(57)【要約】本発明は、多色量子ドット標識ビーズの製造方法、多色量子ドット標識ビーズ、そのコンジュゲート、およびこのようなビーズまたはコンジュゲートを含む組成物を提供する。更に、本発明は、そのコンジュゲートの製造方法、および標的分子の多重分析のためのコンジュゲートの使用方法を提供する。
2005508493.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多色量子ドット標識ビーズの製造方法であって、
（ａ）少なくとも１つの多孔性ポリマービーズを提供すること（但し、ビーズの孔は、量子ドットを組み込むのに十分に大きい）；
（ｂ）所定量の多色量子ドットを、少なくとも１つのビーズと結合させること；および
（ｃ）多色量子ドット標識ビーズを単離すること；
を含む方法。
【請求項２】
多孔性ポリマービーズが乳化重合、懸濁重合またはシード重合によって提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
多色量子ドットが逐次加えられる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
多色量子ドットが並行して加えられる、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ビーズがシーラント化合物でシールされる、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
シーラント化合物が、メルカプトプロピルトリメトキシシラン、アミノプロピルトリメトキシシランおよびトリメトキシシリルプロピルヒドラジドからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ビーズが溶媒中で膨潤される、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
溶媒がブタノールを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ビーズが架橋ポリマーである、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
架橋ポリマーが、ポリスチレン、ジビニルベンゼンおよびアクリル酸を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１つの多色量子ドットと、ビーズとを含み、量子ドットが正確に制御された比で存在する、請求項２に記載の方法によって製造される多色量子ドット標識ビーズ。
【請求項１２】
多色量子ドットがビーズに包埋される、請求項１１に記載の多色量子ドット標識ビーズ。
【請求項１３】
ビーズがシーラント化合物でシールされる、請求項１１に記載の多色量子ドット標識ビーズ。
【請求項１４】
シーラント化合物が、メルカプトプロピル−トリメトキシシラン、アミノプロピルトリメトキシシランおよびトリメトキシシリルプロピルヒドラジドからなる群から選択される、請求項１３に記載の多色量子ドット標識ビーズ。
【請求項１５】
ビーズが架橋ポリマーを含む、請求項１１に記載の多色量子ドット標識ビーズ。
【請求項１６】
架橋ポリマーが、ポリスチレン、ジビニルベンゼンおよびアクリル酸を含む、請求項１５に記載の多色量子ドット標識ビーズ。
【請求項１７】
少なくとも１つの量子ドットと、多孔性ポリマービーズとを含み、ビーズが量子ドットを組み込むのに十分に大きい孔を有し、量子ドットが正確に制御された比で存在する、多色量子ドット標識ビーズ。
【請求項１８】
ビーズがシーラント化合物でシールされる、請求項１７に記載の多色量子ドット標識ビーズ。
【請求項１９】
量子ドットが、ビーズに組み込まれる前に、シラン化合物で修飾される、請求項１７に記載の多色量子ドット標識ビーズ。
【請求項２０】
量子ドットがビーズに組み込まれた後、シラン化合物が重合される、請求項１９に記載の多色量子ドット標識ビーズ。
【請求項２１】
請求項１７に記載の多色量子ドット標識ビーズと、担体とを含む組成物。
【請求項２２】
少なくとも１つの多色量子ドットと、ビーズと、プローブとを含み、プローブがビーズに結合する、請求項２に記載の方法によって製造される多色量子ドット標識ビーズを含むコンジュゲート。
【請求項２３】
プローブが蛋白質またはそのフラグメントである、請求項２２に記載のコンジュゲート。
【請求項２４】
蛋白質またはそのフラグメントが、抗体またはその抗原反応性フラグメントである、請求項２３に記載のコンジュゲート。
【請求項２５】
プローブが核酸である、請求項２２に記載のコンジュゲート。
【請求項２６】
プローブが、リンカーを介してビーズに結合する、請求項２２に記載のコンジュゲート。
【請求項２７】
請求項２２に記載のコンジュゲートと、担体とを含む組成物。
【請求項２８】
請求項１１に記載の多色量子ドット標識ビーズと、プローブとを含むコンジュゲートの製造方法であって、
（ａ）請求項１１に記載の多色量子ドット標識ビーズを、ビーズに直接結合できるプローブと接触させること；および
（ｂ）コンジュゲートを単離すること；
を含む方法。
【請求項２９】
（ａ）が、多色量子ドット標識ビーズおよびプローブを、クロスリンカーと接触させることをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
請求項１１に記載の多色量子ドット標識ビーズと、プローブとを含むコンジュゲートの製造方法であって、
（ａ）請求項１１に記載の多色量子ドット標識ビーズを、（ｉ）リンカー、中間クロスリンカーまたは二官能性分子、および（ｉｉ）リンカー、中間クロスリンカーまたは二官能性分子と直接的に結合できるプローブと接触させること；および
（ｂ）コンジュゲートを単離すること；
を含む方法。
【請求項３１】
請求項１１に記載の多色量子ドット標識ビーズと、プローブとを含むコンジュゲートの製造方法であって、
（ａ）プローブを、（ｉ）リンカー、中間クロスリンカーまたは二官能性分子、および（ｉｉ）請求項１１に記載の多色量子ドット標識ビーズと接触させること；および
（ｂ）コンジュゲートを単離すること；
を含む方法。
【請求項３２】
プローブが、蛋白質もしくはそのフラグメントまたは核酸である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
ビーズが、架橋ポリマーである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
リンカーが、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンまたはビオチンである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
サンプル中の１つ以上の標的の検出方法であって、
（ａ）サンプルを、請求項２２に記載のコンジュゲートと接触させること（但し、コンジュゲートのプローブは、標的と特異的に結合する）；および
（ｂ）ルミネセンスを検出すること（但し、ルミネセンスの検出は、コンジュゲートがサンプル中の標的に結合したことを示す）；
を含む方法。
【請求項３６】
標的が蛋白質を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
標的が核酸を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
標的が、蛍光を発するタグで標識される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
コンジュゲートのプローブが蛋白質またはそのフラグメントである、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
コンジュゲートのプローブが、抗体またはその抗原反応性フラグメントであり、サンプル中の蛋白質が、抗体またはその抗原反応性フラグメントによって結合される抗原またはそのエピトープである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
抗原またはそのエピトープがウイルス性または細菌性である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
コンジュゲートのプローブが、抗原またはそのエピトープであり、サンプル中の蛋白質が、抗原またはそのエピトープに結合する抗体またはその抗原反応性フラグメントである、請求項３５に記載の方法。
【請求項４３】
抗体またはその抗原反応性フラグメントが、ウイルス、細菌、ウイルスの一部、または細菌の一部に特異的である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
プローブが核酸である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４５】
核酸が、蛍光を発するタグで標識される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
サンプル中の（ｉ）２つ以上の異なる分子、および／または（ｉｉ）所定の分子の２つ以上の領域を同時に検出する方法であって、
（ａ）サンプルを、請求項２２に記載の２つ以上のコンジュゲートと接触させること（但し、２つ以上のコンジュゲートの各々は、異なる所定比の多色量子ドットと、サンプル中の異なる分子または所定の分子の異なる領域に特異的に結合するプローブとを含む）；および
（ｂ）ルミネセンスを検出すること（但し、所定のスペクトルコードのルミネセンスの検出は、サンプル中の分子に結合するコンジュゲートを示す）；
を含む方法。
【請求項４７】
サンプルが、２つ以上の異なる蛋白質またはそのフラグメントを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
サンプルが、２つ以上の異なる核酸を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
サンプルが、少なくとも１つの核酸と、少なくとも１つの蛋白質もしくはそのフラグメントとを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
マイクロチャンネルと組み合わせた波長分離分光法を用いて、蛍光放出を検出する、請求項３５に記載の方法。
【請求項５１】
１つ以上の標的の多重分析のために、マイクロチャンネルを通って流れるか、または基体表面に拡げられる請求項２２に記載の１つ以上のコンジュゲートを含む、診断ライブラリ。
【請求項５２】
プローブが、リンカーを介してビーズに結合する、請求項５１に記載の診断ライブラリ。
【請求項５３】
リンカーが１級アミンである、請求項５２に記載の診断ライブラリ。
【請求項５４】
リンカーが、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンまたはビオチンである、請求項５２に記載の診断ライブラリ。
【請求項５５】
プローブが、蛋白質もしくはそのフラグメントまたは核酸である、請求項５１に記載の診断ライブラリ。
【請求項５６】
マイクロチャンネルと組み合わせた波長分離分光法を用いて、蛍光放出を検出する、請求項５１に記載の診断ライブラリ。
【請求項５７】
プローブが、ステムおよびループ構造を含む一本鎖オリゴヌクレオチドであり、一本鎖オリゴヌクレオチドの１端がフルオロフォアと結合し、クエンチング部分が一本鎖オリゴヌクレオチドの他端と結合し、ビーズが、フルオロフォアまたはクエンチング部分とリンカーによって間接的に結合し、クエンチング部分がフルオロフォアのルミネセンスをクエンチする、請求項２２に記載のコンジュゲート。
【請求項５８】
サンプル中の核酸の検出方法であって、
（ａ）サンプルを、請求項５７に記載のコンジュゲートと接触させること（但し、ループが、核酸中の標的配列と結合するプローブ配列を含み、その結果、コンジュゲートが、ステムを開かせるコンフォメーション変化を受け、それによって、フルオロフォアとクエンチング部分を分離する）；および
（ｂ）ルミネセンスを検出すること（但し、フルオロフォアのルミネセンスの検出は、コンジュゲートが、サンプル中の核酸に結合していることを示す）；
を含む方法。
【請求項５９】
核酸の標的配列が蛍光標識されない、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
少なくとも１つの量子ドットと、多孔性ポリマービーズと、プローブとを含むコンジュゲートであって、ビーズが、量子ドットを組み込むために十分に大きな孔を有し、量子ドットが正確に制御された比で存在し、コンジュゲートが標的配列とハイブリダイズし、プローブがビーズと結合し、標的が量子ドットで標識される、コンジュゲート。
【請求項６１】
多色量子ドット標識ビーズの製造方法であって、
（ａ）約０．３〜５容量％の架橋剤を含む溶媒−システム重合によって、少なくとも１つの多孔性ビーズを提供すること（但し、ビーズの孔は、少なくとも約１ｎｍの平均直径を有する）；
（ｂ）所定量の多色量子ドットを、少なくとも１つのビーズと結合させること；および
（ｃ）多色量子ドット標識ビーズを単離すること；
を含む方法。
【請求項６２】
約１容量％の架橋剤を加える、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
架橋剤が、ジビニルベンゼン、エチレングリコールジメタクリレート、エチレングリコールジアクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレートおよびＮ，Ｎ’メチレン−ビス−アクリルアミドからなる群から選択される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
溶媒−システム重合が、スチレンモノマーと、末端ＣＯＯＨ、ＯＨ、ＮＨ２またはＳＨ基を有する官能基化モノマーとを含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６５】
