(57)【要約】特定の二次構造を有する、ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡの分子相互作用部位を含むポリヌクレオチドを提供する。該ポリヌクレオチドに結合する化合物のコンビナトリアル・ライブラリーを仮想的又は現実的にスクリーニングするためのこのようなポリヌクレオチドの使用方法も提供する。ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡ又はこれを含有する原核細胞の活性を、このような仮想的又は現実的スクリーニングによって同定される化合物によってモジュレートする方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドを含む組成物であって、
第１ポリヌクレオチドが、少なくとも２６ヌクレオチドから１１７ヌクレオチド以下までを含み、そして約１ヌクレオチド〜約３ヌクレオチドを含むダングリング領域、約３ヌクレオチド〜約７ヌクレオチドを含む第１ステムの第１側、約３ヌクレオチド〜約７ヌクレオチドを含む第２ステムの第１側、約３ヌクレオチド〜約７ヌクレオチドを含む第１末端ループ、約３ヌクレオチド〜約７ヌクレオチドを含む第２ステムの第２側、約２ヌクレオチド〜約６ヌクレオチドを含む第３ステムの第１側、約２ヌクレオチド〜約６ヌクレオチドを含む第２末端ループ、約２ヌクレオチド〜約６ヌクレオチドを含む第３ステムの第２側、この第３ステムの第２側には約１ヌクレオチド〜約２ヌクレオチドを含むバルジが存在する、約２ヌクレオチド〜約６ヌクレオチドを含む第４ステムの第１側、この第４ステムの第１側には約２ヌクレオチド〜約５ヌクレオチドを含むバルジが存在する、及び約２ヌクレオチド〜約５ヌクレオチドを含むダングリング領域によって定義される二次構造を含む；並びに
第２ポリヌクレオチドが、少なくとも８ヌクレオチドから７０ヌクレオチド以下までを含み、そして約３ヌクレオチド〜約７ヌクレオチドを含むダングリング領域、約２ヌクレオチド〜約６ヌクレオチドを含む第４ステムの第２側、及び約３ヌクレオチド〜約７ヌクレオチドを含む第１ステムの第２側によって定義される二次構造を含む組成物。
【請求項２】
第１ポリヌクレオチドが、少なくとも４５ヌクレオチドから９５ヌクレオチド以下までを含み、そして２ヌクレオチドを含むダングリング領域、５ヌクレオチドを含む第１ステムの第１側、５ヌクレオチドを含む第２ステムの第１側、５ヌクレオチドを含む第１末端ループ、５ヌクレオチドを含む第２ステムの第２側、４ヌクレオチドを含む第３ステムの第１側、４ヌクレオチドを含む第２末端ループ、４ヌクレオチドを含む第３ステムの第２側、この第３ステムの第２側の第３ヌクレオチドと第４ヌクレオチドとの間には１ヌクレオチドを含むバルジが存在する、４ヌクレオチドを含む第４ステムの第１側、この第４ステムの第１側の第２ヌクレオチドと第３ヌクレオチドとの間には３ヌクレオチドを含むバルジが存在する、及び３ヌクレオチドを含むダングリング領域によって定義される二次構造を含む；並びに
第２ポリヌクレオチドが、少なくとも１４ヌクレオチドから６４ヌクレオチド以下までを含み、そして５ヌクレオチドを含むダングリング領域、４ヌクレオチドを含む第４ステムの第２側、及び５ヌクレオチドを含む第１ステムの第２側によって定義される二次構造を含む組成物。
【請求項３】
第１ポリヌクレオチドが配列番号１を含む、請求項２記載の組成物。
【請求項４】
第２ポリヌクレオチドが配列番号２を含む、請求項２記載の組成物。
【請求項５】
第１ポリヌクレオチド、第２ポリヌクレオチド及び第３ポリヌクレオチドを含む組成物であって、
第１ポリヌクレオチドが、少なくとも６ヌクレオチドから５６ヌクレオチド以下までを含み、そして約１ヌクレオチド〜約３ヌクレオチドを含むダングリング領域、及び約４ヌクレオチド〜約１０ヌクレオチドを含む第１ステムの第１側、この第１ステムの第１側には約１ヌクレオチド〜約３ヌクレオチドを含むバルジが存在する、によって定義される二次構造を含む；
第２ポリヌクレオチドが、少なくとも１３ヌクレオチドから８４ヌクレオチド以下までを含み、そして約４ヌクレオチド〜約１０ヌクレオチドを含む第１ステムの第２側、この第１ステムの第２側には約１ヌクレオチド〜約３ヌクレオチドを含むバルジが存在する、約４ヌクレオチド〜約１０ヌクレオチドを含むバルジ、約３ヌクレオチド〜約９ヌクレオチドを含む第２ステムの第１側、及び約１ヌクレオチド〜約２ヌクレオチドを含むダングリング領域によって定義される二次構造を含む、並びに
第３ポリヌクレオチドが、少なくとも５ヌクレオチドから６３ヌクレオチド以下までを含み、そして約１ヌクレオチド〜約２ヌクレオチドを含むダングリング領域、約３ヌクレオチド〜約９ヌクレオチドを含む第２ステムの第２側、及び約１ヌクレオチド〜約２ヌクレオチドを含むダングリング領域によって定義される二次構造を含む組成物。
【請求項６】
第１ポリヌクレオチドが、少なくとも１１ヌクレオチドから６１ヌクレオチド以下までを含み、そして２ヌクレオチドを含むダングリング領域、７ヌクレオチドを含む第１ステムの第１側、この第１ステムの第１側の第５ヌクレオチドと第６ヌクレオチドとの間に２ヌクレオチドを含むバルジが存在する、によって定義される二次構造を含む；
第２ポリヌクレオチドが、少なくとも２３ヌクレオチドから７３ヌクレオチド以下までを含み、そして７ヌクレオチドを含む第１ステムの第２側、この第１ステムの第２側の第５ヌクレオチドと第６ヌクレオチドとの間に２ヌクレオチドを含むバルジが存在する、７ヌクレオチドを含むバルジ、６ヌクレオチドを含む第２ステムの第１側、及び１ヌクレオチドを含むダングリング領域によって定義される二次構造を含む、並びに
第３ポリヌクレオチドが、少なくとも８ヌクレオチドから５８ヌクレオチド以下まで含み、そして１ヌクレオチドを含むダングリング領域、６ヌクレオチドを含む第２ステムの第２側、及び１ヌクレオチドを含むダングリング領域によって定義される二次構造を含む、請求項５記載の組成物。
【請求項７】
第１ポリヌクレオチドが配列番号３を含む、請求項６記載の組成物。
【請求項８】
第２ポリヌクレオチドが配列番号４を含む、請求項６記載の組成物。
【請求項９】
第３ポリヌクレオチドが配列番号５を含む、請求項６記載の組成物。
【請求項１０】
第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドを含む組成物であって、
第１ポリヌクレオチドが少なくとも１０ヌクレオチドから７９ヌクレオチド以下までを含み、そして約１ヌクレオチド〜約３ヌクレオチドを含むダングリング領域、約２ヌクレオチド〜約６ヌクレオチドを含む第１ステムの第１側、約３ヌクレオチド〜約９ヌクレオチドを含む内部ループの第１側、約３ヌクレオチド〜約９ヌクレオチドを含む第２ステムの第１側、及び約１ヌクレオチド〜約２ヌクレオチドを含むダングリング領域によって定義される二次構造を含む；並びに
第２ポリヌクレオチドが、少なくとも１０ヌクレオチドから７７ヌクレオチド以下までを含み、そして約３ヌクレオチド〜約９ヌクレオチドを含む第２ステムの第２側、約３ヌクレオチド〜約７ヌクレオチドを含む内部ループの第２側、約２ヌクレオチド〜約６ヌクレオチドを含む第１ステムの第２側、及び約２ヌクレオチド〜約５ヌクレオチドを含むダングリング領域によって定義される二次構造を含む組成物。
【請求項１１】
第１ポリヌクレオチドが少なくとも１９ヌクレオチドから６９ヌクレオチド以下までを含み、そして２ヌクレオチドを含むダングリング領域、４ヌクレオチドを含む第１ステムの第１側、６ヌクレオチドを含む内部ループの第１側、６ヌクレオチドを含む第２ステムの第１側、及び１ヌクレオチドを含むダングリング領域によって定義される二次構造を含む；及び
第２ポリヌクレオチドが、少なくとも１８ヌクレオチドから６８ヌクレオチド以下までを含み、そして６ヌクレオチドを含む第２ステムの第２側、５ヌクレオチドを含む内部ループの第２側、４ヌクレオチドを含む第１ステムの第２側、及び３ヌクレオチドを含むダングリング領域によって定義される二次構造を含む、請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
第１ポリヌクレオチドが配列番号６を含む、請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
第２ポリヌクレオチドが配列番号７を含む、請求項１１記載の組成物。
【請求項１４】
少なくとも１２ヌクレオチドから８４ヌクレオチドまでを含むポリヌクレオチドであって、約３ヌクレオチド〜約９ヌクレオチドを含むステムの第１側、該ステムの第１側には約２ヌクレオチド〜約５ヌクレオチドを含む内部ループの第１側が存在する、約２ヌクレオチド〜約６ヌクレオチドを含む末端ループ、約３ヌクレオチド〜約９ヌクレオチドを含む該ステムの第２側、該ステムの第２側には約１ヌクレオチド〜約３ヌクレオチドを含む該内部ループの第２側が存在する、及び約１ヌクレオチド〜約２ヌクレオチドを含むダングリング領域によって定義される二次構造を含むポリヌクレオチド。
【請求項１５】
少なくとも２２ヌクレオチドから７２ヌクレオチドまでを含む、請求項１４記載のポリヌクレオチドであって、６ヌクレオチドを含むステムの第１側、該ステムの第１側の第３ヌクレオチドと第４ヌクレオチドとの間には３ヌクレオチドを含む内部ループの第１側が存在する、４ヌクレオチドを含む末端ループ、６ヌクレオチドを含む該ステムの第２側、該ステムの第２側の第３ヌクレオチドと第４ヌクレオチドとの間には２ヌクレオチドを含む該内部ループの第２側が存在する、及び１ヌクレオチドを含むダングリング領域によって定義される二次構造を含むポリヌクレオチド。
【請求項１６】
配列番号８を含む、請求項１５記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
第１ポリヌクレオチド、第２ポリヌクレオチド、第３ポリヌクレオチド、第４ポリヌクレオチド及び第５ポリヌクレオチドを含む組成物であって、
第１ポリヌクレオチドが、少なくとも３ヌクレオチドから５９ヌクレオチド以下までを含み、そして約２ヌクレオチド〜約６ヌクレオチドを含む第１ステムの第１側、及び約１ヌクレオチド〜約３ヌクレオチドを含む第２ステムの第１側によって定義される二次構造を含む；
第２ポリヌクレオチドが、少なくとも３ヌクレオチドから５８ヌクレオチド以下までを含み、約１ヌクレオチド〜約３ヌクレオチドを含む第２ステムの第２側、及び約２ヌクレオチド〜約５ヌクレオチドを含む第３ステムの第１側によって定義される二次構造を含む；
第３ポリヌクレオチドが、少なくとも７ヌクレオチドから６８ヌクレオチド以下までを含み、そして約２ヌクレオチド〜約５ヌクレオチドを含む第３ステムの第２側、該第３ステムの第２側には約１ヌクレオチド〜約２ヌクレオチドを含むバルジが存在する、約１ヌクレオチド〜約３ヌクレオチドを含む第４ステムの第１側、約１ヌクレオチド〜約３ヌクレオチドを含むバルジ、及び約２ヌクレオチド〜約５ヌクレオチドを含む第５ステムの第１側によって定義される二次構造を含む；
第４ポリヌクレオチドが、少なくとも８ヌクレオチドから７０ヌクレオチド以下までを含み、そして約２ヌクレオチド〜約５ヌクレオチドを含む第５ステムの第２側、約３ヌクレオチド〜約７ヌクレオチドを含むバルジ、約１ヌクレオチド〜約３ヌクレオチドを含む第６ステムの第１側、及び約２ヌクレオチド〜約５ヌクレオチドを含むダングリング領域によって定義される二次構造を含む；並びに
第５ポリヌクレオチドが、少なくとも５ヌクレオチドから６５ヌクレオチド以下までを含み、そして約１ヌクレオチド〜約３ヌクレオチドを含むダングリング領域、約１ヌクレオチド〜約３ヌクレオチドを含む第６ステムの第２側、約１ヌクレオチド〜約３ヌクレオチドを含む第４ステムの第２側、及び約２ヌクレオチド〜約６ヌクレオチドを含む第１ステムの第２側によって定義される二次構造を含む組成物。
【請求項１８】
第１ポリヌクレオチドが、少なくとも６ヌクレオチドから５６ヌクレオチド以下までを含み、そして４ヌクレオチドを含む第１ステムの第１側、及び２ヌクレオチドを含む第２ステムの第１側によって定義される二次構造を含む；
第２ポリヌクレオチドが、少なくとも５ヌクレオチドから５５ヌクレオチド以下までを含み、そして２ヌクレオチドを含む第２ステムの第２側、及び３ヌクレオチドを含む第３ステムの第１側によって定義される二次構造を含む；
第３ポリヌクレオチドが、少なくとも１０ヌクレオチドから６０ヌクレオチド以下までを含み、３ヌクレオチドを含む第３ステムの第２側、この第３ステムの第２側の第２ヌクレオチドと第３ヌクレオチドとの間に１ヌクレオチドを含むバルジが存在する、２ヌクレオチドを含む第４ステムの第１側、１ヌクレオチドを含むバルジ、及び３ヌクレオチドを含む第５ステムの第１側によって定義される二次構造を含む；
第４ポリヌクレオチドが、少なくとも１３ヌクレオチドから６３ヌクレオチド以下までを含み、そして３ヌクレオチドを含む第５ステムの第２側、５ヌクレオチドを含むバルジ、２ヌクレオチドを含む第６ステムの第１側、及び３ヌクレオチドを含むダングリング領域によって定義される二次構造を含む；並びに
第５ポリヌクレオチドが、少なくとも１０ヌクレオチドから５０ヌクレオチド以下までを含み、そして２ヌクレオチドを含むダングリング領域、２ヌクレオチドを含む第６ステムの第２側、２ヌクレオチドを含む第４ステムの第２側、及び４ヌクレオチドを含む第１ステムの第２側によって定義される二次構造を含む、請求項１７記載の組成物。
【請求項１９】
第１ポリヌクレオチドが５’−ｃｇｕｇｃｃ−３’を含む、請求項１８記載の組成物。
【請求項２０】
第２ポリヌクレオチドが５’−ｇｇｇｃａ−３’を含む、請求項１８記載の組成物。
【請求項２１】
第３ポリヌクレオチドが配列番号９を含む、請求項１８記載の組成物。
【請求項２２】
第４ポリヌクレオチドが配列番号１０を含む、請求項１８記載の組成物。
【請求項２３】
第５ポリヌクレオチドが配列番号１１を含む、請求項１８記載の組成物。
【請求項２４】
少なくとも１３ヌクレオチドから８４ヌクレオチドまでを含むポリヌクレオチドであって、約２ヌクレオチド〜約５ヌクレオチドを含むダングリング領域、約２ヌクレオチド〜約５ヌクレオチドを含むステムの第１側、約６ヌクレオチド〜約１６ヌクレオチドを含む末端ループ、約２ヌクレオチド〜約５ヌクレオチドを含む該ステムの第２側、及び約１ヌクレオチド〜約３ヌクレオチドを含むダングリング領域によって定義される二次構造を含むポリヌクレオチド。
【請求項２５】
少なくとも２２ヌクレオチドから７２ヌクレオチドまでを含む請求項２４記載のポリヌクレオチドであって、３ヌクレオチドを含むダングリング領域、３ヌクレオチドを含むステムの第１側、１１ヌクレオチドを含む末端ループ、３ヌクレオチドを含む該ステムの第２側、及び２ヌクレオチドを含むダングリング領域によって定義される二次構造を含むポリヌクレオチド。
【請求項２６】
配列番号１２を含む、請求項２５記載のポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡの分子相互作用部位の同定、同部位に結合する化合物の仮想的又は現実的スクリーニング、並びに仮想的及び現実的スクリーニングで同定される該化合物によるＲＮアーゼＰ  ＲＮＡ活性のモジュレーティングに関する。
【０００２】
発明の背景
