(57)【要約】Ｄ体ポリヌクレオチド配列部分と、そのＤ体ポリヌクレオチド配列部分に共有結合しているＬ体ポリヌクレオチド配列部分とを含む、へテロ配座ポリヌクレオチドを利用する、方法が、本明細書中で開示される。このヘテロ配座ポリヌクレオチドを利用する、組成物、およびキットもまた、本明細書中で開示される。５〜１００個のＬヌクレオチドを含む異なる配列のポリヌクレオチドのアレイもまた、本明細書中で開示され、そのポリヌクレオチドは、固体支持体上のアドレス可能な位置に固定化されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチド組成物であって、
ヘテロ配座ポリヌクレオチドを含み、
該へテロ配座ポリヌクレオチドは、Ｄ体ポリヌクレオチド配列部分と、該Ｄ体ポリヌクレオチド配列部分に共有結合しているＬ体ポリヌクレオチド配列部分と、
を含む、ポリヌクレオチド組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物であって、前記Ｌ体ポリヌクレオチド配列部分が、５〜５０個のＬヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の組成物であって、前記Ｄ体ポリヌクレオチド配列部分が、５〜５０個のＤヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項４】
請求項３に記載の組成物であって、前記Ｌ体ポリヌクレオチド配列部分が、５〜５０個のＬヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項５】
請求項１〜４のうちのいずれか１項に記載の組成物であって、前記Ｌ体ポリヌクレオチド配列部分が、少なくとも１つのＬ体２’−４’ＬＮＡヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項６】
請求項１〜４のうちのいずれか１項に記載の組成物であって、前記Ｌ体ポリヌクレオチド配列部分は、少なくとも１つのＬ体ヌクレオチドを含み、該Ｌ体ヌクレオチドは、１’−α−アノマーヌクレオチドまたは４’−α−アノマーヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項７】
請求項１〜４のうちのいずれか１項に記載の組成物であって、前記Ｌ体ポリヌクレオチド配列部分は、少なくとも１つのＬ体ヌクレオチドを含み、該Ｌ体ヌクレオチドは、１’−βアノマー配座にてリボース、アラビノース、キシロース、またはピラノースを含む、組成物。
【請求項８】
請求項１〜４のうちのいずれか１項に記載の組成物であって、前記Ｌ体ポリヌクレオチド配列部分は、少なくとも１つのＬ体ヌクレオチドを含み、該Ｌ体ヌクレオチドは、１’−αアノマー配座にてリボース、アラビノース、キシロース、またはピラノースを含む、組成物。
【請求項９】
請求項１〜４のうちのいずれか１項に記載の組成物であって、前記Ｌ体ポリヌクレオチド配列部分は、少なくとも１つのＬ体ヌクレオチドを含み、該Ｌ体ヌクレオチドは、リボース、２’−デオキシリボース、２’，３’−ジデオキシリボース、２’−フルオロリボース、２’−クロロリボース、または２’−Ｏ−メチルリボースを含む、組成物。
【請求項１０】
請求項１〜９のうちのいずれか１項に記載の組成物であって、前記Ｄ体ポリヌクレオチド配列部分が、少なくとも１つのＤ体２’−４’ＬＮＡヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項１１】
請求項１〜９のうちのいずれか１項に記載の組成物であって、前記Ｄ体ポリヌクレオチド配列部分が、少なくとも１つのＬ体ヌクレオチドを含み、該Ｌ体ヌクレオチドは、１’−α−アノマーヌクレオチドまたは４’−α−アノマーヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項１２】
請求項１〜９のうちのいずれか１項に記載の組成物であって、前記Ｄ体ポリヌクレオチド配列部分が、少なくとも１つのＬ体ヌクレオチドを含み、該Ｌ体ヌクレオチドは、１’−βアノマー配座にてリボース、アラビノース、キシロース、またはピラノースを含む、組成物。
【請求項１３】
請求項１〜９のうちのいずれか１項に記載の組成物であって、前記Ｄ体ポリヌクレオチド配列部分が、少なくとも１つのＬ体ヌクレオチドを含み、該Ｌ体ヌクレオチドは、１’−αアノマー配座にてリボース、アラビノース、キシロース、またはピラノースを含む、組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１３のうちのいずれか１項に記載の組成物であって、前記Ｄ体ポリヌクレチド配列部分が、少なくとも１つのＬ体ヌクレオチドを含み、該Ｌ体ヌクレチド配列部分は、リボース、２’−デオキシリボース、２’，３’−ジデオキシリボース、２’−フルオロリボース、２’−クロロリボース、または２’−Ｏ−メチルリボースを含む、組成物。
【請求項１５】
請求項１〜１４のうちのいずれか１項に記載の組成物であって、前記Ｄ体ポリヌクレチド配列部分および前記Ｌ体ポリヌクレオチド配列部分のうちの少なくとも１つが、ヌクレオチド間結合を含み、該ヌクレオチド間結合は、２−アミノエチルグリシン、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、およびホスホロアミデートから選択される、組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１５のうちのいずれか１項に記載の組成物であって、前記ヘテロ配座ポリヌクレオチドが、核酸塩基を含み、該核酸塩基は、ウラシル、チミン、シトシン、アデニン、７−デアザアデニン、グアニン、および７−デアザグアノシンから選択される、組成物。
【請求項１７】
請求項１〜１５のうちのいずれか１項に記載の組成物であって、前記ヘテロ配座ポリヌクレオチドが、核酸塩基を含み、該核酸塩基は、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、プソイドウリジン、Ｃ−５−プロピン、イソシトシン、イソグアニン、および２−チオピリミジンから選択される、組成物。
【請求項１８】
請求項１〜１７のうちのいずれか１項に記載の組成物であって、前記Ｌ体ポリヌクレオチド配列部分にハイブリダイズしている第１の相補ポリヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項１９】
請求項１８に記載の組成物であって、前記第１の相補ポリヌクレオチドが、少なくとも１つのＬ体ヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項２０】
請求項１８に記載の組成物であって、前記第１の相補ポリヌクレオチドが、Ｌ体２’デオキシリボースまたは２’−４’ＬＮＡヌクレオチドを少なくとも１つ含む、組成物。
【請求項２１】
請求項１８に記載の組成物であって、前記第１の相補ポリヌクレオチドが、少なくとも２つのペプチド核酸サブ単位を含む、組成物。
【請求項２２】
請求項１８〜２１のうちのいずれか１項に記載の組成物であって、前記第１の相補ポリヌクレオチドが、固体支持体に結合している、組成物。
【請求項２３】
請求項２２に記載の組成物であって、前記固体支持体が、ポリスチレン、ガラス、シリカゲル、シリカ、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリアミド、ポリエチレン、ポリエチレンオキシ、またはナイロンを含む、組成物。
【請求項２４】
請求項２２または請求項２３に記載の組成物であって、前記固体支持体が、小粒子、ビーズ、膜、フリット、スライド、プレート、微細機械加工されたチップ、アルカンチオール−金層、非多孔性表面、アドレス可能なアレイ、またはゲルを含む、組成物。
【請求項２５】
請求２４に項記載の組成物であって、前記固体支持体が、ビーズを含む、組成物。
【請求項２６】
請求項２５に記載の組成物であって、前記固体支持体が、ポリスチレンビーズを含む、組成物。
【請求項２７】
請求項２３に記載の組成物であって、前記固体支持体が、ナイロン膜を含む、組成物。
【請求項２８】
請求項２４に記載の組成物であって、前記固体支持体が、ナノ粒子、ミクロスフェア、またはリポソームから選択される小粒子を含む、組成物。
【請求項２９】
請求項２２に記載の組成物であって、前記固体支持体が、ガラスを含む、組成物。
【請求項３０】
請求項２２〜２９のうちのいずれか１項に記載の組成物であって、前記第１の相補ポリヌクレオチドが、切断可能なリンカーを介して前記支持体に結合している、組成物。
【請求項３１】
請求項３０に記載の組成物であって、前記切断可能なリンカーは、カルボニル基を含み、該カルボニル基を介して、前記第１の相補ポリヌクレオチドが前記支持体と連結している、組成物。
【請求項３２】
請求項１〜３１のいずれか１項に記載の組成物であって、前記Ｄ体ポリヌクレオチド配列部分にハイブリダイズしている第２の相補ポリヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項３３】
請求項１〜３２のいずれか１項に記載の組成物であって、検出可能な標識を含む、組成物。
【請求項３４】
請求項３３に記載の組成物であって、前記標識が、蛍光色素、蛍光クエンチャー、エネルギー移動対、量子ドット、または化学発光前駆体を含む、組成物。
【請求項３５】
請求項３４に記載の組成物であって、前記標識が、フルオレセイン、ローダミン、またはシアニンを含む、組成物。
【請求項３６】
請求項３３〜３５のうちのいずれか１項に記載の組成物であって、前記標識が、前記Ｄ体ポリヌクレオチド配列部分にハイブリダイズしている第２の相補ポリヌクレオチドと結合している、組成物。
【請求項３７】
５〜１００個のＬヌクレオチドを含む異なる配列のポリヌクレオチドのアレイであって、該ポリヌクレオチドは、固体支持体上のアドレス可能な位置に固定化されている、アレイ。
【請求項３８】
請求項３７に記載のアレイであり、前記固体支持体が、ポリスチレン、ガラス、シリカゲル、シリカ、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリアミド、ポリエチレン、ポリエチレンオキシ、またはナイロンを含む、アレイ。
【請求項３９】
請求項３７に記載のアレイであって、前記固体支持体が、小粒子、ビーズ、膜、フリット、スライド、プレート、微細機械加工されたチップ、アルカンチオール−金層、非多孔性表面、アドレス可能なアレイ、またはゲルを含む、アレイ。
【請求項４０】
請求項３９に記載のアレイであって、前記固体支持体が、ビーズを含む、アレイ。
【請求項４１】
請求項４０に記載のアレイであって、前記固体支持体が、ポリスチレンビーズを含む、アレイ。
【請求項４２】
請求項３９に記載のアレイであって、前記固体支持体が、ナイロン膜を含む、アレイ。
【請求項４３】
請求項３９に記載のアレイであって、前記固体支持体が、ナノ粒子、ミクロスフェア、またはリポソームから選択される小粒子を含む、アレイ。
【請求項４４】
請求項３９に記載のアレイであって、前記固体支持体が、ガラスを含む、アレイ。
【請求項４５】
請求項３７〜４４のうちのいずれか１項に記載のアレイであって、前記第１の相補ポリヌクレオチドが、切断可能なリンカーを介して前記支持体に結合している、アレイ。
【請求項４６】
請求項４５に記載のアレイであって、前記切断可能なリンカーは、カルボニル基を含み、該カルボニル基を介して、前記第１の相補ポリヌクレオチドが前記支持体と連結している、アレイ。
【請求項４７】
請求項３７〜４６のうちのいずれか１項に記載のアレイであって、前記固体支持体が、９６ウェルフォーマットとして構成されている、アレイ。
【請求項４８】
請求項３７〜４７のうちのいずれか１項に記載のアレイであって、少なくとも１つのポリヌクレオチドが、標識を含む、アレイ。
【請求項４９】
請求項４８に記載のアレイであって、前記標識が、蛍光色素、クエンチャー、エネルギー移動色素、量子ドット、ジゴキシゲニン、ビオチン、移動度改変剤、ポリペプチド、ハイブリダイゼーション安定化部分、または化学発光前駆体を含む、アレイ。
【請求項５０】
請求項４９に記載のアレイであり、少なくとも１つの固定化されたポリヌクレオチドが、構造：
【化１】
2005516595.tif 000031
を含み、この構造において、Ｓは、固体支持体であり；
Ａは、リンカーであり；
Ｘは、３つ以上の結合部位を含むリンカーであり；
Ｙは、Ｏ、ＮＨ、ＮＲ、またはＳであり、Ｒは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６置換アルキル、Ｃ５〜Ｃ１４アリール、およびＣ５〜Ｃ１４置換アリールから選択され；
Ｌは、水素または標識であり；
ＮＬは、Ｌ体ヌクレオチドの配列であり；
ＮＤは、Ｄ体ヌクレオチドの配列であり；
ｍは、０〜１００の整数であり；そして
ｎは、５〜１００の整数であり；そして
ｑは、０〜１００の整数である、
アレイ。
【請求項５１】
請求項５０に記載のアレイであって、Ａが、切断可能なリンカーである、アレイ。
【請求項５２】
請求項５１に記載のアレイであって、Ａが、構造：
【化２】
2005516595.tif 000032
のうちの１つ以上を含む、アレイ。
【請求項５３】
請求項５０に記載のアレイであって、（ＮＤ）ｍおよび（ＮＬ）ｎ、ならびに（ＮＬ）ｎおよび（ＮＤ）ｑ、が、互いにリンカーによって連結している、アレイ。
【請求項５４】
請求項５３に記載のアレイであって、前記リンカーが、１つ以上のエチレンオキシ単位を含む、アレイ。
【請求項５５】
請求項５０に記載のアレイであって、ｍ＝０である、アレイ。
【請求項５６】
請求項５０に記載のアレイであって、ｍ＝ｑ＝０である、アレイ。
【請求項５７】
ポリヌクレオチドハイブリッドを形成する方法であって、該方法は、
ヘテロ配座ポリヌクレオチドを提供する工程であって、該ヘテロ配座ポリヌクレオチドは、Ｄ体ポリヌクレオチド配列部分と、該Ｄ体ポリヌクレオチド配列部分に共有結合しているＬ体ポリヌクレオチド配列部分とを含む、工程、および
該ヘテロ配座ポリヌクレオチドを第１の相補ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせて、該第１の相補ポリヌクレオチドと該Ｌ体ポリヌクレオチド配列部分との間で二重鎖を形成する工程、
を包含する、方法。
【請求項５８】
請求項５７に記載の方法であって、前記Ｌ体ポリヌクレオチド配列部分が、５〜５０個のＬヌクレオチドを含む、方法。
【請求項５９】
請求項５７に記載の方法であって、前記Ｄ体ポリヌクレオチド配列部分が、５〜５０個のＤヌクレオチドを含む、方法。
【請求項６０】
請求項５９に記載の方法であって、前記Ｌ体ポリヌクレオチド配列部分が、５〜５０個のＬヌクレオチドを含む、方法。
【請求項６１】
請求項５７〜６０のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記Ｌ体ポリヌクレオチド配列部分が、少なくとも１つのＬ体２’−４’ＬＮＡヌクレオチドを含む、方法。
【請求項６２】
請求項５７〜６０のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記Ｌ体ポリヌクレオチド配列部分が、少なくとも１つのＬ体ヌクレオチドを含み、該Ｌ体ヌクレオチドは、１’−α−アノマーヌクレオチドまたは４’−α−アノマーヌクレオチドを含む、方法。
【請求項６３】
請求項５７〜６０のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記Ｌ体ポリヌクレオチド配列部分が、少なくとも１つのＬ体ヌクレオチドを含み、該Ｌ体ヌクレオチドは、１’−βアノマー配座にてリボース、アラビノース、キシロース、またはピラノースを含む、方法。
【請求項６４】
請求項５７〜６０のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記Ｌ体ポリヌクレオチド配列部分が、少なくとも１つのＬ体ヌクレオチドを含み、該Ｌ体ヌクレオチドは、１’−αアノマー配座にてリボース、アラビノース、キシロース、またはピラノースを含む、方法。
【請求項６５】
請求項５７〜６０のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記Ｌ体ポリヌクレオチド配列部分が、少なくとも１つのＬ体ヌクレオチドを含み、該Ｌ体ヌクレオチドは、リボース、２’−デオキシリボース、２’，３’−ジデオキシリボース、２’−フルオロリボース、２’−クロロリボース、または２’−Ｏ−メチルリボースを含む、方法。
【請求項６６】
請求項５７〜６５のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記Ｄ体ポリヌクレオチド配列部分が、少なくとも１つのＤ体２’−４’ＬＮＡヌクレオチドを含む、方法。
【請求項６７】
請求項５７〜６５のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記Ｄ体ポリヌクレオチド配列部分が、少なくとも１つのＬ体ヌクレオチドを含み、該Ｌ体ヌクレオチドは、１’−α−アノマーヌクレオチドまたは４’−α−アノマーヌクレオチドを含む、方法。
【請求項６８】
請求項５７〜６５のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記Ｄ体ポリヌクレオチド配列部分が、少なくとも１つのＬ体ヌクレオチドを含み、該Ｌ体ヌクレオチドは、１’−β−アノマー配座にてリボース、アラビノース、キシロース、またはピラノースを含む、方法。
【請求項６９】
請求項５７〜６５のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記Ｄ体ポリヌクレオチド配列部分が、少なくとも１つのＬ体ヌクレオチドを含み、該Ｌ体ヌクレオチドは、１’−α−アノマー配座にてリボース、アラビノース、キシロース、またはピラノースを含む、方法。
【請求項７０】
請求項５７〜６９のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記Ｄ体ポリヌクレオチド配列部分が、少なくとも１つのＬ体ヌクレオチドを含み、該Ｌ体ヌクレオチドは、リボース、２’−デオキシリボース、２’，３’−ジデオキシリボース、２’−フルオロリボース、２’−クロロリボース、または２’−Ｏ−メチルリボースを含む、方法。
【請求項７１】
請求項５７〜７０のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記Ｄ体ポリヌクレオチド配列部分および前記Ｌ体ポリヌクレオチド配列部分のうちの少なくとも１つが、ヌクレオチド間結合を含み、該ヌクレオチド間結合は、２−アミノエチルグリシン、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、およびホスホロアミデートから選択される、方法。
【請求項７２】
請求項５７〜７２のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記第１の相補ポリヌクレオチドが、少なくとも１つのＬ体ヌクレオチドを含む、方法。
【請求項７３】
請求項５７〜７２のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記第１の相補ポリヌクレオチドが、Ｌ体２’デオキシリボースまたは２’−４’ＬＮＡヌクレオチドを少なくとも１つ含む、方法。
【請求項７４】
請求項５７〜７２のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記第１の相補ポリヌクレオチドが、少なくとも２つのペプチド核酸サブ単位を含む、方法。
【請求項７５】
請求項５７〜７２のうちのいずれか１項に記載の方法であって、ハイブリダイズしていない第１の相補ポリヌクレオチドが、前記ハイブリッドから分離される、方法。
【請求項７６】
請求項７５に記載の方法であって、前記ハイブリッドを検出する工程をさらに包含する、方法。
【請求項７７】
請求項５７〜７６のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記ヘテロ配座ポリヌクレオチドのプライマー伸長を包含する、方法。
【請求項７８】
請求項５７〜７６のうちのいずれか１項に記載の方法であって、ヌクレアーゼ酵素による前記ヘテロ配座ポリヌクレオチドの切断を包含する、方法。
【請求項７９】
請求項５７〜７６のうちのいずれか１項に記載の方法であって、ヘテロ配座ポリヌクレオチドと、該ヘテロ配座ポリヌクレオチドの末端に隣接してハイブリダイズしているポリヌクレオチドとの連結反応を包含する、方法。
【請求項８０】
請求項５７〜７９のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記ハイブリッドが、固体支持体上に固定化される、方法。
【請求項８１】
キットであって、
請求項１〜１７のうちのいずれか１項に記載のヘテロ配座ポリヌクレオチド、および
Ｌ体ポリヌクレオチド配列部分を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドが結合している固体支持体であって、該Ｌ体ポリヌクレオチド配列部分は、該ヘテロ配座ポリヌクレオチドにおける前記Ｌ体ポリヌクレオチド配列部分と相補的である、固体支持体、
を備える、キット。
【請求項８２】
請求項８１に記載のキットであり、複数の固体支持体を備え、各支持体は、Ｌ体ポリヌクレオチド配列部分を含むヘテロ配座ポリヌクレオチドと結合しており、該Ｌ体ポリヌクレオチドは、該複数のうちの他の固体支持体におけるＬ体ポリヌクレオチド配列部分の配列とは異なる独特の配列を含む、キット。
【請求項８３】
