(57)【要約】本発明は、ブドウ球菌の鼻コロニー形成および以後の感染のリスクのある被験者の鼻孔前部に投与することができる鼻内リソスタフィン組成物、およびその使用法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
a) 粘性製剤、およびb) 少なくとも0.125％のリソスタフィンとを含む鼻内投与用の薬剤。
【請求項２】
0.125％〜10％のリソスタフィンを含む請求項１記載の薬剤。
【請求項３】
リソスタフィンが、野生型リソスタフィン、ヒトまたは動物リソスタフィン、リソスタフィン変異体、変種または断片、合成リソスタフィン、または組換え発現されたリソスタフィンから選択され；リソスタフィンは、ブドウ球菌の細胞壁ペプチドグリカン中のグリシン含有ブリッジに対してタンパク質分解活性を有する、請求項１または２に記載の薬剤。
【請求項４】
リソスタフィン以外に少なくとも１つの抗生物質、抗細菌剤、またはブドウ球菌溶解酵素をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項５】
バシトラシンをさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項６】
phi11ヒドロラーゼをさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項７】
粘性製剤が粘性液体製剤である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項８】
粘性製剤がクリーム製剤である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項９】
ワセリン、SOFTISAN649、パラフィン、密蝋、MIGLYOL812、ステアリン酸亜鉛、およびステアリン酸アルミニウム（ステアリン酸金属）の少なくとも１つを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項１０】
約：15％〜50％のMIGLYOL812、15％〜50％のSOFTISAN649、15％〜50％の白色ワセリン、０％〜10％のパラフィン、０％〜10％の密蝋、および０％〜５％のステアリン酸アルミニウム、および０％〜５％のステアリン酸亜鉛もしくはアルミニウム（ステアリン酸金属）を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項１１】
36％のMIGLYOL812（カプリリック／カプリックトリグリセリド）、24.2％のSOFTISAN649（ビス-ジグリセリルポリアシルアジペート-2）、27.5％の白色ワセリン、3.4％のパラフィン、3.4％の密蝋、および0.5％のステアリン酸亜鉛もしくはアルミニウム（ステアリン酸金属）を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項１２】
ポリホスホエステル、ポリエチレングリコール、および高分子量ポリ（乳酸）、ヒドロキシプロピルセルロース、キトサン、およびポリスチレンスルファネートの少なくとも１つを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項１３】
少なくとも１つのマイクロカプセル化剤を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項１４】
ポリスチレンフルフォネートとキトサンの少なくとも１つを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項１５】
約0.5％のポリスチレンフルフォネートを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項１６】
ヒトまたは非ヒト患者の鼻孔に１回以上の注入により、請求項１〜１５に記載の組成物のいずれかの有効量を投与することを含む、患者の治療法。
【請求項１７】
組成物が、指またはアプリケータでぬぐう；組成物のチューブ、シリンジ、またはアプリケータを鼻孔に押しだす；エアゾル剤、噴霧剤、鼻スプレー剤、もしくは点鼻剤により、のいずれかにより、患者の鼻孔に注入される請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
投与が、以下の１つ以上から選択される有益な結果を与える、請求項１６または１７の方法：
a) 組成物の最後の注入後少なくとも12時間はブドウ球菌による鼻コロニー形成は無い、
b) 組成物の最後の注入後のある時間内で、鼻孔から採取される陽性培養物の頻度の低下（ここで該時間は、最後の注入後４時間以内、12時間以内、および24時間以内から選択される）、
c) 組成物の最後の注入後のある時間内で、鼻孔中の陽性培養物の頻度の低下（ここで該時間は、最後の注入後４時間以内、12時間以内、および24時間以内から選択される）、
d) 組成物の最後の注入後のある時間、鼻孔中のリソスタフィンの活性の持続（ここで該時間は、最後の注入後少なくとも８時間、少なくとも12時間、および少なくとも24時間から選択される）、
e) 組成物の単回投与による、ブドウ球菌による患者の鼻孔のコロニー形成の根絶、緩和、または阻止、
f) 組成物の10回までの注入による、ブドウ球菌による患者の鼻孔のコロニー形成の根絶、緩和、または阻止、
g) 患者の鼻孔の将来のブドウ球菌コロニー形成に対する阻止または予防、および
h) 患者のブドウ球菌感染の可能性の識別可能な低下。
【請求項１９】
ブドウ球菌は黄色ブドウ球菌である、請求項１８の方法。
【請求項２０】
請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の方法に従って患者集団を治療することを含む、患者集団のリソスタフィン耐性細菌の出現を低下させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、アメリカ合衆国仮出願 S.N.60/341,802号（2001年12月21日出願）（整理番号7787.6009）に基づき、その利益を主張する。この仮出願の全開示内容は本出願の基礎であり、かつ参照することにより本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
概論
ブドウ球菌感染症は、特に病院、ナーシングホーム、学校および診療所などの環境における疾患と死亡の重要な原因である。特にリスクのある患者には、幼児、老人、免疫無防備状態者、免疫抑制患者、回復期患者、およびしばしば入院の必要な慢性症状患者がある。さらに黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）の多剤耐性菌株の出現は、かかる感染症のタイミング良い阻止と治療に対する関心とニーズを上昇させている。実際「Astionicro経口耐性を克服する」と題された最近の世界保健機構の報告は、薬剤耐性レベルの上昇が最近数十年間の医学の進歩を阻害しているという懸念を詳述している。提起された問題には、入院患者の感染症がある。アメリカ合衆国単独でも、病院で獲得した薬剤耐性微生物の結果として、毎年約14,000人が感染し死亡している。世界中では、病院で獲得した感染症の実に60％が、薬剤耐性微生物により引き起こされている。
【０００３】
黄色ブドウ球菌（S. aureus）が引き起こす感染症では、ヒトの黄色ブドウ球菌の主要な生息場所は、鼻孔前部である。ブドウ球菌の鼻腔保菌は、感染症の流行と病原性において主要な役割を果たす（13、23、34、51、68、71、72、74）。健常者では、３つのパターンの黄色ブドウ球菌の鼻腔保菌が経時的に区別される：人工の約20％は持続性保菌者であり、約60％は間欠性保菌者であり、約20％は黄色ブドウ球菌を持っていないようである（34）。
【０００４】
ブドウ球菌の鼻腔保菌は、黄色ブドウ球菌感染症に罹る重要な危険因子である。最もリスクの高い患者は、入院してまたは通院して手術を受けている患者、集中治療室（ICU）の患者、連続的血液透析患者、HIV感染者、AIDS患者、やけど患者、治療または疾患により自然の免疫が低下した人、慢性疾患または衰弱患者、老人、免疫系が未成熟な幼児、および血管内装置または他の異種の体を有する人である（13、23、25、34、35、41、51、72、74）。ICU患者のある研究（19）では、入院時に752人の患者のうちの166人（22％）が黄色ブドウ球菌の鼻保菌者であった。これらの患者ではブドウ球菌感染を発症する確率が、非保菌者より有意に高かった（p<0.0001、相対リスクは59.6）。以後のブドウ球菌感染の30症例のうちの28症例では、鼻孔にコロニー形成している黄色ブドウ球菌株は、感染症から分離された株と同一であることを、研究者らは見いだした。さらに顕著なことは、Mestら（46）が証明したように、黄色ブドウ球菌の鼻培養物が陽性のICUに入院した19人の患者のうち、５人（26％）がブドウ球菌感染症を発症し、これに対して、ブドウ球菌の鼻腔保菌が陰性の465人の患者の群では６人（1.3％）のみが黄色ブドウ球菌感染症を発症した。
【０００５】
Changら（12）は、肝移植ユニットに入院した84人の肝硬変患者を調べた。全体として39人（46％）は黄色ブドウ球菌の鼻保菌者であり、これらの患者のうち23％は以後黄色ブドウ球菌感染症を発症したが、非保菌者ではわずかに４％のみの発症であった。HIV患者の研究（51）は、49％（296人のうち114人）の患者が、黄色ブドウ球菌の少なくとも１つの陽性鼻培養物を有することを示した。201人の患者のうち34％は鼻保菌者と見なされ、これらのうちの38％は持続性保菌者であり、62％は間欠性保菌者であった。黄色ブドウ球菌感染の21の発症例が、これらの患者の13人で起きた。分子的な株の型判定では、７人の感染患者のうちの６人について、感染部位から分離された黄色ブドウ球菌株は、以前鼻孔から分離されたものと同じであった。鼻黄色ブドウ球菌保菌患者は、有意に高率に黄色ブドウ球菌感染症を発症する（P＝0.04；オッズ比、3.6；寄与危険度、0.44）。この知見により研究者らは、HIV患者では鼻腔保菌が黄色ブドウ球菌感染の重要な危険因子であると結論した（51）。
【０００６】
多くの細菌病原体と同様に、ブドウ球菌の抗生物質耐性は出現し続ける問題である。この問題は黄色ブドウ球菌の鼻コロニー形成に及び、鼻コロニー形成の研究で見いだされた多くの株が抗生物質耐性であった。例えば、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（「MRSA」）は、よく研究されている国民の医療の問題である（23、25、46）。ナーシングホームで行われたある研究では、29％の居住者が鼻孔に黄色ブドウ球菌を有し、これらの分離株のうちの31％はMRSAであった（37）。術後腹腔内感染の別の研究では、MRSAが術後腹腔内感染の原因菌であり、これは鼻コロニー形成に関連する可能性があると結論した（23）。
【０００７】
上記文献の調査から、抗生物質感受性および抗生物質耐性黄色ブドウ球菌による鼻コロニー形成は、解決すべき主要な健康リスクであることが明らかである。現在の技術は、鼻バクトロバン（Bactroban Nasal）（２％ムピロシン（mupirocin）クリーム）を使用して、ブドウ球菌の鼻コロニー形成を除去することを指示している（22、35、41、63、72）。実際これは、特に黄色ブドウ球菌の鼻コロニー形成を排除するための、唯一の市販製品である。特に鼻での使用のために製造されてはいない他の抗生物質は、黄色ブドウ球菌の鼻コロニー形成を根絶するための鼻内抗菌剤としてはあまり有効ではない（26、35、63）。鼻バクトロバン（Bactroban Nasal）はいまだに、黄色ブドウ球菌の鼻コロニー形成の最も有効な現在利用可能な治療法である。残念ながら、メチシリンと同様に、多くの地域で黄色ブドウ球菌のムピロシン耐性株（MupRSA）が出現している（14、18、20、40）。従って、これらを考慮すると、迅速なかつ哺乳動物の鼻孔に対する介入に対するニーズが当該分野に存在する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の簡単な説明
