(57)【要約】カノーラ油糧種子粗粉からのカノーラタンパク質単離物の回収に際し、着色成分の形成を抑制するステップ、および着色成分を形成する傾向のある物質の存在を減少させるステップを取り入れ、より淡色で黄色味の少ないカノーラタンパク質単離物を得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
カノーラ種子を処理してカノーラタンパク質粗粉を形成し、
該カノーラタンパク質粗粉を抽出してタンパク質水溶液を形成し、
該タンパク質水溶液を濃縮し、
該濃縮タンパク質水溶液からカノーラタンパク質単離物を回収する
カノーラタンパク質単離物の形成方法における、着色の減少したカノーラタンパク質を生じさせる前記方法の間に少なくとも１つのプロセスステップを実施することを含む改善。
【請求項２】
前記の少なくとも１つのプロセスステップが、前記種子を処理することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記の種子処理が、前記種子中のミロシナーゼを不活性化することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記の少なくとも１つのプロセスステップが抽出ステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記の抽出ステップが、抗酸化剤の存在下でのカノーラタンパク質粗粉の抽出、低温脱溶媒粗粉の抽出、気流脱溶媒粕の抽出の少なくとも１つ、および少なくとも１種の着色成分吸着剤によるカノーラタンパク質溶液の処理を利用して実施される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記の少なくとも１つのプロセスステップが濃縮ステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
濃縮ステップに続いて、該濃縮タンパク質水溶液を透析濾過する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記の少なくとも１つのプロセスステップには粗粉が関与する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記カノーラタンパク質粗粉が溶媒抽出されている、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記の少なくとも１つのプロセスステップには回収したカノーラタンパク質単離物が関与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記のカノーラタンパク質単離物が溶媒抽出されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記のカノーラタンパク質単離物を、濃縮タンパク質水溶液から、該濃縮水溶液を冷水に添加してタンパク質ミセル集合体を形成すること、および該タンパク質ミセル集合体を上澄液から分離することによって回収する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
上澄液を濃縮し、濃縮した上澄液を透析濾過すること、および透析濾過した上澄液からカノーラタンパク質単離物を回収することによって前記上澄液を処理し、該上澄液からさらなるカノーラタンパク質単離物を回収する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
（ａ）抗酸化剤を含む塩水溶液を使用してカノーラ油糧種子粗粉を抽出し、カノーラ油糧種子粗粉中のタンパク質を可溶化し、約５〜約６．８のｐＨを有するタンパク質水溶液を形成すること、
（ｂ）油糧種子粗粉残渣からタンパク質水溶液を分離すること、
（ｃ）選択膜技術を使用してイオン強度を実質的に一定に維持しながら前記タンパク質水溶液のタンパク質濃度を高め、濃縮タンパク質溶液を準備すること、
（ｄ）前記濃縮タンパク質溶液を、温度が約１５℃未満の冷水中に希釈し、水相中に離散したタンパク質ミセルを形成すること、
（ｅ）タンパク質ミセルを沈降させて、無定形粘着性ゼラチン状グルテン様ミセル集合体を形成すること、および
（ｆ）乾燥重量基準少なくとも約90重量％(Ｎ×6.25)のタンパク質濃度を有する上澄みからタンパク質ミセルを回収すること、
を含むカノーラ油糧種子粗粉からのカノーラタンパク質単離物の調製方法。
【請求項１５】
前記抗酸化剤が、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗酸化剤が、前記塩水溶液中に約０．０１〜約１重量％の量で存在する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記カノーラ油糧種子粗粉が、油抽出用溶媒の残渣を除去するために約５０℃未満の温度で気流脱溶媒されているカノーラ油糧種子粗粉である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記カノーラ油糧種子粗粉が、油抽出用溶媒の残渣を除去するために約１００℃未満に高められた温度で脱溶媒されているカノーラ油糧種子粗粉である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
（ａ）カノーラ油糧種子粗粉をアルコールで洗浄すること、
（ｂ）洗浄したカノーラ油糧種子粗粉を抽出し、洗浄したカノーラ油糧種子粗粉中のタンパク質を可溶化し、約５〜約６．８のｐＨを有するタンパク質水溶液を形成すること、
（ｃ）油糧種子粗粉残渣からタンパク質水溶液を分離すること、
（ｄ）選択膜技術を使用してイオン強度を実質的に一定に維持しながら前記タンパク質水溶液のタンパク質濃度を高め、濃縮タンパク質溶液を準備すること、
（ｅ）前記の濃縮タンパク質溶液を、温度が約１５℃未満の冷水中に希釈し、水相中に離散したタンパク質ミセルを形成すること、
（ｆ）タンパク質ミセルを沈降させて、無定形粘着性ゼラチン状グルテン様ミセル集合体を形成すること、および
（ｇ）乾燥重量基準少なくとも約90重量％(Ｎ×6.25)のタンパク質濃度を有する上澄みからタンパク質ミセルを回収すること、、
を含むカノーラ油糧種子粗粉からのカノーラタンパク質溶液の調製方法。
【請求項２０】
前記アルコールがエタノールである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記洗浄ステップが、カノーラ油糧種子粗粉を溶媒中に約１：３〜約１：１０のｗ／ｖ比で分散させること、生じたスラリーを約１５℃〜約４５℃の温度で約５〜約６０分間攪拌すること、および洗浄したカノーラ油糧種子粗粉を該スラリーから分離することによって実施される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記スラリーを約３０℃〜約７５℃の温度で約１５〜約３０分間攪拌する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記洗浄を、さらなるフェノール化合物および／または目に見える着色が回収されなくなるまで複数回実施する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記カノーラ油糧種子粗粉が、油抽出用溶媒の残渣を除去するために約５０℃未満の温度で気流脱溶媒されているカノーラ油糧種子粗粉である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記カノーラ油糧種子粗粉が、油抽出用溶媒の残渣を除去するために約１００℃未満に高められた温度で脱溶媒されているカノーラ油糧種子粗粉である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
（ａ）カノーラ油糧種子粗粉を抽出し、カノーラ油糧種子粗粉中のタンパク質を可溶化し、約５〜約６．８のｐＨを有するタンパク質水溶液を形成すること、
（ｂ）油糧種子粗粉残渣からタンパク質水溶液を分離すること、
（ｃ）タンパク質水溶液の限外濾過を実施することによって、イオン強度を実質的に一定に維持しながら前記タンパク質水溶液のタンパク質濃度を高め、濃縮タンパク質溶液を準備すること、
（ｄ）濃縮タンパク質溶液を透析濾過すること、
（ｅ）透析濾過したタンパク質溶液を、温度が約１５℃未満の冷水中に希釈し、水相中に離散したタンパク質ミセルを形成すること、
（ｆ）タンパク質ミセルを沈降させて、無定形粘着性ゼラチン状グルテン様ミセル集合体を形成すること、および
（ｇ）乾燥重量基準少なくとも約90重量％(Ｎ×6.25)のタンパク質濃度を有する上澄みからタンパク質ミセルを回収すること、
を含むカノーラ種子油粕からのカノーラタンパク質単離物の調製方法。
【請求項２７】
前記透析濾過が、約２〜約２０倍容の透析濾過溶液を用いて実施される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記透析濾過が、約５〜約１０倍容の透析濾過溶液を用いて実施される、請求項２８に記載の方法。
【請求項２９】
前記抽出ステップが、約５〜約６．８の範囲のｐＨを有する塩水溶液を使用して実施され、前記の透析濾過溶液が前記抽出ステップで使用した溶液と同一の濃度およびｐＨを有する塩水溶液である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記透析濾過が、約３０００〜約５０，０００ダルトンの範囲の分画分子量を有する膜を使用して実施される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記の膜が約５０００〜約１０，０００ダルトンの分画分子量を有する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記の透析濾過溶液が、前記透析濾過ステップの少なくとも一部において抗酸化剤を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記抗酸化剤が亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記抗酸化剤を約０．０１〜約１重量％の量で使用する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記抽出ステップが、約５〜約６．８のｐＨを有し抗酸化剤を含む塩水溶液を用いて実施される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３６】
前記カノーラ油糧種子粗粉をアルコールで洗浄する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３７】
前記タンパク質ミセル集合体を乾燥し、乾燥したカノーラタンパク質単離物をアルコール水溶液で抽出する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３８】
前記上澄液を上澄液の限外濾過を実施することによって濃縮して濃縮上澄液を準備し、該濃縮上澄液を透析濾過する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記透析濾過が、約２〜約２０倍容の透析濾過溶液を使用して実施される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記透析濾過が、約５〜約１０倍容の水を使用して実施される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記透析濾過が、約３０００〜約５０，０００ダルトンの範囲の分画分子量を有する膜を使用して実施される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記膜が約５０００〜約１０，０００ダルトンの分画分子量を有する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記透析濾過溶液が、前記透析濾過ステップの少なくとも一部において抗酸化剤を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記抗酸化剤が亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記抗酸化剤を約０．０１〜約１重量％の量で使用する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記透析濾過タンパク質溶液を前記希釈ステップの前に着色吸着剤と接触させる、請求項２６に記載の方法。
【請求項４７】
前記着色吸着剤がポリビニルピロリドンである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ポリビニルピロリドンを約０．５〜約６重量％の量で使用する、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記ポリビニルピロリドンを約２〜約３重量％の量で使用する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
カノーラ油糧種子粗粉を、カノーラ油糧種子中のミロシナーゼを不活性化すること、およびその処理した油糧種子からカノーラ油を回収してカノーラ油糧種子粗粉を形成することによって調製する、請求項２６に記載の方法。
【請求項５１】
前記カノーラ油糧種子粗粉が、油抽出用溶媒の残渣を除去するために約５０℃未満の温度で気流脱溶媒されている、請求項４０に記載の方法。
【請求項５２】
前記カノーラ油糧種子粗粉が、油抽出用溶媒の残渣を除去するために約１００℃未満に高められた温度で脱溶媒されている、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記の透析濾過されたタンパク質溶液を前記希釈ステップの前に低温殺菌する、請求項２６に記載の方法。
【請求項５４】
前記の低温殺菌ステップが、透析濾過されたタンパク質溶液を約５５〜約７０℃の温度で約１０〜約１５分間加熱することによって実施される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
（ａ）カノーラ油糧種子粗粉を抽出し、カノーラ油糧種子粗粉中のタンパク質を可溶化し、約５〜約６．８のｐＨを有するタンパク質水溶液を形成すること、
（ｂ）油糧種子粗粉残渣からタンパク質水溶液を分離すること、
（ｃ）選択膜技術を使用してイオン強度を実質的に一定に維持しながら前記タンパク質水溶液のタンパク質濃度を高め、濃縮タンパク質溶液を準備すること、
（ｄ）前記濃縮タンパク質溶液を、温度が約１５℃未満の冷水中に希釈し、水相中に離散したタンパク質ミセルを形成すること、
（ｅ）タンパク質ミセルを沈降させて、無定形粘着性ゼラチン状グルテン様ミセル集合体を形成すること、
（ｆ）上澄液からタンパク質ミセル集合体を分離すること、
