(57)【要約】【課題】投与される細胞への核酸の導入、ならびに核酸の機能の発現を促進する組成物を提供する。【解決手段】核酸、及びアミノ基に共有結合した分枝基を含有するキトサン、ここで、該分枝基は炭素原子数２以上のアルキル、単糖類、オリゴ糖類または多糖類から選択される、を含有する新規組成物を提供する。該組成物は非ウイルス性遺伝子送達システムとして特に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）核酸、及び
ｂ）アミノ基に共有結合した分枝基をもつキトサンを含有する組成物であって、該分枝基が２個以上の炭素原子をもつアルキル、単糖類、オリゴ糖類または多糖類から選らばれる組成物。
【請求項２】
前記キトサンのＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基の分率（ＦＡ）が、０と０．７０の間、好ましくは０と０．３５の間、さらに好ましくは０と０．１０の間、最も好ましくは０と０．０１の間である、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記キトサンの重量平均重合度（ＤＰｗ）が、２〜２５００、好ましくは３〜２５０、最も好ましくは４〜５０である、請求項１または２記載の組成物。
【請求項４】
前記キトサンのＤ−グルコサミン残基の１〜６０％、好ましくは２〜４０％、最も好ましくは３〜２０％が分枝基を有する、請求項１〜３のいずれか１つの項記載の組成物。
【請求項５】
前記の枝が、下記の式：
【化１】
2005538943.tif 000004
（式中、Ｎはキトサンのグルコサミン残基のＣ−２に結合したＮ原子を表し、
Ｒ１およびＲ２は各々独立に水素原子を表すか、または
Ｒ１は水素原子を表し、そしてＲ２は１０以下の炭素原子をもつ、置換されていてもよい線状または分枝状の飽和もしくは不飽和炭化水素基を表すか、または
Ｒ１およびＲ２は各々独立に、１０以下の炭素原子をもつ置換されていてもよい線状もしくは分枝状の飽和もしくは不飽和炭化水素基を表し、または
カルボニル化合物が、単糖類、オリゴ糖類または多糖類を表す）
に従ってシッフ塩基を生成し、可能ならば、該シッフ塩基生成物を還元して、下記のタイプの化合物：
【化２】
2005538943.tif 000005
を生ずる、前記アミノ基とカルボニル化合物分枝基との反応で得ることができる、請求項１〜４のいずれか１つの項記載の組成物。
【請求項６】
前記カルボニル化合物がアセトアルデヒドである、ここでＲ１は水素原子を表し、そしてＲ２はエチル基を表す、請求項５記載の組成物。
【請求項７】
前記カルボニル化合物が単糖類Ｄ−グルコースである、請求項５記載の組成物。
【請求項８】
前記カルボニル化合物が、１→４結合したＤグルコサミン残基から成り、その還元末端に２，５−アンヒドロ−Ｄ−マンノースの残基を有し、そのＦＡが場合によっては０〜０．５の範囲である、式：
【化３】
2005538943.tif 000006
（式中、ｎは非末端残基の数を表し、０〜１００の間、好ましくは０〜１０の間、最も好ましくは０〜３の間である）
のオリゴマーである請求項５記載の組成物。
【請求項９】
前記カルボニル化合物が、１→４結合したＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基から成り、その還元末端に２，５−アンヒドロ−Ｄ−マンノースを有する、式：
【化４】
2005538943.tif 000007
（式中、ｎは非末端残基の数を表し、０〜１００の間、好ましくは０〜１０の間、最も好ましくは０〜３の間である）
のオリゴ糖類である請求項５記載の組成物。
【請求項１０】
前記カルボニル化合物が、１→４結合したＮ−アセチル−Ｄグルコサミン残基からなる、式：
【化５】
2005538943.tif 000008
（式中、Ｈ、ＯＨは、還元末端のα−またはβ−アノマーを表し、ｎは非末端残基の数を表し、０〜１００の間、好ましくは０〜１０の間、最も好ましくは０〜３の間である）
のオリゴマーである請求項５記載の組成物。
【請求項１１】
前記カルボニル化合物が、１→４結合したＤグルコサミン残基から成り、そのＦＡが場合によっては０〜０．５の範囲である、式：
【化６】
2005538943.tif 000009
（式中、Ｈ、ＯＨは、還元末端のα−またはβ−アノマーを表し、そしてｎは非末端残基の数を表し、０〜１００の間、好ましくは０〜１０の間、最も好ましくは０〜３の間である）
のオリゴマーである、請求項５に記載の組成物。
【請求項１２】
正味正電荷を本質的に有する、請求項１〜１１のいずれか１つの項記載の組成物。
【請求項１３】
３．５から８．０の範囲のｐＨを有する、請求項１〜１２のいずれか１つの項記載の組成物。
【請求項１４】
前記核酸が、宿主細胞に導入された時にその機能を発現することとなるコード配列を含む、請求項１〜１３のいずれか１つの項記載の組成物。
【請求項１５】
前記核酸が、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子から成る群より選択される、請求項１−１４のいずれか１つの項記載の組成物。
【請求項１６】
（ａ）請求項１の（ｂ）に記載の分枝型キトサンを水性溶媒に暴露する段階と、
（ｂ）段階（ａ）の水性溶液を、水性溶媒中の前記核酸と混合する段階と、
（ｃ）段階（ｂ）で得られた生成物溶液の量を減少させて、所望の組成物濃度を達成する段階と、
を含む、請求項１〜１５のいずれか１つの項記載の組成物の製法。
【請求項１７】
請求項１〜１５のいずれか１つの項記載の組成物を使用し、該組成物を哺乳動物に導入することによる、哺乳動物への核酸の投与方法。
【請求項１８】