リボヌクレアーゼＰ（ＲＮアーゼＰ）は、ｔＲＮＡの５’末端の成熟中のｔＲＮＡ前駆体からのリーダー配列の除去の原因となるエンドリボヌクレアーゼである。Altman et al.,FASEB J.,1993,7,7-14 及びPace et al.,J.Bacteriol.,1995,177,1919-1928. ＲＮアーゼＰは、少なくとも細菌におけるその触媒機能が、タンパク質によってではなく、そのＲＮＡ成分（ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡ）によって行なわれるリボ核タンパク質である。Guerrier-Takada et al.,Cell,1983,35,849-857. ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡの他の特徴は、そのｐｒｅ−ｔＲＮＡ基質の三次構造を認識するその能力である。Kahle et al.,EMBO J.,1990,9,1929-1937. 細菌ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡの二次構造は、配列の一次比較分析から推測され（James et al.,Cell,1988,52,19-26)、さらなる配列が入手可能であったときに微細調整された(Haas et al.,Science,1991,254,853-856; Haas et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1994,91,2527-2531; Brown et al.,Nutl.Acids Res.,1993,21,671-679)。さらに、大腸菌（E.coli）及び枯草菌(Bacillus subtilis)からの細菌ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡの立体構造(three-dimensional architecture)の誘導は、Massire et al.,J.Mol.Biol.,1998,279,773-793（これは、その全体で本明細書に援用される）に記載されている。
【０００３】
ゲノミクス、分子生物学及び構造生物学における最近の進歩は、ＲＮＡ分子が、細胞におけるタンパク質発現に必要である多くのイベントにどのように関与するか、又は制御するかを強調している。ＲＮＡ分子は、単なる中間体として機能するのではなく、ＤＮＡからのそれら自身の転写を積極的に調節し、ｍＲＮＡ分子及びｔＲＮＡ分子をスプライスし、編集し、リボソームにおけるペプチド結合を合成し、新生タンパク質の、細胞膜へのマイグレーションを触媒し、メッセージの翻訳速度を微調整する。ＲＮＡ分子は、これらの機能を果たすために必要なフレームワークを与える、多様な特有の構造モチーフを導入することができる。
【０００４】
構成されたＲＮＡ分子に特異的に結合する“小(small)”分子治療薬(therapeutics)は、ポリマーではない有機化学分子である。“小”分子治療薬は、例えば、最強力な天然発生抗生物質である。例えば、アミノグリコシド及びマクロライド抗生物質は、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）構造の一定の(defined)領域に結合して、タンパク質合成に必要な、ＲＮＡのコンホメーション変化(conformational change)を妨害することによって作用すると考えられる“小”分子である。さらに、ＲＮＡ分子のコンホメーションにおける変化が、ｍＲＮＡの転写及び翻訳の速度を調節することが判明している。小分子は一般に１０ｋＤａ未満である。
【０００５】
ＲＮＡ分子又は関連ＲＮＡ分子群は、タンパク質合成に細胞によって利用される調節領域を有すると、出願人は考える。細胞は、ＲＮＡとの直接の特異的相互作用によって合成されるタンパク質のタイミング及び量の両方に制御を及ぼすと考えられる。この考えは、転写に高度に集中している、遺伝子調節に関する科学論文を読むことによって得られる印象とは矛盾する。ＲＮＡ成熟、輸送、細胞内局在及び翻訳のプロセスは、薬物結合のための良好な機会を与えるＲＮＡ認識部位に富んである。出願人の発明は、とりわけ、微生物ゲノムにおけるＲＮＡ分子、特にＲＮアーゼＰ  ＲＮＡの、これらの部位を見い出すことに関する。出願人の発明はさらに、多数の化学的エンティティを、これらの薬物結合部位に結合する及び／又はこれらの薬物結合部位をモジュレートするそれらの能力に関して、現実的に又は仮想的に製造する及び／又はスクリーニングするために、コンビナトリアル・ケミストリーを利用する。
【０００６】
核酸及びそれらの付随構造モチーフの可能な立体構造の決定は、例えば、ＲＮＡによる触媒作用、ＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用、ＲＮＡ−核酸相互作用、ＲＮＡ−タンパク質相互作用、及び核酸による小分子の認識の研究のような、分野に識見を与える。ＲＮＡのモデル立体構造を形成するための４つの一般的アプローチが、文献において実証されている。これらの全てが、例えばＲＮＡのような、標的核酸内のフォールディング及び三次相互作用(tertiary interaction)のシミュレーションのために、難解な分子モデリング及びコンピュータによるアルゴリズムを用いている。ＷｅｓｔｈｏｆとＡｌｔｍａｎ（Proc.Natl.Acad.Sci.,1994,91,5133,これはその全体で本明細書に援用される）は、対話型コンピュータ・モデリング・プロトコールによる、大腸菌(E.coli)からのＲＮアーゼＰの触媒ＲＮＡサブユニット、Ｍ１  ＲＮＡの立体作用モデルの作製を述べている。ＭｕｅｌｌｅｒとＢｒｉｍａｃｏｍｂｅ(J.Mol.Biol.,1997,271,524)は、リボソームＲＮＡに関する極低温電子顕微鏡検査（ｃｒｙｏ−ＥＭ）及び生化学研究の分野における重要な一連の研究を利用して、大腸菌１６ＳリボソームＲＮＡの立体モデルを構築している。核酸ヘアピン・モチーフをモデル化する方法は、核酸構造を表す一組の縮小座標(reduced coordinates)と、ＭｏｎｔｅＣａｒｌｏ（ＭＣ）シミュレーションを用いて構造を平衡させるサンプリング・アルゴリズムとに基づいて開発されている(Tung, Biophysical J.,1997,72,876, これはその全体で本明細書に援用される）。ＭＣ−ＳＹＭプログラムは、制約−充足方法を用いて、ＲＮＡの立体構造を予測するためのさらに別のアプローチである(Major et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,1993,90,9408）。ＭＣ−ＳＹＭプログラムは、問題入力制約(query input constraints)を満たす全てのモデルに関してコンホメーション・スペースをサーチする制約−充足に基づくアルゴリズムであり、例えば、Cedergren et al., RNA Structure And Function,1998, Cold Spring Harbor Lab.Press,p.37-75に記載されている。ＲＮＡの立体構造は、この方法によると、成長するオリゴヌクレオチド・モデルに１つ又は幾つかの異なるコンホメーションを有するヌクレオチドを段階的に添加することによって作製される。
【０００７】
ＷｅｓｔｈｏｆとＡｌｔｍａｎ(Proc.Natl.Acad.Sci.,1994,91,5133)は、対話型コンピュータ・モデリング・プロトコールによる、大腸菌(E.coli)からのＲＮアーゼＰの触媒ＲＮＡサブユニット、Ｍ１  ＲＮＡの立体作用モデルの作製を述べている。このモデリング・プロトコールは、化学的及び酵素的防御実験、系統発生的分析、突然変異体の活性の研究、及びＭ１  ＲＮＡへの基質の結合によって触媒される反応の動力学からのデータを組み入れていた。モデリングは、大部分に関して、該文献に記載されたように行なわれた（Westhof et al.,in “Theoretical Biochemistry and Molecular Biophysics”, Beveridge and Lavery(Eds.),Adenine,NY,1990,399)。一般に、Ｍ１  ＲＮＡの一次配列から出発して、二次構造のステム−ループ構造及び他の要素(elements)を作製した。コンピュータ・グラフィックス・ステーション及びＦＲＯＤＯを用いた、これらの要素から立体構造へのその後のアセンブリ(Jones, J.Appl.Crystallogr.,1978,11,268)、その後のＮＵＣＬＩＮ−ＮＵＣＬＳＱを用いた精密化(refinement)は、正確なジオメトリー、不良な接点の不在及び適当な立体化学を有するＲＮＡモデルを提供した。このように作製されたモデルは、Ｍ１  ＲＮＡに関する経験的データの大部分と一致することが見出されており、ＲＮアーゼＰの作用機構についての仮説をもたらすものである。しかし、この方法によって作製されたモデルは、あまり充分に分析されていないので、該構造はＸ線結晶学によって決定される。
【０００８】
ＭｕｅｌｌｅｒとＢｒｉｍａｃｏｍｂｅ(J.Mol.Biol.,1997,271,524,これはその全体で本明細書に援用される）は、ＥＲＮＡ−３Ｄと呼ばれるモデリング・プログラムを用いて、大腸菌１６ＳリボソームＲＮＡの立体モデルを作製している。このプログラムは、低分解能回折データから得られる電子密度にフィットする、一本鎖の力学的ドッキング(dynamic docking)によってＡ形ＲＮＡヘリックス(A-form RNA helices)及び一本鎖領域のような立体構造を作製する。ヘリカル要素を決定して、モデル内に位置付けた後に、例えばＲＮＡ−タンパク質架橋及びフットプリンティング・データのような、任意の既知生化学的制約を満たすように、一本鎖領域の配置が調整されている。
【０００９】
核酸ヘアピン・モチーフをモデル化する方法は、核酸構造を表す一組の縮小座標と、ＭｏｎｔｅＣａｒｌｏ（ＭＣ）シミュレーションを用いて構造を平衡させるサンプリング・アルゴリズムとに基づいて開発されている(Tung, Biophysical J.,1997,72,876, これはその全体で本明細書に援用される）。核酸のステム領域は、標準的な二本鎖形成(canonical duplex formation)を用いることによって、適切にモデル化することができる。一組の縮小座標を用いて、１対の固定末端を有する一本鎖ループ構造を形成することができるアルゴリズムを作製した。これは、コンホメーション・スペースにおける該ループの効果的な構造サンプリングを可能にする。このアルゴリズムを改変されたＭｅｔｒｏｐｏｌｉｓ  Ｍｏｎｔｅ  Ｃａｒｌｏアルゴリズムと組み合わせると、核酸ヘアピン構造の研究をコンピュータ手段によって簡略化する構造シミュレーション・パッケージが得られる。ＲＮＡサブドメインがひと度同定されたならば、それらを必要に応じて、米国特許第５，７１２，０９６号に開示された方法によって安定化させることができる。
【００１０】
Ｘ線結晶学は、バイオポリマー標的の幾つかの二次構造及び三次構造の決定を可能にする、非常に強力な方法であるが(Erikson et al.,Ann.Rep.in Med.Chem.,1992,27,271-289)、この方法は費用のかかる手段であり、達成が非常に困難である可能性がある。バイオポリマーの結晶化は、極めてやり甲斐があるが、適当な分解能で行なうのが困難であり、しばしば、科学(science)と同様な技術であると見なされる。薬物開発プロセスにおけるＸ線結晶構造の有用性をさらに混乱させているのは、結晶学が液相への洞察、したがって生物学的に関連がある、問題の標的の構造を明らかにすることができないことである。リガンド（アゴニスト、アンタゴニスト又は阻害剤）とその標的との相互作用の性質及び強度の幾つかの分析が、ＥＬＩＳＡ(Kemeny and Challacombe, in ELISA and oher Solid Phase Immunoassays:1988)、ラジオリガンド結合アッセイ（Berson et al., Clin.1968; Chard,in “An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques”,1982)、表面プラスモン共鳴(Karlsson et al.,1991, Jonsson et al., Biotechniquws,1991)、又はシンチレーション近似アッセイ(Udenfriend et al., Anal.Biochem.,1987)（これらは全て以前に引用したものである）によって行なうことができる。ラジオリガンド結合アッセイは通常、ラジオリガンドの結合に関して結合部位における未知物質の競合結合を評価するときにのみ有用であり、さらに放射能の使用を必要とする。表面プラスモン共鳴法はより直接的に使用できるが、非常に費用もかかる。結合動力学についての慣用的な生化学的アッセイと、解離及び結合定数も、標的−リガンド相互作用の性質を明らかにする上で有用である。
【００１１】
したがって、本発明の１態様は、ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡ中の分子相互作用部位を同定する。二次構造要素を構成する、これらの分子相互作用部位は、“小”分子等との重要な治療的、調節的又は他の相互作用を生じる可能性が高い。本発明の他の態様は、ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡの分子相互作用部位を、それとの相互作用のために提案された化合物と比較することである。
【００１２】
本発明のさらに他の態様は、ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡの分子相互作用部位の三次元構造の数値的表現のデータベースの確立である。このようなデータベース・ライブラリーは、分子相互作用部位の構造及び、分子相互作用部位と可能なリガンドとの相互作用の解明及びそれらの予測のための強力なツールである。本発明の他の態様は、ライブラリーのいずれの要素が標的に結合するのかを決定するために、ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡに対する個々の化合物又は化合物の混合物を含むコンビナトリアル・ライブラリーをスクリーニングするための一般的な方法を提供することである。
【００１３】
発明の概要
本発明は、特定の二次構造を含むＲＮアーゼＰ  ＲＮＡの分子相互作用部位の同定に関する。
本発明はさらに、分子相互作用部位に結合する化合物のコンビナトリアル・ライブラリーを仮想的又は現実的にスクリーニングするために用いることができる、分子相互作用部位を含む核酸分子、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドにも関する。
本発明はさらに、分子結合部位の構造の三次元表現を含むコンピュータ可読の媒体にも関する。
【００１４】
本発明はさらに、ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡ又はそれを含む原核細胞を、このような仮想的又は現実的スクリーニングで同定される化合物と接触させることによるＲＮアーゼＰ  ＲＮＡ活性のモジュレーティングにも関する。
本発明はまた、原核細胞をこのような仮想的又は現実的スクリーニングで同定される化合物と接触させることを含む、原核細胞増殖のモジュレーティングにも関する。
【００１５】
本発明の好ましい実施態様の説明
本発明は、とりわけ、ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡの分子相互作用部位の同定に関する。このような分子相互作用部位は、翻訳及び他の細胞プロセスのために必要な、例えば因子及びタンパク質のような細胞成分(cellular components)と相互作用することができる二次構造を含む。分子相互作用部位を含む核酸分子又はポリヌクレオチドを用いて、それと結合する化合物のコンビナトリアル・ライブラリーを仮想的又は現実的にスクリーニングすることができる。このようなスクリーニングによって同定される化合物は、ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡの活性をモジュレートするために用いられるので、原核細胞増殖をモジュレート、即ち、阻害するか又は刺激するために、このような化合物を用いることができる。したがって、ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡのモジュレーションを介して作用する、新規な薬物、農業用化学物質、工業用化学物質等を同定することができる。