本発明は、鼻内使用のためのリソスタフィン（lysostaphin）を含む製剤に関する（「鼻内リソスタフィン（lysostaphin intranasals）」）。リソスタフィンは、1964年にスタフィロコッカス・シミュランス（Staphylocossus simulans）（以前はスタフィロコッカス・スタフィロリティカス（S. staphylolyticus）として知られていた）株中で初めて同定された抗菌酵素である。リソスタフィンは、ブドウ球菌の細胞壁中の架橋ペンタグリシンブリッジを特異的に切断することができるエンドペプチダーゼである。黄色ブドウ球菌の細胞壁ブリッジは高率のペンタグリシンを含有するため、ブドウ球菌以外の種に対する活性も証明されているが、リソスタフィンは黄色ブドウ球菌の溶解に非常に有効である（75）。リソスタフィンは、その抗菌作用を誘発するために活発な細菌増殖を必要としない。これに対して、メチシリンのようなβ−ラクタム剤は、活発に増殖している細菌にのみ抗菌作用を示す。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の鼻内リソスタフィン組成物中に存在するリソスタフィンは、天然の細菌源から単離されるか；人工的に作成された組換え型のリソスタフィン；または、ブドウ球菌の細胞壁中の架橋ペンタグリシンブリッジを特異的に切断することができる完全に合成のリソスタフィン分子でもよい。本発明はまた、ブドウ球菌の鼻コロニー形成を緩和または阻止するための、鼻孔への鼻内リソスタフィンの投与に関する。ブドウ球菌の鼻コロニー形成の結果として侵襲性疾患のリスクのある対象者には、非常に若い人、非常に高齢の人、入院または外来手術のために通院した患者、ブドウ球菌感染症に罹りやすくなる種々の症状を有する患者（異種の体の存在を含む）、または退院前の任意の患者がある。退院前治療としての鼻内リソスタフィンの使用は、院内感染したブドウ球菌株の地域の流行を防ぐのに有用であろう。非ヒト患者でリスクのあるものは、動物園の動物、家畜動物、および狭苦しい所で飼われている動物（例えばブタ）、小屋で飼われている動物、および厩舎で飼われている動物がある。
【００１０】
本発明の鼻内リソスタフィンは、従来の抗ブドウ球菌治療法ではなし得なかったいくつかの利点を与える。まず、鼻内リソスタフィンの粘度と粘膜接着性により、哺乳動物鼻孔中の保持時間が長くなる。保持時間が長いと、鼻孔中でのブドウ球菌への接触が多くなり、従って有効性が上昇し、代替治療法より適用回数が少なくて良い。第２に、哺乳動物鼻孔への鼻内リソスタフィンの適用は、リソスタフィン耐性ブドウ球菌を出現させない。リソスタフィンを全身に投与するとリソスタフィン耐性細菌が出現したと報告した以前の研究（17）に対して、本発明の発明者らは、哺乳動物の鼻腔では、リソスタフィン耐性ブドウ球菌が出現しないという驚くべき発見をした。すなわち、鼻内リソスタフィンは、抗生物質耐性が問題である細菌で特に有用である。
【００１１】
最後に、組換えリソスタフィンを含む鼻内リソスタフィンは、より大きな比活性（すなわち、製剤の単位容量当たりの活性量）を有する。リソスタフィンは、天然には細菌によりプロ酵素として産生され、これは後にタンパク質分解処理を受けて成熟タンパク質を産生する。細菌からリソスタフィンが単離される時、得られる調製物中には活性型とあまり活性の無いプロ酵素型が存在する。プロ酵素型は、成熟した活性型より約４倍活性が低い（67）。天然に産生されるリソスタフィンの活性型は、ポリペプチドの異種混合物を含む。この不均一性は、リソスタフィンのプロ酵素のタンパク質分解的プロセシングのためである。このタンパク質分解的プロセシングは、完全長リソスタフィンのＮ末端の近くの多くの異なる部位で起き、最終的に活性なリソスタフィン分子の不均一混合物となる。この変わり易さは、天然の供給源から得られるリソスタフィン調製物により異なる。より活性の低いリソスタフィンの存在は、調製物中の活性リソスタフィンの濃度を希釈し、従って天然に得られるリソスタフィンを含有する製剤の比活性を低下させる。これに対して、組換えリソスタフィン調製物は、単一の完全に活性型のリソスタフィンを含有する。このような調製物においては、成熟型のリソスタフィンの活性を希釈する活性の低い型は存在しない。すなわち、組換えリソスタフィンを含む鼻内リソスタフィンは、天然由来のものより高い比活性を有する。
【００１２】
上記したように、鼻コロニー形成は、ブドウ球菌の主要な病原巣であり、ブドウ球菌の鼻コロニー形成と、(i) コロニー形成されたものにおける以後のブドウ球菌感染症；(ii) 鼻コロニー形成が拡散する可能性；および(iii) コロニー形成されたものの近くの他の個体の感染の可能性、との間に強い相関が証明されている。本発明は、既存のブドウ球菌の鼻コロニー形成を根絶し、こうして治療された個体の以後の感染の確率、および他の個体への黄色ブドウ球菌の鼻コロニー形成の拡散を低下させる。さらに、既存のブドウ球菌の鼻コロニー形成の根絶は、主要な病原巣を排除することにより、一般大衆のブドウ球菌感染症の全体的頻度を低下させる。抗生物質耐性ブドウ球菌株（例えば、MRSA）の出現があるため、ある地域のブドウ球菌感染症の全体的低下は特に重要である。新しいブドウ球菌感染症の数を低下させることは、次に一般大衆中に新しい耐性株が出現する頻度を低下させることになる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明が標的とするブドウ球菌生物の１つは、黄色ブドウ球菌である。これらの鼻内リソスタフィン組成物は、一般大衆における黄色ブドウ球菌の鼻内病原巣を根絶するのに使用することができ、こうして、以後のブドウ球菌感染症と上記の薬剤耐性黄色ブドウ球菌の拡散を低下させる。患者集団のすべてまたは一部（例えば、入院患者、医療従事者、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、または他の家畜動物）への投与は、集団の全体の健康を上昇させるであろう。
【００１４】
鼻内リソスタフィンはまた他の製剤と組合せて使用してもよいことを理解されたい。これらの製剤は、例えばブドウ球菌抗原を認識するモノクローナル抗体を含有してもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明の１つの態様は、ブドウ球菌の鼻コロニー形成を根絶するのに有用な、リソスタフィンを含むクリーム製剤に関する。リソスタフィンクリームはまた、その粘度を上昇させ粘膜接着性にし従って鼻孔中のリソスタフィンの保持時間を上昇させる追加の成分を、含有してもよい。これらの成分には、例えばクリーム基剤、粘度調節剤、乳化剤、および安定剤がある。クリーム基剤は、クリーム製剤の粘度のほとんどの原因である。粘度調節剤は、クリーム製剤を硬化させ、また粘度に影響を与える。乳化剤と安定剤は、クリーム製剤の安定性に寄与するが、粘度にも影響を与えることがある。本発明の鼻内リソスタフィンは、いくつかの方法により哺乳動物の鼻孔に導入され、これらの方法には、無菌スワブを用いて鼻内リソスタフィンを適用、鼻内リソスタフィンのチューブを鼻腔に押しだし次に鼻をマッサージ、および患者の指にある量を押しだし、鼻腔または鼻腔前部に適用、または任意の種類の供給装置を介しての適用、がある。
【００１６】
本発明の別の態様において、鼻内リソスタフィンは、粘性液体型または噴霧型でもよく、種々の鼻送達ビヒクルおよび／または担体を含んでもよい。そのようなビヒクルは、哺乳動物鼻孔中でのリソスタフィンの保持時間を上昇させる。これらの担体には、例えばポリホスホエステル、ポリエチレングリコール、および高分子量ポリ（乳酸）、微小球カプセル化剤、ヒドロキシプロピルセルロース、キトサン、およびポリスチレンサルファネートがある。そのような液体製剤は、エアゾルでまたは噴霧して鼻腔に投与されるか、または液滴を鼻腔に導入することにより投与される。さらにクリームと鼻内液体の両方とも、他の抗細菌物質（例えば、バシトラシン、ベータ−ラクタム、ポリスポリン、グリコペプチド、ランチビオティクス（例えば、ナイシンまたはズブチリシン）、および鼻内に適用できる抗ブドウ球菌作用を有する任意の他の抗生物質）を含有してもよい。
【００１７】
本発明の別の態様は、ブドウ球菌による鼻孔のコロニー形成を根絶、緩和または阻止するために、本発明の鼻内リソスタフィンを哺乳動物の鼻孔に投与する方法に関する。鼻内リソスタフィンは、単独で、または他の抗細菌物質（例えば、β−ラクタム、抗体、ランチビオティクス（例えば、ナイシンまたはズブチリシン）、および他の抗生物質（例えば、バシトラシンまたはネオマイシン）、または他の抗ブドウ球菌酵素（例えば、ムタノリシン、リゾチーム、またはセロジルムラミダーゼ））とともに投与してもよい。
【００１８】
用語「リソスタフィン」は本明細書において、ブドウ球菌の細胞壁ペプチドグリカン中のグリシン含有ブリッジに対して、in vitroおよびin vivoでタンパク質分解活性を有する任意の酵素または抗ブドウ球菌剤を包含する。従って本発明の組成物は、リソスタフィン活性による攻撃に感受性の任意の細菌に対して適用することができる。本発明の範囲内においてリソスタフィンは、野生型リソスタフィンおよび関連するタンパク質または抗ブドウ球菌剤、リソスタフィン変異体、変種、完全に合成のおよび部分的に合成のリソスタフィン、ヒトまたは動物のリソスタフィン、および組換え発現させたリソスタフィンタンパク質、を包含する。リソスタフィン変種は、タンパク質の翻訳後プロセシング（産生株中に存在する酵素により、またはプロセスの任意の段階で導入される酵素または試薬による）、または構造遺伝子の変異により作成される。変異には、部位欠失、挿入、点突然変異、ドメイン除去および置換変異がある。リソスタフィンには、例えばエス・シミュランス（S. simulans）、アンビシン・エル（Ambicin L）（バチルス・スフェリクス（Bacillus sphaericus）で産生される組換えリソスタフィンで、ヌトリション21（Nutrition 21）（以前はAMBI）から入手できる）、およびラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）発現系または大腸菌（E. coli）発現系から精製される成熟リソスタフィン、および本出願と同時に出願された同時係属出願「ブドウ球菌溶解活性が上昇した末端切断型リソスタフィン分子」（参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載の末端切断型リソスタフィンがある。
【００１９】
