(57)【要約】DNAサンプル中のシトシンのメチル化を検出する方法を提供する。該方法は、以下の工程を含む。ａ）メチル化シトシン塩基と非メチル化シトシン塩基を区別することができる方法で、ゲノムDNAサンプルを処理する；ｂ）前処理したDNAを、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマー、ポリメラーゼ及び少なくとも１つが第一のタイプの標識で標識されたヌクレオチドのセットを用いて増幅する；ｃ）配列特異的オリゴヌクレオチド又はオリゴマープローブを該増幅産物にハイブリダイズさせ、その結果、第二のタイプの標識で標識された該オリゴヌクレオチド又はオリゴマープローブが、該増幅産物に組み込まれた標識ヌクレオチドの１つに近接して結合した場合にFRETが起こる；ｄ）サンプルのメチル化の程度を、上記第一及び第二のタイプの標識間の相互作用の程度により決定する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、DNAサンプル中のシトシンのメチル化を検出する方法。
ａ）メチル化シトシン塩基と非メチル化シトシン塩基を区別することができる方法で、ゲノムDNAサンプルを処理する；
ｂ）前処理したDNAを、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマー、ポリメラーゼ及び少なくとも１つが第一のタイプの標識で標識されたヌクレオチドのセットを用いて増幅する；
ｃ）配列特異的オリゴヌクレオチド又はオリゴマープローブを該増幅産物にハイブリダイズさせ、その結果、第二のタイプの標識で標識された該オリゴヌクレオチド又はオリゴマープローブが、該増幅産物に組み込まれた標識ヌクレオチドの１つに近接して結合した場合にFRETが起こる；
ｄ）サンプルのメチル化の程度を、上記第一及び第二のタイプの標識間の相互作用の程度により決定する。
【請求項２】
第一のタイプの標識は、ドナーフルオロフォアであり、第二のタイプの標識は、アクセプターフルオロフォアであり、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）の程度が測定されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
第一のタイプの標識は、アクセプターフルオロフォアであり、第二のタイプの標識は、ドナーフルオロフォアであり、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）の程度が測定されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
ｂ）工程のヌクレオチドが蛍光成分を含み、ｃ）工程のプローブがクエンチャー成分を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
ｂ）工程のヌクレオチドがクエンチャー成分を含み、ｃ）工程のプローブが蛍光成分を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
プローブの分解を避けるために、ポリメラーゼが、５’→３’ エキソヌクレアーゼ活性をもたないことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
増幅反応の間、蛍光強度の変化をリアルタイムでモニターすることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】
蛍光強度の変化を、ターゲット増幅のエンドポイントで、モニターすることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】
増幅反応をポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で行うことを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
プローブが１つだけのCpGを含むことを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
プローブが複数のCpGを含むことを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
各CpGに対する各プローブが蛍光標識を有することを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
プローブの末端を標識するか、又は内部を標識することを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
PCRの引き続いて起こるラウンドの間における蛍光強度の変化によって、メチル化の情報を決定することを特徴とする請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
サンプルDNAの特異的部位に、確実なメチル化状態が存在する場合には、選択したPCRプライマーによって、サンプルDNAを増幅することを特徴とする請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
サンプルDNAの特異的部位に、確実なメチル化状態が存在していた場合には、選択したPCRプライマーによって、サンプルDNAを増幅し、その配列コンテキストが、PCR反応において付加的に使用する１又はそれ以上のオリゴヌクレオチドあるいはPNAオリゴマーと実質的に相補的であることを特徴とする請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
プローブの３’末端からの増幅が、リン酸化によってブロックされることを特徴とする請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
付加的なデータを収集するため、PCRの最後に融解曲線を作成することを特徴とする請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
蛍光成分は、フルオレセイン色素、ローダミン色素又はシアニン色素であることを特徴とする請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
クエンチャー成分が、ローダミン色素であることを特徴とする請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
重亜硫酸塩試薬でDNAの脱アミノ反応処理を行うことを特徴とする請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
脱アミノ反応処理に先だって、制限エンドヌクレアーゼを用いてDNAサンプルを切断することを特徴とする請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
DNAサンプルが、ほ乳動物に由来するもの、例えば、細胞系、血液、唾液、糞便、尿、脳脊髄液、パラフィンに埋め込まれた組織、例えば、視覚組織、腸、腎臓、脳、心臓、前立腺、肺、胸あるいは肝臓、組織学的なスライド、及び全ての可能な組合せから単離したものであることを特徴とする請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれかに記載の方法において、ゲノムDNAのメチル化状態を検出するための前処理した該ゲノムDNAの使用。
【請求項２５】
ゲノムDNAのシトシン塩基を選択的脱アミノ反応するための試薬、増幅工程のための１又はそれ以上のプライマー及び標識ヌクレオチド、検出可能なプローブ及び、選択的に、上記請求項１〜２３のいずれかに記載の方法のためのプロトコールあるいは指示書を含む、ゲノムDNAサンプル中のシトシン塩基のメチル化を検出するための診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の解析、特に、ゲノムDNAの重亜硫酸塩処理後のメチル化部位を特徴とする核酸の検出方法を提供することによるゲノムDNAのメチル化パターンの解析に関する。本方法は、標識の組み込み及び増幅されたDNAサンプルの蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）の検出を利用する。
【背景技術】
【０００２】
DNAのメチル化
分子生物学において、近年研究されている観察のレベルは、遺伝子、それら遺伝子のRNAへの翻訳、及びRNAのタンパク質への転写に集中している。遺伝子コントロールに関連した調節機構の一層限定的な解析がなされている。遺伝子調節、例えば、個体の発達のどの過程において、遺伝子が活性化又は阻害化されるか、及びこの調節の組織特異的な性質は、あまり解明されていない。しかしながら、そのことは、ある程度まで、高い程度の確率と遺伝子又はゲノムのメチル化の特性に関連付けることができる。この観察から、病原性の遺伝子疾患は、不規則な遺伝子のメチル化パターンから検出しうると推測することは論理的である。
【０００３】
ヒトゲノムプロジェクトの努力は、ヒトゲノムのシーケンシングに集中している。これは疾患の治療に対して、相当の治療上及び診断上の恩恵をもたらすと考えられている。しかしながら、これらの努力は、現在に至るまで、遺伝病の重大な一面であるエピジェネティックな要因を説明することはできない。遺伝子転写のエピジェネティックな調節は、多くの病気に影響することが示されている。現在までに確認されている最も重要なエピジェネティック機構の１つは、シトシンのメチル化である。５位でのシトシンのメチル化は、ゲノムDNAの唯一知られている修飾である。DNAのメチル化がDNAの転写に影響を及ぼす正確なメカニズムは不明であるが、疾患とメチル化の関係は、数多く報告されている。特にゲノムの調節領域内にあるCpG島のメチル化パターンは、非常に組織特異的であるように思われる。したがって、遺伝子の誤調節は、そのメチル化パターンと表現型的に‘正常な’パターンとを対比することによって予見しうるということが理解できる。
【０００４】
