(57)【要約】本発明は、限定されるものではないが炎症性疼痛、慢性疼痛および／または神経障害性疼痛を含めた疼痛障害の治療および診断のための方法および組成物に関する。本発明は、さらに、疼痛障害を治療しまたは疼痛および／または炎症を変調することができる化合物を同定するための方法を提供する。本発明は、さらに、対象において疼痛および／または炎症を変調するための方法を提供する。加えて、本発明は、異常な２０４７ポリペプチドの活性または異常な２０４７核酸発現によって特徴付けられる疼痛障害を有する患者を治療する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２０４７核酸発現、または２０４７ポリペプチド活性を変調する化合物の能力を検定し、それにより、疼痛性障害を治療することが可能な化合物を同定することを特徴とする疼痛性障害を治療することが可能な化合物を同定する方法。
【請求項２】
ａ）テスト化合物と２０４７を発現する細胞を接触させ、
ｂ）２０４７核酸の発現または２０４７ポリペプチドの活性を変調するテスト化合物の能力を検定し、疼痛のシグナル伝達を調節することが可能な化合物を同定することを特徴とする疼痛シグナリングメカニズムを変調することが可能な化合物を同定する方法。
【請求項３】
細胞と２０４７モジュレーターを接触させ、それにより、細胞内の疼痛シグナリングメカニズムを変調することを特徴とする細胞内の疼痛シグナリングメカニズムを変調する方法。
【請求項４】
細胞が脳細胞、ニューロン、または、脊髄もしくは後根神経節に由来する細胞である請求項２の方法。
【請求項５】
２０４７モジュレーターが小さな有機分子、ペプチド、抗体、またはアンチセンス核酸分子である請求項３の方法。
【請求項６】
２０４７モジュレーターが２０４７ポリペプチド活性を変調することが可能である請求項３の方法。
【請求項７】
２０４７モジュレーターが小さな有機分子、ペプチド、抗体、またはアンチセンス核酸分子である請求項６の方法。
【請求項８】
２０４７モジュレーターが２０４７核酸発現を変調することが可能である請求項６の方法。
【請求項９】
異常な２０４７ポリペプチド活性、または異常な２０４７核酸発現を特徴とする疼痛性障害を有する対象に、２０４７モジュレーターを投与することを特徴とする疼痛性障害を持つ対象を治療する方法。
【請求項１０】
該疼痛性障害が炎症性の疼痛、慢性的疼痛、神経因性疼痛、灼熱痛、線維筋痛、癌疼痛、偏頭痛／頭痛または組織疼痛を含む請求項９の方法。
【請求項１１】
該２０４７モジュレーターを医薬上許容される処方にて投与する請求項９の方法。
【請求項１２】
２０４７モジュレーターが小さな有機分子、ペプチド、抗体またはアンチセンス核酸分子である請求項９の方法。
【請求項１３】
２０４７モジュレーターが２０４７ポリペプチド活性を調節することができる請求項９の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、引用によって全内容が本明細書に組み込まれる、２００１年１０月３１日に出願された、合衆国仮出願番号60/335,009に対して優先権を主張する。
【０００２】
疼痛は、感覚神経の下位集団の末端周辺が、有害な化学的、力学的、または熱性の刺激によって活性化された時に起こる。侵害受容器と呼ばれるこれらのニューロンは、組織損傷に関する情報を、脊髄および脳内の疼痛処理センターに伝達する (Fields, H.L. Pain, McGraw-Hill, New York, 1987)。
【０００３】
哺乳動物における神経系および末梢組織は、神経系で神経伝達物質または神経変調物質として機能する、多数の生物学的に活性なペプチドおよびプロテアーゼを含み、一般的なヒトの神経性疾患および特定の疼痛において役割を持っている。
【０００４】
２０４７（カリクレイン６、ニューロシン（Neurosin)、ザイム(zyme)、プロテアーゼＭとしても知られる）は、分泌分子であり、神経系およびいくつかの腫瘍で発現するセリンプロテアーゼのカリクレイン・ファミリーのメンバーである。このプロテインは、アルツハイマー病およびパーキンソン病、および卵巣癌といったような神経変性疾患の生物マーカーとして使用される。
【０００５】
カリクレインには二つの原理カテゴリー、すなわち血漿カリクレイン（Enzyme Commission of the International Union of Biochemistry Committee on Nomenclature or "EC" Number 3.4.21.34)、および、腺性および器官カリクレインとも呼ばれる、組織カリクレイン (EC number 3.4.21.35)がある。約１００，０００ダルトンの分子重量を持つ血漿カリクレインは、カリクレイノーゲンまたはプレカリクレインと呼ばれる前駆体型で、血液中を循環する。プレカリクレインは、ハーゲマン因子として知られる凝血カスケードのＸＩＩ因子によってその活性型へと変換される。血漿カリクレインの原理機能は、凝血の活性化および酵素カスケードを補助することである。凝固プロセスにおいて、ＸＩＩ因子は、さらなるプレカリクレインおよび内因性の血液凝固を活性化する血漿カリクレインを活性化させる。
【０００６】
組織カリクレインは、唾液、腸、肺、脳、血漿、および様々な他の体内細胞や体液に加えて、尿や膵臓から、最も顕著に単離されてきた。生化学的な研究によって、組織カリクレインは、２７，０００ないし４０，０００ダルトンの分子量を持つ単一のアミノ酸鎖からなる熱安定性の糖蛋白質であることがわかった。組織カリクレインの基質には、プロコラゲナーゼ、キニノーゲン、プロインシュリン、プロレニン、ＢＡＭ２２Ｐ、心房性利尿因子、低密度リポ蛋白質、アトリオペプチゲン、および組織プラスミノゲン活性化因子が含まれる。特にキニノーゲンは、プロセシングおよび活性化にカリクレイン活性を必要とする。キニノーゲンの切断生成物は、例えばブラジキニンおよびカリジンといった、キニンである。
【０００７】
キニンは、炎症、主要な特徴である疼痛を仲介することが知られており、疼痛認知を伝達し変調するＣ−ファイバー末端の侵害受容性の受容体の末端に位置するキニンによる活性化において主要なニューロンの役割を持つという証拠がある。キニン（ブラジキニンおよびカリジン）は、キニノーゲンを切断するカリクライン（蛋白質分解酵素）の活性化の結果として、皮膚の負傷および炎症の間に放出される。原形質膜を横切る塩化物の輸送の増加、ホスホリパーゼＡ２の活性化、およびインターロイキン、サブスタンスＰ、プロスタグランジン、および腫瘍壊死因子の放出を含む多数の他機能が、キニンにあるとされている。キニンの主要な役割は、血流、血圧およびナトリウム／水のバランスの調節を含むと示されてきた。キニンはまた関節リウマチ、アレルギー反応、および鼻炎が原因である血管の漏出（浮腫）とも結び付けられてきた。
【０００８】
炎症プロセスにおける疼痛は、疼痛受容体またはＰ−ファイバーを感作するalgogenicまたは他の物質の放出の結果である。力学的破損は疼痛の発生において重要な役割を持っていると考えられているが、疼痛受容体はmechano-sensitiveではなく、疼痛や腫脹は一定の様式で関連しているわけではない。疼痛受容体は、本質的に化学受容性であり、体の内臓および皮膚部位で見受けられる。熱性の負傷(thermal injury)、化学的負傷(chemical injury)、電気的負傷(electrical injury)、local traumaおよびlocalized or systematic infectionsを含む負傷性および局所性虚血は、循環および固定細胞の分解に繋がる。これらの細胞はリソソームプロテアーゼを放出し、局在するアシドーシスを生成し、プロスタグランジンおよび血管作用性のアミンの生成を刺激し、キニンシステムを活性化する。あらゆるこれらの状態は、疼痛受容体の刺激および感作を助長する。
【０００９】
本発明は、疼痛性障害を診断および治療するための方法および組成物を提供する。本発明は、少なくとも部分的に、２０４７遺伝子が坐骨の負傷後およびフロイントアジュバント（ＣＦＡ）誘発性の炎症疼痛（図２Ｄ参照）後に坐骨神経によって神経支配された無毛の皮膚においてアップレギュレートされるという発見に基づいている。理論による制限を受けずに考えれば、２０４７は負傷部位に存在する侵害受容器を活性化すると考えられる疼痛メディエーターの放出により作用し得ると考えられる。したがって、２０４７分子は、疼痛シグナリング機構に関与することによって、疼痛誘発を変調し得、疼痛を制御し、疼痛性障害を治療するための診断の標的および治療薬を提供し得る。
【００１０】
一つの側面において、本発明は例えば炎症疼痛、慢性的疼痛、および／あるいは神経因性疼痛といった疼痛性障害を治療することが可能な化合物を同定するための方法を提供する。その方法には、２０４７核酸の発現または２０４７ポリペプチド活性を変調する化合物の能力を検定することが含まれる。一つの具体例において、核酸の発現または２０４７ポリペプチド活性を変調する化合物の能力は、細胞におけるプロテアーゼ、例えばセリンプロテアーゼの活性の変調を検出することによって判断される。
【００１１】
もう一つの側面において、本発明は疼痛および／または炎症を変調することが可能な化合物を同定するための方法を提供する。方法には、２０４７核酸またはニューロンのようなポリペプチドを発現している細胞をテスト化合物と接触させ、２０４７核酸または２０４７ポリペプチドの活性を変調するテスト化合物の能力を検定することが含まれる。
【００１２】
さらなる側面において、本発明は細胞中で疼痛シグナリング機構を変調する方法をその要旨とする。その方法には、ニューロンといった細胞を、例えば抗２０４７抗体、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を特徴とする２０４７ポリペプチド、またはその断片、少なくとも９０％がアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と同様であるアミノ酸配列を特徴とする２０４７ポリペプチド、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で構成されたポリペプチドの単離された自然発生の対立遺伝子の変異体、小さな分子、アンチセンス２０４７核酸分子、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の核酸分子、またはその断片またはリボザイムといった、効果的な量の２０４７モジュレーターと接触させることを含む。
【００１３】
さらにもう一つの側面において、本発明は、例えば異常な２０４７ポリペプチド活性または異常な２０４７核酸発現によって特徴付けられる疼痛性障害といったような疼痛性障害に罹った対象を治療するための方法をその要旨とする。方法には、対象に治療上有効な量の２０４７モジュレーターを、例えば医薬上許容される処方にて、または遺伝子療法ベクターを使用することによって投与することが含まれる。一つの具体例において、２０４７モジュレーターは、小分子、抗２０４７抗体、配列番号：２のアミノ酸配列を含む２０４７ポリペプチド、もしくはその断片、少なくとも９０％が配列番号：２のアミノ酸配列と同様であるアミノ酸配列を含む２０４７ポリペプチド、配列番号：２のアミノ酸配列からなるポリペプチドの単離した自然発生の対立遺伝子の変異体、アンチセンス２０４７核酸分子、配列番号：１の核酸分子、もしくはその断片、またはリボザイムであることもある。
【００１４】
一つの具体例において、疼痛性障害は炎症疼痛、慢性的疼痛、神経因性疼痛である。
【００１５】
本発明の他の特徴および利点は、下記の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【００１６】
本発明は疼痛性障害を診断および治療するための方法および組成物を提供する。本発明は、少なくとも部分的に、２０４７遺伝子が坐骨損傷後および完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）誘発性の炎症性疼痛（図２Ｄ参照）後に、坐骨神経に神経支配された無毛の皮膚においてアップレギュレートされるという発見に基づいている。理論による制限なしに考えれば、２０４７は損傷部位に存在する侵害受容器を活性化すると考えられている疼痛メディエーターを放出することによって作用し得ると考えられる。すなわち、２０４７分子は、疼痛シグナリング機構に関与することによって、疼痛誘発を変調し、疼痛を調節し、疼痛性障害を治療するための診断標的および治療薬を提供する。
【００１７】
本明細書中で使用する、「疼痛シグナリング機構」という用語には、例えば、ヒトといった哺乳動物のような対象における、有害化学物質、力学的または温熱性の刺激によって誘発される疼痛のような、疼痛の発達と規制に関与する細胞機構が含まれる。哺乳動物において「痛覚」と呼ばれるプロセスである有害化学物質、力学的または温熱性の刺激の最初の検知は、多様式の侵害受容器と呼ばれる、特別な小さな直径の主要な求心性ニューロンの末端周辺で主に起こる。こういった求心性のニューロンは、疼痛の知覚または不快感を誘起し、かつ適切な保護反射を開始しながら、中枢神経系に情報を伝達する。
【００１８】
本明細書中で使用する、「疼痛性障害」という用語には、疼痛と関連するおよびそれによって引き起こされる疾患、および障害または症状が含まれる。疼痛性障害の例には、関節炎、異痛症、非定型の三叉神経痛、三叉神経痛、身体表現性障害、ハイポエセスシス、ハイパアルゲシア、神経痛、ヒューリティス、神経因性疼痛、痛覚消失、有痛性感覚脱失、灼熱痛、坐骨神経痛障害、変性間接障害、線維筋痛、内臓疾患、慢性痛障害、偏頭痛／頭痛、慢性的な疲労症候群、複合性局所性疼痛症候群、ニューロジストロフィー、足底筋膜炎または癌に伴う疼痛が含まれる。
【００１９】
本明細書中で使用する疼痛性障害という用語には、慢性痛および／または神経因性疼痛などの障害に二次的な、すなわち、慢性痛および／あるいは神経因性疼痛といった障害によって影響される、または引き起こされる症状や障害も含まれる。そのような症状の例には、血管拡張および低血圧；例えばアルコール依存症というような行動性の症状（例えばHungund and Basavarajappa, (2000) Alcohol and Alcoholism 35:126-133  参照)；あるいは（複数の）有害な効果が、例えば多発性硬化症または脊髄損傷などの、別の障害や損傷の結果である場合の症状が含まれる。
【００２０】
本明細書中で使用する「疼痛」という用語には、例えばヒトなど哺乳動物のような対象における有害な化学物質、力学的または温熱性の刺激によって誘発される体の感覚と技術的に認識され、それらが含まれる。疼痛は感覚ニューロンの下位集団の末端周辺が、有害な化学物質、力学的または温熱性の刺激によって活性化される場合に開始する。侵害受容器と呼ばれるこれらのニューロンは、組織損傷に関する情報を脊髄や脳内にある疼痛プロセシングセンターに伝達する (Fields, H.L. Pain, McGraw-Hill, New York, 1987)。疼痛という用語には、下位背痛などの慢性痛；例えば骨関節炎などの関節炎に起因する痛覚；例えば膝痛または手根管症候群などの関節痛；筋筋膜性疼痛、および神経因性疼痛が含まれる。さらに「疼痛」という用語には、肉離れや捻挫に付随する疼痛などの急性痛；歯痛；頭痛；手術に伴う疼痛；または、例えば炎症、感染症および虚血というような、様々な形の組織損傷に付随する疼痛も含まれる。
【００２１】
本明細書中で互換的に使用するように、「２０４７活性」、「２０４７の生物学的活性」、または「２０４７の機能的活性」という用語には、科学的な技術によってイン・ビボまたはイン・ビトロで決定されるような、２０４７応答性の細胞または組織あるいは２０４７蛋白質基質に対する２０４７蛋白質、ポリペプチドまたは核酸分子によって発揮される活性が含まれる。２０４７活性は、例えばキニノーゲンなどの２０４７−標的分子との連合のように、直接的な活性でもあり得る。本明細書中で使用する「基質」または「標的分子」または「結合パートナー」は、例えばキニノーゲンの蛋白加水分解性切断または疼痛シグナリング機構の変調といった、２０４７−媒介機能が達成されるように、２０４７蛋白質が本質的に結合または相互作用する分子である。２０４７標的分子は、非−２０４７分子（例えばキニノーゲンまたはＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、あるいは他の補助因子、または疼痛シグナリング機構に関与する生化学的分子など）、または２０４７蛋白質あるいはポリペプチドでもあり得る。そのような標的分子の例には、例えば疼痛シグナリング経路の２０４７蛋白質の上流（活性の刺激装置および阻害剤を含む）または下流で機能する蛋白質のような、２０４７蛋白質と同じシグナリング経路にある蛋白質が含まれる。あるいは、２０４７標的分子と２０４７蛋白質の相互作用によって媒介される、細胞のシグナリング活性のように２０４７活性は間接的な活性である。２０４７の生物学的な活性を本明細書に記載する。例えば、２０４７蛋白質は、またはそれを超える次の活性を有し得る。（１）キニノーゲンの蛋白加水分解性切断を変調する；（２）例えばブラジキニンおよびカリジンのようなキニンの産生を変調する；（３）疼痛シグナリング機構を変調する；（４）炎症性の応答を変調する；（５）対象における疼痛の知覚を変調する；（６）生化学分子（例えば核受容体のリガンドであり得るステロイドのような、疼痛応答の変調に関与する分子）の代謝あるいは異化を変調する。
【００２２】
本発明の様々な側面を次のサブセクションでさらに詳細に説明する。
【００２３】
Ｉ．スクリーニング  アッセイ：
本発明は、モジュレーター、すばわち２０４７蛋白質に結合し、２０４７発現または２０４７活性に刺激性または阻害性効果を持ち、あるいは２０４７標的分子の発現または活性に刺激性または阻害性効果を持つ、候補、またはテスト化合物、あるいは因子（例えばペプチド、ペプチドミメティックス、小さな分子、リボザイム、または２０４７アンチセンス分子）を同定するための方法（本明細書中で「スクリーニング  アッセイ」ともいう）を提供する。記載するアッセイを用いて同定された化合物は疼痛性障害を治療するのに有効かもしれない。
【００２４】
候補／テスト化合物には、例えば１）Ig-結合（tailed）融合ペプチドおよびランダムなペプチドライブラリを含む（例えば、 Lam, K.S.ら (1991) Nature 354:82-84; Houghten, R.ら (1991) Nature 354:84-86 参照）、可溶性ペプチドのようなペプチド、およびＤ−および／あるいはＬ−配置のアミノ酸からなる、コンビナトリアル化学−派生分子ライブラリ；２）リンペプチド（例えば無秩序で部分的に変性、定方向リンペプチドライブラリ．Songyang, Z.ら (1993) Cell 72:767-778); 3  参照)、抗体（例えばポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗−イディオタイプ、そして単鎖抗体およびＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ発現ライブラリ断片、および抗体のエピトープ−結合断片）；４）小さな有機および無機分子（例えばコンビナトリアルおよび自然生成物ライブラリから得られた分子）
【００２５】
本発明のテスト化合物は、当該技術分野で知られるコンビナトリアルライブラリ法における、生物学ライブラリ、空間的にaddressableな固相あるいは液相ライブラリ、逆重畳を要する合成ライブラリ、「one-bead one-compound」ライブラリ法、そしてアフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリ法を含む多数のアプローチのいずれかを用いて得ることができる。生物学ライブラリ・アプローチは、ペプチドライブラリに限られるが、他の四つのアプローチはペプチド、非−ペプチドオリゴマーあるいは化合物の小分子ライブラリに適用できる（Lam. K.S.(1997) Anticancer Drug Des. 12:145)。
【００２６】
分子ライブラリの合成方法の例は、例えばDeWittら (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909;Erbら (1994)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 91:11422; Zuckermannら (1994) J. Med. Chem. 37:2678; Choら (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; およびGallopら (1994) J. Med. Chem. 37:1233などに当該技術分野において、見つけることができる。
【００２７】
化合物のライブラリは溶液中にあることがあり（例えば Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421)、あるいはビーズ上に（Lam(1991)Nature 354:82-84)、チップ（Fodor (1993) Nature 364:555-556)、バクテリア（Ladner 米国特許第5,223,409号)、胞子(Ladner 米国特許第'409号)、プラスミド（Cullら (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869)、ファージ（Scott および Smith (1990) Science 249:386-390; Devlin (1990) Science 249:404-406; Cwirla ら (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382; Felici(1991) J. Mol. Biol. 222:301-310; Ladner前掲)にあることもある。
【００２８】