用語「リソスタフィンクリーム」は本明細書において、リソスタフィンを活性成分として含むクリームベースの製剤を意味する。リソスタフィンクリームは、0.125％〜10％またはそれ以上のリソスタフィンからなり、最適投与量は0.05％のみ異なってよい。すなわち、代表的実施形態において、リソスタフィンは少なくとも以下の任意の濃度で存在してもよい：0.125％、0.25％、0.5％、0.75％、1.0％、1.25％、1.50％、1.75％、2.0％、2.25％、2.50％、2.75％、3.0％、3.25％、3.50％、3.75％、4.0％、4.25％、4.50％、4.75％、5.0％、5.25％、5.50％、5.75％、6.0％、6.25％、6.50％、6.75％、7.0％、7.25％、7.50％、7.75％、8.0％、8.25％、8.50％、8.75％、9.0％、9.25％、9.50％、9.75％、または10％のリソスタフィン。
【００２０】
上記したように、リソスタフィンが加えられるクリーム製剤は、クリーム基剤、粘度調節物質、乳化剤および安定剤がある。クリーム基剤の成分には、例えばワセリンおよびSOFTISAN649（サソル社（Sasol, Inc.））（ビス−ジグリセリルポリアシルアジペート-2）がある。粘度調節物質には、例えばパラフィンおよび密蝋がある。乳化剤と安定剤には、例えばMIGLYOL812（サソル社（Sasol, Inc.））（カプリリック／カプリックトリグリセリド）、ステアリン酸亜鉛、およびステアリン酸アルミニウムがある。ある実施形態において、クリーム製剤は、15％〜50％のMIGLYOL812、15％〜50％のSOFTISAN649、15％〜50％の白色ワセリン、０％〜10％のパラフィン、０％〜10％の密蝋、および０％〜５％のステアリン酸アルミニウムからなる。別の実施形態において、クリーム製剤は、36％のMIGLYOL812、24.2％のSOFTISAN649、27.5％の白色ワセリン、3.4％のパラフィン、3.4％の密蝋、および0.5％のステアリン酸アルミニウムである。別の実施形態において、ステアリン酸アルミニウムの代わりにまたは部分的にステアリン酸亜鉛が代用される（まとめて「ステアリン酸金属」）。
【００２１】
さらに別の実施形態において、クリーム製剤は、41％のMIGLYOL812、24.2％のSOFTISAN649、27.5％の白色ワセリン、3.4％のパラフィン、3.4％の密蝋、および0.5％のステアリン酸亜鉛である。クリーム製剤にリソスタフィンを加えると、リソスタフィンはMIGLYOL812含量の一部を置換する。例えば、クリーム製剤の５％がリソスタフィン溶液からなるなら、MIGLYOL812は製剤の36％を占めるであろう。
【００２２】
本明細書において用語「リソスタフィン液剤」は、活性成分としてのリソスタフィンおよびポリマーを含む粘性の液体ベースの製剤を意味する。リソスタフィン液剤は、0.125％〜10％またはそれ以上のリソスタフィンからなり、最適投与量は0.05％のみ異なってよい。すなわち、リソスタフィンは少なくとも以下の任意の濃度で存在してもよい：0.125％、0.5％、0.75％、1.0％、1.25％、1.50％、1.75％、2.0％、2.25％、2.50％、2.75％、3.0％、3.25％、3.50％、3.75％、4.0％、4.25％、4.50％、4.75％、5.0％、5.25％、5.50％、5.75％、6.0％、6.25％、6.50％、6.75％、7.0％、7.25％、7.50％、7.75％、8.0％、8.25％、8.50％、8.75％、9.0％、9.25％、9.50％、9.75％、または10％のリソスタフィン。リソスタフィンが加えられる液体製剤は、少なくとも１つのヒドロキシプロピルセルロース、キトサンおよびポリスチレンスルフォネートからなる。用語「鼻内リソスタフィン」は、リソスタフィンを含む粘性の製剤であって、リソスタフィンクリームおよびリソスタフィン液剤とを含む。
【００２３】
本明細書において用語「保持時間」は、哺乳動物の鼻孔への鼻内リソスタフィンの最初の導入から、哺乳動物の鼻孔中のリソスタフィンまたは抗菌リソスタフィン活性の消失までの時間の長さを意味する。
【００２４】
鼻内リソスタフィンは、その暴露がブドウ球菌の意図的注入または一般的暴露であっても、鼻内リソスタフィンが、ブドウ球菌への暴露前、その最中、または後に投与される時、もし 1) 哺乳動物の鼻孔中のコロニーの数、または 2) 黄色ブドウ球菌の存在について鼻培養物が陽性となる頻度、を低下させることが可能なら、ブドウ球菌コロニー形成を「緩和」すると言われる。例えば、鼻組織または鼻スワブのサンプルから増殖することができる細菌コロニーの数が、鼻内リソスタフィンの投与後に低下するなら、鼻内リソスタフィンはコロニー形成を緩和すると考えられる。鼻内リソスタフィンがコロニーの数を少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも90％、または100％低下させる時、本明細書に記載の鼻コロニー形成アッセイのように、鼻内リソスタフィンはコロニー形成を緩和する。100％の緩和は「根絶」であろう。
【００２５】
鼻内リソスタフィンが、ブドウ球菌への暴露前、その最中、または後に投与される時、鼻孔への意図的注入または他の方法であっても、哺乳動物の鼻コロニー形成を防止することができるなら、鼻内リソスタフィンはブドウ球菌コロニー形成を「阻止」するといわれる。本発明の鼻内リソスタフィンを用いて、対照哺乳動物よりも長期間（例えば、12時間またはそれ以上、または24時間またはそれ以上）治療された哺乳動物から採取した鼻組織のサンプルからブドウ球菌コロニーが増殖できないなら、本明細書に記載の鼻コロニー形成アッセイで、鼻内リソスタフィンはコロニー形成を阻止する。
【００２６】
臨床の場では、ヒト患者での鼻のブドウ球菌コロニー形成の有無は、ブロス培養で一晩増菌した後、鼻スワブを適当な細菌培地上で培養することにより測定される。これらの培養物は、ブドウ球菌コロニーの有無についてスコア付けされる。この種のアッセイ系では、ブドウ球菌コロニー形成の阻止と緩和とを区別することは困難かも知れない。阻止または緩和がいったん起きると、患者は外からの供給源により再度コロニー形成されることがある。すなわち、鼻スワブのように定性的アッセイの目的には、鼻コロニー形成のリスクがあり、治療の時鼻コロニー形成が陰性であるヒト患者が、長期間（例えば、12時間またはそれ以上、または24時間またはそれ以上）陰性のままなら、鼻内リソスタフィンはコロニー形成を「阻止」している。もしこれが、本発明の鼻内リソスタフィンを投与する前に、すでにブドウ球菌が陽性であるヒト患者から採取した陽性の培養物または回収可能な細菌の頻度の識別可能な低下を引き起こすなら、鼻内リソスタフィンはヒト患者のブドウ球菌の鼻コロニー形成を「緩和」する。適用前にヒト患者から採取される陽性培養物が、適用後に無いなら、鼻内リソスタフィンは鼻コロニー形成を「根絶」する。
【００２７】
本発明の別の態様は、以後のブドウ球菌感染の主要な病原巣を除去するために上記の鼻内リソスタフィンを投与することにより、呼吸器ウイルス感染症、移植患者、HIV感染患者、やけど患者、血管内装置または異種の体を有する患者、回復期の患者、および２次感染を受けやすい他の患者の２次ブドウ球菌感染症を根絶、緩和、または阻止する方法に関する。
【００２８】
本発明の方法はまた、種々のカプセル型、ならびにメチシリン、バンコマイシン、ムピロシンおよび他の抗生物質に耐性の株を含むブドウ球菌の任意の臨床分離株による鼻コロニー形成の、かかる投与による根絶、緩和、または阻止に関する。さらに本発明は、ブドウ球菌の抗生物質耐性株の主要な病原巣である医療の場から解放されたヒトの鼻コロニー形成を根絶することにより、地域のブドウ球菌の抗生物質耐性株の拡散を抑制するという追加の利点がある。
【００２９】
本発明の目標は、ブドウ球菌感染症の頻度を低下させることであるため、本発明の鼻内リソスタフィンの有効量の注入は、ブドウ球菌感染（例えば、全身性感染、または外傷もしくは手術部位での感染）の可能性の、医学的に意味のある、区別可能な、または統計的に有意な低下を証明するのに充分な量の注入を含む。そのような証明は例えば、動物試験、またはリスクのある患者（例えば医療従事者、新生児および未熟児、入院または通院手術を受けている人、やけど患者、埋め込みカテーテル、ステント、関節置換物を受けている患者、老人患者、および遺伝的、化学的またはウイルス的に免疫系が抑制された人を含む）の臨床治験を包含する。
【００３０】
本明細書において「治療」とは、患者の鼻孔に本発明の組成物の有効量を１回以上投与することを包含する。有効量とは、黄色ブドウ球菌または他のブドウ球菌の既存のコロニー形成の、医学的に意味のある、区別可能な、または統計的に有意な低下、ならびに将来のコロニー形成の阻止または予防を引き起こすのに充分な量である。従って患者の治療は、以下のいずれかに定義される「治療的に有益な結果」を与える：1) 組成物の最後の注入後少なくとも12時間は、ブドウ球菌による鼻コロニー形成が無い、2) 組成物の最後の注入後、４時間、12時間、または24時間以内の、鼻孔中のブドウ球菌コロニー数の、医学的に意味のある、区別可能な、または統計的に有意な低下、3) 組成物の最後の注入後、４時間、12時間、または24時間以内の、鼻孔から採取される陽性培養物の頻度の低下、4) 組成物の最後の注入後、少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも48時間の、鼻孔中のリソスタフィンの活性の持続、6) 組成物の１回の投与、２回の投与、３回の投与、４回の投与、５回の投与、６回の投与、７回の投与、８回の投与、９回の投与、10回の投与による、ブドウ球菌による哺乳動物の鼻孔のコロニー形成の根絶、緩和、または阻止、7) 将来のブドウ球菌コロニー形成に対する医学的に意味のある、区別可能な、または統計的に有意な阻止または予防、または 8) 院内ブドウ球菌感染症を含む治療患者中のブドウ球菌感染症の確率の、医学的に意味のある、区別可能な、または統計的に有意な低下。
【００３１】
従って治療は、コロニー形成した患者の鼻孔中のブドウ球菌の数の、医学的に意味のある、区別可能な、または統計的に有意な低下、ならびに将来のコロニー形成またはブドウ球菌感染症の可能性の低下を包含する。本明細書において「コロニー形成した」は、患者の鼻孔におけるブドウ球菌の無症状の存在を意味し、「感染した」は、体の任意の部位の症状のある感染を意味する。「医学的に意味のある」治療は、患者の症状を改善する；患者の予後を改善する；患者の疾患率または死亡率を低下させる；将来のコロニー形成または感染の可能性を低下させる；または、患者集団中の、本明細書の細菌感染による疾患頻度または死亡率を低下させる、任意の治療を包含する。「統計的に有意な」結果の具体的な測定または同定は、使用される正確な統計検定に依存する。検定自体のパラメータにより決定されるように、使用される任意の統計検定の統計的に有意な結果を、当業者は容易に認識できるであろう。これらの公知の統計検定の例には、特に限定されないが、χ2 検定（カイ二乗検定）、Studentのｔ検定、Ｆ検定、Ｍ検定、Fisherの正確度検定、二項正確度検定、ポワソン正確度検定、一元または二元の繰り返し測定分散分析、および相関係数の計算（PersonとSpearman）がある。
【００３２】
本発明の鼻内リソスタフィン組成物は、ヒトの鼻孔に投与される。リソスタフィンを含有する化合物の鼻内投与は、３つの独立した試験で証明されるように、ブドウ球菌の鼻保菌者を治療するのに有効であるとして文献に報告されている。まず、MartinとWhiteによる研究ではこれらの研究者は、黄色ブドウ球菌がコロニー形成した成人について、0.5％リソスタフィン含塩噴霧剤の使用を試験した（42）。試験の各参加者は、７〜12日間毎日３回、鼻腔に自ら噴霧剤を適用した。MartinとWhiteは、黄色ブドウ球菌陽性の鼻培養物の数が、治療スケールの終了までに100％から20％まで低下するのを認めた。さらに、保菌者のままであった被験者から分離した黄色ブドウ球菌コロニーの数も低下した。
