(57)【要約】特徴的な蛍光寿命を有する新規キナクリドン色素誘導体が開示されている。また、キナクリドン色素を用いた標的生物材料の標識方法および生物学的検定法における標識材料の使用についても開示されている。キナクリドン誘導体は構造(Ｉ)[ただし、Ｚ１およびＺ２は、独立して、１環、２縮合環または３縮合環芳香族または複素芳香族系を完成させるのに必要な原子を表しており、各環は、炭素原子、および酸素、窒素および硫黄から選択される所望による２個以下の原子から選択された５または６個の原子を有し、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、独立して、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、モノ‐もしくはジ‐ニトロ−置換ベンジル、アミノ、モノ‐もしくはジ‐Ｃ１‐Ｃ４アルキル‐置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、Ｃ１‐Ｃ６アルコキシ、アクリレート、ビニル、スチリル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ１‐Ｃ２０アルキル、アラルキル、スルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウム、基−Ｅ−Ｆおよび基−(ＣＨ２‐)ｎＹから選択され、Ｒ１およびＲ２は、独立して、水素、モノ‐もしくはジ‐ニトロ‐置換ベンジル、Ｃ１‐Ｃ２０アルキル、アラルキル、基−Ｅ−Ｆおよび基−(ＣＨ２‐)ｎＹから選択され、Ｅはスペーサー基であり、Ｆは標的結合基であり、Ｙは、スルホネート、スルフェート、ホスホネート、ホスフェート、第４級アンモニウムおよびカルボキシルから選択され、ｎは１〜６の整数である]を有する。本発明はまた、異なる蛍光性キナクリドン色素誘導体のセットに関するものであり、各色素は異なる蛍光寿命を有するものとし、色素のセットはマルチパラメーター分析に特に有用である。
2005501228.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試薬が、式
【化１】
2005501228.tif 000029
［式中、
基Ｒ３およびＲ４はＺ１環構造に結合され、基Ｒ５およびＲ６はＺ２環構造に結合されており、
Ｚ１およびＺ２は、独立して、１環、２縮合環または３縮合環芳香族または複素芳香族系を完成させるのに必要な原子を表しており、各環は、炭素原子、および酸素、窒素および硫黄から選択される所望による２個以下の原子から選択された５または６個の原子を有し、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、独立して、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、モノ‐もしくはジ‐ニトロ−置換ベンジル、アミノ、モノ‐もしくはジ‐Ｃ１‐Ｃ４アルキル‐置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、Ｃ１‐Ｃ６アルコキシ、アクリレート、ビニル、スチリル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ１‐Ｃ２０アルキル、アラルキル、スルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウム、基−Ｅ−Ｆおよび基−(ＣＨ２‐)ｎＹから選択され、
Ｒ１およびＲ２は、独立して、水素、モノ‐もしくはジ‐ニトロ‐置換ベンジル、Ｃ１‐Ｃ２０アルキル、アラルキル、基−Ｅ−Ｆおよび基−(ＣＨ２‐)ｎＹから選択され、
Ｅは、炭素、窒素、酸素、硫黄およびリン原子から成る群から選択される１〜６０個の原子の鎖を有するスペーサー基であり、Ｆは標的結合基であり、
Ｙは、スルホネート、スルフェート、ホスホネート、ホスフェート、第４級アンモニウムおよびカルボキシルから選択され、ｎは１〜６の整数である］
で示される色素である、標的生物材料標識用試薬の使用。
【請求項２】
色素が蛍光色素であり、
基Ｒ３およびＲ４がＺ１環構造の原子に結合され、基Ｒ５およびＲ６がＺ２環構造の原子に結合されており、Ｚ１およびＺ２が前記の意味であり、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８が、独立して、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、モノ‐もしくはジ‐Ｃ１‐Ｃ４アルキル‐置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、Ｃ１‐Ｃ６アルコキシ、アクリレート、ビニル、スチリル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ１‐Ｃ２０アルキル、アラルキル、スルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウム、基−Ｅ−Ｆおよび基−(ＣＨ２‐)ｎＹから選択され、そして
Ｒ１およびＲ２が、独立して、水素、Ｃ１‐Ｃ２０アルキル、アラルキル、基−Ｅ−Ｆおよび基−(ＣＨ２‐)ｎＹから選択され、
Ｅ、Ｆ、Ｙおよびｎが前記の意味である、請求項１記載の使用。
【請求項３】
色素が非蛍光性または実質的に非蛍光性色素であり、
基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｚ１およびＺ２が、前記の意味であり、そして、基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうち少なくとも１個が少なくとも１個のニトロ基を含む、請求項１記載の使用。
【請求項４】
基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうち少なくとも１個が基−Ｅ−Ｆであり、ＥおよびＦが前記の意味である、請求項１〜３記載の使用。
【請求項５】
標的結合基Ｆが、標的材料における官能基と反応するための反応性基、または標的材料における反応性基と反応するための官能基を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
反応基が、カルボキシル、スクシンイミジルエステル、スルホ‐スクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミド、ハロアセトアミド、酸ハライド、ヒドラジド、ビニルスルホン、ジクロロトリアジンおよびホスホラミダイトから選択される、請求項５記載の使用。
【請求項７】
官能基が、ヒドロキシ、アミノ、スルフヒドリル、イミダゾール、アルデヒドおよびケトンを含むカルボニル、リン酸およびチオリン酸基から選択される、請求項５記載の使用。
【請求項８】
スペーサー基Ｅが、
-(CHR')p-
-{(CHR')q-O-(CHR')r}s-
-{(CHR')q-NR'-(CHR')r}s-
-{(CHR')q-(CH=CH)-(CHR')r}s-
-{(CHR')q-Ar-(CHR')r}s-
-{(CHR')q-CO-NR'-(CHR')r}s-
-{(CHR')q-CO-Ar-NR'-(CHR')r}s-
［式中、Ｒ'は、水素、Ｃ１−Ｃ４アルキルまたはアリールであって、所望によりスルホネートにより置換され得、Ａｒは、所望によりスルホネートにより置換されていてもよいフェニレンであり、ｐは１〜２０、好ましくは１〜１０であり、ｑは０〜１０であり、ｒは１〜１０であり、そしてｓは１〜５である］
から選択される、請求項１〜７のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
標的生物材料標識方法であって、
ｉ）標的生物材料を含む液体に、式
【化２】
2005501228.tif 000030
［式中、
基Ｒ３およびＲ４はＺ１環構造に結合され、基Ｒ５およびＲ６はＺ２環構造に結合されており、Ｚ１およびＺ２は前記の意味であり、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、独立して、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、モノ‐もしくはジ‐Ｃ１‐Ｃ４アルキル‐置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、Ｃ１‐Ｃ６アルコキシ、アクリレート、ビニル、スチリル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ１‐Ｃ２０アルキル、アラルキル、スルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウム、基−Ｅ−Ｆおよび基−(ＣＨ２‐)ｎＹから選択され、
Ｒ１およびＲ２は、独立して、水素、Ｃ１‐Ｃ２０アルキル、アラルキル、基−Ｅ−Ｆおよび基−(ＣＨ２‐)ｎＹから選択され、Ｅ、Ｆ、Ｙおよびｎは前記の意味である］
の色素を加え、そして
ii）標的を標識するのに適切な条件下、色素と標的生物材料をインキュベーションする
工程を含む方法。
【請求項１０】
基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうち少なくとも１個が基−Ｅ−Ｆであり、ＥおよびＦが前記の意味である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
標的生物材料が、抗体、脂質、タンパク質、ペプチド、炭水化物、１個またはそれ以上のアミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシルおよびカルボキシル、リン酸およびチオリン酸基を含むかまたは含むように誘導体化されているヌクレオチド、および１個またはそれ以上のアミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシルおよびカルボキシル、リン酸およびチオリン酸基を含むかまたは含むように誘導体化されているオキシまたはデオキシポリ核酸、微生物材料、薬剤、ホルモン、細胞、細胞膜および毒素から成る群から選択される、請求項９または請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
試料中における被検体の検定方法であって、
ｉ)被検体の少なくとも一部分を特異的結合パートナーと結合させるのに適切な条件下、被検体を被検体に特異的な結合パートナーと接触させることにより、複合体を形成させ、そして被検体および特異的結合パートナーのうちの一方を、式
【化３】
2005501228.tif 000031
［式中、
基Ｒ３およびＲ４はＺ１環構造の原子に結合され、基Ｒ５およびＲ６はＺ２環構造の原子に結合されており、Ｚ１およびＺ２は前記の意味であり、
基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうち少なくとも１個は基−Ｅ−Ｆであり、ここでＥは、炭素、窒素、酸素、硫黄およびリン原子から成る群から選択される１〜６０個の原子の鎖を有するスペーサー基であって、Ｆは標的結合基であり、
基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうちの何れかが基−Ｅ−Ｆではないとき、残りの基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、独立して、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、モノ‐もしくはジ‐Ｃ１‐Ｃ４アルキル‐置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、Ｃ１‐Ｃ６アルコキシ、アクリレート、ビニル、スチリル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ１‐Ｃ２０アルキル、アラルキル、スルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウムおよび基−(ＣＨ２‐)ｎＹから選択され、そして
基Ｒ１およびＲ２のうちいずれかが基−Ｅ−Ｆではないとき、残りの基Ｒ１およびＲ２は、独立して水素、Ｃ１‐Ｃ２０アルキル、アラルキルおよび基−(ＣＨ２‐)ｎＹから選択され、
Ｙおよびｎは前記の意味である］
の蛍光色素で標識し、
ii)標識複合体から放出された蛍光を測定し、および
iii)放出された蛍光と試料中における被検体の存在または量との相互関係を明らかにする
工程を含む方法。
【請求項１３】
測定工程ii)が、標識複合体の蛍光寿命または蛍光偏光を測定することにより行なわれる、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
被検体‐特異的結合パートナーが、抗体／抗原、レクチン／糖タンパク質、ビオチン／ストレプトアビジン、ホルモン／受容体、酵素／基質または補因子、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡおよびＤＮＡ／結合タンパク質から成る群から選択される、請求項１２または請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
試料中における酵素測定についての検定方法であって、
ｉ)酵素についての基質を準備し、ただし基質は、式
【化４】
2005501228.tif 000032
［式中、
基Ｒ３およびＲ４はＺ１環構造の原子に結合され、基Ｒ５およびＲ６はＺ２環構造の原子に結合されており、Ｚ１およびＺ２は前記の意味であり、
基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうち少なくとも１個は基−Ｅ−Ｆであり、ここでＥは、炭素、窒素、酸素、硫黄およびリン原子から成る群から選択される１〜６０個の原子の鎖を有するスペーサー基であって、Ｆは標的結合基であり、
基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうちの何れかが基−Ｅ−Ｆではないとき、残りの基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、独立して、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、モノ‐もしくはジ‐Ｃ１‐Ｃ４アルキル‐置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、Ｃ１‐Ｃ６アルコキシ、アクリレート、ビニル、スチリル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ１‐Ｃ２０アルキル、アラルキル、スルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウムおよび基−(ＣＨ２‐)ｎＹから選択され、そして
基Ｒ１およびＲ２のうちいずれかが基−Ｅ−Ｆではないとき、残りの基Ｒ１およびＲ２は、独立して水素、Ｃ１‐Ｃ２０アルキル、アラルキルおよび基−(ＣＨ２‐)ｎＹから選択され、
Ｙおよびｎは前記の意味である］
の蛍光色素で標識されているものとし、
ii)酵素反応の開始に適した条件下、標識基質を酵素と合わせ、そして
iii)試料の蛍光偏光を測定することにより、反応の程度を測定する
工程を含む方法。
【請求項１６】
２種またはそれ以上の異なる蛍光色素セットであって、色素セットの各色素が、式
【化５】
2005501228.tif 000033
［式中、
基Ｒ３およびＲ４はＺ１環構造に結合され、基Ｒ５およびＲ６はＺ２環構造に結合されており、Ｚ１およびＺ２は前記の意味であり、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、独立して、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、モノ‐もしくはジ‐Ｃ１‐Ｃ４アルキル‐置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、Ｃ１‐Ｃ６アルコキシ、アクリレート、ビニル、スチリル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ１‐Ｃ２０アルキル、アラルキル、スルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウム、基−Ｅ−Ｆおよび基−(ＣＨ２‐)ｎＹから選択され、
Ｒ１およびＲ２は、独立して、水素、Ｃ１‐Ｃ２０アルキル、アラルキル、基−Ｅ−Ｆおよび基−(ＣＨ２‐)ｎＹから選択され、
Ｅは、炭素、窒素、酸素、硫黄およびリン原子から成る群から選択される１〜６０個の原子の鎖を有するスペーサー基であり、そしてＦは標的結合基であり、
Ｙは、スルホネート、スルフェート、ホスホネート、ホスフェート、第４級アンモニウムおよびカルボキシルから選択され、ｎは１〜６の整数である］
を有し、セットの各色素が、セットの残りの色素の寿命と比べて明確に異なる蛍光寿命を有するものである、セット。
【請求項１７】
基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうち少なくとも１個が基−Ｅ−Ｆであり、ここでＥおよびＦは前記の意味である、請求項１６記載のセット。
【請求項１８】
４種の異なる色素を含む、請求項１６または請求項１７記載のセット。
【請求項１９】
セットの各色素が、１〜３０ナノ秒の範囲、さらに好ましくは１０〜２５ナノ秒の範囲での異なる蛍光寿命を呈する、請求項１６〜１８のいずれかに記載のセット。
【請求項２０】
色素の各々の蛍光放出の寿命が少なくとも０.５ナノ秒ごとに分離される、請求項１６〜１９のいずれかに記載のセット。
【請求項２１】
式
【化６】
2005501228.tif 000034
［式中、
基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｚ１およびＺ２は、前記の意味であり、そして、基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうち少なくとも１個は少なくとも１個のニトロ基を含む］
で示される非蛍光または実質的に非蛍光色素の蛍光を増加させる方法であって、少なくとも一ニトロ基の、−ＮＨＯＨまたは−ＮＨ２への還元を特徴とする方法。
【請求項２２】
組成物におけるニトロレダクターゼ酵素活性の検出方法であって、
ｉ)ニトロレダクターゼ活性を高める条件下、組成物を式
【化７】
2005501228.tif 000035
［式中、
基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｚ１およびＺ２は、前記の意味であり、そして、基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうち少なくとも１個は少なくとも１個のニトロ基を含む］
で示される色素と混合し、そして
ii)ニトロレダクターゼ活性の量の尺度である、蛍光の増加を測定する
ことを含む方法。
【請求項２３】
ｉ)特異的結合対の第１成分を表面に結合させ、
ii)成分間の結合を促す条件下、特異的結合対の第２成分を加え、ただし、その第２成分はニトロレダクターゼ酵素で標識されているものとし、
iii)式
【化８】
2005501228.tif 000036
［式中、
基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｚ１およびＺ２は、前記の意味であり、そして、基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうち少なくとも１個は少なくとも１個のニトロ基を含む］
で示される色素を加え、そして
iv)結合ニトロレダクターゼ活性の尺度として蛍光の増加を測定することにより、第１成分への第２成分の結合を検出する
ことを含む検定方法。
【請求項２４】
特異的結合対が、抗体／抗原、レクチン／糖タンパク質、ビオチン／ストレプトアビジン、ホルモン／受容体、酵素／基質、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡおよびＤＮＡ／結合タンパク質から成る群から選択される、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
