(57)【要約】式(Ｉ)で示されるような、インドールのポリマー性誘導体が開示される。また、該誘導体および関連するポリマーコンジュゲートを作製および使用する方法も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式：
【化１】
2005528380.tif 000028
〔式中、
R1はポリマー残基であり、
Y1はO、SまたはNR2であり、
R2は水素、C1-6アルキル、C3-12分岐アルキル、C3-8 シクロアルキル、C1-6 置換アルキル、C3-8 置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、C1-6 ヘテロアルキル、置換C1-6 ヘテロアルキル、C1-6 アルコキシ、フェノキシおよびC1-6 ヘテロアルコキシからなる群より選択され、
L1は二官能性リンカーであり、
pは0または1であり、また
Bは複素芳香族アミン含有部分の残基からなる群より選択される〕
を含む化合物。
【請求項２】
R1が、OH、NH2、SH、CO2H、C1-6 部分および
【化２】
2005528380.tif 000029
からなる群より選択されるキャッピング基Aをさらに含む、請求項1記載の化合物。
【請求項３】
下記式：
【化３】
2005528380.tif 000030
で示される、請求項2記載の化合物。
【請求項４】
Y1がOである、請求項3記載の化合物。
【請求項５】
R2が水素、メチルおよびエチルからなる群より選択される、請求項1記載の化合物。
【請求項６】
R2が水素である、請求項5記載の化合物。
【請求項７】
Bがポーロンの残基である、請求項3記載の化合物。
【請求項８】
前記ポーロンが、アルスターポーロンおよびケンポーロンからなる群のメンバーである、請求項7記載の化合物。
【請求項９】
Bが、ビンブラスチン、ビノレビン、ピンドロール、ヨヒンビン、テルグリド、ニフェジピン、メチルエルゴノビン、5-ヒドロキシ-L-トリプトファン、クロザピン、ナルトルインドール、インドラミン、インドール酢酸およびノル-ビナトロフィミンからなる群より選択される化合物に由来する残基である、請求項8記載の化合物。
【請求項１０】
R1がポリアルキレンオキシド残基を含む、請求項1記載の化合物。  
【請求項１１】
R1がポリエチレングリコール残基を含む、請求項1記載の化合物。
【請求項１２】
R1がポリエチレングリコール残基を含む、請求項3記載の化合物。
【請求項１３】
R1が、
A-O-(CH2CH2O)x-
A-O-(CH2CH2O)x-CH2C(O)-O-、
A-O-(CH2CH2O)x-CH2CH2NR3-、
A-O-(CH2CH2O)x-CH2CH2SH、
-O-C(O)CH2-O-(CH2CH2O)x-CH2C(O)-O-、
-NR3CH2CH2-O-(CH2CH2O)x-CH2CH2NR3-、
-SHCH2CH2-O-(CH2CH2O)x-CH2CH2SH-
〔式中、
xは重合度であり、
R3は水素、C1-6アルキル、C3-12分岐アルキル、C3-8 シクロアルキル、C1-6 置換アルキル、C3-8 置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、C1-6 ヘテロアルキル、置換C1-6 ヘテロアルキル、C1-6 アルコキシ、フェノキシおよびC1-6 ヘテロアルコキシからなる群より選択され、また
Aはキャッピング基である〕
からなる群より選択される、請求項11記載の化合物。
【請求項１４】
R1が-O-(CH2CH2O)x-を含み、かつxが重量平均分子量が少なくとも約20,000Daとなるような正の整数であり、請求項13記載の化合物。
【請求項１５】
R1が約20,000Da〜約100,000Daの重量平均分子量を有する、請求項13記載の化合物。
【請求項１６】
R1が約25,000Da〜約60,000Daの重量平均分子量を有する、請求項13記載の化合物。
【請求項１７】
L1が、
【化４】
2005528380.tif 000031
〔式中、
R3、R4、R5、R7およびR8は水素、C1-6 アルキル、C3-12分岐アルキル、C3-8シクロアルキル、C1-6置換アルキル、C3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、C1-6ヘテロアルキル、置換C1-6 ヘテロアルキル、C1-6アルコキシ、フェノキシおよびC1-6 ヘテロアルコキシからなる群より独立して選択され、
R6は水素、C1-6 アルキル、C3-12分岐アルキル、C3-8シクロアルキル、C1-6置換アルキル、C3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、C1-6ヘテロアルキル、置換C1-6 ヘテロアルキル、C1-6アルコキシ、フェノキシおよびC1-6 ヘテロアルコキシ、NO2、ハロアルキルおよびハロゲンからなる群より選択され、また
nおよびqは各々が正の整数である〕
からなる群より選択される、請求項1記載の化合物。
【請求項１８】
ここに記載した合成技術の結果であって、以下を含むもの：
【化５】
2005528380.tif 000032
2005528380.tif 000033
〔式中、
PEGは-O(-CH2CH2O)-であり、
R4、R5およびR6は水素、C1-6 アルキル、C3-12分岐アルキル、C3-8シクロアルキル、C1-6置換アルキル、C3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、C1-6ヘテロアルキル、置換C1-6 ヘテロアルキル、C1-6アルコキシ、フェノキシおよびC1-6 ヘテロアルコキシからなる群より独立して選択され、また
Bは複素芳香族アミン含有部分の残基である〕  
からなる群より選択される、請求項1記載の化合物。
【請求項１９】
Bがポーロン：
【化６】
2005528380.tif 000034
〔式中、
Y2はO、SまたはNR12’であり、
R1〜R12’ は水素、C1-6 アルキル、C3-12分岐アルキル、C3-8 シクロアルキル、C1-6 置換アルキル、C3-12 アルケニル、C3-12 置換アルケニル、C3-12 アルキニル、C3-12 置換アルキニル、C3-8 置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、C1-6 ヘテロアルキル、置換C1-6 ヘテロアルキル、C1-6 アルコキシ、フェノキシ、C1-6 ヘテロアルコキシ、ハロ-、ニトロ-、シアノ-、ヒドロキシル-、アミノ-、カルボキシ-およびトリフルオロメチルからなる群より各々独立して選択される〕
の残基である、請求項18記載の化合物。
【請求項２０】
前記ポーロンが、アルスターポーロンおよびケンポーロンからなる群のメンバーである、請求項19記載の化合物。
【請求項２１】
Bが生物活性を有する複素芳香族アミン含有部分の残基である請求項3記載の化合物を、治療を必要とする哺乳動物に有効量で投与することを含む治療方法。
【請求項２２】