前記組成物が、経肺経路、経鼻経路、経口経路、口腔内経路、舌下経路、直腸内経路または経膣経路による粘膜組織への導入により哺乳動物に投与される、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記組成物が、非経口経路、すなわち、静脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、皮下投与もしくは心臓内投与による粘膜下組織への導入によって、あるいは外科手術中に漏出される内臓、血管または他の体表もしくは腔への導入によって哺乳動物に投与される、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
前記核酸が前記哺乳動物体内でその機能を発現することができる、先行請求項のいずれか１つの項に記載の組成物を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項２１】
哺乳動物において予防薬または治療薬として使用するための、請求項１〜１５のいずれか１つの項記載の組成物。
【請求項２２】
悪性疾患、自己免疫疾患、遺伝性疾患、病原感染および他の病理学的疾患の予防的または療法的治療のための遺伝子療法、アンチセンス療法または遺伝学的ワクチン接種において使用するための、請求項２１記載の組成物。
【請求項２３】
インビトロまたはインビボ診断薬として使用するための、請求項１〜１５のいずれか１つの項記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸のための新規非ウイルス性送達システムに関し、より具体的には、宿主組織に投与すると、該組織内の細胞への核酸の導入を助長するシステムに関する。本発明の組成物は、所望の産物をコードし、および／または該組織内に存在する細胞における所望の産物の発現を促進するオリゴ−またはポリヌクレオチドなどの生物学的に活性な核酸のより効率的な送達が一定の化学変性によって達成される、生体分解性多糖類キトサンをベースにしている。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子療法の概念は、核酸ＤＮＡまたはＲＮＡが、適切な部位において治療用蛋白質をインビボ生産させるための医薬品として使用できることに基づく。核酸の送達システムは、多くの場合、ウイルス性送達システムおよび非ウイルス性送達システムとして分類される。それらの非常に進化し、特殊化された成分のため、ウイルス性システムは、送達においても発現においても非常に高い効率を達成する、ＤＮＡ送達の現在最も有効な手段である。しかし、ウイルス性送達システムについては、安全性が案じられる。毒性、免疫抗原性、特定の細胞タイプに制限されたターゲッティング、限定されたＤＮＡ収容力、生産およびパッケージングの問題、組換え、ならびに非常に高い生産コストが、それらの臨床使用を妨げている（非特許文献１）。これらの理由のため、基礎研究室においても、臨床環境においても、非ウイルス性送達システムが益々望ましくなってきていた。しかし、製薬学的見地から、ウイルス性送達システムに比べて、非ウイルス性送達システムでは、インビボで得られる発現が比較的低いので、核酸の送達法には、未だ課題が残る（非特許文献２）。
【０００３】
プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）との複合体の形態のカチオン性脂質、ペプチドまたはポリマーを含む様々な非ウイルス性送達システムは、先行技術において説明されている（非特許文献３）；（非特許文献４）；（非特許文献５）。負電荷の核酸は、主としてイオン−イオン相互作用によりカチオン性分子と相互作用し、遊離形から緊密状態に転移することとなる。この状態で、カチオン性分子は、ヌクレアーゼ分解に対する保護を確保することができ、また、細胞との相互作用および細胞による取り込みに有利な核酸−カチオン性分子複合体表面特性も得ることができる（非特許文献６）。
【０００４】
これらのカチオン性分子の中で、合成ポリマーポリエチレンイミン（ＰＥＩ）は、ｐＤＮＡと安定な複合体を形成し、インビトロでもインビボでも比較的高いトランスジーン発現を媒介することが示されている（非特許文献７）；（非特許文献８）；（非特許文献９）。このため、ＰＥＩは、実験設定の際の基準系としてよく用いられる。しかし、ＰＥＩについての毒性と有効性の間のおおまかな相関関係が示され（非特許文献１０）、最近の研究は、ＰＥＩの使用に関わる毒性の懸念に取り組んでいる（非特許文献１１）；（非特許文献１２）。ＰＥＩに伴うもう一つの欠点は、それが生体分解性でなく、そのため長期にわたって体内に蓄積されうるということである。それ故、有効で非毒性の生体分解性非ウイルス性送達システムについての研究は、非常に望ましい。
【０００５】
最も一般的には、非ウイルス性送達システムは、非経口経路によりインビボ送達されている。マウスに静脈内投与すると、核酸−カチオン性分子緊密複合体が、主として肺毛細血管内に堆積し、遺伝子は、その肺胞中隔の毛細血管内皮において（非特許文献１３）；（非特許文献１４）；（非特許文献１５）または肺胞細胞においてでさえ発現した（非特許文献１６）；（非特許文献１７）が、上皮においては発現しなかった。しかし、配合されていない裸のＤＮＡは、その標的に到達する前に血液循環において急速に分解し、その結果、一般には遺伝子の発現は生じなかった。対照的に、骨格筋への裸のＤＮＡの注入は、結果として用量依存性の遺伝子発現を生じ（非特許文献１８）、それは、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）またはポリビニルアルコール（ＰＶＡ）などの緊密化しないが、「相互作用する」ポリマーと複合した時にさらに増進された（特許文献１）（非特許文献１９）；（非特許文献２０）。このように、インビボでの遺伝子トランスフェクションは、予測できない方法で組織依存性であり、故に課題が残る。
【０００６】
胃腸管、鼻および気道への送達である非ウイルス送達システムの粘膜送達も記載されている（非特許文献２１）；（非特許文献２２）、（特許文献２）。非緊密形のＤＮＡが最良の遺伝子発現をもたらす鼻組織への送達（特許文献３）を除き、粘膜組織での高い発現が求められる時には核酸−カチオン性分子緊密複合体のほうが非緊密ＤＮＡより好ましい。