【００３３】
第２に、以後の試験でHarrisらは、幼児と小児について食塩水中の0.5％リソスタフィンの使用を試験した（28）。患者は、７〜14日間毎日４回リソスタフィン噴霧剤を投与された。10人の被験者のうち10人で黄色ブドウ球菌コロニー形成が根絶された。70％の患者は、16日間またはそれ以上の間コロニーは無かった。Harrisらは、被験者の一人にリソスタフィンに対する免疫感受性を認めた。当時これらの研究者が記載したように、リソスタフィン調製物は他のタンパク質に汚染されており、他の試験は、リソスタフィンが、動物で抗体形成を誘導し、アナフラキシーショックを誘発することができることを示した。
【００３４】
最後に、Quickelらの試験では、食塩水噴霧剤中の0.5％リソスタフィンを使用して、黄色ブドウ球菌が鼻にコロニー形成した数人の成人患者を治療した（57）。患者を３つの治療群に分けた。第１群は、５日間毎日３回リソスタフィン噴霧治療を受けた。第２群は、ネオスポリン（Neosporin）軟膏を投与された。第３群は治療を受けなかった。治療スケールの終了後、リソスタフィン治療患者の40％はまだ黄色ブドウ球菌を有し、60％の患者は、治療後５日目まで保菌者であった。Harrisらの研究と同様にQuickelらもまた、数人の患者で免疫応答を認め、ヒトでの使用のためのリソスタフィンの安全性を証明するために、さらなる試験が必要であることを示唆した。
【００３５】
これらをまとめると、これらの試験の３つすべてで、多くの用量の食塩水中の天然由来のリソスタフィンが被験者に使用された。これらの試験で使用される攻撃的な投与スケジュールにもかかわらず、何人かの被験者はコロニー形成されたままであった。他の被験者は、鼻のブドウ球菌コロニー形成の根絶を示さなかったが、再度これは７日間にわたって１日数回の投与による治療後であった。たとえそのような投与スケジュールがすべての被験者で根絶を引き起こしても、患者がそのような長く複雑な投与スケジュールを最後まで続けるかどうかは疑問である。投与処方が単純なほど、患者または医療従事者は治療を成功させやすい。また上記したようにある試験では、数人の被験者でリソスタフィンに対する免疫応答が認められ、これはリソスタフィンへの繰り返し暴露のせいかも知れない。前記研究の欠点を考慮して本発明者らは、ブドウ球菌による鼻コロニー形成を、少ない回数または１回のみの投与で迅速に根絶または緩和できる鼻内リソスタフィンの作成を試みた。
【００３６】
得られた本発明の鼻内リソスタフィンは、２つの点でこれらの研究を改善している。まず、前記研究で使用されたリソスタフィンは、エス・シミュランス（S. simulans）から精製された天然のリソスタフィンであった。リソスタフィンは細菌によりプロ酵素として天然に産生され、これは一連の工程で切断されて、完全長の完全に活性型のリソスタフィンを産生する。リソスタフィンが細菌から単離されると、得られる調製物中には活性型と活性の低い型のプロ酵素が存在する（67）。活性の低い型のリソスタフィンの存在は、調製物中の完全に活性なリソスタフィンの濃度を希釈し、こうして天然由来のリソスタフィンを含有する製剤の比活性を低下させる。これに対して、本発明はある実施形態で組換えリソスタフィン調製物を使用し、これは単一の完全活性型のリソスタフィンのみを含有する。そのような調製物において、リソスタフィンの成熟型の活性を希釈する活性の低い型は無い。すなわち、組換えリソスタフィンで作成した鼻内リソスタフィンの比活性（単位容量の調製物当たりの活性量）は、天然起源のリソスタフィンから作成した鼻内リソスタフィンの比活性より高く、得られる組換えリソスタフィン調製物は、エス・シミュランス（S. simulans）からの汚染細胞生成物を含有しない。
【００３７】
第２に、本発明者らは、クリーム製剤中のリソスタフィンの投与が、鼻孔中のリソスタフィンの保持を改善することを証明し、粘性液体製剤もまた、鼻孔中の保持時間を改良すると考えられる。改良された保持時間は、天然由来のリソスタフィンでもまたは組換えリソスタフィンで作成しても、鼻内リソスタフィンの有効性を改良することができる。
【００３８】
上記したように、本発明の少なくとも１つの実施形態において本発明者らは３つの利点を組合せた：(i) 食塩水に対して改良された保持時間；(ii) 天然由来のリソスタフィンより高い比活性を有する組換えリソスタフィンの使用；および(iii) リソスタフィンの均一調製物の使用。リソスタフィンの不均一調製物中のＮ末端アミノ酸が異なるリソスタフィン分子の存在は、汚染物質について「精製した」生成物を分析することをさらに困難にする。すなわち均一なリソスタフィン調製物では、汚染物質の検出はより容易に行われる。
【００３９】
これらの改良の結果として本発明者らは、鼻内リソスタフィンの単回投与が、コトンラット動物モデルで黄色ブドウ球菌の鼻コロニー形成を完全に根絶したことを以下に証明する。以下のコトンラット動物モデルを使用して、この根絶は少なくとも１週間続くことが証明された。
【００４０】
別の実施形態において本発明の鼻内リソスタフィンは、例えば抗生物質（例えば、ムピロシンおよびバシトラシン）を含む他の抗ブドウ球菌剤；抗ブドウ球菌物質（例えば、リゾチーム、ムタノリシン、およびセロジルムラミダーゼ）；抗ブドウ球菌抗体；抗菌ペプチド（例えばデフェンシン）；およびランチビオティクス、または任意の他のランチオン含有分子（例えば、ナイシンまたはズブチリシン）とともに投与してもよい。
【００４１】
提供された開示を考慮して、本発明の鼻内リソスタフィンの投与は、当業者のノウハウと経験の範囲内である。特に、必要な鼻内リソスタフィンの量、適切な担体との組合せ、投与スケジュールおよび量は、請求された本発明の範囲を逸脱することなく、当該分野の標準的知識に基づいて、広範囲に変化してもよい。ある実施形態において、リソスタフィンクリームは、１日に１回、２回、または３回を１〜５日間投与してもよい。ある実施形態においてリソスタフィンクリームは、１日に１回、１投与当たり0.5％〜2.0％で投与してもよい。これらの用量は、109の黄色ブドウ球菌（動物モデルで100％のコロニー形成を確実にすることが知られている量）の初期量で有効であることが知られている（33）。初期用量109の黄色ブドウ球菌は一般に、細菌の注入の５日後に、動物当たり103〜104 CFUの鼻コロニー形成を引き起こす。この鼻内コロニー形成のレベルは、注入後少なくとも１ヶ月続く。そのようなリソスタフィン投与処方は、非常に若い患者、非常に高齢の患者、回復期の患者、妊娠女性、手術のために入院した患者、ブドウ球菌コロニー形成に罹りやすくなる種々の状況の患者、または退院前の患者で有効であろう。患者は、予防または他の治療が必要な任意のヒトまたは非ヒト哺乳動物である。鼻内注入が企図される代表的患者は、黄色ブドウ球菌または他のブドウ球菌感染または保菌に罹りやすい任意の哺乳動物であり、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、霊長類、反芻動物（ウシ、乳牛、バッファロー、ラクダ、毛皮獣を含む）、家畜動物、実験室動物、動物園動物、および農場動物、小屋および厩舎動物、家畜ペット、および家畜動物がある。
【００４２】
本発明はさらに、以下の例により例示され、これは本発明の実施法を当業者に教示する。以下の例は本発明を例示するためのみであり、本発明のいくつかの実施形態の種々の有効な性質を開示する。以下の例は、請求された本発明を決して限定するものではない。
【実施例１】
【００４３】
リン酸緩衝化生理食塩水中のリソスタフィン
上記したように本発明者らは、ブドウ球菌による鼻コロニー形成を、少ない回数または１回のみの投与で迅速に根絶または緩和できる鼻内リソスタフィンの作成を試みた。MartinとWhite、Harris、およびQuickelによる研究は、天然由来のリソスタフィンを使用し、これは、活性の低いプロ型のリソスタフィンとタンパク質分解処理された完全に活性な型の両方を含有する。ブドウ球菌による鼻コロニー形成の治療を改良するための最初の試みとして本発明者らは、コトンラット中の鼻コロニー形成を治療するために食塩水中の組換えリソスタフィンを使用した。活性の低いプロ型のリソスタフィンが欠如し完全に活性なリソスタフィンのみを含有する組換えリソスタフィンを使用して、本発明者らは、天然由来のリソスタフィンを使用する鼻内製剤に対して、鼻内リソスタフィンの比活性を上昇させることができた。
【００４４】
リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）中のリソスタフィンの有効性を、コトンラット動物モデルで黄色ブドウ球菌コロニー形成について試験した。４〜６週齢のシグマドン・ヒスピディス（Sigmadon hispidis）コトンラットに、細菌を注入する24時間前、ナフシリン（１g/l）を含有する無菌水を自由に（動物が望むだけ）与えた。ナフシリンの投与は、鼻中の内因性細菌による増殖に対する競合を低下させ、こうして実験的MRSA株が鼻孔中でコロニー形成を確立する能力を増強するが、ナフシリンはMRSAコロニー形成を確立するのに絶対に必要ではない。同時に２％NaClを含有するColumbia寒天プレート（CSA）に、凍結ストックからの黄色ブドウ球菌MBT5040株を接種した。MBT5040は、組織から分離された臨床MRSA株であり、本発明者らのコレクション中ではリソスタフィンに対する最も高い最小阻止濃度（MIC）の１つを有する。この株はウォルターリードアーミイメディカルセンター（Walter Reed Army Medical Center）（WRAMC）から来た。MBT5040に対するメチシリンMICは＞36μg/mlである。MBT5040に対するリソスタフィンのMICは0.064μg/mlであり、これは、試験したMICの高いほうであり、従ってMBT5040は、このモデルで使用するのに黄色ブドウ球菌の良好な代表株である。特定の細菌株に対する薬剤のMICは、特定の細菌株の正常な増殖を阻害する薬剤の最小濃度である。CSAプレート上の増殖は、細菌の周りのカプセル形成を促進し、これは次に、鼻孔のより効率的なコロニー形成を与える。
【００４５】
注入の日に、サンプルの透過パーセントが650nMで10mmの光路長で約10％になるまで、コロニーを無菌PBS（注入される動物につき1ml）に掻き取って、CSAプレートから黄色ブドウ球菌MBT5040を採取した。遠心分離して細菌をペレットにし、次に10μl／動物の無菌PBS中に懸濁した。200μlのケタミン（25mg/kg）、ロンプン（2.5mg/kg）、およびアセプロマジン（2.5mg/kg）を筋肉内投与して、コトンラットを鎮静させた。PBS中10μl（約109 の黄色ブドウ球菌CFU／動物）のMBT5040を、鼻孔に触れずにマイクロピペットを使用して鼻孔に注入した。具体的には、細菌接種物１滴を、鼻孔に触れずにマイクロピペットを使用して鼻孔に入れた。次に、動物の正常の呼吸プロセスにより、液滴が鼻孔中に吸入された。MBT5040細菌の導入後コトンラットを、ナフシリンの無い正常な水に戻した。特に明記しない場合は、この方法は、後述のすべての例で鼻孔に黄色ブドウ球菌を注入するのに使用した。
【００４６】
