(57)【要約】  移植の拒絶反応のリスクを求める方法とともに、移植の拒絶反応のリスクを減ずるための、組織を処理する方法及び物質を記載する。G22P1、XRCC5、hPOT1、及びSIRT2、及びこれらのホモログ及びアナログのような、様々な老化関連遺伝子の発現をレベルは、組織の拒絶反応の指標であると考えられ、拒絶反応のリスクを減ずるために、そのレベルを調整することができる。組織は、好ましくは、腎臓組織である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドナー組織における内因性のテロメア結合蛋白質の発現レベルを求める工程、及び、前記求めたレベルを発現のリファレンスレベルと比較する工程を含む方法であり、前記ドナー組織における変化した発現レベルが拒絶反応を生じやすい傾向の指標となる、拒絶反応傾向の哺乳類のドナー組織をスクリーニングする方法。
【請求項２】
前記方法が、ドナーの体から摘出される前に、ドナー組織に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記哺乳類の組織がヒト組織である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記組織が腎臓組織である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記方法が、少なくとも2のテロメア結合蛋白質の発現レベルを求めることを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記方法が、少なくとも3のテロメア結合蛋白質の発現レベルを求めることを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記テロメア結合蛋白質が、G22P1、XRCC5、hPOT1、及びSIRT2、及びこれらのホモログ又はアナログを含む群から選択される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記テロメア結合蛋白質が、Rif1、Rif2、Rap1、SIRTs1、3、4、5、6、7、8、Est1、Est2、TLG1、cdc13、A26、ATM、HDAC1、hSEP1、hTEP1、HuCds1、MYC、NEK2、p21、PIN2、TNKS、TERC、hTERT、TOP2A、TOP2B、TP53、TRF1、TRF2、及びWRNを含む群から選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記発現のリファレンスレベルを、前記ドナー組織の発現レベルと同じ時に実質的に求める、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記発現のリファレンスレベルを、健康な組織サンプルから求める、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ドナー組織における少なくとも1の内因性のテロメア結合蛋白質の発現レベル決定剤を含む、拒絶反応傾向の哺乳類のドナー組織をスクリーニングするキット。
【請求項１２】
前記キットが、前記テロメア結合蛋白質をコードするmRNAを検出するためのPCRプライマーを含む、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
前記蛋白質が、G22P1、XRCC5、hPOT1、及びSIRT2、又はこれらのホモログ及びアナログを含む群から選択される、請求項１１又は１２に記載のキット。
【請求項１４】
前記蛋白質が、Rif1、Rif2、Rap1、SIRTs1、3、4、5、6、7、8、Est1、Est2、TLG1、cdc13、A26、ATM、HDAC1、hSEP1、hTEP1、HuCds1、MYC、NEK2、p21、PIN2、TNKS、TERC、hTERT、TOP2A、TOP2B、TP53、TRF1、TRF2、及びWRNを含む群から選択される、請求項１１又は１２に記載のキット。
【請求項１５】
哺乳類のドナー組織を、少なくとも1の内因性のテロメア結合蛋白質の活性、半減期又は発現レベル調整剤で処理する工程を含む、拒絶反応のリスクを減らすために、前記組織を処理する方法。
【請求項１６】
哺乳類のドナー組織を、少なくとも1の内因性のテロメア結合蛋白質の効果的な機能を調整する剤で処理する工程を含む、拒絶反応のリスクを減らすために、前記組織を処理する方法。
【請求項１７】
前記少なくとも1の蛋白質の活性、半減期、発現レベル又は効果的な機能が増す、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
更に、前記組織を、組織老化又は細胞死防止剤で処理する工程を含む、請求項１５から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記組織の老化防止剤が、カルシニュリン阻害剤又はそのアナログを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも1の蛋白質が、G22P1、XRCC5、hPOT1、及びSIRT2、及びこれらのホモログ又はアナログを含む群から選択される、請求項１５から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記少なくとも1の蛋白質が、Rif1、Rif2、Rap1、SIRTs1、3、4、5、6、7、8、Est1、Est2、TLG1、cdc13、A26、ATM、HDAC1、hSEP1、hTEP1、HuCds1、MYC、NEK2、p21、PIN2、TNKS、TERC、hTERT、TOP2A、TOP2B、TP53、TRF1、TRF2、及びWRNを含む群から選択される、請求項１５から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ドナー組織の処理が、ドナー及びレシピエント両方の体外で行われる、請求項１５から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
ドナー哺乳類組織の拒絶反応抑制薬を調製するための、哺乳類テロメア結合蛋白質の使用。
【請求項２４】
少なくとも1の内因性のテロメア結合蛋白質の発現が調整されている、非ヒトの哺乳類ドナー組織。
【請求項２５】
前記少なくとも1の蛋白質の発現が増す、請求項２４に記載の組織。
【請求項２６】
組織ストレスの細胞マーカーの蓄積を検出することを含む、組織の損傷を評価する方法。
【請求項２７】
前記マーカーが、老化に関連したベータ ガラクトシダーゼ（SA β-gal）、リポフスチン、糖化最終産物、及びイソプロスタンを含む群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ドナー組織の組織拒絶反応のリスクの評価に使用するための調製物に関する。本発明は、更には、組織拒絶反応を抑えるのに使用するための調製物、更には、ドナーの組織拒絶反応を評価する及び抑える方法に関する。              
【背景技術】
【０００２】
移植は、今や、慢性腎不全の患者のための好ましい治療方法である。しかしながら、見込まれるレシピエントと提供可能なドナーの腎臓の数には大きな隔たりがある。この隔たりは、また、他の全ての移植の場合でも明白に存在する。移植された(transplanted or grafted)組織拒絶反応の失敗は（ここでも用いられる“組織”とう単語は、細胞及び臓器を等しく意味すると理解される）は、それゆえ、ドナー組織のレシピエントにとって臨床的に、経済的に、感情的に非常に重要である。腎臓移植において、いったん患者が死亡した場合には、慢性移植腎症(chronic allograft nephropathy (CAN))は、移植片喪失の最も一般的な原因である。不幸なことに、CANの病因は、現在のところ、不十分にしか理解されておらず、発症を減らすことにもほとんど進展がない。CANの病因をより理解することが、CANの発症を減らす方法についての新たな光明を見出すことになると予想されている(Halloran et al, 1999)。
【０００３】
CANの病因を説明する以前の仮説は、考えられる免疫に基づく説明に集中していた。しかしながら、大部分のCANの危険要因は非免疫であり、1980年代に新たな免疫抑制薬が幅広く導入されたことによってもCANの発症が顕著に落ちこまなかったことから(Paul, 1999)、これらの仮説は今や正しくないと考えられている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の実施態様の対象においては、ドナー組織のCANの発症を減じるための調製物を供給する。このことは、1つには、CANに感受性の組織において、多くの老化関連遺伝子（senescence-associated genes(SAGs)）の発現が変わることが見出されたという、本発明の驚くべき知見によって達せられた。1の可能性あるCANの原因は、促進老化、すなわち、蓄積した損傷及び加齢の負担によって、重要な細胞が修復及びリモデルする能力が磨耗し、それ故、組織の一貫性を保持する能力が磨耗ことになると考えられている(Halloran et al, 1999)。本発明は、組織への損傷が、CANの発病の要因になっている、老化に関与する遺伝子発現の変化をもたらすという、CANのモデルに基づく。細胞の老化に関係があると考えられている特定の遺伝子は、以下に示す、テロメア結合蛋白質である。驚くべきことに、本発明によって、CANにかかりやすい腎臓においては、通常の組織と比べた場合、特異的なテロメア結合蛋白質の発現量が増加しているということを見出された。驚くべきことに、本発明によって、生体ドナー由来の組織、又は実際にその後にCANを生じる生体ドナー由来の組織に比べて、死体ドナー由来の組織においては、特定のSAG発現が減少することも見出された。    
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の第一の側面については、拒絶反応の素因のために哺乳類のドナー組織をスクリーニングする方法を供給する。本方法は、ドナー組織における内因性のテロメア結合蛋白質の発現レベルを求める工程、及び求めたレベルとリファレンスの発現レベルを比較する工程を含み、ドナー組織において発現のレベルが変わることは、拒絶反応の素因であることを示す。
【０００６】
当然のことながら、本発明単独によって、医学熟練者が、ドナー組織が臓器移植に適しているか否かを断定的に評価できるものではないことは明らかであろう。多くの他の要因を考慮に入れなければならず、例えば、ドナー及びレシピエント両方の年齢及び一般的な健康状態、移植の緊急性、免疫要因等がある。当業者にとっては、考慮しなければならない多くの関連した要因を承知しているであろう。それにもかかわらず、本発明の方法は、当業者の他の考慮及び技術への有益な追加であると考えられる。
【０００７】
好ましくは、本方法は、ドナーの体から取り出す前にドナー組織について実施する。その代わりに、本方法は、移植後のドナー組織に実施することもできる；治療行為又は治療計画の変化の決定及び妥当性のためのデータを供給するために、本方法を用いることができる。
【０００８】
哺乳類の組織はヒト又は動物の組織、例えば豚の組織とすることができる。
【０００９】
特に好ましい実施態様においては、テストされる組織は腎臓組織である。
【００１０】
本方法は、1以上のテロメア結合蛋白質；好ましくは少なくとも2の、更に好ましくは少なくとも3の蛋白質の発現レベルを求めることを含む。擬似ポジティブのリスクを減じるために、多数の診断に用いることができる蛋白質に基づいて、評価を行うことができる。
【００１１】
好ましくは、テロメア結合蛋白質は、G22P1、XRCC5、hPOT1、及びSIRT2、及びこれらのホモログ又はアナログを含む群から選択される。これらの遺伝子及び蛋白質は、OMIMデーターベースにおいてリストアップされている刊行物に特徴付けられている：
GP22P1 − http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Omim/dispmin?152690
XRCC5  − http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Omim/dispmin?194364
hPOT1  − http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Omim/dispmin?606478
SIRT2  − http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Omim/dispmin?604479
【００１２】
テロメア結合蛋白質が1以上のG22P1、XRCC5、及びhPOT1、及びこれらのホモログである場合において、これらの蛋白質の発現が増すことは、拒絶反応に対する素因を示す。テロメア結合蛋白質がSIRT2又はこのホモログである場合において、この蛋白質の発現が減ることは、死体に由来する組織の拒絶反応の素因を示す。
【００１３】
テロメア結合蛋白質の発現レベルを求める工程は、抗体を用いて蛋白質を検出する方法によって行うことができる；この抗体は、抗体自身をいくつかの方法（例えば、放射線標識、蛍光標識等）で標識することができ、又は、抗体は、この分野の当業者に既知のELISAアッセイのように、更なる試薬を用いて、実質的に検出することができる。代わりに、例えば、ノザンブロッティング、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）検出、in situハイブリダイゼーション等を用いて、この蛋白質をコードするmRANの発現レベルを求めることができる。
【００１４】
発現のリファレンスレベルは、予め求めたリファレンスレベルとすることができ、または、ドナー組織の発現レベルと実質的に同じ時において求めることができる；リファレンスレベルは、例えば、レシピエント又はコントロール対象の組織に由来する。好ましくは、レファレンスレベルは、健康な組織サンプルから得られる。
【００１５】
本発明の第二の側面については、哺乳類のドナー組織の拒絶反応に対する素因をスクリーニングするためのキットを供給し、本キットは、ドナー組織における内因性のテロメア結合蛋白質の発現レベルを求める試薬を含む。
【００１６】
好ましくは、本キットは、テロメア結合蛋白質をコードするmRNAを検出するためのPCRプライマーを含む。好ましくは、この蛋白質は、G22P1、XRCC5、hPOT1、及びSIRT2、又はこれらのホモログ又はアナログを含む群から選択される。本発明の別の実施態様においては、この蛋白質は、限定するものではなくRif1、Rif2、Rap1、SIRTs1、3、４、５、Est1、Est2、TLG1、cdc13、A26、ATM、HDAC1、hSEP1、hTEP1、HuCds1、MYC、NEK2、p21、PIN2、TNKS、TERC、hTERT、TOP2A、TOP2B、TP53、TRF1、TRF2、WRNで例示される、他のテロメア結合蛋白質又は老化関連遺伝子に由来することができる。このような遺伝子の詳細は、以下の場所にリストアップ及びリンクされている；http://www3.genlink,wustl.edu/teldb/pteldb/pteldb3.html
【００１７】
代わりに、本キットには、テロメア結合蛋白質に対する抗体を含むことができる。本キットは、更に、結合した抗体を検出する検出剤を含むことができる；代わりに又は加えて、抗体自身を標識し、直接又は間接に検出することもできる。例えば、放射線標識又は蛍光標識を使用することができる。本キットの更なる代替物としては、更なる剤、例えば、抗体のような蛋白質性の剤とともに、プローブ（例えば、DNA、RNA、又は、両方又はどちらかの化学的な組み合わせ）を供給することができる。
【００１８】
本発明の更なる側面については、拒絶反応のリスクを減じる、哺乳類のドナー組織を処理する方法を供給し、本方法は、内因性のテロメア結合蛋白質の活性、半減期又は発現レベルを増すために組織を剤で処理する工程を含む。代わりに、又は加えて、組織を剤で処理し、内因性のテロメア結合蛋白質の効率的な機能性を増すことができる。
【００１９】