（ｇ）タンパク質ミセル集合体を乾燥して、乾燥重量基準で少なくとも約９０重量％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含有量を有するカノーラタンパク質単離物を準備すること、および
（ｈ）前記カノーラタンパク質単離物をアルコール水溶液で抽出すること
を含む、カノーラ種子油粕からのカノーラタンパク質単離物の調製方法。
【請求項５６】
前記アルコール水溶液が、約２：１〜約１：２のエタノール：水の容積比を有するエタノール水溶液である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記抽出ステップが、カノーラタンパク質単離物をアルコール水溶液中に約５〜約２５重量％の量で分散させること、生じたスラリーを約３０〜約６０分間攪拌すること、および該スラリーから抽出したカノーラタンパク質単離物を分離することによって実施される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記抽出ステップを、カノーラタンパク質単離物からさらなるフェノール化合物および／または目に見える着色が除去されなくなるまで繰り返す、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
（ａ）カノーラ油糧種子粗粉を抽出し、カノーラ油糧種子粗粉中のタンパク質を可溶化し、約５〜約６．８のｐＨを有するタンパク質水溶液を形成すること、
（ｂ）油糧種子粗粉残渣からタンパク質水溶液を分離すること、
（ｃ）選択膜技術を使用してイオン強度を実質的に一定に維持しながら前記タンパク質水溶液のタンパク質濃度を高め、濃縮タンパク質溶液を準備すること、
（ｄ）濃縮タンパク質溶液を低温殺菌して低温殺菌したタンパク質溶液を形成すること、
（ｅ）低温殺菌したタンパク質溶液を、温度が約１５℃未満の冷水中に希釈し、水相中に離散したタンパク質ミセルを形成すること、
（ｆ）タンパク質ミセルを沈降させて、無定形粘着性ゼラチン状グルテン様ミセル集合体を形成すること、および
（ｇ）乾燥重量基準少なくとも約90重量％(Ｎ×6.25)のタンパク質濃度を有する上澄みからタンパク質ミセルを回収すること、
を含むカノーラ油糧種子粗粉からのカノーラタンパク質単離物の調製方法。
【請求項６０】
前記の低温殺菌が濃縮タンパク質溶液を約５５〜約７０℃で約１０〜約１５分間加熱することによって実施される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記濃縮タンパク質溶液を約６０〜約６５℃で約１０分間加熱する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
（ａ）カノーラ油糧種子を処理して油種子に含まれるミロシナーゼを不活性化し、処理した油糧種子を生成すること、
（ｂ）前記油糧種子を処理して種子からカノーラ油を取り出し、かつカノーラ油糧種子粗粉を生成すること、
（ｃ）カノーラ油糧種子を抽出し、カノーラ油糧種子中のタンパク質を可溶化し、約５〜約６．８のｐＨを有する水溶液を形成すること、
（ｄ）油糧種子粗粉残渣からタンパク質水溶液を分離すること、
（ｅ）選択膜技術を使用してイオン強度を実質的に一定に維持しながら前記タンパク質水溶液のタンパク質濃度を高め、濃縮タンパク質溶液を準備すること、
（ｆ）前記濃縮タンパク質溶液を、温度が約１５℃未満の冷水中に希釈し、水相中に離散したタンパク質ミセルを形成すること、
（ｇ）タンパク質ミセルを沈降させて、無定形粘着性ゼラチン状グルテン様ミセル集合体を形成すること、および
（ｈ）乾燥重量基準少なくとも約90重量％(Ｎ×6.25)のタンパク質濃度を有する上澄みからタンパク質ミセルを回収すること、
を含むカノーラ油種子からのカノーラタンパク質単離物の調製方法。
【請求項６３】
前記カノーラ油糧種子粗粉を、前記抽出ステップに先立って、油抽出用溶媒の残渣を除去するために約５０℃未満の温度で気流脱溶媒する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記カノーラ油糧種子を、前記抽出ステップに先立って、油抽出用溶媒の残渣を除去するために約１００℃未満に高められた温度で脱溶媒する、請求項７６２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(関連出願の参照)
本出願は、米国特許法第119条第(e)項に基づいて、同時係属の米国仮特許出願、2002年６月20日出願の第60/389,957号、および2002年11月６日出願の第60/432,985号からの優先権を主張する。
【０００２】
(発明の分野)
本発明は、カノーラ種子粗粉からのカノーラタンパク質単離物の回収に関する。
【０００３】
(発明の背景)
譲受者に譲受されその開示がここで参考のために取り込まれる米国特許第5,844,086号および第6,005,076号(「Murray II」)において、脂肪含量の多いカノーラ油糧種子粗粉を含む、脂肪含量の多い油糧種子粗粉からタンパク質単離物を単離するための方法が開示されている。このプロセスに含まれる工程は、油糧種子粗粉からのタンパク質材料を可溶化し、粗粉中の脂肪も可溶化し、得られるタンパク質水溶液から脂肪を除去することを含む。タンパク質水溶液は、脂肪除去工程の前または後に残留油糧種子粗粉から分離することができる。次に、イオン強度を実質的に一定に維持しつつ、脱脂タンパク質溶液を濃縮してタンパク質濃度を上昇させ、その後、濃縮されたタンパク質溶液をさらなる脂肪除去工程に付することができる。次に、濃縮されたタンパク質溶液を希釈して、ミセル状の分離したタンパク質滴として高度に会合したタンパク質分子の曇状塊の形成を引き起こす。タンパク質ミセルを沈降させて、「タンパク質ミセル塊」すなわちＰＭＭと呼ばれる凝固し癒着した濃い無定形の粘着性のグルテン様タンパク質単離物塊を形成し、これを、残留水相から分離し乾燥する。
【０００４】
タンパク質単離物は、(ケルダール窒素または他の都合のよい方法のＮ×6.25で測定して)少なくとも約90重量％のタンパク質含量を有し、実質的に非変性(示差走査熱量測定により決められる)であり、低残留脂肪含量を有する。ここで用いられる「タンパク質含量」という用語は、乾燥重量基準で表される、タンパク質単離物中のタンパク質の量を意味する。乾燥タンパク質単離物として回収される油糧種子粗粉から抽出されるタンパク質の割合としての、この手順を用いて得られるタンパク質単離物の収率は、通常、40重量％より小さい、典型的には約20重量％であった。
【０００５】
前記Murray II特許に記載された手順は、米国特許第4,208,323号(Murray IB)に記載のように、油糧種子を含む種々のタンパク質源材料からタンパク質単離物を形成するための手順の変更としておよび改良のために開発された。米国特許第4,208,323号が発行された1980年に入手できた油糧種子粗粉は、Murray II特許の際に利用できたカノーラ油糧種子粗粉の油糧混入水準を有しておらず、その結果、Murray IB特許の手順はそのような油糧種子粗粉から、タンパク質含量が90重量％を越えるタンパク質材料を製造することができない。出発材料としてナタネ(カノーラ)粗粉を用いて行われるいかなる特定の実験もMurray IB特許において記載されていない。
【０００６】
Murray IB特許それ自体は、希釈前に濃縮工程を導入してＰＭＭを形成することにより米国特許第4,169,090号および第4,285,862号(Murray IA)に記載のプロセスを改良するために設計された。Murray IAの特許は、ナタネ油を含むが、生成物の純度は指示していない一つの実験を記載している。Murray IBの特許に記載の濃縮工程は、Murray IAのプロセスについての約20％から、タンパク質単離物の収率を改良するのに役立った。
【０００７】
このような従来法によって製造されるカノーラタンパク質単離物の有する１つの難点が、比較的濃い黄色と不快な臭いである。粗粉を含むカノーラタンパク質製品のこれらの問題の原因はフェノール性化合物であることが報告されている。カノーラには、フェノール性化合物が大豆中に見出される量の約10倍含まれており、シナピンおよび縮合型タンニンが含まれているかもしれない。フェノール性化合物は、酸化により、濃い着色の発生させることができる。この問題は、等電沈殿によって製造されたカノーラタンパク質で特に深刻であり、等電沈殿では、その強アルカリ性条件によってフェノール性化合物のキノンへの酸化が容易に起こり、次いで、そのキノンはタンパク質と反応して、タンパク質およびその水溶液を暗緑色または暗褐色に変色させる。その他の化合物および反応も着色形成に寄与しているかもしれない。
【０００８】
(発明の概要)
本発明者らは、本明細書で、カノーラ種子を処理してカノーラタンパク質粗粉を形成し、カノーラタンパク質粗粉を抽出に付してタンパク質水溶液を形成し、タンパク質水溶液を濃縮し、その濃縮タンパク質水溶液からカノーラタンパク質単離物を取り出す、カノーラタンパク質単離物を形成する方法の改善を提供する。
【０００９】
フェノール性化合物は、抽出ステップでカノーラ粗粉から抽出され、存在する遊離フェノール性化合物の量は330ｎｍでのＵＶ吸光度(A330)から得ることができる。このようなフェノール性化合物はキノンに酸化される傾向があり、キノンはタンパク質と反応して、より長波長で吸収する傾向のある着色化合物を形成する。420ｎｍでの吸光度(A420)を測定すると、単離物およびカノーラタンパク質溶液の実際に目に見える黄色の着色のより直接的な測定値が得られる。本発明では、カノーラタンパク質単離物を得るための処理の間に、フェノール性化合物を除去してフェノール性化合物が目に見える着色成分を形成できないようにするステップ、フェノール性化合物が目に見える着色成分に酸化されるのを阻止するステップ、およびその他の目に見える着色成分を除去するステップを提供する。
【００１０】
本発明の１つの態様によって提供される改善には、上記工程の間に、着色の減少したカノーラタンパク質単離物を生じさせる少なくとも１つのプロセスステップを実施することが含まれる。本発明者らは、この方法に対して多面的に取り組み、
−カノーラ種子を処理
−粗粉の処理
−特定形態のカノーラタンパク質粗粉の利用
−特定条件下でカノーラタンパク質の抽出を行うこと
−抽出物の処理
−回収カノーラタンパク質単離物の処理
を含む１つまたは複数のいくつかのステップを採用できる。
【００１１】
このような処理の２つ以上が採用されるかもしれないし、このような処理の組合せを使用することも多い。
【００１２】
種子の処理を実施する場合には、その処理に、今まで通り殻をむくと同時に、ミロシナーゼを不活性化することを少なくとも含める。ミロシナーゼを不活性化することによって、味および着色の一因であって抗栄養剤である硫黄成分へのグルコシノレートの分解に対するミロシナーゼの何らかの触媒効果をもたらす。処理については、その譲受人に譲渡され、その開示が参照により本細書に組み込まれる、          出願の同時係属の米国特許出願第          号に、より完全に記載されている。
【００１３】
粗粉の処理には、エタノールなどのアルコールを含む、水と混和する有機溶媒を用いて粗粉を抽出して、フェノール性化合物および／またはその他の着色成分を抽出することを含むことができる。
【００１４】
特定形態のカノーラタンパク質粗粉を使用する場合には、そのような粗粉としては、溶媒抽出によるカノーラ油糧種子粗粉から残存溶媒を約50℃未満の温度、一般には約15〜30℃の外界温度で除去することによって調製した通風脱溶媒粗粉でよい。
【００１５】
さらに、特定形態のカノーラタンパク質粗粉としては、溶媒抽出によるカノーラ油糧種子粗粉から残存溶媒を約100℃未満の高められた温度で除去することによって調製した低温焙煎カノーラ油糧種子粗粉でもよい。
【００１６】
プロセスステップに抽出ステップを含める場合には、その抽出ステップを、フェノール性化合物の酸化および目に見える着色の形成を阻止する抗酸化剤の存在下で実施してもよい。別法または組合せで、抽出ステップによって形成されたタンパク質水溶液を少なくとも１種の着色成分吸着剤で処理してもよい。追加または別法として、少なくとも１種の着色成分吸着剤との処理を、濃縮ステップで形成される濃縮カノーラタンパク質溶液について実施してもよい。
【００１７】
プロセスステップに濃縮ステップを含む場合には、濃縮カノーラタンパク質水溶液を透析濾過に付し、濃縮カノーラタンパク質溶液から着色物を洗い流す。透析濾過は、透析濾過中のフェノール化合物の酸化および目に見える着色の形成を阻止するための抗酸化剤を含む水溶液を用いて実施してもよい。
【００１８】
プロセスステップに回収カノーラタンパク質単離物を含む場合には、そのプロセスステップに、カノーラタンパク質単離物をエタノール水溶液などのアルコール水溶液を用いて抽出し、カノーラタンパク質単離物からフェノール性化合物および／またはその他の着色物を抽出することを含めることができる。
【００１９】
カノーラタンパク質単離物は、濃縮タンパク質水溶液から、その濃縮水溶液を冷水に添加してタンパク質ミセル集合体を形成し、そのタンパク質ミセル集合体を上澄液から分離することによって取り出すことができる。
【００２０】
上澄液を濃縮すること、その濃縮上澄液を透析濾過に掛けて濃縮上澄液からフェノール化合物および／または目に見える着色物を除去すること、および続いてその透析された上澄液を乾固するなどによって透析濾過上澄液からカノーラタンパク質単離物を回収することによって上澄液を処理して、上澄液からさらなるカノーラタンパク質単離物を回収できる。
【００２１】
着色の形成を防止することおよびカノーラタンパク質単離物の色調を改善することによって、広範囲の応用分野でその製品を使用できるであろう。本発明による着色物の除去および形成防止によってカノーラタンパク質単離物の風味もまた改善されると考えられる。
【００２２】
本発明方法によって作られるタンパク質単離物は、加工食品のタンパク質強化、オイルの乳化、ベークトフーズの本体形成材、およびガスを閉じ込める製品における発泡剤など、タンパク質単離物の従来の応用分野で使用できる。さらに、カノーラタンパク質分離物を、肉類似物として有用なタンパク質繊維に形成してもよいし、結合材として卵白を使用する食料製品における卵白代替物または増量剤として使用してもよい。カノーラタンパク質単離物は、栄養補助食品としても使用できる。カノーラタンパク質単離物は、他にも、ペット食品、動物飼料、工業および化粧用への応用分野、およびパーソナルケアーへの応用分野で使用される。
【００２３】
本発明の１つの具体的態様によれば、(a)カノーラ油糧種子粗粉を、抗酸化剤を含む食塩水溶液を使用する抽出に付し、カノーラ油糧種子粗粉中のタンパク質を可溶化し、ｐＨが約５〜約6.8のタンパク質水溶液を形成する工程、(b)残留油糧種子粗粉からタンパク質水溶液を分離する工程、(c)選択的膜技術を用いて、イオン強度を実質的に一定に維持しつつ、前記タンパク質水溶液のタンパク質濃度を高め、濃厚タンパク質溶液を提供する工程、(d)前記濃厚タンパク質溶液を約15℃未満の冷却水中に希釈して、水相中に離散したタンパク質ミセルを形成させる工程、(e)タンパク質ミセルを沈降させて、無定形粘着性ゼラチン状グルテン様ミセル塊を形成する工程、および(f)乾燥重量基準少なくとも約90重量％(Ｎ×6.25)のタンパク質濃度を有する上澄みからタンパク質ミセルを回収する工程