一つの側面において、アッセイは、２０４７蛋白質またはその生物学的に活性な部分を発現する細胞をテスト化合物と接触させ、テスト化合物が２０４７活性を変調する能力を決定する、細胞ベースの検定である。好ましい具体例において、２０４７蛋白質の生物学的に活性な部分には、疼痛および／または炎症を変調することができるドメインまたはモチーフが含まれる。テスト化合物が２０４７活性を変調する能力は、例えばセリンプロテアーゼ活性、キニンのレベル、またはキニノーゲンのレベルの変調を、モニターすることによって成し得る。例えば、細胞が哺乳動物を起源とする場合もある。
【００２９】
本発明の一つの側面において、セリンプロテアーゼ活性は、例えば脳脊髄液（ＣＦＳ）または組み換えニューロシンなどの組織試料の一定分量を採り、３７℃の２００μｌ  ０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ８．０(Okui, A.ら (2001) Neurochemistry 12:1345-1350)中の０．１μＭ  Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−ＭＣＡ  （Peptide Inc., Osaka, Japan)とインキュベートすることによって、測定することができる。蛍光活性は、毎時３８０／４６０ｎｍで測定することができる。さらに、例えばＣＳＦ―ニューロシンおよび組み換え成熟ニューロシンなどの組織試料は、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ  ８．０中で２０時間の３７℃でのインキュベートに続き、非還元条件下のゼラチン共重合ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で電気泳動する。引き続いて、ゼラチンゲルをＣＢＢで染色する。
【００３０】
基質に結合する２０４７を変調するテスト化合物の能力も決定することができる。基質に結合する２０４７を変調するテスト化合物の能力を決定することは、例えば、２０４７への２０４７基質の結合が複合物中の標識された２０４７基質を検出することによって決定し得るように、２０４７基質を放射性同位元素、蛍光、または酵素ラベルとカップリングすることによって成し得る。あるいは、２０４７は、放射性同位元素または酵素ラベルとカップリングして、複合物中の２０４７基質に結合する２０４７を変調するテスト化合物の能力をモニターすることもできる。２０４７を結合するテスト化合物の能力を決定することは、例えば、化合物の２０４７への結合が複合物中の標識された２０４７を検出することによって決定し得るように、化合物を放射性同位元素または酵素ラベルとカップリングさせることによって成し得る。例えば、２０４７基質は、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈによって、および直接に放射性放出を数えるかシンチレーションカウントで数えるかによって、直接的にせよ間接的にせよ、標識することが可能である。あるいは、化合物は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、あるいはルシフェラーゼ、および適切な基質の生成物への変換の決定によって検出される酵素ラベルによって、酵素学的に標識することが可能である。
【００３１】
本発明の範囲内には、どの相互作用体も標識せずに、２０４７と相互作用する化合物の能力を決定することも含まれている。例えば、マイクロフィジオメーター（microphysiometer）は、化合物も２０４７も標識することなしに、２０４７との化合物の相互作用を検出するのに使用することができる(McConnell, H.M. ら. (1992) Science 257:1906-1912)。本明細書中で使用する、「マイクロフィジオメーター（microphysiometer）」（例えばCytosensor)はlight-addressable potentiometric sensor (LAPS)を使って細胞が環境を酸性化する比率を測定する分析用の装置である。この酸性化比率における変化は、化合物と２０４７の相互作用との間の指標として使用することができる。
【００３２】
２０４７発現は、坐骨損傷後およびＣＦＡ誘発性の炎症性疼痛後に坐骨神経によって神経支配された無毛の皮膚においてダウンレギュレートされるため、疼痛および／または炎症を変調する化合物は、２０４７発現を変調するその能力に基づいて同定することができる。テスト化合物が２０４７発現を変調するかどうかを決定するには、２０４７を発現する細胞をテスト化合物と接触させ、２０４７発現を変調するテスト化合物の能力を、例えばノザンブロッティング、定量 PCR (例えば TaqMan)またはインビトロ転写アッセイで２０４７ｍＲＮＡを測定することによって決定することができる。インビトロ転写アッセイを実施するために、２０４７のプロモーターおよびエンハンサーの全長を、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）またはルシフェラーゼのようなレポーター遺伝子に連結し、宿主細胞に導入することができる。次いで、同宿主細胞をテスト化合物でトランスフェクトするか、またはそれと接触させることができる。テスト化合物の効果は、レポーター遺伝子活性およびテスト化合物を含まない細胞内でのレポーター遺伝子の活性との比較によって測定することができる。レポーター遺伝子活性の増加または減少は、２０４７発現の変調を指し示し、したがって、疼痛および／または炎症を変調するテスト化合物の能力の指標となる。
【００３３】
２０４７活性を変調する化合物を同定するために用いるアッセイには、疼痛および／または炎症を変調する化合物の能力をテストするアッセイも含まれる。疼痛および／または炎症を変調するテスト化合物の能力は、損傷部位周辺の組織の炎症を変調するその能力によって測定することができる。
【００３４】
さらなるもう一つの具体例において、本発明のアッセイは、２０４７蛋白質またはその生物学的に活性な部分をテスト化合物と接触させ、２０４７蛋白質またはその生物学的に活性な部分にテスト化合物が結合するあるいはそれらの活性を変調する（例えば刺激する、または阻害する）能力を決定する。本発明のアッセイで用いる好ましい２０４７蛋白質の生物学的に活性な部分には、例えばハイ・サーフェイス・プロバビリティー・スコア（high surface probability scores）を有する断片のような、非−２０４７分子との相互作用に関与する断片が含まれる。テスト化合物の２０４７蛋白質への結合は、直接的にせよ間接的にせよ、上記したように決定することができる。テスト化合物へ結合する２０４７蛋白質の能力を決定することは、また、real-time Biomolecular Interaction Analysis (BIA) のような技術を用いても成し得る(Sjolander, S. および Urbaniczky. C. (1991) Anal. Chem. 63:2338-2345; Szabo ら (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705)。本明細書で使用する、「ＢＩＡ」とは、どの相互作用体も標識することなしに、リアルタイムで生物特異的な相互作用を研究するための技術である(例えば BIAcore)。表面プラズモン共鳴(SPR)の光学的現象における変化は、生物的分子間のリアルタイム反応の指標として用いることができる。
さらにもう一つの具体例において、セルフリーのアッセイは、２０４７蛋白質またはその生物学的に活性な部分を２０４７蛋白質を結合する既知の化合物と接触させてアッセイ混合物を形成させ、アッセイ混合物をテスト化合物と接触させ、２０４７蛋白質と相互作用するテスト化合物の能力を決定することを含む。ここで、２０４７蛋白質と相互作用するテスト化合物の能力を決定することには、２０４７標的分子(例えば２０４７基質）に優先的に結合する、またはその活性を変調させる２０４７蛋白質の能力を決定することが含まれる。
【００３５】
本発明のセルフリーアッセイは、単離した蛋白質（例えば２０４７蛋白質またはその生物学的に活性な部分）の可溶性および／または膜結合形態の両方の使用に受けいれられる。単離した蛋白質の膜結合形態を使用するセルフリーアッセイにおいては、単離した蛋白質の膜結合形態が溶液で維持されるように、可溶剤を利用することが望ましい場合がある。そのような可溶剤の例には、n-オクチルグルコシド、n-ドデシルグルコシド、n-ドデシルマルトシド、オクタノイル-N-メチルグルカミド、デカノイル-N-メチルグルカミド、Triton（登録商標）X-100、Triton（登録商標）X-114、Thesit（登録商標）、イソトリデシルポリ(エチレングリコールエーテル)n、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホン酸(CHAPS)、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ヒドロキシ-1-プロパンスルホン酸 (CHAPSO)、または
N-ドデシル=N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホン酸のような非−イオン性洗浄剤が含まれる。
【００３６】
本発明の上記のアッセイ方法の一つを超える具体例において、一つのまたは両方の蛋白質の非複合形態からの複合形態の分離を促進するために、またアッセイの自動化を提供するためにも、２０４７または２０４７標的分子のいずれかを固定化することが望ましい場合がある。２０４７蛋白質へのテスト化合物の結合、またはテスト化合物の存在下および非存在下での２０４７蛋白質と２０４７標的分子との相互作用は、反応物を含むのに適切な、いずれの容器でも成し得る。そのような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管、および微量遠心管が含まれる。一つの具体例において、一つまたは両方の蛋白質がマトリックスに結合することを許容するドメインを加える融合蛋白質が提供される。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／２０４７融合蛋白質またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的融合蛋白質を、グルタチオンセファロースビーズ（Sigma Chemical, St.Louis, MO)またはグルタチオン誘導化マイクロタイタープレートに吸着させることができ、それらをテスト化合物、またはテスト化合物および非−吸着標的蛋白質または２０４７蛋白質のいずれかと、複合体形成を助成する条件下で（例えば塩とｐＨに対して生理的条件で）混合物をインキュベートし得る。インキュベーションに続いて、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルは、あらゆる未結合成分を除去するために洗浄され、マトリックスは、ビーズの場合には、固定化され、上記されるように、複合体形成は直接的にまたは間接的に決定される。あるいは、複合物はマトリックスから解離することができ、標準的な技術を用いて２０４７結合または活性のレベルを決定し得る。
【００３７】
マトリックスに蛋白質または細胞膜調製物を固定化する他の技術は、本発明のスクリーニングアッセイで用いることもできる。例えば、２０４７蛋白質または２０４７標的分子のいずれかを、ビオチンおよびストレプトアビジンのコンジュゲートを利用して固定化することができる。ビオチン化された２０４７蛋白質または標的分子は、当該技術分野で知られる技術（例えば、ビオチン化キット、Pierce Chemicals, Rockford, IL)を用いてビオチン−ＮＨＳ’（Ｎ−ヒドロキシ−スクミンイミド）から調製することができ、ストレプトアビジンでコートした９６ウェルプレート (Pierce Chemicals)のウェルに固定化することができる。あるいは、２０４７蛋白質または標的分子と反応性があるが２０４７蛋白質のその標的分子への結合を妨害しない抗体を、プレートのウェルに誘導化し、未結合標的蛋白質または２０４７蛋白質を抗体接合によってウェルに捕捉することもできる。そのような複合体を検知する方法には、ＧＳＴ−固定化複合体に関して上記したものに加えて、２０４７蛋白質または標的分子と反応性のある抗体を用いる複合体の免疫検出、ならびに２０４７蛋白質または標的分子に付随する酵素活性を検知することに頼る酵素結合アッセイが含まれる。
【００３８】
本発明のさらにもう一つの側面において、２０４７蛋白質またはその断片は、two-hybrid assay またはthree-hybrid assayにおいて（例えば U.S. Patent No. 5,283,317; Zervos ら (1993) Cell 72:223-232; Madura ら (1993) J. Biol. Chem. 268:12046-12054; Bartel ら (1993) Biotechniques 14:920-924; Iwabuchi ら (1993) Oncogene 8:1693-1696; および Brent WO94/10300  参照）における「ベイト蛋白質」として用いて、２０４７（「２０４７−結合蛋白質」または「２０４７−ｂｐ」）に結合するかまたはそれと相互作用し、２０４７活性に関与する他の蛋白質を同定することができる。そのような２０４７−結合蛋白質は、例えば２０４７−媒介シグナリング経路の下流エレメントとして、２０４７蛋白質または２０４７標的によるシグナルの伝播に関与する可能性も高い。あるいは、そのような２０４７−結合蛋白質は２０４７阻害剤である可能性が高い。
【００３９】
two-hybridシステムは、分離可能なＤＮＡ−結合ドメインおよび活性化ドメインからなる、大部分の転写因子のモジュラー性質に基づいている。簡潔にいえば、アッセイは二種の異なるＤＮＡ構築物を利用する。一方の構築物では、２０４７蛋白質をコードする遺伝子を、既知の転写因子（例えばＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合する。もう一方の構築物では、未同定蛋白質をコードするＤＮＡ配列ライブラリからのＤＮＡ配列（「餌（prey)」または「資料」）を、既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合する。もし、「ベイト」および「餌」が２０４７−依存複合物を形成しながらインビボで相互作用可能ならば、転写因子のＤＮＡ−結合ドメインおよび活性化ドメインは隣接範囲内にもたらされる。この近接は、転写因子に応答性の転写制御配列部位に作動可能に連結したレポーター遺伝子（例えばＬａｃＺ）の転写を許容する。レポーター遺伝子の発現は、検知することができ、機能的な転写因子を含有する細胞コロニーは単離することができ、２０４７蛋白質と相互作用する蛋白質をコードするクローン化遺伝子を得るために使用することができる。
【００４０】
もう一つの側面において、本発明は本明細書中に記載する二つかそれを超えるアッセイの組み合わせに関係する。例えば、変調剤は細胞ベースのアッセイまたはセルフリーのアッセイを用いて同定することができ、２０４７蛋白質の活性を変調させる剤の能力はインビボにおいて、例えば慢性痛および／または神経因性疼痛の動物モデルのような動物において、確認することができる。
【００４１】
また、本明細書中に記載するように同定された２０４７モジュレーター（例えばアンチセンス２０４７核酸分子、２０４７−特異的抗体、または小分子）は、そのようなモジュレーターを用いた治療の有効性、毒性、または副作用を決定するために、動物モデルにおいて使用することができる。あるいは、本明細書中に記載するように同定された２０４７モジュレーターは、そのようなモジュレーターの作用の機構を決定するために、動物モデルにおいて使用することができる。
【００４２】
疼痛を変調する所与の変調剤の能力は、次のテストのうちのいずれか一つを用いて定量化することができる。神経因性疼痛のモデルとしてのＬ６およびＬ７の密接連結、長期間にわたる炎症性疼痛のモデルとしての膝関節または後肢足への完全フロイントアジュバント（Palecek, J. (1992) Neurophysiol 68: 1951-66)、神経連結（ＣＣＩ）、温熱性の痛覚過敏、接触異痛（tactile allodynia） および冷異痛（cold allodynia） (Carlton, S.M. ら (1997) NeuroReport 8:3131-3135)、サーマルパウウィズドローアルラテンシー（thermal paw withdrawal latency） ハーグリーブテスト(Hargreaves test)、ホン・フレイ力学的離脱閾値（von Frey mechanical withdrawal threshold）、ホット・プレートラテンシーテスト（the hot-plate latency test）、テイルフリックテスト（tail flick test） (Stone, L.S. ら (1997) NeuroReport 8:3131-3135)、坐骨神経の粉砕負傷のテスト（the crush injury to the sciatic nerve test） (De Konig, ら (1986) J.Neurol. Sci. 74:237-246)、冷水異痛テスト（the cold water allodynia test） (Hunter, ら (1997) Pain 69:317-322)、足圧縮潜伏分析（the paw pressure latency assay）(Hakki-Onen, S., ら (2001) Brain Research 900(2):261-7、またはthe radiant heat test (Yoshimura, M., (2001) Pharm. Research 44(2): 105-11)。
【００４３】
簡潔にいえば、テイル・フリック・ラテンシー・テスト（the tail flick latency test）には、動物の尾部に光線を投射することが含まれる。時間は尾部の加温の開始から尾部がぱっと動く瞬間までが測定される。概しては、tail flick latency (TFL)測定は、治験の間の５ないし１０分間のセッションあたり、１ラットあたりに５回行われる。
【００４４】
Hargreaves testとしても知られるthermal paw withdrawal latency testは、下方からラットの左後肢足の腹側の表面に光線を直射し、足が光から再帰的に動かされるまでの時間を測定することからなる。
【００４５】
von Frey mechanical withdrawal thresholdには、スクリーン表面上にラットを置き、フォーストランスデューサーにvon Freyフィラメントを付着することが含まれる。フィラメントは、足が引き抜かれる瞬間の力を測定するために、動物の腹側の右後肢足に対して上向きに圧縮される。
【００４６】
hot-plate latency testには、ラットを加熱された表面に置き、動物が跳びあがる、または後肢足を舐めるまでにどれぐらいの時間を要するかを測定することが含まれる。
【００４７】
疼痛または炎症に対する動物モデルは、次の方法を用いて作ることもできる。炎症性疼痛を起こすホルマリン、ラムダカラゲナン、マスタードオイル、または動物の右後肢足あるいは膝への完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）の皮下注射；神経因性疼痛を引き起こす動物の坐骨神経の慢性的な収縮、動物における慢性的な膵臓の炎症を起こす二塩化ジブチル注射、坐骨神経の軸索切断または動物の脛骨神経、あるいは神経因性疼痛を引き起こす動物の脊髄神経の慢性的な収縮。
【００４８】
ＩＩ．予測的な医薬
本発明は、診断アッセイ、予後アッセイ、および臨床試験のモニタリングが予後（予測的な）目的で使用され、それにより個人を予防的に治療する、予測的医薬の分野にも関係している。したがって、本発明の一側面は、生物学試料（例えば血液、血清、細胞、または組織、例えば神経組織）における、２０４７蛋白質および／または核酸発現ならびに２０４７活性を決定し、それにより個人が疼痛性障害に苦しんでいるかどうかを決定する、診断上のアッセイに関係している。本発明はまた、個人が疼痛性障害を発病するリスクにあるかどうかを決定する予後の（あるいは予測的な）アッセイも提供する。例えば、２０４７遺伝子における突然変異は生物学試料においてアッセイすることができる。そのようなアッセイは、予後のまたは予測的な目的で使用することができ、それにより、個人が疼痛性障害を発病する前に予防的に治療することが可能となる。
【００４９】
本発明のもう一つの側面は、臨床試験での２０４７発現または活性における２０４７モジュレーター（例えば抗−２０４７抗体または２０４７リボザイム）の影響をモニターすることに関係している。
【００５０】
これらおよび他の媒介物については次のセクションでさらに詳細に記載する。
【００５１】
Ａ．疼痛性障害の診断アッセイ
対象が疼痛性障害に悩まされているかどうかを決定するためには、生物試料を対象より得て、生物試料における２０４７蛋白質をコードする２０４７蛋白質または核酸（例えばｍＲＮＡまたはゲノムのＤＮＡ）を検知することができる化合物または剤と生物試料を接触させることができる。２０４７ｍＲＮＡまたはゲノムのＤＮＡを検知するのに好ましい剤は、２０４７ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡにハイブリッド形成することができる、標識された核酸プローブである。核酸プローブは、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示された２０４７核酸、またはそれについての少なくとも長さが１５、２０、２５、３０、２５、４０、４５、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチドで、ストリンジェントな条件下で２０４７ｍＲＮＡまたはゲノムのＤＮＡに特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドのような部分でもあり得る。本発明の診断上のアッセイでの使用に適した他のプローブはここに記載されるとおりである。
