(57)【要約】界面活性剤と、バシラス・ズブチリス (Bacillus subtilis) 株に対して内因的であるDNA配列によりコードされるペクチン酸リアーゼ (EC 4.2.2.2) またはその安定化変異型とを含んでなる洗浄剤組成物は、よりすぐれたクリーニングおよび汚染除去を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
界面活性剤と、バシラス・ズブチリス (Bacillus subtilis) 株に対して内因的であるDNA配列によりコードされるペクチン酸リアーゼ (EC 4.2.2.2) 酵素またはその安定化変異型とを含んでなる洗浄剤組成物。
【請求項２】
ポリペプチドがバシラス・ズブチリス (Bacillus subtilis) DSM 14218から得られたDNA配列によりコードされる、請求項1に記載の洗浄剤組成物。
【請求項３】
ポリペプチドが配列番号1の位置1〜1197を含んでなるDNA配列によりコードされる、請求項1に記載の洗浄剤組成物。
【請求項４】
ポリペプチドが配列番号1の位置1〜1197を含んでなるDNA配列によりコードされるペクチン酸リアーゼ酵素の安定化変異型である、請求項1に記載の洗浄剤組成物。
【請求項５】
ペクチン酸リアーゼが全組成物の重量の0.0001％〜2％、好ましくは0.0005〜0.5％、より好ましくは0.001％〜0.02％の純粋な酵素レベルで存在する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の洗浄剤組成物。
【請求項６】
プロテアーゼ、セルラーゼ (エンドグルカナーゼ)、β−グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、リダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、キシログルカナーゼ、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ペクチンリアーゼ、他のマンナナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、セロビオヒドラーゼ、トランスグルタミナーゼ、およびそれらの混合物から成る群から選択される1または2以上の酵素をさらに含んでなる、前述の請求項のいずれかに記載の洗浄剤組成物。
【請求項７】
漂白剤、好ましくはマクロポリサイクリック硬質リガンド (Macropolycyclic Rigid Ligand) の遷移金属錯体、過酸化水素放出剤と4−[N−(ノナノイル)アミノヘキサノイルオキシ]−ベンゼンスルホン酸ナトリウムとの組み合わせおよび／またはそれらの混合物をさらに含んでなる、請求項1〜6のいずれか1項に記載の洗浄剤組成物。
【請求項８】
界面活性剤が全洗浄剤組成物の重量の30％まで、好ましくは10％〜25％のレベルで存在するアニオン界面活性剤である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の洗浄剤組成物。
【請求項９】
よりすぐれたクリーニング性能のために、請求項1〜8のいずれか1項に記載の洗浄剤組成物で布帛、食卓用器具または硬質表面をクリーニングする方法。
【請求項１０】
布帛のクリーニングおよび／または布帛の汚染の除去および／または布帛の白色度の維持および／または布帛の柔軟化および／または布帛の色外観および／または布帛の染料移動抑制のための請求項1〜9のいずれか1項に記載の洗浄剤組成物の使用。
【請求項１１】
硬質表面、例えば、床、壁、浴室タイルおよびその他をクリーニングするための請求項1〜8のいずれかに記載の洗浄剤組成物の使用。
【請求項１２】
手および機械による皿洗浄のための請求項1〜8のいずれかに記載の洗浄剤組成物の使用。
【請求項１３】
口腔および／または歯科的適用のための請求項1〜8のいずれかに記載の洗浄剤組成物の使用。
【請求項１４】
下記の1つから選択されるペクチン酸リアーゼ (EC 4.2.2.2) 活性を有するポリペプチド：
(a)配列番号1の位置1〜1197のDNA配列によりコードされるポリペプチド；
(b)DNA配列が発現される条件下に配列番号1の位置1〜1197の配列を含んでなる細胞を培養することによって製造されたポリペプチド；
(c)1、2、3、4または5つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に変更されることによって安定化された (a) または (b) のポリペプチドの位置指定変異型。
【請求項１５】
細菌、好ましくは細菌種バシラス・ズブチリス (Bacillus subtilis) に属する株、好ましくはバシラス・ズブチリス (Bacillus subtilis) DSM 14218から得られたまたは得ることができる、請求項14に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
ポリペプチドが単離され、相同的不純物を含有しない、請求項14に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
請求項14〜16のいずれかに記載の酵素と、慣用の充填剤または安定剤とを含んでなる酵素調製物。
【請求項１８】
プロテアーゼ、セルラーゼ (エンドグルカナーゼ)、β−グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、リダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、キシログルカナーゼ、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ペクチンリアーゼ、他のマンナナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、セロビオヒドラーゼ、トランスグルタミナーゼ、およびそれらの混合物から成る群から選択される1または2以上の酵素をさらに含んでなる、請求項17に記載の調製物。
【請求項１９】
ペクチン酸リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド分子であって、前記ポリヌクレオチド分子は中程度のストリンジェンシイ条件下に変性された二本鎖DNAに対してハイブリダイゼーションし、ここでプローブは配列番号1の位置1〜1197に示す配列を含んでなるDNAプローブ、および配列番号1の位置1〜1197の下位配列を含んでなるDNAプローブから成る群から選択され、前記下位配列は少なくとも約100塩基対の長さを有する、単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項２０】
下記の作用可能に連鎖された因子を含んでなる発現ベクター：転写プロモーター； (a) 配列番号1のヌクレオチド1〜ヌクレオチド1197に示すヌクレオチド配列を含んでなるペクチン酸リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子、および (b)  (a) の縮重ヌクレオチド配列から成る群から選択されるDNAセグメント；および転写ターミネーター。
【請求項２１】
DNAセグメントによりコードされるポリペプチドを発現する、請求項20に記載の発現ベクターが導入された、培養された細胞。
【請求項２２】
請求項20に記載の発現ベクターが導入された細胞を培養し、これにより前記細胞はDNAセグメントによりコードされるポリペプチドを発現し、そして前記ポリペプチドを回収することを含んでなる、ペクチン酸リアーゼ活性を有するペプチドを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バシラス・ズブチリス (Bacillus subtilis) 株から単離されたペクチン酸リアーゼ酵素 (EC 4.2.2.2)、好ましくはバシラス・ズブチリス (Bacillus subtilis) 株からクローニングされたペクチン酸リアーゼ酵素またはその安定化変異型を含んでなる洗浄剤組成物、バシラス・ズブチリス (Bacillus subtilis) 株DSM 14218のプラスミドの中に存在するDNA配列によりコードされるペクチン酸リアーゼ酵素、バシラス (Bacillus) 発現ベクター、およびバシラス (Bacillus) 宿主細胞中でペクチン酸リアーゼを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペクチンポリマーは植物細胞壁の重要な構成成分である。ペクチンは交互するホモガラクツロナン (平滑領域) およびラムノガラクツロナン (毛のある領域) から構成されたバックボーンを有するヘテロ多糖である。平滑領域は1,4−結合α−D−ガラクツロン酸の直鎖状ポリマーである。ガラクツロン酸残基は変化する程度に、通常非ランダム方式でカルボキシル基上においてメチルエステル化することができ、ポリガラクツロン酸のブロックは完全にメチルエステル化される。
【０００３】
ペクチナーゼ類はそれらの優先的基質、高度にメチルエステル化されたペクチンまたは低度にメチルエステル化されたペクチンおよびポリガラクツロン酸 (ペクテート)、およびそれらの反応メカニズム、β−排除または加水分解に従い分類することができる。ペクチナーゼは主として内部作用性であり、ポリマーを連鎖内のランダム部位においてポリマーを切断してオリゴマー混合物を形成するか、あるいは外部作用性であり、ポリマーの1端から攻撃し、モノマーまたは二量体を生成する。ペクチンの平滑領域に対して作用する、いくつかのペクチナーゼ活性は酵素命名法 (Enzyme Nomenclature) により提供される酵素、例えば、ペクチン酸リアーゼ (EC 4.2.2.2)、ペクチンリアーゼ (EC 4.2.2.10)、ポリガラクツロナーゼ (EC 3.2.1.15)、エキソ−ポリガラクツロナーゼ (EC 3.2.1.67) およびエキソ−ポリ−アルファ−ガラクツロナーセ (EC 3.2.1.82) の分類の中に含められる。
【０００４】
WO 99／27083として公開された国際特許出願は、バシラス・リヘニフォルミス (Bacillus licheniformis) からクローニングされたペクチン酸リアーゼを開示している。WO 99／27084として公開された国際特許出願は、バシラス・アガラドヘレンス (Bacillus agaradhaerens)、バシラス・ハロヅランス (Bacillus halodurans) および他のバシラス (Bacillus) 種からクローニングされたペクチン酸リアーゼを開示している。
【０００５】
バシラス・ズブチリス (Bacillus subtilis) からのペクチン酸リアーゼのクローニングは、Nasser他、(1993) FEBS 335：319−326に記載された。このペクチン酸リアーゼは最大の活性のために2価のカチオンを必要とし、カルシウムイオンは最も刺激性である。
JP 2000-262292Aは、バシラス (Bacillus) プロトペクチナーゼをコードする遺伝子、この遺伝子を含有する形質転換体、およびこの形質転換体を使用する繊維の精製を開示している。
【０００６】
米国特許第6,172,030号は、プロトペクチンおよびポリガラクツロン酸基質に対するバシラス (Bacillus) プロトペクチナーゼを含有し、7またはそれより高い最適pHを有する洗浄剤組成物を開示している。
本発明の目的は、洗浄剤組成物において高い性能を有するペクチン酸リアーゼ酵素を提供することである。
【発明の開示】
【０００７】
今回、本発明者らはペクチンリアーゼ (EC 4.2.2.2) 活性を有する新規なポリペプチドを発見し、バシラス (Bacillus) 宿主においてペクチン酸リアーゼ酵素をクローニングし、発現させることに成功した。
したがって、第1の面において、本発明は、界面活性剤と、バシラス・ズブチリス (Bacillus subtilis) 株に対して内因的であるDNA配列またはその安定化変異型によりコードされるペクチン酸リアーゼ (EC 4.2.2.2) 酵素、好ましくはバシラス・ズブチリス (Bacillus subtilis) DSM 14218から得られたDNA配列によりコードされるペクチン酸リアーゼ、またはその位置指定変異型、例えば、配列番号1の位置1〜1197を含んでなるDNA配列によりコードされるポリペプチド、または配列番号1の位置1〜1197を含んでなるDNA配列によりコードされるペクチン酸リアーゼ酵素の位置指定変異型とを含んでなる洗浄剤組成物に関する。
【０００８】
第2の面において、本発明は、よりすぐれたクリーニング性能のために、本発明による洗浄剤組成物で布帛、食卓用器具または硬質表面をクリーニングする方法に関する。
第3の面において、本発明は、布帛のクリーニングおよび／または布帛の汚染の除去および／または布帛の白色度の維持および／または布帛の柔軟化および／または布帛の色外観のためのおよび／または硬質表面、例えば、床、壁、浴室タイルおよびその他をクリーニングするためのおよび／または手および機械による皿洗浄のためのおよび／または口腔および／または歯科的適用のための本発明による洗浄剤組成物の使用に関する。
【０００９】
それ以上の面において、本発明は、下記の1つから選択されるペクチン酸リアーゼ (EC 4.2.2.2) 活性を有するポリペプチドに関する：(a) 配列番号1の位置1〜1197のDNA配列によりコードされるポリペプチド；(b) DNA配列が発現される条件下に配列番号1の位置1〜1197の配列を含んでなる細胞を培養することによって製造されたポリペプチド；(b) 1、2、3、4または5つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に変更されることによって安定化された (a) または (b) のポリペプチドの位置指定変異型。
【００１０】
なおそれ以上の面において、本発明のペクチン酸リアーゼ酵素を含んでなる酵素調製物、本発明のペクチン酸リアーゼをコードする単離されたポリヌクレオチド分子、本発明のペクチン酸リアーゼを発現することができる培養された細胞、および本発明のペクチン酸リアーゼを製造する方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の目的に対して、用語「から得られた」または「から得ることができる」は、特定の源に関して本明細書において使用するとき、酵素が特定の源により、または前記源からの遺伝子が挿入された細胞により、産生されるか、あるいは産生されることができることを意味する。
【００１２】
用語「野生型酵素」は、天然に存在する生物、例えば、天然に見出される真菌または細菌に対して内因的である酵素を意味する。
用語「親酵素」は、本明細書において使用するとき、本発明の酵素変異型を生成するように修飾された酵素を意味する。親酵素は天然源から単離された酵素、または以前に1または2以上の修飾がなされたが、問題の酵素の特徴ある活性を保持する酵素であることができる。本発明の親ペクチン酸リアーゼは野生型ペクチン酸リアーゼであることができる。
【００１３】
用語「酵素変異型」は、アミノ酸配列が親酵素のそれと異なる酵素を意味する。差は親酵素に比較して置換、欠失および／または挿入を含む。
本発明のペクチン酸リアーゼはバシラス・ズブチリス (Bacillus subtilis) 株から得ることができる。
好ましい態様において、本発明のペクチン酸リアーゼはバシラス・ズブチリス (Bacillus subtilis) 種から得られる。バシラス・ズブチリス (Bacillus subtilis) 株は、特許手続きの目的のための微生物の寄託の国際的承認についてのブタベスト条約の規定に従い本発明者らにより寄託された (Deutsche Sammlung von Mikrooganismen und Zellkulturen GmbH、Mascheroder Weg 1b、D−38124 Braunschweig、ドイツ国、2001年4月5日、受託番号DSM 14218)。
【００１４】
本発明の関係において、用語「酵素調製物」は、下記のものを意味することを意図する：単一種の微生物から、可能ならば単離および精製された、慣用の酵素発酵産物、このような調製物は通常多数の異なる酵素活性を含んでなる；または1成分の酵素、好ましくは慣用組換え技術を使用することによって細菌または真菌種から誘導される酵素の混合物、前記酵素は発酵され、可能ならば別々に単離され、精製されており、そして異なる種、好ましくは真菌または細菌種に由来することができる；または組換えペクチン酸リアーゼを発現する宿主細胞として作用する微生物の発酵産物、しかし前記微生物は同時に他の酵素、例えば、キシログルカナーゼ、プロテアーゼ、またはセルラーゼを産生し、前記酵素は微生物の天然に存在する発酵産物、すなわち、対応する天然に存在する微生物により普通に産生される酵素複合体である。
【００１５】
本発明の関係において、用語「発現ベクター」は、その転写を提供する追加のセグメントに作用可能に連鎖された問題のポリペプチドをコードするセグメントを含んでなる、線状または環状のDNA分子を意味する。このような追加のセグメントはプロモーターおよびターミネーター配列を包含することができ、必要に応じて1または2以上の複製領域、1または2以上の選択可能なマーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、およびその他を含むことができる。発現ベクターは一般にプラスミドまたはウイルスDNAに由来し、または両方の因子を含有することができる。
【００１６】
本発明の発現ベクターは組換えDNA手順に好都合に付される任意の発現ベクターであることができ、そしてベクターの選択はしばしばベクターを導入すべき宿主細胞に依存するであろう。こうして、ベクターは自律的に複製するベクター、すなわち、染色体外実在物として存在するベクターであることができ、その複製は染色体複製に対して独立であり、例えば、プラスミドである。選択的に、ベクターは、宿主細胞の中に導入したとき、宿主細胞ゲノムの中に組込まれ、それが組込まれた1または2以上の染色体と一緒に複製するものであることができる。
【００１７】
用語「発現された組換え体」または「組換え的に発現された」は、ポリペプチドまたはタンパク質の発現に関して本明細書において使用するとき、この分野において標準的定義に従い定義される。一般に、タンパク質の組換え発現は、直ぐ上に記載した発現ベクターを使用することによって実施される。
【００１８】
用語「単離された」は、ポリヌクレオチド分子に適用するとき、ポリヌクレオチドがその天然の遺伝的環境から除去されており、こうして他の外部または不必要なコーディング配列を含まず、そして遺伝子操作されたタンパク質産生系内の使用に適当な形態であることを意味する。このような単離された分子は天然の環境から分離された分子であり、cDNAおよびゲノムクローンを包含する。本発明の単離されたDNA分子は、それらが通常関連する他の遺伝子を含まないが、天然に存在する5’ および3’ 非翻訳領域、例えば、プロモーターおよびターミネーターを包含することができる。関連する領域の同定は当業者にとって明らかであろう (例えば、下記文献を参照のこと、DynanおよびTijan、Nature 316：774−78、1985)。用語「単離されたポリヌクレオチド」は、選択的に、「クローニングされたポリヌクレオチド」と命名することができる。
【００１９】
タンパク質／ポリペプチドに適用するとき、用語「単離された」は、タンパク質がその自然環境以外の条件において見出されることを示す。好ましい形態において、単離されたタンパク質は他のタンパク質、特に他の相同的タンパク質 (すなわち、「相同的不純物」(下文参照)) を実質的に含まない。40％より高い純粋な形態、より好ましくは60％より高い純粋な形態でタンパク質を提供することが好ましい。
なおより好ましくは、SDS−PAGEにより測定して、高度に精製された形態、すなわち、80％より高い、より好ましくは95％高い、なおより好ましくは99％より高い純粋な形態でタンパク質を提供することが好ましい。
【００２０】
用語「単離されたタンパク質／ポリペプチド」は、選択的に、用語「精製されたタンパク質／ポリペプチド」と命名することができる。
用語「相同的不純物」は、本発明のポリペプチドが本来得られる相同的細胞に由来する任意の不純物 (例えば、本発明のポリペプチド以外の他のポリペプチド) を意味する。
用語「から得られた」は、特定の微生物源に関して本明細書において使用するとき、ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドが特定の源により、または前記源からの遺伝子が挿入されている細胞により産生されることを意味する。
【００２１】
用語「作用可能に連鎖された」は、DNAセグメントについて言及するとき、セグメントがそれらの意図する目的に対してと共同して機能するように、例えば、転写がプロモーターにおいて開始し、コーディングセグメントを通してターミネーターに進行するように、セグメントが配置されていることを意味する。
用語「ポリヌクレオチド」は、5’ → 3’ 末端の方向に読んでデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドはRNAおよびDNAを包含し、そして天然源から単離し、in vitro合成し、または天然分子と合成分子との組み合わせから調製することができる。
【００２２】
用語「ポリヌクレオチド分子の相補体」は、参照配列に比較して相補的塩基配列および逆向きを有するポリヌクレオチド分子を意味する。例えば、配列5’ ATGCACGGG 3’ は5’ CCCGTGCAT 3’に対して相補的である。
用語「縮重ヌクレオチド配列」は、1または2以上の縮重コドンを含むヌクレオチド配列を意味する (ポリペプチドをコードする参照ポリヌクレオチド分子に比較して)。縮重コドンはヌクレオチドの異なるトリップレットを含有するが、同一アミノ酸残基をコードする (すなわち、GAUおよびGACトリップレットの各々はAspをコードする)。
【００２３】
用語「プロモーター」は、RNAポリメラーゼ結合および転写開始を提供するDNA配列を含有する遺伝子の部分を意味する。プロモーター配列は、常にではなく、普通に、遺伝子の5’ 非コーディング領域の中に見出される。
用語「分泌シグナル配列」は、より大きいポリペプチドの構成成分として、より大きいポリペプチドを合成する細胞の分泌経路を通してそれを向けるポリペプチド (「分泌ペプチド」) をコードするDNA配列を意味する。より大きいペプチドは、分泌経路を通して移行する間に普通に切断されて、分泌ペプチドを除去する。
【００２４】
用語「同一性」は、2つのアミノ酸配列間または2つのヌクレオチド配列間の相同性を意味する。本発明の目的に対して、2つのアミノ酸配列間の同一性の程度は、タンパク質およびDNAの両方のアラインメントに有用な、ニードルマン-ウンシュ (Needleman-Wunsch) アラインメントにより決定される。タンパク質のアラインメントについて、使用するデフォルトスコアリングマトリックスはBLOSUM 50であり、そしてギャップ中の第1残基についてのペナルティーは−12であるが、ギャップ中の追加の残基についてのペナルティーは−2である。FASTAパッケージバージョンv20u6からのアライン (Align) ソフトウェアを使用して、アラインメントを実行することができる (W. R. PearsonおよびD. J. Lipman (1988)、“Improved Tools for Biological Sequence Analysis”、PNAS 85：2444−2448；およびW. R. Pearson (19910) “Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA”、Methods in Enzymology 183：63−98)。
【００２５】
