(57)【要約】本発明は免疫反応を生起し得るタンパク質分子上の決定基およびエピトープを識別するためのスクリーニング方法を提供する。本発明は、特に、治療タンパク質中のＴ細胞に対するエピトープの識別に関する。最後に、本発明は、前記エピトープマッピング方法に由来するＭＨＣクラスIIリガンドの識別およびそうしたリガンドおよびエピトープの数をそれぞれ減少させた配列アナログの設計と連携してエピトープマッピングを使用する組合せ法に関する。
2005529170.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップを含む、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)により、被験タンパク質またはその断片のＴ細胞エピトープマップを構築する方法：
(i)被験タンパク質全体または該被験タンパク質のアミノ酸配列を代表するかそれから生成される合成ペプチド、もしくはそれらの断片を用いて、ＰＢＭＣ誘導Ｔ細胞とともに合成ペプチドをインキュベートおよび培養することによりin vitroで抗原をプライミングすること；
(ii)プライミングされたＴ細胞をサイトカインによって処理し培養すること；
(iii)自己由来の照射されたＰＢＭＣにプライミングされたＴ細胞を添加し、前記合成ペプチドによって新たにプライミングおよび培養すること；ならびに
(iv)Ｔ細胞増殖アッセイにおけるＴ細胞応答を予め選択された経時的プロトコルによって測定すること。
【請求項２】
Ｔ細胞を含むＰＢＭＣは、事前に被験タンパク質に暴露されていない多数の異なる健常な個体から単離されるか、その断片またはペプチド抗原である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＰＢＭＣは、ＭＨＣクラスIIのレパートリーの90％以上に相当する十分な免疫学的多様性のドナー個体プールに由来する請求項２に記載の方法。
【請求項４】
Ｔ細胞を含むＰＢＭＣは、被験タンパク質またはその断片に対する確立した免疫反応が存在する個々の患者から単離される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
個体がヒトであり、かつ、被験タンパク質がヒトタンパク質である請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
被験タンパク質の全長を、前もって定義した均一のサイズであり選択された領域から少なくとも３個のアミノ酸残基によって構成される合成重複ペプチドについて走査する請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記合成重複ペプチドが９〜15アミノ酸残基を含む請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記合成ペプチドが15アミノ酸残基を含む請求項７に記載の方法。
【請求項９】
サイトカインがＩＬ−２である請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
経時的プロトコルを実施例３に従って行う請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
被験タンパク質が治療タンパク質である請求項１から10のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
請求項１から11に記載のいずれかの方法を含むＴ細胞活性化アッセイ。
【請求項１３】
免疫原性の弱いタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの検出のための請求項12に記載のＴ細胞活性化アッセイの使用。
【請求項１４】
同一の生物学的活性を有する親分子から得た免疫原性が修飾された生体被験タンパク質であって、修飾された分子は前記親分子のそれと異なるアミノ酸配列を有しており、所与の種の免疫系に露出されたときに親分子と比べて縮小された免疫性を示すものを調製する以下のステップ：
(i)親タンパク質またはその部分のアミノ酸配列を決定すること；
(ii)１または複数の潜在的なＴ細胞エピトープを識別すること；
(iii)本来識別されたＴ細胞エピトープ配列内の少なくとも１つのアミノ酸残基の変更によって新しい配列変異体を設計し、前記変異体は、ペプチドのＭＨＣへの結合およびペプチド−ＭＨＣ複合体のＴ細胞への結合により決定される、Ｔ細胞エピトープ配列の活性もしくは数および／または前記生体分子から誘導されるペプチドに結合し得るＭＨＣアロタイプの数をそれぞれ実質的に縮小するか除去すること；
(iv)組み換えＤＮＡ技術によってそのような配列変異体を構築し、所望の特性を備えた１または複数の変異体を識別するために前記変異体を試験すること、および
(v)場合によってステップ(ii)〜(iv)を繰り返すこと；
を含む方法であって、ステップ(ii)によるＴ細胞エピトープ配列の識別が、請求項１から11のいずれかによる方法を含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
識別ステップ(ii)は、さらに、前記サンプリングされたアミノ酸残基セグメントに存在する個々の疎水性アミノ酸残基側鎖に対する割り当てられた値を合計することにより、前記各合成ペプチドセグメントのＭＨＣクラスII分子結合スコアを計算することを計算方法として含み、また、修飾のために前記合成ペプチドセグメントの少なくとも１つを選択することを含む請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
選択された合成ペプチドは2.0以上の免疫原性刺激指数(ＳＩ)を有し、ここでＳＩは、選択されたペプチドにおいて測定されたＴ細胞増殖スコアをペプチドで接触させていない細胞において測定されたスコアによって分ることによって得られる請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
修飾された被験タンパク質は1.8未満の免疫原性刺激指数(ＳＩ)を有する請求項14から16のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(発明の技術分野)
本発明は免疫学の分野に関する。本発明は免疫反応を生起し得るタンパク質分子上の決定基(determinant)およびエピトープを識別するためのスクリーニング方法を提供する。本発明は、特に、治療タンパク質中のＴ細胞に対するエピトープの識別に関する。最後に、本発明は、前記エピトープマッピング方法に由来するＭＨＣクラスIIリガンドの識別およびそうしたリガンドおよびエピトープの数をそれぞれ減少させた配列アナログの設計と連携してエピトープマッピングを使用する組合せ法に関する。
【０００２】
(発明の背景)
治療用タンパク質に対して望ましくない免疫反応が起こるために、治療用タンパク質の有効性が制限される例が多々ある。いくつかのマウスモノクローナル抗体はヒトの多数の疾病症状において治療剤としての見込みを示すが、ヒト抗マウス抗体(ＨＡＭＡ)反応が著しく誘導するため失敗したケースもある[Schroff,R.W. et al(1985)Cancer Res. 45：879-885；Shawler,D.L. et al(1985)J.Immunol.135：1530-1535]。モノクローナル抗体については、ＨＡＭＡ反応を低減させようと多数の技術が開発されている[WO 89/09622；EP 0239400；EP 0438310；WO 91/06667]。これらの組換えＤＮＡ手法は、一般に最終的な抗体コンストラクトにおいてマウス遺伝子情報を低減させる一方、最終コンストラクト中のヒト遺伝子情報を増加させるものである。それにもかかわらず、得られた「ヒト化」抗体は、依然として患者に免疫反応を誘発する場合があった[Issacs J.D.(1990)Sem.Immunol.２：449,456；Rebello,P.R. et al(1999)Transplantation 68：1417-1420]。
【０００３】
抗体は、治療剤として投与した際にそれに対して免疫反応が発動し得る唯一の種類のポリペプチド分子ではない。ヒトに由来する、しかも人体内に存在するのと同じアミノ酸配列を有するタンパク質でさえ、人体内で免疫反応を引き起こすことがある。顕著な例としては、とりわけ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子[Wadhwa,M. et al(1999)Clin.Cancer Res.５：1353-1361]やインターフェロンアルファ２[Russo,D. et al(1996)Bri.J.Haem.94：300-305；Stein,R. et al(1988)New Engl.Med.318：1409-1413]の治療上の使用が挙げられる。これらのヒトタンパク質が免疫原性であるような状況では、これらの被験者においてこれらのタンパク質に対しそうでなければ作動しているであろう免疫寛容が壊れていると推定される。
【０００４】
タンパク質の構成上の不足がある場合、例えば、タンパク質の構成的欠如がある遺伝病などでヒトタンパク質が置換療法として投与されている場合(血友病Ａ、クリスマス病、ゴーシェ病および他の多数の疾病の場合などこうしたケースがあり得る）、この状況は異なる。そのような場合、治療用置換タンパク質は、最初から外来分子として免疫学的に機能し得る。また、個体が治療剤に対する免疫反応をマウントし得る場合、治療効果は著しく弱められるであろう。
【０００５】
治療タンパク質が宿主の免疫系によって外来分子と見なされるか、あるいは、分子に対する既存の耐性が克服されるかどうかに関わらず、タンパク質への免疫反応のメカニズムは同じである。免疫反応誘導の鍵は、ＭＨＣクラスII分子上での提示を介してＴ細胞活性を刺激し得るペプチド、いわゆる「Ｔ細胞エピトープ」がタンパク質内に存在することである。このようなＴ細胞エピトープは、ＭＨＣクラスII分子に結合する能力を備えた任意のアミノ酸残基配列として一般に定義される。暗黙にではあるが、「Ｔ細胞エピトープ」は、ＭＨＣ分子に結合する際、Ｔ細胞レセプター(ＴＣＲ)によって認識され、少なくとも原理的には、ＴＣＲと結びつきＴ細胞応答を促進することによって、これらＴ細胞の活性化を引き起こし得るエピトープを意味する。
【０００６】
ＭＨＣクラスII分子は、ヘルパーＴ細胞の選択および活性化に中心的な役割を果たす高度に多型的なタンパク質のグループである。ヒトの白血球抗原グループＤＲ(ＨＬＡ−ＤＲ)はこのグループタンパク質で優性なアイソタイプである。しかし、アイソタイプＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ−ＤＰも同様の機能を果たし、本発明は、ＤＲ、ＤＰまたはＤＱ ＭＨＣクラスIIの範囲内で提示されたＴ細胞エピトープの検出に適用可能である。ヒト集団では、個体は２〜４個のＤＲ対立遺伝子、２個のＤＱおよび２個のＤＰ対立遺伝子を有する。多数のＤＲ分子の構造が解明されており、これらは、ペプチドの疎水性残基(ポケット残基)と結合する多数の疎水性ポケットを有する開放端のペプチド結合溝として現われる[Brown et al Nature(1993)364：33；Stern et al(1994)Nature 368：215]。クラスII分子の様々なアロタイプを識別する多型は、ペプチド結合溝内の様々な異なるペプチド結合表面に寄与し、集団レベルで外来タンパク質を認識し病原性有機体への免疫反応を引き起こす能力に関する最大の柔軟性を保証する。
【０００７】
本発明の対象であるタンパク質などの治療のタンパク質に対する免疫反応は、ＭＨＣクラスIIペプチド提示経路経由で進行する。ここに外来タンパク質は、ＤＲ、ＤＱまたはＤＰタイプのＭＨＣクラスII分子と連携した提示のために飲み込まれ処理される。ＭＨＣクラスII分子は、とりわけマクロファージおよび樹状細胞などの専門的な抗原提示細胞(ＡＰＣ)によって発現される。Ｔ細胞表面上の同族のＴ細胞レセプターによるＭＨＣクラスIIペプチド複合体の結合は、ＣＤ４分子などの他のある種のコレセプターの相互結合を伴って、Ｔ細胞内での活性化状態を引き起こすことができる。活性化は、サイトカインの放出をもたらし、Ｂ細胞などの他のリンパ細胞をさらに活性化して抗体を産生するか、完全な細胞性免疫反応としてＴリンパ球を活性化する。
【０００８】
Ｔ細胞エピトープ識別はエピトープ除去に向けての最初のステップである。しかし、当技術分野において、エピトープ識別およびエピトープ削除が単一のスキームに統合される明瞭なケースはほとんどない。したがって、W098/52976とW000/34317は、ポリペプチド配列を、ヒトのＭＨＣクラスII ＤＲアロタイプのサブセットに結合する能力を有するポリペプチドを識別するための計算によるスレッディング(computational threading)手法を教示する。これらの教示では、予想されたＴ細胞エピトープは、対象タンパク質で慎重なアミノ酸置換を用いることによって除去される。
【０００９】
しかし、このスキームおよびエピトープ識別のための他の計算に基づく手順[Godkin,A.J. et al(1998)J.Immunol.161：850-858；Sturniolo,T. et al(1999)Nat.Biotechnol.17：555-561]によってＭＨＣクラスII分子に結合し得ると予測されたペプチドも、すべての状況において、特にin vivoでは、処理経路その他の現象のため、Ｔ細胞エピトープとして機能し得るとはかぎらない。さらに、Ｔ細胞エピトープ予測に対する計算アプローチは、一般にＤＰまたはＤＱ制限を備えたエピトープを予測することができなかった。
