(57)【要約】一般的な機構が図1に示されている、タンパク質および他の生体分子を結晶化するためのシステムは、結晶化される生体分子を含む溶液を搬送するための流路(12)と、流路に沿って形成された、結晶化処理に関連づけられた1つまたは複数のサブステーション(40、50、60、70)とを備える。該システムは、流路(12)に生体分子溶液を流し、次いでマイクロスケールの透析を行って、結晶化条件を設定することによって動作する。透析後に、水または溶媒を生体分子溶液から除去することによって生体分子溶液の濃度を変化させて、流路のある区間における結晶の形成を促進する。形成された結晶を観察し、流路から採取することができる。
2005538163.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子を結晶化させる方法であって、
結晶化される生体分子を含む生体分子溶液を生体分子流路に流す工程と、
前記生体分子流路内の膜を通して前記生体分子溶液を透析して、前記生体分子の結晶を形成する工程とを含む方法。
【請求項２】
前記生体分子溶液を透析する前記工程は、タンパク質溶液にエフェクタを設定して、前記生体分子の結晶化を促進する請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記エフェクタは、前記膜を通して交換されるイオンを含む請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記エフェクタは、前記タンパク質溶液のpHを含む請求項2に記載の方法。
【請求項５】
前記エフェクタは、前記タンパク質溶液の温度を含む請求項2に記載の方法。
【請求項６】
前記エフェクタは、膜を通して前記タンパク質溶液と交換される洗剤を含む請求項2に記載の方法。
【請求項７】
結晶の形成を観察する工程をさらに含む請求項1に記載の方法。
【請求項８】
観察中に形成された前記結晶を採取する工程をさらに含む請求項1に記載の方法。
【請求項９】
x線回折に向けて前記結晶を凍結させる工程をさらに含む請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
生体分子を結晶化する方法であって、
結晶化される生体分子を含む生体溶液を生体分子流路に流す工程と、
前記生体分子流路に沿って形成された濃縮ステーションで前記生体分子溶液から溶媒を除去することによって前記生体分子を濃縮する工程とを含む方法。
【請求項１１】
前記濃縮工程は、前記生体分子流路の側壁に形成された開口を通じて、前記生体分子溶液から前記溶媒を蒸発させることを含む請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記濃縮工程は、生体分子不透過膜を通して前記生体分子溶液を濾過して、前記生体分子溶液から溶媒を除去することを含む請求項10に記載の方法。
【請求項１３】
結晶の形成を観察する工程をさらに含む請求項10に記載の方法。
【請求項１４】
観察中に形成された前記結晶を採取する工程をさらに含む請求項10に記載の方法。
【請求項１５】
x線回折に向けて前記結晶を凍結させる工程をさらに含む請求項10に記載の方法。
【請求項１６】
生体分子を結晶化させる方法であって、
結晶化される生体分子を含む生体分子溶液を生体分子流路に流す工程と、
膜を通して前記生体分子溶液を透析して、前記生体分子溶液中にエフェクタを設定する工程と、
前記生体分子流路に沿って形成された濃縮ステーションで前記生体分子溶液から溶媒を除去することによって、前記生体分子の結晶を前記生体流路内に形成する工程とを含む方法。
【請求項１７】
結晶の形成を観察する工程をさらに含む請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
観察中に形成された前記結晶を採取する工程をさらに含む請求項16に記載の方法。
【請求項１９】
x線回折に向けて前記結晶を凍結させる工程をさらに含む請求項16に記載の方法。
【請求項２０】
生体分子を結晶化するためのシステムであって、
基板と、
結晶化される生体分子を含む生体分子溶液を搬送するための、前記基板に形成された微小流路と、
前記生体分子の結晶化を促進するために前記生体分子溶液を濃縮するための、第1の微小流路に沿って前記基板に形成された濃縮ステーションとを備えたシステム。
【請求項２１】
生体分子を結晶化するためのシステムであって、
膜の第1の側面上の第1のチャンバと膜の第2の側面上の第2のチャンバとの間で溶質を交換するための膜と、
結晶化させる生体分子を含む生体分子溶液を前記第1のチャンバに輸送するための第1の微小流路と、
緩衝剤溶液を前記第2のチャンバに供給するための第2の微小流路であって、前記生体分子溶液は、前記緩衝剤溶液と溶媒を交換して、結晶化を促進する第2の微小流路と、
前記生体分子溶液に流れを含めるための、前記第1の微小流路と連通する第1の流動源とを備えたシステム。
【請求項２２】
生体分子を結晶化するためのシステムであって、
基板と、
結晶化される分子を含む生体分子溶液を搬送するための基板内の第1の微小流路と、
前記分子の結晶化を促進するための緩衝剤溶液を搬送するための、前記第1の微小流路を横切る第2の微小流路と、
前記第2の微小流路と連通する、前記基板に形成された穴と、
前記第1の微小流路と前記第2の微小流路との間で溶質を交換するための膜と、
結晶化チャンバを定める、前記膜の上方に配置されたキャップとを備えたシステム。
【請求項２３】
生体分子を結晶化するための微小流体チップであって、
基板と、
前記生体分子の結晶化を促進するために結晶化させる前記生体分子を含む生体分子溶液中にエフェクタを設定するための、前記基板に形成されたエフェクタ設定サブステーションと、
前記生体分子溶液を濃縮するための、前記基板に形成された濃縮サブステーションと、
前記生体分子溶液中に形成された結晶を検出するための、前記基板に形成された検出サブステーションと、
前記結晶を前記微小流体チップから取り出すための採取サブステーションとを備えた微小流体チップ。
【請求項２４】
生体分子を結晶化するためのシステムであって、
生体分子溶液が流れる主流路と、
前記生体分子の結晶化を促進するために、緩衝剤溶液と前記生体分子溶液の間で特定サイズの溶質を選択的に交換するための、前記主流路に沿って形成されたエフェクタ設定ステーションと、
溶媒を前記生体分子溶液から制御除去するための、前記主流路に沿って形成された濃縮ステーションと、
前記主流路内に形成された結晶を観察するための観察ステーションと、
形成された結晶を前記主流路から取り出すための結晶採取ステーションとを備えたシステム。
【請求項２５】
