(57)【要約】  本発明は、ペニシリウムssp.から単離された天然のスタチンに類似する構造を有する化合物に関する。特に、本発明は、HPLC−DADにより測定される場合、222−224nm（100％）、229−234nm肩（84−89％）、290nm肩（13％）、303−305nm（14−15％）、318−320nm肩（９−11％）、331−333nm（7.5−8.5％）のUV最大相対吸光スペクトル、及び構造式IVを有する単離された化合物、及びそれを含んで成る医薬組成物に関する。
2005513042.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
HPLC−DADにより測定される場合、222−224nm（100％）、229−234nm肩（84−89％）、290nm肩（13％）、303−305nm（14−15％）、318−320nm肩（９−11％）、331−333nm（7.5−8.5％）のUV最大相対吸光スペクトル、及びHPLC−DADにより測定される場合、202−204nm（26−45％）、254−258（2−3％）、326−328nm（6−8％）のUV最少相対吸光スペクトルを有する単離された化合物。
【請求項２】
前記化合物が、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Aレダクターゼを阻害することができる化合物、例えばスタチン（stain）を含んで成る請求項１記載の単離された化合物。
【請求項３】
前記アルキルフェノン保持指数（RI）が887−967の範囲である請求項１又は２記載の単離された化合物。
【請求項４】
前記RIが、891−904、946−959、又は960−964である請求項３記載の単離された化合物。
【請求項５】
前記化合物が、230nmの励起波長及び450nmの発光波長を用いる場合、蛍光を発する請求項１〜４のいずれか１項記載の単離された化合物。
【請求項６】
下記式（I）：
【化１】
2005513042.tif 000010
［式中、R1は、OH、C6H5COO、R6COOを表し、ここでR6は、C1−C5アルキルを表し；
R2-4は、H、C1-C5アルキル、C1−C5アシルを表し；
R5は、H、CH3を表し；そして
Xは、下記式（II）又は（III ）：
【化２】
2005513042.tif 000011
で表される化合物を表す］
で表される単離された化合物。
【請求項７】
R1が２−メチルブチリル又は２−ジメチルブチリルであり、R2〜R4がHであり、R5がH又はCH3であり、そしてXが式（II）又は（III ）の化合物を表す式（I）の単離された化合物。
【請求項８】
下記式（IV）:
【化３】
2005513042.tif 000012
［式中、Xは式（II）又は（III ）の化合物を表す］
を有する請求項６記載の単離された化合物。
【請求項９】
前記化合物が、ペニシリウムssp. (Penicillium spp.) から供給される請求項１〜６及びいずれか１項記載の単離された化合物。
【請求項１０】
前記ペニシリウムssp. が好ましくは、ペニシリウム・ソリタム（Penicillium solitum）,  好ましくはCBS111, 242株；P.ネオコムン（P. neocommune）、好ましくはCBS111, 239株；P.ノボニウォテンス（P. novoniwotense）、好ましくはCBS111,240株；P.ランデリ（P. landeri）、好ましくはCBS111,241株；P.ラノサム（P. lanosum）、好ましくはCBS111,243株；及びP.ピニコラ（P. pinicola）、好ましくはCBS111,244株から成る群から選択される請求項９記載の単離された化合物。
【請求項１１】
前記ペニシリウムが、P.ソリタムCBS147,86 (CBS111,242として再寄託されている)である請求項10記載の単離された化合物。
【請求項１２】
ａ）請求項１〜11記載の少なくとも１つの化合物、又は医薬的に許容できるその塩又は代謝物又はプロドラッグ；及び
ｂ）医薬的に許容できるキャリヤー；
を含んで成る医薬組成物。
【請求項１３】
アセチルサリチル酸をさらに含んで成る請求項12記載の医薬組成物。
【請求項１４】
ａ）少なくとも１のソリスタチン（solistatin）、又は医薬的に許容できるその塩又は代謝物又はプロドラッグ；及び
ｂ）医薬的に許容できるキャリヤー；
を含んで成る医薬組成物。
【請求項１５】
薬剤としてのソリスタチンの使用。
【請求項１６】
高コレステロール血症及び/又はオステオポローシスの処理のための医薬組成物の生成のためへのソリスタチンの使用。
【請求項１７】
イムノサプレッサーとしてのソリスタチンの使用。
【請求項１８】
スタチンの生成のためへの請求項１〜11のいずれか１項記載の化合物の使用。
【請求項１９】
前記スタチンが、コンパクチン（compactin）、シムバスタチン（simvastatin）、ロバスタチン（lovastatin）及びプラバスタチン（pravastatin）を含んで成る請求項18記載の使用。
【請求項２０】
薬剤としての請求項１〜11のいずれか１項記載の化合物の使用。
【請求項２１】
高コレステロール血症及び/又はオステオポリーシスの処理のための薬剤の製造のためへの請求項１〜11のいずれか１項記載の化合物の使用。
【請求項２２】
イムノサプレッサーとしての請求項１〜11のいずれか１項記載の化合物の使用。
【請求項２３】
有効量の少なくとも１つの請求項１〜８のいずれか１項記載の化合物及び/又はソリスタチンを投与することによって、ヒト又は動物における低密度リポタンパク質コレステロール（LDL−C）のレベルを低めるための方法。
【請求項２４】
ａ）前記化合物の生成を促進する条件下で適切な培養培地において生物を培養し；そして
ｂ）段階ａ）で得られた宿主生物又は培養培地から前記化合物を回収することを含んで成る請求項１〜11のいずれか１項記載の化合物の生成方法。
【請求項２５】
前記生物が、菌類、特にペニシリウムspp.の菌類である請求項24記載の方法。
【請求項２６】
前記生物が、ペニシリウム・ソリタム,  好ましくはCBS111, 242株；P.ネオコムン、好ましくはCBS111, 239株；P.ノボニウォテンス、好ましくはCBS111,240株；P.ランデリ、好ましくはCBS111,241株；P.ラノサム、好ましくはCBS111,243株；及びP.ピニコラ、好ましくはCBS111,244株から成る群から選択される請求項25記載の方法。
【請求項２７】
医薬組成物の調製のためへの請求項１〜11のいずれか１項記載の化合物を含んで成るペニシリウムssp.の培養物の使用。
【請求項２８】
ａ）スタチン化合物の生成を促進する条件下で適切な培地において請求項９〜11のいずれか１項記載のペニシリウムssp.を培養し；
ｂ）段階ａ）で得られる培養物ブイヨンを回収し；
ｃ）前記培養物ブイヨンを含んで成る組成物を調製することによって調製される前記細胞の培養物からの培養物ブイヨンを含んで成る組成物。
【請求項２９】
前記スタチン化合物が、１又は複数の請求項１〜11のいずれか１項記載の化合物である請求項28記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペニシリウムssp.から単離された天然のスタチンに類似する構造を有する化合物に関する。特に、本発明は、HPLC−DADにより測定される場合、222−224nm（100％）、229−234nm肩（84−89％）、290nm肩（13％）、303−305nm（14−15％）、318−320nm肩（９−11％）、331−333nm（7.5−8.5％）のUV最大相対吸光スペクトルを有する単離された化合物に関する。
【０００２】
本発明のもう１つの観点は、本発明の化合物を含んで成る医薬組成物、及び薬剤としての前記化合物の使用に関する。本発明のさらにもう１つの観点は、本発明の化合物の生成方法に関する。また、本発明の観点は、ヒト又は動物における低密度リポタンパク質コレステロールのレベルを低めるための方法に関する。さらなる観点は、本発明の化合物の生成方法に関する。単離された化合物は、高コレステロール血症又はオステオポローシスの処理のための治療に、又は治療効果を有する先導化合物のための前駆体として使用され得る。
【背景技術】
【０００３】
スタチンは、いくつかの最も重要なヒト疾患に対して一連の強い効果を有する、菌類からの天然の生成物（ポリケチド）を含んで成る。
【０００４】