【００１０】
同様に、例えば、合成ペプチドがＭＨＣクラスII分子に結合する能力を測定するin vitroの方法、例えば、定義されたＭＨＣアロタイプのＢ細胞系をＭＨＣクラスII表面結合源として使用すること[Marshall K.W. et al.(1994)J.Immunol.152：4946-4956；O'Sullivan et al(1990)J.Immunol.145：1799-1808；Robadey C. et al(1997)J.Immunol.，159：3238-3246]が、ＭＨＣクラスIIリガンド識別に適用され得るかもしれない。しかし、そのような技術は、広く様々なＭＨＣアロタイプに対する多重潜在的なエピトープをスクリーニングするのには適していないし、それらは、Ｔ細胞エピトープとしての機能するためのペプチド結合能力を確認することができない。
【００１１】
最近では、合成ペプチドとの組合せによる組換えＭＨＣ分子の可溶性複合体を開発する技術が使用されるようになっている[Kern,F. et al(1998)Nature Medicine ４：975-978；Kwok,W.W. et al(2001)TRENDS in Immunol.22：583-588]。これらの試薬および手順は、ヒトまたは実験動物被験体に由来する末梢血液試料から、特定のＭＨＣペプチド複合体を結合し得るＴ細胞クローンの存在を識別するために使用されるが、広く様々なＭＨＣアロタイプに対する多重潜在的なエピトープをスクリーニングするのには適していない。
【００１２】
Ｔ細胞活性化の生物学的アッセイは、依然として、試験ペプチド／タンパク質配列が免疫反応を生起する能力を測定するための最良の実際的な選択肢である。この種のアプローチの例としては、バクテリアのタンパク質スタフィロキナーゼ(protein staphylokinase)に対するＴ細胞増殖アッセイを使用し、続いてＴ細胞系を刺激するために合成ペプチドを使用してエピトープマッピングを行うPetraらの仕事が挙げられる[Petra,A.M. et al(2002)J.Immunol.168：155-161]。同様に、破傷風毒素タンパク質の合成ペプチドを使用するＴ細胞増殖アッセイは、毒素の免疫優性エピトープ領域の定義をもたらした[Reece J.C.et al(1993)J.Immunol.151：6175-6184]。WO99/53038は、ヒト免疫細胞の単離されたサブセットを使用し、対象合成ペプチドの存在下においてin vitroでのその細胞の分化および培養を促進して試験タンパク質におけるＴ細胞エピトープを決定し得るアプローチ、およびＴ細胞中での任意の誘導された増殖の測定を開示する。同じ技術は、Sticklerらによっても記載されており[Stickler,M.M. et al(2000)J.Immunotherapy 23：654-660]、両者の例において、方法は、バクテリアのサブチリシン内のＴ細胞エピトープの検出に適用される。そのような技術は、所望の免疫細胞サブセット(樹状細胞、ＣＤ４＋、またはＣＤ８＋Ｔ細胞)を得るために、細胞単離技術の注意深い適用および多数のサイトカインを添加した細胞培養物を必要とし、多数のドナー試料を使用する迅速なスループットスクリーニングにはつながらない。
【００１３】
これらのアプローチの変法において、Hiemstraら[Hiemstra,H.S. (1997)Proc.Natl.Acad.Sci USA 94：10313-10318]は、既知のＴ細胞を刺激し得るペプチドエピトープを識別するための手順について記載しており、そのようなプロセスは、(自動)抗原が未知である自動反応的Ｔ細胞クローンの検出に価値がある。
【００１４】
上記の例およびin vitroでのＴ細胞活性化事象を測定するテーマに関する技術的な変法(通常は、誘導された増殖反応の測定による)を含む他の生物学的アッセイは、多い。しかし、こうした手順のいずれもヒト起源のタンパク質における生物学的に関連するエピトープの検出の一体的スキームをもたらさないし、ＭＨＣアロタイプの広範な集団に意味のあるエピトープの検出に容易には適用可能ではない。本発明はそのようなスキームを提供するために案出されたものであり、所与の、基本的には治療上価値があるが、本来的には免疫原性であるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質からのＴ細胞エピトープの識別および削除のために基礎を提供する。
【００１５】
要約して言えば、本発明は下記の点に関する：
・ナイーブＴ細胞アッセイにおいて、タンパク質、特に治療タンパク質の免疫原領域(複数を含む)をマッピングするために合成ペプチドのパネルを使用すること(ここでタンパク質はヒトタンパク質である)；
・治療タンパク質の免疫原領域(複数を含む)の微細マッピングするために、リコールアッセイにおいて合成ペプチドのパネルを使用すること；
・in vitroにおいて最小の免疫原性を表示する変異体を選択するために全タンパク質変異体のパネルを使用すること；
・in vitroにおいて最小の免疫原性を表示するペプチド配列を選択するために合成ペプチド全変異体のパネルを使用すること；
・ナイーブＴ細胞アッセイにおいて、2.0未満の、好ましくは1.8未満の刺激指数を示すペプチド配列を選択するためにＴ細胞刺激の生物学的分析を使用すること；
・ナイーブＴ細胞アッセイにおいて、2.0未満の、好ましくは1.8未満の刺激指数を示すタンパク質変異体を選択するためにＴ細胞刺激の生物学的分析を使用すること；。
【００１６】
・治療分子の免疫原領域(複数を含む)をマッピングするために、Ｔ細胞系を、予め治療タンパク質を受けた個体から発生させる方法およびそれらの細胞系の使用；
・治療分子の免疫原領域(複数を含む)をマッピングするために、さらに、予め治療タンパク質を受けた個体から発生させたＴ細胞系と平行にＢ細胞系を発生させる上記による方法；
・同じ個体に由来するＴ細胞系の発生と平行して予め治療タンパク質を受けた個体から発生させたＢ細胞系の、Ｔ細胞刺激のさらなる繰り返しにおける自己由来ＡＰＣ源としての、また場合によっては合成ペプチド結合アッセイのための結合表面としての使用；
・健常なドナーから単離されたＰＢＭＣを使用する被験タンパク質Ｔ細胞エピトープマップの構築および以下のステップを含むスクリーニング方法：
i)７日以内の培養期間の間、合成ペプチドまたは全タンパク質免疫源を使用する、in vitroでの抗原プライミング；
ii)ＩＬ−２の添加および３日間以内の培養；
iii)プライミングＴ細胞の照射された自己由来ＰＢＭＣへの添加およびさらに４日間の培養期間中に行う抗原による再チャレンジ、ならびに
iv)Ｔ細胞活性化、例えば、任意の適当な方法による増殖指数の測定；。
【００１７】
・被験タンパク質またはその誘導体に対して確立された免疫反応の存在する患者から単離されたＰＢＭＣの使用および以下のステップを含むスクリーニング方法の適用による被験タンパク質のＴ細胞エピトープマップの構築：
i)７日以内の培養期間の間、合成ペプチドまたは全タンパク質免疫源を使用する、in vitroでの抗原プライミング、ii)
ii)ＩＬ−２の添加および３日間以内の培養、iii)
iii)プライミングＴ細胞の照射された自己由来ＰＢＭＣへの添加およびさらに４日間の培養期間中に行う抗原による再チャレンジ、ならびに
iv)Ｔ細胞活性化、例えば、任意の適当な方法による増殖指数の測定；
・対象タンパク質に対して確立した免疫反応を有する、健常なドナーまたは患者から得たＰＢＭＣ試料に由来するポリクローナルもしくはモノクローナルな細胞系を有効に利用するＴ細胞エピトープマップの構築。ＩＬ−２+/-フィトヘムアグルチニン(ＰＨＡ)または他の細胞分裂促進性の刺激の存在下、１回または複数回のプライミングステップによって免疫学的にプライミングされた状態に前記細胞系を増殖させ、拡大された細胞数において完結させること。前記プライミングさせた細胞を個別の合成ペプチドまたは多数の合成ペプチドを含むペプチドプールのいずれかと接触させ、刺激を受けて増殖した細胞系を何らかの適当な手段を使用して検出する。プールされたペプチド免疫原から刺激が検出された場合は、刺激ペプチドの同一性を、個別のペプチドまたはより小さなペプチドプールおよびさらにプライミングした細胞によるスクリーニングの繰り返しをさらに使用して明らかにする；
・ナイーブＴ細胞活性化アッセイと１または複数のＭＨＣアロタイプへのペプチドリガンドの結合をシミュレートする計算スキームとを使用するタンパク質配列中にＴ細胞エピトープの位置をマッピングする協同的方法；。
【００１８】
・以下のステップを含むタンパク質配列中にＴ細胞エピトープを位置付ける方法；
i)Ｔ細胞を活性化し得るエピトープ領域を識別するための、ナイーブＴ細胞活性化アッセイおよび対象タンパク質配列を集合的に包含する合成ペプチドの使用；
ii)ステップ(i)において識別されたエピトープ領域を分析し、それによりエピトープ領域内のＭＨＣクラスIIリガンドを識別するための、１または複数のＭＨＣアロタイプとのペプチドリガンドの結合をシミュレートする計算スキームの使用；
iii)もはやＭＨＣクラスIIを結合しないか、より少数のＭＨＣアロタイプにより低い親和性で結合する、エピトープ領域(複数も含む)内に包含されるＭＨＣリガンドの配列アナログを識別する１または複数のＭＨＣアロタイプとのペプチドリガンドの結合をシミュレートする計算スキームの使用；
iv)ナイーブＴ細胞活性化アッセイおよび対象タンパク質内に識別されるエピトープ領域を完全にまたは集合的に包含する合成ペプチドの使用ならびに野生型の(親)配列と平行してナイーブＴ細胞活性化アッセイにおいて配列アナログを試験すること；
・ステップ(ii)および(iii)がWO 02/069232によって教示される計算上のアプローチを使用して実行される上記スキームによる方法；
・約20人以上の無関係なドナーに由来するＰＢＭＣ細胞を使用して、ナイーブＴ細胞活性化アッセイを行う上記のスキームによる方法；
・２以上の独立したドナー試料中で約2.0の刺激指数スコアが観察される場合に、Ｔ細胞エピトープの位置が見出される上記スキームによる方法；
・２以上の独立したドナー試料中で約2.0の刺激指数スコアが観察されるときであって、計算システムを使用して同じ配列場所内に１または複数のＭＨＣクラスIIリガンドを識別することができる場合に、Ｔ細胞エピトープの位置が見出される上記スキームによる方法；。
【００１９】
・WO 02/069232によって教示される計算上のアプローチを使用して実行される上記スキームによる方法；
・免疫反応を促進する能力が低減したタンパク質配列の識別は、上記スキームの免疫学的にプライミングされた細胞および多数の変異体ペプチドまたは全タンパク質抗原が野生型の配列のみを含む参照ペプチドプールまたは全タンパク質抗原と平行して試験されるスクリーニングプロセスを使用して達成され得る。参照プールまたは野生型タンパク質に対してより低い刺激指数を有するペプチドまたはタンパク質変異体を、さらなる分析のために選択する；
・免疫反応を促進する能力が増加したタンパク質配列またはタンパク質調製物の識別は、上記スキームの免疫学的にプライミングされた細胞および１または複数のペプチドまたは全タンパク質抗原が既知のin vitro免疫反応を与える参照ペプチドプールまたは全タンパク質抗原と平行して試験されるスクリーニングプロセスを使用して達成され得る。参照調製物に対して異なる刺激指数プロフィールを生起することが示されたペプチドまたはタンパク質調製物を、さらなる分析のために選択するか、または生産工程から除去してもよい；。
【００２０】
・ナイーブＴ細胞アッセイにおいて1.8を超える、好ましくは、2.0を超える刺激指数を生起することができ、任意の治療タンパク質から選択されるペプチド配列；
・ナイーブＴ細胞活性化アッセイにおいて1.8を超え、好ましくは、2.0を超える刺激指数を生起することができ、任意の治療タンパク質から選択されるペプチド配列(ここで、ペプチドは最小限修正され、ナイーブＴ細胞活性化アッセイにおいて試験され、2.0未満の刺激指数を有することが見出されている)；
・野生型のタンパク質配列と100％のアミノ酸同一性を共有し、Ｔ細胞アッセイにおいて1.8以上、好ましくは2.0を超える刺激指数を生起し得るペプチド配列；
・免疫原領域がＴ細胞アッセイを用いてマッピングされ、次いで、Ｔ細胞アッセイにおける再試験時に、修正されたタンパク質分子が、親(未修正)分子より小さく最も好ましくは2.0未満である刺激指数を生起するタンパク質分子。
【００２１】
(発明の詳細な説明)
本発明の第１の実施形態によれば、万一そのタンパク質がヒト被験者に未修飾状態で導入された場合、Ｔ細胞駆動された免疫反応を生起し得る決定基がその配列内に存在するかによりタンパク質抗原がスクリーニングされ得る方法が提供される。これにより、この方法は、タンパク質が、獲得した疾病状態の治療のために供給されることになっている場合、かつ、そのタンパク質がヒトタンパク質であり得る場合、ヒトにおいて治療可能性のあるタンパク質においてＴ細胞エピトープを識別するための予測ツールを提供する。
【００２２】