溶媒−システム重合が、沈殿重合である、請求項６１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府支援
本発明は、国立衛生研究所とエネルギー省によって授与された助成金番号Ｒ０１ＧＭ６０５６２とＦＧ０2−９８ＥＲ１４８７３の政府支援によってなされた。政府は、本発明に一定の権利を有し得る。
【０００２】
発明の技術分野
本発明は、多色量子ドット標識ビーズ(multicolor quantum dot-tagged bead)を得る方法、多色量子ドット標識ビーズ、そのコンジュゲート（conjugate）、およびこのような量子ドット標識ビーズまたはコンジュゲートを含む組成物に関する。更に、本発明は、標的、特に、生体分子標的の多重検出（multiplexed detection）のためのコンジュゲートの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
生体分析科学と生体工学の最近の進歩は、ＤＮＡチップ、小型バイオセンサー、微小流動デバイスの開発をもたらした。更に、蛍光標識から利益を得る用途として、医学（および非医学）蛍光顕微鏡検査、組織学、フローサイトメトリー、基礎的な細胞および分子生物学プロトコル、蛍光インサイチュ（in situ）ハイブリダイゼーション、ＤＮＡ配列決定、免疫アッセイ、結合アッセイおよび分離が挙げられる。これらの可能にする技術は、遺伝子発現プロファイリング、薬剤の発見、臨床診断薬などの生物医学研究の多くの分野に実質的に衝撃を与えた。
【０００４】
蛍光標識された分子は、広範囲の用途に広く使用されてきた。典型的には、有機色素はプローブに結合され、プローブは、次いで、標的と選択的に結合する。次いで、色素分子を励起し、それに蛍光を生じさせることによって、標的は同定される。これらの蛍光標識システムにおいて有機色素を使用することは多数の不利点がある。励起された色素分子からの可視光の発光は、通常、幅広い発光スペクトル（約１００ｎｍ）と、赤色波長での発光の幅広い尾（tail）（別の約１００ｎｍ）の存在によって特徴付けられる。結果として、分析において、同時に、または逐次利用できる異なる色の有機色素分子の数にきびしい制限がある。それは、標識分子の幅広い発光スペクトルと発光の尾に起因する多くの異なる検出可能物質の存在を、同時に、または非同時にさえ、検出または識別するのが困難だからである。別の問題は、有機色素が、しばしば、狭い吸収スペクトル（約３０〜５０ｎｍ）を有し、そのために、多重波長プローブが必要であるか、または幅広いスペクトル励起源が必要であるということである。この励起源は、異なる波長でそれぞれ励起される一連のプローブの逐次励起のために、異なるフィルターと共に逐次使用される。
【０００５】
有機色素に関連した別の問題は、その光安定性の欠如である。しばしば、有機色素は、繰返しの励起で色があせるか、蛍光放出を止める。これらの問題は、しばしば、サンプルを光源に曝す時間量を最小化することによって、サンプルからラジカル種（酸素を含む）を除去することによって克服される。
【０００６】
可視光を発光し、狭い発光および幅広い励起を有し、光安定性であるタグの利点を利用した、標的分子の同定アッセイを提供することが望ましい。蛍光タグとしてルミネセンス半導体量子ドットを使用することは、生体分子などの標的を同定する際に有用なアプローチである。有機色素（例えば、ローダミン）と比較して、量子ドットは、明るさが２０倍であり、光安定性が約１００倍であり、そして幅が約１／３の発光スペクトルを有する。これらの望ましい性質により、異なる発光波長（即ち、色）の量子ドットの同時使用が可能となり、一方で、互いに分離する能力は保持される。更に、幅広い励起スペクトルは、多数の異なる量子ドットが、共通の光源によって励起されるのが可能となる。
【０００７】
過去１０年間にわたって、広範な半導体量子ドットの合成とキャラクタリゼーションに多大な進歩があった。最近の進歩により、比較的単分散の量子ドットの大規模製造がなされた（Murray et al., J. Am. Chem. Soc., 115, 8706-15 (1993); Bowen Katari et al., J. Phys. Chem., 98, 4109-17 (1994); および Hines et al., J. Phys. Chem., 100, 468-71 (1996))。他の進歩により、量子ドット格子構造のキャラクタリゼーション（Henglein, Chem. Rev., 89, 1861-73 (1989); および Weller et al., Chem. Int. Ed. Engl. 32, 41-53 (1993))、また、量子ドットアレイの作製(Murray et al., Science, 270, 1335-38(1995); Andres et al., Science, 273, 1690-93 (1996); Heath et al., J. Phys. Chem., 100, 3144-49 (1996); Collier et al., Science, 277,1978-81 (1997); Mirkin et al., Nature, 382, 607-09 (1996); および Alivisatos et al., Nature, 382, 609-11 (1996))、および発光ダイオードの作製(Colvin et al., Nature, 370, 354-57 (1994); および Dabbousi et al., Appl. Phys. Let., 66, 1316-18 (1995))がもたらされた。特に、ＩＩＢ−ＶＩＢ半導体は、多大の注目の焦点であって、前例の無い程の単分散性と結晶秩序を有するＣｄＳｅ量子ドットの開発をもたらした(Murray (1993)、上記)。
【０００８】
多重コーディングの可能性（例えば、多重波長（multiple wavelengths）および多重強度(multiple intensities)の使用）は、また、他の研究者らによっても認識されている(例えば、WO 99/37814, WO 01/13119, WO 01/13120, WO 99/19515, WO 97/14028参照)。例えば、Fultonらは、多重バイオアッセイおよび多成分分析物バイオアッセイのために、１セット約１００個のビーズをコードするために、２種の有機色素を使用した(Fulton, R. J., et al., Clin. Chem. 43,1749-1756 (1997)参照)。Waltおよびその共同研究者らは、蛍光でコードされたミクロスフェアに基づく無作為秩序の繊維−光学マイクロアレイを報告した(Steemers, F. J., et al. Nature Biotechnol. 18, 91-94(2000); Ferguson, J. A., et al. Nature Biotechnol. 14, 1681-1684(1996); Ferguson, J. A., et al. Anal. Chem. 72, 5618-5624 (2000)参照)。しかし、これらの以前の研究は、有機色素とランタナイド錯体に基づき、これらの材料の好ましくない吸光および発光特性によって限定された（例えば、２〜３より多くのフルオロフォアを励起する能力の無さ、幅広く、非対称の発光プロファイル、スペクトルの重複）。
【０００９】
ビーズに包埋された２つ（または２より多く）の有機色素を含むシステムは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が生じる傾向があり、包埋された有機色素によるビーズの発光スペクトルは、予測できず、従って、信頼性に乏しいことを示し、そしてマイクロチャンネルと組み合わせた波長分離分光法（wavelength-resolved spectroscopy combined with a microchannel）によって検出できない。更に、有機色素は、連続的に可変な発光波長を有することができない。最後に、異なる有機色素が、溶媒に溶解度（可変）まで可溶なので、色素は、正確に制御された比でビーズに包埋されることができない。色素の比は、組み込み前に予め決定できない。この欠点により、標的の多重分析に有用なビーズの数はきびしく制限される。
【００１０】
生体分子標的を検出するために、ビーズなどの基体と量子ドットを結合させる最近のアプローチが開示されている(例えば、 WO 01/71044、WO 00/71995、WO 01/13119および WO 99/47570参照)。しかし、これらのアプローチはいずれも、正確に制御された比および再現性のある様式でビーズに包埋された量子ドットを含むビーズを提供しない。例えば、WO 01/71044は、ジヒドロリポ酸でキャップされた水溶性量子ドットを、水溶液中で市販のポリマービーズに結合させることを開示している。ビーズの内部と比較して、ビーズ表面により多くのカルボキシル基が存在するので、親水性量子ドットは、ビーズの外側を囲む水溶液中に留まることを好む。更に、ビーズ内部に入る量子ドットの数と大きさ（即ち、色）  対  ビーズ表面に留まる量子ドットの数と大きさは制御できないので、生じる量子ドット標識ビーズは、互いに対し、そしてバッチ毎に比較して、あまり再現性がない。典型的には、ビーズと結合するＱＤの数はかなり少ない。更に、WO 01/71044は、ビーズを膨潤させるために、大量のクロロホルム中で、ポリマービーズと量子ドットを加熱することを開示している。水溶性量子ドットを熱にさらすことより、ＱＤが不安定になる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ゲノミクスおよびプロテオミクスでの現在の研究により、より多くの配列データが提示されるので、大量の核酸と蛋白質を迅速にスクリーニングできる、新規、かつ、改良された技術が強く求められている。上記から、生体分子の検出のために、有機色素が過去において有用であったが、多重標的の多重分析の方法を含む、より正確で、より感受性のある、より幅広い検出方法が必要とされていることがわかる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の簡単な要旨
分子標的のより良い検出を究極の目的とし、本発明は、光学コーディング技術（optical coding technology）、好ましくは多重光学コーディングを可能とする。このような技術は、標的、特に生物学的分子の大量パラレルおよびハイスループット分析のための「ビーズ上の実験室（lab-on-a-bead）」を可能とする。この技術は、少なくとも部分的には、半導体量子ドットの新規な光学特性と、正確に制御された比でビーズに多色量子ドットを組み込む能力とを前提とする。加えられた量子ドットの比に基づいて、固有の同定可能なコードが、各ビーズに存在する。次いで、多色量子ドット標識ビーズは、ビーズにプローブを結合することによって、コンジュゲートに変換され得る。このコンジュゲートは標的と結合することが可能であり、標的の容易な同定が可能となる。
【００１３】
従って、１局面では、本発明は、少なくとも１つの量子ドットと、多孔性ビーズとを含む量子ドット標識ビーズを提供する。ビーズは、ビーズを通してその中に量子ドットが入るのを可能とするのに十分な大きさの孔を有する。好ましくは、量子ドットは、正確に制御された所定の比で存在する。
【００１４】
本発明は、また、多色量子ドット標識ビーズの製造方法を提供する。また、当該方法によって製造される多色量子ドット標識ビーズ、ならびに、多色ルミネセンス量子ドット標識ビーズと担体とを含む組成物が提供される。本発明は、更に、当該方法によって製造される多色量子ドット標識ビーズとプローブとを含むコンジュゲートを提供し、プローブはビーズに直接的または間接的に結合する。また、コンジュゲートと担体とを含む組成物が提供される。更に、本発明によって、当該コンジュゲートの製造方法、ならびに多色量子ドット標識ビーズによる標的の検出方法が提供される。
【発明の効果】
【００１５】
有機色素を使用するコーディングシステムと比較して、本発明は多くの利点を有する：蛍光放出波長が連続的に調整できる；異なる色の全ての量子ドットの同時励起に単一波長を使用することができる；発光スペクトルが狭く、多色（即ち、多重波長）を使用することが可能となる；量子ドット間で蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が存在しない；および量子ドットが光安定性である。
【００１６】
本発明は、また、多数の標的の多重分析が可能となる点で、有機色素システムに対して利点を有する。分析は、多色量子ドット標識ビーズの高い安定性、およびその製造、修飾および検出の容易さによって促進される。平面ＤＮＡチップと比較して、コードされた本発明のビーズ技術は、標的選別においてより柔軟であること、結合キネティクスにおいてより迅速であること（均一溶液におけるそれと同様）、および製造がより安価であることが期待される。
本発明のこれらの目的、他の目的および利点、ならびに更なる発明の特徴は、本明細書記載の詳細な説明を読むと、当業者には明らかとなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明は、多色量子ドット標識ビーズ、そのコンジュゲート、ならびに、これらに関連した方法、診断ライブラリおよび分子ビーコンを提供する。本発明の好適な実施態様に基づき、種々なプローブを多色量子ドット標識ビーズに直接的および間接的に結合することができ、分子、特に、生物学的分子の大量パラレルおよびハイスループット分析を提供する。
【００１８】
１局面では、本発明は、多色量子ドット標識ビーズの製造方法を提供する。一般的に、多色量子ドット標識ビーズの製造方法は、工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を包含する：