−Head and neck cancer (Sanchez-Cespedes Mら 、"Gene promoter hypermethylation in tumors and serum of head and neck cancer patients" Cancer Res.2000 Feb.15;60(4):892-5)
−Hodgkin's disease (Garcia JFら、 "Loss of p16 protein expression associated with methylation of the p16INK4A gene is a frequant finding in Hodgkin's disease"Lab invest 1999 Dec;79(12):1453-9)
−Gastric cancer (Yanagisawa Yら、 "methylation of the hMLH1 promoter in familial gastric cancer with microsatellite instability"Int J Cancer 2000 Jan 1;85(1):50-3)
−Prader-Willi/Angelman's syndrome(Zeschnighら、 "Imprinted segments in the human genome: different DNA methylation patterns in the Prader-Willi/Angelman's syndrome region as determined by the genomic sequencing method"Human
Mol.Genetics(1997)(6)3pp387-395) 
−ICF syndrome (Tuck-Mullerら、 "CMDNA hypomethylation and unusual chromosome instability in cell lines from ICF syndrome patients"Cytogenet Call Genet 2000;89(1-2):121-8 
−Dermatofibroma (Chen TCら、 "Dermatofibroma is a clonal proliferative disease"J Cutan Pathol 2000 Jan;27(1):36-9)
−Hypertention (Lee SDら 、"Monoclonal endothelial cell proliferation is present in primary but not secondary pulmonary hypertention"J clin Invest 1998 Mar1,101(5):927-34)
−Autism(Klauck SMら 、"Molecular genetic analysis of the FMR-1 gene in a large collection of autistic patients"Human Genet 1997 Aug;100(2):224-9)
−Fragile X Syndrome(Hornstra IKら、 "High resolution methylation analysis of the FMR1 gene trinucleotide repeat region in fragile X syndrome"Hum Mol Genet 1993 Oct,2(10):1659-65)
−Huntigton's disease(Ferluga Jら、 "possible organ and age related epigenetic factors in Huntigton's disease and colorectal carcinoma"Med hyptheses 1989 May;29(1);51-4
【０００５】
上記した全ての文献は、ここに参考文献として組み入れる。
【０００６】
重亜硫酸塩処理
比較的新しく、また、最近最もよく使用される、DNAの５−メチルシトシンの解析方法は、重亜硫酸塩(bisulfite)とシトシンとの特異的反応に基づいている。このシトシンは、続くアルカリ加水分解により、塩基対挙動の点で、チミジンに相当するウラシルに変換される。しかしながら、５−メチルシトシンは、これらの条件下において、修飾されず、そのままである。結果的に、ハイブリダイゼーション挙動の点では、本来シトシンと区別できないメチルシトシンが、例えば、増幅及びハイブリダイゼーション又はシーケンシングといった“通常の”分子生物学的技術を用いて、唯一残存するシトシンとして検出することができるように、元のDNAは変換される。これらの技術の全ては、現在十分に利用しうる塩基の対合に基づいている。感受性の点から、公知技術としては、アガロースマトリックス中に分析されるDNAを包含し、これによりDNAの拡散及び再結合を防止し（重亜硫酸塩のみが、一重鎖DNAと反応する）、全ての沈降工程と精製工程を高速透析で置き換えた方法が挙げられる（Olek A、Oswald J、Walter J. A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res.1996 Dec 15;24(24):5064-6)。この方法を用いることによって、個々の細胞を解析することが可能であり、このことは、該方法の潜在的可能性を示している。しかしながら、現在、約3000塩基対までの長さの個々の領域のみが解析され、何千もの可能なメチル化の発生に対して、細胞全体を解析することは不可能である。また、この方法は、少量のサンプルから得られた非常に小さな断片を、信頼性をもって解析することができない。拡散保護にもかかわらず、それらはマトリックスを通じて失われる。
【０００７】
５−メチルシトシンを検出するための、更なる公知方法に関する概観は、以下のレビュー記事から収集することができる：Rein,T.,DePamphilis,M.L.,Zorbas,H.,Nucleic Acids Res.1998,26,2255。
【０００８】
現在に至るまで、ごく少数の例外（例えば、Zeschnigk M,Lich C,Buiting K,Doerfler W,Horsthemke B. A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman and Prader-Willi syndrome based on allelic methylation differences at the SNRPN locus.Eur J Hum Genet.1997 Mar-Apr;5(2):94-8）を除き、重亜硫酸塩の技術が研究において唯一使用されている。しかしながら、周知遺伝子の短く、特異的な断片は、重亜硫酸塩処理に続いて、常に増幅され、完全にシーケンスされるか（Olek A,Walter J.The preimplantation ontogeny of the H19 methylation imprint. Nat Genet.1997 Nov;17(3):275-6）、あるいは、プライマー伸長反応により（Gonzalgo ML, Jones PA. Rapid quantitation of methylation differences at specific sites using methylation-sensitive single nucleotide primer extension(Ms-SNuPE). Nucleic Acids Res.1997 Jun 15;25(12):2529-31, WO Patent 9500669）、あるいは、酵素分解により（Xiong Z, Laird PW. COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay. Nucleic Acids Res.1997 Jun 15;25(12):2532-4）、個々のシトシンの位置が検出される。さらに、ハイブリダイゼーションによる検出も開示されている（Olekら、WO 9928498）。 
【０００９】
個々の遺伝子において、メチル化を検出するための重亜硫酸塩技術の使用に関する更なる文献は、以下の通りである：Grigg G, Clark S. Sequencing 5-methylcytosine residues in genomic DNA. Bioessays. 1994 Jun;16(6):431-6,431; Zeschnigk M, Schmitz B, Dittrich B, Buiting K, Horsthemke B, Doerfler W. Imprinted segments in the human genome: different DNA methylation patterns in the Prader-Willi/Angelman syndrome region as determined by the genomic sequencing method. Hum Mol Genet. 1997 Mar;6(3):387-95; Feil R, Charlton J, Bird AP, Walter J, Reik W. Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing. Nucleic Acids Res. 1994 Feb 25;22(4):695-6; Martin V, Ribieras S, Song-Wang X, Rio MC, Dante R. Genomic sequencing indicates a correlation between DNA hypomethylation in the 5' region of the pS2 gene and its expression in human breast cancer cell lines. Gene. 1995 May 19;157(1-2):261-4; WO 9746705, WO9515373 and WO 45560.
