(57)【要約】本発明は、本明細書に開示の式(I)の化合物、およびこれらの化合物を含む薬学的組成物に関する。また、LPA受容体のアゴニストおよびアンタゴニストとしての活性を有するこれらの化合物の使用法についても開示する。このような方法は、LPA受容体上でLPAの活性を阻害する、LPA受容体の活性を調節する、癌を治療する、細胞増殖を促進する、創傷を治療する、アポトーシスを処置する、または細胞、組織、もしくは器官における機能を維持もしくは回復する、細胞を培養する、器官もしくは組織の機能を維持する、および、皮膚科学的状態を治療することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アポトーシスを処置するかまたは細胞、組織、もしくは臓器の機能を維持するもしくは回復する方法であって：
LPA受容体のアゴニストとしての活性を有する式(I)の化合物を提供する工程：
2005508319.tif 000101
(式中、X1、X2およびX3の少なくともひとつが、(HO)2PO-Z1-または(HO)2PO-Z2-P(OH)O-Z1-であり、X1およびX2が、-O-PO(OH)-O-として共に結合するか、もしくはX1およびX3が、-O-PO(OH)-NH-として共に結合しており；
X1、X2およびX3の少なくともひとつが、R1-Y1-A-であるか(ここでX1、X2およびX3のふたつがR1-Y1-A-である場合に、各々同じもしくは異なる)、またはX2およびX3が-N(H)-C(O)-N(R1)-として共に結合しており；
選択的に、X1、X2およびX3のひとつが、Hであり；
Aが、直接結合、(CH2)k(ここでkが0〜30の整数である)、またはOのいずれかであり；
Y1が、-(CH2)l-(ここでlが1〜30の整数である)、-O-、
2005508319.tif 000102
、-S-、または-NR2-であり；
Z1が、-(CH2)m-もしくは-O(CH2)m-(ここでmが1〜50の整数である)、-C(R3)H-、-NH-、-O-、または-S-であり；
Z2が、-(CH2)n-もしくは-O(CH2)n-(ここでnが1〜50の整数である)、または-O-であり；
Q1およびQ2が、独立して、H2、=NR4、=O、Hおよび-NR5R6の組合せであり；
R1が、各X1、X2またはX3については、独立して水素、直鎖または分枝鎖のC1〜C30アルキル、直鎖または分枝鎖のC2〜C30アルケニル、環に1置換基、2置換基、もしくは3置換基を伴うまたは伴わない芳香環またはヘテロ芳香環、C1〜C30アルキルを含むアシルまたは芳香環またはヘテロ芳香環、直鎖または分枝鎖のC1〜C30アルキルを含むアリールアルキル、直鎖または分枝鎖のC1〜C30アルキルを含むアリールオキシアルキル、
2005508319.tif 000103
であり；並びに
R2、R3、R4、R5、R6、R7およびR8が、独立して水素、直鎖または分枝鎖のC1〜C30アルキル、直鎖または分枝鎖のC2〜C30アルケニル、環に1置換基、2置換基、もしくは3置換基を伴うまたは伴わない芳香環またはヘテロ芳香環、C1〜C30アルキルを含むアシルまたは芳香環またはヘテロ芳香環、直鎖または分枝鎖のC1〜C30アルキルを含むアリールアルキル、もしくは直鎖または分枝鎖のC1〜C30アルキルを含むアリールオキシアルキルであり；並びに
細胞、組織、または臓器を、アポトーシスを処置するのに有効量または細胞、組織、もしくは臓器における機能を維持もしくは回復するのに有効量のこの化合物と接触する工程を含む、方法。
【請求項２】
LPA受容体が、EDG-2、EDG-4、EDG-7、およびPSP-24からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
接触が、インビトロにおいて実行される、請求項1記載の方法。
【請求項４】
接触が、インビボにおいて実行される、請求項1記載の方法。
【請求項５】
接触が、この化合物を、アポトーシス、虚血、外傷性損傷、または再灌流障害に関連した状態に罹患した患者へ投与することを含む、請求項4記載の方法。
【請求項６】
接触が、この化合物を、胃腸の混乱に罹患した患者に投与することを含む、請求項4記載の方法。
【請求項７】
細胞を培養する方法であって：
LPA受容体のアゴニストとしての活性を有する、式(I)の化合物を含む培地において細胞を培養する工程を含み：
2005508319.tif 000104
(式中、X1、X2およびX3の少なくともひとつが、(HO)2PO-Z1-または(HO)2PO-Z2-P(OH)O-Z1-であり、X1およびX2が、-O-PO(OH)-O-として共に結合するか、もしくはX1およびX3が、-O-PO(OH)-NH-として共に結合しており；
X1、X2およびX3の少なくともひとつが、R1-Y1-A-(ここでX1、X2およびX3のふたつがR1-Y1-A-である場合に、各々同じもしくは異なる)であるか、またはX2およびX3が-N(H)-C(O)-N(R1)-として共に結合しており；
選択的に、X1、X2およびX3のひとつが、Hであり；
Aが、直接結合、(CH2)k(ここでkが0〜30の整数である)、またはOのいずれかであり；
Y1が、-(CH2)l-(ここでlが1〜30の整数である)、-O-、
2005508319.tif 000105
、-S-、または-NR2-であり；
Z1が、-(CH2)m-もしくは-O(CH2)m-(ここでmが1〜50の整数である)、-C(R3)H-、-NH-、-O-、または-S-であり；
Z2が、-(CH2)n-もしくは-O(CH2)n-(ここでnが1〜50の整数である)、または-O-であり；
Q1およびQ2が、独立して、H2、=NR4、=O、Hおよび-NR5R6の組合せであり；
R1が、各X1、X2またはX3については、独立して水素、直鎖または分枝鎖のC1〜C30アルキル、直鎖または分枝鎖のC2〜C30アルケニル、環に1置換基、2置換基、もしくは3置換基を伴うまたは伴わない芳香環またはヘテロ芳香環、C1〜C30アルキルを含むアシルまたは芳香環またはヘテロ芳香環、直鎖または分枝鎖のC1〜C30アルキルを含むアリールアルキル、直鎖または分枝鎖のC1〜C30アルキルを含むアリールオキシアルキル、
2005508319.tif 000106
であり；並びに
R2、R3、R4、R5、R6、R7およびR8が、独立して水素、直鎖または分枝鎖のC1〜C30アルキル、直鎖または分枝鎖のC2〜C30アルケニル、環に1置換基、2置換基、もしくは3置換基を伴うまたは伴わない芳香環またはヘテロ芳香環、C1〜C30アルキルを含むアシルまたは芳香環またはヘテロ芳香環、直鎖または分枝鎖のC1〜C30アルキルを含むアリールアルキル、もしくは直鎖または分枝鎖のC1〜C30アルキルを含むアリールオキシアルキルである）；並びに、
アポトーシスを防止するのに有効量または培養物中の細胞を維持するのに有効量で存在する、方法。
【請求項８】
細胞が哺乳類細胞である、請求項7記載の方法。
【請求項９】
LPA受容体が、EDG-2、EDG-4、EDG-7、およびPSP-24からなる群より選択される、請求項7記載の方法。
【請求項１０】
臓器または組織を維持する方法であって：
LPA受容体のアゴニストとしての活性を有する、式(I)の化合物を提供する工程：
2005508319.tif 000107
(式中、X1、X2およびX3の少なくともひとつが、(HO)2PO-Z1-または(HO)2PO-Z2-P(OH)O-Z1-であり、X1およびX2が、-O-PO(OH)-O-として共に結合するか、もしくはX1およびX3が、-O-PO(OH)-NH-として共に結合しており；
X1、X2およびX3の少なくともひとつが、R1-Y1-A-(ここでX1、X2およびX3のふたつがR1-Y1-A-である場合に、各々同じもしくは異なる)であるか、またはX2およびX3が-N(H)-C(O)-N(R1)-として共に結合しており；
選択的に、X1、X2およびX3のひとつが、Hであり；
Aが、直接結合、-(CH2)k(ここでkが0〜30の整数である)、またはOのいずれかであり；
Y1が、-(CH2)l-(ここでlが1〜30の整数である)、-O-、
2005508319.tif 000108
、-S-、または-NR2-であり；
Z1が、-(CH2)m-もしくは-O(CH2)m-(ここでmが1〜50の整数である)、-C(R3)H-、-NH-、-O-、または-S-であり；
Z2が、-(CH2)n-もしくは-O(CH2)n-(ここでnが1〜50の整数である)、または-O-であり；
Q1およびQ2が、独立して、H2、=NR4、=O、Hおよび-NR5R6の組合せであり；
R1が、各X1、X2またはX3については、独立して水素、直鎖または分枝鎖のC1〜C30アルキル、直鎖または分枝鎖のC2〜C30アルケニル、環に1置換基、2置換基、もしくは3置換基を伴うまたは伴わない芳香環またはヘテロ芳香環、C1〜C30アルキルを含むアシルまたは芳香環またはヘテロ芳香環、直鎖または分枝鎖のC1〜C30アルキルを含むアリールアルキル、直鎖または分枝鎖のC1〜C30アルキルを含むアリールオキシアルキル、
2005508319.tif 000109
であり；並びに
R2、R3、R4、R5、R6、R7およびR8が、独立して水素、直鎖または分枝鎖のC1〜C30アルキル、直鎖または分枝鎖のC2〜C30アルケニル、環に1置換基、2置換基、もしくは3置換基を伴うまたは伴わない芳香環またはヘテロ芳香環、C1〜C30アルキルを含むアシルまたは芳香環またはヘテロ芳香環、直鎖または分枝鎖のC1〜C30アルキルを含むアリールアルキル、もしくは直鎖または分枝鎖のC1〜C30アルキルを含むアリールオキシアルキルである）；並びに
この化合物を、臓器または組織の機能を維持するのに有効量含有する溶液で、臓器または組織を処置する工程を含む、方法。
【請求項１１】
LPA受容体が、EDG-2、EDG-4、EDG-7、およびPSP-24からなる群より選択される、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
臓器または組織の機能を維持する方法であって；
LPA受容体アゴニストとしての活性を有する式(I)の化合物を提供する工程：
2005508319.tif 000110
(式中、X1、X2およびX3の少なくともひとつが、(HO)2PO-Z1-または(HO)2PO-Z2-P(OH)O-Z1-であり、X1およびX2が、-O-PO(OH)-O-として共に結合するか、もしくはX1およびX3が、-O-PO(OH)-NH-として共に結合しており；
X1、X2およびX3の少なくともひとつが、R1-Y1-A-(ここでX1、X2およびX3のふたつがR1-Y1-A-である場合に、各々同じもしくは異なる)であるか、またはX2およびX3が-N(H)-C(O)-N(R1)-として共に結合しており；
選択的に、X1、X2およびX3のひとつが、Hであり；
Aが、直接結合、(CH2)k(ここでkが0〜30の整数である)、またはOのいずれかであり；
Y1が、-(CH2)l-(ここでlが1〜30の整数である)、-O-、
2005508319.tif 000111
、-S-、または-NR2-であり；
Z1が、-(CH2)m-もしくは-O(CH2)m-(ここでmが1〜50の整数である)、-C(R3)H-、-NH-、-O-、または-S-であり；
Z2が、-(CH2)n-もしくは-O(CH2)n-(ここでnが1〜50の整数である)、または-O-であり；
Q1およびQ2が、独立して、H2、=NR4、=O、Hおよび-NR5R6の組合せであり；
R1が、各X1、X2またはX3については、独立して水素、直鎖または分枝鎖のC1〜C30アルキル、直鎖または分枝鎖のC2〜C30アルケニル、環に1置換基、2置換基、もしくは3置換基を伴うまたは伴わない芳香環またはヘテロ芳香環、C1〜C30アルキルを含むアシルまたは芳香環またはヘテロ芳香環、直鎖または分枝鎖のC1〜C30アルキルを含むアリールアルキル、直鎖または分枝鎖のC1〜C30アルキルを含むアリールオキシアルキル、
2005508319.tif 000112
であり；並びに
R2、R3、R4、R5、R6、R7およびR8が、独立して水素、直鎖または分枝鎖のC1〜C30アルキル、直鎖または分枝鎖のC2〜C30アルケニル、環に1置換基、2置換基、もしくは3置換基を伴うまたは伴わない芳香環またはヘテロ芳香環、C1〜C30アルキルを含むアシルまたは芳香環またはヘテロ芳香環、直鎖または分枝鎖のC1〜C30アルキルを含むアリールアルキル、もしくは直鎖または分枝鎖のC1〜C30アルキルを含むアリールオキシアルキルであり；並びに
この化合物を臓器または組織の機能を維持するのに有効量、移植した臓器または組織のレシピエントに投与する工程を含む、方法。
【請求項１３】
LPA受容体が、EDG-2、EDG-4、EDG-7、およびPSP-24からなる群より選択される、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
皮膚科学的状態を治療する方法であって；
LPA受容体アゴニストとしての活性を有する式(I)の化合物を提供する工程：
2005508319.tif 000113
(式中、X1、X2およびX3の少なくともひとつが、(HO)2PO-Z1-または(HO)2PO-Z2-P(OH)O-Z1-であり、X1およびX2が、-O-PO(OH)-O-として共に結合するか、もしくはX1およびX3が、-O-PO(OH)-NH-として共に結合しており；
X1、X2およびX3の少なくともひとつが、R1-Y1-A-(ここでX1、X2およびX3のふたつがR1-Y1-A-である場合に、各々同じもしくは異なる)であるか、またはX2およびX3が-N(H)-C(O)-N(R1)-として共に結合しており；
選択的に、X1、X2およびX3のひとつが、Hであり；
Aが、直接結合、(CH2)k(ここでkが0〜30の整数である)、またはOのいずれかであり；
Y1が、-(CH2)l-(ここでlが1〜30の整数である)、-O-、
2005508319.tif 000114
、-S-、または-NR2-であり；
Z1が、-(CH2)m-もしくは-O(CH2)m-(ここでmが1〜50の整数である)、-C(R3)H-、-NH-、-O-、または-S-であり；
Z2が、-(CH2)n-もしくは-O(CH2)n-(ここでnが1〜50の整数である)、または-O-であり；
Q1およびQ2が、独立して、H2、=NR4、=O、Hおよび-NR5R6の組合せであり；
R1が、各X1、X2またはX3については、独立して水素、直鎖または分枝鎖のC1〜C30アルキル、直鎖または分枝鎖のC2〜C30アルケニル、環に1置換基、2置換基、もしくは3置換基を伴うまたは伴わない芳香環またはヘテロ芳香環、C1〜C30アルキルを含むアシルまたは芳香環またはヘテロ芳香環、直鎖または分枝鎖のC1〜C30アルキルを含むアリールアルキル、直鎖または分枝鎖のC1〜C30アルキルを含むアリールオキシアルキル、
2005508319.tif 000115
であり；並びに
R2、R3、R4、R5、R6、R7およびR8が、独立して水素、直鎖または分枝鎖のC1〜C30アルキル、直鎖または分枝鎖のC2〜C30アルケニル、環に1置換基、2置換基、もしくは3置換基を伴うまたは伴わない芳香環またはヘテロ芳香環、C1〜C30アルキルを含むアシルまたは芳香環またはヘテロ芳香環、直鎖または分枝鎖のC1〜C30アルキルを含むアリールアルキル、または直鎖または分枝鎖のC1〜C30アルキルを含むアリールオキシアルキルである)；並びに
この化合物を含有する組成物を、患者へ局所的に投与する工程を含み、この化合物が、皮膚科学的状態を治療するのに有効量で存在する、方法。
【請求項１５】
皮膚科学的状態が、皺および脱毛を含む、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
LPA受容体が、EDG-2、EDG-4、EDG-7、およびPSP-24からなる群より選択される、請求項14記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2001年3月19日に出願された米国特許出願第09/811,838号の一部継続出願であり、2000年3月17日に出願された米国特許仮出願第60/190,370号の利益を主張するものであり、その全文が本明細書に参照として組み入れられる。
【０００２】
本発明の一部は、米国国立保健研究所の助成金(助成金番号HL07641-12およびGM43880)および全米科学財団の助成金(助成金番号IBN-9728147)によるものであった。米国政府が本発明の権利の一部を保有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、リゾホスファチジン酸(「LPA」)誘導体であってLPA受容体に対しアゴニストもしくはアンタゴニストのいずれかとしての活性を示す前記誘導体、およびその各種治療用途に関するものであり、治療用途には前立腺癌治療、卵巣癌治療および創傷治癒が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
非形質転換細胞はいずれも、その生存および増殖に増殖因子を必要とする。ポリペプチド性の増殖因子のほかにも、増殖因子様の性質を有する脂質の新規のクラスが発見され、総称してリン脂質増殖因子(PLGF)と呼ばれている。PLGFは、ほとんどの休止期の細胞を増殖誘導する際に、類似した性質を有しているが(Jalinkら、1994a、Tokumura 1995、Moolenaarら、1997)、構造的にはさらに大まかな二つのカテゴリーに分類することができる。第一のカテゴリーには、グリセロール骨格を有するグリセロリン脂質伝達物質(GPM)が含まれる。GPMの例としては、LPA、ホスファチジン酸(PA)、環状ホスファチジン酸(環状PA)、アルケニルグリセロールリン酸(アルケニルGP)、およびリゾホスファチジルセリン(LPS)が挙げられる。第二のカテゴリーには、スフィンゴシン塩基のモチーフを有するスフィンゴリン脂質伝達物質(SPM)が含まれる。SPMの例としては、スフィンゴシン-1-リン酸(SPP)、ジヒドロスフィンゴシン-1-リン酸、スフィンゴシルホスフォリルコリン(SPC)、およびスフィンゴシン(SPH)が挙げられる。
【０００５】
LPA(Tigyiら、1991、TigyiおよびMiledi、1992)、PA(Myherら、1989)、アルケニルGP(Liliomら、1998)、環状PA(Kobayashiら、1999)、SPP(Yatomiら、1995)、およびSPC(Tigyiら、2000)については、血清中で検出された。これらの脂質伝達物質については、同定、特徴付けがなされている。血清および血漿中には未知のPLGFが存在し、これらは増殖因子様の性質を示す(TigyiおよびMiledi、1992)。LPAはおおよそ20μMの濃度であり、血清中で最も豊富に存在するPLGFである(TigyiおよびMiledi、1992、Jalinkら、1993)。
【０００６】
真核細胞では、LPAは主に小胞体(ER)膜で起こるリン脂質の生合成の初期段階における重要な中間体である(Bosch、1974、BishopおよびBell、1988)。LPAはERにおいてグリセロール3リン酸に対するアセチルCoAの作用によって生じ、さらにアセチル化されてPAとなる。LPAがアセチル化されてPAになる速度は大変速いため、生合成部位でLPAが蓄積することはほとんどない(Bosch、1974)。LPAはERに限定されているため、その代謝中間体としての役割は、シグナル伝達分子としての役割とほとんど関連ないと考えられる。
【０００７】
LPAは血清の成分であり、そのレベルは低濃度のマイクロモル範囲(μM)にある(Eicholtzら、1993)。LPAは凝固過程において活性化血小板から放出されるので、このレベルが推測される。血清とは異なり、新鮮血や血漿では検出できない(TigyiおよびMiledi、1992、Eicholtzら、1993)。LPAは血清中でアルブミンと結合しており、全血清中において熱安定性で非透析性の生物学的活性の大部分を占めるものである(Moolenaar、1994)。アフリカツメガエル(Xenopus)の卵細胞で内向き塩素電流を誘発させる血清中の活性成分は、LPA(18：0)であることが同定された(TigyiおよびMiledi、1992)。アルブミン結合LPA(18：0)の大部分は、リゾPCに対するリゾホスホリパーゼD(PLD)の作用によるものではなく、むしろ凝固過程で生産されるものである。後者の経路はヘパリンもしくはクエン酸とブドウ糖の作用によって脱凝固した「老化」血漿中でのLPAの存在に関与している(Tokumuraら、1986)。他に特記すべき点としては、EDTAを用いた血漿にはLPAが存在しない点である。このことは、血漿のリゾホスホリパーゼがCa2＋依存性であることを示している(Tokumuraら、1986)。
【０００８】
アルブミンの役割は、血清中に存在するホスホリパーゼの作用からLPAを保護することである(TigyiおよびMiledi、1992)。TigyiとMilediは、アルブミンが血流中でLPAの担体として働いているだけでなく、生理学的半減期を延ばす役割もあることを示唆した。アフリカツメガエルの卵細胞で塩素電流を誘発させる際、血清中のLPAの作用を模倣する血清アルブミンに存在する脂質伝達物質には未同定のものがある。
【０００９】
LPA反応性の細胞種には、粘性糸状アメーバやアフリカツメガエルの卵細胞から哺乳動物の体細胞までに及ぶ。従って、LPAの供給源とその放出は活性化血小板のみに限定されない可能性が高いように思われる。最近の実験により、ペプチド性の増殖因子で刺激すると、哺乳動物の線維芽細胞は速やかにLPAを産生し、細胞外培養液中に放出されることが示された(FukamiおよびTakenawa、1992)。
【００１０】
卵巣癌の患者の腹水中には、どの細胞に由来するのか明らかではない生理活性LPAが比較的多量に存在することを示す証拠があり、このような患者の腹水が卵巣癌の細胞に対し細胞分裂活性を示すことが知られている(Millsら、1988、Millsら、1990)。これを細胞外の体液へと分泌するのが腫瘍細胞であるのか、白血球細胞であるのか、またはより複雑な脂質から各種のホスホリパーゼの作用により生成されるのかについては解っていない。
【００１１】
GPMよびSPMは、系統樹にわたる多種多様な細胞応答を誘起する(Jalinkら、1993a)。LPAは一過的なCa2＋シグナルを誘起させる。このようなCa2＋シグナルは、様々な細胞の細胞内貯蔵物に由来するものである。このような細胞としては、神経細胞(Jalinkら、1993、Durieuxら、1992)、血小板、正常および形質転換した線維芽細胞(Jalinkら、1990)、上皮細胞(van Corvenら、1989、Moolenaar、1991)、およびアフリカツメガエルの卵細胞(TigyiおよびMiledi、1992、Durieuxら、1992、Fernhoutら、1992)等である。LPAは血小板凝集(Schumacherら、1979、Tokumuraら、1981、Gerrandら、1979、Simonら、1982)、および平滑筋収縮(Tokumuraら、1980、Tokumuraら、1994)を誘起する。静脈内投与すると、血圧を種依存的に変化を誘導する(Schumacherら、1979、Tokumuraら、1978)。
【００１２】
休止期の線維芽細胞に添加した場合には、LPAはDNA合成と細胞分裂を刺激する(van Corvenら、1989、van Corvenら、1992)。このようなPLAの増殖因子様の効果には、ペプチド性増殖因子の存在は不要である。このような所見によれば、LPAは、細胞増殖を継続させるためにインシュリンもしくは上皮成長因子の存在を必要とするエンドテリンおよびバソプレッシンとは異なるものである(Moolenaar、1991)。特記すべき点は、Sp2ミエローマ細胞において、LPAがcAMPレベルの増加によって仲介される抗細胞分裂応答を担っていたという点である(Tigyiら、1994、Fischerら、1998)。細胞分裂経路と異なり、抗細胞分裂経路は百日咳毒素(PTX)によって影響を受けない。また、フォルスコリンおよびイソブチルメチルキサンチンを添加することによって、LPAのSp2ミエローマ細胞に対する抗細胞分裂作用は付加的であっった(Tigyiら、1994)。線維芽細胞における限局性接着およびストレス繊維の形成を含む各種の細胞の細胞骨格変化を、LPAは引き起こす(RidleyおよびHall、1992)。LPAはまた、発生中の神経突起の収縮を誘起することにより神経芽細胞腫の分化の逆行および抑制を促進する(Jalinkら、1994a、Jalinkら、1994b)。血清飢餓状態の神経芽細胞腫N1E-115細胞にLPAをナノモル(nmol)量で添加すると、即座に神経突起収縮が起こり、これは迅速ではあるが一過性の細胞体の球状化により行なわれた(Jalinkら、1993b)。継続的なLPAの存在が提供される場合には、神経芽細胞腫の細胞は未分化形質に関しては保持しているが、細胞分裂できなくなる(Jalinkら、1993b)。細胞周期を進めるために、インシュリン様増殖因子等の他の因子が必要であった。一度、この細胞が形態的に分化すると、LPAの添加によってこの形態変化が逆戻りする。従って、LPAで誘導した神経突起収縮は、基層への接着の消失によるものであるよりもむしろ、アクチン細胞骨格の収縮によって起こるものである(Jalinkら、1993a、Jalinkら、1994b)。
【００１３】
他の生理学的な化学誘引物質(例えば、インターロイキン8)と同様にLPAは、ヒト単球において走触的な機序による細胞遊走を誘起する(Zhouら、1995)。細胞遊走を誘導に加えて、LPAは、単層の中皮細胞に対する肝癌細胞および癌細胞の浸潤を促進する(Imamuraら、1993)。この浸潤の基礎になる機序は現在のところ不明であるが、細胞運動の亢進と細胞接着の増加によるも可能性がある。最後に、LPAが新生児の心筋細胞のアポトーシスを遮断することも知られている(Umanskyら、1997)。
【００１４】
環状PAと名付けられた独特の天然のリン脂質は、細胞の種類に応じて、他のGPMと類似したもしくは相反する作用を細胞に与えることが示された。アフリカツメガエルの卵細胞を用いて試験を行うと、他のGPMと全く同様に塩素電流を誘発させたが、この応答はLPAによって脱感作しなかった(Fischerら、1998)。Murakami-Murofushiら(1993)は環状PAが増殖を引き起こすLPAとは異なり、抗増殖性の作用を示すことを報告していた。
【００１５】
