(57)【要約】共通の配列モチーフを有するＰＭＳ２相同体を使用する細胞を超変異性にする方法が開示される。本発明のＰＭＳ２相同体はＡＴＰアーゼ様モチーフを有し、そしてＰＭＳ２−１３４に最低約９０％同一である。変異体ライブラリーの生成方法ならびに癌についての診断および治療の応用でのＰＭＳ２相同体の使用方法もまた開示される。
2005531291.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２３のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるＰＭＳ２相同体を細胞に導入してそれにより超変異性細胞を作成すること（ここで前記ＰＭＳ２相同体はＰＭＳＲ２およびＰＭＳＲ３以外である）を含んでなる、前記細胞を超変異性にする方法。
【請求項２】
前記ポリペプチドが配列番号２４のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ポリペプチドが配列番号２２のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記ＰＭＳ２相同体がＡＴＰアーゼドメインを有するタンパク質をコードする、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が真核生物細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記細胞が原核生物細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項５記載の方法。
【請求項８】
前記細胞がヒト細胞である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記細胞を変異原と接触させることをさらに含んでなる、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
目的遺伝子中の１突然変異について前記細胞をスクリーニングすることをさらに含んでなる、請求項１もしくは９記載の方法。
【請求項１１】
前記スクリーニングが前記超変異性細胞の核酸に対して実施される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記スクリーニングが前記超変異性細胞のタンパク質に対して実施される、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
前記スクリーニングが、前記超変異性細胞の表現型を検査することにより実施される、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
前記超変異性細胞の遺伝的安定性を復帰させることをさらに含んでなる、請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
配列番号２３のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるＰＭＳ２相同体を、目的の１遺伝子を含有する細胞中に導入してそれにより前記細胞を超変異性にすること、および目的の前記遺伝子中に１突然変異を含んでなる変異体細胞を選択することを含んでなる、目的遺伝子中における突然変異の作成方法。
【請求項１６】
前記ポリペプチドが配列番号２４のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリペプチドが配列番号２２のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
前記ＰＭＳ２相同体がＡＴＰアーゼドメインを有するタンパク質をコードする、請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞が真核生物細胞である、請求項１５記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞が原核生物細胞である、請求項１５記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞がヒト細胞である、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞を変異原と接触させることをさらに含んでなる、請求項１５記載の方法。
【請求項２４】
前記変異体細胞の遺伝的安定性を復帰させることをさらに含んでなる、請求項１５もしくは２３記載の方法。
【請求項２５】
配列番号２３のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるＰＭＳ２相同体を１細胞型に導入してそれにより超変異性細胞を作成すること（ここで前記ＰＭＳ２相同体はＰＭＳＲ２およびＰＭＳＲ３以外である）、前記超変異性細胞型をインキュベートして突然変異を蓄積させること、前記超変異性細胞から核酸を抽出すること、ならびに核酸ライブラリーを創製することを含んでなる、前記細胞型における変異体遺伝子のライブラリーの生成方法。
【請求項２６】
前記ポリペプチドが配列番号２４のアミノ酸配列を含んでなる、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記ライブラリーがｃＤＮＡライブラリーである、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記ライブラリーがゲノムライブラリーである、請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
配列番号２３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と試料とを接触させて、配列番号２３のアミノ酸配列を含んでなるＰＭＳ２相同体をコードするポリヌクレオチドの発現を検出すること（ここで前記ＰＭＳ２相同体の発現は新形成と関連する）を含んでなる、新形成を検出するための細胞のアッセイ方法。
【請求項３０】
検出することがノーザンブロット分析を含んでなる、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
検出することがＰＣＲを含んでなる、請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
検出することがＲＴ−ＰＣＲ分析を含んでなる、請求項２９記載の方法。
【請求項３３】
ＰＭＳ２相同体もしくはそのペプチドフラグメントに対し作られた抗体と試料とを接触させること；およびＰＭＳ２相同体もしくはそのペプチドフラグメントとともに形成される抗体複合体の存在を検出してそれにより前記試料中の前記ＰＭＳ２相同体の存在を検出すること（ここで前記ＰＭＳ２相同体の存在は新形成と関連する）ことを含んでなる、新形成を検出するための細胞のアッセイ方法。
【請求項３４】
検出することが、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロットアッセイ、免疫蛍光アッセイ、酵素免疫測定法および化学発光アッセイよりなる群から選択されるイムノアッセイを含んでなる、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
ＰＭＳ２相同体関連の新形成を伴う患者を同定すること、前記ＰＭＳ２相同体の発現の阻害剤を前記患者に投与すること（ここで前記阻害剤は前記ＰＭＳ２相同体関連の新生物における前記ＰＭＳ２相同体の発現を抑制する）を含んでなる、癌を伴う患者の治療方法。
【請求項３６】
前記ＰＭＳ２相同体関連の新生物がリンパ腫である、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
前記ＰＭＳ２相同体の前記阻害剤が前記ＰＭＳ２相同体をコードするポリヌクレオチドに対し向けられたアンチセンス核酸である、請求項３５記載の方法。
【請求項３８】
前記ＰＭＳ２相同体の前記阻害剤がリボザイムである、請求項３５記載の方法
【請求項３９】
前記阻害剤が、前記ＰＭＳ２相同体に特異的に結合するＡＴＰアーゼ類似物である、請求項３５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２００２年２月２１日出願の米国仮出願第６０／３５８，５７８号明細書（その開示はそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）の利益を主張する。
本発明はミスマッチ修復遺伝子の領域に関する。具体的には、それは、ドミナントネガティブのミスマッチ修復遺伝子を使用する超変異性（ｈｙｐｅｒｍｕｔａｂｌｅ）細胞の生成の分野に関し、ここで、該ミスマッチ修復遺伝子によりコードされるタンパク質はＡＴＰアーゼのコンセンサス配列を含んでなる。
【背景技術】
【０００２】
過去４年以内に、遺伝性非ポリープ性結腸直腸癌症候群（ＨＮＰＣＣ）（リンチ症候群ＩＩ型としてもまた知られる）の遺伝的原因が、該疾患に冒された家系の大多数について確かめられた（非特許文献１）。ＨＮＰＣＣの分子的基礎は不完全なミスマッチ修復（ＭＭＲ）由来の遺伝的不安定性を伴う。今日まで、ｍｕｔＳ相同体（ｈｏｍｏｌｏｇ）ＧＴＢＰ、ｈＭＳＨ２、ｈＭＳＨ３ならびにｍｕｔＬ相同体ｈＭＬＨ１、ｈＰＭＳＩおよびｈＰＭＳ２を包含するＭＭＲの過程中のタンパク質をコードしかつそれに参画すると思われる６遺伝子がヒトで同定されている（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８）。これらの遺伝子の機能に影響を及ぼす突然変異すなわち後成的変化が、上に列挙された相同体の全部について、マイクロサテライトの不安定性（ＭＩ）（ＭＭＲ欠損による一、二もしくは三ヌクレオチド反復中の「翻訳スリップ突然変異」から生じるある型のゲノムの不安定性）を表す腫瘍組織中で報告されている（非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１）。これらの遺伝子の全部中の生殖系列突然変異がＨＮＰＣＣの家系で同定されている（非特許文献２；非特許文献４；非特許文献１；非特許文献５；非特許文献８）一方、ＭＩを表す腫瘍型が既知のＭＭＲ遺伝子のいずれか中の突然変異を欠く多くの例が存在し、ＭＭＲ過程に関与する付加的遺伝子の存在を示唆している（個人的観察結果；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４）。ＨＮＰＣＣ患者で生じる事実上全部の腫瘍におけるその発生に加え、ＭＩは、多くの異なる組織型から発する独特の分子および表現型の特性をもつ散発性腫瘍の１サブセットにおいてもまた見出され、他の癌の型における不完全なＭＭＲの拡大された関与のためのある役割を示唆している（非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６）。
【０００３】
ＭＭＲ欠損から生じる変異誘発体（ｍｕｔａｔｏｒ）欠損はいずれかのＤＮＡ配列に影響を及ぼし得るとはいえ、マイクロサテライト配列はＭＭＲ異常に対しとりわけ感受性である（非特許文献１７）。マイクロサテライトの不安定性（ＭＩ）は従って不完全なＭＭＲの有用な指標である。ＨＮＰＣＣ患者で生じる事実上全部の腫瘍におけるその発生に加え、ＭＩは独特の分子および表現型の特性をもつ散発性腫瘍の小さな部分で見出される（非特許文献１０）。
【０００４】
ＨＭＰＣＣは常染色体ドミナントの様式で遺伝され、その結果、冒された家族メンバーの正常細胞は、関連するＭＭＲ遺伝子の１変異体アレル（冒された親から遺伝される）および１野性型アレル（冒されていない親から遺伝される）を含有する。しかしながら、腫瘍発生の初期段階の間に、野性型アレルは体細胞突然変異により不活性化されて機能的なＭＭＲ遺伝子をもたない細胞を残し、そしてＭＭＲ活性の大きな欠陥をもたらす。体細胞突然変異は、生殖系列突然変異に加えて腫瘍細胞中で不完全なＭＭＲを生成させるのに必要とされるため、この機構は一般に、他の遺伝性癌を開始させる腫瘍抑制遺伝子の二対立遺伝子的不活性化に類似の２ヒットを伴うものと称されている（非特許文献４；非特許文献１；非特許文献１８）。この２ヒット機構と一致して、ＨＭＰＣＣ患者の非腫瘍性細胞は一般に、野性型アレルの存在により正常レベル近くのＭＭＲ活性を保持する。
【０００５】
遺伝的研究は、ＰＭＳ２を包含するミスマッチ修復（ＭＭＲ）遺伝子の不活性化がヒトおよびげっ歯類組織中での遺伝的不安定性および腫瘍形成性をもたらすことを明確に示した。大多数の症例において、ＭＭＲスペルチェック系（腫瘍抑制アレルの不活性化の「２ヒット」仮説に類似である過程）の１成分を完全にノックアウトするために特定の１ＭＭＲ遺伝子の双方のアレルの不活性が必要とされる。正常および腫瘍性組織中の突然変異されたＭＭＲ遺伝子のスクリーニングに焦点をあてた独立した研究が、ＭＭＲ遺伝子の単一の突然変異されたアレルのみが腫瘍に関連して見出された２症例を除き、２ヒット仮説を確認した。このアレルはコドン１３４にナンセンス突然変異を含有するＰＭＳ２遺伝子であり、これは細胞のＭＭＲ活性に対するドミナントネガティブな影響を導き出すことが可能な１３３アミノ酸のタンパク質をコードする短縮型ポリペプチドをもたらす。この仮説は、それ以外はＭＭＲに熟達した哺乳動物細胞のＭＭＲ活性に対するドミナントネガティブな影響を引き起こすＰＭＳ１３４タンパク質の能力を示すその後の研究により確認された。
【０００６】
ＰＭＳ１３４の短縮型ドメインはＰＭＳＲ２およびＰＭＳＲ３タンパク質のコーディング領域に高度に相同性であり、タンパク質レベルで９０％以上の同一性を共有する。しかしながら、ＰＭＳＲ２およびＰＭＳＲ３は正常組織中で発現されるとは思われず、また、ＨＭＰＣＣと関連することが示されていない。
【０００７】
野性型タンパク質もしくはそのフラグメントの過剰発現または該タンパク質の特定のタンパク質ドメインへの突然変異の導入（いわゆるドミナントネガティブの阻害性変異体）のいずれかによる遺伝子産物機能の操作によりシグナル伝達経路を変える能力は、Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ（非特許文献１９）により酵母の系、ビール酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）で１０年にわたって記述された。野性型遺伝子産物の過剰発現が、最もありそうには低レベルで存在しかつ活性に必要であるタンパク質のようなある因子の「飽和（ｓａｔｕｒａｔｉｎｇ−ｏｕｔ）」により類似のドミナントネガティブの阻害性表現型をもたらし得；高レベルのその同族のパートナーへの結合によるタンパク質の除去が同一の正味の影響をもたらし、タンパク質および関連するシグナル伝達経路の不活性化に至る。最近、Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓら（非特許文献２０；特許文献１）によりなされた研究は、包括的ＤＮＡ超変異性を賦与するための哺乳動物細胞中へのドミナントネガティブの阻害性ミスマッチ修復変異体の導入の利用性を示した。ＭＭＲ過程を操作しかつ従ってこの例では哺乳動物細胞中の標的の宿主ゲノムの変異性を随意に増大させる能力は、元の野性型細胞の革新的な細胞サブタイプもしくはバリアントの生成を可能にする。これらのバリアントは指定される所望の選択過程下に置くことができ、その結果は変えられた生物学的分子（１種もしくは複数）を発現しかつ新たな特質を有する新規生物体である。細菌細胞中のＭＭＲアレルを包含する１遺伝子のドミナントネガティブのアレルの創製かつ導入という概念は、遺伝的に変えられた原核生物のミスマッチ修復遺伝子をもたらすことが報告されている（非特許文献２１；非特許文献２２；非特許文献２３）。