【００５２】
試料中の２０４７蛋白質を検知するのに好ましい剤は、２０４７蛋白質に結合可能な抗体、好ましくは検知可能な標識を持つ抗体である。抗体は、ポリクローナル性またはより好ましくはモノクローナル性であることもある。無傷の抗体、またはそれについての断片（例えばＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）を使用することもできる。プローブあるいは抗体に関する、「標識された」という用語は、プローブまたは抗体に検知可能な物質をカップリング（物理的に連結）させることによって、プローブまたは抗体を直接的に標識すること、および直接的に標識されたもう一つの試薬との反応性によって、プローブまたは抗体を間接的に標識することを包含することが意図されている。抗体または核酸プローブにカップリングすることができる直接的物質の例は、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射性物質を含む。間接的な標識の例は、蛍光で標識された二次抗体を使用し、蛍光標識されたストレプトアビジンで検知できるように、ＤＮＡプローブをビオチンで末端標識することによる、一次抗体の検知を含む。
【００５３】
「生物試料」という用語には、対象から単離された組織、細胞および生物学的な液体、ならびに対象内に存在する組織、細胞、および液体を含む。つまり、本発明の検知方法は、生物試料における、インビトロおよびインビボでの、２０４７ｍＲＮＡ、蛋白質、またはゲノムのＤＮＡを検知することに使用することができる。例えば、２０４７ｍＲＮＡ検知のインビトロ技術は、酵素結合の免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光が含まれる。２０４７ゲノムＤＮＡ検知のインビトロ技術は、サザンハイブリダイゼーションを含む。さらに、２０４７蛋白質検知のインビボ技術は、標識された抗−２０４７抗体を対象に導入することを含む。例えば、抗体は、対象内の存在および位置が通常のイメージング技術で検知可能である放射性マーカーによって標識することができる。
【００５４】
もう一つの具体例では、方法はさらに、対照対象から対照生物試料を得、２０４７蛋白質、ｍＲＮＡまたはゲノムのＤＮＡの存在が生物試料中で検知されるように、対照試料を２０４７蛋白質、ｍＲＮＡ、またはゲノムのＤＮＡを検知することが可能な化合物あるいは剤と接触させ、対照試料中の２０４７蛋白質、ｍＲＮＡ、またはゲノムのＤＮＡの存在を、テスト試料中の２０４７蛋白質、ｍＲＮＡ、またはゲノムのＤＮＡと比較することを含む。
【００５５】
Ｂ．疼痛性障害の予後のアッセイ
本発明は、さらに、疼痛性障害、例えば異常な２０４７発現あるいは活性と関連のある疼痛性障害、を有する、または生じるリスクにある対象を同定する方法に関連している。
【００５６】
ここで使用されるように、「異常な」という用語は、野生型２０４７発現または活性から偏向する２０４７発現または活性を含む。異常な発現または活性は、増加あるいは減少した発現または活性、および発現の野生型発展パターンあるいは発現の細胞下のパターンに沿わない発現または活性を含む。例えば、異常な２０４７発現または活性は、２０４７遺伝子の突然変異が２０４７遺伝子の過少発現または過大発現を引き起こす場合またはそのような突然変異が非−機能的２０４７蛋白質、または例えば２０４７基質と相互作用しない蛋白質のような野生型のように機能しない蛋白質あるいは非−２０４７基質と相互作用する蛋白質を生じる場合を含むように意図されている。
【００５７】
ここに記載するアッセイは、前述の診断上のアッセイまたは次のアッセイのように、疼痛性障害、例えば炎症性疼痛、慢性的疼痛および／または神経因性疼痛、を有するあるいは生ずるリスクにある対象を同定するために使用することができる。生物試料を対象から得、遺伝子の変質の存在もしくは不在をテストすることができる。例えば、そのような遺伝子の変質は、次のうちの少なくとも一つの存在を確認することによって検知することができる。１）２０４７遺伝子からの一つ以上のヌクレオチドの決失、２）２０４７遺伝子への一つ以上のヌクレオチドの付加、３）２０４７遺伝子のヌクレオチドの一つ以上の置換、４）２０４７遺伝子の染色体の再配列、５）２０４７遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物のレベルの変質、６）ゲノムのＤＮＡのメチル化パターンのもののような２０４７遺伝子の異常な変調、７）２０４７遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非−野生型スプライシングパターンの存在、８）２０４７−蛋白質の非−野生型レベル、９）２０４７遺伝子の対立遺伝子の喪失、１０）２０４７−蛋白質の不適当な翻訳後の修飾。
【００５８】
ここに記載されるように、２０４７遺伝子における遺伝子の変質を検知するのに使用可能な多くのアッセイが当該分野で知られている。例えば、２０４７遺伝子の遺伝子変質は、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ  ＰＣＲのような、ポリメラーゼ連鎖反応法において（e.g., U.S.Patent Nos. 4,683,195 and 4,683,202 参照）または、代わりに、核酸連結連鎖反応（ＬＣＲ）（e.g., Lamdegran ら. (1988) Science 241:1077-1080; and Nakazawa ら (1994) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 91: 360-364 参照）において、プローブ／プライマーを使用して検知することができ、後者は２０４７遺伝子における点突然変異の検知に特に有効と成り得る（Abravaya ら (1995) Nucleic Acids Res. 23: 675-682 参照）。
この方法は、対象から生物試料を集め、核酸（例えばゲノムのＤＮＡ、ｍＲＮＡまたは両方）を試料から単離し、（もし存在するなら）２０４７遺伝子のハイブリダイゼーションおよび増幅が起こるような条件下で２０４７遺伝子に特異にハイブリダイズするプライマー一つ以上と核酸試料を接触させ、増幅生成物の存在または不在を検知あるいは増幅生成物の大きさを検知し対照試料と長さを比較することを含む。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲが、ここに記載する突然変異を検知するために使用されるいずれかの技術との結合における、予備的な増幅段階として使用されるのが望ましいと予想されている。
【００５９】
代わりの増幅方法は、自己持続性配列複製（Guatelli, J.C. ら (1990) Proc Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878)、転写製増幅システム（Kwoh, D.Y. ら (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177)、Q-Beta レプリカーゼ（Lizardi, P.M. ら (1988) Bio-Technology 6:1197)、または、当業者によく知られた技術を用いて増幅された分子の検知に続く何か他の核酸増幅システムを含む。こういった検知スキームは特に、もし核酸分子が非常に低い数で存在している場合に、分子の検知に役立つ。
【００６０】
代わりの具体例では、生物試料からの２０４７遺伝子における突然変異は、制限酵素切断パターン中の変化によって同定することができる。例えば、試料および対照ＤＮＡは単離され、（任意に）増幅され、一つ以上の制限エンドスクレアーゼで消化され、断片長のサイズはゲル電気泳動によって決定され比較される。試料および対照ＤＮＡ間の断片長のサイズにおける差異は、試料ＤＮＡ中の突然変異を指し示す。また、配列特異リボザイムの使用（例えばU.S. Patent No. 5,498,531  参照）は、リボザイム切断部位の発達または喪失による特異な突然変異の存在を記録するのに用いることができる。
【００６１】
他の具体例では、２０４７における遺伝子の突然変異は、誘導化した生物試料および対照核酸（例えばＤＮＡやＲＮＡ）を何百または何千ものオリゴヌクレオチドプローブを含む高密度アレイにハイブリダイズすることによって同定することができる（Cronin, M.T. ら (1996) Hum. Mutat. 7:244-255; Kozal, M.L. ら (1996) Nat. Med. 2:753-759)。例えば、２０４７中の遺伝子の突然変異は、Croni, M.T. ら (1996) 前掲）に記載されるように、光発生ＤＮＡプローブを含む二つの二次元アレイにおいて同定することができる。簡単に言えば、プローブの最初のハイブリダイゼーションアレイは、一連の重複するプローブの直鎖状アレイを作ることによって、配列間の塩基変化を同定するために、試料および対照中のＤＮＡの長い広がりをスキャンするために使用することができる。このステップは、点突然変異の同定を許容する。このステップには、検知されたあらゆる変異体または突然変異に相補的な、より小さく特別なプローブアレイの使用による、特定の突然変異の特質決定を許容する第二のハイブリダイゼーション配列が続く。各々の突然変異アレイは、野生型遺伝子に相補的なものおよび突然変異遺伝子に相補的なものがある、平行なプローブのセットで構成されている。
【００６２】
さらにもう一つの具体例では、当該分野で知られる様々な配列決定反応はどれでも、生物試料中の２０４７遺伝子を直接的に配列決定し、生物試料中の２０４７の配列と、対応する野生型（対照）配列を比較することによって突然変異を検知するのに使用することができる。配列決定反応の例は、Maxam and Gilbert (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:560) または Sanger (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463)によって開発された技術に基づくものを含む。また、様々な自動化した配列決定手順は、質量分析による配列決定を含む診断上のアッセイ（Naeve, C.W. (1995) Biotechniques 19:448-53)を行う時に利用することもできる（例えば PCT 国際公開番号  WO 94/16101; Cohen ら. (1996) Adv. Chromatogr. 36:127-162; および Griffin ら (1993) Appl. Biochem. Biotechnol. 38:147-159  参照)。
【００６３】
２０４７遺伝子中の突然変異を検知する他の方法は、切断因子からの保護がＲＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロデュプレックスにおけるミスマッチ塩基を検知するのに使用される方法を含む（Myers ら (1985) Science 230:1242)。一般的に、当該技術分野の「ミスマッチ切断」技術は、野生型２０４７配列を含む（標識された）ＲＮＡまたはＤＮＡを、組織試料から得られた潜在的な突然変異ＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズすることによって形成されるヘテロデュプレックスを提供することによって開始する。二本鎖デュプレックスは、対照および試料鎖間の塩基対ミスマッチにより存在するであろうデュプレックスの一重鎖形成領域を切断する剤で処理する。例えば、不適正領域を酵素的に消化するために、ＲＮＡ／ＤＮＡデュプレックスは、ＲＮａｓｅで処理し得、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドはＳ１ヌクレアーゼで処理し得る。他の具体例では、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡデュプレックスのどちらかは、ミスマッチ領域を消化するために、ヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムおよびピペリジンと共に扱うことができる。不適正領域の消化の後、生成された物質は、突然変異の部位を決定するために、変性ポリアクリルアミドゲル上でサイズによって分離することができる。例えば、Cotton ら. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4397 および Saleena ら. (1992) Methods Enzymol. 217:286-295を参照されたし。好ましい具体例では、対照ＤＮＡまたはＲＮＡは検知のために標識することができる。
【００６４】
さらなる具体例では、不適正分割反応は、細胞の試料から得られた２０４７ｃＤＮＡにおける点突然変異を検知し位置づけるために定義されたシステム内の二重鎖ＤＮＡにおける不適正塩基対を認識する蛋白質（いわゆる「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素）を一つ以上使用する。例えば、E.coliのｍｕｔＹ酵素はＧ／Ａ不適正のＡを切断し、ＨｅＬａ細胞由来のチミジンＤＮＡグリコシラーゼはＧ／Ｔ不適正のＴを切断する（Hsu ら (1994) Carcinogenesis 15:1657-1662)。模範的な具体例では、２０４７配列に基づいたプローブ、例えば野生型２０４７配列、はｃＤＮＡまたはテスト細胞の他のＤＮＡ生成物にハイブリダイズする。デュプレックスは、ＤＮＡ不適正対酵素で処理し、分割生成物は、もしそういうものが存在するならば、電気泳動プロトコルまたはそういったものから検知することができる。例えば、U.S. Patent No. 5,459,039を参照されたし。
【００６５】
他の具体例では、電気泳動移動度における変化は、２０４７遺伝子中の突然変異を同定するのに使用可能だろう。例えば、一本鎖高次構造多形性（ＳＳＣＰ）は、突然変異体および野生型核酸間の電気泳動移動度における差異を検知するのに使うこともできる(Orita ら. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci USA: 86:2766; see also Cotton (1993) Mutat. Rs. 285:125-144 および Hayashi (1992) Genet. Anal. Tech. Appl. 9:73-79)。試料および対照２０４７核酸の一本鎖ＤＮＡ断片は、変性され、再生することが許容されるだろう。一本鎖核酸の二次的構造は、配列によって様々であり、電気泳動移動度における帰着変化は、単一の塩基変化でさえも検知することを可能にする。ＤＮＡ断片は、標識することができ、あるいは標識されたプローブで検知することができる。アッセイの感度は、二次的構造が配列内の変化により敏感なＲＮＡ（むしろＤＮＡよりも）を使用することによって高められる。好ましい具体例では、主題の方法は、電気泳動移動度における変化に基づく二本鎖へテロデュプレックス分子を分離するために、ヘテロデュプレックス分析を利用する(Keen ら (1991) Trends Genet. 7:5)。
【００６６】
さらにもう一つの具体例では、変性剤の勾配を含むポリアクリルアミドゲル中の変異体または野生型断片の移動は、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を用いて検知する（Myers ら. (1985) Nature 313:495)。ＤＧＧＥが分析の方法として使われる時、ＤＮＡは例えばＰＣＲによる高融解GC-リッチなDNAの約４０ｂｐのＧＣクランプを加えることによって、完全には変性しないよう保証するように変調されるだろう。さらなる具体例では、温度勾配は、対照および試料ＤＮＡの移動度における差異を同定するために変性勾配の代わりに使用される（Rosenbaum および Reissner (1987) Biophys. Chem. 265:12753)。
【００６７】
点突然変異を検知する他の技術の例には、選択性オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択性増幅、または選択性プライマー伸長があるが、それらに限定されるわけではない。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーは、既知の突然変異が中心に配置され、完璧な組み合わせが見つかった場合に限りハイブリダイゼーションを容認する条件下で標的ＤＮＡにハイブリダイズする中で調製される(Saiki ら. (1986) Nature 324:163); Saiki ら. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6230)。そのようなアレル特異的オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドがハイブリダイジング膜に付着し標識された標的ＤＮＡとハイブリダイズされる時に、ＰＣＲ増幅標的ＤＮＡまたは多くの異なる突然変異にハイブリダイズされる。
【００６８】
代わりに、選択性ＰＣＲ増幅に依存するアレル特異的増幅技術は、本発明と併せて使用されるかもしれない。
【００６９】
特異的な増幅にプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、（増幅が差動的なハイブリダイゼーションに依存するように）分子の中央あるいは、適切な状況下では、不適正がポリメラーゼ伸長を妨害または低下する１のプライマーの著しい３’末端に、重要な突然変異を保有しているかもしれない。加えて、分割に基づく検知を創るために、突然変異の領域に新規の制限部位を導入することが望ましい場合もある。ある具体例では、増幅は、増幅のためのＴａｑリガーゼを用いて行うことも予想される（Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189)。そのような場合には、５’配列の３’末端に完全なマッチが存在する場合にのみ連結が起こり、増幅の存在または不在を探すことによって特定の部位に既知の突然変異の存在を検知することが可能である。
【００７０】
さらに、ここに記載する予後のアッセイは、対象に２０４７モジュレーター（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチドミメチック、蛋白質、ペプチド、核酸、または小分子）を疼痛を効果的に治療するために投与することが可能かどうかを決定するために使用することができる。
【００７１】
Ｃ．  臨床試験における効果のモニタリング
本発明はさらに、２０４７モジュレーター（例えばここに同定される２０４７モジュレーター）が対象における疼痛性障害を治療する際に効果的かどうかを決定するため方法を提供する。例えば、２０４７遺伝子発現、蛋白質レベルを増加すること、または２０４７活性をアップレギュレートすることにおける２０４７モジュレーターの有効性は、２０４７遺伝子発現、蛋白質レベル、またはダウンレギュレートされた２０４７活性などの減少を示す対象の臨床試験でモニターすることができる。代わりに、２０４７遺伝子発現、蛋白質レベルを低下すること、または２０４７活性をダウンレギュレートすることにおける２０４７モジュレーターの有効性は、増大した２０４７遺伝子発現、蛋白質レベル、または２０４７活性を示す対象の臨床試験でモニターすることができる。そのような臨床試験においては、２０４７遺伝子の発現または活性は、好ましくは、例えば疼痛性障害などに関係している他の遺伝子の発現または活性を、「リード・アウト（read out）」または特定の細胞の表現型のマーカーとして使用することができる。
【００７２】
例えば、限定されるものではないが、２０４７活性を変調する剤（例えばここに記載されるスクリーニングアッセイで同定されるような）での処理によって細胞内で変調される、２０４７を含む遺伝子を同定することができる。
かくして、例えば臨床試験における、疼痛性障害に苦しむ対象に対する２０４７活性を変調する剤の効果を研究するためには細胞を単離し、ＲＮＡを調製し、疼痛性障害に関係している２０４７または他の遺伝子の発現レベルにつき分析することができる。遺伝子発現のレベル（例えば遺伝子発現パターン）は、本明細書中に記載するように、ノーザンブロット分析またはＲＴ−ＰＣＲによって、あるいは別法として、本明細書中に記載する方法の一つにより、産生された蛋白質の量を測定することによって、または２０４７あるいは他の遺伝子の活性レベルを測定することによって定量化され得る。このように、遺伝子発現パターンは、２０４７活性を変調する剤に対する細胞の生理的応答を示すマーカーとして役立つ。この応答状態は事前に決定され得、２０４７活性を変調する剤で個体を治療している間の様々な段階で決定し得る。
【００７３】
好ましい具体例において、本発明は、
（ｉ）剤の投与前に対象から投与前試料を得；
（ｉｉ)投与前試料中の２０４７蛋白質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現レベルを検出し；
（ｉｉｉ）対象から一つ以上の投与後試料を得；
（ｉｖ）投与後の試料中の２０４７蛋白質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを検出し；
（ｖ）投与前の試料中の２０４７蛋白質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性レベルを、投与後の試料または（複数試料）中の２０４７蛋白質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性レベルと比較し；次いで
（ｖｉ）それに応じて、対象への剤の投与を変える；