PLGF受容体(PLGFR)は、7回膜貫通型(7TM)グアニン・ヌクレオチド結合制御蛋白質(G蛋白質)結合型受容体(GPCR)スーパーファミリーに属している。7TM型GPCRは、ヘテロ三量体G蛋白質との相互作用による細胞応答を媒介する細胞表面受容体ファミリーである。LPA受容体は複数同定されており、特にEDG-2、EDG-4、EDG-7およびPSP-24が含まれる。これらのLPA受容体およびその他のものについて、関連を示す系統樹を図1に示す。
【００１６】
1996年に、Hechtらは、ディファレンシャルハイブリダイゼーション法により、推定サーペンチン受容体をコードするcDNAをマウスの新皮質細胞株からクローニングした(Hechtら、1996)。この遺伝子は脳室領域遺伝子1(Vzg-1)と名付けられた。この遺伝子は、皮質神経組織発生領域に発現し、分子量41kDa(364アミノ酸)の蛋白質をコードしていた。Vzg-1は、内皮分化遺伝子2(EDG-2)と命名された未報告のヒツジの配列と非常に類似していた。同一のcDNAはマウスおよびウシのライブラリーからもオーファン受容体として単離されており、rec1.3として報告されたものであった(Macraeら、1996)。これはマウスの様々な組織に分布しており、脳と心臓で発現が最も高かった。
【００１７】
1996年に、Guoらは、PCRによるプロトコールを用いて、別のLPA受容体と推定されるPSP-24(372アミノ酸)をアフリカツメガエルの卵細胞から単離した(Guoら、1996)。この受容体は、Vzg-1／EDG-2／rec1.3にほとんど類似性を示さなかった(Guoら、1996)。EDG-2ヒトLPA受容体のcDNA配列を使用したスフィンゴ脂質受容体の配列検索によって、よく似た2種類のGPCRが得られ、ラットH218(EDG-5、354アミノ酸)およびEDG-3(378アミノ酸)と命名された(Anら、1997a)。ノーザン解析の結果、EDG-3およびEDG-5でコードされるmRNAの発現は心臓組織で高いことが明らかとなった。
【００１８】
LPAの機能的受容体としてEDG-2が最近同定され、これをもとにAnらはLPA受容体の新規のサブタイプを配列検索した(Anら、1998a)。GPCRをコードするヒトのcDNAを得て、EDG-4と名付けた(Anら、1998a)。ノーザンブロット解析の結果、EDG-2とEDG-4は共にGMP受容体として働き、組織における分布は非常に異なっていることが解った。EDG-2とは異なり、EDG-4は主に末梢血リンパ球細胞と精巣で発現していた(Anら、1998a)。
【００１９】
PCR増幅したcDNAにより、ヒトのジャーカット(Jurkat)T細胞からEDGファミリーに属するがこれまで未知であったGPCRが同定された。同定されたこのGPCRはEDG-7と命名された。これは40kDaの分子量を有している(353アミノ酸)。ノーザンブロット解析を行い、ヒトの組織におけるEDG-7の発現を調べたところ、心臓、膵臓、前立腺、および精巣で発現していることが明らかとなった(Bandohら、1999)。このように、2種類の異なるPLGF受容体のファミリー、PSP24およびEDG、が存在する。合計では10種類のPLGFRである(図1)。このリストはさらに増え続けている。
【００２０】
以下の表1に示すように、これら各種の受容体はそのGPMおよびSPMに対するリガンド特異性を基に分類することができる。
【００２１】
（表１）リン脂質増殖因子受容体、長さおよび主なリガンド
2005508319.tif 000002
【００２２】
アフリカツメガエルのPSP24およびマウスで発現するPSP24は、特異的にGPM(LPA、Fischerら、1998)により誘起される振動性塩素電流を媒介する。これらは構造的にはEDGファミリーと相同ではない(TigyiおよびMiledi、1992、Fernhoutら、1992)。EDGファミリーは2種類の異なる亜群に分類されうる。第一の群は、EDG-2、EDG-4およびEDG-7を含み、GPMのみに受容体として働き(Hechtら、1996、Anら、1998a、Bandohら、1999、Anら、1998b)、リガンド結合に応答して様々なシグナルを伝達する。第二の群は、EDG-1、EDG-3、EDG-5、EDG-6およびEDG-8を含み、SPMに特異的である(Anら、1997a、Imら、2000、van Brocklynら、1998、van Brocklynら、2000、SpiegelおよびMilstein 2000)。各種PLGFRを発現する主な組織については、以下の図2に示す。
【００２３】
（表２）リン脂質増殖因子受容体のヒト組織における発現
2005508319.tif 000003
【００２４】
PLGFは複数のG蛋白質媒介性シグナル伝達現象を活性化する。これらの過程は、ヘテロ三量体G蛋白質ファミリー、Gq／11、Gi／0、およびG12／13により媒介される(Moolenaar、1997、SpiegelおよびMilstein、1995、Gohlaら、1998)。
【００２５】
Gq／11経路はホスホリパーゼC(PLC)の活性化を担い、この活性化によって次にイノシトール3リン酸(IP3)の生成が誘導され、さらにCa2＋動員が多様な細胞で起こる(Tokumura、1995)。この応答がPTX感受性である細胞もあり、このことは複数のPTX感受性および非感受性経路が関わっていることを示す(Tigyiら、1996)。この経路はジアシルグリセロール(DAG)媒介性のプロテインキナーゼC(PKC)の活性化も担っている。PKCは、ホスファチジルコリンの遊離のコリンとPAへの加水分解を担う細胞内ホスホリパーゼD(PLD)を活性化する(van der Bendら、1992a)。また、特定の種類の細胞では、PLCは直接的に、もしくはPKCのDAG活性化を経てMAPキナーゼを活性化することができる(Ghoshら、1997)。
【００２６】
細胞分裂のシグナル伝達経路はG蛋白質のヘテロ三量体Gi／0サブユニットによって媒介される。トランスフェクションを用いた研究は、αiサブユニットよりむしろGiβγ二量体がRas-MAPキナーゼ活性化を担うことを示している。Rasの活性化は、EGF(Cunnickら、1998)やPDGF受容体(Herrlichら、1998)等の受容体チロシンキナーゼ(RTK)のトランス活性化に先行される。トランス活性化したRTKはRasを活性化し、これによってRafを経てMAPキナーゼ(ERK1、2)が活性化される。PTX感受性であるGiαサブユニットは、アデニルシクラーゼ(AC)を阻害し、その結果前記受容体をリン酸化し脱感作するG蛋白質結合受容体キナーゼ(GRK)にβγ二量体が結合する。βアレスチンによりリン酸化された受容体が補充され、srcキナーゼを補充する。srcキナーゼはEGF受容体をリン酸化し活性型の構造に変換する(Linら、1997、Ahnら、1999、Luttrellら、1999)。トランス活性化されたRTKは、次に、Rasを活性化し、これによりRafを経てMAPキナーゼ(ERK1、2)の活性化が起こる。PTX感受性であるGiαサブユニットはACを阻害し、その結果サイクリックAMP(cAMP)のレベルが下がる。LPAによる逆方向の細胞の効果、すなわち、細胞分裂と抗細胞分裂は、cAMPの第二メッセンジャー系に対する相反する効果によって起こる。細胞分裂はcAMPのレベルを下げるGiα経路によって媒介され(van Corvenら、1989、van Corvenら、1992)、抗細胞分裂は非PTX感受性でCa2＋依存的なcAMPレベルの上昇によって起こる(Tigyiら、1994、Fischerら、1998)。
【００２７】
対照的に、アクチン細胞骨格の再構成を起こすPTX非感受性のGI2／I3シグナル伝達経路に関してはほとんど何も解っていない。この経路にはRTKのトランス活性化(Linら、1997、Ahnら、1999、Luttrellら、1999、Gohkaら、1998)および小型GTPase、Rhoへの収束(Moolenaar、1997)も含まれるものと考えられる。Rhoの下流のシグナル伝達に関してはもっとよくわかっている。なぜなら、各種の蛋白質パートナーが単離、同定されているからである。RhoはSer／Thrキナーゼを活性化する。このSer／Thrキナーゼはミオシン軽鎖ホスファターゼ(MLCホスファターゼ)をリン酸化することによって阻害する(Kimuraら、1996)。この経路によりリン酸化型MLCの蓄積が起こり、神経突起の収縮等の細胞効果を与える細胞骨格応答(TigyiおよびMiledi、1992、Tigyiら、1996、Dyerら、1992、Postmaら、1996、Satoら、1997)、ストレス繊維の誘導(RindleyおよびHall、1992、Gondaら、1999)、走化性の刺激(Jalinkら、1993a)、細胞遊走(Zhouら、1995、Kimuraら、1992)、および腫瘍細胞浸潤(Imamuraら、1993、Imamuraら、1996)を起こす。PLGF誘導性でRho媒介性の腫瘍細胞浸潤はADP依存的機序でRhoを特異的にリボシル化するC. ボタリニウム(C. Botulinium)C3毒素により阻止される(Imamuraら、1996)。
【００２８】
Rhoはまた、休止期の線維芽細胞におけるDNA合成を刺激する作用を有する(MarcheskyおよびHall、1996、Ridley 1996)。RhoファミリーGTPaseの発現によって、初期遺伝子の転写を媒介する血清応答因子(SRF)が活性化さる(Hillら、1995)。さらに、PLGF(LPA)は腫瘍細胞浸潤を誘導する(Imamuraら、1996)。しかし、これが細胞骨格の変化もしくは遺伝子の転写のいずれか、またはその両方に関与しているか否かは今のところ明らかではない。
【００２９】
多くの細胞内経路および増殖および/もしくは遊走等の細胞活性にLPA／LPA受容体が関与していること、および創傷治癒および癌に関連があることから、上記の同定されたLPA受容体に対し、好ましくは選択的にアンタゴニストもしくはアゴニストとして働くことのできる新規の化合物を同定することは重要であると考えられる。
【００３０】
現在のところ、LPA受容体に対する合成もしくは内因性の阻害剤に既知のものはほとんどない。現在までに報告されているアンタゴニストのうちで、最も効果のあるものはSPH、SPP、N-パルミトイル-L-セリン(Bittmanら、1996)、およびN-パルミトイル-L-チロシン(Bittmanら、1996)であった。上記の化合物はアフリカツメガエルの卵細胞におけるLPA誘起性の塩素電流を阻害することが知られている(Bittmanら、1996、Zsirosら、1996)。しかし、これらの化合物はすべての細胞系で調べられているわけではない。SPPも腫瘍細胞浸潤を阻害することが知られているが、SPPがLPAの阻害剤であるためなのか、自身の受容体の作用によるためなのかについては明らかではない。N-パルミトイル-L-セリンおよびN-パルミトイル-L-チロシンもLPA誘導性の血小板凝集を阻害する(Sugiuraら、1994)が、これらの化合物がLPA受容体に作用するか否かについては明らかではない。リゾホスファチジルグリセロール(LPG)はLPA作用をある程度阻害することが示された最初の脂質であった(van der Bendら、1992b)。しかし、これは複数種類のLPA応答性細胞種に検出されなかった(Liliomら、1996)。これらの阻害剤は、いずれも特定のLPA受容体に選択的には作用することが示されているわけではなかった。
【００３１】
ポリスルホン化化合物であるスラミンは、可逆的および用量依存的にLPA誘導性DNA合成を阻害することが示された。しかし、スラミンはLPA受容体に対し何らの特異性も持たず、非常に高いミリモル(mM)濃度でのみLPAの作用を遮断することが示された(van Corvenら、1992)。
【００３２】
現在のところLPAアゴニストおよびアンタゴニストに関してはこのように貧弱であるが、本発明はこれを克服することを目的とする。
【発明の開示】
【００３３】
発明の概要
本発明は下記の式(I)に係る化合物に関する。
2005508319.tif 000004
ここで、X1、X2およびX3のうち少なくとも1つが、(HO)2PO-Z1-もしくは(HO)2PO-Z2-P(OH)O-Z1-であり、X1およびX2が互いに結合した-O-PO(OH)-O-であるか、またはX1およびX3が互いに結合した-O-PO(OH)-NH-であり；
X1、X2およびX3のうち少なくとも1つが、R1-Y1-A-であり、X1、X2およびX3のうち2つがR1-Y1-A-であればそれぞれが同一であっても異なっていてもよく、またはX2とX3が互いに結合した-N(H)-C(O)-N(R1)-であり；
選択的にX1、X2およびX3のうちの1つがHであり；
Aが、kが0〜30の整数である直接結合(CH2)k、もしくはOであり、Y1が、lが1〜30の整数である-(CH2)l-、-O-、
2005508319.tif 000005
-S-、または-NR2-であり；
Z1が、mが1〜50の整数である-(CH2)m-もしくは-O(CH2)m-、-C(R3)H-、―NH-、-O-、もしくは-S-であり；
Z2が、nが1〜50の整数である-(CH2)n-もしくは-O(CH2)n-、もしくは-O-であり；
Q1およびQ2が独立にH2、=NR4、=O、もしくはHと-NR5R6の組み合わせであり；
X1、X2およびX3のそれぞれについてR1が独立に水素、直鎖もしくは分岐鎖C1〜C30のアルキル、直鎖もしくは分岐鎖C2〜C30のアルケニル、環に1置換基、2置換基もしくは3置換基を有するもしくは有していない芳香族環または複素環式芳香族環、C1〜C30のアルキルもしくは芳香族環または複素環式芳香族環を含むアシル、直鎖もしくは分岐鎖C1〜C30のアルキルを含むアリールアルキル、直鎖もしくは分岐鎖C1〜C30のアルキルを含むアリールオキシアルキル、
2005508319.tif 000006
であり、
R2、R3、R4、R5、R6、R7およびR8が、独立に水素、直鎖もしくは分岐鎖C1〜C30のアルキル、直鎖もしくは分岐鎖C2〜C30のアルケニル、環に1置換基、2置換基もしくは3置換基を有するもしくは有していない芳香族環または複素環式芳香族環、C1〜C30のアルキルもしくは芳香族環または複素環式芳香族環を含むアシル、直鎖もしくは分岐鎖C1〜C30のアルキルを含むアリールアルキル、または直鎖もしくは分岐鎖C1〜C30のアルキルを含むアリールオキシアルキルであり；
ここで式(I)の化合物がリゾホスファチジン酸、ホスファチジン酸、環状ホスファチジン酸、アルケニルグリセロールリン酸、ジオクチルグリセロールピロリン酸、もしくはN-パルミトイル-L-セリンではない。
【００３４】
また、本発明の化合物と薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物も開示される。
【００３５】
さらに本発明の一局面は、LPA受容体アンタゴニストとしての活性を有する本発明の化合物を提供する段階、およびLPA受容体のLPAによって誘起される活性を効果的に阻害する条件下で、前記化合物をLPA受容体と接触させる段階を含む、LPA受容体のLPA誘導性活性を阻害する方法に関する。
【００３６】
本発明の別の一局面は、LPA受容体のアゴニストもしくはアンタゴニストのいずれかとしての活性を有する本発明の化合物を提供する段階、およびLPA受容体の活性を効果的に調節する条件下でLPA受容体に前記化合物を接触させる段階を含む、LPA受容体の活性を調節する方法に関する。
【００３７】
本発明のさらに別の局面は、本発明の化合物を提供する段階、および癌を効果的に治療する方法で患者に前記化合物を効果的な量を投与する段階を含む、癌の治療法に関する。
【００３８】
本発明のさらに別の局面は、LPA受容体のアゴニストの活性を有する本発明の化合物を提供する段階、およびLPA受容体により誘導される細胞増殖の促進が効果的に起こる方法で細胞上のLPA受容体に前記化合物を接触させる段階を含む細胞増殖を促進する方法に関する。
【００３９】
本発明のさらに別の局面は、LPA受容体のアゴニストの活性を有する本発明の化合物を提供する段階、および創傷治癒を促進する細胞のLPA受容体に前記化合物が結合する創傷部位に効果的な量の前記化合物を送達することによって、創傷治癒を促進するためにLPA受容体のアゴニストにより誘導される細胞増殖を刺激する段階を含む、創傷を治療する方法に関する。
【００４０】
本発明のさらに別の局面は、本発明の化合物を生成する方法に関する。本発明の化合物を生成する方法の1つには、
(Y2O)2PO-Z11-Z13もしくは(Y2O)2PO-Z12-P(OH)O-Z11-Z13を(ここで、Z11がmが1〜50の整数である-(CH2)m-もしくは-O(CH2)m-、-C(R3)H-もしくは-O-であり；
Z12がnが1〜50の整数である-(CH2)n-もしくは-O(CH2)n-、もしくは-O-であり；
Z13がHもしくは第一の脱離基、もしくは前記第一の脱離基とともに形成している-Z11-Z13であり；
かつY2がHもしくは保護基である)、式(VI)の中間体化合物と反応させ、
2005508319.tif 000007
ここで、X11、X12およびX13のうち少なくとも1つが、X11、X12およびX13のうち二つがR11-Y11-A-もしくはである、またはX12およびX13が互いに結合して-N(H)-C(O)-N(R11)-となっている場合には同一であっても異なるものであってもよいR11-Y11-A-であり；
X11、X12およびX13のうち少なくとも1つが、OH、NH2、SHもしくは第二の脱離基であり；
選択的に、X11、X12およびX13の1つがHであり；
Aが、kが0〜30の整数である直接結合(CH2)k、もしくはOであり、
Y11が、lが1〜30の整数である-(CH2)l-、-O-、
2005508319.tif 000008
-S-、または-NR2-、であり；
Q1およびQ2が独立にH2、=NR13、=O、Hおよび-NR14R15の組み合わせであり；
X11、X12およびX13のそれぞれについてR11が独立に水素、直鎖もしくは分岐鎖C1〜C30のアルキル、直鎖もしくは分岐鎖C2〜C30のアルケニル、環に
2005508319.tif 000009
および1置換基、2置換基もしくは3置換基を有するもしくは有していない芳香族環または複素環式芳香族環、C1〜C30のアルキルもしくは芳香族環または複素環式芳香族環を含むアシル、直鎖もしくは分岐鎖C1〜C30のアルキルを含むアリールアルキル、直鎖もしくは分岐鎖C1〜C30のアルキルを含むアリールオキシアルキルであり、
R12、R13、R14、R15、R16、およびR17が、独立に水素、直鎖もしくは分岐鎖C1〜C30のアルキル、直鎖もしくは分岐鎖C2〜C30のアルケニル、環に1置換基、2置換基もしくは3置換基を有するもしくは有していない芳香族環または複素環式芳香族環、C1〜C30のアルキルもしくは芳香族環または複素環式芳香族環を含むアシル、直鎖もしくは分岐鎖C1〜C30のアルキルを含むアリールアルキル、または直鎖もしくは分岐鎖C1〜C30のアルキルを含むアリールオキシアルキルであり；
反応後に、脱保護工程を実施し、必要に応じて、X1、X2およびX3のうち1つまたは2つが、(HO)2PO-Z1-、もしくは(HO)2PO-Z2-P(OH)O-Z1-である式(I)の化合物が効果的に得られる条件下で前記反応と脱保護の段階の両方を実施する方法が挙げられる。
【００４１】
更に別の本発明の局面は、アポトーシスを処置するまたは細胞、組織、もしくは臓器の機能を維持もしくは回復する方法に関し：これは、LPA受容体のアゴニストとしての活性を有する本発明の化合物を提供すること；並びに、細胞、組織、または臓器と、アポトーシスを処置するのに有効量または細胞、組織、もしくは臓器の機能を維持もしくは回復するのに有効量の化合物を接触することを含む。
【００４２】
本発明の更なる局面は、細胞を培養する方法に関し：これは、LPA受容体のアゴニストとしての活性を有し、並びにアポトーシスを防止するのに有効量または培養物中の細胞を維持するのに有効量で存在する本発明の化合物を含有する培地中において、細胞を培養することを含む。
【００４３】
本発明の別の局面は、臓器または組織を維持する方法に関し：これは、LPA受容体のアゴニストとしての活性を有する本発明の化合物を提供すること；並びに、臓器または組織を、この化合物を臓器または組織の機能を維持するのに有効量含有する溶液で治療することを含む。
【００４４】
本発明の関連した局面は、臓器または組織を維持する代替法に関し：これは、LPA受容体のアゴニストとしての活性を有する本発明の化合物を提供すること；並びに、移植された臓器または組織のレシピエントに、臓器または組織の機能を維持するのに有効量のこの化合物を投与することを含む。
【００４５】
より更なる本発明の局面は、皮膚科学的状態を治療する方法に関し：これは、LPA受容体のアゴニストとしての活性を有する本発明の化合物を提供すること；並びに、この化合物を含有する組成物を、患者へ局所的に投与し、この化合物は皮膚科学的状態を治療するのに有効量存在することを含む。
【００４６】
本明細書において1種類または複数種類のLPA受容体のアゴニストもしくはアンタゴニストとして同定される本発明の化合物の用途は、LPA受容体のシグナル伝達によって媒介される生化学的経路をそれぞれ阻害もしくは促進する用途が見出されている。LPA受容体のシグナル伝達を調節することによる前記アゴニストもしくはアンタゴニストの特異的かつ実質的な用途は、癌の治療および創傷治癒の促進である。
【００４７】
発明の詳細な説明
本発明の一局面は、式(I)に記載の化合物に関する。
2005508319.tif 000010
ここで、X1、X2およびX3のうち少なくとも1つが、(HO)2PO-Z1-もしくは(HO)2PO-Z2-P(OH)O-Z1-であり、X1およびX2が互いに結合した-O-PO(OH)-O-であるか、またはX1およびX3が互いに結合した-O-PO(OH)-NH-であり；
X1、X2およびX3のうち少なくとも1つが、R1-Y1-A-であり、X1、X2およびX3のうち2つがR1-Y1-A-である場合にはそれぞれが同一であっても異なってもよく、またはX2とX3が互いに結合した-N(H)-C(O)-N(R1)-であり；
選択的にX1、X2およびX3のうちの1つがHであり；
Aが、kが0〜30の整数である直接結合(CH2)k、もしくはOであり、Y1が、lが1〜30の整数である-(CH2)l-であり、-O-、
2005508319.tif 000011
-S-、または-NR2-であり；
Z1が、mが1〜50の整数である-(CH2)m-もしくは-O(CH2)m-、-C(R3)H-、―NH-、-O-、もしくは-S-であり；
Z2が、nが1〜50の整数である-(CH2)n-もしくは-O(CH2)n-、もしくは-O-であり；
Q1およびQ2が独立にH2、=NR4、=OもしくはHおよび-NR5R6の組み合わせであり；
X1、X2またはX3のそれぞれについてR1が独立に水素、直鎖もしくは分岐鎖C1〜C30アルキル、直鎖もしくは分岐鎖C2〜C30アルケニル、環に1置換基、2置換基もしくは3置換基を有するもしくは有していない芳香族環もしくは複素環式芳香族環、C1〜C30のアルキルもしくは芳香族環もしくは複素環式芳香族環を含むアシル、直鎖もしくは分岐鎖C1〜C30のアルキルを含むアリールアルキル、直鎖もしくは分岐鎖C1〜C30のアルキルを含むアリールオキシアルキル、
2005508319.tif 000012
であり、
R2、R3、R4、R5、R6、R7およびR8が、独立に水素、直鎖もしくは分岐鎖C1〜C30のアルキル、直鎖もしくは分岐鎖C2〜C30アルケニル、環に1置換基、2置換基もしくは3置換基を有するもしくは有していない芳香族環もしくは複素環式芳香族環、分岐鎖C1〜C30のアルキルもしくは芳香族環もしくは複素環式芳香族環を含むアシル、直鎖もしくは分岐鎖C1〜C30のアルキルを含むアリールアルキル、または直鎖もしくは分岐鎖C1〜C30のアルキルを含むアリールオキシアルキルである。
【００４８】
上記のR基(例えば、R1-R8)のそれぞれについて、xが0〜29である-(CH2)xCH3の式を有する直鎖状アルキルであり、
一つまたはそれ以上のCH2基が、CHW基で置換される(ここでWがアルキル側鎖である)ことを除き、直鎖状アルキルの上記に定義される式を有する分岐鎖アルキルであり、式 -(CH2) xaCH=CH(CH2)xbCH3 (ここでxaとxbはそれぞれ0〜27であり、(xa ＋ xb)が27より小さい)を有する直鎖状アルケニルであり、一つまたはそれ以上のCH2基がCHW基で置換されるもしくはCH基がCW基で置換される(ここでWはアルキル側鎖である)ことを除き、直鎖状アルケニルの上記に定義される式を有する分岐鎖アルケニルを有する。
【００４９】
芳香族環もしくは複素環式芳香族環としては、フェニル、インデン、ピロール、イミダゾール、オキサゾール、ピラゾール、ピリジン、ピリミジン、ピロリジン、ピペラジン、チオフェン、フラン、ナフトール、ビフェニルおよびインドールが挙げられるが、これらに限定されるものではない。前記芳香族環もしくは複素環式芳香族環は、環がR1-Y1-A- 鎖のY1基に結合する場合に対して環のオルト位、メタ位もしくはパラ位に1置換基、2置換基もしくは3置換基を有していてもよい。環上の置換には、アルキル、アルコキシ、アミン(2級もしくは3級アミンを含む)、アルキルアミン、アミド、アルキルアミド、酸、アルコール等を含むことができるが、これらに限定されるものではない。
【００５０】
アシル基としては、上記のアルキル、アルケニル、もしくは芳香族環もしくは複素環式芳香族環のいずれかを含むことができる。
【００５１】
アリールアルキルおよびアリールオキシアルキル基は、R1-Y1-A-鎖のY1基に結合したアルキル基を有する上記の直鎖もしくは分岐鎖C1〜C30のアルキル基 を含むことができるが、これらに限定されるものではない。
【００５２】
上記の式(I)に記載の化合物の上記で特定された定義より、特に例外となるものとしては、以下に示す既知の内因性もしくは合成化合物が挙げられる。すなわち、リゾホスファチジン酸、ホスファチジン酸、環状ホスファチジン酸、アルケニルグリセロールリン酸、ジオクチル-グリセロールピロリン酸およびN-パルミトイル-L-セリンである。
【００５３】
式(I)に記載の化合物の例としては、以下の(II)〜(V)に記載の化合物の下位集団が挙げられる。
【００５４】
式(II)Aおよび(II)Bの構造において、Q1およびQ2がいずれもH2であり、
X1、X2およびX3の一つが、(HO)2PO-Z2-P(OH)O-Z1-であり、ここでZ1およびZ2がOであり、
