(57)【要約】本発明は、心筋におけるアポトーシスを阻止または制限することにより、心臓の虚血または機械的過負荷に対応した心筋損傷を阻止または制限するための医薬の製造における、機械的増殖因子(MGF)ポリペプチドまたはMGFポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
心筋におけるアポトーシスを阻止または制限することにより、心臓の虚血または機械的過負荷に対応した心筋損傷を阻止または制限するための医薬の製造における、機械的増殖因子(MGF)ポリペプチドまたはMGFポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用。
【請求項２】
虚血が一過性虚血であるか、または機械的過負荷が一過性過負荷である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記医薬が心臓発作に対する投与を目的とする、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
MGFポリペプチドがグリコシル化されていない、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
MGFポリペプチドが、
(a)ヒトMGF(配列番号2)、ラットMGF(配列番号4)、もしくはウサギMGF(配列番号6)の配列；
(b)(a)の配列に対して70%以上の相同性を有する配列；
(c)配列番号1、3もしくは5のヒト、ラットもしくはウサギMGF DNAのエキソン5および6、もしくは4、5および6、もしくは3、4、5および6により全体的にもしくは部分的にコードされるアミノ酸を含む配列、もしくはそれに対して70%以上の相同性を有する配列；または
(d)(a)、(b)もしくは(c)の配列と選択的にハイブリダイズすることができる核酸配列によりコードされる配列；
を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
MGFポリペプチドが心筋細胞において肥大表現型を誘発する能力を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
MGFポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが請求項５または６で規定したMGFポリペプチドをコードする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
前記医薬が筋肉内投与用に製剤化される、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチドがベクター内に含まれる、請求項５、６または７に記載の使用。
【請求項１０】
ベクターがプラスミドベクターまたは無毒化したウイルスベクターである、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
心臓の虚血または機械的過負荷に対応した心筋損傷の阻止において同時に、別個にまたは逐次使用するためのMGFポリペプチドおよびMGFポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる製品。
【請求項１２】
前記ポリペプチドが請求項１、４、５および６のいずれか１項に規定したものであるか、または前記ポリヌクレオチドが請求項７〜１０のいずれか１項に規定したものであるか、または虚血または機械的過負荷が請求項２または３に規定したものである、請求項９に記載の製品。
【請求項１３】
MGFポリペプチドが前記ポリヌクレオチドの前に投与するためのものである、請求項１１または１２に記載の製品。
【請求項１４】
心臓の虚血または機械的過負荷に対応した心筋損傷を阻止または制限する方法であって、該虚血または機械的過負荷を被った被験体に有効量の機械的増殖因子(MGF)ポリペプチドまたはMGFポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与することを含んでなる、前記方法。
【請求項１５】
前記被験体にMGFポリペプチドおよびMGFポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの両方が投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
MGFポリペプチドが前記ポリヌクレオチドの前に投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリペプチドが請求項１、４、５および６のいずれか１項に規定したものであるか、または前記ポリヌクレオチドが請求項７〜１０のいずれか１項に規定したものであるか、または虚血または機械的過負荷が請求項２または３に規定したものである、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、虚血および／または機械的過負荷後の心筋損傷の阻止における、IGF-Iスプライス変異体であるMGFの配列に由来するポリペプチドおよびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
虚血性心疾患
虚血は筋肉その他の器官へ酸素を含んだ血液を供給する動脈が閉塞した際に起こる。これにより影響を受けた器官の機能性が低下し、血液供給が低減した領域での細胞死を生じ得る。
【０００３】
虚血性心疾患は主要な死因である。心臓発作から生還した患者であっても、心筋の損失のために活動的な生活様式の見通しは著しく損なわれる。心筋は、骨格筋や中枢神経系と同様、分裂後組織である。生涯、細胞の置き換わりは事実上ないので、効果的な継続的局所修復機構が存在するはずである。局所的な物理的損傷およびフリーラジカル損傷は健康な組織でも起こり、従って修復がなされているはずである。そうでなければその細胞は細胞死を起こし、永久的な機能欠損が起きる。
【０００４】
心臓では、虚血は冠状動脈の閉塞によって起こり得る。これにより、ある領域の心筋細胞には血液、すなわち酸素が届かなくなる。やがて、それらは死に向かう。これは、損傷を受けている領域の生き残っている心筋細胞に対する機械的負担が増大することを意味し、これが細胞死にもつながる。このようにして酸欠の結果として、また、過度な機械的負担の結果としても、細胞死が起こる。細胞死、すなわちネクローシスの領域は梗塞として知られる。
【０００５】
IGF-IのMGFスプライス変異体
哺乳類IGF-Iポリペプチドは、選択的mRNAスプライシングの結果として生じる複数のイソ型を有する。大別すれば、2つのタイプのイソ型、すなわち肝型イソ型と非肝型イソ型がある。肝型イソ型は肝臓またはそれ以外の部分で発現され得るが、もし肝臓以外の部分で発現される場合でも肝臓で発現されるものと同等である。肝型イソ型は全身的作用を有し、また哺乳類における主たるイソ型である。非肝型イソ型はそれほど一般的なものではなく、そのいくつかは自己分泌／傍分泌作用を有すると考えられている。本発明のMGFイソ型は後者のタイプである。IGF-Iスプライス変異体という用語は、肝イソ型に基づくものであり(Chewら, 1995)、非肝組織により産生されるものを考慮に入れるほどには十分に発展したものではない。ホルモンに応答し、かつプロモーター2の制御下にある非肝イソ型は、肝IGF-Iイソ型に対する異なるプロモーター(プロモーター1)によりある程度制御されている。
【０００６】
ヒト骨格筋では、本発明者らは3つのIGF-Iスプライス変異体のcDNAをクローン化した。図１を見れば、エキソン1および2は異なる転写開始部位を有する選択的リーダーエキソンであり、共通のエキソン3に対し異なる様式でスプラシングされる。エキソン3および4は成熟IGF-Iペプチド(B、C、AおよびDドメイン)、ならびにEドメインの最初の16個のアミノ酸をコードしている。エキソン5および6は各々、選択的部分である異なる伸長ペプチドのEドメインをコードしている。この後ろに、前駆体IGF-Iの終結コドン、3'非翻訳領域およびポリ(A)付加シグナル部位が続く。
【０００７】
骨格筋においては、運動負荷がかかった筋肉、および／または損傷を受けた（伸長され、かつ／または電気的に刺激された)筋肉では、この3つの筋IGF-Iスプライス変異体のうち1つのmRNAしか検出できず、その発現は筋活性のレベルと関連している。本発明者らはこれを機械的増殖因子(Mechano Growth Factor, MGF)と名付けた。ジストロフィー性の骨格筋では伸長された場合でもMGF mRNAは検出されない。
【０００８】
MGF(図１; Yangら, 1996; McKpyら, 1999)はエキソン4、5および6を有するが、一方、筋で発現される肝型IGF-Iはエキソン4および6を有する。ヒトの筋肉で見られる他の2つのスプライス変異体は肝全身型のIGF-Iと類似の配列を有する。注目すべきは、ヒトMGFは49bpの挿入(Eドメイン)を有し、これがその読み枠をカルボキシ末端で変化させることである。
【０００９】
本発明者らは、骨格筋の障害、特に筋ジストロフィーの治療のため(W097/33997; 米国特許第6,221,842号; Yangら, 1996; McKoyら, 1999)、また神経障害の治療のため(WO01/136483)、また神経修復のため(WO01/85781)のMGFをすでに同定している。
【発明の開示】
【００１０】
発明の概要
心筋におけるL.IGF-IおよびMGFの役割
細胞が機械的刺激に応答する際のシグナル伝達経路をはじめとする、遺伝子発現の局所的調節の薬理学は、新しく、そして重要な研究分野である。機械的因子(外的因子および内的因子の双方)は心筋細胞内の遺伝子発現のスイッチ、ならびに転写および翻訳過程の調節に関与している。機械的刺激が変化すると心筋増殖の増大(心臓肥大)をもたらす可能性があり、これは最初は心拍出量を増大させるための適応応答である。しかし、ある条件下では、病的な肥大への移行が起こることがあり、この場合、心筋量は増えるが、心臓の性能は落ちる。心室細胞は胚性イソ型の収縮遺伝子を発現するよう逆戻りし、その結果、エネルギー利用が速くなる。この問題がさらに悪化すると、起こり得る別の形の心筋が損傷によってしばしば心筋細胞の細胞死(アポトーシス)が生じ、これにより機能的な心筋細胞の損失が起こる。残っている健康な心筋細胞は一般に心拍出量を維持するために大きさが増大する。これがさらに肥大状態をもたらし、病的状態となるまでに発達することもある。
【００１１】
全身型の肝型IGF-I(L.IGF-I)が心筋増殖のレギュレーターおよび心筋細胞死に対するプロテクターとして重要であるという証拠がある。心筋症の動物モデルおよび臨床試験で成長ホルモン(GH)投与の後に心機能の有意な改善が報告されている(Thuesenら, 1998; Fazioら, 1996)。成長ホルモンは肝臓に対するその作用を介して全身性インスリン様増殖因子の発現を誘発する。Buerkeら(1995)は、ラットにおいて一過性心筋虚血の後に組換えL.IGF-Iを投与すると細胞死が減少し、CK洗浄によって示されるように細胞膜が減少したことを報告した。一般的なIGF-I抗体を用い、Matthewsら(1999)は、L.IGF-Iが梗塞領域でアップレギュレートされたことを示した。臨床試験での成長ホルモンおよび組換え肝型IGF-Iの投与もまた、末期心症例において心拍出量に対し有益な効果があることが示されている(Gluckman, WO92/11865)。しかし、この研究では全体として明らかに肝型または全身型の組換えIGF-Iを用いたか、あるいは複数のIGF-Iイソ型の存在を認識していなかったかのいずれかである。その研究のいずれもMGFイソ型を特定したものはなかった。