ｉ)ニトロレダクターゼをコード化する配列に機能し得るように結合された発現制御配列を含む核酸分子によりトランスフェクションされた宿主細胞を、式
【化９】
2005501228.tif 000037
［式中、
基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｚ１およびＺ２は、前記の意味であり、そして、基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうち少なくとも１個は少なくとも１個のニトロ基を含む］
で示される色素と接触させ、
ii)ニトロレダクターゼ遺伝子発現の尺度として蛍光の増加を測定する
ことを含む検定方法。
【請求項２６】
遺伝子発現に対するその効果が測定されるべき試験剤の存在下で検定を実施する、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
式
【化１０】
2005501228.tif 000038
［式中、
基Ｒ３およびＲ４はＺ１環構造の原子に結合され、基Ｒ５およびＲ６はＺ２環構造の原子に結合されており、
Ｚ１およびＺ２は、独立して、１環、２縮合環または３縮合環芳香族または複素芳香族系を完成させるのに必要な原子を表しており、各環は、炭素原子、および酸素、窒素および硫黄から選択される所望による２個以下の原子から選択された５または６個の原子を有し、
基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうち少なくとも１個は基−Ｅ−Ｆであり、ここでＥは、炭素、窒素、酸素、硫黄およびリン原子から成る群から選択される１〜６０個の原子の鎖を有するスペーサー基であって、Ｆは標的結合基であり、そして
基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうちの何れかが基−Ｅ−Ｆではないとき、残りの基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、独立して、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、アミノ、モノ‐もしくはジ‐Ｃ１‐Ｃ４アルキル‐置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、Ｃ１‐Ｃ６アルコキシ、アクリレート、ビニル、スチリル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ１‐Ｃ２０アルキル、アラルキル、スルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウムおよび基−(ＣＨ２‐)ｎＹから選択され、そして
基Ｒ１およびＲ２のうちいずれかが基−Ｅ−Ｆではないとき、残りの基Ｒ１およびＲ２は、独立して水素、モノ‐もしくはジ‐ニトロ‐置換ベンジル、Ｃ１‐Ｃ２０アルキル、アラルキルおよび基−(ＣＨ２‐)ｎＹから選択され、
Ｅは、炭素、窒素、酸素、硫黄およびリン原子から成る群から選択される１〜６０個の原子の鎖を有するスペーサー基であって、Ｆは標的結合基であり、
Ｙは、スルホネート、スルフェート、ホスホネート、ホスフェート、第４級アンモニウムおよびカルボキシルから選択され、ｎは１〜６の整数であり、
ただし、基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうち少なくとも１個は水可溶化基であるものとする］
で示される色素。
【請求項２８】
標的結合基Ｆが、
ｉ)カルボキシル、スクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミド、ハロアセトアミド、酸ハライド、ヒドラジド、ビニルスルホン、ジクロロトリアジンおよびホスホラミダイトから選択される反応性基、または
ii)ヒドロキシ、アミノ、スルフヒドリル、イミダゾール、アルデヒドおよびケトンを含むカルボニル、リン酸およびチオリン酸から選択される官能基
を含む、請求項２７記載の色素。
【請求項２９】
スペーサー基Ｅが、
-(CHR')p-
-{(CHR')q-O-(CHR')r}s-
-{(CHR')q-NR'-(CHR')r}s-
-{(CHR')q-(CH=CH)-(CHR')r}s-
-{(CHR')q-Ar-(CHR')r}s-
-{(CHR')q-CO-NR'-(CHR')r}s-
-{(CHR')q-CO-Ar-NR'-(CHR')r}s-
［式中、Ｒ'は、水素、Ｃ１−Ｃ４アルキルまたはアリールであって、所望によりスルホネートにより置換され得、Ａｒは、所望によりスルホネートにより置換されていてもよいフェニレンであり、ｐは１〜２０、好ましくは１〜１０であり、ｑは０〜１０であり、ｒは１〜１０であり、そしてｓは１〜５である］
から選択される、請求項２７または請求項２８記載の色素。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、新規蛍光標識に関するものである。特に、本発明は、標的生物材料への結合用標識として使用され得る新規キナクリドン誘導体に関するものである。本発明はまた、標的生物材料の標識方法および生物学的検定法における上記標識材料の使用に関するものである。
【０００２】
生物材料の標識および検出に使用される蛍光標識についての関心および要求はますます増大しつつある。蛍光標識は、一般的に安定して、高感度であり、現時点では広い範囲の方法が生体分子の標識に利用可能である。典型的には、蛍光色素の放出スペクトルは、色素独特の特性である。蛍光強度、蛍光寿命または蛍光偏光の測定は、その色素で標識された材料の検出および定量で使用され得る。蛍光標識生体分子の検出および／または濃度測定手段としての蛍光強度の測定に伴う一つの問題は、バックグラウンド蛍光が測定に干渉し得ることである。すなわち、蛍光検出感度の改善を達成するためは、シグナル対ノイズ比を改善することが非常に望ましい。
【０００３】
バックグラウンドノイズの問題を克服する一手段は、米国特許第５２６８４８６号(Waggoner et al.)に開示されている通り、波長の長い色素、例えばシアニン色素Ｃｙ(登録商標)５およびＣｙ７の使用によるものであった。これらの色素は、６００〜７５０ｎｍのスペクトル領域の蛍光を発し、その場合、バックグラウンド蛍光はほとんど問題にならない。蛍光測定におけるシグナル対ノイズ比を改善する別の手段は、例えばランタニドキレート、例えばＥｕ３＋およびＴｂ３＋に基いた蛍光標識を用いることによる(Selvin et al,米国特許第５６２２８２号)、時間分解蛍光の使用によるものである。時間分解蛍光標識では、蛍光放出は、典型的にはバックグラウンド蛍光の場合よりも長いため、適切な器具を用いてゲーティングされ得る。
【０００４】
線形トランス‐キナクリドンは蛍光性が高く、キナクリドン誘導体は、高感度ホトセンサーおよび有機発光ダイオードおよび光学プローブで使用するための有機色素として開発されてきた(米国特許第２８４４４８４号(Reidinger,A.D.et al)、米国特許第３３８６８４３号(Jaffe,E.E.et al))。Liu,P-H et al(J.Photochem.Photobiol.、(２０００)、１３７、９９−１０４)は、若干の５,１２−Ｎ,Ｎ'−ジアルキル−２,９−ジアルコキシキナクリドンを合成し、それらのスペクトル特性を研究している。Klein,G.et al(J.Chem.Soc.Chem.Commun.、(２００１)、５６１−２)は、蛍光金属センサーとして使用するためのエチレンジアミン官能化キナクリドン誘導体を製造した。
【０００５】
Val'kova,G.et al(Dokl.Akad.Nauk.SSR、(１９７８)、２４０(４)、８８４−７)は、キナクリドンの蛍光寿命を測定してきたが、現在までのところ、生物材料、例えば核酸、ペプチド、タンパク質、抗体、薬剤、ホルモン、細胞などの標識および検出に適切な色素としてのキナクリドンの使用に関する報告は為されていないと思われる。したがって、本発明は、キナクリドン発色団の修飾による、生物材料の標識に有用な一連のキナクリドン誘導体の製造について記載している。さらに、本発明のキナクリドン誘導体は、共通の骨格構造を有し、マルチパラメーター分析に特に有用である蛍光標識の貴重なセットを提供する。色素セットの各色素において、吸収および放出スペクトルは本質的に同じままであり、色素の蛍光寿命が変化している。すなわち、一般的励起源を使用し、同じ発光波長での蛍光寿命を測定することにより、マルチパラメーター実験で使用される検出器具についての必要条件を単純化することが可能である。本発明による色素の別の利点は、キナクリドン誘導体の蛍光発光波長および寿命が一般的に他の蛍光標識および天然蛍光材料、例えばタンパク質およびポリヌクレオチドの寿命より長いことにより、上記色素を利用した検定においてバックグラウンド蛍光との区別が容易に行われ得ることである。
【０００６】
したがって第一の態様において、本発明は、試薬が、式(Ｉ)
【化１】
2005501228.tif 000003
(Ｉ)
［式中、
基Ｒ３およびＲ４はＺ１環構造に結合され、基Ｒ５およびＲ６はＺ２環構造に結合されており、
Ｚ１およびＺ２は、独立して、１環、２縮合環または３縮合環芳香族または複素芳香族系を完成させるのに必要な原子を表しており、各環は、炭素原子、および酸素、窒素および硫黄から選択される所望による２個以下の原子から選択された５または６個の原子を有し、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、独立して、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、モノ‐もしくはジ‐ニトロ−置換ベンジル、アミノ、モノ‐もしくはジ‐Ｃ１‐Ｃ４アルキル‐置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、Ｃ１‐Ｃ６アルコキシ、アクリレート、ビニル、スチリル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ１‐Ｃ２０アルキル、アラルキル、スルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウム、基−Ｅ−Ｆおよび基−(ＣＨ２‐)ｎＹから選択され、
Ｒ１およびＲ２は、独立して、水素、モノ‐もしくはジ‐ニトロ‐置換ベンジル、Ｃ１‐Ｃ２０アルキル、アラルキル、基−Ｅ−Ｆおよび基−(ＣＨ２‐)ｎＹから選択され、
Ｅは、炭素、窒素、酸素、硫黄およびリン原子から成る群から選択される１〜６０個の原子の鎖を有するスペーサー基であり、Ｆは標的結合基であり、
Ｙは、スルホネート、スルフェート、ホスホネート、ホスフェート、第４級アンモニウムおよびカルボキシルから選択され、ｎは１〜６の整数である］
で示される色素である、標的生物材料標識用試薬の使用に関するものである。
【０００７】
第一態様の第一の実施例において、式(Ｉ)の色素は、
基Ｒ３およびＲ４がＺ１環構造の原子に結合され、基Ｒ５およびＲ６がＺ２環構造の原子に結合されており、Ｚ１およびＺ２が前記の意味であり、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８が、独立して、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、モノ‐もしくはジ‐Ｃ１‐Ｃ４アルキル‐置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、Ｃ１‐Ｃ６アルコキシ、アクリレート、ビニル、スチリル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ１‐Ｃ２０アルキル、アラルキル、スルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウム、基−Ｅ−Ｆおよび基−(ＣＨ２‐)ｎＹから選択され、そして
Ｒ１およびＲ２が、独立して、水素、Ｃ１‐Ｃ２０アルキル、アラルキル、基−Ｅ−Ｆおよび基−(ＣＨ２‐)ｎＹから選択され、Ｅ、Ｆ、Ｙおよびｎが前記の意味である、蛍光色素である。
【０００８】
第一態様の第一の実施例によるキナクリドン色素は、蛍光寿命色素としての使用に特に適切である。本発明の明細書において、寿命色素の語は、色素が、励起後にその励起状態のままである時間の平均量として定義される(Lakowicz,J.R.、Principles of Fluorescence Spectroscopy、クルワー・アカデミック／プレナム・パブリッシャーズ、ニューヨーク(１９９９))、測定可能な蛍光寿命を有する色素を意味するものとする。別法として、色素は、蛍光偏光を利用する検定法で使用され得る。
【０００９】
好適には、第一態様の第一の実施例による蛍光色素は、１〜３０ナノ秒の範囲の蛍光寿命を呈する。好ましくは、色素の蛍光寿命は、１０〜２５ナノ秒の範囲である。
【００１０】
第一態様の第二の実施例において、式(Ｉ)の色素は、基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｚ１およびＺ２が、前記の意味であり、そして、基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうち少なくとも１個が少なくとも１個のニトロ基を含む、非蛍光または実質的非蛍光色素である。
【００１１】
この実施例において、好適には、少なくとも１個のニトロ基は、Ｚ１および／またはＺ２環構造に直接結合され得る。他の例では、モノ‐もしくはジ‐ニトロ‐置換ベンジル基は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７またはＲ８位に結合され得、所望によりさらにＺ１および／またはＺ２環構造へ直接結合された１個またはそれ以上のニトロ基により置換され得る。
【００１２】
好ましくは、第一および第二実施例において、式(Ｉ)の染料における基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうちの少なくとも１個は、基−Ｅ−Ｆ(ただし、ＥおよびＦは前記の意味である)である。
【００１３】
好適には、標的結合基Ｆは、反応性または官能性基である。式(Ｉ)の色素の反応基は、適切な条件下で標的材料の官能基と反応し得、また式(Ｉ)の色素の官能基は、適切な条件下で標的材料の反応基と反応し得、いずれにしても標的材料が化合物によって標識されるように行なわれる。
【００１４】
好ましくは、Ｆが反応基であるとき、それは、スクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミド、ハロアセトアミド、酸ハライド、ビニルスルホン、ジクロロトリアジン、カルボジイミド、ヒドラジドおよびホスホラミダイト(phosphoramidite)から選択される。好ましくは、Ｆが官能基であるとき、それは、ヒドロキシ、アミノ、スルフヒドリル、イミダゾール、アルデヒドおよびケトンを含むカルボニル、リン酸およびチオリン酸から選択される。これらの反応および官能基により、式(Ｉ)の色素は標的材料と反応し、共有結合し得る。
【００１５】
好適には、Ｚ１およびＺ２は、フェニル、ピリジニル、ナフチル、アントラニル、インデニル、フルオレニル、キノリニル、インドリル、ベンゾチオフェニル、ベンゾフラニルおよびベンゾイミダゾリル部分から成る群から選択され得る。追加的１、２縮合または３縮合環構造は、当業者には容易に理解できるはずである。好ましいＺ１およびＺ２は、フェニル、ピリジニル、ナフチル、キノリニルおよびインドリル部分から成る群から選択される。特に好ましいＺ１およびＺ２は、フェニルおよびナフチル部分である。
【００１６】
好ましくは、式(Ｉ)で示される色素の基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうちの少なくとも１個は、化合物に親水特性を付与する水可溶化基である。可溶化基、例えばスルホネート、スルホン酸および第４級アンモニウムは、式(Ｉ)で示される化合物の芳香族環構造Ｚ１および／またはＺ２に直接結合され得る。別法として、可溶化基は、Ｃ１−Ｃ６アルキルリンカー鎖により上記芳香族環構造へ結合され得、基−(ＣＨ２−)ｎＹ(ここで、Ｙは、スルホネート、スルフェート、ホスホネート、ホスフェート、第４級アンモニウムおよびカルボキシルから選択され、ｎは１〜６の整数である)から選択され得る。別の可溶化基は、炭水化物残基、例えば単糖類であり得る。水可溶化成分の例には、Ｃ１−Ｃ６アルキルスルホネート、例えば−(ＣＨ２)３−ＳＯ３−および−(ＣＨ２)４−ＳＯ３−がある。しかしながら、式(Ｉ)で示される色素の芳香族環構造に直接結合される１個またはそれ以上のスルホネートまたはスルホン酸基が特に好ましい。水可溶性は、タンパク質標識時に有利であり得る。
【００１７】
適切なスペーサー基Ｅは、炭素、窒素、酸素、硫黄およびリンから成る群から選択される１〜６０個の鎖原子を含み得る。例えばスペーサー基は、
-(CHR')p-
-{(CHR')q-O-(CHR')r}s-
-{(CHR')q-NR'-(CHR')r}s-
-{(CHR')q-(CH=CH)-(CHR')r}s-
-{(CHR')q-Ar-(CHR')r}s-
-{(CHR')q-CO-NR'-(CHR')r}s-
-{(CHR')q-CO-Ar-NR'-(CHR')r}s-
［式中、Ｒ'は、水素、Ｃ１−Ｃ４アルキルまたはアリールであって、所望によりスルホネートにより置換され得、Ａｒは、所望によりスルホネートにより置換されていてもよいフェニレンであり、ｐは１〜２０、好ましくは１〜１０であり、ｑは０〜１０であり、ｒは１〜１０であり、そしてｓは１〜５である］であり得る。
【００１８】
反応基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８の具体例およびＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８と反応し得る基の具体例は表１に示されている。別の例では、基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、標的材料の反応基と反応する表１の官能基であり得る。
【００１９】
表１：可能な反応性置換基およびそれと反応性を示す部位
【表１】
2005501228.tif 000004
【００２０】
利用可能なアミノおよびヒドロキシル官能基による標的材料の標識に特に有用である好ましい反応基には、以下のものが含まれる：
【化２】
2005501228.tif 000005
(式中、ｎは０または１〜１０の整数である)
【００２１】
アリールは、６〜１０個の炭素原子を含む１個または２個の縮合芳香族環を含む芳香族置換基、例えばフェニルまたはナフチルであり、アリールは、所望により、そして独立して１個またはそれ以上の置換基、例えばハロゲン、ヒドロキシル、１〜１０個の炭素原子を含む直鎖または分枝状鎖アルキル基、アラルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシ、例えばメトキシ、エトキシ、プロポキシおよびｎ−ブトキシにより置換されていてもよい。
【００２２】
ヘテロアリールは、Ｎ、ＯおよびＳから選択され得る少なくとも１個および３個以下のヘテロ原子を含む単環式または二環式５〜１０員芳香族環系であり、所望により、そして独立して１個またはそれ以上の置換基、例えばハロゲン、ヒドロキシル、１〜１０個の炭素原子を含む直鎖または分枝状鎖アルキル基、アラルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシ、例えばメトキシ、エトキシ、プロポキシおよびｎ−ブトキシにより置換されていてもよい。
【００２３】
アラルキルは、アリールまたはヘテロアリール基により置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル基である。
【００２４】