X1、X2およびX3のうちの2つがR1-Y1-A-であり、ここでそれぞれAが直接結合でありY1がOである。R1のそれぞれが、上記の式(I)のように独立に定義される。
2005508319.tif 000013
【００５５】
式(III)の構造において、Q1がH2であり、Q2が=Oであり、X1は (HO)2PO-Z1-(ここで、Z1がOである)であり、およびX2とX3がR1-Y1-A-(ここでそれぞれAが直接結合でありY1が-NH-である)である。上記の式(I)同様、R1はそれぞれ独立に定義される。式(III)の範囲内で好ましい種は、X3が-NH2であり、X2はR1がC14〜C18アルキルであり、さらに好ましくはC14アルキルもしくはC18アルキルのいずれかである-NHR1であり、またはX3はR1がアセチル基である-NHR1であり、X2はR1がC14アルキルである-NHR1である。
2005508319.tif 000014
【００５６】
式(IV)の構造において、Q1が=NR4であり、Q2がH2であり、X1とX2が互いに結合した-O-PO(OH)-O-であり、X3がR1-Y1-A-であり、ここでAが直接結合でありY1が-NH-である。R1とR4が上記の式(I)で定義したものと同様である。
2005508319.tif 000015
【００５７】
式(V)Aおよび(V)Bの構造において、Q1およびQ2がいずれもH2であり、
X1、X2およびX3のうちの2つが(HO)2PO-Z1-であり、ここでそれぞれのZ1がOであり、またX1、X2およびX3のうちの1つはR1-Y1-A-であり、ここでAが直接結合でY1が-O―である。R1は上記の式(I)で定義したものと同様である。式(V)Aおよび(V)Bの範囲内で好ましい種は、R1がC21アルキルを含むアシルである化合物、もしくはR1がC18アルキルである化合物を含む。
2005508319.tif 000016
【００５８】
式(I)の化合物ならびに式(II)A、(II)B、(III) 、(IV)、(V)Aおよび(V)Bの化合物の亜種は、下記の合成スキームを用いて調製することができる。
【００５９】
一群のセリンアミド(SA)およびセリンアミドリン酸(SAP)(式(III))を合成する目的で、まず、前駆体であるt-Boc保護されたβ-ラクトン(25)を合成した。市販のt-Boc-L-セリン(図2、24)から出発して、ミツノボ(Mitsunobo)条件下でトリフェニルホスフィン酸(PPh3)およびアジドジカルボン酸ジエチル(DEAD)を導入し、化合物25を約50％の収量で得た(Sunら、1996)。ヒドロキシアミド26〜34を得る目的で、各種一級アミンで化合物25の非常に不安定なβ-ラクトンを開裂させるために、Sunらが開発した方法を用いた。しかしながら、様々な試薬(トリエチルアミン等)を用いたにもかかわらず成功には至らなかった。代わりに、β-ラクトンを有する一級アミンをTHF中で還流することにより、t-Bocで保護されたヒドロキシアミド26〜34を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィを用いて化合物26〜34を精製した。t-Boc保護基をトリフルオロ酢酸(TFA)ではずし、化合物35〜43をTFA塩として得た。
【００６０】
化合物55〜59を合成する目的で、t-Bocで保護されたヒドロキシアミド26〜30をリン酸化した。最終的に得られた化合物を精査した結果、最終的に得られた化合物は高度に疎水性の領域と高度に親水性の領域を有することが示唆された。両領域とも、抽出過程および/もしくは精製過程でのカラムへの結合の際に問題を生じる可能性がある。これら潜在的な問題を克服するために、ホスホラミダイト化学を使用した。ホスホラミダイト化学を用いることによって、リン酸水酸基を保護して前記分子を完全な疎水性にし、それによって円滑に精製を容易にしうると考えられた。
【００６１】
本質的には、複数の方法の組み合わせを用いて所望の産物(55〜59)を得た(Lynchら、1997; Bittmanら、1996; Liuら、1999)。出発物質であるヒドロキシアミド(26〜30)を無水ピリジンで繰り返し洗浄し、高真空下で48時間乾燥した。ピリジンで洗浄したヒドロキシアミドは、アルゴン雰囲気下で維持した。次に、1H-テトラゾールおよび蒸留したばかりのTHF/CH2Cl2の1：1混合物を添加した。リン酸化試薬ジベンジルジイソプロピルホスホラミダイトを添加した。反応をTLCでモニターした後、ホスホネートをインサイチューで過酢酸により酸化してリン酸塩に変換した。反応混合物をカラムクロマトグラフィで精製し、化合物50〜54をベンジル保護されたリン酸塩として得た。化合物55〜59(図3)を得るために、化合物50〜54を60psiのH2雰囲気下、活性炭-10％パラジウム(Pd/C)を用いて触媒的に還元し、エタノール中でベンジル保護基を外した。化合物56を無水酢酸と反応させ、化合物56aを調製した(図3)。
【００６２】
リン酸化法が一連のSAP(化合物55〜59)の合成に使用できることが解ったので、同様の方法により二リン酸塩(式(V)Aおよび(V))(図4および5A〜B)を合成した。市販のジオール60〜62を無水ピリジンで洗浄し、高真空下で48時間乾燥した。これら乾燥したジオール(60〜62)を蒸留したばかりの1：1のTHF/CH2Cl2に溶解し、1H-テトラゾールを添加した。この混合を撹拌して、これにジベンジルジイソプロピルホスホラミダイトを添加した。反応混合物をTLCでモニターし、適当な時間でホスホネートをインサイチューで過酢酸により酸化してリン酸塩に変換した。反応混合物をカラムクロマトグラフィで精製し、化合物63〜65をベンジル保護された二リン酸として得た。二リン酸化合物として化合物66〜68 を得るために、化合物63〜65を60psiのH2雰囲気下、活性炭-10％パラジウム(Pd/C)を用いて触媒的に還元し、エタノール中でベンジル保護基を外した。化合物66〜68の合成に関する上記の方法と同様の方法で化合物85〜92を得た。
【００６３】
化合物85〜92は1,2-二リン酸であるが、図5Bには1,3-二リン酸の合成を示す。市販の2-フェノキシ-1,3-プロパンジオールを出発原料として用いた。出発化合物を、まず、メチルインドールの存在下でt-BuOKによって保護し、触媒的水素化を行って中間体を得た後、ハロゲン化物(RX、ここでRは上記のR1に関する定義と同様である)と反応させた。回収した中間体を、次にエチル-SHの存在下でAlCl3により処理して、骨格のC2位に結合したRO基を有する1,3-ジオールを得た。回収した1,3-ジオールを蒸留したばかりの1：1混合のTHF/CH2Cl2に溶解した後、1H-テトラゾールを添加した。この混合物を撹拌し、これにジベンジルジイソプロピルホスホラミダイトを添加した。前記反応混合物をTLCでモニターし、適当な時間でホスホネートをインサイチューで過酢酸により酸化してリン酸塩に変換した。前記反応混合物をカラムクロマトグラフィで精製し、ベンジル保護された二リン酸化合物を得た。1,3-二リン酸化合物を得るために、60psiのH2雰囲気下、活性炭-10％パラジウム(Pd/C)を用いて前記化合物を触媒的に還元し、エタノール中でベンジル保護基を外した。
【００６４】
式(II)Aおよび(II)Bのピロリン酸を合成する目的で、グリシダルトシル酸((2R)(-)もしくは(2R)(＋))を出発物質として用いた(図6A〜B)。アルコールの存在下BF3等のルイス酸触媒により環を開き、C1位をトシル化保護した中間体を調製した。次の工程では、過剰のR-トリフレートおよび2,6-ジ-tert-ブチル-4-メチルピリジンを用いて、C2位のアルコールをR基(例えば、上記のR1)で置換し、ジエーテル中間体を得た。トリス(テトラ-n-ブチルアンモニウム)水素ピロリン酸でジエーテル中間体を処理によりトシル酸を求核攻撃し、ピロリン酸置換基でトシル酸のC1位を置換した。
【００６５】
式 (II)Bのピロリン酸を得るために、トシル酸保護した中間体を、トリフルオロメタンスルホン酸無水物および2,6-ジ-tert-ブチル-4-メチルピリジンの存在下でベンジルアルコールを用いて処理し、中間体のC2位をベンジル化した。まず、18-クラウン-6の存在下で過酸化カリウムの作用によりベンジレート中間体上のトシル酸保護基をはずし、過剰のR-トリフレートおよび2,6-ジ-tert-ブチル-4-メチルピリジンを用いてC1位の水酸基をR基 (例えば、上記のR1)で置換した。得られたジエーテル中間体はC2位にベンジル保護基を有したままであった。ベンジル保護基を水素化によってはずし、次に、ピリジンおよびp-トルエンスルホニルクロリドの作用により水酸基をトシル化し、C2位にトシル基を含むジエーテルを作製した。トリス(テトラ-n-ブチルアンモニウム)水素ピロリン酸処理による求核攻撃でトシル基をはずし、トシル酸のC2位をピロリン酸置換基で置換した。
【００６６】
リン酸および二リン酸(ならびにピロリン酸、ホスホネート等)を調製する別のスキームを 図15および16に示す。
【００６７】
図15では、臭化グリシダルとアルコール(ROH)を出発原料として用いていた。前記反応条件においては、K2CO3で処理した後、C6H6CH2N＋(C2H5)3Cl-のアンモニウム塩で処理し、臭素がR基で置換されることを含んでいた。次に、エーテル中の1MのHClおよびアルコール(R1OH)を用いてグリシダル中間体の環を開き、C2位に水酸基を有するジエーテル中間体を得た。ジエーテルを1H-テトラゾールと混合、撹拌した後、この混合物にジベンジルジイソプロピルホスホラミダイトを添加した。反応混合物をTLCでモニターし、適当な時間でホスホネートをインサイチューで過酢酸により酸化してリン酸塩に変換した。反応混合物をカラムクロマトグラフィで精製し、ベンジル保護されたリン酸塩を得た。モノリン酸化合物を得るために、60psiのH2雰囲気下で活性炭-10％パラジウム(Pd/C)を用いてベンジルで保護されたリン酸を触媒的に還元し、エタノール中でベンジル保護基を外した。
【００６８】
図16では、臭化グリシダルをアルコール(ROH)と反応させる代わりにC3位の保護にBnOHを使用することを除き、同様の反応スキームを用いた。前記反応条件においては、K2CO3で処理した後に、C6H6CH2N＋(C2H5)3Cl-アンモニウム塩による処理を行い、これにより、臭素がBn基で置換されることを含んだ。次に、エーテル中の1MのHClおよびおよび無水BnOHを用いてグリシダル中間体の環を開き、C1位を保護した。得られたジエーテル中間体はC2位に、水酸基を有している。ジエーテルを、K2CO3の水溶液に溶解したハロゲン化物塩(RX)と混合し、C2位においてエーテル結合を介して結合したR基を有する保護された中間体を得た。1,3-ジオールを得るために、60psiのH2雰囲気下、活性炭-10％パラジウム(Pd/C)を用いて触媒的還元を行い、この中間体を脱保護した。ジオールを1H-テトラゾールと混合、撹拌し、この混合物にジベンジルジイソプロピルホスホラミダイトに添加した。反応混合物をTLCでモニターし、適当な時間でホスホネートをインサイチューで過酢酸により酸化してリン酸塩に変換した。前記反応混合物をカラムクロマトグラフィで精製し、ベンジル保護されたリン酸塩を得た。1,3-二リン酸を得るために、60psiのH2雰囲気下で活性炭-10％パラジウム(Pd/C)を用いてベンジルで保護したリン酸の触媒的還元を行い、エタノール中でベンジル保護基を外した。
【００６９】
図6Aのようにして調製したジエーテル中間体(例えば、RとR1置換基を含む)を使用して、トシル基を除くと複数の修飾リン酸およびホスホネートをC1位に結合させることができる。図7Aに示すように、塩基性条件下で中間体をX4-Z1-PO(O-保護基)2と反応させる。ここで、Z1 は -(R3)CH-であり、X4は水素である。塩基性条件によって、トシル酸保護基を外し、修飾リン酸塩-Z1-PO(O-保護基)2をCl位に単結合させる。TMSBr処理により保護基を外し、C1位が-(R3)CH-PO(OH)2基を得る。図7Bに示すように、トリス(テトラ-n-ブチルアンモニウム)を用いた塩基性条件下で、中間体をX4-Z1-PO(OH)-Z2-PO(OH)2と反応させる。ここで、Z1が-O-であり、Z2が-CH2-、およびX4は水素である。塩基性条件によって、トシル酸保護基を外し、修飾ホスホネート-Z1-PO(OH)-Z2-PO(OH)2がC1位に単結合させる。酸性条件でCH3CNを用いて処理した場合には、-O-PO(OH)-CH2-PO(OH)2基がC1位に結合する。図7Cに示すように、塩基性条件下で中間体をX4-Z1-PO(O-保護基)2と反応させる。ここで、Z1が-OCH2CH2-であり、X4は水素である。塩基性条件によって、トシル酸保護基を外し、修飾リン酸塩-Z1-PO(O保護基)2がCl位に単結合させる。コリジンに溶解したTMSBrと水洗によって、保護基を外し、C1位が-OCH2CH2-PO(OH)2 基となる。
【００７０】
構造的に束縛された式(III)の環状リン酸化合物を調製する目的で、図11に示す合成スキームにおいて、化合物26〜30を出発原料として用いた。化合物26〜30を1H-テトラゾールと反応させ、得られた産物をジ-tert-ブチルジイソプロピルホスホラミダイトで処理した。これにより、分子内環化が起こる。ホスホネートの過酢酸によるインサイチュー酸化により、環状リン酸中間体が得られた。TFAによる還元により、式(III)の化合物が得られた。
【００７１】
他の構造的に束縛を受けた化合物も調製することができる。
【００７２】
図12に示すのは、X1とX2が互いに-O-PO(OH)-O-である環状リン酸を調製する別のスキームである。ベンジル保護された 1,3-ジオール中間体をPOCl3と反応させ、分子内環化させた。H2雰囲気下で活性炭-10％パラジウム(Pd/C)を用いた処理(上記のように実施)により、C2位の炭素に結合した水酸基を有する環状リン酸を得る。 次に、環状中間体を過剰のR-トリフレートおよび2,6-ジ-tert-ブチル-4-メチルピリジンで処理し、最終的な化合物を得た。
【００７３】
図13に示すのは、X1とX3がともに-O-PO(OH)-NH-である環状リン酸を調製するスキームである。上記のようにして調製した中間体35〜43を出発原料として用い、トリス(1,2,4,-トリアゾール)リン酸による処理後、2％のHClで洗浄して、分子内環化させる。
【００７４】
図14に示すのは、リン酸基が環の一部ではなく、具体的には、X2とX3がともに-N(H)-C(O)-N(R1)-である環状化合物を調製するスキームである。上記のようにして調製した中間体50〜54を出発原料として用い、無水 COCl2で処理し、環化過程においてC2およびC3炭素に結合したアミン間にカルボニルを挿入する。 H2雰囲気下、活性炭-10％パラジウム(Pd/C)を用いてリン酸からベンジル保護基を外した(上記のように行った)。
【００７５】
LPA受容体のアゴニストもしくはアンタゴニストとして用いることのできる他の種類の化合物は、脂肪酸リン酸もしくは直鎖状リン酸である。 図8に示されるように、無水塩化メチレンは無水n-アルカノールおよび1H-テトラゾールを溶解してもよい。無水塩化メチレンに溶解したジベンジル-N,N-ジイソプロピルホスホラミダイトの溶液を加えることができる。その後、無水塩化メチレン中の過酢酸を滴下し、ベンジル保護した脂肪酸リン酸101〜105を調製することができる。脂肪酸リン酸106〜110を得るために、H2雰囲気下、活性炭-10％パラジウム(Pd/C)を用いて、無水メタノール中でベンジル保護基を外した(上記のように行った)。
【００７６】
脂肪酸リン酸を調製する代わりに、チオリン酸およびアミドリン酸を調製することもできる。図9に示されるように、例えば、n-メルカプトアルカンおよび1H-テトラゾールを無水塩化メチレンに溶解してもよい。無水塩化メチレンに溶解したジベンジル-N,N-ジイソプロピルホスホラミダイトの溶液を加えることができる。その後、無水塩化メチレンに溶解した過酢酸を滴下し、ベンジル保護した脂肪酸チオリン酸を調製することができる。脂肪酸チオリン酸を得るために、H2雰囲気下で活性炭-10％パラジウム(Pd/C)を用いて無水メタノール中でベンジル保護基を外す(上記のように実施する)。図10に示されるように、例えば、n-アルキルアミンおよび1H-テトラゾールは、無水塩化メチレンに溶解することができる。無水塩化メチレンに溶解したジベンジル-N,N-ジイソプロピルホスホラミダイトの溶液を加えることができる。その後、無水塩化メチレンに溶解した過酢酸を滴下し添加し、ベンジル保護した脂肪酸アミドリン酸を得ることができる。脂肪酸アミドリン酸を得るために、H2雰囲気下活性炭-10％パラジウム(Pd/C)を用いて無水メタノール中で処理後にベンジル保護基を外した(上記のように実施した)。
【００７７】
上記の各々の反応スキームは、図17〜20に示す一級アミン基を攻撃することにより、さらに修飾されうる。例えば、TFAで処理してt-Boc保護基を外した化合物50〜54から中間体を調製し、リン酸を保護したままC2位を一級アミンを得る。
【００７８】
図17においては、C2位に一級アミンを有する中間体化合物は、酸ハロゲン化物(例えば、R1COCl)の攻撃を受け、これによって一級アミンがアミド(-N(H)-C(O)-R1)に変換する。次に、H2雰囲気下、活性炭-10％パラジウム(Pd/C)による処理(上記のように実施する)を用いてベンジルで保護されたリン酸を脱保護することができる。
【００７９】
図18においては、C2位に一級アミンを有する中間体化合物が、POCl3に溶解したN-アセチルイミダゾリンの攻撃を受け、このことによって一級アミンが2級アミン (-N(H)-イミダゾール)に変換する。また、置換されたイミダゾリンも用いることができる。次に、H2雰囲気下、活性炭-10％パラジウム(Pd/C)による処理(上記のように実施する)を用いてベンジルで保護されたリン酸を脱保護することができる。
【００８０】
図19においては、C2位に一級アミンを有する中間体化合物が、R1OC(O)Clの攻撃を受け、これによって一級アミンが  カルバメート (-N(H)-C(O)-O-R1)に変換する。次に、H2雰囲気下、活性炭-10％パラジウム(Pd/C)による処理(上記のように実施する)を用いてベンジルで保護されたリン酸を脱保護することができる。
【００８１】
図20においては、C2位に一級アミンを有する中間体化合物が、R1NCOもしくはR1NCSの攻撃を受け、これによって一級アミンをウラミド(-N(H)-C(O)-N(H)-R1)もしくはチオウラミド(-N(H)-C(S)-N(H)-R1)のいずれかに変換する。次に、H2雰囲気下、活性炭-10％パラジウム(Pd/C)による処理(上記のように実施する)を用いてベンジルで保護されたリン酸を脱保護することができる。
【００８２】
従って、(Y2O)2PO-Z11-Z13もしくは(Y2O)2PO-Z12-P(OH)O-Z11-Z13を式(VI)に記載の中間体化合物と反応させた後、脱保護の工程を実施することによって、本発明の非環状化合物を調製することができる。ここで、Z11は、mが1〜50の整数である -(CH2)m-もしくは -O(CH2)m-または-C(R3)H-もしくは-O-であり、Z12は -(CH2)n- もしくはnが1〜50の整数である -O(CH2)n- または-O-であり、Z13はHもしくは第一の脱離基または第一の脱離基とともに形成する-Z11-Z13であり、Y2はHもしくは保護基である。必要に応じて、反応と脱保護の両方の工程を、X1、X2およびX3のうちの1つもしくは2つが(HO)2PO-Z1-もしくは(HO)2PO-Z2-P(OH)O-Z1-であり、Z1およびZ2が上記で定義される式(I)に記載の化合物が効果的に生成する条件下で実施する。
【００８３】
式(VI)の中間体化合物は次の構造を有する：
2005508319.tif 000017
ここで、X11、X12およびX13のうち少なくとも1つがR11-Y11-A-であり、X11、X12とX13のうちの2つがR11-Y11-A-である場合にはそれぞれが同一であっても異なってもよく、またはX12とX13が互いに結合した-N(H)-C(O)-N(R11)-であり；
X11、X12およびX13のうち少なくとも1つがOH、NH2、SHもしくは第二の脱離基であり、
選択的にX11、X12およびX13のうちの1つがHであり、
Aが、kが0〜30の整数である直接結合(CH2)k、もしくはOであり、
Y11が、lが1〜30の整数である-(CH2)l-、-O-、
2005508319.tif 000018
、-S-、または-NR2-であり、
Q1およびQ2が独立にH2、=NR13、=O、Hおよび-NR14R15の組み合わせであり；
X11、X12およびX13のそれぞれについてR11が独立に水素、直鎖もしくは分岐鎖C1〜C30アルキル、直鎖もしくは分岐鎖C2〜C30アルケニル、環に1置換基、2置換基もしくは3置換基を有するもしくは有していない芳香族環もしくは複素環式芳香族環、C1〜C30のアルキルもしくは芳香族環もしくは複素環式芳香族環を含むアシル、直鎖もしくは分岐鎖C1〜C30のアルキルを含むアリールアルキル、直鎖もしくは分岐鎖C1〜C30のアルキルを含むアリールオキシアルキル、
2005508319.tif 000019
であり、
R12、R13、R14、R15、R16およびR17は、独立に水素、直鎖もしくは分岐鎖C1〜C30アルキル、直鎖もしくは分岐鎖C2〜C30アルケニル、環に1置換基、2置換基もしくは3置換基を有するもしくは有していない芳香族環もしくは複素環式芳香族環、C1〜C30アルキルもしくは芳香族環もしくは複素環式芳香族環を含むアシル、直鎖もしくは分岐鎖C1〜C30アルキルを含むアリールアルキル、または直鎖もしくは分岐鎖C1〜C30アルキルを含むアリールオキシアルキルである。
【００８４】
本発明のLPA受容体アゴニストおよびアンタゴニストを調製し、この化合物を用いて本明細書中で後述する患者の治療に好適な薬学的組成物を調製することができる。それ故、本発明の別の局面は、薬学的に許容される担体と本発明の化合物を含む薬学的組成物に関する。薬学的組成物は適当な賦形剤もしくは安定化剤を含み得るものでもあり、また錠剤、カプセル、粉末、溶液、懸濁剤、エマルジョン等の固体もしくは液体状であってもよい。通常、前記組成物は担体、賦形剤、安定化剤等と共に、有効な化合物を約0.01〜99％、好ましくは有効な化合物を約20〜75％含む。
【００８５】
固体である場合の単位剤形は通常の種類のものでよい。固体の剤形は、本発明の化合物および担体を含む通常のゼラチンタイプ等のカプセルであってもよく、担体としては、例えば、滑沢剤、およびラクトース、ショ糖、もしくはコーンスターチ等の挿入充填剤が挙げられる。別の態様においては、これらの化合物は、アラビアゴム、コーンスターチもしくはゼラチン等の結合剤、コーンスターチ、ジャガイモデンプンもしくはアルギン酸等の崩壊剤、およびステアリン酸もしくはステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤と組み合わせて、ラクトース、ショ糖、もしくはコーンスターチ等の従来の錠剤用基剤を用いて、錠剤化してもよい。
【００８６】
本発明の化合物は、薬学的担体を含む生理的に許容される希釈剤におけるこれらの原料からなる溶液もしくは懸濁剤によって注射可能もしくは局所に投与する剤形として投与することもできる。そのような担体としては、界面活性剤、および佐剤、賦形剤もしくは安定化剤を含む他の薬学的、生理学的に許容される担体が添加されているもしくはされていない、水および油等の滅菌された液体が挙げられる。油の例としては、石油、動物、植物、もしくは合成供給源に由来するものが挙げられ、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油もしくは鉱油が挙げられる。一般的に、水、食塩水、ブドウ糖および類似の糖溶液、およびプロピレングリコールもしくはポリエチレングリコール等のグリコールは、特に、注射可能な溶液のための担体として好適な液体担体である。
【００８７】
エアロゾルの用途であれば、溶液もしくは懸濁剤における本発明の化合物を加圧して、通常の佐剤とともに適当な噴射剤、例えば、プロパン、ブタンもしくはイソブタン等の炭化水素噴射剤を一緒にエアロゾル容器に充填することができる。本発明の物質を、噴霧器もしくは霧化器等で、非加圧的に投与することもできる。
【００８８】
治療効果に応じて、本発明の化合物は、経口、局所、経皮、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔滴注、腔内もしくは膀胱内滴注、眼内、動脈内、病巣内に投与、もしくは鼻、喉、および気管支等の粘膜への適用によって投与することができる。
【００８９】
本発明の範囲に含まれる組成物は、所期の目的の達成に効果的な量の本発明の化合物を含むすべての組成物である。個々の必要量は異なるが、個々の成分の効果的な量の最適範囲の決定は、当技術分野内のものである。通常の用量は、体重kg当たり約0.01mgから約100mgを含む。好適な用量は、体重kg当たり約0.1mgから約100mgを含む。最適な用量は、体重kg当たり約1mgから約100mgを含む。治療に用いる本発明の化合物の投与法についても、当業者であれば容易に決定できる。
【００９０】
本発明のある化合物はLPA受容体アゴニストとして有用であり、本発明の他の化合物はLPA受容体のアンタゴニストとして有用であることが解っている。活性の差異によって、各種化合物は異なる用途を見出されている。本発明の好ましい対象動物は哺乳動物(すなわち、哺乳類に属する個体)である。本発明は特にヒトを対象とした治療に特に有用である。
【００９１】
本発明の一局面は、LPA受容体アゴニストもしくはLPA受容体アンタゴニストとしての活性を有する本発明の化合物を提供する段階、およびLPA受容体の活性を調節するために効果的な条件下で前記化合物をLPA受容体と接触させる段階を含む、LPA受容体の活性を調節する方法に関する。
【００９２】
LPA受容体は、通常LPA受容体を発現する細胞または特定のLPA受容体を発現するように形質転換した細胞の表面に存在する。好適なLPA受容体としては、EDG-2、EDG-4、EDG-7およびPSP-24受容体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。通常これらの受容体を発現する細胞を含む組織を、上記の表1に示す。細胞に本発明のLPA受容体アゴニストもしくはLPA受容体アンタゴニストを接触させる場合には、細胞残渣をインビトロで接触させることも、インビボで接触させることもできる。
