(57)【要約】本発明は、細胞のアポトーシスの増大または減少が必要とされる病的状態の治療的な治療のための、FVII、および／またはFVIIaおよび／または別のTFアゴニスト、および／またはFVIIaiおよび／または別のTFアンタゴニストの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞群においてアポトーシスを減少または抑制するための方法であって、前記細胞を組織因子アゴニストと接触させる工程を含む方法。
【請求項２】
組織因子アゴニストがFVIIまたはFVIIaである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
細胞群においてアポトーシスを誘導するまたは増強するための方法であって、前記細胞を組織因子アンタゴニストと接触させる工程を含む方法。
【請求項４】
組織因子アンタゴニストが修飾されたFVIIである、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞は、線維芽細胞、平滑筋細胞、腫瘍細胞、造血細胞、単球、マクロファージ、上皮細胞、ケラチノサイト、神経細胞、および内皮細胞を含む、組織因子を発現するヒト細胞である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
請求項4に記載の方法であって、前記修飾されたVII因子は、Phe-Phe-Argクロロメチルケトン、Phe-Phe-Argクロロメチルケトン、D-Phe-Phe-Argクロロメチルケトン、D-Phe-Phe-Argクロロメチルケトン、Phe-Pro-Argクロロメチルケトン、D-Phe-Pro-Argクロロメチルケトン、Phe-Pro-Argクロロメチルケトン、D-Phe-Pro-Argクロロメチルケトン、L-Glu-Gly-Argクロロメチルケトン、およびD-Glu-Gly-Argクロロメチルケトン、ダンシル-Phe-Phe-Argクロロメチルケトン、ダンシル-Phe-Phe-Argクロロメチルケトン、ダンシル-D-Phe-Phe-Argクロロメチルケトン、ダンシル-D-Phe-Phe-Argクロロメチルケトン、ダンシル-Phe-Pro-Argクロロメチルケトン、ダンシル-D-Phe-Pro-Argクロロメチルケトン、ダンシル-Phe-Pro-Argクロロメチルケトン、ダンシル-D-Phe-Pro-Argクロロメチルケトン、ダンシル-L-Glu-Gly-Argクロロメチルケトン、およびダンシル-D-Glu-Gly-Argクロロメチルケトンで修飾されたVII因子から選択される方法。
【請求項７】
細胞群のアポトーシスのレベルの阻害または減少により、アポトーシスのレベルの増加によって特徴づけられる個体における症状の重篤さを減少する方法であって、
該方法は、VIIa因子もしくはVII因子または別の組織因子アゴニストを含む薬学的組成物の有効な量を前記個体に投与することを含む方法。
【請求項８】
細胞群のアポトーシスのレベルの誘導または増強により、アポトーシスのレベルの減少によって特徴づけられる個体における症状の重篤さを減少する方法であって、
該方法は、組織因子アンタゴニストを含む薬学的組成物の有効な量を前記個体に投与することを含む方法。
【請求項９】
請求項7に記載の方法であって、前記症状は、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、除神経衰退、耳硬化症、脳卒中、痴呆、多発性硬化症、ハンチントン病、および後天性免疫不全症（AIDS）に伴う脳症、筋障害および筋ジストロフィー、糸球体硬化症、メンケベルク中動脈硬化症、炎症性腸疾患、クローン病、自己免疫性肝炎、血色素症およびウィルソン病、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、種々の病因による急性肝不全、胆管疾患、アテローム性動脈硬化症、高血圧、アポトーシスで誘導される毛の減少、並びに化学療法剤の使用に関連するアポトーシスからなる群より選択される方法。
【請求項１０】
前記疾患または症状が、原発腫瘍増殖、腫瘍の浸潤、転移、乾癬、自己免疫疾患、および再狭窄からなる群より選択される、請求項8に記載の方法。
【請求項１１】
前記組織因子アンタゴニストが、修飾されたVII因子である、請求項8〜10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
細胞群における望まれないアポトーシスに関連した疾患または症状の治療のための薬物の製造のための、組織因子アゴニストの使用。
【請求項１３】
前記組織因子アゴニストは、FVIIもしくはFVIIaまたはこれらの組み合わせである、請求項12に記載の使用。
【請求項１４】
細胞群におけるアポトーシスの誘導または増強が望まれる疾患または症状の治療のための薬物の製造のための、組織因子アンタゴニストの使用。
【請求項１５】
前記組織因子アンタゴニストが、修飾されたVII因子である、請求項14に記載の使用。
【請求項１６】
請求項15に記載の使用であって、前記修飾されたVII因子は、Phe-Phe-Argクロロメチルケトン、Phe-Phe-Argクロロメチルケトン、D-Phe-Phe-Argクロロメチルケトン、D-Phe-Phe-Argクロロメチルケトン、Phe-Pro-Argクロロメチルケトン、D-Phe-Pro-Argクロロメチルケトン、Phe-Pro-Argクロロメチルケトン、D-PhePro-Argクロロメチルケトン、L-Glu-Gly-Argクロロメチルケトン、およびD-Glu-Gly-Argクロロメチルケトン、ダンシル-Phe-Phe-Argクロロメチルケトン、ダンシル-Phe-Phe-Argクロロメチルケトン、ダンシル-D-Phe-Phe-Argクロロメチルケトン、ダンシル-D-Phe-Phe-Argクロロメチルケトン、ダンシル-Phe-Pro-Argクロロメチルケトン、ダンシル-D-Phe-Pro-Argクロロメチルケトン、ダンシル-Phe-Pro-Argクロロメチルケトン、ダンシル-D-Phe-Pro-Argクロロメチルケトン、ダンシル-L-Glu-Gly-Argクロロメチルケトン、およびダンシル-D-Glu-Gly-Argクロロメチルケトンによって修飾されたVII因子から選択される使用。
【請求項１７】
細胞群におけるアポトーシスを調節する方法であって、前記細胞を組織因子アゴニストと接触させること、または前記細胞を組織因子アンタゴニストと接触させることのいずれかの工程を含む方法。
【請求項１８】
前記組織因子アゴニストがFVIIまたはFVIIaである、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
前記組織因子アンタゴニストが修飾されたFVIIである、請求項18に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
組織因子（TF）アゴニスト、たとえば凝固VII因子（FVII）など、または組織因子アンタゴニスト、たとえば組織因子（TF）を発現する細胞における不活性化された凝固VIIa因子（FVIIai）などの活性を調節する新規細胞が記載されている。本発明は、TFアゴニスト、たとえばFVIIa、またはTFアンタゴニスト、たとえばFVIIaiと細胞を接触させることによって細胞のアポトーシスを調節するための方法に関する。また、本発明は、患者のアポトーシスに関連した症状の調節のための薬物の調製のための、FVIIaもしくは別のTFアゴニスト、またはFVIIaiもしくは別のTFアンタゴニストの使用に関する。さらに、本発明は、アポトーシスの減少または増大が必要である患者の症状を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
血漿中に循環しているFVIIaが、必須膜タンパク質の組織因子（TF）に結合するときに、血液凝固の外因性経路が惹起される。血液凝固カスケードにおいて、タンパク質分解酵素としてFVIIaが関与するのは、TF発現細胞の細胞外リーフレット（leaflet）に限定されると考えられている。FVIIaの推定上の細胞内シグナリング能力の研究では、これが、恒常的にTFを発現するヒト膀胱癌細胞株およびインターロイキン１によって前処理されてTFを発現するが、細胞内チロシンキナーゼのいかなるサイトカイン様の活性化も示さなかった臍帯脈（umbelical vein）内皮細胞の細胞内において、フリーのカルシウム（Ca2+）の動員を誘導することが示した。最近の報告では、TFが血管形成、胎児血管新生、および腫瘍転移などの凝固以外の重要な生物学的な機能に影響している可能性があることを示す。しかし、現在、TFがどのようにこれらの生物学的プロセスに関与しているのか不明である。
【０００３】
TFの前転移性（prometastatic）の機能が、TFの細胞質ドメインにきわめて依存的であることを示した研究において、TFの細胞質ドメインのシグナル伝達における潜在性役割が示されている。さらに、TFの細胞質ドメインは、アクチン結合タンパク質280（ABP-280）と相互作用し、TFを媒介した接着接触のためのABP-280の動員を介した細胞の接着および移動を補助することが示されている。
【０００４】
