップされ、かつ、
（ｂ）カルボキシ末端がＮＨ２、ＯＨ、およびＮＨＲ（式中、Ｒはアルキルおよびアリールからなる群から選択される）からなる群から選択された化合物でキャップされている、請求項１に記載の血管新生阻害トリペプチド。
【請求項６】
アミノ末端がアセチル基でキャップされ、かつ、カルボキシ末端がアミド基でキャップされている、請求項４に記載の血管新生阻害トリペプチド。
【請求項７】
請求項１に記載の血管新生阻害トリペプチドを含む、血管新生阻害組成物。
【請求項８】
血管新生阻害量の請求項１に記載の血管新生阻害トリペプチドを含む、血液新生阻害剤として有用な医薬組成物。
【請求項９】
組織における血管新生を阻害する方法であって、組織に血管新生阻害量の請求項１に記載のトリペプチドを投与する工程を含む方法。
【請求項１０】
動物における血管新生を阻害する方法であって、動物に血管新生阻害量の請求項１に記載のトリペプチドを投与する工程を含む、方法。
【請求項１１】
個体における血管新生を阻害する方法であって、個体に血管新生阻害量の請求項１に記載のトリペプチドを投与する工程を含む、方法。
【請求項１２】
前記組織が炎症を起こしている、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記組織が固形腫瘍、固形腫瘍転移、網膜組織および絨毛膜組織からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
血管新生が、目血管新生病、脈絡膜血管新生病、網膜血管新生病、隅角の血管新生、バルトネラ症、慢性炎症、変形性関節症、リウマチ様関節炎、アテローム性動脈硬化症、トラコーマ、またはオースラーウェーバーランデュ病からなる群から選択された状態に関連する、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記トリペプチドが薬学的に許容し得る媒体によって投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記トリペプチドが浸透ミニポンプによって投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
前記トリペプチドが生分解性ポリマーによって投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１８】
前記トリペプチドが、請求項１に記載の血管新生阻害トリペプチドの核酸をコードすることによって投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１９】
レトロウィルス、アデノウィルス、リガンド複合核酸、単離ＤＮＡ、単離ＲＮＡ、リポソーム、およびポリリシンからなる群から選択されるベクター中へ組み入れることによって前記投与が実施される請求項９に記載の方法。
【請求項２０】
前記投与が経口、局部的、経鼻、経皮、腹腔内、頭蓋内、大脳内、膣内、子宮内、直腸、非経口、および眼投与からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
前記トリペプチドが、化学療法剤、抗生物質、抗ウィルス剤、抗炎症剤、標的化合物、サイトカイン、免疫毒素、抗腫瘍抗体、血管新生阻害剤、抗浮腫剤、放射線増感剤およびそれらの組合せからなる群から選択される治療化合物と共に投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項２２】
前記トリペプチドが、外科、化学療法、放射線およびレーザー療法からなる群から選択される治療法と共に投与される請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織、動物およびヒトにおける内皮細胞管形成、腫瘍血管新生の最初の工程、および血管新生依存病を阻害するための使用の方法および組成物に関する。より具体的には、本発明は、癌、目血管新生、炎症性疾病のような血管新生実現（ｍｅｄｉａｔｅｄ）過程の阻害を示すトリペプチド、その類似体、模倣物および化学的誘導体に関する。開示される抗血管新生剤はまた、外科、化学療法、放射線療法、およびレーザー療法と共に使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
血管新生は、既存血管からの新血管の発育である（非特許文献１）。生理学的に、血管新生は、成熟した生物の適切な発育を確実にし、卵着床のために子宮を準備し、創傷治癒で重要な役割を演じる。他方では、血管新生は、癌、炎症および眼病のような多くの疾病状態に関連した異常状態を支える。
【０００３】
胚形成または正常および異常血管新生中の血管ネットワークの発育は、成長因子および細胞と細胞外マトリックスとの相互作用に依存する（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）。血管は、胚形成中に２つの過程（脈管形成および血管新生）によって生じる（非特許文献５）。血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ｂＦＧＦ、ＩＬ−８およびＴＦＮ−ａは、固形腫瘍、糖尿病性網膜病およびリウマチ様関節炎に関連した異常血管新生を促す成長因子の幾つかである（非特許文献６）。血管新生は、創傷治癒および胚形成においては起こるが、成人または成熟組織においては一般に存在しない（非特許文献７）。
【０００４】
血管新生または「血管新生」は、親−と抗−血管新生因子とのバランスによって制御される多段階過程である。この過程の後半の段階は、内皮細胞（ＥＣ）の管様構造物への増殖および組織化を伴う。ＦＧＦ２およびＶＥＧＦのような成長因子は、内皮細胞成長および分化を促進することで重要な役割を演じるものであると考えられている。内皮細胞は、血管新生過程の枢要な構成成分であり、その細胞表面受容体および細胞内シグナル化機構によって多くのサイトカインに反応する。培養物中の内皮細胞は、管腔を有する管様構造物を形成することが可能である。それゆえ、内皮細胞は、血管新生の前提条件であるだけでなく、同様に基底構造要件であるように見える。
【０００５】
血管新生依存病は次のものを含む：免疫性および非免疫性炎症、リウマチ様関節炎、乾癬のような炎症性疾患；糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、早期網膜症、老年性黄斑退化、角膜移植拒絶のような目疾患；固形腫瘍、腫瘍転移、および白血病、血管繊維錘、カポージ肉腫、良性腫瘍などの血液起源腫瘍、ならびに腫瘍成長を支えるために血管新生を必要とする他の癌のような癌関連疾患。
【０００６】
血管新生の阻害が腫瘍成長を制限するのに有用な療法であることが提案されてきた。血管新生の阻害は、フォークマン（Ｆｏｌｋｍａｎ）ら（非特許文献８）によって提案されているように血管新生刺激への内皮細胞反応を阻害することによって達成することができ、該文献には、アンジオスタティックステロイド、フマギリンなどのカビ誘導生成物、血小板因子４、トロンボスポンジン、アルファ−インターフェロン、ビタミンＤ類似体およびＤ−ペニシラミンのようなそれらの内皮細胞反応阻害剤の例が記載されている。追加の提案された血管新生の阻害剤については、（非特許文献５）、（非特許文献７）ならびに（特許文献１、特許文献２、特許文献３および特許文献４）を参照のこと。
【０００７】
１９９７年に、ペンシルバニア大学医学部の結合組織研究所（Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）のケファライデス（Ｋｅｆａｌｉｄｅｓ）および共同研究者は、基底膜コラーゲンタイプＩＶのα３−鎖の非コラーゲン性１（ＮＣ１）領域の残基配列１８５−２０３に対応するペプチドが多形核白血病（ＰＭＮ’ｓ）の活性化を阻害することを報告した（非特許文献９）。配列ＣＮＹＹＳＮＳＹＳＦＷＬＡＳＬＮＰＥＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を有するペプチドα３（ＩＶ）残基１８５−２０３は、対照よりも５０〜６０％だけヒト黒色腫（メラノーマ）細胞の着生を促進し、また、それらの増殖を４０％だけ阻害することが分かった。ペプチド配列のアラニン置換は、観察された活性がＳＮＳ配列と言われる残基１８９−１９１の存在に依存することを示唆した。ケファライデス（Ｋｅｆａｌｉｄｅｓ）グループは、タイプＩＶコラーゲンによる黒色腫細胞増殖の阻害が増加したレベルのｃＡＭＰを必要とすることと（非特許文献１０）、黒色腫および前立腺細胞上のタイプＩＶコラーゲンのα３（ＩＶ）鎖用の２つの受容体としてのＣＤ４７／インテグリン関連タンパク質（ＩＡＰ）およびαｖβ３の識別（非特許文献１１）とを後になって報告した。もっと最近になって、彼らは、腫瘍細胞化学走性におけるＣａ２＋依存性（非特許文献１２）ならびにタイプＩＶコラーゲンのＮＣ１領域によるマトリックスメタロプロテイナーゼの発現および活性化の阻害（非特許文献１３）を報告した。
【０００８】
独立して、ハーバード・メディカル・スクール（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ）のカルリ（Ｋａｌｌｕｒｉ）のグループもまた、試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）および生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）アッセイの両方を用いてα３（ＩＶ）ＮＣ１領域の２つの異なるタイプの抗腫瘍活性（抗増殖および抗血管新生）の特性付けを報告した（非特許文献１４）。総合的に、これらの報告は、α３（ＩＶ）ＮＣ１領域の明瞭でユニークな抗腫瘍性と、小さな分子、抗腫瘍ドラッグデザインのための手がかりとしてのその潜在的な使用とを効果的に強調している。
【０００９】
【特許文献１】
米国特許第５，０９２，８８５号明細書
【特許文献２】
米国特許第５，１１２，９４６号明細書
【特許文献３】
米国特許第５，１９２，７４４号明細書
【特許文献４】
米国特許第５，２０２，３５２号明細書
【非特許文献１】
Ｓ．Ａ．Ｍｏｕｓａ著、「Ｉｎ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｓ：Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（血管新生阻害剤および刺激剤中の：潜在的な治療的含蓄）」、テキサス州ジョージタウン（Ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ，ＴＸ）、Ｌａｎｄｅｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、第１章、２０００年
【非特許文献２】
Ｂｒｅｉｅｒら著、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６（１９９６）、ｐ．４５４−４５６
【非特許文献３】
Ｆｏｌｋｍａｎ著、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １（１９９５）、ｐ．２７−３１
【非特許文献４】
Ｒｉｓａｕ著、Ｎａｔｕｒｅ  ３８６（１９９７）、ｐ．６７１−６７４
【非特許文献５】
Ｂｌｏｏｄら著、Ｂｉｏｃｈ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０３２（１９９０）、ｐ．８９−１１８
【非特許文献６】
Ｆｏｌｋｍａｎら著、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５（１９８７）、ｐ．４４２−４４７
【非特許文献７】
Ｍｏｓｅｓら著、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８（１９９０）、ｐ．１４０８−１４１０
【非特許文献８】
Ｆｏｌｋｍａｎら著、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３（１９９２）、ｐ．８９−９６
【非特許文献９】
Ｈａｎら著、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１９９７）、ｐ．２０３９５−２０４０１
【非特許文献１０】
