(57)【要約】  本発明は放線菌からの新規のアルキルスルファターゼおよびその使用、特に第二硫酸エステルの触媒反応の際の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
放線菌から得られる第二アルキルスルファターゼ。
【請求項２】
ロドコッカス種から得られる請求項１記載のスルファターゼ。
【請求項３】
ロドコッカス−ルバー、ロドコッカス−エクイまたはロドコッカス種Ｒ３１２から得られる請求項１または２記載のスルファターゼ。
【請求項４】
スルファターゼが変性された状態で３０ｋＤａ〜６０ｋＤａの分子量を有する、請求項１から３までのいずれか１項記載のスルファターゼ。
【請求項５】
スルファターゼが変性された状態で４１ｋＤａ〜４５ｋＤａの分子量を有する、請求項４記載のスルファターゼ。
【請求項６】
スルファターゼがネイティヴな状態で６０〜８０ｋＤａの分子量を有する、請求項１から５までのいずれか１項記載のスルファターゼ。
【請求項７】
スルファターゼが配列番号１〜３０（配列Ｉ〜Ｖ）の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列領域を有する、請求項１から６までのいずれか１項記載のスルファターゼ。
【請求項８】
第二アルコールを製造する際の、またはアルキル硫酸エステルを分解するための請求項１から７までのいずれか１項記載のスルファターゼの使用。
【請求項９】
エナンチオ選択的なラセミ体分割のための請求項１から７までのいずれか１項記載のスルファターゼの使用。
【請求項１０】
アルキル硫酸エステルを酵素により加水分解のために請求項１から７までのいずれか１項記載の第二アルキルスルファターゼを使用する、第二アルコールの製造方法。
【請求項１１】
添加剤として鉄（ＩＩ）塩または鉄（ＩＩＩ）塩および／またはＣＭＡＢを反応バッチに添加する、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
第二アルキルスルファターゼをＥｃｔｅｏｌａセルロースに固定して使用する、請求項１０または１１記載の方法。
【請求項１３】
反応を有機溶剤の存在下で実施する、請求項１０から１２までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
請求項１から７までのいずれか１項記載の第二アルキルスルファターゼを第二（Ｃ７〜Ｃ１０）−アルキル硫酸エステルの加水分解のために使用する、請求項１０から１３までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
細胞不含の放線菌溶菌液から
ａ）スルフェート不含の、低下する塩勾配を有するフェニル−セファロースカラムによる精製および引き続き
ｂ）イオン交換体を用いた、酵素的アルキルスルファターゼ活性を有する得られたフラクションのクロマトグラフィーによる精製、その際、次いで
ｃ）イオン交換クロマトグラフィーにより得られた、酵素的アルキルスルファターゼ活性を有するフラクションをブルーセファロースを用いてクロマトグラフィー処理し、かつ
ｄ）酵素的アルキルスルファターゼ活性を有する得られたフラクションをＳｕｐｅｒｄｅｘ２００を用いて濾過する
ことにより得られる、請求項１から７までのいずれか１項記載の第二アルキルスルファターゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は放線菌からの新規のスルファターゼおよびその使用、特に第二硫酸エステルを触媒反応させるための使用に関する。
【０００２】
スルファターゼは硫酸エステルが加水分解により無機硫酸塩および相応するアルコールへと分解されることを触媒する酵素である。その際、硫酸エステルの酵素的加水分解は次の一般的な反応図式に従って進行する：
Ｒ−Ｏ−ＳＯ３−  ＋  Ｈ２Ｏ  →  Ｒ−ＯＨ  ＋  ＳＯ４２−  ＋  Ｈ＋
現在のところ、その有利な基質に関してアルキルスルファターゼ、アリールスルファターゼおよび炭水化物のスルファターゼに分類することができる多数のスルファターゼが公知である。高等生物ではスルファターゼは特にグリコリピド硫酸エステル、グリコサミノグリカン硫酸エステルまたはステロイド硫酸エステルの加水分解を媒介する。これに対してバクテリアでは周囲からの硫黄の同化作用およびおそらく細胞成長のためのエネルギーを貯蔵する硫黄含有化合物の提供は重要な役割を果たす。
【０００３】
スルファターゼの最も特徴的な群は、芳香族、特にフェノール性基質を受容する著しく保存されたアリールスルファターゼである。いくつかのアリールスルファターゼ、たとえばヒトの細胞から単離することができるアリールスルファターゼはたしかに有利に炭水化物の硫酸エステルを反応させる。アリールスルファターゼにとって特徴的であるのは、セリン−セミアルデヒド単位、つまり酵素の活性中心におけるＣα−ホルミルグリシン（Ｆｇｌｙｃ）単位であり、これは翻訳後変性システイン基またはセリン基から形成することができる。この翻訳後変性は酵素の生化学的機能にとって重要である。微生物のアリールスルファターゼはいわゆる「スルフェート欠乏誘発蛋白質(sulfate starvation-induced proteine)」（ＳＳＩ−蛋白質）に属し、これはたとえば硫黄源をたとえばスルホン酸アリール、硫化アルキル、チオエーテルなどのように交換しながら培養する際に形成することができる。
【０００４】
第一および第二アルコールの有機硫酸エステルの加水分解を触媒するアルキルスルファターゼのクラスはこれよりはるかに特徴がない。これは毎年大量のアルキルスルフェートが家庭用品（たとえば洗剤）からの成分として環境に放出され、微生物によって分解されるという背景の前でなおさら驚くべきである（Y.-C. Hsu, Nature 200, 1091-1092(1963); Williams, J. et al., Appl. Microbiol. 12, 360-362(1964); White, G. F., et al., Environ. Pollut. Ser. A. 37, 1-11(1985)）。
【０００５】