【０００８】
さらに、変えられたＭＭＲ活性は、酵母、哺乳動物細胞および植物を包含する多様な種からのＭＭＲ遺伝子が過剰発現される場合に示されている（非特許文献３；非特許文献２４；非特許文献２５；非特許文献２６）。
【０００９】
最近、Ｇｕａｒｎｅら（非特許文献２７）はＭＬＨ１およびＰＭＳ２のヘテロ二量体ＭｕｔＬαのＡＴＰアーゼ機能を記述した。ＧｕａｒｎｅらはＰＭＳ２の三次元構造を研究し、そしてＡＴＰ結合および加水分解に参画する分子の部分を決定した。Ｇｕａｒｎｅらは、二量体化およびＡＴＰアーゼ活性がおそらくＭＭＲ機能に必要とされると仮定した。しかしながら、Ｇｕａｒｎｅらは彼らの知見がミスマッチ修復のドミナントネガティブの表現型にどのように関係するかを教示もしくは示唆していない。
【００１０】
それらの作動の特徴および能力を増大させるための細胞の遺伝的操作方法に対する当該技術分野における継続的必要性が存在する。この目的のため、超変異性細胞の生成における使用のためにドミナントネガティブな影響を賦与するＭＭＲ遺伝子を理解、開発および設計することの当該技術分野における必要性が存在する。
【特許文献１】Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓらへの米国特許第６，１４６，８９４号明細書
【非特許文献１】Ｌｉｕ，Ｂ．ら（１９９６）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：１６９−１７４
【非特許文献２】Ｂｒｏｎｎｅｒ，Ｃ．Ｅ．ら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：２５８−２６１
【非特許文献３】Ｆｉｓｈｅｌ，Ｒ．ら（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７：１０２７−１０３８
【非特許文献４】Ｌｅａｃｈ，Ｆ．Ｓ．ら（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７５：１２１５−１２２５
【非特許文献５】Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ，Ｎ．Ｃ．ら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３７１：７５−８０
【非特許文献６】Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ，Ｎ．Ｃ．ら（１９９６）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３１：３９５−３９７
【非特許文献７】Ｐａｌｏｍｂｏ，Ｆ．ら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：１９１２−１９１４
【非特許文献８】Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ，Ｎ．ら（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３：１６２５−１６２９
【非特許文献９】Ｊｉｒｉｃｎｙ，Ｊ．とＭ．Ｎｙｓｔｒｏｍ−Ｌａｈｔｉ（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．１０：１５７−１６１
【非特許文献１０】Ｐｅｒｕｃｈｏ，Ｍ．（１９９６）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７７：６７５−６８４
【非特許文献１１】Ｓｔｒａｎｄ，Ｍ．ら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６５：２７４−２７６
【非特許文献１２】Ｎａｇｙ，Ｍ．ら（２０００）Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １４：２１４２−２１４８
【非特許文献１３】Ｐｅｌｔｏｍａｋｉ  Ｐ．（２００１）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１０：７３５−７４０
【非特許文献１４】Ｗａｎｇ  Ｙ．ら（２００１）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ９３：３５３−３６０
【非特許文献１５】Ｓｔａｒｏｓｔｉｋ  Ｐ．ら（２０００）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５７：１１２９−１１３６
【非特許文献１６】Ｃｈｅｎ  Ｙ．ら（２００１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：４１１２−４１２１
【非特許文献１７】Ｍｏｄｒｉｃｈ，Ｐ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：１９５９−１９６０
【非特許文献１８】Ｐａｒｓｏｎｓ，Ｒ．ら（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７５：１２２７−１２３６
【非特許文献１９】Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２９（６１３６）：２１９−２２２
【非特許文献２０】Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ  Ｎ．Ｃ．ら（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：１６３５−１６４１
【非特許文献２１】Ａｒｏｎｓｈｔａｍ  Ａ．とＭ．Ｇ．Ｍａｒｉｎｕｓ（１９９６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：２４９８−２５０４
【非特許文献２２】Ｗｕ  Ｔ．Ｈ．とＭ．Ｇ．Ｍａｒｉｎｕｓ（１９９４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：５３９３−４００
【非特許文献２３】Ｂｒｏｓｈ  Ｒ．Ｍ．Ｊｒ．とＳ．Ｗ．Ｍａｔｓｏｎ（１９９５）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：５６１２−５６２１
【非特許文献２４】Ｓｔｕｄａｍｉｒｅ  Ｂ．ら（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：７５９０７６０１
【非特許文献２５】Ａｌａｎｉ  Ｅ．ら（１９９７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７：２４３６−２４４７
【非特許文献２６】Ｌｉｐｋｉｎ  Ｓ．Ｍ．ら（２０００）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２４：２７−３５
【非特許文献２７】Ｇｕａｒｎｅら（２００１）ＥＭＢＯ  Ｊ．２０（１９）：５５２１−５５３１
【発明の開示】
【００１１】
［発明の要約］
本発明は、配列番号２３のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるＰＭＳ２相同体を細胞に導入してそれにより細胞を超変異性にすることを含んでなる、細胞を超変異性にする方法を提供し、ここで該ＰＭＳ２相同体はＰＭＳＲ２およびＰＭＳＲ３以外である。
【００１２】
本発明はまた、ポリペプチド（ここで該ポリペプチドは配列番号２３のアミノ酸配列を含んでなる）をコードするヌクレオチド配列を含んでなるＰＭＳ２相同体を、目的の１遺伝子を含有する細胞中に導入してそれにより前記細胞を超変異性にすること（ここで該ＰＭＳ２相同体はＰＭＳＲ２およびＰＭＳＲ３以外である）、ならびに目的の前記遺伝子中の１突然変異を含んでなる変異体細胞を選択することを含んでなる、目的の１遺伝子中での突然変異の作成方法も提供する。
【００１３】
本発明はまた、超変異性細胞を創製するための細胞中への導入のためのドミナントネガティブのＭＭＲ遺伝子の作成方法も提供する。該ドミナントネガティブのＭＭＲ遺伝子は、配列番号２３のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードしかつＰＭＳ２−１３４（配列番号１３）と最低約９０％の相同性を共有する。
【００１４】
本発明はまた、突然変異された遺伝子のライブラリーの生成方法も提供する。本発明の該方法の態様において、ＰＭＳ２相同体のドミナントネガティブなアレルが細胞中に導入されてそれにより該細胞は超変異性となる。該細胞は遺伝子中に突然変異を蓄積し、そして細胞の一集団は従って安定なゲノムをもつ野性型細胞に比較して突然変異された遺伝子のライブラリーを含みうる。
【００１５】
本発明の該方法のいくつかの態様において、該ポリペプチドは配列番号２４のアミノ酸配列を含んでなる。いくつかの態様において、該ポリペプチドは保存されたＡＴＰアーゼドメインを有する。本発明の該方法のいくつかの態様において、ＰＭＳ２相同体はＰＭＳＲ６である。本発明の該方法のある態様において、ＰＭＳＲ６ポリペプチドは配列番号２２のアミノ酸配列を含んでなりかつ配列番号２１のポリヌクレオチド配列によりコードされる。
【００１６】
本発明の該方法のいくつかの態様において、ＰＭＳ２相同体はさらに、ＭＬＨ１と二量体化することの不能をもたらす短縮を含んでなる。これは、例えばＧｕａｒｎｅら（２００１）ＥＭＢＯ  Ｊ．２０（１９）：５５２１−５５３１により記述されかつ図２に示されるところの、Ｅ’  α−へリックスからＣ末端、Ｅ  α−へリックスからＣ末端、Ｆ  α−へリックスからＣ末端、Ｇ  α−へリックスからＣ末端、Ｈ’  α−へリックスからＣ末端、Ｈ  α−へリックスからＣ末端、もしくはＩ  α−へリックスからＣ末端からの短縮でありうる。
【００１７】
本発明の方法は真核生物細胞、とりわけ原生動物、酵母、昆虫、脊椎動物、および哺乳動物、とりわけヒトからの細胞に使用してよい。本発明の方法は細菌細胞のような原核生物細胞にもまた使用してよく、そして植物細胞に使用してよい。
【００１８】
本発明の方法はまた、ミスマッチ修復単独を混乱させることにより観察されるものを上回って突然変異の率を増大させるように化学物質変異原もしくは放射線で細胞を処理することを含んでもよい。
【００１９】
本発明の超変異性細胞は、所望の表現型を賦与する目的の遺伝子中の突然変異を検出するためにスクリーニングしてよい。該細胞は、該細胞の核酸、タンパク質もしくは表現型を検査することによりスクリーニングしてよい。
【００２０】
本発明の該方法のいくつかの態様において、遺伝的安定性が超変異性細胞に復帰されるかもしれず、それによりさらに誠実に増殖しうる、目的の遺伝子中に突然変異を含んでなる細胞を維持することができる。
【００２１】
本発明はまた、配列番号２３のアミノ酸配列を含んでなるＰＭＳ２相同体をコードするポリヌクレオチドの発現を検出するために配列番号２３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と前記サンプルを接触させることを含んでなる、新形成を検出するための細胞のアッセイ方法も提供し、ここで前記ＰＭＳ２相同体の発現は新形成と関連する。ＰＭＳ２相同体の検出は、限定されるものでないがノーザンブロット分析およびＲＴ−ＰＣＲを挙げることができる当該技術分野で既知のいかなる手段によって達成してもよい。
【００２２】
本発明はまた、ＰＭＳ２相同体もしくはそのペプチドフラグメントに反応する抗体と前記サンプルを接触させること；およびＰＭＳ２相同体もしくはそのペプチドフラグメントとともに形成された抗体複合体の存在を検出してそれにより前記サンプル中の前記ＰＭＳ２相同体の存在を検出することを含んでなる、新形成を検出するための細胞のアッセイ方法も提供し、ここで前記ＰＭＳ２相同体の存在は新形成と関連する。ＰＭＳ２相同体の検出方法は、限定されるものでないがラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロット、免疫蛍光アッセイ、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）および化学発光アッセイを挙げることができる当該技術分野で既知のいずれの手段によってもよい。
【００２３】
本発明はまた、ＰＭＳ２相同体関連の新形成を伴う患者を同定すること、前記ＰＭＳ２相同体の発現の阻害剤を前記患者に投与することを含んでなる、癌を伴う患者の治療方法も提供し、ここで前記阻害剤は前記ＰＭＳ２相同体関連の新生物における前記ＰＭＳ２相同体の発現を抑制する。こうした新形成は例えばリンパ腫を包含する。ＰＭＳ２相同体発現の阻害剤は、ＰＭＳ２相同体を特異的に結合するアンチセンスヌクレオチド、リボザイム、抗体フラグメントおよびＡＴＰアーゼ類似物を包含する。
［発明の詳細な説明］
本発明はＡＴＰアーゼのコンセンサス配列をもつミスマッチ修復遺伝子の誘導体を使用して細胞を超変異性にする方法を提供する。このコンセンサス配列は、宿主細胞にトランスフェクトされる場合にミスマッチ修復のドミナントネガティブな表現型を賦与する多数のＰＭＳ２相同体中に存在する。
【００２４】
ＰＭＳＲ２およびＰＭＳＲ３のようなＰＭＳ２相同体はタンパク質のｍｕｔＬミスマッチ修復ファミリーの相同体をコードする。ＰＭＳＲ２およびＰＭＳＲ３双方のタンパク質は、例えばヒトＰＭＳ２遺伝子およびそのコードされるポリペプチドのＮ末端に高度に相同性である。機能研究は、ＰＭＳＲ２もしくはＰＭＳＲ３  ｃＤＮＡがＭＭＲに熟練した哺乳動物細胞中で発現される場合にこれらの相同体のいずれもドミナントネガティブな様式でＭＭＲを不活性化することが可能であり遺伝的不安定性に至ることを示している（図５を参照されたい）。
【００２５】
予備的遺伝子発現研究は、ＰＭＳＲ２もしくはＰＭＳＲ３遺伝子が非腫瘍性組織中で発現されず、また、マイクロサテライトの不安定性（ＭＭＲ欠損の特質）を表すバーキットリンパ腫起源のヒトリンパ腫細胞株の１サブセット中でのみ検出されることを見出している（図３および４を参照されたい）。
【００２６】
本発明は、ドミナントネガティブな様式でＭＭＲ活性を低下させるよう機能するＰＭＳ２相同体をコードするポリヌクレオチド配列を細胞中に導入することによる、超変異性細胞の生成における使用のための、ＰＭＳ１３４、ＰＭＳＲ２およびＰＭＳＲ３の保存されたドメインを含んでなりかつＡＴＰアーゼドメインの保存された部分を共有するＰＭＳ２相同体の使用に向けられる。
【００２７】
コンセンサス配列、およびＡＴＰアーゼドメインの構造的特徴を包含するＰＭＳ２のＮ末端ドメインに対する相同性を含んでなるタンパク質がドミナントネガティブのミスマッチ修復阻害剤として機能することが発見された。特定の一態様において、ＰＭＳＲ６発現は細胞中のＭＭＲ欠損のドミナントネガティブの表現型を賦与する。
【００２８】
配列番号２３もしくは配列番号２４のコンセンサス配列を含んでなりかつＰＭＳ２−１３４と最低約９０％の相同性を有する一部分を含んでなるタンパク質が、細胞中に導入される場合にドミナントネガティブの表現型およびＭＭＲ活性の低下を賦与し得ることがさらに発見された。いくつかの態様において、ＰＭＳ２相同体はＡＴＰアーゼドメインを含んでなる。ＰＭＳ２相同体はさらに、ＰＭＳ２−１３４に相同であるドメインおよび異種である部分を含んでなるキメラもしくは融合タンパク質のようなＭＭＲタンパク質以外であるドメインを含んでもよい。
【００２９】