2つのヌクレオチド配列間の同一性の程度は、デフォルトスコアリングマトリックスとして同一性マトリックスを使用する前述と同一のアルゴリズムおよびソフトウェアパッケージを使用して決定することができる。ギャップ中の第1残基についてのペナルティーは−12であるが、ギャップ中の追加の残基についてのペナルティーは−4である。
【００２６】
酵素変異型
本発明の関係において、用語「酵素変異型」は、そのアミノ酸配列が標準的酵素のアミノ酸配列と異なる酵素を意味する。差は標準的酵素に比較して置換、欠失および／または挿入を含む。
本発明の関係において、細胞壁分解酵素、特にペクチン酸リアーゼ酵素中のアミノ酸残基位置の特定のナンバリングを用いる。例えば、既知のペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列を整列させることによって、アミノ酸配列が既知である場合、アミノ酸位置の番号を任意のペクチン酸リアーゼ酵素中の任意のアミノ酸残基に明瞭に割り当てることが可能である。
【００２７】
多数の他のペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列と整列させた、配列番号2に開示する、バシラス・ズブチリス (Bacillus subtilis) 株DSM 14218のプラスミド中に存在するポリヌクレオチドによりコードされるペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に由来するナンバリングシステムを使用して、ペクチン酸リアーゼ中のアミノ酸残基の位置を明瞭に示すことが可能である。
本発明に従い産生されたまたは意図される種々のペクチン酸リアーゼ酵素を記載するとき、参照を容易とするために下記の命名法を採用する：
【００２８】
置換：
［もとのアミノ酸；位置；置換されたアミノ酸］
したがって、位置72におけるセリンのイソロイシンによる置換はS72Iと表示される。
複数の突然変異は追加のマーク (“＋”) で分離し、例えば、M169I＋F198Vであり、位置169および198において、それぞれ、メチオニン (M) がイソロイシン (I) 、およびフェニルアラニン (F) がバリン (V) により置換されている突然変異体を表す。
【００２９】
欠失：
位置195におけるグリシンの欠失は下記により示される：
Gly195* またはG195*
相応して2以上のアミノ酸残基の欠失、例えば、位置195および196におけるグリシンおよびロイシンの欠失は次のように表示される：
Gly195*＋Leu196* またはG195*＋L196*
【００３０】
挿入：
追加のアミノ酸残基の挿入、例えば、G195後のリシンの挿入は下記により表示される：
Gly195GlyLysまたはG195GK
または、2以上のアミノ酸残基が挿入されるとき、例えば、G195後にLysおよびAlaが挿入されるとき、これは次のように表示される：
Gly195GlyLysAlaまたはG195GKA
【００３１】
このような場合において、1または2以上の挿入されたアミノ酸残基は、1または2以上の挿入されたアミノ酸残基に先行するアミノ酸残基の位置番号にロワーケース文字を付加することによって番号を付される。上の例において、配列194〜196はこうして次のように変化される：
【００３２】
【表１】
2005507644.tif 000002
【００３３】
存在するアミノ酸残基と同一のアミノ酸残基が挿入される場合、命名法における縮重が発生することが明らかである。例えば、グリシンが上の例においてグリシン後にグリシンが挿入される場合、これはG195GGにより示される。同一の実際の変化はちょうど下記の変化についてその上A194AGとして示すことができるであろう：
【００３４】
【表２】
2005507644.tif 000003
【００３５】
このような例は当業者にとって明らかであり、そして指示G195GGおよびこの型の挿入についての対応する指示はこうしてこのような同等の縮重指示を含んでなることを意味する。
ペクチン酸リアーゼのナンバリングにより本明細書において言及するすべての位置は、特記しない限り、前述のナンバリングを意味し、そして配列番号2に開示する、バシラス・ズブチリス (Bacillus subtilis) 株DSM 14218のプラスミド中に存在するポリヌクレオチドによりコードされるペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に関して決定される。
【００３６】
用語「洗浄剤安定性」または「貯蔵安定性」は、洗浄剤、例えば、アニオン界面活性剤を含有する配合物中のタンパク質の安定性を意味することを意図する。アニオン界面活性剤はアニオン基と疎水性テイルとの組み合わせにより特徴づけられる。タンパク質に結合するとき、リシンまたはアルギニンのような正に帯電した残基、および疎水性領域はこうして相互作用点である可能性がある。同様に、特定の柔軟性領域の力学は、タンパク質の内部に通常埋もれているアミノ酸に対するアクセス可能性を提供する。これらの残基は典型的には疎水性であり、こうして界面活性剤のテイルにとって魅力的である。酵素と界面活性剤との間の化学的相互作用は、高い確実性で酵素を不活性にして残すであろう。こうして、改良された洗浄剤安定性および貯蔵安定性は、ある洗浄剤濃度および温度において、ある期間後に、より高い酵素活性を保持するであろう (より高い残留活性)。したがって、熱安定性および洗浄剤安定性はタンパク質または酵素の2つの独立的特性である。
【００３７】
ポリヌクレオチド
本発明の好ましい態様において、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、少なくとも中程度のストリンジェンシイ条件下に、配列番号1の同様な大きさの領域またはそれに対して相補的な配列に対してハイブリダイゼーションするであろう。
特に、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号1に示す完全な配列または配列番号1の位置1〜1197に示す配列を含んでなる変性された二本鎖DNAプローブ、または少なくとも約100塩基対の長さを有する配列番号1の下位配列を含んでなる任意のプローブに対して、少なくとも中程度のストリンジェンシイ条件下に、好ましくは高ストリンジェンシイ条件下に、以後詳細に記載するように、ハイブリダイゼーションするであろう。
【００３８】
ヌクレオチドプローブと相同的DNAまたはRNA配列との間の中程度または高いストリンジェンシイ条件におけるハイブリダイゼーションを決定するために適当な実験条件は、5×SSC (塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム、Sambrook他、1989) 中でハイブリダイゼーションすべきDNAフラグメントまたはRNAを含有するフィルターを10分間前ソーキングし、5×SSC、5×デンハルト溶液 (Sambrook他、1989)、0.5％SDSおよび100 μg／mlの変性超音波処理サケ精子DNA (Sambrook他、1989) の溶液中でフィルターをプレハイブリダイゼーションし、次いで10 ng／mlの濃度のランダムプライムド (Feinberg A. P. およびVogelstein B. (1983) Anal. Biochem. 132：6−13)、32P−dCTP標識化 (1×109 cpm／μg高い比活性) プローブを含有する同一溶液中で約45 ℃において12時間インキュベートした。次いでフィルターを2回30分間2×SSC、0.5％SDS中で少なくとも60 ℃ (中程度のストリンジェンシイ) 、なおより好ましくは少なくとも65 ℃ (中程度／高いストリンジェンシイ) 、さらにより好ましくは少なくとも70 ℃ (高いストリンジェンシイ) 、さらにいっそう好ましくは少なくとも75 ℃ (非常に高いストリンジェンシイ) において洗浄する。
【００３９】
これらの条件下にオリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイゼーションする分子を、X線フィルムにより検出する。
前述したように、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、DNAおよびRNAを包含する。DNAおよびRNAを単離する方法は、この分野においてよく知られている。DNAおよびRNAをコードする問題の遺伝子は、この分野において知られている方法により遺伝子バンクまたはDNAライブラリー中でクローニングすることができる。
【００４０】
次いで、本発明のペクチン酸リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えば、ハイブリダイゼーションまたはPCRにより、同定し、単離する。
さらに、本発明は、異なる細菌株からの対応物ポリペプチドおよびポリヌクレオチドを提供する (オーソログまたはパラログ)。株DSM 14218により例示される、バシラス・ズブチリス (Bacillus subtilis) 株からのペクチン酸リアーゼポリペプチドは特に重要である。
【００４１】
慣用のクローニング技術と組み合わせて本発明により提供される情報および組成を使用して、本発明のペクチン酸リアーゼ活性を有するポリペプチドの種相同体をクローニングすることができる。例えば、本発明のDNA配列は、タンパク質を発現する細胞型から得られた染色体DNAを使用してクローニングすることができる。ノザンブロットを本明細書に開示する配列から設計したプローブでプロービングすることによって、適当なDNA源を同定することができる。次いで陽性細胞系統の染色体DNAから、ライブラリーを調製する。次いで、種々の方法により、例えば、本明細書に開示する配列から設計したプローブで、または開示された配列をベースとする1または2以上の組の縮重プローブでプロービングすることによって、ペクチン酸リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする本発明のDNA配列を単離することができる。
【００４２】
また、本発明のDNA配列は、本明細書に開示する配列から設計したプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応すなわちPCR (Mullis、米国特許第4,683,202号) によりクローニングすることができる。追加の方法において、DNAライブラリーを使用して宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトすることができ、そして問題のDNAの発現をバシラス・ズブチリス (Bacillus subtilis)、例えば、DSM 14218からクローニングされたペクチン酸リアーゼに対して発生した抗体 (モノクローナルまたはポリクロナール) で検出し、材料および方法および実施例に記載されているように、またはペクチン酸リアーゼ活性に関する活性試験により、発現させ、精製することができる。
【００４３】
ポリペプチド
配列番号1の位置1〜1197におけるアミノ酸配列は、本発明の酵素の触媒活性ドメインを含んでなる成熟ペクチン酸リアーゼ配列を表す。
また、本発明は、配列番号1の位置1〜1197におけるアミノ酸のポリペプチドおよびそれらの種相同体 (パラログまたはオーソログ) に対して実質的に相同的であるペクチン酸リアーゼポリペプチドを提供する。用語「実質的に相同的」は、本明細書において、配列番号1の位置1〜1197のアミノ酸に示す配列に対して98.5％、好ましくは少なくとも99％、より好ましくは少なくとも99.5％の配列同一性を有するポリペプチドまたはそのオーソログまたはパラログを意味するために使用される。配列同一性百分率は、前述したようにニードルマン−ウンシュ (Needleman−Wunsch) アラインメントにより決定される。
【００４４】
実質的に相同的なタンパク質は、1または2以上のアミノ酸の置換、欠失または付加を有するとして特性決定される。これらの変化は下記の小さい特質を有することが好ましい：保護的アミノ酸置換 (表2参照) およびタンパク質またはポリペプチドのフォルディングまたは活性に有意に影響を与えない他の置換；小さい欠失、典型的には1〜約30アミノ酸の欠失；および小さいアミノ末端またはカルボキシル末端のエクステンション、例えば、アミノ末端のメチオニン残基、約20〜25残基までの小さいリンカーペプチド、または精製を促進する小さいエクステンション (親和標識) 、例えば、ポリヒスチジン、プロテインA (Nilsson他、ENBO J. 4：1075、1985；Nilsson他、Methods Enzymol. 198：3、1991。一般に、下記の文献を参照のこと：Ford他、Protein Expression and Purification 2：95−107、1991、これは引用することによって本明細書の一部とされる)。親和標識をコードするDNAは商業的供給会社 (例えば、Pharmacia Biotec、ニュージャージー州パルシパニイ；New England Biolabs、マサチューセッツ州ベッドフォード) から入手可能である。
【００４５】
しかしながら、前述の変化が小さい特質を有するが、このような変化はまたより大きい特質、例えば、300またはそれより多いアミノ酸のより大きいポリペプチドとペクチン酸リアーゼ活性を有する本発明のポリペプチドとの融合物であることがある。
【００４６】
【表３】
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【００４７】
20の標準的アミノ酸に加えて、非標準的アミノ酸 (例えば、4−ヒドロキシプロリン、6−N−メチルリシン、2−アミノイソ酪酸、イソバリンおよびα−メチルセリン) を本発明によるポリペプチドのアミノ酸残基と置換することができる。制限された数の非保存的アミノ酸、遺伝コードによりコードされないアミノ酸、および非天然アミノ酸をアミノ酸残基と置換することができる。「非天然アミノ酸」はタンパク質合成後に修飾されてきており、および／または標準的アミノ酸と1または2以上の側鎖の化学的構造が異なる。非天然アミノ酸は化学的に合成することができるか、あるいは好ましくは、商業的に入手可能であり、そしてピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、3−および4−メチルプロリン、および3,3−ジメチルプロリンを包含する。
【００４８】
本発明のペクチン酸リアーゼポリペプチド中で必須アミノ酸は、この分野において知られている手順、例えば、位置指定突然変異誘発またはアラニン走査突然変異誘発に従い同定することができる (CunninghamおよびWells、Science 244：1081−1085、1989)。後者の技術において、単一アラニン突然変異を分子中のすべての残基に導入し、そして生ずる突然変異体分子を生物活性 (すなわち、ペクチン酸リアーゼ活性) について試験して、この分子の活性に対して重大であるアミノ酸残基を同定する。
【００４９】
また、下記の文献を参照のこと：Hilton他、J. Biol. Chem. 271：4699−4708、1996。また、核磁気共鳴、結晶学、電子回折またはフォトアフィニティーラベリングと、推定上の接触部位アミノ酸の突然変異との組み合わせのような技術により測定する、構造の物理的解析により、酵素の活性部位または生物学的相互作用を決定することができる。例えば、下記の文献を参照のこと：de Vos他、Science 255：306−312、1992；Smith他、J. Mol. Biol. 224：899−904、1992；Wlodaver他、FEBS Lett. 309：59−64、1992。また、必須アミノ酸の同一性は本発明によるポリペプチドに関係するポリペプチドとの相同性の解析から推定することができる。
【００５０】
既知の突然変異誘発、組換えおよび／またはシャフリング法および引き続くスクリーニング手順、例えば、下記の文献に記載されている手順を使用して、複数のアミノ酸置換を実施し、試験することができる：Reidhaar−OlsonおよびSauer、Science 241：53−57、1988；BowieおよびSauer、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86：2152−2156、1989；WO 95／17413；またはWO 95／22625。簡単に述べると、これらの著者らは、ポリペプチド中の2またはそれ以上の位置を同時にランダム化し、異なる突然変異の組換え／シャフリングし (WO 95／17413、WO 95／22625) 、引き続いて機能的ポリペプチドを選択し、次いで突然変異化したポリペプチドを配列決定して各位置における許容可能な置換のスペクトルを決定する方法を開示している。使用できる他の方法は、ファージディスプレイ (例えば、Lowman他、Biochem. 30：10832−10837、1991；Ladner他、米国特許第5,223,409号；Huse、WIPO公開WO 92／06204) および領域指定突然変異誘発 (Derbyshire他、Gene 46：145、1986；Ner他、DNA 7：127、1988) を包含する。
【００５１】
前述の突然変異誘発／シャフリング法を高い処理量の自動化スクリーニング法と組み合わせて、宿主細胞中のクローニングされた突然変異化ポリペプチドを検出することができる。活性ポリペプチドをコードする突然変異化DNA分子を宿主細胞から回収し、現代的装置を使用して急速に配列決定する。これらの方法は、問題のポリペプチド中の個々のアミノ酸残基の重要性の急速な決定を可能とし、未知の構造のポリペプチドに適用することができる。
【００５２】
好ましい態様において、本発明は、バシラス・ズブチリス (Bacillus subtilis) DSM 14218または他のバシラス・ズブチリス (Bacillus subtilis) 株に対して内因的であるペクチン酸リアーゼの変異型酵素を提供し、前記変異型は1、2、3、4または5つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に変更されている位置指定変異型であり、これにより洗浄剤組成物中の安定性が増加した変異型酵素を得る。
配列番号2のペクチン酸リアーゼの変異型酵素の例は、下記の実施例6およびC. 免疫学的交差反応性に開示されているものを包含するが、これらに限定されない。
【００５３】
免疫学的交差反応性の決定において使用するポリクローナル抗体、特に単一特異性ポリクローナル抗体は、ペクチン酸リアーゼ活性を有する精製された酵素を使用することによって調製することができる。より詳しくは、下記の文献に記載されている手順に従いウサギ (他の齧歯類) を免疫化することによって、本発明のペクチン酸リアーゼに対する抗血清を発生させることができる：N. Axelsen他、 A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis、Blackwell Scientific Publications、1973、Chapter 23、またはA. JohnstoneおよびR. Thorpe、Immunochemistry in Practice、Blackwell Scientific Publications、1982 (より詳しくは、pp. 27−31)。
【００５４】
抗血清から、例えば、塩沈降 ((NH4)2SO4) 、および引き続く透析および、例えば、DEAE−Sephadex上の、イオン交換クロマトグラフィーにより、精製された免疫グロブリンを得ることができる。タンパク質の免疫化学的特性決定は、Outcherlony二重拡散分析 (O. Outcherlony、Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir編者) 、Blackwell Scientific Publications、1967、pp. 655−706)、交差免疫電気泳動 (N. Axelsen他、前掲、Chapter 3および4)、またはロケット免疫電気泳動 (N. Axelsen他、Chapter 2) により実施することができる。
【００５５】
ベクター
さらに詳細に後述するように、ペクチン酸リアーゼをコードするDNA配列を含んでなるベクターで本発明の宿主を形質転換する。好ましくは、ベクターを宿主のゲノムの中に組込み、より好ましくはベクターはゲノム上で増幅されている。
本発明の好ましい態様において、ベクターは発現プラスミドとして、好ましくはマルチコピープラスミドとして存在する。
本発明のバシラス (Bacillus) 発現ベクターは、挿入されたペクチン酸リアーゼエンコーディングDNA配列を担持する。好ましくは、ベクターの発現カセットは、バシラス (Bacillus) 種からの調節領域を含んでなり、より好ましくは宿主に対して内因的である、このような調節領域である。
【００５６】
ペクチン酸リアーゼ酵素の発現
組換え発現ベクター
本発明の酵素をコードするDNA構築物を含んでなる組換えベクターは組換えDNA手順に好都合に付すことができる任意のベクターであり、そしてベクターの選択はそれを導入すべき宿主細胞にしばしば依存するであろう。この宿主細胞の中へのベクターの導入は、形質転換された宿主細胞としばしば言及される。このような形質転換は、例えば、プロトプラスト、天然のコンピテント細胞、トランスフェクション、接合、エレクトロポレーション、または任意の同等の方法による宿主細胞の中へのDNAの導入を示す。こうして、ベクターは自律的に複製するベクター、すなわち、染色体外実在物であることができ、その複製は染色体の複製に対して独立であり、例えば、プラスミドである。選択的に、ベクターは、宿主細胞の中に導入したとき、宿主細胞ゲノムの中に組込まれ、それが組込まれた1または2以上の染色体と一緒に複製するものであることができる。
【００５７】
ベクターは、本発明のペクチン酸リアーゼ酵素をコードするDNA配列がDNAの転写に必要な追加のセグメントに作用可能に連鎖されている、発現ベクターであることが好ましい。一般に、発現ベクターはプラスミドまたはウイルスのDNAに由来するか、あるいは両方の因子を含有することができる。用語「作用可能に連鎖された」は、セグメントがそれらの意図する目的に対してと共同して機能するように、例えば、転写がプロモーターにおいて開始し、CBDをコードするDNA配列を通して進行するように、セグメントが配置されていることを意味する。
【００５８】
プロモーターは選択した宿主細胞において転写活性を示す任意のDNA配列であることができ、宿主細胞に対して相同的または異種的であるタンパク質をコードする遺伝子に由来することができる。
【００５９】
細菌宿主細胞において使用するために適当なプロモーターの例は次の通りである：バシラス・ステアロサーモフィラス (Bacillus sterothermophillus) マルトジェニックアミラーゼ遺伝子、バシラス・リヘニフォルミス (Bacillus licheniformis) α−アミラーゼ遺伝子、バシラス・アミロリクファシエンス  (Bacillus amyloliquefaciens) α−アミラーゼ遺伝子、バシラス・ズブチリス (Bacillus subtilis) アルカリ性プロテアーゼ遺伝子、またはバシラス・プミラス (Bacillus pumillus) キシロシダーゼ遺伝子のプロモーター、またはファージラムダPRまたはPLプロモーターまたは大腸菌 (E. coli) lac、trpまたはtacプロモーター。選択的に、ペクチン酸リアーゼ酵素をコードするDNAがいったん宿主ゲノムの中に適切に、例えば、滞留プロモーターから下流に組込まれると、それがはじめて機能的に発現されるようになるように、組込みベクターを設計することが可能である。
【００６０】
本発明のペクチン酸リアーゼ酵素をコードするDNA配列を、必要に応じて、適当なターミネーターに作用可能に結合させることができる。
