(57)【要約】  本発明は、貨幣金属表面上へのチオラート単層への共有結合を通じて、機能性有機生体分子を不動化する物品を提供する。物品を製造する方法及びこの商品上に機能性有機生体分子を不動化する方法も提供される。このチオラート単層は、ふたつの部分を含み、ひとつは生体分子との反応に抵抗する不活性基を有し、及びひとつは機能性有機生体分子を単層上に共有的に不動化するためにこれと反応する共有結合形成する基を有する。
2005509737.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
貨幣金属表面及び少なくともその貨幣金属表面の一部を覆っている混合型自己組織化単層表面を有する物品であり、
この混合型自己組織化単層表面は、第一の単層部分及び第二の単層部分を含み、
第一の単層部分は、共有結合を形成する反応基を生じるチオラートを含み、及び
第二の単層部分は、不活性基を生じるチオラートを含む、物品。
【請求項２】
第一の単層部分の共有結合を形成する反応基が、マイケル（Michael）受容体である、請求項1記載の物品。
【請求項３】
マイケル受容体が、キノン、マレイミド、α-β不飽和ケトン、α-β不飽和アミド及びα-β不飽和エステルからなる群より選択される、請求項2記載の物品。
【請求項４】
マイケル受容体がマレイミドである、請求項3記載の物品。
【請求項５】
マレイミドが、下記式：
【化１】
2005509737.tif 000028
(式中、R1は、水素又は電子求引基である。)を有するマレイミドラジカルである、請求項4記載の物品。
【請求項６】
R1は、電子求引基である、請求項5記載の物品。
【請求項７】
電子求引基が、カルボン酸、エステル、アミド、カルバメート、ニトリル、ハロゲン化アシル及びイミダゾリドからなる群より選択されるカルボン酸誘導体である、請求項6記載の物品。
【請求項８】
第二の単層部分の不活性基が、生体分子の非-特異的吸着に抵抗する、請求項1記載の物品。
【請求項９】
不活性基が、ポリエチレングリコールである、請求項8記載の物品。
【請求項１０】
貨幣金属表面及び混合型自己組織化単層表面を有する物品であり、
この混合型自己組織化単層表面は、第一の単層部分及び第二の単層部分を含み、
第一の単層部分は、共有結合を形成する反応基を生じるチオラートを含み、及び
第二の単層部分は、不活性基を生じるチオラートを含み、
ここで、第一及び第二の単層部分は、第一の単層部分対第二の単層部分の予め定められた比で存在する、物品。
【請求項１１】
第一の単層部分が、表面上の第一及び第二の単層部分の合計の10モル％又は未満である、請求項10記載の物品。
【請求項１２】
第一の単層部分が、表面上の単層部分の合計の5モル％又は未満である、請求項11記載の物品。
【請求項１３】
第一の単層部分が、表面上の単層部分の合計の約0.01モル％〜約2モル％である、請求項12記載の物品。
【請求項１４】
貨幣金属表面領域及びその表面領域上のチオラートの混合型自己組織化単層を有する物品を製造する方法であり、
この方法が、貨幣金属表面を、共有結合を形成する反応基を生じる第一の単層を形成するジスルフィド部分及び不活性基を生じる第二の単層を形成するジスルフィド部分の混合物を含有する溶液と接触する接触工程を含み、この混合物は、不活性溶媒中にあり、
ここで、接触工程は、表面領域上にチオラートの混合型自己組織化単層を形成し、ここで第一の単層を形成するジスルフィド部分が、貨幣金属表面領域と反応し、共有結合形成する反応基を生じる第一の単層チオラート部分を形成し、並びに第二の単層を形成するジスルフィド部分が、貨幣金属表面領域と反応し、不活性基を生じる第二の単層チオラート部分を形成する、方法。
【請求項１５】
第一の単層を形成する部分のジスルフィド化合物が、対称であり、2個のマイケル受容体を有する、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
第一の単層を形成する部分のジスルフィド化合物が、非対称であり、及び1個のマイケル受容体を有する、請求項14記載の方法。
【請求項１７】
非対称ジスルフィド化合物が、下記式：
【化２】
2005509737.tif 000029
(式中、R1は、水素又は電子求引基であり、
R2は、飽和又は不飽和の、置換又は未置換のヒドロカルビルであり、
R3は、飽和又は不飽和の、置換又は未置換のヒドロカルビルであり、及び
Wは、親水性又は疎水性の置換基である。）を有する、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
R2及びR3は各々、線状であり、並びに硫黄原子に結合した第一のアルキルセグメント並びにこのアルキルセグメントに結合したポリアルコキシ、ポリペルフルオロアルキル、ポリ(ビニルアルコール)及びポリプロピレンスルホキシドからなる群より選択される第二のセグメントで形成される、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
第二のセグメントが、ポリアルコキシである、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
R2が、式：-(CH2)m-(O(CH2)n)o-NHC(O)-(CH2)pであり、ここで、mは10〜24の数であり、nは2であり、oは1〜10の数であり、及びpは1〜16の数である、請求項17記載の方法。
【請求項２１】
R3が、式：-(CH2)i-((CH2)j-O)k-であり、ここでiは10〜24の数であり、jは2であり、及びkは1〜10の数である、請求項17記載の方法。
【請求項２２】
Wが、ヒドロキシル、スルホネート、ヒドロキシ置換されたC1-C4アルキル及びメチルからなる群より選択される、請求項17記載の方法。
【請求項２３】
不活性基が、生体分子の非-特異的吸着に抵抗する親水性基である、請求項14記載の方法。
【請求項２４】
貨幣金属表面領域及びチオラートの混合型自己組織化単層を有する物品の製造方法であり、
この方法が、貨幣金属表面を、共有結合形成する反応基を生じる第一の単層を形成するジスルフィド部分、及び不活性基を生じる第二の単層を形成するジスルフィド部分の混合物を含有する溶液と接触する接触工程を含み、この混合物は、不活性溶媒中にあり、
ここで、この溶液は、第一及び第二の単層を形成するジスルフィド部分を、第一の単層を形成するジスルフィド部分対第二の単層を形成するジスルフィド部分の予め定められた比で含み、
ここで接触工程は、表面領域上にチオラートの混合型自己組織化単層を形成し、ここで第一の単層を形成するジスルフィド部分は、共有結合形成する反応基を生じる第一の単層チオラート部分を形成するために貨幣金属表面領域と反応し、並びに第二の単層を形成するジスルフィド部分は、不活性基を生じる第二の単層チオラート部分を形成するために貨幣金属表面領域と反応し、
ここで溶液中の第一及び第二の単層を形成するジスルフィド部分の予め定められた比が、貨幣金属表面領域上の第一及び第二の単層チオラート部分の比を決定する、方法。
【請求項２５】
混合型単層表面上に予め定められた密度で機能性有機分子を不動化する方法であり、この混合型単層表面は、共有結合形成する反応基を有する第一の単層部分及び不活性基を有する第二の単層部分を備え、
ここで第一の単層部分は、混合型単層表面に予め定められた密度で存在し、
この方法は、混合型単層表面を、機能性有機分子と接触する工程を含み、ここでこの接触工程は、機能性有機分子を不動化するために、機能性有機分子と第一の単層部分の共有結合形成する反応基の間に共有結合を形成し、並びに
ここで不動化された機能性有機分子の密度は、混合型単層表面中の第一の単層部分の密度により決定される、方法。
【請求項２６】
混合型単層表面上に予め定められた密度で機能性有機分子を不動化する方法であり、この混合型単層表面は、共有結合形成する反応基を有する第一の単層部分及び不活性基を有する第二の単層部分を含み、
ここで第一の単層部分は、混合型単層表面に予め定められた密度で存在し、
この方法は、混合型単層表面を、機能性有機分子と接触する工程を含み、
ここで接触工程は、機能性有機分子を不動化するために、機能性有機分子と第一の単層部分の共有結合形成する反応基の間に共有結合を形成し、並びに
ここで不動化された機能性有機分子の密度は、混合型単層表面中の第一の単層部分の密度により決定され、
ここで共有結合形成は、酵素反応を必要としない、方法。
【請求項２７】
混合型単層表面が、自己組織化単層である、請求項25記載の方法。
【請求項２８】
第一の単層部分の共有結合形成する反応基が、マイケル受容体である、請求項25記載の方法。
【請求項２９】
マイケル受容体が、キノン、マレイミド、α-β不飽和ケトン、α-β不飽和アミド及びα-β不飽和エステルからなる群より選択される、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
マイケル受容体がマレイミドである、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
マレイミドが、下記式：
【化３】
2005509737.tif 000030
(式中、R1は、水素又は電子求引基である。)を有するマレイミドラジカルである、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
R1が、電子求引基である、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
電子求引基が、カルボン酸、エステル、アミド、カルバメート、ニトリル、ハロゲン化アシル及びイミダゾリドからなる群より選択されるカルボン酸誘導体である、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
第二の単層部分の不活性基が、生体分子の非-特異的吸収に抵抗する、請求項25記載の方法。
【請求項３５】
不活性基が、ポリエチレングリコールである、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
機能性有機分子が、チオール基により官能基化され、及び接触工程が、機能性有機分子のチオール基の、マイケル受容体へのマイケル付加反応を含む、請求項28記載の方法。
【請求項３７】
機能性有機分子は、共役炭素-炭素二重結合により官能基化され、並びにここで接触工程は、マイケル受容体と共役炭素-炭素二重結合の間の付加環化反応を含む、請求項28記載の方法。
【請求項３８】
機能性有機分子は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、炭水化物、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、酵素、酵素基質、リガンド、受容体、抗体、抗原、脂質、及び小分子からなる群より選択される、請求項25記載の方法。
【請求項３９】
機能性有機分子は、炭水化物である、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
炭水化物は、還元末端を含み、この還元末端は、n-ペンテニル基を有する過アセチル化された糖質を含む、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
更に炭水化物を誘導体化し、その還元末端にn-ペンテニル基を有する過アセチル化された糖質を、チオールアセテート誘導糖に転換することを含む、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
チオールアセチル化された誘導糖が、酸素不存在条件下でケン化され、中和工程の後、還元末端にチオール基を含む脱保護された炭水化物を生じる、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
タンパク質を、予め定められた密度で混合型単層表面上に不動化する方法であり、ここでタンパク質は、反応基及びタンパク質を含む融合タンパク質であり、
この方法は、混合型単層表面を、二官能性アフィニティータグ及び融合タンパク質と接触する工程を含み、
混合型単層表面は、共有結合形成する反応基を有する第一の単層部分及び不活性基を有する第二の単層部分を含み、
ここで第一の単層部分は、混合型単層表面に予め定められた密度で存在し、
ここで二官能性アフィニティータグは、第一の反応基及び第二の反応基を含み、この第一の反応基は、第一の単層部分の共有結合形成する反応基と反応するための共有結合形成する反応パートナーを含み、及び第二の反応基は、融合タンパク質の反応基と反応するための反応パートナーを含み、
ここで接触工程は、二官能性アフィニティータグを不動化するために、二官能性アフィニティータグの第一の反応基と第一の単層部分の共有結合形成する反応基の間に共有結合を形成し、並びに
ここで接触工程は、融合タンパク質を不動化するために、二官能性アフィニティータグの反応基と融合タンパク質の反応基の間に会合を形成し、並びに
ここで、不動化された融合タンパク質の密度は、混合型単層表面における第一の単層部分の密度により決定される、方法。
【請求項４４】
混合型単層表面が、自己組織化単層である、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
融合タンパク質の反応基が、ヒスチジンを含み、及びここで二官能性アフィニティータグの第二の反応基が、金属イオンであり、及びここで会合が、イオン性会合である、請求項43記載の方法。
【請求項４６】
融合タンパク質の反応基が、抗体であり、及びここで二官能性アフィニティータグの第二の反応基が、その抗体の抗原標的であり、及びここで会合が、抗体-抗原会合である、請求項43記載の方法。
【請求項４７】
融合タンパク質の反応基が、ビオチン分子であり、及びここで二官能性アフィニティータグの第二の反応基は、アビジン又はストレプトアビジンである、請求項43記載の方法。
【請求項４８】
混合型単層表面上に予め定められた密度でタンパク質を不動化する方法であり、ここでタンパク質は、共有結合形成する反応基及びタンパク質を含む融合タンパク質であり、
この方法は、混合型単層表面を、二官能性アフィニティータグ及び融合タンパク質と接触する工程を含み、
混合型単層表面は、共有結合形成する反応基を有する第一の単層部分及び不活性基を有する第二の単層部分を含み、
ここで第一の単層部分は、混合型単層表面に予め定められた密度で存在し、
ここで二官能性アフィニティータグは、第一の反応基及び第二の反応基を含み、第一の反応基は、第一の単層部分の共有結合形成する反応基と反応するための共有結合形成する反応パートナーを含み、及び第二の反応基は、融合タンパク質の反応基と反応するための反応パートナーを含み、
ここで接触工程は、二官能性アフィニティータグを不動化するために、二官能性アフィニティータグの第一の反応基と第一の単層部分の共有結合形成する反応基の間に共有結合を形成し、及び
ここで接触工程は、融合タンパク質を共有的に不動化するために、二官能性アフィニティータグの第二の反応基と融合タンパク質の反応基の間に共有結合を形成し、及び
ここで不動化された融合タンパク質の密度は、混合型単層表面中の第一の単層部分の密度により決定される、方法。
【請求項４９】
融合タンパク質の共有結合形成する基が、クテナーゼであり、ここで二官能性アフィニティータグの第一の反応基は、チオールであり、ここで二官能性アフィニティータグの第二の反応基は、p-ニトロフェノールリン酸である、請求項48記載の方法。
【請求項５０】
混合型単層表面上に予め定められた密度で機能性有機分子を不動化する方法であり、
混合型単層表面は、スイッチ可能な共有結合形成する反応基を有する第一の単層部分及び不活性基を有する第二の単層部分を含み、
ここでスイッチ可能な共有結合形成する反応基は、反応性状態及び非反応性状態を有し、ここで活性化シグナルは、非反応性状態を活性状態へと転換し、スイッチ可能な共有結合形成する反応基をスイッチオンし、ここで鎮静化シグナルは、反応性状態を非反応性状態へと転換し、スイッチ可能な共有結合形成する反応基をスイッチオフし、
この方法は、混合型単層表面を、機能性有機分子と接触する工程を含み、ここで接触工程は、活性化シグナルを提供し、機能性有機分子を不動化するために第一の単層部分の共有結合形成する反応基及び機能性有機分子の間に共有結合を形成することができるように、スイッチ可能な共有結合形成する反応基をスイッチオンすることを含み、
共有結合形成が一定時間発生することができ、
この一定時間の後、スイッチ可能な共有結合形成する反応基をスイッチオフするために、鎮静化シグナルを提供し、
この一定時間が、混合型単層表面上の不動化された機能性有機分子の密度を決定する、方法。
【請求項５１】
共有結合形成は、酵素反応を必要としない、請求項50記載の方法。
【請求項５２】
混合型単層表面は、自己組織化単層である、請求項50記載の方法。
【請求項５３】
第一の単層部分の共有結合形成する反応基は、マイケル受容体である、請求項50記載の方法。
【請求項５４】
マイケル受容体は、キノン、マレイミド、α-β不飽和ケトン、α-β不飽和アミド及びα-β不飽和エステルからなる群より選択される、請求項53記載の方法。
【請求項５５】
マイケル受容体がマレイミドである、請求項54記載の方法。
【請求項５６】
マレイミドが、下記式：
【化４】
2005509737.tif 000031
(式中、R1は、水素又は電子求引基である。)を有するマレイミドラジカルである、請求項55記載の方法。
【請求項５７】
R1は、電子求引基である、請求項56記載の方法。
【請求項５８】
電子求引基は、カルボン酸、エステル、アミド、カルバメート、ニトリル、ハロゲン化アシル及びイミダゾリドからなる群より選択されるカルボン酸誘導体である、請求項57記載の方法。
【請求項５９】
第二の単層部分の不活性基は、生体分子の非-特異的タンパク質吸収に抵抗する、請求項50記載の方法。
【請求項６０】
不活性基が、ポリエチレングリコールである、請求項59記載の方法。
【請求項６１】
機能性有機分子が、チオール基により官能基化され、及び接触工程が、機能性有機分子のチオール基のマイケル受容体へのマイケル付加反応を含む、請求項53記載の方法。
【請求項６２】
機能性有機分子が、共役炭素-炭素二重結合により官能基化され、ここでこの接触工程は、マイケル受容体と共役炭素-炭素二重結合の間の付加環化反応を含む、請求項53記載の方法。
【請求項６３】
機能性有機分子が、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、炭水化物、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、酵素、酵素基質、リガンド、受容体、抗体、抗原、脂質、及び小分子からなる群より選択される、請求項50記載の方法。
【請求項６４】
機能性有機分子が、炭水化物である、請求項63記載の方法。
【請求項６５】
炭水化物は、還元末端を含み、この還元末端は、n-ペンテニル基を有する過アセチル化された糖質を含む、請求項64記載の方法。
【請求項６６】
更に、炭水化物を誘導体化し、その還元末端にn-ペンテニル基を有する過アセチル化された糖質を、チオールアセテート誘導糖に転換することを含む、請求項65記載の方法。
【請求項６７】
チオールアセチル化された誘導糖が、酸素非存在条件下でケン化され、中和工程の後、還元末端にチオール基を含む脱保護された炭水化物を生じる、請求項66記載の方法。
【請求項６８】
活性化及び鎮静化シグナルが、電気インパルス、pHの変化、及び露光からなる群より選択される、請求項50記載の方法。
【請求項６９】
混合型単層表面上の共有結合形成する反応基の密度を測定する方法であり、
混合型単層表面は、検出可能なシグナルを提供するための電気的活性化合物及び共有結合形成する反応基を含む第一の単層部分、並びに不活性基を有する第二の単層部分を含み、
この方法は、検出可能なシグナルを測定することを含み、並びに
シグナルの測定値を、第一の単層部分の密度に相関し、並びに第一の単層部分の密度を、共有結合形成する反応基の密度と相関することを含む、方法。
【請求項７０】
電気的活性化合物は、チオール基を含む置換基を伴うシクロペンタジエニル環を有するビスシクロペンタジエニルメタロセンである、請求項69記載の方法。
【請求項７１】
電気的活性化合物は、フェロセン-2-カルボン酸(2-メルカプト-エチル)-アミドである、請求項70記載の方法。
【請求項７２】
混合型単層表面上の不動化された機能性有機分子の密度を測定する方法であり、
混合型単層表面は、検出可能なシグナルを提供するための電気的活性化合物及び共有結合形成する反応基(reactive)を含む第一の単層部分、並びに不活性基を含む第二の単層部分を含み、
ここで共有結合形成する反応基は、機能性有機分子と反応し、共有結合を形成し、混合型単層表面上に機能性有機分子を不動化し、
この方法は、検出可能なシグナルを測定すること、及び
検出可能なシグナルの測定値を、第一の単層部分の密度と相関すること、及び
第一の単層部分の密度を、不動化した機能性有機分子の密度と相関することを含む、方法。
【請求項７３】
電気的活性化合物が、チオール基を含む置換基を伴うシクロペンタジエニル環を有する、ビスシクロペンタジエニルメタロセンである、請求項72記載の方法。
【請求項７４】
電気的活性化合物が、フェロセン-2-カルボン酸(2-メルカプト-エチル)-アミドである、請求項73記載の方法。
【請求項７５】
検出可能なシグナルの測定が、サイクリックボルタンメトリーによる、請求項69記載の方法。
【請求項７６】
検出可能なシグナルの測定が、サイクリックボルタンメトリーによる、請求項70記載の方法。
【請求項７７】
機能性有機分子を混合型単層表面上に不動化する方法であり、混合型単層表面を機能性有機分子と接触する工程を含み、
混合型単層表面は、共有結合形成する反応基を有する第一の単層部分及び不活性基を有する第二の単層部分を含み、
ここで接触工程は、機能性有機分子と第一の単層部分の共有結合形成する反応基の間に共有結合を形成し、機能性有機分子を不動化する、方法。
【請求項７８】
混合型単層表面上の機能性有機分子を不動化する方法であり、混合型単層表面を機能性有機分子と接触する工程を含み、
混合型単層表面は、共有結合形成する反応基を有する第一の単層部分及び不活性基を有する第二の単層部分を含み、
ここで接触工程は、機能性有機分子と第一の単層部分の共有結合形成する反応基の間に共有結合を形成し、機能性有機分子を不動化し、及び
この共有結合形成は、酵素反応を必要としない、方法。
【請求項７９】
混合型単層表面は、第一の単層部分の第二の単層部分に対する予め定められた比を含む、請求項77記載の方法。
【請求項８０】
混合型単層表面が、自己組織化単層である、請求項77記載の方法。
【請求項８１】
第一の単層部分の共有結合形成する反応基は、マイケル受容体である、請求項77記載の方法。
【請求項８２】
マイケル受容体が、キノン、マレイミド、α-β不飽和ケトン、α-β不飽和アミド及びα-β不飽和エステルからなる群より選択される、請求項81記載の方法。
【請求項８３】
マイケル受容体が、マレイミドである、請求項82記載の方法。
【請求項８４】
マレイミドが、下記式：
【化５】
2005509737.tif 000032
(式中、R1は、水素又は電子求引基である。)を有するマレイミドラジカルである、請求項83記載の方法。
【請求項８５】
R1は、電子求引基である、請求項84記載の方法。
【請求項８６】
電子求引基は、カルボン酸、エステル、アミド、カルバメート、ニトリル、ハロゲン化アシル及びイミダゾリドからなる群より選択されるカルボン酸誘導体である、請求項85記載の方法。
【請求項８７】
機能性有機分子は、チオール基により官能基化され、及び接触工程は、機能性有機分子のチオール基のマイケル受容体へのマイケル付加反応を含む、請求項81記載の方法。
【請求項８８】
機能性有機分子が、共役炭素-炭素二重結合により官能基化され、及びここで接触工程は、マイケル受容体と共役炭素-炭素二重結合の間の付加環化反応を含む、請求項81記載の方法。
【請求項８９】
機能性有機分子は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、炭水化物、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、酵素、酵素基質、リガンド、受容体、抗体、抗原、脂質、及び小分子からなる群より選択される、請求項77記載の方法。
【請求項９０】
機能性有機分子は、炭水化物である、請求項89記載の方法。
【請求項９１】
炭水化物は、還元末端を含み、この還元末端は、n-ペンテニル基を有する過アセチル化された糖質を含む、請求項90記載の方法。
【請求項９２】
更に炭水化物を誘導体化し、還元末端にn-ペンテニル基を有する過アセチル化された糖質を、チオールアセテート誘導糖に転換することを含む、請求項91記載の方法。
【請求項９３】
チオールアセチル化された誘導糖が、酸素非存在条件下でケン化され、中和工程後に、還元末端にチオール基を含む脱保護された炭水化物を得る、請求項92記載の方法。
【請求項９４】
第二の単層部分の不活性基が、生体分子の非-特異的吸着に抵抗する、請求項77記載の方法。
【請求項９５】
不活性基がポリエチレングリコールである、請求項94記載の方法。
【請求項９６】
混合型単層表面上にタンパク質を不動化する方法であり、ここでタンパク質は、反応基及びタンパク質を含む融合タンパク質であり、
この方法は、混合型単層表面の二官能性アフィニティータグ及び融合タンパク質との接触工程を含み、
混合型単層表面は、共有結合形成する反応基を有する第一の単層部分及び不活性基を有する第二の単層部分を含み、
ここで二官能性アフィニティータグは、第一の反応基及び第二の反応基を含み、第一の反応基は、第一の単層部分の共有結合形成する反応基と反応するための共有結合形成する反応パートナーを含み、及び第二の反応基は、融合タンパク質の反応基と反応するための反応パートナーを含み、
ここで接触工程は、二官能性アフィニティータグの第一の反応基と第一の単層部分の共有結合形成する反応基の間に共有結合を形成し、二官能性アフィニティータグを不動化し、並びに
接触工程は、二官能性アフィニティータグの第二の反応基と融合タンパク質の反応基の間に会合を形成し、融合タンパク質を不動化する、方法。
【請求項９７】
混合型単層表面は、第一の単層部分の第二の単層部分に対する予め定められた比を含む、請求項96記載の方法。
【請求項９８】
混合型単層表面は、自己組織化単層である、請求項96記載の方法。
【請求項９９】
融合タンパク質の反応基は、ヒスチジンを含み、及びここで二官能性アフィニティータグの第二の反応基は、金属イオンであり、会合はイオン性会合である、請求項96記載の方法。
【請求項１００】
融合タンパク質の反応基は、抗体であり、及びここで二官能性アフィニティータグの第二の反応基は、その抗体の抗原標的であり、ここで会合は、抗体-抗原会合である、請求項96記載の方法。
【請求項１０１】
融合タンパク質の反応基は、ビオチン分子であり、及びここで二官能性アフィニティータグの第二の反応基は、アビジン又はストレプトアビジンである、請求項100記載の方法。
【請求項１０２】
混合型単層表面上のタンパク質を不動化する方法であり、ここでタンパク質は、共有結合形成する基及びタンパク質を含む融合タンパク質であり、
この方法は、混合型単層表面を二官能性アフィニティータグ及び融合タンパク質と接触する工程を含み、
混合型単層表面は、共有結合形成する反応基を有する第一の単層部分及び不活性基を有する第二の単層部分を含み、
ここで二官能性アフィニティータグは、第一の反応基及び第二の反応基を含み、第一の反応基は、第一の単層部分の共有結合形成する反応基と反応するための共有結合形成する反応パートナーを含み、及び第二の反応基は、融合タンパク質の共有結合形成する基と反応するための共有結合形成する反応パートナーを含み、
ここで接触工程は、二官能性アフィニティータグを不動化するために、二官能性アフィニティータグの第一の反応基と第一の単層部分の共有結合形成する反応基の間に共有結合を形成し、及び
ここで接触工程は、融合タンパク質を不動化するために、二官能性アフィニティータグの第二の反応基と融合タンパク質の共有結合形成する基の間に共有結合を形成する、方法。
【請求項１０３】
融合タンパク質の共有結合形成する基が、クテナーゼであり、並びにここで二官能性アフィニティータグの第一の反応基はチオールであり、及びここで二官能性アフィニティータグの第二の反応基は、p-ニトロフェノールリン酸である、請求項102記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、特許仮出願第60/315,261号(2001年8月27日出願)；第60/315,544号(2001年8月28日出願)；第60/358,412号(2002年2月15日出願)；第60/356,765号(2002年2月15日出願)；第60/357,136号(2002年2月19日出願)；第60/375,023号(2002年2月20日出願)；及び、第60/380,259号(2002年4月26日出願)に基づく優先権を主張する。
【０００２】
発明の技術分野
本発明は、一般に生体分子を単層を有する商品上に不動化することに関する。本発明は、商品、この商品の製造法、不動化された生体分子の密度の制御法、及びこの密度を特徴決定する方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、炭水化物、脂質及び細胞のような生物学的物質を、表面上に不動化することには、このような表面結合した物質の可能性のある適用のために非常に興味深い。例えばこれらの物質は、医学及び薬学研究のための診断用装置及び機器において有用であることができる。従ってタンパク質のような物質を表面上に不動化する様々な技術が研究されている。Blawas, A.S.；Reichert「Protein Patterning」、Biomaterials、19:595-609 (1998)の表1及び引用された参考文献を参照のこと。
【０００４】
タンパク質は疎水性表面上に吸着し、及びこの現象は、ガラススライド上での試験のためのタンパク質の不動化に使用される。しかしこの吸着は、タンパク質は溶液と接触する場合に表面から漏出する傾向があるので、十分に安定ではないことがある。同じく、吸着によりタンパク質を選択的に配置し及び配向することが困難であることがあり、吸着は部分的変性を引き起こすことがある。
【０００５】
別の試験された非-共有的不動化法は、ビオチン化された分子を不動化するための、ビオチン及びストレプトアビジンの間の密な結合相互作用を使用する。例えば、Blawas, A.S.；Olivier, T.F.；Pirrung, M.C.；Reichert, W.M.、Langmuir、14:4243-4250 (1998)参照。しかし、ストレプトアビジンの大きいサイズ及びそのビオチンとの複数の結合部位は、規定不良の(ill-defined)リガンド組成を有する表面を生じることがある。
【０００６】
公知の共有的不動化法は、選択性の問題もあることがある。関心のある分子と固相支持体の間の結合の高度の選択性は、結合はこの分子を不動化するのみではなく、周囲の環境に関してこれを配向するので重要である。タンパク質の適切な配向は、結合部位が、表面に面さないが、そこで結合パートナーと反応することができる周囲環境に対して提示されることを確実にする。適切な配向を生じる方法によるタンパク質の不動化は、不動化されたタンパク質に対する結合事象を検出するようにデザインされたアッセイ感度を増大するであろう。
【０００７】
ある種の公知の共有的不動化技術は、関心のある分子、又はリンカー分子の、ポリマー基板との反応が関連している。例えばペプチド、ポリペプチド及びタンパク質は、セルロース中の高密度ヒドロキシル基の利点により、セルロースフィルターペーパー上に不動化することができる。しかしセルロースは、多くの化学的に個別の反応部位を有し、そのためこの支持体それ自身は、特異的配向でのポリペプチド又はタンパク質の不動化のための、理想的基板ではないことがある。
【０００８】
ポリペプチドのアミン末端の、表面上の活性化された表面-結合したカルボン酸誘導体との反応による、ポリペプチドのポリマーへの共有的結合も知られている。例えば、米国特許第5,602,207号参照。多くの共通のアミノ酸は、活性化されたカルボン酸と反応することが可能な側鎖、例えばセリン、トレオニン及びリシンなどを有するので、この方法によるポリペプチドの不動化は、高度に選択性ではないことがある。同じく過フッ素化されたアリールアジド由来のニトレンのC-H結合挿入によりポリマー表面を修飾する方法を説明している、米国特許第5,580,697号も参照のこと。
【０００９】
自己組織化単層(SAM)技術は、別の型の不動化プラットホームとして研究されている。自己組織化単層を用いC-末端でペプチド及びポリペプチドを不動化するひとつの方法は、ガラス基板に結合したアミン-末端のシロキサンを使用する。この不動化法は、米国特許第5,744,305号に開示されている。この方法において、例えば、3-アミノプロピル-トリエトキシシランによる透明ガラススライドの処理は、周囲環境へアミン基を提示しているガラス表面上にシラノール-アミン単層を形成する。ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質上のカルボン酸基は、そのような表面へアミド連結を形成することができる。この方法は、ポリペプチド上の豊富なカルボン酸基のために、選択性の問題に悩まされることがある。
【００１０】
Macbeath, G.ら(J. Am. Chem. Soc.、121:7967-7968 (1999))は更に、小分子リガンドとタンパク質の間の結合事象を検出する方法を説明している。それらの方法において、小分子、チオール-誘導されたリガンドは、3工程でガラススライド上に不動化される。第一の工程において、ガラススライドは、スライドの片面の3-アミノプロピル-トリエトキシシランによるシラン化により誘導体化された。第二の工程において、このシラン化された表面は、N-スクシンイミジル-3-マレイミド-プロピオン酸エステルにより処理され、このスライドの表面全体がマレイミド基により密に官能基化される。工程1及び2を以下に示す。
【化１】
2005509737.tif 000003
【００１１】
第三の工程において、チオール-官能基化されたリガンドは、ロボット型マイクロアレイヤーを用い、その表面上に200〜250μmスポットで付着され、この時点でマレイミド基にマイケル付加が行われる。その後残余の表面を、チオエタノールで洗浄することにより、チオール残基との反応をブロックする。このスライドは、小分子リガンドの蛍光標識したタンパク質複合体で処理した。蛍光検出は、タンパク質が、その不動化された小分子複合体のスポットにのみ結合したことを明らかにした。このSchreiberらの不動化法は、小分子リガンドを不動化するためのガラススライドを調製するための2工程を必要とし、マレイミド基で密に官能基化された表面を作成する。同じくNeutrAvidinの不動化を明らかにしている、Rowe, C.A.らの論文(Anal. Chem.、1:3846-3852 (1999))も参照のこと。
【００１２】
米国特許第5,077,210号は、ガラスのような、表面ヒドロキシル基を有するシラン化された基板上にタンパク質のような活性物質を不動化する方法を開示している。この特許は、タンパク質を、3工程において遊離のアミノ基を介して不動化する方法を開示している。ガラス基板は、チオール-末端基としたアルキルシロキサンによりシラン化され、その結果チオール基は環境に曝される。チオール基は、その後チオール反応基及びアミノ反応基を有するヘテロ二官能性基化合物と反応される。第三の工程において、不動化されたアミン反応基は、活性物質又はタンパク質の遊離アミンと反応される。