本明細書で使用されるところの「ＰＭＳ２相同体」という用語はＡＶＫＥ  ＬＶＥＮＳＬＤＡＧＡ  ＴＮ（配列番号２３）のコンセンサス配列を有するポリペプチド配列を指す。いくつかの態様において、ＰＭＳ２相同体はＬＲＰＮＡＶＫＥ  ＬＶＥＮＳＬＤＡＧＡ  ＴＮＶＤＬＫＬＫＤＹ  ＧＶＤＬＩＥＶＳＧＮ  ＧＣＧＶＥＥＥＮＦＥ（配列番号２４）のポリペプチド配列を含んでなる。ＰＭＳ２相同体はこの構造的特徴を含んでなり、また、作動のいずれか特定の理論により拘束されることを願わない一方、この構造的特徴は既知のＡＴＰアーゼとの高い相同性によりＡＴＰアーゼ活性と相関すると考えられている。この構造的特徴および相互に関連づけられる機能の知識、ならびに本明細書に提供される代表的な数の例は、本発明の方法でどのタンパク質を使用してよいかを当業者に容易に同定させることができる。
【００３０】
本明細書で使用されるところの「ＰＭＳ２相同体をコードする核酸配列」は、ＡＴＰアーゼコンセンサス配列モチーフを有しかつ細胞中で発現される場合に該細胞中でのミスマッチ修復の活性を低下させるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を指す。ＰＭＳ２相同体をコードする核酸配列は、細胞中に導入しかつ発現される場合に、内因性のミスマッチ修復媒介性のＤＮＡ修復活性の有効性を低下させることにより自発的突然変異の率を増大させ、それにより該細胞を遺伝的変化に対し高度に感受性にする（すなわち細胞を超変異性とする）。超変異性細胞は、その後、野性型細胞中で見出されない発現特質（ｏｕｔｐｕｔ  ｔｒａｉｔ）（１種もしくは複数）を表すバリアント同胞中での１遺伝子もしくは一組の遺伝子中の突然変異についてスクリーニングするのに利用し得る。ＰＭＳ２相同体は変えられたミスマッチ修復遺伝子であってよいか、もしくは、細胞中で過剰発現される場合は損なわれたミスマッチ修復活性をもたらすミスマッチ修復遺伝子であってよい。
【００３１】
ＰＭＳ２相同体をコードする核酸配列を細胞中に導入しかつ発現させる。該細胞のミスマッチ修復活性が低下され、そして該細胞は超変異性となる。いくつかの態様において、細胞をさらに化学物質変異原とともにインキュベートして突然変異の率をさらに高めてもよい。
【００３２】
ＭＭＲ欠損が宿主の内在性のＤＮＡ突然変異率の約１０００倍の増大に至る可能性があることが報告されている一方、ＭＭＲ欠損単独で、新たな活性（１種もしくは複数）をもつ変えられた生化学物質（ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を創製するように宿主細菌のＤＮＡ内のすべての遺伝子を変えるのに十分であることができるという保証は存在しない。従って、臭化エチジウム、ＥＭＳ、ＭＮＮＧ、ＭＮＵ、タモキシフェン、８−ヒドロキシグアニンのような化学物質変異原およびそれらのそれぞれの類似物、ならびに：Ｋｈｒｏｍｏｖ−Ｂｏｒｉｓｏｖ，Ｎ．Ｎ．ら（１９９９）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．４３０：５５−７４）；Ｏｈｅ，Ｔ．ら（１９９９）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．４２９：１８９−１９９）；Ｈｏｕｒ，Ｔ．Ｃ．ら（１９９９）Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３７：５６９−５７９）；Ｈｒｅｌｉａ，Ｐ．ら（１９９９）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔｅｒａｃｔ．１１８：９９１１１）；Ｇａｒｇａｎｔａ，Ｆ．ら（１９９９）Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｏｌ．Ｍｕｔａｇｅｎ．３３：７５−８５）；Ｕｋａｗａ−Ｉｓｈｉｋａｗａ  Ｓ．ら（１９９８）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．４１２：９９−１０７；ｗｗｗ．ｅｈｓ．ｕｔａｈ．ｅｄｕ／ｏｈｈ／ｍｕｔａｇｅｎｓなどに教示されるもののような他者の使用は、突然変異の範囲をさらに拡大しかつ所望の新たな発現特質（１種もしくは複数）をもつ宿主細胞を順に生成させ得る１種もしくはそれ以上の遺伝子中の変化を得る見込みを増大させるために使用し得る。ミスマッチ修復欠損は、ＤＮＡ損傷活性をもつ化学物質による毒性に対する増大された抵抗性をもつ宿主に至る。この特徴は、ミスマッチ欠損細胞がこうした作用物質に曝露される場合に、こうした化学物質変異原の毒性の影響によりそうでなければ不可能であるとみられる付加的な遺伝的に多彩な宿主の創製を可能にする［Ｃｏｌｅｌｌａ，Ｇ．ら（１９９９）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８０：３３８−３４３）；Ｍｏｒｅｌａｎｄ，Ｎ．Ｊ．ら（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：２１０２−２１０６）；Ｈｕｍｂｅｒｔ，Ｏ．ら（１９９９）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２０：２０５−２１４）；Ｇｌａａｂ，Ｗ．Ｅ．ら（１９９８）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．３９８：１９７−２０７］。
【００３３】
ＰＭＳ２相同体でトランスフェクトしてよい細胞はいかなる原核生物もしくは真核生物細胞も包含する。原核生物細胞は多様な属の細菌細胞であってよい。
【００３４】
他の態様において、細胞は限定されるものでないが昆虫細胞、原生動物、酵母、真菌、脊椎動物細胞（例えば魚類、鳥類、は虫類および両生類細胞のような）、哺乳動物細胞（例えばヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類、ヤギ、ウマ、ウシおよびヒツジ細胞を包含する）を挙げることができる真核生物細胞である。
【００３５】
他の態様において、植物細胞をＰＭＳ２相同体でトランスフェクトして該植物細胞を超変異性にしてもよい。
【００３６】
細胞が一旦超変異性にされれば、細胞のゲノムは目的の遺伝子中の突然変異を包含する突然変異を蓄積し始めることができる。目的の遺伝子中の突然変異は、選択し得る望ましい新たな表現型をこれらの遺伝子に賦与するかもしれない。制限しない一例として、タンパク質をコードする遺伝子中の突然変異は該タンパク質をより高レベルで発現されるようにするかもしれない。別の制限しない例として、抗体および酵素のようなタンパク質は、それぞれそれらの抗原もしくは基質に対するより高い親和性のような変えられた結合の特徴を有するかもしれない。こうした変えられた表現型はスクリーニングすることができ、そして、該遺伝子を含有しかつ変えられた表現型を表す細胞をさらなる培養のため選択してよい。
【００３７】
新たな表現型を伴う目的の遺伝子を含有する細胞のゲノムは、トランスフェクトされたＰＭＳ２相同体の影響を相殺することにより遺伝的に安定にされるかもしれない。当業者は、ＰＭＳ２相同体を含有するプラスミドの細胞を「キュアリング」、つまりＰＭＳ２相同体がもはや発現されないように細胞内のＰＭＳ２相同体を破壊しうる。薬物圧下でのみ細胞中で維持されるプラスミドを使用して、ＰＭＳ２相同体をもつ細胞を培養してよい。薬物圧を除去する場合に、該細胞は該プラスミドを喪失する傾向がある。他の態様において、誘導可能な発現ベクターを使用してＰＭＳ２相同体を発現させてもよい。その後、誘導物質分子を取り上げてゲノムを安定化させることができる。
【００３８】
本明細書で使用されるところの、「ミスマッチプルーフリーディング」ともまた呼ばれる「ミスマッチ修復」という用語は、細菌のような原核生物細胞からより複雑な哺乳動物細胞までほど異質な細胞で報告されているタンパク質複合体により実施される進化上高度に保存された過程を指す（Ｍｏｄｒｉｃｈ，Ｐ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：１９５９−１９６０；Ｐａｒｓｏｎｓ，Ｒ．ら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：７３８−７４０；Ｐｅｒｕｃｈｏ，Ｍ．（１９９６）Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．３７７：６７５−６８４）。ミスマッチ修復遺伝子はこうしたミスマッチ修復複合体のタンパク質の１種をコードする遺伝子である。いずれかの特定の作用機序理論により拘束されることを欲しないとは言え、ミスマッチ修復複合体はヌクレオチド塩基の非相補的対形成から生じるＤＮＡらせんの歪みを検出すると考えられている。より新しいＤＮＡ鎖上の非相補的塩基が取り出され、そして該取り出された塩基がより古いＤＮＡ鎖に相補的である適切な塩基で置換される。こうして、細胞は、ＤＮＡ複製中の誤りの結果として起こる多くの突然変異を排除して、親細胞由来の同胞細胞の遺伝的安定性をもたらす。
【００３９】
数種の野性型アレル、ならびにドミナントネガティブのアレルは、同一細胞中の野性型アレルの存在下であってもミスマッチ修復欠損表現型を生じさせる。ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブのアレルの一例は、コドン１３４に短縮突然変異を持つヒト遺伝子ｈＰＭＳ２−１３４である（Ｐａｒｓｏｎｓ，Ｒ．ら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：７３８−７４０；Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ  Ｎ．Ｃ．ら（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：１６３５−１６４１）。突然変異はこの遺伝子の産物を１３４番目のアミノ酸の位置で異常に終止させ、Ｎ末端の１３３アミノ酸を含有する短縮されたポリペプチドをもたらす。こうした突然変異は、ＤＮＡ複製後に細胞中に蓄積する突然変異の率の増大を引き起こす。ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブのアレルの発現は、野性型アレルの存在下であってもミスマッチ修復活性の減損をもたらす。こうした影響を生じさせるいかなるＰＭＳ２相同体も、それが野性型であろうと変えられていようと、それが哺乳動物、酵母、真菌、両生類、昆虫、植物、細菌由来であろうとキメラもしくは融合タンパク質として設計されていようと、本発明で使用し得る。
【００４０】
例えば宿主ＭＭＲの供給源となりうる酵母は突然変異されていてももしくはされていなくてもよい。本出願で使用される「酵母」という用語は、限定されるものでないがサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）種、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）種および他の真菌を挙げることができる真核生物界からのいかなる株も含んでなる（Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ，Ｇ．とＨｏｌｌｅｎｂｅｒｇ，Ｃ．Ｐ．（１９９７）Ｇｅｎｅ  １９０（１）：８７−９７）。これらの生物体は例えば化学物質変異原もしくは放射に曝露し得、そして不完全なミスマッチ修復についてスクリーニングし得る。ミスマッチ修復タンパク質をコードするいかなる細胞からのゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡもしくはタンパク質も野性型配列からの変異について分析し得る。ＰＭＳ２相同体のドミナントネガティブのアレルもまた、例えば、タンパク質の一部分が配列番号２３もしくは配列番号２４のコンセンサス配列を含んでなり、ＰＭＳ２−１３４と約９０％のアミノ酸相同性を有する、および異種アミノ酸配列である別の部分の融合タンパク質もしくはキメラタンパク質を創製することにより人工的に創製し得る。
【００４１】
部位特異的突然変異誘発の多様な技術を使用し得る。超変異性酵母の生成における使用のためのこうしたアレル（天然であれ人工的であれ）の適合性は、（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ  Ｎ．Ｃ．ら（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：１６３５−１６４１に記述される方法を使用して）１種もしくはそれ以上の野性型アレルの存在下での該アレルにより引き起こされるミスマッチ修復活性を試験してそれがドミナントネガティブのアレルであるかどうかを決定することにより評価し得る。
【００４２】
ミスマッチ修復遺伝子の野性型ミスマッチ修復アレルもしくはドミナントネガティブのアレルを過剰発現する細胞は超変異性になることができる。これは、こうした細胞の自発的突然変異率がこうしたアレルを伴わない細胞に比較して上昇されることを意味している。自発的突然変異率の上昇の程度は、１時間あたりの細胞倍加の関数として測定されるところの正常細胞のものの最低２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍もしくは１０００倍であり得る。
【００４３】
本発明の一局面によれば、ＰＭＳ２相同体をコードするポリヌクレオチドを例えば哺乳動物細胞、脊椎動物細胞、植物細胞もしくは酵母のような細胞中に導入する。該遺伝子はＰＭＳ２相同体でありかつドミナントネガティブである。ＰＭＳ２相同体は天然に存在し得るか、もしくは実験室で作成し得る。ポリヌクレオチドはゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、または化学的に合成されたポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの形態であり得る。該分子は、形質転換、電気穿孔法、交接、粒子砲撃法、もしくは文献中に記述される他の方法により細胞中に導入し得る。
【００４４】
形質転換は、本明細書で、それによりポリヌクレオチドもしくはポリペプチドが細胞中に導入されるいずれかの方法として使用される。形質転換の方法は細胞の懸濁液を使用して酵母培養物中で実施し得る。
【００４５】
一般に、形質転換は細胞の懸濁液を使用して実施することができるが、しかし、他の方法もまた、処理された細胞の十分な部分がトランスフェクトされた細胞を増殖かつ利用させるように該ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドを取り込む限りは使用可能である。ポリヌクレオチドのタンパク質産物は細胞中で一過性にもしくは安定に発現されてよい。形質転換の技術は当業者に公知である。細胞中にポリヌクレオチドもしくはポリペプチドを導入するのに利用可能な技術は、限定されるものでないが電気穿孔法、ウイルス形質導入、細胞融合、スフェロプラストもしくは化学的にコンピテントな細胞（例えば塩化カルシウム）の使用、および目的の細胞との融合のための脂質と一緒のポリヌクレオチドのパッケージングを挙げることができる。細胞がミスマッチ修復遺伝子もしくはタンパク質で一旦形質転換されれば、該細胞を液体培養物中もしくはペトリ皿のような固形アガーマトリックス上のいずれかで増殖させかつ操作し得る。トランスフェクトした細胞が安定である場合、遺伝子は多くの細胞世代について一貫したレベルで発現されることができ、そして安定な超変異性酵母株が生じる。
【００４６】