生体分子を結晶化するための結晶化システムであって、
基板と、
結晶化される生体分子を含む生体分子溶液を搬送するための生体分子流路と、
生体分子を結晶化するための、前記生体分子流路に沿って直列に形成された複数の結晶化領域とを備えた結晶化システム。
【請求項２６】
前記生体分子溶液が各結晶化領域を通過した後に前記生体分子流路内に条件を再設定するための、各結晶化領域の間の1つまたは複数の条件再設定サブステーションをさらに備えた請求項25に記載のシステム。
【請求項２７】
前記生体分子の結晶化を観察するための、前記生体分子流路に沿って形成された観察ステーションをさらに備えた請求項25に記載のシステム。
【請求項２８】
形成された結晶を前記流路から抽出するための、前記生体分子流路に沿って形成された採取ステーションをさらに備えた請求項25に記載のシステム。
【請求項２９】
生体分子を結晶化するためのシステムであって、
前記生体分子で形成された結晶を搬送するための流路と、
前記結晶を観察するための、前記流路に沿って形成された観察ステーションとを備えたシステム。
【請求項３０】
前記結晶を前記流路から取り出すための採取ステーションをさらに備えた請求項29に記載のシステム。
【請求項３１】
前記採取ステーションは、
前記流路の側壁に形成された開口と、
ピン上に結晶を取得するために前記開口に挿入されるように構成された採取ピンとを備える請求項30に記載のシステム。
【請求項３２】
前記採取ピンは、第1の先端と、前記第1の先端から間隔をおいて配置されて、前記結晶を保持するための結晶取得領域を形成する第2の先端とを備える請求項31に記載のシステム。
【請求項３３】
結晶を処理する方法であって、
流路内に結晶を形成すること、
採取デバイスを使用して前記結晶を前記流路から取り出すこと、および
前記採取デバイス上で前記結晶を凍結させることを含む方法。
【請求項３４】
第1の先端を有する第1のピンと、前記第1の先端から間隔をおいて配置されて、前記結晶を保持するための結晶取得領域を形成する第2の先端を有する第2のピンとを備える請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
生体分子を結晶化するための微小流体システムであって、
生体分子溶液を搬送するための、基板に形成された生体分子流路と、
前記生体分子溶液中の生体分子の結晶化を促進するための、前記生体分子流路に沿って形成された第1結晶化領域と、
前記生体分子溶液中の生体分子の結晶化を促進するための、前記生体分子流路に沿って、前記第1の結晶化領域と直列に形成された第2の結晶化領域とを備えた微小流体システム。
【請求項３６】
前記生体分子溶液を透析するための、前記第1の結晶化領域と前記第2の結晶化領域との間に形成された透析ステーションをさらに備えた請求項35に記載のシステム。
【請求項３７】
生体分子結晶化システムを製造する方法であって、
基板を設けること、
前記基板に流路を形成すること、および
前記流路内の生体分子溶液を処理するためのサブステーションを前記流路に沿って設けることを含む方法。
【請求項３８】
薬物を設計するようにタンパク質結晶構造体群から導かれたパラメータを利用することを含む集合的な合理的薬物設計方法。
【請求項３９】
改良は、タンパク質構造体群の使用を含む合理的薬物設計方法。
【請求項４０】
統合比が1:2500未満である結晶化ポリペプチド。
【請求項４１】
動的条件下で形成された結晶化ポリペプチド。
【請求項４２】
構造決定に有効である請求項41に記載の結晶化ポリペプチド。
【請求項４３】
請求項1の方法を用いて形成された結晶化ポリペプチド。
【請求項４４】
構造決定に有効である請求項43に記載の結晶化ポリペプチド。
【請求項４５】
静的条件下で形成される請求項43に記載の結晶化ポリペプチド。
【請求項４６】
動的条件下で形成される請求項43に記載の結晶化ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質などの生体分子を結晶化するための微小流体システムおよび方法に関する。
本出願は、2002年12月23日に出願された「タンパク質結晶化のための微小流体チップ」という名称の米国特許出願第10/328931号、2002年12月23日に出願された「微小流体システムにおける微小流体成分の実装」という名称の米国特許出願第10/329018号、2002年11月19日に出願された「タンパク質結晶化のための微小流体チップ」という名称の米国仮特許出願第60/427620号、2002年9月9日に出願された米国仮特許出願第60/409489号、および2002年9月13日に出願された米国仮特許出願第60/410685号に基づいて優先権を主張するものである。本願は、米国特許出願第10/028852号、米国特許出願第10/027484号米国特許出願第10/027516号および米国特許出願第10/027171号に関連している。本出願は、さらに、2002年12月23日に出願された「生体分子結晶化のための微細加工型二ピンシステム」という名称の米国特許出願第10/328932号に関連している。先述の出願の各々の内容は、特に、参照により本明細書に組み込まれている。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の具体的な特性、機能および三次元構造の理解は、タンパク質-リガンド相互作用および合理的な薬物設計を理解するための非常に貴重な資産である。例えば、基礎的な生化学的観点から、タンパク質等の三次元構造に関する情報は、生化学システムにおける分子の機能的役割を理解するための基礎となる。
【０００３】
タンパク質の構造を分析する上で、少量の生体分子からX線回折質結晶を成長させることが一般に望ましい。しかし、タンパク質の構造分析は、現在では、高価な高分子および試薬を多量に消費することを必要とする労働集約的な長いプロセスである。堅固な発現およびタンパク質精製システム、高強度、シンクロトロンx線源、および回折パターンを解読するコンピュータベースの方法の出現により、構造研究における律速段階は、少量の生体分子からx線質結晶を急速に成長させることにある。
【特許文献１】米国特許出願第10/328931号
【特許文献２】米国特許出願第10/329018号
【特許文献３】米国仮特許出願第60/427620号
【特許文献４】米国仮特許出願第60/409489号
【特許文献５】米国仮特許出願第60/410685号
【特許文献６】米国特許出願第10/028852号
【特許文献７】米国特許出願第10/027484号
【特許文献８】米国特許出願第10/027516号
【特許文献９】米国特許出願第10/027171号
【特許文献１０】米国特許出願第10/328932号