本発明の組換えベクターは、問題の宿主細胞中でベクターを発現させることができるDNA配列をさらに含んでなることができる。
ベクターは、また、選択可能なマーカー、例えば、その産物が宿主細胞における欠陥を補足する遺伝子、または、例えば、カナマイシン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、テトラサイクリン、スペクチノマイシン、およびその他のような抗生物質に対する耐性、または重金属または除草剤に対する耐性をコードする遺伝子を含んでなることができる。
【００６１】
本発明のペクチン酸リアーゼ酵素を宿主細胞の分泌経路の中に向けるために、分泌シグナル配列 (またリーダー配列、プレプロ配列またはプレ配列として知られている) を組換えベクターの中に準備ことができる。ペクチン酸リアーゼ酵素をコードするDNA配列に正しいリーデイングフレームで分泌シグナル配列を結合する。分泌シグナル配列はペクチン酸リアーゼ酵素をコードするDNA配列に対して5’ に普通に位置決定される。分泌シグナル配列は、通常ペクチン酸リアーゼ酵素に関連するものであるか、あるいは他の分泌されるタンパク質をコードする遺伝子に由来することができる。
【００６２】
ペクチン酸リアーゼ酵素をコードするDNA配列、プロモーターおよび必要に応じてターミネーターおよび／または分泌シグナル配列を連結するか、あるいはこれらの配列を適当なPCR増幅スキームにより構築し、そして複製または組込みに必要な情報を含有する適当なベクターの中にそれらを挿入するために使用する手順は当業者によく知られている (例えば、下記文献を参照のこと、Sambrook他、前掲)。
【００６３】
宿主細胞
宿主細胞の中に導入されるクローニングされたDNA分子は、問題の宿主に対して相同的または異種的であることができる。宿主細胞に対して相同的である場合、すなわち、天然の宿主細胞により産生される場合、それは典型的には他のプロモーター配列、あるいは適用可能な場合、その天然の環境以外において他の分泌シグナル配列および／またはターミネーター配列に作用可能に結合されている。用語「相同的」は、問題の宿主生物に対して自然である酵素をコードするDNA配列を包含することを意図する。用語「異種的」は、自然における宿主細胞により発現されないDNA配列を包含することを意図する。こうして、DNA配列は他の生物に由来するか、あるいは合成配列であることができる。
【００６４】
本発明のクローニングされたDNA分子が導入された宿主細胞は必要な酵素を産生することができる任意の細胞であることができ、そして細菌、酵母、真菌および高等真核生物の細胞を包含する。
【００６５】
培養時に本発明の酵素を産生することができる細菌細胞の例は、グラム陽性細菌、例えば、バシラス (Bacillus) 株、特にバシラス・アルカロフィルス (Bacillus alkalophilus)、バシラス・アミロリクファシエンス (Bacillus amyloliquefaciens)、バシラス・ブレビス (Bacillus brevis)、バシラス・ラウツス (Bacillus lautus)、バシラス・レンツス (Bacillus lentus)、バシラス・リヘニフォルミス (Bacillus licheniformis)、バシラス・サーキュランス (Bacillus circulans)、バシラス・コアギュランス (Bacillus coagulans)、バシラス・メガテリウム (Bacillus megatherium)、バシラス・ステアロサーモフィラス (Bacillus sterothermophillus)、バシラス・ズブチリス (Bacillus subtilis) およびバシラス・スリンジェンシス (Bacillus thuringiensis)、ラクトバシラス (Lactobacillus) 株、ストレプトコッカス (Streptococcus) 株、ストレプトマイセス (Streptomyces) 株、特にストレプトマイセス・リビダンス (Streptomyces lividans) およびストレプトマイセス・ムリヌス (Streptomyces murinus) であることができるか、あるいは宿主細胞はグラム陰性菌、例えば、大腸菌 (Escherichia coli) 株であることができる。
【００６６】
細菌の形質転換は、プロトプラストの形質転換、エレクトロポレーション、接合により、またはそれ自体知られている方法 (例えば、Sambrook他、前掲、参照) においてコンピテント細胞を使用することによって実施することができる。
【００６７】
大腸菌 (Escherichia coli) のような細菌中で酵素を発現させるとき、酵素を細胞質の中に、典型的には不溶性粒体 (封入体として知られている) として保持することができるか、あるいは細菌分泌経路により周辺腔に向けることができる。前者の場合において、細胞を溶解し、粒体を回収し、変性し、次いで変性剤を希釈することによって酵素をリフォルディングする。後者の場合において、例えば、超音波処理または浸透圧ショックにより、細胞を崩壊させることによって、周辺腔の内容物を解放し、酵素を回収することによって、酵素を周辺腔から回収することができる。
【００６８】
グラム陽性細菌、例えば、バシラス (Bacillus) 株またはストレプトマイセス (Streptomyces) 株中で酵素を発現させるとき、酵素を細胞質の中に保持することができるか、あるいは細菌分泌経路により細胞外媒質に向けることができる。
【００６９】
培養時に本発明の酵素を産生することができる真菌宿主の例は、例えば、アスペルギルス (Aspergillus) またはフザリウム (Fusarium) の株、特にアスペルギルス・アワモリ (Aspergillus awamori)、アスペルギルス・ニヅランス (Aspergillus nidulans)、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger)、アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryze) 、およびフザリウム・オキシスポラム (Fusarium oxysporum)、およびトリコデルマ (Trichoderma) 株、好ましくはトリコデルマ・ハルジアナム (Trichoderma harzianum)、トリコデルマ・リーセイ (Trichoderma reesei) およびトリコデルマ・ビリデ (Trichoderma viride) である。
【００７０】
真菌細胞は、それ自体知られている方法におけるプロトプラストの形成およびプロトプラストの形質転換および引き続く細胞壁の再生を包含するプロセスにより形質転換することができる。宿主細胞としてアスペルギルス (Aspergillus) 株の使用は、EP 238 023 (Novo Nordisk A／S) (その内容は引用することによって本明細書の一部とされる) に記載されている。
【００７１】
培養時に本発明の酵素を産生することができる酵母由来の宿主細胞の例は、例えば、ハンゼヌラ (Hansenula) 種の株、例えば、クライベロマイセス (Kluyveromyces)、特にクライベロマイセス・ラクチス (Kluyveromyces lactis) およびクライベロマイセス・マルシアヌス (Kluyveromyces marcianus)、ピキア (Pichia) 種の株、サッカロマイセス (Saccharomyces) の株、特にサッカロマイセス・カルスベルゲンシス (Saccharomyces carlsbergensis) 、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisae) 、サッカロマイセス・ルルイベリ (Saccharomyces kluyveri) およびサッカロミセス・ウバラム (Saccharomyces uvarum)、シゾサッカロマイセス (Schizosaccharomyces) 種の株、特にシゾサッカロマイセス・ポンベ (Schizosaccharomyces pombe)、およびヤロウィア (Yarrowia) 種の株、特にヤロウィア・リポリチカ (Yarrowia lipolytica) である。
【００７２】
培養時に本発明の酵素を産生することができる植物由来の宿主細胞の例は、ソラヌム・ツベロサム (Solanum tuverosum) またはニコチアナ・タバクム (Nicotiana tabacum) の植物細胞である。
【００７３】
ペクチン酸リアーゼ酵素を製造する方法
他の面において、本発明は、また、本発明の酵素調製物を製造する方法に関し、この方法は酵素の産生を可能とする条件下にペクチン酸リアーゼを産生する微生物を培養し、そして培養物から酵素を回収することを含んでなる。慣用の発酵技術に従い、例えば、震蘯フラスコまたは発酵槽中で攪拌して増殖培地上に十分に通気しながら培養してペクチン酸リアーゼ酵素の産生を誘導することによって、培養を実施することができる。増殖培地は慣用の窒素源、例えば、ペプトン、酵母エキスまたはカサアミノ酸、減少量の慣用の炭素源、例えば、デキシトロースまたはスクロース、およびインデューサー、例えば、ペクチナーゼに無関係に複合植物物質、例えば、穀物ふすま (例えば、コムギふすままたはイネ殻) を含有することができる。慣用技術、例えば、遠心または濾過によるバイオマスおよび上澄みの分離、問題の酵素が細胞内に存在する場合、細胞の上澄みまたは崩壊物の回収、多分引き続くそれ以上の精製 (EP 0 406 314に記載されている) または結晶化 (WO 97／15660に記載されている) を使用して、回収を実施することができる。
【００７４】
さらに、本発明は、本発明による単離された酵素を製造する方法を提供し、ここで酵素の産生を可能とする条件下に、酵素をコードするDNA配列で形質転換された適当な宿主細胞を培養し、そして生ずる酵素を培養物から回収する。
本明細書において定義するように、単離されたポリペプチド (例えば、酵素) は他のポリペプチドを本質的に含まないポリペプチドであり、例えば、SDS−PAGEにより測定して、少なくとも約20％の純度、好ましくは少なくとも約40％の純度、なおより好ましくは約80％の純度、最も好ましくは約90％の純度、なお最も好ましくは約95％の純度である。
【００７５】
用語「単離されたポリペプチド」は、選択的に「精製されたポリペプチド」と命名することができる。
酵素をコードするDNA配列を含んでなる発現ベクターを異種的宿主細胞の中に形質転換するとき、本発明の酵素を異種的組換えにより産生することができる。
これにより、相同的不純物を含有しないことによって特性決定される、高度に精製されたまたは1成分のペクチン酸リアーゼ組成物を製造することができる。
これに関して、相同的不純物は、本発明の酵素が本来得られた相同的細胞に由来する、いずれかの不純物 (例えば、本発明の酵素以外の他のポリペプチド) を意味する。
本発明において、相同的宿主細胞はバシラス・ズブチリス (Bacillus subtilis) 株であることができる。
【００７６】
形質転換された宿主細胞を培養するために使用する培地は、問題の宿主細胞を増殖するために適当な、任意の慣用培地であることができる。発現されたペクチン酸リアーゼ酵素を好都合に培地の中に分泌させることができ、よく知られている手順により培地から回収することができ、このような手順は遠心または濾過による培地からの細胞の分離、硫酸アンモニウムのような塩による培地のタンパク質成分の沈降、および引き続くクロマトグラフィー手順、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、またはその他を包含する。
【００７７】
本発明は、また、回収可能な量で本発明の酵素を発現し、産生するように、この酵素をコードするDNA配列で形質転換されているトランスジェニック植物、植物部分または植物細胞に関する。この酵素は植物または植物部分から回収することができる。
トランスジェニック植物は、双子葉植物または単子葉植物、簡潔化のために双子葉または単子葉であることができる。単子葉植物の例は、イネ科植物、例えば、ナカハグサ (イチゴツナギ、イネ科イチゴツナギ科) 、飼料の草、例えば、フェスツカ (festuca)、ロリウム (lolium)、温帯のイネ科植物、例えば、アグロスチス (Agrostis)、および穀物、例えば、コムギ、カラスムギ、ライムギ、オオムギ、イネ、モロコシおよびトウモロコシ (コーン) である。
【００７８】
双子葉植物の例は、タバコ、マメ科植物、例えば、ハウチワマメ、ジャガイモ、テンサイ、エンドウマメ、ソラマメ・インゲン・ササゲの類およびダイズ、およびアブラナ科 (Brassicaceae科)、例えば、カリフラワー、セイヨウアブラナおよび密接に関係するモデルの生物アラビドプシス・タリアナ (Arabidopsis thaliana) である。
植物部分の例は、幹、カルス、葉、根、果実、種子、および塊茎である。本発明の関係において、また、特定の植物組織、例えば、葉緑体、アポプラスト、ミトコンドリア、空胞、ペルオキシソームおよび細胞質は植物部分であると考えられる。さらに、任意の植物細胞は、どんな組織由来であるかどうかにかかわらず、植物部分であると考えられる。
【００７９】
また、このような植物、植物部分および植物細胞の子孫は本発明の範囲内に入る。
本発明の酵素を発現するトランスジェニック植物または植物細胞は、この分野において知られている方法に従い構築することができる。簡単に述べると、本発明の酵素をコードする1または2以上の発現構築物を植物宿主ゲノムの中に組込み、そして生ずる修飾された植物または植物細胞をトランスジェニック植物または植物細胞に増殖させることによって、植物または植物細胞を構築する。
【００８０】
好都合には、発現構築物は、選択した植物または植物細胞中の遺伝子の発現に必要な適当な調節配列と操作的にアソシエートして、本発明の酵素をコードする遺伝子を含んでなるDNA構築物である。さらに、発現構築物は、発現構築物が組込まれた宿主細胞の同定に有用な選択可能なマーカーと、問題の植物の中への構築物の導入に必要なDNA配列とを含んでなることができる (後者は使用すべきDNA導入法に依存する)。
【００８１】
調節配列、例えば、プロモーターおよびターミネーター配列および必要に応じてシグナルまたはトラシット配列の選択は、例えば、酵素をいつ、どこでおよびどのようにして発現させるかに基づいて、決定される。例えば、本発明の酵素をコードする遺伝子の発現は構成的または誘導可能であるか、あるいは発生、段階または組織特異的であることができ、そして遺伝子産物は特定の組織または植物部分、例えば、種子または葉にターゲッティングすることができる。調節配列は、例えば、Tague他、Plant Phys. 86：506、1988に記載されている。
【００８２】
構成的発現のために、35S−CaMVプロモーターを使用することができる (Frank他、1980、Cell 21：285−294)。器官特異的プロモーターは、例えば、下記のプロモーターであることができる：貯蔵シンク組織、例えば、種子、ジャガイモ塊茎、および果実からのプロモーター (EdwardsおよびCoruzzi、1990、Annu. Rev. Genet. 24：275−303)、または代謝的シンク組織、例えば、分裂組織からのプロモーター (Ito他、1994、Plant Mol. Biol. 24：863−878)、種子特異的プロモーター、例えば、イネからのグルテリン、プロラミン、グロブリンまたはアルブミンのプロモーター (Wu他、Plant and Cell Physiology Vol. 39、No. 8 pp. 885−889 (1998))、ソラマメ・ナンテンハギ (Vicia faba) からのレグミンB4および未知の種子タンパク質遺伝子からのソラマメ・ナンテンハギ (Vicia faba) プロモーター (Conrad U.他、Journal of Plant Physiology Vol. 152、No. 6 pp. 708−711 (1998))、種子脂肪体タンパク質からのプロモーター (Chen他、Plant and Cell Physiology Vol. 39、No. 9 pp. 935−941 (1998))、ブラシカ・ナプス (Brassica napus) からの貯蔵タンパク質napAプロモーター、またはこの分野において知られている任意の他の種子特異的プロモーター (WO 91／14772に記載されているような)。
【００８３】
さらに、プロモーターは下記のプロモーターであることができる：葉特異的プロモーター、例えば、イネまたはトマトからのrbcsプロモーター (Kyozuka他、Plant Physiology Vol. 102、No. 3 pp. 991−1000 (1993)、クロレラウイルスアデニンメチルトランスフェラーゼ遺伝子プロモーター (Mitra AおよびHiggins DW、Plant Molecular Biology Vol. 26、No. 1 pp. 85−93 (1994) 、またはイネからのaldP遺伝子プロモーター (Kagaya他、Molecular and General Genetics Vol. 248、No. pp. 668−674 (1995) 、または創傷誘導可能なプロモーター、例えば、ジャガイモpin2プロモーター (Xu他、Plant Molecular Biology Vol. 22、No. 4 pp. 573−588 (1993)。
【００８４】
プロモーターエンハンサー因子を使用して、植物における酵素の発現を高くすることができる。例えば、プロモーターエンハンサー因子はプロモーターと酵素をコードするヌクレオチド配列との間に位置するイントロンであることができる。Xu他、前掲は、発現を増強するためにイネアクチン1遺伝子の第1イントロンを使用することを開示している。
選択可能なマーカー遺伝子および発現構築物の任意の他の部分は、この分野において入手可能なものから選択することができる。
【００８５】
DNA構築物をこの分野において知られている慣用技術に従い植物ゲノムの中に組込むことができる。このような技術は、アグロバクテリウム (Agrobacterium) 仲介形質転換、ウイルス仲介形質転換、マイクロインジェクション、粒子衝撃、生物分解形質転換、およびエレクトロポレーションを包含する (Gasser他、Science 244：1293；Potrykus、Bio／Techn. 8：535、1990；Shimamoto他、Nature 338：274、1989)。
【００８６】
最近、アグロバクテリウム・ツメファシエンス (Agrobacterium tumefaciens) 仲介遺伝子導入は、トランスジェニック双子葉植物を発生させるために選択する方法である (概観については、下記の文献を参照のこと：HooykasおよびSchilperoort、1992、Plant Mol. Biol. 19：15−38)。しかしながら、また、それは単子葉植物の形質転換に使用できるが、他の形質転換法は一般にこれらの植物のために好ましい。現在、トランスジェニック単子葉植物を発生させるために選択する方法は胚カルスまたは発生する胚の粒子衝撃 (形質転換性DNAを被覆した微視的金またはタングステン粒子) である (Christou、1992、Plant J. 2：275−281；Shimamoto、1994、Cur. Opin. Biotechnol. 5：158−162；Vasil他、1992、Bio／Technology 10：667−674)。単子葉植物を形質転換する別法は、下記の文献に記載されているプロトプラスト形質転換に基づく：Omirulleh S他、Plant Molecular Biology Vol. 21、No. 3 pp. 415−428 (1993)。
【００８７】
形質転換後、この分野においてよく知られている方法に従い、発現構築物を組込んで有する形質転換体を選択し、全植物に再生する。
【００８８】
酵素組成物
なお他の面において、本発明は前述のペクチン酸リアーゼ活性を示す酵素を含んでなる酵素組成物に関する。
本発明の酵素組成物は、本発明のペクチン酸リアーゼに加えて、1または2以上の他の酵素型、例えば、ヘミセルラーゼ、例えば、キシラナーゼおよびマンナナーゼ、セルラーゼまたはエンド−β−1,4−グルカナーゼ成分、キチナーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、ペクチナーゼ、キシログルカナーゼ、クチナーゼ、フィターゼ、オキシドレダクターゼ (ペルオキシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、オキシダーゼ、ラッカーゼ)、プロテアーゼ、アミラーゼ、レダクターゼ、フェノールオキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ペクチンリアーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、トランスグルタミナーゼ、またはそれらの混合物を含んでなることができる。
【００８９】
酵素組成物はこの分野において知られている方法に従い調製することができ、そして液体または乾燥組成物の形態であることができる。例えば、酵素組成物は粒体または微小粒体の形態であることができる。組成物の中に含めるべき酵素は、この分野において知られている方法に従い安定化することができる。
【００９０】
用途
ペクチン酸リアーゼは、多数の異なる産業および応用において潜在的用途を有する。しかしながら、本発明のペクチン酸リアーゼは洗浄剤組成物の1成分として特に有用である。本発明の洗浄剤組成物の好ましい用途の例を後述する。本発明の酵素組成物の用量および組成物の使用条件は、この分野において知られている方法に基づいて決定することができる。
本発明のペクチン酸リアーゼは本発明の洗浄剤組成物の必須要素であり、そして組成物重量の好ましくは0.000％〜2％、より好ましくは0.0005％〜0.1％、最も好ましくは0.001％〜0.02％の純度の酵素で混入される。
【００９１】
本発明のペクチン酸リアーゼは、触媒ドメインを含んでなる酵素コアに加えて、また、セルロース結合ドメイン (CBD) を含有し、この酵素のセルロース結合ドメインおよび酵素コア (触媒的に活性なドメイン) は作用可能に連鎖されている。セルロース結合ドメイン (CBD) はコード化酵素の一体的部分として存在することができるか、あるいは他の起源からのCBDを酵素の中に導入し、こうして酵素ハイブリッドを作ることができる。これに関して、用語「セルロース結合ドメイン」は、下記の文献において定義されているように理解されることを意図する：Peter Tomme他、「セルロース結合ドメイン：分類および性質」、“Enzymatic Degradation of Insoluble Carbohydrates”、John N. SaddlerおよびMichael H. Penner (編者)、ACS Symposium Series、No. 618、1996。
【００９２】
この定義は、120より多いセルロース結合ドメインを10ファミリー (I〜X) に分類し、そしてこれらのCBDが種々の酵素、例えば、セルラーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラーゼおよびキチナーゼの中に見出されることを証明している。また、CBDは藻類、例えば、紅藻ポルフィラ・プルプレア (Porphyra purpurea) の中に非加水分解的多糖結合タンパク質として見出された (Tomme他、前掲、参照)。
【００９３】
しかしながら、CBDの大部分はセルラーゼおよびキシラナーゼに由来し、CBDはタンパク質のN末端およびC末端にまたは内部の中に見出される。酵素ハイブリッドは、この分野において知られており (WO 90／00609およびWO 95／16782参照)、そしてリンカーの存在または非存在下にペクチン酸リアーゼ酵素をコードするDNA配列に結合したセルロース結合ドメインをコードするDNAのフラグメントを少なくとも含んでなるDNA構築物を宿主細胞の中に形質転換し、そして宿主細胞を増殖して融合遺伝子を発現させることによって調製することができる。