特殊なアルキルスルファターゼの存在はDodgson, K. S. et al., Sulfatases of Microbial Origin, 2 vols., CRC Press, Inc., Boca Raton (1982)によって初めて包括的な評論で記載された。
【０００６】
従来最も特徴的なアルキルスルファターゼは、グラム陰性バクテリア株であるシュードモナスＣ１２Ｂ（ＮＣＩＭＢ  １１７５３＝ＡＴＣＣ  ４３６４８）およびコマモナス−トリゲナ（ＮＣＩＭＢ  ８１９３）に由来する（Dodgson, K. S. et al., Sulfatases of Microbial Origin, 2 vols., CRC Press, Inc., Boca Raton (1982))。シュードモナスＣ１２Ｂは、第一または第二アルキル硫酸エステルの加水分解のために適切な培養条件に応じて５種類の異なったアルキルスルファターゼを発現することができる（Dodgson, K. S., et al., Biochem. J. 138, 53-62(1974); Bartholomew, B., et al., Biochem. J. 169, 659-667(1978); Cloves, J. M., et al., Biochem. J. 185, 13-21(1980)）。これに対してコマモナス−トリゲナは２種類の第二アルキルスルファターゼを有するのみである（Fitzgerald, J. W., et al., Biochem. J. 149, 477-480(1975); Barrett, C. H., et al., Biochem. J., 191, 467-473(1980); Matcham, G. W. J., et al., Biochem. J. 167, 723-729(1977)）。
【０００７】
さらに従来、シュードモナス−プチダＦＬＡ、汚物好気菌（Payne, W. J., et al., Nature 214, 623-624(1967)）およびおそらくまたシュードモナスＢ−２（Lijmbach, G. W. M., et al., J. Microbiol. Serol. 39, 415(1973)）中でもアルキルスルファターゼ活性を検出することができた。さらに活性な懸濁液から単離した微生物からなる混合培養中でもアルキルスルファターゼ活性を確認することができた（Vacium, L. et al., Res. Roum. Biochim. 2, 149(1976)）。
【０００８】
従来は唯一のグラム陽性バクテリア株としてバシラス−セレウス（Singh, K. L., et al., World J. Microbiol. Biotechnol. 14, 777-779、（１９９８年））およびコリネフォルム種Ｂ１ａ（Payne, W. J. et al., Appl. Microbial 13, 698(1965)）が第一のアルキルスルファターゼ活性を有していたことを示すことができる。
【０００９】
従来は個別的な場合にのみアルキルスルファターゼが実際に均質になるまで精製することができた。これに対してこれらの構造、基質特異性またはその特性に関しては従来、ほとんど認識がなかった。これらの理由から従来はアルキルスルファターゼをたとえば有機合成において利用しなかったが、ただしまさに第二アルコールのエナンチオ選択的な製造の場合にこのような酵素はたとえばラセミ体分割の際の貴重なツールであり得る。従ってアルキルスルファターゼの技術的な潜在能力はほとんど開発されなかった。
【００１０】
このことから出発して本発明の課題は、たとえばアルキル硫酸エステル分解の際の酵素的なツールとして利用することができる新規のアルキルスルファターゼを提供することである。
【００１１】
しかし顕著な二次物質代謝に関して公知であるアルキルスルファターゼに関して試験した原核微生物および真核微生物の大多数は第二アルキル硫酸エステルの加水分解に関して活性を示さない（第１表）。
【００１２】
これに対して意外なことにその他のグラム陽性バクテリアとは全く反対に、放線菌、特にロドコッカス中では第二アルキルスルファターゼが発現することが判明した。さらにこれらの第二アルキルスルファターゼは均質になるまで精製することができ、その際、酵素はその酵素的活性を失わない。こうして放線菌、有利にはロドコッカス種から得られる第二アルキルスルファターゼが本発明の対象である。
【００１３】
【表１】
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【００１４】
酵素的活性な第二アルキルスルファターゼは、次の精製工程を実施することによりそれぞれの放線菌株から単離することができる：
ａ）細胞不含の溶菌液をフェニル−セファロース−カラムによりスルフェート不含の低下する塩勾配を用いて粗精製し、
ｂ）得られた、酵素的アルキルスルフェート活性を有するフラクションをイオン交換樹脂、有利にはアニオン交換樹脂によりさらに精製し、
ｃ）イオン交換クロマトグラフィーにより得られた、酵素的アルキルスルファターゼ活性を有するフラクションをブルーセファロースカラムに通過させ、かつ
ｄ）引き続き得られた、酵素的アルキルスルファターゼ活性を有するフラクションから酵素をSperdex200カラムを用いて均質になるまで精製する。
【００１５】
その際、細胞不含の溶菌液を予めＤＥＡＥ−、ＴＥＡＥ−またはＥｃｔｅｏｌａセルロースを用いて、またはＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−２５を用いて非ペプチド成分の分離のために処理することが有利である。その際、第二アルキルスルファターゼは担体に結合しており、かつ塩含有の緩衝液を用いて該担体からその後の精製のために溶解する。
【００１６】
第二アルキルスルファターゼをロドコッカスから単離するために特に有利であることが証明されている精製パターンは、次の方法工程を含む：
ａ）カロチノイド、リピドなどを分離するためのバッチ法でのＤＥＡＥセルロースを用いた放線菌株の細胞溶菌液の処理、
ｂ）１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌおよび０．５Ｍ  ＮａＣｌからなる溶液による酵素の溶離、
