(57)【要約】患者の免疫を増進させ又は患者をミコバクテリア感染に対してワクチン接種するための組成物及び方法を開示する。この発明は、ホルマリン不活性化したミコバクテリウム例えばM.bovisの培養物及びＮｏｖａｓｏｍｅアジュバントを含む組成物並びにかかる組成物の利用方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物において、ミコバクテリアに対するイン・ビボのＴ細胞媒介の免疫応答を生成するためのアジュバントを含むワクチンであって、該ワクチンは、有効量のホルマリン不活性化ミコバクテリウム及びアジュバントを含み、該アジュバントは、油含有非リン脂質少ラメラ脂質小胞を含む当該ワクチン。
【請求項２】
ミコバクテリウムを、M.tuberculosisコンプレックス及びnontuberculosisミコバクテリアコンプレックス(ＮＴＭ)よりなる群から選択する、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
前記のM.tuberculosisミコバクテリウムを、M.tuberculosis、M.bovis、M.microtti、M.africanus、及びBacille Calmette-Guerin(ＢＣＧ)よりなる群から選択する、請求項２に記載のワクチン。
【請求項４】
ＮＴＭミコバクテリウムを、M.kansasii, M.marinum, M.similae, M.scrofulaceum, M.szulgai, M.gordonae, M.avium, M.intracellulare, M.ulcerans, M.fortuitum, M.chelonae, M.xenopi及びM.malmoenseよりなる群から選択する、請求項２に記載のワクチン。
【請求項５】
脂質小胞が、負に帯電している、前記の請求項の何れか１つに記載のワクチン。
【請求項６】
脂質小胞が、更に、ＭＰＬを含む、前記の請求項の何れか１つに記載のワクチン。
【請求項７】
脂質小胞が、更に、バチルアルコールを含む、請求項６に記載のワクチン。
【請求項８】
脂質小胞が、非融合性である、前記の請求項の何れか１つに記載のワクチン。
【請求項９】
患者のリンパ様組織又は肺を標的とする、前記の請求項の何れか１つに記載のワクチン。
【請求項１０】
患者のマクロファージを活性化する、前記の請求項の何れか１つに記載のワクチン。
【請求項１１】
患者において、Ｔｈ１免疫応答を開始する、前記の請求項の何れか１つに記載のワクチン。
【請求項１２】
患者をtuberculosisに対してワクチン接種する方法であって、前記の請求項の何れか１つに記載のワクチンを投与することを含む当該方法。
【請求項１３】
患者に、生存力のあるミコバクテリウムをエアゾル形態で病原菌投与する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ミコバクテリウムを、M.tuberculosisコンプレックス又はnontuberculosisミコバクテリアコンプレックス(ＮＴＭ)よりなる群から選択する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
M.tuberculosisミコバクテリウムを、M.tuberculosis、M.bovis、M.microtti、M.africanus及びBacille Calmette-Guerin(ＢＣＧ)よりなる群から選択する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＮＴＭミコバクテリウムを、M.kansasii, M.marinum, M.similae, M.scrofulaceum, M.szulgai, M.gordonae, M.avium, M.intracellulare, M.ulcerans, M.fortuitum, M.chelonae, M.xenopi及びM.malmoenseよりなる群から選択する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