代わりに、又は加えて、組織を、組織の老化又は細胞死を防ぐことができる剤で処理することができる。このような処理は、移植した組織に対するストレスを防ぐことを目的とし、この処理は移植前又は移植後に行うことができる。このような剤は、カルシニュリン阻害剤を含むことができる。代わりに、このような剤のアナログ、例えば、ミトコンドリア膜透過性遷移孔(mitochondrial membrane permeability transition pore (MPTP))の小分子阻害剤を用いることができる。これらの剤（カルシニュリン阻害剤、又はこれらのアナログ）は、ミトコンドリアへのカルシウム流入を抑制し、ミトコンドリア膜電位の崩壊をもたらすことによってアポトーシスシグナルを直接的に又は間接的に抑制してアポトーシスを防ぐ。このことは、移植に関する付記１に、詳細に記載されている。
【００２０】
特定のテロメア結合蛋白質の発現レベルが増加することは、拒絶反応を受けやすい組織における細胞の損傷レベルが増加することを示すと考えられる。理論によって拘束されることを希望するものではないが、細胞のDNAが損傷を受けると、テロメア核蛋白質複合体は分離し、テロメアの侵食が生じると考えられている。これらの蛋白質の発現が増すと、細胞がテロメアで十分な蛋白質を保持しようとすることになる；この増加した発現は、前記のように検出できる。しかしながら、もしも不十分な蛋白質しか存在しないならば、テロメア損傷及び細胞死又は分解が生じるであろう。それ故、これらの蛋白質の発現を更に増したり、これらの蛋白質の機能をアシストすることによって、この損傷を修復するように機能させ、結果、組織拒絶反応のリスクを減らすことができると考えられる。
【００２１】
ドナー組織は、ヒト又は動物とすることができる。
【００２２】
都合の良いことには、組織は腎臓組織である。
【００２３】
好ましくは、蛋白質は、G22P1、XRCC5、hPOT1、及びSIRT2、及びこれらのホモログ又はアナログを含む群から選択される。蛋白質は、その代わりに、G22P1、XRCC5、hPOT1、又はSIRT2の活性部位ホモログを含むことができる。代わりに、蛋白質は、以下に示す群、この群を限定するとみなすものではないが、Rif1、Rif2、Rap1、SIRTs1、3、４、５、Est1、Est2、TLG1、cdc13、A26、ATM、HDAC1、hSEP1、hTEP1、HuCds1、MYC、NEK2、p21、PIN2、TNKS、TERC、hTERT、TOP2A、TOP2B、TP53、TRF1、TRF2、WRNのような他のSAGに由来することもできる。
【００２４】
1以上の蛋白質の活性、発現レベル又は半減期を増すことができる；好ましくは2以上、更に好ましくは3以上の蛋白質について増すことができる。
【００２５】
遺伝子発現レベルを変化させることは、遺伝子治療；プロモーター/エンハンサーのノックイン；プロモーター/エンハンサーの導入；遺伝子置換；RNA干渉等を含む、多数の方法によって行うことができる。これらの方法は、この業界の当業者に一般的に知られている方法を全て網羅する完全なリストとみなすものではない。本発明の特定の実施態様においては、特定の発現レベルを減少させることは、特定の発現レベルを増すことに変えて、又は、加えて望ましいものであろう。
【００２６】
本発明の更なる側面については、ドナー哺乳類組織の拒絶反応を抑えるための薬の調製において、哺乳類のテロメア結合蛋白質の使用を供給する。
【００２７】
組織は、好ましくは、腎臓組織である。蛋白質は、好ましくは、G22P1、XRCC5、hPOT1、及びSIRT2、及びこれらのホモログ又はアナログを含む群から選択される。代わりに、蛋白質は、以下に示す群、この群を限定するとみなすものではないが、Rif1、Rif2、Rap1、SIRTs1、3、４、５、Est1、Est2、TLG1、cdc13、A26、ATM、HDAC1、hSEP1、hTEP1、HuCds1、MYC、NEK2、p21、PIN2、TNKS、TERC、hTERT、TOP2A、TOP2B、TP53、TRF1、TRF2、WRNのような他のSAGに由来することもできる。  
【００２８】
本発明の更なる側面については、少なくとも1の内因性のテロメア結合蛋白質の発現が増加しているヒト以外の哺乳類のドナー組織を供給する。
【００２９】
このような組織は、異種移植に有用であり、ドナー組織の拒絶反応のリスクを減じることができる。増加させることは、遺伝子治療、又は、核移植に実質的に用いられる細胞の形質転換又は分子又は分子マニピュレーションの結果として得ることができる。プロモーター又はエンハンサーのノックイン又は誘導因子のノックインも、これらの目的のために利用することができる。
【００３０】
本発明の更なる他の側面については、組織ストレスの細胞マーカーの蓄積に基づく組織損傷を評価する方法を供給する。このマーカーは、pH6での老化関連ベータガラクトシダーゼ(SA beta gal, 又はSA β gal)のレベル、又は、リポフスチン、糖化最終産物又はイソプロスタンの蓄積を含むことができる。
【００３１】
[参考文献１]
2005514960.tif 000002
2005514960.tif 000003
2005514960.tif 000004
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
本発明のこれらの側面及び他の側面を、添付する図面を参照に記す。
【００３３】
本出願は、本出願の発明者及び共同発明者による様々な刊行物である、多くの付記を含む。これらの付記は、本発明の理解又は実施に必須ではないが、本発明の内容を理解できる、より詳細な背景を供給するために含まれている。4の付記の詳細を以下に記す。図４は、付記２から引用し、図５は付記３から、そして、図６から１３は付記４から引用する。
【００３４】
付記１は、出版中の、“Senescence and Transplantation” by Nolan CE, Wright SM and Shiels PG. Transplant Topics (2003)という論文である。
【００３５】
付記２は、出版中の、“Dolly, no longer the exception; telomeres and implications for transplantation” Shiels PG and AG Jardine. Cloning and Stem Cells (2003)という論文である。
【００３６】
付記３は、出版中の、“Cellular senescence, organ ageing and transplantation” Shiels PG, Nolan CE and Sklavouou E. Am J Transpl. (2003)という論文である。
【００３７】
付記4は、出版中の、“Telomere shortening and cellular senescence in a model of chronic renal allograft rejection”Joosten SA, van Ham V, Nolan CE, Borrias MC, Jardine AG, Shiels PG, van Kooten C, and Paul LC. Am J Path (2003)という論文である。
【００３８】
それぞれの図の議論をする前に、本発明を更に良く理解するために、細胞の老化及び関連する蛋白質の働きについての、更なる背景の詳細を説明する。
【００３９】
テロメアの不安定性
テロメアは、単純反復DNAからなる真核生物の染色体の末端に見られる、特殊化した構造を有する。単純反復DNAは、哺乳類では、配列(TTAGGG)nを含む。テロメアをキャップし、細胞分裂の間にテロメアを複製する特化した構造がなければ、テロメアは時間が経つにつれて徐々に短くなる。時間の経過に伴って繰り返される細胞分裂を通じてテロメアの長さが短くなることは、体細胞の加齢及び老化の一因となっていると一般的に考えられている（Shiels 1999のレビュー）。
【００４０】
テロメアのキャップ形成機能は、特徴的な四次構造及び特異的なテロメア結合蛋白質の組み合わせによってもたらされると思われる。電子顕微鏡によって、哺乳類のテロメアが、テロメアDNAが自らに折りたたまれて、ラリアット型（その先端は、テロメアの3’G鎖が突出している）を形成することによって、t-ループというループを形成することが示された。近接する二本鎖テロメア反復配列に侵入してくると考えられ、このため、置換ループ（D-ループ）を形成する。特殊化したDNA結合蛋白質が、D-ループとラリアットの接合部を安定化し、二本鎖DNA結合蛋白質は、t-ループのテロメア反復配列に沿って結合すると提案されている(Griffith et al., 1999)。
【００４１】
最近、全てのテロメアの末端で見られる一本鎖のGリッチな部位に結合することができる蛋白質が同定された（Baumann and Cech, 2001）。この蛋白質はPOT1(Protection of Telomeres)と命名され、酵母及びヒトといったように多様に、真核生物で保存されている。分裂酵母のpot1遺伝子産物の欠失は、染色体の不安定性及びテロメアDNAの迅速な喪失を示す。テロメアのキャップ形成は、それゆえ、染色体を不安定にし、死へ致させることを避けるために不可欠であると考えられる。テロメアーゼがネガティブなヒトの体細胞では、テロメアが細胞分裂ごとに短くなり、最終的には、死に至るレベルに達する。しかしながら、テロメアがそのキャップ形成蛋白質を喪失し不安定にならない限り、細胞死は誘導されない。テロメアの状態（キャップが形成されているか、又は、されていないか）は、または、細胞分裂ごとに生じる短くなる程度も決定する。それゆえ、テロメア結合蛋白質は、また、細胞がいつ老化が始まるかということを決定する内部メカニズムにも直接関与しているであろう。
【００４２】
酸化損傷
フリーラジカル（ROS）は、DNA損傷を促進し、それゆえ、細胞の老化を促進する損傷を蓄積する一因になることが知られている。酸化的代謝は、更に、ROSの産生を促進し、老化を促進することが知られている。実際、組織の代謝を遅くすること、例えば、食事を与えることを制限することによって、ある程度寿命を延長することが見出されている。多数の観察結果によって、どのようにROSが細胞を老化へ向かわせる速度を上げうるかということについての洞察が得られた。
【００４３】
最初に、酸素圧を増すことによって、in vitroにおいてヒトの繊維芽細胞が複製する際にテロメアの侵食が促進される(von Zglinicki and Schewe, 1995)。第二に、ヒトの繊維芽細胞を慢性的な酸化ストレスに供すると、テロメアが、大部分のゲノムよりも顕著に高頻度で一本鎖の突出、ギャップ及び一本鎖切断を促進することが観察された(Peterson et al., 1998)。反対に、ヒトの血管内皮細胞を抗酸化型のアスコルビン酸と培養させると、コントロールと比較して、テロメアが短くなる割合が52-62%減り、細胞の寿命を延ばすことが示された(Furumoto et al., 1998)。
【００４４】
このことの可能な説明としては、テロメアのGリッチな塩基の反復によって、特に、ROSからの損傷を受けやすいということがある。このことは、テロメア構造の崩壊が、このような損傷の結果として生じる、より下等な真核生物において観察される。ROSによって促進されるゲノムDNAへのDNA損傷によって、修復機構の一部として、テロメアからゲノムDNAの損傷部位へ、重要なテロメア結合蛋白質が補充されるという可能性もある。このことによって、テロメアが暴露されてキャップが形成されず、それゆえ、不安定になりやすいということであろう。
【００４５】
ヒトのin vivoで、酸化ストレス条件下によってテロメアを短くすることを促進することは、呼吸鎖の障害を有する患者のテロメアを用いた実験によって、見出すことができた。これらの条件は、不完全なミトコンドリアの呼吸が原因となりROSの産生が増すことと関連しており、これらの患者のテロメアは、コントロールよりも平均して1.5 kb短い(Oexle and Zwirner, 1997)。
【００４６】
CANの根本的な病因となる分子メカニズム
前記の観察は、酸化損傷によって老化の表現型を導き、このような損傷がCANの発症の根幹をなすという仮説に一致する。このような損傷は、特に、移植(transplantation  and grafting)に関連し、ドナー組織が虚血性及び低酸素ストレスを受け、結果として代謝及びROS産生が変化する。更に、関連する観察には：
・生理学的にはノーマルであるように見える動物であるにもかかわらず、クローン化されたヒツジ及びウシにおいて、テロメア侵食のような老化特性が存在することは、酸化損傷に基づく老化のモデルと一致する。これらの観察及び移植との関連性は、付記２でより詳細に論じる。
・加齢変化が、XRCC5によって媒介される顕著なDNA末端結合能力の変化とともに、ミトコンドリアDNA配列及び構造において観察される(Kopsidas et al., 2000)。
・虚血再灌流障害の原因として知られている、ミトコンドリアのキサンチン酸化還元酵素は、加齢とともに発現を変え、ミトコンドリアの酸化ストレスレベルを上昇させる(Chung et al., 1999)。
・マウスのin vivo遺伝子発現分析及び間質性繊維症のin vitroモデルによって、老化細胞と同様に、テロメア結合蛋白質、抗酸化酵素、及びリボソームのコンポーネントの遺伝子の特異的な撹乱が示唆される。
・テロメア結合蛋白質の機能を変更する変異は、早老症をもたらす(Myung et al., 2000)。
・細胞骨格及び細胞外マトリクスの形成を含む遺伝子の発現についての、特定の年齢関連性の変化が、CANの治療を受けた腎臓に観察される(Linskens et al., 1995)。
【００４７】
分子レベルでは、虚血時間を延長したことによる損傷の大部分が、低酸素細胞に再び酸素を負荷した時に産生するROSに直接由来する。慢性的な移植片拒絶反応の増加が、虚血時間が増すことと関連して観察される。
【００４８】
ROSは、前記したメカニズムによって直接、細胞の老化を促進する。それ故、既にドナー組織内に存在する、細胞の及び生理学的な老化の程度が重要であり、それは、当該細胞が有する蓄積の程度でもある（付記３を参照）。寿命の終わりが近い細胞（例えば、テロメアが短い）は、ROS由来の損傷をより受けやすく、より早く老化へと進む。生理学的な老化を示す臓器又は組織は、また、虚血/再灌流障害をより受けやすく、移植後の生理学的な老化が促進されやすい。このことは、付記１でより詳細に論ずる。
【００４９】
理論によって拘束されることを希望するものではないが、本出願の発明者は、移植の拒絶反応に影響を与える酸化ストレスが、ROSの産生に変化をもたらし、結果としてテロメア結合蛋白質の発現の変化をもたらすと考えている。特に、22P1、XRCC5、hPOT1、及びSIRT2の発現の変化を調べた。これらの蛋白質は、テロメア構造の維持、DNA修復、及びサブテロメアの領域のサイレンシングに従事している。
【００５０】
G22P1及びXRCC5モノマーは、強皮症のような自己免疫疾患の患者における主要な自己抗原として元々は同定された複合体の一部を形成する。高い親和性で二本鎖DNAの末端に結合し、NHEJによるDNA修復に従事することが知られている。これらは、また、テロメアにSITR2及びRap1と特異的に同一場所に配置され、酵母においてテロメアを保持するのに重要な役割を果たしていることが知られている。これらの生成物は、ウェルナー・ヘリカーゼ蛋白質と相互作用することが知られており、テロメアに近接する遺伝子のサイレンシングをも担っており(Nugent et al., 1998)、テロメアの隣のサイレンシングされた領域に沿って、SIRT2とともに見出される。酵母においては、テロメアから、アナログヘテロダイマー、Ku、が損失することにより、例えば、Kuが二本鎖DNA切断を修復するために補充されるとき、SIRT2の減少が促進される。
【００５１】
テロメア結合蛋白質の発現は、CAN及び移植片の安定性の診察に用いることができると考えられる。本出願の発明者は、移植によって蓄積するDNA損傷によって、それぞれの遺伝子産物が染色体の他のDNA切断部位に補充されることから、テロメアの不安定化と同時に、G22P1及びXRCC5の実質的な発現上昇をもたらすことを提案する。hPOT1の発現の増加により、不安定さを相殺しようとする試みがなされる。更には、移植前の組織におけるこれらの蛋白質の発現を増すことにより、細胞へのROS損傷のリスクを減じ、それゆえ、その後に続く組織の拒絶反応のリスクを軽減することができる。移植後の診療によっても、その後に続く損傷及びそれによる拒絶反応のリスクを減ずる可能性がある。