ｃ）最終濃度が４Ｍ  ＮａＣｌになるまでの溶離液へのＮａＣｌの添加および４Ｍ  ＮａＣｌを含有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５（緩衝液Ｂ）により平衡化した、フェニル−セファロース−カラムを介した、得られる溶液のカラムクロマトグラフィーによる精製、その際、酵素の溶離のために４Ｍ〜０Ｍまでの段階的なＮａＣｌ勾配を利用する。その後、さらなる精製のために、
ｄ）酵素的活性フラクションを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５に対して透析し、次いで、
ｅ）Ｑ６−カラム（ＢｉｏＲａｄ）によるイオン交換クロマトグラフィー、その際、カラムは１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５（緩衝液Ａ）により平衡化されており、かつ溶離のために０Ｍ〜１ＭのＮａＣｌ勾配を利用する。勾配はたとえば緩衝液Ａおよび緩衝液Ｃ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１Ｍ  ＮａＣｌ）からなる緩衝液混合物の段階的な添加により行うことができる。その後の精製は、
ｆ）酵素的活性フラクションをブルーセファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に適用し、その際、酵素的活性フラクションを１０ｍＭのピペラジン−緩衝液、ｐＨ６．０中に装入し、かつ溶離する。引き続きカラムをさらにＴｒｉｓ／グリシン−緩衝液、ｐＨ８．９により洗浄する。
【００１７】
ｇ）５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４緩衝液、ｐＨ７．０を用いた、ＮａＣｌ濃度０．１５ＭでのＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムを使用した、均質になるまでの精製
により行う。
【００１８】
酵素的活性フラクションの測定のために、第二アルキル硫酸エステルの酵素的加水分解を利用することができ、その際、遊離される硫酸塩または遊離されるアルコールの量を個々のフラクションの酵素的活性のための尺度として測定することができる。第一の方法はたとえばDodgson, K. S., Biochem. J., 78, 312-319, 1961; Tudball, N., et al., Biochem. J. 126, 187-191, 1972に記載されている。
【００１９】
こうして単離した本発明による放線菌からの第二アルキルスルファターゼは有利には変性された形で３０〜６０ｋＤａの分子量および／またはネイティヴな状態で６０〜８０ｋＤａの分子量を有する。変性された状態で４１〜４５ｋＤａの分子量を有するか、かつ／またはネイティヴな状態で６５〜６９ｋＤａの分子量を有する第二アルキルスルファターゼが特に有利である。変性された状態での分子量の測定はＳＤＳ−ＰＡＧＥ法を用いてゲル電気泳動により行う。
【００２０】
記載した方法によりたとえば第二アルキルスルファターゼＲＳ１およびＲＳ２をロドコッカス−ルバーＤＳＭ４４５４１から単離することができる。変性した第二アルキルスルファターゼＲＳ２の分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により測定し、かつ４３．３ｋＤａである。この酵素はネイティヴな状態でＳｕｐｅｒｄｅｘ２００を用いて溶離することにより測定して６７ｋＤａの分子量を有しており、これは酵素の二量体の存在を示唆しうる。酵素ＲＳ２の等電点は５．１である。
【００２１】
ロドコッカス−ルバーＤＳＭ４４５４１からの第二アルキルスルファターゼＲＳ２のさらなる特徴付けのために、酵素を質量分析により試験した。その際、個々の特徴的なペプチド断片をエレクトロスプレー−タンデム質量分析を用いて検出することができた。このためにたとえばゲル電気泳動により分離したスルファターゼフラクションを単離し、かつトリプシンにより消化させた。得られたペプチド混合物をＥＳ  ＭＳ／ＭＳにより分析した。こうしてロドコッカス−ルバーＤＳＭ４４５４１からの第二アルキルスルファターゼＲＳ２に関して次の５つのペプチド断片を検出することができる：
［Ｌ，Ｉ］ＴＡＴ［Ｌ，Ｉ］［Ｌ，Ｉ］ＮＮ［Ｌ，Ｉ］ＱＭＰＰＲ  配列Ｉ（配列番号１〜１６）
Ｔ［Ｌ，Ｉ］ＡＥＧＧＴＡＷＥＳＰＲ                            配列ＩＩ（配列番号１７／１８）
ＰＥＡＶ［Ｌ，Ｉ］ＶＳＡＡＲ                                  配列ＩＩＩ（配列番号１９／２０）
ＮＰ［Ｌ，Ｉ］ＦＡＤＡＥＡＲ                                  配列ＩＶ（配列番号２１／２２）
Ｅ［Ｌ，Ｉ］Ｇ［Ｌ，Ｉ］ＴＰ［Ｌ，Ｉ］ＡＲ                    配列Ｖ（配列番号２３〜３０）
（［Ｌ，Ｉ］＝ロイシンまたはイソロイシン）
その際、断片の配列ＩおよびＩＩは、その他の蛋白質に対して顕著な相同性を示さない。配列ＩＩＩおよびＶはストレプトマイシス−コエリコロール(Streptomyces coelicolor)Ａ３（２）からの推定されるチオラーゼに対して相同であり、配列Ｖはさらにマイコバクテリウム−ツベルクローシスからのチオラーゼセグメントに対して相同であり、配列ＩＶはストレプトマイシス−ベネズエラエからの推定されるアセチル−ＣｏＡ−アセチルトランスフェラーゼに対して相同である。従って本発明の有利な対象は、配列Ｉ〜Ｖによる少なくとも１つのアミノ酸配列領域を有する放線菌からの第二アルキルスルファターゼである。
【００２２】
本発明による第二アルキルスルファターゼは酵素的活性な状態で単離することができるのみではなく、さらにその良好な安定性により優れており、このことにより該スルファターゼは硫酸エステルの酵素的−有機的加水分解における使用のために適切である。この場合、可能な使用はたとえば浄化装置および／または洗剤からの硫酸エステルの分解における使用である。アルキルスルファターゼはたとえばその酵素的活性を有機溶剤の存在下で、広いｐＨ値および温度の範囲において維持する。ｐＨ５．５〜ｐＨ１０のｐＨ値範囲および４０℃より低い反応温度が有利である。
