(57)【要約】色素／蛍光特性が相互転換されている野生型色素／蛍光タンパク質の変異体をコードする核酸組成物に加え、それによりコードされるタンパク質が提供される。色素タンパク質を蛍光タンパク質へ相互転換する方法、およびその逆に相互転換する方法も提供される。前記の特定のタンパク質に、実質的に類似したタンパク質またはそれらの変異体も関心対象である。核酸の断片およびそれによりコードされるペプチドに加え、本発明のタンパク質に対する抗体、ならびにトランスジェニック細胞およびトランスジェニック生物も提供される。本発明のタンパク質および核酸の組成物は、様々な異なる適用において用途を見出す。最後に、例えば、本発明の核酸組成物を含む、このような適用において使用するためのキットが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
色素タンパク質または蛍光性タンパク質の相互転換された変異体をコードする核酸。
【請求項２】
色素タンパク質または蛍光性タンパク質が、刺胞動物種に由来する、請求項1記載の核酸。
【請求項３】
色素タンパク質または蛍光性タンパク質が、非生物発光性刺胞動物種に由来する、請求項1または2記載の核酸。
【請求項４】
非生物発光性刺胞動物種が、花虫綱種である、請求項1、2または3記載の核酸。
【請求項５】
相互転換された変異体が、148位および165位での変異から選択される点変異を含む、請求項1から4のいずれか一項記載の核酸。
【請求項６】
相互転換された変異体が、148位および165位の両方での点変異を含む、請求項5記載の核酸。
【請求項７】
相互転換された変異体が、色素タンパク質の蛍光性変異体である、請求項6記載の核酸。
【請求項８】
相互転換された変異体が、167位および203位に点変異をさらに含む、請求項5記載の核酸。
【請求項９】
相互転換された変異体が、蛍光性タンパク質の非蛍光性色素タンパク質である、請求項8記載の核酸。
【請求項１０】
請求項1から9のいずれか一項記載の核酸の断片。
【請求項１１】
ベクターおよび請求項1から10記載の核酸を含む、構築物。
【請求項１２】
(a)発現宿主において機能的な転写開始領域；
(b)請求項1から10記載の核酸；および
(c)該発現宿主において機能的な転写終結領域
を含む、発現カセット。
【請求項１３】
宿主細胞への発現カセットの導入の結果として、染色体外要素の一部として存在するか、または宿主細胞のゲノムへ組込まれた、請求項12記載の発現カセットを含む細胞、またはその子孫。
【請求項１４】
色素タンパク質および／または蛍光性タンパク質を作製する方法であって：
請求項13記載の細胞を増殖させ、これにより該タンパク質が発現される段階；および
実質的に他のタンパク質を含まない該タンパク質を単離する段階
を含む方法。
【請求項１５】
請求項1から10記載の核酸によりコードされる、タンパク質またはその断片。
【請求項１６】
請求項15記載のタンパク質に特異的に結合する抗体。
【請求項１７】
請求項1から10記載の核酸である導入遺伝子を含む、トランスジェニック細胞またはその子孫。
【請求項１８】
色素タンパク質または蛍光性タンパク質を利用する適用において、請求項15記載のタンパク質を利用する段階を含む改良。
【請求項１９】
色素タンパク質または蛍光性タンパク質を利用する適用において、請求項1から10記載の核酸を利用する段階を含む改良。
【請求項２０】
請求項1から10記載の核酸を含むキット。
【請求項２１】
親色素/蛍光性タンパク質の相互転換された変異体をコードする核酸を作製する方法であって：
該相互転換された変異体をコードする該核酸を作製するために、該親タンパク質と比較して、148位および165位から選択される少なくとも1個の点変異を有するタンパク質をコードする核酸を作製する段階
を含む方法。
【請求項２２】
作製された核酸が、148位および165位の両方に点変異を有するタンパク質をコードする、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
相互転換された変異体が、親非蛍光性色素タンパク質の蛍光性変異体である、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
作製された核酸が、167位および203位での変異をさらに含むタンパク質をコードする、請求項22記載の方法。
【請求項２５】
相互転換された変異体が、親蛍光タンパク質の非蛍光色素タンパク質である、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
相互転換された変異体をコードする核酸であって、請求項21から25のいずれか一項記載の方法により作製される核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
米国特許法(35 U.S.C.)第119条(e)項に準拠し、本出願は、2001年12月26日に出願された米国仮特許出願第60/343,128号の出願日に対する優先権を主張するものであり；その開示は本明細書に参照として組み入れられている。
【０００２】
序論
発明の分野
本発明の分野は、色素タンパク質および蛍光性タンパク質である。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
標識は、関心対象のタンパク質、細胞、または生物に印をつけるための道具であり、多くの生化学、分子生物学、および医学的診断適用において顕著な役割を果たしている。放射性標識、色素標識、蛍光標識、化学発光標識等を含む多様な異なる標識が開発されている。しかしながら、新規の標識の開発への関心は依然としてある。特に関心があるのは、色素タンパク質および／または蛍光性タンパク質標識を含む、新規のタンパク質標識の開発である。
【０００４】
関連文献
関心対象の米国特許には、第6,066,476号；第6,020,192号；第5,985,577号；第5,976,796号；第5,968,750号；第5,968,738号；第5,958,713号；第5,919,445号；第5,874,304号；および第5,491,084号が含まれる。関心対象の国際特許出願には、国際公開公報第00/46233号；国際公開公報第99/49019号；およびDE 197 18 640 Aが含まれる。Anderluhら、Biochemical and Biophysical Research Communications（1996）220：437-442；Dove ら、Biological Bulletin（1995）189：288-297；Fradkovら、FEBS Lett.（2000）479（3）： 127-30；Gurskayaら、FEBS Lett.,（2001）507（1）：16-20；Gurskayaら、BMC Biochem.（2001）2：6；Lukyanov,K.ら、（2000）J Biol Chemistry 275（34）：25879-25882；Macekら、Eur.J.Biochem.（1995）234：329-335；Martynovら、J Biol Chem.（2001）276： 21012-6；Matz,M.V.ら（1999）Nature Biotechnol.,17：969-973；Terskikhら、Science（2000）290：1585-8；Tsien, Annual Rev. of Biochemistry（1998）67：509-544；Tsien, Nat. Biotech. （1999）17：956-957；Wardら、J.Biol.Chem.（1979）254：781-788；Wiedermannら、Jarhrestagung der Deutschen Gesellschact fur Tropenokologie-gto.Ulm.17-19.02.1999.Poster P-4.20；Yarbroughら、Proc Natl Acad Sci U S A（2001）98：462-7も関心対象である。
【０００５】
発明の概要
それらの色素／蛍光特性が相互転換された野生型色素／蛍光タンパク質の変異体をコードする核酸組成物に加え、それらにコードされたタンパク質が提供される。色素タンパク質を蛍光性タンパク質に相互転換する方法、およびその反対に相互転換する方法も提供される。前記の特定のタンパク質に実質的に類似しているタンパク質またはその変異体もまた関心対象である。更にこれらの核酸の断片およびそれによりコードされたペプチドに加え、本発明のタンパク質に対する抗体、ならびにトランスジェニック細胞および生物も提供される。本発明のタンパク質および核酸の組成物は、様々な異なる適用における用途が見出される。最後に、このような適用における使用のための、例えば、本発明の核酸組成物を含むキットが提供される。
【０００６】
定義
本発明に従い、当技術分野の技術の範囲内にある従来の分子生物学、微生物学、および組み換えDNA技術が利用され得る。そのような技術は、文献中に充分に説明されている。例えば、Maniatis、Fritsch、およびSambrook、「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」（1982）；「DNA Cloning：A Practical Approach」、第IおよびII巻（D.N.Glover編 1985）；「Oligonucleotide Synthesis」（M.J.Gait編 1984）；「Nucleic Acid Hybridization」（B.D.HamesおよびS.J.Higgins編（1985））；「Transcription and Translation」（B.D.HamesおよびS.J.Higgins編（1984））；「Animal Cell Culture」（R.I.Freshney編（1986））；「Immobilized Cells and Enzymes」（IRL Press,（1986））；B. Perbal、「A Practical Guide To Molecular Cloning」（1984）を参照のこと。
【０００７】
「ベクター」とは、別のDNAセグメントが、そのセグメントの複製が行われるように付加され得る、プラスミド、ファージ、またはコスミドのようなレプリコンである。
【０００８】
「DNA分子」とは、一本鎖形態または二本鎖ヘリックスのいずれかのデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミン、またはシトシン）の重合体形態をさす。この用語は、分子の一次構造および二次構造のみをさし、任意の特定の三次形態に分子構造を制限するものではない。従って、この用語には、特に直鎖状DNA分子（例えば、制限断片）、ウイルス、プラスミド、および染色体に見出される二本鎖DNAが含まれる。
【０００９】
DNA「コード配列」とは、適切な制御配列の調節下に置かれた場合に、インビボで転写されポリペプチドへと翻訳されるDNA配列である。コード配列の境界は、5'（アミノ）末端の開始コドンおよび3'（カルボキシル）末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列には、これらに制限はされないが、原核生物配列、真核生物mRNAに由来するcDNA、真核生物（例えば、哺乳動物）DNAに由来するゲノムDNA配列、および合成DNA配列が含まれ得る。ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列が、コード配列の3'に位置していてもよい。
【００１０】
本明細書において使用されるように、「ハイブリダイゼーション」という用語は、相対するの核酸鎖の残基間の水素結合によって安定化された逆平行二重鎖を形成するための、2個の核酸鎖の会合の過程をさす。
【００１１】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、短い（100塩基長未満の）核酸分子をさす。
【００１２】
「DNA制御配列」とは、本明細書において使用されるように、宿主細胞におけるコード配列の発現を提供および／または制御する、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター等のような転写および翻訳の調節配列である。
【００１３】
「プロモーター配列」とは、細胞内でRNAポリメラーゼと結合し、下流（3'方向）のコード配列の転写を開始させることができるDNA制御領域である。本発明を定義する目的のため、プロモーター配列は、転写開始部位を3'末端の境界とし、バックグラウンドを超える検出可能なレベルで転写を開始させるために必要な最少数の塩基、または要素を含むように、上流（5'方向）に拡がっている。プロモーター配列内には、転写開始部位のみならずRNAポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメインが見い出されると考えられる。真核生物のプロモーターは、常にではないが、多くの場合、「TATA」ボックスおよび「CAT」ボックスを含有しているであろう。誘導可能プロモーターを含む様々なプロモーターが、本発明の様々なベクターを駆動するために使用され得る。
【００１４】
本明細書において使用されるように、「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」という用語は、各々が特異的なヌクレオチド配列で、またはその近傍で二本鎖DNAを切断する細菌酵素をさす。
【００１５】
外因性または異種のDNAが細胞内に導入されている場合、その細胞は、そのようなDNAによって「形質転換」または「トランスフェクト」されている。形質転換DNAは、細胞のゲノムへ組み込まれて（共有結合して）いてもよく、またはそうでなくてもよい。例えば、原核生物、酵母、および哺乳動物細胞においては、形質転換DNAは、プラスミドのようなエピソーム要素上に維持され得る。真核細胞に関して、安定に形質転換された細胞とは、形質転換DNAが、染色体複製を通じて娘細胞によって受け継がれるように、染色体へ組み込まれているものである。この安定性は、形質転換DNAを含有している娘細胞の集団から構成される細胞株またはクローンを確立する真核細胞の能力によって証明される。「クローン」とは、有糸分裂によって単一の細胞または共通の祖先より派生した細胞の集団である。「細胞株」とは、多くの世代にわたりインビトロで安定に増殖することができる初代細胞のクローンである。
【００１６】
DNA構築物の「異種」領域とは、自然界において、より大きなDNA分子に関連して見出されない、そのより大きな分子中の同定可能なDNAのセグメントである。従って、異種領域が哺乳動物遺伝子をコードする場合、その遺伝子は通常、起源生物のゲノムにおいて哺乳動物ゲノムDNAと隣接していないDNAと隣接していると考えられる。もう一つの例において、異種DNAには、融合タンパク質生成物を作製するために二つの異なる起源に由来する遺伝子の一部が集められた構築物の中のコード配列が含まれる。対立遺伝子変化または天然に存在する変異事象は、本明細書において定義されるようなDNAの異種領域を生成しない。
【００１７】
本明細書において使用されるように、「レポーター遺伝子」という用語は、構築物が組織または細胞へ導入された場合に、産物が容易かつ定量的にアッセイされ得る、異種のプロモーター要素またはエンハンサー要素に付加されたコード配列をさす。
【００１８】
本明細書に記載されたアミノ酸は、「L」異性体であることが好ましい。アミノ酸配列は、一文字記号（A：アラニン；C：システイン；D：アスパラギン酸；E：グルタミン酸；F：フェニルアラニン；G：グリシン；H：ヒスチジン；I：イソロイシン；K：リジン；L：ロイシン；M：メチオニン；N：アスパラギン；P：プロリン；Q：グルタミン；R：アルギニン；S：セリン；T：トレオニン；V：バリン；W：トリプトファン；Y：チロシン；X：任意の残基）で与えられる。NH2は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基をさす。COOHは、ポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離カルボキシ基をさす。標準的なポリペプチド命名法に沿って、J Biol.Chem.,243（1969）,3552-59が使用される。
