(57)【要約】マクロライド系、特にアジスロマイシンなどのアザライド系は、緑膿菌により引き起こされる院内感染症の治療に好適である。その作用機構は、緑膿菌の菌体密度感知機構の阻害、特にｌａｓ及びｒｈｌ菌体密度感知機構系の合成の妨害、ならびに自己誘導因子Ｎ−［３−オキソドデカノイル］−Ｌ−ホモセリンラクトン及びＮ−ブチリルホモセリンラクトンの合成の妨害である。これにより、マクロライドの非阻害濃度における緑膿菌感染症の治療が可能になる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
院内緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）感染症を、かかる治療または予防の必要がある被験者において治療または予防する方法であって、緑膿菌の菌体密度感知機構を妨害するのに有効な量のマクロライド系抗生物質を上記被験者に投与することを含む、上記方法。
【請求項２】
上記量がｌａｓ菌体密度感知機構を妨害するのに有効である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記量がｌａｓ菌体密度感知機構の自己誘導因子であるＮ−［３−オキソドデカノイル］−Ｌ−ホモセリンラクトン分子の合成を妨害するのに有効である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
上記量がｒｈｌ菌体密度感知機構を妨害するのに有効である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
上記量がｒｈｌ菌体密度感知機構の自己誘導因子であるＮ−ブチリルホモセリンラクトン分子の合成を妨害するのに有効である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
上記量がｌａｓおよびｒｈｌ菌体密度感知機構を妨害するのに有効である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
上記量がｌａｓ菌体密度感知機構の自己誘導因子であるＮ−［３−オキソドデカノイル］−Ｌ−ホモセリンラクトン分子の合成を妨害しかつｒｈｌ菌体密度感知機構の自己誘導因子であるＮ−ブチリルホモセリンラクトン分子の合成を妨害するのに有効である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
マクロライド系抗生物質がアザライドである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
アザライドがアジスロマイシンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
上記感染症が、挿管した患者の人工呼吸器に関連する肺炎、院内感染尿路感染症，免疫不全状態の患者の感染症、院内感染と一緒に嚢胞性線維症、敗血症、肺炎および慢性炎症性応答を患う患者の感染症からなる群より選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
マクロライド系抗生物質を静脈内に投与する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
マクロライド系抗生物質を経口投与する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
院内緑膿菌感染症の治療または予防用の医薬を製造するためのマクロライド系抗生物質の使用。
【請求項１４】
上記医薬が緑膿菌の菌体密度感知機構を妨害するのに有効な量のマクロライド系抗生物質を含有する、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
上記量が緑膿菌におけるｌａｓ菌体密度感知機構を妨害するのに有効であることを特徴とする、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
上記量が緑膿菌におけるｌａｓ菌体密度感知機構の自己誘導因子であるＮ−［３−オキソドデカノイル］−Ｌ−ホモセリンラクトン分子の合成を妨害するのに有効であることを特徴とする、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
上記量が緑膿菌におけるｒｈｌ菌体密度感知機構を妨害するのに有効であることを特徴とする、請求項１４に記載の使用。
【請求項１８】
上記量が緑膿菌におけるｒｈｌ菌体密度感知機構の自己誘導因子であるＮ−ブチリルホモセリンラクトン分子の合成を妨害するのに有効であることを特徴とする、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
上記量がｌａｓおよびｒｈｌ菌体密度感知機構を妨害するのに有効であることを特徴とする、請求項１４に記載の使用。
【請求項２０】
上記量がｌａｓ菌体密度感知機構の自己誘導因子であるＮ−［３−オキソドデカノイル］−Ｌ−ホモセリンラクトン分子の合成を妨害しかつｒｈｌ菌体密度感知機構の自己誘導因子であるＮ−ブチリルホモセリンラクトン分子の合成を妨害するのに有効であることを特徴とする、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
マクロライド系抗生物質がアザライドであることを特徴とする、請求項１３〜２０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２２】
