(57)【要約】歯または智歯の歯嚢から単離された非胚性組織から得ることができる、歯周靱帯様膜構造に分化することができる幹細胞。【特許請求の範囲】
【請求項１】
歯または智歯の歯嚢から単離された非胚性組織から得ることができる、ｉｎ ｖｉｔｒｏで歯周靱帯様膜構造に分化することができる幹細胞。
【請求項２】
石灰化組織様構造に分化することができる請求項１の幹細胞。
【請求項３】
非胚性または生後の動物細胞または組織に由来する、自己再生することができ、かつ内胚葉性、外胚葉性、および中胚葉性系譜の細胞に分化することができる幹細胞。
【請求項４】
ヒト細胞である請求項１の幹細胞。
【請求項５】
請求項１の幹細胞から得ることができる多能性間葉系幹細胞。
【請求項６】
ａ）嚢細胞に由来し、自己再生することができ、かつ中胚葉性系譜の細胞に分化することができる多能性胚性様幹細胞；および
ｂ）前記幹細胞の増殖を支持することができる培地。
ｃ）前記幹細胞の、血管または他の脈管を有する生体膜を構築する細胞への増殖を支持することができる培地。
：を含む培養物。
【請求項７】
さらに増殖因子または系譜決定因子を含む、請求項６の培養物。
【請求項８】
前記幹細胞がヒト細胞である請求項６の培養物。
【請求項９】
・細胞を歯嚢から得る
・細胞を培養する
段階を含む、多能性胚性様幹細胞を単離する方法。
【請求項１０】
・歯嚢からクローン原性細胞を得る
・当該細胞を異なる培地中で培養する
・前記培養細胞をクローン密度に希釈する；
・前記希釈細胞を培養する；
・単一の細胞を有するこれらの培養物を増殖させる
段階を含む、クローン性多能性胚性様幹細胞を単離する方法。
【請求項１１】
請求項１０の方法によって得ることができるクローン性多能性胚性様幹細胞株。
【請求項１２】
目的の遺伝子またはタンパク質を発現するよう遺伝子組み換えされた請求項１の幹細胞。
【請求項１３】
（ａ）多能性胚性様幹細胞に少なくとも一つのマーカー遺伝子または目的遺伝子を含むＤＮＡ構築物を遺伝子導入する；
（ｂ）多能性胚性様幹細胞におけるマーカー遺伝子または目的遺伝子の発現について選択する；
（ｃ）（ｂ）で選択された幹細胞を培養する
段階を含む遺伝子組み換えされた多能性胚性様幹細胞を作製する方法。
【請求項１４】
請求項１３の方法によって得ることができる遺伝子組み換えされた多能性胚性様幹細胞。
【請求項１５】
歯嚢細胞である請求項１４の幹細胞。
【請求項１６】
・請求項１の幹細胞を、系譜決定因子である物質を含むと思われる試料と接触させる；および
・そのように接触させた細胞の系譜を、ｍＲＮＡ発現、抗原発現、または他の方法によって判定する；ここでその接触させた細胞の系譜は、前記試料中の系譜決定因子の存在または活性を示す
段階を含む、系譜決定因子である物質の存在または活性を検出するための方法。
【請求項１７】
・系譜決定されていない細胞として幹細胞を維持する培地中で、請求項１の幹細胞を培養すること；
・供試する物質、化合物、または因子を加えること；および
・ｍＲＮＡ発現、抗原発現、または他の方法によって、そのように接触させた細胞の系譜を判定すること
を含む、系譜決定されていない細胞の系譜決定を調節する、物質、化合物、または因子の能力を試験する方法。
【請求項１８】
・系譜決定されていない細胞として幹細胞を維持する培地中で、請求項１の幹細胞を培養すること、
・供試する物質、化合物、または因子を加えること；および
・ｍＲＮＡ発現、抗原発現、または他の方法によって、そのように接触させた細胞の系譜を判定すること
：を含む、系譜決定されていない細胞の系譜決定を調節する能力について、物質、化合物、または因子をスクリーニングするための分析システム。
【請求項１９】
・請求項１の幹細胞を、増殖因子である物質を含むと思われる試料と接触させる；および
・そのように接触させた細胞の増殖および系譜を、ｍＲＮＡ発現、抗原発現、または他の方法によって判定する；ここでその接触させた細胞の系譜決定なしの増殖は、前記試料中の増殖因子の存在または活性を示す
段階を含む、増殖因子である物質の存在または活性を検出するための方法。
【請求項２０】
・系譜決定されていない細胞として幹細胞を維持する培地中で、請求項１の幹細胞を培養すること；
・供試する物質、化合物、または因子を加えること；および
・ｍＲＮＡ発現、抗原発現、または他の方法によって、そのように接触させた細胞の増殖および系譜を判定すること
を含む、系譜決定されていない細胞の増殖を調節する、物質、化合物、または因子の能力を試験する方法。
【請求項２１】
歯周炎、腱、靱帯、筋膜、および、中皮性／内皮性細胞の血管へのまたは外胚葉性または神経組織への分化を支援するその他の種類の結合組織を再生するのに用いられる膜に、請求項１の幹細胞を培養するための方法。
【請求項２２】
インシュリン、レチノイン酸、インドメタシン、イソブチルキサンチン、テオフィリン、形質転換成長因子−β（任意の）、骨形成タンパク質（任意の）、繊維芽細胞成長因子（任意の）、上皮成長因子（任意の）、血小板由来成長因子（任意の）、血管内皮成長因子（任意の）、肝細胞成長因子、インターフェロン（任意の）、インシュリン様成長因子（任意の）、インターロイキン（任意の）、神経成長因子：の一つまたは組み合わせを分化のために含む任意の培地で請求項１の幹細胞を培養するための方法。
【請求項２３】
請求項１の多能性胚性様幹細胞に目的のタンパク質または遺伝子を発現するＤＮＡまたはＲＮＡを含むベクターを遺伝子導入する段階を含む、目的のタンパク質または遺伝子のｅｘ ｖｉｖｏ投与の方法。
【請求項２４】
治療的に有効な量の多能性胚性様幹細胞、またはそれに由来する細胞または組織を哺乳類に投与することを含む、哺乳類における細胞の衰弱、異常および／または機能障害および／または他の疾患状態を予防するおよび／または治療する方法。
【請求項２５】
治療的に有効な量の多能性胚性様幹細胞、またはそれに由来する細胞または組織を哺乳類に投与することを含む、哺乳類における組織修復または移植の使用。
【請求項２６】
請求項１の幹細胞に由来する中胚葉性系譜決定された細胞の治療的に有効な量を哺乳類に投与することを含む、哺乳類における細胞の衰弱、異常および／または機能障害および／または他の疾患状態を予防するおよび／または治療する方法。
【請求項２７】
請求項１の幹細胞に由来する中胚葉性系譜決定された細胞の治療的に有効な量を哺乳類に投与することを含む、哺乳類における組織修復または移植の方法。
【請求項２８】
・治療的に有効な量の多能性胚性様幹細胞、またはそれに由来する細胞または組織；および
・薬学的に受容可能な培地または担体
：を含む、哺乳類における細胞の衰弱，異常および／または機能障害の治療のための医薬組成物。
・さらに増殖因子または系譜決定因子を含む、請求項２８の医薬組成物。
【請求項２９】
請求項１の幹細胞をマトリクス上で培養することによって歯を作製するための、表１から成る足場。
【請求項３０】
歯周疾患治療用の歯結合歯周細胞株を作製するための、表１から成る足場。
【請求項３１】
歯の周囲の骨／骨マトリクス歯槽骨または顎骨の形成のための、表１から成る足場。
【請求項３２】
口内の動脈および静脈の形成のための、表１から成る足場。
【請求項３３】
接着シグナルを提供することによってその挙動を調節する細胞外マトリクス上に播種される歯、および表１から成る表２に記載の細胞結合領域配列を有する足場上に播種される成長因子結合部位に由来する幹細胞。
【請求項３４】
細胞が表３中のバイオリアクター内のマトリクスに播種される細胞培養の方法。
【請求項３５】
歯周組織を再建するために歯周組織中に幹細胞を移植する方法。
【請求項３６】
抜歯および皮膚病変の治癒を改善する方法。
【請求項３７】
歯のセメント質を作製または修復するために、歯周組織中に幹細胞を移植する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、歯由来の胚性様多能性幹細胞を含む多能性幹細胞に関する。本発明はまた、細胞または組織の移植における、遺伝子治療における、ならびに、細胞−細胞相互作用、系譜決定、発生遺伝子および成長因子または分化因子に関する同定、分析、またはスクリーニングにおける、組織製作のためのその幹細胞の用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞の局在
静止状態にあるかまたは、修復中であって結合組織要素を有する任意の組織または器官は、間葉系幹細胞の常在性の集団を有する。現在までに分析された器官、組織、およびそれらに付属する結合組織要素は、全胚、全胎仔、骨格筋、真皮、脂肪、腱、靱帯、軟骨膜、骨膜、心臓、大動脈、心内膜、心筋、心外膜、大きな動脈および静脈、肉芽組織、末梢神経、末梢神経節、脊髄、硬膜、軟髄膜、気管、食道、胃、小腸、大腸、肝臓、脾臓、膵臓、壁側腹膜、臓側腹膜、壁側胸膜、臓側胸膜、膀胱、胆嚢、腎臓付属結合組織および骨髄を含む。
【０００３】
近年、歯髄由来の幹細胞がグロンソスら（Ｇｒｏｎｔｈｏｓ ｅｔ ａｌ．）２０００， シーら（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．）ＷＯ０２／０７６７９によって単離されている。シャープ（Ｓｈａｒｐｅ）（ＷＯ０１／６０９８１）は、胚性幹細胞または成体幹細胞または組織培養からの歯前駆細胞の作製を請求した。さらに、イェリック（Ｙｅｌｉｃｋ）および共同研究者（米国特許出願第２００２０１１９１８０号）は、第三大臼歯胚由来の生物学的歯の方法および作製（ヤングら（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．） ２００２）を請求した。彼らは未熟な歯の尖端を除去して廃棄し、残りのエナメルおよび歯髄器官組織の細胞を歯の培養に用いた。
【０００４】
本発明によって当業者は歯のようなおよび歯に関係する器官および組織を組織製作によって同定、分離、および作製することができる。本発明の驚くべき長所は、成人および小児で日常的に摘出されている智歯の嚢細胞の好ましい用途である。このように、任意の成人患者についてさえ自由に入手可能な幹細胞の起源が開発された。上述の幹細胞とは対照的に、これらの前記幹細胞は歯周靱帯に関連する生体膜へ分化することができる。
【０００５】
幹細胞の定義
幹細胞はそれ自身を複製することができ、また、より特化した機能を担う細胞を産することができる。より分化した娘細胞およびその子孫が身につけた機能は、その幹細胞の発生能または発生能力と一般に言われる。一つの型だけの分化した細胞を生じる幹細胞は単分化能性という。一般的な用法では、相対的な用語である少能性、複数分化能性、および多能性は、分化した型の数の少数から多数または大多数への増加を表す。全能性細胞は、生物体を構成することのできる細胞型の全体を生じることのできる細胞である。実際的には、これらのわずかしかない用語は一連の可能性を十分に表現しない。
【０００６】
幅広い細胞型を形成する能力によって、多能性幹細胞は組織製作および移植の有望な資源となる。増幅、選択、発現、および選別技術の使用を通じて、幹細胞のｉｎｖｉｔｒｏ分化は将来の移植治療に確実に貢献する。
【０００７】
複数分化能性幹細胞はいくつかの胎児および成人起源から培養することができる。おそらく最も良く知られた起源は骨髄であり、これは造血幹細胞（チビン（Ｃｉｖｉｎ）ら、 １９８４）と間葉系幹細胞（ピッテンジャー（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ）ら，１９９９）の両者を含む。神経幹細胞もまた、脳室の内側を覆う上衣細胞から培養されている（ジョナソン（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ）ら， １９９９ａ）。系譜が限られた多数のｉｎ ｖｉｖｏに存在する幹細胞集団のうち、一部はｉｎ ｖｉｔｒｏで成長および分析を行うことができる可能性が高い。
【０００８】
三層への胚の構成は概ね成体の構成に対応し、内臓が内側、表皮が外側、そして結合組織がその間となる。内胚葉は呼吸路および消化管の内壁上皮の起源であり、また咽頭、食道、胃、腸を、および唾液腺肝臓、膵臓、および肺を含む多数の付属腺を生じる。中胚葉は平滑筋層、結合組織、および組織および器官に付属する管を生じる；中胚葉はまた心臓血管系の大部分を形成し、血球および骨髄、骨格、横紋筋、および生殖器官および分泌器官の起源である。外胚葉は表皮（皮膚の表皮層）、感覚器官、ならびに脳、脊髄、および神経系の末端の構成要素すべてを含む神経系全体を形成する。