【０００７】
先行技術では、非ウイルス性送達システムは、どちらかと言えば高分子量、多くの場合、数百キロダルトン（ｋＤａ）で下限５ｋＤａのカチオン性ポリマー（キトサンなど）をベースにしている（例えば、（非特許文献２３）；（非特許文献２４）、（特許文献４）。低分子量（＜５ｋＤａ）のポリマーは、ＤＮＡと不安定な複合体を形成し、その結果生じる遺伝子発現が低いというのが、その主な理由である（非特許文献２５）。しかし、高分子量のカチオンの使用には、核酸−カチオン性分子緊密複合体の凝集増加および溶解度の問題などの多くの欠点がある（非特許文献２６）。さらに、低分子量のカチオン性分子の使用には、幾つかの生物学的利点がある。すなわち、それらは、一般に、より高分子量のカチオンに比べて低減された毒性および低減された補体活性化を示す（非特許文献２７）；（非特許文献２８）。
【０００８】
先行技術分野において、核酸と複合体を形成するための低分子量カチオンの使用に関する幾つかの例が説明されている（非特許文献２９）；（非特許文献３０）；（非特許文献３１）；（非特許文献３２）；（非特許文献３３）。しかし、これらの低分子量カチオンは、電場において分離し（アガロースゲル電気泳動）、その結果、インビトロで遺伝子発現を全く生じないか、より高分子量のカチオンと比べて生じる遺伝子発現が非常に低い不安定な緊密体をＤＮＡと形成する。これは、ＤＮＡと低分子量のカチオンとで形成される複合体が一般に不安定で、容易に解離することによって説明することができる（非特許文献３４）。実際、アガロースゲル電気泳動中のカチオン性分子−ＤＮＡ緊密体の解離および裸のＤＮＡの遊離は、文献（非特許文献３５）；（非特許文献３６）；（非特許文献３７）において無効な配合と有効な配合とを識別するためのアッセイとしてよく利用されている。
【０００９】
先行技術には、非ウイルス性ベクターを使用して核酸を気道に送達するための方法の様々な例が含まれている（非特許文献３８）；（非特許文献３９）；非特許文献４０）。本発明者らは、最近、ＤＮＡと複合体を形成するポリマーキトサン（非特許文献４１）、キチンから誘導することができる線状多糖類、をベースにした、そうしたシステムの一つを特定し、特性付けした。キトサンをベースにした遺伝子送達システムは、（特許文献５）、（特許文献６）および（特許文献７）にも記載されている。
【００１０】
キトサンは、上皮関門を越える薬剤送達の改善のための密着結合改変薬剤として導入されている（非特許文献４２）。キトサンは、ヒトに経口投与しても毒性が無いと考えられ、食品添加物として認可されており、創傷治癒用製品にも組み込まれている（非特許文献４３）。
【００１１】
キトサンは、様々な組成および配列の（１→４）結合した２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコース（ＧｌｃＮＡｃ、Ａ単位）と２−アミノ−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコース（ＧｌｃＮ、Ｄ単位）から成る水溶性線状多糖類のファミリーを含む（図１参照）。Ａ単位とＤ単位の相対含有率は、Ａ単位の分率として表現することができる：
ＦＡ＝Ａ単位の数／（Ａ単位の数＋Ｄ単位の数）
ＦＡは、下記の関係による脱Ｎアセチル化単位のパーセンテージに関する：
％脱Ｎアセチル化単位＝１００％・（１−ＦＡ）
各Ｄ単位は、親水性でプロトン化可能なアミノ基を含有し、これに対して各Ａ単位は、疎水性のアセチル基を含有する。これら二つのモノマーの相対量（すなわち、Ａ／Ｄ＝ＦＡ／（１−ＦＡ））は、広範に変化させることができ、その結果、それらの化学的、物理的および生物学的特性に幅広い多様性が生じる。これには、溶液での、ゲル状態でのおよび固体状態でのキトサンの特性、ならびに他の分子、細胞および他の生物学的・非生物学的物質とそれらの相互作用が挙げられる。
【００１２】
キトサンの化学構造の影響は、キトサンが、非ウイルス性遺伝子送達システムにおいて使用された最近になって証明された（非特許文献４４）。異なる化学組成のキトサンは、遺伝子送達システムとして構造に依存した効率を示した。ｐＤＮＡと安定な複合体を形成したキトサンのみが、有意なトランスジーン発現を生じた。
【００１３】
キトサンは、それらのＦＡや分子量にかかわらず、化学物質の導入により化学的に変性することができる。そのグルコサミン単位のアミノ基は、その反応性のために容易な誘導体化を可能ならしめる。ヒドロキシル基での置換も、キトサン誘導体、例えば、Ｏ−カルボキシメチルキトサンへの可能な経路である（非特許文献４５）。
【００１４】
非常に多数のキトサン誘導体が文献に記載されているが、遺伝子送達システムに関して試験されたものは殆どない。しかし、トリメチル化キトサンは、上皮細胞系統における遺伝子送達ベクターとして機能することが報告されている（非特許文献４６）。
【００１５】
（非特許文献４７）は、アルデヒドをＤ単位のアミノ基と反応させることによりシッフ塩基の生成を経由して分枝が発生する、一連の分枝型キトサンを記載している。グルコース、ガラクトースなどの単糖類、ラクトースなどの二糖類、ならびに一般的なオリゴ糖類は、（非特許文献４８）が記載しているように、それらの糖類のアルデヒド基とキトサンの非置換アミノ基とのシッフ塩基生成によりキトサンに結合させることができる。大部分の炭水化物では、還元末端のアルデヒド基が、分子内環形成に関与する。しかし、環形（ヘミアセタール）と開鎖（アルデヒド形）の間のよく知られた平衡のため、殆どすべての炭水化物がアルデヒドとして反応する。フルクトースなどのケト糖については、対応する平衡が、環形（ヘミケタール）と開鎖（ケト形）の間にある。
【００１６】