スタチンは、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａレダクターゼ（HMGR）のインヒビターである。HMGRは、コレステロール生合成経路における初期の速度制限段階である、HMG−CoAのメバロネートへの転換の触媒を担当する酵素である。スタチンは、効果的な脂質低減剤であり、そして従って、心臓発作の危険性を低める、高コレステロール血症の処理において血清コレステロールレベルを低めるために広く使用されて来た。スタチンはまた、骨形態発生タンパク質−２（BMP−２）の発現に影響を及ぼすことによって骨形成を促進し、そしてこの刺激は、骨折及びオステオポローシスの処理に対して有益な効果を有することができる（Mundyなど., Science( 1999) 286: 1946-1949; Sugiyamaなど., Biochem Biophys Res Commun (2000) 271: 688-92）。
【０００５】
最近、スタチンはまた、INF−γによるMHC−II発現の誘発の直接的なインヒビターとして、及び従って、MHC−II−介在性T−細胞活性化のリプレッサーとして作用することによって新規タイプのイムノモジュレーターとして認識されて来た（Kwarkなど., Nature Med., (2001) 6: 1399-1402）。天然に存在するスタチンは、抗菌活性を有する（Auclairなど.,Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters）2001),11: 1527-1531）。化学的に修飾されたスタチン分子は、身体における蓄積の領域、及び他の差異間での用量当たりの有効性において変化する（Mottiなど., Ann. Ital. Med. Int. 200, 15: 9b 102）。
【０００６】
天然に存在するスタチンは、メビノリン（＝モナコリン）及びコンパクチンに再分され得る。メビノリンは、アスペルギラス・テレウス（Aspergillus terreus）及びモナスカス・ルベル（Monascus ruber）により生成され、そしてEndoなど. (Journal Antibiotics, (1976), 26: 1346-1348) は、ペニシリウム・シトリナム（Penicillium Citrinum）によるコンパクチンの生成を報告する。
Istvan and Deisenhofer, (Science (2001) 292: 1160-1164) は、最近、天然の及び化学的に合成されたスタチンによるHMGRの阻害の推定された機構を開示する。
【０００７】
スタチンの多面発生効果、それらの報告される副効果（胃腸疾患、皮膚発疹及び頭痛（アメリカ特許第6,245,800号））、及び身体における保持時間及び用量当たりの有効性の変動のために、市販のスタチンに比較して、ユニーク且つ所望の性質、例えば特定の器官における高められた有効性、低い毒性、変更された保持時間又は濃度を有するスタチン分子についての必要性がまだ存在する。
【発明の開示】
【０００８】
第１の観点においては、本発明は、HPLC−DADにより測定される場合、222−224nm（100％）、229−234nm肩（84−89％）、290nm肩（13％）、303−305nm（14−15％）、318−320nm肩（９−11％）、331−333nm（7.5−8.5％）のUV最大相対吸光スペクトル、及びHPLC−DADにより測定される場合、202−204nm（26−45％）、254−258（2−3％）、326−328nm（6−8％）のUV最少相対吸光スペクトルを有する単離された化合物に関する。
【０００９】
第2の観点においては、本発明は、下記式（IV）：
【化１】
2005513042.tif 000003
［式中、Xは、下記式（II）又は（III ）：
【００１０】
【化２】
2005513042.tif 000004
で表される化合物を表す]で表される化合物に関する。
【００１１】
第３の観点においては、本発明は、少なくとも１つの本発明の化合物又はソリスタチン、又は医薬的に許容できるその塩又は代謝物又はプロドラッグ、及び医薬的に許容できるキャリヤーを含んで成る医薬組成物に関する。
第４の観点においては、本発明は、薬剤の生成noためへの本発明の化合物又はソリスタチンの使用に関する。
第５の観点においては、本発明は、薬剤としての本発明の化合物又はソリスタチンの使用に関する。
【００１２】
第６の観点においては、本発明は、高コレステロール血症及び/又はオステオポローシスの処理のための薬剤の製造、又はイムノサプレッサーとしての使用のためへの本発明の化合物の使用に関する。
第７の観点においては、本発明は、有効量の少なくとも１つの本発明の化合物又はソリスタチンを投与することによって、ヒト又は動物における低密度リポタンパク質コレステロール（LDL−C）のレベルを低めるための方法に関する。
【００１３】
第８の観点においては、本発明は、本発明の化合物の生成方法に関し、ここで前記方法は、
ａ）前記化合物の生成を促進する条件下で適切な培養培地において生物を培養し；そして
ｂ）段階ａ）で得られた宿主生物又は培養培地から前記化合物を回収することを含んで成る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
定義：
本発明の詳細な態様の論議の前、本発明の主要観点に関する特定の用語の定義が提供される。
“スタチン”：本発明の用語“スタチン”は、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Aレダクターゼ（HMGR）のいずれかのインヒビターを意味し、ここでスタチンのHMG−様成分（すべての既知スタチンに存在する）は、HMG−レダクターゼの活性部位での結合のために、HMG−CoAのHMG−成分と競争する。
【００１５】
“ソリスタチン”は、式（I）（ここで、R1はHであり；R2-4はHであり；R5はHであり、そしてXは式（II）の化合物である）の化合物である。
【００１６】
“保持指数”：保持指数又は括弧された保持指数は、個々の一連のHPLC試験の前、一連のアルキルフェノン標準（アセトフェノン、プロピオフェノン、ブチロフェノン、バレロフェノン、ヘキサノフェノン、オクタノフェノン及びデカノフェノン）試験に基づかれている。アセトフェノンは、RI値800を有し（分子に８個の炭素原子が存在するので）、プロピオフェノンは900（９個の炭素原子）である。抽出物からの化合物の保持時間に基づいて、化合物は、前記化合物の前後で溶出する２種のアルキルフェノン間に配置され、そしてRI値は線状内挿により計算される（Frisvad and Thrane, J. Chramatogr. (1987) 404: 195-214における式を参照のこと）。
【００１７】
“HPLC−DAD”：ダイオードアレイ検出（UV検出器を有する高性能液体クロマトグラフィー。化合物のUV吸光度は、異なった（スペクトル）波長で同時に測定される。
【００１８】
発明の特定の記載：
メビノリンは、分子のナフチル部分に１又は２個の二重結合（後者は、トランソイド接合されたジエン）を含み、主要1, 2, 6, 7, 8, 8a−ヘキサヒドロナフチル基の特徴的でない末端−吸光度又は特徴的なUVスペクトルのいずれかを付与する（231,238及び247nmでの吸光度；Endo, J. Antibiotics (1979), 32: 852-584における図１を参照のこと）。この特徴的な発色団は、天然に存在するスタチン及びベルシオール（LL−N313エプシロン）においてのみ見出されて来た。
【００１９】
後者は、アスペルギラス・ベルシコロル（Aspergillus versicolor）及びスポロルミア・アフィニス（Sporormia affinis）において見出されている（Turner, Fungal metabolites, Academic Press, London (1971); Turner and Aldridge, Fungal metabolites 11, Academic Press, London (1983)）。ベルシオールは、デルタ−ファクトン（３−ヒドロキシヘプタン−５−オリド）、又はスタチンの活性のために重要であるその活性開環酸性形を有さない（Istvan and Deisenhofer, Science (2001) 292: 1160-1164）。
【００２０】