【００１９】
「免疫学的に活性な」という用語は、天然の、組換えの、または合成の色素／蛍光性タンパク質またはそれらの任意のオリゴペプチドの、適切な動物または細胞において特異的な免疫応答を誘導する能力、および特異的抗体と結合する能力を定義する。本明細書において使用されるように、「抗原性アミノ酸配列」とは、単独でまたは担体分子と会合して、哺乳動物において抗体応答を誘発することができるアミノ酸配列を意味する。抗体の抗原への結合に関連して、「特異的結合」という用語は、当技術分野においてよく理解されている用語であり、抗体が、その抗体を産生させた抗原と結合し、その他の無関係な抗原とは結合しないことさす。
【００２０】
本明細書において使用されるように、「単離された」という用語は、そのポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、または宿主細胞が天然に存在する環境とは異なる環境に存在するポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、または宿主細胞を記載することが意図される。
【００２１】
生物発光（BL）とは、暗所において充分可視であり、動物の視覚的な行動に影響を与える、生物による光の放射と定義される（例えば、Harvey, E.N.（1952）. Bioluminescence. New York：Academic Press；Cell Physiology （N. Speralakis編）pp.651-681における、Hastings,J.W.（1995）. Bioluminescence. New York：Academic Press.；Wilson,T.およびHastings,J.W.（1998）. Bioluminescence.Annu Rev Cell Dev Biol 14,197-230を参照のこと）。生物発光には、高感度の照度測定装置を使用して事実上全ての生物構造において検出され得る、いわゆる極微弱光放射（Murphy,M.E.およびSies,H.（1990）, Visible-range low-level chemiluminescence in biological systems. Meth.Enzymol.186,595-610；Radotic,K,Radenovic,C,Jeremic,M.（1998）Spontaneous ultra-weak bioluminescence in plants：origin, mechanisms and properties. Gen Physiol Biophys 17,289-308）、およびタケ成長円錐の発光（Totsune,H.,Nakano,M.,Inaba,H.（1993）. Chemiluminescence from bamboo shoot cut. Biochem.Biophys.Res Comm.194,1025-1029）、または動物卵の受精中の光の放射（Klebanoff,S. J., Froeder, C. A., Eddy, E. M.,Shapiro,B.M.（1979）. Metabolic similarities between fertilization and phagocytosis. Conservation of peroxidatic mechanism. J.Exp.Med.149,938-953；Schomer,B.およびEpel,D.（1998）. Redox changes during fertilization and maturation of marine invertebrate eggs. Dev Biol 203,1-11）のような、おそらくいかなる生態学的役割も果たさない微弱光放射は含まれない。
【００２２】
具体的態様の説明
色素／蛍光特性が相互転換された野生型色素／蛍光タンパク質の変異体をコードする核酸組成物に加え、それにコードされるタンパク質が提供される。色素タンパク質の蛍光性タンパク質への相互転換、およびその逆の相互転換の方法も提供される。前記の特定のタンパク質に実質的に類似しているタンパク質またはその変異体も関心対象である。核酸の断片およびそれによりコードされたペプチドに加え、本発明のタンパク質に対する抗体ならびにトランスジェニック細胞および生物も提供される。本発明のタンパク質および核酸組成物は、様々な異なる適用における使用が認められる。最後に、このような適用における使用のための、例えば、本発明の核酸の組成物を含むキットが提供される。
【００２３】
本発明をさらに記載する前に、本発明は下記の本発明の特定の態様に制限されず、特定の態様の変形物が作成されてもよく、それらも添付の特許請求の範囲内に含まれることを理解されたい。利用された語法は、特定の態様を記載するためのものであり、本発明を制限するものではないことも理解されたい。その代わり、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって確立される。
【００２４】
この明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形の「一つの（a）」、「一つの（an）」、および「その（the）」には、特記しない限り、複数形の言及が含まれる。他に定義しない限り、本明細書において使用された全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有している。
【００２５】
ある範囲の値が提供される場合には、その範囲の上限と下限との間に入るそれぞれの値（特記しない限り、下限の単位の10分の1まで）、およびその記述された範囲における他の任意の記述された値または間に入る値が、本発明に包含されることが理解される。これらのより小さな範囲の上限および下限は、記述された範囲において任意の限度が特に除外される条件において、独立にそのより小さな範囲に含まれてもよく、同様に本発明に包含される。記述された範囲が、限度の一方または両方を含む場合、含まれている限度のいずれかまたは両方を除く範囲も、本発明に含まれる。
【００２６】
他に定義しない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語は、全て、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有している。本明細書に記載されたものと類似しているかまたは等価である任意の方法、機器、および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法、機器、および材料が以下に記載される。
【００２７】
本明細書において言及された全ての刊行物は、本明細書に記載された発明に関して使用され得る、刊行物中に記載されている細胞株、ベクター、方法論、およびその他の発明の構成要素を記載かつ開示する目的のため、参照として本明細書に組み込まれる。
【００２８】
本発明のさらなる記載においては、まず本発明の核酸組成物、ならびにその作製方法を記載し、続いて本発明のタンパク質組成物、抗体組成物、およびトランスジェニック細胞／生物について考察する。次に、本発明のタンパク質が有益である代表的な方法の概要を提供する。
【００２９】
核酸組成物
上記で要約されたように、本発明は、それらの対応する野生型タンパク質から相互転換された変異体色素タンパク質および蛍光タンパク質に加え、これらのタンパク質の断片および相同体をコードする核酸組成物を提供する。色素タンパク質および／または蛍光性タンパク質とは、発色されるタンパク質、すなわち着色されたタンパク質を意味し、ここでタンパク質は、蛍光性であってもなくてもよく、例えば励起波長の光が照射された場合に、低い、中程度の、または高い蛍光を示すことができる。いずれにしても、関心対象の本発明のタンパク質は、発色特性、すなわち色素および／または蛍光特性が、タンパク質の2つまたはそれ以上の残基の相互作用から生じるものであり、タンパク質の単独の残基、より具体的には単独の残基の単独の側鎖から生じないものである。このように、本発明の蛍光タンパク質は、それ自身が内在性の蛍光団として作用する残基、すなわち、トリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニンからのみの蛍光を示すタンパク質を含まない。このようにして、本発明の蛍光性タンパク質は、その蛍光が、前記の特定した単独の残基以外のタンパク質内の何らかの構造から生じる、例えば、2つまたはそれよりも多い残基の相互作用から生じる、蛍光性タンパク質である。
【００３０】
核酸組成物とは、本発明の色素／蛍光ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するDNA配列、すなわち、色素／蛍光タンパク質遺伝子を含む組成物を意味し、かつ適当な条件下で本発明の色素／蛍光タンパク質として発現され得る。この用語には、本発明の核酸と相同的であるか、実質的に類似しているか、または同一である核酸も包含される。従って本発明は、本発明のタンパク質をコードする遺伝子およびそれらのコード配列に加え、それらの相同体も提供する。本発明の核酸は、それらの天然の環境以外に存在し、例えばこれらは、それらの天然の環境、例えばそれらが得られた生物体などから、単離され、濃縮された量などで存在する。
【００３１】
ある態様において、これらの核酸は、下記のいずれかから得られるタンパク質の変異体であるタンパク質をコードする点で、更に特徴付けられる：(1)非生物発光性種、多くは非生物発光性刺胞動物種、例えば非生物発光性花虫綱種(Anthozoan)；または、(2)ウミエラ目(Pennatulacean)種でない、すなわちウミエラ(sea pen)でない、花虫綱種。このように、核酸は、花虫綱種がウミエラ種でない限り、例えばこれらがウミシイタケ（Renillan）またはプチロサルカン(Ptilosarcan)種でない限りは、生物発光性花虫綱種由来のタンパク質をコードしてもよい。
【００３２】
ある態様において特に興味深いことは、下記の特定の野生型タンパク質(またはそれらの変異体)の相互転換された変異体である：(1)その開示が本明細書に参照として組み入れられている特許出願第10/006,922号に開示された、amFP485、cFP484、zFP506、zFP540、drFP585、dsFP484、asFP600、dgFP512、dmFP592；(2)その開示が本明細書に参照として組み入れられている特許出願第09/976,673号に開示された、hcFP640；(3)その開示が本明細書に参照として組み入れられている特許出願第60/255,533号に開示された、CgCP；ならびに、(4)その開示が本明細書に参照として組み入れられている特許出願第60/332,980号に開示された、hcriGFP、zoanRFP、scubGFP1、scubGFP2、rfloRFP、rfloGFP、mcavRFP、mcavGFP、cgigGFP、afraGFP、rfloGFP2、mcavGFP2、mannFP。
【００３３】
上記で要約されたように、本発明の核酸によりコードされたタンパク質は、親色素タンパク質および蛍光性タンパク質の相互転換された変異体である。相互転換された変異体は、そのスペクトル特性において、その対応する親タンパク質(すなわち、変異体がそのタンパク質の変異体であるようなタンパク質)とは異なる変異体タンパク質を意味する。より具体的には、相互転換された変異体は、反対の蛍光特性を有することによりその親タンパク質とは異なる変異体である。例えば、蛍光タンパク質の相互転換された変異体は、蛍光を欠いているものである(ここで、蛍光を欠くとは、変異体が実質的に非蛍光性であることを意味し、ここで変異体はその測定可能な蛍光が、下記実験の項に説明されたプロトコールを用い決定されたものとして、DsRed-NFの蛍光を約5倍を超えて、典型的には約3倍を超えて、より典型的には約2倍を超えて上回らない場合、実質的に非蛍光性である)が、色素タンパク質ではあり続ける。あるいは、色素タンパク質の相互転換された変異体は、親タンパク質がそうでない場合に、測定可能な蛍光(下記実験の項に説明されたプロトコールを用い決定されたもの)を示すことにより、親色素タンパク質とは異なるタンパク質である。
【００３４】
多くの態様において特に関心があるのは、148位および165位の少なくともひとつに点変異を有することにより、それらの親タンパク質(それらがそのタンパク質の変異体であるもの)とは異なる、相互転換された変異体であり、多くの態様において、これらの変異体は、これらの両方の位置において点変異を有する(これらの位置は、Matzら、Nature Biotech.(1999) 17:969-973)に説明された、蛍光タンパク質に関するGFP番号付け法を用いて同定された位置である)。色素タンパク質の相互転換された変異体に関して、これらの変異体が蛍光を示す場合、特に関心のある点変異は、148位および165位での点変異、例えば148のSへの変異および165位のVへの変異である。蛍光タンパク質の相互転換された変異体に関して、これらの変異体が色素タンパク質であるが、たとえあるにしても実質的に蛍光を示さない場合、特に関心のある点変異は、148位、165位、167位および203位での点変異、例えば148位のAまたはCへの変異、165位のSまたはNへの変異、167位のMへの変異、および203位のAへの変異である。
【００３５】
ある態様において、本発明の核酸によりコードされたタンパク質は、野生型イソギンチャクモドキ(Discosoma)種「赤色」蛍光タンパク質(DsRed)の変異体(drFP585)であり、このタンパク質の核酸コード配列およびアミノ酸配列は、その開示が本明細書に参照として組み入れられている特許出願第10/006,922号に開示されている。関心のある特定のDsRed変異体は、DsRed-NF(S148C、I165N、K167MおよびS203A)などの下記表2に列記されたものを含む。
【００３６】
ある態様において、本発明の核酸によりコードされたタンパク質は、ヘビイソギンチャク(Anemonia sulcata)由来の野生型紫色色素タンパク質asCPの変異体(asFP595)であり、このタンパク質の核酸コード配列およびアミノ酸配列は、その開示が本明細書に参照として組み入れられている特許出願第10/006,922号に開示されている。関心対象の特定のasCP変異体は、下記表2に列記されたものを含む。
【００３７】
前述の特異的な核酸組成物に加え、前記配列の相同体も関心がある。本発明の核酸の相同体に関して、相同遺伝子の供与源は、植物もしくは動物のいずれかの種であり、またはこの配列は全体的もしくは部分的に合成することができる。ある態様において、相同体間の配列類似性は、少なくとも約20％、時には少なくとも約25％であり、30％、35％、40％、50％、60％、70％、またはそれ以上、例えば75％、80％、85％、90％および95％もしくはそれ以上であってもよい。配列類似性は、保存されたモチーフ、コード領域、隣接領域などのような、より大きい配列のサブセットであり得る、参照配列に基づき計算される。参照配列は、通常、少なくとも約18ヌクレオチド長、より一般的には少なくとも約30ヌクレオチド長であり、比較される完全配列まで及んでいてもよい。配列解析のためのアルゴリズムは、当技術分野において公知であり、例えばAltschul(1990)、J. Mol. Biol.、215:403-10)に説明されたBLAST(デフォルト設定を使用、すなわち、パラメータw＝4およびT＝17)などである。本明細書に提供された配列は、データベース検索において関連した核酸および相同な核酸の認識のために必須である。ある態様において特に関心があるのは、本明細書において同定された核酸と実質的に同じ長さの核酸であり、ここで実質的に同じ長さとは、長さの差が約20個数(number)％を超えず、一般的には約10個数％、より一般的には約5個数％を超えないことを意味し；かつ、核酸の全長にわたり、これらの配列のいずれかと少なくとも約90％、一般的には少なくとも約95％、より一般的には少なくとも約99％同一な配列を有する。多くの態様において、これらの核酸は、本明細書において同定された配列と実質的に類似している(すなわち、同じである)か、または同一である配列を有する。実質的に類似しているとは、配列同一性が、全般に少なくとも約60％、通常少なくとも約75％、多くの場合少なくとも約80％、85％、90％、または更には95％であることを意味する。