工程を含む、２０４７活性を変調する剤（例えば、本明細書中に記載するスクリーニングアッセイによって同定された、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチドミメティック、蛋白質、ペプチド、核酸、または小分子）で、対象の治療の効果をモニタリングする方法を提供する。例えば、剤の投与を増加することは、２０４７の発現または活性を検出されたものよりも高いレベルに増加させるために、つまり剤の有効性を増加させるために、望ましいだろう。別法として、剤の投与を減少することは、２０４７の発現または活性を検出されたものよりも低いレベルまで減少するために、つまり剤の有効性を低下させるために、望ましいだろう。そのような具体例によると、２０４７発現または活性は、観察可能な表現型の応答の不在においてさえ、剤の有効性の指標として用いることができる。
【００７４】
ＩＩＩ. 疼痛性障害に苦しむ対象を治療する方法
本発明は、例えば炎症性疼痛、慢性的疼痛、神経因性疼痛、線維筋痛、偏頭痛／頭痛、癌痛、慢性的疲労症候群、関節炎、複雑部位疼痛症候群、灼熱痛、ニューロジストロフィー、または足底筋膜炎といった疼痛性障害のリスクがある（またはそれに羅患した）ヒトのような対象を治療する予防および治療方法の両方を提供する。本明細書で用いるように、対象の「治療」には、病気または障害を持つ、病気または障害の症状を持つ、あるいは病気または障害のリスクがある（またはそれに羅患した）対象に、病気または障害、病気または障害の症状、あるいは病気または障害のリスクがある（またはそれに羅患した）を治療、治癒、緩和、軽減、変化、治療、回復、改善、または影響するといった目的で、治療剤を適用または投与すること、あるいは対象から得た細胞または組織に治療剤を適用または投与することが含まれる。本明細書中で用いるように、「治療剤」には、制限されるものではないが、小分子、ペプチド、ポリペプチド、抗体、リボザイム、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。
【００７５】
処置の予防的および治療的方法の両方に関して、そのような処置は薬理ゲノミクスの分野から得られる知識に基づいて、特異的に合わせたり、変調しても良い。本明細書中で用いるように、「薬理ゲノミクス」とは、臨床的開発ならびにマーケットにおける薬物に対する遺伝子配列決定、統計遺伝子学、および遺伝子発現分析といったゲノム技術の適用を指す。より具体的には、該用語は、患者の遺伝子が薬物に対する彼または彼女の応答をどのように決定するか（例えば患者の「薬物応答表現型」または「薬物応答遺伝子型」）を研究することを指す。薬理ゲノミクスは、臨床家または医師が、予防的または治療的処置をその処置によって最も恩恵を受ける患者に施し、有毒な薬物関連副作用を経験するだろう患者への処置を避けることを許容する。
【００７６】
Ａ．予防的方法
一つの態様において、本発明は、細胞内、例えばニューロン内での２０４７発現または２０４７活性を変調する剤を対象に投与することによって、対象における疼痛性障害を予防する方法を提供する。疼痛性障害を発症するリスクにある対象は、例えば、本明細書中に記載する診断アッセイまたは予後アッセイのいずれかまたはその組合せによって同定することができる。予防剤の投与は、疼痛性障害を防ぐ、または代わりにその進行を遅らせるために、異常な２０４７発現または活性に特徴的な症状が現れる前に行うことができる。２０４７異常の形態によっては、例えば２０４７分子、２０４７アゴニストまたは２０４７アンタゴニスト剤を、対象を治療するために用いることができる。適当な剤は、本明細書中に記載するスクリーニング・アッセイに基づいて決定することができる。
【００７７】
Ｂ．治療方法
本発明のもう一つの態様は、疼痛性障害に苦しむ対象を治療する方法に関係する。これらの方法には、２０４７発現または活性を変調する剤（例えば本明細書中に記載するスクリーニング・アッセイによって同定された剤）またはそのような剤の組合せを対象に投与することが含まれる。もう一つの具体例において、該方法には、２０４７蛋白質または核酸分子を、減少した、異常な、または望まない２０４７発現または活性を補償するための療法として、対象に投与することが含まれる。
【００７８】
２０４７活性の刺激は、２０４７が異常にダウンレギュレートされる、および／あるいは増加した２０４７活性が有益な効果を持つ可能性が高い状況において望ましい。同様に、２０４７活性の阻害は、２０４７が異常にアップレギュレートされる、および／または減少した２０４７活性が有益な効果を持つ可能性が高い状況において望ましい。
【００７９】
２０４７活性を変調する剤は、そのような投与に適当な医薬成分を用いて、対象に投与することができる。そのような組成物は、典型的には、剤（例えば核酸分子、蛋白質、または抗体）および医薬上許容される担体を含む。本明細書中で使用するように、「医薬上許容される担体」という言葉は、医薬投与に適合する溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、およびそういったもののいずれかおよび全てを含むように意図されている。医薬上活性な物質に対するそのような媒体および剤の使用は、当該分野でよく知られている。従来の媒体または剤のいずれかが活性な化合物と不適合でない限り、組成物中におけるその使用は考慮される。補充的活性化合物を組成物に配合することもできる。
【００８０】
本発明の治療方法において使用される医薬組成物は、投与のその意図された経路に適合するように処方される。投与経路の例には、非経口投与、例えば静脈内投与、皮内投与、皮下投与、経口投与（例えば吸入）、経皮投与（局所的）、経粘膜投与、および直腸投与が含まれる。非経口、皮内、または皮下適用に使用される溶液または懸濁液には、次の成分を含むことができる：注射用水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒のごとき減菌希釈剤；ベンジルアルコール、またはメチルパラペンのごと抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムのごとき抗酸化物；エチレンジアミン四酢酸のごときキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩のごとき緩衝剤、および、塩化ナトリウムまたはデキストロースのごとき等張度調節剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムのごとき酸または基によって調節できる。非経口製剤は、アンプル、使い捨て注射器あるいはガラスまたはプラスチック製の多用量バイアルに入れることもできる。
【００８１】
注射使用に適した医薬組成物には、無菌水溶液（水溶性である場合）、または分散液および無菌の注射溶液または分散液の即席調製のための無菌粉末が含まれる。静脈内投与に適当な担体には、生理食塩水、静菌性溶液、Cremophor ELTM(BASF, Parsippany, NJ)またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。全ての場合において、組成物は無菌でなければならず、容易な注射が可能である程度に流動性であるべきである。組成物は製造および貯蔵の状況下で安定していなければならず、細菌および真菌といった微生物の汚染作用に備えて保存されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液状ポリエチレングリコール等）およびその適した混合物のような、溶媒または分散媒であっても良い。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングを使用することによって、分散の際に必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性物質の使用によって、維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサル等によって達成することができる。多くの場合において、組成物に、等張剤、例えば糖、マニトール、ソルビトールのようなポリアルコール、および塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射組成物の長びいた吸収は、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの吸収を遅延させる剤を組成物中に含むことによってもたらされる。
【００８２】
無菌注射用溶液は、上記した成分のうちの一つまたは組合せに適当な水溶液中に、必要な量の２０４７活性を変調する剤（例えば２０４７蛋白質または抗−２０４７抗体の断片）を配合し、続いて濾過滅菌することによって調製できる。一般に、分散液は、基本的な分散媒および上記に記載したものからなる必要な他の成分を含む無菌媒体に、活性な化合物を配合することによって調製される。無菌注射用溶液の調製のための無菌粉の場合、調製の好ましい方法は、活性成分の粉末と先に無菌ろ過されたその溶液からのいずれかの望ましいさらなる成分を生じる真空乾燥および凍結乾燥である。
経口組成物は、一般に、不活性な希釈剤または食用担体を含む。それらはゼラチンカプセルに同封するか、または錠剤に圧縮することができる。経口の治療上投与の目的のために、活性化合物は賦形剤に配合することができ、ならびに錠剤、トローチ、またはカプセル形態で使用することができる。経口の組成物はマウスウォッシュとして使用される液状担体を用いて調製することもでき、ここに液状担体中の化合物は経口適用され、ひゅーと鳴らし、痰を吐き、飲み込む。医薬的に適合した結合剤ならびに／あるいはアジュバント物質は、組成物の一部として含むことができる。錠剤、ピル、カプセル、トローチ等は次の成分または似た性質の化合物のいずれかを含むことができる：マイクロクリスタリンセルロース、トラガカントガムまたはゼラチンのような結合剤；スターチまたはラクトースのような賦形剤、アルギン酸、Primogel、またはコーンスターチのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはSterotesのような滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素のような流動促進剤；スクロースまたはサッカリンのような甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジフレーバーのような調味剤。
【００８３】
吸入による投与のためには、化合物は、例えば二酸化炭素のようなガスといった適当なプロペラントを含む圧縮容器またはディスペンサーからのエアロゾルの形態で送達される。
【００８４】
全身投与は、経粘膜または経皮手段によっても行われる。経粘膜または経皮投与には、浸透させるべきバリアに適当な浸透剤が処方において使用される。そのような浸透剤は当該分野で一般的に知られており、例えば経粘膜投与、洗剤、胆汁酸塩、ならびにフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、点鼻薬または坐薬の使用を介して達成することができる。経皮投与において、活性化合物は、当該分野で一般的に知られる軟膏、膏薬、ゲル、またはクリームに処方される。
【００８５】
２０４７活性を変調する剤は、（例えばココアバターおよび他のグリセリドのような従来の坐薬基剤での）坐薬または直腸送達のための保持浣腸の形態で調製することもできる。
【００８６】
一つの具体例において、２０４７活性を変調する剤は、インプラントおよびマイクロカプロル送達システムを含む制御された放出処方のような、体からの急速な排除から化合物を保護する担体で調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリアンヒトリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸のような生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような処方を調製するための方法は、当業者には明らかであろう。該材料は、Alza CorporationならびにNova Pharmaceuticals, Inc. から商業的に入手することもできる。（ウィルス性抗原に対するモノクローナル抗体に感染した細胞を標的とするリポソームを含む）リポソーム懸濁液は、医薬上許容される担体として使用することもできる。これらは、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるごとく、当業者に知られる方法によって調製できる。
【００８７】
容易な投与および投与量の均一性のためには、経口または非経口成分を用量単位で処方することが特に有益である。本明細書に記載する用量単位形態は、治療される対象に単位の用量として適した物理的に分離した単位；必要な医薬担体との関連において望まれる治療効果を生み出すために、活性な化合物の事前に決定された量を含む各単位を指す。本発明の用量単位形態の詳細は、２０４７活性を変調する剤の特異な特徴および達成されるべき特定の治療効果、ならびに対象の治療用のそのような剤を調合するという当該分野に本質的な制限にしたがっており、また直接的に依存している。
【００８８】
そのような剤の毒性および治療の有効性は、例えばＬＤ５０（集団の５０％に致命的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）を決定すための、細胞培養または実験動物における標準的医薬的手順、によって決定することができる。毒性および治療効果の間の用量比率は、治療指標であり、比率ＬＤ５０／ＥＤ５０として表記することもできる。大きな治療指標を示す剤が好ましい。毒性の副作用を示す剤が使用される間は、感染していない細胞への将来的な損傷を最小化し、それにより副作用を軽減するために、患部組織部位にそのような剤を標的する配達システムを構築するように配慮されるべきである。
【００８９】
細胞培養アッセイから得られたデータおよび動物研究は、ヒトにおける使用のために用量の範囲を処方するのに使用することができる。そのような２０４７変調剤の用量は、微量の毒性を含む、あるいは全く毒性のないＥＤ５０を含む循環する濃度の範囲内にあるのが好ましい。用量は、使用される用量形態および利用される投与経路によって、この範囲内で変動する。本発明の治療方法で使用されるいずれかの剤において、治療上有効な用量は、細胞培養アッセイから最初に推定することができる。用量は、細胞培養で決定されるように、ＩＣ５０を含む循環する血漿濃度範囲（つまり、症状の半−最大阻害を達成するテスト化合物の濃度）を達成するために、動物モデルにおいて処方することができる。そのような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために使用できる。血漿のレベルは、例えば高性能液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
本明細書中に記載するように、蛋白質またはポリペプチドの治療上有効な量（つまり効果的な用量）は、約０．００１から３０ｍｇ／ｋｇ疼痛、好ましくは約０．０１から２５ｍｇ／ｋｇ疼痛、より好ましくは約０．１から２０ｍｇ／ｋｇ疼痛、さらに好ましくは約１から１０ｍｇ／ｋｇ、２から９ｍｇ／ｋｇ、３から８ｍｇ／ｋｇ、４から７ｍｇ／ｋｇ、または５から６ｍｇ／ｋｇの範囲である。当業者は、病気または障害の重症度、以前の治療、対象の一般的な健康および／または年齢、現存する他の病気を含めるがそれに制限されるものではない、特定の因子が対象を効果的に治療するのに必要な用量を影響するかもしれないことを認識するだろう。また、医薬上効果的な量の蛋白質、ポリペプチド、または抗体で対象を治療することには、一度の治療が含まれ、または好ましくは、連続した治療が含まれる。
【００９０】
好ましい例において、対象は、約０．１ないし２０ｍｇ／ｋｇ疼痛の範囲で、一週間に一度を１ないし１０週間、好ましくは２ないし８週間、より好ましくは約３ないし７週間、およびさらに好ましくは約４、５、または６週間、抗体、蛋白質、またはポリペプチドで治療される、治療に使用される抗体、蛋白質、またはポリペプチドの有効量は、特定の治療の過程で増加あるいは減少することも認識されるだろう。用量における変化が起こり、また本明細書中に記載する診断的アッセイの結果から明らかになる。
【００９１】
本発明は、２０４７発現または活性を変調する剤を包含する。例えば、剤は小分子であっても良い。例えば、そのような小分子は、１モル当たり約１０，０００グラム以下の分子量を持つペプチド、ペプチドミメテックス、アミノ酸、アミノ酸アナログ、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドアナログ、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、有機または非有機化合物（つまり、ヘテロ有機および有機金属化合物を含む）、１モル当たり５，０００グラム以下の分子量を持つ有機または非有機化合物、１モル当たり１，０００グラム以下の分子量を持つ有機または非有機化合物、１モル当たり５００グラム以下の分子量を持つ有機または非有機化合物、および塩、エステル、およびそのような化合物のほかの医薬上許容される形態を含むが、これらに制限されるものではない。並のスキルを持つ医師、獣医、または研究者の知識の範囲内では、小分子剤の適当な用量は多くの因子に依存すると考えられている。小分子の用量は、例えば、治療を受ける対象または試料のアイデンティティ、サイズ、および状態に依存し、組成物が投与される経路、および、もし適用できるならば、開業医が小分子に本発明の核酸またはポリペプチド上に持つように望む効果にさらに依存する。
【００９２】
例示的用量は、対象または試料の重量の１キログラム当たり小分子のミリグラムまたはマイクログラム量（例えば１キログラム当たり約１マイクログラムないし１キログラム当たり約５００ミリグラム、１キログラム当たり約１００マイクログラムないし１キログラム当たり約５ミリグラム、あるいは１キログラム当たり１マイクログラムないし１キログラム当たり５０マイクログラム）を含む。小分子の適当な用量は、変調される発現または活性に関する小分子の作用強度に依存することがさらに理解されるだろう。そのような適当な用量は、本明細書中に記載するアッセイを用いて決定することができる。２０４７ポリペプチドまたは核酸分子の発現あるいは活性を変調するために、一つ以上のこれらの小分子が動物（例えばヒト）に投与されると、医師、獣医、または研究者は、例えば、最初は比較的低用量を処方し、その後に、適当な応答が得られるまで用量を増やしていくだろう。加えて、いずれかの特定の動物対象に対する特定の用量レベルは、使用される特定の化合物の活性、年齢、疼痛、一般的健康、性別、および対象の常食、投与の時間、投与経路、排出の割合、いずれかの薬物の組合せ、および変調される発現または活性の度合いを含む様々な因子に依存するであろう。
【００９３】
さらに、抗体（またはその断片）は、細胞毒、治療剤または放射性銀イオンのような治療部位にコンジュゲートさせることもできる。細胞毒または細胞傷害剤は、細胞に有害ないずれかの剤を含む。例には、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアンスラチンジオン、ミトキサントロン、ミスラマイシン、アクティノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロパノロール、およびプロマイシンならびにそのアナログまたはホモログが含まれる。治療剤には、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシル  デカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパ  クロランブシル、メルファラン、カルメスチン（carmustine）(BSNU)およびロムスチン（lomustine）(CCNU)、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトーウ、ストレプトゾシン、マイトマイシンＣ、およびシス−ジクロロジアミン  プラティナム（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、mithramycin、およびanthramycin(AMC))、および抗−有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００９４】
本発明のコンジュゲートは、与えられた生物学的応答を変調するために使用することができ、薬物部位は古典的な化学的治療剤に制限されるように構築されるべきではない。例えば、薬物部位は、望まれる生物学的活性を持つ蛋白質またはポリペプチドであることができる。そのような蛋白質は、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒素といった毒素；腫瘍壊死因子、アルファ−インターフェロン、ベータ−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子といった蛋白質、；あるいは、例えば、リンホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、または他の成長因子といった生物学的応答修飾因子を含むことができる。
【００９５】