ハロゲンおよびハロ基は、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素から選択される。
【００２５】
第一態様の第一実施例による色素の実例は以下の通りである：
ｉ)６−{２,９−ジメトキシ−１２−(５−カルボキシペンチル)−７,１４−ジオキソ−７,１４−ジヒドロ−１２Ｈ−キノ[２,３−ｂ]アクリジン−５−イル}ヘキサン酸、ジエチルエステル、
ii)６−{２,９−ジブロモ−１２−(５−カルボキシペンチル)−７,１４−ジオキソ−７,１４−ジヒドロ−１２Ｈ−キノ[２,３−ｂ]アクリジン−５−イル}ヘキサン酸、
iii)６−{１２−エチル−７,１４−ジオキソ−２,９−ジスルホ−７,１４−ジヒドロ−１２Ｈ−キノ[２,３−ｂ]アクリジン−５−イル}ヘキサン酸。
【００２６】
本発明による蛍光色素は、様々な標的生物材料を標識し、それによって蛍光特性を与えるのに使用され得る。すなわち、第２の態様では、標的生物材料の標識方法であって、
ｉ）標的生物材料を含む液体に、式(Ｉ)
【化３】
2005501228.tif 000006
(Ｉ)
［式中、
基Ｒ３およびＲ４はＺ１環構造に結合され、基Ｒ５およびＲ６はＺ２環構造に結合されており、Ｚ１およびＺ２は前記の意味であり、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、独立して、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、モノ‐もしくはジ‐Ｃ１‐Ｃ４アルキル‐置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、Ｃ１‐Ｃ６アルコキシ、アクリレート、ビニル、スチリル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ１‐Ｃ２０アルキル、アラルキル、スルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウム、基−Ｅ−Ｆおよび基−(ＣＨ２‐)ｎＹから選択され、
Ｒ１およびＲ２は、独立して、水素、Ｃ１‐Ｃ２０アルキル、アラルキル、基−Ｅ−Ｆおよび基−(ＣＨ２‐)ｎＹから選択され、Ｅ、Ｆ、Ｙおよびｎは前記の意味である］の色素を加え、そして
ii）標的を標識するのに適切な条件下、色素と標的生物材料をインキュベーションする
工程を含む方法が提供される。
【００２７】
好適には、基Ｒ１〜Ｒ８の少なくとも１個が電荷、例えば第４級アミノを含む本発明の蛍光色素は、荷電した生物分子、例えばＤＮＡおよびＲＮＡに非共有結合するのに使用され得る。別法として、基Ｒ１〜Ｒ８の少なくとも１個が非荷電基、例えば長鎖アルキル、アリール基、またはエステル基である本発明の蛍光色素は、非荷電生物分子、例えば生物脂質、並びに無傷の細胞膜、膜フラグメントおよび細胞に結合することによってそれを標識するのに使用され得る。
【００２８】
第二の態様による好ましい実施例において、式(Ｉ)の色素における基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうちの少なくとも１個は、基−Ｅ−Ｆ(ただし、ＥおよびＦは前記の意味である)である。この実施例において、蛍光色素は、標的生物材料を共有結合標識するのに使用され得る。標的結合基は、標的材料の官能基と反応するための反応基であり得る。別法として、標的結合基は、標的生物材料における反応基と反応させるための官能基であり得る。本方法では、標的材料および色素間に共有結合を形成させる条件下で標的生物材料と一定量の本発明色素をインキュベーションする。標的は、標的生物材料の官能または反応基と共有結合し得る反応性または官能性基を含む基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうちの少なくとも１個を有する一定量の本発明化合物とインキュベーションされ得る。
【００２９】
適切な標的生物材料には、抗体、脂質、タンパク質、ペプチド、炭水化物、１個またはそれ以上のアミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシルおよびカルボキシル、リン酸およびチオリン酸基を含むかまたは含むように誘導体化されたヌクレオチド、および１個またはそれ以上のアミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシルおよびカルボキシル、リン酸およびチオリン酸基を含むかまたは含むように誘導体化されたオキシまたはデオキシポリ核酸、微生物材料、薬剤、ホルモン、細胞、細胞膜および毒素から成る群が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００３０】
本発明による蛍光色素は、例えば蛍光強度、蛍光寿命または蛍光偏光測定を用いる被検体の検出および／または測定に蛍光標識を用いる検定方法で使用され得る。上記検定法の例には、タンパク質‐タンパク質結合検定法、イムノアッセイおよび核酸ハイブリダイゼーション検定法がある。
【００３１】
第三の態様では、試料中における被検体の検定方法であって、
ｉ)被検体の少なくとも一部分を特異的結合パートナーと結合させるのに適切な条件下、被検体を被検体に特異的な結合パートナーと接触させることにより、複合体を形成させ、そして被検体および特異的結合パートナーのうちの一方を、式（Ｉ）
【化４】
2005501228.tif 000007
(Ｉ)
［式中、
基Ｒ３およびＲ４はＺ１環構造の原子に結合され、基Ｒ５およびＲ６はＺ２環構造の原子に結合されており、Ｚ１およびＺ２は前記の意味であり、
基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうち少なくとも１個は基−Ｅ−Ｆであり、ここでＥは、炭素、窒素、酸素、硫黄およびリン原子から成る群から選択される１〜６０個の原子の鎖を有するスペーサー基であって、Ｆは標的結合基であり、
基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうちの何れかが基−Ｅ−Ｆではないとき、残りの基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、独立して、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、モノ‐もしくはジ‐Ｃ１‐Ｃ４アルキル‐置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、Ｃ１‐Ｃ６アルコキシ、アクリレート、ビニル、スチリル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ１‐Ｃ２０アルキル、アラルキル、スルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウムおよび基−(ＣＨ２‐)ｎＹから選択され、そして
基Ｒ１およびＲ２のうちいずれかが基−Ｅ−Ｆではないとき、残りの基Ｒ１およびＲ２は、独立して水素、Ｃ１‐Ｃ２０アルキル、アラルキルおよび基−(ＣＨ２‐)ｎＹから選択され、
Ｙおよびｎは前記の意味である］
の蛍光色素で標識し、
ii)標識複合体から放出された蛍光を測定し、および
iii)放出された蛍光と試料中における被検体の存在または量との相互関係を明らかにする
工程を含む方法が提供される。
【００３２】
好適には、工程ii)は、標識複合体の蛍光強度、蛍光寿命または蛍光偏光の測定により遂行され得る。好ましくは、測定工程ii)は、標識複合体の蛍光寿命または蛍光偏光を測定することにより遂行される。
【００３３】
一実施例において、検定方法は、試料中の被検体を測定する直接検定法である。既知または推定阻害剤化合物は、所望により反応混合物に含まれ得る。
【００３４】
第二または別の態様において、本検定法は、被検体とトレーサーとを特異的に結合させ得る結合パートナー上の限られた数の結合部位について被検体含有試料を蛍光トレーサーと競合させる競合検定法であり得る。好適には、トレーサーは、標識が式(Ｉ)の蛍光色素である、標識被検体または標識被検体類似体である。試料中における被検体の量(または濃度)が増加すると、特異的結合パートナーに結合される蛍光標識被検体または蛍光標識被検体類似体の量は減少する。蛍光シグナルを測定し、標準曲線からの補間法により被検体濃度が得られる。
【００３５】
さらに別の実施例において、結合検定法は２段階フォーマットを使用し得、その場合、第一成分(所望により不溶性支持体にカップリングされ得る)を第二成分に結合させて特異的結合複合体を形成させ、次いでそれを第三成分に結合させる。このフォーマットでは、第三成分は、第二成分または特異的結合複合体に特異的に結合し得る。第二または第三成分のどちらかは、本発明蛍光色素により標識され得る。例としては、特異的結合対の一成分、例えば第一抗体を表面、例えばマルチウェルプレートのウェルへコーティングする「サンドイッチ」検定法がある。第一抗体への抗原の結合後、蛍光標識第二抗体を検定混合物に加えることにより、抗原‐第一抗体複合体と結合させ得る。蛍光シグナルを測定し、標準曲線からの補間法により抗原の濃度が得られる。
【００３６】
特に好ましい実施例において、測定段階は蛍光偏光を用いて遂行され得る。すなわち、蛍光トレーサーが特異的結合パートナーに結合されていないとき、それは蛍光色素の蛍光寿命に対して急速にタンブリング(回転)および再配向する。特異的結合パートナーに結合しているとき、トレーサーは、色素の蛍光寿命に対して緩慢にタンブリングおよび再配向する。したがって、偏光度は、試料中における蛍光トレーサーの結合程度に比例し、試料中の被検体の量に反比例する。
【００３７】
被検体‐特異的結合パートナー対の例には、抗体／抗原、レクチン／糖タンパク質、ビオチン／ストレプトアビジン、ホルモン／受容体、酵素／基質または補因子、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡおよびＤＮＡ／結合タンパク質があるが、これらに限定されるわけではない。互いについて特異的結合親和力を有する分子であれば全て使用され得るものと解釈すべきであり、したがって、本発明の蛍光色素は、特異的結合対の一成分を標識するのに使用され得、次いで他の成分への結合の検出に使用され得る。
【００３８】
本発明色素はまた、蛍光偏光測定を利用する酵素検定法で使用され得る。酵素活性検出についての検定法は以下の要領で設定され得る。酵素および本発明による蛍光色素で標識した蛍光基質を合わせることにより反応混合物を製造する。既知または推定阻害剤化合物は、所望により反応混合物に含まれ得る。反応の進行は、試料の蛍光偏光の変化を観察することによりモニターされ得る。
【００３９】
すなわち、第四の態様では、試料中における酵素測定についての検定方法であって、
ｉ)酵素についての基質を準備し、ただし基質は、式(Ｉ)
【化５】
2005501228.tif 000008
(Ｉ)
［式中、
基Ｒ３およびＲ４はＺ１環構造の原子に結合され、基Ｒ５およびＲ６はＺ２環構造の原子に結合されており、Ｚ１およびＺ２は前記の意味であり、
基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうち少なくとも１個は基−Ｅ−Ｆであり、ここでＥは、炭素、窒素、酸素、硫黄およびリン原子から成る群から選択される１〜６０個の原子の鎖を有するスペーサー基であって、Ｆは標的結合基であり、
基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうちの何れかが基−Ｅ−Ｆではないとき、残りの基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、独立して、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、モノ‐もしくはジ‐Ｃ１‐Ｃ４アルキル‐置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、Ｃ１‐Ｃ６アルコキシ、アクリレート、ビニル、スチリル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ１‐Ｃ２０アルキル、アラルキル、スルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウムおよび基−(ＣＨ２‐)ｎＹから選択され、そして
基Ｒ１およびＲ２のうちいずれかが基−Ｅ−Ｆではないとき、残りの基Ｒ１およびＲ２は、独立して水素、Ｃ１‐Ｃ２０アルキル、アラルキルおよび基−(ＣＨ２‐)ｎＹから選択され、
Ｙおよびｎは前記の意味である］
の蛍光色素で標識されているものとし、
ii)酵素反応の開始に適した条件下、標識基質を酵素と合わせ、そして
iii)試料の蛍光偏光を測定することにより、反応の程度を測定する
工程を含む方法が提供される。
【００４０】
好適には、酵素は、開裂酵素、例えば２またはそれ以上のフラグメントへの基質の開裂を触媒するプロテアーゼから選択され得、その結果蛍光偏光が減少する。別法として、酵素が２成分を結合させ得る場合、例えばリガーゼまたはトランスフェラーゼがあり、その結果試料の偏光が増加する。
【００４１】
第一態様の第一実施例による蛍光色素は、混合物中の様々な成分間における検出および識別を含む適用で使用され得る。第五態様において、本発明は、２種またはそれ以上の異なる蛍光色素セットであって、色素セットの各色素が、式(Ｉ)
【化６】
2005501228.tif 000009
(Ｉ)
［式中、
基Ｒ３およびＲ４はＺ１環構造に結合され、基Ｒ５およびＲ６はＺ２環構造に結合されており、Ｚ１およびＺ２は前記の意味であり、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、独立して、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、モノ‐もしくはジ‐Ｃ１‐Ｃ４アルキル‐置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、Ｃ１‐Ｃ６アルコキシ、アクリレート、ビニル、スチリル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ１‐Ｃ２０アルキル、アラルキル、スルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウム、基−Ｅ−Ｆおよび基−(ＣＨ２‐)ｎＹから選択され、
Ｒ１およびＲ２は、独立して、水素、Ｃ１‐Ｃ２０アルキル、アラルキル、基−Ｅ−Ｆおよび基−(ＣＨ２‐)ｎＹから選択され、
Ｅは、炭素、窒素、酸素、硫黄およびリン原子から成る群から選択される１〜６０個の原子の鎖を有するスペーサー基であり、そしてＦは標的結合基であり、
Ｙは、スルホネート、スルフェート、ホスホネート、ホスフェート、第４級アンモニウムおよびカルボキシルから選択され、ｎは１〜６の整数である］
を有し、セットの各色素が、セットの残りの色素の寿命と比べて明確に異なる蛍光寿命を有するものであるセットを提供する。
【００４２】
好ましくは、色素セットの各色素において、基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうち少なくとも１個は基−Ｅ−Ｆ(ここでＥおよびＦは前記の意味である)である。
【００４３】
好ましくは、本発明による蛍光色素セットは４種の異なる色素を含み、セットの各色素は異なる蛍光寿命を有している。好ましくは、色素セットの蛍光色素の各々は、１〜３０ナノ秒の範囲、さらに好ましくは１０〜２５ナノ秒の範囲の蛍光寿命を呈する。
【００４４】
色素セットにおける異なる蛍光色素を識別するため、色素の各々の蛍光放出の寿命は、好ましくは少なくとも０.５ナノ秒ごとに分離される。
【００４５】
色素セットは、色素セットの異なる蛍光色素を複数の異なる一次成分に共有結合させる検出方法で使用され得、その場合各一次成分は異なる二次成分について特異的であることにより、二次成分の混合物中から複数の二次成分の各々を同定し得る。本方法では、本発明の第五態様による蛍光色素セットの異なる色素を、セットの各色素が、セットの残りの色素の蛍光寿命と比べて、異なる蛍光寿命を有する多成分混合物中の異なる一次成分に共有結合させ、色素標識一次成分の各々の少なくとも一部分をその各二次成分に結合させ得る条件下、二次成分を含む調製物に色素標識一次成分を加え、そして標識一次成分‐二次成分複合体の各々の蛍光寿命を測定することにより結合二次成分の存在または量を測定する。
【００４６】
必要な場合、未反応一次成分があれば、例えば洗浄することによりそれらを調製物から除去するかまたは分離することによって、被検体についての干渉が阻止され得る。
【００４７】
好ましくは、単一励起波長を用いることにより、混合物中の２種またはそれ以上の材料からの蛍光を励起させ得、その場合、各蛍光は異なる特徴的な蛍光寿命を有するものとする。
【００４８】
本発明による蛍光色素セットは、蛍光一次成分の生成が可能な系であればいずれにおいても使用され得る。例えば、本発明による適切な反応性蛍光色素を、ＤＮＡまたはＲＮＡフラグメントにコンジュゲートさせ、次いで生成したコンジュゲートをＤＮＡまたはＲＮＡの相補的標的鎖に結合させ得る。検出され得る一次成分‐二次成分複合体の他の例には抗体／抗原およびビオチン／ストレプトアビジンがある。
【００４９】
本発明による蛍光色素セットはまた、ＤＮＡフラグメントの蛍光寿命識別に基いた蛍光ＤＮＡ配列決定で有利に使用され得る。簡単に述べると、色素セットの各々はプライマーにカップリングされ得る。様々なプライマーが利用可能であり、例えばｐＵＣ／Ｍ１３、λｇｔ１０、λｇｔ１１などからのプライマーがある(Sambrook et al.、Molecular Cloning、A Laboratory Manual 第２版、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス(１９８９)参照)。ＤＮＡ配列を、配列決定すべきＤＮＡフラグメントへ結合されたプライマー配列を有する適切なベクターへクローン化する。ＤＮＡ鋳型とのハイブリダイゼーション後、相補鎖のポリメラーゼ酵素指定合成が行われる。異なる２',３'−ジデオキシヌクレオチドターミネーターを異なる各配列決定反応で使用することにより、連鎖伸長反応の塩基特異的終結が達成される。生成したＤＮＡフラグメントのセットを電気泳動により分離し、標識フラグメントの蛍光寿命を検出することにより終結ヌクレオチド(およびすなわちＤＮＡ配列)が決定される。ＤＮＡ配列決定はまた、本発明蛍光色素により共有結合標識されたジデオキシヌクレオチドターミネーターを用いて遂行され得る。
【００５０】
第一態様の第二実施例による非蛍光または実質的非蛍光色素は、酵素基質として使用され得、酵素との反応時、蛍光生成物を生じる。
【００５１】
細菌性ニトロレダクターゼは、下記反応スキーム１に示されている一般的反応を触媒することが示された。
【化７】
2005501228.tif 000010
反応スキーム１
この場合、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在下、有機分子上の１個またはそれ以上のニトロ基は、ヒドロキシルアミン(−ＮＨＯＨ)基に還元され得、それに続いてアミン(−ＮＨ２)基に変換され得る。
【００５２】
すなわち、本発明の第六態様では、式(Ｉ)：
【化８】
2005501228.tif 000011
(Ｉ)
［式中、
基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｚ１およびＺ２は、前記の意味であり、そして、基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうち少なくとも１個は少なくとも１個のニトロ基を含む］
で示される非蛍光または実質的非蛍光色素の蛍光を増加させる方法であって、少なくとも一ニトロ基の−ＮＨＯＨまたは−ＮＨ２への還元を特徴とする方法が提供される。
【００５３】