【００１０】
蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）
蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）は、２つの分子間における相互作用であり、１つの分子（ドナー）の励起常態が、他の分子（アクセプター）にエネルギーを移動させる。ドナーの分子はフルオロフォアであり、一方、アクセプター分子は、そうであったり、そうでなかったりする。該エネルギー移動は、光子の放出なしに起こり、２つの該分子間の双極子相互作用に基づいている。FRETで最も一般的に使用される分子は、フルオレセイン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（TAMRA）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ROX）、４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（DABCYL）、及び５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（EDANS）である。
【００１１】
FRETの基礎的な条件としては、以下の事項が挙げられる。
−ドナー分子とアクセプター分子がきわめて近接していること（通例、10−100Å）、
−ドナー分子の放出スペクトルは、アクセプター分子の吸収スペクトルと重ならなければならない。ドナー分子とアクセプター分子の転移双極子配向は、大体平行でなければならない。
−エネルギー移動の程度は、２つの分子間の距離、及びドナーとアクセプターのスペクトル間の重なりに依存している。それは、以下の式で記載しうる：
kt (r) ＝  tD−１ ・ (R0／r)６
この式において、rはドナーとアクセプター間の距離、tDはエネルギー移動がないときのドナーの寿命、R0はフェルスター距離である。
エネルギー移動の有効性（１つのドナー−アクセプターのペアにとって）は、以下で与えられる。
Ｅ ＝ R06 ／（R06 ＋ r6）
【００１２】
フェルスター距離は、通例、30−60Åの範囲である。したがって、FRETは、微視的な距離を測定する非常に感受性の高い方法として使用しうる。この方法は、特に、分子生物学の領域内で有益であり、分子生物学において多くの面で使用されている。それは、細胞膜及びイムノアッセイだけでなく、タンパク質の構造、アセンブリー、分配、コンホーメーション及び相互作用の研究において使用されている。FRETは、核酸の解析においても、多くの面で使用されている。それには、核酸の構造及びコンホーメーションの解析、ハイブリダイゼーション、PCR、シーケンシング及びプライマー伸長アッセイが含まれる。
【００１３】
プローブ標識のもう１つのクラスとしては、蛍光クエンチャーが挙げられる。クエンチャーの放出スペクトルは、蛍光共鳴エネルギー移動“FRET”（Clegg（1992）Meth.Enzymol.,211：353-388）により、蛍光色素の蛍光が実質的に減少又は消失するように、蛍光色素と部分的に重なる。蛍光レポーター色素及びクエンチャーは、フルオロフォアからクエンチャーへのエネルギー移動が蛍光色素の蛍光の減少になることを可能とする立体配置で結合する。該レポーターは、化学反応、化学発光の産生、又は光吸収、蛍光の産生によって励起しうる発光化合物である。クエンチャーは、レポーターと相互作用して、その光発散を変えることができ、通常、レポーターの発散効率の減少となる。この消光現象の効率は、直接的に、レポーター分子とクエンチャー分子間の距離に相関する（Yaron(1979) Analytical Biochemistry, 95:228-35）。
【００１４】
ローダアミン色素に限定した特定のクエンチャーとしては、テトラメチル−６−カルボキシローダミン（TAMRA）あるいはテトラプロパノ−６−カルボキシローダミン（ROX）が挙げられる（Bergot、米国特許No.5,366,860）。
【００１５】
酵素的増幅
PCRは、例えば、米国特許番号4683195、4683202、及び4800159に記載されている一般的に使用される技術である。簡潔に言えば、アニーリングと、結果として生じる二重鎖分子の変性で得られる一重鎖核酸へのプライマーの伸長の反復サイクルによる核酸配列の増幅である。PCR（及びその変形法）は、多くの適用を有しており、大部分の形式の核酸解析及び操作に関与する主要技術の１つである。
【００１６】
重要な変形法は、Multiplex−PCRであり、２以上の特異的プライマーが使用され、１回の反応チャンバーで、多数の異なる特異的な増幅物が得られる。
ゲル電気泳動や標識プライマーであるオリゴヌクレオチド及びヌクレオシド三リン酸の使用のように、PCR産物を検出するために、一般的に使用するいくつかの方法がある。核酸解析を目的として、PCRにおいて、蛍光標識化したヌクレオチド及びオリゴマーを使用することも公知である。
【００１７】
PNA FRETプローブ
PNAは、平行又は逆平行のいずれかの配向で、ターゲットである相補物にハイブリダイズすることができる。しかしながら、逆平行の二本鎖（PNAのカルボキシ末端はDNAの５’末端に配置され、アミノ末端はDNAの３’−末端に配置される）は、通例、より安定している（Egholm (1993) Nature, 365:566-68）。PNAプローブは、ターゲットDNA配列と高い特異性とアフィニティーで結合することが知られている（Coull,米国特許No.6110676）。レポーター又はクエンチャー成分を用いた本発明のPNA FRETプローブの実施例は、PNAがターゲット配列と逆平行の配向で、アニーリングするように設計されている。
【００１８】
PNAは、自動シンセサイザーで、いかなる規模でも合成しうる。PNA FRETプローブは、多くの一般に使用される固体の支持層により合成が可能である。合成が完了した後は、PNAは支持層から分離し、精製し、分析、定量化される。蛍光標識PNAプローブは、ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、好ましい特性を示した（Hyldig-Nielsen,米国特許No.5985563）。