アザライドがアジスロマイシンであることを特徴とする、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
上記感染症が、挿管した患者の人工呼吸器に関連する肺炎、院内尿路感染症，免疫不全状態の患者の感染症、院内感染と一緒に嚢胞性線維症、敗血症、肺炎および慢性炎症性応答を患う患者の感染症からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１３〜２２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２４】
上記医薬が静脈内投与に好適であることを特徴とする、請求項１３〜２３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２５】
上記医薬が経口投与に好適であることを特徴とする、請求項１３〜２３のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）感染症の治療または予防に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
緑膿菌は流行が増大している日和見性ヒト病原体であり、院内感染の（すなわち、病院で罹る）感染症に見出される最もありふれたグラム陰性菌である。緑膿菌は院内感染の肺炎症例の１６％、院内感染の尿路感染症の１２％、外科創傷感染症の８％、および血液流感染症の１０％の病因を占める。好中球減少性癌および骨髄移植患者などの免疫不全状態の患者は特に日和見感染症に罹りやすい。この患者群では、緑膿菌が肺炎および敗血症の病因となり、これが原因となって死亡するのは３０％に達する。緑膿菌はまた、挿管した患者における人工呼吸器に関連した肺炎の病因になりうる最も一般的で致死性の病原体の１つでもあり、これが直接の原因となる死亡率は３８％に達する。火傷患者では緑膿菌菌血症も懸念される。火傷部位における緑膿菌の激増は高い死亡率（６０％）に関連する。広がるＡＩＤＳ集団において、緑膿菌菌血症は５０％の死亡率に関連する。嚢胞性線維症（ＣＥ）患者は緑膿菌による慢性感染に罹りやすいことが特徴であり、この集団における高い罹患率および死亡率の原因である。
【０００３】
かかる感染症を発病する緑膿菌の能力は、ある範囲の細胞外毒性因子に依るものである。緑膿菌による複数の細胞外毒性因子の分泌は、２つの複雑な調節系、すなわちｌａｓおよびｒｈｌ菌体密度感知機構系（「菌体密度感知機構（quorum sensing）」は「細胞間シグナル伝達」としても知られる）により制御されることが示されている。緑膿菌におけるｌａｓおよびｒｈｌ菌体密度感知機構系の原理は総説に報じられている（Van Delden, C., Iglewski, B.H., Emerging Infectious Diseases, 1998, 4(4), 551-559）。緑膿菌について記載された第１の細胞間シグナル伝達系は毒性因子ＬａｓＢエラスターゼの発現を調節することが示され、ｌａｓ系と名付けられた（Passador, L., Cook, J.M., Gambello, M.J., Rust, L., Iglewski, B.H., Science 1993, 260, 1127-1130）。ｌａｓ細胞間シグナル伝達系は、３−オキソ−Ｃ１２−ＨＳＬ（Ｎ−［３−オキソドデカノイル］−Ｌ−ホモセリンラクトン）の合成に関わる自己誘導因子の合成酵素遺伝子ｌａｓＩ、および転写活性化因子タンパク質をコードするｌａｓＲ遺伝子から構成される。第２の公知の緑膿菌細胞間シグナル伝達系は、毒性因子ラムノリピドの産生を制御する能力があるのでｒｈｌ系と名付けられた。この系は、Ｃ４−ＨＳＬ（Ｎ−ブチリルホモセリンラクトン）自己誘導因子の合成酵素遺伝子であるｒｈｌＩ、および転写活性化因子タンパク質をコードするｒｈｌＲ遺伝子から構成される。この系は、ラムノリピド産生に必要なラムノシルトランスフェラーゼをコードするｒｈｌＡＢオペロンの発現を調節する（Ochsner, U.A., Fiechter, A., Reiser J., J. Biol. Chem. 1994, 269, 19787-19795）。ｒｈｌ系はまた、ＬａｓＢエラスターゼ、ＬａｓＡプロテアーゼ、ピオシアニン、シアン化物、およびアルカリプロテアーゼの最適な産生のためにも必要である。
【０００４】
これらの菌体密度感知機構系により、緑膿菌はその細胞数が身体免疫系を打ち勝つのに十分大きくなるまで、毒性因子、特にエステラーゼおよびラムノリピドの産生開始を遅らせることができる。しかし、慢性感染症の病原性における菌体密度感知機構の重要性は未だ知られていない。
【０００５】
先行技術