【００１２】
従って、ましてやこれまでに、L.IGF-1とは対照的に、心筋におけるMGFに関する証拠は十分確立されていない。RT-PCRを用い、Skarliら(1998)は、大動脈を短時間クランプ止めした24時間後のウサギ心筋ではMGFが発現するが、残りの心臓部にはL.IGFのみが存在することを見出し、さらに機械的シグナルに対応して心筋によりMGF転写物が翻訳・産生されたと結論づけた。WO97/3397(米国特許第6,221,842号)でもまた、筋ジストロフィーおよびその他の骨格筋疾患とともに、心疾患、心筋のタンパク質合成の促進が有益な治療となる疾病、心筋症、急性心不全または急性発作(心筋炎または心筋梗塞を含む)の予防、および心臓／体積を増大させることによる心拍出量の向上の可能性は述べられているものの、骨格筋とは対照的に、MGFを心臓病と関連付ける実験的知見は示されていない。
【００１３】
本明細書で発明者らは、ラットおよびヒツジ心臓において虚血後の梗塞領域でMGFが強く発現されることを示す。L.IGF-1に関する状況とは対照的に、本発明者らはまた、MGFの発現が機械的過負荷および一過性虚血後の初期回復段階と一致することも示した。従って、MGFの発現はL-IGF-Iの発現よりも迅速である。本発明者らはまた、アポトーシスを起こしている心筋細胞でMGFの発現が誘発され、心筋様細胞系H9C2をMGFで安定的にトランスフェクトするとアポトーシスが阻止されることを示し、MGFがin vitroで心筋細胞において肥大表現型を誘発するという証拠を得た。
【００１４】
さらに本発明者らは、心筋細胞におけるMGFの発現の長期化が筋フィラメントの太いフィラメントタンパク質の抑制と関連するが、細いフィラメントタンパク質の抑制とは関連しないことを示した。これは筋細胞を脱分化させる働きをする。本発明者らは、MGFの発現が梗塞領域の再構築をもたらすこと、すなわちMGFが筋細胞を脱分化させることによって修復プロセスを促進すると結論づける。
【００１５】
本発明者らは、心筋は幹細胞を持っているとは考えられていないのでEドメインが幹細胞の活性化を起こすとは思われないが、Eドメイン(エキソン4の部分)が心筋の局所的な組織修復に重要であることを見出した。従って、本発明者らのデータは、MGFにおけるEドメインの挿入が、L.IGF-Iの場合と比べてペプチドのC末端の読み枠を変化させるだけでなく、Eドメインが細胞性の心筋細胞修復に別の機能を果す可能性があることも示唆する。
【００１６】
本明細書における本発明者らの知見は、MGFが心臓組織の損傷に応答して活性化され、虚血性および／または過剰負荷がかかった心臓において修復作用を持つことを示す。さらにこれは、これまでに示されている用途に加え、虚血または過負荷に対応したアポトーシスに由来する心筋損傷から保護するために使用できる。これに関して、心臓の修復プロセスには2つの局面があり、これはすなわちアポトーシスの阻止と、心筋細胞の欠損を補償するための損傷領域で生き残った心筋細胞の肥大である。
【００１７】
心臓発作後速やかにMGFポリペプチドを投与することが特に望ましく、特に、ポリペプチドを最初に投与した後に心筋のMGFレベルを維持するためにMGFポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを送達することにより、より長期にわたる治療も行うことができる。
【００１８】
よって、本発明は、
心筋におけるアポトーシスを阻止または制限することにより、心臓の虚血または機械的過負荷に対応した心筋損傷を阻止または制限するための医薬の製造における、機械的増殖因子(MGF)ポリペプチドまたはMGFポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用；
心臓の虚血または機械的過負荷に対応した心筋損傷の阻止において同時に、別個にまたは逐次使用するためのMGFポリペプチドおよびMGFポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる製品；および
心臓の虚血または機械的過負荷に対応した心筋損傷を阻止または制限する方法であって、該虚血または機械的過負荷を被った被験体に有効量の機械的増殖因子(MGF)ポリペプチドまたはMGFポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与することを含んでなる方法；
を提供する。
【００１９】
図面の説明
図１。IGF-I遺伝子の選択的スプライシング
この図面は、ヒト骨格筋で発現したIGF-Iスプライス変異体のエキソン配列を示す。これら2つは肝臓が産生した全身型のIGF-Iと類似の配列を有する。ヒトMGF転写物はEドメインに49塩基(ラットおよびウサギでは52塩基)の挿入を有し、これが読み枠を変更し、従って、このペプチドのC末端はその他のスプライス変異体のそれとは異なる。
【００２０】
また、ヒツジ虚血心臓における全身型IGF-I(A)およびMGF(B)の発現も示す。MGFの場合、発現はより迅速で、BのE3のように、梗塞の誘発から心臓サンプルの採取までの間隔が相対的に極めて短い場合に認められる。
【００２１】
図２。大動脈結紮心臓におけるMGF発現の誘導
マウス群(3)を7日間結紮し、その後、心臓から抽出した全RNAにおいて定量的リアルタイムRT-PCRを用いてMGF発現をアッセイした。A. MGFおよびIGFに関してアガロースゲル上でのRT-PCR反応物を流した結果。B. リアルタイムRT-PCR後の遺伝子（すなわちMGF、IGF、ANFおよびBax）の発現の定量化。
【００２２】
図３。MGFの過剰発現による肥大マーカー遺伝子の誘発
MGF(NT-GFP)プラスミドでトランスフェクトされた一次心筋細胞培養物において、ANFおよびbMHCはいずれも他の条件に比べて有意な発現上昇があった。このデータはMGFの発現がin vitroで肥大表現型を誘発するのに十分なものであることを示す。
【００２３】
図４。心筋細胞におけるMPAに応答したMGF発現の誘発
心筋細胞一次培養物を、PMAを添加(200nM)する前の24時間にわたり血清不含培地で培養した。30分後、全RNAを抽出し、リアルタイムRT-PCRを用いてMGF遺伝子の発現をアッセイした。A. MGFの発現はPMA処理後に有意に高まるが、IGFの発現は変化しない。B. 第3の群で培地を変えずに培養物にPMAを加えたこと以外は、最初の実験の繰り返し。MGFの発現は新鮮な培地とともにPMAを添加する場合よりも高い程度まで増強される。
【００２４】
図５。アポトーシス条件下での心筋細胞におけるMGFの発現
0.3Mソルビトールを添加する前の24時間にわたり血清不含培地で心筋細胞を培養した。処理4時間後および24時間後に全RNAを抽出した。A. 遺伝子発現解析は、リアルタイムRT-PCRを用いて、MGF、IGF、抗アポトーシスマーカーBcl2、およびアポトーシスマーカーBaxに関して行った。B. 同じ細胞からDNAを抽出し、フラグメンテーションの程度を調べるために電気泳動を行った。24時間ソルビトール処理した細胞においてDNAフラグメンテーションが見られるが(矢印)、これはこれらの筋細胞でアポトーシスが起こったことを示している。
【００２５】
図６。MGFおよびL.IGFでトランスフェクトされた心臓細胞系におけるアポトーシスの誘発
細胞をMGFおよびL.IGF-IをコードするcDNAで安定トランスフェクトし、標準的な技術を用いて抗生物質耐性により選択した。クローンが同定されたところで、それらを単離し、別個の細胞系として増殖させた。トランスフェクトしなかった対照細胞と、安定MGFおよびL.IGF-Iクローンをプレーティングし、0.3Mソルビトールで24時間処理した。処理後、DNAを抽出し、DNAフラグメンテーションが起こっているかどうかを調べるために電気泳動(1%アガロース)に供した。レーン1および5はDNAマーカーである(それぞれ100bpおよび1kB)。レーン2は、24時間ソルビトール後の対照H9C2細胞である。レーン3は、24時間ソルビトール後のMGFをトランスフェクトしたH9C2細胞である。レーン4は、24時間ソルビトール後のIGFをトランスフェクトしたH9C2細胞である。明らかに、アポトーシスを受けている対照細胞ではDNAフラグメンテーションが起こっているが、MGFまたはL.IGF-I遺伝子のいずれかを過剰発現している細胞はアポトーシスを受けないことがわかる。
【００２６】
図７。ヒトMGFのcDNAおよびアミノ酸配列(そのエキソン構造を示す)
図８。ラットMGFのcDNAおよびアミノ酸配列(そのエキソン構造を示す)
図９。ウサギMGFのcDNAおよびアミノ酸配列(そのエキソン構造を示す)
図１０。ヒトL.IGF-IのcDNAおよびアミノ酸配列(そのエキソン構造を示す)
図１１。ラットL-IGF-IのcDNAおよびアミノ酸配列(そのエキソン構造を示す)
図１２。ウサギL-IGF-IのcDNAおよびアミノ酸配列(そのエキソン構造を示す)
図１３。ヒト、ラットおよびウサギMGFおよびL-IGF-Iのエキソン構造を示す配列アライメントであり、類似点と相違点が強調表示されている。
【００２７】
図１４。24時間MGFおよびIGFウイルスに感染させた心筋細胞
A. MGFの核への局在。B. L-IGFは核に存在しているが、細胞質全体にも存在している。
【００２８】
図１５。MGFおよびIGFウイルスに感染させた心筋細胞およびDAPIによる対比染色
左上は、IGF-GFPウイルス。右上は、DAPI染色した同ウイルス。左下は、MGF-GFPウイルス。右下は、DAPI染色した同ウイルス。
【００２９】
図１６。MGFおよび対照GFP発現ウイルスに48時間にわたり感染させた心筋細胞
細胞をファロイジンおよびDAPIで対比染色して筋フィラメントを可視化した。A. 対照筋細胞＋DAPI染色。B. GFPウイルスを感染させた筋細胞。C. MGFウイルスを感染させた筋細胞＋DAPI染色。D. MGFウイルスを感染させた筋細胞。
【００３０】
図１７。心筋細胞における48時間MGFウイルス感染後のRT-PCRによる太いフィラメントと細いフィラメントの分析
上の3つのパネル：太いフィラメントのタンパク質。下の3つのパネル：細いフィラメントのタンパク質。
【００３１】
図１８。MGFウイルス感染の48時間後の心筋細胞におけるαMHC発現の定量分析
図１９。2つの損傷モデルにおける筋切片全体に対する損傷再生筋線維領域の平均パーセンテージ
A. 筋量に対する損傷／再生領域のパーセンテージ。B. 胚性MyHCで染色した面積パーセンテージ。ひし形で示す線：ブピバカイン、四角で示す線：伸縮／刺激。
【００３２】
図２０。筋損傷の2つのモデルにおけるMGFおよびIGF-IEaイソ型のmRNAレベル
A. MGF mRNAレベル(pg/μg全RNA)。B. IGF-IEa mRNAレベル(pg/μg全RNA)。ひし形で示す線：ブピバカイン、四角で示す線：伸縮／刺激。
【００３３】
発明の詳細な説明
MGFポリペプチドおよびポリヌクレオチド
ポリペプチド
背景
MGFは機械的増殖因子を表す(McKoyら, 1999参照)。上記で述べたように、MGFはIGF-Iの選択的スプライシングされた変異体である。肝型IGF-I(L.IGF-I)はエキソン4および6によってコードされるアミノ酸を含むが、MGFはエキソン4、5および6によってコードされるアミノ酸を含む。MGFはまた、エキソン5に49bp(ヒト)または52bp(ラット、ウサギ)が挿入された結果としてカルボキシ末端において読み枠が変更されており、グリコシル化されないことから小さい。Chewら(1995)およびYangら(1996)は4-5-6スプライス変異体を定義するのにMGFの呼称は用いずに、IGF-I Ecと呼んだ。Ecドメインを有する筋肉性イソ型は現在ではMGFとして知られている(McKoyら, 1999; WO01/136483; WO01/85781参照)。