【００１９】
更なる増幅のためのゲノムDNAは、標準的な方法を用いて、細胞、組織あるいは他の試験サンプルのDNAから得ることができる。この標準的な方法は、Fritsch and Maniatis eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989．のような参考文献中に見出すことができる。
【００２０】
リアルタイムPCR
蛍光を用いたリアルタイムPCRモニタリングは、いくつかの形で記載されている。第一には、臭化エチジウムのような二重鎖DNAに特異的な蛍光色素の結合は、増加する蛍光との相関関係により、PCR産物の蓄積のモニタリングを可能にする。第二の検出方法であるポリメラーゼを介したエキソヌクレアーゼによる切断は、Taqのようなポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ活性を利用する。PCR産物に相補的であるが、PCRプライマーとは区別されるオリゴヌクレオチドプローブは、ドナー分子がアクセプター分子によって消光されるように、FRETペアで標識される。PCRによる増幅の間、５’エキソヌクレアーゼは、プローブを消化し、FRETペアを分離し、蛍光を増加させる。この技術の変形法は、核酸を使用し、例えば、ヘアピンコンホーメーションをとることにより、FRETペアは内部で消光されるものである。目的とする配列にハイブリダイゼーションすると、FRETペアは分離し、ドナー分子は蛍光を発する。この技術は、例えば、SNPの解析に使用することができる。
【００２１】
代替技術は、２種類のハイブリダイゼーションプローブの使用に基づくものであり、それぞれFRETペアで標識化される。適当な近さで、ターゲット配列に両方のプローブがハイブリダイゼーションすると、蛍光シグナルが発せられる。再度述べると、この技術は、SNPを目的として使用しうる。
【００２２】
このようなFRETを基礎とするPCR技術を使用する大きな長所は、閉じたチューブ反応で反応がモニターされ、ハイスループット及びミーディアムスループットでの使用及び汚染の可能性の低下に適していることである。
【発明の開示】
【００２３】
本発明は、DNAサンプル中のシトシンのメチル化を検出する方法を提供するものであり、以下の工程を含む。
ａ）メチル化シトシン塩基と非メチル化シトシン塩基を区別することができる方法で、ゲノムDNAサンプルを処理する；
ｂ）前処理したDNAを、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマー、ポリメラーゼ及び少なくとも１つが第一のタイプの標識で標識されたヌクレオチドのセットを用いて増幅する；
ｃ）配列特異的オリゴヌクレオチド又はオリゴマープローブを該増幅産物にハイブリダイズさせ、その結果、第二のタイプの標識で標識された該オリゴヌクレオチド又はオリゴマープローブが、該増幅産物に組み込まれた標識ヌクレオチドの１つに近接して結合した場合にFRETが起こる；
ｄ）サンプルのメチル化の程度を、上記第一及び第二のタイプの標識間の相互作用の程度により決定する。
【００２４】
本発明では、第一のタイプの標識は、ドナーフルオロフォアであり、第二のタイプの標識は、アクセプターフルオロフォアであり、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）の程度が測定されることが好ましい。さらに、第一のタイプの標識は、アクセプターフルオロフォアであり、第二のタイプの標識は、ドナーフルオロフォアであり、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）の程度が測定されることが好ましい。
【００２５】
本発明のさらに好ましい態様は、ｂ）工程のヌクレオチドが蛍光成分を含み、ｃ）工程のプローブがクエンチャー成分を含むという点で特徴付けられる。本発明では、また、ｂ）工程のヌクレオチドがクエンチャー成分を含み、ｃ）工程のプローブが蛍光成分を含むことも好ましい。
【００２６】
本発明では、プローブの分解を避けるために、上記ポリメラーゼが、５’→３’ エキソヌクレアーゼ活性をもたないことが好ましい。
【００２７】
さらに、本発明では、増幅反応の間、蛍光強度の変化をリアルタイムでモニターすることが好ましい。
【００２８】
また、本発明では、蛍光強度の変化を、ターゲット増幅のエンドポイントで、モニターすることが好ましい。
【００２９】
本発明の他の好ましい態様は、増幅反応をポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で行う。
【００３０】
本発明では、プローブが１つだけのCpGを含むか、又はプローブが複数のCpGを含むことが好ましい。特に、この場合、各CpGに対する各プローブが蛍光標識を有することがさらに好ましい。
【００３１】
本発明のさらに好ましい態様では、プローブの末端を標識するか、又は内部を標識することができる。
【００３２】
また、本発明の好ましい態様では、PCRの引き続いて起こるラウンドあるいはサイクルの間における蛍光強度の変化によって、メチル化の情報を決定する。
【００３３】
また、サンプルDNAの特異的部位に、確実なメチル化状態が存在する場合には、選択したPCRプライマーによって、サンプルDNAを増幅することが好ましい。
【００３４】
本発明では、サンプルDNAの特異的部位に、確実なメチル化状態が存在していた場合には、選択したPCRプライマーによって、サンプルDNAを増幅し、その配列コンテキストが、PCR反応において付加的に使用する１又はそれ以上のオリゴヌクレオチドあるいはPNAオリゴマーと実質的に相補的であることが好ましい。
【００３５】
プローブの３’末端からの増幅が、リン酸化によってブロックされることが好ましい。
【００３６】
