(57)【要約】  本発明は、化学種（化学的分子、生物学的分子、または生化学的分子を含む）のサインおよび／または化学種間の相互作用のサインを得ること、ならびにこれらを使用して、化学種を特徴付け、相互作用を特徴付け、そして／または種々の設定において有用であり得る化学種を同定することを包含する。サインは、水性多相分配を使用して得ることができ、そして薬物発見のような応用のために分子の相互作用を予測するために使用され得る。複数の水性多相分配配置は、全系を規定し、情報強調サインを提供し、精度および感度を最大化する。
2005509856.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
方法であって、以下：
第１の系において、少なくとも１つの化学種と第１の相互作用成分との間、および該化学種とさらなる相互作用成分との間の相互作用の相対的指標を決定する工程であって、該第１の系において、該第１の相互作用成分および該第２の相互作用成分の各々が、該化学種と相互作用し得る、工程；
第２の系において、該化学種を用いて決定段階を繰り返す工程であって、該第２の系が、少なくとも１つの異なる相互作用成分を含む、工程；
該化学種の異なる系における相互作用成分との相互作用の相対的指標から、該化学種の特徴を示す相互作用サインを解釈する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記化学種が、少なくとも１つの補助分子と組み合わせて提供され、該補助分子が、該化学種と第１の相互作用成分および第２の相互作用成分との間の相互作用に影響する、方法。
【請求項３】
前記特徴が、前記化学種の分子アイデンティティーである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記特徴が、前記化学種のコンフォメーション状態である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記特徴が、前記化学種と少なくとも１つのさらなる化学種との間の相互作用の１つである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、該方法が、以下：
ａ）前記化学種を提供する工程；
ｂ）第１の相互作用成分および少なくとも１つのさらなる相互作用成分を、該化学種と接触させる工程であって、該化学種が、各相互作用成分と相互作用し得、該化学種および該相互作用成分が、１つの系を形成する、工程；
ｃ）該化学種と各相互作用成分との間の相互作用の相対的指標を決定する工程；
ｄ）係数を計算する工程であって、該係数が、該化学種と第１の相互作用成分との間の相互作用の相対的指標と、該化学種と第２の相互作用成分との間の相互作用の相対的指標との比を規定する、工程；
ｅ）少なくとも１回の追加回数、ｂ）−ｄ）を繰り返す工程であって、ｂ）が変化される工程；ならびに、
ｆ）（ｄ）からの該係数の数値表示、数学的表示および／または視覚的表示を使用して、相互作用サインを解釈する工程、
を包含する、方法。
【請求項７】
ｂ）−ｄ）を少なくとも３回繰り返す工程を包含する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項６に記載の方法であって、ここで、前記ｂ）が、
ｉ）水性分配系を形成する工程であって、２つ以上の混合不可能な相に分離し得る、工程；
ｉｉ）特徴付けされるべき前記化学種を、該分配系と混合する工程；および
ｉｉｉ）該分配系を、熱力学的に平衡化された相分離が生じるまで、維持する工程；
を包含し、ここで、ｄ）の前記係数が、分配係数である、方法。
【請求項９】
請求項６に記載の方法であって、ここで、前記ｂ）が、
前記化学種を、不均一な相系と接触させる工程であって、ここで、第１の相が、流動性であり、第２の相が、非流動性である、工程；および
該第１の相に、該第２の相を通り越させる工程；
を包含し、ここで、ｄ）の前記係数が、見かけの分配係数である、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、ここで、ｃ）が、前記化学種の保持をモニタリングする工程を包含する、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、ここで、前記化学種の保持が、時間または前記流動性の第１の相の容量の関数として測定される、方法。
【請求項１２】
請求項９に記載の方法であって、ここで、該方法が、クロマトグラフィー方法である、方法。
【請求項１３】
請求項６または７に記載の方法であって、ここで、ｂ）の前記相互作用成分が、溶媒接近可能である化学種のトポグラフィーおよび官能基の型に基づく、該化学種と相互作用する能力において異なる、方法。
【請求項１４】
請求項７に記載の方法であって、ここで、該方法が：
ａ）〜ｆ）を繰り返す工程であって、ａ）における前記化学種が変化される、工程；および、
該化学種の各々について得られるサインを比較する工程、
を包含する、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、ここで、前記化学種の群が、生体分子の混合物であり、該生体分子が、構造的に密接に関連する、方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の方法であって、ここで、前記化学種の群が、生体分子の微小不均一混合物である、方法。
【請求項１７】
請求項１４に記載の方法であって、ここで、前記化学種の群が、少なくとも１つの低分子量リガンドに結合される生体分子である、方法。
【請求項１８】
請求項１４に記載の方法であって、ここで、前記化学種の群が、他の生体分子に結合される生体分子である、方法。
【請求項１９】
請求項１４に記載の方法であって、ここで、前記化学種の群が、他のタンパク質に結合されるタンパク質を含む、方法。
【請求項２０】
１つを超える化学種の構造状態を特徴付けするための方法であって、該方法が：
第１の化学種の相互作用サインを決定する工程；
少なくとも１つの第２の化学種の相互作用サインを決定する工程であって、ここで、該第１の化学種の該相互作用サインを決定する工程または該第２の化学種の該相互作用サインを決定する工程のいずれかまたは両方が、該化学種とのみ相互作用し得る少なくとも２つの異なる系の各々との相互作用サインを決定する工程を包含する、工程；
該第１の化学種のサインを該第２の化学種のサインと比較する工程；および
該第１の化学種のサインと該第２の化学種のサインとの間の相違を記録する工程、
を包含する、方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法であって、ここで、前記化学種が、生体分子、密接に関連する生体分子の混合物、生体分子の微小不均一混合物、少なくとも１つの低分子量リガンドに結合される生体分子および他の生体分子に結合される生体分子からなる群から選択される、方法。
【請求項２２】
請求項２０に記載の方法であって、ここで、前記化学種が、タンパク質を含む、方法。
【請求項２３】
請求項１４または２０に記載の方法であって、ここで、前記少なくとも１つの化学種の生物学的活性レベルが、既知である、方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法であって、ここで、前記化学種が、生体分子、密接に関連する生体分子の混合物、生体分子の微小不均一混合物、少なくとも１つの低分子量リガンドに結合される生体分子および他の生体分子に結合される生体分子からなる群から選択される、方法。
【請求項２５】
目的の生体分子の生物学的活性レベルを予測するための方法であって、該生体分子は、結合パートナーに結合し、該方法が：
ａ）第１の系において、結合パートナーに結合される生体分子（生体分子／結合パートナー）の参照サインを得る工程であって、該参照サインを得る工程について、目的の生物学的活性の参照レベルが、該生体分子／結合パートナーと第１の相互作用成分との間、および該生体分子／結合パートナーと第２の相互作用成分との間の相互作用の相対的指標を決定することによって知られ、該第１の系において、第１の相互作用成分および第２の相互作用成分の各々が、該生体分子／結合パートナーと相互作用し得る、工程；
ｂ）該生体分子の該参照サインと該生物学的活性の参照レベルとの間の関係を決定する工程；
ｃ）実験結合パートナーに結合される該生体分子のサインを得る工程；
ｄ）ｃ）の該サインおよびｂ）において誘導された該関係とを比較する工程；ならびに、ｅ）該実験結合パートナーの該生物学的活性を予測する工程、
を包含する、方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法であって、ここで、前記結合パートナーが、低分子量リガンドおよび他の生体分子からなる群から選択される、方法。
【請求項２７】
請求項２５に記載の方法であって、ここで、ｅ）が、予測された活性の相対的程度を、前記参照結合パートナーの前記参照活性の順にランク付けする工程、を包含する、方法。
【請求項２８】
請求項２５に記載の方法であって、ここで、ｅ）が、他の結合パートナーに対して相対的な尺度にランク付けする工程、を包含する、方法。
【請求項２９】
請求項２５に記載の方法であって、ここで、前記実験結合パートナーが、候補薬物である、方法。
【請求項３０】
請求項２５に記載の方法であって、ここで、前記生物学的活性が、異なる組織における同じ生体分子に対する生物学的活性のプロフィール（セット）である、方法。
【請求項３１】
請求項２５に記載の方法であって、ここで、前記生物学的活性が、同じ組織において同じ結合パートナーに結合される場合、異なる生体分子に対する活性のプロフィール（セット）である、方法。
【請求項３２】
請求項２５に記載の方法であって、ここで、前記生物学的活性が、異なる組織において同じ結合パートナーに結合される異なる生体分子に対する生物学的活性の多次元プロフィール（セット）である、方法。
【請求項３３】
請求項２５に記載の方法であって、ここで、前記参照サインおよび前記実験サインが、相互作用系において、他の生体分子の存在下で得られる、方法。
【請求項３４】
請求項１に記載の方法であって、ここで、第１の系が、第１の多相分配系を含み、第２の系が、第２の多相分配系を含み、該方法は：
ａ）特徴付けられるべき生体分子を、該第１の系および該第２の系と接触させる工程であって、該各々の系において、該相の分離を可能にする、工程；
ｂ）該第１の系および該第２の系において分離された相中の生体分子の濃度を定量化する工程；
ｃ）第１の系に対する分配係数および第２の系に対する分配係数を決定する工程であって、ここで、該分配係数が、分離された相中に存在する生体分子の比である、工程；ならびに、
ｄ）該生体分子に対して特異的な分配係数のセットを使用してサインを解釈する工程、
を包含する、方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法であって、ここで、前記多相分配系が、ポリマー／ポリマー系およびポリマー／塩系からなる群から選択される、水性多相系である、方法。
【請求項３６】
請求項３４に記載の方法であって、ここで、分配係数が、前記系中の前記生体分子の総量の関数として決定され、該分配係数値の精度を上昇する、方法。
【請求項３７】
請求項３４に記載の方法であって、ここで、各系が、特異的に選択された低分子量化合物および高分子量化合物のセットを使用して較正され、該低分子量化合物および該高分子量化合物は、公知の分配係数を有する、方法。
【請求項３８】
請求項３４に記載の方法であって、ここで、ｃ）が、全てではない各系について分離された相中の生体分子の濃度を実験的に測定し、存在する全生体分子について、公知の値を使用して分配係数が計算される工程を包含する、方法。
【請求項３９】
化学種の第１の分配係数および第２の分配係数を決定する方法であって、該方法が：
ａ）第１の水性分配系を提供する工程；
ｂ）少なくとも第２の水性分配系を提供する工程；
ｃ）特徴付けられるべき該化学種を、該第１の系と接触させ、そしてさらなる系と接触させる工程；
ｄ）該相の分離を可能にする工程；
ｅ）該第１の系における少なくとも１つの分離された相中の化学種の濃度および該さらなる系における少なくとも１つの分離された相中の化学種の濃度を定量化する工程；ならびに、
ｆ）該第１の系における少なくとも１つの分離された相中の化学種の該濃度および該さらなる系における少なくとも１つの分離された相中の化学種の該濃度を使用して、サインを解釈する工程、
を包含する、方法。
【請求項４０】
請求項３９に記載の方法であって、ここで、前記化学種が、生体分子、低分子量リガンドに結合される生体分子および別の生体分子に結合される生体分子からなる群から選択される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、米国特許仮出願番号６０／３３６，８９５（２００１年１１月１２日出願）、米国特許仮出願番号６０／３５２，４７３（２００２年１月２８日出願）、米国特許仮出願番号６０／３６１，６６１（２００２年３月４日出願）、および米国特許仮出願番号６０／４１２，７５４（２００２年９月２３日出願）に対し、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下に優先権の利益を主張する。これらの仮出願の各々は、その全体が、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般に、分子の物理特性および構造特性ならびに分子間相互作用の物理特性および構造特性の特徴付けに関する。さらに詳細には、本発明は、例えば多数の水相分離によって得られたサインの開発および使用に関し、これらのサインは、生体分子および／または生体分子と相互作用する分子の構造特性および機能特性を反映する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
本発明は、一般に、生体分子、生体分子を含む複合体またはそれらの類似化学種の分析および特徴付けに関する。分析の結果は、サインとして表され、本発明の方法を使用して分析および特徴付けされたこれらの化学種の特性の相関に基づく特定の使用のための化学種の選択を可能にする多数の化学種の特性間の関係を確立するために使用され得る。
【０００４】
生体分子は、一般に、柔軟な三次元（３−Ｄ）分子構造である。生体分子であるポリペプチドの１つの原型のクラス（ｐｒｏｔｏｔｙｐｉｃａｌ  ｃｌａｓｓ）のメンバーは、直鎖状配列アミノ酸から通常は構築される（すなわち、このメンバーは、アミノ酸配列を含む）。ポリペプチドに含まれるアミノ酸の大多数は、２０個の一般的に知られるアミノ酸である。タンパク質および他の生体分子の場合、タンパク質の３−Ｄ構造の特定の詳細が、特定の生体分子に特徴的な生物学的情報の多くを決定することが公知である。一般に、３−Ｄ構造（コンフォメーション）の変化は、特定の生物学的効果と関連する。従って、その意味では、生体分子のコンフォメーションの状態は、この生体分子に特徴的な生物学的情報の特定の局面を反映するべきである。
【０００５】
特定の生体分子の生物学的情報が、特定の生体分子と他の化学種との間の非共有相互作用によって、別の化学種へ移動され得るかまたは別の化学種から移動され得ることが、一般に理解される。このような非共有相互作用の例としては、結合事象が挙げられ、生体分子へのより小さな分子の結合が、この生体分子のコンフォメーションの変化を引き起こす。多くの場合、当業者によって認識されるように、生体分子のコンフォメーションの変化は、関与する生体分子の挙動または特性のいずれかにさらなる変化を生じ得る。これらの変化は、しばしばかなり有意であり、そして、他の生体分子がこの生体分子によって結合され得るような変化を含む。これらのような一連の事象は、多くの特定の生物学的効果の根底にある。従って、生体分子構造の分析は、有効な治療およびバイオテクノロジーの改善の探究において、かなり興味深い。
【０００６】
一般に実行されるように、生体分子の構造解析は、多くの詳細なレベルでの構造の試験を含む。タンパク質に関して、これは、アミノ酸配列（一次構造）、二次構造（例えば、αヘリックスまたはβシート構造）、三次構造（３−Ｄの詳細な原子構造）、および四次構造（この生体分子が不連続サブドメインから構成される場合）のレベルでの解析を含む。これらの構造局面の各々を評価する技術は、一般に、所望の情報のタイプに特異的である。例えば、生体分子の一次配列を決定するために好ましい方法は、通常、三次構造の情報を提供する能力が無く、そして三次構造の情報を提供するための技術は、一次配列の決定に不適当である。第一に、高次構造（すなわち、コンフォメーション情報）を解析するために利用可能な方法および器具は、複雑であり、遅く、かつ実施困難である。詳細な３−Ｄ情報とは、原子型および原子スケールで空間におけるそれらの座標の決定を定義により含むので、これは意外ではない。容易かつ単純に、有用な高次構造情報を迅速に獲得するために、異なるアプローチが必要である。
【０００７】
多くの生物学的プロセスは、タンパク質と別の分子との間の非共有結合に媒介される。これらの生物学的プロセスの例としては、レセプター（例えば、ホルモンのレセプター、メッセンジャーのレセプターおよび／または薬物のレセプター）、ならびにレセプターの結合パートナー（例えば、ホルモン、メッセンジャーおよび／または任意の他のリガンド）の関与が挙げられる。生物学的プロセスの媒介におけるこのような相互作用および相互作用の役割は、当業者に周知である。さらに、１つの生体分子と別の生体分子との相互作用に関する生物学的プロセスは、異なるタンパク質間の相互作用を含むことが、一般に理解される。相互作用（例えば、上記のような）の同定および特徴付けは、薬物の発見および開発のプロセスにおいて非常に重要であることもまた、理解される。生化学的結合相互作用を分析するための方法（特に、構造特性に関する眼識を得る目的のために）は、一般に、より多数の潜在的に関連する結合対または有益な結合対に適用させるための非常に多くの時間、努力を必要とする。
【０００８】