【００１３】
加えて、ヒス-タグ付きタンパク質は、ヒスチジンのイミダゾール環を介してニッケル金属キレート錯体及びイオウを介して表面にチオール結合したカルボキシル基を形成することにより、平坦な金表面上に不動化される。Sigal G.B.ら、Anal. Chem、68:490-97 (1996)参照。下記式のチオールは：
【化２】
2005509737.tif 000004
ガラススライドを、エタノールを溶媒とするリンカー分子を含有する溶液中に含浸することにより、金被覆されたガラススライドの上に不動化された。この表面上のリンカー分子の密度は、溶液中に別のトリエチレングリコール末端基としたチオール(HS-(CH2)11-(OCH2CH2)3-OH)を提供することにより調節された。
【００１４】
Wilnerらは、連続方式で表面に結合した個別の分子上のチオール及びマレイミド基の分離を明らかにしている。Wilner, I.ら、J. Am. Chem. Soc.、121:6455-6468 (1999)。Wilnerらは、電気的活性タンパク質で被覆されている金電極の電気化学的挙動を調べた。システアミン(-SCH2-CH2NH2)で電極を被覆するために、システアミン溶液中に電極を最初に含浸することにより、タンパク質を金電極に結合した。これらのシステアミンは、その後、ヘテロ二官能性リンカーN-スクシンイミジル-3-マレイミドプロピオン酸エステルと反応し、マレイミド-修飾された表面を生じた。この2工程を以下に示す。
【化３】
2005509737.tif 000005
マレイミド表面に結合したタンパク質の量は、比色アッセイにより特徴付け、推定表面被覆4.8x10-11mol/cm2を得た。チオラートの密にパックされた単層の形成は、一般に隣接分子間に、システアミンのエチル基により提供されるものよりも、より広範なVan der Waals接触を必要とする。
【００１５】
線状アルカンチオラートの金表面への吸着に関する研究は、自己組織化単層は、吸着されたチオラート分子の核から発生する傾向があることを明らかにした。アルキル鎖間のVan der Waals相互作用は、単層を安定化し、及び密なパッキングを促進する。Ulman, A.、Introduction to Thin Organic Films: From Langmuir-Blodgett to Self-Assembly (Academic Press社、ボストン、1991)。これらの理由のために、表面の被覆に使用した溶液中のチオール濃度の低下は、それ相応に低い密度のチオラートの単層で均一に被覆された表面の作成を無効にするであろう。
【００１６】
いくつかの研究においてわざと、非-特異的吸着がタンパク質の不動化に使用されるが(Blawas A.S.ら、Langmuir、14:4243-4250 (1998))、表面上へのパターンでタンパク質を不動化するために共有的不動化技術が使用される場合には、非-特異的タンパク質吸着は問題が多いことがある。これはアッセイ感度を低下することができる。更に、表面結合したタンパク質が細胞の表面への結合に使用される場合、非-特異的タンパク質結合は、細胞のその表面への無作為な接着を引き起こすことがある。Blawas, A.S.；Reichert、「Protein Patterning」、Biomaterials、19:595-609 (1998)。
【００１７】
ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、細胞などの非-特異的吸着に抵抗する別の方法は、自己組織化を促進するための近位の線状アルキルセグメント及び生物物質の非-特異的吸着に抵抗するための遠位ポリエチレングリコール(ポリエトキシ)セグメントを有するチオールの使用に関連する。Singhvi R.ら、「Engineering Cell Shape and Function」、Science、264:696-698 (1994)。
【００１８】
米国特許第5,843,650号は、被験試料中の標的核酸を増幅する方法を開示している。この方法において、オリゴヌクレオチドプローブの対が使用される。このプローブ対が標的ポリヌクレオチドへハイブリダイズされる場合は、このプローブ上の化学官能基が、プローブと共に結合するように反応する。この特許は、プローブと共に結合するように使用することができると同時に、標的へハイブリダイズする官能基は、チオール及びマレイミドのような、求核／求電子対、及びディールスアルダー反応対を含むことを開示している。
国際公開公報第98/30575号は、巨大分子が他の分子実体に複合する方法として、ディールスアルダー反応を開示している。
【発明の開示】
【００１９】
発明の概要
本発明は、貨幣金属表面及び貨幣金属表面の少なくとも一部を被覆する混合型自己組織化単層表面を有する商品を提供し、この混合型自己組織化単層表面は、第一の単層部分及び第二の単層部分を含み、第一の単層部分は、共有結合形成する反応基を生じるチオラートを含み、並びに第二の単層部分は不活性基を生じるチオラートを含む。
【００２０】
第一の単層部分の共有結合を形成する反応基は、マイケル受容体であることができる。好ましいマイケル受容体は、キノン、マレイミド、α-β不飽和ケトン、α-β不飽和アミド及びα-β不飽和エステルを含む。このマレイミドは、下記式を有するドラジカルであることができる：
【化４】
2005509737.tif 000006
(式中、R1は、水素又は電子求引基である。)。
【００２１】
この電子求引基は、カルボン酸、エステル、アミド、カルバメート、ニトリル、ハロゲン化アシル及びイミダゾリドからなる群より選択されるカルボン酸誘導体であることができる。
第二の単層部分の不活性基は、ポリエチレングリコールのような、生体分子の非-特異的吸着に抵抗する。
【００２２】
この商品は、第一及び第二の単層部分を有し、予め定められた第一の単層部分対第二の単層部分の比で存在することができる。例えば、第一の単層部分は、表面上の第一及び第二の単層部分の合計の10モル％又は未満である。別の態様においては、第一の単層部分は、表面上の総単層部分の5モル％又は未満である。更に別の態様においては、第一の単層部分は、表面上の総単層部分の約0.01モル％〜約2モル％である。
【００２３】
本発明は、貨幣金属表面領域及びこの表面領域上のチオラートの混合型自己組織化単層を有する商品を製造する方法も提供し、この方法は、貨幣金属表面を、共有結合を形成する反応基を生じる第一の単層を形成するジスルフィド部分及び不活性基を生じる第二の単層を形成するジスルフィド部分の混合物を含有する溶液と接触する工程を含み、この混合物は、不活性溶媒中にあり、ここでこの接触工程は、表面領域上にチオラートの混合型自己組織化単層を形成し、ここで第一の単層を形成するジスルフィド部分は、貨幣金属表面領域と反応し、共有結合形成する反応基を生じる第一の単層チオラート部分を形成し、並びに第二の単層を形成するジスルフィド部分は、貨幣金属表面領域と反応し、不活性基を生じる第二の単層チオラート部分を形成する。
【００２４】
非対称ジスルフィド化合物は、下記式を有することが好ましい：
【化５】
2005509737.tif 000007
(式中、R1は、水素又は電子求引基であり、R2は、飽和又は不飽和の、置換又は未置換のヒドロカルビルであり、R3は、飽和又は不飽和の、置換又は未置換のヒドロカルビルであり、及びWは、親水性又は疎水性の置換基である。）。
別の態様において、R2及びR3は各々、線状であり、並びに硫黄原子に結合した第一のアルキルセグメント、並びにこのアルキルセグメントに結合したポリアルコキシ、ポリペルフルオロアルキル、ポリ(ビニルアルコール)及びポリプロピレンスルホキシドからなる群より選択される第二のセグメントで形成される。R2は、式：-(CH2)m-(O(CH2)n)o-NHC(O)-(CH2)pであって良く、ここでmは10〜24の数であり、nは2であり、oは1〜10の数であり、及びpは1〜16の数である。R3は、式：-(CH2)i-((CH2)j-O)k-であって良く、ここでiは10〜24の数であり、jは2であり、及びkは1〜10の数である。Wは、ヒドロキシル、スルホネート、ヒドロキシ置換されたC1-C4アルキル又はメチルであることができる。
【００２５】
別の態様において、貨幣金属表面領域及びチオラートの混合型自己組織化単層を有する商品を製造する方法があり、この方法は、貨幣金属表面を、共有結合形成する反応基を生じる第一の単層を形成するジスルフィド部分、及び不活性基を生じる第二の単層を形成するジスルフィド部分の混合物を含有する溶液と接触する接触工程を含み、この混合物は、不活性溶媒中にあり、ここで溶液は、第一及び第二の単層を形成するジスルフィド部分を、予め定められた第一の単層を形成するジスルフィド部分対第二の単層を形成するジスルフィド部分の比で含み、ここで接触工程は、表面領域上にチオラートの混合型自己組織化単層を形成し、ここで第一の単層を形成するジスルフィド部分は、貨幣金属表面領域と反応し、共有結合形成する反応基を生じる第一の単層チオラート部分を形成し、並びに第二の単層を形成するジスルフィド部分は、貨幣金属表面領域と反応し、不活性基を生じる第二の単層チオラート部分を形成し、ここで溶液中の第一及び第二の単層を形成するジスルフィド部分の予め定められた比は、貨幣金属表面領域上の第一及び第二の単層チオラート部分の比を決定する。
【００２６】
本発明は、混合型単層表面上に予め定められた密度で機能性有機分子を不動化する方法も提供し、この混合型単層表面は、共有結合形成する反応基を有する第一の単層部分及び不活性基を有する第二の単層部分を含み、ここで第一の単層部分は、混合型単層表面に予め定められた密度で存在し、この方法は、混合型単層表面を、機能性有機分子と接触する工程を含み、ここでこの接触工程は、機能性有機分子を不動化するために、機能性有機分子と第一の単層部分の共有結合形成する反応基の間に共有結合を形成し、並びにここで不動化された機能性有機分子の密度は、混合型単層表面中の第一の単層部分の密度により決定される。別の態様において、この共有結合形成は、酵素反応を必要としない。
【００２７】
別の態様において、タンパク質を予め定められた密度で混合型単層表面上に不動化する方法が提供され、ここでタンパク質は、反応基及びタンパク質を含む融合タンパク質であり、この方法は、混合型単層表面を、二官能性アフィニティータグ及び融合タンパク質と接触する工程を含み、この混合型単層表面は、共有結合形成する反応基を有する第一の単層部分及び不活性基を有する第二の単層部分を含み、ここで第一の単層部分は、混合型単層表面に予め定められた密度で存在し、ここで二官能性アフィニティータグは、第一の反応基及び第二の反応基を含み、第一の反応基は、第一の単層部分の共有結合形成する反応基と反応するように共有結合形成する反応パートナーを含み、及び第二の反応基は、融合タンパク質の反応基と反応する反応パートナーを含み；ここでこの接触工程は、二官能性アフィニティータグを不動化するために、二官能性アフィニティータグの第一の反応基と第一の単層部分の共有結合形成する反応基の間に共有結合を形成し、並びにここで接触工程は、融合タンパク質を不動化するために、二官能性アフィニティータグの反応基と融合タンパク質の反応基の間に会合を形成し、並びにここで、不動化された融合タンパク質の密度は、混合型単層表面における第一の単層部分の密度により決定される。
【００２８】
本発明は、混合型単層表面上に予め定められた密度でタンパク質を不動化するための方法も提供し、ここでタンパク質は、共有結合形成する反応基及びタンパク質を含む融合タンパク質であり、この方法は、混合型単層表面を、二官能性アフィニティータグ及び融合タンパク質と接触する工程を含み、この型単層表面は、共有結合形成する反応基を有する第一の単層部分及び不活性基を有する第二の単層部分を含み、ここで第一の単層部分は、混合型単層表面に予め定められた密度で存在し、ここで二官能性アフィニティータグは、第一の反応基及び第二の反応基を含み、第一の反応基は、第一の単層部分の共有結合形成する反応基と反応するための共有結合形成する反応パートナーを含み、及び第二の反応基は、融合タンパク質の反応基と反応するための反応パートナーを含み、ここで接触工程は、二官能性アフィニティータグを不動化するために、二官能性アフィニティータグの第一の反応基と第一の単層部分の共有結合形成する反応基の間に共有結合を形成し、並びにここで接触工程は、融合タンパク質を共有的に不動化するために、二官能性アフィニティータグの第二の反応基と融合タンパク質の反応基の間に共有結合を形成し、並びにここで不動化された融合タンパク質の密度は、混合型単層表面中の第一の単層部分の密度により決定される。
【００２９】
好ましくは、この融合タンパク質の共有結合形成する基はクテナーゼ(cutenase)であり、ここで二官能性アフィニティータグの第一の反応基はチオールであり、及びここで二官能性アフィニティータグの第二の反応基はp-ニトロフェノールリン酸である。
【００３０】
別の本発明の態様は、混合型単層表面上に予め定められた密度で機能性有機分子を不動化する方法を提供し、この混合型単層表面は、スイッチ可能な共有結合形成する反応基を有する第一の単層部分及び不活性基を有する第二の単層部分を含み、ここでスイッチ可能な共有結合形成する反応基は、反応性状態及び非反応性状態を有し、ここで活性化シグナルは、非反応性状態を活性状態へと転換し、スイッチ可能な共有結合形成する反応基をスイッチオンし、ここで鎮静化シグナルは、反応性状態を非反応性状態へと転換し、スイッチ可能な共有結合形成する反応基をスイッチオフし、この方法は、混合型単層表面を、機能性有機分子と接触する工程を含み、ここでこの接触工程は、活性化シグナルを提供し、機能性有機分子を不動化するために第一の単層部分の共有結合形成する反応基と機能性有機分子の間に共有結合を形成することができるように、スイッチ可能な共有結合形成する反応基をスイッチオンし、共有結合形成が一定時間発生することができるようにし、この一定時間の後、スイッチ可能な共有結合形成する反応基をスイッチオフするために、鎮静化シグナルを提供することを含み、この一定時間が、混合型単層表面上の不動化された機能性有機分子の密度を決定する。
【００３１】
機能性有機分子が、炭水化物である場合、これは好ましくは還元末端を含み、この還元末端は、n-ペンテニル基を有する過アセチル化された糖質を含む。この炭水化物は、その還元末端にn-ペンテニル基を有する過アセチル化された糖質を、チオールアセテート誘導糖に転換するように誘導体化することができる。このチオールアセチル化された誘導糖は、酸素非存在条件下でケン化され、中和工程の後、還元末端にチオール基を含む脱保護された炭水化物を生じる。
活性化及び鎮静化シグナルは、電気インパルス、pHの変化、及び露光からなる群より選択される。
【００３２】
本発明は、混合型単層表面上の共有結合形成する反応基の密度を測定する方法も提供する。この混合型単層表面は、検出可能なシグナルを提供するための電気的活性化合物及び共有結合形成する反応基を含む第一の単層部分、並びに不活性基を有する第二の単層部分を含み、この方法は、検出可能なシグナルを測定すること、及びシグナル測定値を、第一の単層部分の密度に相関すること、及び第一の単層部分の密度を、共有結合形成する反応基の密度と相関することを含む。
【００３３】
好ましい電気的活性化合物は、チオール基を含む置換基を伴うシクロペンタジエニル環を有するビスシクロペンタジエニルメタロセンである。より好ましい電気的活性化合物は、フェロセン-2-カルボン酸(2-メルカプト-エチル)-アミドである。
【００３４】
別の態様において、この方法は、混合型単層表面上の不動化された機能性有機分子の密度を測定することに関連し、この混合型単層表面は、検出可能なシグナルを提供するための電気的活性化合物及び共有結合形成する反応基(reactive)を含む第一の単層部分、並びに不活性基を含む第二の単層部分を含み、ここで共有結合形成する反応基は、機能性有機分子と反応し、混合型単層表面上に機能性有機分子を不動化するための共有結合を形成し、この方法は、検出可能なシグナルを測定すること、及び検出可能なシグナル測定値を、第一の単層部分の密度と相関すること、及び第一の単層部分の密度を、不動化された機能性有機分子の密度と相関することを含む。
検出可能なシグナルの測定は、サイクリックボルタンメトリー又は当該技術分野において公知の他の方法により行われることが好ましい。
【００３５】
本発明は、機能性有機分子を混合型単層表面上に不動化する方法も提供し、これは混合型単層表面を機能性有機分子と接触する工程を含み、混合型単層表面は、共有結合形成する反応基を有する第一の単層部分及び不活性基を有する第二の単層部分を含み、ここでこの接触工程は、機能性有機分子と第一の単層部分の共有結合形成する反応基の間に共有結合を形成し、機能性有機分子を不動化する。
好ましい混合型単層表面は、第一の単層部分の第二の単層部分に対する予め定められた比を有する。
【００３６】
本発明は、混合型単層表面上にタンパク質を不動化する方法も提供し、ここでタンパク質は、反応基及びタンパク質を含む融合タンパク質であり、この方法は、混合型単層表面の二官能性アフィニティータグ及び融合タンパク質との接触工程を含み、混合型単層表面は、共有結合形成する反応基を有する第一の単層部分及び不活性基を有する第二の単層部分を含み、ここで二官能性アフィニティータグは、第一の反応基及び第二の反応基を含み、第一の反応基は、第一の単層部分の共有結合形成する反応基と反応するための共有結合形成する反応パートナーを含み、及び第二の反応基は、融合タンパク質の反応基と反応するための反応パートナーを含み、ここで接触工程は、二官能性アフィニティータグの第一の反応基と第一の単層部分の共有結合形成する反応基の間に共有結合を形成し、二官能性アフィニティータグを不動化し、並びにここで接触工程は、二官能性アフィニティータグの第二の反応基と融合タンパク質の反応基の間に会合を形成し、融合タンパク質を不動化する。
【００３７】
ひとつの態様において、融合タンパク質の反応基は、抗体であり、及びここで二官能性アフィニティータグの第二の反応基は、抗体の抗原標的であり、ここで会合は、抗体-抗原会合である。
【００３８】
別の態様において、混合型単層表面上にタンパク質を不動化する方法が提供され、ここでタンパク質は、共有結合形成する基及びタンパク質を含む融合タンパク質であり、この方法は、混合型単層表面を二官能性アフィニティータグ及び融合タンパク質と接触する工程を含み、この混合型単層表面は、共有結合形成する反応基を有する第一の単層部分及び不活性基を有する第二の単層部分を含み、ここで二官能性アフィニティータグは、第一の反応基及び第二の反応基を含み、第一の反応基は、第一の単層部分の共有結合形成する反応基と反応するための、共有結合形成する反応パートナーを含み、及び第二の反応基は、融合タンパク質の共有結合形成する基と反応するための、共有結合形成する反応パートナーを含み、ここで接触工程は、二官能性アフィニティータグの第一の反応基と第一の単層部分の共有結合形成する反応基の間に共有結合を形成し、二官能性アフィニティータグを不動化し、及びここで接触工程は、二官能性アフィニティータグの第二の反応基と融合タンパク質の共有結合形成する基の間に共有結合を形成し、融合タンパク質を不動化する。
【００３９】
好ましい態様において、融合タンパク質の共有結合形成する基は、クテナーゼであり、及びここで二官能性アフィニティータグの第一の反応基はチオールであり、ここで二官能性アフィニティータグの第二の反応基は、p-ニトロフェノールリン酸である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
発明の詳細な説明
本開示において使用したいくつかの用語は、以下に示した意味を有する。
「アグリコン」は、糖質でないグリコシドの構成要素である。
「非対称」ジスルフィドは、2個の異なるチイル(thiyl)ラジカルのイオウ原子の共有結合により形成されたと見なすことができるジスルフィドである。
【００４１】
「炭水化物」は、ポリヒドロキシアルデヒド又はケトン、又は加水分解時にこのような化合物を生じる物質である。炭水化物の非-限定的例は、単糖、二糖、オリゴ糖、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質及び他の誘導体である。本開示において使用される炭水化物は、アルデヒド又はケトン官能性が低下されたポリヒドロキシアルデヒド及びケトン、例えばアルジトール、シクリトールなど、及びそれらの誘導体、並びに酸化型、例えばアルドン酸、ウロン酸、アルダル酸、ケト酸及びそれらの誘導体を含む。M. Sznaidman、Introduction to Carbohydrates in Bioorganic Chemistry: Carbohydrates, 1-55頁(S.M. Hecht編集、Oxford Press社、1999)。
【００４２】
「カルボン酸誘導体」は、カルボン酸及びそれらの「誘導体」である。カルボン酸誘導体は、エステル、アミド、カルバメート、ニトリル、ハロゲン化アシル及びイミダゾリドを含む。
「貨幣金属」は、金、銀、白金及び銅である。
「誘導体」は、単純な化学的方法により他の化合物から得ることができる化合物である。Grant及びHackh、「Chemical Dictionary」第5版(1987)。
【００４３】
「単層を形成する部分」は、「単層部分」への前駆体分子である部分である。例えば、「単層を形成するジスルフィド部分」は、貨幣金属表面と接触させた時に、貨幣金属との結合を形成し、チオラート単層を形成する前駆体分子であり、以後「単層チオラート部分」と称す。
【００４４】
「不活性基を生じる単層を形成する部分」は、「不活性基を生じる単層部分」への前駆体分子である。例えば、不活性基を生じる単層を形成する部分は、貨幣金属表面との接触時に、不活性基を生じるジスルフィド化合物であるならば、不活性基を生じるジスルフィド化合物は、不活性基を生じるチオラートとなるか、又は本明細書において「不活性基を生じる単層チオラート部分」と称される。「不活性基を生じる単層を形成するジスルフィド部分」の例は、式R-(O-(CH2)y)z-(CH2)x-S-S-(CH2)x-((CH2)y-O)z-Hのジスルフィドである(式中、xは10〜24の数であり、yは好ましくは2であり、zは1〜10の数であり、及びRはH又はCH3、又は生体分子の非-特異的吸着に抵抗する不活性基である。)。「不活性基を生じる単層を形成するジスルフィド部分」は、本明細書を通じて「希釈ジスルフィド」と互換的にも使用される。同様に、「不活性基を生じる単層チオラート部分」も、本明細書を通じて「希釈チオラート」と互換的に使用される。
【００４５】
「共有結合形成する反応基を生じる単層を形成する部分」は、「共有結合形成する反応基を生じる単層部分」への前駆体分子である。例えば、共有結合形成する反応基を生じる単層が、共有結合形成する反応基を生じるジスルフィド化合物であるならば、貨幣金属表面との接触時に、このジスルフィド化合物は、共有結合形成する反応基を生じるチオラート又は本明細書において「共有結合形成する反応基を生じる単層チオラート部分」と称される。
【００４６】
「共有結合形成する反応基」は、共有結合を形成するように、反応パートナーと反応する基である。単層部分上の共有結合形成する反応基は、機能性有機分子上の反応パートナーと反応し、共有結合を形成し及び機能性有機分子を単層上に不動化するであろう。反応の例は、マイケル付加反応又はディールスアルダー反応を含むが、これらに限定されるものではない。マイケル付加の場合、例証的共有結合形成する反応基は、マレイミドであることができ、これは機能性有機分子上のチオールと反応するであろう。この機能性有機分子は、チオール基を含むように誘導体化することができる。他の共有結合形成する反応基の例は、以下を含むが、これらに限定されるものではない：カルボン酸及びアミン；ホスホニル基及びエステル；チオール及びカルボン酸；遊離アミノ基及びカルボン酸；遊離アミノ基及びジカルボン酸；並びに、スルホニル基及びエステル。単純化のため及び例証のみを目的として、本図面は、機能性有機分子上のチオール基とマイケル付加で反応するマレイミドとしての、共有結合形成する反応基を示している。当業者は、かなり多くの適当な化学を、共有結合を形成するために利用することができることを理解するであろう。いくつかの非-限定的例は、前記を含む。好ましい化学は、反応が良く挙動されるものを含み、及び良く理解された反応速度論を有する。この反応は完了することが好ましい。
【００４７】
「電子求引基」(あるいは「EWG」)は、それらが結合した原子から電子密度を求引する傾向がある原子(官能基)の集合として当業者により良く理解される。EWGの非-限定的例は、エステル、アミド、カルバメート、ニトリル、ハロゲン化アシル、及びイミダゾールのような、しかしこれらに限定されない、カルボン酸誘導体、ケト基、ニトロ基を含む。
【００４８】
「機能性有機分子」は、生物学的生体の機能における役割を有する有機分子及びそのような有機分子に選択的に結合する分子を意味する。機能性有機分子は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質(三次元構造を伴う巨大ポリペプチド)、ヌクレオチド、ヌクレオシド、炭水化物、脂質酵素、酵素基質、リガンド、受容体、抗体、抗原、小分子及び核酸を含む。これらの広範なポリマー及びオリゴマーの分類は、生体における機能型を想定している。一部のタンパク質は、酵素、受容体又は抗体である。一部の炭水化物は、細胞表面認識に関連しており、その結果受容体タンパク質が結合するリガンドとして機能する。機能性有機分子は更に、リガンド及び受容体、抗体及び抗原、酵素などを含む。
【００４９】
「ヒドロカルビル」は、炭素及び水素を含有する分子の断片を意味する。この用語は、元素炭素及び水素を含む断片を含む広範な意味を有することが意図される。ヒドロカルビル基は、炭素及び水素に加え、いくつかのヘテロ原子を有することができる。ヘテロ原子は、カルボニル酸素又はジフルオロメチレンのフッ素原子のように、ペンダント基であることができる。ヘテロ原子は同じく、例えばトリエチルアミンの窒素又はジエチルエーテルもしくはポリアルコキシ断片の酸素原子のようにヒドロカルビル断片を組込むこともできる。
「リガンド」は、別の分子に特異的に結合する分子である。
【００５０】
「マイケル付加」は、求核試薬の電子求引基に共役炭素-炭素二重結合への共役付加反応である。この求核付加には、プロトン引き抜き(abstraction)又は付加を受ける炭素原子からの二重結合を超える炭素原子による求電子試薬の捕獲が続くことが多い。全般的には、Mundy, B.P.；Ellerd, M.G.、「Name Reactions and Reagents in Organic Synthesis」(John Wiley & Sons社：ニューヨーク、1988)及びMarch, J.、「Advanced Organic Chemistry: Reactions Mechanisms and Structure」(John Wiley & Sons社: ニューヨーク、第4版、1992)を参照のこと。
「マイケル受容体」は、マイケル付加（Michael addition）に参画することができる電子求引基に共役炭素-炭素二重結合を有する求電子化合物である。マイケル受容体は、キノン、マレイミド、α-β不飽和ケトン、α-β不飽和アミド、及びα-β不飽和エステルを含むが、これらに限定されるものではない。
【００５１】
「ポリペプチド」は、1個のアミノ酸のアミノ基の別のカルボキシル基との縮合により形成されたペプチド結合により結合したアミノ酸のオリゴマー又はポリマーである。用語「ペプチド」は、アミノ酸オリゴマー及び約50個未満のアミノ酸の単鎖ポリマーを意味するようにこの開示において使用される。これらの用語は、当業者に良く理解された意味を有する。ペプチドが10個又はそれ未満のアミノ酸を含むことが意図される場合、用語「オリゴペプチド」が使用される。Hawley, G.G.、「The Condensed Chemical Dictionary」759(Van Nostrand Reinhold社、ニューヨーク、1981)。
本明細書において使用される「小分子」は、分子量1,000ダルトン又はそれ未満を有する小さい有機又は非-有機構造を意味する。
【００５２】
本明細書において使用される「スイッチ可能な共有結合形成する基」は、ある刺激の導入時に、共有結合を実現するために、様々な化学反応を通じて機能性有機分子に結合するように活性化され得る基を意味する。例えば刺激は、電気インパルス、温度、pHなどの変化であることができる。「可逆的にスイッチする基」は、非反応性状態から活性状態にスイッチ「オン」にされ、活性状態から非反応性状態へスイッチ「オフ」にされる。活性状態をスイッチオンするシグナルは、本明細書において「活性化シグナル」と称される。活性状態をスイッチオフするシグナルは、本明細書において「鎮静化シグナル」と称される。可逆的にスイッチ可能な基の例はキノンである。キノンは、電気化学的に修飾することができ―これらは電子の追加又は除去のいずれかをスイッチオン又はオフすることができる。キノンがその酸化された(電子が除去された)状態である場合、これはその活性状態にある。キノンが還元された(電子が付加された)状態である場合、これはその非反応性状態にある。「不可逆的スイッチする基」は、最初は非反応性であるが、シグナルへの曝露時に、その活性状態に変化するものである。しばしばこのシグナルは、結合を破壊するように作用し、その結果化合物を非反応性とする基を放出する。例えば、ニトロベラトリルオキシカルボニル("NVOC")は、光により取り外し可能な光に不安定な基である。NVOC基は、通常アミン、カルボン酸又はヒドロキシル基を保護するために光化学において使用される。化合物は、これらの部位においてNVOC基の共有的結合を有するように調製される。NVOC基は、これらの部位で化合物を非反応性とする。化合物が活性化されることが望ましい場合、光を用い、NVOC基を切断し、化合物を活性とする。光がこれらの化合物上で輝く場合、NVOC基は放出され、アミン、カルボン酸又はヒドロキシル基を曝露し、その結果これらを引き続きの反応に参加させる。
【００５３】
「チオール」は、-SH官能基を含む有機化合物であり、メルカプタンとしても公知である。本開示において、チオールは、当該技術分野において通常であるようにSH官能基を意味するようにも使用される。チオール官能基は、スルフヒドリル及びメルカプトとしても公知である。用語チオールが化合物又は官能基を意味するかどうかは、文脈から明らかであろう。
【００５４】
「チオラート」は、炭素原子に単独で結合したイオウアニオン、及び炭素原子に単独で結合したイオウアニオンを含有する化合物を意味する。用語チオラートも、貨幣金属表面-S結合(例えば、Au-S結合など)中の電子分布について何らかの妨害を伴わない、チオール又はジスルフィドを貨幣金属表面と接触することにより形成された自己組織化単層の有機構成物質を意味するように使用される。
用語「チイル断片」は、ジスルフィド基のイオウ原子のひとつ及びそのイオウ原子に結合した置換基を含むジスルフィドの断片(同義語、部分、ラジカル)を意味するように使用される。
【００５５】
表面化学の技術分野の業者は、表面上で行われた反応の生成物は、特徴付けることが困難であることを理解するであろう。1H NMRのような慣習的液相特徴決定技術は、表面に結合した反応生成物の特徴決定に利用することができない。特定の用途のためにそれらを調製するための表面上で行われる化学反応の数を減少するという改善は、良く定義された特徴及び同じ方法で調製された表面間でより再現可能な特徴を伴う表面を提供するはずである。本発明はこの必要性を満たしている。
【００５６】
本発明は、生体分子の不動化に有用な商品を製造する方法を提供する。この方法は、貨幣金属表面上にチオラートの自己組織化単層を形成する技術を使用する。本発明の方法は、当該技術分野において公知の方法に必要なものよりもより少ない表面に対する操作工程による、マイケル受容体及びその他のような共有結合形成する反応基の不動化を可能にする。予備形成されたSAMを共有結合形成する反応基で誘導体化する必要性は避けられる。この誘導体化工程を避けることは、誘導体化の完全性及び誘導体化後の表面の組成に関する懸念を避ける。
【００５７】
従って、本発明は、少なくともチオラートの一部が共有結合形成する反応基で官能基化されている表面上のチオラートの単層を形成することにより、機能性有機分子を貨幣金属表面上に不動化する方法を提供する。本発明の著しい特徴は、この単層が、表面の、共有結合を形成する反応基を生じるジスルフィド化合物との反応により、一工程で形成されることである。この共有結合形成する反応基は、機能性有機分子と反応し、チオラート単層へ共有結合し(図1)、機能性有機分子の表面上への不動化を生じる。
【００５８】
本発明は更に、金表面により例示され、その理由は、金/チオラート単層は、本発明が最も最初に考慮した、最も完全に研究された自己組織化単層だからであるからである。金表面は、固形金商品の表面であって良いが、表面操作により作成された金表面は、通常ガラスのような基板上への金コーティングである。顕微鏡スライド及びカバーガラスのようなガラス商品は、商品の透明なガラス表面上へのチタン接着層の蒸着、その後の接着層上への金の蒸着により金の層がコーティングされる。金コーティングをガラス基板に塗布する装置は、Pharmacia Biosensors社から市販されている。
【００５９】
金表面の下側には、この商品は、金表面が商品に接着している限りは、これを機能性有機分子を不動化するための支持体として利用するために、いずれかの材料を備えることができる。更にこの商品は、研究又は診断の道具、もしくはこの商品について認められたその他の適当な用途として有用であることができる。例えば、ガラスに加え、ポリカーボネート及びポリウレタンが、当該技術分野において周知の方法に従い金をコーティングすることができる適当な基板である。
【００６０】
この方法に従い、金表面は、例えば含浸により、単層を形成する部分、好ましくはジスルフィドの溶液と接触される。通常、自己組織化単層を調製するために使用されるジスルフィド及びチオール溶液は、10-3Mの桁に希釈される。従って、この溶液の濃度は、好ましくは総ジスルフィド濃度で約9x10-3M又はそれ未満であり、及びより好ましくは約1x10-3M又はそれ未満である。単層を形成する部分としてチオールよりもむしろジスルフィドを使用する利点は、チオールを使用する場合には、自己-反応が生じ、そこに組込まれたダイマー及びオリゴマー分子を有する規定不良の単層の生成が生じることがあることである。単層を形成するための分子前駆体としてチオールよりもむしろジスルフィドを使用することにより、本発明は、この前駆体の自己-反応を防止する。更に、前駆体としての共有結合形成する反応基で官能基化されるジスルフィドの提供は、その表面に存在する共有結合形成する反応基を有するチオラート単層が形成されるであろう。
【００６１】
従って、本発明のひとつの態様は、貨幣金属表面領域及びこの表面領域上にチオラートの混合型自己組織化単層を有する商品を製造する方法を提供する。この方法は、貨幣金属表面を、不活性溶媒中の2種の単層を形成するジスルフィド部分の混合物を含有する溶液と接触することに関与している。
この溶媒は、貨幣金属表面と接触された場合に、ジスルフィドが単層を形成することを可能にするものである。エタノール及びメタノールが、ふたつのこのような溶媒である。当業者は、作業することができる他の溶媒を認識しかつ理解するであろう。例えば、DMSOのよう溶媒は、単層を形成することができないので適していない。