【特許文献１１】米国仮特許出願第60/410685号
【特許文献１２】米国特許出願整理番号第TGZ-023
【特許文献１３】米国特許第10/028852号
【特許文献１４】米国特許第10/027484号
【特許文献１５】米国特許第10/027516号
【特許文献１６】米国特許第10/027171号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、タンパク質溶液からの結晶成長を促進するパラメータのリアルタイムまたは動的な制御を用いて、生体高分子の結晶を成長させるための方法およびハードウェアを提供する。結晶化条件のハイスループットスクリーニングに利用可能な従来の結晶化デバイスは、以下に列記する特徴の少なくともいくつかに対応することが不可能である。
【０００５】
本発明は、タンパク質または他の生体分子を結晶化するための微小流体チップを提供する。該システムは、ナノグラム量のタンパク質から5から50ミクロンサイズのx線分析品質のタンパク質結晶を成長させることが可能である。本発明の結晶化チップは、わずか数マイクログラムのタンパク質しか利用できないときでも、タンパク質結晶化条件の研究を行うことを可能にする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明のタンパク質結晶化システムは、タンパク質含有溶液を微小流路に流し、次いでミクロスケールで透析を行って、結晶化条件を設定することにより動作する。イオン強度の変化、洗剤濃度の変化、タンパク質濃度の変化およびpHの変化などの影響はタンパク質結晶化に関与しており、それらを用いて、結晶化を実施または促進することができるが、そのいずれかまたはすべてを本発明に用いることができる。イオン、水、低分子、緩衝剤、pH、または結晶化の他の透析性エフェクタを交換し、かつ/または微小流路内の温度を局所的に制御することによって、結晶化条件を設定することができる。透析後、タンパク質不透過膜を通して緩衝剤を除去するか、または微小流路内の開口を通じて、温度および湿度が制御された大気中に水を蒸発させることによって、タンパク質溶液の濃度を変化させる。
【０００７】
本発明のタンパク質結晶化システムは、いくつかのステーションを単一の流路に沿って直列に配置することによって形成される。該システムは、結晶化されるタンパク質を含むタンパク質溶液を搬送するためのタンパク質流路と、溶質をタンパク質流路と緩衝剤流路または液溜の間で透析により選択的に交換するための、タンパク質流路に沿って配置されたエフェクタステーションとを備える。透析後にタンパク質溶液を濃縮するための濃縮ステーションをタンパク質流路に沿って配置することもできる。濃縮ステーションは、タンパク質不透過膜を通して、またはタンパク質流路の側壁の開口からの蒸発により水または溶媒をタンパク質溶液から除去することができる。濃縮ステーションの後に、結晶化を行うことができるタンパク質流路の結晶化領域が続く。タンパク質結晶化システムは、タンパク質流路に沿って形成された観察ステーションまたは領域をさらに含むことができる。観察ステーションは、結晶の存在を検出するための偏光光学素子、またはタンパク質凝集体を検出するための光散乱光学素子によって各結晶化プロセスをリアルタイムに監視する手段を提供する。これによって、自動化システムの精密な適応制御が可能になる。採取ステーションを観察ステーションの下流に配置して、形成位置から、光学的手段により結晶が形成するのを観察するx線回折装置まで結晶を輸送する手段を設けることができる。採取ステーションは、凍結およびx線構造分析に向けて、結晶を含む一定分量の液体を流路から取り出すことによって結晶を採取することができる。
【０００８】
複数のタンパク質結晶化システムを直列および/または並列に配列することによって、600から1000のタンパク質結晶化条件を試験するための自動化システムを構築することができる。次いで、当該自動化システムは、全条件試験シリーズに対してわずか数マイクログラムのタンパク質を使用して、一日に600から1000の異なるタンパク質結晶化条件を試験することができる。
【０００９】
癌に関与するタンパク質の構造的分析のための結晶化ツールを開発し、応用することによって、癌の構造的かつ機能的ゲノムを促すのに本発明を用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、微小流体チップ上に形成することができる微構造結晶化システムを提供する。該結晶化システムを使用して、ナノグラム量のタンパク質または他の生体分子から単結晶を作製したり、あるいはマイクログラム量のタンパク質または他の生体分子からの600から1000の結晶化条件を試験することができる。タンパク質を結晶化するための例示的な実施形態に関して本発明を説明する。本発明を用いて、任意の所望の生体分子を結晶化したり、または生体分子の任意の組合せの共結晶を生成させることができ、また本発明をいくつかの異なる用途と実施形態に実施できることを当業者なら理解するであろう。本発明は、その用途において、本明細書に記載されている特定の実施形態に限定されるものではない。
【００１１】
本発明の生体分子結晶化システムは、微小流路内の流れに対する微量透析または微量濾過を行うために、従来の濾過膜技術を微小流体チップに統合する。生体分子結晶化システムは、膜を通して溶質を交換することにより溶液中の生体分子を結晶化するための条件を設定する。タンパク質結晶化処理に関して本発明を説明するが、該結晶化システムを使用して、任意の好適な生体分子を結晶化できることを当業者なら認識するであろう。該結晶化システムは、生体分子のハイスループット結晶化に向けた堅固で使用しやすい自動化可能な微小流体システムである。該結晶化システムを使用して、ナノグラム量の純物質から生体高分子の結晶を成長させることができる。
【００１２】
本明細書に用いられている「微小流体システム」という用語は、マイクロスケールの寸法を有する少なくとも1つの成分を含む生体試料を操作し、加工し、処理し、精製し、かつ/または分析するためのシステムまたはデバイスを意味する。
【００１３】
本明細書で用いられている「流路」という用語は、液体および気体などの流体の移動を可能にする、媒体内または媒体を通じて形成された経路を意味する。「微小流路」という用語は、約1.0μmから約500μm、好ましくは約25μmから約200μm、最も好ましくは約50μmから約150μmの範囲の断面寸法を有する微小流体システムまたはデバイスに形成されるのが好ましい流路を意味する。
【００１４】
本明細書に用いられている「膜」または「フィルタ」という用語は、サイズ排除または他の手段によって溶液中の物質を分離または濾過するのに使用できる任意の好適な組成およびサイズの材料を意味する。