そのような治療部位を抗体にコンジュゲートさせる技術はよく知られており、例えばArnonら、"Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld ら  (eds.), pp.243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom ら"Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (第二版）、Robinsonら(eds), pp.623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, Pinchera ら(eds.), pp.475-506(1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibodies In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin ら(eds.), pp.303-16(Academic Press 1985), およびThorpe ら, "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxxin Cinjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982）を参照されたし。別法として、抗体は、米国特許第４，６７６，９８０号でセガール(Segal）によって記載されているように、抗体ヘテロコンジュゲートを形成するために第二の抗体にコンジュゲートすることができる。
【００９６】
本発明の方法で使用する核酸分子は、ベクターに挿入し、遺伝子療法ベクターとして使用することができる。遺伝子療法ベクターは、例えば静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号参照）または定位的注射によって対象に送達することができる。遺伝子療法ベクターの医薬的製剤には、許容性のある希釈剤中の遺伝子療法ベクターが含まれるか、または遺伝子送達媒体が埋め込まれている徐放性マトリックスが含まれる。別法として、完全な遺伝子送達ベクターが、例えばレトロウィルスベクターといった、組換え型細胞から無傷で産出できる場合、医薬製剤には遺伝子送達システムを産生する１つ以上の細胞が含まれる。
【００９７】
Ｃ．薬理ゲノミクス
本発明の治療的方法と組み合わせて、薬理ゲノミクス（つまり、対象の遺伝子型とその対象の異物化合物または薬物への応答との間にある関連性の研究）が考えられる。薬物療法学の代謝における差異は、薬理学的に活性な薬物の用量と血中濃度間の関係を変化させることによって、重度の有毒性または治療的失敗を引き起こし得る。すなわち、医師または臨床家は、２０４７活性を変調する剤を投与するかどうかを決定する際および２０４７活性を変調する剤による療法の用量および／または治療的投与計画を合わせる際に、関連する薬理ゲノミクス研究で得られた知識を適応することを考えるだろう。
【００９８】
薬理ゲノミクスは、患者における変化させた薬物処分および異常な作用を原因とする薬物への応答における臨床的に重要な遺伝性差異を扱う。例えば、Eichelbaum, Mら(1996) Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23(10-11):983-985 およびLinder, M.W. ら(1997) Clin. Chem. 43(2):254-266を参照されたし。一般的に、薬理遺伝学条件の二つのタイプを分けることができる。薬物が体内で作用する方法を変化させる単一因子として伝達される遺伝的状態（変化された薬物作用）または体が薬物に作用する方法を変化させる単一因子として伝達される遺伝的状態（変化された薬物代謝）。これらの薬理遺伝的状態は、稀な遺伝的欠陥または自然に起こる遺伝子多型のどちらかとして起こり得る。例えば、グルコース−６−リン酸アミノペプチダーゼ欠乏症とは、主な臨床的合併症がオキシダント薬物（抗−マラリア、スルホンアミド、鎮痛薬、ニトロフラン）の摂取およびファヴァ豆(fava beans)の消費後の溶血である通常の遺伝性酵素異常症である。
【００９９】
「ゲノム−広範囲会合」として知られる薬物応答を予測する遺伝子を同定するための１つの薬理ゲノミクスのアプローチは、既知の遺伝子−関連マーカー（例えば、６０，０００−１００，０００多型または各々が二つの変異体を有するヒトゲノムの様々な部位よりなる「二−対立形質」遺伝子マーカーマップ）からなるヒトゲノムの高−解像度マップに、第一に依拠している。そのような高−解像度マップは、特定の観察される薬物応答または副作用と関連するマーカーを同定するために、相ＩＩ／ＩＩＩ薬物治験に参加している統計学的に重要な数の患者の各々のゲノムのマップと比較することができる。代わりに、そのような高解像度マップは、ヒトゲノムにおける１０００万ほどの既知の単一ヌクレオチド多型（複数のＳＮＰ）の組合せから得ることができる。本明細書中で使用するように、「ＳＮＰ」は、ＤＮＡストレッチの単一ヌクレオチド基で起こるふつうの変化である。例えば、ＳＮＰはＤＮＡのあらゆる１０００基につき一度起こり得る。ＳＮＰは、疾患プロセスに関与しているかもしれないが、膨大な大部分は疾患−関連ではないかもしれない。そのようなＳＮＰの発生に基づく遺伝子マップを仮定すると、その個々のゲノムの特定のＳＮＰパターンによって遺伝子カテゴリーにグループ化することができる。そのような場合、治療法は、遺伝子的に似た個体の間によくある特徴を考慮に入れながら、そのような遺伝子的に似た個体のグループに合わせることができる。
【０１００】
代わりに、「候補遺伝子アプローチ」と名付けられる方法は、薬物応答を予測する遺伝子を同定するのに利用することができる。この方法によれば、もし薬物標的をコードする遺伝子が分かっていれば（例えば、本発明の２０４７蛋白質）、その遺伝子の全ての普通の変異体は、集団中で比較的容易に同定することができ、もし遺伝子の１つのバージョン対もう１つを有することが特定の薬物応答と関連しているなら、それを決定することができる。
【０１０１】
説明的具体例として、酵素を代謝する薬物の活性は、薬物作用の強度および持続の療法の重要な決定要素となる。酵素を代謝する薬物の遺伝子的多型（例えばＮ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）およびチトクロームＰ４５０酵素ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９）の発見は、なぜ薬物の通常および安全な用量を摂取した後に、何人かの患者が期待される薬物効果を得なかったり、または悪化するような薬物反応および重篤な有害性を見せたりするのかに対する説明を提供してきた。これらの多型は、集団の二つの表現型、高代謝群（ＥＭ）および低代謝群（ＰＭ）で発現する。ＰＭの有病率は、異なる集団間で異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は、非常に多型性でありいくつかの突然変異がＰＭ中で同定されており、これら全ては機能的ＣＹＰ２Ｄ６の不在に繋がる。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９の低代謝群は、通常の用量を摂取するとかなり頻繁に悪化するような薬物反応や副作用を経験する。ＣＹＰ２Ｄ６−型代謝物モルヒネによって媒介されるコデインの鎮痛効果に対して実証されるように、もし代謝物が活性な治療成分であるならば、ＰＭは治療的応答を見せない。他の極端なものは、通常の用量に応答しないいわゆる超急速代謝群である。最近、超急速代謝の分子ベースは、ｍＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅によるものであると同定された。
【０１０２】
代わりに、「遺伝子発現プロファイリング」と呼ばれる方法は、薬物反応を予測する遺伝子を同定するのに使用することができる。例えば、薬物（例えば、本発明の２０４７分子または２０４７モジュレーター）を投薬された動物の遺伝子発現は、有毒性に関連する遺伝子経路にスイッチが入ったかどうかを見るための指標を与える。
【０１０３】
上記の薬理ゲノミクスアプローチの１つ以上から発生する情報は、対象の予防的または療法的処置に対する適当な用量および治療計画を決定するのに使用できる。この知識は、投薬または薬物選択に適応される場合、有害な反応または治療的失敗を避けることができ、すなわち、疼痛性障害に苦しむ対象を２０４７活性を変調する剤で治療する際に、治療的または予防的効率を強めることができる。
【０１０４】
ＩＶ．本発明の方法で用いられる組換え型発現ベクターおよび宿主細胞
本発明の方法（例えば、本明細書中に記載するスクリーニングアッセイ）には、２０４７蛋白質（またはその蛋白質）をコードする核酸を含むベクター、好ましくは発現ベクターの使用が含まれる。本明細書中に記載するように、「ベクター」という用語は、もう一つの核酸をそれが連結されているものに運ぶことが可能な核酸分子を指す。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、さらなるＤＮＡセグメントが連結することができるものへの環状の二重鎖ＤＮＡを指す。ベクターのもう一つのタイプはウィルス性ベクターであり、ここにさらなるＤＮＡセグメントはウィルス性ゲノムに連結することができる。あるベクターは、それらが導入されるもの（例えば、増殖の細菌性起源を有する細菌性ベクターおよびエピソームの哺乳類ベクター）への宿主細胞における自律増殖が可能である。他のベクター（例えば、非−エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入において宿主細胞のゲノムへ組込まれ、それにより宿主ゲノムとともに増殖する。さらに、あるベクターは、それらが作動的に連結されているものへ遺伝子の発現を配向することが可能である。そのようなベクターは、本明細書中では「発現ベクター」と呼ばれる。一般的に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。プラスミドが最も一般的に使用されるベクターの形態であるため、本明細書中では「プラスミド」および「ベクター」は相互互換的に使用される。しかしながら、本発明は、細菌性ベクター（例えば、増幅欠陥レトロウィルス、アデノウィルスおよびアデノ−関連ウィルス）といった、同等の機能を果たす他の形態の発現ベクターを含むように意図されている。
【０１０５】
本発明の方法で使用される組換え発現ベクターは、宿主細胞中の核酸の発現に適した形態の本発明の核酸からなり、つまりそれは組換え発現ベクターは発現に使用され、発現される核酸配列に作動的に連結されている宿主細胞に基づいて選択される１つ以上の調節配列を含むということである。組換え発現ベクターにおいて、「作動的に連結されている」とは、注目されるヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を許容するような形で（例えば、イン・ビトロ転写／翻訳システムまたはベクターが宿主細胞に導入される際の宿主細胞で）、調節配列に連結されているということを意味するように意図されている。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現対照エレメント（例えばポリアデニル化シグナル）を含むように意図されている。例えば、そのような調節配列は、Goeddel(1990) Methods Enzymol. 185:3-7に記載されている。調節配列には、多くのタイプの宿主細胞におけるヌクレオチド配列の構成型発現を指令するものおよび特定の宿主細胞のみでヌクレオチド配列の発現を指令するもの（例えば組織―特異的調節配列）が含まれる。当業者は発現ベクターのデザインが、変換される宿主細胞、望まれる蛋白質の発現レベル等の選択といったような因子に依存していることを理解するだろう。本発明の発現ベクターは宿主細胞に導入され、それにより、本明細書に記載するように、融合蛋白質またはペプチドを含みかつ核酸によってコードされる蛋白質、またはペプチド（例えば２０４７蛋白質、２０４７蛋白質の突然変異型、融合蛋白質等）を産生する。
【０１０６】
本発明の方法で用いられる組換え型発現ベクターは、原核細胞または真核細胞における２０４７蛋白質の発現に対してデザインされている。例えば、２０４７蛋白質はＥ．ｃｏｌｉ、昆虫細胞（バキュロウイルスベクターを用いて）、酵母細胞、または哺乳類の細胞のような細菌性細胞において発現する。適した宿主細胞は、上記したGoeddel(1990)でさらに検討されている。代わりに、例えばＴ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて、組換え型発現ベクターはイン・ビトロで転写され翻訳される。
【０１０７】
原核生物における蛋白質の発現は、融合または非−融合蛋白質のいずれかの発現を指令する構成的なまたは誘導性のプロモーターで、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて最も頻繁に起こる。融合ベクターは、コードされる蛋白質に、大抵は組換え型蛋白質のアミノ終端に、多くのアミノ酸を加える。そのような融合ベクターは、概して、３つの目的を果たす：１）組換え型蛋白質の発現を増加させること；２）組換え型蛋白質の溶解性を増加させること；および３）アフィニティー精製におけるリガンドとして作用することによって組換え型蛋白質の精製を助けること。しばしば、融合発現ベクターにおいて、融合蛋白質の精製に続いて融合成分から組換え型蛋白質の分離を可能とするために、蛋白質分割切断部位は、融合成分および組換え型蛋白質の接合部に導入される。そのような酵素、および同族の認識配列には、第Xaの因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが含まれる。典型的な融合発現ベクターには、ｐＧＥＸ(Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B. およびJohnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40)、ｐＭＡＬ(New England Biolabs, Beverly, MA)およびＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を融合するｐＲＩＴ５(Pharmacia, Piscataway, NJ)、それぞれ、標的組換え型への蛋白質マルトースＥ結合蛋白質、または蛋白質Ａが含まれる。
【０１０８】
精製された融合蛋白質は、２０４７活性アッセイで使用することができ、（例えば、後記する直接的アッセイまたは競合的アッセイ）あるいは２０４７蛋白質に特異的な抗体を発生するために使用することができる。好ましい具体例において、本発明のレトロウィルス発現ベクターで発現する２０４７融合蛋白質は、照射されたレシピエントへ引き続いて移植される骨髄細胞を感染するように使用される。そして、対象レシピエントの病理学は、十分な時間（例えば６週間）が過ぎた後に検査される。
【０１０９】
もう一つの具体例において、本発明の核酸は哺乳類の発現ベクターを用いて、哺乳類細胞で発現する。哺乳類発現ベクターの例には、ｐＣＤＭ８(Seed, B. (1987) Nature 329:840)および(Kaufman ら  (1987) EMBO J. 6:187-195)が含まれる。哺乳類細胞において使用される場合、発現ベクターの対照機能はしばしばウィルス性調節エレメントによって提供される。例えば、普通使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウィルス、サイトメガロウィルスおよびシミアンウィルス40から誘導される。原核および真核細胞の両方に適した他の発現システムについては、Sambrook, J. ら  Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 第二版、Cold spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 1989の１６章および１７章を参照されたし。
【０１１０】
もう一つの具体例において、組換え型哺乳類発現ベクターは、特定の細胞タイプにおいて、核酸の発現を優先的に指令することが可能である（例えば、組織―特異型調節エレメントは核酸を発現するのに使用される）。
【０１１１】
本発明の方法は、さらに、アンチセンス配向で発現ベクターにクローン化された本発明のＤＮＡ分子を含む組換え型発現ベクターを使用することができる。つまり、ＤＮＡ分子は、２０４７ｍＲＮＡにアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現を（ＤＮＡ分子の転写によって）許容するような方法で調節配列に作動的に連結する。アンチセンス配向でクローン化された核酸に作動的に連結する調節配列は、様々な細胞タイプにおけるアンチセンスＲＮＡ分子の連続発現を指令するもの、例えばウィルス性プロモーターおよび／またはエンハンサー、あるいは制御配列が構成的な、組織特異的、またはアンチセンスＲＮＡの細胞タイプ特異型発現を指令するものが選択され得る。アンチセンス発現ベクターは、高効率調節領域の制御下でアンチセンス核酸が生成され、かつその活性がベクターが導入される細胞型によって決定される、組換え型プラスミド、ファージミド、または弱毒化したウィルスの形態であり得る。アンチセンス遺伝子を用いる遺伝子発現の調節を検討するには、Weintraub, H. ら Antiseise RNA as a molecular toold for genetic analysis, Reviews-Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986を参照されたし。
【０１１２】
本発明のもう一つの態様は、本発明の２０４７核酸分子が導入される宿主細胞、例えば組換え型発現ベクター内の２０４７核酸分子、またはそれが宿主細胞ゲノムの特定部位に相同的に組換えされることを許容する配列を有する２０４７核酸分子の使用に関係する。用語「宿主細胞」および「組換え型宿主細胞」は、本明細書中で相互互換的に使用する。そのような用語は、特定の対象細胞だけでなくそのような細胞の子孫または将来的な子孫も指すと理解されている。突然変異または環境的影響によって次の世代で特定の改変が起こるかもしれないので、そのような子孫は、事実、親細胞と同一ではないが本明細書中で使用する用語の範囲内に含まれる。
【０１１３】
宿主細胞は、原核または真核細胞のいずれかであり得る。例えば、E.coliといった細菌性細胞、昆虫細胞、酵母または（チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞のような）哺乳類細胞で、２０４７蛋白質は発現する。他の適した宿主細胞は、当業者に知られている。
【０１１４】
従来の形質変換または形質移入技術を介して、ベクターＤＮＡは原核または真核細胞に導入できる。本明細書中で使用するように、用語「形質変換」および「形質移入」は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン−媒介形質移入、リポフェクション、またはエレクトロポレーションを含む宿主細胞に異種の核酸（例えばＤＮＡ）を導入するための当該分野で認識されている様々な技術を指すように意図されている。宿主細胞を形質転換または形質移入するのに適した方法は、Sambrookら  (Molecular Cloning: A Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 198)および他のラボラトリーマニュアルで見つけられる。
【０１１５】
培養中の原核または真核細胞のような本発明の方法で用いる宿主細胞は、２０４７蛋白質を産生（つまり発現）するために使用される。従って、本発明の宿主細胞を用いて２０４７蛋白質を産生する方法を、本発明はさらに提供する。１つの具体例において、方法は、２０４７蛋白質が産生されるように、適した培地で本発明の（２０４７蛋白質をコードする組換え型発現ベクターが導入される）宿主細胞を培養することからなる。もう一つの具体例において、該方法は、さらに、培地または宿主細胞から２０４７蛋白質を単離することからなる。
【０１１６】
Ｖ．本発明の方法で使用される単離された核酸分子
単離されたヒト２０４７遺伝子のｃＤＮＡ配列およびヒト２０４７ポリペプチドの予測されるアミノ酸配列は、配列番号：１および２、それぞれにおいて示される。ヒト２０４７遺伝子の５’または３’非翻訳領域のないコード領域は、配列番号：３において示される。
【０１１７】
本発明の方法には、２０４７蛋白質またはその生物学的に活性な部分をコードする単離された核酸分子、および２０４７−コード核酸分子（例えばｍＲＮＡ）を同定するハイブリダイゼーションプローブとして使用するのに十分な核酸断片、ならびに２０４７核酸分子を増幅または突然変異させるＰＣＲプライマーとして使用するための断片の使用を含む。本明細書中で使用するように、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（ｍＲＮＡ）ならびにヌクレオチドアナログを使用することによって発生するＤＮＡまたはＲＮＡのアナログを含むように意図されている。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【０１１８】
本発明の方法において使用する核酸分子、例えば配列番号：１のヌクレオチド配列を有する核酸分子、またはその部分は、通常の分子生物技術および本明細書中で提供される配列情報を用いて単離することができる。ハイブリダイゼーションプローブとしてのあらゆるまたは部分的な配列番号：１の核酸分子配列を用いて、２０４７核酸分子は通常のハイブリダイゼーションおよびクローン技術によって単離される（例えば、Sambrook, J., Fritish, E.F., およびManiatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 第二版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)に記載されているように）。
【０１１９】
さらに、全てまたは部分的な配列番号：１を包含する核酸分子は、配列番号：１の配列に基づいて構築された合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によって単離され得る。
【０１２０】