特に、マップが、可能なＭＨＣアロタイプの広いスペクトルに関連がある場合、対象タンパク質のエピトープマップを提供することが望まれる。マップは、修飾されたタンパク質の設計または選択を可能にする十分な典型であり、タンパク質がＴ細胞駆動される免疫反応を生起する能力が、そのタンパク質が投与されるであろう大多数の患者について除去されているか少なくとも軽減されていることが望まれる。したがって、本発明の実行においては、ナイーブなドナー由来のＰＢＭＣ駆動されるＴ細胞を利用するスクリーニング方法は、ヒト集団において、ＭＨＣクラスIIレパートリー(ＨＬＡ−ＤＲ)の少なくとも90％以上(好ましくはそのレパートリーの95％を超えて現存する)の試料を提供するのに十分な免疫学の多様性のあるドナーのプールから集められる。理想的状態では、99％を超える表現に等しいことが好ましいが、この理想の達成には実際的な制限があることは認識される。したがって、所与の合成ペプチドに対してナイーブＴ細胞応答が検出されるべき場合、ペプチドは、実際上は、多数の独立したドナーに由来するＰＢＭＣ調製物に接触させられるであろう(ドナー、または本願ではより好ましくは「ドナープール」と称するが、その数は、実際上は20未満の無関係な個人(予めそれらのＭＨＣクラスIIハロタイプによって選択される)であろう)。
【００２３】
「ナイーブなドナー」という用語は、本発明の文脈では、個体から得られたＴ細胞がそれ以前に対象タンパク質またはペプチド抗原に暴露されたことがなく、タンパク質抗原がヒトタンパク質である場合、個人はそのタンパク質をいかなる治療すなわち外生源から受けたことがないことを意味する。
【００２４】
したがって、本発明の第１の実施形態によれば、免疫学的にナイーブなＴ細胞を利用するＴ細胞エピトープのマッピング方法が提供される。Ｔ細胞は、複数の異なる健常なドナーから得た末梢血液試料から提供され、彼らにとって対象タンパク質は内生的な分子であってもよいが、ドナーは何らかの外生的な出所から対象タンパク質の受けた(例えば、治療のために投与を受けた)ことがないものである。
【００２５】
アッセイは、当技術分野で普通の手順を使用してin vitroで培養したＰＢＭＣを使用して行い、ＰＢＭＣを対象タンパク質を代表する合成ペプチド種に接触させ、適当な期間インキュベーションした後、細胞増殖などペプチドにより誘導されるＴ細胞活性化の測定を含む。測定は任意の適当な手段により、例えば、3Ｈ−チミジン取り込み(それによって細胞物質中への3Ｈの蓄積が機器的に容易に測定される)によって行うことができる。ＰＢＭＣ試料と合成ペプチドの各組合せの細胞増殖の程度を、ペプチド処理していないＰＢＭＣ試料で見られるそれに比べて検討する。増殖効果が予期されるペプチド(複数可)での処理後に見られる増殖応答に対して標準をとってもよい。この点で、既知の広いＭＨＣ制限を備えたペプチド、特にＤＰまたはＤＱのアイソタイプへのＭＨＣ制限を備えたペプチドエピトープを使用するのが特に有利であると考えられる。
【００２６】
所与の対象タンパク質についてのエピトープマップの作成を容易にするために、タンパク質配列を代表する１セットの合成ペプチドを生産する。本発明のスキームの下での典型的な分析は、15アミノ酸残基を含むペプチドの使用を含むが、９アミノ酸残基以上を含むペプチドが原則として適当なペプチドであることは認識されるであろう。15アミノ酸残基を大きく超過するペプチドも使用できるが、細胞内処理のもたらし得る２次構造の影響または複合体がペプチドが引き起こす増殖応答の能力を不明瞭にするかもしれないことは等しく認識されるであろう。所与のタンパク質の全長さを走査するため、特に便利なスキームは、長さが各々15アミノ酸残基の合成ペプチドであって、各々、連続する次のペプチドと12アミノ酸残基重複するもの(すなわち、連続する各ペプチドは分析にさらなる３アミノ酸を漸増的に加えたもの)を生じることである。このようにして、任意の隣接するペアペプチドは、対象タンパク質中の連続する配列の18アミノ酸をマッピングするであろう。したがって、ｎアミノ酸残基を含む対象タンパク質については、前記タンパク質の完全な走査のために必要な15-merの合成ペプチドの数は、１＋(ｎ−12)／３となるであろう。他のスキームも考えられるが、等しく効果があるかもしれない。
【００２７】
上に概説し、本願実施例に詳細に例証するスキームを使用して、本発明者らは、異なる個々の健常なドナーから得たナイーブＰＢＭＣにおいて増殖応答を生起し得るタンパク質配列の領域を発見した。問題のタンパク質配列は、免疫寛容の期待があり得るが、それでも、そこで代理免疫反応をin vitroで生起する実証可能な能力のある、全ヒトタンパク質に由来する配列ストリングである。万一問題のタンパク質のいずれかが、例えば治療の実体として投与されるのであれば、伸長によるこの能力はin vivoでも当てはまるかもしれない。具体的には、これらのタンパク質はインターフェロンα２とインターフェロンβである。これらのタンパク質は両方とも治療上使用され、その両者にとって重要なことに、患者においてこれらの分子両者に対し著しく免疫原性であることが記録されている[Russo,D. et al(1996)ibid；Stein,R. et al(1988)ibid；Myhr，K.M. et al(2000)Neurology 55：1569-1572；Bertolotto,A. et al(2000)Immunopharmacology48：95-100]。
【００２８】
したがって、本発明は、正常なヒトタンパク質内のエピトープ領域の解明のために一般化されたスキームを提供し、健常なドナーに由来するナイーブＰＢＭＣにおけるin vitroの増殖応答を生起するこれらのタンパク質に由来するペプチドの能力を実証する。
【００２９】
第１の実施形態のナイーブＴ細胞アッセイを使用してＴ細胞マップを定義する特に有効な方法は、実施例１および２に示され、それによって分子インターフェロンβ(ＩＦＮβ)およびインターフェロンα２(ＩＦＮα２)の免疫原領域が開示される。in vivoで弱く免疫原性であるタンパク質におけるＴ細胞エピトープ識別のための特に好ましい方法は、実施例３に記載される。
【００３０】
第２の実施形態では、本発明はＴ細胞エピトープマップを解明するが、そのようなマップは修飾タンパク質の設計をガイドするために使用でき、それによって分子上のエピトープ領域が適当に修飾され、それらは本発明のスキームによって増殖応答を生起することがもはやできなくなり、したがって、対象タンパク質はヒトに対して免疫原性が低下する。
【００３１】
この第２の実施形態によれば、タンパク質への適当な修飾は、特定の残基または残基の組合せのアミノ酸置換を含んでもよい。Ｔ細胞エピトープの除去のためには、好ましくは、Ｔ細胞エピトープ活性の実質的な低減または除去を達成すると予側されるペプチド配列内の適当なポイントでアミノ酸置換がなされる。実際上、適当なポイントは、好ましくは、ＭＨＣクラスII結合溝内に提供されるポケットのうちの１つの中で結合するアミノ酸残基と一致するであろう。ペプチドのいわゆる「ＰＩ」または「ＰＩアンカー」位置の裂け目の第１ポケット内の結合を変更することが最も好ましい。ペプチドのＰＩアンカー残基と、ＭＨＣクラスII結合溝の第１のポケットの間の結合相互作用の質は、ペプチド全体についての全面的な結合親和性の主な決定基であると認められる。ペプチドのこの位置での適当な置換は、残基をポケット内により収容されにくくするであろう(例えば、親水性のより大きな残基への置換）。ＭＨＣ結合裂け目内の他のポケット領域内に結合することと一致する位置でのペプチド中のアミノ酸残基も考えられ、本発明の範囲に入る。
【００３２】
所与の潜在的なＴ細胞エピトープ内の単一アミノ酸置換が、エピトープを除去し得る最も好ましいルートであると理解される。単一エピトープ内の置換の組合せも考えられるし、例えば、個々に定義されたエピトープが互いに重複する場合は、特に適当であり得る。さらに、アミノ酸置換は、所与のエピトープ内における単一の置換であれエピトープ内の組合せであれ、ＭＨＣクラスII結合溝に関して「ポケット残基」と一致する位置でなく、ペプチド配列内の任意のポイントで行うことができる。置換は、当技術分野で知られているインシリコ技術を用いて生成した相同構造または構造的方法を参照して行うことができるし、分子の既知の構造の特徴に基づいてもよい。例えば、変異体分子について構造や生物学的活性を回復させるために変更を考えることができる。そのような補償的変更(複数箇所でもよい)は、ポリペプチドからの特定のアミノ酸残基の除去や追加を含むものでもよい。
【００３３】
タンパク質分子からエピトープを除去する特に有効な手段は本願に概説するようなナイーブＴ細胞活性化アッセイスキームとWO 02/069232(参照によって全体が本願に組み込まれる)に記載されたスキームによって開発されたインシリコツールとの協同的使用である。
【００３４】
ソフトウェアは、ペプチドＭＨＣクラスII結合相互作用のレベルでの抗原提示のプロセスをシミュレートして任意の所与のペプチド配列に対する結合スコアを与える。集団に現存する優勢なＭＨＣクラスIIアロタイプの多くについてそのようなスコアが決定される。このスキームはいかなるペプチド配列も試験できるので、ペプチドがＭＨＣクラスII結合溝と相互作用する能力についてのアミノ酸置換、付加物または除去の結果を予測できる。したがって、ＭＨＣクラスIIと相互作用することができ、かつそれによって免疫原性Ｔ細胞エピトープとして機能し得るペプチドの数の減少を含む新しい配列構成を設計することができる。与えられる任意のドナー試料を使用する生物学的アッセイが最大４個のＤＲアロタイプへの結合を評価し得る場合、インシリコプロセスで＞40個のアロタイプを同時に使用して、同じペプチド配列を試験できる。実際上、このアプローチは、多数のＭＨＣアロタイプと相互作用するその能力が弱められた新しい配列変異体の設計に用いることができる。
【００３５】
エピトープ識別と除去の組合せ法の有用性の例として、ヒトインターフェロンアルファ(ＩＦＮα)の遺伝子操作を含むプログラムの結果を本願において提示する。ヒトＩＦＮα配列全体を、１セットの51個の15merペプチド(実施例２の表２に挙げる)に翻訳した。Ｔ細胞アッセイは分子内に３つの免疫原性領域(Ｒ１、Ｒ２およびＲ３と名付けられた)を定義することができ、WO02/069232のスキームによるソフトウェアシステムは、エピトープＲ１からＲ３の各々に予言されたＭＨＣクラスIIリガンドを識別することができた。さらに、システムは、ペプチド配列とシステムで提示される実質的にすべてのＭＨＣクラスIIアロタイプとの間の結合親和性の顕著な喪失をもたらす、エピトープ内のアミノ酸置換をさらに識別できた。野生型のエピトープ領域およびＭＨＣクラスII結合をアミノ酸置換によって除去したその変異体配列を包含する合成ペプチドのパネルを構築した。ナイーブＴ細胞活性化アッセイにおいてこれらのペプチドを用い、各ペプチドとドナーＰＢＭＣ試料との組合せについて刺激指数を決定した。ドナー試料が野生型のペプチドに応答すると見出された、すべての例において、変異体ペプチドはＴ細胞(図３)を活性化しないことが見出された。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態は、試験タンパク質またはペプチドを加えた後、異なるときにＴ細胞応答の測定を行う修正されたＴ細胞活性化アッセイを使用することである。アッセイのためのこの新規なフォーマットは、全タンパク質または弱い免疫原性ポリペプチドのＴ細胞応答を見出すのに特に有用である。アッセイフォーマットは、白血球およびサイトカインを含む種々の分子を含有するＴ細胞アッセイ混合物中の成分の複雑さを打ち消す。任意の試験タンパク質またはペプチドについては、アッセイにおけるＴ細胞応答の動力学は、Ｔ細胞アッセイ混合物内のＴ細胞の状態(例えばメモリＴ細胞対ナイーブＴ細胞)、様々な時点でのサイトカイン濃度、および特定のペプチド−ＭＨＣクラスII複合体の濃度などの要因による顕著なＴ細胞増殖を生成する速度を含む多数の要因に依存する。所与のタンパク質またはペプチドについては、アッセイシステムにおけるＴ細胞増殖のピークは、アッセイ混合物へのタンパク質またはペプチドの添加後、７日前後にピークに達し、７日目(標準的なアッセイ時点)までには、Ｔ細胞増殖は顕著ではなくなっている。Ｔ細胞増殖を経時的に、例えば、４、５、６、７、８および９日目の各々において試験することによって、７日目では必ずしも検出されないＴ細胞応答を検出することができる。経時的Ｔ細胞アッセイの例を実施例３に示す。タンパク質全体については、経時的Ｔ細胞アッセイがＴ細胞免疫性の鋭敏な分析となり、したがってタンパク質についての鋭敏な免疫原性スクリーニングとなる。さらに、実施例３において実証されるように、このアッセイは免疫原性に対するアミノ酸置換の影響を試験するためにも使用できる。
【００３７】
エピトープマッピングと生物学的原理に基づくＴ細胞活性化アッセイを用いた再試験と協働して、ＭＨＣクラスIIリガンドの識別のためのインシリコツールとＭＨＣクラスIIリガンドを欠く配列アナログの設計を使用する組合せ法は、特に有効であり、本発明において最も好ましい実施形態である。この最も好ましい実施形態による一般的な方法は以下のステップを含む：
i)Ｔ細胞を活性化し得るエピトープ領域を識別するための、ナイーブＴ細胞活性化アッセイおよび対象タンパク質配列を集合的に包含する合成ペプチドの使用；
ii)ステップ(i)において識別されたエピトープ領域を分析し、それによりエピトープ領域内のＭＨＣクラスIIリガンドを識別するための、１または複数のＭＨＣアロタイプとのペプチドリガンドの結合をシミュレートする計算スキームの使用；