【実施例】
【００５２】
材料及び方法
RNAの単離
ヒトの同種移植片由来の小さな凍結させた生検（10-50 mg）サンプルを、Trizol(Sigma-Aldrich Co. Ltd, Poole, UK)を用い、取扱説明書のアドバイスに従って、RNAを調製するのに用いた。
【００５３】
サンプルは、PowerGen 125 Tissue Homogenizer(Fisher Scientific)を用いて、Trizol中で試験管用の内筒を用いてホモゲナイズした。均一な溶液が得られ、極少量の目に見える組織片が存在するようになるまで、ホモゲナイズする。その後、サンプルを室温で5-10分間反応させ、ホモジュネートを遠心チューブに移して、12,000 g(10,000 RPM on SS34)で5-10分間、4℃で遠心した。
【００５４】
パスツールピペットを用いて上層を取り除き、最初に用いたTrizol試薬1 mlあたり0.2 mlのクロロホルムを加えた。チューブを15-30秒間激しく攪拌し、その後、室温で5分間反応させた。その後、サンプルを、12,000 gで15分間、4℃で遠心した。全てのRNAが含まれている、上の水層を取り除き、新しい遠心チューブに入れた。
【００５５】
用いたTrizol試薬1 mlあたり0.5 mlのイソプロピルアルコールを加えて、RNAを再沈殿させ、その後、室温で10分間反応させ、12,000 gで10分間、4℃で遠心した。その後、上清をデカントし、ペレットを一回70％エタノールで洗浄し、7,500 g(7,500 RPM in SS34)で5分間、4℃で遠心した。上清を再びデカントし、ペレットを簡単に風乾させた。その後、RNAペレットを200 ulのDEPC水で再懸濁させ、吸光度を測定して定量した。
【００５６】
スロットブロッティング
特に、RNAサンプルをロードする前にウェル間でリークしないように注意しながら、固体支持体としてHybond N+ナイロンメンブレン（Amersham, UK）を用いて、製品の取扱説明書に従って、スロットブロット装置を構築した。マーカー色素として、蒸留水中にOrange Gを用いてテストを行った。ウェルを二回10×SSCでリンスし、真空下マニホールドを通して液体を吸引した。その後、真空を解除し、更に50 mlの10×SSCを各ウェルに加えた。2容量のRNAローディングバッファーを、それぞれ5 ugのRNAサンプルに加え、その後、70℃で10分間変性させ、氷上で冷却した。その後、RNAサンプルを、既に10×SSCを含むウェルにロードし、真空下で吸引した。その後、ウェルを二回200 ulの10×SSCでリンスし、真空下で吸引した。その後、得られたスロットブロットを2×SSCでリンスし、簡単に風乾し、その後、所定の位置にRNAをUVでクロスリンクさせ、室温でハイブリダイゼーションに必要となるまで保存した。
【００５７】
ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションは、α-32Pで標識したそれぞれのプローブを用いて、65℃で、6×SSC中で一晩行った。その後に続く、ハイブリダイゼーション後の洗浄は、65℃で、0.2×SSCを用いてストリンジェンシーに行った。その後、Molecular Dynamics PhosphorImagerを用いて、ブロットを分析に供した。シグナルの統計的な評価は、Microsoft Excelを用いて行った。
【００５８】
ハイブリダイゼーションプローブの調製
対象とする遺伝子のmRNA配列の一部を増幅させるようにデザインしたプライマーを用いて、ヒトのメサンギウム細胞RNAのRT-PCRによって、プローブを調製した。hPOT1用のプライマーは、印刷物のデータに従って選択した(Baumann and Cech, 2001)。SIRT2、G22P1及びXRCC5用のプライマーセットは、Vector NTI suite(Informax)によって供給された特定のアルゴリズムを用いて、それぞれのGeneBankの配列記録から調製した。プライマー配列を以下に記す。
【００５９】
１．XRCC5
センスプライマー：CTG AGG ACC GGC AAC ATG GT
アンチセンスプライマー：CCA TCT TCC TTG CCA AGT GA
２．G22P1
センスプライマー：AAC ACG TCT CTT GCC AGG TC
アンチセンスプライマー：CAC AAG TCT GGT GGT GGT GT
３．hPOT1
センスプライマー：GGA AGT GCA GCA GGG TTC AG
アンチセンスプライマー：GGT TCT GCT TCC CTT TCA GT
４．SIRT2
センスプライマー：CCG CTA AGC TGG ATG AAA GA
アンチセンスプライマー：GAC TGG GCA TCT ATG CTG GC
【００６０】
遺伝子発現のレベルを、増幅産物を用いたin situハイブリダイゼーションによって測定した。
【００６１】
HTEC培養
37℃で、5%CO2気下で、20 ug ml-1のPenstrepを加えたDMEM/Glutamax-1/+ pyridoxine medium(Life technologies)中で、最初のHTEC培養を行った。Joosten et al 2003で記載されているように、SA β Gal活性で細胞を測定した。
【００６２】
実験１
移植又は腎摘出術での同種移植片由来の腎臓組織の小さな生検(10-50 mg)を採取するのに、コンセンサスを得た。RNAをこの生検から抽出し、5 ugをスロットブロットによって、Hybond N+メンブレン上に移した。前記のプライマーを用いて、ヒトのメサンギウム細胞RNAのRT-PCRによってプローブを調製した。その後、遺伝子発現のレベルを適切なα-32P標識プローブを用いて、in situハイブリダイゼーションによって測定した。その後、ImageQuantを用いて、ハイブリダイズしたブロットのPhospho-imageを行って分析した。
【００６３】
CANに罹患した移植片由来の4サンプル、T0死体ドナーの生検由来の4サンプル、及びT0生体ドナーの生検由来の8サンプルを、複合的ノザンスロットブロットで分析した。代表的なブロットの比較発現データを図１に示す。この結果は、T0生体及び死体サンプルに比べて、CANサンプルにおいては、G22P1及びXRCC5の発現が増したことを示す。split-plot分散分析を用いた統計分析によって、テストを行った4の遺伝子について、3種類の生検の間で比較を行い、a) T0生体及びT0死体サンプル；及びb) T0生体及びCANサンプルにおける、それぞれの遺伝子の発現を比較した。本分析の生データを図２に示す。
【００６４】
サンプル間の残差変動を比較することによって、総合的な腎臓のタイプの差異を評価した。その際、p<0.01で有意差とした。サンプル内での残差変動を比較することによって、遺伝子の差異を評価した。その際、p<0.001で有意差とした。サンプル間の変動及びサンプル内の変動を組み合わせて比較することによって、腎臓のタイプ間おける遺伝子の総合的な差異を評価した。その際、p<0.05で有意差とした。それぞれのグループ間で分析したG22P1、XRCC5、及びhPOT1は、発現について、有意差を示した(p<0.05)。驚くべきことに、T0生体サンプルとCANサンプルの間では差異が無いにもかかわらず(p<0.05)、T0死体サンプルと比較した場合に、T0生体サンプルのSIRT2の発現が顕著に増加していた。
【００６５】
CAN生検においてG22P1、XRCC5、及びpPOT1の発現が増加していることは、細胞の老化がCANの病因の一因となる要素であることを示している。T0生体サンプルと比較した場合に、T0死体サンプルのSIRT2発現が減少していることは興味深く、このことは、酸化損傷が細胞の老化及びその結果生じるCANを促進するというメカニズムに反映しており、他の3つの老化関連遺伝子では見られなかった。発現データにおける観測された差異は、ドナー臓器の年齢と関連性があるわけではなく、むしろ老化に関連する過程に具体的に反映している。
【００６６】
これらの結果は、G22P1、XRCC5、及びpPOT1遺伝子が、CANの発病の早期診断マーカーとなりうることを示し、移植に先立ってドナー組織をスクリーニングする方法を示唆する。例えば、G22P1及びXRCC5の発現が増加するというような、細胞の老化の特徴がドナー腎臓に見られるならば、これらの移植片は、これらの遺伝子の発現レベルが低いものよりも、よりCANが発症しやすいと想定される。G22P1又はXRCC5の発現の急激な増加、及び、それにともなう今にも起きようとしているCANの発症を指示する、通常の生検は、腎臓移植をより厳格に実施すること、又はCANの発症を抑制するのに貢献するであろう。更には、SIRT2発現の分析結果によって、死体サンプルのSIRT2発現の減少から死体組織の更なる有用性が予想できるようになることが示される。全ての4つの遺伝子の発現が増加することは、細胞及びDNAの維持及び修復のための更なる蛋白質が付与されることを予期し、移植した臓器の寿命を延ばし、拒絶反応のリスクを減ずる。
【００６７】
実験２
本発明は、慢性拒絶反応のモデルラットにおいて例示される。付記４（Joosten et al., 2003）の「物質及び材料」でより完全に説明しているが、以下に要約する。
【００６８】
一連の試験的な実験において、ラットの慢性腎拒絶反応の実験モデルを用いて、老化の促進を明らかにした。このモデルにおいて、拒絶反応が生じた同種移植片は、老化に関連したβガラクトシダーゼ(SA β gal)染色、p16及びp21発現の上昇及び大量のテロメア侵食を示す（詳細のために付記４を参照）。これらのデータは、非常に顕著であり、たった45分間の虚血によって迅速にテロメアが喪失することを示す。損失の程度が非常に激しいので、分裂寿命では説明できず、臓器における免疫でもない。これは、生理学的な老化を引き起こす同種移植片内のアポトーシスと一致する。特異的なテロメア侵食は、アポトーシスにおいて、カスパーゼの活性化に先行して早期に起こる。重要なことに、拒絶反応が生じた腎臓だけが、尿細管上皮においてSA β gal染色を示す。このことは、付記２及び３でより完全に論じ、以下にまとめる。
【００６９】
拒絶反応が生じた腎臓の上皮細胞における、老化に対する明白で特異的な感受性は、核移植によって得られた動物での観察結果と一致する。上皮細胞ドナーの核から生じた動物は、短いテロメアを有し、これらの核内の老化の効果を完全に調整することができないことを示している(Shiels et al., 1999a, b;Shiels 1999; Miyashita et al., 2002)。上皮細胞がストレス誘導老化に対して明らかに影響を受けやすいことは、ヒトの主要な抗酸化物である、尿酸のトランスポーター(URAT1)が、腎臓の尿細管上皮だけで見られるという観察結果によって支持される。重要なことに、URAT1の変異は、特発性高カルシウム血症（腎臓内で、運動によって誘導される活性酸素種（reactive oxygen species(ROS)）の産生によって特徴付けられる致命的な状態）の発症に関連している(Enamoto et al., 2002)。
【００７０】
実験３  ヒトの腎臓の老化のin vitroモデル
げっ歯類の観察結果にもとづいて、本発明者は、早期のヒト腎臓の老化を評価でき、モデルとなりうる、ヒトの尿細管上皮細胞（HTEC）in vitroシステムを構築した。このシステムから得られるデータは、SA β Gal染色から判断して、個々のカルシニュリン阻害剤の存在下で、HTECの老化が異なっていることを示す。このことは図３で示され、老化の測定として、pH6での尿細管上皮培養物のSA β Gal染色を示す。
【００７１】
培養物は、+/- 100 ng/mlのシクロスポリン(cyc)又は10 ng/mlのタクロリムス(FK)で生育させ、75 uMのH2O2を用いて酸化処理する又は酸化処理しないことについて評価を行った。シクロスポリンは、このシステムにおいて酸化障害を悪化させ、一般的な免疫療法に影響を与える。
【００７２】
1つのこのような阻害剤、タクロリムスは、細胞を、酸化剤である過酸化水素（H2O2）で処理した場合、酸化ストレスの効果に対して保護するようである。このことは、移植の成果及び現在の診療行為にとって、意義深い意味合いを有している。このデータは、カルシニュリン阻害剤が細胞を保護し、アポトーシスを防ぐという最近のデータと一致している(Shirane et al., 2003)。
【００７３】
付記１
老化と移植
ドナー臓器の需要は増え続けており、死体組織の最近の利用をもってしても満たされない。移植された臓器がなぜ機能しなくなるかをより良く理解するにつれて、異種移植1-3及び“近縁の”ドナーの使用のような別の手段によって、長期間にわたって将来性のある解決策が示された。更なるオプションは、幹細胞治療である、この方法は可能性としては有望であるが、まだ初期段階である。
【００７４】
生物体、臓器及び細胞レベルでの加齢のメカニズムによって、病気への感受性及び病気の症状の進展のための重要な教示をもたらしていることは、より明らかになりつつある。これは、特に、後期（慢性）移植拒絶反応に関連する。移植時の酸化損傷によって、移植片において、更なるストレスに対応できなくなるような老化を促進する、一連のイベントが発動する4,5。結果として、移植片は、免疫及び非免疫によってもたらされる損傷を受けやすくなり、病気にかかりやすくなる。このレビューは、最近の老化に対する知見に焦点を当て、どのようにしたら臓器の移植に成功するのに著しく貢献できるかという評価を提供する。
【００７５】
老化
老化は、3つの部分に分けることができる：
・加齢性の変化−誕生以来、本質的には時間は経過している。この老化は、環境の及び代謝の損傷の負担が累積することによってもたらされる、臓器の大きさ、統一性及び機能が衰えることによって特徴付けられる。
・細胞の老化−細胞レベルの加齢を指す。この老化は、成長停止及び複製可能性(replicative potential)の損失によって、特徴付けられる。主に、DNAへの酸化損傷、及び、蛋白質及び脂質の酸化が原因である。
・生理学的な老化−加齢性の変化及び細胞の老化によってもたらされる、生理学的な能力の衰退である。生理学的な老化の程度は、損傷、アポトーシス又は細胞の老化により喪失した細胞の数と場所に、非常に依存しているであろう。
【００７６】
生理学的な老化及び細胞の老化は別個のものであるが、広範囲にわたって重なっていることは注目に値する。
【００７７】
哺乳類においては、細胞の老化は、新生組織形成に対抗する進化のメカニズムと考えられている6。細胞の老化に特有の成長停止は、細胞周期の制御、抗酸化防御、テロメアの安定性、リボソームRNAの統一性の保持、細胞骨格及び細胞外骨格マトリクス形成に携わるものを含む、テロメアの侵食及び特定の老化関連遺伝子（SAGs）の発現によって特徴付けられる（表１）。
【００７８】
テロメアおよびストレスへの応答
テロメアは、真核細胞の染色体の末端で見られる、特殊化された核蛋白質複合体である。哺乳類においては、複合体と結合した、長く伸びた単純なDNAの反復(TTAGGG)n7、並びに、遊離しているDNAをキャップする機能、DNAの損傷を感知してシグナルを伝える機能、及び、DNAの修復を容易にする機能を有する、活動的な一列に並んだ蛋白質を含む。損傷に適切に対応する能力がなかったり、修復する能力がないことによって、加齢が促進する。ワーナー症候群、ブルーム症候群及びハンチントン-ギルフォード症候群のような、早老症は全て、テロメア蛋白質の機能障害である。
【００７９】
テロメアによって、染色体末端の完全な複製を非常に容易に行うことができる8。染色体末端の不完全な複製及びテロメアDNAの損失によって、ヒトの体細胞のテロメアは、分裂加齢の間で短くなる。このことにより、徐々に細胞の死へと合図を送っている分裂時計が供給される。生殖細胞及び幹細胞においては、テロメアーゼ酵素の活性が、この侵食に対抗している。テロメアーゼ活性を欠損したマウスは、徐々に、テロメアDNAを失っていき、早期老化の表現型となる9。テロメアーゼの再導入によって、これらの遺伝子組換え体においてテロメアを長くするだけでなく、早期老化を防ぐこともできる10。ヒトの細胞老化、病気、及び、一般的には高等動物の生理学的な加齢工程は、テロメアが短くなることが原因であると示唆されている。