【００９３】
通常は発現していない宿主細胞でこれらの受容体を異種的に発現させるためには、1種もしくは複数種類のこれら受容体をコードする核酸分子を、適当な転写および翻訳制御領域(すなわち、プロモーターおよび転写終結シグナル)を含む発現ベクターにセンス方向で挿入した後、宿主細胞を前記発現ベクターで形質転換することができる。発現ベクターは、細胞ゲノムに組み込むこともでき、または単に染色体外核内物質として存在させることもできる。発現は構成的なものであっても誘導的なもののいずれでもよいが、構成的発現のほうが大方の目的には適している。
【００９４】
EDG-2のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、Anら(1997b)が報告しており既知である。これはゲンバンクアクセッション番号U80811に対応し、本明細書に参照として組み入れられる。EDG-2をコードする 核酸分子は、以下の配列番号1のヌクレオチド配列を有している。
2005508319.tif 000020
コードされるEDG-2受容体は、以下の配列番号2のアミノ酸配列を有する。
2005508319.tif 000021
【００９５】
EDG-4のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、Anら(1998b)が報告しており既知である。これは、ゲンバンクアクセッション番号NM_004720に対応し、本明細書に参照として組み入れられる。EDG-4をコードする核酸分子は、以下の配列番号3のヌクレオチド配列を有している。
2005508319.tif 000022
コードされるEDG-4受容体は、以下の配列番号4のアミノ酸配列を有する。
2005508319.tif 000023
【００９６】
EDG-7のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、Bandohら(1999)が報告しており既知である。これは、ゲンバンクアクセッション番号NM_012152に対応し、本明細書に参照として組み入れられる。EDG-7をコードする核酸分子は、以下の配列番号5のヌクレオチド配列を有している。
2005508319.tif 000024
コードされるEDG-7受容体は、以下の配列番号6のアミノ酸配列を有する。
2005508319.tif 000025
【００９７】
PSP-24のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、Kawasawaら(2000)が報告しており既知である。これは、ゲンバンクアクセッション番号AB030566に対応し、本明細書に参照として組み入れられる。PSP-24をコードする核酸分子は、以下の配列番号7のヌクレオチド配列を有している。
2005508319.tif 000026
コードされるPSP-24受容体は、以下の配列番号8のアミノ酸配列を有する。
2005508319.tif 000027
【００９８】
LPA受容体アゴニストは、LPA受容体からLPA様活性を誘導する特徴があり、これは、化学的(例えば、卵細胞におけるCa2＋ もしくはCl-電流)、もしくは細胞形態、運動性、増殖等の変化を調べることのいずれかにより測定することができる。対照的に、LPA受容体アンタゴニストは、LPA受容体に対してLPA様活性を阻害する特徴がある。これに関しても、化学的(例えば、卵細胞におけるCa2＋もしくはCl- 電流)、もしくは細胞形態、運動性、増殖等の変化を調べることのいずれかにより測定することができる。
【００９９】
本発明の化合物はLPA受容体アンタゴニストとして働くので、本発明はまた、LPAで誘導されたLPA受容体上の活性を阻害する方法に関する。この方法は、LPA受容体アンタゴニストとしての活性を有する本発明の化合物を提供する段階、およびLPA受容体のLPAによって誘起される活性を効果的に阻害する条件下で、前記化合物をLPA受容体と接触させる段階を含む。LPA受容体は上で定義されるものであってもよい。LPA受容体は、通常受容体を発現する、もしくは異種的に受容体を発現する細胞の表面に存在する。LPA受容体に本発明の化合物を接触させる場合には、インビトロで接触させることも、インビボで接触させることもできる。
【０１００】
上記のように、LPAは、上記のLPA受容体を含むLPA受容体に媒介されるシグナル伝達を含む複数の異なる細胞内経路に関与するシグナル伝達分子である。それ故、本発明の化合物は、LPA受容体アンタゴニスト、もしくはLPA受容体アゴニストのいずれかの作用で細胞動態に対するLPAの効果を調節すると予想される。
【０１０１】
本発明の一局面は、本発明の化合物を提供する段階、および癌を効果的に治療する方法で患者に効果的な量の前記化合物を投与する段階を含む、癌の治療法に関する。本発明の化合物で治療することのできる癌の種類としては、癌細胞の挙動が少なくとも部分にはLPAの媒介する活性によるものである癌細胞により特徴付けられるこれらの癌が挙げられる。 通常、この種の癌は1種類または複数種類のLPA受容体を発現する癌細胞として特徴付けられる。癌の形態の例としては、前立腺癌と卵巣癌が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１０２】
癌治療において特に有用である本発明の化合物はLPA受容体アンタゴニストである。
【０１０３】
本発明の化合物を投与する場合には、全身投与することもできるし、または、癌細胞が存在する特異的部位に直接投与することもできる。従って、前記化合物の癌細胞への送達に効果的である方法で投与することができる。特定の理論に拘束されなくとも、LPA受容体アンタゴニストはLPA受容体に結合することによって、癌細胞の増殖もしくは転移を阻害する、または癌細胞を破壊すると考えられる。後述の実施例12に示されるように、本発明の複数のLPAアンタゴニスト化合物は、上記の種類のLPA受容体を1種もしくは複数種類発現する前立腺癌細胞株に対し毒性を示した。
【０１０４】
癌の治療の目的で、本発明のLPAアンタゴニスト化合物もしくは薬学的組成物を投与する場合には、薬学的組成物は、各種の癌の治療を目的とした現在既知であるもしくは今後開発される他の治療薬もしくは治療法を含む、もしくは共に投与することができる。
【０１０５】
癌の浸潤は、個々の細胞もしくは細胞集団が原発腫瘍から脱離して、全身循環もしくはリンパ管に至り、異なる器官に広がる複雑な複数事象からなる過程である(Liottaら、1987)。 この過程において、腫瘍細胞が毛細血管で止まり、管外に遊出し、組織の間質へと遊走して、二次的な病巣を形成する必要がある。第一に、腫瘍細胞は循環を停止させる内皮細胞のシグナルを認識する必要がある。第二に、腫瘍細胞は細胞表面のラミニン受容体により基底膜の糖蛋白質ラミニンに接着する必要がある。基底膜への接着後に、腫瘍細胞は基底膜を分解するプロテアーゼを分泌する。 接着および局所での分解後、浸潤の第三の段階は腫瘍細胞の遊走である。細胞の運動性が腫瘍細胞の浸潤および転移に中心的な役割を演じる。腫瘍細胞のインビトロでの運動性と動物実験における転移の挙動の関係は強い直接的な相関を示す(Hoffman-Wellenhofら、1995)。PLGFがインビトロにおける癌細胞の増殖を促進し、浸潤性を増加させることについては詳細な報告がある。Imamuraらは、癌細胞の浸潤に血清因子が必要であることを見いだし(Imamuraら、1991)、その後LPAが血清を含まない系では腫瘍細胞の浸潤を完全に回復できる最も重要な血清成分であることが明らかになった(Xuら、1995a; Imamuraら、1993; Mukaiら、1993)。
【０１０６】
PLGFRが卵巣癌細胞株、すなわち、OCC1およびHEY細胞に発現することが示されている。具体的には、RT-PCR解析より、EDG-2およびEDG-7受容体がこれらの細胞株に存在することが示されている。最近、Imら(2000)は、EDG-7が前立腺癌細胞株、すなわち、PC-3およびLNCaP細胞に発現することを明らかにした。前立腺癌細胞株DU-145、PC-3およびLNCaP株に関するRT-PCR解析から、EDG-2、4、5およびEDG-7がこれら前立腺癌細胞株のいずれにおいても存在し、EDG-3は前立腺癌細胞株LNCaPおよびDU-145に存在することが示されている。
【０１０７】
実施例に示されるように、本発明の複数のLPA受容体のアンタゴニストは、特異的な前立腺癌細胞株および特異的な卵巣癌細胞株を標的化できる。従って、本発明のLPAのアンタゴニストは、前立腺癌および卵巣癌を含むLPAが媒介する癌の別の治療法を提供する。
【０１０８】
本発明の他の局面は、細胞増殖を促進する方法に関する。細胞増殖を促進するこの方法は、LPA受容体のアゴニストとしての活性を有する本発明の化合物を提供する段階、およびLPA受容体誘導性の細胞増殖を効果的に促進する方法で細胞表面の前記LPA受容体を化合物と接触させる段階を含む。
【０１０９】
癌細胞の活性を調節する際のLPAの役割に加えて、LPAが自然的創傷治癒において生理学的役割を果たしていることを強く示唆する所見がある。創傷部位では、活性化血小板に由来するLPAは、他の血小板に由来する因子とおそらく同期して、少なくとも部分的には傷害および炎症部位における細胞の増殖刺激を担うと考えられる(Balazsら、2000)。さらに、LPAそれ自身が血小板凝集を刺激する。これが、次に初期凝集応答の陽性フィードバック要素を惹起する因子となることができる(Schumacherら、1979; Tokumuraら、1981; Gerrardら、1979; Simonら、1982)。
【０１１０】
LPAは細胞増殖に一定の役割を果たすので、LPA受容体アゴニスト活性を有する化合物は、創傷治癒を促進する効果的な方法で使用することができる。従って、本発明の別の局面は、創傷の治療法に関する。この方法は、LPA受容体のアゴニストとしての活性を有する本発明の化合物を提供し、創傷治癒を促進する細胞のLPA受容体に前記化合物が結合する創傷部位に効果的な量の前記化合物を送達することによって、創傷治癒を促進するためにLPA受容体のアゴニストにより誘導される細胞増殖を刺激することによって行なわれる。
【０１１１】
創傷治療の主な目標は、創傷の閉合である。開放性の皮膚創傷は、創傷の主要なカテゴリーの一つであり、火傷、神経症性潰瘍、褥瘡、静脈性うっ血性潰瘍および糖尿性潰瘍を含む。開放性の皮膚創傷は、通常、以下の6つの主要な構成要件からなる過程を経て治癒する。すなわち、(1)炎症、(2)線維芽細胞の増殖、(3)血管造成、(4)結合組織の合成、(5)上皮化、および(6)創傷の縮小である。これらの構成要件のいずれか一つ、もしくはそのすべてが正常に機能しない場合には、創傷の閉合による治癒が起こらない。栄養不良、感染、薬物(例えば、アクチノマイシンおよびステロイド)、糖尿病および老化を含む多種の因子が創傷治癒に影響しうる(HuntおよびGoodson、1988を参照のこと)。
【０１１２】
リン脂質が、細胞分裂(Xuら、1995b)、アポトーシス、細胞接着、および遺伝子発現の制御等の細胞活性に重要な制御因子であることが示されている。具体的には、例えば、LPAは細胞増殖(Moolenaar、1996)および細胞遊走(Imamuraら、1993)に対し増殖因子様の効果を誘起する。LPAは創傷治癒および再生に関係していることも示唆されている(TigyiおよびMiledi、1992)。
【０１１３】
一般的に、線維芽細胞、内皮および上皮細胞の創傷へのより迅速な流入を促す薬剤は創傷治癒の速度を増加させるべきものである。創傷の治療に有用である本発明の化合物は、複数のインビトロおよびインビボモデルにより同定、試験が可能である。
【０１１４】
創傷治癒の構成要件の異なるインビトロ系のモデルは、例えば、線維芽細胞(Verrierら、1986)、内皮細胞 (Miyataら、1990)もしくは上皮細胞 (Karthaら、1992)等による、集密単層状態の組織培養細胞の「創傷」における細胞の回復が挙げられる。別の系を用いることによって、内皮細胞の遊走および/もしくは増殖の測定が可能となる(Mullerら、1987; Satoら、1988)。
【０１１５】
創傷治癒のインビボモデルも当技術分野において公知であり、創傷を含む豚の表皮(Ohkawaraら、1977)もしくは薬剤によって誘導したハムスターの頬嚢の口腔粘膜病変(Cherrickら、1974)が挙げられる。
【０１１６】
創傷治癒に効果的である本発明の化合物を組み合わせて投与することもできる。すなわち、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗寄生虫剤、抗炎症剤、鎮痛剤、鎮痒薬もしくはその組み合わせからなる群より選択される薬剤を本発明の薬学的組成物中に混合して、もしくは同時に異なる経路で投与することもできる。
【０１１７】
創傷治癒に関し、好適な投与形態は、局所的経路でなされる。しかしながら、択一的にもしくは同時に、前記薬剤を非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内もしくは経皮的経路で投与してもよい。択一的にもしくは同時に、経口経路で投与することもできる。投与量は、投与を受ける者の年齢、健康状態、および体重、同時に実施している治療があればその治療法、治療頻度、およびに所望の効果の性質に依存すると考えられる。
【０１１８】
好適な局所投与に関しては、特に創傷を有するヒトおよび動物を治療する場合には、効果的な量の本発明の化合物を、例えば、皮膚表面等の創傷部位に投与することが好ましい。この量は通常、一回当たり約0.001mgから約1gの範囲であり、これは治療する面積、症状の重傷度および用いる局所賦形剤の性質に依存すると考えられる。好ましい局所製剤は、PEG-1000等の軟膏基剤1ml当たり約0.01mgから約50mgの有効成分が用いられる軟膏である。
【０１１９】
本発明は更に、アポトーシスを阻害するかまたは細胞、組織もしくは臓器の機能を維持もしくは回復する方法を提供する。本方法は、LPA受容体のアゴニストとしての活性を有する本発明の化合物を提供すること、並びにアポトーシスを処置する、もしくは細胞、組織、または臓器を、細胞、組織、もしくは臓器の機能を維持または回復するのに有効量の化合物と接触することにより実行される。この接触は、インビトロ(すなわち、細胞培養または臓器もしくは組織の移植時)またはインビボ(すなわち、以下に説明されるように患者へ化合物の有効量を投与することにより)において実行することができる。
【０１２０】
治療することができる様々な適応症は、アポトーシス、虚血、外傷性損傷および再灌流障害に関連したものを含むが、これらに限定されるものではない。アポトーシスに関連した状態は、加齢の皮膚作用、虚血性事象後の再灌流の作用、免疫抑制、胃腸の混乱、心臓血管系障害、組織移植の拒絶反応、創傷治癒、およびアルツハイマー病を含むが、これらに限定されるものではない。この治療は、免疫抑制ウイルス、化学療法剤、または放射線療法および免疫抑制剤に随伴したアポトーシスに関連した問題点を縮小することもできる。
【０１２１】
これらの治療は同じく、臓器移植の全ての段階にも適している。LPA受容体に対するアゴニスト活性を有する化合物は、ドナーにこの化合物を臓器を安定化するまたは維持するのに有効量投与することにより、臓器を調製するために使用することができる。この臓器は、この化合物を含有するOPSで再灌流されるかおよび／またはその中で維持することができる。その後この臓器のレシピエントは、臓器の安定性および機能を向上するのに有効量のこの化合物を投与され得る。これらの組成物は、移植または他の外科的介入に関連しているかどうかに関わらず、心臓麻痺の治療における使用に特に適している。
【０１２２】
アポトーシスに関連した問題点は、HIVを含むが、これらに限定されるものではないウイルス、化学療法剤、および放射線療法を含むが、これらに限定されるものではない様々な刺激により引き起こされる。これらの刺激は、消化管組織のものおよび関連した胃腸の混乱を含むが、これらに限定されるものではない様々な障害においてアポトーシスを引き起こす。
【０１２３】
胃腸の混乱は、腸管内層の損傷、重度の慢性潰瘍、結腸炎、放射線が誘発した損傷、化学療法が誘導した損傷、および寄生体が引き起こした胃腸の混乱、並びに他の原因による下痢を含むが、これらに限定されるものではない。様々なウイルスおよび細菌の感染症が、胃腸の混乱を生じることは公知である。LPA受容体に対するアゴニスト活性を有する化合物は、これらの感染症に関連した副作用の治療における使用にも適している。このような化合物は、化学療法に関連した胃腸の混乱の改善における使用に特に適している。従ってこのような化合物は、化学療法に関連した下痢のみではなく、悪心の予防における使用に適している。
【０１２４】
これらの化合物は、家畜および飼い馴らされた動物を含むが、これらに限定されるものではない動物における様々な胃腸の状態の治療に特に適している。このような状態、特に下痢は、脱水および栄養不良による多くの子ウシおよび子イヌの死亡を説明している。胃腸の状態の治療は、好ましくは胃腸への投与による。家畜および飼い馴らされた動物の場合、都合がよいことにこれらの化合物の有効量を食餌に混合することができる。ヒトにおいて、投与は、胃腸への投与の技術分野において公知の方法のいずれかによることができる。好ましい投与は経口である。
【０１２５】
加えて、LPA受容体に対するアゴニスト活性を有する化合物は、AIDS患者において認められるような免疫不全の増悪を生じるような状態に随伴したT細胞のアポトーシスによる死を予防または少なくとも緩和するために、免疫不全の患者、特にHIV-陽性患者に投与することができる。好ましくは、このような患者への投与は、非経口であるが、経皮的または経胃腸的に投与することもできる。
【０１２６】
LPA受容体に対するアゴニスト活性を有する化合物は、冠動脈閉塞；脳梗塞；脊髄／頭部外傷およびこれに随伴する重度の麻痺；凍傷、冠動脈血管形成、血管付着、四肢付着、臓器付着および腎再灌流のような他の傷害に起因した再灌流障害を含むが、これらに限定されるものではない様々な状態に関連した再灌流障害に随伴したアポトーシスを処置するために投与することもできる。
【０１２７】
心筋梗塞および脳梗塞(卒中)は、一般に塞栓、血栓、または巨視的領域の壊死を生じる圧力に起因した突然の不充分な動脈血または静脈血の供給により引き起こされ；恐らく心臓、脳、脾臓、腎臓、小腸、肺および精巣が罹病される可能性が高い。細胞死は、この領域への血液の再灌流時に梗塞を取り囲む組織において生じ；従ってこの組成物は、梗塞の開始時、再灌流時、又はそれらの直後に投与される場合に有効である。本発明は、LPA受容体に対するアゴニスト活性を有する化合物の治療有効量を、そのような治療を必要とする患者へ投与することによる、再灌流障害を治療する方法を含む。
【０１２８】
本発明は更に、LPA受容体に対するアゴニスト活性を有する化合物の治療有効量を、そのような治療を必要とする患者へ投与することによる、心臓発作および卒中のリスクが高い患者について心筋梗塞および脳梗塞に随伴した損傷を軽減する方法を包含している。好ましくは、このような損傷の治療は、このような化合物の非経口投与による。しかし例えば、いずれか他の適当な方法を、心筋梗塞の場合は直接の心臓への注射を使用することができる。このような注射用器具は、当該技術分野において公知であり、例としてはアボジェクト（Aboject）心臓用注射器がある。
【０１２９】
本発明は更に、LPA受容体に対するアゴニスト活性を有する化合物を、哺乳類の臓器、組織、および細胞を培養または維持する際に当該技術分野において使用される培地または溶液に添加することにより、哺乳類の臓器、組織、および細胞の培養または維持の際に、細胞におけるアポトーシスを制限および予防するか、さもなければ細胞を保持する方法を提供する。
【０１３０】
本発明は更に、LPA受容体に対するアゴニスト活性を有する化合物を、細胞、組織もしくは臓器の機能を維持もしくは回復するのに有効量、または培養物中の細胞のアポトーシスを制限もしくは予防するのに有効量含有する、哺乳類の臓器、組織および細胞を培養しおよび維持する当該技術分野において公知の培地および溶液を包含している。本発明のこれらの局面は、LPA受容体に対するアゴニスト活性を有する化合物の少なくとも1種を有効量含有する哺乳類細胞の培地、並びに細胞、組織もしくは臓器の機能を維持もしくは回復するため、または哺乳類細胞培養物中のアポトーシスを制限もしくは予防するための、そのような培地の使用を包含している。有効量は、アポトーシスの割合を減少しおよび／または細胞、組織または臓器を維持する量である。このような化合物は、細胞が通常はアポトーシスを刺激するような中程度の外傷を受けるような環境下で、アポトーシスを制限または防止することができる。例示的外傷は、低レベルの照射、凍結細胞ストックの解凍、培地中の温度、pH、浸透圧、もしくはイオン濃度の急な変化、細胞毒への曝露、初代細胞培養物の調製における細胞の無傷の組織からの解離、および血清枯渇(または血清非含有培地における増殖)を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１３１】
従って本発明は、組織の培地およびLPA受容体に対するアゴニスト活性を有する化合物を有効量含有する組成物を包含している。本組成物が抗アポトーシス性培地補充物として添加され得る無血清培地は、AIM V(P培地、NeumanおよびTytell低血清培地、Trowell T8培地、Waymouth MB 752/1および705/1培地、並びにWilliams培地Eを含むが、これらに限定されるものではない。無血清培地に加え、LPA受容体に対するアゴニスト活性を有する化合物が抗アポトーシス性培地補充物として添加され得る適当な哺乳類細胞培地は、イーグル基礎培地、Fischer培地、McCoy培地、培地199、RPMI培地1630および1640、F-10およびF-12栄養混合物を基にした培地、Leibovitz L-15培地、Glasgow最小必須培地、およびダルベッコ変法イーグル培地を含むが、これらに限定されるものではない。LPA受容体に対するアゴニスト活性を有する化合物が添加され得る哺乳類細胞培地は更に、当該技術分野において公知の培地補充物のいずれかを含む。補充物の例は、糖質、ビタミン、ホルモン、メタロプロテイン、抗生物質、抗真菌剤、増殖因子、リポタンパク質、および血清を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１３２】
本発明は更に、溶液がLPA受容体に対するアゴニスト活性を有する化合物を有効量含有するような、哺乳類の臓器を移植前に維持する溶液、並びにそれらの移植前の外科的摘出および取扱い時に、処置した哺乳類臓器の臓器の機能を維持または回復し、もしくはアポトーシスを制限または防止するためのこのような溶液の使用を包含している。これらの溶液は、臓器を流水洗浄(rush)、灌流および／または貯蔵するために使用することができる。全ての場合において、臓器への損傷を制限または防止するために必要な化合物(LPA受容体に対するアゴニスト活性を有する)の濃度は、当該技術分野において公知の方法により当業者により経験的に決定することができる。
【０１３３】
前述のことに加え、LPA受容体に対するアゴニスト活性を有する化合物は、様々な皮膚科学的状態を治療するために皮膚へ局所的に塗布することができる。これらの状態は、脱毛並びに加齢および／または光障害に起因した皺を含むが、これらに限定されるものではない。従って本発明は、皮膚科学的状態を治療する方法も包含している。特に脱毛は、毛包細胞のアポトーシスにより引き起こされ得る(Stennら、「Expression of the bcl-2 Protooncogene in the Cycling Adult Mouse Hair Follicle」、J. Invest. Dermatol.、103:107-111(1994)、これは本明細書に参照として組入れられている)。従って、LPA受容体に対するアゴニスト活性を有する化合物は、連続脱毛を予防するための皮膚の局所的治療における使用に適している。
【０１３４】
様々な皮膚状態は、LPA受容体に対するアゴニスト活性を有する化合物(またはそれを含有する組成物)を有効量局所的に塗布することにより治療されることが好ましい。このような化合物の有効量は、皮膚科学的状態の症状を改善または縮小するものである。好ましくは、この治療は、皮膚科学的状態の解決または正常な皮膚機能の回復を生じるが、何らかの症状の改善または軽減も、本発明により包含される。
【０１３５】
実施例
以下に実施例を示すが、これは例として示すものであって、添付の特許請求の範囲に記載する本発明の範囲を制限するものではない。
【０１３６】
方法と材料
融点(mp)はいずれもトーマス-フーバー毛細管融点(mp)装置を用いて測定したが、補正は行わなかった。
【０１３７】
1Hおよび13C核磁気共鳴(NMR)スペクトルは、ブルカ(Bruker) AX 300 分光計(300、75.5MHz)で記録した。化学シフト値(δ)は、テトラメチルシラン(TMS)に対する百万分率(ppm)で表した。ピークは次のように略記する。sは一重項、dは二重項、tは三重項、qは四重項、bsはブロードな一重項、mは多重項である。
【０１３８】
プロトン、炭素13およびリン31磁気共鳴スペクトルは、ブルカ(Bruker) AX 300 分光計を用いて得られた。プロトンおよび炭素13化学シフトはテトラメチルシラン(TMS)に対する百万分率(δ)として表す。リン31スペクトルは、アセトン-d6中の0.0485Mのトリフェニルリン酸をδ＝0ppmとした場合の相対的な百万分率(δ)として表す。
【０１３９】
パーキン エルマー システム(Perkin Elmer System) 200-FTIRを用いて、赤外(IR)スペクトルを記録した。
【０１４０】
マススペクトル(MS)は、ブルカ  エスクワイア(Bruker Esquire) AGもしくはブルカ  エスクワイア(Bruker Esquire)LC/MS 分光計のいずれかを用いて、エレクトロスプレー インターフェイス(Electrospray Interface)(ESI)を使用した直接注入により陽性もしくは陰性モードのいずれかで記録した。スペクトルのデータは、割り当てられた構造と一致していた。
【０１４１】
元素分析はアトランティック マイクロラボ社(Atlantic Microlabs, Inc.) (Norcross、GA)に依頼し、実測値は理論値の±0.4％以内であった。
【０１４２】