【００３８】
前述の核酸によりコードされているが、遺伝暗号の縮重のために前述の核酸とは配列が異なるタンパク質をコードする核酸も提供される。
【００３９】
ストリンジェントな条件下で、前述の核酸にハイブリダイズする核酸も提供される。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、50℃またはそれ以上、および0.1×SSC(15mM塩化ナトリウム／1.5mMクエン酸ナトリウム)でのハイブリダイゼーションである。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の別の例は、50％ホルムアミド、5×SSC(150mM NaCl、15mMクエン酸三ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5×デンハルト液、10％硫酸デキストラン、および20μg/ml変性剪断サケ精子DNAの溶液中、42℃での一晩のインキュベーション、それに続く0.1×SSC中約65℃でのフィルター洗浄である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、少なくとも前述の代表的な条件と同じくらいストリンジェントなハイブリダイゼーション条件であって、前述の特定のストリンジェント条件に比べて、少なくとも約80％ストリンジェントである場合、典型的には少なくとも約90％ストリンジェントである場合に、その条件は少なくとも同じようにストリンジェントであると考えられる。他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、当技術分野において公知であり、本発明の特定の態様の核酸を同定するために利用され得る。
【００４０】
本発明のタンパク質の変異体をコードする核酸も提供される。変異核酸は、当技術分野において慣例的である周知の技術を使用して、無作為変異誘発または標的変異誘発により生成され得る。いくつかの態様において、相同体または変異体をコードする核酸によってコードされる色素タンパク質または蛍光性タンパク質は、野生型蛍光性タンパク質と同じ蛍光特性を有している。その他の態様において、相同体または変異核酸は、本明細書により詳細に記載されるように、改変されたスペクトル特性を有する色素タンパク質または蛍光性タンパク質をコードする。
【００４１】
特に関心がある変異体の一つのカテゴリは、非凝集性変異体である。多くの態様において、非凝集性変異体は、天然に存在するタンパク質または変異体の非凝集性変異体を作製するのに十分な様式で、例えば電荷を逆転させるかまたは中和するため、N末端残基の側鎖上に出現する電荷を調整するN末端の変異によって、野生型配列と異なっている（ここで、ある特定のタンパク質は、米国特許出願第60/270,983号（これの開示は参照として本明細書に組み込まれる）に報告されたアッセイを使用して非凝集性であると決定された場合に、非凝集性であると見なされる）。より具体的には、タンパク質のN-末端近傍に位置する塩基性残基は置換され、例えばN-末端に近接したLysおよびArg残基は、負に荷電した残基または中性残基により置換されている。関心対象の特定の非凝集性変異体は、FP1-NA；FP3-NA；FP4-NA；FP6-NA；E5-NA；6/9Q-NA；7A-NA；などを含むが、これらに限定されるものではなく、これらの特定の非凝集性変異体は、下記にさらに記載されている。
【００４２】
特に関心がある変異体のもう一つのカテゴリは、改変オリゴマー形成変異体（modulated oligomerization mutant）である。ある変異体は、オリゴマー形成特性が野生型タンパク質と比較して異なる場合、改変オリゴマー形成変異体であると見なされる。例えば、ある特定の変異体が、野生型よりオリゴマー形成の程度が高いかまたは低い場合、それは、オリゴマー形成変異体であると見なされる。特に関心があるのは、オリゴマー形成しない、即ち生理学的（例えば、細胞内）条件下で単量体であるか、または野生型よりオリゴマー形成の程度が低い、例えば細胞内条件下で二量体もしくは三量体であるオリゴマー形成変異体である。例えば、ある種の態様において、色素／蛍光性ドメインは天然に四量体を形成するタンパク質である。その他の態様において、ドメインは四量体形成タンパク質の変異体であって、四量体ではなく二量体を形成する変異体である。
【００４３】
本発明の核酸は、cDNAもしくはゲノムDNAまたはその断片であってよい。ある態様において、本発明の核酸は、特定の蛍光タンパク質およびポリペプチドをコードする1個または複数のオープンリーディングフレーム、ならびにイントロン、更にはコード領域を超え約20kbまで、しかしおそらくいずれかの方向にさらに遠くの、発現の調節に関与している隣接5'および3'非コードヌクレオチド配列を含む。本発明の核酸は、以下により詳細に説明されるように、染色体外維持(maintenance)または宿主ゲノムへの組込みのために適当なベクターへ導入することができる。
【００４４】
本明細書において使用される用語「cDNA」とは、天然の成熟型mRNA種において認められる配列要素の配置を共有する全ての核酸を含むことが意図されており、ここで配列要素とは、エキソンならびに5'および3'側非コード領域である。通常mRNA種は、隣接するエキソンを、介在するイントロンと共に有し、イントロンが存在する場合、核RNAスプライシングにより取り除かれ、タンパク質をコードする連続するオープンリーディングフレームを作出する。
【００４５】
関心対象のゲノム配列は、列記された配列において定義されるような、通常天然の染色体に存在する全てのイントロンを含む、開始コドンと停止コドンの間に存在する核酸を含む。これは更に、成熟型mRNAにおいて認められる5'および3'非翻訳領域をさらに含んでよい。これは、転写される領域の5'または3'末端のいずれかに隣接するゲノムDNAの、約1kbであるがそれ以上であり得る、プロモーター、エンハンサーなどの、特定の転写調節配列および翻訳調節配列をさらに含んでよい。ゲノムDNAは、100kbまたはそれよりも小さい断片として；かつ、実質的には隣接する染色体配列を含まずに、単離され得る。3'または5'のいずれかでコード領域に隣接するゲノムDNA、または時々イントロンにおいて認められる内部調節配列は、適当な組織および段階に特異的な発現に必要な配列を含む。
【００４６】
本発明の核酸組成物は、本発明のタンパク質の全部または一部をコードし得る。二本鎖または一本鎖の断片は、従来の方法によるオリゴヌクレオチドの化学合成、制限酵素消化、PCR増幅等によってDNA配列より入手され得る。大抵、DNA断片は、少なくとも約15nt、通常は少なくとも約18ntまたは約25 ntであると考えられるが、少なくとも約50ntであってもよい。いくつかの態様において、本発明の核酸分子は、約100nt、約200nt、約300nt、約400nt、約500nt、約600nt、約700nt、または約720ntの長さであり得る。本発明の核酸は、本発明のタンパク質の断片または完全長タンパク質をコードすることができ、例えば、本発明の核酸は、約25aa、約50aa 、約75aa 、約100aa 、約125aa、約150aa、約200aa、約210aa、約220aa、約230aa、または約240aa、最大でタンパク質全体の長さまでのポリペプチドをコードし得る。
【００４７】
本発明の核酸は、単離され、かつ実質的に純粋状態で、一般には完全な染色体以外のものとして得られる。通常DNAは、本発明の核酸またはその断片を含まないその他の核酸配列を、実質的に含まないように得られ、全般に少なくとも約50％、一般に少なくとも約90％の純度であり、典型的には「組換え体」である、すなわち、天然の染色体においては通常会合しないような1個または複数のヌクレオチドにより隣接されている。
【００４８】
本発明のポリヌクレオチド、対応するcDNA、完全長遺伝子、およびそれらの構築物が提供される。これらの分子は、当業者に公知の多くの異なるプロトコールにより合成的に作成することができる。適当なポリヌクレオチド構築物は、例えば、Sambrookら、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、第2版(1989)、Cold Spring Harbor Press、Cold Spring Harbor、NY)に記載される標準の組換えDNA技術を用い、かつ米国保健社会福祉省(United States Dept. of HHS)国立衛生研究所(NIH)の組換えDNA研究に関する指針に記載された現行の規制に従い精製される。
【００４９】
第二のタンパク質、例えば分解配列、シグナルペプチドなどに融合されている、本発明のタンパク質の融合タンパク質、またはそれらの断片をコードする核酸も提供される。融合タンパク質は、本発明のポリペプチドまたはそれらの断片、ならびに本発明のペプチドのN-末端および／またはC-末端にインフレームで融合された非花虫綱ポリペプチド（融合パートナー）を含んでも良い。融合パートナーは、融合パートナーに特異的な抗体に結合することができるポリペプチド(例えば、エピトープタグ)；抗体またはその結合断片；触媒機能を提供するかまたは細胞反応を誘導するポリペプチド；リガンドもしくは受容体またはそれらの模倣体；などを含むが、これらに限定されない。このような融合タンパク質において、融合パートナーは、一般に、融合タンパク質の花虫綱部分に天然には会合せず、かつ典型的に花虫綱タンパク質またはその誘導体／断片ではなく、すなわちこれは花虫綱種においては見出されない。
【００５０】
増幅、タンパク質生産等を含む、多数の異なる適用のために使用され得る、ベクターに挿入された本発明の核酸を含む構築物も提供される。プラスミドを含むウイルス・ベクターおよび非ウイルス・ベクターが、調製され使用され得る。ベクターの選択は、増幅が望まれる細胞の型および増幅の目的に依存するであろう。ある種のベクターは、所望のDNA配列を増幅し、大量に作製するために有用である。培養細胞における発現に適しているベクターも存在する。さらに、完全な動物またはヒトの体内の細胞における移入および発現に適しているベクターも存在する。適切なベクターの選択は、十分に当技術分野の技術の範囲内にある。多くのそのようなベクターが、市販されている。構築物を調製するためには、部分的または完全長のポリヌクレオチドが、典型的にベクター内の切断された制限酵素部位へのDNAリガーゼによる付加によって、ベクターへと挿入される。または、所望のヌクレオチド配列は、インビボにおける相同的組み換えによって挿入され得る。典型的には、これは、ベクターの所望のヌクレオチド配列の両側に相同領域を付加することにより達成される。相同領域は、例えば、オリゴヌクレオチドのライゲーションによって、または相同領域および所望のヌクレオチド配列の一部の両方を含むプライマーを使用した、ポリメラーゼ連鎖反応によって追加される。
【００５１】
適用の中でも、とりわけ本発明のタンパク質の合成において有益である発現カセットまたは発現系も提供される。発現のため、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる遺伝子産物は、例えば細菌、酵母、昆虫、両生動物、および哺乳動物の系を含む任意の便利な発現系において発現される。適当なベクターおよび宿主細胞は、米国特許第5,654,173号に記載されている。発現ベクターにおいて、本発明のポリヌクレオチドは、所望の発現特性を得るため、適宜制御配列と連結される。これらの制御配列には、プロモーター（センス鎖の5'末端、またはアンチセンス鎖の3'末端に付加される）、エンハンサー、ターミネーター、オペレーター、リプレッサー、およびインデューサーが含まれ得る。プロモーターは、制御型または構成型であってもよい。いくつかの状況においては、組織特異的プロモーターまたは発達段階特異的プロモーターのような、条件活性プロモーターを使用することが望まれ得る。これらは、ベクターとの連結に関する前記の技術を使用して、所望のヌクレオチド配列に連結される。当技術分野において既知の任意の技術が使用され得る。換言すると、発現ベクターは、誘導可能であるか、または構成型であってもよい、転写および翻訳の開始領域（コード領域が、転写開始領域の転写調節下で機能可能に連結されている）、ならびに転写および翻訳の終結領域を提供するであろう。これらの調節領域は、本発明の核酸が得られる本発明の種に在来するものであってもよいし、または外因的な起源に由来してもよい。
【００５２】
発現ベクターは、一般に、異種タンパク質をコードする核酸配列の挿入を提供するため、プロモーター配列の近傍に位置する便利な制限部位を有している。発現宿主において機能する選択可能マーカーが存在してもよい。発現ベクターは、とりわけ前記の融合タンパク質の生産のために使用され得る。
【００５３】
転写開始領域、遺伝子またはその断片、および転写終結領域を含む発現カセットが調製され得る。特に関心対象であるのは、通常は少なくとも8アミノ酸長、より通常には少なくとも約15アミノ酸長〜約25アミノ酸長、最大で遺伝子の完全なオープン・リーディング・フレームの長さまでの、機能性のエピトープまたはドメインの発現を可能にする配列の使用である。DNAの導入の後、構築物を含有している細胞が選択可能なマーカーによって選択され、その細胞が増幅され、次いで発現のために使用され得る。
【００５４】
前記の発現系は、発現の目的に依って、従来の方式に従い原核生物または真核生物を用いて利用され得る。タンパク質の大量生産のためには、大腸菌、枯草菌（B.subtilis）、出芽酵母（S.cerevisiae）のような単細胞生物、バキュロウイルス・ベクターと組み合わされた昆虫細胞、または脊椎動物のような高等生物の細胞、例えばCOS7細胞、HEK293、CHO、アフリカツメガエル（Xenopus）卵母細胞等が、発現宿主細胞として使用され得る。いくつかの状況においては、発現したタンパク質が、在来の折り畳みおよび翻訳後修飾の恩恵を得ると考えられる真核細胞において遺伝子を発現させることが望ましい。小さなペプチドは、実験室において合成することもできる。完全タンパク質配列のサブセットであるポリペプチドは、機能にとって重要なタンパク質の部分を同定し検討するために使用され得る。
【００５５】
関心対象の特定の発現系には、細菌、酵母、昆虫細胞、および哺乳動物細胞に由来する発現系が含まれる。これらの各カテゴリーからの代表的な系を、以下に挙げる。
【００５６】
細菌
細菌における発現系には、Changら、Nature（1978）275：615；Goeddelら、Nature（1979）281：544；Goeddelら、Nucleic Acids Res.（1980）8：4057；欧州特許第0 036,776号；米国特許第4,551,433号；DeBoerら、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)（1983）80：21-25；およびSiebenlistら、Cell（1980）20：269に記載されたものが含まれる。 
【００５７】
酵母