投与のステップが、tuberculosisの複製から肺及び脾臓を防御する、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ミコバクテリウム属は、世界中で、他のすべての細菌の属を合わせたよりも多くの病気の原因となっている。ミコバクテリアは、２つの広い範疇に分類される。第一の範疇のM. tuberculosisコンプレックスは、M. tuberculosis, M. bovis, M. microtti, 及びM. africanusを含む。第二の範疇は、他のすべての種を含み、nontuberculosis mycobacteria （ＮＴＭ）又はtubercule bacilli以外のミコバクテリア（ＭＯＴＴ）と呼ばれ、これは、他の内で、M.kansasii, M.marinum, M.similae, M.scrofulaceum, M.szulgai, M.gordonae, M.avium, M.intracellulare, M.ulcerans, M.fortuitum, M.chelonae, M.xenopi及びM.malmoenseを包含する。現在、６０種を超えるミコバクテリアが、定義されている。すべての培養可能なミコバクテリアの内で、M.tuberculosisのみが、真の病原菌である。
【０００２】
M.tuberculosis又はM.bovisの感染によって引き起こされる結核症（ＴＢ）は、ヒト及び動物の最も重大な疾患の一つのままであり（１〜３）、ヒト及び動物の健康及び財源（４〜７）に関して、社会に莫大なコストを課している。ＴＢの予防のために現在利用できる唯一のワクチンは、Mycobacterium bovisに由来する弱毒化生ワクチンである、Bacille Calmette-Guerin（ＢＣＧ）である。ＢＣＧは、多くの理想的ワクチンの特質を有している。即ち：それは、製造して投与するのが安価であり、多くの環境において、特に子供の重くて致命的な結核症（８）に対して安全で且つ効果がある。しかしながら、ＢＣＧは、多くの臨床的試みにおいて、変動する効力を与えることが見出されてきた。英国におけるMedical Research Councilの試みにおいて、ＢＣＧは、７７％の防御（９）を与えたが、スペクトルの他端においては、インドにおける最大の臨床的試みにおいて、それは、防御効果ゼロを示している（１０）。ＢＣＧが、一般に、成人の肺結核に対して乏しい防御を与えるにもかかわらず、それは、改良された効果のＴＢワクチン候補を測る「第一等の基準」であり続けている。ＨＩＶ／ＡＩＤＳの流行の出現により、関心は、ＢＣＧの安全性を超えて高まっている。ＢＣＧは、不十分な又は不完全な免疫では病原性でありうるものであり（１１）、ＢＣＧのワクチン接種は、結核にかかる危険にある個人に対しては禁忌でありうる。
【０００３】
ＢＣＧの全般的な効力及び安全性の欠如の周辺の問題は、新たな結核症ワクチンの生成を開発するための増大した努力を生じた。遂行されている一つのアプローチは、アジュバント中のミコバクテリアの核酸、タンパク質又はペプチドの接種を必要とするサブユニットワクチンの生成である。個々のタンパク質は、一般に、二義的効力しか有しないが、タンパク質混合物は、一層よく働き、これは、完全な防御には多くの抗原に対する免疫が必要とされることを示唆している。これは、多数の抗原を有するＤＮＡワクチン接種は、防御的効力に付加的効果を有するという観察（１３）によって支持されている。他のアプローチは、分子遺伝学的ツールを利用して、免疫無防備状態の宿主に対して弱毒化された無発病性のＴＢ複合体の変異型膜を生成した（１４）。例えば、アミノ酸及びプリンの生合成に関与する遺伝子の欠失は、免疫適格の（１５、１６）及び重篤な免疫無防備マウス（１７）の両者において生き残ることのできないＢＣＧの栄養要求性の変異体を生じた。しかしながら、これらの変異体は、代謝性抗原を発現してある程度の防御免疫を生じるだけ十分に長く生存することができた。かかる変異体を用いて、遺伝子改変した生ワクチンのヒト又は家畜における使用に関する懸念（１４、１８）は残っているが、妥協免疫又は免疫不全を発症する危険にある個体にワクチン接種することができるであろうことが示唆されている（１７）。
【０００４】