【０００９】
保存されている幹細胞は前駆幹細胞および多能性幹細胞を含む。前駆細胞前駆幹細胞、直接の幹細胞、および形成細胞または芽細胞、たとえば、筋芽細胞、脂肪芽細胞、軟骨芽細胞、など）は系譜決定されている。単分化能性幹細胞は単一の系譜（たとえば筋原性、繊維原性、脂肪原性、軟骨原性、骨原性系譜、など）に限られた組織を形成する。二分化能性幹細胞は二つの系譜に属する組織を形成する（たとえば軟骨−骨原性、脂肪−繊維芽細胞系譜、など）。三分化能性幹細胞は三つの系譜に属する組織を形成する（たとえば軟骨−骨−脂肪原性系譜、など）。複数分化能性幹細胞は一つの系譜内の複数の細胞型を形成する（たとえば造血系譜）。前駆幹細胞は、培地に加えられた誘導物質にかかわらず、自身の系譜に限られた組織を形成する。前駆幹細胞は休止状態に留まることができる。系譜決定された前駆細胞は自己複製することができるが、プログラムされた細胞老化が起こるまでの寿命は限られている（約５０〜７０回の細胞分裂）。前駆幹細胞はさまざまな成長因子によって増殖するよう刺激することができる。分化するよう活性化された場合、これらの細胞は表現型発現を促進するのに進行因子（すなわち、インシュリン、インシュリン様成長因子−１、およびインシュリン様成長因子−１１）を必要とする。対照的に、多能性細胞は系譜決定されていない、すなわち、どの特定の組織系譜にも決定されていない。多能性幹細胞は休止状態に留まることができる。多能性幹細胞はまた刺激されることもできる。
【００１０】
中胚葉由来の前駆および多能性幹細胞の例は、筋肉の単分化能性筋衛星筋芽細胞；脂肪組織の単分化能性脂肪芽細胞）；軟骨膜および骨膜のそれぞれ単分化能性軟骨原性細胞および骨原性細胞；脂肪組織の二分化能性脂肪繊維芽細胞（Ｖｉｅｒｃｋ ｅｔ ａｌ．， １９９６）；骨髄の二分化能性軟骨原性／骨原性幹細胞）；骨髄の三分化能性軟骨原性／骨原性／脂肪原性幹細胞（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９９）；骨髄の複数分化能性造血幹細胞；骨髄の複数分化能性心原性／造血／内皮原性細胞；および結合組織の多能性間葉系幹細胞を含む。
【００１１】
多能性間葉系幹細胞ならびにその単離の方法およびその使用は、１９９８年１０月２７日発行の米国特許第５，８２７，７３５号に記載されている。
【００１２】
多能性間葉系幹細胞は、中胚葉起源（すなわち、骨、軟骨、筋肉、脂肪組織、脈管構造、腱、靱帯、および造血）の、可能性としては複数の組織の置換に利用することができ、そのような組織は、たとえば、失われた組織を再生するために特定の形態形成タンパク質および成長因子と共にｅｘ ｖｉｖｏで作製することができる。再生された組織はその後、移植されて組織喪失の部位を修復する。別の戦略は、細胞組成物として、またはたとえばマトリクスに組み込み、必要な部分に移植し、内因性形態形成タンパク質および成長因子に誘導させて多能性幹細胞に組織の失われた組織構造を再生させる、多能性幹細胞を提供することでありうる。この手法は、全体が参照により本開示に含まれる米国特許第５，９０３，９３４号で例示されており、これは軟骨修復のための部位での軟骨および／または骨への分化を与えるために多能性間葉系幹細胞のポリマー性担体への埋め込みを記載している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
組織および器官の形成はヒト初期正常発生において自然に起こるが、しかし、外傷または疾患が原因で損傷したかまたは失われたヒト組織の大多数を再生する能力は、成人ではかなり低下している。本発明の一つの目的は、歯組織および歯に関係する組織の置換の問題を解決することである。もう一つの目的は、成人由来の再生細胞の起源を提供することである。
【００１４】
驚くべきことに、智歯中に幹細胞が発見され、これは歯、歯周組織、および骨のような関係する組織の、延長された自己再生の可能性を有する。本発明は多能性幹細胞、特に多能性、複数分化能性、三分化能性、二分化能性、および単分化能性幹細胞に関する。
【００１５】
本発明はさらに、多能性胚性様幹細胞を精製する方法およびその組成物、培養物、およびクローンに関する。本発明はまた、幹細胞を宿主に導入することから成る、本発明の多能性幹細胞をたとえばヒトのような哺乳類宿主に移植する方法に関する。本発明はさらに、多能性幹細胞に目的のタンパク質をコードするＤＮＡを遺伝子導入し、次いでその幹細胞を目的のタンパク質または遺伝子が発現される宿主へ導入することを含む、目的のタンパク質または遺伝子のｉｎｖｉｖｏ投与の方法に関する。本発明はまた、中胚葉、内胚葉、または外胚葉に系譜決定された細胞を、多能性幹細胞の培養または移植、またはこれらの胚葉を本発明の前駆（複数分化能性，三分化能性，二分化能性、および最終的には単分化能性）系譜への進行する系譜決定を通じて分離することによって、作製する方法に関する。
【００１６】
本発明はまた、歯および、象牙質（類象牙質）または歯に関係する骨、血管、または神経といった歯の周囲の組織の作製に関する。
【００１７】
本発明はまた、歯または歯由来組織のための幹細胞バンクの開発、同様に幅広い再生医療に使用することのできる膜様中胚葉／内胚葉性マトリクスの開発に関する。
【００１８】
新しい歯関連組織の作製には二つの一般的戦略が用いられてきている；
（１）単離された幹細胞または細胞代替物が組織欠損または感染の範囲に適用される。
（２）マトリクス上またはマトリクス中に配置された細胞が移植され、組織誘導物質と組み合わされて体内に組み込まれ、特定の細胞を成長の決定されたパターンに調節する成長因子に依存して、その結果として組織再生が起こる、およびこれらの物質をその標的に送達する方法。
【００１９】
歯および関係する組織を作製するための手法が本発明で例示される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の幹細胞は、歯周靱帯様膜構造へ分化することができる、歯または智歯の歯嚢から単離された非胚性組織から得ることができる。加えて、本発明の幹細胞は石灰化組織様構造へ分化することができる。
【００２１】
非胚性または生後動物の細胞または組織から得られた本発明の幹細胞は、自己再生することができ、また内胚葉性、外胚葉性、および中胚葉性系譜の細胞へ分化することができる。特に、本発明の幹細胞はヒト細胞である。
【００２２】
本発明の対象はまた、本発明の幹細胞から得ることができる多能性間葉系幹細胞である。
【００２３】
本発明の幹細胞は下記から成る培養物中に保持することができる；
ａ）自己再生することができ中胚葉性系譜の細胞へ分化することができる嚢細胞に由来する、多能性胚性様幹細胞；および
ｂ）前記幹細胞の増殖を支持することができる培地。
ｃ）前記幹細胞の、血管または他の脈管を有する生体膜を構築する細胞への増殖を支持することができる培地。
【００２４】
好ましくは、この培養物はさらに、増殖因子または系譜決定因子を含む。特に、当該幹細胞はヒト細胞である。
【００２５】
本発明の対象はまた、多能性胚性様幹細胞を単離する方法であり、
・細胞を歯嚢から得る
・細胞を培養する
段階を含む。
【００２６】
本発明によればクローン性多能性胚性様幹細胞株は
・歯嚢からクローン原性細胞を得る
・当該細胞を異なる培地中で培養する
・前記培養細胞をクローン密度に希釈する；
・前記希釈細胞を培養する；
・単一の細胞を有する培養を増殖させる
段階を含む単離の方法によって得ることができる。
【００２７】
したがって、この方法によって得ることができるクローン性多能性胚性様幹細胞株もまた本発明の対象である。
【００２８】
目的の遺伝子またはタンパク質を発現するよう遺伝子組み換えされた本発明の幹細胞もまた本発明の対象物である。そのような幹細胞は、
（ａ）多能性胚性様幹細胞に少なくとも一つのマーカー遺伝子または目的遺伝子を含むＤＮＡ構造を遺伝子導入する；
（ｂ）多能性胚性様幹細胞におけるマーカー遺伝子または目的遺伝子の発現について選択する；
（ｃ）（ｂ）で選択された幹細胞を培養する
段階を含む遺伝子組み換えされた多能性胚性様幹細胞を作製する方法によって生じることができる。
【００２９】
特に、この方法によって得ることができる幹細胞は、遺伝子組み換えされた多能性胚性様幹細胞、たとえば歯嚢細胞である。
【００３０】
本発明の幹細胞はまた、系譜決定因子である物質の存在または活性を検出するための方法に用いることができる。本発明のこの方法は、
・本発明の幹細胞を、系譜決定因子である物質を含むと思われる試料と接触させる；および
・そのように接触させた細胞の系譜を、ｍＲＮＡ発現、抗原発現、または他の方法によって判定する；ここでその接触させた細胞の系譜は、前記試料中の系譜決定因子の存在または活性を示す
段階を含む。
【００３１】
本発明の幹細胞はまた、系譜決定されていない細胞の系譜決定を調節する、物質、化合物、または因子の能力を試験する方法に用いることができる。本発明のこの方法は、
・系譜決定されていない細胞として幹細胞を維持する培地中で、本発明の幹細胞を培養すること；
・供試する物質、化合物、または因子を加えること；および
・ｍＲＮＡ発現、抗原発現、または他の方法によって、そのように接触させた細胞の系譜を判定すること
を含む。
【００３２】
本発明の幹細胞はまた、系譜決定されていない細胞の系譜決定を調節する能力について、物質、化合物、または因子をスクリーニングするための分析システムで使用することができる。本発明のこの方法は、
・系譜決定されていない細胞として幹細胞を維持する培地中で、本発明の幹細胞を培養すること、
・供試する物質、化合物、または因子を加えること；および
・ｍＲＮＡ発現、抗原発現、または他の方法によって、そのように接触させた細胞の系譜を判定すること
を含む。
【００３３】
本発明の幹細胞はまた、増殖因子である物質の存在または活性を検出するための方法に用いることができる。本発明のこの方法は、
・本発明の幹細胞を、増殖因子である物質を含むと思われる試料と接触させる；および
・そのように接触させた細胞の増殖および系譜を、ｍＲＮＡ発現、抗原発現、または他の方法によって判定する；ここでその接触させた細胞の系譜決定なしの増殖は、前記試料中の増殖因子の存在または活性を示す
段階を含む。
【００３４】
本発明の幹細胞はまた、系譜決定されていない細胞の増殖を調節する、物質、化合物、または因子の能力を試験する方法に用いることができる。本発明のこの方法は、
・系譜決定されていない細胞として幹細胞を維持する培地中で、本発明の幹細胞を培養すること；
・供試する物質、化合物、または因子を加えること；および
・ｍＲＮＡ発現、抗原発現、または他の方法によって、そのように接触させた細胞の増殖および系譜を判定すること
を含む。
【００３５】
本発明の幹細胞を培養して、歯周炎、腱、靱帯、筋膜、および、中皮性／内皮性細胞の血管へのまたは外胚葉性または神経組織への分化を支援するその他の種類の結合組織を再生するのに用いられる膜にする方法もまた、本発明の対象物である。
【００３６】
本発明に記載の、本発明の幹細胞は分化のためのインシュリン、レチノイン酸、インドメタシン、イソブチルキサンチン、テオフィリン、形質転換成長因子−β（任意の）、骨形成タンパク質（任意の）、繊維芽細胞成長因子（任意の）、上皮成長因子（任意の）、血小板由来成長因子（任意の）、血管内皮成長因子（任意の）、肝細胞成長因子、インターフェロン（任意の）、インシュリン様成長因子（任意の）、インターロイキン（任意の）、神経成長因子：の一つまたは組み合わせを含む任意の培地で培養するための方法によって培養することができる。
【００３７】
本発明はまた、本発明の多能性胚性様幹細胞に目的のタンパク質または遺伝子を発現するＤＮＡまたはＲＮＡを含むベクターを遺伝子導入する段階を含む、目的のタンパク質または遺伝子のｅｘ ｖｉｖｏ投与の方法に関する。
【００３８】
治療的に有効な量の多能性胚性様幹細胞、またはそれに由来する細胞または組織を哺乳類に投与することを含む、哺乳類における細胞の衰弱、異常および／または機能障害および／または他の疾患状態を予防するおよび／または治療する方法もまた、本発明の対象物である。当業者は本発明の幹細胞を移植するために幹細胞の発生段階の時間を選択する方法、同様にその用量を知る。たとえば、投与する細胞の数は治療する疾患によって変化しうる。動物実験では典型的には細胞は約１０6個の細胞数で投与された。