【００１５】
「タンパク質溶液」または「生体分子溶液」という用語は、結晶化される分子、例えばタンパク質または生体分子を含む溶液を包括する。
【００１６】
「タンパク質」という用語は例示的なものであり、本発明を用いて、本明細書に記載されている条件下で結晶化されやすい、または結晶化することが可能な物質を結晶化できることが理解される。例えば、本発明で使用できる分子としては、タンパク質、例えばDNAまたはRNAのような核酸、共同因子、基質、基質類似体、またはこれらの分子のいずれかの誘導体が挙げられる。さらに、本発明は、生体分子の断片、例えばペプチドまたは核酸断片にも用いられる。本発明は、例えば生体内または生体外で改質された高分子にも用いられる。例えば、タンパク質分子を生体内で改質、例えばグリコシル化、ミリストイル化またはアデニル化することができる。あるいは、タンパク質分子を生体外で改質、例えば化学的に改質することができる。
【００１７】
「エフェクタ」という用語は、すべての可能な溶質または成分、あるいは結晶化を促進する条件として設定されうる緩衝剤の条件を表す。この用語は、イオン、pH、温度、洗剤、ならびに生体分子結晶化の技術分野の当業者に知られている他の分子および成分を包括する。
【００１８】
「統合比」という用語は、結晶を成長させる目的で消費されるタンパク質の全量に対する、結晶に取り入れられるタンパク質の比率を意味する。他の結晶化技術に比べての大きな改良点において、本方法は、少量の精製高分子からの結晶の成長を可能にする。この新規の方法から得られる結晶は、ほぼ二桁も少ない開始物質を使用するにもかかわらず、他の技術によって成長させた結晶とサイズがほぼ同じである。一実施形態において、結晶を成長させるのに使用する全タンパク質に対する結晶中のポリペプチドの統合比は、1:50、1:100、1:150、1:200、1:250、1:300、1:400、1:500、1:750、1:1000、1:1500、1:2000、1:2500、1:3000、1:4000、1:5000、1:6000、1:7500、1:10000、1:20000、1:30000、1:40000、1:50000である。上記比率のいずれも、本発明が網羅する比率の範囲に対する開始点または終点でありうることを理解されたい。
【００１９】
「静的結晶化条件」という用語は、高分子を、緩衝剤、沈殿剤、添加剤、リガンドおよび基質を含む様々なエフェクタと混合することによって、結晶化を行うパラメータを変化させる場合に定められる。
【００２０】
従来の結晶化実験では、静的条件を設定し、次いで溶液条件を「変動」させる。「変動」という用語は、結晶化が生じるまで、あるいは長時間が経過して静的条件の設定を断念するまで、結晶化条件における様々なエフェクタを無制御に変化させることを意味する。例えば、現在利用可能な懸滴法では、液滴中のタンパク質の濃度が、液滴中に結晶が出現するまで無制御の速度で増加するように、液滴中のタンパク質の濃度を液溜め溶液と平衡させる。従来のシステムでは、「静的条件」の後に上述の「変動」を採用して、それぞれの良好な結晶化に対する試験を行う。
【００２１】
「動的開環条件」という用語は、エフェクタを制御速度で変化するように設定し、その速度を予め設定する場合に定められる。例えば、pHを1秒当たり0.05pH単位で変化させるか、あるいはタンパク質濃度を1秒当たり0.5mg/ml増加させることができる。
【００２２】
動的開環条件を適用するためには、好ましくはフルスケール変動の30%、最も好ましくはフルスケール変動の10%より良好な有効精度でエフェクタレベルを制御することができなければならず、好ましくは分単位、最も好ましくは秒単位である有効速度で制御できなければならない。
【００２３】
「動的閉環条件」という用語は、結晶化過程のリアルタイムな観察を考慮に入れたプログラムに応じて初期設定から変化するように設定されるエフェクタにより定められる。一例において、タンパク質濃度は、結晶が形成を開始するのが観察されるまで1秒当たり0.5mg/mlの速度で増加するように設定され、その後タンパク質濃度が一定になる。他の例において、NaCl濃度は、結晶が出現するのが観察されるまで100mM/秒の速度で増加するように設定され、その後NaCl濃度は、結晶化過程が完了するまで約10mM/秒の速度で減少する。第1の結晶の生成に応じてエフェクタを変化させることによって、多結晶の形成を避けることができる。
【００２４】
動的閉環条件を適用するためには、好ましくはフルスケール変動の30%、最も好ましくはフルスケール変動の10%より良好な有効精度でエフェクタレベルを制御することができなければならず、好ましくは分単位、最も好ましくは秒単位である有効速度で制御できなければならない。また、観察結果に応じて目標エフェクタレベルを制御変化させるために、結晶化の過程または結晶化溶液の状態をリアルタイムで観察できなければならない。
【００２５】
形成される結晶の質および数は結晶形成過程の動態に大いに影響されるため、結晶化に対して開または閉環動的条件を用いることができることは特に有意義である。
【００２６】
エフェクタのいくつかの集合体が設定される最も一般的なタイプの結晶化の条件では、それらのエフェクタのいくつかが静的条件で、いくつかが開環動的条件で、いくつかが閉環動的条件であってもよい。開環動的条件を受けるエフェクタに対して設定される変化速度は同一であってもよいし、異なっていてもよい。変化率と、閉環動的条件を受けるエフェクタに対する応答プログラムは同一であってもよいし、異なっていてもよい。蒸発のような特定のエフェクタ変化方法は、試験用液におけるすべての分子濃度を同時に、かつ同じ速度で変化させることにのみ適している。微量透析および微量濾過を用いて、異なる分子の濃度を異なる速度で変化させることができる。
【００２７】
エフェクタレベルを変化させるためのシステムの「応答時間」は、エフェクタを変化させ、溶液を通じて平衡させるのに必要な最小限の時間である。このために、より小さな容量で処理すると、任意のシステムの応答時間が短くなる。特に、ナノリットルスケールの容量においてエフェクタレベルを動的に変化させることに関連する現行の発明は、より大きい容量を用いるものに比べて好ましい。
【００２８】
「エフェクタの集合体に対する結晶化条件スペース」は、結晶化に対する試験を行うための実験にそれらのエフェクタを設定するすべての可能な方法を意味する。これは、静的開環動的設定および閉環動的設定を包括する。開環動的および閉環動的オプションを含む、エフェクタの集合体に対する条件スペースは、これらのオプションを含まないエフェクタの集合体に対する条件スペースより大きい。