Ｓｈａｈａｎら著、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．４０（１９９９）、ｐ．２２１−２３２
【非特許文献１１】
Ｓｈａｈａｎら著、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９（１９９９）、ｐ．４５８４−４５９０
【非特許文献１２】
Ｓｈａｈａｎら著、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（２０００）、ｐ．４７９６−４８０２
【非特許文献１３】
Ｐａｓｃｏら著、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０（２０００）、ｐ．４６７−４７３
【非特許文献１４】
Ｍａｅｓｈｉｍａら著、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（２０００）、ｐ．２１３４０−２１３４８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
より大きなペプチドの活性を保持するより小さな認識エピトープの識別は、これらの報告された結果には欠けている。それゆえ、解決されるべき課題は、小さな認識エピトープの識別を提供することであり、その識別は、小さな分子類似体またはペプチドアイソスターを目指した構造に基づくドラッグデザイン戦略のための鋳型を提供する工程における重大な工程である。かかる小さな分子は、癌のような血管新生依存病の邪魔をする、好ましい生理化学的および薬物動力学特性を持った環式ペプチドおよびペプチド同配体を含むであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、第１のアミノ酸（ａａ１）、第２のアミノ酸（ａａ２）および第３のアミノ酸（ａａ３）を有する、式ａａ１−ａａ２−ａａ３の血管新生阻害トリペプチドであって、
（ａ）前記第１のアミノ酸がセリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、Ａｌａ（アラニン）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リシン（Ｌｙｓ）、プロリン（Ｐｒｏ）、アルギニン（Ａｒｇ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、トリプトファン（Ｔｒｙ）、バリン（Ｖａｌ）、ジアミノプロピオン酸およびトランス−４−ヒドロキシプロリンからなる群から選択され、
（ｂ）前記第２のアミノ酸がアスパラギン（Ａｓｎ）、Ａｌａ（アラニン）、グリシン（Ｇｌｙ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、ジアミノプロピオン酸およびトランス−４−ヒドロキシプロリンからなる群から選択され、かつ
（ｃ）前記第３のアミノ酸がセリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、Ａｌａ（アラニン）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リシン（Ｌｙｓ）、プロリン（Ｐｒｏ）、アルギニン（Ａｒｇ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、トリプトファン（Ｔｒｙ）、バリン（Ｖａｌ）、ジアミノプロピオン酸およびトランス−４−ヒドロキシプロリンからなる群から選択される、トリペプチドに関する。
【００１２】
トリペプチドを投与することによって血管新生を阻害する方法もまた提供される。
【００１３】
次の図面は、本発明の実施形態を例示するものであり、特許請求の範囲によって包含されるような本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
出願人らは、小さな認識エピトープとして、内皮細胞管形成を阻害して血管新生実現過程の阻害を示す３アミノ酸残基ペプチド、すなわちトリペプチドを提供することによって述べられた課題を解決した。トリペプチドの使用の方法もまた提供される。
【００１５】
本明細書で用いられるように、用語「トリペプチド」は、３アミノ酸残基を有するペプチドを意味することを意図され、本明細書で議論される類似体、ペプチド模倣物、および化学的誘導体のうち任意のものを含む。
【００１６】
本明細書で用いられるように、用語「ペプチド」は、一緒に共有結合した２種以上のアミノ酸残基を意味することを意図される。本発明のペプチドは、幾つかのヒンダードまたはより多くのアミノ酸残基を有するポリペプチドを含む。通常、２種以上のアミノ酸残基の間の共有結合はアミド結合である。しかしながら、アミノ酸は、ペプチドおよび化学技術の当業者に公知の様々な他の方法によって一緒に結合することができる。それゆえ、用語「ペプチド」は、全体にまたは部分的に、アミノ酸、アミノ酸類似体および模倣物の間の非アミド結合を含有する分子を含むことを意図される。同様に、該用語はまた環式ペプチドおよび他の立体配座的に拘束された構造物をも含む。
【００１７】
ＳＮＳおよびＳＱＳトリペプチド
本発明のトリペプチドは、組織、動物、および個体において血管新生粗媒作用を示す３アミノ酸残基を有する。
【００１８】
本発明の好ましい一トリペプチドは、構造１で描写され、またＳｅｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒによって表され、また単一文字アミノ酸コードで略記されて本明細書で以下「ＳＮＳ」と言われる、配列セリン−アスパラギン−セリンによって特徴付けられる。好ましいアミノ酸は、左旋性形態であり、アミノ末端はアセチル基でキャップされ、カルボキシ末端はカルボキサミドでキャップされている。
【００１９】
【化１】
2005507363.tif 000002
【００２０】
本発明の別の好ましい実施形態は、セリン−グルタミン−セリン（Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ）であり、また単一文字アミノ酸コードでＳＱＳとして略記され、ここで、アミノ酸は左旋性形態であり、アミノ末端はアセチル基でキャップされ、カルボキシ末端はカルボキサミドでキャップされている。
【００２１】
本明細書でさらに議論されるように、本発明のトリペプチドの追加の実施形態は、トリペプチドが追加の化学的部分、または普通天然産タンパク質の部分ではない変性アミノ酸を含有するように、セリン−アスパラギン−セリン（Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ）の類似体、ペプチド模倣物、および化学的誘導体である。
【００２２】
用語「キャップされる」は、トリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端への基の付加を意味する。本発明のトリペプチドの末端は、好ましくは、本発明のトリペプチドのＮ−末端アミノ基に結合したアセチル基（ＣＨ３ＣＯ−）および「カルボキサミド」とも省略される、Ｃ−末端カルボキシル基に結合したアミド（−ＮＨ２）基でブロックまたは「キャップ」される。トリペプチドは、任意の他の基でキャップすることができる。
【００２３】
本開示において、多数の省略形が使用される。次の定義が与えられる。
「内皮細胞」はＥＣと省略される。
「繊維芽細胞成長因子塩基性」はＦＧＦ２と省略される。
「しょう尿膜」はＣＡＭと省略される。
「血管内皮成長因子」はＶＥＧＦと省略される。
「トランス−４−ヒドロキシプロリン」はｔ４Ｈｙｐと省略される。
「１−ヒドロキシベンゾトリアゾール」はＨＯＢｔと省略される。
「２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート」はＨＢＴＵと省略される。
「ジイソプロピルエチルアミン」はＤＩＥＡと省略される。
「ジメチルホルムアミド」はＤＭＦと省略される。
「トリフルオロ酢酸」はＴＦＡと省略される。
「トリイソプロピルシラン」はＴＩＳと省略される。
「ヒト臍静脈内皮細胞」はＨＵＶＥＣと省略される。
「内皮細胞成長培地」はＥＧＭと省略される。
「内皮細胞基底培地」はＥＢＭと省略される。
「ウシ血清アルブミン」はＢＳと省略される。
「９−フルオレニルメチルオキシカルボニル」はＦＭＯＣと省略される。
【００２４】
一般的な化学合成法
それらの短い長さを与えられて、当該技術において公知である他の同等な化学合成もまた有用であるが（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ著、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５（１９６３）、２１４９−２１５４）、本発明のトリペプチドは、好ましくはチャン（Ｃｈａｎ）らによって一般に記載されたもののような固相合成を用いて調製される（Ｃｈａｎら著、「ＩｎＦＭＯＣＳｏｌｉｄＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ（ＦＭＯＣ固相ペプチド合成中の：実際的アプローチ）」、オックスフォード大学出版（ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ）、第３章、２０００年）。固相ペプチド合成は、保護されたα−アミノ酸を樹脂にカップリングすることによってペプチドのＣ−末端から開始されてもよい。かかる出発原料は、クロロメチル化樹脂もしくはヒドロキシメチル樹脂にエステル結合により、またはＢＨＡ樹脂もしくはＭＢＨＡ樹脂にアミド結合によりα−アミノ酸−保護アミノ酸を結びつけることによって調製することができる。ＢＨＡおよびＭＢＨＡ樹脂支持体は、商業的に入手可能であり、合成中の所望のポリペプチドがＣ−末端に非置換アミドを有する場合にのみ一般に使用される。
【００２５】
アミノ酸は、ペプチド結合の形成のための当該技術で周知の技術を用いて、成長中ペプチド鎖にカップリングすることができる。例えば、一方法は、アミノ酸のカルボキシル基を成長中ペプチド鎖の遊離のＮ−末端アミノ基と反応しやすいようにする誘導体にアミノ酸を変換する工程を伴う。具体的には、保護されたアミノ酸のＣ−末端は、そのＣ−末端とクロロギ酸エチル、クロロギ酸フェニル、クロロギ酸第ニブチル、クロロギ酸イソブチル、またはピバロイルクロリドもしくは他の類似の酸塩化物との反応によって混成無水物に変換することができる。あるいはまた、アミノ酸のＣ−末端は、２，４，５−トリクロロフェニルエステル、ペンタクロロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル、または１−ヒドロキシベンゾトリアゾールから形成されたエステルのような活性エステルに変換することができる。別のカップリング方法は、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミドまたはＮ，Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミドのような好適なカップリング剤の使用を伴う。
【００２６】
ペプチド合成に使用される各アミノ酸のα−アミノ基は、それらの活性なα−アミノ官能基を含む副反応を防ぐためにカップリング反応の間ずっと保護されていなければならない。ある種のアミノ酸は、反応性の側鎖官能基（例えば、スルフヒドリル、アミノ、カルボキシル、およびヒドロキシル）を含有し、かかる官能基もまた、最初の工程および次のカップリング工程の間ずっと（１）α−アミノ基部位または（２）反応性側鎖部位のどちらでも化学反応が起こるのを防ぐのに好適な保護基で保護されなければならない。
【００２７】
ペプチドを合成するのに使用されるべき特定の保護基の選択において、次の一般則に典型的に従う。具体的には、α−アミノ保護基は、（１）カップリング反応で使用される条件下でα−アミノ官能基を不活性にするべきであり、（２）カップリング反応後に側鎖保護基を除去せず、ペプチド断片の構造を変えない条件下で容易に除去できるべきであり、（３）カップリング直前の活性化でラセミ化の可能性を実質的に減らすべきである。
【００２８】