【００３９】
本発明の幹細胞は、治療的に有効な量の多能性胚性様幹細胞、またはそれに由来する細胞または組織を哺乳類に投与することによる、哺乳類における組織修復または移植に用いることができる。
【００４０】
本発明の記載によると幹細胞は、本発明の幹細胞に由来する中胚葉性系譜決定された細胞の治療的に有効な量を哺乳類に投与することによる、哺乳類における細胞の衰弱、異常および／または機能障害および／または他の疾患状態を予防するおよび／または治療する方法に用いることができる。
【００４１】
本発明の幹細胞は、本発明の幹細胞に由来する中胚葉性系譜決定された細胞の治療的に有効な量を哺乳類に投与することを含む、哺乳類における組織修復または移植の方法を可能にする。
【００４２】
本発明の幹細胞は、哺乳類における細胞の衰弱，異常および／または機能障害の治療のための下記を含む医薬組成物の本質的要素であることができる；
・治療的に有効な量の多能性胚性様幹細胞、またはそれに由来する細胞または組織；および
・薬学的に受容可能な培地または担体。
【００４３】
本発明の医薬組成物の一実施形態では、増殖因子または系譜決定因子が添加される。
【００４４】
本発明の幹細胞は、本発明の幹細胞をマトリクス上で培養することによって、または歯周疾患治療用の歯結合歯周細胞株を作製するため、歯を製作するために表１からなる足場(scaffold)中に存在することができる。表１からなる足場はまた、歯の周囲の骨／骨マトリクス歯槽骨または顎骨の形成、または口内の動脈および静脈の形成に用いることができる。
【００４５】
本発明の別の一実施形態では、歯由来の幹細胞を、接着シグナルを提供することによってその挙動を調節する細胞外マトリクス上に播種し、また成長因子結合部位が表１からなる表２に記載の細胞結合領域配列を有する足場上に播種される。
【００４６】
本発明はまた、細胞が表３中のバイオリアクター内のマトリクスに播種される細胞培養の方法に関する。
【００４７】
本発明の幹細胞はまた、抜歯および皮膚病変の治癒を改善する目的で、歯周組織を再建するために歯周組織中に幹細胞を移植する方法に使用することができる。
【００４８】
さらに、本発明の幹細胞は、歯のセメント質を作製または修復するために、歯周組織中に移植される。
【００４９】
本発明をより詳細にさらに説明する。
【００５０】
智歯由来幹細胞の培養および単離
別の態様では、本発明は下記を含む培養物(culture)に関する；
（ａ）自己再生が可能でありまた内胚葉性、外胚葉性、および中胚葉性系譜の細胞への分化が可能である多能性胚性様幹細胞；および
（ｂ）前記幹細胞の増殖を支持することができる培地。
【００５１】
そのような幹細胞を含む培養物はさらに、増殖因子または系譜決定因子を含みうる。そのような培養物の幹細胞は、非ヒト細胞またはヒト細胞から単離されうる。
【００５２】
本発明はさらに、多能性胚性様幹細胞を単離する方法に関する。特に、本発明の多能性胚性様幹細胞を単離する一つの方法は、
（ａ）非胚性動物またはヒト起源から細胞を得る；
（ｂ）７．５%（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシドを含む培地中で最終温度−８０℃に達するまで前記細胞を緩慢凍結して、またはせずに、；および
（ｃ）その細胞を培養する
段階を含む。
【００５３】
本発明はさらに、多能性胚性様幹細胞を単離する方法に関し、特に、
（ａ）生後動物またはヒト起源から細胞を得る；
（ｂ）７．５%（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシドを含む培地中で最終温度−８０℃に達するまで前記細胞を緩慢凍結して、またはせずに、；および
（ｃ）その細胞を培養する
段階を含む、本発明の多能性胚性様幹細胞を単離する方法に関する。
【００５４】
本発明はさらに、多能性胚性様幹細胞を単離する方法に関する。特に、本発明の多能性胚性様幹細胞を単離する一つの方法は、
（ａ）成体動物またはヒト起源から細胞を得る；
（ｂ）７．５%（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシドを含む培地中で最終温度−８０℃に達するまで前記細胞を緩慢凍結して、またはせずに、；および
（ｃ）その細胞を培養する
段階を含む。
【００５５】
本発明はさらに、多能性胚性様幹細胞を単離する方法に関する。特に、本発明の多能性胚性様幹細胞を単離する一つの方法は、
（ａ）非胚性動物またはヒト起源から細胞を得る；
（ｂ）前記細胞を濾し器を通して濾過する；
（ｃ）７．５%（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシドを含む培地中で最終温度−８０℃に達するまで前記細胞を緩慢凍結して、またはせずに、；および
（ｄ）その細胞を培養する
段階を含む。
【００５６】
別の一態様では、多能性胚性様幹細胞を単離する方法は、それによってそのような幹細胞のクローン性集団が単離される方法に関し、ここで単一の多能性胚性様幹細胞がまず単離され、次いでさらに培養されて拡大し、クローン性集団を生じる。単一の多能性胚性様幹細胞は、限界希釈または当業者に既知であるそのような他の方法によって単離されうる。
【００５７】
遺伝子組み換え幹細胞
したがって、本発明はまた、そのような方法によって作製されたクローン性多能性胚性様幹細胞株に関する。特定の一態様では、本発明は多能性胚性様幹細胞、または形質転換または遺伝子導入されそれによって目的の遺伝子またはタンパク質を含み発現することができるような細胞の集団に関する。したがって、本発明は目的の遺伝子またはタンパク質を発現するように遺伝子組み換えされた多能性胚性様幹細胞を含む。そのような遺伝子組み換えされた幹細胞はその後に系譜決定を受けることができるので、本発明はさらに、遺伝子組み換えされた多能性胚性様幹細胞に由来し、目的の遺伝子またはタンパク質を発現する、系譜決定された細胞を包含する。
【００５８】
その系譜決定された細胞は、内胚葉性、外胚葉性、または中胚葉性系譜決定された細胞であることができ、また、多能性間葉系幹細胞のような多能性、または脂肪原性細胞または筋原性細胞のような前駆細胞でありうる。本発明はしたがって、
（ａ）多能性胚性様幹細胞にマーカー遺伝子または目的遺伝子の少なくとも一つを含むＤＮＡを導入する；
（ｂ）多能性胚性様幹細胞におけるマーカー遺伝子または目的遺伝子の発現について選択する；
（ｃ）（ｂ）で選択された幹細胞を培養する
段階を含む、遺伝子組み換えされた多能性胚性様幹細胞を作製する方法に関する。
【００５９】
ある特定の態様では、本発明はそのような方法で作製されたヒトおよび非ヒト細胞を含む遺伝子組み換えされた多能性胚性様幹細胞を包含する。本発明はさらに、下記の段階を含む、系譜決定因子である物質の存在または活性を検出するための方法に関する：
Ａ．本発明の多能性胚性様幹細胞を、系譜決定因子である物質を含むと思われる試料と接触させる；および
Ｂ．そのように接触させた細胞の系譜を、形態、ｍＲＮＡ発現、抗原発現、または他の方法によって判定する；
ここでその接触させた細胞の系譜は、前記試料中の系譜決定因子の存在または活性を示す。
【００６０】
細胞調節物質の分析法
本発明はまた、下記を含む、系譜決定されていない細胞の系譜決定を調節する、物質、化合物、または因子の能力を試験する方法に関する。
Ａ．系譜決定されていない細胞として幹細胞を維持する培地中で、本発明の多能性胚性様幹細胞を培養すること；および
Ｂ．供試する物質、化合物、または因子を加えること；および
Ｃ．形態、ｍＲＮＡ発現、抗原発現、または他の方法によって、そのように接触させた細胞の系譜を判定すること。
【００６１】
本発明は、本発明の多能性胚性様幹細胞の増殖または系譜決定を調節するのに有効な物質、化合物、または薬物の候補のスクリーニングのための分析システムを含む。
【００６２】
別のそのような一態様では、本発明は系譜決定されていない細胞の系譜決定を調節する能力について、物質、化合物、または因子をスクリーニングするための、下記を含む分析システムに関する；
Ａ．系譜決定されていない細胞として幹細胞を維持する培地中で、本発明の多能性胚性様幹細胞を培養すること
Ｂ．供試する物質、化合物、または因子を加えること；および
Ｃ．形態、ｍＲＮＡ発現、抗原発現、または他の方法によって、そのように接触させた細胞の系譜を判定すること
【００６３】
本発明はまた、増殖因子である物質の存在または活性を検出するための、下記の段階を含む方法に関する：
Ａ．本発明の多能性胚性様幹細胞を、増殖因子である物質を含むと思われる試料と接触させる；および
Ｂ．そのように接触させた細胞の増殖および系譜を、形態、ｍＲＮＡ発現、抗原発現、または他の方法によって判定する；ここでその接触させた細胞の系譜決定なしの増殖は、前記試料中の増殖因子の存在または活性を示す。
【００６４】
別の一態様では、本発明は系譜決定されていない細胞の増殖を調節する、物質、化合物、または因子の能力を試験する、下記を含む方法を含む：
Ｂ．系譜決定されていない細胞として幹細胞を維持する培地中で、本発明の多能性胚性様幹細胞を培養すること；
Ｃ．供試する物質、化合物、または因子を加えること；および
Ｄ．ｍＲＮＡ発現、抗原発現、または他の方法によって、そのように接触させた細胞の増殖および系譜を判定すること。
【００６５】
本発明はさらに、系譜決定されていない細胞の増殖を調節する能力について、物質、化合物、または因子をスクリーニングするための、下記を含む分析システムに関する；
Ａ．系譜決定されていない細胞として幹細胞を維持する培地中で、本発明の多能性胚性様幹細胞を培養すること；
Ｂ．供試する物質、化合物、または因子を加えること；および
Ｃ．ｍＲＮＡ発現、抗原発現、または他の方法によって、そのように接触させた細胞の増殖および系譜を判定すること。
【００６６】
重要なことには、分析システムは、本発明の多能性胚性様幹細胞をin vitroまたはin vivoのいずれかで調節することが可能な薬物または他の存在を同定するために適用することができる。そのような分析法は、多能性胚性様幹細胞がたとえば増殖するようにかまたは、特定の系譜または細胞型に決定するように調節するのに特異的な物質、因子、または薬物の開発に有用となる。たとえば、そのような薬物は、細胞または組織移植医療を円滑にするのに用いられうる。
【００６７】
当該分析システムは、増殖または系譜決定因子をコードするかまたは、さもなければ細胞の分化および発生に関与するタンパク質または分子をコードする遺伝子をスクリーニング、同定、または特徴づけるために容易に適用することができる。
【００６８】
たとえば、特定の系譜に沿った分化に関与するかまたはその間に発現するタンパク質をコードする遺伝子は、既知の方法（たとえばｃＤＮＡライブラリ、ディファレンシャルディスプレイ）などによって同定することができる。したがって、本発明の多能性胚性様幹細胞は、特定の系譜を生じる条件下で培養することができ、そこで発現される遺伝子が次いで特徴づけられる。本発明の多能性胚性様幹細胞を多能性胚性様状態に維持するために必要な因子およびタンパク質は、自己再生能力を維持する条件下で本発明の多能性胚性様幹細胞を培養すること、およびそのように発現されたかまたは外部から提供された場合に自己再生能力を維持する遺伝子およびタンパク質を同定することによって、同様に同定しおよび特徴づけることができる。
【００６９】
移植
別の一実施形態では、本発明は細胞またはそれに由来する組織を含む本発明の多能性胚性様幹細胞の活性を基礎とする、または増殖因子および系譜決定因子を含む、任意のそのような細胞または組織に対して作用することが知られる物質またはその他の薬物を基礎とする、ある種の治療的方法に関する。一つの例示的な治療的方法は、特定の系譜の細胞の欠如または不足の原因となるかまたはそれに起因する症状の表れの予防または調節に関連し、細胞またはそれに由来する組織を含む本発明の多能性胚性様幹細胞を、個別に、または増殖因子または系譜決定因子との混合物として、宿主においてそれらの症状の発生または進行を防ぐのに有効な量で投与することを含む。
【００７０】