【００２９】
「構造決定に有効」という用語は、結晶化試験から採取し、x線結晶解析を施すことができる結晶を意味する。本発明の方法は、多くの結晶化条件群の試験を可能にし、当該技術分野において現在利用可能な方法とは異なり、x線結晶解析構造決定に使用される微小流体チップから結晶を取り出すことを可能にする。
【００３０】
図1aは、タンパク質および他の生体分子の結晶化に好適な本発明の実施形態による結晶化システムの概略図である。タンパク質の結晶化に関して本発明を説明するが、本発明は任意の好適な物質の結晶化を網羅することを当業者なら理解するであろう。本発明の結晶化システム10は、微小流体チップに実装される。X線回折による分子構造決定に向けて質単結晶の成長を促進するために結晶条件を選別することを可能にする。微小流体システムは、1つまたは複数の流路が形成された基板、ならびに結晶化過程を通じてタンパク質または生体分子溶液を扱うための1つまたは複数のサブシステムを備える。例示の結晶化システムは、薄い透明のガラスまたはプラスチック構造体で構成される基板に形成された流路を備えるが、本発明の教示によれば任意の好適な材料を使用できることを当業者なら理解するであろう。
【００３１】
結晶化過程は、3つの段階、すなわち核形成、結晶成長、および結晶成長の停止を含む。核形成を通じて、初期の分子クラスタが、三次元会合して、熱力学的に安定な凝集体を形成する。結晶は、タンパク質濃度が核形成濃度を上回る超飽和溶液で形成する。結晶成長は、タンパク質溶液からタンパク質分子が十分に除去されたとき、または他の条件が変化して、核形成濃度を改変したときに停止する。タンパク質は、一般には、その表面チャージャ(charger)を変化させるか、またはタンパク質とバルク溶媒水の間の相互作用を攪乱して、結晶化をもたらす会合を促進する薬剤を添加することによって、結晶化される。
【００３２】
本発明の例示の結晶化システム10は、結晶化される分子を含むタンパク質溶液を搬送するためのタンパク質流路12を備える。タンパク質結晶化に有効なユニット処理のための1つまたは複数のサブステーション40、50、60、70が流路に沿って配置される。タンパク質結晶化システムの各サブステーション40、50、60、70を主要流路に沿って配置して、幅広いクラスの結晶化条件試験をシステム10で試験することを可能にする。
【００３３】
本発明において、タンパク質流路12を流れる結晶化物質の制御された層流、ならびに1つまたは複数のエフェクタ設定サブステーション40および1つまたは複数の濃度変更サブステーション50の存在によって、マイクロスケール透析または蒸気拡散法による結晶成長が可能になる。
【００３４】
図1aに示されるように、第1のサブステーションは、透析により緩衝剤を含むタンパク質にエフェクタを設定するためにタンパク質流路12に沿って配置されたエフェクタ設定ステーション40を備えることができる。図1aは、タンパク質流路12の各サブステーションを通じたタンパク質溶液およびエフェクタの濃度をグラフで示す図でもある。ここに示されるように、最初は、タンパク質溶液におけるタンパク質溶液のタンパク質濃度は、核形成濃度より小さい。エフェクタ変更ステーション40は、結晶化条件を設定するために、緩衝剤流路における緩衝剤とタンパク質流路におけるタンパク質溶液との間で溶質を選択的に交換することを可能にする。エフェクタ変更ステーション40では、タンパク質溶液のエフェクタを変化させて、タンパク質流路と、タンパク質不透過膜によりタンパク質流路から分離された緩衝剤との間の透析による結晶化を促進することができる。例えば、タンパク質の塩入または塩析を行うこと、緩衝剤タイプおよび濃度を変化させること、イオン、リガンドおよび/または共同因子を交換すること、溶液のpHを変化させること、溶液の温度を変化させること、あるいは当該技術分野で知られている他の手段によって結晶化条件を設定することができる。
【００３５】
タンパク質流路12に沿う他のステーションは、濾過または蒸発によって水(または他の溶媒)をタンパク質溶液から除去することによって、タンパク質溶液におけるタンパク質およびエフェクタの濃度を増加させる濃度変更ステーション50である。濃縮ステーションは、核形成を開始し、続く結晶の成長を促進するために、タンパク質溶液の濃度を核形成濃度より大きくする。
【００３６】
エフェクタ設定ステーション40および濃縮ステーション50に加えて、タンパク質結晶化システム10は、タンパク質流路に沿う観察ステーション60または領域、および採取ステーション70をさらに含むことができる。観察ステーション60では、光学的手段を使用して、タンパク質分子の凝集または結晶の形成を観察することができる。光学的手段を使用して、流れにおける結晶の速度を測定することができる。例示の観察ステーション60は、偏光光学素子を使用して、撮像または光散乱光学素子によって結晶の存在を検出して、タンパク質の凝集を検出することができる。観察ステーションは、形成過程を観察し、異なる成分にフィードバックを提供することによってシステムの繊細な適応制御を可能にする。採取ステーション70は、結晶が形成されるタンパク質流路から、x線回折装置に結晶を配置するのに適したデバイスへ結晶を抽出する手段を提供する。
【００３７】
特定の結晶化試験の要件に応じて、異なるステーションの配置を変えることが可能である。タンパク質結晶化チップは、先述のサブステーションのうちの1つまたは複数のサブステーションを任意の好適な組合せで含むことができることを当業者なら認識するであろう。
【００３８】
図1bに示される本発明の代替的な実施形態によれば、タンパク質結晶化システム10'は、形成された結晶13を搬送する結晶流路12'、観察ステーション60、および/または流路から結晶を抽出するために結晶流路に沿って配置された採取ステーション70を備える。結晶流路で結晶を形成する任意の好適な手段を図1bに示される実施形態に使用できる。
【００３９】
図2および3aおよび3bは、本発明の例示的な実施形態のエフェクタ変更サブステーション40を示す図である。示されるように、エフェクタ変更サブステーションは、2つの流路(すなわちタンパク質流路12と緩衝剤流路14)を分離するための従来の濾過膜52を利用して、試料の小量の制御可能な透析を提供する。例示のエフェクタ変更システムは、タンパク質溶液をエフェクタ変更ステーション40に供給するためのタンパク質流路12と、緩衝剤を緩衝剤入力領域141から濾過ステーションに供給するための緩衝剤流路14とを含む4ポート横断フィルタである。タンパク質流路12は、第1の導入口121、およびエフェクタ変更サブステーションから透析タンパク質溶液を受け取って搬送するための濾過チャンバからの排出口122においてエフェクタ変更サブステーションを横切る。緩衝剤流路14は、緩衝液をチップ10に入力するためのチップ導入口141と、使用された緩衝液をチップから除去するためのチップ排出口142とを含む。緩衝剤流路14は、第2の導入口において膜52の下方の濾液チャンバを横切り、エフェクタ変更サブステーションから緩衝液を輸送するための第2の出口を含む。