しかし、TFは、推定上のタンパク質分解性の機構による細胞外シグナリングにおいて、その生理学的なリガンドのFVIIaの補因子として機能することによって、特定のタイプの細胞シグナリングに関与することも示されている。たとえば、細胞表面TFに対するFVIIaの結合は、多くのTF発現細胞の細胞内Ca2+周期的変動、単球におけるチロシンの一過性のリン酸化、MAPキナーゼの活性化、線維芽細胞における遺伝子発現の変化、および腫瘍細胞におけるウロキナーゼ受容体発現の増強を誘導することが示されている。触媒的に不活性のFVIIa（FVIIai）は、Ca2+周期的変動からMAPキナーゼ活性化および遺伝子減少まで、上記シグナリング反応の多くを誘導することができず、FVIIaの触媒活性は、少なくとも一部のTF-FVIIaを媒介したシグナル伝達に必要とされるであろう。現在、タンパク分解性に活性なFVIIaによって誘導されるシグナリング経路（類）の多くは既知でない。
【０００５】
体の正常組織は、末端分化した状態に到達し、もはや分裂しない細胞によって、またはしばらくして死んでしまい、分裂細胞のプールから再配置される細胞によって、形成される。たとえば、神経組織は、発生初期に形成され、神経系の細胞は、出生直後に末端分化した状態に達する。一般に、神経組織が損傷を受けた場合、神経細胞は、分裂することができず、したがって、傷害を受けた神経細胞による機能喪失は治療されない。
【０００６】
神経系と比較して、皮膚は、上皮細胞において層別化された層から成り、細胞上部の（外側の）層は、常に脱落し、失われた細胞を置換するために細胞の下層が分裂する。したがって、皮膚は、失われる細胞数が、産生される新たな細胞数に等しい定常状態で維持される組織の例である。
【０００７】
皮膚などの一部の組織において、定常状態は、一部では、細胞が一定期間の経過後に死ぬように遺伝的に「プログラムされた」ものであるプログラム細胞死のプロセスによって維持される。プログラム細胞死を受ける細胞は、たとえばそのDNAの断片化およびその細胞核の崩壊を含む、アポトーシスの特徴である形態的な変化を受ける。
【０００８】
アポトーシスは、特に生物の発生の間に顕著であり、一過性の機能を行う細胞が、もはやこれらの機能が必要とされなくなった後に死ぬようにプログラムされている。加えて、アポトーシスは、主要な遺伝的変化を受けた細胞において生じ得るし、したがって、欠陥があり、潜在的に癌形成性の細胞から生物が逃れる手段を提供する。また、アポトーシスは、たとえば、細菌毒素、エタノール、および紫外線を含む種々の外部刺激に生物を暴露することによって誘導することができる。癌を治療するための化学療法薬も、アポトーシスの強力な誘導因子である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の記載
本発明は、アポトーシスに関連し得る病理学的症状の治療的な治療における、FVIIおよび／またはFVIIaおよび／または別のTFアゴニストおよび／またはFVIIaiおよび／またはTFアンタゴニストの利用に関する。
【００１０】
一般に、凝固「カスケード」といわれているものに参加する血液成分は、酵素的に不活性なタンパク質である、酵素前駆体（proenzyme）または酵素原（zymogen）であって、それ自体が活性化された凝固因子である活性化因子の作用によって、タンパク質分解酵素に変換される。このような変換を受けた凝固因子は、一般に「活性因子」といわれ、凝固因子の名前に「a」の文字を付加することによって示される（たとえばVIIa因子）。
【００１１】
「FVII」または「VII因子」の用語は、「単鎖」の（酵素源の）凝固VII因子を意味する。「VIIa因子」または「FVIIa」の用語は、Arg152-Ile153のペプチド結合の特異的な切断によって切断された「二本鎖」の凝固VII因子を意味する。FVIIおよびFVIIaは、血液から生成されるか、または組換え手段によって産生されるであろう。本明細書に記載されている方法の実施は、どのほど精製されたVIIa因子に由来するかということからは独立していることは明らかであり、したがって、本発明は、本明細書における使用に適したあらゆる因子FVIIまたはFVIIa標品の使用を包含することが想定される。ヒトFVIIaは、好ましい。
【００１２】
「修飾されたVII因子」、「不活性化されたFVII」、または「FVIIai」の用語は、少なくとも１つの修飾を有するFVIIaを意味することが企図され、このような修飾は、修飾されたFVIIaが実質的にFXおよび／またはFIXを活性化する能力を阻害する。この修飾は、FVIIaの触媒中心に存在するであろう。本用語は、交換可能に使用されてもよい。このような修飾は、触媒的三連残基のSer344、Asp142、およびHis193の1つまたは複数のアミノ酸の置換（または交換）を含み、また、有機リン光体化合物、フッ化スルファニル、ペプチドハロメチルケトン、またはアザペプチドなどのセリンプロテアーゼ阻害剤による触媒的三連残基の修飾も含む。また、修飾は、アミノ酸の欠失および挿入を含む。FFR-FVIIaは、不可逆的阻害剤、D-フェニルアラニン-L-フェニルアラニン-L-アルギニンクロロメチルケトン（FFRcmk）によるFVIIaの活性中心のブロッキングによって得られるFVIIai誘導体の１つの例である。その他の適切なFVIIai誘導体は、L-フェニルアラニン-L-フェニルアラニン-L-アルギニンクロロメチルケトン、ダンシル-L-フェニルアラニン-L-フェニルアラニン-L-アルギニンクロロメチルケトン、またはダンシル-D-フェニルアラニン-L-フェニルアラニン-L-アルギニンクロロメチルケトンによる活性中心のブロッキングによって得られたか、または得ることができる不活性化されたFVIIaであり、好ましくは、FFR-FVIIa（FFRcmkによって不活性化されたFVIIa）である。
【００１３】
本明細書に使用されるものとして、「TFアゴニスト」の用語は、実施例3に記載されているアポトーシスアッセイ法で決定されるものとして、TF（たとえばFVIIa）に対する直接的結合またはその他のTF依存的機構によって、細胞群のアポトーシスを減少または阻害する任意の化合物を意味することが企図される。
【００１４】
本発明の1つの態様において、TFアゴニストは、組換えVIIa因子である。さらなる態様において、TFアゴニストは、組換えヒトVIIa因子である。さらなる態様において、TFアゴニストは、VIIa因子相当物である。1つの態様において、VII因子相当物は、野生型VII因子と比較して、20個以下のアミノ酸が置換され、欠失され、または挿入されたアミノ酸配列変異体である（すなわち、米国特許第4,784,950に開示されたアミノ酸配列を有するポリペプチド）。もう１つの態様において、野生型VII因子と比較して、VIIa因子変異体は、15個以下のアミノ酸が置換され、欠失され、または挿入され;もう1つの態様において、VII因子変異体は、10個以下のアミノ酸が置換され、欠失され、または挿入され;もう1つの態様において、VII因子変異体は、8個以下のアミノ酸が置換され、欠失され、または挿入され;もう1つの態様において、VII因子変異体は、6個以下のアミノ酸が置換され、欠失され、または挿入され;もう1つの態様において、VII因子変異体は、5個以下のアミノ酸が置換され、欠失され、または挿入され;もう1つの態様において、VIIa因子変異体は、3個以下のアミノ酸が置換され、欠失され、または挿入されている。1つの態様において、VIIa因子変異体は、L305V-FVIIa、L305V/M306D/D309S-FVIIa、L3051-FVIIa、L305T-FVIIa、F374P-FVIIa、V158T/M298Q-FVIIa、V158D/E296V/M298Q-FVIIa、K337A-FVIIa、M298Q-FVIIa、V158D/M298Q-FVIIa、L305V/K337A-FVIIa、V158D/E296V/M298Q/L305V-FVIIa、V158D/E296WM298Q/K337A-FVIIa、V158D/E296WM298Q/L305V/K337A-FVIIa、K157A-FVIIa、E296V-FVIIa、E296V/M298Q-FVIIa、V158D/E296V-FVIIa、V158D/M298K-FVIIa、およびS336G-FVIIaのリストから選択される。
【００１５】
従来の意味で使用されにおいて、アミノ酸の3文字または1文字の表示は、表1に示したとおり、これらの従来の意味で使用した。明示的に示されない限り、本明細書において言及されるアミノ酸は、Lアミノ酸である。アミノ酸置換を有するVIIa因子変異体のための用語法は、以下の通りである。1文字コードによって表される最初の文字は、ヒト野生型VIIa因子の位置において天然に存在するアミノ酸を表す。続く数は、ヒト野生型VIIa因子の位置を表す。第2の文字は、天然のアミノ酸を置換する異なるアミノ酸をコードする1文字コードによって表す。例は、L305V/K337A-FVIIであり、野生型VIIa因子の位置305のロイシンがバリンによって置換され、ヒト野生型VIIa因子の位置337のリジンがアラニンによって置換され、両者とも同じVII因子変異体において変異する。
【００１６】
表1：
アミノ酸のための略語：
2005507008.tif 000002