治療を必要とする哺乳動物に有効量の請求項19記載の化合物を投与することを含む、治療方法。
【請求項２３】
下記式：
【化７】
2005528380.tif 000035
〔式中、
R1はポリマー残基であり、
L1は二官能性スペーサーであり、
Y1はO、SまたはNR2であり、
R2は水素、C1-6アルキル、C3-12分岐アルキル、C3-8シクロアルキル、C1-6置換アルキル、C3-8 置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、C1-6 ヘテロアルキル、置換C1-6 ヘテロアルキル、C1-6 アルコキシ、フェノキシ およびC1-6 ヘテロアルコキシからなる群より選択され、
pは0または1であり、また
Bは複素芳香族アミン含有生物活性化合物の残基である〕
のポリマーコンジュゲートを調製する方法であって、ポリマーコンジュゲートが形成されうる条件下で、
(a)  複素芳香族アミン含有生物活性化合物をアシル化すること、
(b)  ブロック化二官能性スペーサーを結合することにより、ブロック化中間体を形成すること、および
(c)  前記ブロック化中間体を脱ブロック化し、この脱ブロック化中間体を活性化ポリマーと反応させること
を含む、上記方法。
【請求項２４】
下記式：
【化８】
2005528380.tif 000036
〔式中、
R1はポリマー残基であり、
L1は二官能性スペーサーであり、
Y1はO、SまたはNR2であり、
R2は水素、C1-6アルキル、C3-12分岐アルキル、C3-8シクロアルキル、C1-6置換アルキル、C3-8 置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、C1-6 ヘテロアルキル、置換C1-6 ヘテロアルキル、C1-6 アルコキシ、フェノキシおよびC1-6 ヘテロアルコキシからなる群より選択され、
pは0または1であり、また
Bは複素芳香族アミン含有生物活性化合物の残基である〕
のポリマーコンジュゲートを調製する方法であって、ポリマーコンジュゲートが形成されうる条件下で、
(a)  複素芳香族アミン含有生物活性化合物を脱プロトン化すること、
(b)  ブロック化二官能性スペーサーを結合することにより、ブロック化中間体を形成すること、および
(c)  前記ブロック化中間体を脱ブロック化し、この脱ブロック化中間体を活性化ポリマーと反応させること
を含む、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
目的
本出願は、増殖性疾患の治療において有用な新規インドール誘導体に関する。特に、本発明は、溶解度を高めたインドールのポリマー性アシル誘導体(例えばポーロン[paullones])および該誘導体を調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
プロテインキナーゼファミリーの1種、すなわちサイクリン依存性キナーゼ(CDK)は、細胞分裂周期において中心的な役割を果たすことが見出されている。CDK活性の脱制御は、多くのヒト原発腫瘍および腫瘍細胞系で実証されている(Kamb, A. Cyclin-dependent kinase inhibitors and human cancer, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 227: 139-148, 1998を参照されたい)。従って、これらのキナーゼの優先的阻害が、増殖性疾患を治療または予防する際の鍵となることは明白である。
【０００３】
ポーロンは新規クラスの小分子CDK阻害剤である。それらは有望な抗腫瘍特性を有するベンズアゼピノンファミリーの１種である。最近では、ポーロンは、サイクリン依存性キナーゼを調節する細胞周期の強力なATP競合阻害剤であると言われている。また、それらはグリコーゲン合成キナーゼ-3B(GSK-3B)およびニューロンDCK5/p25の強力な阻害剤であると指摘されている(Leostら、Paullones are potent inhibitors of glycogen synthase kinase-3B and cyclin-dependent kinase 5/p25, Eur. J. Biochem., 267: 5983-5994, 2000を参照されたい)。
【０００４】
選択的CDK阻害剤である幾つかの化学物質が公知であるかまたは開発されており、その2、3例を挙げると、ラクトン(例えばブチロラクトンI)、フラボノイド(例えばフラボピリドール)およびプリン誘導体などがある。大腸癌および膵癌の細胞系に対して増殖抑制作用を示すものもある。フラボピリドールは抗癌剤としての臨床試験に入っている。ポーロンはこれらの公知化合物と比較され、CDK阻害に関して等しい効力を有することが見出されている。
【０００５】
リード構造体の1種であるアルスターポーロン(alsterpaullone)(9-ニトロ-7,12-ジヒドロインドロ-[3,2-d][1] ベンズアゼピン-6(5H)-オンは、ラクタムおよび／またはインドール部分の両方を誘導体化することにより、その抗腫瘍活性を高めている。ポーロンファミリーは全般的に、CDK阻害活性は高いが増殖抑制作用は低い。その理由の1つとして、これらの化合物の不溶性が挙げられる。
【０００６】
ここ何年かの間に、生物学的に有効な材料を哺乳動物に投与する幾つかの方法が提案されている。多くの薬剤は水溶性の塩として利用可能であり、比較的容易に医薬製剤中に含有させることができる。問題は、所望の薬剤が水性液体に不溶であるかまたはin vivoで急速に分解される場合である。ポーロンには、特に可溶化しにくいものが多い。
【０００７】
薬剤を可溶化する1つの方法は、それらを可溶性プロドラッグの一部として含有させることである。プロドラッグは生物活性親化合物の化学的誘導体を含んでおり、これを投与すると、最終的にin vivoで該親化合物を遊離する。プロドラッグを用いると、熟練者が薬剤のin vivoでの発現および／もしくは作用期間を改変することが可能となるし、また体内における薬物の輸送、分布または溶解性を改変することができる。さらに、プロドラッグ製剤には、その毒性を低減するもの、および／または医薬調製物を投与した際に直面する問題を別の方法で克服するものが多い。プロドラッグの典型例としては、有機リン酸塩またはアルコールもしくはチオアルコールのエステルが挙げられる(Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., A. Osol, Ed. (1980)を参照されたい。この文献の開示内容は、引用により本明細書中に含まれるものとする)。
【０００８】
プロドラッグは、親化合物もしくは活性化合物の生物学的不活性形態または実質的不活性形態である。活性薬物の遊離速度(すなわち加水分解速度)は、幾つかの要素、特に親薬物を改変因子に連結している結合のタイプの影響を受ける。十分な量の親化合物が加水分解される前に腎臓または網内系などを介して排除されるプロドラッグを調製することのないよう、注意しなくてはならない。