【００３４】
本発明のMGFポリペプチドの構造特性
本明細書では、MGFポリペプチドは、4-5-6エキソン構造を有する任意のIGF-Iポリペプチドであるか、または4-5-6エキソン構造と、本明細書に記載のMGFの機能特性または本発明者らが、例えばWO97/33997および／またはWO01/136483および／またはWO01/85781においてすでに同定したMGFの機能特性のうち1以上とを有するIGF-Iポリペプチドに由来するものであると理解される。ヒト、ラットおよびウサギにおけるMGFのエキソン構造は図7、8および9(配列番号1/2、3/4および5/6)で示されている。比較のため、ヒト、ラットおよびウサギL.IGF-Iのエキソン構造が図10、11および12(配列番号9/10、11/12および13/14)に示され、MGFとL.IGF-Iの間の比較は図13に示されている。
【００３５】
好ましくは、本発明のMGFポリペプチドは、元々のMGFにおいて、上記で述べた49/52bpの挿入により作り出された読み枠を有する。好ましくは、本発明のMGFポリペプチドはグリコシル化されない。しかし、それらはいくつかの実施形態においてはグリコシル化されていてもよいし、あるいは部分的にグリコシル化されていてもよい。部分的にグリコシル化されているとは、10、20、30、50、70、80、90、95または99%までL.IGF-Iと同程度のグリコシル化を意味し、例えば全てでないがいくつかのL.IGF-Iのグリコシル化部位を含むことを意味する。グリコシル化のパターンは、糖のタイプおよび配置に関して、L.IGF-Iのそれと同じであってもよいし、あるいは異なってもよい。
【００３６】
好ましくは、本発明のMGFはエキソン3、4、5および6によりコードされる配列、またはそれと同等の配列を含んでなる。所望により、それらはエキソン1および／もしくは2、またはその同等配列もまた含んでもよい。しかし、それらはより短くてもよく、例えばエキソン5および6、またはエキソン4、5および6によってコードされる配列のみを含むものであってもよい。
【００３７】
本発明のMGFポリペプチドは、4-5-6型スプライスされたIGF-Iを有するいずれの種にもその起源を見出し得る。従って、本発明のMGFポリペプチドはヒトMGFの配列を有してもよく、あるいはヒトMGFの末端切断型であってもよい。このようなヒトMGFポリペプチドが一般に好ましい。動物MGFの配列を有するMGFポリペプチドを使用してもよく、例えばラット、ウサギ、マウス、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、イヌ、ネコMGFが挙げられる。使用するMGFポリペプチドの種起源は治療する被験体の種と一致することが好ましい。特に、ヒト患者を治療するにはヒトMGFポリペプチドを使用するのが好ましい。
【００３８】
ヒトMGF(IGF-I-Ec)(配列番号1/2、図7)、ラットMGF(配列番号3/4、図8)およびウサギMGF(IGF-I-Eb)(配列番号5/6、図9)のエキソン3、4、5および6の配列を、それらの対応するcDNA配列とともに以下に示す。配列番号1、3および5はcDNAであり；配列番号2、4および6はポリペプチドである。比較のため、ヒト(配列番号9/10、図10)、ラット(配列番号11/12、図11)およびウサギ(配列番号13/14、図 12)肝型IGF-I(L.IGF-1)のエキソン3、4および6の配列も示した(特に比較には図13を参照)。本発明の好ましい実施形態においては配列番号2、4および6の配列を有するポリペプチドを使用してもよい。
【００３９】
本発明のMGFポリペプチドの機能特性
本発明において、MGFポリペプチドはWO97/33997において本発明者らが確認した機能特性を有するものであり得る。特に、それらは骨格筋組織の増殖を誘導する能力を持ち得る。同様に、本明細書に述べているように、それらは骨格筋の修復に必要なタンパク質合成をアップレギュレートし、かつ／または骨格筋の衛星(幹)細胞を活性化させる能力を持ち得る。その代わりに、またはそれに加えて、本発明のMGFポリペプチドはWO01/136483において本発明者らがすでに確認した神経学的特性も持ち得る。すなわち、それらは運動ニューロンのレスキューを行う能力を持ち得る。特に、それらは処置した被験体の、神経捻除後の運動ニューロンの損失を、無処置の被験体の同等の条件と比較して20、30、40、50、60、70、80、90、95、99または100%だけ低減させ得る。運動ニューロンの損失を70%以上または80%以上(すなわち30%以下または20%以下に)低減させることが好ましい。レスキューの程度は適当な技術、例えば立体解析学などの公知の技術を用いて計算できる。特定の試験として、WO01/136483で使用した、ラットにおける顔面神経捻除に対する運動ニューロンのレスキューの測定に基づく技術を用いてもよい。
【００４０】
より好ましくは、本発明のMGFポリペプチドは心筋の筋細胞の細胞死、すなわちアポトーシスを防ぐことにより虚血または機械的過負荷後の心筋の損傷を阻止または制限する能力を有する。好ましくは、本発明のMGFポリペプチドは適用された心筋の領域でアポトーシスを完全に防ぐ能力を有する。しかし、アポトーシスは部分的にのみ阻止、すなわち制限されてもよい。本発明の治療を行わずに生じたであろうものに比べて損傷のいくらかの減少が達成される場合、例えば、損傷が死に至る細胞の数または割合、または機能を失う筋肉領域の大きさ、または血液を送り出す心臓の全体的な能力によって評価した場合に1%以上、5%以上、10%以上、20%以上、30%以上、50%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、98%以上、または99%以上減少する場合、損傷は制限されている。
【００４１】
特に損傷の減少は、最小侵襲法を用いて心拍出量、駆出率などを求めることによりin vivoで測定することができる。血清中のクレアチンキナーゼおよびトロポニンTなどのマーカーをアッセイすることもできる。傷害後の心筋に対する損傷の程度を求めるために臨床現場で用いられるパラメーターがある。
【００４２】
アポトーシスを阻止する能力は好適な任意の技術によって測定することができる。例えば、実施例4、ならびに図3および6を参照すれば、DNAのフラグメンテーションによって示されるような心筋細胞または心筋様細胞系におけるアポトーシス阻止能によって測定することができる。これは特にMGFポリペプチドを発現するベクターで安定的にトランスフェクトされたH9C2などの心筋様細胞系でアッセイしてもよい。DNAのフラグメンテーションによって示されるようなアポトーシス阻止能は、細胞をソルビトールまたはその他の薬剤で処理して、例えば1、2、4、6、12、24または48時間、好ましくは12〜24時間、より好ましくは24時間以上、浸透圧ストレス下に置き、アポトーシスと関連したフラグメンテーションのパターンが観察できるかどうかを調べることにより、試験することができる。このようにして発現された本発明のMGFポリペプチドは、6、12または24時間のソルビトール処理後、非トランスフェクトまたは偽トランスフェクト(MGFコード配列を持たないベクター)と比べた場合に、これらの条件下でDNAフラグメンテーションを通常低下させ、好ましくは喪失させる。
【００４３】
アポトーシスのマーカーとして働く遺伝子の発現がないか、または低ければ、アポトーシスの阻止の指標としても役立ち得る。1つの好適なマーカーとしてBax遺伝子がある。同様に、アポトーシス条件下でMGFトランスフェクト細胞の抗アポトーシスマーカーの発現が上昇していれば、本発明のポリペプチドがアポトーシスを阻止している徴候と考えることができる。1つの好適な抗アポトーシスマーカー遺伝子としてBcl2がある。
【００４４】
また、このアポトーシス阻止能は、in vitroにおいて筋細胞の細胞数の減少を防ぐMGFポリペプチドの能力を基準として測定してもよい。例えば、MGFポリペプチドをコードするベクターで細胞をトランスフェクトして、それを過剰発現させることができる。次に、MGFトランスフェクト培養物と対照培養物の細胞総数をアポトーシス条件下で経時的に比較することができる。好ましくは、MGFトランスフェクト培養物では細胞の死滅が遅く、例えば24、48または72時間後のこれらの培養物中は最初の細胞数がより高割合で残る。例えば、24、48または72時間後に対照培養物よりもMGFトランスフェクト培養物では、最大5%以上、10%以上、20%以上、または50%以上の細胞が残っている。
【００４５】
本発明のMGFポリペプチドのもう1つの好ましい特性は、心筋細胞において肥大表現型を誘導する能力である。特に、これはin vitroにおいて心筋細胞一次培養物において肥大表現型を誘導する能力を評価することによって試験することができる。例えば、このような培養物を、MGFポリペプチドをコードするベクター、例えばプラスミドでトランスフェクトして、本発明のポリペプチドを過剰発現させ、肥大表現型を誘導する能力を判定することができる。これを判定するための好ましい方法としては、ANF(心房ナトリウム利尿因子)および／またはbMHC(βミオシン重鎖)の発現の増加を試験する。ANFは肥大状態でアップレギュレートされる胚性マーカー遺伝子である。bMHCは筋肉の重要な収縮性タンパク質である。
【００４６】
天然に存在するMGF配列を有するMGFポリペプチドが好ましい。しかし、同じ標準4-5-6エキソン構造と特性を有する変異型MGFを用いてもよい。
【００４７】
本発明のポリヌクレオチドの配列
本発明のポリペプチドは下記のようなポリヌクレオチドによってコードされ得る。
【００４８】
本発明のMGFポリペプチドは、本発明の機能的特性が維持される限り、配列番号2、4もしくは6で示されるアミノ酸配列もしくはそれらと実質的に相同な配列、またはこれらの配列のいずれかの断片のアミノ酸配列から本質的になるものであってよい。一般的に、配列番号2、4および6で示される天然に存在するアミノ酸配列が好ましい。しかし、本発明のポリペプチドは、本明細書で定義されたように、MGFの1以上の機能的特性を有する、天然配列の相同体、ならびに天然配列およびその相同体の断片を含む。
【００４９】
特に、本発明のポリペプチドは、
(a)配列番号2(図7、ヒトMGF)、4(図8、ラットMGF)、もしくは6(図9、ウサギMGF)のポリペプチド配列；
(b)(a)のポリペプチドに対して少なくとも70、80、90、95、98もしくは99%の相同性を有するポリペプチド配列；
(c)配列番号1、3、もしくは5のヒト、ラットもしくはウサギMGF DNAのエキソン5および6、もしくは4、5および6、もしくは3、4、5および6により全体的にもしくは部分的にコードされるアミノ酸を含む配列、または該配列に対して70%以上の相同性を有する配列；
(d)(a)、(b)または(c)の配列と選択的にハイブリダイズすることができる核酸配列によりコードされる配列；または
(e)(a)の配列の対立遺伝子変異体もしくは種相同体；
を含んでもよい。
【００５０】
対立遺伝子変異体