iii)もはやＭＨＣクラスIIを結合しないか、より少数のＭＨＣアロタイプにより低い親和性で結合する、エピトープ領域(複数も含む)内に包含されるＭＨＣリガンドの配列アナログを識別する１または複数のＭＨＣアロタイプとのペプチドリガンドの結合をシミュレートする計算スキームの使用；
iv)ナイーブＴ細胞活性化アッセイおよび対象タンパク質内に識別されるエピトープ領域を完全にまたは集合的に包含する合成ペプチドの使用ならびに野生型の(親）配列と平行してナイーブＴ細胞活性化アッセイにおいて配列アナログを試験すること；
高い程度の確実性をもって、ＩＦＮなどの任意のヒトタンパク質について、許容可能なＭＨＣクラスリガンドの母集団を含むすべてのペプチドのデータセットを定義するためにWO 02/069232に概説されたソフトウェアスキームを使用し得ると理解される。in vivoでの免疫原性ペプチドの提示に結びつく、タンパク質分解を生ずる処理および他の生理学的ステップに対する要求などの理由のために、ペプチドの全レパートリーの比較的小さなサブセットが、最終的に生物学関連性を有するであろうことは明らかであろう。そのような状況において、本発明者らは、生物学的に関連のあるペプチドを識別するために、ex vivoでのヒトＴ細胞活性化アッセイを使用し得ることを確証した。したがって、in vitroで培養されるヒトＴ細胞中での増殖応答を生起するその能力に関して合成ペプチドを試験する。健常なドナーから得られたナイーブなヒトＴ細胞を使用して、この種のアプローチを行う場合、本発明者らはそのようなアッセイの操作において、2.0以上の刺激指数が誘導された増殖の有用な手段であることを確立した。刺激指数(ＳＩ)は、慣用的に、試験ペプチドに対して測定された増殖スコア(例えば3Ｈ−チミジン組み込みを使用する場合、放射能の１分当たりカウント)を試験ペプチドと接触させていない細胞において測定されたスコアで割ることにより得られる。応答を生起しないペプチドはＳＩ＝1.0を与えるが、実際的には0.8〜1.2の範囲内のＳＩ値は際立ったものではない。記録されたスコアに対する確信を保証するために、多数の技術的な手順がそのようなアッセイの操作に組み込まれ得る。典型的には、すべての測定は少なくとも３重になされ、平均スコアを計算することができる。計算されたＳＩ＝＞2.0である場合、３重の個別スコアは異常値の証拠があるかどうか検討することができる。同様に、大多数のＰＢＭＣドナー試料が応答するであろうと予想される対照ペプチドの包含は、各アッセイプレートに含まれ得る。インフルエンザウイルス血球凝集素ペプチド307-309、配列ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡ）；およびクラミジアＨＳＰ 60ペプチド配列ＫＶＶＤＱＩＫＫＩＳＫＰＶＱＨは特に適当な対照ペプチドであるが、他の多くの例も利用できるであろう。また、好ましくは、アッセイは、キーホールリンペット由来のヘモシニアン(これに対しては、すべてのＰＢＭＣ試料が2.0を超えて顕著なＳＩを示すと予想される)などの有力な全タンパク質抗原を使用するべきである。
【００３８】
本発明のスキームによれば、単一のアミノ酸置換であれ、いくつかの他の変更または変更の組合せであれ、修飾により、Ｔ細胞活性化効果を誘導するペプチド(複数の場合も含む)の能力を喪失させるか少なくとも低減させることを確実にするために、実質的に同一のペプチド配列の多数のバージョンを試験する実際的必要があるかもしれない。多くの様々な実際的なアプローチを使用することにより、この要求は満たされ得るが、その１つとしては、最初から多数の様々なペプチドのスクリーニングを行い、それらの親の(例えば、野生型)ペプチド配列に対して増殖誘導能力が縮小されているか存在しないようなものを識別する選択スキームを行うことが挙げられるであろう。このようなアプローチは、ナイーブなＰＢＭＣ試料を完全に使用して行うことができ、マッピング作業を同時に(すなわち、平行して)実行することができるであろう。このアプローチは合成ペプチド種のスクリーニングに限定される必要はなく、全タンパク質分子(例えば、そこから所望のメンバーが選択されるべき変異体の「ライブラリー」として生産される多数の変異体を含み得る)のスクリーニングに利用され得ることが理解される。このようなライブラリーは、例えば、当技術分野でよく知られた組換え手段によって生産され得るし、あるいは、例えば、コンビナトリアルケミストリーの原理を用いた合成手段を使用して生産した種を含み得る。いずれにせよ、この文脈におけるライブラリーメンバーから選択される所望の性質は、ＰＢＭＣ調製物中では増殖応答を引き起こす無能力となるであろう。
【００３９】
あるいは、試料の完全に異なるドナープールに由来するナイーブＰＢＭＣを使用して変異体ペプチドをスクリーニングすることができる。すなわち、ほとんどまたは全く増殖誘導のないと予想される修飾ペプチドを使用することを除いてエピトープマッピングを繰り返す。
【００４０】
別の特に好ましいスキームは、免疫学のリコールアッセイフォーマットにおける増殖効果を誘導するその能力についての修飾されたペプチドの試験を含むであろう。これは、例えば、既知の応答ドナーから得た初期のナイーブなＰＢＭＣアッセイ過程で識別されたＰＢＭＣを使用し、合成ペプチド(例えば、プールの中で)または全タンパク質のいずれかを用いてこれらの細胞を刺激し、その後、ＩＬ−２などのサイトカインの存在下、適当な期間培養を行うことで達成できる。このインキュベーションに続いて、合成の(修飾された)ペプチドまたは修飾された対象タンパク質全体を使用して、培養物を再度刺激し、適当な手段も使用して増殖効果を測定してもよい。本発明者らは「リコール」アッセイとしてこのアッセイフォーマットを分類した。これは、増殖応答の原因であるＴ細胞集団が再刺激過程において起動されるためである。
【００４１】
リコールタイプアッセイは、in vivoで弱い免疫原性を示すタンパク質またはペプチド抗原中のＴ細胞エピトープの識別において特に有用であり、エピトープが、他の手段によって、例えば、計算上の手法または生物学的アッセイの使用によりもともと識別されていた場合、所与のアミノ酸配列中におけるＴ細胞エピトープの存在に補強証拠を提供する。このようなリコールアッセイの手順において、ＰＢＭＣは、健常なドナーまたは所与の治療に対して確立した免疫反応を示す患者から単離される。後の手順で抗原提示細胞(ＡＰＣ)としてそれらを使用できるように、自己由来ＰＢＭＣのアリコートを凍結させることが必要である。アッセイは抗原プライミングステップによって開始する。１つの典型的で好ましいプロトコルでは、２〜４×１０6ＰＢＭＣを24ウェルプレートの各ウェルに添加することが必要である。タンパク質全体もしくはペプチド抗原またはペプチドプールのいずれかを、典型的な濃度１〜10μｇ/ｍｌおよび１〜10μＭで細胞にそれぞれ(ペプチドプール中のペプチド濃度の合計は１μＭとなるであろう)加えられる。最終の培養ボリュームは２ｍｌである。細胞は７日間インキュベートし、７日目に10Ｕ/ｍｌのＩＬ−２を加えて細胞をさらに３日間インキュベートすると、細胞は抗ジャンルチャレンジ相の準備ができた状態となる。
【００４２】
抗原の再チャレンジにはＡＰＣとして自己由来のＰＢＭＣが必要である。ＡＰＣは、タンパク質全体または合成ペプチド抗原(例えば、濃度１〜10μｇ/ｍｌ)とともに37℃で１時間インキュベートする。ＡＰＣの増殖能力は、最も好ましくはガンマ線照射(例えば、4000rad)を丸底96ウェルプレート(１×１０5ＰＢＭＣ/ウェル)中で使用して破壊する。プライミングされた１〜10×１０4のＴ細胞をＡＰＣを含む各ウェルに加える。再チャレンジ抗原の非存在下においてガンマ線照射したＡＰＣとともに培養した抗原プライミングされたＴ細胞を含む非治療対照反応をセットアップすることが重要である。パルス増殖評価、例えば、３Ｈ−チミジン組み込みアッセイを行う前に４日間細胞をインキュベートする。細胞を多くするか精製した集団を使用して、等しくそのようなプロトコルを行い得ることが理解される。
【００４３】
第３の実施形態では、個体(遺伝病(体質性疾患)に対する治療効果のために対象タンパク質が投与されるべき個体であって、実際、個体における遺伝欠損の性質によるタンパク質抗原が外来タンパク質を構成する)においてＴ細胞免疫反応を生起し得るその配列内の決定基の有無に関してタンパク質抗原をスクリーニングし得る方法が提供される。この意味で、タンパク質はin vivoで有力な抗原を提示することが最もありそうなものであり、本発明者らは、そうした個体のＰＢＭＣからin vitroのポリクローナルまたはモノクローナルＴ細胞系を容易に確立できること、および、これらの細胞系はタンパク質内のＴ細胞エピトープのマッピングにおいて有効な試薬として使用され得ることを確証した。これは、Ｔ細胞がin vitroで抗原刺激に何回もさらされ、直後にＩＬ−２の存在によって展開される点を除いて、前述のリコール分析と実質的に同じ方法で達成される。ポリクローナルＴ細胞系の確立のためには、一般に２〜３回の抗原刺激が多数の抗原特異的細胞を生成するのに十分である。これらは多数の合成ペプチド(例えば、ペプチドプール状のもの)をスクリーニングするために使用され、それらは後日使用するために低温保存され得る。抗原とＰＢＭＣを７日間同時インキュベートする初回の抗原刺激後、後の抗原による再チャレンジは、抗原提示細胞として最も好ましくは自己由来の照射されたＰＢＭＣの存在下で実行する。抗原選択のこれらの繰り返しは３〜４日間実行し、ＩＬ−２による刺激を含む展開相を断続的に加える(これは、全９日間の間３日目ごとに加え得る)。最終的な再チャレンジは「休止した」Ｔ細胞(すなわち、ＩＬ−２刺激からほぼ４日経過していないもの)を使用して実行する。前述のようにほぼ４日間、最も好ましくは自己由来の抗原提示細胞を使用してこれらの細胞を抗原(例えば、合成ペプチドまたはタンパク質全体)により刺激し、その後(もしあれば)後の増殖応答を測定する。
【００４４】
したがって、第３の実施形態の方法は、対象となる疾病に罹患している個体から得たＰＢＭＣ試料に由来するＴ細胞系またはオリゴクローナルな培養物の生産、合成ペプチドまたはタンパク質全体とともにin vitroで前記細胞系を刺激するか培養し、(もしあれば)個々の合成ペプチドまたはタンパク質のうちのいずれかの増殖効果をin vitroで測定し、個々の合成ペプチドまたはタンパク質全体の修飾された変異体を生産し、前記修飾されたペプチドまたはタンパク質をＴ細胞系または培養で有意な増殖応答を促進する継続的な能力について再試験する。
【００４５】
遺伝子欠陥を有し、治療のための代償療法を開始し、代償療法が治療タンパク質への免疫反応の誘導をもたらした個体から得たオリゴクローナルな培養物のＴ細胞系を確立することは特に有用である。この種の被験者の顕著な例は、血友病Ａ治療を受けているが治療因子VIIIに対し測定可能な阻害抗体の顕著なタイター濃度を示す個体によってもたらされる。相当数のこれらの個体のＴ細胞レパートリーによって定義される第VIII因子タンパク質のエピトープマップは、in vivoの状況において提示され得る最も一般的なペプチドエピトープの代表になるであろうと予想され得ることから、本発明のスキームの下では、このクラスのいわゆる「阻害患者」から得たＰＢＭＣ試料を利用することが特に望まれるであろう。この意味で、事前に免疫反応があることとが示されている患者から得たＰＢＭＣは、in vivoでのプライミングステップの製品を構成し、本発明のスキームの下で特に価値がある。実施例４は、本願において、健常なドナーから得たナイーブなヒトＴ細胞および血友病Ａ患者に由来するＰＢＭＣの両者を利用するヒトFVIII上でなされるエピトープマッピングプログラムの詳細な説明を提供する。
【００４６】
事前に免疫学的に外来のタンパク質を受けた個体から得たＰＢＭＣ細胞系の使用は基本的にリコールアッセイだということを考えれば、それはさらに、任意の所与の刺激ペプチドまたはタンパク質に対する増殖反応のはるかに大きな大きさに対する能力があるという実際的な長所がある。これは、増殖測定を行う技術的困難を低減し、そのような状況で多数のエピトープが標的タンパク質に対して示されるとき、免疫優性な(immunodominant)エピトープの可能な階層性を定義する機会を与え得る。これは第VIII因子などの特に大きなタンパク質の場合に確実であるが、本願に実証するように、小さなヒトタンパク質分子(例えば、200未満のアミノ酸残基)は多数または複合体(すなわち、オーバーラップ)Ｔ細胞エピトープ内に収まると予想され得る。
【００４７】
本発明の第４の実施形態では、それによって前述のアッセイフォーマットが治療用の生体タンパク質の生産バッチのスクリーニングに適用されるスキームが提供される。そのようなスクリーニングプロセスの目的は、試験用生物の免疫原プロフィールの一貫性を確認することであり、例えば、特に生物の生産プロセスがいくつかのパラメーターによって変更されており、タンパク質の測定された物性は容認される範囲内にあるが、タンパク質の潜在的な免疫原特性が変更され得る場合に価値がある。したがって、対象分子の任意の新しい調製物に対する免疫原応答の生成を予想するために、本願で設計される方法は、そのようなスクリーニング手順を提供するのに特に有効である。
【００４８】