【００４０】
その内容が参照により本明細書に組み込まれている2002年9月13日に出願された「微細加工型オンチップ粒子濾過システム」という名称の米国仮特許出願第60/410685号、およびそれと同じ日付で出願された「微小流体システムにおける微小流体部品の実装」という名称の米国特許出願整理番号第TGZ-023には、好適なエフェクタ変更サブステーションが記載されている。
【００４１】
結晶化される分子を含むタンパク質溶液は、タンパク質流路12からエフェクタ設定サブシステムに導入され、第1の濾過チャンバ58に入って、膜52の上を通る。緩衝液は、膜52の下方の第2の濾過チャンバ56に導入される。タンパク質溶液は透析され、溶質は膜を通して交換されて、タンパク質の結晶化を促進する。上述のように、タンパク質溶液のイオン強度を変化させ、洗剤濃度を変化させ、タンパク質濃度を変化させ、または試料のpHを変化させるなど、エフェクタを設定することによってタンパク質結晶化を促進または実施することができる。
【００４２】
エフェクタ設定サブステーション40は、特定サイズの溶質の選択的な交換を可能にする。緩衝剤とタンパク質流路の間で特定のイオン、リガンドおよび共同因子の交換を可能にするために、適切な濾過膜を選択することができる。溶質を、膜を通してタンパク質流路に送り、圧力によって回収壁の方へ誘導することができる。膜に沿う拡散を溶質の受動的なサイズ選定流とすることができ、あるいは圧力、および緩衝剤流路に沿う流速によって制御することができる。
【００４３】
図4は、濃縮ステーション50がタンパク質濃度を高めるためにタンパク質溶液から水または他の溶媒を制御蒸発させるための蒸発ステーション500を備える。図4の実施形態によれば、蒸発サブステーション500は、タンパク質流路120の側壁に形成された開口501によって形成されるが、結晶化溶液を制御可能に蒸発させる他の好適な手段を使用できることを当業者なら認識するであろう。例えば開口501内、または開口501に沿って、または開口501の近傍に設けられた局所ヒータ502を使用して、タンパク質溶液の温度を制御することによって蒸発速度を制御することができる。開口501上方の大気の温度および湿度、蒸発ステーションを定めるタンパク質流路内の開口のサイズ、および/またはタンパク質流路12内のタンパク質溶液の流速を制御することによって蒸発速度を制御することもできる。蒸発サブステーションに対する微妙な温度制御は、結晶化溶液の蒸発分布を変化させ、そのためタンパク質の濃縮速度を変化させる手段を提供する。
【００４４】
図5に示される他の実施形態によれば、濃縮ステーションは、結晶化されるタンパク質を通さない膜を通してタンパク質溶液から水(または他の溶媒)を制御除去することを可能にする濾過ステーション510を備える。図5の実施形態によれば、濾過ステーション510は、図2および3に示されるエフェクタ設定ステーションに類似の構成を有する。例示の濃縮ステーション510は、タンパク質不透過膜520と、膜の上方に形成され、導入口521および排出口522を介してタンパク質流路12に接続するタンパク質チャンバ516とを含む。しかし、膜520を通じて溶質を交換するのではなく、濾過ステーション510が、加圧力または他の好適な手段を用いて、水または他の溶媒をタンパク質溶液から、タンパク質不透過膜520を通じて輸送する。溶媒の水は、濾過流路515、または膜520の下方に形成されたチャンバに輸送され、処分または再使用されうる。この種の濾過ステーションによってどの成分の濃度を増加させるかを制御する方法として、タンパク質のみを阻止するか、またはタンパク質とタンパク質緩衝剤におけるいくつかのエフェクタの両方を阻止するように膜を選択できることを透析の技術分野の当業者なら認識するであろう。
【００４５】
結晶化のための条件を設定した後に、タンパク質結晶を形成する準備が整っているタンパク質溶液は、結晶が形成されるタンパク質流路12の結晶化区間12aまたは領域に沿って形成された観察ステーション60に流入する。例示の実施形態によれば、顕微鏡光学素子を偏光させることによってタンパク質流路12における結晶の存在を観察することができる。光散乱光学素子を使用する観察ステーションによって結晶の初期の形成、すなわちタンパク質流路12におけるタンパク質凝集体の存在を監視することもできる。
【００４６】
観察ステーション60は、各結晶化実験をCCDカメラによってリアルタイムに監視し、偏光光学素子が結晶の存在を検出したり、あるいは光散乱光学素子がタンパク質凝集を検出することを可能にする。結晶化過程、すなわち結晶の良好な形成または結晶の形成の失敗をリアルタイムで監視する能力により、結晶化条件設定アルゴリズムの適応的調整が可能になる。観察ステーション60は、結晶が採取ステーション70にいつ到達するかを予測するために、流れに形成された任意の結晶の速度を測定することもできる。
【００４７】
結晶の検出後に、採取ステーション70は、流路12から結晶を抽出することができる。例示の採取ステーション70は、好適なサブシステムを使用して、結晶を含む一定分量の液体を抽出する。その実施形態が図6に示される例示の採取ステーション70は、その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第10/028852号、米国特許第10/027484号、米国特許第10/027516号および米国特許第10/027171号に記載されている微細加工型2ピン/仮想壁システムを備えることができる。図6に示されるように、採取ステーション70は、タンパク質流路の内部へのアクセスを提供する、タンパク質流路12の側壁704に形成された開口702と、採取デバイス710とを備える。例示的な実施形態によれば、採取デバイスは、毛管サイズの試料取得領域および流路720を画定する、第2のピン712から間隔をおいて配置された第1のピン711を備えた微細加工型2ピンデバイスとして示される毛管捕捉ピンを備える。開口702は、開口内にタンパク質溶液のメニスカスを形成するようにサイズおよび寸法設定されている。形成された結晶が開口702付近にあるときに、毛管捕捉ピン710が、開口702を通じてタンパク質流路内部に導入されて、結晶を抽出する。毛管捕捉ピン710は、結晶を含む一定体積の液体をタンパク質溶液から吸い取る。ピン710の毛管領域720、すなわち2ピンデバイスにおける2つのピン711、712の間隔は、結晶を含む一定分量の液体を毛管作用によって保持する。次いで、毛管捕捉ピン710は、開口702から取り外され、所望の結晶を含む一定分量の液体を運び去る。本発明によれば、微小流路から物質を抽出するための任意の好適なサブシステムを使用できることを当業者なら認識するであろう。