【０００９】
薬物の循環寿命を延ばすために、ポリマーをプロドラッグ系の一部として組み込むことが提案されている。しかし、ほんの1, 2個の約10,000ダルトン未満のポリマーをアルカロイド化合物などの特定の生物活性物質に結合させた場合、特に幾らかの加水分解耐性の結合が用いられていると、得られるコンジュゲートがin vivoで急速に排除されることがわかっている。実際、かかるコンジュゲートは余りに急速に体内から除去されるため、加水分解性のエステル結合を使用したとしても、治療効果を示すほど十分な量の親分子がin vivoで再生されることはない。
【００１０】
ポーロンには難溶性のものが多く、PEGプロドラッグ技術の恩恵を受けうる物質の代表例といえる。
【００１１】
ポーロンの増殖抑制作用を高めるための試みが報告されている(Kunickら、2-Substituted Paullones: CDK1/Cyclin B-Inhibiting Property and In Vitro Antiproliferative Activity, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 10: 567-569, 2000を参照されたい)。しかし、その研究は、9-トリフルオロメチル-ポーロンの2位を、特にシアノ、および炭素鎖エステルおよび種々の長さと飽和状態を有するエーテルなどの基で置換することに専念している。かかる研究は、CDK活性を維持しつつポーロン類似体の増殖抑制作用を高めるかまたは溶解度を向上させるという課題を解決するものではない。
【００１２】
従って、依然として、強力な優先的CDK阻害作用と同時に高い増殖抑制作用を呈する誘導体化複素芳香族アミン含有化合物、例えばポーロンなどのインドール含有化合物が必要とされている。本発明は、この必要性に取り組むものである。
【発明の開示】
【００１３】
発明の概要
本発明の1態様では、下記式(I)の化合物が提供される：
【化１】
2005528380.tif 000002
〔式中、
R1はポリマー残基であり、
Y1はO、SまたはNR2であり、
R2は水素、C1-6 アルキル、C3-12 分岐アルキル、C3-8 シクロアルキル、C1-6 置換アルキル、C3-8 置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、C1-6ヘテロアルキル、置換C1-6ヘテロアルキル、C1-6 アルコキシ、フェノキシおよびC1-6 へテロアルコキシからなる群より選択され、
L1は二官能性リンカーであり、
pは0または1であり、また
Bは複素芳香族アミン含有部分(例えばインドールまたは本明細書中に記載のアシル化反応を受けうる関連化合物を含有する生物活性部分)の残基である〕。
【００１４】
本発明の別の態様は、前記ポリマー残基(R1)がαおよびω末端結合基の両方を含む場合に形成される二官能性化合物を含んでおり、そのため2当量の複素芳香族アミン含有部分(生物活性薬剤、薬物またはタンパク質など)(ここではBとする)が送達される。かかる二官能性ポリマーコンジュゲートの一例を式(II)として以下に例示する：
【化２】
2005528380.tif 000003
〔式中、全ての可変要素は、先に記載した通りである〕。
【００１５】
本発明において、「残基」という用語は、複素芳香族アミン含有生物活性化合物(好ましくはインドール含有化合物)の部分であって、ポリマー性プロドラッグ担体部分がインドール第二級アミンのアシル化を介して結合される置換反応を受けた後も残存する前記部分を意味する、と理解されるものとする。
【００１６】
本発明において、「ポリマー残基」または「PEG残基」という用語は、複素芳香族アミン含有化合物との反応を受けた後も残存するポリマーまたはPEGの部分を意味する、と理解されるものとする。
【００１７】
本発明において、「アルキル」という用語は、直鎖、分岐、置換(例えばハロ-、アルコキシ-、ニトロ-)の、C1-12アルキル、C3-8シクロアルキルまたは置換シクロアルキルなどを含む、と理解されるものとする。
【００１８】
本発明において、「置換」という用語は、官能基もしくは化合物内に含まれる1個以上の原子に1個以上の異なる原子を付加すること、またはこれらと置き換えることを含む、と理解されるものとする。
【００１９】
本発明においては、置換アルキルとしてカルボキシアルキル、アミノアルキル、ジアルキルアミノ、ヒドロキシアルキルおよびメルカプトアルキルが挙げられ、置換アルケニルとしてカルボキシアルケニル、アミノアルケニル、ジアルケニルアミノ、ヒドロキシアルケニルおよびメルカプトアルケニルが挙げられ、置換アルキニルとしてカルボキシアルキニル、アミノアルキニル、ジアルキニルアミノ、ヒドロキシアルキニルおよびメルカプトアルキニルが挙げられ、置換シクロアルキルとして4-クロロシクロヘキシルなどの部分が挙げられ、アリールとしてナフチルなどの部分が挙げられ、置換アリールとして3-ブロモ-フェニルなどの部分が挙げられ、アラルキルとしてトルイルなどの部分が挙げられ、ヘテロアルキルとしてエチルチオフェンなどの部分が挙げられ、置換へテロアルキルとして3-メトキシ-チオフェンなどの部分が挙げられ、アルコキシとしてメトキシなどの部分が挙げられ、またフェノキシとして3-ニトロフェノキシなどの部分が挙げられる。ハロ-はフルオロ、クロロ、ヨードおよびブロモを含むと理解されるものとする。
【００２０】
「十分な量」という用語は、本発明においては、当業者には明らかな治療効果を達成する量を意味するものとする。
【００２１】
本発明の1つの利点は、ポリマー輸送系を介して送達される標的化合物は、その溶解度が増加しているという点である。
【００２２】
本発明の化合物の別の利点は、特定の好適な実施形態において、ポリマー性プロドラッグのプラットフォームを、種々の生物学的に有用な小分子、ペプチドなどに見出される複素芳香族アミン基へ遊離可能な形で結合しうるという点である。かかる生物活性部分を、その生物活性を損なうことなくこの位置で官能化しうるということは、これまで知られていなかった。
【００２３】
本発明の化合物のさらなる利点は、それらは、ポリマー残基とそれに結合した生物学的に有効な結合薬剤との間を、プロドラッグの加水分解速度に影響を及ぼしうる様々な部分により置換しうるという点である。従って、熟練者であれば、プロドラッグの加水分解速度のモジュレーションを可能にする置換基を含有させることができる。
【００２４】
さらに、本明細書中に記載の化合物およびコンジュゲートを作製および使用する方法も提供される。
【００２５】
図面の簡単な説明
図1および2は、後述の実施例で記載した本発明の化合物の形成方法を、概略図を用いて説明したものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
発明の詳細な説明
A.式(Ｉ) 
本発明のある好適な実施形態では、下記式(Ｉ)の化合物が提供される。
【化３】
2005528380.tif 000004
〔式中、
R1 はポリマー残基であり、