【００８０】
細胞から生命体へ
細胞老化の観察結果を生命体のレベルに当てはめることは、いつも単純にいくわけではない。細胞が酸化ストレスを受けた場合、ミトコンドリア、テロメア及びリボソームを含む機能的な3つの物質とリンクしながら、一連の統合された応答が続いて起こる（図４を参考）。もしも損傷のレベルが非常に大きい場合、その細胞はアポトーシスを起こすであろう。前記レベルが致死量以下であるならば、修復及び老化のシグナルを送るであろう。このことは、ストレス直後の臓器の生理機能に直接影響を有し、以下の移植の文脈において説明する。核移植（クローニング）の到来によって、in vitroでの観察結果を、生きている生命体での結果と統合することができるようになった。注目に値すべきことに、異なる細胞タイプはどのようにストレスに対応しているか、及び、クローン動物の生理機能にどのような反響を示すかという、いくつかの新規な洞察が得られた。これらのデータは、移植のための実質的な意義を有している。
【００８１】
クローン化した核の細胞タイプが、結果として得られたクローンにおいて、細胞の老化の効果が無効であるかどうかを求めるのに重大であろう。上皮細胞ドナー核から生じたクローンは、繊維芽細胞又は筋肉細胞から生じたものに比べて16-20、短いテロメアを有している14-16。このことは、異なる細胞タイプは、酸化損傷の効果に耐えること及び修復することの両方において異なる能力を有しいているであろうことを示している。言い換えると、このことは、クローン動物の臓器において、生理学的な老化の程度に影響を与えるであろう。
【００８２】
非常に短いテロメアが動物の寿命を調整するならば、このような老化の効果によって、加齢による病気が早期発症するであろう。in vivoにおけるテロメアの侵食の速度は非常に遅く、寿命に影響を与える危機を防ぐのに十分なテロメアDNAを有するので、クローン羊及び牛の観察結果は、分裂寿命だけでは、このような状態を促進するには不十分であることを示唆している。このことは、以下に論ずるように、移植された細胞又は臓器においては正しくないであろう。
【００８３】
慢性移植腎症
慢性移植腎症（CAN）は、腎臓の同種移植片の進行性の機能障害によって特徴付けられる。移植後の最初の10年間において、CANが腎臓の同種移植片の障害の主原因である21。その病因は不明であり、結果として、予防又は治療することが困難であるが、組織学的に、生活加齢に共通した特徴を示す。高いドナーの年齢にも関連性があり、細胞老化が果たす役割を示唆している。このことは、老化細胞及び拒絶反応が生じた腎臓における共通の遺伝子発現プロファイルによっても支持される22。結果として、臓器の移植における促進老化によって、CANで見られる進行性の変化を有することになると考えられる。この仮説によって、多くの重要な疑問点が対処することができる。
【００８４】
なぜ促進老化が腎臓の同種移植片に生じるのか？
虚血及び再灌流障害によって、移植片の機能にとって深い因果関係をもたらす“ダブルパンチ”がもたらされる。同種移植片への虚血/再灌流(ischaemia/reperfusion (I/R))障害及びその後に続く酸化障害の影響は、低く見られてきた。動物の研究によって、迅速に拒絶反応が引き起こされたラット死体同種移植片の組織において、活性酸素種（ROS）が引き起こす脂質過酸化反応のレベルが上昇することが確かめられ23、フリーラジカル遊離の増加が、移植後のレシピエントの血清で見られた24。挿話として、アポトーシス及び炎症は、I/R障害及びフリーラジカルがもたらす障害の結果であると認識されている。
【００８５】
しかしながら、これらの工程が移植片の機能において重要であるならば、我々は、I/R障害の減少及び抗酸化治療に続く改良された移植片の成果を期待するであろう。実際に、ROSのスカベンジャーである、スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）を用いて治療した患者においては、死体腎臓移植後の1及び4年の移植片の生着率が顕著に改善され、初期の急性の拒絶反応が顕著に減少することが報告された26。この結果は、いつも再現性があるとは限らず、SODの投与の方法及びタイミング、投与量、SODの短い半減期、適切な標的の喪失（例えば、ミトコンドリアへの）、及び、SOD自身が過酸化水素の形態をとり、それゆえ、この状況においては最適な抗酸化剤ではないという事実を反映している。より最近になって、焦点は、他の抗酸化剤にシフトした。ヘムオキシゲナーゼ1の誘導によって、組織損傷が防がれるという知見28,29は、非常に興味深く、I/R障害における虚血性の前調整の保護効果の新たな証拠、及びこのセッティングにおける免疫抑制剤の果たす役割が示された。
【００８６】
移植時に最も重要な細胞の巨大分子への酸化障害によって、損傷があまりにも大きい場合に細胞をアポトーシス経路へと導く、又はその代わりに、完全に細胞の老化をもたらす修復経路へと導く細胞障害がもたらされる。結果として、臓器は更に障害を受けやすくなり、慢性的な機能障害の特徴を示すようになる。それゆえ、移植時における老化の役割の明確に理解することは、移植片の機能障害を理解するのに不可欠であり、これにより、新規の治療標的を特定し現存の免疫療法を調整することができる。
【００８７】
どのようにこれらの効果が移植片の中で現れるのか？
虚血障害及び再灌流障害は、膨大なテロメアを不安定化し、SAGの発現を変えるであろう。特異的なテロメア侵食は、アポトーシスにおいて初期の出来事であり、ミトコンドリアでのカスパーゼカスケードの活性に先立って行われる。我々の研究室では、LeidenのLeen Paulのグループと協働して、腎臓の同種移植片の拒絶反応のラットモデルにおいて、わずか45分間の虚血時間で、大量のテロメアが損失することを見出した。重要なことには、この損失は、その後に続く、再灌流後のp21及びp61（老化の古くからある分子マーカー）の発現の上昇と付随しておこる。これらの観察結果は、同種移植片における促進老化の進展と一致する。老化に関連する酸化ストレスの古くからある細胞学マーカーである、老化関連βガラクトシダーゼの発現（SA beta Gal）は、拒絶反応が生じた移植片のみに限定されている。これらのデータは、DNA損傷をシグナル伝達して修復する、テロメア結合蛋白質の発現の変化（表１）と一致する。我々は、ヒトにおいて、CANでのSAG発現の顕著な変化も観察した。
【００８８】
これらの観察結果は、虚血及び再灌流障害のモデルラットから得られたデータを支持し、SA beta Gal陽性染色細胞の量によって求まる、組織老化の程度が、I/R障害後の機能回復と正反対の関係にあることを明らかにする。
【００８９】
慢性移植腎症の重要な一つの特徴は、細胞の老化であり、これは、尿細管上皮に限定されている、SA beta Gal陽性染色細胞の量によって求まる。このことは、移植に関連する酸化ストレスの生理学的な効果にとって、深い暗示を有する。この細胞タイプの酸化障害に対する明白な感受性は、二つの重要な観察結果と一致する。(i)前記したように、上皮細胞からクローン化した動物は、進行性のテロメア侵食を示し、老化に関連する酸化障害を完全には修復できない14-16。(ii)尿酸トランスポーター(URAT1)は、腎臓の尿細管上皮にのみ見られる。尿酸は、ヒト血液における基本的な抗酸化剤である。URAT1の変異は、特発性抗カルシウム性腎症の原因となり、運動誘発急性腎臓機能障害及びROS誘導細管細胞死によって特徴付けられる病気である。このことは、前記仮定と一致する。
【００９０】
影響と治療
生理学的な及び細胞レベルにおいて、老化に取り組むことは、同種の及び異種の細胞、並びに、固形臓器の移植に影響を与える。I/R障害は、ブタ臓器とヒト臓器の間を区別せず、効果は同じである。異種移植片の由来が核移植によって生じた動物であるならば、異種移植においては、これを悪化させるであろう。この場合において、移植後の臓器において、危機的なテロメアの長さにならないためにも、動物の内因性のテロメアの長さが重要である。歳が同じサンプルに比べてテロメアの長さが短い動物から得られた移植片は、いったんI/R障害が生じると、障害が起こることが判明した。同種移植において、より年齢が高いドナーの移植片では、死体からの移植片のように、移植後、あまりよく機能しない。このことは、臨床の観察結果と一致する。
【００９１】
細胞の移植の場合は、より複雑である。というのも、培地で分化した細胞群は、既に、酸化損傷及び促進老化のレベルが上昇しているからである。in vivoで分化させる方法を用いた幹細胞治療は、場合によっては、このことを回避するであろうが、このような移植の分化をin vivoでコントロールすることは、未だ初期の段階である。最近の観察結果でより興味深いのは、テロメア侵食に対応するために、単純にテロメアーゼを用いるだけでは、分化した細胞を移植するには不十分であることである。もしもテロメアーゼ活性が不十分であれば、細胞は老化を回避できるが、不安定なゲノムを保持し続け、結果、異常増殖しやすくなるであろう33。
【００９２】
この分野での治療的介入は、見込みがありそうである。最も単純な方法は、移植前に適切な抗酸化剤を投与してI/R障害に対抗することである。テロメア-核蛋白質複合体との関係を考えると、ミトコンドリアを抗酸化剤の標的とすることが有用であることが判明するであろう。抗アポトーシス剤も、この場合、重要であることが判明するであろう。尿細管上皮を標的として、酸化ストレスを減じ、DNA修復能力を高めることを助けることができる、又は、移植後の重要な損傷の場所を処理することができる、遺伝子治療も適切であろう。
【００９３】
どのように老化が移植に関連しているかを理解することのもう一つの最後の利点は、観察者の先入観無しに、移植片の予後診断及び病気の進展のための標準を供することである。
【００９４】
[参考文献２]
2005514960.tif 000005
2005514960.tif 000006
2005514960.tif 000007
【００９５】
【表１】
2005514960.tif 000008
【００９６】
付記２
テロメア及び移植の影響
核移植(nuclear transfer(NT))によって生じた羊において、不正確なゲノム・リプログラミングを示したという初期の観察結果（Shiels et al., 1999a, b）は、牛及びマウスでの観察結果と矛盾していた。しかしながら、これらのデータから、加齢性の変化、細胞の老化、最終的には生理学的な老化をもとめることは、容易なことではない。
【００９７】
一つの複雑にしている要素は、NTによって生じた哺乳類の大部分は、エピジェネティックの影響に関連したインプリンティングエラー及びアブノーマルな遺伝子の発現を示すことにより、妊娠中又は妊娠時に死亡することである(Humpherys et al., 2002)。これは、健康に関して、クローニングに長時間影響を与え、“最も損傷が少ないものが生存”として、生き残ったクローンを記載していることを支持している。これは、ヒトの生殖クローニングへの異端的な試みに明らかに影響を与える。これらのデータの付属として、セルトリ細胞由来の、NTによって生じたマウスは短い寿命を示す(Ogonuki et al., 2002)一方で、卵丘細胞由来のマウスは大きな体サイズになり、肥満症を示す(Tamashiro et al., 2002)ことが報告された。重要なことに、この遺伝子の調節不全は、不正確な核のプログラミングを原因としており、in vitroでの培養が原因ではない(Miyashita et al., 2002)。しかしながら、細胞移植を行うための治療用のクローニングは、比較的それほど影響を受けないべきであるが、そうである程度は、種及び細胞のタイプに依存するであろう。
【００９８】
NTによって生じた牛のテロメアに関する最近のデータによって、ドナー核の細胞のタイプは、実際に重要な要素であろうことが示された(Miayshita et al., 2002)。
【００９９】
NTによって生じた動物のテロメア
二匹の動物、羊の乳腺上皮細胞から生じた6LL3(Dolly)及び羊の胚細胞から生じた6LL6における、短い平均テロメア制限酵素断片長(mean telimere restriction fragment (mTRF) length)の最初の報告によって、完全な遺伝子的な核のリプログラミングが全ての場合で達成されていなかったことが示された。注目すべきことに、三番目の羊である、繊維芽細胞の核から生じた6LL7は、通常のmTRF長を有していた(Shiels et al., 1999a,b)。このことは、歳を合わせたコントロールと比較して、NTによって生じた牛においては短いmTRFを示すという、Miyashita et al.の最近の観察結果(2002)までは、ユニークであった。
【０１００】
核移植によって生じた牛の以前の観察結果によって、テロメアに基づく核時計のリセットが達成されるが、必ずしも正確とは限らないことが示された。NTによって胎児の繊維芽細胞から生じた子牛は、年齢を合わせたコントロールよりも長いテロメアを、又は同じ長さのテロメアを有していた(Lanza et al., 2000; Tian et al., 2000; Kubota et al., 2000; Betts et al., 2001)。通常のテロメアの長さは、マウスでも報告されている(Wakayama et al., 2000)。このように異なる理由は不明であり、よく似た老化細胞を用いてクローン牛を得ることに成功していることから、培地中でドナー細胞が過ごす時間に関連しているわけではない(Lanza et al., 2000)。
【０１０１】
最近の観察結果によって、異なる細胞タイプから生じた牛においてテロメアの長さが顕著な差異を示した(Miyashita et al., 2002)。この実験で注目すべきことは、上皮細胞から生じた動物は、年齢を合わせたコントロールよりも短いmRFT長を示すが、反対に、繊維芽細胞ドナーの場合は伸張したテロメアを有する動物が得られたことである。これらのデータは、限定的なものであるが、興味深い。これは、上皮細胞源から生じたDollyにおける、年齢を合わせたコントロールと比較して短いmRFT長を有しているというオリジナルの観察結果と一致する。Dollyは、この点において、もはや例外ではないように思われる。注目すべきことに、羊の繊維芽細胞クローン6LL7は、Miyashita et al.の観察結果と一致して、通常のmTRF長を有していた。
【０１０２】
これらの観察結果を説明する多くの可能性が存在する。羊、牛及びマウスのデータ間の差を説明する一つのオリジナルの仮説として、単純に種の差異があった。これは、現在のところ、ありそうにないように思われる。よりありそうなこととしては、NT工程によってテロメアの伸張が導かれ、ドナー細胞特異的な差異がこの伸張に影響を与えていることが挙げられる。
【０１０３】
どのようにしてNTがテロメアの伸張に影響を及ぼしているのか？
NTに付いてまわる、発生におけるリプログラミングによって、ドナー細胞が培養している間にTERTコード配列が不利に変異が生じない限り、又は、その後に続くテロメアーゼ活性が、NT後に制限されない限り、生き残ったクローンにおいてテロメアーゼを再活性化し、任意の体細胞のテロメアの伸張を修復する。不適切なテロメアーゼ活性を用いることよって、最初の羊の繊維芽細胞培養物について老化を回避させることが示された。テロメアの短縮化及びその結果として生じるゲノムの不安定さが、これらの細胞において未だに失われずに残っているという事実によって、この状況は複雑である(Cui et al., 2002)。このことは、以下に示すように、移植治療のベースとなる細胞に多大な影響を与えている。
【０１０４】
なぜ、外見上の細胞のタイプが、テロメアの長さに差異をもたらすのであろうか？差異の一つのポイントは、レシピエントの卵母細胞からの核摘出にある。重要な細胞質コンポーネントの差異のある除去は、逆に、結果として得られるクローンにおいて、テロメア核蛋白質複合体の再構築に影響を与えるかもしれない。不十分な蛋白質、又は、母方から受け継いだ卵細胞質中の伝達物によって、不正確な又はより不安定なテロメア複合体がもたらされ、それゆえ、発生したクローンの減少率が容易に増すことになるかもしれない。このことは、動物の生理機能に影響を与える。