【００６２】
第一の単層を形成するジスルフィド部分は、共有結合を形成する反応基を生じる。溶液混合物中の第二の単層を形成するジスルフィド部分は、不活性基を生じる。理解を簡易及び容易にするために、不活性基を生じる単層を形成するジスルフィド部分は、本明細書において希釈ジスルフィドと呼んでも良く、その理由はこれが機能性有機分子と反応し、官能有機生体分子を不動化するための共有結合を形成することはできないからである。単層を形成するジスルフィド部分が表面領域と接触する場合、チオラートの混合型自己組織化単層は表面領域上に形成される。共有結合形成する反応基を生じる第一の単層を形成するジスルフィド部分は、貨幣金属表面領域と反応し、共有結合形成する反応基を生じる第一の単層チオラート部分を形成する。第二の単層を形成するジスルフィド部分は、貨幣金属表面領域と反応し、不活性基を生じる第二の単層チオラート部分(希釈チオラートとも称される)を形成する。
【００６３】
本発明においてあらゆるジスルフィドを使用することができる。非限定的例は、対称及び非対称のジスルフィドである。好ましくは共有結合反応基を生じる単層を形成する部分として使用されるジスルフィドは、非対称ジスルフィドであろう。非対称ジスルフィドは、一方の端に共有結合形成する反応基及び他方の端に不活性基を有することが好ましい。
【００６４】
対称ジスルフィドは、従来のようにω-アミノ-官能基化されたチオール、例えばHS-(CH2)a-(OCH2CH2)b-NH2(式中、a及びbは各々独立して広範に変動することができ、例えば0〜24(しかしaもしくはbは両方とも0ではない)又はそれらのより高次のホモログ(しかしここでaは6〜24が好ましく、及びbは1〜10が好ましい。)を酸化しジスルフィドを形成し、次にアミン基は、マイケル受容体のような共有結合形成する反応基を有する化合物、及び図2の化合物10のような活性化されたカルボキシル基と反応することにより調製しても良い。対称ジスルフィドを使用することにより、金表面は専ら、共有結合形成する反応基を提示するチオラートにより、又はこの場合はマイケル受容体により、表面が被覆される。一部の適用に関して、このような高密度は望ましいが、タンパク質、炭水化物及び他の生物学的物質を共有的に不動化するための表面を提供することに関しては、はるかに低い密度が好ましい。従って非対称ジスルフィドがこれらの場合に好ましい。
【００６５】
このジスルフィド化合物は、非対称であっても良く、好ましくは一方の端にマイケル受容体のような共有結合形成する反応基をひとつ、及び他方に不活性基を有する。好ましい非対称ジスルフィドは、下記式のマレイミド置換されたジスルフィドである：
【化６】
2005509737.tif 000008
(式中、R2及びR3は、飽和又は不飽和の、置換又は未置換のヒドロカルビルであり、並びにR1は、水素又は電子求引基であり、並びにWは親水性又は疎水性置換基である。)。Wは更に、ヒドロキシル、スルホネート、ヒドロキシ置換されたC1-C4アルキル及びメチルからなる群より選択されても良い。R2は、式-(CH2)m(O(CH2)n)o-NHC(O)-(CH2)pの鎖であることができる(式中、mは10〜24の数であり、nは好ましくは2であり、oは1〜10の数であり、及びpは1〜16の数である。)。好ましくはR3は、式-(O-(CH2)j)k-(CH2)i-である(ここで、iは10〜24の数であり、jは好ましくは2であり、及びkは1〜10の数である。)。Wは、好ましくはヒドロキシル、スルホネート又はメチルであり、より好ましくはヒドロキシルである。ひとつの態様において、R2及びR3は各々線状であり、かつイオウ原子に結合したアルキルセグメント、並びにこのアルキルセグメントに結合したポリアルコキシ、ポリペルフルオロアルキル、ポリ(ビニルアルコール)及びポリプロピレンスルホキシドからなる群より選択される第二のセグメントで形成される。
【００６６】
非対称ジスルフィドは、従来のように、2種のチオールの混合物を酸化的条件に曝し、及び混合型ジスルフィドを回収することにより形成することができる。しかしこの共有結合形成する反応基がマイケル受容体であるならば、チオールとマイケル受容体の間のマイケル付加はこの段階で生じることができ、及び混合型酸化的カップリングの統計学的収量はもともと低いので、図2に示された戦略のような保護戦略を使用することが好ましい。その図は、1個のチオラート部分上に末端マレイミドマイケル受容体官能基及び他方にヒドロキシ末端としたポリエトキシ-アルキルセグメントを生じる非対称ジスルフィドの調製を概略的に示している。
【００６７】
図2を参照し、ω-ヒドロキシポリアルコキシ-アルキルチオール3は、そのトリチルチオエーテルとして保護される。チオエーテル4のヒドロキシ基は、そのスルホネート5へと転換される。このスルホネートは、イミノジカルボン酸ジ-tert-ブチルと交換され、保護されたアミンチオール6を生じる。このトリチル基及びBoc基は切断され、ω-アンモニウムチオール7を生じる。得られるω-アンモニウムチオールは次に、(ポリアルコキシ-アルキル)-(2-ピリジル)ジスルフィド9と反応し、一端にアンモニウム基及び他端にヒドロキシ基を有する非対称ジスルフィド8を生じる。この8のγ-マレイミド酪酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル10の非-求核塩基の存在下での処理は、非対称ジスルフィド前駆体化合物1を生じる。当業者は、この調製は高度に多目的であることを認識するであろう。ω-ヒドロキシポリアルコキシ-アルキルチオール3は、異なる望ましい鎖全長の及び／又は異なる鎖長のアルキル又はポリアルコキシ鎖セグメントを有する別のω-ヒドロキシチオールにより置換することができる。別のマイケル受容体、鎖長又はアミン-反応官能性を有する化合物を、化合物10と置換することができ、表面上に様々な方法で、様々なマイケル受容体を提示している様々な前駆体化合物を調製する。
【００６８】
更に、化合物9のポリアルコキシ-アルキルチイル断片の代わりに異なるチイル断片を有するジスルフィドは、工程(e)において化合物9と置換することができる。例えば、線状アルキルチイル断片を有するピリジニウムジスルフィドは、置換することができる。別の場合、このチイル断片は、多種多様な末端基を伴うポリアルコキシ-アルキル鎖であることができる。
【００６９】
前述の非対称ジスルフィドを使用する、本発明の別の局面は、不活性基を生じるチオラート(又は1種よりも多い希釈チオラート)中に分散された、共有結合形成する反応基を生じるチオラートの均一な混合型単層を提供するが、ここでこれらのチオラートは全て、ジスルフィド前駆体に由来している。本発明のこの局面に従い、ひとつの共有結合形成する反応基を生じる非対称ジスルフィド前駆体は、表面上に共有結合形成する反応基を生じるチオラート及び不活性基を生じるひとつのチオラートを同調(synchronously)及び隣接して吸着するように、表面と接触されている。この方法は、表面上に不活性基を生じるチオラート中の共有結合形成する反応基を生じるチオラートのより均一な最初の分散を提供し、これは、本発明の方法により調製された単層間のより均一な単層及びより再現性のある特徴につながると予想される。
【００７０】
金/チオラート単層において、個々のチオラートは、隣接分子により、表面を超えた移動が妨げられる。金上のアルカンチオラート単層の研究に従い、単層形成は、ふたつの化学速度論的に異なる段階において生じる。チオールのミリモル溶液からの最初の吸着は、数分以内に生じる。最初の吸着後、チオラートは、Van der Waals相互作用及び他の安定化相互作用を最大にするように再配向し、これは数時間かけて生じると考えられる。再配向現象は、単層の厚さの緩徐な増加として検出される。これらの両反応速度相の間に、これらのチオラートは、再配向後のそれらよりも、表面を超えて移動することからの隣接分子による拘束が減る。混合型単層は、1種のチオラートが豊富なミクロドメインを形成する傾向がある。Stranick, S.J.；Parikh, A.N.；Tao, Y.T.；Allara, D.L.；Weiss, P.S.、J. Phys. Chem.、98:7636 (1994)。ミクロドメインは、表面の均一性を低下する。これらは更に、同じ手法の繰返しで得られた表面特性の再現性に作用することができる制御できない要素を導入する。チオラートの表面移動は、ミクロドメインを形成することを可能にする重要な要因であるように見える。非対称ジスルフィド前駆体を使用する単層内の共有結合形成する反応基を生じるチオラート及び不活性基を生じるチオラートのより均一な分布により、ミクロドメイン形成は抑制され、より均一及び再現可能な表面特性を生じる。
【００７１】
前述のように、共有結合形成する反応基は、反応パートナーと反応し共有結合を形成するいずれかの基であることができる。共有結合形成する反応基の限定的でない例は、マイケル受容体である。マイケル受容体は、マイケル付加(電子求引基と共役炭素-炭素二重結合への求核試薬の共役付加反応)に参加するであろう。マイケル受容体は、キノン、マレイミドなどを含む。好ましいマイケル付加は、マレイミド及びチオールに関連している。マイケル受容体官能基の限定的でない例は、下記式である：
【化７】
2005509737.tif 000009
(式中、マレイミド基は、窒素を介してジスルフィドの残基(residuum)に結合され、及び置換基R1は、水素又は電子求引基のいずれかである。)。引き続きの不動化反応を促進するようにマレイミドの反応性を修飾することが望ましいことがある。従って、適当なマレイミド基は、マレイミドそれ自身に加え、1個を超えないビニル性炭素上に電子求引基を有するマレイミドの誘導体を含む。好ましい電子求引基は、カルボン酸誘導体、ケト基、ニトロ基、エステル、アミド、カルバメート、ニトリル、ハロゲン化アシル及びイミダゾリドである。
【００７２】
反応パートナー(チオール)のマレイミド(R1=H)への付加の速度は極めて迅速であり、及び出発材料の商業的易入手性及び経費の理由から、最も好ましいマレイミド誘導体は、機能性有機分子が、チオール基のマレイミド基へのマイケル付加により不動化される場合には、マレイミドそれ自身である。代わりのマイケル受容体官能基は、オルト-及びパラ-キノン並びにキノン誘導体、アクリル酸及びそれらの誘導体、スルホン酸ビニル、エナミン及びエナミドを含む。
【００７３】
ひとつの単層形成する部分上の共有結合形成する反応基とは対照的に、他方の単層を形成する部分は不活性基を有する。この不活性基は、生体分子の非-特異的吸着("NSA")又は非-特異的結合("NSB")に抵抗する基である。特に、本発明の商品又は方法がタンパク質を不動化するために使用される場合、不活性基は、タンパク質の非-特異的吸着に抵抗することが好ましい。親水性基はこのようなNSAに抵抗することが多い。ひとつの好ましい不活性基は、ポリエチレングリコールであり、例えばトリエチレングリコール("EG3")である。
【００７４】
本発明に従い、不活性基を生じる単層チオラート部分は、不活性基を生じる単層を形成するジスルフィド部分に由来しても良い。この不活性基を生じるジスルフィドは、金表面にSAMを形成することが可能なジスルフィドのいずれかであることができる。更に、先に考察されたジスルフィドのいずれかであって良い。対称な線状アルカンジスルフィドは一例である。好ましい不活性基を生じるジスルフィドは、表面への非-特異的生体分子吸着に対する抵抗を付与する。より特に好ましい不活性基を生じるジスルフィドは、式W-R4-S-S-R4-W(式中、R4は、イオウに結合したアルキルセグメント並びにこのアルキルセグメント及びWに結合した線状ポリアルコキシセグメントを有するヒドロカルビルである。)。置換基Wは、親水基又は疎水基のいずれかであって良く、好ましくはタンパク質の吸着に抵抗する官能基である。より好ましくは、Wは、ヒドロキシル又はスルホネートのような親水基であり、最も好ましくはヒドロキシルである。このポリアルコキシセグメントは、タンパク質接着に抵抗する。好ましいポリアルコキシはポリエトキシである。特に好ましい希釈ジスルフィドは、式H-(O-(CH2)y)z-(CH2)x-S-S-(CH2)x-((CH2)y-O)z-Hである(式中、xは10〜24の数であり、yは好ましくは2であり、及びzは1〜10の数である。)。他の適当な不活性基を生じるジスルフィドは、ポリアルコキシセグメント及びWに代わり、ポリペルフルオロアルキル、ポリ(ビニルアルコール)又はポリプロピレンスルホキシドセグメントを有し、各々タンパク質接着に対する抵抗を示す。Folch, A.；Toner, M.、Annu. Rev. Biomed. Eng.、2:227-56 (2000)。
【００７５】
本発明は、官能有機生体分子の不動化に有用な商品も提供する。この商品は、貨幣金属表面及び貨幣金属表面の少なくとも一部を覆っている混合型自己組織化単層表面で構成される。混合型自己組織化単層表面は、第一の単層部分及び第二の単層部分を含む。第一の単層部分は、共有結合形成する反応基を生じるチオラートを含み、及び第二の単層部分は、不活性基を生じるチオラートを含む。前述のように、共有結合形成する反応基は、その反応パートナーとの反応に参加し共有結合を形成することができる基のいずれかであってよい。共有結合形成する反応基及び不活性基は前述のものである。
【００７６】
表面上の異なるリガンド密度の範囲を忠実に再現する能力にとって重要なのは、不動化された機能性有機分子の絶対密度を測定する能力である。本発明は更に、貨幣金属表面上の混合型自己集合されたチオラート単層における、共有結合形成する反応基、具体的にはマイケル受容体の密度の定量を電気化学的にアッセイする都合の良い方法を提供する。この本発明の態様において、電気的活性化合物は、共有結合形成する反応基と反応され、電気化学的活性を有する表面を形成する。図13参照のこと。この表面上の電気化学的活性は測定され、及び表面上の共有結合形成する反応基の密度は、この測定から決定される。一旦表面上の共有結合形成する反応基の密度が分かったならば、この密度は、不動化された機能性有機分子の密度と相関することができ、共有結合形成する反応は完了へと進み、及び全ての共有結合形成する反応基は、不動化した機能性有機分子を有すると想定される。
【００７７】
電気的活性化合物の限定しない例は、Ru2+化合物及びヒドロキノンを含む。特に有用な電気的活性化合物は、チオール基を含む置換基を伴うシクロペンタジエニル環を有するビス-シクロペンタジエニルメタロセンである。好ましい電気的活性化合物は、フェロセン-チオール13(図6)(フェロセン-2-カルボン酸(2-メルカプト-エチル)-アミド)である。フェロセン-チオール13は、市販のフェロセンカルボン酸から2工程で到達可能である。図6のフェロセン13調製の概略的説明を参照し、フェロセンカルボン酸のカルボン酸を、そのNHSエステルに転換し、これはその後(2-アミノエチル)-(2-ピリジル)ジスルフィド11の遊離アミンと反応する。直接の生成物12のジスルフィド結合は、その後、ジチオスレイトールで還元される。
【００７８】
フェロセン-チオール13は、その電気的活性を考慮することにより、希釈チオラートを含む混合型自己組織化単層において、マレイミド基を生じるチオラートの密度を試験するために使用することができる。フェロセン-チオール13により官能基化された混合型チオラート単層のサイクリックボルタンメトリーは、レドックス波下面積が、表面上のフェロセン密度に比例しているボルタンモグラムを生じる。この技術は、表面上のマレイミド基密度の正確で信頼性のある定量を提供することは分かっている。過剰なフェロセン-チオール13のマレイミドを提示するSAMとの反応は、迅速かつ完全であり、従ってサイクリックボルタンメトリーで検出されたフェロセン密度とフェロセン-チオール13との反応に利用可能なマレイミド官能基の密度の間で、1:1の対応を提供する。この表面上のマレイミド密度を測定する方法は、マレイミドを生じる表面を電気的に活性化したものに誘導体化するためにただひとつの化学反応を必要とするので、都合がよい。
【００７９】
図7(B)のサイクリックボルタンモグラムは、様々な比(ジスルフィド2中のジスルフィド1の容量％として図に示した)のマレイミドを生じるジスルフィド及び希釈ジスルフィドの溶液で処理された表面から得られた。得られるSAMは、フェロセン-チオール13溶液で処理し、その後0.5M KNO3においてサイクリックボルタンメトリーを用い走査速度200mV/秒で分析した。480mVに中心があるふたつの波は、不動化したフェロセン分子の酸化及び還元に相当していた。不動化したフェロセン基、従ってマレイミドの密度は、標準化されたレドックス波下面積から決定することができる。図7(B)のプロットは、この方法で作成した。図7(C)は、単層が形成される溶液中の不活性基を生じるジスルフィドに対するマレイミド基を生じるジスルフィドのモル分率(χsolution)に対する、並びに表面に組込まれたマレイミドのモル分率(χsurface)に対するプロットである。認められるように、表面上にマレイミドを生じるチオラートのモル分率は、処理溶液中のマレイミドを生じるジスルフィドのモル分率と直線的に変動する。従って、本発明者らの化合物13のようなフェロセン-チオール及びサイクリックボルタンメトリーを利用するマレイミド定量技術を使用することにより、当業者は、望ましい条件下での混合型SAMのマレイミド密度を定量することができる。この技術は、製造の状況においてマイケル受容体を提示する表面の製造に関する品質管理プロトコールを提供する。更に本発明のこの局面は、マイケル受容体を提示している本発明に従い調製された表面又は他の表面において実行される研究実験の結果を正規化する技術を提供する。
【００８０】
本発明は更に、マトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)、質量分析(MS)、及び表面プラスモン共鳴などであるが、これらに限定されるものではない、当該技術分野において公知の手段による、不動化されたリガンドの相対密度の測定を提供する。
【００８１】
図1に示されたようなマイケル受容体-誘導体化された表面は、バイオセンサー、高処理能アッセイ、結合アッセイ、酵素アッセイ及び細胞培養のような用途のための、機能性有機分子の選択的不動化及び配向のために良く適合される。図3-5は、本発明による共有的不動化の選択性及び表面の堅牢性を説明している、表面プラスモン共鳴("SPR")センサーグラムを示している。表面結合は、ビオチン化されたシステイン-含有ペプチド及びストレプトアビジンを用いて検出した。密度2％でマレイミド基を提示しているSAMは、本実施例の金-被覆したカバースリップに塗布した。SAMで被覆したカバースリップは各々、リン酸緩衝液(pH6)に溶解した様々な反応性分子を含有する溶液で処理し、及び表面の反応性を、SAM上の、ビオチンと選択的に結合するタンパク質ストレプトアビジンを追跡することにより特徴決定した。ストレプトアビジン結合は、表面プラスモン共鳴により定量した。
【００８２】
図3センサーグラム(A)を参照し、SAM-被覆したカバースリップは、モデルビオチン化したペプチドであるビオチン-NH-Arg-Asp-Cys-CONH2 (1.2mM)の溶液で12分間処理した。2280RUのストレプトアビジン結合が認められた。センサーグラム(B)は、モデルペプチド(0.6mM)及びリシン(16mM)の混合物を含有する溶液を用いて得た。SAM-被覆したカバースリップを、この溶液に12分間含浸し、その後ストレプトアビジンで処理した。センサーグラム(B)は、モデルペプチドの純粋な溶液が使用される場合に、(A)と同量のストレプトアビジン結合、従って同量結合したモデルペプチドを示している。これらの結果は、リシン側鎖のアミン基のようなアミン基は、マイケル供与体のように本質的にチオールと競合しないことを示している。センサーグラム(C)は、最初にメルカプトエタノール溶液(1mM)で12分間、次に(A)のようにモデルペプチド溶液で12分間処理したSAM-被覆したカバースリップから得た。認められるように、前処理は、親水性マイケル供与体メルカプトエタノールによるマイケル受容体の不活性化により、ストレプトアビジン結合をブロックし、その結果ビオチン化したモデルペプチドの不動化を防止している。センサーグラム(D)は、チオール基を欠いている異なるモデルビオチン化したペプチド(ビオチン-NH-Arg-Asp-Lys-CONH2)の溶液で処理したSAM-被覆したカバースリップから得た。SAM-被覆したカバースリップのモデルペプチドであるビオチン-NH-Arg-Asp-Lys-CONH2 (4mM)を含有する溶液による12分間の処理は、ストレプトアビジン結合を生じず、このことはこの表面はアミンに対して反応性ではないことを示している。
【００８３】
図4は、本発明に従い調製された表面は、非-特異的タンパク質吸着に対して不活性であることを示している。図4は、密度2％でマレイミドを提示しているSAMの表面プラスモン共鳴センサーグラムである。このSAM-被覆したカバースリップは、ビオチン化したチオール-含有するモデルペプチドであるビオチン-NH-Arg-Asp-Cys-CONH2 (1.2mM)で12分間処理した。その後、「粘着性」のタンパク質フィブリノーゲン(0.5mg/mL)の溶液を、その表面上に流した。わずかに60RUの吸着が認められた。別のカバースリップは、モデルペプチド溶液で処理し、その後ビオチンとプレインキュベーションしたストレプトアビジンで処理した。そのカバースリップの表面プラスモン共鳴は、ストレプトアビジンもその表面に付着しないことを示した。
【００８４】
図5は、通常のアッセイ条件下で本発明に従い調製された表面の安定性を示している。密度2％でマレイミドを提示している3個のカバースリップの各々は、ペプチドビオチン-NH-Arg-Asp-Cys-CONH2 (1.2mM)溶液で12分間処理し、表面にビオチン及びそのペプチドを提示させた。カバースリップの1個は、対照として除外し、及び他の2個を、不動化したタンパク質の表面が使用時に曝される条件に類似するように選択された溶液中に含浸した。被験カバースリップのひとつは、PBS緩衝液(pH7.4)中に4時間含浸した。他の被験カバースリップは、PBS緩衝液(pH7.4)中のDTT(5mM)及びリシン(5mM)の溶液中に、2時間含浸した。その後、これらの被験表面及び対照表面を洗い流し、次にストレプトアビジンで処理し、その後SPRにより分析した。SPR反応は表面に結合したストレプトアビジンの量に比例するので、この反応は、曝露後に表面上に残存するビオチン化したペプチドの割合を反映している。センサーグラム(B)は、対照で得た。センサーグラム(A)は、PBS緩衝液に曝したカバースリップで得た。センサーグラム(C)は、PBS緩衝液中のDTT及びリシンに曝されたカバースリップから得た。これらのセンサーグラムは、曝された表面と対照表面の間でほぼ等しいSPR共鳴を示しており、従ってこれらの単層はこれらの条件下で安定していることを明らかにしている。
【００８５】
従って本発明のひとつの態様は、混合型単層表面上の共有結合を形成する反応基の密度を測定する方法を提供する。混合型単層表面は、第一の単層部分及び第二の単層部分を備える。第一の単層部分は、検出可能なシグナルに加え共有結合形成する反応基を提供するための、電気的活性化合物を有する。第二の単層部分は、不活性基を有する。この方法は、検出可能なシグナルを測定すること、及びこのシグナル測定値を、第一の単層部分の密度と相関することを含む。その後第一の単層部分の密度を、共有結合形成する反応基の密度と相関してもよい。
【００８６】
電気的活性化合物は好ましくは、フェロセン-2-カルボン酸(2-メルカプト-エチル)-アミドのような、チオール基を含む置換基を伴うシクロペンタジエニル環を有するビス-シクロペンタジエニルメタロセンである。好ましい検出可能なシグナルは、サイクリックボルタンメトリーにより測定される。
【００８７】
別の態様において、混合型単層表面上に不動化した機能性有機分子の密度を測定する方法が提供される。混合型単層表面は先に説明されている。この方法は、検出可能なシグナルを測定すること、検出可能なシグナルの測定値を、第一の単層部分の密度と相関すること、並びに第一の単層部分の密度を、不動化した機能性有機分子の密度と相関することを含む。好ましくはこの検出可能なシグナルは、サイクリックボルタンメトリーにより測定される。好ましい電気化学基は先に説明されている。
【００８８】
チオラート単層表面上の共有結合形成する反応基の密度を特徴付けることに関連し前述の態様を使用し、溶液中の単層を形成するジスルフィド部分の比は、正確に同じ比を有する単層チオラート表面を生じないことがわかった。例えば、共有結合形成する反応基を生じる第一の単層を形成するジスルフィド部分の不活性基を生じる第二の単層を形成するジスルフィド部分に対する比が溶液中で2:98であるならば、単層を形成するジスルフィドの貨幣金属表面との接触後に形成された表面は全く同じ比2:98ではないであろう。別の表現をすると、共有反応基を生じる単層を形成するジスルフィド部分を2％含有した溶液という理由のみでは、この単層チオラート表面は、共有結合形成する反応基を生じるチオラートを正確に2％は有さないであろう。従って本発明者らは、溶液対表面の可変性が存在することを発見した。これは、溶液中の不純物は形成されたチオラートの比を変動し得るという事実により明らかである。加えて、これらふたつの単層を形成するジスルフィド部分は異なる構造を有するので、これらはわずかに異なる表面との反応性を有するであろう。例えば、ひとつの基が溶媒システム中においてより多い又はより少ない可溶性であり、その結果他のジスルフィドと比べてより高い又はより低い反応速度定数を有することがある。典型的には、ジスルフィドの溶解度が低いならば、これは貨幣金属表面とより反応性である傾向がある。
【００８９】
それにもかかわらず、本発明者らは、好ましくは前述の方法を用いて、一旦溶液を使用しチオラート単層を形成し、及びこの単層が特徴決定されるならば、事実上表面毎の可変性は存在しないことを発見した。従って例えば第一及び第二の単層形成するジスルフィド部分の溶液が、溶液中に2:98の比で存在し、及びその溶液が貨幣金属表面と接触され、密度比が2.5:97:5である混合型自己集合したチオラート単層を作成するならば、次の時点で同じ溶液を使用し、別のチオラート単層を作成し、その表面は再度ふたつのチオラートの比2:5:97.5を有するであろう。
【００９０】
従って、望ましい表面密度を達成するために、溶液中の比は、それが表面上で望ましい比を生じるまで、微調整され変更される。一旦表面上に望ましい密度が達成されたならば、その同じ溶液を何度も使用し、既報の密度を伴う表面を作成することができる。
不純物のために、ある比を有する溶液の異なるバッチは、表面上に常に同じ密度を生じるわけではないことに注意することは重要である。従って表面の特徴決定に関連している本発明の方法は、溶液の新たなバッチが作成される度に表面の密度を特徴決定するために使用されなければならない。
【００９１】
従って本発明のひとつの態様は、貨幣金属表面領域及びチオラートの混合型自己組織化単層を有する商品を製造する方法を提供し、ここで表面は、共有結合形成する反応基の予め定められた密度を有し、その結果機能性有機分子の結合／不動化に利用可能な基の予め定められた密度を有するであろう。この方法は、貨幣金属表面を、共有結合形成する反応基を生じる第一の単層を形成するジスルフィド部分、及び不活性基を生じる第二の単層を形成するジスルフィド部分の混合物の溶液と接触することを含む。単層を形成するジスルフィド部分の混合物は、前述のような不活性溶媒の溶液中にある。この溶液は、第一及び第二の単層を形成するジスルフィド部分を、第一の単層を形成するジスルフィド部分の第二の単層を形成するジスルフィド部分に対する予め定められた比で含む。単層形成するジスルフィド部分の溶液を貨幣金属表面領域と接触する場合、チオラートの混合型自己組織化単層は、表面領域の上に形成され、自己集合されたチオラート単層を形成する。溶液中の第一及び第二の単層を形成するジスルフィド部分の予め定められた比は、貨幣金属表面領域上の第一及び第二の単層チオラート部分の比を決定する。
【００９２】
本発明は更に、貨幣金属表面及び混合型自己組織化単層表面を有する商品を提供する。この混合型自己組織化単層表面は、第一及び第二の単層部分を含む。第一の単層部分は、共有結合形成する反応基を生じるチオラートを含む。第二の単層部分は、不活性基を生じるチオラートを含む。第一及び第二の単層部分は、第一の単層部分の第二の単層部分に対する予め定められた比で存在する。好ましい態様において、第一の単層部分は、表面上の第一及び第二の単層部分の合計の20モル％又は未満である。より好ましい態様において、第一の単層部分は、表面上の第一及び第二の単層部分の合計の5モル％又は未満である。最も好ましい態様において、第一の単層部分は、表面上の第一及び第二の単層部分の合計の0.01モル％〜約2モル％である。
【００９３】
本発明は更に、混合型単層表面上に予め定められた密度で機能性有機分子を不動化する方法も提供する。混合型単層表面は、共有結合形成する反応基を有する第一の単層部分及び不活性基を有する第二の単層部分を含む。第一の単層部分は、混合型単層表面上に予め定められた密度で存在する。この方法は、混合型単層表面を機能性有機分子に接触する工程を含み、ここでこの接触工程は、機能性有機分子と第一の単層部分の共有結合形成する反応基の間に共有結合を形成し、機能性有機分子を不動化する。不動化された機能性有機分子の密度は、混合型単層表面の第一の単層部分の密度により決定される。好ましい態様において、共有結合形成には酵素反応は必要ではない。
【００９４】
本発明は、貨幣金属表面上に不動化された機能性有機分子の密度を制御する更に別の方法を提供する。この態様において、不動化された機能性有機分子の密度は、溶液中の、従って表面上の、3種の異なる単層形成する部分(各々異なる共有結合形成する反応基を生じる、ふたつの単層を形成するジスルフィド部分、並びに不活性基を生じるひとつの単層を形成するジスルフィド部分)の比を調節することにより決定される。好ましくは、異なる共有結合形成する反応基は各々、異なる化学を用いて、機能性有機分子に結合する。限定的でない化学は、マイケル付加反応による求核試薬の不動化、及びディールスアルダー反応においてジエノフィルとして機能するアルケンの不動化を含む。当業者は、共有結合形成を達成する他の化学の使用を理解するであろう。
【００９５】
ふたつの異なる共有結合形成する反応化学の別の限定しない例は、ひとつの共有結合形成する基がマレイミドであり；他方の共有結合形成する基はアセトフェノンであり；及び、不活性基はトリ(エチレングリコール)としてであるものである。アセトフェノンは、求核付加においてヒドラジドでタグ付けした分子と選択的に反応し、及びマレイミドは、マイケル付加においてチオールと選択的に反応する。マレイミド及びアセトフェノンの密度は、溶液中のこれらの基を生じる単層を形成するジスルフィド部分の比により決定される。更に、様々な不動化された機能性分子の密度も、マレイミド及び／又はアセトフェノンの、各々、チオール及び／又はヒドラジドを保持する不動化された基との選択的反応により左右される。
【００９６】
本発明は、貨幣金属表面上の不動化された機能性有機分子の密度を制御する更に別の方法を提供する。この態様において、不動化した機能性有機分子の密度は、望ましい量の官能基化された有機分子を不動化した後に、電気化学的にスイッチ可能な基をオン・オフスイッチすることにより決定される。Yousaf及びMrksich、J. Am. Chem. Soc.、121:14286-14287 (1999)を参照し、これは本明細書に援用される。
【００９７】
この方法は、混合型単層表面上のスイッチ可能な共有結合形成する反応基及び不活性基を有する第二の単層部分の使用に関する。スイッチ可能な共有結合形成する反応基は、反応性状態及び非反応性状態を有する。活性化シグナルは、非反応性状態を、反応性状態へと代え、スイッチ可能な共有結合形成する反応基にスイッチを入れる。鎮静化シグナルは、反応性状態を非反応性状態へと代え、スイッチ可能な共有結合形成する反応基のスイッチを止める。この方法において、活性化シグナルは、スイッチ可能な共有結合形成する反応基のスイッチを入れ、第一の単層部分の共有結合形成する反応基と機能性有機分子の間の共有結合を可能にし、機能性有機分子を不動化するために使用される。共有結合形成は、ある期間発生することができる。この期間の経過後、鎮静化シグナルが提供され、スイッチ可能な共有結合形成する反応基がスイッチを止める。スイッチ可能な共有結合形成する反応基が残存する期間は、混合型単層表面上の不動化された機能性有機分子の密度を決定する。前述のように、好ましくは共有結合形成は、酵素反応を必要としない。共有結合形成する反応基、不活性基及び機能性有機分子は先に説明したものである。
【００９８】
更に別のスイッチ可能な共有結合形成する反応基に関連する態様において、共有結合形成する反応基を有するスイッチ可能な基を生じる第一のジスルフィド化合物及び不活性基を生じるジスルフィド化合物の混合物は、貨幣金属表面と接触され、その表面上にチオラートの混合型単層を形成する。表面上のスイッチ可能な基を生じるチオラートの割合は、混合物中の第一のジスルフィド化合物及び第二のジスルフィド化合物の予め定められた比により決定される。次に第一の反応が、予め定められた期間行われ、第一の機能性有機分子がスイッチ可能な基に結合することを可能にする。その後このスイッチ可能な基の化学反応性は、一過性にオフにされ、第一の機能性有機分子のスイッチ可能な基との更なる反応を阻害する。未結合の第一の機能性有機分子は、洗浄除去しても良い。次にスイッチ可能な基の化学反応性はオンに戻され、第二の機能性有機分子がこのスイッチ可能な基に結合することを可能にする。表面上の第一及び第二の機能性有機分子の比は、第一の反応が進行し、ふたつの異なるリガンド型を、各々、制御された密度で提示している表面を生じる期間により決定される。
【００９９】
ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、細胞などの機能性有機分子の不動化のために、不活性基を生じるチオラート、並びに約20モル％未満、より好ましくは約5モル％未満、及び最も好ましくは約0.01〜約2モル％の共有結合形成する反応基を生じるチオラートで構成された混合型単層を使用することが好ましい。比較的高い密度の共有結合形成する反応基、例えばマレイミドで、若干の非特異的タンパク質吸着が生じることがある。下記式の不活性基を生じるジスルフィドに由来した自己組織化単層：H-(O-(CH2)y)z)-(CH2)x-S-S-(CH2)x-(CH2)y-O)z-H (式中、x、y及びzは、先に定義されたものである。)において密度約2％のマレイミドを生じるチオラートを提示している表面は、非常に低い非-特異的結合による選択的共有不動化が可能である。
【０１００】
表面上の共有結合形成する反応基の密度を不動化された機能性有機分子の量に対し相関するために、共有結合形成する反応基と機能性有機分子の間の反応は、十分に挙動しかつ完全に進行しなければならないことは、当業者に理解されるであろう。従って、単層チオラート上のマレイミド基の、機能性有機分子上のチオール基との間のマイケル付加のような反応は、十分に特徴付けられており、十分に挙動しかつ完全なまで進行するので、この反応は特に好ましい。更にタンパク質及び他の複雑な生物学的物質、例えばオリゴヌクレオチド、炭水化物、補因子及び小分子薬物などの露出した表面上のチオール基の相対希有性は、表面結合したマイケル受容体への直接マイケル付加による、表面上のこのような物質の不動化の選択性に有利に働く。