ミコバクテリアの殺した全細胞調製物に基づくワクチンは、古典的に、毒性ミコバクテリアによる病原菌投与（challenge）後に、殆ど特異的防御を与えなかった（１９〜２２）が、これは、おそらく、重要な防御的抗原が、これらの細菌が代謝的に活性であるときにしか発現されないからであろう（２１、２３、２４）。これに対しては例外があり（２５、２６）、防御免疫の生成によって、提示された特定の抗原は、それらが提示された方法よりも一層重要でないということが提案されている（２７、２８）。ミコバクテリアの殺した調製物を用いるワクチン接種の研究の大部分は、殺菌方法として熱を利用してきた。しかしながら、この処理は、重要な抗原を有意に変性させうるし、かかるワクチンを用いて一般に見られる失望させる結果（２９）を説明することができよう。熱による不活性化に対する別法はホルマリン処理である。ホルマリンによる不活性化は、最初に、１９２０年代に、コリネバクテリウム・ジフテリアエの培養から単離されたジフテリア毒素を解毒するために利用され（３０、３１）；このアプローチは、このワクチンの生産に未だに利用されている（３２）。全ミコバクテリアのホルマリン処理は、存在するタンパク質の多くの抗原的完全性を保持しつつこの微生物を殺す利点を有している（３３）。
【０００５】
本発明は、ミコバクテリアの感染に対抗する患者の免疫を増進させ又は患者にワクチン接種するための組成物及び方法を提供する。特に、本発明の部分として、様々な非リン脂質リポソームアジュバント（Ｎｏｖａｓｏｍｅｓ（登録商標））と混合されたミコバクテリア（例えば、M.bovis）のホルマリン不活性化調製物が、モルモットに皮下接種により投与された場合に防御を与えるということが発見された。従って、本発明の組成物及び方法は、ミコバクテリア（例えば、M.tuberculosisコンプレックスに由来するミコバクテリア又はNTMコンプレックスに由来するミコバクテリア）のホルマリン不活性化された培養物及びＮｏｖａｓｏｍｅ（登録商標）アジュバントを包含する。Ｎｏｖａｓｏｍｅ（登録商標）アジュバントは、ここに規定する通り、非リン脂質、ステロール、油及び緩衝剤を含む少ラメラリポソームであり、米国特許第５，４７４，８４８号（そのまま、参考として本明細書中に援用する）に記載されている。好適具体例において、Ｎｏｖａｓｏｍｅ（登録商標）アジュバントは、ＮＡＸ  Ｍ６８７である。
【０００６】
ここに記載の研究において示したように、本発明の組成物を利用して、ミコバクテリアによって引き起こされる感染症（例えば、結核症）に対して防御することができる。従って、一具体例において、この発明は、ホルマリンで不活性化したミコバクテリアの培養物及びＮｏｖａｓｏｍｅ（登録商標）アジュバントを含む組成物を提供する。
【０００７】
他の具体例において、この発明は、患者のミコバクテリア（例えば、M.bovis）に対する免疫を、該患者に、ホルマリンで不活性化したミコバクテリア培養物及びＮｏｖａｓｏｍｅ（登録商標）を含む組成物を投与することによって増進させる方法を提供する。
【０００８】
本発明の組成物は、任意の適当な投与経路を利用して患者に投与することができる。典型的には、これらの組成物は、適当な量及び投薬養生法で、注射により投与されて治療効果を達成する。
【０００９】
本発明の他の特徴及び利点は、下記の詳細な説明及び請求の範囲から明らかとなろう。
【００１０】
発明の詳細な説明
本発明は、ミコバクテリアによる感染症（例えば、結核症）に対抗する患者の免疫を増進させ又は患者にワクチン接種するための組成物及び方法を提供する。この発明の組成物は、ホルマリンで不活性化したミコバクテリア培養物及びＮｏｖａｓｏｍｅ（登録商標）アジュバントを含む。本発明に包含されるホルマリン不活性化したミコバクテリアは、M.tuberculosisコンプレックスのミコバクテリアとnontuberculosisミコバクテリアコンプレックス（ＮＴＭ）のミコバクテリアの両者を含む。M.tuberculosisコンプレックスに由来するミコバクテリアの例には、M.tuberculosis, M.bovis, M.microtti, M.africanus及びBacille Calmette-Guerin （ＢＣＧ）が含まれる。ＮＴＭコンプレックス由来のミコバクテリアの例には、他の内で、M.kansasii, M.marinum, M.similae, M.scrofulaceum, M.szulgai, M.gordonae, M.avium, M.intracellulare, M.ulcerans, M.fortuitum, M.chelonae, M.xenopi及びM.malmoenseが含まれる。