これに反して、側鎖保護基は、（１）カップリング反応で使用される条件下で側鎖官能基を不活性にするべきであり、（２）α−アミノ保護基を除去するのに使用される条件下で安定であるべきであり、（３）ペプチド鎖の構造を変えない反応条件下で所望の完全組立てペプチドから容易に除去できるべきである。
【００２９】
ペプチド合成に有用であることが知られている保護基がそれらの除去に使用される試剤との反応性の点で変わることは当業者には明らかであろう。例えば、トリフェニルメチルおよび２−（ｐ−ビフェニル）イソプロピルオキシカルボニルのようなある種の保護基は、非常に不安定であり、穏和な酸性条件下で切断することができる。ｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、ｔ−アミルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、およびｐ−メトキシベンジルオキシカルボニルのような他の保護基は、それほど不安定ではなく、それらの除去のために、トリフルオロ酢酸、塩酸、または酢酸中の三フッ化ホウ素のような適度に強い酸を必要とする。ベンジルオキシカルボニル（ＣＢＺ）、ハロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、およびイソプロピルオキシカルボニルのようなさらに他の保護基は、さらにもっと不安定ではなく、それらの除去のために、フッ化水素、臭化水素、またはトリフルオロ酢酸中のボロントリフルオロアセテートのようなさらにより強い酸を必要とする。
【００３０】
α−アミノ基を保護するのに、または側鎖基を保護するのに有用なアミノ酸保護基のクラスには、次のものが含まれる。
（１）α−アミノ基については、保護基の３つの典型的なクラスは、
（ａ）フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、ＣＢＺ、ならびにｐ−クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル、およびｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル、ｏ−クロロベンジルオキシカルボニル、２，４−ジクロロベンジルオキシカルボニル、２，６−ジクロロベンジルオキシカルボニルなどの置換ＣＢＺのような芳香族ウレタン型保護基と、
（ｂ）ＢＯＣ、ｔ−アミルオキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、２−（ｐ−ビフェニル）イソプロピルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニルなどのような脂肪族ウレタン型保護基と、
（ｃ）シクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、およびシクロヘキシルオキシカルボニルのようなシクロアルキルウレタン型保護基と、である。
好ましいα−アミノ保護基はＢＯＣおよびＦＭＯＣである。
（２）リシン（Ｌｙｓ）中に存在する側鎖アミノ基については、保護は、ＢＯＣ、２−クロロベンジルオキシカルボニルなどのような（１）で上述した基のうちのいずれによってもよい。
（３）アルギニン（Ａｒｇ）のグアニジノ基については、保護は、ニトロ、トシル、ＣＢＺ、アダマンチルオキシカルボニル、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル、２，３，６−トリメチル−４−メトキシフェニルスルホニル、またはＢＯＣ基によって提供されてもよい。
（４）セリン（Ｓｅｒ）またはスレオニン（Ｔｈｒ）のヒドロキシル基については、保護は、例えば、ｔ−ブチル、ベンジル（ＢＺＬ）、またはｐ−メトキシベンジル、ｐ−ニトロベンジル、ｐ−クロロベンジル、ｏ−クロロベンジル、および２，６−ジクロロベンジルのような置換ＢＺＬによってもよい。
（５）アスパラギン酸（Ａｓｐ）またはグルタミン酸（Ｇｌｕ）のカルボキシル基については、保護は、例えば、ＢＺＬ、ｔ−ブチル、シクロヘキシル、シクロペンチルなどのような基を用いたエステル化によってもよい。
（６）ヒスチジン（Ｈｉｓ）のイミダゾール窒素については、ベンジルオキシメチル（ＢＯＭ）またはトシル部分が保護基として好適に使用される。
（７）チロシン（Ｔｙｒ）のフェノール性ヒドロキシル基については、テトラヒドロピラニル、ｔ−ブチル、トリチル、ＢＺＬ、クロロベンジル、４−ブロモベンジル、および２，６−ジクロロベンジルのような保護基が好適に使用される。好ましい保護基はブロモベンジルオキシカルボニルである。
（８）アスパラギン（Ａｓｎ）またはグルタミン（Ｇｌｎ）の側鎖アミノ基については、キサンチル（Ｘａｎ）が好ましくは用いられる。
（９）メチオニン（Ｍｅｔ）については、アミノ酸は好ましくは保護されないままである。
（１０）システイン（Ｃｙｓ）のチオ基については、ｐ−メトキシベンジルが典型的に使用される。
【００３１】
成長中ペプチド鎖の第１のＣ−末端アミノ酸、例えば、グルタミン酸（Ｇｌｕ）は、典型的にはＢＯＣのような適切に選択された保護基によってα−アミノ位置で保護される。ＢＯＣ−グルタミン酸（Ｇｌｕ）−（γ−シクロヘキシル）−ＯＨは、先ず、撹拌しながら約２５℃で２時間イソプロピルカルボジイミドを用いてベンツヒドリルアミン樹脂に、またはクロロメチル化樹脂にカップリングすることができる。樹脂支持体へのＢＯＣ保護アミノ酸のカップリングに引き続き、典型的には塩化メチレン中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）またはＴＦＡのみを用いることによって、α−アミノ保護基が通常除去される。α−アミノ酸基の脱保護反応は、広範囲の温度にわたって起こり得るが、約０℃および室温の間の温度で通常実施される。
【００３２】
ジオキサン中のＨＣｌのような他の標準的α−アミノ基脱保護試薬、および具体的なα−アミノ保護基の除去の条件は、当業者の力量内にある。α−アミノ保護基の除去に引き続き、一般に側鎖が保護されたままの非保護α−アミノ基は、意図される順に段階的なやり方でカップリングすることができる。
【００３３】
各保護アミノ酸またはアミノ酸配列は、通常、化学量論量より多い量で固相反応器中へ導入され、カップリングは、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、塩化メチレンまたはそれらの混合物のような有機溶媒中で好適に実施される。不完全なカップリングが起こる場合、次のアミノ酸へのカップリングに備えたＮ−アミノ保護基の除去の前に、カップリング手順が慣例上繰り返される。α−アミノ保護基の除去に引き続き、残存するα−アミノおよび側鎖保護アミノ酸は、意図される順に段階的なやり方でカップリングすることができる。合成の各段階でのカップリング反応の成功はモニターされてもよい。合成をモニターする好ましい方法は、ニンヒドリン反応による。カップリング反応はまた、周知の商業的な方法および装置、例えば、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）９９０ペプチド合成器（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｓｉｚｅｒ）を用いて自動的に行うことができる。
【００３４】
所望のペプチド配列が完成すると、保護されたペプチドは樹脂支持体から切断されなければならず、すべての保護基は除去されなければならない。切断反応および保護基の除去は、脱保護反応と同時にまたはそれに引き続き好適に成し遂げられる。ペプチドを樹脂に固定する結合がエステル結合である場合、それは、エステル結合を破壊することが可能で、樹脂マトリックスに浸透することが可能である任意の試薬によって切断することができる。特に有用な一方法は、液体無水フッ化水素での処理による。この試薬は通常ペプチドを樹脂から切断するだけでなく、すべての酸に不安定な保護基をも除去し、従って、完全に脱保護されたペプチドを直接与えるであろう。酸に不安定ではない追加の保護基が存在する場合、追加の脱保護工程が実施されなければならない。特定の必要性および状態に応じて、これらの工程は、上記のフッ化水素処理の前か後のいずれかに行うことができる。
【００３５】
クロロメチル化樹脂が使用される場合、フッ化水素切断／脱保護処理は一般に遊離ペプチド酸の形成をもたらす。ベンツヒドリルアミン樹脂が使用される場合、フッ化水素処理は一般に遊離ペプチドアミドをもたらす。アニソールおよびジメチルスルフィドの存在下に０℃で１時間のフッ化水素との反応は、典型的に側鎖保護基を除去し、ペプチドを樹脂から解放するであろう。
【００３６】
保護基を除去することなくペプチドを切断することは望ましい場合、保護されたペプチド−樹脂はメタノリシスを受けることができ、こうして、Ｃ−末端カルボキシルがメチル化されている保護ペプチドを生じる。このメチルエステルは、次に、穏和なアルカリ性条件下に加水分解することができ、遊離Ｃ−末端カルボキシル基を与える。次に、ペプチド鎖上の保護基は、液体フッ化水素のような強酸での処理によって除去することができる。メタノリシスにとって特に有用な技術は、保護されたペプチド樹脂がクラウンエーテルの存在下にメタノールおよびシアン化カリウムで処理される技術である。
【００３７】
クロロメチル化樹脂が使用される場合に保護されたペプチドを樹脂から切断する他の方法は、（１）アンモニア分解および（２）ヒドラジン分解を含む。必要ならば、生じたＣ−末端アミドまたはヒドラジドは、遊離のＣ−末端カルボキシル部分へ加水分解することができ、保護基は型通りに除去することができる。Ｎ−末端α−アミノ基上に存在する保護基は、保護されたペプチドが支持体から切断される前または後のいずれかに除去されてもよい。
【００３８】
本発明のペプチドの精製は、分取ＨＰＬＣ（逆相ＨＰＬＣを含む）、ゲル浸透クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー（モノクローナル抗体カラムを含む）などのようなクロマトグラフ技術、または向流分配などのような他の従来技術を用いて典型的に達成される。
【００３９】
本発明のＳＮＳトリペプチドはまた、組換えＤＮＡ技術を用いて調製されてもよい。
【００４０】
アミノ酸類似体
本明細書で用いるように、用語「アミノ酸」は、天然産および非天然産アミノ酸の両方、ならびにアミノ酸類似体および模倣物を意味することを意図される。天然産アミノ酸は、タンパク質生合成の間に利用される２０種の（Ｌ）−アミノ酸、ならびに４−ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、デスモシン、イソデスモシン、ホモシステイン、シトルリンおよびオルチニンのような他のものを含む。非天然産アミノ酸は、例えば、（Ｄ）−アミノ酸、ノルロイシン、ノルバリン、ｐ−フルオロフェニルアラニン、エチオニンなどを含む。
【００４１】
本明細書で用いられるように、アミノ酸「類似体」またはペプチド「類似体」は、天然産および非天然産アミノ酸の変性形態を含む。かかる変性は、例えば、アミノ酸上の化学基および部分の置換もしくは交換またはアミノ酸の誘導体化（ｄｅｒｉｖｉｔｉｚａｔｉｏｎ）を含むことができる。
【００４２】
少なくとも１種のアミノ酸残基が式（１）（セリン−アスパラギン−セリン（Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ））のトリペプチドから変わったトリペプチドは本発明に含まれる。タンパク質化学および構造の詳細な説明については、Ｇ．Ｅ．Ｓｃｈｕｌｚら著、「ＩｎＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎＳｔｒｕｃｔｕｒｅ（タンパク質構造の原理中の）」、ニューヨーク、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ社、１９７９年およびＴ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ著、「ＩｎＰｒｏｔｅｉｎｓ：ＳｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（タンパク質中の：構造および分子原理）」、サンフランシスコ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．社、１９８４年を参照のこと。本発明の式（１）（セリン−アスパラギン−セリン（Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ））のトリペプチドで行われてもよい置換のタイプは、保守的置換であってもよく、本明細書では次群のうちの一つ以内の交換と定義される。しかしながら、本発明はこれらの置換に限定されるものではない。