（ａ）少なくとも１つの多孔性ビーズを提供する工程（但し、ビーズの孔は、量子ドットを組み込むのに十分に大きい）；
（ｂ）所定量の多色量子ドットを、少なくとも１つのビーズと結合させる工程；および
（ｃ）多色量子ドット標識ビーズを単離する工程。
【００１９】
別の局面では、本発明は、少なくとも１つの多色量子ドットと、多孔性ポリマービーズとを含み、ビーズが量子ドットを組み込むのに十分な大きさの孔を有し、量子ドットが正確に制御された比で存在する、多色量子ドット標識ビーズを提供する。用語「多孔性」は、ビーズがその表面およびその内部に開口を有し、この開口が、量子ドットがビーズを通過してその内部に入るのに十分に大きいことを意味する。説明を明瞭にすると、多色量子ドットが孔を通過し、包埋された後に、シーラント化合物によってシールされたビーズは、本発明の目的から、依然として多孔性であると考えられる。
【００２０】
量子ドットを組み込むのに十分大きな孔を有するビーズは、任意の適切な方法によって提供できる。例えば、幾つかの実施態様では、多孔性ポリマービーズは、乳化重合、懸濁重合またはシード重合によって合成される。本明細書記載の特定の方法は、特定の実施態様に特に適し得ること、およびビーズ製造の各方法は固有の利点を有することを当業者は理解する。一般的に、本明細書記載の方法を用いてポリマービーズを合成するのが望ましく、それらの幾つかは、当業者の技術内の方法に基づく(例えば、 Ferguson, J. A., et al., Anal. Chem. 72, 5618-5624 (2000)参照)。乳化重合は、当業界公知の方法などの任意の方法で行える。例えば、標準的な方法は、開始剤の存在下、モノマー（および任意のクロスリンカー）を重合するために、油−水エマルションを用いる。懸濁重合は、任意の適切な方法によって行える。１例として、エタノール／水溶液中に安定化剤を溶解させることが挙げられる。開始剤をモノマーに溶解し、モノマー−開始剤混合物を、エタノール／水溶液と混合する。シード重合は、必要とされるだけの数の工程、例えば、１または２工程で行える。しかし、一般的には、小さなポリマービーズを、モノマー、開始剤、乳化剤の存在下、より大きな直径に成長させる。
【００２１】
本発明のビーズは、ビーズの内部構造への量子ドットの通過を可能とするために十分に多孔性である。これは、量子ドットが有機色素分子よりも比較的大きいからである。好ましくは、ビーズはマクロ多孔性である。「マクロ多孔性」とは、ビーズの孔が、少なくとも約１ｎｍの平均直径を有することを意味する。より好ましくは、孔は、約１ｎｍ〜約２０ｎｍ、より好ましくは約２ｎｍ〜約１０ｎｍの平均直径を有する。幾つかの実施態様では、孔は、約２ｎｍ〜約５ｎｍの平均直径を有する。典型的には、通常の、市販のビーズは、恐らく、多孔性の欠如、またはかなりの程度溶液中で膨潤する能力の欠如のために、ＱＤを包埋することができない。多孔性の欠如、およびかなりの程度溶液中で膨潤する能力の欠如はともに、高量の架橋に起因するらしい。通常の、市販のビーズは多孔性ではないので、当業者は、ビーズを膨潤させるために、高濃度のクロロホルム（例えば、４０〜５０％）をしばしば使用する。過剰量（例えば、４０％ｖ／ｖ）のクロロホルムは、典型的には、ビーズにダメージを与え得る。本発明の多孔性ビーズは、膨潤し得るが、かなり低量（例えば、約１０％ｖ／ｖ、好ましくは約５％ｖ／ｖ未満）の膨潤剤（例えば、クロロホルム、ブタノール）を必要とする。更に、市販のビーズは、典型的には、疎水性内部を有さず、それによって、ＱＤ、特に、疎水性ＱＤの組み込みを更に阻害する。
【００２２】
多孔性ビーズは典型的には、数回、溶液、好ましくは、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコールで洗浄し、溶液（好ましくは、また、アルコール溶液）中でＱＤ組み込み前に、ビーズを脱水する。ＱＤは、任意の適切な方法でビーズに組み込まれ得る。例示すると（限定ではない）、ＱＤは、幾つかの異なる方法：（ｉ）ＱＤは、マクロ多孔性ビーズに直接的に組み込まれる（マクロ多孔性ビーズは、アクリル酸の長鎖誘導体（例えば、モノ−２−メタクリロイルオキシエチルスクシネート）などのモノマーを用いて、シード乳化重合または懸濁重合によって一般的に製造される）；（ｉｉ）室温または昇温（好ましくは室温）での浸漬または超音波処理によって；および（ｉｉｉ）溶媒を用い、ビーズを膨潤し、次いで、ＱＤ組み込みによって、直接的に組み込まれ得る。
【００２３】
ビーズが十分に膨潤して種々の大きさのＱＤの組み込みを可能とする限り、方法（ｉｉｉ）の溶媒は、特に限定されない。典型的には、溶媒は、ハロゲン、酸素、硫黄および窒素を有しているか、または有していない、有機（例えば、アシル）脂肪族、シクロ脂肪族、芳香族または複素環式炭化水素またはアルコールであるが、場合によっては、水または水溶液が望まれ得る。有用な溶媒の例として、ベンゼン、トルエン、キシレン、シクロヘキサン、ペンタン、ヘキサン、リグロイン、メチルイソブチルケトン、メチルアセテート、エチルアセテート、ブチルアセテート、メチルCELLOSOLVE （登録商標）(Union Carbide)、 エチルCELLOSOLVE（登録商標） (Union Carbide)、 ブチルCELLOSOLVE（登録商標） (Union Carbide)、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテルアセテート、アルコール（例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、ｉ−プロパノール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブタノール、ｎ−ペンタノール、ｎ−ヘキサノール、分岐鎖ヘキサノール、シクロヘキサノール、２−エチルヘキシルアルコール）、アセトン、ＤＭＳＯ、メチレンクロリド、クロロホルム、およびそれらの組合せが挙げられるが、それらに限定されない。好ましくは、溶媒はアルコールであり、より好ましくは溶媒はＣ３−Ｃ６直鎖または分岐鎖アルコールである。最も好適な実施態様では、溶媒はブタノール（ノルマルまたは３級）であり、ビーズは、スチレン／ジビニルベンゼン／アクリル酸から誘導された架橋ポリマーである。
【００２４】
種々の色（例えば、赤色、緑色、青色）の蛍光放出を伴う単分散ＱＤが、上記方法のいずれかに従ってビーズ構造に組み込まれる。典型的には、ＱＤは、逐次または並行して包埋される。これらの方法が成功するために、ビーズ内の孔の大きさの分布は望ましくは慎重に制御される。ビーズに包埋されるＱＤの比は、所定量の各色の注意深い添加から生じる。
【００２５】
好ましくは、ＱＤは、ビーズに逐次組み込まれる。例えば、一回で一色のＱＤが包埋される。添加の順序は限定されない。例えば、最大直径（例えば、赤色）を最初に加え、次に大きなもの（例えば、緑色）を加えるなどして、その後、最小（例えば、青色）を加える。あるいは、最小直径で出発して、逐次、次に大きなＱＤを加え、最大直径ＱＤで終わるように、ＱＤを加える。幾つかの実施態様では、ビーズへの多色ＱＤの組み込み方法は、（ａ）孔が十分に大きくなければ、場合によっては、溶媒中でビーズを膨潤させること；（ｂ）溶媒に、所望色の所定量のＱＤを加えること；（ｃ）所望色の所望量のＱＤが全て包埋されるまで、（ｂ）を繰り返すこと；および（ｄ）多色量子ドット標識ビーズを単離することを含む。
【００２６】
あるいは、当該方法は、（ｂ）所望の比で各々の所望の色のＱＤを含む１つの溶液にビーズを浸すことを含む。多色ＱＤの完全な並行組み込みが起こるように、ビーズを溶液に浸し、その後、多色量子ドット標識ビーズを単離する。
【００２７】
ＱＤを組み込むために、ビーズを溶液に浸すよりもむしろ、ビーズは、ＱＤを含む溶液中で超音波処理され得る。また、超音波処理によるＱＤの組み込みは、逐次または並行して実施され得る。
【００２８】
１ビーズ当たりのＱＤの数は、好ましくは１〜約６０，０００の範囲である。より好ましくは、１ビーズ当たりのＱＤの数は、約１００〜５０，０００であり、最適には、約６００〜約４０，０００である。組み込み工程が完全である（即ち、上清に遊離ＱＤは存在しない）という仮定のもと、１ビーズ当たりのＱＤの数は、混合物中のＱＤの合計数を、ビーズの合計数で除算することによって計算される。蛍光測定によって、組み込み工程が低〜中程度の充填（loading）（１ビーズ当たり４０，０００ＱＤまで）で完了することが確認された。包埋されたＱＤは遊離ＱＤと同様の光学特性を有し、これら２つの強度の比は、１ビーズ当たりのＱＤ数にほぼ等しい。これら２つの独立した測定は、ほぼ等しい結果を与え、それによって、測定された蛍光強度と包埋されたＱＤの数との間に直線関係が確立される。
【００２９】
ビーズは、任意の材料から形成され得るが、好ましくは、材料は、適切な溶媒中で安定である。ビーズ材料は、有機、無機、またはそれらの混合物であってもよい。同様に、ビーズは固体（多孔性または非多孔性）または中空であってもよい。好ましくは、ビーズは、固体多孔性材料を包含する。孔の分布は慎重に制御されるのが望ましい。ビーズは親水性または疎水性であってもよいが、本発明のビーズは好ましくは疎水性である。望ましくは、ビーズの内部が疎水性である場合、ビーズの内部に組み込まれるＱＤもまた疎水性であり、ビーズの内部が親水性である場合、ビーズの内部に組み込まれるＱＤもまた親水性である（例えば、米国特許出願第09/405,653号（引用により本明細書に含まれる）参照）。ビーズとして、ポリマー、二酸化チタン、ラテックスもしくは他の架橋デキストラン、セルロース、ナイロン、架橋ミセル、テフロン、トリアゾル（thoria sol）、グラファイト炭素、樹脂、セラミック、ゼオライト、金属およびガラスが挙げられる。好ましくは、ビーズは、有機ポリマーなどのポリマー材料である。
【００３０】
ビーズに有用なポリマー材料の例として、ポリスチレン、臭素化ポリスチレン、ポリアクリル酸、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、ポリアクリルアミド、ポリアクロレイン、ポリブタジエン、ポリカプロラクトン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリジメチルシロキサン、ポリイソプレン、ポリウレタン、ポリビニルアセテート、ポリビニルクロライド、ポリビニルピリジン、ポリビニルベンジルクロライド、ポリビニルトルエン、ポリビニリデンクロライド、ポリジビニルベンゼン、ポリメチルメタクリレート、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリ（ラクチド−共−グリコリド）、ポリアンハイドライド、ポリオルトエステル、ポリホスファゼン、ポリスルホン、およびそれらの組合せまたは共重合体が挙げられるが、これらに限定されない。樹脂の例として、例えば、硬化ロジン、エステルゴムおよび他のロジンエステル、マレイン酸樹脂、フマル酸樹脂、ダイマーロジン、ポリマーロジン、ロジン変性フェノール樹脂、フェノール樹脂、キシレン樹脂、ウレア樹脂、メラミン樹脂、ケトン樹脂、クマロン−インデン樹脂、石油樹脂、テルペン樹脂、アルキル樹脂、ポリアミド樹脂、アクリル樹脂、ポリビニルクロライド、ビニルクロライド−ビニルアセテート共重合体、ポリビニルアセテート、エチレン−無水マレイン酸共重合体、スチレン−無水マレイン酸共重合体、メチルビニルエーテル−無水マレイン酸共重合体、イソブチレン−無水マレイン酸共重合体、ポリビニルアルコール、修飾ポリビニルアルコール、ポリビニルブチリル（butryl）（ブチリル樹脂）、ポリビニルピロリジン、塩素化ポリプロピレン、スチレン樹脂、エポキシ樹脂およびポリウレタンが挙げられる。
【００３１】
所望ならば、当業界公知の任意の適切な架橋剤（例えば、ジビニルベンゼン、エチレングリコールジメタクリレート、エチレングリコールジアクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレートまたはＮ，Ｎ’メチレン−ビス−アクリルアミド）によって、ポリマービーズは架橋され得る。一般的には、約０．３〜３０容量％、好ましくは約０．３〜５容量％、最適には約１容量％の架橋剤（市販の架橋剤は一般に約５０〜８０％の活性クロスリンカーであることを考慮する）および２０〜５０％スチレンまたは他のモノマーが使用される。ビーズ構築のための好適なポリマー材料はポリスチレンである。望ましくは、ポリスチレンは、ジビニルベンゼンとアクリル酸で架橋される。ビーズは好ましくは、約０．０１μｍ〜約１０ｍｍの範囲の直径を有する。より好ましくは、直径は約０．１μｍ〜約１００μｍ、より好ましくは約０．１μｍ〜約２５μｍ、より好ましくは約０．１μｍ〜約１０μｍ、より好ましくは約０．１μｍ〜約５μｍ、最適には約０．５μｍ〜約５μｍである。
【００３２】