請求項８１に記載のキットであり、異なる位置にヘテロ配座ポリヌクレオチドのアドレス可能なアレイを含み、各ポリヌクレオチドは、Ｌ体ヘテロ配座ポリヌクレオチド配列部分を含み、該Ｌ体ヘテロ配座ポリヌクレオチド配列部分は、該アレイ上の他の位置にあるヘテロ配座ポリヌクレオチド配列部分におけるＬ体ポリヌクレオチド配列部分の配列とは異なる独特の配列を含む、キット。
【請求項８４】
請求項８１〜８３のうちのいずれか１項に記載のキットであり、該キットは、少なくとも１０個の異なるヘテロ配座ポリヌクレオチドを含み、該ヘテロ配座ポリヌクレオチドは各々が、他のヘテロ配座ポリヌクレオチドにおけるＬ体ポリヌクレオチド配列部分とは異なる独特の配列を含む、キット。
【請求項８５】
請求項８４に記載のいずれか１項のキットであり、該キットは、少なくとも１００個の異なるヘテロ配座ポリヌクレオチドを含み、該ヘテロ配座ポリヌクレオチドは各々が、他のヘテロ配座ポリヌクレオチドにおけるＬ体ポリヌクレオチド配列部分とは異なる独特の配列を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、Ｌ−ＤＮＡを使用する核酸の検出のための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
（緒言）
核酸検出アッセイは、分子生物学研究において、そして医学的診断のために重要な手段である。サンプル中の特異的な核酸配列を検出する多数の核酸プローブアッセイは、ハイブリダイゼーション、ライゲーション、プライマー伸長、および複製事象を示すシグナルの検出に基づいている。核酸検出は、微生物を同定し、遺伝子発現をモニタリングし、そして組織および血液サンプルを型決定および同定するアッセイにおいて、重要である。
【０００３】
種々のＤＮＡハイブリダイゼーション技術は、多数の配列領域を含む、サンプル中の１つ以上の選択されたポリヌクレオチド配列の存在を検出するために利用可能である。フラグメントの捕捉および標識に依存する簡易な方法において、選択された配列を含む核酸フラグメントは、固定化されたプローブとのハイブリダイゼーションによって捕捉される。捕捉されたフラグメントは、検出可能なレポーター部分を含む第２のプローブとのハイブリダイゼーションによって標識され得る。あるいは、核酸フラグメントは、標識されたヌクレオチドのプライマー伸長取り込み、標識されたプライマーでの増幅、化学的な標識反応、標識されたプローブのライゲーション、およびハイブリダイゼーション複合体の架橋を含む種々の手順によって、捕捉前に標識され得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
既存のアッセイの欠点の１つは、プローブと意図しない標的配列との間、または異なるプローブ間での交差ハイブリダイゼーションが、アッセイ性能を妨げ得ることである。したがって、良いアッセイ性能を維持しつつ、そのような交差ハイブリダイゼーションを避けるために改善が必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
１つの局面で、本発明は、ヘテロ配座ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド組成物を含み、このヘテロ配座ポリヌクレオチドは、Ｄ体ポリヌクレオチド配列部分およびＤ体ポリヌクレオチド配列部分に共有結合しているＬ体ポリヌクレオチド配列部分を含む。いくつかの実施形態において、Ｌ体ポリヌクレオチド配列部分は、５〜５０個のＬ−ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｄ体ポリヌクレオチド配列部分は、５〜５０個のＤ−ヌクレオチドを含む。
【０００６】
いくつかの実施形態において、Ｌ体ポリヌクレオチド配列部分は、少なくとも１つのＬ体２’−４’ＬＮＡヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｌ体ポリヌクレオチド配列部分は、１’−α−アノマーヌクレオチドまたは４’−α−アノマーヌクレオチドを含む少なくとも１つのＬ体ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｌ体ポリヌクレオチド配列部分は、１’−βアノマー配座にリボース、アラビノース、キシロース、またはピラノースを含む少なくとも１つのＬ体ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｌ体ポリヌクレオチド配列部分は、１’−αアノマー配座にリボース、アラビノース、キシロース、またはピラノースを含む少なくとも１つのＬ体ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｌ体ポリヌクレオチド配列部分は、リボース、２’−デオキシリボース、２’，３’−ジデオキシリボース、２’−フルオロリボース、２’−クロロリボース、または２’−Ｏ−メチルリボースを含む少なくとも１つのＬ体ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｄ体ポリヌクレオチド配列部分は、少なくとも１つのＤ体２’−４’ＬＮＡヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｄ体ポリヌクレオチド配列部分は、１’−α−アノマーヌクレオチドまたは４’−α−アノマーヌクレオチドを含む少なくとも１つのＬ体ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｄ体ポリヌクレオチド配列部分は、１’−βアノマー配座にリボース、アラビノース、キシロース、またはピラノースを含む少なくとも１つのＬ体ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｄ体ポリヌクレオチド配列部分は、１’−αアノマー配座にリボース、アラビノース、キシロース、またはピラノースを含む少なくとも１つのＬ体ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｄ体ポリヌクレオチド配列部分は、リボース、２’−デオキシリボース、２’，３’−ジデオキシリボース、２’−フルオロリボース、２’−クロロリボース、または２’−Ｏ−メチルリボースを含む少なくとも１つのＬ体ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｄ体ポリヌクレオチド配列部分およびＬ体ポリヌクレオチド配列部分のうちの少なくとも１つは、２−アミノエチルグリシン、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、およびホスホルアミデートから選択されるヌクレオチド間結合を含む。
【０００７】
いくつかの実施形態（前述の特許請求項のうちのいずれか１項に記載の組成物である）において、ヘテロ配座ポリヌクレオチドは、ウラシル、チミン、シトシン、アデニン、７−デアザアデニン、グアニン、および７−デアザグアノシンから選択される核酸塩基を含む。
【０００８】
いくつかの実施形態において、ヘテロ配座ポリヌクレオチドは、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、プソイドウリジン、Ｃ−５−プロピン、イソシトシン、イソグアニン、および２−チオピリミジンから選択される核酸塩基を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態において、この組成物は、Ｌ体ポリヌクレオチド配列部分とハイブリダイズする第１の相補的ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、第１の相補的ポリヌクレオチドは、少なくとも１つのＬ体ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、第１の相補的ポリヌクレオチドは、少なくとも１つのＬ体２’デオキシリボースまたは２’−４’ＬＮＡヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、第１の相補的ポリヌクレオチドは、少なくとも２つのペプチド核酸サブユニットを含む。
【００１０】
いくつかの実施形態において、第１の相補的ポリヌクレオチドは、固体支持体と結合する。いくつかの実施形態において、固体支持体は、ポリスチレン、ガラス、シリカゲル、シリカ、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリアミド、ポリエチレン、ポリエチレンオキシ、またはナイロンを含む。いくつかの実施形態において、固体支持体は、小粒子、ビーズ、膜、フリット、スライド、プレート、微細機械加工されたチップ、アルカンチオール−金層、非多孔性の表面、アドレス可能（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）アレイ、またはゲルを含む。いくつかの実施形態において、固体支持体は、ビーズ、ポリスチレンビーズ、および／またはナイロン膜を含む。いくつかの実施形態において、固体支持体は、ナノ粒子、ミクロスフェア、またはリポソームから選択される小粒子を含む。いくつかの実施形態において、固体支持体は、ガラスを含む。いくつかの実施形態において、第１の相補的ポリヌクレオチドは、切断可能なリンカーを介してこの支持体と結合する。いくつかの実施形態において、切断可能なリンカーは、第１の相補的ポリヌクレオチドが支持体と連結するカルボニル基を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態において、組成物は、Ｄ体ポリヌクレオチド配列部分とハイブリダイズする第２の相補的ポリヌクレオチドを含む。
【００１２】
いくつかの実施形態において、組成物は、蛍光色素、蛍光クエンチャー、エネルギー移動対、量子ドット、または化学発光体前駆体のような検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態において、標識は、フルオレセイン、ローダミン、またはシアニンを含む。いくつかの実施形態において、標識は、Ｄ体ポリヌクレオチド配列部分とハイブリダイズする第２の相補的ポリヌクレオチドと結合される。
【００１３】
また、５〜１００個のＬ−ヌクレオチドを含む異なる配列のポリヌクレオチド（これらのポリヌクレオチドは、固体支持体上でのアドレス可能な位置で固定化される）のアレイも提供される。いくつかの実施形態において、固体支持体は、ポリスチレン、ガラス、シリカゲル、シリカ、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリアミド、ポリエチレン、ポリエチレンオキシ、またはナイロンを含む。いくつかの実施形態において、固体支持体は、小粒子、ビーズ、膜、フリット、スライド、プレート、微細機械加工されたチップ、アルカンチオール−金層、非多孔性の表面、アドレス可能なアレイ、またはゲルを含む。いくつかの実施形態において、固体支持体は、ビーズを含む。いくつかの実施形態において、固体支持体は、ポリスチレンビーズを含む。いくつかの実施形態において、固体支持体は、ナイロン膜を含む。いくつかの実施形態において、固体支持体は、ナノ粒子、ミクロスフェア、またはリポソームから選択される小粒子を含む。いくつかの実施形態において、固体支持体は、制御孔ガラスのようなガラスを含む。いくつかの実施形態において、第１の相補的ポリヌクレオチドは、切断可能なリンカーを介して支持体に連結される。いくつかの実施形態において、切断可能なリンカーは、第１の相補的ポリヌクレオチドが支持体と連結されるカルボニル基を含む。いくつかの実施形態において、固体支持体は、９６ウェル形式として構成される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのポリヌクレオチドが、標識を含む。いくつかの実施形態において、標識は、蛍光色素、クエンチャー、エネルギー移動色素、量子ドット、ジゴキシゲニン、ビオチン、移動度改変剤（ｍｏｂｉｌｉｔｙ−ｍｏｄｉｆｉｅｒ）、ポリペプチド、ハイブリダイゼーション安定化部分、または化学発光前駆体を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの固定化されたポリヌクレオチドは、以下の構造を含む：
【００１４】
【化３】
2005516595.tif 000002
いくつかの実施形態において、Ａは、切断可能なリンカーである。いくつかの実施形態において、Ａは、以下の構造：
【００１５】
【化４】
2005516595.tif 000003
の１つ以上を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態において、（ＮＤ）ｍおよび（ＮＬ）ｎ、ならびに（ＮＬ）ｎおよび（ＮＤ）ｑ、は、リンカーによってお互いに連結される。いくつかの実施形態において、リンカーは、１つ以上のエチレンオキシ単位を含む。いくつかの実施形態において、ｍ＝０である。いくつかの実施形態において、ｍ＝ｑ＝０である。
【００１７】
種々の方法も提供される。いくつかの実施形態において、本発明は、ポリヌクレオチドハイブリッドを形成する方法を含み、この方法は、ヘテロ配座ポリヌクレオチド（Ｄ体ポリヌクレオチド配列部分およびＤ体ポリヌクレオチド配列部分と共有結合したＬ体ポリヌクレオチド配列部分を含む）を提供する工程、および第１の相補的ポリヌクレオチドとＬ体ポリヌクレオチド配列部分との間で二重鎖を形成するために、ヘテロ配座ポリヌクレオチドを第１の相補的ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせる工程を包含する。いくつかの実施形態において、Ｌ体ポリヌクレオチド配列部分は、５〜５０個のＬ−ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｄ体ポリヌクレオチド配列部分は、５〜５０個のＤ−ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｌ体ポリヌクレオチド配列部分は、５〜５０個のＬ−ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｌ体ポリヌクレオチド配列部分は、少なくとも１つのＬ体２’−４’ＬＮＡヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｌ体ポリヌクレオチド配列部分は、１’−α−アノマーヌクレオチドまたは４’−α−アノマーヌクレオチドを含む少なくとも１つのＬ体ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｌ体ポリヌクレオチド配列部分は、１’−βアノマー配座にリボース、アラビノース、キシロース、またはピラノースを含む少なくとも１つのＬ体ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｌ体ポリヌクレオチド配列部分は、１’−αアノマー配座にリボース、アラビノース、キシロース、またはピラノースを含む少なくとも１つのＬ体ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｌ体ポリヌクレオチド配列部分は、リボース、２’−デオキシリボース、２’，３’−ジデオキシリボース、２’−フルオロリボース、２’−クロロリボース、または２’−Ｏ−メチルリボースを含む少なくとも１つのＬ体ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｄ体ポリヌクレオチド配列部分は、少なくとも１つのＤ体２’−４’ＬＮＡヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｄ体ポリヌクレオチド配列部分は、１’−α−アノマーヌクレオチドまたは４’−α−アノマーヌクレオチドを含む少なくとも１つのＬ体ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｄ体ポリヌクレオチド配列部分は、１’−βアノマー配座にリボース、アラビノース、キシロース、またはピラノースを含む少なくとも１つのＬ体ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｄ体ポリヌクレオチド配列部分は、１’−αアノマー配座にリボース、アラビノース、キシロース、またはピラノースを含む少なくとも１つのＬ体ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｄ体ポリヌクレオチド配列部分は、リボース、２’−デオキシリボース、２’，３’−ジデオキシリボース、２’−フルオロリボース、２’−クロロリボース、または２’−Ｏ−メチルリボースを含む少なくとも１つのＬ体ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｄ体ポリヌクレオチド配列部分およびＬ体ポリヌクレオチド配列部分のうちの少なくとも１つは、ヌクレオチド間結合を含み、このヌクレオチド間結合は、２−アミノエチル��リシン、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、およびホスホロアミデートから選択される。いくつかの実施形態において、第１の相補的ポリヌクレオチド配列は、少なくとも１つのＬ体ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、第１の相補的ポリヌクレオチドは、少なくとも１つのＬ体２’デオキシリボースまたは２’−４’ＬＮＡヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、第１の相補的ポリヌクレオチドは、少なくとも２つのペプチド核酸サブユニットを含む。いくつかの実施形態において、ハイブリダイズしない第１の相補的ポリヌクレオチドは、前記ハイブリッドから分離される。いくつかの実施形態において、この方法は、ハイブリッドを検出する工程を包含する。いくつかの実施形態において、この方法は、ヘテロ配座ポリヌクレオチドのプライマー伸長を包含する。いくつかの実施形態において、この方法は、ヌクレアーゼ酵素によるヘテロ配座ポリヌクレオチドの切断を包含する。いくつかの実施形態において、方法は、ヘテロ配座ポリヌクレオチドと、ヘテロ配座ポリヌクレオチドの末端に隣接してハイブリダイズするポリヌクレオチドとのライゲーション（連結反応）を包含する。いくつかの実施形態において、ハイブリッドは、固体支持体上で固定化される。
【００１８】
キットもまた提供される。いくつの実施形態において、このキットは、上のようなヘテロ配座ポリヌクレオチド、およびＬ体ポリヌクレオチド配列部分（ヘテロ配座ポリヌクレオチドにおけるＬ体ポリヌクレオチド配列部分と相補的である）を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドと結合する固体支持体を含む。いくつかの実施形態において、このキットは、複数の固体支持体を含み、各支持体は、Ｌ体ポリヌクレオチド配列部分（複数の他の固体支持体におけるＬ体ポリヌクレオチド配列部分の配列とは異なる独特の配列を含む）を含むヘテロ配座ポリヌクレオチドと結合する。いくつかの実施形態において、このキットは、異なる位置でのヘテロ配座ポリヌクレオチドのアドレス可能なアレイを含み、各ポリヌクレオチドは、アレイ上の他の位置でのヘテロ配座ポリヌクレオチドにおけるＬ体ポリヌクレオチド配列部分の配列とは異なる独特の配列を含む、Ｌ体ヘテロ配座ポリヌクレオチド配列部分を含む。いくつかの実施形態において、このキットは、少なくとも１０個の異なるヘテロ配座ポリヌクレオチドを含み、それぞれは、他のヘテロ配座ポリヌクレオチドにおけるＬ体ポリヌクレオチド配列部分とは異なる独特の配列を含む。いくつかの実施形態において、このキットは、少なくとも１００個の異なるヘテロ配座ポリヌクレオチドを含み、それぞれは、他のヘテロ配座ポリヌクレオチドにおけるＬ体ポリヌクレオチド配列部分とは異なる独特の配列を含む。
【００１９】
本発明のこれらの特徴および他の特徴は、図面および以下の説明からより明らかになる。
【００２０】
（Ｖ．詳細な説明）
参照が、ここで、本発明の特定の実施形態、添付の実施例に例示される実施例に対して詳細になされ得る。本発明が例示的な実施例に関連して記載される一方で、本発明はそれらの実施形態に限定されることを意図しないことが理解される。一方、本発明は、全置換、改変体、および本発明の範囲に含まれ得る等価物を包含することが意図される。
【００２１】
（定義）
立体化学用語が：「Ｓｔｅｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」（１９９４）Ｅ．Ｅｌｉｅｌ  ａｎｄ  Ｓ．Ｗｉｌｅｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに従って使用される。
【００２２】
用語「配座」とは、立体配座における違いに起因する区別以外の立体異性体（同じ構造の異性体）を区別する原子の空間整列をいう。配座異性体は、配座が異なる立体異性体である。本明細書中の新規組成物の正確な配座は、特定のキラル中心（例えば、糖炭素原子）によって規定される。キラル炭素は、回転に関してアルファベットの記号手段で設計される：Ｒは直筋（ｒｅｃｔｕｓ）であり、そしてＳは左であり、これらは、Ｃａｈｎ、Ｉｎｇｏｌｄ、およびＰｒｅｌｏｇ（「Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、第５版（２０００）Ｊ．ＭｃＭｕｒｒｙ，Ｂｒｏｏｋｓ／Ｃｏｌｅ，Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｇｒｏｖｅ，ＣＡ，３１５〜３１９頁）の結合優先規則によって規定される。
【００２３】
用語「ヘテロ配座」とは、異なる立体化学配座を含むサブユニットを有する化合物をいう。
【００２４】