所定のレセプターの結合パートナーとの結合は、結合によって誘導されるレセプターの物理化学的特性における変化をモニタリングすることが可能な種々の技術によって、または結合していない結合パートナーの濃度に感受性である技術によって検出され得る。レセプターに結合している特定のリガンドの結合パートナーによる競合置換に基づく技術が、当該分野において特に知られている。しばしば、目的の特定のリガンドは、蛍光標識または放射性標識される。このようにリガンドが標識されると、結合パートナーによるレセプターと複合体中のリガンドとの置換に起因する遊離の非結合型リガンドの出現が、容易にモニターされる。しかし、これらの技術は、特定のリガンドの親和性を越えるレセプター親和性を有する化合物のみが、有意量のリガンドを置換可能であり、これによってそのリガンドの検出が可能になるという事実によって妨害される。さらに、リガンドを検出可能にするために使用されるこれらの方法に関連する深刻な廃棄物処理問題が存在する（すなわち、放射能、毒性）。
【０００９】
いくつかの場合において、リガンドの結合は、レセプターの機能を変更するのに十分である。そうであるならば、リガンド結合の決定はまた、レセプターの機能がまた変化される（例えば、変更された酵素活性または他の生体分子に対して変更された親和性）ことを決定するために使用され得る。これらの場合において、リガンド−レセプター結合の定量化は、レセプター機能および／または活性に影響し得る化合物をスクリーニングするのに適切である。しかし、このような単純なアプローチは、通常、適切でも有用でもない。
【００１０】
多くの場合において、特異的なリガンド結合は、レセプター活性および／または機能の特定の変更を生じるが、一方、別のリガンドの結合は、活性および／または機能の異なる特定の変更を生じる。リガンド結合に応答するこれらの差異は、レセプターの３−Ｄ構造における変化（コンフォメーション変化）の特定の詳細に依存する。この１つの例は、エストロゲンレセプターに対する異なるエストロゲン化合物の効果である。この場合、異なる化合物は、異なる別個のコンフォメーション変化を生じ、そしてこれらの異なる変化は、このエストロゲンレセプターの異なる活性および／または機能を生じる。従って、このレセプター、または類似の特性を有するレセプターに対するそれらの影響について化合物のクラスをスクリーニングする場合、レセプターに対するリガンドの親和性のいかなる測定も、任意の化合物の潜在的な薬理学的活性に関する十分な情報を提供しない。さらに、この親和性の強さは、一般的に、レセプターにおけるコンフォメーション変化の特定の詳細に相関しない。親和性と構造との間の相関の欠如は、単純な親和性の特徴付けに基づく任意の予測的な試み（あまり成功しそうにないとしても）を付与する。しかし、代替的な、有用であり得るコンフォメーション情報の入手は非常に困難でありかつ高価である。
【００１１】
生体分子または生体分子（例えば、レセプター−リガンド複合体）を含む複合体のコンフォメーションの状態を特徴付けることを必要とする実験的作業は広範である。特定のコンフォメーション変化についての情報は、限定されないが、レセプター分子の分光学的な特徴付け、流体力学的特徴付け、または免疫原性的特徴付けのような間接的な方法によって得られ得る。あるいは、限定されないが、生体分子の結晶化またはリガンド−レセプター複合体の同時結晶化、その後のＸ線回析研究および溶液中の生体分子またはリガンド−レセプター複合体のＮＭＲスペクトルのようなより直接的な方法が使用され得る。
【００１２】
間接的な方法は、一般的に、レセプター分子の単一特性を検出し、この単一特性は、任意の特定の場合においてコンフォメーション変化を引き起こすことによって影響されても影響されなくてもよい。変化が検出される場合、コンフォメーション状態においてどのような変化が生じるかをモニタリングすることは、しばしば特に有用ではない。なぜならこの変化は１次元であるのみだからである。従って、より複雑な分子について、間接的技術の使用は、しばしば十分に詳細に特徴付けられたモニタリングシステムに限定される。
【００１３】
直接的な方法（特にＸ線分析およびＮＭＲ分析）は、生体分子の３−Ｄ構造またはレセプター−リガンド複合体の３−Ｄ構造の特徴付けのための最も決定的な技術である。しかし、間接的な方法と同様に、直接的方法もまた広範囲にわたる限定を有する。特に、直接的な方法は、かなりの時間を必要とし、しばしば、大きなタンパク質を研究するためには不適切であり（ＮＭＲ）、そして得ることが困難な物質（例えば、回析品質（Ｘ線結晶学）の結晶）を必要とする。
【００１４】
レセプターへの特異的リガンド結合の生物学的な影響は、細胞または生理学的な影響を直接モニタリングすることによって決定され得る。これは、通常、任意の薬物または医薬の開発の間の同じ時点で必要とされるが、生物学的影響を直接的に研究することは、現在利用可能であるか、まもなく利用可能になる、非常に多くの候補薬物または潜在的な標的をスクリーニングするための実現可能な手段ではない。単純な状況では、細胞培養物および動物の臨床試験はどちらの時点および供給源においてもあまりにも高価であり、多くの潜在的な候補化合物に適用され得ない。
【００１５】
分子を特徴付けるために有用な多くの技術が存在するが、化学種（化学的な化学種、生物学的な化学種、または生化学的な化学種を含む）を特徴付けるため、化学種の構造的な局面を特徴付けるため、種々の化学種間の相互作用を特徴付けるためなどのための、多用途な単純で強力なさらなる技術についての必要性が当該分野に存在する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
（発明の要旨）
本発明は、化学種、化学種のコンフォメーション的な局面、化学種間の相互作用などの特徴づけに関する種々の技術を提供する。広範な化学種としては、化学種（例えば、低分子）、タンパク質のような生物学的化学種などが挙げられ、これらは本発明に従って使用され得る（すなわち、本発明に関連して利点を実現し得る）。１つの局面において、本発明は、化学種を特徴付ける方法に関する。１つの実施形態において、この方法は、第１の系において、少なくとも１つの化学種と第１の相互作用成分との間、およびこれらの化学種とさらなる相互作用成分との間の相互作用の相対的指標を決定する工程であって、この第１の系において、第１の相互作用成分および第２の相互作用成分の各々が、これらの化学種と相互作用し得る、工程を包含する。第２の系において、決定段階はこれらの化学種を用いて繰り返され、第２の系が、少なくとも１つの異なる相互作用成分を含む。この方法はまた、異なる系におけるこれらの化学種と相互作用成分との相互作用の相対的指標から、これらの化学種の特徴を示す相互作用サインを解釈する工程を包含する。この特徴は、上記化学種の分子アイデンティティー、上記化学種のコンフォメーション的特徴、上記化学種と少なくとも１つのさらなる化学種との間の相互作用の特徴、および／または他の特徴であり得る。相互作用成分は、その構成成分に加えて、化学種（例えば、処方物賦形剤、シャペロンタンパク質など）とさらに相互作用し得る他の分子を含み得る。
【００１７】
別の実施形態において、この方法は、化学種を提供する工程、第１の相互作用成分および少なくとも１つのさらなる相互作用成分を、この化学種と接触させる工程を包含する。これらの成分は、この化学種が各相互作用成分と相互作用し得るように選択される。これらの化学種および相互作用成分は系を形成する。さらに、この方法は、化学種と各相互作用成分との間の相互作用の相対的指標を決定する工程、およびこれら化学種と第１の相互作用成分との間の相互作用の相対的指標ならびにこれらの化学種と第２の相互作用成分との間の相互作用の相対的指標の比を規定する係数を計算する工程を包含する。
【００１８】
別の局面において、本発明は、１つより多い化学種の構造状態を特徴付ける方法に関する。この方法は、第１の化学種のサインを決定する工程、少なくとも１つの第２の化学種のサインを決定する工程、第１の化学種のサインとさらなる種のサインとを比較する工程、ならびに第１の化学種とさらなる化学種との間の分散を記録する工程を包含する。
【００１９】
別の局面において、本発明は、結合パートナーに結合される生体分子の目的の生物学的活性のレベルを予測するための方法に関する。一般的に、本方法は、目的の生物学的活性の参照レベルが既知である、他の結合パートナーに結合される生体分子の参照サインを得る工程、実験的結合パートナーに結合される生体分子のサインを得る工程、実験的な結合パートナーに結合される場合の生体分子のサインと初期の参照サインからのデータとを比較する工程、本発明の実施において誘導された任意の関係の使用を含む工程、およびこの実験的結合パートナーの生物学的活性を予測する工程を包含する。
【００２０】
別の局面において、本発明は、変化したサインを生成する方法に関する。この方法は、サインを決定する工程、および数学的技術および／または視覚的技術を使用してサインを表示する工程を包含する。この方法はさらに、サインを比較する工程を包含する。特定の局面において、この比較は、サイン間の数学的に記載された距離としての、サイン間の差異を表す工程を包含する。
【００２１】
別の局面において、本発明は、生体分子の第１および第２の分配係数を決定するための方法に関する。本発明のこの局面は、第１の水性分配系を提供する工程、少なくとも１つの第２の水性分配系を提供する工程、ならびに特徴付けされるべき分子を第１の系およびさらなる系と接触させ、この相の分離を可能にする工程を包含する。この方法はさらに、第１の系およびさらなる系において分離された相における生体分子の濃度および／または相対濃度を定量化する工程、ならびに分配係数（例えば、第１の系およびさらなる系について、分離された相に存在する生体分子の比）を決定する工程を包含する。この方法はさらに、この生体分子に特異的な分配係数のセットを用いて、サインを解釈する工程を包含する。
【００２２】
別の局面において、本発明は、化学種の第１および第２の分配係数を決定するための方法に関する。本方法のこの局面は、第１の水性分配系を提供する工程、特徴付けされるべきこれらの化学種と、第１の系およびさらなる系とを接触させる工程、これらの相の分配を可能にする工程、第１の系およびさらなる系において、少なくとも１つの分離された相における化学種濃度および／または相対濃度を定量化する工程、ならびに第１の系およびさらなる系において、少なくとも１つの分離された相に存在する化学種の濃度を使用してサインを解釈する工程を包含する。
【００２３】
別の局面において、本発明は、サインと参照サインとを比較するための装置に関する。この装置は、参照データベースを形成する化学種または化学種の群のサインおよびアイデンティティーを記録するメモリ、ならびに実行可能な指示書を備え得る。この装置は、指示を実行して、候補化学種についてのサインを受信し、候補化学種が参照データベースにある化学種に類似のサインを有するか否かを決定し、そしてその判定結果を出力するプロセッサを備える。
【００２４】
別の局面において、本発明は、デジタルコードされたサインデータを含むコンピューターで読み取り可能な記録媒体に関する。このデジタルコードされたサインデータは、生体分子のアイデンティティーおよびサインを含む。
【００２５】
別の局面において、本発明は、参照サインの貯蔵部（ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）およびソフトフェアに関連する。参照サインの貯蔵部における参照サイン値は、相関を示す参照範囲の値を有し得る。このソフトウェアは、実験的サインを作製し、各対象セットの値と参照サインの値とを比較する実験対象セットの値を受け取るように構成され得、ここで、この参照サインは、目的の活性または機能に相関され、そして参照値の参照範囲の内外にある実験対象値の比率を決定し、それにより、実験対象への機能を割り当てるか、割り当てない。
【００２６】
本発明の別の局面において、結合パートナーに結合した生体分子の構造状態を使用して、構造状態の生物学的に関連する局面を予測し得る。構造状態の生物学的に関連する局面の予測としては、結合パートナーに結合した他の生体分子の構造状態の考慮および生物的に関連する影響を誘導する際の他の生体分子の構造状態の役割が挙げられ得る。
【００２７】
１つの局面において、本発明は、生体分子または生体分子の混合物の構造状態を特徴付けるための方法に関する。生体分子は、単離され得るか、または他の化学種との溶液中にあり得る。生体分子は、他の化学種との非共有結合的相互作用によって媒介される直接接触状態にあり得る。
【００２８】
生体分子の特徴付けは、参照状態との比較を含み得る。この特徴付けは、参照状態にある生体分子の構造と、結合パートナーと結合した場合の構造、分解した場合の構造、および構造状態がより密接に関連する生体分子の混合物から生じる平均的な構造状態を表す場合の構造との比較を含み得る。
【００２９】
幾つかの場合において、本願の主題は、相互関連する産物、特定の問題に対する代替の解決法、および／または単一のシステムもしくは物品の複数の異なる用途に関与し得る。
【００３０】
本発明の他の利点、特徴、および用途は、添付の図面（これらは、概略的であり、スケールに対して描写されることを意図しない）と組み合わせて考慮する場合に、本発明の非限定的な実施形態の以下の詳細な説明から明らかとなる。図面において、種々の図面において図示される各同一またはほぼ同一の構成要素は、代表的に、単一の数字によって表される。明確性の目的のために、全ての構成要素が、全ての図面において表示されてはおらず、当業者が本発明を理解するのに例示することが不要な、本発明の各実施形態の全ての構成要素も、示されていない。本願明細書および参考として援用される書類が、矛盾する開示を含む場合、本願明細書が制御する。
【００３１】
（発明の詳細な説明）
本発明は、分子および／または分子間の相互作用についての情報を決定するための技術に関する。より詳細には、本発明は、例えば、水性多相分配を介して得られたサインの開発および使用に関する。このサインは、生体分子または生体分子と相互作用する分子の構造的および機能的特徴付けを反映する。これらのサインは、構造と機能との間の関係を確立することを目的としてか、または活性もしくは状態に対する機能的関係および構造的関係を確立することを目的として使用され得る。
【００３２】
本発明の方法は、生体分子または生体分子と相互作用する分子の構造における変化を、検出、分類、および／または予測するために有用であり得る。これらの変化は、主に配列改変によって、化学物質、熱、または他の変性機構を介する生体分子の分解によって、他の生体分子との相互作用によって、あるいは低分子量の化合物との相互作用によって誘導されるコンフォメーションまたは構造における変化であり得る。
【００３３】
本発明の方法は、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、核酸、ポリヌクレオチド、脂質、ステロール、およびそれらの混合物または誘導体を含むがこれらに限定されない生物学的材料を分析および／または特徴付けるために用いられ得る。これらの生物学的材料は、生物薬学的薬物組成物、薬学的薬物処方物、天然供給源からの抽出物、コンビナトリアル化学的技法または生化学的技法およびそれらの組合せにより生成された分子のコレクションの形態で見出され得ることが当業者によって認識される。分析および／または特徴付けられるべき挙動の例は、レセプターのコンフォメーションの変化の検出および分類、生体分子間の相互作用の検出、それらの改変および組合せに起因する構造的変化を含むがこれらに制限されるわけではない。
【００３４】
本発明のこれらの局面の適用により集められた情報は、可能な薬物候補をスクリーニングするため、毒物学関心事に関して化合物を特徴付けるため、薬物安全性研究のため、品質管理のため、および基礎研究を含む関連する目的のために有用である。
【００３５】
本発明は、特定の方法、特定の溶液、または特定のデバイスに制限されず、従って、勿論変動し得ることが理解されるべきである。本明細書で用いられる用語は、特定の実施形態を記載する目的に過ぎず、そして制限的であることは意図されないこともまた理解されるべきである。本明細書および請求項を通じ、用語の数になされる参照は、以下の意味を有すると規定される：
本明細書および添付の請求項で用いられるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が他であることを明瞭に指示しなければ複数の参照物を含む。従って、例えば、「生体分子」への参照は、生体分子の混合物を含み得る、などである。
【００３６】
本明細書において、範囲は、「約」１つの特定の値〜および／または「約」別の特定の値までとして表現され得る。このような範囲で表現されるとき、別の実施形態は、１つの特定の値〜および／または他の特定の数値を含む。同様に、値が、先行詞「約」の使用により、概数として表現されるとき、特定の値が別の実施形態を形成することが理解される。範囲の各々の終点は、他の終点に関連して、および他の終点とは独立しての両方の意味であることがさらに理解されるべきである。
【００３７】
「必要に応じて」または「随意に」は、次に記載される事象または状況が、生じるか、または生じなくても良く、しかも、この記載が、上記事象または状況が生じる例、およびそれが生じない例を含むことを意味する。
【００３８】
「分析物」、「分析物分子」または「分析物化学種」は、分子、代表的には、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのような、その存在、量および／または同一性が決定されるべき高分子をいう。
【００３９】
本明細書で用いられるとき「抗体」は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を意味する。さらに、用語「抗体」は、インタクトな免疫グロブリン分子、キメラ免疫グロブリン分子、またはＦａｂもしくはＦ（ａｂ’）２フラグメントを意味する。このような抗体および抗体フラグメントは、当該分野で周知の技法により産生され得、これには、本明細書に参考として援用される、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９））およびＫｏｈｌｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５〜９７（１９７５））および米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号および同第５，６２５，１２６号に記載されるものが含まれる。それ相応に、本明細書で規定されるとき、抗体はまた、連結されたＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む単鎖抗体（ＳｃＦｖ）を含み、そしてこれは、抗体のネイティブのイディオタイプのコンフォメーションおよび特異的結合活性を保持している。このような単鎖抗体は、当該分野で周知であり、そして標準的な方法によって産生され得る（例えば、Ａｌｖａｒｅｚら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：２２９〜２４２（１９９７）を参照のこと）。本発明の抗体は、任意のアイソタイプＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭであり得る。