緑膿菌は通常β−ラクタム、アミノグリコシドまたはキノロンなどの抗生物質を用いて対抗する。しかし、緑膿菌株に対するマクロライド系抗生物質の最小阻害濃度（ＭＩＣ）は、典型的にはマクロライド系抗生物質の臨床的にｉｎ  ｖｉｖｏで達成可能なレベルよりも５０−１００桁も高いために、マクロライド系抗生物質は緑膿菌感染症の治療または予防に有用でないと当業者は評価している。従って、緑膿菌株に対するマクロライド系抗生物質の臨床試験において、微生物の生存率に対する影響は観察されなかった（例えば、クラリスロマイシンについて：Yanagihara, K., Tomono, K., Sawai, T., Kuroki, M., Kaneko, Y., Ohno, H., Higashima, Y., Miyazaki, Y., Hirakata, Y., Maesaki, S., Kadota, J., Tashiro, T., Kohno, S.; J. Antimicrob. Chemother. 2000, 46, 69-72；およびYanagihara, K., Tomono, K., Sawai, T., Hirakata, Y., Kadota, J., Koga, H., Tashiro, T., Kohno, S., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1997, 155, 337-342）。複数の研究によって、ＤＰＢまたはＣＦを患う患者における長期マクロライド系治療の利点が観察されている（エリスロマイシンについて：Fuji T., Kadota, K., Kawakami, K., Iida, R., Shirai, R., Kaseda, M., Kawamoto, S., Kohno, S., Thorax 1995, 50, 1246-1252；アジスロマイシンについて: Jaffe, A., Francis, M., Rosenthal, M., Bush, A., Lancet 351, p.420）。
【０００６】
５０μｇ／ｍｌのエリスロマイシンによる自己誘導因子産生の低下が示唆されている（Sofer, D.N., Gilboa-Garber, A., Belz, A., Garber, N.C., Chemotherapy 1999, 45, 335-341）；しかしこの参考文献に用いられたクロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violaceum）バイオアッセイはＣ４−ＨＳＬ自己誘導因子を測定できただけである（McClean, K.H., Winson, M.K., Fish, L., Taylor, A., Chhrabra, S.R., Camara, M., Daykin, M., Lamb, J.H., Swift, S., Bycroft, B.W., Stewart, G.S., Williams, P., Microbiology, 1997, 143, 3703-3711）。
【０００７】
緑膿菌感染症に対する、特に耐性の増強を阻止する治療法を提供する必要性は現に存在する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題及び課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
本特許出願の１つの目的は、マクロライド系抗生物質を使用する緑膿菌に対する改良された治療法であって、上記緑膿菌の菌体密度感知機構を妨害するのに有効な量のマクロライドを投与することを特徴とするものである。この量は典型的には緑膿菌のＭＩＣよりかなり低くしうる。この目的の好ましい実施形態においては、上記の量はｌａｓまたはｒｈｌ菌体密度感知機構を妨害するのに有効であり、特にｌａｓおよびｒｈｌ菌体密度感知機構系の両方を妨害するのに有効である。ｌａｓおよびｒｈｌ菌体密度感知機構系は、それぞれの自己誘導因子である３−オキソ−Ｃ１２−ＨＳＬ（Ｎ−［３−オキソドデカノイル］−Ｌ−ホモセリンラクトン）分子およびＣ４−ＨＳＬ（Ｎ−ブチリルホモセリンラクトン）分子に依存する。従って、この目的のさらなる好ましい実施形態においては、投与するマクロライドの量は緑膿菌における３−オキソ−Ｃ１２−ＨＳＬおよび／またはＣ４−ＨＳＬの合成を妨害するのに有効である。
【０００９】
本発明の上記目的の特に好ましい実施形態においては、投与されるマクロライドはアザライド、特にアジスロマイシンである。
【００１０】
本発明のさらなる目的は、院内感染による緑膿菌感染症に対抗するのに好適な医薬を製造するためのマクロライド系抗生物質の使用であって、上記医薬が緑膿菌の菌体密度感知機構を妨害するのに有効な量の該マクロライドを含有することを特徴とするものである。この目的の好ましい実施形態においては、医薬は緑膿菌のｌａｓおよびｒｈｌ菌体密度感知機構系の両方を妨害するのに有効な量のマクロライド系抗生物質を含有し；そして特に好ましい実施形態においては、上記の量は緑膿菌における３−オキソ−Ｃ１２−ＨＳＬおよび／またはＣ４−ＨＳＬの合成を妨害するのに有効である。特に好ましいのはアザライド系（マクロライド環が１個の窒素原子だけ拡大したマクロライド系）、特にアジスロマイシンの使用である。
【００１１】
本特許出願の発明者は、マクロライド系、アザライド系そして特にアジスロマイシンが緑膿菌における菌体密度感知機構を妨害することを見出した。特に、マクロライド系は緑膿菌のｌａｓおよび／またはｒｈｌ菌体密度感知機構系を妨害し、そしてこれらは、緑膿菌の菌体密度感知機構系にとって必須である自己誘導因子Ｃ４−ＨＳＬ分子および３−オキソ−Ｃ１２−ＨＳＬ分子の両方の産生を阻害することを見出した。この阻害は、それぞれの緑膿菌の最小阻害濃度（ＭＩＣ）より遥かに低い濃度で達成される。
【００１２】
図面の簡単な説明
図１ａは、ルリア・ベルターニ（ＬＢ）培地においてアジスロマイシンの不在下（正方形）および存在下（円、２μｇ／ｍｌ；三角、３μｇ／ｍｌ；逆三角、４μｇ／ｍｌ；菱形、５μｇ／ｍｌ）で増殖させたときの、緑膿菌ＰＡＯ１株の増殖（典型的な実験）ならびにそのエラスターゼおよびラムノリピド産生を示す。
【００１３】