酵母における発現系には、Hinnenら、Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）（1978）75：1929；Itoら、J.Bacteriol.（1983）153：163；Kurtzら、Mol.Cell.Biol.（1986）6：142；Kunzeら、J.Basic Microbiol.（1985）25：141；Gleesonら、J.Gen.Microbiol.（1986）132：3459；Roggenkampら、Mol.Gen.Genet.（1986）202：302；Dasら、J.Bacteriol.（1984）158：1165；De Louvencourtら、J.Bacteriol.（1983）154：737；Van den Bergら、Bio/Technology（1990）8：135；Kunzeら、J.Basic Microbiol.（1985）25：141；Creggら、Mol.Cell.Biol.（1985）5：3376；米国特許第4,837,148号および第4,929,555号；BeachおよびNurse、Nature（1981）300：706；Davidowら、Curr.Genet.（1985）10：380；Gaillardinら、Curr.Genet.（1985）10：49；Ballanceら、Biochem.Biophys.Res.Commun.（1983）112：284-289；Tilburnら、Gene（1983）26：205-221；Yeltonら、Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）（1984）81：1470-1474；KellyおよびHynes、EMBO J.（1985）4：475479；欧州特許第0 244,234号；および国際公開公報第91/00357号に記載されたものが含まれる。
【００５８】
昆虫細胞
昆虫における異種遺伝子の発現は、米国特許第4,745,051号；The Molecular Biology Of Baculoviruses（1986）（W.Doerfler編）における、Friesenら、The Regulation of Baculovirus Gene Expression；欧州特許第0 127,839号；欧州特許第0 155,476号；およびVlakら、J.Gen.Virol.（1988）69：765-776；Millerら、Ann.Rev.Microbiol.（1988）42：177；Carbonellら、Gene（1988）73：409；Maedaら、Nature（1985）315：592-594；Lebacq-Verheydenら、Mol.Cell.Biol.（1988）8：3129；Smithら、Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）（1985）82：8844；Miyajimaら、Gene（1987）58：273；およびMartinら、DNA（1988）7：99に記載されたようにして達成される。多数のバキュロウイルス株およびバリアント、ならびに対応する許容性昆虫宿主細胞が、Luckowら、Bio/Technology（1988）6：47-55、Millerら、Generic Engineering（1986）8：277-279、およびMaedaら、Nature（1985）315：592-594に記載されている。
【００５９】
哺乳動物細胞
哺乳動物発現は、Dijkemaら、EMBO J.（1985）4：761、Gormanら、Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）（1982）79：6777、Boshartら、Cell（1985）41：521、および米国特許第4,399,216号に記載されたようにして達成される。哺乳動物発現のその他の特質は、HamおよびWallace,Meth.Enz.（1979）58：44、BarnesおよびSato、Anal.Biochem.（1980）102：255、米国特許第4,767,704号、第4,657,866号、第4,927,762号、第4,560,655号、国際公開公報第90/103430号、国際公開公報第87/00195号、米国再発行特許第30,985号に記載されたようにして促進される。
【００６０】
上記の宿主細胞、またはその他の適切な宿主細胞もしくは宿主生物のいずれかが、本発明のポリヌクレオチドまたは核酸を複製、および／または発現させるために使用される場合、得られる複製した核酸、RNA、発現したタンパク質またはポリペプチドは、宿主細胞または宿主生物の産物として、本発明の範囲内に含まれる。産物は、当技術分野において既知の任意の適切な手段によって回収される。
【００６１】
選択されたポリヌクレオチドに対応する遺伝子が一旦同定されると、その発現を、遺伝子がその細胞に固有のものである細胞内で調節することができる。例えば、細胞の内因性遺伝子は、細胞内遺伝子の発現を少なくとも増強するのに十分な位置で細胞のゲノムに挿入された外因性調節配列により、調節され得る。この調節配列は、その開示が本明細書に参照として組み入れられている、米国特許第5,641,670号および第5,733,761号に開示された相同組換えによってゲノムに組み込むように設計されるか、またはその開示が本明細書に参照として組み入れられている、国際公開公報第99/15650号に開示された非相同組換えによりゲノムへ組み込むように設計され得る。このように、本発明には、上記に組み入れられた特許文書に説明されているような、コードする核酸自身を操作することなく、しかし、代わりに望ましいタンパク質をコードする遺伝子を既に含む細胞ゲノムへの調節配列の組込みを通じて、本発明のタンパク質を生成することも包含されている。
【００６２】
本発明の核酸の相同体も提供される。相同体は、多くの方法のいずれかにより同定される。提供されたcDNAの断片は、関心対象の標的生物からのcDNAライブラリーに対するハイブリダイゼーションプローブとして使用することができ、ここでは低いストリンジェンシー条件が使用される。このプローブは、大きい断片であっても、または1種もしくは複数の短い縮重プライマーであってもよい。配列類似性を有する核酸は、例えば、50℃および6×SSC(0.9M塩化ナトリウム／0.09Mクエン酸ナトリウム)の低ストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションにより検出され、1×SSC(0.15M塩化ナトリウム／0.015Mクエン酸ナトリウム)中、55℃で洗浄に供された場合に、結合が維持される。配列同一性は、例えば、50℃またはそれ以上でかつ0.1×SSC(15mM塩化ナトリウム／1.5mMクエン酸ナトリウム)のような、ストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションにより、決定することができる。例えば対立遺伝子変種、遺伝的に変更された遺伝子型などのような、提供された配列に実質的に同一の領域を有する核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、提供された配列に結合する。プローブ、特にDNA配列の標識プローブを使用することにより、相同または関連した遺伝子を単離することができる。
【００６３】
本発明のゲノム配列のプロモーター要素も関心対象であり、5'隣接領域の配列は、例えば、本発明のタンパク質遺伝子が発現される細胞／組織内での発現の調節を提供する、エンハンサー結合部位を含むプロモーター要素のために利用することができる。
【００６４】
本発明の核酸の小さいDNA断片も提供され、この断片は、PCRのプライマー、ハイブリダイゼーションスクリーニングプローブなどとして有用である。より大きいDNA断片、すなわち100ヌクレオチドより大きいものは、前項に説明されたような、コードされたポリペプチドの作製に有用である。幾何学的(geometric)PCRなどの、幾何学的増幅反応における使用のために、プライマー対が使用されると考えられる。プライマー配列の正確な組成は、本発明にとって重要ではないが、ほとんどの適用について、これらのプライマーは、当技術分野において公知であるように、このような本発明の配列に、ストリンジェント条件下でハイブリダイズすると考えられる。少なくとも約50ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約100ヌクレオチドの増幅産物を作製するプライマー対を選択することが好ましい。プライマー配列の選択のアルゴリズムは、一般に公知であり、市販のソフトウェアパッケージにおいて利用可能である。増幅プライマーは、DNAの相補鎖へハイブリダイズし、かつ互いに対しプライミング(prime)するであろう。
【００６５】
このDNAは、生物学的標本中の遺伝子の発現を同定するためにも使用することができる。ゲノムDNAまたはRNAのような、特定のヌクレオチド配列の存在に関して、細胞を探査する方式は、文献において良く確立されている。簡単に述べると、DNAまたはmRNAが、細胞試料から単離される。mRNAは、相補DNA鎖を形成するために逆転写酵素を用いるRT-PCR、引き続き本発明のDNA配列に対し特異的なプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応増幅により、増幅することができる。あるいは、mRNA試料は、ゲル電気泳動により分離され、例えばニトロセルロース、ナイロンなどの適当な支持体へ転写され、その後プローブとしての本発明のDNAの断片により、探査される。オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ法、インサイチューハイブリダイゼーション、および固体チップ上に整列化されたDNAプローブへのハイブリダイゼーションのような他の技術も、用途を見出すことができる。本発明の配列へハイブリダイズするmRNAの検出は、試料中の花虫綱種タンパク質遺伝子発現の指標となる。
【００６６】
隣接プロモーター領域およびコード領域を含む本発明の核酸は、当技術分野において公知の様々な方法で変異され、プロモーター強度、コードされたタンパク質の配列、コードされたタンパク質の蛍光特性を含むコードされたタンパク質の特性、などにおける標的化された変化を生成することができる。このような変異のDNA配列またはタンパク質の生成物は、通常本明細書に提供された配列に実質的に類似しており、例えば各々、少なくとも1個のヌクレオチドまたはアミノ酸が異なり、少なくとも2個、しかし約10個を超えないヌクレオチドまたはアミノ酸が異なっていてよい。これらの配列の変化は、置換、挿入、欠失またはそれらの組合せであることができる。欠失は更に、ドメインまたはエキソンの欠失、例えば、10、20、50、75、100、150またはそれよりも多いアミノ酸残基のストレッチの欠失などの、より大きい変化を含んでよい。クローニングされた遺伝子のインビトロ変異誘発の技術は公知である。部位特異的変異誘発のプロトコールの例は、Gustinら(1993)、Biotechniques、14:22；Barany(1985)、Gene、37:111-23；Colicelliら(1985)、Mol. Gen. Genet.、199:537-9；および、Prentkiら(1984)、Gene、29:303-13に見出されうる。部位特異的変異誘発の方法は、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、CSH Press社、1989年、15.3-15.108頁；Weinerら(1993)、Gene、126:35-41；Sayersら(1992)、Biotechniques、13:592-6；JonesおよびWinistorfer(1992)、Biotechniques、12:528-30；Barton(1990)ら、Nucleic Acids Res、18:7349-55；MarottiおよびTomich(1989)、Gene Anal. Tech.、6:67-70；ならびに、Zhu(1989)、Anal Biochem、177:120-4に見ることができる。このような変異した核酸誘導体を使用し、特定の色素／蛍光タンパク質の構造-機能関係を研究するか、またはその機能もしくは調節に影響を及ぼすタンパク質の特性を変更することができる。
【００６７】
多くの態様において特に関心があるのは、下記の特定の変異プロトコールであり、このプロトコールは、色素タンパク質(例えば、蛍光があるとしてもほとんど有さないような発色タンパク質)の蛍光変異体への変異において用途を見出す。このプロトコールにおいて、候補タンパク質の配列は、Matzら「Fluorescent proteins from non-bioluminescent Anthozoa species」、Nature Biotechnology、(1999年10月)、17:969-973に報告されたプロトコールに従い、エクオリア・ビクトリア(Aequorea victoria)野生型GFPのアミノ酸配列と整列化される。整列化された色素タンパク質の残基148が同定され、次に例えば部位特異的変異誘発によりSerへ変更され、これにより野生型色素タンパク質の蛍光変異体の生成をもたらす。例えば、下記に説明されるNFP-7を参照されたい（その野生型タンパク質は、148位での天然のAla残基をSerに置換することにより、蛍光タンパク質へ変異される、色素タンパク質である。
【００６８】
本発明の核酸のヒト化型も、関心対象である。本明細書において使用されるように、「ヒト化」という用語は、ヒト細胞におけるタンパク質の発現のためのコドンを最適化するために、核酸配列に対してなされる変化をさす（Yangら、Nucleic Acids Research 24 （1996）,4592-4593）。タンパク質のヒト化を記載している米国特許第5,795,737号（その開示は参照として本明細書に組み込まれる）も、参照されたい。
【００６９】
タンパク質／ポリペプチド組成物
本発明により、色素タンパク質および／または蛍光タンパク質ならびにそれらの変異体に加え、それらに関連したポリペプチド組成物も提供される。本発明のタンパク質は色素タンパク質であるので、これらは、発色タンパク質であり、蛍光性、低蛍光性または非蛍光性であってもよい。本明細書に使用される色素タンパク質および蛍光タンパク質という用語は、ウミシイタケのルシフェラーゼのようなルシフェラーゼを含まず、かつ例えば白色光または特定波長(もしくは励起波長のような波長の狭いバンド)の光が照射された場合に、着色または発色し、かつ／または蛍光される、任意のタンパク質を意味する。本明細書において使用されるポリペプチド組成物という用語は、完全長タンパク質、ならびにその一部または断片を意味する。この用語には、以下により詳細に説明されるように、天然に存在するタンパク質の変形物（このような変形物は天然に存在するタンパク質と相同であるか、または実質的に類似している）、および天然に存在するポリペプチドの変異体も含まれる。本発明のポリペプチドは、それらの天然の環境以外に存在する。
【００７０】
多くの態様において、本発明のタンパク質は、約300nm〜700nm、通常は約350nm〜650nm、より通常には約400nm〜600nmの範囲の吸光極大を有している。本発明のタンパク質が蛍光性タンパク質である場合、即ち、ある波長の光により励起された後、別の波長で光を放射することができる場合、本発明のタンパク質の放射スペクトルは、典型的には約400nm〜800nm、通常は約425nm〜775nm、より通常には約450nm〜750nmの範囲である一方、本発明のタンパク質の励起スペクトルは、典型的には約300nm〜700nm、通常は約350nm〜650nm、より通常には約400nm〜600nmの範囲である。本発明のタンパク質は、一般に約10,000〜50,000、通常は約15,000〜45,000の範囲の極大吸光係数を有している。本発明のタンパク質は、典型的には、約150〜300アミノ酸残基長、一般的には約200〜300アミノ酸残基長であり、一般には、約15kDa〜35kDa、通常は約17.5kDa〜32.5 kDaの範囲の分子量を有している。
【００７１】
ある種の態様において、本発明のタンパク質は明るい（明るいとは、通常の方法（例えば、視覚的スクリーニング、分光測光法、分光蛍光分析、蛍光顕微鏡検、FACS機等）により、色素タンパク質およびそれらの蛍光性変異体が検出され得ることを意味する）。特定の蛍光性タンパク質の蛍光輝度は、極大吸光係数を掛けた量子収量により決定される。色素タンパク質の輝度は、その極大吸光係数によって表され得る。