本発明では、また、付加的なデータを収集するため、PCRの最後に融解曲線を作成することが好ましい。
【００３７】
本発明の範囲内において、蛍光成分は、フルオレセイン色素、ローダミン色素又はシアニン色素であることが特に好ましい。特にクエンチャー成分が、ローダミン色素であることも特に好ましい。
【００３８】
本発明で特に好ましいことは、重亜硫酸塩試薬でDNAの脱アミノ反応処理を行うことである。
【００３９】
本発明では、また、脱アミノ反応処理に先だって、制限エンドヌクレアーゼを用いてDNAサンプルを切断することが好ましい。
【００４０】
本発明方法の好ましい態様は、DNAサンプルが、ほ乳動物に由来するもの、例えば、細胞系、血液、唾液、糞便、尿、脳脊髄液、パラフィンに埋め込まれた組織、例えば、視覚組織、腸、腎臓、脳、心臓、前立腺、肺、胸あるいは肝臓、組織学的なスライド、及び全ての可能な組合せから単離したものである。
【００４１】
本発明の他の好ましい態様は、ゲノムDNAのメチル化状態を決定する本発明の方法において、前処理した該ゲノムDNAを使用する。
【００４２】
本発明の他の目的は、ゲノムDNAサンプル中のシトシン塩基のメチル化を検出するための診断キットを提供することであり、それには、ゲノムDNAのシトシン塩基を選択的脱アミノ反応するための試薬、増幅工程のための１又はそれ以上のプライマー及び標識ヌクレオチド、検出可能なプローブ及び、選択的に、上記請求項に係る方法のためのプロトコールあるいは指示書を含む。
【００４３】
本発明は、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を用いて、DNA断片の特異的CpGジヌクレオチドの存在を決定するための方法を記述する。この方法は、DNAサンプル断片の配列特性についての情報を得るために使用することができる。例えば、点突然変異の結果として、野生型に存在しないヌクレオチドが断片の配列に存在する場合、点突然変異を断片中に確認することができる。
【００４４】
本方法は、好ましくは、シトシンのメチル化を測定するために使用される。上述したように、重亜硫酸塩は、選択的なシトシンの脱アミノ反応を起こさせ、５−メチルシトシンは実質的に変えない。シトシンのメチル化は、ほどんど独占的に、配列構造５’−CG−３’で起こる。したがって、重亜硫酸塩処理後、Ｃを含むあるジヌクレオチドは、１つの鎖の中で、もう生じないが、重亜硫酸塩処理DNAの増幅、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の使用で形成された相補的鎖においては、まだ生じうる。
【００４５】
この発明は、非常に低いバックグラウンドシグナルで、非常に感度良く、定められた位置で、CpGのメチル化状態を視覚化するための方法を提供する。
【００４６】
本方法は、簡潔に言えば、以下の工程を含む。
ａ）ゲノムDNAサンプルを、メチル化シトシン塩基と非メチル化シトシン塩基を区別することができる方法で処理すること；
ｂ）前処理したDNAを、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマー、ポリメラーゼ及び少なくとも１つが第一のタイプの標識で標識されたヌクレオチドのセットを用いて増幅すること；
ｃ）配列特異的オリゴヌクレオチド又はオリゴマープローブを増幅産物にハイブリダイズすること、第二のタイプの標識で標識されたオリゴヌクレオチド又はオリゴマープローブが、増幅産物に組み込まれた標識ヌクレオチドの１つに近接して結合した場合に、FRETが起こる；
ｄ）サンプルのメチル化の程度を、上記第一と第二のタイプの標識間の相互作用の程度により決定すること。
【００４７】
本発明の好ましい態様は、第一のタイプの標識は、ドナーフルオロフォアであり、第二のタイプの標識は、アクセプターフルオロフォアであり、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）の程度が測定されることである。
【００４８】
さらに、本発明の好ましい態様は、上記第一のタイプの標識は、アクセプターフルオロフォアであり、第二のタイプの標識は、ドナーフルオロフォアであり、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）の程度が測定されることである。
【００４９】
増幅反応において、２又はそれ以上のCpGを別々に調べることが好ましい。
【００５０】
好ましくは、各CpGのための分離したプローブであって、それぞれが、それ自身の蛍光標識を有するプローブを使用する。
【００５１】
本発明は、また、multiplex PCRにおいて、最適なアッセイパラメータ及び、ターゲット解析物の定量的解析のために、速くて、原価効率が良く、そして正確なシステムを迅速に決定することを可能とする。多重的なアッセイ（multiplexed assay）は、例えば、サンプル移送及び調製のための通常のロボティックシステムを用いた、室温での標準的な96ウェルmicrotiterプレートフォーマットに設計することができる。
【００５２】
好ましくは、使用されるオリゴヌクレオチド又はオリゴマープローブは、ヌクレオ塩基類似体、２’−デオキシリボース類似体、インターヌクレオチド類似体、PNA又はLNAから選択される１又はそれ以上のヌクレオチド類似体を含む。
【００５３】
CpG配列の重亜硫酸塩処理の後、Ｃ又はＧヌクレオチド（相補鎖中）を検出することは好ましい適用であるが、他のあらゆるヌクレオチド又は多型もまた、原則的に検出することができる。
好ましい適用は、重亜硫酸塩処理したDNAの未変換のＣとそれにハイブリダイズした標識オリゴヌクレオチドとの間の相互作用の程度を決定することにより、確実なCpGの位置のメチル化状態を決定することである。したがって、相補鎖（PCR後）中のグアニンは、同様の目的に使用することができる。
【００５４】
また、重亜硫酸塩処理後の変換した位置は、この技術を使用して、選択した位置でチアミン（又は相補鎖中のアデニン）を検出することにより同定することができる。しかしながら、元のゲノム配列にあったＴと、それぞれのシトシンでのメチル化の欠如を示す、重亜硫酸塩で変換して生じたＴの位置を区別することは不可能であるため、プローブの設計は、より困難になる。