好適には、還元はニトロレダクターゼにより行われる。これは、ニトロレダクターゼの作用による式(Ｉ)の化合物におけるニトロ基の−ＮＨＯＨまたは−ＮＨ２基への酵素変換により達成され得る。色素の構造によって、ニトロレダクターゼ反応生成物からの蛍光放出の強度および／または寿命は、典型的には１〜３０ナノ秒の範囲の寿命を呈するように増強され得る。さらに、反応生成物の蛍光寿命特性は、ニトロレダクターゼとの反応に関与するニトロ基(複数も可)を保持しながらも、追加置換基による適用に合うよう改変され得る。すなわち、複合系における他の蛍光体との使用に適合し得る蛍光リポーターが提供され得る。
【００５４】
本発明の第七態様では、組成物におけるニトロレダクターゼ酵素活性の検出方法であって
ｉ)ニトロレダクターゼ活性を高める条件下、組成物を式(Ｉ)：
【化９】
2005501228.tif 000012
(Ｉ)
［式中、
基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｚ１およびＺ２は、前記の意味であり、そして、基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうち少なくとも１個は少なくとも１個のニトロ基を含む］
で示される色素と混合し、そして
ii)ニトロレダクターゼ活性の量の尺度である、蛍光の増加を測定する
ことを含む方法が提供される。
【００５５】
好適には、測定段階(ii)は、ニトロレダクターゼ反応の標識生成物の蛍光強度および／または蛍光寿命の尺度であり得る。
【００５６】
第七態様の一実施例において、組成物は細胞または細胞抽出物を含む。原則として、いかなるタイプの細胞、すなわち原核生物または真核生物細胞(細菌、哺乳類、および植物細胞を含む)でも使用され得る。適切な場合、細胞抽出物は、蛍光測定前に、当業者に公知の標準方法を用いて細胞から調製され得る(Molecular Cloning、A Laboratory Manual、第２版(１９８９)、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス)。
【００５７】
ニトロレダクターゼ活性についての典型的条件は、ＮＡＤＨおよびＦＭＮの存在下約３７℃での適切な培地中における組成物および色素のインキュベーションを含む。
【００５８】
本発明の第八態様では、
ｉ)特異的結合対の第１成分を表面に結合させ、
ii)成分間の結合を促す条件下、特異的結合対の第２成分を加え、ただし、その第２成分はニトロレダクターゼ酵素で標識されているものとし、
iii)式(Ｉ)
【化１０】
2005501228.tif 000013
(Ｉ)
［式中、
基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｚ１およびＺ２は、前記の意味であり、そして、基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうち少なくとも１個は少なくとも１個のニトロ基を含む］
で示される色素を加え、そして
iv)結合ニトロレダクターゼ活性の尺度として蛍光の増加を測定することにより、第１成分への第２成分の結合を検出する
ことを含む検定方法が提供される。
【００５９】
第八態様の好ましい実施例において、特異的結合対は、抗体／抗原、レクチン／糖タンパク質、ビオチン／ストレプトアビジン、ホルモン／受容体、酵素／基質、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡおよびＤＮＡ／結合タンパク質から成る群から選択される。
【００６０】
簡単に述べると、抗体結合検出についてのインビトロ検定法は、以下の要領で設定され得る。興味の対象である抗原に特異的な抗体を、酵素活性ニトロレダクターゼにそれを共有結合させることにより標識し得る。次いで、標識抗体を、結合条件下、抗原含有試験試料中へ導入し得る。洗浄により未結合抗体を全て除去後、ニトロレダクターゼ活性を促進する条件下、少なくとも１個のニトロ基を有する式(Ｉ)の化合物を含む基質と試料をインキュベーションし、蛍光の増加を測定することにより、結合抗体の量を検出する。検出された蛍光の量は、被検体に結合したニトロレダクターゼ標識抗体の量に比例する。
【００６１】
ハイブリダイゼーションによる核酸結合の検出についてのインビトロ検定法では、標的およびプローブ核酸対の一方を膜または表面に結合させる。未結合パートナーをニトロレダクターゼで標識し、ハイブリダイゼーション条件下で結合核酸とインキュベーションする。未結合の標識核酸を洗い流し、ニトロレダクターゼ活性に適切な条件下、少なくとも１個のニトロ基を有する式(Ｉ)の化合物と膜または表面をインキュベーションすることにより、結合標識核酸の量を測定する。蛍光の増加量は、結合標識ＤＮＡの量の尺度を与える。
【００６２】
酵素、例えばニトロレダクターゼを他の生体分子、例えばタンパク質および核酸にカップリングさせる方法は公知である(Bioconjugate Techniques、アカデミック・プレス(１９９６))。カップリングは、直接的手段により、例えば適切な二官能性架橋剤(例、Ｎ−[γ−マレイミドプロピオン酸]ヒドラジン、ピアス)を用いて酵素および結合パートナーを共有結合させることにより達成され得る。別法として、カップリングは、間接的手段により、例えば化学反応性ビオチン誘導体(例、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド‐ビオチン、ピアス)を用いて酵素および結合パートナーを別々にビオチニル化し、それに続いてストレプトアビジン架橋性分子を通じて分子をカップリングすることにより達成され得る。
【００６３】
細胞に基く検定法は、高スループットスクリーニング(ＨＴＳ)で使用されるインビトロ生化学検定法に比べてますます魅力あるものとなっている。これは、細胞に基く検定法が最小限の操作ですむためであり、リードアウトは、通常の生理学的状況をより忠実に模倣する生物学的コンテクストで調べられ得る。かかるインビボ検定法は、細胞プロセスを測定する能力およびその出力の測定手段を必要とする。例えば、若干の遺伝子の転写パターンにおける変化は、例えば、アゴニストとその細胞表面受容体との相互作用によりまたは内部細胞事象、例えばＤＮＡ損傷により誘発された細胞シグナルにより誘導され得る。転写で誘導された変化は、特異的活性化シグナルに応答性であることが知られているプロモーター領域にリポーター遺伝子を融合させることにより同定され得る。
【００６４】
蛍光に基く酵素‐基質系では、蛍光の増加はリポーター遺伝子の発現活性化の尺度を与える。
【００６５】
したがって、本発明の第九の態様では、
ｉ)ニトロレダクターゼをコード化する配列に機能し得るように結合された発現制御配列を含む核酸分子によりトランスフェクションされた宿主細胞を、式(Ｉ)：
【化１１】
2005501228.tif 000014
(Ｉ)
［式中、
基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｚ１およびＺ２は、前記の意味であり、そして、基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうち少なくとも１個は少なくとも１個のニトロ基を含む］
で示される色素と接触させ、
ii)ニトロレダクターゼ遺伝子発現の尺度として蛍光の増加を測定する
ことを含む検定方法が提供される。
【００６６】
好適には、測定段階(ii)は、ニトロレダクターゼ反応の標識生成物の蛍光強度および／または蛍光寿命の尺度であり得る。
【００６７】
第九態様の一実施例において、検定方法は、その遺伝子発現に対する効果が測定される試験剤の存在下で実施される。
【００６８】
哺乳類細胞におけるリポーター遺伝子としての様々な酵素遺伝子の使用方法は公知である(概説については、Naylor L.H.、Biochemical Pharmacology、(１９９９)、５８、７４９−７５７参照)。リポーター遺伝子は、他の細胞タンパク質の存在下で遺伝子産物が測定可能であるように選択され、宿主細胞における遺伝子発現の変化に対して応答性である選択された調節配列の制御下で細胞へ導入される。典型的調節配列は、ホルモン応答性のもの、第二メッセンジャーおよび他の細胞制御およびシグナル伝達因子を包含する。例えば、７貫膜受容体に結合するアゴニストは、ｃＡＭＰ応答性エレメント、ＮＦ−ＡＴ、ＳＲＥおよびＡＰ１を含むプロモーターエレメントを調節することが知られている。ＭＡＰキナーゼ活性化は、ＦｏｓおよびＪｕｎ転写に至るＳＲＥの調節をまねく。ＤＮＡ損傷は、ＤＮＡ修復酵素および腫瘍サプレッサー遺伝子ｐ５３の転写活性化に至る。適切な調節配列の選択により、リポーター遺伝子を用いて、試験下にある選択された調節配列を伴う細胞プロセスに対する添加薬剤の効果が検定され得る。
【００６９】
リポーター遺伝子として使用するため、ニトロレダクターゼ遺伝子を、公知方法により、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)の使用によるｃＤＮＡライブラリーからの増幅により単離し得る(Molecular Cloning、A Laboratory Manual、第２版、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス(１９８９)、１４.５−１４.２０頁)。一旦単離すると、ニトロレダクターゼ遺伝子を、試験下にある遺伝子調節配列と連係的にそしてその制御下で哺乳類プロモーターとの使用に適したベクター(Molecular Cloning、A Laboratory Manual、第２版、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス(１９８９)、１６.５６−１６.５７頁)へ挿入し得る。次いで、ニトロレダクターゼリポーターおよび関連調節配列を含むベクターを、公知技術を用いて、例えばＤＥＡＥ−デキストランまたはリン酸カルシウムの使用により(Molecular Cloning、A Laboratory Manual、第２版、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス(１９８９)、１６.３０−１６.４６頁)、トランスフェクションにより宿主細胞へ導入させ得る。他の適切な技術も当業者にはよく知られている。
【００７０】
第九態様の別の実施例において、式(Ｉ)(ただし、基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｚ１およびＺ２は、前記の意味であり、そして、基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうち少なくとも１個は少なくとも１個のニトロ基を含む)の色素は細胞透過性である。この実施例において、好ましくは、基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうち少なくとも１個は、細胞膜透過性基を含む。膜透過性化合物は、親水性基を遮蔽してより疎水性の高い化合物を与えることにより生成され得る。遮蔽基は、細胞内で基質から開裂されて、細胞内誘導された蛍光基質を生じるように設計され得る。基質は膜透過性誘導体よりも親水性が高いため、細胞で捕らえられる。適切な細胞膜透過性基は、内在性哺乳類細胞内エステラーゼにより容易に開裂されるアセトキシメチルエステル(Jansen,A.B.A.およびRussell,T.J.、J.Chem.Soc.、(１９６５)、２１２７−２１３２およびDaehne W et al.、J.Med.Chem.、(１９７０)１３、６９７−６１２)およびピバロイルエステル(Madhu et al.、J.Ocul.Pharmacol.Ther.、(１９９８)、１４(５)、３８９−３９９)から選択され得るが、他の適切な基も当業者により認められている。
【００７１】
典型的には、試験下の調節配列を介した細胞応答を活性化する試験剤の活性を検定するため、ニトロレダクターゼリポーターによりトランスフェクションされた細胞を、試験剤とインキュベーションし、次いで、式(Ｉ)(色素における基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５のうち少なくとも１個は少なくとも１個のニトロ基を含む)の色素を加えると、上記化合物は細胞透過性にされる。蛍光特性を呈する形態に基質を変換するのに要求される適切な期間後、細胞からの蛍光強度および／または蛍光寿命を、選択された色素に適切な発光波長で測定する。蛍光の測定は、蛍光顕微鏡(例、ＬＳＭ４１０、ツァイス)、マイクロプレート読取り装置(例、ＣｙｔｏＦｌｕｏｒ４０００、パーキン・エルマー)、ＣＣＤイメージングシステム(例、ＬＥＡＤシーカー(登録商標)、アマーシャム・ファルマシア・バイオテック)およびフローサイトメーター(例、ＦＡＣＳカリバー、ベクトン・ディッキンソン)を含む一連の検出器具の使用により容易に達成され得る。
【００７２】
測定された蛍光を、試験剤に暴露されていない対照細胞からの蛍光と比較し、調節配列を通じて調節された遺伝子発現に対する試験剤の効果があるとすれば、それを試験細胞での蛍光対対照細胞での蛍光の比から測定する。適当な場合、細胞抽出物は慣用的方法を用いて調製され得る。
【００７３】
ニトロレダクターゼ酵素を発現させるのに適した手段には、発現プラスミドまたは他の発現構築物がある。上記発現構築物の製造方法は、当業者にはよく知られている。
【００７４】
本発明の第十態様では、式(Ｉ)：
【化１２】
2005501228.tif 000015
(Ｉ)
［式中、
基Ｒ３およびＲ４はＺ１環構造の原子に結合され、基Ｒ５およびＲ６はＺ２環構造の原子に結合されており、
Ｚ１およびＺ２は、独立して、１環、２縮合環または３縮合環芳香族または複素芳香族系を完成させるのに必要な原子を表しており、各環は、炭素原子、および酸素、窒素および硫黄から選択される所望による２個以下の原子から選択された５または６個の原子を有し、
基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうち少なくとも１個は基−Ｅ−Ｆであり、ここでＥは、炭素、窒素、酸素、硫黄およびリン原子から成る群から選択される１〜６０個の原子の鎖を有するスペーサー基であって、Ｆは標的結合基であり、そして
基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうちの何れかが基−Ｅ−Ｆではないとき、残りの基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、独立して、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、アミノ、モノ‐もしくはジ‐Ｃ１‐Ｃ４アルキル‐置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、Ｃ１‐Ｃ６アルコキシ、アクリレート、ビニル、スチリル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ１‐Ｃ２０アルキル、アラルキル、スルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウムおよび基−(ＣＨ２‐)ｎＹから選択され、そして
基Ｒ１およびＲ２のうちいずれかが基−Ｅ−Ｆではないとき、残りの基Ｒ１およびＲ２は、独立して水素、モノ‐もしくはジ‐ニトロ‐置換ベンジル、Ｃ１‐Ｃ２０アルキル、アラルキルおよび基−(ＣＨ２‐)ｎＹから選択され、
Ｅは、炭素、窒素、酸素、硫黄およびリン原子から成る群から選択される１〜６０個の原子の鎖を有するスペーサー基であって、Ｆは標的結合基であり、
Ｙは、スルホネート、スルフェート、ホスホネート、ホスフェート、第４級アンモニウムおよびカルボキシルから選択され、ｎは１〜６の整数であり、
ただし、基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうち少なくとも１個は水可溶化基であるものとする］
で示される色素が提供される。
【００７５】
好ましくは、標的結合基Ｆは、標的材料上の官能基と反応するための反応基、または標的材料上の反応基と反応するための官能基を含む。好ましい反応基は、カルボキシル、スクシンイミジルエステル、スルホ‐スクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミド、ハロアセトアミド、酸ハライド、ヒドラジド、ビニルスルホン、ジクロロトリアジンおよびホスホラミダイトから選択され得る。好ましい官能基は、ヒドロキシ、アミノ、スルフヒドリル、イミダゾール、アルデヒドおよびケトンを含むカルボニル、リン酸およびチオリン酸から選択され得る。
【００７６】
好ましくは、スペーサー基Ｅは、
-(CHR')p-
-{(CHR')q-O-(CHR')r}s-
-{(CHR')q-NR'-(CHR')r}s-
-{(CHR')q-(CH=CH)-(CHR')r}s-
-{(CHR')q-Ar-(CHR')r}s-
-{(CHR')q-CO-NR'-(CHR')r}s-
-{(CHR')q-CO-Ar-NR'-(CHR')r}s-
［式中、Ｒ'は、水素、Ｃ１−Ｃ４アルキルまたはアリールであって、所望によりスルホネートにより置換され得、Ａｒは、所望によりスルホネートにより置換されていてもよいフェニレンであり、ｐは１〜２０、好ましくは１〜１０であり、ｑは０〜１０であり、ｒは１〜１０であり、そしてｓは１〜５である］から選択される。
【００７７】
第十の態様による色素は、色素含有ポリマーの形成に適した重合性基を含み得る。適切な重合性基は、アクリレート、メタクリレートおよびアクリルアミドから選択される。重合は、適切に誘導体化された本発明化合物により実施され得、これを第二の重合性モノマー出発材料、例えばスチレンまたはビニルトルエンと連係的に使用することにより色素含有コポリマーを形成させる。本発明の色素は重合性基をもつ必要は無く、例えば、色素は重合または粒子形成中に組込まれ得るかまたはポリマー粒子中または上に吸収され得る。
【００７８】
式(Ｉ)の色素は、公表された方法(Jaffe,E.E.およびMarshall,W.J.、米国特許第３３８６８４３号、Jaffe,E.E.およびEhrich,F.F.、米国特許第３８７３５４８号参照)にしたがって、ジエチルスクシニル‐スクシネートと適切に置換されたアニリンとの反応を含む方法により製造され得る。例えば、ジエチルスクシニル‐スクシネートを４−アミノ安息香酸と共に加熱して、ジエチル−２,５−ジ(４−カルボキシアニリノ)−３,６−ジヒドロテレフタレートを生成させる。さらに高沸点溶媒中で加熱して、２,９−ジカルボキシ−６,１３−ジヒドロキナクリドンを生成させる。３−ニトロベンゼンスルホン酸ナトリウムにより酸化して、２,９−ジカルボキシキナクリドンを得る。キナクリドンおよびその誘導体の別の合成方法は、Bender,H.et al.(米国特許第４９５６４６４号)により開示されており、その場合２,５−ジアニリノ−３,６−ジヒドロテレフタル酸誘導体を閉環し、５００〜６００℃で脱水素化し得る。Maki,H.et al.(米国特許第５６５９０３６号)はキナクリドン誘導体の製造方法を報告しており、その方法では、１,４−シクロヘキサジオン−２,５−ジカルボン酸のアルキルエステルを、適切に置換された芳香族アミンと反応させ得、生成した２,５−ジ(アリールアミノ)−３,６−ジヒドロテレフタル酸ジアルキルエステル誘導体を閉環して６,１３−ジヒドロキナクリドンを得、次いでこれをニトロベンゼンスルホン酸で酸化することにより、キナクリドンを得る。
【００７９】
式(Ｉ)で示されるある種の色素は、当業者に公知の方法による式(Ｉ)で示される他の色素への変換についての中間体として有用であり得ることは容易に理解できるはずである。同様に、ある種の中間体は、式(Ｉ)の色素の合成に有用であり得る。本発明化合物は、本明細書で開示されている方法により合成され得る。特定用途を有する色素の誘導体は、適切な前駆体を選択するか、または既知方法により生成された化合物を、様々な位置に官能基を含むよう修飾することにより製造される。例として、本発明の色素は、蛍光標識試薬を製造するためのある種の反応基を含むように修飾され得るか、または荷電または極性基を付加することにより、極性または非極性溶媒または物質中における化合物の溶解度を高め得る。変換の例として、エステルはカルボン酸に変換され得るか、またはアミド誘導体に変換され得る。基Ｒ１〜Ｒ８は、本発明化合物が異なる蛍光特性を有するように選択され得、それによって、単一試料中の種々の化合物の存在および量を若干の検出された蛍光発光の波長および寿命に基いて識別し得るマルチパラメーター分析で使用され得る若干の関連色素が提供される。本発明の色素は、Ｒ基の適切な選択により標識すべき材料を含む水性、他の極性または非極性媒質において可溶性にされ得る。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