【０１０１】
従って、共有結合形成する反応基がマイケル受容体であるような本発明の態様に従い機能性有機分子を不動化するために、この機能性有機分子は、チオール基により官能基化されても良い。機能性有機分子は、共役炭素-炭素二重結合により官能基化することもできる。この態様において、反応工程は、マイケル受容体と共役炭素-炭素二重結合の間の付加環化反応に関連している。
【０１０２】
マレイミドのようなマイケル受容体は求ジエン体として挙動するので、単層チオラート部分は、ディールスアルダー又は他の付加環化反応により、共役炭素-炭素二重結合を有する機能性有機分子を共有的に不動化するために使用することができる。付加環化による不動化は、ペプチド、ポリペプチド、炭水化物、オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオシドを不動化する高度に化学選択的方法であり、その理由はこれらの生体分子においてジエニルは天然の官能性ではないからである。結果的にこのような天然の生体分子は、ジエンにより誘導体化されなければならない。ペプチド及びポリペプチドは、その側鎖上のアミノ酸を生じるジエニル基による鎖伸長により、ジエニル基で誘導体化することができる。共役炭素-炭素二重結合を含むための機能性有機分子の誘導体化については豊富な文献がある。オリゴヌクレオチド及びポリペプチドのジエンによる誘導体化を目的とした開示を伴う特許／刊行物の組合せは、米国特許5,843,650号及び国際公開公報第98/30575号があり、これらは本願明細書に参照として組入れられている。同じくBergstromら、J. Am. Chem. Soc.、100:8206 (1977)も参照のこと。
【０１０３】
化合物をチオール化する多くの技術が、当該技術分野において公知である。全般的には、Hermanson, G.T.、Bioconjugate Techniques (Academic Press社：ニューヨーク、1996)を参照のこと。例えば、ほんの数例を挙げると、Traut試薬、N-スクシンアミジル-S-アセチルチオアセテート(SADA)、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)/DTT、CMPT、N-アセチルホモシステインチオールアセトン、及びS-アセチルメルカプト無水コハク酸を使用し、遊離アミン基は、チオールを生じる置換基で置換することができる。場合によっては、直接生成物は、遊離のチオールを示すために加水分解しなければならないチオアセテートである。アルデヒド及びケトンは、2-アセトアミド-4-メルカプト酪酸無水物(AMBH)により、チオール化することができる。カルボン酸は、シスタミンとのジイミド(例えば、EDC)カップリング、その後のジスルフィド結合の還元により、N-(2-チオエチル)アミドに誘導体化することができる。生物学的システムにおいて使用するための一般的な弱いS-S結合還元剤は、メルカプトエタノール、2-メルカプトエチルアミン(2-MEA)、DTT、ジチオエリスリトール(DTE)及びNaBH4がある。ジイミドが触媒したシスタミンカップリングも、オリゴヌクレオチドのリン酸基へのチオール基の結合に使用することができる。シスタミンは、酸素の代わりにリンへ直接結合する。次にシスタミンは、還元的に切断され、チオールを示す。化合物のチオール化のこれらの及び他の手法は周知であり、及びBioconjugate Techniquesなどの当業者に公知の参考文献において入手可能である。
【０１０４】
別の態様において、オリゴペプチド、ペプチド又はポリペプチドは、システインへのカップリングにより、都合良く誘導体化することができる。タンパク質のリガンドを介した間接的不動化は、チオール化反応を可能にし、必要ならば例えば、巨大なタンパク質又はオリゴヌクレオチドよりも恐らく官能性の干渉が少ないであろう小分子上で行われる。従って、このようなリガンドは、例えば、先に説明した方法に従い、チオールで誘導体化することができる。小分子のチオール化に良く適合されるチオール化の技術は、その分子のビニル置換基による最初の誘導体化が関連している。例えば、このリガンドがアミン又はヒドロキシルのような弱い求核置換基により提供されるならば、ビニル基は従来のようにハロゲン化アリル又はスルホネートとの反応により導入される。その後このビニル基は、チオ酢酸と遊離ラジカル条件下で反応され、ビニル基にチオアセテートを付加する。加水分解によるアセテート基の除去は、どのR基がビニル基上にあるかに応じて、3-チオプロピル置換基又は2-チオールエチル置換基のいずれかをそのリガンド上に残す。
【０１０５】
炭水化物は、チオール-含有アグリコンとも称される。不動化に適した適当な炭水化物誘導体は説明されており、もしくは当業者は容易に調製することができる。例えば、Liangら、PNAS、97:13092-96 (2000)；Koranら、PNAS、96:11782-86 (1999)参照。
好ましい方法において、炭水化物は、単層表面上の共有結合形成する反応基(例えばマレイミド)と反応するであろうチオール化学タグを有するように誘導体化される。この方法において、連結化学は選択的であり、従って炭水化物上の又はその内部の官能基との非-特異的化学反応が発生しないことを確実にすることを助ける。このような選択的連結化学は、炭水化物の配向した不動化を生じる。これは、例えば、不動化した炭水化物に対する特異的タンパク質結合を試験する場合に利点であり、その理由は炭水化物との全ての結合相互作用は、炭水化物との特異的タンパク質結合の結果であり、非特異的結合に起因しないからである。
【０１０６】
本発明の好ましい態様において、チオール化学タグは、下記の方法で作成される。不動化されるべき炭水化物は、還元末端にn-ペンテニル基を有する過アセチル化された糖質の、チオールアセテート誘導体への転換により誘導される。図10を参照のこと。チオアセテート糖は、好ましくは酸素非存在条件下でケン化され、中和後、還元末端にチオール基を含む完全に脱保護された炭水化物(以後、チオール-炭水化物と称す)を生じる。
このチオール-炭水化物は、マレイミドを提示しているSAMの単層へ共有的に結合することができる。図11参照。好ましくは、マレイミド提示しているSAMは、不活性トリ(エチレングリコール)マトリックス内に約0.1〜約50％の密度でマレイミドを含む。より好ましくは、マレイミド密度は約1％〜約10％である。
【０１０７】
完全な不動化反応を確実にするために、溶解したチオール-炭水化物及びSAMを含有する溶液は、約1時間インキュベーションされる。好ましくはこの溶液中のチオール-炭水化物は、濃度が約0.01mM〜約100mMである。より好ましくは、チオール-炭酸塩(carbonate)の濃度は、約0.1mM〜約5mMである。最も好ましくは、チオール-炭水化物は濃度約1mMである。
この誘導体化反応は、メタノール又は水のような溶媒中において行われ、並びに好ましくはpH範囲が約pH4〜約pH10で行われる。使用される溶媒は、好ましくはメタノール又は水である。より好ましくは、pHは約5〜約8である。最も好ましくは、pHは約6.0である。最適な温度範囲は、約0℃〜約60℃である。より好ましくは、最適温度範囲は、約10℃〜約40℃である。誘導体化反応後、この表面は、好ましくは水及びエタノールで洗浄され、並びに窒素流れ下で乾燥される。
炭水化物の不動化を提供することにより、本発明は、炭水化物-ベースのアッセイ表面を提供する。例えば、グリコシルトランスフェラーゼアッセイのような、様々な酵素アッセイにおいて、不動化されたチオール-炭水化物を使用することができる。図12及び実施例4を参照のこと。
【０１０８】
図12を参照し、グリコシルトランスフェラーゼアッセイにおいて、様々な炭水化物を、マレイミド基を生じる単層チオラートに結合したチオール化学タグを用いて不動化した。グリコシルトランスフェラーゼ酵素は、不動化した炭水化物に添加した。放射標識した糖質を不動化した炭水化物に付加するこの酵素の能力を測定した。グリコシルトランスフェラーゼアッセイにおいて、使用した酵素は、ウシ組換えβ1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼである。好ましくは、この酵素は、濃度約10pM〜約100uMである。より好ましくは、この酵素は、濃度約100pM〜約1uMである。
放射標識した供与体糖質は、好ましくは約0.1uM〜約1000uMである。好ましくは、この濃度は、約1uM〜約10uMである。グリコシルトランスフェラーゼアッセイのための好ましい温度は、約0℃〜約60℃である。より好ましくは、この温度範囲は、約20℃〜約40℃である。
【０１０９】
グリコシルトランスフェラーゼアッセイにおいて基板上にマレイミドを生じる単層チオラート基の密度は、基板の酵素への接近可能性に関する立体因子により制限される。従って、マレイミドを生じる不動化した単層チオラート基は、約0.1％〜約50％であることが好ましい。より好ましくは、不動化された基質は、約1％〜約10％である。
ベースプレート上に不動化された炭水化物基質のグリコシル化の検出は、放射能測定により行われた。14Cの取込みは、貯蔵リン光体スクリーン(storage phosphor screen)をプレートに露光することにより定量し、その後これをVariable Mode Imager (Typhoon 8600；Molecular Dynamics社、サニーベール、CA)上に造影した。
【０１１０】
更に別の態様において、本発明は、融合タンパク質を混合型単層表面上に不動化することを提供する。この融合タンパク質は、反応基、及び展示タンパク質又はペプチドを含む。この方法は、混合型単層表面を二官能性アフィニティータグ及び融合タンパク質に接触する工程を含む。この混合型単層表面は、最初に共有結合形成する反応基を有する単層部分及び不活性基を生じる第二の単層部分を有する。共有結合を形成する反応基、不活性基及び単層部分は、先に説明されたようなものである。この密度は同じく、先に説明されたように制御及び決定することができる。
【０１１１】
二官能性アフィニティータグは、第一の反応基及び第二の反応基を含み、第一の反応基は、共有結合形成する反応パートナーを有し、第一の単層部分の共有結合形成する反応基と反応する。第二の反応基は、融合タンパク質の反応基と反応するための反応パートナーを有する。この接触工程は、二官能性アフィニティータグの第一の反応基と第一の単層部分の共有結合形成する反応基の間に共有結合を形成し、二官能性アフィニティータグを不動化する。同じく、この接触工程は、二官能性アフィニティータグの第二の反応基と融合タンパク質の反応基の間に会合を形成し、融合タンパク質を不動化する。
【０１１２】
ひとつの態様において、融合タンパク質の反応基はヒスチジンを含み、及び二官能性アフィニティータグの第二の反応基は金属イオンであり、従って融合タンパク質とアフィニティータグの間のイオン的会合が可能であり、不動化化学を提供し、その結果融合タンパク質を不動化する。
更に融合タンパク質の反応基は、抗体であることができる。この態様において、二官能性アフィニティータグの第二の反応基は、この抗体の抗原標的である。この抗体及び標的抗原は、抗体-抗原会合において会合し、融合タンパク質を不動化するであろう。あるいは、融合タンパク質の反応基は、標的抗原であっても良く、及び二官能性アフィニティータグの第二の反応基は、標的抗原を認識する抗体であっても良い。本明細書において使用される抗体は、抗体全体である必要はない。Fab、Fab2、Fv、又はScFvなどのような、抗体断片であってもよい。
【０１１３】
別の態様において、融合タンパク質の反応基はビオチン分子であり、二官能性アフィニティータグの第二の反応基は、アビジン又はストレプトアビジンである。あるいは、融合タンパク質の反応基は、アビジン又はストレプトアビジンであっても良く、並びに二官能性アフィニティータグの第二の反応基は、ビオチンであっても良い。他の公知の結合標的／リガンド会合を使用し、二官能性アフィニティータグの第二の反応基を、融合タンパク質の反応基に結合することができる。
【０１１４】
本発明は、混合型単層表面上に予め定められた密度で融合タンパク質を不動化する更に別の方法を提供する。この融合タンパク質は、融合タンパク質の反応基が共有結合形成する反応基(更に前に説明したような)である以外は、先に説明されたものである。この方法は、先に説明された方法に類似しているが、二官能性アフィニティータグの第二の反応基は、融合タンパク質の共有結合形成する基と反応する共有結合形成する反応パートナーを有する。
前述の方法において、好ましい態様での、融合タンパク質の共有結合形成する基はクテナーゼであり、及び二官能性アフィニティータグの第一の反応基はチオールである。二官能性アフィニティータグの第二の反応基は、p-ニトロフェノールリン酸("PNPP")である。この態様においてPNPPは、クテナーゼに共有的に結合し、融合タンパク質を不動化するであろう。
【０１１５】
前述のように、融合タンパク質は、共有結合形成する基及び展示タンパク質／ペプチド(以後「展示ポリペプチド」と称す)を含む。この共有結合形成する反応基は、先に説明されたものである。この展示ポリペプチドは、不動化される関心のあるペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質である。融合タンパク質のふたつの成分は、組換え技術及び自然の(native)化学連結による(Kentら、米国特許第6,184,344B1号)又は他の当該技術分野において公知の方法のような様々な方法で互いに連結することができる。好ましくは、展示ポリペプチド及び共有結合形成する反応基は両方とも、融合ポリペプチドの各生化学特性を保持している。
【０１１６】
あるいは、融合遺伝子は、自動DNA合成装置を含む、通常の技術により合成されても良い。ふたつの連続する遺伝子断片の間に相補的に重複を生じるアンカープライマーを使用し、引き続きアニーリング及び再増幅され得、キメラ遺伝子配列を生じるようなPCR増幅も有用であることができる。Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology(1987)。展示ポリペプチドの融合部分にインフレームでのサブクローニングを促進する多くのベクターが、市販されている。
【０１１７】
ベクターは、宿主細胞間で又はヌクレオチド配列を発現する手段としてDNAを運搬するために使用される道具である。一部のベクターは、原核細胞においてのみ機能するが、他のものは原核細胞及び真核細胞の両方において機能し、真核細胞において発現するための原核細胞からの大規模DNA調製を可能にする。ヌクレオチド配列又は断片のような関心のあるDNAのベクターへの挿入は、当業者に周知の連結技術及び／又は接合プロトコールにより実現される。このようなDNAは、その組込みがそのベクターに必要な構成要素を破壊しないように挿入される。挿入されたDNAタンパク質の発現に使用されるベクターの場合、導入されたDNAは、その転写及び翻訳を駆動するベクター要素に機能的に連結される。
【０１１８】
ベクターは、ふたつの一般的クラスに分けられる：クローニングベクター及び発現ベクター。クローニングベクターは、適当な宿主細胞における伝播に必須でない領域を伴う複製プラスミド又はファージであり、それに外来DNAを挿入することができ；この外来DNAは、これがベクターの構成要素であるならば、複製及び伝播される。発現ベクター(例えばプラスミド、酵母、又は動物ウイルスゲノム)を使用し、この外来DNAを転写及び翻訳するために、外来遺伝物質を、宿主細胞又は組織へ導入する。発現ベクターにおいて、導入されたDNAは、挿入されたDNAを転写するために、宿主細胞にシグナル伝達するプロモーターのような要素に機能可能に連結される。例えば特異的因子に反応して遺伝子転写を制御する誘導性プロモーターなどの、一部のプロモーターは、並はずれて有用である。誘導性プロモーターに機能的に連結されている特定のヌクレオチド配列又はアンチセンス構築体は、このヌクレオチド配列、もしくは断片、又はアンチセンス構築体の発現を制御することができる。古典的誘導性プロモーターの例は、α-インターフェロン、熱ショック、重金属イオン、糖質コルチコイドのようなステロイド、及びテトラサイクリンに反応するものを含む。他の望ましい誘導性プロモーターは、その構築体が導入される細胞に対し内因性でないが、しかしそれらの細胞において誘導剤が外部から供給された場合には反応するものを含む。
【０１１９】
ベクターは、多くの異なる具現(manifestation)を有する。「プラスミド」は、付加的DNAセグメントが導入され得る環状二本鎖DNA分子である。ウイルスベクターは、付加的DNAセグメントをウイルスゲノムへ受け入れることができる。ある種のベクターは、宿主細胞において自律複製が可能である(例えば、エピソームの哺乳類ベクター又は細菌複製起点を有する細菌ベクター)。他のベクター(例えば、非-エピソームの哺乳類ベクター)は、宿主細胞への導入時に宿主細胞ゲノムに組込まれ、これにより宿主ゲノムと共に複製される。一般に、有用な発現ベクターは、プラスミドであることが多い。しかし発現ベクターの他の形、例えばウイルスベクター(例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス)は、本発明により企図されている。
【０１２０】
特定のヌクレオチド配列(又は断片)を含む組換え発現ベクターは、ヌクレオチド配列に機能的に連結された1種又は複数の宿主細胞-反応性の(又はin vitroにおいて操作することができる)調節配列を利用することにより、ポリペプチドの転写を調節する。「機能的に連結された」とは、ヌクレオチド配列の発現が実現されるように、関心のあるヌクレオチド配列が調節配列に連結されていることを示す。
ベクターは、様々な生物及び／又は細胞へ導入することができる。あるいは、ベクターは、例えば、T7プロモーター調節配列及びT7ポリメラーゼを用い、in vitroにおいて転写及び翻訳することができる。
【０１２１】
ベクター選択は、使用される生物又は細胞及び望ましいベクターの運命により決定づけられる。ベクターは、一旦標的細胞において複製することができるか、もしくは「自殺」ベクターであることができる。一般に、ベクターは、シグナル配列、複製起点、マーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの要素の選択は、ベクターが使用されるであろう生物によって左右され、並びに容易に決定される。これらの要素の一部は、条件が適している場合にスイッチ「オン」される誘導性又は条件(conditional)プロモーターのように、条件付けることができる。誘導性プロモーターの例は、組織-特異性のものを含み、これはある種の細胞型、ステロイド-反応性、又は熱-ショック反応性に対し発現を低下させる(relegate)。lacオペロンのような一部の細菌抑制システムは、哺乳類細胞及びトランスジェニック動物において利用されている(Fieckら、Nucleic Acids Res.、20:1785-91(1992)；Wyborskiら、Environ. Mol. Mutagen、28:447-58 (1996)；Wyborskiら、Nucleic Acids Res.、19:4647-53 (1991))。ベクターは、このベクターを組込んでいるこれらの細胞の同定を促進するために、選択マーカーを使用することが多い。原核細胞と共に使用するための多くの選択マーカーが、当該技術分野において周知である。これらは、通常抗生物質-耐性遺伝子であるか、又は独立栄養性及び栄養要求性の突然変異体である。選択マーカーの例は、アデノシンデアミナーゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ヒドロマイシン-β-ホスホトランスフェラーゼ及びチミジンキナーゼである。
【０１２２】
用語「宿主細胞」及び「組換え宿主細胞」は、互換的に使用される。このような用語は、特定の対象細胞のみではなく、そのような細胞の子孫又は可能性のある子孫も意味する。ある種の修飾が、突然変異又は環境の影響に起因した継代において生じ得るので、このような子孫は、実際、親細胞と同じではないが、依然この用語の範囲内である。
【０１２３】
真核細胞トランスフェクション及び原核細胞形質転換の方法は、当該技術分野において周知である。宿主細胞の選択は、関心のある核酸導入のための好ましい技術を決定し、及び当該技術分野において公知である。技術の例は、塩化カルシウムトランスフェクション、電気穿孔、リン酸カルシウムトランスフェクション、ジエチルアミノエチル(DAEA)-デキストラントランスフェクション、微量注入、プロトプラスト融合、遺伝子銃、ポリエチレングリコール処理などを含む。核酸の生物への導入は、トランスフェクションのin vitro法を使用するex vivo技術に加え、もしあれば特定の生物のために確立された遺伝技術により行ってもよい。
【０１２４】
共有結合形成する反応基として有用なポリペプチドの例は、クテナーゼ及びリパーゼを含む、様々な天然及び合成のエステルを加水分解することが可能である高い相同性の加水分解酵素のクラスを含む。これらは、小さい球形の単量体酵素であり、分子量は2OkD〜3OkDの範囲である。Longhiら、Biochim Biophys Acta.、1441:185-96(1992)；Martinezら、Nature、356:615-8(1992)。これらの酵素の一束(ran)は、広範な範囲の展示ポリペプチドを伴う融合ポリペプチドとして発現される。p-ニトロフェニルホスホン酸("PNPP")は、クチナーゼのための効果的結合パートナーであり、及び先に説明されたような二官能性アフィニティータグの好ましい第二の反応基である(Deussenら、2000b；Martinezら、1994)。本方法において使用するための好ましいシステムについてのいくつかの考察を、ニトロフェニルホスホン酸−クチナーゼ対で行う。この酵素は小さく(2OkD)；結合パートナーによるその阻害速度は迅速であり；これは、E. coli及び酵母の両方において高レベルで発現され；並びに、有機溶媒中であっても、優れた安定性を示す。クチナーゼは、不動化したホスホン酸リガンドにより安定した共有付加体を形成し、これは位置特異性であり及び加水分解に対し抵抗性である。組換え技術を用い、クチナーゼの展示ポリペプチドとの融合体を提供することができる(Bandmannら、2000；Berggrenら、2000)。クチナーゼが表面上の反応性PNPPである場合に、クチナーゼを捕獲ポリペプチドとして有する融合体の展示ポリペプチドは、境界面に良く定義された配向で存在するであろう。
従ってひとつの態様において、二官能性アフィニティータグの第二の反応基は、p-ニトロフェノールリン酸基であり、及びこの融合タンパク質の共有結合形成する基は、クテナーゼタンパク質である。
【０１２５】
本発明は、係属出願(Pealable and Resealable Devices for Biochemical Assays)第101206,074号；第10/206,080号；第10/206,075号；第10/206,590号；第10/206,534号；第10/206,081号において開示された、新規装置及び方法と併用しても良く、これらの出願は全て2002年7月29日に出願されている。これらの出願は、その全体が本明細書に参照として組入れられており、以下に説明される。
【０１２６】
本発明の装置及び方法は、様々なアッセイを行い、並びに様々な相互作用及び事象を検出するために使用することができる。本発明は、ウェル内での生化学的相互作用の発生及び程度を検出するための方法及び装置を提供する。生化学的反応の例は、酵素修飾、例えば表面-結合した基質の切断(例えば、プロテアーゼ、ホスファターゼ、リパーゼ及び／又はトランスフェラーゼによる切断)、付加及び／又は連結(例えば、キナーゼ、リガーゼ及び／又はトランスフェラーゼによる)、再構築(構造修飾)、並びに酸化還元酵素、トランスフェラーゼ、hychrolases、リアーゼ及びリガーゼなどであるが、これらに限定されるものではない他の酵素による修飾を含むが、これらに限定されるものではない。より詳細であるが、依然限定的でない例は、グリコシルトランスフェラーゼ、グリコシダーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ホスホジエステラーゼ、ホスホイノシチド、スルホトランスフェラーゼ、DNA修飾酵素、制限酵素、リガーゼ、ポリメラーゼ、及び非-ペプチド性キナーゼ；他の生化学的修飾(例えば、酵素が関与しない修飾)；結合事象、例えば、抗体-抗原、ホルモン-受容体、タンパク質-タンパク質、小分子-タンパク質、タンパク質-ペプチド結合事象などであるが、これらに限定されないもの；化学修飾、例えば、異性化、酸化及び還元など；並びに、前記事象のいずれかの組合せを含む。
【０１２７】
測定することができる特異的反応の例は、抗体の抗原又はそれらの断片への結合、タンパク質調節ドメインへのタンパク質結合、酵素-基質結合、並びに生体膜構造及びその中に包埋された生体分子(例えば受容体)へのタンパク質結合を含むが、これらに限定されるものではない。本発明の装置及び方法の具体的用途の例は、溶液中の化合物の集合による酵素阻害の決定；酵素基質(フィッシング(fishing)/選択性)の決定、不動化された生体分子(例えば、ペプチド、タンパク質、核酸、抗体、酵素、糖タンパク質、プロテオグリカン、及び他の生物学的物質、更には化学物質)のための結合パートナーの同定、タンパク質-タンパク質、タンパク質-小分子又はタンパク質-受容体結合のインヒビターの同定、酵素群の活性の決定(1個のウェル又は1個よりも多いウェルにおける)、並びに阻害データの作成と同時に行われることが好ましい、酵素又は他の生物学的活性分子のインヒビターの選択性指標の作成を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１２８】
ここで本発明の装置を、図面を参照し説明するが、これは本質的な例であり、いかなる観点においても本発明の範囲を制限する意図はない。
図17は、本発明の実施態様に従う、生物学的物質のアレイ形成のための装置を示す。図17(a)は未組立図を示す一方、図17(b)は組立図を示す。
装置100の要素は、追加的に多くの変形及び態様をとるこができ、そのいくつかは本明細書において説明されており、他のものは本明細書に提供された指針が与えられることで当業者には明らかであろう。これらの図面を通して、類似の要素には、異なる態様に含まれる場合であっても同じ番号を付けた。
【０１２９】
装置100は、ベースプレート110及び取り外し可能な部材140を具備する。ベースプレート110は、上面111を具備する。表面111は、好ましくは金属の層130がオーバーレイされている。層130は、表面131を具備する。層130を形成するのに有用な金属の例は、金、銀、白金、パラジウム、及び銅である。最も好ましくは、層130は金を含む。ある態様においては、表面111は、層130によりオーバーレイされる前に、金属の層120によりオーバーレイされることがある。このような態様において、層120は表面111の上にオーバーレイされ、及び層130は層120の表面上にオーバーレイされる。層120を形成するのに有用な金属の例は、クロム及びチタンを含む。ベースプレート100を形成するために選択された材料に接着することが可能であり及び層130を形成するために選択された他の材料を、層120を形成するために使用しても良い。層120及び／又は130は、浴への浸漬、光化学、及び蒸着などの、当該技術分野において公知の方法を用い、ベースプレート110上にオーバーレイすることができる。
【０１３０】
ベースプレート110を形成するために有用な材料の例は、ポリマー、金属、セラミックス、酸化物などを含む。ベースプレート110は、ガラス、シリコンウエハー(複数)、溶融シリカ、金属フィルム(金、銀、銅、白金など)を単独で含むか、又はポリスチレン、ポリ(メタクリレート)、及びポリカーボネートなどの平坦な表面上に担持することができる。
表面111及び／又は表面131のための好ましい材料は、生物学的に不活性であるか及び／又は非-特異的反応によりタンパク質のような生体分子の吸着に抵抗可能なものである。非-特異的吸着は、関心のある特異的生体分子を不動化する能力及び／又は特異的位置で生体分子を不動化する能力を妨害するので、避けるべきである。
【０１３１】
更に図17を参照し、表面111又は表面131は、そこで修飾された表面とアレイ要素の間に吸着、化学反応、又は物理的相互作用が生じ得るアレイを担持、適応、触媒又は作成を促進するように修飾することもできる。表面111又は表面131は、タンパク質吸着の適応、非-特異的タンパク質吸着の防止、又は細胞付着の促進もしくは抵抗などであるが、これらに限定されないような、特異的界面特性を示すように修飾することもできる。このような修飾の一例は、表面111又は表面131上の自己組織化単層(SAM)の形成である。このような単層は、パターン化される必要はない。しかしこのような単層は、例えば、タンパク質が特異的領域に結合するが、他には結合しないようにパターン化することができる。このようなパターン化は、マイクロ密着焼付けなどの方法により、実現することができる。Andre Bernardら、Langmuir、14(9):2225-2229 (1998)、「Printing Patterns of Proteins」、C.D. Jamesら、Langmuir、14:741-744 (1998)、「Patterned Protein Layers on Solid Substrates by Thin Stamp Microcontact Printing」；M. Mrksich及びG.M. Whitesides、「Using Self-Assembled Monolayers to Understand the Interactions of Man-Made Surfaces with Proteins and Cells」、 Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct.、25:55-78 (1996)を参照のこと。同じく米国特許出願第60/225,363号も参照。同じく混合型SAMを用い不動化したペプチドを例証している、図40も参照。このような修飾は、表面111又は131にシールした取り外し可能な部材140を伴い、又はそのようにシールしていない取り外し可能な部材140を伴わずに行うことができる。
【０１３２】
取り外し可能な部材140は、上面141及び下面142を具備する。取り外し可能な部材140は、複数のウェルオリフィス143を規定している。好ましくは、ウェルオリフィス143は、図17に認めることができるように、空間的に境界が規定されたアレイに配列される。例えば、ウェルオリフィス143の空間的配列及び寸法は、業界標準の6-ウェル、12-ウェル、24-ウェル、96-ウェル、384-ウェル、1536-ウェルプレートの、更には9,600-マイクロウェルプレートのウェル開口部に対応することができる。業界標準のプレートは、生物学、化学、及び薬学産業を通じて、及びこのような分野の研究において通常使用される、容易に入手可能なものである。ウェルオリフィス143は、新規の形状で配列することもできる。従って本発明は、今日の業界標準を利用するのに必要ないずれかの形状を提供し、更に新規形状をデザインするための柔軟性を提供する。
【０１３３】
取り外し可能な部材140は、表面131又は表面111と接触するように配置された場合に、表面131又は表面111と液密シール(fluid-tight seal)を自然発生的に形成することが可能な材料で形成される。取り外し可能な部材140はセルフシールであり、及び取り外し可能な部材140と表面111又は131の間の液密シールは、取り外し可能な部材140が表面111又は131と接触するように配置された場合に取り外し可能な部材140及び表面131又は表面111の外側に接着剤、超音波、熱又は他のシール手段を使用せずに作成される。取り外し可能な部材140は、表面131又は表面111にシールされることが可能であり、その後表面131又は表面111を損傷せず又はその上に残留物を残さずに、それから取り外され(手動又は機械により行うことができる剥離及び持ち上げ(lifting)のような手段により)；表面131又は表面111は、平坦であるか、又は実質的に平面であり、及び取り外し可能な部材140を取り除いた後には実質的に残留物を含まない。代わりの態様において、表面111又は表面131は、非平面であることができる。非平面の表面111又は表面131の例は、例えば、突出部、隆線、凹部ウェル、凸面領域、溝、微小流路などを含む。ある態様において、表面111は、狭い凹部ウェルを有する。取り外し可能な部材140は、表面111又は131に再シールされることも可能であり、及び取り外し可能な部材140と表面111又は131の間の液密シールは、取り外し可能な部材140が表面111又は131と接触するように配置された場合に取り外し可能な部材140及び表面131又は表面111の外側に接着剤、超音波、熱又は他のシール手段を使用せずに作成される。
【０１３４】
取り外し可能な部材140は、表面131又は表面111に再シールされることも可能である。図17から分かるように、ベースプレート110、層120及び130、並びに取り外し可能な部材140は、好ましくは互いに同じフットプリントを有する。「フットプリント」とは、表面111及び131により規定された平面のサイズ及び形状を意味する。好ましくは、取り外し可能な部材140及びベースプレート110、表面111、層130及び／又は表面131は、位置合わせ、又は位置決定機構を具備する。このような機構は、例えば、視覚的、光学的、磁気的、及び／又は機械的位置合わせを促進する構成部品を具備しても良い。位置合わせの他の適当な手段を使用しても良い。このような機構は、例えば視覚的マーカー又は構造的機構を含むことができる。このような位置合わせ手段は、本明細書に示された及び／又は説明された態様毎に例示されていないにも関わらず、好ましくはこのような手段が本発明の態様に存在することが好まれることが多いであろう。
【０１３５】
構造的機構の一例は、位置合わせピンであり、これは好ましくは、表面111、141及び131で規定された平面内の全ての方向において、約200μm以内、好ましくは100μm以内、より好ましくは50μm以内又はそれよりも小さく、この装置の構成部品間の整列を確実にする。位置合わせピンは、例えばベースプレート110と一体化して形成することができ、並びに層120及び／又は130、及び取り外し可能な部材140の位置合わせオリフィスを通して伸び、そこでピン及び位置合わせオリフィスは位置決定し、表面111又は表面131上の取り外し可能な部材140の位置決定及び再位置決定を促進する。別の好ましい例として、位置合わせピンは、前述の構成部品から分離することができ、並びにベースプレート110を通して、層120及び／又は130を通して、取り外し可能な部材140を通して取り外しできるように挿入することができ、ここでこのピン及び位置合わせオリフィスは、表面111又は表面131上の取り外し可能な部材140の位置決定を促進するように配置される。このような取り外し可能なピンは、表面111又は表面131上の取り外し可能な部材140の位置決定後取り外すか、もしくはこれらは取り外し可能な部材140の取り外しが望ましくなるまで位置合わせオリフィスに留めることができる。位置合わせピンを有する追加の例証的態様は、図31に示されている。
【０１３６】