【００２３】
さらに多数の界面活性剤、糖類およびポリアルコールによる酵素の活性への影響はわずかである。大部分の塩の影響もまた試験されるアルキルスルファターゼの加水分解活性に対して著しい影響を与えない。これに対してこれらの添加剤のいくつかはアルキル硫酸エステルの酵素的加水分解の反応率またはエナンチオ選択性に対してプラスの影響を与える。
【００２４】
さらに該酵素はイオン的に問題なく固定することができ、かつこのことにより反応バッチから除去し、かつ再使用することができ、その際、スルファターゼはその酵素的活性を失わない。固定化のために特にアニオン性のイオン交換樹脂、たとえばＤＥＡＤ−セルロース、ＴＥＡＥ−セルロース、ＥｃｔｅｏｌａセルロースまたはＤＥＡＥ  ＳｅｐｈａｄｅｘＡ−２５が適切である。固定化は７．５のｐＨ値で特に効果的に行われる。緩衝液としてたとえば０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝液を使用することができる。
【００２５】
ここから本発明のもう１つの対象、つまりアルキル硫酸エステルの酵素的加水分解のため、または第二アルコールの酵素的製造のための、請求されている第二アルキルスルファターゼの使用が生じる。
【００２６】
従ってたとえばロドコッカス−ルバーＤＳＭ４４５４１からの第二アルキルスルファターゼＲＳ１およびＲＳ２を、第二アルコールの製造のために利用することができる。基質として有利には、７〜１０個の炭素原子の炭素鎖を有する第二アルキル硫酸エステルを反応させる。炭素原子８個の炭素鎖長は特に有利である。さらに、その硫酸エステル結合がエステル化されたアルコール性炭素鎖の２位、３位または４位に存在する硫酸エステルが有利である。
【００２７】
硫酸エステルの加水分解のために第二アルキルスルファターゼＲＳ２を使用する場合、有利にはｐＨ７．０〜ｐＨ８．５のｐＨ値範囲で１５℃〜３６℃、特に有利には２７℃〜３２℃の温度で作業する。
【００２８】
さらに本発明によるスルファターゼを用いてアルキル硫酸エステルを加水分解する際に、反応はスルフェート不含の条件下で、または極めて低いスルフェート濃度で有利であることが判明した。実質的にスルフェート不含の条件はたとえばバリウムイオンを反応バッチに添加することにより生じることができる。
【００２９】
第二アルキルスルファターゼはさらに、第二アルキル硫酸エステルの加水分解をエナンチオ選択的に触媒反応させることができる。エナンチオ選択性はその他の添加剤、たとえば鉄（ＩＩ）イオンまたは鉄（ＩＩＩ）イオンを低い濃度で添加することにより向上することができる。その際、鉄（ＩＩ）イオンに関しては１ｍＭ〜１５ｍＭおよび鉄（ＩＩＩ）イオンに関しては３ｍＭ〜６ｍＭの濃度が、特にロドコッカスからの第二アルキルスルファターゼを使用する場合には有利であることが判明した。セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＭＡＢ）の添加によっても加水分解のエナンチオ選択性は著しく向上することができる。
【００３０】
遊離の第二アルキルスルファターゼを反応バッチ中で使用する以外に、固定された第二アルキルスルファターゼもまた使用することができる。このために本発明によるアルキルスルファターゼはたとえばアニオン性担体材料、たとえばＤＥＡＥ−セルロース、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−２５、ＴＥＡＥ−セルロースまたはＥｃｔｅｏｌａ−セルロースに固定することができる。その際、特に適切な担体はＥｃｔｅｏｌａ−セルロースである。というのも、該セルロースに固定したアルキルスルファターゼは高いエナンチオ選択性を示すからである。
【００３１】
第二アルキルスルファターゼは従って硫酸エステルから第二アルコールを製造するために特に好適である。特に興味深いのはたとえばラセミ体分割の際にキラルな第二アルコールをエナンチオ選択的に製造する方法である。
【００３２】
この場合、酵素による攻撃の種類に応じてアルキル硫酸エステルの加水分解は立体配置を維持するか、または反転して行うことができる。ロドコッカス−ルバーＤＳＭ４４５４１から単離した第二アルキルスルファターゼＲＳ１およびＲＳ２はたとえば（Ｒ）−（−）−２−オクチルスルフェートの立体配置を立体選択的に（Ｓ）−（＋）−２−オクタノールに反転させて加水分解する。
【００３３】
以下に本発明を明確にするためにいくつかの実施例を記載する。
【００３４】
例１：ロドコッカス−ルバーの培養
菌株ＤＳＭ４４５４１のロドコッカス−ルバーの細胞の培養はグルコース１０ｇ／ｌ、ペプトン１０ｇ／ｌ、酵母抽出液１０ｇ／ｌ、ＮａＣｌ２ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １．５ｇ、ＮａＨ２ＰＯ４  １．３ｇ／ｌおよびＫ２ＨＰＯ４  ４．４ｇ／ｌからなる液状媒体中、好気性条件下で行う。培養液はバッフルを有するフラスコ中、３０℃および１３０ｒｐｍで振とうし、細胞の成長を５４６ｎｍの吸収波長で光学密度を測定することにより追跡する。
【００３５】
例２：第二アルキルスルファターゼの精製
細胞を破壊するために、ロドコッカス−ルバーＤＳＭ４４５４１の細胞ペースト４７ｇ（湿潤質量）をＴｒｉｓ緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．５）１２０ｍｌ中に懸濁させる。該懸濁液に直径約０．３５ｍｍを有するガラスビーズ１２０ｍｌを添加する。懸濁液の細胞を外部の氷／水−冷却装置を有する振動ミルを用いて４℃より低い温度で破壊する。その際、細胞の破壊は２分間の振動段階およびその後の５分間の冷却からなるサイクルで４回行う。ガラスビーズを濾過した後、細胞溶解産物を４℃および３８０００×ｇで２時間遠心分離する。遠心分離した細胞溶解産物を、カロチノイド、リピドなどの分離のためにバッチ法でＤＥＡＥ−セルロースを用いて処理し、その際、アルキルスルファターゼをＤＥＡＥ−セルロース担体に結合させる。アルキルスルファターゼの溶離は１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌおよび０．