【００５５】
より詳しくは、DNAサンプルの特異的ヌクレオチドを検出する本方法は、単離されたゲノムＤＮＡサンプルを、メチル化と非メチル化シトシン塩基が区別できるように処理し、その前処理したDNAを、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマー、ポリメラーゼ及び少なくとも１つが第一のタイプの標識で標識された１セットのヌクレオチドを使用して増幅する点に特徴があり、第一のタイプの標識の第一の態様は、ドナーフルオロフォアであり、第二の態様は、アクセプターフルオロフォアである。
【００５６】
好ましくは、アクセプター及びドナー色素（フルオロフォア）は、ドナー色素の放射波長がアクセプター色素の励起波長と重なるように選択する。放射及び励起スペクトルは、シャープなピークであり、色素の放射スペクトルは重なりそうにないことが好ましい。
【００５７】
ポリメラーゼは、プローブの分解を避けるため、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性をもたないことが好ましい。
【００５８】
例えば、dGTPを蛍光色素で標識する。標識されたdGTPを、元のDNAサンプル中のメチル化シトシンのあった所にのみ取り込む。代わりに、dCTPを蛍光色素で標識することができる。
【００５９】
伸長フェーズの後、DNAを変性し、その後、再アニーリングすることが可能となる。
【００６０】
第二のタイプの標識で標識した配列特異的オリゴヌクレオチド又はオリゴマープローブ（DNA類似体のPNAが使用されるならば、オリゴマープローブと称する）は、増幅産物にハイブリダイズし、第二のタイプの標識についての第一の態様は、アクセプターフルオロフォアであり、第二の態様は、ドナーフルオロフォアである。好ましくは、プローブの３’末端からの増幅は、リン酸化（ジデスオキシヌクレオチド使用）によってブロックする。
【００６１】
標識は、好ましくは、標準的な酵素的方法でオリゴヌクレオチドプローブ中に導入する。例えば、５’標識のための５’標識増幅プライマーあるいは内部標識のための蛍光標識塩基類似体を使用する。
【００６２】
蛍光的に標識したオリゴヌクレオチド、１つの好ましい態様では、蛍光成分が、増幅産物に組み込まれたクエンチャー成分で標識したヌクレオチドに近接して結合、あるいは、もう１つの態様では、クエンチャー成分が、増幅産物に組み込まれた蛍光成分で標識したヌクレオチドに近接して結合すると、FRET反応が生じる（図１）。
【００６３】
プローブは、CpGに関係がある複数の場所に配置することが好ましい。DNAのコンホーメーションは、２つの蛍光色素の間隔を調節する。好ましくは、上記配置を各CpGに対して最適化する。
【００６４】
好ましい態様では、プローブは、増幅プライマーから分離しているか、あるいは、代わりに、プライマーの１つの５’末端に結合している。
【００６５】
こうして、CGジヌクレオチドを同定して、メチル化の程度を決定することができる。TGジヌクレオチドが代わりに存在すれば、FRETは観察されない。したがって、本方法は、DNAのメチル化をモニターするために直接使用することができる（図２）。
【００６６】
本発明の好ましい態様は、FRETシグナルのリアルタイムモニタリングを、増幅反応の間、行うというものである。こうして、増幅の進み具合を調べることができる（図３）。非常に好ましくは、増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）である。標本をクローニングするための他の増幅手段あるいはSDA法（Strand Displacement Amplification）も好ましい。
【００６７】
本発明の他の好ましい態様は、蛍光強度の変化を、ターゲット増幅のエンドポイントでモニターすることである。PCRのエンドポイント解析には、サーマルサイクリング及び増幅が完了した時に、蛍光色素シグナルの測定が含まれる。結果は、蛍光、例えば、PCRサーマルサイクリングの初めから終わりの蛍光色素シグナル、好ましくはあらゆる内部のコントロールシグナルを引いた蛍光強度単位の変化で報告される。
【００６８】
付加的なデータを収集するために、PCRの最後に融解曲線を作成することも好ましい。
【００６９】
本発明の他の好ましい態様は、増幅産物においてCpGジヌクレオチドが一度だけ生じるというものである。概略を上で示したように、サンプルDNAの配列特性について結論を出すために、FRETシグナルの存在を直接的に用いるならば、このことは非常に役に立つ。
【００７０】
例えば、重亜硫酸塩処理したサンプルの増幅産物に１つだけ標識CGが存在し、蛍光的に標識化したプローブが近接してそれに結合すると、FRETが起こり、ゲノムDNAサンプルのある位置にメチル化シトシンが存在していたという結論が導かれる。
【００７１】
重亜硫酸塩処理サンプルの増幅産物に、例えば、いくつかの標識CGが存在し、それぞれが自己の蛍光標識を有するプローブがそれらに近接して結合すると、FRET反応が起こり、関与する全ての部位のメチル化シトシンに関する結論が導かれる。
【００７２】
本発明のさらに好ましい態様は、PCRの連続するラウンドの間、蛍光強度の変化により、メチル化情報を決定するというものである。
【００７３】
好ましくは、増幅反応の間、適当な波長の照明でサンプルを照らす。
【００７４】
本発明の好ましい態様は、PCRに先だって、実質的にDNAサンプルの全てのシトシンは選択的に脱アミノ化されるが、５−メチルシトシンは実質的に変わらないか、実質的にDNAサンプルの全ての５−メチルシトシンは選択的に脱アミノ化されるが、シトシンは実質的に変わらないというものである。シトシン−グアニン（CpG）ジヌクレオチドが検出され、上記DNAサンプルの上記CpGジヌクレオチド中のシトシンのメチル化状態についての結論が導かれる。この脱アミノ化は、好ましくは重亜硫酸塩試薬を用いて行う。