【００９４】
実施例ハイブリッドは下記式で記載することができる：
CBD−MR−X
式中CBDは少なくともセルロース結合ドメインに対応するアミノ酸配列のN末端またはC末端領域であり、MRは中央領域 (リンカー) であり、そして結合、または好ましくは約2〜約100炭素原子、より好ましくは約2〜40炭素原子の短い結合基であることができるか、あるいは好ましくは約2〜約100アミノ酸、より好ましくは約2〜約40アミノ酸であり、そしてXは本発明のペクチン酸リアーゼのN末端またはC末端領域である。
【００９５】
洗浄剤産業における用途
洗浄および着用の間、染色した布帛または被服から染料は普通にブレードし、次いで布帛または被服は退色し、着古したように見える。布帛からの表面繊維の除去は布帛の本来の色および外観を部分的に回復する。用語「色の清澄化」は、本明細書において使用するとき、複数の洗浄サイクルを通じて布帛または被服の初期の色が部分的に回復することを意味する。
用語「脱ピリング」は、布帛表面からピルの除去を意味する。
【００９６】
用語「ソーキング液」は、普通の洗浄プロセスに付す前に、洗濯物を浸漬する水性液を意味する。ソーキング液は洗浄または洗濯において普通に使用する1または2以上の成分を含有することができる。
用語「洗浄液」は、洗浄プロセス、すなわち、手動的にまたは洗濯機における化学的および機械的作用の組み合わせに洗濯物を付すために使用する水性液を意味する。普通に、洗浄液は粉末状または液状の洗浄剤組成物の水溶液である。
用語「すすぎ液」は、普通に洗浄プロセスに付した直後に、洗濯物を浸漬し、処理して、洗濯物をすすぐ、すなわち、洗濯物から洗浄剤溶液を本質的に除去するために使用する水性液を意味する。
【００９７】
本発明の方法に付す洗濯物は、普通の洗浄可能な洗濯物であることができる。好ましくは、洗濯物の主要な部分は、綿、綿ブレンドまたは天然または人造セルロース系材料 (例えば、キシランを含有するセルロース繊維、例えば、木材パルプに由来する) またはそれらのブレンドから作られた縫製または非縫製の布帛、例えば、織物、デニム、紡績糸、およびタオルである。ブレンドの例は、綿またはレーヨン／ビスコースと1または2以上のコンパニオン材料とのブレンドである。
【００９８】
このようなコンパニオン材料の例は次の通りである：羊毛、合成繊維 (例えば、ポリアミド繊維、アクリル繊維、ポリエステル繊維、ポリビニルアルコール繊維、ポリ塩化ビニル繊維、ポリ塩化ビニリデン繊維、ポリウレタン繊維、ポリ尿素繊維、アラミド繊維)、およびセルロースを含有する繊維 (例えば、レーヨン／ビスコース、ラミー、亜麻／リネン、ジュート、酢酸セルロース繊維、リオセル)。
驚くべきことには、本発明の洗浄剤組成物は、布帛繊維からのヘミセルロース成分に対するペクチン酸リアーゼの加水分解作用により、色の清澄化、脱ピリングおよび粘土汚染の除去を提供することが発見された。
【００９９】
植物、木材、型粘土をベースとするよごれ、泥のよごれ、および果実に由来する汚染の除去は今日の最も頑強なクリーニング仕事の1つであり、特に低い洗浄温度に向かう傾向を有する。これらの汚染は典型的には主として炭水化物およびそれらの誘導体：繊維および細胞壁成分をベースとする繊維材料の複雑な混合物を含有する。食物のよごれはよごれた支持体から効果的に除去することがしばしば困難である。果物および／または野菜ジュースに由来する高度に着色したまたは「乾燥接着した」よごれは除去が特に困難である。このようなよごれの特定の例は、オレンジジュース、トマトジュース、バナナ、マンゴーまたはブロッコリーのよごれを包含するであろう。ペクチンを含有する汚染が普通に見出される支持体は、布帛、食卓用器具または硬質表面であることがある。
【０１００】
本発明の洗浄剤組成物は、洗濯、皿洗浄および硬質表面のクリーニングを含めて、よりすぐれたクリーニングおよび汚染除去を提供することが発見された。理論により拘束されたくないが、本発明の洗浄剤組成物の中に含有されるペクチン酸リアーゼ酵素は汚染の中に見出されるペクチンおよびペクテートを非常に効果的に加水分解し、これにより汚染除去の寄与すると考えられる。事実、前述したように、このようなペクチンおよびペクテート成分は、野菜および／または果物由来の汚染、例えば、りんご、バナナ、トマト、オレンジ、マンゴー、アボカドおよび草の汚染の植物細胞壁成分の中に見出される。また、ペクチンおよびペクテート成分は、食品および美容産業、例えば、アイスクリーム、ジャム、シャンプーおよびリップスティックにおいて広範に使用されている。
【０１０１】
さらに、本発明の洗浄剤組成物は、洗濯組成物として配合するとき、布帛に柔軟性を提供することが発見された。理論により拘束されたくないが、布帛汚染上に見出されるペクチンおよびペクテート成分は、それらの酸性特性により、カルシウムおよびカチオン性原子と強く結合し、布帛を粗くすると考えられる。それらのペクチンおよびペクテート成分を除去すると、それらのカルシウムおよびカチオン性原子の結合が防止され、それゆえ多少の柔軟化効果を提供すると考えられる。
【０１０２】
詳細な説明および実施例
界面活性剤系
本発明による洗浄剤組成物は界面活性剤系を含んでなり、ここで界面活性剤は非イオンおよび／またはアニオンおよび／またはカチオンおよび／または両性および／または双性および／または半極性界面活性剤から選択することができる。
界面活性剤は典型的には0.1〜60重量％のレベルで存在する。
界面活性剤は組成物の中に存在する酵素成分と相溶性であるように配合することが好ましい。液状またはゲル状組成物において、界面活性剤は、それがこれらの組成物中の酵素の安定性を促進するか、あるいは少なくとも分解しないように、配合することが最も好ましい。
【０１０３】
本発明に従い使用すべき好ましい系は、界面活性剤として、本明細書に記載する非イオンおよび／またはアニオン界面活性剤の1または2以上を含んでなる。より好ましくは、本発明の組成物は、高いレベルのアニオン界面活性剤、すなわち、遊離酸として表して30重量％まで、好ましくは10〜20重量％のアニオン界面活性剤を含んでなるであろう。本発明において使用すべき好ましいアニオン界面活性剤は、前述したように、酸形態のアルキルベンゼンスルホネート、アルキルスルホネートおよびアルキルエトキシスルホネートである。
【０１０４】
それ以上の好ましい態様において、本発明の高アニオン界面活性剤の組成物は、アミンオキシド界面活性剤および／またはアミドアミン、例えば、アミドプロピルジエチルアミンを含んでなるであろう。洗濯、皿洗浄および硬質表面のクリーニングを包含し、さらに高いレベルのアニオン界面活性剤を含んでなる、本発明の洗浄剤組成物は、きわめてすぐれたクリーニングおよび汚染除去を提供することが発見された。理論により拘束されたくないが、アニオン界面活性剤は本発明の酵素により加水分解された小さいペクチン断片の可溶化を促進し、クリーニングすべき表面上にそれらの断片が再付着するのを防止すると考えられる。
【０１０５】
使用すべき適当なアニオン界面活性剤は、下記の文献に従う、SO3ガスでスルホン化された、C8−C20カルボン酸 (すなわち、脂肪酸) の直鎖状エステルを包含する、アルキルエステルスルホネート界面活性剤である：“The Journal of the American Oil Chemical Society”、52 (1975)、pp. 323−329。適当な出発物質は、獣脂、ヤシ油、およびその他に由来する天然の脂肪族物質を包含するであろう。
特に洗濯用途のための、好ましいアルキルエステルスルホネート界面活性剤は、下記の構造式のアルキルエステルスルホネート界面活性剤を含んでなる：
【０１０６】
【化１】
2005507644.tif 000005
【０１０７】
式中R3はC8−C20ヒドロカルビル、好ましくはアルキル、またはそれらの組み合わせであり、R4はC1−C6ヒドロカルビル、好ましくはアルキル、またはそれらの組み合わせであり、そしてMはカチオンであり、これはアルキルエステルスルホネートと水溶性塩を形成する。適当な塩形成カチオンは、金属、例えば、ナトリウム、カリウム、およびリチウム、および置換または非置換のアンモニウムカチオン、例えば、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、およびトリエタノールアミンを包含する。好ましくは、R3はC10−C16アルキルであり、そしてR4はメチル、エチルまたはイソプロピルである。R3がC10−C16アルキルである、メチルエステルスルホネートは特に好ましい。
【０１０８】
他の適当なアニオン界面活性剤は、式ROSO3Mの水溶性塩または酸であるアルキルスルホネート界面活性剤であり、式中Rは好ましくはC10−C24ヒドロカルビル、好ましくはアルキルまたはC10−C20アルキル成分を有するヒドロキシアルキル、より好ましくはC12−C18アルキルまたはヒドロキシアルキルであり、そしてMはHまたはカチオン、例えば、アルカリ金属カチオン (例えば、ナトリウム、カリウム、およびリチウム)、および置換または非置換のアンモニウム (例えば、メチル−、ジメチル−、およびトリメチルアンモニウムカチオンおよび第四級アンモニウムカチオン、例えば、テトラメチルアンモニウムおよびジメチルピペリジニウムカチオンおよびアルキルアミン、例えば、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、およびそれらの混合物から誘導された第四級アンモニウムカチオン、およびその他) である。典型的には、C12−C16のアルキル鎖はより低い洗浄温度 (例えば、約50 ℃以下) について好ましく、そしてC16−C18はより高い洗浄温度 (例えば、約50 ℃以上) について好ましい。
【０１０９】
また、洗浄性の目的に有用な他のアニオン界面活性剤を本発明の洗濯洗浄剤組成物の中に添加することができる。これらのアニオン界面活性剤は下記のものを包含する：石鹸、C8−C22第一級または第二級アルカンスルホネート、C8−C24オレフィンスルホネート、例えば、英国特許第1,082,179号に記載されているように、アルカリ土類金属クエン酸塩の熱分解生成物を熱分解することによって製造されたスルホン化ポリカチオン、C8−C24アルキルポリグリコエーテルスルホネート (10モルまでのエチレンオキシドを含有する) の塩 (例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、および置換アンモニウム塩、例えば、モノ−、ジ−およびトリエタノールアミン塩を包含する)；
【０１１０】
アルキルグリセロールスルホネート、脂肪族アシルグリセロールスルホネート、脂肪族オレイルグリセロールスルホネート、アルキルフェノールエチレンオキシドエーテルスルホネート、パラフィンスルホネート、アルキルホスホネート、イセチオネート、例えば、アシルイセチオネート、N−アシルタウレート、アルキルスクシナメートおよびスルホスクシネート、スルホスクシネートのモノエステル (特に飽和および不飽和C12−C18モノエステル) およびスルホスクシネートのジエステル (特に飽和および不飽和C6−C12ジエステル)、
【０１１１】
アシルサルコシネート、アルキル多糖のサルフェート、例えば、アルキルポリグルコシド(非イオン非硫酸化化合物が後述されている) のサルフェート、分枝鎖状第一級アルキルサルフェート、およびアルキルポリエトキシカルボキシレート、例えば、RO(CH2CH2O)k−CH2COO-M+のもの、式中RはC8−C22アルキルであり、kは1〜10であり、そしてMは可溶性塩形成カチオンである。また、樹脂酸および水素化樹脂酸、例えば、タル油の中に存在するか、あるいはそれから誘導されたロジン、水素化ロジン、および樹脂酸および水素化樹脂酸。
【０１１２】
アルキルベンゼンスルホネートは高度に好ましい。アルキル基が好ましくは10〜18個の炭素原子を含有する、直鎖状 (直線の鎖) アルキルベンゼンスルホネート (LAS) は特に好ましい。
それ以上の例は“Surface Active Agents and Detergents”(Vol. IおよびII、編者Schwartz、PerryおよびBerch) に記載されている。また、種々のこのような界面活性剤は一般に米国特許第3,929,678号 (第23欄、第58行〜第29欄、第23行、引用することによって本明細書の一部とされる) に記載されている。
【０１１３】
それ以上の好ましいアニオン界面活性剤は、アルキルアルコキシ化サルフェート界面活性剤を包含する。それらの例は次の通りである：式RO(A)mSO3Mの水溶性塩または酸、式中Rは非置換C10−C24アルキルまたはC10−C24アルキル成分を有するヒドロキシアルキル、好ましくはC12−C20アルキルまたはヒドロキシアルキル、より好ましくはC12−C18アルキルまたはヒドロキシアルキルであり、Aはエトキシまたはプロポキシ単位であり、mはゼロより大きく、典型的には約0.5〜約6、より好ましくは約0.5〜約3であり、そしてMはHまたはカチオンであり、ここでカチオンは、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、およびその他)、アンモニウムまたは置換アンモニウムカチオンであることができる。
【０１１４】
アルキルエトキシル化サルフェートならびにアルキル化プロポキシル化サルフェートはここにおいて考えれられる。置換アンモニウムカチオンの特定の例は次の通りである：メチル−、ジメチル−、トリメチル−アンモニウムカチオンおよび第四級アンモニウムカチオン、例えば、テトラメチル−アンモニウムおよびジメチルピペリジニウムカチオンおよびアルキルアミン、例えば、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、およびそれらの混合物から誘導された第四級アンモニウムカチオン、およびその他。
【０１１５】
典型的な界面活性剤は、C12−C18アルキルポリエトキシレート (1.0) サルフェート (C12−C18 E(1.0)M)、C12−C18アルキルポリエトキシレート (2.25) サルフェート (C12−C18 E(2.25)M)、およびC12−C18アルキルポリエトキシレート (3.0) サルフェート (C12−C18 E(3.0)M)、およびC12−C18アルキルポリエトキシレート (4.0) サルフェート (C12−C18 E(4.0)M) であり、ここでMはナトリウムおよびカリウムから好都合に選択される。添加するとき、本発明の洗濯洗浄剤組成物は典型的には約1〜約40重量％、好ましくは約3〜約20重量％のこのようなアニオン界面活性剤を含んでなる。
【０１１６】
アルキルフェノールのポリエチレン、ポリプロピレン、およびポリブチレンオキシド縮合物は本発明の界面活性剤系の非イオン界面活性剤として使用するために適当であり、ポリエチレンオキシド縮合物は好ましい。これらの化合物は、直鎖状または分枝鎖状の約6〜約14個の炭素原子、好ましくは約8〜約14個の炭素原子を有するアルキル基を有するアルキルフェノールとアルキレンオキシドとの縮合生成物を包含する。好ましい態様において、エチレンオキシドは約2〜約25モル、より好ましくは約3〜約15モルのエチレンオキシド／モルのアルキルフェノールに等しい量で存在する。
【０１１７】
この型の商業的に入手可能な非イオン界面活性剤は、IgepalTM CO−630、GAFコーポレーション (GAF Corporation) により市販されている；およびTritonTM X−45、X−114、X−100およびX−102、すべてはローム・アンド・ハース・カンパニー (Rohm ＆ Haas Company) により市販されている；を包含する。普通に、これらの界面活性剤はアルキルフェノールアルコキシレート (例えば、アルキルフェノールエトキシレート) と呼ばれる。
【０１１８】
第一級および第二級脂肪族アルコールと約1〜約25モルのエチレンオキシドとの縮合生成物は、本発明の非イオン界面活性剤系の非イオン界面活性剤として使用するために適当である。脂肪族アルコールのアルキル鎖は直鎖状または分枝鎖状、第一級および第二級であることができ、一般に約8〜約22個の炭素原子を有する。約8〜約20個の炭素原子、より好ましくは約10〜約18個の炭素原子を有するアルキル基を有するアルコールと約2〜約10モルのアルキレンオキシド／モルのアルコールとの縮合生成物は好ましい。約2〜約7モルのアルキレンオキシド、最も好ましくは約2〜約5モルのアルキレンオキシド／モルのアルコールは前記縮合生成物の中に存在する。
【０１１９】
この型の商業的に入手可能な非イオン界面活性剤の例は次の通りである：TergitolTM 15−S−9 (C11−C15直鎖状アルコールと9モルのエチレンオキシドとの縮合生成物)、TergitolTM 24−L−6 NMW (C12−C14第一級アルコールと6モルのエチレンオキシドとの狭い分子量分布を有する縮合生成物)、の両方はユニオン・カーバイド・コーポレーション (Union Carbide Corporation) により市販されている；NeodolTM 45−9 (C14−C15直鎖状アルコールと9モルのエチレンオキシドとの縮合生成物)、NeodolTM 23−3 (C12−C15直鎖状アルコールと3.0モルのエチレンオキシドとの縮合生成物)、
【０１２０】
NeodolTM 45−7 (C14−C15直鎖状アルコールと7モルのエチレンオキシドとの縮合生成物)、NeodolTM 45−5 (C14−C15直鎖状アルコールと5モルのエチレンオキシドとの縮合生成物)、シェル・ケミカル・カンパニー (Shell Chemical Company) により市販されている；KyroTM EOB (C13−C15直鎖状アルコールと9モルのエチレンオキシドとの縮合生成物)、プロクター・ガンブル・カンパニー (Procter & Gamble Company) により市販されている；およびGenapol LA 050 (C12−C14直鎖状アルコールと5モルのエチレンオキシドとの縮合生成物)、ヘキスト (Hoechst) により市販されている。これらの生成物におけるHLBの好ましい範囲は8〜11、最も好ましくは8〜10である。
【０１２１】
また、本発明の界面活性剤系の非イオン界面活性剤として、約6〜約30個の炭素原子、好ましくは約10〜約16個の炭素原子を有する疎水性基、および約1.3〜約10、好ましくは約1.3〜約3、最も好ましくは約1.3〜約2.7サッカリド単位を含有する多糖、例えば、ポリグリコシドの親水性基を有する、米国特許第4,565,647号に開示されているアルキル多糖は有用である。5または6個の炭素原子を有する任意の還元性多糖、例えば、グルコース、ガラクトースおよびガラクトシル部分をグリコシル部分の代わりに使用することができる (必要に応じて疎水性基は2−、3−、4−、およびその他の位に取り付け、こうしてグルコシドまたはガラクトシドと反対にグルコースおよびガラクトースを形成する)。サッカリド内の結合は、例えば、追加のサッカリド単位の1つの位と先行するサッカリド単位上の2−、3−、4−、および／または6−位との間に存在することができる。
【０１２２】
好ましいアルキルポリグルコシドは下記式を有する：
R2O(CnH2nO)t(グリコシル)x
式中R2はアルキル、アルキルフェニル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルキルフェニル、およびそれらの混合物から選択され、ここでアルキル基は約10〜約18、好ましくは約12〜約14個の炭素原子を有し、nは2または3、好ましくは2であり、tは0〜約10、好ましくは0であり、そしてxは約1.3〜約10、好ましくは約1.3〜約3、最も好ましくは約1.3〜約2.7である。グリコシルは好ましくはグルコースから誘導される。これらの化合物を製造するために、まずアルコールまたはアルキルポリエトキシアルコールを生成し、次いでグルコース、またはグルコース源と反応させて、グルコシドを生成する (1位における結合)。次いで追加のグリコシル単位をそれらの1位と先行するグリコシル単位2−、3−、4−、および／または6−位、好ましくは主として2−位との間に取り付けることができる。
【０１２３】
ポリプロピレンオキシドとポリプロピレングリコールとの縮合反応により生成した疎水性基本的部分を有するエチレンオキシドの縮合生成物は、また、本発明の追加の非イオン界面活性剤系として使用するために適当である。これらの化合物の疎水性部分は好ましくは約1500〜約1800の分子量を有し、水不溶性を示すであろう。この疎水性部分に対するポリオキシエチレン部分の付加は全体としてこの分子量の溶解度を増加させる傾向があり、そしてポリオキシエチレン含量が縮合生成物の約50％である点まで、生成物の液状特性は保持され、これは約40モルまでのエチレンオキシドとの縮合に対応する。この型の化合物の例は、商業的に入手可能なPluronicTM界面活性剤 (BASFにより市販されている) のあるものを包含する。
【０１２４】
また、エチレンオキシドと、ポリプロピレンオキシドおよびエチレンジアミンの反応から生ずる生成物との縮合生成物は、本発明の非イオン界面活性剤系の非イオン界面活性剤として使用するために適当である。これらの生成物の疎水性部分は、エチレンジアミンと過剰のポリプロピレンオキシドとの反応生成物から成り、一般に約2500〜約3000の分子量を有する。この疎水性部分を、縮合生成物が約40〜約80重量％のポリオキシエチレンを含有し、かつ約5,000〜約11,000の分子量を有する程度に、エチレンオキシドと縮合させる。この型の非イオン界面活性剤の例は、TetronicTM化合物(BASFにより市販されている) のあるものを包含する。
【０１２５】
アルキルフェノールのポリエチレンオキシドの縮合生成物、第一級および第二級アルコールと約1〜約25モルのエチレンオキシド、アルキルポリサッカリド、およびそれらの混合物との縮合生成物は、本発明の界面活性剤系の非イオン界面活性剤として使用するために好ましい。3〜15のエトキシ基を有するC8−C14アルキルフェノールエトキシレートおよび2〜10のエトキシ基を有するC8−C18アルコールエトキシレート (好ましくは平均C8−C18) 、およびそれらの混合物は最も好ましい。
【０１２６】
高度に好ましい非イオン界面活性剤は、下記式のポリヒドロキシ脂肪酸アミドである：
【化２】
2005507644.tif 000006
式中R1はHであるか、あるいはR1はC1-4ヒドロカルビル、2−ヒドロキシエチル、2−ヒドロキシプロピルまたはそれらの混合物であり、R2はC5-31ヒドロカルビルであり、そしてZは少なくとも3つのヒドロキシルが鎖に直接結合している直鎖状ヒドロカルビル鎖を有するポリヒドロキシヒドロカルビル、またはそれらのアルコキシ誘導体である。好ましくは、R1はメチルであり、R2は直鎖状C11-15アルキルまたはC16-18アルキルまたはアルケニル鎖、例えば、ココナツアルキルまたはそれらの混合物であり、そしてZは還元性アミン化反応において還元砂糖、例えば、グルコース、フルクトース、マルトースまたはラクトースから誘導される。
【０１２７】
本発明の洗濯洗浄剤組成物は、また、カチオン、両性、双性、半極性界面活性剤および／または補助界面活性剤、ならびに既に本明細書に記載したもの以外の非イオンおよび／またはアニオン界面活性剤を含有することができる。添加するとき、本発明の洗浄剤組成物は典型的には0.2〜約25重量％、好ましくは約1〜約8重量％のこのようなカチオン界面活性剤、両性、双性、および／または半極性界面活性剤を含んでなる。
本発明の洗濯洗浄剤組成物本発明において使用するために適当なカチオン洗浄性界面活性剤は、1つの長鎖ヒドロカルビル基を有するものである。このようなカチオン界面活性剤の例は、アンモニウム界面活性剤、例えば、アルキルトリメチルアンモニウムハロゲン化物、および下記式を有する界面活性剤を包含する：