５Ｍ  ＮａＣｌからなる溶液を用いて行う。こうして調製した酵素の粗製抽出物を撹拌下および氷冷下で、４Ｍの最終濃度が達成されるまでＮａＣｌを添加する。その後、カラムクロマトグラフィーにより酵素の粗製抽出物の精製をフェニル−セファロース−カラム（ファルマシアＶ＝２０ｍｌ）を介して行い、その際、カラムをまず１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、４Ｍ  ＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５（緩衝液Ｂ）を用いて平衡化する。溶離は段階的にＮａＣｌ濃度を低下させることにより行う。このために緩衝液Ｂと緩衝液Ａ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５）の混合物を使用する。その際、ロドコッカス−ルバーＤＳＭ４４５４１（ＲＳ１およびＲＳ２）からの２種類の第二アルキルスルファターゼを検出することができ、スルファターゼＲＳ１は１ＭのＮａＣｌ濃度で溶離し（緩衝液Ｂ２５％、緩衝液Ａ７５％）、より親油性のスルファターゼＲＳ２は０ＭのＮａＣｌ濃度で溶離する（緩衝液Ｂ０％、緩衝液Ａ１００％）。
【００３６】
そのつど得られるスルファターゼフラクションを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ−緩衝液、ｐＨ７．５に対して透析した後で、酵素的活性なフラクションを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５により平衡にしたＱ６−カラム（ＢｉｏＲａｄ、Ｖ＝６ｍｌ）を用いてさらに精製する。使用されるフラクションの蛋白質成分の溶離は１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ−緩衝液、ｐＨ７．５を用いて行い、その際、ＮａＣｌ  ０Ｍから１Ｍまでの段階的なＮａＣｌ勾配を使用する。第二アルキルスルファターゼＲＳ１およびＲＳ２の脱着は０．１５〜０．３１ＭのＮａＣｌ濃度で行う。ＲＳ１およびＲＳ２を含有するフラクションを引き続き１０ｍＭ  ピペラジン緩衝液、ｐＨ６．０中でブルーセファロースカラム（ファルマシア）に適用する。与えられた条件下でＲＳ１もＲＳ２もカラム材料に結合せず、かつ従って直ちに回収することができる。引き続きカラムをＴｒｉｓ／グリシン緩衝液、ｐＨ８．９で洗い流す。得られる酵素的活性なフラクションを１ｍｌに濃縮し（Ｃｅｎｔｒｉｐｌｕｓ  １０、Ａｍｉｃｏｎ）、かつＳｕｐｅｒｄｅｘ２００−カラムに装入する。カラムの平衡化およびそのつどのスルファターゼの溶離は５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ−緩衝液、ｐＨ７．０を用いて行う。
【００３７】
個々の精製工程の進行を図１に示す。図１は蛋白質含有試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％）分析を示す：
帯域Ａは細胞の粗製抽出物を示す。
帯域ＢはＤＥＡＥ−セルロースによる処理後の試料を示す。
帯域Ｃはフェニル−セファロースを用いたクロマトグラフィー後の試料を示す。
帯域ＤはＱ６を用いたイオン交換クロマトグラフィー後の試料を示す。
帯域Ｅはブルーセファロースを用いたクロマトグラフィー後の試料を示す。
帯域ＦはＳｕｐｅｒｄｅｘ２００を用いた精製後の精製された第二アルキルスルファターゼＲＳ２の試料を示す。
帯域Ｇは分子量マーカーを示す。
試料はＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ  Ｒで染色した。
【００３８】
例３：酵素的活性を測定するためのアッセイ
ａ）酵素により遊離するスルフェートイオンの量の測定
酵素により遊離するスルフェートイオンを測定するためにDodgson, K. S. et al., Biochem. J., 78, 312-319, 1961の方法を使用したが、これはTudball, N. et al., Biochem. J. 126, 187-192, 1972により変更を加えたものである。この場合、アルキルスルファターゼ−溶液２００μｌを３０ｍＭ  ３−オクチル硫酸エステル溶液２００μｌと共に培養する。０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ−緩衝液、ｐＨ７．５を使用する。反応を温度３０℃で実施し、かつ１５分後に１５％のトリクロロ酢酸（ｗ／ｖ）の添加により中断する。短時間の遠心分離の後、反応溶液の２００μｌ試料をTudballによるスルフェート測定のために使用する。
【００３９】
酵素的活性を検出するための基質として２−オクチル硫酸エステルを使用する場合には反応時間を１〜２時間延長する。
【００４０】
酵素活性単位（＝ユニット）を、１分あたり１μモルのＳＯ４２−−イオンを遊離する酵素量として定義する。
【００４１】
ｂ）酵素により遊離するアルコールの量の測定
酵素的活性を測定するために、イオン交換クロマトグラフィーにより得られた完全に、または不完全に精製した酵素溶液、またはフェニル−セファロースを用いてクロマトグラフィー処理により得られた親液化した、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５中のスルファターゼ粉末の再懸濁溶液４００μｌに同じ緩衝液中の３０ｍＭ基質溶液４００μｌを添加する。該混合物を６〜１２時間の反応過程に依存して２４℃、１３０ｒｐｍで振とうする。
【００４２】
例４：反応率の測定
反応混合物のアリコート２００μｌを酢酸エチル２００μｌで抽出した。反応バッチを０．５分間、完全に混合し、かつ引き続き該混合物を１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後に、上澄みの有機相の試料１００μｌにエタノール中のメンソール（ｃ＝１５．４ｍｇ／ｍｌ）の原液５μｌを添加し、これを内部標準として使用する。反応率をＧＣによりアキラルなカラムを用いて測定し（ＨＰ１３０１、シアノプロピルフェニルメチルポリシロキサン６％、３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍ（フィルム）およびＨＰ−１、３０ｍ×０．５３ｍｍ×０．５μｍ；Ｎ２）、その際、温度を２．５分間、９５℃に維持し、次いで１０℃／分の加熱速度で温度を１１０℃に高める。記載した温度プログラムは２−、３−および４−オクタノールの測定に関して調整されている。