以下の実施例で更に記載するように、溶媒系の相は、脱気および洗浄を伴い、約０．１４ｇ ＡＩＢＮ、約１０ｍｌスチレン、約１００μｌアクリル酸、約１００μｌジビニルベンゼン、約１０ｍｌ脱イオン水、約９０ｍｌエタノールおよび約１ｇ ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン，ＭＷ＝４０，０００）を混合することによって処方され得る。合成ビーズを官能基化するために含まれるアクリル酸の代わりに、所望の官能性の種類によって他の重合可能な部分が使用され得る。例えば、末端ＣＯＯＨ、ＮＨ２、ＯＨまたはＳＨ官能性を有するモノマーが使用され得る。この段落に記載のアプローチは、典型的な最適方法、即ち、懸濁（沈殿としても知られる）重合であり、これは、低度の架橋を伴う溶媒−システム重合（solvent-system polymerization）のサブセットである。溶媒−システム重合は、界面活性剤または任意の他の乳化剤が実質的にまたは完全に存在せず、少量の安定化剤の存在の可能性を考慮に入れない重合である。理論上、理論に縛られる意図は無いが、低度の架橋を伴う溶媒−システム重合、より特定すると、低度の架橋を伴う沈殿重合は、別個のポリスチレンオリゴマーを最初に形成し、次にこれは、その間に少数の架橋を有する鎖長が限定された別個のポリマー鎖を形成し、従って、このように形成された各ビーズの至るところに高度に展開した孔の迷路が形成される。このように作製されたビーズの孔は、一般的に、本明細書の他で記載のように、少なくとも約１ｎｍの平均直径を有する。溶媒−システム重合によって、特に沈殿重合によって作製されるビーズは、プロパノールおよび／またはブタノールおよび／またはペンタノールなどの主に直鎖または分岐鎖のＣ３−Ｃ５アルコールを含む溶媒中での膨潤に驚くほど良く適している。更に、ポリスチレンが高溶解性を有する比較的少量の溶媒、例えば、ハロゲン化アルカン（例えば、ＣＨ２Ｃｌ２、ＣＨ３ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ３ＣＨＣｌ２、ＣＨ２Ｃｌ−ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨＣｌ３）、ベンゼン、トルエン、ジメチルベンゼン、エチルベンゼン、クロロベンゼンおよびクロロトルエンなどが膨潤溶媒に加えられ得る。この型の典型的な混合物は、５％クロロホルムおよび９５％の１つ以上のＣ３−Ｃ５アルコールを含み得る。膨潤後のビーズの収縮が、本明細書の他で記載したように達成され得る。
【００３３】
当業者に理解されるように、本発明の用語「量子ドット」（「ＱＤ」）は、半導体ナノ結晶を示すために使用される。各ＱＤは典型的には、異なる材料からなるコアおよびキャップを含むが、一種類の材料のみを含むＱＤは本発明に包含される。しかし、一般的には、コア／キャップ構造が使用されるとき、蛍光放出が増大する。単一材料またはコア／キャップ構造が使用されるか否かにかかわらず、全ＱＤは好ましくは、０．５ｎｍ〜３０ｎｍ、より好ましくは１ｎｍ〜１０ｎｍの範囲の直径を有する。
【００３４】
「コア」は、ナノ粒径の半導体である。ＩＩ−ＶＩ半導体（例えば、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＨｇＳ、ＨｇＳｅ、ＨｇＴｅ、およびそれらの混合物）、ＩＩＩ−Ｖ半導体（例えば、ＧａＡｓ、ＩｎＧａＡｓ、ＩｎＰ、ＩｎＡｓ、およびそれらの混合物）またはＩＶ（例えば、Ｇｅ、Ｓｉ)半導体の任意のコアも本発明の状況で使用できるが、コアはキャップと組合せてルミネセンス量子ドットが生じるようなものでなければならない。ＩＩ−ＶＩ半導体は、周期表のＩＩ族からの少なくとも１つの元素と、ＶＩ族からの少なくとも１つの元素とを含む化合物である。などなど。好ましくは、コアは、約１ｎｍ〜約１０ｎｍの大きさの範囲のＩＩＢ−ＶＩＢ半導体、ＩＩＩＢ−ＶＢ半導体またはＩＶＢ−ＩＶＢ半導体である。より好ましくは、コアは、ＩＩＢ−ＶＩＢ半導体であり、約２ｎｍ〜約５ｎｍのサイズの範囲である。最適には、コアは、ＣｄＳまたはＣｄＳｅである。
【００３５】
「キャップ」は、コアの半導体とは異なる半導体であって、コアと結合する半導体であり、それによって、コア上に表層またはシェルを形成する。キャップは、所定の半導体コアと組合せて、ルミネセンス量子ドットが生じるようなものでなければならない。好ましくは、コアよりも高いバンドギャップを有することによって、キャップはコアを不動態化し、そうして、ＱＤの励起をコアに制限し、それによって、非放射経路を除去し、光化学分解を防止する。この点で、キャップは、好ましくは、高バンドギャップのＩＩＢ−ＶＩＢ半導体である。更に、好ましくは、キャップはＺｎＳまたはＣｄＳである。最適には、キャップはＺｎＳである。特に、コアがＣｄＳｅまたはＣｄＳであるとき、キャップは好ましくはＺｎＳであり、コアがＣｄＳｅであるとき、キャップは好ましくはＣｄＳである。ＱＤに関するコア／キャップの組み合わせの他の例として、ＣｄＳ／ＨｇＳ／ＣｄＳ、ＩｎＡｓ／ＧａＡｓ、ＧａＡｓ／ＡｌＧａＡｓおよびＣｄＳｅ／ＺｎＳが挙げられる。一般的には、キャップは、１−１０単原子層（monolayer）厚、より好ましくは１−５単原子層、最適には１−３単原子層である。単原子層の分数も本発明に包含される。例えば、ＣｄＳキャップ１．３単原子層厚が特に好適である。
【００３６】
ＱＤの合成は、例えば、米国特許第5,906,670号、同第5,888,885号、同第5,229,320号、同第5,482,890号、および Hines, M. A. J. Phys. Chem., 100, 468-471 (1996), Dabbousi, B. O. J. Phys. Chem. B, 101, 9463-9475 (1997), Peng, X., J. Am. Chem. Soc., 119, 7019-7029 (1997)（これらは、引用により本明細書に含まれる）に記載のように当業界周知である。
【００３７】
ＱＤによって放出される波長は、ＱＤの物理的性質（ナノ結晶の大きさなど）によって選択できる。ＱＤは、約３００ｎｍ〜約１７００ｎｍの光を発することが知られている。ＱＤによって発せられる光の波長バンドは、コアとキャップを構成する材料に依存して、コアの大きさ、またはコアとキャップの大きさによって決定される。発光波長バンドは、ＱＤの組成と大きさを変えることによって、および／または、同心円シェル（concentric shell）の形態でコアの周りに１つ以上のキャップを加えることによって調整できる。
【００３８】
ＱＤの各色（即ち、波長）は所定の強度でビーズに包埋されることができ、それによって、多色ＱＤ標識ビーズを形成する。各色に関し、１０の強度レベル（０，１，２，・・・９）の使用は、９の固有コード（１０１−１）を与える。なぜなら、レベル「０」がバックグラウンドから区別できないからである。使用される各強度と各色に関し、コード数は指数的に増加する。例えば、３色と１０強度のスキームは９９９コード（１０３−１）を与え、一方、６色と１０強度のスキームは約１００万（１０６−１）の理論コーディング容量を有する。概して、ｍ色でｎ強度レベルは、（ｎｍ−１）の固有コードを与える。しかし、実際のコーディング能力は、スペクトル重複、蛍光強度変動、シグナル対ノイズ要件のために、実質的にさらに低くなるようである。一般的に、使用できるコードの数を増加させるために、強度レベルの増大よりも色の増加を用いることが、より利点となる。強度数は、好ましくは０〜２０、より好ましくは１〜１０、より好ましくは２〜８、より好ましくは３〜７、より好ましくは４〜６、より好ましくは５〜６、最適には６である。色の数は、好ましくは、１〜１０（例えば、２〜８）、より好ましくは３〜７、最適には５〜６である。用語「多色ＤＱ」は、１色よりも多くのルミネセンス量子ドットがビーズに包埋されることを意味する。好ましくは１色よりも多くの量子ドットがビーズに組み込まれるが、１以上の色の強度が０である場合（例えば、赤色：緑色：青色のコードが１：０：０であるビーズ）も本発明に包含される。
【００３９】
好適な実施態様では、赤色、緑色、青色のＱＤが、正確に制御された比でビーズに包埋される。用語「正確に制御された比」は、使用されるＱＤの各色の強度の比がビーズに組み込まれる前に予め決定されていることを意味する。望ましい正確な比は、当業者に容易に決定され得る。例えば、ビーズは、赤色、緑色および青色が１：１：１、２：１：１または２：３：５（赤色：緑色：青色）（各色について所望の強度まで）の多色量子ドットで包埋され得る。
【００４０】
もともと、包埋されたＱＤが、ビーズ内で凝集し、結合する（これは、スペクトル幅の拡張、波長移動、エネルギー移動を引き起こし得る。）かどうかは不明であった。驚くべき知見は、包埋されたＱＤが、互いに空間的に分離し、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を受けないことである。ＱＤは、ビーズの本体全てにわたって均一に拡散するか、またはビーズに侵入して、蛍光環、ディスク、または他の幾何学的に固有なパターンを形成し得る。多色ＱＤ標識ビーズの蛍光スペクトルは、遊離ＱＤのスペクトルよりも約１０％狭く、発光最大は不変である。如何なる特定の理論にも縛られないが、ビーズの多孔性構造は、包埋されたＱＤを空間的に分離するマトリクスとして、また、不均一集団における大きな粒子の組み込みを阻止するフィルターとしても作用すると考えられる。計算は、２つの隣接ＱＤ間の平均距離が、直径１．２μｍを有し、約５０，０００個のＱＤを含むビーズ内において、約３０ｎｍであることを示す。この計算は、平均分離距離がＱＤのForsterエネルギー移動半径（Ｒ０＝５〜８ｎｍ）(Kagan, C. R., et al. Phys. Rev. Lett. 76, 1517-1520 (1996); Micic, O. I., et al. J. Phys. Chem. B, 102, 9791-9796 (1998))よりもかなり大きいことを示唆する。図２Ａ、Ｂで示す定量的および統計学的データは、１ビーズ当たりのＱＤ数と、コーディングのための蛍光強度レベルについて得られた。測定された蛍光強度と、包埋されたＱＤ数との間の直線関係（図２Ａ）によって、包埋された量子ドット間のＦＲＥＴ（多重光学コーディングの重要な要件）の欠如がさらに確認される。
【００４１】
多色ＱＤ標識ビーズを製造するために、単色ビーズのシグナルの変動を調べることによって、および、使用された１０の強度レベルの各々に関するヒストグラムプロットによって、標識されたビーズの均一性と再現性を分析した。図２Ａに示すように、測定された蛍光強度の狭い幅は、高レベルのビーズ均一性を示す。単一ビーズのシグナルの統計解析は、標準偏差が５〜１０％の範囲内であることを示す。図２Ｂのヒストグラムは、４標準偏差（±４σ）において最初の６レベルの間では強度重複は無く、３標準偏差（±３σ）において最後の４レベルの間では重複が無いことを示す。従って、ビーズ同定の精度が、最初の６強度レベルに関して９９．９９％と高く、残りの４レベルに関して約９９．７４％と高いことが概算された。これらの値は、異なる強度レベルの単色ビーズを同定するための統計学的な精度であり、絶対蛍光強度測定の精度または再現性ではない。以前にWildおよびその共同研究者らは、単一蛍光分子を４種のうち１種に帰属させるのに、信頼レベル９９．９％で、わずか５００個の光子が必要であることを示した(Prummer, M. et al., Anal. Chem., 72 443-447 (2000))。図２Ａのような単色ビーズの検量線は、所望の各色に関して作成され得る。また、検量線を併用してもよい（図３の概略図）。各色の直線関係によると、所望のコードのビーズを製造するのに各色どの位の数のビーズを加えるべきか容易に決定することができる。
【００４２】
図４Ａは、これらの３色蛍光ビーズのカラーイメージを多数の単色ビーズと共に示す。顕著な特徴は、３色ビーズが、３色全てに関して発光強度が正確にバランスされているので、「白色」に見えることである。このバランスは、異なる大きさのＱＤの割合を制御することによって達成された。単一ビーズの分光法によって、３つの蛍光ピークがほぼ同一の強度を有することが確認された（図４Ｂ）。ビーズ中のＱＤの量に加えて、色と強度のバランスは、異なる大きさのＱＤの光学特性の差異によって、および装置応答の波長に関する依存性によって影響される。しかし、これらの因子全ては、各発光色に関しＱＤの量を変えることによって補償され得る。これにより、実験則が発展して、所定の強度レベルの多色標識ビーズを製造することが可能となる。例えば、ＱＤ蛍光スペクトルは、ほぼ対称であり、ガウス分布としてモデル化できる。予め設定された発光最大と強度レベルにより、スペクトル解析とシグナル処理方法によって、異なる条件下でのコード同定が可能となるはずである。
【００４３】
一般的に、ＱＤは、ビーズ内に包埋され、ビーズの孔構造によってその中に物理的に保持されるのみである。しかし、他の可能な結合様式が可能である。例えば、ビーズへのＱＤの吸着は、共有結合、イオン結合、水素結合、ファンデルワールス力結合、力学的結合を介して起こり得る。ＱＤが（ビーズ内に包埋されることに加えて、またはその代わりに）ビーズの表面に吸着される実施態様は、本発明に包含される。
【００４４】
ビーズに包埋されたＱＤおよび標的分子は、例えば、（幅広い、または狭いバンド幅の）電磁放射線源からエネルギーを吸収でき、励起されたとき、狭い波長幅の検出可能な電磁放射を発することができる。ＱＤは、約４０ｎｍまたはそれ未満、好ましくは約２０ｎｍまたはそれ未満の狭い波長バンド内の放射を発することができる。従って、スペクトルが重複することなく、同一ビーズに包埋された複数の異なる色のＱＤの同時使用が可能となる。好ましくは、ＱＤは、ＱＤの発光スペクトルが標的の発光スペクトルと重複しないように選択される。
【００４５】
包埋されたＱＤは、水性条件下、ならびに化学的および生化学的試薬への暴露に対し安定である必要がある。好適な実施態様では、水性環境で安定であるために、多孔性ビーズは、シーラント化合物でシールされる。シーラント化合物は、特に限定されないが、ビーズを完全にシールするべきであり、ＱＤの蛍光に影響を与えず、プローブの容易な直接的または間接的な結合を許容すべきである。メルカプトプロピル−トリメトキシシラン、アミノプロピルトリメトキシシランおよびトリメトキシシリルプロピルヒドラジドなどのシラン化合物が好適なシーラント化合物である。水性緩衝液中の遊離ＱＤとは違って、包埋され、保護されたＱＤは、ＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイに必要な温度サイクリング条件に安定である。
【００４６】