【００４３】
（１）Ｌ−アミノ酸の代わりにＤ−アミノ酸、
（２）小さな脂肪族の非極性またはわずかに極性の残基：例えば、アラニン（Ａｌａ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、グリシン（Ｇｌｙ）、
（３）極性の、負に帯電した残基およびそれらのアミド：例えば、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、
（４）極性の、正に耐電した残基：例えば、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、リシン（Ｌｙｓ）。
【００４４】
そうする前に置換の正確な効果を予測することが困難である場合でさえ、当業者は、型通りのスクリーニングアッセイ、好ましくは下記のバイオアッセイによって、その効果を評価できることを認めるであろう。酸化還元もしくは熱安定性、疎水性、タンパク分解性劣化への感受性またはキャリアと凝集するもしくは多量体へと凝集する傾向をはじめとするペプチド特性の変性は、普通の当業者に周知の方法によって検査される。
【００４５】
当業者は、どんな構造物が機能的に等価のアミノ酸類似体を構成するかを知っているかまたは決定することができる。
【００４６】
化学的誘導体
本明細書で用いられるように、本発明のトリペプチドの「化学的誘導体」は、普通はトリペプチドの部分ではない追加の化学的部分を含有する。トリペプチドの共有結合的変性は、本発明の範囲内に含まれる。かかる変性は、ペプチドの標的アミノ酸残基を、選択された側鎖または末端残基と反応することが可能である有機誘導体化試薬と反応させることによって分子中へ導入されてもよい。
【００４７】
アミノおよびカルボキシル末端は、好ましくは、アミノ末端Ｎに結合したアセチル（ＣＨ３ＣＯ−）および「カルボキサミド」とも省略される、Ｃ−末端カルボキシル基に結合したアミド（−ＮＨ２）でブロックされるまたは「キャップされる」が、任意の他の基で容易にキャップすることもできる。キャッピング基の思慮深い選択は、ペプチドへの他の活性の追加を可能にする。例えば、Ｎ−またはＣ−末端キャップに連結したスルフヒドリル基の存在は、誘導体化されたペプチドの他の分子への結合を可能にするであろう。幾つかのアミノ−末端キャッピング基は、アセチル、ベンゾイル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アルキルアミノアシル、アリールアミノアシル、ホルミル、ペプチドおよびポリマーからなる群から選択された化合物である。カルボキシ−末端基の例は、ＮＨ２、ＯＨ、およびＮＨＲ（式中、Ｒはアルキル、アリール、ペプチドおよびポリマーからなる群から選択される）からなる群から選択される化合物である。
【００４８】
キャップされたペプチドは、天然の（Ｌ−アミノ酸立体配置）キャップされていないペプチドの好ましい化学的誘導体の例である。類似体または化学的誘導体の上の組合せのどれもが、本明細書で開示されるキャッピング基のどれでキャップされてもよい。
【００４９】
アミノ酸およびペプチド模倣物
本明細書で用いられるように、「アミノ酸模倣物」は、例えば、参照アミノ酸の電荷および電荷間隔特性のような機能的に類似の特性を示す有機構造物を含む。模倣物はまた、アミノ酸またはアミノ酸官能基の最適間隔および電荷相互作用を維持するように、拘束構造物を含む。当業者は、どんな構造物が機能的に等価のアミノ酸模倣物を構成するかを知っているかまたは決定することができる。
【００５０】
本明細書で用いられるように、「ペプチド模倣物」は、対応するペプチド中に存在するような類似のペプチド鎖ファルマコフォア基を保有する有機分子である。ペプチド模倣物はまた、特定ペプチドの機能的等価物であることもできる。本発明のＳＮＳトリペプチドは、ファルマコフォア特性に基づいて分類することができる。本明細書で用いられるように、用語「ファルマコフォア」は、化合物が特定の反応を示すまたは所望の活性を有するのに必要とされる官能基の特定の配置と定義される。
【００５１】
本発明の好ましいペプチド模倣化合物は、キャップされたまたはキャップされていないＳＮＳの生物学的効果を模倣するものである。ペプチド模倣剤は、それがキャップされたまたはキャップされていない本発明のトリペプチドの結合活性または生物活性を有するように、キャップされたまたはキャップされていない本発明のトリペプチドの立体化学的特性を有する非天然産ペプチド（Ｄ−アミノ酸立体配置）または非ペプチド剤であってもよい。
【００５２】
ペプチド模倣化合物、アゴニスト、基質または阻害剤のいずれかは、オピオイドペプチド、ＶＩＰ、トロンビン、ＨＩＶプロテアーゼなどのような多数の生体活性ペプチドについて記載されてきた。ペプチド模倣化合物をデザインし調製する方法は、当該技術において公知である（Ｄ．Ｊ．Ｋｅｍｐｆ著、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４１（１９９４）、ｐ．３３４−３５４、Ｖ．Ｊ．Ｈｒｕｂｙ著、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ３３（１９９３）、ｐ．１０７３−１０８２、Ｗｉｌｅｙら著、Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．１３（１９９３）ｐ．３２７−３８４、Ｇ．Ｃｌａｅｓｏｎ著、Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌ．Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  ５（１９９４）、ｐ．４１１−４３６）。これらの方法は、少なくともトリペプチドの結合能力および特異性を所有し、好ましくは生物活性をも所有する、キャップされたまたはキャップされていないペプチド模倣物を調製するのに用いられてもよい。当業者に利用可能なペプチド化学および一般有機化学の知識は、かかる化合物のデザインおよび試験実施にとって十分である。
【００５３】
例えば、かかるペプチド模倣物は、本発明のペプチドの結晶学的に誘導された三次元構造の検査によって特定されてもよい。あるいはまた、その受容体に結合した本発明のトリペプチドの構造は、核磁気共鳴分光学の技術によって得ることができる。例えば、キャップされたまたはキャップされていないＳＮＳとその受容体との相互作用の立体化学についてのより良い知識は、かかるペプチド模倣剤の合理的なデザインを可能にするであろう。
【００５４】
血管新生および血管新生依存病
本明細書で用いられるように、用語「血管新生阻害の」、「血管新生を阻害する」または「抗血管新生の」は、脈管形成を含み、血管新生の範囲、量、または速度の減少をもたらすことを意味することを意図される。組織における内皮細胞増殖または移行の範囲、量、または速度の減少をもたらすことは、血管新生を阻害することの具体的な例である。
【００５５】
用語「血管新生阻害組成物」は、内皮細胞移行、増殖、管形成のような血管新生実現過程を阻害し、結果として既存血管からの新血管の発生の阻害、その結果として血管新生依存病の阻害をもたらす組成物を意味する。
【００５６】
本明細書で用いられるように、用語「血管新生依存病」は、血管新生または脈管形成の過程が異常状態を持続するまたは拡大する疾病を意味することを意図される。血管新生は、既存毛細血管または後毛細血管小静脈からの新血管の形成である。脈管形成は、内皮細胞前駆体である血管芽細胞から生じる新血管の形成から起こる。両方の過程は、新血管新生をもたらし、用語血管新生依存病の意味に含まれる。同様に、用語「血管新生」は、本明細書で用いられるように、脈管形成から生じるものならびに既存の血管、毛細血管および小静脈の分枝および新芽形成から生じるもののような血管の新規形成を含むことを意図される。
【００５７】
脈管形成を含む血管新生は、重要な生理学的過程であり、それなしでは胚の発育および創傷治癒は起こらないであろう。しかしながら、血管新生はまた、冒された組織内の細胞への十分な血液および栄養分供給を提供するための手段として多くの異常状態中へ不適当に動員される。これらの異常状態の多くは、異常な細胞増殖または調節を含む。血管新生が重要であると考えられるかかる状態は、本明細書では血管新生依存病と言われる。しかしながら、本発明の方法はまた、正常な生理学的過程に関連した血管新生を阻害するのにも有益に使用することもできる。例えば、月経周期に関連した血管新生の阻害は、受胎調節の有効な方法として予防的に使用することができる。それゆえ、血液形成依存病の処置に関する下の説明はまた、予防または治療上の必要性または便益が存在する正常な血管新生反応の阻害にも適用できる。
【００５８】
血管新生依存病は、例えば、免疫性および非免疫性炎症、リウマチ様関節炎、慢性関節性リウマチおよび乾癬のような炎症性疾患；糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、早期網膜症、黄斑退化、角膜移植拒絶、後水晶体繊維増殖症、ルベオーシス、アテローム硬化性血小板および骨粗しょう症における毛細血管増殖のような血管の不適切なまたは不適当な浸潤に関連した疾患；および例えば、固形腫瘍、腫瘍転移、白血病、血管繊維錘、カポージ肉腫、血管腫のような良性腫瘍、聴覚神経腫、神経繊維腫、トラコーマおよび化膿性肉芽腫のような血液起源腫瘍、ならびに腫瘍成長を支えるために血管新生を必要とする他の癌をはじめとする癌関連疾患含む。血管新生依存病の追加の例は、例えば、オースラーウェーバー（Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｂｅｒ）症候群、心筋層血管新生、血小板血管新生、毛細血管拡張症、血友病関節症および創傷肉芽化を含む。異常状態の維持または進行において血管新生が役割を演じる他の疾病は、当業者には公知であり、本明細書で用いられる用語の意味の範囲内に含まれることを同様に意図される。
【００５９】
血管新生阻害活性の試験管内バイオアッセイ
本発明の化合物は、幾つかの試験管内アッセイシステムでそれらの血管新生阻害活性について試験された。内皮細胞、例えば、調製または商業的に入手できるヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）またはヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）は、２×１０５細胞／ｍＬの濃度でフィブリノーゲン（リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）中５ｍｇ／ｍＬ）と１：１（ｖ／ｖ）比で混合された。トロンビンが添加され（５単位／ｍＬ最終濃度）、混合物は直ちに２４−溜めプレートに移された（溜め当たり０．５ｍＬ）。フィブリンゲルが形成させられ、次に試験化合物と共に血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）および繊維芽細胞成長因子塩基性（ＦＧＦ２）が溜めに添加された（各５ｎｇ／ｍＬ最終濃度で）。細胞は５％ＣＯ２中３７℃で４時間培養され、その時点で各溜め中の細胞がカウントされ、円い、分枝なしで伸びた、一分枝で伸びたまたは２以上の分枝で伸びた、のいずれかに分類された。結果は、化合物の各濃度について５つの異なる溜めの平均として表される。典型的には、血管新生阻害剤が存在すると、細胞は丸いままかまたは分化していない管を形成する（例えば、０または１分枝）かのいずれかである。このアッセイは、生体内の血管新生効力（または血管新生阻害活性）を予報するものであると当該技術において認められている（Ｇｒａｎｔら著、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２７Ａ（１９９１）、ｐ．３２７−３３６、Ｍｉｎら著、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６（１９９６）、ｐ．２４２８−２４３３）。