対立遺伝子変異体として、天然に存在し、かつ上記で定義したような配列番号2、4もしくは6のタンパク質と実質的に類似した方法で機能する変異体があり得る。同様に、タンパク質の種相同体として、他の種で天然に存在する同等のタンパク質があり得る。そのような相同体はいずれの種、好ましくは哺乳類の種に、例えば、ウシ、ウマ、ヒツジもしくはヤギ、ネコ、またはイヌなどのウシ科、ウマ科、ヒツジ科、ネコ科またはイヌ科の種に；またはラット(配列番号4)もしくはウサギ(配列番号6)以外の齧歯類の種に、またはヒト（配列番号2)以外の霊長類の種に存在し得る。非哺乳類MGF、例えば、魚類または鳥類MGF、例えばニワトリMGFも本発明のMGFである。いずれの種内でも、相同体は複数の対立遺伝子変異体として存在し得るので、これらは全て配列番号2、4または6のタンパク質の相同体と考えられる。
【００５１】
対立遺伝子変異体および種相同体は、当技術分野で公知の方法によって、例えば、好適な細胞供給源を配列番号1、3または5から得られたプローブを用いてプロービングすることによって得ることができる。得られたクローンを通常の技術によって操作することにより本発明のポリペプチドを作製することができ、それをそれ自体公知の組換えまたは合成技術によって産生させることができる。
【００５２】
相同体
本発明のポリペプチドは、配列番号2、4または6のタンパク質と、好ましくは少なくとも70%の相同性、より好ましくは少なくとも80または90%、そしてよりいっそう好ましくは少なくとも95、97または99%の相同性を、少なくとも20、好ましくは少なくとも30、例えば少なくとも40、60、または100以上の連続するアミノ酸の領域にわたって有する。タンパク質相同性を算出する方法は当技術分野で周知であり、当業者ならば、本明細書の文脈において、相同性がアミノ酸同一性に基づいて計算される(「ハードホモロジー(hard homology）」と呼ばれることもある）ことがわかるであろう。
【００５３】
相同性の程度は、ポリヌクレオチド配列について本明細書に述べられている周知の方法によって算出することができる。
【００５４】
配列番号2、4および6のポリペプチドならびに対立遺伝子変異体および種相同体の配列を改変して、さらなる本発明のポリペプチドを提供することができる。
【００５５】
置換
アミノ酸置換は、例えば、1、2もしくは3〜10、20もしくは30個の置換から形成されるものであり得る。例えば、全部で1、2、5、10もしくは20個までのアミノ酸を、ポリペプチド中の50、100もしくは200個のアミノ酸の長さにわたって置換してもよい。例えば、最大20個のアミノ酸を50個のアミノ酸の長さにわたって置換してもよい。改変したポリペプチドは一般的に、本明細書で定義したようなMGFの1以上の機能的特性を保持する。例えば次の表に従う保存的置換を形成してもよい。第2列の同じブロック中のアミノ酸、好ましくは第3列の同じ行のアミノ酸は互いに置換することができる。
【表１】
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【００５６】
断片
本発明のポリペプチドはまた、配列番号2、4および6で示される配列の断片をはじめとする、上記の全長ポリペプチドとその変異体の断片も含む。
【００５７】
好適な断片は一般的に、サイズが少なくとも約20、例えば少なくとも20、30、40、50、60、70、80、90または100個のアミノ酸である。配列番号2、4および6のポリペプチドならびにその対立遺伝子変異体および種変異体のポリペプチド断片は、保存的置換を含む1以上(例えば2、3、5、5〜10またはそれ以上)の置換、欠失または挿入を含有し得る。それぞれの置換、挿入または欠失は、任意の長さ、例えば1、2、3、4、5、5〜10または10〜20個のアミノ酸長であってよい。
【００５８】
特に、本発明の断片は、配列番号1、3または5のヒト、ラットまたはウサギDNAのエキソン5および6、または4、5および6によりコードされるアミノ酸を含んでもよい。エキソン4の第1のアミノ酸であるAsnは、一部はエキソン3(ヌクレオチド1個)により、また、一部はエキソン4(ヌクレオチド2個)によりコードされる。本発明の断片中にはこの第1のアミノ酸が存在することが好ましい。
【００５９】
キメラ配列
本発明のキメラポリヌクレオチド配列(以下参照)によりコードされるMGFポリペプチドを用いてもよい。
【００６０】
単離、精製および改変
本発明のポリペプチドは実質的に単離された形態であってもよい。ポリペプチドを、ポリペプチドの意図した目的を妨害しない担体または希釈剤と混合してもよく、それでもなお実質的に単離されているとみなされることはわかるであろう。本発明のポリペプチドはまた、実質的に精製された形態であってもよく、その場合、一般的に、調製物中のポリペプチドの70%を超えるもの、例えば80、90、95、98または99%を超えるものが本発明のポリペプチドであるように調製物中にポリペプチドを含んでなる。
【００６１】
本発明のポリペプチドは、それらの天然の細胞環境から外れた形態で提供してもよい。すなわち、本発明のポリペプチドは、上記で述べたように、実質的に単離もしくは精製されてもよいし、またはそれらが天然に存在しない細胞、例えば他の植物種、動物、酵母もしくは細菌の細胞内にあってもよい。
【００６２】
本発明のポリペプチドは、例えばヒスチジン残基またはT7タグの付加により改変してそれらの同定または精製を助けるように改変したり、またはシグナル配列の付加により改変してそれらの細胞からの分泌を促進するように改変したりしてもよい。
【００６３】
本発明のポリペプチドは検出標識を用いて標識することができる。検出標識は、ポリペプチドの検出を可能にする好適ないずれの標識であってもよい。好適な標識としては、放射性同位体、例えば125I、35S、酵素、抗体、ポリヌクレオチドおよびビオチンなどのリンカーが挙げられる。
【００６４】
本発明のポリペプチドは化学的修飾、例えば翻訳後修飾をしてもよい。例えば、本発明のポリペプチドは修飾アミノ酸残基を含んでもよい。また、MGFは天然にはグリコシル化されてないが、本発明のポリペプチドはグリコシル化(上記参照)されていてもよい。このような修飾ポリペプチドは本発明のポリペプチドであると理解される。
【００６５】
MGFの配列に対する改変の効果は好適ないずれかの方法によって試験することができる。例えば、変異体MGFの結合特性および／または安定性は、in vitroまたはin vivoで改変されていないMGFのものと比較することによって試験することができる。
【００６６】
ポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをコードする。
【００６７】
本発明の好ましいポリヌクレオチドは、本明細書で定義したように、MGFの1以上の機能的特性を有するポリペプチドをコードするコード配列を含んでなり、そのコード配列は、  (a)配列番号1、3または5のいずれか1つのコード配列；
(b)配列番号1、3または5のいずれか1つのエキソン5および6、または4、5および6、またはエキソン3、4、5および6のコード配列；
(c)(a)もしくは(b)の配列、または(a)もしくは(b)の配列と相補的な配列と選択的にハイブリダイズできる配列；
(d)(a)もしくは(b)の配列に対して70%以上の相同性を有する配列；
(e)(a)〜(d)のいずれか1つの配列の断片である配列；および
(e)(a)〜(d)のいずれか1つの配列と異なるが、遺伝暗号の縮重によって同じポリペプチドをコードする配列；
から選択される。
【００６８】
従って、本発明は、配列番号1、3または5のいずれか1つに示したコード配列を含むポリヌクレオチド、および関連する配列を有するその変異体を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドを使って本発明のベクターを調製することができる。
【００６９】
配列番号1、3および5
本発明の好ましいポリヌクレオチドは配列番号1、3および5に示すコード配列を含んでなる。
【００７０】
ハイブリダイズ可能な配列
本発明のポリヌクレオチドは配列番号1、3または5のコード配列と、バックグラウンドを有意に超えるレベルで選択的にハイブリダイズできる。バックグラウンドのハイブリダイゼーションは、例えばcDNAライブラリー内に存在する他のcDNAが原因で生じ得る。本発明のポリヌクレオチドと配列番号1、3、5、7、9または11のコード配列との間の相互作用により生じるシグナルレベルは、典型的には、他のポリヌクレオチドと配列番号1、3または5のコード配列との間の相互作用の少なくとも10倍、好ましくは少なくとも100倍の強度である。相互作用の強度は、プローブを例えば32Pを用いて放射性標識することにより測定することができる。選択的ハイブリダイゼーションは、典型的には、中〜高ストリンジェンシーの条件(例えば、0.03M塩化ナトリウムおよび0.03Mクエン酸ナトリウム、約50℃〜約60℃、例えば45〜50、50〜55、55〜60℃、例えば50または60℃)を用いて実施する。
【００７１】
しかし、このようなハイブリダイゼーションは当技術分野で公知のいずれの好適な条件下で行ってもよい(Sambrookら(1989)、Molecular Cloning：A Laboratory Manual参照）。例えば、高ストリンジェンシーが必要であれば、好適な条件としては、0.2 x SSX、60℃付近、例えば40〜50℃、50〜60℃または60〜70℃、例えば50または60℃が挙げられる。低ストリンジェンシーが必要であれば、好適な条件としては、2 x SSC、60℃付近、例えば40〜50℃、50〜60℃または60〜70℃、例えば50または60℃が挙げられる。
【００７２】
ストリンジェンシーは、典型的には、ほぼTm-5℃(お互いにハイブリダイズして二本鎖となる2つの配列の融解温度(Tm)より5℃下)からTmより約20〜25℃下までの範囲で生じる。従って、本発明によれば、ハイブリダイズ可能な配列は、Tm〜(Tm-25)℃、例えば、Tm〜(Tm-5)℃、(Tm-5)〜(Tm-10)℃、(Tm-10)〜(Tm-20)℃または(Tm-20)〜(Tm-25)℃の温度にて、配列番号1、3または5とハイブリダイズするものであり得る。
【００７３】
相同配列
本発明のポリヌクレオチド配列は、配列番号1、3または5のコード配列に対して少なくとも70%、好ましくは少なくとも80または90%、より好ましくは少なくとも95、98または99%相同なコード配列を含む。
【００７４】
このような相同性は好ましくは少なくとも20、好ましくは少なくとも50、例えば100〜500個以上連続したヌクレオチドの領域にわたって当てはまる。
【００７５】
核酸およびポリペプチドの相同性を測定する方法は当技術分野では周知である。これらの方法は本発明のポリペプチドおよび核酸の双方に対する相同性の測定に適用できる。例えば、UWGCGパッケージは、相同性を計算するために使用できるBESTFITプログラムを提供する(Devereuxら(1984), Nucleic Acids Research 12, 387-395頁）。
【００７６】
同様に、PILEUPおよびBLASTアルゴリズムを使って配列を並べることができる(例えば、Altschul, S.F., 1993, J. Mol. Evol. 30:290-300；Altschul, S.F.ら(1990) J. Mol. Biol. 215:403-410に記載)。
【００７７】
このようなプログラムでは、多くの異なる設定が可能である。本発明によれば、デフォルトの設定を用いることができる。
【００７８】