を含むカノーラ油糧種子粗粉からのカノーラタンパク質単離物の調製方法が提供される。
【００２４】
本発明の他の具体的態様によれば、(a)カノーラ油糧種子粗粉をアルコールで洗浄する工程、(b)洗浄したカノーラ油糧種子粗粉を抽出に付し、洗浄したカノーラ油糧種子粗粉中のタンパク質を可溶化し、ｐＨが約５〜約6.8のタンパク質水溶液を形成する工程、(c)残留油糧種子粗粉からタンパク質水溶液を分離する工程、(d)選択的膜技術を用いて、イオン強度を実質的に一定に維持しつつ、前記タンパク質水溶液のタンパク質濃度を高め、濃厚タンパク質溶液を提供する工程、(e)前記濃厚タンパク質溶液を約15℃未満の冷却水中に希釈して、水相中に離散したタンパク質ミセルを形成させる工程、(f)タンパク質ミセルを沈降させて、無定形粘着性ゼラチン状グルテン様ミセル塊を形成する工程、および(g)乾燥重量基準少なくとも約90重量％(Ｎ×6.25)のタンパク質濃度を有する上澄みからタンパク質ミセルを回収する工程、
を含むカノーラ油糧種子粗粉からのカノーラタンパク質単離物の調製方法が提供される。
【００２５】
本発明のさらなる具体的態様によれば、(a)カノーラ油糧種子粗粉を抽出に付し、カノーラ油糧種子粗粉中のタンパク質を可溶化し、ｐＨが約５〜約6.8のタンパク質水溶液を形成する工程、(b)残留油糧種子粗粉からタンパク質水溶液を分離する工程、(c)該タンパク質水溶液の限外濾過を行うことによって、イオン強度を実質的に一定に維持しつつ、前記タンパク質水溶液のタンパク質濃度を高め、濃厚タンパク質溶液を提供する工程、(e)透析濾過したタンパク質溶液を約15℃未満の冷却水中に希釈して、水相中に離散したタンパク質ミセルを形成させる工程、(f)タンパク質ミセルを沈降させて、無定形粘着性ゼラチン状グルテン様ミセル塊を形成する工程、および(g)乾燥重量基準少なくとも約90重量％(Ｎ×6.25)のタンパク質濃度を有する上澄みからタンパク質ミセルを回収する工程、
を含むカノーラ油糧種子粗粉からのカノーラタンパク質単離物の調製方法が提供される。
【００２６】
本発明のさらなる態様によれば、(a)カノーラ油糧種子粗粉を抽出に付し、カノーラ油糧種子粗粉中のタンパク質を可溶化し、ｐＨが約５〜約6.8のタンパク質水溶液を形成する工程、(b)残留油糧種子粗粉からタンパク質水溶液を分離する工程、(c)選択的膜技術を用いて、イオン強度を実質的に一定に維持しつつ、前記タンパク質水溶液のタンパク質濃度を高め、濃厚タンパク質溶液を形成する工程、(d)透析濾過したタンパク質溶液を約15℃未満の冷却水中に希釈して、水相中に離散したタンパク質ミセルを形成させる工程、(e)タンパク質ミセルを沈降させて、無定形粘着性ゼラチン状グルテン様ミセル塊を形成する工程、(f)上澄液からタンパク質ミセルを回収する工程、(g)タンパク質ミセルを乾燥し、乾燥重量基準少なくとも約90重量％(Ｎ×6.25)のタンパク質濃度を有するカノーラタンパク質単離物を準備する工程、および(h)該カノーラタンパク質単離物をアルコール水溶液による抽出に付す工程、
を含むカノーラ油糧種子粗粉からのカノーラタンパク質単離物の調製方法が提供される。
【００２７】
本発明のさらなる具体的態様によれば、(a)カノーラ油糧種子粗粉を抽出に付し、カノーラ油糧種子粗粉中のタンパク質を可溶化し、ｐＨが約５〜約6.8のタンパク質水溶液を形成する工程、(b)残留油糧種子粗粉からタンパク質水溶液を分離する工程、(c)選択的膜技術を用いて、イオン強度を実質的に一定に維持しつつ、前記タンパク質水溶液のタンパク質濃度を高め、濃厚タンパク質溶液を提供する工程、(d)濃縮タンパク質溶液を殺菌して殺菌されたタンパク質溶液を形成する工程、(e)殺菌されたタンパク質溶液を約15℃未満の冷却水中に希釈して、水相中に離散したタンパク質ミセルを形成させる工程、(f)タンパク質ミセルを沈降させて、無定形粘着性ゼラチン状グルテン様ミセル塊を形成する工程、および(g)乾燥重量基準少なくとも約90重量％(Ｎ×6.25)のタンパク質濃度を有する上澄みからタンパク質ミセルを回収する工程、
を含むカノーラ油糧種子粗粉からのカノーラタンパク質単離物の調製方法が提供される。
【００２８】
本発明の他の具体的態様によれば、(a)カノーラ油糧種子を処理して油糧種子に含まれるミロシナーゼを不活性化し、処理済油糧種子を作る工程、(b)該処理済油糧種子を加工して種子からカノーラ油を取り出し、カノーラ油糧種子粗粉を作る工程、(c)そのカノーラ油糧種子粗粉を抽出に付し、カノーラ油糧種子粗粉中のタンパク質を可溶化し、ｐＨが約５〜約6.8の水溶液を形成する工程、(d)残留油糧種子粗粉からタンパク質水溶液を分離する工程、(e)選択的膜技術を用いて、イオン強度を実質的に一定に維持しつつ、前記タンパク質水溶液のタンパク質濃度を高め、濃厚タンパク質溶液を提供する工程、(f)前記濃厚タンパク質溶液を約15℃未満の冷却水中に希釈して、水相中に離散したタンパク質ミセルを形成させる工程、(g)タンパク質ミセルを沈降させて、無定形粘着性ゼラチン状グルテン様ミセル塊を形成する工程、および(h)乾燥重量基準少なくとも約90重量％(Ｎ×6.25)のタンパク質濃度を有する上澄みからタンパク質ミセルを回収する工程、
を含むカノーラ油糧種子粗粉からのカノーラタンパク質単離物の調製方法が提供される。
【００２９】
カノーラは、菜種またはアブラナ種子としても知られている。
【００３０】
(発明の一般的説明)
着色の改善は種子を処理することによって達成できる。殻を除去した種子を蒸気を使用してミロシナーゼの加熱不活性化に付す。次いで、不活性化した種子を通常の方法で処理して種子から油糧を取り出し、カノーラ油糧種子粗粉を形成する。
【００３１】
本発明の一実施形態によれば、約100℃未満に高められた温度で焙煎することによって油糧種子の脱溶媒を行うことが好ましい。なぜなら、このような粗粉で生じる着色の度合いは、通常のより高い焙煎温度で脱溶媒した粗粉よりも小さいからである。このような粗粉からタンパク質含有量が少なくとも約90重量％(Ｎ×6.25)、好ましくは少なくとも約100重量％のカノーラタンパク質単離物を形成することは、その譲受人に譲渡され、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、2002年12月９日出願の同時係属の米国特許出願第10/314,202号に記載されている。
【００３２】
より望ましくは、油糧種子粗粉を約50℃未満の温度の、好ましくは約15〜約30℃のほぼ外界温度の気流中で脱溶媒する。なぜなら、焙煎粗粉を使用した場合よりも抽出物溶液の着色がいっそう少ないからである。このような粗粉からタンパク質含有量が少なくとも約90重量％(Ｎ×6.25)、好ましくは少なくとも約100重量％のカノーラタンパク質単離物を形成することは、その譲受人に譲渡され、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、同時係属の米国特許出願、2002年６月21日出願の第60/390,126号、2002年８月８日出願の第60/401,712号に記載されている。
【００３３】
カノーラタンパク質単離物はカノーラ油糧種子粗粉から形成することができる。そのすべてが、その譲受人に譲渡され、その開示が参照により本明細書に組み込まれる同時係属の米国特許出願、2001年５月４日出願の第60/288,415号、2001年10月５日出願の第60/326,987号、2001年11月７日出願の第60/331,066号、2001年11月26日出願の第60/333,494号、2002年４月24日出願の第60/374,801号および2002年５月３日出願の第10/137,391号(国際公開第02/089597号)には、カノーラ油糧種子粗粉からのカノーラタンパク質単離物の製造方法が記載されており、その単離物は少なくとも約100重量％のタンパク質含有量(Ｎ×6.25)を有している。その方法には、カノーラ油糧種子粗粉を食塩溶液を用いる抽出に付すこと、生じたタンパク質水溶液を油糧種子粗粉残渣から分離すること、選択的膜技術を用いて、イオン強度を実質的に一定に維持しつつ、前記タンパク質水溶液のタンパク質濃度を少なくとも約200ｇ/Ｌまで高めること、生じた濃縮タンパク質溶液を冷水中に希釈してタンパク質ミセルを形成すること、タンパク質ミセルを沈降させて、無定形粘着性ゼラチン状グルテン様ミセル塊(ＰＭＭ)を形成すること、および上澄液から少なくとも約100重量％(Ｎ×6.25)のタンパク質含有量を有するタンパク質ミセルを回収すること、を含む多ステップの工程が含まれる。本明細書において、タンパク質含有量は乾燥重量基準で測定される。取り出したＰＭＭを乾燥してもよい。
【００３４】
上記方法および具体的には米国特許出願第60/326,987号、第60/331,066号、第60/333,494号、第60/374,801号および第10/137,391号に記載されているような１つの実施形態では、ＰＭＭ沈降ステップからの上澄液を処理し、湿潤ＰＭＭと上澄液とから乾燥タンパク質単離物を含むタンパク質単離物を回収する。この方法は、先ず限外濾過膜を用いて上澄液を濃縮し、その濃縮上澄液を湿潤ＰＭＭと混合し、混合物を乾燥することによって実施できる。得られるカノーラタンパク質単離物は、タンパク質が少なくとも約90重量％(Ｎ×6.25)、好ましくは少なくとも約100重量％(Ｎ×6.25)である高い純度を有している。
【００３５】
上記方法および具体的には出願第60/333,494号、60/374,801号および第10/137,391号に記載されているような他の実施形態では、ＰＭＭ沈降ステップからの上澄液を処理してその上澄液からタンパク質単離物を回収する。この方法は、先ず限外濾過膜を用いて上澄液を濃縮し、ついでその濃縮液を乾固することによって実施できる。得られるカノーラタンパク質単離物は、タンパク質が少なくとも約90重量％(Ｎ×6.25)、好ましくは少なくとも約100重量％(Ｎ×6.25)である高い純度を有している。
【００３６】
前記の米国特許出願に記載されている方法は本質的にバッチ法である。その譲受人に譲渡され、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、同時係属の米国特許出願、2001年11月20日出願の第60/331,646号、2002年5月30日出願の第60/383,809号、2002年11月19日出願の第10/298,678号(国際公開第03/043439号)には、カノーラタンパク質単離物の連続的製造法が記載されている。それによれば、カノーラ油糧種子粗粉を塩溶液と連続的に混合し、その混合物をパイプを通して輸送する間にカノーラ油糧種子粗粉からタンパク質を抽出してタンパク質水溶液を形成し、タンパク質水溶液をカノーラ油糧種子粗粉残渣から連続的に分離し、そのタンパク質水溶液を選択的膜技術を介して輸送しイオン強度を実質的に一定に維持しながらタンパク質水溶液のタンパク質含有量を少なくとも200ｇ/Ｌまで高め、得られる濃厚タンパク質溶液を冷水と連続的に混合してタンパク質ミセルを形成し、そのタンパク質ミセルを、上澄液を連続的にオーバーフローさせながら所望量のＰＭＭが沈降槽に蓄積するまで連続的に沈降させる。ＰＭＭを沈降槽から取り出し乾燥すればよい。ＰＭＭは、少なくとも約90重量％(Ｎ×6.25)、好ましくは少なくとも約100重量％(Ｎ×6.25)のタンパク質含有量を有する。
【００３７】
前記の米国特許出願、第60/326,987号、第60/331,066号、第60/333,494号、第60/333,494号、第60/374,801号および第10/137,391号に記載されているように、オーバーフローした上澄液を処理して上澄液からカノーラタンパク質単離物を回収できる。
【００３８】
本発明の一実施形態によれば、油糧種子粗粉をまず溶媒抽出に付して粗粉からフェノール化合物および着色物を除去してもよい。このような溶媒抽出は、フェノール化合物および／または目に見える着色物のための水溶性有機溶媒、例えば水溶性アルコール、好ましくはエタノールを用いて実施できる。
【００３９】
抽出は、カノーラ油糧種子粗粉を溶媒中に約１：３〜約１：10、好ましくは約１：５のｗ/ｖ比で分散させて実施すればよい。このスラリーを約15℃〜約45℃、好ましくは約30℃〜約35℃の温度で約５〜約60分間、好ましくは約15〜約30分間攪拌すればよい。好ましい条件の組合せの１つは35℃で30分間の抽出である。このような抽出は、フェノール化合物および／または目に見える着色が抽出されなくなるまで複数回実施してもよい。
【００４０】
本発明の方法では、カノーラ油糧種子粗粉からタンパク質系成分を可溶化する。タンパク質系成分はカノーラ種子中に天然に存在するタンパク質でもよいし、あるいはタンパク質系成分が遺伝子操作によって改質されてはいるが、天然タンパク質に特有の疎水性および極性を所持していればよい。カノーラ粗粉は、カノーラ油糧種子からカノーラ油を取り出すことによって得られる、例えば、熱へキサン抽出または冷油押出法によって得られる、様々なレベルの非変性タンパク質を有する任意のカノーラ粗粉でよい。カノーラ油糧種子からカノーラ油を取り出すために種子の処理を実施する場合には、その種子の処理は、通常、本明細書に記載する本発明のタンパク質単離物の回収手順とは別個の操作として実施される。
【００４１】
塩が存在すると油糧種子粗粉からの可溶性タンパク質の取り出しが増すので、タンパク質の可溶化は、最も効率的には食品級塩溶液を用いて実施される。カノーラタンパク質単離物が非食品用途を意図したのものである場合には、非食品級の化学薬品も使用できる。塩は通常塩化ナトリウムであるが、塩化カリウムなどのその他の塩も使用できる。塩溶液は、可溶化されるはずのタンパク質を十分に可溶化できるように、少なくとも約0.10、好ましくは少なくとも約0.15のイオン強度を有する。塩溶液のイオン強度が増加するにつれて、油糧種子粗粉中のタンパク質の可溶化度は始め最大値に達するまで増加する。続いてイオン強度がいくらか増加しても可溶化されるタンパク質の総量は増加しない。タンパク質を最大に可溶化する食品級塩溶液のイオン強度は、関係する塩および選択した油糧種子粗粉に応じて変動する。食品級塩溶液は、最大約0.25までの範囲のイオン強度を有してよい。
【００４２】
イオン強度の増加に伴って、タンパク質を沈殿させるためにより大きな希釈度が必要になることを考慮すると、約0.8未満のイオン強度値、より好ましくは約0.15〜約0.6のイオン強度の値を利用するのが好ましい。
【００４３】
バッチ法では、塩によるタンパク質の可溶化は、低くとも約５℃、好ましくは最大約35℃までの温度で、好ましくは可溶化時間を短縮するために通常約10〜約60分間攪拌をしながら実施する。全体としての高い製品収率を得るために、油糧種子粗粉から実質的に実行可能な限りのタンパク質を抽出できるように可溶化を実施することが好ましい。