【００７２】
ある種の態様において、本発明のタンパク質は、宿主細胞における発現の後、迅速に折り畳まれる。迅速な折り畳みとは、タンパク質が、色素性または蛍光性を生じる三次構造に短時間で達することを意味する。これらの態様において、タンパク質は、一般に約3日を超えない期間、通常は約2日を超えない期間、より通常には約1日を超えない期間に折り畳まれる。
【００７３】
関心対象の特定のタンパク質は、上記で列記した特定の種の相互転換された色素／蛍光タンパク質（およびその変異体）である。前記で提供される本発明の特定のアミノ酸配列と配列が異なる、相同体またはタンパク質（またはそれらの断片）も提供される。相同体とは、D.G.HigginsおよびP.M.Sharp、「Fast and Sensitive multiple Sequence Alignments on a Microcomputer」（1989）CABIOS、5：151-153に記載されているDNAstar（1998）クラスタル・アルゴリズムであるMegAlign（使用されるパラメータは、ktuple 1、ギャップ・ペナルティ（gap penalty）3、ウィンドウ（window）5、および保存対角（diagonals saved）5である）を使用して決定されるように、本発明のタンパク質と少なくとも約10％、通常は少なくとも約20％、より通常には少なくとも約30％、そして多くの態様においては少なくとも約35％、通常には少なくとも約40％、より通常には少なくとも約60％の、アミノ酸配列同一性を有するタンパク質を意味する。多くの態様において、関心対象の相同体は、はるかに高い配列同一性、例えば65％、70％、75％、80％、85％、90％、またはそれ以上を有する。
【００７４】
野生型タンパク質と実質的に同一のタンパク質も提供される（実質的に同一とは、タンパク質が、野生型タンパク質の配列と少なくとも約60％、通常は少なくとも約65％、より通常には少なくとも約70％のアミノ酸配列同一性を有することを意味し、いくつかの例において、同一性ははるかに高く、例えば75％、80％、85％、90％、95％、またはそれ以上であり得る）。
【００７５】
多くの態様において、本発明の相同体は、β-can折り畳みを含む、前記で提供される特定の配列に見出される構造的特質を有している。
【００７６】
上記に記載された天然に存在するタンパク質の変異体であるタンパク質も提供される。変異体は、野生型の（例えば、天然に存在する）タンパク質の生物学的特性を保持するか、または野生型のタンパク質と異なる生物学的特性を有してもよい。本発明のタンパク質の「生物学的特性」という用語には、吸光極大、放射極大、極大吸光係数、輝度（例えば、野生型タンパク質またはA.ビクトリア（victoria）由来の緑色蛍光性タンパク質のような別の参照タンパク質と比較したもの）等のようなスペクトル特性；インビボおよび／またはインビトロの安定性（例えば、半減期）等が含まれるが、これらに制限はされない。変異体は、単一のアミノ酸変化、1個または複数のアミノ酸の欠失、N末端短縮、C末端短縮、挿入等を含む。
【００７７】
変異体は、分子生物学の標準的な技術、例えば無作為変異誘発および標的変異誘発を使用して生成され得る。いくつかの変異体は、本明細書に記載されている。実施例に案内が提供されることを考慮すると、標準的な技術を使用して、当業者は極めて多様な追加の変異体を容易に製造し、生物学的特性が改変されているか否かを試験することができる。例えば、蛍光強度は、様々な励起波長で分光測光器を使用して測定され得る。
【００７８】
天然のタンパク質である本発明のこれらのタンパク質は、非天然の環境に存在し、例えばそれらの天然の環境から分離される。ある態様において、本発明のタンパク質は、本発明のタンパク質についてその天然の環境と比べ濃縮された組成物中に存在する。例えば、精製されたタンパク質が提供され、ここで精製された、とは、タンパク質が、関心対象の非色素／蛍光タンパク質を実質的に含まない組成物中に存在することを意味し、ここで、実質的に含まない、とは、組成物の90％未満、一般に60％未満、より一般には50％未満が、関心対象の非色素タンパク質またはそれらの変異体で占められることを意味する。本発明のタンパク質は、単離体として存在することもでき、これは、タンパク質が他のタンパク質、ならびにオリゴ糖、ポリヌクレオチド、およびそれらの断片などのその他の天然の生物学的分子を実質的に含まないことを意味し、ここで用語「実質的に含まない」とは、この状況において、単離されたタンパク質を含有する組成物の70％未満、一般には60％未満およびより一般には50％未満が、いくつかの他の天然の生物学的分子であることを意味する。ある態様において、これらのタンパク質は、実質的に純粋な形態で存在し、ここで「実質的に純粋な形態」とは、少なくとも95％、一般には少なくとも97％、より一般には少なくとも99％純粋であることを意味する。
【００７９】
天然のタンパク質に加え、天然のタンパク質と異なるポリペプチド、例えば前記で説明された変異体タンパク質も提供される。一般に、そのようなポリペプチドには、全長タンパク質およびその断片、特に生物学的活性を有する断片および／または機能性ドメインに相当する断片等を含み、本発明のポリペプチドの他のタンパク質またはその一部との融合体を含む、本発明の野生型タンパク質をコードする遺伝子のオープン・リーディング・フレーム（ORF）によりコードされたアミノ酸配列が含まれる。関心対象の断片は、典型的には、少なくとも10aa長、一般的には少なくとも約50aa長であり、300aa長またはそれ以上であってもよいが、一般的には約1000aa長を超えず、また、少なくとも約10aa長、一般的には少なくとも約15aa長、多くの態様においては少なくとも約50aa長の本発明のタンパク質と同一のアミノ酸のストレッチを有すると考えられる。いくつかの態様において、本発明のポリペプチドは、約25aa長、約50aa長、約75aa長、約100aa長、約125aa長、約150aa長、約200aa長、約210aa長、約220aa長、約230aa長、または約240aa長であり、最大で完全タンパク質である。いくつかの態様において、タンパク質断片は、野生型タンパク質の生物学的特性の全部または実質的に全部を保持している。
【００８０】
本発明のタンパク質およびポリペプチドは、天然の供与源から得られるか、または合成により作製することができる。例えば、野生型タンパク質は、これらのタンパク質を発現している生物学的給源、例えば非生物発光性刺胞動物、例えば上記に列記した特定のものなどの花虫綱種から誘導することができる。本発明のタンパク質は、合成手段、例えば、前述のような、適当な宿主における関心対象のタンパク質をコードする組換え遺伝子または核酸コード配列の発現により、誘導することもできる。いずれか都合の良いタンパク質精製手法を用いることができ、ここで適当なタンパク質精製法は、「Guide to Protein Purification」(Deuthser編)(Academic Press、1990年)に説明されている。例えば、細胞溶解液を、当初の供与源から調製し、HPLC、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィーなどを用い精製することができる。
【００８１】
抗体組成物
本発明の蛍光タンパク質に特異的に結合する抗体も提供される。適当な抗体は、本発明のタンパク質の全てまたは一部を含むペプチドによる宿主動物の免疫処置により得られる。適当な宿主動物は、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ハムスター、ウサギなどを含む。タンパク質免疫原の起源は、一般に刺胞動物種、特に非生物発光性刺胞動物種、例えば花虫綱種またはペタルセアン(Petalucean)でない花虫綱種であると考えられる。宿主動物は、一般に例えばマウスなどのその免疫原以外の様々な種であると考えられる。
【００８２】
免疫原は、完全なタンパク質、またはそれらの断片および誘導体を含んでよい。好ましい免疫原は、タンパク質の全てまたは一部を含み、これらの残基は、天然の標的タンパク質に認められた翻訳後修飾を含む。免疫原は、当技術分野において公知の様々な方法、例えば通常の組換え法を使用するクローニングされた遺伝子の発現、起源の花虫綱種からの単離で作出される。
【００８３】
ポリクローナル抗体の調製のための第一段階は、約1％未満の汚染物質を含む、好ましくは実質的に純粋な形態で存在すると考えられる標的タンパク質による、宿主動物の免疫化である。免疫原には、完全な標的タンパク質、その断片または誘導体が含まれ得る。宿主動物の免疫応答を増加させるため、標的タンパク質は、アジュバントと組み合わせられてもよく、適当なアジュバントには、ミョウバン、デキストラン、硫酸塩、高分子重合体陰イオン、油水乳剤、例えばフロイントのアジュバント、フロイントの完全アジュバント等が含まれる。標的タンパク質は、合成担体タンパク質または合成抗原に抱合させられてもよい。多様な宿主が、ポリクローナル抗体を作製するために免疫化され得る。そのような宿主には、ウサギ、モルモット、げっ歯動物、例えばマウス、ラット、ヒツジ、ヤギ等が含まれる。標的タンパク質は、通常は皮内に初回用量を投与された後、1回または複数回、通常は少なくとも2回の付加的な追加用量を投与される。免疫化の後、宿主から血液が収集され、続いて血球から血清の分離が行われる。得られた抗血清の中に存在するIgは、アンモニウム塩分画、DEAEクロマトグラフィー等のような既知の方法を使用してさらに分画され得る。
【００８４】
モノクローナル抗体は、従来の技術によって作製される。一般に、免疫化された宿主動物の脾臓および／またはリンパ節が、プラズマ細胞の起源を提供する。プラズマ細胞は、ハイブリドーマ細胞を作製するため、骨髄腫細胞との融合によって不死化される。産生される抗体が所望の特異性を有することを確認するため、個々のハイブリドーマに由来する培養上清が、標準的な技術を使用してスクリーニングされる。ヒト・タンパク質に対するモノクローナル抗体の作製に適した動物には、マウス、ラット、ハムスター等が含まれる。マウス・タンパク質に対する抗体を生成させるための動物には、一般に、ハムスター、モルモット、ウサギ等が考えられる。抗体は、従来の技術、例えば不溶性支持体、プロテインAセファロース等と結合したタンパク質を使用したアフィニティ・クロマトグラフィーによって、ハイブリドーマ細胞上清または腹水より精製され得る。
【００８５】
抗体は、通常の多量体構造ではなく、単鎖として作製されてもよい。単鎖抗体は、Jostら（1994）J.B.C.269：26267-73、およびその他に記載されている。重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域をコードするDNA配列が、グリシンおよび／またはセリンを含む、小さな中性アミノ酸を少なくとも約4アミノ酸コードするスペーサーへ連結される。この融合体によってコードされるタンパク質は、元の抗体の特異性および親和性を保持する機能性可変領域の組み立てを可能にする。
【００８６】
ある種の態様において、ヒト化抗体も関心対象である。抗体をヒト化する方法は、当技術分野において既知である。ヒト化抗体は、遺伝子導入したヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子を有する動物の産物であり得る（例えば、国際特許出願、国際公開公報第90/10077号および第90/04036号を参照のこと）。または、関心対象の抗体を組替えDNA技術によって設計して、CH1、CH2、CH3、ヒンジ・ドメイン、および／またはフレームワーク・ドメインを、対応するヒトの配列に置換してもよい（国際公開公報第92/02190号を参照のこと）。
【００８７】
キメラ免疫グロブリン遺伝子の構築のためのIg cDNAの使用は、当技術分野において既知である（Liuら（1987）P.N.A.S.84：3439および（1987）J.Immunol.139：3521）。mRNAが、抗体を産生するハイブリドーマまたはその他の細胞から単離され、cDNAを作製するために使用される。関心対象のcDNAは、特異的プライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応によって増幅され得る（米国特許第4,683,195号および第4,683,202号）。または、ライブラリーが作成され、関心対象の配列を単離するためにスクリーニングされる。抗体の可変領域をコードするDNA配列は、次いで、ヒト定常領域配列と融合させられる。ヒト定常領域遺伝子の配列は、Kabatら（1991）Sequences of Proteins of Immunological Interest、N.I.H.刊行物第91-3242号に見出すことができる。ヒトC領域遺伝子は、既知のクローンより容易に入手可能である。アイソタイプの選択は、補体結合、または抗体依存性細胞毒性における活性のような所望のエフェクター機能によって導かれると考えられる。好ましいアイソタイプは、IgG1、IgG3、およびIgG4である。ヒト軽鎖定常領域であるκまたはλのいずれかが使用され得る。次いで、キメラ・ヒト化抗体が、従来の方法によって発現させられる。
【００８８】
Fv、F(ab')2、およびFabのような抗体断片は、完全なタンパク質の切断によって、例えばプロテアーゼまたは化学的切断によって調製され得る。または、切断型遺伝子が設計される。例えば、F(ab')2断片の一部をコードするキメラ遺伝子は、H鎖のCH1ドメインおよびヒンジ・ドメインをコードするDNA配列の後に、切断型分子を生じるための翻訳終止コドンを含むと考えられる。
【００８９】
後に続くV領域セグメントのヒトC領域セグメントへの連結のために、有用な制限部位をJ領域へ導入するためのプライマーとして使用するためのオリゴヌクレオチドを設計するために、HおよびLのJ領域のコンセンサス配列が使用され得る。C領域cDNAは、ヒト配列内の類似の位置に制限部位を置くための、部位特異的変異誘発により改変され得る。
【００９０】
発現ベクターには、プラスミド、レトロウイルス、YAC、EBV由来エピソーム等が含まれる。便利なベクターは、任意のVHまたはVL配列が容易に挿入され、かつ発現させられるよう設計された適切な制限部位を有する、機能的に完全なヒトCHまたはCL免疫グロブリン配列をコードするものである。そのようなベクターにおいては、スプライシングが、通常は、挿入されたJ領域内のスプライス供与部位と、ヒトC領域の前に位置するスプライス受容部位との間に起こり、そしてヒトCHエクソン内に存在するスプライス領域においても起こる。ポリアデニル化および転写終結は、コード領域の下流の在来の染色体部位において起こる。得られたキメラ抗体は、レトロウイルスLTR、例えばSV-40初期プロモーター（Okayamaら（1983） Mol.Cell.Bio.3：280）、ラウス肉腫ウィルスLTR（Gormanら（1982）P.N.A.S.79：6777）、およびモロニーマウス白血病ウィルスLTR（Grosschedlら（1985） Cell 41：885）；在来のIgプロモーター等を含む、任意の強力なプロモーターに接続され得る。
【００９１】
トランスジェニック
本発明の核酸は、トランスジェニック非ヒト植物もしくは動物、または細胞株における部位特異的遺伝子改変を生じるために使用され得る。本発明のトランスジェニック細胞は、導入遺伝子として存在する本発明による核酸を1個または複数含んでいる（この定義には、導入遺伝子を含むよう形質転換された親細胞およびそれらの子孫が含まれる）。多くの態様において、トランスジェニック細胞は、本発明に係る核酸を通常は保有または含有していない細胞である。トランスジェニック細胞が本発明の核酸を天然に含有している態様においては、その核酸は、細胞内の天然の位置ではない位置に存在すると考えられ、即ち細胞のゲノム物質内に非天然の位置で組み込まれているであろう。内因性遺伝子座を改変したトランスジェニック動物は、相同的組み換えを介して作製され得る。または、核酸構築物は、ゲノム内へ無作為に組み込まれる。安定的な組み込みのためのベクターには、プラスミド、レトロウイルスおよびその他の動物ウイルス、YAC等が含まれる。