炭水化物をベースにしたアルデヒドのもう一つのタイプは、キトサンまたはヘパリンなどの長鎖炭水化物の硝酸での分解によって得ることができるものである。この反応では、グルコサミンの残基を脱アミノ化して、アルデヒド基を有する２，５−アンヒドロ−Ｄ−マンノースを生成するが、これは、従来の環形成には関与しない。この残基において終止するオリゴマーは、シッフ塩基形成によりキトサンのアミノ基または他のアミンに容易に結合させることができる（非特許文献４９）、（非特許文献５０）、（非特許文献５１）。
【００１７】
本発明に従って、驚くべきことに、一定の分枝型キトサンは、以前から知られている対応する非分枝型キトサンおよびキトサンオリゴマーより、遺伝子送達に関して有効な複合体形成剤であることが見出された。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
一つの態様によると、本発明は、
ａ）核酸；および
ｂ）アミノ基に共有結合した分枝基を含有するキトサン（この場合、前記枝は、次の群から選択される：炭素原子数２以上のアルキル、単糖類、オリゴ糖類または多糖類）
を含有する組成物に関する。分枝型キトサンを含む前記組成物は、宿主組織の細胞への核酸の送達に特に有用である。本発明に従って、プラスミドＤＮＡなどの核酸および一定の分枝型キトサンを含む配合物は、選択された組織の細胞への核酸の送達を達成するため、および様々な核酸によってコードされた所望の分子のインビボでの発現を達成するために有利であることが、意外にも見出された。
【００１９】
好ましい実施形態において、本発明の組成物は、下記図式：
【００２０】
【化７】
2005538943.tif 000002
【００２１】
（図式中、
Ｎは、キトサンのグルコサミン残基のＣ−２に結合したＮ原子を表し、
Ｒ１およびＲ２は、各々無関係に、水素原子を表すか、
Ｒ１は、水素原子を表し、Ｒ２は、炭素原子数１０以下の場合によっては置換されている線状もしくは分枝状の飽和もしくは不飽和炭化水素基を表すか、
Ｒ１およびＲ２は、各々無関係に、炭素原子数１０以下の場合によっては置換されている線状もしくは分枝状の飽和もしくは不飽和炭化水素基を表し；または
カルボニル化合物が、単糖類、オリゴ糖類または多糖類を表す）
に従ってシッフ塩基を生成し、恐らく、そのシッフ塩基産物を還元して、次のタイプの化合物：
【００２２】
【化８】
2005538943.tif 000003
【００２３】
を生じるような、キトサンのアミノ基とカルボニル化合物分枝基との反応で得ることができる枝を含む。
【００２４】
本発明のもう一つの目的は、宿主組織の細胞に核酸を送達するための、プラスミドＤＮＡなどの核酸および一定の分枝型キトサンを含む組成物の調製方法を提供することである。
【００２５】
本発明の方法は、
（ａ）請求項１の（ｂ）に記載の分枝型キトサンを水性溶媒に暴露する段階；
（ｂ）段階（ａ）の水性溶液を、水性溶媒中の前記核酸と混合する段階；および
（ｃ）段階（ｂ）で得られた生成物溶液の量を減少させて、所望の組成物濃度を達成する段階を含む。
【００２６】
本発明のさらにもう一つの目的は、プラスミドＤＮＡなどの核酸および一定の分枝型キトサンを宿主組織の細胞に投与する方法を提供することである。本発明による哺乳動物への核酸の投与方法は、本組成物を哺乳動物に導入することによるものである。
【００２７】
本発明のさらなる目的は、哺乳動物において予防薬または治療薬として使用するための本発明の組成物である。本発明の組成物は、同様に、インビトロまたはインビボ診断薬として使用するためのものでもあってもよい。
【００２８】
本発明のこれらおよび他の目的は、以下に記載する一つ以上の実施形態によって提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
宿主組織の細胞に核酸を送達するための本発明の組成物の調製方法は、一定の分枝型キトサンを生成する段階、ならびに（ａ）前記分枝型キトサンをｐＨ範囲４．０〜８．０の水性溶媒に暴露する段階、（ｂ）段階（ａ）の水性溶液を水性溶媒中の前記核酸と混合する段階、および（ｃ）インビボでの投与前に、段階（ｂ）で得られた溶液を脱水して、所望の組成物濃度を達成する段階を含む。段階（ｃ）は、（１）段階（ｂ）において生成物溶液の液体を蒸発させて、所望の濃度を得ることによって、または（２）段階（ｂ）において生成物溶液を凍結乾燥させ、その後、再構成して所望の濃度を得ることによって、達成することができる。
【００３０】
本発明のさらにもう一つの実施形態では、宿主組織の細胞に前記配合物を送達する方法を提供する。好ましくは、前記組成物は、経口経路、口腔内経路、舌下経路、直腸内経路、経膣経路、経鼻経路または経肺経路による粘膜組織への投与によって哺乳動物に導入される。特定の実施形態によると、前記組成物は、非経口投与によって哺乳動物に導入される。
【００３１】
さらに具体的には、本発明は、本請求項１から１５に記載の組成物に関する。本発明のさらなる実施形態は、本請求項１６から２４に記載の主題に関する。
【００３２】
本発明の他の目的、特徴および利点は、後続の詳細な説明から明らかとなろう。しかし、そうした詳細な説明および特定の実施例は、本発明の精神および範囲内での様々な変更および改変がこの詳細な説明から当業者に明らかになるので、本発明の好ましい実施形態を示しているとはいえ、単に実例として与えるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
インビトロ細胞モデルにおける治療用蛋白質についてのモデルとしてレポータ蛋白質、ルシフェラーゼの発現を利用することにより、プラスミドＤＮＡおよび一定の分枝型キトサンを含む本発明の組成物は、細胞への核酸の送達を達成するため、および核酸にコードされた所望の分子の発現を達成するために有利であることが、意外にも見出された。
【００３４】