単離された酵母細胞は、発現ベクターの抗生物質選択を使用して株を化学的に選択することにより酵母培養物から得ることができる。酵母細胞が単一細胞由来である場合はそれをクローンと定義する。酵母のような微生物の単一細胞クローニング技術は当該技術分野で公知である。
【００４７】
ＰＭＳ２相同体をコードするポリヌクレオチドは、酵母のゲノム中に導入し得るか、もしくは２−μプラスミドのような染色体外プラスミド上で増殖させ得る。ミスマッチ修復遺伝子発現ベクターをもつクローンの選択は、適切なアミノ酸もしくは記述されるところの（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｊ．Ｃ．とＬ．Ｇｕａｒｅｎｔｅ（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １９４：３７３）他の必須栄養素を欠く合成完全培地上で細胞をプレーティングすることにより達成し得る。酵母は、限定されるものでないがサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）および他者を包含する属を挙げることができるトランスジェニック微生物を生じさせるのに適する技術が利用可能であるいかなる種でもあり得る。
【００４８】
当該技術分野で既知のトランスジェニック酵母のいかなる作成方法も使用し得る。トランスジェニック微生物の１製造方法によれば、当業者に公知の方法の一によりポリヌクレオチドを酵母中に導入する。次に、ミスマッチ修復遺伝子をコードするポリヌクレオチドが安定な実体として宿主ゲノム中に取り込まれるかもしくは自己複製する染色体外プラスミド上で増殖するかのいずれかでありかつ該ポリヌクレオチドフラグメントによりコードされるタンパク質が細胞内で転写されかつその後機能的タンパク質に翻訳される細胞について選択する条件下で、該酵母培養物を増殖させる。トランスジェニック酵母が発現構築物をもつように一旦工作すれば、その後それを増殖させてトランスジェニック酵母の培養物を生成させかつ無期限に持続する。
【００４９】
ＰＭＳ２相同体を発現するように安定なトランスジェニック細胞を一旦工作すれば、該細胞を培養して同一細胞内に保持される目的の１種もしくはそれ以上の遺伝子中で新規突然変異を創製し得る。目的の遺伝子は細胞により天然に有されるいかなる遺伝子、もしくは標準的組換えＤＮＡ技術により細胞宿主中に導入されたものであり得る。標的遺伝子（１種もしくは複数）は選択前に知られていてももしくは未知であってもよい。酵母内の常在性のもしくは染色体外遺伝子中で突然変異を誘発するためにトランスジェニック酵母細胞を使用する一利点は、標的遺伝子（１種もしくは複数）中に一連のランダムな遺伝子変化を生じさせるために細胞を変異原性傷害（それが化学物質であるにせよ放射であるにせよ）に曝露することが不必要であることである。これは、変えられたミスマッチ修復過程の結果として生じる天然に生じる突然変異の高度に効率的な性質および範囲による。しかしながら、ＭＭＲ欠損細胞と一緒に化学物質および／もしくは放射のいずれかの同時の使用により突然変異の範囲および頻度を増大させることが可能である。組合せ処置の正味の影響は、新たな発現特質を生じさせるのに有用である遺伝的に変えられた酵母における突然変異率の増大である。組合せ処置の率は、ＭＭＲ欠損細胞のみもしくは野性型ＭＭＲ細胞とともに変異原のみを使用する率より高い。同一の戦略が脊椎動物および哺乳動物細胞を包含する他の型の細胞に有用である。
【００５０】
本発明のＭＭＲ欠損細胞は、商業的に望ましい応用とともに新たな発現特質を表すバリアントサブクローンの直接選択のための遺伝子スクリーニングで使用し得る。これは遺伝子の同定、単離および特徴付けの退屈かつ時間のかかる段階を迂回することを可能にする。
【００５１】
突然変異は、その遺伝子型および／もしくは表現型の変化について突然変異誘発した細胞を内的にかつ／もしくは外的に分析することにより検出し得る。ＭＭＲ欠損微生物細胞中で変えられた表現型を生じさせる遺伝子は、当業者に公知の多様な分子技術のいずれかにより識別し得る。例えば、細胞のゲノムを単離し得、そして、酵母ゲノムの制限フラグメントのライブラリーをプラスミドベクター中にクローン化し得る。該ライブラリーを「正常」細胞に導入し得、そして新規表現型を表す細胞をスクリーニングし得る。新規表現型を表す正常細胞からプラスミドを単離し得、そして遺伝子（１種もしくは複数）をＤＮＡ配列分析により特徴付けし得る。
【００５２】
あるいは、ドライバーおよびテスターＲＮＡ（それぞれ野性型および新規変異体由来）を利用し、次いで、当業者に公知の標準的分子生物学の方法により示差的転写物をクローニングしかつそれらを特徴付けする示差的メッセンジャーＲＮＡスクリーニングを使用し得る。さらに、探究された変異体が染色体外プラスミドによりコードされる場合には、ドミナントネガティブのＭＭＲ遺伝子および目的の遺伝子の共発現後、ならびに表現型選択後に、プラスミドを変異体クローンから単離し得、そして当業者に公知の方法を使用するＤＮＡ配列分析により分析し得る。
【００５３】
ＭＭＲ欠損変異体における発現特質についての表現型スクリーニングは、変えられた遺伝子産物の生化学的活性および／もしくは容易に観察可能な表現型によることができる。変異体の表現型はまた、変異体遺伝子によりコードされるタンパク質の電気泳動の移動度、転写因子の場合はＤＮＡ結合、ＩＲ、ＣＤ、Ｘ線結晶学もしくは高電界型ＮＭＲ分析のような分光学的特性または他の物理的もしくは構造的特徴の変化を同定することによっても検出可能である。ｉｎ  ｓｉｔｕで、単離された形態でもしくはモデル系でタンパク質の変えられた新規機能についてスクリーニングすることもまた可能である。遺伝子が選択前に既知であろうと未知であろうと、目的の遺伝子の機能に関連した酵母のいかなる特性の変化についてもスクリーニングし得る。
【００５４】
論考されるスクリーニングおよび選択方法は商業的に価値のある発現特質をもつ新規変異体を得る潜在的手段を具体的に説明することを意味しているが、しかし、それらはスクリーニングおよび選択が当業者により実施され得る多くの可能な方法を制限することを意味していない。
【００５５】
ＰＭＳ２相同体挿入物をもつプラスミド発現ベクターを多数の商業的に入手可能な制御配列とともに使用して、ドミナントネガティブのＭＭＲタンパク質の一時的および定量的双方の生化学的発現レベルを制御し得る。制御配列はプロモーター、エンハンサーもしくはプロモーター／エンハンサーの組合せより構成され得、そして、ＭＭＲ遺伝子の上流もしくは下流のいずれかに挿入して発現レベルを制御し得る。制御配列は、染色体外発現ベクターについて当業者に公知のもののいずれであることもできるか、もしくは相同的組換えを介してゲノム中に組込まれる構築物上にあり得る。これらの型の制御系は学術的刊行物中に開示されており、そして当業者に馴染みがある。
【００５６】
目的の新規の所望の発現特質をもつ細胞が一旦創製されれば、異常なＭＭＲ活性の活性は、望ましくは、当該技術分野で既知のいずれかの手段により減弱もしくは排除される。これらは、限定されるものでないが、培地からプロモーター活性化の原因である誘導物質を除去すること、形質転換された酵母細胞からプラスミドをキュアリングすること、および目的の遺伝子を「ループアウトさせる」５−フルオロオロト酸のような化学物質の添加を挙げることができる。
【００５７】
誘導可能に制御されるドミナントネガティブのＰＭＳ２相同体の場合には、ＰＭＳ２相同体の発現のスイッチを入れて（誘導して）新たな発現特質をもつ超変異性細胞の一集団を生成させることができる。ドミナントネガティブのＭＭＲアレルの発現のスイッチを迅速に切って、商業的目的の新たな発現特質を表す遺伝的に安定な株を再構成することができる。生じる細胞は今や、それにかけられる選択方法に依存して多様な商業的応用に適用し得る安定な細胞株として有用である。
【００５８】
遺伝的に欠損のミスマッチ修復細胞を使用して新たな発現特質を得る場合には、遺伝的欠損を補いそして従って特質選択後に宿主のミスマッチ修復活性を復帰させるのに十分な野性型ミスマッチ修復遺伝子を発現するトランスジェニック構築物を使用し得る［Ｇｒｚｅｓｉｕｋ，Ｅ．ら（１９９８）Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  １３：１２７−１３２）；Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ｂ．Ａ．ら（１９９７）ＥＭＢＯ  Ｊ．１６：３３４９−３３５６）；ＬｅＣｌｅｒｃ，Ｊ．Ｅ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １５：１２０８−１２１１）；Ｊａｗｏｒｓｋｉ，Ａ．ら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２：１１０１９−１１０２３］。生じる細胞は遺伝的に安定でありかつ多様な商業的応用に使用し得る。
【００５９】
ヒトおよびＭＳＨ２、ＭＬＨ１、ＭＬＨ３などのような酵母からの外来（外因性、トランスジェニック）ミスマッチ修復遺伝子の過剰発現の使用は、酵母宿主においてドミナントネガティブの変異誘発体表現型を生じさせることが以前に示されている（Ｓｈｃｈｅｒｂａｋｏｖａ，Ｐ．Ｖ．ら（２００１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２１（３）：９４０−９５１；Ｓｔｕｄａｍｉｒｅ，Ｂ．ら（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：７５９０−７６０１；Ａｌａｎｉ  Ｅ．ら（１９９７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７：２４３６−２４４７；Ｌｉｐｋｉｎ，Ｓ．Ｍ．ら（２０００）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２４：２７−３５）。加えて、原核生物のドミナントネガティブのＭＭＲ遺伝子を発現する酵母株ならびに内在性ＭＭＲタンパク質中にゲノム欠損を有する宿主の使用もまた、ドミナントネガティブの変異誘発体表現型をもたらすことが以前に示されている（Ｅｖａｎｓ，Ｅ．ら（２０００）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．５（５）：７８９７−７８９９；Ａｒｏｎｓｈｔａｍ，Ａ．とＭ．Ｇ．Ｍａｒｉｎｕｓ（１９９６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：２４９８−２５０４；Ｗｕ，Ｔ．Ｈ．とＭ．Ｇ．Ｍａｒｉｎｕｓ（１９９４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：５３９３−５４００；Ｂｒｏｓｈ  Ｒ．Ｍ．Ｊｒ．とＳ．Ｗ．Ｍａｔｓｏｎ（１９９５）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：５６１２−５６２１）。しかしながら、ここに開示される知見は、超変異性酵母を創製するための、ヒトＰＭＳＲ２遺伝子（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ，Ｎ．Ｃ．ら（１９９５）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３０：１９５−２０６）、関連するＰＭＳ２−１３４短縮型ＭＭＲ遺伝子（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ  Ｎ．Ｃ．ら（１９９５）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２９：３２９−３３４）、植物のミスマッチ修復遺伝子（米国特許出願第０９／７４９，６０１号明細書）およびＰＭＳ２遺伝子の１３４個のＮ末端アミノ酸に相同である遺伝子を包含するＰＭＳ２相同体の使用を教示する。
【００６０】
ＰＭＳ２相同体を使用して超変異性生物体を創製する能力は、限定されるものでないが製造業を挙げることができる多様な応用、新たな生化学物質の生成、有毒化学物質（製造工程の副生成物もしくは触媒として使用されるもののいずれか）の解毒、ならびに、限定されるものでないがポリクロロベンゼン（ＰＣＢ）、重金属および他の環境の危険を挙げることができる環境中に存在するトキシンの是正を助けるのに有用な新たな出力の特徴を表す革新的酵母株を生成させるのに使用し得る。新規細胞株は、生体内変換によってタンパク質もしくは非タンパク質治療的分子の増大された量もしくは質のいずれかを生じさせる高められた活性について選択し得る。生体内変換は、微生物もしくは微生物由来の抽出物による、経路もしくはスキーム中の一化学物質中間体の次の中間体もしくは生成物への酵素的転化である。ペニシリンＧ、エリスロマイシンおよびクラブラン酸を包含する重要な生物学的および化学的生成物の商業的製造のための使用における生体内変換の多数の例が存在する。「原」材料の次段階の（ａｄｖａｎｃｅｄ）中間体および／もしくは最終生成物への転化で効率的である生物体もまた生体内変換を実施し得る（Ｂｅｒｒｙ，Ａ．（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４（７）：２５０−２５６）。ＰＭＳ２相同体を使用する宿主細胞中でのＤＮＡの超変異性を制御する能力は、限定されるものでないがトキシン耐性であり、トキシンをｉｎ  ｓｉｔｕで分解する能力もしくはある分子を中間体から次段階の中間体もしくは最終生成物のいずれかに転化する能力を有する生物体を挙げることができる商業的目的の新たな表現型について選択し得るバリアントサブタイプの生成を可能にする。
【００６１】