【０１２８】
[R2(OR3)y][R4(OR3)y]2R5N＋X-
式中R2はアルキル鎖中にアルキルまたはアルキルベンジル基であり、各R3は−CH2CH2−、−CH2CH(CH3)−、−CH2CH(CH2OH)−、−CH2CH2CH2−、およびそれらの混合物から成る群から選択され、各R4はC1−C4アルキル、C1−C4ヒドロキシアルキル、2つのR4基の結合により形成されたベンジル環構造、−CH2CHOHCHOHCOR6CHOHCH2OH−から成る群から選択され、ここでR6は約1000より小さい分子量を有する任意のヘキソースまたはヘキソースポリマーであり、そしてyが0ではないとき、水素であり、R5はR4と同一であるか、あるいはアルキル鎖であり、ここでR2＋R5の炭素原子の総数は約18以下であり、各yは0〜約10であり、そしてy値の合計は0〜約15であり、そしてXは任意の適合性アニオンである。
【０１２９】
高いカチオン界面活性剤は下記式を有する本発明の組成物において有用な水溶性第四級アンモニウム化合物である：R1R2R3R4N+X- (i) 式中R1はC8−C16アルキルであり、R2、R3およびR4の各々は独立してC1−C4アルキル、C1−C4ヒドロキシアルキル、ベンジル、および−(C2H40)xHであり、ここでxは2〜5の値であり、そしてXはアニオンである。R2、R3およびR4の1以下はベンジルである。
【０１３０】
R1について好ましいアルキル鎖長さはC12−C15であり、特にここでアルキル基はココナツまたはヤシ仁脂肪に由来する鎖長の混合物であるか、あるいはオレフィン増成またはOXOアルコール合成により合成的に誘導される。
R2、R3およびR4について好ましい基はメチルおよびヒドロキシエチルであり、そしてアニオンXはハライド、メトサルフェート、アセテートおよびホスフェートイオンから選択することができる。
【０１３１】
本発明における使用に適当な式 (i) の第四級アンモニウム化合物の例は次の通りである：
ココナツトリメチルアンモニウムクロライドまたはブロミド；
ココナツメチルジヒドロキシエチルアンモニウムクロライドまたはブロミド；
デシルトリエチルアンモニウムクロライド；
デシルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロライドまたはブロミド；
C12-15ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロライドまたはブロミド；
ココナツジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロライドまたはブロミド；
ミリスチルトリメチルアンモニウムメチルサルフェート；
ラウリルジメチルベンジルアンモニウムクロライドまたはブロミド；
ラウリルジメチル (エテノキシ)4 アンモニウムクロライドまたはブロミド；
コリンエステル (R1が
【０１３２】
【化３】
2005507644.tif 000007
あり、そしてR2R3R4がメチルである、式 (i) の化合物)；
ジアルキルイミダゾリン［式 (i) の化合物］。
【０１３３】
また、本発明において有用な他のカチオン界面活性剤は、米国特許第4,228,044号およびEP 000 224に記載されている。
また、両性界面活性剤は、本発明の洗濯洗浄剤組成物において使用するために適当である。これらの界面活性剤は、脂肪族基が直鎖状または分枝鎖状であることができる、第二級または第三級アミンの脂肪族誘導体、または複素環式第二級および第三級アミンとして広く記載することができる。脂肪族置換基の1つは少なくとも約8個の炭素原子、典型的には約8〜約18個の炭素原子を有し、そして少なくとも1つはアニオン可溶化基、例えば、カルボキシ、スルホネート、サルフェートを含有する。両性界面活性剤の例については、米国特許第3,929,678号 (第19欄、第18〜35行) 参照。
【０１３４】
双性界面活性剤は、また、洗濯洗浄剤組成物において使用するために適当である。これらの界面活性剤は、第二級および第三級アミンの誘導体、複素環式第二級および第三級アミンの誘導体、または第四級アンモニウム、第四級ホスホニウムまたは第三級スルホニウム化合物の誘導体として広く記載することができる。双性界面活性剤の例については、米国特許第3,929,678号 (第19欄、第38行〜第22欄、第48行) 参照。
【０１３５】
半極性界面活性剤は、約10〜約18個の炭素原子の1つのアルキル部分および約1〜約3個の炭素原子を有するアルキル基およびヒドロキシアルキル基から成る群から選択される2つの部分を含有する水溶性アミンオキシド；約10〜約18個の炭素原子の1つのアルキル部分および約1〜約3個の炭素原子を有するアルキル基およびヒドロキシアルキル基から成る群から選択される2つの部分を含有する水溶性ホスフィンキシド；および約10〜約18個の炭素原子の1つのアルキル部分および約1〜約3個の炭素原子のアルキル基およびヒドロキシアルキル基から成る群から選択される1つの部分を含有する水溶性スルホキシドを包含する非イオン界面活性剤の特別のカテゴリーである。
【０１３６】
半極性非イオン洗浄剤界面活性剤は、下記式を有するアミンオキシド界面活性剤を包含する：
【化４】
2005507644.tif 000008
【０１３７】
式中R3は約8〜約22個の炭素原子を有するアルキル、ヒドロキシアルキル、またはアルキルフェニル基であり、R4は約2〜約3個の炭素原子を有するアルキレンまたはヒドロキシアルキレン基であり、xは0〜約3であり、そしてR5は約1〜約3個の炭素原子を有するアルキルまたはヒドロキシアルキル基または約1〜約3個のエチレンオキシド基を含有するポリエチレンオキシド基である。R5基は、例えば、酸素または窒素原子を通して、互いに結合して環構造を形成することができる。
これらのアミンオキシド界面活性剤は、特にC10−C16アルキルジメチルアミンオキシドおよびC8−C12アルコキシエチルジヒドロキシエチルアミンオキシドを包含する。
適当な補助界面活性剤は第一級または第三級アミンから成る群から選択される。
【０１３８】
本発明における使用に適当な第一級アミンは下記式に従うアミンを包含する：R1NH2、式中R1はC6−C12、好ましくはC6−C10アルキル鎖またはR4X(CH2)nであり、Xは−O−、−C(O)NH−または−NH−であり、R4はC6−C12アルキル鎖であり、nは1〜5、好ましくは3である。R1アルキル鎖は直鎖状または分枝鎖状であることができ、そして12まで、好ましくは5より小さいエチレンオキシド部分で中断されることができる。
【０１３９】
上記式に従う好ましいアミンはn−アルキルアミンである。本発明における使用に適当なアミンは、1−ヘキシルアミン、1−オクチルアミン、1−デシルアミンおよびラウリルアミンから選択することができる。他の好ましい第一級アミンは、C8−C10オキシプロピルアミン、オクチルオキシプロピルアミン、2−エチルヘキシル−オキシプロピルアミン、ラウリルアミドプロピルアミンおよびアミドプロピルアミンを包含する。
本発明における使用に適当な第三級アミンは、式R1R2R3Nを有する第三級アミンを包含する：式中R1およびR2はC1−C8アルキル鎖または
【０１４０】
【化５】
2005507644.tif 000009
【０１４１】
であり、R3はC6−C12、好ましくはC6−C10アルキル鎖であるか、あるいはR3はR4X(CH2)nであり、ここでXは−O−、−C(O)NH−または−NH−であり、R4はC4−C12であり、nは1〜5、好ましくは2〜3である。R5はHまたはC1−C2アルキルであり、そしてxは1〜6である。
R3およびR4は直鎖状または分枝鎖状であることができ、R3アルキル鎖は12まで、好ましくは5より少ないエチレンオキシド部分で中断されることができる。好ましい第三級アミンは、R1がC6−C12アルキル鎖であり、R2およびR3がC1−C3アルキルまたは
【０１４２】
【化６】
2005507644.tif 000010
【０１４３】
であり、ここでR5がHまたはCH3であり、そしてxが1〜2である、R1R2R3Nである。
また、下記式のアミドアミンは好ましい：
【０１４４】
【化７】
2005507644.tif 000011
【０１４５】
式中R1はC6−C12アルキルであり、nは2〜4であり、好ましくはnは3であり、R2およびR3はC1−C4である。
【０１４６】
最も好ましいアミンは、1−オクチルアミン、1−ヘキシルアミン、1−デシルアミン、1−ドデシルアミン、C8−10オキシプロピルアミン、Nココヤシ1−3ジアミノプロパン、ココナツアルキルジメチルアミン、ラウリルジメチルアミン、ラウリルビス (ヒドロキシエチル) アミン、ココヤシビス (ヒドロキシエチル) アミン、ラウリルアミン2モルのプロポキシル化、オクチルアミン2モルのプロポキシル化、ラウリルアミドプロピルジメチルアミン、C8−10アミドプロピルジメチルアミンおよびC10アミドプロピル−ジメチルアミンを包含する。
【０１４７】
本発明における組成物において使用するために最も好ましいアミンは、1−ヘキシルアミン、1−オクチルアミン、1−デシルアミン、1−ドデシルアミンである。n−ドデシルジメチルアミンおよびビスヒドロキシエチルココナツアルキルアミンおよびオレイルアミノ7回エトキシル化、ラウリルアミドプロピルアミンおよびココヤシアミドプロピルアミンは特に望ましい。
【０１４８】
ビルダー系
本発明による組成物は、ビルダー系をさらに含んでなることができる。任意の慣用ビルダー系は本発明における使用に適当であり、アルミノケイ酸塩物質、ケイ酸塩、ポリカルボン酸塩および脂肪酸、エチレンジアミン四酢酸のような物質、金属イオン封鎖剤、例えば、アミノプロピルホスホン酸塩、特にエチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸およびジエチレントリアミンペンタメチレンホスホン酸を包含する。明らかな環境的理由で好ましさに劣るが、リン酸塩ビルダーを本発明において使用することもできる。
適当なビルダーは、無機イオン交換物質、普通に無機水和アルミノケイ酸塩物質、さらに詳しくは水和合成ゼオライト、例えば、水和ゼオライトA、X、B、HSまたはMAPであることができる。
【０１４９】
他の適当な無機ビルダー物質は層状ケイ酸塩、例えば、SKS−6 (Hoechst) である。SKS−6はケイ酸ナトリウム (Na2Si2O5) から成る結晶質ケイ酸塩である。
1つのカルボキシ基を含有する適当なポリカルボン酸塩は、乳酸、グリコール酸およびそれらのエーテル誘導体 (ベルギー国特許第831,367号、第821,369号および第821,370号に開示されている) を包含する。2つのカルボキシ基を含有するポリカルボン酸塩は、コハク酸、マロン酸、 (エチレンジオキシ) 二酢酸、ジグリコール酸、酒石酸、タルツロン酸およびフマル酸の水溶性塩、ならびに ドイツ国公開第2,446,686号および第2,446,487号、米国特許第3,935,257号に記載されているエーテルカルボキシレートおよびベルギー国特許第840,623号に記載されているスルフィニルカルボキシレートを包含する。
【０１５０】
3つのカルボキシ基を含有するポリカルボン酸塩は、特に、水溶性クエン酸塩、アコニット酸塩およびシトラコン酸塩ならびに英国特許第1,379,241号に記載されているコハク酸塩誘導体、例えば、カルボキシメチルオキシコハク酸塩、オランダ国出願第7205873号に記載されているラクトキシコハク酸塩、および英国特許第1,387,447号に記載されているオキシポリカルボン酸塩物質、例えば、2−オキサ−1,1,3−プロパントリカルボン酸塩を包含する。
【０１５１】
4つのカルボキシ基を含有するポリカルボン酸塩は、英国特許第1,261,829号に記載されているオキシジコハク酸塩、1,1,2,2−エタンテトラカルボン酸塩、1,1,3,3−プロパンテトラカルボン酸塩を包含する。スルホ置換基を含有するポリカルボン酸塩は、英国特許第1,398,421号および第1,398,422号および米国特許第3,936,448号に開示されているスルホコハク酸塩誘導体、および英国特許第1,082,179号に記載されているスルホン化熱分解クエン酸塩を包含するが、ホスホン置換基を含有するポリカルボン酸塩は英国特許第1,439,000号に記載されている。
【０１５２】
脂環式および複素環式ポリカルボン酸塩は、シクロペンタン−シス,シス,シス−テトラカルボン酸塩、シクロペンタジエニドペンタカルボン酸塩、2,3,4,5−テトラヒドロ−フラン−シス,シス,シス−テトラカルボン酸塩、2,5−テトラヒドロフラン−シス,ジスカルボン酸塩、2,2,5,5−テトラヒドロフラン−テトラカルボン酸塩、1,2,3,4,5,6−ヘキサン−ヘキサカルボン酸塩および多価アルコール、例えば、ソルビトール、マンニトールおよびキシリトールのカルボキシメチル誘導体を包含する。芳香族ポリカルボン酸塩は、英国特許第1,425,343号に開示されているメリット酸、ピロメリット酸およびフタル酸誘導体を包含する。
【０１５３】
前述のうちで、好ましいポリカルボン酸塩は3つまでのカルボキシ基／分子を含有するヒドロキシ−カルボン酸塩、特にクエン酸塩である。
本発明の組成物において使用するために好ましいビルダー系は、水不溶性アルミノケイ酸塩ビルダー、例えば、ゼオライトAまたは層状ケイ酸塩 (SKS−6) と、水溶性カルボン酸塩キレート化剤、例えば、クエン酸との混合物を包含する。
【０１５４】
本発明による洗浄剤組成物中に添加するために適当なキレート化剤は、エチレンジアミン−N,N’−ジコハク酸 (EDDS) またはそれらのアルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム、または置換アンモニウム塩、またはそれらの混合物である。好ましいEDDS化合物は、遊離酸形態およびそれらのナトリウムまたはマグネシウム塩に示す。EDDSのこのような好ましいナトリウム塩の例は、Na2EDTAおよびNa4EDTAを包含する。EDDSのこのような好ましいマグネシウム塩の例は、MgEDDSおよびMg2EDDSを包含する。マグネシウム塩は、本発明による組成物の中への添加に最も好ましい。
【０１５５】
好ましいビルダー系は、水不溶性アルミノケイ酸塩の混合物、例えば、ゼオライトA、および水溶性カルボン酸塩キレート化剤、例えば、クエン酸を包含する。
粒状組成物において使用するためのビルダー系の部分を形成することができる他のビルダー物質は、無機物質、例えば、アルカリ金属炭酸塩、重炭酸塩、ケイ酸塩、および有機物質、例えば、有機ホスホン酸塩、アミノポリアルキレンホスホン酸塩およびアミノポリカルボン酸塩を包含する。
他の適当な水溶性有機塩は、ポリカルボン酸が2以下の炭素原子により互いに分離されている少なくとも2つカルボキシル基を含んでなる、それらのホモ−またはコ−ポリマーである。
【０１５６】
このポリマーは、GB−A−1,596,756に開示されている。このような塩の例は、分子量2000〜5000のポリアクリレートおよび無水マレイン酸とのそれらのコポリマー、分子量20,000〜70,000、特に約40,000を有するこのようなコポリマーである。
洗浄性ビルダー塩は、通常組成物の5〜80重量％の量で添加される。液状洗浄剤についてビルダーの好ましいレベルは5％〜30％である。
【０１５７】
酵素
好ましい洗浄剤組成物は、本発明の酵素調製物に加えて、クリーニングの性能および／または布帛管理の利益を提供する、1または2以上の他の酵素を含んでなる。
このような酵素は、プロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ (例えば、ラッカーゼ) を包含する。
【０１５８】
プロテアーゼ：アルカリ性溶液において使用するために適当な任意のプロテアーゼを使用することができる。適当なプロテアーゼは、動物、野菜または微生物起源のプロテアーゼを包含する。微生物由来は好ましい。化学的または遺伝的に修飾された突然変異体を添加する。プロテアーゼはセリンプロテアーゼ、好ましくはアルカリ性微生物プロテアーゼまたはトリプシン様プロテアーゼであることができる。アルカリ性プロテアーゼの例は、スブチリシン、特にバシラス (Bacillus) に由来するもの、例えば、スブチリシンNovo、スブチリシンCarlsberg、スブチリシン309、スブチリシン147およびスブチリシン168 (WO 89／06279に記載されている) である。トリプシン様プロテアーゼの例はトリプシン (例えば、ブタまたはウシ起源) およびWO 89／06270に記載されているフザリウム (Fusarium) プロテアーゼである。
【０１５９】
好ましい商業的に入手可能なプロテアーゼ酵素は、ノボザイムA／S (Novozymes A／S) (デンマーク国) により商品名Alcalase、Savinase、Primase、Durazym、およびEsperaseで販売されているもの、ジンコル・インターナショナル (Genencor International) により商品名Maxatase、Maxacal、Maxapem、Properase、PurafectおよびPurafect OXPで販売されているもの、およびソルベイ・エンザイム (Solvay Enzymes) により商品名OpticleanおよびOptimaseで販売されているものを包含する。プロテアーゼ酵素は本発明による組成物の中に組成物の0.00001〜2重量％の酵素タンパク質、好ましくは0.0001〜1重量％の酵素タンパク質、より好ましくは0.001〜0.5重量％の酵素タンパク質、なおより好ましくは0.01〜0.2重量％の酵素タンパク質のレベルで混入される。
【０１６０】
リパーゼ：アルカリ性溶液中で使用するために適当な任意のリパーゼを使用することができる。適当なリパーゼは、細菌または真菌起源のリパーゼを包含する。化学的にまたは遺伝的に修飾された突然変異体が包含される。
【０１６１】
有用なリパーゼの例は次の通りである：フミコラ・ラヌギノサ (Humicola lanuginosa) リパーゼ、例えば、EP 258 068およびEP 305 216に記載されているもの、リゾムコル・ミエヘイ (Rhizomucor miehei) リパーゼ、例えば、EP 238 023に記載されているもの、カンジダ (Candida) リパーゼ、例えば、カンジダ・アンタルクチカ (C. Antarctica) リパーゼ、例えば、EP 214 761に記載されているカンジダ・アンタルクチカ (C． Antarctica) リパーゼAまたはB、シュードモナス (Pseudomonas) リパーゼ、例えば、EP 218  272に記載されているシュードモナス・アルカリゲネス (P. alcaligenes) およびシュードモナス・シュードアルカリゲネス  (Pseudomonas pseudoalcaligenes) リパーゼ、
【０１６２】
例えば、EP 331 376に記載されているシュードモナス・セパシア (P. cepacia) リパーゼ、例えば、GB 1,372,034に開示されているシュードモナス・スツゼリ (P. stutzeri) リパーゼ、シュードモナス・フルオレッセンス (Pseudomonas fluorescens) リパーゼ、バシラス (Bacillus) リパーゼ、例えば、バシラス・ズブチリス (B. subtilis) リパーゼ (Dartosis他、(1993)、Biochimica et Biophysica Acta 1131：253−260)、バシラス・ステアロサーモフィラス (B. stearothermophilus) リパーゼ (JP 64／744992) およびバシラス・プミラス (B. pumillus) リパーゼ (WO 91／16422)。
【０１６３】
さらに、多数のクローニングされたリパーゼは有用であり、下記のものを包含する：Yamaguchi他、(1991)、Gene 103、61−67) に記載されているペニシリウム・カメンベルチイ (Penicillium camembertii) リパーゼ、ゲトリカム・カンジヅム (Geotricum candidum) リパーゼ (Schimada Y. 他、J. Biochem. 106：383−388)、および種々のリゾプス (Rhizopus) リパーゼ、例えば、リゾプス・デレマル (Rhizopus delemar) リパーゼ (Hass M. J. 他、(1991)、Gene 109：117−113)、リゾプス・ニベウス (R. niveus) リパーゼ (Kugimiya他、(1992)、Biosci. Biotech. Biochem. 56：716−719) およびリゾプス・オリゼ (R. oryzae)。
【０１６４】
また、他の型の脂肪分解酵素、例えば、クチナーゼ、例えば、WO 88／09367に記載されているシュードモナス・メンドナ (Pseudomonas mendocina) に由来するクチナーゼ、またはフザリウム・ソラニ・ピシ (Fusarium solani pisi) (WO 88／09446) は有用である。
特に適当なリパーゼは、リパーゼ、例えば、M1 LipaseTM、Luma fastTMおよびLipomaxTM (Genencor)、LipolaseTMおよびLipolase UltraTM (Novozymes A／S)、およびLipase P“Amano” (Amano Pharmaceutical Co. Ltd.) である。
【０１６５】
リパーゼは通常本発明による洗浄剤組成物の中に組成物の0.00001〜2重量％の酵素タンパク質、好ましくは0.0001〜1重量％の酵素タンパク質、より好ましくは0.001〜0.5重量％の酵素タンパク質、なおより好ましくは0.01〜0.2重量％の酵素タンパク質のレベルで混入される。
【０１６６】
アミラーゼ：アルカリ性溶液中で使用するために適当な任意のアミラーゼ (αおよび／またはβ) を使用することができる。適当なアミラーゼは、細菌または真菌起源のリパーゼを包含する。化学的にまたは遺伝的に修飾された突然変異体が包含される。アミラーゼは、例えば、GB 1,296,839にいっそう詳細に記載されているバシラス・リヘニフォルミス (B． licheniformis) の特別の株から得られるα−アミラーゼを包含する。商業的に入手可能なアミラーゼは、DuramlyTM、TermamylTM、FungamylTMおよびBANTM (Novozymes A／Sから入手可能である) およびRapidaseTMおよびMaxamylTM (Genencorから入手可能である) を包含する。
【０１６７】
アミラーゼは通常洗浄剤組成物の中に組成物の0.00001〜2重量％の酵素タンパク質、好ましくは0.0001〜1重量％の酵素タンパク質、より好ましくは0.001〜0.5重量％の酵素タンパク質、なおより好ましくは0.01〜0.2重量％の酵素タンパク質のレベルで混入される。
【０１６８】
セルラーゼ：アルカリ性溶液中で使用するために適当な任意のセルラーゼを使用することができる。適当なセルラーゼは、細菌または真菌起源のリパーゼを包含する。化学的にまたは遺伝的に修飾された突然変異体が包含される。セルラーゼは、米国特許第4,435,307号およびWO 91／17243 (フミコラ・インソレンス (Humicola insolens) から産生される真菌セルラーゼを開示している)、WO 96／34108およびWO 96／34092 (バシラス (Bacillus) からの細菌好アルカリ性セルラーゼ (BCE 103) を開示している)、およびWO 94／21801、米国特許第5,475,101号および米国特許第5,419,778号 (トリコデルマ (Trichoderma) からのBG IIIセルラーゼを開示している) に開示されている。
【０１６９】