本発明の方法で用いる核酸は、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたは、代わりに、通常のＰＣＲ増幅技術による鋳型および適したオリゴヌクレオチドプライマーとしてのゲノムＤＮＡを用いて増幅される。さらに、２０４７ヌクレオチド配列に関するオリゴヌクレオチドは、通常の合成技術、例えば自動ＤＮＡ合成機を用いることによって調製することができる。
【０１２１】
好ましい具体例において、本発明の方法で使用する単離された核酸分子は、配列番号：１で示されるヌクレオチド配列、配列番号：１で示されるヌクレオチド配列の相補体、またはこれらのヌクレオチド配列のいずれかの部分を含む。配列番号：１で示されるヌクレオチド配列の相補体である核酸分子は、配列番号：１で示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズし、それにより安定した二本鎖を形成するのに、配列番号：１で示されるヌクレオチド配列に対して十分に相補的であるものである。
【０１２２】
もう一つの好ましい具体例において、本発明の方法で用いられる単離された核酸分子は、配列番号：１で示されるヌクレオチド配列の全長に対して、少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％あるいはより同一であるか、またはこのヌクレオチド配列のいずれかの部分であるヌクレオチド配列を含む。
【０１２３】
さらに、本発明の方法において使用される核酸分子は、配列番号：１の核酸配列の部分、例えば２０４７蛋白質の部分をコードするプローブまたはプライマーあるいは断片として用いられる断片、例えば２０４７蛋白質の生物学的に活性な部分のみを含むことができる。プローブ／プライマーは概しては実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは概して、ストリンジェントな条件下で、配列番号：１のセンス配列または配列番号：１のアンチセンス配列、または配列番号：１の自然発生型対立形質変異体または突然変異体の、少なくとも約１２または１５、好ましくは約２０または２５、より好ましくは約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、または７５の連続したヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。１つの具体例において、本発明の方法で使用する核酸分子は、５０、５０−１００、１００−２００、２００−３００、３００−４００，４００−５００、５００−６００、６００−７００、７００−８００、８００−９００、９００−１０００、１０００−１１００以上のまたはそれ以上のヌクレオチド長であり、およびストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号：１の核酸分子にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。
【０１２４】
本明細書中で使用するように、用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、お互いに有意に同一または相同的でお互いにハイブリダイズしたままであるヌクレオチド配列下でのハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を示すように意図されている。好ましくは、条件は、少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましくは少なくとも約８５％または９０％お互いに同一である配列がお互いにハイブリダイズしたままであるようなものである。そのようなストリンジェントな条件は、当業者に知られており、Current Protocols in molecular Biolody, Ausubel ら  eds., John Wiley & Sons, Inc. (1995), section 2, 4 および6で見つけることができる。さらなるストリンジェントな条件は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook ら, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), 7,9 および11章で見つけることができる。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件の好ましい非―限定的な例には、約６５―７０℃での１ＸＳＳＣにおける一度以上の洗浄に続いての、４Ｘまたは６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）における約６５−７０℃でのハイブリダイゼーション（または４Ｘ  ＳＳＣとホルムアミドにおける約４２−５０℃でのハイブリダイゼーション）が含まれる。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件のさらに好ましく、非―限定的な例には、６５℃での０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおける一度以上の洗浄に続いての、４５℃での６ＸＳＳＣにおけるハイブリダイゼーションが含まれる。高ストリンジェントハイブリダイゼーション条件の好ましく非―限定的な例には、約６５―７０℃での０．３ＸＳＳＣにおける一度以上の洗浄に続いての、１ＸＳＳＣにおける約６５―７０℃でのハイブリダイゼーション（または１ＸＳＳＸと５０％ホルムアミドにおける約４２−５０℃でのハイブリダイゼーション）が含まれる。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションの好ましく非―限定的な例には、約５０―６０℃での２ＸＳＳＣにおける一度以上の洗浄に続いての、約５０−６０℃での４Ｘまたは６ＸＳＳＣにおけるハイブリダイゼーション（または代わりに、約４０−４５℃での６ＸＳＳＣと５０％ホルムアミドにおけるハイブリダイゼーション）が含まれる。上記した値に中間的な範囲、例えば６５−７０℃または４２―５０℃での、は本発明によって包含するようにも意図されている。ＳＳＰＥ（１ｘＳＳＰＥは０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、および１．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄緩衝液においてＳＳＣ（１ｘＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸ナトリウムである）と置換することができる；洗浄はハイブリダイゼーション完了後に、各々１５分間行われる。長さが５０基組以下になると思われるハイブリッドに対するハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より５−１０℃低くあるべきであり、Ｔｍは次の方程式によって決定される。長さが１８基組以下のハイブリッドに対しては、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ基の＃）＋４（Ｇ＋Ｃ基の＃）。長さが１８および４９基組の間であるハイブリッドに対しては、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏ��１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）で、Ｎはハイブリッドの基の数であり、および［Ｎａ＋］はハイブリダイゼーション緩衝液におけるナトリウムイオンの濃度である（１ｘＳＳＣ＝０．１６５Ｍに対する［Ｎａ＋］）。また、例えばニトロセルロースまたはナイロン膜、限定されるわけでないが遮断薬（例えばＢＳＡまたはサケまたはニシン精子担体ＤＮＡ）、洗剤（例えばＳＤＳ）、キレート薬（例えばＥＤＴＡ）、フィコール、ＰＶＰ等といった膜への核酸分子の非―特異的ハイブリダイゼーションを減少させるために、さらなる試薬がハイブリダイゼーションおよび／または洗浄緩衝液に加えられることができることが、熟練した開業医によって認識されるだろう。特にナイロン膜を使用する場合、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件のさらなる好ましい、非―限定的な例は、６５℃での０．０２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４での一度以上の洗浄に続いての、約６５℃での０．２５−０．５Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４におけるハイブリダイゼーションである。
【０１２５】
好ましい具体例において、プローブはさらに、それに付着した標識群を含み、例えばその標識群は放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子でもあり得る。そのようなプローブは、対照からの細胞の試料における２０４７−コード核酸のレベルを測定することによって、例えば２０４７ｍＲＮＡレベルを検出するまたはゲノム２０４７遺伝子が突然変異するまたは欠失されるかどうかを決定することによって、２０４７蛋白質を異所性発現する細胞または組織を同定するための診断的テストキットの一部として使用することができる。
【０１２６】
本発明の方法は、さらに、遺伝子コードの縮重が原因で配列番号：１に示されるヌクレオチド配列と異なる核酸分子の使用を包含し、すなわち配列番号：１で示されるヌクレオチド配列によってコードされるものと同一の２０４７蛋白質をコードする。もう一つの具体例において、本発明の方法に含まれる単離された核酸分子は、配列番号；２に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列を持つ。
【０１２７】
本発明の方法には、さらに、例えば機能的および非―機能的対立形質の変異体といったヒト２０４７の対立形質の変異体の使用が含まれる。機能的対立形質変異体は、２０４７活性を維持するヒト２０４７蛋白質の自然発生型アミノ酸配列変異体である。機能的対立形質変異体は、概しては、配列番号：２の１つ以上のアミノ酸の連続置換、または蛋白質の非―臨界的領域における非―臨界的残基置換、欠失または導入のみを含む。
【０１２８】
非―機能的対立形質変異体は、２０４７活性を持たないヒト２０４７蛋白質の自然発生型アミノ酸配列変異体である。非―機能的対立形質変異体は、概しては、配列番号：２のアミノ酸配列の非−保存的置換、欠失、または導入または成熟前切形、あるいは蛋白質の臨界的残基または臨界的領域における置換、導入、または欠失を含む。
【０１２９】
本発明の方法はさらにヒト２０４７蛋白質の非−ヒトオルソログの使用を含む。ヒト２０４７蛋白質のオルソルグは、非−ヒト生物から単離され、同一の２０４７活性を保有する蛋白質である。
【０１３０】
本発明の方法は、さらに、突然変異体が導入された、配列番号：１のヌクレオチド配列からなる核酸分子またはその一部分を含む。突然変異は、「非−重要な」アミノ酸残基または「重要な」アミノ酸残基でのアミノ酸置換へと導く。「非−重要な」アミノ酸残基は、生物学的活性を改変することなしに、２０４７の野生型配列（例えば配列番号：２の配列）から改質され得る残基であるが、「重要な」アミノ酸残基は、生物学的活性に必要である。例えば、本発明の２０４７蛋白質および短鎖ジハイドロゲナーゼ族の他のメンバー間で保存されるアミノ酸残基は、恐らく改質を受け入れないだろう。
【０１３１】
突然変異は、部位特異的然変異誘発およびＰＣＲ―媒介突然変異誘発のような通常の技術によって、配列番号：１へ導入される。好ましくは、保存的アミノ酸置換は、一つ以上の予測される非―必須アミノ酸残基で作られる。「保存的なアミノ酸置換」は、アミノ酸残基が似た側鎖を有するアミノ酸残基によって置換されるものである。似た側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーは、当該分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基体側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、無極性側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ−分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。すなわち、２０４７蛋白質における予測される非必須なアミノ酸残基は、好ましくは同一側鎖ファミリーからのもう一つのアミノ酸残基によって置換される。代わりに、もう一つの具体例において、突然変異は、飽和突然変異誘起によってのように、全てまたは一部の２０４７コード配列にランダムに沿いながら導入され、結果として生じる突然変異体は、活性を保持する突然変異体を同定するために、２０４７生物学的活性に対してスクリーンされる。配列番号：１の突然変異誘に続いて、コードされた蛋白質は、組換え型に発現され、蛋白質の活性は本明細書中に記載するアッセイを用いて決定することができる。
【０１３２】
本発明のもう一つの態様は、配列番号：１のヌクレオチド配列にアンチセンスな単離された核酸分子の使用に関係する。「アンチセンス」核酸には、蛋白質をコードする「センス」核酸に相補的な、例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的な、あるいはｍＲＮＡ配列に相補的な、ヌクレオチド配列を含む。従って、アンチセンス核酸はセンス核酸に水素結合することができる。アンチセンス核酸は、２０４７コード鎖全体、またはその一部に相補的であり得る。１つの具体例において、アンチセンス核酸分子は、２０４７をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」にアンチセンスである。用語「コード鎖」は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンからなるヌクレオチド配列の領域を指す。もう一つの具体例において、アンチセンス核酸は、２０４７をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」にアンチセンスである。用語「非コード領域」は、アミノ酸に翻訳されないコード領域に隣接する５’および３’配列を指す（また、５’および３’非翻訳領域とも呼ばれる）。
【０１３３】
本明細書中に開示する２０４７をコードするコード鎖配列を仮定すれば、本発明のアンチセンス核酸は、ワトソンおよびクリック基対の法則によって構築することができる。アンチセンス核酸は、２０４７ｍＲＡの全コード領域に相補的であり得るが、より好ましくは、２０４７ｍＲＮＡのコード領域または非コード領域の一部のみにアンチセンスなオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２０４７ｍＲＮＡの翻訳開始部位を取り囲む領域に相補的である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、全長が約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ヌクレオチドである。本発明のアンチセンス核酸は、当該分野で知られる手法を用いる化学合成的および酵素連結反応を用いて構築できる。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、分子の生物学的安定性を増加させるために、またはアンチセンスおよびセンス核酸の間で形成された二本鎖の物理的安定性を増加させるためにデザインされた自然発生型ヌクレオチドまたは様々に修飾されたヌクレオチドを用いて化学的に合成でき、例えば、ホスホロチオネート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用することができる。アンチセンス核酸を生じさせるために使用可能な修飾されたヌクレオチドの例には、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノエチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルケシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルケオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シウウラシル、ケオシン、２−チオサイトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ，および２，６−ジアミノプリンが含まれる。代わりに、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス配向においてサブクローン化された発現ベクターを用いて生物学的に生成することができる（つまり、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、次のサブセクションでさらに詳細に記載するように、注目する標的核酸に対してアンチセンス配向になるであろう）。
【０１３４】
本発明の方法において使用されるアンチセンス核酸分子は、対象に概して投与されるか、あるいは、２０４７蛋白質をコードする細胞性ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズするかあるいはそれに結合し、それにより蛋白質の発現を阻害するように、例えば転写および／または翻訳を阻害することによって、in situで産生される。ハイブリダイゼーションは、安定なデュプレックスを形成するための慣用的なヌクレオチドの相補性によることができ、あるいは、例えば、ＤＮＡデュプレックスに結合するアンチセンス核酸分子の場合には、デュプレックスラセンの主要な溝における特異的な相互作用を介することもできる。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例は、組織部位における直接的な注射を含む。別法として、アンチセンス核酸分子を選択された細胞を標的とするように修飾し、次いで、全身投与することもできる。例えば、全身投与では、例えば、細胞表面の受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体にアンチセンス核酸分子を連結させることによって、それらが選択された細胞表面に発現された受容体または抗原に特異的に結合するように修飾することができる。また、本明細書中に記載されたベクターを用い、アンチセンス核酸分子を細胞に送達することもできる。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するためには、アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌ  ＩＩ  またはｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの制御下に置かれるベクター構築体が好ましい。
【０１３５】
さらにもう一つの具体例において、本発明の方法で用いるアンチセンス核酸分子はα−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は相補的なＲＮＡとで特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、ここに、通常のβ−単位とは対照的にストランドは相互に対して平行に走る（Ｇａｕｌｔｉｅｒら（１９８７）  Nucleic Acids Res. 15:6625-6641)。また、アンチセンス核酸分子は２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら  （１９８７）  Nucleic Acids Res. 15:6131-6148)またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Inoueら  （１９８７） FEBS LETT. 215:327-330)であり得る。
【０１３６】
なお、もう一つの具体例において、本発明の方法で用いるアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、それに対して相補性領域を有する、ｍＲＮＡのごとき一本鎖核酸を切断することができるリボヌクレアーゼを持つ触媒ＲＮＡ分子である。かくして、リボザイム（例えば、（HaseloffおよびGerlach (1988) Nature 334:585-591に記載された）ハンマーヘッドリボザイム）を用いて２０４７ｍＲＮＡ転写体を触媒により切断し、それにより、２０４７ｍＲＮＡの翻訳を阻害することができる。２０４７−コーディング核酸に対する特異性を有するリボザイムは、本明細書中に開示された２０４７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（すなわち、配列番号：１）に基づいて設計することができる。例えば、活性部位のヌクレオチドが２０４７−コーディングｍＲＮＡにおいて切断すべきヌクレオチド配列に対して相補的なテトラヒメナＬ−１９  ＩＢＳ  ＲＮＡの誘導体を構築することができる。例えば、Ｃｅｃｈらの米国特許第４，９８７，０７１号；およびＣｅｃｈらの米国特許第５，１１６，７４２号参照。別法として、２０４７ｍＲＮＡを用いて、ＲＮＡ分子のプールからの特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡを選択することができる。例えば、Ｂａｒｔｅｌ，  Ｄ．およびＳｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．（１９９３）Science 261:1411-1418参照。
【０１３７】