ビーズは、任意の適切な方法によってシールされる。例示すると（限定ではない）、ビーズは、３つの方法のうちの１つによってシールされる。第１の方法では、量子ドットがビーズに組み込む前に修飾される。親水性と疎水性のＱＤはともに、使用するビーズ（およびその内部）の種類に依存して製造できる。例えば、親水性量子ドットは、溶解化のために、シリカまたはメルカプト酢酸によってコートできる。クロロホルム中でＣｄＳｅ／ＺｎＳナノ結晶と反応するとき、メルカプト基はＺｎ原子と結合し、極性カルボン酸基は、量子ドットを水溶性にする。同様の結果を生じる試薬も使用できる。疎水性量子ドットは、シラン（例えば、メルカプトプロピルトリメトキシシラン、アミノプロピルトリメトキシシランまたはトリメトキシシリルプロピルヒドラジドなど）によってコートでき、その結果、ＱＤは、プロパノール、ブタノール、メタノール、エタノール、ヘキサノール、ジメチルホルムアミド、ホルムアミド、クロロホルムなどの、その中にマイクロビーズを懸濁できるアルコールまたは他の有機溶媒中に溶解させることができる。ＴＯＰＯでキャップされた疎水性量子ドットは、また、プロパノール、ブタノールまたはヘキサノール、クロロホルムまたは炭化水素溶媒中で直接的に製造できる。修飾されたＱＤは多孔性ビーズに包埋される。次いで、微量の水の添加によって、ＱＤ表面上のシラン化合物は、ビーズ内で重合され、それによって孔をシールする。第２の方法では、量子ドットは、ビーズへの組み込み後、シラン（例えば、メルカプトプロピルトリメトキシシラン、アミノプロピルトリメトキシシランまたはトリメトキシシリルプロピルヒドラジドなど）で修飾され、次いで、微量の水の添加によって、ビーズ内で重合される。第３の方法では、カルボキシル基またはアミノ基で官能基化したマイクロビーズはシランを用いてシールできる。例えば、アミノプロピルトリメトキシシランは、１工程カルボジイミドカップリングによって、ビーズ表面でカルボキシレート（Ｃ（Ｏ）ＯＨ）基に結合できる。次いで、シランは、ビーズ表面で重合され、それによって、完全にそれをシールする。第４の方法は、第１と第３の方法の両方、または第２と第３の方法の両方の組合せである。最初に、ＱＤは官能基化され、ビーズ孔はシールされ、次いで、ビーズ表面がシールされる。
【００４７】
非多孔性と考えられるシリカマイクロビーズを使用する場合、ＱＤは、最初に、マイクロビーズの表面に結合することができ、次いで、複合体全体が、シーラント化合物（例えば、メルカプトプロピルトリメトキシシラン、アミノプロピルトリメトキシシラン、トリメトキシシリルプロピルヒドラジド）および微量の水でシールされ得る。ビーズが合成されたときにシリカビーズ内にＱＤが包埋されるならば、ビーズの非多孔性の性質のために、ビーズは更に保護またはシールされる必要はない。非多孔性の性質および比較的親水性の内部のためにシリカビーズの使用は好ましくはない。
【００４８】
上記の観点から、本発明は、多色量子ドット標識ビーズ（当該ビーズは、量子ドットを組み込むのに十分な大きさの孔を有する）を具体化する。ビーズは、乳化、懸濁またはシード重合によって製造できる。ＱＤが所定量で包埋されると、ビーズは、シーラント化合物でシールされ得る。好適実施態様では、量子ドットは油溶性であり、換言すれば、ＱＤは有機溶媒に可溶性である。好ましくは、油溶性量子ドットは、量子ドットを組み込むのに十分大きな孔を有する多孔性ビーズの内部に包埋される（ビーズは、疎水性内部を有する）。ビーズは疎水性内部を有するので、疎水性量子ドットは、ビーズ表面に結合するよりも、ビーズ内部に容易に運ばれる。溶液中のＱＤの全量がビーズ内に包埋され、量子ドットは、溶液中またはビーズ外面上に留まらないであろう。これにより、正確に制御された包埋されたＱＤの比を有するＱＤ標識ビーズの再現性のある生産が保証される。
【００４９】
別の実施態様では、本発明はまた、上記の多色量子ドット標識ビーズと担体とを含む組成物を提供する。任意の適切な担体が、組成物で使用できる。好ましくは、担体は水性である。望ましくは、担体は、組成物を、室温などの所望温度で安定にし、担体はほぼ中性ｐＨである。適切な水性担体の例は、当業者公知であり、生理食塩水やリン酸緩衝化生理食塩水溶液（例えば、ＰＢＳ、ＴＲＩＳ、ＴＢＳ、ＭＥＳ、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＯＢＳ、ＴＡＰＳＯ、ＴＲＩＺＭＡ、ＨＥＰＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＴＥＡ、ＥＰＰＳ、ＴＲＩＣＩＮＥ、ＧＬＹ−ＧＬＹ、ＢＩＣＩＮＥ、ＨＥＰＢＳ、ＴＡＰＳ、ＡＭＰＤ、ＴＡＢＳ、ＡＭＰＳＯ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ、ＡＭＰ、ＣＡＰＳ、ＣＡＢＳ）が挙げられる。
【００５０】
更に別の実施態様では、本発明は、上記で調製された多色量子ドット標識ビーズとプローブとを含み、プローブがビーズに結合するコンジュゲートを提供する。一般に、同一種の幾つかのプローブが単一ビーズに結合する。しかし、多重標的の同時検出を可能とするために、異なる種類の多重プローブを単一ビーズに結合させることができる。一般的に、１〜５０，０００個のプローブをビーズに結合させる。好ましくは、１００〜３０，０００個のプローブを結合させ、最適には１，０００〜１０，０００個のプローブを結合させる。ＱＤからの発光が標的の発光（この発光は、プローブ数に直接関連する）を圧倒しないように、プローブ数は調整できる。ビーズへのプローブの結合は、例えば、共有結合、イオン結合、水素結合、ファンデルワールス力および力学的結合を介して生じ得る。
【００５１】
プローブは、直接的に、またはリンカーを介して間接的にビーズに結合できる任意の分子である。更に、プローブは、検出を望む標的分子に対するアフィニティを有する。例えば、標的が核酸配列ならば、標的とプローブのハイブリダイゼーションが起こるように、プローブは、標的配列に相補的であるように選択されるべきである。配列は、完全に相補的である必要はない；標的配列とプローブ配列との間のハイブリダイゼーションを妨害する塩基対ミスマッチは許容できる。しかし、変異数が多すぎて、最小ストリンジェントのハイブリダイゼーション条件下でさえ、ハイブリダイゼーションが起こり得ないならば、配列は相補標的配列ではない。従って、用語「実質的に相補的」は、プローブが、選択された反応条件下でハイブリダイズするのに標的配列に十分に相補的であることを意味する。
【００５２】
好ましくは、プローブは、蛋白質（例えば、モノクローナルまたはポリクローナルを含む抗体）、核酸（モノマーおよびオリゴマーの両方）、多糖、糖、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、薬剤またはリガンドである。適切なプローブのリストは、"Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals", (第６版), R. P. Haugland, Molecular Probes, Inc.,（引用により本明細書に、内容全部が含まれる）で利用できる。特に好適なプローブは、蛋白質および核酸である。
【００５３】
句「蛋白質またはそのフラグメント」の使用は、ウイルス、細菌、植物または動物（例えば、ヒトなどの哺乳動物）起源の天然から単離された、または合成の、蛋白質、糖蛋白質、ポリペプチド、ペプチドなどを包含することを意図する。本発明のコンジュゲートでのプローブとしての使用に好適な蛋白質またはそのフラグメントは、抗原、抗原のエピトープ、抗体、または抗体の抗原反応性フラグメントである。句「核酸」の使用は、天然起源または非天然起源のヌクレオチドを含む、ウイルス、細菌、植物または動物（例えば、ヒトなどの哺乳動物）に由来する、天然から単離された、または合成、または一本鎖、または二本鎖、または化学修飾のＤＮＡとＲＮＡを包含することを意図する。好適な核酸は、一本鎖オリゴヌクレオチドである。
【００５４】
プローブは、任意の適切な手段によって直接または間接的にビーズへの任意の安定な物理的または化学的結合によって結合され得る。望ましくは、プローブは、１以上の共有結合を介して直接または間接的にビーズに結合される。プローブとビーズとの直接結合は、ビーズ表面の官能基とプローブそれ自体だけが、化学結合点として役立つことを意味する。プローブが間接的にビーズに結合するならば、好ましくは、結合は、「リンカー」による。用語「リンカー」の使用は、多色ＱＤを含むビーズにプローブを結合させるために使用できる任意の適切な手段を包含することを意図する。リンカーは、量子ドットのルミネセンスまたは結合したプローブの機能に悪影響を与えるべきではない。リンカーは、一官能性または二官能性であってもよい。好ましくは、リンカーは、アミン基、カルボキシル基、ヒドロキシ基またはチオール基である。特に好適なリンカーとしては、また、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、アビジンおよびビオチンが挙げられる。プローブを結合するために１つより多くのリンカーが使用できる。例えば、第１のリンカーは、ＱＤが包埋されているビーズに結合できる。第２のリンカーは、第１のリンカーに結合できる。第３のリンカーは第２のリンカーに結合できる、などなど。環境との相互作用が可能であるように、一般的には、プローブは末端リンカーに結合する。更に、１つのリンカーはビーズに結合でき（例えば、ビオチン）、１つのリンカーはプローブに結合できる（例えば、アビジン）。この実施態様では、２つのリンカーが結合して（例えば、ビオチン−アビジン）、コンジュゲートを形成する。
【００５５】
所望ならば、チオール、アミン、カルボキシル、ヒドロキシルなどの反応基を有する官能性有機分子によって、ビーズの表面は、表面修飾できる。これらの表面活性反応物としては、脂肪族および芳香族アミン、メルカプトカルボン酸、カルボン酸、アルデヒド、アミド、クロロメチル基、ヒドラジド、ヒドロキシル基、スルホネートおよびサルフェートが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
本発明によれば、リンカーは、結合蛋白質の機能、結合アフィニティまたは活性に必須なアミノ酸において蛋白質プローブまたはそのフラグメントに接触すべきではない。中間クロスリンカーなどのクロスリンカーが、ＱＤを含むビーズにプローブを結合させるために使用できる。エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）は、中間クロスリンカーの一例である。本発明で使用される中間クロスリンカーの他の例は、当業界公知である（例えば、 Bioconjugate Techniques, Academic Press, New York, (1996)参照)。多色ＱＤを含むビーズへのプローブの結合は、また、当業界公知の二官能性化合物によって達成できる（例えば、 Bioconjugate Techniques(1996)上記、参照）。
【００５７】
短いリンカーが立体障害の問題を引き起こすか、プローブの機能化に影響を及ぼす場合には、リンカーの長さは、当業界周知の方法（例えば、 Bioconjugate Techniques(1996)上記、参照）を用い、例えば、約１０〜約２０原子のスペーサーの添加によって延長できる。１つの可能なリンカーは、親水性かつ標識オリゴヌクレオチドを製造するのに広範に使用される、活性ポリエチレングリコールである。
【００５８】
本発明はまた、多色量子ドット標識ビーズと、プローブとを含むコンジュゲート（例えば、本明細書記載のコンジュゲート）の製造方法を提供する。上記のように製造された多色ＱＤを含むビーズにプローブを直接的に結合させる場合、当該方法は、（ａ）プローブをビーズに結合させること；および（ｂ）コンジュゲートを単離することを含む。好ましくは、プローブは、蛋白質もしくはそのフラグメントまたは核酸である。当該方法の１実施態様では、ビーズは、上記のように製造されたスチレン／ジビニルベンゼン／アクリル酸由来の架橋ポリマーであり、プローブは蛋白質である。あるいは、多色ＱＤ標識ビーズと、プローブとを含むコンジュゲートの製造方法は、以下の工程（ａ）および（ｂ）を包含する：（ａ）プローブを、（ｉ）リンカー、中間クロスリンカーまたは二官能性分子、および（ｉｉ）多色量子ドット標識ビーズと接触させる工程；および（ｂ）コンジュゲートを単離する工程。
【００５９】
上記のように製造された多色量子ドットを含むビーズにプローブを間接的に結合させる場合、本発明は、（ａ）リンカーをビーズに結合させること；（ｂ）プローブをリンカーに結合させること；および（ｃ）コンジュゲートを単離することを含む方法を提供する。プローブをビーズに間接的に結合させる方法の１実施態様では、ビーズは、スチレン／ジビニルベンゼン／アクリル酸由来の架橋ポリマーであり、リンカーおよびプローブは蛋白質である。プローブをビーズに直接的に結合させる方法の別の実施態様では、ビーズは、スチレン／ジビニルベンゼン／アクリル酸由来の架橋ポリマーであり、リンカーはストレプトアビジンであり、プローブはオリゴヌクレオチドである。プローブをビーズに間接的に結合させる方法の別の実施態様では、リンカーは１級アミンまたはストレプトアビジンであり、ビーズは、スチレン／ジビニルベンゼン／アクリル酸由来の架橋ポリマーであり、プローブは核酸である。
【００６０】
プローブが多色量子ドット標識ビーズに結合すると、ここで形成されたコンジュゲートは、少なくとも１つの標的分子の検出に有用である。標的分子は、プローブに対しアフィニティを有する任意の分子である。好適実施態様では、プローブは、十分に相補的な標的配列とハイブリダイズし、サンプル中の標的配列の存在または非存在を決定する。好ましくは、標的分子は、蛋白質、核酸、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、抗原、抗体、金属、リガンド、遺伝子の一部、制御配列、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡとｒＲＮＡを含むＲＮＡなどの生体分子である。標的分子は任意の長さを有していてもよいが、配列が長い程、より特異的であることが理解される。好ましくは、標的分子は、多色量子ドット標識ビーズに結合したプローブとハイブリダイズまたは結合するために、十分な長さを有しているか、天然コンフォメーションを含む。