【００１６】
強力な薬物及び他の生物学的に有用な化合物を同定するために、幾つかの方法及びプロトコールを統合することが好ましい。薬剤、獣医学用薬物、農業用化学物質、殺虫剤、除草剤、殺真菌剤、工業用化学物質、検査用化学物質及び、汚染防止、工業用生化学及び生体触媒系(biocatalytic system)に有用な、多くの他の有効化合物を、本発明の実施態様によって同定することができる。幾つかの手段の新規な組み合わせが、本発明の方法に非常な能力と汎用性を与える。本明細書でさらに詳しく記載するように、本出願の譲受人によって開発された幾つかのプロセスを統合することが、一部の実施態様では好ましいが、他の方法論を本発明と充分に効果的に統合することができることを認識すべきである。したがって、本発明の教示に従ってＲＮアーゼＰ  ＲＮＡ上の分子結合部位を決定することは非常に有利であるが、リガンド及びリガンド混合物と、重要であると同定された、他のＲＮアーゼＰ  ＲＮＡとの相互作用は、本発明の他の態様から非常に恩恵を受ける可能性がある。このような組み合わせの全てが本発明の範囲内である。
【００１７】
出願人の発明の１態様は、“分子相互作用部位”と呼ばれる、ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡ中の二次構造の同定に関する。本明細書で用いる限り、“分子相互作用部位”とは、二次構造を有する、ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡの領域である。分子相互作用部位は、ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡの複数の異なる分類学的種の間に保存されうる。分子相互作用部位は、大きいＲＮＡ分子内に含有される、小さい、好ましくは２００ヌクレオチド未満、好ましくは１５０ヌクレオチド未満、好ましくは７０ヌクレオチド未満、好ましくは５０ヌクレオチド未満、或いは３０ヌクレオチド未満である、独立的に折り畳まれた機能的サブドメインである。分子相互作用部位は一本鎖領域と二本鎖領域の両方を含有することができる。したがって、分子相互作用部位は、“小さい”分子との、及びそうでなくとも、相互作用を受けることができ、治療用途及び他の用途において例えばオリゴヌクレオチド及び他の化合物のような、“小さい”分子、オリゴマーとの相互作用のための部位として役立つと期待される。分子相互作用部位はさらに、小分子、薬物等を結合するためのポケットを含む。
【００１８】
分子相互作用部位は、少なくともＲＮアーゼＰ  ＲＮＡ内に存在する。本発明の一部の実施態様によると、分子相互作用部位（単数又は複数）を有するＲＮアーゼＰ  ＲＮＡが多くの供給源に由来することができることが理解される。したがって、このようなＲＮアーゼＰ  ＲＮＡを任意の手段によって同定して、三次元表現に翻訳して、ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡと相互作用して、該ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡのモジュレーションを行なうことができる化合物を同定するために用いることができる。幾つかの実施態様では、ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡ中に同定される分子相互部位は、真核生物、特にヒトには存在しない、したがって、ヒトに毒性を及ぼさずに、原核生物のＲＮアーゼＰ  ＲＮＡを同時にモジュレートしながら、“小”分子結合部位として役立つことができる。
【００１９】
当業者に知られた任意の手段によって、分子相互作用部位を同定することができる。本発明の一部の実施態様では、ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡ中の分子相互作用部位は、国際公開ＷＯ９９／５８７１９（これはその全体で本明細書に援用される）に記載された一般的方法によって同定される。簡単に説明すると、標的ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡヌクレオチド配列は、既知配列から選択される。任意のＲＮアーゼＰ  ＲＮＡヌクレオチド配列を選択することができる。標的ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡのヌクレオチド配列を、異なる分類学的種からの複数のＲＮアーゼＰ  ＲＮＡのヌクレオチド配列と比較する。該複数のＲＮアーゼＰ  ＲＮＡと標的ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡとに有効に保存される、少なくとも１つの配列領域を同定する。このような保存された領域を、いずれかの二次構造が存在するか否かを決定するために試験して、二次構造を有する保存領域に関して、このような二次構造を同定する。
【００２０】
本発明の一部の実施態様によると、標的ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡのヌクレオチド配列を異なる分類学的種からの複数の対応するＲＮアーゼＰ  ＲＮＡのヌクレオチド配列と比較する。特定の標的核酸の最初の選択は、いずれかの機能的基準に基づくことができる。例えば、細菌及び酵母のような、病原性ゲノムに関与することが知られているＲＮアーゼＰ  ＲＮＡが、具体的な標的である。病原性細菌及び酵母は、当業者に周知である。他のＲＮアーゼＰ  ＲＮＡ標的は独立的に決定することができるか、又は当業者に知られた、公に利用可能な原核生物遺伝子データベースから選択することができる。データベースは、例えば、Ｍａｎ（ＯＭＩＭ）におけるＯｎｌｉｎｅ  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ、ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｔｏｍｙ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＣＧＡＰ）、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＰＩＲ、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ等を包含する。疾患に関連した遺伝子突然変異のデータベースであるＯＭＩＭは、一部は、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のために開発されたものである。ＯＭＩＭは、例えば、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｏｍｉｍ／でインターネットの世界的ウェブを介してアクセスすることができる。癌細胞の分子アナトミーを解読するために必要な、情報及びテクノロジー・ツールを確立するインターディシプリナリー・プログラムであるＣＧＡＰは、例えば、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｃｉｃｇａｐ／でインターネットの世界的ウェブを介してアクセスすることができる。これらのデータベースの一部は、完全な又は部分的なヌクレオチド配列を含有する可能性がある。さらに、ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡ標的は、プライベート遺伝子データベースから選択することもできる。或いは、ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡ標的を利用可能な刊行物から選択することができるか、又は特に本発明に関連して用いるために決定することができる。
【００２１】
ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡ標的を選択するか又は用意した後に、該ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡ標的のヌクレオチド配列を決定して、次に、異なる分類学的種からの複数のＲＮアーゼＰ  ＲＮＡのヌクレオチド配列に比較する。本発明の１実施態様では、ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡ標的のヌクレオチド配列を少なくとも１つの遺伝子データベースをスキャンすることによって決定するか、又は利用可能な刊行物中で同定する。当業者に既知で、利用可能なデータベースは、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ等を包含する。これらのデータベースは、例えば、当業者に既知で、利用可能であるＥｎｔｒｅｚのような、サーチング・プログラムと共に用いることができる。Ｅｎｔｒｅｚは、例えば、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｎｔｒｅｚ／でインターネットの世界的ウェブを介してアクセスすることができる。好ましくは、種々なデータベースから入手可能な最も完全な核酸配列表現を用いる。当業者に既知で、利用可能であるＧｅｎＢａｎｋデータベースも、最も完全なヌクレオチド配列を得るために用いることができる。ＧｅｎＢａｎｋは、ＮＩＨ遺伝子配列データベースであり、全ての公に入手可能なＤＮＡ配列の注釈付きコレクションである。ＧｅｎＢａｎｋは、例えば、Nuc.Acids Res.,1998,26,1-7（これは、その全体で本明細書に援用される）に記載されており、当業者が、例えば、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｗｅｂ／Ｇｅｎｂａｎｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌでインターネットの世界的ウェブを介してアクセスすることができる。或いは、完全なヌクレオチド配列が入手不能である場合に、ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡ標的の部分ヌクレオチド配列を用いることができる。
【００２２】
ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡ標的のヌクレオチド配列を、異なる分類学的種からの複数のＲＮアーゼＰ  ＲＮＡのヌクレオチド配列と比較する。異なる分類学的種からの複数のＲＮアーゼＰ  ＲＮＡと、そのヌクレオチド配列は、利用可能な刊行物からの遺伝子データベースに見出すことができるか、又は特に、本発明に関連して用いるために決定することができる。本発明の１実施態様では、ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡ標的を、異なる分類学的種からの複数のＲＮアーゼＰ  ＲＮＡのヌクレオチド配列と、配列類似性サーチ、オーソログ・サーチ又は両方を行なって比較する、このようなサーチは当業者に知られている。
【００２３】
配列類似性サーチの結果は、ウインドウ領域と呼ばれる、標的ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡの少なくとも８から２０ヌクレオチドまでの領域に相同である、それらのヌクレオチド配列の少なくとも一部を有する、複数のＲＮアーゼＰ  ＲＮＡである。好ましくは、該複数のＲＮアーゼＰ  ＲＮＡは、標的ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡのいずれかのウインドウ領域に少なくとも６０％相同性である少なくとも１つの部分を含む。より好ましくは、この相同性は少なくとも７０％である。さらに好ましくは、この相同性は少なくとも８０％である。最も好ましくは、この相同性は少なくとも９０％又は９５％である。例えば、該ウインドウサイズ、即ち、該複数の配列が比較される、標的ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡの部分は、約８〜約２０連続ヌクレオチド、好ましくは約１０〜約１５連続ヌクレオチド、最も好ましくは約１１〜約１２連続ヌクレオチドでありうる。したがって、該ウインドウサイズは、調節することができる。次に、異なる分類学的種からの複数のＲＮアーゼＰ  ＲＮＡを、標的ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡの各可能なウインドウに、好ましくは、該複数の配列の全ての部分が該標的ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡの該ウインドウに比較されるまで、比較する。標的ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡのいずれかのウインドウ配列に少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、又は最も好ましくは少なくとも９０％相同性である部分を有する、異なる分類学的種からの複数のＲＮアーゼＰ  ＲＮＡの配列は、可能な相同配列と見なされる。
【００２４】
配列類似性サーチは、手動で、又は当業者に知られた、幾つかの利用可能なコンピュータ・プログラムを用いて行なうことができる。好ましくは、当業者に利用可能で、知られた、Ｂｌａｓｔ及びＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム等が使用可能である。Ｂｌａｓｔは、ヌクレオチド及びタンパク質配列データベースの分析をサポートするように設計されたＮＣＢＩの配列類似性サーチ・ツールである。Ｂｌａｓｔは、例えば、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／でインターネットの世界的ウェブを介してアクセスすることができる。ＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅは、パブリックのドメイン・データベース又は任意のローカルに入手可能で、サーチ可能なデータベースのいずれかによって利用することができるＢｌａｓｔのローカル版を提供する。ＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｖ．９．０は、１００を超える相互関連ソフトウェア・プログラムを含有し、それらの編集、マッピング、比較及びアライニングによって配列の分析を可能にする、商業的に入手可能なソフトウェア・パッケージである。ＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅに包含される他のプログラムは、例えば、ＲＮＡ二次構造予測、核酸断片アセンブリ、及び進化的分析(evolutionary analysis)を促進するプログラムを包含する。さらに、非常に優れた遺伝子データベース（ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＰＩＲ及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ）がＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅと共に配布され、これらはデータベース・サーチング及び操作プログラムによって完全にアクセス可能である。ＧＣＧは、例えば、ｇｃｇ．ｃｏｍ．／でインターネットの世界的ウェブを介してアクセス可能である。Ｆｅｔｃｈは、ＧＣＧに利用可能なツールであり、これは受け入れ番号(accession number)に基づいて注釈付きＧｅｎＢａｎｋレコードを得ることができ、Ｅｎｔｒｅｚに類似する。他の配列類似性サーチは、ＰａｎｇｅａからのＧｅｎｅＷｏｒｌｄ及びＧｅｎｅＴｈｅｓａｕｒｕｓによって行なうことができる。ＧｅｎｅＷｏｒｌｄ２．５は、ポリヌクレオチド及びタンパク質配列の分析のための、自動化された、フレキシブルな高スループット・アプリケーションである。ＧｅｎｅＷｏｒｌｄは、配列の自動的分析及び注釈を可能にする。ＧＣＧと同様に、ＧｅｎｅＷｏｒｌｄは、相同性サーチング、遺伝子検出、多重配列アラインメント、二次構造予測、及びモチーフ同定のための幾つかのツールを組み込む。ＧｅｎｅＴｈｅｓａｕｒｕｓ１．０ＴＭは、多重ソースからの情報を与え、パブリック及びローカル・データに関するリレーショナル・データ・モデルを提供する、配列及び注釈データ・サブスクリプション・サービスである。