したがって、第４の実施形態の下で、対象タンパク質のエピトープマッピングプロセスの一部として誘導されるＴ細胞系(オリゴクローナルまたはモノクローナル)、または、場合によって、さらに、ナイーブなＰＢＭＣ調製物のパネル(それについて既知の応答性調製物の集団が確率されているもの)を用いて、in vitroでの免疫原性に関して被験タンパク質を試験してもよいし、また、試験タンパク質に対して得点された応答を、基準すなわちタンパク質の「ゴールドスタンダード」調製物と比較する。この点に関して、Ｔ細胞系を使用する場合、それは特に、参照タンパク質に対して実証された事前の免疫反応が存在する被験者に由来する細胞系を使用することが好ましい。そのような細胞系はin vitroでの抗原チャレンジにおける高い刺激指数スコアをもたらすと予想され、また、タンパク質内で最も生物学的に関連があり免疫優性なエピトープを代表するであろう。第４の実施形態の下で、これらの細胞系はエピトープの喪失／変更に指標を与える。対照的に、第４の実施形態の下では、標的タンパク質に応答するアロタイプの既知のセットを含むナイーブＰＢＭＣのパネルは、試験製品タンパク質に現われる新たな(de novo)エピトープ生成の表示を提供し、望ましくない臨床的免疫原の応答の予測においても同じく価値がある。
【００４９】
「Ｔ細胞エピトープ」という用語は、本発明についての理解によれば、ＭＣＨ IIを結合可能で、Ｔ細胞を刺激するおよび／または(必ずしも測定可能な程度に活性化せずに)Ｔ細胞を複合体中でＭＨＣ IIに結合可能であるアミノ酸配列を意味する。
【００５０】
本明細書および添付する特許請求の範囲において「ペプチド」という用語は、２個以上のアミノ酸を含む化合物である。アミノ酸はペプチド結合(以下に定義される)によって互いに連結される。ペプチドの生物学的生産に関わる20個の異なる天然アミノ酸が存在し、これらが任意の数、任意の順序で連結して、ペプチド鎖または環を形成する。ペプチドの生物学的生産で使用される天然アミノ酸はすべてＬ−配置である。合成ペプチドは、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸またはこれら２種の異なる配置のアミノ酸の様々な組合せを使用して従来の合成方法を用いて調製できる。ペプチドによっては数単位のアミノ酸しか含まないものもある。短いペプチド、例えばアミノ酸単位が10個未満のものは、時に「オリゴペプチド」と呼ばれる。他のペプチドは多数のアミノ酸残基、例えば100個以上を含み「ポリペプチド」と呼ばれる。従来、「ポリペプチド」は３個以上のアミノ酸を含む任意のペプチド鎖と考えられ、「オリゴペプチド」は通常、特に「短い」タイプのポリペプチドと見なされる。したがって、本願では「ポリペプチド」へのどのような言及もオリゴペプチドを含むと理解される。さらに、「ペプチド」へのどのような言及もポリペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質を含む。アミノ酸の個々の異なる配置は異なるポリペプチドまたはタンパク質を形成する。形成することができるポリペプチドの数、したがって異なるタンパク質の数は、実際上無制限である。
【００５１】
以下の実施例によって本発明を例証する。実施例およびこれまでの説明では以下の図を参照する：
図１は、ＩＦＮβ内の免疫原性領域を示し、ナイーブなヒトＴ細胞を刺激することができるこれらの領域から得たペプチド配列を詳しく示す。
【００５２】
図２は、ナイーブなヒトＴ細胞のin vitroでの増殖を促進することができるＩＦＮβペプチドを示す表を提示する。ドナーのうちの２名については、応答は、領域Ｒ１またはＲ２のいずれかから得た多数の重複するペプチドに記録される。エピトープ領域Ｒ１またはＲ２にマッピングされる個々の合成ペプチドに対する応答は、６名のドナーから得点される。
【００５３】
図３は、経時的Ｔ細胞活性化アッセイからの典型的なデータを示す。図はＩＦＮαに由来する合成ペプチドについて、時間(日)に対して刺激指数(ＳＩ)をプロットしたものである。Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３エピトープ領域ならびにアミノ酸置換を含むアナログペプチド配列を並行して試験した。
【００５４】
実施例１
ＭＨＣ、ペプチドおよびＴ細胞レセプター(ＴＣＲ)の間の相互作用は、Ｔ細胞認識の抗原特異性に構造的な基礎を与える。Ｔ細胞増殖アッセイによりペプチドのＭＨＣへの結合およびＭＨＣ／ペプチド複合体のＴＣＲによる認識を試験する。この実施例のin vitroでのＴ細胞増殖アッセイは、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)の刺激と関係しており、抗原提示細胞(ＡＰＣ)およびＴ細胞を含んでいる。刺激はin vitroで、合成ペプチド抗原、実験によってはタンパク質抗原全体を使用して行った。刺激されたＴ細胞増殖を、3Ｈ−チミジン(3Ｈ−Thy)を用いて測定し、取り込まれた3Ｈ−Thyの存在を洗浄した固定細胞のシンチレーションカウントを使用して評価した。
【００５５】
保存時間12時間未満のヒト血液からの軟膜層(buffy coat)を、National Blood Service (Addenbrooks病院、ケンブリッジ、英国)から得た。フィコールパック(Ficoll−paque)はAmersham Pharmacia Biotech(Amersham、英国)から得た。血清を含まず、Ｌ−グルタミン、50μｇ/ｍｌストレプトマイシン、10μｇ/ｍｌゲントマイシン(gentomycin)および0.1％ヒト血清アルブミンを含む主要ヒトリンパ細胞の培養用のＡＩＭ Ｖ培地は、Gibco−BRL(Paisley、英国)から得た。合成ペプチドは、Eurosequence(Groningen Pepcan(Netherlands(オランダ))およびBabraham Technix(Cambridge、英国)から得た。
【００５６】
軟膜層の穏やかな遠心分離により、赤血球と白血球とを血漿と血小板とから分離した。最上相(血漿と血小板を含む)を除去、廃棄した。赤血球と白血球を１：１リン酸塩バッファー食塩水(ＰＢＳ)で希釈し15ｍｌフィコールパック(Amersham Pharmacia(Amersham英国))上で層状にした。遠心分離はメーカー推奨条件によって行い、ＰＢＭＣを血清＋ＰＢＳ/フィコールパック界面から収穫した。ＰＢＭＣをＰＢＳと混合(１：１)し、遠心分離によって回収した。上清を除去、廃棄し、50ｍｌ ＰＢＳ中にＰＢＭＣペレットを再懸濁させた。細胞を遠心分離によって再びペレット化し、ＰＢＳの上清を捨てた。細胞を50ｍｌ ＡＩＭＶ培地を使用して再懸濁し、この時点で計数しトリパンブルー(trypan blue)染料排除法を使用して生細胞率(viability)を評価した。細胞を遠心分離によって再び集め上清を廃棄した。細胞は、１ｍｌ当たり３×１０7の密度で低温貯蔵用に再懸濁した。貯蔵培地は加熱不活性化したＡＢヒト血清(Sigma、Poole、英国)90％(v/v)とＤＭＳＯ(Sigma、Poole、英国)10％(v/v)とした。細胞を制御された冷凍容器(Sigma)に移し、-70℃で一夜静置した後で、長期保存のために液体窒素に移した。使用のために必要になったとき、細胞を水浴中37℃で急速解凍し、予め温めておいたＡＩＭ Ｖ培地10ｍｌに移した。
【００５７】
96ウェル平底プレート中、ＰＢＭＣを２×１０5ＰＢＭＣ/ウェルの密度で、タンパク質とペプチド抗原で刺激した。ＰＢＭＣを37℃で７日間インキュベートし、3Ｈ−Thy(Amersham-Phamacia、Amersham、英国)でパルス処理した。この研究のために、３ａａ増分によって重複させた合成ペプチド(15mers)を生成した。これはＩＦＮβの全配列にわたるものである。ペプチド識別番号(ＩＤ＃)および配列を表１に示す。
【００５８】
【表１】
2005529170.tif 000003
【００５９】
各ペプチドを、20名のナイーブドナーから分離したＰＢＭＣに対して個別にスクリーニングした。事前に免疫原性であることが示されていた２種の対照ペプチド、および強力な(potent)非リコール抗原ＫＬＨを、各ドナーアッセイで使用した。
【００６０】
この研究で使用した対照抗原は、インフルエンザウイルス血球凝集素307-319（配列：ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ）；クラミジアＨＳＰ 60ペプチド(配列：ＫＶＶＤＱＩＫＫＩＳＫＰＶＱＨ)およびキーホールリンペットヘモシニアンとした。
【００６１】
ペプチドをＤＭＳＯに最終濃度10ｍＭで溶解し、次いで、これらのストック溶液をＡＩＭ Ｖ培地で１/500に希釈した(最終濃度20μＭ)。100μｌ中の最終濃度が２μＭおよび２０μＭとなるようにペプチドを平底96ウェルプレートに加えた。解凍したＰＢＭＣの生細胞率(viability)をトリパンブルー染料排除法を使用して評価し、次いで細胞を２×１０6細胞/ｍｌの密度に再懸濁し、ペプチドを含む各ウェルに100μｌ(２×１０5ＰＢＭＣ/ウェル)を移した。三重ウェル培養を各ペプチド濃度で分析した。プレートを湿潤大気中37℃５％ＣＯ2で７日間インキュベートした。細胞を18〜21時間、１μＣｉの3Ｈ−Thy/ウェルでパルス処理し、フィルタマット上に収穫した。Wallacマイクロプレート(microplate)ベータトッププレートカウンター(Perkin Elmer)を使用してＣＰＭ値を測定した。結果は刺激指数として表わす。ここで、刺激指数(ＳＩ)は、試験ペプチドに対して測定された増殖スコア(例えば放射能の１分当たりカウント)を試験ペプチドと接触させていない細胞において測定されたスコアで割ることにより得られる。
【００６２】
Ｔ細胞増殖分析を使用してＩＦＮβ配列にＴ細胞エピトープをマッピングした結果、２つの免疫原の領域Ｒ１とＲ２が識別され、いずれの場合も、４個の重複するペプチドに対する反応によって得られた(図１)。
【００６３】
実施例２
実施例１の方法を用いて、ヒトタンパク質インターフェロンａ２(ＩＦＮα)についてのエピトープマップを導いた。方法は、合成ペプチドを表２(下記)に示すものとし、ＰＢＭＣ調製物とのインキュベーションを10μＭの濃度とした以外はすべての点で実施例１に準じた。
【００６４】
ＩＦＮα配列におけるＴ細胞エピトープのマッピングは、３つの免疫原領域Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３の識別をもたらした。これは図２に示すように、Ｔ細胞増殖によってそれぞれ７、４および５個の重複するペプチドと決定された。領域３は増殖がＩＦＮαペプチドに応じるドナーの３分の２で得点されることから、潜在的な免疫優性Ｔ細胞エピトープを含むと考えられる。
【００６５】
【表２】
2005529170.tif 000004
【００６６】
実施例３
経時的Ｔ細胞活性化アッセイを行う方法
経時的Ｔ細胞活性化アッセイを行うための一般的なプロトコルは以下のステップを含む：
１．ドナー当たりＰＢＭＣ １バイアルを解凍する。
２．細胞を２〜４×１０6細胞/ｍｌ(ＡＩＭ Ｖ中)を再懸濁する。
３．２つの異なる濃度で抗原を試験し、非抗原で処理した対照に対して比較するのが通常であるため(例えば、10〜50μｇ/ｍｌタンパク質または１〜５μＭペプチド)、24ウェルプレートの３ウェルに１ｍｌを移す(最終濃度２〜４×１０6ＰＢＭＣ/ウェル)。
４．典型的にタンパク質については100μｇ/ｍｌ、ペプチドについては２〜10μＭ抗原ストック溶液を作成する。最終濃度10〜50μｇ/ｍｌタンパク質または１〜５μＭペプチドを与えるように各ウェルに抗原１ｍｌを加える。
５．５日間インキュベートする。
６．ピペットで移すことにより細胞を穏やかに２ｍｌ培養液中に再懸濁し、各条件から細胞100μｌを取り、96ウェルプレート(丸底)に入れ、この到達培養条件(時間ポイント当たり各培養条件から合計300μｌを取る)を３回繰り返す。
７．96ウェルプレートの各細胞ウェルに100μｌ ＡＩＭ Ｖ中１μＣｉ/ウェル３Ｈ[Thy]を加える。
８．一夜インキュベートし収穫する。
９．段階６〜８を６、７および８日(必要な場合、９日目を含むことができる)繰り返す。
１０．ＳＩ測定を行い、各抗原のＳＩ対時間をプロットする。
【００６７】
図３は、インターフェロンα２(実施例２参照)の免疫原領域にまたがるペプチド長の免疫原性について経時的アッセイの典型的な結果を示す。この新規な経時的方法は、Ｔ細胞免疫原性(ＳＩ＞1.8)についてのスクリーンとしてタンパク質全体の分析に、また、タンパク質内のアミノ酸修正の免疫原性に対する影響を分析するのに特に有用である。
【００６８】
実施例４
Ｔ細胞系およびクローンの樹立方法
血友病患者から得た末梢血から単核細胞(ＰＢＭＣ)を単離し、液体窒素下で低温保存した。血液試料は、十分なインフォームドコンセントおよびアッデンブルック(Addenbrooke)ヘルスケアトラストのローカルな倫理的承認の下で提供された。
【００６９】