新たな発現特質について宿主細胞の遺伝的変化を生じさせるＰＭＳ２相同体を使用する他の応用は、限定されるものでないがより多量の組換えポリペプチドを生じさせる組換え生産株、ならびに化学物質を転換もしくは製造下流の工程を触媒し得る変えられた内因性遺伝子の使用を挙げることができる。調節可能なＰＭＳ２相同体を使用して商業的に有益な発現特質をもつ細胞を生じさせ得る。この方法を使用して、ＰＭＳ２相同体を発現する細胞を目的の表現型について直接選択し得る。指定された発現特質をもつ選択された細胞が一旦単離されれば、当業者に公知のいくつかの方法により超変異性活性のスイッチを切ることができる。例えば、ＰＭＳ２相同体が誘導可能なプロモーター系により発現される場合、誘導物質が除去もしくは枯渇され得る。こうした系は、限定されるものでないが：ラクトースの誘導可能なＧＡＬｉ−ＧＡＬ１０プロモーター（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｍ．とＲ．Ｗ．Ｄａｖｉｓ（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４：１４４０）；リン酸の誘導可能なＰＨ０５プロモーター（Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ，Ａ．ら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ  ８０：１−５）；アルコール脱水素酵素Ｉ（ＡＤＨ）および３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＫＧ）プロモーターのようなプロモーター、限定されるものでないが乳酸（Ａｍｍｅｒｅｒ，Ｇ．（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １９４：１９２；Ｍｅｌｌｏｒ，Ｊ．ら（１９８２）Ｇｅｎｅ  ２４：５６３）；Ｈａｈｎ  Ｓ．とＬ．Ｇｕａｒｅｎｔｅ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：３１７）；ピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）中のアルコール酸化酵素（ＡＯＸ）（Ｔｓｃｈｏｐｐ，Ｊ．Ｆ．ら（１９８７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５（９）：３８５９−７６；および分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）中のチアミンで抑制可能な発現プロモーターｎｍｔｌ（Ｍｏｒｅｎｏ，Ｍ．Ｂ．ら（２０００）Ｙｅａｓｔ  １６（９）：８６１−８７２）を挙げることができる、構成的であると考えられるがしかし酵母細胞を醗酵可能でない炭素源中で増殖させる場合に抑制／脱抑制され得るものを挙げることができる。酵母細胞は、ＬｉＣｌでの化学的形質転換（Ｍｏｕｎｔ，Ｒ．Ｃ．ら（１９９６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５３：１３９−１４５）および電気穿孔法（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．ら（１９９８）Ｙｅａｓｔ  １４（６）：５６５−５７１）を包含する当業者に既知のいずれかの手段により形質転換し得る。ＤＮＡで形質転換されている酵母細胞は、限定されるものでないが選択可能なマーカー（ＵＲＡ３；Ｒｏｓｅ，Ｍ．ら（１９８４）Ｇｅｎｅ  ２９：１１３；ＬＥＵ２；Ａｎｄｒｅａｄｉｓ，Ａ．ら（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：８０５９；ＡＲＧ４；Ｔｓｃｈｕｍｐｅｒ  Ｇ．とＪ．Ｃａｒｂｏｎ（１９８０）Ｇｅｎｅ  １０：１５７；およびＨＩＳ３；Ｓｔｒｕｈｌ，Ｋ．ら（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：１０３５）ならびに酵母細胞の増殖を阻害する薬物（ツニカマイシン、ＴＵＮ；Ｈａｈｎ  Ｓ．ら（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂ��ｏｌ．８：６５５）を挙げることができる多様な方法により増殖について選択し得る。組換えＤＮＡは上述されたとおり酵母に導入し得、また、酵母ベクターは染色体外でもしくは特定の遺伝子座中に組込まれてのいずれかで酵母細胞内で持たれ得る。染色体外に基づく酵母発現ベクターは高コピーに基づく（２−ｐｍベクターＹｅｐｌ３のような；Ｒｏｓｅ，Ａ．Ｂ．とＪ．Ｒ．Ｂｒｏａｃｈ（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５：２３４）、ＹＲｐ７のような自律複製配列（ＡＲＳ）を含有する低コピーセントロメアベクター（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ−Ｈａｙｅｓ，Ｍ．ら（１９８２）Ｃｅｌｌ  ２９：２３５）ならびに目的の遺伝子を宿主ゲノム内の指定された遺伝子座に導入させかつ安定な様式で増殖させる組込みベクター（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，Ｒ．Ｊ．（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １０１：２０２）のいずれかであり得る。酵母におけるＭＭＲ遺伝子の異所性発現は、限定されるものでないが特定の化学的誘導物質の培地からの除去（例えば、ビール酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中のＧＡＬ１０プロモーターの発現を駆動するガラクトース、もしくはピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）中のＡＯＸ１プロモーターの発現を駆動するメタノールを枯渇させる）を挙げることができる多様な方法により随意に減弱もしくは完全に排除し得、染色体外で複製するプラスミドは非選択的条件下での細胞の増殖により発現プラスミドから「キュアリング」され得（例えば、ＹＥｐｌ３を持つ細胞はロイシンの存在下で増殖し得る）、また、ゲノム中に挿入された遺伝子を有する細胞は挿入された遺伝子座を「ループアウト」させる化学物質とともに増殖させ得る（例えば、ＵＲＡ３を有する組込み体は５−フルオロオロト酸での組込み体の増殖により挿入された遺伝子の喪失について選択し得る（Ｂｏｅｋｅ，Ｊ．Ｄ．ら（１９８４）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９７：３４５−３４６）。誘導物質の除去によるにしろ化学物質での酵母細胞の処理にしろ、ＭＭＲ発現の除去は遺伝的に安定な酵母細胞株の再樹立をもたらす。その後、変異体ＭＭＲの欠如は、宿主細胞中での内因性の野性型ＭＭＲ活性が正常に機能してＤＮＡを修復することを可能にする。新規の選択された発現特質を表す新たに生成された変異体酵母株は、広範な商業的工程もしくは特定の発現特質の生成に関与する新たな生体分子を同定するための遺伝子／タンパク質の発見に適する。もちろん、酵母は使用しうる細胞型の一例にすぎず、そして、既知のプロモーターおよび誘導物質を使用する類似の戦略を、例えば脊椎動物、昆虫および哺乳動物細胞を包含する他の型の細胞での使用に使用してよい。
【００６２】
さらに、ミスマッチ修復は化学的に誘導されるＤＮＡ付加物の修復を司り、従って、この過程を遮断することは、理論上、酵母の数、型、突然変異率およびゲノムの変化を増大させ得る［Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ，Ｌ．Ｊ．ら（１９９６）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １７：２０８５−２０８８）；Ｓｌｅｄｚｉｅｗｓｋａ  Ｇｏｊｓｋａ，Ｅ．ら（１９９７）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．３８３：３１−３７）；およびＪａｎｉｏｎ，Ｃ．ら（１９８９）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２１０：１５−２２）］。上に列挙した化学物質に加え、酵母中でＤＮＡ突然変異誘発を引き起こすことが知られているイオン化放射およびＵＶ照射を包含する他の型のＤＮＡ変異原もまたこの過程を潜在的に高めるのに使用し得る（Ｌｅｅ  Ｃ．Ｃ．ら（１９９４）Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ９：４０１−４０５；Ｖｉｄａｌ  Ａ．ら（１９９５）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １６：８１７−８２１）。宿主細胞に対し極めて毒性でありかつ従って変えられた酵母細胞の実際のプールのサイズの減少をもたらすこれらの作用物質はＭＭＲ欠損宿主中でより耐えられ、そして順に高められた範囲および程度のゲノム突然変異誘発を可能にする。
【００６３】
本発明の一般的方法は、従って、ＰＭＳ２相同体の導入から超変異性にされた細胞が突然変異を蓄積する、突然変異された遺伝子のライブラリーの生成方法もまた提供し、そして、その後、突然変異された遺伝子（野性型親宿主細胞に比較して）を含んでなるｃＤＮＡおよびゲノムライブラリーを生じさせるのに使用してよい。ｃＤＮＡおよびゲノムライブラリーの製造方法は当該技術分野で公知であり、そして、技術は例えばＳａｍｂｒｏｏｋら  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第３版、２００１に見出されるかもしれない。
【００６４】
本発明はまた、配列番号２３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と前記サンプルを接触させて配列番号２３のアミノ酸配列を含んでなるＰＭＳ２相同体をコードするポリヌクレオチドの発現を検出することを含んでなる、新形成を検出するための細胞のアッセイ方法も提供し、ここで前記ＰＭＳ２相同体の発現は新形成と関連する。
【００６５】
ＰＭＳ２相同体は配列番号２３もしくは配列番号２４のコンセンサス配列を有するとして同定され、そして、配列番号２３もしくは配列番号２４をコードする配列を含んでなる核酸により検出されうる。当業者は、腫瘍性であると疑われる細胞中のＰＭＳ２相同体の発現を検出するように逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ（ＲＴ−ＰＣＲアッセイ）を設計しうる。ノーザンブロットもまた、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第３版、２００１に見出されるもののような標準的プロトコルを使用してＰＭＳ２相同体発現を検出するのに使用してよい。
【００６６】
本発明はまた、ＰＭＳ２相同体もしくはそのペプチドフラグメントに対し向けられた抗体と前記サンプルを接触させること；およびＰＭＳ２相同体もしくはそのペプチドフラグメントとともに形成された抗体複合体の存在を検出してそれにより前記サンプル中の前記ＰＭＳ２相同体の存在を検出することを含んでなる、新形成を検出するための細胞のアッセイ方法も提供し、ここで前記ＰＭＳ２相同体の存在は新形成と関連する。ＰＭＳ２相同体の検出方法は、限定されるものでないがラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロット、免疫蛍光アッセイ、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）および化学発光アッセイを挙げることができる当該技術分野で既知のいかなる手段によってもよい。これらのアッセイの多様なプロトコルが当該技術分野で公知である。
【００６７】
本発明はまた、ＰＭＳ２相同体関連の新形成を伴う患者を同定すること、前記患者に前記ＰＭＳ２相同体の発現の阻害剤を投与することを含んでなる、癌を伴う患者の治療方法も提供し、ここで前記阻害剤は前記ＰＭＳ２相同体関連の新形成における前記ＰＭＳ２相同体の発現を抑制する。こうした新形成は例えばリンパ腫を包含する。ＰＭＳ２相同体発現の阻害剤は、ＰＭＳ２相同体を特異的に結合するアンチセンスヌクレオチド、リボザイム、抗体フラグメントおよびＡＴＰアーゼ類似物を包含する。
【００６８】
アンチセンス分子は、ＰＭＳ２相同体をコードするＲＮＡの一部分に相補的でありかつ該ＲＮＡに特異的に結合するポリヌクレオチドである。アンチセンス分子はＰＭＳ２相同体ＲＮＡの翻訳を阻害し、そしてそれによりＰＭＳ２発現の影響を阻害する。アンチセンス分子は、リボソーム結合もしくは翻訳の開始に関与するＲＮＡの部分ならびにコーディング配列の部分に向けられてよい。一般に、アンチセンス分子は長さが最低１５ヌクレオチドであるが、しかし、長さが２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチドもしくはそれ以上であってよい。
【００６９】
リボザイムは、基質ヌクレオチドを切断する特定の触媒的分類のアンチセンス分子である。ＰＭＳ２相同体のためのリボザイムの設計は、例えばＬｙｎｇｓｔａｄａａｓ  ＳＰ．（２００１）“Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ  ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ  ａｓ  ｔｏｏｌｓ  ｉｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｒａｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１２（６）：４６９−７８；Ｓａｍａｒｓｋｙ  Ｄ，Ｆｅｒｂｅｙｒｅ  Ｇ，Ｂｅｒｔｒａｎｄ  Ｅ．（２０００）“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａｃｔｉｖｅ  ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌｓ”Ｃｕｒｒ．Ｉｓｓｕｅｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２（３）：８７−９３に記述されるところの当該技術分野で公知の方法を使用して実施してよい。リボザイムもしくはリボザイムをコードするベクターを、ＰＭＳ２相同体を発現する細胞に導入し、そしてＰＭＳ２相同体をコードするポリヌクレオチドにリボザイムが結合しかつ切断するように活性化し、それによりＰＭＳ２相同体の発現を予防する。
【００７０】
上の開示は本発明を一般的に記述する。より完全な理解は、具体的説明のみの目的上本明細書に提供されることができかつ本発明の範囲を制限することを意図していない以下の特定の実施例への言及により得ることができる。
【実施例】
【００７１】
実施例１：リンパ組織の腫瘍中のＰＭＳＲ２およびＰＭＳＲ３  ＲＮＡ発現の関連の評価ならびにマイクロサテライトの不安定性プロファイルとの比較
一団のリンパ腫組織および細胞系を、ＰＣＲ媒介性の遺伝子型分析によりマイクロサテライトの不安定性（ＭＩ）について、ならびに以前に使用されかつＮｉｃｏｌａｉｄｅｓ博士による刊行物中（Ｌｉｕ，Ｂ．ら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．２：１６９−１７４；Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ，Ｎ．Ｃ．ら（１９９６）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３１：３９５−３９７）で記述された方法に従ったＲＴ−ＰＣＲを介してＰＭＳＲ２およびＰＭＳＲ３発現について分析する。ＲＮＡ発現研究のため、製造元（ギブコ／ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ））により記述されたところのトライゾール法を使用して一団の８３種のリンパ腫細胞株（ＡＴＣＣおよび個人的接触から得た）からＲＮＡを抽出する。１００ｎｇの全ＲＮＡを、製造元（ギブコ／ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ））により推奨されるとおり２０μｌの反応中でスーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）ＩＩ逆転写酵素（ＲＴ）およびプライマーとしてのランダムヘキサマーを使用して逆転写する。各サンプルをＲＴを含む（ＲＴ＋）もしくは含まない（ＲＴ−）反応緩衝液中でインキュベートし、ここでＲＴ−サンプルは陰性対照としてはたらく。反応を３７℃で１時間インキュベートし、そして１００マイクロリットルの最終容量まで希釈する。慣例で、５μｌの各サンプルを、６７ｍＭトリス、ｐＨ８．８、１６．６ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、６．７ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、４％ＤＭＳＯ、１．２５ｍＭの４種のｄＮＴＰのそれぞれ、１７５ｎｇの各ｃＤＮＡ特異的プライマー、および１ＵのＴａｑポリメラーゼを含有する２５μｌの反応中でのＰＣＲ反応に使用する。増幅は９４℃３０秒間、５８℃９０秒間、７２℃９０秒間で３０周期実施する。反応の半分を１×トリス酢酸ＥＤＴＡ泳動用緩衝液中１％アガロースゲル上に負荷し、そして臭化エチジウム染色により検出する。下は、遺伝子特異的プライマーおよび期待される分子量のＰＣＲフラグメントを含む表（表１）である。サンプルは、ＲＴ＋反応が期待された分子量のＤＮＡフラグメントを含有する一方でＲＴ−もしくは水対照中でシグナルが観察されない場合に陽性と評価する。