この理由のために、ベルシオールが排除される限り、1, 2, 6, 7, 8, 8a−ヘキサヒドロナフチル基の特徴的な発色団を認識するために、ダイオードアレイ検出を有する高性能液体クロマトグラフィーを用いて、スタチンについてスクリーンすることができる（UV 検出) (=HPLC-DAD) (Frisvad and Thrane, J. Chromatogr. (1987) 404: 195-214; Frisvad and Thrane, In Betina, V. (Ed. ) Chromatography of mycotoxins: techniques and applications J. of Chromatography Library (1993) 54: 253-372）。
【００２１】
これは、クロマトグラフィー分析においてメビノリン及びコンパクチンの外部標準を用いることによって確証され得る。メビノリンは常に、メビノリン二次代謝物生合成ファミリーにおける主要スタチンであり、そしてコンパクチンは常に、コンパクチン二次代謝物生合成ファミリーに置ける主要スタチンであり、そしてそれらの少なくとも１つは、スタチンが生物により生成されることを主張するために、抽出物に存在すべきである。
【００２２】
上記方法を用いて、ペニシリウム・ソリタムの新鮮な単離物が、UV−スペクトルデータにより明らかなように、コンパクチン及びメビノリンの両者に存在する1, 2, 3, 6, 7, 8, 8a−ヘキサヒドロナフチル基及びソリスタチンのナフチル基の特徴的な発光団とは異なる発色団を含んで成る化合物（本明細書においては、スタタンと呼ばれる）を含んで成るものとして同定された。前記発色団は、既知の二次代謝物とは異なるが、しかし８−メトキシ−１−ナフトールの発色団に対する類似性を有し（Stadler, M. など., Mycological research 105 (10): 1191-1205を参照のこと）、そしてその存在は少数のコンパクチン生成種に確実に関連づけられる。本発明の化合物（スタタン）に含まれ、そしてP.ソリタムのスタチン生成単離物から単離された前記発色団は、それらのユニークUV−スペクトルにより特徴づけられ得る。
【００２３】
第１の観点においては、本発明は、HPLC−DADにより測定される場合、222−224nm（100％）、229−234nm肩（84−89％）、290nm肩（13％）、303−305nm（14−15％）、318−320nm肩（９−11％）、331−333nm（7.5−8.5％）のUV最大相対吸光スペクトル、及びHPLC−DADにより測定される場合、202−204nm（26−45％）、254−258（2−3％）、326−328nm（6−8％）のUV最少相対吸光スペクトルを有する単離された化合物に関する。
【００２４】
上記UV−スペクトル（図１にも示される）により特徴づけられる単離された化合物は、特にペニシリウム属の少数のコンパクチン生成菌類種において見出される。観察される上記スペクトルを有する本発明の単離された化合物は、コンパクチン（メバスタチンとしても知られている）、シムバスタチン、ロバスタチン及びプラバスタチンとして知られている、天然に存在するスタチンに類似する構造を有する。前記化合物はスタチンファミリーの新規メンバーであるか、又はそれらはスタチン代謝経路における中間体であり得る。
【００２５】
本発明の１つの態様においては、単離された化合物はスタチンを含んで成る。
単離された化合物は、上記で定義されたような類似するUV−スペクトルを有し、そして前記定義されるようなそれらのアルキルフェノン保持指数（RI）は、例において示されるように、887−967の範囲である。さらに、単離された化合物（スタチンB、スタチンA、及びスタチンA1）は、891−904、946−959又は960−964の範囲から選択されたRIを有することによって特徴づけられ得る。本発明の化合物はまた、230nmの励起波長及び450nmの発光波長を有する場合、高い蛍光を発する。
【００２６】
NMR−スペクトル：
例に記載されるように、本発明の化合物は、精製され、そしてNMR−スペクトルが、1Hについては600.13MHz及び13Cについては150.92MHzで記録された。化学シフトがDMSO（ジメチルスルホキシド）に対して与えられ、1Hについては2.5ppm及び13Cについては39.5ppmであった。NMR−データは、下記に示されるような式（IV）：
【００２７】
【化３】
2005513042.tif 000005
[式中、Xは、下記式（II）又は（III ）：
【００２８】
【化４】
2005513042.tif 000006
【００２９】
で表される化合物を表す]
で表される化学構造をもたらした。スタチンAは、Xが式（III ）で示される基である式（IV）の化合物である。スタチンAは、好都合には、式（I）で示されるような本発明の他のスタタンを調製するための中間体として、本発明に従って使用され得る。
【００３０】
さらなる観点においては、本発明は、下記式（I）：
【化５】
2005513042.tif 000007
【００３１】
［式中、R1は、OH、C6H5COO、R6COOを表し、ここでR6は、C1−C5アルキルを表し；
R2〜R4は、H、C1-C5アルキル、C1−C5アシルを表し；
R5は、H、CH3を表し；そして
Xは、式（II）又は（III ）の化合物を表す］
で表される化合物に関する。式（I）の化合物は、式（IV）の化合物から生成され得る。
【００３２】
式（I）の化合物は、本発明においては、“スタタン”として言及される。R2, R3, R4は、例８に記載のように、Fridel Kraft アルキル化又はアシル化により、C1−C5アルキル又はC1−C5アシルにより置換され得る。R6COO（ここで、R6はC1−C5アルキルを表す）を表すR1は、例５及び６に記載されるように、R1位置のエステル化により、式（IV）の化合物から生成され得る。
１つの態様においては、R1は２−メチルブチリル又は２−ジメチルブチリル又はC6H5COO（又はPhCOO）である。R1でのスタタンAのベンジル化は、例７に記載されている。
【００３３】
他方では、エステル化は、非水性システムにおいて、固定されたリパーゼ酵素を使用する方法により行われ得る。そのようなリパーゼ酵素の例は、カンジダ・シリンドラセアC（Candida cylindracea C）(Sigma Chemical Co.からのType VII )である。前記方法は、アメリカ特許第5,420,024号に記載されており、そしてさらに、その特許はその対応する寄託番号を有する酵素を製造する微生物を列挙する。調製され得る化合物は、R6がエチル、ｎ−プロピル、２−ブチル又は２−メチル−２−ブチルであるそれらの化合物を包含する。
【００３４】
さらなる態様においては、スタタンAは、エーテル形成、例えば例９に記載されるように、スタタンブチルエーテルの形成のために使用される。
R5は、TETRAB, Tetrahedron, 44,18, 1988: 5745-5760 or J. Org. Chem, 48, 17, 1983: 2814-2820に記載されるか、又は例11及び12に示されるように、当業界において知られているいずれかの方法を用いて、メチルにより置換され得る。
本発明の範囲においては、本発明は、本発明の化合物のすべての光学的異性体（それらのいくつかは光学的に活性である）、及びまた、それらの混合物、例えばそれらのラセミ混合物を包含する。
本発明の範囲においては、本発明は、本発明の化合物のすべての互変異形、及び代謝物又はプロドラッグを包含する。
【００３５】
本発明の化合物は、コンパクチン生成種に見出される。従って、本発明の１つの態様においては、上記に記載される単離された化合物は、ペニシリウム種、例えば、好ましくはペニシリウムの好冷又は寒冷耐性種から誘導される。もう１つの態様においては、前記ペニシリウムspはP.ソリタムである。本発明の化合物を供給するための適切なP.ソリタム株は、さらなる態様においては、P.ソリタムCBS147,86 (Centraalbureau voor Schimmelculturesで寄託されている)であり得る。また、次の寄託されたペニシリウム種、すなわちP.ネオコムン、好ましくはCBS111, 239株；P.ノボニウォテンス、好ましくはCBS111,240株；P.ランデリ、好ましくはCBS111,241株；P.ラノサム、好ましくはCBS111,243株；及びP.ピニコラ、好ましくはCBS111,244株が特に、企画される。
【００３６】
上記で論じられるように、スタチンは、血清コレステロールレベルを低めるために使用される脂質低減剤としてのいくつかの有益な治療効果、オステオポリーシスへの使用のための骨成分の促進効果、免疫抑制効果、及び改良された多面発現性効果を有することが示されている。