本明細書に使用されるものとして、「TFアンタゴニスト」の用語は、実施例3に記載されているアポトーシスアッセイ法で決定されるものとして、細胞群のアポトーシスを減少または阻害することなくTFに対して直接結合する任意の化合物（たとえばFVIIai）を意味することが企図される。本発明の1つの態様において、TFアンタゴニストは、ヒトTFに対する抗体である。1つの態様において、抗体は、ヒト抗体である。さらなる態様において、抗体は、モノクローナル抗体である。さらなる態様において、抗体は、Fab断片、F（ab）2断片、F（ab'）2断片、または単鎖Fv断片である。
【００１７】
この文脈において、「治療」の用語は、有害な症状を防止すること、および症状を阻害する、または最小にする目的ですでに生じている症状を調節することの両方を含むことを意味する。したがって、FVIIaもしくは別のTFアゴニスト、またはFVIIaiもしくは別のTFアンタゴニストの予防的投与は、「治療」の用語に含まれる。この文脈において、「患者」の用語は、任意の動物、特にヒトなどの哺乳類としても定義される。「被検体」の用語は、「患者」と交換可能に使用される。
【００１８】
治療されるであろう症状は、たとえば、種々の癌、種々の退行性の神経疾患や、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、除神経衰退、耳硬化症、脳卒中、痴呆、多発性硬化症、ハンチントン病、および後天性免疫不全症（AIDS）に伴う脳症を含む神経病理などの病的状態含む病状を含む。皮膚および小腸などの組織では、生物の生涯の間に絶えず代謝回転しており、これらの組織を形成する細胞は、生物の生涯を通じてプログラム細胞死を受ける。通常、このプロセスは、厳密に調節されており、細胞分裂のために産生される細胞数は、プログラム細胞死を受ける細胞数と釣り合う。しかし、プログラム細胞死の調節は、多くの経路を含む複雑なプロセスであり、時には、プログラム細胞死の調節に欠陥が生じる。組織における細胞数を不変に維持する際の、または生物の発生の間に適切な細胞を維持する際の、このプロセスの重要な役割を考えると、プログラム細胞死の欠陥は、病的な症状を伴うことが多い。生物におけるプログラム細胞死の異常な調節によって、種々の疾病状態が生じる。たとえば、組織におけるアポトーシスのレベルの減少を生じる欠陥は、組織において不変に維持するために必要とされる正常なレベルと比較して、組織において細胞数の増大を生じ得る。細胞数を増大するこのような機構は、種々の癌において同定されており、腫瘍の形成は、癌細胞がこれらの正常な対応物よりも必然的に急速に分裂するためだけでなく、該細胞が、これらの通常の速度で死なないために生じる。癌と比較して、細胞がアポトーシスを受ける可能性が減少している場合、種々の病態が通常量よりも多くのアポトーシを受けている細胞を含む組織と関連している。たとえば、アポトーシスのレベルの増大は、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、除神経衰退、耳硬化症、脳卒中、痴呆、多発性硬化症、ハンチントン病、および後天性免疫不全症（AIDS）に伴う脳症を含む種々の神経病理を伴う。神経細胞は、一般に成体では分離しないので、したがって、死んだ細胞の変わりに新たな細胞を利用できず、このような疾患において生じる神経細胞死は、該疾患を患っている患者の症状を次第に悪化させる。正常よりも高いアポトーシスレベルに関与するその他の症状は、TFアゴニストで治療されてもよく、筋障害および筋ジストロフィー、糸球体硬化症、メンケベルク中動脈硬化症、炎症性腸疾患、クローン病、自己免疫性肝炎、血色素症およびウィルソン病、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、種々の病因による急性肝不全、胆管疾患、アテローム性動脈硬化症、高血圧、並びに化学療法剤の使用に関連するアポトーシスを含む。
【００１９】
第1の側面において、本発明は、細胞群におけるアポトーシスを減少または阻害するための方法であって、組織因子アゴニストと前記細胞を接触させる工程を含む方法に関する。1つの態様において、細胞は、線維芽細胞、平滑筋細胞、腫瘍細胞、造血性の細胞、単球、マクロファージ、上皮細胞、ケラチノサイト、神経細胞、および内皮細胞を含む組織因子を発現するヒト細胞である。
【００２０】
第2の側面において、本発明は、細胞群におけるアポトーシスを誘導または増強するための方法であって、組織因子アンタゴニストと前記細胞を接触させる工程を含む方法に関する。1つの態様において、細胞は、線維芽細胞、平滑筋細胞、腫瘍細胞、造血性の細胞、単球、マクロファージ、上皮細胞、ケラチノサイト、神経細胞、および内皮細胞を含む組織因子を発現するヒト細胞である。
【００２１】
さらなる側面において、本発明は、細胞群のアポトーシスのレベルの阻害または減少により、アポトーシスのレベルの増加によって特徴づけられる個体における症状の重篤さを減少する方法であって、該方法は、VIIa因子もしくはVII因子または別の組織因子アゴニストを含む薬学的組成物の有効な量を個体に投与することを含む方法に関する。本発明の1つの態様において、アポトーシスのレベルの増加によって特徴づけられる症状は、神経変性疾患である。本発明のさらなる態様において、アポトーシスのレベルの増加によって特徴づけられる疾患または症状は、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、除神経衰退、耳硬化症、脳卒中、痴呆、多発性硬化症、ハンチントン病、および後天性免疫不全症（AIDS）に伴う脳症、筋障害および筋ジストロフィー、糸球体硬化症、メンケベルク中動脈硬化症、炎症性腸疾患、クローン病、自己免疫性肝炎、血色素症およびウィルソン病、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、種々の病因による急性肝不全、胆管疾患、アテローム性動脈硬化症、高血圧、アポトーシスで誘導される毛の減少、並びに化学療法剤の使用に関連するアポトーシスからなる群より選択される。1つの態様において、化学療法剤の使用に関連するアポトーシスにより、毛の減少を生じる。
【００２２】
さらなる側面において、本発明は、細胞群のアポトーシスのレベルの誘導または増強により、アポトーシスのレベルの減少によって特徴づけられる個体における症状の重篤さを減少する方法であって、該方法は、組織因子アンタゴニストを含む薬学的組成物の有効な量を個体に投与することを含む方法に関する。本発明の1つの態様において、アポトーシスのレベルの減少によって特徴づけられる疾患または症状は、原発腫瘍増殖、腫瘍の浸潤、転移、乾癬、自己免疫疾患、および再狭窄からなる群より選択される。
【００２３】
さらなる側面において、本発明は、細胞群における望まれないアポトーシスに関連した疾患または症状の治療のための薬物の製造のための、組織因子アゴニストの使用に関する
さらなる側面において、本発明は、細胞群におけるアポトーシスの誘導または増強が望まれる疾患または症状の治療のための薬物の製造のための、組織因子アンタゴニストの使用に関する。
【００２４】
さらなる側面において、本発明は、細胞群におけるアポトーシスを調節する方法であって、前記細胞を組織因子アゴニストと接触させること、または前記細胞を組織因子アンタゴニストと接触させることのいずれかの工程を含む方法に関する。
【００２５】
本発明の1つの態様において、組織因子アゴニストは、FVIIまたはFVIIaである。
【００２６】
本発明のさらなる態様において、組織因子アンタゴニストは、修飾されたFVIIである。1つの態様において、修飾されたVII因子は、Phe-Phe-Argクロロメチルケトン、Phe-Phe-Argクロロメチルケトン、D-Phe-Phe-Argクロロメチルケトン、D-Phe-Phe-Argクロロメチルケトン、Phe-Pro-Argクロロメチルケトン、D-Phe-Pro-Argクロロメチルケトン、Phe-Pro-Argクロロメチルケトン、D-PhePro-Argクロロメチルケトン、L-Glu-Gly-Argクロロメチルケトン、およびD-Glu-Gly-Argクロロメチルケトン、ダンシル-Phe-Phe-Argクロロメチルケトン、ダンシル-Phe-Phe-Argクロロメチルケトン、ダンシル-D-Phe-Phe-Argクロロメチルケトン、ダンシル-D-Phe-Phe-Argクロロメチルケトン、ダンシル-Phe-Pro-Argクロロメチルケトン、ダンシル-D-Phe-Pro-Argクロロメチルケトン、ダンシル-Phe-Pro-Argクロロメチルケトン、ダンシル-D-Phe-Pro-Argクロロメチルケトン、ダンシル-L-Glu-Gly-Argクロロメチルケトン、およびダンシル-D-Glu-Gly-Argクロロメチルケトンによって修飾されたVII因子から選択される。
【００２７】
もう一つの側面において、本発明は、細胞群のアポトーシスを調節する薬物候補を検出する方法であって、該方法は：
a）TF発現細胞を培養すること;
b）細胞群のアポトーシスを測定すること;
c）候補薬と細胞をインキュベートすること、および
d）インキュベートした細胞のアポトーシスを測定し、工程bにおいて測定したアポトーシスのレベルと比較して、アポトーシスのレベルのあらゆる変化を決定すること、
を含み、このような変化は、前記細胞において生物学的に活性な候補薬の指標である方法に関する。
【００２８】
「TF発現細胞」の用語は、TFを発現する任意の哺乳類細胞を意味する。
【００２９】