別の特定の一態様では、本発明は、系譜決定されていない細胞の集団、系譜決定された細胞の集団、それに由来する組織および器官を含む、本発明の多能性胚性様幹細胞の移植を含む、そのような治療によって利益を受ける症状、疾患、障害、細胞の衰弱、または機能不全の治療または緩和における治療的方法を含む。これらの方法は、細胞、組織、または器官の交換または補充を含む。そのような交換または補充は、本発明の多能性胚性様幹細胞の移植によって、または系譜決定されていない細胞の集団、系譜決定された細胞の集団、それに由来する組織および器官の移植によって達成されうる。
【００７１】
したがって、本発明は、本発明の多能性胚性様幹細胞を宿主に導入する段階を含む、多能性胚性様幹細胞を宿主に移植する方法を含む。
【００７２】
別の一態様では、本発明は、本発明の多能性胚性様幹細胞を宿主に導入する段階を含む、精製された多能性胚性様幹細胞を宿主に提供する方法を提供する。
【００７３】
さらに別の一態様では、本発明は、本発明の多能性胚性様幹細胞に目的のタンパク質または遺伝子を発現するＤＮＡまたはＲＮＡを含むベクターを導入する段階を含む、目的のタンパク質または遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏ投与の方法を含む。
【００７４】
本発明は、治療的に有効な量の多能性胚性様幹細胞を哺乳類に投与することを含む、哺乳類における組織修復または移植の方法を提供する。
【００７５】
本発明は、治療的に有効な量の多能性胚性様幹細胞を哺乳類に投与することを含む、哺乳類における細胞の衰弱、異常および／または機能障害および／または他の疾患状態を予防するおよび／または治療する方法を提供する。
【００７６】
別の一態様では、本発明は、本発明の多能性胚性様幹細胞に由来する内胚葉性，外胚葉性、または中胚葉性系譜決定された細胞の治療的に有効な量を哺乳類に投与することを含む、哺乳類における細胞の衰弱、異常および／または機能障害および／または他の疾患状態を予防するおよび／または治療する方法を提供する。
【００７７】
ここで一般に言う治療的方法は、増殖因子または系譜決定因子を、単独でまたは本発明の多能性胚性様幹細胞、またはそれに由来する細胞または組織、またはたとえば本発明の別の一態様にしたがって作製され使用される薬物スクリーニング分析法によって同定された他の同様に有効な物質、薬物、または化合物と組み合わせて含むことができる医薬組成物の投与による、さまざまな病因または他の細胞の機能障害および異常の治療の方法を含むことができる。
【００７８】
医薬組成物
薬学的に受容可能な担体と共に、系譜決定されていない細胞の集団、系譜決定された細胞の集団、それに由来する組織および器官を含む、本発明の多能性胚性様幹細胞を含むかまたはそれを基礎とする治療的方法における用途のために医薬組成物を提供することは、本発明のさらに別の目的である。同様に考えられるのは、薬学的に受容可能な担体と共に、本発明の多能性胚性様幹細胞および／またはそれに由来する細胞、組織、および器官に作用するかまたはそれらを調節する増殖因子または系譜決定因子を含む医薬組成物である。増殖因子または系譜決定因子の当該医薬組成物は、さらに本発明の多能性胚性様幹細胞、またはそれに由来する細胞、組織、または器官を含みうる。当該医薬組成物は、本発明の多能性胚性様幹細胞、またはそれに由来する細胞、組織、または器官を、非ポリマー性担体または細胞外マトリクス中に含みうる。
【００７９】
本発明はまた、哺乳類における細胞の衰弱、異常および／または機能障害の治療のための、下記を含む医薬組成物を提供する；
Ａ．治療的に有効な量の本発明の多能性胚性様幹細胞；および
Ｃ．薬学的に受容可能な培地または担体。
【００８０】
本発明の医薬組成物はまた、本発明の多能性胚性様幹細胞に由来する内胚葉性、外胚葉性、または中胚葉性系譜決定された細胞、および医薬品として受容可能な培地または担体を含む組成物を含む。任意のそのような医薬組成物は、さらに増殖因子または系譜決定因子を含むことができる。
【００８１】
歯の発生
下記の図に歯発生の要約を示す。歯の起源は、歯を構成するすべての細胞を形成する能力を有する歯胚である。ここでは、多能性の段階、歯の器官である歯乳頭および歯嚢の細胞へ分化する能力を有する未分化の前駆体段階がある。
【００８２】
これは図１０に示す。Ａ．Ｒ．Ｔｅｎ Ｃａｔｅ， Ｏｒａｌ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ， Ｆｉｆｔｈ Ｅｄ．， Ｍｏｓｂｙ Ｉｎｃ． １９９８：より引用。
【００８３】
歯の始まり
図１１は歯の発生を説明する（ｈｔｔｐ／／；ｂｉｔｅ−ｉｔ．ｈｅｌｓｉｎｋｉ．ｆｉより）。第一鰓弓上皮はこの歯原性能力を失い、その能力はその後外胚葉性間葉組織によって担われそのためこの組織がさまざまな上皮から歯形成を導くことができる。たとえば、後期第一鰓弓外胚葉性間葉組織の胚性足底（足部）上皮との組み換えは、その上皮の発生方向を、歯器官が形成されるように変化させる。逆に、上皮性歯器官が皮膚間充織と組み換えられた場合、それは歯の特徴を失い表皮の特徴を身につける。これらの実験が示すことは、歯形成はまず外胚葉性間葉組織に影響を与える第一鰓弓上皮に存在する因子によって開始されるということである。これらの実験的知見は、これらの組織に置ける転写および成長因子の発現パターンに反映されている。このように骨形成タンパク質（ＢＭＰ）２および４は歯が形成される部位の上皮で特別にまた一過性に発現され、そしてそれらがいくつかの分子、特にＢＭＰ４ならびにホメオボックス遺伝子ＭＳＸ１およびＭＳＸ２の外胚葉性間葉組織における発現をアップレギュレートすることが実験的に示されている。このように、実験発生学、組み換えＤＮＡ技術、および免疫細胞化学からの結果は、第一鰓弓上皮が歯発生の開始に必須であることを示す。歯発生を開始させる能力が外胚葉性間葉組織によっていったん獲得されると、それは歯乳頭細胞によって維持される。したがって、初期歯胚を長期間培養した場合、細胞は脱分化し、歯胚の形態は完全に失われる；さらに、これらの脱分化した上皮性および外胚葉性間葉系細胞を採集してｉｎ ｖｉｖｏで再結合させた場合、それらは歯を形成する（歯形成のためのプログラムは失われていない）。この点で特に興味深いのは、マウス歯外胚葉性間葉組織をニワトリ上皮と組み合わせた場合、歯が発生するという知見である。
鐘状期（組織分化および形態分化）
【００８４】
歯器官の周辺では、細胞は立方形を取り、外部、または外側の、歯上皮を形成する。歯乳頭に接する細胞は組織学的に異なる二つの構成成分に分化する。歯乳頭に直接隣接する細胞は短い円柱状形を取り、また高いグリコーゲン含量で特徴づけられる；それらは共に内部（または内側の）歯上皮を形成する。内部歯上皮と新しく分化した星状網との間で一部の上皮性細胞が中間層と呼ばれる層に分化する。この層の細胞は間もなく酵素のアルカリホスファターゼの例外的に高い活性で特徴づけられる。この層の細胞は内部歯上皮の細胞とは組織学的に異なるが、両方の層はエナメルの形成を担う一つの機能単位として考えるべきである。内部歯上皮は外部歯上皮と歯器官の縁で接する；この結合部は頸部環（cervical loop）として知られる。
【００８５】
血管の束が歯嚢中で歯胚の周囲で分岐し歯乳頭（または歯髄）に入るのが帽状期に見られる。歯萌出の間に歯嚢は歯周靱帯、歯槽骨、およびセメント質を形成する。歯周靱帯（periodontal ligament）（PDL）は、繊維芽細胞、コラーゲン、および脈管路および膜様構造を定める血管を有する結合組織である。
【００８６】
実施例
対象および細胞培養。正常なヒト埋伏第三大臼歯を成人（さまざまな年齢）から採取した。歯嚢表面を清掃し、滅菌メスを用いて細かく刻んだ。組織は０．１Ｕ／ｍｌＩ型コラゲナーゼおよび１Ｕ／ｍｌディスパーゼ（ロシュ・マンハイム）（Ｒｏｃｈｅ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の溶液中で１時間３７℃にて消化した。さらにまた細胞は歯嚢組織から細切およびトリプシンを含む平衡塩溶液を用いた洗浄後に単離された。この目的のために、組織片を０．２５%トリプシンのカルシウムを含まないＥＤＴＡ添加Ｄ−ＭＥＭ溶液中で最長１８時間、わずかなトリプシン活性の最大の浸透のためにインキュベートした。トリプシンを傾斜法で廃棄し、組織を残存のトリプシンで３７℃にて２０分間〜３０分間、リン酸緩衝液中で処理した。細胞を７０−μｍの濾し器（ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ））を通すことによって単細胞懸濁液を得た。正常ヒトボランティアの骨髄吸引液から処理された骨髄細胞をポエティック・テクノロジーズ（Ｐｏｉｅｔｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から購入し、その後に培地中で洗浄した。単細胞懸濁液または細切し消化した歯嚢の組織を、２ｍＭ Ｌ−グルタミン／１００ ｕｎｉｔｓ／ｍｌ ペニシリン／１００ μｇ／ｍｌストレプトマイシン（バイオフルーズ（Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓ）、メリーランド州ロックヴィル）を添加したノックアウト Ｄ−ＭＥＭ 無血清培地 培地 （ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）、または２０%ＦＣＳ（エクイテック・バイオ（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ−Ｂｉｏ）、テキサス州カーヴィル）／１００ μＭ Ｌ−アスコルビン酸２−リン酸（和光純薬工業、大阪）／２ｍＭ Ｌ−グルタミン／１００ ｕｎｉｔｓ／ｍｌ ペニシリン／１００ μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン （バイオフルーズ（Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓ）、メリーランド州ロックヴィル）を添加したＤＭＥＭ（バイオクローム（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ） 、またはＭＳＣＢＭバレットキット（ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ）（ポエティックス（Ｐｏｉｅｔｉｃｓ））：の異なる培地を入れた６０ｍｍシャーレに播種し、その後３７℃にて５% ＣＯ2中でインキュベートした。骨髄細胞はＭＳＣＢＭバレットキット（ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ）（ポエティックス（Ｐｏｉｅｔｉｃｓ）））中で培養した。コロニー形成効率を評価するために、１４日目の培養を４%ホルマリンを用いて固定し、次いで０．１%トルイジンブルーを用いて染色した。石灰化骨マトリクス沈着のｉｎ ｖｉｔｒｏの誘導のためには、細胞を １０% ＦＣＳ、２ ｍＭ Ｌ−グルタミン （シグマ（ｓｉｇｍａ））、１０−８ Ｍ デキサメタゾン（シグマ（ｓｉｇｍａ））、１００ μＭ Ｌ−アスコルビン酸２−リン酸、１．８ ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（シグマ（Ｓｉｇｍａ））、２０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を添加したＤ−ＭＥＭ（バイオクローム（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）中で培養した。歯嚢幹細胞（ＤＦＳＣ）および骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）の密集に達しない培養の増殖速度を、２４時間のブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵｒｄ）組み込みによって、ザイメッド（Ｚｙｍｅｄ）ＢｒｄＵｒｄ染色キット（ベクター・ラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））を使用することで評価した。
【００８７】