【００４０】
本明細書で用いられるとき「水性」は、溶媒和する物質が所定の親水性特徴を有する溶媒／溶質系の特徴的性質をいう。水性溶媒／溶質系の例は、水または水を含む組成物が優勢な溶媒であるものを含む。
【００４１】
本明細書で用いられるとき「水性多相系」は、分析物化学種が存在し得、そして本明細書に記載の方法に従って分析物化学種の構造状態を特徴付けるために用いられ得る１つ以上の水相から構成される水系をいう。例えば、これは、２つ、３つ、またはそれ以上の混和不能の相に平衡して分離し得る水系を含む。水性多相系は、当該分野で公知であり、そして、この語句は、本明細書で用いられるとき、当該分野で受容された意味と不一致であることは意味しない。
【００４２】
「相互作用する成分」は、水性多相系の相のような、化学種と相互作用し、そしてその化学種についての情報（例えば、この化学種についての親和性）を提供し得る成分を意味する。化学種に曝される、複数の相互作用する成分は、各成分とこれら化学種間の「相対的尺度の相互作用」を提供し得る系を規定し得る。相互作用する成分は、水性または非水性であり得、ポリマー性、有機性（例えば、タンパク質、小分子など）、無機性（例えば、塩）など、または任意の組合せであり得る。相互作用する成分のセットは、本明細書に記載の方法に従って、分析物化学種のような化学種の構造状態を特徴付けるために用いられる任意の実験方法を規定すること、および一部規定することで有用な系を形成し得る。代表的には、相互作用する成分の系は、化学種間および少なくとも２つの相互作用する成分間の相対的相互作用を測定し得る。水性多相系は、相互作用する成分の系の化学種であり、そして「水性系」または「水性多相系」が本明細書で用いられる場合、これは、例示のみであって、そして相互作用する成分の任意の適切な系が用いられ得ることが理解されるべきである。
【００４３】
本明細書で用いられるとき、水性２相系および水性多相系の両方はまた、水性溶液または懸濁液のみを含むような系に類似の系をいう。例えば、水性２相系は、特徴上、液体ではない１つ以上の相にある非水性成分を含み得る。この局面では、水性相系はまた、別の媒体に対し１つの媒体への生体分子の異なる親和性に依存する関連技法をいい、ここで、１つの媒体、および必要に応じて別の媒体間の生体分子の輸送が水性環境で生じる。このような「不均一相システム」の例は、当業者に公知であるような、液体−液体分配クロマトグラフィーのためのＨＰＬＣカラムまたはシステムを含むがこれに制限されるわけではない。
【００４４】
本明細書で用いられる「分配係数」は、２つの混合不可能な相において平衡にある溶質の濃度間の比率によって規定される係数をいう。例えば、２相系中の分析物の分配係数（Ｋ）は、第１の相中の分析物の濃度の第２の相中のそれに対する比率として規定される。多相系については、複数の分配係数があり、ここで、各分配係数は、第１の選択された相と第２の選択された相における分析物の比率を規定する。任意の多相系における分配係数の総数は、相の総数マイナス１に等しいことが認識される。
【００４５】
不均一相系については、本明細書で用いられる「見かけの分配係数」は、相間の相対的分配に関連している代替の技法から得られる情報を記載する係数をいう。例えば、ＨＰＬＣカラムで不均一２相系が用いられる場合、この「見かけの分配係数」は、分析物に対する保持時間であり得る。当業者によって、分析物の保持時間は、第１の移動相および第２の固定相間の分析物の平均分配を反映することが認識される。また、分析物のその他の同様に決定可能な性質もまた、分析物の物理的性質における差異を定量するために用いられ得、そしてそれ故、見かけの分配係数としての使用に適切であることが認識される。
【００４６】
本明細書で用いられるとき「結合する」は、生体分子とその結合性パートナー間の周知のレセプター／リガンド結合およびその他のランダムでない会合を意味する。本明細書で用いられるとき「特異的に結合する」は、特定の単数の生体分子また複数の生体分子の他の任意の生体分子と実質的に交差反応しない結合性パートナーまたはその他のリガンドを記載する。
【００４７】
一般に、互いに優先的に結合する分子は、「特異的結合性対」と称される。このような対は、抗体およびその抗原、レクチンおよびそれが結合する炭水化物、酵素およびその基質、ならびにホルモンおよびその細胞レセプターを含むがこれらに制限されるわけではない。一般的に用いられるとき、用語「レセプター」および「リガンド」は、結合性分子の対を識別するために用いられる。通常、用語「レセプター」は、その結合活性のために既知であるクラスの分子、例えば、抗体である、特異的結合性対のメンバーに割り当てられる。用語「レセプター」はまた、例えば、レクチン−炭水化物対の場合、レクチンに対し、サイズがより大きい対のメンバーについて優先的に与えられる。しかし、当業者によって、レセプターおよびリガンドの識別が幾分任意的であり、そして用語「リガンド」が、そうでなければ「レセプター」と呼ばれるであろう分子をいうために用いられ得ることが認識される。用語「抗リガンド」は、しばしば、「レセプター」の代わりに用いられる。
【００４８】
本明細書で用いられるとき「生体分子」は：ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、タンパク質複合体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸複合体、糖、オリゴ糖、炭水化物、脂質およびそれらの組合せ、誘導体および模倣物を意味する。
【００４９】
本明細書で用いられる「検出可能」は、種の能力および／または区別され得る種の性質をいう。種を区別可能にする１つの方法は、この第１の種と結合または相互作用し、検出可能な標識を含むさらなる種を提供することである。検出可能な標識の例は、核酸標識、化学的に反応性の標識、蛍光標識、酵素標識および放射活性標識を含むがこれらに限定されるわけではない。
【００５０】
本明細書で用いられる「模倣物」は、その構造が抗体または抗原の結合性領域に基づくか、または由来する化学的化合物、または有機分子、または任意のその他の模倣物を含む。例えば、ペプチドの結合性ループのような結合領域の構造を模倣する推定された化学的構造をモデルし得る。このようなモデリングは、標準的な方法（例えば、Ｚｈａｏら、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：１１３１〜１１３７（１９９５）を参照のこと）を用いて実施され得る。このような方法によって識別され模倣物は、本明細書に記載の結合アッセイに従って目的の当初識別された分子と同じ結合機能を有するとしてさらに特徴付けられ得る。
【００５１】
あるいは、模倣物はまた、ペプチドがそうであるのとほとんど同じ様式でコンビナトリアル化学的ライブラリーから単離され得る。（Ｏｓｔｒｅｓｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１１３８〜１１１４２（１９９４）；Ｄｏｒｎｅｒら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４：７０９〜７１５（１９９６）；Ｅｉｃｈｌｅｒら、Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．１５：４８１〜９６（１９９５）；Ｂｌｏｎｄｅｌｌｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１３：１４１〜１４７（１９９６）；Ｐｅｒｅｚ−Ｐａｙａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４１２０〜６（１９９６））。
【００５２】
「固体支持体」は、本明細書で使用される場合、本発明の化学種々の成分が、物理的に結合され、それにより、本発明の成分が固定化される、十分に理解されている固体材料を意味する。用語「固体支持体」は、本明細書で使用される場合、非液体基板を意味する。固体支持体は、メンブレン、シート、ゲル、ガラス、プラスチックまたは金属であり得るが、これらに限定されない。本発明の固定された成分は、共有結合および／または非共有結合的誘引力（例えば、水素結合相互作用、疎水性誘引力およびイオン力）によって固体支持体に結合され得る。
【００５３】
「異種水性系」は、本明細書で使用される場合、水性成分またはほぼ水性成分に加えて、ほぼ非水性成分もまた存在する系をいう。非水性成分は、分析物を固定化または、分析物と相互作用し得る。非水性成分の例としては、固体支持体が挙げられ得る。
【００５４】
「構造」、「構造状態」または「コンフォメーション」は全て、本明細書で使用される場合、その用語の一般的に理解されている意味をいう。最も具体的には、それらが、生体分子（例えば、タンパク質および核酸）だけでなく、薬理学的に活性な低分子に適用されるような、用語の意味である。異なる状況において、これらの用語の意味は、当業者に理解されるように変化する。例えば、用語；一次、二次、三次または四次をタンパク質構造について使用するときは、当該分野において受容可能な意味を有し、これらは、核酸構造をいうために使用される場合のそれらの意味とは幾つかの点において異なる（ＣａｎｔｏｒおよびＳｃｈｉｍｍｅｌ，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｉ−ＩＩＩ部を参照のこと）。他に特定されない限り、これらの用語の意味は、当業者によって一般的に受容可能な意味である。
【００５５】
生体分子の構造状態は、詳細についてのレベルがいかなるものであろうとも、以下の多くの異なる因子によって影響され得る；生体分子の化学組成の変化（例えば、タンパク質におけるアミノ酸の付加、欠失または置換、化学薬剤による共有結合改変または化学分解もしくは熱分解による切断）、および他の生体分子またはリガンドとの相互作用が挙げられるが、これらに限定されない。異なる構造状態の評価を主要な方法の１つとして使用して、異なる生体分子の潜在的な有効性を決定する。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「サイン」とは、所望の情報の特定の表現をいい、これは、異なる相互作用的成分との実験から得られる、上記の相互作用の相対的測定のセットとして規定され得る。代表的に、サインは、より詳細な情報を得ることが困難である場合、またはこのような情報を完全に記載してそれを利用する必要がない場合に、より詳細な情報の代わりに使用される。例えば、個々の人々の指紋を採取することは、個人を（合理的な確実性にまで）特有に同定するための十分に認識された技術であり、他の表現（例えば、遺伝子構造）を使用して個人を記載するか、または徹底的な身体記述および他の情報を使用する代わりに、簡便に得られる情報セットかつ簡便に密な情報セットを提供する。
【００５７】
同様に、識別を提供するのに限定されているのみであるが、十分な記述を開示するサインは、市場分析を蓄積するためにレーダー信号同定と同等の多様性のある適用において慣用的に使用される。科学において、分光学的技術は、例えば、近赤外スペクトル（特定の化合物を同定するための迅速かつ簡便な方法を提供する様式で、実質的に処理される）を使用して、化学成分のサインベースの識別を利用する。
【００５８】
上記の示された例の各々は、サインにとって必要な有用であるべきものの量を示す。第１に、それは、表現を試みる基礎的な情報に対応するべきである。第２に、それは、一般的に、それが誘導される基礎的な情報より入手が簡単である。第３に、それは、一般的に、基礎的情報を操作および理解するより簡単である。これらの要求およびそれらが生体分子を特徴付ける正確な方法にいかに匹敵するかを考慮することは、生体分子についてのサインシステムを開発することが所望される理由を示す。
【００５９】
「相互作用サイン」は、本明細書で使用される場合、化学種と少なくとも１つの他の化学種との相互作用のサイン特性、また、必要に応じて、化学種のいずれかまたはその両方と、別の化学種または化学種が存在するかそして／または化学種が相互作用する環境（媒体）との相互作用の特性を意味する。例えば、相互作用サインは、化学種と多相系のうちの１つの相との相互作用、および化学種と多相系のうちの別の相との相互作用、ならびに化学種と２つ（以上）の相との相対的相互作用の全体的な相互作用サイン特性を特徴付け得る。さらなる例としては、相互作用サインは、化学種と多相系の任意のメンバーとの相互作用の特性であり得、そして相互作用サインは、化学種々の化学種と多相系の化学種々の相との間の相互作用について存在し得る。
【００６０】
可撓性生体分子のコンフォメーション情報は、その核においてデータの非常に複雑なセットを形成する。生体分子を構成する全ての構成原子の識別および座標の両方を示す完全表示３Ｄ構造は、同時に入手するには大きく困難であり、しばしばほぼ理解不能である。従って、本発明の状況において、実際のコンフォメーションの詳細な３Ｄ表示は、サインは考慮されないが、基礎的な情報は考慮される。時に、例えば、レセプターの活性部位と相互作用するリガンドの構造を最適化するために、コンフォメーション自体の詳細を入手することが、必要である。しかし、多くの、おそらく、最も、他の適用について、このような詳細な情報は、必要でも所望でもない。高度に詳細な３Ｄ構造情報が、必要でない適用において、必要とされるのは、上記の３つの属性に同意するコンパクトなサインのみである。
【００６１】
サインの所望の属性に従って、情報セットは、多数の数学的表現によって、視覚表現によってまたは当業者に公知の他の手段によって、記載され得る。サインがどのように表現されるかの特定の選択は、主に、サインを構築するために使用される代理情報を得るために使用される特定の技術、およびサインが最終的に使用される予定の様式に依存する。当業者によって理解されるように、サインまたはサインのセットの確立における使用に適切である様式で、情報を要約および伝達するための多数の技術が開発されている。
【００６２】
有用なサインを得るのに適切な数学的技術は、多数ある。これらとしては、線形写像（ｍａｐｐｉｎｇ）または非線形写像（例えば、人工ニューラルネットワークおよび部分最小二乗回帰）、行列（ｍａｔｒｉｘ）回転および保護（例えば、主成分分析および特異値分解）、基礎物理的プロセスが公知である場合、基礎物理的プロセスを反映する異なる等式を使用する直接モデリングが挙げられるが、これらに限定されない。特に、視覚表現が、観察者に容易に伝達される形状および色を用いて、所望の情報（例えば、個々のセットの間の差異）を容易に伝達する場合、時に、視覚表現は、優れたサインを形成する。
【００６３】
サイン生成において使用される情報セットは、２つ以上の試験条件または実験条件からのデータを含み得る。好ましい実施形態において、この方法は、２、３、４、５、６、８、１０または２０より多い異なるセットの条件を使用する。認識されるように、測定値を得るのに使用される実際の測定または技術は、特定の技術に限定されない。例として本明細書に記載されるように、データは、分配係数または見かけの分配係数を含み得る。それゆえに、他の型のデータおよびデータを得るための手段もまた、当業者によって認識される。
【００６４】
例えば、水性二相系分配を使用して、サインを生成する情報を収集し得る。米国特許第６，１３６，９６０号（その全体が本明細書で援用される）に記載される水性二相系分配は、情報がサインを生成するために得られ得る１つの方法である。水性二相系における生体ポリマーの分配は、その三次元構造および型および溶媒に曝される化学基の局所構造に依存する。幾つかの効果によって（例えば、リガンド結合によって、または構造分解によって）誘導されるレセプターの３Ｄ構造の変化はまた、生体分子における溶媒接触可能な化学基の局所構造または溶媒に接触可能な基の局所構造ならびに型の両方を変化させる。これらの変化の１つの結果は、生体分子またはリガンド結合レセプターの分配挙動の変化である。結果として、分析物の分配係数をモニタリングすることによって、分配係数がすでに既知である構造状態の変化を検出することが、可能である。
【００６５】
同様に、このような変化は、溶媒接触可能基のトポグラフィーおよび／または型に対して基礎的な依存性を有する他の方法を使用して検出され得る。このような方法の例としては、カラム液−液分配クロマトグラフィー（ＬＬＣＰ）、異種二相系または多相異種系が挙げられるが、これらに限定されない。これらの他の場合において、第１の相と第２の相との間の平均的な分配の相対的変化を表す見かけの分配係数が、生成され得る。例えば、ＬＬＰＣにおいて、レセプターの保持容量は、見かけの分配係数として使用され得る。
【００６６】
方法が、相対的な分配（それが、分配係数または見かけの分配係数であるか）を反映する係数を決定する際のものである場合、単一の記述子が得られる。これは、方法に対する使用の多大な簡易性および容易性を与えるが、しかし、上記のように、単一の記述子は、サインを提供するには十分でない。多くの異なる水性二相系は全て、化学種々の化学基（例えば、荷電基および非極性基）に対するそれらの感度において異なるが、分配係数の変化という形態での、２つのコンフォメーション状態の間の検出可能な差異の存在は、非常に多くの異なる機構から生じ得る。このように、単一の分配係数の同様の変化は、非常に異なるコンフォメーション変化を反映し得る。あるいは、各分配係数は、互いに補完する複数の構造変化を反映し得る。単一の、特定の水性二相系において、これらの補完変化は、互いに分離され得ない。結果として、観測された分配係数の基礎となる構造データおよびコンフォメーションデータのごく僅かな部分のみが、単一の条件下にある生体分子の観測により識別され得る。結果として、単一の分配係数は、サインを提供しないが、異なる条件下で得られた他の分配係数と組み合わされて、サインを提供し得る。あるいは、見かけの分配係数を組み合わせて、生体分子についてのサインを提供し得る。
【００６７】