特に適当なセルラーゼは色管理利益を有するセルラーゼである。このようなセルラーゼの例は、欧州特許出願第0 495 257号に開示されているセルラーゼである。商業的に入手可能なセルラーゼは、フミコラ・インソレンス (Humicola insolens) 株により産生されるCelluzymeTMおよびCarezymeTM (Novozymes A／S)、KAC−500 (B)TM (Kao Corporation)、およびPuradaxTM (Genencor International) である。
【０１７０】
セルラーゼは通常洗浄剤組成物の中に組成物の0.00001〜2重量％の酵素タンパク質、好ましくは0.0001〜1重量％の酵素タンパク質、より好ましくは0.001〜0.5重量％の酵素タンパク質、なおより好ましくは0.01〜0.2重量％の酵素タンパク質のレベルで混入される。
【０１７１】
ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ：ペルオキシダーゼ酵素は過酸化水素またはその源 (例えば、過炭酸塩、過臭素酸塩または過硫酸塩) と組み合わせて使用される。オキシダーゼ酵素は酸素と組み合わせて使用される。両方の型の酵素は、「溶液漂白」に、すなわち、染色された布帛を洗浄液中で、好ましくは、例えば、増強剤と一緒に、洗浄するとき、繊維材料の染料が染色された布帛から他の布帛へ転移するのを防止ために使用される (例えば、WO 94／12621およびWO 95／01426に記載されているように)。適当なペルオキシダーゼ／オキシダーゼは、植物、細菌または真菌起源のものを包含する。化学的または遺伝的に修飾された突然変異体が包含される。
【０１７２】
ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ酵素は通常洗浄剤組成物の中に組成物の0.00001〜2重量％の酵素タンパク質、好ましくは0.0001〜1重量％の酵素タンパク質、より好ましくは0.001〜0.5重量％の酵素タンパク質、なおより好ましくは0.01〜0.2重量％の酵素タンパク質のレベルで混入される。
前述の酵素の混合物、特にプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼおよび／またはセルラーゼの混合物がここにおいて考えれる。
【０１７３】
本発明の酵素、または洗浄剤組成物の中に混入される任意の他の酵素は、通常洗浄剤組成物の中に組成物の0.00001〜2重量％の酵素タンパク質、好ましくは0.0001〜1重量％の酵素タンパク質、より好ましくは0.001〜0.5重量％の酵素タンパク質、なおより好ましくは0.01〜0.2重量％の酵素タンパク質のレベルで混入される。
【０１７４】
漂白剤
本発明の洗浄剤組成物の中に添加できる追加の任意の洗浄剤成分は、漂白剤を包含する。これらの漂白剤は1または2以上の酸素漂白剤および、選択した漂白剤に依存して、1または2以上の漂白アクチベーターを包含することができる。存在するとき、酸素漂白化合物は典型的には約1％〜約25％のレベルで存在するであろう。本発明の組成物に好ましい漂白剤は次の通りである：後述するようにマクロポリサイクリック硬質リガンド (Macropolycyclic Rigid Ligand) の遷移金属錯体、特にジクロロMnジメチルエチレン架橋シクラム (Cyclam) および／またはジクロロMnジエチルエチレン架橋シクラム；および過酸化水素解放剤と漂白アクチベーター4−[N−(ノナノイル)アミノヘキサノイルオキシ]ベンゼンスルホン酸ナトリウム (NACA−OBS) との組み合わせ。
【０１７５】
洗濯、皿洗浄および硬質表面クリーニングを含み、漂白剤をさらに含んでなる本発明の洗浄剤組成物は、きわめてすぐれたクリーニングおよび汚染除去を提供することが見出された。理論により拘束されたくないが、漂白剤はさらにペクチン／ペクテート成分中のヒドロキシル基を酸化し、それらをいっそう安定性とし、除去容易とすると考えられる。
【０１７６】
驚くべきことには、漂白系はペクチン酸リアーゼ酵素のクリーニング効能を最大にすることが発見された。さらに、驚くべきことには、本発明のペクチン酸リアーゼと漂白系とを含んでなる洗浄剤組成物は、漂白系の相乗作用のためによりすぐれたクリーニングを提供し、クリーニング、汚染除去および洗濯の関係において白色度の維持を提供し、そしてペクチン酸リアーゼはこのような汚れのペクチン成分および／または、洗濯の関係において、このような汚れと結合する布帛のペクチン成分を分解することが発見された。これらの漂白系−酵素混合系は、特に食物着色汚染および体の汚れに対して、顕著なクリーニング作用を与える。その上、洗濯および／または布帛管理組成物として配合するとき、本発明の組成物は相乗的白色度維持を提供する。
【０１７７】
理論により拘束されたくないが、多数の普通の果実および野菜に基づく汚れならびに綿繊維の主要な壁の中に見出される天然のペクチンは汚れ残留物、特に高度に着色した汚れ成分を攻撃し、保持すると考えられる。ペクチン酸リアーゼによるペクチン成分の除去は、これらの色物体を漂白系に対して暴露する。相乗作用は、頑強な色成分を脱色して食物の汚染および体の汚れを除去する、これらの漂白系のためであり、そしてこのような汚れのペクチン成分および／または洗濯の関係において、このような汚れと結合し、そうでなければそれと相互作用し、前記汚れを除去困難とするペクチン成分を分解するペクチン酸リアーゼのためであると考えられる。
【０１７８】
本発明において使用する漂白剤成分は、酸素漂白剤を含む洗浄剤組成物に有用な、任意の漂白剤、ならびにこの分野において知られている他の漂白剤、例えば、400〜800ミクロンの粒度を有する一水和物または四水和物の過臭素酸塩および過炭酸塩であることができる。
【０１７９】
本発明に適当な漂白剤は、活性化または非活性化であることができる。
使用できる酸素漂白剤の1つのカテゴリーは、過カルボン酸漂白剤およびそれらの塩を包含する。このクラスの漂白剤の適当な例は、マグネシウムモノペルオキシフタレートヘキサ水和物、メタ−クロロ過臭素酸のマグネシウム塩、4−ノニルアミノ−４−オキソペルオキシ酪酸およびジペルオキシドデカジオン酸を包含する。このような漂白剤は、米国特許第4,483,781号、米国特許第740,446号、EP 0 133 354および米国特許第4,412,934号に開示されている。また、高度に好ましい漂白剤は、米国特許第4,634,551号に記載されている6−ノニルアミノ−6−オキソペルオキシカプロン酸を包含する。
【０１８０】
使用できる漂白剤の他のカテゴリーは、ハロゲン漂白剤を包含する。例えば、次亜ハロゲン酸塩の例は、トリクロロイソシアヌル酸およびナトリウムおよびカリウムのジクロロイソシアヌル酸塩およびN−クロロおよびN−ブロモアルカンスルホンアミドを包含する。このような物質は通常仕上げられた生成物の0.5〜10重量％、好ましくは1〜5重量％である。
【０１８１】
過酸化水素放出剤は、漂白アクチベーター、例えば、テトラ−アセチルエチレンジアミン (TAED)、ノナノイルオキシベンゼンスルホネート (MOBS、米国特許第4,412,934号に記載されている)、3,5−トリメチル−ヘキサノールオキシベンゼンスルホネート (ISONOBS、EP 120 591に記載されている) またはペンタアセチルグルコース (PAG) (これらは過加水分解して活性漂白種として過酸を生成し、漂白作用を改良する) と組み合わせて使用することができる。さらに、漂白アクチベーターC8 (6−オクタアミド−カプロイル) オキシベンゼンスルホネート、C9 (6−ノナアミド−カプロイル) オキシベンゼンスルホネートおよびC10 (6−デカンアミド−カプロイル) オキシベンゼン−スルホネートまたはそれらの混合物は非常に適当である。
【０１８２】
それ以上の疎水性漂白アクチベーターは下記のものを包含するが、これらに限定されない：4−[N−(ノナノイル)アミノヘキサノイルオキシ]ベンゼンスルホン酸ナトリウム (NACA−OBS) (その例は米国特許第5,523,434号に記載されている)、ドデカノイルオキシベンゼンスルホネート (LOBSまたはC12−OBS)、10−ウンデカノイルオキシベンゼンスルホネート (UDOBSまたはC11−OBS) (10位に不飽和を有する)、およびデカノイルオキシ安息香酸 (DOBA)。また、適当なアクチベーターをアシル化シトレートエステル、例えば、EP 624 154に記載されているものである。
【０１８３】
ペルオキシ酸、および本発明による洗浄剤組成物において使用する漂白アクチベーターと過酸素漂白化合物とを含んでなる漂白系を包含する、有用な漂白剤は、WO 95／10592に記載されている。
また、洗浄および／またはすすぎプロセスの開始時または間に過酸化水素を発生することができる、酵素系 (すなわち、酵素およびその基質) を添加することによって、過酸化水素を存在させることができる。このような酵素系は、欧州特許出願EP 0 537 381に開示されている。
【０１８４】
また、酸素漂白剤以外の漂白剤はこの分野において知られており、そして本発明において利用することができる。特に重要な非酸素漂白剤の1つの型は、光活性化漂白剤、例えば、スルホン化亜鉛および／またはアルミニウムフタロシアニンを包含する。これらの物質は洗浄プロセス間に支持体上に付着することができる。例えば、日光中で布を吊下げ乾燥することによって、酸素の存在下に光で照射すると、スルホン化亜鉛フタロシアニンは活性化され、結局、支持体は漂白される。好ましい亜鉛フタロシアニンおよび光活性化漂白プロセスは、米国特許第4,033,718号に記載されている。
【０１８５】
典型的には、洗浄剤組成物は約0.025〜約1.25重量％のスルホン化亜鉛フタロシアニンを含有するであろう。また、漂白剤はマンガンおよびコバルトの触媒、例えば、米国特許第5,576,282号、第5,246,621号、第5,244,594号、第5,194,416号、および第5,114,606号、および欧州特許出願公開No. 549,271 A1、549,272 A1、544,440 A2、および544,490 A1に開示されているマンガンをベースとする触媒を含んでなることができる；例えば、コバルト漂白触媒は、例えば、米国特許第5,597,936号、第5,595,967号、および第5,703,030号、およびM. L. Tobe、「遷移金属錯体の塩基加水分解」、Adv. Inorg. Bioinorg. Mech. (1983)、2：1−94に記載されている。
【０１８６】
また、本発明における組成物は、適当には、漂白触媒としてマクロポリサイクリック硬質リガンドの遷移金属錯体を含む。使用量は、触媒的に有効な量であり、適当には約1 ppbまたはそれより多く、例えば、約99.9％まで、より典型的には約0.001 ppmまたはそれより多く、好ましくは約0.05 ppm〜約500 ppmである。
本発明の組成物において使用するために適当であるマクロポリサイクリック硬質リガンドの遷移金属漂白触媒は、下記により非限定的に例示される：
【０１８７】
ジクロロ−5,12−ジメチル−1,5,8,12−テトラアザビシクロ[6.6.2]ヘキサデカンマンガン (II) ；
ジクロロ−4,11−ジメチル−1,4,8,11−テトラアザビシクロ[6.6.2]ヘキサデカンマンガン (II) ；
ジクロロ−5,12−ジエチル−1,5,8,12−テトラアザビシクロ[6.6.2]ヘキサデカンマンガン (II) ；
ジクロロ−4,11−ジエチル−1,4,8,11−テトラアザビシクロ[6.6.2]ヘキサデカンマンガン (II) ；
ジアクオ−5,12−ジメチル−1,5,8,12−テトラアザビシクロ[6.6.2]ヘキサデカンマンガン (II) ヘキサフルオロホスフェート；
【０１８８】
アクオ−ヒドロキシ−5,12−ジメチル−1,5,8,12−テトラアザビシクロ[6.6.2]ヘキサデカンマンガン (III) ヘキサフルオロホスフェート；
ジアクオ−5,12−ジメチル−1,5,8,12−テトラアザビシクロ[6.6.2]ヘキサデカンマンガン (II) テトラフルオロボレート；
ジクロロ−5,12−ジメチル−1,5,8,12−テトラアザビシクロ[6.6.2]ヘキサデカンマンガン (III) ヘキサフルオロホスフェート；
ジクロロ−5,12−ジ−n−ブチル−1,5,8,12−テトラアザビシクロ[6.6.2]ヘキサデカンマンガン (II) ；
【０１８９】
ジクロロ−5,12−ジベンジル−1,5,8,12−テトラアザビシクロ[6.6.2]ヘキサデカンマンガン (II) ；
ジクロロ−5−n−ブチル−12−メチル−1,5,8,12−テトラアザビシクロ[6.6.2]ヘキサデカンマンガン (II) ；
ジクロロ−5−n−オクチル−12−メチル−1,5,8,12−テトラアザビシクロ[6.6.2]ヘキサデカンマンガン (II) ；
ジクロロ−5−n−ブチル−12−メチル−1,5,8,12−テトラアザビシクロ[6.6.2]ヘキサデカンマンガン (II)。
【０１９０】
泡抑制剤
他の任意の成分は、泡抑制剤、例えば、シリコーン、およびシリカ−シリコーン混合物である。一般に、シリコーンはアルキル化ポリシロキサン物質により代表されるが、シリカは通常微細な形態であり、例えば、シリカエーロゲルおよびキセロゲルおよび種々の形態の疎水性シリカである。これらの物質は粒子として混入することができ、ここで泡抑制剤は水溶性または水分散性、実質的に非表面活性、洗浄剤不透過性担体の中に好都合に解放可能に混入される。選択的に、泡抑制剤は液状担体中に溶解または分散させることができ、そして1または2以上の他の成分上に噴霧することによって供給することができる。
【０１９１】
好ましいシリコーン泡抑制剤は、米国特許第3,933,672号に記載されている。他の特に有用な泡抑制剤は、ドイツ国特許出願DTOS 2,64,126に記載されている、自己乳化性泡抑制剤である。このような化合物の例は、ダウ・コーニング (Dow Corning) から商業的に入手可能である、DC−544であり、これはシロキサン−グリコールコポリマーである。特に好ましい泡抑制剤は、シリコーン油と2−アルキル−アルカノールとの混合物を含んでなる泡抑制剤である。適当な2−アルキル−アルカノールは、商品名Isofol 12Rで商業的に入手可能である、2−ブチル−オクタノールである。
【０１９２】
このような泡抑制剤系は、欧州特許出願EP 0 593 841に記載されている。
特に好ましいシリコーン泡抑制剤は、欧州特許出願No. 92201649.8に記載されている。前記組成物は、ヒュームド非多孔質シリカ、例えば、AerosilRと組み合わせたシリコーン／シリカ混合物を含んでなることができる。
前述の泡抑制剤は、通常、組成物の0.001〜2重量％、好ましくは0.01〜1重量％のレベルで存在する。
【０１９３】
他の成分
洗浄剤組成物において使用される他の成分、例えば、汚れ懸濁剤、汚れ解放剤、蛍光増白剤、研磨剤、殺菌剤、曇り抑制剤、着色剤、および／またはカプセル封入または非カプセル封入香料を使用することができる。
特に適当なカプセル封入物質は、GB 1,464,616に記載されているような、多糖およびポリヒドロキシ化合物のマトリックスから成る水溶性カプセルである。
【０１９４】
他の適当な水溶性カプセル封入物質は、米国特許第3,455,838号に記載されているような、置換ジカルボン酸の非ゲル化澱粉に由来するデキストリンを含んでなる。これらの酸−エステルデキストリンは、好ましくは、蝋質トウモロコシ、蝋質モロコシ、サゴヤシ、タピオカおよびジャガイモのような澱粉から製造される。前記カプセル封入物質の適当な例はN−Lok (National Starch製) を包含する。N−Lokカプセル封入物質は、改質されたトウモロコシ澱粉およびグルコースから成る。澱粉は、一官能性置換グループ、例えば、オクテニルコハク酸無水物を添加することによって変性される。
【０１９５】
ここにおいて適当な再付着防止剤および汚れ懸濁剤は、セルロース誘導体、例えば、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースおよびヒドロキシエチルセルロース、およびホモポリマーまたはコポリマーのポリカルボン酸またはそれらの塩を包含する。この型のポリマーは、ビルダーとして前述したポリアクリレートおよび無水マレイン酸−アクリル酸コポリマー、ならびに無水マレイン酸とエチレン、メチルビニルエーテルまたはメタクリル酸とのコポリマーを包含し、ここで無水マレイン酸はコポリマーの少なくとも20モル％を構成する。これらの物質は、通常、組成物の0.5〜10重量％、より好ましくは0.75〜8重量％、最も好ましくは1〜6重量％のレベルで使用される。
【０１９６】
好ましい蛍光増白剤はアニオン性であり、それらの例は次の通りである：4,4’−ビス−(2−ジエタノールアミノ−4−アニリノ−s−トリアジン−6−イルアミノ)−スチルベン−2,2’−ジスルホン酸二ナトリウム、 4,4’−ビス−(2−モルホリノ−4−アニリノ−s−トリアジン−6−イルアミノ)−スチルベン−2,2’−ジスルホン酸二ナトリウム、4,4’−ビス−(2,4−ジアニリノ−s−トリアジン−6−イルアミノ)−スチルベン−2,2’−ジスルホン酸二ナトリウム、4’,4”−ビス−(2,4−ジアニリノ−s−トリアジン−6−イルアミノ)−スチルベン−2−スルホン酸ナトリウム、4,4’−ビス−(2−アニリノ−4−(N−メチル−N−2−ヒドロキシエチルアミノ)−s−トリアジン−6−イルアミノ)−スチルベン−2,2’−ジスルホン酸二ナトリウム、4,4’−ビス−(4−フェニル−2,1,3−トリアゾル−2−イル)−スチルベン−2,2’−ジスルホン酸二ナトリウム、4,4’−ビス−(2−アニリノ−４−(1−メチル−2−ヒドロキシエチルアミノ)−s−トリアジン−6−イルアミノ)−スチルベン−2,2’−ジスルホン酸二ナトリウム、2−(スチビル−4”−(ナフト−1’,2’,4,5)−1,2,3−トリアゾル−2”−スルホン酸ナトリウムおよび4,4’−ビス(2−スルホスチリル)ビフェニル。
【０１９７】
他の有用なポリマー物質は、ポリエチレングリコール、好ましくは分子量1000〜10000、より好ましくは2000〜8000、最も好ましくは約4000のポリエチレングリコールである。これらは0.20〜5重量％、より好ましくは0.25〜2.5重量％のレベルで使用される。これらのポリマーおよび前述のホモポリマーまたはコポリマーのポリカルボン酸塩は、白色度の維持、布帛の灰付着、および遷移金属の存在下の粘土、タンパク質および酸化可能な汚れに対するクリーニング性能を改良するために有効である。
【０１９８】
本発明の組成物において有用な汚れ解放剤は、種々の配置でエチレングリコールおよび／またはポリプロピレングリコール単位を有するテレフタル酸の普通のコポリマーおよびターポリマーである。このようなポリマーの例は、米国特許第4,116,885号および第4,711,730号およびEP 0 272 033に開示されている。EP 0 272 033に従う特に好ましいポリマーは、下記式を有する：
(CH3(PEG)43)0.75(POH)0.25[T-PO)2.8(T-PEG)0.4]T(POH)0.25(PEG)43CH3)0.75
式中PEGは−(OC2H4)O−であり、POは(OC3H6O)であり、そしてTは(pOOC6H4CO)である。
【０１９９】
また、ジメチルテレフタレート、ジメチルスルホイソフタレート、エチレングリコールおよび1,2−プロパンジオールのランダムコポリマーとして変性されたポリエステルは非常に有用であり、末端基は大部分がスルホベンゾエートおよび二次的にエチレングリコールおよび／または1,2−プロパンジオールのモノエステルから成る。ターゲットは両端がスルホベンゾエート基でキャップされたポリマーを得ることであり、本発明における前記コポリマーの「大部分」は、本発明の関係において、スルホベンゾエート基により末端キャップされているであろう。しかしながら、いくつかのコポリマーは完全より少なくキャップされ、したがってそれらの末端基はエチレングリコールおよび／または1,2−プロパンジオールのモノエステルから成り、したがって「二次的に」このような種から成る。
【０２００】
本発明において選択されるポリエステルは、約46重量％のジメチルテレフタレート、約16重量％の1,2−プロパンジオール、約10重量％のエチレングリコール、約13重量％のジメチルスルホベンゾエートおよび約15重量％のスルホイソフタル酸を含有し、約3,000の分子量を有する。ポリエステルおよびそれらの製造方法は、EP 311 342に詳述されている。
【０２０１】
柔軟剤
また、布帛柔軟剤を本発明に従う洗濯洗浄剤組成物の中に混入することができる。これらの柔軟剤は、無機または有機の型であることができる。無機柔軟剤は、GB−A−1 400898および米国特許第5,019,292号に開示されているスメクタイト粘土により例示される。有機布帛柔軟剤は、GB−A−1 514 276およびEP 0 011 340に開示されている不溶性第三級アミン、それらとEP−B−0 026 528に開示されているC12−C14第四級アンモニウム塩との組み合わせ、およびEP 0 242 919に開示されているジ−長鎖アミドを包含する。布帛柔軟剤系の他の有用な有機成分は、EP 0 299 575およびEP 0 313 146に開示されている高分子量ポリエチレンオキシド物質を包含する。
【０２０２】
スメクタイト粘土のレベルは通常5〜15重量％、より好ましくは8〜12重量％の範囲であり、この物質は乾式混合成分として配合物の残部に添加される。有機布帛柔軟剤、例えば、水不溶性第三級アミンまたはジ長鎖アミド物質は0.5〜5重量％、通常1〜3重量％のレベルで混入されるが、高分子量ポリエチレンオキシド物質および水溶性カチオン性材料は0.1〜2重量％、通常0.15〜1.5重量％のレベルで添加される。これらの物質は通常組成物の噴霧乾燥した部分に添加されるが、いくつかの場合において、これらの物質を乾式混合した粒子に添加するか、あるいは組成物の他の固体状成分に溶融液体として添加することはいっそう好都合であることがある。
【０２０３】
ポリマーの染料転移抑制剤
本発明による洗浄剤組成物は、また、0.001〜10重量％、好ましくは0.01〜2重量％、より好ましくは0.05〜1重量％のポリマーの染料転移抑制剤を含んでなることができる。前記ポリマーの染料転移抑制剤は、染料が着色された布帛から洗浄剤組成物で洗浄される布帛上に転移するのを防止するために、通常洗浄剤組成物の中に混入される。これらのポリマーは、染料が洗浄液中の他の物品に結合する機会を有する前に、染色された布帛から洗浄除去された不安定染料と錯化しまたはそれを吸収する能力を有する。
【０２０４】
特に適当なポリマーの染料転移抑制剤は、ポリアミンN−オキシドポリマー、N−ビニル−ピロリドンおよびN−ビニルイミダゾールのコポリマー、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリビニルオキサゾリドンおよびポリビニルイミダゾールまたはそれらの混合物である。
また、このようなポリマーの添加は本発明による酵素の性能を増強する。
本発明による洗浄剤組成物は、液体、ペースト、ゲル、バーまたは粒体の形態であることができる。
【０２０５】
非ダスチング粒体は、例えば、米国特許第4,106,991号および米国特許第4,661,452号 (両方はNovo Industri A／S) に開示されているように製造することができ、そしてこの分野において知られている方法により必要に応じて被覆することができる。蝋状被覆物質の例は次の通りである：分子量1000〜20000を有するポリ (エチレンオキシド) 生成物 (ポリエチレングリコール、PEG)；16〜50エチレンオキシド単位を有するエトキシル化ノニルフェノール；アルコールが12〜20個の炭素原子を有し、かつ15〜80エチレンオキシド単位が存在する、エトキシル化脂肪族アルコール；脂肪族アルコール；脂肪酸；および脂肪酸のモノ−またはジ−およびトリグリセリド。流動床技術による適用に適当な皮膜形成被覆物質の例は、GB 1483591に記載されている。
【０２０６】