図１ｂは、アジスロマイシンの不在下（正方形）または２μｇ／ｍｌの存在下（円）のいずれかで増殖した細胞の上清のエラスターゼ活性を示す（２連で実施した３回の独立実験の平均±標準偏差）。
【００１４】
図１ｃは、ＬＢ培地においてアジスロマイシンの不在下（正方形）または２μｇ／ｍｌの存在下（円）のいずれかで増殖させたときの、ｒｈｌＡＢオペロン（そのｒｈｌＡ’−ｌａｃＺレポーター融合体、ｐＥＣＰ６０を担持する緑膿菌ＰＡＯ１株中の）の発現を示す（β−Ｇａｌ活性として測定、２連で実施した３回の独立実験の平均±標準偏差）。
【００１５】
図２ａは、ＰＡＯ１株におけるｌａｓＲおよびｒｈｌＲ遺伝子の発現（ｌａｃＺレポーター融合体による、β−Ｇａｌ活性として測定）を示す。１、アジスロマイシン不在下でのｌａｓＲ、２、アジスロマイシン２μｇ／ｍｌの存在下でのｌａｓＲ；３、アジスロマイシン２μｇ／ｍｌならびに３−オキソ−Ｃ１２−ＨＳＬおよびＣ４−ＨＳＬ自己誘導因子（それぞれ１０μＭ）の存在下でのｌａｓＲ；４、アジスロマイシン不在下でのｒｈｌＲ；５、アジスロマイシン２μｇ／ｍｌの存在下でのｒｈｌＲ；６、アジスロマイシン２μｇ／ｍｌならびに３−オキソ−Ｃ１２−ＨＳＬおよびＣ４−ＨＳＬ自己誘導因子（それぞれ１０μＭ）の存在下でのｒｈｌＲ。
【００１６】
図２ｂは、ＰＡＯ１株におけるｌａｓＩおよびｒｈｌＩ遺伝子の発現（ｌａｃＺレポーター融合体による、β−Ｇａｌ活性として測定）を示す。１、アジスロマイシン不在下でのｌａｓＩ；２、アジスロマイシン２μｇ／ｍｌの存在下でのｌａｓＩ；３、アジスロマイシン不在下でのｒｈｌＩ；４、アジスロマイシン２μｇ／ｍｌの存在下でのｒｈｌＩ。
【００１７】
図３ａは、ＰＡＯ１株における自己誘導因子３−オキソ−Ｃ１２−ＨＳＬおよびＣ４−ＨＳＬの産生の低下を示す。１、アジスロマイシン不在下での３−オキソ−Ｃ１２−ＨＳＬ、；２、アジスロマイシン２μｇ／ｍｌの存在下での３−オキソ−Ｃ１２−ＨＳＬ；３、アジスロマイシン不在下でのＣ４−ＨＳＬ、；４、アジスロマイシン２μｇ／ｍｌの存在下でのＣ４−ＨＳＬ。
【００１８】
図３ｂは、ＰＡＯ１株におけるラムノシルトランスフェラーゼをコードするｒｈｌＡＢオペロンの相対的発現（β−Ｇａｌ活性から測定）、およびエラスターゼの産生を示す。１、アジスロマイシン不在下でのｒｈｌＡＢ発現；２、アジスロマイシン２μｇ／ｍｌの存在下でのｒｈｌＡＢ発現；３、アジスロマイシン２μｇ／ｍｌならびに３−オキソ−Ｃ１２−ＨＳＬおよびＣ４−ＨＳＬ自己誘導因子（それぞれ１０μＭ）の存在下でのｒｈｌＡＢ発現；４、アジスロマイシン不在下でのエラスターゼ産生；５、アジスロマイシン２μｇ／ｍｌの存在下でのエラスターゼ産生；６、アジスロマイシン２μｇ／ｍｌならびに３−オキソ−Ｃ１２−ＨＳＬおよびＣ４−ＨＳＬ自己誘導因子（それぞれ１０μＭ）の存在下でのエラスターゼ産生。
【発明の実施するための最良の形態】
【００１９】
発明の詳細な説明
用語「被験者」は、本特許出願との関連において、哺乳動物およびヒトを含むあらゆる動物を意味するものとする。
【００２０】
用語「院内感染」は、本特許出願との関連において、上記被験者が入院中に彼らに発症しうる感染症を意味する。かかる感染症の例は、肺炎、挿管した患者における人工呼吸器に関連する肺炎、敗血症、尿カテーテル挿管後に院内感染した尿路感染症、免疫不全状態の（例えば、好中球減少、ＡＩＤＳ由来の）患者に生じる感染症および嚢胞性線維症である。
【００２１】
用語「妨害」は、本特許出願との関連において、菌体密度感知機構、特にｌａｓおよび／またはｒｈｌ菌体密度感知機構系におけるそれぞれ対応する自己誘導因子の分子合成が、適当なアッセイによって検出可能な程度まで阻害されることを意味する。
【００２２】
緑膿菌における菌体密度感知機構、特にｌａｓおよび／またはｒｈｌ菌体密度感知機構を妨害することによる、そしてさらに特に自己誘導因子Ｎ−［３−オキソドデカノイル］−Ｌ−ホモセリンラクトンおよび／またはＮ−ブチリルホモセリンラクトンの合成を妨害することによる、院内緑膿菌に由来する疾患を治療または予防するのに有効なマクロライドの量は、マクロライドの種類によりおよび問題の緑膿菌株によって変化しうるが、これは実験動物またはヒトボランティアに対する臨床研究により決定することができる。
【００２３】
第１の示唆は、この有効なｉｎ  ｖｉｖｏ量を、例えば医薬組成物形態のマクロライドを投与することにより使用した（以下参照）ことであり、それが院内感染それ自身を克服することである。
【００２４】
さらなる示唆は、この有効量がｉｎ  ｖｉｖｏで達成したことであり、それが慢性炎症性応答または組織損傷などの緑膿菌感染に関連しかつ緑膿菌による細胞外毒性因子の放出後に起こりうる症候群が退行するかまたは消滅することである。マクロライドによる菌体密度感知機構の妨害の究極的効果として、緑膿菌集団が独立した細胞として挙動する（すなわち、細菌はそれらの存在をもはや相互に認識しない）こと、そしてこの誤り（misleading）により上記集団のエラスターゼおよびラムノリピドなどの細胞外毒性因子の産生が阻止されることが想起される。
【００２５】