【００４８】
例示的な実施形態によれば、結晶を抽出し、採取デバイス710上の所定の位置で凍結することができるため、凍結と観察のための個別の構造体に結晶を移送する必要がなくなる。
【００４９】
図7に示される本発明の他の実施形態によれば、タンパク質結晶化システムは、タンパク質流路内で形成された結晶に化合物を添加するための浸漬ステーション800を含むこともできる。浸漬ステーションは、共同因子またはタンパク質リガンド、例えば阻害剤または活性化剤を予め存在する結晶に導入することを可能にする。
【００５０】
本発明のタンパク質結晶化システムは、10から50ミクロンサイズのタンパク質結晶をナノグラム量のタンパク質から成長させることができるため、数マイクログラムのタンパク質しか利用できないときも、100から1000の条件を試験するタンパク質結晶化試験を行うことが可能である。
【００５１】
タンパク質結晶化システムは、単一流路上で毎秒約1個の速度で結晶化試験を実行できる完全自動化システムを提供する。該システムは、x線データ収集に向けて、形成箇所から結晶を採取する簡単な自動化可能手段を含む。
【００５２】
本発明は、溶質の交換、例えばタンパク質の塩入または塩析に使用される濾過サブシステムを有する微小流体システムを使用したタンパク質結晶化試験を可能にする。本発明のタンパク質結晶化システムは、従来のハイスループット結晶化システムと比べて、高価な試料および試薬の消費量を少なくとも二桁のオーダで低減する。エフェクタ変更サブステーションおよび濾過サブステーションは、極めて単純な構造を有しており、フィルタを基板材料に接着するための適切な接着剤が利用可能な任意のフィルタに適応可能である。
【００５３】
タンパク質結晶化チップは、例示されているサブシステムの配列および配置に限定されず、蒸発、濾過、観察および採取サブステーションの異なる配列および配置によって、タンパク質結晶化のいくつかの異なる実施形態を設計できることを当業者なら認識するであろう。
【００５４】
一実施形態によれば、図8に示されるように、タンパク質流路12a、12b、12c、12dおよび1つまたは複数のサブステーション40、50、60および/または70をそれぞれ備えた複数の異なるタンパク質結晶化システム10を単一基板100上に配置し、並列動作させることができる。単一基板上の並列システムを使用することで、処理量が増加するとともに、資源が効果的に利用される。
【００５５】
他の実施形態によれば、タンパク質結晶化チップ500は、図9に示されるように、直列に配列した複数のタンパク質結晶化システム10a、10bを備えることができる。示されるように、チップ500は、各結晶化システム10を貫通して接続する単一のタンパク質流路120を含む。各システム10に伴うサブステーション40、50、60および/または70は、タンパク質流路120に沿って形成される。流路120に沿う各システムは、採取ステーション70における良好な結晶の形態を除いて、目標タンパク質がタンパク質流路120から出るのを防止する。したがって、蒸発および透析ステーションを含めて、複数のシステムを直列に配置することで、1つの結晶化実験に伴うタンパク質の損失を最小限にする。したがって、第1の結晶化条件群の下で動作する第1のタンパク質結晶化システム10aが結晶を生成しない場合は、流路120内のタンパク質溶液を、流路に沿って直列に配置された他の結晶化システム10bに連続的に流して、同一または異なる結晶化条件群の下で結晶化を試みることができる。単一流路は、直列に配置された10から100の結晶化システムを潜在的に有することができる。サブステーションの具体的な配置は、本発明の一実施形態を例示するもので、各タンパク質結晶化システム10は、1つまたは複数の記載のサブステーション40、50、60および70を任意の好適な組合せで備えることができることを当業者なら認識するであろう。
【００５６】
直列に配列された複数の結晶化システムを備えたタンパク質結晶化チップにおいて、流路内のタンパク質溶液を透析するための透析システムサブシステムなどのエフェクタ設定ステーション40と、タンパク質溶液を後続のシステムに送る前に水を添加するための図9の濃縮システムなどの濾過サブシステムとを含めることによって、タンパク質流路120における条件を各システム10の間で再設定することができる。本来の入力条件ではなく、先のシステム出力条件に基づいて新しい結晶化条件を設定するために、任意のシステムにおいてエフェクタ変更サブシステムおよび濃度変更サブシステムを構成することもできることを濾過および透析の技術分野の当業者なら認識するであろう。さらに、本発明のフィルタ配置は、結晶化混合物における任意の溶質の蒸発を可能にすることを濾過および透析の技術分野の当業者なら認識するであろう。
【００５７】
1つまたは複数のタンパク質結晶化システム10の直列配置構造は、各単一結晶化システムにおいて、良好な結晶化以外はタンパク質が消費されない(つまりシステムを出ない)ため、タンパク質の質量当たりの試験の数を増加させる。例えば、断面寸法が100um×50umのタンパク質流路に注入されたタンパク質溶液の2mmの注入プラグによって、約100nlのタンパク質溶液が例えば1ナノグラム/ナノリットルの量でシステムに注入される。100nlのタンパク質溶液を50のタンパク質結晶化システムの直列配置構造に供給し、わずか100nlのタンパク質溶液を使用して、50の結晶化試験を行うようにすることができる。1ナノグラム毎ナノリットルの単位体積当たりの質量ででは、ハイスループットでのタンパク質の利用量は、結晶化試験毎当たり2ナノグラムにすぎない。
【００５８】
他の実施形態によれば、タンパク質結晶化システムを、図10に示されるように、流体輸送環110状に配置して、単一の結晶化システムで複数の結晶化試験を行うようにすることができる。流体輸送環は、タンパク質溶液を循環させ、タンパク質結晶化システムを通じて複数回送り戻すことを可能にする。システムを動作させるために、初期のタンパク質溶液を弁1002を通じて注入し、次いで弁1002を閉じる。ポンプ1003は、タンパク質を結晶化するための複数のサブステーション40、50、60、70を含む環状タンパク質流路1200を通じて溶液を循環させるように動作する。上述したように、エフェクタ設定ステーション40を介してタンパク質溶液中にエフェクタを設定し、その後濃縮ステーション50でタンパク質溶液を濃縮し、その後タンパク質流路に結晶を形成できる。観察ステーション60で結晶化を観察した後に、採取ステーション70で採取できる。