Y1はO、SまたはNR2であり、
R2は水素、C1-6アルキル、C3-12分岐アルキル、C3-8シクロアルキル、C1-6置換アルキル、C3-8 置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、C1-6ヘテロアルキル、置換C1-6ヘテロアルキル、C1-6アルコキシ、フェノキシおよびC1-6ヘテロアルコキシからなる群より選択され、
L1は二官能性リンカーであり、
pは0または1であり、また
Bは複素芳香族アミン含有化合物の残基である〕。
【００２７】
本発明のポリマー輸送系は主に、本明細書中でR1と指定したポリマー残基をベースとする。場合により、R1はキャッピング基Aを含む。このポリマーキャッピング基Aとしては、OH、CO2H、NH2、SH、C1-6アルキル部分などの部分、および以下に示す式(III)の化合物が挙げられる。
【化４】
2005528380.tif 000005
好適なキャッピング基(III)を用いると、以下に示す式(II)の組成物を形成することが可能となる：
【化５】
2005528380.tif 000006
〔式中、全ての可変要素は、先に記載した通りである〕。
【００２８】
本発明の式を構成する他の可変要素については、以下のものが好適である：
Y1は酸素であり、
R2は水素およびC1-6アルキルから選択されるが、メチルおよびエチルが最も好適であり、
L1は次の非限定的化合物の1つから選択される：
【化６】
2005528380.tif 000007
〔式中、
R3、R4、R5、R7およびR8は前記R2を規定するものと同一の基から独立して選択され、
R6はR2を規定するもの、NO2、ハロアルキルおよびハロゲンからなる基より選択され、また
nおよびqは各々、正の整数である〕。
【００２９】
プロドラッグの加水分解を介する薬物の創出
好ましくは、前記化合物中に含まれる結合は、治療しようとする哺乳動物の血漿において、十分な量の親化合物、すなわち複素芳香族アミン含有生物活性化合物を排除される前に遊離させるほど短い加水分解速度を有する。
【００３０】
実質的に非抗原性のポリマー
先に述べたように、R1は、好ましくは実質的に非抗原性の水溶性ポリマー残基(ポリアルキレンオキシドやポリエチレングリコールなど)である。本発明の好適な態様では、R1はさらに既述のキャッピング基(Aと指定)を含み、これにより二官能系または二ポリマー(bispolymer)系を形成することが可能となる。
【００３１】
一例を挙げると、本発明の化合物のポリエチレングリコール残基部分は、次の非限定的リストから選択することができる：
A-O-(CH2CH2O)x-
A-O-(CH2CH2O)x-CH2C(O)-O-、
A-O-(CH2CH2O)x-CH2CH2NR3-、
A-O-(CH2CH2O)x-CH2CH2SH、
-O-C(O)CH2-O-(CH2CH2O)x-CH2C(O)-O-、
-NR3CH2CH2-O-(CH2CH2O)x-CH2CH2NR3-、
-SHCH2CH2-O-(CH2CH2O)x-CH2CH2SH-、
〔式中、
xは重合度であり、
R3は本明細書中で先に記載した通りであり、また
Aはキャッピング基である〕。
【００３２】
本発明においては、下記構造：
【化７】
2005528380.tif 000008
〔式中、xは正の整数である〕
を、本出願全範囲にわたり、PEGと称する。
【００３３】
ポリマーの重合度(x)は、約10〜約2,300とすることができる。これは該ポリマー鎖中の反復単位の数を表しており、該ポリマーの分子量によって決まる。(A)部分は本明細書中で規定したキャッピング基、すなわち該ポリマーの末端部に見出される基であり、幾つかの態様においては、NH2、OH、SH、CO2H、C1-6アルキルまたは当業者には明らかな他のPEG末端活性化基のいずれかから選択することができる。
【００３４】
同様に有用なのは、ポリプロピレングリコール、同一出願人による米国特許第5,643,575号に記載されている「星型PEG(star-PEG’s)」などの分岐PEG誘導体およびShearwater Corporationの2001年度版カタログ「Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Application」に記載されているようなマルチアーム型(multi-armed)PEGである。これらの文献各々の開示内容は、引用により本明細書中に含まれるものとする。必要に応じて、過度の試験を行うことなしに、水溶性ポリマーを二官能性結合基へ結合するために官能化しうることは理解されよう。
【００３５】
本発明の多くの態様では、ジ置換または複数置換型ポリマーコンジュゲートが求められている場合には、ビス活性化ポリエチレングリコールが好適である。あるいは、モノ置換型ポリマーが求められている場合には、ポリエチレングリコール(PEG)、モノメチル末端ポリエチレングリコール(mPEG)などのモノ活性化C1-4 アルキル末端ポリアルキレンオキシド(PAO)が好適である。
【００３６】
所望の加水分解性結合を提供するには、モノ-またはジ-PEGアミンおよびモノ-またはジ-PEGジオールだけでなく、PEG酸やPEG二価酸などの一価または二価酸活性化ポリマーを使用することができる。適切なPAO酸は、まずCH3O-PEG-OH (mPEG-OH)をエチルエステルに変換し、次いでけん化することにより合成できる[Gehrhardt, H.ら、Polymer Bulletin 18: 487 (1987)およびVeronese, F.M.ら、J. Controlled Release 10; 145 (1989)も参照されたい]。あるいは、PAO酸は、mPEG-OHをt-ブチルエステルに変換してから酸開裂させることにより合成できる(例えば、同一出願人による米国特許第5,605,976号を参照されたい)。これらの文献各々の開示内容は、引用により本明細書中に含まれるものとする。
【００３７】
PAOおよびPEGはその平均分子量を実質的に変化させることができるが、プロドラッグのポリマー部分は、本発明の大部分の態様においては平均で少なくとも約20,000Daである。好ましくは、R1は約20,000Da〜約100,000Da、より好ましくは約25,000Da〜約60,000Daの重量平均分子量を有する。プロドラッグに包含させるために選択されるポリマーの平均分子量は、リンカーの加水分解前にプロドラッグの十分な循環を提供するに足るものとしなくてはならない。
【００３８】
本明細書中に記載のポリマー物質は、好ましくは室温で水溶性である。かかるポリマーの非限定的リストには、ポリエチレングリコール(PEG)やポリプロピレングリコールなどのポリアルキレンオキシドホモポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール、それらのコポリマーおよびそれらのブロックコポリマー(ただし、該ブロックコポリマーの水溶性が維持される場合に限る)が含まれる。
【００３９】