【００２５】
他の代替の配列類似性サーチは、例えば、ＢｌａｓｔＰａｒｓｅによって行なうことができる。ＢｌａｓｔＰａｒｓｅは、上記方策を自動化する、ＵＮＩＸ（登録商標）プラットフォーム上をランするＰＥＲＬスクリプトである。ＢｌａｓｔＰａｒｓｅは、問題の標的受入番号のリストを受け取って、全てのＧｅｎＢａｎｋフィールドを解析して、“タブ区切りの(tab-delimited)”テキストを形成する、これは、次に、フレキシビリティーを与える、より容易なサーチ及び分析のための“リレーショナル・データベース(relational database)”フォーマットに登録されることができる。最終結果は、容易に選別され、濾過され、照会されることができる、一連の完全に解析されたＧｅｎＢａｎｋレコード、並びに注釈−リレーショナル・データベースである。
【００２６】
配列類似性サーチング及びデータ操作を行なうことができる、他のツールキットは、同様にＮＣＢＩからのＳＥＡＬＳである。このツールセットは、パール及びＣで書き込まれ、これらの言語をサポートする任意のコンピュータ・プラットフォーム上をランすることができる。これは、例えば、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｗａｌｋｅｒ／ＳＥＡＬＳ／でインターネットの世界的ウェブにおいてダウンロードするために利用可能である。このツールキットは、Ｂｌａｓｔ２又はギャップド・ブラスト(gapped blast)へのアクセスを可能にする。これはまた、タックス−コレクター(tax-collector)と呼ばれるツールを包含し、このツールは、タックス−ブレイク(tax-break)と呼ばれるツールと共に、Ｂｌａｓｔ２の出力を解析して、存在する各種の照会配列(query sequence)に最も相同性である配列の識別子(identifier)を戻す。他の有用なツールは、ｆｅａｔｕｒｅ２ｆａｓｔａであり、これは入力配列から注釈に基づいて配列断片を抽出する。
【００２７】
好ましくは、配列類似性サーチにおいて上述したように、標的核酸に相同性を有する、異なる分類学的種からの複数のＲＮアーゼＰ  ＲＮＡを、その中に標的ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡのオーソログを見出すために、さらに線引きする(delineated)。オーソログは、配列類似性を有し、生物に関連して同様な機能を果たす、広く分岐した生物(widely divergent organisms)における２つの遺伝子を意味するように遺伝子分類において定義された用語である。これとは対照的に、パラログは、遺伝子重複によって生じるが、新たな機能を発達させ、アイソタイプとも呼ばれる、種内の遺伝子である。任意に、パラログ・サーチを行なうこともできる。オーソログ・サーチを行なうことによって、多様な生物からの相同配列の網羅的なリストが得られる。その後、これらの配列を分析して、オーソログであるための基準にフィットする最良の代表的配列を選択する。オーソログ・サーチは、例えば、Ｃｏｍｐａｒｅを含めた、当業者に入手可能なプログラムによって行なうことができる。好ましくは、オーソログ・サーチは、配列の各々に関する完全な、解析済みＧｅｎＢａｎｋ注釈にアクセスして行なわれる。現在、ＧｅｎＢａｎｋから得られるレコードは、“フラット−ファイル(flat-files)”であり、自動化分析に理想的に適するとは言えない。好ましくは、オーソログ・サーチをＱ−Ｃｏｍｐａｒｅプログラムを用いて行なう。Ｂｌａｓｔ  Ｒｅｓｕｌｔｓ−Ｒｅｌａｔｉｏｎデータベース及びＡｎｎｏｔａｔｉｏｎｓ−Ｒｅｌａｔｉｏｎａｌデータベースが、Ｑ−Ｃｏｍｐａｒｅプロトコールに用いられる、これによって、オーソログ配列のリストを得て、以下に述べる種間配列比較プログラムで比較する。
【００２８】
上記類似性サーチは、ｅ−スコアと呼ばれる、カットオフ値に基づいた結果を与える。ｅ−スコアは、ヌクレオチドの一定のウインドウ内での無作為の配列マッチ(random sequence match)の確率を表す。ｅ−スコアが低ければ低いほど、該マッチは良好である。
当業者はｅ−スコアを熟知している。ユーザーは、ストリンジェンシー又は上述したような、所望の相同性度に依存してｅ−値カットオフを定義する。本発明の一部の実施態様では、同定されるＲＮアーゼＰ  ＲＮＡの相同ヌクレオチド配列のいずれも、ヒトゲノムに存在しないことが好ましい。
【００２９】
本発明の別の実施態様では、オーソログ・データベースをサーチすることによって、必要な配列を得る。このようなデータベースの１つは、Ｈｏｖｅｒｇｅｎであり、これは、脊椎動物オーソログのキュレート済み・データベース(curated database)である。オーソログ・セットを、このデータベースから輸出して、そのまま用いることができる、又は上述したような、他の配列類似性サーチのためのシード(seeds)として用いることができる。例えば、無脊椎動物オーソログを見い出すために、さらなるサーチが望ましい可能性がある。Ｈｏｖｅｒｇｅｎは、例えば、ｐｂｉｌ．ｕｎｉｖ−ｌｙｏｎ１．ｆｒ／ｐｕｂ／ｈｏｖｅｒｇｅｎ／でファイル・トランスファー・プログラムとしてダウンロードすることができる。原核生物オーソログのデータベース、ＣＯＧＳは利用可能であり、例えば、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＣＯＧ／でインターネットの世界的ウェブを介して対話形式で用いることができる。
【００３０】
上記オーソログ又は仮想的転写体(virtual transcripts)を、配列類似性サーチ又はオーソログ・サーチのいずれかによって得た後に、異なる分類学的種からの複数のＲＮアーゼＰ  ＲＮＡ及び標的ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡの中に保存される少なくとも１つの配列領域を同定する。当業者に利用可能で、知られた、多くのコンピュータ・プログラムを用いて、種間配列比較を行なうことができる。当業者に利用可能で、知られたＣｏｍｐａｒｅを用いて、種間配列比較を行なうことが好ましい。Ｃｏｍｐａｒｅは、ウインドウ／ストリンジェンシー判断基準を用いて、配列のペアワイズ比較を可能にするＧＣＧツールである。Ｃｏｍｐａｒｅは、指定された性質のマッチが見い出される点を含有する出力ファイルを生じる。これらを、別のＧＣＧツール、ＤｏｔＰｌｏｔでプロットすることができる。
【００３１】
或いは、ＣｏｍｐａｒｅＯｖｅｒＷｉｎｓと組み合わせたＱ−Ｃｏｍｐａｒｅから得られるオーソログ配列を用いた種間配列比較によって、保存配列領域の同定を行なう。好ましくは、比較のための配列のリスト、即ち、Ｑ−Ｃｏｍｐａｒｅから得られるオーソログ配列をＣｏｍｐａｒｅＯｖｅｒＷｉｎｓアルゴリズム中に入力する。好ましくは、種間配列比較を、マスター標的配列のウインドウ上に照会配列をスライドさせるペアワイズ配列比較によって行なう。好ましくは、該ウインドウは約９〜約９９連続ヌクレオチドである。
【００３２】
標的ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡと、上述したように得られる複数のＲＮアーゼＰ  ＲＮＡのいずれかの照会配列との間の配列相同性は、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％又は９５％である。閾値を選択する最も好ましい方法は、５０％〜１００％の全ての閾値をコンピュータに自動的にトライさせて、ユーザーが提供した測定基準に基づいて閾値を選択することである。このような測定基準の１つは、ｎを通常３に設定する場合に、正確にｎヒット(hits)が戻されるように、閾値を選定することである。このプロセスを、上記複数のＲＮアーゼＰ  ＲＮＡのメンバーである照会核酸(query nucleic acid)上の全ての塩基がマスター標的配列上の全ての塩基に比較されるまで、繰り返す。得られるスコアリング・マトリックスを散布図としてプロットすることができる。一定位置におけるマッチ密度(match density)に基づいて、ドットが存在しないか、単離ドットが存在するか、又はラインのように見えるほど一緒に密接した、一組のドットが存在するかのいずれかが起こりうる。小さいとは言え、ラインの存在は、一次配列相同性を示唆する。分岐した種におけるＲＮアーゼＰ  ＲＮＡ内の配列保存は、二次構造を有する可能性もある、保存された調節要素(conserved regulatory elements)のインジケーターであるように思われる。種間配列比較の結果は、当業者に知られた、完全に自動化された方法で、ＭＳ  Ｅｘｃｅｌ及び視覚的基本ツールを用いて分析することができる。
【００３３】
ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡ標的のヌクレオチド配列と、異なる分類学的種からの複数のＲＮアーゼＰ  ＲＮＡのヌクレオチド配列との間に保存される少なくとも１つの領域を好ましくはオーソログによって同定した後に、該保存領域を分析して、それが二次構造を含有するか否かを決定する。同定された保存領域が二次構造を含有するか否かの決定は、当業者に知られた多くの手段によって行なうことができる。二次構造の決定は、好ましくは、自己相補性比較(self complementarity comparison)、アラインメント及び共分散分析、二次構造予測又はこれらの組み合わせによって行なわれる。
【００３４】
本発明の１実施態様では、アラインメント及び共分散分析によって、二次構造分析を行なう。アラインメント及び共分散分析のための多くのプロトコールが、当業者に知られている。好ましくは、アラインメントは、当業者に利用可能で、知られているＣｌｕｓｔａｌＷによって行なわれる。ＣｌｕｓｔａｌＷは、ＧＣＧの一部ではないが、既存のＧＣＧツールセットの延長として加えて、ローカル配列と共に用いることができる、多重配列アラインメントのためのツールである。ＣｌｕｓｔａｌＷは、例えば、ｄｏｔ．ｉｍｇｅｎ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕ：９３３１／ｍｕｌｔｉ−ａｌｉｇｎ／Ｏｐｔｉｏｎｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｈｔｍｌでインターネットの世界的ウェブを介してアクセスすることができる。ＣｌｕｓｔａｌＷはさらに、Thompson,et al., Nuc.Acids Res.,1994,22,4673-4680に記載されており、これはその全体で本明細書に援用される。これらのプロセスは、初期段階で同定された保存ＵＴＲ領域を自動的に用いるようにスクリプトすることができる。Ｓｅｑｅｄ、即ち、当業者に利用可能で、知られたＵＮＩＸ（登録商標）コマンド・ライン・インターフェイスは、大きい配列からの選択されたローカル領域の抽出を可能にする。多くの異なる種からの多重配列をクラスター化して、さらなる分析のためにアラインすることができる。
【００３５】
本発明の他の実施態様では、全ての可能なペアワイズＣｏｍｐａｒｅＯｖｅｒＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）比較の出力をコンパイルし、ＡｌｉｇｎＨｉｔｓと呼ばれるプログラム、即ち、当業者が再生することができるプログラムを用いて、基準配列に合わせてアラインする。このプログラムの１つの目的は、ペアワイズ比較で得られた全てのヒットを基準配列上の位置にマッピングすることである。ＣｏｍｐａｒｅＯｖｅｒＷｉｎｄｏｗ及びＡｌｉｇｎＨｉｔｓを組み合わせた、この方法は、如何なる他のアルゴリズムよりも、大きくローカルなアラインメント（２０〜１００塩基にわたる）を生じる。このローカル・アラインメントは、例えば共変動(covariation)又はＲｅｖＣｏｍｐのような、後に述べる構造検出ルーチン(structure finding routine)のために必要である。このアルゴリズムは、アラインされた配列のファスタファイル(fasta file)を書き込む。これを、ＣｏｍｐａｒｅＯｖｅｒＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）及びＡｌｉｇｎＨｉｔｓなしに、ＣｌｕｓｔａｌＷだけを用いることから区別することが重要である。
【００３６】
共変動は、コンセンサス二次構造予測のための一次構造情報の系統発生的分析を用いるプロセスである。共変動は、下記参考文献に記載されており、これらの文献の各々はそれらの全体で本明細書に援用される：Gutell et al., “Comparative Sequence Analysis Of Experiments Performed During Evolution”In Ribosomal RNA Group I Introns,Green,Ed.,Austin:Landes,1996; Gautheret et al.,Nuc.Acids Res.,1997,25,1559-1564; Gautheret et al., RNA,1995,I,807-814; Lodmell et al., Proc.Natl.Sci.USA,1995,92,10555-10559; Gautheret et al.,J.Mol.Biol.,1995,248,27-43; Gutell, Nuc.Acids Res.,1994,22,3502-3517; Gutell, Nuc.Acids Res.,1993,21,3055-3074; Gutell, Nuc.Acids Res.,1993,21,3051-3054; Woese,Proc.Natl.Sci.USA,1989,86,3119-3122; 及びWoese et al., Nuc.Acids Res.,1980,8,2275-2293,これらの各々はその全体で本明細書に援用される。好ましくは、共分散ソフトウェアを共分散分析のために用いる。好ましくは、共変動、即ち、配列アラインメントからのＲＮＡ構造の比較分析のためのプログラムセットを用いる。共変動は、コンセンサス二次構造予測のための一次配列情報の系統発生的分析を用いる。共変動は、例えば、ｍｂｉｏ．ｎｃｓｕ．ｅｄｕ／ＲＮａｓｅＰ／ｉｎｆｏ／ｐｒｏｇｒａｍｓ／ｐｒｏｇｒａｍｓ．ｈｔｍｌでインターネットの世界的ウェブを介して得ることができる。該プログラムのバージョンについての完全な説明は、刊行されている(Brown,J.W.1991, Phylogenetic analysis of RNA structure on the Macintosh computer. CABIOS 7:391-393)。現在のバージョンは、ｖ４．１であり、これは、標準共変動分析、代償性塩基−変化(compensatory base-changes)の同定、及び相互情報分析を含めた、ＲＮＡ配列アラインメントからの種々なタイプの共変動分析を実行することができる。該プログラムは文書で充分に立証されており、広範囲な実例ファイルを備えている。これは、独立型プログラムとして編集されており；これはＨｙｐｅｒｃａｒｄを必要としない（但し、非常に小さい“スタック(stack)”バージョンが包含される）。このプログラムは、任意のＭａｃｉｎｔｏｓｈ環境ランニングＭａｃＯＳ  ｖ７．１以上においてランする。高速プロセッサー装置(faster processor machines)（６８０４０又はＰｏｗｅｒＰＣ）が、相互情報分析又は大きい配列アラインメントの分析のために提案される。