フラッシュカラムクロマトグラフィには、シリカゲル(Merk、230〜400メッシュもしくは200〜425メッシュ、60A0) を用いた。
【０１４３】
分析TLCは、アルミニウムの裏打ち(厚さ200もしくは250ミクロン)を有するシグマ-アルドリッチ(Sigma-Aldric)のシリカゲル60F 254TLCシートを用いて実施した。
【０１４４】
試薬、溶媒、およびクロマトグラフィの媒体はいずれも、特記しない限り、アルドリッチ(Aldrich Chemical Company)(Milwaukee、WI)、フィシャーサイエンティフィック(Fisher Scientific)(Pittsburgh、PA)もしくはシグマ(Sigma Chemical Co.)(St. Louis、MO)のいずれかから購入したものであり、さらに精製することなく使用した。テトラヒドロフラン(THF)は、ベンゾフェノンを指標として用い金属ナトリウムから蒸留によって乾燥を行った。無水塩化メチレン(CH2Cl2)は、水素化カルシウム(CaH2)から蒸留した。モノグリセリドはいずれも、Nu-Check -Prep (Minneapolis、MN)から得た。t-Boc-L-セリンはフルカ(Fluka)から購入した。
【０１４５】
脂質はいずれもアバンティ ポーラー リピッド(Avanti Polar Lipids)(Alabaster、AL)から購入した。脂肪酸を含まないウシ血清アルブミン(BSA)。LPA は使用前に、1mM EGTAを含みCa2＋を含まないハンクス平衡塩溶液に溶解した1mMのBSAと1：1のモル比で混合した。他の脂質はいずれのアリコートも、MeOHに溶解し、使用前にLPAと混合した。もしくは、これ以外の場合には、特記した。
【０１４６】
サイトフェクテン トランスフェクション(Cytofectene transfection)試薬は、バイオラッド(Bio-Rad; Hercules、CA)から購入した。フラ(Fura)-2AMはモレキュラープローブ(Molecular Probes)(Eugene、OR)から購入した。
【０１４７】
培地、ウシ胎児血清(FBS)およびG418は、セルグロ(Cellgro；Herndon、VA)から購入した。
【０１４８】
ヒトEdg-4を安定に発現するRH7777細胞はKevin Lynch博士(バージニア大学、Charlottesville、VA)の好意により提供された。ヒト Edg-4およびEdg-7をコードするフラッグ(Flag)タグの付加したcDNAはpcDNA3発現プラスミド(Invitrogen、Carlsbad、CA)に挿入されており、Junken Aoki博士(東京大学、東京、日本)の多大な提供によるものであった。RH7777およびNIH3T3細胞は、米国菌培養収集所(American Type Culture Collection)(Manassas、VA)から得た。HEY細胞は、Lisa Jennings博士(テネシー大学、Memphis)から提供されたものである。細胞株はいずれも、10％FBSおよび2mM グルタミンを含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で維持した。アフリカツメガエル(Xenopus laevis)成体から卵細胞を、既報(Tigyiら、1999)のように調製した。
【０１４９】
安定トランスフェクション
RH7777細胞をヒト Edg-2、Edg-4、もしくはEdg-7をコードするcDNA構築物でトランスフェクションした後、サイトフェクテン トランスフェクション試薬を用いて供給元のプロトコールに従い、pcDNA3発現ベクターにサブクローニングした。トランスフェクションした細胞を、10％FBSおよび1 mg/mlのジェンタマイシンを含むDMEMで選抜した。耐性細胞を回収して、限界希釈法によりサブクローニングした。次に、得られたクローンは機能アッセイ法およびRT-PCR解析を使用してスクリンーニングした。データは異なる3クローンの代表的なものを表す。
【０１５０】
一過性トランスフェクション
トランスフェクションの前日にポリリジンでコートしたカバーグラス(Bellco、Vineland、NJ)にRH7777細胞を蒔いた。次の日、6 μ l のサイトフェクテンと混合した1 μ g の プラスミドDNAで細胞を一晩(16〜18時間)トランスフェクションした。次に、細胞をDMEMで二回洗い、10％FBSを含むDMEMで培養した。次の日、細胞をDMEMでリンスし、最低でも細胞内カルシウムイオンのモニター2時間前に、血清を除いた。
【０１５１】
細胞内Ca2＋の測定とデータ解析
既報に従い(Tigyiら、1999)、蛍光Ca2＋指示薬フラ(Fura)-2AMを用いて細胞内Ca2＋変化をモニターした。細胞内Ca2＋の測定データ点は、一過的に誘起したCa2＋のピークの全面積を表し、FLウィンラボ(WinLab)ソフトウエアー(Perkin-Elmer、Wellesley、MA)で決定した。データ点は、少なくともの3回の測定の平均値±標準偏差を表す。データ点の有意性は、スチューデントt-検定を用いて決定し、P < 0.05である場合に値を有意であるとした。
【０１５２】
アフリカツメガエル卵細胞における電気生理学的データ
LPAによって誘起された振動性Cl-電流を、既報(Tigyiら、1999)に従い、電極電圧型クランプシステムを用いて記録した。
【０１５３】
EdgおよびPSP24 mRNAのRT-PCR解析
RT-PCRによるEdgおよびPSP24受容体のmRNAの同定は、既報(Tigyiら、1999)に従い、以下のオリゴヌクレオチド配列を用いて実施した。
2005508319.tif 000028
2005508319.tif 000029
【０１５４】
細胞増殖アッセイ法
NIH3T3細胞の増殖は、既報(Tigyiら、1999)に従い、直接的に細胞を計数して評価した。NIH3T3細胞を10％FBS含有したDMEMの入った24穴プレートに10,000細胞/ウェルの密度で蒔いた。次の日、細胞をリンスし、DMEM中で6時間、血清飢餓状態にした。次に、脂質を24時間添加した。細胞数をコールターカウンター(Coulter Electronics、Hialeah、FL)で計数し決定した。
【０１５５】
3Hチミジンの取り込み
RH7777細胞への3Hチミジンの取り込みは、既報(Tigyiら、1994)に従い決定した。
【０１５６】
実施例1  N-(tert-ブトキシカルボニル)-L―セリン β-ラクトン、中間体化合物25の合成
低温温度計および100ml滴下漏斗を備えた500mlの3つ首フラスコを用いた。ガラス器具はいずれも、使用前にアルゴン(Ar)下で炎光乾燥した後、室温まで冷却した。このフラスコにトリフェニルホスフィン(Ph3P)(10g、38mmol、真空下でP2O5により72時間乾燥させた)および蒸留したばかりのTHF(190ml)を添加した。溶液をアルゴン下で冷却し、-78℃で撹拌した(ドライアイス-アセトン浴)。激しく撹拌しながら、蒸留したばかりのジエチルアゾジカルボキシレート(DEAD)(6.2ml、39.9mmol)をシリンジで30分かけて添加した。添加し終わった後、ミルク状の白色ペーストが得られるまで(約30〜40分)、混合物を撹拌した。蒸留したばかりのTHF(75ml)中のN-(tert-ブトキシカルボニル)-L-セリン(24) (7.79 g、38mmol、真空下でP2O5により72時間乾燥した)の溶液を、反応混合物に45分かけて滴下で添加した。アルゴン下で混合物を-78℃で一晩撹拌し、0℃に暖めた(温度が-10℃になった段階で、フラスコを氷浴に置いた)。約30分後に、氷浴を水浴に換え、反応混合物を2時間撹拌し、30℃で回転式蒸発装置を用いて淡黄色油状になるまで濃縮した。次に、この油状物質を25％EtOAc/ヘキサン(100 ml)で処理し、得られた白色固体を濾過によって除き、25％EtOAc/ヘキサン(2 x 70 ml)で洗浄した。ろ液を混合して濃縮し、残った油状物質を順次25％(500ml)および30％ (1500ml)EtOAc/ヘキサンを用いたシリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィにかけた。
【０１５７】
適当な画分を混合して、白色固体3.4g(47％)を得た。
2005508319.tif 000030
【０１５８】
実施例2  化合物26〜34の合成
用いたガラス器具はアルゴン雰囲気下で炎光乾燥した後、室温まで冷却した。アルゴン雰囲気下で反応を行った。使用の前にTHFを新たに蒸留した。
【０１５９】
化合物26: tert-ブチルN-[1-(ヒドロキシメチル)-2-(ノニルアミノ)-2-オキソエチル]カルバミン酸
デシルアミン(490mg、3.20mmol)のTHF(60ml)溶液に、N-(tert-ブトキシカルボニル)-L-セリン βラクトン(300mg、1.60mmol)を添加し、混合物をアルゴン下で一晩還流した。反応混合物を回転式蒸発装置で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィにかけ、異なる組成のEtOAc/ヘキサンで溶出した。
【０１６０】
適当な画分をプールし、真空中で濃縮乾燥して白色ワックス状粉末の化合物26を290mg(52％)得た。
2005508319.tif 000031
【０１６１】
化合物27: tert-ブチルN-[1-(ヒドロキシメチル)-2-オキソ-2-(テトラデシルアミノ)エチル]カルバミン酸
テトラデシルアミン(273mg、1.28mmol)のTHF(40 ml)溶液に、N-(tert-ブトキシカルボニル)-L-セリン βラクトン(200 mg、1.06mmol)を添加し、混合物をアルゴン下で一晩還流した。反応混合物を回転式蒸発装置で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィにかけ、異なる組成のEtOAc/ヘキサンで溶出した。
【０１６２】
適当な画分をプールし、真空中で濃縮乾燥して、白色粉末状の化合物27を245 mg (57％)得た。
2005508319.tif 000032
【０１６３】
化合物28: tert-ブチルN-[1-(ヒドロキシメチル)-2-(オクタデシルアミノ)-2-オキソエチル]カルバミン酸
オクタデシルアミン(516 mg、2.08mmol) のTHF溶液(60 ml)に、N-(tert-ブトキシカルボニル)-L-セリン βラクトン(300mg、1.60mmol) を添加し、混合物をアルゴン下で一晩還流した。反応混合物を回転式蒸発装置で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィにかけ、異なる組成のEtOAc/ヘキサンで溶出した。
【０１６４】
適当な画分をプールし、真空中で濃縮乾燥して、白色粉末状の化合物28を300mg(41％)得た。
2005508319.tif 000033
【０１６５】
化合物29: tert-ブチル N-{1-(ヒドロキシメチル)-2-オキソ-2- [4-(テトラデシルオキシ)アニリノ]エチル}カルバミン酸
4-(テトラデシルオキシ)アニリン(150mg、0.490mmol)のTHF溶液(40 ml)に、N-(tert-ブトキシカルボニル)-L-セリン β-ラクトン (91mg、0.490mmol)を添加し、混合物をアルゴン下で48時間還流した。反応混合物を回転式蒸発装置で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィにかけ(二回)、異なる組成のEtOAc/ヘキサンで溶出した。
【０１６６】
適当な画分をプールし、真空中で濃縮乾燥して、白色粉末の化合物29を110mg(45％)得た。
2005508319.tif 000034
【０１６７】
化合物30: tert-ブチル N-[1-(ヒドロキシメチル)-2-(4-メトキシアニリノ)-2-オキソエチル]カルバミン酸
p-アニシジン(100mg、0.8mmol)のTHF(20ml)溶液に、N-tert-ブトキシカルボニル)-L-セリン β-ラクトン(151mg、0.8mmol)を添加し、混合物をアルゴン下で一晩還流した。反応混合物を回転式蒸発装置で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィにかけ、異なる組成のEtOAc/ヘキサンで溶出した。
【０１６８】
適当な画分をプールし、CHCl3/ヘキサンから結晶化して、白色粉末の化合物30を135mg(54％)得た。
2005508319.tif 000035
【０１６９】
化合物31: tert-ブチルN-{1-(ヒドロキシメチル)-2-オキソ-2-[3-(テトラデシルオキシ)アニリノ]エチル}カルバミン酸
3-(テトラデシルオキシ)アニリン(179 mg、0.588mmol)のTHF(25ml)溶液に、N-(tert-ブトキシカルボニル)-L-セリン β-ラクトン (91mg、0.490mmol)を添加し、混合物をアルゴン下で48時間還流した。反応混合物を回転式蒸発装置で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィにかけ、異なる組成のEtOAc/ヘキサンで溶出した。
【０１７０】
適当な画分をプールし、真空中で濃縮乾燥して、白色粉末の化合物31を105mg(43％)得た。
2005508319.tif 000036
【０１７１】
化合物32: tert-ブチルN-[1-(ヒドロキシメチル)-2-(3-メトキシアニリノ)-2-オキソエチル]カルバミン酸
m-アニシジン(171mg、1.38mmol)のTHF(30ml)溶液に、N-(tert-ブトキシカルボニル)-L-セリン βラクトン(200mg、1.06mmol)を添加し、混合物をアルゴン下で一晩還流した。反応混合物を回転式蒸発装置で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィにかけ、異なる組成のEtOAc/ヘキサンで溶出した。
【０１７２】
適当な画分をプールし、黄色油状の化合物32を154 mg(46％)得た。
2005508319.tif 000037
【０１７３】
化合物33: tert-ブチルN-{1-(ヒドロキシメチル)-2-オキソ-2-[2-(テトラデシルオキシ)アニリノ]エチル}カルバミン酸
2-(テトラデシルオキシ)アニリン (200 mg、0.654mmol)のTHF(25 ml)溶液に、N-(tert-ブトキシカルボニル)-L-セリン β-ラクトン(102mg、0.545mmol)を添加し、混合物をアルゴン下で48時間還流した。反応混合物を回転式蒸発装置で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィにかけ、異なる組成のEtOAc/ヘキサンで溶出した。
【０１７４】
適当な画分をプールし、真空中で濃縮乾燥して黄色油状の化合物33を33mg (< 10％)得た。
2005508319.tif 000038
【０１７５】
化合物34: tert-ブチル N-[1-(ヒドロキシメチル)-2-(2-メトキシアニリノ)-2-オキソエチル]カルバミン酸
o-アニシジン (238mg、1.93mmol)のTHF(30ml)溶液に、N-(tert-ブトキシカルボニル)-L-セリン βラクトン(200mg、1.06mmol)を添加し、混合物をアルゴン下で48時間還流した。反応混合物を回転式蒸発装置で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィにかけ、異なる組成のEtOAc/ヘキサンで溶出した。
【０１７６】
適当な画分をプールし、CHCl3/ヘキサンから結晶化して黄色粉末の化合物34を150mg(45％)得た。
2005508319.tif 000039
【０１７７】
実施例3  化合物35〜43の合成
化合物35: N-1-ノニル-2-アミノ-3-ヒドロキシプロパンアミドトリフルオロ酢酸
化合物26(20mg、0.0580mmol)の冷却した(0℃の氷浴)CH2Cl2 (1 ml)溶液に、TFA(1 ml)をアルゴン雰囲気下で滴下し添加した。添加が終了した後、反応物を室温で3時間撹拌した。室温減圧下で濃縮した後、真空ポンプで乾燥し、白色固体の化合物35を19mg(95％)得た。
2005508319.tif 000040
【０１７８】
化合物36: N-1-テトラデシル-2-アミノ-3-ヒドロキシプロパンアミドトリフルオロ酢酸
化合物27(50 mg、0.124mmol)の冷却した(0℃の氷浴)CH2Cl2(1.5 ml)溶液にTFA(1.5 ml)をアルゴン雰囲気下で滴下し添加した。添加が終了した後、反応物を室温で3時間撹拌した。室温減圧下で濃縮した後、真空ポンプで乾燥し、白色固体状の化合物36を48mg(94％)得た。
2005508319.tif 000041
【０１７９】
化合物37: N-1-オクタデシル-2-アミノ-3-ヒドロキシプロパンアミドトリフルオロ酢酸
化合物28(25mg、0.0547mmol)の冷却した(0℃の氷浴)CH2Cl2(1ml)溶液にTFA(1ml)をアルゴン雰囲気下で滴下し添加した。添加が終了した後、反応物を室温で3時間撹拌した。室温減圧下で濃縮した後、真空ポンプで乾燥し、白色固体の化合物37を23mg(92％)得た。
2005508319.tif 000042
【０１８０】
化合物38: N-1-[4-(テトラデシルオキシ)フェニル] -2-アミノ-3-ヒドロキシプロパンアミドトリフルオロ酢酸
化合物29(54mg、0.110mmol)の冷却した(0℃の氷浴)CH2Cl2(0.050ml)溶液に、TFA(0.050ml)をアルゴン雰囲気下で滴下し添加した。添加が終了した後、反応物を室温で3時間撹拌した。室温減圧下で濃縮した後、真空ポンプで乾燥し、白色固体の化合物38を55mg(99％)得た。
2005508319.tif 000043
【０１８１】
化合物39: N-1-(4-メトキシフェニル)-2-アミノ-3-ヒドロキシプロパンアミドトリフルオロ酢酸
化合物30(50mg、0.161mmol)の冷却した(0℃の氷浴)CH2Cl2(0.049ml)溶液にTFA(0.049ml)をアルゴン雰囲気下で滴下し添加した。添加が終了した後、反応物を室温で3時間撹拌した。室温減圧下で濃縮した後、真空で乾燥して、白色固体の化合物39を50mg(96％)得た。
2005508319.tif 000044
【０１８２】
化合物40: N-1-[3-(テトラデシルオキシ)フェニル] -2-アミノ-3-ヒドロキシプロパンアミドトリフルオロ酢酸
化合物31(45mg、0.091mmol)の冷却した (0℃、氷 浴)CH2Cl2(0.062ml)溶液にTFA(0.062ml)をアルゴン雰囲気下で滴下し添加した。添加が終了した後、反応物を室温で3時間撹拌した。室温減圧下で濃縮した後、真空ポンプで乾燥し、黄色味を帯びた緑色の固体の化合物40を45g(99％)得た。
2005508319.tif 000045
【０１８３】
化合物41: N-1-(3-メトキシフェニル)-2-アミノ-3-ヒドロキシプロパンアミドトリフルオロ酢酸
化合物32(120mg、0.386mmol)の冷却した(0℃の氷浴)CH2Cl2 (1ml)溶液に、TFA(1ml)をアルゴン雰囲気下で滴下し添加した。添加が終了した後、反応物を室温で3時間撹拌した。室温減圧下で濃縮した後、真空ポンプで乾燥し、灰色がかった白色固体の化合物41を123mg(98％)得た。
2005508319.tif 000046
【０１８４】
化合物42: N-1-[2-(テトラデシルオキシ)フェニル] -2-アミノ-3-ヒドロキシプロパンアミドトリフルオロ酢酸
化合物33(21mg、0.044mmol)の冷却した(0℃の氷浴)CH2Cl2(1ml)溶液に、TFA(1ml)をアルゴン雰囲気下で滴下し添加した。添加が終了した後、反応物を室温で3時間撹拌した。室温減圧下で濃縮した後、真空ポンプで乾燥し、灰色がかった白色固体の化合物42を21mg(95％)得た。
2005508319.tif 000047
【０１８５】
化合物43: N-1-(2-メトキシフェニル)-2-アミノ-3-ヒドロキシプロパンアミドトリフルオロ酢酸
化合物34(80mg、0.257mmol)の冷却した(0℃の氷浴)CH2Cl2(1ml)溶液に、TFA(1ml)をアルゴン雰囲気下で滴下し添加した。添加が終了した後、反応物を室温で3時間撹拌した。室温減圧下で濃縮した後、真空ポンプで乾燥し、灰色がかった白色固体の化合物43を81mg(97％)得た。
2005508319.tif 000048
【０１８６】
実施例4  中間体化合物50〜54の合成
用いたガラス器具はアルゴン雰囲気下で炎光乾燥した後、室温まで冷却した。出発物質のアルコールは、無水ピリジンで洗浄し(3時間)、乾燥した(高真空度下で、48時間)。アルゴン雰囲気下で反応を行った。使用の前にTHFおよびCH2Cl2を新たに蒸留した。
【０１８７】
化合物50: tert-ブチル N-[1-{([ジベンジルオキシ]ホスホリル)オキシ}メチル]-2-(ノニルアミノ)-2-オキソエチル]カルバミン酸
ピリジンで洗浄した出発物質28(252mg、0.551mmol)に1H-テトラゾール (231mg、3.31mmol)を添加した。この混合物に、蒸留したばかりの1：1混合のTHF/CH2Cl2(50ml)を添加した。10分後、ジベンジルジイソプロピルホスホラミダイト(1.14g、3.13mmol)を添加し、アルゴン雰囲気下で反応物を90分間撹拌した。反応混合物をTLCで調べた結果、産物が生成していることが分かった。この混合物を、0℃(氷浴)まで冷却し、大過剰の過酢酸を加えた。混合物をさらに35分間撹拌した後、過剰の過酢酸を除去するためにメタ重亜硫酸ナトリウムを加えた。THFおよびCH2Cl2 を減圧下で除去した。濃縮物をEtOAc(70ml)で処理し、メタ重亜硫酸ナトリウム(2x25ml)、NaHCO3(2x30ml)、水(2x30ml)および鹹水(2x30ml)で洗浄した。NaSO4で有機部分を乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィにかけ、異なる組成のEtOAc/ヘキサンで溶出した。
【０１８８】
適当な画分をプールし、真空中で濃縮乾燥して、無色の油状である化合物50を195mg(49％)得た。
2005508319.tif 000049
【０１８９】
化合物51: tert-ブチル N-[1-{([ジ(ベンジルオキシ)ホスホリル]オキシ)メチル}-2-オキソ-2-(テトラデシルアミノ)エチル]カルバミン酸
ピリジンで洗浄した出発物質27(305mg、0.761mmol)に1H-テトラゾール(319 mg、4.56mmol)を添加した。この混合物に、蒸留したばかりの1：1混合のTHF/CH2Cl2(40ml)を添加した。10分後、ジベンジルジイソプロピルホスホラミダイト(1.57g、4.56mmol)を添加し、次に、アルゴン雰囲気下で反応物を90分間撹拌した。反応混合物をTLCで調べた結果、産物が生成していることが分かった。この混合物を、0℃(氷浴)まで冷却し、大過剰の過酢酸を加えた。混合物をさらに35分間撹拌した後、過剰の過酢酸を除去するためにメタ重亜硫酸ナトリウムを加えた。THFおよびCH2Cl2を減圧下で除去した。濃縮物をEtOAc(70ml)で処理し、メタ重亜硫酸ナトリウム(2x30ml)、NaHCO3(2x40ml)、水(2x35ml)および鹹水(2x35ml)で洗浄した。NaSO4で有機部分を乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィにかけ、異なる組成のEtOAc/ヘキサンで溶出した。
【０１９０】
適当な画分をプールし、真空中で濃縮乾燥して、白色ワックス状の固体である化合物51を451mg(89％)得た。
2005508319.tif 000050
【０１９１】
化合物52: tert-ブチル N-[1-{([ジ(ベンジルオキシ)ホスホリル]オキシ)メチル}-2-(オクタデシルアミノ)-2-オキソエチル]カルバミン酸
ピリジンで洗浄した出発物質26(270mg、0.783mmol)に1H-テトラゾール(329mg、4.70mmol)を添加した。この混合物に、蒸留したばかりの1：1混合のTHF/CH2Cl2(50ml)を添加した。10分後、ジベンジルジイソプロピルホスホラミダイト(1.62g、4.70mmol) を添加し、次に、アルゴン雰囲気下で反応物を90分間撹拌した。反応混合物をTLCで調べた結果、産物が生成していることが分かった。この混合物を、0℃(氷浴)まで冷却し、大過剰の過酢酸を加えた。混合物をさらに35分間撹拌した後、過剰の過酢酸を除去するためにメタ重亜硫酸ナトリウムを加えた。THFおよびCH2Cl2を減圧下で除去した。濃縮物をEtOAc(50ml)で処理し、メタ重亜硫酸ナトリウム (2x25ml)、NaHCO3(2x25ml)、水(2x25ml)および鹹水(2x25ml)で洗浄した。NaSO4で有機部分を乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィにかけ、異なる組成のEtOAc/ヘキサンで溶出した。
【０１９２】
適当な画分をプールし、真空中で濃縮乾燥して、白色固体状の化合物52を135mg(28％)得た。
2005508319.tif 000051
【０１９３】
化合物53: tert-ブチル N-{1-{([ジ(ベンジルオキシ)ホスホリル]オキシ)メチル}-2-オキソ-2-[4-(テトラデシルオキシ)アニリノ]エチル}カルバミン酸
ピリジンで洗浄した出発物質29(310mg、0.647mmol)に1H-テトラゾール(450mg、6.42mmol)を添加した。この混合物に、蒸留したばかりの1：1混合のTHF/CH2Cl2(40ml)を添加した。10分後、ジベンジルジイソプロピルホスホラミダイト(2.21g、6.42mmol) を添加し、次に、アルゴン雰囲気下で反応物を90分間撹拌した。反応混合物をTLCで調べた結果、産物が生成していることが分かった。この混合物を0℃(氷浴)まで冷却し、大過剰の過酢酸を加えた。混合物をさらに35分間撹拌した後、過剰の過酢酸を除去するためにメタ重亜硫酸ナトリウムを加えた。THFおよびCH2Cl2を減圧下で除去した。濃縮物をEtOAc(70ml)で処理し、メタ重亜硫酸ナトリウム(2x25ml)、NaHCO3 (2x35ml)、水(2x35ml)および鹹水(2x35ml)で洗浄した。NaSO4で有機部分を乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィにかけ、異なる組成のEtOAc/ヘキサンで溶出した。
【０１９４】