【００９２】
本発明のトランスジェニック生物には、内因性遺伝子の発現が、排除されない場合には少なくとも減少している、内因性ノックアウトである細胞および多細胞生物、例えば植物および動物が含まれる。関心対象のトランスジェニック生物には、タンパク質またはそのバリアントが、それが通常発現しない細胞または組織において発現しており、かつ／またはそのような細胞または組織において通常は存在しないレベルで発現している、細胞および多細胞生物、例えば植物および動物も含まれる。
【００９３】
相同的組替えのためのDNA構築物は、所望の（1個以上の）遺伝学的改変を有しており、標的遺伝子座と相同な領域を含む、本発明の遺伝子の少なくとも一部を含むと考えられる。無作為組み込みのためのDNA構築物には、組み換えを媒介するための相同領域が含まれている必要はない。都合のよいことには、ポジティブ選択およびネガティブ選択のためのマーカーが含まれる。相同的組替えを介して標的遺伝子を改変した細胞を産生するための方法は、当技術分野において既知である。哺乳動物細胞をトランスフェクトするための様々な技術については、Keownら（1990）、Meth.Enzymol.185：527-537を参照のこと。
【００９４】
胚性幹（ES）細胞については、ES細胞株が使用されてもよいし、または胚細胞が、例えばマウス、ラット、モルモット等の宿主から新鮮に得られてもよい。そのような細胞は、適切な繊維芽細胞フィーダー層の上で増殖させられるか、または白血病阻止因子（LIF）の存在下で増殖させられる。ESまたは胚細胞が形質転換された場合、それらはトランスジェニック動物を作製するために使用され得る。形質転換の後、細胞は、適切な培地中でフィーダー層上に播かれる。構築物を含有している細胞は、選択培地を利用することにより検出され得る。コロニーが増殖するのに十分な時間の後、それらは選び取られ、構築物の相同的組み換えまたは組み込みの発生に関して分析される。次いで、陽性であるコロニーが、胚操作および胚盤胞注入のために使用され得る。胚盤胞は、4〜6週齢の過排卵雌より得られる。ES細胞がトリプシン処理され、改変した細胞が胚盤胞の胞胚腔へと注入される。注入の後、胚盤胞が偽妊娠雌の各子宮角に戻される。次いで、雌を満期に到達させ、得られた子孫を構築物に関してスクリーニングする。発現型の異なる胚盤胞および遺伝学的に改変した細胞を提供することにより、キメラ子孫は容易に検出され得る。
【００９５】
キメラ動物は、改変遺伝子の存在に関してスクリーニングされ、改変を有している雄および雌がホモ接合性子孫を作製するために交配される。遺伝子改変が、発達中のある時点で致死を引き起こす場合には、組織または器官が、同種異系もしくは類遺伝子性の移植片もしくは移植物として、またはインビトロ培養物中に維持され得る。トランスジェニック動物は、実験動物、家畜等の任意の非ヒト哺乳類であり得る。トランスジェニック動物は、機能研究、薬物スクリーニング等において使用され得る。トランスジェニック動物の使用の代表的な例には、下記のものが含まれる。
【００９６】
トランスジェニック植物は、類似の様式で作製され得る。トランスジェニック植物細胞およびトランスジェニック植物体を調製する方法は、米国特許第5,767,367号；第5,750,870号；第5,739,409号；第5,689,049号；第5,689,045号；第5,674,731号；第5,656,466号；第5,633,155号；第5,629,470号；第5,595,896号；第5,576,198号；第5,538,879号；第5,484,956号（これらの開示は本明細書に参照として組み込まれる）に記載されている。トランスジェニック植物体を作製する方法は、Plant Biochemistry and Molecular Biology（LeaおよびLeegood編、John Wiley＆Sons）（1993）pp.275-295にも概説されている。簡潔には、植物種の性質に依って適当な植物細胞または組織が収穫される。そのため、ある種の例においては、プロトプラストが単離されると考えられ、そのようなプロトプラストは多様な異なる植物組織、例えば葉、胚軸、根等より単離され得る。プロトプラスト単離のためには、収穫された細胞が、細胞壁を除去するためセルラーゼの存在下でインキュベートされる（ここで、正確なインキュベーション条件は、細胞の由来した植物および／または組織の型に依って変動する）。次いで、ふるい分けおよび遠心分離により、得られた細胞砕片から、得られたプロトプラストが分離される。プロトプラストを使用する代わりに、体細胞を含む胚形成外植片が、トランスジェニック宿主の調製のために使用されてもよい。細胞または組織の収穫の後、関心対象の外因性DNAが、植物細胞へ導入され、そのような導入には、多様な異なる技術が利用可能である。単離されたプロトプラストを得ることにより、多価陽イオン、例えばPEGまたはPLO存在下における、関心対象の外因性コード配列を含む、裸のDNA、例えばプラスミドとのプロトプラストのインキュベーション；および関心対象の外因性配列を含む裸のDNAの存在下での、プロトプラストの電気穿孔を含む、DNA媒介性の遺伝子移入プロトコルを介した導入の機会が生じる。次いで、外因性DNAの取り込みに成功したプロトプラストを選択し、カルスへ成長させ、適切な量および比率の刺激因子、例えばオーキシンおよびサイトカイニンとの接触を通じて、最終的にはトランスジェニック植物体へと成長させる。胚形成外植片を用いる場合、標的体細胞に外因性DNAを導入する便利な方法は、粒子加速プロトコルまたは「遺伝子銃」プロトコルの使用を介したものである。次いで、得られた外植片を、キメラ植物体へと成長させ、交雑させ、トランスジェニック子孫を得る。前記の裸のDNAアプローチの代わりに、トランスジェニック植物を作製するもう一つの便利な方法は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）により媒介される形質転換である。アグロバクテリウムにより媒介される形質転換では、外因性DNAを含む共組み込み（co-integrative）またはバイナリー・ベクターを調製し、次いで、適切なアグロバクテリウム株、例えばA.ツメファシエンス（A.tumefaciens）へと導入する。次いで、得られた細菌を、調製したプロトプラストまたは組織外植片、例えばリーフディスクと共にインキュベートし、カルスを作製する。次いで、カルスを選択条件下で成長させ、選択し、根および苗条の成長を誘導するための成長培地に供し、最終的にはトランスジェニック植物体を作製する。
【００９７】
有用性
本発明の色素タンパク質およびその蛍光性変異体は、多様な異なる適用において有益であるが、適用は、タンパク質が色素タンパク質であるかまたは蛍光性タンパク質であるかに依って必然的に異なる。これらの各タンパク質型の代表的な用途を以下に記載するが、以下に記載された用途は、単なる代表的なものであり、本発明のタンパク質の使用を下記のものに制限するものでは決してない。
【００９８】
色素タンパク質
本発明の色素タンパク質は、多様な異なる適用において有益である。一つの関心対象の適用は、問題としている特定の組成物に色または色素を付与することができる着色料としての本発明のタンパク質の使用である。ある種の態様において特に関心対象であるのは、無毒の色素タンパク質である。本発明の色素タンパク質は、問題とする多様な異なる組成物に取り込まれ得る（問題とする組成物の代表には、食物組成物、医薬品、化粧品、生物、例えば動物および植物等が含まれる）。着色料または色素として使用される場合、所望の色または色素を付与するために十分な量の色素タンパク質が、問題とする組成物に取り込まれる。色素タンパク質は、任意の便利なプロトコルを使用して、問題とする組成物に取り込まれてもよく、利用される特定のプロトコルは、少なくとも部分的には、着色すべき問題とする組成物の性質に必然的に依存すると考えられる。利用され得るプロトコルには、混和、拡散、摩擦、噴霧、注入、および入れ墨等が含まれるが、これらに制限はされない。
【００９９】
色素タンパク質は、分析物検出アッセイ法、例えば関心対象の生物学的分析物に関するアッセイ法における標識としても有益であり得る。例えば、色素タンパク質は、分析物に特異的な抗体またはその結合性断片を含む付加体に取り込まれ、その後、米国特許第4,302,536号（この開示は参照として本明細書に組み込まれる）に記載されるように、複合試料中の関心対象の分析物に関する免疫アッセイ法において利用され得る。抗体またはその結合性断片の代わりに、本発明の色素タンパク質またはその色素生産性断片は、当業者には容易に明らかであるように、関心対象の分析物と特異的に結合するリガンド、またはその他の成分（moiety）、増殖因子、ホルモン等と抱合されてもよい。
【０１００】
さらなる他の態様において、本発明の色素タンパク質は、組替えDNA適用、例えば前記のようなトランスジェニック細胞およびトランスジェニック生物の作製において、選択可能マーカーとして使用され得る。そのため、成功プロトコルまたは非成功プロトコルのいずれかのために、選択可能マーカーとして本発明の色素タンパク質の発現を利用するため、特定のトランスジェニック作製プロトコルを設計することが可能である。従って、特定のプロセスによって作製されたトランスジェニック生物の発現型における、本発明の色素タンパク質の色の出現は、特定の生物が、多くの場合、生物における導入遺伝子の発現を提供する様式で組み込まれる、関心対象の導入遺伝子の保有に成功したことを示すために使用され得る。選択可能マーカーとして使用される場合、本発明の色素タンパク質をコードする核酸は、より詳細に上記で記載されたトランスジェニック産生プロセスにおいて利用され得る。本発明のタンパク質が選択可能マーカーとして利用され得る特定の関心対象のトランスジェニック生物には、トランスジェニック植物、トランスジェニック動物、トランスジェニック細菌、トランスジェニック真菌等が含まれる。
【０１０１】
さらなる他の態様において、本発明の色素タンパク質（および蛍光性タンパク質）は、国際公開公報第00/46233号に記載されたタンパク質の用途と類似の様式で、日焼け止め、選択的フィルター等として有益である。
【０１０２】
蛍光性タンパク質
本発明の蛍光性タンパク質（および前記の本発明のその他の構成要素）は、以下のものを含むがこれらに制限はされない、多様な異なる適用において有益である。第一の関心対象の適用は、蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）の適用における本発明のタンパク質の使用である。これらの適用において、本発明のタンパク質は、第二の蛍光性タンパク質または染料、例えばMatzら、Nature Biotechnology（1999年10月）17：969-973に記載されたような蛍光性タンパク質、例えば米国特許第6,066,476号；第6,020,192号；第5,985,577号；第5,976,796号；第5,968,750号；第5,968,738号；第5,958,713号；第5,919,445号；第5,874,304号（これらの開示は参照として本明細書に組み込まれる）に記載されたようなエクオリア・ビクトリア（Aequoria victoria）由来の緑色蛍光性タンパク質またはその蛍光性変異体、その他の蛍光染料、例えばクマリンおよびその誘導体、例えば7-アミノ-4-メチルクマリン、アミノクマリン、ボディピー（Bodipy）FLのようなボディピー（bodipy）染料、カスケードブルー（cascade blue）、フルオレセインおよびその誘導体、例えばフルオレセイン・イソチオシアネート、およびオレゴングリーン（Oregon green）、ローダミン染料、例えばテキサスレッド、テトラメチルローダミン、エオシン、およびエリスロシン、シアニン染料、例えばCy3およびCy5、ランタニド・イオンの大環状キレート、例えば量子染料（quantum dye）等、化学発光染料、例えば米国特許第5,843,746号；第5,700,673号；第5,674,713号；第5,618,722号；第5,418,155号；第5,330,906号；第5,229,285号；第5,221,623号；第5,182,202号（これらの開示は本明細書に参照として組み込まれる）に記載されたものを含むルシフェラーゼと組み合わされて、供与体および／または受容体として機能する。本発明の蛍光性タンパク質を利用したFRETアッセイ法が使用され得る特定の例には、多数の異なる事象のバイオセンサーとしての、タンパク質−タンパク質相互作用、例えば哺乳動物ツー・ハイブリッド系、転写因子の二量体化、膜タンパク質の多量体化、多重タンパク質の複合体形成等の検出（この場合、ペプチドまたはタンパク質が、本発明の蛍光性タンパク質を含むFRET蛍光組合せと共有結合的に連結され、連結されるペプチドまたはタンパク質は、例えばカスパーゼ媒介切断などのためのプロテアーゼ特異的基質であるか、FRETを増加または減少させるシグナル、例えばPKA制御ドメイン（cAMPセンサー）、リン酸化（例えば、リンカー内にリン酸化部位が存在するか、またはリンカーが別のタンパク質のリン酸化／脱リン酸化ドメインとの結合特異性を有するか、またはリンカーがCa2+結合ドメインを有する場合）の受容によりコンフォメーション変化を起こすリンカーである）が含まれるが、これらに制限はされない。本発明のタンパク質が有益である代表的な蛍光共鳴エネルギー転移またはFRETの適用には、米国特許第6,008,373号；第5,998,146号；第5,981,200号；第5,945,526号；第5,945,283号；第5,911,952号；第5,869,255号；第5,866,336号；第5,863,727号；第5,728,528号；第5,707,804号；第5,688,648号；第5,439,797号（これらの開示は本明細書に参照として組み込まれる）に記載されたものが含まれるが、これらに制限はされない。
【０１０３】