【００３７】
本発明の他の実施態様では、二次構造分析を二次構造予測によって行う。熱力学的パラメータ及びエネルギー計算に基づいて、ＲＮＡ二次構造を予測するアルゴリズムが多く存在する。Ｍ−ｆｏｌｄ又はＲＮＡ構造２．５２のいずれかを用いて、二次構造予測を行なうことが好ましい。Ｍ−ｆｏｌｄは、例えば、ｉｂｃ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／−ｚｕｋｅｒ／ｍａ／ｆｏｒｍ２．ｃｇｉで世界的ウェブを介して、アクセスすることができる、又はローカル使用のためにはＵＮＩＸ（登録商標）プラットフォーム上をダウンロードすることができる。Ｍ−ｆｏｌｄは、ＧＣＧパッケージの一部としても入手可能である。ＲＮＡ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２．５２は、Ｍ−ｆｏｌｄアルゴリズムのウインドウズ・アダプテーションであり、例えば、１２８．１５１．１７６．７０／ＲＮＡｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．ｈｔｍｌでインターネットの世界的ウェブを介してアクセスすることができる。
【００３８】
本発明の他の実施態様では、自己相補的比較(self complementarity comparison)によって、二次構造分析を行う。好ましくは、自己相補的比較は、上述したＣｏｍｐａｒｅを用いて、行なう。より好ましくは、Ｃｏｍｐａｒｅを修飾して、対合マトリックスを拡大して、従来のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ  Ｇ−Ｃ／Ｃ−Ｇ又はＡ−Ｕ／Ｕ−Ａ対の他に、Ｇ−Ｕ又はＵ−Ｇ塩基対を占めるようにすることができる。このような修飾Ｃｏｍｐａｒｅプログラム（修飾Ｃｏｍｐａｒｅ）は、一定の配列内の全ての可能な塩基対合を予測することによって、開始する。上述したように、一連のオーソログの一次配列比較に基づいて、小さいが保存される領域が同定される。修飾されたＣｏｍｐａｒｅでは、これらの配列の各々が、それ自身の逆補体(its own reverse complement)に比較される。許容される塩基対合は、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ  Ａ−Ｕ、Ｇ−Ｃ対合及び非標準的(non-canonical)Ｇ−Ｕ対合を包含する。全ての利用可能なオーソログの、このような自己相補的プロットのオーバーレイと、各々における最大の反復パターンの選択は、最少数の可能な折り畳み立体配置を生じる。次に、これらのオーバーレイを、上記エネルギー考察によって制限されるものを含めた、付加的な制約と共に用いて、最も可能な二次構造を演繹することができる。
【００３９】
本発明の他の実施態様では、ＡｌｉｇｎＨｉｔｓの出力を、ＲｅｖＣｏｍｐと呼ばれるプログラムによって読み取る。このプログラムは、当業者によって再生することができる。このプログラムの目的の１つは、塩基対合ルール及びオーソログ進化(ortholog evolution)を用いて、ＲＮＡ二次構造を予測することである。ＲＮＡ二次構造は、一本鎖領域と、ステムと呼ばれる塩基対合領域とから構成される。進化によって保存される構造をサーチするので、オーソログ配列の一定のアラインメントに関する最も有望なステムは、最も多くの配列によって形成されうるステムである。可能なステム形成又は塩基対合ルールは、例えば、ＮＭＲなどの、他の手法によって決定されたステムの塩基対合統計(base pairing statistics)を分析することによって決定される。ＲｅｖＣｏｍｐの出力は、この構造を形成することができたオーソログ・セット・メンバー配列の割合(percentage)によってランクされる、可能な構造の分類リストである。このアプローチはパーセンテージ閾値(percentage threshold)アプローチを用いるため、ノイズ配列(noise sequences)には鈍感である。ノイズ配列は、実際のオーソログではないか、又はサーチされる構造の例を表さないとしても、高度な配列相同性のためにＡｌｉｇｎＨｉｔｓの出力に及ぶ配列のいずれかである配列である。非常に類似したアルゴリズムが、ＰＣｓ上をランするために、Ｖｉｓｕａｌ  ｂａｓｉｃ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ＶＢＡ）及びＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌを用いて実施されて、一定の配列セットに対する逆補体マトリックス・ビュー(reverse complement matrix view)を形成する。
【００４０】
上記二次構造分析の結果は、アラインメント及び共変動、自己相補的分析、例えばＭ−ｆｏｌｄ若しくはその他の形式を用いるような二次構造予測のいずれによって行なわれたとしても、標的ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡ及び異なる分類学的種からの複数のＲＮアーゼＰ  ＲＮＡの中の保存領域における二次構造の同定である。同定されうる具体的な二次構造は、非限定的に、バルジ、ループ、ステム、ヘアピン、ノット(knot)、トリプル・インターアクト(triple interacts)、クローバーリーフ(cloverleafs)、又はヘリックス、或いはこれらの組み合わせを包含する。或いは、新たな二次構造が同定される可能性がある。
【００４１】
本発明はまた、１６Ｓ  ｒＲＮＡ中に存在する分子相互作用部位を含む、例えばポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドのような、核酸分子に関する。核酸分子は、物質的な化合物自体、並びに同化合物のコンピュータ内(in silico)表現を包含する。したがって、核酸分子はＲＮアーゼＰ  ＲＮＡに由来する。分子相互作用部位は、この分子相互作用部位に結合するときに、細胞におけるＲＮアーゼＰ  ＲＮＡの発現をモジュレートする、少なくとも１つの分子のための結合部位として役立つ。ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、実施例においてさらに詳述する分子相互作用部位の二次構造を与えるように選択される。ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、好ましくは、上述した標的ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡのヌクレオチド配列である。或いは、該ヌクレオチド配列は、好ましくは、同様に分子相互作用部位を含有する、複数の異なる分類学的種からのＲＮアーゼＰ  ＲＮＡのヌクレオチド配列である。
【００４２】
本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡの分子相互作用部位を含む。したがって、本発明のポリヌクレオチドは、分子相互作用部位のヌクレオチド配列を含む。さらに、該ポリヌクレオチドは、各ポリヌクレオチドの５’又は３’末端又はこれらの組み合わせに、５０まで、より好ましくは４０まで、さらに好ましくは３０まで、さらに好ましくは２０まで、最も好ましくは１０までの付加的ヌクレオチドを含むことができる。したがって、例えば、分子相互作用部位が２５ヌクレオチドを含む場合に、ポリヌクレオチドは７５ヌクレオチドまでを含むことができる。分子相互作用部位に存在する以外のヌクレオチドは、分子相互作用部位の二次構造を維持するように選択される。当業者は、二次構造を保存するために、このような付加的なヌクレオチドを選択することができる。該ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ若しくはＤＮＡのいずれかを含むことができる、又はキメラＲＮＡ／ＤＮＡであることができる。該ポリヌクレオチドは、当業者に周知である、修飾塩基、糖及び主鎖を含むことができる。さらに、単一ポリヌクレオチドは、複数の分子相互作用部位を含むことができる。さらに、複数のポリヌクレオチドが、一緒に、単一分子相互作用部位を含むことができる。或いは、複数のポリヌクレオチドが一緒に分子相互作用部位を含む場合に、当業者はこれらのポリヌクレオチドを相互に結合させて、単一ポリヌクレオチドを形成することができる。
【００４３】
分子相互作用部位を含む、ポリヌクレオチドの部分は１つ以上の欠失、挿入及び置換を含むことができる。ステム、末端ループ、バルジ、内部ループ及びダングリング領域は、１つ以上の欠失、挿入及び置換を含むことができる。したがって、例えば、１０ヌクレオチドから成る分子相互作用部位の末端ループを、１つ以上の挿入、欠失又は置換を含有するように修飾して、末端ループに先行するステムを短縮又は伸長することができる。さらに、例えば、二本鎖領域に隣接する不対ダングリング・ヌクレオチドを欠失させることができる、又は他のヌクレオチドを加えて、塩基対合を形成して、ステムを伸長することができる。さらに、ステム内のヌクレオチド塩基対合も、置換、欠失又は挿入させることができる。したがって、例えば、分子相互作用部位のステム部分内のＡ−Ｕ塩基対をＧ−Ｃ塩基対と置換することができる。さらに、非標準的塩基対合（例えば、Ｇ−Ａ、Ｃ−Ｔ、Ｇ−Ｕ等）もポリヌクレオチド内に存在することができる。このように、例えば、以下の実施例に記載するような、分子相互作用部位と少なくとも７０％、より好ましくは８０％、さらに好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％、最も好ましくは９９％相同性を有するポリヌクレオチドが、本発明の範囲内に包含される。相同性パーセントは、例えば、Ｇａｐプログラム(Wisconsin Sequence Analysis Package,Version 8 for Unix（登録商標）,Genetics Computer Group,University Research Park,Madison WI)、によって、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム(Adv.Appl.Math.,1981,2,482-489,これはその全体で本明細書に援用される）を用いる規定の設定を用いて、決定することができる。
【００４４】
本発明はさらに、ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡ内に存在する、上述した、精密化及び単離済み核酸又はポリヌクレオチドに関する。分子相互作用部位を含むポリヌクレオチドは、分子相互作用部位を含むＲＮアーゼＰ  ＲＮＡの部分を模倣する。
【００４５】
ポリヌクレオチド及びそれらの修飾は、当業者に周知である。本発明のポリヌクレオチドは、例えば、分子相互作用部位と結合する自然発生分子を検出するためのリサーチ試薬として、用いることができる。或いは、以下に詳述するように、分子相互作用部位に結合する小分子を、現実的に又は仮想的に、スクリーニングするために、本発明のポリヌクレオチドを用いることができる。分子相互作用部位に結合するための化合物の仮想的形成とそれらのスクリーニングは、例えば、国際出願公開ＷＯ９９／５８９４７（これはその全体で本明細書に援用される）に記載されている。本発明のポリヌクレオチドは、リサーチ、診断及び治療的用途に関して、細胞内の自然発生分子相互作用部位と競合するデコイ(decoys)として用いることもできる。特に、該ポリヌクレオチドは、細菌増殖を阻害するための治療的用途に用いることができる。分子相互作用部位と結合する分子は、翻訳中のＲＮアーゼＰ  ＲＮＡの機能を、増強又は縮小のいずれかによって、モジュレートする。該ポリヌクレオチドはさらに、農業的、工業的及び他の用途にも使用可能である。
【００４６】
本発明はまた、上記ポリヌクレオチドを少なくとも１つ含む組成物にも関する。本発明の一部の実施態様では、１つの組成物中に２つのポリヌクレオチドを包含させる。本発明の組成物は、任意に、キャリヤーを含むことができる。“キャリヤー”は、動物に１つ以上の核酸をデリバリーするための、許容される溶媒、希釈剤、懸濁化剤又は任意の他の不活性ビヒクルであり、当業者に周知である。該キャリヤーは、製薬的に受容されるキャリヤーでありうる。該キャリヤーは液体又は固体であることができ、組成物の他の成分と一緒にしたときに、所望のバルク(bulk)、コンシステンシー等を与えるように、念頭において予定された投与方法によって選択される。典型的な製薬的キャリヤーは、非限定的に、結合剤（プレゼラチン化(pregelatined)トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース等）；充填剤（例えば、ラクトースと他の糖、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート又はリン酸水素カルシウム等）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属ステアリン酸塩、水素化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等）；崩壊剤（例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウム等）；又は湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム等）を包含する。
【００４７】
本発明はまた、ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡの分子相互作用部位に結合する化合物を同定する方法であって、分子相互作用部位の三次元構造の数値的表現を用意し、複数の有機化合物の三次元構造の数値的表現を含む化合物データセットを用意することを含む方法に関する。次に、分子相互作用部位の該数値的表現を該化合物データセットのメンバーと比較して、該有機化合物が、分子相互作用部位との物理的相互作用を生じる能力に従ってランクされる有機化合物の序列(hierarchy)を形成する。
【００４８】
本発明はまた、ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡ又はそれを含むポリヌクレオチドの分子相互作用部位に結合する化合物を同定する方法にも関する。本発明の一部の実施態様では、ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡ又はそれを含むポリヌクレオチドの分子相互作用部位に結合する化合物が、国際出願公開ＷＯ９９／５８９４７（これはその全体で本明細書に援用される）に記載された一般的方法に従って、同定される。簡単に説明すると、該方法は、分子相互作用部位又はそれを含むポリヌクレオチドの三次元構造の数値的表現を用意し、複数の有機化合物の三次元構造の数値的表現を含む化合物データセットを用意し、分子相互作用部位の該数値的表現を該化合物データセットのメンバーと比較して、該有機化合物が、該分子相互作用部位との物理的相互作用を生じる能力に従ってランクされる有機化合物の序列を形成することを含む。
【００４９】