【００７２】
【表１】
2005531291.tif 000003
【００７３】
ＰＭＳＲ２およびＰＭＳＲ３を発現することが既に決定された細胞株を陽性対照として使用する一方、ＰＭＳＲヌルと以前に同定された株を陰性対照として使用する。サンプルを二重で分析して発現の再現性を確認する。
【００７４】
リンパ腫サンプルのマイクロサテライトの不安定性を評価するために、上述されたところの一団のリンパ腫からＤＮＡを単離する。ＤＮＡは記述されるところの（Ｌｉｕら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．２：１６９−１７４）プロテイナーゼＫ消化およびフェノール抽出手順を使用して単離することができる。リンパ腫細胞およびＨＣＴ１１６（ＭＭＲ欠損のヒト結腸上皮細胞株）からの多様な量の試験ＤＮＡを使用してわれわれのマイクロサテライト試験の感受性を決定する。Ｄ２Ｓ１２３、ＢＡＴ２６およびＢＡＴ４０アレルはＨＣＴ１１６細胞中で不均一であることが知られており、そして従ってＭＩの検出のための陽性対照として使用する。ＭＩについて測定するために、ＤＮＡを制限希釈により力価測定して各マーカーの組について感受性のレベルを決定する。ＤＮＡは、ＢＡＴ２６Ｆ：５’−ｔｇａｃｔａｃｔｔｔｔｇａｃｔｔｃａｇｃｃ−３’（配列番号３５）およびＢＡＴ２６Ｒ：５’−ａａｃｃａｔｔｃａａｃａｔｔｔｔｔａａｃｃｃ−３’（配列番号３６）；ＢＡＴ４０Ｆ：５’−ａｔｔａａｃｔｔｃｃｔａｃａｃｃａｃａａｃ−３’（配列番号３７）およびＢＡＴ４０Ｒ：５’−ｇｔａｇａｇｃａａｇａｃｃａｃｃｔｔｇ−３’（配列番号３８）；ならびにＤ２Ｓ１２３Ｆ：５’−ａｃａｔｔｇｃｔｇｇａａｇｔｔｃｔｇｇｃ−３’（配列番号３９）およびＤ２Ｓ１２３Ｒ：５’−ｃｃｔｔｔｃｔｇａｃｔｔｇｇａｔａｃｃａ−３’（配列番号４０）プライマーを記述された（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ，Ｎ．Ｃ．ら（１９９５）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３０：１９５−２０６）ところの緩衝液中で使用してＰＣＲ増幅する。簡潔には、１ｐｇないし１００ｎｇのＤＮＡを以下の条件すなわち９４℃３０秒間、５０〜５５℃３０秒間、７２℃３０秒間を３０周期を使用して増幅する。その後ＰＣＲ反応を８％変性ポリアクリルアミドゲル上で分離しかつオートラジオグラフィーにより可視化する。これらの試薬およびパラフィン包埋組織から抽出したＤＮＡを使用する予備試験は、０．１ｎｇのゲノムＤＮＡがわれわれの条件を使用する検出の限界であることを慣例に見出している。
【００７５】
マイクロサテライトの安定性は、同一の臨床サンプルもしくは細胞からの０．０１ｎｇのＤＮＡの２０回の独立した反応を使用してＰＣＲにより細胞中で測定しうる。この濃度は、典型的に、サンプルあたり同等な１ゲノムの測定を可能にし、また、特定の１細胞株もしくは組織の増殖の間に起こっていたクローン性バリアント中のマイクロサテライトの変化の検出を可能にする。サンプルは、特定の１マーカーの最低２サンプルが所定のサンプルの優位を占めるアレルの大きさと異なるＰＣＲフラグメントを有することが見出される場合にＭＩ＋と評価する。統計学的解析は、ＰＭＳＲ２もしくはＰＭＳＲ３を発現するＭＩ＋細胞の数をいずれのＰＭＳＲ遺伝子も発現しないものと比較することにより実施する。
実施例２：免疫染色およびタンパク質レベルでの概念の証明のためのＰＭＳＲ２およびＰＭＳＲ３に特異的なポリクローナル抗血清の生成
ＰＭＳＲ２もしくはＰＭＳＲ３を特異的に認識し得る抗体を産生する能力は、診断的マーカーとして、これらのタンパク質を発現する組織のｉｎ  ｓｉｔｕ分析方法を確立するために非常に有用である。図４に示されるとおり、ＰＭＳＲ特異的ペプチドの生成を、特定の１ＰＭＳＲポリペプチドの特異的発現を測定するための組織分析に使用する。図４に示されるイムノブロットは、他のＰＭＳ相同体に対する交差反応性をもたないＰＭＳＲタンパク質の特異的検出を可能にする新たな抗血清に対する必要性を示す。ＰＭＳＲ特異的抗血清を生成させるために、われわれは２０アミノ酸のペプチドを合成しかつウサギでの抗血清産生のためにＫＬＨ免疫原にそれらを結合することができる。ｈＰＭＳＲ２およびｈＰＭＳＲ３タンパク質のアミノおよびカルボキシ末端に向けられるペプチドを既知の方法により生成しうる。合成されるべきペプチドのアミノ酸配列を表２に提供する。全ペプチドは、過去にわれわれのグループについて溶解性の問題を呈した複数のシステインおよびトリプトファン残基を回避するようにアミノ酸５ないし２６を含有するＮ末端ｈＰＭＳＲ３ペプチドを除き、コードされるポリペプチド（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ，Ｎ．Ｃ．ら（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：１６３５−１６４１）の最初のもしくは最後の２０アミノ酸残基に向けられる。
【００７６】
【表２】
2005531291.tif 000004
【００７７】
製造したペプチドを精製し、そして質量分析およびＨＰＬＣ分析により分析する。３ｍｇの免疫純粋なペプチドを、配列中のシステイン残基に対する必要性を排除する水溶性カルボジイミドを使用してキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）担体に複合体化する。残存するペプチド物質はＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットによる抗血清分析に使用する。複合体化後にＫＬＨに連結したペプチドをフロイントのアジュバントに再懸濁し、そして免疫感作の準備が完了である。
【００７８】
以下のプロトコルを使用してウサギを各ペプチドに対し免疫する。第０日に前採血を各宿主ウサギから採取することができる。２０ｍｌの血清サンプルを収集しかつ分析する第４９、６３および７７日の３回の予定した採血を伴う毎週の予定でのアジュバントを含有する溶液の注入により、抗原をウサギに投与する。採血は酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）およびウェスタンブロットにより、ＰＭＳＲ２およびＰＭＳＲ３についての免疫化ペプチドに対し向けられた抗血清について分析することができる。
【００７９】
ＥＬＩＳＡアッセイを実施して、上述された天然のペプチドに対する抗体の反応性について測定するための未精製採血中で抗体力価を試験する。簡潔には、各ペプチドを含有する１μｇ／ｍｌ溶液５０μｌで９６ウェルプレートを４℃で４時間被覆する。各ペプチドを含有するウェルを各抗血清によりプロービングしてバックグラウンドおよび抗体特異性について測定する。プレートをカルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ−／−）で３回洗浄し、そして５％粉乳を含む１００μｌのＰＢＳ−／−中室温で１時間ブロッキングする。ブロッキング後にウェルをすすぎ、そして各ウサギからの免疫前血清もしくはそれぞれの採血の５倍希釈物を含有する１００μｌのＰＢＳ溶液とともに２時間インキュベートする。その後プレートをＰＢＳ−／−で３回洗浄し、そしてヒツジ抗ウサギワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合二次抗体の３０００倍希釈物を含有する５０μｌのＰＢＳ−／−溶液とともに室温で１時間インキュベートする。その後、プレートをＰＢＳ−／−で３回洗浄し、そして５０μｌのＴＭＢ−ＨＲＰ基質（バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ））とともに室温で１５分間インキュベートして抗体力価を検出する。５０μｌの５００ｍＭ重炭酸ナトリウムを添加することにより反応を停止し、そしてバイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）のプレートリーダーを使用して４１５ｎｍのＯＤにより分析する。サンプルは、バックグラウンド（免疫前血清および／もしくは陰性対照ペプチド）を上回る高められたシグナルが観察される場合に陽性であると決定する。
【００８０】
全細胞抽出物中の期待される分子量のタンパク質を認識する抗血清の能力を立証するため、プローブとして上で生成された抗血清を使用してウェスタンブロットもまた実施する。最初に、複合体化されていないペプチドを抗体反応性について試験する。表２に列挙したペプチドを２０μｌの２×ＳＤＳ溶解緩衝液（６０ｍＭトリス、ｐＨ６．８／２％ＳＤＳ／０．１Ｍ  ２−メルカプトエタノール／０．１％ブロモフェノールブルー）に添加しかつ２分間沸騰させる。その後、１８％トリス−グリシンＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル中で各サンプル２０マイクロリットルを１０分間電気泳動し、そして転写緩衝液（４８ｍＭトリス／４０ｍＭグリシン／０．０３７５％ＳＤＳ／２０％メタノール）中でイモビロン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ）−Ｐ（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））メンブレンに２０分間電気ブロッティングしてペプチド結合を最大にする。フィルターをブロッキング緩衝液（ＴＢＳ、０．０５％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０／５％粉乳）中で一夜ブロッキングする。フィルターは、各ウサギからの多様な前採血および抗血清、次いで二次ワサビペルオキシダーゼ結合抗ウサギ（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ））でプロービングし、そして化学発光のため調製する。サンプルは、適切な抗血清が対応するペプチド抗原と反応する一方で陰性もしくはペプチド対照レーンで反応が観察されない場合に陽性とみなす。サンプルはまた、免疫前血清を使用して反応が観察されない場合にも陽性とみなす。
【００８１】
上述されたところの陽性の抗血清の反応性は、ＲＮＡおよび／もしくはＰＭＳＲ２の場合はタンパク質レベルで（抗ＰＭＳ２抗血清により認識される、図４を参照されたい）ＰＭＳＲ２およびＰＭＳＲ３を発現することが以前に同定された細胞からの抽出物を使用するウェスタンブロットで全細胞ライセートを使用して分析する。５０，０００個の細胞を遠心分離し、そして２５μｌの２×サンプル緩衝液中で直接溶解しかつ５分間沸騰させる。サンプルを４〜２０％トリス−グリシンゲルに負荷し、そして電気泳動および転写時間が１時間であることを除き上述されたとおり電気ブロットする。フィルターを多様な抗血清および採血ロットでプロービングしかつ上のとおり検出する。抗血清は、ＰＭＳＲ陽性株で免疫反応が観察されるがしかしＰＭＳＲ陰性細胞株で非存在である場合に陽性とみなす。陽性反応は、図４にみられるところの内因性ＰＭＳ２の交差反応性に関するモニタリングならびに結合についてモニターするための多様なペプチドを使用する競合により、特異性についてさらに確認することができる。バックグラウンドがいずれかの抗血清で観察される場合は、ブロッキング緩衝液、洗浄のストリンジェンシーおよび抗血清の希釈（成功裏の抗体プロービングのためわれわれのグループにより慣例に改変されたパラメータ）を変えることにより反応条件を変える。
【００８２】
ＰＭＳＲ特異的抗血清は、例えば＞９５％純度まで全免疫グロブリンを精製することが可能であるピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）のＩｇ精製キットを使用して精製してよい。抗体全体を分光測光法により定量し、保存剤としてアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌの濃度で再懸濁する。抗血清を、１０、１００および１０００倍希釈物を使用するウェスタンブロットにて活性について再試験して純粋な物質の至適濃度を決定する。その後、精製した抗血清を下述されるところの組織ブロックの免疫組織学的分析に使用してよい。
【００８３】
ＰＭＳＲで生じられた抗血清が全細胞抽出物中の標的タンパク質を検出することが不可能である場合には、製造元のプロトコル（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ））に従って臭化シアンで活性化したアガロースビーズに対応するペプチドを結合することにより抗体をアフィニティー精製することができる。全抗血清を、５周期の間、回転装置の回転板上で２時間アフィニティー樹脂とともにインキュベートし、ＰＢＳ緩衝液中で洗浄し、次いで遠心分離することができる。酸性グリシン緩衝液中でのインキュベーションにより抗体を樹脂から遊離させる。遊離抗体を１Ｍトリス  ｐＨ８．０中の中和緩衝液に添加する。その後抗体を上述されたとおり再試験する。
実施例３：ＰＭＳＲ２およびＰＭＳＲ３発現についての他の腫瘍源の分析
一次組織からのＲＮＡを使用して、ならびに結腸直腸腫瘍組織および細胞株のサブセットで、ＰＭＳＲ２およびＰＭＳＲ３発現の予備分析を実施した。以前に同定されたＭＭＲ遺伝子中での検出可能な突然変異を欠くＭＩ腫瘍の広範な分布（Ｘｕ，Ｌ．ら（２００１）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ９１：２００−２０４）を鑑み、ＰＭＳＲ２およびＰＭＳＲ３発現についての他の組織型のより広範囲の調査を実施してもよい。サンプルは、協同ヒト組織ネットワーク（Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋ）により支援されるＮＣＩの組織アレイ研究プログラム（Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｒｒａｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｇｒａｍ）（ＴＡＲＰ）のような供給元から購入した組織団を使用して試験してもよい。マイクロアレイをｈＰＭＳＲ２およびｈＰＭＳＲ３抗血清を用いてスクリーニングして、腫瘍性試料中での発現についてモニターする。
【００８４】