【００５９】
条件が結晶を生成することができない場合は、タンパク質溶液にシステムを逆循環させて、同一または異なる条件群の下で結晶化を試みることができる。示されるように、タンパク質溶液は、ポンプ1003を流れる前に濃縮再設定ステーション1005および緩衝剤再設定ステーション1006を連続的に流れることができる。ポンプ1003は、タンパク質溶液を結晶化システムの上流末端に送り込む。再循環タンパク質溶液は、タンパク質が最初に注入された同じエフェクタ/緩衝剤条件を有することができる。
【００６０】
並列、直列および直列環状のタンパク質結晶化システムの動作について説明したが、これらの任意の組合せも本発明の一部であることは、当業者に明確に理解されるであろう。
【００６１】
本発明の例示的な実施形態のタンパク質結晶化チップは、方法とデバイスを組み合わせて、タンパク質結晶化のための結晶化物質の蒸発および選択的濾過を制御する。該タンパク質結晶化チップは、従来のハイスループット結晶化方法およびデバイスのすべての利点を保持しながら、その欠点の多くを克服する。本発明を用いて、蒸発および透析膜平衡技術により、高質の回折グレード結晶を成長させることができる。本発明は、微小流体システムに不可欠である、横断フィルタ技術と少量動的液体制御を組み合わせる。
【００６２】
本発明のタンパク質結晶化デバイスは、従来技術に比べて著しい利点を提供する。該タンパク質結晶化システムは、ナノグラム量のタンパク質からピコグラム量の結晶を成長させることを可能にし、従来のハイスループット結晶化システムに比べて、試薬および試料消費量が少なくとも二桁のオーダで低減される。本発明は、さらに、制御された密封環境に活性流体システムのカスタマイズネットワークを設計する能力、ならびにレーザ散乱(凝集体形成の監視)および偏光顕微鏡(結晶の存在)によって結晶化実験をリアルタイムで自動的に監視する能力を提供する。本発明では、ピンシステムまたは他の好適な採取手段を使用して、フラッシュ凍結およびデータ収集に向けて、形成された結晶を容易に採取することができる。本発明は、さらに、バッチ法、液-液法、透析法および蒸発法を介して結晶成長させることを可能にする。本発明は、結晶成長溶液を正確に混合および分配するために、ラボ・オン・チップ技術を使用する。本発明は、完全に自動化することができ、安価で、コスト効果が高く、使用が容易である。タンパク質結晶化チップは、従来の透析膜技術を組み合わせて、微小流体網において溶質の交換および制御蒸発を行うシステムを可能にする。タンパク質結晶化チップは、必要な流体体積を最小にする上での微小流体の利点をさらに活かすものである。
【００６３】
本発明は、タンパク質の結晶化に限定されず、タンパク質結晶化チップを使用して、核酸および他の生体分子を含むが、それらに限定されない任意の所望の生体分子を結晶化できることを当業者なら認識するであろう。
【００６４】
一実施形態において、本発明の結晶は、同じポリペプチドおよび核酸の異なるスペースグループ、例えば幾何学的形状、対象性または単位細胞である結晶群である。本発明は、当業者が、従来の技術よりはるかに小量のタンパク質を使用し、はるかに短い時間でより多くの条件をサンプリングすることを可能にする。これらの向上により、同一のタンパク質の異なる結晶形態が識別される可能性が高くなる。よって、本発明は、少なくとも一部に、すべてが同一の非溶媒分子、例えばタンパク質、核酸、共同因子または基質を含むことによって関連づけられる3、4、5、6、7、8、9、10、15、20または25の構成要素を含む構造体群である。
【００６５】
例示的な実施形態に関して本発明を説明した。本発明の範囲を逸脱することなく上記構成に一定の変更を加えることができるため、上記説明に含まれ、添付の図面に示されるすべての内容は、例示的なものであって、限定的な意味をもたないものと解釈されるべきである。
【００６６】
添付の請求項は、本明細書に記載されているすべての一般的かつ具体的な特徴、ならびに言語の問題によりその間にあると見なされうる本発明の範囲のすべての記述を網羅するものであるということも理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１ａ】本発明の例示的な実施形態の結晶化システムの概略図である。
【図１ｂ】本発明の代替的な実施形態による結晶化システムを示す図である。
【図２】結晶化システムのタンパク質の詳細図である。
【図３】（ａ）結晶化システムのエフェクタ変更ステーションを示す図である。（ｂ）結晶化システムのエフェクタ変更ステーションを示す図である。
【図４】本発明の例示的な実施形態のタンパク質結晶化システムの採取ステーションの例示的な実施形態を示す図である。
【図５】本発明のタンパク質結晶化システムにおける濃度変更ステーションの実施形態を示す図である。
【図６】本発明のタンパク質結晶化システムにおける濃度変更ステーションの他の実施形態を示す図である。
【図７】浸漬ステーションを含む結晶化システムを示す図である。
【図８】並列に並ぶ複数の結晶化システムを含む微小流体チップを示す図である。
【図９】直列に並ぶ複数の結晶化システムを含む微小流体チップを示す図である。
【図１０】複数の結晶化処理を実施するための環状結晶化システムを含む微小流体チップを示す図である。
【符号の説明】
【００６８】
10  結晶化システム
12、120  タンパク質流路
14  緩衝剤流路
40  エフェクタ設定サブステーション
50  濃度変更サブステーション
52  濾過膜
56、58、515  濾過チャンバ
60  観察ステーション
70  採取ステーション
500  蒸発サブステーション
502  局所ヒータ
510  濾過ステーション
520  タンパク質不透過膜
710  採取デバイス
720  毛管サイズ試料取得領域または流路
800  浸漬ステーション
1002  弁
1003  ポンプ
1005  濃度再設定ステーション
1006  緩衝剤再設定ステーション
1200  環状タンパク質流路
【図１ａ】
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2005538163.tif 000004
【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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