水性二相系が、異なる水溶性ポリマーの水性混合物または単一のポリマーと特異的な塩との水性混合物中に生じる。２つの特定のポリマー（例えば、デキストラン（Ｄｅｘ）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、または単一の特定のポリマーおよび特定の無機塩（例えば、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）および硫酸ナトリウム）が、特定の濃度を超えて水中で混合される場合、この混合物は、２つの混合不可能な水相に分離する。２つの相を分離する別個の界面の境界があり、１つの相は、１つのポリマーを多量に含み、そしてもう１つの相は、もう１つのポリマーまたは無機塩を多量に含む。両方の相における水性溶媒が、生物学的産物に適切な媒体を提供する。二相系は、異なる化学成分を用いることによって、複数の相系に一般化され得、そして多数の相を持つ水系は、文献中に述べられてきた。
【００６８】
溶質が、このような二相系に導入される場合、溶質は、２つの相の間に分散する。溶質の分配は、平衡状態で２つの混合不可能な相における溶質濃度間の比として定義される分配係数Ｋによって特徴付けられる。水性ポリマー系における相分離が、水性構造における２つのポリマー（または単一のポリマーおよび塩）の異なる効果から生じることが、以前に示された（Ｂ．Ｚａｖｌａｖｓｋｙ，Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｔｗｏ−Ｐｈａｓｅ  Ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ：Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９５）。水構造に対する異なる効果の結果として、共存する相における水性媒体の溶媒の特徴は、お互いに異なる。相の間の違いが、誘電性測定、ソルバトクロミック測定、電位差測定、分配測定によって実証され得る。
【００６９】
水性の二相系における溶質分配の基本的な法則は、水−有機溶媒系におけるものと類似であることが示された（Ｚａｖｌａｖｓｋｙ）。しかし、水性ポリマー系における二相の特徴に存在する違いは、水−有機溶媒系に観察される違いに比べて非常に小さく、同様に同じ（水性の）性質の一対の溶媒について予期されるはずである。重要なことに、水性の二相系または複数の相の系における相の溶媒の特徴の間の小さな差は、特定の構造的特徴が存在する場合に起こる観察される分配を増幅するように改変され得る。
【００７０】
各々の相のポリマーおよび塩組成が、水性の二相系の全てのポリマーおよび塩組成に依存することが知られている。今度は、所定の相のポリマーおよび塩組成が、この相の水性媒体の溶媒の特徴を支配する。これらの特徴としては、誘電特性、溶媒極性、溶質との疎水性水和相互作用に関与する溶媒能、溶質との静電的相互作用に関与する溶媒能、ならびに溶媒の水素結合酸度および水素結合塩基度が挙げられるが、これらに限定されない。共存する相における水性媒体のこれらおよび他の溶媒の特徴全てが、水性の二相系のポリマーおよび塩組成の選択により操作され得る。この媒体の溶媒のこれらの特徴は、レセプター中の溶媒の接近可能な化学基の特定の型に対する所定の水性の二相系の感度を支配する。２つの異なるタンパク質における溶媒接近可能基の感度、型および形態が、例えば、所定の水性の二相系においてタンパク質が分離する可能性を決定する。
【００７１】
現在、この分野は、系のポリマーおよび塩組成を、生体分子における異なる溶媒接近可能化学基に対する二相における水性媒体の感度と関連付け得る説を欠いている。この感度は、例えば、微妙な差異が、化学的化合物に密接に関する結合によって誘導されるレセプターのコンフォメーション変化の間に検出される場合に、最も重要である。しかし、各々の生体分子をスクリーニングする広範な異なる試験的条件または実験的条件を利用することにより、水性の二相分配または任意の他の関連技術もしくは置換可能な技術の基礎をなす理論を完全に理解する必要なしに、サインを確かに入手し得る。
【００７２】
また、サインの概念の使用により、生体分子の特徴付けにおける他の問題を克服し得る。特に、密接に関連したリガンドによって、レセプターにおいて、構造が不均一なレセプターの集団において、または関連した生体分子の混合物の構造において誘導されるコンフォメーション変化の評価は、達成するのが非常に困難である。確かに達成することが難しい理由は、生体分子の集団と任意の所定の二相系について存在する二つの溶媒との間の分子相互作用における正味の変化がないことが、まれでないことである。その結果、特定の状況下で誘導され得る全てのコンフォメーション変化に対する必要な感度を提供し得る単一の二相系を設計することは困難である。
【００７３】
生体分子の異なるコンフォメーション状態に関する情報が、生物学的活性を評価するのに非常に有用であり得る。例えば、密接に関連しているがなお不均一の、生体分子の混合物は、レセプターおよびリガンドの集団について上記の混合物と類似している特徴を有し得、すなわち、１つの混合物中に存在する個体の化学種が、次の混合物中に存在するものに対して、お互い非常に異なり得、しかし単純なアッセイを使用する場合、決して検出されない。
【００７４】
しかし、生体分子のこれらの混合物に対するサインの概念の適用、およびその結果を、参照の状態の結果（例えば、直接測定された生物学的活性レベルに対応するもの）と比較することにより、単純なアッセイの組み合わせを使用して、異なる不均一の成分のレベルをモニタリングし得る。これらのサインを使用して、調製物の活性レベルのモニタリングさえし得る。
【００７５】
従って、サインは、生物工学製品の製造過程中のモニタリングのために、およびワクチンのような複数の成分の生物薬剤の品質制御のために用い得る。これらはまた、生産のロット間変動、製品の処方の間に使用される賦形剤の構造的効果などを比較するために使用される。さらに、サインは、疾患状態をモニタリングするための補助として使用され得、疾患の診断および処置への応答をモニタリングすることを包含する。さらに、サインは、病理学的分析における組織および体液の非形態的評価に対して使用され得る。
【００７６】
サインはまた、リガンドの結合によって誘導される生物学的レセプターにおけるコンフォメーション変化についての情報を得るのに使用され得る。同様に、サインは、お互いに結合する結合パートナーのコンフォメーション効果を同定し、特徴付けするのに用い得る。
【００７７】
サインの概念の使用により得られるコンフォメーション情報は、創薬のための高スループットスクリーニングを改善するために使用し得る。例えば、可能性のある標的タンパク質に結合する５０の異なる化合物が得られる場合、５０の異なる化合物の各々についてタンパク質のサインにおける変化が迅速に見出され得る。このさらなる情報が、さらなる分析および比較を可能にし得る。この実施例において、５０の化合物の内１つが非常に独特のサインを有する場合、この化合物は、他と違って独特な様式で標的と相互作用する化合物であるとして同定され得る。この例の別のバリエーションにおいて、いくつかの薬物が既に、それぞれの生物学的効果および本発明の方法を用いて決定されるそれらのサインと一緒に入手可能である。この場合、公知の薬物と類似の好ましい生物学的効果のプロフィールを有し、しかし例えば、軽減された副作用を有する、同じ生物学的レセプターと相互作用する新しい化合物が、捜し求められる。本実施例において、同じ標的と結合する５０の化合物のサインが、公知の薬物に対応するサインと迅速に比較され得、そのサインが好ましい薬物と有望に対応する化合物のみを、さらなる医薬開発に進展させる。さらに、一連のプロフィールが、異なる組織において同じ化合物と結合する同じレセプターについて得られ得る。例えば、エストロゲンレセプターと結合したエストロゲンは、代表的に、異なる体の組織（例えば、胸、骨など）において異なる程度の生物学的活性を示す。従って、プロフィールは、複数の生物学的活性レベル（数学的ベクトルとして表され得る）に現在対応するエストロゲンレセプターに結合する化合物のサインから成る。さらに、プロフィールの概念はまた、異なる生物学的標的に（例えば、同じ化合物のレセプターに、およびＣＹＰ−４５０のような特定の肝臓酵素に）結合した同じ化合物のサインを含み得る。従って、このプロフィールが、行列の値として数学的に表され、例えば、生物学的活性だけでなく、化合物の可能性のある肝臓毒性を特徴付けるのに有用である。このような情報は、当業者によって理解されるように、有用である。
【００７８】
同様に、サインの用途はタンパク質−タンパク質相互作用の発見、生物薬学の薬剤の処方物の賦形剤の分析、ならびに生物学的薬剤および生物薬学の薬剤の製造を改善し得る。生体分子における作用または薬剤の効果をモニタリングし、かつ特徴付けする両方に使用され得るので改善として認識される。その使用により得られる情報はまた、毒物学、法医学、薬物安全性研究、および当業者によって理解されるような他の関連するバイオ医薬品の分野に関するプロセスを改善するために使用し得る。
【００７９】
本発明によって提供される１つの方法は、生体分子の構造的状態または構造的状態における変化を特徴付ける以前の方法の改善である。特に、この方法は、目的の生物学的分子またはプロセスを反映し、目的の生物学的分子またはプロセスを他の参照の生物学的分子またはプロセスと比較するために用い得る、サインを得る手段を提供する。
【００８０】
各々の実験について用いられる生体分子の量は、１、２、３、５、１０、１５、２０、３０、５０、１００、２５０、４００、６００および８００ｐｇ、ｎｇ、またはμｇより多量であり得る。各々の実験について用いられる生体分子の量は、２、３、５、１０、１５、２０、３０、５０、１００、２５０、４００、６００、８００および１０００μｇ、ｎｇ、またはｐｇより少量であり得る。本実験の容量は、１、２、３、５、１０、１５、２０、３０、５０、１００、２５０、４００、６００および８００ｐｌ、ｎｌ、μｌまたはｍｌより大きくあり得る。各々の実験についての容量は、２、３、５、１０、１５、２０、３０、５０、１００、２５０、４００、６００、８００または１０００ｐｌ、ｎｌ、μｌまたはｍｌより小さくあり得る。
【００８１】
利用されるタンパク質または溶液成分の特定の容量および量が、生体分子、その濃度、および所望の実験プロトコルによる制限なしに変わることは当業者に理解される。
【００８２】
水性ポリマー二相系における分配は、結合パートナーへの結合により誘導されるレセプターにおける変化を検出するための高度に効率的な、多用途な、かつ費用効率の良い方法である。水性の二相系が、異なる水溶性ポリマー、または単一のポリマーと特定の塩の水性混合物において生じる。例えば、デキストランおよびポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）が、特定の濃度を超えて水中で混合されると、この混合物は、明らかな界面の境界によって分離した２つの混合不可能な水相に分離する。これらの２つの分離した相が、分離されたと言われる。１つの相において、この溶液は１つのポリマーを多量に含み、そして第２の相のこの境界の別の側において、溶液は別のポリマーを多量に含む。両方の相における水性溶媒は、タンパク質のような生物学的産物または他の生体分子に適切な媒体を提供する。
【００８３】
例えば、相形成ポリマーの化学的性質、構造、および分子量において反映されるような型の選択および改変ならびにポリマーの濃度を用いて、相の特徴を変え得る。加えて、相の組成がまた、無機塩および／または有機添加剤を加えることによって変化し得る。相の組成への変化が、相の特徴を変え得る。レセプターへの結合パートナーの結合を検出および／または特徴付けるために有用な水性の二相系の型の例としては、デキストラン／ＰＥＧ、デキストラン／ポリビニルピロリドン、ＰＥＧ／塩、およびポリビニルピロリドン／塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８４】
タンパク質、核酸または他のような生体分子はまた、このような系に置かれた場合、２つの相の間に分散する。２つの相の間の生体分子の分配は、全く単純である。いくつかの点において、これは化学の分野において通常であるように、抽出に類似する。例えば、相形成ポリマーが用いられる場合において、２つのポリマーの１つ以上を含む溶液および生体分子が、一緒に混合され、その結果、相形成ポリマーおよび生体分子の両方が、混合される。生じる溶液が、分離され、そして二相系が形成される。必要に応じて、遠心分離を用いて相の分離を高め得る。生体分子の分配様式が、多くの変数（例えば、ｐＨ、用いられるポリマー、用いられる塩、系の組成に関する他の因子および温度、容量などのような他の要素）により影響され得る。所望される効果についてのこれらの因子の最適化が、本開示と組み合わされて関連技術における当業者による慣用的実施により達成され得る。
【００８５】
生体分子の分配からのデータの評価は、分配係数（「Ｋ」）の使用を含み得、これは、平衡状態での２つの混合不可能な相において、生体分子の濃度間の比として定義される。例えば、タンパク質の分配係数Ｋは、二相系における、最初の相におけるタンパク質の、第２の相におけるタンパク質に対する比として定義される。複数の相系が形成される場合、任意の２つの相の間に規定され得る複数の独立した分配係数があり得る。質量平衡を考えると、独立した分配係数の数は、系中の相の数より１つ少ない。
【００８６】
所定のコンフォメーションの所定の生体分子についての分配系数Ｋは、二相系が供される、二相系の条件および組成が、一定に保たれる場合、一定であることが理解される。従って、可能性のある結合パートナーの添加の際にタンパク質について観察される分配系数Ｋに変化がある場合、これらの変化は、タンパク質結合パートナー複合体の形成により引き起こされるタンパク質構造における変化から生じると推定され得る。本明細書中で使用される場合、「Ｋ」は、以下で特に数学的に定義されるように用いられ、また、全ての場合において、定義によると、化学種と少なくとも２つの相互作用する成分との間の相互作用の相対的指標を表す任意の係数を含む。
【００８７】
タンパク質、またはタンパク質と別の分析されるべき化合物との組成の分配係数Ｋを決定するために、水中全ての成分（ポリマー１、例えば、デキストラン；ポリマー２、例えば、ＰＥＧ、ポリビニルピロリドン、塩など）の濃縮された貯蔵溶液が、別個に調製され得る。相ポリマー、塩、およびタンパク質混合物の貯蔵溶液が、系に所望の組成をもたらすために、適切な条件および量（例えば、約３．０〜約９．０のｐＨ、約４℃〜約６０℃の温度、０．００１ｍｏｌｅ／ｋｇ〜５ｍｏｌｅ／ｋｇの塩濃度）で混合され得、そして力強く振られ得る。次いで、系は平衡化（相を分離する）され得る。平衡が、溶液を静置したままにすることによって、達成され得るか、または遠心分離（約１０００〜４０００ｇ以上で２〜３０分の間）によって速められ得る。各々の安定した（分離された）相のアリコートが、上方の相および下方の相の両方から引き出され得る。生体分子の濃度が、上方の相および下方の相の両方について決定され得る。
【００８８】
異なるアッセイ方法が、各々の相の生体分子の濃度を決定するのに用いられ得る。これらのアッセイは、存在する生体分子のアイデンティティーおよび型に依存する。適切なアッセイの例としては、分光学的アッセイ、免疫化学アッセイ、化学的アッセイ、蛍光アッセイ、放射性物質アッセイ、酵素アッセイが挙げられるが、これらに限定されない。生体分子がペプチドまたはタンパク質である場合、一般的なペプチド検出またはタンパク質検出技術が、使用され得る。これらの技術は、直接の分光測光法（２８０ｎｍでの吸光度をモニタリングする）ならびにＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ  Ｇ−２５０もしくはフルオレスカミン、ｏ−フタルジアルデヒド、または他の染料および／または試薬との色素結合反応を含む。あるいは、タンパク質が抗体または抗原のいずれかである場合、免疫化学的アッセイがまた、用いられ得る。
【００８９】
次いで、各々の相の生体分子の濃度が、特定の系の条件下でサンプルの分配係数Ｋを決定するために用いられ得る。Ｋが、２つの濃度の比のみを反映するので、絶対値は典型的に必要とされない。このことが特定の分析手段を単純化するのを可能にし得る（例えば、較正がいくつかの場合において削除され得る）ことが理解される。
【００９０】
次いで、分配係数が、他のＫ値と比較され得る。例えば、ある化学種についてのＫ値は、異なる条件下のその化学種についてのＫ値と比較され得るか、ある化学種についてのＫ値は、他の化学種と混合される場合、その化学種についてのＫ値と比較され得るか、またはある化学種についての一連のＫ値は、他の一連のＫ値と比較され得る。
【００９１】
加えて、決まった組成の二相系における生体分子濃度が一定に保たれる場合、分配係数における変化が、分配係数値の変化としてではなく、所定の相（例えば、系の一番上の相）における生体分子濃度の変化として測定され得る。以下のいくつかの実施例に記載されるとおり、手順の種類は、系の各々の相の生体分子濃度の測定から分配係数値を決定するよりも、より費用、時間および労力の効率が良くあり得る。
【００９２】
しかし、上記のように、単一の二相系の分配係数は、多くの適用における生体分子の構造的状態の適切なサインの提示と考えられ得ない。単一の二相系を用いることは、例えば、結合したレセプターに対して遊離のレセプターを表すコンフォメーションの２つの特異的な状態間の比較について、可能である。しかし、より高い次元のサインが、特に、異なる溶媒構造を提供する複数の水性の二相系から得られ得る場合に、所望される。このような系は、異なるｐＨ値、異なるポリマー型および分子量値、異なるイオン組成などで形成され得る。構造における異なる変化に対する感度を示すサインが、一般に有意に異なる溶媒構造を持つ系からのＫ値を用いることによって形成される。
【００９３】
一連のＫ値を得るための複数のかつ異なる溶媒構造の使用は、別の方法では１つの特定の二相系において相殺され得た一般構造の変化の検出を可能にする本発明の重要な利点である。類似の利点が、分配が、複数の相において同時に達成される１つ以上の複数の相系を用いて、実現され得る。
【００９４】