適当な画分をプールし、真空中で濃縮乾燥して、白色固体状の化合物53を81mg(17％)得た。
2005508319.tif 000052
【０１９５】
化合物54: tert-ブチル N-[1-{([ジ(ベンジルオキシ)ホスホリル]オキシ)メチル}-2-(4-メトキシアニリノ)-2-オキソエチル]カルバミン酸
ピリジンで洗浄した出発物質30(225mg、0.725mmol)に1H-テトラゾール(245mg、3.625mmol)を添加した。この混合物に、蒸留したばかりの1：1混合のTHF/CH2Cl2(20ml)を添加した。10分後、ジベンジルジイソプロピルホスホラミダイト(1.25g、3.625mmol)を添加し、次に、アルゴン雰囲気下で反応物を90分間撹拌した。反応混合物をTLCで調べた結果、生成物が形成していることが分かった。この混合物を、0℃(氷浴)まで冷却し、大過剰の過酢酸を加えた。混合物をさらに35分間撹拌した後、過剰の過酢酸を除去するためにメタ重亜硫酸ナトリウムを加えた。回転式蒸発装置によりTHFおよびCH2Cl2を減圧下で除去した。濃縮物をEtOAc(50ml)で処理し、メタ重亜硫酸ナトリウム(2x15ml)、NaHCO3(2x25ml)、水(2x25ml)および鹹水(2x25ml)で洗浄した。NaSO4で有機部分を乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィにかけ、異なる組成のEtOAc/ヘキサンで溶出した。
【０１９６】
適当な画分をプールし、真空中で濃縮乾燥して、白色固体状の化合物54を195mg(47％)得た。
2005508319.tif 000053
【０１９７】
実施例5  化合物55〜59の合成
化合物55: 2-アミノ-3-(ノニルアミノ)-3-オキソプロピル二水素リン酸
化合物50(100mg、0.165mmol)のエタノール(15ml)溶液に、10％Pd/C(触媒作用量)を添加した。50psiで4時間水素化した。4時間後にTLCで反応終結を調べ、反応混合をセライトで濾過した。溶出液を減圧下で濃縮し、白色粉末の化合物55を48mg(90％)得た。
2005508319.tif 000054
【０１９８】
化合物56: 2-アミノ-3-オキソ-3-(テトラデシルアミノ)プロピル二水素リン酸
化合物51(145mg、0.219mmol)のエタノール(15ml)溶液に、10％Pd/C(触媒作用量)を添加した。45psiで3時間水素化した。3時間後にTLCで反応終結を調べ、反応混合をセライトで濾過した。溶出液を減圧下で濃縮し、白色粉末の化合物56を75mg(90％)得た。
2005508319.tif 000055
【０１９９】
化合物56a: 2-(アセチルアミノ)-3-オキソ-3-(テトラデシルアミノ)プロピル二水素リン酸
化合物56(20mg、0.052mmol)の0.5mlピリジン試料に、大過剰の無水酢酸を添加した。混合物を室温で一晩撹拌した。過剰のピリジンと無水酢酸を回転式蒸発装置にかけた。得られた混合物を20mlのHCl水溶液と混ぜ、撹拌した。この酸性混合物をEtOAc(2x25ml)で抽出した。EtOAc層を水(2x25ml)および鹹水(2x25ml)で洗浄した。NaSO4で有機部分を乾燥し、濾過した。溶出液を減圧下で濃縮し、ゴム状の固体である化合物56aを15mg(71％)得た。
2005508319.tif 000056
【０２００】
化合物57: 2-アミノ-3-(オクタデシルアミノ)-3-オキソプロピル二水素リン酸
化合物52(117mg、0.164mmol)のエタノール(15ml)溶液に、10％Pd/C(触媒作用量)を添加した。50psiで4時間水素化した。4時間後にTLCで反応終結を調べ、反応混合をセライトで濾過した。溶出液を減圧下で濃縮し、白色粉末の化合物57を70mg(98％)得た。
2005508319.tif 000057
【０２０１】
化合物58: 2-アミノ-3-オキソ-3-[4-(テトラデシルオキシ)アニリノ] プロピル二水素リン酸塩
化合物53(40mg、0.054mmol)のエタノール(15ml)溶液に、10％Pd/C(触媒作用量)を添加した。50psiで4時間水素化した。4時間後にTLCで反応終結を調べ、反応混合をセライトで濾過した。溶出液を減圧下で濃縮し、白色粉末の化合物55を22mg(88％)得た。
2005508319.tif 000058
【０２０２】
化合物59: 2-アミノ-3-(4-メトキシアニリノ)-3-オキソプロピル二水素リン酸
化合物54(125mg、0.219 mmol)のエタノール(15ml)溶液に、10％Pd/C(触媒作用量)を添加した。45psiで2時間水素化した。2時間後にTLCで反応終結を調べ、反応混合をセライトで濾過した。溶出液を減圧下で濃縮し、白色粉末の化合物59を82mg(96％)得た。
2005508319.tif 000059
【０２０３】
実施例6 中間体化合物63〜65の合成
用いたガラス器具はアルゴン雰囲気下で炎光乾燥した後、室温まで冷却した。出発物質のアルコールは、無水ピリジンで洗浄し(3回)、高真空度下で、48時間乾燥した。アルゴン雰囲気下で反応を行った。使用の前にTHFおよびCH2Cl2を新たに蒸留した。
【０２０４】
化合物63: 1,2-(3-オクタデシルオキシプロパン)-ビス(ジベンジルリン酸)
ピリジンで洗浄した出発物質のdl-バチルアルコール(化合物60、225mg、0.625mmol)に1H-テトラゾール(229mg、3.26mmol)を添加した。この混合物に、蒸留したばかりの1：1混合のTHF/CH2Cl2(50ml)を添加した。10分後、ジベンジルジイソプロピルホスホラミダイト(1.12g、3.26mmol) を添加し、アルゴン雰囲気下で反応物を90分間撹拌した。反応混合物をTLCで調べた結果、産物が生成していることが分かった。この混合物を、0℃(氷浴)まで冷却し、大過剰の過酢酸を加えた。混合物をさらに35分間撹拌した後、過剰の過酢酸を除去するためにメタ重亜硫酸ナトリウムを加えた。THFおよびCH2Cl2を減圧下で除去した。濃縮物をEtOAc(70ml)で処理し、メタ重亜硫酸ナトリウム(2x25ml)、NaHCO3(2x30ml)、水(2x30ml)および鹹水(2x30ml)で洗浄した。NaSO4で有機部分を乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィにかけ、異なる組成のEtOAc/ヘキサンで溶出した。
【０２０５】
適当な画分をプールし、真空中で濃縮乾燥して、透明な油状の化合物63を303mg(53％)得た。
2005508319.tif 000060
【０２０６】
化合物64: 1,2-(3-ドデシルオキシプロパン)-ビス(ジベンジルリン酸)
ピリジンで洗浄した出発物質のdl-3-O-n-ドデシル-1,2-プロパンジオール(化合物61、400mg、1.5mmol)に1H-テトラゾール(645mg、9.2mmol)を添加した。この混合物に、蒸留したばかりの1：1混合のTHF/CH2Cl2(40ml)を添加した。10分後、ジベンジルジイソプロピルホスホラミダイト(3.18g、9.2mmol)を添加し、アルゴン雰囲気下で反応物を90分間撹拌した。反応混合物をTLCで調べた結果、産物が生成していることが分かった。この混合物を、0℃(氷浴)まで冷却し、大過剰の過酢酸を加えた。混合物をさらに35分間撹拌した後、過剰の過酢酸を除去するためにメタ重亜硫酸ナトリウムを加えた。THFおよびCH2Cl2を減圧下で除去した。濃縮物をEtOAc(80ml)で処理し、メタ重亜硫酸ナトリウム(2x35ml)、NaHCO3(2x40ml)、水(2x30ml)、および鹹水(2x30ml)で洗浄した。NaSO4で有機部分を乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィにかけ、異なる組成のEtOAc/ヘキサンで溶出した。
【０２０７】
適当な画分をプールし、真空中で濃縮乾燥して、透明な油状の化合物64を100mg(＜10％)得た。
2005508319.tif 000061
【０２０８】
化合物65: 1,2-(3-ヘキサデシルオキシプロパン)-ビス(ジベンジルリン酸)
ピリジンで洗浄した出発物質のdl-3-O-n-ヘキサデシル-1,2-プロパンジオール(化合物62、500mg、1.57mmol)に1H-テトラゾール(664mg、9.47mmol)を添加した。この混合物に、蒸留したばかりの1：1混合のTHF/CH2Cl2(50ml)を添加した。 10分後、ジベンジルジイソプロピルホスホラミダイト(3.27g、9.47mmol)を添加し、アルゴン雰囲気下で反応物を90分間撹拌した。反応混合物をTLCで調べた結果、産物が生成していることが分かった。この混合物を、0℃(氷浴)まで冷却し、大過剰の過酢酸を加えた。混合物をさらに35分間撹拌した後、過剰の過酢酸を除去するためにメタ重亜硫酸ナトリウムを加えた。THFおよびCH2Cl2を減圧下で除去した。濃縮物をEtOAc(80ml)で処理し、メタ重亜硫酸ナトリウム(2x35ml)、NaHCO3(2x40ml)、水(2x30ml)および鹹水(2x30ml)で洗浄した。NaSO4で有機部分を乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィにかけ、異なる組成のEtOAc/ヘキサンで溶出した。
【０２０９】
適当な画分をプールし、真空中で濃縮乾燥して、透明な油状の化合物65を205mg(15％)得た。
2005508319.tif 000062
【０２１０】
実施例7  化合物66〜68の合成
化合物66: 1,2-(3-オクタデシルオキシプロパン)-ビス(二水素リン酸塩)
化合物63(135mg、0.156mmol)のエタノール(15ml)溶液に、10％Pd/C(触媒作用量)を添加した。60psiで4時間水素化した。4時間後にTLCで反応終結を調べ、反応混合をセライトで濾過した。溶出液を減圧下で濃縮し、透明なワックス状の化合物66を70mg(89％)得た。
2005508319.tif 000063
【０２１１】
化合物67: 1,2-(3-ドデシルオキシプロパン)-ビス(二水素リン酸塩)
化合物64(70mg、0.089mmol) のエタノール(15ml)溶液に、10％Pd/C(触媒作用量)を添加した。60psiで4時間水素化した。4時間後にTLCで反応終結を調べ、反応混合をセライトで濾過した。溶出液を減圧下で濃縮し、透明なワックス状の化合物67を35mg(94％)得た。
2005508319.tif 000064
【０２１２】
化合物68: 1,2-(3-ヘキサデシルオキシプロパン)-ビス(二水素リン酸塩)
化合物65(138mg、0.164mmol)のエタノール(15ml)溶液に、10％Pd/C(触媒作用量)を添加した。60psiで4時間水素化した。4時間後にTLCで反応終結を調べ、反応混合をセライトで濾過した。溶出液を減圧下で濃縮し、透明なワックス状の化合物68を75mg(96％)得た。
2005508319.tif 000065
【０２１３】
実施例8  中間体化合物77〜84の合成
用いたガラス器具はアルゴン雰囲気下で炎光乾燥した後、室温まで冷却した。出発物質のアルコールは、無水ピリジンで洗浄し(3回)、高真空度下で、48時間乾燥した。アルゴン雰囲気下で反応を行った。使用の前にTHFおよびCH2Cl2を新たに蒸留した。
【０２１４】
化合物77: 1,2-(3-テトラデカノイルオキシプロパン)-ビス(ジベンジルリン酸)
ピリジンで洗浄した出発物質のモノミリスチン(化合物69、800mg、2.6mmol)に1H-テトラゾール(1.01g、1.45mmol)を添加した。この混合物に、蒸留したばかりのTHF(45ml)を添加した。10分後、ジベンジルジイソプロピルホスホラミダイト(5.02g、14.5mmol)を添加し、アルゴン雰囲気下で反応物を90分間撹拌した。反応混合物をTLCで調べた結果、産物が生成していることが分かった。この混合物を、0℃(氷浴)まで冷却し、大過剰の過酢酸を加えた。混合物をさらに35分間撹拌した後、過剰の過酢酸を除去するためにメタ重亜硫酸ナトリウムを加えた。THFを減圧下で除去した。濃縮物をEtOAc(100ml)で処理し、メタ重亜硫酸ナトリウム (2x50ml)、NaHCO3(2x75ml)、水(2x50ml)および鹹水(2x50ml)で洗浄した。NaSO4で有機部分を乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィにかけ、異なる組成のEtOAc/ヘキサンで溶出した。
【０２１５】
適当な画分をプールし、真空中で濃縮乾燥して、透明な油状の化合物77を600mg(28％)得た。
2005508319.tif 000066
【０２１６】
化合物78: 1,2-(3-ペンタンデカノイルオキシプロパン)-ビス(ジベンジルリン酸)
ピリジンで洗浄した出発物質のモノペンタデカノイン(化合物70、800mg、2.5mmol)に1H-テトラゾール(970mg、13.9mmol)を添加した。この混合物に、蒸留したばかりのTHF(45ml)を添加した。10分後、ジベンジルジイソプロピルホスホラミダイト(4.80g、13.9mmol)を添加し、アルゴン雰囲気下で反応物を90分間撹拌した。反応混合物をTLCで調べた結果、産物が生成していることが分かった。この混合物を、0℃(氷浴)まで冷却し、大過剰の過酢酸を加えた。混合物をさらに35分間撹拌した後、過剰の過酢酸を除去するためにメタ重亜硫酸ナトリウムを加えた。THFを減圧下で除去した。濃縮物をEtOAc(100ml)で処理し、メタ重亜硫酸ナトリウム (2x50ml)、NaHCO3(2x100ml)、水(2x50ml)および鹹水(2x50ml)で洗浄した。NaSO4で有機部分を乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィにかけ、異なる組成のEtOAc/ヘキサンで溶出した。
【０２１７】
適当な画分をプールし、真空中で濃縮乾燥して、透明な油状の化合物78を741mg(35％)得た。
2005508319.tif 000067
【０２１８】
化合物79: 1,2-(3-ヘキサデカノイルオキシプロパン)-ビス(ジベンジルリン酸)
ピリジンで洗浄した出発物質のモノパルミチン(化合物71、800mg、2.4mmol) に1H-テトラゾール(1.00g、14.2mmol)を添加した。この混合物に、蒸留したばかりのTHF(45ml)を添加した。10分後、ジベンジルジイソプロピルホスホラミダイト(4.90g、14.2mmol)を添加し、アルゴン雰囲気下で反応物を90分間撹拌した。反応混合物をTLCで調べた結果、産物が生成していることが分かった。この混合物を、0℃(氷浴)まで冷却し、大過剰の過酢酸を加えた。混合物をさらに35分間撹拌した後、過剰の過酢酸を除去するためにメタ重亜硫酸ナトリウムを加えた。THFを減圧下で除去した。濃縮物をEtOAc(100ml)で処理し、メタ重亜硫酸ナトリウム (2x50ml)、NaHCO3(2x100ml)、水(2x50ml)および鹹水(2x50ml)で洗浄した。NaSO4で有機部分を乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィにかけ、異なる組成のEtOAc/ヘキサンで溶出した。
【０２１９】
適当な画分をプールし、真空中で濃縮乾燥して、透明な油状の化合物79を786mg(38％)得た。
2005508319.tif 000068
【０２２０】
化合物80: 1,2-(3-ヘプタデカノイルオキシプロパン)-ビス(ジベンジルリン酸)
ピリジンで洗浄した出発物質のモノヘプタデカノイン(化合物72、800mg、2.32mmol)に1H-テトラゾール(980mg、13.9mmol)を添加した。この混合物に、蒸留したばかりのTHF(40ml)を添加した。10分後、ジベンジルジイソプロピルホスホラミダイト(4.81g、13.9mmol) を添加し、アルゴン雰囲気下で反応物を90分間撹拌した。反応混合物をTLCで調べた結果、産物が生成していることが分かった。この混合物を、0℃(氷浴)まで冷却し、大過剰の過酢酸を加えた。混合物をさらに35分間撹拌した後、過剰の過酢酸を除去するためにメタ重亜硫酸ナトリウムを加えた。THFを減圧下で除去した。濃縮物をEtOAc(100ml)で処理し、メタ重亜硫酸ナトリウム(2x50ml)、NaHCO3(2x100ml)、水(2x50ml)および鹹水(2x50ml)で洗浄した。NaSO4で有機部分を乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィにかけ、異なる組成のEtOAc/ヘキサンで溶出した。
【０２２１】
適当な画分をプールし、真空中で濃縮乾燥して、透明な油状の化合物80を1.48g(74％)得た。
2005508319.tif 000069
【０２２２】
化合物81: 1,2-(3-オクタデカノイルオキシプロパン)-ビス(ジベンジルリン酸)
ピリジンで洗浄した出発物質のモノステアリン(化合物73、800mg、2.2mmol)に1H-テトラゾール(1.00g、14.2mmol)を添加した。この混合物に、蒸留したばかりのTHF(40ml)を添加した。10分後、ジベンジルジイソプロピルホスホラミダイト(4.92g、14.2mmol)を添加し、アルゴン雰囲気下で反応物を90分間撹拌した。反応混合物をTLCで調べた結果、産物が生成していることが分かった。この混合物を、0℃(氷浴)まで冷却し、大過剰の過酢酸を加えた。混合物をさらに35分間撹拌した後、過剰の過酢酸を除去するためにメタ重亜硫酸ナトリウムを加えた。THFを減圧下で除去した。濃縮物をEtOAc(100ml)で処理し、メタ重亜硫酸ナトリウム (2x50ml)、NaHCO3(2x100ml)、水(2x50ml))および鹹水(2x50ml)で洗浄した。NaSO4で有機部分を乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィにかけ、異なる組成のEtOAc/ヘキサンで溶出した。
【０２２３】
適当な画分をプールし、真空中で濃縮乾燥して、透明な油状の化合物81を870mg(45％)得た。
2005508319.tif 000070
【０２２４】
化合物82: 1,2-(3-ノナデカノイルオキシプロパン)-ビス(ジベンジルリン酸)
ピリジンで洗浄した出発物質のモノノナデカノイン(化合物74、800mg、2.1mmol)に1H-テトラゾール(977g、13.9mmol)を添加した。この混合物に、蒸留したばかりのTHF(40ml)を添加した。10分後、ジベンジルジイソプロピルホスホラミダイト(4.81g、13.9mmol)を添加し、アルゴン雰囲気下で反応物を90分間撹拌した。反応混合物をTLCで調べた結果、産物が生成していることが分かった。この混合物を、0℃(氷浴)まで冷却し、大過剰の過酢酸を加えた。混合物をさらに35分間撹拌した後、過剰の過酢酸を除去するためにメタ重亜硫酸ナトリウムを加えた。THFを減圧下で除去した。濃縮物をEtOAc(100ml)で処理し、メタ重亜硫酸ナトリウム (2x50ml)、NaHCO3 (2x125ml)、水(2x75ml)および鹹水(2x50ml)で洗浄した。NaSO4で有機部分を乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィにかけ、異なる組成のEtOAc/ヘキサンで溶出した。
【０２２５】
適当な画分をプールし、真空中で濃縮乾燥して、透明な油状の化合物82を1.47g(78％)得た。
2005508319.tif 000071
【０２２６】
化合物83: 1,2-(3-イコサノイルオキシプロパン)-ビス(ジベンジルリン酸)
ピリジンで洗浄した出発物質のモノアラキジン(化合物75、800mg、2.06mmol) に1H-テトラゾール(1.00g、14.2mmol)を添加した。この混合物に、蒸留したばかりのTHF(40ml)を添加した。10分後、ジベンジルジイソプロピルホスホラミダイト(4.92g、14.2mmol)を添加し、アルゴン雰囲気下で反応物を90分間撹拌した。反応混合物をTLCで調べた結果、産物が生成していることが分かった。この混合物を、0℃(氷浴)まで冷却し、大過剰の過酢酸を加えた。混合物をさらに35分間撹拌した後、過剰の過酢酸を除去するためにメタ重亜硫酸ナトリウムを加えた。THFを減圧下で除去した。濃縮物をEtOAc(100ml)で処理し、メタ重亜硫酸ナトリウム (2x50ml)、NaHCO3(2x125ml)、水(2x75ml)および鹹水(2x50ml)で洗浄した。NaSO4で有機部分を乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィにかけ、異なる組成のEtOAc/ヘキサンで溶出した。
【０２２７】
適当な画分をプールし、真空中で濃縮乾燥して、透明な油状の化合物83を1.39g(74％)得た。
2005508319.tif 000072
【０２２８】
化合物84: 1,2-(3-ドコサノイルオキシプロパン)-ビス(ジベンジルリン酸)
ピリジンで洗浄した出発物質のモノベヘーニン(化合物76、800mg、1.92mmol) に1H-テトラゾール(1.00g、14.2mmol)を添加した。この混合物に、蒸留したばかりのTHF(40ml)を添加した。10分後、ジベンジルジイソプロピルホスホラミダイト(5.14g、14.8mmol)を添加し、アルゴン雰囲気下で反応物を90分間撹拌した。反応混合物をTLCで調べた結果、産物が生成していることが分かった。この混合物を、0℃(氷浴)まで冷却し、大過剰の過酢酸を加えた。混合物をさらに35分間撹拌した後、過剰の過酢酸を除去するためにメタ重亜硫酸ナトリウムを加えた。THFを減圧下で除去した。濃縮物をEtOAc(100ml)で処理し、メタ重亜硫酸ナトリウム (2x50ml)、NaHCO3(2x125ml)、水(2x75ml)および鹹水(2x50ml)で洗浄した。NaSO4で有機部分を乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィにかけ、異なる組成のEtOAc/ヘキサンで溶出した。
【０２２９】
適当な画分をプールし、真空中で濃縮乾燥して、白色ワックス様の化合物84を1.27g(71％)得た。
2005508319.tif 000073
【０２３０】
実施例9  化合物の合成85〜92
化合物85: 1,2-(3-テトラデカノイルオキシプロパン)-ビス(二水素リン酸塩)
化合物77(385mg、0.468mmol)のエタノール(15ml)溶液に、10％Pd/C(触媒作用量)を添加した。60psiで4時間水素化した。4時間後にTLCで反応終結を調べ、反応混合をセライトで濾過した。溶出液を減圧下で濃縮し、白色ワックス状の化合物85を210mg(98％)得た。
2005508319.tif 000074
【０２３１】
化合物86: 1,2-(3-ペンタンデカノイルオキシプロパン)-ビス(二水素リン酸塩)
化合物78(451g、0.538mmol) のエタノール(15ml)溶液に、10％Pd/C(触媒作用量)を添加した。60psiで4時間水素化した。4時間後にTLCで反応終結を調べ、反応混合をセライトで濾過した。溶出液を減圧下で濃縮し、白色ワックス状の化合物86を250mg(97％)得た。
2005508319.tif 000075
【０２３２】
化合物87: 1,2-(3-ヘキサデカノイルオキシプロパン)-ビス(二水素リン酸塩)
化合物79(561g、0.659mmol)のエタノール(15ml)溶液に、10％Pd/C(610mg)を添加した。60psiで4時間水素化した。4時間後にTLCで反応終結を調べ、反応混合をセライトで濾過した。溶出液を減圧下で濃縮し、白色ワックス状の化合物87を300mg(92％)得た。
2005508319.tif 000076
【０２３３】
化合物88: 1,2-(3-ヘプタデカノイルオキシプロパン)-ビス(二水素リン酸塩)
化合物80(636mg、0.736mmol)のエタノール(15ml)溶液に、10％Pd/C(724mg)を添加した。60psiで4時間水素化した。4時間後にTLCで反応終結を調べ、反応混合をセライトで濾過した。溶出液を減圧下で濃縮し、白色ワックス状の化合物88を365mg(98％)得た。
2005508319.tif 000077
【０２３４】
化合物89: 1,2-(3-オクタデカノイルオキシプロパン)-ビス(二水素リン酸塩)
化合物81(530mg、0.603mmol)のエタノール(15ml)溶液に、10％Pd/C(617mg)を添加した。60psiで4時間水素化した。4時間後にTLCで反応終結を調べ、反応混合をセライトで濾過した。溶出液を減圧下で濃縮し、白色ワックス状の化合物89を305mg(97％)得た。
2005508319.tif 000078
【０２３５】
化合物90: 1,2-(3-ノナデカノイルオキシプロパン)-ビス(二水素リン酸塩)
化合物82(952mg、1.06mmol)のエタノール(25ml)溶液に、10％Pd/C(1g)を添加した。60psiで4時間水素化した。4時間後にTLCで反応終結を調べ、反応混合をセライトで濾過した。溶出液を減圧下で濃縮し、白色ワックス状の化合物90を555mg(98％)得た。
2005508319.tif 000079
【０２３６】
化合物91: 1,2-(3-イコサノイルオキシプロパン)-ビス(二水素リン酸塩)
化合物83(711mg、0.784mmol)のエタノール(25ml)溶液に、10％Pd/C(813mg)を添加した。60psiで4時間水素化した。4時間後にTLCで反応終結を調べ、反応混合をセライトで濾過した。溶出液を減圧下で濃縮し、白色ワックス状の化合物91を419mg(97％)得た。
2005508319.tif 000080
【０２３７】
化合物92: 1,2-(3-ドコサノイルオキシプロパン)-ビス(二水素リン酸塩)
化合物84(663mg、0.709mmol) のエタノール(25ml)溶液に、10％Pd/C(710mgを添加した。60psiで4時間水素化した。4時間後にTLCで反応終結を調べ、反応混合をセライトで濾過した。溶出液を減圧下で濃縮し、白色ワックス状の化合物92を400mg(98％)得た。
2005508319.tif 000081
【０２３８】
実施例10  アフリカツメガエルの卵細胞アッセイ法
PSP24 PLGFRを内因的に発現するアフリカツメガエルの卵細胞を用いて、LPA阻害活性に関する新たに設計、合成した化合物のスクリーニングを実施した。
【０２３９】