スライドガラスの免疫組織化学を、記述された（Ｇｒａｓｓｏ，Ｌ．ら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２４０１６−２４０２４）ところの標準的プロトコルを使用して実施する。簡潔には、パラフィン包埋切片をキシレン中で各１０分間インキュベートし、次いで１００％エタノール中で２分間インキュベートする。次に、サンプルを９５％、７０％、５０％、３０％エタノール中に各２分間入れることによりそれらを水和させる。その後、水和させたサンプルをメタノール中０．３％過酸化水素中で３０分間インキュベートして内因性のペルオキシダーゼ活性を封鎖する。スライドガラスを流水のチャンバー中で２０分間洗浄しそして０．２５Ｍトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５緩衝液に入れる。免疫染色のために、加湿したチャンバー中室温でＰＢＳ中１０％ヤギ血清を用いてスライドガラスを２０分間ブロッキングし、次いでＰＢＳ緩衝液中で最終洗浄する。０．２５Ｍトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５；０．５％ＢＳＡおよび２％ウシ胎児血清を含有する反応緩衝液で抗体を２０倍希釈し、そして、組織領域を浸水するのに十分な容量でスライドガラス表面に添加する。スライドガラスを室温で４時間インキュベートし、そしてＰＢＳ中で５分間洗浄し、反応緩衝液中で５分間ブロッキングし、そして加湿したチャンバー中、反応緩衝液で２００倍希釈した二次抗ウサギＨＲＰ結合抗体で３０分間プロービングする。二次染色後にスライドガラスを前のとおり緩衝液中で５分間洗浄する。製造元の説明書に従ってベクタスタチンキット（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））を使用するペルオキシダーゼ染色により切片を可視化する。均一な褐色が切片上で目に見えるようになった後に、水中ですすぐことにより反応を停止する。特異的結合についてモニターするための競合体としての免疫化ペプチドとともにもしくは伴わずに抗体を使用して反応を実施する。顕微鏡を介してスライドガラスを検査し、そして、適切な抗体を単独でもしくはナンセンスペプチド競合体の存在下でインキュベートした場合に内的染色が観察されるが、抗体をブロッキングペプチドとともにインキュベートした場合には陰性なサンプルを陽性と評価する。サンプルを反復して再現性を確認することができる。
実施例４：誘導可能なＭＭＲドミナントネガティブアレルベクターおよび該発現ベクターをもつ酵母細胞の生成
酵母発現構築物を調製して、ヒトＰＭＳ２関連遺伝子（ｈＰＭＳＲ２）（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ，Ｎ．Ｃ．ら（１９９５）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３０（２）：１９５−２０６）およびヒトＰＭＳ１３４遺伝子（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ  Ｎ．Ｃ．ら（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：１６３５−１６４１）が酵母のＭＭＲ活性を不活性化することが可能でありそしてそれによりゲノムの超変異性（その結果は宿主選択後の新規発現特質を伴うバリアント同胞細胞の生成である）の全体的頻度を増大させるかどうかを決定した。これらの研究のため、ｈＰＭＳ１３４  ｃＤＮＡをコードするプラスミドをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により変えた。５’オリゴヌクレオチドは、ＮｄｅＩ制限部位ＣＡＴ  ＡＴＧを包含する以下の構造すなわち５’−ＡＣＧ  ＣＡＴ  ＡＴＧ  ＧＡＧ  ＣＧＡ  ＧＣＴ  ＧＡＧ  ＡＧＣ  ＴＣＧ  ＡＧＴ−３’（配列番号４５）を有する。３’−オリゴヌクレオチドは、ＥｃｏＲＩ部位ＧＡＡ  ＴＣＣおよびＶ５抗体の１４アミノ酸のエピトープを包含する以下の構造すなわち５’−ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＴＴＡ  ＴＣＡ  ＣＧＴ  ＡＧＡ  ＡＴＣ  ＧＡＧ  ＡＣＣ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＡＧＧ  ＧＴＴ  ＡＧＧ  ＧＡＴ  ＡＧＧ  ＣＴＴ  ＡＣＣ  ＡＧＴ  ＴＣＣ  ＡＡＣ  ＣＴＴ  ＣＧＣ  ＣＧＡ  ＴＧＣ−３’（配列番号４６）を有する。該オリゴヌクレオチドは２５周期のＰＣＲ（９５℃１分間、５５℃１分間、７２℃１．５分間を２５周期、次いで７２℃で３分）を包含した標準的条件下でのＰＣＲに使用した。
【００８５】
ＰＣＲフラグメントをゲル電気泳動により精製し、そして標準的クローン化方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第３版、２００１）によりｐＴＡ２．１（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローン化してプラスミドｐＴＡ２．１−ｈＰＭＳ１３４を創製した。ｐＴＡ２．１−ｈＰＭＳ  １４３を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化して挿入物を遊離させ、それをｐＰＩＣ３．５Ｋ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））のＥｃｏＲＩ制限部位にクローン化した。ヒトＰＭＳ１３４をクローン化するための上述されたものに類似の以下の戦略を使用してヒト関連遺伝子ＰＭＳＲ２の発現ベクターを構築した。最初に、ｈＰＭＳＲ２フラグメントを、２個の制限部位すなわちフラグメントの５’端のＮｄｅＩ制限部位および３’端のＥｃｏＲＩ部位を導入するためのＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲに使用した５’−オリゴヌクレオチドは、ＮｄｅＩ制限部位ＣＡＴ  ＡＴＧを包含する以下の構造すなわち５’−ＡＣＧ  ＣＡＴ  ＡＴＧ  ＴＧＴ  ＣＣＴ  ＴＧＧ  ＣＧＧ  ＣＣＴ  ＡＧＡ−３’（配列番号４７）を有する。ＰＣＲに使用した３’−オリゴヌクレオチドは、ＥｃｏＲＩ部位ＧＡＡ  ＴＴＣおよび抗体検出を可能にするＶ５エピトープを包含する以下の構造すなわち５’−ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＴＴＡ  ＴＴＡ  ＣＧＴ  ＡＧＡ  ＡＴＣ  ＧＡＧ  ＡＣＣ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＡＧＧ  ＧＴＴ  ＡＧＧ  ＧＡＴ  ＡＧＧ  ＣＴＴ  ＡＣＣ  ＣＡＴ  ＧＴＧ  ＴＧＡ  ＴＧＴ  ＴＴＣ  ＡＧＡ  ＧＣＴ−３’（配列番号４８）を有する。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ中にヒトＰＭＳＲ３を含有したプラスミド（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ  Ｎ．Ｃ．ら（１９９５）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３０（２）：１９５−２０６）を、上のｈＰＭＳ２特異的オリゴヌクレオチドとともにＰＣＲ標的として使用した。２５周期のＰＣＲ（９５℃１分間、５５℃１分間、７２℃１．５分を２５周期、次いで７２℃で３分）後、ＰＣＲフラグメントをゲル電気泳動により精製し、そして標準的クローン化方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第３版、２００１）によりｐＴＡ２．１（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローン化してプラスミドｐＴＡ２．１−ｈＲ２を創製した。ｐＴＡ２．１−ｈＲ２を次に制限酵素ＥｃｏＲＩで消化して挿入物（挿入物に隣接するｐＴＡ２．１のマルチクローニング部位に２個のＥｃｏＲＩ制限部位が存在する）を遊離させ、そして酵母発現ベクターｐＰＩＣ３．５Ｋ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に挿入した。
【００８６】
ピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）酵母細胞を、後に続くとおりｐＰＩＣ３．５Ｋベクター、ｐＰＩＣ３．５Ｋ−ＰＭＳ１３４およびｐＰＩＣ３．５Ｋ−ｈＲ２で形質転換した。最初に、５ｍｌのＹＰＤ（１％酵母抽出物、２％バクトペプトン、１％Ｄ−ブドウ糖）培地にＹＰＤプレート（ＹＰＤ液体と同一だがしかしプレート化するため２％Ｄｉｆｃｏアガーを添加する）からの単一コロニーを接種し、そして振とうを伴い３０℃で一夜インキュベートした。一夜培養物を使用して５００ｍｌのＹＰＤ培地に接種し（２００μｌの一夜培養物）、そして６００ｎｍでの光学密度が１．３ないし１．５に達するまで培養物を３０℃でインキュベートした。その後細胞を回転して落とし（４，０００×ｇ、１０分間）、そしてその後滅菌水で２回洗浄し（各回１容量）、その後細胞を２０ｍｌの１Ｍソルビトールに懸濁した。ソルビトール／細胞懸濁液を回転して落とし（４，０００×ｇ、１０分間）そして１ｍｌの１Ｍソルビトールに懸濁した。８０μｌの細胞懸濁液を５ないし１０μｇの直鎖状にしたプラスミドＤＮＡと混合し、そして０．２ｃｍキュベットに入れ、７，５００Ｖ／ｃｍの電場強度で長さ５ないし１０ミリ秒でパルス投与した（ｐｕｌｓｅｄ）。次に、細胞を１ｍｌの１Ｍソルビトールで希釈しかつ１５ｍｌチューブに移し、そして振とうを伴わずに３０℃で１ないし２時間インキュベートする。次に細胞を回転して落とし（４，０００×Ｇ、１０分間）かつ１００μｌの滅菌水に懸濁し、そして５０μｌ／プレートを適切な選択培地プレート上に広げる。プレートを３０℃で２ないし３日間インキュベートし、そしてコロニーをさらなる試験のためＹＰＤプレート上に斑点状にする。
実施例５：ミスマッチ修復遺伝子の誘導可能なドミナントネガティブのアレルをもつ超変異性酵母の生成
ヒトＰＭＳ２相同体２ＰＭＳ−Ｒ２もしくは空のベクターを発現する酵母クローンをＢＭＧ（１００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．０、１．３４％ＹＮＢ（酵母窒素ベース）、４×１０−５％ビオチン、１％グリセロール）液体培養物中で３０℃で２４時間増殖させた。次の日に培養物をＭＭ培地（１．３４％ＹＮＢ、４×１０−５％ビオチン、０．５％メタノール）で１００倍希釈し、そして振とうを伴い３０℃でインキュベートした。細胞を変異体選択のため、下述されるとおりメタノールインキュベーション後２４および４８時間に取り出した（実施例６を参照されたい）。
実施例６：ドミナントネガティブのＭＭＲ遺伝子は酵母中で新たな遺伝的バリアントおよび商業的に実現可能な発現特質を生じさせ得る。
【００８７】
実施例５に提示されたところの酵母中でＭＭＲ遺伝子を発現する能力は、ドミナントネガティブのＭＭＲ遺伝子を発現する酵母中で遺伝的変化および新たな表現型を生成する能力を示す。本実施例において、われわれは、商業的に有意義な発現特質をもつ真核生物株を創製するための本方法の利用性を教示する。
ウラシル依存性酵母株の生成
利用性の一例は、アミノ酸もしくはヌクレオチドのような特定の代謝産物についての変異体である酵母株の生成である。こうした酵母株の工作は、組換え製造の測定可能な工程のための遺伝子の導入のための酵母株の組換え操作を可能にすることができる。ＭＭＲを酵母中で操作して特定の分子構成要素を産生する能力を欠く変異体を生成させ得ることを示すために、以下の実験を実施した。メタノールで誘導可能なヒトＰＭＳ２相同体ｈＰＭＳ２−Ｒ２（上の実施例４に記述されるところの）を発現する酵母細胞をＢＭＹ培地中で一夜増殖させ、その後１００倍希釈しかつＭＭ培地に移し、これはＡＯＸプロモーターの活性化および酵母細胞内に常在性であるｈＰＳＭ２−Ｒ２  ＭＭＲ遺伝子の産生をもたらす。対照細胞を同一の様式で処理し（これらの細胞は酵母中にｐＰＩＣ３．５ベクターを含有するが挿入物を欠く）、細胞を２４および４８時間誘導し、そしてその後、後に続くとおりウラシル要求突然変異について選択した。細胞を５−ＦＯＡ培地（Ｂｏｅｋｅ，Ｊ．Ｄ．ら（１９８４）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９７：３４５−３４６）にプレーティングした。プレートは後に続くとおり作成する。すなわち、（２×濃縮物（フィルター滅菌）：酵母窒素ベース７グラム；５−フルオロオロト酸１グラム；ウラシル５０ミリグラム；ブドウ糖２０グラム；水で５００ｍｌまで；５００ｍｌの４％アガー（オートクレーブ済み）に添加しかつプレートに注ぐ。細胞を５−ＦＯＡプレート上にプレーティングし（０、２４および４８時間の時間点）、そして３０℃で３と５日との間インキュベートする。典型的な実験からのデータを表３に示す。ウラシル要求クローンは「空の」ベクターをもつ酵母細胞中の誘導していないもしくは誘導した培養物では観察されなかった一方、ＭＭＲ遺伝子ｈＰＭＳ２−Ｒ２をもつ細胞は選択培地上での増殖が可能であるクローンを有する。ｈＰＭＳ２−Ｒ２の誘導されない培養物は５−ＦＯＡに対し抵抗性であるいかなるコロニーも有さず、新規表現型が生成されるためには該遺伝子が誘導されなければならないことを示すことに注目されたい。
【００８８】
（エチルメチルスルホン酸のような変異原が少数のｕｒａ変異体をもたらすこと、およびこの分類の変異体を生成させるための自発的突然変異率が低いことが示されている（Ｂｏｅｋｅ，Ｊ．Ｄ．ら（１９８４）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９７：３４５−３４６）。
表３：ウラシル要求変異体ピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）酵母細胞の生成。
＃は２４時間メタノール誘導を、および＠は４８時間誘導を表す。比較のため処理／未処理の野性型酵母細胞を示す（Ｇａｌｌｉ，Ａ．とＲ．Ｈ．Ｓｃｈｉｅｓｔｌ、（１９９９）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．４２９（１）：１３−２６）。
【００８９】
【表３】
2005531291.tif 000005
【００９０】
熱抵抗性産生株の生成
商業的利用性の一例は熱抵抗性組換えタンパク質産生株の生成である。組換え体製造のスケーラブルな工程において、原核生物および真核生物双方の大スケール醗酵は培養物内での過度の熱の生成をもたらす。この熱は、培養物が活発に増殖しかつ生成物を産生している際にそれを取り囲む冷却ジャケットを使用することのような物理的手段により散逸させなければならない。高温の出現に効果的に耐え得る酵母株の製造は、大スケールの組換え体製造工程に有利であるとみられる。この目的のため、実施例５に記述されたところの酵母株をメタノールの存在下で増殖させてドミナントネガティブのＭＭＲ遺伝子を誘導し得、そして該細胞を多様な時間の間（例えば１２、２４、３６および４８時間）増殖させ得、その後プレート上に置きかつ上昇された温度でインキュベートして高温の出現（例えば３７℃もしくは４２℃）に耐える変異体について選択し得る。これらの株は醗酵の開発および工程のスケールアップに有用であるとみられ、また、より少なくしばしば醗酵を冷却する必要性による製造費用の減少をもたらすはずである。
高組換えタンパク質生産株およびより低い内因性プロテアーゼ活性をもつ株の生成
酵母は増殖させるのが安価でありかつスケールで（ａｔ  ｓｃａｌｅ）の醗酵に容易に役立つ単細胞生物体であるために、それは価値のある組換え製造生物体である。さらに、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の系で発現される場合に効果的にフォールディングすることが不可能である多くの真核生物タンパク質は、酵母中で適正なコンホメーションを伴いフォールディングし、そしてそれらの哺乳動物の対蹠物に構造上同一である。組換えタンパク質の過剰および／もしくは不適切なグリコシル化、内因性の酵母の酵素によるタンパク質分解、ならびに酵母細胞の内側から培地への組換えタンパク質の不十分な分泌（精製を助長する）を包含する、酵母中で発現される多くのタンパク質のいくつかの固有の限界が存在する。タンパク質を過剰分泌するこの能力、またはより低い内因性プロテアーゼ活性およびもしくはより低い高グリコシル化活性を伴う酵母細胞を生成させるために、実施例４に記述されたところの酵母細胞を１２、２４、３６および４８時間メタノールとともに増殖させ得、そして、酵母細胞を、目的のタンパク質を過剰分泌しそれを過小グリコシル化する能力について、もしくは減弱されたプロテアーゼ活性を伴うもしくはプロテアーゼ活性をもたない細胞を選択し得る。こうした株は組換え製造もしくは他の商業的目的上有用であることができ、そして上に概説された熱抵抗性株と組合せ得る。