【００６０】
代わりのアッセイでは、内皮細胞がペンシルバニア州ベッドフォードのベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＰＡ）から商業的に入手可能なマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（登録商標）マトリックス被覆プレート上で培養される場合、内皮細胞管形成が観察される（Ｓｃｈｎａｐｅｒら著、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１６５（１９９５）、ｐ．１０７−１１８）。内皮細胞（１×１０４細胞／溜め）がマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（登録商標）マトリックス被覆２４溜めプレート上へ移され、４８時間後に管形成が評価される。阻害剤は、内皮細胞と同時にまたはその後様々な時点でのいずれかでそれらを添加することによって試験される。
【００６１】
このアッセイは、特定タイプの基底膜、すなわち移行および分化する内皮細胞が最初に遭遇すると予期されるマトリックスの層を内皮細胞に与えることによって血管新生をモデル化している。結合した成長因子に加えて、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（登録商標）マトリックス中に（および生体内の基底膜中に）見出されるマトリックス構成成分またはそれのタンパク質分解生成物もまた、このモデルにフィブリンゲル血管新生モデルを補足させる内皮細胞管形成にとって刺激性であるかもしれない。
【００６２】
さらに、本発明の化合物の血管新生活性は、ニワトリしょう尿膜（ＣＡＭ）アッセイ（Ｏｉｋａｗａら著、ＣａｎｃｅｒＬｅｔｔ．５９（１９９１）、ｐ．５７−６６）によって評価された。
【００６３】
投与の方法
本発明は、血管新生阻害量のＳＮＳトリペプチド、それの類似体、模倣物または化学的誘導体を投与することによって組織中の血管新生を阻害する方法を提供する。
【００６４】
本発明はさらに、血管新生阻害量のＳＮＳトリペプチド、それの類似体または機能等価物を投与することによって動物における血管新生依存病を処置する方法を提供する。
【００６５】
本発明はまた、血管新生阻害量のＳＮＳトリペプチド、それの類似体または機能等価物を投与することによってヒトにおける血管新生依存病を阻害する方法をも提供する。
【００６６】
ＳＮＳトリペプチド、その類似体、または化学的誘導体は、腫瘍保持動物に投与して、非−抗血液形成ペプチド対照物に比べて、該ペプチドの腫瘍成長阻害活性または効力を測定することができる。腫瘍成長の速度または範囲の減少、または腫瘍の消滅は、血管新生依存病の進行に対する抗血管新生活性および効力と関連がある。腫瘍保持動物モデルの説明については、例えば、参照により本明細書に援用される米国特許第５，６３９，７２５号を参照のこと。
【００６７】
投与の適用量
上記方法のいずれかでＳＮＳトリペプチド、類似体または化学的誘導体の活性および／または効力を測定する際に、ペプチドは、ある特定のアッサイにおいて阻害剤の活性を示すことが当該技術で知られている濃度範囲内で投与することができる。例えば、ウシ毛細血管内皮細胞アッセイにおいて存在を示す結果をもたらすポリペプチド阻害剤の濃度は、一般に約１００〜１０００ｎｇ／ｍＬである。同様に、ＣＡＭにおける血管新生に対して活性であるという陽性結果をポリペプチド阻害剤にもたらすポリペプチド阻害剤の濃度は、一般に、例えば、約０．５〜２０μｇ／ｍＬ、１０〜２０μｇ／ディスク、０．１〜１００μｇ／ディスクの濃度の範囲にわたって、または２５μｇ／ディスクである。ラビット角膜アッセイにおいて陽性結果をもたらすと予期されるポリペプチド阻害剤の存在を示す濃度は、一般に約４０μｇ／ハイドロンペレットである。最後に、腫瘍転移および上記の腫瘍保持動物モデルにおける存在を示す結果をもたらすポリペプチド阻害剤の濃度は、それぞれ、毎週２回約２５０μｇまたは１０日間１０ｍｇ／ｋｇ／日、および毎日１２．５μｇまたは週に２回１ｍｇである。例えば、活性な濃度範囲内でＳＮＳトリペプチドの濃度を変えることによってさらなる精密化を行い、血管新生を阻害するための最適濃度または量を決定することができる。
【００６８】
さらに、血管新生依存病を阻害または処置するためのＳＮＳトリペプチド、類似体、模倣物または化学的誘導体の投与のタイミング、投与の回数および投与当たりの量に関して適切な適用量処方を決定するために、上記のモデル、ならびに当業者に公知の他の方法を同様に用いることができる。同様に、上記の方法はまた、新しい、変性されたまたは改善されたＳＮＳトリペプチド、類似体、模倣物または化学的誘導体を製造および特定するために日常的に用いることができる。本明細書に記載される教示および指導を考えれば、当業者は、血管新生依存病を阻害または処置するのに有効なＳＮＳトリペプチド、類似体、模倣物または化学的誘導体の量を知るであろうし、または該量を決定することができる。
【００６９】
本明細書で用いられるように、用語「血管新生阻害量」は、組織、動物または個体に投与された場合に血管新生の範囲、量または速度の減少をもたらすのに必要とされる本発明のＳＮＳトリペプチド、類似体、模倣物または化学的誘導体の量を意味することを意図される。治療上有効であるのに必要とされるＳＮＳトリペプチド、類似体、模倣物または化学的誘導体の適用量は、例えば、処置されるべき毛管形成依存病、投与の経路および形態、投与予定分子の効力および大活性半減期、組織、動物または個体の重量および状態、ならびに以前のまたは平行の療法に依存するであろう。本方法の適切な適用量は、本明細書に提供された手引を用いて、当業者によって決定することができる。例えば、該量は、上記の試験管内または生体内血管新生アッセイ結果から外挿することができる。当業者は、治療の経過を通して患者の状態がモニターされる必要があること、および投与される組成物の量をそれに従って調節できることを認めるであろう。
【００７０】
血管新生を阻害するためにまたは血管新生依存病を処置するために、本発明のペプチドの血管新生阻害量は、処置処方に依存して、例えば、約１０μｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、または好ましくは約１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇであることができる。例えば、ペプチドが日に１〜数回投与される場合、その時には、ペプチドが週に１回または月に１回またはより少ない頻度で投与される場合よりも低い用量が必要とされるであろう。同様に、ペプチドの時限放出を見込んでいる調合物は、単一の巨丸剤用量として投与される場合よりも少量のペプチドの連続放出を提供するであろう。例えば、ペプチドは４ｍｇ／ｋｇ／週で投与することができる。
【００７１】
配送システム
本発明のＳＮＳトリペプチド、類似体、模倣物または化学的誘導体は、静脈内でまたは動脈内でのように、体系的に配送することができる。ＳＮＳトリペプチド、類似体、模倣物または化学的誘導体はまた、血管新生の部位に局部的に投与することもできる。ＳＮＳトリペプチド、類似体、模倣物または化学的誘導体の投与に適切な部位は、処置中の個体の臨床的徴候に依存して、当業者によって知られているかまたは決定されることができる。例えば、上記の阻害活性を有する、ＳＮＳトリペプチド、類似体、模倣物または化学的誘導体は、普通の当業者に公知の調合方法を用いて、薬学的に許容し得る調合物中に、単離され実質的に精製されたタンパク質およびタンパク質断片ならびに不溶性凝集物として提供することができる。これらの調合物は、例えば、局部的、経皮、鼻孔間、腹腔内、頭蓋内、脳内心室、大脳内、膣内、子宮内、経口、直腸または非経口（例えば、静脈内、髄腔内、皮下または筋肉内）ルートをはじめとする標準ルートによって投与することができる。さらに、ＳＮＳトリペプチド、類似体、模倣物または化学的誘導体は、該化合物の持続的放出を考えて生分解性ポリマー中へ組み入れることができ、ＳＮＳトリペプチド、類似体、模倣物または化学的誘導体が自然に体系的に放出されるように、該ポリマーは、薬物配送が望まれる場所の近辺に、例えば、腫瘍の部位または着床した部位に植えつけられる。浸透ミニポンプペプチド、類似体、模倣物または化学的誘導体はまた、カニューレを通して腫瘍の転移性成長または血管供給部位へ直接になど当該部位に、高濃度のＳＮＳトリペプチド、類似体、模倣物または化学的誘導体の制御された配送を提供するために用いることができる。生分解性ポリマーおよびそれらの使用は、例えば、参照により本明細書に援用されるＢｒｅｍら著、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  ７４（１９９１）、ｐ．４４１−４４６に詳細に記載されている。
【００７２】
ＳＮＳトリペプチド、類似体、模倣物または化学的誘導体はまた、化学療法剤、抗生物質、抗ウィルス剤、抗炎症剤、標的化合物、サイトカイン、免疫毒素、抗腫瘍抗体、血管新生阻害剤、抗浮腫剤、放射線増感剤およびそれらの組合せからなる群から選択された追加の治療化合物と共に投与することもできる。
【００７３】
本発明は、薬学的に許容し得る媒体および調合物と一緒にＳＮＳトリペプチド、類似体、模倣物または化学的誘導体の組成物を提供する。かかる組成物は、本発明の方法で使用して、血管新生を阻害するまたは血管新生依存病を処置することができる。例えば、ＳＮＳトリペプチド、類似体、模倣物または化学的誘導体は、薬学的に許容し得る媒体と一緒に溶液または懸濁液として投与することができる。かかる薬学的に許容し得る媒体は、例えば、水、リン酸ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝塩類溶液、標準生理食塩水もしくはリンガー（Ｒｉｎｇｅｒ）溶液もしくは他の生理緩衝食塩水、またはグリコール、グリセリン、オリーブ油もしくは注射可能な有機エステルなどの油のような他の溶剤もしくは賦形剤であることができる。
【００７４】
ＳＮＳトリペプチド、類似体、模倣物または化学的誘導体調合物は、皮下、腹腔内、筋肉内、静脈内、皮内、頭蓋内、気管内、および硬膜外投与のような非経口投与に適用できるものを含む。同様に調合物は経口、直腸、眼（イントラヴィトリール（ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌ）もしくはイントラカメラル（ｉｎｔｒａｃａｍｅｒａｌ）をはじめとする）、鼻、局部的（頬および舌下をはじめとする）子宮内、または膣内投与にも適用できる。ＳＮＳトリペプチド、類似体、模倣物または化学的誘導体調合物は、単位適用量形態で与えることができ、当業者に周知の製薬技術によって調製することができる。かかる技術は、活性成分と製薬キャリアまたは賦形剤とを混ぜ合わせる工程を伴う。本発明のＳＮＳトリペプチド、類似体、模倣物または化学的誘導体はまた、該ペプチド用のコード化核酸を投与することによって血管新生を阻害するまたは血管新生依存病を処置するために個体に配送することもできる。それゆえ、本発明のＳＮＳトリペプチド、類似体、模倣物または化学的誘導体用のコード化核酸は、当該技術において公知の多種多様な遺伝子治療方法と共に血管新生阻害量のペプチドまたは変異体を配送するために有用である。本明細書に提供される教示および手引を用いて、１種以上のＳＮＳトリペプチド、類似体、模倣物、化学的誘導体またはそれらの組合せ用のコード化核酸は、当該技術で公知であってコード化配列の配送および発現に用いられるベクターまたは配送システム中へ組み入れられて、血管新生阻害量を達成することができる。当該技術で公知の適用可能なベクターおよび配送システムは、例えば、レトロバイラルベクター、アデノウィルスベクター、アデノ関連ウィルス、配位子接合粒子（ｌｉｇａｎｄ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）および標的用核酸、単離ＤＮＡおよびＲＮＡ、リポソーム、ポリリシン、ならびに参照によって本明細書に援用されるＳｈｅａら著、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（１９９９）、ｐ．５５１−５５９に記載されたもののような、当業者に公知の様々な他の遺伝子配送方法および改良法だけでなく、ＳＮＳトリペプチドを発現するために改良された細胞の移植を使用する、肝臓細胞療法をはじめとする細胞療法を含む。