以下の実施例および図面を通してさらに本発明を説明する。
【図１】図１は、６−{７,１４−ジオキソ−２,９−ジスルホ−７,１４−ジヒドロ−１２Ｈ−キノ[２,３−ｂ]アクリジン−５−イル}ヘキサン酸の吸光度および放出スペクトルを示すプロットである。
【図２】図２は、本発明による３色素の蛍光寿命減衰プロットを示す。
【図３】図３は、６−{７,１４−ジオキソ−２,９−ジスルホ−７,１４−ジヒドロ−１２Ｈ−キノ[２,３−ｂ]アクリジン−５−イル}ヘキサン酸およびその卵アルブミンとのコンジュゲートの寿命減衰プロットである。
【図４】図４は、蛍光偏光によりモニターされた６−{１２−エチル−７,１４−ジオキソ−２,９−ジスルホ−７,１４−ジヒドロ−１２Ｈ−キノ[２,３−ｂ]アクリジン−５−イル}ヘキサン酸とアルブミンのコンジュゲートのトリプシン開裂を示すプロットである。
【００８１】
Ｃｙ(登録商標)およびＬＥＡＤシーカー(登録商標)は、アマーシャム・ファルマシア・バイオテックＵＫリミテッドの登録商標である。
【実施例】
【００８２】
実施例
１.  ２−ブロモ−５,１２−ジヘキシルキナクリドン(Ａ)および２,９−ジブロモ−５,１２−ジヘキシルキナクリドン(Ｂ)
【化１３】2005501228.tif 000016
１.１  ５,１２−ジヘキシルキナクリドン
２５ｍｌのＲＢフラスコにキナクリドン(Ｄｏｊｉｎｄｏ：１５６ｍｇ、０.５ｍｍｏｌ)および無水Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド(５ｍｌ)を加えた。フラスコを窒素でパージングし、攪拌させた。混合物に水素化ナトリウム(油中６０重量％分散液、１.２ｍｍｏｌ)を加え、混合物を攪拌させておいた。液相に青色がゆっくりと現れたが、固体の多くは２時間後も未溶解のままだった。ジメチルスルホキシド(３ｍｌ)を加えることにより溶解を達成し、さらに１時間後濃青色溶液を得た。この時点で、１−ヨードへキサン(２９５μｌ、２.０ｍｍｏｌ)を加え、混合物を３日間攪拌させておいた。この期間中に青色は完全に抜け、オレンジ色固体が沈澱した。
【００８３】
混合物を０.５Ｍの塩酸水溶液中へクエンチングし、固体を濾過により集め、過剰の水で洗浄した。次いで、無水硫酸マグネシウムを含むジクロロメタン中へ溶解することにより湿った固体を乾燥した。スラリーを濾過し、褐色‐オレンジ色濾液を真空下で濃縮し、粗生成物を得た。これをフラッシュクロマトグラフィー(シリカ。ジクロロメタン中０〜２.５％酢酸エチル)により精製した。純粋なフラクションをプールし、濾過し、濃縮し、次いでジエチルエーテルで磨砕することにより、オレンジ色粉末を得た。収率＝１６１ｍｇ(６７％)。λmax (CH2Cl2) = 526, 493nm. δH (200MHz, CDCl3) 0.95 (6H, t), 1.20-1.65 (12H, m), 2.01 (4H, m), 4.52 (4H, app t), 7.28 (2H, app t), 7.52 (2H, app d), 7.76 (2H, td), 8.58 (2H, dd) and 8.79 (2H, s)。マススペクトル：(ＥＳ＋)４８１(Ｍ＋Ｈ)、５０３(Ｍ＋Ｎａ)。正確な質量：(Ｍ＋Ｈ)＝Ｃ３２Ｈ３７Ｎ２Ｏ２の計算値：４８１.２８５５。実測値：４８１.２８４４(‐２.３ｐｐｍ)。
【００８４】
１.２  ２−ブロモ−５,１２−ジヘキシルキナクリドンおよび２,９−ジブロモ−５,１２−ジヘキシルキナクリドン
５,１２−ジヘキシルキナクリドン(６０ｍｇ、１２５μｍｏｌ)を、エタノール(２.５ｍｌ)およびベンジルトリメチルアンモニウムトリブロミド(９７ｍｇ、２５０μｍｏｌ)と混合した。生成したスラリーを周囲温度で２４時間攪拌し、次いで１６時間還流加熱して部分反応物を得た。クロロホルム(２.５ｍｌ)を加えて固体を全て溶かすことにより、オレンジ色溶液を得、還流を続行してモノ‐およびジ‐臭素化生成物の緩和な生成を見た。溶媒蒸発後、フラッシュクロマトグラフィー(シリカ、ジクロロメタン)により生成物を分離し、純粋な試料を得た。
【００８５】
２−ブロモ−５,１２−ジヘキシルキナクリドン(Ａ)：λmax (CH2Cl2) = 526, 493nm. δH (200MHz, CDCl3) 0.95 (6H, m), 1.3-1.7 (12H, m), 1.9-2.1 (4H, m), 4.4-4.5 (4H, m), 7.25 (1H, m), 7.36 (1H, d), 7.48 (1H, d), 7.70-7.80 (2H, m), 8.52 (1H, dd), 8.61 (1H, s), 8.67 (1H, s)および8.71 (1H, s).マススペクトル(DEI+):  558+560 (比 1:1) (M+)。
【００８６】
２,９−ジブロモ−５,１２−ジヘキシルキナクリドン(Ｂ)：λmax (CH2Cl2) = 532, 498nm.  δH (200MHz, CDCl3) 0.95 (6H, t), 1.3-1.7 (12H, m), 1.8-2.0 (4H, m), 4.5 (4H, t), 7.36 (2H, d), 7.78 (2H, dd), 8.58 (2H, d) および 8.64 (2H, s). マススペクトル (DEI+):  636+638+640 (比 1:2:1) (M+)。
【００８７】
２．キナクリドン−２,９−ジスルホン酸、(ジカリウム塩)
【化１４】2005501228.tif 000017
キナクリドン(２００ｍｇ、０.６４５ｍＭ)を、マグネチックスターラーおよび空冷コンデンサーを備えた丸底フラスコに入れた。固体を９８％硫酸(２ｍｌ)に溶かし、窒素雰囲気下で６時間１１０℃に加熱した。ＴＬＣ(ＲＰ Ｃ−１８５０／５０メタノール／水)は、出発材料が全て単一高速移動成分に変換されたことを示した(長い波長のｕｖ光線下で可視化された)。反応物を１０ｍｌ氷上へ滴下し、暗赤色溶液を得た。これを固体炭酸水素カリウムで中和して、暗赤色沈澱物を得た。これを遠心分離により集め、上清を廃棄した。
【００８８】
水からの再結晶化により、キナクリドン−２,９−ジスルホン酸のジカリウム塩として同定された赤色固体０.２１ｇ(０.３８６Ｍｍ、６０％)を得た。マススペクトル(ES+). MH+  473.1; MK2+  550.5. MPt＞300 OC. λmax(ab)  499, 527nm (水); λmax(em)  560,590nm (水)。
【００８９】
３．キナクリドン−２,４,９,１１−テトラスルホン酸(テトラカリウム塩)
【化１５】2005501228.tif 000018
キナクリドン(５００ｍｇ、１.６１ｍＭ)を、マグネチックスターラーおよび空冷コンデンサーを備えた丸底フラスコに入れた。固体を２０％の油(５ｍｌ)に溶かし、窒素雰囲気下で２０時間１１０℃に加熱した。ＴＬＣ(ＲＰ Ｃ−１８５０／５０メタノール／水)は、出発材料が全て主要高速移動成分、これに伴って少量のそれより速く移動する二成分および少量のそれより緩慢に移動する一成分に変換されたことを示した(長い波長のｕｖ光線下で可視化された)。反応物を１０ｍｌ氷上へ滴下し、暗赤色溶液を得た。これを固体炭酸水素カリウムで中和して、オレンジ色沈澱物を得た。これを遠心分離により集め、上清を廃棄した。
【００９０】
水からの２回の再結晶化により、キナクリドン−２,４,９,１１−テトラスルホン酸のテトラカリウム塩として同定されたオレンジ色固体１.１ｇを得た。マススペクトル(ES+). MH+   632.9。NMR (200MHz, D2O): δ 8.94 (二重線), δ 8.81(単一) δ 8.63 (二重線) 1:1:1。MPt＞300oC. λmax(ab)  499,527nm (水); λmax(em)  552nm (水)。
【００９１】
４．Ｏ−(Ｎ−スクシンイミジル)−６−{７,１４−ジオキソ−２,９−ジスルホ−７,１４−ジヒドロ−１２Ｈ−キノ[２,３−ｂ]アクリジン−５−イル}ヘキサノエート
【化１６】2005501228.tif 000019
４.１  ６−{７,１４−ジオキソ−２,９−ジスルホ−７,１４−ジヒドロ−１２Ｈ−キノ[２,３−ｂ]アクリジン−５−イル}ヘキサン酸エチルエステル
キナクリドン−２,９−ジスルホン酸(２００ｍｇ)を乾燥ＤＭＦとの反復回転蒸発により乾燥した。次いで、材料を１０ｍｌの乾燥ＤＭＳＯに溶かしてオレンジ色液体を得た。カリウムｔ−ブトキシド(４５ｍｇ、０.４ｍＭ)を加えると、溶液は即座に青色になった。次いで、溶液を３０分間マグネチックスターラーで攪拌し、次いでエチル・６−ブロモヘキサノエート(７０μｌ、０.４ｍＭ)を加え、溶液を窒素雰囲気下でさらに２４時間攪拌した。ＴＬＣ(ＲＰ Ｃ−１８ ５０／５０メタノール／水)は、出発材料の約半分が僅かにゆっくりと移動する成分に変換されたことを示した。さらに反応させても、生成物の量は増えなかった。マススペクトルは、要求された生成物についてのＭＫ２＋に対応する６９２でピークを示した。５５０でのさらなるピークは、出発材料についてのＭＫ２＋に対応している。溶媒を回転蒸発により除去すると、赤色固体が残存した。この物質を精製する試みはそれ以上行わずに、後続反応でそのままそれを使用した。
【００９２】
４.２  ６−{７,１４−ジオキソ−２,９−ジスルホ−７,１４−ジヒドロ−１２Ｈ−キノ[２,３−ｂ]アクリジン−５−イル}ヘキサン酸
上記反応からの物質を、１Ｍ塩酸：氷酢酸(１：３)の混合物８ｍｌに溶かし、窒素雰囲気下空冷コンデンサーを備えたフラスコにおいて１００℃で２時間加熱した。マススペクトルは、前実施例で記載された６９２でのピークの消失および６−(７,１４−ジオキソ−２,９−ジスルホ−７,１４−ジヒドロ−１２Ｈ−キノ[２,３−ｂ]アクリジン−５−イル)ヘキサン酸についてのＭＫ２＋に対応する６６４でのピークの出現を示した。５５０でのさらなるピークは、キナクリドン−２,９−ジスルホン酸についてのＭＫ２＋に対応している。ＴＬＣ(上記と同様単一スポットを示した)。溶媒を回転蒸発により除去すると、赤色固体が残存した。この物質を精製する試みはそれ以上行わずに、次の反応でそれを使用した。
【００９３】
４.３  Ｏ−(Ｎ−スクシンイミジル)−６−{７,１４−ジオキソ−２,９−ジスルホ−７,１４−ジヒドロ−１２Ｈ−キノ[２,３−ｂ]アクリジン−５−イル}ヘキサノエート
前反応からの物質を、ＤＭＦから反復回転蒸発により乾燥した。次いで、固体を１０ｍｌの乾燥ＤＭＳＯに溶かし、２００μｌのジイソプロピルエチルアミン、次いでＯ−(スクシンイミジル)−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラメチレンウロニウムヘキサフルオロホスフェート(ＨＳＰｙＵ、８５ｍｇ)を加えた。混合物を窒素雰囲気下周囲温度で２時間攪拌した。ＴＬＣ(上記と同様)は、２スポットの存在を示した。マススペクトルは、前実施例で記載された６９２でのピークの消失およびＯ−(Ｎ−スクシンイミジル)−６−{７,１４−ジオキソ−２,９−ジスルホ−７,１４−ジヒドロ−１２Ｈ−キノ[２,３−ｂ]アクリジン−５−イル}ヘキサノエートについてのＭＨ＋に対応する６８４でのピークの出現を示した。５５０でのさらなるピークは、キナクリドン−２,９−ジスルホン酸についてのＭＫ２＋に対応している。溶媒を回転蒸発により除去すると、赤色ゴムが残存した。酢酸エチルと磨砕して、赤色固体７４ｍｇを得た。
【００９４】
５．Ｏ−{Ｎ−スクシンイミジル−６−(１２−エチル−７,１４−ジオキソ−２,９−ジスルホ−７,１４−ジヒドロ−１２Ｈ−キノ[２,３−ｂ]アクリジン−５−イル}ヘキサノエート
【化１７】2005501228.tif 000020
５.１  ６−{１２−エチル−７,１４−ジオキソ−７,１４−ジヒドロ−１２Ｈ−キノ[２,３−ｂ]アクリジン−５−イル}ヘキサン酸、エチルエステル
キナクリドン(１.５６ｇ、５.０ｍｍｏｌ)を、窒素雰囲気下無水ジメチルホルムアミド(１５ｍｌ)および無水ジメチルスルホキシド(１５ｍｌ)に懸濁した。水素化ナトリウム(油中６０％懸濁液；２４０ｍｇ；６.０ｍｍｏｌ)を加え、泡立ちが止まるまで混合物を攪拌した。さらなる水素化ナトリウム(２４０ｍｇ；６.０ｍｍｏｌ)を加え、泡立ちが止まるまで混合物を１０分間攪拌した。反応物を１時間６０℃に加熱した。エチル・６−ブロモヘキサノエート(８９０μｌ；５.０ｍｍｏｌ)を濃緑色溶液に加え、混合物を６０℃で一晩攪拌した。次いで、ヨードエタン(１.０ｍｌ；１２.５ｍｍｏｌ)を加え、混合物を６０℃で２時間攪拌した。濃オレンジ‐赤色溶液を放冷し、次いで混合物を水(３００ｍ)中に注いだ。固体を濾過し、水で洗浄し、風乾した。次いで、固体をジクロロメタン(３００ｍｌ)に溶かし、無水硫酸マグネシウムを加えた。混合物を濾過し、溶媒を回転蒸発により除去して、赤色固体を得た。これをフラッシュクロマトグラフィー(シリカ、１５％酢酸エチル／ジクロロメタン)により精製して、１.０４ｇ(４３％)の６−{１２−エチル−７,１４−ジオキソ−７,１４−ジヒドロ−１２Ｈ−キノ[２,３−ｂ]アクリジン−５−イル}ヘキサン酸ジエチルエステルを得た。
【００９５】
５.２  ６−{１２−エチル−７,１４−ジオキソ−２,９−ジスルホ−７,１４−ジヒドロ−１２Ｈ−キノ[２,３−ｂ]アクリジン−５−イル}ヘキサン酸
６−{１２−エチル−７,１４−ジオキソ−７,１４−ジヒドロ−１２Ｈ−キノ[２,３−ｂ]アクリジン−５−イル}ヘキサン酸のジエチルエステル(２４１ｍｇ；０.５ｍｍｏｌ)を、濃硫酸(５ｍｌ)に溶かし、紫色溶液を窒素雰囲気下一晩１１０℃で加熱した。反応物を放冷し、次いで氷(〜２０ｍｇ)に注いだ。溶液を４０重量％水酸化ナトリウム水溶液で中和して、明赤色溶液を得た。これを氷酢酸で酸性化すると、オレンジ色‐赤色沈澱物が形成された。これを遠心分離により集め、次いで０.１％トリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)水溶液に溶かした。溶液を逆相ＨＰＬＣにより精製した。Ｖｙｄａｃ Ｃ１８セミ分取カラム、水〜アセトニトリル勾配(両方とも０.１％ｖ／ｖのＴＦＡ含有)、流速５ｍｌ／分、５３０ｎｍで検出。精製した物質をプールし、真空下で濃縮乾固し、次いで真空下五酸化リンで乾燥して、３００ｍｇ(９７％)の６−{１２−エチル−７,１４−ジオキソ−２,９−ジスルホ−７,１４−ジヒドロ−１２Ｈ−キノ[２,３−ｂ]アクリジン−５−イル}ヘキサン酸を暗赤色固体として得た。
δH (200MHz, CD3OD +D2O) 1.48(3H, t), 1.8(6H, m), 2.38(2H, m), 4.52(4H, m), 7.59(2H, m), 8.10(2H, d), 8.60(2H, m),  8.89(2H, d)。
正確な質量:(M+H)=C28H27N2O10S2の計算値 615.1107。実測値 615.1089 (2.9ppm)。
λmax(ab) 294nm (ε=65,800/M-1cm-1);506nm (ε=5590/M-1cm-1);536nm (ε=4790/M-1cm-1).(PBS緩衝液)  λmax(em)  563nm (PBS緩衝液)。
【００９６】
５.３  Ｏ−{Ｎ−スクシンイミジル−６−(１２−エチル−７,１４−ジオキソ−２,９−ジスルホ−７,１４−ジヒドロ−１２Ｈ−キノ[２,３−ｂ]アクリジン−５−イル}ヘキサノエート
６−{１２−エチル−７,１４−ジオキソ−２,９−ジスルホ−７,１４−ジヒドロ−１２Ｈ−キノ[２,３−ｂ]アクリジン−５−イル}ヘキサン酸(１５ｍｇ、２４μｍｏｌ)、Ｏ−(Ｎ−スクシンイミジル)−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(８ｍｇ、２７μｍｏｌ)、無水ジメチルスルホキシド(５００μｌ)およびジイソプロピルエチルアミン(１７.５μｌ)を混合して、オレンジ色溶液を得た。これを３０分間放置したところ、ＴＬＣ(ＲＰ１８３０：７０ 水：メタノール)は、出発物質が、質量分析法によりＯ−{Ｎ−スクシンイミジル−６−{１２−エチル−７,１４−ジオキソ−２,９−ジスルホ−７,１４−ジヒドロ−１２Ｈ−キノ[２,３−ｂ]アクリジン−５−イル}ヘキサノエートとして同定されたゆっくりと移動する成分に変換されたことを示した。マススペクトル：(ＥＳ＋)(Ｍ＋Ｈ)７１２
【００９７】
６.  ６−{２,９−ジブロモ−１２−(５−カルボキシペンチル)−７,１４−ジオキソ−７,１４−ジヒドロ−１２Ｈ−キノ[２,３−ｂ]アクリジン−５−イル}ヘキサン酸
【化１８】2005501228.tif 000021
６.１  ２,５−ビス{(４−ブロモフェニル)アミノ}シクロヘキサ−１,４−ジエン−１,４−ジカルボン酸ジメチル
１,４−シクロヘキサンジオン−２,５−ジカルボン酸ジメチル(４.５６ｇ；２０ｍｍｏｌ)およびメタノール(１００ｍｌ)を加熱して沸騰させ、次いで４−ブロモアニリン(６.８８ｇ；４０ｍｍｏｌ)、次いで濃塩酸(２００μｌ)を加えた。混合物を窒素雰囲気下で５時間還流させた。冷却すると、クリーム色固体が沈澱し、これを濾過により集め、メタノールで洗浄し、真空下乾燥して、１０.１８ｇ(９５％)の２,５−ビス{(４−ブロモフェニル)アミノ}シクロヘキサ−１,４−ジエン−１,４−ジカルボン酸ジメチルを得た。
【００９８】
６.２  ２,５−ビス{(４−ブロモフェニル)アミノ}テレフタル酸
２,５−ビス{(４−ブロモフェニル)アミノ}シクロヘキサ−１,４−ジエン−１,４−ジカルボン酸ジメチル(５.３６ｇ；１０ｍｍｏｌ)、３−ニトロベンゼンスルホン酸のナトリウム塩(２.３ｇ；１０ｍｍｏｌ)、エタノール(５０ｍｌ)および１.０Ｍ水酸化ナトリウム(３０ｍｌ)を７時間窒素雰囲気下で加熱還流した。明黄色溶液を放冷し、水(１２０ｍｌ)を加えた。混合物を濃塩酸で酸性化すると、赤紫色固体が沈澱した。この物質を濾過し、水で洗浄し、真空下五酸化リンで乾燥することにより、４.８４ｇ(９６％)の２,５−ビス{(４−ブロモフェニル)アミノ}テレフタル酸を得た。
【００９９】
６.３  ２,９−ジブロモキナクリドン
２,５−ビス{(４−ブロモフェニル)アミノ}テレフタル酸(４.０ｇ；７.９ｍｍｏｌ)およびポリリン酸(３４ｇ)を窒素雰囲気下で４時間１５０℃で加熱した。混合物を放冷し、次いで氷水(１００ｍｌ)中に注ぐと、赤紫色固体が形成された。固体を濾過し、水、次いでメタノールで洗浄し、真空下五酸化リンで乾燥することにより、３.６８ｇ(９９％)の２,９−ジブロモキナクリドンを得た。
【０１００】
６.４  ６−{２,９−ジブロモ−１２−(５−カルボキシペンチル)−７,１４−ジオキソ−７,１４−ジヒドロ−１２Ｈ−キノ[２,３−ｂ]アクリジン−５−イル}ヘキサン酸、ジエチルエステル
２,９−ジブロモキナクリドン(２.３５ｇ；５.０ｍｍｏｌ)を、窒素雰囲気下無水ジメチルホルムアミド(１５ｍｌ)に懸濁した。水素化ナトリウム(油中６０％懸濁液；４８０ｍｇ；１２ｍｍｏｌ)を加え、泡立ちが止まるまで混合物を攪拌した。無水ジメチルスルホキシド(２５ｍｌ)を加えた。反応物を２時間７０℃に加熱した。６−ブロモへキサン酸エチル(２.６７ｍｌ、１５ｍｍｏｌ)を、濃緑色溶液に加え、混合物を５０℃で一晩攪拌した。紺青色溶液を放冷し、次いで混合物を水(２００ｍｌ)中に注ぎ、濃塩酸で酸性化した。固体を濾過し、水で洗浄し、風乾した。これをフラッシュクロマトグラフィー(シリカ、５〜２０％酢酸エチル／ジクロロメタン)により精製して、１.７４ｇ(４６％)の６−{２,９−ジブロモ−１２−(５−カルボキシペンチル)−７,１４−ジオキソ−７,１４−ジヒドロ−１２Ｈ−キノ[２,３−ｂ]アクリジン−５−イル}ヘキサン酸、ジエチルエステルを得た。δH (200MHz, CDCl3) 1.25(6H, t), 1.80(12H, m), 2.39(4H, t), 4.15(4H, dd), 4.39(4H, t ), 7.24(2H, d), 7.70(2H, dd),  8.42(4H, s).