従って、本発明のさらなる観点は、少なくとも１つの本発明の化合物、又は医薬的に許容できるその塩又は代謝物又はプロドラッグ、及び医薬的に許容できるキャリヤーを含んで成る医薬組成物に関する。
【００３７】
本明細書に開示される化合物の“代謝物”は、化合物が代謝される場合に生成される本明細書に開示される化合物の活性誘導体である。本明細書に開示される化合物の代謝物は、宿主への化合物の投与及び宿主からの血液サンプルの分析により、又は化合物と肝細胞とのインビトロでのインキュベーション及びそのインキュベーション物の分析により同定され得る。
“プロドラッグ”とは、本出願に開示される化合物にインビボで転換されるか、又は本出願に開示される化合物と同じ活性代謝物を有する化合物である。
【００３８】
そのようなプロドラッグ形は、ヒドロキシル基がエステル化され、そして投与される用量で、それ自体、生理学的に耐性である酸を精製する生理学的条件下で加水分解できるエステルを意味する、生理学的に加水分解性で且つ許容できるエステルであり得る。従って、この用語は、規則的にプロドラッグ形を定義するものとして理解されるべきである。そのようなエステルの例は、例えばアセテート、及び本発明の化合物のベンゾエートを包含する。
【００３９】
塩は、医薬的に許容できる酸付加塩、医薬的に許容できる金属又は任意にアルキル化されたアンモニウム塩、例えば塩酸、臭酸、ヨウ酸、リン酸、硫酸、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、シュウ酸、マレイン酸、ピルビン酸、マロン酸、琥珀酸、クエン酸、酒石酸、フマル酸、マンデル酸、安息香酸、桂皮酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ピクリン酸及び同様のものの塩を包含し、そして引用により本明細書に組み込まれる、Journal of Pharmaceutical Science, 66, 2 (1977)に列挙される医薬的に許容できる塩に関連する酸、又はリチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム及び同様のものの塩を包含する。
【００４０】
さらに、本発明の医薬組成物は、１又は複数の他の薬理学的活性化合物と組み合わされる、少なくとも１つの本発明の化合物を含んで成ることができる。
本発明のもう１つの態様においては、医薬組成物はさらに、アセチルサリチル酸を含んで成る。
さらなる態様においては、本発明は式（V）又は（I）の化合物の生成方法にも関する。式（V）は、R1がOHを表し、R2-4がHを表し、R5がCH3を表し、そしてXが式（II）又は（III ）の化合物を表す式（I）である。
【００４１】
下記式（V）：
【化６】
2005513042.tif 000008
【００４２】
で表す化合物は、本発明の式（IV）の化合物の位置R5のメチル化により調製され得る。メチル化は、例えば上記又は例11又は12に記載されるように、当業界において知られているいずれかの方法を用いて行われ得る。
【００４３】
医薬組成物：
本発明はまた、活性成分として、少なくとも１つの本発明の化合物又は医薬的に許容できるその塩を含んで成る医薬組成物にも関し、そして通常、そのような組成物はまた、医薬的に許容できるキャリヤー又は希釈剤を含む。
本発明の化合物を含んで成る医薬組成物は、従来の技術により、例えばRemington：The Science and Practise of Pharmacy, 19th Ed., 1995に記載されるようにして調製され得る。組成物は従来の形、例えばカプセル、錠剤、エアロゾル、溶液又は懸濁液の形で存在することができる。
【００４４】
典型的な組成物は、本発明の化合物又は医薬的に許容できるその酸付加塩、及びキャリヤー又は希釈剤であり得るか又はキャリヤーにより希釈されるか、又はカプセル、サケット、紙又は他の容器の形で存在することができるキャリヤー内に封入され得る医薬的に許容できる賦形剤を含む。組織物を製造する場合、医薬組成物の調製のための従来の技法が使用され得る。例えば、活性化合物が通常、キャリヤーと共に混合され、又はキャリヤーにより希釈され、又はアンプル、カプセル、サケット、紙、又は他の容器の形で存在するキャリヤー内に封入されるであろう。キャリヤーが希釈剤として作用する場合、それは、活性化合物のためのビークル、賦形剤又は培地として作用する、固体、半固体又は液体材料であろう。
【００４５】
活性化合物は、例えばサケットにおける粒状固体容器上に吸着され得る。適切なキャリヤーのいくつかの例は、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ポリヒドロキシエトキシ化されたヒマシ油、シロップ、ピーナッツ油、オリーブ油、ゼラチン、ラクトース、白土、スクロース、シクロデキストリン、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸、又はセルロース、珪酸、脂肪酸、脂肪酸アミン、脂肪酸モノグリセリド及びジグリセリドの低級アルキルエーテル、ペンタエリトリトール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン、ヒドロキシメチルセルロース及びポリビニルピロリドンである。
【００４６】
配合物はまた、湿潤剤、乳化剤及び懸濁剤、保存剤、甘味剤又は風味剤も含むことができる。
医薬製剤は、減菌され、そして所望により、活性化合物と有害的に反応しない、補助剤、乳化剤、浸透圧に影響を与えるための塩、緩衝液及び/又は着色物質、及び同様のものと共に混合され得る。
投与の経路は、作用の適切な又は所望する部位に活性化合物を効果的に輸送するいずれかの経路、例えば経口、鼻、肺、肺、経皮又は非経口、例えば直腸、デポット、皮下、筋肉内、又は鼻腔内経路であり得、そして経口経路が好ましい。
【００４７】
固体キャリヤーが経口投与のために使用される場合、製剤は錠剤化され、粉末又はペレット形で硬質ゼラチンカプセルに配置され得、又はそれはトローチ又はロゼンジの形で存在することができる。液体キャリヤーが使用される場合、製剤はシロップ、エマルジョン、軟質ゼラチンカプセル又は無菌注射用液体、例えば水性又は非水性液体懸濁液又は溶液の形で存在することができる。
【００４８】
鼻腔投与に関しては、製剤は、エアロゾル適用のために、液体キャリヤー、特に水性キャリヤーに溶解され又は懸濁された本発明の化合物を含むことができる。キャリヤーは、添加剤、例えば溶解剤、例えば、プロピレングリコール、界面活性剤、吸収増強剤、例えばレシチン（ホスファチジルコリン）又はシクロデキストリン、又は保存剤、例えばパラベンを含むことができる。
【００４９】
タルク及び/又は炭水化物キャリヤー又は結合剤、又は同様のものを有する錠剤、糖剤又はカプセルが経口適用のために特に適切である。錠剤、糖剤又はカプセルのための好ましいキャリヤーは、ラクトース、コーンスターチ及び/又はジャガイモスターチを包含する。シロップ又はエリキシルが、甘味ビークルが使用される場合に用いられ得る。
本発明の化合物は、脂肪食物の摂取の低減又は低下の必要な哺乳類、特にヒトに投与され得る。そのような哺乳類はまた、動物、家畜動物、例えば家庭用ペット、及び非家畜動物、例えば野生動物を包含する。
【００５０】
本発明の化合物は、そのアルカリ金属又はアルカリ土類金属塩の形で、医薬的に許容できるキャリヤー又は希釈剤と同時に又はそれと一緒に、特に及び好ましくは、その医薬組成物の形で、有効量で投与され得る。
本発明の化合物を含む医薬組成物は、１日又は１週当たりの１又は複数回、投与され、便利には食事時間で投与され得る。そのような医薬組成物の有効量は、脂肪食物の消費に対して臨床的に有意な効果を提供する量である。そのような量は、患者の処理されるべき特定状態、年齢、体重、及び一般的健康、及び当業者に知られている他の要因に一部依存するであろう。
【００５１】
本発明の化合物の構造は、天然に存在するスタチンの構造に類似し、そして従って、本発明の追加の態様は、スタチンの生成のためへの前記化合物の使用に関する。前記スタチンは、もう１つの態様においては、コンパクチン、シムバスタチン、イオバスタチン及びパラバスタチンを含んで成る。
もう１つの態様においては、本発明は、薬剤としての本発明の化合物の使用に関する。さらなる態様においては、本発明は、高コレステロール血症又はオステオポローシスの処理のための、又はイムノサプレッサーとしての薬剤の製造のためへの本発明の化合物の使用に関する。
【００５２】