この有効量を達成したことのさらなる実験的示唆は、被験体（血清、血漿、痰、組織サンプル、スメア）、すなわち緑膿菌に感染した被験者の身体部位内のマクロライド系抗生物質を使用した環境のアッセイサンプルから、誘導することができる。菌体密度感知機構にとって必須である上記自己誘導因子の分子は、細菌によりこの環境中に放出されることが知られている。緑膿菌株に感染しておりマクロライドで処理されてない被験者からのサンプルと、上記株に感染したがマクロライド系で処理された被験者からのサンプルとを比較すると、所与の投与されたマクロライドの閾値量において、２群から得たサンプルの間で自己誘導因子濃度に統計的に有意な（グループの個々の被験者間の差ならびに細菌細胞数および細菌株挙動における変動を考慮した上での統計的に有意な）差を示しうる。従って、この閾値量は「有効な」量と考えることができる。サンプルはこの目的のために当技術分野で公知のいずれの技術によりアッセイしてもよい。アッセイの例は、自己誘導因子の３−オキソ−Ｃ１２−ＨＳＬについては、Pearson, J.P., Pesci, E.C., Iglewski, B.H., J. Bacteriol. 1997, 179, 5756-5767に記載のもの；そしてＣ４−ＨＳＬについては、クロモバクテリウム・ビオラセウム菌（Chromobacterium violaceum）アッセイ（McClean,K.H., Winson, M.K., Fish, L., Taylor, A., Chhabra, S.R. Camara, M., Daykin M., Lamb, J.H., Swift, S., Bycroft, B.W., Stewart, G.S.A.B., Williams, P., Microbiology 1997, 143, 3703-3711；Shaw, P.D., Ping, G., Daly, S.L., Cha, C., Cronan, J.E. Jr., Rinehart, K.L., Farand, S.K., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94, 6036-6041）、またはSeed, P.C., Passador, L., Iglewski, B.H., J. Bacteriol. 1995, 177, 654-659に記載のアッセイが挙げられる。分析サンプルの一例は嚢胞性線維症を患う患者の痰である（Geisenberger, O., Givskov, Riedel, K., Hoiby, N., Tummler, B., Eberl. L., FEMS Microbiol. Lett. 184, 273-278；Singh, P.K., Schaefer, A.L., Parsek, M.R., Moninger, T.O., Welsh, M.J., Greenberg, E.P., Nature 2000, 407, 762-764）。
【００２６】
特に、マクロライドのｉｎ  ｖｉｖｏ有効量は、使用環境（例えば血清、血漿）１ｍｌあたり約１〜５μｇ／ｍｌ、好ましくは約１〜３μｇ／ｍｌ、そして具体的には約２μｇ／ｍｌであってもよい。
【００２７】
本発明による治療法および用途において使用することができるマクロライド系の例は、エリスロマイシンＡおよびＢ、ロキシスロマイシン、ＥＰ−Ｂ−０  ６９９  ２０７の式（ＶＩ）の化合物ならびにクラリスロマイシンである。
【００２８】
マクロライド系の好ましいクラスは、マクロライド環がＣ９位で１個の窒素原子だけ拡大したアザライド系である。本発明により使用しかつ投与することができるアザライド系の例は、アジスロマイシン、ＥＰ−Ｂ−０  １０１  １８６の化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）ならびにＥＰ−Ｂ−０  ６９９  ２０７の化合物（ＩＩＩ）、（Ｖ）および（ＶＩＩ）である。特に好ましいのはアジスロマイシンである。
【００２９】
本発明の使用および治療は、緑膿菌がコロニー形成し次いで院内疾患の症候群を発症しうる被験体（ヒトまたは動物）の身体内のあらゆる部位における院内感染を阻止するのに好適である。かかる部位は、マクロライド系の使用環境と考えることができる。かかる使用環境の例は、肺気管および気管支（例えば人工呼吸用の挿管を導入するために切開する場合）、表面創傷病変、および上記身体中へのカテーテル導入の任意の部位（例えば泌尿器カテーテル）、および緑膿菌菌血症の症例などの全身感染症例における患者の全身であってもよい。
【００３０】
本発明の治療法により影響を受けうる緑膿菌株の例は、ｌａｓおよび／またはｒｈｌ菌体密度感知機構系を持つ全ての株である。このような株の例はＡＴＣＣ  ３３３４７、ＰＡ  Ｂ１６、ＰＡ  Ｎ４２、ＰＡ１０３、そして特にＰＡＯ１株である。
【００３１】
本発明の治療法によって、問題の緑膿菌株の生存能がマクロライドにより影響されないことが好ましい。すなわちかかる処置は緑膿菌にとって非阻害性である。このタイプの処置は、マクロライド耐性株に対して有利な選択圧が作用しないので、緑膿菌集団のマクロライド耐性の発生を阻止する。
【００３２】
本発明の方法を実施する目的で、マクロライド系を、従来公知のマクロライド含有医薬と同様の方法で製剤化することができる。マクロライドの量は、菌体密度感知機構、特にｌａｓおよびｒｈｌ菌体密度感知機構系、そして具体的には、その自己誘導因子である３−オキソ−Ｃ１２−ＨＳＬ分子およびＣ４−ＨＳＬ分子の合成を妨害するのに有効となるように選択することができる。
【００３３】
かかる医薬の例は錠剤またはカプセル剤などの経口医薬である。実際上、マクロライド系の菌体密度感知機構に影響を与える能力を利用するだけであるので、緑膿菌院内感染症に対して経口投与剤形（典型的には約１．５μｇ／ｍｌより高いマクロライド系血清濃度を生じることがない）を使用することができる。
【００３４】