本発明による粒状組成物は、また、「圧縮形態」であることができる、すなわち、それらは普通の粒状洗浄剤よりも比較的高い密度、すなわち、550〜950 g／lを有することができる；このような場合において、本発明による粒状洗浄剤組成物は、普通の粒状洗浄剤に比較して、少量の「無機充填剤塩」を含有するであろう；典型的な充填剤塩はアルカリ土類金属の硫酸塩および塩化物、典型的には硫酸ナトリウムである；「圧縮」洗浄剤は典型的には10％以下の塩を含んでなる。また、本発明による液状組成物は「濃縮された形態」であることができ、このような場合において、本発明による液状洗浄剤組成物は、普通の液状洗浄剤に比較して、少量の水を含有するであろう。典型的には、濃縮された液状洗浄剤の水分は、組成物の30重量％より少なく、より好ましくは20重量％より少なく、最も好ましくは10重量％より少ない。
【０２０７】
本発明の組成物は、例えば、洗濯添剤加組成物および汚染した布帛の処理において使用するために適当な組成物、すすぎ添加した布帛柔軟剤組成物、および一般に家庭の硬質表面クリーニング操作および皿洗浄操作において使用する組成物を包含する、手および機械による洗濯洗浄剤組成物として配合することができる。
下記の実施例により、本発明の組成物を説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定しないか、あるいは他の方法でその範囲を規定しない。洗浄剤組成物において、略した成分の識別は下記の意味を有する：
【０２０８】
【表４】
2005507644.tif 000012
【０２０９】
【表５】
2005507644.tif 000013
【０２１０】
【表６】
2005507644.tif 000014
【０２１１】
1または2以上の酵素成分は、実施例において全組成物の重量％純度の酵素で含まれている。
下記の非限定的実施例により、本発明を例示する。
【０２１２】
材料および方法
菌株およびドナー生物
バシラス・ズブチリス (Bacillus subtilis) DSM 14218は、本発明のペクチン酸リアーゼ (配列番号1) をコードするDNAを含有するプラスミドを含んでなる。また、この遺伝子を菌株ATCC 23857 (B. subtilis PL2306) からクローニングするか、あるいはDNAを同一菌株ATCC 23857Dからクローニングした (両方は下記から入手可能である、ATCC、LGC Promochem AB、スウェーデン国SE−501 17ボラス、PO Box 1737)。
【０２１３】
バシラス・ズブチリス (B. subtilis) PL 1801。この菌株は、既知のバシラス・ズブチリス (Bacillus subtilis) セルラーゼ遺伝子の転写単位において崩壊し、セルラーゼ陰性細胞を生ずる、崩壊したaprおよびnpr遺伝子 (Diderichsen B.、Wedsted U.、Hedegaard L.、Jensen B. R.、Sjφholm C. (1990) Cloning of aldB、これはアルファ−アセトラクテートデカルボキシラーゼ、バシラス・ブレビス (Bacillus brevis) からのエキソ酵素をコードする、J. Bacteriol. 172：4315−4321) を有するバシラス・ズブチリス (B. subtilis) DN 1885である。この崩壊は本質的に下記の文献に記載されているようにして実施した：編者A. L. Sonenshein、J. A. HochおよびRichard Losick (1993) Bacillus subtilis and other Gram-Positive Bacteria、American Society for microbiology、p. 618。
【０２１４】
コンピテント細胞を下記の文献に記載されているように調製し、形質転換した：Yasbin R. E.、Wilson G. A. およびYoung F. E. (1975) バシラス・ズブチリス (Bacillus subtilis) の溶原性株における形質転換およびトランスフェクション：コンピテント細胞におけるプロファージの選択的誘導の証拠。J. Bacteriol. 121：296−304。
【０２１５】
一般的分子生物学的方法
特記しない限り、すべてのDNAの操作および形質転換は分子生物学の標準的方法を使用して実施した (Sambrook他 (1989) Molecular Cloning : A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NY；Ausubel F. M. 他 (編者) “Current protocol in Molecular Biology”、John Wiley and Sons、1995；Harwood C. R. およびCutting S. M. (編者)“Molecular Biological Methods for Bacillus”、John Wiley and Sons、1990)。
DNA操作のための酵素は、製造業者の使用説明書に従い使用した (例えば、制限エンドヌクレアーゼ、リガーゼおよびその他はNew England Biolabs, Inc.から入手した)。
【０２１６】
ゲノムDNA調製物
ドナー生物として使用したバシラス・ズブチリス (Bacillus subtilis) をATCCにより特定された液体培地3中で増殖させた (American Type Culture Collection、USA)。37 ℃および300 rpmにおいて18時間後、細胞を収集し、そして下記の文献に記載されている方法により、ゲノムDNAを単離した：Pitcher D. G.、Saunders N. A.、Owen R. J.、グアジニウムチオシアネートを使用する細菌ゲノムDNAの急速抽出、Lett. Appl. Microbiol. 8：151−156、1989。
【０２１７】
プラスミド
pMOL995。このプラスミドはpUB110誘導体であり、このプラスミドをバシラス・ズブチリス (Bacillus subtilis) において増殖可能とする因子、カナマイシン耐性遺伝子を本質的に含有し、バシラス・アミロリクファシエンス (B. amyloliquefaciens) のamyQ遺伝子からクローニングされた強いプロモーターおよびシグナルペプチドを有する。このシグナルペプチドはSacII部位を含有し、この部位はシグナルペプチドと融合したタンパク質の成熟部分をコードするDNAをクローニングするためにシグナルペプチドを好都合とする。これは細胞の外部に向けられたプレタンパク質を発現させる。
このプラスミドは通常の遺伝子操作により構築し、簡単に後述する。
【０２１８】
プラスミドpMOL995の説明
pMOL995の構築基準として、pUB110プラスミド (McKenzie T. 他、1986、Plasmid 15：93−103) を使用した。いくつかのクローニング工程において、異なる特徴をpUB110のNciI制限部位の中に導入した。
pMOL995 (配列番号3) の特徴は次の通りである：
塩基対4076〜6661および1〜1962は、pUB110プラスミドをコードする。
塩基対1963〜2305は、バシラス・リヘニフォルミス (B. licheniformis) ATCC 14580のamyL遺伝子からの転写ターミネーター＋わずかの導入された制限部位 (EagI、SalIおよびその他) をコードする。
【０２１９】
塩基対2306〜3766 (逆方向) は、WO 95／26379からのα−アミラーゼの成熟部分をコードする (WO 95／26379中に配列番号4として開示されている)。
塩基対3767〜4075 (逆方向) は、バシラス・アミロリクファシエンス (Bacillus amyloliquefaciens) からクローニングされたα−アミラーゼのプロモーターおよびシグナルペプチド (プロモーターとして使用し、WO 95／10603に記載されている) ＋塩基対4075付近に導入されたユニークSacIおよびXmaI部位および塩基対3769付近に導入されたユニークSacII部位 (シグナルペプチドに対する後のインフレームクローニングにおいて使用する) をコードする。
【０２２０】
pMOL944
このプラスミドはpUB110誘導体であり、このプラスミドをバシラス・ズブチリス (Bacillus subtilis) において増殖可能とする因子、カナマイシン耐性遺伝子を本質的に含有し、バシラス・リヘニフォルミス (B. licheniformis) ATCC 14580 のamyL遺伝子からクローニングされた強いプロモーターおよびシグナルペプチドを有する。このシグナルペプチドはSacII部位を含有し、この部位はシグナルペプチドと融合したタンパク質の成熟部分をコードするDNAをクローニングするためにシグナルペプチドを好都合とする。これは細胞の外部に向けられたプレタンパク質を発現させる。
このプラスミドは通常の遺伝子操作により構築し、簡単に後述する。
【０２２１】
プラスミドpMOL944の説明
pUB110プラスミド (McKenzie T. 他、1986、Plasmid 15：93−103) をユニーク制限酵素NciIで消化した。プラスミドpDN1981上にコードされたamyLプロモーターから増幅されたPCRフラグメント (P. L. Jφrgensen他、1990、Gene 96：37−41) をNciIで消化し、NciI消化pUB110の中に挿入してプラスミドpSJ2624を形成した。
【０２２２】
使用した2つのPCRプライマーは下記の配列を有する：
プライマーC (配列番号8)
5’ −GTCGCCGGGGCGGCCGCTATCAATTGGTAACTGTATCTCAGC−3’
プライマーC (配列番号9)
5’ −GTCGCCCGGGAGCTCTGATCAGGTACCAAGCTTGTCGACCTGCAGAATGAGGCAGCAAGAAGAT−3’
プライマーCはNotI部位をプラスミドの中に挿入する。
【０２２３】
次いでプラスミドpSJ2624をSacIおよびNotIで消化し、そしてpDN1981上にコードされたamyLプロモーター上で増幅し、プライマーEおよびFを使用して合成した新しいPCRフラグメントをSacIおよびNotIで消化し、このDNAフラグメントをSacI−NotI消化pSJ2624の中に挿入してプラスミドpSJ2670を形成した。
【０２２４】
このクローニングは、同一であるが、反対方向のプロモーターを使用する第1のamyLプロモーターのクローニングと置換する。PCR増幅に使用した2つのプライマーは下記の配列を有する：
プライマーE (配列番号10)
5’ −GTCGGCGGCCGCTGATCACGTACCAAGCTTGTCGACCTGCAGAATGAGGCAGCAAGAAGAT−3’
プライマーF (配列番号11)
5’ −GTCGGAGCTCTATCAATTGGTAACTGTATCTCAGC−3’
【０２２５】
プラスミドpSJ2670を制限酵素PatIおよびBclIで消化し、2つのプライマーGおよびHを使用してアルカリ性アミラーゼSP722 (WO9526397−A1に記載されている) をコードするクローニングされたDNA配列から増幅したPCRフラグメントを、PatIおよびBclIで消化し、挿入してプラスミドpMOL944を形成した。PCR増幅に使用した2つのプライマーは下記の配列を有する：
プライマーG (配列番号12)
5’ −AACAGCTGATCACGACTGATCTTTTAGCTTGGCAC−3’
プライマーH (配列番号13)
5’ −AACTGCAGCCGCGGCACATCATAATGGGACAAATGGG−3’
プライマーHはSalI部位をプラスミドの中に挿入する。
【０２２６】
培地
TY (下記の文献に記載されている：Ausubel F. M. 他 (編者) “Current Protocols in Molecular Biology”、John Wiley and Sons、1995)。
LB寒天 (下記の文献に記載されている：Ausubel F. M. 他 (編者) “Current Protocols in Molecular Biology”、John Wiley and Sons、1995)。
LBPGは、0.5％グルコースおよび0.05Mリン酸カリウムを補充したLB寒天pH 7.0である。
BPX培地は、EP 0 506 780 (WO 91／09129) に記載されている。
【０２２７】
終点リアーゼアッセイ (235 nmにおいて)、ペクテート単位
β−排除を決定するために、0.1 MのEPPS緩衝液pH 8中に可溶化した基質1.0％ポリガラクツロン酸ナトリウム (Sigma P−1879) を使用して、235 nmにおける吸収の増加を測定するアッセイを実施した。70 ℃における20分間のインキュベーション。5体積の0.02 MのH3PO4の添加により、反応を停止させる。触媒速度を計算するために、235における5.2吸収単位／分の増加は不飽和生成物の1 μmolの生成に対応する (NasunaおよびStaar (1966) J. Biol. Chem. Vol. 241、pp. 5298−5306；およびBartling、WegenerおよびOlsen (1995) Microbiology Vol. 141、pp. 873−881)。
1ペクテート単位は、pH 8.0および70 ℃において1 μmol切断／分を生成する酵素量である。
【０２２８】
実施例１．バシラス・ズブチリス (Bacillus subtilis) ペクチン酸リアーゼ遺伝子のクローニング
バシラス・ズブチリス (B. subtilis) における成熟ペクチン酸リアーゼのサブクローニング
これらの2つのオリゴヌクレオチドから成るPCRプライマー組を使用して、本発明のペクチン酸リアーゼをコードするDNA配列をPCR増幅した。
配列番号4 (プライマーA)
5’ −CAT TCT GCA GCC GCG GCA GCT GAT TTA GGC CAC CAG ACG−3’
配列番号5 (プライマーB)
5’ −GTA CCT CGC GAG TCG ACT TCT TAA TTT AAT TTA CCC GCA CCC GC−3’
制限部位SacIIおよびSalIに下線が引かれている。
【０２２９】
200 μMの各dNTP、2.6単位のHiFidelityTM Expand酵素混合物および200 pmolの各プライマーを補充した、HiFidelityTM PCR緩衝液 (Boehringer Mannheim、ドイツ国) 中のPCR反応において、オリゴヌクレオチドを使用した。種バシラス・ズブチリス (Bacillus subtilis) の株から単離したゲノムDNAを、PCR反応の鋳型として添加した。前述したように、ゲノムDNAを単離した。
【０２３０】
DNAサーマルサイクラー (Landgraf、ドイツ国) を使用して、PCR反応を実施した。94 ℃において1分間の1回のインキュベーション、次いで94 ℃において15秒間の変性、60 ℃において60秒間のアニリーング、および72 ℃において120秒間のエクステンションのサイクルプロファイルを使用して実施した10サイクルのPCR、次いで20サイクルの94 ℃において15秒間、60 ℃において60秒間および72 ℃において120秒間の変性 (この伸長工程において、20秒をサイクル毎に加える)。0.7％アガロースゲル (NuSieve、FMC) 中の電気泳動により、増幅生成物の5 μlのアリコートを分析した。DNAフラグメント大きさ1.2 kbの出現は、遺伝子セグメントの適切な増幅を示した。
【０２３１】
PCRフラグメントのサブクローニング：
製造業者の使用説明書に従いQIAquick PCR精製キット (Qiagen、米国) を使用して、前述したように発生させたPCR生成物の45 μlのアリコートを精製した。精製したDNAを50 μlの10 mM Tris−HCl、pH 8.5中で溶離した。
5 μgのpMOL995および25 μlの精製したPCRフラグメントをSacIIおよびSalIで消化し、0.7％アガロースゲル (NuSieve、FMC) 中で電気泳動させ、関係するフラグメントをゲルから切り取り、製造業者の使用説明書に従いQIAquick Gel抽出キット (Qiagen、米国) を使用して精製した。次いで単離したPCR DNAフラグメントを、SacII−SalI消化し精製したpMOL995に結合させた。0.5 μgの各DNAフラグメント、1単位のT4 DNAリガーゼおよびT4リガーゼ緩衝液 (Boehringer Mannheim、ドイツ国) を使用して、結合を16 ℃において一夜実施した。
【０２３２】
結合混合物を使用して、コンピテントバシラス・ズブチリス (Bacillus subtilis) PL2306を形質転換した。形質転換した細胞をLBPG−10 μg／mlのカナマイシン寒天平板上にプレートした。37℃において18時間インキュベートした後、コロニーが平板上に見られた。一夜の培養ブロスからプラスミドDNAを単離することによって、いくつかのクローンを分析した。
【０２３３】
1つのこのような陽性クローンを上で使用した寒天平板上で数回再ストリークし、このクローンをMB331と呼んだ。クローンMB331をTY−10 μg／mlのカナマイシン中で37℃において一夜増殖させ、次の日にバシラス・ズブチリス (B. subtilis) プラスミド調製物について製造業者の推奨に従いQiaprepスピン・プラスミド・ミニプレプ (Spin Plasmid Miniprep) キット＃27106を使用して、1 mlの細胞を使用して細胞からプラスミドを単離した。このDNA配列を配列決定し、DNA配列は成熟ペクチン酸リアーゼをコードする配列番号1中のペクチン酸リアーゼ遺伝子の部分と同一であることが明らかになった。
【０２３４】
実施例２．バシラス・ズブチリス (Bacillus subtilis) ペクチン酸リアーゼの発現、精製および特性決定
500 mlのバッフルド震蘯フラスコ内で10 μg／mlのカナマイシンを含む25×200 mlのBPX培地中で37 ℃、300 rpmにおいて5日間、上記実施例1に記載するようにして得られたクローンMB331 (DSM 14218として寄託された) を増殖させ、これにより4550 mlの培養ブロスが得られた。酢酸を使用してpHを6.1に調節し、そして25 mlのカチオン剤 (C521 10％) および60 mlのアニオン剤 (A130 0.1％) を凝集のために攪拌間に添加した。Sorval RC 3B遠心機を使用して10000 rpm、6 ℃において30分間遠心することによって、凝集した物質を分離した。生ずる上清は3750 mlの総体積を含有した。
【０２３５】
上清をWhatmanガラスフィルターGF／GおよびCにより清澄化し、最後に10 kDaのカットオフのFiltron UF膜上で濃縮した。1500 mlの総体積をpH 6.0に調節した。
高度に精製されたペクチン酸リアーゼを得るために、S−セファローズ(Sepharose) カチオン交換クロマトグラフィーを使用する最終工程を実施した。50mM酢酸ナトリウム緩衝液pH 6.0と平衡化したS−セファローズ (Pharmacia) を含有する800 mlのカラムに、1500 mlの溶液を適用した。結合したペクチン酸リアーゼを0.5 M NaCl勾配で溶離した。
【０２３６】
特性決定
純粋な酵素は44 kDaのSDS−PAGEにおいて単結合を構築し、そして約7.6の等電点を有した。
71950のモル吸光係数 (配列から推定されたアミノ酸組成に基づく) を使用して、タンパク質濃度を決定した。
ペクチン酸リアーゼ活性をEDTAにより阻害することができた。
純粋な酵素の示差走査熱量測定DSCは、0.1 M Tris緩衝液pH 8中で58.8 ℃の融解温度を明らかにした。
【０２３７】
実施例３．バシラス・ズブチリス (Bacillus subtilis) 168ペクチン酸リアーゼ遺伝子のクローニング
バシラス・ズブチリス (B. subtilis) における成熟ペクチン酸リアーゼのサブクローニング
これらの2つのオリゴヌクレオチドから成るPCRプライマー組を使用して、本発明のペクチン酸リアーゼをコードするDNA配列をPCR増幅した。
配列番号14 (プライマーJ)
5’ −CAT TCT GCA GCC GCG GCA GCT GAT TTA GGC CAC CAG ACG−3’
配列番号15 (プライマーK)
5’ −GTA CCT CGC GAG CGG CCG CTT CTT AAT TTA ATT TAC CCG CAC CCG C−3’
制限部位SacIIおよびNotIに下線が引かれている。
【０２３８】
200 μMの各dNTP、2.6単位のHiFidelityTM Expand酵素混合物および200 pmolの各プライマーを補充した、HiFidelityTM PCR緩衝液 (Boehringer Mannheim、ドイツ国) 中のPCR反応において、オリゴヌクレオチドを使用した。種バシラス・ズブチリス (Bacillus subtilis) の株から単離したゲノムDNAを、PCR反応の鋳型として添加した。前述したように、ゲノムDNAを単離した。
【０２３９】
DNAサーマルサイクラー (Landgraf、ドイツ国) を使用して、PCR反応を実施した。94 ℃において1分間の1回のインキュベーション、次いで94 ℃において15秒間の変性、60 ℃において60秒間のアニリーング、および72 ℃において120秒間のエクステンションのサイクルプロファイルを使用して実施した10サイクルのPCR、次いで20サイクルの94 ℃において15秒間、60 ℃において60秒間および72 ℃において120秒間の変性 (この伸長工程において、20秒をサイクル毎に加える)。0.7％アガロースゲル (Agarose、SIGMA) 中の電気泳動により、増幅生成物の5 μlのアリコートを分析した。DNAフラグメント大きさ1.2 kbの出現は、遺伝子セグメントの適切な増幅を示した。
【０２４０】
PCRフラグメントのサブクローニング：
製造業者の使用説明書に従いQIAquick PCR精製キット (Qiagen、米国) を使用して、前述したように発生させたPCR生成物の45 μlのアリコートを精製した。精製したDNAを50 μlの10 mM Tris−HCl、pH 8.5中で溶離した。
5 μgのpMOL944および25 μlの精製したPCRフラグメントをSacIIおよびSalIで消化し、0.7％アガロースゲル (NuSieve、FMC) 中で電気泳動させ、関係するフラグメントをゲルから切り取り、製造業者の使用説明書に従いQIAquick Gel抽出キット (Qiagen、米国) を使用して精製した。次いで単離したPCR DNAフラグメントを、SacII−SalI消化し精製したpMOL944に結合させた。0.5 μgの各DNAフラグメント、1単位のT4 DNAリガーゼおよびT4リガーゼ緩衝液 (Boehringer Mannheim、ドイツ国) を使用して、結合を16 ℃において一夜実施した。
【０２４１】
結合混合物をを使用して、コンピテントバシラス・ズブチリス (Bacillus subtilis) PL1801を形質転換した。形質転換した細胞をLBPG−10 μg／mlのカナマイシン寒天平板上にプレートした。37℃において18時間インキュベートした後、コロニーが平板上に見られた。一夜の培養ブロスからプラスミドDNAを単離することによって、いくつかのクローンを分析した。
【０２４２】
1つのこのような陽性クローンを上で使用した寒天平板上で数回再ストリークし、このクローンをMB1306と呼んだ。クローンMB1306をTY−10 μg／mlのカナマイシン中で37℃において一夜増殖させ、次の日にバシラス・ズブチリス (B. subtilis) プラスミド調製物について製造業者の推奨に従いQiaprepスピン・プラスミド・ミニプレプ (Spin Plasmid Miniprep) キット＃27106を使用して、1 mlの細胞を使用して細胞からプラスミドを単離した。このDNA配列を配列決定し、DNA配列は成熟ペクチン酸リアーゼをコードする配列番号xx中のペクチン酸リアーゼ遺伝子の部分と同一であることが明らかになった。