【００６１】
標的分子は好ましくは、検出手段（例えば、タグ）によって直接的に標識される。タグは、（蛍光タグ付きアビジンへの結合のための）蛍光色素またはビオチンなどの可視、紫外または赤外領域で蛍光を発し、ＱＤと同一領域で励起される任意の分子である。例えば、有用な蛍光タグは、カスケードブルー(Cascade Blue)であり、これは、包埋されたＱＤと同時に約３５０ｎｍで励起され得る。他の有機色素として、ピレン、クマリン、ＢＯＤＩＰＹ、オレゴングリーンおよびローダミンが挙げられるが、これらに限定されない。単一ＱＤが分析物シグナルとして使用される全量子ドットシステムが合成できる。この例では、分析物標識は、（カスケードブルーの場合のように）青色を蛍光する必要はない；コーディングシグナルと重複しない限り、任意の波長であってもよい。例えば、コーディングシグナルが長波長側（赤色側）にある場合、青色発光ＱＤが分析物シグナルに使用され得る。コーディングシグナルが短波長側（青色側）にある場合、そのとき、赤色発光ＱＤが、分析物シグナルとして使用できる。別の実施態様では、コーディングシグナルのピークが互いに遠く離れている場合、分析物シグナルは、コーディングシグナルの中央にあってもよい。標的分子に結合したタグによって生じるシグナルの強度は、サンプルに存在する標的の量に直接比例する。非常に低い濃度で標的シグナルを検出するために、多色ＱＤ標識ビーズにおいて弱いＱＤコーディングシグナルを使用することが必要であってもよい。
【００６２】
多色量子ドット標識ビーズからのコーディングシグナルおよび標的分析物は、ともに、それらの蛍光放出によって検出される。検出は、任意の適切な装置で行える。好ましくは、標的は、微小流動チャンネルと組み合わせた波長分離分光法（wavelength-resolved spectroscopy combined with a microfluidic channel）を用いて検出される。この方法では、ビーズは、単一ファイル様式（single-file manner）で微小流動チャンネルを流れる。各読み取りで、１つのビーズのみが検出される。
【００６３】
本発明は、サンプル中の１つ以上の標的の検出方法を提供する。当該方法は、（ａ）サンプルを、上記のように製造された本発明のコンジュゲートと接触させること（但し、コンジュゲートのプローブは、標的と特異的に結合する）；および（ｂ）ルミネセンスを検出すること（但し、ルミネセンスの検出は、コンジュゲートが、サンプル中の標的に結合したこと示す）を含む。「特異的に結合する」は、プローブが、サンプル中で、非標的分子よりも大きなアフィニティを有する標的と優先的に結合することを意味する。
【００６４】
また、本発明によって、サンプル中の１つ以上の蛋白質の検出方法が提供される。当該方法は、（ａ）サンプルを、上記のように製造された本発明のコンジュゲートと接触させること（但し、コンジュゲートのプローブは、蛋白質に特異的に結合する）；および（ｂ）ルミネセンスを検出すること（但し、ルミネセンスの検出は、コンジュゲートが、サンプル中の蛋白質に結合したこと示す）を含む。
【００６５】
好ましくは、蛋白質検出の方法において、コンジュゲートのプローブは蛋白質またはそのフラグメント（抗体またはその抗原反応性フラグメントなど）であり、サンプル中の蛋白質は、抗体またはその抗原反応性フラグメントによって結合される抗原またはそのエピトープである。抗原またはそのエピトープは、好ましくは、ウイルスまたは細菌の全体または一部である。あるいは、コンジュゲートのプローブは、抗原またはそのエピトープであり、サンプル中の蛋白質は、抗原またはそのエピトープと結合する抗体またはその抗原反応性フラグメントである。抗体またはその抗原反応性フラグメントは、好ましくは、ウイルス、細菌、またはウイルスもしくは細菌の一部に特異的である。更に別の代替の実施態様では、コンジュゲートのプローブは核酸であり、サンプル中の蛋白質は核酸結合蛋白質、例えば、ＤＮＡ結合蛋白質である。
【００６６】
本発明によって提供される別の方法は、サンプル中の１つ以上の核酸の検出方法である。当該方法は、（ａ）サンプルを、上記のように製造されたコンジュゲートと接触させること（但し、コンジュゲートのプローブは、核酸と特異的に結合する）；および（ｂ）ルミネセンスを検出すること（但し、ルミネセンスの検出は、コンジュゲートが、サンプル中の核酸に結合したこと示す）を含む。好ましくは、コンジュゲートのプローブは核酸である。あるいは、コンジュゲートのプローブは、核酸と結合する蛋白質またはそのフラグメント（例えば、ＤＮＡ結合蛋白質）である。
【００６７】
生物学的アッセイへのＱＤ標識ビーズの使用を例証するために、図５に示すように、オリゴヌクレオチドプローブと３色コードビーズとを用いて、モデルＤＮＡハイブリダイゼーションシステムを設計した。標的ＤＮＡ分子は、蛍光色素またはビオチン（蛍光標識されたアビジンへの結合のため）で直接的に標識される。単一ビーズレベルでの光学分光法（例えば、微小流動チャンネルと組み合わせた波長分離分光法）は、コーディングシグナルと標的シグナルの両方を与える。コーディングシグナルはＤＮＡ配列を同定し、他方、標的シグナルはその配列の存在と量を示す。
【００６８】
図６は、３色コードビーズにハイブリダイズした、１つのミスマッチオリゴと３つの相補オリゴのアッセイ結果を示す。コード１：１：１はオリゴプローブ5'-TCA AGG CTC AGT TCG AAT GCA CCA TA-3'に対応する。対照オリゴ（非相補配列）がハイブリダイゼーションに使用されたとき、分析物の蛍光は検出されなかった（Ａ）。この結果は、高度の配列特異性と低レベルの非特異的吸光を示した。パネル（Ｂ）〜（Ｄ）で示すように、分析物の蛍光シグナルは、相補的な標的の存在下でのみ観察された。プローブコンジュゲーションと標的ハイブリダイゼーションの両方を１００％効率と仮定すると、各ビーズは、２４，０００個以下のプローブ分子と１０，０００個以下の標的分子とを含んでいたことが概算された。
【００６９】
好ましくは、標的検出の精度を増大させるために、コーディングシグナルと標的シグナルを選択してこれらのシグナルの発光ができるだけ分離するようにし、重複によって起こるスペクトル干渉を最小化する。複雑な生物学的条件下、ＱＤ標識ビーズの性能（例えば、特異性および感度）は、Waltとその共同研究者らによって報告された性能と同様であることが期待される。最近の論文では、Waltらは、３．１μｍのコードビーズを用い、２５配列（癌遺伝子と嚢胞性線維症遺伝子を含む）を研究し、検出感度１０〜１００ｆＭ標的ＤＮＡを達成した(Ferguson, J. A., et al., Anal. Chem. 72, 5618-5624 (2000))。核酸ハイブリダイゼーションと蛍光検出の基礎原理は同様であるが、多色ＱＤ標識ビーズのコーディングは、有機色素では利用できない重要な利点と用途を提供するはずである。
【００７０】
本発明のビーズを用いて、２つ以上の異なる分子および／または所定の分子の２つ以上の領域が、サンプル中で同時に検出できることを当業者は理解する。２つ以上の異なる分子または単一分子の２つ以上の異なる領域の検出方法は、１セットのコンジュゲートの使用を含み、このコンジュゲートの各々は、サンプル中の異なる分子または所定の分子の異なる領域に特異的に結合するプローブに結合した、異なる比（即ち、コード）の種々の色の量子ドットを含む。サンプル中の異なる標的分子の検出は、１セットのコンジュゲートを構成する異なる比の量子ドットによって生じるルミネセンススペクトルコードの固有発光スペクトル「コード」から生じる。この方法によって、また、例えば、単一蛋白質の異なる機能ドメインを区別するのが可能となる。あるいは、異なるプローブが結合する単一の多色標識ビーズは、２つ以上の異なる分子および／または所定の分子の２つ以上の領域を検出するために同時に使用できる。
【００７１】
当該方法は、サンプルを、２つ以上のコンジュゲートと接触させることを包含し、ここで、２つ以上のコンジュゲートの各々は、上記のように製造された多色量子ドット標識ビーズと、サンプル中の異なる分子または所定の分子の異なる領域に特異的に結合するプローブとを含む。包埋されたＱＤは、所定の異なる比で存在し、各コンジュゲートは、多色ＱＤの強度の比に基づくそれ自身の固有のコードを有する。当該方法はルミネセンスの検出を更に包含し、所定のスペクトルコードのルミネセンスの検出は、サンプル中の分子に結合するコンジュゲートを示す。
【００７２】
本発明によれば、２つ以上の蛋白質またはそのフラグメントが、１サンプル中で同時に検出できる。あるいは、２つ以上の核酸が同時に検出できる。この点に関し、サンプルは、核酸と蛋白質（またはそのフラグメント）の混合物を含み得る。
【００７３】
好ましくは、２つ以上の蛋白質またはそのフラグメントの検出方法において、各コンジュゲートのプローブは、蛋白質またはそのフラグメント（抗体またはその抗原反応性フラグメントなど）であり、サンプル中の蛋白質またはそのフラグメントは、抗体またはその抗原反応性フラグメントによって結合される抗原またはそのエピトープである。あるいは、各コンジュゲートのプローブは、抗原またはそのエピトープであり、サンプル中の蛋白質またはそのフラグメントは、抗原またはそのエピトープと結合する抗体またはその抗原反応性フラグメントである。また、好ましくは、各コンジュゲートのプローブは核酸であり、サンプル中の蛋白質またはそのフラグメントは、核酸結合蛋白質（例えば、ＤＮＡ結合蛋白質）である。
【００７４】
また、本発明によれば、２つ以上の核酸が１サンプル中で同時に検出できる。サンプル中の核酸の上記検出方法のいずれも、核酸に結合し得るプローブに結合した異なる比の多色量子ドットを含む２つ以上のコンジュゲートと共に使用できる。従って、サンプル中の２つ以上の核酸の同時検出の１つの方法は、（ａ）サンプルを、上記のように製造した２つ以上のコンジュゲートと接触させること（但し、各コンジュゲートは、サンプル中の標的核酸と特異的に結合するプローブ、好ましくは、核酸、特に一本鎖核酸、あるいは蛋白質またはそのフラグメント（ＤＮＡ結合蛋白質など）に結合した異なる比の多色量子ドットを含む）；および（ｂ）ルミネセンスを検出すること（但し、ルミネセンスの検出は、コンジュゲートが、サンプル中のその標的核酸に結合したことを示す）を含む。
【００７５】
１サンプル中の２つ以上の分子の同時検出の本発明の方法の別の実施態様では、サンプルは、少なくとも１つの核酸と、少なくとも１つの蛋白質またはそのフラグメントとを含む。サンプル中の核酸および蛋白質またはそのフラグメントの同時検出は、上記のように、サンプル中の蛋白質またはそのフラグメントの上記検出方法、およびサンプル中の核酸の上記検出方法に従って、上記の方法を用いて達成できる。
【００７６】
多重標的（または標的の多重部分）のこれらの検出方法は、診断ライブラリを可能にし、ここで、このライブラリは、マイクロチャンネルを通って流れるか、または基体表面に拡げられる、上記のように製造された多重コンジュゲートを含む。コンジュゲートのビーズは、基体表面に化学的に結合していても、結合していなくてもよい。ビーズは、他の非結合相互作用（例えば、静電相互作用）により基体表面に存在し得る。コンジュゲートは、種々の色のＱＤが特定の所定比で包埋されたビーズに結合したプローブを含む。コンジュゲートは、当業界公知の方法により、マイクロチャンネルを通り流れるか、または基体表面に拡げられる。ビーズが基体表面に拡げられる場合、その蛍光放出によって、（各ビーズがそれ自身固有のコードを有するので）各ビーズを同定するマップが作成され得る。ライブラリは、標的を含むサンプル溶液と接触できる。ハイブリダイゼーション後、蛍光放出スペクトルは、どの標的が溶液中に存在するかを示す。サンプル中に標的が存在すること（または存在しないこと）が見出され、マップ上のその位置がビーズコードによって同定されると、プローブの同一性（identity）が分かる。プローブの同一性が分かると、標的の同一性を見出すことができる。診断ライブラリは、理論上、非限定数のコンジュゲートを含む。診断ライブラリは、少なくとも１つのコンジュゲート、好ましくは少なくとも約１００のコンジュゲート、より好ましくは少なくとも約５００のコンジュゲート、最適には少なくとも約１０００のコンジュゲートを含む。
【００７７】
基体表面は、多色ＱＤを含むビーズが結合できる任意の適切な物質である。例えば、適切な基体として、プラスチック、ガラス、セラミックおよび金属が挙げられる。プラスチック基体の例として、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエーテル、ポリアミド、およびそれらの組合せを含むプラスチック基体が挙げられる。金属基体として、ステンレス鋼、金、チタン、ニッケル、およびそれらの組合せが挙げられる。
【００７８】
本発明の１実施態様では、多色量子ドット標識ビーズと、プローブと、フルオロフォアと、クエンチング部分とを含むコンジュゲートを含む分子ビーコンが形成される。プローブは、ステムとループ構造とを含む一本鎖オリゴヌクレオチドであり、親水性の結合基が、一本鎖オリゴヌクレオチドの一端に結合し、クエンチング部分が、一本鎖オリゴヌクレオチドの他端に結合している。フルオロフォアは、その発光が、多色量子ドット標識ビーズのそれと重複しないような、任意の蛍光有機色素または単一量子ドットであり得る。
【００７９】