【０１０５】
ドナー核中でのテロメア核蛋白質の分布によって、この状況は悪化し、観察された細胞タイプにおけるmTFR長の差異がもたらされる。このような仮説についての先例がある。重要なテロメア結合蛋白質であり、有用なテロメアーゼアンタゴニストである、TFR1は、細胞のタイプによって、異なって分布している(Steensel and de Lange, 1997; Broccoli et al., 1997)。異なって発現しているテロメア結合蛋白質の他の例としては、TNKS 1、TNKS 2、TERF 1及びTERF2が含まれる（それぞれの発現パターンの詳細は、http://bioinformatics.weizmann.ac.il/cardsにて見ることができる）。細胞周期における、このような遺伝子の発現の違いが、テロメア結合蛋白質の利用可能性に影響を与えることも、もっともらしいことである。
【０１０６】
もう一つの考察としては、テロメア修復メカニズムの特性及び程度がある。テロメアーゼがNTによって生じた動物のテロメアの長さをリセットすることのみ担当しているのか、又は、それに替わるテロメア維持メカニズム(alternative telomere lengthening (ALT) mechanism)が分担しているのかどうかは不明である。通常、この二つのメカニズムは、相互に相容れず、修復を完成させるのはテロメアーゼである(Henson et al., 2002)。老化細胞の核から生じたものを含む、繊維芽細胞クローンで観察されたテロメア伸張の原因は、テロメア核蛋白質複合体における重要な蛋白質コンポーネントの不十分な利用可能性の結果として、染色体末端へのテロメアのアクセスが増すことかもしれない。不正確なリプログラミングによって活性化されるかもしれない、任意のそれに替わるテロメア維持（ALT）は、正式には、まだ実験によって評価されておらず、推測をまねきやすい。テロメアーゼと協調して機能して、リコンビノジェニックなメカニズム(recombinogenic mechanism)が、テロメアの伸張を産生していると予想される。これによって、このような動物において、染色体の不安定さをも増しているかもしれない。
【０１０７】
より適正な考察は、発生の間のテロメアーゼ活性の程度及びタイミングであろう。これは、いくつかのNTによって生じた動物の間での、観察された種による差異の一因となっているのかもしれない。例えば、羊の胚細胞から生じた羊クローン6LL6は、テロメアの短縮を示した。反対に、牛の胚細胞から生じたクローンは、テロメアの伸張を示した(Shiels et al., 1999a,b; Miyashita et al., 2002)。NTは、以前に、牛胚に特異的に、テロメアーゼ活性を上昇調整すると報告されており、このことは、報告されている、牛胚細胞から生じたクローンにおけるテロメア伸張と一致している。羊における、発生上のテロメアーゼ活性の程度及びタイミングは、不明である。
【０１０８】
テロメア動態の生理学的な影響
複雑であいまいなリプログラミングのエラーであるならば、生き残ったクローンにおいて観察されたテロメア動態の生理学的な影響を評価することは、容易なことでない。更なる考察は、種についてである。例えば、マウステロメアは、テロメアーゼポジティブな体細胞において機能し、他の哺乳類のテロメアに機能的に類似するが、それらの核蛋白質テロメア複合体の正確な構成体は、結果として、同一ではないであろう。マウスのテロメアが、実質的にヒトより長いという事実によって、限界のテロメアの長さは、動物の一生においては達せられないので、テロメア侵食の生理学的な影響はあまりシビアではないことを示唆する。同じように、Dolly及び牛上皮細胞から生じた動物で観察された、相対的なテロメアの短縮は、動物の寿命における真に迫った物理的な影響をもたらさないであろう。なぜならば、限界のテロメアの長さは達せられないであろうからである。このことは、in vitroで求めた、牛細胞の限界のテロメアの長さ、及び、同じ細胞ラインから生じたクローンの生き残りの限界のテロメア長さの比較によって支持される(Miyashita et al., 2002)。
【０１０９】
治療用の移植に置き換えた場合、この事情はそのままではないかもしれない。核移植は、同種及び異種移植の両方のための細胞及び臓器の準備を容易にする点において、大いなる期待を与える。しかしながら、移植は、細胞レベル及び生理学的なレベルの両方で、移植片を早期に老化させるストレスを誘導する。
【０１１０】
これは、核移植によって生じたブタ由来の異種移植片を含む、固形臓器の移植と関連性を有する。移植は、虚血及び再灌流によって引き起こされる酸化損傷の結果として、組織片におけるアポトーシス及び促進老化の両方を含む。これは、移植片において、虚血時に好気的な代謝から嫌気的な代謝へスイッチすること、及び、再灌流時に好気的な代謝に戻ることによって起こる。結果として、アポトーシス又は早期老化のどちらかで喪失した、細胞の数及び部位に依存して、臓器の生理学的な能力は影響を受けるであろう。臓器が更なるストレス（例えば、免疫損傷）を受けた場合、拒絶反応の病状にかかりやすくなるのに十分であろう。このような状況の先例は、同種移植で見ることができる。ヒトの腎臓同種移植片の早期老化は、以前に、慢性的な拒絶反応にかかりやすくなる提案されており(Halloran and Melk 2001; Shiels et al., 2002)、一方で、慢性的な腎臓の拒絶反応を示すモデルラットでは、慢性的な拒絶反応と特異的に関連して、膨大なテロメア侵食及び促進老化が観察された(Joosten et al., 2002)。重要なことに、後者の例においては、老化に関連した変化は、ものに尿細管上皮で見られるようである。これは、腎臓の上皮細胞が、周囲の細胞と比較してストレスが多い環境にいるということ、又は、損傷にあまり耐えることができないことを反映している。上皮細胞のような、ターンオーバー速度が速い細胞は、損傷対応メカニズムとして、他のタイプよりも容易に解離するテロメア核蛋白質複合体を有していることが、直感的に感じられる。これを文脈に当てはめるために、尿細管上皮を著しい流体ストレス下におくと、コンポーネント細胞で老化の相対的速度が悪化し、このため、総じて臓器に生理学的な老化がもたらされた。これは、血行動態ストレスが上昇した状況で内皮細胞の観察結果に一致する。これらの細胞は、管の分岐点及びアテローム硬化型の病変部で、テロメア侵食が促進していた(Minamino et al., 2002)。牛又は羊の内皮細胞クローンもテロメア短縮を示しているかどうかを求めることは、興味深いであろう。
【０１１１】
最近、前記のラット腎臓移植の観察結果と一致する、大量で特異的なテロメア侵食が、DNA損傷によって誘導されるアポトーシスの早期マーカーとして報告された(Ramirez et al., 2002)。このテロメアDNAの喪失は、アポトーシスの初期に起こり、ミトコンドリアの膜電位の崩壊及び活性酸素種の産生と同時に起こる。
【０１１２】
促進老化もまた、細胞移植に影響を与える。in vitroで分化させて増殖させた任意の細胞群は、この細胞がテロメアーゼポジティブでない限り、老化促進しやすくなる。テロメア侵食の速度における、in vitroでの酸化ストレスの効果が、提供されている(Shiels 1999c; Gorbunova et al., 2002)。固形臓器移植については、このようなテロメア侵食は、移植後において生理学的な重要性を有しているであろう。このことは、幹細胞療法にも影響を与えるであろうし、in vitroで幹細胞を分化及び増殖させるよりも、in vivoで分化させた方が好もしいことを示唆する。このような移植の結果生じる異常増殖のリスクを、依然として、in vivoで求めていかなければならない。
【０１１３】
結論：上皮細胞クローン
核移植によって生じた、上皮細胞由来の（短いテロメアを示す）牛が得られたことは、Dollyが例外でもなく“まぐれ”でもないことがわかる。これら全ての動物において短いテロメアを有していることの生理学的な因果関係は、この状況が、NTの結果として、不可解なリプログラミングのエラーによって複雑にされていない限り、動物の生存期間に影響を与えないようである。これらの観察結果は、NTによって生じた動物、異種移植、又は同種移植に影響を与えるであろう。このような場合、移植は、細胞の老化及び生理学的な老化の促進をもたらし、結果として移植後に病気にかかりやすくなる。
【０１１４】
[参考文献３]
2005514960.tif 000009
2005514960.tif 000010
2005514960.tif 000011
【０１１５】
付記３
細胞老化、臓器老化及び移植
近縁ドナーの使用、及び、異種移植及び幹細胞療法のような、前途有望な代替治療法が継続して開発されているにもかかわらず、ドナー細胞及び臓器移植の需要が、供給を凌駕し続けている。
【０１１６】
しかしながら、移植の成功への重要な教示が、病気にかかりやすい分子プロセス及び病気の状態の進展についてのより良い理解によって、見出すことができた。この関係においては、老化のメカニズムを理解することが特に有益であろう。これは、特に、後期（慢性）移植拒絶反応、及び、より歳をとった近縁ドナーの使用に関連している。移植時の酸化損傷によって、一連の出来事が開始され(1-3)、その結果、移植片において促進老化がもたらされ、更なるストレスに対応できにくくなるということが提案された。結果として、この移植片は、免疫による損傷及び皮免疫的な損傷の被害を受けやすくなり、病気にかかりやすい。このミニレビューは、老化に関する現在の研究を、そして、その研究をどのようにして移植細胞及び臓器の成功にかかわりを持たせるかについて理解するうえでの手掛かりとなることを意図したものである。
【０１１７】
老化の効果は、全組織のレベルから、臓器レベル及び細胞レベルにわたる、三つの考え方から見なければならない。これらは、大まかに以下のように要約することができる；
・加齢性の変化−誕生以来、時間の経過とともに環境の及び代謝の損傷の、累積した負担。この表現型は、臓器機能の衰えとともに、臓器の大きさ及び統一性が喪失することによって特徴付けられる。
・細胞の老化−細胞レベルの加齢を指す。主に、DNAへの酸化損傷、及び、蛋白質及び脂質の酸化を原因として、成長停止及び複製可能性(replicative potential)の損失によって、特徴付けられる。
・生理学的な老化−臓器レベルでの、生理学的な能力の衰退である。これは、細胞の老化とはっきりと識別できるが、広範囲にわたって重複している。生理学的な老化の程度は、細胞の老化によって影響をうけ、損傷、アポトーシスによって喪失した細胞の数と場所に、非常に依存しているであろう。
【０１１８】
分子レベルでの老化
老化は、異常増殖に対応するために進化で獲得したメカニズムであると考えられている(4)。細胞レベルでは、成長停止テロメア侵食及び特異的な老化関連遺伝子(SAGs)の発現によって特徴付けられる。これらの遺伝子の発現によって、細胞内で、エネルギー産生、エネルギー利用及び細胞周期のコントロールとリンクした、酸化ストレスへの統合的な対応を形成する（図５を参照）。結果として、ミトコンドリア、リボソームの産生及びテロメア核蛋白質複合体との機能的な連携が必要となる(4,5)。
【０１１９】
テロメア
テロメアは、真核生物の染色体末端に見られる特殊な核蛋白質複合体である。哺乳類では、単純なDNA反復配列(TTAGGG)nに結合した蛋白質の活動的な複合体を含む(6)。テロメアは、損傷によるDNA切断と見分けながら、遊離しているDNAをキャップする機能を有し、染色体末端の完全な複製を保障している。体細胞におけるヒト染色体のテロメアDNAコンポーネントは、加齢とともに短くなる(7)。これは、染色体末端の不完全な複製及び／又はヌクレアーゼ活性によるテロメアDNAの損失の結果である(8)。しかしながら、生殖細胞及び幹細胞においては、テロメアーゼ酵素の活性が、この侵食に対抗している。体細胞においては、テロメア侵食は衰えずに続き、徐々に細胞の死へとシグナルを送る分裂時計を与えると考えられている。テロメア短縮は、ヒトの病気の原因と考えられており、一般的な推測によって、高等動物における生理学的な加齢プロセスの原因と考えられている(7, 9, 10)。
【０１２０】
この理由は、テロメア蛋白質が損傷を感知し、シグナルを送るシステムの一部を形成しているという事実に端を発する。これにより、損傷のレベルに依存して、DNA修復又はアポトーシスが容易になる。適切に損傷に対応できない、又は修復できないことは、老化の促進につながる。ワーナー症候群、ブルーム症候群及びハンチントン-ギルフォード症候群のような、早老症は全て、テロメア蛋白質の機能障害である。マウスにおいて、テロメアーゼコード配列をノックアウトすることによって、連続的なテロメアの損失及び早老症がもたらされた(11)。テロメアーゼの再産生によって、これらの効果は逆転した(12)。
【０１２１】
臓器レベルでの老化
細胞老化の観察結果を臓器レベルに当てはめることは、単純にいくわけではないが、どのようにして老化が移植の成功に影響を与えうるかを理解することは重要である。この事情は、臓器内の老化細胞の数及び、特に臓器の機能のために、その細胞の部位を要因の一つとして入れる必要性によって、複雑である。損傷によって、又は、加齢性の変化に伴う大きさの喪失の結果として、喪失した細胞の数及び部位に注意を向ける、類似の必要性によって、更に複雑である（図５）。
【０１２２】
核移植（NTクローニング）の発展によって、細胞老化のin vitroでの観察結果ｊと生物体での生理機能での観察結果が統合されることになった。最近、どのようにして、特定の細胞タイプの老化が、病気にかかりやすくするのに重要であるか、及び、どのようにして、このことがNTによって生じた動物の生理機能に反映しているかということを理解するうえでの有力な手掛かりになっている。これらのデータは、実質的に移植に影響を与えている。
【０１２３】
上皮細胞ドナー核由来のNTによって生じた動物は、短いテロメアを有しているようであり(13-15)、これは、繊維芽細胞又は筋細胞由来のものとは対照的である(15-19)。このことは、異なる細胞タイプは、酸化損傷の効果の耐性及び修復に対して異なる能力を有していることを示唆する。逆に、このことは、クローン動物の臓器における、生理学的な老化の程度に影響を与えるであろう。
【０１２４】
もしも非常に短いテロメアが動物の生存期間に影響を及ぼすならば、このような老化の効果は、老化の病気が早期に発症するであろう。クローン羊及び牛での観察結果は、分裂寿命だけでは、このような状態を促進するには不十分であることを示唆している。というのも、in vivoにおけるテロメアの侵食の速度は非常に遅く、寿命に影響を与える危機を防ぐのに十分なテロメアDNAを有しているからである。これらの動物は、どの点から見ても、生理学的にノーマルであるが、以下に論ずるように、このような動物から生じた、異種移植された細胞又は臓器においては正しくないであろう。
【０１２５】
老化及び慢性移植腎症
老化腎臓における以前の観察結果は、後期機能障害を示す同種移植片と一致する多くの特徴を共用していることを示唆している(1,2)。後期移植片機能障害（例えば、慢性移植腎症（CAN））は、移植後の最初の10年間において、移植片を喪失する主原因である。その病因は不明であるが、免疫及び非免疫要因の両方を含んでいると考えられている。間質の繊維化、小動脈の内膜肥厚及び尿細管萎縮によって特徴付けられる。これらの特徴は、ヒトの腎臓において生活年齢が増した場合でも明らかに有している。複数の観察結果が、分子及び細胞レベルの両方において、同種移植片の機能障害が、老化の特徴を示しているとう仮説を支持している(1,20)。これらは、以下を含む；
・慢性移植腎症(CAN)とドナーの歳が高いこととの関連性
・近縁のドナーでの芳しくない移植結果
・臓器の回収に先立つ虚血障害
・老化関連細胞外マトリクス蛋白質の発現を含む、CANの組織学的特徴と老化腎臓との類似性
・テロメア侵食の促進とともに生じる、移植機能障害モデルラットにおける、既知の老化マーカーである老化関連ベータガラクトシダーゼ、p16及びp21の発現の増加(PG Shiels and LC Paul pers.obs.)