免疫組織化学。歯嚢は４%ホルマリン中で固定し、パラフィンに包埋した。切片を免疫組織化学法に供した。一次ＤＰＳＣおよびＢＭＳＣを継代培養した。細胞は４%ホルマリン中で固定した。切片および細胞は、ザイメッド（Ｚｙｍｅｄ）広スペクトル免疫ペルオキシダーゼキット（ベクター・ラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））を用いることによって、飽和濃度の一次抗体および対応する対照抗体と反応させた。血清、モノクローナル上清、および精製抗体の作業用希釈液を使用した。使用した抗体；Ｎｏｔｃｈ Ａｂ−１（Ａ６）マウスＭａｂ（抗Ｎｏｔｃｈ１）（ネオマーカーズ（ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ））、ＡＣ１３３／２（抗ＣＤ１３３）（ミルテニー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ））、Ｆｌｋ−１（抗ＶＥＧＦＲ−２）、マウスＩｇＧ１（クローン５３）抗マウスＦＮＫ（繊維芽細胞成長因子）、マウスＩｇＧ１（クローン２５）抗ラットネスチン、マウスＩｇＧ１（クローン５２）抗ヒトＧＦＡＰ（グリア線維性酸性タンパク質）（（ＢＤバイオサイエンス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））
【００８８】
組織化学。二次ＤＦＳＣおよびＢＭＳＣ培養をＰＢＳで洗浄し、次いで４%ホルマリンを用いて固定した。カルシウム沈着は２%アリザリンレッドＳ（ｐＨ４．２）を用いた処理によって検出した。組織の染色はトリクロームおよびヘマトキシリン／エオシン染色法を用いて行った。
【００８９】
逆転写−ＰＣＲ。全ＲＮＡを単離された細胞からＲｎイージー（Ｒｎｅａｓｙ(登録商標）キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ登録商標）、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ））を用いることによって 調製した。第一鎖ｃＤＮＡ 合成は、０．１ μｇ〜１μｇの全ＲＮＡおよびオムニスクリプト（Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ）キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ登録商標）、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ））を用いることによって、オリゴｄＴプライマー （インビトロゲン（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いることによって実施した。キアゲンＨｏｔＳｔａｒＴａｑマスターミックス（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ(）、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ））をＰＣＲに使用した。ｑＰＣＲにはクオンティテクト（Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ  Ｓｙｂｒ Ｇｒｅｅｎキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を使用した。すべてのＰＣＲ用の標準プログラムは、９５℃で１５分間（酵素活性化のために）および９５℃４５秒間、５５℃３０秒間、および７２℃１分間で３５サイクル、 および７２℃５分間による最後の伸長であった （プライマー 表Ａについて）。標準ＰＣＲについてはＰＣＲエクスプレスサーモサイクラー（サーモハイバイド（ｔｈｅｒｍｏｈｙｂａｉｄ））を使用し、ｑＰＣＲ（定量的ＰＣＲ）についてはオプティコン（Ｏｐｔｉｃｏｎ）（ＭＪリサーチ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ））をオプティコンモニターソフトウェアと共に用いた。ＰＣＲ産物の定量化については、ワイナー（Ｗｉｎｅｒ）ら、１９９９によって記載されたデルタ／デルタ計算をＥｘｃｅｌソフトウェアパッケージと共に用いた。すべての応用で、ＧＡＰＤＨ遺伝子を参照遺伝子として用いた。
【００９０】
【表１】
2005516616.tif 000002
2005516616.tif 000003
【００９１】
ＤＦＳＣの単離。歯上皮および神経幹細胞において推定される幹細胞のマーカーとして記載された（ハラダ（Ｈａｒａｄａ）ら、１９９９；ジョナソン（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ）ら、１９９９ｂ）、Ｎｏｔｃｈ−１およびネスチン陽性細胞は歯嚢切片での免疫組織化学法によって同定されたが（図１。αおよびβ）、ＣＤ１３３、ＶＥＧＦＲ−２、およびＧＦＡＰについては陰性であった（表Ｂ）。
【００９２】
図１は歯嚢の免疫表現型を示す。免疫ペルオキシダーゼ反応性に基づく試験が、歯嚢の切片を用いて実施された。抗体；α）Ｎｏｔｃｈ−、１β）ネスチン。
【００９３】
フリーデンシュタイン（Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ）ら、１９７６は、骨前駆細胞を骨髄の吸引液から、プラスチック基層またはコロニー形成単位繊維芽細胞（ＣＦＵ−Ｆ）に接着するその能力によって単離することができることを立証した。歯嚢組織中にクローン原性かつプラスチック接着性細胞集団の存在（図２α）が実証されている。各コロニー内の細胞はヒト骨髄ＣＦＵ−Ｆの子孫と類似した典型的な繊維芽細胞様形態によって特徴づけられ、またそれらはＮｏｔｃｈ−１およびネスチンについて免疫化学法によって陽性であった（図２βおよびγ）。
【００９４】
図２は、α）１４日後の代表的なコロニーを示す。β）およびγ）は、β）ネスチンおよびγ）Ｎｏｔｃｈ−１についての代表的な染色パターンを有する、培養ＤＦＳＣの免疫表現型を特徴づける。
【００９５】
歯嚢由来ＤＦＳＣを特徴づけるために、異なる表現型に伴う既知の抗原に特異的な抗体を用いることによって、免疫組織化学試験を実施した。ＤＰＳＣについての代表的な免疫反応性パターンを示す（表Ｂ）。
【００９６】
【表２】
2005516616.tif 000004
【００９７】
歯嚢組織由来のコロニー形成細胞の頻度は、ＭＳＣＢＭバレットキット（ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ）では；３０／播種細胞１０4個、および添加ＤＭＥＭ培地では；１５／播種細胞１０4個であった。対照的に、ノックアウトＤ−ＭＥＭ無血清培地培地では１４日後にコロニーは得られなかった。しかし、細胞は球状の形態でより長期間にわたって培養された。２名の別のドナーのＤＰＳＣ培養中の増殖している細胞の平均数は、ＢｒｄＵｒｄ取り込み法を用いることによって、ＢＭＳＣ培養（６．４%ＢｒｄＵｒｄ−陽性細胞＋−０．８%ＳＥＭと比較した場合、より高かった（９．７%ＢｒｄＵｒｄ陽性細胞＋−１．５ＳＥＭ）。
【００９８】
ＲＴ−ＰＣＲおよびＲＴ−ｑＰＣＲによるＤＦＳＣのｉｎ ｖｉｔｒｏでの表現型の特徴づけ。表Ｃ中のマーカーの多数が、ＤＦＳＣ集団において、およびＢＭＳＣ集団において発現されていた。ＤＦＳＣ細胞は象牙芽細胞特異的マーカーＤＳＰＰについて陰性であることがわかった。我々はまた、神経フィラメントのＢＭＳＣおよびＤＦＳＣのｍＲＮＡ、ＶＥＧＦＲ−２、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩＢ、およびＦＧＦＲ３−ＩＩＩＢについて測定した遺伝子発現が無いことを見出した（表Ｃ）。
【００９９】
【表３】
2005516616.tif 000005
【０１００】
ＤＰＳＣおよびＢＭＳＣは、コラーゲン１、骨シアロタンパク質、オステオカルシン、およびｐｈｅｘを発現する。これらの遺伝子は典型的には骨前駆細胞のためである。両方の細胞型がＦＧＦＲ１−ＩＩＩＣを発現し、これは歯周靱帯から単離された繊維芽細胞によっても検出されたが、造血幹細胞の共通マーカーであるＣＤ３４およびＣＤ１３３は検出されなかった。我々はＩＧＦ−２とＦＧＦＲ３−ＩＩＩＣに遺伝子発現についてわずかな違いを検出した。興味深いことに、ＩＧＦ−２シグナルの強度はＤＦＳＣについてＢＭＳＣよりも良好であった。見つからない違いのために、ＤＦＳＣとＢＭＳＣをｑＰＣＲを用いて調べた（図Ｃ）。ＤＦＳＣ細胞におけるＩＧＦ−２発現はＢＭＳＣ細胞と比較して１００倍以上高かったことが検出され、ＢＳおよびＯＣＮの発現が減少した（１５倍）ことと対照的であった。
【０１０１】
興味深いことに幹細胞はノックアウトＤ−ＭＥＭでまたはＭＳＣＢＭバレットキット（ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ）で培養した場合、コラーゲンについて異なる発現 パターンを有する。 ノックアウト Ｄ−ＭＥＭ 無血清培地で培養されたＤＦＳＣについて、ＭＳＣＢＭバレットキット（ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ）に由来する培地で培養されたＤＦＳＣと比較して、Ｃｏｌ_１およびＣｏｌ_３について遺伝子発現はそれぞれ１２６倍および８２倍増加した（図３ｂ）。高いコラーゲン発現と球形様構造を持つノックアウトＤ−ＭＥＭ培養細胞は、形状および遺伝子発現について、最近発表されたウシ由来培養歯嚢細胞と同等であった。ハンダ（Ｈａｎｄａ）ら、２００２は、嚢細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで石灰化細胞に分化することができない、しかしｉｎ ｖｉｖｏでできるセメント芽細胞前駆細胞と説明した（ハンダ（Ｈａｎｄａ）ら（２００２） Ｂｏｎｅ ３１（５）； ６０６−６１１）。ＤＦＳＣはおそらくノックアウトＤ−ＭＥＭ無血清培地中で球状様構造に成熟した。
【０１０２】
図３ａはＭＳＣＢＭバレットキット（ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ）で成長させた培養ＢＭＳＣおよびＤＦＳＣを用いたＱＰＣＲを示す。相対濃度の値はデルタ／デルタ法（ワイナー（Ｗｉｎｅｒ）ら、１９９９）を用いて計算し、ＢＭＳＣ由来の総ＲＮＡをキャリブレーターとして使用した。ハウスキーピング遺伝子はＧＡＰＤＨであった。
図３ｂはＭＳＣＢＭバレットキット（ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ）、２０%ＦＣＳ添加Ｄ−ＭＥＭ、およびノックアウトＤ−ＭＥＭ（無血清培地）で成長させた培養ＤＦＳＣを用いたＱＰＣＲを示す。数値はＭＳＣＢＭバレットキット（ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ）で培養したＤＦＳＣから得た総ＲＮＡを用いて計算した。
【０１０３】
表現型発現に関するデキサメタゾン分析
クローンは、その同一性、すなわち系譜決定された前駆細胞かまたは系譜決定されていない多能性細胞かのどちらかを判定するため、インシュリンおよびデキサメタゾンを用いて調べた。デキサメタゾンのような系譜誘導物質は多能性細胞において系譜決定および発現を誘導するが、前駆細胞においては表現型を変化させない。デキサメタゾンで処理した培養は複数の発現された表現型を示す。したがってデキサメタゾンおよびインシュリンを用いた処理の効果を比較することによって、未知の細胞群内の前駆細胞の特定の型および多能性細胞を同定することができる。
【０１０４】
ＤＦＳＣおよびＢＭＳＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化能  Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸、グルココルチコイド、デキサメタゾン、および無機リン酸の存在下で生育させたＤＦＳＣの長期培養（５〜６週間）は、高濃度のカルシウムを有するアリザリンレッド陽性範囲を形成する能力を示した（図４）。沈着は単一の石灰化領域として、または接着層全体にわたって、全体に分散した。対照的に、ＢＭＳＣ培養は６週間の誘導後、接着層全体にわたって石灰化沈着の広範囲のシートを生じた（図４）。
【０１０５】
図４はＤＦＳＣおよびＢＭＳＣのｉｎ ｖｉｔｒｏの分化を示す；培養ＤＦＳＣ（α、β）およびＢＭＳＣ（γ）の接着層は、１０%ＦＣＳ、Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸、無機リン酸、およびデキサメタゾンを含むＤＭＥＭを用いた５（β）および６週間（α、γ）の誘導後のカルシウム蓄積の指標として、アリザリンレッド染色で示す。