一定の分枝型キトサンは、ｐＬｕｃと（アガロースゲル電気泳動によって示されるように）安定な複合体を形成し、その結果、高いルシフェラーゼ遺伝子発現を生じることが見出された。その安定な複合体の形成は、（１）キトサンとｐＤＮＡの間のアミン／リン酸塩電荷比（＋／−）、（２）キトサンの分枝度、および（３）分枝のタイプによる影響を受けることが見出された。一般に、分枝度が増大すると、安定な複合体の形成には、分枝型キトサンとｐＤＮＡの間により高いアミン／リン酸塩電荷比（＋／−）が必要であった。結果として、６０：１（＋／−）という高い電荷比でさえ、低い遺伝子発現を媒介する不安定な複合体が、４０％三量体ＡＡＭで分枝形成したキトサンオリゴマーでは形成されたが、高い遺伝子発現を媒介する安定なｐＤＮＡ複合体は、７％三量体ＡＡＭで分枝形成したキトサンオリゴマーと、１０：１（＋／−）の電荷比で、すでに形成されていた。
【００３５】
不安定な複合体より安定な複合体のほうが高い遺伝子発現を生じるということは、先行技術と一致する（非特許文献５２）（非特許文献５３）（非特許文献５４）。従って、複合体の安定性が強化される配合は、安定性が劣る複合体と比較してインビトロでの遺伝子トランスフェクションに関して有利であると考えられる。
【００３６】
非分枝型キトサンと比較して高いルシフェラーゼ遺伝子発現が、前記の分枝型キトサンをベースにした安定な複合体で得られた。
【００３７】
ヒト胎児腎臓細胞系統２９３における遺伝子発現の媒介効率は、次の順位で分枝分子の構造に依存することが見出された：７％三量体ＡＡＭ＞６％グルコース＞６％アセトアルデヒド＞非分枝型キトサンオリゴマー。
【００３８】
先行技術によると、キトサンをベースにしたｐＤＮＡ複合体は、合成ポリマーポリエチレンイミン、ＰＥＩをベースにしたｐＤＮＡ複合体と比較した場合、遺伝子発現の開始が遅く、トランスフェクションの４８時間後といった早い時点で媒介する遺伝子発現は低いことが示されている（非特許文献５５）、（非特許文献５６）。
【００３９】
驚くべきことに、ヒト胎児腎臓細胞系統２９３における非分枝型キトサンと比較した場合、７％三量体ＡＡＭで分枝形成した一定のキトサンをベースにしたｐＤＮＡ複合体で、ＰＥＩと類似の遺伝子発現動態が得られた。ヒト肺上皮細胞系統Ｃａｌｕ−３においても同様の遺伝子発現動態が得られたが、意外にも、ＰＥＩと比較した場合、１０倍高い発現が、７％三量体ＡＡＭで分枝形成したキトサンオリゴマーで得られた。
【００４０】
気道上皮細胞における細胞取り込みの増加、およびＤＮＡ複合体形成剤とカップリングした糖残基を含有するｐＤＮＡ複合体の細胞内輸送の増進は、先行技術において説明されている（非特許文献５７）、（非特許文献５８）、（非特許文献５９）。細胞膜表面における特異的糖結合レクチンの存在ばかりでなく、細胞内部のレクチンの存在も、糖残基を含有するこれらのｐＤＮＡ系のトランスフェクション効率の増大の原因となりうる。しかし、例えば、糖残基とカップリングしたポリリシンの場合、その効率は別の薬剤、クロロキンとの同時投与に依存し、これは容易には本組成物と同じ細胞を標的にすることができず、その有意な毒性のためにインビボで使用することができない。一定の枝を有するキトサンをベースにしたｐＤＮＡ複合体に関する上の説明では、同時投与される他の薬剤は、まったくなかった。
【００４１】
適切には、枝を有する前記キトサンは、０と０．７０の間、好ましくは０と０．３５の間、さらに好ましくは０と０．１０の間、最も好ましくは０と０．０１の間のＦＡを有する非分枝型キトサンを選択することによって得られる。その後、前記キトサンを、酸水解、酵素的加水分解によって、または硝酸と反応させることによって分解して、２〜２５００、好ましくは３〜２５０、最も好ましくは４〜５０の重量平均重合度（ＤＰｗ）を生じる。場合によっては、その分解したキトサンを、ゲル濾過などの分画に付して、より狭い分子量分布を有するキトサンを生じることができる。分枝形成に特に有用な開始キトサン物質は、同日出願のノルウェー特許同時係属出願第２００２  ２１４８号に記載されているものである。この出願は、参照として本明細書に組み込まれている。カルボニル化合物、好ましくはアルデヒドとキトサンのＤ−グルコサミン残基のアミノ基の間でシッフ塩基を形成することを含む方法で、前記キトサンに分枝が形成される。この分枝反応は、シッフ塩基を還元するために、ＮａＣＮＢＨ３などの好適な還元剤の存在下で好ましくは行われる。一般に、分枝度は、カルボニル化合物とＤ−グルコサミン残基の比率を制御することによって制御される。
【００４２】
本発明の一つの実施形態において、前記カルボニル化合物は、アセトアルデヒドであり、これに前記キトサンで分枝形成すると、図２に示されている構造が生じる。
【００４３】
本発明のもう一つの実施形態において、前記カルボニル化合物は、Ｄ−グルコースであり、これに前記キトサンで分枝形成すると、図３に示されている構造が生じる。
【００４４】
本発明のさらにもう一つの実施形態において、前記カルボニル化合物は、所望の平均ＤＰと鎖末端に反応性アルデヒド２，５−アンヒドロ−Ｄ−マンノースが得られるように硝酸で部分的な解重合反応を行うによってキトサンから誘導された、図４に示されているような多糖類またはオリゴ糖類である（非特許文献６０））。場合によっては、（非特許文献６１）が記載したように、その部分的に分解されたキトサンをさらにゲル濾過などの分画に付して、単分散性オリゴマー（単一ＤＰ）を得ることもできる。前記反応性アルデヒドを含有するこれらのオリゴマーを、さらに任意のキトサンと反応させて、図５に例示されているタイプの枝を生じることもできる。
【００４５】
本発明のもう一つの実施形態において、前記カルボニル化合物は、所望の平均ＤＰと正常な還元末端が得られるように酸またはキトサナーゼで部分的に加水分解することによってキトサンから誘導される多糖類またはオリゴ糖類である（非特許文献６２）。場合によっては、（非特許文献６３）が記載したように、その部分的に分解されたキトサンをさらにゲル濾過に付して、単分散性オリゴマー（単一ＤＰ）を得ることもできる。（非特許文献６４）がオリゴ糖類について総体的に記載しているように、前記還元末端を含有するこれらのオリゴマーをさらに任意のキトサンと反応させて、枝を生じることもできる。