「核酸塩基」は、相補的な核酸塩基または核酸塩基アナログ（例えば、プリン、７−デアザプリン、またはピリミジン）と対合する際に、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｌｉｃｋ水素結合を形成することが出来る任意の窒素含有ヘテロ環式部分を意味する。代表的な核酸塩基は、天然に存在する核酸塩基であるアデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、および天然に生じる核酸塩基のアナログ（米国特許第５，４４６，１３９号を参照のこと（ｓｅｅｌａ））（例えば、７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、７−デアザ−８−アザアデニン、イソニン、ネブラリン、ニトロピロール（Ｂｅｒｇｓｔｏｒｍ，（１９９５）  Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：１２０１〜０９）、ニトロインドール、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、プソイドウリジン、プソイドシトシン、プソイドイソシトシン、５−プロピニルシトシン、イソシトシン、イソグアニン（米国特許第６，１４７，１９９号を参照のこと）、７−デアザグアニン（米国特許第５，９９０，３０３号を参照のこと）、２−アザプリン（ＷＯ  ０１／１６１４９を参照のこと）、２−チオピリミジン、６−チオグアニン、４−チオチミン、４−チオウラシル、Ｏ６−メチルグアニン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｏ４−メチルチミン、５，６−ジヒドロチミン、５，６−ジヒドロウラシル、４−メチルインドール、ピラゾール［３，４−Ｄ］ピリミジン、「ＰＰＧ」（Ｍｅｙｅｒ，米国特許第６，１４３，８７７号および第６，１２７，１２１号；Ｇａｌｌ  ＷＯ  ０１／３８５８４）、およびエタノアデニン（ｅｔｈｅｎｏａｄｅｎｉｎｅ）（Ｆａｓｍａｎ（１９８９）  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３８５〜３９４頁，ＣＲＣ  ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆ１））である。
【００２５】
「ヌクレオシド」とは、糖（例えば、天然のβアノマー配座またはαアノマー配座におけるリボース、アラビノース、キシロース、およびピラノース）のＣ−１’炭素と結合する核酸塩基からなる化合物をいう。糖は、置換され得るか、または置換され得ない。置換されたリボース糖としては、１つ以上の炭素原子（例えば２’−炭素原子）が、１つ以上の同じか、または異なるＣｌ、Ｆ、−Ｒ、−ＯＲ、−ＮＲ２もしくはハロゲン群（各Ｒが、独立してＨ、Ｃ１−Ｃ６アルキルまたはＣ５−Ｃ１４アリールである）で置換されるリボースが挙げられるが、これらに限定されない。リボースの例としては、リボース、２’−デオキシリボース、２’，３’−ジデオキシリボース、２’−ハロリボース、２’−フルオロリボース、２’−クロロリボース、および２’−アルキルリボース（例えば、２’−Ｏ−メチル、４’−α−アノマーヌクレオチド、１’−α−アノマーヌクレオチド（Ａｓｓｅｌｉｎｅ（１９９１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１９：４０６７〜７４）、２’−４’−および３’−４’結合し、そして他の「ロックされた」二環式の糖改変体または「ＬＮＡ」二環式の糖改変体（ＷＯ  ９８／２２４８９；ＷＯ  ９８／３９３５２；ＷＯ  ９９／１４２２６））が挙げられる。ポリヌクレオチド内の典型的なＬＮＡ糖アナログとしては、この構造を含む：
【００２６】
【化５】
2005516595.tif 000004
ここでＢは、任意の核酸塩基である。
【００２７】
糖は、２’位または３’位での改変体（例えば、メトキシ、エトキシ、アリルオキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、メトキシエチル、アルコキシ、フェノキシ、アジド、アミノ、アルキルアミノ、フルオロ、クロロおよびブロモ）を含む。ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、天然のＤ配座異性体（Ｄ体）ならびにＬ配座異性体（Ｌ体）を含む（Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ，米国特許第６，２５１，６６６号；Ｃｈｕ，米国特許第５，７５３，７８９号；Ｓｈｕｄｏ，ＥＰ０５４０７４２；Ｇａｒｂｅｓｉ（１９９３）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：４１５９〜６５；Ｆｕｊｉｍｏｒｉ（１９９０）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２：７４３５；Ｕｒａｔａ，（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒ．Ｎｏ．２９：６９〜７０）。核酸塩基がプリン（例えば、ＡまたはＧ）である場合、リボース糖は、通常この核酸塩基のＮ９位に結合する。核酸塩基がピリミジン（例えば、Ｃ、ＴまたはＵ）である場合、ペントース糖は、通常この核酸塩基のＮ１位に結合する（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ  および  Ｂａｋｅｒ，（１９９２）ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，第２版，Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）。
【００２８】
「ヌクレオチド」とは、モノマーユニットとしてのヌクレオシドのリン酸エステルまたは核酸内のヌクレオシドのリン酸エステルをいう。「ヌクレオチド５’−三リン酸」とは、５’位での三リン酸エステル基を有するヌクレオチドをいい、そして時に「ＮＴＰ」、またはこのリボース糖の構造的特徴を特に指摘するように「ｄＮＴＰ」および「ｄｄＮＴＰ」として示される。この三リン酸エステル基は、種々の酸素に対する硫黄置換（例えば、α−チオ−ヌクレオチド５’−三リン酸）を含み得る。核酸化学の総説に関しては、Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．および  Ｂｏｇｄａｎｏｖ，Ａ．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，ＶＣＨ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４を参照のこと。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、交換可能に使用され、そしてヌクレオチドモノマーの一本鎖ポリマーおよび二本鎖ポリマーを意味し、これには、ヌクレオチド間ホスホジエステル結合連鎖（例えば、３’−５’および２’−５’）および逆連鎖（例えば、３’−３’および５’−５’）によって結合する２’−デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）およびリボヌクレオチド（ＲＮＡ）、分枝構造、またはヌクレオチド間アナログが挙げられる。ポリヌクレオチドは、関連する対イオン（例えば、Ｈ＋、ＮＨ４＋、トリアルキルアンモニウム、Ｍｇ２＋、Ｎａ＋など）を有する。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド全体、リボヌクレオチド全体、またはそれらのキメラ混合物から構成され得る。ポリヌクレオチドは、核酸塩基または糖アナログからなる。ポリヌクレオチドは、代表的なサイズでは、数個のモノマーユニット（例えば、それらが当該分野でより一般的で頻繁にオリゴヌクレオチドとして称される場合、５〜４０個）から数千個のモノマーヌクレオチドユニットの範囲にわたる。他の点で示されない限り、ポリヌクレオチド配列が示される場合はいつでも、ヌクレオチドは、左から右へ５’→３’の順序で、そして他の点で記述されない限り、「Ａ」はデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」はデオキシシチジンを示し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを示し、そして「Ｔ」はチミジンを示すことが理解される。
【００３０】
用語「ヘテロ配座オリゴヌクレオチド」は、異なる配座のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを意味する。ヘテロ配座オリゴヌクレオチドは、Ｌ体ヌクレオチドの１つ以上の部分およびＤ体ヌクレオチドの１つ以上の部分を有する。
【００３１】
「ヌクレオチド間アナログ」は、リン酸エステルアナログまたはポリヌクレオチドの非リン酸アナログを意味する。リン酸エステルアナログとしては：（ｉ）Ｃ１−Ｃ４アルキホスファネート（例えば、メチルホスファネート）；（ｉｉ）ホスホルアミデート；（ｉｉｉ）Ｃ１−Ｃ６アルキル−ホスホトリエステル；（ｉｖ）ホスホロチオエート；および（ｖ）ホスホロジチオネートが挙げられる。非リン酸アナログとしては、糖／ホスフェート部分が、通常ＰＮＡとして称される２−アミノエチルグリシンユニットのようなアミド連鎖によって置換される化合物（Ｂｕｃｈａｒｄｔ，ＷＯ  ９２／２０７０２；Ｎｉｅｌｓｅｎ（１９９１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７〜１５００）が挙げられる。
【００３２】
「ポリペプチド」とは、タンパク質、合成ペプチド、抗体、ペプチドアナログ、およびモノマーがアミノ酸であり、そしてアミド結合を介してともに結合されるペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）を含むポリマーをいう。アミノ酸がαアミノ酸である場合、Ｌ光学異性体またはＤ光学異性体のいずれかが使用され得る。さらに、非天然のアミノ酸（例えば、バリン、フェニルグリシンおよびホモアルギニン）もまた、含まれる。遺伝子にコードされていない一般的に遭偶する（ｅｎｃｏｕｎｔｅｒｅｄ）アミノ酸もまた、本発明において使用され得る。本発明において使用される全アミノ酸は、Ｄ光学異性体またはＬ光学異性体のいずれかであり得る。さらに、他のペプチド模倣体はまた、本発明において有用である。一般的な総説について、Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．，  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，編，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２６７頁（１９８３）を参照のこと。
【００３３】
用語「アミノ酸」とは、天然に生じるアミノ酸および合成アミノ酸、ならびにアミノ基およびカルボン酸基を含むアミノ酸アナログをいう。
【００３４】
「結合部位」とは、共有結合されるか、または共有結合され得る部分または分子（例えば、クエンチャー、蛍光色素、またはポリヌクレオチド）、リンカーまたは別の部分上の部位をいう。
【００３５】
「リンカー」とは、共有結合もしくは１つの部分または分子を別のものに共有結合させる（例えば、クエンチャーをポリヌクレオチドに共有結合させる）原子鎖を含む分子における化学部分をいう。「切断可能なリンカー」は、反応または条件の結果によって破壊され得る１つ以上の共有結合を有するリンカーである。例えば、分子内のエステルは、試薬（例えば、水酸化ナトリウム）によって切断され得るリンカーであり、これは、カルボキシレート含有フラグメントおよびヒドロキシル含有生成物を生じる。
【００３６】
「反応性結合基」とは、共有結合を形成するために別の分子と反応することができる分子上の、化学的に反応性のある置換基または部分（例えば、求核試薬または求電子試薬）をいう。反応性結合基は、アミノ基と結合するために通常使用される活性なエステルを含む。例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルは、非常に安定な脂肪族アミド産物を形成するために脂肪族アミンへの選択性を有する。芳香族アミン、アルコール、フェノール（チロシン）、およびヒスチジンとの反応速度は、比較的低い。非水性条件下でのＮＨＳエステルとアミンとの反応は容易であり、それゆえ、それらは、低ペプチドおよび他の低分子量の生体分子の誘導体化のために有用である。実質的に、カルボン酸を含むか、カルボン酸を含むように化学的に改変され得る任意の分子は、そのＮＨＳエステルへと転化され得る。ＮＨＳエステルは、改善された水溶性スルフォネート基により入手可能である。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「置換」とは、１つ以上の水素原子が１つ以上の非水素原子と交換される分子、官能基または部分をいう。例えば、非置換の窒素は、−ＮＨ２である一方、置換された窒素は、−ＮＨＣＨ３である。例示的な置換基としては、ハロ（例えば、フッ素および塩素）、Ｃ１−Ｃ８アルキル、スルフェート、スルフォネート、スルホン、アミノ、アンモニウム、アミド、ニトリル、ニトロ、アルコキシ（ＲがＣ１−Ｃ１２アルキルである−ＯＲ）、フェノキシ、芳香族、フェニル、多環式芳香族、ヘテロ環、水溶性基、および結合部分が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】
「アルキル」は、飽和性または不飽和性の、分枝鎖を持つ、直鎖、分枝鎖を持つ、環式、または、親のアルカン、アルケンまたはアルキンの単一炭素原子から１つの水素原子の除去によって誘導される置換された炭化水素基を意味する。代表的なアルキル基は、１〜１２個の飽和性および／または非飽和性の炭素からなり、これらの飽和性および／または非飽和性の炭素としては、メチル、エチル、シアノエチル、イソプロピル、ブチル、などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
「アルキルジイル」は、飽和性または不飽和性の、分枝鎖を持つ、直鎖、分枝鎖を持つ、環式、または、１〜１２個の炭素原子の置換された炭化水素基を意味し、そして親のアルカン、アルケンまたはアルキンの同じまたは２つの異なる炭素原子からの２つの水素原子の除去によって誘導される２つの１価の基中心を有する。代表的なアルキルジイル基としては、１，２−エチルジイル（−ＣＨ２ＣＨ２−）、１，３−プロピルジイル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、１，４−ブチルジイル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、などが挙げられるが、これらに限定されない。「アルコキシジイル」は、酸素からの水素原子の除去によって誘導される２つの１価基中心および炭素原子からの水素原子の除去によって誘導される第２の基を有するアルコキシル基を意味する。代表的なアルコキシジイル基としては、メトキシジイル（−ＯＣＨ２−）および１，２−エトキシジイルまたはエチレンオキシ（−ＯＣＨ２ＣＨ２−）が挙げられるが、これらに限定されない。「アルキルアミノジイル」は、窒素からの水素原子の除去によって誘導される２つの１価基中心および炭素原子からの水素原子除去によって誘導される第２の基を有するアルキルアミノ基を意味する。代表的なアルキルアミノジイル基としては、−ＮＨＣＨ２−、−ＮＨＣＨ２ＣＨ２−、および−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−が挙げられるが、これらに限定されない。「アルキルアミドジイル」は、窒素からの水素原子の除去によって誘導される２つの１価基中心および炭素原子からの水素原子の除去によって誘導される第２の基を有するアルキルアミド基を意味する。代表的なアルキルアミドジイルとしては、−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２−、および−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
「アリール」は、親の芳香族環系の単一の炭素原子からの１つの水素原子の除去によって誘導される５〜１４個の炭素原子の１価の芳香族炭化水素基を意味する。代表的なアリール基としては、ベンゼン、置換ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ビフェニル、など（置換されたアリール基を含む）に誘導される基が挙げられるが、これに限定されない。
【００４１】
「アリールジイル」は、結合した共鳴電子系（ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）および親のアリール化合物（置換されたアリールジイル基を含む）の２つの異なる炭素原子からの２つの水素原子の除去によって誘導される、少なくとも２つの１価基中心を有する５〜１４個の炭素原子の不飽和環式炭化水素または多環式炭化水素基を意味する。
【００４２】
「置換アルキル」、「置換アルキルジイル」、「置換アリール」および「置換アリールジイル」は、それぞれアルキル、アルキルジイル、アリールおよびアリールジイル（１つ以上の水素原子が、それぞれ独立して別の置換基と置換される）を意味する。代表的な置換基としては、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｒ、ＯＨ、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＳＨ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、−＋ＮＲ３、−Ｎ＝ＮＲ２、−ＣＸ３、−ＣＮ、−ＯＣＮ、−ＳＣＮ、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、−ＮＯ、−ＮＯ２、−Ｎ２＋、−Ｎ３、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）２Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−ＯＳ（Ｏ）２ＯＲ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ）２、−Ｐ（Ｏ）（Ｏ−）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−Ｃ（Ｓ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＣＯ２−、−Ｃ（Ｓ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ、−Ｃ（Ｓ）ＳＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｃ（Ｓ）ＮＲ２、−Ｃ（ＮＲ）ＮＲ２、（各Ｒは、独立して−Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ５−Ｃ１４アリール、ヘテロ環、また結合基である）が挙げられるが、これらに限定されない。置換基としてはまた、ジアゾ（−Ｎ＝Ｎ−）のような２価架橋官能基（ｂｒｉｄｇｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ）、エステル、エーテル、ケトン、ホスフェート、アルキルジイル、およびアリールジイル基が挙げられる。
【００４３】
「ヘテロ環」とは、１つ以上の環原子が、ヘテロ原子（例えば、窒素、酸素、および硫黄（炭素とは対照的に））である環系を有する分子をいう。
【００４４】
「酵素的に伸長可能」とは、（ｉ）ポリメラーゼ酵素の作用を通してポリヌクレオチドの末端上に酵素的に取り込まれることができ、そして（ｉｉ）さらなるプライマー伸長を支持することができるヌクレオチドをいう。酵素的に伸長可能なヌクレオチドとしては、ヌクレオチド５’−三リン酸（すなわち、ｄＮＴＰおよびＮＴＰ）およびそれらの標識された形態が挙げられる。
【００４５】
「酵素的に取り込み可能」とは、ポリメラーゼ酵素の作用を通してポリヌクレオチドの末端上に酵素的に取り込まれることができるヌクレオチドをいう。酵素的に取り込み可能なヌクレオチドとしては、ｄＮＴＰ、ＮＴＰ，および２’，３’−ジデオキシヌクレオチド５’−三リン酸（すなわち、ｄｄＮＴＰ）ならびにそれらの標識された形態が挙げられる。
【００４６】
「ターミネーターヌクレオチド」とは、ポリメラーゼ酵素の作用を通してポリヌクレオチドの末端上に酵素的に取り込まれることができるが、さらに伸長され得ない（すなわち、ターミネーターヌクレオチドは、酵素的に取り込み可能であるが、酵素的に伸長不可能である）ヌクレオチドを意味する。ターミネーターヌクレオチドの例としては、ｄｄＮＴＰおよび２’−デオキシヌクレオチド５’−三リン酸、３’−フルオロヌクレオチド５’−三リン酸、ならびにそれらの標識された形態が挙げられる。
【００４７】