さらなる実施形態では、PAOベースポリマーの代替物として、R1は場合により1種以上の事実上非抗原性の材料(デキストラン、ポリビニルアルコール、炭水化物ベースのポリマー、ヒドロキシプロピルメタクリルアミド(HPMA)、ポリアルキレンオキシド、および／またはそれらのコポリマーなど)の中から選択される。同一出願人による米国特許第6,153,655号も参照されたい。この文献の内容は、引用により本明細書中に含まれるものとする。当業者であれば、PEGなどのPAOについて本明細書に記載したの同一タイプの活性化が使用できることは理解されよう。当業者であれば、前記リストは単に例示に過ぎず、本明細書中に記載の特質を有する全てのポリマー材料を意図していることが理解されよう。本発明において、「事実上非抗原性」および「実質的に非抗原性」は、実質的に非毒性であり、かつ哺乳動物において感知できるほどの免疫応答を引き起こすものではないと当分野で理解されている全ポリマー材料を含む、と理解されるものとする。
【００４０】
前記内容から、前記のものの他のポリアルキレンオキシド誘導体(例えば、ポリプロピレングリコール酸など)ならびに他の二官能性結合基も意図されていることは明らかである。
【００４１】
複素芳香族アミン含有化合物の残基
本発明の幾つかの態様では、Bは好ましくは複素芳香族アミン含有化合物(好ましくはインドール含有化合物)の残基である。適切な化合物の非限定的リストには、有機化合物、酵素、タンパク質、ポリペプチドなどの残基が含まれる。幾つかの好適な有機化合物としては、限定するものではないが、以下に示すポーロン構造体などのCDK阻害剤が挙げられる：
【化８】
2005528380.tif 000009
〔式中、
Y2はO、SまたはNR12’であり、
R1’- R12’ は水素、C1-6 アルキル、C3-12分岐アルキル、C3-8シクロアルキル、C1-6置換アルキル、C3-12 アルケニル、C3-12置換アルケニル、C3-12アルキニル、C3-12置換アルキニル、C3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、C1-6ヘテロアルキル、置換C1-6 ヘテロアルキル、C1-6アルコキシ、フェノキシ、C1-6 ヘテロアルコキシ、ハロ-、ニトロ-、シアノ-、ヒドロキシ-、アミノ-、カルボキシ-およびトリフルオロメチルなどからなる群より各々独立して選択される〕。
【００４２】
より具体的には、置換ポーロン、例えば
【化９】
2005528380.tif 000010
【００４３】
などが好適である。
【００４４】
本発明の方法において有用な他のCDK阻害剤としては、以下のものが挙げられる：
【化１０】
2005528380.tif 000011
【００４５】
ポーロンファミリーの他の公知の誘導体、例えばLeostら、Paullones Are Potent Ihnhibitors of Glycogen Synthase Kinase-3B and Cyclin-dependent Kinase 5/p25, Eur. J. Biochem, (2000), 267, 5983-5994および1999年6月16日に出願されたPCT出願WO 99/65910中に見出される誘導体は、本発明の目的に沿う化合物であると考えられる。これら各文献の開示内容は、引用により本明細書中に含まれるものとする。
【００４６】
さらに、本発明の方法に適していると考えられる他の化合物としては、以下に示す一般構造を持つものが挙げられる：
【化１１】
2005528380.tif 000012
【００４７】
〔式中、直線は置換が生じうる位置を表している〕。
【００４８】
インドールまたはインドール様部分を含有する生物活性化合物の例としては、限定するものではないが、
【化１２】
2005528380.tif 000013
などの抗癌剤、
【化１３】
2005528380.tif 000014
などの血管拡張薬、β-アドレナリン遮断薬、
【化１４】
2005528380.tif 000015
などのα2アドレナリン拮抗薬、
【化１５】
2005528380.tif 000016
などの混合ドーパミン作動薬／拮抗薬、
【化１６】
2005528380.tif 000017
などのカルシウムチャネル遮断薬、
【化１７】
2005528380.tif 000018
などの幅広いセロトニン作動性、ドパミン作動性およびα-アドレナリン作動性の活性化合物、
【化１８】
2005528380.tif 000019
などのセロトニン前駆物質、抗うつ薬、
【化１９】
2005528380.tif 000020
などの強力な5-HT1cセロトニン受容体拮抗薬、
【化２０】
2005528380.tif 000021
などの高選択性非ペプチドδ-オピオイド拮抗薬、
【化２１】
2005528380.tif 000022
などの血圧降下薬、
【化２２】
2005528380.tif 000023
などの植物成長調節薬、
【化２３】
2005528380.tif 000024
などの高選択性κ-オピオイド拮抗薬、ならびにアントラサイクリン系化合物および関連する代謝拮抗化合物から選択される他のものが挙げられる。あるいは、本発明の方法において有用であると思われる他の適切な化合物は、アミン含有心血管作動薬、抗新生物薬、抗感染症薬、抗真菌薬、抗不安薬、胃腸薬、中枢神経系活性化薬、鎮痛薬、排卵誘発薬、避妊薬、抗炎症薬、ステロイド薬、抗尿毒症薬(anti-urecemic agents)、血管拡張薬、および血管収縮薬の残基であってもよい。
【００４９】
当業者であれば、特定の生物活性化合物が複数の官能基を含有しており、また該官能基のうちの幾つかは、本発明の方法をかかる化合物に適用する前にまず保護またはブロックしておかなくてはならないことが分かるだろう。
【００５０】
本発明の好適な態様では、複素芳香族アミン含有化合物は、動物(例えばヒトを含む哺乳動物)の治療時に、かかる治療が求められる症状に対して医療または診断目的で使用するのに適した生物活性化合物である。前記のリストは単に例示を目的としたものであって、改変しうる化合物を限定するものではない。当業者であれば、他のそうした化合物も、過度の実験を行うことなく同様に改変しうることが分かるだろう。明記されてはいないが適切な複素芳香族アミン基を有する生物活性材料も意図されており、また本発明の範囲内にあることが理解されよう。本発明に含めるのに適した複素芳香族アミン含有分子のタイプに課されるわずかな制限は、担体部分と反応してこれと結合することのできる芳香族化合物の特性を呈しうる少なくとも1個の利用可能なアミン部分が存在するということ、およびプロドラッグ系が親化合物を遊離して再生した後の生物活性が実質的に損なわれないこと、である。
【００５１】
本発明のプロドラッグ組成物中に組み込むのに適した親化合物は、それら自体が、結合していた組成物から加水分解により遊離した時点では活性ではないが、さらなる化学工程／反応を受けた後に活性となる物質／化合物であってもよい、ということが知られている。例えば、二重プロドラッグ輸送系により血流へと送達される抗癌剤は、癌または腫瘍細胞内に入るまでは不活性のまま維持することができるが、その後はすぐに癌または腫瘍細胞の化学的性質により(例えばその細胞に特有の酵素反応により)活性化される。