【００４６】
当業者には、特定の組織および／または細胞を標的にするペプチドなどの他の分子ならびにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの安定剤で分枝形成したキトサンを生成できることは、ご理解いただけよう。
【００４７】
本発明の組成物の核酸は、前記核酸が宿主細胞に導入された時にその機能を発現することとなるコード配列を適切に含む。
【００４８】
本発明のもう一つの好ましい実施形態によると、前記核酸は、ＲＮＡ分子およびＤＮＡ分子から成る群より選択される。これらのＲＮＡ分子およびＤＮＡ分子は、環状分子、線状分子または両者の混合物から成りうる。好ましくは、前記核酸は、プラスミドＤＮＡから成る。
【００４９】
本発明の一つの態様によると、前記核酸は、治療活性、診断活性、免疫原活性または抗原活性を有する蛋白質、ポリペプチドまたはペプチドなどの生物学的活性産物をコードしているコード配列を含む。
【００５０】
本発明は、前記核酸が、蛋白質、酵素、ポリペプチド抗原もしくはポリペプチドホルモンをコードしているコード配列を含むか、前記核酸が、ＲＮＡ、すなわち化学的に修飾されたＲＮＡなどのアンチセンス分子として機能するヌクレオチド配列を含む、上記のような組成物にも関する。
【００５１】
本発明は、上記のような分枝型キトサンを提供する段階、（ａ）前記分枝型キトサンをｐＨ範囲３．５〜８．０の水性溶媒に暴露する段階、（ｂ）段階（ａ）の水性溶液を水性溶媒中の前記核酸と混合する段階、および（ｃ）インビボでの投与前に、段階（ｂ）で得られた生成物溶液を脱水して、高い組成物濃度を達成する段階を含む、本組成物の調製方法にも関する。段階（ｃ）は、（１）段階（ｂ）において生成物溶液の液体を蒸発させて、所望の濃度を得ることによって、または（２）段階（ｂ）において生成物溶液を凍結乾燥させ、その後、再構成して所望の濃度を得ることによって、達成することができる。典型的には、前記核酸は、段階（ｂ）では１ｎｇ／ｍＬ〜３００μｇ／ｍＬ、好ましくは１μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬ、最も好ましくは１０〜５０μｇ／ｍＬの濃度で存在し、段階（ｃ）（１）では、１０ｎｇ／ｍＬ〜３，０００μｇ／ｍＬ、好ましくは１０μｇ／ｍＬ〜１，０００μｇ／ｍＬ、最も好ましくは１００〜５００μｇ／ｍＬの濃度で存在する。
【００５２】
当業者には、負、中性または正の電荷比を含む、異なるアミン／リン酸塩電荷比で本組成物を生成できることは、ご理解いただけよう。
【００５３】
本発明は、さらに、本発明の組成物を使用し、哺乳動物に本組成物を導入する、哺乳動物への核酸の投与方法に関する。好ましくは、前記組成物は、経肺経路、経鼻経路、経口経路、口腔内経路、舌下経路、直腸内経路または経膣経路による粘膜組織への投与によって哺乳動物に導入される。特定の実施形態によると、前記組成物は、非経口経路によって哺乳動物に導入される。
【００５４】
本発明は、哺乳動物の予防的または療法的治療用の薬剤の製造、またはインビボもしくはインビトロでの診断法のための診断薬の製造、および特に、悪性疾患、自己免疫疾患、遺伝性疾患、病原感染および他の病的状態の予防的または療法的治療のための遺伝子療法、アンチセンス療法または遺伝学的ワクチン接種において使用するための薬剤の製造における上記組成物の使用にも関する。
【実施例１】
【００５５】
完全脱−Ｎ−アセチル化キトサン（ＦＡ＜０．０１）の調製
ＦＡが１．０の市販のキトサン（１０ｇ）を、不均一アルカリ脱アセチル化（気密ガラス容器内で４時間、１００℃で５０％（重量／重量）ＮａＯＨ溶液）により、さらに脱−Ｎ−アセチル化した。そのキトサンを濾過し、２ｘ１５０ｍＬのメタノールおよび１ｘ１５０ｍＬのメチルエーテルで洗浄した後、一晩、室温で乾燥させ、その後、０．２ＭのＮａＣｌおよび脱イオン水で透析した。１Ｈ  ＮＭＲ分光分析は、ＦＡ＜０．０１を示した。
【実施例２】
【００５６】
完全脱−Ｎ−アセチル化キトサン（ＤＰｎ＝２５）の解重合
キトサン（ＦＡ＜０．０１、ＨＣｌ形で５００ｍｇ）を、ＡｌｌａｎおよびＰｅｙｒｏｎ（１９８９、１９９５ａ，ｂ）が記載しているように亜硝酸（１７ｍｇのＮａＮＯ２）で解重合し、その後、ＮａＢＨ４による従来の還元を行って、透析し、凍結乾燥させた。そのキトサンは完全に還元されていることが見出され、１Ｈおよび１３Ｃ−ＮＭＲ分光分析により数平均重合度（ＤＰｎ）が２５であると判定された。
【実施例３】
【００５７】
反応性還元末端を有するＮ−アセチル化オリゴマーの調製
キトサン（ＦＡ＝０．５９、固有粘度［η］＝８２６ｍＬ／ｇ、５００ｍｇ、ＨＣｌ形）を２．５％（重量／重量）の酢酸３０ｍＬに溶解した。５分間、その溶液に窒素ガスを通してバブリングすることにより、溶解している酸素を除去した。４℃に冷却した後、調製したてのＮａＮＯ２溶液（１００ｍｇ）を添加し、暗所にて４℃で１２時間、反応を進行させた。その生成物を遠心分離（１０分間、５０００ｒｐｍ）し、濾過（８μｍ）して、完全Ｎ−アセチル化オリゴマーの不溶性画分を取り出して、凍結乾燥させた。
【実施例４】
【００５８】
Ｎ−アセチル化オリゴマーの分離およびそれらの化学構造の決定
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ３０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ）を充填した、二本の直列連結した２．５ｃｍ  ｘ  １００ｃｍカラムを用い、ｐＨ４．５の０．１５Ｍ  酢酸アンモニウム、流量０．８ｍＬ／分で溶出するゲル濾過により、上記オリゴマー（５００ｍｇ）を分離した。その溶出をオンライン屈折率（ＲＩ）検出器（Ｓｈｉｍａｚｕ  ＲＩＤ−６Ａ）によってモニターした。４ｍＬの画分を回収し、プールして、最終凍結段階後、精製オリゴマーを生じた。