λmax(ab)   493nm, 527nm   λmax(em)  560nm, 600nm。(ジクロロメタン)
【０１０１】
６.５  ６−{２,９−ジブロモ−１２−(５−カルボキシペンチル)−７,１４−ジオキソ−７,１４−ジヒドロ−１２Ｈ−キノ[２,３−ｂ]アクリジン−５−イル}ヘキサン酸
６−{２,９−ジブロモ−１２−(５−カルボキシペンチル)−７,１４−ジオキソ−７,１４−ジヒドロ−１２Ｈ−キノ[２,３−ｂ]アクリジン−５−イル}ヘキサン酸、ジエチルエステル(１.０ｇ)を、氷酢酸(２０ｍｌ)に溶かして、濃赤紫色溶液を得た。１.０Ｍ塩酸(１０ｍｌ)を加え、混合物を５時間加熱還流した。反応物を放冷し、赤色沈澱物を濾過し、酢酸、次いでジエチルエーテルで洗浄し、真空下五酸化リンで乾燥することにより、０.８６ｇ(９３％)の６−{２,９−ジブロモ−１２−(５−カルボキシペンチル)−７,１４−ジオキソ−７,１４−ジヒドロ−１２Ｈ−キノ[２,３−ｂ]アクリジン−５−イル}ヘキサン酸を得た。マススペクトル：(ＥＳ＋)(Ｍ＋Ｈ)７５３、７５５、７５７。
λmax(ab)  499nm, 533nm.  λmax(em)  552nm, 595nm。(メタノール)
【０１０２】
７．  ６−{２,９−ジクロロ−１２−(５−カルボキシペンチル)−７,１４−ジオキソ−７,１４−ジヒドロ−１２Ｈ−キノ[２,３−ｂ]アクリジン−５−イル}ヘキサン酸、ジエチルエステル
【化１９】2005501228.tif 000022
７.１  ２,５−ビス{(４−クロロフェニル)アミノ}シクロヘキサ−１,４−ジエン−１,４−ジカルボン酸ジメチル
１,４−シクロヘキサンジオン−２,５−ジカルボン酸ジメチル(４.５６ｇ；２０ｍｍｏｌ)およびメタノール(１００ｍｌ)を沸騰するまで加熱した。次いで、４−クロロアニリン(５.３６ｇ；４２ｍｍｏｌ)、次いで濃塩酸(２００μｌ)を加えた。混合物を５時間窒素雰囲気下で還流させた。冷却すると、クリーム色固体が沈澱し、これを濾過により集め、メタノールで洗浄し、真空下乾燥することにより、８.６２ｇ(９６％)の２,５−ビス{(４−クロロフェニル)アミノ}シクロヘキサ−１,４−ジエン−１,４−ジカルボン酸ジメチルを得た。
【０１０３】
７.２  ２,５−ビス{(４−クロロフェニル)アミノ}テレフタル酸
２,５−ビス{(４−クロロフェニル)アミノ}シクロヘキサ−１,４−ジエン−１,４−ジカルボン酸ジメチル(４.４７ｇ；１０ｍｍｏｌ)、３−ニトロベンゼンスルホン酸のナトリウム塩(２.３ｇ；１０ｍｍｏｌ)、エタノール(７０ｍｌ)および１.０Ｍ水酸化ナトリウム(４０ｍｌ)を窒素雰囲気下で一晩加熱還流した。明黄色溶液を放冷し、水(１２０ｍｌ)を加えた。混合物を濃塩酸で酸性化すると、赤色固体が沈澱した。この物質を濾過し、水で洗浄し、真空下五酸化リンで乾燥することにより、４.０ｇ(９６％)の２,５−ビス{(４−クロロフェニル)アミノ}テレフタル酸を得た。
λmax(ab)  308nm, 379nm。(０.１Ｍ水酸化ナトリウム)
マススペクトル(ＥＳ＋)  (Ｍ＋Ｈ)４１７
【０１０４】
７.３  ２,９−ジクロロキナクリドン
２,５−ビス{(４−クロロフェニル)アミノ}テレフタル酸(３.３５ｇ；８ｍｍｏｌ)およびポリリン酸(３０ｇ)を窒素雰囲気下で３時間１５０℃で加熱した。混合物を放冷し、次いで氷水(２００ｍｌ)中に注ぐと、赤紫色固体が沈澱した。これを濾過し、水およびメタノールで洗浄し、真空下五酸化リンで乾燥することにより、３.１ｇ(１００％)の２,９−ジクロロキナクリドンを得た。マススペクトル(ＥＳ＋)(Ｍ＋Ｈ)３８１
【０１０５】
７.４  ６−{２,９−ジクロロ−１２−(５−カルボキシペンチル)−７,１４−ジオキソ−７,１４−ジヒドロ−１２Ｈ−キノ[２,３−ｂ]アクリジン−５−イル}ヘキサン酸、ジエチルエステル
２,９−ジクロロキナクリドン(３８１ｍｇ；１.０ｍｍｏｌ)を、窒素雰囲気下無水ジメチルホルムアミド(４ｍｌ)に懸濁した。水素化ナトリウム(油中６０％懸濁液；１００ｍｇ；２.４０ｍｍｏｌ)を加え、泡立ちが止まるまで混合物を攪拌した。無水ジメチルスルホキシド(７ｍｌ)を加えた。反応物を１時間７０℃に加熱した。６−ブロモへキサン酸エチル(５３５μｌ、３.０ｍｍｏｌ)を、濃緑色溶液に加え、混合物を７０℃で一晩攪拌した。濃オレンジ‐赤色溶液を放冷し、次いで混合物を水(１５０ｍｌ)および１.０Ｍ塩酸(１０ｍｌ)中に注いだ。固体を濾過し、水で洗浄し、風乾した。これをフラッシュクロマトグラフィー(シリカ、２０％酢酸エチル／ジクロロメタン)により精製して、赤色油状物を得、これをジエチルエーテルと磨砕して結晶化させることにより、２０５ｍｇ(３１％)の６−{２,９−ジクロロ−１２−(５−カルボキシ−ペンチル)−７,１４−ジオキソ−７,１４−ジヒドロ−１２Ｈ−キノ[２,３−ｂ]アクリジン−５−イル}ヘキサン酸、ジエチルエステルを得た。マススペクトル(ＥＳ＋)  (Ｍ＋Ｈ)６６５
δH (200MHz, CDCl3) 1.27( 6H, t), 1.80(12H, m), 2.39(4H, t), 4.15(4H, dd), 4.46(4H, t ), 7.40(2H, d). 7.64(2H, dd), 8.40(2H, d), 8.6(2H, s)。
λmax(ab)  464nm, 493nm, 528nm.   λmax(em)  560nm, 600nm。(ジクロロメタン)
【０１０６】
８.  ６−{２,９−ジフルオロ−１２−(５−カルボキシペンチル)−７,１４−ジオキソ−７,１４−ジヒドロ−１２Ｈ−キノ[２,３−ｂ]アクリジン−５−イル}ヘキサン酸、ジエチルエステル
【化２０】2005501228.tif 000023
８.１  ２,５−ビス{(４−フルオロフェニル)アミノ}シクロヘキサ−１,４−ジエン−１,４−ジカルボン酸ジメチル
１,４−シクロヘキサンジオン−２,５−ジカルボン酸ジメチル(９.１２ｇ；４０ｍｍｏｌ)およびメタノール(２００ｍｌ)を沸騰するまで加熱し、次いで、４−フルオロアニリン(８.３５ｍｌ(９.７８ｇ)；４２ｍｍｏｌ)、次いで濃塩酸(４００μｌ)を加えた。混合物を３時間窒素雰囲気下で還流させた。冷却すると、黄色固体が沈澱し、これを濾過により集め、メタノールで洗浄し、真空下乾燥することにより、１５.８ｇ(９６％)の２,５−ビス{(４−フルオロフェニル)アミノ}シクロヘキサ−１,４−ジエン−１,４−ジカルボン酸ジメチルを得た。
【０１０７】
８.２  ２,５−ビス{(４−フルオロフェニル)アミノ}テレフタル酸
２,５−ビス{(４−フルオロフェニル)アミノ}シクロヘキサ−１,４−ジエン−１,４−ジカルボン酸ジメチル(６.２１ｇ；１５ｍｍｏｌ)、３−ニトロベンゼンスルホン酸のナトリウム塩(３.６ｇ；１６ｍｍｏｌ)、エタノール(９０ｍｌ)および１.０Ｍ水酸化ナトリウム(５０ｍｌ)を窒素雰囲気下で一晩加熱還流した。明黄色溶液を放冷し、水(１２０ｍｌ)を加えた。混合物を濃塩酸で酸性化すると、赤色固体が沈澱した。この物質を濾過し、水で洗浄し、真空下五酸化リンで乾燥することにより、５.６ｇ(９７％)の２,５−ビス{(４−フルオロフェニル)アミノ}テレフタル酸を得た。
λmax(ab)  ２９５nm, ３８０nm。(０.１Ｍ水酸化ナトリウム)
【０１０８】
８.３  ２,９−ジフルオロキナクリドン
２,５−ビス{(４−フルオロフェニル)アミノ}テレフタル酸(５.０ｇ；１３ｍｍｏｌ)およびポリリン酸(〜５０ｇ)を窒素雰囲気下で３時間１５０℃で加熱した。混合物を放冷し、次いで氷水(２００ｍｌ)中に注ぐと、赤紫色固体が沈澱した。これを濾過し、水、次いでメタノールで洗浄し、真空下五酸化リンで乾燥することにより、４.５ｇ(９９％)の２,９−ジフルオロキナクリドンを得た。マススペクトル(ＥＳ＋)(Ｍ＋Ｈ)３４９
【０１０９】
８.４  ６−{２,９−ジフルオロ−１２−(５−カルボキシペンチル)−７,１４−ジオキソ−７,１４−ジヒドロ−１２Ｈ−キノ[２,３−ｂ]アクリジン−５−イル}ヘキサン酸、ジエチルエステル
２,９−ジクロロキナクリドン(３５０ｍｇ；１.０ｍｍｏｌ)を、窒素雰囲気下無水ジメチルホルムアミド(４ｍｌ)に懸濁した。水素化ナトリウム(油中６０％懸濁液；１００ｍｇ；２.４０ｍｍｏｌ)を加え、泡立ちが止まるまで混合物を攪拌した。反応物を１時間７０℃に加熱した。６−ブロモへキサン酸エチル(５３５μｌ、３.０ｍｍｏｌ)を、濃緑色溶液に加え、混合物を７０℃で一晩攪拌した。濃オレンジ‐赤色溶液を放冷し、次いで混合物を水(１５０ｍｌ)および１.０Ｍ塩酸(１０ｍｌ)中に注いだ。固体を濾過し、水で洗浄し、風乾した。これをフラッシュクロマトグラフィー(シリカ、２０％酢酸エチル／ジクロロメタン)により精製して、赤色油状物を得、これをジエチルエーテルと磨砕して結晶化させることにより、１７１ｍｇ(２７％)の６−{２,９−ジフルオロ−１２−(５−カルボキシペンチル)−７,１４−ジオキソ−７,１４−ジヒドロ−１２Ｈ−キノ[２,３−ｂ]アクリジン−５−イル}ヘキサン酸、ジエチルエステルを得た。
δH (200MHz, CDCl3 ) 1.27(6H, t), 1.80(12H, m), 2.39(4H, t), 4.15(4H, dd), 4.48(4H, t ),  7.46(4H, dd), 8.12(2H, d), 8.61(2H, s)。
λmax(ab)  495nm, 533nm.   λmax(em)  570nm, 605nm。
(ジクロロメタン)  マススペクトル(ＥＳ＋)  (Ｍ＋Ｈ)  ６３３
【０１１０】
９.  ６−{２,９−ジメチル−１２−(５−カルボキシペンチル)−７,１４−ジオキソ−７,１４−ジヒドロ−１２Ｈ−キノ[２,３−ｂ]アクリジン−５−イル}ヘキサン酸、ジエチルエステル
【化２１】2005501228.tif 000024
９.１  ２,５−ビス{(４−メチルフェニル)アミノ}シクロヘキサ−１,４−ジエン−１,４−ジカルボン酸ジメチル
１,４−シクロヘキサンジオン−２,５−ジカルボン酸ジメチル(４.５６ｇ；２０ｍｍｏｌ)およびメタノール(１００ｍｌ)を沸騰するまで加熱し、次いで、４−メチルアニリン(４.５ｇ；４２ｍｍｏｌ)、次いで濃塩酸(２００μｌ)を加えた。混合物を５時間窒素雰囲気下で還流させた。冷却すると、クリーム色固体が沈澱し、これを濾過により集め、メタノールで洗浄し、真空下乾燥することにより、７.９２ｇ(９７％)の２,５−ビス{(４−メチルフェニル)アミノ}シクロヘキサ−１,４−ジエン−１,４−ジカルボン酸ジメチルを得た。
【０１１１】
９.２  ２,５−ビス{(４−メチルフェニル)アミノ}テレフタル酸
２,５−ビス{(４−メチルフェニル)アミノ}シクロヘキサ−１,４−ジエン−１,４−ジカルボン酸ジメチル(５.１ｇ；１２.５ｍｍｏｌ)、３−ニトロベンゼンスルホン酸のナトリウム塩(２.９３ｇ；１３ｍｍｏｌ)、エタノール(７５ｍｌ)および１.０Ｍ水酸化ナトリウム(４０ｍｌ)を窒素雰囲気下で一晩加熱還流した。明黄色溶液を放冷し、水(１２０ｍｌ)を加えた。混合物を濃塩酸で酸性化すると、紫色固体が沈澱した。この物質を濾過し、水で洗浄し、真空下五酸化リンで乾燥することにより、４.５３ｇ(９６％)の２,５−ビス{(４−クロロフェニル)アミノ}テレフタル酸を得た。
λmax(ab)  ２９９nm, ３８６nm。(０.１Ｍ水酸化ナトリウム)
【０１１２】
９.３  ２,９−ジメチルキナクリドン
２,５−ビス{(４−メチルフェニル)アミノ}テレフタル酸(３.７６ｇ；１０ｍｍｏｌ)およびポリリン酸(４０ｇ)を窒素雰囲気下で２.５時間１５０℃で加熱した。混合物を放冷し、次いで氷水(１００ｍｌ)中に注ぐと、赤紫色固体が沈澱した。これを濾過し、水、次いでメタノールで洗浄し、真空下五酸化リンで乾燥することにより、３.１２ｇ(９２％)の２,９−ジメチルキナクリドンを得た。
【０１１３】
９.４  ６−{２,９−ジメチル−１２−(５−カルボキシペンチル)−７,１４−ジオキソ−７,１４−ジヒドロ−１２Ｈ−キノ[２,３−ｂ]アクリジン−５−イル}ヘキサン酸、ジエチルエステル
２,９−ジメチルキナクリドン(６８０ｍｇ；２.０ｍｍｏｌ)を、窒素雰囲気下無水ジメチルホルムアミド(１０ｍｌ)および無水ジメチルスルホキシド(１０ｍｌ)の混合物に懸濁した。水素化ナトリウム(油中６０％懸濁液；２００ｍｇ；５.０ｍｍｏｌ)を加え、泡立ちが止まるまで混合物を攪拌した。反応物を１時間７０℃に加熱した。６−ブロモへキサン酸エチル(１.０７ｍｌ(１.３４ｇ)、６.０ｍｍｏｌ)を、濃青−緑色溶液に加え、混合物を６０℃で一晩攪拌した。濃オレンジ‐赤色溶液を放冷し、次いで混合物を水(１５０ｍｌ)および１.０Ｍ塩酸(３０ｍｌ)中に注いだ。固体を濾過し、水で洗浄し、風乾した。これをフラッシュクロマトグラフィー(シリカ、５〜２５％酢酸エチル／ジクロロメタン)により精製して、赤色油状物を得、これをジエチルエーテルと磨砕して結晶化させることにより、７８０ｍｇ(６２％)の６−{２,９−ジメチル−１２−(５−カルボキシペンチル)−７,１４−ジオキソ−７,１４−ジヒドロ−１２Ｈ−キノ[２,３−ｂ]アクリジン−５−イル}ヘキサン酸、ジエチルエステルを得た。
δH (200MHz, CDCl3) 1.24 (6H, t), 1.80(12H, m), 2.38(10H, m), 4.15(4H, dd), 4.45(4H, t), 7.30(2H dd), 7.47(2H, dd), 8.21(2H, d), 8.57(2H, s).