別法として、２０４７遺伝子発現は、２０４７の調節領域（例えば、２０４７プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を標的化して、標的細胞における２０４７遺伝子の転写を妨げる三重ラセン構造を形成することによって阻害することができる。一般に、Ehelene, C. (1991) Anticancer Drug Des. 6(6):569-84; Helene, Cら(1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36; およびMaher, L.J.(1992)Bioessays 16(12):807-15参照。
【０１３８】
さらにもう一つの具体例において、本発明の方法で用いる２０４７核酸分子は塩基部位、糖部位またはリン酸骨格において修飾して、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは溶解度を改良することができる。例えば、核酸分子のデオキシリボースリン酸骨格を修飾して、ペプチド核酸を生じさせることができる（Hyrup.B.およびNielsen, P. E.(1996) Bioorg. Med. Chem. 4(1):5-23参照）。本明細書中で用いるごとく、用語「ペプチド核酸」または「PNA」とは、デオキシリボースリン酸骨格が偽ペプチド骨格によって置き換えられ、かつ４つの天然ヌクレオベースのみが保持された核酸ミミック、例えば、ＤＮＡミミックをいう。ＰＮＡの中性骨格は、低いイオン強度の条件下でのＤＮＡおよびＲＮＡへの特異的ハイブリダイゼーションを可能とすることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、Hyru B. およびNielsen (1996) supra およびPerry-O'Keefeら(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14670-675に記載された標準的な固相ペプチド合成プロトコルを用いて行うことができる。
【０１３９】
２０４７核酸分子のＰＮＡを、本明細書中に記載した治療および診断適用で用いることができる。例えば、ＰＮＡは、例えば、転写または翻訳阻止または複製阻害を誘導することによって、遺伝子発現の配列−特異的変調用のアンチセンスまたはアンチジーン剤として用いることができる。また、２０４７核酸分子のＰＮＡは、（例えば、ＰＮＡ−特異的ＰＣＲクランピングによって）遺伝子中の単一塩基対突然変異の分析において；他の酵素（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ（ＨｙｒｕｐおよびNielsen(1996) supra))と組み合わせて用いる場合に「人工制限酵素」として；またはＤＮＡ配列決定またはハイブリダイゼーション用のプローブまたはプライマーとして（HyrypおよびNielsen (1996) supra; Perry-O'Keefe ら (1996) supra)用いることもできる。
【０１４０】
もう一つの具体例において、親油性または他のヘルパー基をＰＮＡに付着させることによって、ＰＮＡーＤＮＡキメラの形成によって、または当該分野で知られた薬物送達のリポソームまたは他の技術の使用によって、２０４７のＰＮＡを修飾して（例えば、その安定性または細胞摂取を増強することができる）。例えば、２０４７核酸分子のＰＮＡーＤＮＡキメラを生じさせることができ、それは、ＰＮＡおよびＤＮＡの有利な特性を組み合わせることができる。そのようなキメラは、ＤＮＡ認識酵素（例えば、ＲＮＡse H およびＤＮＡポリメラーゼ）がＤＮＡ部分と相互作用するようにでき、他方、ＰＮＡ部分は高い結合親和性および特異性を供するであろう。塩基スタッキング、ヌクレオベースおよび向きの間の結合の数の観点で選択された適当な長さのリンカーを用い、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラを連結させることができる（HyrupおよびNielsen(1996) supra)。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、HyrupおよびNielsen(1996)supraおよびFinn P.J. ら  （1996)  Nucleic Acids Res. 24(17):3357-63に記載されたごとく行うことができる。例えば、ＤＮＡ鎖は、標準的なホスホルアミダイドカップリング化学を用い、固体支持体上で合成することができ、修飾されたヌクレオシドアナログ、例えば、５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−チミジンホスホルアミダイトをＰＮＡおよびＤＮＡの５’末端の間として用いることができる（Mag, M.ら（１９８９）  Nucleic Acids Res. 17: 5973-88)。次いで、ＰＮＡ分子を二段階でカップリングさせて、５’ＰＮＡセグメントおよび３’ＤＮＡセグメントを持つキメラ分子を生じさせる（Finnら（１９９６）supra )。別法として、５’ＤＮＡセグメントおよび３’ＰＮＡセグメントでキメラ分子を合成することができる（Peterser, K.H.ら(1975) Bioorganic Med. Chem. Lettp.5:1119-11124)。
【０１４１】
他の具体例において、本発明の方法で用いるオリゴヌクレオチドは、（例えば、イン・ビボにて宿主細胞受容体を標的化するための）ペプチド、細胞膜を横切る輸送を容易とする剤（例えば、Letsingerら (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6553-6556; Lemartie ら（１９８７）Proc.Natl. Acad. Sci.USA 84:648-652; PCT 公開番号WO 88:09810参照）または脳−血液関門（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ８９／１０１３４参照）のごとき他の付属した基を含むことができる。加えて、オリゴヌクレオチドを、ハイブリダイゼーション−トリガード切断剤（例えば、Krolら(1988) Biotechnics 6:958-976)またはインターカレーティング剤（例えば、Zon (1988) Pharm. Res. 5:539-549参照）で修飾することができる。この目的では、オリゴヌクレオチドをもう一つの分子（例えばペプチド、ハイブリダイゼーショントリガード架橋剤、輸送剤、またはハイブリダイゼーション−トリガード切断剤）にコンジュゲートさせることができる。
【０１４２】
VI. 本発明の方法で用いる単離された２０４７蛋白質および抗−２０４７抗体
本発明の方法は単離された２０４７蛋白質、その生物学的に活性な部分、ならびに抗−２０４７抗体を生起させるために免疫原として用いるのに適したポリペプチド断片の使用を含む。一つの具体例において、天然２０４７蛋白質は、標準的な蛋白質精製技術を用いる適切な精製スキームによって、細胞または組織源から単離することができる。もう一つの具体例において、２０４７蛋白質は組換えＤＮＡ技術によって生産される。組換え発現に対する別法として、標準的なペプチド合成技術を用い、２０４７蛋白質またはポリペプチドを化学的に合成することができる。
【０１４３】
本明細書中で用いるごとく、２０４７蛋白質の「生物学的に活性な部分」は、２０４７活性を有する２０４７蛋白質の断片を含む。２０４７蛋白質の生物学的に活性な部分は、２０４７蛋白質のアミノ酸配列、例えば、全長２０４７蛋白質よりは少ないアミノ酸を含み、かつ２０４７蛋白質の少なくとも一つの活性を呈する配列番号：２に示されたアミノ酸配列と十分に同一な、またはそれに由来するアミノ酸配列を含むペプチドを含む。典型的には、生物学的に活性な部分は、２０４７蛋白質の少なくとも一つの活性を持つドメインまたはモチーフを含む。２０４７蛋白質の生物学的に活性な部分は、例えば、長さが２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００以上のアミノ酸であるポリペプチドであり得る。２０４７蛋白質の生物学的に活性な部分は、２０４７活性を変調する剤を開発するための標的として用いることができる。
【０１４４】
好ましい具体例において、本発明の方法で用いる２０４７蛋白質が配列番号：２に示されたアミノ酸配列を有する。他の具体例においては、２０４７蛋白質は配列番号：２に対して実質的に同一であり、配列番号：２の蛋白質の機能的活性を保持するが、前記サブセクションＶに詳細に記載したごとく、天然対立遺伝子変異または突然変異誘発のためアミノ酸配列が異なる。従って、もう一つの具体例において、本発明の方法で用いる２０４７蛋白質は、配列番号：２の少なくとも約５０％、５４％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％またはそれ以上同一のアミノ酸配列を含む蛋白質である。
【０１４５】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列のパーセント同一性を測定するためには、最適な比較目的で配列を整列させる（例えば、ギャップを第一および第二のアミノ酸または核酸配列の一方または双方に最適整列のために導入することができ、非−同一配列を比較目的で無視することができる）。好ましい具体例においては、比較目的で整列させた好ましい配列の長さは参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、なおより好ましくは少なくとも６０％、なおより好ましくは少なくとも７０％、８０％または９０％である（例えば、２４４のアミノ酸残基を有する配列番号：２の２０４７アミノ酸配列に対して第二の配列を整列させた場合、少なくとも９３、好ましくは少なくとも１２４、より好ましくは少なくとも１５６、なおより好ましくは少なくとも１８７、なおより好ましくは少なくとも２００、２１０、２１５以上のアミノ酸残基を整列させる）。対応するアミノ酸位置またヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基はヌクレオチドを次いで比較する。第二の配列における位置が第二の配列における対応する位置と同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められる場合、分子はその位置において同一である（本明細書中で用いるごとく、アミノ酸または核酸の「同一性」はアミノ酸または核酸「相同性」と同等である）。２つの配列の間のパーセント同一性は、２つの配列の最適な整列のために導入する必要があるギャップの長さ、各ギャップの長さを考慮し、配列によって共有される同一位置の数の関数である。
【０１４６】
２つの配列の間の配列の比較およびパーセント同一性の決定は数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。好ましい具体例において、２つのアミノ酸配列の間のパーセント同一性は、Blosum 62マトリックスまたはPAM250マトリックスいずれか、および１６、１４、１２、１０、８、６または４ギャップ重率、および１、２、３、４、５または６の長さの重率を用い、（http://www.gcg.comで入手可能な）ＧＣＧソフトウエアパッケージ中のＧＡＰプログラムに取り込まれているNeedlemanおよびWunsch (J.Mol.Biol.48:444-453 1970)）を用いて決定される。さらにもう１つの好ましい具体例において、２つのヌクレオチド配列のパーセント同一性は、ＮＷＳgapdna.CMPマトリックスおよび４０、５０、６０、７０または８０のギャップ重率および１、２、３、４、５または６の長さ重率を用い、（http://www.gcg.comで入手可能な）ＧＣＧソフトウエアパッケージ中のＧＡＰプログラムを用いて決定される。もう１つの具体例において、２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列の間のパーセント同一性は、PAM120重率残基表、１２のギャップ長さペナルティーおよび４のギャップペナルティーを用い、ALIGNプログラム（バージョン２．０または２．０Ｕ）に取り込まれているE.MeyersおよびW.Miller (Comput. Appl. Biosci. 4:11-17(1988)）のアルゴリズムを用いて決定される。
【０１４７】
また、本発明の方法は２０４７キメラまたは融合蛋白質を用いることもできる。本明細書中で用いるごとく２０４７「キメラ蛋白質」または「融合蛋白質」は、非−２０４７ポリペプチドに作動可能に連結した２０４７ポリペプチドを含む。「２０４７ポリペプチド」とは、２０４７分子に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいい、「非−２０４７ポリペプチド」とは、２０４７蛋白質に対して実質的に相同ではない蛋白質、例えば、２０４７蛋白質とは異なり、かつ同一または異なる生物に由来する蛋白質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。２０４７融合蛋白質内で、２０４７ポリペプチドは２０４７蛋白質の全てまたは一部に対応することができる。好ましい具体例において、２０４７融合蛋白質は２０４７蛋白質の少なくとも１つの生物学的に活性な部分を含む。もう１つの好ましい具体例において、２０４７融合蛋白質は２０４７蛋白質の少なくとも２つの生物学的に活性な部分を含む。融合蛋白質内では、用語「作動可能に連結した」は、２０４７ポリペプチドおよび非−２０４７ポリペプチドが相互にイン−フレームにて融合していることを示すのを意図する。非−２０４７ポリペプチドは２０４７ポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端に融合させることができる。
【０１４８】
例えば、１つの具体例において、融合蛋白質は、２０４７配列がＧＳＴ配列のＣ−末端に融合されたＧＳＴ−２０４７融合蛋白質である。そのような融合蛋白質は組換え２０４７の精製を容易とすることができる。
【０１４９】
もう１つの具体例において、この融合蛋白質が、そのＮ−末端において異種シグナル配列を含む２０４７蛋白質である。ある宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）において、２０４７の発現および／または分泌は異種シグナル配列の使用を介して増加させることができる。
【０１５０】
本発明の方法で用いる２０４７融合蛋白質は医薬組成物に配合し、イン・ビボで対象に投与することができる。２０４７融合蛋白質を用いて、２０４７基質のバイオアベイラビリティーに影響させることができる。２０４７融合蛋白質の使用は、例えば、（i）２０４７蛋白質をコードする遺伝子の異常な収縮または突然変異；  （ii）２０４７遺伝子の誤調節；および（iii）２０４７蛋白質の異常な翻訳後修飾によって引き起こされた障害の処置で治療的に用いることができる。
【０１５１】
さらに、本発明の方法で用いる２０４７−融合蛋白質は、対象において免疫原として用いて抗−２０４７抗体を生じさせ、２０４７リガンドを精製することができ、およびスクリーニングアッセイで用いて、２０４７と２０４７基質との相互作用を阻害する分子を同定することができる。
【０１５２】
好ましくは、本発明の方法で用いられる２０４７キメラまたは融合蛋白質は、標準的な組換えＤＮＡ技術によって生産される。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片を、例えば、適切には連結用の平滑末端または粘着末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、粘着末端を満たすこと、望ましくない接合を回避するためのアルカリ性ホスファターゼ処理、および酵素連結を使用することによって、慣用的な技術に従って一緒にイン−フレームにて連結する。もう１つの具体例において、融合遺伝子は、自動ＤＮＡシンセサイザーを含めた慣用的な技術によって合成することができる。別法として、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、引き続いてアニールし、再度増幅してキメラ遺伝子配列を生じさせることができる２つの連続遺伝子断片の間に相補的突出を生起させるアンカープライマーを用いて行うことができる（例えば、Current Protocols in Molecular Biology編, Ausubelら, John Wiley & Sons:1992参照）。さらに、融合部位（例えば、ＧＳＴポリペプチド）を既にコードする多くの発現ベクターは商業的に入手可能である。２０４７−コーディング核酸は、融合部位が２０４７蛋白質とイン−フレームにて連結するようにそのような発現ベクターにクローン化することができる。
【０１５３】
また、本発明は、２０４７アゴニスト（ミメティックス）または２０４７アンタゴニストいずれかとして機能する２０４７蛋白質の変異体の使用に関する。２０４７蛋白質の変異体は、突然変異誘発、例えば、２０４７蛋白質の区別される点突然変異または切形によって生じさせることができる。２０４７蛋白質のアゴニストは２０４７蛋白質の天然に生じる形態と実質的に同一な生物学的活性またはそのサブセットを保持することができる。２０４７蛋白質のアンタゴニストは、例えば、２０４７蛋白質の２０４７−媒介活性を競合的に変調することによって、２０４７蛋白質の天然に生じる形態の活性の１以上を阻害することができる。かくして、特異的生物学的効果は、限定された機能の変異体での処理によって誘導することができる。１つの具体例において、蛋白質の天然に生じる形態の生物学的活性のサブセットを有する変異体での対象の処理は、２０４７蛋白質の天然に生じる形態での処置に対して対象において副作用は少ない。
【０１５４】
１つの具体例において、２０４７アゴニスト（ミメティックス）または２０４７アンタゴニストいずれかとして機能する２０４７蛋白質の変異体は、２０４７蛋白質アゴニストまたはアンタゴニストの活性につき２０４７蛋白質の突然変異体、例えば、切形突然変異体のコンビナトーリアルライブラリーをスクリーニングすることによって同定することができる。１つの具体例において、２０４７変異体の斑入り型ライブラリーは核酸レベルでのコンビナトーリアル突然変異誘発によって生じ、斑入り型遺伝子ライブラリーによってコードされる。２０４７変異体の斑入り型ライブラリーは、例えば、潜在的２０４７配列の縮重組が個々のポリペプチドとして、あるいはその中に２０４７配列の組を含む（例えば、ファージ提示用の）より大きな融合蛋白質の組として発現可能であるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素により連結することによって生じさせることができる。縮重オリゴヌクレオチド配列からの潜在的２０４７変異体のライブラリーを生じさせるのに用いることができる種々の方法がある。縮重遺伝子配列の合成は自動ＤＮＡシンセサイザーで行うことができ、次いで、合成遺伝子を適当な発現ベクターに連結させる。遺伝子の縮重組の使用は、１つの混合物において、潜在的２０４７配列の所望の組をコードする配列の全ての提供を可能とする。縮重オリゴヌクレオチドを合成するための方法は当該分野で知られている（例えば、Narang, S.A.(1983) Tetrahedron 39:3;Itakuraら(1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323;Itakuraら(1984)Science 198:1056;Ikeら(1983) Nucleic Acid Res. 11:477参照）。
【０１５５】
加えて、２０４７蛋白質をコードする配列の断片のライブラリーを用いて、２０４７蛋白質の変異体のスクリーニングおよび引き続いての選択用の２０４７断片の斑入り型集団を生じさせることができる。一つの具体例において、コーディング配列の断片のライブラリーは、２０４７コーディング配列の二本鎖ＰＣＲ断片を、ニッキングが分子当たり約１回のみ起こる条件下でヌクレアーゼを処理し、二本鎖ＤＮＡを変性し、該ＤＮＡを再度天然状態として、異なるニックド産物からのセンス／アンチセンス対を含むことができる二本鎖ＤＮＡを形成し、Ｓ１ヌクレアーゼでの処理によって再度形成されたデュプレックスから一本鎖部分を除去し、次いで、得られた断片ライブラリーを発現ベクターに連結することによって生じさせることができる。この方法によって、２０４７蛋白質の種々のサイズのＮ−末端、Ｃ−末端および内部断片をコードする発現ライブラリーを得ることができる。
【０１５６】
点突然変異または切形により作成されたコンビナトーリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングし、および選択された特性を有する遺伝子産物につきｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのいくつかの技術が当該分野で知られている。そのような技術は、２０４７蛋白質のコンビナトーリアル突然変異誘発によって生じた遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングで適用することができる。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための、高スループット分析に適用することができる最も広く用いられている技術は、典型的には、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローン化し、適当な細胞を得られたベクターのライブラリーで形質転換し、次いで、所望の活性の検出が、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を容易とする条件下でコンビナトーリアル遺伝子を発現させることを含む。ライブラリーにおいて機能的突然変異体の頻度を増加させる新しい技術である帰納的アンサンブル(Recursive ensemble)突然変異誘発（ＲＥＭ）は、スクリーニングアッセイと組み合わせて用いて、２０４７変異体を同定することができる（Arkin および Youvan(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815; Delagraveら  (1993) Prot. Eng. 6(3):327-331)。