バルク培養物中、抗原特異的Ｔ細胞をFVIIIを用いて刺激し、次いで、ＩＬ−２誘導展開を複数回繰り返すことによりＴ細胞系を確立した。最初にＰＢＭＣを24ウェルプレートにおいて４μｇ/ｍｌ FVIII(Refacto(商標))を含む２ｍｌのＡＩＭ Ｖ媒体中２×１０6でインキュベートした(湿潤大気中37℃ ５％ＣＯ2)。７日のインキュベーションの後、100Ｕ/ｍｌ ＩＬ−２を加え、培養物をさらに３日間インキュベートした。Ｔブラストを回収し、10日抗原/ＩＬ−２刺激の完成時に計数した。抗原特異性を維持するために、Ｔブラストを、抗原提示細胞としてγ照射された自己由来ＰＢＭＣを使用して、２回目の抗原刺激にさらした。これは、１×１０6自己由来ＰＢＭＣ/ウェルを0.75ｍｌＡＩＭ Ｖ(５％の熱不活性化したヒトＡＢ血清を含む)中４μｇ/ｍｌ FVIIIとともに24ウェルプレートにおいて１時間インキュベートし、4000radのγ放射にさらすことにより達成した。自己由来のＴブラストを0.25mlのＡＩＭ Ｖ中４×１０5細胞／ｍｌでγ照射された抗原提示細胞(予めFVIIIをロードした)に加え、３日間インキュベートした。Ｔブラストを３日間100Ｕ/ｍｌ ＩＬ−２を有する細胞で刺激することにより展開し；次いで、培養物に合計９日間３日おきに、新鮮なＩＬ−２を加えた(最終濃度100Ｕ/ｍｌ)。展開したＴブラストがすべて抗原特異的であることを確実にするために、３回目の抗原刺激を実行し、Ｔブラストを回収し、ＡＩＭ Ｖ媒体中４×１０5細胞/ｍｌで再懸濁した。上記のように、１×１０6自己由来ＰＢＭＣ/ウェルを0.75ｍｌＡＩＭ Ｖ(５％の熱不活性化したヒトＡＢ血清を含む)中４μｇ/ｍｌ FVIIIとともに24ウェルプレートにおいて１時間インキュベートすることにより抗原提示細胞を生成した。0.25ｍｌのＡＩＭ Ｖ中４×１０5細胞/ｍｌの自己由来Ｔブラストをγ照射した抗原提示細胞に加え３日間インキュベートした。10Ｕ/ｍｌＩＬ−２中最後の展開を３日間実行し、Ｔブラストを回収して、ペプチドプールのスクリーニングのために使用した。
【００７０】
バルク培養からのクローニング
FVIII抗原よる３回目の刺激後に、Ｔブラストを回収し、４×１０2〜１×１０4細胞/ｍｌの密度に連続希釈によって再懸濁した(２×最終培養密度)。自己由来ＰＢＭＣを解凍し、ポリプロピレンチューブ中で２×１０6細胞／ｍｌ(２×最終培養密度)に溶解し再懸濁した。次いで、ＰＢＭＣを4000 radのγ放射に暴露し、希釈を制限することにより抗原反応性Ｔ細胞クローンを選択するために抗原提示細胞として使用した。γ照射した抗原提示細胞(最終密度１×１０6)をＴブラスト(最終密度２×１０2〜５×１０3細胞/ｍｌ)、１〜10μｇ/ｍｌ FVIII抗原および100Ｕ/ｍｌＩＬ−２と混合した。20μｌのＡＰＣ、Ｔブラスト、FVIIIおよびＩＬ−２混合物を各ウェルに加えることにより、Terasakiプレート中Ｔ細胞クローンを確立した。希釈クローニングの制限はTerasakiプレートの２〜50Ｔブラスト/ウェルを使用して行った。
【００７１】
Ｔ細胞クローンの選択および維持
ＴブラストをFVIII抗原、ＩＬ−２およびγ照射した自己由来抗原提示細胞とともにおよそ14日間インキュベートした。明白な成長を示す細胞を含むウェルを識別した後、Ｔブラストを、丸底96ウェルプレートの、１×１０5のγ照射した異質遺伝子型(allogenic)のＰＢＭＣ(最終体積200μｌＡＩＭ Ｖ(１％の熱不活性化したヒトＡＢ血清を含む)中100Ｕ/ｍｌ ＩＬ−２および１μｇ/ｍｌ フィトヘマトグルチニン(ＰＨＡ)を含む単一ウェルに移した。細胞がコンフルエントになった時点で、Ｔ細胞クローンを分割し、最終的には最終体積２ｍｌＡＩＭ Ｖ(１％の熱不活性化したヒトＡＢ血清を含む)中１×１０5のγ照射した異質遺伝子型ＰＢＭＣ(支持細胞)、100Ｕ/ｍｌ ＩＬ−２および１μｇ/ｍｌフィトヘマトグルチニン(ＰＨＡ)を含む24ウェルの単一ウェルに移した。Ｔ細胞クローンの日常的メンテナンスは、(細胞成長に依存して)２〜３週ごとに新鮮なＰＨＡおよび異質遺伝子型支持細胞での刺激、および２週ごとに100Ｕ/ｍｌ ＩＬ−２に刺激を含んでいた。FVIII特異的であると判明したＴ細胞クローンのみを展開しFVIIIペプチドをスクリーニングするのに用いた。
【００７２】
自己由来のＢ細胞のＥＢＶ形質転換
３ｍｌのろ過した(0.45μ)Ｂ９５．８上澄液を４×１０6ＰＢＭＣに添加し37℃で１時間インキュベートすることによって、ＰＢＭＣ調製物から得たＢ細胞を不死化し、Ｂ リンパ芽細胞系(ＢＬＣＬ)を生成した。ＰＢＭＣをペレット化し、熱不活性化したウシ胎仔血清(ＦＣＳ)５％および１μｇ/ｍｌシクロスポリンＡを含む２ｍｌ ＲＰＭＩ中に再懸濁した。７日間インキュベートした後、１ｍｌの培地を５％ＦＣＳおよび２μｇ/ｍｌシクロスポリンＡを含む新鮮なＲＰＭＩに取り替えた(シクロスポリンＡの最終濃度１μｇ/ｍｌ)。この供給法(feeding regime)を細胞が分割後14日目および21日目に繰り返し、必要なときにはウシ胎仔血清(ＦＣＳ)５％を含むＲＰＭＩを用いて組織培養フラスコ内に展開した。
【００７３】
Ｔ細胞系／クローンを用いたFVIIIペプチドのスクリーニング
15残基長で、かつ、12アミノ酸の増分によって前のペプチドと重複するペプチドを合成した(Pepscan(オランダ))。ペプチドは、最初、保存用に100％ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)10ｍＭ中に溶解した。同時にFVIII特異的Ｔ細胞系から多くのペプチドをスクリーニングするためペプチドプールを生成した。プールは、含有される各プールが後のプールと重複するペプチドを含むように構成し、このアプローチを用いて２個のペプチドの重複したＴ細胞エピトープは２つの別個のプールの増殖を引き起こす結果をもたらす。各プールは、典型的には各ペプチド１または５μＭのいずれかで試験した８ペプチドからなるものであった。
【００７４】
自己由来のＰＢＭＣ(Ｔ細胞系用)またはＥＢＶで形質転換したＢＬＣＬ(Ｔ細胞クローン用)を、１×１０5ＰＢＭＣまたはＢＬＣＬを50μｌのＡＩＭ Ｖ培地に再懸濁し、次いで、丸底96ウェルプレートの各ウェルに加えることにより抗原提示細胞として使用した。ペプチドプールは、両方の濃度(１または５μｌ)で各プールについて３連で作成しウェルに加えた。抗原提示細胞およびペプチドプールを37℃で１時間インキュベートしてから4000radのγ照射を行った。ＢＬＣＬを、37℃で１時間、１μｇ/ｍｌマイトマイシンＣで予め処理し、Ｔ細胞クローンのために細胞抗原提示細胞(γ−照射した自己由来ＰＢＭＣの代わり)として使用する場合は、ＡＩＭ Ｖで４回洗浄した。次いで、抗原特異的Ｔ細胞系またはＴ細胞クローンをウェル当たり５×１０4細胞で添加し、培養物を３日間インキュベートした。３日目に、各ウェルを１μＣｉの3Ｈ−Thy/ウェルで最少８時間パルス処理した。プレートをフィルタマット上に収穫した後、Wallacマイクロプレートベータカウンターを使用してｃｐｍ/ウェルを決定した。
【００７５】
健常なドナーから得たＰＢＭＣを用いたナイーブなＴ細胞エピトープマップ
40名の健常なＨＬＡ−ＤＲタイプドナーからの血液を用いてＰＢＭＣを単離し、これを用いて２種の濃度(１または５μｌ)で個々のFVIIIペプチドをスクリーニングした。各ドナーから得たＰＢＭＣの数はFVIIIペプチドをすべてスクリーニングするには不十分であったので、ドナーを２群に分け、最初の20名のドナーは分子の前半のペプチドをスクリーニングするために使用し、第２のドナー集合は残るペプチドをスクリーニングするために使用した。ドナーは、世界人口の中に多数存在するアロタイプをカバーするように発現されたＭＨＣクラスII アロタイプに従って選択した。ＭＨＣアロタイプは用いて検出した。
【００７６】
市販の試薬システム(Dynal、Wirral、英国)を使用してすべてのＰＢＭＣ試料について組織タイプをアッセイした。アッセイは、プロトコルおよび標準的な付属試薬をサプライヤーの推奨するプロトコルおよびアガロース電気泳動システムに従って行った。
【００７７】
ＰＢＭＣは、生理学的数のナイーブＴ細胞および抗原提示細胞を含む。これらの細胞は密度２×１０5細胞/ウェル(96平底プレート)で使用し、３重の200μｌ培養物中１または５μＭでペプチドをスクリーニングした。細胞を37℃で６日間インキュベートし、各ウェルを１μＣｉの3Ｈ−Thy/ウェルで最少８時間パルス処理した。培養物をフィルタマット上に収穫した後、Wallac マイクロプレートベータカウンターを使用してｃｐｍ/ウェルを決定した。
【００７８】
表３は、血友病患者から得たＴ細胞系と健常な個体から得たナイーブＴ細胞調製物を用いて生成したヒトのＢドメインを削除したエピトープマップを示す。ＴブラストおよびナイーブＰＢＭＣ誘導Ｔ細胞を、Ｔ細胞エピトープを含むペプチド識別のために使用した場合、次いで、Ｔ細胞エピトープを含む個々のペプチドを識別するためにそれらのプールを解読した。
【００７９】
【表３】
2005529170.tif 000005
【００８０】
実施例５
計算スキーム
タンパク質やポリペプチドの全体的構造を決定するのに重要な役割を果たす要因は多数存在する。第１に、ペプチド結合、アミノ酸を鎖状に互いに連結するその結合は、共有結合である。この結合は平面構造であり実質的に置換アミドである。「アミド」は−ＣＯＮＨ−基を含む有機化合物の任意の基である。
【００８１】
隣接アミノ酸のＣαを連結する平面状ペプチド結合は以下に示すように表すことができる：
【００８２】
【化１】
2005529170.tif 000006
【００８３】
Ｏ＝ＣおよびＣ−Ｎ原子は比較的剛性な平面内にあるので、これらの軸の周りに自由な回転は生じない。このため、破線によって模式的に描いた平面は時として「アミド平面」または「ペプチド平面」と呼ばれ、この平面にはペプチド骨格の酸素(Ｏ)、炭素(Ｃ)、窒素(Ｎ)および水素(Ｈ)原子が載る。このアミド平面の相対する両隅にはＣα原子が位置する。ペプチド平面すなわちアミド平面内では、Ｏ＝ＣおよびＣ−Ｎ原子の周りの回転が実質的にないので、ポリペプチド鎖はＣα原子を連結する一連の平面状ペプチド結合を含む。
【００８４】
ポリペプチドまたはタンパク質の全体構造または立体構造を規定する上で重要な役割を果たす第２の要因は、共通なＣα連結の周りの各アミド平面の回転角である。「回転角」および「ねじり角」という用語は以下では同義語と見なされる。アミド平面にＯ、Ｃ、ＮおよびＨ原子が載ると仮定すると(立体構造によってはこれらの原子のうちいくつかは平面から若干ずれるかもしれないが、これは通常有効な仮定である)、これらの回転角はＮとＲポリペプチドの骨格の立体構造、つまり隣接残基間に存する構造を定義する。これらの２つの角度はφおよびψとして知られている。したがって、１組の角度、φiおよびψi(ここで添字ｉはポリペプチド鎖の特定の残基を表す)はポリペプチドの２次構造を有効に規定する。角度φおよびψを定義するのに使用される慣用規則、すなわち、所与のポリペプチドについてのアミド平面が角度０を形成する参照ポイント、並びに角度φの定義および角度ψの定義は、文献に定義される。例えば、Ramachandran et al.Adv.Prot.Chem.23：283−437(1968)、特に285−94頁参照(これらの頁は言及によって本願に組み込まれる)。
【００８５】
本発明の方法は任意のタンパク質に適用することができ、ヒトでは、ＭＨＣクラスII分子結合溝の主要なポケット１アンカー位置が、特定のアミノ酸側鎖に対してよく設計された特異性を有するという発見に部分的に基づいている。このポケットの特異性は、ＭＨＣクラスII分子のベータ鎖の位置86でのアミノ酸の同一性によって決定される。このサイトはポケット１の底に位置し、このポケットに収容され得る側鎖の大きさを決定する。Marshall, K.W.、J.Immunol.、152：4946−4956(1994)。この残基がグリシンである場合、すべての疎水性脂肪族および芳香族アミノ酸(疎水性脂肪族は以下のものである：バリン、ロイシン、イソロイシンおよびメチオニン、また芳香族は以下のものである：フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン)は、ポケット内に収容され得る(芳香族側鎖が優先される)。このポケット残基がバリンである場合、このアミノ酸側鎖はポケット内部に突出するので、収容できるペプチド側鎖のサイズを制限する(例えば疎水性脂肪族側鎖だけが収容可能である)。したがって、アミノ酸残基配列において、疎水性脂肪族および芳香族側鎖を有するアミノ酸が存在する場合にはいつでも、ＭＨＣクラスII制限Ｔ細胞エピトープが存在する可能性がある。しかし、側鎖が疎水性脂肪族である場合は、芳香族側鎖の場合と比較して、(全人口において、ポケット１タイプの分布がほぼ均一であると定すれば)Ｔ細胞エピトープに関連する可能性はおよそ２倍である。
【００８６】
本発明を具体化する計算方法は、以下のようにＴ細胞エピトープを含むペプチド領域の可能性を特徴づける：
(１)予め定義した長さのペプチドセグメントの１次配列を走査し、存在する疎水性脂肪族と芳香族側鎖をすべて識別する。(２)疎水性脂肪族側鎖には芳香族側鎖用のそれより大きな値、好ましくは芳香族側鎖に割り当てる値の約２倍を割り当てる(例えば、疎水性脂肪族側鎖に対しては値２を、芳香族側鎖に対しては値１を割り当てる)。(３)ペプチド内の予め定義した一定の長さの各重複するアミノ酸残基セグメント(ウィンドウ)について存在が決定された値を合計し、特定のセグメント(ウィンドウ)に対する値の合計を、セグメント(ウィンドウ)の中間位置で単一のアミノ酸残基、好ましくは、サンプリングされたセグメント(ウィンドウ)の中間点付近の残基に割り当てる。この手続きを、サンプリングされた各重複するアミノ酸残基セグメント(ウィンドウ)について繰り返す。したがって、ペプチドの各アミノ酸残基は、特定のセグメント(ウィンドウ)内に存在するＴ細胞エピトープの可能性に関係のある値を割り当てられる。(４)上記ステップ３に記載するように計算し割り当てた値は、評価するアミノ酸残基配列全体のアミノ酸座標に対してプロットすることができる。(５)予め定義した値(例えば値１)のスコアを有する配列のすべての部分は、Ｔ細胞エピトープを含むと認められ、必要であれば修飾することができる。本発明のこの特定の実施態様は、Ｔ細胞エピトープを含むであろうペプチド領域を記述できる一般的な方法を提供する。これらの領域内のペプチドに対する修飾は、ＭＨＣクラスII結合特性を修飾する可能性を有する。