「候補薬」の用語は、細胞系において、生物学的な機能を有するか、または生物学的な効果を及ぼす任意の試料を示すことが企図される。試料は、微生物または植物の抽出物などの生物物質の試料であってもよく、または有機合成または遺伝学的技術によって調製された化合物もしくは化合物の混合物を含む試料であってもよい。
【００３０】
さらなる側面において、本発明は、アポトーシスから細胞を保護のための組織因子の使用に関する。本発明の発明者によって開示された実験から分かるように、TF発現細胞のみが、アポトーシスから保護されている。したがって、さらなる側面において、本発明は、組換えタンパク質を産生する方法であって、該方法は：
a）TFをコードするポリヌクレオチド構築物を細胞にトランスフェクションすること;
b）産生される組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド構築物を同じ細胞にトランスフェクションすること;
c）ポリヌクレオチド構築物を発現することができる条件下において、適切な増殖培地液中で細胞を培養し、生じるポリペプチドを培地から回収することを含む方法に関する。
【００３１】
本発明の1つの態様において、産生される組換えタンパク質は、ヒトFVIIである。さらなる態様において、適切な細胞増殖培地は、FVIIaを含む。
【００３２】
さらなる側面において、本発明は、細胞群のアポトーシスを減少のまたは抑制するための方法であって、活性化された凝固因子と前記細胞を接触させる工程を含む方法に関する。
【００３３】
さらなる側面において、本発明は、細胞群におけるアポトーシスの減少のまたは抑制のための方法であって、トロンビンまたは凝固因子Xaと前記細胞を接触させる工程を含む方法に関する。
【００３４】
さらなる側面において、本発明は、細胞群においてアポトーシスを誘導または増強するための方法であって、トロンビン阻害剤または凝固因子Xa阻害剤と前記細胞を接触させる工程を含む方法に関する。
【００３５】
さらなる側面において、本発明は、細胞群のアポトーシスのレベルの阻害または減少により、アポトーシスのレベルの増加によって特徴づけられる個体における症状の重篤さを減少する方法であって、該方法は、トロンビンまたは凝固因子Xaを含む薬学的組成物の有効な量を前記個体に投与することを含む方法に関する。
【００３６】
さらなる側面において、本発明は、細胞群のアポトーシスのレベルの誘導または増強により、アポトーシスのレベルの減少によって特徴づけられる個体における症状の重篤さを減少する方法であって、該方法は、トロンビン阻害剤または凝固因子Xa阻害剤を含む薬学的組成物の有効な量を前記個体に投与することを含む方法に関する。
【００３７】
さらなる側面において、本発明は、細胞群における望まれないアポトーシスに関連した疾患または症状の治療のための薬物の製造のための、トロンビンまたは凝固因子Xaの使用に関する。
【００３８】
さらなる側面において、本発明は、細胞群におけるアポトーシスの誘導もしくは増強が望まれる疾患または症状の治療のための薬物の製造のための、トロンビン阻害剤または凝固因子Xa阻害剤の使用に関する。
【００３９】
さらなる側面において、本発明は、細胞群におけるアポトーシスを調節する方法であって、前記細胞をトロンビンもしくは凝固因子Xaと接触させること、または前記細胞をトロンビン阻害剤もしくは凝固因子Xa阻害剤と接触させることのいずれかの工程を含む方法に関する。
【００４０】
本発明の1つの態様において、トロンビン阻害剤は、ヒルジンである。本発明のもう１つの態様において、凝固因子Xa阻害剤は、ダニ抗凝固タンパク質（Tick Anticoagulant Protein：TAP）である。特定の態様において、ダニ抗凝固タンパク質は、組換えヒトタンパク質である。
【００４１】
略語：
TF      組織因子
FVII    VII因子の単鎖、不活性化形態
FVIIa    VII因子の活性化形態
rFVIIa    組換えVII因子の活性化形態
FVIIa    修飾された（不活性型）VII因子
FFR-FVIIai    D-Phe-L-Phe-L-Argクロロメチルケトンによって不活性化された因子FVII
組織因子（TF）は、因子FVIIa（FVIIa）の細胞受容体であり、該複合体は、血液凝固の主要な発動因子である。我々は、多量のTFを発現する細胞における細胞アポトーシスに対する、FVIIaのTFへの結合の効果を研究した。FVIIaとインキュベートしたTF発現細胞は、アポトーシスにより感受性でなくなることが示される。
【００４２】
以下において、我々は、FVIIaのTFへの結合と、細胞のアポトーシスとの間の明白な関係を初めて示す。我々は、TF発現細胞のFVIIa刺激が、細胞群におけるアポトーシスの減少または阻害を引き起こすというデータを示す。さらに、活性部位が阻害されたFVIIa（FFR-FVIIa）は、細胞群においてアポトーシスを誘導または増強することを示する。TFは、血管の周膜の、並びに肝臓、脾臓、および腎臓の線維性莢膜の間質性線維芽細胞などの多くの血管外細胞に恒常的に発現されている。したがって、TFの発現は、循環している血液から物理的に離れた部位において見いだされ、止血性エンベロープを提供する。傷害の際には、この障壁が出血から生物を保護すると考えられる。しかし、TFは、サイトカインおよび成長因子を含む種々の薬剤によって、単球/マクロファージ、血管平滑筋細胞、内皮細胞において、および多くの腫瘍細胞において誘導することができる。刺激後に、転写レベルでの誘導が迅速に生じ、TFは、増殖関連の前初期遺伝子として同定される。
【００４３】
活性部位が阻害されたFVIIaは、アポトーシスからの保護を誘発しなかったので、TFに対して結合することだけでなく、TF/FVIIaの触媒活性も、必須のようである。TAPおよびヒルジンは、アポトーシス・アッセイ法においてFVIIaの効果を消失させなかったので、我々はFXaまたはトロンビンにより、FVIIaによるアポトーシスからの保護が生じることを除外した。FVIIaの抗アポトーシスの効果の用量反応を、TFをトランスフェクトしたBHK細胞において判断した。
【００４４】
本明細書において言及したFVIIaもしくは別のTFアゴニストまたはFVIIaiもしくは別のTFアンタゴニストで治療するどの患者のための療法も、当業者によって決定されるべきである。治療において投与される１日量は、医師が決定することができ、使用される特定の化合物に、投与の経路に、および患者の重量および症状に依存する。有効な量は、最適には、約5μg/kg/日〜約500μg/kg/日、好ましくは約10μg/kg/日〜約300μg/kg/日、より好ましくは、約15μg/kg/日〜約200μg/kg/日、もっとも好ましくは、約20μg/kg/日〜約100μg/kg/日の1日用量である。
【００４５】
FVIIaもしくは別のTFアゴニストまたはFVIIaiもしくは別のTFアンタゴニストは、1回の単一用量で投与されるべきであるが、与えられる用量および患者の症状に依存して、好ましくは4〜6〜12時間の間隔で多回投与で与えることもできる。
【００４６】
特定の態様において、有効な量は、約5μg/kg/日〜約500μg/kg/日のFVIIaもしくは別のTFアゴニストまたはFVIIaiもしくは別のTFアンタゴニストの1日用量である。
【００４７】
FVIIaもしくは別のTFアゴニストまたはFVIIaiもしくは別のTFアンタゴニストは、静脈内に投与されてもよく、または持続性もしくは拍動性の注射によって投与されてもよく、またはたとえば直接腫瘍に注入するなど、関連した部位に直接投与されてもよい。FVIIaもしくは別のTFアゴニストまたはFVIIaiもしくは別のTFアンタゴニストは、好ましくは静脈内注射によって、かつ約100〜100,000単位／kg体重の量で、および好ましくは約5〜500μg/kgに対応する約250〜25,000単位／kg体重の量で、24時間あた2〜4回繰り返さなければならない用量によって投与される。
【００４８】
本発明に従って使用することができる薬学的組成物を調製するための従来技術は、たとえばRemington's Pharmaceutical Sciences, 1985に記載されている。
【００４９】
本発明に従って使用される組成物は、当業者に既知の方法によって調製される。
【００５０】
手短に言えば、本発明に従って使用するために適した薬学的標品は、FVII、FVIIaもしくは別のTFアゴニスト、またはFVIIaiもしくは別のTFアンタゴニストを、好ましくは精製した形態で、適切なアジュバントおよび適切なキャリアまたは希釈液と混合することによって作成される。適切な生理学的に許容されるキャリアまたは希釈液は、滅菌水および塩類溶液を含む。この点に関しては、適切なアジュバントは、精製したVIIa因子を安定化するためのカルシウム、タンパク質（たとえばアルブミン）、またはその他の非活性のペプチド（たとえばグリシルグリシン）もしくはアミノ酸（たとえばグリシンまたはヒスチジン）を含む。その他の生理学的に許容されるアジュバントは、非還元糖、多価アルコール（たとえばソルビトール、マンニトール、またはグリセリン）、低分子量のデキストリンなどの多糖体、界面活性剤（たとえばポリソルベート）、および抗酸化物（たとえば亜硫酸水素塩およびアスコルビン酸塩）である。アジュバントは、一般に、0.001〜4%w/vの濃度で存在する。また、本製剤は、プロテアーゼ阻害剤、たとえばアプロチニン、および保存剤を含んでいてもよい。
【００５１】