一旦一連の分配係数値が得られると、生体分子の、または生体分子リガンド複合体の、または生体分子の混合物の構造のサインが、一連の数値として利用可能である。次いで、この情報をさらに表す複数の方法が利用可能であり、その方法の特定の選択はセットの複雑さ（例えば、いくつのＫ値が利用可能か？）、およびサインが用いられる様式（例えば、単純な視覚的表示に十分か？）に主に依存する。情報の異なる処理および情報の選択は、当業者の技術の範囲内である。サインを表現する１つの単純な方法は、行中に各々の場合についてＫ値を書き出すことである。例えば、異なるリガンドに応答する生体分子の異なる構造の状態に対応する、異なる場合が、サインを構築するのに用いられる種々の水系を表わす列と共に、一連の行に書かれる。直前に記載された場合では、その提示は他の全てのサインに対する場合の容易な比較を可能にする数学の行列である。あるいは、この情報が視覚的に、例えば、各々の状態について棒グラフ（ここで各々の棒の位置が、特定の系を示し、その高さがＫの実際の値を示す。）を用いることによって、視覚的に表現され得る。一連の水系から得られるＫ値の範囲が大きい場合、直線の横座標の目盛りを用いて全ての値を視覚的に表すのは困難であり得る。このような場合において、単純な移動操作、対数操作、または標準化操作を用いてデータを最初に変換するのは容易である。
【００９５】
構造的サインを使用する１つの有用な方法は、異なるリガンドに結合されるようなレセプターの構造的状態を比較することである。リガンドが小さな分子であり、レセプターが、タンパク質のような、はるかに大きな分子である場合、サインが、生体分子のみの構造的状態を表し得る。さらに、特定のリガンドが、特定の生物学的応答（例えば、アンタゴニストに対するアゴニスト）を生成することが知られている場合、既知のリガンドに結合したときこのようなレセプターのサインが、１つ以上の既知のリガンドに対するサインの類似性に従い、新しいリガンドを分類する使用のための例として働き得る。別の実施形態において、他の方法では他の技術を用いて特徴付けられた生体分子の異なる構造的状態が、一連のサインを介して表され得、そしてその一連の既知のサインに対する同じ生体分子の不明な構造の状態の比較を用いて、不明の状態の、以前に特徴付けられた状態との類似性を指示し得る。
【００９６】
なお別の実施形態において、例えば、生物学的活性、部分的活性、または不活性構造状態に属する構造的に類似の生体分子（アイソフォーム）の混合物のサインが、得られ得、そして同じ生体分子混合物の新しいサンプルまたは生産ロットが、特定の生物学的活性レベルに対応する以前に既知の構造状態に対して、いかに類似し、または異なるかによって分類され得る。
【００９７】
サインの数的表示または視覚的表示のいずれかによって伝達される情報が、かなり大きい場合（例えば、多くの水性系および比較すべきサインがある場合）、特定の情報写像技術が、一般性、感度、および特異性を失うことなく情報量を圧縮するために用い得る。
【００９８】
多くのサインが入手可能である場合、および数値（代表的に、出力と称される）（例えば、生物学的活性の程度を表す数値）が各々割り当てられ得る場合に非常に有用であり得る、１つの特定の実施形態は、特定の非線形写像（例えば、人工ニューラルネットワーク）の使用を包含する。このような場合において、サインは、ニューラルネットワークの係数として表され、そして特定のモデル、型、およびネットワーク構造内で変動する。このような写像の能力（ｐｏｗｅｒ）は、原理的に、それらの用途に由来する：Ｋ値の観点での未知の構造状態の新たなサインを考慮すると、これは、所望の出力値の予測値に容易に写像され得る。さらに、逆最適化技術もまた、すでに構築された写像モデルと共に使用されて、所望の出力値に対応する所望のセットのＫ値を決定し得る。同じ技術を使用して、各Ｋ値の出力に対する感度を決定し得る。この情報は、系（例えば、水系）のセットを、基礎にある構造情報を十分に表すために必要な最小値までトリミングするために、特に有利である。
【００９９】
これらの写像技術は、一般性を失わずに、以下の式によって表され得る：
【０１００】
【数１】
2005509856.tif 000003
ここで、記号ＢＩは、生物学的指数（例えば、特定の組織における活性レベル）を表し、記号Ｃは、写像から得られる係数であり、指数ｎは、サンプルの数を表し、指数ｍは、特定のコンフォメーション状態に関する異なる生物学的活性（例えば、異なる組織における）の数を表し、そして指数ｌは、Ｋ値の数（サインの範囲）を表す。一旦、指数Ｃ（これは、１つのみの生物学的活性レベルが関連する場合、ほんの１であり得る）のセットが計算されると、これは、未知の化合物に対して測定されたサイン（以下の逆写像：
【０１０１】
【数２】
2005509856.tif 000004
に従ってＫ値によって表される）から生物学的活性レベルＢＩのセットを予測するために、逆に使用され得る。
【０１０２】
サインによって提供される情報空間を圧縮するための他の技術が、利用可能である。例えば、行列の回転および射影の技術が、当業者に周知である。主成分分析および／またはサイン値の分解を使用して、サインに埋め込まれた情報が、最適に回転され得、そして例えば、主成分（固有ベクトル）に対応して次第に減少する固有値のセットに表され得る。これらの固有値は、各サインに対して、数値でか、または視覚的に表現され得る。
【０１０３】
本発明の１つの好ましい実施形態においては、構造状態における唯一の変化が重要である。このような適用において、このことは、新たなサインと、参照状態に対応するサインとの間に差異を表示するためにしばしば十分である。これらの適用において、差異の０のサインは、存在する場合、２つの状態が類似であることを示唆する。新たなサインが、例えば、特定のリガンドによってインビボで産生された既知の生物学的活性の構造状態に対応する、既知のサインのセットと比較される場合、先のセットに対する新たなセットの類似性の指標を決定することが、有用である。次いで、この類似性は、例えば、新たなリガンドによって他の既知のリガンドに対して誘導された生物学的活性の接近の程度と考えられ得る。より具体的には、この実施形態は、十分に研究された生物学的レセプター標的（これに対して、既知の生物学的効果を有する複数の薬物（リガンド）がすでに存在する）についての新たなリガンドを、迅速に分類するか、予測するか、または選択するために使用され得る。２つ以上のサインの類似性は、いくつかの距離の測定値（例えば、ユークリッド距離）の１つ以上を使用して、評価および定量され得る。特定の生体分子に結合する場合に、既知の生物学的効果を含むリガンドが利用可能である場合、数学的関係が、写像技術を使用して構築され得る。一旦、写像が既知になると、新たなリガンドの活性レベルが、そのサイン、および写像を介して表現されるサイン空間と生物学的活性との間の関係を使用して、決定されるか、または分類され得る。
【０１０４】
以下の実施例は、本明細書中に特許請求される化合物、組成物、物品、デバイス、および／または方法がどのように作製され、そして評価されるかの完全な開示および説明を、当業者に提供するために記載され、そして本発明の単なる例示であることが意図され、そして本発明者らが自分たちの発明であるとみなしているものの範囲を限定することは意図されない。数（例えば、量、温度など）に関して正確さを確実にするための努力がなされたが、いくらかの誤差および偏差が、考慮されるべきである。他に示されない限り、部は、重量部であり、温度は、℃または周囲温度においてであり、そして圧力は、大気圧またはその近くである。
【実施例】
【０１０５】
（実験実施例）
以下の実施例は、本明細書中に特許請求される化合物、組成物、物品、デバイス、および／または方法がどのように作製され、そして評価されるかの完全な開示および説明を、当業者に提供するために記載され、そして本発明の単なる例示であることが意図され、そして本発明者らが自分たちの発明であるとみなしているものの範囲を限定することは意図されない。数（例えば、量、温度など）に関して正確さを確実にするための努力がなされたが、いくらかの誤差および偏差が、考慮されるべきである。他に示されない限り、部は、重量部であり、温度は、℃または周囲温度においてであり、そして圧力は、大気圧またはその近くである。
【０１０６】
（実施例１）
この実施例において、生物分子の構造状態のサインが作製される。作製されるサインは、数値でおよび視覚的に示され得る。異なるリガンドの結合は、異なるコンフォメーション変化を誘導し、次いでこれらがモニタリングされて、サインが得られた。
【０１０７】
牛乳由来のβ−ラクトグロブリン、レチノール、ニトロフェニルホスフェートおよびブロモエタノールを、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入し、そしてさらに精製せずに使用した。β−ラクトグロブリンのストック水溶液を、１０．０ｍｇ／ｍｌの濃度で調製した。ニトロフェニルホスフェート、レチノール、およびブロモエタノールを、タンパク質ストック溶液に、表１に示されるようなモル比で溶解した。これらのタンパク質／結合パートナー溶液を、一連の異なる水性二相系（これもまた、以下に示される）に分配した。
【０１０８】
水性二相系は、１３．７５重量％のＰＥＧ−６００（分子量約６００）および２１．００重量％のリン酸ナトリウム／カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）を含んだ。各系を、液体操作ワークステーションＨａｍｉｌｔｏｎ  ＭＬ−２２００によって１．２ｍＬのマイクロチューブ中に分配された、適切な量のストックポリマーおよび緩衝溶液を混合することによって調製した。８００μＬの総体積を、マイクロチューブに分配した。種々の量（４０μＬ、８０μＬ、１２０μＬ、１６０μＬ、および２００μＬ）のβ−ラクトグロブリン溶液または所定の比のこれらの量の混合物および対応する量（１６０μｌ、１２０μｌ、８０μｌ、４０μｌ、および０．０μｌ）の水を系に添加した。１．００ｍＬの最終体積の各系の２つの相の体積間の比は、１：１であった。この系を激しく振盪し、そして２つの相の分離を加速するために、約４０００ｒｐｍにて３０分間遠心分離した。チューブを遠心機から取り出し、そして上部相および下相から所定の体積（直接分光光度分析に対しては１００μｌ、および蛍光分析に対しては１５０μｌ）のアリコートを２連で引き抜いた。各アリコートを希釈し、そして適切な試薬と混合し、そして以下に記載のような分析のために用いた。
【０１０９】
他の水性二相系は、８．８８重量％のデキストラン−６４（分子量約６４，０００）、１２．８６重量％のフィコール−４００（分子量約４００，０００）および０．０１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．６）を含んだ。各系を、液体操作ワークステーションＨａｍｉｌｔｏｎ  ＭＬ−２２００によって総体積１．２ｍＬのマイクロチューブ中に８２０μＬの系の総体積になるように分配された種々の量（４０μｌ、８０μｌ、１２０μｌ、および１６０μｌ）のβ−ラクトグロブリン溶液または所定の比のこれらの量の混合物および対応する量（１４０μｌ、１００μｌ、６０μｌ、および２０μｌ）の水を各系に添加した。１．００ｍＬの最終体積の各系の２つの相の体積間の比は、１：１であった。この系を激しく振盪し、そして相の分離を加速するために、約４０００ｒｐｍにて３０分間遠心分離した。チューブを遠心機から取り出し、そして上部相および下相から所定の体積（直接分光光度分析に対しては１００μｌ、および蛍光分析に対しては１５０μｌ）のアリコートを２連で引き抜き、そして各各を希釈し、そして以下に記載のような適切な試薬と混合し、そして以下に記載のように実施されたさらなる分析のために用いた。
【０１１０】
他の水性二相系は、１０．９８重量％のデキストラン−６４（分子量約６４，０００）、１５．９５重量％のフィコール−４００（分子量約４００，０００）、０．２４ＭのＮａＳＣＮ、および０．０１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．６）を含んだ。各系を、液体操作ワークステーションＨａｍｉｌｔｏｎ  ＭＬ−２２００によって総体積１．２ｍＬのマイクロチューブ中に９２０μＬの系の総体積になるように分配された、適切な量のストックポリマー、塩、および緩衝溶液を混合することによって調製した。種々の量（２０μｌ、４０μｌ、６０μｌ、および８０μｌ）のβ−ラクトグロブリン溶液または所定の比のこれらの量の混合物および対応する量（６０μｌ、４０μｌ、２０μｌ、および０μｌ）の水を系に添加した。１．００ｍＬの最終体積の各系の２つの相の体積間の比は、１：１であった。この系を激しく振盪し、そして相沈降を加速するためにバケット型ローターを用いて遠心機中で約４０００ｒｐｍにて３０分間遠心分離した。チューブを遠心機から取り出し、そして上部相および下相からの直接的分光光度分析のために１００μｌのアリコートを２連で引き抜き、そして各アリコートを希釈し、そして以下に記載のような適切な試薬と混合し、そして以下に記載のように実施されたさらなる分析のために用いた。
【０１１１】
他の水性二相系は、１２．３３重量％のデキストラン−６４（分子量約６４，０００）、６．０５重量％のＰＥＧ−６０００（分子量約６，０００）、０．１５ＭのＮａＣｌ、および０．０１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を含んだ。各系を、液体操作ワークステーションＨａｍｉｌｔｏｎ  ＭＬ−２２００によって総体積１．２ｍＬのマイクロチューブ中に８００μＬの系の総体積になるように分配された、適切な量のストックポリマー、塩、および緩衝溶液を混合することによって調製した。種々の量（５０μｌ、１００μｌ、１５０μｌ、および２００μｌ）のβ−ラクトグロブリン溶液または所定の比のこれらの量の混合物および対応する量（１５０μｌ、１００μｌ、５０μｌ、および０μｌ）の水を系に添加した。１．００ｍＬの最終体積の各系の２つの相の体積間の比は、１：１であった。この系を激しく振盪し、そして相沈降を加速するためにバケット型ローターを用いて遠心機中で約４０００ｒｐｍにて３０分間遠心分離した。チューブを遠心機から取り出し、そして上部相および下相からの直接的分光光度分析のために１００μｌのアリコートを２連で引き抜き、そして各アリコートを希釈し、そして以下に記載のような適切な試薬と混合し、そして以下に記載のように実施された分析のために用いた。
【０１１２】
直接的分光光度分析のために、上部相および底部相からの１００μｌのアリコートを、２連で引き抜き、そして各アリコートを８００μｌの水と混合した。各相におけるタンパク質濃度を、ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計ＨＰ−８５３０を用いて、２７８ｎｍでの光学吸光度を測定することによって、評価した。上部相からの希釈アリコートの、２７８ｎｍで測定された光学吸光度値を、底部相からの同様に希釈したアリコートの、２７８ｎｍで測定された光学吸光度値の関数としてプロットした。このタンパク質についての分配係数を、このプロットを表す線形曲線の傾きとして決定した。
【０１１３】
さらに、各相におけるタンパク質濃度を、蛍光マイクロプレートリーダーＢｉｏ−Ｔｅｋ  Ｆ−６０００を用いて、３６０ｎｍの励起フィルターおよび４６０ｎｍの放出フィルターを使用して、９６ウェルマイクロプレートのウェル内の相対蛍光強度を測定することによって、評価した。この目的で、上部相および底部相からの５０μｌのアリコートを引き抜き、各々を、５００μｌのホウ酸緩衝液（ｐＨ８．４）および７５μｌのアセトン中フルオレスカミン溶液（０．１ｍｇ／ｍｌ）と混合し、周囲温度で１５分間維持し、そしてさらなる分析のために使用した。混合物のアリコート（２５０μｌ）を、蛍光測定のために、マイクロプレートのウェルに入れた。上部相からのアリコートの測定された蛍光強度を、底部相からのアリコートの蛍光強度の関数としてプロットした。所定のタンパク質についての分配係数を、そのプロットを表す線形曲線の傾きから決定した。
【０１１４】
分配実験を、二連または三連で実施した。２つの異なるアッセイを用いて決定した分配係数の値は、各場合において、２〜３％以内の誤差範囲で一致した。β−ラクトグロブリンおよびその結合パートナーの試験された混合物の分配係数を、表１に示す。
【０１１５】
表１に示されるデータの分析は、タンパク質の分配係数Ｋ値が、ほとんど全ての系（Ｄｅｘ−ＰＥＧ系でのブロモエタノールの存在下を除く）において試験された各リガンドの存在下で変化することを示す。しかし、１つのみの系が、リガンド結合によって誘導されるコンフォメーション変化の分析のために使用される場合、不十分な結論が引き出され得る。例えば、酢酸レチノールの結合は、使用したＰＥＧ−ホスフェート系、Ｄｅｘ−ＰＥＧ系、およびＤＥＸ−フィコール−ＮａＳＣＮ系において、タンパク質のＫ値を増加させ、そして使用したＤｅｘ−フィコール系のＫ値を減少させる。同時に、リン酸ニトロフェニルとブロモエタノールとの結合は、ここで使用した全ての系において、タンパク質のＫ値を減少させる。
【０１１６】
表１．示された水性二相系における、異なる結合パートナーを伴うウシβ−ラクトグロブリンの分配係数Ｋ（各場合において、タンパク質：結合パートナーのモル比は１：１）。系の組成は本文中に記載されている。
【０１１７】
【表１】
2005509856.tif 000005
この実施例は、一連の異なる水性二相系の使用が、異なるリガンドの結合によってタンパク質において誘導されるコンフォメーション変化を説明する能力を、有意に改善することを例証する。この実施例に示されるような、本発明の目的で使用されるべき異なる系は、単一のポリマーおよび無機塩によって、異なるポリマーの対によって、ならびに同じポリマーの対および異なる塩添加物によって、形成された組成を含み得る。レセプター濃度の決定のために使用される分析アッセイ技術もまた、異なり得る。この場合には、フルオレスカミンベースのアッセイを使用して、約２８０ｎｍでの直接の吸光度測定を用いて得られた結果と同一の結果を提供した。
【０１１８】
この実施例における構造の状態のサインは、種々の様式で表され得る。例えば、表１の情報の視覚的表現は、各系に対して得られるＫ値をまず最大値によって標準化し、次いで、得られた行列をグラフの形式で表示することによって、解釈され得る。これが実施され、そしてその結果が、図１に示される。この特定のグラフ表示において、各棒の高さは等しく、そして各系の、各棒の高さに対する相対寄与は、その垂直延長線によって示される。また、各構造状態のサインは、棒の構築によって４つの場合について得られるパターン（横座標上に示される）として理解され、ここで、各部分セクションの高さは、異なる水系における標準化されたＫ値に対応する。