【００７５】
好ましくは、サンプルDNAの特定の位置に、確実なメチル化状態が存在し、その配列コンテキストが実質的に１又はそれ以上の選択PCRプライマーと相補的であれば、選択PCRプライマーで増幅を行う。これは、ゲノムDNAのメチル化状態に基づき、ある位置にTG又はCGを含む重亜硫酸塩処理したDNAに選択的にアニーリングするプライマーを用いて行うことができる。プライマーはいずれのケースでも設計することができる。プライマーはその３’末端にGを含むことができ、そのため、それぞれの位置にCを含むDNAに結合し、それゆえ、このプライマーは、メチル化DNAだけ、又はメチル化DNAを優先的に増幅する。なぜなら、重亜硫酸塩処理後、Cはこの位置のメチル化を表すからである。この方法は、MSP、メチル化感受性PCRとして知られている。
【００７６】
本発明の他の好ましい態様は、確実なメチル化状態がサンプルDNAの特定部位に存在し、その配列コンテキストが、PCR反応において付加的に使用される、実質的に１又はそれ以上のオリゴヌクレオチド又はPNAオリゴマーと相補的であれば、サンプルDNAが増幅されるというものである。これらのオリゴヌクレオチド又はPNAオリゴマーは、選択的に鋳型DNAに結合し、重亜硫酸塩変換に先だち、メチル化状態に基づいて、その増幅を妨げる。
【００７７】
好ましくは、蛍光成分は、フルオレセイン色素、ローダミン色素、又はシアニン色素、クエンチャー成分は、ローダミン色素である。
【００７８】
本発明の他の好ましい態様では、脱アミノ化（例えば、重亜硫酸塩）処理に先だって、DNAサンプルを、制限エンドヌクレアーゼを用いて切断する。
【００７９】
該処理DNAの酵素的増幅により、該DNAサンプルの１重鎖のみを増幅する方法も好ましい。
【００８０】
好ましくは、DNAサンプルは、ほ乳動物に由来するもの、例えば、細胞系、血液、唾液、糞便、尿、脳脊髄液、パラフィンに埋め込まれた組織、例えば、視覚組織、腸、腎臓、脳、心臓、前立腺、肺、胸あるいは肝臓、組織学的なスライド、及び全ての可能な組合せから単離したものである。
【００８１】
本発明の他の態様は、ゲノムDNAサンプル中のシトシン塩基のメチル化を検出するための診断キットを提供することであり、それには、ゲノムDNAのシトシン塩基の選択的脱アミノ反応のための試薬、増幅工程のための１又はそれ以上のプライマー及び蛍光的に標識したヌクレオチド、及び、選択的に、上記いずれかの請求項のいずれかの方法のためのプロトコールあるいは指示書を含む。
【００８２】
このキットは、標本の検出可能プローブに対する付加的な品目を含めることもできる。
【００８３】
上記キットの構成成分には、例として、本方法を行うのに十分な質を有する、以下のための容器を含めることができる。
１）サンプルDNAを重亜硫酸塩変換するための試薬
２）変換されたサンプルの増幅及びフルオロフォアで標識したヌクレオチドを組み込むための試薬であり、以下を含む：
ａ）核酸プライマー及び
ｂ）非標識及びフルオロフォア標識ヌクレオチドの適当な混合物及び
ｃ）フルオロフォア標識ヌクレオチドを組み込むことができるDNAポリメラーゼ
３）使用説明書
【００８４】
用語‘使用説明書’は、アッセイ方法のための試薬濃度、結合すべき試薬の相対的量のようなパラメータ、試薬／サンプル混合物のためのメンテナンス時間、温度、バッファー条件等について述べた実態的な記載を含める。
【００８５】
以下に、本発明の好ましい態様の工程をより詳細に記述する。
【００８６】
DNA単離
ゲノムDNAサンプルは、組織又は細胞源から単離しなければならない。ほ乳類、より好ましくはヒトでは、DNAサンプルは、ゲノム内のターゲット部位を発現すると思われる組織、また、限定されないが、細胞系、血液、唾液、糞便、尿、脳脊髄液、パラフィンに埋め込まれた組織、例えば、視覚組織、腸、腎臓、脳、心臓、前立腺、肺、胸あるいは肝臓、組織学的なスライドからも採取される。抽出は当業者にとって標準的な方法で行い、それには、界面活性剤ライセート、超音波破砕法及びガラスビーズを用いた振盪の使用を含む。一旦、核酸が抽出されると、ゲノム二重鎖DNAは解析に使用される。
【００８７】
重亜硫酸塩処理
次いで、非メチル化シトシン塩基をウラシルに変換するため、サンプルDNAを化学的に処理する。化学的修飾は、例えば、重亜硫酸塩溶液で行う（限定されない）。上記化学的修飾は、当業界のあらゆる標準的なフォーマットで行うことができる。限定されないが、それには、アガロースゲル内での修飾あるいは変性溶媒での修飾が含まれる。
【００８８】
化学的修飾が、DNAの重亜硫酸塩処理の方法を用いる場合、その後に以下の工程を行うことができる。
【００８９】
二重鎖DNAは、変性させる必要がある。これは、可変温度で行う熱変性の形態をとる。高分子量のDNAに対しては、変性温度は、通常90℃より高い。しかし、解析は、このような高い温度を必要としない小さい断片で行ってもよい。付け加えると、反応が進み、シトシン残基がウラシルに変換するにつれて、鎖間の相補性は減少する。そのため、サイクリック反応プロトコルは、可変変性温度からなることができる。
【００９０】
次いで、重亜硫酸塩による変換は、２つの重要な過程であるシトシンのスルホン反応及びそれに続く脱アミノ反応からなる。反応の平衡は、反応の各過程において、２つの異なる温度で正しい側にある。反応の動力学を考慮すると、反応は、変動する温度で、サイクリック状況下で起こることが好ましい。温度及び各過程を行う長さは、状態の特異的な要求に基づいて変化しうる。しかし、本方法の好ましい態様においては、４℃（10分間）から50℃（20分間）の温度変化を含む。この形の重亜硫酸塩処理は、WO99／28498で公知技術である。
【００９１】
上記化学的変換は、当業界で標準的なあらゆるフォーマットで行う。これには、限定されないが、アガロースゲル内、変性溶媒中あるいはキャピラリー内での修飾を含む。
【００９２】