本発明のさらなる観点は、有効量の少なくとも１つの発明の化合物を投与することによって、ヒト又は動物における低密度リポタンパク質コレステロール（LDL−C）のレベルを低めるための方法に関する。
さらなる態様においては、本発明は、薬剤の調製のためへのソルスタチン（Sorensenなど., 1999, Phytochemistry 51: 1027-1029）の使用、及び特定の態様においては、高コレステロール血症又はオステオポローシスの処理のための、又はイムノサプレッサーとしての前記薬剤の使用に関する。
【００５３】
本発明の化合物は、本発明の化合物を含んで成る適切な宿主生物を供給し、そして前記化合物の生成を促進する条件下で適切な培養培地において前記生物を増殖し、そして前記宿主生物又は培養培地から前記化合物を回収することによって、当業者に知られているいずれかの従来の手段で生成され得る。
本発明の生物を増殖した後、スタタンを含んで成る培養物ブイヨンが医薬組成物の調製のために使用され得ることもまた企画される。
前記宿主生物は、１つの態様においては、菌類である。
【００５４】
もう１つの態様においては、前記宿主生物は、ペニシリウムsp.,例えばP.ソリタム、例えばP.ソリタムCBS147,86 (2002年11月29日、ペニシリウム・ソリタムCBS111.242 (NN049656) として再寄託されている)、又は次の寄託された菌株の１つである：
寄託物              NZ番号         受託番号              寄託日            
ペニシリウムsp.     NN049653       CBS111239      2002年11月29日
ペニシリウムsp.     NN049654       CBS111240      2002年11月29日
ペニシリウムsp.     NN049655       CBS111241      2002年11月29日
ペニシリウムsp.     NN049657       CBS111243      2002年11月29日
ペニシリウムsp.     NN049658       CBS111244      2002年11月29日
【００５５】
前記菌株は、培養物が、本特許出願の係属の間、入手できるであろうことを保証する条件下で寄託されている。
それらの菌類は、Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), Uppsalalaan 8,3584 CT Utrecht, The Netherlandsで、特許手続の目的のために微生物の寄託物の国際認識に基づいてブダペスト条約下で寄託された。
【００５６】
菌株CBS111, 239 (NN049653)は、ペニシリウム・ネオコムンFrisvad (sp.nov) として言及され、そしてWgoming Natienal Forest, USに起因する。
菌株CBS111, 240 (NN049654)は、ペニシリウム・ノボニウォテンスFrisvad (sp.nov)として言及され、そしてFaeroe Islands, Denmarkに起因する。
菌株CBS111, 241 (NN049655)は、ペニシリウム・ランデリFrisvad (sp.nov)として言及され、そしてWind River Range, Wyoming, USに起因する。
【００５７】
菌株CBS111, 242 (NN049656)は、種ペニシリウム・ソリタムのものであり、そしてDenmarkのリンゴから単離された。
菌株CBS111, 243 (NN049657)は、種ペニシリウム・ラノサムのものであり、そしてBrandy Wine Falls, British Colombia, Canadaのトウヒネの木下の土壌から単離された。
菌株CBS111, 244 (NN049658)は、ペニシリウム・ピニコラFrisvad (sp.nov)として言及され、そしてWyoming, USに起因する。
【００５８】
スタチン活性：
スタチンは、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａレダクターゼ（HMGR）のインヒビターである。HMGRは、コレステロール生合成経路における初期の速度制限段階である、HMG−CoAのメバロネートへの転換の触媒を担当する酵素である。本発明の化合物は、対象におけるLDL−コレステロールのレベルを直接的に又は間接的に測定することができるいずれかの方法により、HMGRインヒビターとしてのそれらの有効性について分析され得る。１つのそのような試験は、COBAS INTEGRA（商標）HDL-Cholesterol Direct (Roche Diagnostics)である。Nielsen など. (Pharmacology & Toxicology, 1993,72 : 148-151) 及び Holmなど. (Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, 1997,17 : 2264-2272)（両者とも引用により本明細書に組み込まれる）は、種々の形のコレステロールの決定方法を記載する。
例においては、２種の異なった化合物の特徴、式（IV）の単離された化合物についてのNMR−スペクトル分解及び、本発明の化合物のHMGR阻害効果が記載される。
【実施例】
【００５９】
例１．スタタンについてのスクリーニング
菌類ペニシリウム・ソリタムをCBS147,88 (CBS111, 242として再寄託されている)を保存された凍結乾燥胞子の再懸濁液から接種し、そして麦芽抽出物寒天上に接種し（Blakesleeに従って）（Samson, R. A. , Hoekstra, E. S. , Frisvad, J. C. and Filtenborg, O. (eds. ) Introduction to food-and airborne fungi. 6th edition. , 2000,378-382を参照のこと）、そして20℃で１週間インキュベートする。分生胞子を、水中、ペプトン（0.1％）に懸濁し、１ml当たり約10,000個の分生胞子の懸濁液を生成する。
【００６０】
この懸濁液から、１７mlのYES（酵母抽出物スクロオース）寒天を有する11cmのペトリ皿（Samson, R. A. , Hoekstra, E. S., Frisvad, J. C. and Filtenborg, O. (eds. ) Introduction to food-and airborne fungi. 6th edition., 2000,378-382）を、接種用針により３点接種し、そしてYES寒天プレートを、暗室下で25℃で２週間インキュベートした。10枚のペトリ皿の内容物を、200mlの酢酸エチル及び１％蟻酸により２分間、Colworth Stomacher 400において抽出する。有機相を、疎水性フィルターを用いて濾過し、そして有機溶媒を40℃で真空下で、回転蒸発器により蒸発する。残存する乾燥抽出物を0.5mlのメタノールに再溶解し、濾過し、そしてHPLC−DADシステム（Agilent）中に注入する。
【００６１】
そのHPLC−DADシステムは、スタタンの存在を確かめるために、効果的蛍光検出器により連結されるべきである。すべての化合物は、外部及び内部標準としてコンパクチン及び外部標準としてアルキルフェノンを用いて、Smedsgaard (J. Chromatogr. A., システム（Frisvad and Thrane, J. Chromatogr. (1987) 404: 195-214; Frisvad and Thrane In Betina, V. (Ed. ) Chromatography of mocotoxins: techniques and applications J. of Chromatography Library (1993) 54: 253-372) as modified by Smedsgaard (J. Chromatogr. A, 1997,760 : 264- 270）を用いて分析されるべきである。このシステムにおいては、新規スタチン様化合物（スタタン）は、次の性質を有する：
【００６２】