「標的」、「標的ポリヌクレオチド」、および「標的配列」は、特定のポリヌクレオチド配列を意味し、その存在または非存在が検出され、そして相補的なポリヌクレオチド（例えば、プライマーまたはプローブ）とのハイブリダイゼーションの対象である。標的配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらのアナログからなり得、そしてそれらの組み合わせを含む。標的は、一本鎖または二本鎖であり得る。プライマー伸長工程において、プライマーとのハイブリダイゼーション二本鎖を形成する標的ポリヌクレオチドとはまた、「テンプレート」として称され得る。テンプレートは、別の相補的な核酸の合成のための型として作用する（Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（１９９６）ＣＰＬ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃｉｎｇ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗｂｕｒｙ，ＵＫ）。本発明とともに使用するための標的配列は、原核生物、真核生物、植物、動物、およびウイルスを含むが、これらに限定されない任意の生物またはかつて生存していた生物に由来し得る。標的配列は、細胞の核（例えば、ゲノムＤＮＡ）に起源し得るか、または核外核酸（例えば、プラスミド、ミトコンドリアの核酸、種々のＲＮＡ、など）であり得る。標的核酸配列は、標的核酸がＲＮＡである場合、まずｃＤＮＡに逆転写され得る。種々の方法が、本発明の組成物および方法とともに使用するための標的核酸配列を得るために有用である。標的配列が、生物サンプルからの単離を介して得られる場合、好ましい単離技術としては、（１）有機物による抽出、それに引き続くエタノール沈殿析出（例えば、フェノール／クロロホルム有機試薬を使用する工程（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら，編，（１９９３）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  １，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ２，  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｉ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ））、または自動ＤＮＡ抽出機（例えば、モデル３４１ＤＮＡ抽出機，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）；（２）固定相吸着法方（例えば、Ｂｏｏｍら，米国特許第５，２３４，８０９号；Ｗａｌｓｈら，（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １０（４）：５０６〜５１３）；および（３）塩誘導性ＤＮＡ沈殿法（例えば、Ｍｉｌｌｅｒら，（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６（３）：９〜１０）が挙げられる。
【００４８】
用語「プローブ」は、標的ポリヌクレオチドの配列と対になる相補塩基による二本鎖構造を形成することができるポリヌクレオチドを意味する。例えば、プローブは、例えばクエンチャー部分、もしくは蛍光レポーターおよびクエンチャーからなるエネルギー移動対で標識され得る。
【００４９】
「プライマー」は、標的配列の相補的なプライマー特異的部分、プローブ、またはライゲーション産物とハイブリダイズし、そしてプライマー伸長を進めるために設計される定義された配列のオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは、ヌクレオチドの重合のための開始点として機能する（Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（１９９６）ＣＰＬ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗｂｕｒｙ，ＵＫ）。
【００５０】
用語「二重鎖」は、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ、または核酸塩基の他の配列に特異的な相互作用によって塩基対化された核酸の分子間または分子内の二本鎖部分を意味する。二本鎖は、プライマーおよびテンプレート鎖、またはプローブおよび標的鎖からなり得る。「ハイブリッド」は、塩基特異的な相互作用（例えば、水素結合）によって相互作用する核酸の二重鎖、三重鎖、または他の塩基対複合体を意味する。
【００５１】
用語「プライマー伸長」は、テンプレート依存性ポリメラーゼを使用して５’〜３’方向へ標的とアニールされるプライマーを伸長する工程を意味する。特定の実施形態によって、適切な緩衝液、塩、ｐＨ、温度、およびヌクレオチド三リン酸（これらのアナログおよび誘導体を含む）とともに、テンプレート依存性のポリメラーゼは、相補鎖を産生するために、アニールされたプライマーの３’末端での開始でテンプレート鎖と相補的なヌクレオチドを取り込む。
【００５２】
用語「標識」とは、ポリヌクレオチドと結合され得、そして（ｉ）検出可能なシグナルを提供するか；（ｉｉ）第２の標識（例えば、ＦＲＥＴ）によって提供される検出可能なシグナルを改変するために第２の標識と相互作用するか；（ｉｉｉ）ハイブリダイゼーションを安定化させるか（すなわち、二本鎖の形成）；（ｉｖ）捕捉機能（すなわち、疎水性親和力、抗体／抗原、イオン複合体）を提供するか、または（ｖ）電気泳動の移動度、疎水性、親水性、可溶性、またはクロマトグラフィー的な挙動のような物理的性質を変化させる、任意の部分をいう。標識は、多数の公知の技術（公知の標識、結合、結合基、試薬、反応条件ならびに分析方法および精製方法を使用する）のいずれか１つを使用することで達成され得る。標識としては、光を放出する化合物または光を吸収する化合物（検出可能な蛍光を生成するか、または消滅させる）、化学発光シグナル、または生物発光シグナルが挙げられる（Ｋｒｉｃｋａ，Ｌ．Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９２），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，３〜２８頁）。生体分子を標識するために有用な蛍光レポーター色素としては、フルオレセイン（例えば、米国特許第５，１８８，９３４号；同第５，６５４，４４２号；同第６，００８，３７９号；同第６，０２０，４８１号）、ローダミン（例えば、米国特許第５，３６６，８６０号；同第５，８４７，１６２号；同第５，９３６，０８７号；同第６，０５１，７１９号；同第６，１９１，２７８号）、ベンゾフェノキサジン（例えば、米国特許第６，１４０，５００号）、ドナーおよびアクセプターのエネルギー移動色素対（例えば、米国特許第５，８６３，７２７号；同第５，８００，９９６号；同第５，９４５，５２６号）、およびシアニン（例えば、Ｋｕｂｉｓｔａ，ＷＯ９７／４５５３９）、ならびに検出可能なシグナルを生成することができる任意の他のフルオレセイン色素が挙げられる。フルオレセイン色素の特定の実施例としては、６−カルボキシフルオレセイン；２’，４’，１，４，−テトラクロロフルオレセイン；および’２，４’，５’，７’，１，４−ヘキサクロロフルオレセイン（例えば、米国特許第５，６５４，４４２号）が挙げられる。
【００５３】
別種類の標識は、二重鎖ハイブリダイゼーションを増強するか、安定化させるか、またはそれらに影響を及ぼすように作用するハイブリダイゼーション安定化部分（例えば、インターカレーター、副溝バインダー、および架橋官能基（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．ａｎｄ  Ｇａｉｔ，Ｍ．編，「ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２版，（１９９６）  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１５〜８１頁））である。さらに別種類の標識は、特異的または非特異的な捕捉による分子（例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン、および他のハプテン（Ａｎｄｒｕｓ，「Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ５’  ｎｏｎ−ｉｓｏｔｏｐｉｃ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ＰＣＲ  ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｉｍｅｒｓ」（１９９５）ＰＣＲ  ２：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，３９〜５４頁）の分離または固定化をもたらす。非放射能標識方法、技術、および試薬は、以下に概説される：Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｇａｒｍａｎ，Ａ．Ｊ．（１９９７）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、「エネルギー移動」とは、励起基（例えば、蛍光レポーター色素）の励起状態エネルギーが、スペーサーへ伝達されるか、または別の基（例えば、クエンチャー部分（これは、エネルギーを減衰させる（消光する）か、もしくはそうでなければ放出させるか、または転移させる））への結合を介して伝達される工程をいう。エネルギー移動は、蛍光共鳴エネルギー移動、直接エネルギー移動、および他の機構を通して生じ得る。正確なエネルギー移動機構は、本発明に関して制限されない。本出願におけるエネルギー移動に関する任意の参考文献が、これらの機械論的に異なる全現象を含むと理解され得る。
【００５５】
「エネルギー移動対」とは、エネルギー移動に関与する任意の２つの部分をいう。代表的に、この部分のうちの１つは、蛍光レポーター（すなわち、ドナー）として作用し、そしてもう１つの部分は、蛍光クエンチャー（すなわち、アクセプター）（「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ」Ｓｅｌｖｉｎ  Ｐ．（１９９５）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２４６：３００〜３３４；ｄｏｓ  Ｒｅｍｅｄｉｏｓ  Ｃ．Ｇ．（１９９５）Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１１５：１７５〜１８５；「Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ：ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」Ｗｕ  Ｐ．ａｎｄ  Ｂｒａｎｄ  Ｌ．（１９９４）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２１８：１〜１３）として作用する。蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）は、励起エネルギー（すなわち、光）が、ドナー（「レポーター」）からアクセプターへ光量子の放出なしに転移される２つの部分間の距離依存性相互作用である。このアクセプターは、蛍光であり得、そして転移エネルギーをより長い波長で放出し得るか、もしくは非蛍光であり得、そしてアクセプターの検出可能な蛍光を減少させる（消光する）ために作動し得る。ＦＲＥＴは、分子間事象または分子内事象のいずれかであり得、そしてドナーおよびアクセプターの分離に対する６乗の逆数に依存し、これは、生物学的高分子の寸法と比較することが可能な距離を越えて有効にする。したがって、２つの部分間の距離がいくらかの検出可能な量によって変化される場合、エネルギー移動対のスペクトル特性は、全体としていくつかの測定可能な方法で変化する。蛍光ドナーと非蛍光アクセプターの組み合わせに取り込まれる自己クエンチプローブは、主にタンパク質分解（Ｍａｔａｙｏｓｈｉ，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：９５４〜９５８）および核酸ハイブリダイゼーション（「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ」Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｌ．，Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｌ．Ｋｒｉｃｋａ，編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，（１９９２）  ３１１〜３５２頁；Ｔｙａｇｉ  Ｓ．（１９９８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：４９〜５３；Ｔｙａｇｉ  Ｓ．（１９９６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １４：３０３〜３０８）の検出のために開発された。ほとんどの適用において、ドナー色素およびアクセプター色素は異なり、この場合、ＦＲＥＴは、アクセプターの感光性蛍光の出現またはドナーの蛍光の消滅によって検出され得る。
【００５６】
用語「クエンチ（消光）（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）」とは、機構にかかわらずクエンチャー部分（エネルギー移動による）によって引き起こされた蛍光レポーター部分の蛍光の減少をいう。それゆえ、クエンチャー存在下での蛍光レポーターの発光は、予想より低い強度であるか、または完全に欠乏さえしている放出シグナルを導く。
【００５７】
用語「アニーリング」および「ハイブリダイズ」は、互換的に使用され、そして二本鎖または他のより高次構造の形成を生じる、１つの核酸と別の核酸の塩基対合相互作用を意味する。第１の相互作用は、塩基特異性（すなわち、Ｗａｔｓｏｎ／ＣｒｉｃｋによるＡ／ＴおよびＧ／ＣおよびＨｏｏｇｓｔｅｅｎ型水素結合）である。
【００５８】
用語「固体支持体」とは、オリゴヌクレオチドが合成され、結合され、または固定化される任意の固相物質をいう。固体支持体は、「樹脂」、「固相」、および「支持体」のような用語を含む。固体支持体は、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシ、およびポリアクリルアミドのような有機ポリマー、ならびにそれらのコポリマーおよびグラフトからなり得る。固体支持体はまた、ガラス、シリカ、制御孔ガラス（ＣＰＧ）、または逆相シリカのような無機でもあり得る。固体支持体の構成は、ビーズ形態、球形態、粒子形態、顆粒形態、ゲル形態、または表面形態であり得る。表面は、平面、実質的な平面、または非平面であり得る。固体支持体は、孔性または非多孔性であり得、そして膨潤または非膨潤の特徴を有し得る。固体支持体は、ウェル形態、凹部または他のコンテナー、容器、特徴もしくは位置の形態で構成され得る。固体支持体の大多数は、試薬のロボット送達のためにアドレス可能な種々の位置でのアレイで、またはレーザー照明および共焦点採光（ｌｉｇｈｔ  ｇａｔｈｅｒｉｎｇ）または偏位性採光によるスキャンニングを包含する検出方法によって構成され得る。
【００５９】
「アレイ」または「マイクロアレイ」は、固体支持体上または容器の配置において存在するポリヌクレオチドの前もって決定された空間的配置を意味する。特定のアレイ形式は、「チップ」または「バイオチップ」として称される（Ｍ．Ｓｃｈｅｎａ，編  Ｍｉｃｒｏａｒａｙ  Ｂｉｏｃｈｉｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅ  Ｂｏｏｋｓ，Ｅａｔｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ（２０００））。アレイは、低密度数のアドレス可能な位置（例えば、２個から約１２個）、中間密度数のアドレス可能な位置（例えば、約１００個以上の位置）、または高密度数のアドレス可能な位置（例えば、１０００個以上）を含み得る。代表的に、アレイ形式は、製造、取り扱い、配置、組み立て（ｓｔａｃｋｉｎｇ）、試薬の導入、検出、そして貯蔵を考慮した幾何学的に規則的な形である。アレイは、それぞれの位置間での規則的な間隔を有して、列形式およびカラム形式で構成され得る。あるいは、位置は、均等な処理またはサンプリングのために束にされるか、混合されるか、または均質にブレンドされ得る。アレイは、それぞれの位置が、高度なスループットの取り扱い、ロボット送達、マスキング、または試薬のサンプリング、あるいはレーザー照明および共焦点採光または偏光性採光によるスキャンニングを包含する検出方法によって空間的にアドレス可能であるように構成されたアドレス可能な位置の大多数を含み得る。
【００６０】
用語「エンドポイント分析」とは、反応が実質的に完結した場合のみにデータ収集が生じる方法をいう。
【００６１】
用語「リアルタイム分析」とは、ＰＣＲの間の周期的なモニタリングをいう。ＡＢＩ７７００および７９００ＨＴ配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）のような特定のシステムは、各熱サイクルの間、各サイクルにおいて前もって決定されるかまたは使用者が規定する段階でモニタリングを実行する。ＦＲＥＴプローブでのＰＣＲのリアルタイム分析は、好ましくは任意の内部コントロールシグナルを差し引いて、サイクルからサイクルへの蛍光色素シグナル変化を測定する。
【００６２】
（典型的なヘテロ配座オリゴヌクレオチド組成物）
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、多くの用途（例えば、分子生物学および核酸ベースの診断アッセイにおける）を有するヘテロ配座オリゴヌクレオチドを含む。ヘテロ配座オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＤ体（Ｄ配座ヌクレオチド）配列部分と結合する少なくとも１つのＬ体（Ｌ配座ヌクレオチド）配列部分を含むオリゴヌクレオチドである。この配列部分は、互いに任意の方法によって（代表的には、結合またはリンカーによって）結合され得る。いくつかの実施形態において、Ｄ体配列部分は、そのＬ体配列相補体とのハイブリダイゼーションによる安定な二本鎖を形成するように、少なくとも５つのＤヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ヘテロ配座オリゴヌクレオチドは、結合またはリンカーによって５〜５０個のＤヌクレオチドを含むＤ体配列部分と共有結合する５〜５０個のＬヌクレオチドを含むＬ体配列部分を含む。本発明の化合物の糖部分の配座は、ほとんどの天然に生じるヌクレオシド（例えば、シチジン、アデノシン、チミジン、グアノシンおよびウリジンのような）リボース糖部分のＤヌクレオチドＬ体配座と対照的である。糖のＬ配座は、１’，３’、および４’炭素原子でのキラル、ならびにリボース炭素原子については２’でのキラルによって規定される。Ｌ体ヌクレオチドは、鏡像（天然に生じるＤ体ヌクレオチドの鏡像立体異性体）である。図１は、ＤＮＡオリゴヌクレオチドの鏡像異性Ｄ体部分およびＬ体部分を示す。絶対配座は、１’，３’、および４’の非対称の、キラル炭素部分で表わされる。ＲＮＡは、２’位での付加的なキラル炭素を有する。
【００６３】
いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つの標識を含む標識されたヘテロ配座オリゴヌクレオチドを含む。代表的には、標識は、ヘテロ配座オリゴヌクレオチドと結合体またはリンカーによって共有結合され得る。標識は、上のように（例えば、蛍光色素、クエンチャー、エネルギー移動色素、量子ドット、ジゴキシゲニン、ビオチン、易動度改変因子、ポリペプチド、ハイブリダイゼーション安定化部分、または化学発光前駆体のように）規定され得る。典型的な蛍光色素標識は、フルオレセイン、ローダミン、およびシアニン構造型に由来する化合物を含み、以下の構造によって例示される：
【００６４】
【化６】
2005516595.tif 000005
クエンチャー標識は、分子内蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）効果により蛍光色素から放出される蛍光のエネルギー移動を受ける。クエンチャー自体は、蛍光また非蛍光（例えば、Ｒｅｅｄ、ＷＯ０１／４２５０５；およびＣｏｏｋ、ＷＯ００／７５３７８を参照のこと）であり得る。クエンチャー標識は、例えば、フルオレセイン、ローダミン、ニトロ−シアニン（Ｌｅｅ、米国特許第６，０８０，８６８）、およびアリールジアゾ構造型から選択される化合物を含む。
【００６５】
標識はまた、ハイブリダイゼーション安定化部分（例えば、副溝バインダー）、インターカレーター、ポリカチオン（例えば、ポリリジンおよびスペルミンのような）、または架橋官能基を含み得る。ハイブリダイゼーション安定化剤は、塩基対の安定化（すなわち、親和性）、もしくはプライマーと標的、またはプローブと標的のハイブリダイゼーション速度（Ｃｏｒｅｙ（１９９５）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：９３７３〜７４）を増大し得る。ハイブリダイゼーション安定化剤は、塩基対の特異性（完全な相補オリゴヌクレオチドと標的配列の間のＴｍにおける大きな違いによって例示される）を増加させるために働き、そしてこの結果生じる二本鎖は、Ｗａｔｓｏｎ／Ｃｒｉｃｋ塩基対合の１つ以上のミスマッチを含む（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．ａｎｄ  Ｇａｉｔ，Ｍ．編，「ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２版，（１９９６）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１５〜８１頁および３３７〜４６頁）。典型的な副溝バインダーとしては、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８（Ｒａｊｕｒ（１９９７）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６２：５２３〜２９）、ディスタマイシン（ｄｉｓｔａｍｙｃｉｎ）、ネトロプシン（ｎｅｔｒｏｐｓｉｎ）（Ｇｏｎｇ（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２４０：５５７〜６０）、およびＣＤＰＩ１−３（米国特許第５，８０１，１５５；ＷＯ  ９６／３２４９６）が挙げられる。副溝バインダーの実施例は、ＣＤＰＩ３であり、以下の構造によって示される：