【実施例５】
【００５９】
オリゴ糖類で分枝形成した完全脱−Ｎ−アセチル化キトサンの調製
以下の手順の後、精製三量体により完全脱−Ｎ−アセチル化キトサン（ＦＡ＜０．００１、ＤＰｎ＝２５）を還元Ｎ−アルキル化した：０．１Ｍ  ＮａＣｌを含有する０．１Ｍ酢酸中の低分子量完全脱−Ｎ−アセチル化キトサン（ＤＰｎ＝２５、Ｄ単位２０μｍｏｌ）、および完全Ｎ−アセチル化三量体（Ａ−Ａ−Ｍ）（２．０、１２、２０および４０μｍｏｌ）の溶液を四日間反応させた（５ｍＬ、ｐＨ５．５、室温）。それぞれ２時間後および２４時間後に、その反応混合物にＮａＣＮＢＨ３（５０ｍｇ）を添加した。反応の間、ｐＨは決して６．５を越えなかった。残った未反応三量体（Ａ−Ａ−Ｍ）を透析によって除去し、分枝形成されたキトサンを塩化物に転化させて、凍結乾燥し、−２０℃で保管した。
【実施例６】
【００６０】
Ｄ−グルコースで分枝形成した完全脱−Ｎ−アセチル化キトサンの調製
三量体（Ａ−Ａ−Ｍ）の代わりにＤ−グルコース（４．０μｍｏｌ）を使用したことだけは異なるが、実施例５で説明したのと同じ手順によって、完全脱−Ｎ−アセチル化キトサン（ＦＡ＜０．０１、ＤＰｎ＝２５）をＤ−グルコースで還元Ｎ−アルキル化した。
【実施例７】
【００６１】
アセトアルデヒドで分枝形成した完全脱−Ｎ−アセチル化キトサンの調製
三量体（Ａ−Ａ−Ｍ）の代わりにアセトアルデヒド（４．０μｍｏｌ）を使用したことだけは異なるが、実施例５で説明したのと同じ手順によって、完全脱−Ｎ−アセチル化キトサン（ＦＡ＜０．０１、ＤＰｎ＝２５）をアセトアルデヒドにより還元Ｎ−アルキル化した。
【実施例８】
【００６２】
分枝型キトサンおよびｐＤＮＡを含有する組成物の配合
キトサンオリゴマーと、６、１０および２０％アセトアルデヒドとグルコースそれぞれで、ならびに７、２３および４０％の三量体ＡＡＭで分枝形成したキトサンオリゴマーとを、実施例５から７で説明した方法に従ってキトサンから調製した。発光飛翔昆虫ルシフェラーゼプラスミドＤＮＡ（ｐＬｕｃ）をＡｌｄｅｖｒｏｎ，Ｆａｒｇｏ，ＮＤ，ＵＳＡから購入した。滅菌蒸留脱イオン水（ｐＨ６．２±０．１）中のカチオン性キトサンオリゴマーの保存溶液（２ｍｇ／ｍＬ）を調製し、その後、滅菌濾過した。ボルテックスミキサー（Ｈｅｉｄｏｌｐｈ  ＲＥＡＸ  ２０００，ＫＥＢＯ  Ｌａｂ，Ｓｐａｎｇａ，Ｓｗｅｄｅｎ）で激しく攪拌しながら滅菌水にカチオン性オリゴマーを添加し、その後、ｐＬｕｃを添加することによって、カチオン性キトサンオリゴマーとｐＬｕｃとの複合体を１０：１、３０：１および６０：１（＋／−）の電荷比で配合した。ｐＤＮＡの濃度は、１３．３μｇ／ｍＬで一定に保った。加えて、ｐＬｕｃを、以前に最適化された電荷比５：１（＋／−）（非特許文献６４）；（非特許文献６５）で、ＰＥＩ  ２５ｋＤａ（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｓｗｅｄｅｎ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）と配合した。
【００６３】
それらの複合体の安定性をアガロースゲル電気泳動アッセイで試験した。複合体の安定性は、分枝度に非常に依存していた。アセトアルデヒドおよびグルコースを用いて分枝度１０％および２０％で分枝形成したキトサンオリゴマーでは、安定な複合体が形成されなかった。このアッセイでは、４０％三量体で分枝形成したキトサンオリゴマーでも、安定な複合体は形成されなかった。
【００６４】
図７は、分枝型キトサンオリゴマーとｐＬｕｃとの安定な複合体の形成を示す、アガロースゲル遅延アッセイを示す図である。非置換キトサンオリゴマーと７％三量体ＡＡＭで分枝形成したキトサンは、すでに電荷比１０：１（＋／−）でｐＤＮＡとの安定な複合体を形成していた（図１）。しかし、それぞれ６％アセトアルデヒドおよびグルコースで分枝形成したキトサンオリゴマーと安定な複合体を形成するためには、６０：１（＋／−）といった高い電荷比が必要であった。
【実施例９】
【００６５】
分枝型キトサンオリゴマーおよびｐＤＮＡを含有する配合物での遺伝子発現研究
分枝型キトサンオリゴマーとｐＬｕｃとの複合体を実施例８で説明したようにして調製した。トランスフェクションの２４時間前、ヒト胎児腎臓上皮細胞系統２９３（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）を、９６ウエル組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）に集密度７０％で播種した。ヒト肺上皮細胞系統Ｃａｌｕ−３を９６ウエル組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ）に細胞数１００，０００／ｃｍ２で播種し、１４日間培養して、分化細胞を得た後、トランスフェクションした。トランスフェクション前に細胞を洗浄して、次に１ウエルあたり５０μＬ（ｐＬｕｃ  ０．３３μｇに対応する）の前記複合体配合物を添加した。５時間のインキュベーション後、それらの配合物を取り出し、０．２ｍＬの新鮮培地を添加した。その培地を、二日を越える実験では一日おきに充填した。指示されている時点で、細胞をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄して、溶解バッファ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）で溶解し、ルシフェラーゼ遺伝子発現を照度計（Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ＰｈＬ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）で測定した。