マクロライド系を投与する経口医薬は、例えば徐放性錠剤であってもよく、かつマクロライド系のほかに、製薬上許容される当技術分野で共通の賦形剤および希釈剤を含みうる。それらとしては、ポリエチレンオキシド、様々なエーテル化度のセルロース（ヒドロキシプロピルセルロースもしくはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）、アルファ化デンプン、キサンタンガム、ポリビニルピロリドンまたはナトリウムカルボキシメチルセルロースなどの放出遅延剤または放出制御剤；糖類などの希釈剤（例えばラクトースまたはスクロース）；一、二および三塩基性リン酸塩などの緩衝化剤、滑沢剤などの製錠用助剤（例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリルフマル酸ナトリウム）、ならびに人工香料または着色剤が挙げられる。錠剤の放出特性はさらに例えば腸溶コーティングなどの特別なコーティングによる影響を受けてもよい。経口投与剤形の場合、マクロライドは、好ましくは、１日１回投与剤形としてマクロライド約１００〜７００ｍｇの含量で製剤する。これは、１日につき（患者体重を７０ｋｇと仮定して）約１．５〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量に相当する。好ましくは、製剤の含量は約２５０ｍｇである。
【００３５】
経口医薬はまた、マクロライドの顆粒、ペレットまたはビーズを含むカプセル剤であってもよい。ペレットまたは顆粒自身の製剤については、錠剤と同じ製薬上許容される助剤を使用してもよい。
【００３６】
経口マクロライド製剤のｉｎ  ｖｉｖｏ放出に対する最初の推量値を得るために、徐放投与剤形のｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出挙動（全放出量−対−時間）を、米国薬局方ＸＸＩＩＩ（ＵＳＰ）溶解試験、７１１章、装置２（Dissolution Test Chapter 711, Apparatus 2）に開示された標準ＵＳＰ回転パドル装置で決定することができ、その際、試験培地は標的とするｉｎ  ｖｉｖｏ放出部位に応じて人工胃液または人工腸液としうる。実際に得られる血清、血漿、痰または様々な組織中のマクロライドのｉｎ  ｖｉｖｏ濃度は複数の因子に依存し、それらの因子としては、マクロライドの種類、胃および／または小腸におけるその放出濃度、その排出速度ならびに様々なｉｎ  ｖｉｖｏ媒質のマクロライドに対するアフィニティ（例えば、アジスロマイシンは身体組織に蓄積する傾向があり、血清および血漿では比較的低濃度である）が挙げられる。経口投与後のｉｎ  ｖｉｖｏ濃度の測定を代表的な一群のボランティアを用いる通常の臨床試験を使って行うことができる。
【００３７】
静脈投与用の医薬は、水溶液、等張生理食塩水、等張デキストロースまたはリンゲル液として製剤化することができる。中性型のマクロライドは水に難溶であるかまたはさらに不溶であることもあり、場合によっては有効成分の溶解度を上昇する目的で、調製物の使用する容積もしくは比率において治療効力を妨げることなくかつ無毒である非水性共溶媒、例えば、ジメチルスルホキシド、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、およびその他の非水性ビヒクルを溶液に混合してもよい。代わりにまたはさらに、マクロライド系をそのデソサミン部分の窒素原子において酸付加塩に転化してもよい。ここで使用する酸は製薬上許容される酸であって、それらの酸としては、塩酸、リン酸、硫酸、酢酸、コハク酸、（半エステル化した）ヘミコハク酸、酒石酸、（半エステル化した）ヘミ酒石酸およびホウ酸が挙げられる。エリスロマイシンＡのエチルヘミコハク酸塩は、例えばＥｒｙｔｈｒｏ  ＥＳ（登録商標）として市販されている。アザライド系の場合、二塩（disalt）への転化が可能である。最も好ましいマクロライド系アジスロマイシンの二塩酸塩は、例えばＵＳ−Ａ−４  ４７４  ７６８の実施例８で調製されている。さらにこのような予め調製した注射溶液のほかに、投与直前の溶液の即時調製に好適な固体または予め溶解した組成物を、マクロライドから調製すると有利である。このようなマクロライドの再構成可能な調製物の一般に知られる市販品の一例は、Ｐｆｉｚｅｒ社のＺｉｔｈｒｏｍａｘ（登録商標）（注射用アジスロマイシン）である。注射用溶液または再構成用組成物は、マクロライドおよび溶媒溶液のほかに、液体希釈剤；例えば、プロピレングリコール、炭酸ジエチル、グリセロール、ソルビトール、他；緩衝剤、ヒアルロニダーゼ、局所麻酔剤および所望の薬理学的特性を付与する無機塩を含む。
【００３８】
即時使用可能な注射溶液中のマクロライドの濃度は、使用時に約０．５〜１０μｇ／ｍｌ血清、好ましくは約２〜５μｇ／ｍｌの全身濃度を達成する濃度であってもよい。
【００３９】
本発明の治療は、緑膿菌菌体密度感知機構系におけるＣ４−ＨＳＬおよび３−オキソ−Ｃ１２−ＨＳＬ自己誘導因子の合成を、緑膿菌のＭＩＣより十分低い濃度のアジスロマイシンによって妨害し、そして順に、細胞外毒性因子の産生の効率的な抑制に導く。これは、マクロライドを用いる治療によってこれらの毒性因子から生じる疾患を予防する道を開く。さらに、３−オキソ−Ｃ１２−ＨＳＬ自己誘導因子はそれ自身、呼吸器上皮細胞によるインターロイキン８の産生を刺激する若干の免疫調節活性を有するので、従って３−オキソ−Ｃ１２−ＨＳＬ合成を低下させるマクロライドの投与は、院内感染症に伴う慢性炎症性応答から生じる組織傷害を部分的に予防しうる。