図17、特に図17(b)に示されているように、取り外し可能な部材140が、表面131又は表面111にシールされている場合は、複数のウェル145が形成される。ウェルのオリフィス壁144は、ウェル側面145を形成し、並びにウェル底147は、表面131又は表面111により形成される。ウェル145の空間的配列及び形状は、ウェルオリフィス143の空間的配列及び形状に対応している。ウェル底147の空間的配列及び位置は、表面142により規定された平面中のウェルオリフィス143の空間的配列及び寸法に対応している。取り外し可能な部材140が表面111又は131にシールされているか又はシールされていないかには関わらず、ウェル底147は、サイズ、形状、及び空間的配列が一定であることは理解されるであろう。従って取り外し可能な部材140が表面111又は131にシールされているか又はシールされていないかには関わらず、ウェル底147は、表面142により規定された面のウェルオリフィス143の空間的配列及び形状に相当している、表面111又は131の一部を説明するように、本明細書において使用される。
【０１３７】
ある態様において、ウェル壁144を、物質、特に生体分子の結合を阻害する物質で被覆することは望ましいことがあり、その結果ウェル底147上に不動化されるようにウェル145に沈着されている物質は、ウェル底147に不動化され、ウェル壁144には不動化されないであろう。適当な物質の例は、不活性SAMを含み、これは更に本明細書において考察され及び当該技術分野において公知である。
【０１３８】
取り外し可能な部材140は、表面131又は表面111からの取り外しの間に損傷を受けず、分解せず及び複数の試験において使用されることにより容易に損傷を受けないのに十分くらい頑丈であることが好ましく、従って本発明の取り外し可能な部材は、1回のアッセイ期間中に複数回表面から取り外しし及びそれに再シールするように、もしくは複数回のアッセイにおいて使用するように、シールすることが可能であるが；しかし、これは必要とはされてはいない。頑丈さの程度が変動する取り外し可能な部材140は、本発明に包含されており、並びに取り外し可能な部材140の組成は、頑丈さと接着特性、レジリエンス及び厚さのような他の特性の間の望ましい平衡を達成するように、当業者により調節することができる。この望ましい特性は、用途で異なるであろう。
【０１３９】
取り外し可能な部材140の二次加工に有用な材料の例は、コポリマー又はポリマーを含み、最も好ましくはウレタン、ゴム、熱可塑性ゴム、成形されたプラスチック、ポリメチルメタクリレート(PMMA)、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン(TEFLON(商標))、ポリ塩化ビニル(PVC)、ポリジメチルシロキサン(PDMS)、ポリスルホン、シロキサン、ポリアミドなどを含む。このような材料は、それらの製造の容易さ、低コスト及び廃棄性、更には最も極端な反応条件に対するそれらの一般的不活性に関して好ましい。このような材料は、透明性、蛍光及び反射のような、光学特性を変更するために、着色した充填剤を含有しても良い。このような変更は、ある装置による検出を増強するために望ましいことがあり、及び熟練した使用者により理解されるように、装置及びアッセイに従い変動するであろう。
【０１４０】
取り外し可能な部材140は、射出成形、レリーフ成形、型押又は打抜き、又は型内での高分子前駆材料の重合のような、周知の成形技術を用い、二次加工された原型から製造することができる。原型は、機械加工、マイクロ機械加工、ホトリソグラフィー、射出成形、レリーフ成形、型押及び打抜きのような、適当な技術により、二次加工することができる。多くのこのような技術は、当該技術分野において公知である。Xia, Y.及びWhitesides, G.、Angew. Chem. Int. ed.、37:550-575 (1998)を参照し、これは本明細書に援用される。
【０１４１】
多くの態様において、取り外し可能な部材140は、規格準拠した(compliant)柔軟な材料で製造される。このような態様において、図17(a)に例示されたように、取り外し可能な部材140を、より頑丈な支持的部材150によりオーバーレイすることが望ましいことがある。支持的部材150は、取り外し可能な部材140中のウェルオリフィス143にサイズ及び空間的配列が対応しているウェルオリフィス151を規定することができる。このような態様において、装置100が、支持的部材150と共に集成された場合、支持的部材150は、ウェル145の深度を、支持的部材150を伴わずに集成された装置100と比べ増大するが、ベースプレート110の表面111により規定された平面のウェル145の形状又は配向は変更しないであろう。
【０１４２】
ベースプレート110は、生体分子、金に接着することが可能である適当な材料、及び／又は金もしくは生体分子の接着を促進する表面処理により形成されても良い。例は、ガラス、シリコン、並びにポリスチレン及びポリカーボネートのようなプラスチックを含む。ベースプレート110は、平坦又は非-平面であることができる。好ましくは、ベースプレート100は、平坦かつ硬質である。ある態様においては、ベースプレート110は、非-平面であり、例えばベースプレート100は、凹もしくは凸形であるか、又は表面111上に、突出部、隆線、凹部ウェル、凸面領域、溝、流路などを有することができる。ベースプレート110は、適当な方法を用いて二次加工することができる。多くのこのような方法が、当該技術分野において公知である。例証的方法は、取り外し可能な部材140を製造するために使用することができるものを含む。
【０１４３】
支持的部材150は、取り外し可能な部材140へ支持体を提供することが可能であり及び望ましい形状及びサイズで形成することが可能であるような材料から製造することができる。支持的部材150がウェルオリフィス151を規定するような態様において、支持的部材150は、そこに形成された望ましいサイズ及び配向のウェルオリフィスを有することに加え、前述の必要要件に合致することが可能である材料から製造される。支持的部材150は、取り外し可能な部材140の二次加工に関して先に説明された方法に加え、他の適当な方法により二次加工することもできる。
【０１４４】
支持的部材150は、取り外し可能な部材140に永久に又は取り外し可能に取付けることができる。支持的部材150が取り外し可能な部材140に永久に取付けられる場合、支持的部材150は、ウェルオリフィス151を規定することが好ましい。支持的部材150が取り外し可能である場合、ウェルオリフィスを伴わずに取り外し可能な部材140が二次加工されることが望ましいことがある。
【０１４５】
更に図17を参照し、支持的部材150は、好ましくは、取り外し可能な部材140に接着することが可能な材料で形成される。接着は、取り外し可能な部材140及び支持的部材150の外側に、接着剤、超音波、熱又は他のシール手段の使用を伴う又は伴わずに実現することができる。しかしこのような態様において、支持的部材150は、好ましくは、取り外し可能な部材140に接着することが可能であり、その後取り外し可能な部材140に損傷を与えず又はその上に残留物を残さずにそこから取り除くことができる。このような態様において、支持的部材150は、好ましくは、取り外し可能な部材140に再シールすることが可能である。このような態様において、支持的部材150は、好ましくはガラスを含み、及び金のような金属で被覆することもできる。接着の程度が変動する取り外し可能な部材140は、本発明に包含されており、及びこの取り外し可能な部材140の組成は、接着特性とレジリエンス及び厚さのような他の特性の間の望ましい平衡を実現するように、当業者は調節することができる。望ましい特性は、用途で変動するであろう。
【０１４６】
好ましくは、支持的部材150(存在するならば)、取り外し可能な部材140、ベースプレート110、表面111、層130及び／又は表面131は、位置合わせ、又は位置決定の機構を具備する。このような機構は、例えば視覚的、光学的、磁気的、及び／又は機械的位置合わせを促進する構成部品を具備することができる。このような機構は、視覚的マーク、構造的機構などを具備することができる。構造的機構の一例は、位置合わせピンであり、これは好ましくは、表面111、141及び131で規定された平面内の全ての方向において、約200μm以内、好ましくは100μm以内、より好ましくは50μm以内又はそれよりも小さく、この装置の構成部品間の整列を確実にする。位置合わせピンは、ベースプレート110と一体化して形成することができ、並びに層120及び／又は130、及び取り外し可能な部材140及び支持的部材150の位置合わせオリフィスを通して伸びており、そこでピン及び位置合わせオリフィスは位置決定し、表面111又は表面131上の取り外し可能な部材140及び／又は支持的部材150の位置決定及び再位置決定を促進する。図18に例証された別の好ましい例として、位置合わせピンは、前述の構成部品から分離することができ、並びにベースプレート110を通して、層120及び／又は130を通して、取り外し可能な部材140を通して取り外しできるように挿入することができ、ここでこのピン及び位置合わせオリフィスは、表面111又は表面131上の取り外し可能な部材140の位置決定を促進するように配置される。このような取り外し可能なピンは、表面111又は表面131上の取り外し可能な部材140及び／又は支持的部材150の位置決定後に取り外されるか、もしくはこれらは取り外し可能な部材140の取り外しが望ましい時までその場に留めることができる。図17に提供された例である支持的部材150を具備する態様において、この支持的部材は、取り外し可能な部材140のそれに対応する位置合わせオリフィスを規定することができ、この支持的部材中の位置合わせオリフィスを、表面141上の支持的部材の位置決定の促進に使用することができる。図18は、位置合わせピンを具備する本発明の装置を示す。図18(a)は、本発明の態様に従う分析装置200の未組立図を示す一方で、図18(b)は、組立図を示す。装置200は、図17の装置100に非常に類似しており、ベースプレート110、層120、層130、及び複数のウェルオリフィス143を規定している取り外し可能な部材140を具備する。取り外し可能な部材140は、同じく位置合わせオリフィス160、170、及び180も具備する。ベースプレート110は、位置合わせオリフィス152、162、及び172を具備する。層120及び130は、ベースプレート110の上にオーバーレイされ、位置合わせオリフィス152、162、及び172は開放されたままである。
【０１４７】
位置合わせピン151、161、及び171、位置合わせオリフィス160、170、及び180、並びに位置合わせオリフィス152、162、172は、互いに関連する大きさであり、並びに表面141、131、及び111により規定された平面の全ての方向において200μm以内の、好ましくは100μm以内の、より好ましくは50μm以内又はそれよりも小さい装置の構成部品間の整列を確実にするような、互いの関係で表面111、131、及び141により規定された平面に間隔をあける。
【０１４８】
図18に示した態様において、位置合わせオリフィス160及び162は、表面141、131、及び111で規定された平面において、実質的に同じ形状及びサイズである。位置合わせオリフィス152及び172は、表面141、111、及び131で規定された平面において伸長し、一方の軸は他方よりも長く、位置合わせオリフィス162の長軸は、オリフィス172の長軸に対して垂直である。このような伸長(elongation)は、この装置の配置及び集成を促進するために役立ち得る。位置合わせオリフィス162及び172の伸長した軸は互いに平行であるので、正確な位置合わせが依然提供され、ずれが避けられる。位置合わせオリフィス152及び172は、長方形であることができるが、好ましくは楕円であり、位置合わせオリフィス152の短軸は、位置合わせオリフィス180の直径の長さとほぼ等しく、並びに位置合わせオリフィス172の短軸は、位置合わせオリフィス170の直径の長さとほぼ等しい。位置合わせオリフィス180、160、170、152、162、及び172は、位置合わせピン151、161、及び171のサイズ及び形状に関連して表面141、131、及び111の平面のサイズ及び形状であり、その結果、表面111、141、及び131により規定された平面の全ての方向において200μm以内の、好ましくは100μm以内の、より好ましくは50μm以内又はそれよりも小さい装置の構成部品間の整列は、位置合わせピンを位置合わせオリフィス内に配置した時に確実になる。
【０１４９】
更に図18を参照し、位置合わせピン151、161、及び171は、表面111、131、及び141の面に対して垂直な長さ(L)であり、その結果ピンは、ベースプレート110の底面から、上面141まで伸びている。位置合わせピン151、161、及び171は、位置合わせオリフィス180、160、170、152、162、及び172に関連して表面111、131、及び141で規定された平面のサイズ及び形状であり、その結果、表面111、141、及び131により規定された平面の全ての方向において200μm以内の、好ましくは100μm以内の、より好ましくは50μm以内又はそれよりも小さい装置の構成部品間の整列は、位置合わせピンを位置合わせオリフィス内に配置した時に確実になる。
【０１５０】
図18に見ることができるように、位置合わせピン151、161、及び171は、取り外し可能な部材140が表面131と接触するように配置される前に、オリフィス180、160、及び170に配置されることが好ましく−このような集成法において、取り外し可能な部材140は表面131と接触するように配置されるので、位置合わせピン151、161、及び171は、オリフィス152、162、及び172へ配置される。あるいは、取り外し可能な部材が表面131と接触するように配置される前に、位置合わせピン151、161、及び171を、オリフィス152、162、及び172へ配置することができ−このような集成法において、取り外し可能な部材140は表面131と接触するように配置されるので、位置合わせピン151、161、及び171は、オリフィス180、160、及び170へ配置される。前述の集成法は、表面131上に既に不動化された生体分子のような物質のパターンと、取り外し可能な部材140を並置することが望ましい装置の使用又はこの装置を使用する方法の工程にとって特に望ましい。物質が依然表面131上に不動化されていない又は物質が均一な層に不動化されているような装置の使用又はこの装置を使用する方法の工程のような別の場合には、取り外し可能な部材140を、表面131と接触するように配置し、次に位置合わせピン151、161、及び171をオリフィス180及び152、160及び162、並びに170及び172に配置することが望ましいことがある。
【０１５１】
本明細書に開示されたように、本発明の装置は好ましくは、表面111、141、及び131により規定された平面の全ての方向において200μm以内の、好ましくは100μm以内の、より好ましくは50μm以内又はそれよりも小さい装置の構成部品間の整列を確実にすることが可能である位置合わせ手段を具備する。熟練した使用者には明らかであるように、図18に示された態様は、本発明の装置において有用である位置合わせオリフィス及びピンの配列の単なる一例である。
別の例として、位置合わせピンに関連して一方の軸上で伸長している位置合わせオリフィスを、取り外し可能な部材内に配置することができ、及びそのようには伸長していない対応する位置合わせオリフィスは、ベースプレート及びその上のいずれかの層内に配置することができる。
【０１５２】
本発明の位置合わせピンは、好ましくは、ピンが位置合わせ孔に挿入された場合に、ピンのたわみを避けるのに十分であり、並びに本発明の取り外し可能な部材とベースプレート、又はその上のコーティングもしくは表面の間の界面で規定された平面中の本発明の装置の構成部品の偏りを防ぐのに十分であるような剛性を提供するような材料、及び製造法により形成される。位置合わせピンは、いずれか適当な技術により製造することができ、その多くは当該技術分野において公知である。適当な方法の例は、本発明の取り外し可能な部材の二次加工について本明細書において説明されたものを含む。本発明の位置合わせピンは、好ましくは取り外し可能な部材とベースプレート、又はその上のコーティングもしくは表面の間の界面に垂直な面における長さに二次加工され、これは取扱いを容易にするのに十分である。
本発明の取り外し可能な部材のシール可能で、取り外し可能で、及び再シール可能な特性は、本発明の装置を用いて行われたアッセイ並びにアッセイ結果の読取り、観察及び測定の両方の性能を促進する。
【０１５３】
関心のある物質は、表面111又は131上に不動化することができる。関心のある物質は、生体分子のような生物学的物質、有機分子、及び細胞を含む。不動化することができる生物学的物質のより具体的な例は、タンパク質、核酸、抗体、生物学的-活性のある小分子、酵素、糖タンパク質、ペプチド、プロテオグリカン、及び他の生物学的物質に加え、化学的又は生化学的物質を含む。様々な物質の不動化に関する表面化学も、当該技術分野において公知である。ひとつの好ましい例は、金の上にアルカンチオールを含む自己組織化単層(SAM)を介した不動化である。
【０１５４】
図17に示されたように、ウェルオリフィス143の壁144は、表面141及び142に対して、実質的に垂線(normal)(すなわち、約88°〜約92°)である。あるいは、ウェルオリフィス143の壁144は、表面141及び142と鈍角又は鋭角を形成することができる。
【０１５５】
図19は、図17の装置100と非常に類似しており、並びにベースプレート110、層120、層130、及び複数のウェルオリフィス143を規定している取り外し可能な部材140を具備している。図19は、ウェルオリフィス143の壁144が表面141及び142と鈍角又は鋭角を形成することができるような態様の横断面図を示している。図19に示されるように、壁144は、表面141及び142と角度を形成し、壁144は、表面141と鈍角(A)を及び表面142と鋭角(B)を形成し、その結果壁144は、ウェルオリフィス143に関して下方内部へと細くなり、ウェル145は、倒立した先端が切断された角錐の形状である。好ましくは壁144は、ウェルオリフィス143に関して内部へと細くなる。細くなる程度は、特定の用途について望ましいように調節することができる。壁144が細くなる場合、ウェルオリフィス143のサイズは、表面141の平面、表面142の平面及び中間の平面の間で変動することは理解されるであろう。
【０１５６】
生物学的物質をパターン化する方法は、当該技術分野において公知であり、更に本明細書において考察されている。例えば、生体分子は、手作業によるミクロピペッティング又は自動化されたミクロピペッティング装置の使用を介して、ソフトリソグラフィーを介して、表面上にパターン化された選択的SAMへの結合により、及び他の適当な当該技術分野において公知の方法によりパターン化することができる。望ましい結果を実現するために、2種又はそれよりも多いパターン化法を組合わせることが好ましいことが多い。Xia, Y.及びWhitesides, G.、Angew. Chem. Int. ed.、37:550-575 (1998)を参照し、これは本明細書に参照として組入れられている。同じくAlbert Folch及びMehmet Toner；Annu. Rev. Biomed. Eng.、第2巻(2000年)、227-56頁、「Microengineering of Cellular Interactions」も参照のこと。
【０１５７】
本発明の装置及び方法は、不動化した物質の他の物質、特に溶液中の物質への曝露を必要とするアッセイ性能を促進する。不動化した物質の生体分子(例えば、関心のある酵素又は抗体)の曝露、洗浄、化学物質との反応、試薬への曝露、不動化した物質の固定、シグナル分子の添加(例えば抗体、蛍光分子、呈色分子、特定の化学物質に曝露した場合に呈色する分子、特定の化学物質に曝露した場合に蛍光となる分子)、並びに非呈色から呈色へ又は非蛍光から蛍光へと変化を引起こす物質(「発色剤」)へのシグナル分子の曝露などが集合的に「プロセス工程」と称される。蛍光色素の例は、Cy3、Cy5(Amersham社、英国)、及びDELFIA-ベースの標識を含む。生体分子、シグナル分子などは、溶液中に存在することが好ましい。
【０１５８】
表面111又は131上に不動化された全ての物質についてプロセス工程又は検出工程を同時に行うことが望ましい場合、取り外し可能な表面140は取り外すことができ、並びに望ましいプロセス工程又は検出工程は、表面111又は131の全体で一度に行うことができる。表面111又は131上に不動化された全ての物質について行われるプロセス工程は、「バルクプロセス工程」と称される。
バルクプロセス工程として行うことができる他のプロセス工程の例は、洗浄液、試薬溶液、生体分子溶液中の浴技術による含浸；物質の抗体溶液とのインキュベーション；未結合の抗体又は他の物質を除去するための洗浄工程；不動化された物質を固定するための固定工程；シグナル分子の添加、又はシグナル分子の、それらに例えば非-呈色から呈色もしくは非-蛍光から蛍光へのような変化を生じるような物質(例えば「発色剤」)への曝露のような発色工程；光が補助する化学などを含むが、これらに限定されるものではない。
【０１５９】
このようなバルクプロセス工程も、自動化することができ、従って速度及び効率がより一層増大する。例えば、浴は自動化することができ、及び多くの装置を連続してプロセスすることができる。非限定的例として、生体分子のような被験物質を、表面111又は131全体に一度に適用することができる。試薬、洗浄液、及び／又は生体分子を、各ウェル底147に不動化された物質に同時に適用することができ；従って、ウェル底147に不動化された全ての物質は、各個別のウェル145にピペッティングすることを必要とせずに、試薬又は生体分子に同時に洗浄又は曝露することができる。このような適用は、不動化された物質全てを、1種又は複数の溶液、試薬又は洗浄液などに曝露することが望ましい場合に、特に有用である。
【０１６０】
不動化された物質の条件又は状態は、望ましいいずれかの時点で、検出、観察、読取り、記録などすることができる。例えば、不動化された物質の関心のある試薬(複数)への曝露工程を含むアッセイにおいて、このアッセイの結果は、望ましい曝露後に観察することができる。このような検出、観察、測定、記録、読取りなどは、集合的に「検出工程」と称される。
【０１６１】
本発明の装置は、測定される項目が邪魔のない平坦な表面(すなわち、平坦な表面から垂直に突き出している部分を含まない、及び好ましくは本発明の取り外し可能な部材由来の粒子又は残留物を実質的に含まない、実質的に平面の表面)上にある場合にのみ機能する、又はより良く機能する機器の場合、状態などを観察するために特に有用である。このような機器の例は、顕微鏡(明視野顕微鏡、位相差顕微鏡、及び落射照明蛍光顕微鏡を含むが、これらに限定されるものではない)、MALDI(マトリックス支援レーザー脱離イオン化)質量分析(これはApplied Biosystems社のような商業的供給業者から入手できる)、ELISA-組合せたドキュメントスキャナー、表面プラスモン共鳴(SPR)センサー(これはBiacore社、GWC社、Texas Instruments社及びLeica社などの商業的供給業者から入手できる)、フラットベッド式レーザー共焦点スキャナー(これはFuji社、Biorad社及びMolecular Dynamics社などの商業的供給業者から入手できる(利用可能な機器の例はTyphoonを含む))、フラットベッド式スキャナー(共焦点フラットベッドレーザースキャナーを含むが、これらに限定されるものではない)、比色スキャナー、蛍光スキャナー、リン光スキャナー(これはとりわけ、放射性同位元素のフラット方式リン光-ベースの造影において有効であり、DNAアレイの読取りに通常使用され、これはAffyrnetrix社及びAgilent社などの商業的供給業者から入手できる)、並びに走査型プローブ顕微鏡(走査型電子顕微鏡(SEM)及び原子間力顕微鏡(AFM))を含むが、これらに限定されるものではない。更に別の放射性シグナル分子が使用される例として、リン光基質を、本発明の装置の表面(図17の表面111又は131など)に配置することができ、発色を可能にする。
【０１６２】
プロセス工程及び／又は検出工程は、例えば通常のマイクロタイタープレートリーダーを使用し、取り外し可能な部材140が表面111又は131にシールされる場合に行うこともできることは認められるであろう。
プロセス工程及び／又は検出工程の後、取り外し可能な部材140は、表面111又は表面131上に再シールし、ウェル145を再形成することができる。ウェル145が再形成される場合は、追加のプロセス工程を、ウェル底147上に不動化された物質に個別に行うことができる(及び、検出工程を行うことができることは理解されるであろう)。取り外し可能な部材140を表面111又は131にシールし、及び物質を不動化し、及び／又は個別のウェル底(複数)147上に不動化された物質に工程を行うこと；取り外し可能な部材140を取り外し、及び個別のウェル底(複数)147に不動化された物質にプロセス工程又は検出工程を行うこと；並びに、取り外し可能な部材140を、表面111又は113に再シールし、及び個別のウェル底(複数)147に不動化された物質に工程を行うサイクルを、望ましい限り複数回反復してもよい。
【０１６３】
図20は、本発明の態様を示している。図20の装置400は、図17の装置100に非常に類似しており、ベースプレート110、層120、層130、及び複数のウェルオリフィス143を規定している取り外し可能な部材140を具備している。図20において、取り外し可能な部材140は、表面131にシールされ、及び関心のある物質は、ウェルオリフィス143により規定される空間パターンで表面131上に不動化される。より詳細に述べると、関心のある物質のウェルオリフィス143への適用により、関心のある物質491-496は、ウェル底147上に不動化される。ウェル底147上に不動化された物質491-496を伴う装置400で、表面131にシールされた取り外し可能な部材140を伴うものを図20(b)に、及び取り外し可能な部材140を取り外したものを図20(c)に示した。
【０１６４】
物質のオリフィス、又はウェルへの沈着法は、当該技術分野において周知であり、並びにピペッティング、マイクロピペッティング、及び自動アレイヤーの使用などの、手作業及び自動化技術の両方を含む。不動化された物質491-496は同じであるか又は互いに異なることができ−従って、各ウェル底147上に不動化された物質は、ウェル底147間で同じであるか又は変動することができる。これは図20において例示されてはいないが、関心のある物質の1種より多く(物質491-496の2種又はそれよりも多い組合せなど)を、単独のウェル底147に不動化することができる。装置400は、本明細書においてより詳細に説明するもののような、アッセイ及び方法を行うために使用することができる。
【０１６５】
取り外し可能な部材140は、プロセス工程及び／又は検出工程を行うために、関心のある物質の不動化後取り外しても良く(図20(c)に示されたように)、もしくはその場に留めても良い(図29(b)に示されたように)。取り外し可能な部材140をその場に留める態様において、プロセス工程及び／又は検出工程は、ウェル内で行うことができ、その結果ウェル間で変動することができ、多くの異なるプロセス工程及び／又は検出工程を不動化された物質に行うことが可能になる。取り外し可能な部材140は、表面111又は131上に不動化された全ての物質にプロセス工程を同時に行うことが望ましい場合はいつでも、取り外すことができる。取り外した後、各ウェル145に不動化された物質にプロセス工程を個別に行うことが望ましい場合はいつでも、取り外し可能な部材140を、表面111又は131上に再シールすることができる。
【０１６６】
別の態様において、関心のある物質は、表面111又は131にシールされた取り外し可能な部材140を伴わずに、表面111又は表面131上に不動化することができ、その後取り外し可能な部材140を、物質を不動化した後に、表面111又は表面131にシールすることができる。このような方法及びそれにより形成された装置は、図21に例示している。図21の装置500は、図17の装置100に非常に類似しており、並びにベースプレート110、層120、層130、及び複数のウェルオリフィス143を規定する取り外し可能な部材140を具備する。
【０１６７】
図21(a)は、表面131にシールされた取り外し可能な部材140を伴わない、本発明の装置を示している。図21(b)の態様において、関心のある物質590は、取り外し可能な部材140を使用していない表面131上に不動化される。図21に例示された本発明の態様において、ウェルオリフィス143を有する取り外し可能な部材140は、図21(c)に示されたように、関心のある物質590の最上層表面131にシールされる。関心のある物質590の複数の個別の領域595は、ウェルオリフィス143により隔離される。領域595は、取り外し可能な部材140と表面131の間に形成された液密シールにより互いに隔離され、及び取り外し可能な部材141の上からウェルオリフィス143を介してアクセス可能である。
液密シールの使用は、プレートの表面全体が個別の領域595へと再生可能に修飾されることを可能にし、これは剛性プレートにおいては、各ウェルに液体をピペッティングすることを伴わずに達成することはできず、従ってこれらのウェル内で夾雑する可能性がある。
【０１６８】
装置500は、本明細書においてより詳細に説明されたもののような、アッセイ及び方法を行うために使用することができる。追加の物質を、取り外し可能な部材140の表面111又は131へのシール時に、ウェルオリフィス143及び表面111又は131により形成されたウェルへ添加することができる。装置500を使用し、本明細書においてより詳細に説明されたもののような、アッセイ及び方法を行うことができる。取り外し可能な部材140は、望ましいように、表面131から取り外し及び再シールすることができる。
【０１６９】
関心のある（着目の）物質が、表面111又は131にシールされた取り外し可能な部材を伴わない表面111又は131に不動化される場合は、図21に例示されたように、単独の物質を表面111又は131に不動化することができる。関心のある物質は、表面111又は131上にパターン化することもできる。例えば、タンパク質又は他の生体分子が特異的領域に結合するが、他には結合しないような自己組織化単層(SAM)は、表面111又は表面131上にパターン化することができる。このような単層は、例えば、ある種のタンパク質がひとつの領域に結合し、他のタンパク質は他の領域に結合し、並びに他の領域はタンパク質が結合しない状態であり続け得るように、パターン化することができる。図22は、本発明のそのような方法及び装置を示している。取り外し可能な部材140は、関心のある物質を不動化した後に取り外すか、又はプロセス工程及び／又は検出工程を行うためにその場に留めることができる。取り外し可能な部材140がその場に留められる態様において、プロセス工程及び／又は検出工程は、ウェル内で実行することができ、その結果ウェル間で変動することができ、多くの異なるプロセス工程及び／又は検出工程を不動化された物質について行うことが可能になる。取り外し可能な部材140は、表面111又は131上の不動化された全ての物質にプロセス工程を同時に行うことが望ましい場合はいつでも、取り外すことができる。取り外した後、取り外し可能な部材140は、各ウェル145内に不動化された物質に対しプロセス工程を個別に行うことが望ましい場合はいつでも、表面111又は131上に再シールすることができる。
【０１７０】
図22に示されたような態様においては、生体分子のような関心のある物質の個別の島が、予め定められた、空間的に規定されたアレイ中に不動化される。各島は、生体分子を実質的に含まない領域により取り囲まれることが好ましい。一般に各島中に生体分子のただひとつの種が不動化されることが好ましいであろう。同じく一般に生体分子を実質的に含まない領域により各々取り囲まれた異なる島中に生体分子の異なる種が不動化されることが好ましく、その結果生体分子島のアレイが形成される。このアレイパターンは、表面111又は131上で2回又はそれよりも多く繰り返すことができ、従って図22において認められるように「1個又は複数のアレイ」を作成する。
【０１７１】
図22は、本発明の「アレイのアレイ」を示し、並びに更に別の本発明の装置及び方法を例示している。図22の装置600は、図17の装置100に非常に類似しており、並びにベースプレート110、層120、層130、及び複数のウェルオリフィス143を規定する取り外し可能な部材140を具備している。この態様において、関心のある物質の個別のパターンのアレイ(複数)は、図22(a)に示されたように、表面131にシールされる取り外し可能な部材140を伴わない表面131上に不動化され、並びにウェルオリフィス143を有する取り外し可能な部材140は、物質が不動化された後、表面131にシールされ、これにより図22(b)に例示されるように、表面131を伴うウェル145を形成する。図22に示された本発明の態様において、文字N、P、R、T、U、V、W、Y、及びZは各々、生体分子の特定の種の島を表わし、N、P、R、T、U、V、W、Y、及びZの各々は生体分子の異なる種を表わしている。取り外し可能な部材140は、表面111又は131上に不動化された物質全てに対しプロセス工程が同時に行われることが望ましい場合にはいつでも、取り外すことができる。取り外した後、取り外し可能な部材140は、各ウェル145中の不動化された物質にプロセス工程が個別に行われることが望ましい場合にはいつでも、表面111又は131上に再シールすることができる。装置600は、本明細書により詳細に説明しているもののような、アッセイ及び方法を行うために使用することができる。
【０１７２】
図22に示されたもののような態様において、取り外し可能な部材140が表面111又は131上にシールされる場合、図22(b)に認められるように、各ウェルオリフィス143は、生体分子を実質的に含まない領域により取り囲まれた少なくとも1個の生体分子の島を包含していることが好ましい。より好ましい態様において、各ウェルオリフィス143は、実質的に生体分子を含まない領域により取り囲まれた生体分子の1個よりも多い島を包含している。
【０１７３】
本発明の装置は、アッセイにおいて使用するために局所的対照領域(local control region)の作成及び使用を可能にするために使用することもできる。図23は、このような局所的対照領域を作成し及び使用する例証的装置を示している。装置700は、図17の装置100に非常に類似しており、並びにベースプレート110、層120、層130、及び複数のウェルオリフィス143を規定している取り外し可能な部材140を具備している。装置700は、好ましくは取り外し可能な部材140に連続して使用することができる追加の取り外し可能な部材740も具備している。
【０１７４】
図23(a)に示されたように、取り外し可能な部材140が表面131にシールされた場合、ウェル底147を有する複数のウェル145が形成される。図23に例示された方法において、関心のある物質791、792、793、及び794の島790は、ウェル145により不動化され、ウェル底145に不動化された物質のパターンを形成する。図23(b)に示されたように、次に取り外し可能な部材140は、表面131から取り除かれ、及びウェル底145に対応する物質のパターンが、表面131上に不動化され続ける。関心のある物質791、792、793及び794は、同じ物質であることができ、もしくは異なることができる。