【００４４】
温度下限は、その温度未満では可溶化が非実用的なほど遅いので約５℃が選択され、一方好ましい上限温度は、バッチ法でより高い温度レベルでは工程が非経済的になるので約35℃が選択される。
【００４５】
連続法においては、カノーラ油糧種子粗粉からのタンパク質の抽出は、カノーラ油糧種子粗粉からタンパク質を連続抽出することと矛盾しない任意の方式で実施される。１つの実施形態では、カノーラ油糧種子粗粉を食品級塩溶液と連続的に混合し、混合物を、本明細書に記載のパラメーターによる所望の抽出を実施するに十分な滞留時間を得るための長さおよび流速を有するパイプまたは導管を通して輸送する。このような連続処理では、塩による可溶化ステップは急速に、最大で約10分間で、好ましくはカノーラ油糧種子粗粉から実質上実行可能な限りのタンパク質を抽出できるように実施される。連続処理における可溶化は、好ましくは高められた温度、好ましくは約35℃を超え、一般には最大で約65℃までまたはそれ以上で実施される。
【００４６】
食品級塩水溶液およびカノーラ油糧種子粗粉は、本来的に約５〜約6.8のｐＨを有しており、以下で詳細に説明するように、タンパク質単離物をミセル経路で形成できる。
【００４７】
ｐＨ範囲の限界点およびその近傍では、タンパク質単離物の形成は、部分的にのみミセル経路を通してかつ、ｐＨ範囲の他の点で得られるよりも低い収率で起こる。これらの理由により、約5.3〜約6.2のわずかに酸性であるｐＨ値が好ましい。
【００４８】
必要なら、抽出ステップで使用するために塩溶液のｐＨを、任意の都合のよい酸、通常は塩酸、またはアルカリ、通常は水酸化ナトリウムを使用して約５〜約6.8の任意の所望する値に調整すればよい。
【００４９】
可溶化ステップにおける食品級塩溶液中の油糧種子粗粉の濃度は広範に変動できる。典型的な濃度値は約５〜約15％ｗ/ｖである。
【００５０】
本発明の一実施形態によれば、カノーラ油糧種子粗粉中のフェノール類が、タンパク質と反応し着色を濃くする成分に酸化されるのを阻止するために、食品級塩溶液中に抗酸化剤を存在させてもよい。亜硫酸ナトリウムおよびアスコルビン酸など、任意の所望する食品級抗酸化剤を使用すればよい。食品級塩水溶液中で使用する抗酸化剤の量は使用する材料によって決まり、約0.01〜約１重量％、好ましくは約0.05〜約0.1重量％で変化できる。抗酸化剤を使用してフェノール化合物の酸化を抑制すると、抽出物の着色が減少するが(420nmでの吸光度)、フェノール化合物の濃度(330nmでの吸光度)はほとんど変化しない。
【００５１】
添加した亜硫酸ナトリウムが存在する場合には、0.05Ｍの低い塩濃度でさえ、ｐＨ6.3における抽出物中のタンパク質濃度は亜硫酸ナトリウムの存在しない0.15Ｍの場合の濃度と同等である。
【００５２】
抽出ステップから得られるタンパク質溶液は、一般に約５〜約40ｇ/Ｌ、好ましくは約10〜約30ｇ/Ｌのタンパク質濃度を有する。
【００５３】
抽出ステップのパラメーターの選択に際しては、カノーラ油糧種子粗粉から可能な限りのタンパク質を抽出するという要求を、得られる抽出液の着色を最小にするという要求と比較検討する。本明細書に提示されたデータを考慮すると、抽出時間が30分であれば、通常、一般的なｐＨおよび塩の重量モル濃度のもとで抽出されるであろうタンパク質のすべてを抽出するに十分である。ｐＨが高くなると抽出されるタンパク質の量が増加し、かつ、明らかに着色の濃い(A420での吸光度で測定して)タンパク質溶液が生じる。
【００５４】
ｐＨ8.0の0.1Ｍ塩水を用いる10分間の抽出で、ｐＨ6.3の0.15Ｍ塩水を用い30分間で抽出されると同じ量のタンパク質を抽出することが可能である。ｐＨが高くなるにつれ着色は明らかに濃くなるが、低ｐＨでの抽出と比較した場合、ｐＨ9.8での抽出ではA330が著しく減少する。この現象は、フェノール性化合物が反応して、A330での吸収はないがより長波長のA360〜A400に吸収のある黄色着色物を形成していると解釈できるかもしれない。これらの理由により、カノーラタンパク質粗粉の抽出は８未満のｐＨで実施される。
【００５５】
次に、抽出ステップから得られる水相を、真空濾過、続いて遠心および／または濾過を採用することなどによる任意の都合のよい方式で、カノーラ粗粉残渣から分離し、粗粉残渣を除去する。分離した粗粉残渣は乾燥して廃棄する。
【００５６】
カノーラ種子粗粉がかなりの量の脂肪を含む場合には、次に、Murray II特許に記載されているように、該特許に記載の脱脂ステップを、分離したタンパク質水溶液についておよび以下で考察する濃縮タンパク質水溶液について実施すればよい。
【００５７】
カノーラ油糧種子粗粉から塩水溶液を用いてタンパク質を抽出することの代替法として、このような抽出を水のみを用いて行うこともできるが、水のみを用いると、カノーラ油糧種子粗粉からのタンパク質の抽出が塩水溶液の場合よりも減少する傾向がある。このような代替法を採用する場合には、次いで、以下で説明する濃縮ステップ中にタンパク質を溶液状に維持するために、油糧種子粗粉残渣から分離した後のタンパク質溶液に上で考察した濃度で塩を添加すればよい。最初の脂肪除去ステップを実施する場合には、塩は、一般にこのような操作の完了後に添加する。
【００５８】
他の代替法では、カノーラ油糧種子粗粉を約6.8を超え一般には約11までの比較的高いｐＨ値で食品級塩溶液を用いる抽出に付す。しかし、先に触れたように、約８より高いｐＨ値での抽出は、このようなｐＨではかなりの目に見える着色が形成されるので、一般には回避される。食品級塩溶液のｐＨは、水酸化ナトリウム水溶液など、任意の都合のよい食品級アルカリを使用することによって、所望のアルカリ値にｐＨを調整できる。あるいは、約ｐＨ５より低く一般には約ｐＨ３までの比較的低いｐＨの塩溶液を用いてカノーラ油糧種子粗粉からタンパク質を抽出することもできる。このような代替法を採用する場合には、次いで、カノーラ油糧種子粗粉の抽出ステップから得られる水相を、真空濾過、続いて遠心および／または濾過を採用することなどによる任意の都合のよい方式でカノーラ粗粉残渣から分離し、粗粉残渣を除去する。分離したカノーラ粗粉残渣は乾燥して廃棄すればよい。
【００５９】
次いで、高ｐＨまたは低ｐＨでの抽出ステップから得られるタンパク質水溶液を、以下で考察するような主としてミセル経路によりカノーラタンパク質単離物を取り出すためのさらなる処理に先立って、ｐＨを上で考察したように約５〜約6.8、好ましくは約5.3〜約6.2の範囲に調整してもよい。適当であるなら、このようなｐＨ調整は、任意の都合のよい、塩酸などの酸、または水酸化ナトリウムなどのアルカリを用いて実施できる。
【００６０】
タンパク質の抽出に続いて、タンパク質溶液を、限外濾過／透析濾過および着色吸着剤との接触を含む、本発明の他の実施形態による１つまたは複数の着色除去ステップに付すことができる。限外濾過ステップでは、塩濃度を変えないでタンパク質水溶液のタンパク質含有量を増加させる。限外濾過は、タンパク質を保持しながらフェノール性化合物および着色原因物質を透過液と共に膜を通過させることと矛盾しない分画分子量を有する膜、典型的には、約3,000〜約50,000ダルトン、好ましくは約5000〜約10,000ダルトンの分画分子量を有し、様々な膜材料および膜配置を考慮した限外濾過膜を用いて実施できる。膜は、中空糸膜またはスパイラル膜でもよい。連続操作の場合、膜は、タンパク質水溶液が膜を通して通過する際に所望の濃縮度が得られるような大きさであればよい。
【００６１】
タンパク質溶液は、限外濾過ステップによって約４〜約20倍に濃縮され、好ましくは少なくとも約200ｇ/Ｌ、より好ましくは少なくとも約250ｇ/Ｌタンパク質濃度を有する濃縮タンパク質溶液が得られるように実施される。
【００６２】
次いで、濃縮タンパク質溶液を、抽出溶液と同じ重量モル濃度およびｐＨの塩水溶液を用いて透析濾過する。このような透析濾過は、約２〜約20倍容の透析濾過液、好ましくは約５〜約10倍容の透析濾過液を用いて実施すればよい。透析濾過操作では、透過液と共に膜を通過させることによってタンパク質水溶液からさらなる量のフェノール性化合物および目に見える着色が除去される。透析濾過操作は、透過液中にフェノール性化合物および目に見える着色のさらなる量がほとんどなくなるまで実施すればよい。このような透析濾過は、約3000〜約50,000ダルトン、好ましくは約5,000〜約10,000ダルトンの範囲の分画分子量を有し、様々な膜材料および膜配置を考慮した膜を用いて実施できる。
【００６３】
本発明のこの実施形態の１つの態様によれば、透析濾過ステップの少なくとも一部で使用する透析濾過媒質中に抗酸化剤が存在していてもよい。抗酸化剤は、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸など、任意の都合のよい食品級抗酸化剤でよい。透析濾過媒質中で使用する抗酸化剤の量は、使用する材料によって決まり、約0.01から約１重量％、好ましくは約0.05重量％まで変化してもよい。抗酸化剤は、濃縮カノーラタンパク質単離物溶液中に存在するフェノール性化合物の酸化を抑制するのに役立つ。
【００６４】
濃縮ステップおよび透析濾過ステップは、任意の都合のよい温度、一般には約20℃〜約60℃で、所望の濃縮度をもたらすような時間実施すればよい。使用する温度およびその他の条件は、ある程度まで濃縮を実施するのに使用する膜装置および所望する溶液のタンパク質濃度によって決まる。
【００６５】
限外濾過／透析濾過の操作を実施するには、タンパク質濃度が最高でかつ着色が最も少ないタンパク質溶液を提供するという要求を考慮して諸条件を選択する。以下で報告する実験に基づき、限外濾過／透析濾過(ＵＦ／ＤＦ)の処理は、ｐＨおよび塩含有量に応じて、約28％〜約74％だけ効果的にＡ330値(フェノール性化合物濃度)を低下させることが可能である。限外濾過／透析濾過の操作には、抗栄養因子を除去する効果もあり、それによってカノーラタンパク質単離物の栄養学的品質が改善される。
【００６６】
ＵＦ／ＤＦ透過液はｐＨ8.0および6.3で最大のＡ330値を有していた。透過液のこれらの高いＡ330値は、おそらく、膜を通って透過液中に移行できる非結合フェノール性化合物によるものと考えられ、一方、ｐＨ9.8およびｐＨ11.0で、フェノール性化合物は反応して着色物を形成してしまってＡ330で同じくらい強くは吸収しない。
【００６７】
より高いｐＨおよび塩濃度で抽出を実施すると、Ａ330の初期示度はもっとも大きく、ほとんどの場合、最終保持液のＡ330示度はもっとも小さかった。より高いｐＨおよび塩分値では、透過液中にタンパク質の損失を示すより高い濃度の窒素が含まれていた。
【００６８】
最終保持液に対するＡ330／タンパク質比は、最良比がｐＨ6.3からおよび8.0のｐＨ値で達成されることを示しており、このことは、より高いｐＨでの試験よりもタンパク質当たりのＡ330成分がより少ないこと、およびＵＦ／ＤＦ処理による除去がより効果的であることを示している。０Ｍおよび0.25Ｍの塩濃度を除くすべてにおいて、ｐＨ6.3が最良のＡ330／タンパク質比を有していた。これを考慮に入れると、ｐＨ6.3が、最も高いタンパク質濃度を得るのに最良の塩濃度である0.25Ｍを用いる、タンパク質溶液から着色を透析濾過するために実験された最良のｐＨレベルであると思われる。
【００６９】
限外濾過／透析濾過に続いて色素吸着剤による処理を行ってもよい。前記の同時係属の米国特許出願、第60/288,415号、第60/326,987号、第60/331,066号、第60/333,494号、第60/374,801号および第10/137,391号(国際公開第02/089597号)には、減色を実施するのに粉末活性炭を使用することが記載されている。
【００７０】
このような出願中に記載されているように、このような減色ステップは、濃縮前のカノーラタンパク質溶液に対して実施され、この減色ステップにより、このようなステップを欠く場合に較べると、製品であるカノーラタンパク質単離物の着色が薄くなり、それほど濃くない黄色になる。本発明の他の実施形態によれば、着色成分吸着材料は、好ましくは濃縮され透析濾過されたカノーラタンパク質溶液に対して使用する。本発明では粒状活性炭(ＧＡＣ)ばかりでなく粉末活性炭も使用できる。着色吸着剤として使用できるその他の材料はポリビニルピロリドンである。別法として、本発明の他の実施形態によれば、着色成分吸着材料を、限外濾過および任意選択の透析濾過の前のカノーラタンパク質溶液に対して、および／または抽出ステップで直接的に使用できる。着色吸着材料を限外濾過ステップの前に採用する場合には、このような透析濾過によってさらなるフェノール化合物および／または目に見える着色が少しも除去されないなら、透析濾過を省いてもよい。
【００７１】
後記の実験で、ポリビニルピロリドンおよびＧＡＣは、ｐＨ9.8および11でよりもｐＨ6.3および8.0においてＡ330値をより低下させたが、多分、高い方の２つのｐＨレベルではキノン類がタンパク質に結合するためであろう。ポリビニルピロリドンによって、タンパク質の損失なしに、Ａ330の良好な低下が生じた。他に可能性のある材料を試験したが、タンパク質の容認し難い損失または溶液のＡ330を低下させる能力の欠如のため、満足できるものではなかった。
【００７２】
着色吸着剤で処理するステップは、任意の都合のよい条件、一般にはカノーラタンパク質溶液の外界温度で実施できる。粉末活性炭の場合には、約0.025％〜約５％ｗ/ｖ、好ましくは約0.05％〜約２％ｗ/ｖの量を使用すればよい。着色吸着剤としてポリビニルピロリドンを使用する場合には、約0.5％〜約５ｗ/ｖ、好ましくは約２〜約３％ｗ/ｖの量を使用すればよい。着色吸着剤は、カノーラタンパク質溶液から、濾過によるなど、任意の都合のよい手段によって除去できる。
【００７３】
透析済みカノーラタンパク質溶液に対する着色吸着剤による処理の完了に続いて、得られたタンパク質溶液を処理して、その溶液からカノーラタンパク質単離物を取り出す。カノーラタンパク質単離物の取り出しは、タンパク質溶液の諸特質に応じて、任意の都合のよい方式で実施できる。
【００７４】
例えば、カノーラタンパク質単離物は、アルカリ性溶液からの等電点沈殿によって、あるいはより中性の溶液からのタンパク質ミセル集合体法によって取り出すことができる。あるいは、塩濃度を高めることによってタンパク質を沈殿させてもよい。
【００７５】
カノーラタンパク質単離物を取り出すためのカノーラタンパク質溶液の処理は、好ましくは、前記米国特許出願およびより詳細には以下に記載した通りのタンパク質ミセル集合体法を用いて実施される。なぜなら、その抽出ｐＨ条件であると、等電沈殿技法で採用されるｐＨよりも着色の形成が少ないことになるからである。
【００７６】