【０１２６】
年輩の又は近縁のドナーの臓器に関連する、移植の芳しくない観察結果は、老化の関与と一致している。
【０１２７】
老化している細胞は、外部の増殖因子に応答しないが、代謝的には活性である。結果として、減少した組織統合性、及び、老化に関連した、炎症誘発性のサイトカイン遺伝子発現の上昇により永続的な炎症の一因となっている(22)。
【０１２８】
生活年齢からくる大きさの喪失によって悪化する、機能するネフロンの数及びストレスに耐える能力の減少は、腎臓の老化表現型の固有の特徴である(1,20)。このような臓器は、適切に機能するが、単純に、既に実質的な生理学上の老化を示し、これに相応するように、ストレスに耐えて損傷を修復する能力が減少しているために、移植に関連したストレスの効果に反応しやすいであろう。
【０１２９】
より歳がいったレシピエントへの移植の結果もまた、生活年齢が増すとともにストレス対応が低下することによって、否定的な影響を受ける。
【０１３０】
移植関連ストレス
移植時のストレスは、虚血及び再灌流(I/R)障害を中心とする。この因果関係は深く、その効果はもしかすると過小評価されているかもしれない。I/Rに関連した酸化ストレスは、二つのレベルで起こる。一つ目は、虚血時における好気的な代謝から嫌気的な代謝へのスイッチであり、二つ目は、再灌流時に好気的な代謝に戻るスイッチである。
【０１３１】
I/R障害によるフリーラジカルの産生は、以前に、アポトーシス及び炎症を誘導すると報告されている。これらは、移植レシピエントの血清において、移植後、容易に検出することができる(23)。ラジカルの産生の直接的な結果として、DNA、脂質及び蛋白質へのフリーラジカルによる損傷がもたらされ、これにより、移植片の生理機能が影響をうける。重大なことに、細胞障害のレベルに依存して、もしも損傷が致死量以下であるならば、細胞老化が結果として起こり、もしも損傷があまりにも大きいならば、アポトーシスが結果として起こる。喪失又は損傷を受けた細胞の数及び部位が、その後の臓器の機能にとって重要であろうことを示唆することは、合理的である。結果として、更なる損傷（例えば、免疫損傷）により、移植片が更なる損傷を受けやすくなり、CANのような病気にかかりやすくなるであろう。
【０１３２】
これに対応して、抗酸化剤治療が、I/R障害を減じ、移植片の結果を改良することを証明するために用いられている(25)。スーパーオキシドジスムターゼ(superoxide dismutase (SOD))を用いれば、死体腎臓移植後の、1及び4年の移植片の生着率及び初期の急性の拒絶反応が顕著に改善されることが報告された。SODは、本質的に、悪名高い酸化剤である、過酸化水素を産生する。更には、SODの投与方法、投与量及び細胞内の標的の差異は、曖昧な結果が得られる原因となりうる。その代わり、カタラーゼ又はヘムオキシゲナーゼI等は、この場合に用いるより適切な抗酸化剤であろう。
【０１３３】
実験結果
多数の証拠が、I/R障害がアポトーシスを導いているとことを示唆している。慢性的な腎臓の同種移植片拒絶反応のモデルラットにおいて、アポトーシス及びこれによる生理学的な老化の促進とともに、移植片における大量のテロメアの不安定化及びSAGsの発現の変化が、たった４５分間の虚血で観察された(PG Shiels and LC Paul per obs)。特異的なテロメア侵食は、アポトーシスの初期の出来事であり、ミトコンドリアでのカスパーゼカスケードの活性化に先立つものである(5)。重要なことに、細胞老化の古典的な分子マーカーp21及びp16について、これらの移植片において、再灌流後に、発現の上昇が見られた。これらのデータは、DNA損傷のシグナル伝達及び修復にリンクしている、テロメア結合蛋白質の発現の変化と一致している。しかしながら、老化に関連した酸化ストレスの古典的な細胞マーカーである、老化に関連したベータガラクトシダーゼ(SA beta Gal)の発現は、拒絶反応が生じた移植片の尿細管上皮に制限されている。このことは、移植に関連したストレス及び病気のかかりやすさに、多大な生理学的な影響を与えている。これらの観察結果は、I/R障害のモデルラットから得られたデータと一致している(27)。SA beta Gal染色の量から求めたところ、このモデルにおける、I/R障害後の機能の回復は、細胞の老化の程度と逆の関係にあった。
【０１３４】
尿細管上皮細胞のストレスに対する感受性が明白に増していることは、二つの異なる観察結果と一致している。第一に、上皮細胞からクローン化された動物は、進行性のテロメア侵食を示し、老化に関連した酸化障害を完全には修復できないようである(13-15)。第二に、尿酸トランスポーター(URAT1)が、腎臓の尿細管上皮にのみ見られる(28)。尿酸は、ヒトの血液内の基本的な抗酸化剤である。URAT1の変異は、特発性高カルシウム血症（運動によって誘導される急性の腎臓障害、及び、活性酸素種によって誘導される尿細管細胞の死によって特徴付けられる症状）に関連しており、このことは、前記仮説と一致する。上皮細胞の老化は、それゆえ、腎臓の機能に不均衡な効果を与える。
【０１３５】
移植片の老化が促進することは、同種移植及び異種移植の両方にとって問題である；I/R障害は両方に共通であろう。異種移植における問題は、核移植によって、更に複雑化するであろう。この場合、短い長さのテロメアを有する動物由来の移植片は、いったんI/R障害になると、かかりやすくなることが判明するであろう(3)。同種移植においては、より歳がいったドナーに由来する移植片は、死体由来のものと同様に、移植後あまりよく機能しないことが示されるであろう。この場合も先と同様に、臨床の観察結果と一致する。
【０１３６】
細胞移植は他の複雑な問題を有している。培養中の体細胞は、一般的に、テロメア侵食を含めた、促進老化を示す(4)。in vivoによる分化方法を用いた幹細胞療法は、可能性としてこのことを避けることができるが、in vivoによる幹細胞移植の分化を制御することが、技術的な課題として残っている。
【０１３７】
幹細胞はテロメアーゼ活性を示し、培養中に、テロメア侵食及び成長停止で定義されるような一般的な老化を示さない。この記載では、幹細胞は培養中にフリーラジカル損傷の影響をうけ、移植後に、可能性として腫瘍成形が導かれることが明らかになるという事実が隠されている。重要なことに、幹細胞は、ex vivo p53に依存した非対称な細胞の動態を示し、エンドポイントとして老化を有する。非対称な生育動態は、それゆえ、成体幹細胞群の増殖の困難性のいくつかを説明でき、これらの細胞においてテロメアーゼ活性が減少していることに関連しているかもしれない。幹細胞における任意のミトコンドリア損傷の寄与は、このような状況下で、完全に評価しなければいけない。
【０１３８】
しかしながら、造血幹細胞の移植が、この方法の可能性を例示する。もしも必要な細胞の増殖があまりうまくいかず、内因性のテロメアーゼ活性が十分であるならば、明白なテロメアの長さのホメオタシスは移植後に達せられる。もしそうでないならば、老化が結果として起こるであろう(30)。この有用な結果は、免疫感応性における制限である。
【０１３９】
この問題の付属のものとしては、細胞老化に対抗するテロメアーゼ発現コンストラクを有する、完全に分化した細胞のタイプの移植がある。これは、問題があるであろう。最近のデータによると、このような細胞は老化を回避するが、不適当なテロメアーゼ活性のために、不安定なゲノムを保持し、腫瘍が形成されやすい(31)。テロメアーゼ活性のレベルを制御することは、更なる細胞移植の重要な側面である。
【０１４０】
抗酸化剤を用いてI/R障害を軽減する移植療法は、十分に有用なことが判明するであろう。テロメア-核蛋白質複合体との関係を考えると、ミトコンドリアを抗酸化剤の標的とすることが有用であることが判明するであろう。抗アポトーシス剤も、この場合、重要であることが判明するであろう。そして、免疫抑制剤のための新たな治療手段を開拓するであろう。カルシニュリン阻害剤が、この能力におけるいくつかの効果を有していることが既に試されており(32)、その投与のタイミングが重要であろう。小分子のアナログを使用のために考慮することができる。
【０１４１】
更なる手段は、遺伝子治療である；可能性としては、移植関連ストレスを減少させること、又は、移植後の損傷を受けた病巣領域に対処することに役立たせるために、尿細管上皮を標的とする。
【０１４２】
[参考文献４]
2005514960.tif 000012
2005514960.tif 000013
2005514960.tif 000014
2005514960.tif 000015
2005514960.tif 000016
【０１４３】
【表２】
2005514960.tif 000017
【０１４４】
付記４  Joosten et al., Am J Path 2003-in press
慢性的な腎臓の同種移植片の拒絶反応モデルにおけるテロメア短縮及び細胞の老化
【０１４５】
Simone A. Joosten#, Vanessa van Ham, Claire E. Nolan1, Maria C. Borrias, Alan G. Jardine1, Paul G. Shiels1, Cees Van Kooten and Leendert C. Paul.