λmax(ab)  495nm, 530nm   λmax(em)  545nm。(ジクロロメタン)
【０１１４】
１０.  ６−{２,９−ジメトキシ−１２−(５−カルボキシペンチル)−７,１４−ジオキソ−７,１４−ジヒドロ−１２Ｈ−キノ[２,３−ｂ]アクリジン−５−イル}ヘキサン酸、ジエチルエステル
【化２２】2005501228.tif 000025
１０.１  ２,５−ビス{(４−メトキシフェニル)アミノ}シクロヘキサ−１,４−ジエン−１,４−ジカルボン酸ジメチル
１,４−シクロヘキサンジオン−２,５−ジカルボン酸ジメチル(９.１２ｇ；４０ｍｍｏｌ)およびメタノール(２００ｍｌ)を沸騰するまで加熱し、次いで、４−メトキシアニリン(１０.８４ｇ；８８ｍｍｏｌ)、次いで濃塩酸(４００μｌ)を加えた。混合物を２.５時間窒素雰囲気下で還流させた。冷却すると、オレンジ色固体が沈澱し、これを濾過により集め、メタノールで洗浄し、真空下乾燥することにより、１７.０ｇ(９７％)の２,５−ビス{(４−メトキシフェニル)アミノ}シクロヘキサ−１,４−ジエン−１,４−ジカルボン酸ジメチルを得た。
【０１１５】
１０.２  ２,５−ビス{(４−メトキシフェニル)アミノ}テレフタル酸
２,５−ビス{(４−メトキシフェニル)アミノ}シクロヘキサ−１,４−ジエン−１,４−ジカルボン酸ジメチル(６.５８ｇ；１５ｍｍｏｌ)、３−ニトロベンゼンスルホン酸のナトリウム塩(３.６ｇ；１６ｍｍｏｌ)、エタノール(９０ｍｌ)および１.０Ｍ水酸化ナトリウム(５０ｍｌ)を窒素雰囲気下で一晩加熱還流した。オレンジ色溶液を放冷し、水(１２０ｍｌ)を加えた。混合物を濃塩酸で酸性化すると、紫色固体が沈澱した。この物質を濾過し、水、次いで２５％エタノール／水で洗浄し、真空下五酸化リンで乾燥することにより、６.０ｇ(９８％)の２,５−ビス{(４−メトキシフェニル)アミノ}テレフタル酸を得た。λmax(ab)  ２９９nm, ３９２nm。(０.１Ｍ水酸化ナトリウム)
【０１１６】
１０.３  ２,９−ジメトキシキナクリドン
２,５−ビス{(４−メトキシフェニル)アミノ}テレフタル酸(１.０２ｇ；２.５ｍｍｏｌ)およびポリリン酸(１０ｇ)を窒素雰囲気下で１５分間１６０℃で加熱した。混合物を放冷し、次いで氷水(２００ｍｌ)中に注ぐと、紫色固体が沈澱した。これを濾過し、水およびメタノールで洗浄し、次いで真空下五酸化リンで乾燥することにより、９４８ｍｇ(１００％)の２,９−ジメトキシキナクリドンを得た。マススペクトル(ＥＳ＋)  (Ｍ＋Ｈ)３７３
【０１１７】
１０.４  ６−{２,９−ジメトキシ−１２−(５−カルボキシペンチル)−７,１４−ジオキソ−７,１４−ジヒドロ−１２Ｈ−キノ[２,３−ｂ]アクリジン−５−イル}ヘキサン酸のジエチルエステル
２,９−ジメトキシキナクリドン(３７５ｍｇ；１.０ｍｍｏｌ)を、窒素雰囲気下無水ジメチルホルムアミド(５ｍｌ)および無水ジメチルスルホキシド(５ｍｌ)の混合物に懸濁した。水素化ナトリウム(油中６０％懸濁液；１００ｍｇ；２.４０ｍｍｏｌ)を加え、泡立ちが止まるまで混合物を攪拌した。反応物を１時間７０℃に加熱した。６−ブロモへキサン酸エチル(５３５μｌ、３.０ｍｍｏｌ)を、濃緑色溶液に加え、混合物を７０℃で一晩攪拌した。濃紫‐赤色溶液を放冷し、次いで混合物を水(１５０ｍｌ)および１.０Ｍ塩酸(２０ｍｌ)中に注いだ。固体を濾過し、水で洗浄し、風乾した。これをフラッシュクロマトグラフィー(シリカ、５〜３０％酢酸エチル／ジクロロメタン)により精製して、２３０ｍｇ(３５％)の６−{２,９−ジメトキシ−１２−(５−カルボキシペンチル)−７,１４−ジオキソ−７,１４−ジヒドロ−１２Ｈ−キノ[２,３−ｂ]アクリジン−５−イル}ヘキサン酸、ジエチルエステルを赤色固体として得た。δH (200MHz, CDCl3) 1.25(6H, t), 1.80(12H, m), 2.40(4H, t), 4.00(6H, s), 4.15(4H, m), 4.50(4H, t ), 7.42(4H, m), 7.91(2H, d),  8.70(2H, s).  λmax(ab)  510nm,  547nm.  λmax(em)  592nm. (メタノール)。マススペクトル(ES+)  (M+H) 656  (M+Na) 679。
【０１１８】
１１.  ６−{２,９−ジニトロ−１２−(５−カルボキシペンチル)−７,１４−ジオキソ−７,１４−ジヒドロ−１２Ｈ−キノ[２,３−ｂ]アクリジン−５−イル}ヘキサン酸、ジエチルエステル
【化２３】2005501228.tif 000026
５,１２−ビス(Ｏ−エチル−６−ヘキサノイル)−５,１２−ジヒドロキノ[２,３−ｂ]アクリジン−７,１４−ジオン(３００ｍｇ；０.５ｍｍｏｌ)を氷浴中で冷却し、次いで窒素雰囲気下濃硫酸(３ｍｌ)に溶かして、紫色溶液を得た。濃硝酸(７０μｌ；１.０８ｍｍｏｌ)を加え、反応混合物を氷浴から除去した。１時間後、反応混合物を氷に加えると、オレンジ色沈澱物が形成された。混合物をジクロロメタンで抽出した。有機相を希重炭酸ナトリウム溶液で洗浄し、次いで無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過後、溶媒を回転蒸発により除去して、オレンジ色固体を得た。これをフラッシュクロマトグラフィー(シリカ、２〜３％メタノール／ジクロロメタン)により精製した。溶媒除去後、残さをジエチルエーテルで磨砕することにより、オレンジ色固体として２４０ｍｇ(７０％)の６−{２,９−ジニトロ−１２−(５−カルボキシペンチル)−７,１４−ジオキソ−７,１４−ジヒドロ−１２Ｈ−キノ[２,３−ｂ]アクリジン−５−イル}ヘキサン酸、ジエチルエステルを得た。
δH (200MHz, CD3OD) 1.28(6H, t), 1.80(12H, m), 2.43(4H, t), 4.17(4H, dd), 4.56(4H, t ), 7.56(2H, d), 8.48(2H, dd), 8.66(2H, s), 9.30(2H, d).
λmax(ab)  408nm, 474nm, 506nm.  λmax(em) 518nm, 556nm。(ジクロロメタン)
注：この物質は、ＤＭＦ、ＤＭＳＯおよびメタノール中において非常に弱い蛍光性または非蛍光性である。
【０１１９】
１２．蛍光寿命試験
図２は、本発明によるある種の色素の蛍光寿命を示すプロットである。エディンバラ・インスツルメンツＦＬ９００ＣＤＴ時間分解蛍光光度計を用いる時間相関単一光子計数技術により、一連の色素の蛍光寿命を測定した。水素充填フラッシュランプを用いて試料を５００ｎｍで励起した。検出は５５０ｎｍであった。非線形最小二乗法アルゴリズムを用いたデコンヴォルーションにより、表２に示した結果が得られた。
表２：蛍光寿命
【表２】2005501228.tif 000027
【０１２０】
１３．タンパク質標識
１３.１  ６−{７,１４−ジオキソ−２,９−ジスルホ−７,１４−ジヒドロ−１２Ｈ−キノ[２,３−ｂ]アクリジン−５−イル}ヘキサン酸と卵アルブミンとのコンジュゲートの製造
１０ｍｌの卵アルブミン(０.１Ｍの炭酸緩衝液中１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ９.３)に、１００μｌのＯ−(Ｎ−スクシンイミジル)−６−{７,１４−ジオキソ−２,９−ジスルホ−７,１４−ジヒドロ−１２Ｈ−キノ[２,３−ｂ]アクリジン−５−イル}ヘキサン酸(ＤＭＳＯ中１ｍｇ／１００μｌ)を攪拌しながら滴下した。ホイルで包んだバイアル中において周囲温度で１時間緩やかな攪拌を続けた。非コンジュゲート色素を、少なくともＰＢＳを２回交換し、＋４℃での一晩透析(１２−１４Ｋ ＭＷＣＯ)により除去した。色素‐コンジュゲート(コンジュゲートＡ)を採取し、＋４℃で貯蔵した。
【０１２１】
１３.２  ６−{７,１４−ジオキソ−２,９−ジスルホ−７,１４−ジヒドロ−１２Ｈ−キノ[２,３−ｂ]アクリジン−５−イル}ヘキサン酸およびその卵アルブミンとのコンジュゲート(コンジュゲートＡ)の蛍光寿命の測定
６−{７,１４−ジオキソ−２,９−ジスルホ−７,１４−ジヒドロ−１２Ｈ−キノ[２,３−ｂ]アクリジン−５−イル}ヘキサン酸およびその卵アルブミンとのコンジュゲート(コンジュゲートＡ)の蛍光寿命をＰＢＳ中で測定した。結果を図３に示す。非線形最小二乗法アルゴリズムを用いたデコンヴォルーションおよび曲線の当てはめにより、表３に示した結果が得られた。
【０１２２】
表３．蛍光寿命
【表３】2005501228.tif 000028
【０１２３】
１４．Ｏ−{Ｎ−スクシンイミジル−６−(１２−エチル−７,１４−ジオキソ−２,９−ジスルホ−７,１４−ジヒドロ−１２Ｈ−キノ[２,３−ｂ]アクリジン−５−イル}ヘキサノエートによるＭＭＰペプチド基質の標識
ＭＭＰ３ペプチド基質(ＮＨ２−ＲＰＫＰＶＥ(Ｎｖａ)ＷＲＫ−ＮＨ２)を、標準Ｆｍｏｃ化学およびリンクアミド樹脂を用いたアプライド・バイオシステムズモデル４３１Ａペプチド合成装置で合成した。合成の終わりに、Ｎ−末端Ｆｍｏｃ基を除去した。部分保護ペプチドを固体支持体に付着させたままにし、そこでＯ−{Ｎ−スクシンイミジル−６−(１２−エチル−７,１４−ジオキソ−２,９−ジスルホ−７,１４−ジヒドロ−１２Ｈ−キノ[２,３−ｂ]アクリジン−５−イル}ヘキサノエートと反応させた。次いで、標準技術を用いて標識ペプチドを固体支持体から開裂させ、次いで逆相ＨＰＬＣにより精製した。
【０１２４】
５０ｍｇの樹脂結合ペプチド(１６μモルのペプチドに相当)を秤量して１.５ｍｌねじぶた式ポリプロピレンＶバイアルに入れ、そこに１ｍｌの無水ＤＭＳＯに溶かした１２ｍｇ(１６μモル)のＯ−{Ｎ−スクシンイミジル−６−(１２−エチル−７,１４−ジオキソ−２,９−ジスルホ−７,１４−ジヒドロ−１２Ｈ−キノ[２,３−ｂ]アクリジン−５−イル}ヘキサン酸、次いで２０μｌのジイソプロピルエチルアミンを加えた。バイアルを周囲温度(２２℃)で２０時間遮光したローラー上に置いた。次いで、焼結ガラスフリットを用いて樹脂を濾過し、５ｍｌの乾燥ＤＭＳＯ、５ｍｌのメタノールおよび最後に５ｍｌのジクロロメタンで洗浄し、次いで真空下２時間乾燥した。
【０１２５】
樹脂を小型丸底フラスコに入れ、そこにトリフルオロ酢酸(１.９ｍｌ)の氷冷溶液２ｍｌ、水(５０リットル)およびトリイソプロピルシラン(ＴＩＳ)(５０μｌ)を加えた。混合物をマグネチックスターラーで９０分間攪拌し、そのまま周囲温度まで温めた。次いで、グラスウールプラグにより混合物を濾過し、１０ｍｌの氷冷ジエチルエーテル中に滴下した。淡黄色沈澱物の回転速度を落し、上清を除去し、沈澱物を１ｍｌのトリフルオロ酢酸に再溶解し、１０ｍｌの氷冷エーテルに再懸濁した。沈澱物の回転速度を落とし、エーテルで２回洗浄し、次いで真空下乾燥した。
【０１２６】
粗標識ペプチドを水に溶かし、０.４５μｍミリポアフィルターで濾過し、３０分にわたり流速４ｍｌ／分で０.１％ＴＦＡ／水〜１００％の０.１％ＴＦＡ／アセトニトリルの勾配を用いた２５ｃｍ×１ｃｍのＣ−１８フェノメネックス・ジュピターカラム(コード００Ｇ−４０５５−Ｎ０)で一分量を精製した。検出は２２０および５００ｎｍで行なわれた。一主要ピークが１３分後に溶離された。この物質を凍結乾燥することにより、１１.４ｍｇ(６.０μｍ)の赤色固体を得た。
マススペクトル(ＥＳ＋)(Ｍ＋Ｈ)１８９３(キナクリドン標識ペプチドの計算分子量＝１８９２)
【０１２７】
１５．蛍光偏光によりモニターされる６−{１２−エチル−７,１４−ジオキソ−２,９−ジスルホ−７,１４−ジヒドロ−１２Ｈ−キノ[２,３−ｂ]アクリジン−５−イル}ヘキサン酸とアルブミンのコンジュゲートのトリプシン開裂
１５.１  アルブミンコンジュゲートの製造
１０ｍｌのヒト血清アルブミン(０.１Ｍ炭酸緩衝液中２ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ９.３)に、攪拌しながらＯ−{Ｎ−スクシンイミジル−６−(１２−エチル−７,１４−ジオキソ−２,９−ジスルホ−７,１４−ジヒドロ−１２Ｈ−キノ[２,３−ｂ]アクリジン−５−イル}ヘキサノエート(１１０μｌ；ＤＭＳＯ中２ｍｇ／ｍｌ)を滴下した。ホイルで包んだバイアルにおいて緩やかな攪拌を周囲温度で１時間続行した。セファデックスＧ２５カラム(ＰＤ１０−アマーシャム・バイオサイエンシーズ)を用いて精製することによりコンジュゲートを脱イオン水中で溶離させた。
【０１２８】
１５.２  アルブミンコンジュゲートのトリプシン開裂
キュベット中における２ｍｌの緩衝液(２０ｍＭのトリスｐＨ７.５；２００ｍＭのＮａＣｌ；６ｍＭのＣａＣｌ２)中のコンジュゲート(２０μｇ)１０μｌに、５０μｌ緩衝液(無酵素対照として)または５０μｌ(５００μｇ)のトリプシンを加えた。周囲温度で２０分間４８５ｎｍでの励起および５５５ｎｍでの検出で、フルオロマックス３分光蛍光計(ＪＹ堀場)を用いて蛍光偏光シグナルの測定を行った。図４に概説された結果は、偏光理論から予測される通り、アルブミンコンジュゲートがトリプシンにより小フラグメントへ開裂されると、シグナルの偏光が低下することを示している。
【図１】
2005501228.tif 000039
【図２】
2005501228.tif 000040
【図３】
2005501228.tif 000041
【図４】
2005501228.tif 000042
【国際公開パンフレット】
2005501228.tif 000043
2005501228.tif 000044
2005501228.tif 000045
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2005501228.tif 000116
2005501228.tif 000117
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005501228.tif 000118
2005501228.tif 000119
【手続補正書】
【提出日】平成15年8月25日(2003.8.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試薬が、式
【化１】
2005501228.tif 000120
［式中、
基Ｒ３およびＲ４はＺ１環構造に結合され、基Ｒ５およびＲ６はＺ２環構造に結合されており、
Ｚ１およびＺ２は、独立して、１環、２縮合環または３縮合環芳香族または複素芳香族系を完成させるのに必要な原子を表しており、各環は、炭素原子、および酸素、窒素および硫黄から選択される所望による２個以下の原子から選択された５または６個の原子を有し、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、独立して、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、モノ‐もしくはジ‐ニトロ−置換ベンジル、アミノ、モノ‐もしくはジ‐Ｃ１‐Ｃ４アルキル‐置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、Ｃ１‐Ｃ６アルコキシ、アクリレート、ビニル、スチリル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ１‐Ｃ２０アルキル、アラルキル、スルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウム、基−Ｅ−Ｆおよび基−(ＣＨ２‐)ｎＹから選択され、
Ｒ１およびＲ２は、独立して、水素、モノ‐もしくはジ‐ニトロ‐置換ベンジル、Ｃ１‐Ｃ２０アルキル、アラルキル、基−Ｅ−Ｆおよび基−(ＣＨ２‐)ｎＹから選択され、
Ｅは、炭素、窒素、酸素、硫黄およびリン原子から成る群から選択される１〜６０個の原子の鎖を有するスペーサー基であり、Ｆは標的結合基であり、
Ｙは、スルホネート、スルフェート、ホスホネート、ホスフェート、第４級アンモニウムおよびカルボキシルから選択され、ｎは１〜６の整数である］
で示される色素である、標的生物材料標識用試薬の使用。
【請求項２】
色素が蛍光色素であり、
基Ｒ３およびＲ４がＺ１環構造の原子に結合され、基Ｒ５およびＲ６がＺ２環構造の原子に結合されており、Ｚ１およびＺ２が前記の意味であり、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８が、独立して、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、モノ‐もしくはジ‐Ｃ１‐Ｃ４アルキル‐置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、Ｃ１‐Ｃ６アルコキシ、アクリレート、ビニル、スチリル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ１‐Ｃ２０アルキル、アラルキル、スルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウム、基−Ｅ−Ｆおよび基−(ＣＨ２‐)ｎＹから選択され、そして
Ｒ１およびＲ２が、独立して、水素、Ｃ１‐Ｃ２０アルキル、アラルキル、基−Ｅ−Ｆおよび基−(ＣＨ２‐)ｎＹから選択され、
Ｅ、Ｆ、Ｙおよびｎが前記の意味である、請求項１記載の使用。
【請求項３】
色素が非蛍光性または実質的に非蛍光性色素であり、
基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｚ１およびＺ２が、前記の意味であり、そして、基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうち少なくとも１個が少なくとも１個のニトロ基を含む、請求項１記載の使用。
【請求項４】
基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうち少なくとも１個が基−Ｅ−Ｆであり、ＥおよびＦが前記の意味である、請求項１〜３記載の使用。
【請求項５】
標的結合基Ｆが、標的材料における官能基と反応するための反応性基、または標的材料における反応性基と反応するための官能基を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
反応基が、カルボキシル、スクシンイミジルエステル、スルホ‐スクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミド、ハロアセトアミド、酸ハライド、ヒドラジド、ビニルスルホン、ジクロロトリアジンおよびホスホラミダイトから選択される、請求項５記載の使用。
【請求項７】
官能基が、ヒドロキシ、アミノ、スルフヒドリル、イミダゾール、アルデヒドおよびケトンを含むカルボニル、リン酸およびチオリン酸基から選択される、請求項５記載の使用。
【請求項８】