【００４３】
例５：エナンチオマー過剰の測定
エナンチオマー過剰（ｅｅ）の測定は、キラルなChrompack CP 7500カラム（シクロデキストリン−Ｂ−２、２５ｍ×０．２５ｍｍ×２５μｍ）およびChrompack Chirasil-Dex CB/G-PN（γ−シクロデキストリンプロピオニルカラム、３０ｍ×０．３２ｍｍ）を用いてキャリアガスとして水素を使用して行う。（Ｒ）−または（Ｓ）−アルコールの同定は相応するキラルなアルコールの同時注入により行う。
【００４４】
２−アルカノールの誘導
エナンチオマー過剰を測定するためにアルコールをトリフルオロ酢酸無水物（ＴＦＡ）により誘導する。このことによりキラルなＧＣ−カラムを用いてエナンチオマーの改善された分離が達成される。このために酵素により反応させた反応混合物４００μｌをジクロロメタン５００μｌにより抽出し、かつ無水硫酸ナトリウムにより乾燥させる。ＴＦＡ４０μｌの添加後に、該溶液を２０分間、６０℃に加熱する。溶液を室温に冷却した後、試料を５％の炭酸ナトリウム溶液０．５ｍｌにより２回抽出する。その後、有機相を無水硫酸ナトリウムにより乾燥させた後に、試料をガスクロマトグラフィーにより分析する。
【００４５】
重炭酸ナトリウム抽出物の後処理を回避するために代替的に試料をジクロロメタン中のＮ−メチル−ビス−トリフルオロアセトアミド（１：３ｖ／ｖ）からなる溶液を用いて４０℃で１時間処理し、かつ引き続き直接ガスクロマトグラフィーにより試験することができる。
【００４６】
もう１つの代替法は相応するアセテートのガスクロマトグラフィー分析である。このために酵素により反応した反応溶液４００μｌを酢酸エチル４００μｌで抽出する。有機相を無水硫酸ナトリウムにより乾燥させる。無水酢酸８０μｌおよび触媒量のｐ−ジメチルアミノピリジンを添加した後で、該溶液を室温で一夜振とうさせる。その後、該溶液を水０．５ｍｌで２回抽出し、かつ引き続き有機相を無水硫酸ナトリウムにより乾燥させ、かつ分析する。
【００４７】
注意すべきことは、トリフルオロアセテートをアセテートエステルに対して逆の順序で溶離することである。
【００４８】
例６：ＲＳ２を用いた第二アルキル硫酸エステルの酵素による加水分解
試験すべき基質を例３に記載したように反応させる。反応の結果は第２表に記載されている。
【００４９】
【表２】
2005508654.tif 000003
【００５０】
第２表の結果は、記載した方法により単離可能な第二アルキルスルファターゼは、潜在的な基質に対して高い特異性を有することを示している。ロドコッカス−ルバーＤＳＭ４４５４１からの第二アルキルスルファターゼＲＳ２の場合、適切な基質は、別の置換基を有していない、直鎖状の脂肪族第二（Ｃ７〜Ｃ１０）アルキル硫酸エステルである。このようなエステルは良好な収率および良好なエナンチオ選択率で反応する。ＲＳ１はＲＳ２と同様の基質特異性を有する。
【００５１】
例７：塩の影響
例３に記載したそのつど試験すべき添加剤を添加して反応を行う。その結果は第３表〜第５表にまとめられている。その際、意外なことに、本発明による第二アルキルスルファターゼの選択率は、鉄イオンの添加により、有利にはＦｅ２＋イオンの添加により向上させることができることが判明した。従ってたとえばｒａｃ−３−オクチルスルフェートに対するＲＳ２のエナンチオ選択率はＦｅＣｌ２の添加によりＥ＝４からＥ＝８０（第３表）およびｒａｃ−４−オクチルスルフェートに対してはＥ＝１からＥ＝１０（第４表）に上昇する。このことは、ＥＤＴＡの添加もメルカプトエタノールおよびジチオトレイトールの添加もアルキルスルファターゼの活性に影響を与えないだけに驚くべきことである。
【００５２】
【表３】
2005508654.tif 000004
【００５３】
【表４】
2005508654.tif 000005
【００５４】
【表５】
2005508654.tif 000006
【００５５】
例８：界面活性剤による影響
例３に記載したようにそのつど試験すべき界面活性剤を添加して反応を行う。その結果は第６表にまとめられている。請求されている第二アルキルスルファターゼの活性に対する界面活性剤の影響は、使用される界面活性剤に応じて異なっている。ＳＤＳまたはジ−ｎ−オクチルスルホスクシネートの添加により、酵素はその活性をほぼ完全に失う。これに対して多くの界面活性剤は反応率に対して影響を与えないか、またはごくわずかに影響を与えるにすぎないが、しかし、さらにいくつかの界面活性剤は酵素的反応のエナンチオ選択率に対して有利な影響さえ与える（第６表）。従ってたとえば硫酸エステルの加水分解のエナンチオ選択率の向上はＣＭＡＢの添加によって達成することができる。
【００５６】
【表６】
2005508654.tif 000007
【００５７】
例９：その他の添加剤の影響
例３に記載したようにそれぞれの試験すべき添加剤を添加して反応を行う。その結果は第７表にまとめられている。本発明による第二アルキルスルファターゼによる第二硫酸エステルの反応率および酵素的加水分解のエナンチオ選択率に対する異なった糖およびポリアルコールの影響はいくつかの例外（たとえばＣＭＡＢ）があるが、極めてわずかである（第７表および第８表）。
【００５８】
【表７】
2005508654.tif 000008
【００５９】
【表８】
2005508654.tif 000009
【００６０】
例１０：固定した酵素に対する担体の影響