【０１１９】
（実施例２）
本実施例では、結合によって誘導されるコンフォメーション状態の構造的サインを観察することによって、構造的サインをどのように使用して、生体分子に対するリガンドの特異的結合と非特異的結合とを識別するかを実証した。
【０１２０】
鶏卵卵白由来のリゾチーム、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースおよびＮ，Ｎ’，Ｎ”−トリアセチルキトトリオースを、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入し、そしてさらなる精製を行わずに用いた。グルコースおよびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンをＵＳＢ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ，ＵＳＡ）から購入し、そしてさらなる精製を行わずに用いた。水中のリゾチームのストック溶液を、５．０ｍｇ／ｍｌの濃度で調製した。Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースおよびＮ，Ｎ’，Ｎ”−トリアセチルキトトリオースを１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、そして１：１のタンパク質：リガンド分子比を提供するに適切な比でタンパク質溶液と混合した。リゾチームのストック溶液およびリゾチーム−リガンド混合物のストック溶液を、以下に記載のように、水性２相系に添加した。
【０１２１】
この水性２相系は、１２．３３ｗｔ．％  デキストラン−６４（分子量約６４，０００）、６．０５ｗｔ．％  ＰＥＧ−６０００（分子量約６，０００）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、および０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を含んでいた。各系を、液体操作ワークステーションＨａｍｉｌｔｏｎ  Ｈ−２２００によって総体積１．２ｍＬのマイクロチューブ中に８００μＬの系の総体積になるように分配された、適切な量のストックポリマー、塩、および緩衝溶液を混合することによって調製した。種々の量（５０μｌ、１００μｌ、１５０μｌ、および２００μｌ）のリゾチーム溶液またはこれらの量のリゾチーム−リガンド混合物および対応する量（１５０μｌ、１００μｌ、５０μｌ、および０μｌ）の水を系に添加した。１．００ｍＬの最終体積の各系の２つの相の体積間の比は、１：１であった。この系を激しく振盪し、そして相沈降を加速するためにバケット型ローターを用いて遠心機中で約４０００ｒｐｍにて３０分間遠心分離した。チューブを遠心機から取り出し、そして上部相および底部相からの直接的分光光度分析のために１００μｌのアリコートを２連で引き抜き、そして各々希釈し、そして以下に示すような適切な試薬と混合し、そして以下に記載のように行われるさらなる分析のために用いた。
【０１２２】
他の水性２相系は、８．８８ｗｔ．％  デキストラン−６４（分子量約６４，０００）、１２．８６ｗｔ．％  フィコール−４００（分子量約４００，０００）および０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．６）を含んでいた。各系を、液体操作ワークステーションＨａｍｉｌｔｏｎ  Ｈ−２２００によって総体積１．２ｍＬのマイクロチューブ中に８２０μＬの系の総体積になるように分配された、適切な量のストックポリマーおよび緩衝溶液を混合することによって調製した。種々の量（４０μｌ、８０μｌ、１２０μｌ、および１６０μｌ）のリゾチーム溶液またはこれらの量のリゾチーム−リガンド混合物、（１４０μｌ、１００μｌ、６０μｌ、および２０μｌ）の水を各系に添加した。１．００ｍＬの最終体積の各系の２つの相の体積間の比は、１：１であった。この系を激しく振盪し、そして相沈降を加速するためにバケット型ローターを用いて遠心機中で約４０００ｒｐｍにて３０分間遠心分離した。チューブを遠心機から取り出し、そして所定の体積（直接的分光光度分析に関しては１００μｌ、そして蛍光分析に関しては１５０μｌ）のアリコートを上部相および底部相から２連で取り出し、そして各アリコートを希釈し、そして適切な試薬と混合し、そして以下に記載のように行われるさらなる分析のために用いた。
【０１２３】
他の水性の２相系は、８．８８ｗｔ．％  デキストラン−６４（分子量約６４，０００）、１２．８６ｗｔ．％  フィコール−４００（分子量約４００，０００）、０．２５Ｍ  Ｎａ２ＳＯ４、および０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．６）を含んでいた。各系を、液体操作ワークステーションＨａｍｉｌｔｏｎ  Ｈ−２２００によって総体積１．２ｍＬのマイクロチューブ中に９１０μＬの系の総体積になるように分配された、適切な量のストックポリマー、塩、および緩衝溶液を混合することによって調製した。
【０１２４】
種々の量（２０μｌ、４０μｌ、６０μｌ、および９０μｌ）のリゾチーム溶液またはこれらの量のリゾチーム−リガンド混合物および対応する量（７０μｌ、５０μｌ、３０μｌ、および０μｌ）の水を系に添加した。１．００ｍＬの最終体積の各系の２つの相の体積間の比は、１：１であった。この系を激しく振盪し、そして相沈降を加速するためにバケット型ローターを用いて遠心機中で約４０００ｒｐｍにて３０分間遠心分離した。チューブを遠心機から取り出し、そして上部相および底部相からの直接的分光光度分析のために１００μｌのアリコートを２連で引き抜き、そして各々希釈し、そして以下に示すような適切な試薬と混合し、そして以下に記載のように行われるさらなる分析のために用いた。
【０１２５】
直接的分光光度学的分析のために、上部相および底部相からの１００μｌのアリコートを２連で引き抜き、各々８００μｌの水と混合した。各相におけるタンパク質濃度を、２７８ｎｍでの光学的吸光度をＵＶ／ＶＩＳ分光光度計ＨＰ−８５３０で測定することによってアッセイした。上部相からの希釈したアリコートの２７８ｎｍで測定した光学的吸光度の値を、底部相からの同様に希釈したアリコートの２７８ｎｍでの光学的吸光度の値の関数としてプロットした。このタンパク質についての分配係数を、プロットを表す線形曲線の傾きとして決定した。
【０１２６】
上部相におけるタンパク質濃度を、４０５ｎｍの励起フィルターおよび４８０ｎｍの発光フィルターを用いる蛍光マイクロプレートリーダーＦｌｕｏｒｏｌｉｔｅ−１０００を用いて、９６ウェルマイクロプレートのウェルにおける相対蛍光強度を測定することによってアッセイした。上部相からのアリコートの測定した蛍光強度を、系に添加したタンパク質溶液の体積の関数としてプロットした。上部相における所定のタンパク質／結合パートナー対の濃度を、プロットを表す線形曲線の傾きとして決定した。分配実験を、２連または３連で実施した。
【０１２７】
リゾチームおよびその結合パートナーの試験混合物についての分配係数値を、表２に示す。
【０１２８】
（表２．異なる水性の２相系中で鶏卵卵白リゾチームおよびその異なる結合パートナーとの混合物についての分配係数値（各場合においてモル比  リゾチーム：リガンド＝１：１）
【０１２９】
【表２】
2005509856.tif 000006
この実施例は、非特異的リガンドの結合（例えば、グルコースおよびマンノース）が、特異的なリガンドの結合から区別され得る分配係数に関する変化を生じることを示す。特に、この実施例において、タンパク質分配係数値に関する変化は、５％を超過しなかったが、リゾチームの活性部位での特異的なリガンドの結合は、特定の水性２相系に依存して、６％〜８０％までの範囲の分配係数変化を生じた。さらに、実施例は、表２のような、分配データのセット、および異なる２相系のセット中でタンパク質−リガンド複合体の分配挙動のパターンの分析は、単一２相サインの収集から期待されるより大きな信頼度および質の情報を提供することを実証する。
【０１３０】
例えば、Ｄｅｘ−フィコール系における分配係数によって示される一次元サインの評価は、各リガンドによって誘発されるコンフォメーション改変の型を明らかにしない。しかし、多数次元サインとして全体の情報のセットを使用することによって、（例えば、レーダープロット（ここで、各頂点は、特定の系に対応する）に関する分割係数の規格値を使用して図２において提供されるように視覚的に）、別な方法で類似データであることが明らかであることの間でより容易に判別し得る。
【０１３１】
サインのこの特定の表示において、非特異的結合事象は、単独の遊離レセプターのサインから有意な視的（または数量的）偏差を生じないものとして認識されたが、特異性の増加程度（それぞれＮからＮ，Ｎ’までＮ，Ｎ’，Ｎ’’まで）が公知である３つのリガンドが、遊離レセプターのものから増加的に逸脱するサインを生じた。しかし、サインのグラフ表示を使用することによって、サインを提供するために有用な情報を提供しなかったサインの成分で決定することも容易であった。サインが有用であるためには、たとえ基礎にある情報がサインを生じる基底が、公知でなくとも、それは、基礎にある情報との一対一対応を提供しなければならない。このように、本発明者らが、例えば、各システムについてのすべてのサインの成分の変化を別々にプロットする場合（図３）、最後の２つの系（Ｄｅｘ−フィコール−ＮａＳＣＮおよびＤｅｘ−ＰＥＧ）が、異なるリガンドの間の明敏な構造的な異なりについてより有用性が低いことが証明される。
【０１３２】
（実施例３）
この実施例において、いかに感受性のコンフォメーション情報を、サインを使用して得ることができるか、そしていかに生体分子の構造の異なる状態を、参考状態に対して比較し得るかを示した。異なるコンフォメーションのサインの間の差異の単純な数量値の凝縮の仕方も示した。さらに、サインの差異を反映するような凝縮情報セットについてのいくつかの代表的適用が開示される。
【０１３３】
ヒト血清由来のアポトランスフェリンを、Ｉｎｔｅｒｇｅｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｐｕｒｃｈａｓｅ、ＮＹ、ＵＳＡ）から購入し、そしてさらなる精製をすることなく使用した。アポトランスフェリンを、０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．５中でニトリロ酢酸のナトリウム塩および過剰のビカルボネートの存在下で３連のモル過剰のＦｅＣｌ３、またはＣｕＣｌ２、Ａｌ２（ＳＯ４）３、Ｂｉ６Ｍｏ２Ｏ１５、およびＣａＣｌ２とともに１時間、氷上でインキュベートすることによる標準手順に従って、鉄（Ｆｅ３＋）、銅（Ｃｕ２＋）、アルミニウム（Ａｌ３＋）、ビスマス（Ｂｉ３＋）、およびカルシウム（Ｃａ２＋）で飽和した。結合しない金属塩を、３，０００ｇで約４時間、分子量カットオフ３Ｋを備えるＭＡＣＲＯＳＥＰ遠心分離濃縮器中で溶液の遠心分離によって金属飽和トランスフェリンの各溶液から除去した。その後、水中の金属飽和トランスフェリンおよびアポトランスフェリンのストック溶液を、約１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で調製した。これらのタンパク質溶液を、以下の水性の２相系における分配に供した。
【０１３４】
水性の２相系は、３．６０重量％ＰＥＧ−８０００、７．７４重量％デキストラン５００（約５００，０００の分子量を有する）、および０．２０Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０１）を含有した。各系を、１．２ｍＬの全容量のマイクロチューブ中に系の全容量７００μＬまで、液体操作作業ステーションＨａｍｉｌｔｏｎ  ＭＬ−２２００によって分配された、適切な量のストックポリマー、塩、および緩衝溶液を混ぜ合わせることによって調製した。種々の量（１００、１５０、２００、２５０、および３００μｌ）のアポトランスフェリン溶液またはその量の金属トランスフェリンおよび対応する量（２００、１５０、１００、５０、および０μｌ）の水を、系に加えた。１．００ｍＬの最終容量の各系の２相の容量の間の比率は、１：１であった。系を、激しく撹拌し、そして相沈降を加速するために、バケット型ローターを備える遠心機において、約４０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。チューブを、遠心分離機から取り出し、そして上相部および下相部から直接分光分析のための１００μｌのアリコートを、二連で引き抜き、そして以下に示されるような適切な薬剤を用いてそれぞれ希釈および混合し、そして以下に記載されるように実施されたさらなる分析について使用した。
【０１３５】
他の水性の２相系は、２０．００重量％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、６．１９重量％デキストラン−５００（約５００，０００の分子量を有する）、および０．１７２５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を含有した。各系を、１．２ｍＬの全容量のマイクロチューブ中に系の全容量７５０μＬまで液体操作作業ステーションＨａｍｉｌｔｏｎ  ＭＬ−２２００によって分配された適切な量のストックポリマーと緩衝溶液とを混ぜ合わせることによって調製した。種々の量（５０、１００、１５０、２００、および２５０μｌ）のアポトランスフェリン溶液またはその量の金属トランスフェリンおよび対応する量（２００、１５０、１００、５０、および０μｌ）の水を、系に加えた。１．００ｍＬの最終容量の各系の２相の容量の間の比率は、１：１であった。系を、激しく撹拌し、そして相沈殿を加速するために、バケットローターを有する遠心分離機中、約４０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。チューブを、遠心分離機から取り出し、そして上相部および下相部から直接分光分析のための１００μｌのアリコートを、二連で引き抜き、そして以下に示されるような適切な薬剤を用いてそれぞれ希釈および混合し、そして以下に記載されるように実施されたさらなる分析について使用した。
【０１３６】
他の水性の２相系は、８．８８重量％デキストラン−６４（約６４，０００の分子量）、１２．８６重量％フィコール−４００（約４００，０００の分子量）、および０．０１Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．６）を含有した。各系を、１．２ｍＬの全容量のマイクロチューブ中に系の全容量８４０μＬまで液体操作作業ステーションＨａｍｉｌｔｏｎ  Ｈ−２２００によって分配された適切な量のストックポリマーと緩衝溶液とを混ぜ合わせることによって調製した。種々の量（４０、８０、１２０、および１６０μｌ）のアポトランスフェリン溶液またはその量の金属トランスフェリンおよび対応する量（１４０、１００、６０、および２０μｌ）の水を、系に加えた。１．００ｍＬの最終容量の各系の２相の容量の間の比率は、１：１であった。系を、激しく撹拌し、そして相沈殿を加速するために、バケットローターを有する遠心分離機中、約４０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。チューブを、遠心分離機から取り出し、そして上相部および下相部から直接分光分析のために１００μｌのアリコートを、二連で引き抜き、そして以下に示されるような適切な薬剤を用いてそれぞれ希釈および混合し、そして以下に記載されるように実施されたさらなる分析について使用した。
【０１３７】
他の水性の２相系は、８．８８重量％デキストラン−６４（約６４，０００の分子量）、１２．８６重量％フィコール−４００（約４００，０００の分子量）、０．２５Ｍ  Ｎａ２ＳＯ４、および０．０１Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．６）を含有した。各系を、１．２ｍＬの全容量のマイクロチューブ中に系の全容量９１０μＬまで液体操作作業ステーションＨａｍｉｌｔｏｎ  Ｈ−２２００によって分配された適切な量のストックポリマーと緩衝溶液とを混ぜ合わせることによって調製した。種々の量（２０、４０、６０、および９０μｌ）のアポトランスフェリン溶液またはその量の金属トランスフェリンおよび対応する量（７０、５０、３０、および０μｌ）の水を、系に加えた。１．００ｍＬの最終容量の各系の２相の容量の間の比率は、１：１であった。系を、激しく撹拌し、そして相沈殿を加速するために、バケットローターを有する遠心分離機中、約４０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。チューブを、遠心分離機から取り出し、そして上相部および下相部から直接分光分析について１００μｌのアリコートを、二連で引き抜き、そして以下に示されるような適切な薬剤を用いてそれぞれ希釈および混合し、そして以下に記載されるように実施されたさらなる分析について使用した。
【０１３８】
他の水性の２相系は、８．８８重量％デキストラン−６４（約６４，０００の分子量）、１２．８６重量％フィコール−４００（約４００，０００の分子量）、０．２５Ｍ  Ｌｉ２ＳＯ４、および０．０１Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．６）を含有した。各系を、１．２ｍＬの全容量のマイクロチューブ中に系の全容量９２０μＬまで液体操作作業ステーションＨａｍｉｌｔｏｎ  Ｈ−２２００によって分配された適切な量のストックポリマーと緩衝溶液とを混ぜ合わせることによって調製した。種々の量（２０、４０、６０、および８０μｌ）のアポトランスフェリン溶液またはその量の金属トランスフェリンおよび対応する量（６０、４０、２０、および０μｌ）の水を、系に加えた。１．００ｍＬの最終容量の各系の２相の容量の間の比率は、１：１であった。系を、激しく撹拌し、そして相沈殿を加速するために、バケットローターを有する遠心分離機中、約４０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。チューブを、遠心分離機から取り出し、そして上相部および下相部から直接分光分析のために００μｌのアリコートを、二連で引き抜き、そして以下に示されるような適切な薬剤を用いてそれぞれ希釈および混合し、そして以下に記載されるように実施されたさらなる分析について使用した。