【００５２】
ポリマー性プロドラッグ輸送系の合成 
具体的で典型的なポリマー性プロドラッグの合成については、後述の実施例で説明する。しかし一般に、本発明のプロドラッグ輸送系を調製するためのある好適な方法では、該輸送系により送達しようとする生物活性材料または親分子のインドールを最初に塩基性条件下でアシル化する。一旦活性化した後は、ブロック化二官能性スペーサーを結合し、脱ブロック化し、さらにSC-PEGやPEG-COOHなどの活性化ポリマーと反応させる。図1では、ポーロンのインドール環を、この基質を塩基性条件下でアシル化剤と反応させることにより活性化する。一旦活性化した後は、次にその中間体を、保護された二官能性リンカーと反応させる。脱保護した後、ポリマー残基を塩基性カップリング条件下でリンカー-ポーロン部分に連結することにより、所望の生成物を形成する。
【００５３】
アシル化剤の非限定的リストには、ホスゲン、トリホスゲン、ジスクシンイミジルカーボネート、カルボニルジイミダゾール、p-ニトロフェニルクロロホルメート、N-クロロカルボニルオキシフタリミドおよびジフタリミドカーボネートが含まれる。
【００５４】
あるいは、図2に示すように、インドール含有化合物をまず強塩基(例えば、KOHやカリウムt-ブトキシドなど)で処理してから、ポーロンのインドール窒素を脱プロトン化する。その後、該中間体を、アミンを保護した二官能性酸塩化物と反応させる。次に生成物を酸で脱保護し、活性化ポリマーと反応させることにより、塩基性カップリング条件下でポリマー残基を結合して所望の生成物を形成する。
【００５５】
活性化ポリマーの非限定的リストには、ビス-スクシンイミジルカーボネート活性化PEG (SC-PEG)、ビス-チアゾリジン-2-チオン活性化PEG(T-PEG)、N-ヒドロキシフタラミジルカーボネート活性化PEG(BSC-PEG)(同一出願人による米国特許出願第09/823,296号を参照されたい。この文献の開示内容は、引用により本明細書中に含まれるものとする)、スクシンイミジルスクシネート活性化PEG(SS-PEG)、およびモノ活性化(mono-activated) PEG(例えば前記の2001 Shearwaterカタログ中に見出されるものなど)が含まれる。
【００５６】
中間体のPEG残基への結合は、カップリング剤の存在下で実施することができる。適切なカップリング剤の非限定的リストには、1,3-ジイソプロピルカルボジイミド(DIPC)、任意の適切なジアルキルカルボジイミド、2-ハロ-1-アルキル-ピリジニウムハロゲン化物(Mukaiyama試薬)、1-(3-ジメチルアミノ-プロピル)-3-エチルカルボジイミド(EDC)、プロパンホスホン酸環状無水物(PPACA)およびフェニルジクロロホスフェートなどが含まれており、これらは例えばSigma-Aldrich Chemical などの商業的供給源から調達することができるし、また公知技術を用いて合成することもできる。
【００５７】
好ましくは、前記置換基を、テトラヒドロフラン(THF)、アセトニトリル(CH3CN)、塩化メチレン(DCM)、クロロホルム(CHCl3)、ジメチルホルムアミド(DMF)またはそれらの混合物といった不活性溶媒中で反応させる。この反応は、好ましくはジメチルアミノ-ピリジン(DMAP)、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、トリエチルアミン、KOH、カリウムt-ブトキシドおよびNaOHなどの塩基の存在下で0℃〜約22℃(室温)の温度にて実施することにより、インドール窒素原子の脱プロトン化により該反応を触媒し、生成した酸を全て中和する。
【００５８】
選択した合成方法に関わらず、本明細書中に記載の合成技術で得られる好適な化合物の一部として、以下のものが挙げられる。
【化２４】
2005528380.tif 000025
2005528380.tif 000026
【００５９】
〔式中、全ての可変要素は先に規定した通りである〕。
【００６０】
治療方法
本発明の別の態様では、哺乳動物における種々の病状の治療方法を提供する。該方法は、かかる治療を必要とする哺乳動物に、本明細書に記載されている通りに調製した有効量のプロドラッグ(9-ニトロ-ポーロン-PEGコンジュゲートなど)を投与することを含む。かかる組成物は、とりわけ、哺乳動物において新生物性疾患を治療したり、全身腫瘍組織量を減らしたり、新生物の転移を抑制したり、また腫瘍の再発／新生物の成長を防いだりする際に有用である。
【００６１】
投与するプロドラッグの量は、その内部に含まれる親分子によって決まる。一般に、治療方法に用いられるプロドラッグの量は、哺乳動物において所望の治療結果を効率的にもたらす量とする。当然ながら、種々のプロドラッグ化合物の用量は、多少はその親化合物、in vivoでの加水分解速度、ポリマーの分子量などに応じて変化するだろう。しかし一般に、ポーロンのプロドラッグは、ポーロン部分の量を基準として、1日当たり約10〜約30mg／kgの範囲の量にて投与される。同様に、アルスターポーロンのプロドラッグは1日当たり約12〜約20mg／kgの範囲の量にて投与される。好ましくは、アルスターポーロンのプロドラッグは、1日当たり約12〜約18mg／kgの範囲の量にて投与される。前記範囲は単なる例示であり、当業者であれば、選択されたプロドラッグの最適な投与を臨床試験および治療指標に基づいて決定することができるだろう。実際の用量は、過度の試験を行わずとも、熟練者には明らかとなろう。
【００６２】
本発明のプロドラッグは、哺乳動物投与用の1種以上の適切な医薬組成物中に包含させることができる。該医薬組成物は、当分野で周知の方法に従って調製される溶液、懸濁液、錠剤、カプセル剤などの形態であってもよい。かかる組成物の投与を熟練者のニーズに応じて経口および／または非経口経路によるものとしうる、ということも考えられる。該組成物の溶液および／または懸濁液は、例えば該組成物を当分野で公知のいずれかの方法(例えば静脈注射、筋肉内注射、皮下注射など)により注射するかまたは浸潤させるための担体ビヒクルとして利用してもよい。
【００６３】
また、かかる投与は、体隙または体腔への注入によるもの、ならびに吸入および／または鼻腔内経路によるものであってもよい。しかし、本発明の好適な態様では、プロドラッグはそれを必要とする哺乳動物に非経口的に投与される。
【実施例】
【００６４】
実施例
本発明のさらなる理解のために以下の実施例を提供するが、かかる実施例は本発明の効力が及ぶ範囲を何ら制限するものではない。実施例中に列挙されている下線および太字の数字は、図中の数字に対応している。
【００６５】