０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ−緩衝液、ｐＨ７．５中のスルファターゼ調製物（１１ｍｇ／ｍｌ）の溶液を、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５からなる緩衝液であらかじめ洗浄した固定化担体（ＤＥＡＥ−、ＴＥＡＥ−、Ｅｃｔｅｏｌａ−セルロース（Ｓｅｒｖｉａ、ハイデルベルク）、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−２５）１００ｍｇに添加する。該バッチを５分間、慎重に混合し、かつ４℃で３０分間放置する。その後、該バッチを遠心分離し、上澄みを除去し、かつ固定化担体を０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ−緩衝液、ｐＨ７．５で短時間洗浄し、かつアルキルスルファターゼ活性に関して例３と同様に試験する。その結果は第９表にまとめられている。
【００６１】
【表９】
2005508654.tif 000010
【００６２】
従って、Ｅｃｔｅｏｌａ−セルロースは第二アルキルスルファターゼを固定化するためのアニオン性担体材料として、反応率に対して、および特にアルキル硫酸エステルの加水分解のエナンチオ選択率に対して有利な影響を与えることが判明する。
【００６３】
例１１：有機溶剤の影響
ｒａｃ−２−オクチルスルフェート（５％（ｖ／ｖ）の反応は、３０℃で種々の有機溶剤中のＲＳ２を用いて行う。その結果は第１０表に記載されている。
【００６４】
【表１０】
2005508654.tif 000011
【００６５】
本発明による第二アルキルスルファターゼのもう１つの利点、つまり有機溶剤の存在下で大きな活性の損失もなく安定していることが判明した。第二アルキル硫酸エステルのエナンチオ選択的な反応のために特に適切な有機溶剤の例はｔ−ＢｕＯＨである。
【００６６】
例１２：バリウムイオンの添加
第二アルキルスルファターゼＲＳ２の酵素的活性に対するＢａ２＋の影響を、ｐＨ値７．５および温度２４℃で０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ−緩衝液中、基質としてのｒａｃ−２−オクチル硫酸エステル１５ｍＭを使用して測定する。
【００６７】
図２は、反応バッチにバリウムイオンを添加した場合と添加しない場合の反応時間に依存する第二アルキル硫酸エステルの反応率を示す。
【００６８】
例１３：ロドコッカス−ルバーＤＳＭ４４５４１からの第二アルキルスルファターゼＲＳ２の生化学的な特徴付け
ａ）分子量の測定
ＲＳ２の分子量をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル−電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて確認した分子量の再検査はＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムを用いて酵素の大きさに基づいて行う。較正はキモトリプシノーゲンＡ（２５ｋＤａ）、オバルブミン（４３ｋＤａ）、ＢＳＡ（６７ｋＤａ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（１５０ｋＤａ）およびブルーデキストラン（２０００ｋＤａ）を分子量標準として使用して行う。
【００６９】
変性条件下でＳＤＳ−ポリアクリルアミド−ゲル電気泳動による分子量の測定により第二アルキルスルファターゼＲＳ２に関して４３．３ｋＤａの分子量が生じた。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００により精製された酵素の溶離により約６７ｋＤａの分子量が生じ、これは酵素の非球状または二量体の構造を示唆している。
【００７０】
ｂ）等電点（ｐｌ）の測定
第二アルキルスルファターゼＲＳ２の等電点をｐＨ３〜ｐＨ１０のｐＨ値でＢｉｏＲａｄ  ＩＥＦ  Ｒｅａｄｙ  Ｇｅｌ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて測定した。ＲＳ２のｐｌ測定により５．１の値が生じた。
【００７１】
ｃ）最適ｐＨの測定
１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／マレイン酸緩衝液中、基質としての１５ｍＭ  ｒａｃ−２−オクチル硫酸エステルを使用して２４℃で６．０〜９．０のｐＨ範囲によりスルファターゼＲＳ２の最適ｐＨを測定した。第二アルキルスルファターゼＲＳ２の活性最大値は７．５〜８．０のｐＨ値である。
【００７２】
図３はｐＨ値に依存するスルファターゼＲＳ２の酵素的活性を示す。
【００７３】
ｄ）温度最適値の測定
１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／マレイン酸緩衝液中、基質として１５ｍＭ  ｒａｃ−２−オクチル硫酸エステルを使用してｐＨ値７．５で２０℃〜４０℃の温度範囲で第二アルキルスルファターゼＲＳ２の酵素的活性に対する温度の影響を測定した。２−オクチルスルフェートに対するＲＳ２の酵素的活性は約３０℃で最適値を示す。
【００７４】
図４は温度に依存するスルファターゼＲＳ２の酵素的活性を示す。
【００７５】
例１４：基質の合成、一般的な方法規定
ナトリウムｓｅｃ−（±）−アルキルスルフェートを、たとえばWhite, G. F. et al., Biochem. J. 187, 191, 1980に記載されている合成方法に準じてトリエチルアミン−ＳＯ３−錯体を添加して相応する第二アルコールをスルフェート化することにより製造する。その際、水素化ナトリウム０．１３２ｇ（５．５２ミリモル、鉱油中６０％の分散液、石油エーテルを用いて洗浄）をアルゴン雰囲気下でジオキサン２ｍｌ中に懸濁させる。この懸濁液に第二アルコール２．４８ミリモルを隔膜によりゆっくり滴加する。混合物を室温で１時間撹拌する。三酸化硫黄−トリエチルアミン錯体（０．５ｇ、２．７６ミリモル）を加熱下に無水ジオキサン４ｍｌ中に溶解させる。得られる溶液を引き続きゆっくりナトリウムアルコラート溶液に滴加し、かつ一夜撹拌する。反応の中断は蒸留水の添加により行う。その後、溶液を回転蒸発器中で完全に蒸発させる。残留物を蒸留水１５ｍｌ中にとり、かつ酢酸エチル１０ｍｌで５回抽出する。引き続き水を親液化により除去する。得られる粉末をメタノール３０ｍｌ中にとり、かつ濾別する。濾液から減圧下で溶剤を除去する。
【００７６】