【０１０６】
デキサメタゾンを用いた５週間の刺激後、ＤＦＳＣの長期培養から、新規の嚢組織膜（ＦＴＭ）の層が形成された。その膜は透明で、頑丈で可塑性で、および−図５に示す通り−培養瓶の底部との密な接触を部分的に失っていた。この現象はＢＭＳＣについては見出されなかった。
【０１０７】
図５はＤＦＳＣの新規の嚢組織膜（ＦＴＭ）へのｉｎ ｖｉｔｒｏの分化を示す；培養ＤＦＳＣの層を有する培養瓶を、１０%ＦＣＳ、Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸、無機リン酸、およびデキサメタゾンを含むＤＭＥＭを用いた５週間の誘導後のカルシウム蓄積の指標として、アリザリンレッド染色で示す。
【０１０８】
分化した細胞をＮｏｔｃｈ−１およびネスチンについて試験した。興味深いことにＢＭＳＣから得られた分化した細胞だけがＮｏｔｃｈ−１およびネスチンを発現した一方、デキサメタゾン含有培地で生育したＤＦＳＣの子孫についてはネスチンだけが検出された（表Ｄ）。
【０１０９】
【表４】
2005516616.tif 000006
【０１１０】
さらにデキサメタゾンあり（分化）および無し（未分化）で培養した、ＤＦＳＣおよびＢＭＳＣの長期培養の、ＱＰＣＲを用いた遺伝子発現（図６）を調査した。
【０１１１】
図６はデキサメタゾンありおよび無しの培地で培養したＤＦＳＣ由来のｃＤＮＡを用いたＱＰＣＲを示す；略語は上記参照。
【０１１２】
分化した細胞は、１８型コラーゲン、３型コラーゲン、ＰＨＥＸ、オステオカルシン、およびＰＨＥＸを、デキサメタゾン処理されていないＤＦＳＣより多く発現した。驚くべきことに、典型的には骨形成を担う細胞では増加する骨シアロタンパク質、１型コラーゲン、およびアルカリホスファターゼについては等しい発現率しか見出されなかった。デキサメタゾン中で培養されたＤＦＳＣの子孫は特殊な種類の結合組織（ＦＴＭ）を形成すると結論することができる。ＦＴＭを単離し、組織化学分析用に薄切片を作製した。ＨＥおよびトリクローム染色では、平行なコラーゲンフィラメントおよび繊維芽細胞性／線維嚢胞性様細胞と共に結合組織様構造が見出された。コラーゲン性構造は、トリクローム染色後に緑のフィラメントによって支持された。圧縮した中皮性または内皮性細胞を伴う薄い細胞層は概ね結合組織に向かっていた（図７）。少なくとも薄い血管がＦＴＭの結合組織マトリクス内部に形成されている。結論として、これらすべての事実がＦＴＭの生体膜構造を確認する。
【０１１３】
図７はＦＴＭ切片を用いたＨＥ染色およびトリクローム染色を示す。
【０１１４】
歯由来幹細胞を用いた歯周用途のための組織工学
歯および周辺組織の組織工学
歯、および神経、骨、および結合組織といった歯に関係する組織（歯周組織）の製作の足場としての生分解性ポリマーの用途
本発明の医薬組成物は、本発明の多能性胚性様幹細胞、またはそれに由来する細胞、組織、または器官を、単独で、またはポリマー性担体または細胞外マトリクス中に含みうる。適当なポリマー性担体は、合成または天然ポリマーでできた多孔性メッシュまたはスポンジ、およびポリマー溶液を含む。マトリクスの一つの形は、ポリマー性メッシュまたはスポンジである；他方の形はポリマー性ハイドロゲルである。使用することのできる天然ポリマーは、コラーゲン、アルブミン、およびフィブリンのようなタンパク質；およびアルギン酸塩、およびヒアルロン酸のポリマーといった多糖類を含む。合成ポリマーは生分解性および非生分解性ポリマーの両方を含む。
【０１１５】
生分解性ポリマー選択基準
生分解性ポリマーは、組織修復または再構築が目的である組織工学産物に適用することができるが、材料の長期安定性が必要である場合はできない。生分解性ポリマーはまた、下記を有しなければならない：
（１）バルクポリマーの十分な市販量を含む、製造の実行可能性；
（２）ポリマーを最終製品設計に形成する能力；
（３）短期機能に適切に対応し長期機能に干渉しない機械的性質；
（４）局所組織反応および全身反応の両方に関して、分解産物の低いかまたは無視できる毒性；および
（５）活性化合物の放出または結合を要する用途での、薬物送達の適合性。
【０１１６】
生分解性ポリマーの例は、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、およびポリ乳酸−グリコール酸（ＰＬＧＡ）といったヒドロキシ酸のポリマー、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリホスファゼン、およびその組み合わせを含む。
【０１１７】
生物由来生体吸収性材料
コラーゲンは組織工学用の最も重要な足場の一つである。
【０１１８】
グリコサミノグリカン
グリコサミノグリカン（ＧＡＧｓ）は、直線配列の繰り返し二糖単位から成り、通常はウロン酸成分（たとえばグルクロン酸）およびヘキソサミン成分（たとえばｎ−アセチル−ｄ−グルコサミン）を含む。プロテオグリカンの天然に存在するコアタンパク質に結合したＧＡＧの主な型は、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、およびヘパラン硫酸を含む。ＧＡＧｓは３または４個の単糖を含む特異的な糖配列によってコアタンパク質と結合する。
【０１１９】
最大のＧＡＧであるヒアルロン酸（ヒアルロナン）は、ｎ−アセチルグルコサミンとグルクロン酸の繰り返し二糖単位を有し、枝分かれしない５００から数千の範囲の単位を持つ陰イオン性多糖である。ヒアルロン酸は、天然起源（たとえば、ニワトリのとさか）から、または細菌発酵を経て単離することができる。その水結合能力のために、ヒアルロン酸の希薄溶液は粘性である。
【０１２０】
コラーゲンのように、カルボキシル部分のエーテル化によってのように、ヒアルロン酸は容易に化学修飾することができ、それはヒアルロン酸の水溶性を低下させ粘度を上昇させる（ヒアルロン酸は架橋させることができ、８から２４ｘ１０6の範囲の分子量複合体を形成するかまたは、無限の分子ネットワーク（ゲル）を形成する。一つの方法では、アルデヒドと小分子タンパク質を用いてヒアルロン酸を架橋し、多糖のＣ−ＯＨ基とタンパク質のアミノ基からイミノ基との間に結合を形成し、このように高分子複合体を得る。結果として生じる無限ネットワークゲルは、さまざまな形状および大きさの鞘、膜、管、スリーブ、および粒子に成形することができる。
【０１２１】
ポリヒドロキシアルカン酸
ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）ポリエステルは、いくつかの微生物によって作られる、分解性の、生体適合性の、熱可塑性材料である。それらは細胞内貯蔵ポリマーであり、その機能は炭素およびエネルギーの蓄積を提供することである。ＰＨＢおよび最大３０%の３−ヒドロキシ吉相酸を含むその共重合体は、バイオポール（Ｂｉｏｐｏｌ）の商品名で現在市販されている。
【０１２２】
分解性チロシン−ポリカーボネートは細胞接着および組織工学のための別の重要なポリマーである。
【０１２３】
ポリ（α−ヒドロキシ酸）
天然に存在するヒドロキシ酸、たとえばグリコール酸、乳酸、および(−カプロン酸は、さまざまな医療用製品用途向けの一連の有用な生分解性ポリマーを合成するために利用されている。一例としては、ポリ（α−ヒドロキシ酸）から作られた生体吸収性外科縫合糸は１９７０年以来臨床用途に用いられている；これらの汎用ポリマーから作られた他の埋め込み可能器具（たとえば整形外科的修復用の内固定器具）は標準手術手順の一部となりつつある。
【０１２４】
ポリ（ヒドロキシ酸）埋め込み器具の最終的な分解および吸収は、炎症反応が一部の治癒現象に有害な影響を与えうることが関係し、これらのポリマーは細胞移植および組織再生のためのマトリクスとして導入され成功している。
【０１２５】
非生分解性ポリマー
非生分解性ポリマーは、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、エチレン酢酸ビニル、およびポリビニルアルコールを含む。可鍛性のイオン性または共有結合架橋ハイドロゲルを形成することができるポリマーが、細胞をカプセル封入するのに用いられる。ハイドロゲルは、有機ポリマー（天然または合成）が共有結合、イオン結合、または水素結合を介して架橋し、水分子を補足してゲルを形成する三次元開格子構造を生じるときに形成される物質である。
【０１２６】
ハイドロゲルを形成するのに用いることができる材料の例は、アルギン酸のような多糖類、ポリホスファジン、およびイオン性に架橋する、ポリアクリル酸、または、プルロニクスまたはテトロニクスといったブロック共重合体、温度またはｐＨによってそれぞれ架橋する、ポリエチレンオキサイド−ポリプロピレングリコールブロック共重合体を含む。一般的に、これらのポリマーは、水、緩衝塩溶液、または側鎖に電荷を持つ水性アルコール溶液、またはその一価イオン塩といった水系溶液に少なくともいくらかは可溶である。陽イオンと反応することのできる酸性側基を有するポリマーの例は、ポリ（ホスファゼン）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、アクリル酸とメタクリル酸の共重合体、ポリ（酢酸ビニル）、および、スルホン化ポリスチレンといったスルホン化ポリマーである。
【０１２７】
アクリル酸またはメタクリル酸とビニルエーテルモノマーまたはポリマーとの反応によって形成された酸性側鎖を持つ共重合体もまた用いることができる。酸性基の例は、カルボキシル酸基、スルホン酸基、ハロゲン化（好ましくはフッ化）アルコール基、フェノール性ＯＨ基、および酸性ＯＨ基である。陰イオンと反応することのできる塩基性側基を有するポリマーの例は、ポリ（ビニルアミン）、ポリ（ビニルピリジン）、ポリ（ビニルイミダゾール）、および一部のイミノ置換ポリホスファゼンである。ポリマーのアンモニウムまたは四級塩もまた骨格窒素またはイミノ側基から形成することができる。塩基性側基の例は、アミノ基およびイミノ基である。
【０１２８】
実施例        足場およびその調製
発泡材様足場の調製のためにいくつかの実験が行われている；
・ＣＨ2Ｃｌ2に溶解したＰＬＬＡ、非組織ＰＧＡ線維上に注型、蒸発および真空乾燥、融点ＰＧＡ以上に加熱、急冷、冷却、ＣＨ2Ｃｌ2によってＰＬＬＡを選択的に溶解
・回転するＰＧＡメッシュの噴射、ＰＬＬＡによる
・溶媒注型および孔材の溶脱；
ＰＬＬＡ微小構造／ ＣＨＣｌ3 溶液中に分散した塩（砂糖）粒子、注型、乾燥、水、塩を溶脱
・塩-ＰＬＬＡ混合物の融解
・ＰＬＧＡをＰＥＧと配合、軟組織用途
・ＰＬＬＡをＰＶＡに浸漬
・押し出し成形、ＮａＣｌとの複合薄板、溶脱
・印刷； ３−Ｄ印刷−粉末への塩の組み込み
・エマルション−凍結乾燥処理  水をＰＬＧＡのＣＨ2Ｃｌ2溶液へ、エマルション化、凍結乾燥、孔径２０〜３０μｍ
・ＰＬＬＡの氷酢酸溶液、−１０℃凍結、乾燥（１週間）
・ポリマー−セラミック； ＮａＣｌ ＋ ヒドロキシアパタイト、ＰＬＧＡ 溶液、ＣＨＣＬ3 水− ＰＶＡ 溶液をエマルションへ、乾燥、溶脱
・ヒドロキシアパタイト −粉末をＰＬＧＡジオキセン溶液へ、凍結、凍結乾燥
【０１２９】
好ましくはＰＬＬＡの溶媒注型は、水で溶脱することができ５０〜３００μｍの相互連絡した孔を形成する、分散したＮａＣｌ粒子と共に用いる。
【０１３０】
生分解性発泡材に用いられる他のポリマー；
・ポリヒドロキシブチラートおよび共重合体
・バイオポール
・ポリジオキサノン
・ポリ （ε）− カプロラクトン
・ポリオルトエステル
・ポリ無水物（Ｆ−Ｋ−Ｇｌｉａｄｅｌ）
・ポリホスファゼン
・ポリアミノ酸
・ポリアミノカーボネート− ポリアミノカーボネート−チロシン
・その混合物
【０１３１】
【化１】
2005516616.tif 000007
【０１３２】
歯周炎