クエンチング部分は望ましくは、フルオロフォアのルミネセンスをクエンチする。フルオロフォアのルミネセンスをクエンチする任意の適切なクエンチング部分が、上記コンジュゲートで使用できる。クエンチング部分は好ましくは、非蛍光の有機クロモフォアまたは金属粒子であり、これは、オリゴヌクレオチドの３’アミノ基と共有結合している。好ましくは、クエンチング部分は４−[４’−ジメチルアミノフェニルアゾ]安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）または典型的には直径１〜１０ｎｍの金粒子もしくは銀粒子である(例えば、Dubertret, B., et al., Nature Biotech., 19, 365-370(2001) ; Fang, X., et al., J. Am. Chem. Soc., 121, 2921-2922 (1999); Fang, X., et al., Anal. Chem., 72, 3280-3285 (2000)参照)。好ましくは、コンジュゲートは、３’末端に１級アミン基と５’末端にビオチン基を含む。好ましくは、多色量子ドット標識ビーズは、最初に、ストレプトアビジンと結合し、次いで、５’ビオチン基とコンジュゲートする（好ましくは１：１モル比）。
【００８０】
本発明は、また、ステムとループ構造とを有する一本鎖オリゴヌクレオチドと、多色量子ドット標識ビーズと、フルオロフォアと、クエンチング部分とを含む分子ビーコンを用いて、サンプル中の１つ以上の核酸の検出方法を提供する。オリゴヌクレオチドのループは、サンプル中の検出すべき核酸中の標的配列に相補的なプローブ配列を含む。望ましくは、ループは、標的配列と接触すると容易に開くのに十分な大きさを有するが、容易に剪断されるほどには大きくない。好ましくは、ループは、約１０ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチド、より好ましくは約１５ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドである。プローブ配列は、ループの全部または全部未満を含み得る。好ましくは、プローブ配列は、長さが少なくとも約１５ヌクレオチドである。ステムは、一本鎖オリゴヌクレオチドの２端であるか、または、その近傍である相補配列のアニーリングによって形成される。フルオロフォアは一本鎖オリゴヌクレオチドの１端に結合し、クエンチング部分は一本鎖オリゴヌクレオチドの他端に共有結合する。次いで、多色ＱＤ標識ビーズが、フルオロフォアまたはクエンチング部分に結合する（直接的または間接的）。図７は、分子ビーコンの異なる実施態様を示す。ステムは、フルオロフォアとクエンチング部分を互いに近接に保ち、そのために、一本鎖オリゴヌクレオチドが標的配列と結合していないとき、フルオロフォアのルミネセンスはクエンチされる。この点に関し、ステムが構成される相補配列は、量子ドットのクエンチングを生じさせるように、オリゴヌクレオチドの両末端に十分に近くなければならない。プローブ配列が、サンプル中で検出されるべき核酸中の標的配列に遭遇するとき、プローブは、標的配列と結合し、即ち、ハイブリダイズし、それによって、ステムハイブリッドよりも長く、より安定であるプローブ−標的ハイブリッドを形成する。プローブ−標的ハイブリッドの長さと剛性は、ステムハイブリッドの同時形成を防止する。結果として、構造は、ステムを開かせる自発的コンフォメーション変化を受け、それによって、フルオロフォアとクエンチング部分を分離させ、フルオロフォアのルミネセンスが回復する。標的がプローブと結合していることをフルオロフォアのルミネセンスは示し、多色量子ドット標識ビーズの発光コードは、プローブ（そして、それ故、標的）を同定する。この型の分子ビーコンを用いると、標的それ自体は、蛍光標識される必要はなく、標的の更により容易な検出が可能となる。
【００８１】
従って、当該方法は、全て上記のように、（ａ）サンプルを、上記のように製造したコンジュゲートと接触させること（但し、プローブは、ステム−および−ループ構造を含む一本鎖オリゴヌクレオチドであり、フルオロフォアは一本鎖オリゴヌクレオチドの一端と結合し、クエンチング部分は一本鎖オリゴヌクレオチドの他端と結合し、多色量子ドット標識ビーズは、フルオロフォアまたはクエンチング部分と結合し、クエンチング部分は、フルオロフォアのルミネセンスをクエンチする）を含む。ループは、サンプル中の核酸中の標的配列と結合するプローブ配列を含む。結合すると、コンジュゲートは、ステムを開かせるコンフォメーション変化を受け、それによって、フルオロフォアとクエンチング部分を分離する。当該方法は、（ｂ）フルオロフォアと多色量子ドット標識ビーズの両方のルミネセンスを検出することを更に含む。フルオロフォアルミネセンスの検出は、コンジュゲートがサンプル中の核酸と結合していることを示す。
【００８２】
別の方法はサンプル中の２つ以上の核酸の同時検出の方法を含み、サンプル中の２つ以上の核酸の同時検出の方法は、上記のようなコンジュゲートなどを使用する方法に従って、２つ以上の分子ビーコンを使用することを含み、その各々は、ステム−および−ループ構造を有する、異なる上記の一本鎖オリゴヌクレオチドを含む。本発明は、ウイルス感染、癌、心臓疾患、肝臓疾患、遺伝子疾患および免疫疾患の検出を含むが、これらに限定されない、種々の診断アッセイに適用される。本発明は、例えば、（ａ）患者から試験すべきサンプルを取り出すこと；（ｂ）サンプルを、上記のように製造した多色量子ドット標識ビーズコンジュゲートと接触させること；（ｃ）ルミネセンスを検出すること（但し、ルミネセンスの検出は、疾患標的がサンプル中に存在することを示す）によって、特定の疾患標的を検出するための診断アッセイで使用できる。プローブは典型的には、ウイルス（例えば、ＨＩＶ、肝炎）、または所定の疾患状態（例えば、癌、心臓疾患、肝臓疾患）と関連した蛋白質と結合する抗体もしくはその抗原反応性フラグメントである。例えば、ＨＩＶ ｇｐ１２０に対する抗体は、サンプル中のＨＩＶの存在を検出するために使用できる；あるいは、ＨＩＶ ｇｐ１２０は、サンプル中のＨＩＶに対する抗体の存在を検出するために使用できる。患者サンプルは、体液（例えば、唾液、涙、血液、血清、尿）、細胞または組織生検材料であってもよい。
【００８３】
実施例
以下の実施例で、本発明を更に説明する。これらの実施例は、本発明を更に説明するのに役立つが、本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例１】
【００８４】
実施例１
本実施例は、標準的乳化重合によって形成されるポリマービーズの形成を説明する。
【００８５】
以下の方法で７０℃での標準的な油−水（ｏ／ｗ）乳化重合を使用することによって、ポリスチレンビーズを合成した。
【００８６】
第１の方法では、油相は、ラジカル開始剤ＡＩＢＮと安定化剤ＳＤＳの存在下、スチレン（９８％ｖ／ｖ）、ジビニルベンゼン（１％ｖ／ｖ）、およびアクリル酸もしくは誘導体(モノ−２−メタクリロイルオキシエチルスクシネートなど）（１％ｖ／ｖ）からなっていた。
【００８７】
第２の方法では、油相は、ラジカル開始剤ＡＩＢＮと安定化剤ＳＤＳの存在下、スチレン（９３％ｖ／ｖ）、ジビニルベンゼン（１％ｖ／ｖ）、アクリル酸もしくは誘導体（モノ−２−メタクリロイルオキシエチルスクシネートなど）（１％ｖ／ｖ）、および５％ドデカン（またはオクタン、デカン）からなっていた。P. A. Lovell, Mohamed S. El-Aasser, "Emulsion polymerization and emulsion polymerization", Wiley, Inc., (1997)。
【実施例２】
【００８８】
実施例２
本実施例は、連続的なシード乳化重合による多孔性ポリマービーズの形成を説明する。
【００８９】
この方法では、モノマー、開始剤、乳化剤の存在下、小ラテックス粒子（１００〜２００ｎｍ直径）をより大きな大きさに成長させた。１例では、１０ｍｌポリスチレンシード粒子、２０ｍｌ蒸留水、３ｍｌシクロヘキサン、５０μｌアクリル酸、４ｍｌスチレン、２００μｌジビニルベンゼン、１０ｍｇ過酸化ベンゾイル、３０ｍｇドデシルスルホン酸ナトリウム（ＳＤＳ）から、混合物を処方した。混合物を室温で１８時間撹拌し、モノマーと架橋試薬がシードを大きくさせた。次いで、窒素気体流を、混合物に５分間パージし、反応混合物の温度を７５℃に上げた。１５時間後、混合物はサイズ分布２〜３％のポリスチレン粒子（１〜１０μｍ）の懸濁液を与えた。
【実施例３】
【００９０】
実施例３
本実施例は、２工程シード重合による多孔性ポリマービーズの形成を説明する。
【００９１】
第１工程では、ジブチルフタレート（ＤＢＰ）０．２ｍｌを、０．２５％（ｗ／ｗ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む水性媒質１５ｍｌ内で乳化した。１２０ｍｇポリスチレンシード粒子（１００〜２００ｎｍ直径）を含む水性懸濁液約１ｍｌを、水性ＤＢＰエマルションに加えた。生じた懸濁液を室温で撹拌し、ついに、乳液の全てが粒子に移った（約５時間）。
【００９２】
第２工程では、ＤＢＰ膨潤シード粒子をモノマー相（０．３ｍｌスチレン、０．３ｍl ＤＶＢ、１０μｌアクリル酸、４０ｍｇ過酸化ベンゾイルを含む）で更に膨潤化した。モノマー相約０．６ｍｌを水性媒質１５ｍｌ中で超音波処理することによって乳化した。次いで、モノマーエマルションをＤＢＰ膨潤シード粒子の水性懸濁液と混合した。ＤＢＰ膨潤シード粒子によるモノマー相の吸収を室温で２４時間撹拌した。生じたエマルションを、１０％ＰＶＡ（ポリビニルアルコール）水溶液３ｍｌと混合し、窒素の泡で約５分間パージした。シード粒子内のモノマー相の再重合をシェーカー上で７０℃で２４時間行った。この２工程処理により、サイズ範囲１〜１０μｍ（直径）の均一でマクロ多孔性のラテックス粒子が得られた。
【実施例４】
【００９３】
実施例４
本実施例は、懸濁（沈殿としても知られる）重合による多孔性ポリマービーズの形成を説明する。
【００９４】
均一ビーズを、異なる媒質と異なる開始剤濃度で、懸濁重合によって調製した。エタノール／水またはエタノール／メトキシエタノール混合液を、懸濁媒質として使用した。典型的な調製では、エタノール／水またはエタノール／メトキシエタノール混合液に適量の安定化剤を溶解することによって、懸濁媒質を得た。スチレンに所望量の開始剤を溶解することによって、モノマー相を調製した。重合リアクター内で、モノマー相を懸濁媒質と混合した。生じた均一溶液を、窒素の泡で、室温で５分間パージした。重合を振盪水浴上で７０℃、２０時間行った。
【００９５】
１例では、０．１４ｇ ＡＩＢＮ、１０ｍｌスチレン、１００μｌアクリル酸、１００μｌジビニルベンゼン、１０ｍｌ脱イオン水、９０ｍｌエタノール、１ｇＰＶＰ（ポリビニルピロリドン，ＭＷ＝４０，０００）を混合することによって、分散相を処方した。この反応混合物を、窒素で、室温、５分間脱気し、次いで、重合を行った。重合が完了したとき、粒子を蒸留水で洗浄し、懸濁媒質の未反応のモノマーと他の成分を除去した。
【実施例５】
【００９６】
実施例５
本実施例は、単色量子ドットの組み込みを説明する。
【００９７】
ビーズを、５％（ｖ／ｖ）クロロホルムと９５％（ｖ／ｖ）プロパノールまたはブタノールとを含む溶媒混合液中で膨潤し、ＺｎＳでキャップされた制御された量のＣｄＳｅ ＱＤを混合液に加えた。１０の強度レベルを有する単色（緑色など）コーディングに関し、ＱＤ対ビーズの比は、約６４０〜約５０，０００の範囲であった。包埋処理は、室温で約３０分以内に完了した。
あるいは、単色量子ドットの組み込みは、５％（ｖ／ｖ）クロロホルムと９５％（ｖ／ｖ）ブタノールとを含む溶媒混合液中で、ビーズと量子ドットを単純に混合することによって達成された。更に別の方法は、ブタノールまたはプロパノールなどのアルコール溶液中に多孔性ポリマービーズと量子ドットを浸漬し、超音波処理する工程を含んでいた。
【実施例６】
【００９８】
実施例６
本実施例は、１０の強度レベルを有するコードマイクロビーズの調製を説明する。
【００９９】
単一ビーズの蛍光強度と、包埋されたＱＤの数との間の関係を決定するために、検量線を作成した（図２Ａ、Ｂ参照）。この検量線に基き、ストック溶液中の所定量のＱＤを使用して、強度がコードされたビーズを調製した。ＱＤストック溶液の容量を相対的に増加させることによって、１０の強度または充填レベルが容易に達成された。
【実施例７】
【０１００】
実施例７
本実施例は、逐次ＱＤ組み込みによる多色をコードしたビーズの調製を説明する。
【０１０１】
多色量子ドットの組み込みは、５％（ｖ／ｖ）クロロホルムと９５％（ｖ／ｖ）プロパノールまたはブタノールを含む溶媒混合物中でビーズを膨潤させ、混合物に、ＺｎＳでキャップされた所定量の多色ＣｄＳｅ ＱＤを加えることによって達成された。多色コーディングに関し、異なる色のドットの異なる光学特性を補償するために、各色のＱＤの量を実験的に調整した。包埋処理は、室温で約３０分以内に完了した。
【実施例８】
【０１０２】
実施例８
本実施例は、並行ＱＤ組み込みによる多色をコードしたビーズの調製を説明する。
【０１０３】
２以上の色の量子ドットを、特別に予め決定した比で有機溶媒混合液に溶解した。ビーズをこの混合物溶媒中で膨潤させ、多色量子ドットを、膨潤したビーズに同時に組み込んだ。単色／１０強度コーディングの場合におけるように、各色の検量線を開発し、所定の強度レベルで多色をコードしたビーズを調製することができる。図３は、各色の検量線を如何にして決定できるかを示す概略図である。直線関係から、各々の所望色のストック溶液を処方し、ビーズに適量を加えて所望比を得ることができる。
【実施例９】
【０１０４】
実施例９
本実施例は、組み込まれたＱＤの保護を説明する。
【０１０５】