カノーラタンパク質水溶液に対して行われる着色除去ステップで採用する温度に応じて、濃縮タンパク質溶液を低くても約20℃から最高で約60℃、好ましくは約25〜約40℃の温度に加温し、濃縮、場合によっては透析濾過したタンパク質溶液の粘度を低下させ、後に続く希釈ステップおよびミセル形成の実行を容易にしてもよい。濃縮、場合によっては透析濾過したタンパク質溶液は、濃縮、場合によっては透析濾過したタンパク質溶液の温度がその温度以上であると冷水で希釈してもミセルを形成できなくなる温度を超えて加熱されてはならない。必要なら、Murray II特許に記載のように、濃縮、場合によっては透析濾過したタンパク質溶液をさらなる脱脂操作に付してもよい。
【００７７】
着色除去ステップから得られる濃縮タンパク質溶液を低温殺菌して、貯蔵の結果として最初の粗粉中に存在していたかもしれない、あるいは抽出ステップで粗粉からカノーラタンパク質単離物溶液中に抽出されたかもしれないなんらかの細菌を死滅させてもよい。このような低温殺菌は、任意の所望する低温殺菌条件下で実施すればよい。一般には、濃縮、場合によっては透析濾過したタンパク質溶液を約55〜約70℃、好ましくは約60〜65℃の温度に約10〜約15分間、好ましくは約10分間加熱する。次いで、低温殺菌した濃縮タンパク質溶液を、後記載するようなさらなる処理に備えて、好ましくは約25℃〜約40℃の温度に冷却してもよい。
【００７８】
次いで、着色除去ステップならびに任意選択の脱脂および低温殺菌ステップから得られた濃縮タンパク質溶液を、所望の希釈度とするのに必要な容積の冷水と混合することによって希釈し、ミセルを形成する。ミセル経路によって得ることを希望するカノーラタンパク質の割合、および上澄液から得ることを希望するカノーラタンパク質の割合に応じて、濃縮タンパク質溶液の希釈度を変えることができる。希釈度合が高いと、水相中により多くの割合のカノーラタンパク質が残存する。
【００７９】
ミセル経路によるタンパク質をより多くの割合で得ることを希望する場合には、濃縮タンパク質溶液を、約15倍またはそれ以下、好ましくは約10倍またはそれ以下で希釈する。
【００８０】
濃縮タンパク質溶液と混合される冷水の温度は、約15℃未満、一般には約３℃〜約15℃、好ましくは約10℃未満である。なぜなら、タンパク質ミセル集合体の形態でのタンパク質単離物の収率は、使用した希釈率においてこれらの低い温度で改善されるからである。
【００８１】
バッチ操作では、濃縮タンパク質溶液の１槽分を、前に考察したように、所望の容積を有する冷水の静止本体に添加する。濃縮タンパク質溶液の希釈およびその結果として起こるイオン強度の低下によって、離散したタンパク質小滴の形態で高度に会合したタンパク質分子のミセル状での雲状様集合体の形成が起こる。バッチ法では、タンパク質ミセルを冷水の本体中で沈降させ、無定形粘着性ゼラチン状グルテン様ミセル集合体(ＰＭＭ)を形成する。沈降は、遠心などによって促進できる。このような誘導沈降によってたんぱく質ミセル集合体の液体含有量が低下し、それによって、一般にはミセル集合体総量の約70％〜約95重量％の水分含有量が約50％〜約80重量％の値に低下する。この方法でミセル集合体の水分含有量を低下させると、ミセル集合体に吸蔵された塩の含有量、したがって乾燥単離物の塩含有量が低下する。
【００８２】
別法として、Ｔ型パイプの一方の入口に濃縮タンパク質溶液を連続的に通し、同時にＴ型パイプの他方の入口に希釈水を供給しながら、パイプ中での混合を可能にすることによって、希釈操作を連続的に実施してもよい。希釈水は、所望の希釈度を達成するのに十分な比率でＴ型パイプに供給される。
【００８３】
パイプ中での濃縮タンパク質溶液と希釈水の混合によって、タンパク質ミセルの形成が始まり、混合物は、Ｔ型パイプからの出口から沈降槽中に供給される。沈降層が満杯になったら、そこから上澄液をオーバーフローさせる。混合物は、好ましくは、沈降槽内の液体の本体に、液体本体内の乱れを最小にする方式で供給される。
【００８４】
連続法では、沈降槽中でタンパク質ミセルを沈降させ、凝集、合体し、密で、粘着性の、グルテン様タンパク質ミセル集合体(ＰＭＭ)を形成し、この手順を所望量のＰＭＭが沈降槽の底部に蓄積するまで継続し、そこで蓄積したＰＭＭを沈降槽から取り出す。
【００８５】
タンパク質溶液を少なくとも約200ｇ/Ｌのタンパク質含有量まで濃縮するプロセスパラメーターと約15未満の希釈率の使用を組み合わせると、前記米国特許中で考察されている周知の従来似術によるタンパク質単離物形成方法のいずれを利用して達成されるよりも、最初の粗粉抽出物からのタンパク質ミセル集合体の形態でのタンパク質の回収率で表現して収率がより高く、しばしば相当より高くなり、タンパク質の含有量で表現して単離物がより純粋になる。
【００８６】
沈降した集合体から残留水槽をデカンテーションすること、または遠心などによって、沈降した単離物を残留水相または上澄液から分離する。ＰＭＭは、湿潤体でも使用できるし、噴霧乾燥、凍結乾燥または真空ドラム乾燥などの任意の都合のよい技術によって乾燥して乾燥体を形成できる。乾燥ＰＭＭは、タンパク質が約90重量％、好ましくは少なくとも約100重量％を超える高いタンパク質含有量を有し(Ｎ×6.25として計算して)、実質的に未変性である(示差走差熱量法で判定して)。Murray II特許の方法を採用した場合には、油脂種子粗粉から単離される乾燥ＰＭＭも残留脂肪含有量が低く、約１重量％未満であることもある。
【００８７】
ＰＭＭの形成と沈降のステップからの上澄液には、希釈ステップで沈殿しなかったかなりの量のカノーラタンパク質が含まれており、上澄液を処理してこれからカノーラタンパク質単離物を回収する。ＰＭＭを取り出した後に、希釈ステップからの上澄液を濃縮してそのタンパク質濃度を高める。このような濃縮は、カノーラタンパク質を溶液中に保持しながら、塩、およびタンパク質原料から抽出される非タンパク質系低分子量物質を含む低分子量種が膜を通過するのを可能にする、適切な分画分子量を有する膜を使用する限外濾過など、任意の都合のよい選択膜技術を利用して実施される。約3,000〜10,000ダルトンの分画分子量を有し、様々な膜材料および配置を考慮した限外濾過膜を使用できる。この方法で上澄液を濃縮すると、タンパク質を回収するために乾固する必要のある液体の容積が減少する。上澄液は、乾固に先立って、一般に、約100〜約400ｇ/Ｌ、好ましくは約200〜約300ｇ/Ｌのタンパク質濃度に濃縮する。このような濃縮操作は、タンパク質溶液の濃縮ステップについて前記したように、バッチ方式または連続操作で実施できる。
【００８８】
本発明の他の実施形態によれば、乾固に先立って、濃縮上澄液を水を使用する透析濾過ステップにかける。このような透析濾過は、約２〜約20倍容の、好ましくは約５〜約10倍容の透析濾過溶液を用いて実施すればよい。透析濾過操作中に、透過液と共に膜を通過することによってさらなる量のフェノール性化合物および目に見える着色が除去される。透析濾過操作は、さらなるフェノール性化合物および目に見える着色が透過液中にかなりの量で除去されることがなくなるまで実施すればよい。このような透析濾過は、約3000〜約50,000ダルトン、好ましくは約5,000〜約10,000ダルトンの範囲の分画分子量を有し、様々な膜材料および配置を考慮した膜を用いて実施できる。
【００８９】
本発明のこの実施形態の１つの態様によれば、透析濾過媒質中に抗酸化剤が存在していてもよい。抗酸化剤は、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸など、任意の都合のよい食品級抗酸化剤でよい。透析濾過媒質中で使用する抗酸化剤の量は、使用する物質によって決まり、約0.01から約１重量％、好ましくは約0.05重量％まで変化してもよい。抗酸化剤は、濃縮カノーラタンパク質単離物溶液中に存在するフェノール性化合物の酸化を抑制するのに役立つ。
【００９０】
濃縮上澄液は、湿潤体でも使用できるし、あるいは、噴霧乾燥、凍結乾燥または真空ドラム乾燥などの任意の都合のよい技術によって乾燥して乾燥体とし、さらなるカノーラタンパク質単離物を提供できる。このようなさらなるカノーラタンパク質単離物は、タンパク質が約90重量％、好ましくは少なくとも約100重量％を超えるタンパク質含有量を有し(Ｎ×6.25として計算して)、実質的に未変性である(示差走差熱量法で判定して)。
【００９１】
所望であれば、湿潤ＰＭＭの少なくとも一部を濃縮上澄液の少なくとも一部と配合し、その後、配合したタンパク質流系を任意の都合のよい技術によって乾燥し、本発明の１つの実施形態によるカノーラタンパク質単離物の配合組成物を提供できる。一緒に混合されるタンパク質系材料の相対比は、得られるカノーラタンパク質単離物が所望の２Ｓ/７Ｓ/12Ｓタンパク質プロフィール有するように選択すればよい。別法としては、乾燥タンパク質単離物を任意の望む比率で配合し、その混合物に任意の所望する特定の２Ｓ/７Ｓ/12Ｓタンパク質プロフィールを付与してもよい。カノーラタンパク質単離物の配合組成物は、タンパク質が約90重量％、好ましくは少なくとも約100重量％を超える高いタンパク質含有量を有し(Ｎ×6.25として計算して)、実質的に未変性である(示差走差熱量法で判定して)。
【００９２】
他の代替法で、濃縮上澄液の一部のみをＰＭＭの一部のみと混合し、その得られた混合物を乾燥する場合には、ＰＭＭの残りの任意量を乾燥できると同様、濃縮上澄液の残りを乾燥できる。さらに、乾燥ＰＭＭおよび乾燥上澄を、前に考察したように、任意の所望相対比率でドライ混合してもよい。
【００９３】
この方式で操作することによって、乾燥ＰＭＭ、乾燥上澄、およびＰＭＭ由来カノーラタンパク質および上澄液由来カノーラタンパク質の様々な重量比、一般には重量で約５：95〜約95：５の乾燥混合物の形態で、多くのカノーラタンパク質単離物を取り出すことができる。このことは、組成物の２Ｓ/７Ｓ/12Ｓタンパク質の異なる比率に基づく様々な機能的および栄養学的特性を得る上で望ましいことであろう。
【００９４】
本発明の他の実施形態によれば、ＰＭＭ由来カノーラタンパク質単離物および上澄液由来カノーラタンパク質単離物を処理してこれらの単離物から着色付与成分を除去することができる。このような処理は、好都合には、混合物中のフェノール性化合物および／または目に見える着色物に対する水に混和可能な有機溶媒を水と一緒に使用して実施される。
【００９５】
水に混和可能な有機溶媒はアルコールでよいので、好ましいのは一般に約２：１〜約１：２、好ましくは１：１の体積比の、エタノールと水の混合物である。混合溶媒中に、一般には外界温度で、カノーラタンパク質単離物を約５〜約25％ｗ/ｖ、好ましくは約８〜約23％ｗ/ｖの量で分散させる。カノーラタンパク質単離物のスラリーを約30〜約60分間、好ましくは約30分間混合する。抽出過程に続いて、遠心などによってスラリーを沈降させ、カノーラタンパク質を回収する。望むなら、さらなるフェノール性化合物および／または目に見える着色物が除去されなくなるまで抽出を繰り返してもよい。カノーラタンパク質単離物をエタノールなどのアルコールに再分散させ、単離物から水を除去し、次いで、分離して乾燥すればよい。
【００９６】
実施例
実施例１：
この実施例ではタンパク質の抽出およびタンパク質溶液の着色に対する各種パラメーターの影響を示す。
【００９７】
37.5ｇの市販カノーラ粗粉(AL-016)を所望のｐＨで、所望濃度のＮａＣｌを含む水と、7.5％ｗ/ｖの粗粉濃度で20℃で混合する一連の実験を実施した。採用した塩化ナトリウム濃度は、0、0.05、0.10、0.15および0.25Ｍであり、採用したｐＨ値は、ｐＨ6.3、8.0、9.8および11.0であった。60分間の抽出時間中、10分毎に、抽出液のサンプル約30ｍＬを採取し、10,000×ｇで15分間遠心した。抽出時間の終末時点で、各サンプルの上澄液のタンパク質濃度を分析した。バッチ全体を10,000×ｇで15分間遠心し、その上澄液を0.45μｍのミクロフィルターを用いて真空濾過した。濾過した上澄液のタンパク質含有量および遊離フェノール性化合物の濃度(330nｍでの吸光度)を分析した。
【００９８】
分画分子量が10,000の膜を備えたAmicon8400装置を使用する濃縮率４での限外濾過(ＵＦ)のために、清浄化した上澄液から100ｍｌのアリコートを抜き取った。25ｍｌの保持液および貯まった透過液のタンパク質濃度およびＡ330吸光度を測定した。限外濾過した溶液を、抽出に使用したと同一塩濃度および同一ｐＨの溶液150ｍｌを用いる透析容積６による透析濾過(ＤＦ)にかけた。透析濾過の終末時点で、透析濾過から得られた保持液および貯まった透過液の双方についてそのタンパク質濃度およびＡ330を分析した。
【００９９】
次いで、最終保持液のアリコートを５つの異なった吸着剤の１種を含むカラムに通し、得られたタンパク質溶液について再度タンパク質濃度およびＡ330を調べた。吸着剤は、アンバーライトXAD-16HP(高分子吸着剤)、アンバーライトSF120NA(陽イオン交換樹脂)、Polyclar Super R(ポリビニルピロリドン)、シリカゲル(28〜200メッシュ)、および粒状活性炭(食品級)であった。
【０１００】
抽出実験から得られたデータは、粗粉から抽出可能なすべてのタンパク質を取り出すためには、30分の抽出時間で十分であることを示している。30分を超えても、試験したｐＨおよび塩濃度のいずれにおいても抽出されるタンパク質の増加はほとんど認められない。次表Ｉに各ｐＨおよび各塩濃度で得られた抽出タンパク質の量を示す。
【０１０１】
【表１】
2005529979.tif 000002
【０１０２】
次表II〜VIに、様々なｐＨにおいて、時間との相関として抽出タンパク質(量ｇ/Ｌ)に対する塩濃度の影響を示す。
【０１０３】
【表２】
2005529979.tif 000003
【０１０４】
【表３】
2005529979.tif 000004
【０１０５】
【表４】
2005529979.tif 000005
【０１０６】
【表５】
2005529979.tif 000006
【０１０７】
【表６】
2005529979.tif 000007
【０１０８】
これらの表から判るように、実施した実験では、各塩濃度において抽出ｐＨが高いほどタンパク質含有量が高くなったが、0.05Ｍを超えて塩含有量を高めてもタンパク質の溶解性は増加しなかった。
【０１０９】
次表VIIに、各ｐＨおよび各塩濃度での抽出タンパク質の330ｎｍにおける吸光度を示す。
【０１１０】
【表７】
2005529979.tif 000008
【０１１１】
表VIIから判るように、0.1Ｍ、0.15Ｍ、および0.25Ｍでの抽出において、ｐＨ9.8で、抽出されるＡ330色の低下が起こり、色は他のｐＨ値のものよりも明らかに濃く、タンパク質含有量に対応する低下はない。前に触れたように、これらの抽出のタンパク質含有量はｐＨ9.8〜ｐＨ11.0を通じて上昇し続ける。
【０１１２】
次表VIIIに、限外濾過を終え透析濾過する前のタンパク質溶液の330ｎｍでの吸光度を示す。また、表IXには透析濾過後のタンパク質溶液のＡ330を示す。これらの表から判るように、各実験で保持液のＡ330は透析濾過後のほうがより低かった。
【０１１３】
【表８】
2005529979.tif 000009
【０１１４】
【表９】
2005529979.tif 000010
【０１１５】