図23(c)に示された取り外し可能な部材740は、取り外し可能な部材140毎に実質的に同じ構造、組成及びシール特性を有し、並びに同様の方法及び物質を使用し製造することができる。
【０１７５】
取り外し可能な部材740は、これらの表面のいずれかと接触するように配置した場合に、表面111、131、又は141と液密シールを形成することが可能である物質により作成される。この液密シールは、取り外し可能な部材740又は表面111、131、もしくは141の外側に接着剤、超音波、熱又は他のシール手段を使用することなく作成される。従って、取り外し可能な部材740は、表面111、131、又は141にシールすることが可能であり、次に表面111、131、又は141を損傷するか又はその上に残留物を残すことなく、そこから除去される。表面111、131、又は141は、取り外し可能な部材740を取り除いた後は平坦である。同様に、取り外し可能な部材740は、表面111、131、又は141から取り除いた後は平坦である。取り外し可能な部材740は、表面111又は131に再シールすることも可能であり、並びに取り外し可能な部材140と表面111又は131の間の液密シールは、取り外し可能な部材140を表面111、131又は141と接触するように配置した場合に、取り外し可能な部材140及び表面131又は表面111の外側に接着剤、超音波、熱又は他のシール手段を使用することなく作成される。
【０１７６】
取り外し可能な部材740は、ウェルオリフィス143よりも、表面741、131、及び111により規定された平面においてより小さいウェルオリフィス743を規定する。取り外し可能な部材740が表面131にシールされた場合、図23(c)に示されたように、ウェル747を有するウェル745が形成される。図23(c)に見られるように、ウェルオリフィス743は、好ましくはウェル底147に関連して形作られ、方向付けられ及び寸法づけられ、その結果ウェル底747は、各島790の露出した部分795を包含しており、並びにウェル底747を取り囲んでいる各島790の保護された境界796は、取り外し可能な部材740で覆われている。
【０１７７】
取り外し可能な部材740が表面131にシールされている場合、このシールは、液密であり；従って液体は、ウェル747に添加することができ、これにより露出された部分795が液体に曝されると同時に、保護された境界796は、液体に曝されないでいる。次にプロセス工程及び／又は検出工程は、露出された部分795で行うことができる一方で、保護された境界796はプロセス工程又は検出工程には曝されない。この方法において、局所的対照が各ウェル447について形成される。単独の露出されないウェル又はタンパク質を伴わないウェルが反応のプレート全体の対照として利用されなければならないアッセイとは異なり、図23に示されたような本発明のシステム及び装置では、使用者がウェル毎の変動に対処することができる。
【０１７８】
図24は、ふたつの取り外し可能な部材を使用する装置を示している。装置800は、図17の装置100と非常に似ており、及びベースプレート110、層120、層130、及び複数のウェルオリフィス143を規定する取り外し可能な部材140を具備している。装置800を使用し、例えば、ウェル内にウェルを形成することができる(例えば、ふたつの膜を同時に使用することにより)。装置800は、上面841及び下面842を備える取り外し可能な部材840も具備する。取り外し可能な部材840は、複数のウェルオリフィス843を規定している。取り外し可能な部材840は、取り外し可能な部材140毎と実質的に同じ構造的、組成的及びシール特性を有し、同様の方法及び物質を用いて製造することができる。
【０１７９】
取り外し可能な部材840は、表面111、131、又は141の表面と接触するように配置された場合に、これらと液密シールを形成することが可能な物質で形成される。液密シールは、取り外し可能な部材840又は表面111、131もしくは141の外側に接着剤、超音波、熱又は他のシール手段を用いずに作成される。従って、取り外し可能な部材840は、表面111、131、又は141をシールすることが可能であり、次に表面111、131、又は141を損傷するか又はその上に残留物を残すことなく、そこから除去される。表面111、131、又は141は、取り外し可能な部材840を取り除いた後に平坦である。同様に、取り外し可能な部材840は、表面111、131、又は141から取り除いた後に平坦である。取り外し可能な部材840は、表面111、131又は141に再シールすることが可能でもあり、並びに取り外し可能な部材840と表面111、131又は141の間の液密シールは、取り外し可能な部材840を表面111、131又は141と接触するように配置した場合に、取り外し可能な部材840及び表面111、131又は141の外側に接着剤、超音波、熱又は他のシール手段を使用することなく作成される。
【０１８０】
図24に示されるように、第一のウェルは、複数の第一のウェルオリフィス(143)のひとつに対応する壁によりそれらの側面に、及びベースプレートの対応する第一の露出された領域によりそれらの底に結合されたウェルとして規定される。第二のウェルは、複数の第二のオリフィスのひとつに対応する壁により少なくとも部分的にそれらの側面に結合され、並びに第一の取り外し可能な部材及び／又はベースプレート上の対応する第二の露出された領域によりそれらの各底で結合されたウェルとして規定される。要素の露出された領域は、オリフィス規定する部材がこの要素上に配置されることにより、オリフィス規定する部材のオリフィスにより露出された要素の領域である。
図24に認められるように、ウェルオリフィス843は、表面111、131、141、及び841により規定された平面中のウェルオリフィスよりも大きく、及びウェルオリフィス843は、再シール可能な部材141及び841が互いに接触するように配置された場合に、1個よりも多いウェルオリフィス143を包含している。
【０１８１】
第二の取り外し可能な部材840は、表面111又は131にシールされているか (取り外し可能な部材140は表面111又は131にシールされていない場合)又は第二の取り外し可能な部材840が表面141にシールされているかどうかにかかわらず、ウェル845の空間的配列及び形状は、オリフィス843の空間的配列及び形状に対応している。ウェル底847の空間的配列及び位置は、表面141、131、111、及び841により規定された平面のオリフィス843の空間的配列及び寸法に相当している。取り外し可能な部材840が、表面111又は131にシールされているか又はそのようにシールされていないかどうかにかかわらず、並びに第二の取り外し可能な部材840が、表面141にシールされているか又はそのようにシールされていないかどうかにかかわらず、ウェル底847は、サイズ、形状、及び空間的配列が一定であることは理解されるであろう。従って、取り外し可能な部材140が、表面111又は131にシールされているか又はそのようにシールされていないかどうかにかかわらず、並びに第二の取り外し可能な部材840が、表面111、表面131、又は表面141にシールされているかどうか、又はそのようにシールされていないかどうかにかかわらず、ウェル底847は、表面562により規定された平面においてオリフィス843に空間的配列及び形状が対応する表面111又は131の部分を説明するように本明細書において使用される。各オリフィス843が複数のオリフィス143を包含している態様において、各ウェル底847は、複数のウェル底147を包含していることも認識されるであろう。
【０１８２】
取り外し可能な部材140及び840のシール可能な、取り外し可能な、及び再シール可能な特性は、装置800を用いて行われるアッセイの性能並びにアッセイ結果の読取り、観察及び測定の両方を促進する。
例えば、図24に示されたように、取り外し可能な部材140は、表面131にシールされ、並びに取り外し可能な部材840は、表面141にシールされる。ウェル底147を有する複数のウェル145は、ウェルオリフィス143及び表面141により形成される。複数のウェル845も形成される。ウェル845の壁は、ウェルオリフィス843により形成され、並びにウェル845の底は、表面141及び表面131により形成される。ウェル845は、1個よりも多いウェル145を包含している。
【０１８３】
装置800は、生物学的アッセイのようなアッセイを行うために有用である。例として、装置800が図24のように構成された場合、関心のある物質は、ウェル底147にウェル145を通じて不動化され、次に複数のウェル145は、ウェル845により液体に同時に曝される。
多くの好ましい態様において、取り外し可能な部材140及び取り外し可能な部材840は、アッセイ又は手法の経過の途中で1回又は複数回、交互にシールされ、取り外され、及び表面131へ再シールされる。
【０１８４】
例えば、取り外し可能な部材140は、表面131にシールすることができ、並びに関心のある生物学的分子、有機分子、細胞又は他の物質は、ウェルオリフィス143により規定された、規定された空間的パターンで表面131上に不動化され得る。より詳細に述べると、関心のある物質は、ウェル底147に、ウェルオリフィス143への関心のある物質の適用を介して不動化される。不動化され得る物質の更なる例は、タンパク質、核酸、抗体、生物学的活性のある小分子、酵素、糖タンパク質、ペプチド、プロテオグリカン、及び他の生物学的物質に加え、化学物質又は生化学的物質を含む。物質をオリフィス、又はウェルへ沈着する方法は、当該技術分野において周知であり、並びにピペッティング、マイクロピペッティング、及び自動アレイヤーの使用のような、手作業及び自動化された技術の両方を含む。様々な物質の不動化に関する表面化学も、当該技術分野において公知であり、及び本明細書において考察されている。不動化された物質は、各ウェル底147上で同じであるか、又はウェル底147間で変動することができる。同様に、1種よりも多い関心のある物質を、単独のウェル底147に不動化することができる。
【０１８５】
関心のある物質の不動化後、取り外し可能な部材140は、表面131から取り外すことができるか、又はその場に残すことができ(図24に示されたように)、並びに第二の取り外し可能な部材840は、表面131又は表面141へシールすることができる。次にプロセス工程が、各ウェル845において行われ得る。この方法において、異なるプロセス工程を、各ウェル底847に不動化された物質の各群について行うことができる。所定のウェル847において行われるプロセス工程は、所定のウェル845に包含された各ウェル底147で行われることは理解されるであろう。従ってひとつのプロセス工程(複数)は、所定のウェル底847内のウェル底147上に不動化された物質の群について同時に行うことができ；並びに、第二のプロセス工程(複数)は、第二の所定のウェル底847内のウェル底147上に不動化された物質の第二の群について行うことができる。
【０１８６】
検出工程及び／又は同じプロセス工程(複数)を全てのウェル底847の各々上に不動化された物質に行うことが望ましい場合、取り外し可能な部材140及び第二の取り外し可能な部材840の両方を取り除くことができる。
再度、取り外し可能な部材140及び／もしくは第二の取り外し可能な部材840のシール、取り外し、及び再シール、物質の不動化、並びに／又は個別のウェル底(複数)147及び／もしくは847上に不動化された物質に対するプロセス工程及び／もしくは検出工程を行うことは、望ましいならば複数回繰り返すことができる。そこでオリフィスの異なる配列を有する追加の取り外し可能な部材が、本発明に従い集成され及び使用され得ることは理解されるであろう。
【０１８７】
装置800は、例えば、ウェル内のウェルを形成する(例えば、ふたつの部材を同時に使用することにより)ため、又はウェル内のウェル内に限定される群であるようなスポットをパターン化し(例えば、ひとつの部材でパターン化し、第一の部材を取り除き、次に別の部材を配置し、ウェルを形成することにより)、又はウェル内のウェル内に限定される群であるようなスポットをパターン化する(例えば、ひとつの部材でパターン化し、第一の部材を取り除き、次に別の部材を配置し、ウェルを形成することにより)ために使用することができる。
【０１８８】
1個よりも多い取り外し可能な部材が本発明の装置において使用される場合、1個又は複数の取り外し可能な部材により規定されるウェルオリフィスの壁は、図24に示したように、取り外し可能な部材の上側及び下面に関して実質的に垂直(すなわち、約88°〜約92°)であることができる。
【０１８９】
あるいは、1個又は複数の取り外し可能な部材により規定されたウェルオリフィスの壁は、取り外し可能な部材の上側及び下面と鈍角又は鋭角を規定することができる。このような垂直でないウェルオリフィスは、望ましい本発明のいずれかの態様において使用することができる。図25は、取り外し可能な部材の上側及び下面と鈍角又は鋭角を規定する壁を有するウェルオリフィスを規定するふたつの取り外し可能な部材を使用する装置の横断面図を示す。装置900は、図17の装置800に非常に類似しており、ベースプレート110、層130、複数のウェルオリフィス143を規定する取り外し可能な部材140、上面841及び下面842を具備し複数のウェルオリフィス843を規定する取り外し可能な層840を具備する。装置900は、例えば、ウェル内にウェルを形成するために(例えば、ふたつの部材を同時に使用することにより)使用することができる。
【０１９０】
図25に例示されているように、壁144が表面142及び141と角度をなす場合、好ましくは壁144は、表面142と鈍角(A)を、及び表面141と鋭角(B)を形成し、その結果壁144はウェルオリフィス143に関して下方内部へと先細となり、及びウェル145は倒立した先端が切られた角錐の形状である。先細の程度は、特定の用途に望ましいように調節することができる。
【０１９１】
好ましくは図25に認められるように、ウェルオリフィス843の寸法及び空間的配列は、第二の取り外し可能な部材840が表面141にシールされる場合は、各ウェルオリフィス843は、少なくともひとつのウェルオリフィス、好ましくは複数のウェルオリフィス543を包含するものである。
図25に認められるように、ウェルオリフィス843及びウェルオリフィス143の寸法及び形状は、第二の取り外し可能な部材840が表面141にシールされる場合に、ウェルの壁144及びウェルの壁844は、実質的に滑らかかつ連続した表面を形成し、その結果表面141の一部が実質的に露出されないように選択することができる。
【０１９２】
ここで図26を参照し、装置1000は、本発明の別の態様である。装置1000は、下側集成体1080及び上側集成体1090を具備する。装置1000の下側集成体1080は、図17の装置100に非常に類似しており、ベースプレート110、層120、層130、及び複数のウェルオリフィス143を規定する取り外し可能な部材140を具備している。集成体1080は、装置100、装置500、又はウェルオリフィスを規定するふたつより多い取り外し可能な部材を具備するもしくは使用する装置に類似することもできる。図26に見られるように、取り外し可能な部材140は、ウェルオリフィス143を規定している。
装置1000の上側集成体1090は、特徴、材料、及び製造が、ベースプレート110に類似したベースプレート1010；特徴、材料、及び製造が、層120に類似した層1020；並びに、特徴、材料、及び製造が、ベースプレート110に類似した層1030を具備している。取り外し可能な部材141は、取り外し可能な部材140が表面131に結合することが可能であるのと同じ方法で、表面1031にセルフシールすることが可能である。
【０１９３】
図26に見られるように、集成体1080及び1090は、好ましくは互いに同じフットプリントを有する。取り外し可能な部材140の表面141が、表面1031にシールされる場合、取り外し可能な部材140のウェルオリフィス143、取り外し可能な部材140の表面141、及び表面1030は、複数の液密流路1070を形成する。液密流路1070は、互いに流動的に連結され、及び外側周囲から流動的にシールされている。例えば、細胞集団を培養するために、装置1000のような装置を使用することができ、その結果ひとつの集成体上に不動化された細胞から放出された分子1098、又は他の物質は、他方の集成体上に不動化された細胞、又は他の物質1099と相互作用することができるが、これらの細胞それ自身は物理的に相互作用することはできない。複数の液密流路1070が形成されるので、複数の細胞の相互作用を、同時に試験することができる。本明細書において考察するように、細胞と不動化された関心のある物質の間の相互作用は、同様に試験することができる。取り外し可能な部材140のシール可能な、取り外し可能な、及び取り外し可能な特性は、培地の収集、添加、及び交換などを促進する。加えて、ひとつの集成体上に不動化され及び第二の集成体上に不動化された物質へ曝露された物質は、第二の集成体上に不動化され及び第三の集成体上に不動化された物質に曝露された物質への曝露から、容易に同時に取り除くことができ、従って互換可能なシステムを作成する。
【０１９４】
図27を参照し、装置11は、本発明の別の態様である。装置11は、下側集成体1180及び上側集成体1190を具備する。装置1100の下側集成体1180は、図17の装置100に非常に類似しており、ベースプレート110、層120、層130、及び複数のウェルオリフィス143を規定している取り外し可能な部材140を具備する。装置1100の上側集成体1190は、特徴、材料、及び製造が、ベースプレート110に類似したベースプレート1110；特徴、材料、及び製造が、層120に類似した層1120；特徴、材料、及び製造が、ベースプレート110に類似した層1130；並びに、特徴、材料、及び製造が、取り外し可能な部材140に類似した取り外し可能な部材1140を具備している。
【０１９５】
取り外し可能な部材1140は、表面111、131、1111、1131、又は141と、これらの表面のいずれかと接触するように配置された場合に液密シールを形成することが可能な材料で形成される。液密シールは、取り外し可能な部材1140又は表面111、131、1111、1131、又は141の外側に接着剤、超音波、熱又は他のシール手段を使用せずに作成される。従って取り外し可能な部材1140は、表面111、131、1111、1131、又は141にシールされ、次にそれらから表面111、131、1111、1131、又は141を損傷するか又は残留物を残すことなく取り外すことが可能である。表面111、131、1111、1131、又は141は、取り外し可能な部材1140を取り外した後平坦である。同様に、取り外し可能な部材1140は、表面111、131、1111、1131、又は141から取り外された後に平坦である。取り外し可能な部材1140は、表面111、131、1111、1131、又は141に再シールすることが可能でもあり、並びに取り外し可能な部材1140と表面111、131、1111、1131、又は141の間の液密シールは、取り外し可能な部材1140を表面111、131、1111、1131、又は141と接触するように配置した場合に、取り外し可能な部材1140及び表面111、131、1111、1131、又は141の外側に接着剤、超音波、熱又は他のシール手段を使用せずに作成される。
【０１９６】
各集成体1180及び集成体1190は、装置100、装置500、又はウェルオリフィスを規定するふたつよりも多い取り外し可能な部材を具備するかもしくは使用する装置に類似している。図27に見られるように、取り外し可能な部材140は、ウェルオリフィス143を規定し、及び取り外し可能な部材1140は、ウェルオリフィス1143を規定する。
図27に見られるように、集成体1180及び1190は、互いに同じフットプリントを有することが好ましい。取り外し可能な部材1140の表面1141が取り外し可能な部材140の表面141にシールされる場合、ウェル145(取り外し可能な部材140及び表面131により形成)及びウェル1145(取り外し可能な部材1140及び表面1131により形成)は、複数の液密流路1170を形成し、並びに互いに流動的に連結され、及び外側周囲から流動的にシールされている。
【０１９７】
例えば、細胞集団を培養するために、装置1100のような装置を使用することができ、その結果ひとつの集成体上に不動化された細胞から放出された分子又は他の物質(1198)は、他方の集成体上に不動化された細胞、又は他の物質(1199)と相互作用することができるが、これらの細胞それ自身は物理的に相互作用することはできない。複数の液密流路1170が形成されるので、複数の細胞の相互作用を、同時に試験することができる。本明細書において考察するように、細胞と不動化された関心のある物質の間の相互作用は、同様に試験することができる。取り外し可能な部材140及び1140のシール可能な、取り外し可能な、及び取り外し可能な特性は、培地の収集、添加、及び交換などを促進する。加えて、ひとつの集成体上に不動化され及び第二の集成体上に不動化された物質へ曝露された物質は、第二の集成体上に不動化され及び第三の集成体上に不動化された物質に曝露された物質への曝露から、容易に同時に取り除くことができる。
【０１９８】
本発明の装置は、手動又はモーターの使用のような、いずれか適当な手段により回転することができる。このような回転は、望ましいように数回繰り返しても良い。例えば、図27に示したように装置1100は、ウェルオリフィス143内の液体が、ウェルオリフィス1143へ流れるように、連続して回転することができる。このような回転は、ウェル底147上で第一の型の細胞及びウェル底1147上で第二の型の細胞を培養し、第一及び第二の型の細胞は物理的に分離され続けるが、その中でそれらが増殖する液体は両方の型の細胞に曝されるような操作に有用であろう。
【０１９９】
本明細書に説明された取り外し可能な部材は、均一でない空間的配列のウェルオリフィスを規定することができることは理解されるであろう。例えば、取り外し可能な部材は、ひとつの領域で空間的配列及び寸法が96-ウェルマイクロタイタープレートのウェルに対応するウェルオリフィスを規定し、同時に別の領域で空間的配列及び寸法が384-ウェルマイクロタイタープレートのウェルに対応するウェルオリフィスを規定することができる。図28及び図29は、均一でない空間的配列のウェルオリフィスを規定する取り外し可能な部材140の例を示す。
【０２００】
ウェルオリフィス143、ウェル145、及びウェル底147は、いずれか望ましい形状であることができることは理解されるであろう。ウェルオリフィス143、ウェル145及びウェル底147の「形状」は、表面111、131、141及び／又は142により規定された又はこれに平行な平面中のウェルオリフィスの幾何学的形状を意味する。好ましい形状は、円形、正方形及び長方形を含む。様々な形状のウェルオリフィス143を有する本発明の態様が、図28及び図29に示されている。
同様に、本発明の装置は、ベースプレートと同じフットプリントを有さないが、むしろベースプレートよりもより小さいフットプリントを有するような取り外し可能な部材を具備することもできる。このような装置の例は、図30に示されている。
【０２０１】
図35は、取り外し可能な部材140が表面131にシールされ、生体分子が、ウェル145(これは取り外し可能な部材140が表面131へシールされた場合形成される)へ自動又は手動用のピペッティング装置を用いピペッティングされ及び表面131上に不動化され、不動化された生物学的物質について生物学的アッセイが行われ、取り外し可能な部材140が表面131から取り外され、アッセイ及び結果がフラットベッド蛍光スキャナーを用いて読取られるような本発明の方法を示している。図35(a)は、関心のある物質をウェル145へ添加するためにピペッティング装置を使用する例を示している。このピペッティング装置は、都合の良いことに、384-ウェルマイクロタイタープレートのような、マイクロタイタープレートで使用される標準のピペッティング装置であって良く、本発明の装置の取り外し可能な部材中のウェルオリフィス及びベースプレートにより規定されたウェルへ、液体を送達するために使用される。プロセス工程は、取り外し可能な部材140が表面131へシールされる間に個別のウェル内で行われるか、及び／又は取り外し可能な部材140がそのようにシールされない間にはバルクで行うことができる。図35(b)は、表面131から取り外し可能な部材を取り外す、又は剥離し、その結果その上に不動化された関心のある物質1990を伴う平坦な表面を提供することを示している。図35(c)は、フラットベッドスキャナーを用いる走査による、関心のある物質1990の変化の検出を示している。装置1900はスキャナー上に、表面131がスキャナーと接触し、ベースプレート110の下面112が上を向くように配置される。
【０２０２】
図35に見られるように、本発明の装置は、プロセス工程の間の物質の分離のためのマイクロウェルの利便性、及びフラットベッドスキャナーのような平坦な表面を必要とする又は好む機器を用いる検出を組合せることができる。このような機器の別の例は、表面プラスモン共鳴(SPR)機器及びマトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)分析装置のような質量分析装置がある。
【０２０３】
図38Aは、本発明のベースプレート上にペプチド、アミノ酸、及びタンパク質を不動化するために使用することができる、表面化学の例の概略図である。示された自己組織化単層(SAM)は、アルカンチオールを含む。ヒドロキシ(-OH)基を末端とする分子は、生体分子に結合しない。化学選択的末端を有する分子は、不活性分子間に分散される。示された単層において、化学選択的分子は、ペプチドに結合するためのつなぎとして作用する。結合されるペプチドは、特定の位置で結合するように操作される。図40において、ペプチドEGPWLEEEEEAYGWMDFは、化学選択的SAMへ末端Eで結合する。この化学選択的分子は不活性分子により取り囲まれているので、化学選択的分子に結合したペプチドは、他の分子に非選択的には結合しない。
【０２０４】
図41は、本発明の態様を示している。装置2500は、表面131に不動化された関心のある物質のパターン化のために、4つの取り外し可能な部材を使用する。図41の装置2500は、図17の装置100に非常に類似しており、ベースプレート110、層120、層130、及び複数のウェルオリフィス2543、2553、2563、及び2573を規定する取り外し可能な部材2540、2550、2560、及び2570を具備する。図41(a)において、取り外し可能な部材2540は、表面131にシールされ、及び関心のある物質は、ウェルオリフィス2543により規定された空間的パターンで、表面131上に不動化される。より詳細に述べると、関心のある物質Aは、ウェルオリフィス2543への関心のある物質の適用により、ウェル底2547上に不動化される。ウェル底2547上に不動化された物質Aを伴う装置2500は、表面131にシールした取り外し可能な部材2540と共に、図41(b)に示され、並びに図41(c)において、取り外し可能な部材2540を取り外されている。
【０２０５】
図41(d)に示されるように、関心のある物質Aの不動化及び取り外し可能な部材2540の取り外し後、第二の取り外し可能な部材2550が、表面131にシールされ、及び関心のある物質Bが、ウェルオリフィス2553により規定された空間的パターンで表面131上に不動化される。より詳細に述べると、関心のある物質Bは、ウェルオリフィス2553への関心のある物質の適用によりウェル底2557上に不動化される。ウェル底2557上に不動化された関心のある物質Bを伴う装置2500は、表面131にシールされた取り外し可能な部材2550と共に、図41(d)に示され、並びに図41(e)において、取り外し可能な部材2550が取り外されている。
【０２０６】
図41(f)に示されるように、関心のある物質Bを不動化後に取り外し可能な部材2550を取り外した後、第三の取り外し可能な部材2560を、表面131にシールし、及び関心のある物質Cが、ウェルオリフィス2563により規定された空間的パターンで表面131上に不動化される。より詳細に述べると、関心のある物質Cは、ウェルオリフィス2563への関心のある物質の適用によりウェル底2567上に不動化される。ウェル底2567上に不動化された関心のある物質Cを伴う装置2500は、表面131にシールされた取り外し可能な部材2560と共に、図41(f)に示され、及び図41(g)において、取り外し可能な部材2560が取り外されている。
【０２０７】
図41(h)に示されるように、関心のある物質Cを不動化し及び取り外し可能な部材2560を取り外した後、第四の取り外し可能な部材2570を、表面131にシールし、及び関心のある物質Dが、ウェルオリフィス2573により規定された空間的パターンで表面131上に不動化される。より詳細に述べると、関心のある物質Dは、ウェルオリフィス2573への関心のある物質の適用によりウェル底2577上に不動化される。ウェル底2577上に不動化された関心のある物質Dを伴う装置2500は、表面131にシールされた取り外し可能な部材2550と共に、図41(h)に示され、及び図41(i)において、取り外し可能な部材2550が取り外されている。
装置2500を用い、本明細書により詳細に説明されているもののような、アッセイ及び方法を行うことができる。
【０２０８】
図42は、本発明の非-平面のベースプレートを伴う装置を示している。装置2600は、図17の装置100に非常に類似しており、ベースプレート110、層120、層130、及び複数のウェルオリフィス2643を規定している取り外し可能な部材2640を具備している。装置2600は、例えば非-平面のベースプレート上に規定された領域をパターン化するために使用することができる。
【０２０９】
図42に見られるように、オリフィス2643の空間的配列及び形状は、層120及び層130が存在しない表面131又は表面111により規定されたウェル底133の配列及び位置に対応している。表面131及び111により規定された平面に形成されたウェル底133の寸法及び空間的配列は、本発明の装置が、顕微鏡(明視野顕微鏡、位相差顕微鏡、落射照明蛍光顕微鏡を含むが、これらに限定されるものではない)、MALDI(マトリックス支援レーザー脱離イオン化)質量分析装置(これはApplied Biosystems社のような商業的供給業者から入手される)、ELISA-組合わせたドキュメントスキャナー、表面プラスモン共鳴(SPR)センサー(これはBiacore社、GWC社、Texas Instruments社、及びLeica社のような商業的供給業者から入手される)、フラットベッドレーザー共焦点スキャナー(これはFuji社、Biorad and Molecular Dynamics社(使用可能な機器の例はTyphoonを含む)のような商業的供給業者から入手される)、フラットベッドスキャナー(共焦点フラットベッドレーザースキャナーを含むが、これらに限定されるものではない)、比色スキャナー、蛍光スキャナー、リン光スキャナー(これはとりわけ、放射性同位元素のフラット方式リン光-ベースの造影に効果的であり、DNAアレイを読みとるために通常使用され、Affymetrix社及びAgilent社のような商業的供給業者から入手できる)、並びに走査型プローブ顕微鏡(走査型電子顕微鏡(SEM)及び原子間力顕微鏡(AEM))などを含むが、これらに限定されるものではない機器を用いる、検出工程に使用することができるようなものである。放射性シグナル分子が使用される更に別の例として、リン光基質を、本発明の装置の表面に配置し(例えば図42の表面111又は131など)、発色を可能にすることができる。
【０２１０】
本発明の装置は、平面の及び非-平面の表面上にパターン化された領域を作成するために使用することもできる。図43は、非-平面の表面131及び表面111を有する装置の横断面図を示している。装置2700は、図17の装置100に非常に類似しており、ベースプレート110、層130、及び複数のウェルオリフィス2743を規定している取り外し可能な部材2740を具備している。装置2700を、例えば、本明細書においてより詳細に説明されているもののような、アッセイ及び方法を行うために使用することができる。
図43に見られるように、オリフィス2743の空間的配列及び形状は、表面131及び111により規定されたウェル底133の配列及び位置に対応しており、その結果部材2740が表面131にシールされている場合、各ウェルオリフィス2743はひとつのウェル底133に包含される。
【０２１１】
図44を参照する装置2800は、本発明の別の態様である。装置2800は、図17の装置100に非常に類似しており、ベースプレート110、層120、層130、及び複数のウェルオリフィス2843を規定している取り外し可能な部材2840を具備している。図44において、取り外し可能な部材2840は、平坦である表面131の一部にシールされており、及び関心のある物質は、ウェル底133の空間的パターンに加え、ウェルオリフィス2843の空間的パターンを規定するように表面131上に不動化されている。より詳細に述べると、関心のある物質2891-2896は、ウェルオリフィス2843への関心のある物質の適用により、ウェル底133上に不動化される。ウェル底133上に不動化された物質2891-2896を伴う装置2800は、表面131にシールされた取り外し可能な部材2840と共に、図44(b)に示されており、及び図44(c)においては、取り外し可能な部材2940が取り外されている。
【０２１２】
物質をオリフィス、又はウェルへ沈着する方法は、当該技術分野において周知であり、並びにピペッティング、マイクロピペッティング、及び自動化されたアレイヤーのような、手動及び自動化された技術の両方を含む。不動化された物質2891及び2892は、互いに同じであるか、又は異なることができ−従って各ウェル底133に不動化された物質は、ウェル底133間で同じであるか又は変動することができる。これは図44においては例示されていないが、1種よりも多い型の関心のある物質(2種又はそれよりも多い物質2891 -2896の組合せなど)を、単独のウェル底133に不動化することができる。装置2800は、本明細書においてより詳細に説明されているもののような、アッセイ及び方法を行うために使用することができる。
【０２１３】
図20に示された装置により、取り外し可能な部材2840を、関心のある物質の不動化後に取り除くことができる(図44(c)に示したように)か、もしくはプロセス工程及び／又は検出工程を行うために、その場に残すことができる(図44(b)に示したように)。取り外し可能な部材2840がその場に残されるような態様において、プロセス工程及び／又は検出工程は、ウェル内で行うことができ、及びその結果ウェル間で変動することができ、多くの異なるプロセス工程及び／又は検出工程を不動化された物質について行うことができる。取り外し可能な部材2840は、プロセス工程を表面111又は131に不動化された全ての物質に同時に行うことが望ましい場合はいつでも、取り外すことができる。取り外した後取り外し可能な部材2840は、各ウェル133に不動化された物質にプロセス工程を個別に行うことが望ましい場合はいつでも、表面111又は131へ再シールすることができる。