本標品は、たとえば細菌保持フィルターを通して濾過することによって、組成物に殺菌剤を組み込むことによって、組成物に照射することによって、または組成物を加熱することによって殺菌されていてもよい。また、これらは、無菌の固体組成物の形態で製造することもでき、使用の前または直前に、これを滅菌水またはその他の注射に適した無菌培地に溶解することができる。
【００５２】
本発明は、実施例によってさらに例証されるが、保護の範囲を限定するものとして解釈されない。前述の記述において、および以下の実施例において開示された特徴は、両方とも別々に、およびそのいかなる組み合わせにもおいても、本発明のその多様な形態を理解するための材料である。
【実施例】
【００５３】
実施例1
FVIIの調製  
本発明に使用するために適したヒト精製VIIa因子は、たとえばHagenら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 : 2412-2416, 1986に記載されているように、または欧州特許番号第200.421号（ZymoGenetics）に記載されているように、好ましくはDNA組換技術によって作成される。組換技術によって産生されるVIIa因子は、真のVIIa因子またはこのようなVIIa因子が実質的に真のVIIa因子と同じ血液凝固の生物活性を有することを条件として、多少修飾されたVIIa因子であってもよい。このような修飾されたVIIa因子は、周知の手段、たとえば部位特異的突然変異により天然のFVIIをコードする核酸において、アミノ酸コドンを変えることによって、またはのいくつかのアミノ酸コドンを除去することによってVII因子をコードする核酸配列を修飾することによって産生されてもよい。
【００５４】
また、VII因子は、Broze and Majerus, J. Biol. Chem. 255 （4）: 1242-1247,1980並びにHedner and Kisiel, J. Clin. lnvest. 71: 1836-1841, 1983に記載されている方法によって産生されてもよい。これらの方法では、検出可能な量のその他の血液凝固因子を伴わずにVII因子を産生する。さらに精製VII因子標品は、最終的な精製工程としてさらなるゲル濾過を含むことによって得てもよい。次いで、既知の手段によって、たとえばBjoernら（Research Disclosure, 269 September 1986, pp. 564- 565）によって記載されているように、因子XIIa、IXa、またはXaなどのいくつかの異なる血漿タンパク質によって、VII因子を活性化されたFVIIaに変換し、VII因子をMono Q（登録商標）（Pharmacia fine Chemicals）などのイオン交換クロマトグラフィーに通すことにより、活性化してもよい。
【００５５】
実施例2
FVIIaiの調製  
本発明における使用に適した修飾VII因子は、たとえば国際公開番号第92/15686号、94/27631号,96/12800号、および97/47651号（ZymoGenet-ics/NovoNordisk）に記載されたとおりに作成される。
【００５６】
実施例3
BHK（+TF）およびBHK wt細胞の生存に対するFVIIaの効果を調査するために、24時間および48時間の血清枯渇によって細胞にアポトーシスを誘導した。アポトーシスは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼdUTPニック末端ラベリング（TUNEL）後に、フローサイトメトリーによって検出した。アポトーシスの後期段階のうちの1つは、アポトーシスのプログラムの間にエンドヌクレアーゼの活性化によって生じるプロセスであるDNA断片化である。ヌクレアーゼが高次染色質構造を約300kbの断片に分解し、その後に約50塩基対の長さのより小さなDNA部分に分解する。TUNELアッセイ法（PharmingenからのAPO-BRDU）では、TdTが、パラホルムアルデヒドおよびエタノールで固定した細胞において、2本鎖および1本鎖DNAの3'ヒドロキシル末端に対する臭素化されたデオキシウリジントリホスフェート（Br-dUTP）の鋳型非依存的な付加を触媒する。取り込み後、FITCラベルした抗BrdU mAbで細胞を染色することによって、フローサイトメトリー法によりこれらの部位を同定する。細胞周期の進行については、最終工程で細胞をヨウ化プロピジウム（PI）でラベルする。
【００５７】
Thim, L.ら、Biochem 27: 7785-7793,1988に記載されているように、タンパク質−ヒト組換えFVIIおよびFVIIaを発現させて精製した。
【００５８】
FVIIaiは、Sorensen B. B.ら、J. Biol. Chem. 272: 11863-11868,1997によって前述されているように、D-Phe-L-Phe-L-Argクロロメチルケトン（FFR-FVIIa）でFVIIaの活性部位をブロッキングすることによって得た。
【００５９】
トロンビンは、酵素調査研究室（Enzyme Research Lab）からのものである。特異的なトロンビン阻害剤ヒルジンは、Sigma-Aldrichから購入してもよく、特異的なFXa阻害剤の組換えTAP（Tick抗凝固タンパク質）は、G.P.Vlasuk博士、Corvas（SanDiego,CA）によって親切に提供された。細胞培養−ベビー・ハムスター腎臓細胞株BHK-21tk-ts13（ATCC CRL 1632）は、10%のFCS、100IU/mlペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシンを含むダルベッコ修飾さイーグル培地において培養した。全ての細胞株は、T80またはT175フラスコ中で培養し、単一の10cmの培養皿（78cm2）において二次培養した。
【００６０】
TFでのBHK細胞のトランスフェクション−完全ヒトTF cDNAを哺乳類Zem219b発現ベクターにクローン化した。BHK細胞には、リン酸カルシウム共沈の標準的な技術を使用して、TF発現プラスミドをトランスフェクトした。安定に構築物が組み込まれた細胞を1μMメトトレキセートによって選択した。
【００６１】
実験：
細胞を10%のFCS、100 IU/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン（DMEM+/+）を補ったDMEMにまいた（800.000細胞/ディッシュ）。2日後に、細胞は約80%コンフルエントであり、血清枯渇の準備ができていた。細胞をDMEM-/-培地（正しいpH安定化および温度にするために、使用前にDMEM-/-を一晩インキュベータに入れたままにしておいた）で2回洗浄し、最終的な洗浄後に、細胞を6mlのDMEM-/-および示された化合物と共に、24時間および／または48時放置した。インキュベーション期間終了後、付着細胞をトリプシン処理して培地中のゆるんだ細胞をプールして、5分間300×gで遠心した。細胞をPBSで洗浄後、1%パラホルムアルデヒドのPBS溶液において氷中で15分間固定した。その後、PBS中で洗浄して500μlのPBSに再懸濁した後に、5mlの70%エタノールを添加した。細胞懸濁液を-20℃において少なくとも18時間放置した後、製造者の手順に従ってTUNELアッセイ法によって解析した（PharmingenからのApo-BRDU）。
【００６２】
結果：
BHK（+TF）およびBHK wt細胞におけるFVIIaの抗アポトーシスの効果の用量反応。BHK（+TF）細胞において、24時間または48時間の血清枯渇によってアポトーシスが誘導され、アポトーシス細胞が、TUNEL染色およびフローサイトメトリーによって検出された。結果は、対数x-スケールに対してFITCラベルしたDNA破壊（FITC-dUTP）（x軸の値が右へ移動するほど、細胞におけるDNA破壊が多い）として表し、y軸にリニアスケールで細胞数を示す。濃度を増大してFVIIaが存在すると（12.5nM〜100nM）、BHK（+TF）細胞では血清が枯渇した。BHK（+TF）細胞を血清除去した培地中に24時間放置すると、アポトーシス細胞の明らかな増加が見られ、10%の血清の存在下において増殖する健康な細胞（10%の血清）を表すピークが減少する（図1A）。図1Aの残りの4つの曲線は、FVIIaの濃度増大を表し、結果は、12.5nM程度の低濃度のFVIIaでは、アポトーシスから細胞群を救うことが可能であったことを示す。図1Bでは、BHK（+TF）細胞を、FVIIaの濃度を増大して血清を除去した培地に48時間維持した。この実験において、10%の血清処理した細胞と無処置の細胞を比較することによって観察されるアポトーシス細胞に明らかな増加があった。48時間後において、無処置の細胞は、血清除去の24時間後よりもアポトーシスが多かった。血清枯渇の48時間後において、FVIIaによるアポトーシスの阻害に非常に明らかな濃度依存性が見られた。100nMのFVIIaでは、ほぼ全てのアポトーシスの抑制が見られた。
【００６３】
FVIIaで誘導されるアポトーシスの阻害に対するTAPおよびヒルジンの効果。