【００７５】
当該技術で周知の方法の具体的な例は、例えば、米国特許第５，３９９，３４６号、米国特許第５，５８０，８５９、米国特許第５，５８９，４６６号、米国特許第５，４６０，９５９号、米国特許第５，６５６，９６５号、米国特許第５，６４３，５７８号、米国特許第５，６２０，８９６号、米国特許第５,４６０,９５９号、米国特許第５，５０６，１２５号、欧州特許出願Ｎｏ．ＥＰ０７７９３６５Ａ２、ＰＣＴＮｏ．ＷＯ９７／１０３４３、ＰＣＴＮｏ．ＷＯ９７／０９４４１に記載されており、そのすべてが参照により本明細書に援用される。当業者に公知の他の方法もまた存在し、コード化核酸配列を発現することによって血管新生阻害量のＳＮＳトリペプチド、類似体、模倣物または化学的誘導体の配送に同様に適用できる。
【００７６】
本発明はまた、遺伝子治療方法に有用な、当該技術で公知の方法によって調製することができるコード化核酸およびベクターにも関する。かかる核酸、ベクターおよび薬学的に許容し得る媒体を含有する組成物もまた提供される。薬学的に許容し得る媒体は、所望の核酸を劣化させる要素を含有するべきではない。ＳＮＳトリペプチド、類似体、模倣物または化学的誘導体を用いる方法は、先に述べられた様々な種類のＳＮＳトリペプチド、類似体、模倣物または化学的誘導体のいずれも使用することができる。
【００７７】
非ＳＮＳ配列は、本発明のペプチド上へ構造的または機能的特性を与えることができる。異常血管新生の部位をＳＮＳトリペプチド、類似体、模倣物または化学的誘導体の標的にすることは、異常状態部位にペプチドを固定するという追加の治療上の利点を与える。この結果は、それゆえ、自然に血管新生区中へ拡散し得る高い有効濃度のペプチドを持続し、ＳＮＳトリペプチド、類似体、模倣物または化学的誘導体の血管新生部位への連続的な局部投与を本質的に見込んでいる。
【００７８】
さらに、２種以上の本発明のＳＮＳトリペプチド、類似体、模倣物または化学的誘導体は、本発明の方法で投与されて、血管新生を阻害するかまたは血管新生依存病を処置することができる。同様に、１種以上のＳＮＳトリペプチド、類似体、模倣物または化学的誘導体は、１種以上のＳＮＳトリペプチド、類似体、模倣物または化学的誘導体と組み合わせて投与し、血管新生を阻害するかまたは血管新生依存病を処置することができる。それゆえ、ＳＮＳトリペプチド、ＳＮＳ類似体、ＳＮＳ模倣物またはＳＮＳ化学的誘導体およびそれらの組合せの様々な組合せおよび変形を、血管新生の有効な阻害および血管新生依存病の有効な処置のための本発明の方法で投与することができる。
【００７９】
ＳＮＳトリペプチド、類似体、模倣物または化学的誘導体およびそれらの組合せはまた、それらの血管新生阻害効果を自然に組み合わせるために交互投与で配送することもできる。例えば、ＳＮＳ類似体を単一の巨丸剤用量で投与し、引き続き１種以上のＳＮＳトリペプチドを単独でまたはＳＮＳトリペプチド、類似体、模倣物または化学的誘導体と組み合わせて複合投与することができる。ＳＮＳトリペプチド、類似体、模倣物、化学的誘導体またはそれらの組合せの同時配送であろうと交互配送であろうと、投与の方法は、先に記載されたそれらのタイプの投与のうちの任意のものであることができ、特定の治療上の必要性と該目的のために選択されたＳＮＳトリペプチド、類似体、模倣物または化学的誘導体の効力とに依存するであろう。どの種類のＳＮＳトリペプチド、類似体、模倣物または化学的誘導体をカクテル中で組み合わせるかまたは一時的投与処方中で組み合わせるかの決定は、血管新生依存病と該疾病に冒された個体の具体的な物理特性とに依存するであろう。当業者は、特定の血管新生依存病の技術分野内で公知の診断的および臨床的判断基準と一緒に本明細書で提供される教示および手引を用いて、特定の適用にとって有効である投与の具体的なカクテルまたは処方を知るであろうし、または決定することができる。
【００８０】
治療用途
ＳＮＳトリペプチド、類似体、模倣物または化学的誘導体を投与することによって血管新生を阻害するまたは血管新生依存病を処置する方法は、さらに、他の療法と共に実行することができる、本発明の可能な実施形態は、固形腫瘍に対しておよび転移達成の制御のために行われる従来の化学療法のような他の療法と共に、かかる投与の使用を熟考する。血管新生阻害剤の投与は、典型的には化学療法の間ずっと、または化学療法後腫瘍組織への血液供給物および栄養分の供給により回復するべく血管新生を誘発することによって腫瘍組織が毒の襲撃に反応するはずである時点で、実施される。さらに、固形腫瘍が取り除かれた手術後に転移の予防法としてかかる血管新生阻害手順を行うことが好ましい。
【００８１】
本組成物は、他の血管新生阻害剤と共に同様に使用することができる。血管新生阻害剤は、当該技術で公知であり、公知の方法によって調製することができる。例えば、血管新生阻害剤は、αｖインテグリン阻害抗体、細胞接着タンパク質または細胞接着結合配列を含有するそれの機能的断片のようなインテグリン阻害化合物を含む。追加の血管新生阻害剤は、例えば、アンジオスタチン、アンジオスタチンの機能的断片、エンドスタチン、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）阻害剤、ＦＧＦ受容体阻害剤、ＶＥＧＦ阻害剤、ＶＥＧＦ受容体阻害剤、血管透過性因子（ＶＰＦ）阻害剤、ＶＰＦ受容体阻害剤、トロンボスポンジン、血小板因子４、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ガンマ、インターフェロン−誘導性タンパク質１０、インターロイキン１２、グロ−ベータ（ｇｒｏ−ｂｅｔａ）、およびプロラクチンの１６ｋＤａＮ−末端断片、サリドマイド、ならびに血管新生阻害のための他の仕組みを含む。
【００８２】
アンジオスタチンは上記米国特許第５，６３９，７２５号の主題であり、エンドスタチンは上記ＰＣＴ公開ＷＯ９７／１５６６６の主題である。残りの血管新生阻害剤および上述の標的の記載については、例えば、それぞれ、Ｃｈｅｎら著、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５（１９９５）、４２３０−４２３３、Ｇｏｏｄら著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７（１９９０）、６６２９−６６２８、Ｏ‘Ｒｅｉｌｌｙら著、Ｃｅｌｌ７９（１９９４）、ｐ．３１５−３２８、Ｐａｒａｎｇｉら著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３（１９９６）、ｐ．２００２−２００７、Ｒａｓｔｉｎｅｊａｄら著、Ｃｅｌｌ５６（１９８９）、ｐ．３４５−３５５、Ｇｕｐｔａら著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２（１９９５）、ｐ．７７９９−７８０３、Ｍａｉｏｎｅら著、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７（１９９０）、ｐ．７７−７９、Ａｎｇｉｏｌｉｌｌｏら著、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２（１９９５）、ｐ．１５５−１６２、Ｓｔｒｉｅｔｅｒら著、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２１０（１９９５）、ｐ．５１−５７、Ｖｏｅｓｔら著、Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．８７（１９９５）、ｐ．５８１−５８６、Ｃａｏら著、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２（１９９５）、２０６９−２０７７、Ｃｌａｐｐら著、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３３（１９９３）、ｐ．１２９２−１２９９を参照のこと。追加の血管新生阻害剤の記載については、例えば、Ｂｌｏｏｄら著、Ｂｉｏｃｈ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０３２（１９９０）、ｐ．８９−１１８、Ｍｏｓｅｓら著、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８（１９９０）、ｐ．１４０８−１４１０、Ｉｎｇｂｅｒら著、Ｌａｔ  Ｉｎｖｅｓｔ．５９（１９８８）、ｐ．４４−５１および米国特許第５，０９２，８８５号、第５，１１２，９４６号を参照のこと。
【００８３】
調合物
非経口的投与に好適な調合物は、上記の薬学的に許容し得る媒体のような水性および非水性の無菌注射液を含む。該液はさらに、例えば、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および調合物を意図される受容体の血液と等張にする溶質を含有することができる。他の調合物は、例えば、懸濁剤および増粘剤を含むことができる水性および非水性無菌懸濁液を含む。調合物は、単位用量または複数用量容器、例えば、密封したアンプルおよびバイアルで提供することができ、例えば、使用の直前に無菌液体キャリアの添加を必要とする凍結乾燥状態で貯蔵することができる。必要に応じて調合される注射液および懸濁液は、先に記載された種類の無菌粉末、顆粒およびタブレットから調製することができる。
【００８４】
薬学的に許容し得る媒体は、例えば、ＳＮＳトリペプチド、類似体、模倣物または化学的誘導体の吸収を安定または増加させる役割を果たす生理学的に許容し得る化合物をさらに含有することができる。かかる生理学的に許容し得る化合物は、例えば、ブドウ糖、蔗糖もしくはデキストランのような炭水化物、アスコルビン酸もしくはグルタチオンのような抗酸化剤、微生物膜を分断するＥＤＴＡのようなキレート剤、カルシウムもしくはマグネシウムのような二価金属イオン、低分子量タンパク質、脂質もしくはリポソーム、または他の安定剤もしくは賦形剤を含む。ＳＮＳトリペプチド、類似体、模倣物または化学的誘導体はまた、生分解性ポリマーのような薬学的に許容し得る媒体で調合することができる。
【００８５】
ポリマー調合物
また、本発明によって熟考されていることは、ポリマー調合物での血管新生阻害トリペプチド、類似体、模倣物または化学的誘導体の使用である。トリペプチドは、表面グラフト共重合、マトリックス中への非共有結合的組入れ、または別の方法で生医学材料としてカプセルに包むことによって共有結合的に結びつけることができる。新血管新生の調節および制御は、親血管新生因子および抗血管新生因子のバランスが維持されなければならない組織エンジニアリング材料へのアプローチの本質的な部分である。トリペプチドは、組織における新血管新生を調節する、公知の血管新生促進剤、移植および人工器官材料のような機能性生医学材料、組織エンジニアリング用足場、創傷治癒材料、生体外人工器官材料と共に使用されてもよい。ポリマー調合物はまた、新血管新生阻害用の抗血管新生阻害ペプチドの持続的放出のために使用されてもよい。これは、抗血管新生阻害ペプチドのキャリア材料への接合を伴う、血管新生依存病でかかる調合物の抗血管新生効果を局部的に配送するために用いることができる、薬物配送方法の一例である。
【００８６】
実施例
本発明を今一般的に記載してきたが、同じことは、例示として提供し、かつ、明記しない限り本発明を限定することを意図しない次の実施例を参照することによってより容易に理解されるであろう。
【００８７】
一般的方法
薬品