さらに詳細に説明すると、BLASTアルゴリズムは配列類似性を決定するのに好適であり、Altschulら(1990). J. Mol. Biol. 215:403-410に記載されている。BLAST分析を実行するためのソフトウェアは、バイオテクノロジー情報国立センター(National Center for Biotechnology Information）(http://www.ncbi/nlm.hih.gov/)を通じて公的に入手可能である。このアルゴリズムは、最初に、データベース配列中の同じ長さの文字列とアラインしたときに一致するかまたは何らかのポジティブ値の閾スコアTを満足するクエリー配列中の長さWの短い文字列を同定することによって高スコアを示す配列対(HSP)を同定することを要する。Tは隣接文字列スコア閾値(neighbourhood word score threshold)と呼ばれる(Altschulら,前掲)。これらの最初の隣接文字列ヒットは、それらを含有するHSPを見つける検索を開始するための種子として役立つ。文字列ヒットをそれぞれの配列に沿って両方向へ、累積アラインメントスコアが増加し得る限り伸長する。各方向の文字列ヒットの伸長が停止されるのは、累積アラインメントスコアが最高達成値から量Xだけ低下するか；累積スコアが1以上のネガティブスコア残基のアラインメントの累積によってゼロ以下になるか；またはいずれかの配列の末端に到達したときである。BLASTアルゴリズムパラメーターW、TおよびXはアラインメントの感度と速度を決定する。BLASTプログラムはデフォルト値として文字列長(W)=11、BLOSUM62スコアリングマトリックス(HenikoffおよびHenikoff (1992) Proc. Natl Acad Sci. USA 89:10915-10919を参照)アラインメント(B)=50、期待値(E)=10、M=5、N=4、および両鎖の比較を使用する。
【００７９】
BLASTアルゴリズムは2つの配列間の類似性の統計解析を実行する；例えば、KarlinおよびAltschul (1993) Proc. Natl. Sci. USA 90:5873-5787を参照。BLASTアルゴリズムにより提供される類似性の1つの基準は最小和確率(P(N))で、これは2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間で一致が偶然に起こり得る確率の指標を与える。例えば、ある核酸は、もしその試験核酸と融合核酸を比較したときの最小和確率が約1未満、好ましくは約0.1未満、より好ましくは約0.01未満、最も好ましくは約0.001未満であれば、融合遺伝子またはcDNAと類似しているとみなされる。
【００８０】
断片
また、上記(a)〜(d)の配列の断片であるが本発明に述べる特性を有するMGFポリペプチドをコードする配列も本発明の範囲に含まれる。
【００８１】
特に、断片は配列番号1、3または5のヒト、ラットまたはウサギMGF DNAのエキソン5および6、または4、5および6、またはエキソン3、4、5および6を含んでもよい。
【００８２】
エキソン4の第1のアミノ酸であるAsnは一部はエキソン3により、そして一部はエキソン4によりコードされる。エキソン3からの必須コード塩基が存在して前記第1のアミノ酸Asnをコードすることが好ましい。
【００８３】
縮重配列
また、(a)〜(e)の配列と異なるが遺伝暗号の縮重のために同じ保護ポリペプチドをコードする配列も本発明の範囲内に含まれる。例えば、本発明は、配列番号2、4および6のポリペプチドをコードする配列番号1、3および5の配列の縮重変異体を提供する。
【００８４】
相補的配列
さらに、本発明は上記配列のいずれかと相補的な配列を有するポリヌクレオチドを提供する。
【００８５】
キメラ配列
２以上の種に由来するエキソンを含んでなるキメラ配列も使用可能である。例えば、エキソン3〜6のうち1以上がヒト由来であり、1以上がラットおよび／またはウサギ由来であってよい。
【００８６】
その他の特性
本発明の核酸配列は、本発明のポリペプチドをコードする限り、いずれの長さのものであってもよい。本発明による核酸配列は、配列番号1、3もしくは5の配列の連続した断片、または該断片に上記のいずれかのように関係する配列であってよい。あるいは、本発明の核酸は、配列番号1、3または5の配列中で連続していないDNA配列を含むものでもよい。これらの配列は配列番号1、3もしくは5の配列の断片、またはこのような断片に上記のいずれかのように関係する核酸配列であってよい。本発明の核酸配列は、好ましくは、少なくとも50個の塩基または塩基対、例えば、50〜100、100〜500、500〜1000または1000〜2000個の塩基または塩基対を含むものでもよい。
【００８７】
上記の相同性の程度と最小サイズとの任意の組合せを用いて本発明のポリヌクレオチドを定義してもよく、よりストリンジェントな組合せ(例えば、より長い長さにわたるより高い相同性および／またはよりストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション)が好ましい。従って、例えば100個のヌクレオチドにわたって少なくとも90%相同であるポリヌクレオチドは本発明の一態様をなし、また100または200個のヌクレオチドにわたって少なくとも95%相同であるポリヌクレオチドも同様である。
【００８８】
本発明のポリヌクレオチドはDNAまたはRNAからなるものであってよい。それらはまた、合成または修飾ヌクレオチドをその中に含有するポリヌクレオチドであってもよい。ポリヌクレオチドに対する多数の異なるタイプの修飾が当技術分野では公知である。修飾は、例えばヌクレアーゼ耐性を増強し、かつ／または細胞に進入する能力を増強するものであってもよい。例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを用いてもよい。他のデオキシヌクレオチド類似体としては、メチルホスホネート、ホスホロアミデート、ホスホロジチオエート、N3'P5'-ホスホロアミデートおよびオリゴリボヌクレオチドホスホロチオエートならびにそれらの2'-O-アルキル類似体および2'-O-メチルリボヌクレオチドメチルホスホネートが挙げられる。さらに可能な修飾としては、該分子の3'および／または5'末端におけるアクリジンまたはポリリジン鎖の付加がある。
【００８９】
あるいは、混合主鎖オリゴヌクレオチド(MBO)を用いてもよい。MBOは、ホスホチオエートオリゴデオキシヌクレオチドのセグメントおよび適宜配置した修飾オリゴデオキシ-またはオリゴリボヌクレオチドのセグメントを含有する。MBOは、非イオン性でヌクレアーゼに対して非常に耐性があるメチルホスホネートまたは2'-O-アルキルオリゴリボヌクレオチドのような、ホスホロチオエート結合のセグメントおよび他の修飾オリゴヌクレオチドの他のセグメントを有する。本発明の目的のために、本明細書に記載のポリヌクレオチドは当技術分野で利用できるいずれの方法により修飾してもよいことがわかるであろう。このような修飾は、本発明のポリヌクレオチドのin vivo活性を増強するか、または寿命を引き延ばす目的で行ってもよい。
【００９０】
本発明のポリヌクレオチドを用いて、プライマー、例えば、選択的増幅反応用のプライマーであるPCRプライマー、プローブ、例えば、通常の手法により放射性もしくは非放射性標識を用いて検出標識により標識したプローブを作製してもよいし、ポリヌクレオチドをベクター中にクローニングしてもよい。このようなプライマー、プローブおよび他の断片は、好ましくは少なくとも10、好ましくは少なくとも15もしくは20、例えば少なくとも25、30もしくは40個のヌクレオチドの長さである。これらは、上記で述べたような種相同体および対立遺伝子変異体を同定するのに有用であろう。
【００９１】
本発明によるDNAポリヌクレオチドおよびプライマーなどのポリヌクレオチドは、組換え、合成、または当業者が利用可能ないずれの手段によって作製してもよい。それらはまた、標準技術によりクローニングしてもよい。ポリヌクレオチドは、典型的には単離したおよび／または精製した形態で提供される。
【００９２】
一般的に、プライマーは、所望の核酸配列を一度に１ヌクレオチドずつ段階的に製造することを含む合成的手法によって作製される。自動化技術を使ってこれを達成する技術は当技術分野で容易に利用できる。
【００９３】
例えばイントロンおよびプロモーター領域を含有する、配列番号1、3および5のcDNAに対応するゲノムクローンもまた本発明の態様であり、これは組換え手法を用い、例えばPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)によるクローニング技術を使って製造することができる。
【００９４】
MGFの4-5-6エキソンパターンは本発明のポリヌクレオチドの特徴である。このパターンをコード配列、そして従ってコードされるポリペプチドに確実に反映させるために、いずれの好適な方法を用いてもよい。例えば、イントロンおよびスプライスシグナルを欠いていてエキソン4、5および6のコード配列を含むcDNA配列を用いてもよい。あるいは、ゲノムDNAが手近な状況で正しくスプライシングされるのであれば、ゲノムDNAを用いてもよい。
【００９５】
一般的に本明細書に述べた技術は当技術分野で周知であるが、特にSambrookら(1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manuelを参照することができる。
【００９６】
上記で述べたように、本発明の配列に100%相同的ではないが本発明の範囲内にあるポリヌクレオチドは、多数の方法で、例えば、他の植物種からのcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーを配列番号1、3または5由来のプローブを用いてプロービングすることによって得ることができる。縮重プローブは、配列番号1、3または5のDNA配列と、中〜高ストリンジェンシー条件(例えば0.03M塩化ナトリウムおよび0.03Mクエン酸ナトリウム、約50〜約60℃にて)または他の好適な条件(例えば上記のような)の下でプロービングされる配列との間での縮重バリエーションの可能性を考慮に入れて、当技術分野で公知の手法により作製することができる。
【００９７】
対立遺伝子変異体および種相同体はまた、おそらく保存されているアミノ酸配列をコードする変異体および相同体内の配列を標的として設計したプライマーを用いる縮重PCRを使って得てもよい。おそらく保存されている配列は、本発明のアミノ酸配列(配列番号2、4または6)を互いに、かつ／または当技術分野で公知のいずれかの相同配列のアミノ酸配列とアラインすることにより推定することができる。これらのプライマーは1以上の縮重位置を含み、既知配列に対する単一配列プライマーを用いて配列をクローニングするために用いる場合より低いストリンジェンシー条件で用いられる。
【００９８】
あるいは、このようなポリヌクレオチドは、配列番号1、3または5の配列またはその対立遺伝子変異体の部位特異的突然変異誘発により得ることができる。これは、例えばポリヌクレオチド配列を発現させる特定の宿主細胞に対してのコドン選択性を最適化するために、配列にサイレントなコドン変化が必要な場合に有用であり得る。制限酵素認識部位を導入するため、またはポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの特性もしくは機能を変更するため、他の配列が所望される場合もある。
【００９９】
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドとその相補鎖を含んでなる二本鎖ポリヌクレオチドを提供する。
【０１００】
本発明のポリヌクレオチド、プローブまたはプライマーは検出標識を有していてもよい。好適な標識としては、32Pもしくは35Sなどの放射性同位体、酵素標識、またはビオチンなどの他のタンパク質標識が挙げられる。このような標識は、本発明のポリヌクレオチド、プローブまたはプライマーに付加してもよく、それ自体公知の技術を用いて検出することができる。