歯周炎は、結果として歯の支持組織の崩壊、続く歯肉ポケット形成、そして最後には歯の喪失を生じる疾患である。主な病因は細菌感染であるが、咬合疾患および全身疾患が増悪因子と考えられている。歯周炎は命には関わらないが、ヒト集団でみられる最も広まった疾患の一つである。欧州での大多数の調査は、３５〜４５歳の年齢集団の人の４０%以上に歯周ポケットが存在するとしている。歯周状態は被験者が加齢するにつれて悪化する；フランスでは歯周疾患を有する人の割合は４５〜６４歳の年齢集団で６０%を超える。米国では１９歳以上の人口の３６%に歯周炎がある；これは４５〜６４歳の人の５２．２%へ増加する）。この疾患のための医療コストは、大多数の患者が治療を受けないにもかかわらず、１２０〜１３３百万時間の治療を含む５０〜６０億ドルと推定されている。
【０１３３】
当初の関心は、最後の歯周材料を回復後に本疾患の進行を止めることにあった。数十年の間、歯周病専門医は破壊された歯周組織を再生させるよう努力してきた。初期の試みのうち、掻爬、開放型創面切除術、および多様な骨移植法を挙げることができる。これらの治療様式は非常にしばしば、部分的修復のみ、およびポケットが残存する結果となり、主に高度に特化した組織の前駆細胞は容易に入手されないためだけでなく、歯周手術に関する特に困難な創傷閉鎖条件のためでもある。創傷の種類のように、血栓が非常に速やかに形成される。皮膚創傷では、フィブリン架橋は創傷を閉じるのに十分であり、そして上皮性増殖は、２４時間以内に開始するが、上皮損傷に限定される。歯周病変では、歯肉は歯の血管表面にしか結合できず、非常にしばしば接着は脆弱すぎ、または血栓の吸収が速すぎる。この場合には、歯と歯肉弁の間に長い付着上皮が発達する可能性があり、結果としてポケットが形成される。別の問題は歯垢の蓄積である。口内微生物は、歯表面の歯肉縁に隣接する部分に付着する。これらの創傷閉鎖の妨げのために、歯肉弁の下の歯を完全に覆うことは推奨されているがヒトの臨床的状況ではほぼ実行可能でない。
【０１３４】
歯周医療の新しい進歩は、再生組織を導く膜バリアの用途、および骨代替物の埋め込みを含む。これらの技術は垂直的骨病変に適用され、非常に有効かつ予測的になりつつある。距離を置いて骨細胞の潜在的起源から再生を促進することは困難なままであるが、化学誘引物質(chemoattractants）、成長因子、および骨誘導タンパク質のよりよい知識が、治癒を促進し骨または歯肉再生のための適当な細胞集団の選択を助長する臨床応用の開発を助ける可能性が高い。脈管形成、歯周組織、歯肉組織、および骨の再生のための歯由来幹細胞の導入は、組織再生誘導法の改善のための重要な一歩である。
【０１３５】
組織再生誘導法
組織再生は、再生過程の重要な分野であり、幹細胞および皮下由来または刺激細胞株によって改善される。歯肉の存在は付属器の再生には悪影響を与える。しかし、ニーマン（Ｎｙｍａｎ）と共同研究者は、歯肉上皮性および結合組織細胞を再生部位から除く有効な方法を最初に発見した。ヒトで歯周組織を再生する彼らの最初の試みは、セメント質に埋め込まれたコラーゲン線維との５ｍｍの新しい接着の形成に成功した。彼らはミリポアフィルターを使用し、これが結合組織細胞を吸収部位から閉め出し、また歯肉上皮の根表面に沿った下向きの成長を避けるバリアとして作用した。おそらくフィルターが歯に対して潰れたため、骨はほとんど形成されなかった。その後間もなく、別の材料が採用された；拡張ポリ（テトラフルオロエチレン）（ｅ−ＰＴＦＥ）、すなわちテフロンである。ｅ−ＰＴＦＥの長所はその固さであって、そのためそれは骨形成のためにより多くの空間を与え、また生体適合性であり、容易に除去することができることである。多数の研究が、ｅ−ＰＴＦＥ膜が骨欠損および分岐部欠損の修復を促進する能力を証明している。セメント質、歯周靱帯、および歯槽骨の新たな形成を証明する、修復の組織学的確認は、ヒトと動物の両方で得られた）。本材料は、しかし、二つの大きな欠点を有した；それは重症の歯肉後退の原因となり、また、一旦曝露されると、大量の細菌プラークを蓄積する。歯肉縁の脈管形成は末端毛細血管だけによってもたらされた。細胞を通さないバリアの設置は血液供給を妨害し、下にある組織から発する血管との内皮の接合を防ぐ。歯の歯肉溝部分で活発に増殖している細菌がその後ｅ−ＰＴＦＥ膜にコロニー形成する。その後の炎症のために、テフロン膜は交換後４〜６週間の間に取り除かなければならない。第二段階の膜の回収の必要性を避けるためと細菌感染を最小化するため、コラーゲンまたは多糖ポリマーを用いて吸収性膜が開発されている。実験的に用いたコラーゲン膜は、ラット尾、ウシ真皮、または他の起源から製することができる。工業生産されたコラーゲン膜は、仔ウシ心内膜由来コラーゲンを含み、ヒトの病院で用いられている。さまざまな種類のポリ（乳酸）、ポリ（ガラクト酸）、またはＮ−メチル−２−ピロリドンに乳酸を溶解する新製品が、ポリマー膜を形成するのに用いられている。曝露された場合、細菌酵素と唾液酵素が吸収を加速するため、吸収性膜は少量の細菌プラークを蓄積する。このように浸透化すると、膜は組織滲出物によって部分的に保護される。多数のポリマーバリアは、液体循環を可能にし、限られた量の組織の内生をも可能にする、孔を特徴とする。吸収性バリアの吸収速度は調節することができ、したがって必要な場合にはその効果を延長することができる。膜をどのくらいの期間定位置に留めるべきかはまだ決定されていない。
【０１３６】
膜は歯肉組織を排除するが、歯周靱帯細胞または骨細胞の選択はできない。歯周靱帯細胞は移動が最も遅いと第一に仮定された。このことは、傷害の後に歯周靱帯細胞の増殖は２または３日目に最高となることを示す実験によって支持された。この見かけ上限られた増殖は弱い血管新生が原因で起こり、また未熟な分化が移動を遅らせたと思われた。歯周靱帯細胞はセメント質および歯周様靱帯を産生しながら、インプラントに沿って数ミリメートル移動した。その細胞は、骨細胞がドリルによって残された微小な空隙を横断するよりずっと速く、非常に大きな表面にコロニー形成することができた。そこで、これらの二つの型の細胞は競合しないがまず自身の目的の機能を回復するように見える。吸収性であってもｅ−ＰＴＦＥ製でも、膜は歯肉弁の縁の下に位置させるべきである。バリア膜の適切な使用は、予測可能な骨修復、およびセメント質と歯周靱帯線維の新しい形成に伴う組織学的に検証可能な新しい結合を促進する。この視点から、嚢細胞由来の幹細胞の移植は歯周組織の再構築を．実行することができる。
【０１３７】
骨代替物
口内自家骨移植片は、もちろん、骨欠陥を修復する必要がある場合は、最適の材料である。しかし、特に患者に重度歯周炎から生じた歯槽骨の欠陥がある場合、口内自家骨は常に十分な量で入手可能なわけではない。
【０１３８】
骨代替物は、ヒドロキシアパタイトおよびメタクリル酸メチルのような合成材料、および珊瑚質、またはウシ海綿骨および凍結乾燥ヒト骨のような修飾した石灰化生体物質を含む。これらの製品は手術の容易さと患者の快適性を提供し、その多様な吸収速度は興味深い。骨移植技術の反対者は、歯周付属器の再生は膜移植以外の方法によっては達成できない、または少なくとも証明されていないと主張する。最良の結果は、歯が歯肉弁の下に埋め込まれた場合、または部位が歯肉移植片による上皮の下向きの成長から保護されていた場合に得られた）。骨代替物は結合組織の結合の再生を損なうことが疑われている。歯周靱帯細胞は歯根表面に埋め込まれたヒドロキシアパタイトブロックを覆うことができ、その後に合成材料上にセメント質を分泌することができる。挿入されたコラーゲンとのこの新しく形成された結合接着の形成は、天然の象牙質表面上への再生と比較してわずかに遅れている。新しい結合は新しい骨が存在する場所に優先的に起こると時に仮定される。そこで、骨形成を促進するすべての技術は結合接着の再生に有益となる。レーウェングート（Ｌｏｗｅｎｇｕｔｈ）ら（１９９３）による研究は、歯の工学に重要である可能性がある因子を明らかにした。彼らは表面を脱灰した象牙質の円筒をラット皮膚に移植し、象牙質表面の適当な接近が円筒の壁に垂直な繊維芽細胞およびコラーゲン線維の配向を促進したことを観察した。骨代替物の習慣的な用途は骨欠損ポケット（ユクナ（Ｙｕｋｎａ）、１９９４ａ）および歯槽堤保存（グリーンシュタイン（Ｇｒｅｅｎｓｔｅｉｎ）ら、１９８５）であるが、これは一定の制限がある。吸収性の場合は、物質は歯肉によって吸収することができる。材料はまた欠損部を覆う歯乳頭および歯肉組織の壊死を引き起こしうる。そのような場合には骨代替物は失われ、欠損はますます治療が困難になる。したがって、骨代替物が大量の骨修復を誘導しうるという事実にかかわらず。膜技術の支持者はしばしば、バリア単独は多量の歯槽骨の形成を含まず、または少なくとも既存の骨頂レベルを超えないことを認める。骨または代替材料を用いた骨移植技術だけが、新しい骨、セメント質、および歯槽堤について冠状の歯周靱帯の形成を促進する（ユクナ（Ｙｕｋｎａ）、１９９４ｂ）。
【０１３９】
嚢細胞由来の幹細胞を患者の骨に播種することによって、下顎／上顎骨を生じることも可能でありうる。
【０１４０】
歯周組織工学のための成長因子
フィブロネクチンは繊維芽細胞性活性の有望なプロモーターと考えられており、フィブロネクチンの脱灰歯根への局所塗布が治療に有益であると考えられている。繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）は歯周靱帯組織由来の繊維芽細胞に対して強力な走化性効果を有する。ＦＧＦは繊維芽細胞成長の誘導においてはフィブロネクチンより１０，０００倍強力である。血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）は強力な別の化学誘引物質であり、最大量のフィブロネクチンでも歯周靱帯繊維芽細胞の増殖をナノグラム単位のＰＤＧＦによって達成される程度に刺激することはできない。また、フィブロネクチンは基底ケラチン生成細胞の移動を促進することが示されているため、その有用性を問題にすることができる。（結合組織が形成される前に上皮性細胞が根部にコロニー形成する場合、付着器官は生じない。したがって、フィブロネクチンは繊維芽細胞を適切に誘引し方向付けるが、その効果の一部は望ましくない可能性がある。多量のフィブリノーゲンだけでなくフィブロネクチンおよび凝集因子を含む血漿タンパク質シーラントは、縫合を避けるために使用され成功しているが、フィブロネクチンを脱灰化根部表面に塗布した場合は接着レベルの利益は非常に穏和である。膜バリアを根部から離しておくためのスペーサーとして、生体糊もまた提案されているが、フィブリノーゲンおよび／またはフィブロネクチンの歯周外科における有用性はまだ結論されていない−幹細胞を生体糊に入れることが可能である。
【０１４１】
ＦＧＦおよびＰＤＧＦは両方とも歯周靱帯繊維芽細胞に対して強い効果を有する。歯周病専門医は、形質転換成長因子にも関心を示している。（ＴＧＦ−、これは他のどの成長因子よりも繊維芽細胞コラーゲンの顕著な沈着を促進するように見えるが、繊維芽細胞化学誘引物質ではない。ＦＧＦとインシュリン様成長因子（ＩＧＦ−１）の組み合わせは、同様に有望に思われ、ＴＧＦ−と同じコラーゲン沈着と、ＰＤＧＦ単独より強い靱帯繊維芽細胞の増殖を促進する）。ＰＤＧＦ−ＩＧＦ−１の組み合わせは、歯周繊維芽細胞について走化性かつ細胞分裂誘起性である；ＰＤＧＦは骨芽細胞について走化性であり、また骨培養において非コラーゲン性タンパク質の合成を促進し、そしてＩＧＦ−１はコラーゲンタンパク質の合成を促進する。ＰＤＧＦ−ＩＧＦ−１の組み合わせは、結果として個別の成長因子のどれよりも大きな骨マトリクス形成を生じ、相乗的に相互作用して、軟組織創傷において顕著なコラーゲン形成および治癒をもたらす）。ゲルを通した成長因子の送達によって、大量のＰＤＧＦおよびＩＧＦ−１が短い期間に存在でき、徐放系ではさらに良好な結果をおそらく得ることができる。修復は数週間を要し、幹細胞徐放器具を用いる加速を開発するのは興味深い。骨形成タンパク質（ＢＭＰ）は、当初は骨成長因子として同定され後に少なくとも１３の個別のタンパク質を含むことが示されたペプチド混合物であり、既存の骨の骨成長速度を変化させるのでなく、新しい骨形成を移植部位で促進することができる。ＢＭＰは間葉系前駆細胞を誘導して軟骨におよび骨形成細胞に分化させる。このように、組み換えヒト骨形成タンパク質２（ｒｈＢＭＰ２）については、残存する骨の近接は骨形成についての重要性がより低い。担体中のＲｈＢＭＰは歯周再生を促進する。その膜は移動に有利であり、既にＲｈＢＭＰの増殖は間葉系幹細胞の、後に適当な組織へ発生する群への分類を促進する。ＲｈＢＭＰは水平的骨欠陥における垂直的骨形成を促進しうる。産生された多量の骨は裸出された半分の歯根を覆うだけでなく、一部の例では歯冠の一部を覆って成長した。１２．５−ｋＤａの小ペプチドであるＰＤＬ−ＣＴＸもまた、細胞分裂の性質を持つかまたは幹細胞といった早い段階にある細胞について、歯周靱帯細胞に対する強力な化学誘引物質であるように見える。成長因子であるアメロジェニンは、エナメル器官を形成する上皮性細胞中に見られるが、ブタから抽出されており、無細胞セメント質の新たな形成を結果として生じる。アメロジェニンは靱帯繊維芽細胞の増殖を増大させるが、上皮性細胞の増殖は増大させない。アメロジェニンは幹細胞由来組織工学のための強力なプロモーターである。