スタタン：スタタンA：RI（アルキルフェノン保持指数）平均953（946−956の範囲）。スタタンA1：RI平均961（960−964の範囲）、スタタンB：RI平均898（891−904の範囲）（コンパクチンRI範囲1108に比較して）。DADにより測定されるようなUVスペクトル：（UV最大、相対的吸光度）：222−224nm（100％）、229−234nm肩（84−89％）、290nm肩（13％）、303−305nm（14−15％）、318−320nm肩（９−11％）、331−333nm（7.5−8.5％）（202−204nm（26−45％）、254−258（2−3％）、326−328nm（6−8％）での吸光度最少）。スタタンは、励起が230nmで、及び450nmの発光波長を用いて行われる場合、高く蛍光を発する。菌類からの少々の他の二次代謝物がそれらの条件で蛍光を発する（例は、オクラトキシン（ochratoxin）A及びBであるが、しかしそれらは完全に異なったUVスペクトル及び保持指数を有する）。
【００６３】
例２．スタタンAの生成及び単離
単離物CBS147,86 (CBS111,242として再寄託されている)を、約20Lの酵母抽出物スクロース寒天（YES）（酵母抽出物20g、スクロース150g、寒天20g、蒸留水）を含む1000個のペトリ皿（9cm）上での３点質量接種として、暗室において20℃で２週間、培養した。
ペトリ皿の内容物を、10LのEtOACにより２度、抽出し、約25gの粗抽出物を得、これを、合計ILのヘプタンと1Lの90％メタノールとの間に分け、脂質及び無極性化合物を除去した。メタノール画分を60％に希釈し、そして合計1LのCH2Cl2により抽出し、8gのスタタンA（式IV）に富んだ抽出物を得た。
【００６４】
次に、抽出物を、8gのセライト上に被覆し、そして３つの部分に分け、続いてそれらを、次の量のA：（75：25）、B：（50：50）、C:（25：75）及びD（0：100）での水/メタノール100mlを用いて、C18 SPEカラム上での真空液体クロマトグラフィーにより４つの画分に分離した。スタタンAに富んでいるC画分（4.0g）をさらに、1ml/分でメタノールを用いて、Sephadex LH20カラム（25×900mm）上で分離し、８種の画分（CA−CF）を得た。最終的に、CE画分（96mg）を、移動相として水/CH3CH（65：35）を用いて、Waters Prep Nova-Pak C18カートリッジ（25×100mm、６μm）上でのHPLC分離にゆだね、30mgの純粋なスタタンAを得た。
【００６５】
例３．液内培養でのスタタンの生成
接種材料の調製：
PDA（ジャガイモデキストロース寒天）を含むペトリ皿を、菌類単離物P.ソリタムCBS147,86（CBS111,242として再寄託されている）により接種し（３点で）、そして35℃で７日間インキュベートした。
分生胞子を、0.1％のTweenを保持しながら、プレート当たり5mlの無菌水の添加により収穫した。分生胞子を、ピペット先端により軽くこすり落とすことによって、菌子体から開放した。得られる分生胞子の懸濁液を、２種のプレートから同時にプレートし、そして100mlの合計体積の水を含むフラスコ（0.1％Tween, 最終濃度）に添加した。
【００６６】
培養条件：
2Lの規模でのフェドバッチ（fed batch）培養条件を使用した。
培地の組成：
20g/lの酵母抽出物（Difco）、
20g/lのスクロース、
18mg/lのZnSO4・7H2O、
8mg/lのCuSO4・5H2O、1ml/lのプルロン酸（消泡剤）、
殺菌の前、pHを5.0に調節した。
供給物：500g/lのスクロース、2ml/lのプルロン酸（消泡剤）。
発酵タンクを、2mlの胞子懸濁液（上記で説明された）を添加することによって、接種した。
【００６７】
フィード開始：接種の36時間後、供給速度＝2.5g/L/時。
pH調節：＞4（10％NaOH）及び＜6（10％H3PO4）。
温度：21℃
攪拌速度：開始500rpm、50％以上に溶解された酵素を維持するために高め、最大1100rpm。
気流：1L/分。
発酵時間：185時間（＝8日）。
【００６８】
培養ブイヨンの抽出：
3mlの完全な培養ブイヨンを、超音波浴において１時間、3mlの酢酸エチレン（１％（v/v）の蟻酸を含む）により抽出した。酢酸エチレンをバイアルに移し、そして回転真空濃縮器において蒸発した。0.5mlのメタノールを用いて、超音波浴において１時間、残存物を再溶解した。メタノールを、0.22μmのフィルターを通して、HPLC−バイアル中に濾過した。
【００６９】
HPLC条件：カラム：BDS−C18 を備えたAgilent, Hypersil, 3μm（mymeter）、4.0×100mm。
注入：10μl。
流れ：1ml/分。
グラジエント：85％MilliQ H2O（50ppmのTFAを含む）で開始、及び15％アセトニトリル（50ppmのTFAを含む）、40分まで（ここで100％アセトニトリルに達する）、40〜45分（100％アセトニトリル）。
【００７０】
結果：
発酵は、良好なレベルのいくつかのスタタンを与えた。さらに、それらの発酵条件は、驚くべき低レベルの他の代謝物を与えた。
【００７１】
例４．スタタンAの構造解明
正確な質量分析を、Z−噴霧電子噴霧源（ESI）及び型噴霧プローブを備えたLCT Micromass oaTOF装置に連結されたダイオードアレイ検出器（DAD）を備えたAgilent HP1100液体クロマトグラフ上で行った。１μlのサンプルを、Agilent Hypersil BDS-C16 125×2mmカラム（3μm粒子）上に注入した。水−アセトニトリルグラジエント：15％アセトニトリル−水により開始〜40分で100％アセトニトリル、5分間の100％アセトニトリルの維持、その後、８分での開始条件への回帰（５分間の平衡化）。50ppmのTFAを前記水に添加した。MSを、ロックマス（lockmass）としてロイシンエンケファリンを用いて、正のESLモードで操作した（556.2771 Da/eで[M+H]+イオン）。陽子化されたスタタンAの分子イオンは、9DBEに対応する組成C16H20O4（Δ−6.3ppm）に対応する301.1421で出現した。
【００７２】
スタタンのNMRスペクトルを、Larsenなど., 2001, (J. Agricult. and Food Chem. 49: 5081-5084) に従って、Bruker DRX600上で、DMSO−d6を用いて、1Hについては600.13MHzで及び13Cについては150.92MHzで、5mmの管において記録した。13C及びC, H−COSYスペクトルは、１つのメチル、４個のメチレン及び２個のメチレン基、並びに５個の芳香族プロトン、2個のヒドロキシプロトン（9.95及び5.20ppm）、５個の四級芳香族炭素原子及び最終的に、エステル又はラクトンを示す170.2でのカルボキシ基の存在を閉めした。1H及びH, H−COSYスペクトルは、１つの脂肪族（-CH2-CHOH-CH2-CH-CH2-CH2-）及び２個の芳香族回転システム（AB及びABC）、並びに単一のメチル基の存在を示した。ヘテロ核多重結合干渉スペクトル（HMBC）の解釈は、スタタンAの構造を確立した。
【００７３】
分子のナフタレン部分における炭素の化学シフト値は、モデル化合物７，８−ジメチル−１−ナフトールの値に非常に類似し（Jung, K. Y., Koreeda, M., 1989, J. Organic Chem. 54: 5667-5675）、そして同様に、分子の脂肪族部分の化学シフト値は、ソリスタチン（Sorensenなど., 1999, Phytochemistry 51: 1027-1029）及び他のスタチンについて報告されるそれらの値に非常に類似し、結果的に、下記提案された構造を強く支持する：
【００７４】
【化７】
2005513042.tif 000009
【００７５】
1H NMR (DMSO-d6): 8 9.95 (1 H, bs, 8'-OH), 7.54 (1 H, d, J = 8.2 Hz, H-4'), 7.24 (1 H, d, J = 8.2 Hz, H-3'), 7.24 (1H, d, J=7. 9Hz, H-5'), 7.16 (1H, dd, J = 7. 9 and 7. 5 Hz, H-6'), 6.83 (1 H, d, J =7. 5Hz, H-7'), 5.20 (1 H, br s, 3-OH), 4.72 (1 H, m, 5-H), 4.16, br s, 3-H), 3.45 (1 H, br s, H-7a), 3.36 (1 H, br s, H-7b), 2.68 (1 H, dd, J = 17.2 and 4.7 Hz, H-2a), 2.44 (3H, s, Me), 2.43 (1H, d m, 17.2 Hz, H-2b), 1.92 (2H, m, H-6), 1.91 (1 H, m, H-4a), 1.79 (1H, ddd, 14.3, 11.7 and 3.3 Hz, H-4b).