【０１０１】
本発明の治療
虚血および機械的過負荷
本発明の１つの目的は、本発明のMGFポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、またはその両者を用いて心筋のアポトーシスを阻止または制限することにより心臓の虚血または機械的過負荷に対応した心筋の損傷を阻止または制限することである。虚血は筋肉または他の器官へ酸素を含んだ血液を供給する動脈が閉塞した際に起こる。これにより影響を受けた器官の機能性が低下し、血液供給が減少した領域で細胞死を生じ得る。心臓では、虚血は冠状動脈の閉塞によって起こり得る。これにより、特定領域の心筋細胞には血液、従って酸素が届かなくなる。やがて、それらは死に向かう。これは、物理的に損傷を受けている領域で生き残っている心筋細胞に対する機械的負担が、それらが肥大および適応しない限り、大きくなることを意味する。このようにして酸欠の結果として、また、過度な機械的負担の結果としても、細胞死が起こる。細胞死、すなわちネクローシスの領域は梗塞として知られる。過負荷は、静脈の逆流ならびに数が少なくなった心筋細胞から必要とされる収縮力の上昇によって心筋の損傷部分が伸張することを意味する。心筋細胞が過剰に伸張されると、アクチンフィラメントとミオシンフィラメントが、重なり合わない位置まで引っ張られ、サルコメア(力を生じるユニット)が破壊されてしまう。
【０１０２】
心筋損傷の阻止を目的とする被験体へのMGFポリペプチドの送達
MGFポリペプチドは治療の必要な被験体にいずれかの好適な方法によって送達することができる。一般的にMGFポリペプチドは、安全かつ信頼性のある送達方法である静脈注射によって送達される。適当な臨床環境下(例えば、心臓専門チーム下)で、例えば、心臓へポリペプチドを送達するためのいわゆる「ニードルレス」インジェクションシステム(例えば、Powderjectにより提供)を用いた、心臓への直接送達も可能である。
【０１０３】
望ましくは、MGFポリペプチドは、虚血または心臓への機械的過負荷の発症後できるだけ早く、例えば虚血から生じる心臓発作が診断されたらすぐに、投与する。これは5、10、15、30もしくは60分以内、または2もしくは5時間以内に投与することが好ましい。ポリペプチドの再投与により長期治療も行えるが、MGFをコードするポリヌクレオチドの送達は次の目的であることが好ましい(下記を参照)。
【０１０４】
好ましくは、MGFポリペプチドまたはポリヌクレオチドを投与する対象の虚血または機械的過負荷は、一過性の状態である。
【０１０５】
特に好ましい実施形態では、MGFポリペプチドは心臓発作に対して投与される。本発明の治療は、心臓発作患者を良好に回復させ、通常の活動的な生活様式に復帰させる手助けをする上で特に効果的である。
【０１０６】
MGFポリペプチドの製造
MGFポリペプチドはいずれの好適な方法で製造してもよい。いくつかの実施形態では、MGFポリペプチドは動物組織から抽出することができる。しかし、MGFポリペプチドは組換え生産することが好ましい。これは既知の技術を用いて行うことができる。
【０１０７】
MGFポリペプチドに加えたMGFポリヌクレオチドの使用
短期送達と長期送達の双方が望ましい状況では、MGFポリペプチドだけでなく本発明のMGFポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを送達してもよい。MGFポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは該ポリペプチドと同時に送達してもよいし、別個に送達してもよい。それは同じ、または異なる医薬製剤として送達してもよいし、同じまたは異なる投与経路によって送達してもよい。MGFの半減期は短く、MGFのin vivo発現は局在化を容易にし、長期治療のための反復注射の必要がなくなる。本発明のポリヌクレオチド、特にプラスミドおよび他の裸の核酸については筋肉内投与が好ましい。
【０１０８】
ポリヌクレオチド送達のためのベクター
本発明のポリヌクレオチドはいずれの好適な方法で送達してもよい。特に、それらは一般的にはベクターによって送達される。いずれの好適なベクターを用いてもよい。
【０１０９】
ポリヌクレオチドは「裸(naked)」の形態で(例えば、プラスミドベクターで)送達してもよいし、所望により、以下に述べるように浸透を助ける薬剤と組み合わせて送達してもよい。あるいは、ベクターは核酸を封入するベクター、例えばウイルスであってもよい。ベクターは、例えばプラスミドもしくはコスミドベクター、または他のタイプのベクターであってもよい。
【０１１０】
ベクターは、受容被験体の細胞に感染し得るウイルスを含むベクターのようなウイルスベクターであってもよい。従って、ベクターはいずれの好適なウイルスであってもまたはそれに由来するものであってもよく、例えば、アルファウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、レトロウイルス(例えばレンチウイルス)ベクター、またはバキュロウイルスであってもよい。ウイルスベクターは、典型的には無傷のウイルスと同じ方法では複製できないかまたは病原作用を生じることができないという意味で、無力化される。ウイルスベクターは典型的には弱毒化され、例えば複製欠陥を有する。
【０１１１】
特に、「裸」の形態で、例えばプラスミドとして送達するとき、そのポリヌクレオチドを細胞の浸透を助ける薬剤と組み合わせてもよい。例としては、陽イオン剤(例えば陽イオン脂質)、ポリリシン、脂質、および沈降剤(例えばカルシウム塩)が挙げられる。このような薬剤は一般的に細胞膜を横切るポリヌクレオチドの通過を助ける。ポリヌクレオチドは、例えば上述の浸透剤のいずれかと組み合わせられたリポソームまたは粒子の形態であってもよい。ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドがヒストンなどのよりコンパクトな形態をとり得るようにする薬剤と組み合わせてもよい。ポリヌクレオチドはスペルミジンと組み合わせてもよい。
【０１１２】
同様に、リポソームを用いて本発明のポリヌクレオチドを細胞中に輸送するのを助けてもよい。
【０１１３】
ポリヌクレオチドは、バイオリスティック(biolistic)技術を用いてポリヌクレオチドを細胞中にまたは核中にすら送達するのに用いることができる担体と組み合わせてもよい。このような担体は、金またはタングステン粒子などの金属粒子であってもよい。
【０１１４】
典型的には、ポリヌクレオチドは受容者の細胞中で発現させることができるものである。従って、ポリヌクレオチドはまた、典型的には、本発明のMGFコード配列と機能的に連結された制御配列も含み、該制御配列は、例えば細胞のゲノム中にポリヌクレオチドが組み込まれた後で受容者の細胞内でコード配列を発現させることができる。
【０１１５】
制御配列は、典型的にはプロモーター(一般的にコード配列の5'側)および／またはターミネーターおよび／または翻訳開始配列(例えば、GCCACCATGG(配列番号7)またはGCCCCCATGG(配列番号8)）および／または翻訳停止コドン(例えば、TAA、TAGまたはTGA)および／またはポリアデニル化シグナルおよび／または1以上のエンハンサー配列および／またはRNA停止部位を含んでなる。制御配列はポリヌクレオチドの転写または翻訳を増強し得る。制御配列は、ポリヌクレオチドがある特定の組織でだけ発現するように組織特異的であってもよく、または構成的に発現される遺伝子の制御配列であってもよい。筋特異的プロモーターおよびエンハンサーが特に好ましい。制御配列は、典型的には本明細書で述べたいずれかの真核生物の制御配列、または、例えばヒト受容者に対するヒトウイルスのように受容者の生物種の真核生物に感染するウイルスの制御配列である。ポリヌクレオチドは複製起点を含んでもよい。
【０１１６】
プロモーターは、例えば、(特に哺乳類細胞における発現のためには)メタロチオネイン遺伝子プロモーター、SV40ラージT抗原プロモーター、CMVまたはアデノウイルスプロモーターであってもよい。
【０１１７】
組織特異的発現に関する限り、筋特異的プロモーターおよびエンハンサーなどの筋特異的制御エレメントが特に好ましく、とりわけ核酸を筋内に例えばプラスミド形態で送達する場合に好ましい。このようなエレメントは、例えばミオシン遺伝子から誘導することができる。例えば、ミオシン軽鎖または重鎖プロモーターを利用してもよいし、ミオシン軽鎖または重鎖エンハンサーを利用してもよい。
【０１１８】
これまでに、複数のミオシンエンハンサーおよびプロモーターがミオシン軽鎖およびミオシン重鎖遺伝子の両方から同定されている。好ましくは、使用するミオシンエンハンサーおよび／またはプロモーターは脊椎動物起源、より好ましくは鳥類、魚類または哺乳類起源である。
【０１１９】
ミオシン軽鎖エンハンサーが好ましい。ラットミオシン軽鎖1/3エンハンサー(Donoghueら(1988) Genes Dev. 2:1779-1790；Nevilleら(1996) Dev. Genetics 19:157-162）が特に好ましい。エンハンサーはプロモーターと機能的に連結されている。エンハンサーはプロモーターの上流または下流のいずれにあってもよい。エンハンサーはいずれの向きで用いてもよい。
【０１２０】
ミオシン重鎖プロモーターが好ましい。特に好ましいミオシン重鎖プロモーターは末端切断型のウサギβ-心臓ミオシン重鎖プロモーターであり、とりわけ転写開始部位の上流の789塩基対までを含むものである。別の既知のミオシン重鎖プロモーターとして、コイFG2プロモーターがあり、特に転写開始部位の上流の901塩基対までを含むものである(Gauvryら(1996) Eur. J. Biochem. 236:887-894）。ラット、ウサギ、ヒト、ブタおよびニワトリのミオシン重鎖遺伝子に由来するミオシン重鎖プロモーターのさらなる詳細は、Gauvryら(1996)およびその参考文献に記載されている。これらのプロモーターは全て、本発明において使用することができる。
【０１２１】
しかし、いずれの好適な調節エレメントを用いてもよく、上述のものは単に例に過ぎない。
【０１２２】
本発明に関して、患者の全体的状態に対して適当であるならば、本発明のMGFの導入は物理的活性と結びつけることができる。筋肉は運動に応答し、そして、ミオシンは筋肉中で最も豊富なタンパク質であるので、ミオシンプロモーター／エンハンサー調節エレメントは、cDNAの発現が筋活性の増加によりアップレギュレーションされることを意味する。
【０１２３】
プラスミドベクターと無力化ウイルスベクターが好ましい実施形態である。プラスミドベクターは特に好ましく、とりわけ筋肉内の局所的発現の確保を目的とする筋内投与に対して好ましい。
【０１２４】
ベクターは、受容者の細胞のゲノム中に安定して組込まれるように設計することができる。あるいは、組込まれないように設計することもできる。安定な導入では、ポリヌクレオチドが細胞のゲノム中に組込まれる(すなわちゲノムに隣接する)。従って、ポリヌクレオチドはまた、バクテリオファージP1 Cre組換え系のloxP部位、酵母FLP組換え系のFRT部位またはアデノ随伴ウイルス(AAV)末端反復配列などのポリヌクレオチドの組込みを促進する配列を含んでもよい。組込みはバクテリオファージP1由来のCre、酵母由来のFLPリコンビナーゼ、AAV Repタンパク質、CreもしくはFLPリコンビナーゼ、または細菌Recタンパク質などの存在する他の因子により増強され得る。一実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドはこのような因子を発現することができる。