【０１３９】
他の水性の２相系は、１０．９８重量％デキストラン−６４（約６４，０００の分子量）、１５．９５重量％フィコール−４００（約４００，０００の分子量）、０．１３Ｍ  ＣｓＣｌ、および０．０１Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．６）を含有した。各系を、１．２ｍＬの全容量のマイクロチューブ中に系の全容量９２０μＬまで液体操作作業ステーションＨａｍｉｌｔｏｎ  Ｈ−２２００によって分配された適切な量のストックポリマーと緩衝溶液とを混ぜ合わせることによって調製した。種々の量（２０、４０、６０、および８０μｌ）のアポトランスフェリン溶液またはその量の金属トランスフェリンおよび対応する量（６０、４０、２０、および０μｌ）の水を、系に加えた。１．００ｍＬの最終容量の各系の２相の容量の間の比率は、１：１であった。系を、激しく撹拌し、そして相沈殿を加速するために、バケットローターを有する遠心分離機中、約４０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。チューブを、遠心分離機から取り出し、そして上相部および下相部から直接分光分析のために１００μｌのアリコートを、二連で引き抜き、そして以下に示されるような適切な薬剤を用いてそれぞれ希釈および混合し、そして以下に記載されるように実施されたさらなる分析について使用した。
【０１４０】
他の水性の２相系は、１０．９８重量％デキストラン−６４（約６４，０００の分子量）、１５．９５重量％フィコール−４００（約４００，０００の分子量）、０．１３Ｍ  ＮａＣｌＯ４、および０．０１Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．６）を含有した。各系を、１．２ｍＬの全容量のマイクロチューブ中に系の全容量９２０μＬまで液体操作作業ステーションＨａｍｉｌｔｏｎ  ＭＬ−２２００によって分配された適切な量のストックポリマーと緩衝溶液とを混ぜ合わせることによって調製した。種々の量（２０、４０、６０、および８０μｌ）のアポトランスフェリン溶液またはその量の金属トランスフェリンおよび対応する量（６０、４０、２０、および０μｌ）の水を、系に加えた。１．００ｍＬの最終容量の各系の２相の容量の間の比率は、１：１であった。系を、激しく撹拌し、そして相沈殿を加速するために、バケットローターを有する遠心分離機中、約４０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。チューブを、遠心分離機から取り出し、そして上相部および下相部から直接分光分析のために１００μｌのアリコートを、二連で引き抜き、そして以下に示されるような適切な薬剤を用いてそれぞれ希釈および混合し、そして以下に記載されるように実施されたさらなる分析について使用した。
【０１４１】
他の水性の２相系は、１０．９８重量％デキストラン−６４（約６４，０００の分子量）、１５．９５重量％フィコール−４００（約４００，０００の分子量）、０．２４Ｍ  ＮａＳＣＮ、および０．０１Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．６）を含有した。各系を、１．２ｍＬの全容量のマイクロチューブ中に系の全容量９２０μＬまで液体操作作業ステーションＨａｍｉｌｔｏｎ  ＭＬ−２２００によって分配された適切な量のストックポリマーと緩衝溶液とを混ぜ合わせることによって調製した。種々の量（２０、４０、６０、および８０μｌ）のアポトランスフェリン溶液またはその量の金属トランスフェリンおよび対応する量（６０、４０、２０、および０μｌ）の水を、系に加えた。１．００ｍＬの最終容量の各系の２相の容量の間の比率は、１：１であった。系を、激しく撹拌し、そして相沈殿を加速するために、バケットローターを有する遠心分離機中、約４０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。チューブを、遠心分離機から取り出し、そして上相部および下相部から直接分光分析のために１００μｌのアリコートを、二連で引き抜き、そして以下に示されるような適切な薬剤を用いてそれぞれ希釈および混合し、そして以下に記載されるように実施されたさらなる分析について使用した。
【０１４２】
直接的な分光分析のため、上相部および下相部からアリコート１００μｌを、二連で引き抜き、そして各々を、８００μｌ水と混ぜた。各相のタンパク質濃度を、ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計ＨＰ−８５３０を用いて、２７８ｎｍで光学吸光度を測定することによってアッセイした。上相部からの希釈されたアリコートの２７８ｎｍで測定された光学吸収値を、下相部からの同様に希釈されたアリコートの２７８ｎｍでの光学吸収値の関数としてプロットした。タンパク質の分配係数を、プロットを表示する線形曲線の傾きとして決定した。
【０１４３】
試験されたタンパク質についての分配係数を、表３に与える。表３に示されたデータは、アポトランスフェリンおよび異なる金属で飽和されたトランスフェリンの分配に関して差異があることを明らかに示す。観察された差異は、異なる金属の結合によって誘発されるトランスフェリンの異なるコンフォメーションに起因する。表３において与えられたデータはまた、変化は、使用される系のいずれかにおいて観察されるが、結合パートナーの結合によって誘発されたタンパク質の分配係数値に関する変化が、使用される特定の二相系に依存することを示す。
【０１４４】
（表３．異なる水性二相系に関するヒトアポトランスフェリンの分配係数および異なる金属トランスフェリン）
【０１４５】
【表３】
2005509856.tif 000007
表３において示されるデータは、各リガンドに対応する構造的サインを示す。このデータは、いくつかの方法で視覚的に示され得、いくつかは、以前の実施例において概説される。時々、サインそれ自体の複雑性をさらに減少することは、簡便である。サイン縮合を達成するための一つの方法は、各サイン対参考ケースについて、（標準化された）Ｅｕｃｌｉｄｉａｎ距離を計算することである。以下において、本発明者らは、アポＴｆサインのそれに対して、各リガンドに対応する各コンフォメーション状態の間の距離を記載することを選択する。各距離を計算するための一つの形式は、以下：
【０１４６】
【数３】
2005509856.tif 000008
である。ここで、距離は、ｎ個の水性系について、任意のサインｊと参考サインｉとの間で計算される。表４における最初の３つのリガンドに対するこのような距離測定を適用する場合、以下のデータを作成する。
Ｆｅ３＋からアポ−Ｔｆ：                    ０．６２
Ａｌ３＋からアポ−Ｔｆ：                    ０．５４
Ｃｕ２＋からアポ−Ｔｆ：                    ０．６４
上記データを、遊離レセプターのそれに対するそのリガンドによって誘発されるコンフォメーションの間の全体的類似性の指標として、各リガンドについて個別に解釈し得る。他のデータの変換法および凝縮法を、容易に考案し得、サインの最終的な使用に依存する。従って、例えば、一つのリガンド誘発コンフォメーションの類似性を、別の、または生物学的な活性が公知であるリガンドについてのものであり得る参考状態に対して、容易に比較することを所望する場合、距離測定は、簡潔な様式において類似性を表現するための簡便な一つの方法である。別の適用は、無傷の生体分子のサインに対する、特定のアイソフォームまたは改変された型または生体分子（例えば、単一点変異）のサインがどれほど近いかを評価するための類似性距離の使用であり得る。サイン類似性の距離測定を使用するためのなお別の可能性は、非哺乳動物宿主における組換えＤＮＡ技術を使用して作製される多くの微小不均一タンパク質（例えば、糖タンパク質）を簡便に比較することである。この場合において、混合物の平均コンフォメーション状態を示す、各ロットのサインは、良く特徴付けられる多くの公知の生物学的活性レベルから生じるものに対して容易に比較され得る。
【０１４７】
（実施例４）
この実施形態において、それらが、コンフォメーションに関する有意な変化を導く場合、生体分子の一次構造における小さな差異が、サインを使用してどのように検出され得るかを示す。
【０１４８】
ウシミルク由来のβラクトグロブリンＡおよびβラクトグロブリンＢを、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入し、そしてさらなる精製をすることなく使用した。これらのタンパク質は、２アミノ酸残基だけ異なる。βラクトグロブリンＡは、位置６４でＡｓｐ残基および位置１１８でＶａｌ残基を有し、一方βラクトグロブリンＢは、位置６４でＧｌｙ残基および位置１１８でＡｌａ残基を有する。水中のβラクトグロブリンＡおよびβラクトグロブリンＢのストック溶液を、５．０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃縮で調製した。βラクトグロブリンＡのストック溶液およびβラクトグロブリンＢのストック溶液を、以下に記載されるような水性の２相系に加えた。
【０１４９】
水性の２相系は、１２．３３重量％デキストラン−６４（約６４，０００の分子量）、６．０５重量％ＰＥＧ−６０００（約６，０００の分子量）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、および０．０１Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を含有した。各系を、１．２ｍＬの全容量のマイクロチューブ中に系の全容量８００μＬまで液体操作作業ステーションＨａｍｉｌｔｏｎ  ＭＬ−２２００によって分配された適切な量のストックポリマーと緩衝溶液とを混ぜ合わせることによって調製した。各タンパク質溶液の種々の量（５０、１００、１５０、および２００μｌ）および対応する量（１５０、１００、５０、および０μｌ）の水を、系に加えた。１．００ｍＬの最終容量の各系の２相の容量の間の比率は、１：１であった。系を、激しく撹拌し、そして相沈殿を加速するために、バケットローターを有する遠心分離機中、約４０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。チューブを、遠心分離機から取り出し、そして上相部および下相部から直接分光分析のために１００μｌのアリコートを、二連で引き抜き、そして以下に示されるような適切な薬剤を用いてそれぞれ希釈および混合し、そして以下に記載されるように実施されたさらなる分析について使用した。
【０１５０】
他の水性二相系は、１３．７５重量％のＰＥＧ−６００（分子量約６００）および２１．００重量％のリン酸ナトリウム／カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）を含有した。各系を、適切な量のストックポリマーおよび液体操作ワークステーションＨａｍｉｌｔｏｎ  ＭＬ−２２００で分配した緩衝溶液を混合することによって、総容量１．２ｍＬのマイクロチューブに、総容量８００μＬまでの系を調製した。様々な量（４０，８０，１２０，１６０および２００μｌ）の各タンパク質溶液と対応する量（１６０，１２０，８０，４０および０．０μｌ）の水を系に添加した。最終容量１．００ｍＬの二相の各系の容量間の比は、１：１であった。系を激しく振って、バケットローターを備える遠心分離機中、約４０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、相の分離を加速した。チューブを遠心分離機から取り出し、上部相および下部相から所定の容量（直接分光光度分析のための１００μｌおよび蛍光分析のための１５０μｌ）のアリコートを二連で引き抜き、そして、各々を希釈し、以下に示される適切な試薬と混合し、そして、以下に記載されるように実施されるさらなる分析に使用した。
【０１５１】
他の水性二相系は、１２．３３重量％のデキストラン−６４（分子量約６４，０００）、６．０５重量％のＰＥＧ−６０００（分子量約６，０００）および０．１１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を含有した。各系を、適切な量のストックポリマー塩および液体操作ワークステーションＨａｍｉｌｔｏｎ  ＭＬ−２２００で分配した緩衝溶液を混合することによって、総容量１．２ｍＬのマイクロチューブに、総容量８００μＬまでの系を調製した。様々な量（５０，１００，１５０および２００μｌ）の各タンパク質溶液と対応する量（１５０，１００，５０および０μｌ）の水を系に添加した。最終容量１．００ｍＬの二相の各系の容量間の比は、１：１であった。系を激しく振って、バケットローターを備える遠心分離機中、約４０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、相の分離を加速した。チューブを遠心分離機から取り出し、上部相および下部相から直接分光光度分析のために１００μｌのアリコートを二連で引き抜き、そして、各々を希釈し、以下に示される適切な試薬と混合し、そして、以下に記載されるように実施されるさらなる分析に使用した。
【０１５２】
他の水性二相系は、１２．３３重量％のデキストラン−６４（分子量約６４，０００）、６．０５重量％のＰＥＧ−６０００（分子量約６，０００）、０．１ＭのＬｉ２ＳＯ４および０．０１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を含有した。各系を、適切な量のストックポリマー塩および液体操作ワークステーションＨａｍｉｌｔｏｎ  ＭＬ−２２００で分配した緩衝溶液を混合することによって、総容量１．２ｍＬのマイクロチューブに、総容量８００μＬまでの系を調製した。様々な量（５０，１００，１５０および２００μｌ）の各タンパク質溶液と対応する量（１５０，１００，５０および０μｌ）の水を系に添加した。最終容量１．００ｍＬの二相の各系の容量間の比は、１：１であった。系を激しく振って、バケットローターを備える遠心分離機中、約４０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、相の分離を加速した。チューブを遠心分離機から取り出し、上部相および下部相から直接分光光度分析のために１００μｌのアリコートを二連で引き抜き、そして、各々を希釈し、以下に示される適切な試薬と混合し、そして、以下に記載されるように実施されるさらなる分析に使用した。
【０１５３】
他の水性二相系は、１２．３３重量％のデキストラン−６４（分子量約６４，０００）、６．０５重量％のＰＥＧ−６０００（分子量約６，０００）、０．１ＭのＮａＳＣＮおよび０．０１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を含有した。各系を、適切な量のストックポリマー塩および液体操作ワークステーションＨａｍｉｌｔｏｎ  ＭＬ−２２００で分配した緩衝溶液を混合することによって、総容量１．２ｍＬのマイクロチューブに、総容量８００μＬまでの系を調製した。様々な量（５０，１００，１５０および２００μｌ）の各タンパク質溶液と対応する量（１５０，１００，５０および０μｌ）の水を系に添加した。最終容量１．００ｍＬの二相の各系の容量間の比は、１：１であった。系を激しく振って、バケットローターを備える遠心分離機中、約４０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、相の分離を加速した。チューブを遠心分離機から取り出し、上部相および下部相から直接分光光度分析のために１００μｌのアリコートを二連で引き抜き、そして、各々を希釈し、以下に示される適切な試薬と混合し、そして、以下に記載されるように実施されるさらなる分析に使用した。
【０１５４】
直接分光光度分析のために、上部相および下部相からの１００μｌのアリコートを二連で引き抜き、各々を８００μｌの水と混合した。各相におけるタンパク質の濃度をＵＶ／ＶＩＳ分光光度計ＨＰ−８５３０を用いて２７８ｎｍにて光学吸光度を測定することによってアッセイした。希釈した上部相からのアリコートの２７８ｎｍでの光学吸光度の測定値を、同様に希釈した下部相からのアリコートの２７８ｎｍでの光学吸光度の値の関数としてプロットした。タンパク質についての分配係数を、プロットを表す線形曲線の勾配として決定した。
【０１５５】
さらに、各相におけるタンパク質の濃度を、３６０ｎｍの励起フィルターおよび４６０ｎｍの放出フィルターを使用して、蛍光マイクロプレートリーダーＢｉｏ−Ｔｅｋ  Ｆ−６０００を用いて９６ウェルマイクロプレートのウェル中の相対蛍光強度を測定することによってアッセイした。この目的のために、上部相および下部相から５０μｌのアリコートを引き抜き、各々を５００μｌのホウ酸緩衝液（ｐＨ８．４）およびアセトン中の７５μｌフルオレスカミン溶液（０．１ｍｇ／ｍｌ）と混合し、周囲温度で１５分間維持し、そして、さらなる分析に使用した。混合物（２５０μｌ）のアリコートを蛍光測定のためにマイクロプレートのウェルに配置した。上部相からのアリコートの測定蛍光強度を、下部相からのアリコートの蛍光強度の関数としてプロットした。所定のタンパク質の分配係数を、プロットを表す線形曲線の勾配として決定した。
【０１５６】
二重または三重で分配実験を実施した。２つの異なるアッセイで決定された分配係数値は、各場合において２〜３％の誤差範囲内で一致した。
【０１５７】
試験したβ−ラクトグロブリンＡおよびβ−ラクトグロブリンＢについての分配係数を表４に示す。
（表４．異なる水性二相系におけるウシの乳由来のβ−ラクトグロブリンＡおよびβ−ラクトグロブリンＢについての分配係数値）
【０１５８】
【表４】
2005509856.tif 000009
この実施例は、この場合において、例えば、β−ラクトグロブリンＡとβ−ラクトグロブリンＢの間のタンパク質の３−Ｄ構造の小さな違いが、一組の異なる二相系を使用する場合、明らかに異なる分配挙動パターンとして示され得ることを示す。上記の実施例に類似する様式において、サインはまた、所望される場合、可視化され得る。このような一組の異なる分配条件を使用すると、単一の二相系で得られる情報よりさらにより信頼できかつさらにより説得力のある情報を提供する。
【０１５９】
（実施例５）
この実施例において、コンフォメーションの有意な変化をもたらす場合、生体分子の一次構造のいかに小さい違いも、サインを使用して検出され得ることが示される。