スペーサー基Ｅが、
-(CHR')p-
-{(CHR')q-O-(CHR')r}s-
-{(CHR')q-NR'-(CHR')r}s-
-{(CHR')q-(CH=CH)-(CHR')r}s-
-{(CHR')q-Ar-(CHR')r}s-
-{(CHR')q-CO-NR'-(CHR')r}s-
-{(CHR')q-CO-Ar-NR'-(CHR')r}s-
［式中、Ｒ'は、水素、Ｃ１−Ｃ４アルキルまたはアリールであって、所望によりスルホネートにより置換され得、Ａｒは、所望によりスルホネートにより置換されていてもよいフェニレンであり、ｐは１〜２０、好ましくは１〜１０であり、ｑは０〜１０であり、ｒは１〜１０であり、そしてｓは１〜５である］
から選択される、請求項１〜７のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
標的生物材料標識方法であって、
ｉ）標的生物材料を含む液体に、式
【化２】
2005501228.tif 000121
［式中、
基Ｒ３およびＲ４はＺ１環構造に結合され、基Ｒ５およびＲ６はＺ２環構造に結合されており、Ｚ１およびＺ２は前記の意味であり、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、独立して、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、モノ‐もしくはジ‐Ｃ１‐Ｃ４アルキル‐置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、Ｃ１‐Ｃ６アルコキシ、アクリレート、ビニル、スチリル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ１‐Ｃ２０アルキル、アラルキル、スルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウム、基−Ｅ−Ｆおよび基−(ＣＨ２‐)ｎＹから選択され、
Ｒ１およびＲ２は、独立して、水素、Ｃ１‐Ｃ２０アルキル、アラルキル、基−Ｅ−Ｆおよび基−(ＣＨ２‐)ｎＹから選択され、Ｅ、Ｆ、Ｙおよびｎは前記の意味である］
の色素を加え、そして
ii）標的を標識するのに適切な条件下、色素と標的生物材料をインキュベーションする
工程を含む方法。
【請求項１０】
基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうち少なくとも１個が基−Ｅ−Ｆであり、ＥおよびＦが前記の意味である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
標的生物材料が、抗体、脂質、タンパク質、ペプチド、炭水化物、１個またはそれ以上のアミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシルおよびカルボキシル、リン酸およびチオリン酸基を含むかまたは含むように誘導体化されているヌクレオチド、および１個またはそれ以上のアミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシルおよびカルボキシル、リン酸およびチオリン酸基を含むかまたは含むように誘導体化されているオキシまたはデオキシポリ核酸、微生物材料、薬剤、ホルモン、細胞、細胞膜および毒素から成る群から選択される、請求項９または請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
試料中における被検体の検定方法であって、
ｉ)被検体の少なくとも一部分を特異的結合パートナーと結合させるのに適切な条件下、被検体を被検体に特異的な結合パートナーと接触させることにより、複合体を形成させ、そして被検体および特異的結合パートナーのうちの一方を、式
【化３】
2005501228.tif 000122
［式中、
基Ｒ３およびＲ４はＺ１環構造の原子に結合され、基Ｒ５およびＲ６はＺ２環構造の原子に結合されており、Ｚ１およびＺ２は前記の意味であり、
基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうち少なくとも１個は基−Ｅ−Ｆであり、ここでＥは、炭素、窒素、酸素、硫黄およびリン原子から成る群から選択される１〜６０個の原子の鎖を有するスペーサー基であって、Ｆは標的結合基であり、
基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうちの何れかが基−Ｅ−Ｆではないとき、残りの基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、独立して、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、モノ‐もしくはジ‐Ｃ１‐Ｃ４アルキル‐置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、Ｃ１‐Ｃ６アルコキシ、アクリレート、ビニル、スチリル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ１‐Ｃ２０アルキル、アラルキル、スルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウムおよび基−(ＣＨ２‐)ｎＹから選択され、そして
基Ｒ１およびＲ２のうちいずれかが基−Ｅ−Ｆではないとき、残りの基Ｒ１およびＲ２は、独立して水素、Ｃ１‐Ｃ２０アルキル、アラルキルおよび基−(ＣＨ２‐)ｎＹから選択され、
Ｙおよびｎは前記の意味である］
の蛍光色素で標識し、
ii)標識複合体から放出された蛍光を測定し、および
iii)放出された蛍光と試料中における被検体の存在または量との相互関係を明らかにする
工程を含む方法。
【請求項１３】
測定工程ii)が、標識複合体の蛍光寿命または蛍光偏光を測定することにより行なわれる、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
被検体‐特異的結合パートナーが、抗体／抗原、レクチン／糖タンパク質、ビオチン／ストレプトアビジン、ホルモン／受容体、酵素／基質または補因子、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡおよびＤＮＡ／結合タンパク質から成る群から選択される、請求項１２または請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
試料中における酵素測定についての検定方法であって、
ｉ)酵素についての基質を準備し、ただし基質は、式
【化４】
2005501228.tif 000123
［式中、
基Ｒ３およびＲ４はＺ１環構造の原子に結合され、基Ｒ５およびＲ６はＺ２環構造の原子に結合されており、Ｚ１およびＺ２は前記の意味であり、
基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうち少なくとも１個は基−Ｅ−Ｆであり、ここでＥは、炭素、窒素、酸素、硫黄およびリン原子から成る群から選択される１〜６０個の原子の鎖を有するスペーサー基であって、Ｆは標的結合基であり、
基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうちの何れかが基−Ｅ−Ｆではないとき、残りの基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、独立して、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、モノ‐もしくはジ‐Ｃ１‐Ｃ４アルキル‐置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、Ｃ１‐Ｃ６アルコキシ、アクリレート、ビニル、スチリル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ１‐Ｃ２０アルキル、アラルキル、スルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウムおよび基−(ＣＨ２‐)ｎＹから選択され、そして
基Ｒ１およびＲ２のうちいずれかが基−Ｅ−Ｆではないとき、残りの基Ｒ１およびＲ２は、独立して水素、Ｃ１‐Ｃ２０アルキル、アラルキルおよび基−(ＣＨ２‐)ｎＹから選択され、
Ｙおよびｎは前記の意味である］
の蛍光色素で標識されているものとし、
ii)酵素反応の開始に適した条件下、標識基質を酵素と合わせ、そして
iii)試料の蛍光偏光を測定することにより、反応の程度を測定する
工程を含む方法。
【請求項１６】
２種またはそれ以上の異なる蛍光色素セットであって、色素セットの各色素が、式
【化５】
2005501228.tif 000124
［式中、
基Ｒ３およびＲ４はＺ１環構造に結合され、基Ｒ５およびＲ６はＺ２環構造に結合されており、Ｚ１およびＺ２は前記の意味であり、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、独立して、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、モノ‐もしくはジ‐Ｃ１‐Ｃ４アルキル‐置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、Ｃ１‐Ｃ６アルコキシ、アクリレート、ビニル、スチリル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ１‐Ｃ２０アルキル、アラルキル、スルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウム、基−Ｅ−Ｆおよび基−(ＣＨ２‐)ｎＹから選択され、
Ｒ１およびＲ２は、独立して、水素、Ｃ１‐Ｃ２０アルキル、アラルキル、基−Ｅ−Ｆおよび基−(ＣＨ２‐)ｎＹから選択され、
Ｅは、炭素、窒素、酸素、硫黄およびリン原子から成る群から選択される１〜６０個の原子の鎖を有するスペーサー基であり、そしてＦは標的結合基であり、
Ｙは、スルホネート、スルフェート、ホスホネート、ホスフェート、第４級アンモニウムおよびカルボキシルから選択され、ｎは１〜６の整数である］
を有し、セットの各色素が、セットの残りの色素の寿命と比べて明確に異なる蛍光寿命を有するものである、セット。
【請求項１７】
基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうち少なくとも１個が基−Ｅ−Ｆであり、ここでＥおよびＦは前記の意味である、請求項１６記載のセット。
【請求項１８】
４種の異なる色素を含む、請求項１６または請求項１７記載のセット。
【請求項１９】
セットの各色素が、１〜３０ナノ秒の範囲、さらに好ましくは１０〜２５ナノ秒の範囲での異なる蛍光寿命を呈する、請求項１６〜１８のいずれかに記載のセット。
【請求項２０】
色素の各々の蛍光放出の寿命が少なくとも０.５ナノ秒ごとに分離される、請求項１６〜１９のいずれかに記載のセット。
【請求項２１】
式
【化６】
2005501228.tif 000125
［式中、
基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｚ１およびＺ２は、前記の意味であり、そして、基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうち少なくとも１個は少なくとも１個のニトロ基を含む］
で示される非蛍光または実質的に非蛍光色素の蛍光を増加させる方法であって、少なくとも一ニトロ基の、−ＮＨＯＨまたは−ＮＨ２への還元を特徴とする方法。
【請求項２２】
組成物におけるニトロレダクターゼ酵素活性の検出方法であって、
ｉ)ニトロレダクターゼ活性を高める条件下、組成物を式
【化７】
2005501228.tif 000126
［式中、
基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｚ１およびＺ２は、前記の意味であり、そして、基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうち少なくとも１個は少なくとも１個のニトロ基を含む］
で示される色素と混合し、そして
ii)ニトロレダクターゼ活性の量の尺度である、蛍光の増加を測定する
ことを含む方法。
【請求項２３】
ｉ)特異的結合対の第１成分を表面に結合させ、
ii)成分間の結合を促す条件下、特異的結合対の第２成分を加え、ただし、その第２成分はニトロレダクターゼ酵素で標識されているものとし、
iii)式
【化８】
2005501228.tif 000127
［式中、
基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｚ１およびＺ２は、前記の意味であり、そして、基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうち少なくとも１個は少なくとも１個のニトロ基を含む］
で示される色素を加え、そして
iv)結合ニトロレダクターゼ活性の尺度として蛍光の増加を測定することにより、第１成分への第２成分の結合を検出する
ことを含む検定方法。
【請求項２４】
特異的結合対が、抗体／抗原、レクチン／糖タンパク質、ビオチン／ストレプトアビジン、ホルモン／受容体、酵素／基質、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡおよびＤＮＡ／結合タンパク質から成る群から選択される、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
ｉ)ニトロレダクターゼをコード化する配列に機能し得るように結合された発現制御配列を含む核酸分子によりトランスフェクションされた宿主細胞を、式
【化９】
2005501228.tif 000128
［式中、
基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｚ１およびＺ２は、前記の意味であり、そして、基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうち少なくとも１個は少なくとも１個のニトロ基を含む］
で示される色素と接触させ、
ii)ニトロレダクターゼ遺伝子発現の尺度として蛍光の増加を測定する
ことを含む検定方法。
【請求項２６】
遺伝子発現に対するその効果が測定されるべき試験剤の存在下で検定を実施する、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
式
【化１０】
2005501228.tif 000129
［式中、
基Ｒ３およびＲ４はＺ１環構造の原子に結合され、基Ｒ５およびＲ６はＺ２環構造の原子に結合されており、
Ｚ１およびＺ２は、独立して、１環、２縮合環または３縮合環芳香族または複素芳香族系を完成させるのに必要な原子を表しており、各環は、炭素原子、および酸素、窒素および硫黄から選択される所望による２個以下の原子から選択された５または６個の原子を有し、
基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうち少なくとも１個は基−Ｅ−Ｆであり、ここでＥは、炭素、窒素、酸素、硫黄およびリン原子から成る群から選択される１〜６０個の原子の鎖を有するスペーサー基であって、Ｆは標的結合基であり、そして
基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうちの何れかが基−Ｅ−Ｆではないとき、残りの基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、独立して、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、アミノ、モノ‐もしくはジ‐Ｃ１‐Ｃ４アルキル‐置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、Ｃ１‐Ｃ６アルコキシ、アクリレート、ビニル、スチリル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ１‐Ｃ２０アルキル、アラルキル、スルホネート、スルホン酸、第４級アンモニウムおよび基−(ＣＨ２‐)ｎＹから選択され、そして
基Ｒ１およびＲ２のうちいずれかが基−Ｅ−Ｆではないとき、残りの基Ｒ１およびＲ２は、独立して水素、モノ‐もしくはジ‐ニトロ‐置換ベンジル、Ｃ１‐Ｃ２０アルキル、アラルキルおよび基−(ＣＨ２‐)ｎＹから選択され、
Ｅは、炭素、窒素、酸素、硫黄およびリン原子から成る群から選択される１〜６０個の原子の鎖を有するスペーサー基であって、Ｆは標的結合基であり、
Ｙは、スルホネート、スルフェート、ホスホネート、ホスフェート、第４級アンモニウムおよびカルボキシルから選択され、ｎは１〜６の整数であり、
ただし、基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうち少なくとも１個はスルホネート、スルフェート、第４級アンモニウム、および基−(ＣＨ２‐)ｎＹから選択され、および／または
基Ｒ１およびＲ２のうち少なくとも１個は基−(ＣＨ２‐)ｎＹであり、Ｙおよびｎは前記の意味である］
で示される色素。
【請求項２８】
標的結合基Ｆが、
ｉ)カルボキシル、スクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミド、ハロアセトアミド、酸ハライド、ヒドラジド、ビニルスルホン、ジクロロトリアジンおよびホスホラミダイトから選択される反応性基、または
ii)ヒドロキシ、アミノ、スルフヒドリル、イミダゾール、アルデヒドおよびケトンを含むカルボニル、リン酸およびチオリン酸から選択される官能基
を含む、請求項２７記載の色素。
【請求項２９】
スペーサー基Ｅが、
-(CHR')p-
-{(CHR')q-O-(CHR')r}s-
-{(CHR')q-NR'-(CHR')r}s-
-{(CHR')q-(CH=CH)-(CHR')r}s-
-{(CHR')q-Ar-(CHR')r}s-
-{(CHR')q-CO-NR'-(CHR')r}s-
-{(CHR')q-CO-Ar-NR'-(CHR')r}s-
［式中、Ｒ'は、水素、Ｃ１−Ｃ４アルキルまたはアリールであって、所望によりスルホネートにより置換され得、Ａｒは、所望によりスルホネートにより置換されていてもよいフェニレンであり、ｐは１〜２０、好ましくは１〜１０であり、ｑは０〜１０であり、ｒは１〜１０であり、そしてｓは１〜５である］
から選択される、請求項２７または請求項２８記載の色素。
【国際調査報告】
2005501228.tif 000130
2005501228.tif 000131