分子相互作用部位と、例えば有機化合物のような、リガンドとの結合を特徴付けるには多くの方法があるが、国際出願公開ＷＯ９９／５８７１９、ＷＯ９９／５９０６１、ＷＯ９９／５８７２２、ＷＯ９９／４５１５０、ＷＯ９９／５８４７４及びＷＯ９９／５８９４７には方法論が記載されており、これらの各々は本発明の譲受人に譲渡され、これらの各々はその全体で本明細書に援用される。
【００５０】
さらに、本発明は、上述した、核酸分子及びそれを含む組成物の三次元表現にも関する。ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡの分子相互作用部位の三次元構造は、数値的表現として操作することができる。三次元表現、即ち、in silico（例えば、コンピュータ可読形での）表現は、例えば、国際出願公開ＷＯ９９／５８９４７（これはその全体で本明細書に援用される）に開示された方法で生成することができる。簡単に説明すると、好ましくはＲＮＡの分子相互作用部位の三次元構造は、数値的表現として操作することができる。行なわれる化学及び入手可能な反応ビルディング・ブロックに基づいて分子を設計する能力を当業者に与えるコンピュータ・ソフトウェアは、商業的に入手可能である。例えば、Ｓｙｂｙｌ／Ｂａｓｅ（Tripos,St.Louis,MO)、Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ（Molecular Simulations,San Diego,CA)、及びＳｃｕｌｐｔ（MDL Information Systems,San Leandro,CA)のような、ソフトウェア・パッケージが、構造のコンピュータによる生成手段を与える。これらのソフトウェア製品はまた、コンピュータによって生成した分子及びそれらの構造を評価し、比較するための方法を与える。分子相互作用部位のin silicoコレクションは、上記供給メーカーのいずれかからのソフトウェア及び入手可能である又は入手可能になる可能性がある他のソフトウェアを用いて、生成することができる。三次元表現を用いて、例えば、分子（単数又は複数）を可能な治療用化合物にドッキングすることができる。このように、三次元表現を薬物サーチング手段に用いることができる。したがって、本発明の、核酸分子及びそれを含む組成物は、同核酸分子の三次元表現を包含する。
【００５１】
ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡの分子相互作用部位に対する一連の構造制約は、例えば、酵素によるマッピング及び化学的プローブのような生化学的分析から、及び例えば共変動及び配列保存のようなゲノミクス情報から生じる可能性がある。例えばこれのような情報を用いて、特定の二次構造のステム及び他の領域において塩基対合を形成することができる。ループ及びバルジ領域における非標準的塩基対合スキームに関して、付加的な構造仮説が生じる可能性がある。Ｍｏｎｔｅ  Ｃａｒｌｏサーチ方法は、プログラム制約と調和するＲＮアーゼＰ  ＲＮＡの可能なコンホメーションをサンプリングして、三次元構造を作製することができる。
【００５２】
三次元のin silico表現の生成についてのレポートは、ライブラリー設計、発生、及びタンパク質標的に対するスクリーニングの見地から利用可能である。同様に、ＲＮＡモデル形成の分野における幾つかの試みが、文献に報告されている。しかし、ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡ構造の三次元、in silico表現を有する、有機分子、“小”分子、ポリヌクレオチド、又は他の核酸のin silico表現を照会するための構造に基づく設計アプローチの使用に関するレポートは存在しない。本発明は好ましくは、ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡ構造の三次元モデルの構成、複数の有機化合物、“小”分子、ポリマー化合物、ポリヌクレオチド及び他の核酸の三次元のin silico表現の構成、in silicoでのＲＮアーゼＰ  ＲＮＡ分子相互作用部位に対する、このようなin silico表現のスクリーニング、複数の化合物からの最良に可能な結合剤(binders)のスコアリングと同定、並びに最後に、コンビナトリアル形式でのこのような化合物の合成と、このようなＲＮアーゼＰ  ＲＮＡ標的のための新たなリガンドを同定するための該化合物の実験的試験を可能にするコンピュータ・ソフトウェアを用いる。
【００５３】
本発明の方法を用いてスクリーニングすることができる分子は、非限定的に、有機又は無機の、小分子量〜大分子量の個々の化合物と、リガンド、阻害剤、アゴニスト、アンタゴニスト、基質及び例えばペプチド又はポリヌクレオチドのようなバイオポリマーのコンビナトリアル混合物又はライブラリーを包含する。コンビナトリアル混合物は、非限定的に、化合物のコレクション及び化合物のライブラリーを包含する。これらの混合物は、混合物のコンビナトリアル合成によって、又は個々の化合物の混合によって生成することができる。化合物のコレクションは、非限定的に、個々の化合物セット又は混合物セット又は化合物プールを包含する。これらのコンビナトリアル・ライブラリーは、合成から、又は例えば微生物性、植物性、海洋性、ウイルス性及び動物性物質の天然ソースのような、天然ソースから得ることができる。コンビナトリアル・ライブラリーは、少なくとも約２０化合物、数千ほど多くの個々の化合物、及び恐らくは、さらに多くを包含する。コンビナトリアル・ライブラリーが化合物の混合物である場合には、これらの混合物は、典型的に２０〜５０００化合物、好ましくは５０〜１０００、より好ましくは５０〜１００化合物を含有する。１００〜５００化合物の組み合わせが、５００〜１０００の個々の種を有する混合物と同様に有用である。典型的に、コンビナトリアル・ライブラリーのメンバーは、約１０，０００Ｄａ未満、より好ましくは７，５００Ｄａ未満、最も好ましくは５０００Ｄａ未満の分子量を有する。
【００５４】
仮想的スクリーニングの分野での重要な進歩は、問題の受容体(a receptor of interest)に対する既知分子の相互作用を見い出して、同定するための構造に基づくデータベース・サーチを可能にする、ＤＯＣＫと呼ばれるソフトウェア・プログラムの開発であった(Kuntz et al.,ACC.Chem.Res.,1994,27,117; Geschwend and Kuntz, J.Compt.-Aided Mol.Des.,1996,10,123)。ＤＯＣＫは、それらの３Ｄ構造がin silicoで形成されているが、それらに関して受容体との相互作用についての先行知識が得られないような分子のスクリーニングを可能にする。それ故、ＤＯＣＫは、問題の受容体に対する新規なリガンドの発見を助成するツールを提供する。したがって、ＤＯＣＫは、本発明の方法によって調製された化合物を所望の標的にドッキングさせるために用いることができる。ＤＯＣＫの実施は、例えば、国際出願公開ＷＯ９９／５８９４７（これは、その全体で本明細書に援用される）に記載されている。
【００５５】
本発明の幾つかの実施態様では、例えば上述したような、自動化されたコンピュータによるサーチ・アルゴリズムを用いて、ユーザーによって指定された生化学的及びゲノム的制約と合致する、ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡからの許容される三次元分子相互作用部位構造の全てを予測する。これらの構造は、例えば、それらの二乗平均平方根偏差値に基づいて、異なるファミリーにクラスター化される。各ファミリーの代表的なメンバー（単数又は複数）に対して、明白な(explicit)溶媒及びカチオンでの分子動力学による、さらなる構造精密化(structural refinement)を行なうことができる。
【００５６】
これらのソフトウェア・プログラムによる構造列挙(structural enumeration)及び表現は、典型的に、ニ次元で分子骨格及び置換基を描くことによって、行なわれる。ひと度描いて、コンピュータに記憶させたならば、これらの分子を、商業的に入手可能なソフトウェア内に存在するアルゴリズムを用いて、三次元構造にすることができる。好ましくは、分子相互作用部位の三次元表現を作製するために、ＭＣ−ＳＹＭを用いる。分子相互作用部位の二次元構造を三次元モデルにすることは、典型的に、各分子の低エネルギー・コンホメーション又は低エネルギー・コンホーマー(conformers)のコレクションを生じる。これらの商業的に入手可能なプログラムの最終結果は、分子相互作用部位を含有するＲＮアーゼＰ  ＲＮＡ配列の、該分子相互作用部位の三次元構造の同様な数値的表現のファミリーへの変換である。これらの数値的表現は集合データセット(ensemble data set)を形成する。
【００５７】
複数の化合物、好ましくは“小”有機化合物の三次元構造は、これらの化合物の三次元構造の数値的表現を含む化合物データセットとして表示することができる。これに関連して、“小”分子とは、非オリゴマー有機化合物を意味する。化合物の二次元構造を、分子相互作用部位に関して上述したように、三次元構造に変換させて、該分子相互作用部位の三次元構造に対する照会(querying)に用いることができる。商業的に入手可能な構造表現アルゴリズム(structure rendering algorithm)を用いることによって、化合物の二次元構造を迅速に生成することができる。例えばポリヌクレオチド又は他の核酸構造のような、性質がポリマーである化合物の三次元表現は、上記文献方法を用いて生成することができる。“小”分子又は他の化合物の三次元構造を生成することができ、低エネルギー・コンホメーションを短い分子動力学最小化(short molecular dynamics minimization)から得ることができる。これらの三次元構造はリレーショナル・データベースに記憶させることができる。三次元構造が構成される化合物は、独自に開発されたもの(proprietary)であるか、商業的に入手可能であるか、又は仮想的であることができる。
【００５８】
本発明の一部の実施態様では、複数の有機化合物の三次元構造の数値的表現を含む化合物データセットは、例えば、商業的プログラムから改変されたコンピュータ・プログラムによって生成される二次元化合物ライブラリーから、例えば、Ｃｏｎｖｅｒｔｅｒ（MSI,San Diego)によって提供される。化学化合物の二次元構造を、上述したように、三次元構造に変換させることによって、他の適当なデータベースを構成することができる。最終結果は、有機化合物の二次元構造から、複数の有機化合物の三次元構造の数値的表現への変換である。これらの数値的表現は、化合物データセットとして提示される。
【００５９】
分子相互作用部位を含むポリヌクレオチドの三次元構造の数値的表現と、複数の有機化合物の三次元構造の数値的表現を含む化合物データセットの両方が得られた後に、分子相互作用部位の数値的表現を、該化合物データセットのメンバーと比較して、有機化合物の序列を形成する。この序列は、該有機化合物が分子相互作用部位と物理的相互作用を形成する能力に従ってランクされる。好ましくは、この比較は、化合物データセットのメンバーに対して逐次行なわれる。一部の実施態様によると、この比較を、分子相互作用部位を含む、複数のポリヌクレオチドによって同時に行なうことができる。
【００６０】
“小”分子又は有機化合物の、例えば核酸のような生物学的標的との相互作用を研究し、最適化するための、多様な理論的及びコンビナトリアル方法は当業者に知られている。これらの、構造に基づく薬物設計ツールは、タンパク質と小分子リガンドとの相互作用をモデル化し、これらの相互作用を最適化することに非常に有用であった。典型的に、この種類の研究は、タンパク質受容体の構造が、この受容体に対して１度に１つずつ、個々の小分子を照会する(querying)ことによって知られた場合に、行なわれている。通常、これらの小分子は、受容体と共結晶化されているか、又は共結晶化されている他の分子に関係付けられているか、又は該受容体とのそれらの相互作用に関して幾らかの一連の知識が存在する分子であるかのいずれかであった。上述したＤＯＣＫを用いて、分子相互作用部位を含むポリヌクレオチドに、したがって、問題のＲＮアーゼＰ  ＲＮＡに結合すると予想される分子を見い出して、同定することができる。ＤＯＣＫ４．０は、Regents of the University of Californiaから商業的に入手可能である。同等なプログラムも本発明に包含される。
【００６１】
ＤＯＣＫプログラムは、タンパク質標的と、それに結合するリガンドの同定に広く適用されている。典型的に、既知標的に結合する新しいクラスの分子が同定されており、後で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験で実証されている。ＤＯＣＫソフトウェア・プログラムは、ＳＰＨＧＥＮ(Kuntz et al., J.Mol.Biol.,1982,161,269)及びＣＨＥＭＧＲＩＤ(Meng et al., J.Comput.Chem.,1992,13,505,これらの各々は、その全体で本明細書に援用される）を包含する、幾つかのモジュールから成る。ＳＰＨＧＥＮは、標的受容体内の結合ポケットの溶媒アクセス可能な表面を表すオーバーラッピング・スフェア(overlapping spheres)のクラスターを形成する。各クラスターは、小分子の可能な結合部位を表す。ＣＨＥＭＧＲＩＤは、結合する分子と標的ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡとの相互作用のフォース・フィールド・スコアリング(force field scoring)のために必要な情報を予め算定して、グリッド・ファイル(grid file)に記憶させる。スコアリング機能は、分子力学相互作用エネルギーを概算するものであり、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａａｌｓ成分及び静電気成分から成る。ＤＯＣＫは、選択されたスフェア・クラスター(selected cluster of spheres)を用いて、ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡ上の標的部位にリガンド分子を配向させる(orient)。予め形成された三次元データベース内の各分子を該部位内での非常に多くの配向(in thousands of orientations)で試験して、各配向をスコアリング機能によって評価する。このようにスクリーニングされた各化合物に関して最良のスコアを有する配向のみを出力ファイル(output file)に記憶させる。最後に、データベースの全ての化合物をスコアの順の序列でランクし、次に、最良の候補のコレクションを実験的にスクリーニングすることができる。
【００６２】
ＤＯＣＫを用いて、多様なタンパク質標的に対する非常に多くのリガンドが同定されている。この分野における最近の試みは、例えばＲＮＡ二重らせんのような核酸に対して結合特異性を示す小分子リガンドを同定し、設計するためのＤＯＣＫの使用についてのレポートを生じている。ＲＮＡは、例えばＡＩＤＳ、ウイルス感染症及び細菌感染症のような、多くの疾患において重要な役割を果たしているが、特異的なＲＮＡ結合が可能な小分子に関しては殆ど研究がなされていない。ＲＮＡ二重らせんに対して、その深い主要な溝の特有のジオメトリー(geometry)に基づいて、特異性を有する化合物が、ＤＯＣＫ方法論を用いて同定された。Chen et al., Biochemistry,1997,36,11402;及びKuntz et al., ACC.Chem.Res.,1994,27,117. 最近、ＤＮＡ四重らせん(quadruplexes)におけるリガンド認識の問題へのＤＯＣＫ適用が報告されている。Chen et al., Proc.Natl.Acad.Sci.,1996,93,2635.