すべての試薬は、化学品グレードであり、ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））から、またはニュージャージー州ブリッジポートのブイ・ダブリュ・アール・サイエンティフィック（ＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｂｒｉｄｇｅｐｏｒｔ，ＮＪ））を通して購入した。酢酸コルチゾン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびゼラチン溶液（ウシ皮膚からの２％タイプＢ）は、シグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）から購入した。イアード塩（Ｅａｒｄ’ｓ  ｓａｌｔ）入りＭ１９９増殖培地、塩基性ＦＧＦ、インシュリン−トランスフェリン−セレン−Ｇ補強剤（Ｉ−Ｔ−Ｓｅ）１００Ｘ、Ｃａ＋２およびＭｇ＋２入りまたはなしのダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）のリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）および０．５Ｍ  ＥＤＴＡは、ニューヨーク州グランド・アイランドのギブコ・ビー・アール・エル（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ））から入手した。ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、内皮細胞基底培地（血清を含まないＥＢＭ）、ＥＧＭ（成長因子、ウシ胎児血清で栄養補強された）、および０．０２５％トリプシン／０．０１％ＥＤＴＡ溶液は、カリフォルニア州サンジェゴのクロネティックス社（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））から購入した。ヒト前立腺（ＴＳＵ−Ｐｒ）腫瘍細胞は、メリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ））から入手した。マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（登録商標）マトリックスおよびヒト・コラーゲン・タイプＩＩＩは、マサチューセッツ州ベッドフォードのベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ））から購入した。ヘマ（ＨＥＭＡ）−３固定および染色液は、ニュージャージー州スウェーデスボーロのバイオケミカル・サイエンシズ社（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｗｅｄｅｓｂｏｒｏ，ＮＪ））から購入した。受精鶏卵は、コネチカット州ノース・フランクリンのスペイファス・アビアン・プロダクツ・アンド・サービス、チャールス・リバー・ラボラトリーズ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＳＰＡＦＡＳ  Ａｖｉａｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ＆  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｎｏｒｔｈ  Ｆｒａｎｋｌｉｎ））から購入した。
【００８８】
ペプチド合成
記載するすべてのペプチドは、ＦＭＯＣ化学（Ｃｈａｎら著、「Ｉｎ  ＦＭＯＣ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＦＭＯＣ固相ペプチド合成中の：実際的アプローチ）」、オックスフォード大学出版（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）、第３章、２０００年）を用いて標準固相合成プロトコルによって調製した。固相、高負荷ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ樹脂およびＦＭＯＣ保護アミノ酸のすべては、マサチューセッツ州フラミングハムのパーセプティブ・バイオシステムズ（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ））から入手した。ペプチド合成は次の３工程を伴う。
（１）アミノ酸カップリング：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）／２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）／ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（樹脂負荷容量を基準にして４．０／４．０／８．０当量）およびＦＭＯＣ保護アミノ酸（４．０当量）ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中室温で４．０時間；
（２）ＦＭＯＣ脱保護：ＤＭＦ中２０％ｖピペリジン１．５時間；
（３）樹脂からの切断：９５：５トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）室温で６時間。エチルエーテルを加えて粗生成物を微粉砕し、水溶液から減圧下で凍結乾燥した。すべてのペプチドの分子量を電気スプレー質量分析法によって確認した（ＭＷ＝３４７．３２、実測値Ｍ＋１＝３４８．２３）。Ｎ−アセチルセリン−アスパラギン−セリン−カルボキサミド（１）（Ａｃ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ（１））の構造および純度評価は、１Ｈ  ＮＭＲスペクトルの検査によっておよびＨＰＬＣによって行い、ＨＰＬＣで純度はおおよそ８０％であると推定した。主な汚染物質は、ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ樹脂からのポリエチレングリコール残基であった（δ３．６ｐｐｍに１Ｈ  ＮＭＲスペクトルピーク）。より大きなペプチド、アセチル−アスパラギン−チロシン−チロシン−セリン−アスパラギン−セリン（Ａｃ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、アセチル−セリン−アスパラギン−セリン−チロシン−セリン−フェニルアラニン−トリプトファン−ロイシン（Ａｃ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）およびアセチル−システイン−アスパラギン−チロシン−チロシン−セリン−アスパラギン−セリン−チロシン−セリン−フェニルアラニン−トリプトファン−ロイシン（Ａｃ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）を、同じペプチド合成法を用いて調製した。
【００８９】
ＳＮＳ類似体ライブラリの合成
一般−
ライブラリの合成は、クエスト（Ｑｕｅｓｔ）２１０シンセサイザーで５ｍＬテフロン（登録商標）反応管（デラウェア州ウィルミントンのデュポン社（Ｅ．Ｉ．ｄｕ  Ｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ  ｏｆ  Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）の登録商標）を用いて実施した。固相ペプチド合成は、アルゴゲルリンク（Ａｒｇｏｇｅｌ  Ｒｉｎｋ）樹脂でＦＭＯＣ法を用いて行った。所望の長さのペプチドが形成されるまで、脱保護とカップリングとの繰返しサイクルを行った。次にペプチドをアシル化し、樹脂から切断した。
【００９０】
手順−
脱保護：
アルゴゲルリンク（Ａｒｇｏｇｅｌ  Ｒｉｎｋ）−ＦＭＯＣ（２００ｍｇ、０．０６４ミリモル）を５ｍＬ反応容器中へ秤り取り、３ｍＬＤＭＦで洗浄した。２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（４ｍＬ）を加えて、樹脂を２分間撹拌した。反応混合物を濾過し、２０％ピペリジン溶液の新４ｍＬアリコットを使って追加の２０分間手順を繰り返した。次に樹脂から排液し、５ｍＬＤＭＦで４回洗浄した。各洗浄工程の間に５分撹拌を用いた。
【００９１】
カップリング：
反応容器に、０．６ｍＬ乾燥ＤＭＦ、引き続き最初のＮ−ＦＭＯＣ−アミノ酸および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）の各３当量を乾燥ＤＭＦ中の０．５Ｍ溶液として添加した。樹脂を１分間撹拌し、引き続き３当量のＨＢＴＵを乾燥ＤＭＦ中の０．５Ｍ溶液として添加した。樹脂を４時間撹拌し、次に排液して、再び洗浄ごとに５分撹拌を用いて４ｍＬＤＭＦで５回洗浄した。
【００９２】
第２および第３のＦＭＯＣ−アミノ酸について脱保護手順およびカップリング手順を繰り返した。第３のアミノ酸をカップリングした後、再びそれを脱保護手順にかけた。
アシル化：
【００９３】
上の手順からの樹脂を３ｍＬの無水酢酸：ジイソプロピルエチルアミン：ＤＭＦの１：１：２混合物で１時間処理した。樹脂から排液し、ＤＭＦで繰り返し洗浄した。
【００９４】
切断：
樹脂に３ｍＬの５０％ＴＦＡ／塩化メチレン溶液を添加した。樹脂を１時間撹拌した。樹脂を濾過し、濾液を集めた。濾液を氷冷したエーテルにゆっくりと添加し、所望の生成物を沈殿させた。濾過によってその沈殿を集め、５０％アセトニトリル溶液に溶解した。溶液を減圧下で凍結乾燥して、所望の生成物を固体として得た。
【００９５】
省略形の意味は次のとおりである。「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｄ」は日を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味する。
【実施例１】
【００９６】
内皮細胞管形成の阻害
内皮細胞による分化は、グラント（Ｇｒａｎｔ）ら（ＩｎＶｉｔｒｏＣｅｌｌＤｅｖ．Ｂｉｏｌ．２７Ａ（１９９１）、ｐ．３２７−３３６）によって開発された方法を用いて調べた。マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（登録商標）マトリックス、フェノール−レッドを含まない（マサチューセッツ州ベッドフォードのベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から商業的に入手可能）を４℃で一晩融解した。冷たいピペット吸い口を用いて、３．０ｍｇ／マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（登録商標）マトリックスの溜めを、冷たい２４の多溜めプレート（ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ））中に置いた。３７℃で３０分間培養している間にマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（登録商標）マトリックスを重合させた。
【００９７】
ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、２％胎児ウシ血清入り内皮細胞増殖培地（ＥＧＭ）中５％ＣＯ２および９５％湿度で３７℃に維持した。０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と１：１００希釈インシュリン−トランスフェリン−セレン−Ｇ補強剤（Ｉ−Ｔ−Ｓｅ、１００Ｘ）とで栄養補強した内皮細胞基底培地（ＥＢＭ）中で管アッセイを行った。ＨＵＶＥＣをトリプシン消化し、遠心分離し、次に、リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）中で２回洗浄した。カウントした後、細胞密度を３５，０００細胞／ｍＬに調整した。
【００９８】
３５，０００細胞／ｍＬ／溜めという最終濃度で、１００ｎｇ／ｍＬの組換えヒト繊維芽成長因子塩基性（ＦＧＦ２）とＥＢＭ培地に溶解した０．０１５μモル濃度のペプチド（下を参照のこと）とで処理した。細胞結合をさせるために、処理した細胞を５％ＣＯ２および９５％湿度で、３７℃で一晩培養した。
【００９９】
次に、培地を吸引除去し、改質ＨＥＭＡ−３染色キットを用いて細胞を固定して染色した。ＤＫＣ５０００  ３−ＣＣＤカラービデオカメラシステム（ニューヨーク州ニューヨークの東芝アメリカ（Ｔｏｓｈｉｂａ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ））を用いてマイクロタイター溜め切片のデジタル画像を集め、画像−プロ・プラス・ソフトウェア（メリーランド州シルバー・スプリングのメディア・サイバーネティックス（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ，ＭＤ）で分析した。マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（登録商標）マトリックス表面（ペンシルバニア州ベッドフォードのベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＰＡ））上の管形態を有する染色細胞の面積および主軸長さを５画像／溜めからカウントした。