本発明の蛍光性タンパク質は、原核細胞および真核細胞におけるバイオセンサーとして、例えばCa2+イオン指示薬として；pH指示薬として、リン酸化指示薬として、その他のイオン、例えばマグネシウム・イオン、ナトリウム・イオン、カリウム・イオン、塩素イオン、およびハロゲン・イオンの指示薬としても有益である。例えば、Caイオンの検出に関して、EF-ハンド・モチーフを含有しているタンパク質は、Ca2+との結合により、細胞質ゾルから膜へと移動することが既知である。これらのタンパク質は、タンパク質の他の領域との疎水性相互作用によって分子内に埋め込まれているミリストイル基を含有している。Ca2+の結合は、ミリストイル基を露出させるコンフォメーション変化を誘導し、次いでミリストイル基が脂質二重層への挿入に利用可能となる（「Ca2+-ミリストイル・スイッチ」と呼ばれる）。そのようなEF-ハンド含有タンパク質のフルオレセント・プロテイン（FP）との融合体は、共焦点顕微鏡検によって細胞質ゾルから原形質膜への移動をモニタリングすることにより、細胞内 Ca2+の指示薬となり得る。この系において使用するのに適したEF-ハンド・タンパク質には、リカバリン（recoverin）（1-3）、カルシニューリンB、トロポニンC、ビシニン（visinin）、ニューロカルシン（neurocalcin）、カルモジュリン、パルブアルブミン等が含まれるが、これらに制限はされない。pHについては、ヒサクトフィリン（hisactophilins）に基づく系が使用され得る。ヒサクトフィリンは、ジクチオステリウム（Dictyostelium）に存在することが既知である、ミリストイル化されたヒスチジンリッチなタンパク質である。それらのアクチンおよび酸性脂質との結合は、細胞質pH変動の範囲内で鮮明にpH依存的である。生細胞において、膜結合は、ヒサクトフィリンとアクチン・フィラメントとの相互作用より優先されるようである。pH≦6.5においては、それらは、原形質膜および核へと移行する。対照的に、pH7.5においては、それらは、細胞質空間全体に均一に分布する。この分布の変化は可逆的であり、分子表面上のループ内に露出したヒスチジン・クラスターに起因する。細胞質pH変動の範囲内での細胞内分布の復帰は、ヒスチジン残基の6.5というpKと合致する。細胞分布は、タンパク質のミリストイル化には依存しない。FP（フルオレセント・プロテイン）をヒサクトフィリンと融合させることによって、融合タンパク質の細胞内分布は、レーザー走査型共焦点顕微鏡検、または標準的な蛍光顕微鏡検によって追跡され得る。定量的蛍光分析は、細胞のライン・スキャン（line scans）（レーザー走査型共焦点顕微鏡検）またはその他の電子データ分析（例えば、メタモルフ（metamorph）ソフトウェア（Universal Imaging社）を使用）を実行し、細胞集団において収集されたデータの平均をとることにより実施され得る。細胞質ゾルから原形質膜へのヒサクトフィリン-FPの実質的なpH依存性の再分布は、1分〜2分以内に起こり、5分〜10分後には定常状態レベルに達する。逆反応は同様のタイムスケールで起こる。そのため、類似の様式で働くヒサクトフィリン-蛍光性タンパク質融合タンパク質は、哺乳動物生細胞におけるリアルタイムの細胞質ゾルpH変化をモニタリングするために使用され得る。そのような方法は、高処理量の（high throughput）適用、例えば���殖因子受容体活性化（例えば、上皮増殖因子または血小板由来増殖因子）、走化刺激／細胞運動の結果としてのpH変化の測定において、セカンドメッセンジャーとしての細胞内pH変化の検出において、pH操作実験における細胞内pHのモニタリング等において有益である。PKC活性の検出のため、レポーター系は、MARCKS（ミリストイル化アラニンリッチCキナーゼ基質）と呼ばれる分子がPKC基質であるという事実を活用する。それは、ミリストイル化、および負の電荷を有する原形質膜と静電相互作用によって結合する、正の電荷を有するアミノ酸の領域（ED-ドメイン）によって原形質膜につながれている。PKC活性化により、PKCによってED-ドメインはリン酸化され、それにより負に荷電し、静電的反発の結果として、MARCKSが原形質膜から細胞質へと移動する（「ミリストイル-静電スイッチ」と呼ばれる）。MARCKSのミリストイル化モチーフからED-ドメインまでの範囲にわたるMARCKSのN末端の、本発明の蛍光性タンパク質との融合体は、PKC活性の検出系となる。PKCによってリン酸化されると、融合タンパク質は、原形質膜から細胞質ゾルへと移動する。この移動は、標準的な蛍光顕微鏡検または共焦点顕微鏡検によって、例えばセロミクス（Cellomics）技術、またはその他のハイ・コンテンツ・スクリーニング系（High Content Screening systems）（例えば、Universal Imaging社/Becton Dickinson）を使用して追跡される。上記のレポーター系は、ハイ・コンテンツ・スクリーニングにおける適用、例えばPKC阻害剤のスクリーニングにおける適用、およびこのシグナル伝達経路を妨害する可能性のある試薬に関する多くのスクリーニング・シナリオにおける、PKC活性の指示薬としての適用を有している。蛍光性タンパク質をバイオセンサーとして使用する方法には、米国特許第972,638号；第5,824,485号、および第5,650,135号（ならびに、これらの中に引用された参照）に記載されたものも含まれ、これらの開示は参照として本明細書に組み込まれる。
【０１０４】
本発明の蛍光性タンパク質は、顕微鏡による画像化、および電子分析を使用することによる、蛍光性レポート基を発現している細胞のアレイの、自動化スクリーニングを含む適用においても有益である。スクリーニングは、薬物発見のため、そして機能ゲノム科学の分野において使用され得る：例えば、本発明のタンパク質は、多細胞の再編成および遊走における変化、例えば内皮細胞による多細胞細管の形成（血管形成）、フルオロブロック・インサート・システム（Fluoroblok Insert System）（Becton Dickinson社）を介した細胞の遊走、創傷治癒、神経突起伸長等を検出するため、全細胞のマーカーとして使用され得る（この場合、タンパク質は、細胞活性、刺激によるキナーゼおよび転写因子の移動（プロテインキナーゼC、プロテインキナーゼA、転写因子NFkB、およびNFATなど）；サイクリンA、サイクリンB1、およびサイクリンEなどの細胞周期タンパク質、切断された基質のその後の運動を伴うプロテアーゼ切断、リン脂質などのシグナル伝達の指標としての細胞内位置の変化の、小胞体、ゴルジ装置、ミトコンドリア、ペルオキシソーム、核、核小体、原形質膜、ヒストン、エンドソーム、リソソーム、微小管、アクチンなどの細胞内構造のマーカーをハイ・コンテンツ・スクリーニングのための道具として用いる（他の蛍光性融合タンパク質と、これらの局在マーカーとの共局在を、細胞内蛍光性融合タンパク質の運動の指標として用いる、またはマーカー単独として用いる）検出等を可能にするペプチド（例えば、ターゲティング配列）およびタンパク質と融合されたマーカーとして使用される）。本発明の蛍光性タンパク質が有益である細胞アレイの自動化スクリーニングを含む適用の例には、米国特許第5,989,835号；ならびに国際公開公報第0017624号；第00/26408号；第00/17643号；および第00/03246号（これらの開示は本明細書に参照として組み込まれる）が含まれる。
【０１０５】
本発明の蛍光性タンパク質は、ハイ・スループット・スクリーニング・アッセイ法においても有益である。本発明の蛍光性タンパク質は、24時間を超える半減期を有する安定なタンパク質である。薬物発見のための転写レポーターとして使用され得る、より短い半減期を有する本発明の蛍光性タンパク質の不安定化型も提供される。例えば、本発明によるタンパク質は、より短い半減期を有するタンパク質に由来する推定タンパク質分解シグナル配列、例えばマウス・オルニチン・デカルボキシラーゼ遺伝子由来のPEST配列、マウス・サイクリンB1破壊ボックス、およびユビキチン等と融合させられ得る。不安定化タンパク質およびそれを作製するために利用され得るベクターの記載については、米国特許第6,130,313号（この開示は参照として本明細書に組み込まれる）を参照されたい。シグナル伝達経路、例えばAP1、NFAT、NFkB、Smad、STAT、p53、E2F、Rb、myc、CRE、ER、GR、およびTRE等のプロモーターは、薬物スクリーニングのための本発明の蛍光性タンパク質の不安定化型を使用して検出され得る。
【０１０６】
本発明のタンパク質は、例えば本発明のタンパク質を特定のドメイン、例えばPKCγCa結合ドメイン、PKCγDAG結合ドメイン、SH2ドメイン、およびSH3ドメイン等と融合させることによって、セカンドメッセンジャー検出剤として使用され得る。
【０１０７】
本発明のタンパク質の分泌型を、例えば分泌型先導配列を本発明のタンパク質と融合させ、本発明のタンパク質の分泌型を構築することによって、調製することができ、そして、多様な異なる適用において使用され得る。
【０１０８】
本発明のタンパク質は、蛍光標示式細胞分取適用においても有益である。そのような適用においては、本発明の蛍光性タンパク質が、細胞集団に印をつけるための標識として使用され、次いで、得られた標識細胞集団が、当技術分野において既知である、蛍光標示式細胞分取機により分取される。FACS法は、米国特許第5,968,738号および第5,804,387号（これらの開示は本明細書に参照として組み込まれる）に記載されている。
【０１０９】
本発明のタンパク質は、動物（例えば、トランスジェニック動物）におけるインビボのマーカーとしても有益である。例えば、本発明のタンパク質の発現を、組織特異的プロモーターによって駆動することができ、そのような方法は、遺伝子治療の研究において、例えば適用の中でも特に導入遺伝子発現の効率の試験において有益である。本発明のタンパク質のこのクラスの適用を例示する、トランスジェニック動物における蛍光性タンパク質の代表的な適用は、国際公開公報第00/02997号（この開示は参照として本明細書に組み込まれる）に見出される。
【０１１０】
本発明のタンパク質のさらなる適用には、細胞または動物への注入の後の、定量的測定（蛍光およびタンパク質）のための較正におけるマーカーとしての適用；細胞生存率をモニタリングするための酸素バイオセンサー機器における、マーカーまたはレポーターとしての適用；動物、ペット、玩具、食物等のためのマーカーまたは標識としての適用等が含まれる。
【０１１１】
本発明の蛍光性タンパク質は、プロテアーゼ切断アッセイ法においても有益である。例えば、切断不活化蛍光アッセイ法が、本発明のタンパク質を使用して開発され得る。この場合、本発明のタンパク質は、タンパク質の蛍光性を破壊することなく、プロテアーゼ特異的切断配列を含むよう改造される。活性化されたプロテアーゼにより蛍光性タンパク質が切断されると、機能性発色団の破壊により、蛍光は鮮明に減少するであろう。または、切断によって活性化された蛍光が、本発明のタンパク質を使用して現像され得る。この場合、本発明のタンパク質は、発色団の近傍／または内部に付加的なスペーサー配列を含有するよう設計される。機能性発色団の部分がスペーサーによって分割されるため、このバリアントの蛍光活性は有意に減少するであろう。スペーサーは、2個の同一のプロテアーゼ特異的切断部位によって構成されるであろう。活性化されたプロテアーゼによる分解によって、スペーサーが切り出され、蛍光性タンパク質の2個の残存「サブユニット」が、機能性の蛍光性タンパク質が生成するよう再び組み立てられ得る。多様な異なる型のプロテアーゼ、例えばカスパーゼ等に関するアッセイ法において、上記の型の適用の両方が開発され得る。
【０１１２】
本発明のタンパク質は、生体膜中のリン脂質組成を決定するためのアッセイ法においても、使用され得る。例えば、特定のリン脂質ラフト（raft）における膜タンパク質の共局在をも可能にする、生体膜内のリン脂質分布のパターンを特定／可視化するための、特定のリン脂質との結合を可能にする本発明のタンパク質の融合タンパク質（または本発明のタンパク質のその他の任意の種類の共有結合的修飾または非共有結合的修飾）が、本発明のタンパク質を用いて達成され得る。例えば、GRP1のPHドメインは、ホスファチジルイノシトール三リン酸（PIP3）に対する高い親和性を有しているが、PIP2に対する親和性は有していない。そのため、GRP1のPHドメインと本発明のタンパク質との間の融合タンパク質が、生体膜内のPIP3リッチな区域を特異的に標識するために構築され得る。
【０１１３】
さらにもう一つの本発明のタンパク質の適用は、蛍光性タンパク質の加齢に付随する、ある蛍光色のもう一つの色への（例えば、緑色から赤色への）スイッチが、遺伝子発現、例えば発達遺伝子発現、細胞周期依存性遺伝子発現、概日リズム特異的遺伝子発現等の活性化／不活化を決定するために使用される、蛍光タイマーとしての適用である。
【０１１４】
前記の本発明の抗体は、その他の蛍光性タンパク質からの本発明のタンパク質の区別を含む、多数の適用においても有益である。
【０１１５】
キット
典型的には、本発明のタンパク質を作成するための要素、例えば本発明のタンパク質のコード領域を含むベクターを含む構築物を含む、前記の適用のうちの一つ以上の実施において使用するためのキットも、本発明によって提供される。本発明のキット成分は、典型的には、適当な容器内に、適当な保存媒体、例えば緩衝溶液の中に存在する。本発明のキットには、提供されたタンパク質に対する抗体も存在し得る。ある種の態様において、キットは、各々が本発明のタンパク質をコードする複数の異なるベクター（この場合、ベクターは、異なる環境における、かつ／または異なる条件下での発現、例えば構成性発現のために設計されており、かつ哺乳動物細胞における発現のための強力なプロモーターを含む）、プロモーターのカスタム（custom）挿入およびテーラード（tailored）発現のためのマルチプル・クローニング・サイトを有するプロモーターレス・ベクター等を含む。
【０１１６】
上記の成分に加え、本発明のキットは、本発明の方法を実施するための説明をさらに含むであろう。これらの説明は、多様な形態で本発明のキット内に存在することができ、1個以上の形態がキット内に存在してもよい。これらの説明が存在し得る一つの形態は、キットの包装材の中、パッケージ・インサートの中等の適当な媒体または基体の上に印刷された情報（例えば情報が印刷された1枚以上の紙）としてである。さらにもう一つの手段は、情報が記録されたコンピューター読取可能媒体、例えばディスク、CD等であろう。さらにもう一つの存在し得る手段は、遠隔地において情報にアクセスするためにインターネットを介して使用され得る、ウェブサイト・アドレスである。任意の便利な手段が、キット内に存在し得る。 
【０１１７】
以下の実施例は、制限のためではなく、例示のために提示されるものである。
【０１１８】
実施例
実施例1. 変異誘発による花虫綱種GFP-様蛍光タンパク質と非蛍光タンパク質の相互転換
A. 材料および方法
1. 変異誘発およびタンパク質発現
部位特異的変異誘発を、重複伸長法(overlap extension)[Hoら、Gene 1989、77:51-59]を用い、標的置換を含むプライマーを用いるPCRにより行った。Diversity PCR Random Mutagenesisキット(Clontech Laboratories社、パロアルト、CA)を、1000bp当り4〜5変異の最適条件下でasCPの無作為変異誘発に使用した。全ての変異体を、pQE30ベクター(Qiagen社)にクローニングし、その結果組換えタンパク質は、それらのN末端に6-ヒスチジンタグを含んだ。変異体タンパク質を発現するために、大腸菌XL1 Blue細胞を、標準プロトコールに従いこのプラスミドで形質転換し、選択のためにアンピシリンを補充したLB寒天培地を含む3〜4個のペトリ皿上に播種した。一晩37℃で増殖した後、これらのプレートを、室温または4℃で2〜5日間保存し、タンパク質を完全に成熟させた。その後、これらのプレートを、PBSで洗浄した。細胞は、音波処理により破壊し、可溶性の組換えタンパク質を、TALON金属-アフィニティー樹脂(Clontech社)上で精製した。
【０１１９】
2. 分光法
吸光スペクトルは、Beckman DU520 UV/VIS分光光度計で記録した。Cary Eclipse蛍光光度計(Varian)を用い、励起-発光スペクトルを測定した。
【０１２０】
モル吸光係数の決定に関して、本発明者らは、総タンパク質濃度よりも、成熟発色団濃度の測定に頼った。DsRedおよびその変異体は、等量の2M NaOHでアルカリ変性した。asCPおよびその変異体は、等量の2M HClで酸変性した。これらの条件下において、DsRedおよびasCP発色団は、452nmおよび430nmで各々吸収した[Niwaら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996、93:13617-13622、Weberら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999、96:6177-6182]。発色団の量(成熟したタンパク質の量に相当する)を、試料間で等しくし、未変性のタンパク質の吸光スペクトルを収集した。吸光度強度は、DsRedのもの(吸光係数は75,000M-1cm-1である[Bairdら、Proc. Natl. Acad. Sci. 2000、97:11984-11989])またはasCPのもの(吸光係数は56,000M-1cm-1である[Lukyanovら、J. Biol. Chem. 2000、275:25879-25882])と比較し、ならびにモル吸光係数を各変異体について概算した。
【０１２１】
量子収量の決定に関して、変異体の蛍光を、同等に吸収しているDsRedと比較した(DsRedの量子収量は、0.70であると測定された[Bairdら、前掲])。
【０１２２】
B. 結果