【００８７】
本発明の別の実施態様によれば、ＭＨＣクラスII対立遺伝子モデルによりペプチドの相互作用を考慮に入れたより精巧な計算方法を使用して、Ｔ細胞エピトープをより高精度で予想できる。特にこの実施態様によるペプチド内に存在するＴ細胞エピトープの計算上の予想では、すべての公知のＭＨＣクラスII分子の構造に基づく少なくとも42個のＭＨＣクラスII対立遺伝子のモデルの構築が考えられ、Ｔ細胞エピトープの計算による識別におけるこれらのモデルの使用、相対的なペプチド骨格アルファ炭素(Ｃα)位置の知られた変わりやすさを考慮に入れるための各モデルのペプチド骨格のライブラリーの構築、ペプチドとＭＨＣクラスII分子との間の相互作用において重要な位置での20個のアミノ酸置換各々のための各モデルを備えた各骨格ドック(dock)のアミノ酸側鎖コンホメーションのライブラリーの構築、および特定のＭＨＣクラスII分子に収容(dock)された特定のペプチドについての最適な骨格および側鎖コンホメーション選択のための、これら骨格および側鎖コンホメーションライブラリーの使用、並びにこの相互作用からの結合スコアの誘導が考えられる。
【００８８】
ＭＨＣクラスII分子のモデルは相同モデリングによって、ブルックヘブン(Brookhaven)タンパク質データバンク(「ＰＤＢ」)で見出された多数の同様の構造から誘導できる。これらは、エネルギー最小化のためのＣＨＡＲＭｍ力場(Molecular Simulations Inc.、San Diego、Ca．から入手可能)と共に、シミュレートされたアニーリング機能を組み込んだ半自動的な相同モデリングソフトウェア(Modeller,Sali A.＆ Blundell TL.、1993.J.Mol.Biol 234：779−815)によって形成できる。別のモデリング方法も同様に利用できる。
【００８９】
本願の方法は、ＭＨＣクラスII分子の小さな集合について結合溝内の各位置での各アミノ酸選択肢の実験により得た結合データのライブラリーを使用する他の計算方法(Marshall, K.W.、et al．、Biomed.Pept.proteins Nucleic Acids、１(３)：157−162)(1995)や溝内の特定タイプの結合ポケットの結合特性を定義するために実験による同様の結合データを使用し(ここでもまたＭＨＣクラスII分子の比較的小さな部分集合を使用する)次いでこのポケットライブラリーからポケットタイプを「混合およびマッチング」して人為的に別の「仮想的な」ＭＨＣクラスII分子を生成するさらに別の計算方法(Sturniolo T.、et al．、Nat.Biotech、17(６)：555−561(1999)と著しく異なる。先行技術は両方とも分析が複雑である点および多数のペプチド変異体を合成する必要がある点の不利益を被り、少数のＭＨＣクラスII分子しか実験的に走査できない。したがって、第１の先行技術の方法は少数のＭＨＣクラスII分子の予想しかできない。第２の先行技術の方法は、異なるクラスII対立遺伝子間においては、１個の分子中で類似したアミノ酸で裏打ちされているポケットは同じ結合特性を持つという仮定も前提としており、ポケットライブラリーに含まれるポケットを含むそうしたＭＨＣクラスII分子だけが「仮想的に」生成されるという欠点をさらに有する。本明細書に述べるモデリング手法を使用すれば、任意の数およびタイプのＭＨＣクラスII分子の構造を推定でき、したがって全集団を代表する対立遺伝子を特異的に選択できる。さらに、走査されるＭＨＣクラスII分子の数は、複雑な実験によって追加データを生成する必要以上にさらにモデルを生成することにより増加させることができる。
【００９０】
骨格ライブラリーの使用により、走査されている様々なペプチドについて、特定のＭＨＣクラスII分子に収容された時のＣα原子位置における変化を考慮に入れることができる。この点もまた、上記の先行技術における計算方法(これらは特定のポケット中でアミノ酸結合を走査するため単純化されたペプチド骨格の使用に依存している)と対照的である。これらの単純化された骨格は、「実際の」ペプチドで見つかる骨格構成の代表ではないであろうし、その結果、ペプチド結合の予想が不正確になる。本発明の骨格ライブラリーは、タンパク質データバンク内で見出されるＭＨＣクラスII分子に結合するすべてのペプチドの骨格を重ね、結合溝内に位置する11個のアミノ酸各々のＣα原子間の２乗平均平方根(ＲＭＳ)偏差を記録することにより生成される。このライブラリーは、より大きな変動の可能性までも考慮に入れるために、少数(現在13個)の適切な利用可能なマウスおよびヒト構造から誘導できる一方、各Ｃ"-αについてのＲＭＳ数値は、50％増加する。その後、各アミノ酸の平均のＣα位置が決定され、その半径がその位置でのＲＭＳ偏差プラス50％と等しい球がこの点のまわりに描かれる。この球体は許容されるＣα位置をすべて表す。最小のＲＭＳ偏差を有するＣα(これは、上記のポケット１中のアミノ酸であり、結合溝中の11個の残基の位置２と等価である)を動かして、球体は３次元的にグリッド化され、次いでグリッド内の各頂点はそのアミノ酸のＣαのために可能な位置として使用される。結果として得られるアミド平面は、引き続きアミノ酸へのペプチド結合に対応し、これらのＣαの各々にグラフトされ、次のＣαを位置付けるためにφおよびψ角を所定の間隔で回転させる。引き続きＣαがＣαに対して「許容される位置の球」内にある場合にはジペプチドの向きが許容され、それが球の外部になる場合には、ジペプチドは拒絶される。その後、先行するＣαのあらゆる組合せから９個の後続Ｃαがすべて位置付けられるまで、ペプチドがポケット１ Ｃα「種子」から成長するように後続Ｃα位置の各々についてこのプロセスを繰り返す。次いで、ポケット１の前の単一Ｃαについてこのプロセスをもう一度繰り返して結合溝内に位置する骨格Ｃα位置のライブラリーを生成する。生成された骨格の数はいくつかの要因に依存する：「許容される位置の球」の大きさ；ポケット１位置の「１次球」のグリッドの精密さ；後続Ｃαを位置付けるために用いるφおよびψの段階的回転角の精密さ。このプロセスを使用すると、大きな骨格ライブラリーを生成できる。骨格ライブラリーが大きい程、ＭＨＣクラスII分子の結合溝内の特定のペプチドに対して最もよく適合するものが見つかる可能性は大きくなる。各対立遺伝子について、結合領域のアミノ酸との衝突により、必ずしもすべての骨格がＭＨＣクラスII分子のすべてのモデルに収容されるのには適さないため、その対立遺伝子によって収容され得る骨格を含むライブラリーの部分集合が生成される。骨格ライブラリーの使用は、ＭＨＣクラスII分子モデルと共に、各許容される骨格に収容される各ＭＨＣクラスII分子について結合溝の各位置の各アミノ酸の許容される側鎖コンホメーションからなる徹底的なデータベースを作成する。このデータセットは、単純な立体的重���り関数を用いて生成され、ここで、ＭＨＣクラスII分子は骨格と結合し、アミノ酸側鎖は所望の位置で骨格上にグラフトされる。各々の側鎖の回転可能な結合を設定した間隔で段階的に回転させ、得られる原子位置は注目する結合に依存する。原子と結合溝の側鎖の原子との相互作用が注目され、位置は次の基準によって許容されるか拒絶される：ここまでに位置付けられたすべての原子の重なりの合計は、予め決めた値を超過してはならない。したがって、コンホメーション探索の厳格性は、結合の段階的回転で用いる間隔と全重なりについて予め決めた限界の関数である。特定のポケットが剛性であると知られている場合、この後者の値は小さくなり得るが、ポケット側鎖の位置に比較的柔軟性があると知られている場合は、比較的緩和である。したがって、許容は結合溝ポケット内の柔軟性における変化を模倣するようになすことができる。次いで、ＭＨＣクラスII分子の各々に収容された時、このコンホメーション探索を各骨格のすべての位置にあるすべてのアミノ酸について繰り返し、側鎖コンホメーションの徹底的なデータベースを作成する。
【００９１】
適切な数式を用いて、上記骨格／側鎖コンホメーションの大きなデータベースの走査により経験的に導き出さなければならないペプチドリガンドコンホメーションと組み合うＭＨＣクラスII分子モデル間の結合エネルギーを評価する。したがって、９〜20アミノ酸の範囲で長さが変化する(もっとも、長さは各走査に対しては一定にしておく)可能なペプチドに、以下の計算を施すことにより、タンパク質を潜在的なＴ細胞エピトープについて走査する：ＭＨＣクラスII分子をその分子に許容されるペプチド骨格とともに選択し、所望のペプチド配列に対応する側鎖をグラフトする。骨格上の特定の位置での原子の識別および特定の側鎖に関する原子間距離データを、そのアミノ酸の許容される各コンホメーションについて集める(上記データベースから得られる)。これを骨格に沿って各側鎖に対して繰り返し、スコアリング関数を用いてペプチドスコアを導く。その骨格のための最良のスコアを保持し、選択されたモデルについて各許容される骨格に対してこのプロセスを繰り返す。すべての許容される骨格から得られたスコアを比較し、最高のスコアをそのＭＨＣクラスIIモデル中の所望のペプチドについてのペプチドスコアであると見なす。次いで、このプロセスを、走査されているタンパク質に由来するあらゆる可能なペプチドを備えた各モデルについて繰り返し、ペプチド対モデルのスコアを表示する。
【００９２】
本発明の状況では、結合親和性計算のために提示される各リガンドは、上に議論されるようなペプチドまたはタンパク質から選択されるアミノ酸断片である。したがって、リガンドは、公知の配列のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質から得られ、長さがおよそ９〜20個のアミノ酸である選択されたアミノ酸伸張物である。「アミノ酸」および「残基」という用語は以下においては同義語と見なされる。リガンドは、骨格ライブラリーから得た骨格上にグラフトされて検査されるペプチドの連続アミノ酸の形をしており、ペプチド骨格のＣ"-α原子の座標を介して、ＭＨＣクラスII分子モデルライブラリーから得られるＭＨＣクラスII分子の結合溝中に位置し、各側鎖に対して許容されるコンホメーションは許容されるコンホメーションデータベースから選択される。関連する原子同一性および原子間距離もこのデータベースから検索し、ペプチド結合スコアを計算するために使用する。ＭＨＣクラスII結合ポケットへの高い結合親和性を備えたリガンドには、部位指図突然変異生成に対する候補としてフラグが立てられる。フラグが立てられたリガンド(したがって対象タンパク質)でアミノ酸置換を行い、これはその後、結合親和性を予め定義した閾値以下に低減する変更を決定するためにスコアリング関数を使用して再試験する。次いで、これらの変更を対象タンパク質に組み入れ、Ｔ細胞エピトープを除去する。ＭＨＣクラスII分子のペプチドリガンドと結合溝の間は、非共有結合性の相互作用(水素結合、静電気的相互作用、疎水性(親油性)相互作用およびファンデアワールス相互作用を含むが、これらに限定されない)を含む。これらは、以下に詳細に述べるペプチドスコアリング関数に含まれている。水素結合は極性または帯電基間で形成され得るもので、２つの他の原子によって共有された水素原子からなる非共有結合であることが理解されるべきである。水素受容体が部分的に負帯電を有する一方で、水素供与体の水素は正電荷を有する。
【００９３】
ペプチド／タンパク質相互作用のために、水素結合供与体は、水素と結合した窒素または酸素もしくは窒素に結合した水素のいずれでもよい。水素結合受容体原子は水素と結合していない酸素、水素が全く結合しておらず１個か２個の結合がある窒素、または１つの結合のみある硫黄でもよい。水素を結合した酸素またはイミン窒素(例えばＣ＝ＮＨ−)などのある種の原子は、水素受容体とも供与体ともなり得る。水素結合エネルギーは３〜７kcal/molの範囲であり、ファンデアワールス結合よりはるかに強いが共有結合よりは弱い。
【００９４】
水素結合はまた指向性が強く、供与体原子、水素原子および受容体原子が同一直線上にある場合に最も強い。静電的結合は反対荷電のイオン対間で形成され、相互作用の強さはクーロンの法則による原子間の距離の二乗に反比例する。イオン対間の最適距離は約2.8Åである。タンパク質／ペプチド相互作用では、静電的結合がアルギニン、ヒスチジンまたはリジンとアスパラギン酸塩またはグルタミン酸塩との間で形成され得る。それらは水素結合と強さがほぼ似ているが、結合の強さはイオン化基のｐＫａおよび媒体の誘電率に依存するであろう。親油性(脂肪親和性)相互作用は、タンパク質とペプチドリガンド間に生じる良好な疎水性−疎水性接触である。通常、これらは結合溝のポケット内に埋没したペプチドの疎水性アミノ酸側鎖間に、それらが溶媒に露出しないように生じる。疎水性残基の溶媒への露出は、周囲の溶分子が互いに水素結合を強いられ、かご状のクラスレート構造を形成するので非常に不利である。結果として生じるエントロピーの減少は非常に不利である。脂肪親和性の強い原子は、極性でもなく水素受容体でもない硫黄や非極性の炭素原子などである。ファンデアワールス結合は３〜４Å離れた原子間で見られる非特異的な結合である。これは水素結合や静電的結合より弱く特異性も低い。原子のまわりの電荷分布は時間とともに変化し、どの瞬間でも、電荷分布は対称ではない。電荷分布におけるこの一時的な非対称性は、近隣の原子にも同様の非対称性を引き起こす。この結果生じる原子間引力は、ファンデアワールス接触距離で最大に達するが、約２Å〜約１Åに至ると非常に急速に低減する。逆に、原子間の隔たりが接触距離未満になるとともに、原子の外殻電子雲が重なるため、強い斥力が支配的になる。引力は静電的結合や水素結合に比べて比較的弱いが(約0.6Kcal/mol）、斥力は特に、ペプチドリガンドがタンパク質に成功裡に結合するかどうか決する上で非常に重要であろう。