【０２１４】
本発明の装置は、非-平面のベースプレートを有することもできる。図45は、非-平面のベースプレート110及び表面111を有する装置の横断面図を示している。装置2900は、図17の装置100に非常に類似しており、ベースプレート110、層120、層130、及び取り外し可能な層2940を具備している。装置2900は、例えば、本明細書により詳細に説明されたもののような、様々な生体分子のプロセス及び不動化を行うために使用することができる。
非-平面のベースプレートは、いずれか望ましい幾何を有することができる。例えば図45(a)に示されたように、非-平面のベースプレート100は凹であるか、又は図45(b)に示されたように、非-平面のベースプレート100は凸であることができる。
【０２１５】
本明細書に説明され及び示されたように、表面上の関心のある物質、特に生体分子の不動化及び／又はパターン化は、本発明の装置及び方法において特に重要である。
自己組織化単層(SAM)の使用は、物質、特に生体分子の不動化及び／又はパターン化にとって好ましい方法を提供する。SAMは、最も広範に試験され、最も良く開発された非生物学的自己集合システムの例である。これらは、適当な基板の表面に、官能基化された長-鎖有機分子の化学吸着及び自己組織化により自発的に形成する。SAMは、基板を表面と反応するリガンドを含有する溶液中に含浸することにより、又は基板を反応性種の蒸気に曝すことにより、通常調製される。SAMを製造するための多くのシステムが当該技術分野において公知である。
【０２１６】
SAMの最も良く特徴付けられたシステムは、金の上のアルカンチオラートCH3(CH2)nS-である。アルカンチオールは、溶液から金表面上に自発的に化学吸着し、及び吸着されたアルカンチオラートを形成する。金表面に結合したイオウ原子は、アルキル鎖を密に接触させ−これらの接触は、立体配置エントロピーを駆逐し(freeze out)及び配向構造に導く。最大およそ20原子の炭素鎖について、SAM内の相互作用の程度は、表面上の分子密度及びアルキル骨格の長さと共に増加する。n＞11であるアルカンチオラートのみが、金上に担持された密に充填され及び本質的に二次元有機準結晶を形成し、これがこのSAMをソフトリソグラフィーにおいて最も有用なものと特徴付ける。アルカンチオールからの金上へ配向されたSAMの形成は、比較的迅速なプロセスである。金上のヘキサンデカンチオラートの高度に配向されたSAMは、金基板を、エタノールを溶媒とするヘキサデカンチオール(thiold)の溶液(約2mM)中に数分間含浸することにより調製することができ、及びミクロ接触印刷時のSAMの形成は、数秒で生じる。
【０２１７】
ある態様において、SAMをアレイ形成された表面を有するようにパターン化することが望ましいことがある。表面により規定された平面におけるSAMのパターン化は、多種多様な技術により実現され、これはミクロ接触印刷、光酸化、光架橋結合、光活性化、ホトリソグラフィー／めっき、電子ビームライティング、集束イオンビームライティング、ニュートラル準安定原子ライティング、SPMリソグラフィー、ミクロ機械加工、ミクロ-ペンライディングを含む。好ましい方法は、ミクロ接触印刷である。ミクロ接触印刷は、米国特許第5,776,748号に開示されており、これはその全体が本明細書に援用される。
【０２１８】
別の態様において、SAMを含むコーティングは、ミクロ接触印刷により「パターン化される」。SAMパターンは、「インク」が化学吸着が可能な化合物を含有する溶液からなる「印刷」法でスタンプを用い支持体へ塗布され、SAMを形成する。このインクは、スタンプを用いプレートの表面に塗布され、及びスタンプ上のパターンにより定められたパターンでSAMは支持体上に沈着する。この支持体は、様々な方向で同じ又は異なるスタンプにより及び同じ又は異なるSAM-形成する溶液で、繰返しスタンプ押しされ得る。加えて、スタンプ押し後、裸のまま残された又はSAMにより覆われていない支持体の部分は、誘導体化することができる。このような誘導体化は、通常、SAM-形成する化合物を含有する他の溶液への曝露を含む。SAM-形成又は誘導体化する溶液は、パターンにより規定された仕上げられた支持体の領域が、生物学的物質に結合するそれらの能力の点で互いに異なるように選択される。従って例えば格子パターンを、格子の正方形領域が特異的生体分子又は全般的生体分子に結合するが、しかし格子の直線領域は実質的に生体不活性であり、及びほとんどもしくは全く生体分子はこれらの領域に結合しないように作成することができる。
【０２１９】
ミクロ接触印刷の一般的方法の簡単な説明は、下記のようである。高分子材料を、パターンを規定する隆起した機構を伴う鋳型に注型し、スタンプを形成する。スタンプ押し表面を伴うスタンプを、硬化後鋳型から離型する。このスタンプに、SAM-形成する化合物を含有する望ましい「インク」でインクを付ける。この「インク付けた」スタンプを、基板を含むプレートに接触させ、及び任意に、表面物質の薄いコーティングで被覆する。インクのSAM形成する化合物は、物質表面に化学吸着し、スタンプのスタンプ押しする表面に対応するパターンで、表面領域にSAMを形成する。次にプレートを、SAM-形成する化合物を含有する第二の又は充填溶液に曝すことができる。この第二の溶液は、第二の又は充填用SAMで、表面物質の裸の領域に充填する。次にパターン化されたSAMを有するプレートは、第一のSAMの表面領域に選択的には結合したが第二のSAMの表面領域には結合していない物質、又はその逆を有することができる。
【０２２０】
スタンプは、表面への化学吸着により、SAMを形成することが可能な溶液をインク付けられる。インク付けは、例えば、(1)スタンプをインクで湿らせた糸くずのでない紙片と接触するか、(2)インクを直接スタンプの上に注ぐか、又は(3)インクを綿棒でスタンプへ塗布することにより実現することができる。次にインクは、スタンプ上で乾燥するか、又は送風乾燥ことができ、その結果ぶれを引き起こすことがある、液体インクはスタンプ上に残留されない。SAM-形成する化合物は、表面をスタンプ押しするために、非常に迅速に転写することができる。例えば、スタンプ押しする表面を化合物と約2秒間接触すると、一般に十分な転写が実現するように適合され、又は接触は実質的により長い期間維持されても良い。SAM-形成する化合物は、このような転写のための溶媒中に溶解することができ、これは本発明の利点であることが多い。本化合物が溶解するあらゆる有機溶媒を使用することができるが、好ましくはスタンプ押しする表面により、SAM-形成する化合物の吸収を補助するものが選択される。従って、例えば、エタノール、THF、アセトン、ジエチルエーテル、トルエン、イソオクタンなどを使用することができる。PDMSスタンプとの使用のためには、エタノールが特に好ましく、トルエン及びイソオクタンは良く吸収されないので、これらは好ましくない。インク溶液中のSAM-形成する化合物の濃度は、1μMと低くて良い。濃度1〜10mMが好ましく、100mMを上回る濃度は推奨されない。
【０２２１】
次に支持体が、スタンプと接触され、その結果パターンを生じるインクでスタンプ押しした表面が、プレートの表面物質と接触する。これは、わずかな指圧を加えることにより手作業で、又は機械装置により実現することができる。このスタンプ及びプレートは、長い期間接触を維持する必要はなく；1秒〜1時間の間の接触時間は、金表面を伴うプレートに塗布されたヘキサデカンチオール(エタノール中1〜10mM)インクと明らかに同じパターンを生じる。接触時に、インクのSAM-形成する化合物は、プレートの表面と反応し、スタンプがゆっくりと取り除かれた時点で、SAMはスタンプに対応するパターンでプレートへ化学吸着されている。
【０２２２】
様々な化合物を、インクとしての溶液において使用することができ、及び様々な物質が、インクがスタンプ押しされ及びSAMが形成される表面物質を提供することができる。一般に、インクの選択は、スタンプ押しされる表面物質によって左右されるであろう。一般に、表面物質及びSAM-形成する化合物は、SAM-形成する化合物が、表面物質の表面に結合又は化学吸着する官能基の第一の末端で終結するように選択される。本明細書において使用される用語化合物の「末端」は、分子の物理的末端に加え、化合物がSAMを形成することができる方法で表面との結合を形成するために利用可能な分子の部分の両方を含むことを意味する。この化合物は、スペーサー部分により分離された、第一及び第二の最終末端を有する分子を含んで良く、この第一の最終末端は、プレートの表面物質に結合するように選択された第一の官能基を含み、並びに第二の採集末端は、望ましい露出された官能性を有する物質表面上にSAMを提供するように選択された第二の官能基を任意に含む。この分子のスペーサー部分は、得られるSAMの特定の厚さを提供することに加え、SAM形成を促進するように選択することができる。本発明のSAMは厚さが変動することができるが、以下に記されたように、約50Å未満の厚さを有するSAMが一般に好ましく、より好ましくは約30Å未満の厚さを有するもの、及びより好ましくは約15Å未満の厚さを有するものである。これらの寸法は、一般に化合物及び特にそれらのスペーサー部分の選択により指示される。
【０２２３】
多種多様な表面物質及びSAM-形成する化合物が、本発明での使用に適している。表面物質及びそれらの表面物質に湾曲する(bend)官能基の組合せの限定的でない例の一覧は、下記のものである。下記の一覧は、好ましい物質を、それらに固く結合する好ましい官能基と共にクラス分けしているが、下記の官能基の多くは、クラス分けされていない例証的物質との使用に適しており、並びにこのような組合せのいずれか及び全てが本発明の範囲内である。表面物質としての使用について好ましい物質は、チオール、スルフィド、ジスルフィドなどのイオウ-含有官能基と共に使用される場合には、金属、例えば金、銀、銅、カドミニウム、亜鉛、パラジウム、白金、水銀、鉛、鉄、クロム、マンガン、タングステン、及び前述の合金など；シラン及びクロロシランと共に使用される浸漬された又はされないシリコン；カルボン酸と共に使用される、シリカ、アルミナ、石英、ガラスなどの、金属酸化物；ニトリル及びイソニトリルと共に使用される白金及びパラジウム；並びに、ヒドロキサム酸と共に使用される、銅である。追加の適当な官能基は、酸塩化物、酸無水物、スルホニル基、ホスホリル基、ヒドロキシル基及びアミノ酸基を含む。追加の表面物質は、ゲルマニウム、ガリウム、ヒ素、及びヒ化ガリウムを含む。加えて、エポキシ化合物、ポリスルホン化合物、プラスチック及び他の高分子は、本発明の表面物質としての用途を見いだすことができる。ポリ酸無水物、及びポリ乳酸及びポリグリコール酸を含むが、これらに限定されるものではない生体腐蝕性商品を形成するために使用される高分子も適している。追加の本発明における使用に適した物質及び官能基は、1992年1月7日に発行された米国特許第5,079,600号に認めることができ、これは本明細書に援用される。
特定の好ましい態様において、表面物質としての金、並びにチオール、スルフィド、又はジスルフィドのような少なくとも1個のイオウ-含有官能基を有するSAM-形成する化合物の組合せが選択される。
【０２２４】
SAM-形成する化合物は、様々な官能性のいずれかを伴う、表面物質に結合するように選択された官能基を生じる末端とは反対側の、第二の末端又は「ヘッド基」で終結することができる。すなわち、この化合物は、化合物が表面物質上にSAMを形成する場合に、露出される官能性を含むことができる。このような官能性は、様々な生物学的種又は他の化学種などに選択的に結合する、疎水性、親水性であるSAMを形成するために選択することができる。例えば、イオン性、非イオン性、極性、非極性、ハロゲン化された、アルキル、アリール又は他の官能性が、化合物の露出された部分に存在することができる。このような官能基の限定的でない例証的一覧は、表面物質への結合のための官能基に関する先に説明されたものに加え、以下を含む：-OH、-CONH-、-CONHCO-、-NH2、-NH-、-COOH、-COOR、-CSNH-、-NO2-、-SO2-、-RCOR-、-RCSR-、-RSR、-ROR-、-PO4-3、-OSO3-2、-SO3-、-NHxR4-x+、-COO-、-SOO-、-RSOR-、-CONR2、-O(CH2CH2)OR-、-(OCH2CH2)nOH (ここでn=1〜20、好ましくは1〜8)、-CH3、-PO3H-、-2-イミダゾール、-N(CH3)2、-NR2、-PO3H2、-CN、-(CF2)nCF3 (ここでn=1〜20、好ましくは1〜8)、オレフィンなど。前記一覧において、Rは、水素又は炭化水素もしくはフッ素化炭化水素のような有機基である。
【０２２５】
追加例として、生体分子が結合されるSAMSは、ビオチン、アビジン、グルタチオン、及びニトリロ酢酸のような部分を末端とすることができる。アビジン、ビオチン、His-タグ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)タグ、グルタチオン、及びニトリロ酢酸のような部分を末端とする生体分子は、次にそれらの各結合パートナーと特異的に結合することができる(例えば、ビオチン-アビジン、グルタチオン-グルタチオン-S-トランスフェラーゼ-タグ、ニトリロ酢酸-His-タグ)。
【０２２６】
本明細書において使用される用語「炭化水素」は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アルカリル、アラルキルなどを含む。この炭化水素基は、例えば、メチル、プロペニル、エチニル、シクロヘキシル、フェニル、トリル及びベンジル基を含む。用語「フッ素化炭化水素」は、前述の炭化水素基のフッ素化誘導体を意味する。
【０２２７】
加えて官能基は、以下に定義される用語のようなSAMを一般的又は特異的に「生体親和性(biophilic)」とする多種多様な化合物又はそれらの断片から選択することができる。一般的に生体親和性官能基は、例えば、完全な細胞、分画された細胞、細胞オルガネラ、タンパク質、ポリペプチド、小分子、脂質、多糖、単糖(simple carbohydrate)、複合糖質、及び／又は核酸のような生物学的物質の結合、接着又は吸着を一般に促進するものである。一般的に生体親和性官能基は、-COO-、-PO3H-又は2-イミダゾロ基のような帯電した部分を伴う疎水基又はアルキル基、並びに細胞外マトリックスタンパク質、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、血清アルブミン、ポリガラクトース、シアル酸、及び様々なレクチン結合糖質のような化合物又は化合物断片を含む。特異的に生体親和性の官能基は、例えば、物質の混合物から特異的物質を同定又は単離するために、生物学的物質のひとつ又は複数の特異的型に選択的又は優先的に結合、接着又は吸着するものである。特異的生体親和性物質は、抗体又は抗体断片、及びそれらの抗原、細胞表面受容体及びそれらのリガンド、核酸配列及び多くの他の当業者に公知のものを含む。適当な生体親和性官能基の選択は、結合することが求められる生物学的物質の考慮事項、求められる結合親和性、利用可能性、容易さ(facility of ease)、SAM-形成する化合物の効果的にSAMを形成する能力に対する作用、並びに経費によって決まる。このような選択は、当業者の知識、能力及び自由裁量の範囲内である。
【０２２８】
あるいは、この官能基は、SAMを以下に定義される用語のような「生体疎性(biophobic)」とする多種多様な化合物又はそれらの断片から選択しても良い。生体疎性SAMは、完全な細胞、分画された細胞、細胞オルガネラ、タンパク質、脂質、多糖、単糖、複合糖質、及び／又は核酸のような生物学的物質の結合、接着又は吸着について一般に低親和性のものである。生体疎性官能基は、不飽和炭化水素を含む、極性はあるが未帯電の基である。特に好ましい生体疎性官能基は、ポリエチレングリコール(PEG)である。
【０２２９】
SAM-形成する化合物を含む分子の中心部分は、一般に、表面物質及び露出された官能性に結合するように選択された官能基を連結するスペーサー官能性を含む。あるいは、特定の官能基がスペーサー以外は選択されない場合は、スペーサーは本質的に露出された官能性を含む。以下に説明されるように、有機又は水性環境への添加時に、SAMパッキング(packing)を破壊せず、並びにSAM層をエッチング剤のような様々な薬剤に対し若干非浸透性とするようなあらゆるスペーサーが適している。このスペーサーは、極性；非-極性；ハロゲン化、もしくは特にフッ素化；正帯電；負帯電；又は、未帯電であることができる。例えば、飽和又は不飽和の線状又は分枝したアルキル、アリール、又は他の炭化水素スペーサーを使用することができる。
【０２３０】
様々な長さのSAM-形成する化合物を、本発明において使用することができる。例えば、2種又はそれよりも多い化合物の混合型SAMをインク内で使用する場合、活性分子は、不活性分子(非-結合)よりもより長いことが利点であることが多く、このことは、コンホメーション次数(conformational order)を有する前者の化合物を、生物学的分子と相互作用させ、溶液へと「突き出す」ようにする。
【０２３１】
別の例として、第一のSAMが表面に提供され及び少なくとも第二のSAMが表面に提供されるような2種又はそれよりも多い工程プロセスを使用し、様々なSAMが連続又は非連続である場合、一部の状況において、異なる長さを有する様々なSAMを形成するための分子種を選択することは利点であろう。例えば、スタンプにより形成されたSAMは第一の分子長を有し、及び表面に実質的に誘導体化されたSAMが、スタンプ押しされたSAMのそれよりも長い第二の分子長を有する場合、複数の「ウェル」を有する連続SAMが生じる。これらのウェルは、より長い鎖長を有する第二のSAMにより取り囲まれたスタンプ押しされたSAMの結果である。このようなウェルは、例えば、ウェルに捕獲される細胞のような特定の生物学的物質により大きい側面安定性(lateral stability)を加えることが望ましい場合に、ある態様に従い有利に二次加工することができる。このようなウェルは、反応容器の底を形成することもできる。
【０２３２】
加えて、表面物質上に形成されたSAMは、様々な目的のために、そのような形成後に修飾しても良い。例えば、SAM-形成する化合物は、SAM中の表面物質上に沈着することができ、この化合物は、SAMの更なる修飾を実行するために取り外すことができる保護基を含む露出された官能性を有する。例えば、光により取り外し可能な保護基を使用することができ、この基は、それが一部となっているSAMを妨害することなく取り外すことができるように有利に選択される。例えば、保護基は、好ましくはo-ニトロベンジル誘導体又はベンジルスルホニルのようなニトロ芳香族化合物を含む多種多様な能動的光-反応基から選択することができる。光除去可能な保護基は、例えば本明細書に参照として組入れられている米国特許第5,143,854号に開示されており、更にはPatchornikの論文(JACS、92:6333 (1970))及びAmitらの論文(JOC、39:192 (1974))に記載されており、これらは両方とも本明細書に参照として組入れられている。あるいは、反応基は、電子ビームリソグラフィー、x-線リソグラフィー又はいずれか他の放射線照射により活性化又は失活することができるSAMの露出された部分に提供することができる。このような保護及び脱保護は、現存の表面-結合したSAMの化学的又は物理的修飾、例えばSAMを形成する現存の分子種の伸長を補助することができる。このような修飾は、先に言及した米国特許第5,143,857号に開示されている。
【０２３３】
細胞パターン化層に合致するアレイを有するようにSAMをパターン化する別の好ましい方法は、例えば、当該技術分野において公知であるソフトリソグラフィー法を介してである。ソフトリソグラフィーは、George M. Whitesidesにより開発され、米国特許第5,976,826号及びPCT国際公開公報第01/70389号に開示されており、これらはその全体が本明細書に参照として組入れられている。例えば、微小-オリフィス(300)を有する細胞パターン化層(150)が、SAMの上に配置される。この細胞パターン化膜は、SAM上に整合した(conformal)シールを形成する。その後修飾液を、細胞パターン化膜の上に置き、微小オリフィス(300)により露出されたSAM表面を接触させる。「修飾」液は、SAMのヘッド基を望ましい特性を実現するように修飾するもの、又は望ましい生体分子をヘッド基に付加もしくは除去するものである。例えば、つなぎを露出したSAMヘッド基に付加し、これは次にタンパク質を捕獲し、これは次に引き続きウェル-規定する層によりパターン化される細胞への親和性を提供する。
【０２３４】
好ましいパターン化されたSAMの表面部分は、細胞親和性であり、すなわち、細胞接着を促進するように適合される。細胞親和性表面を作出する分子実体は、当業者に周知であり、抗原、抗体、細胞接着分子、ラミニン、フィブロネクチンのような細胞外マトリックス分子、合成ペプチド、炭水化物などを含む。
【０２３５】
本発明の方法及び装置において、平坦な表面(例として図17の表面131及び／又は例として図17の表面1031など)が、SAMにより好ましく被覆され、並びに生体分子のよう関心のある物質がこのSAM上に不動化される。一般に、特異的化学基に結合することが可能である化学基を末端とするSAM-形成する分子を約0.1％〜約10％、より好ましくは約0.5％〜約5％、最も好ましくは約1％〜約2％含有する混合型SAMが適用されることが好ましい。この混合型SAMの残余は、好ましくは、生物学的分子に対して実質的に不活性である化学基を末端とするSAM-形成する分子であろう。このような混合物の例は、実質的に不活性であるトリ(エチレングリコール)末端基をバックグランドとする中に、特異的にチオール基とカップリングするマレイミド-末端基を2％含む混合型SAMである。この方法において、チオールを含む分子は、分子それ自身の上の特異的部位を介して、既知の密度(マレイミド-末端のSAM-形成する分子の密度に対応する)で、SAM-被覆した表面上に不動化することができる。この不活性バックグラウンドは、非-特異的結合を低下又は排除する。
【０２３６】
本発明の装置及び方法は、生化学、分子生物学、細胞生物学、臨床診断、環境スクリーニング、免疫学、ゲノム、顕微鏡及びプロテオミクスの分野のような、生物学及び薬学の科学における特定の用途を認める。これらの装置及び方法は、例えば標的化合物の同定及びバリデーション、毒性スクリーニングなどにおいて用途を認める、創薬の領域において特に有用である。
【０２３７】
本発明の装置及び方法は、ハイスループットアッセイに適しており、及びアッセイが新規及び改善された技術を用いて実行されることを可能にする。注目すべきなのは、本発明の装置及び方法は、平坦な表面の利点を、ウェル構造の利点と組合せていることである。本発明の装置及び方法を用い、これらの使用者は、関心のある物質を予め定められた空間的に規定された方法でパターン化することができ、アッセイを行い、並びに表面が平坦と読取られることを必要とするか又は読取られる表面が平坦である場合に最適に機能するような装置及び技術を用い、アッセイの結果を連続して及び正確に読取り、検出し又はモニタリングするためにウェル構造を利用することができる。表面上の関心のある物質をパターン化する代わりに、使用者は、関心のある物質を、表面全体上に不動化し、その後本発明の装置及び方法を使用しある領域を他から区別することができる。
【０２３８】
図20に例示されたもののような装置を使用する別の例として、使用者は、各被験ウェルに関する局所的対照によりアッセイを行うことができる。単独の露出されないウェル又はタンパク質を伴わないウェルを全反応プレートの対照として利用しなければならないアッセイとは異なり、本発明の方法及び装置は、使用者がウェル毎の変動に対処することを可能にする。
【０２３９】
本発明の好ましい態様において、自己組織化単層は、「スイッチ可能な表面」を有するように修飾される。例えば、自己組織化単層は、望ましい分子を捕獲するであろう「ヘッド基」を伴いデザインすることができる。次にこのヘッド基は、望ましい時点で捕獲した分子を放出するように修飾される。本発明の好ましい態様において、ヘッド基は、捕獲された細胞を放出後、ヘッド基は細胞をもはや求引及び付着しないように修飾される。この放出は、パターン化された細胞を移動するために重要である。自己組織化単層が「スイッチ可能な」ヘッド基を有さなかった場合は、この細胞の移動は妨げられる。「スイッチ可能な」対照の例は、図30に示されている。この図は、細胞がそれらに付着することを可能にする特定のペプチド-展示する化合物を示している。電位を加えた時に、ペプチド展示する化合物は切断され、支持体からの細胞の放出を引き起こす。重要なことは、電位を加えるた後に残留するペプチド展示する化合物の一部は、細胞に結合することができず、その結果非-特異的細胞結合の可能性を排除することである。
【０２４０】
細胞、タンパク質又は他の生物学的物質の非特異的吸着に抵抗するために、生体不活性支持体物質を利用することが望ましいことも多い。タンパク質の吸着に対するこの抵抗性を付与する最も成功した方法は、その表面を、ポリ(エチレングリコール)PEGで被覆することである。吸着、共有的不動化、及び放射線照射による架橋を含む様々な方法を使用し、表面をPEGで改質している。炭水化物単位を含むポリマーも、表面を不動態化(passivate)するが、これらの物質は、PEGよりも安定性及び有効性が低い。広範に使用される戦略は、他のタンパク質の吸着に抵抗するタンパク質−通常ウシ血清アルブミン−の予備吸着である。加えて、エチレングリコール基の短いオリゴマーを末端とするアルカンチオール[HS(CH2)11(OCH2CH2)nOH：n=2〜7]から調製された自己組織化単層は、いくつかのモデルタンパク質の吸着に抵抗する。例え50％ものメチル-末端形成されたアルカンチオラートを含む自己組織化単層であっても、オリゴ(エチレングリコール)-末端形成されたアルカンチオラートと混合された場合は、タンパク質の吸着に抵抗する。更に、オリゴ(エチレングリコール)基で末端形成された自己組織化単層は、不活性支持体としての広範な実用性を有し、その理由は様々な反応基が、制御された環境下で、自己組織化単層へ組込まれるからである。
【０２４１】
生体不活性処理又は支持体物質の使用とは対照的に、適当な支持体又は処理を選択することにより、この表面を、いずれか望ましい官能性を有するように修飾することができる。例えば、この支持体は、他の細胞、DNA/RNA、化学物質、又は他の生物学的もしくは化学的実体などの、不動化された生体分子を有するように修飾することができる。
本発明は更に下記の限定的でない実施例により例証される。
【実施例】
【０２４２】
実施例
実施例1：一般的実験法
NMR
1H NMRスペクトルは、CDCl3、CD3OD又はD2O中で、Varian 400MHzスペクトロメーターで、各溶媒の残存ピークに関連して報告された化学シフトと共に記録した。反応は、アルゴン大気下で行った。試薬は、特に記さない限りは、受け取ったまま使用した。
【０２４３】
クロマトグラフィー
フラッシュクロマトグラフィーを、Merckシリカゲル60(230-400)メッシュを用い行った。薄層クロマトグラフィー(TLC)を、EM Scienceシリカゲル60プレート(厚さ0.25mm)上で行った。全ての化合物を、短波長紫外線、ニンヒドリン染色液、又は硫酸セリウム／七モリブデン酸アンモニウム四水和物染色液のいずれかにより、視覚化した。全ての試薬は、Aldrich社又はVWR社から購入した。
【０２４４】
基板調製
金基体は、顕微鏡用カバーガラス(VWR 24x50mm #2)又はカバースリップ(VWR 25x75mm)上の、チタン接着層(1.5nm)、それに続く金層(45nm)の蒸着(evaporation)により調製した。蒸着前に基板を、ヘキサン(20分間)及び95％EtOH(20分間)中の音波処理により洗浄し、その後窒素流れ下で乾燥した。蒸着は、サーマルエバポレーター(Edwards Auto 306)を圧力6x10-6 Torr (8x10-4Pa)及び速度0.3nm/秒で用いて行った。この金で被覆した基板を、約1x1cmの小片に切断し、無水エタノールで洗浄し、及び窒素流れ下で乾燥した。単層を、様々な比のジスルフィド1及び2の混合物(総ジスルフィド濃度0.2mM)のエタノール性溶液への清潔な金基板の含浸により形成した。16時間後、単層を無水エタノールですすぎ、窒素ガス流れ下で乾燥した。
【０２４５】
マレイミド／EG3混合型SAM表面の品質管理
EG3バックグラウンド中に1.5％マレイミド基を示す金チップを、SPR機械(Biacore 3000)に装填した。このチップ上のツーフローチャネルは、1.5％ビオチンがその表面に存在するために、マレイミドと反応するシステイン-ビオチンに同時に曝露した。引き続き、ひとつのチャネルは、ストレプトアビジン70μg/mLに曝露し、次にひとつのチャネルは、フィブリノーゲン500ug/mLに曝露した。ストレプトアビジンの吸着により引き起こされた大きいシグナルの変化(2100RU)は、ビオチンの大きい特異的結合能を示し；フィブリノーゲンの吸着により引き起こされた小さいシグナルの変化(90RU)は、その表面が、低い非-特異的結合(NSB)を保持したことを示している。この実験は、このマレイミド/EG3表面のバッチが、タンパク質不動化(下記参照)に適していることを示した。
【０２４６】
表面プラスモン共鳴分析
SPRは、Biacore 3000装置で行った。分析されるSAMを提示している金で被覆したガラスの顕微鏡用カバーガラスを、SPRカートリッジに実装した。全ての実験は、流量10μL/分を用いた。
【０２４７】
電気化学
電気化学的試験は、BAS Epsilon定電位装置を用いて行った。SAMに関する電気化学は、作動電極として金基板を、対電極として白金線を、及びAg/AgCl/KCl参照電極を用い、電解質として0.5M KNO3を含有する水中で行った。全ての実験は、サイクリックボルタンメトリー様式で、走査速度200mV/秒で行った。
Q＝nF；F＝96,5O0C/mol       (1)
密度＝n／cm2 ／0.78 nmol/cm2           (2)
【０２４８】
SAMに組込まれたマレイミド基の密度の決定は、電気化学的に決定した。マレイミドの密度が変動するSAMは、電気活性フェロセン13(無水EtOH中1mM)の溶液中に2時間含浸し、引き続きEtOHで広範にすすいだ。このSAMを窒素下で乾燥した後、サイクリックボルタンメトリーを行った。
レッドクス波下面積から、総電荷(Q)を決定し(式1)、これは表面上のレドックス-活性分子のモル数(n)に比例している。密度は、レドックス活性分子のモル数を表面上の分子の総モル数で除算する(これらふたつの数値は、SAM表面積に対して標準化された後) (式2)ことにより決定した。本発明者らは、表面上のマレイミド基は全てフェロセン-チオール分子と反応したと想定し、そのような表面上のフェロセン密度から、本発明者らは、これのマレイミド密度を推察した。
【０２４９】
実施例2：化合物の調製
SAM調製のためのジスルフィド合成
2-｛2-[2-(2-｛2-[2-(11-トリチルスルファニル-ウンデシルオキシ)-エトキシ]-エトキシ｝-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ｝-エタノール(4)
THF 10mLに溶解した、Pale-GrosdemangeらHの方法に従い調製した2-｛2-[2-(2-｛2-[2-(11-メルカプト-ウンデシルオキシ)-エトキシ]-エトキシ｝-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ｝-エタノール(3)(1.22g, 2.6mmol)の溶液に、トリフェニルメチルクロリド(1.46g, 5.2mmol)を添加した。室温で48時間撹拌後、反応混合物を濃縮した。粗残留物を、フラッシュクロマトグラフィー(勾配溶離、EtOAcから20:1 EtOAc/MeOHへ)により精製し、化合物4を910mg(49％)得た。
【化８】
2005509737.tif 000010
H  Pale-Grosdemange, C.；Simon, E.S.；Prime, K.L.；Whitesides, G.M.、J. Am. Chem. Soc、113:12-20 (1991)。
【０２５０】
トルエン-4-スルホン酸2-｛2-[2-(2-｛2-[2-(11-トリチルスルファニル-ウンデシルオキシ)-エトキシ]-エトキシ｝-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ｝-エチルエステル(5) 
p-トルエンスルホニルクロリド(900mg, 4.7mmol)を、CH2Cl2 12mL及びピリジン2mLの0℃の溶液中に溶解したアルコール4(910mg, 1.28mmol)の溶液に添加した。この溶液を室温に温め、16時間攪拌した。反応混合物を、ブライン(2x30mL)及びH2O(2x30mL)で洗浄し、その後有機物をMgSO4上で乾燥した。溶媒を蒸発させた後、粗残留物を、フラッシュクロマトグラフィー(勾配、1:1ヘキサン／EtOAcからEtOAcへ)で精製し、純粋な化合物5を1.01g(91％)得た。
【化９】
2005509737.tif 000011
【０２５１】
DiBOC保護したアミン(6)
DMF 10mL中のイミノジカルボン酸ジ-tert-ブチル(136mg, 0.63mmol)の0℃の溶液に、水素化ナトリウム(60％, 25mg, 0.63mmol)を添加した。室温で40分間攪拌した後、3mLのDMF中の化合物5(452mg, 0.52mmol)の溶液を滴下した。この溶液を45時間攪拌し、次に溶媒を真空蒸発させた。粗残留物を、CH2Cl2 30mLに溶解し、H2O(2x10mL)で洗浄した。有機層をMgSO4上で乾燥し及び溶媒を蒸発させた後、この残留物を、カラムクロマトグラフィー(ヘキサン／EtOAc, 1:1(v/v))で精製し、純粋な化合物6 343mg(72％)を得た。
【化１０】
2005509737.tif 000012
【０２５２】
2-｛2-[2-(2-｛2-[2-(11-メルカプト-ウンデシルオキシ)-エトキシ]-エトキシ｝-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ｝-エチル-アンモニウムトリフルオロ酢酸(7)
トリフルオロ酢酸10mLに溶解したエタンジチオール(0.5mL)、H2O(0.5mL)、フェノール(1g)、及びチオアニソール(0.5mL)の溶液に、化合物6(247mg, 0.27mmol)を添加した。室温で6時間攪拌した後、この反応混合物を濃縮し、カラムクロマトグラフィー(勾配溶離、CH2Cl2／MeOH 20:1(v/v)から10:1から5:1へ)により精製し、化合物7(約75％)及びトリチル保護されたチオール(約25％)の混合物147mgを得た。更に精製することなく次工程を続けた。
【化１１】
2005509737.tif 000013
【０２５３】
2-(2-｛2-[11-(ピリジン-2-イルジスルファニル)-ウンデシルオキシ]-エトキシ｝-エトキシ)-エタノール(9)
アルドリチオール-2(145mg, 0.66mmol)を、MeOH 5mL中の2-｛2-[2-(11-メルカプト-ウンデシルオキシ)-エトキシ]-エトキシ｝-エタノールref(201mg, 0.66mmol)の溶液に添加した。この溶液を18時間室温で攪拌した後、溶媒を蒸発させ、残留物を、フラッシュクロマトグラフィー(勾配溶離、ヘキサン／EtOAc 1:1(v/v)からEtOAc)で精製し、化合物9を148mg(56％)得た。