【００１１】
ここに記載の研究において示したように、ホルマリンで不活性化した培養物は、生育培地上での培養及び重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスへの接種によって測定されたように、完全に生存不能であることが見出された。ホルマリンで不活性化した調製物を、ある範囲のＮｏｖａｓｏｍｅ（登録商標）アジュバント（非リン脂質、ステロール、油及び緩衝剤よりなる少ラメラリポソーム）と混合して、モルモットに投与した。これらの調製物は、この動物において有害な反応を生じなかった。事実、処理したモルモットの多くは、低投与量の生存可能なM.bovisのエアゾルによる病原菌投与から防御された。幾つかの場合において、防御のレベルは、第一等の基準のワクチンである生ＢＣＧパスツールにより達成されるものと同等であった。
【００１２】
殺菌した全ミコバクテリア細胞調製物に基づくワクチンは、それらの安全性及びそれらがタンパク質と非タンパク質抗原の複雑な混合物を表すという事実について利点を有する。やはり、殺菌したミコバクテリアワクチンに対する免疫応答は、宿主の遺伝的性質によっては、生ＢＣＧによるよりも一層制限されない（２６）。しかしながら、かかるワクチンは、防御免疫を与えることができないことを報告する多くの研究のために広く使われてはいない（１９〜２２）。かかるワクチンが有効であることが見出された研究において、油のアジュバントを用いなければならず、又は該ワクチンは、防御を達成するには、不穏当な経路（例えば、腹腔内）から多数回投与しなければならなかった（２７、３８〜４０）。皮内投与した場合、かかるワクチンは、防御に失敗した（４１）。
【００１３】
本発明は、調製物の抗原性を保持するのに、以前にＴｈ１応答を誘導することが示された（４２、４３）新世代の非リン脂質リポソームアジュバント（Ｎｏｖａｓｏｍｅｓ（登録商標））の利用と共に、温和なホルマリン固定を利用する。下記の研究において示したように、これらの配合物は、ミコバクテリアのエアゾル病原菌投与に対して、生ＢＣＧによって達成されるものと同等の防御をモルモットにおいて与える。かかる防御は、例えば皮下投与されたワクチンの単一投与量によって達成することができる。M.tuberculosisについて報告されたように（２１）、アジュバントを伴わない殺菌したＢＣＧワクチンは、M.bovisによる病原菌投与に対する防御を与えなかった。しかしながら、ホルマリンで不活性化したM.bovisは、アジュバントの非存在下で、肺に対して防御を与えず、これは、ＢＣＧが、M.bovisにより潜在的に発現される細胞と結合した防御抗原の完全なレパトアを欠くことを示している。
【００１４】
特定の具体例において、Ｎｏｖａｓｏｍｅ（登録商標）リポソームを、正味の負の電荷を有するようにデザインした。負に帯電したリポソームは、中性又は正に帯電したリポソームよりも、一層迅速に循環から除去されて、一層迅速に肝臓、脾臓及び骨髄に局在化し、そして一層効果的に肺で捕捉される（４４）。
【００１５】
最少効果のアジュバントは、ＮＡＸ５７｛ＭＰＬ（モノホスホリル脂質Ａ）を含まない唯一のＮｏｖａｓｏｍｅ（登録商標）｝である。ＭＰＬは、様々なミコバクテリアワクチン／病原菌投与モデル（４５〜４７）においてアジュバント特性を有することが既に示されており、脂質Ａは、リポソームの関係において、抗原提示のためにマクロファージを活性化する（４８、４９）。最良のワクチン／アジュバントの組合せは、ホルマリン不活性化M.bovisとＮＡＸ  Ｍ６８７であった。これは、肺及び脾臓におけるM.bovisの死及び増殖に対する統計的に生ＢＣＧパスツール又はＢＣＧトウキョウと同等の防御を与えた。ＮＡＸ  Ｍ６８７は、ＭＰＬ及びバチルアルコールの両方を含み、後者も、マクロファージ活性化特性を有する（５０）。Ｎｏｖａｓｏｍｅｓ（登録商標）（特に、ＮＡＸ  Ｍ６８７）のアジュバント活性は、部分的に、それらのリンパ様組織及び肺を標的とする性質並びにマクロファージを活性化する性質によるものである。