【００４０】
さらに本発明を以下の実施例により説明する。これらは単に例示として記載するものであり、添付した特許請求の範囲を何ら限定することを意味するものではない。
【実施例】
【００４１】
実施例１：緑膿菌の細胞増殖に対するアジスロマイシンの影響
緑膿菌ＰＡＯ１株を、全１０時間にわたりそれぞれ２、３、４および５μｇ／ｍｌのアジスロマイシンを含有するルリア・ベルターニ（ＬＢ）培地において増殖させた。培地における細胞増殖は、６６０ｎｍにおける光吸収測定値（濁度）により２時間間隔で測定した。結果を図１ａに示す。２μｇ／ｍｌのアジスロマイシンの存在下で指数増殖は僅かに影響を受けたが、定常増殖期に対する影響は観察されなかった。アジスロマイシンの不在下または２μｇ／ｍｌの存在下で増殖した細胞の全タンパク質抽出物のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ったところ大きな差は示されなかった。この実験は、２μｇ／ｍｌのアジスロマイシンのｉｎ  ｖｉｔｒｏ濃度はＰＡ０１を阻害しないことを示す。
【００４２】
実施例２：エラスターゼ産生に対するアジスロマイシンの影響
緑膿菌ＰＡＯ１株を、全１６時間にわたりブロス培地にて、アジスロマイシンの不在下または２μｇ／ｍｌの存在下で増殖させた。両方の培養物の上清サンプルを４時間間隔で採取し、サンプル中のエラスターゼ活性をエラスチン・コンゴレッドアッセイを用いて測定した（Pearson, J.P., Pesci, E.C., Iglewski, B.H., J. Bacteriol. 1997, 179, 5756-5767）。測定したエラスターゼ活性をサンプリング時間に対してプロットして、図１ｂを得た。増殖曲線（データは示してない）も６６０ｎｍにおける光密度測定値により測定した。増殖に対する有意な影響は観察されなかった。
【００４３】
実施例３：ラムノリピド産生に対するアジスロマイシンの影響
緑膿菌ＰＡＯ１株を、アジスロマイシンの０μｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌの勾配を組みこんだＭ９ベースの寒天プレート（Siegmund, I., Wagner, F., Biotechnol. Tech. 1991, 5, 265-268）上で増殖させた。定性的ラムノリピド（Ｒｈａｍｎｏｌｉｐｉｄ（登録商標））プレートアッセイを用いた。ラムノリピドの産生はアジスロマイシン濃度の増加とともに漸次減少したが、増殖はそれと並行して低下しなかった。
【００４４】
実施例４：ｒｈｌＡＢオペロンの発現に対するアジスロマイシンの影響
ｒｈｌＡ’とｌａｃＺレポーターとの融合遺伝子ｐＥＣＰ６０（Pesci, E.C., Pearson, J.P., Seed, P.C., Iglewski, B.H., J. Bacteriol. 1997, 179, 3127-3132）を担持する緑膿菌ＰＡＯ１株を、１６時間にわたりＬＢ培地でアジスロマイシンの不在下または２μｇ／ｍｌの存在下で増殖させ、β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）の活性（Miller, J.H., 「分子遺伝学における実験（"Experiments in Molecular Genetics"）」, p.352-355. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY）を両方の培養物について４時間間隔で測定した。それぞれの培養物に対する６回の実験の結果（平均±ＳＤ）を、サンプリング時間に対してプロットした（図１ｃ）。増殖曲線（データは示してない）も６６０ｎｍにおける光密度測定により測定した。増殖に対する有意な影響は観察されなかった。
【００４５】
本実験は、アジスロマイシンが自己誘導因子合成の妨害によって、（ラムノリピド産生に必要な）ラムノシルトランスフェラーゼをコードするｒｈｌＡＢオペロンの発現に影響を与えることを示す。
【００４６】
実施例５：転写活性化因子遺伝子ｌａｓＲおよびｒｈｌＲの発現ならびに自己誘導因子合成酵素遺伝子ｌａｓＩおよびｒｈｌＩの発現に対するアジスロマイシンの影響
ｌａｓＲ’とｌａｃＺレポーターとの融合遺伝子（ｐＰＣＳ１００ｌ１；Pesci, E.C., Pearson, J.P., Seed, P.C., Iglewski, B.H., J. Bacteriol. 1997, 179, 3127-3132）、またはｒｈｌＲ’とｌａｃＺとの融合遺伝子（ｐＰＣＳ１００２；同上）、またはｌａｓＩ’とｌａｃＺとの融合遺伝子（ｐＰＣＳ２２３；Van Delden, C., Pesci, E.C., Pearson, J.P., Iglewski, B.H., Infect. Immun. 1998, 66, 4499-4502）、またはｒｈｌＩ’とｌａｃＺとの融合遺伝子（ｐＬＰＲＩ；同上）を担持する緑膿菌ＰＡＯ１株の培養物を、１０時間にわたりアジスロマイシンの不在下または２μｇ／ｍｌの存在下でブロス培地において増殖させ、β−Ｇａｌ活性を定量した。ｌａｓＲおよびｒｈｌＲについての結果を図２ａに、ｌａｓＩおよびｒｈｌＩについての結果を図２ｂに示す（プロットした棒グラフはそれぞれ６回の独立実験の平均±ＳＤである）。ｌａｓＲおよびｒｈｌＲ発現の場合、それぞれ１０μＭの濃度の外因性３−オキソ−Ｃ１２−ＨＳＬおよびＣ４−ＨＳＬを培養物に同時添加することにより、アジスロマイシンの影響はほとんど完全に補うことができた（図２ａの斜線付棒グラフ）。ｌａｓＩの発現は、１０μＭの外因性自己誘導因子を同時添加しても回復できなかった。