【０１６０】
ヒト組換えインシュリンをＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．（Ａｕｒｏｒａ，ＯＨ，ＵＳＡ）から購入し、ウシインシュリンおよびブタインシュリンをＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入し、そして、さらなる精製をせずに使用した。このタンパク質は、２または３アミノ酸残基が異なる−−ヒトインシュリンは、Ａ鎖の８位にＴｈｒ残基を、Ａ鎖の１０位にＩｌｅ残基を有し、そして、Ｂ鎖の３０位にＴｈｒ残基を有するが、ブタインシュリンは、Ｂ鎖の３０位のＡｌａ残基によってヒトインシュリンと異なり、そして、ウシインシュリンは、Ａ鎖の８位にＡｌａ残基を、Ａ鎖の１０位にＶａｌ残基を、そして、Ｂ鎖の３０位にＡｌａ残基を有する。０．００９Ｍ  ＨＣｌ中に全てのインシュリンのストック溶液を調製し、約１．０ｍｇ／ｍｌの最終タンパク質濃度を有するｐＨ約６．０まで０．０１Ｍ  ＮａＯＨで滴定した。ヒトインシュリンのストック溶液、ブタインシュリンのストック溶液、およびウシインシュリンのストック溶液を以下に記載するように水性二相系に添加した。
【０１６１】
水性二相系は、０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中に１１．７４重量％のデキストラン−６９（分子量約６９，０００）、１７．５１重量％のフィコール−７０（分子量約７０，０００）および０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含有した。各系を、適切な量のストックポリマーおよび液体操作ワークステーションＨａｍｉｌｔｏｎ  ＭＬ−２２００で分配した緩衝溶液を混合することによって、総容量１．２ｍＬのマイクロチューブに、総容量８７０μＬまでの系を調製した。様々な量（０，２６，５２，７８，１０４および１３０μｌ）の各タンパク質溶液と対応する量（１３０，１０４，７８，５２，２６および０μｌ）の水を各系に添加した。最終容量１．００ｍＬの二相の各系の容量間の比は、１：１であった。系を激しく振って、約４０００ｒｐｍで４０分間遠心分離し、相の分離を加速した。チューブを遠心分離機から取り出し、上部相および下部相から５０μｌのアリコートを二連で引き抜き、そして、各々を希釈し、以下に示される適切な試薬と混合し、そして、以下に記載されるように実施されるさらなる分析に使用した。
【０１６２】
他の水性二相系は、１３．６７重量％のデキストラン−６９（分子量約６９，０００）、１８．３４重量％のフィコール−７０（分子量約７０，０００）、０．３３ＭのＮａＳＣＮおよび０．０１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を含有した。各系を、適切な量のストックポリマー塩および液体操作ワークステーションＨａｍｉｌｔｏｎ  ＭＬ−２２００で分配した緩衝溶液を混合することによって、総容量１．２ｍＬのマイクロチューブに、総容量８８０μＬまでの系を調製した。様々な量（０，２４，４８，７２，９６および１２０μｌ）の各インシュリン溶液と対応する量（１２０，９６，７２，４８，２４および０μｌ）の水を系に添加した。最終容量１．００ｍＬの二相の各系の容量間の比は、１：１であった。系を激しく振って、バケットローターを備える遠心分離機中、約４０００ｒｐｍで４０分間遠心分離し、相の分離を加速した。チューブを遠心分離機から取り出し、上部相および下部相から５０μｌのアリコートを二連で引き抜き、そして、各々を希釈し、以下に示される適切な試薬と混合し、そして、以下に記載されるように実施されるさらなる分析に使用した。
【０１６３】
他の水性二相系は、１２．１６重量％のデキストラン−６９（分子量約６９，０００）、６．０５重量％のＰＥＧ−６０００（分子量約６，０００）、０．４３ＭのＮａＣｌＯ４および０．０１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を含有した。各系を、適切な量のストックポリマー塩および液体操作ワークステーションＨａｍｉｌｔｏｎ  ＭＬ−２２００で分配した緩衝溶液を混合することによって、総容量１．２ｍＬのマイクロチューブに、総容量８８０μＬまでの系を調製した。様々な量（０，２４，４８，７２，９６および１２０μｌ）の各インシュリン溶液と対応する量（１２０，９６，７２，４８，２４および０μｌ）の水を系に添加した。最終容量１．００ｍＬの二相の各系の容量間の比は、１：１であった。系を激しく振って、バケットローターを備える遠心分離機中、約４０００ｒｐｍで４０分間遠心分離し、相の分離を加速した。チューブを遠心分離機から取り出し、上部相および下部相から５０μｌのアリコートを二連で引き抜き、そして、各々を希釈し、以下に示される適切な試薬と混合し、そして、以下に記載されるように実施されるさらなる分析に使用した。
【０１６４】
他の水性二相系は、１２．１６重量％のデキストラン−６９（分子量約６９，０００）、６．０５重量％のＰＥＧ−６０００（分子量約６，０００）、１．２６ＭのＮａＳＣＮおよび０．０１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を含有した。各系を、適切な量のストックポリマー塩および液体操作ワークステーションＨａｍｉｌｔｏｎ  ＭＬ−２２００で分配した緩衝溶液を混合することによって、総容量１．２ｍＬのマイクロチューブに、総容量８８０μＬまでの系を調製した。様々な量（０，２４，４８，７２，９６および１２０μｌ）の各インシュリン溶液と対応する量（１２０，９６，７２，４８，２４および０μｌ）の水を系に添加した。最終容量１．００ｍＬの二相の各系の容量間の比は、１：１であった。系を激しく振って、バケットローターを備える遠心分離機中、約４０００ｒｐｍで４０分間遠心分離し、相の分離を加速した。チューブを遠心分離機から取り出し、上部相および下部相から５０μｌのアリコートを二連で引き抜き、そして、各々を希釈し、以下に示される適切な試薬と混合し、そして、以下に記載されるように実施されるさらなる分析に使用した。
【０１６５】
各相におけるタンパク質の濃度を、３６０ｎｍの励起フィルターおよび４６０ｎｍの放出フィルターを使用して、蛍光マイクロプレートリーダーＢｉｏ−Ｔｅｋ  Ｆ−６０００を用いて９６ウェルマイクロプレートのウェル中の相対蛍光強度を測定することによってアッセイした。この目的のために、上部相および下部相からの５０μｌのアリコートを引き抜き、各々を２８０μｌのｏ−フタルジアルデヒド試薬溶液と（完全に）混合し、蛍光測定のためのマイクロプレートのウェルに配置し、周囲温度で２分間振盪し、そして、蛍光測定を実施した。上部相からのアリコートの測定蛍光強度を、下部相からのアリコートの蛍光強度の関数としてプロットした。所定のタンパク質の分配係数を、プロットを表す線形曲線の勾配として決定した。
【０１６６】
二連または三連で分配実験を実施した。２つの異なるアッセイで決定された分配係数値は、各場合において２〜３％の誤差範囲内で一致した。
【０１６７】
ヒトインシュリン、ウシインシュリンおよびブタインシュリンについての分配係数を表５に示す。
【０１６８】
（表５．異なる水性二相系におけるヒトインシュリン、ウシインシュリンおよびブタインシュリンについての分配係数値）
【０１６９】
【表５】
2005509856.tif 000010
この実施例は、ヒトインシュリン、ウシインシュリンおよびブタインシュリンに対応するタンパク質の３−Ｄ構造の小さな違いが、一組の異なる二相系を使用する場合、異なる分配挙動パターンによって示されることを示す。上記の実施例に類似する様式において、サインはまた、所望される場合、可視化され得る。構造上のバリエーションが各インシュリンサンプル内に存在し得るので、複数の系から得られた情報から構成されるサインの使用は、未知のサンプルを確実に識別または分類するためのより多くの強力な手段を提供する。
【０１７０】
（実施例６）
この実施例は、このコンフォメーションのサインが、いかにして参照の場合のように既知の薬物のサインを使用して、未知の薬物の生物学的活性を評価するのに使用され得るかを示す。
【０１７１】
既知の標的（例えば、レセプター）に対する新規薬物の送達経路において、時折、よく特徴付けられた生物学的効力プロフィールを有するすでに入手可能な１つ以上の以前の薬物が存在する。レセプターの生物学的活性がそのコンフォメーション状態において反映されることを想定すると、当面の問題は、新規薬物候補の期待される生物学的活性を迅速に評価するために、同じレセプターに対する以前の薬物（リガンド）についてすでに入手可能であるコンフォメーションの情報をいかにして使用するかである。より一般的には、問題は、このようなプロフィールがすでに他の薬物について存在する場合、新規薬物候補のコンフォメーション関連の生物活性のプロフィールをいかにして予測するかである。コンフォメーション関連の生物活性の例は、生物学的活性レベルおよび毒性であり、後者は、他のレセプターに対する望ましくない結合の結果として表され、望ましくない生物学的活動を活性化するコンフォメーション状態を生じる。この特定の実施形態は、異なる薬物への結合に応答して、複数のコンフォメーション変化を受ける、多くのクラスのレセプターの分析に対して有意に価値を有する。例えば、多くの転写因子（例えば、エストロゲンレセプター）が、異なるエストロゲンへの結合に応答して複数のコンフォメーション状態を示すことが知られる。中間コンフォメーションが、体内の種々の組織において望ましい生物学的活性プロフィールを示す新規エストロゲンを発見するための実際的な関心事であることが広く認識されているので、エストロゲンレセプターを調節する新規エストロゲンの発見は、最も最近の関心事である。従って、結合の際にレセプターを単に「作動させる」代わりに、多くの薬物は、改善した生物効力を生じ得る特定のコンフォメーション状態を誘導するように仕立てられ得る。
【０１７２】
以下の仮想の実施例において、本発明者らは、任意の数値を使用して、同じレセプターに対する未知の薬物の生物活性を分類または予測するのに使用され得るいくつかの方法を調査した。サインの根底にある数値を実験的に得るための技術は、上記の実施例においてすでに広範に示されそして議論された。
【０１７３】
数学的には、各薬物についてのサインは、各々が特定の系に対応する、ｎの値からなるベクトルである。このサインがコンフォメーション状態に対応し、このコンフォメーション状態がレセプターの生物学的活性に関係することが予想される。特定の薬物に結合される場合にレセプターの生物活性が既知であり、そして、例えば、他の薬物と比較して、規格化したスケール（純粋アンタゴニストについて０そして純粋アゴニストについて１０を割り当てる）を使用して数的に分類され得る場合、この生物活性は、サインに数学的に関係し得る。生物活性にサインを関係付けるのに使用される数学的技術は、一般に、写像と称される。これらは、線形または非線形であり得、（上記の実施例に示される指標と類似する様式で）距離的指標としての単一の概念を含み得、有効性などの範囲において局所的または全体的のいずれかである。この写像は、本質的に、値のベクトルによって示される入力と（代表的に）単一の値によって示される出力との間の数学的な関係である。
【０１７４】
１つの既知の薬物に対応する１つのサインおよび１つの生物学的活性指標のみが入手可能である場合、２つのサイン（既知の薬物と未知の薬物）の単純な比較は、一般に、未知の薬物の生物活性を予測するのに十分ではない。１つの例外は、２つのサインが非常に似ていて、その結果、同じ生物学的作用を生じる場合である。既知であり生物活性のレベルが異なる２つの薬物が入手可能である場合、未知の薬物に対するサインは、例えば、２つの既知のサインに対する距離指標を使用して比較され得る。２つの距離の間の比は、単に両方の既知の活性に対する予測された生物活性の比として使用され得る。例えば、３つの（規格化された）サインの場合、その代表的な活性は以下である：
【０１７５】
【表６】
2005509856.tif 000011
。
【０１７６】
例えば、実施例４の式を使用して、２つの既知の薬物（ＸおよびＹ）に対するＺのサインの距離は：
Ｚ−Ｘ：      ０．７９  
Ｚ−Ｙ：      ０．５３  
である。
【０１７７】
従って、Ｚの生物活性は、０．７９／０．５３＝１．５の因子のＹに近いことが予想され、この比を使用する単純な計算によって予測される活性が４であることが示される。さらに一般的な場合において、複数のサインおよび複数の生物活性レベルが存在するが、同じ方法論に従い得る。行列技術を含む他の写像代替物（例えば、特異値分解、最小二乗法など）は、同じものに対する強力で一般的な手段を提供し得る。同じレセプターについて入手可能な多くのサインが存在する例として、他の写像および予測選択肢が使用され得る。非線形回帰、人工ニューラルネットワークなどは、写像を構築するのに使用され得る。一旦写像が知られると、その写像は未知の薬物のサインベクトルを使用して未知の薬物の活性を予測するのに使用され得る。後者の場合、多くの潜在的な薬物の生物学的活性が、例えば、細胞ベースのアッセイにおいてかまたは動物モデルを使用して、慣習的に測定される現代の薬物発見に関して特に価値がある。ほんのわずかな薬物候補（代表的に１つ）は、最終的に、臨床試験において試験されるが、臨床試験に進まなかった多くのリガンドについての以前に入手可能な生物学的活性レベルを使用して、未知の薬物の活性を予測するための有用性の写像を開発し得る。
【０１７８】
同じ薬物のいくつかのレセプターに対する複数のサインを開発することがまた可能である。従って、本明細書中に記載される方法論を使用して、複数の生物学的標的に対する、薬物の所望される生物学的プロフィールを選択することが可能である。最終的に、所定のサインと複数の生物学的応答との間の複数の写像を導き、本明細書中に記載される技術と類似する様式で、未知の薬物について写像を予想することが可能である。例えば、エストロゲン性化合物は、体内のいくつかの組織における異なる活性レベルから構成される生物学的プロフィールを生成することが公知である。ＳＥＲＭ化合物（選択的エストロゲンレセプター調節因子）の設計は、生物学的プロフィールを最適化することを試み、本発明の方法論は、異なる生物活性レベルに対する同じサインのいくつかの写像を考察することによって、この応用または類似する応用のために使用され得る。
【０１７９】
本願全体にわたって、種々の刊行物が参照される。これらの刊行物のその全体における開示は、本願に参考として援用され、本発明が関する当該分野の状態をより十分に記載する。さらに、各参考は、当業者の誰もに明らかなように引用される課題に関する、その参考の中の教示について、援用される。これらの刊行物に対する参考は、これらが先行技術であるとも、これらが、本明細書中に記載されるように本発明を開示するとも解釈されないべきである。
【０１８０】
本発明のいくつかの実施形態が、本明細書中に記載され、そして示され、その一方で、当業者は、本明細書中に記載される機能を実施するためおよび／または結果もしくは利点を得るために、種々の他の手段および構造を容易に構想し、このようなバリエーションまたは改変の各々は、本発明の範囲内であるとみなされる。より一般的には、当業者は、本明細書中に記載される全てのパラメーター、大きさ、材料、および形状が、例示であることを意味されること、および実際のパラメーター、大きさ、材料、および形状が、本発明の教示が使用される特定の適用に依存することを容易に理解する。当業者は、慣用的な実験のみを使用して、本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物が、本明細書中に記載されることを認識するか、または確かめ得る。従って、前述の実施形態は、例としてのみ示され、添付の特許請求の範囲およびそれに対する等価物の範囲内に、本発明は、具体的に記載される以外に実施され得ることが理解されるべきである。本発明は、本明細書中に記載される、各個々の特徴、システム、材料および／または方法に関する。さらに、２つ以上のこのような特徴、システム、材料および／または方法の任意の組み合わせは、このような特徴、システム、材料および／または方法が、相互に相反しないものではない場合、本発明の範囲内に含まれる。
【０１８１】
特許請求の範囲において（および上記本明細書中において）、全ての移行句（例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「保有する」、「有する」、「含む（ｃｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「関与する」、「から構成される」、「から作られる」、「から形成される」など）は、開放型である、すなわち、含むがそれらに限定されないことが理解されるべきである。米国特許商標庁の審査手順のマニュアルセクション２１１１．０３に示されるように、移行句「からなる」および「から本質的になる」のみが、それぞれ、閉鎖移行句または半閉鎖移行句である。
【図面の簡単な説明】
【０１８２】
添付の図面（これらは本明細書中に援用され、そして本明細書の一部を構成する）は、本発明のいくつかの実施形態を例証し、そして説明と一緒に本発明の原理を説明するのに役立つ。
【図１】図１は、正規化された棒グラフを用いた、サインの視覚的表示であり、これらの数値は表１に列挙される。横座標上の値１〜４は、それぞれＰＥＧ−ホスフェート、Ｄｅｘ−フィコール、Ｄｅｘ−フィコール−ＮａＳＣＮ、およびＤｅｘ−ＰＥＧの系をいう。
【図２】図２は、正規化されたレーダープロットを用いた、サインの視覚的表示であり、これらの数値は表２に列挙される。各レーダープロットの値１〜４は、それぞれＤｅｘ−ＰＥＧ、ＰＥＧ−３３５０−ホスフェート、Ｄｅｘ−フィコール、およびＤｅｘ−Ｆｉｃｏｌｌ−Ｎａ２ＳＯ４の系をいう。
【図３】図３は、サインに対する、各系の相対的寄与の視覚的表示であり、これらの数値は表２に列挙される。横座標上の値１〜４は、それぞれＤｅｘ−ＰＥＧ、ＰＥＧ−３３５０−ホスフェート、Ｄｅｘ−フィコール、およびＤｅｘ−フィコール−Ｎａ２Ｓ０４の系をいう。
【図１】
2005509856.tif 000012
【図２】
2005509856.tif 000013
【図３】
2005509856.tif 000014
【国際調査報告】
2005509856.tif 000015
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