【００９１】
例えば、高温の出現に対し抵抗性でありかつ大量のタンパク質を培地中に分泌し得る変異体酵母細胞が生じるとみられる。
【００９２】
同様の結果が、ＰＭＳＲ２、ＰＭＳＲ３およびヒトＭＬＨ１タンパク質のような他のドミナントネガティブ変異体で観察された。
実施例７：不完全なＭＭＲにより酵母の宿主ゲノム中で生成される突然変異は遺伝的に安定である
実施例６に記述されたとおり、酵母中のＭＭＲ経路の操作は宿主ゲノム内の変化、および新規発現特質について選択する能力、例えば特定の栄養素を要求する酵母細胞の能力をもたらす。ＭＭＲ経路により導入される突然変異は遺伝的に安定であり、そして野性型ＭＭＲ経路が一旦再確立されれば娘細胞に再現可能に渡されることが重要である。酵母ゲノム中に導入された突然変異の遺伝的安定性を決定するために以下の実験を実施した。ｕｒａ−であるｐＰＩＣ３．５ＫｈＰＭＳ２−Ｒ２からの５個の独立したコロニー、５個の野性型対照細胞（ＵＲＡ＋）および５個のｐＰＩＣ３．５Ｋ形質転換細胞（「空のベクター」）を５ｍｌのＹＰＤ（１％酵母抽出物、２％バクトペプトンおよび１％Ｄ−ブドウ糖）中で単離されたコロニーから３０℃で振とうを伴い一夜増殖させた。ＹＰＤ培地は、ウラシルを包含する、酵母が増殖するのに必要な全栄養素を含有する。次に、＞３．０の６００ｎｍで測定されるところの光学密度（ＯＤ）であった一夜培養物１ｐＬをＹＰＤで０．０１のＯＤ６００に希釈し、そして培養物を振とうを伴い３０℃で追加の２４時間インキュベートした。この過程をもう３回、合計５回の一夜インキュベーションの間反復した。これは１００世代以上の倍加（プレート上の最初のコロニーから最後の一夜インキュベーションの終わりまでの同等物である。その後、細胞（ｕｒａである５個の独立したコロニーおよび野性型であった５個を３００ないし１，０００細胞／プレートの細胞密度でＹＰＤプレート上でプレーティングし、そして３０℃で２日間インキュベートした。これらのプレートからの細胞を、以下のプレート；合成完全（ＳＣ）ＳＣ−ｕｒａ（１．３４％酵母窒素ベースおよび硫酸アンモニウム；４×１０−５％ビオチン；全アミノ酸を補充、ウラシル補充なし；２％Ｄ−ブドウ糖および２％アガー）；ＳＣ＋ＵＲＡ（ＳＣ−ｕｒａと同一だがしかし５０ｍｇのウラシル／培地１リットルを含む補充プレート）、ならびにＹＰＤプレートにレプリカプレーティングし、そして３０℃での３日インキュベーション後の増殖について評価した。それらは以下の順序−ＳＣ−ｕｒａ、ＳＣ完全、ＹＰＤでレプリカプレーティングした。変異体ＭＭＲ（本実施例においてはＰＭＳ２のヒト相同体ｈＰＭＳ２−Ｒ２）の発現により生成された酵母ゲノム内に常在性である新規発現特質が不安定である場合は、ウラシル依存性細胞はウラシル非依存性の表現型を「復帰」させるはずである。該表現型が安定である場合、非選択的条件下での変異体細胞の増殖は、ウラシルの外因性補給に依存するそれらの生存可能性を維持する酵母細胞をもたらすはずである。表４に提示されるデータで見ることができるとおり、ウラシル依存性の表現型は、酵母細胞が非選択的条件下で増殖される場合に安定であり、ウラシル生合成経路遺伝子の１つ中の突然変異に由来するＭＭＲで生成される表現型が遺伝的に安定であることを示す。
【００９３】
【表４】
2005531291.tif 000006
【００９４】
これらのデータは、遺伝的に変えられた株を生成させるために真核生物系で誘導可能な発現系およびドミナントネガティブのＭＭＲ遺伝子を使用することの利用性を示す。本実施例で開発された株（今や増殖のためにウラシルの添加を必要とする酵母株）は組換え製造のための株として潜在的に有用であり；組込みプラスミドもしくは染色体外ベクターのいずれか上で野性型ＵＲＡ３遺伝子をもつ発現ベクターを構築することにより、目的のタンパク質を発現する新規細胞を形質転換かつ創製することが今や可能である。酵母細胞中の他の常在性遺伝子を改変しかつ新規生体内変換を実施する能力のような他の有用な表現型を与える遺伝子中の突然変異について選択することもまた可能である。さらに、上述されたところの変えられたＭＭＲ活性を有する酵母株中で染色体外で遺伝子を発現させかつ該染色体外遺伝子中の突然変異について選択することが可能である。従って、上述されたものに類似の様式で変異体の酵母細胞を特定の選択圧下に置きかつ商業的に重要な生化学的属性をもつ新規タンパク質を選択することが可能である。
【００９５】
これらの例は具体的説明としてのみ意味しており、そして本発明の範囲を制限することを意味していない。
【００９６】
最後に、上述されたとおり、突然変異が一旦目的の遺伝子中に導入されれば、ＭＭＲ活性が減弱されるかもしくは完全に廃止される。該結果は目的の標的遺伝子（１種もしくは複数）中に安定な変異体をもつ酵母細胞である。
実施例８：新たな発現特質の生成のためのＭＭＲ欠損酵母および化学物質変異原の高められた生成
ＭＭＲ欠損が、増大された突然変異頻度、ならびに限定されるものでないが：臭化エチジウム、ＥＭＳ、ＭＮＮＧ、ＭＮＵ、タモキシフェン、８−ヒドロキシグアニンのようなもの、ならびに限定されるものでないが：Ｋｈｒｏｍｏｖ−Ｂｏｒｉｓｏｖ，Ｎ．Ｎ．ら（１９９９）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．４３０：５５−７４；Ｏｈｅ，Ｔ．ら（１９９９）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．４２９：１８９−１９９；Ｈｏｕｒ，Ｔ．Ｃ．ら（１９９９）Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３７：５６９−５７９；Ｈｒｅｌｉａ，Ｐ．ら（１９９９）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔｅｒａｃｔ．１１８：９９−１１１；Ｇａｒｇａｎｔａ，Ｆ．ら（１９９９）Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｏｌ．Ｍｕｔａｇｅｎ．３３：７５−８５；Ｕｋａｗａ−Ｉｓｈｉｋａｗａ  Ｓ．ら（１９９８）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．４１２：９９−１０７；ｗｗｗ．ｅｈｓ．ｕｔａｈ．ｅｄｕ／ｏｈｈ／ｍｕｔａｇｅｎｓ；Ｍａｒｃｅｌｉｎｏ，Ｌ．Ａ．ら（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８（１３）：２８５７−２８６２；Ｋｏｉ，Ｍ．ら（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：４３０８−４３１２による刊行物中に列挙される他者を挙げることができる化学物質変異原（ＣＭ）およびそれらのそれぞれの類似物の毒性の影響に対する増大された抵抗性を生じさせることが以前に報告されている。ミスマッチ修復はメチル化剤もしくは６チオグアニン（しかしエチル化剤でない）で処理したハムスター細胞中の染色体異常を惹起する。ＭＭＲ欠損酵母細胞中での突然変異頻度を増大させるＣＭの能力を示すために、われわれは、メタノール（ＰＭＳ２に対する常在性のヒト相同体ｈＰＭＳ２−Ｒ２の発現を誘導する）の存在もしくは非存在下でのＣＭへの酵母細胞の曝露が酵母細胞内での突然変異の増大をもたらすであろうことを予測することができる。
【００９７】
ｈＰＭＳ２−Ｒ２（誘導されたもしくは誘導されない）を発現する酵母細胞および空のベクター対照細胞を実施例５および６）に記述されるとおりかつ２４時間増殖させ、そして上述されたとおりＭＭ培地で希釈する。次に、ＭＭ中の細胞を０から１、１０、５０、１００および２００ｐＭの増大する量のエチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）とともにもしくは伴わずにのいずれかでインキュベートする。培養物の１０個の活発な（ｚｉｐ）アリコート（３００μｌのＭＭで希釈）かつ３０分、６０分および１２０分間インキュベートし、次いで上で実施例３に記述されたところの５−ＦＯＡプレート上に細胞をプレーティングする。変異体を上のとおり選択かつ評価する。われわれは、メタノールで誘導されるＰＭＳ２−Ｒ２培養物において、誘導されない親もしくは野性型株に比較してｕｒａ変異体の頻度の増大が存在するであろうことを予測することができる。本実施例のさらなる一拡張において、ヒトＰＭＳ２−Ｒ２をもつ細胞を２４および４８時間誘導することができ、その後ＥＭＳで突然変異誘発することができる。これはＭＭＲ遺伝子が完全に活性にされかつ高レベルで発現されることを可能にすることができ、それにより、得られるｕｒａ変異体の数の増大をもたらす。われわれは、誘導されない親対照もしくは野性型の「空のベクター」細胞中で得られるｕｒａ変異体の数の変化が存在しないであろうことを予測することができる。本実施例は、新たな発現特質について選択し得る高められた数の遺伝的に変えられた酵母株を生じさせるための、調節されたドミナントネガティブのＭＭＲの系に加えて化学物質変異原を使用することの使用を示す。本方法は、限定されるものでないが組換え製造、生体内変換、および高められた活性をもつ変えられた生化学物質を挙げることができる商業的応用のためのこうした生物体の生成に有用である。それはまた、上の実施例４に記述されるものに類似の染色体外発現ベクター上に持たれる異所性に発現されるタンパク質からのタンパク質活性の変化を得るのにも有用である。
ＭＭＲ遺伝子およびコードされるポリペプチドの例
酵母ＭＬＨ１  ｃＤＮＡ（受託番号Ｕ０７１８７）（配列番号１）；酵母ＭＬＨ１タンパク質（受託番号Ｕ０７１８７）（配列番号２）；マウスＰＭＳ２タンパク質（配列番号３）；マウスＰＭＳ２  ｃＤＮＡ（配列番号４）；ヒトＰＭＳ２タンパク質（配列番号５）；ヒトＰＭＳ２  ｃＤＮＡ（配列番号６）；ヒトＰＭＳ１タンパク質（配列番号７）；ヒトＰＭＳ１  ｃＤＮＡ（配列番号８）；ヒトＭＳＨ２タンパク質（配列番号９）；ヒトＭＳＨ２  ｃＤＮＡ（配列番号１０）；ヒトＭＬＨ１タンパク質（配列番号１１）；ヒトＭＬＨ１  ｃＤＮＡ（配列番号１２）；ｈＰＭＳ２−１３４タンパク質（配列番号１３）；ｈＰＭＳ２−１３４  ｃＤＮＡ（配列番号１４）；ｈＭＳＨ６（ヒトタンパク質）（受託番号Ｕ０２８９４６（配列番号１５）；ｈＭＳＨ６（ヒトｃＤＮＡ）（受託番号Ｕ２８９４６）（配列番号１６）；ｈＰＭＳＲ２（ヒトｃＤＮＡ）（受託番号Ｕ３８９６４）（配列番号１７）；ｈＰＭＳＲ２（ヒトタンパク質）（受託番号Ｕ３８９６４）（配列番号１８）；ＨＰＭＳＲ３（ヒトｃＤＮＡ）（受託番号ＭＭ＿００５３９５．１）（配列番号１９）；ｈＰＭＳＲ３（ヒトタンパク質）（受託番号Ｕ３８９７９．１）（配列番号２０）；ｈＰＭＳＲ６（ヒトｃＤＮＡ）（受託番号Ｕ３８９８０．１）（配列番号２１）；ｈＰＭＳＲ６（ヒトタンパク質）（受託番号Ｕ３８９８０．１）（配列番号２２）。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】下線付けでコンセンサス配列領域を示すＰＭＳＲ２、ＰＭＳＲ３およびＰＭＳＲ６のポリペプチド配列を示す。
【図１Ｂ】ＰＭＳ２のコンセンサス配列領域のＤＮＡジャイレース様ＡＴＰアーゼモチーフとのアライメントを示す。
【図２Ａ−Ｂ】ＰＭＳ２のＮ末端フラグメントの構造（直交図）を示す。
【図２Ｃ】図２Ａおよび２Ｂに対応するｈＰＭＳ２、ｈＭＬＨ１およびＭｕｔＬのＮ末端フラグメントの配列のアライメントならびに構造的特徴を示す（Ｇｕａｒｎｅら（２００１）ＥＭＢＯ  Ｊ．２０（１９）：５５２１−５５３１、図２Ａ−Ｃから）。
【図３】リンパ腫細胞株中のＰＭＳＲ遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。マイクロサテライトの不安定性（ＭＩ）を伴う（レーン３〜５）もしくは伴わない（レーン２）リンパ腫細胞株で３０周期のＲＴ−ＰＣＲ増幅を実施した。上で示されたとおり、ＭＩを伴う各株はＰＭＳＲ２もしくはＰＭＳＲ３いずれかの遺伝子を発現した一方、ＭＩを欠く細胞株（レーン２）では発現が観察されなかった。ｈＰＭＳ２およびβ−アクチンのメッセージを内部対照として使用してＲＮＡ負荷について測定した。レーン１は潜在的アーチファクトもしくは汚染について測定するための疑似反応であった。４５周期の増幅を使用して追加のＰＣＲ増幅を実施し、これは、３０周期で観察されたところの陽性レーン中でのより確固たる産物をもたらした一方、レーン１および２に提示されるもののような陰性サンプル中ではＰＭＳＲシグナルが検出されなかった。
【図４】マイクロサテライトの不安定性（ＭＩ）を伴う（ＬＭＭ−１）（レーン２）もしくは伴わない（ＬＮＭ−ａ）（レーン１）ヒトリンパ腫細胞株のウェスタンブロット分析を示す。矢印はｈＰＭＳ２およびｈＰＭＳＲ２ポリペプチドの期待される分子量をもつタンパク質を示す。ＭＩを表すリンパ腫細胞株でＰＭＳＲ発現の相関が観察される。
【図５】ＰＭＳ２およびＰＭＳＲ相同体に加えてＭＭＲ感受性のｐＣＡＲ−ＯＦレポーターを発現する２９３細胞中でのβ−ガラクトシダーゼ活性を示す。ＭＭＲ活性が低下されている細胞はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子内の挿入−欠失突然変異につながるＭＩをもたらし、その１サブセットは読み取り枠（ＯＲＦ）を復帰させかつ機能的酵素を産生することができる。細胞を１７日間増殖させ、そしてその後タンパク質ライセートのため収集して各細胞株により生成されたβ−ガラクトシダーゼ活性を測定する。高率の突然変異誘発が発生していた細胞はβ−ガラクトシダーゼ活性を生じさせることができる一方、ＭＭＲ活性が機能的である細胞はバックグラウンドレベルの酵素活性を保持することができる。各細胞株を２回の独立した実験（実験１および実験２）で試験した。抽出物を比色性ガラクトース基質とともに１時間インキュベートした。基質転化の関数としての酵素活性を、記述されたとおり（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ，Ｎ．Ｃ．ら（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：１６３５−１６４１）５７６ｎｍでの光学密度により測定した。上に示されたとおり、ＰＭＳＲ２およびＰＭＳＲ３を発現する細胞はβ−ガラクトシダーゼ活性の増大につながる高程度のＭＩを有した。ＭＩを遺伝子レベルでモニターして、遺伝子変化がβ−ガラクトシダーゼのＯＲＦを混乱させるポリヌクレオチド反復内で発生したことを確認した。
【配列表】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図４】
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【図３】
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【図５】
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