１−ブロモオクタン−７−オールをYadav, J. S. et al. Tetrahedron, 45, 6263-6270, 1989により合成により製造し、かつ引き続き記載されているようにスルフェート化する。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】個々の精製工程の進行を示す
【図２】反応バッチにバリウムイオンを添加した場合と添加しない場合の反応時間に依存する第二アルキル硫酸エステルの反応率を示す
【図３】ｐＨ値に依存するスルファターゼＲＳ２の酵素的活性を示す
【図４】温度に依存するスルファターゼＲＳ２の酵素的活性を示す
【配列表】
2005508654.tif 000012
2005508654.tif 000013
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2005508654.tif 000018
【図１】
2005508654.tif 000019
【図２】
2005508654.tif 000020
【図３】
2005508654.tif 000021
【図４】
2005508654.tif 000022
【手続補正書】
【提出日】平成15年8月15日(2003.8.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
放線菌から得られる第二アルキルスルファターゼにおいて、該スルファターゼが変性された状態で３０ｋＤａ〜６０ｋＤａの分子量を有するか、かつ／またはネイティヴな状態で６０ｋＤａ〜８０ｋＤａの分子量を有することを特徴とする、放線菌から得られる第二アルキルスルファターゼ。
【請求項２】
ロドコッカス種から得られる請求項１記載のスルファターゼ。
【請求項３】
ロドコッカス−ルバー、ロドコッカス−エクイまたはロドコッカス種Ｒ３１２から得られる請求項１または２記載のスルファターゼ。
【請求項４】
スルファターゼが変性された状態で４１ｋＤａ〜４５ｋＤａの分子量を有する、請求項３記載のスルファターゼ。
【請求項５】
スルファターゼが、ネイティヴな状態で６５ｋＤａ〜６９ｋＤａの分子量を有する、請求項１から４までのいずれか１項記載のスルファターゼ。
【請求項６】
スルファターゼが配列番号１〜３０（配列Ｉ〜Ｖ）の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列領域を有する、請求項１から５までのいずれか１項記載のスルファターゼ。
【請求項７】
第二アルコールを製造する際の、またはアルキル硫酸エステルを分解するための請求項１から６までのいずれか１項記載のスルファターゼの使用。
【請求項８】
エナンチオ選択的なラセミ体分割のための請求項１から６までのいずれか１項記載のスルファターゼの使用。
【請求項９】
第二アルコールの製造方法において、アルキル硫酸エステルを酵素により加水分解するために請求項１から６までのいずれか１項記載の第二アルキルスルファターゼを使用することを特徴とする、第二アルコールの製造方法。
【請求項１０】
添加剤として鉄（ＩＩ）塩または鉄（ＩＩＩ）塩および／またはＣＭＡＢを反応バッチに添加する、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
第二アルキルスルファターゼをＥｃｔｅｏｌａセルロースに固定して使用する、請求項９または１０記載の方法。
【請求項１２】
反応を有機溶剤の存在下で実施する、請求項９から１１までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
請求項１から６までのいずれか１項記載の第二アルキルスルファターゼを第二（Ｃ７〜Ｃ１０）−アルキル硫酸エステルの加水分解のために使用する、請求項９から１２までのいずれか１項記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
従来最も特徴的なアルキルスルファターゼは、グラム陰性バクテリア株であるシュードモナスＣ１２Ｂ（ＮＣＩＭＢ  １１７５３＝ＡＴＣＣ  ４３６４８）およびコマモナス−トリゲナ（ＮＣＩＭＢ  ８１９３）に由来する（Dodgson, K. S. et al., Sulfatases of Microbial Origin, 2 vols., CRC Press, Inc., Boca Raton (1982))。シュードモナスＣ１２Ｂは、第一または第二アルキル硫酸エステルの加水分解のために適切な培養条件に応じて５種類の異なったアルキルスルファターゼを発現することができる（Dodgson, K. S., et al., Biochem. J. 138, 53-62(1974); Bartholomew, B., et al., Biochem. J. 169, 659-667(1978); Shaw, D. J. et al., Biochemical Journal, Vol. 187, No.1、第１８１〜１９０頁; Cloves, J. M., et al., Biochem. J. 185, 13-21(1980)）。これに対してコマモナス−トリゲナは２種類の第二アルキルスルファターゼを有するのみである（Fitzgerald, J. W., et al., Biochem. J. 149, 477-480(1975); Barrett, C. H., et al., Biochem. J., 191, 467-473(1980); Matcham, G. W. J., et al., Biochem. J. 167, 723-729(1977)）。


【国際調査報告】
2005508654.tif 000023
2005508654.tif 000024
2005508654.tif 000025
2005508654.tif 000026
2005508654.tif 000027
2005508654.tif 000028
2005508654.tif 000029
2005508654.tif 000030
2005508654.tif 000031
2005508654.tif 000032
2005508654.tif 000033
2005508654.tif 000034