アガロースゲル内における重亜硫酸塩による変換は、公知技術であり、Olekら、Nucl. Acids. Res. 1996, 24, 5064−5066に記載されている。DNA断片をアガロースゲルに埋め込み、シトシンからウラシルへの変換は、亜硫酸水素塩及びラジカルスカベンジャーを用いて行う。その後、更なる精製工程の必要なく、増幅することができる。
【００９３】
より好ましい態様は、DNA変換をアガロースマトリックスなしで行うものである。亜硫酸水素塩及びラジカルスカベンジャーを用いて、上昇した温度でDNAをインキュベートする。上記反応は、有機変性溶媒中で起こる。変性溶媒の例としては限定されないが、ポリエチレン
グリコール ジアルキル ポリエチレングリコール−ジアルキルエーテル、ジオキサン及び置換誘導体、尿素又は誘導体、アセトニトリル、１級アルコール、２級アルコール、３級アルコール、DMSO、又はTHFが挙げられる。
【００９４】
更なる態様では、化学的処理に先だち、小さな分子に対して透過性のある加熱可能なキャピラリー内にDNAサンプルを移す。その後、化学修飾の反応工程は、接続したキャピラリーを通じて、試薬を添加及び除去することにより、キャピラリーチューブ内で行うことができる。
【００９５】
化学的処理の結果、DNAの２つの鎖は、もはや相補的ではない。
【００９６】
標識ヌクレオチドの増幅及び組み込み
そのように処理したゲノムDNAの断片は、次いで、オリゴヌクレオチドプライマーを用いて酵素的に増幅する。上記プライマーの長さ及び設計は、解析するゲノムの領域に特異的である。この技術では、非常に広い範囲のプライマーが使用に適している。そのようなプライマーの設計は、公知技術の範囲である。
【００９７】
増幅反応で生じたヌクレオチドの適当な断片、例えば、Gヌクレオチドは、第一又は第二のタイプの標識で標識し、第一のタイプはフルオロフォア、第二のタイプはクエンチャー、あるいはこの逆である。ヌクレオチドを標識するための許容されるフルオロフォアは、当業者によく知られているものであり、限定されないが、フルオレセイン、ローダミン、シアニン、フィコエリトリン、Cy５、Cy5.5、Cy７、LCレッド640又はLCレッド705であり、一方、許容されるクエンチャーは、ローダミン色素である。これらの色素をヌクレオチドに付すことは、公知技術である。
【００９８】
本発明の好ましい態様は、サンプルを増幅反応の間、適当な波長の光で照らすというものである。
【００９９】
本発明のスキルは、配列特異的オリゴヌクレオチドプローブが増幅産物にハイブリダイズし、蛍光的に標識したオリゴヌクレオチドが接近して、サンプルのメチル化状態に関する知識を得るために増幅産物に組み込まれた標識ヌクレオチドの１つに結合して、FRETが発生した状態において、FRETシグナルを解釈するという点にある。
【０１００】
高度のデータプロセシング
本方法は、ゲノムDNAサンプルのハイスループット解析に使用されることが期待されている。したがって、また、本発明は、コンピュータ装置を用いたデータ解析を含む。さらに好ましい態様は、上記装置が１又はそれ以上の学習アルゴリズムを含む。
【０１０１】
図面の記載
【０１０２】
図１
説明：
１：重亜硫酸塩処理
２：標識ヌクレオチドの組み込み
３：Fretによるターゲットの検出
４：リアルタイムPCR
【０１０３】
組織から抽出したDNAは、重亜硫酸ナトリウムで処理する（Ａ）。リアルタイムPCRの間、重亜硫酸塩処理したDNA（一重鎖（Ｂ）に、蛍光色素で標識したdGTPを組み込む（Ｃ＋Ｄ）。蛍光的に標識されたオリゴヌクレオチドが、増幅産物に組み込まれた標識ヌクレオチド（Ｅ）の１つに、近接して結合すると、FRETが発生する。
【０１０４】
図２
説明：
１．重亜硫酸塩処理
２．標識dGTPを用いたPCR
３．プライマーの伸長
４．変性
５．アニーリング及び蛍光モニタリング
６．より多くのサイクル
【０１０５】
目的のDNAは化学的に処理され、配列中に残存するシトシンのみが、元のサンプルにおいてメチル化されたものである。DNA鎖の１つをターゲットとするように設計されたPCRプライマーは、鋳型にアニーリングし、標識ヌクレオチド（dGTP）を導入することによって、それを伸長する。標識dGTPは、元のDNAサンプルにメチル化シトシンが存在したところにだけ組み込まれる。伸長工程の後、DNAは変性され、再アニーリング及び蛍光のモニターを可能にする。PCRの各ラウンドにおいて、プローブに相補的なより多くのターゲットが蓄積する。プローブから放射された蛍光の量は測定される。
【０１０６】
図３
説明：
１．非標識のdCTP、dATP、dTTP及び標識GTP
２．蛍光標識遺伝子特異的オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション
３．FRET、リアルタイム蛍光検出
【０１０７】
PCRはDNA鎖の１つをターゲットとするプライマーを用いて行われる。第一のプライマーは、鋳型にアニーリングし、適当なヌクレオチドを組み込むことにより、それを伸長する。ヌクレオチドの１つ、このケースではdGTPは、蛍光色素で標識される。配列特異的オリゴヌクレオチドプローブは、所望の部位にハイブリダイズする。標識されたグアニンが存在すると、FRET反応が起こる。グアニンから放射されるエネルギーは、プローブの標識に移動する。プローブから放射されるエネルギーは、リアルタイム蛍光検出によって検出される。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】本発明のＤＮＡサンプルの定量的メチル化検出を実施するための説明図である。
【図２】本発明のＤＮＡサンプルの定量的メチル化検出を実施するための説明図である。
【図３】本発明のＤＮＡサンプルの定量的メチル化検出を実施するための説明図である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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2005516628.tif 000009
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