【０１４６】
Department of Nephrology, Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands and 1Department of Surgery, University of Glasgow, Glasgow, Nuited Kingdom
【０１４７】
#Adress correspondence to:
Simone A. Joosten, Msc
Department of Nephrology, C3P
Leiden University Medical Center
Albinusdreef 2
2333 ZA Leiden, The Netherlands
Phone: +31 71 5263964
Fax: +31 71 5248118
S.A. Joosten@LUMC.nl
【０１４８】
number of page: 24 text pages and 8 pages with figures
Abbreviated title: Cellular senescence in renal transplantation
【０１４９】
この仕事は、Dutch Kidney Foudation (grant C98.1783)からの補助金によってサポートされ、CNは、British Transplantation training fellowshipを受け取っており、PS及びAJは、Darlinda’s Charitable trustによってサポートされている。
【０１５０】
要約
細胞の老化は、腎臓の移植片の機能の悪化に重要な役割を果たしていることが示唆されており、テロメア短縮とも関連している。我々は、F344からLEW（慢性的な腎臓の移植拒絶反応のモデルラット）への移植において、細胞の老化のマーカーを調べた。同系移植及びLEWからF344への移植を、コントロールとして用いた。実質的なテロメアの短縮化は、移植後7日間で、同種異系の及び同系の移植片を含む、全ての移植で観察された。ネイティブなF344腎臓の虚血によって、テロメアの短縮が十分に誘導された。テロメアを短くなることによって、p21及びp16のような細胞周期制御因子が活性化されることが知られている。従って、全ての場合で、最高が7日となる、一時的なp21の増加を示し、p16の発現を保持した。重要なことに、老化のための細胞マーカーである、老化に関連するβ-ガラクトシダーゼ染色が、移植後30日から、慢性的な拒絶反応を示すF344同種移植片の尿細管上皮細胞において観察された。長期間生き残ったLEW同種移植片又は同系のF344移植片は、老化に関連するβ-ガラクトシダーゼにネガティブであった。結論として、移植の間における虚血によって、テロメア短縮及びその後に続くp21及びp16の活性化が生じるが、老化に関連するβ-ガラクトシダーゼ染色は、唯一、慢性的な拒絶反応が起こった腎臓移植片にしか存在しない。
【０１５１】
はじめに
慢性的な同種移植片の拒絶反応(CR)は、腎臓移植の失敗の最も重要な原因である。その病因として、様々な免疫的な及び非免疫的な要因が関与している1。慢性的な拒絶反応及び移植腎症で観察された病変は、歳をとった腎臓で観察された変化2と重なっており、腎臓細胞の老化が移植片の機能の決定の一因になっていることが示唆されている3。in vivoで、体細胞は、ヘイフリック限界と名づけられた、複製能力の限界を有している4。この限界は、染色体末端のテロメア配列の喪失に帰する。連続した複製におけるテロメア反復配列(TTAGGG)の喪失によって、徐々に、テロメアの機能が損なわれ、染色体が不安定になり、遺伝情報が失われることとなる。細胞が、自信の最大の複製可能なところまで到達すると、増殖をやめ、老化の状態になるのであろう。老化細胞は、取り返しがつかないまでに、細胞周期のG1期で止まってしまう。老化状態にある細胞は、様々な外部の刺激に応答しないが、代謝的には活性であり、組織の統一性が損なわれ、永続的な炎症の一因となる5。in vivoでの細胞老化は、細胞の異常増殖を示す形質転換を防ぐためのメカニズムとして機能していると提案された。更に、細胞の寿命を延ばす、恒常性維持メカニズムとして機能していると考えられている6,7。 
【０１５２】
老化細胞は、短いテロメア、特異的な腫瘍抑制遺伝子発現の増加、老化に関連したβ-ガラクトシダーゼ(SA β-gal)活性の上昇を含む、いくつかの特徴を示す8,9。加えて、細胞の形の変形、マトリクスメタロプロテイナーゼの変形及び細胞骨格コラーゲンの発現が記載されている10,11。培養中の体細胞の老化に関連したテロメア侵食は、生理学的な能力の衰え、大きさの喪失及びストレスに対する抵抗性の衰えを含む、生活加齢の特徴に当てはめることができる。歳を経た腎臓における比較的短いテロメアによって、移植後に損傷した移植片になりやすい2,12。この点における、一つの重要な観察結果は、より歳をとったドナー由来の腎臓は、移植片の生着がより悪くなることである13。
【０１５３】
テロメア侵食が増殖の可能性を制限している分子メカニズムは、解明されておらず、曖昧な仮説が提案されている。一つの仮説は、限界まで短くなったテロメアは、十分な量のテロメア蛋白質を補充して、有効な核蛋白質キャップを形成することができず、結果として、フリーの損傷したDNA末端が露出しているというものである。その代わりに、テロメア反復配列の長さが短くなり、又は、基質部位の喪失によって遊離のテロメア蛋白質の利用可能性が増して、老化に必要なシグナルが伝達される14。
【０１５４】
細胞が老化状態になると、細胞をG1細胞周期にとどめることを含む、付随するp21及びp16の発現の変化が生じる。これらは、DNA損傷(例えば、p53の活性化)への対応において誘導され、その後に、サイクリン依存キナーゼ（CDK）インヒビターファミリーのメンバー活性化する15。p53の活性化によって、CDK4のインヒビター（p16INK4を含む、INK4ファミリー）、並びに、サイクリンE及びA依存キナーゼのインヒビター（Cip/Kipファミリー、p21Cip1,Waf1, Sdi1）を活性化する16。INK4及びKipファミリーのメンバーの活性化によって、網膜芽細胞種蛋白質を介して細胞周期をG1期で阻害する。p21の発現が増すことは、老化の誘導を含むが、p16は老化細胞内に蓄積され、老化の維持に従事する16-18。老化細胞に特異的であると考えられているマーカーは、pH6.0で活性化される、リソソームの老化関連β-ガラクトシダーゼ(SA β-gal)の蓄積である8,9。in vitroでの観察結果によって、細胞が老化するにつれて、SA β galが蓄積することが示されたが、in vivoでの観察結果では、このことが制限されていることが支持された19,20。
【０１５５】
本研究では、我々は、老化マーカーが腎臓の同種移植片にどの程度存在しているかを調べるために、ヒトの慢性移植拒絶反応のモデルラットを用いた。F344腎臓をLEWレシピエントへ移植することによって、軽い急性の拒絶反応の症状が見られた後、慢性的な拒絶反応が生じた21。LEW腎臓をF344レシピエントへ移植することによっても、急性の拒絶反応が生じたが、慢性の拒絶反応は起こらなかった。このモデルにおいて、我々は、F344からLEWへの移植、及び、LEWからF344への移植の両方において、テロメアが短くなり、その後にp21及びp16蛋白質が発現することを証明する。しかしながら、SA β-gal染色は、唯一、慢性的な拒絶反応を示すF344の同種移植片の尿細管上皮細胞に見られ、異系移植片又はLEW同種移植片には見られなかった。それゆえ、この慢性的な拒絶反応のモデルラットによって、我々は、テロメア短縮が細胞老化の第一ステップであって、虚血が原因で生じるが、SA β-galの蓄積の誘導には付加的なプロセスが必要であることを見出した。
【０１５６】
方法
動物
9週齢の、雄の同系交配のFisher(F344, RT1lv1)及びLewis(LEW, RT11)ラットを、Harlan, Horst, The Netherlandsから購入した。動物は、自由に水及び標準的なラットの食事が摂れるようにした。実験動物の成育及び使用のためのNational Institutes of Health Guideに従って、動物の成育及び実験を行った。
【０１５７】
腎臓移植
以前に記載したように、腎臓移植を行った22。移植時、ラットは9-11週齢であった。レシピエントの左の腎臓を摘出し、ドナー腎臓を同じ部位に移植した。残ったネイティブな右の腎臓は、移植後7日後に摘出した。術後、痛みを除くために、皮下に、1 mg/kg体重のTemgesic(buprenorphine-hydrochlorid, Schering-Plough B.V., Amstelveen, The Netherlands)を投与した。冷虚血した時間は、30分と45分の間で変更した。
【０１５８】
F344の腎臓移植片を受け取るLEWラットは、移植後、7日、14日、30日、60日及び100日で殺し、PBSで灌流させ、液体窒素内で急速凍結した。同じように、LEWの腎臓を受け取るF344ラットは、移植後、7日、14日、30日、60日及び100日で殺した。加えて、同系移植、F344からF344及びLEWからLEWの両方も行い、移植後（Tx後）、14日及び60日で殺した。全ての実験は、免疫抑制剤が存在しない条件で行った。
【０１５９】
虚血-再灌流実験
雄のF344ラット（9週齢）を、はろたん麻酔下で手術した。腎臓動脈を45分間小さな動脈鉗子を用いてクランプした（温虚血）。それぞれのラットについて、両方の腎臓を45分間クランプし、一つ目の腎臓を45分間虚血した後に摘出し、二つ目の腎臓は、2時間灌流させた。腎臓を集め、液体窒素の中で急速に凍結した。
【０１６０】
組織学
組織サンプルをメチルカルノア固定液中で固定化し、パラフィン包埋し、過ヨウ素酸シッフ染色又はヘメトキシリン-エオシン染色を行った。切片は、Banff working classificationに準じて、病理学者によって無分別で得られた23。
【０１６１】
テロメアの長さのアッセイ
トータルのテロメアDNAの含有量を求めるために、記載されているように、TeloREADTMアッセイを用いた(Promega Corporation, Wisconsin, USA)24。簡単に記載すると、トータルのゲノムDNAを、標準的なフェノール/クロロホルム抽出方法に従って、単離した。10ナノグラムのDNAを変性させ、TeloDetection酵素及びテロメア特異的プローブと反応させて、ピロリン酸分解を55℃で60秒間行った。最後にENLITEN試薬を加え、ルミノメーターで得られた光を測定した。TeloREADTMアッセイによって求めたテロメアの長さは、テロメア制限酵素断片長の標準的なサザンブロット分析によって求めた既知のテロメアの長さを有する独立したコントロールサンプルとの比較によって照合した。
【０１６２】
蛋白質の単離及びウェスタンブロット分析
腎臓同種移植片における細胞周期調整因子p21及びp16を検出するために、ウェスタンブロット分析を行った。腎臓皮質の一部を、ultra turrax(IKA labortechnik, Staufe, Germany)を用いてホモゲナイズし、20 mM Tris-HCl(pH7.4)、137 mM NaCl、10% NaCl、10%グリセロール、1% Triton X-100、2 mM EDTA、1 mM PMSF、2 ug/mlロイペプチン、2 ug/mlアンチパイン、2 ug/mlキモスタチン及び5 U/mlトラジロールを含む溶解バッファーを用いて溶解した。蛋白質の量は、BCA蛋白質アッセイ(Pierce Cheical Co., Rockford, Illinois)を用いて求め、70 ugの蛋白質を、還元条件で、12% SDS-PAGEゲル(p21)又は15% SDS-PAGEゲル(p16)に供した。電気泳動後、蛋白質をセミドライ法で、ポリフッ化ビニリデン（PVDF）メンブレン(Immobilon-P, Millipore, Bedford, USA)にブロッティングした。一次抗体と反応させる前に、メンブレンをPBS/0.05% Tween 20/2%カゼインでブロッキングした。p21蛋白質を染色するために、我々は、p21を直接認識するヤギ抗体(sc-397Gm Santa Cruz Biotechnology, California, USA)を用い、その後に、HRP結合ウサギ抗ヤギ抗血清(Dako, Glostrup, Denmark)で反応させた。p16蛋白質を検出するために、我々は、マウスモノクローナル抗体(sa-1661, Santa Cruz)を用い、その後に、HRP結合ヤギ抗マウス抗血清(Dako)で反応させた。最後に、ブロットの現像は、Supersignal(Pierce)と反応させて、HyperfilmTMフィルム(Amersham Pharmacia Biotech, UK)に露光させた。
【０１６３】
ブロットは、RestoreTM Western Blot Stripping buffer(Pierce)を用いて、20分間37℃でストリップさせた。その後、ブロットをアクチンに反応するマウスモノクローナル抗体と反応させ(sc-8432, Santa Cruz)、その後、HRP結合ヤギ抗マウス抗血清(Dako)と反応させて、全てのサンプル中のタンパク質量を定量した。
【０１６４】
Stratagene-EagleSight software(Stratagene, Amsterdam, The Netherlands)を用いて、発現を定量した。
【０１６５】
免疫組織化学
p16蛋白質発現の検出は、アセトン固定、厚さ3 umのクリオスタット切片を用いて、免疫組織化学で行った。最初に、内因性のペルオキシダーゼ活性及び非特異的な蛋白質結合を、それぞれ0.6% H2O2/0.01% NaN3が溶けたPBS及びPBS/ 1% BSA/ 1% ヤギ血清を用いて、ブロッキングした。一次抗体、PBS/ 1% BSAで希釈したp16に対するマウスモノクローナル抗体(Santa Cruz)を一晩アプライした。洗浄後、切片を二次抗体、HRP結合ヤギ抗マウスイムノグロブリン(Dako)で反応させた。最後に、切片をジアミノベンジジン塩酸で染色し、entellan(Merck, Darmstadt, Germany)中に包埋した。
【０１６６】
老化の染色
前記に8いくつかの修正を加えて、老化に関連したβ-ガラクトシダーゼ(SA β-gal)活性染色を行った。簡単に記載すると、Tx後の及びノーマルな腎臓を急速凍結したクリオスタット切片(3 um)を、0.2%グルタルアルデヒド及び2%ホルムアルデヒドで固定した。PBSで洗浄後、切片を、18時間、新たに調製した染色溶液を用いて37℃で（no CO2）、反応させた。染色溶液は、40 mMクエン酸/リン酸ナトリウム pH6.0、5 mMフェロシアン化カリウム、5 mMフェリシアン化カリウム、150 mM NaCl, 30 mM MgCl2中に、2 mg/ml 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル β-D-ガラクトピラノシド (X-gal, Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri, USA)を含む。その後、切片を洗浄し、エオジンで対比染色した。
【０１６７】
SA β-gal染色の定量は、フルカラー3CCDカメラを備えたZeiss顕微鏡を用いて行った。イメージは、Zeiss KontronのKS-400イメージ分析ソフトウェアを用いて、細胞内の青色染色の量を定量した。損傷を受けた組織、血管、糸球体を手で分析から除いた。全ての切片を同時に染色し、全ての分析パラメーターを同一にした。
【０１６８】
結果
テロメア短縮が、移植後7日からF344及びLEW同種移植片の両方に見られる。
Tx後の様々な時間においてLEWレシピエントから摘出したF344腎臓同種移植片は、間質浸潤及び様々な糸球体病変が見られた。Tx後30日及びその後の時間において摘出した腎臓に、尿細管萎縮及び血管病変が存在した（図６）。対照的に、F344レシピエントから摘出したLEW同種移植片は、如何なる時間においても、尿細管萎縮及び血管異常が見られなかった。
【０１６９】
F344からLEW移植及びLEWからF344移植腎臓同種移植片における、テロメアの長さは、TeloREADTMアッセイ24を用いて測定し、コントロール、移植を行っていないLEW及びF344腎臓と比較した。ノーマルなラットの腎臓は、約45 kbという平均的なテロメアの長さを有している（図７Ａ）。Tx後60日で摘出したF344からLEW及びLEWからF344同種移植片は、約10-20 kbという短いテロメアを有している（図７Ａ）。更に、Tx後7日で摘出したF344からLEWへの腎臓同種移植片は、既に短いテロメアを有している（図７Ｂ）。全てのより時間が経った時（100日を含む）に見られたテロメアの短縮は、7日の腎臓で見られたテロメアの長さに匹敵する（図７Ｂ）。F344ラットから摘出したLEW同種移植片は、比較する時間において、同じようなテロメア短縮を示した（データを示さず）。