【化１２】
2005509737.tif 000014
【０２５４】
2-(2-｛2-[2-(2-｛2-[11-(11-｛2-｛2-(2-ヒドロキシ-エトキシ)-エトキシ｝-エトキシ｝-ウンデシルジスルファニル)-ウンデシルオキシ]-エトキシ｝-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ｝-エトキシ)-エチル-アンモニウムトリフルオロ酢酸(8)
MeOH 5mL中の化合物7(120mg, 0.2mmol)の溶液に、化合物9(101mg, 0.22mmol)を添加した。この溶液を室温で33時間攪拌した。濃縮後、この反応混合物を、フラッシュクロマトグラフィー(勾配：CH2Cl2／MeOH、20:1から10:1から5:1(v/v))で精製し、不純物8を137mg得た。
【化１３】
2005509737.tif 000015
【０２５５】
4-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-N-[2-(2-｛2-[2-(2-｛2-[11-(11-｛2-[2-(2-ヒドロキシ-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ｝-ウンデシルジスルファニル)-ウンデシルオキシ]-エトキシ｝-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ｝-エトキシ)-エチル]-ブチルアミド(1)
無水DMF 4mL中の粗化合物8(137mg, 0.2mmol)の溶液に、γ-マレイミド酪酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(10)(58mg, 0.21mmol)及びEt3N (48μL, 0.34mmol)を添加した。この溶液を、室温で24時間攪拌した。濃縮後、この反応混合物を、フラッシュクロマトグラフィー(EtOAc／MeOH、10:1(v/v))により精製し、化合物1を22mg得た。
【化１４】
2005509737.tif 000016
【０２５６】
2-(2-｛2-[11-(11-｛2-[2-(2-ヒドロキシ-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ｝-ウンデシルジスルファニル)-ウンデシルオキシ]-エトキシ｝-エトキシ)-エタノール(2)
THF 5mLに溶解した2-｛2-[2-(11-メルカプト-ウンデシルオキシ)-エトキシ]-エトキシ｝-エタノール(145mg, 0.43mmol)の溶液に、NaOH溶液(0.1M)1mL、その後ヨウ素(5結晶)を溶解した。この溶液を室温で24時間攪拌し、CH2Cl2を20mL添加した。この溶液をH2O(2x5mL)で洗浄した後、有機物をMgSO4上で乾燥し、濃縮した。粗残留物を、フラッシュクロマトグラフィー(CH2Cl2／MeOH、20:1(v/v))で精製し、化合物2を78mg(54％)得た。
【化１５】
2005509737.tif 000017
【０２５７】
フェロセンチオールの合成
フェロセン-2-カルボン酸[2-(ピリジン-2-イルジスルファニル)-エチル]-アミド(12)
EDC(213mg, 1.1mmol)を、CH2Cl2 20mLに溶解したフェロセンカルボン酸(232mg, 1.0mmol)及びN-ヒドロキシスクシンイミド(128mg, 1.1mmol)の溶液に添加した。この溶液を室温で5時間攪拌し、濃縮した。粗残留物を、DMF 8mL中に溶解し、及び2-(ピリジン-2-イルジスルファニル)-エチル-塩化アンモニウム(222mg, 1.0mmol)を、引き続きEt3N (0.14mL, 1.0mmol)を添加した。48時間攪拌した後、溶媒を真空蒸発させた粗残留物を、フラッシュクロマトグラフィー(勾配：ヘキサン／EtOAc、1:1(v/v)からEtOAcへ)で精製し、化合物12を113mg(2工程で28％)得た。
【化１６】
2005509737.tif 000018
【０２５８】
フェロセン-2-カルボン酸(2-メルカプト-エチル)-アミド(13)
MeOH 6mL中に溶解した化合物12(113mg, 0.28mmol)の溶液に、DTT(438mg, 2.8mmol)及びEt3N(79μL, 0.57mmol)を添加した。この溶液を室温で18時間攪拌し、その後溶媒を蒸発させた。この残留物を、EtOAc 15mLに溶解し、H2O(8x15mL)で洗浄し、過剰なDTTを除去した。MgSO4上で乾燥し濃縮した後、残留物を、フラッシュクロマトグラフィー(ヘキサン／EtOAc、1:1(v/v))により精製し、化合物13を46mg(57％)得た。
【化１７】
2005509737.tif 000019
【０２５９】
エチル-4-ニトロフェニル(8-メルカプト-オクチル)ホスホン酸ジエチル(7-オクテン)ホスホン酸(phosponate)(15)の合成
8-ブロモ-1-オクテン(14)(5g, 26.16mmol)及び亜リン酸トリエチル(8.69g, 52.32mmol)の混合物を、ゆっくり加熱し156℃とした。この反応混合物を、この温度で、アルゴン下で一晩攪拌した。発生した臭化エチルは、冷却器及び氷浴中の受けフラスコで捕集した。過剰な亜リン酸トリエチルを真空除去し、残留油分を高真空下で蒸留し(〜160℃)、無色の油状物(15)を得た(6.22g, 96％)。
【化１８】
2005509737.tif 000020
【０２６０】
エチル-4-ニトロフェニル(7-オクテン)ホスホン酸(16)
化合物(15)(1.00g, 4.03mmol)を、CH2Cl2 (30mL)に溶解した。混合物をアルゴン下で0℃に冷却した後、塩化オキサリル(1.28g, 10.07mmol)を滴下した。この混合物をゆっくり室温とし、16時間攪拌した。過剰な塩化オキサリル及び溶媒を真空除去した。中間体モノクロロリン酸エステル及び4-ニトロフェノール(561mg, 4.03mmol)を、無水CH2Cl2 (30mL)に溶解した。トリエチルアミン(816mg, 8.06mmol)を滴下し、この混合物を室温で5時間攪拌した。これを真空で濃縮し、黄色油状物を得、これをフラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル、Hex:EtOAc(1:1))で精製し、純粋な化合物(3)を油状物として得た(1.06g, 77％)。
【化１９】
2005509737.tif 000021
【０２６１】
エチル-4-ニトロフェニル(8-チオアセテート-オクチル)ホスホン酸(17) 
チオール酢酸(359mg, 4.72mmol)及びAIBN(15.4mg, 0.094mmol)を含有する無水1,4-ジオキサン(5mL)中の化合物(16)(161mg, 0.47mmol)の溶液を、アルゴン下で、還流温度で2.5時間攪拌した。この混合物を濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル、CH2Cl2:EtOAc (4:1))で精製し、化合物(4)を黄色油状物として得た(149mg, 76％)。
【化２０】
2005509737.tif 000022
【０２６２】
エチル-4-ニトロフェニル(8-メルカプト-オクチル)ホスホン酸(18)
濃塩酸(545mL, 13.6mmol)を含有するMeOH (30mL)中の化合物(17)(1.14g, 2.72mmol)の溶液を、40℃で16時間攪拌した。この混合物を真空で濃縮し、CH2Cl2に再溶解し、飽和した炭酸水素ナトリウム(2x20mL)及びブライン(1x20mL)で洗浄した。有機層をNa2SO4上で乾燥し、濃縮し、純粋な化合物(18)を黄色油状物として得た。
【化２１】
2005509737.tif 000023
【０２６３】
実施例2：キナーゼアッセイ
ペプチド不動化
C-末端システインを伴うsrcキナーゼ基質(IYGEFKKKC)を、1mMペプチド溶液(pH6)と1時間インキュベーションし、引き続き水で洗浄し及び窒素流れで乾燥することにより、マレイミドを提示しているSAMへ密度2％で共有的に不動化した。
【０２６４】
キナーゼインヒビターアッセイ
スタウロスポリン(Calbiochem社)を、DMSO中に様々な濃度で調製した。活性p60c-src は、Upstate Biotechnology社から購入し、最終アッセイ濃度20pM p60c-src となるよう、キナーゼアッセイ緩衝液(KAB)(50mM HEPES pH7.4、0.1mM EDTA、0.015％ Brij35)及びキナーゼ希釈緩衝液(KDB)(KABに0.1mg/ml BSA及び0.2％ β-メルカプトエタノールを添加)で希釈した。キナーゼ反応を、スタウロスポリン希釈液0.6μlを、4μlのp60c-src 希釈液と予め混合させ、最終濃度50μM ATP及び10mM Mg2+となるような、ATP／Mg2+カクテル(KAB中に作成)を添加することにより開始した。反応混合液6μlを、直ぐに各ウェルに分配し、この試料を37℃で30分間インキュベーションした。インキュベーション後、試料を、8mM SDSで1分間、TBST (TBS(10mM Tris pH7.4、150mM NaCl)と0.05％ Tween-20)で3分間3回、並びにTBSで3分間2回洗浄した。
【０２６５】
基質ペプチドのリン酸化は、3％(w/v)BSAを含むTBS中に1μg/mlとなるよう希釈したポリクローナル抗-ホスホチロシン抗体(Calbiochem社)との1時間のインキュベーションにより検出した。再度、TBSTで3分間2回及びTBSで3分間2回洗浄した後、試料を1時間、1％(w/v)BSAを含むTBST中2μg/mlに希釈したアルカリホスファターゼと複合した抗-ウサギ(抗体)(Rockland Immunochemicals社)と共にインキュベーションし、BCIP/NBTアルカリホスファターゼ基質(参照)で発色した。得られた試料を、通常のフラットベッド式ドキュメントスキャナーを用い、16-ビットグレースケールで走査し、及び各スポットの平均グレースケール画素値を、標準の画像解析ソフトウェアを用いて得た。
【０２６６】
色強度(青)は、キナーゼ活性に比例している。図8(A)は、発色後の基質のグレースケール画像である。図8(B)は、阻害率(％)に変換したスポット強度のプロットである。S字型用量反応曲線をこのプロットに当てはめ、p60c-src に対するスタウロスポリンの対数IC50(M)を-6.9±0.09と決定した。
【０２６７】
実施例4：炭水化物の不動化
炭水化物タグ付け
全ての炭水化物は、還元末端にn-ペンテニル基を有する過アセチル化された糖質のチオールアセテート誘導体への転換により誘導体化した。次にこれらの糖質は、酸素非存在条件下でケン化し、中和後、還元末端にチオール基を含む十分に脱保護された炭水化物を得た。図10参照。
【０２６８】
炭水化物の不動化
炭水化物は、還元末端ペンタンチオール基を含む完全に脱保護された炭水化物の溶液(pH6のリン酸緩衝液中の1mM炭水化物)と共に1時間インキュベーションすることにより、密度2％のマレイミドを提示する単層(顕微鏡スライド上)に共有的に不動化した。水及びエタノールで洗浄後、これらの単層を窒素流れ下で乾燥した。図11参照。
【０２６９】
実施例5：グリコシルトランスフェラーゼアッセイ
グリコシルトランスフェラーゼアッセイのための3種の異なる基質を提示している表面を、誘導体化されたマレイミド表面を、3種の異なる炭水化物-チオール溶液と接触することにより形成した。これらの炭水化物は、剥離可能及び再シール可能な装置を用い、溶液を制限することにより、スライド上の個別の位置に不動化された。図12参照。
【０２７０】
実施例6：融合タンパク質の共有的不動化
Cutenaseの調製
乾腐病菌(Fusarium solani pisi)クテナーゼ遺伝子は、50bpイントロンにより分離されたふたつのエキソンを含む。イントロンを取り除くために、各エキソンを、制限エンドヌクレアーゼ部位を含むプライマーセットを用いて増幅した。PCR増幅及びPCR産物の制限消化後、これらふたつのエキソンを連結し、イントロンを含まないクチナーゼ遺伝子を得た。次にこの遺伝子を、組換え法を用いてプラスミドへ挿入した。
【０２７１】
プラスミドを、プライマーExon 1F及びExon2Bを使用し、F. solaniゲノムDNAから増幅した、ふたつのエキソン及びイントロンを含むDH5 E. coliにおいて、維持及び増殖した。次にふたつのクチナーゼエキソンを、精製したクチナーゼ遺伝子からプライマーを使用し増幅した。PCR時に、KpnI制限酵素-認識部位を、各エキソンに導入した。アガロースゲル精製及びKpnI制限消化後、これらのエキソンを、T4 DNAリガーゼを用いて連結し、及び正確に連結したDNAを、1.5％アガロース-ゲル電気泳動を用いて精製した。連結したDNAを、NcoI及びBamHIにより消化し、並びにpET-22b(+)(NOVAGEN社、マジソンWI)の対応する部位へ連結した。得られるプラスミドpCut22bは、N-末端リーダー配列が発現されたタンパク質のペリプラスム局在化のためのpelBリーダー配列で置換られている組換えクチナーゼの遺伝子をコードしている。プラスミド構築体は、制限解析及びデオキシヌクレオチド配列決定により確認した。
【０２７２】
Tプライマーオリゴヌクレオチド配列。制限部位には下線をつけた。
【化２２】
2005509737.tif 000024
【化２３】
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【化２４】
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【化２５】
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【０２７３】
クチナーゼ遺伝子は、E. coliにおいて発現した。クチナーゼは、その機能に重要であるふたつのジスルフィド橋を含む。E. coli細胞質の還元により、このタンパク質は、ペリプラスムの酸化的環境へ輸送され、ジスルフィド結合を適切に形成することができる。当初のリーダー配列代わりのpelBリーダー配列の取り込みは、クチナーゼがE coliのペリプラスムへ輸送されることを可能にし、このことは、天然の細菌の機構を使用した、ジスルフィド結合を含む酵素の適切なフォールディングを促進する環境である。
【０２７４】
組換え体クチナーゼは、T7発現システムを用い、pCut22bを収容しているE. coli株BL21(DE3)において発現した。pCut22bを収容している細胞は、50g/mlアンピシリンを補充した10mL Luria-Bertani(LB)ブロス中で37℃で増殖した。一晩培養した後、2L-バッフル付きフラスコ中で100-倍希釈し、更に37℃で240rpmで増殖した。クチナーゼ発現は、0.5mMのIPTG添加により、0D600＝0.3に誘導され、このクチナーゼの発現は、37℃で連続振盪しながら更に4時間可能であった。次に細胞を、5,000xgで30分間(SORVALL SLA-3000ローター、KENDRO社、ニュータウン、CT)での遠心分離により収集し、及びペリプラスムタンパク質を、文献に記載されたようなショ糖浸透圧ショック法を用いて収集した。ペリプラスム画分を更に、サイズ排除クロマトグラフィー法を用いて精製した。簡単に述べると、ペリプラスム画分を、緩衝液A(50mMビシン、pH8.3)で平衡としたSEPHADEX G-75カラム(1.8cm x 75cm、AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH社、ピスカタウェイ、NJ)に4℃で負荷し、アイソクラチックに精製した(流量＝1mL/分)。エステラーゼ活性を有する画分を、15％SIDS-PAGEにより分析し、CENTRIPREP YM-10 (MILLIPORE社, MA)を用いて濃縮した。タンパク質濃度は、変性条件(10mMリン酸ナトリウム、pH6.5、6.0Mグアニジン-HCl)において、算出された吸光係数(280＝13,370/M・cm)を用いて決定した。
【０２７５】
クチナーゼの発現を特徴決定するために、E. coli溶解液画分を、SIDS PAGEにより分析した。E. coli溶解液の全ての画分は、分子量22kDaに対応するバンドを示し、これはクチナーゼの予想された移動である。この酵素は、E. coliにおいて効率的に発現され、この発現されたタンパク質は、図12(F1-F3)に示されたようにペリプラスムに輸送された。例え精製前であっても、このペリプラスム画分は、80％より大きい純度を示した。更にクチナーゼは、MALDI-TOF質量分析により特徴決定し、これは計算値に一致した(実験値m/z＝22,515.89、計算値m/z＝22,421)。発現されたタンパク質の大きい画分は、細胞質ゾル画分中に分配した。
【０２７６】
このタンパク質が機能性であるかどうかを決定するために、クチナーゼの高活性基質である4-ニトロフェニル酪酸の酵素による加水分解の反応速度試験を行った。クチナーゼ濃度は1Mであった。PNPの放出は、吸光光度計を用いて辿った。加水分解反応の初速の基質濃度に対するプロットは、この反応がミカエリス-メンテン速度論に従うことを確認し、ミカエリス定数(Km)は1mMであり、これは報告された値と同等であった。
【０２７７】
分光光度測定は、BECKMAN DU-640分光光度計(BECKMAN COULTER社、フラートン、CA)を用い室温で行った。精製した組換えクチナーゼのエステラーゼ活性は、緩衝液A中でp-ニトロフェノール酪酸(PNB)加水分解速度を410nmでモニタリングすることにより測定した(＝8,800/M・cm)。
【０２７８】
クチナーゼのSAMへの不動化
ホスホン酸結合パートナー部分を末端とする自己組織化単層(SAM)を調製した。このリガンドは、非-特異的タンパク質吸着に抵抗するトリ(エチレングリコール)基と混合され、低密度で存在した。クチナーゼのこの単層への不動化は、SPR分析により特徴決定した。リン酸緩衝した生理食塩水(pH7.4)を、単層上に2分間流し、ベースラインを確立し、その後同じ緩衝液中のタンパク質溶液を10分間流し、結合を観察した。最後に、このタンパク質溶液を、緩衝液と6分間交換し、不可逆的に不動化されたタンパク質量を定量した。クチナーゼ(25M)が表面に不可逆的に結合した。この単層のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)(0.5mg/mL)による処理は、表面からのクチナーゼの取り外しを生じず、これはこの不動化は共有的であることを確認した。SDSは、非-共有的に不動化された分子を表面から取り除くために利用する界面活性剤である。最初に20で妨害されたクチナーゼは、表面への結合を示さず、これはこの不動化が特異的であることを明らかにしている。
【０２７９】
クチナーゼプラスミドによる形質転換後に得た粗E. coliペリプラスム抽出物を、特異的不動化について試験した。粗抽出物に単層上を流したところ、精製したクチナーゼの場合と同量の結合が認められ、かつSDSで洗浄後同量が残存した。クチナーゼプラスミドで形質転換しなかったE. coliのペリプラスム溶解液は、この単層に結合せず、このことはホスホン酸リガンドを提示している単層は、非-特異的タンパク質吸収に抵抗性があり、クチナーゼの精製及び不動化に使用することができることを明らかにしている。
【０２８０】
混合型SAMと生体機能分子の間の共有結合形成
EG3バックグラウンド中に1.5％マレイミド基を提示している金チップを、(8-メルカプト-オクチル)-ホスホン酸エチルエステル4-ニトロ-フェニルエステル−二官能性分子(化合物5；HS-PNPP)−の5mMメタノール溶液に1時間曝した。このプロセスの間に、HS-PNPPのチオール基は、表面のマレイミド基と反応し、表面に提示されたPNPPリガンドの1.5％単層を生じた。
【０２８１】
SPRを用い検出されたクチナーゼ-融合タンパク質のPNPP-末端とする表面への生体特異的-共有的結合
前述のように作成されたチップは、次に異なる溶液を、最大4フローチャネルで表面に送達することを可能にする微小流体マニホールドを金チップへ接触するSPR装置へと搭載した。下記の流体プロトコールをこの表面に適用し、SPRシグナル−これは表面に吸着するタンパク質質量を測定する−を、時間の関数として測定した：
t＝0〜300秒：フローチャネル1-3(Fc＝1〜3)は全て、20mMトリス(pH7.4)緩衝液に曝露した。
t＝300〜1500秒：その後Fc＝1〜3を、3種の異なる溶液に曝した。
Fc＝1：20mMトリス(pH7.4)緩衝液中の500ug/mLフィブリノーゲン。
Fc＝2：20mMトリス緩衝液中の40μMヘキサヒスチジンに融合したクチナーゼ(クチナーゼ-his6)
Fc＝3：100μM PNPPに予め混合した40μMクチナーゼ-his6。
t=1500〜2250秒：Fc＝1〜3は全て、20mMトリス(pH7.4)緩衝液に曝した。
t=2250〜2850秒：Fc＝1〜3は全て、20mMトリス(pH7.4)緩衝液中の8mM SDSに曝した。
t＞2850秒：Fc＝1〜3は全て、20mMトリス(pH7.4)緩衝液に曝した。
【０２８２】
これらのデータの分析は、1150RUのクチナーゼ-his6が、Fc＝2において不動化されたことを示し、これはタンパク質の完全な単層に近いことを示唆している。SDS洗浄は、このシグナルを有意に低下せず(1080RU)、このことは、タンパク質は共有的に結合したことを証明している。クチナーゼの結合部位が表面と接触する前に完全に占拠されている場合には、予想されるように、溶液(PNIPP)中で不動化リガンドと予めインキュベーションしたクチナーゼ-his6は、非常にわずかな吸着(Fc＝3において30RU)を生じた。フィブリノーゲンは、この表面に粘着せず、このことは、低い非-特異的結合が存在し及びこの不動化戦略は生体特異的であることを示している。
【０２８３】
本発明者らは、この場合、SPRにおいて、クチナーゼ-his6が不動化されたことに注目した。アッセイなどのためにチップを作成するためには、この方法は、通常SPRの外側の金-被覆した顕微鏡用スライド又はプレート上で行われるであろう。タンパク質(クテナーゼ)と生体機能分子の間に共有結合を形成する方法は、Tween-20のような非変性性界面活性剤を0.05％含む、適当な非変性性の緩衝液、例えばトリス-緩衝された生理食塩水からのタンパク質の沈着に関連している。本発明者らは、タンパク質が表面上でアレイ形成している場合、例えば5〜20％グリセロールの添加により、溶液の蒸発を最小化とした。
【図面の簡単な説明】
【０２８４】
【図１】図1は、本発明に従い調製された自己組織化単層の構造の分子スケールの表示である。
【０２８５】
【図２】図2は、マレイミド基を提示する表面を形成するため使用される非対称ジスルフィド1を調製するために使用される合成経路を概略的に示している。(a)トリチルクロリド、THF、49％；(b)TsCl、ピリジン、CH2Cl2、91％；(c)HN(CO2tBu)2、NaH、DMF、72％；(d)TFA、EDT、PhOH、PhSMe、H2O；(e)9、Et3N、MeOH；(f)10、Bt3N、DMZF。
【０２８６】
【図３】図3は、(A)ビオチン化したチオール-含有ペプチド、次にストレプトアビジン；(B)リシン及びビオチン化したチオール-含有ペプチドの混合物、次にストレプトアビジン；(C)メルカプトエタノール、次にビオチン化したシステイン-含有ペプチド、次にストレプトアビジン；及び、(D)遊離チオール官能性を有さないビオチン化したペプチド、次にストレプトアビジンで処理した後の、本発明に従い調製されたマレイミド-誘導された表面への結合の選択性を示している、表面プラスモン共鳴("SPR")センサーグラムを重ねている。
【０２８７】
【図４】図4は、本発明に従い調製されたマレイミド-誘導された表面の非-特異的タンパク質結合の欠損を示している表面プラスモン共鳴センサーグラムである。このSPRセンサーグラムは、ビオチン化したチオール-含有ペプチド及び粘性のタンパク質フィブリノーゲン溶液で処理した。
【０２８８】
【図５】図5は、典型的アッセイ条件下で本発明に従い調製した表面の堅牢性を示している表面プラスモン共鳴センサーグラムを重ねている。3種のマレイミド-官能基化された表面を、ビオチン化したチオール-含有ペプチドで処理し、次に下記の条件に曝した：(A)PBS緩衝液で4時間処理後；(B)対照、曝露なし；(C)PBS緩衝液中のジチオスレイトール及びリシン溶液で2時間処理後。その後各表面を、ストレプトアビジンで処理し、SPRにより分析し、曝露後の表面上に残留するビオチン化したペプチドの割合についてアッセイした。
【０２８９】
【図６】図6は、本発明の方法を用い、フェロセン-チオール13を調製するために使用した合成経路を概略的に示し、これは単層内のマレイミド基の密度を決定するための電気的タグとして使用した。(a)(i)EDC、NHS、CH2Cl2；(ii)化合物11、Et3N、DMF；(b)ジチオスレイトール("DTT")、Et3N、MeOH。
【０２９０】
【図７Ａ】図7は、単層内のマレイミド基の密度を決定することに関連している。ジスルフィド1及び2の異なる比で形成されたSAMを、フェロセン-2-カルボン酸(2-メルカプト-エチル)アミド(以後"フェロセン13"と称す)の溶液で処理し、次にサイクリックボルタンメトリーを用い、Ag/AgCl参照電極に対して、0.5M KNO3中、走査速度200mV/秒で分析した。本明細書に列記した全ての電位は、Ag/AgCl参照電極に対する。図7Aは、フェロセン13をマレイミドSAMに不動化した後のSAMを表わしている。
【図７Ｂ−Ｃ】図7Bは、ジスルフィド1(フェロセン13を生じるジスルフィド)の様々な溶液比(v/v％として示す)で形成されたSAMの標準化したボルタングラムである。480mVを中心とするふたつの波は、不動化されたフェロセン分子の酸化及び還元に相当している。レドックス波の下側の標準化された面積から、不動化されたフェロセン基、及びその結果のマレイミドの密度を決定し、図7Cに示している。χ溶液は、単層が形成された溶液中のジスルフィド1(フェロセンを生じるジスルフィド)のジスルフィド2(不活性基を生じるジスルフィド)に対するモル分率であるのに対し、χ表面は、その表面に組込まれたマレイミドのモル分率である。
【０２９１】
【図８】図8は、キナーゼアッセイにおけるマレイミドSAMの使用を例示している。srcキナーゼのペプチド基質(IYGEFKKKC)は、C-末端システイン残基を介して、マレイミド表面へ不動化され、薬物スタウロスポリンによるキナーゼの阻害が言及された：図8Aは、p60c-src スタウロスポリンのIC50結果を走査している。図8Bは、阻害率(％)に変換したスポット強度のプロットである。
【０２９２】
【図９】図9は、係留されたマレイミドは、チオールと反応し安定したアルキル-チオール結合を、又はジエンと反応し新規の安定した炭素-炭素結合を、ディールスアルダー反応を介して形成することができることを示している。図9は更に、マレイミドのチオールとの第一の反応における及びディールスアルダー反応マレイミドのジエンとの反応による、ふたつのリガンド表面を作成するための、マレイミドの使用の非-限定的例も示している。
【０２９３】
【図１０】図10は、炭水化物をチオール反応基でタグ付けする一般的方法を例示している。ここではGlcNAcが例として使用される。(a)(i)AcSH、AIBN、ジオキサン；(ii)NaOH、水/ジオキサン。
【図１１】図11は、不動化された炭水化物を示している表面の形成を例示している。マレイミドを1〜2％の密度で示しているSAMを、チオール-タグ付けた炭水化物を含有する溶液(pH6)と30分間接触した。得られた表面は、制御された密度で良く規定された配向の炭水化物を示している。
【０２９４】
【図１２】図12は、グリコシルトランスフェラーゼアッセイの結果を示している。この表面は、行及び対照行(基質なし)により規定された3種の異なる炭水化物基質を含む。各列は、異なる濃度のβ1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ及び一定濃度の糖供与体(UDP[14C]ガラクトース、3.5μM)と反応した。この反応は、リン光造影により検出した。不動化したGlcNAcのみがこの特定の酵素の基質であることは明らかである。
【図１３】不動化された生体分子の密度を決定するために本発明において使用することができる電気化学分子を意味する。
【０２９５】
【図１４】図14は、クチナーゼをSAMへ共有結合するために使用されるエチル-4-ニトロフェニル(8-メルカプト-オクチル)リン酸18を調製するために使用される合成経路を概略的に示す。試薬及び条件：(a)トリエチルホスファイト；(b)1. (COCl)2、2,4-ニトロフェノール/Et3N；(c)チオール酢酸、AIBN；(d)HCl/MeOH。
【図１５】図15は、融合タンパク質が、不動化されている本発明の態様の予想図を示している。
【０２９６】
【図１６】図16は、不動化が、クテナーゼ及びp-ニトロフェノールリン酸の間の共有結合を介して生じる不動化された融合タンパク質を示している。
【図１７】図17は、本発明の実施態様に従った、生物物質のアレイ作成のための装置を示している。図17(a)は未組立図を示すのに対し、図17(b)は組立図を示す。
【図１８】図18は、位置合わせピンを備える、図17に示された装置に類似した、本発明の装置を示す。
【図１９】図19は、別の本発明の実施態様に従い集成された装置の横断面図を示す。
【０２９７】
【図２０】図20は、本発明の装置を示す。
【図２１】図21は、本発明の装置を示す。
【図２２】図22は、本発明の「アレイのアレイ作成」を示している。
【図２３】図23(a)-(c)は、各々複数のウェルオリフィスを有するふたつの取り外し可能な部材を使用する方法を示し、ここで一方の取り外し可能な部材のウェルオリフィスは、他方の取り外し可能な部材のウェルオリフィスとは異なるサイズである。
【図２４】図24は、複数のウェルオリフィスを規定しているふたつの取り外し可能な部材を備えた本発明の態様の集成された図である。
【０２９８】
【図２５】図25は、本発明の態様の装置の横断面図である。
【図２６】図26は、取り外し可能な部材が、2枚のベースプレートの間にチャネルを形成する本発明の態様を示す。関心のある異なる物質は、各ベースプレートの表面上に不動化することができ、及びチャネル内の液体又は多の物質を介して相互作用することが可能である。
【図２７】図27は、ふたつの取り外し可能な部材が、互いにシールされ、チャネルを形成する本発明の態様を示す。
【０２９９】
【図２８】図28は、本発明の態様に従う、非-均一のウェルオリフィスを規定する取り外し可能な部材を示す。
【図２９】図29は、本発明の態様に従う、非-均一のウェルオリフィスを規定する取り外し可能な部材を示す。
【図３０】図30は、ベースプレートと同じフットプリントを有さず、むしろベースプレートよりもより小さいフットプリントを有する取り外し可能な部材を備える、本発明の態様に従う装置を示す。
【図３１】図31は、位置合わせピンを伴うベースプレート及び取り外し可能な部材を示す。
【図３２】図32は、本発明の装置を用いて行われたアッセイの結果を示す。
【図３３】図33(a)は、本発明のアレイを示す。図33(b)は、本発明の装置を用いて行われたアッセイの結果を示す。
【０３００】
【図３４】図34(a)及び(b)は、本発明に従い行われたアッセイの結果を示している。
【図３５】図35は、本発明に従ったプロセスを示す。
【図３６】図36は、本発明の装置を用いて行われたアッセイの感度を明らかにするアッセイ結果を示している。
【０３０１】
【図３７】図37は、本発明の装置を用い行われたアッセイの結果を示している。図37(a)は、図37(c)に示された開発されたベースプレートの一部を示している。図37(b)は、アッセイ結果のグラフである。
【図３８Ａ】図38は、同時に多くのアッセイを行うための、本発明の装置の使用を明らかにするアッセイの結果を示している。
【図３８Ｂ】図38は、同時に多くのアッセイを行うための、本発明の装置の使用を明らかにするアッセイの結果を示している。
【図３９】図39は、本発明に従い行われたアッセイの結果を示している。
【図４０】図40は、表面131上へ生体分子を不動化するために使用することができる例証的技術の代表である。
【図４１Ａ−Ｅ】図41(a)-(i)は、4個の取り外し可能な部材の使用を生じる本発明の装置を示し、各々は複数のウェルオリフィスを有し、ここでひとつの取り外し可能な部材中のウェルオリフィスは、別の取り外し可能な部材中のウェルオリフィスとは異なる位置にある。
【図４１Ｆ−Ｉ】図41(a)-(i)は、4個の取り外し可能な部材の使用を生じる本発明の装置を示し、各々は複数のウェルオリフィスを有し、ここでひとつの取り外し可能な部材中のウェルオリフィスは、別の取り外し可能な部材中のウェルオリフィスとは異なる位置にある。
【図４２】図42は、本発明の装置を示している。
【０３０２】
【図４３】図43は、本発明の装置の横断面図を示している。
【図４４】図44は、本発明の装置を示している。
【図４５Ａ−Ｂ】図45は、本発明の装置の横断面図を示している。
【図４５Ｃ−Ｅ】図45は、本発明の装置の横断面図を示している。
【図１】
2005509737.tif 000033
【図２】
2005509737.tif 000034
【図３】
2005509737.tif 000035
【図４】
2005509737.tif 000036
【図５】
2005509737.tif 000037
【図６】
2005509737.tif 000038
【図７Ａ】
2005509737.tif 000039
【図７Ｂ−Ｃ】
2005509737.tif 000040
【図８】
2005509737.tif 000041
【図９】
2005509737.tif 000042
【図１０】
2005509737.tif 000043
【図１１】
2005509737.tif 000044
【図１２】
2005509737.tif 000045
【図１３】
2005509737.tif 000046
【図１４】
2005509737.tif 000047
【図１５】
2005509737.tif 000048
【図１６】
2005509737.tif 000049
【図１７Ａ】
2005509737.tif 000050
【図１７Ｂ】
2005509737.tif 000051
【図１８Ａ】
2005509737.tif 000052
【図１８Ｂ】
2005509737.tif 000053
【図１９】
2005509737.tif 000054
【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１Ａ−Ｅ】
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【図４１Ｆ−Ｉ】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５Ａ】
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【図４５Ｂ】
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【図４５Ｃ−Ｅ】
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