【０１２５】
ポリヌクレオチドは、無作為に(例えば非配列特異的な方法で)ゲノムの任意の位置に組込むものであっても、またはゲノムの特定の部位に選択的に組込むものであってもよい。一般的に、このポリヌクレオチドの全コード配列と制御配列は、組込み後にゲノムに存在する。
【０１２６】
医薬組成物と製剤
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは製薬上許容される担体または希釈剤を含んでなる医薬製剤の形態で送達される。いずれの好適な製薬製剤を用いてもよい。
【０１２７】
例えば、好適な製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、殺菌抗生物質、および、製剤を意図する受容者の体液と等張にする溶質を含有し得る水性および非水性の無菌注射溶液；ならびに懸濁化剤および増粘剤を含有し得る水性および非水性の無菌懸濁液であってもよい。製剤は単位用量または多用量容器で提供してもよい。例えば、密閉アンプルおよびバイアルであってもよく、使用直前に無菌液体担体、例えば注射用水の添加を必要とするだけの凍結状態もしくは凍結乾燥状態で保存してもよい。
【０１２８】
以上詳細に述べた成分に加えて、本発明の製剤は、問題の製剤のタイプについて当技術分野において通常使われる他の薬剤を含んでもよいものと理解すべきである。無菌で、発熱物質を含まない水性および非水性溶液が好ましい。
【０１２９】
用量
本発明のタンパク質、ポリヌクレオチドおよびベクターはいずれの好適な用量で、いずれの好適な用量計画を用いて送達してもよい。当業者ならば、治療すべき特定の状態の最適な治療を確保するように多数の要因に応じて用量および計画を適合させ得ることじは十分理解しているであろう。このような要因としては、治療すべき被験体の年齢、性別および臨床状態が挙げられる。
【０１３０】
ベクターによる核酸の送達のために用いる用量は、ベクターが核酸を細胞に送達する効率、および核酸が細胞内で発現される効率を含む多くの要因に依存する。
【０１３１】
裸の核酸(例えば、プラスミドまたは他の裸の非ウイルスベクター）の送達については、典型的な用量は、1用量当たり0.1〜5000μg、例えば10〜1000μgであって、10〜100μg、100〜500μgおよび500〜2000μgなどである。
【０１３２】
指針として、ウイルスベクターを104〜1014cfu/mlもしくはpfu/ml、例えば104〜106、106〜108、108〜1010、1010〜1012または1012〜1014cfu/mlもしくはpfu/mlの用量で送達してもよい。105〜109cfu/mlもしくはpfu/mlの範囲の用量が好ましい。pfu(プラーク形成単位)とは、アデノウイルスを含む特定のウイルスに適用され、ウイルス溶液の感染力に対応し、適当な細胞培養を感染させて、一般的には48時間後に感染細胞のプラーク数を測定することにより決定される。cfu(コロニー形成単位)とは、レトロウイルスを含む他のウイルスに適用され、当技術分野で公知の方法により、一般的には選択マーカーとともに14日間インキュベーションした後に決定される。ウイルス溶液のcfuまたはpfu力価を決定する技術は当技術分野で周知である。
【０１３３】
レトロウイルスについては、105〜106cfu/mlの範囲の用量が特に好ましい。偽型レトロウイルスについては、107cfu/mlの範囲の用量が特に好ましい。アデノウイルスについては、109pfu/mlの範囲の用量が特に好ましい。
【０１３４】
本発明のMGFポリペプチドの送達については、好適な用量としては、1〜1000μg、10〜100μg、100〜500μgおよび500〜1000μgの用量が挙げられる。
【０１３５】
投与スケジュールはまた、例えば投与経路、受容者の生物種および受容者の状態によって異なる。しかし、MGFポリペプチドは典型的には上記で述べたように虚血、偶発的過負荷、または機械的過負荷後すぐに与えられる。所望により、さらなる用量を、例えば数日、数週、数ヶ月の期間にわたって拡張してもよい。しかし、上記で述べたように、in vivoで発現されるポリヌクレオチドの手段による送達は、被験体への注入の必要を最小限にするので、長期治療には有利である。
【実施例】
【０１３６】
心筋におけるMGFの調節を調べるするため、本発明者らはいくつかのin vivoおよびin vitroモデルを用いた。MGFの機能を確認するため、本発明者らは一連の「機能獲得実験」において心筋細胞でMGF遺伝子を過剰発現させた。
【０１３７】
実施例1：機能的虚血および過負荷の際のin vivoMGF発現の誘導
Yangら(1996)と同様に逆転写酵素PCR(RT-PCR)を用い、同じ特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、本発明者らは、ラットおよびヒツジの心臓の虚血後、梗塞領域のあたりにMGFが強く発現することを示した(図1B)。
【０１３８】
虚血状況において、梗塞領域の近くの生き残った心筋細胞は機能的に過負荷を受けるようになるので、この細胞死の2つの原因、すなわち、血液供給における酸素欠乏とそれに続いての、酸素欠乏によっていくらかが死滅した後に生き残った筋細胞に対する機械的負担の上昇の区別は困難である。大動脈に小結紮を作ることで(大動脈結紮; Dingら(2000))、心臓が一定の血圧を維持するために血液を排出する上でしなければならない仕事量が増大する。これは負荷後上昇と呼ばれ、高血圧や動脈閉塞(大動脈の壁にプラークが生じる)患者で見られる。心臓はよりハードな仕事をしなければならないので、この要求を満たすため筋肉の補償的応答として肥大が起こる。
【０１３９】
本発明者らはマウスに対してこのような動脈結紮を行い、この心臓肥大モデルにおいてMGFの発現が上昇するかどうかを調べた。図2に、偽手術対照に比べ、7日間結紮を行った3個体のマウス群で得られた結果を示す。図2は機能的に過負荷を受けた心筋細胞においてMGFの発現が顕著に誘導されることを示す。これに対し、肝型IGF-Iの発現が結紮後に上昇するということは見られなかった。
【０１４０】
ANFは肥大状態においてアップレギュレートされる胚性マーカー遺伝子である。結紮が、このモデルにおいて心肥大を示すANFの発現を誘導することがわかるであろう。また、Bax遺伝子の発現もアポトーシス中および病的状態においてアップレギュレートされるが、7日間大動脈結紮したマウスではこれは起こらなかった。このデータは、MGFの発現が機能的過負荷によって上昇すること、そして、肝型IGF-Iについての状況とは対照的に、この発現は過負荷後の初期回復段階と一致することを示している。本発明者らは、ラットおよびヒツジでも一過性虚血後すぐに同様の変化を検出し、MGFの発現は心筋細胞が機械的過負荷を受けている梗塞領域近傍で高いことを見出した(下記参照)。
【０１４１】
実施例2：一次心筋細胞におけるMGFのin vitro過剰発現
心臓の補償におけるMGFの役割をさらに確認するため、本発明者らは一次心筋細胞でMGFの発現を上昇させた。これはMGF cDNAを含むプラスミドを、新生仔マウスから調製した心筋細胞の一次培養物へトランスフェクトすることにより行った(Goldspinkら(1997))。
【０１４２】
トランスフェクション後の最初のアッセイは細胞数に変化があったかどうかを決定するものであった。筋細胞は、ひと度筋細胞系統へと方向付けられた以上は細胞分裂を起こさない最終分化した細胞である。細胞数の増加(過形成)はアッセイされた遺伝子発現の上昇を説明でき、それによりMGFが心肥大には関与しないであろうことが示唆される。骨格筋の場合とは違い、トランスフェクション後いずれの条件でも細胞数の増加は見られなかった。従って、心筋におけるMGFの役割は基本的に細胞分裂の誘導ではないと結論づけることができる。
【０１４３】
トランスフェクション後(72時間後)、細胞からRNAを抽出し、これを用いて胚性肥大マーカーANFの発現をアッセイした。図2には、トランスフェクトされた筋細胞におけるこれらの増殖／修復マーカー遺伝子の発現レベルをモニターするためのリアルタイムRT-PCRからの定量的データを示す。対応するL.IGF-I発現の上昇を伴わないMGFの発現の上昇は、それがアポトーシス条件下で誘導されるMGFイソ型であることを示す。
【０１４４】
実施例3：シグナル伝達経路の活性化に応答したMGF発現の誘導
心筋細胞においてどのシグナルがMGF発現をモジュレートするかを調べるため、数種の薬剤を心筋細胞培養物に適用した。次に、これらは直接的または受容体結合分子を介して間接的にシグナル伝達分子を活性化させる。このような薬剤の1つとして、タンパク質キナーゼCファミリーのセリン／トレオニンシグナル伝達キナーゼを特異的に活性化するホルボールエステルであるミリスチン酸酢酸ホルボール(PMA)がある。図4に示されるように、PMA(200nM)に短時間曝すと、内在するMGF遺伝子の発現の有意な上昇が起こる。MGFの量は、対照条件下での肝型IGFの量と比較すると、心筋細胞においてはかなり少ない。しかし、MGFのレベルはPMAに応答して有意に上昇するが、IGFのレベルには変化がない(図5A)。筋細胞培養物にPMAを加えたこと以外は同じ実験を、PMAの添加前24時間は培地を交換せずに繰り返したところ、新鮮培地とともにPMAを加えた場合よりもMGF発現の上昇は著しく大きかった(図5B)。
【０１４５】
これらのデータはタンパク質キナーゼCのアクチベーターであるPMAが心筋細胞において内在MGF遺伝子の発現を誘導することを示す。培地を交換しなかった条件では、その環境としては1つにはpHが上昇し、栄養素が減少する。これはいくつかの点で、筋細胞が、心臓のある領域への血流が断たれる虚血現象後に起こり得るのと類似の環境である。これらの条件下ではMGFの発現はいっそう上昇することがわかる。このことから、MGFは虚血により活性化されること、そして、一因をになうシグナル伝達分子の1つがタンパク質キナーゼCであることが示唆される。タンパク質キナーゼCファミリーの活性化は心臓におけるいくつかの肥大刺激または病理刺激に応答するものと考えられている。これらのシグナル伝達分子はまた、心筋細胞においてアポトーシス(細胞死)をもたらす現象において役割を果たすとも考えられている。
【０１４６】
また、これらの実験は、IGF-IとMGFが、異なるシグナル伝達経路を有する異なる増殖因子であることを示し、そのことから、それが、その発現が虚血後に明白に示されるMGFのイソ型であることが示唆される。
【０１４７】
実施例4：アポトーシス中のMGF発現の誘導
MGFがアポトーシスが起こっている条件下で活性化されるかどうかを決定するため、心筋細胞をソルビトールの存在下で培養した。これにより細胞は浸透圧ストレス下に置かれ、その結果細胞は膨張し、やがて死に至る。まず、ソルビトール添加前の24時間、筋細胞を血清を含まない規定の培地で培養した。ソルビトールに曝した後、RNAを抽出し、リアルタイムRT-PCRで遺伝子発現をアッセイした。図5に、ソルビトールに短時間(4時間)曝した後のMGFおよびIGF-I遺伝子発現の変化を示す。MGFの発現は最初増加することがわかるが、IGFは変化しない。もっと長く(24時間)ソルビトールに曝した後では、MGFの発現は対照と同じであるが、IGFのほうは上昇する。このことはMGFはIGF-Iと比べて動態が異なることを示し、それは、虚血／機械的過負荷後に明白に示されるのはMGF発現であるという考えをさらに支持するものである。Bax遺伝子発現の上昇もまた、細胞がアポトーシスを受けていることを示し、これはさらに24時間後ソルビトール処理した培養物におけるDNAフラグメンテーションの発生により証明された。