13C NMR (DMSO-d6): 5 170.2 (C-1), 154.8 (C-8'), 135.1 (C-1'), 135.1 (C-4'a), 132.1 (C-2'), 129.0 (C-3'), 125.8 (C-4'), 124.7 (C-6'), 123.1 (C-8'a), 119.5 (C-5'), 109.9 (C-7'), 75.5 (C-5), 61. 0 (C-3), 38.5 (C-2), 36.5 (C-6), 34.8 (C-4), 27.0 (C-7), 19.5 (Me).
【００７６】
例５．水酸化ナトリウムにおける位置R1でのスタタンAのアセチル化
８−スタタニルアセテートの合成及び回収：
ガラスバイアル（2ml）において、10％水酸化ナトリウム（40μl）に19mgのスタタンAを溶解する。粉砕された氷（約5mg）及び無水酢酸（8.2mg、7.6μl）を、前記バイアル添加し、そしてそれを5分間、振盪した。続いて、200μlのジクロロメタンを添加し、そして軽く振盪し、そして２相を分離する。低層のジクロロメタン及びスタチンアセテートを除き、そしてそれを、希炭酸水素ナトリウムと共に振盪する。
【００７７】
前記のわずかに塩基性の水相にもう１つの200μlのジクロロメタンを添加し、そして希炭酸水素ナトリウムにより有機相を洗浄する。供給された有機層を乾燥する。合成生成物を100μlのメタノールに再溶解し、そして2ml/分の流速で、移動相として水/CH3CN（55：45）を用いて、Waters Prep Nova-Pak  C18 カートリッジ（25×100mm、6μm）上でのHPLC分離によりモノー及びジ−アセテートの混合物を分離し、15mg（66％）の純粋８−アセトキシスタタンA及び4mgのジ−アセトキシスタタンAを得る。
【００７８】
例６．８−スタタニルイソブチレートの合成及び回収
ガラスバイアル（15ml）における1mlのピリジンに28mgのスタタンAを溶解する。そのバイアルに無水イソ酪酸を添加し、そしてそれを室温で12時間、静置する。粉砕された氷を添加し、そしてその反応混合物を１時間、静置する。続いて、2mlのジクロロメタンを添加し、そして軽く振動し、そして２つの相を分離する。低層のジクロロメタン及びスタタンAイソブチレートを除き、そしてピリジン−水相を、もう１度、1mlのジクロロメタンにより抽出する。
【００７９】
組合された有機相を、まず希塩酸及び続いて、希炭酸水素ナトリウムにより洗浄する。組合された有機相を乾燥する。前記合成生成物を、100μlのメタノールに溶解し、そして128−スタタニルイソブチレート及びイソブチレートの混合物を、2ml/分の流速で、移動相として水/CH3CN（55：45）を用いて、Waters Prep Nova-Pak  C18 カートリッジ（25×100mm、6μm）上でのHPLC分離により分離し、24mg（69％）の純粋な８−スタタニルイソブチレートを得る。
【００８０】
例７．位置R1でのスタタンAのベンジル化
８−スタタニルベンゾエートの合成：
30mgのスタタンAを、密封されたガラスバイアルにおける10％水酸化ナトリウム（200μl）に溶解する。塩化ベンゾイル（22mg、18μl）を添加し、フラスコを密封し、激しく振動する（15分間）。粉砕された氷を添加し、そして５分間、静置する。続いて、200μlのジクロロメタンを添加し、そして軽く振盪し、そして２相を分離する。低層のジクロロメタン及びスタタニルベンゾエートを除き、そしてそれを、希炭酸水素ナトリウムと共に振動する。200μlのジクロロメタンを水相を添加し、そして有機相を希炭酸水素ナトリウムにより洗浄する。組合された有機相を乾燥し、34mg（84％）の８−スタタニルベンゾエートを得る。
【００８１】
例８．位置R2, R3及びR4でのスタタンAのアシル化
Fies反応による４−、 ５−及び７−アセトスタタンAの合成及び回収：
フェノール及びナフトールケトンを、無水塩化アルミニウムの存在下で、それらのフェノール又はナフトールエステルの転移により生成する。粉末化された８−スタタニルアセテート（36mg）及び粉末化された無水塩化アルミニウム（41mg）を、塩化カルシウム管により密封された空気冷却器を備えた小さなフラスコにおいて混合する。フラスコを油浴において、まず最初に、約110℃で30分、及び次に、約160℃でさらに１分間、ゆっくりと加熱する。
【００８２】
油浴からフラスコを除き、冷却し、粉砕された氷（300mg）、続いて濃塩酸（12μl）を添加し、アルミニウム塩を分解する。水相を、200μlのジクロロメタンにより洗浄する。組合された有機相を乾燥し、そして反応混合物を、2ml/分の流速で、移動相として水/CH3CN（55：45）を用いて、Waters Prep Nova-Pak  C18 カートリッジ（25×100mm、6μm）上でのHPLCにより分離するために、メタノールに再溶解し、純粋な４−、５−及び７−アセト−スタタンAを得る。
【００８３】
例９．位置R1でのスタタンAのエーテル形成
スタタンAブチルエーテル−Williamson合成：
11.5mg（0.5mモル）の清浄ナトリウムを、二重表面冷却器を備えた乾燥フラスコ中に計量添加し、そして250μlのエタノールを添加する。100μlの無水エタノール中、150mg（0.5mモル）の純粋スタタンAの溶液を添加し、そして振盪する。15分間の振盪の間、133mg（82.5μl、0.72mモル）のヨウ化ブチルを添加する。溶液を軽く３時間、煮沸し、その後、できるだけ多くのアルコールを蒸留する。水（400μl）及びジクロロメタン（200μl）を、フラスコ中の残留物に添加し、有機相を分離し、そしてそれを、10％水酸化ナトリウム溶液の一部200μlにより2度、続いて、水、希硫酸及び水により洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥する。
【００８４】
例10．スタタンAカルボン酸の形成
５−及び７−スタタンAカルボン酸の合成−Kolbe−Schmidt反応：
還流冷却器及びガス入口管を備えたフラスコに、109mgのスタタンA、200mgの炭酸水素カリウム及び5mlの水を含む溶液を入れる。上記槽上で軽く４時間、加熱し、次に火炎上で激しく30分間、還流し、この間、溶液に二酸化炭素の急速な蒸気を通す。パスツールピペットを用いて、フラスコの底に180μlの濃塩酸を添加することによって、前記溶液を、まだ暖かいまま酸性化する。
【００８５】
室温に冷却し、氷浴において急冷する。続いて、2mlのジクロロメタンを添加し、そして軽く振盪し、そして２相を分離する。低層のジクロロメタンを取る。水相を、2mlのジクロロメタンにより洗浄し、そして組合された有機相を乾燥する。合成生成物を500μlのメタノールに再溶解し、そして５−及び７−カルボン酸スタタンAの混合物を、2ml/分の流速で、移動相として水/CH3CN（55：45）を用いて、Waters Prep Nova-Pak  C18 カートリッジ（25×100mm、6μm）上でのHPLC分離により分離する。
【００８６】
例11．位置３及び8’でのスタタンAのトリフルオロアセチル化
３，8’−スタタニル−ジ−トリフルオロアセテートの合成及び回収：