発現されたルシフェラーゼの量は、発光飛翔昆虫ルシフェラーゼ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓｅ，ＭＯ）を用いて作成した標準曲線から判定した。各サンプルの総蛋白含量は、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）によって分析し、比較蛋白質としてＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を用いて定量した。マイクロプレート・リーダー（Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ  ＭＣＣ／３４０，Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｏｙ，Ｈｅｌｓｉｎｋｉ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を用い、５４０ｎｍでの吸収を測定した。ルシフェラーゼ遺伝子発現（ルシフェラーゼ（ｐｇ）／総細胞蛋白質（μｇ））は、平均値±一つの基準値（ｎ＝３〜６）として報告される。
【００６６】
図８は、分枝型キトサンオリゴマーとｐＬｕｃとの複合体でトランスフェクションしてから７２時間後の２９３細胞におけるルシフェラーゼ遺伝子発現に対する分枝分子の影響を示す図である。トランスフェクション効率の順位は、７％三量体ＡＡＭ＞６％グルコース＞６％アセトアルデヒド＞非分枝型キトサンオリゴマーであった。
【００６７】
図９は、三量体分枝型キトサンオリゴマーとＰＬｕｃとの複合体でトランスフェクションしてから７２時間後の（Ａ）２９３細胞および（Ｂ）Ｃａｌｕ−３細胞におけるルシフェラーゼ遺伝子発現に対する三量体ＡＡＭでの分枝度の影響を示す図である。２９３細胞での効率の順位は、ＰＥＩ＝７％三量体＞２３％三量体＞非分枝型キトサンオリゴマー＞４０％三量体であった。驚くべきことに、Ｃａｌｕ−３細胞系統では、別の効率順位が得られた：７％三量体＞２３％三量体＞ＰＥＩ＞非分枝型キトサンオリゴマー＞４０％三量体。分枝度４０％のオリゴマーで得られた低いトランスフェクション効率は、この高い分枝度では不安定な複合体が形成されるということで説明できる。
【００６８】
図１０は、７％三量体ＡＡＭで分枝形成したキトサンオリゴマーを用いてトランスフェクションした後の（Ａ）２９３細胞および（Ｂ）Ｃａｌｕ−３細胞におけるルシフェラーゼ遺伝子発現の経時的研究を示す図である。驚くべきことに、２９３細胞系統では、７％三量体ＡＡＭで分枝形成したキトサンオリゴマーをベースにしたｐＬｕｃ複合体で、ＰＥＩに匹敵する早い遺伝子発現開始が認められた。Ｃａｌｕ−３細胞系統でも、７％三量体ＡＡＭで分枝形成したキトサンオリゴマーは、ＰＩＥと比べて１０倍高くルシフェラーゼ遺伝子発現を媒介した。
【００６９】
引用文献一覧
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【特許文献２】国際公開公報第０１／４１８１０号公報
【特許文献３】国際公開公報第０１／４１８１０号公報
【特許文献４】国際公開公報第０１／４２９７５号公報
【特許文献５】米国特許第５，９７２，７０７号明細書
【００７０】
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【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】キトサンの化学構造を示す図である。この例では、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン残基（Ａ単位）１個、およびβ−Ｄ−グルコサミン残基（Ｄ単位）３個を含有する、キトサン鎖のフラグメントを示す。Ｄ単位のアミノ基は、ｐＨに依存してプロトン化形であることもあるし、非プロトン化形であることもある。
【図２】アセトアルデヒドでの還元Ｎ−アルキル化により枝が導入されて、アミノ基上の置換基としてエチル基を得た、分枝型キトサンの例を示す図である。その分枝度は、例えば、添加するアセトアルデヒドの量を変えることによって、または反応時間を変えることによって制御することができる。
【図３】Ｄ−グルコースでの還元Ｎ−アルキル化により枝を導入した、分枝型キトサンを示す図である。
【図４】還元末端に対応する鎖末端に位置する２，５−アンヒドロ−Ｄ−マンノフラノース（Ｍ）残基を含有するキトサンの化学構造を示す図である。この例では、残留残基すべてが、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＦＡ＝１．０）である。
【図５】還元アミノ化によるキトサンのアミノ基への三量体ＡＡＭの枝形成を示す図である。
【図６】分枝度（ＤＳ）が異なるＡＡＭ枝を含有する４つのキトサン（ＤＰｎ＝２５、ＦＡ＜０．００１）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図７】分枝型キトサンとｐＬｕｃとの安定な複合体の形成を示すアガロースゲル遅延アッセイを示す図である。
【図８】分枝型キトサンオリゴマーとｐＬｕｃとの安定な複合体でトランスフェクションしてから７２時間後の２９３細胞におけるルシフェラーゼ遺伝子発現に対する分枝分子の影響を示す図である。
【図９】三量体の分枝型キトサンオリゴマーとＰＬｕｃとの複合体でトランスフェクションしてから７２時間後の（Ａ）２９３細胞および（Ｂ）Ｃａｌｕ−３細胞におけるルシフェラーゼ遺伝子発現に対する三量体での分枝度の影響を示す図である。
【図１０】７％三量体ＡＡＭで分枝形成したキトサンオリゴマーを用いてトランスフェクションした後の（Ａ）２９３細胞および（Ｂ）Ｃａｌｕ−３細胞におけるルシフェラーゼ遺伝子発現の経時的研究を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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