【０１４８】
アポトーシスの阻止におけるMGFの役割をさらに調べるため、心臓様細胞系(H9C2)(Kimesら(1976)、またAmerican Type Culture Collection PO Box 1549, Manassas, Virginia 20108, USAから商業的に入手可能)を、pcDNA3.1/NT-GFPベクター(Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Avenue, Carlsbad, California 92008, USA)およびSouthernら(1982)の技術を用い、MGFおよび肝型IGF cDNAで安定的にトランスフェクトした。安定的にトランスフェクトされた細胞系および非トランスフェクト対照を次にソルビトールで24時間処理し、DNAを抽出し、アポトーシスの指標であるDNAフラグメンテーションの程度を分析した。図6に、ソルビトールで処理後の24時間のDNA分析を示す。対照(非トランスフェクト)細胞から抽出したDNAは、アポトーシスに関連するフラグメンテーションの特徴的なパターンを示していることが明らかにわかるであろう。MGFおよびIGF cDNAで安定的にトランスフェクトされた細胞はDNAフラグメンテーションの徴候を示さず、そのことはそれらがアポトーシスを受けていないことを示す。この保護的特徴は心筋におけるIGFに関してこれまでにも記載されている(Yamashitaら,2001)が、MGFに関する記載はなかった。
【０１４９】
これらのデータはインスリン様増殖因子スプライス変異体であるMGFが心臓組織の損傷に応答して活性化されること、そして、それが修復機能を持つことを示している。従って、その投与は虚血／過負荷を受けた心臓に有益な心臓保護効果を有する。
【０１５０】
実施例5：MGFとL.IGF-Iペプチドは心筋細胞内に異なる形で蓄積することの証拠
これは、MGF受容体はおそらく核にあるが、IGF-IEa受容体は核にないこと、また、この2つのスプライス変異体の生物学的作用が異なることを示す。
【０１５１】
心筋細胞の一次培養物でMGFを発現させるため、アデノウイルス媒介遺伝子発現-AdEasyアデノウイルスベクター系(Stratagene)-を用いて、単離した筋細胞でMGFおよびL.IGF cDNAを発現させた。MGF L.IGF配列はpcDNA3.1/NT-GFPベクター(Invitrogen)のCMVプロモーターの下流にある、緑色蛍光タンパク質(GP5)とイン・フレームで存在した。このカセット全体を取り出し、ウイルスを生産するためpShuttleベクターへ連結した。このベクターは、ヒトアデノウイルス血清型5に由来するpAdEasyベクターとの相同組換えのための相同領域を有する。このウイルスはパッケージング遺伝子および宿主免疫遺伝子(E1およびE3)の欠損によって複製欠陥となっている。得られたウイルス／ベクター構築物を用いて293パッケージング細胞をトランスフェクトし、一次ウイルス原液を作製した。この一次原液を用いて293細胞への一連の感染によってウイルスを増幅した後、最終のウイルス原液をCsCl超遠心分離により精製した。最終のウイルス力価を分光光度法により定量したところ、1011〜1012粒子/mlのオーダーの精製ウイルス力価が得られた。これらの粒子を用い、108〜109粒子/mlの範囲で一次筋細胞を感染させた。
【０１５２】
一次心筋細胞へのウイルス感染24時間後、いくつかの顕著な知見が得られた。図1に、IGF-GFPウイルスの場合とは異なる、MGF-GPFウイルスの細胞内の局在を示す。GFPとの融合タンパク質を作製したので、蛍光顕微鏡で感染細胞を可視化するとMGF-GFPウイルスが離散して核に局在することが証明された(図14A)。これに対し、L.IGF-GFPウイルスは核にも存在するが、さらに細胞の細胞質にも同様に発現した(図14B)。
【０１５３】
筋細胞の核がMGFを発現していたことを確認するため、ウイルス細胞を、核内のクロマチンと結合するジア(DAPI)で対比染色したところ、蛍光を伴って観察することができた。図15に染色の結果を示す。この染色のパターンにより核内でのMGFの発現が確認できる。
【０１５４】
最初の感染期間の後、MGFの過剰発現の効果を調べるために筋細胞をもっと長い期間にわたり感染させた。細胞をプレーティングし、MGFウイルスおよび対照としてGFP発現ウイルスを48時間にわたり感染させた。感染後、細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、筋フィラメントを可視化するためテキサスレッド結合ファロイジン(Molecular Probes)で、また、核を可視化するためにDAPIで対比染色した。図16に48時間感染させた結果を示す。感染させていない対照筋細胞では、線条筋フィラメントの存在がファロイジン染色によって認められる(図16A)。同様に、GFP発現対照ウイルスに感染させた筋細胞では、筋フィラメントは、それらが線条を呈していることに基づけば無傷なままである(図16B)。しかし、MGF感染筋細胞では、ファロイジンで染色した場合に筋フィラメントにおいて線条は見られず、これは筋フィラメントタンパク質は分解されていることを示唆する(図16CおよびD)。
【０１５５】
筋フィラメントタンパク質の明らかな分解をさらに調べるため、いくつかの筋フィラメントタンパク質のmRNA発現レベルをRT-PCRを用いて分析した。全RNAを対照筋細胞から抽出し、また筋細胞を48時間にわたりMGFウイルスに感染させた。通常のRT-PCRを用いて、いくつかの筋フィラメントタンパク質の発現が見られた。図17に、太いフィラメントタンパク質(ミオシン重鎖および軽鎖)と細いフィラメントタンパク質(アクチン、トロポミオシンおよびトロポニンT)の電気泳動後の結果を示す。MGF感染細胞において太いフィラメントタンパク質のダウンレギュレーションが明らかに見られるが、細いフィラメントタンパク質は影響を受けているようには見えない。4種類の異なる培養物を感染させていない対照として用い、さらに4種類の異なる培養物をMGFウイルスに感染させた。
【０１５６】
太いフィラメントタンパク質の発現の抑制のさらなる分析は定量的RT-PCRを用いて行った。図18に、α-ミオシン重鎖(齧歯類の心臓で発現される優勢イソ型)の発現がMGF感染筋細胞において100倍以上低下することを示す。
【０１５７】
これらのデータはMGFの発現が心筋細胞の核に局在化されるが、IGFの発現は細胞全体であることを示している。心筋細胞におけるMGFの発現の長期化は、筋フィラメントの細いフィラメントタンパク質ではなく、太いフィラメントタンパク質の抑制と関係がある。この結果、アクチン細胞骨格は無傷のままであるが、筋細胞内の筋フィラメントの横紋がなくなる。この筋肉特異的タンパク質の選択的ダウンレギュレーションは本質的に筋細胞を脱分化させる働きをするが、これはその最終分化状態から細胞周期に入るために必要なステップであり得る。従って、MGFの発現の結果、梗塞領域の再構築が起こること、すなわち、本発明によれば、MGFは心臓の虚血または機械的過負荷に対応した心筋の損傷を阻止または制限するのに有用であることがわかるであろう。
【０１５８】
実施例6：筋肉損傷後の損傷再生およびMGFおよびIGF-IEaの発現の時間的経過
この実施例は、MGFおよびL.IGF-Iが異なる発現動態を示すことを証明する。筋肉損傷は機械的手段により、また筋毒性剤によって誘導した。結果は明らかに、MGFは損傷後間もなく産生されるが、L.IGF-IEaは数日後に発現したことを示した。
【０１５９】
筋肉損傷は機械的手段、すなわち、伸張と刺激、および筋毒性剤ブピバカインの注射によって誘導した。
【０１６０】
図19では、筋肉切片全体に対する損傷再生筋繊維領域の平均パーセンテージを両損傷モデルにおいて評価する。
【０１６１】
ブピバカインを注射して4日後、および伸張・刺激の5日後(両場合とも最大の損傷が示された時点)に損傷再生領域の継続的低減が見られる(図19A)。両モデルとも、再生領域を染色する胚性ミオシン重鎖を用いた場合でも同じパターンが見られた(図19B)。二元配置分散分析(ANOVA)を用いて平均値間の有意差を決定した。各時点でブピバカインモデルはN=4、伸張／刺激モデルではN=6であった。0時間において試験筋は非処理動物の筋と同等であり、損傷後15日まで全ての差がP<0.01で有意であった。
【０１６２】
図20は、筋肉損傷の2つのモデルにおいてMGFおよびIGF-IEaのmRNAレベルを調べた結果を示している。
【０１６３】
MGFは伸張および刺激後1日、そして、ブピバカイン注射後4日といった早期に最大発現したが(図20A)、肝型IGF-IEaは損傷後7日および11日で最大発現した(図20B)。二元配置分散分析(ANOVA)を用いて平均値間の有意差を決定した。各時点で伸張／刺激モデルではN=6、ブピバカインモデルはN=4であった。MGF測定値は5日まではP>0.01レベルで有意であり、肝型IGF-IEaでは11日までは有意であった。
【０１６４】
これにより、心臓保護をもたらすのはIGF-IEaイソ型ではなくMGFイソ型であるというさらなる証拠が得られた。
【０１６５】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【０１６６】
【図１】IGF-I遺伝子の選択的スプライシングを示す。
【図２】大動脈結紮心臓におけるMGF発現の誘導を示す。
【図３】MGFの過剰発現による肥大マーカー遺伝子の誘発を示す。
【図４】心筋細胞におけるMPAに応答したMGF発現の誘発を示す。
【図５】アポトーシス条件下での心筋細胞におけるMGFの発現を示す。
【図６】MGFおよびL.IGFでトランスフェクトされた心臓細胞系におけるアポトーシスの誘発を示す。
【図７】ヒトMGFのcDNAおよびアミノ酸配列(そのエキソン構造を示す)を示す。
【図８】ラットMGFのcDNAおよびアミノ酸配列(そのエキソン構造を示す)を示す。
【図９】ウサギMGFのcDNAおよびアミノ酸配列(そのエキソン構造を示す)を示す。
【図１０】ヒトL.IGF-IのcDNAおよびアミノ酸配列(そのエキソン構造を示す)を示す。
【図１１】ラットL-IGF-IのcDNAおよびアミノ酸配列(そのエキソン構造を示す)を示す。
【図１２】ウサギL-IGF-IのcDNAおよびアミノ酸配列(そのエキソン構造を示す)を示す。
【図１３】ヒト、ラットおよびウサギMGFおよびL-IGF-Iのエキソン構造を示す配列アライメントを示す。類似点と相違点が強調表示されている。
【図１４】24時間MGFおよびIGFウイルスに感染させた心筋細胞を示す。
【図１５】MGFおよびIGFウイルスに感染させた心筋細胞およびDAPIによる対比染色を示す。
【図１６】MGFおよび対照GFP発現ウイルスに48時間にわたり感染させた心筋細胞を示す。
【図１７】心筋細胞における48時間MGFウイルス感染後のRT-PCRによる太いフィラメントと細いフィラメントの分析を示す。
【図１８】MGFウイルス感染の48時間後の心筋細胞におけるαMHC発現の定量分析を示す。
【図１９】2つの損傷モデルにおける筋切片全体に対する損傷再生筋線維領域の平均パーセンテージを示す。
【図２０】筋損傷の2つのモデルにおけるMGFおよびIGF-IEaイソ型のmRNAレベルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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