このアッセイ法では、FVIIaの有意な効果が見られたので、このアポトーシス抑制の効果がFVIIaに特異的かどうか、または下流の凝固産物によりこれらの知見を説明することができるかどうか決定することが重要である。したがって、BHK（+TF）細胞を、特異的なトロンビン阻害剤ヒルジン（25U/ml）および特異的なFXa阻害剤TAP（100nM）の有り無しにおいて、FVIIa（100nM）の存在下で24時間または48時間血清除去した。対照として、ヒルジン+TAPの有り無しにおいてトロンビン（10nM）でも試験した。図3Aは、無処置の細胞では、血清除去の24時間においてアポトーシス細胞を生じ、FITC-dUTP「健康なピーク」の減少および黒線によって表された健康な血清処理細胞と比較して、ピークのわずかな右への移動を生じた。ここで、FVIIaは、完全にアポトーシスの阻害を示し、この効果のは、ヒルジンおよびTAPの添加によって影響されないことから、FXaおよびFIIaは、FVIIaで誘導されるアポトーシスからの保護に関与していないことを示される。対照実験として、10nM FIIaの存在下において細胞を血清除去した。FIIaでは、FVIIaと同程度にアポトーシスの阻害が可能であった。FIIaおよびヒルジン+TAPを同時に添加することにより、このアポトーシスの阻害は消失し、該細胞では、FITC-dUTPの右へ移動によってアポトーシス細胞の明らかな増大が示され、余分のピークを生じる。48時間の血清枯渇では、無処置の細胞は、24時間の血清枯渇と比較してよりアポトーシスが多い（図3B）。この実験では、FVIIaは、ヒルジンおよびTAPから独立して、部分的にアポトーシスを阻害した。同程度のアポトーシス阻害が、FIIaで見られた。10nMのFVIIa濃度では、48時間の血清枯渇の間にアポトーシスを阻害するには十分でなかった（図3B）。結論として、24時間および48時間の血清枯渇の両者において、FVIIaの抗アポトーシスの効果は、下流の凝固産物のFXaおよびFIIaから独立している。
【００６４】
また、FVIIaの抗アポトーシスの効果に対する下流の凝固産物の特異的な阻害剤の効果を探査する同じ実験で、BHK wt細胞を調査した。BHK wt細胞を24時間血清枯渇した場合、10%処理した細胞と比較して、アポトーシス細胞の増加はなく（図4A）、図2Aに示した実験とよく相関する。BHK wt細胞における48時間の血清枯渇では（図4B）、健康な細胞と比較して、明らかにアポトーシス細胞の増大を生じた（図4B）。この実験において、ヒルジンおよびTAPの有り無しにおける100nMのFVIIa、並びに10nMのFVIIaでは、抗アポトーシスの効果を有さなかった（図4B）。FIIaは、BHK wt細胞（図4B）に対して、BHK（+TF）細胞（図3B）に対する効果と同じ抗アポトーシスの効果を示すことが非常に明白であった。
【００６５】
FVIIaのタンパク分解活性は、抗アポトーシスの効果に必須である。
TFに対するFVIIaの結合が、この抗アポトーシス効果を誘導するために十分であったかどうかを調査するために、枯渇期間の間に、FVIIa（FFR-FVIIa）の活性部位を不活性化した変異体を細胞に添加した。FFR-FVIIaは、TFに対して2倍より高い親和性で結合するが、該複合体は、タンパク分解性が不活性のままである。図5は、BHK（+TF）を使用する実験を表し、ここでは、24時間（図5A）および48時間（図5B）の血清枯渇が、明らかにアポトーシス抑制性の効果を有した。面白いことに、FFR-FVIIa（図5C）は、いかなる細胞を救出することもできず、細胞群は、24時間および48時間の血清除去の両者において無処置の細胞と同じであった。
【００６６】
BHK（+TF）細胞における血清枯渇で誘導されるアポトーシスの時間依存性。
アポトーシス細胞のTUNEL染色では、DNA破壊が形成されなければならないので、後期段階のアポトーシスを検出するのみである。FVIIaおよびFFR-FVIIaの有り無しにおいて、BHK（+TF）細胞で17、22、および44時間血清除去した。実験において、健康な細胞の対照として10%の血清を使用し、アポトーシス陽性の対照として非処理の細胞を使用した。図6から、22時間の血清枯渇（パネルB）が、TUNELアッセイ法での標識化DNA破壊によって測定できるアポトーシスを誘導するための最短時間であったことが分かった。血清を除去した培地において、細胞を17時間培養したときに（パネルA）、有意な量のアポトーシスは見られなかった。対照的に、44時間の血清枯渇では、このアッセイ法で非常に明らかにアポトーシスが誘導された。図6から、FFR-FVIIaでは、44時間の血清除去後において抗アポトーシス効果を示すが、FVIIaでは示さないことが明らかである。
【００６７】
実施例4
組換えヒトFVIIaおよびFFR-FVIIaは、実施例1および2に記載したとおりに調製した。因子X、FXa、トロンビン、およびヒルジンは、Enzyme Research Laboratories（South Bend, IN）から得た。特異的なFXa阻害剤（組換えダニ抗凝固タンパク質（TAP））は、Vlasuk博士（Corvas, La Jolla, C）から寛大に譲り受けた。カスパーゼ3、リン酸化p44/42MAPK、およびリン酸化Aktに対する抗体は、Cell Signaling Technology（Boston, MA）からのものであった。β−アクチン抗体は、Abcam（Cambridge, UK）からのものであった。LY294002およびU0126は、Promega （Madison, WI）からのものであった。
【００６８】
細胞株−ベビーハムスター腎臓細胞株BHK-21 tk-（ATCC CRL 1632）は、10%のFCS、100IU/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシンを含むダルベッコ修飾イーグル培地（DMEM）中で培養した。完全ヒトTF cDNAを哺乳類Zem219b発現ベクターにクローン化し、リン酸カルシウム共沈手順を使用してBHK細胞にトランスフェクトし、安定に組み込まれた構築物を1μMのメトトレキセートを使用して選択した（Sorensen, B. B. , Freskgard, P.-O., Nielsen, L. S. , Rao, L. V. M. , Ezban, M. , and Petersen, L. C. （1999） J. Biol. Chem. 274, 21349-21354）。チャイニーズハムスター卵巣（CHO-K1、ATCCCCL-61）細胞を、10% FCSおよび1%の非必須アミノ酸を補ったHam-F12培地中で培養した。CHO細胞には、FuGene（商標）（Roche Diagnostics, Indi- anapolis, IN）を使用して、pcDNA3（Invitrogen, Carlsbad, CA）内の完全ヒトTFをトランスフェクトした。安定細胞株は、ジェネティシン（0.7mg/ml）に対する耐性によって選択した。クローン細胞株を、無処理の単層の細胞を使用するFXa生成アッセイ法でTFの発現について試験した。FXa生成アッセイ法によって判断されるように、2種のトランスフェクトされた細胞系BHK（+TF）およびCHO（+TF）の機能的TFの発現は同等であった。
【００６９】
TUNEL/フローサイトメトリー−細胞を、10%のFCS、100IU/mlペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシンを補ったDMEM中で、9cmのディッシュ（800,000細胞/ディッシュ）にまいた。細胞が約80%コンフルエントなときに、これらを実験の試験化合物の存在下および非存在化において、血清除去に供した。簡単には、単層をDMEM（pHを安定させるために、使用前にDMEMを一晩インキュベータに放置した）で２回洗浄し、最終的な洗浄後、細胞を実験の試験化合物を含む6mlのDMEMで24時間または48時間おおった。インキュベーション期間終了後、付着細胞をトリプシン処理して培地中のゆるんだ細胞をプールして、5分間300×gで遠心した。細胞をPBSで洗浄後、1%パラホルムアルデヒドのPBS溶液において氷中で15分間固定した。その後、PBS中で洗浄して500μlのPBSに再懸濁した後に、5mlの70%エタノールを添加した。細胞懸濁液を-20℃において少なくとも18時間放置した後、製造者の手順に従ってTUNELアッセイ法によって解析した（Pharmingen, SanDiego,CAからのApo-BRDU）。染色された細胞をFACScan（商標）フローサイトメーター（Becton Dickinson）によって解析した。
【００７０】
カスパーゼ3活性化の検出-TUNELの下で記述したとおりに、細胞を9cmのディッシュにおいて、実験の試験化合物の存在下および非存在化で血清を除去した。特定の時間間隔の終了後、結果に示したとおり、培養したディッシュを氷上に置き、ゆるい細胞を含む上の培地を回収した。付着した細胞をディッシュの底からこすり落として、条件培地によってプールして、4℃において300×gで5分間遠心して細胞ペレットを得た。上清を捨て、チューブから慎重に排出（チューブを逆にすることによって）して細胞ペレットを得た。細胞を50μlの氷冷Chaps Cell Extract Buffer（使用直前に20μg/mlのロイペプチン、10ug/mlのアプロチニン、5mMのDTT、0.1mMのAEBSF（4-（2-アミノエチル）-（ベンゼンスルホニルフルオライド：4-（2-Aminoethyl）-bezenesulfonylfluoride）を補った50mMのPipes/KOH、pH6.5、2mMのEDTA、0.1%のChaps）に添加することによって溶解した。可溶化液を3回凍結融解し、4℃において5分間15,000×gで遠心した。上清を回収し、総タンパク質量濃度をバイオラド・タンパク質アッセイキットによって決定した。約10μgのタンパク質を還元条件下で4〜12%勾配ゲルのSDS-PAGEに供した。酵素前駆体（zymogen）（33kDa）および切断された抗原（18kDa）を認識するカスパーゼ3に対する抗体を使用するウエスタンブロット解析によって、カスパーゼ3活性化を評価した。