基本手順  アルスターポーロン(9-ニトロポーロン)1は米国国立癌研究所(National Cancer Institute)から提供されたものであり、これをさらに精製することなく使用した。全ての反応は、乾燥窒素またはアルゴン雰囲気下で実施した。市販試薬は、さらに精製することなく使用した。全てのPEG化合物を、真空下で、またはトルエンからの共沸蒸留により、使用前に乾燥した。NMRスペクトルは、特に定めのない限り、Varian Mercury(登録商標)300 NMR分光計および溶媒としての重水素化クロロホルムまたはメタノールを用いて取得した。化学シフト(δ)は、テトラメチルシラン(TMS)よりも低磁場側に百万分の一(ppm)単位で記録される。
【００６６】
HPLC法  反応混合物および中間体と最終生成物の純度は、0.5％のトリフルオロ酢酸(TFA)中5〜80％のアセトニトリルを含む勾配を流速1mL／分にて使用し、多波長UV検出器(主波長として280nmを使用)を備えたZOBAX(登録商標)300 SB C8逆相カラム(150×4.6 mm)またはPhenomenex Jupiter(登録商標)300A C18逆相カラム(150×4.6 mm)を利用して、Beckman Coulter System Gold(登録商標)HPLC装置によりモニターした。
【００６７】
実施例1
化合物3  1,4ジオキサン(150mL)中にジ-t-ブチルジカーボネート(15g、0.086mol)を含む溶液を氷浴中で5℃まで冷却したものに、1,4-ジオキサン(100mL)中に2,2’-(エチレンジオキシ)ビス(エチルアミン)(25.85g、174.4mmol)を含む溶液を1時間かけて滴下した。得られた反応混合物を室温まで温めてから、さらに2時間攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣を塩化メチレン(DCM、150mL)中に溶解し、水で洗浄し(3×150mL)、硫酸マグネシウム(MgSO4)上で乾燥し、ろ過し、さらに溶媒を減圧下で蒸発させることにより、3を得た(13.84g、mmol、80％)。13C NMR (75.5 MHz, CDCl3) δ28.39, 40.31, 70.12, 73.45, 79.03, 115.76。
【００６８】
実施例2 
化合物4  無水テトラヒドロフラン(THF、600mL)中にアルスターポーロン1(1.5g、5.11mmol)を含む懸濁液に、4-ニトロフェニルクロロホルメート(3.082g、15.29mmol)および4-ジメチルアミノピリジン(DMAP、3.736g、30.57mmol)を加え、得られた反応混合物を室温で2時間攪拌した。化合物3(12.54g、50.97mmol)を加え、この混合物を室温でさらに12時間攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をDCM(300mL)中に溶解し、ろ過し、0.25N HCl(3×300mL)で洗浄した。有機層を乾燥し(MgSO4)、ろ過し、さらに溶媒を減圧下で除去した。残渣をカラムクロマトグラフィーでさらに精製することにより、4を得た(1.18g、2.08mmol、40.6％)。13C NMR(75.5MHz、CDCl3) δ28.36, 29.74, 31.56, 40.12, 40.96, 68.92, 69.99, 70.30, 79.51, 113.89, 115.05, 116.92, 119.87, 121.69, 123.03, 124.42, 126.44, 129.10, 129.62, 133.92, 135.55, 140.88, 143.37, 150.83, 155.88, 172.94。
【００６９】
実施例3
化合物5  トリフルオロ酢酸(TFA、0.2mL)と無水DCM(1.8mL)との混合物に4(0.10mg、0.176mmol)を加え、得られた反応混合物を室温で45分間攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をエチルエーテルで洗浄することにより、5を得た(0.102g、0.176mmol、99％)。13C NMR (75.5 MHz、CDCl3/DMSO-d6) δ30.42, 38.75, 39.96, 65.96, 68.32, 69.28, 69.49, 112.11, 114.35,115.22, 118.44, 121.42, 122.32, 123.63, 125.78, 127.66, 128.61, 134.44, 135.03, 139.93, 142.53, 151.21, 172.44。
【００７０】
実施例4
化合物7  無水ジメチルホルムアミド(DMF、3mL)およびDCM(37mL)中に5(0.102g、0.176mmol)を含む溶液に、BSC-PEGリンカー6(2.36g、0.059mmol)およびDMAP(0.022g、0.176mmol)を加えた。この反応物を室温で12時間攪拌し、溶液を減圧下で濃縮し、さらにエチルエーテル(150mL)を用いてPEG誘導体を析出させた。得られた粗生成物をイソプロパノール(IPA、200mL)から結晶化することにより、7を得た(2.0g、0.0488mmol、87％)。13C NMR(75.5MHz、CDCl3)δ31.24, 40.17, 40.52, 63.52, 68.56, 69.00, 70.10-74.00
(PEG), 113.25, 114.64, 116.26, 119.17, 121.28, 122.91, 123.68, 126.00, 128.42, 128.94, 1 35.43, 140.30, 142.83, 150.46, 155.94, 171.64。
【００７１】
実施例5
化合物9   無水DMF(20mL)およびDCM(90mL)中に5(0.765g、1.64mmol)を含む溶液に、PEG二価酸8(7.5g、0.37mmol)、塩酸1-[3-(ジメチルアミノ)-プロピル]-3-エチルカルボジイミド(EDC、0.315g、1.64mmol)、およびDMAP(0.364g、2.98mmol)を加え、さらに
室温で12時間攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をIPA(200mL)から結晶化することにより、9を得た(7.2g、0.343mmol、93％)。13C NMR (75.5MHz、CDCl3)δ31.22, 37.97, 40.47, 68.50-74.00 (PEG), 113.27, 114.58, 116.24, 119.10, 121.19, 122.91, 123.57, 125.98, 128.38, 128.90, 133.78, 135.49, 140.30, 142.77, 150.39, 169.76, 171.62。
【００７２】
実施例6
化合物13  (A) クロロホルム(125mL)中にt-ブチルN-(3-ヒドロキシプロピル)-カルバメート(5.0g、28.57mmol)、 N,N’-ジスクシンイミジルカーボネート(DSC、9.6g、37.5mmol)を含む溶液にピリジン(2.99mL、37.02mmol)を加え、得られた反応混合物を室温で12時間攪拌した。この混合物を0.5N HCl(60mL)で洗浄し、乾燥し(MgSO4)、ろ過し、さらに溶媒を減圧下で除去することにより、化合物12を得た(8.2g、25.92mmol、90.7％)。13C NMR (75.5MHz、CDCl3) δ25.46, 28.36, 28.91, 36.80, 68.91, 79.35, 151.40, 155.76, 168.50。