リポソームの融合性（fusogenicity）は、それらの積み荷が細胞下レベルで何処に送達されるかに影響を及ぼすが、すべてのＮｏｖａｓｏｍｅｓ（登録商標）は、マクロファージに内在する酸化的代謝過程によって生物分解性である（５１）。融合性（fusogenic）リポソームは、それらの積み荷を直接サイトゾル中に送達して、抗原をＭＨＣクラスＩ分子によるＣＤ８+Ｔ細胞への提示のために利用可能にする（５２、５３）。対照的に、融合性でないリポソームは、エンドソーム経路に入って、それらの抗原性の積み荷は、ＭＨＣクラスＩＩ分子によるＣＤ４+Ｔ細胞への提示のために分解される（５２、５３）。ＮＡＸ  Ｍ６８７は、ここに記載した唯一の融合性Ｎｏｖａｓｏｍｅ（登録商標）である。
【００１６】
生ＢＣＧの報告された散在性結核症に対して防御する能力（５４、５５）と合致して、ホルマリンで不活性化したＢＣＧワクチンの幾つかは、脾臓に対する有意の防御を与えたが、何れも肺を防御することはできなかった。ホルマリンで不活性化したM.bovisとＮＡＸ Ｍ６８７は、肺と脾臓の両方を細菌の複製から防御する唯一の殺菌されたワクチンであった。これは、部分的に、種々の細胞壁結合抗原が組織特異的増殖及びＴＢコンプレックスミコバクテリアの播種の原因であり；肺における増殖には、脂質フチオセロールジミコセロセート（ＰＤＩＭ）が必要であるが、脾臓又は肝臓では必要でなく（５６）；そして肺外播種にはヘパリン結合性ヘマグルチニン接着（ＨＢＨＡ）が必要である（５７）という事実によるものである。ＰＤＩＭ及びＨＢＨＡは、ミコバクテリアの細胞壁と結合するので、これらの分子（又は、これらの類似物）に向けられた免疫応答は、防御が肺又は脾臓又は両方において発現されるかどうかを決定する。事実、ＢＣＧの抗ＨＢＨＡ抗体でのコーティングは、鼻内感染後の細菌の播種を減じた（５７）。
【００１７】
生又はホルマリン不活性化の何れであっても、M.bovis病原菌投与に対するこれら２種のＢＣＧ株の効力に差異がないことが見出された。これは、マウス及びヒトにおいて行われた以前の研究であって、ＢＣＧパスツールがM.tuberculosisに対してＢＣＧトウキョウの防御よりも優れたレベルを与えた該研究（５８、５９）と対照的である。ＢＣＧパスツール及びＢＣＧトウキョウは、異なる量の細胞壁結合抗原ＭＰＢ８３を発現する（６０）。この抗原は、天然のM.bovis感染においては免疫優性であり（６１、６２）、マウスにおいては防御的抗原である（６３）が、ここに記載した結果は、それがＢＣＧワクチンの優性防御抗原ではないことを示している。
【００１８】
本発明のワクチン配合物は、製造するのが安価で且つ安全であり（少なくとも、ＢＣＧ配合物と比較して）、ネイティブなモルモットにおいて反応原性（reactogenicity）を有しない。
【００１９】
本発明を、下記の実施例によって、更に説明するが、該実施例を制限と解釈すべきではない。すべての図面及びすべてのこの出願中で引用された参考文献、特許及び公開された特許出願の内容を、明白に参考として本明細書中に援用する。当業者は、ここに記載したこの発明の特定の具体例の多くの同等物を、日常的実験を利用して認め又は確認することができるであろう。かかる同等物は、下記の実施例及び請求の範囲に包含されるものである。
【実施例】
【００２０】
材料と方法
細菌株及びホルマリン処理：ＢＣＧパスツール及びトウキョウ株を、Statens Serum Institut （デンマーク、コペンハーゲン）から得た。この研究で用いたM.bovis株（２１２２／９７）を、ツベルクリン試験陽性反応を示すウシから１９９７年に単離して、VLA Waybridgeにて増殖させた。０．２％（ｖ／ｖ）グリセロール（ＢＣＧ）又は４．１６ｍｇ／ｍｌ ピルビン酸ナトリウムを補ったＭ−ＡＤＣ−ＴＷブロス（３４）中で生育させたすべての株の４週培養物（M.bovis）を、遠心分離によって集めた。これらの細菌細胞を、１．５％（ｖ／ｖ）ホルマリン（ＰＢＳ中）に再懸濁させて、１ｍｌ当たり０．２５ｇの細菌重量（湿量）の濃度とした。これらの培養物を４℃で９６時間撹拌してから、４℃での遠心分離によって集めた。これらのホルマリン処理した細胞をＰＢＳで一度洗って、必要となるまで４℃に保存した。
【００２１】