個々の化合物を、例えば、モルファイル(mol file)として表して、適当な化学構造プログラム又は同等なソフトウェアを用いて、in silico表現のコレクションに一緒にすることが好ましい。これらの二次元モルファイルは、輸出されて、例えば、上述したような、Ｃｏｎｖｅｒｔｅｒ(Molecular Simulations Inc.,San Diego)又は同等なソフトウェアのような商業的ソフトウェアを用いて、三次元構造に変換される。例えばＤＯＣＫ又はＱＸＰのようなドッキング・プログラムによる使用に適した原子種類は、例えば、Ｂａｂｅｌのようなソフトウェアを用いて又は同等なソフトウェアによって、三次元モルファイル中の全ての原子に割り当てられる(assigned to)。
【００６３】
各分子の低エネルギー・コンホメーションは、例えば、Ｄｉｓｃｏｖｅｒ(MSI,San Diego)のようなソフトウェアによって生成される。配向サーチ(orientation search)は、複数の化合物のうちの各化合物を、分子相互作用部位に多くの配向で、ＤＯＣＫ又はＱＸＰを用いて近接させることによって行なわれる。各配向に対する接触スコア(contact score)を決定して、その後に、該化合物の最適の配向を用いる。或いは、該化合物のコンホメーションを、予め決定された骨格(scaffold)の鋳型コンホメーションから決定することができる。
【００６４】
複数の化合物と分子相互作用部位との相互作用を、該分子相互作用部位の数値的表現を化合物データセットのメンバーと比較することによって、調べる。好ましくは、例えば、コンピュータ・プログラムによって又は他の方法で作製されたような、複数の化合物を分子相互作用部位と比較し、化合物のジヘドラル結合(dihedral bonds)間のランダムな“動き”を経験させる。好ましくは、約２０，０００〜１００，０００化合物を少なくとも１つの分子相互作用部位と比較する。典型的には、２０，０００化合物を約５分子相互作用部位と比較して、スコアをつける(scored)。三次元構造の個々のコンホメーションを標的部位に多くの配向で配置する。さらに、ＤＯＣＫプログラムの実行中に、化合物と分子相互作用部位とは、最適の水素結合、静電気及びｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａａｌｓ接触(contacts)が実現されうるように、“フレキシブル”であることが許される。相互作用のエネルギーを、化合物と分子相互作用部位との１０〜１５の可能な配向に関して、算出して、記憶させる。ＱＸＰ方法論は、リガンドと標的の両方における実際のフレキシビリティー(true flexibility)を可能にするので、現在好ましい。
【００６５】
各エネルギー寄与の相対的重み(relative weights)は絶えず更新されて、全ての化合物に関して算出された結合スコアが、実験的結合データを表すことを保証する。各配向に関する結合エネルギーは、水素結合、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａａｌｓ接触、静電気、溶媒和／脱溶媒和(desolvation)、及びフィットの質(quality of the fit)に基づいてスコアをつけられる。化合物と分子相互作用部位との間の低エネルギーｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａａｌｓ、二極性及び水素結合相互作用を測定して、合計する。一部の実施態様では、これらのパラメータを、経験的に得られた結果によって調整することができる。標的に対する各分子の結合エネルギーは、リレーショナル・データベースへの出力である。該リレーショナル・データベースは、化合物が分子相互作用部位と物理的相互作用を形成する能力に従ってランクされる化合物の序列を含有する。高くランクされた化合物は、分子相互作用部位との物理的相互作用をより良好に形成することができる。
【００６６】
他の実施態様では、最高のランクを有する、即ち、最良にフィットする化合物を合成のために選択する。本発明の一部の実施態様では、結合データに基づいて所望の結合特徴を有すると考えられるような化合物を合成のために選択する。好ましくは、最高ランキング５％が合成のために選択される。より好ましくは、最高ランキング１０％が合成のために選択される。さらにより好ましくは、最高ランキング２０％が合成のために選択される。選択された化合物の合成は、パラレル・アレイ・シンセサイザー(parallel array synthesizer)を用いて自動化することができる、又は液相若しくは固相方法及び機器を用いて調製することができる。さらに、高ランクされた化合物と、分子相互作用部位を含有する核酸との相互作用を以下に述べるように評価する。
【００６７】
高ランクされた有機化合物と、ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡ分子相互作用部位を含むポリヌクレオチドとの相互作用は、当業者に知られた非常に多くの方法によって評価することができる。例えば、最高ランキング化合物を、高スループット（ＨＴＳ）機能及び細胞スクリーンにおける活性に関して試験することができる。ＨＴＳアッセイは、シンチレーション・プロキシミティ(scintillation proximity)、沈降、蛍光に基づくフォーマット、濾過に基づくアッセイ、比色アッセイ(colorometry assay)等によって測定することができる。次に、リード化合物(lead compound)をスケールアップして、動物モデルで活性及び毒性に関して試験することができる。この評価は、好ましくは、ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡポリヌクレオチドと、少なくとも１種類の化合物との混合物の質量分析法又は機能バイオアッセイを含む。
【００６８】
質量分析(mass spectroscopy)を用いる、ある一定の評価法は、本発明によって用いるためのある種の有用な質量分析法の例示として、国際出願公開ＷＯ９９／４５１５０（これはその全体で本明細書に援用される）に開示される。しかし、本発明を実施するために、これらの特定の質量分析法を用いることが必須ではないことは、明確に理解すべきである。むしろ、如何なる評価方法も、本発明の目的が維持される限り、試みる(undertake)ことができる。
【００６９】
本発明の一部の実施態様では、ＤＯＣＫプログラム又はＱＸＰを用いて形成された序列から最高ランキング２０％の化合物を用いて、該序列における高ランキングの化合物に化学的に関連した化合物を含む有機化合物の三次元表現のさらなるデータセットを形成する。最良フィッティング(the best fitting)化合物は最高ランキング１％に含まれると思われるが、多様性（環サイズ、鎖長さ、官能基）を与えるために、第２比較に関して、約２０％までの付加的化合物が選択される。このプロセスは、分子相互作用部位中の小さいエラーが化合物同定プロセスにまで拡張しないことを保証する。例えば最高ランキング２０％から得られる構造／スコア・データを数学的に研究して（クラスター化して）、結合を強化する化合物内の傾向又は特徴を見い出す。化合物類を異なる、幾つかのグループにクラスター化する。上述した、化合物の化学的合成及びスクリーニングは、算定されたＤＯＣＫ又はＱＸＰスコアを実際の結合データと相関させることを可能にする。化合物を調製し、スクリーニングした後に、各化合物に関して、予測結合エネルギーと実測(observed)Ｋｄ値とを相関させる。
【００７０】
該結果を用いて、種々な要素（立体的、静電気的）を適当に比較検討する(weigh)予測スコアリング・スキームを開発する。上記方策(strategy)は、高ランクされる化合物に関して、異なる官能基の種々なサイズ及び形状を有する、多くの骨格の迅速な評価を可能にする。このやり方で、序列中で高いランクにある有機化合物に化学的に関連する化合物を含む有機化合物の表現の他のデータセットを、分子相互作用部位の数値的表現に比較して、有機化合物が分子相互作用部位との物理的相互作用を形成する能力に従ってランクされるさらなる序列を決定することができる。このやり方で、序列中で高くランクされる化合物に関連する化合物の三次元構造の表現のさらなるデータセットを得て、これを実際に、現実的結合を仮想的結合に相関させて、最適化している。序列において最高の化合物の所望の数が得られるまで、該全サイクルを必要に応じて反復させることができる。
【００７１】
標的バイオ分子、特に、標的ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡに対してアフィニティ及び特異性を有すると分かっている、又は標的ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡに結合して、それをモジュレートすることができることが判明している化合物を、本発明の一部の実施態様によって、検出可能な形式で、タグを付ける又は標識することができる。このような標識化方法(labeling)は、例えば、蛍光団、放射性標識、酵素標識及び多くの他の形式のような、当業者に知られた標識化形式の全てを包含することができる。このような標識化又はタグ化は、分子相互作用部位の検出を助長し、染色体の容易なマッピング及び他の有用なプロセスを可能にする。
【００７２】
本明細書に開示する本発明がさらに充分に理解されうるために、以下に実施例を提供する。これらの実施例が例示のためのみのものであり、如何なる意味でも本発明を限定するものと見なすべきではないことは、理解すべきである。本明細書に述べた他に、本発明の種々な修飾は、上記説明から当業者に明らかであろう。このような修飾も、特許請求の範囲内に入るように意図される。さらに、本明細書に引用され、記載された各特許、特許出願及び公開の開示は、それらの全体で本明細書に援用される。
【００７３】
実施例
実施例１：ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡの選択
小分子に対する分子相互作用部位を同定する方策を説明するために、ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡを用いた。該ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡの構造は、Massire et al.,J.Mol.Biol.,1998,279,773-793に開示される。該ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡは、幾つかのドメインに折り畳まれる約３７５〜４００ヌクレオチドのＲＮＡである。
【００７４】
実施例２：ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡ中の分子相互作用部位
ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡ内に非常に多くの分子相互作用部位が発見されている。部位１は第１及び第２ポリヌクレオチドを含む、ＲＮＡの領域を含む。第１ポリヌクレオチドは約２４ヌクレオチド〜約６９ヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドの部分は、下記特徴（５’〜３’）：約１ヌクレオチド〜約３ヌクレオチドを含むダングリング領域、約３ヌクレオチド〜約８ヌクレオチドを含む第１ステムの第１側、約３ヌクレオチド〜約８ヌクレオチドを含む第２ステムの第１側、約３ヌクレオチド〜約８ヌクレオチドを含む第１末端ループ、約３ヌクレオチド〜約８ヌクレオチドを含む第２ステムの第２側、約２ヌクレオチド〜約６ヌクレオチドを含む第３ステムの第１側、約２ヌクレオチド〜約６ヌクレオチドを含む第２末端ループ、約２ヌクレオチド〜約６ヌクレオチドを含む第３ステムの第２側、この第３ステムの第２側には約１ヌクレオチド〜約３ヌクレオチドを含むバルジが任意に存在する、約２ヌクレオチド〜約６ヌクレオチドを含む第４ステムの第１側、この第４ステムの第１側には約１ヌクレオチド〜約５ヌクレオチドを含むバルジが任意に存在する、及び約１ヌクレオチド〜約５ヌクレオチドを含むダングリング領域を有する二本鎖ＲＮＡを形成する。第２ポリヌクレオチドは、約８ヌクレオチド〜約２２ヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドの部分は、下記特徴（５’〜３’）：約３ヌクレオチド〜約８ヌクレオチドを含むダングリング領域、約２ヌクレオチド〜約６ヌクレオチドを含む第４ステムの第２側、及び約３ヌクレオチド〜約８ヌクレオチドを含む第１ステムの第２側を有する二本鎖ＲＮＡを形成する。
【００７５】
部位１に関して、第１ポリヌクレオチドは、好ましくは、４５ヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドの部分は、下記特徴（５’〜３’）：２ヌクレオチドを含むダングリング領域、５ヌクレオチドを含む第１ステムの第１側、５ヌクレオチドを含む第２ステムの第１側、５ヌクレオチドを含む第１末端ループ、５ヌクレオチドを含む第２ステムの第２側、４ヌクレオチドを含む第３ステムの第１側、４ヌクレオチドを含む第２末端ループ、４ヌクレオチドを含む第３ステムの第２側、この第３ステムの第２側の第３ヌクレオチドと第４ヌクレオチドとの間には１ヌクレオチドを含むバルジが存在する、４ヌクレオチドを含む第４ステムの第１側、この第４ステムの第１側の第２ヌクレオチドと第３ヌクレオチドとの間には３ヌクレオチドを含むバルジが存在する、及び３ヌクレオチドを含むダングリング領域を有する二本鎖ＲＮＡを形成する。好ましくは、第１ポリヌクレオチドは、配列：
【００７６】
【化１】
2005503148.tif 000002
【００７７】
（配列番号１）（太字ヌクレオチドは好ましい塩基対合(basepairing)を表示する）を含む。第２ポリヌクレオチドは、好ましくは、１４ヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドの部分は、下記特徴（５’〜３’）：５ヌクレオチドを含むダングリング領域、４ヌクレオチドを含む第４ステムの第２側、及び５ヌクレオチドを含む第１ステムの第２側を有する二本鎖ＲＮＡを形成する。好ましくは、第２ポリヌクレオチドは、配列：
【００７８】
【化２】
2005503148.tif 000003
【００７９】
（配列番号２）（太字ヌクレオチドは好ましい塩基対合を表示する）を含む。部位１は、図１に示すように、大腸菌(E.coli)中に存在する。
部位２は、第１、第２及び第３ポリヌクレオチドを含む、ＲＮＡの領域を含む。第１ポリヌクレオチドは、約６ヌクレオチド〜約１６ヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドの部分は、下記特徴（５’〜３’）：約１ヌクレオチド〜約３ヌクレオチドを含むダングリング領域、及び約４ヌクレオチド〜約１０ヌクレオチドを含む第１ステムの第１側、この第１ステムの第１側には約１ヌクレオチド〜約３ヌクレオチドを含むバルジが任意に存在する、を有する二本鎖ＲＮＡを形成する。第２ポリヌクレオチドは、約１３ヌクレオチド〜約３４ヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドの部分は下記特徴（５’〜３’）：約４ヌクレオチド〜約１０ヌクレオチドを含む第１ステムの第２側、この第１ステムの第２側には約１ヌクレオチド〜約３ヌクレオチドを含むバルジが任意に存在する、約４ヌクレオチド〜約１０ヌクレオチドを含むバルジ、約３ヌクレオチド〜約９ヌクレオチドを含む第２ステムの第１側、及び約１ヌクレオチド〜約２ヌクレオチドを含むダングリング領域を有する二本鎖ＲＮＡを形成する。第３ポリヌクレオチドは、約５ヌクレオチド〜約１３ヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドの部分は、下記特徴（５’〜３’）：約１ヌクレオチド〜約２ヌクレオチドを含むダングリング領域、約３ヌクレオチド〜約９ヌクレオチドを含む第２ステムの第２側、及び約１ヌクレオチド〜約２ヌクレオチドを含むダングリング領域を有する二本鎖ＲＮＡを形成する。
【００８０】
部位２に関して、第１ポリヌクレオチドは、好ましくは、１１ヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドの部分は、下記特徴（５’〜３’）：２ヌクレオチドを含むダングリング領域、及び７ヌクレオチドを含む第１ステムの第１側、この第１ステムの第１側の第５ヌクレオチドと第６ヌクレオチドとの間に２ヌクレオチドを含むバルジが存在する、を有する二本鎖ＲＮＡを形成する。好ましくは、該第１ポリヌクレオチドは、配列：
【００８１】
【化３】
2005503148.tif 000004
【００８２】
（配列番号３）（太字ヌクレオチドは好ましい塩基対合を表示する）を含む。第２ポリヌクレオチドは、好ましくは、２３ヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドの部分は、下記特徴（５’〜３’）：７ヌクレオチドを含む第１ステムの第２側、この第１ステムの第２側の第５ヌクレオチドと第６ヌクレオチドとの間には２ヌクレオチドを含むバルジが存在する、７ヌクレオチドを含むバルジ、６ヌクレオチドを含む第２ステムの第１側、及び１ヌクレオチドを含むダングリング領域を有する二本鎖ＲＮＡを形成する。好ましくは、第２ポリヌクレオチドは、配列：
【００８３】
【化４】
2005503148.tif 000005
【００８４】