【００７１】
Aktおよびp44/42MAPキナーゼ活性化の決定−細胞を6穴プレートの完全培地中にまいた。細胞が80〜90%のコンフルエンシーに達したときに、細胞を無血清培地中で２回洗浄し、細胞を静止状態にするために無血清培地に2時間入れたままにしておいた。細胞を37℃において10分間FVIIaで刺激した。阻害剤を含めた場合には、これらをFVIIaの添加の30分前に細胞に添加した。FVIIaで10分間処理した後、細胞を溶解緩衝液に溶解（20mMのトリス、0.1%（v/w）トリトンX-100、1mMのEDTA、1mMのEGTA、50mMのフッ化ナトリウム、10mMのβ−グリセロリン酸ナトリウム、5mMのピロリン酸ナトリウム、0.1mMのAEBSF（4-（2-アミノエチル）-ベンゼンスルホニルフルオライド：4-（2-Aminoethyl）-bezenesulfonylfluoride）、1mMのベンズアミジン、150mMのNaCl、pH7.5。使用直前に：1mMのオルトバナジウム酸ナトリウム、5μg/mlのロイペプチン、10μg/mlのアプロチニンを添加した）。10μgのタンパク質をSDS-PAGE（4〜12%勾配ゲル、還元条件）に充填し、リン酸化p44/42MAPKおよびcAktに対する特異抗体を使用するウエスタンブロット解析に供した。
【００７２】
ウエスタンブロット解析−電気ブロッティング後、膜をブロッキング緩衝液（0.1%のTween-20および5%の脱脂粉乳を含むTBS）中で1時間ブロックし、0.1%のTween-20を含むTBS（TBS/T）で3回洗浄した後、ブロッキング緩衝液に一次抗体（1：1,000、およびベータ−アクチンについては1：1000,000）を添加した。4℃において一次抗体と一晩インキュベーションした後に、膜をTBS/Tで3回を洗浄した後、ブロッキング緩衝液にHRP結合二次抗体（1：2000）を添加した。膜を室温において1時間インキュベートした後、TBS/Tで３回洗浄した。化学発光基質（Supersignal, Pierce）を5分間添加して、冷却したCCDカメラ（LAS1000、Fujifilm）によって化学発光を検出した。Image Gaugev.4.0（Fujifilm）を使用してバンドの強度を定量するために、これらのデジタル画像を使用した。
【００７３】
免疫細胞化学−BHK（+TF）細胞を8チャンバーのガラススライド（Nalge Nunc International, Rochester, NY）にまき、30%コンフルエンスに増殖させた。細胞を洗浄し、なし、20nM FVIIa、20nM FFR-FVIIa、または10%のFCSを補った無血清培地中で6時間インキュベートした。実験の終わりに細胞を洗浄し、4%（v/v）パラホルムアルデヒドのリン酸塩緩衝食塩水（PBS）溶液中で4℃において15分間固定し、PBSで簡単にすすぎ、70%（v/v）エタノール中で15分間RTにおいて後固定（post-fixed）し、空気乾燥した。3×5分間、60℃に予熱した10mMのクエン酸緩衝液pH6.0中において、80%の効果で電子レンジ（Polar Patent, Umea, Sweden）で前処理することによって、抗原回収（antigen retrieval）を達成した。細胞をクエン酸緩衝液中で室温において10分間冷却し、トリス緩衝化塩類溶液（TBS）中ですすいで、5%のロバ血清のTBS溶液中で15分間プレインキュベートし、続いてヤギ抗ヒトTF IgG（American Diagnostica Incorporation, Greenwich, Ct）と4℃において一晩インキュベーションした。次いで、細胞を、ビオチン化したロバ抗ヤギ（Jackson ImmunoReseach Laboratory, West Growe, PE）と1時間、HRPストレプトアビジン（NEN Life Science Products, Boston, MA）と30分、およびTSA-FITC（チラミドシグナル増幅蛍光系：Tyramide Signal Amplification Fluorescein system）（NEN Life Science Products, Boston, MA）とインキュベートした。TBS中で簡単にリンスした後、アポトーシス細胞の形態学的な解析のために、細胞をヘキスト（Hoechst：Molecular Probes, Leiden, The Netherlands）で対比染色し、H2Oですすいで着色してMounting Medium Fluorescence（DAKO, Glostrup, Denmark）でマウントした。選択的AMCAおよびFITCHフィルタを備えているオリンパスBX51反射蛍光系顕微鏡、並びにDP50デジタルカメラを使用して細胞を撮影した。
【００７４】
結果：
FVIIaは、無血清条件下において核染色質の凝集を妨げる。本発明の発明者は、血清除去により、細胞が寄せ集まり、ゆるく培養ディッシュに付着して（容易にディッシュから分離する）、微妙な形態学的な変化を受ける傾向があることを見いだした。これらの変化は、FVIIaを無血清培地に含めたときに減弱された。本発明は、アポトーシスの形態学的変化について細胞を検査した場合の、細胞生存性およびアポトーシスに対する、検査したFVIIaおよびるFFR-FVIIaの効果に基づいている。血清枯渇条件下では（図7、パネルAおよびB）、蛍光顕微鏡観察により、かなり数のBHK（+TF）細胞がアポトーシス小疱および濃縮された染色質体の核によって特徴づけられることが示されたが、血清枯渇の間にFVIIaが存在すると著しくアポトーシス形態を有する細胞数が減少され（図7、パネルCおよびD）、その結果、FVIIaにさらされた細胞培養は、血清を含有する培地中で維持したものと同様の見かけを有した（図7、パネルGおよびH）。FVIIaとは対照的に、FFR-FVIIaは、血清除去によって誘導される核凝縮を妨げることができなかったことから（図7、パネルEおよびF）、FVIIaのタンパク分解活性がこの効果に必須であったことを示唆する。
【００７５】
血清除去条件下におけるFVIIaの抗アポトーシス効果−図7における細胞形態観察では、血清枯渇したBHK（+TF）細胞に対するFVIIaの暴露によって抗アポトーシス効果を生じることを示唆する。この効果の定量的特徴付けを得るために、我々は、TUNEL/フローサイトメトリーによって、DNA分解を測定してアポトーシスの変化について細胞を検査した。血清の対照と比較して、無血清条件において24時間のBHK（+TF）細胞の培養では、DNA分解が促進されてアポトーシス細胞の画分が著しく増大し（図8A）、48時間（図8B）までの長期の血清枯渇によって、この画分はわずかに増大した。しかし、特に、血清を除去した培地に1pM〜100nMのFVIIaを添加することにより、用量依存的に細胞がアポトーシスから救出された。FVIIaの抗アポトーシス効果は、1nMで明らかであり、10nM FVIIaでは、細胞の生存がかなり増大された;これは、FVII血漿レベルと同等の濃度である。100nM FVIIaにさらに増大すると、細胞生存がわずかに改善された。FVIIaに48時間さらされた細胞において、FVIIaの抗アポトーシス効果の同様のプロフィールが観察された（図8B）。
【００７６】
野生型の非トランスフェクトBHK細胞は、検出可能なレベルのTFを発現しない。TFトランスフェクト細胞のように、48時間の無血清条件下におけるこれらの細胞の培養では、TUNELアッセイ法によって示されるとおり、広範なアポトーシスを生じた。しかし、図8Cは、BHK（+TF）細胞とは対照的に、野生型BHK細胞では、FVIIaによってアポトーシスから細胞を救出することができなかったことを示し、TFに対する結合がその抗アポトーシス効果に必須であることを示唆する。
【００７７】
活性部位がブロックされたFVIIaであるFFR-FVIIaではなく、FVIIaでは、血清枯渇によって誘導される形態学的な変化からBHK（+TF）細胞を保護することが可能であったという観察は、TUNELアッセイ法によってこれをさらに探査することを我々に促す。次に、FVIIaのタンパク分解活性がその抗アポトーシスの効果に必要であることを確立した。図9Aに示した結果は、FFR-FVIIaではなく、FVIIaがBHK（+TF）細胞をアポトーシスから保護したので、該活性が必須であることを明らかに示した。
【００７８】
FVIIaのように、TF凝固経路の下流プロテアーゼであるFXaおよびトロンビンは、種々の細胞の反応を生じる細胞内シグナリングを誘導することが知られている。したがって、FVIIaが、少量の下流凝固因子を生成することを介してその効果を及ぼすことを除外することが重要であった。我々は、これらの研究において組換えFVIIaを使用し、かつ我々の実験系においてFXaまたはトロンビンの生成の証拠は見出されていないが、我々は、FXaおよびトロンビンの特異的な阻害剤、すなわち、それぞれTAPおよびヒルジンの存在下において、FVIIaの抗アポトーシスの効果を評価した。図9Bに示すように、TAPおよびヒルジンは、FVIIaの抗アポトーシスの効果を妨げることができなかったが、これらは、FXaおよびトロンビンの抗アポトーシスの効果を完全に消失させた。これらのデータにより、FVIIa/TFの特異的なプロテアーゼ活性が、FVIIaにさらされたTF発現細胞において観察されるアポトーシスの減少の原因であることを証明される。