ホルマリン不活性化の確認：ホルマリン処理した細胞の各調製物のアリコート（約２．５×１０7ＣＦＵを意味する）を、ミドルブルック７Ｈ１０寒天に１０％（ｖ／ｖ）ミドルブルックＯＡＤＣエンリッチメントを加えたものにプレートして、６週間インキュベートした。同一サイズの更なるアリコートを５匹のＳＣＩＤベージュマウスの３グループ（ＣＡＭＲに維持）の首筋に皮下注射した。これらのマウスを病気の臨床徴候について１２週間にわたって監視し、その時点で、それらを屠殺して内臓における結節病変の存在を調べた。
【００２２】
アジュバントを含む配合物：ホルマリン処理した細胞の各調製物を、下記の負に帯電したＮｏｖａｓｏｍｅ（登録商標）（非リン脂質リポソーム）アジュバントと混合した：ＮＡＸ５７（融合性；ポリオキシエチレン−２−セチルエーテル例えばＢｒｉｊ５６より作成）；ＮＡＸ  Ｍ５７（融合性；ポリオキシエチレン−２−セチルエーテル及びモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）より作成）；ＮＡＸ  Ｍ７７（融合性；ポリオキシエチレン−２−ステアリルエーテル即ちＢｒｉｊ７１及びＭＰＬより作成）；ＮＡＸ  Ｍ６８７（非融合性；グリセロールモノステアレート及びバチルアルコール及びＭＰＬより作成）。これらの細胞を、アジュバントに、１８ゲージの針を付けたツベルクリン注射器を利用して再懸濁させてから、その懸濁液を２つのツベルクリン注射器を４０回往復させることによって完全に均質化した。各ミコバクテリアの対照用調製物を、アジュバントの代わりに無菌水を利用する以外は同様にして生成した。
【００２３】
モルモットのワクチン接種及び病原菌投与：体重３５０〜４５０ｇの雌の介入感染のないDunkin-HartleyモルモットをCharles River UK Ltd.（英国、Margate在）より入手した。６匹のモルモットのグループを１００μｌの各ホルマリン処理したワクチン／アジュバント配合物の首筋への皮下注射免疫化し、他の６匹は、５×１０4ＣＦＵ ＢＣＧトウキョウの生懸濁液で免疫化した。１８匹のマウスの更なる２つの対照用グループに、５×１０4ＣＦＵ 生ＢＣＧパスツール又はＰＢＳのみをワクチン接種した。ワクチン接種の５週間後に、すべてのモルモットに、M.bovis 2122/97の生懸濁液を、気体により病原菌投与して、約１０匹の肺における吸入により維持された投薬量を達成した（３５）。更なる２匹のモルモットに、ホルマリン処理した／水調製物をワクチン接種したが、ワクチンの無菌性を確認するために病原菌投与はしなかった。
【００２４】
モルモットの検死：動物を、病原菌投与の１０週間後に、又は個体がその最大体重の２０％を失った時点で（人道的終点）、ナトリウムペントバルビトンの腹腔内過剰投与により屠殺した。検死を死後すぐに行なった。身体状況の外部評価の後に、頚部領域並びに胸腔及び腹腔の肉眼による内部検査を行なった。両肺を正中線に沿って切り；左肺を細菌学のために５ｍｌの無菌水中に入れ、右肺を後の肉眼での検査のために１０％ホルマリン緩衝塩溶液に入れた。全脾臓を無菌的に取り出して、細菌学のために５ｍｌの無菌蒸留水に入れた。
【００２５】
細菌列挙：肺及び脾臓を、５ｍｌの無菌蒸留水中で、回転ブレード細断システムを用いて均質化した。生存細胞計数を、細断物の連続希釈法で行ない、４週間３７℃でインキュベーションした後にミコバクテリアの増殖につき調べた。
【００２６】
統計分析：適当な統計検定を選択して、全データをＩｎＳｔａｔソフトウェアパッケージ（バージョン３．００、GraphPad, カリフォルニア、San Diego在）を利用して分析した。この生存データを、フィッシャーの完全検定（Exact Test）を用いて分析した。各データセットを調べてガウス分布に従う集団に由来することが見出されたので、片側ｔ検定をこの微生物学的データに適用した。
【００２７】
実施例１：ホルマリン処理は、培養物を非生存可能にする。
１００μｌのアリコート（約２．５×１０7のＣＦＵのホルマリン処理したＢＣＧパスツール、ＢＣＧトウキョウ及びM.bovis 2122/97を意味する）を固体培地上にプレートし、ホルマリン処理がミコバクテリアを殺したかどうかを調べるために、ＳＣＩＤベージュマウスに注射した。何れの細菌も培養されなかったし、病原菌投与されたすべてのマウスは、１２週間生存して、何らの病気の臨床徴候もなかった。検死において、何れのマウスの内臓においても何らの病変も認められなかった。