公知のGFP-様タンパク質の配列比較は、FPとCPとの間の絶対的に不変の差異を明らかにしないが、これら2種のタンパク質において顕著に異なる残基により占められる、3個の位置、より具体的には148位、165位、および203位に注意が引きつけられる(図1、表1)。これらの位置の残基は、発色団に密に近接しているので(図2A、2B)、これらは、特定のタンパク質の状態(蛍光または非蛍光)の決定に関係する。
【０１２３】
（表１）公知のGFP-様タンパク質における148位、165位、および203位(GFP番号付け、Matzら(前掲)に記載)を占拠しているアミノ酸
2005514032.tif 000002
【０１２４】
1. asCPの148位での無作為変異誘発
以前に、本発明者らは、いくつかのCPに関して、Ser-148含有変異体が赤色蛍光を有することを明らかにした[Lukyanovら、J. Biol. Chem. 2000、275:25879-25882；Gurskayaら、FEBS Lett 2001、507:16-20]。他の残基をチェックするために、本発明者らは、148位でいずれかのアミノ酸をコードする縮重プライマーを用い、変異誘発を実現した。約50種の組換えクローンの肉眼による検査および選択されたクローンの配列解析は、以下に示した。Ser148のみが、明らかな蛍光を確実にした。いくつかの強く発色した非蛍光クローンは、148位にAla、Cys、Asn、またはGlyを含んでいた(注目すべきことに、公知の野生型CPは、この位置にまさにAla、Cys、またはAsnを保持している)。他の全てのA1a148の置換は、適切なタンパク質の折り畳みおよび発色団成熟にとって容認し難く見える。
【０１２５】
2. asCPの165位での変異誘発
まず第一に、本発明者らは、置換S165Vを試験したが、その理由はいくつかのFPは、この位置にValを有しているからである。この変異は、最大620nmである明らかに可視の赤色蛍光の出現を生じた(図3A、表2)。興味深いことに、野生型asCPとの比較において、変異体asCP-S165Vは、390nmに追加のピークを含んだ強力に改変された吸収スペクトルを示した。この波長での吸収は、465nmにおける非常に弱い(赤色蛍光の約10分の1)青色蛍光を生じた。
【０１２６】
（表２）asCPおよびDsRedのいくつかの変異体のスペクトル特性
2005514032.tif 000003
aデータ出典[Lukyanovら、前掲]
bデータ出典[Bairdら、前掲]
【０１２７】
本発明者らは、蛍光出現につながり得る165位でのその他の置換を明らかにするために、この位置で無作為化を利用した。結果として、異なる輝度のいくつかの赤色蛍光クローンが、選択された。最も明るいクローンは、既知の置換S165Vを有していた。他の蛍光変異体は全て、かなり(5〜10倍)薄暗く(dimmer)、かつAla、Cys、またはThr165を含んでいた(輝度の低下順)。これらの変異体の吸光スペクトルは、約390nmに特徴的ピークを有しているが、検出可能な青色蛍光は生じていない(図3B、3C、3D)。これらの低い蛍光変異体の興味深い特徴は、赤色発光に関するそれらの励起スペクトルが、吸収スペクトルと一致しないことである。この現象は、これらの変異体タンパク質分子のスペクトル的に不均一な集団内の、異なるスペクトル型の存在を暗示している。赤色を発光するスペクトル型は、不十分に表示されている(underrepresented)、またはこれらは非常に低い吸光係数を有する。同時に、主要な赤色光吸収スペクトル型は、非蛍光性である。
【０１２８】
3. asCPの無作為変異誘発
本発明者らは、asCPを蛍光タンパク質へ転換することができるアミノ酸置換の検索を拡大するために、全asCP遺伝子の無作為変異誘発を使用した。約5000種の組換えクローンの目視スクリーニングにより、わずかにひとつの明るい蛍光コロニーを明らかにした。配列解析により、この蛍光変異体が、既知の置換A148Sを含むことを示した。より徹底した目視による検証後、本発明者らは、下記の置換を含むいくつかの非常に弱い蛍光のクローンを発見した：S68G；I72N；H176R/K219I；H203R；H203Q；Q220L(図1)。重要なことは、203位に異なる置換を保持するふたつの独立したクローンが収集されたことである。
【０１２９】
まとめると、148位、165位は、asCPの状態に影響を及ぼす最も重要な部位である。
【０１３０】
4. DsRedの変異誘発 
最後に、本発明者らは、蛍光DsRedを色素タンパク質へ転換することを試みた。まず第一に、変異S148Aを試験した。予想外にも、この置換は、蛍光に強い影響を及ぼさなかった（DsRed-S148A変異体の量子収量は、野生型タンパク質と比較して、1.5分の1にしか減少しなかった(表2)）。その後、この変異体を基に、異なる組合せで置換I165S、K167M、およびS203A、Lを有する一連の変異体を作成した。Lys167と発色団のTyr66の間の直接相互作用を明らかにする結晶試験を考慮し、167位に変異誘発を追加した(図2B)。この結合は、DsRed蛍光団のイオン化した形を安定化するようである。Leu203を含む変異体タンパク質は、大腸菌における不十分なタンパク質の折り畳みのために、無色であった。他の変異体のスペクトル特性に従い、発光強度の勾配に注目し、先に言及した全ての位置はDsRed蛍光にとって重要であると結論することができる(表2)。しかし、四重変異体S148A/I165S/K167M/S203Aであっても、いくつかのasCP蛍光変異体(例えば、asCP-S165V)のものと同等の明らかに可視の蛍光を示した。従ってこのDsRed変異体は、DsRedと比較して100分の1に減少した蛍光を有することから、CP状態に非常に近いが、真の色素タンパク質とみなすことはできない。
【０１３１】
次に、本発明者らは、148位および165位で各々、いくつかの他の公知のCPについて特徴付けられているCysおよびAsnを試験した。三重変異体DsRed-S148C/I165N/S203Aは、前述の変異体S148A/I165S/K167M/S203Aに類似した低い量子収量を有した。置換K167Mが追加されると、最終の四重変異体S148C/I165N/K167M/S203Aは、実際には非蛍光となった(表2)。同時にこの変異体(DsRed-NFと称す)は、強力に光を吸収した。まとめるとこれらの特性は、DsRed-NFを野生型CPから事実上識別不能としている。
【０１３２】
DsRed-NFのスペクトルは、図3Dに示した。極めて弱い二色蛍光を、高いタンパク質濃度でのみ検出することができた。言及したasCPの低い蛍光の変異体同様(図3B、C、D参照)、DsRed-NFの吸収および励起スペクトルは、互いに強く異なっている。興味深いことに、緑色発光のための励起スペクトルは2つのピークを示し：大きいピークが410nmおよび小さいピークが490nmである。このような励起曲線の形状は、野生型GFPのものに類似し、かつDsRed変異体については検出されない(今日まで、EGFP-様単ピーク励起スペクトルのみが、DsRedの緑色発光変異体について説明されている)。おそらく、短波長励起ピークは、DsRed-NF内のGFP-様発色団の中和(プロトン化した)型に相当している。
【０１３３】
C. 考察
本発明者らの作業の第一の部分は、asCPをFPへ転換する試みである。この作業は、蛍光出現に関する165位の重要性を明らかにした。この知見は、他のCPに適用することができる。今日まで、天然のCPの変異誘発は、様々な適用において高度に要求される近赤外FPを作成する唯一の方法である。追加の近赤外の蛍光色は、多色標識、および蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)に基づくアッセイ法の能力を広げる。CPをFPへ変換する方法に関する知識は、赤色-シフトした吸光スペクトルを伴う新規CPが認められた場合に、新規近赤外FPを形成するために有用である。
【０１３４】
本発明者らの作業の第二の部分は、DsRedのCPへの変換である。一見して、このような蛍光消光は、実際に使用することはできない。しかし本発明者らは、DsRed-NF変異体を使用し、このタグの主要な欠点であるDsRed四量体化の問題点を解決することができることを認めた。DsRedが標的タンパク質、特にオリゴマータンパク質と融合される場合、これはタグ化パートナーの不適切な折り畳みおよび機能に加え、融合タンパク質の強い凝集を生じることが多い。DsRed四量体化の不利な結果を無効にするために、本発明者らは、DsRed-タグ化タンパク質の過剰な遊離DsRed-NFとの同時共発現を使用する。この場合、混合されたヘテロ四量体が形成され、DsRedは「モノマー性」タグとなる。
【０１３５】
前述の知見は、GFP-様タンパク質内の各発色団は、タンパク質環境に応じて、蛍光性または非蛍光性であることができることを示している。この仮説の裏付けは、以下のようである。第一に、先に言及した全ての重要な残基(148位、165位、167位、および203位)は、Tyr66のフェノール環に密に近接してグループ化される(図2)。従って、これらはおそらく、発色団の安定化および位置決定には関わるが、発色団の多様性を生じる発色団の環化事象には関わらないであろう。第二に、asCPは、光誘導した蛍光の可逆的増加の目立った現象を示す[Lukyanov(2000)、前掲]。この光転換は、最初は非蛍光性のタンパク質分子が、若干のコンフォメーション変化により、蛍光状態に切り替わることができることを明確に示している。
【０１３６】
シス-トランス異性化が可能であるGFP-様発色団および他の発色団は、発色団異性化を通じた励起状態の急速緩和のために、溶液中において実際には非蛍光性であることは周知である[Niwaら、前掲；Weberら、前掲]。このようにして、FP中の発色団は、高い量子収量を確実にするためにアミノ酸環境により、強力に安定化されなければならず、他方で、CP内で取り囲んでいる発色団は、吸収された光エネルギーの熱への分散を可能にするように、より緩和されなければならない。
【０１３７】
この観点から、本発明者らは、下記のDsRed発色団安定化の概要を描くことができる。DsRedの結晶構造に従い、Ser148およびLys167は、フェノラート酸素との直接相互作用により発色団を保持する(図2B)。かさ高いIle165は、Tyr66の環を支え、発色団異性化に必要なその移動を妨げる(図2D)。Ser203は、野生型DsRedにおいては発色団との直接のH-結合を有さないが、このような結合は、148位、165位および167位での変更を伴う変異体において形成され得る。おそらく、DsRed変異体中のSer203は、同様にGFP Thr203へ転換し、これは発色団のフェノラート酸素とH-結合を形成する。
【０１３８】
蛍光強度に対する各置換の影響に関する定量的データは、このスキームが好ましいことを物語っている。ひとつの置換により互いに異なる、入手可能なDsRed変異体の量子収量を対で比較し(表2参照)、以下に注目することができる。各置換の寄与は、変異の順番に強く依存しており：より後に置換が導入されると、その影響はより強力となる。例えば、変異体S203Aは、野生型タンパク質と同じ量子収量を示す。同時に変異体S148AへのS203Aの追加は、量子収量の1.5分の1への減少につながる。次に二重変異体S148A/K167MへのAla-203の導入は、蛍光の2.4分の1の減少を生じる。同様に、変異K167Mは、Met167が第二、第三または第四の置換として導入された場合に、各々、量子収量の2分の1、3.2分の1、または8.6分の1の減少につながる。同じく、蛍光強度の4.8分の1または12.9分の1の減少が、S148A/S203AまたはS148A/K167M/S203A変異体への、置換I165Sの追加に関連している。各相互作用の重要性は、1つ、2つまたはそれ以上の他の結合の非存在下で、漸進的に増加しなければならないので、前述のいくつかの発色団安定化の相互作用のモデルは、このような傾向を暗示する。
【０１３９】
DsRed-NF内の発色団環境のコンピュータモデリングは、以下を示した(図2C、2E、2F)。DsRedのSer148およびLys167とは対照的に、DsRed-NF中のCys148およびMet167は、フェノラート酸素とのH-結合による発色団の安定化が不可能である。更に、置換I165Nは、発色団の近傍に空の空間を形成する(図2Dおよび2Eを比較)。本発明者らは、この空間は、光吸収後の発色団のシス-トランス異性化を確実にするのに十分であると考える(図2F)。従って、発色団の周囲の自由な空間と共に、フェノラート-安定化相互作用が存在しないことは、DsRed-NFの極めて低い蛍光量子収量を説明することができる。
【０１４０】
D. 結論
ここで、本発明者らは、CPのFPへの変換およびその逆の変換のために、部位特異的変異誘発および無作為変異誘発を適用した。ヘビイソギンチャク(Anemonia sulcata)由来の紫色の色素タンパク質asCP(asFP595)およびイソギンチャクモドキ種由来の赤色蛍光タンパク質DsRedを、各々、CPおよびFPの代表として選択した。asCPに関して、148位および165位(番号付けはGFPに従う)のいくつかの置換は、赤色蛍光の量子収量を劇的に増加することが認められた。DsRedに関して、148位、165位、167位、および203位での置換は、蛍光強度を有意に減少し、その結果これらの変異体のスペクトル特性は、CPのものにより接近し始めた。最後に、事実上非蛍光性の変異体DsRed-NFを作成した。この変異体は、4種のアミノ酸置換、具体的にはS148C、I165N、K167M、およびS203Aを保持した。DsRed-NFは、高い吸光係数および極めて低い量子収量(＜0.001)を有した。これらのスペクトル特性は、DsRed-NFを真の色素タンパク質とみなすことを可能にしている。
【０１４１】
GFP-様タンパク質の蛍光の能力は、発色団のフェノール環の周囲に大きく左右される。asCP色素タンパク質に関して、148位および165位での変異は、赤色蛍光出現につながることができる。DsRed赤色蛍光タンパク質について、蛍光は、148位、165位、167位、および203位での変異誘発により消光することができる。この知識は、FPおよびCPのスペクトル特性を個別調整する努力において、他のGFP-様タンパク質に適用され得る。
【０１４２】
前述の結果および考察から、本発明は、蛍光タンパク質の重要な新規クラスを提供することは明白である。従って、本発明は、当技術分野への意義のある貢献を示すものである。
【０１４３】
この明細書中に引用された全ての刊行物および特許出願は、あたかも個々の出版物または特許出願が各々参照として組み込まれると特別に個々に示されたかのごとく、参照として本明細書に組み込まれる。任意の出版物の引用は、出願日より前の開示のためであり、本発明が、先行発明のためそのような刊行物に先行している権利を有しないことの承認として解釈されるべきではない。
【０１４４】
以上、本発明を、理解の明確のため、例示および具体例によってある程度詳細に記載したが、本発明の教示を考慮することにより、添付の請求請求の範囲の本旨または範囲から逸脱することなく、ある種の変化および修飾が、本発明に対してなされ得ることは、当業者には容易に明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】asCP、GFP、およびDsRedタンパク質の配列アライメントである。
【図２】「スティック型(stick)」および「空間充填型(spacefill)」表示でのGFP(A)、DsRed(B、D)、およびDsRed-NF(C、E、F)の発色団、および選択された隣接残基の概略図である。
【図３】asCPおよびDsRedの選択された変異体に関する標準化されたスペクトルである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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