【００７９】
FVIIaはカスパーゼ3活性化を抑制する−システインプロテアーゼファミリーのカスパーゼは、アポトーシスの中心的調節因子である。カスパーゼは、カスケード系において組織化された、潜在性の酵素前駆体として合成され、アポトーシスの活性化を刺激する。アポトーシスの阻害は、カスパーゼの活性を阻害することによって、またはこれらの活性化を妨げることによって達成される。FVIIaがアポトーシスを阻害する機構の手掛かりを得るために、我々は、中心的アポトーシスのエフェクターであるカスパーゼ3の活性化を、酵素前駆体並びに活性化された酵素系形態を認識する抗体を使用するウエスタンブロット解析によって調査した。血清除去により、BHK（+TF）細胞において18〜20kDaのカスパーゼ3のバンドの時間依存的な出現を誘導した（図10）。カスパーゼ3の活性化は、血清除去の2時間後に明らかであり、3時間において最大に達した。活性化は、少なくとも5時間（実験の期間）維持された。しかし、無血清培地における100nM FVIIaの存在下では、3、4、および5時間において明らかにカスパーゼ3の活性化を70〜80%に減少した。さらなる実験において（データ示さず）、FVIIaは、カスパーゼ3活性化の用量依存的な阻害を誘導し、TUNELアッセイ法で測定されるアポトーシスの用量依存的阻害と相関があった。BHK（+TF）細胞とは対照的に、FVIIaは、TFを発現しない野生型BHK細胞のカスパーゼ3活性化を阻害することができなかった（図11B）。血清により、BHK（+TF）および野生型BHK細胞の両者におけるカスパーゼ3の活性化は消失した。同様のデータは、野生型CHO-K1およびTFをトランスフェクしたCHO細胞でも得られた（図12）。
【００８０】
FVIIa/TFは、静止状態のBHK（+TF）細胞において、p44/42MAPK（図13A）並びにAkt（図13B）を活性化することが示され、両者とも、生存シグナリングの重要なプレーヤであると考えられる。しかし、どのキナーゼが、FVIIaの抗アポトーシスの効果の原因となるかは現在明らかではない。特異的なMEK阻害剤U0126および特異的なP13-キナーゼ阻害剤LY294003による実験では、両方のキナーゼがFVIIaの抗アポトーシス効果に関与するかもしれないことを示す（データ示さず）。
【００８１】
FVIIaの抗アポトーシス効果がTFを媒介することを確認するために、無血清培地中にFVIIaを添加する前にFVIIa-TF相互作用のアンタゴニスト（FFR-FVIIaおよびmAb1F44A1）を細胞とプレインキュベートした。アポトーシスは、カスパーゼ-3活性化によって検出した。FFR-FVIIaおよびモノクローナル抗ヒトTF抗体1F44A1は、FVIIaの抗アポトーシス効果を減弱することができた（図14）。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】BHK（+TF）のFITC-dUTP染色によって例証されるアポトーシス。FVIIaの用量反応。
【図２】BHK wt.のFITC-dUTP染色によって例証されるアポトーシス。FVIIaの用量反応。
【図３】BHK（+TF）のFITC-dUTP染色によって例証されるアポトーシス。FXaおよびトロンビン阻害剤の関与。
【図４】BHK wtのFITC-dUTP染色によって例証されるアポトーシス。FXaおよびトロンビン阻害剤の関与。
【図５】BHK（+TF）のFITC-dUTP染色によって例証されるアポトーシス。血清枯渇で誘導されるアポトーシスに対するFVIIaおよびFFRFVIIaの効果。
【図６】BHK（+TF）のFITC-dUTP染色によって例証されるアポトーシス。血清枯渇で誘導されるアポトーシスの時間依存性。
【図７】細胞をBHK（+TF）の凝縮した核（矢印でマークした）のヘキスト染色によって例証されるアポトーシス。
【図８】FlTC-dUTP染色によって例証されるアポトーシス。TF発現細胞におけるFVIIaの用量依存的な抗アポトーシスの効果。フローサイトメトリによるTUNEL解析。
【図９】TUNELおよびフローサイトメトリによって解析したBHK（+TF）のFIT-DUT染色によって例証されるアポトーシス。FFR-FVIIaの関与。FXaおよびトロンビン阻害剤の関与。
【図１０】BHK（+TF）細胞における血清欠乏によるカスパーゼ3活性化の時間依存性。抗カスパーゼ3 ab'sを使用するウエスタンブロット解析。FVIIaは、試験下時間の全てにおいて抗アポトーシスの効果を示す。
【図１１】カスパーゼ3の活性化によって例証されるアポトーシス。抗カスパーゼ3 ab'sを使用するウエスタンブロット解析。TF発現細胞のみにおけるFVIIaの抗アポトーシスの効果。
【図１２】CHO細胞のカスパーゼ3活性化によって例証されるアポトーシス。抗カスパーゼ3 ab'sを使用するウエスタンブロット解析。TF発現細胞のみにおけるFVIIaの効果。
【図１３】FVIIaの抗アポトーシスの効果は、用量依存的であり、BHK（+TF）細胞においてFVIIaがp44/42MAPKおよびAktを活性化する能力に関連がある。ウエスタンブロット解析。
【図１４】BHK（+TF）細胞における活性化されたカスパーゼ3のWb解析によって例証されるアポトーシス。TFへのFVIIaの結合を妨げることにより、FVIIaの抗アポトーシス効果を中和する。
【図１】
2005507008.tif 000003
【図２】
2005507008.tif 000004
【図３】
2005507008.tif 000005
【図４】
2005507008.tif 000006
【図５】
2005507008.tif 000007
【図６】
2005507008.tif 000008
【図７】
2005507008.tif 000009
【図８】
2005507008.tif 000010
【図９】
2005507008.tif 000011
【図１０】
2005507008.tif 000012
【図１１】
2005507008.tif 000013
【図１２】
2005507008.tif 000014
【図１３】
2005507008.tif 000015
【図１４】
2005507008.tif 000016
【国際公開パンフレット】
2005507008.tif 000017
2005507008.tif 000018
2005507008.tif 000019
2005507008.tif 000020
2005507008.tif 000021
2005507008.tif 000022
2005507008.tif 000023
2005507008.tif 000024
2005507008.tif 000025
2005507008.tif 000026
2005507008.tif 000027
2005507008.tif 000028
2005507008.tif 000029
2005507008.tif 000030
2005507008.tif 000031
2005507008.tif 000032
2005507008.tif 000033
2005507008.tif 000034
2005507008.tif 000035
2005507008.tif 000036
2005507008.tif 000037
2005507008.tif 000038
2005507008.tif 000039
2005507008.tif 000040
2005507008.tif 000041
2005507008.tif 000042
2005507008.tif 000043
2005507008.tif 000044
2005507008.tif 000045
2005507008.tif 000046
2005507008.tif 000047
2005507008.tif 000048
2005507008.tif 000049
2005507008.tif 000050
2005507008.tif 000051
2005507008.tif 000052
2005507008.tif 000053
2005507008.tif 000054
2005507008.tif 000055
2005507008.tif 000056
2005507008.tif 000057
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005507008.tif 000058
【国際調査報告】
2005507008.tif 000059
2005507008.tif 000060
2005507008.tif 000061
2005507008.tif 000062
2005507008.tif 000063
2005507008.tif 000064
2005507008.tif 000065
2005507008.tif 000066
2005507008.tif 000067