【０２４３】
実施例４．バシラス・ズブチリス (B. subtilis) 168からのペクチン酸リアーゼの発現
500 mlのバッフルド震蘯フラスコ内で10 μg／mlのカナマイシンを含む25×200 mlのBPX培地中で37 ℃、300 rpmにおいて5日間、上記実施例3に記載するようにして得られたクローンMB1306を増殖させ、これにより4550 mlの培養ブロスが得られた。
【０２４４】
実施例５．バシラス・ズブチリス (Bacillus subtilis) DSM 14979ペクチン酸リアーゼのクローニング
下記のオリゴヌクレオチドから成るPCRプライマー組を使用して、バシラス・ズブチリス (Bacillus subtilis) DSM 14979からのペクチン酸リアーゼをコードするDNA配列をPCR増幅した。
配列番号16 (プライマーL)
5’ −CAT TCT GCA GCC GCG GCA GCT GAT TTA GGC CAC CAG ACG−3’
配列番号17 (プライマーM)
5’ −GTA CCT CGC GAG CGG CCG CTT CTT AAT TTA ATT TAC CCG CAC CCG C−3’
制限部位SacIIおよびNotIに下線が引かれている。
【０２４５】
200 μMの各dNTP、3.5mM MgCl2、2.5単位のAmpliTaq GoldTM (Perkin−Elmer) 、およびPCR増幅の鋳型として使用する、ほぼ100〜200 ngのゲノムDNAを含有するPCR緩衝液 (10mM Tris−HCl、pH 8.3、50mM KCl) 中のPCR反応において、50 pmolの各オリゴヌクレオチドを使用した。総体積は50 μｌであった。パーキン・エルマー (Perkin Elmer) GeneAmp PCRシステム2400中で、PCR反応を実施した。
【０２４６】
下記のサイクルプロファイルを使用して、PCR反応を実施した：
94 ℃ − 10分；1サイクル
94 ℃ − 1分、55 ℃ − 30秒、72 ℃ − 1分30秒；25サイクル
72 ℃ − 7分；1サイクル。
1.0％アガロースゲル (Agarose、SIGMA) 中の電気泳動により、増幅生成物の5 μlのアリコートを分析した。DNAフラグメント大きさ1.2 kbの出現は、遺伝子セグメントの適切な増幅を示した。フラグメントを配列決定すると、配列番号18に示すシグナル配列が明らかになり、これはバシラス・ズブチリス (B. subtilis) DSM 14979からの成熟ペクチン酸リアーゼ (配列番号19に示す) をコードする。
【０２４７】
実施例６．液状洗浄剤中のペクチン酸リアーゼの安定性の測定
後述するように、酵素−洗浄剤混合物のインキュベーション後、本発明のペクチン酸リアーゼ変異型の安定性を測定することによって、これらの変異型の洗浄剤安定性を評価した。
【０２４８】
残留活性のアッセイ
30 μlの酵素溶液 (培養上清または精製された酵素) を、2本の試料管中で1 mlの典型的なヨーロッパまたは米国の重質液状洗浄剤と混合する。管の一方を氷上で貯蔵するが、他方を40 ℃において90分間インキュベートする。参照として、30 μlの水を1 mlの洗浄剤と混合し、氷上でインキュベートする。
インキュベーション後、9 mlの氷冷水を試料に添加し、これを激しく攪拌し、それ以上の分析のために氷上で貯蔵する。
【０２４９】
次のようにして、酵素活性を測定する。第1に50 μlの酵素−洗浄剤混合を5 mlのアッセイ緩衝液 (100 mM Tris−HCl、0.68 mM CaCl2、pH 8.0) と混合し、第2にこの溶液から、75 μlを75 μlの新しく調製した基質溶液 (アッセイ緩衝液中の1％ポリガラクツロン酸) と混合し、40 ℃において10分間インキュベートする。第3に、100 μlのインキュベーション混合物を紫外線透明マイクロタイタープレート中の100 μlの停止緩衝液 (50 mM H3PO4) に添加し、235 nmにおける吸収を分光光度計で測定する。水−洗浄剤試料を使用して、分光光度計をゼロにする。
【０２５０】
ここで、氷上で貯蔵した試料における活性に関して、40 ℃において90分間インキュベートした試料における活性 (A235吸収) として、残留活性を計算する：
【数１】
2005507644.tif 000015
こうして、残留活性は酵素の洗浄剤安定性に等しい。表7及び表8において、典型的なヨーロッパ型重質液状洗浄剤中でインキュベートしたMB331ペクチン酸リアーゼの多数の置換体の改良された残留活性を列挙する。置換体の大部分は、親ペクチン酸リアーゼの洗浄剤安定性を50％より大きく改良する。等しく、表9に列挙するMB331ペクチン酸リアーゼの置換体は、典型的な米国型重質液状洗浄剤中でインキュベートしたとき、酵素の安定性を有意に改良する。
【０２５１】
【表７】
2005507644.tif 000016
【０２５２】
【表８】
2005507644.tif 000017
【０２５３】
【表９】
2005507644.tif 000018
【０２５４】
洗浄性能の実施例
洗浄性能の実施例A．
全規模における本発明のペクチン酸リアーゼ
ある範囲の異なる試験スワッチを使用して、全規模でヨーロッパ型重質液状洗浄剤中で、クローンMB331からのペクチン酸リアーゼ (配列番号2) (以後においてMB331酵素と呼ぶ) を評価した。使用した酵素レベルは0.05 mgのMB331酵素／リットルの洗浄水であった。下記表に示すようにこの用量レベルにおいて、多数の異なる果実または野菜をベースとする汚染に対して非常に高い洗浄性能が見出された。
【０２５５】
【表１０】
2005507644.tif 000019
【０２５６】
方法の説明
下記の装置および洗浄条件を使用した。
洗浄装置：AFG Φkolavamat 86820更新
洗浄プログラム：40 ℃の短い洗浄
洗浄剤：5 g／lのヨーロッパ型重質液状洗浄剤
水硬度：15°dH (4：1 Ca／Mg；2.14 mM CaCl2および0.54 mM MgCl2)
酵素：0.05 mg MB331ペクチン酸リアーゼタンパク質／リットルの洗浄水
スワッチ：前もって作られた食物汚染 (Equestから)
評価：460 nmにおいてElrepho 2000規約反射率分光光度計により規約反射率を測定した。
デルタ規約反射率を次のようにして計算する：
R酵素 − R無酵素、ここでRは460 nmにおける規約反射率である。
【０２５７】
洗浄性能の実施例B．
小規模洗浄におけるバナナスワッチに対するペクチナーゼの洗浄性能
小規模アッセイにおいてラウンダー−オメーター (Launder−ometer) およびバナナスワッチを使用してヨーロッパ型重質液状洗浄剤中で、クローンMB331からのペクチン酸リアーゼ (配列番号2) を他のペクチン酸リアーゼと比較した。結果を下記表に示し、ここでMB331の洗浄性能作用を100％に調節する。
【０２５８】
最良の洗浄性能はDSM 14218から (クローンMB331からの配列番号2) およびバシラス・ズブチリス (B. subtilis) A168から (クローンMB1306からの配列番号7) の2つのバシラス・ズブチリス (Bacillus subtilis) ペクチン酸リアーゼにより観測されるが、バシラス・リヘニフォルミス (B. licheniformis) (SP958) およびバシラス・アガラドヘレンス (B. agaradhaerens) (SP956) からのペクチン酸リアーゼは50％より低い性能を示す。
【０２５９】
【表１１】
2005507644.tif 000020
【０２６０】
方法の説明
バナナスワッチの調製：3本のバナナをマッシュし、ブレンダー中で3〜4分間70 mlの脱イオン水で均質化した。この懸濁液をトレーの中に注ぎ、約2時間貯蔵した。きれいな綿スワッチ (Testfabric Inc.からのスタイル400) を溶液中に浸漬し、2本のローラー間で絞り、一夜乾燥した。
【０２６１】
洗浄性能アッセイ：ラウンダー−オメーター (Launder−ometer) を使用してヨーロッパ型重質液状洗浄剤および15°dH水 (4：1 Ca／Mg) 中で、バナナスワッチを洗浄した。CaCl2 (2.14 mM) およびMgCl2 (0.54 mM) を添加することによって、水硬度を調節した。各ビーカー (500 ml) に、20個の鋼球、200 mlの洗浄剤溶液、0.05 mg／lのペクチナーゼおよび3本のバナナスワッチ (5 cm×5 cm) を添加した。洗浄プログラムは、25 ℃から40 ℃までの10分間加熱、次いで40 ℃において20分間の洗浄であった。スワッチを水道水ですすぎ、温室において一夜乾燥した。
【０２６２】
評価：MacBeth ColorEye 7000規約反射率分光光度計を使用して、スワッチの規約反射率を440 nmにおいて測定した。
洗浄性能の実施例C．
液状洗浄剤中で改良された安定性を有するMB331変異型
重質液状洗浄剤中で改良された安定性を有するMB331ペクチン酸リアーゼ変異型をつくった。液状洗浄剤中で35 ℃において7日間ペクチン酸リアーゼを貯蔵し、次いでバナナスワッチを使用してラウンダー−オメーター (Launder−ometer) アッセイにおいて洗浄性能を評価することによって、安定性を決定した。4つの異なるMB331変異型の貯蔵安定性の大きい改良を下記表に示す。洗浄性能はMB331−var147および168について未変化であるが、MB331−var135および137の洗浄性能はMB331の洗浄性能よりもわずかに低かった。
【０２６３】
【表１２】
2005507644.tif 000021
【０２６４】
方法の説明
35 ℃の水浴上においてヨーロッパ型重質液状洗浄剤中でペクチナーゼを7日間インキュベートした。上記洗浄性能の実施例Bに開示するラウンダー−オメーター (Launder−ometer) 洗浄性能アッセイにおいて、バナナ汚染物 (Equestから購入した) および0.01 mg／lのペクチナーゼを使用して、貯蔵した酵素および新鮮な酵素の試料を試験した。新鮮なMB331の洗浄性能を100％に調節する。新鮮な酵素に比較した7日間後の残留洗浄性能％として、貯蔵安定性を測定する。
【０２６５】
洗浄剤の実施例
洗浄剤の実施例I．
本発明による粒状布帛洗浄剤組成物を次のようにして調製することができる：
【表１３】
2005507644.tif 000022
【０２６６】
洗浄剤の実施例II．
本発明による圧縮粒状布帛洗浄剤組成物 (密度800 g／l) を次のようにして調製することができる：
【表１４】
2005507644.tif 000023
【０２６７】
洗浄剤の実施例III．
着色した布帛の洗濯において特に有効である、本発明による粒状布帛洗浄剤組成物を次のようにして調製した：
【表１５】
2005507644.tif 000024
【０２６８】
洗浄剤の実施例IV．
「洗浄による柔軟化」能力を提供する、本発明による粒状布帛洗浄剤組成物を次のようにして調製することができる：
【表１６】
2005507644.tif 000025
【０２６９】
洗浄剤の実施例V．
粒体またはタブレットの形態である、下記の洗濯組成物を本発明に従い調製した：
【表１７】
2005507644.tif 000026
【０２７０】
洗浄剤の実施例VI．
下記の粒状洗浄剤を本発明に従い調製した：
【表１８】
2005507644.tif 000027
【０２７１】
洗浄剤の実施例VII．
下記の液状洗浄剤配合物を本発明に従い調製した：
【表１９】
2005507644.tif 000028
【０２７２】
洗浄剤の実施例VIII．
本発明による重質液状布帛洗浄剤組成物を次のようにして調製することができる：
【表２０】
2005507644.tif 000029
【０２７３】
洗浄剤の実施例IX．
本発明による重質液状布帛洗浄剤組成物を次のようにして調製することができる：
【表２１】
2005507644.tif 000030
【０２７４】
洗浄剤の実施例X．
皿洗浄機において使用するために適当である本発明の洗浄剤タブレットを下記に例示する：
【表２２】
2005507644.tif 000031
【０２７５】
洗浄剤の実施例XI．
皿洗浄機において使用するために適当である本発明の液状洗浄剤組成物を下記に例示する：
【表２３】
2005507644.tif 000032
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年7月22日(2003.7.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
界面活性剤と、バシラス・ズブチリス (Bacillus subtilis) DSM 14218から得られるDNA配列によりコードされるペクチン酸リアーゼ (EC 4.2.2.2) またはその安定化変異型とを含んでなり、前記変異型は、
Q40E、
F251I、
A332P、
L106Q、
R272H、
R272Y、
A91E、
K115I＋K213E、
K139I＋K213N、
H5R＋K257N＋S302A、
K139M、
K87A、
D48P、
K99I＋I196V、
T105P、
K115A＋K118A、
K115A＋K118A＋M122N、
K115Q、
K213T、
V141E＋C199S＋K213E、
K115I＋Q146H、
K257N、
K71E＋K118E、
S331P、
T49P＋N156S、
K314N＋S340P、
V141E＋I235V、
G46D＋K257N、
Q146H、
A305P、
K218P、
S28T＋S30F＋K334E＋N363S、
D48E＋L106Q＋I140V＋F215Y＋K218E、
H193Y＋S256C＋V389I＋A393V、
R272C、
E9G＋H31N＋N50D＋L106Q＋A111E＋T136S＋V141L＋F201L＋N202K＋F215Y＋G286A＋A381D＋H384N、
K213N＋T258I、
E9G＋H31N＋L106Q＋D303S＋A305P＋T335S＋H384N＋S391N、
E9G＋H31N＋D48E＋L106Q＋A111E＋S301Y＋D303S＋A305P＋T378S＋H384N＋S391N、
L45V＋N50Y＋N185H、
N11Y＋K87E＋K99N、
E9G＋D48E＋L106Q＋S316F＋A381D、
S30P＋K115I＋K139I＋Q146H＋S337C、
E9G＋H31N＋D48E＋L106Q＋I140V＋F215Y＋D303S＋A305P＋T378S＋H384N＋S391N、
H31N＋T105A＋L106Q＋A111E＋V141L＋K218E＋D303S＋A305P＋D326N＋T335S＋H384N＋S391N、
K26Q＋K47N＋L106Q＋I140V＋F215Y＋D303S＋A305P＋T378S＋H384N＋S391N、
D48E＋L106Q＋I140V＋F215Y＋D303S＋A305P＋T378S＋H384N＋S391N、
K213N、
K213T＋K218L＋A305P、
S337C、
M64F＋K213T＋K218L＋A305P、
M64F＋M122K＋K118E＋K213T＋K218L＋A305P、
K139I＋Q146H＋S377C、
K139I＋Q146H＋K257N＋S337C、
M64F＋K139I＋Q146H＋S337C、
R272Y、
M237I、
C199N、
F215Y、
K213T、
A228I＋F251I、
K115I＋Q146H、
K257N、
K213N＋T258I、
M122Q、
K218P、
K386P、
A332P、
F251I、
A305P、
D48P、
S134L＋K257E、
S331P、
K139I＋Q146H＋S337C、
M64F＋V123I＋K139I＋Q146H＋S337C、
K139N＋E158N＋Q146H＋S337Cおよび
M64F＋M237I＋K139I＋Q146H＋S337C、
から成る群から選択される、洗浄剤組成物。
【請求項２】
ペクチン酸リアーゼ酵素が配列番号1の位置1〜1197を含んでなるDNA配列によりコードされる、請求項1に記載の洗浄剤組成物。
【請求項３】
ペクチン酸リアーゼが全組成物の重量の0.0001％〜2％、好ましくは0.0005〜0.5％、より好ましくは0.001％〜0.02％の純粋な酵素レベルで存在する、請求項1又は2に記載の洗浄剤組成物。
【請求項４】
プロテアーゼ、セルラーゼ (エンドグルカナーゼ)、β−グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、リダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、キシログルカナーゼ、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ペクチンリアーゼ、他のマンナナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、セロビオヒドラーゼ、トランスグルタミナーゼ、およびそれらの混合物から成る群から選択される1または2以上の酵素をさらに含んでなる、請求項1〜3のいずれか1項に記載の洗浄剤組成物。
【請求項５】
漂白剤、好ましくはマクロポリサイクリック硬質リガンド (Macropolycyclic Rigid Ligand) の遷移金属錯体、過酸化水素放出剤と4−[N−(ノナノイル)アミノヘキサノイルオキシ]−ベンゼンスルホン酸ナトリウムとの組み合わせおよび／またはそれらの混合物をさらに含んでなる、請求項1〜4のいずれか1項に記載の洗浄剤組成物。
【請求項６】
界面活性剤が全洗浄剤組成物の重量の30％まで、好ましくは10％〜25％のレベルで存在するアニオン界面活性剤である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の洗浄剤組成物。
【請求項７】
よりすぐれたクリーニング性能のために、請求項1〜6のいずれか1項に記載の洗浄剤組成物で布帛、食卓用器具または硬質表面をクリーニングする方法。
【請求項８】
布帛のクリーニングおよび／または布帛のしみの除去および／または布帛の白色度の維持および／または布帛の柔軟化および／または布帛の色外観および／または布帛の染料移動抑制のための請求項1〜7のいずれか1項に記載の洗浄剤組成物の使用。
【請求項９】
硬質表面、例えば、床、壁、浴室タイルおよびその他をクリーニングするための請求項1〜6のいずれかに記載の洗浄剤組成物の使用。
【請求項１０】
手および機械による皿洗浄のための請求項1〜6のいずれかに記載の洗浄剤組成物の使用。
【請求項１１】
口腔および／または歯科的適用のための請求項1〜6のいずれかに記載の洗浄剤組成物の使用。
【請求項１２】
下記の1つから選択されるペクチン酸リアーゼ (EC 4.2.2.2) 活性を有するポリペプチド：
(a) 配列番号1の位置1〜1197のDNA配列によりコードされるポリペプチド；
(b) DNA配列が発現される条件下に配列番号1の位置1〜1197の配列を含んでなる細胞を培養することによって製造されたポリペプチド；
(c) 下記から成る群から選択される (a) または (b) のポリペプチドの位置指定変異型：
Q40E、
F251I、
A332P、
L106Q、
R272H、
R272Y、
A91E、
K115I＋K213E、
K139I＋K213N、
H5R＋K257N＋S302A、
K139M、
K87A、
D48P、
K99I＋I196V、
T105P、
K115A＋K118A、
K115A＋K118A＋M122N、
K115Q、
K213T、
V141E＋C199S＋K213E、
K115I＋Q146H、
K257N、
K71E＋K118E、
S331P、
T49P＋N156S、
K314N＋S340P、
V141E＋I235V、
G46D＋K257N、
Q146H、
A305P、
K218P、
S28T＋S30F＋K334E＋N363S、
D48E＋L106Q＋I140V＋F215Y＋K218E、
H193Y＋S256C＋V389I＋A393V、
R272C、
E9G＋H31N＋N50D＋L106Q＋A111E＋T136S＋V141L＋F201L＋N202K＋F215Y＋G286A＋A381D＋H384N、
K213N＋T258I、
E9G＋H31N＋L106Q＋D303S＋A305P＋T335S＋H384N＋S391N、
E9G＋H31N＋D48E＋L106Q＋A111E＋S301Y＋D303S＋A305P＋T378S＋H384N＋S391N、
L45V＋N50Y＋N185H、
N11Y＋K87E＋K99N、
E9G＋D48E＋L106Q＋S316F＋A381D、
S30P＋K115I＋K139I＋Q146H＋S337C、
E9G＋H31N＋D48E＋L106Q＋I140V＋F215Y＋D303S＋A305P＋T378S＋H384N＋S391N、
H31N＋T105A＋L106Q＋A111E＋V141L＋K218E＋D303S＋A305P＋D326N＋T335S＋H384N＋S391N、
K26Q＋K47N＋L106Q＋I140V＋F215Y＋D303S＋A305P＋T378S＋H384N＋S391N、
D48E＋L106Q＋I140V＋F215Y＋D303S＋A305P＋T378S＋H384N＋S391N、
K213N、
K213T＋K218L＋A305P、
S337C、
M64F＋K213T＋K218L＋A305P、
M64F＋M122K＋K118E＋K213T＋K218L＋A305P、
K139I＋Q146H＋S377C、
K139I＋Q146H＋K257N＋S337C、
M64F＋K139I＋Q146H＋S337C、
R272Y、
M237I、
C199N、
F215Y、
K213T、
A228I＋F251I、
K115I＋Q146H、
K257N、
K213N＋T258I、
M122Q、
K218P、
K386P、
A332P、
F251I、
A305P、
D48P、
S134L＋K257E、
S331P、
K139I＋Q146H＋S337C、
M64F＋V123I＋K139I＋Q146H＋S337C、
K139N＋E158N＋Q146H＋S337Cおよび
M64F＋M237I＋K139I＋Q146H＋S337C。
【請求項１３】
細菌、好ましくは細菌種バシラス・ズブチリス (Bacillus subtilis) に属する株、好ましくはバシラス・ズブチリス (Bacillus subtilis) DSM 14218から得られたまたは得ることができる、請求項12に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
ポリペプチドが単離され、相同的不純物を含有しない、請求項12に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
請求項12〜14のいずれかに記載の酵素と、慣用の充填剤または安定剤とを含んでなる酵素調製物。
【請求項１６】
プロテアーゼ、セルラーゼ (エンドグルカナーゼ)、β−グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、リダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、キシログルカナーゼ、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ペクチンリアーゼ、他のマンナナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、セロビオヒドラーゼ、トランスグルタミナーゼ、およびそれらの混合物から成る群から選択される1または2以上の酵素をさらに含んでなる、請求項15に記載の調製物。
【国際調査報告】
2005507644.tif 000129
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