【００２８】
２匹のマウスに、ホルマリン処理したM.bovis（水中）をワクチン接種したが、病原菌投与しなかった。１５週間後に、これらのマウスを屠殺して、結核症の徴候につき検査した。何れの動物の内臓にも何らの病変も認められなかったし、それらの脾臓及び肺から細菌は培養されなかった。
【００２９】
実施例２：ホルマリンで不活性化したＮｏｖａｓｏｍｅ（登録商標）をアジュバントとするワクチンは、モルモットをM.bovisによる病原菌投与から防御する
ホルマリンで不活性化したワクチンが非生存性であることが確立されたので、それらの防御効力を、以前に記載された低投与量M.bovisエアゾル病原菌投与モデルのモルモット（３５）を用いて試験した。実験中、何れの動物のワクチン接種部位においても、有害な反応は認められなかった。M.bovisによる病原菌投与後に、各グループの内の何匹かのモルモットは、人道的終点に達したので、実験終了前に屠殺しなければならなかった。表１は、実験終了まで生存した各処理グループにおける動物の数を示している。各株のワクチンについて少なくとも一種のアジュバント配合物が、このグループにＰＢＳ対照と比較して有意の生存を与えた。ＢＣＧパスツール及びＢＣＧトウキョウの生調製物を用いるワクチン接種も又、有意の生存を与えた。
【００３０】
【表１】
2005538923.tif 000002
【００３１】
死亡時の各モルモットに由来する肺及び脾臓のホモジェネートを、M.bovisの列挙のためにプレートした。表２及び３は、それぞれ、M.bovisのエアゾル感染の１０週間後にワクチン接種されたモルモットの肺及び脾臓に由来するM.bovisの収率を示している。M.bovisベースのホルマリン不活性化配合物だけが、肺における細菌の複製に対する有意の防御を与えた（表２）。これらの配合物の一つ（M.bovis−ＮＡＸ  Ｍ６８７）は又、脾臓に対する有意の防御をも与えた（表３）。対照的に、４つのホルマリン不活性化ＢＣＧワクチンは、肺に対する有意の防御を与えなかったが、脾臓に対する有意の防御を与えた。ＢＣＧパスツール及びＢＣＧトウキョウの生調製物によるワクチン接種は、肺及び脾臓の両者における細菌負荷を有意に低減させた。アジュバントの非存在下では、何れのホルマリン不活性化ワクチンも、有意の防御効果を有しなかったが、但し、ホルマリン不活性化M.bovis（水中）は、肺由来の培養細菌数において、小さい（０．５８ｌｏｇ10）が、有意（ｐ＜０．０５、ｔ検定）の低下を与えた。
【００３２】
【表２】
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【００３３】
【表３】
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【００３４】
各動物の右肺の肉眼で見える結核の程度を、重量測定（固定前）、肺表面に見える病変の数の計数並びに病変の大きさ及び激しさに基づくスコアの採点（固定後）により評価した（３６）。これらの基準によって、２種の生ＢＣＧワクチンを含む何れのワクチンも、肉眼で見える肺結核に影響を及ぼさなかった（データは示さない）。
【００３５】
従って、少なくとも一種のM.bovisベースのホルマリン不活性化配合物は、肺及び脾臓の両方における細菌の複製に対する有意の防御を与えた。
【００３６】
参考文献
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2005538923.tif 000006
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【００３７】
参考文献の援用
本明細書中で引用したすべての特許、係属中の特許出願及び他の刊行物を、そのまま、参考として本明細書中に援用する。
【００３８】
同等物
当業者は、ここに記載したこの発明の特定の具体例に対する多くの同等物を認識し、又は日常的実験を用いて確認することができよう。かかる同等物は、後記の請求の範囲に包含されるものである。
【国際調査報告】
2005538923.tif 000010