注入の４日後と５日後に、または５日後のみに、PBS中のリソスタフィンまたはPBSのみで動物を処理した。この例ではおよび実施例２〜10では、組換えリソスタフィンの供給源としてアンビシン・エル（Ambicin L）（アンビ社（Ambi Inc.））を使用した。再度動物を麻酔し、10μlのPBS単独またはPBS中のリソスタフィン（110μgのリソスタフィン／動物）を鼻孔上に置き、上記したように吸入させた。最後の処理の２時間後、動物をCO2吸入により屠殺した。無菌の70％エタノールワイプで鼻を拭いた後、これを外科的に除去し、切開し、0.5％ツイーン20を含有する500μlの無菌PBS中でボルテックス混合して、コロニー形成細菌を放出させた。種々のタイプの寒天プレート上に50〜100μlのPBSを入れて、実際のコロニー形成を測定してリソスタフィン耐性を調べた。具体的には、血液寒天とトリプシンダイズアガロース（TSA）＋7.5％NaCl（ナフシリンまたはストレプトマイシンは無い）上で増殖したコロニーのリソスタフィン感受性を測定することにより、リソスタフィン耐性を追跡した。MBT5040黄色ブドウ球菌は、ナフシリンとストレプトマイシン耐性であったため、全体の鼻コロニー形成を、TSA＋7.5％NaCl、ナフシリンおよび／またはストレプトマイシン（それぞれ10μg/mlと500μg/ml）プレート上で、CFUとして測定した。次に、血液寒天またはTSA＋7.5％NaCl上のコロニーが（もしあれば）黄色ブドウ球菌かどうかを調べるため、微生物検査を使用した。MRSAをリソスタフィンで処理した場合、上清もまた、抗生物質を含まないTSA＋NaCl上に蒔き、メチシリン感受性になるかも知れないリソスタフィン耐性コロニーを増殖させた。NaClを補足したTSAプレートを37℃で48時間インキュベートして、黄色ブドウ球菌コロニーを容易に計測できるサイズまで増殖させた。
【００４７】
リソスタフィン処理後に検出された黄色ブドウ球菌を、マイクロタイター希釈アッセイによりリソスタフィン耐性について試験した。リソスタフィンを無菌PBS中に再懸濁し、アリコートとし、−80℃に保存した。プロテインアッセイ（例えば、ピアス  ビーシーエー（Pierce BCA））を使用して、実際のタンパク質濃度を測定した。いったん融解した後、リソスタフィンのアリコートを４℃に保存し、２週間以内に使用した。陽イオン調整したミュラーヒントンブロス＋２％ NaClおよび0.1％ BSA（CAMHB+）中でリソスタフィン希釈物を作成して、プレートを調製した。まずCAMHB＋２％ NaClを作成し、オートクレーブし、次に無菌の30％ BSAを加えて、等しい0.1％ BSA濃度にした。BSAは、リソスタフィンとプラスチックとの非特異結合を防ぐ。各ウェル中のCAMHB+の最終容量は50μlであった。希釈は１：２であり、前記の希釈物50μlを新鮮な培地50μl中に混合することにより調製した。プレートの最後の列は、リソスタフィンを加えず増殖対照とした。１μg/mlリソスタフィンの出発濃度をストック濃度として使用した。リソスタフィンのストック濃度は、アッセイで最も高濃度について所望のものの２倍であり、いったん細菌を加えた時、さらに１：２希釈が可能であった。最初の列の最終濃度として250ng/mlはしばしば、リソスタフィン感受性株の適切な出発点であった。細菌を非選択培地（トリプシンダイズブロス）中または非選択寒天（TSA＋５％ヒツジ血液）上で増殖させた。一晩培養物を経験的に決定されたように、〜１：1000希釈して、650nmの光学密度（OD650）を測定することにより、最終濃度５×105／mlを得た。ウェル当たりの細菌の最終接種物は、〜５×105 CFU/mlであった。各ウェルのリソスタフィン希釈シリーズに、CAMHB+中１：1000希釈物の50μl（〜５×104 CFU）を接種した。ウェル当たりの最終容量は100μlであった。プレートを37℃で24時間振盪してインキュベートした。リソスタフィンの最小阻止濃度（MIC）（正常な増殖を妨害するリソスタフィンの最小濃度）を、マイクロプレートリーダー上でOD650を読んで測定した。
【００４８】
本発明者らは、非選択培地中のほとんどの黄色ブドウ球菌一晩培養物が、非常に少数の天然に存在するリソスタフィン耐性細菌を含有することを発見し、ウェル中のリソスタフィンの濃度に無関係に、充分な数のこれらの耐性細菌が、MICアッセイ中にウェル中にランダム確率で接種されるなら、その特定のウェルで細菌の生育があるかも知れない。そのウェル中のリソスタフィンにより選択された少数のリソスタフィン耐性コロニーの生育とは反対に、ある濃度のリソスタフィンの存在下で増殖が陽性の任意のサンプルが実際の正常な黄色ブドウ球菌であることを証明するために、１〜２μl容量中の25〜50μg/mlの追加のリソスタフィンを、増殖を示した各ウェルに加えた。プレートを室温で６〜18時間インキュベートした。OD650を測定した。過剰のリソスタフィンの添加後にOD650が実質的に低下したなら、そのウェル中の細菌は正常と見なされ、その結果、特定のウェル中の元々のリソスタフィンの濃度はその株のMIC以下であった。OD650が同じであるかまたは上昇したなら、そのサンプル中の細菌はリソスタフィン耐性生育と見なされ、その株のリソスタフィンの最小阻止濃度以下で正常な増殖ではなかった。耐性生育は、異なる濃度で見られるかも知れない。真に耐性の分離株は増殖を示し、試験したすべての濃度のリソスタフィンと最初にリソスタフィンの無い対照ウェル中では、以後はリソスタフィン耐性であった。このアッセイの条件下では、一部のブドウ球菌が非常に耐性であり、MICが検出できないかも知れないことは、当業者には明らかであろう。
【００４９】
表1aと1bに示すように、PBS中の組換えリソスタフィンは、２つの処理を行っても、４匹の動物のうち３匹で鼻コロニー形成を根絶できなかった。すなわち、PBS中の組換えリソスタフィンは、表1a中のコロニー形成した動物の２つの処理と表1b中の１つの処理で使用した時、鼻コロニー形成を根絶するのに非常に有効ではなく、コロニー形成を緩和するわずかな能力を示した。リソスタフィン耐性黄色ブドウ球菌は分離されなかった。
【表１ａ】
2005516985.tif 000002
【表１ｂ】
2005516985.tif 000003
【実施例２】
【００５０】
クリーム製剤中のリソスタフィン
上記観察結果を考慮して、本発明者らは、鼻の中でリソスタフィンのより長い保持を可能にするより粘性の製剤を作成することにより、実施例１の鼻内リソスタフィンをさらに改良した。このために本発明者らは、リソスタフィンクリームを使用してコトンラットで黄色ブドウ球菌の鼻コロニー形成を治療した。
【００５１】
クリーム製剤中のリソスタフィンの効力を、コトンラットモデルでも試験した。クリーム製剤は、MIGLYOL812（カプリリック／カプリックトリグリセリド）（41％）、SOFTISAN649（ビス-ジグリセリルポリアシルアジペート-2）（24.2％）、白色ワセリン（27.5％）、パラフィン（3.4％）、密蝋（3.4％）、およびステアリン酸アルミニウム（0.5％）からなる。鼻内リソスタフィンの製造のために、組換えリソスタフィン、またはアンビシン・エル（Ambicin L）（アンビ社（Ambi Inc.））を、無菌PBS中に溶解して、100mg/mlの濃度にした。このリソスタフィン溶液を次に、上記クリーム製剤と混合して所望の最終濃度とした。リソスタフィンの添加により取られた容量は、得られるリソスタフィンクリーム中のMIGLYOL812含量の一部を置換した。すなわちリソスタフィンクリームの最終製剤は、MIGLYOL812（36％）、SOFTISAN649（24.2％）、白色ワセリン（27.5％）、パラフィン（3.4％）、密蝋（3.4％）、ステアリン酸アルミニウム（0.5％）、および５％の100mg/mlリソスタフィン水溶液であり、最終リソスタフィン濃度は0.5％すなわち５mg/mlが得られた。
【００５２】
コトンラットの鼻に、MBT5040黄色ブドウ球菌を注入した。注入の４日後と５日後に、５匹の動物を0.5％のリソスタフィンクリームで処理し、５匹の動物をリソスタフィンを添加していないクリームで処理した。クリーム製剤を、シリンジによりアンギオカス（Angiocath）（登録商標）22GAフレキシブルカテーテル（ベクトンディッキンソン（Becton Dickinson））を介して、麻酔したコトンラットの鼻孔に入れた。カテーテルを各鼻孔に約３mm挿入し、次にクリームを入れながら引き戻した。クリームを入れた後、コトンラットの鼻を充分マッサージしてクリームが充分分散するようにした。鼻孔に入れたクリームの用量は、約30〜50μlであった。クリームの高粘性のために、鼻孔に入れたクリームの容量を正確に測定することは困難であった。特に明記しない場合は、以下の例を通してこの鼻孔へのクリーム投与法を使用した。
【００５３】
表2aに示すように、クリーム製剤中のリソスタフィンの鼻投与により、PBS溶液を用いる処理と比較して、コロニー形成の根絶率が大きく改善された。リソスタフィンを含まないクリームで処理した陰性対照動物では、いずれも黄色ブドウ球菌コロニー形成は根絶されなかった。これに対して、リソスタフィンクリームで処理した５匹の動物のうちの４匹の鼻コロニー形成は完全に根絶された。５匹目のラットでは鼻コロニー形成は、上記のPBS中のリソスタフィンで観察されたものよりよく緩和された。リソスタフィンクリームで処理した動物中に維持されたコロニーは、リソスタフィン耐性ではなかった。
【表２ａ】
2005516985.tif 000004
【００５４】
鼻コロニー形成の根絶におけるクリーム製剤中のリソスタフィンのより大きな効力を説明できる可能な機構を調べるために、PBS中のリソスタフィンまたはクリーム中のリソスタフィンで処理したラットで鼻保持時間を測定した。12匹の動物に、PBS中0.5％のリソスタフィンを投与し、他の12匹には、0.5％リソスタフィンクリームを投与した。注入の５分、３時間、および24時間後に、各群の４匹を屠殺した。次に鼻中のリソスタフィン濃度をELISAにより測定した。図１に示すように、クリーム製剤中で投与したリソスタフィンは、PBS溶液中で投与したリソスタフィンより長期間鼻孔中にとどまった。
【００５５】
さらに、0.5％リソスタフィンクリームを、注入したブドウ球菌コロニー形成の非存在下で鼻孔に投与し、次に鼻孔を殺菌活性の存在について測定すると、リソスタフィンは、投与後少なくとも24時間鼻孔中に殺菌活性を維持した。表2bに示すように、ワセリンベースのクリーム中で製剤化したリソスタフィンの抗ブドウ球菌活性は、注入後少なくとも24時間鼻内に維持された。コトンラットにクリーム中0.5％リソスタフィンを注入し、注入の４〜24時間後、鼻を外科的に取り出すと、103の黄色ブドウ球菌を排除するex vivoの充分な残存リソスタフィン活性があった。0.125％のリソスタフィンクリームは、注入の４時間後黄色ブドウ球菌を87％低下させたが、プラセボクリームは、注入の４または24時間後に、切除した鼻に加えた回収された黄色ブドウ球菌の数をほんのわずかに低下させた。すなわち、鼻孔（黄色ブドウ球菌コロニー形成の部位）中のリソスタフィンの長期の保持は、リソスタフィンへの細菌のより長期の暴露を可能にした。次に、長期の暴露が、リソスタフィンクリームが鼻コロニー形成を根絶する能力を改良したのであろう。
【表２ｂ】
2005516985.tif 000005
【００５６】
さらに、本発明のクリーム製剤は、他の型の投与（例えばマイクロカプセル化）と同程度に効率的に、鼻孔中の抗細菌物質を保持する。図２は、ポリスチレンスルフォネート（PSSA）またはクリームと混合したPSSAと比較すると、クリーム製剤単独で、抗ブドウ球菌モノクローナル抗体のような抗細菌物質について匹敵する保持時間を与えることを示す。MAbを0.5％ PSSA溶液（PBS中）と混合して最終濃度５μg/mlを得た。１つの群ではこの溶液を直接鼻に適用した。別の群ではこれをまずクリームと混合し、次に鼻に適用した。
【００５７】