【００６６】
【化７】
2005516595.tif 000006
ここで、Ｌは、ヘテロ配座オリゴヌクレオチドに対する結合部位である（Ｄｅｍｐｃｙ，ＷＯ  ０１／３１０６３）。
【００６７】
標識に対するリンカーが、ヘテロ配座オリゴヌクレオチドの核酸塩基に結合される場合、この核酸塩基結合部位は、通常プリン核酸塩基の８位、７−デアザプリン核酸塩基の７位または８位、およびピリミジン核酸塩基の５位であるが、他の結合部位もまた、使用され得る。標識に対するリンカーは、任意のアルキルジリルまたはアリールジイルリンカー、またはそれらの置換形態であり得、以下の構造を含む：
【００６８】
【化８】
2005516595.tif 000007
ここで、Ｂは核酸塩基であり；Ｌは標識であり；Ｒ１はＨまたは（Ｃ１−Ｃ８）アルキルであり；そしてｍは０、１、または２である（Ｋｈａｎ，米国特許第５，７７０，７１６号および同第５，８２１，３５６号；Ｈｏｂｂｓ，米国特許第５，１５１，５０７号）。Ｘはアミド下部構造であり、以下の例示的な構造を含む：
【００６９】
【化９】
2005516595.tif 000008
ここで、ｎは１〜５の整数である。
【００７０】
標識されたヘテロ配座オリゴヌクレオチドは、核酸塩基を介して結合する標識を有し得る。例示的な実施形態は、構造Ｉである：
【００７１】
【化１０】
2005516595.tif 000009
ここで、Ｌは標識であり；Ｂは核酸塩基であり、この核酸塩基としては、ウラシル、チミジン、シトシン、アデニン、７−デアザアデニン、グアニン、および７−デアザグアノシンが挙げられ；Ｒ１０は、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン化物、アジ化合物、アミン、アルキルアミン、アルキル（Ｃ１−Ｃ６）、アリル、アルコキシ（Ｃ１−Ｃ６）、ＯＣＨ３、またはＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２であり；Ｒ１５は、Ｈ、ホスフェート、ヌクレオチド間ホスホジエステル、またはヌクレオチド間アナログであり；Ｒ１６は、Ｈ、ホスフェート、ヌクレオチド間ホスホジエステル、またはヌクレオチド間アナログであり；そしてＲ１７は、結合またはリンカーである。プロパルギル基またはビニル基を含む例示的なリンカーは、すぐ下に示される；
【００７２】
【化１１】
2005516595.tif 000010
ここで、ｎは、０、１、または２である。
【００７３】
あるいは、標識されたヘテロ配座オリゴヌクレオチドは、５’末端で結合する標識を有し得る。例示的な実施形態は、構造ＩＩである：
【００７４】
【化１２】
2005516595.tif 000011
ここで、Ｌ、Ｂ、Ｒ１０およびＲ１５は、構造Ｉから選択される。それぞれのＹは、独立して、Ｏ、ＮＨ、ＮＲ、またはＳであり、ここで、Ｒは、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６置換アルキル、Ｃ５−Ｃ１４アリール、およびＣ５−Ｃ１４置換アリールである。Ｒ１８は、ヘテロ配座オリゴヌクレオチドおよびその標識の５’ホスフェート、またはホスフェートアナログに結合するための結合または共有結合リンカーであり得る。例えば、Ｒ１８は、１〜１００個のエチレンオキシ（ポリエチレンオキシまたはＰＥＯとも呼ばれる）単位、（−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−（ここで、ｎは１〜１００である）））、Ｃ１−Ｃ１２アルキルジリル、Ｃ１−Ｃ１２置換アルキルジリル；Ｃ５−Ｃ１４アリールジリル、またはＣ５−Ｃ１４置換アリールジリルの鎖であり得る。Ｒ１８の例示的な実施形態は、すぐ下に示される。
【００７５】
【化１３】
2005516595.tif 000012
ここで、ｎは１〜１０の範囲にある。
【００７６】
あるいは、標識されたヘテロ配座オリゴヌクレオチドは、３’末端で結合する標識を有し得る。例示的な実施形態は、構造ＩＩＩである：
【００７７】
【化１４】
2005516595.tif 000013
ここで、Ｌ、Ｙ、Ｂ、Ｒ１０、Ｒ１６およびＲ１８は、上で構造ＩおよびＩＩとして規定されたとおりである。
【００７８】
標識されたヘテロ配座オリゴヌクレオチドは、１より多い標識を含み得る。ヘテロ配座オリゴヌクレオチドの１つの実施形態は、リポーター色素およびクエンチャーを含むエネルギー移動対を含み、それによって蛍光エネルギー移動が、リポーター色素とクエンチャーの間で生じ得る。リポーター色素は、任意の適切な色素（例えば、フルオレセイン、ローダミン、ジオキセタン化学発光体色素、クマリン、ナフチルアミン、シアニンまたはボディピ（ｂｏｄｉｐｙ）色素）であり得る。
【００７９】
代表的に、リポーター色素は、ヘテロ配座オリゴヌクレオチドと第１の結合によって結合され、そしてクエンチャーは、ヘテロ配座オリゴヌクレオチドと第２の結合によって結合される。リポーター色素およびクエンチャーは、標識されたヘテロ配座オリゴヌクレオチドが標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズされる場合は、リポーター色素はクエンチャーによって十分には消光されず、そして標識されたオリゴヌクレオチドが標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズされない場合は、リポーター色素は効果的にクエンチャーによって消光されるように配向される。
【００８０】
いくつかの実施形態において、リポーター色素およびクエンチャー標識は、ヘテロ配座オリゴヌクレオチドの末端で共有結合される。例えば、リポーター色素またはクエンチャーのいずれかは、３’末端で結合され、そして他方は５’末端で結合される。
【００８１】
標的に相補的なＤ体配列部分に隣接し、そしてヘテロ配座オリゴヌクレオチドが相補的な標的配列とハイブリダイズされない場合に二重鎖を形成する相補的なＬ体ＤＮＡ配列部分の存在に起因して、リポーター／クエンチャーヘテロ配座オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、安定したヘアピン構造を形成するための十分な自己相補性を含むように選択され得る。この実施形態において、リポーター部分およびクエンチャー部分は、各Ｌ体配列部分の遠位端で位置付けられ得、その結果、ヘアピン構造が形成される場合はリポーター部分およびクエンチャーは近位にあり、そして内部Ｄ体配列部分が相補的な標的配列とハイブリダイズされる場合は遠く離れている。相補的な標的配列の非存在下で、リポーターからの蛍光がクエンチャーによって効果的に消光され、一方、相補的な標的配列の存在下でありかつハイブリダイゼーション二本鎖の形成に関して、消光は妨げられるか、または実質上およびある程度妨げられるが、蛍光は増加するような配列設計によって、ヘアピン形成リポーター／クエンチャーヘテロ配座オリゴヌクレオチドの熱融解特性（Ｔｍ）は最適化され得る。この効果によって、サンプル中の特異的標的配列の存在は検出され得、そしていくつかの場合において、消光され得る。標的配列がＰＣＲアンプリコン内にある場合、ＰＣＲはモニターされ得、そして検出され得る。
【００８２】
いくつかの実施形態において、本発明は、ドナーおよびアクセプターを含むエネルギー移動対で標識されたヘテロ配座オリゴヌクレオチドを含む。ドナー色素は、第１波長で光を吸収し、そして励起エネルギーを放出する。アクセプター色素は、ドナー色素によって放出された励起エネルギーを吸収し、そして応答して第２波長で蛍光を発することができる。エネルギー移動対は、混合物中の複数標識された基質の同時検出における使用（例えば、ＤＮＡ塩基配列決定のような）に関して利点を有する。単一のドナー色素は、エネルギー移動色素のセット中で使用され得、それゆえ、それぞれの色素は、共通の波長で強い吸収性を有する。次いで、エネルギー移動セットにおいてアクセプター色素を変更することによって、アクセプター色素は、そのそれぞれの放出最大によってスペクトルで分解され得る。
【００８３】
ドナー色素とアクセプター色素の間での効能的なエネルギー移動を促進するリンカーを介して、ドナー色素はアクセプター色素に結合され得る（例えば、Ｌｅｅ，米国特許第５，８００，９９６号；Ｌｅｅ，米国特許第５，９４５，５２６号；Ｍａｔｈｉｅｓ，米国特許第５，６５４，４１９号；Ｌｅｅ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：２８１６〜２２号を参照のこと）。あるいは、ドナー色素およびアクセプター色素は、ヘテロ配座オリゴヌクレオチド上の異なる結合部位で標識され得る。例えば、ヘテロ配座オリゴヌクレオチドは、５’末端ではドナー色素で標識され、そして３’末端ではアクセプター色素で標識され得る。
【００８４】
エネルギー移動色素対を含むドナー色素およびアクセプター色素は、エネルギー移動工程を受ける任意の蛍光部分であり得、蛍光部分としては、フルオレセイン、ロードル（ｒｈｏｄｏｌ）、ローダミン、シアニン、フタロシアニン、スクアライン（ｓｑｕａｒａｉｎｅ）、ボディピ、クマリン、またはベンゾフェノキサジンが挙げられる。
【００８５】
一般的に、ドナー色素とアクセプター色素の間のリンカーは、すぐ下に示される構造を含む：
【００８６】
【化１５】
2005516595.tif 000014
ここで、Ｚは、ＮＨ、ＳおよびＯであり；Ｒ２１は、ドナーに結合するＣ１−Ｃ１２アルキルであり；Ｒ２２は、結合、Ｃ１−Ｃ１２アルキルジリル、もしくは少なくとも１つの不飽和性結合を有する５員環および６員環またはカルボニル炭素に結合する縮合環構造であり；そしてＲ２３は、リンカーがアクセプターに結合する官能基を含む。Ｒ２２は、シクロペンタン、シクロヘキサン、フラン、チオフラン、ピロール、ピラゾール、ベンゼン、ピリジン、ピリミジン、ピラジン、オキサゾール、インデン、ベンゾフラン、チオナフテン、インドールおよびナフタレン、またはそれらの置換形態であり得る。詳細には、リンカーは、次の構造を有し得る：
【００８７】
【化１６】
2005516595.tif 000015
ここで、ｎは２〜１０の範囲にある。一般的に、Ｒ２３はまた、次の構造を含み得る：
【００８８】
【化１７】
2005516595.tif 000016
ここで、Ｒ２４はＣ１−Ｃ１２アルキルであり、そしてＺは上述される。
【００８９】
１つの実施形態において、ドナー色素とアクセプター色素の間のリンカーは、このリンカーにある程度の構造的な硬さを与える官能基（例えば、アルケン、ジエン、アルキン、少なくとも１つの不飽和結合を有する５員環および６員環または縮合環構造）を含む。エネルギー移動対のドナー色素およびアクセプター色素は、以下の例示的な構造を含むリンカーによって結合され得る：
【００９０】
【化１８】
2005516595.tif 000017
ここで、（Ｄ／Ａ）は、ドナー色素またはアクセプター色素のいずれかであり、そしてＸは：
【００９１】
【化１９】
2005516595.tif 000018
であり得る。フェニル環は、スルフォネート、ホスホネート、および／または他の荷電基のような基で置換され得る。
【００９２】
いくつかの実施形態によって、ヘテロ配座オリゴヌクレオチドまたは標識されたヘテロ配座オリゴヌクレオチドは、固体支持体に対して結合またはリンカーによって共有結合され得る。オリゴヌクレオチドの結合または固定化は：（１）オリゴヌクレオチドの合成の間（インサイチュ）に生じ得るか、または（２）このオリゴヌクレオチドは、予備合成され得、次いで固体支持体に対してカップリングするか、スポットするか、固定化するかまたは沈着する工程によって、溶液中で結合される。
【００９３】
例えば、固体支持体は、ポリスチレン、制御性ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−ｐｏｒｅ−ｇｌａｓｓ）、シリカゲル、シリカ、ポリアクリルアミド、磁気ビーズ、ポリアクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリアミド、ポリエチレン、ポリエチレンオキシ、またはこれらのコポリマーもしくはグラフトであり得る。いくつかの実施形態において、固体支持体は、小粒子、ビーズ、膜、フリット、スライド、プレート、微小機械加工されたチップ、アルカンチオール金層、非多孔性表面、アドレス可能なアレイ、ゲル、またはポリヌクレオチド固定化媒体を含み得る。
【００９４】
いくつかの実施形態において、ヘテロ配座オリゴヌクレオチドは、切断可能または切断不可能なリンカーによって固体支持体に結合され得る。切断可能なリンカーは、化学試薬、光、または他の条件によって切断され得る。例えば、リンカーは、１つ以上の以下の構造を含み得る：
【００９５】
【化２０】
2005516595.tif 000019
エステルを含むリンカーは、基本的な試薬（例えば、水性、蒸気性、またはガス性の水酸化アンモニウム（Ｋｅｍｐｅ，米国特許第５，５１４，７８９号）、無水アミン（Ｋｅｍｐｅ，米国特許第５，７５０，６７２号）、水性水酸化物試薬、および水性アミン）によって切断され得る。エステルリンカーは、切断速度およびクエンチャー部分と固体支持体の間の結合の所望の安定性を基にして選択され得る。例えば、オキサレート結合は、比較的不安定であり、数分以内に室温での濃縮された水酸化アンモニウム中で、実質的に完全に分割される。スクシネート結合は、同じ条件下で１時間以上を必要とする。キノン結合およびジグリコレート結合は、基本的な切断に対して中間の安定性を有する。アルコキシリルリンカーは、強塩基試薬またはフッ化物試薬によって分割され得る。ジスルフィドリンカーは、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）のような還元剤によって切断され得る。
【００９６】
いくつかの実施形態において、ヘテロ配座オリゴヌクレオチドは、切断不可能なリンカーを使用して固体支持体上で合成される。次いで、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションまたは他の目的のために直接使用され得る。切断不可能なリンカーは、ホスホルアミダイト合成方法の酸性条件、塩基性条件および酸化条件に対して、安定である。切断不可能なリンカーはエチレンオキシ単位、アルキルジリル、ホスフェート、および／またはアミド官能性を含み得る。
【００９７】
ヘテロ配座オリゴヌクレオチドは、標識されていても標識されていなくても、標準的な核酸塩基、糖、およびヌクレオチド間結合の種々の改変体およびアナログを含み得る。そのような改変体またはアナログは、オリゴヌクレオチドの配列中の任意の位置および任意の適切な発生頻度で配置され得る。そのような改変体およびアナログは、Ｌ体ヌクレオチド、Ｄ体ヌクレオチド、または両方で存在し得る。
【００９８】
天然に生じるホスホジエステル結合に加えて、本発明のオリゴヌクレオチドは、ホスフェートアナログ（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、またはホスホルアミダイト）を含む１つ以上のヌクレオチド間結合を含み得る。他のヌクレオチド間結合は、ＤＮＡまたはＲＮＡの糖／ホスフェート骨格が、１つ以上の非環式結合、アキラル結合、および／または中性ポリアミド結合で置換される結合を含む。ヌクレオチド間アナログの１つの種類は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）のファミリーである。アミド結合を介した結合に結合する核酸塩基との２−アミノエチルグリシンポリアミド結合は、ＰＮＡの実施形態として十分に研究され、そして例外的なハイブリダイゼージョンの特異性および親和性を保持することが示された（Ｂｕｃｈａｒｄｔ，ＷＯ  ９２／２０７０２；Ｎｉｅｌｓｅｎ（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７〜１５００；Ｅｇｈｏｌｍ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ，３６５：５６６〜６８）。ＰＮＡは、平行方向またはアンチパラレル方向のいずれかで、その標的相補体とハイブリダイズし得る。しかし、アンチパラレル二本鎖（ＰＮＡのカルボキシル末端は、ＤＮＡの５’末端と整列され、そしてＰＮＡのアミノ末端は、ＤＮＡの３’末端と整列される）は、代表的により安定である（Ｅｇｈｏｌｍ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６５：５６６〜６８）。ＰＮＡプローブは、高い特異性および親和性で標的ＤＮＡ配列と結合することが公知である（Ｃｏｕｌｌ，米国特許１第６，１１０，６７６号）。本発明のヘテロ配座オリゴヌクレオチドは、離散性のＰＮＡおよびＬ体ヌクレオチド配列部分を有するＰＮＡ−ＤＮＡキメラを含む。それらは、ＰＮＡモノマーおよびホスホルアミダイトヌクレオチドの共有結合によって、実質的に任意の組み合わせまたは配列で合成され得る。効能的で自動化された方法は、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラを合成するために発展された（Ｖｉｎａｙａｋ（１９９７）Ｎｕｃｌｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  １６：１６５３〜５６；Ｕｈｌｍａｎｎ（１９９６）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔｌ．編．Ｅｎｇ．３５：２６３２〜３５；Ｕｈｌｍａｎｎ，ＥＰ  ８２９５４２；Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌａａｎ（１９９７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３８：２２４９〜５２；Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌａａｎ（１９９８）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８：６６３〜６８）。
【００９９】
核酸塩基アナログの特定の実施例としては、例えば、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、プソイドウリジン、Ｃ−５−プロピン、イソシトシン、イソグアニン、または２−チオピリミジンが挙げられる。
【０１００】
２’位または３’位での糖改変体としては、例えば、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ５−Ｃ１４アリールオキシ、Ｃ５−Ｃ１４アリール、アミノ、Ｃ１−Ｃ６アルキルアミノ、フルオロ、クロロ、またはブロモが挙げられる。他の糖改変体としては、例えば、４’−α−アノマーヌクレオチド、１’−α−アノマーヌクレオチド、２’−４’Ｌ体ＬＮＡ、２’−４’Ｄ体ＬＮＡ、３’−４’Ｌ体ＬＮＡ、または３’−４’Ｄ体ＬＮＡが挙げられ得る。任意のこれらの改変体は、Ｌ体配列部分、Ｄ体配列部分、または両方において生じ得る。
【０１０１】
（例示的な合成方法）
ヘテロ配座オリゴヌクレオチドは、市販のホスホアミダイドヌクレオシド（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ａｓｈｌａｎｄ，ＭＡ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，米国特許第４，４１５，７３２号），支持体（例えばシリカ）、制御孔ガラス（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，米国特許第４，４５８，０６６号）およびポリスチレン（Ａｎｄｒｕｓ、米国特許第５，０４７，５２４号および米国特許第５，２６２，５３０号）およびモデル３９２，３９４，３９４８，３９００のような自動合成機および急速ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて、ホスホアミダイド法（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，米国特許第４，９７３，６７９号；Ｂｅａｕｃａｇｅ（１９９２）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ４８：２２２３−２３１１）によって固体支持体上で合成され得る。オリゴヌクレオチド合成は、５’保護された、３’ホスホルアミダイドヌクレオシド（例えば、ＩＶ）を用いて合成法の共通の３’から５’方向で行われ得る。あるいは、オリゴヌクレオチド合成は、３’保護された、５’ホスホルアミダイドヌクレオシド（例えば、Ｖ）を用いて５’から３’方向で行われ得る（Ｗａｇｎｅｒ，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １６：１６５７−６０）．
【０１０２】
【化２１】
2005516595.tif 000020