【００７３】
(B) 1(0.25g、0.85mmol)および水酸化カリウム(KOH、0.114g、2.03mmol)を含むDMF／THF(20mL／100mL)を氷塩浴中で0℃にて1時間攪拌して得た反応混合物に12(0.805g、2.55mmol)を加え、得られた反応混合物を室温まで徐々に温めてから24時間攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をDCM(100mL)中に溶解し、ろ過し、0.25N HCl(2×200mL)で洗浄した。有機層を乾燥し(MgSO4)、ろ過し、さらに溶媒を減圧下で除去した。残渣をカラムクロマトグラフィーでさらに精製することにより、13を得た(0.340g、0.706mmol、83％)。13C NMR (75.5MHz、CDCl3) δ25.68, 28.43, 28.95, 31.36, 37.00, 65.53, 67.97, 76.57, 79.56, 114.83, 115.83, 119.35, 120.68, 122.82, 123.89, 127.95, 128.24, 129.87, 134.65, 141.06, 144.30, 150.77, 155.62, 172.72。
【００７４】
実施例7
化合物14  DCM(3mL)中に13(0.146g、0.295mmol)を含む溶液を氷塩浴を用いて0℃まで冷却したものに、攪拌しながら、TFA(3mL)を1時間かけて滴下した。溶媒を減圧下で除去することにより、14を得た(0.146g、0.295mmol、約100％)。
【００７５】
実施例8
化合物15  無水DMF／DCM(6mL／9mL)中に14(0.146g、0.295mmol)を含む溶液に、PEGリンカー6(2.98g、0.074mmol)およびDMAP(0.072g、0.59mmol)を加えた。得られた反応混合物を室温で12時間攪拌し、DCMで希釈し、0.1N HCl(2×20mL)および塩水(20mL)で洗浄した。減圧下での溶媒の除去により粗生成物を得て、これをDMF／エタノール(45mL／45mL)から結晶化することにより、14を得た(2.5g、0.0612mmol、83％)。13C NMR(75.5MHz、CDCl3) δ28.08, 31.36, 38.63, 63.69, 67.05, 69.35, 69.92, 70.12, 70.30-73.50 (PEG), 114.56, 115.42, 119.25, 120.36, 123.11, 123.23, 127.65, 128.95, 129.34, 135.32, 140.85, 144.01, 150.36, 155.61, 171.83。
【００７６】
実施例9
化合物16   無水DMF(30mL)およびDCM(46mL)中に14(0.457g、0.922mmol)および8(4.6g、0.23mmol)を含む溶液を0℃まで冷却した。EDC(0.177g、0.922mmol)およびDMAP(0.562g、 4.6mmol)を同時に加え、得られた反応混合物を室温で12時間攪拌した。溶液を0.1N HCl(2×30mL)および塩水(30mL)で洗浄し、乾燥し(MgSO4)、ろ過し、溶媒を減圧下で除去し、さらに残渣をIPA(100mL)から結晶化することにより、16を得た(4.26g、0.205mmol、89％)。13C NMR (75.5MHz、CDCl3) δ28.08, 31.12, 34.86, 65.20, 68.50-73.50 (PEG), 114.37, 115.43, 118.90, 120.09, 122.68, 123.14, 127.54, 128.71, 129.37, 134.79, 135.29, 140.57, 143.79, 150.28, 169.59, 171.83。
【００７７】
実施例10〜13
化合物17  アルスターポーロン1の代わりに等モル量のテルグリドを使用する点を除いては、実施例1〜4の手順を繰り返す。
【００７８】
実施例14〜16
化合物18  アルスターポーロン1の代わりに等モル量のケンポーロン(kenpaullone)を使用する点を除いては、実施例5〜7の手順を繰り返す。
【００７９】
実施例17
この実施例では、化合物7、9、15および16のin vitroデータが提示される。
【００８０】
IN VITROバイオアッセイ
P388/O(マウスリンパ系新生物、Southern Research Institute)細胞系を使用して一連のin vitroアッセイを行うことにより、非改変アルスターポーロン、化合物7および化合物12のIC50 を測定した。P388/0細胞は、RPMI-1640培地(Whittaker Bioproducts, Walkersville, Maryland)＋10％FBS(Hyclone Inc., Logan UT)中で増殖させた。抗生物質を含有するそれら個々の培地においてバイオアッセイを行った。
PEG-アルスターポーロン誘導体を水に溶かし、培養培地で適切な濃度まで希釈した。
【００８１】
アッセイは、96ウェルマイクロタイター細胞培養プレートにおいて2回ずつ実施した。このマイクロタイタープレート中で、前記化合物の2倍連続希釈を行った。37℃でトリプシン-EDTA(0.05％トリプシン、0.53mM EDTA;GIBCOBRL(Life Technologies))と共にインキュベートすることにより、細胞を剥がした。トリプシンは、各細胞系にとって適切な10％FBS含有培地を加えることにより不活性化した。前記マイクロタイタープレートの各ウェルに10,000個の細胞を加えた。3日後、代謝指示色素を製造業者のプロトコル(Promega)に従って加えることにより、細胞増殖について測定した。試験化合物のIC50値を下記表1に提供する。
【表１】
2005528380.tif 000027
【００８２】
現段階で本発明の好適な実施形態と考えられるものについて記載してきたが、当業者であれば、本発明の精神から逸脱することなく変更および改変を成しうることが理解されよう。かかる変更および改変は全て、本発明の真の範囲内に含まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】図1は、実施例で記載した本発明の化合物の形成方法を、概略図を用いて説明したものである。
【図２】図2は、実施例で記載した本発明の化合物の形成方法を、概略図を用いて説明したものである。
【図１】
2005528380.tif 000037
【図２】
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【国際調査報告】
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