103 の黄色ブドウ球菌を排除するクリームに製剤化されたリソスタフィンの充分な抗ブドウ球菌活性が、注入後少なくとも24時間保持され（表2b）、10μgのリソスタフィン（鼻内に注入したリソスタフィンの元々の用量の〜７％）は20分以内に105 の黄色ブドウ球菌を排除する（表2c）であろうから、切除した鼻中のリソスタフィン活性を有効に排除するが鼻中の残存黄色ブドウ球菌の生存能力と増殖を障害しないリソスタフィンの中和性物質を同定することが必要であった。0.5Ｍ EDTA（pH3.6）バッファー、10mg/mlトリプシン、種々のプロテアーゼインヒビター、および過剰量の熱死滅黄色ブドウ球菌を含む多くの中和物質候補を試験したが、これらのいずれもin vitroでリソスタフィン活性を有意に阻害しなかった（データは示していない）。
【００５８】
しかし表2cに示すように10mg/mlのプロテイナーゼＫは、バッファー中のリソスタフィンを迅速に中和するが、黄色ブドウ球菌の生存能力には影響を与えない。10mg/mlのプロテイナーゼＫの存在下または非存在下で、PBS中の105の黄色ブドウ球菌のいくつかのサンプルにリソスタフィン（10μg）を加えた。サンプルを室温で20分インキュベートし、次に100μlアリコートを血液寒天上に蒔いた。
【表２ｃ】
2005516985.tif 000006
【００５９】
追跡実験で、表2bと同様の実験で投薬経験の無いコトンラットの鼻に、0.5％リソスタフィンGMPクリームを注入した。注入の３時間後動物を屠殺し、切除した鼻を500μlのPBS／ツイーン+/- 10mg/mlプロテイナーゼＫ中に入れた。直ちに黄色ブドウ球菌株MBT5040（105 CFU）を切除した鼻に加え、これをボルテックス混合し30分インキュベートした。ある容量の上清を計測のために蒔いた。表2dに示すように、プロテイナーゼＫの無いPBS／ツイーン中に入れた時３時間目の鼻サンプル中の残存リソスタフィンは、サンプル中の生存能力のある黄色ブドウ球菌を大きく減少させた。10mg/mlのプロテイナーゼＫの存在は、３時間目の鼻のすべての残存リソスタフィンを中和し、すなわち鼻をPBS／ツイーン＋10mg/mlプロテイナーゼＫに入れた時、サンプルから回収された黄色ブドウ球菌の数は低下しなかった。
【表２ｄ】
2005516985.tif 000007
【００６０】
0.5％のリソスタフィンクリーム（表3b）の単回投与で絶えず見られる鼻クリアランス（表3b）が鼻で起き、リソスタフィンキャリーオーバーにより鼻の切除後のバッファー中では起きないことを確認するために、MBT5040で鼻コロニー形成させた２群のコトンラットを、GMP条件下で産生した0.5％リソスタフィンクリームの単回適用で処理した。処理の４時間後に動物を屠殺し、鼻を切除した。１群の鼻をPBS／ツイーンでボルテックス混合し、他の群の鼻は、10mg/mlのプロテイナーゼＫを含有するPBS／ツイーンでボルテックス混合した。これらの切除した鼻からの上清を播き、すべての処理したコトンラットから黄色ブドウ球菌が排除されたことを、プロテイナーゼＫの存在下または非存在下で処理の４時間後に測定した（それぞれ、５匹のうちの５匹と４匹のうちの４匹）（表2e）。この知見は、コトンラットの鼻中の黄色ブドウ球菌コロニー形成のリソスタフィン根絶は、鼻で４時間以内に起き、鼻の切除後のリソスタフィンキャリーオーバーによるex vivoではないことを証明した。
【表２ｅ】
2005516985.tif 000008
【実施例３】
【００６１】
鼻クリーム中のリソスタフィン濃度の力価測定
黄色ブドウ球菌について鼻コロニー形成を根絶するクリーム製剤中のリソスタフィンの最小濃度を決定するために、リソスタフィンの濃度を力価測定した。20匹のコトンラットにMBT5040黄色ブドウ球菌を注入した。動物を４つの処理群に分けた：陰性対照クリーム、0.5％リソスタフィンクリーム、0.25％リソスタフィンクリーム、および0.125％リソスタフィンクリーム。注入後３、４および５日目に、これらのクリーム製剤で動物を処理した。最後のクリーム投与後２〜４時間目に動物を屠殺し、黄色ブドウ球菌コロニー形成を測定した。
【００６２】
表3aに示すように、最終濃度0.5％のリソスタフィンが鼻コロニー形成の根絶に最も有効であった。この群では、すべての５匹の動物が黄色ブドウ球菌コロニー形成が陰性であった。クリーム中のリソスタフィンの濃度が低下すると、各処理群（0.25％と0.125％）のコロニーの平均数が増加した。0.125％リソスタフィンは、陰性対照群と比較してコロニーの平均数の認識できる低下を示さなかったが、0.25％リソスタフィンクリームはコロニー形成を緩和した。リソスタフィン処理動物から分離された株はいずれも、リソスタフィン耐性ではなかった。
【表３ａ】
2005516985.tif 000009
【００６３】
リソスタフィンクリームの投与回数とリソスタフィンクリーム中のリソスタフィンの組成パーセントの組合せを調べるために、追加の実験を行った。動物を７処理群に分けた：処理無し、陰性対照クリームの３回投与、陰性対照クリームの１回投与、0.5％のリソスタフィンクリームの３回投与（１回の投与当たり〜150μgのリソスタフィン）、0.5％のリソスタフィンクリームの１回投与（１回の投与当たり〜150μgのリソスタフィン）、0.125％のリソスタフィンクリームの３回投与（１回の投与当たり〜37.5μgのリソスタフィン）、0.125％のリソスタフィンクリームの１回投与（１回の投与当たり〜37.5μgのリソスタフィン）。注入の４〜７日後に、これらのクリーム製剤で動物を処理した。最後のクリーム投与の４〜24時間後、動物を屠殺し、黄色ブドウ球菌コロニー形成を測定した。処理を受けなかった動物について、注入の４〜８日後動物を屠殺した。
【００６４】
表3bに示すように、最終濃度0.5％のリソスタフィンは鼻コロニー形成の根絶に再度最も有効であった。表3aの結果を確認して、0.5％のリソスタフィンクリームの３回投与は黄色ブドウ球菌コロニー形成を完全に根絶した。0.5％リソスタフィンクリームの単回投与は、コロニー形成を有意に低下させた。これに対して、0.125％リソスタフィンを投与された動物は、黄色ブドウ球菌コロニー形成をまだ示し、３回投与は１回投与より有効であった。
【表３ｂ】
2005516985.tif 000010
【実施例４】
【００６５】
リソスタフィンクリームと鼻内ムピロシンとの比較
黄色ブドウ球菌による鼻コロニー形成を根絶する能力について、リソスタフィンクリームをムピロシンクリーム（バクトロバン（Bactroban））の２％局所製剤と比較した。20匹のコトンラットにMBT5040黄色ブドウ球菌を注入し、４つの処理群に分けた：未処理陰性対照、陰性対照クリーム、0.5％リソスタフィンクリーム、およびバクトロバン局所剤。注入の３、４、および５日後に、動物を適切なクリーム製剤で処理した（群１の処理無し）。最後の処理の２〜４時間後、動物を屠殺し、鼻コロニー形成を測定した。
【００６６】
表４に示すように、リソスタフィンクリームは５匹の動物のうちの４匹でコロニー形成を根絶し、バクトロバン局所剤はすべての４匹の動物でコロニー形成を根絶した。しかしバクトロバン群では、４匹の動物が鼻の周りに重症の痂皮形成を示したが、これはおそらく、バクトロバン局所剤のアルコール含量により引き起こされる炎症のせいだと思われる。さらに、アルコールは単独で抗細菌活性を有するため、バクトロバン群の根絶がムピロシンの存在によるのかアルコールの存在によるのかを区別することが困難である。
【表４】
2005516985.tif 000011
【実施例５】
【００６７】
リソスタフィンクリームとムピロシン鼻軟膏との比較
黄色ブドウ球菌による鼻コロニー形成を根絶する能力について、リソスタフィンクリームを２％ムピロシン鼻軟膏（鼻バクトロバン（Bactroban Nasal））と比較した。20匹のコトンラットにMBT5040黄色ブドウ球菌を注入し、４つの処理群に分けた：陰性対照クリーム、0.5％リソスタフィンクリーム、0.125％リソスタフィンクリーム、および鼻バクトロバン。注入の３、４、および５日後に、動物を適切なクリーム製剤で処理した。最後の処理の２〜４時間後、動物を屠殺し、鼻コロニー形成を測定した。
【００６８】
表5aに示すように、３回の投与で与えると、0.5％リソスタフィンクリームとバクトロバン鼻軟膏の両方は、すべての処理した動物で鼻コロニー形成を根絶した。これに対して0.125％のリソスタフィンクリームは５匹の動物のうちの２匹でコロニー形成を根絶した。残りの３匹の動物では、これらの動物中のコロニーの平均数は、陰性対照クリーム群よりはるかに少なく、従って0.125％のリソスタフィンクリームがコロニー形成を緩和し、ある場合にはこれを根絶することを示している。
【表５ａ】
2005516985.tif 000012
【００６９】
上記実施例３では、0.125％のリソスタフィンクリームは鼻コロニー形成に影響を与えなかった。本発明者らは、この差は上記方法によるクリームの投与方法がうまくなったことによると考える。以下の表5bに示すように、0.125％のリソスタフィンクリームは、わずか２回の投与で鼻のブドウ球菌コロニー形成を根絶するのに有効である。
【表５ｂ】
2005516985.tif 000013
【実施例６】
【００７０】
リソスタフィンクリームの単回投与は、黄色ブドウ球菌のいくつかの株による鼻コロニー形成を根絶する
黄色ブドウ球菌の鼻コロニー形成を根絶する0.5％リソスタフィンクリームの単回投与の効力を測定するために、コトンラットにMBT5040（MRSA）、５型黄色ブドウ球菌（メチシリンに感受性；MSSA）、または８型黄色ブドウ球菌（MSSA）のいずれかを注入した。各群の半分の動物を注入の５日後に陰性対照クリームで１回処理し、他の半分の動物を同じ日に0.5％リソスタフィンクリームで処理した。
【００７１】
表6a、6b、6c、および6dに示すように、単回投与の0.5％リソスタフィンクリームは、黄色ブドウ球菌の鼻コロニー形成の根絶に有効であった。
【表６ａ】
2005516985.tif 000014
【表６ｂ】
2005516985.tif 000015
【表６ｃ】
2005516985.tif 000016
【表６ｄ】
2005516985.tif 000017
【００７２】
上記例で証明されるように、本発明者らは以前の研究を大幅に改良した。
【実施例７】
【００７３】
単回投与のリソスタフィンクリームはin vivoの鼻ムピロシンより有効である
単回投与の0.5％リソスタフィンクリームを、単回投与の２％ムピロシン軟膏と単回投与の２つの濃度のナイシンクリームに対して試験した。ナイシンは、クリーム中で製剤化しても良好なin vivoの抗ブドウ球菌活性を有するランチビオティックである。コトンラットにMBT5040黄色ブドウ球菌と、注入の５日後に以下の１つで処理した：0.5％リソスタフィンクリーム、２％ムピロシン軟膏（バクトロバン）、５％ナイシンクリーム、または0.5％ナイシンクリーム。処理の24時間後、動物を屠殺し、鼻コロニー形成を測定した。表７に示すように、単回投与の0.5％リソスタフィンクリームのみが、ブドウ球菌コロニー形成を根絶することができた。それぞれの他の処理群は、コロニー形成した動物を含有した。すなわち、単回投与で投与すると、鼻コロニー形成を根絶するのにリソスタフィンクリームはムピロシンまたはナイシンより有効である。
【表７】
2005516985.tif 000018
【００７４】