【０１５７】
本発明の方法は、さらに、抗−２０４７抗体の使用を含む。単離された２０４７蛋白質、またはその部分もしくは断片は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体調製用の標準的な技術を用い、２０４７に結合する抗体を生じさせるための免疫原として用いることができる。全長２０４７蛋白質を用いることができるか、あるいは別法として、２０４７の抗原性ペプチド断片を免疫原として用いることができる。２０４７の抗原性ペプチドは、配列番号：２に示されたアミノ酸配列の少なくとも８つのアミノ酸残基を含み、該ペプチドに対して生起された抗体が２０４７蛋白質とで特異的免疫複合体を形成するように２０４７のエピトープを含む。好ましくは、抗原性ペプチドは、少なくとも１０のアミノ酸残基、より好ましくは少なくとも１５のアミノ酸残基、なおより好ましくは少なくとも２０のアミノ酸残基、最も好ましくは少なくとも３０のアミノ酸残基を含む。
【０１５８】
抗原性ペプチドに含まれる好ましいエピトープは、蛋白質の表面に位置する２０４７の領域、例えば親水性領域、ならびに高抗原性を持つ領域である。
２０４７免疫原は、典型的には、適当な対象（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の哺乳動物）を免疫原で免疫化することによって抗体を調製するのに用いられる。適当な免疫原性の調製物は、例えば、組換えにより発現された２０４７蛋白質または化学的に合成された２０４７ポリペプチドを含むことができる。該調製物は、さらに、フロイントの完全または不完全アジュバント、または同様な免疫刺激剤のごときアジュバントを含むことができる。適当な対象の免疫原性２０４７調製物での免疫化は、抗−２０４７ポリクローナル抗体の応答を誘導する。
【０１５９】
本明細書中で用いる用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、２０４７のごとき、抗原に特異的に結合する（抗原と免疫反応する）抗原結合部位を含む分子をいう。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の例はF(ab)およびF(ab')2断片を含み、これはペプシンのごとき酵素で抗体を処理することによって生じさせることができる。本発明は、２０４７分子に結合するポリクローナルおよびモノクローナル抗体を提供する。本明細書中で用いる用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」とは、２０４７の特定のエピトープと免疫反応することができる抗原結合部位の一つの種のみを含む抗体分子の集団をいう。かくして、モノクローナル抗体組成物は、典型的には、それと免疫反応する特定の２０４７蛋白質に対する単一結合親和性を呈する。
【０１６０】
抗−２０４７ポリクローナル抗体は、適当な対象を２０４７免疫原で免疫化することによって前記したごとく調製することができる。免疫化された対象における抗−２０４７抗体の力価は、固定化された２０４７を用い、酵素結合イミュノソルベント検定（ELASA)を用いるごとき標準的な技術によって経時的にモニターすることができる。所望であれば、２０４７に対して向けられた抗体分子は哺乳動物から（例えば、血液から）単離し、さらに、プロテインＡクロマトグラフィーのごときよく知られた技術によって精製して、ＩｇＧ画分を得ることができる。免疫化後の適当な時点において、例えば、抗−２０４７抗体の力価が最高となった場合、抗体−産生細胞を対象から得て、それを用いて、KohlerおよびMilstein (1975) Nature 256:495-497によって元来記載されたハイブリドーマ（Brown ら  (1981) J. Immunol 127:539-46; Brownら  (1980) J. Biol. Chem. 255:4980-83; Yehら  (1976) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:2927-31; およびYehら  (1982) Int. J. Cancer 29:269-75も参照）、最も最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozborら  (1983) Immunol. Today 4:72)、EBV-ハイブリドーマ技術（Coleら(1985) Monocolanl Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp.77-96)またはトリオーマー技術のごとき標準的な技術によってモノクローナル抗体を調製することができる。モノクローナル抗体ハイブリドーマを生産するための技術はよく知られている（一般に、Kenneth, R. H., Monoconal Antibodies:A New Dimension In Biological Analyses, Pleneu Publishing Corp. NY, New York, New York (1980); Lerner, E.A.(1981) Yale J. Biol. Med. 54:387-402; Gefter, M.L.ら(1977) Somat. Cell Genet. 3:231-36)。簡単に述べれば、不滅化細胞系（典型的には、ミエローマ）を、前記したごとく、２０４７免疫原で免疫化した哺乳動物からのリンパ球（典型的には、脾臓細胞）に融合させ、得られたハイブリドーマ細胞のバイオ上澄みをスクリーニングして２０４７に結合するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを同定する。
【０１６１】
リンパ球および不滅化細胞系を融合するのに用いられる多くのよく知られたプロトコルのいずれも、抗−２０４７モノクローナル抗体を生じさせる目的で適用することができる（例えば、G. Galfreら  (1977) Nature 266:5552; Gefter ら  (1977) supra; Lerner (1981) supra; およびKenneth(1980) supra参照）。さらに、当業者であれば、やはり有用であるそのような方法の多くの変形が存在することを認識するであろう。典型的には、不滅化細胞系（例えば、ミエローマ細胞系）は、リンパ球と同一の哺乳動物種に由来する。例えば、ネズミハイブリドーマは、本発明の免疫原生調製物で免疫化されたマウスからのリンパ球を、不滅化マウス細胞系と融合させることによって作成することができる。好ましい不滅化細胞系は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有するバイオ基（「HAT培地」）に対して感受性であるマウスミエローマ細胞系である。多数のミエローマ細胞系のいずれも、例えば、P3-NS1/1-Ag4-1、P3-x63-Ag8.653またはSp2/O-Ag14ミエローマ系は、標準的な技術に従って融合パートナーとして用いることができる。これらのミエローマー系はATCCから入手可能である。典型的には、HAT-感受性マウスミエローマ細胞を、ポリエチレングリコール（Peg)を用いてマウス脾臓細胞に融合させる。次いで、融合していないおよび産生可能に融合していないミエローマ細胞を殺すHAT培地（融合していない脾臓細胞はそれらが形質転換されていないので数日後に死滅する）を用い、融合で得られたハイブリドーマ細胞を選択する。本発明のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞は、例えば、標準的なＥＬＡＳＡアッセイを用い、２０４７に結合する抗体につきハイブリドーマ上澄みをスクリーニングすることによって検出される。
モノクローナル抗体−分泌ハイブリドーマを調製するための代替法として、２０４７で組換えコンビナトーリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージ提示ライブラリー）をスクリーニングして、それにより２０４７に結合する免疫グロブリンライブラリーのメンバーを単離することによって、抗−２０４７モノクローナル抗体を同定し、単離することができる。ファージ提示ライブラリーを生じさせ、それをスクリーニングするためのキッとは商業的に入手可能である（例えば、Pharmacia Rrecombinant Phage Antibody System 、カタログ番号２７−９４００−０１；およびStratagene Surf ZAPTM Phage Display Kit 、カタログ番号２４０６１２）。加えて、特に、抗体提示ライブラリーを生じさせ、スクリーニングするのに用いるのに適用可能な方法および試薬の例は、例えば、Ladnerら  米国特許第5,223,409号; Kangら PCT国際公開番号 WO 92/18619; Dowerら  PCT国際公開番号 WO 91/17271; Winterら PCT国際公開番号 WO 92/20791; Marklandら PCT国際公開番号 PCT国際公開番号 WO 92/15679; Breitlingら PCT国際公開番号 WO 93/01288; McCaffertyら PCT国際公開番号 WO 92/01047; Garrardら PCT国際公開番号 WO 92/09690; Ladnerら PCT国際公開番号 WO 90/02809; Fuchsら (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hayら (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huseら (1989) Science 246:1275-1281; Griffithsら (1993) EMBO J. 12:725-734; Hawkinsら (1992) J. Mol. Biol. 226:889-896; Clarksonら (1991) Nature 352:624-628; Gramら (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580; Garrardら (1991) Biotechnolog (NY) 9:1373-1377; Hoogenboomら (1991) Nucleic Acids Res. 19:4133-4137; Barbasら (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982; および MacCaffertyら (1990) Nature 348:552-554で見出すことができる。
【０１６２】
加えて、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて作成することができるヒトおよび非ヒト部分を共に含むキメラおよびヒト化モノクローナル抗体のごとき組換え抗−２０４７抗体は本発明の方法の範囲内のものである。そのようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、例えば、Robinsonら 国際出願番号 PCT/US86/02269; Akiraら 欧州特許出願番号 184,187: Taniguchi, M., 欧州特許出願番号 171,496; Morrisonら 欧州特許出願番号 173,494; Neubergerら PCT国際公開番号 WO 86/01533; Cabillyら 米国特許第4,816,567号; Cabillyら 欧州特許出願番号 125,023; Betterら (1988) Science 240:1041-1043;Liuら (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liuら (1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sunら (1987) Proc. Natl. Sci. USA 84:214-218; Nishimuraら (1987) Cancer Res. 47:999-1005; Woodら (1985) NAture 314:446-449; Shawら (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559; Morrison, S.L. (1985) Science 229:1202-1207; Oiら (1986) BioTechniques 4:214; Winter 米国特許第5,225,539号; Jonesら (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyenら (1988) Science 239:1536;およびBeidlerら (1988) J. Immunol. 141:4053-4060に記載されている方法を用い、当該分野で知られた組換えＤＮＡ技術によって製造することができる。
【０１６３】
抗−２０４７抗体を用いて、（例えば、細胞溶解物または細胞上澄みにおいて）２０４７蛋白質を検出し、２０４７蛋白質の発現の豊富さおよびパターンを評価することができる。抗−２０４７抗体を診断で用いて、臨床試験手法の一部として組織中の蛋白質のレベルをモニターし、例えば、与えられた治療方法の効率を決定することができる。検出は、抗体を検出可能な基質にカップリングさせる（すなわち、物理的に連結させる）ことによって促進することができる。検出可能な物質の例は、種々の酵素、補欠分子族、蛍光性物質、ルミネセント物質、バイオルミネセント物質および放射性物質を含む。適当な酵素の例は、西洋ワサビテロキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシゼ、またはアセチルコリンエステラーゼを含む。適当な補欠分子族の例は、ストレプトアビジン／ビオチン、フビジン／ビオチンを含む。適当な蛍光物質の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリスリンを含む：ルミネセント物質の例はルミノールを含み、バイオルミネセント物質の例は、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびアクオリンを含み、および適当な放射性物質の例は１２５Ｉ、１３５Ｉ、１３５Ｓまたは３５Ｈを含む。
【０１６４】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。本出願を通じて引用された全ての文献、特許および公開された特許出願ならびに図面および配列表の内容は、ここに引用して本明細書の一部とみなす。
実施例１：
ヒト組織における２０４７の発現
材料および方法
ヒト２０４７発現の分析のために以下の方法を用いた。
【０１６５】
組織は種々のヒト組織から収集した。トリゾール（ｔｒｉｚｏｌ）方法を用いて全ＲＮＡを調製し、ＤＮＡｓｅで処理して汚染したゲノミックＤＮＡを除去した。標準的な技術を用い、ｃＤＮＡを合成した。逆転写酵素の不存在下でのモックｃＤＮＡ合成の結果、対照１８Ｓ  ＲＮＡ遺伝子の検出可能なＰＣＲ増幅はなく、ゲノミックＤＮＡ汚染の効果的な除去が確認された。２０４７の発現は、ＴａｑｍａｎＲ定量ＰＣＴ分析によって測定し、製造業者の指令に従って行った（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｎ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）
【０１６６】
ヒト２０４７の配列（配列番号：１）に基づきPrimer Express Software (PE Biosystems)によってＰＣＲプローブを設計した。
異なる組織の間の結果を標準化するために異なる蛍光標識によって区別される２つのプローブを各試料に添加した。２０４７遺伝子のためのプローブおよび内部対照ＲＮＡのためのプローブの異なる標識は、かくして、同一ウエル中でのそれらの同時測定を可能とした。順方向および逆方向プライマーならびに対照ＲＮＡおよびヒトまたはネズミ２０４７双方のためのプローブをＴａｑｍａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  （ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に添加した。プライマーおよびプローブの最終濃度は変化しうるが、各々は与えられた実験内で内部的に合致した。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７０  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  （ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、Ｔｅｑｍａｎマトリックス実験を行った。サーマルサイクラーの条件は以下の通りであった。５０℃にて２分間および９５℃にて１０分間保持し、続いて、１５秒間の９５℃、続いての１分間の６０℃の４０サイクルの２工程ＰＣＲを行った。
【０１６７】
以下の方法を用いて、同一組織における１８Ｓ  ＲＮＡ発現に対して、組織試料中でのヒト２０４７遺伝子発現を定量的に計算した。ＰＣＲ増幅がその時点で開始された閾値は製造業者のソフトウエアを用いて決定した。閾値におけるＰＣＲサイクル数はＣＴと命名した。相対的発現は以下により計算される：
２−（（ＣＴ試験−ＣＴ１８Ｓ）注目組織−（ＣＴ試験−ＣＴ１８Ｓ）パネルにおける最低発現組織）
試料は二連で行い、２つの相対的な発現測定の平均を示す。全てのプローブを高発現レベルを持つ組織からのＲＮＡの系列希釈に対してテストし、内部対照１８Ｓについての傾きと同様な傾きを持つ鋳型ｃＤＮＡの量に対して直線的な相対的発現レベルを与えたプローブのみを用いた。
【０１６８】
結果
２０４７の発現は、前記したごとく、種々のヒト組織で調べた。図１Ａに示すごとく、ヒト２０４７は、脊髄および脳で最も高度に発現された。ヒトプローブを用いるイン・サイチュハイブリダイゼーションにより、これまでのＴａｑｍａｎデータを確認し、脊髄および脳における２０４７の発現を証明した。種々のヒト組織を用いるＴａｑｍａｎ分析はラットカウントパートのように２０４７は（実施例１に記載したラットパネルにおけるのと同一の発現パターンで発現されることを示した（図１Ｂ参照）。
【０１６９】
実施例２：
疼痛についての動物モデルに由来する組織における２０４７の発現
材料および方法
ラット２０４７発現の分析のために実施例１に記載した方法を用いた。
結果
疼痛／炎症動物モデルにおける２０４７の発現も測定した（図２ＡないしＤ参照）。
用いたモデルの１つは神経連結モデル（ＣＣＩ）であり、そこでは、動物の坐骨神経の慢性的緩い構築が神経障害性疼痛を誘導する。神経損傷の結果、一次求心性疼痛感受体閾値の感覚過敏または長期低下がもたらされた（痛感過敏）。さらに、軸索の負傷の後、機械的および熱的異疼痛が発生する。用いたもう１つの動物−ベースのパラダイムは完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）誘導炎症疼痛モデルであった。齧歯類脚またはサル膝関節へのＣＦＡの注射は、炎症応答を誘導し、有害刺激に対する低下した閾値（痛感過敏）および無害刺激に対する降下した閾値（異疼痛）として現れる改変された疼痛応答の発生が伴う。
【０１７０】
これらの実験の結果は、軸索切除の後に２０４７遺伝子が後根神経節（ＤＲＧ）でアップレギュレートされることを示す。（図２ＢおよびＣ参照）。また、２０４７遺伝子は、慢性収縮性座骨神経負傷（ＣＣＩ）モデルおよび炎症性疼痛の完全フロイントアジュバントＣＦＡ誘導注射モデルでダウンレギュレートされる（図２Ａないし参照）。最も劇的な変化はＣＦＡ処理の後に平滑な皮膚で観察され、ここに、２０４７遺伝は４ないし１０倍上昇調節された（図２Ｄ参照）。ＣＣＩおよび軸索切除の後の後記の時点において、２０４７遺伝子はほぼ８倍アップレギュレートされた。
【０１７１】
同等物
当業者であれば、ルーチン的実験のみを用い、本明細書中で記載した発明の特別な具体例の多くの同等物を確認することができよう。そのような同等物は特許請求の範囲に含まれることを意図する。
【図面の簡単な説明】
【０１７２】
【図１Ａ】図１Ａはヒト２０４７は脊髄および脳内でアップレギュレートされることを証明するグラフを示す。
【図１Ｂ】図１Ｂはラット２０４７は脊髄および脳内でアップレギュレートされることを証明するグラフを示す。
【図２Ａ】図２Ａは２０４７遺伝子は疼痛の様々なモデルにおいてダウンレギュレートされることを証明するグラフを示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは２０４７遺伝子は疼痛の様々なモデルにおいてダウンレギュレートされることを証明するグラフを示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは２０４７遺伝子は疼痛の様々なモデルにおいてダウンレギュレートされることを証明するグラフを示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは２０４７遺伝子は疼痛の様々なモデルにおいてダウンレギュレートされることを証明するグラフを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【国際公開パンフレット】
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2005507666.tif 000075
2005507666.tif 000076
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005507666.tif 000077
【国際調査報告】
2005507666.tif 000078
2005507666.tif 000079