【００９５】
１つの実施形態では、ベーム(Boehm)スコアリング関数(SCORE1手法)が結合定数を評価するために使用される(Boehm, H.J.、J.Comput Aided Mol.Des.、８(３)：243-256(1994)、その内容は言及によってその全体が本願に組み入れられる)。別の実施形態では、スコアリング関数(SCORE2手法)が、Ｔ細胞エピトープを含むリガンドの指標として結合親和力を評価するために使用され(Boehm, H.J.、J.Comput Aided Mol.Des．、12(４)：309-323(1998)、その内容は言及によってその全体が本願に組み入れられる)。しかし、上記の文献に記述されているベームスコアリング関数は、タンパク質へのリガンドの結合親和力を評価するために使用されるが、この場合、リガンドがタンパク質に成功裡に結合することが既に知られており、タンパク質／リガンド複合体はその構造が解明されタンパク質データバンク(「ＰＤＢ」)の中に存在するものである。したがって、スコアリング関数は、陽性であることが知られた結合データを利用して開発されている。陽性および陰性バインダー間の区別を考慮に入れるために、方程式に反発項を加えなければならない。さらに、結合エネルギーのより満足な評価は、上記のベーム関数の領域ベースのエネルギー項を用いるのではなく対同士の方法で脂肪親和性の強い相互作用を計算することで達成される。したがって、好ましい実施形態では、結合エネルギーは修正されたベームスコアリング関数を使用して評価される。修正されたベームスコアリング関数では、タンパク質とリガンド間の結合エネルギー(ΔＧbind)は、以下のパラメーターを考慮して評価される：リガンド(ΔＧo)の並進エントロピーと回転エントロピーの全面的な喪失による結合エネルギーの低減；少なくとも１個のパートナーが中性である、理想的な水素結合からの寄与(ΔＧhb)；摂動のないイオン間相互作用(ΔＧionic)からの寄与；脂肪親和性リガンド原子と脂肪親和性受容体原子の間の脂肪親和性相互作用(ΔＧlipo)；リガンド中の内部自由度の凍結による結合エネルギーの喪失、つまり、各Ｃ−Ｃ結合の周りの回転自由度が低減する(ΔＧrot)；タンパク質とリガンド間の相互作用エネルギー(ＥvdW)。これらの項を考慮すると方程式１が与えられる：
(ΔＧbind)＝(ΔＧo)＋(ΔＧhbｘＮhb)＋(ΔＧionicｘＮionic)＋(ΔＧlipoｘＮlipo)＋(ΔＧrot＋Ｎrot)＋(ＥvdW)
式中、Ｎは特定の項の相互作用を特徴付ける数であり、１つの実施形態では、ΔＧo、ΔＧhb、ΔＧionic、ΔＧlipoおよびΔＧrotは、それぞれ5.4、−4.7、−4.7、−0.17および1.4の値を与えられる定数である。
【００９６】
Ｎhbは方程式２：
Ｎhb＝Σh-bondsｆ(ΔＲ，Δα)×ｆ(Ｎneighb)×ｆpcs
によって計算される。
【００９７】
ｆ(ΔＲ，Δα)は、理想状態からの水素結合の大きな偏差を説明し、方程式３によって計算されるペナルティ関数である：
ｆ(ΔＲ，Δ−α)＝ｆ１(ΔＲ)×ｆ２(Δα)
ここで、ｆ１(ΔＲ)＝１(ΔＲ＜＝ＴＯＬの場合)、
または    ＝１−(ΔＲ−ＴＯＬ)／０．４(ΔＲ＜＝０．４＋ＴＯＬの場合)、
または    ＝０(ΔＲ＞０．４＋ＴＯＬの場合)
さらに、ｆ２(Δα)＝１(Δα＜３０°の場合)
または  ＝１−(Δα−３０)／５０(Δα＜＝８０°の場合)
または  ＝０(Δα＞８０°の場合)。
【００９８】
ＴＯＬは水素結合長さ(＝０．２５Å)で許容される偏差、
ΔＲはＨ−Ｏ／Ｎ水素結合長さの理想的な値(＝１．９Å)からの偏差、
Δαは水素結合角度∠N/O-H,O/Nの理想的な値(＝１８０°)からの偏差、
ｆ(Ｎneighb)は、タンパク質表面の凹面と凸面の部分を識別し、したがってタンパク質表面で見られるものではなくポケットで見られる極性相互作用に大きな重みを割り当てる。この関数は下記方程式４：
ｆ(Ｎneighb)＝(Ｎneighb／Ｎneighb,0)α(ここで、α＝０．５)
によって計算される。
【００９９】
Ｎneighbは任意の所与のタンパク質原子に５Åより接近している非水素タンパク質原子の数であり、
Ｎneighb,0＝定数２５である。
【０１００】
ｆpcsは１つの水素結合当たり極性接触表面積を考慮に入れた関数であり、したがって強い水素結合と弱い水素結合を区別し、その値は次の基準によって決定される：
ｆpcs＝β(Ａpolar／ＮHB＜１０Å2の場合)、
またはｆpcs＝１(Ａpolar／ＮHB＞１０Å2の場合)
Ａpolarはタンパク質リガンド接触表面の大きさであり、
ＮHBは水素結合の数であり、
βは定数＝１．２である。
【０１０１】
修正されたベームスコアリング関数の実行のためには、イオン相互作用からの寄与、ΔＧionicを上記水素結合からの寄与と同様の方法で計算する(同じ幾何学依存性が仮定されるため）。
【０１０２】
Ｎlipo項は方程式５によって計算される：
Ｎlipo＝ΣILｆ(ｒIL)
ｆ(ｒIL)はすべての脂肪親和性リガンド原子について、１また、すべての脂肪親和性タンパク質原子についてＬであり、以下の基準により計算される：
ｆ(ｒIL)＝１(ｒIL＜＝Ｒ１ｆ(ｒIL)＝(ｒIL−Ｒ１)／(Ｒ２−Ｒ１)でＲ２＜ｒIL＞Ｒ１の場合、
ｆ(ｒIL)＝０(ｒIL＞＝Ｒ２の場合）。
【０１０３】
ここで、Ｒ１はｒ１vdw＋ｒLvdw＋０．５および
Ｒ２＝Ｒ１＋３．０であり、
ｒ１vdwは、原子１のファンデアワールスの半径であり、
ｒLvdwは、原子Ｌのファンデアワールスの半径である。
【０１０４】
Ｎrotはアミノ酸側鎖の回転可能な結合の数であり、非環式のｓｐ3−ｓｐ3結合およびｓｐ3−ｓｐ2結合の数である。末端ＣＨ3またはＮＨ3の回転は考慮に入れない。
【０１０５】
最後の項Ｅvdwは方程式６によって計算される：
Ｅvdw＝ε1ε2（（ｒ1vdw＋ｒ2vdw）12／ｒ12−（ｒ1vdw＋ｒ2vdw）6／ｒ6）。
【０１０６】
ここでε1とε2は原子同一性に依存する定数であり、
ｒ1vdw＋ｒ2vdwはファンデアワールスの原子半径であり、
ｒは１対の原子間の距離である。
【０１０７】
方程式６に関して、１つの実施形態では、定数ε1とε2はそれぞれ原子ごとに以下の値を与えられる：Ｃ：0.245、Ｎ：0.283、Ｏ：0.316、Ｓ：0.316(つまり、炭素、窒素、酸素および硫黄のそれぞれの原子について)。方程式５および６については、ファンデアワールスの半径はそれぞれ原子ごとに以下の値を与えられる：Ｃ：1.85、Ｎ：1.75、Ｏ：1.60、Ｓ：2.00Å。
【０１０８】
タンパク質リガンド相互作用についての現時点での理解の制約内ではあるが、上記の方程式に現われるすべての所定の値および定数がすべて決定されることは理解されるべきである(特に本願で試みられている計算のタイプについて）。したがって、このスコアリング関数がさらに精緻化された場合には、これらの値および定数を変更することが可能で、したがって、リガンドへのタンパク質の結合エネルギーを評価する項において所望の結果を与える適当な数値を使用してもよく、したがって、本発明の範囲内である。
【０１０９】
上記のように、スコアリング関数は、側鎖コンホメーション、原子同一性および原子間の距離のデータベースから抽出されたデータに適用される。本発明を説明する目的のために言えば、このデータベースに含まれるＭＨＣクラスII分子の数は42個のモデルと４つの解決された構造である。本発明の計算方法の構築はモジュール化された性質を有するため、新しいモデルを加えペプチド骨格ライブラリーと側鎖コンホメーション関数を用いて走査するだけで、上記のペプチドスコアリング関数によって処理できる追加のデータセットを作成できることは上記の説明から明らかである。これにより、走査されたＭＨＣクラスII分子のレパートリーを容易に増加させることが可能になり、あるいは、データが入手できる場合には構造および関連データを置き換えて、既存の対立遺伝子のより正確なモデルを作成することができる。
【０１１０】
本発明の予想方法は、様々なＭＨＣクラスII分子に対する有する親和性が実験的に測定された多数のペプチドを含むデータセットにより較正できる。計算値を実験値と比較することによって、すべての実験的に測定したＴ細胞エピトープが正確に予想されることがわかれば有益性の一端を決定できる。
【０１１１】
利用可能ないくつかの精巧な方法論と比較して、上記のスコアリング関数は比較的単純であるが、計算が非常に急速に実行される、ということが理解されるべきである。また、目的が、選択されたＭＨＣクラスIIタンパク質の結合溝に収容される各ペプチドについて真の結合エネルギーそれ自身計算するものではないことも理解されるべきである。根本的な目的は、選択されたタンパク質の１次構造(すなわち、アミノ酸配列)に基づいてＴ細胞エピトープの位置を予想する助けとして相対的な結合エネルギーデータを得ることである。比較的高い結合エネルギー、すなわち選択された閾値以上の結合エネルギーは、リガンド中のＴ細胞エピトープの存在を示唆するだろう。次いで、リガンドに少なくとも１回のアミノ酸置換を施し、結合エネルギーを再計算すればよい。計算が迅速性を有するため、ペプチド配列のこれらの操作はコストに見合う利用可能なコンピューターハードウェアにおいてプログラムのユーザインターフェース内で対話形式に実行できる。したがって、コンピューターハードウェアへの大きな投資は要求されない。
【０１１２】
同じ目的のために他の利用可能なソフトウェアを使用しうることは当業者には明白であろう。特に、タンパク質結合サイト内にリガンドをドッキングさせ得るより精巧なソフトウェアをエネルギー最小化と共に使用してもよい。ドッキングソフトウェアの例は次の通りである：ＤＯＣＫ(Kuntz et al.、J.Mol.Biol.、161：269−288(1982))、ＬＵＤＩ(Boehm, H.J.、J.Comput Aided Mol.Des.、８：623−632(1994))およびＦＬＥＸＸ(Rarey M.、et al.、ISMB、３：300−308(1995))。分子モデリングおよび操作ソフトウェアの例としては：ＡＭＢＥＲ(Tripos)およびＣＨＡＲｍ(Molecular Simulations Inc.)。これらの計算方法の使用は、必要な計算を行うために要求される処理時間の長さにより本発明方法の処理能力を厳しく制限するだろう。しかし、本発明の方法によって「陽性なバインダー」であると判明したペプチドについて結合エネルギーのより正確な計算結果を得るために「第２のスクリーン」として、このような方法を使用し得るというのもあり得ることである。洗練された分子の機械的または分子の動的な計算のための処理時間の制限は、これらの計算を行うソフトウェアの設計およびコンピューターハードウェアの現在の技術制限の両者によって決まる。将来的には、より効率的なコードが書かれ、さらにコンピュータープロセッサー速度の持続的な増加によって、より扱いやすい時間枠内でそのような計算を行うことが実現可能になるかもしれない。巨大分子に適用されるエネルギー関数および折り畳まれたタンパク質構造内で起こる様々な相互作用についての考慮に関するさらに詳しい情報は以下に見られる：Brooks, B.R.，et al.、J.Comput.Chem.、４：187−217(1983)。一般的なタンパク質−リガンド相互作用に関するさらに詳細な情報は以下に見られる：Dauber−Osguthorpe et al.、proteins４(１)：31−47(1988)。その内容の全体は言及によって本願に組み入れられる。有用な背景的事項は、例えば以下に見られる：Fasman,G.D.、ed.、Prediction of Protein Structure and the Principles of Protein Conformation、Plenum Press、New York、ISBN：0−306 4313−9。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】ＩＦＮβ内の免疫原性領域を示し、ナイーブなヒトＴ細胞を刺激することができるこれらの領域から得たペプチド配列を詳しく示す。
【図２】ナイーブなヒトＴ細胞のin vitroでの増殖を促進することができるＩＦＮβペプチドを示す表を提示する。
【図３】経時的Ｔ細胞活性化アッセイからの典型的なデータを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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