ナイシンクリーム製剤はin vitroで良好な抗ブドウ球菌活性を有する（図3Aと3B）が、in vivoで鼻コロニー形成を緩和しなかったことがわかる。さらに試験すると、ナイシンクリームは鼻内に注入すると、ナイシン活性の不活性化のため、またはナイシン分子の隔離のために、２時間以内にその抗ブドウ球菌活性をなくした。なぜナイシンクリームがin vitroで有効であるのに、in vivoでは有効ではないかは、まだ調べられてはいないが、これらのデータは、in vitro研究が必ずしもin vivoで起きる相互作用を反映しないことを例示する。
【実施例８】
【００７５】
リソスタフィンクリームの２回投与を受けた動物は、投与後少なくとも１週間はコロニー形成が無い
上記したように0.5％リソスタフィンクリームは、鼻のブドウ球菌コロニー形成を有効に根絶することができる。この根絶はどれだけ長く続くかを測定するために、３匹のコトンラットにMBT5040黄色ブドウ球菌を注入した。注入後５日と６日目に、動物に0.5％リソスタフィンクリームを単回投与した。平行して、５匹のコトンラットにも注入し、処理はしなかった。リソスタフィン注入後１週間目に、リソスタフィンクリームで処理した動物は、鼻孔中にコロニーが存在しなかった。これに対して５匹の未処理動物は、処理時に１つの鼻につき平均2200CFUを有し、一方５匹の他の未処理動物は、屠殺の時１つの鼻につき平均1755CFUを有した。すなわち、0.5％リソスタフィンクリームを２回投与した動物は、投与後少なくとも１週間黄色ブドウ球菌の鼻コロニー形成はなかった。
【実施例９】
【００７６】
リソスタフィンクリームの単回投与は投与後４時間ブドウ球菌コロニー形成を根絶し、少なくとも48時間鼻孔中で活性が持続する
リソスタフィンがいかに早く鼻コロニー形成を根絶するかを測定するために、10匹のコトンラットにMBT5040黄色ブドウ球菌を注入した。注入の６日後、５匹の動物を0.5％リソスタフィンクリームの単回投与で処理し、他の５匹は対照クリームで処理した。クリームの投与後４時間目にすべての動物を屠殺し、その鼻をコロニー形成について分析した。表8aに示すように、リソスタフィンクリームは投与後わずかに４時間でブドウ球菌コロニー形成を根絶した。
【表８ａ】
2005516985.tif 000019
【００７７】
リソスタフィンをクリーム製剤中で投与した時、鼻孔中でどれだけ長く活性を維持するかを測定するために、109 CFUの黄色ブドウ球菌MBT5040を注入する48時間、24時間および８時間前に、コトンラットの鼻に２％リソスタフィンクリームを単回投与した。対照動物には細菌の投与の８時間前に、リソスタフィンの無い対照クリームを投与した。細菌導入の６日後、実験群当たり各５匹の動物を屠殺し、黄色ブドウ球菌のコロニー形成について鼻をチェックした。この実験の結果を表8bに示す。
【表８ｂ】
2005516985.tif 000020
【００７８】
各群の５匹の動物のうちの４匹で、リソスタフィンのプレ注入はコロニー形成を劇的に阻止または緩和した。この作用は細菌を投与する８時間前に処理したラットで最も大きかったが、２％リソスタフィンクリームは、細菌の注入の48時間前に投与してもコロニー形成を緩和した。
【００７９】
すなわち、クリームのような粘性製剤中で投与した時リソスタフィンは、鼻腔のブドウ球菌コロニー形成を迅速に根絶するのみでなく、投与の少なくとも48時間鼻孔中で活性を維持する。
【実施例１０】
【００８０】
USPグレードのリソスタフィンクリーム
同じパーセント量で同じ成分を使用して、上記実施例２に記載のようにリソスタフィンクリーム製剤を調製した。しかしUSPクリームでは、使用した各成分は、臨床的使用の具体的な保証基準を満足するUSPグレード（またはEPヨーロッパ薬局方またはDMF、Drug Master File）であった。さらに、製剤中でステアリン酸アルミニウムの代わりにステアリン酸亜鉛を使用した。USPクリーム製剤を使用して、0.5％と２％リソスタフィンクリームを産生し、これらのUSPクリーム製剤を実施例２のクリーム製剤と有効性について比較した。
【００８１】
実験群当たり５匹のコトンラットにMBT5040黄色ブドウ球菌を注入した。鼻孔前部への細菌導入の５日後、各実験群に従って、ラットに対照クリーム、元々のクリーム中の0.5％リソスタフィン、USPクリーム中の0.5％リソスタフィン、元々のクリーム中の２％リソスタフィン、またはUSPクリーム中の２％リソスタフィンを投与した。すべての動物を24時間後に屠殺し、黄色ブドウ球菌の鼻コロニー形成について分析した。表９に示すように、USPグレードのリソスタフィンクリームは、鼻コロニー形成の根絶において、元々のリソスタフィンクリームと同様に有効であった。
【表９】
2005516985.tif 000021
【実施例１１】
【００８２】
均一なリソスタフィンクリームもまた鼻コロニー形成を根絶する
上記したように、実施例１〜10で使用したリソスタフィンはアンビシン・エル（Ambicin L）（アンビ社（Ambi Inc.））である。アンビシン・エル（Ambicin L）は、リソスタフィンの不均一型の調製物である。具体的には、アンビシン・エル（Ambicin L）中の酵素分子は、組換えプロ酵素のタンパク質分解的プロセシングのために、リソスタフィン配列中で異なるアミノ酸で始まる。すなわちアンビシン・エル（Ambicin L）は、リソスタフィン分子の異なる種の混合物である。リソスタフィンの均一調製物も、鼻内黄色ブドウ球菌コロニー形成を根絶または緩和するかどうかを測定するために、調製物中のすべてのリソスタフィン分子が、リソスタフィン配列中の最初のスレオニンで始まるように、組換えリソスタフィンを調製した。仮特許出願第60/341,804号および本出願とともに出願された関連する非仮出願「ブドウ球菌溶解活性が上昇した末端切断型リソスタフィン分子」（これらの両方は参照することにより本明細書に組み込まれる）は、均一リソスタフィンのクローニングと調製についての詳細をさらに含む。この組換え均一リソスタフィンを使用して、前記したように0.5％リソスタフィンクリームを調製した。
【００８３】
コトンラットにMBT5040黄色ブドウ球菌を注入し、３つの実験群に分けた：陰性対照クリーム、0.5％アンビシン・エル（Ambicin L）リソスタフィンクリーム、および0.5％均一リソスタフィンクリーム。次にこれらの群に従って、各動物を注入の６日後にクリーム調製物の単回投与で処理した。以下の表10に示すように、均一リソスタフィンもまた鼻コロニー形成を根絶した。
【表１０】
2005516985.tif 000022
【００８４】
驚くべきことに、リソスタフィンの種々の用量と製剤を用いて行った60を超える実験で、リソスタフィン処理動物の鼻から、リソスタフィン耐性黄色ブドウ球菌は回収されなかった（データは示していない）。これに対して、全身性感染を治療するためにリソスタフィンが投与される場合の、リソスタフィン耐性が記録されている（17）。リソスタフィン処理鼻孔から分離されたリソスタフィン耐性黄色ブドウ球菌の欠如の理由は、黄色ブドウ球菌をサブMIC用量のリソスタフィンで処理してMBT5040からin vitroで分離された黄色ブドウ球菌のリソスタフィン耐性株を、５匹のコトンラットの鼻孔に注入した時、１匹のみが鼻コロニー形成をして、この動物では細菌がリソスタフィン耐性のままであったという発見にあるかも知れない。これは、リソスタフィン耐性を付与する突然変異が、鼻孔にコロニー形成する細菌の能力に負の影響を与えることを示唆する。この仮説を検定するために、in vitroで分離されたMBT5040（MBT5040 LysoR、MIC＞32μg/ml）のリソスタフィン耐性変種を、コトンラットの鼻孔に〜109で注入した。MBT5040 LysoRを注入した５匹のコトンラットのうち１匹のみが、このリソスタフィン耐性変種でコロニー形成され、この動物は、７日日目の鼻から200 CFUのみが回収され、これに対して、同じ実験で野生型MBT5040を注入した動物の鼻からは、平均〜5000 CFUが回収された。
【００８５】
リソスタフィン耐性と鼻コロニー形成の関係をさらに調べるために、0.5％リソスタフィンクリームの単回投与を用いる黄色ブドウ球菌MRSA12/12株の鼻コロニー形成の治療も調べた。MRSA12/12はコトンラット鼻腔にコロニー形成（表6d）し、0.5％リソスタフィンクリームの単回処理はまた、この株による鼻コロニー形成を根絶した。MRSAがリソスタフィン耐性になるとMSSAに復帰変異するため（17）、処理した動物からの鼻上清を、TSA/NaCl＋ナフシリンおよびTSA/NaCl単独上に蒔いた。抗生物質の無いTSA上で増殖した43のコロニーの本体を調べたが、スタフィロスライド（Staphyloslide）（登録商標）ラテックス検査でいずれも黄色ブドウ球菌ではなく、すなわち0.5％リソスタフィンクリームの単回投与で処理した黄色ブドウ球菌注入動物の鼻から、またはリソスタフィンクリームで処理した任意の動物のからは、どの株の黄色ブドウ球菌が注入されたかにかかわらず、リソスタフィン耐性ブドウ球菌MRSA12/12は回収されなかった（表6d）。
【００８６】
上記したように、黄色ブドウ球菌の鼻コロニー形成の根絶には市販品は１つのみ（鼻バクトロバン（Bactroban Nasal））である。ムピロシンに対する耐性の増加を考慮すると、活性物質に対する耐性を発生させない、鼻コロニー形成（宿主中で感染症の病原巣候補となる主要な部位）の治療法は、現在の治療法に対して重要な付加的利点を与えるであろう。
【００８７】
in vivoでのリソスタフィンクリームの毒性も調べた。コトンラットに、0.5％リソスタフィンクリームを鼻内に、１日１回で３日連続して投与した。２週間後、ラットを再度１日１回の0.5％リソスタフィンで３日間処理した。２週間後ラットに、最後の0.5％リソスタフィンの単回投与を鼻内に行い、この最後の投与の48時間後屠殺した。このリソスタフィン投与スケールは、試験したすべての動物で強い抗体応答を誘発した。次に鼻組織を採取し、組織学的異常について分析した。0.5％リソスタフィンクリームの７回投与で処理した動物から採取したすべての組織は、正常限界内であった。上記実験で使用した0.5％濃度は、抗リソスタフィン抗体の存在下でもin vivoで非毒性であった。
【００８８】
第２のセットの毒性試験では、ウサギの鼻に0.5％リソスタフィンクリームを１日１回14日間適用した。この期間の最後に、鼻の組織的検査を行うと正常であった。
【実施例１２】
【００８９】
GMP条件下で製造されたリソスタフィンクリームは黄色ブドウ球菌を根絶し、優れた安定性を示す
実施例10に記載のように、USPグレードのリソスタフィンクリームを商業的量でGMP基準に従って製造するための方法が開発されている。このリソスタフィンクリームは、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）で製造された組換えリソスタフィンの均一型（上記実施例11に記載）を用いて作成された。GMPリソスタフィンクリームを室温に保存して追跡して、室温で１年間の保存をシミュレートするために、加速安定性試験に付した。リソスタフィンクリームを規則的に、力価、純度、pH、外観、微生物増殖、およびレオロジーについて調べた。
【００９０】
コトンラットにMBT5040黄色ブドウ球菌を注入し、３つの実験群に分けた：陰性対照クリーム、0.5％GMPリソスタフィンクリーム、加速安定性試験に付した0.5％GMPリソスタフィンクリーム。これらの群に従って各動物に、注入の６日後に各クリーム調製物を単回投与して処理した。以下の表11aに示すように、GMPリソスタフィンクリームは鼻コロニー形成を根絶し、加速安定性試験に付したサンプルからほとんど（たとえあったとしても）抗ブドウ球菌活性は失われなかった。表11bは、0.5％と１％リソスタフィンGMPクリームが、注入の７日後でさえブドウ球菌コロニー形成を劇的に低下させることを示す。