【０１７０】
F344及びLEWの両方におけるp21の一過的な発現及びその後に続くp16の発現
p21のような、細胞周期調整蛋白質の発現は、テロメアが短くなる結果であると記載してある。それゆえ、我々は、F344及びLEW腎臓同種移植片の可溶化液でウェスタンブロット分析を行い、p21蛋白質レベルを検出した。ノーマルなF344又はLEWの腎臓では、p21蛋白質は、ウェスタンブロット分析で検出されなかったが（図８Ａ）、両方の場合において、p21蛋白質レベルが、Tx後7日までで増加し、その後に減少した（図８Ｂ）。
【０１７１】
p21蛋白質レベルが増加後に、p16の発現が増加し、老化の間、増加状態が続くと考えられている17,18。ノーマルなF344又はLEW腎臓は、p16発現を示さなかった。F344からLEWへの腎臓同種移植片においては、p16の発現が尿細管上皮細胞で見られた（図９Ａ）。加えて、尿細管基底膜染色が見られたが、これは、一次抗体なしのコントロールでも観察され、それゆえ非特異的であると考えられる（図９Ａ）。F344からLEWへの腎臓同種移植片におけるp16の発現は７日から観察され、60日まで増加した（図９Ｂ）。LEWからF344への同種移植片においては、p16は14日から観察され、時間とともに増加し、60日まで増加レベルを保った（図９Ｂ）。
【０１７２】
F344からLEWへの腎臓同種移植片及びLEWからF344への同種移植片を、SA β-galを用いてpH6.0で染色した。ノーマルなF344腎臓においては、SA β-galポジティブ細胞が散発的に見られたが、Tx後60日までのF344からLEWへの腎臓同種移植片においては、SA β-galポジティブ細胞の数が増していた（図１０Ａ）。F344同種移植片においては、SA β-galポジティブは、主に、尿細管上皮細胞に観察され、糸球体細胞に観察されなかった。対照的に、Tx後60日までのLEWからF344への腎臓同種移植片は、ほとんど如何なるSA β-galポジティブ細胞も見られなかった。SA β-gal染色量の定量によって、LEWからF344及びノーマルな腎臓は、類似のSA β-galポジティブ細胞数を有していた。F344からLEWへの腎臓同種移植片は、60日で、増加したSA β-galポジティブ細胞数を有していた（図１０Ｂ）。
【０１７３】
F344からLEWへの腎臓同種移植片は、Tx後60日で、増加したSA β-gal染色を示したので、我々は、いくつかの他の時間で調べてみた。F344同種移植片は、Tx後30日から増加したSA β-gal染色を有し、これは100日まで増加した。明確にこの染色を定量することによって、拒絶反応が生じたF344同種移植片において、Tx後時間が経てばSA β-galポジティブ細胞が増加することを示す（図１０Ｃ）。
【０１７４】
同系のF344及びLEW移植片はSA β-gal染色を示さず、虚血がテロメア短縮を誘導する
同種移植に加えて、我々は、同系のF344からF344への及びLEWからLEWへの腎臓移植を行い、TRF長及びSA β-gal染色を求めた。同系のF344からF344への移植は、Tx後60日で、ほとんど如何なるSA β-galポジティブ細胞も示さなかった（図１１Ａ）。しかしながら、同系腎臓移植片のTRF長は、異種移植したF344又はLEW移植片（60日）のTRF長と同じくらい短かった（図１１Ｂ）。
【０１７５】
移植後7日の同種及び同系移植の両方は、短いテロメアによって特徴付けられるので、我々は、虚血又は再灌流障害がテロメア短縮を誘導しているかを調べた。45分間腎臓をクランプすれば、実質的なテロメア短縮を誘導するのに十分であり、この短縮は、その後再灌流によって更に増加することはなかった（図１２）。
【０１７６】
考察
我々は、慢性的な腎臓移植片拒絶反応モデルであるF344からLEWへの移植において、細胞老化の特徴を調べた。同系移植片と同様に、F344及びLEW同種移植片の両方において、テロメア短縮が起こった。これにより、F344及びLEW同種移植片において、細胞周期調整因子p21及びp16が活性化される。興味深いことに、唯一F344同種移植片だけが、細胞老化の細胞マーカーであるSA β-gal染色を示す。LEW同種移植片又は同系移植では、同じようなテロメア短縮が生じるにもかかわらず、SA β-gal染色を示さない。それゆえ、我々は、付加的な（恐らく、免疫的な/生理的な）出来事が細胞老化の一因になっていると仮定する。テロメア短縮は老化の引き金となっているが、腎臓移植モデルラットにおいては、SA β-gal染色の誘導が十分ではない（図１３）。
【０１７７】
これらの移植データは、観察されたテロメア喪失及びその開始の敏速さの両方の程度において顕著である。喪失の程度があまりに多く、増殖によっては説明できない。虚血後たった45分で観察されるように、活性酸素種によるDNA断片化に最も反映しているようである。
【０１７８】
移植の間における虚血及び再灌流によって、臓器内に、DNA切断の潜在的な誘導因子である活性酸素種の一過的な増加がもたらされる。活性酸素種がDNAを損傷する能力は、部位特異的なフェントン反応に関連しているであろう。テロメアはGリッチであり、特にDNA酸化されやすく、一本鎖切断されやすい25,26。F344からLEWへのラットモデルにおいて、我々は、虚血後に約45 kbから20 kbへとTRF長が減少することを観察した。この約25 kbの喪失は、酸化損傷及び核蛋白質複合体の崩壊の結果として生じる迅速なテロメア短縮と一致する27,28。この状況は、テロメア結合蛋白質はDNA修復にも従事しているという事実によって、さらに悪化する。酸化ストレスによって誘導される一般的な染色体切断によって、テロメアからこれらの蛋白質が呼び込まれ、結果的にテロメアを安定化する。
【０１７９】
このような迅速で特異的なテロメアの喪失は前例が無い。類似の大量のテロメア喪失は、リンパ球におけるDNA障害によって誘導されたアポトーシスの初期の出来事として報告されている29。リンパ球と尿細管上皮細胞を直接比較できないが、類似のメカニズムが、尿細管上皮細胞でも生じるのであろう。尿細管上皮細胞のアポトーシスは、腎臓の虚血及び再灌流語に見られた30。
【０１８０】
SA β-gal染色は、F344からLEWへのモデルにおいて、慢性的な拒絶反応の、組織的な存在及び機能的な存在と一致しているようである。SA β-gal染色は、LEWレシピエントに移植されたF344腎臓同種移植片においてのみ観察され、F344ラットに移植されたLEW同種移植片では観察されなかった。加えて、F344同系移植片は、SA β-gal染色を示さなかったが、LEWからF344への移植片及び同系移植片の両方は、テロメアが短くなっていた。すでにTRF長が減少しているにも関わらず、明らかに、F344からLEWへの及びLEWからF344への両方の移植において生じた急性の拒絶反応は、細胞を（SA β-galポジティとして定義された）老化に導くには十分ではない。最初のSA β-galポジティブ細胞が検出される時間である30日後に、F344からLEWへの腎臓移植によってCRの兆候を発現した。LEWからF344への同種移植片はSA β-galポジティブの増加を示さないので、我々は更なる（免疫的な/生理学的な）出来事が必要であると考えている。以前に、我々は、LEWレシピエントのF344移植片中の腎臓蛋白質に対する液性応答を示した。この液性応答は、F344レシピエントのLEW同種移植片又はレシピエントの同系移植片においては存在しなかった。テロメア侵食の存在、p16及びp21の発現が細胞老化機能に応じて誘導されることと一致しているが、これらの免疫応答の誘導に関係する要素が、SA β-galの蓄積の一因となっていることは除外できない。
【０１８１】
F344からLEWへの腎臓同種移植片においては、CRの組織病理学的特徴である尿細管萎縮がTx後30日から存在していた。更に、SA β-gal蓄積が、主に、尿細管上皮細胞で見られたが、糸球体で見られなかった。患者においては、虚血/再灌流障害によって、delayed graft functionとなりうる。最近、尿細管機能の欠損が、delayed graft functionの原因となることが示された31。このことは、尿細管上皮細胞が、酸化損傷に対して非常に感受性が高いという仮説によって支持される。加えて、歳がいったヒトの腎臓においては、髄質に比べて間質で、テロメアの長さがより早く短くなる。TRF長アッセイにおいては、主に尿細管細胞DNAからなる、表層DNAを用いた。それゆえ、TRF長が短くなることは、尿細管のテロメアDNAの喪失の最もありそうな結果である。このことは、大部分の尿細管上皮細胞が酸化損傷によってダメージを受けており、移植片の機能の低下の一因になっていることを意味している。
【０１８２】
尿細管上皮細胞が老化するということは、損傷シグナルへの対応が不適切であり、その結果、永続的な炎症及びそれによる瘢痕がもたされることを意味する。老化の場合、損傷した組織は、健康な上皮組織を交換することができず、繊維形成に帰結する32。最近、p21の発現が、早期の慢性的な肝臓同種移植片拒絶反応と関連していることが示された。p21発現は、主に、胆管上皮細胞で見られ、早期CRを有する患者において増加していた33。上皮細胞の分裂寿命は、観察された特徴的な表現型の変化の一因となっていた。我々のモデルにおいては、F344からLEWへの及びLEWからF344への同種移植片の両方において、p21の発現が一過的に見られたが、この増加はSA β-gal蓄積を誘導するには十分ではなかった。CRを有するF344移植片における尿細管上皮細胞は、SA β-galポジティブになっており、それゆえ、尿細管上皮細胞の低下した機能が、腎臓の機能低下の一因となっているであろう。
【０１８３】
ヒトにおいて、加齢にともなうin vivoでのテロメア短縮が示され、ヒトの腎臓移植においては、より歳がいったドナーの腎臓は、劣った予後を示した12,13。移植によってテロメア侵食が誘導されることから、もしも、歳を経た腎臓であり既にテロメアが短く、腎臓が虚血の間に付加的なストレスを受けるならば、結果は悪くなると考えられる。しかしながら、げっ歯類で得られたデータは、如何なる予防策なしに、ヒトへと推定できる。げっ歯類は、ヒトの病気を研究するための実験モデルとしてしばしば用いられているが、幾つかの点で異なっていることが知られている。老化研究においては、マウス及びヒトは異なる病因を有すが34、ラットにおいていまだ明確でない。
【０１８４】
CRを有する患者は、酸化ストレスマーカーが増加し、抗酸化物質が減少しており、酸化ストレスがCRの発症又は進行に役割を果たしていることが示唆された35,36。臓器移植での虚血/再灌流によって、フリーラジカルが産生し、DNA切断及びテロメア侵食が誘導される。テロメア侵食及びそれによる老化の表現型の第一の前提条件を防ぐために、フリーラジカルの産生を防ぐべきである。腎臓保存液に抗酸化剤を使用することは、移植臓器での酸化損傷を防ぐのに役立つかも知れず、長時間機能することに影響をあたえるかもしれない37,38。抗酸化物質の発現は、抗体移植後に、CRの損傷を防ぐことができる。しかしながら、抗酸化物質の発現のタイミングが重要である39。
【０１８５】
結論として、移植の間における酸化損傷によって、ゲノムDNAが損傷され、このことによってテロメアの長さが短くなり、細胞周期調整因子が活性化される。テロメア短縮は、単独でSA β-galポジティブにするには不十分であるが、これは未だ未知の要素によって影響を受けるであろう。
【０１８６】
アクノレッジメント
著者は、腎臓組織の獲得においてDr. H. Benediktssonに、有益な考察においてDr. M.G.A. van Dixhoornに、及び、原稿の批判的な解釈においてDr. M.R. Dahaに感謝する。
【０１８７】
[参考文献５]
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【図面の簡単な説明】
【０１８８】
【図１】図１は、異なるタイプの腎臓組織由来のG22P1、XRCC5、hPOT1、及びSIRT2のmRNAの相対的な発現レベルを示す。
【図２Ａ】図２は、図１の結果の統計分析結果を示す。
【図２Ｂ】図２は、図１の結果の統計分析結果を示す。
【図３】図３は、基本的な尿細管上皮培地における、pH6でのSA β gal染色レベルを示す。
【図４】図４は、酸化損傷に対する細胞のストレス応答の概要を示す。
【図５】図５は、細胞の老化の経路を示す。
【図６】図６は、Banff criteriaに従い、移植後7、14、30、60及び100日後の、F344からLEWへの腎臓同種移植における尿細管萎縮を示す（0：尿細管萎縮が見られない；  1：尿細管の＜25%が尿細管萎縮；  2：尿細管の26-50%が尿細管萎縮；  3：尿細管の＞51%が尿細管萎縮）。移植後60日後における、LEWからF344への同種移植片を示す。
【図７】図７は、ノーマルなF344及びLEWの腎臓、又は、60日経過後のF344及びLEWの同種移植片をTeloRADアッセイで測定した場合における、テロメアの制限断片(telomere restriction fragment (TRF))の長さを示す（Ａ）。Ｂは、移植後の各時間におけるF344からLEWへの腎臓の同種移植片のテロメア結合蛋白質の長さを示す。値は、3サンプルの平均値＋標準誤差(SEM)として表す。
【図８】図８のＡは、ノーマルな及びF344からLEWへの腎臓の同種移植片（7日）のライセートにおける、p21及びアクチンの発現をウェスタンブロット分析した結果を示す。サンプルは、各群の3のサンプルを代表したものである。Ｂは、移植後の様々な時間における、サンプルのアクチン含有量で補正した、F344及びLEWの腎臓の同種移植片をp21ウェスタンブロットに供して得られたデンシトメトリーの結果を示す。データを、平均値＋標準誤差(SEM)として表す（全ての群においてn=3）。
【図９】図９のＡは、ノーマルのF344（左パネル）、及び、60日後におけるF344からLEWへの同種移植片（中央パネル）における、核蛋白質p16の免疫組織染色を示す。一次抗体が存在していない場合には、核染色が観察されない（右パネル）。（400×）  Bは、移植後の様々な時間において、F344及びLEWの腎臓の同種移植片をウェスタンブロットに供した場合における、サンプルのアクチン含有量で補正した、p16全体の染色のデンシトメトリーの結果を示す。データを、平均値＋標準誤差(SEM)として表す（全ての群においてn=3）。
【図１０】図１０のＡは、ノーマルなF344の腎臓、60日後におけるF344からLEWへの腎臓の同種移植片、及び、60日後におけるLEWからF344への腎臓の同種移植片の凍結切片における、老化関連β-ガラクトシダーゼ染色（SA β-gal）の結果を示す。生検は、各群における6の生検の代表的なものとする。（×250）  Ｂは、ノーマルなF344の腎臓、又は、60日後におけるF344及びLEWの腎臓の同種移植片を、Zeiss ks400分析して得られたSA β-gal染色の定量結果である。データを、平均値＋標準誤差(SEM)として表す（全ての群においてn=6）。Ｃは、Zeiss ks400分析して得られたSA β-gal染色の定量結果である。7日間後(n=3)、14日間後(n=3)、30日間後(n=3)、60日間後(n=3)及び100日間後(n=3)におけるF344からLEWへの移植片を表し、データを、平均値＋標準誤差(SEM)として表す。
【図１１】図１１のＡは、移植後60日後における、F344からLEWへの同種移植片（左パネル）及びLEWからF344への同種移植片（右パネル）のSA β-gal染色結果を示す。（×250）Ｂは、F344からF344への同種移植片（14日後及び60日後、n=3）及びLEWからLEWへの同種移植片（14日後、n=3）と比較した、ノーマルなF344及びLEWの腎臓(n=3)のテロメアの制限断片（TRF）の長さを示す。データを、平均値＋標準誤差(SEM)として表す。
【図１２】図１２は、45分間虚血を行ったF344の腎臓(n=3)、及び、45分間の虚血に続き2時間再灌流を行ったF344の腎臓(n=3)のテロメアの制限断片の長さを示す。データを、平均値＋標準誤差(SEM)として表す。
【図１３】図１３は、F344からLEWへの、及び、LEWからF344への腎臓の同種移植片において観察されるイベントの略図である。移植によって、調査した全ての組み合わせにおいて、テロメアが短くなり、このことによって、p21及びp16が活性化される。しかしながら、唯一F344からLEWへの腎臓の同種移植片においてのみ、SA β-gal染色が観察され、このことは、更なるイベントが細胞の老化を誘導するのに必要であることを示唆する。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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