ガラスバイアル（2ml）中の10％水酸化ナトリウム（200μl）に38mgのスタタンAを溶解する。粉砕された氷（約50mg）及び無水トリフルオロ酢酸（50ml）をバイアルに添加し、そしてそれを５分間、振動する。続いて、200μlのジクロロメタンを添加し、そして軽く振盪し、そして２相を分離する。低層のジクロロメタンを除き、そしてそれを希炭酸水素ナトリウムと共に振盪する。さらなる200μlのジクロロメタンを、わずかに塩基性の水相に添加し、そして有機相を、希炭酸水素ナトリウムにより洗浄する。組合された有機相を乾燥し、58mg（93％）のスタタンジ−トリフルオロアセテートを回収する。
【００８７】
例12．６−メチル−スタタンAの形成−フリーデル・クラフツ
乾燥管（CaCl2）を備えた小さなガラスフラスコにおけるメチルシクロへキサン（4ml）に、58mgの３，8’−スタタニル−ジ−トリフルオロアセテートを溶解する。無水塩化アルミニウム（9mg）を添加する。フラスコを氷浴において冷却し、そして攪拌しながら（小回転磁気を用いて）、塩化メチレン（11mg）を添加し、次の４時間、温度を、冷却浴において０〜５℃で維持する。添加の完結後、前記混合物をさらに１時間、攪拌し、乾燥管を除き、粉砕された氷（2g）を少しずつ、攪拌しながら添加し、中間体の付加化合物を分解する。上方の有機相を取り、そしてそれを乾燥する。残留物を、ガラスバイアルフラスコにおける10％水酸化ナトリウム（2ml）に再溶解し、そしてその溶液を還流下で１時間、煮沸し、トリフルオロアセテート基を加水分解により除去する。
【００８８】
混合物を冷却し、そして溶液がリトマス紙を酸性するまで、攪拌しながら、希硫酸を添加する。溶液を30分間、分子内ラクトン化を完結するために静置する。生成物を、水相から新しく蒸留されたジエチルエーテル（２×500μl）により抽出する。ジエチルエーテルを蒸発し、そして合成生成物を500μlのメタノールに再溶解する。混合物を、2ml/分の流速で、（70：30）〜（30：70）に進行する移動相として水/CH3CNのグラジエントを用いて、Waters Prep Nova-Pak  C18 カートリッジ（25×100mm、6μm）上でのHPLCにより分離し、11mg（30％）の純粋な６−メチル−スタタンAを得る。
【００８９】
例13．ウサギにおけるスタタンのコレステロール低減効果の試験
スタタンAのコレステロール低減効果を、雄の白色ウサギ（Hvidesten、DKから購入された）において、対照に対して比較した。ウサギを個々のステンレス鋼のカゴに収容し、水は自由に接近できた。ウサギを、血漿コレステロールの類似する基線値を有するグループに分け、それらのグループは次のものを受け：１）5mg/日のPD498（ｎ＝２）（スタタンA）、そして２）対照グループ（ｎ＝４）はそのままである。ウサギを、３日間、処理した。すべての動物は、１％コレステロールを含む標準のウサギ用規定食（Altromin, Lage, Germany）100gを、毎日、供給された。すべての試験薬物を、その規定食に添加した。残る食物を計量した。
【００９０】
コレステロール決定のための血液サンプルを、基線で及び続く３日後で採血した。血液サンプルを、耳周縁静脈から採血し、そしてコレステロール決定を、COBAS MIRA自動分析機（Roche, Bosle, CH）上で、市販のキット（CHOD−PAP、Roche）を用いて、酵素比色法により同じ日に行った。
本発明の研究の結果は図２に示されている。スタタンAグループにおける合計の血漿コレステロールレベルは、対照グループに比較して、確実に低かった。それらの結果は、低い血漿コレステロール値への強い傾向を有するスタタンAのコレステロール低減効果を示す。
【００９１】
食物調製：
10kgの１％コレステロール食物：100gのコレステロールを、500gのトウモロコシ油に、40℃に加熱することによって溶解する。そのコレステロール混合物を、9400gの標準のウサギ用食物（Altromin, Hvidesten, DK）と共に十分に混合する。試験化合物と共に3.5kgの1％コレステロール食物を、40mlのトウモロコシ油に溶解し、そして10分間、超音波処理し、そして次に、3.5kgのコレステロールに富んでいる食物と共に十分に混合する。
【００９２】
5mg/日のスタタンA：30mgのスタタンAを、1000μlのエタノール（100％）に溶解する。30mlのトウモロコシ油を添加し、そして40℃に過熱する。その混合物を、3.5kgのコレステロールに富んでいる食物と共に十分に混合する。
上記に論じられた方法に代わる方法として、ウサギを、規定食コレステロールに対する高−、正常−、又は低応答性として選択する。低感受性ウサギに、試験薬物の投与の５日前、１％コレステロール食物を供給する。その後、ウサギに、試験薬物を含む、コレステロールに富んでいる（1％）食物を、３日間、毎日供給する。
【００９３】
例14．ウサギにおけるソリスタチンのコレステロール低減効果の試験
ソリスタチンのコレステロール低減効果を、例13に開示されるのと同じ方法を用いて、ウサギにおいて試験した。この試験は、ソリスタチンがコレステロール低減効果を有することを示した。
【００９４】
追加の表示（書式PCT/RO/134）：
“専門家のオプション”に関する供述：
寄託された微生物：
寄託番号 寄託日
CBS111239    2002年11月29日
CBS111240    2002年11月29日
CBS111241    2002年11月29日
CBS111243    2002年11月29日
CBS111244    2002年11月29日
CBS111242    2002年11月29日
【００９５】
書式PCT/RO/134上に詳細される、寄託された微生物に関して、本発明者はいわゆる専門家のオプションを要求する：
ヨーロッパ特許の許可の言及の公開まで、又は適用できる場合、出願が拒絶され、取り下げられるか又は取り下げられたと思われる場合、出願の日から20年間、寄託された微生物のサンプルは、そのサンプルを必要とする個人により指名された独立した専門家に供給されるべきである（規則23（4）EPCを参照のこと）。そして、オーストラリアが関係する限り、専門家のオプションが同様に必要とされ、オーストラリア法令規則1991 No71の条例3.25を参照のこと。また、カナダに関しては、特許局長により指名される独立した専門家のみが、寄託された微生物のサンプルを入手できる権限を授与される。
Bagsvaerd, 3 December 2002
Novozymes A/S
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】図１は、スタタンA、A1及びBについてのHPLC−DADにより測定される場合のUV−吸光スペクトルを示す。
【図２】図２は、ウサギにおけるスタタンAの合計の血漿コレステロール（平均）の進行を示す。
【図１】
2005513042.tif 000013
【図２】
2005513042.tif 000014
【国際調査報告】
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2005513042.tif 000018
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