無菌状態でアフリカツメガエル(Xeopus laevis)成体(Carolina Scientific、Burlington、NC)をキシラジンで麻酔し、卵細胞を得て、実験に用いた。Ca2＋を含まない卵巣用リンゲル-2溶液((OR-2) 82. 5 mM NaCl、2 mM KCl、1 mM MgCl2、5mM HEPES、NaOHでpH 7. 5に調整)中で1.4mg/ml のA型コラゲナーゼ(Boehringer、IN)を用いた処理で段階V-VIの卵細胞を卵胞細胞層から除去した。17〜20℃のインキュベータ内で、卵細胞をバース溶液中で維持し、単離後2〜7日間用いた。
【０２４０】
-60 mV(GeneClamp 500、Axon Instruments、CA)の膜電位を有する標準2電極電位クランプ増幅器を使用して電気生理学的記録を行った。試験化合物はメタノールに溶解し、脂肪酸を含まないBSAと混合した。これをカエル用Na＋リンゲル溶液(120 nM NaCl、2 mM KCl、1.8 mM CaCl2、5 mM HEPES; pH 7.0)で希釈した。これを5ml/分の流速で灌流しながら卵細胞に添加した。NIC-310デジタルオシロスコープ(Nicolet、Madison、WI)で膜電流を記録した。適当な洗浄除去と脱感作からの回復が可能となるように、15分(最小)間隔で添加した。
【０２４１】
図21〜27は、LPA誘導性の塩素電流に対する化合物56、57、66および92による用量依存的阻害を示している。
【０２４２】
非リン酸化誘導体のなかでは、化合物36が最も好適な阻害剤であった。この阻害効果が細胞表面への作用によるものであるか否か、もしくは阻害が細胞内への作用の結果であるのか否かを調べるために化合物36を細胞内注入したところ、化合物36の細胞内添加では、そこが作用部位であることを示唆する結果は何も得られなかった。従って、遊離型水酸基を有する化合物(35〜43)から出発して、細胞中に入らずに細胞表面で相互作用するようなリン酸化化合物(55〜59)を合成した。
【０２４３】
化合物56、57、66および92は、アフリカツメガエル卵細胞におけるLPA誘導性塩素電流の阻害剤であった。化合物56、57、66および92は、LPAの作用を用量依存的に阻害することが可能であった。さらに、アフリカツメガエル卵細胞を洗うことにより、LPA応答は完全に回復した。この実験は、化合物56、57、66および92がLPA誘導性塩素電流を可逆的に阻害可能であったことを示している。化合物66は、5μMでアフリカツメガエル卵細胞におけるLPAの効果を完全に消失させ、このときIC50は約1.2μMであった(図23および24)。さらに、化合物66を細胞内に微量注入し(矢印、図23B)、細胞外にLPA(10nM)を添加した場合、LPA応答を阻害しなかった。この実験は、化合物66の阻害作用が細胞外的であることを示唆する。
【０２４４】
アフリカツメガエル卵細胞を用いて、化合物35、および37〜43を試験したが、結果は決定的ではなかった。化合物55は1μMで弱い阻害(2nM LPAに対し38％)を示した。SAP系では、化合物58および59については、アフリカツメガエル卵細胞でのアッセイ法による試験されるべきである。二リン酸系では、化合物89はLPA誘導性応答を阻害した(2nMのLPAに対して59％)。しかしながら、化合物67(閾値〜1μM)、68(閾値〜10nM)および85(閾値〜100nM)は、応答のみを誘起する。化合物86、87、88、90および91については、さらに評価を行った。化合物56aを設計、合成し、遊離アミノ基の重要性について試験を行った。アフリカツメガエル卵細胞によるアッセイ法で化合物56aを評価した場合、LPAと組み合わせて適用すると化合物56aはLPA応答を促進した。化合物56aは、2μMでは応答を誘起しなかった(データは示してはいない)が、10μMでは化合物56それ自身で応答を誘起することが可能であった(図26)。この実験は、阻害活性に遊離アミノ基が必要であることを示唆する。
【０２４５】
実施例11  HEY卵巣細胞の遊走
HEY卵巣癌細胞は、2種のLPA受容体、EDG-2およびEDG-7を発現していることが知られている。そこで、LPAで誘導される細胞運動性に対する阻害能に関し、化合物56、56aおよび66の評価を行った(化合物濃度:0.1μMのLPA 濃度に対する1μM)。
【０２４６】
HEY卵巣細胞は、2mM L-グルタミン(GIBCO BRL) および10％ウシ胎児血清を加えた(FBS、Hyclone)を含むRPMI1640培地中で維持した。細胞はいずれも、2日間集密状態に増殖することによってG0/G1期に同期させた。再度、細胞を蒔き、フラスコ中で約50〜60％の集密度になったところで実験用に回収した。フラスコから細胞を取り出した後、PBS中で37℃にて0.53mMのEDTAに5分間曝露した。等量の2mM L-グルタミンおよび10％ウシ胎児血清を加えたRPMI1640により、EDTAを中和した。細胞を800rpmで室温10分間、遠心分離した。回収した細胞を2mM L-グルタミン含有RPMI1640で二回洗浄し、1mlあたり1x106 個の細胞密度で再懸濁した後、37℃に1時間放置した。
【０２４７】
改変定量的細胞遊走アッセイ法 (カタログ番号ECM500、Chemicon、Temecula、CA)を用いて、細胞の運動性を試験した。ケミコンチャンバー膜は、ファイブロネクチンを含む直径8ミクロンの細孔でコートした。阻害剤を含まない、もしくは阻害剤(1μM)を含む400μlのRPMI／2mM L-グルタミンを下のチャンバーにピペットで添加した。RPMI1640/2mM L-グルタミン中の約5x104個の細胞を上のチャンバーに添加した。挿入容器を含む24穴プレートを5％CO2のインキュベーターにおいて37℃で4時間インキューベートした。インキュベーションの終わりに、チャンバーを取り出し、新しい24穴プレートと交換した。内部チャンバー中の細胞を何回も塗布することによってはがし、調製した細胞染色液中に室温で30分間浸した。インキュベーションの終わりに、細胞染色液をウェルから除去した。チャンバーをウェルあたり1mlのPBSで3回洗浄した。最後のPBS洗浄後、チャンバーを調べて、適当な細胞形態であるかを確かめ、接着細胞数を倒立顕微鏡下で計数した。
【０２４８】
合成したばかりの化合物のHEY卵巣癌細胞のLPA誘導性遊走に対する効果を図27に示す。化合物66は、LPA誘導性の細胞の運動性を、約70％阻害した。しかしながら、化合物55 (僅かに)および56aはLPA誘導で誘導される細胞の運動性を高める。
【０２４９】
実施例12  化合物の細胞毒性
Imら(2000)およびRT-PCRのデータにより、前立腺癌細胞株DU-145、PC-3およびLNCaPにはPLGFRが存在することが示された。アフリカツメガエル卵細胞におけるアッセイ法および細胞運動性アッセイ法では確実に阻害的活性を示したので、前立腺癌細胞株DU-145、PC-3およびLNCaPに対する増殖阻害効果を複数の化合物について調べた。
【０２５０】
10％ウシ胎児血清(FBS)を加えたRPMI-1640もしくはダルベッコ改変イーグル培地を含む150cm2フラスコでDU-145、PC-3およびLNCaP細胞を増殖させた。トリプシンを用いて細胞をストックフラスコから剥がし、遠心分離を行い新鮮な培地に再懸濁した。これをウェル当たり約2,000細胞の密度で96穴培養プレートに蒔いた。薬剤の最終濃度は0.05μMから10μMもしくは50μMの範囲であった。薬剤を添加しない対照実験(陰性対照)および5-フルオロウラシルを添加した対照実験(陽性対照)も平行して実施した。実験中の薬剤分解の影響を最小限に抑えるため、48時間で培地を除去し置換した。薬剤曝露96時間後に、50％の冷トリフルオロ酢酸(TCA)を添加して細胞を固定し、4℃で1時間インキュベーションした。固定した細胞をスルホローダミンB(SRB)で染色し、540nmの吸光度における、細胞数対吸光度の標準曲線と比較し細胞数を決定した。同一の実験を二回繰り返した。対照(未処理のウェル)に対する％で表した細胞数を、薬剤濃度に対してプロットし、細胞増殖を50％(IC50)阻害した濃度を非線形回帰法(WinNonlin、Pharsight Corporation)により決定した。
【０２５１】
参照化合物5F-ウラシル、LPA (18：1)、SPH (13：0)、SPP(13：0)および N-パルミトイル L-セリン リン酸(15：0)を用い、前立腺癌細胞株DU-145、PC-3およびLNCaPの細胞毒性に関する試験を行った。これを表3に示す。
【０２５２】
（表３）合成化合物の前立腺癌細胞株における細胞毒性
2005508319.tif 000082
X対照(未処理のウェル)に対し％で表した細胞数を薬剤濃度に対してプロットした。濃度および細胞増殖を50％阻害した濃度(IC50)を非線形回帰法(WinNonlin、Pharsight Corporation)で決定した。
WA=弱い活性、NA=無活性、？=最大阻害は50％。
【０２５３】
化合物55、56、56a、66および85は一定範囲の増殖阻害活性を示した。化合物56は、5-フルオロウラシルよりもDU-145およびPC-3の細胞増殖に対しより強い阻害剤であった。興味深いことに、化合物56aは、DU-145細胞の増殖を選択的に阻害したが、PC-3細胞に対してはさほどつよいものではなかった。化合物55はDU-145およびPC-3細胞の増殖に比べLNCaP細胞の増殖に対してより強い阻害剤であった。化合物66は、LNCaP細胞の増殖を選択的に阻害したが、PC-3およびLNCaP細胞に対しては活性を示さなかった。二リン酸 (sn-1 アシル)のなかでは、化合物85が最大の活性を有していた。
【０２５４】
実施例1〜12の考察
3種類の化合物群を特異的に合成し分析した(化合物35〜43、55〜59、66〜68、および85〜92)。第一および第二の組は内在的阻害剤SPHおよびSPPの合成阻害剤N-パルミトイルL-セリンリン酸による汞化反応を含むものであるが、第三の系列は二リン酸を含む。化合物56、57、66および92は、アフリカツメガエル卵細胞におけるLPA誘導性塩素電流アッセイ法では阻害剤であった。また、(sn-1)部位の鎖長がより短い二リン酸はアフリカツメガエル卵細胞に塩素電流を誘起することが可能であった(化合物67(閾値〜1nM)、化合物68(閾値〜10nM)および化合物85(閾値〜100nM))。化合物66が、HEY卵巣癌細胞株のLPA誘導性細胞運動を阻害することが示された。上記の合成化合物のDU-145、PC-3およびLNCaP前立腺癌細胞株に対する増殖阻害効果の評価を行なうと、3種類の強力で選択的な化合物(化合物56、56aおよび66)が発見された。
【０２５５】
上記のデータ(表3)は、以下を示唆する。すなわち、(1)リン酸を含まずアルコールを含む化合物の活性はより低い(化合物27対56)、(2)保護されたリン酸部分を有する化合物の活性はより低い(化合物51対56)、(3) アミンのアルキル化によって活性は低下しない(化合物56a)、(4)最も強力な二リン酸はsn-1位にエーテル結合を有する、(5)SAP系列について鎖長を短くするとDU-145およびPC-3に対する効力は低下する(化合物55対56)(しかしながら、LNCaP細胞に対してはより有効であった)、(6)二リン酸(sn-1アルキル)化合物の鎖長を短くすると、LNCaP細胞に対する選択性は残るが効力は低下する、および(7)sn-1位の置換(アシル対アルキル)は、効力を高めることはなかった。これら分子の標的部位は細胞膜上であると可能性が高い(例えば、膜貫通型受容体)。なぜなら、極性リン酸誘導体は容易に細胞膜を通過するとは考えにくい(能動輸送系がある可能性も存在するが)からである。これらの結果は、PLGFRにおける差もしくは下流のシグナル伝達で起こる現象がこれらの化合物の増殖への阻害的性質における重要な役割を果たす可能性を示唆する
【０２５６】
実施例13  Edg-2、Edg-4および Edg-7を発現する安定な細胞株の調製と特徴付け
Edg-2、4および7受容体に対する選択的アンタゴニストを開発する試みにおいて、候補化合物をスクリーニングする系をはじめて確立した。モデル系としてRH7777細胞を選んだ。なぜなら、各種の細胞アッセイ法でLPA非応答性であることが報告されており、既知のいずれのEdg受容体についてもmRNAがないことがわかったためである(Fukushimaら、1998)。RH7777細胞において、EDG受容体でトランスフェクションした安定細胞株および挿入断片を含まないベクターでトランスフェクションした対照の細胞株を樹立した。
【０２５７】
得られたクローンを、細胞内Ca2＋の過渡応答をモニターすることおよびRT-PCRにより、スクリンーニングした。このスクリーニングにより、少なくとも3種類のEdg-2および-7を発現する陽性細胞株の同定に至ったが、Edg-4を発現する陽性細胞は全く同定できなかった。ベクターをトランスフェクションした細胞は、LPA応答性を示さないことも分かった。Edg-4を発現する安定なクローンは単離されなかったが、Edg-4の一過性発現によってLPA媒介性の細胞内内Ca2＋濃度の過渡応答の増加が起こった。このことは、前記構築物がこれらの細胞において活性を示すことを示唆した。これらの実験に用いた安定Edg-4 細胞株は、Imらが単離し特徴付けを行ったものであり、同クローンは彼らの好意によって提供されたものである(Imら、2000)。
【０２５８】
候補アンタゴニストのスクリーニングに関する適当なアッセイ法を特定する試みにおいて、さらに前記細胞株の特徴付けを行った。Edg-2を発現する細胞株、および一過的にEdg-4を発現する細胞において、LPA誘起性のERK1／2の活性化が見られたが、Edg-7を発現する細胞では、ERK1／2は活性化されなかった。Edg-2、-4および-7を発現する安定な細胞株のいずれにおいても、LPAは細胞内Ca2＋濃度の一過性増加を誘起した。用量反応曲線から、EC50値はEdg-2、-4、-7を発現する細胞において、それぞれ378±53、998±67、および214±26nMであることがわかった(図28A〜C)。安定Edg-4クローンについて決定されたEC50値は以前に報告されているものと異なっていたので、EC50値が186±39である一過的にEdg-4を発現する細胞(図28B、Anら、1998a; Anら、1998b)についても用量反応曲線を作成した。
【０２５９】
安定細胞株においてLPAのDNA合成刺激能を、3Hチミジンの取り込みにより測定することにより調べた。野生型RH7777細胞もベクターをトランスフェクションした RH7777細胞も、10μMのLPAと24時間のインキュベーションしても3Hチミジンの取り込みの増加を示さなかった。この結果は、既報でこれらの細胞においてLPAが分裂促進性であることを示した所見と対照的である。Edg-2が発現する細胞では、3Hチミジンの取り込みが1.8倍増加を示したが、Edg-4および-7 を発現する細胞では、対照の細胞と比較して3Hチミジンの取り込みの増加が見られなかった。
【０２６０】
実施例14  Edg-2およびEdg-7受容体に対する短鎖ホスファチジン酸の活性
Ca2＋濃度の過渡応答がEdg-2、-4および-7を発現する安定な三種類の細胞株のいずれにおいても誘起されたので(図28A〜C)、このアッセイ法を用いて候補アンタゴニストのスクリーニングを実施した。LPAで活性化されるEgd受容体ファミリーの構成員、Edg-2、-4および-7に対する選択的アンタゴニストを同定する試みにおいて、LPAファルマコフォアの構造的特徴が出発点として信頼された。短鎖(8：0)LPA、もしくはLPA(8：0)とLPA(18：1)の混合物を、Edg-2、-4もしくは-7の阻害剤として試験した。細胞をLPA8：0とLPA18：1の混合物を用いて行なってみたが、3種類の安定細胞株のいずれにおいてもCa2＋応答は起こらなかった(図30A〜C、31A〜Cおよび32A〜Bを参照のこと)。10μMの濃度で用いた場合、LPA8：0単独では、いずれの細胞においてもCa2＋応答を誘起することはできなかった。
【０２６１】
これらの結果に基づいて、本出願人らは、立体的に脂肪酸鎖の可動性を拘束するLPAファルマコフォアの修飾はリガンドの性質にも効果を与えるのではないかと考えた。このような理由で、sn-2位に第二の短鎖脂肪酸を有する化合物についても試験を行った。このような短鎖ホスファチジン酸は、対応する短鎖LPAと比較して疎水性が増加する。これにより、受容体のリガンド結合ポケットとの相互作用に束縛を与える。
【０２６２】
ホスファチジン酸(PA)およびジアシルグリセロールピロリン酸(DGPP)はイオン性リン酸基および脂肪酸鎖を有し、LPAファルマコフォアと共通する重要な化学的性質を持った天然の脂質である。これらはいずれもEdg受容体のアゴニストではない(以下を参照のこと)。この類似性に注意しながら、短鎖DGPPを調製し、Edg-2、-4もしくは-7の阻害剤として試験を行った。安定細胞株において10倍過剰のDGPP(8：0)がLPA誘起性Ca2＋応答に与える効果を、図29A〜Dに示す。Edg-2を発現する細胞におけるCa2＋応答は、おおよそ50％阻害されたが(図29A)、Edg-7を発現する細胞における応答は完全に消失することはなかった(図29C)。対照的に、Edg-4を発現する細胞におけるCa2＋応答に対しDGPP8：0は影響を与えなかった(図29B)。Edg-4の安定なおよび一過的な発現においてはEC50値に矛盾があるため(図29B)、一過的にEdg-4でトランスフェクションした細胞について同様にDGPP8：0の試験を実施した。安定細胞の実験で得られた結果と同様に、一過的にEdg-4を発現する細胞においてDGPP8：0はCa2＋応答に影響を与えなかった(図29D)。DGPP8：0に関する上記のアッセイ法それぞれについて、PA8：0を用いた場合でも同様な所見が得られた(以下を参照のこと)。
【０２６３】
研究される受容体に関して、LPA濃度をEC50で一定に保ちながらDGPP8：0濃度を増加させて、Edg-2および-7を発現する細胞に対する阻害曲線を作製した。Edg-7に関するIC50値は285±28nM であり(図30A)、Edg-2に関するIC50値は11.0±0.68μMであった(図31A)。これは前記曲線を用いて決定した。IC50値(Edg-7について250nM、Edg-2について3μM)近傍の一定量のDGPP8：0を用いた場合には、Edg-7 (図30B)および Edg-2 (図 31B)に関する用量反応曲線はいずれも右にシフトした。このことは阻害が競合的メカニズムであることを示した。
【０２６４】
DGPPに関して構造活性相関をより明確にする目的で、LPA、DGPP、PAおよびDAGのDGPP、短鎖(8：0)および長鎖(18：1)種をEdg-2および-7を発現する細胞株を用いて試験した。図30Cは、LPA18：1をこれらの脂質のそれぞれと組み合わせて曝露した場合Ca2＋応答に対するこれら脂質の効果を示す。これらの実験では、試験脂質はDGPP8：0のIC50と同等の濃度で添加したが、LPAはその濃度がEC50付近になるように選択した。LPA8：0はEdg-7に何らの効果も示さなかったが、DGPP8：0およびPA8：0は50％および56％と有意にCa2＋応答を阻害した。対照的に、DAG8：0はCa2＋応答を有意に亢進させた。DGPPおよびPAの鎖長を18：1と長くすると、これらの類似体はもはやEdg-7の阻害剤ではなくなった(図30C)。同様に、DAG18：1はEdg-7に対する阻害効果を示さなかった。
【０２６５】
同様の一揃いの脂質群について、Edg-2を発現する細胞に関する試験を行った(図31C)。DGPP、PAおよびDAGのオクチル鎖長の類似体を10μMで用いた場合には、いずれも前記応答を、それぞれ対照の50％、19％および64％に減少させた。鎖長が18：1と長くなった場合には、DGPPおよびDAGは阻害的効果を示さなくなったが、PA18：1では、中程度の阻害効果を保持しており、Ca2＋応答は18％低下した。同様の脂質群パネルについて、Edg-4を発現する細胞に関して試験を行った(図32A〜B)。Edg-4を発現する安定な細胞株に対してこれらの脂質をアッセイした場合には、短鎖もしくは長鎖脂質はいずれも阻害効果を示さなかったが、PA8：0および18：1は、それぞれ対照の162％および137％と、いずれもCa2＋応答を有意に亢進させた。安定クローンで得られた結果を確認する目的で、一過的にEdg-4を発現する細胞を用いて前記脂質群を試験した(図 32B)。再び、DGPPもしくはPAの短鎖のもの、長鎖のもの、いずれもCa2＋応答に対する阻害効果を示さず、安定細胞株を用いて得られた結果と一致した。安定なEdg-4クローンとは対照的に、Edg-4を一過的に発現する細胞において、いずれのPA類似体もCa2＋応答を促進することはなかった。安定にもしくは一過的にEdg-4を発現する細胞において、単独で添加したいずれのPAも、10μMまでの濃度では、応答を誘起しなかった。
【０２６６】
LPA受容体内因的に発現する細胞に対するDGPP8：0の効果も調べた。IC50 が96±21nMの場合に、DGPP8：0がアフリカツメガエル卵細胞におけるCa2＋媒介性でLPA誘起性である卵内部へのCl-電流を阻害することを見いだした (図33A)。200nM濃度のDGPP8：0の存在下では、LPA18：1の用量反応曲線は右にシフトした。このことは、Edg-2および-7クローンにおいて作用機序が競合的であることを示している(図33B)。DGPP8：0が細胞内もしくは細胞外の機序で働くのか否かを調べる目的で、DGPP8：0を細胞内に注入し、卵細胞をLPA18：1に曝露した。＞300nM濃度に達すると推定されたDGPP8：0の細胞内注入後、5nMのLPA18：1細胞外に適用すると、対照と同等の規模の応答が誘起することを、図32Cは示している。これに比べて、LPA18：1によって通常誘起される応答は、DGPP8：0を細胞外に適用した場合、完全に阻害された(図33C)。10分間の洗浄後には応答が対照のレベルまで回復するので、DGPP8：0の阻害効果は可逆的であった(図33C)。
【０２６７】
卵細胞に発現するLPA受容体に対するDGPP8：0の特異性を明確にする目的で、ラットの脳に由来するポリA+の付加したmRNAを注入することによって前記神経伝達物質受容体の発現を誘導した。この結果、非注入卵細胞では発現していないG蛋白質結合のセロトニンおよびアセチルコリン受容体の発現が起こった。これらの神経伝達物質は、LPAが活性化するイノシトール3リン酸-Ca2＋シグナル伝達の経路と同一の経路を活性化する(Tigyiら、1990)。これらの卵細胞では、DGPP8：0は、セロトニンもしくはカルバコール誘起性の応答に関してはいずれも阻害せず、このことはDGPP8：0がLPA受容体に対して特異性を有していることを示した。同様な濃度で用いたPA8：0も、卵細胞におけるLPA誘起性の応答を阻害する効果があった。
【０２６８】
LPA受容体を内因的に発現する哺乳動物系において、LPA誘起性の応答に対するDGPP8：0の効果も調べた。EdgおよびPSP24受容体のmRNAの存在に関し、RT-PCRでNIH3T3細胞をスクリンーニングした。図34Aは、NIH3T3細胞において、Edg-2、-5および PSP24のmRNA転写産物が検出されたことを示している。DGPP8：0はLPA誘起性Ca2＋応答を特異的に阻害するがSIP誘起性のCa2＋応答は阻害しないことを示すために、10μMのDGPP8：0の存在下で100nMのLPAもしくはSIPにNIH3T3細胞を曝露した。図34Bに示されるように、DGPP8：0はLPA誘起性のCa2＋応答を有意に阻害したが、SIP誘起性の応答には効果を示さなかった。
【０２６９】
LPAが卵巣癌で産生しある役割を果たしていることが示されている(Xuら、1995a)。それ故、治療上適切な標的に対する効果示すか否かを調べるために、HEY卵巣癌細胞に関してもDGPP8：0の試験を実施した。図34Dは、DGPP8：0はLPA誘起性Ca2＋応答を対照の12％まで阻害したが、DGPP18：1は無効果であることを示している。同様に、PA8：0は対照の6％までCa2＋応答を阻害したが、PA18：1は効果を示さなかった。HEYはEdg-1、-2、-5および-7受容体のmRNA転写産物を発現している(図34C)。
【０２７０】
実施例15  NIH3T3細胞の増殖阻害
増殖因子の際だった効果は細胞増殖を誘起できることである。LPAは異なる種類の各種細胞について増殖を刺激することが判明しているので(Goetzlら、2000)、DGPP8：0のNIH3T3細胞の増殖に対する阻害能を調べた。図35は、DGPP8：0はNIH3T3細胞のLPA誘導性の増殖を有意に阻害し、細胞数を対照のレベルまで低下させるが、溶媒で処理した対照の細胞には効果を示さないことを示している。DGPP8：0の阻害効果に関する構造活性の相関を明らかにする目的で、短鎖および長鎖のDGPP、PAおよびDAGをアッセイ法に組み込んだ。図35に示されるように、溶媒で処理した対照の細胞には、被検パネルに組み込まれる脂質は、いずれも有意な阻害的もしくは促進的効果を示さなかった。DGPP8：0だけが、LPA誘導性増殖を阻害した。DGPP18：1も長鎖および短鎖のPAおよびDAGもLPA誘導性増殖に効果がなかった。興味深いことに、このアッセイ法でPA8：0は有意な阻害を示さなかった。
【０２７１】
実施例13〜15の考察
Edg-2、-4および-7 受容体を異種的に発現するRH7777細胞を用いて、候補アンタゴニストのスクリーニングを行った。本発明者らの計算機による既存のEdg受容体のモデル化(Parrillら、2000)および利用可能な構造活性に関するデータ (Jalinkら、1995)に基づき、上記の実験結果から短鎖ホスファチジン酸DGPP8：0は、IC50値が285±28nMであり、Edg-7の選択的、競合的アンタゴニストであることが示される。同一の分子は、Edg-2に関してはIC50値が11.0±0.68μMとEdg-2の阻害剤としては弱いものであるが、Edg-4については阻害を起こさないことが見出された。DGPP8：0はアフリカツメガエル卵細胞における内因性のLPA応答を阻害し、IC50値は96±21nMであった。PA8：0も同様の阻害的性質を示した。それ故、これら短鎖ホスファチジン酸はEdg-2よりもEdg-7に対して40〜100倍の高い選択性を示す。
【０２７２】