【表１１ａ】
2005516985.tif 000023
【表１１ｂ】
2005516985.tif 000024
【００９１】
この特定の実験では、１％ GMPリソスタフィンクリームは、0.5％ GMPリソスタフィンクリームより有効であった。
【実施例１３】
【００９２】
ファージ酵素Phi11ヒドロラーゼはリソスタフィンと相乗作用する
溶解性黄色ブドウ球菌ファージphi11は、それ自体が抗ブドウ球菌性を有する酵素を産生する。以下に示すように、この酵素phi11ヒドロラーゼは、リソスタフィンと相乗作用を示した。すなわち、精製したphi11ヒドロラーゼをリソスタフィンクリームに加えて、その全体的有効性を上昇させ、おそらく有効な製品に必要なリソスタフィンの量を低下させることが有効かも知れない。
【００９３】
リソスタフィンとphi11ヒドロラーゼを組合せた時のブドウ球菌に対する作用を観察するために、チェッカーボード相乗作用アッセイを使用した。96ウェルアッセイプレートで、250ng/ml〜0.25ng/mlまでのリソスタフィンの２倍希釈系列を以下のように調製した。50μlの陽イオン調整したミュラーヒントンブロス＋２％ NaCl＋0.1％ BSA（CAMHB++培地）をカラム１〜11、列A〜Hに加えた。CAMHB++培地中の１μg/mlリソスタフィンのストック溶液を調製した。このリソスタフィンストック100μlを、カラム12、列A〜Hに加えた。リソスタフィンストックの50μlをカラム12からカラム11に移し、ピペットで混合した。カラム11からの希釈液50μlをカラム10に移し、混合し、これをカラム２まで続けた。50μlのリソスタフィン希釈液をカラム２から取り出し捨てた。
【００９４】
別のプレートで、CAMHB++培地中のphi11ヒドロラーゼの２倍希釈系列を調製した。まず、CAMHB++培地中の10μg/mlのphi11ヒドロラーゼのストック溶液を調製した。75μlのCAMHB++培地を、カラム１〜12にわたってA〜G列に加えた。ストック溶液150μlをカラム１〜12にわたってH列に加えた。75μlのヒドロラーゼストックを列Hから列Gに移し、ピペットで混合した。G列からの希釈液75μlをF列に移し混合し、これを続けてB列で止めた。B列から75μlのヒドロラーゼ希釈液を取り出し捨てた。第２のプレートのA列で初めてH列まで進めて、50μlのヒドロラーゼ希釈液を第２のプレートからアッセイプレートに移した。100μl容量のCAMHB++培地中約105 の黄色ブドウ球菌を、カラム１〜12およびA〜H列にわたってアッセイプレートの各ウェルに加えた。アッセイプレートを37℃で一晩振盪してインキュベートした。次に650nmでのODを測定し、リソスタフィン耐性生育が疑われるものに、1.6μg/mlストックリソスタフィンの２μlを加えた。再度、注入条件下でアッセイプレートを一晩インキュベートし、翌日ODをチェックした。
【００９５】
表12は、リソスタフィンとphi11ヒドロラーゼの組合せについてアッセイの結果を示す。具体的には、ヒドロラーゼの濃度が上昇すると、増殖を阻害するのに必要なリソスタフィンの濃度は低下した。
【表１２】
2005516985.tif 000025
【実施例１４】
【００９６】
追加の抗細菌物質を有するリソスタフィン製剤はリソスタフィン耐性生育を阻害する
リソスタフィンを標準的「最小阻止濃度」（MIC）アッセイで試験すると、黄色ブドウ球菌の生育（outgrowth）は時に、試験した黄色ブドウ球菌のほとんどすべての株についてMICより上で黄色ブドウ球菌の生育が観察される。さらに試験すると、これらの生育ウェルは、親株のMICより何倍も希釈率が高いMICを有するリソスタフィン耐性黄色ブドウ球菌を含有することがわかった。リソスタフィン耐性黄色ブドウ球菌は、リソスタフィンクリームで処理したコトンラットの鼻からは回収されておらず、追加の物質は、大きな動物または本発明の組成物で処理したより大きな患者のプールでは、リソスタフィン耐性株が発生しないことを確実にしている。本実施例は、抗細菌剤バシトラシンの添加がin vitroでリソスタフィン耐性生育を排除し、in vivoで耐性生育を低下させるかまたは排除する可能性のあることを示す。特に本実施例は、黄色ブドウ球菌の特定の株についてのバシトラシンのMICより低いバシトラシン濃度で、鼻リソスタフィン製剤にバシトラシンを添加すると、その株のリソスタフィンMICより上のリソスタフィン耐性黄色ブドウ球菌の生育を阻害することを示す。もちろん特定の物質のMICより上の抗細菌物質を含む鼻製剤は、本発明の範囲内である。
【００９７】
表13は、黄色ブドウ球菌の１つの株（ATCC49521）のそのような１つの実験を示す。この実験では、0.1％BSAをアッセイに加えるという変更を行って、NCCLS標準MICを行った。１〜4列は、バシトラシンの非存在下で行ったリソスタフィンMICであり、５〜８列は、バシトラシン（５μg/ml）の存在下で行ったリソスタフィンMICである。
【表１３】
2005516985.tif 000026
【００９８】
試験したほとんど黄色ブドウ球菌株中で、リソスタフィンMICアッセイへのサブMICバシトラシンの添加は、リソスタフィン耐性黄色ブドウ球菌の生育を阻害した。前記したように、コトンラットの鼻からリソスタフィン耐性黄色ブドウ球菌は分離されておらず、従ってこのモデルは同じ作用をin vivoで証明するのに有用ではない。それにもかかわらずこの知見は、バシトラシンまたは他の抗細菌物質をリソスタフィンクリームに加えることは、リソスタフィン耐性株の生育を防ぐことに有用かも知れないことを示唆する。
【００９９】
実施例15
リソスタフィンまたはナイシンを有するリソスタフィン製剤
バシトラシンまたはナイシンのいずれかの物質のサブ阻害濃度（MICの４倍低い希釈）の存在下または非存在下でリソスタフィンMICアッセイを行って、いずれかの物質がこれらのアッセイにおけるリソスタフィン耐性の生育を防ぐかどうかを調べた。これを表14に記載する。
【表１４】
2005516985.tif 000027
【０１００】
すなわちバシトラシンのサブ阻害濃度の存在は、リソスタフィン耐性の生育を強く阻害する。バシトラシンのリソスタフィン耐性黄色ブドウ球菌のMICは、リソスタフィン感受性親株と同じ（データは示していない）であり、これは、リソスタフィン耐性黄色ブドウ球菌が単に、よりバシトラシン感受性になってこの減少を引き起こしているのではないことに注意されたい。
【産業上の利用可能性】
【０１０１】
結論
すなわち実施例１と２は、クリーム製剤中のリソスタフィンが、鼻のブドウ球菌コロニー形成の根絶と緩和において、PBS中のリソスタフィンより有効であることを示す。実施例２はまた、リソスタフィン活性が長期間鼻孔中に維持され、プロテイナーゼＫがリソスタフィンを不活性化させることも示す。実施例２は、リソスタフィンが、サンプリング中にex vivoより鼻中の黄色ブドウ球菌を排除することを示す。実施例３は、0.25％と0.125％のリソスタフィンクリームを比較すると、0.5％リソスタフィンクリームは、鼻孔中のブドウ球菌コロニー形成の根絶と緩和によりよく作用することを示す。実施例４と５は、３回投与で投与されると、0.5％リソスタフィンクリームと２％ムピロシンクリームまたは軟膏が、鼻コロニー形成を根絶することができることを示す。実施例６は、リソスタフィンクリームが、黄色ブドウ球菌のいくつかの株に対して試みた単回投与で毎回、黄色ブドウ球菌の鼻コロニー形成を根絶することを示す。実施例７は、リソスタフィンクリームの単回投与がムピロシンまたはナイシンの単回投与と比較して、鼻コロニー形成を根絶するのにより有効であることを示す。実施例８は、リソスタフィンクリームの投与後少なくとも１週間、黄色ブドウ球菌の再コロニー形成が無いままであることを示す。実施例９は、リソスタフィンクリームが、細菌の注入24時間前まで黄色ブドウ球菌コロニー形成を阻止し緩和することができることを示す。注入の48時間前まで、リソスタフィンは鼻でのコロニー形成を低下し続ける。実施例10と11は、GMP条件下で作成されたUSPグレードのリソスタフィンクリームおよび安定性試験したUSPグレードのリソスタフィンクリームが、鼻での黄色ブドウ球菌コロニー形成の根絶または緩和に有効であることを示す。実施例12は、クリーム製剤中のリソスタフィンの均一調製物が、不均一型のリソスタフィンを含有するリソスタフィンクリームと同様に、鼻コロニー形成を根絶するように作用することを示す。最後に実施例13は、リソスタフィンとphi11ヒドロラーゼとの相乗作用を示し、phi11ヒドロラーゼをリソスタフィンクリームに加えて、その有効性を増強することが有利であることを示唆する。
【０１０２】
要約すると、粘性のある鼻内リソスタフィン（例えばリソスタフィンクリーム）は、バクトロバンのような現在利用可能な代替治療物の単回投与より、鼻のブドウ球菌コロニー形成を根絶または緩和するのにより有効である。リソスタフィンクリームは、最初の投与後非常に迅速に鼻コロニー形成を根絶および緩和し、投与後少なくとも48時間は活性を維持し、わずかに１回の投与で有効である。リソスタフィン耐性黄色ブドウ球菌は、上記実施例のいずれでも検出されず、本発明が、地域に流行するかも知れない耐性株を産生することなく、鼻コロニー形成を根絶する追加の利点を与えることを示している。これに対して、黄色ブドウ球菌株中のムピロシン耐性はますます問題となっており、鼻内で見つかっている（26）。最後に、実施例の多くで使用された0.5％濃度はin vivoでは毒性ではない。
【０１０３】
ブドウ球菌の鼻コロニー形成を根絶、緩和、または阻止する鼻内リソスタフィンが、組換えリソスタフィンに限定されないことを、当業者は理解するであろう。上記した他の型のリソスタフィンもまた、リソスタフィンクリームで使用可能であろう。さらにリソスタフィンクリームは、黄色ブドウ球菌による鼻孔のコロニー形成を根絶するのみでなく、緩和もする。そのような他のリソスタフィンクリームの有用性は、陰性対照クリームで処理したコトンラットの対照群と比較して、リソスタフィンが、測定された作用を引き起こすことを確認することにより、確認されるであろう。
【０１０４】
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本発明の他の実施形態は、本明細書の記載および本明細書に開示の本発明の実施から、当業者には明らかであろう。本明細書の記載および実施例は例示のためのみであり、本発明の真の範囲と精神は特許請求の範囲により示される。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】図１は、リソスタフィンがクリーム製剤で投与されると、PBS溶液中で投与したリソスタフィンより長期間鼻孔中に維持されることを示す。
【図２】図２は、鼻クリームが、ポリスチレンスルフォネート（PSSA）またはクリームと混合したPSSAと同様に、鼻孔中で抗細菌物質を保持するのに有効であることを示す。
【図３Ａ】図3Aは、ナイシンクリームとリソスタフィンクリームの両方とも、in vitroの良好な抗ブドウ球菌活性を有することを示す。
【図３Ｂ】図3Bは、ナイシンクリームとリソスタフィンクリームの両方とも、in vitroの良好な抗ブドウ球菌活性を有することを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【国際調査報告】
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