幅広い実験条件の下、包埋されたＱＤの光学特性を保存するために、結合相クロマトグラフィーで使用される方法(Dorsey, J. G., et al., Anal. Chem. 66, 857A-867A (1994))に従って、薄層のポリシランで多孔性ビーズをシールした。１実施態様では、コードされたビーズを、微量の水の添加によって孔内で重合する３−メルカプトプロピルトリメトキシシランを用いて保護した。量子ドットは、ビーズへの組み込み前後で、３−メルカプトプロピルトリメトキシシランに結合できた。別の実施態様では、カルボジイミド架橋剤の使用によって、アミノプロピルトリメトキシシランを官能性カルボキシレート（またはアミノ）基に結合させることによって、ビーズ表面を保護した。
【実施例１０】
【０１０６】
実施例１０
本実施例は、ビーズ表面に結合したＱＤを有するシリカビーズの保護を説明する。
【０１０７】
シリカマイクロビーズに関し、量子ドットを最初に表面に結合させ、次いで、微量の水の添加によって重合する、メルカプトプロピルトリメトキシシラン、アミノプロピルトリメトキシシランまたはトリメトキシシリルプロピルヒドラジドの使用によって保護した。ビーズを合成するときにＱＤがシリカビーズ内に包埋される場合、ビーズの非多孔性のために、ビーズは、更に保護されるか、またはシールされる必要はない。
【実施例１１】
【０１０８】
実施例１１
本実施例は、同時のＱＤ組み込みと保護を説明する。
【０１０９】
多孔性ポリスチレン／ジビニルベンゼン／アクリル酸ビーズを、メルカプトプロピル トリメトキシシランとテトラメトキシシランを含むＱＤ溶液に浸漬し、超音波処理した。溶液中およびビーズ表面から遊離の量子ドットおよびシランを全て除去するために、ビーズを濯いだ。次いで、孔中に残存するシラン分子を、微量の水の添加によって重合した。
【実施例１２】
【０１１０】
実施例１２
本実施例は、オリゴプローブと多色量子ドット標識ビーズとのコンジュゲーションを説明する。
【０１１１】
標準プロトコルを用いて、ビーズ表面のカルボン酸基をストレプトアビジン分子に共有結合させた。ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（０．５ｍｇ／ｍｌ）を用いて、ビーズ表面の非特異的部位をブロックした。結合ストレプトアビジンを介し、ビオチニル化オリゴプローブ（２６量体のオリゴヌクレオチド、５’−ビオチンＴＥＧ、ＨＰＬＣ精製、TriLink Biotechnol., San Diego, CA)をビーズに結合させた。５プライム（５’）−ビオチニル化された標的オリゴを、アビジン−カスケードブルー(Cascade Blue)で最初に標識し、次いで、４０℃、３０分間、０．１％ ＳＤＳ ＰＢＳ緩衝液中でオリゴプローブとハイブリダイズさせた。蛍光測定前に、ビーズを、２回の遠心分離によって浄化した。逐次アッセイと多重アッセイの両方により同様の結果を得た。プローブオリゴを架橋によってビーズにコンジュゲートさせ、標的オリゴを、カスケードブルーなどの青色蛍光色素によって検出した。ハイブリダイゼーション後、非特異的分子と過剰の試薬を洗浄によって除去した。
【実施例１３】
【０１１２】
実施例１３
本実施例は、多色量子ドット標識ビーズを用いる生体分子標的の検出を説明する。
【０１１３】
実際の色の蛍光画像を倒立オリンパス顕微鏡（ＩＸ−７０）とデジタルカラーカメラ（Nikon DI）によって得た。近紫外（３３０〜３８５ｎｍ）での幅広い励起は、１００Ｗ水銀ランプによって提供された。ロングパス二色性フィルター(DM 400, Chroma Technologies, Brattleboro, VT)を用いて、散乱光を遮断し、ストークスシフトの蛍光シグナルを通過させた。大口径（ＮＡ＝１．４，１００ｘ）の油浸漬対物レンズを用い、合計の広視野励起出力は約５ｍＷであった。
【０１１４】
本明細書で引用した刊行物、特許出願および特許を含む全ての参考文献は、各参考文献が引用により含まれるように、それぞれ、具体的に示され、本明細書にその全体が記載されているかのような程度まで、引用により本明細書に含まれる。
【０１１５】
本発明の説明の文脈において（特に、上記の特許請求の範囲の文脈において）、用語「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」ならびに同様の指示語の使用は、本明細書で違うように記載されるか、文脈によって明確に否定されなければ、単数と複数の両方を包含するように解釈されるべきである。本明細書で値の範囲の記載は、本明細書で違うように記載されていなければ、その範囲内の各々の分離した値へ個々に言及することの略記方法として役立つことが単に意図され、各々の分離した値は、それが本明細書に個々に記載されているかのように本明細書に含まれる。本明細書で記載される方法の全ては、本明細書で違うように記載されるか、文脈によって明確に否定されなければ、任意の適切な順序で行うことができる。本明細書で提供される任意の全ての例、または例示的言葉（例えば、「など」）の使用は、本発明をより良く明瞭にすることが単に意図され、違うように特許請求されていなければ、本発明の範囲を制限するものではない。本明細書の如何なる言葉も、本発明の実施に必須なものとして特許請求されていない要素を示すものとして解釈されるべきではない。
【０１１６】
本発明を実施するのに本発明者らが知っている最良の形態を含む、本発明の好適な実施態様を本明細書に記載している。勿論、上記説明を読むと、それらの好適な実施態様のバリエーションが当業者に明白となる。本発明者らは、当業者が適宜このようなバリエーションを用いることを期待し、本発明者らは、本発明が、本明細書に具体的に記載されたものとは異なるように実施されることを意図する。それ故、本発明は、適用法によって許されるように、本明細書に添えられた特許請求の範囲に記載の主題の全ての改変および均等物を含む。更に、本明細書で違うように記載されていないか、文脈によって違うように明瞭に否定されていなければ、上記要素のその全ての可能なバリエーションでの任意の組み合わせが本発明に包含される。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】図１は、波長および強度の多重性に基づく光学コーディングの概略図である。大きな球は、ポリマーマイクロビーズを表し、その中の小さな色付き球（多色量子ドット）は、所定の強度比に従い包埋される。「＼」クロス線影は赤色量子ドットを示し、「／」クロス線影は緑色量子ドットを示し、「×」クロス線影は青色量子ドットを示す。分子プローブ（Ａ〜Ｅ）は、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションや抗体−抗原／リガンド−レセプター相互作用などの、生物学的結合や認識のためにビーズ表面に結合している。色付き球（赤色、緑色、青色）の数は個々の量子ドットを示さず、蛍光強度レベルを示すために使用される。光学読み出しは、単一ビーズの蛍光スペクトルの測定によって達成される。異なる波長での絶対強度と相対強度の比の両方が、コーディング目的のために使用される；例えば、（１：１：１）、（２：２：２）および（２：１：１）は区別できるコードである。
【０１１８】
【図２】図２は、ＱＤ組み込みの、単一ビーズシグナル強度、均一性と再現性の定量分析である。（Ａ）単一ビーズの蛍光強度と、包埋されたＱＤの数との間の関係。各データ点は、１００〜２００回の測定の平均値であり、シグナル強度の拡がり（最小から最大まで）は、誤差棒で示される。第１点（最小強度）は、１ビーズ当たり約６４０ドットに対応する。最終点は、この充填レベルでビーズへのＱＤの不完全な組み込みのため、直線からの有意な逸脱を示す。（Ｂ）１０の強度レベルについてのヒストグラムプロットは、（Ａ）のデータ点に対応する。各曲線の右側に、平均蛍光強度および標準偏差（括弧内）を示す。代表的な生のデータを、レベル２と８について示す。
【０１１９】
【図３】図３は、１よりも多くの色から作成した検量線の概略図である。点線は、１：１：１のコードを有するビーズがどのように処方されたかを示す。青色（「Ｂ」）、緑色（「Ｇ」）、赤色（「Ｒ」）の量子ドットの溶媒濃度は、Ｘ軸から決定できる。
【０１２０】
【図４】図４は、正確に制御された蛍光強度を有する多色ＱＤ標識ビーズを示す。（Ａ）色のバランスがとれたビーズの蛍光画像。右上コーナーで、単色ビーズが黒色と白色の画像として誤解されるべきではないことを示すために、単色ビーズをデジタルで挿入した。「＼」クロス線影は赤色量子ドットを示し、「／」クロス線影は緑色量子ドットを示し、「×」クロス線影は青色量子ドットを示す。（Ｂ）ほぼ等しい強度を有する３種の分離したピーク（４８４、５４７、６０８ｎｍ）を示す単一ビーズ蛍光スペクトル。「Ｂ」は青色を表し、「Ｇ」は緑色を表し、「Ｒ」は赤色を表す。
【０１２１】
【図５】図５は、ＱＤ標識ビーズを用いたＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイの概略図である。プローブオリゴ（Ｎｏ．１〜４）を架橋によってビーズにコンジュゲートし、標的オリゴ（Ｎｏ．１〜４）をカスケードブルー(Cascade Blue)などの青色蛍光色素（標識「Ｆ」）によって検出した。「＼」クロス線影は赤色量子ドットを示し、「／」クロス線影は緑色量子ドットを示し、「×」クロス線影は青色量子ドットを示す。ハイブリダイゼーション後、非特異的分子と過剰の試薬を洗浄によって除去した。多重アッセイに関し、全てのプローブが同様の溶融温度とハイブリダイゼーションキネティクスを有するように、オリゴの長さと配列を最適化した。
【０１２２】
【図６】図６は、多色をコードしたビーズを用いたＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイを示す。（Ａ）対照ＤＮＡ配列(3'-TGA TTC TCA ACT GTC CCT GGA ACA GA-5')への暴露後、コード１：１：１を有する単一ビーズ(プローブ5'-TCA AGG CTC AGT TCG AAT GCA CCA TA-3'に対応)から得られた蛍光シグナル。対照ＤＮＡは、標的ＤＮＡと同じフルオロフォアで標識された。（Ｂ）標的5'-TAT GGT GCA TTC GAA CTG AGC CTT GA-3'とのハイブリダイゼーション後、コード１：１：１を有する単一ビーズ（（Ａ）と同じ）の蛍光シグナル。（Ｃ）標的5'-GTA AAA GCC GTT CCA TGC TTG TAC GG-3'とのハイブリダイゼーション後、コード１：２：１を有する単一ビーズ(プローブ5'-CCG TAC AAG CAT GGA ACG GCT TTT AC-3'に対応)の蛍光シグナル。（Ｄ）標的5'-GTC GAA CCA TGT GTC GCT ACT GAG TA-3'とのハイブリダイゼーション後、コード２：１：１を有する単一ビーズ(プローブ5'-TAC TCA GTA GCG ACA CAT GGT TCG AC-3'に対応)の蛍光シグナル。
【０１２３】
【図７】図７は、分子ビーコンの概略図を示す。「＼」クロス線影は赤色量子ドットを示し、「／」クロス線影は緑色量子ドットを示し、「×」クロス線影は青色量子ドットを示す。多色量子ドット標識ビーズは、フルオロフォア（Ａ）またはクエンチング部分（Ｂ）に結合し得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005508493.tif 000059
2005508493.tif 000060
【手続補正書】
【提出日】平成15年4月10日(2003.4.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
図６は、３色コードビーズにハイブリダイズした、１つのミスマッチオリゴと３つの相補オリゴのアッセイ結果を示す。コード１：１：１はオリゴプローブ5'-TCA AGG CTC AGT TCG AAT GCA CCA TA-3'（配列番号１）に対応する。対照オリゴ（非相補配列）がハイブリダイゼーションに使用されたとき、分析物の蛍光は検出されなかった（Ａ）。この結果は、高度の配列特異性と低レベルの非特異的吸光を示した。パネル（Ｂ）〜（Ｄ）で示すように、分析物の蛍光シグナルは、相補的な標的の存在下でのみ観察された。プローブコンジュゲーションと標的ハイブリダイゼーションの両方を１００％効率と仮定すると、各ビーズは、２４，０００個以下のプローブ分子と１０，０００個以下の標的分子とを含んでいたことが概算された。


【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２２】
【図６】図６は、多色をコードしたビーズを用いたＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイを示す。（Ａ）対照ＤＮＡ配列(3'-TGA TTC TCA ACT GTC CCT GGA ACA GA-5'（配列番号２）)への暴露後、コード１：１：１を有する単一ビーズ(プローブ5'-TCA AGG CTC AGT TCG AAT GCA CCA TA-3'（配列番号１）に対応)から得られた蛍光シグナル。対照ＤＮＡは、標的ＤＮＡと同じフルオロフォアで標識された。（Ｂ）標的5'-TAT GGT GCA TTC GAA CTG AGC CTT GA-3'（配列番号３）とのハイブリダイゼーション後、コード１：１：１を有する単一ビーズ（（Ａ）と同じ）の蛍光シグナル。（Ｃ）標的5'-GTA AAA GCC GTT CCA TGC TTG TAC GG-3'（配列番号５）とのハイブリダイゼーション後、コード１：２：１を有する単一ビーズ(プローブ5'-CCG TAC AAG CAT GGA ACG GCT TTT AC-3'（配列番号４）に対応)の蛍光シグナル。（Ｄ）標的5'-GTC GAA CCA TGT GTC GCT ACT GAG TA-3'（配列番号７）とのハイブリダイゼーション後、コード２：１：１を有する単一ビーズ(プローブ5'-TAC TCA GTA GCG ACA CAT GGT TCG AC-3'（配列番号６）に対応)の蛍光シグナル。




【国際調査報告】
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