構造式ＩＶおよびＶについて、例示的な置換基としては、次のものが挙げられる。Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル（例えば、シアノエチル）、Ｃ５〜Ｃ１４のアリールおよびＣ５〜Ｃ１４置換アリールから選択され、Ｒ２は、ベンゾイル、イソブチリル、アセチル、フェノキシアセチル、アリールオキシアセチル、ジメチルホルムアミジン、ジアルキルホルムアミジンおよび／またはジアルキルアセトアミジンのような環外窒素保護基である。Ｒ３は、アルキルがＣ１〜Ｃ６である、ＤＭＴ、ＭＭＴ、ピクシル、トリチルおよびトリアルキルシリルのような酸不安定保護基であり、Ｒ４およびＲ５は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル（例えば、イソプロピル）、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ５〜Ｃ１４のアリールおよびＣ５〜Ｃ１４置換アリールから選択されるか、または一緒になって、Ｒ４およびＲ５は、Ｃ５〜Ｃ１４シクロアルキルまたはＣ５〜Ｃ１４のヘテロシクロアルキルである。
【０１０３】
例示的なホスホルアミダイトヌクレオチドＩＶおよびＶは、ＤＮＡ合成のために典型的に使用されるＬ体配座モノマーである。本発明の組成物を調製するための他のモノマー試薬としては、適切な保護基を有する、Ｄ体ホスホルアミダイトヌクレオシド、ＲＮＡホスホルアミダイトヌクレオシド、２−アミノエチルグリシンおよび他のものが挙げられる。自動合成機は、任意のサイクルの間に、試薬送達ボトル中においてその合成機にインストールされる任意のＬ体およびＤ体ホスホアミダイトヌクレオシドを送達するようにプログラムされ得る。従って、ヘテロ配座オリゴヌクレオチドは、Ｌ体およびＤ体のヌクレオチドのどんな配列も用いても合成され得る。
【０１０４】
Ｌ体およびＤ体のホスホルアミダイトヌクレオシドは、個々のヌクレオシドの糖および核塩基の保護およびホスホチル化の既知の手順および方法に従って調製され、オリゴヌクレオチド合成において使用され得る。Ｄ体ヌクレオシドは天然に存在するＤ−ＤＮＡ供給源に由来する。Ｌ体ホスホルアミダイトヌクレオシドは、任意の適切な合成法によって調製され得る。例えば、Ｌ体ホスホルアミダイトヌクレオシドは、Ｌリボースから調製され得る。Ｌリボースは、一連の工程においてＬキシロースに由来する（Ｃｈｕ，米国特許第５，７５３，７８９号；Ｆｕｊｉｍｏｒｉ（１９９２）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １１：３４１−４９；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ，米国特許第．６，２５１，６６６号；Ｆｕｒｓｔｅ，ＷＯ９８／０８８５６）．
【０１０５】
【化２２】
2005516595.tif 000021
いくつかの実施形態において、標識化ヘテロ配座オリゴヌクレオチドは、構造ＶＩを有する標識固体支持体で開始される方法によって合成される：
【０１０６】
【化２３】
2005516595.tif 000022
ここで、Ｓは固体支持体であり、Ａはリンカーであり、Ｘは３つ以上の結合部位を有するリンカーであり、Ｌは標識であり、ＹはＯ、Ｎ、ＮＲ及びＳから選択され、ここで、ＲはＣ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６置換アルキル、Ｃ５〜Ｃ１４アリール、およびＣ５〜Ｃ１４の置換アリールから選択され、Ｒ３は、酸切断可能保護基または酸切断可能保護基を有するヌクレオシドである。その標識化固体支持体は、酸切断可能保護基を除去するために酸性試薬と反応される。酸切断可能保護基Ｒ３を有するホスホアミダイトヌクレオシドモノマーおよびアクチベーターは、脱保護された標識化固体支持体に添加され、それによってＹとヌクレオシドモノマーの３’末端または５’末端の間に結合を形成し、そのヌクレオシドはＬ体ヌクレオシドまたはＤ体ヌクレオシドであり得る。その固体支持体は次に、三価ヌクレオチド間のホスファイトをホスフェートに変換させるために酸化試薬で処理される。（１）酸切断可能保護基を脱保護する工程、（２）ヌクレオシドモノマーを連結する工程、（３）酸化工程が、所望の配列のＬ体およびＤ体のヌクレオチドが完成するまで、周期的に繰り返される。増加するオリゴヌクレオチド上のいかなる未反応の３側’または５’側のヒドロキシル基も除去するための酸化工程の前後で、さらなるキャップ工程が企画される。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、ホスホルアミダイト標識試薬が、最終結合工程としてオリゴヌクレオチドの末端に結合され、それによって３’末端または５’末端を標識する。
【０１０８】
標識化固体支持体ＶＩの例示的な実施形態としては、次のものが挙げられる。
【０１０９】
【化２４】
2005516595.tif 000023
ここで、ｎは、１〜１２であり、Ｓは、固体支持体であり、そしてＡ、Ｌ、ＹおよびＲ３は、構造ＶＩにについて上記されたとおりである。
【０１１０】
標識化固体支持体ＶＩの別の例示的な実施形態は：
【０１１１】
【化２５】
2005516595.tif 000024
であり、ここで、ＤＭＴは４，４’−ジメソキシトリチルである。
【０１１２】
標識化固体支持体ＶＩの別の典型的な実施形態は：
【０１１３】
【化２６】
2005516595.tif 000025
であり、ここで、Ｒ１はＣ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ５〜Ｃ１４アリール、またはＣ５〜Ｃ１４置換アリールであり、Ｒ２はベンゾイル、イソブチリル、アセチル、フェノキシアセチル、アリールオキシアセチル、ジメチルホルムアミジン、ジアルキルホルムアミジン、およびジアルキルアセトアミジンのような環外窒素保護基である。
【０１１４】
いくつかの適用について、独特の配列部分に加えて、共通のまたは保存された配列部分を有する多数のヘテロ配座オリゴヌクレオチドを調製することが望ましくあり得る。例えば、ヘテロ配座ヌクレオチドセットが５’末端に共通のＬ体ヌクレオチド配列を有し、３’末端に異なったＤ体ヌクレオチド配列を有することが望ましい場合、合成は５’から３’の方向に固体支持体上Ｌ体の３’保護（例えばＤＭＴ）、５’ホスホルアミダイトヌクレオチド（例えばＶ）で開始され得る。その固体支持体は、カラム、チップ、ウェル、スポット、または他の容器もしくは位置に典型的に設置される。その合成の規模は数ナノモルから１またはそれ以上のマイクロモルまでの範囲に及び得るが、より大きなまたはより小さな規模でも使用され得る。固体支持体に結合するＬ体ヌクレオチドの配列（例えば５から５０以上のヌクレオチドを含む）は、Ｌ体の３’保護した５’ホスホルアミダイトヌクレオチドの連続添加によって合成され得る。固体支持体は後の使用のために保存され得るか、または直ぐに使用され得る。これは、種々のＤ体ヌクレオチド配列の次の合成のために、多数の容器または位置に分配され得る。その固体支持体がビーズまたは粒に形態である場合、カラム、チップ、または他の容器は分解され、そのビーズは等量または非当量の２つ以上のカラム、チップまたは他の容器に分配され、Ｄ体の３’保護された、５’ホスホアミダイトヌクレオシドの連続添加のために再集合される。その固体支持体が固体表面、膜またはフリットである場合、その支持体は分断され、衝突し、分解され、切断され、そうでなければＤ体ヌクレオチド配列の引き続く合成および別々の合成のために分配され得る。そのＤ体配列部分の合成は、並列してまたは連続して行われ得、直ちにＬ体配列部分の合成が起こるかまたはその必要性が生じるまで延期され得る。より一般的に、Ｄ体およびＬ体配列部分は、別々に合成され得、ブロックポリマーとして後に一緒に結合され得、あるいは１つの部分がまず合成され、対立座を有するモノマーの連続的な添加を伴い得る。
【０１１５】
標識化ヘテロ配座オリゴヌクレオチドは、当業者に周知の方法を用いて、その両方が可溶性または多少の可溶性である適切な溶媒中で、ヘテロ配座オリゴヌクレオチドと、例えば、クエンチャー部分のような標識上の反応性結合基とを結合することによって形成され得る。標識方法論として、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，（１９９６）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．ｐｐ４０−５５，６４３−７１；Ｇａｒｍａｎ，１９９７，Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎを参照のこと。粗製の標識化ヘテロ配座オリゴヌクレオチドは、任意の出発物質または不要の副産物から精製され得、そして好ましくは低温で、後の使用のために、乾燥させてまたは溶液中で保存され得る。
【０１１６】
その標識は、連結を介する共有結合のために、例えば、クエンチャーのアリールカルボキシル基またはフルオレセインもしくはローダミンの５−カルボキシル基もしくは６−カルボキシル基のような置換部位のうちの１つで、反応性結合基を保有し得る。いくつかの実施形態において、ヘテロ配座オリゴヌクレオチドに標識を結合させる連結は、（ｉ）ハイブリダイゼーション親和性または特異性と干渉しない、（ｉｉ）クエンチングを減少させない．、（ｉｉｉ）プライマー伸長と干渉しない、（ｉｖ）ポリメラーゼ活性を抑制しない、（ｖ）その標識の蛍光、クエンチング、捕捉、またはハイブリダイゼーション安定特性に悪影響を及ぼさないできである。求電子反応性結合基は、ポリヌクレオチド上のアミンおよびチオールのような求核性基と共有結合を形成する。求電子反応性結合基の例としては、活性エステル、イソチオシネート、スルホニルクロライド、スルホン酸エステル、シリルハライド、２，６−ジクロロトリアジニル、ホスホルアミダイト、マレイミド、ハロアセチル、エポキシド、アルキルハライド、アリルハライド、アルデヒド、ケトン、アシルアジド、無水物、およびヨードアセトアミドが挙げられる。活性エステルとしては、スクシンイミド（ＮＨＳ）、ヒドロキシベンゾトリアゾリル（ＨＯＢｔ）およびペンタフルオロフェニルエステルが挙げられる。
【０１１７】
標識試薬のＮＨＳエステルは前形成され、単離され、精製され、および／もしくは特徴付けられ得るか、またはインサイチュで形成され、そしてヘテロ配座オリゴヌクレオチドの求核性基と反応され得る。典型的に、標識カルボキシル基は、そのＮＨＳエステルを産生するために、（１）例えば、ジクロロへキシカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド、ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）のようなカルボジイミド試薬、または例えば、ＴＳＴＵ（Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウランテトラフルオロボレート酸、ＨＢＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウランヘキサフルオロリン酸）、または、ＨＡＴＵ（ｏ−（７ーアザベンゾトリアゾ−ル−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’テトラメチルウランヘモサフルオロリン酸のようなウラン試薬、及び（２）ＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）またはＨＯＡｔ（１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾールのようなアクチベーターならびに、（３）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの組合せと反応させることによって活性化される。
【０１１８】
典型的な非ヌクレオシドホスホロアミダイト標識試薬は一般式ＶＩＩを有する：
【０１１９】
【化２７】
2005516595.tif 000026
ここで、Ｌは保護された形態または非保護形態の標識であり、Ｘはリンカーまたは結合であり、別々にとらわれたＲ３０およびＲ３１はＣ１〜Ｃ１２のアルキル基、Ｃ４からＣ１０のアリール基、および／または１０個までの炭素原子を含むシクロアルキルであるかあるいは、ホスホロアミダイト窒素原子と一緒となりＲ３０およびＲ３１は飽和窒素ヘテロ環を形成し；そしてＲ３２は、そのオリゴヌクレオチドの伸長を防ぐ亜リン酸エステル保護基である（Ｔｈｅｉｓｅｎ  （１９９２）「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｄｙｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｎｏ．  ２７，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，ｐｐ．９９−１００）。一般的に、Ｒ３２はオリゴヌクレオチド合成条件に安定であり、そのヘテロ配置オリゴヌクレオチドまたは標識の一体性に悪影響を与えない試薬を用いて合成オリゴヌクレオチド産物から除去され得る。典型的なＲ３２置換基は、（ｉ）メチル、（ｉｉ）２−シアノエチル；−ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、または（ｉｉｉ）２−（４−ニトロフェニル）エチルおよび−ＣＨ２ＣＨ２（ｐ−ＮＯ２Ｐｈ）を包含する。ホスホロアミダイト標識試薬の典型的な実施様態は、以下を包含する：（ｉ）Ｒ３０およびＲ３１は各々イソプロピルである、（ｉ）Ｒ３０およびＲ３１は一緒になってモルホリロであり、（ｉｉｉ）ＸはＣ１〜Ｃ１２のアルキル基であり、（ｉｖ）Ｒ３２は２−シアノエチルである。あるいは、リンカーＸは：
【０１２０】
【化２８】
2005516595.tif 000027
であり得、ここで、ｎの範囲は１〜１０である。典型的なホスホロアミダイト標識試薬は構造式ＶＩＩＩを有する：
【０１２１】
【化２９】
2005516595.tif 000028
ホスホロアミダイト標識試薬ＶＩＩまたはＶＩＩＩは、ヌクレオチド間リン酸基に酸化されるヌクレオチド間亜リン酸基を形成するために、例えば、テトラゾールのような穏やかな酸性活性下で、固体支持体と共有結合するヘテロ配置オリゴヌクレオチドの５’末端のＯＨのようなヒドロキシル基と反応する。いくつかの例では、ホスホロアミダイト標識試薬は、ヘテロ配置オリゴヌクレオチドを標識するための、その試薬の合成またはその引き続く使用のどちらかの間、保護を必要とする官能基を包含する。使用される保護基は、官能基の特性に依存し、当業者に明らかである（Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔ  ａｎｄ  Ｗｕｔｓ，Ｐ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１）。その標識は、例えばＩＶのような５’保護、３’ホスホロアミダイトヌクレオチドを用いて、共通の３’から５’方向の合成法の結果として、そのオリゴヌクレオチドの５’末端と結合される。あるいは、オリゴヌクレオチドの３’末端が、例えばＶのような３’保護、５’ホスホラミダイトヌクレオシドを用いて５’から３’方向で行われ得る塩基、ホスホロアミダイト標識試薬で標識され得る（Ｖｉｎａｙａｋ，米国特許第６，２５５，４７６号）。
【０１２２】
他のホスホロアミダイト標識試薬、ヌクレオチドと非ヌクレオチドの両方は、例えば、３’末端、核塩基、ヌクレオチド間結合、糖などのヘテロ配座オリゴヌクレオチドの他の部位に標識を可能にする。核塩基、ヌクレオチド間結合および糖部位での標識は、内部的及び多種の標識を可能にする。
【０１２３】
（Ｌ体オリゴヌクレオチドアレイ）
いくつかの実施形態において、本発明は固定化Ｌ体ヌクレオチド含有オリゴヌクレオチドのアレイを包含する。そのＬ体ヌクレオチド含有オリゴヌクレオチド（ここでは「Ｌ体ポリヌクレオチド」または「Ｌ体オリゴヌクレオチド」も参照される）は、（例えばヘテロ配置オリゴヌクレオチドのＬ体配列部位との）標的ポリヌクレオチドにおけるそのＬ体相補体とハイブリダイゼーションができるＬ体ヌクレオチドの配列を包含する。典型的に、Ｌ体配列部分は、少なくとも５つのＬヌクレオチド長であり、１００以上の長さであり得る。そのアレイは、Ｌ体ヌクレオチド含有オリゴヌクレオチドの２〜何千もの独特のまたは同一の配列を包含し得る。１つの実施形態では、そのアレイ上の各位置は、例えば、１ピコモル〜１ナノモルまでの予め選択された独特の配列を有する。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、固定化オリゴヌクレオチドは、本発明のヘテロ配置オリゴヌクレオチドを包含する。いくつかの実施形態では、固定化オリゴヌクレオチドは、ヘテロ配座オリゴヌクレオチドを包含しない。いくつかの実施様態では、固定化オリゴヌクレオチドは、Ｌ体ヌクレオチドは包含するが、Ｄ体ヌクレオチドは包含しない。
【０１２５】
本発明のアレイでは、１つ以上のＬ体オリゴヌクレオチドが、各アドレス可能部位で固定化される。そのアドレス可能部位は、試薬、光、熱、冷却、または他の操作が別々の部位に故意に向けられ得るように、血管、分離領域、スポット、または他の配置の配列であり得る。そのアレイは、アレイ表面を満たすか、全表面に光を向けるか、またはマルチウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに真空圧をかけることによって同時に各場所を洗浄するような、全ての位置に共通の操作を提供し得る。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、そのアレイの支持体は１つ以上の膜、ビーズ、またはコート粒子または非コート粒子を包含し得る。支持体は磁性または常磁性の物質を包含し得る。
【０１２７】
支持体は、予め決定された捕捉配列または特異的リガンドを包含する、結合されたまたは固定された空間的にアドレス可能なＬ体ヌクレオチドオリゴヌクレオチドを包含する。
【０１２８】
本発明のアレイおよび支持体は、多種類の幾何異性体および配置を有し得、多くの様々な公知加工技術の１つを用いて加工され得る。典型的な加工技術は、インサイチュ合成技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，米国特許第５，４３６，３２７号）；光方向性インサイチュ合成技術（Ｆｏｄｏｒ，米国特許第５，７４４，３０５号）；ロボットスポット技術（Ｃｈｅｕｎｇ，（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２１：１５−１９；米国特許第５，８０７，５２２号；Ｃａｎｔｏｒ，米国特許第５，６３１，１３４号；Ｄｒｍａｎａｃ，米国特許第６，０２５，１３６号）または結合したオリゴヌクレオチドを有するビーズのアレイ（Ｗａｌｔ，米国特許第６，０２３，５４０号）を包含するが、これらに制限はしない。本発明の固体支持体はまた、マイクロタイタープレート中に配置されたシリコンウェット上に固定される複数のＬ体オリゴヌクレオチドをも包含する（Ｒａｖａ，米国特許第５，５４５，５３１号）。さらに、本発明はまた、光ファイバー末端上に添加されるか、固定されるかまたは、配置されるミクロスフェアまたはビーズに固定される複数のＬ体オリゴヌクレオチドをも包含する。アレイ組成は、光ファイバーの束から加工され得る。標識Ｌ体オリゴヌクレオチドまたはそれらの標識ハイブリダイゼーション複合体からの検出シグナルは、個々の位置とハイブリダイゼーション配列を対応させるために解釈される独特の光学的特徴を生成させ得る（Ｗａｌｔ．米国特許第５，２４４，６３６号および米国特許第５，２５０，２６４号）。
【０１２９】
固定化Ｌ体ヌクレオチド含有オリゴヌクレオチドの１つの実施形態は、ＩＸの構造を有する：
【０１３０】
【化３０】
2005516595.tif 000029
ここで、Ｓ、Ａ、ＸおよびＹは前述のＶＩの構造に記載される。ＮＬはＬ体ヌクレオチドの配列であり、ＮＤはＤ体ヌクレオチドの配列であり、ｍは０〜１００までの整数であり、ｎは５〜１００までの整数であり、ｑは０〜１００までの整数である。いくつかの実施形態では、ｑ＝０およびｍ＞０である。いくつかの実施形態では、ｍ＝０である。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、固定化Ｌ体ヌクレオチド含有オリゴヌクレオチドは、少なくとも５つのＬ体ヌクレオチドを包含し、そしてＤ体ヌクレオチドを包含し得てもしなくてもよい。オリゴヌクレオチド中の任意のＤ体ヌクレオチドは、その配列の任意の部分で現れ得る。従って、ＩＸの構造はまた、次の実施形態ならびにＬ体およびＤ体ヌクレオチドのより多くの配列部分を有する実施形態を有し得る：
【０１３２】
【化３１】
2005516595.tif 000030
固体支持体は、ポリスチレンのような任意の適切な物質、制御孔ガラス、シリカゲル、シリカ、ポリアクリルアミド、磁気ビーズ、ポリアクリレート、ヒドロキシエチルメタフリレート、ポリアミド、ポリエチレン、ポリエチレンオキシ、および／または共重合体またはそのグラストを包含し得る。固体支持体の形成は、微粒子、ビーズ、膜、フリット、スライド、プレート、微細機械加工チップ、アルカンチオール−金層、非多孔表面、アドレス可能アレイまたはポリヌクレオチド固定化媒体であり得る。１つの実施形態では、固体支持体はナイロン膜を包含する。他の実施形態では、固体支持体はポリスチレンビーズを包含する。
【０１３３】
（典型的なハイブリダイゼーション方法）