【０１００】
次の４つのペプチドを試験した：アセチル−セリン−アスパラギン−セリン−カルボキサミド（ａｃｅｔｙｌ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）（構造１）、アセチル−アスパラギン−チロシン−チロシン−セリン−アスパラギン−セリン（ａｃｅｔｙｌ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、アセチル−セリン−アスパラギン−セリン−チロシン−セリン−フェニルアラニン−トリプトファン−ロイシン（ａｃｅｔｙｌ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）およびアセチル−システイン−アスパラギン−チロシン−チロシン−セリン−アスパラギン−セリン−チロシン−セリン−フェニルアラニン−トリプトファン−ロイシン（ａｃｅｔｙｌ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｒｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）。表１および図１は、アセチル−セリン−アスパラギン−セリン−カルボキサミド（ａｃｅｔｙｌ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）（構造１）が試験管内ＦＧＦ２刺激ＥＣ管形成の非常に効力のある阻害剤であることを明らかに例示する。面積データは１０４平方ミクロンの単位で表し、長さデータは長さ／面積としてｍｍ／ｍｍ２の単位で表す。
【０１０１】
【表１】
2005507363.tif 000003
【０１０２】
表２は、アセチル−セリン−アスパラギン−セリン−カルボキサミド（ａｃｅｔｙｌ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）（構造１）がより大きなペプチドよりも試験管内ＦＧＦ２刺激ＥＣ管形成のより効力のある阻害剤であることを例示する。パーセント阻害データは、正の対照値と負の対照値との差で割った実験値マイナス負の対照値（ＥＢＭ培地）の商として表す。
【０１０３】
【表２】
2005507363.tif 000004
【実施例２】
【０１０４】
ＣＡＭでの血管新生およびＣＡＭ切片の顕微鏡分析
オーエルバッハ（Ａｕｅｒｂａｃｈ）ら（Ｊ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．４１（１９７４）、ｐ．３９１−３９４）によって以前に記載された方法によって生体内血管新生を調べた。１０日齢胚をスパファス社（コネチカット州のプレストン）（Ｓｐａｆａｓ  Ｉｎｃ．（Ｐｒｅｓｔｏｎ，ＣＴ））から購入し、５５％相対湿度で、３７℃で培養した。キャンドリング灯の助けをかりた暗所で、皮下注射針で気嚢を隠す外皮中に小さな穴をあけた。キャンドリングの間ずっと観察されるように、胚膜の血管部分の一面に直接卵の幅広い側の外皮中に第２の穴をあけた。第１の穴に負圧をかけることによって偽気嚢を第２の穴の下に作り出し、それは、しょう尿膜（ＣＡＭ）を外皮から分離させた。下にあるＣＡＭに直接アクセスさせる小さなクラフツ研削砥石（ウィスコンシン州レイシンのドレメル、エマーソン・エレクトリック・カンパニーの部門（Ｄｒｅｍｅｌ，Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｍｅｒｓｏｎ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｃｏｐａｎｙ，Ｒａｃｉｎｅ，ＷＩ））を用いて脱落したＣＡＭ一面の外皮中におおよそ１．０ｃｍ２のウィンドウをカットした。＃１濾紙のフィルターディスク（英国のファットマン・インターナショナル（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ））を、９５％エタノールおよび水中の３ｍｇ／ｍＬ酢酸コルチゾン（ミズーリ州セントルイスのシグマ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））溶液中に浸漬し、次に無菌条件下に風乾した。ＦＧＦ２（メリーランド州ガイサースバーグのライフ・テクノロジー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ））を用いて１０日齢ニワトリ胚のＣＡＭに血管を成長させた。ＰＢＳ中に１μｇ／ｍＬで溶解したＦＧＦ２を吸着した無菌フィルターディスクを、成長中のＣＡＭ上に置いた。２４時間で、試験化合物または対照賦形剤を局部的にＣＡＭに直接添加した。
【０１０５】
ＦＧＦ２飽和フィルターディスクの直接下のＣＡＭ組織を、前もって４８時間化合物または対照で処理した胚から切除した。組織をＰＢＳで３回洗浄した。切片を３５ｍｍペトリ皿（ニューヨーク州ロチェスターのナルゲ・ヌンク（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ））中に置いて、ＳＶ６ステレオ顕微鏡（ニューヨーク州ソルンウートのカール・ツェイス（Ｋａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ））下５０倍の倍率で調べた。３−ＣＣＤカラービデオカメラシステム（ニューヨーク州ニューヨークの東芝アメリカ（Ｔｏｓｈｉｂａ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ））を用いてフィルターに隣接したＣＡＭ切片のデジタル画像を集め、画像−プロ・プラス・ソフトウェア（メリーランド州シルバー・スプリングのメディア・サイバーネティックス（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ，ＭＤ）で分析した。それは、図２に見ることができる。表３は、各切片についてカウントされた、フィルターディスクの面積に等しい円形領域に含まれる血管分岐点の数を包含する。パーセント阻害データは、正の対照値と負の対照値との差で割った実験値マイナス負の対照値の商として表す。
【０１０６】
【表３】
2005507363.tif 000005
【実施例３】
【０１０７】
ニワトリしょう尿膜腫瘍アッセイ
千万腫瘍細胞を各ＣＡＭの表面上に置き、１週間培養した。生じた腫瘍を切除し、５０ｍｇ断片にカットした。これらの断片を追加のＣＡＭ上に置き、次の日に静脈内注射によって局部的にまたは体系的に試験剤で処理した。４８時間後に、ＣＡＭを卵から切除し、腫瘍に入り込んだ血管の数をカウントした（血管分岐点として）。データを、処理群当たりの平均血管数として示す（＋／−標準測定誤差）。各処理群は実験当たり少なくとも１０腫瘍を組み入れた。次に腫瘍を卵から切除し、各腫瘍について腫瘍重量を測定した。データを、処理群当たりの平均腫瘍重量として表３に示す（＋／−標準測定誤差）。スチューデント（Ｓｔｕｄｅｎｔ）のｔ−試験を用いて統計的解析を行った。表３に示すようにこのアッセイからの結果は、１６μｇのアセチル−セリン−アスパラギン−セリン−カルボキサミド（ａｃｅｔｙｌ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）（構造１）がＣＡＭにおけるＦＧＦ２刺激新血管新生を抑制するのに有効であることを示した（１６μｇでの１００平均阻害）。
【実施例４】
【０１０８】
ＴＳＵ−Ｐｒ（前立腺）腫瘍成長の阻害
千万腫瘍細胞を各ＣＡＭ（７日齢胚）の表面上に置き、１週間培養した。生じた腫瘍を切除し、５０ｍｇ断片にカットした。これらの断片を追加のＣＡＭ上に置き、次の日にアセチル−セリン−アスパラギン−セリン−カルボキサミド（ａｃｅｔｙｌ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）（構造１）または賦形剤で局部的に処理した。７日後に、ＣＡＭを卵から切除し、腫瘍に入り込んだ血管の数をカウントした（血管分岐点として）。データを、処理群当たりの平均血管数として示す（＋／−標準測定誤差）。各処理群は実験当たり少なくとも１０腫瘍を組み入れた。代表的な腫瘍を１０倍倍率で写真撮影した。次に腫瘍を卵から切除し、各腫瘍について腫瘍重量を測定した。データを、処理群当たりの平均腫瘍重量として示す（＋／−平均の標準誤差）。スチューデント（Ｓｔｕｄｅｎｔ）のｔ−試験を用いて統計的解析を行った。
【０１０９】
アセチル−セリン−アスパラギン−セリン−カルボキサミド（ａｃｅｔｙｌ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）（構造１）は、腫瘍への直接注射によってヒト前立腺腫瘍の生体内成長を阻害することが示された（図３）。４５μｇアセチル−セリン−アスパラギン−セリン−カルボキサミド（ａｃｅｔｙｌ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）（構造１）を注射された１０腫瘍のうち６腫瘍が７日後に顕著な重量収縮を示した（４５μｇで１１１％平均阻害、１６μｇで１００％平均阻害）。
【実施例５】
【０１１０】
アセチル−セリン−アスパラギン−セリン−カルボキサミド（ａｃｅｔｙｌ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）をベースとするライブラリの調製
アセチル−セリン−アスパラギン−セリン−カルボキサミド（ａｃｅｔｙｌ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）（構造１）の観察された抗血管新生活性に基づき、標準ＦＭＯＣ固相ペプチド化学（一般的方法を参照のこと）を用いて次の１５種のペプチド（ＳＡＳ、ＳＱＳ、ｓＮＳ、ｓｎＳ、ＳＧＳ、ＳＥＳ、ｓＮｓ、ｓｎｓ、ＳＤＳ、ＳｎＳ、ＳＮｓ、Ｓｎｓ、ｔ４Ｈｙｐ−ＮＳ、ｔ４Ｈｙｐ−Ｎ−ｔ４ＨｙｐおよびＳＮ−ｔ４Ｈｙｐ）を調製した。大文字はＬ−アミノ酸（天然）を示し、小文字はＤ−アミノ酸（非天然）を示し、ｔ４Ｈｙｐはトランス−４−ヒドロキシプロリンを示す。
【０１１１】
【化２】
2005507363.tif 000006
【０１１２】
実施例１に記載したようにヒト内皮管形成におけるそれらの抗血管新生効果について上の１５種のペプチドおよびアセチル−セリン−アスパラギン−セリン−カルボキサミド（ａｃｅｔｙｌ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）（構造１）を試験した（図４）。３種の最も効力のある化合物ＳＱＳ、ＳＮｓおよびＳＮ−ｔ４Ｈｙｐはまた、実施例２に記載したようにＣＡＭアッセイでも試験した（また図４に）。図５は、ＣＡＭモデルにおけるＳＮＳトリペプチド類似体の血管新生阻害効果を例示する。表４は、ＣＡＭアッセイにおけるＳＱＳ、ＳＮｓおよびＳＮ−ｔ４Ｈｙｐ類似体についての用量反応データを示す。
【０１１３】
【表４】
2005507363.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】繊維芽細胞成長因子塩基性（ＦＧＦ２）によって誘発されるヒト内皮細胞管形成の阻害におけるＳＮＳの効果を例示する。
【図２】しょう尿膜（ＣＡＭ）モデルでのＦＧＦ２誘発血管新生の阻害におけるＳＮＳの効果を例示する。
【図３】ＳＮＳの存在下のＴＳＵ−Ｐｒ（ヒト前立腺）腫瘍成長のパーセント阻害を例示する。
【図４】ヒト内皮管形成およびＣＡＭモデルでのＳＮＳトリペプチド類似体の抗血管新生効果を例示する。
【図５】ＣＡＭモデルでのＳＮＳトリペプチド類似体の抗血管新生効果を例示する。
【図１】
2005507363.tif 000008
【図２】
2005507363.tif 000009
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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