【００４７】
この実験は、自己誘導因子合成に対するアジスロマイシンの妨害がｌａｓＲ、ｒｈｌＲ、ｌａｓＩおよびｒｈｌＩ遺伝子の転写に対する影響によることを示す。
【００４８】
実施例６：３−オキソ−Ｃ１２−ＨＳＬおよびＣ４−ＨＳＬ自己誘導因子の産生に対するアジスロマイシンの影響
緑膿菌ＰＡＯ１株を１２時間にわたりＬＢ培地でアジスロマイシンの不在下または２μｇ／ｍｌの存在下で増殖させた。生成した３−オキソ−Ｃ１２−ＨＳＬおよびＣ４−ＨＳＬ自己誘導因子を両方の培養物の上清から酢酸エチルを用いて抽出し、それらのそれぞれの濃度を特異的バイオアッセイを用いて測定した（Pearson, J.P., Pesci, E.C., Iglewski, B.H., J. Bacteriol. 1997, 179, 3127-3132；Seed, P.C, Passador, L., Iglewski, B.H., J. Bacteriol. 1995, 177, 654-659）。結果を図３ａにプロットした。マクロライドの存在下で、３−オキソ−Ｃ１２−ＨＳＬおよびＣ４−ＨＳＬの濃度はそれぞれ９４％および７２％低下した。
【００４９】
この実験は、アジスロマイシンの自己誘導因子合成に対する妨害を直接示すものである。
【００５０】
実施例７：外因性３−オキソ−Ｃ１２−ＨＳＬおよびＣ４−ＨＳＬ自己誘導因子によるｒｈｌＡＢ発現およびエラスターゼ産生の回復
ｒｈｌＡ’とｌａｃＺレポーターとの融合遺伝子ｐＥＣＰ６０（Pesci, E.C., Pearson, J.P., Seed, P.C., Iglewski, B.H., J. Bacteriol. 1997, 179, 3127-3132）を担持する緑膿菌ＰＡＯ１株を、１０時間にわたりＬＢ培地でアジスロマイシンの不在下または２μｇ／ｍｌの存在下で増殖させ、さらに後者の場合には自己誘導因子なしでまたは自己誘導因子の１０ｍＭを同時添加して実施した。全３種の培養物について、β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）の活性（Miller, J.H., 「分子遺伝学における実験（"Experiments in Molecular Genetics"）」, p.352-355. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY）およびエラスチン・コンゴレッドアッセイを用いるエラスターゼの産生（Pearson, J.P., Pesci, E.C., Iglewski, B.H., J. Bacteriol. 1997, 179, 5756-5767）の両方を１０時間後に測定した。結果を図３ｂに示す（プロットした棒グラフはそれぞれ６回の個々の実験値（平均±ＳＤ）である）。
【００５１】
実施例８：経口投与用のアジスロマイシン・フィルムコーティング錠剤
成分（ｍｇ／錠）：
１）造粒成分：
アジスロマイシン二水和物  ＵＳＰ（アジスロマイシン２５０ｍｇ当量）２６２
アルファ化デンプン                                                  ３０
無水リン酸カルシウム、二塩基性                                    １００
クロスカルメロースナトリウム                                        １０
ステアリン酸マグネシウム／ラウリル硫酸ナトリウム  ９：１            １５
２）コーティング剤：
ユードラジット（Ｅｕｄｒａｇｉｔ）  Ｌ  ３０  Ｄ−５５（登録商標）  ２０
【００５２】
１）の成分を、イソプロパノールを造粒液として用いて湿式造粒し、通常の製錠プレスを用いて圧縮して錠剤とした。これを２）を用いてフィルムコーティングした。
【００５３】
本発明による治療法に利用する場合、完成した錠剤は１日１回、１日２回または１日３回の投与に好適である。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】（ａ）ルリア・ベルターニ（ＬＢ）培地においてアジスロマイシンの不在下および存在下で増殖させたときの、緑膿菌ＰＡＯ１株の増殖ならびにそのエラスターゼおよびラムノリピド産生を示す。（ｂ）アジスロマイシンの不在下または２μｇ／ｍｌの存在下のいずれかで増殖した細胞の上清のエラスターゼ活性を示す。（ｃ）ＬＢ培地においてアジスロマイシンの不在下または２μｇ／ｍｌの存在下のいずれかで増殖させたときの、ｒｈｌＡＢオペロンの発現を示す。
【図２】（ａ）ＰＡＯ１株におけるｌａｓＲおよびｒｈｌＲ遺伝子の発現（ｌａｃＺレポーター融合体による、β−Ｇａｌ活性として測定）を示す。（ｂ）ＰＡＯ１株におけるｌａｓＩおよびｒｈｌＩ遺伝子の発現（ｌａｃＺレポーター融合体による、β−Ｇａｌ活性として測定）を示す。
【図３】（ａ）ＰＡＯ１株における自己誘導因子３−オキソ−Ｃ１２−ＨＳＬおよびＣ４−ＨＳＬの産生の低下を示す。（ｂ）ＰＡＯ１株におけるラムノシルトランスフェラーゼをコードするｒｈｌＡＢオペロンの相対的発現（β−Ｇａｌ活性から測定）、およびエラスターゼの産生を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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