本発明は、Ｄ体ポリヌクレオチド配列部分に共有結合するＤ体ポリヌクレオチド配列部分およびＬ体ポリヌクレオチド配列部分を含むヘテロ配置ポリヌクレオチドを提供することによって、ならびに第１の相補的ポリヌクレオチドおよび（１）Ｌ体ポリヌクレオチド配列部分、（２）Ｄ体ポリヌクレオチド配列部位、または（１）および（２）の両方に間で複合体を形成するために、少なくとも第１の相補的ポリヌクレオチドにヘテロ配置ポリヌクレオチドをハイブリダイズさせることによって、ポリヌクレオチドハイブリッドを形成する方法を包含する。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、ハイブリッドは、ヘテロ配置ポリヌクレオチドに、Ｌ体ポリヌクレオチド配列部分の全てまたはその一部に相補的な第１の相補的ポリヌクレオチドをハイブリダイズさせることによって形成される。いくつかの実施様態では、ハイブリッドは、ヘテロ配置ポリヌクレオチドを、Ｄ体ポリヌクレオチド配列部分の全てまたはその一部に相補的な第１の相補的ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせることによって形成される。いくつかの実施様態では、ハイブリッドは、ヘテロ配置ポリヌクレオチド、Ｄ体ポリヌクレオチド配列部位の全てまたはその一部に相補的な第１の相補的ポリヌクレオチド、およびＬ体ポリヌクレオチド配列部分の全てまたは一部に相補的な第２の相補的ポリヌクレオチドの間に形成される。上述に記載されるいくつかの実施形態では、ヘテロ配置ポリヌクレオチドもその相補的ポリヌクレオチドも固体支持体上に接着または固定されていなければ、ハイブリダイゼーションは溶液中で行われる。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、ヘテロ配置ポリヌクレオチドを包含するハイブリッドは、固体支持体上で捕捉されるかまたは固定される。いくつかの実施形態では、そのハイブリッドは、ヘテロ配座ポリヌクレオチドおよびＬ体ポリヌクレオチド配列部分の全部またはその一部とハイブリダイズされる第１の相補的ポリヌクレオチドを包含する。ここでは、第１の相補的ポリヌクレオチドは、固体支持体上に付着される。いくつかの実施形態では、そのハイブリッドは、ヘテロ配置ポリヌクレオチドおよびＬ体ポリヌクレオチド配列部分の全部またはその一部とハイブリダイズされる第１の相補的ポリヌクレオチドを包含する。ここで、ヘテロ配座ポリヌクレオチドは、固体支持体上に付着される。いくつかの実施形態では、ハイブリッドは、ヘテロ配座ポリヌクレオチドおよびＤ体ポリヌクレオチド配列部分の全部またはその一部とハイブリダイズされる、第１の相補的ポリヌクレオチドを包含する。ここで、第１の相補的ポリヌクレオチドは、固体支持体上に付着される。いくつかの実施形態では、そのハイブリッドは、ヘテロ配座ポリヌクレオチドおよびＤ体ポリヌクレオチド配列部分の全部またはその一部とハイブリダイズする第１の相補的ポリヌクレオチドを包含する。ここで、ヘテロ配置ポリヌクレオチドは、固定支持体上に付着される。いくつかの実施様態では、ハイブリッドは、ヘテロ配座ポリヌクレオチドおよびＤ体ポリヌクレオチド配列部分の全部またはその一部と相補的な（およびハイブリダイズする）、第１の相補的ポリヌクレオチド、ならびにＬ体ポリヌクレオチド配列部分の全部またはその一部に相補的な（およびハイブリダイズされる）、第２の相補的ポリヌクレオチドの間で形成され、ここで、第１の相補的ポリヌクレオチドまたは第２の相補的ポリヌクレオチドまたはヘテロ配置ポリヌクレオチドは、固体支持体上に付着される。上記実施形態では、接触または固定化は共有結合または非共有結合で完成される。また、上記実施様態では、ハイブッドは、支持体上に固定、付着、または捕捉される前、間または後で形成され得る。
【０１３６】
そのハイブリッドは、ヘテロ配置オリゴヌクレオチドのＬ体配列部分またはＤ対配列部分の少なくとも核塩基が特異的相互作用によって、相補的ポリヌクレオチド中の対応する核塩基と結合する、１つ以上の二重鎖、三重鎖または他の高次の構造を包含し得る。いくつかの実施様態では、ヘテロ配置オリゴヌクレオチドは、５〜５０のＤヌクレオチドを有するＤ体配列部分と結合またはリンカーによって共有結合する５〜５０のＬ体ヌクレオチドを有するＬ体配列部位を包含する。図２は、相補的「標的ポリヌクレオチド（下構造）を持つ典型的なヘテロ配置オリゴヌクレオチド（上構造）のハイブリダイゼーションを示す。この例証的な実施形態では、ヘテロ配置オリゴヌクレオチドのＤ体配列部分は、標的内のＤ体相補体の全部またはその一部とハイブリダイズする。
【０１３７】
本発明のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイズを行うための手段は、支持体結合ポリヌクレオチドの特性および固定される溶液中のポリヌクレオチドの特性（Ｂｏｗｔｅｌｌ，（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２１：２５−３２；Ｂｒｏｗｎ，（１９９９  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２１：３３−３７）に依存して変化する。ハイブリダイゼーションのための追加的参考文献は、ＷＯ０２／０２８２３Ａ２およびその文献の引用文献中に見られ得る。
【０１３８】
いくつかの実施様態では、ヘテロ配座オリゴヌクレオチドおよびその標的ポリヌクレオチド（または相補的オリゴヌクレオチド）のいずれかまたはその両方は、１つ以上の標識と共有結合する。標識は検出可能シグナルを生成するか、またはそれに続く反応、変換、または他の試薬との相互作用によって検出可能シグナルを促進する。あるいは、またはさらに、標識はハイブリダイゼーションを安定化させるか、プライマー伸長を促進するか、または標識ヘテロ配座オリゴヌクレオチド／標的ハイブリッドまたはその由来する産物の捕捉、複合体形成、または封鎖を可能にし得る。いくつかの実施様態では、その標的は蛍光色素、クエンチャー、エネルギー移動色素、量子ドット、ジゴキシゲニン、ビオチン、移動性改変物質、ポリペプチド、ハイブリダイゼーション安定化部分、および化学発光前駆物質であり得る。
【０１３９】
ヘテロ配座オリゴヌクレオチドおよび１つ以上の相補的オリゴヌクレオチドを含むハイブリッドは、異なった配列を有する複数の標的ポリヌクレオチドを含む混合物中におけるハイブリダイゼーションによって形成され得る。次いで、非ハイブリダイズ標的ポリヌクレオチドは、所望の場合、そのハイブリッドから分離され得、そのハイブリッドが検出され得る。いくつかの実施様態では、そのハイブリッドが相同体で検出され得るので、そのような分離工程は不必要であり、ここで、検出可能シグナルは、そのヘテロ配座オリゴヌクレオチドと相補的標的の間のハイブリダイゼーションによって産生される。
【０１４０】
いくつかの実施様態では、その標識ポリヌクレオチドは、ＳＮＰ含有核酸、ｍＲＮＡ，ｃＲＮＡ，ｃＤＮＡ，またはゲノムＤＮＡを含む。いくつかの実施様態では、その標的は、ヘテロ配座オリゴヌクレオチドに相補的な合成ポリヌクレオチド配列または配列部位を含む。
【０１４１】
ハイブリダイズしたヘテロ配座オリゴヌクレオチドは、レポーターおよびクエンチャーを含み得る。そのレポーターまたはクエンチャーは、ヘテロ配座オリゴヌクレオチドのＬ体配列部分またはＤ体配列部分に、結合またはリンカーによって、各々共有結合され得る。例えば、そのレポーターは、Ｌ体配列部位にリンカーによって結合し得、そのクエンチャーはＤ体配列部分にリンカーによって結合され得る。
【０１４２】
いくつかの実施様態では、ハイブリダイゼーションは、その標的ポリヌクレオチドが固体支持体に固定されている間、行われ得る。
【０１４３】
標識ヘテロ配座オリゴヌクレオチド／標識ハイブリッドは変性され得、その標識ヘテロ配座オリゴヌクレオチドは次に、相補的Ｌ体配列部位を有する他のオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションして、ヘテロ配座オリゴヌクレオチド／Ｌ−ポリヌクレオチド
ハイブリッドを形成する。配座的特異性は、ヘテロ配座オリゴヌクレオチドの利点的特性であり、ここで、それらのＬ体配列部分のみが、相補的Ｌ体配列部分にハイブリダイズし、そして同様に、それらのＤ体配列部分のみが、相補的Ｄ体配列部位にハイブリダイズする。この配座的特異性、つまり、直交性は、多くの核酸ハイブリダイゼーションアッセイに共通の、標的化工程と捕獲工程の間におけるクロスハイブリダイゼーションを最小限にするかまたは消失させる。
【０１４４】
Ｌ体およびＤ体ポリヌクレオチド配列は、安定状態では互いに塩基対にならないが、非掌性環境におけるそれらの特性は、必然的に同じである。例えば、ホスホルアミド合成法による、鏡像ホスホルアミダイトヌクレオシドの合成効率は、同じでなければならない。非掌性標識試薬を用いた化学的標識反応は、同様に効率的である。その環境が非掌性である限り、精製および解析は、同じ方法によって行われ、鏡像、鏡像異性のＬ体およびＤ体オリゴヌクレオチドについて同じ結果を生じる。例えば、典型的な逆相ＨＰＬＣ解析は、鏡像Ｌ体およびＤ体オリゴヌクレオチドについて同じプロフィールおよび保持時間を生じる。しかしながら、同一のヌクレオチドが同じＬ体およびＤ体配座のヌクレオチドではない同一の配列ヘテロ配座オリゴヌクレオチドは、ジアステレオマーであり、同じ特性を有さない。
【０１４５】
Ｌ体二重鎖のハイブリダイゼーション特性は、本質的に同じであるが、Ｄ体二重鎖に対して直交性である。例えば、特定の配列の全てのＬ体オリゴヌクレオチドは、そのＤ体相補体への結合における同じ配列の全てのＤ体オリゴヌクレオチドを有するように、そのＬ体オリゴヌクレオチド相補体への結合における同じＴｍ値を有する。二重鎖中のヘテロ配座オリゴヌクレオチドにおける非相補的Ｌ体またはＤ体配列部位の存在は、親和性、安定化または不安定化のいずれかに影響を有し得る。
【０１４６】
ヘテロ配座オリゴヌクレオチドの標的配列特異的部位は、相補的な標的配列との特異的アニーリングを許すために十分な長さである。配列特異的アニーリングを提供するプローブ設計の詳細な記述は、他の場所中で、例えば、ＤｉｆｆｅｎｂａｃｈａｎｄＤｖｅｋｓｌｅｒ，ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ａ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５，およびＫｗｏｋら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１８：９９９−１００５，１９９０）において見られ得る。
【０１４７】
本発明の蛍光／クエンチャーヘテロ配座オリゴヌクレオチドプローブは、例えば、５’ヌクレアーゼアッセイ、鎖置換増幅法（ＳＤＡ）、核酸配列ベースの増幅法（ＮＡＳＢＡ）、ローリングサークル増幅法（ＲＣＡ）、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｂａｒａｎｙ，米国特許第Ｎｏ．５，４９４，８１０号）、リガーゼ検出反応（ＬＤＲ）（Ｂａｒａｎｙ，米国特許第Ｎｏ．６，３１２，８９２号および６，０２７，８８９号）、転写媒介増幅法（ＴＭＡ）およびＱ−ベータレプリカ−ゼを包含する、種々のＤＮＡ増幅／定量手段における検出試薬として有益である。蛍光／クエンチャーヘテロ配座オリゴヌクレオチドプローブはまた、他の溶相アッセイまたは個相アッセイにおける標的の直接検出にとって有用である。さらには、そのプローブは、例えば、分子ビーコン、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ  ｐｒｏｂｅＴＭ、Ｓｕｎｒｉｓｅ  ｐｒｏｂｅＴＭ、ライトアッププローブ、ＩｎｖａｄｅｒＴＭ検出プローブ、およびＴａｑＭａｎＴＭプローブを包含する任意の形式において使用され得る。例えば、ＣａｒｄｕＬｌｏ，Ｒ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．ＮａｔＬ。Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：８７９０−８７９４；Ｓｔｒｙｅｒ．Ｌ．，（１９７８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４７：８１９−８４６；Ｒｅｈｍａｎ，Ｆ．Ｎ．，（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２７：６４９−６５５；Ｇｉｂｓｏｎ，Ｅ．Ｍ．，（１９９６）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，６：９９５−１００１；Ｌｉｖａｋ，米国特許第５，５３８，８４８号；Ｗｉｔｔｗｅｒ，Ｃ．Ｔ．（１９９７）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２２：１７６−１８１；Ｗｉｔｔｗｅｒ，Ｃ．Ｔ．，（１９９７ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２２：１３０−３８；Ｔｙａｇｉ，ＷＯ９５／１３３９９，Ｔｙａｇｉ，米国特許第６，０３７，１３０号；米国特許第６，１５０，０９７号；および米国特許第６，１０３，４７６号；Ｕｅｈａｒａ，（１９９９）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２６：５５２−５５８；Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅ，（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７：８０４−８０７；Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ，（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７：２９２；Ｄａｕｂｅｎｄｉｅｋ，（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５：２７３−３５０；Ｎａｒｄｏｎｅ，ＷＯ９９／６４４３２；Ｎａｄｅａｕ，米国特許第５，８４６，７２６号および米国特許第５，９２８，８６９号およびＮａｚａｒｅｎｋｏ，米国特許第５，８６６，３３６号を参照のこと。
【０１４８】
いくつかの実施様態は、本発明は、標識ヘテロ配座オリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブが、プローブセットとして、標的ポリヌクレオチドに隣接してハイブリダイズされ方法を包含する。適切な条件下で、隣接してハイブリダイズされたプローブは、それらのプローブが、適切な反応基例えば、遊離３’−ヒドロキシルまたは５’−リン酸基があるが、これらに限定されない（例えば図４参照）を含む限り、ライゲーション産物を形成するために共に結連され得る。いくつかのライゲーション反応は、１つより多くのヌクレオチドが異なる標的配列間の配列の違いを許容するために１つより多いヘテロ配座オリゴヌクレオチドまたは１つより多い第２のプローブを包み得る。      
【０１４９】
いくつかの実施様態では、標的配列は、上流または５’領域、下流または３’領域、および上流領域と下流領域の間に位置するＳＮＰヌクレオチドを含む。ＳＮＰは、１対のライゲーション可能なプローブ（「プローブセット」）によって検出されるヌクレオチドであり、例えば、多対立遺伝子標識部位における一塩基多型ヌクレオチドを表し得る。いくつかの実施様態では、標的のＳＮＰ部位に相補的なヌクレオチド塩基は、ヘテロ配座オリゴヌクレオチドプローブ（第１プローブ）または標的特異的プローブ対の第２プローブのどちらかの近位端に存在し得る。そのプローブセットのプローブが、適切な上流および下流の標的領域とハイブリダイズされる場合、およびＳＮＰに相補的なヌクレオチド塩基がその標的配列上のＳＮＰと塩基対を形成する場合、そのハイブリダイズされたプローブは共にライゲーション反応されて、ライゲーション産物を形成し得る（図８）。しかしながら、ＳＮＰに相補的なヌクレオチド塩基におけるミスマッチ塩基は、たとえ両方のプローブが、他の場合に、それら各々の標的領域と十分にハイブリダイズしても、ライゲーションを干渉する。このように、一塩基のみ異なる高関連配列が識別され得る。
【０１５０】
図８は、典型的なライゲーション反応を示す。二対立遺伝子部位における２つの潜在的対立遺伝子は、（１）２つの蛍光色素標識プローブであって、それらの配列が、３’末端または５’末端のいずれかにおけるそれらのＳＮＰ相補的位置（Ｎ１およびＮ２）のみ異なる、プローブ、（２）リン酸化ヘテロ配座オリゴヌクレオチドプローブ、ここで、その曲線はＬ体配列位置である、プローブ（３）その標識を含む試料、を含むプローブセットを組み合わせることによって、識別され得る。その２つの蛍光色素Ｄ１およびＤ２は異なり、スペクトルが異なる。３つの全てのプローブは、適切な条件下で標的配列とハイブリダイズするが、ハイブリダイズしたＳＮＰ相補体を有する色素標識プロ−ブのみが、ハイブリダイズしたリン酸化ヘテロ配座オリゴヌクレオチドプローブとライゲーションされる。Ｘ（Ｎ１）に相補的な末端ヌクレオチドを有するプローブは、５’リン酸ヘテロ配座オリゴヌクレオチドプローブとライゲーションし、ミスマッチ末端ヌクレオチド（Ｎ２）を持つプローブはライゲーションしない。例えば、１つの対立遺伝子のみが、そのＳＮＰ位置ＸがＧヌクレオチドＮ１がＣであり、Ｎ２がＴである試料中に存在する場合、Ｎ１がＣであるプローブのみが、ライゲーション産物を形成するためにライゲーションする。ライゲーション産物がライゲーションしないＮ２プローブから分離され得るか、または別個に検出され得るかもしくは検出可能に識別され得る場合、標識Ｄ１の検出はそのＳＮＰ位置がＧであることを教示する。標識Ｄ１およびＤ２の両方が検出され得る場合、両方の対立遺伝子体（ＸはＧおよびＡ）はヘテロ接合性の個体から存在することが推定され得る。
【０１５１】
いくつかの実施様態では、プローブセットは第１プローブまたは第２プローブの末端におけるＳＮＰ相補的部位を包含しない。むしろ、その標識ＳＮＰ部位のヌクレオチドまたは検出されるヌクレオチドは、５’または３’標識領域のいずれかに位置する。検出されるヌクレオチドは、末端あるいは内部であり得る。それらの個々の標的領域と十分に相補的な標的特異的部分は、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。これに対して、標的特異的部分に１つ以上のミスマッチ塩基を有するプローブは、それらの個々の標的領域とハイブリダイズしない。ヘテロ配座オリゴヌクレオチド第１プローブおよび第２プローブの両方のプローブは、産生されるライゲーション産物のための標的とハイブリダイズされなければならない。
【０１５２】
いくつかの実施様態では、プローブセット中のヘテロ配座オリゴヌクレオチドプローブおよび第２プロ−ブは、同じ融解温度（Ｔｍ）で消化される。プローブがＳＮＰ部位を含む場合、ＳＮＰ部位相補体を含むプロ−ブのＴｍ値は、プローブセット中のＳＮＰ部位相補体を含まない他のプローブより、およそ４〜６℃低くなるように設計され得る。ＳＮＰ位置相補体を含むプローブはまた、ライゲーション温度近くのＴｍ値を有するように設計され得る。このように、ミスマッチヌクレオチドを有するプローブは、ライゲーション温度での標的からより容易に解離する。従って、ライゲーション温度は、例えば、標的中の複数の潜在的対立遺伝子間を識別するための別の手段を提供する。
【０１５３】
本発明に従うライゲーション試薬は、多数の酵素的または化学的（すなわち非酵素的）試薬を含み得る。例えば、リガーゼは適切な条件下で、相補的配列とハイブリダイズする場合、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子中の隣接ヌクレオチドの３−ＯＨと５’−リン酸基の間のホスホジエステル結合を形成する酵素的ライゲーション試薬である。温度感受性リガーゼとしては、バクテリオファージＴ４リガーゼおよびＥ．ｃｏｌｉリガーゼが挙げられるが、これらに限定されない。熱安定性リガーゼとしては、Ｔａｑリガーゼ、Ｔｔｈリガーゼ、およびＰｆｕリガーゼが挙げられるが、これらに限定されない。熱安定性リガーゼは好熱性または超好熱性生物から得られ得る。
【０１５４】
プローブを結合させるための化学的ライゲーション試薬としては、制限なく、カルボジイミド試薬、ブロモシアン、臭化物（ＢｒＣＮ）、Ｎ−シアノイミダゾール、イミダゾール、１−メチルイミダゾール／カルボジイミド／シスタミン、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）および紫外光のような活性化剤、縮合剤、および還減が挙げられるが、これらに限定されない。オートライゲーション、すなわちライゲーション試薬の非存在下で自発的ライゲーションはまた、本発明の範囲内である。ヌクレオチド間結合としては、ホスホジエステル結合であり得る。他の典型的なヌクレオチド結合としては、ジスルフィド、ホスホアミダイト、アセタール、ピロリン酸塩、および、α−ハロアシル基およびチオホスホリルアセチルアミノ基を形成するためのホスホエステル基、およびホスホロチオエステルを形成するためのホスホルエステルおよびトルエンスルホン酸塩またはヨウ化物基のような適切な反応基間で形成される結合が挙げられる。化学的ライゲーション手段のための詳細なプロトコールは、とりわけ、例えば、Ｘｕ，（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，２７：８７５−８１；Ｇｒｙａｚｎｏｖ，（１９９３）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ  Ｒｅｓ．２１：１４０３−０８；Ｇｒｙａｚｎｏｖ、（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２２：２３６６−６９；Ｋａｎａｙａ，（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５：７４２３−３０；Ｌｕｅｂｋｅ，（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：３００５−０９；Ｓｉｅｖｅｒｓ，（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６９：２２１−２４；Ｌｉｕ，（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：３３００−０４；Ｗａｎｇ，（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：２３２６−３３；Ｐｕｒｍａｌ（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：３７１３−１９；Ａｓｈｌｅｙ，（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：２９２７−３３；Ｃｈｕ（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６：３６７１−９１；Ｓｏｋｏｌｏｖａ，（１９８８）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２３２：１５３−５５；Ｎａｙｌｏｒ，（１９６６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５：２７２２−２８；およびＬｅｔｓｉｎｇｅｒ，米国特許第５，４７６，９３０号中に見られ得る。