次表Ｘに、透析濾過を用いて達成されるＡ330の低下割合を示す。
【０１１６】
【表１０】
2005529979.tif 000011
【０１１７】
表Ｘから判るように、ＵＦ／ＤＦ後のＡ330値は、ｐＨ6.3、0.1Ｍで抽出したものが最も低下した。試験した５つの異なる塩濃度の中で、１つの濃度を除くすべてにおいて最も低いＡ330はｐＨ6.3で抽出したもので達成された。
【０１１８】
次表XIに、最終保持液の様々なタンパク質濃度を考慮に入れたＡ330/ｇ/Ｌ比を示す。この比に関しては、得られた低いメンバーで示される、Ａ330が低く、かつタンパク質含有量の高いことが最も望ましい。
【０１１９】
【表１１】
2005529979.tif 000012
【０１２０】
表XIから判るように、Ａ330／タンパク質比に注目すると、試験した各ｐＨ水準において0.25Ｍの塩水系列で最良の結果となり、実施した実験の中で全体として最も小さなＡ330／タンパク質比はｐＨ8.0、0.25Ｍで抽出したものであった。
【０１２１】
限外濾過および透析濾過の双方からの透過液のＡ330データ(示していない)を調べてみると、ｐＨ9.8および11.0の場合よりも２つのより低いｐＨ水準においてより多くのＡ330が透過液の中に流れ込んでいることが判った。
【０１２２】
6.3および8.0のｐＨでの吸着剤の試験で、Polyclarは、保持液の遊離フェノール性化合物(Ａ330)を減少させたが、吸着ステップの後にタンパク質の損失は見出されなかった。しかし、ｐＨ9.8および11.0で、Polyclarは、遊離フェノール性化合物をほとんど捕捉しなかった。アンバーライトＸＡＤは高ｐＨで行ったほとんどの場合にＡ330が減少したが、ほとんどいずれの場合もタンパク質の損失があった。
【０１２３】
試験したその他の吸着剤の中で、シリカゲルはほとんどの場合でＡ330を減少させず、サンプルを不透明にすることがかなり多く、Ａ330の示度をより大きくすることになった。アンバーライトＳＦ120は、低い方のｐＨ水準でＡ330のある程度の減少が認められたが、高いほうのｐＨ水準ではやはり効果的とは思われず、多くの場合、タンパク質のかなりの損失を示した。また、これらのサンプルには、吸着剤を通した後に若干の沈殿物が存在していた。
【０１２４】
粒状活性炭(ＧＡＣ)は、低い方のｐＨ水準で保持液のＡ330を減少させるのにかなりよく機能したが、ｐＨ9.8および11.0ではＡ330を減少させるのに有効ではなかった。また、ＧＡＣは試験したほとんどの場合に若干のタンパク質損失を示した。ＧＡＣを通したサンプルは、残留炭素が存在するので、処理後に0.45μＭのフィルターで濾過をしなければならなかった。
【０１２５】
実施例２：
この実施例では、抽出ステップに対する抗酸化剤添加の影響を例示する。
【０１２６】
アスコルビン酸を添加し、ヘリウムで抽出媒質をパージして溶解酸素の99％を除去した0.1Ｍ塩水中、ｐＨ8.0およびｐＨ6.3で抽出を実施し、実施例１の方法を繰り返した。目に見える着色の尺度としてＡ420の吸収も測定した。
【０１２７】
次表XIIに、抽出データを示す。
【０１２８】
【表１２】
2005529979.tif 000013
【０１２９】
表XIIから判るように、抽出中にアスコルビン酸を使用すると、Ａ420で示されるような目に見える着色が減少する。低濃度のアスコルビン酸(0.05％)により抽出Ａ420、または目に見える着色が２分の１以下に低下させることができる。
【０１３０】
次表XIIIに、透析濾過した保持液のＡ330およびＡ420示度を示す。
【０１３１】
【表１３】
2005529979.tif 000014
【０１３２】
表XIIIから判るように、抽出中のアスコルビン酸によるＡ420の減少はやはり透析濾過の後にも反映されている。アスコルビン酸を伴なった抽出からの保持液のＡ420は、抽出にアスコルビン酸を含まなかった保持液よりも低い。
【０１３３】
表XIVに、保持液のＡ330およびＡ420に対するPolyclarの影響を示す。
【０１３４】
【表１４】
2005529979.tif 000015
【０１３５】
表XIVから判るように、抽出で使用したアスコルビン酸によるＡ420の減少は、やはり吸着剤による処理の後でも存在する。Polyclarによって各サンプルのＡ420が減少したが、アスコルビン酸を含む２つのサンプルは、アスコルビン酸を含まない対照品よりも低かった。
【０１３６】
実施例３：
この実施例では、抗酸化剤を用いる抽出に対する塩濃度およびｐＨの影響を例示する。
【０１３７】
この実施例は、抽出ステップの開始前にカノーラ油糧種子粗粉抽出液体に0.5ｇ(0.1％)の亜硫酸ナトリウム(Ｎａ2ＳＯ3)を添加したこと以外は、実施例１の繰り返しである。使用したその他すべてのパラメーターは、透析容積が５であること以外は、実施例１と同一とした。
【０１３８】
次表XV.1〜XV.5に、各ｐＨおよび各塩濃度で得られたタンパク質の量を示す。
【０１３９】
【表１５】
2005529979.tif 000016
【０１４０】
【表１６】
2005529979.tif 000017
【０１４１】
【表１７】
2005529979.tif 000018
【０１４２】
【表１８】
2005529979.tif 000019
【０１４３】
【表１９】
2005529979.tif 000020
【０１４４】
これらの表から判るように、ほとんどの実験で、抽出は約30分間で平衡に達した。塩を添加しない場合には、ｐＨが上昇するにつれてより多くのタンパク質が抽出された。ｐＨの影響は、9.8以上の高いｐＨでよりも、8.0以下のｐＨで影響の度合いが少ないように思われる(表XV.1)。低濃度で塩を添加すると(0.10Ｍ未満)、ｐＨ6.3および8.0では概ねタンパク質抽出能力を増加させることができたが、低い塩濃縮物は、より高い9.8または11.0のｐＨ水準でのタンパク質の抽出を促進しなかった(表XV.2およびXV.3)。
【０１４５】
次表XVIに、タンパク質抽出物の遊離フェノール性化合物含有量(A330吸光度)に対するｐＨおよび塩化ナトリウム溶液濃度の影響を示す。
【０１４６】
【表２０】
2005529979.tif 000021
【０１４７】
この表XVIIで判るように、Ａ330の値は、ｐＨがｐＨ9.8まで上昇するのに伴って次第に減少したが、タンパク質濃度はこのｐＨ領域でｐＨが上昇するのに伴なって高くなった。抽出物の着色はｐＨが上昇するにつれて明らかに濃くなった。塩濃度の着色に対する影響はあまり明白でない。
【０１４８】
次表XVII.1〜XVII.4に、限外濾過からの保持液(表XVII.1)および透過液(表XVII.2)のＡ330に対する、および透析濾過からの保持液(表XVII.3)および透過液(表XVII.4)のＡ330に対するｐＨおよびＮａＣｌ濃度の影響を示す。
【０１４９】
【表２１】
2005529979.tif 000022
【０１５０】
【表２２】
2005529979.tif 000023
【０１５１】
【表２３】
2005529979.tif 000024
【０１５２】
【表２４】
2005529979.tif 000025
【０１５３】
限外濾過によって抽出物中のタンパク質は４倍に濃縮されるので、ｐＨ8.0、0.0ＮａＣｌの場合を除いて、保持液は明らかにより濃くなり、そのＡ330示度は抽出物より高かった(表XVII.1)。上の除外例は異常値かもしれない。ＵＦ前の最初の抽出物と同様、ｐＨ9.8にＡ330の最小値が現れたが、前に考察した理由により、このことは実際に目に見える着色の濃さでは確かめられなかった。Ａ330で測定すると、透過液の高いＡ330示度で示されるように、ＵＦによって抽出物からかなりの量のフェノール性化合物が取り出された(表XVII.2参照)。
【０１５４】
表XVII.3から、透析濾過の保持液は、限外濾過の保持液(表XVII.1)よりさらに低いＡ330の示度を有していたことが判る。ＤＦ透過液のＡ330示度(表XVII.4)は、ＵＦ透過液の示度(表XVII.4)ほど高くはなかったが、それにもかかわらず、ＤＦによって、残存フェノール性化合物のかなりの量がさらに除去された。透析濾過によるフェノール性化合物のこのさらなる除去によって、ＤＦ保持液のＡ330(表XVII.3)はＵＦ保持液のＡ330(表XVII.1)よりもさらに低くなった。
【０１５５】
次表XVIII.1〜XVIII.4に、保持液のＡ330に対する吸着剤およびｐＨの影響を示す。
【０１５６】
【表２５】
2005529979.tif 000026
【０１５７】
【表２６】
2005529979.tif 000027
【０１５８】
【表２７】
2005529979.tif 000028
【０１５９】
【表２８】
2005529979.tif 000029
【０１６０】
表XVIII.1〜XVIII.4から判るように、試験した吸着剤の中でPolyclarは、低いｐＨ(＜9.8)で、最終保持液のＡ330示度を減少させる上で特に有効であった。表XVIII.1に示したように、Ａ330値を最大で40％減少できる。
【０１６１】
ｐＨおよび塩濃度の特定の条件下で、その他の吸着剤もＡ330の示度を低下させることができたが、Polyclarと比較するとその効果は微々たるものであった。9.8のｐＨを採用する場合、PolyclarはＡ330を低下させるのにはあまり有用でなかった。
【０１６２】
次表XVIII.5〜XVIII.8に、保持液のタンパク質濃度(ｇ/Ｌ)に対する吸着剤の影響を示す。
【０１６３】
【表２９】
2005529979.tif 000030
【０１６４】
【表３０】
2005529979.tif 000031
【０１６５】
【表３１】
2005529979.tif 000032
【０１６６】
【表３２】
2005529979.tif 000033
【０１６７】
表XVIII.5〜XVIII.8から判るように、限外濾過によってタンパク質がたとえ大幅に濃縮されても、塩とｐＨのすべての組合せで、試験したすべての吸着剤は、保持液のタンパク質濃度にまったく無関係であった。
【０１６８】
実施例４：
この実施例では、低濃度亜硫酸ナトリウムの使用およびパージ抽出の影響を説明する。
【０１６９】
吸着剤としてPolyclarを使用するｐＨ8.0での３個の実験に、低濃度の亜硫酸ナトリウム(0.05重量％Ｎａ2ＳＯ3)を採用して、実施例３の手順を繰り返した。Ａ330の他にもＡ420を測定した。
【０１７０】
もう１組の実験では、0.05重量％Ｎａ2ＳＯ3を含む抽出溶液を、抽出の前および抽出中にヘリウムでパージも行った。
【０１７１】
次表XIX.１に、タンパク質抽出に対するこれら変更の影響を示す。
【０１７２】
【表３３】
2005529979.tif 000034
【０１７３】
表XIX.１から判るように、３種の塩添加濃度のすべてにおいて、使用する亜硫酸ナトリウムの量を減らした場合には、抽出物のタンパク質濃度が約40重量％増加した。塩濃度が高くなるとタンパク質濃度が高くなった。ヘリウムパージはタンパク質の抽出に対して無関係であった。
【０１７４】
表XIX.２に、Ａ330での着色に対するこれら変更の影響を示す。
【０１７５】
【表３４】
2005529979.tif 000035
【０１７６】
表XIX.２から判るように、Ｎａ2ＳＯ3が減少しても抽出物のＡ330に有意には影響しなかった。ヘリウムパージで溶解酸素の99％が除去されたが、抽出物の吸光度は330ｎｍまたは420ｎｍ(下表XIX.３)のいずれでも改善されなかった。
【０１７７】
【表３５】
2005529979.tif 000036
【０１７８】
次表XXに、保持液のＡ330およびＡ420に対する膜処理の影響を示す。
【０１７９】
【表３６】
2005529979.tif 000037
【０１８０】
表XXで判るように、透析濾過は、抽出物中の着色した成分をかなり除去した。最終保持液のＡ330およびＡ420示度の双方とも最初の抽出物の約半分であった。ヘリウムパージは、Ａ330およびＡ420値に影響を与えなかった。
【０１８１】
次表XXIに、保持液のＡ330およびＡ420に対するPolyclarの影響を示す。
【０１８２】
【表３７】
2005529979.tif 000038
【０１８３】
実施例５：
この実施例では、抗酸化剤および透析濾過を使用する市販カノーラ粗粉からのカノーラタンパク質単離物の調製を例示する。
【０１８４】
150ｋｇの市販カノーラ粗粉(高温焙煎粗粉)を、0.5ｋｇのアスコルビン酸(0.05重量％)を含む1000Ｌの0.15Ｍ ＮａＣｌ溶液に16℃で添加して30分間攪拌し、タンパク質含有量が20.2ｇ/Ｌのタンパク質水溶液を準備した。カノーラ粗粉残渣を真空フィルターベルト上で除去、洗浄した。得られたタンパク質溶液を遠心および濾過により清澄化し、タンパク質含有量が14.6ｇ/Ｌの清澄化タンパク質溶液1040Ｌを調製した。
【０１８５】
タンパク質抽出溶液の容積を、分画分子量が5000ダルトンの膜を用いる限外濾過装置での濃縮によって、４５Ｌまで減容した。次いで、このタンパク質溶液を、分画分子量が5000ダルトンの膜を使用する透析濾過装置で、0.05重量％のアスコルビン酸を含む450Ｌの0.15Ｍ ＮａＣｌ溶液を用いて透析濾過し、タンパク質含有量が225ｇ/Ｌである44Ｌの最終容積とした。
【０１８６】
30℃の濃縮され透析濾過された溶液を、４℃の水中に１：15で希釈した。直ちに生じるタンパク質ミセルの白色雲を沈降させた。上部の希釈水を除去し、沈殿した、粘性のある、粘着性集合体(ＰＭＭ)を槽の底部から取り出し、乾燥した。乾燥したタンパク質のタンパク質含有量は乾基準で103.2重量％(Ｎ×6.25)であった。
【０１８７】
ミセル形成からの上澄液620Ｌを、分画分子量が5000ダルトンの膜を用いる限外濾過装置での濃縮によって30Ｌまで濃縮した。次いで、この濃縮した上澄液を、分画分子量が5000ダルトンの膜を使用する透析濾過装置で、100Ｌの水を用いて透析濾過を行い、タンパク質含有量が121.8ｇ/Ｌである27Ｌの最終容積とした。
【０１８８】
濃縮し透析濾過した溶液を乾燥した。乾燥したタンパク質のタンパク質含有量は、乾基準で100.8重量％(Ｎ×6.25)であった。
【０１８９】
ＰＭＭ由来カノーラタンパク質単離物(ＣＰＩ)および上澄液由来カノーラタンパク質単離物のサンプルの明度(Ｌ)および色度(ａおよびｂ)をミノルタ(CR-310)色彩計を用いて評価した。ラボ空間で、この値は０から100まで変動し、100は白色で０は黒色である。色度座標、ａおよびｂは両方とも＋60と−60の極限値を持ち、＋ａは赤方向、−ａは緑方向、＋ｂは黄色方向および−ｂは青方向である。
【０１９０】
次表XXIIに、得られた結果を示す。
【０１９１】
【表３８】
2005529979.tif 000039
【０１９２】
このカノーラタンパク質単離物は、アスコルビン酸(抗酸化剤として)の添加および透析濾過のステップを省いてこの手順に従って取り出した単離物よりも、より明るく(Ｌ)黄色味(ｂ)の少ない色調を示した(データは示さない)。
【０１９３】
実施例６：
この実施例では、低温焙煎粗粉および気流脱溶媒粗粉からのタンパク質抽出物の着色に対する温度の影響を示す。