アシル鎖の長さが12個の炭素もしくはそれ以下であるLPAがEdg-2、-4もしくは-7を発現する昆虫細胞における応答を誘起しないことを示したBandohら(2000)の結果が、短鎖ホスファチジン酸に関する上記の結果によって確認される。上記のように、哺乳動物発現系において、LPA8：0はEdg-2、-4もしくは-7のアゴニストでもアンタゴニストでもなかった。Edg-7はsn-1 位よりもsn-2位にエステル化した脂肪酸鎖を有するLPAに10倍選択性が高い(Bandohら、2000)。それ故、リン酸部分から距離炭化水素鎖までの相対的距離によって、受容体との結合活性が消失することはなく、受容体の活性化が消失することもない。Edg-7はまた、飽和脂肪酸と比較して長鎖不飽和脂肪酸に対する選択性を有する。エーテル結合もしくはビニルエーテル側鎖があっても、EC50が2桁減少する(Bandohら、2000)。さらに、炭化水素の最適鎖長は18個の炭素であるが、20炭素からなる類似体はこれより弱いアゴニストであった。Edg-7に関するこれらの薬理学的性質は、受容体の活性化が鎖長および側鎖の柔軟性(エステル結合対エーテル結合)に依存していることを示す。
【０２７３】
Edg-1受容体の計算機モデル化から、リガンド結合に必要な3つの荷電性残基が同定されている。これらの残基のうちの一つであるアルギニン120は、リン酸基と相互作用すると予測され、Egdファミリーの構成員すべてにおいて保存されている。第二の残基アルギニン292は、Edg-8を除くEgdファミリーの構成員すべてにおいて近傍に正電荷性の残基を有する位置に現れる。第三の残基グルタミン酸121はLPA特異的Edg受容体間で保存されてはおらず、Edg-2、-4および-7では対応する部位がグルタミンになっている。このグルタミン残基は、LPAの水酸基部分と相互作用すると予測されている。この残基をアラニンに置換すると、リガンド結合および受容体活性化が消失し、このことはPLGFファルマコフォアの荷電性部位とこれら3つの残基間のイオン相互作用がEdg-1のリガンド結合に必要であることを示唆している(Parrillら、2000)。 さらに、受容体と炭化水素鎖それ自身との間の相互作用は、リガンド結合と活性化にとって充分ではない(Parrillら、2000)。それ故、イオン性のアンカーおよび疎水性尾部の両方をふくむ相互作用の組み合わせがアゴニストの活性化に必要であると考えられた。このような仮定を支持するものとして、上記の結果は、短鎖LPA8：0がEdg-2、-4もしくは-7を活性化し得なかったことを示す。これは疎水性尾部とリガンド結合ポケットとの相互作用が重要性であることを意味する。そこで、PLGFファルマコフォアの「スイッチ」領域として疎水性尾部を設計した。これらの受容体による前記脂肪酸のsn-1およびsn-2置換は許容度のために、切断された炭化水素鎖が短いため受容体を活性化できないと考えられる短鎖ホスファチジン酸に注目した。ホスファチジン酸中のアシル鎖の構造的な可動性は、隣接する脂肪酸部分によっても制限を受ける。本出願人らは、ピロリン酸部分の効果についても調べた。この部分は、アンカー領域の負に荷電する特質を変化させることはないが、むしろ荷電を増加させる。
【０２７４】
Edg-2、-4および-7 受容体を発現する細胞株クローンを用いて、このような概念に基づく薬剤設計の試験を行った。DGPP8：0およびPA8：0の薬理学的性質は、3種の受容体間で大きく異なることが解った。いずれの分子とも、Edg-7を効果的に阻害したが、Edg-2に関してその効果は一桁以上低かった。いずれの分子もEdg-4に関しては無効果であった。DGPP8：0はEdg-2および-7の双方に対して競合的阻害剤となることも解った。用量反応曲線を右にシフトさせ、両受容体に対するLPAのEC50値が増加した。PAおよびDGPPの長鎖に対応したアゴニスト活性の欠如により、結合ポケットへの束縛を目立たさせる。DAG8：0による阻害の欠失により、結合ポケットへのリガンドの結合におけるイオン性アンカーが重要性が支持されているが、その細胞内効果はPCK等の他の分子標的への細胞内作用と区別が付かない可能性が高い。
【０２７５】
PAおよびDGPPのいずれも天然のリン脂質である。DGPP(8：0)は1993年に植物の新規脂質として発見された。これはホスファチジン酸キナーゼによるPAのリン酸化産物である(WissingおよびBehrbohm、1993; Munnikら、1996)。DGPPは細菌、酵母菌および植物で同定されているが、哺乳動物細胞では同定されていない。最近の研究によれば、DGPPはマクロファージを活性化し、細胞質内ホスホリパーゼA2の活性化を通じてプロスタグランジン生産を刺激することが示された。このことは、炎症反応におけるDGPPの役割を示唆している(Balboaら、1999; Balsindeら、2000)。この著者らは、これらの効果がLPA受容体によって媒介される可能性を除外していた。長鎖DGPPおよびPA類似体を用いた上記の結果はこのことを確認した。すなわち、Egd受容体を発現する細胞株においてこれらの化合物は10μMまでの濃度ではアゴニストとしての性質を持たなかった。
【０２７６】
3種の異なる細胞に内因的に発現するLPA受容体に対する短鎖ホスファチジン酸の効果についても調べた。DGPP8：0 およびPA8：0は、アフリカツメガエル卵細胞におけるLPA誘起性のCl- 電流に対し効果的な阻害剤であることが解った。作用部位を明らかにするために、DGPP8：0を卵細胞に注入し、LPAを細胞外に添加した。DGPP8：0は、細胞外に適用した場合LPA誘起性のCl- 電流を唯一効果に阻害した。このことは、アンタゴニストとしての効果が細胞表面において起こることを示すものであった。卵細胞および NIH3T3細胞において、DGPP8：0はLPA受容体に対して特異性を示した。これらの細胞においては、DGPP8：0はLPA誘起性Ca2＋応答に唯一効果的な阻害を示し、SIP、アセチルコリンもしくはセロトニンによって誘起された応答には効果がなかった。
【０２７７】
RT-PCR解析によれば、Edg-2だけがNIH3T3細胞に発現し、Edg-4もしくは-7は発現していないことが明らかになった。NIH3T3細胞においては、100倍過剰のDGPP8：0でのみCa2＋応答が40％阻害された。この阻害の程度は、弱い阻害剤として働くEdg-2を発現する安定な細胞株において見られる阻害の程度と同等である。HEY卵巣癌細胞についてLPAに対し10倍過剰量で短鎖DGPPおよびPAを評価したところ、いずれも効果的な阻害を示したが、長鎖はいずれの分子も効果を示さなかった。RT-PCRにより、HEY細胞で主要なmRNAはEdg-7であるが、Edg-2 mRNAに関しては痕跡程度しか検出されなかったことを示された。この阻害の程度は、DGPP8：0およびPA8：0のいずれもが効果的阻害剤として働くEdg-7を発現する安定な細胞株において見られる阻害の程度と同等である。
【０２７８】
LPA誘導性のNIH3T3細胞の増殖に対する遮断能に関し、それぞれの短鎖ホスファチジン酸の評価を行った。DGPP8：0はLPA誘導性増殖を効果的に阻害したが、長鎖DGPPは阻害しなかった。PA8：0はCa2＋応答を効果的に阻害するが、細胞増殖を効果的に阻害することはない。これらの結果は、PA(12：0)がPA18：1の細胞分裂を促す効果を阻害しないことを示した既報と一致する(van Corvenら、1992)。脂質ホスファターゼはアンタゴニストを不活性化するので、分子の安定性に関する長期的アッセイ法が関心対象となる。PAおよびDAGのいずれもが増殖を阻害しなかったことは、このアッセイ期間中はDGPP8：0がより安定である可能性が高いことを。DGPPの安定性は、DGPPが実験中に代謝されなかったことを示すBalboaら (1999)の報告によっても示されていた。
【０２７９】
Edg受容体のみならず他のPLGF受容体に関する研究分野においても、DGPP8：0は重要な新しいツールを提供する。Edgファミリーの計算機モデル化に由来するPLGFファルマコフォアのイオン性アンカーおよび疎水性スイッチの概念は、新規の阻害剤の設計、合成を支援すべきである。
【０２８０】
実施例16  直鎖状リン酸中間体101〜105の合成
化合物101: リン酸ジベンジルエステルブチルエステル
無水 n-ブタノール74mg(1.00mmol)と1H-テトラゾール365mg (5.17mmol)を100mlの丸底フラスコ中の34ml無水塩化メチレンに溶解した。0.895g (2.58mmol)のジベンジル-N,N-ジイソプロピルホスホラミダイトを5mlの無塩化メチレンに溶かした溶液を、撹拌しながらアルゴン雰囲気下でシリンジを用いて添加した。前記反応物を室温で2時間撹拌した。次に、反応混合物をイソプロピルアルコール/ドライアイス浴で〜38℃に冷却した。28mlの無水塩化メチレンに溶かした0.815g(3.43mmol)の32％過酢酸を添加漏斗で滴下した。添加後、反応混合物を氷浴で〜0℃まで暖めた。反応混合物を氷浴で1時間撹拌した。反応混合物を分液漏斗に移し、200mlの塩化メチレンで希釈した。有機層を10％メタ重亜硫酸ナトリウム(2x40ml)、飽和重炭酸ナトリウム(2x40ml)、水(30ml)および鹹水(40ml)で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した。これを濃縮し、真空下で乾燥した。次に、未精製産物を溶出液として1：1混合のヘキサン/酢酸エチルを用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、透明な油状の化合物101を得た(309mg、これは過剰のリン酸化試薬に由来する微量の不純物を含んでいた)。
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【０２８１】
化合物102: リン酸ジベンジルエステルオクチルエステル
無水n-オクタノールを130mg(1.00mmol)を用い、化合物101に関して用いた方法と類似の方法で実施した。未精製産物を、溶出液として7：3混合のヘキサン/酢酸エチルを用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、透明な油状の化合物102を得た(351mg、90％)。
2005508319.tif 000084
【０２８２】
化合物103: リン酸ジベンジルエステルドデシルエステル
無水 n-ブタノール186mg(1.00mmol)を使用し、化合物101に関して用いた方法と類似の方法を用いた。未精製産物を、溶出液として7：3混合のヘキサン/酢酸エチルを用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、透明な油状の化合物103を得た(361mg、81％)。
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【０２８３】
化合物104: リン酸ジベンジルエステルオクタデシルエステル
オクタデカノール270mg (1.00mmol)を使用し、化合物101に関して用いた方法と同様の方法を用いた。未精製産物を、溶出液として7：3混合のヘキサン/酢酸エチルを用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、吸湿性の白色固体として化合物104を得た(474mg、89％)。
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【０２８４】
化合物105: リン酸ジベンジルエステルドコサニルエステル
ドコサノール327mg(1.00mmol) を用い、化合物101に関して用いた方法と類似の方法で実施した。未精製産物を、溶出液として7：3混合のヘキサン/酢酸エチルを用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、吸湿性の白色固体として化合物105を得た(516mg、88％)。
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【０２８５】
実施例17  直鎖状リン酸化合物106〜110の合成
化合物106: リン酸モノブチルエステル
厚壁圧力容器で200mg(0.60mmol)の化合物101を30mlの無水メタノールに溶解した。前記容器にアルゴンを吹き込み10％Pd/Cを約200mg添加した。前記容器に水素化装置をつなぎ、室温で反応容器の内部を〜50psiの水素雰囲気に8時間維持した。次に、反応混合物を減圧下でセライトパッドにより濾過し、メタノールで洗浄した。溶媒を減圧下で蒸発し、黄色油状の化合物106を70mg(86％)得た。
2005508319.tif 000088
【０２８６】
化合物107: リン酸モノオクチルエステル
200mg(0.51mmol)の化合物102を使用し、化合物106に関して用いた方法と類似の方法を用いた。白色/黄色粘着性固体として化合物107を100mg(93％)単離した。
2005508319.tif 000089
【０２８７】
化合物108: リン酸モノドデシルエステル
200mg(0.45mmol)の化合物103を使用し、化合物106に関して用いた方法と類似の方法を用いた。白色固体状の化合物108を112mg(94％)得た。
2005508319.tif 000090
【０２８８】
化合物109: リン酸モノオクタデシルエステル
200mg(0.38mmol)の化合物104を使用し、化合物106に関して用いた方法と同様の方法を用いた。白色固体状の化合物109を104mg(79％)得た。
2005508319.tif 000091
【０２８９】
化合物110: リン酸 モノドコシルエステル
200mg(0.34mmol)の化合物105をを使用し、化合物106に関して用いた方法と同様の方法を用いた。白色固体状の化合物110を98mg(71％)得た。
2005508319.tif 000092
【０２９０】
実施例18  直鎖状リン酸化合物106〜110
PSP24 PLGFRを内因的に発現するアフリカツメガエル卵細胞を用いて、化合物106〜110のLPA阻害的活性に関するスクリーニングを実施した。無菌状態でキシラジンを用いて麻酔したアフリカツメガエル (Xeopus laevis)成体(Carolina Scientific、Burlington、NC)から卵細胞を得て、実験用に調製した。Ca2＋を含まない卵巣用リンゲル-2溶液((OR-2) 82. 5 mM NaCl、2 mM KCl、1 mM MgCl2、5mM HEPES、NaOHでpH 7. 5に調整)中で1.4mg/ml のA型コラゲナーゼ(Boehringer(IN))を用いた処理で段階V〜VIの卵細胞の卵胞細胞層を除去した。17〜20℃のインキュベータ内で、卵細胞をバース溶液中で維持し、単離後2〜7日間を用いた。
【０２９１】
-60 mV(GeneClamp 500、Axon Instruments、CA)の膜電位を有する標準2電極電位クランプ増幅器を使用して電気生理学的記録を行った。試験化合物はメタノールに溶解し、脂肪酸を含まないBSAと混合した。これをカエル用Na＋リンゲル溶液(120 nM NaCl、2 mM KCl、1.8 mM CaCl2、5 mM HEPES; pH 7.0)で希釈した。これを5ml/分の流速で灌流しながら卵細胞に添加した。NIC-310デジタルオシロスコープ(Nicolet、Madison、WI)で膜電流を記録した。適当な洗浄除去と脱感作からの回復が可能となるように、15分(最小)間隔で添加した。
【０２９２】
図36は、LPA誘導性の塩素電流に対する化合物106〜110による用量依存的阻害を示している。化合物108が最適な阻害剤であり、IC50値が約8.1nMであった。より短いもしくはより長い直鎖アルキル基を有する化合物では、LPA誘導性の塩素電流を阻害する効果が減少したが、化合物107は、IC50値が約10.2nMであり、効果は同等であったことを示した。図37にはEC50値の比較を示す。陽性対照溶液(LPA単独)では25nmであり、LPAと100nMの化合物108を含む溶液では343nMであった。従って、化合物108は、アフリカツメガエル卵細胞においてPSP24受容体によるLPAのシグナル伝達を効果的に阻害する。
【０２９３】
上記の結果に基づき、化合物108が、異種的に個々の受容体を発現するRH7777細胞における、Edg-2、―4および-7受容体のアンタゴニストとして効果的であるか否かについても調べた。
【０２９４】
図38には、LPA18：1および化合物108組み合わせに対して曝露した場合の、Edg-2、Edg-4およびEdg-7を発現する細胞におけるCa2＋応答に対する化合物108の効果示す。これらの実験に関して、LPA濃度はEC50付近となるように選択した。化合物108はCa2＋応答を有意に阻害し、Edg-2およびEdg-7を発現する細胞株において、それぞれ対照の約63％および56％に低下させた。対照的に、Edg-4 発現する細胞株では、化合物108はCa2＋応答を有意に亢進し、対照の約148％まで高めた。
【０２９５】
それ故、直鎖状リン酸はEdg-2およびEdg-7 活性をインビボで選択的に阻害し、Edg-4 活性をインビボで選択的に促進すると予想される。
【０２９６】
参照文献一覧
以下に示す参照文献は、ここにそれぞれその全文が本出願の明細書に参照として組み入れられる。
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【０２９７】
本明細書には好ましい態様が示され詳細に記述されているが、本発明の精神を逸脱することなく各種の改変、付加、置き換え等が可能であることは関連の技術分野の当業者であれば容易に理解できると思われる。従って、これらも、以下の特許請求の範囲で定義される本発明の範囲内に含まれるものと理解される。
【図面の簡単な説明】
【０２９８】
【図１】LPA受容体のEDG-2、EDG-4、EDG-7およびPSP-24(α、β)を含む10種類のリン脂質増殖因子受容体の分類と関連を示す系統樹である。
【図２】セリンアミド化合物35〜43の調製に用いる合成スキームを示す。
【図３】セリンリン酸アミド化合物55〜59の調製に用いる合成スキームを示す。
【図４】二リン酸化合物66〜68の調製に用いる合成スキームを示す。
【図５】2リン酸化合物の合成を示す。図5Aは1,2-二リン酸化合物85〜92の調製に用いる合成スキームを示す。図5Bは1,3-二リン酸化合物の調製に用いる合成スキームを示す。
【図６】ピロリン酸化合物の調製に用いる合成スキームを示す。
【図７】置換されたモノリン酸、およびトシル酸で保護された二エーテル中間体由来のモノリン酸の調製に用いる合成スキームを示す。
【図８】直鎖状脂肪酸リン酸化合物106〜110の調製に用いる合成スキームを示す。
【図９】直鎖状チオリン酸モノアルキルエステルの合成を示す。
【図１０】直鎖状リン酸アルキルアミドの合成を示す。
【図１１】構造的に束縛を受ける環状リン酸化合物の調製に用いる合成スキームを示す。
【図１２】構造的に束縛を受ける環状リン酸化合物の調製に用いる合成スキームを示す。
【図１３】構造的に束縛を受ける環状リン酸化合物の調製に用いる合成スキームを示す。
【図１４】遊離リン酸部分を有し構造的に束縛を受ける化合物の調製に用いる合成スキームを示す。
【図１５】2-モノリン酸の調製に用いる別の合成スキームを示す。
【図１６】1,3-二リン酸化合物の調製に用いる別の合成スキームを示す。
【図１７】X3が-N(H)-アシル基を有する化合物の調製に用いる合成スキームを示す。
【図１８】X3が-N(H)-イミダゾール基を有する化合物の調製に用いる合成スキームを示す。
【図１９】X3が-N(H)-C(O)-R7を有する化合物の調製に用いる合成スキームを示す。
【図２０】X3が-N(H)-C(S)-R7を有する化合物の調製に用いる合成スキームを示す。
【図２１】化合物56(SAP、14：0)を細胞外に添加すると、アフリカツメガエルの卵細胞にLPAで誘起される塩素電流が用量依存的に阻害されることを示すグラフである。
【図２２】化合物57(SAP、18：0)を細胞外に添加すると、アフリカツメガエルの卵細胞にLPAで誘起される塩素電流が用量依存的に阻害されることを示すグラフである。
【図２３】化合物66(MAGDP、18：0)を細胞外に添加すると、アフリカツメガエルの卵細胞にLPAで誘起される塩素電流が用量依存的に阻害されることを示すグラフである。矢印は5μMの化合物66を細胞内に注入し、LPAを細胞外に添加した場合の時間を示すグラフである。
【図２４】化合物66(MAGDP、18：0)の用量依存的阻害効果を示すグラフである。一定量のLPA(5nM)とともに化合物66の量を増加させながら卵細胞に添加した。各データの点は、測定した塩素電流のピーク振幅値を表す。
【図２５】化合物92(MAGDP、22：0)を細胞外に添加すると、アフリカツメガエルの卵細胞にLPAで誘起される塩素電流が用量依存的に阻害されることを示すグラフである。
【図２６】アフリカツメガエルの卵細胞に対する化合物56a(SDAP、14：0／2：0)の用量依存的効果を示すグラフである。
【図２７】LPAで誘起されるHEY細胞の遊走に対する化合物56(SPA、14：0)、56a(SDAP、14：0／2：0)、および66(MAGDP、18：0)の効果を示す棒グラフである。試験化合物の濃度は1μMであり、LPA濃度は0.1μMであった。
【図２８】Edg-2(28A)、Edg-4(28B)、もしくはEdg-7(28C)を異種的に発現するRH7777細胞における、Ca2＋応答に対する用量応答の関係を示すグラフである。各データ点は少なくとも3回の測定の平均値±S.D.を表す。
【図２９】Edg-2、およびEdg-7を発現するがEdg-4を発現していないRH7777細胞におけるLPAによるCa2＋応答のDGPP8：0による阻害を示すグラフである。Edg-2、-4もしくはEdg-7を発現しているRH7777細胞を、100nMのLPA18：1および1μMのDGPP8：0からなる混合物に曝露した。対照の細胞は100nMのLPA18：1に曝露した。Edg-2(29A)、Edg-4(29B)、およびEdg-7(29C)を安定に発現する細胞、もしくはEdg-4(29D)を一過的に発現する細胞について代表的なCa2＋応答を示す。
【図３０】A〜Cは、Edg-7を発現するRH7777細胞(Edg-7細胞)におけるDGPP8：0によるLPA応答の阻害に関する薬理学的特徴付けを示すグラフである。DGPP8：0の濃度を増加させながら250nM濃度のLPA18：1と混合し、この混合液に細胞を曝露した。得られたCa2＋応答のピーク部分の面積を測定した(30A)。また、LPA18：1の濃度を増加させながら500nM濃度のDGPP8：0と混合し、この混合液に細胞を曝露した(30B)。Edg-7細胞を、表記の脂質500nMと混合した250nM濃度のLPA18：1に曝露した(30C)。Ca2＋応答のピーク部分の面積を、最低でも3回の測定から得られた平均値±SDで表している。
【図３１】Edg-2を発現するRH7777細胞(Edg-2細胞)におけるDGPP8：0によるLPA応答の阻害に関する薬理学的特徴付けを示すグラフである。DGPP8：0の濃度を増加させながら250nM濃度のLPA18：1と混合し、この混合液に安定なEdg-2細胞を曝露した。Ca2＋応答のピーク部分の面積を測定した(31A)。LPA18：1の濃度を増加させながら10μM濃度のDGPP8：0と混合し、この混合液にEdg-2細胞を曝露した(31B)。Edg-2細胞を、表記の脂質10μM濃度と混合した250nM濃度のLPA18：1に曝露した(31C)。応答を、最低でも3回の測定から得られた平均値±SDで表している。
【図３２】Edg-4を発現するRH7777細胞におけるDGPPの構造活性相関を示すグラフである。安定なEdg-4細胞を、表記の脂質5μM濃度と混合した500nMのLPA18：1に曝露した(32A)。Edg-4を一過的に発現する細胞を、表記の脂質1μMと混合した100nM濃度のLPA18：1に曝露した(32B)。Ca2＋応答のピーク部分の面積を測定し、最低でも3回の測定から得られた平均値±S.D.で表している。
【図３３】アフリカツメガエルの卵細胞にLPAで誘起される塩素イオン電流に関して、DGPP8：0の薬理学的特徴付けを示すグラフである。DGPP8：0の濃度を増加させながら5nM濃度のLPA18：1と混合し、この混合液に卵細胞を曝露した。得られた振動性Cl-電流のピーク振幅値を測定した(33A)。LPA18：1の濃度を増加させながら200nM濃度のDGPP8：0と混合し、この混合液に卵細胞を曝露した(33B)。データ点は、最低でも3回の測定から得られた平均値±S.D.で表した。表記のように、卵細胞を、5nMのLPA18：1、もしくは5nMのLPA18：1と1μMのDGPP8：0の混合物で処理した(33C)。1μMのDGPP8：0の細胞内注入に関しては矢印で示されている。
【図３４】NIH3T3線維芽細胞およびHEY卵巣癌細胞におけるLPA誘導性Ca2＋応答DGPP8：0による阻害を示すグラフである。NIH3T3細胞のEdgおよびPSP24受容体転写産物に関するRT-PCR解析である(34A)。10μM濃度のDGPP8：0と混合した100nM濃度のLPA18：1もしくはSIPにNIH3T3細胞を曝露した(34B)。HEY細胞のEdgおよびPSP24転写産物の存在に関するRT-PCR解析である(34C)。1μM濃度のDGPP8：0と混合した100nM濃度のLPA18：1もしくはSIPにHEY細胞を曝露した(34D)。得られたCa2＋応答のピーク部分の面積を測定し、最低でも3回の測定から得られた平均値±S.D.で表している。
【図３５】LPAで誘起されるNIH3T3細胞の増殖のDGPP8：0による阻害を示すグラフである。NIH3T3細胞を6時間血清飢餓状態におき、表記の脂質10μM濃度と混合した5μM濃度のLPA18：1に曝露した。対照細胞に関しては、LPA18：1の代わりに溶媒(BSA)を用いた。細胞を前記脂質とともに24時間インキュベートし、細胞数を計測した。データは3回の実験を示している。
【図３６】アフリカツメガエル卵細胞におけるLPA応答の直鎖状脂肪酸リン酸化合物106〜110による阻害に関する薬理学的特徴付けを示すグラフである。
【図３７】アフリカツメガエル卵細胞におけるLPA応答の直鎖状脂肪酸リン酸化合物108による阻害に関する薬理学的特徴付けを示すグラフである。
【図３８】個々にEdg-2、Edg-4、およびEdg-7を発現するRH7777細胞を直鎖状脂肪酸リン酸化合物108に曝露した後の、それぞれの細胞においてアゴニストもしくはアンタゴニストで誘起する応答の薬理学的特徴付けを示すグラフである。Ca2＋応答のピーク部分の面積を測定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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