【０１５５】
ライゲーションは、少なくとも１サイクルのライゲーションを包含する。いくつかの実施様態では、（１）ライゲーションに適する第１プローブおよび第２プローブの標的特異的部分に、Ｊそれらの各々に相補的標的領域とハイブリダイズすること、（２）第１プロ−ブの３’末端と第２プローブの５’末端を結合してライゲーション産物を形成すること、および（３）核酸２倍体を変性させて、標的産物からライゲーション産物を分離することを包含する、１つより多くのサイクルが、行われる。そのサイクルは、ライゲーション産物の量を直線的に増加させるために、ライゲーション反応サーマルサイクリングすることによって繰り返しても、または繰り返さなくてもよい。
【０１５６】
ライゲーションの後、そのライゲーション産物は、「捕捉」オリゴヌクレオチドとハイブリダイズされ得る。捕捉オリゴヌクレオチドは、固体支持体上で固定され、アドレス可能なアレイ中に設定され得る。ライゲーション産物のＬ体ヌクレオチド部分（タグ）は、固定化されたオリゴヌクレオチドのＬ体ヌクレオチド配列部分と相補的であり得る。
【０１５７】
本発明の範囲にはまた、ギャプ充填ライゲーションのようなライゲーション技術がある。このライゲーション技術としては、限定ではなく、ギャップ充填ＯＬＡおよびＬＣＲ、架橋オリゴヌクレオチドライゲーション、ならびに補正ライゲーション（例えば、Ｕｌｌｍａｎ，米国特許第５，１８５，２４３号；Ｂａｃｋｍａｎ，ＥＰ  ３２０３０８；ＥＰ４３９１８２，およびＷＯ９０／０１０６９を参照のこと）が挙げられる。
【０１５８】
いくつかの適用において、標的配列検出は、低標的コピー数または低検出感受性に起因して、妨げられ得る。標的配列は、Ｍ．Ｉｎｎｉｓ，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９０）に詳述されているポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような任意の適切な手段を用いて増幅され得る。いくつかの実施形態では、ライゲーション後、そのライゲーション産物は、特異的なプライマーのセットによるＰＣＲによって増幅され得る（例えば、Ｆ．Ｂａｒａｎｙら、ＷＯ９７／４５５５９を参照のこと）。
【０１５９】
必要に応じて、ライゲーション産物は、少なくとも１サイクルのライゲ−ション後のライゲーション反応混合物から少なくともいくつかのライゲーションされないプローブ、標的ＤＮＡ、酵素、または副産物を除去する任意のプロセスによって精製され得る。そのようなプロセスとしては、分子量／サイズ排除プロセス、例えば、ゲル濾過クロマトグラフィーまたは透析、配列特異的ハイブリダイゼーションベースのプルアウト法、親和性捕捉技術、沈降、電気泳動、クロマトグラフィー、吸着、あるいは他の核酸精製技術が挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、増幅の前のライゲーション産物の精製が、ライゲーション産物を増幅するために必要なプライマーの量を減少させ、従って標的配列の検出コストを削減することを評価する。また、増幅前のライゲーション産物の精製は、増幅中の潜在的副産物を減少させ、ハイブリダイゼーション中にライゲーションされないプローブによる競合を減少させる。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、本発明は、プライマー伸長を含む方法を包含し、ここで、ヘテロ配座オリゴヌクレオチドプライマーは、ヘテロ配座オリゴヌクレオチド／標的ハイブリッドを形成するために、標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ヘテロ配座オリゴヌクレオチドプライマーは、５〜５０Ｄ−ヌクレオチドを有するＤ体配列部分に、ボンドまたはリンカーによって共有結合された５〜５０Ｌヌクレオチドを有するＬ体配列部分を含む。いくつかの実施態様において、Ｄ体配列部分の３’末端ヌクレオチドは、３’ヒドロキシルを有する。ハイブリッドの標識されたヘテロ配座オリゴヌクレオチド鎖のＤ体配列部分の３’末端ヌクレオチドは、プライマー伸長試薬で伸長される。図２の下部構造は、点線の二重鎖のヘテロ配座オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端からの核酸鎖の合成におけるヌクレオチド５’−三リン酸の組み込みを表す、ヘテロ配座オリゴヌクレオチド／標的ハイブリッドのプライマー伸長を示す。その反応は、ポリメラーゼ、１つ以上の酵素的取り込み可能なヌクレオチド５’−三リン酸、および緩衝液を含有する。プライマー伸長法によって、１つ以上の標識されたポリヌクレオチドフラグメントが形成され得る。
【０１６１】
本発明に従う増幅は、直線的または指数関数的のどちらかで、核酸配列を増幅するための広範囲の技術を含む。そのような技術の例としては、インビトロ転写法、ＰＣＲおよびプライマー伸長工程を用いる他の方法が挙げられるが、それらに限られない。増幅法は、サーマルサイクリングを包み、または等温で行われ得る。増幅法は、一般的に少なくとも１サイクルの増幅、すなわち、プライマーとライゲーション産物プライマー特異的部分または標的配列のへのハイブリダイズ；ポリメラーゼを用いる温度依存的形式におけるヌクレオチド鎖の合成；およびその鎖を分離するための、新しく形成された核酸二重鎖（アンプリコン）の変性などの連続的な手段を含む。そのサイクルは繰り返されても、または繰り返されなくてもよい。
【０１６２】
図５は、ヘテロ配座オリゴヌクレオチドプライマーを用いる例示的なポリメラーゼ連鎖反応を示す。ヘテロ配座オリゴヌクレオチドプライマーのＤ体配列部分の３’末端からのプライマー伸長は、ＰＣＲアンプリコンにおける「タグ」としてＬ体配列部分組み込む。
Ｌ体ヌクレオチドは、Ｄ体ヌクレオチドと安定な塩基対を形成しなので、増幅される標的部分は、そのプライマーのＤ体ヌクレオチドに限られない。増幅後、生じるアンプリコンの１つの鎖の５’末端は、Ｌ体配列タグを含む。
【０１６３】
いくつかの実施様態において、本発明の方法は、目的のｍＲＮＡの相対的な濃度をモニタリングするための方法およびアッセイを含む。ｍＲＮＡ集団は、サンプル、例えば、組織から単離され得、逆転写酵素によって、より安定なｃＤＮＡに変換され得る。ｍＲＮＡ配列またはｃＤＮＡ配列をコピーするための１つの方法は、ポリＡおよびポリＴを有するプライマーを有するｍＲＮＡの３’末端におけるポリＡテイルを利用することである。あるいは、遺伝子特異的プライマーは、目的の特定のｃＤＮＡをコピーする（例えば増幅する）ために使用され得る。ｍＲＮＡおよびｃＤＮＡをコピーするための方法としては、ＰＣＲ、ローリングサークル増幅、およびインビトロ転写（ＩＶＴ）が挙げられる。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ種は、複数の異なる配列特異的タグを包含するアレイを用いて、検出または定量される。
【０１６４】
ヘテロ配座オリゴヌクレオチドプライマーはまた、そのプライマー配列が５’末端にＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含むＩＶＴ（インビトロ転写法）において有用である。ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）の高コピーは、各々のｃＤＮＡ分子から転写され得る。例えば、標識は、標識されたｃＤＮＡを産生するために、標識されたリボヌクレオチド５’−三リン酸を介してか、あるいは第２逆転写酵素反応中に、直接組み込まれ得る。標識されたｃＤＮＡおよびｃＲＮＡは、固体支持体上に固定されるそれらの相補的配列にハイブリダイズされ得る。いくつかの実施形態において、ヘテロ配座オリゴヌクレオチドプライマーのプライマー伸長からのｃＤＮＡのＬ体配列部分は、支持体上に固定化された相補的オリゴヌクレオチドの相補的Ｌ体配列部分とハイブリダイズすることができる。
【０１６５】
それらの方法を行うためのアレイおよび方法は、例えば、ＷＯ０２／０２８２３および本明細書で引用される参考文献、および、例えば、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｂｉｏｃｈｉｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍ．Ｓｃｈｅｎａ編．，Ｅａｔｏｎ  Ｐｕｂｌｉｘｈｉｎｇ，ＢｉｏＴｃｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｂｏｏｋｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ  ０１７６０に記載されるように、周知である。いくつかの実施形態において、普遍的Ｌ−ＤＮＡアレイは、ＰＴＦＥ、親水性物質（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ  Ｒｅｓｉｓｔ−Ｒ１，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ポリプロピレン（Ａｃｒｏ  Ｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅ，Ｐａｌｌ）、またはナイロン（Ｃｕｎｏ−ｗｈｉｔｅ、Ｃｕｎｏ）から作られる９６ウェルマイクロタイタープレートの底に封入される多孔性膜上にスポットされる。例えば、いくつかの実施形態において、約１〜１５ｎｍｏｌｅのオリゴヌクレオチドが、直径４．５ｍｍ計の１ウェル当たりに固定される。
【０１６６】
複数の固定化オリゴヌクレオチドは、アドレス可能な位置でアレイにされ得る（図６）。各々の位置には、異なるＬ体配列を持つ固定化オリゴヌクレオチドがあり得る。ｃＤＮＡが標識される場合、そのＬ体配列は、任意の特定の遺伝子座から、検出可能なシグナルの存在または非存在によって推定され得る。多数の異なる標識の向きが実行可能である（図９）Ｙ標識された制御位置は基準線、バックグラウンド値を確立し得、シグナルの正規化を提供する（図１０）。
【０１６７】
本発明はまた、標識ポリヌクレオチドがｃＤＮＡであり、そのｃＤＮＡは、プライマー／標的ハイブリッドを形成するために、ヘテロ配座オリゴヌクレオチドプライマーと、ＲＮＡ標的ポリヌクレオチドをハイブリダイズさせることによって、そしてｃＤＮＡ転写物を形成するために、プライマー伸長試薬を用いてプライマー／標識ハイブリッドのプライマーの３’を伸長させることによって、形成される、遺伝子発現分析の方法を包含する。プライマー伸長反応は、少なくとも１つの逆転写酵素、１つ以上のヌクレオチド５’−三リン酸および緩衝液を含む。ヌクレオチド５’−三リン酸の１つ以上は、Ｌ体ＤＮＡ部分にタグ化された、多標識転写ｃＤＮＡを産生するために標識され得る（図３ｄ）。あるいは、ヘテロ配座オリゴヌクレオチドが標識され得る。図３ａは、Ｌ体部分が標識を含む実施形態を示す。図３ｂは、Ｄ体部分が標識を含む実施形態を示す。図３ｃは、ヘテロ配座オリゴヌクレオチドが、検出のためのいくつかの標識を含む相補的ポリヌクレオチドとハイブリダイズされる実施形態を示す。ＲＮＡは次に、高ｐＨ、ＲＮＡａｓｅ（切断））、および／または、例えば、特定の塩Ｍｇ２＋およびＺｎ２＋のような加水分解条件下で、加水分解され得る。得られた標識ｃＤＮＡは次に、スピンカラム法（Ｑｉａｇｅｎ）、シリカゲル処理、限外濾過（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ）、または沈降によって、過剰なプライマーおよびヌクレオチドを除去するために精製される。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、本発明はまた、多くのｍＲＮＡ配列の分析のためのハイスループットアッセイを含む。遺伝子特異的逆転写プライマーが設計および合成され得、そのプライマーは選択的コピーおよび増幅を可能にする。各特異的配列は、ヘテロ配座オリゴヌクレオチドのＤ体配列部分の一部または全体であり得る。各遺伝子特異的配列は、ヘテロ配座オリゴヌクレオチドにおける特異的Ｌ体配列部分にタグ化され得る。ヘテロ配座オリゴヌクレオチドにおける特異的Ｌ体配列部分に相補的なＬ体は、固定化オリゴヌクレオチド中に含まれ得る。限定的な数のｍＲＮＡ配列が検出される例えば、約１００個の場合、固定化オリゴヌクレオチドに数は任意のサンプルについて使用され得るアレイを構成する。Ｌ体のアレイは、適切な変性洗浄業務によって何度でも再利用され得るか、または一度使用されて廃棄され得る。
【０１６９】
Ｄ体核酸分析物（例えばｃＤＮＡ）を配列特異的ハイブリダイゼーションによって、「捕捉する」Ｄ体固定化オリゴヌクレオチドのアレイにおいて、クロスハイブリダゼションの問題が起こり得る。相補的ではなく１つ以上のミスマッチを含むＤ体固定化オリゴヌクレオチドへのＤ体核酸分析物の非特異的結合に起因して、偽陽性の結果が、シグナルが検出されることによって生じ得る。偽陽性に加えて、持続的かつ高レベルのバックグラウンドシグナルが、検出能、感受性その他曖昧な結果を制限し得る。本発明は、たとえ、Ｌ体配列がＷａｔｓｏｎ−ＣｒｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎの塩基対の意味において相補的であっても、Ｄ体配列と効率的にハイブリダイズしないＬ体配列を提供する。言い換えれば、Ｌ−ＤＮＡは、Ｄ−ＤＮＡと効率的にクロスハイブリダイズしない。従って、Ｌ体結合モチーフは、直交性、すなわち、核酸の分子認識特性における別の次元の特異性を提供する。また、Ｌ体核酸はヌクレアーゼ分解の基質ではないので、普遍的アレイは、より優れた安定性、耐久性、頑健性、および貯蔵期限のさらなる利点を有し得る。
【０１７０】
（キット）
試薬キットとして、標準的プライマー対およびプローブを配置することによって、および機械的に管（チューブ、ウェル、アレイ位置、またはスポット）に分配することによって、一塩基多型（ＳＮＰ）、対立遺伝子の識別、または疾患関連遺伝子をプロファイルするためのハイスループットアッセイが行われ得る。
【実施例】
【０１７１】
記載される本発明と、次の実施例は、例示の目的で提供されるが、これらに限られない。
【０１７２】
（実施例１）
（ヘテロ配座オリゴヌクレオチドの合成）
Ｌ−ＤＮＡホスホロアミダイトはＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（Ａｓｈｌａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｒｅ，２００  Ｈｏｍｅｒ  Ａｖｅｎｕｅ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＭＡ  ０１７２１）から購入した。Ｌ−ＤＮＡ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、０．２ｕｍｏｌ  ＤＮＡサイクルを用いて、次に標準的な合成サイクルを用いてＡＢＩ  ３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機上で合成した（ＡＢＩ３９４８，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏｒｐ．１９９５，Ｃｈａｐｔｅｒ  ４：Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）。標準的なＤＮＡアミダイドを、位置１〜４に配置し、Ｌ−ＤＮＡアミダイドは位置５〜８に配置した。合成後、オリゴを、アンモニウム水酸化物を用いて支持体から分け、５５℃で一晩、脱保護した。アンモニアを除き、ペレットを水中に溶解した。サンプルの濃度をＵＶ分光器によって決定し、ｄｄＨ２Ｏ（１００ｍＭ）の貯蔵溶液を調製した。
【０１７３】
（実施例２）
（アレイ上におけるＬ−ＤＮＡ結合）
図１２は、８つの異なったプローブの８×６アレイ（各々６回反復）が調製される実験結果を示す（固定化プローブ：  ＰＮＡ−ＺＩＰ３２（非相補的コントロール）、Ｄ−ＬＮＡ，Ｄ−ＤＮＡ，ＰＮＡ−ＮＨ２，Ｌ−ＤＮＡ，ＰＮＡＮＨＡｃ，ＰＮＡＮＨＡｃＳＨ，およびＰＮＡＮＨ２ＳＨ）が、オリゴＸ−ＳＭ０３２  ０５ｂ  ＣＦ（Ｌ−ＤＮＡ，「ｃｆ」）、オリゴＸ−ＳＭ０３２  ０４  ＣＦ（Ｄ−ＤＮＡ，「ｃｆ」）、オリゴＸ−ＳＭ０３２  ０２ｂ  ＴＦ（Ｌ−ＤＮＡ，「ｔｉｔａ」）またはオリゴＸ−ＳＭ０３２  ０１  ＴＦ（Ｄ−ＤＮＡ「ｔｉｎａ」）のいずれかを含む４つの異なるオリゴヌクレオチド溶液のいずれかとハイブリダイズに供した。初め２つのプローブは、（立体配座が無視されれば）固定化プロ−ブの配列と相補的な配列を含む。第２の２つのプローブは、固定化プローブのいずれとも相補的でない配列を含む。
【０１７４】
図１２から見られ得るように、「ｃｆ」Ｌ−ＤＮＡプローブは、相補的Ｌ−ＤＮＡおよび最後の３つのＰＮＡプローブとハイブリダイズするが、その他のプローブとはハイブリダイズしない。「ｃｆ」Ｄ−ＤＮＡプローブは、相補的Ｄ−ＤＮＡおよび最後の３つのＰＮＡプローブとハイブリダイズするが、その他のプローブとはハイブダイズしない。Ｄ「ｔｉａ」およびＬ「ｔｉａ」はどちらも、配列相補姓を持たないので、固定化プローブのいずれとも有意に結合しない。
【０１７５】
本明細書に記載される全ての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が、具体的にかつ個々に参考として援用されるように示されるかのように、同じ程度にまで参考として援用される。
【０１７６】
本発明はここで十分に記載されたので、本発明の趣旨と範囲から出発することなく、多くの変化と改変が行われ得ることは、当業者に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０１７７】
【図１】図１は、オリゴヌクレオチドのＤ体ＤＮＡ部分およびオリゴヌクレオチドの鏡像Ｌ体ＤＮＡ部分を示す。
【図２】図２は、ヘテロ配座オリゴヌクレオチドと標的ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよびこのヘテロ配座オリゴヌクレオチド／標的ハイブリッドのプライマー伸長を示す。
【図３】図３は、標識されたヘテロ配座オリゴヌクレオチド／標的ハイブリッドの典型的な実施形態を示し、（ａ）Ｌ体配列部分の末端は、標識に共有結合される、（ｂ）Ｄ体配列部分は、標識に共有結合される、（ｃ）標的は、複数標識される、そして（ｄ）標識は、標識されたヌクレオチド５’−三リン酸とともにプライマー伸長によって取り込まれる。
【図４】図４は、ヘテロ配座オリゴヌクレオチドプローブおよび第２のプローブとのライゲーションを示す。
【図５】図５は、Ｌ体配列がタグ化された増幅物を形成するために、ヘテロ配座オリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲを示す。
【図６】図６は、固定化されたオリゴヌクレオチドを含むＬ体配列のアドレス可能なアレイを示す。丸によって示される各位置は、特有のＬ体配列を含み得る。このＬ体配列は、ヘテロ配座オリゴヌクレオチドの相補的なＬ体配列とハイブリダイズし得る。
【図７】図７は、蛍光色素（Ｆ）およびクエンチャー（Ｑ）で標識されたプローブを示し、これにより、蛍光は、ハイブリダイズしていない状態（左）において、このクエンチャーとの接近によって打ち消される。標的配列とのハイブリダイゼーションにおいて、蛍光色素およびクエンチャーは、蛍光を可能にするのに十分に物理的に離される。
【図８】図８は、典型的なライゲーション反応と引き続くＰＣＲ増幅を示す。
【図９】図９は、アドレス可能なアレイ上での固定化され標識されたハイブリッドの例示的な実施形態を示す。
【図１０】図１０は、固定化され標識されたハイブリッドの例示的な実施形態を示し、標的配列の多数のヌクレオチドが標識され、そして１つの位置がコントロールとして標識され得る。
【図１１】図１１は、ヘテロ配座オリゴヌクレオチド／標的ハイブリッドの、ＳＮＰ部位（Ｘ）での標識されたジデオキシヌクレオチド５’−三リン酸を用いたプライマー伸長を示す。この伸長されたハイブリッドは変性され得、そして伸長されたプライマーは、標的から分離され、精製され、そして検出され得る。
【図１２】図１２は、スポットされたアレイ上でのハイブリダイゼーションの平均蛍光強度の、定量的な三次元プロットを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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