【０１９４】
75ｇの(ａ)低温焙煎(100℃)カノーラ油糧種子粗粉(ＬＴ)および(ｂ)気流脱溶媒(20℃)カノーラ油糧種子粗粉(Ｍａｒｃ)を、外界温度または室温(ＲＴ)、55℃、60℃および65℃で0.15Ｍ ＮａＣｌ溶液のサンプル500ｍＬに添加し、溶液の温度を実質的に一定に維持しながら30分間攪拌し、タンパク質水溶液を準備した。５、10、15、20および30分の時点で分析用にタンパク質水溶液を採取した。廃棄粗粉は10.000×ｇで５分間遠心して分離し、凍結乾燥した。
【０１９５】
各種タンパク質溶液サンプルのＡ330およびＡ420での吸光度を測定した。既に前に言及したように、Ａ330でのＵＶ吸光度は溶液中のフェノール性化合物の濃度を示し、一方Ａ420での吸光度は実際の着色のより直接的な測定値である。各種サンプルに対するデータを次表XXIIIおよびXXIVに示す。
【０１９６】
【表３９】
2005529979.tif 000040
【０１９７】
【表４０】
2005529979.tif 000041
【０１９８】
表XXIIIおよびXXIVから判るように、抽出温度を高めても、試験した各種粗粉について抽出タンパク質溶液のＡ330に対する影響はほとんどなかったが、高いほうの温度ではＡ420示度のわずかな増加が認められた。
【０１９９】
実施例７：
この実施例では、カノーラ油糧種子粗粉からのタンパク質抽出物の着色に対するいくつかのパラメーターの影響を示す。
【０２００】
実験の最初の組で、(ａ)100℃で低温焙煎されたカノーラ油糧種子粗粉(ＬＴ粗粉)、および(ｂ)20℃で気流脱溶媒されたカノーラ油糧種子粗粉(Ｍａｒｃ粗粉)のサンプル50ｇを、0.05Ｍまたは0.10Ｍ ＮａＣｌ溶液のサンプル500ｍＬに室温(20℃)で添加し、15分間攪拌した。このスラリーを5000×ｇで10分間遠心し、廃棄粗粉を除去した。
【０２０１】
実験の次の組で、まず、塩を添加していない水をホットプレート攪拌器上で60℃に加熱した。次いで、50ｇの100℃で低温焙煎したカノーラ油糧種子粗粉、または(ｂ)20℃で気流脱溶媒したカノーラ油糧種子粗粉(Ｍａｒｃ粗粉)を添加し、温度を維持しながら15分間攪拌した。5000×ｇで10分間遠心して廃棄粗粉から抽出物を分離した。
【０２０２】
各種タンパク質溶液のＡ330およびＡ420での吸光度ならびにタンパク質濃度を測定した。得られた結果を次表XXV.1およびXXV.2に示す。
【０２０３】
【表４１】
2005529979.tif 000042
【０２０４】
【表４２】
2005529979.tif 000043
【０２０５】
表XXV.1およびXXV.2に含まれる結果から判るように、Ａ330はタンパク質濃度の増加に伴って増加するが、一方、Ａ420で示される着色強度は、タンパク質濃度が変化しても有意には変化せず、このことは肉眼観察とも一致していた。これらの結果から、低温焙煎粗粉に比較して、気流脱溶媒粗粉では、より高いタンパク質収率に伴い、より淡色の製品を期待できることが判る。
【０２０６】
実施例８：
この実施例では、製品着色に対するカノーラタンパク質単離物を溶媒抽出に付すことの影響を示す。
【０２０７】
ＰＭＭ由来単離物がＤ29-02Ａ Ｃ300(57.9重量％)、Ｄ24-02Ａ Ｃ300(34.7重量％)およびＤ11-02Ａ Ｃ300(7.4重量％)である３つの単離物処置から、ＰＭＭ由来カノーラタンパク質単離物の混合物(複合物６)を形成した。さらに、上澄液由来単離物がＥ29-02Ａ Ｃ200(18.7重量％)、Ｄ29-02Ａ Ｃ200(40.1重量％)およびＥ14-02Ａ Ｃ200(41.2重量％)である３つの単離物処置から、上澄液由来カノーラタンパク質単離物の混合物(複合物７)を形成した。
【０２０８】
個々のカノーラタンパク質単離物を調製するのに利用した具体的方法は次の通りである。
【０２０９】
[ａ]ｋｇの市販カノーラ粗粉を「ｂ」Ｌの0.15Ｍ ＮａＣｌ溶液に外界温度で添加し、30分間攪拌してタンパク質含有量が「ｃ」ｇ/Ｌのタンパク質水溶液を準備した。真空フィルターベルト上で残渣カノーラ粗粉を除去、洗浄した。得られたタンパク質溶液を遠心および濾過によって清澄化し、タンパク質含有量が[ｅ]ｇ/Ｌである清澄化タンパク質溶液「d」Ｌを得た。
【０２１０】
タンパク質抽出溶液のアリコート「ｆ」Ｌの容積を、分画分子量が「ｈ」ダルトンの膜を用いる限外濾過装置での濃縮によって「ｇ」Ｌまで減容した。得られた濃縮タンパク質溶液のタンパク質含有量は[ｉ]ｇ/Ｌであった。
【０２１１】
「ｊ」℃の濃縮溶液を４℃の水中に比率「ｋ」で希釈した。直ちに生じる白色雲を沈降させた。上部の希釈水を除去し、沈殿した、粘性のある、粘着性集合体(ＰＭＭ)を槽の底部から抽出されたタンパク質の「ｌ」重量％の収率で取り出した。乾燥したＰＭＭ由来タンパク質のタンパク質含有量は乾基準で「ｍ」％(Ｎ×6.25)であった。製品の呼称を「ｎ」とした。
【０２１２】
次表XXVIに、「ａ」〜「ｍ」のパラメーター値を示す。
【０２１３】
【表４３】
2005529979.tif 000044
【０２１４】
除去した希釈水の容積を、分画分子量が「ｏ」ダルトンの膜を用いる限外濾過によって「ｐ」ｇ/Ｌのタンパク質濃度にまで減容した。濃縮物を乾固した。上澄液からさらなるタンパク質を回収して、全体としてのタンパク質回収は、抽出されたタンパク質の「ｑ」重量％であった。形成された乾燥タンパク質のタンパク質含有量は、乾基準で「ｒ」重量％(Ｎ×6.25)であった。
【０２１５】
製品の呼称を「ｓ」とした。次表XXVIIに、パラメーター「ｏ」〜「ｒ」に対する値を示す。
【０２１６】
【表４４】
2005529979.tif 000045
【０２１７】
1.4ｋｇの複合物６を、３Ｌのエタノール(変性、VWR Canlab Ｄの85％エタノール／15％木精)と３Ｌの逆浸透(ＲＯ)精製水の混合液中に分散させた。オーバーヘッド攪拌機を用いて混合物を30分間攪拌した。サンプルをバッチで8000×ｇで５分間遠心することによって、全部の流体から固形物を分離した。
【０２１８】
次いで、ペレットを、エタノール３ＬおよびＲＯ水３Ｌからなるさらなる混合液中に再分散させ、攪拌しながら30分間再び抽出した。再び遠心(800０ｇ/５分)を用いて固体サンプルを集めた。次いで、サンプルから水を除去する目的で、ペレットを４Ｌのエタノールに分散させた。遠心(8000ｇ／５分)により固体物質を集め、４Ｌの新しいエタノールに再分散させた。
【０２１９】
再び遠心(8000ｇ／５分)を用いて固体を集めた。ペレットを破砕し、ベーキングシート上に拡げ、換気フード中に放置して乾燥させた。
【０２２０】
1.4ｋｇの複合物７を使用し、4.2Ｌのエタノールおよび1.8Ｌの逆浸透精製の混合液に分散させるこの手順を繰り返した。ペレットを、4.2Ｌのエタノールおよび1.8ＬのＲＯ水からなる新しい混合液に再分散させた。
【０２２１】
得られたタンパク質粉末および溶媒抽出物サンプルの総タンパク質含有量をＨＰＬＣで分析した。タンパク質粉末の水分含有量も分析した。溶媒抽出物サンプルは、分光光度計を用いてそのフェノール含有量(330ｎｍでの吸光度)および目に見える着色(420ｎｍでの吸光度)を調べた。乾燥タンパク質製品の色調は、ミノルタCR-310色彩計を用いて評価した。
【０２２２】
エタノール／水溶液で抽出した複合物６の回収は86重量％であり、複合物７の場合は80重量％であった。製品の損失は抽出溶媒に対する溶解度のためであり、次表XXVIIIに、溶媒抽出物のタンパク質含有量を示す。
【０２２３】
【表４５】
2005529979.tif 000046
【０２２４】
その他の損失は、サンプル取扱いによる物質損失に帰することができる。
【０２２５】
得られた色調の示度を次表XXIXに示す。
【０２２６】
【表４６】
2005529979.tif 000047
【０２２７】
表XXIXのデータから判るように、複合物６および複合物７の両方で、カノーラタンパク質単離物を抽出すると、明度(Ｌ)が増加し、「ａ」値が減少し、「ｂ」値も減少する。Ｌ値が増加することは、その製品がより白色で黒色味が少ないことを意味する。「ａ」値の減少は赤から緑への色調の移動に対応し、「ｂ」値の減少は黄色から青への色調の移動に対応する。サンプルの赤味および黄色味の減少は、フェノール性化合物および／またはその反応生成物が除去されていることの指標である。
【０２２８】
次表XXXに、溶媒抽出物の吸光度示度を示す。
【０２２９】
【表４７】
2005529979.tif 000048
【０２３０】
表XXXから判るように、抽出物は少し着色しており、タンパク質単離物から着色物が抽出されていることを示している。
【０２３１】
表XXXIに、溶媒抽出したタンパク質単離物のタンパク質含有量(Ｎ×6.25、Leco FP52D型窒素分析計を用いて測定した窒素パーセント値)および水分含有量を示す。
【０２３２】
【表４８】
2005529979.tif 000049
【０２３３】
表XXXIから判るように、溶媒抽出した製品は、水分量が少なく、かつ単離物として分類される製品に必要な十分に高いタンパク質含有量を有していた。
【０２３４】
実施例９：
この実施例ではカノーラタンパク質単離物の製造における抗酸化剤および吸着剤の使用を例示する。
【０２３５】
低温(100℃)で脱溶媒された150ｋｇの市販カノーラ油糧種子粗粉を、1000Ｌの0.15Ｍ ＮａＣｌに添加し、21℃の室温で30分間混合した。混合15分後に、スラリーに抗酸化剤として0.05重量％(500ｇ)のアスコルビン酸を添加した。
【０２３６】
カノーラ粗粉残渣を真空フィルターベルト上で除去、洗浄し、タンパク質含有量が23.9ｇ/Ｌのタンパク質溶液953.5Ｌを得た。溶液の330ｎｍでのＵＶ吸光度は61.2であった。
【０２３７】
953.5Ｌのタンパク質溶液に21.2ｋｇ(2.2重量％)のPolyclar Super Rを添加し、室温で１時間混合させた。その後、タンパク質溶液をそれぞれ20μＭおよび0.2μＭのフィルターパッドを張ったスラッジ除去遠心機およびその後フィルタープレスに通してPolyclarを除去した。Polyclarの除去により、タンパク質含有量が19.9ｇ/ＬでＡ330吸光度が33.2である842Ｌのカノーラタンパク質溶液を集めた。したがって、極めて少ないタンパク質の損失で、Ａ330吸光度のかなりの低下が得られた。
【０２３８】
次いで、清澄化した溶液を、分画分子量が5000ダルトンの膜を用いる限外濾過装置で、タンパク質含有量が338.4ｇ/ＬでＡ330が20.4である30Ｌの容積まで濃縮した。この濃縮タンパク質抽出物溶液を分画分子量が5000ダルトンの膜を用いる透析濾過装置で0.05重量％のアスコルビン酸を含む300Ｌの0.15Ｍ ＮａＣｌを用いて透析濾過した。得られた29.0Ｌの濃縮し限外濾過したカノーラタンパク質溶液のタンパク質含有量は299.7ｇ/Ｌ、Ａ330は25.6であった。
【０２３９】
実施例１〜３および５で判った結果とは対照的に、透析濾過はＡ330に対してほとんど影響がなかったが、多分、濃縮ステップの前にPolyclarによって遊離のフェノール性化合物が既にカノーラタンパク質溶液から除去されていたためであろう。
【０２４０】
31℃の濃縮され透析濾過された溶液を、温度6.4℃の15倍容の水中に希釈した。直ちに形成されるタンパク質ミセルの白色雲を２時間沈降させた。上部の希釈水を除去し、沈殿した粘性のある粘着性集合体(ＰＭＭ)(40.6ｋｇ)を槽の底部から取り出し、噴霧乾燥した。乾燥したタンパク質単離物のタンパク質含有量は、乾基準で98.8重量％(Ｎ×6.25)であった。
【０２４１】
タンパク質含有量が13.3ｇ/Ｌであるミセル形成から得られる上澄液440Ｌを、分画分子量が5,000ダルトンである膜を用いる限外濾過装置での濃縮によって30Ｌまで濃縮した。次いで、濃縮した上澄液を分画分子量が5,000ダルトンの膜を用いる透析濾過装置で５倍容の水を用いて透析濾過した。得られた溶液のタンパク質含有量は161.0ｇ/Ｌ、Ａ330は10.8であった。
【０２４２】
濃縮し透析濾過した溶液を乾固すると、乾燥タンパク質のタンパク質含有量は乾基準で95.6重量％(Ｎ×6.25)であることが判った。
【０２４３】
ＰＭＭ由来カノーラタンパク質単離物(ＣＰＩ)および上澄液由来カノーラタンパク質単離物のサンプルの明度(Ｌ)および色度(ａおよびｂ)をミノルタ(CR-310)色彩計を用いて分析した。
【０２４４】
次表XXXIIに、得られた結果を示す。
【０２４５】
【表４９】
2005529979.tif 000050
【０２４６】
実施例１０：
この実施例では、抽出ステップでの抗酸化剤および吸着剤の使用を例示する。
【０２４７】
100℃で脱溶媒した市販カノーラ油糧種子粗粉のサンプルを15重量％の濃度で、0.15Ｍ ＮａＣｌを用いて30分間抽出するベンチスケール実験を行った。Polyclar Super Ｒの添加なし、および異なる量、すなわち0.5重量％、1.0重量％、1.5重量％、2.0重量％、2.5重量％、3.0重量％、4.0重量％、および5.0重量％を添加して、ならびにアスコルビン酸の添加なし、および0.5重量％のアスコルビン酸を添加して実施した。抽出に続いて、溶液を遠心し、次いで、フェノール性化合物の含有量(Ａ330吸光度)、目に見える着色(Ａ420吸光度)、およびタンパク質含有量を分析した。
【０２４８】
アスコルビン酸ありまたはアスコルビン酸なしで得られた結果をそれぞれ次表XXXIIIおよびXXXIVに示す。
【０２４９】
【表５０】
2005529979.tif 000051
【０２５０】
【表５１】
2005529979.tif 000052
【０２５１】
表XXXIIIおよびXXXIVに示した結果から判るように、アスコルビン酸の存在ありおよびなしの両方でPolyclarが存在するとＡ330およびＡ420の両方ともかなり低下した。抽出にアスコルビン酸を添加しない場合、2.5ｗ/ｖ％濃度のPolyclarによって、対照でみてＡ330で25％、およびＡ420で11％の低下が達成された。Polyclarの濃度がより高くなるとＡ330およびＡ420はさらに低下した。抽出中にアスコルビン酸が存在すると、2.5重量％のPolyclarを使用した場合でＡ330で12％の低下、Ａ420で34％の低下が見られた。溶液のタンパク質含有量は、Polyclarの有無によって影響されなかった。
【０２５２】
実施例１１：
この実施例では、着色に対するカノーラ油糧種子粗粉のエタノール洗浄の影響を例示する。
【０２５３】
殻を除去したカノーラ油糧種子粗粉のサンプル10ｇを100ｍｌのエタノールと混合し、循環水浴およびジャケット付き容器で調節された、45℃、40℃および室温で30分間混合させた。
【０２５４】
30分間の攪拌時間の後に、粗粉／溶媒のスラリーをフィルターを通して注ぎ出し、抽出物から粗粉を分離した。着色がもはや除去されなくなるまで、またはＡ330およびＡ420の吸光度示度の安定状態に達し始めるまでこの手順を繰り返した。各溶媒洗浄／抽出ステップからの粗粉を乾燥し、外界温度で30分間の0.15Ｍ ＮａＣｌによる抽出を実施した。