（配列番号４）（太字ヌクレオチドは好ましい塩基対合を表示する）を含む。第３ポリヌクレオチドは、好ましくは、８ヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドの部分は、下記特徴（５’〜３’）：１ヌクレオチドを含むダングリング領域、６ヌクレオチドを含む第２ステムの第２側、及び１ヌクレオチドを含むダングリング領域を有する二本鎖ＲＮＡを形成する。好ましくは、第３ポリヌクレオチドは、配列：
【００８５】
【化５】
2005503148.tif 000006
【００８６】
（配列番号５）（太字ヌクレオチドは好ましい塩基対合を表示する）を含む。部位２は、図１に示すように、大腸菌(E.coli)中に存在する。
部位３は、第１及び第２ポリヌクレオチドを含むＲＮＡ領域を含む。第１ポリヌクレオチドは、約１０ヌクレオチド〜約２６ヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドの部分は、下記特徴（５’〜３’）：約１ヌクレオチド〜約３ヌクレオチドを含むダングリング領域、約２ヌクレオチド〜約６ヌクレオチドを含む第１ステムの第１側、約３ヌクレオチド〜約９ヌクレオチドを含む内部ループの第１側、約３ヌクレオチド〜約６ヌクレオチドを含む第２ステムの第１側、及び約１ヌクレオチド〜約２ヌクレオチドを含むダングリング領域を有する二本鎖ＲＮＡを形成する。第２ポリヌクレオチドは、約１０ヌクレオチド〜約２７ヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドの部分は、下記特徴（５’〜３’）：約３ヌクレオチド〜約９ヌクレオチドを含む第２ステムの第２側、約３ヌクレオチド〜約７ヌクレオチドを含む内部ループの第２側、約２ヌクレオチド〜約６ヌクレオチドを含む第１ステムの第２側、及び約２ヌクレオチド〜約５ヌクレオチドを含むダングリング領域を有する二本鎖ＲＮＡを形成する。
【００８７】
部位３に関して、第１ポリヌクレオチドは、好ましくは、１９ヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドの部分は、下記特徴（５’〜３’）：２ヌクレオチドを含むダングリング領域、４ヌクレオチドを含む第１ステムの第１側、６ヌクレオチドを含む内部ループの第１側、６ヌクレオチドを含む第２ステムの第１側、及び１ヌクレオチドを含むダングリング領域を有する二本鎖ＲＮＡを形成する。好ましくは、第１ポリヌクレオチドは、配列：
【００８８】
【化６】
2005503148.tif 000007
【００８９】
（配列番号６）（太字ヌクレオチドは好ましい塩基対合を表示する）を含む。第２ポリヌクレオチドは、好ましくは、１８ヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドの部分は、下記特徴（５’〜３’）：６ヌクレオチドを含む第２ステムの第２側、５ヌクレオチドを含む内部ループの第２側、４ヌクレオチドを含む第１ステムの第２側、及び３ヌクレオチドを含むダングリング領域を有する二本鎖ＲＮＡを形成する。好ましくは、第２ポリヌクレオチドは、配列：
【００９０】
【化７】
2005503148.tif 000008
【００９１】
（配列番号７）（太字ヌクレオチドは好ましい塩基対合を表示する）を含む。部位３は、図１に示すように、大腸菌(E.coli)中に存在する。
部位４は、約１２ヌクレオチド〜約３４ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含むＲＮＡ領域を含み、該ポリヌクレオチドの部分は、下記特徴（５’〜３’）：約３ヌクレオチド〜約９ヌクレオチドを含むステムの第１側、このステムの第１側には約２ヌクレオチド〜約５ヌクレオチドを含む内部ループの第１側が存在する、約２ヌクレオチド〜約６ヌクレオチドを含む末端ループ、約３ヌクレオチド〜約９ヌクレオチドを含む該ステムの第２側、このステムの第２側には約１ヌクレオチド〜約３ヌクレオチドを含む該内部ループの第２側が存在する、及び約１ヌクレオチド〜約２ヌクレオチドを含むダングリング領域を有する二本鎖ＲＮＡを形成する。
【００９２】
部位４に関して、ＲＮＡの領域は、好ましくは、２２ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドの部分は、下記特徴（５’〜３’）：６ヌクレオチドを含むステムの第１側、このステムの第１側の第３ヌクレオチドと第４ヌクレオチドとの間には３ヌクレオチドを含む内部ループの第１側が存在する、４ヌクレオチドを含む末端ループ、６ヌクレオチドを含む該ステムの第２側、このステムの第２側の第３ヌクレオチドと第４ヌクレオチドとの間には２ヌクレオチドを含む該内部ループの第２側が存在する、及び１ヌクレオチドを含むダングリング領域を有する二本鎖ＲＮＡを形成する。好ましくは、該ポリヌクレオチドは、配列：
【００９３】
【化８】
2005503148.tif 000009
【００９４】
（配列番号８）（太字ヌクレオチドは好ましい塩基対合を表示する）を含む。部位４は、図２に示すように、枯草菌(B subtilis)中に存在する。
部位５は、第１、第２、第３、第４及び第５ポリヌクレオチドを含むＲＮＡ領域を含む。第１ポリヌクレオチドは約３ヌクレオチド〜約９ヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドの部分は、下記特徴（５’〜３’）：約２ヌクレオチド〜約６ヌクレオチドを含む第１ステムの第１側、及び約１ヌクレオチド〜約３ヌクレオチドを含む第２ステムの第１側を有する二本鎖ＲＮＡを形成する。第２ポリヌクレオチドは、約３ヌクレオチド〜約８ヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドの部分は、下記特徴（５’〜３’）：約１ヌクレオチド〜約３ヌクレオチドを含む第２ステムの第２側、及び約２ヌクレオチド〜約５ヌクレオチドを含む第３ステムの第１側を有する二本鎖ＲＮＡを形成する。第３ポリヌクレオチドは、約７ヌクレオチド〜約１８ヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドの部分は、下記特徴（５’〜３’）：約２ヌクレオチド〜約５ヌクレオチドを含む第３ステムの第２側、この第３ステムの第２側には約１ヌクレオチド〜約２ヌクレオチドを含むバルジが任意に存在する、約１ヌクレオチド〜約３ヌクレオチドを含む第４ステムの第１側、約１ヌクレオチド〜約３ヌクレオチドを含むバルジ、及び約２ヌクレオチド〜約５ヌクレオチドを含む第５ステムの第１側を有する二本鎖ＲＮＡを形成する。第４ポリヌクレオチドは約８ヌクレオチド〜約２０ヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドの部分は、下記特徴（５’〜３’）：約２ヌクレオチド〜約５ヌクレオチドを含む第５ステムの第２側、約３ヌクレオチド〜約７ヌクレオチドを含むバルジ、約１ヌクレオチド〜約３ヌクレオチドを含む第６ステムの第１側、及び約２ヌクレオチド〜約５ヌクレオチドを含むダングリング領域を有する二本鎖ＲＮＡを形成する。第５ポリヌクレオチドは、約５ヌクレオチド〜約１５ヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドの部分は、下記特徴（５’〜３’）：約１ヌクレオチド〜約３ヌクレオチドを含むダングリング領域、約１ヌクレオチド〜約３ヌクレオチドを含む第６ステムの第２側、約１ヌクレオチド〜約３ヌクレオチドを含む第４ステムの第２側、及び約２ヌクレオチド〜約６ヌクレオチドを含む第１ステムの第２側を有する二本鎖ＲＮＡを形成する。
【００９５】
部位５に関して、第１ポリヌクレオチドは、好ましくは、６ヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドの部分は、下記特徴（５’〜３’）：４ヌクレオチドを含む第１ステムの第１側、及び２ヌクレオチドを含む第２ステムの第１側を有する二本鎖ＲＮＡを形成する。好ましくは、第１ポリヌクレオチドは、配列：
【００９６】
【化９】
2005503148.tif 000010
【００９７】
（太字ヌクレオチドは好ましい塩基対合を表示する）を含む。第２ポリヌクレオチドは、好ましくは、５ヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドの部分は、下記特徴（５’〜３’）：２ヌクレオチドを含む第２ステムの第２側、及び３ヌクレオチドを含む第３ステムの第１側を有する二本鎖ＲＮＡを形成する。好ましくは、第２ポリヌクレオチドは、配列：
【００９８】
【化１０】
2005503148.tif 000011
【００９９】
（太字ヌクレオチドは好ましい塩基対合を表示する）を含む。第３ポリヌクレオチドは、好ましくは、１０ヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドの部分は、下記特徴（５’〜３’）：３ヌクレオチドを含む第３ステムの第２側、この第３ステムの第２側の第２ヌクレオチドと第３ヌクレオチドとの間には１ヌクレオチドを含むバルジが存在する、２ヌクレオチドを含む第４ステムの第１側、１ヌクレオチドを含むバルジ、及び３ヌクレオチドを含む第５ステムの第１側を有する二本鎖ＲＮＡを形成する。好ましくは、第３ポリヌクレオチドは、配列：
【０１００】
【化１１】
2005503148.tif 000012
【０１０１】
（配列番号９）（太字ヌクレオチドは好ましい塩基対合を表示する）を含む。第４ポリヌクレオチドは、好ましくは、１３ヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドの部分は、下記特徴（５’〜３’）：３ヌクレオチドを含む第５ステムの第２側、５ヌクレオチドを含むバルジ、２ヌクレオチドを含む第６ステムの第１側、及び３ヌクレオチドを含むダングリング領域を有する二本鎖ＲＮＡを形成する。好ましくは、第４ポリヌクレオチドは、配列：
【０１０２】
【化１２】
2005503148.tif 000013
【０１０３】
（配列番号１０）（太字ヌクレオチドは好ましい塩基対合を表示する）を含む。第５ポリヌクレオチドは、好ましくは、１０ヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドの部分は、下記特徴（５’〜３’）：２ヌクレオチドを含むダングリング領域、２ヌクレオチドを含む第６ステムの第２側、２ヌクレオチドを含む第４ステムの第２側、及び４ヌクレオチドを含む第１ステムの第２側を有する二本鎖ＲＮＡを形成する。好ましくは、第５ポリヌクレオチドは、配列：
【０１０４】
【化１３】
2005503148.tif 000014
【０１０５】
（配列番号１１）（太字ヌクレオチドは好ましい塩基対合を表示する）を含む。部位５は、図２に示すように、枯草菌(B.subtilis)中に存在する。
部位６は、約１３ヌクレオチド〜約３４ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含むＲＮＡ領域を含み、該ポリヌクレオチドの部分は、下記特徴（５’〜３’）：約２ヌクレオチド〜約５ヌクレオチドを含むダングリング領域、約２ヌクレオチド〜約５ヌクレオチドを含むステムの第１側、約６ヌクレオチド〜約１６ヌクレオチドを含む末端ループ、約２ヌクレオチド〜約５ヌクレオチドを含む該ステムの第２側、及び約１ヌクレオチド〜約３ヌクレオチドを含むダングリング領域を有する二本鎖ＲＮＡを形成する。
【０１０６】
部位６に関して、ＲＮＡの領域は、好ましくは、２２ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドの部分は、下記特徴（５’〜３’）：３ヌクレオチドを含むダングリング領域、３ヌクレオチドを含むステムの第１側、１１ヌクレオチドを含む末端ループ、３ヌクレオチドを含む該ステムの第２側、及び２ヌクレオチドを含むダングリング領域を有する二本鎖ＲＮＡを形成する。好ましくは、該ポリヌクレオチドは、配列：
【０１０７】
【化１４】
2005503148.tif 000015
【０１０８】
（配列番号１２）（太字ヌクレオチドは好ましい塩基対合を表示する）を含む。部位６は図２に示すように、枯草菌(B.subtilis)中に存在する。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】図１は、部位１、２及び３を示す大腸菌(E.coli)ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡの代表的構造を示す。
【図１Ａ】図１Ａは、部位１、２及び３を示す大腸菌(E.coli)ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡの代表的構造を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、部位１、２及び３を示す大腸菌(E.coli)ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡの代表的構造を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、部位１、２及び３を示す大腸菌(E.coli)ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡの代表的構造を示す。
【図２】図２は、部位４、５及び６を示す枯草菌(B.subtilis)ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡの代表的構造を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、部位４、５及び６を示す枯草菌(B.subtilis)ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡの代表的構造を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、部位４、５及び６を示す枯草菌(B.subtilis)ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡの代表的構造を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、部位４、５及び６を示す枯草菌(B.subtilis)ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡの代表的構造を示す。
【国際公開パンフレット】
2005503148.tif 000016
2005503148.tif 000017
2005503148.tif 000018
2005503148.tif 000019
2005503148.tif 000020
2005503148.tif 000021
2005503148.tif 000022
2005503148.tif 000023
2005503148.tif 000024
2005503148.tif 000025
2005503148.tif 000026
2005503148.tif 000027
2005503148.tif 000028
2005503148.tif 000029
2005503148.tif 000030
2005503148.tif 000031
2005503148.tif 000032
2005503148.tif 000033
2005503148.tif 000034
2005503148.tif 000035
2005503148.tif 000036
2005503148.tif 000037
2005503148.tif 000038
2005503148.tif 000039
2005503148.tif 000040
2005503148.tif 000041
2005503148.tif 000042
2005503148.tif 000043
2005503148.tif 000044
2005503148.tif 000045
2005503148.tif 000046
2005503148.tif 000047
2005503148.tif 000048
2005503148.tif 000049
2005503148.tif 000050
2005503148.tif 000051
2005503148.tif 000052
2005503148.tif 000053
2005503148.tif 000054
2005503148.tif 000055
2005503148.tif 000056
2005503148.tif 000057
2005503148.tif 000058
2005503148.tif 000059
2005503148.tif 000060
2005503148.tif 000061
2005503148.tif 000062
2005503148.tif 000063
2005503148.tif 000064
2005503148.tif 000065
2005503148.tif 000066
2005503148.tif 000067
2005503148.tif 000068
2005503148.tif 000069
2005503148.tif 000070
2005503148.tif 000071
2005503148.tif 000072
2005503148.tif 000073
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005503148.tif 000074
【国際調査報告】
2005503148.tif 000075