【０２５５】
抽出物溶液のＵＶ吸光度を各抽出サンプルについて分析した。表XXXV、XXXVI、およびXXXVIIに、それぞれ室温、40℃、および45℃で行った抽出に対するＡ330およびＡ420を示す。
【０２５６】
【表５２】
2005529979.tif 000053
【０２５７】
【表５３】
2005529979.tif 000054
【０２５８】
【表５４】
2005529979.tif 000055
【０２５９】
これらのデータから判るように、低い方の温度での抽出では、40〜45℃の範囲の温度ほどには着色およびフェノール性化合物が除去されず、室温での抽出では６回の抽出だけで汚染物質の除去が終わってしまった。一方、高い方の温度での抽出ではそれぞれ10回目の抽出まで汚染物質を除去した。
【０２６０】
タンパク質抽出物溶液のタンパク質含有量ならびに330ｎｍおよび420ｎｍでの吸光度を測定した。結果を次表XXXVIIIに示す。
【０２６１】
【表５５】
2005529979.tif 000056
【０２６２】
この表から判るように、粗粉をエタノールを用いる40℃での事前抽出に付することにより、フェノール化合物の約40％およびＡ420吸収物質の30％を除去しながら、タンパク質の損失を回避できる。
【０２６３】
実施例１２：
この実施例では、粗粉のエタノール抽出を伴うカノーラタンパク質単離物の調製を例示する。
【０２６４】
殻を除去した油糧種子粗粉の600ｇアリコート11個を、１：５の粗粉対エタノールｗ/ｖ比を用い、３Ｌのエタノールによる４回の抽出した。抽出は35℃で30分間行った。
【０２６５】
30分間の混合時間に続いて、スラリーを沈降させて、上澄液を注ぎ出した。各抽出物に対するＡ330およびＡ420でのＵＶ吸光度を測定し、タンパク質含有量の測定は、抽出した最初の粗粉アリコートからの１回目の抽出物について実施した。
【０２６６】
４回目の抽出の後に、粗粉を換気フード中の浅鍋に拡げ１晩乾燥させた。洗浄した粗粉の全バッチを換気フード中でもう１晩脱溶媒させ、抽出し乾燥した粗粉5.4ｋｇを50Ｌのバッチ抽出に使用した。
【０２６７】
サンプルを抽出する毎に、上澄液の着色は次第に薄くなりＡ330およびＡ420が減少した。平均で、Ａ330では５分の１、Ａ420では６分の１への低下が観察された。異なる抽出物に対するそれぞれＡ420およびＡ330での吸光度値を次表XXXIXおよびXLに示す。
【０２６８】
【表５６】
2005529979.tif 000057
【０２６９】
【表５７】
2005529979.tif 000058
【０２７０】
エタノール抽出した粗粉５ｋｇを50Ｌの0.15Ｍ ＮａＣｌに添加し、20℃の室温で、15分後に抗酸化剤として0.05重量％のアスコルビン酸をスラリーに添加して、30分間混合した。
【０２７１】
カノーラ粗粉残渣を真空フィルターベルト上で除去、洗浄した。得られたタンパク質溶液を20μｍのバグフィルターを通す濾過、それに続く6500ｒｐｍで５分間の遠心によって清澄化し、タンパク質含有量が23.7ｇ/Ｌのタンパク質溶液39.6Ｌを得た。
【０２７２】
37.55Ｌの清澄化タンパク質溶液を分画分子量が10,000ダルトンの膜を用いる限外濾過装置を使用して３Ｌまで濃縮した。濃縮したタンパク質溶液を、分画分子量が10,000ダルトンの膜を使用する透析濾過装置で、0.05重量％のアスコルビン酸を含む24Ｌ(保持液の８倍容)の0.15Ｍ ＮａＣｌを用いて透析濾過した。得られた３Ｌの濃縮し透析濾過したカノーラタンパク質溶液のタンパク質含有量は184ｇ/Ｌであった。
【０２７３】
30℃の濃縮し透析濾過した溶液を、温度が４℃の水30Ｌ中に希釈した。直ちに形成されるタンパク質ミセルを沈降させた。上澄液を除去し、沈殿した粘性のある粘着性集合体(ＰＭＭ)(5.78ｋｇ)を槽の底部から取り出し、噴霧乾燥した。乾燥したタンパク質単離物のタンパク質含有量は、乾基準で101.2重量％(Ｎ×6.25)であった。
【０２７４】
ミセル形成からの上澄液26Ｌを、分画分子量が10,000ダルトンである膜を用いる限外濾過装置での濃縮によって３Ｌまで濃縮した。次いで、濃縮した上澄液を分画分子量が10,000ダルトンの膜を用いる透析濾過装置で６Ｌの水を用いて透析濾過した。
【０２７５】
濃縮し透析濾過した溶液を乾固すると、乾燥タンパク質のタンパク質含有量は乾基準で101.3重量％(Ｎ×6.25)であることが判った。
【０２７６】
ＰＭＭ由来カノーラタンパク質単離物(ＣＰＩ)および上澄液由来カノーラタンパク質単離物のサンプルの明度(Ｌ)および色度(ａおよびｂ)をミノルタＲ-310色彩計を用いて分析した。次表XLIに、得られた結果を示す。
【０２７７】
【表５８】
2005529979.tif 000059
【０２７８】
これらの製品は、かなり淡色で、「ａ」および「ｂ」値は、赤および黄色の着色程度が比較的低いことを示している。
【０２７９】
(開示の概要)
本開示の概要として、本発明は、単離物の調製中に着色物を生じさせる成分を除去するように設計された１つまたは複数の操作を実施すること、着色物を生じさせる成分の酸化を抑制すること、および着色物を除去することによる、着色の減少したカノーラタンパク質単離物の回収を提供する。本発明の範囲内で修正は可能である。
【手続補正書】
【提出日】平成17年2月28日(2005.2.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カノーラ種子を処理してカノーラタンパク質粗粉を形成し、
該カノーラタンパク質粗粉を抽出してタンパク質水溶液を形成し、
該タンパク質水溶液を濃縮し、
該濃縮タンパク質水溶液からカノーラタンパク質単離物を回収する、
ことを含むカノーラタンパク質単離物の形成方法であって、着色の減少したカノーラタンパク質を生じさせる前記方法の間に少なくとも１つのプロセスステップを実施することを特徴とするカノーラタンパク質単離物の形成方法。
【請求項２】
前記少なくとも1つのステップが、以下の少なくとも1つを含むことを特徴とする請求項1に記載の方法：
（ａ）種子を処理して該種子中のミロシナーゼを不活性化する；
（ｂ）(i)抗酸化剤の存在下での抽出
(ii)気流脱溶媒粗粉の抽出
(iii)少なくとも1種の着色成分吸着剤によるカノーラタンパク質溶液の処理
の少なくとも１つの工程を用いて前記抽出工程を行う；
（ｃ）前記濃縮ステップに続いて濃縮タンパク質水溶液を透析濾過する
（ｄ）カノーラタンパク質粗粉を溶媒抽出する；および
（ｅ）カノーラタンパク質単離物を溶媒抽出する。
【請求項３】
前記カノーラタンパク質単離物を、濃縮タンパク質水溶液から、該濃縮水溶液を冷水に添加してタンパク質ミセル集合体を形成すること、および該タンパク質ミセル集合体を上澄液から分離すること、によって回収することを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記上澄液を濃縮し、濃縮した上澄液を透析濾過すること、および透析濾過した上澄液からカノーラタンパク質単離物を回収することによって前記上澄液を処理し、該上澄液からさらなるカノーラタンパク質単離物を回収することを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
（ａ）塩水溶液を使用してカノーラ油糧種子粗粉を抽出し、カノーラ油糧種子粗粉中のタンパク質を可溶化し、５〜６．８のｐＨを有するタンパク質水溶液を形成すること、
（ｂ）油糧種子粗粉残渣からタンパク質水溶液を分離すること、
（ｃ）選択膜技術を使用してイオン強度を実質的に一定に維持しながら前記タンパク質水溶液のタンパク質濃度を高め、濃縮タンパク質溶液を準備すること、
（ｄ）該濃縮タンパク質溶液を、温度が１５℃未満の冷水中に希釈し、水相中に離散したタンパク質ミセルを形成すること、
（ｅ）該タンパク質ミセルを沈降させて、無定形粘着性ゼラチン状グルテン様ミセル集合体を形成すること、および
（ｆ）乾燥重量基準少なくとも90重量％(Ｎ×6.25)のタンパク質濃度を有する上澄みからタンパク質ミセルを回収すること、
を含むカノーラ油糧種子粗粉からのカノーラタンパク質単離物の調製方法であって、
（ａ）該塩水溶液は抗酸化剤を含む、および／または
（ｂ）該カノーラ油糧種子粗粉をアルコールで洗浄する、および／または
（ｃ）該希釈工程の前に該濃縮タンパク質溶液を透析濾過する、および／または
（ｄ）該タンパク質ミセル集合体を乾燥し、乾燥したカノーラタンパク質単離物をアルコール水溶液で抽出する、および／または
（ｅ）前記濃縮したタンパク質溶液を該希釈工程の前に低温殺菌する、および／または
（ｆ）カノーラ油糧種子を処理して油糧種子に含まれるミロシナーゼを不活性化する
ことを特徴とする、調製方法。
【請求項６】
前記抗酸化剤が、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸であり、好ましくは前記塩水溶液中に０．０１〜１重量％の量で存在することを特徴とする、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
前記カノーラ油糧種子粗粉の洗浄に用いるアルコールがエタノールであることを特徴とする、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記洗浄ステップが、カノーラ油糧種子粗粉を溶媒中に１：３〜１：１０のｗ／ｖ比で分散させること、生じたスラリーを１５℃〜４５℃の温度（好ましくは１５℃〜３０℃）で５〜６０分間攪拌すること、および洗浄したカノーラ油糧種子粗粉を該スラリーから分離すること、によって実施されることを特徴とする、請求項５〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記洗浄を、さらなるフェノール化合物および／または目に見える着色が回収されなくなるまで複数回実施することを特徴とする、請求項５〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記透析濾過が、２〜２０倍容の透析濾過溶液、好ましくは５〜１０倍容の透析濾過溶液を用いて実施されることを特徴とする、請求項５〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記抽出ステップが、５〜６．８の範囲のｐＨを有する塩水溶液を使用して実施され、前記の透析濾過溶液が前記抽出ステップで使用した溶液と同一の濃度およびｐＨを有する塩水溶液であることを特徴とする、請求項５〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記透析濾過が、３０００〜５０，０００ダルトン、好ましくは５０００〜１０，０００ダルトンの範囲の分画分子量を有する膜を使用して実施されることを特徴とする、請求項５〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記透析濾過溶液が、前記透析濾過ステップの少なくとも一部において抗酸化剤を含み、該抗酸化剤は亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸であることを特徴とする、請求項５〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記抗酸化剤を０．０１〜１重量％の量で使用することを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記抽出ステップが、５〜６．８のｐＨを有し抗酸化剤を含む塩水溶液を用いて実施されることを特徴とする、請求項５〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記上澄液を限外濾過を用いて濃縮し、濃縮上澄液を準備し、該濃縮上澄液を透析濾過することを特徴とする、請求項５〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記透析濾過が、２〜２０倍容の透析濾過溶液、好ましくは５〜１０倍容の水を使用して実施されることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記透析濾過が、約３０００〜約５０，０００ダルトン、好ましくは５０００〜１００００ダルトンの範囲の分画分子量を有する膜を使用して実施されることを特徴とする、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記透析濾過溶液が、前記透析濾過ステップの少なくとも一部において抗酸化剤を含み、該抗酸化剤は亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸であり、好ましくは０．０１〜１重量％の量含むことを特徴とする、請求項１６〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記透析濾過タンパク質溶液を前記希釈ステップの前に着色吸着剤、好ましくはポリビニルピロリドンと接触させることを特徴とする、請求項５〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記ポリビニルピロリドンを０．５〜６重量％の量、好ましくは２〜３重量％で使用することを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記低温殺菌ステップが、透析濾過されたタンパク質溶液を５５〜７０℃の温度で１０〜１５分間、好ましくは６０〜６５℃の温度で１０分間加熱することによって実施されることを特徴とする、請求項５〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記アルコール水溶液が、約２：１〜約１：２のエタノール：水の容積比を有するエタノール水溶液であり、前記抽出ステップが、カノーラタンパク質単離物をアルコール水溶液中に約５〜約２５重量％の量で分散させること、生じたスラリーを約３０〜約６０分間攪拌すること、および該スラリーから抽出したカノーラタンパク質単離物を分離することであり、前記抽出ステップを、好ましくはカノーラタンパク質単離物からさらなるフェノール化合物および／または目に見える着色が除去されなくなるまで繰り返すこと、を特徴とする請求項５〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記カノーラ油糧種子粗粉を、前記抽出ステップに先立って、油抽出用溶媒の残渣を除去するために５０℃未満の温度で気流脱溶媒することを特徴とする、請求項５〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記カノーラ油糧種子を、前記抽出ステップに先立って、油抽出用溶媒の残渣を除去するために１００℃未満に高められた温度で脱溶媒することを特徴とする、請求項５〜２３のいずれかに記載の方法。
【国際調査報告】
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