【０１４２】
象牙質の再生
ある種の骨形成タンパク質を用いて歯髄組織から象牙芽細胞の分化を誘導し、それによって新しい象牙質の合成または歯髄由来の幹細胞を誘導することは可能でありうる（グロンソス（Ｇｒｏｎｔｈｏｓ）ら、２０００）。歯由来幹細胞を象牙質に移植することもまた可能でありうる。象牙質の再生を成功させるための過程の開発の成功は、強化された歯髄保護物質として、ある状況下での歯根管治療の代替として、および歯充填材の配置にしばしば伴う歯の過敏性を低下させる方法の候補として、商業的用途を有しうる。
【０１４３】
象牙質粉末は象牙質形成性伝達物質として幹細胞の播種に使用が可能である。エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）抽出およびコラゲナーゼ消化によって調製された粗象牙質画分はフェレットの小さい歯髄露出において置換性の象牙質形成を促進し、または切ったばかりの象牙質表面に塗布した場合に反応性の象牙質形成を促進する。一部の細胞外マトリクス成分は象牙芽細胞分化および管状象牙質形成の必須条件である。象牙芽細胞分化、ゆえに組織の構造を調節することは、幹細胞移植によって可能でありうる。象牙質構造の調節が重要である可能性がある。
【０１４４】
歯堤
歯堤の中では、連続した、かつ局在した増殖活性が、将来の乳歯の位置に相当する部位での外胚葉性間葉組織中への一連の上皮性内生の形成に繋がる。この時、分裂指数、標識細胞指数、および上皮性細胞の成長は、下側にある外胚葉性間葉組織における対応する指標より顕著に低く、このことは、「オングロース(ongrowth)」の一部は外胚葉性間葉系の発育によって達成されることを示唆する。ここから歯発生は蕾状期、帽状期、鐘状期の三段階を進行する。これらの用語は発生中の歯胚の形態を記述する；それらは発生中に起こる顕著な機能上の変化、たとえば形態発生および組織分化を適切に説明しない。発生は連続的過程であるため、移行期の間の明瞭な区別は不可能であることにも注意すべきである。初学者にとっての別の問題は、ヒト胚の切片を調べる際に、歯胚を別のモノと似るように発生の特定の段階で区分することが可能であることである（図６−４）。
【０１４５】
血管供給
血管の束が歯嚢中で歯胚の周囲で分岐し歯乳頭（または歯髄）に入るのが帽状期に見られる。歯乳頭中のその数は組織分化の間に増加し、歯発生の歯冠期の開始時に最大に達する。興味深いことに、歯乳頭に入る血管は束になって、歯根が形成される位置と一致する集団となる。加齢と共に、歯髄組織の容量は減少し、血液供給は進行的に減少し、組織の生存可能性に影響を与える。
【０１４６】
上皮だけに由来する歯器官は無血管であるが、嚢の中に重度に集積した血管が外側の歯上皮に隣接して存在する。
【０１４７】
実施例
生分解性ポリマー足場上に作製された組織
我々は生分解性足場をヒト臼歯の形状に製造し、２ｍＭＬ−グルタミン／１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン／１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（バイオフルーズ（Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓ）、メリーランド州ロックヴィル）を添加したＤ−ＭＥＭ無血清培地（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）で培養した幹細胞に由来する幹細胞をその足場に播種し、その細胞／ポリマー構造をシンテコン（Ｓｙｎｔｅｃｏｎ）からの細胞回転反応器型式の、回転式細胞培養システムＲＣＣＳ−Ｄに、５０ｍｌ容器（Ｄ−４０５）を用いて移植した。移植後６週間で単離された微小多孔性ＰＬＬＡ細胞／ポリマー構造は、ポリマーに隣接する細胞層を有した。
【０１４８】
将来の治療的応用のための我々の手法は、歯周組織または骨組織のための幹細胞でコロニー形成した吸収性ポリマー性足場の移植である。
【０１４９】
我々は二種類の異なポリラクチドポリマーマトリクス（ＰＬＬＡ、ＲＧ２０７、べーリンガー・インゲルハイム、ドイツ）の生化学的および生理化学的パラメータ；生体適合性、歯周細胞の成長、分解の動力学、および塩溶脱によって多孔性が誘導される修飾段階の利用可能な能力を調査した。
【０１５０】
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性分析法を用いて、一次培養繊維芽細胞について両方のプロトタイプが毒性を有しないことが証明された。細胞の接着および増殖、そして特異性が、培養した足場の固定切片について顕微鏡法によって確認された（図８）。臨床応用の可能性に関しては、ポリマースポンジはその構造上の特性が理由で、別に薬物放出系の選択肢を有する。
【０１５１】
図８は培養幹細胞と足場の固定切片を示す（ヘキスト３３２５８で染色）。
歯由来幹細胞
図９はＰＬＬＡ−ポリマー孔隙構造を示す（倍率８０倍）。
【０１５２】
表１
・      ＰＬＬＡ  非組織ＰＧＡ線維上に注型
・      ＰＧＡメッシュ  ＰＬＬＡによる
・      ＰＬＬＡ微小構造
・      ＰＬＧＡをＰＥＧと配合
・      ＰＬＬＡをＰＶＡに浸漬
・      印刷； ３−Ｄ印刷
・      エマルション−凍結乾燥処理
・      ポリマー−セラミック； ＰＬＧＡ−ＰＶＡ中のヒドロキシアパタイト
・      ヒドロキシアパタイト ＰＬＧＡ
・      ポリヒドロキシブチラートおよび共重合体
・      バイオポール
・      ポリジオキサノン
・      ポリ （ε）− カプロラクトン
・      ポリオルトエステル−ポリチロシン−カーボネート
・      ポリ無水物（Ｆ−Ｋ−Ｇｌｉａｄｅｌ）
・      ポリホスファゼン
・      ポリアミノ酸
・      ポリアミノカーボネート− ポリアミノカーボネート−チロシン
・      光重合体
・      その混合物
【０１５３】
表２
同分子種間の結合を促進するカドヘリンを有するマトリクス
レクチン様、たとえば分枝オリゴ糖構造すなわちシアリルＸおよびＡ構造である、異分子種間の結合を促進するカドヘリンを有するマトリクス
細胞接着分子（ＣＡＭ）と示される同分子種間および異分子種間の結合のためのタンパク質である、免疫グロブリンファミリーを有するマトリクス
細胞−細胞結合および細胞−マトリクス結合（コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ｖＷＦ、およびラミニン）のためのαおよびβサブユニットから成る二量体分子であるインテグリンを有するマトリクス
【０１５４】
付録
【化１】
2005516616.tif 000008
左
皮膚および歯における修復反応の比較。歯では上皮性反応が無いが、結合組織反応は両方の場合で同様であり、（１）多形、（２）マクロファージ、（３）繊維芽細胞（損傷されていない歯髄細胞と血管周囲細胞の分裂による）、および（４）歯を石灰化して象牙質を形成する、瘢痕組織（コラーゲン）の産生。
治療的手法については、う蝕の治癒の改善のためには歯由来の幹細胞を象牙質に移植するのが慎重と思われる。
【０１５５】
右
抜歯後の修復反応。Ａはｉｎ ｓｉｔｕの歯を示す。抜歯後、歯槽（Ｂ）には凝血が充満している。凝血は、（１）多型反応、（２）マクロファージ反応、および（３）繊維芽細胞反応によって消散する（Ｃ）。加えて、骨欠損は新しい骨芽細胞（４）によってコロニー形成され、それがコラーゲン瘢痕を再構成して骨（Ｄ）を形成する。
本発明の追跡において、幹細胞から作製した加工していない歯を、凝血の形成中に歯槽へ導入することが可能である。
歯周組織の治癒のどの段階でも、歯由来の幹細胞をポリマー性マトリクスと共に、またはそれ無しで、創傷層に移植するのが賢明である。
歯由来の幹細胞の移植によって、誘導足場（膜）ありまたは無しで、治癒の任意の段階（ａ〜ｄ）にある歯周組織を再生することができる。
【０１５６】
【化２】
2005516616.tif 000009
【０１５７】
【化３】
2005516616.tif 000010
【０１５８】
歯肉組織修復の要約。上皮性反応は欠損を覆う細胞の増殖および移動によって達成される。結合組織反応には、連続的に（１）多型反応（１２から２４時間）、（２）マクロファージ反応（２から５日間）、および（３）脱分化した血管周囲細胞および損傷していない繊維芽細胞からの繊維芽細胞反応（２日後から）が関与する。新しい繊維芽細胞（４）は瘢痕組織のコラーゲンを形成する。
【０１５９】
創傷治癒の改善のために、歯由来の幹細胞を創傷層に導入することが可能である。
口内で瘢痕がなぜ稀であるのかを説明する、歯肉上皮における修復。第４段階までの修復過程は図１８−７に示す通りで、（１）多型反応、（２）マクロファージ反応、（３）繊維芽細胞分化、および（４）コラーゲン合成が関与する。創傷は（５）コラーゲン食作用によって再構成される。
【０１６０】
参考文献：
チビン, C. I., L. C.ストラウス, 他.（Civin, C. I., L. C. Strauss, et al.）(1984). J Immunol 133(1): 157-65.
フリーデンシュタイン AJ, ゴルスカヤ U, カルギナ NN （Friedenstein AJ, Gorskaja U, Kalugina NN） (1976) Exp. Hematol. 4: 267-274
グリーンシュタイン, G., R. A. ジャフィン, 他（Greenstein, G., R. A. Jaffin, et al.）(1985). J Periodontol 56(4): 200-3.
グロンソス S, マンカニ M, ブラヒム J, ローベイ PG, シー S. （Gronthos S, Mankani M, Brahim J, Robey PG, Shi S.）(2000) Proc Natl Acad Sci U S A 97:13625-13630
ハラダ H, ケッツネン P, ユング H-S, ムストネン T, ワン YA, セルレフ I （Harada H, Kettunen P, Jung H-S, Mustonen T, Wang YA, Thesleff I）(1999) J Cell Biol. 147:105-20.
ジョナソン, C. B., M. スヴェンソン, 他（Johansson, C. B., M. Svensson, et al.）(1999a). Exp Cell Res 253(2): 733-6.
ジョナソン CB, モマ S, クラーク DL, リスリング M, レンダール U, フリーゼン J （Johansson CB, Momma S, Clarke DL, Risling M, Lendahl U, Frisen J）(1999b) Cell 96:25-34
レーウェングート, R. A., A. M. ポルソン,他（Lowenguth, R. A., A. M. Polson, et al.）(1993). J Periodontol 64(5): 330-42.
ピッテンジャー, M. F., A. M. マッケイ, 他（Pittenger, M. F., A. M. Mackay, et al.）(1999). Science 284(5411): 143-7.
シグルドソン, T. J., M. B. リー, 他（Sigurdsson, T. J., M. B. Lee, et al.）(1995). J Periodontol 66(2): 131-8.
シャープ（Sharpe）(2000) (WO 01/60981)
シー S, グロンソス S, ローベイ PG.（Shi S, Gronthos S, Robey PG.）WO 02/07679
テン  カーテ（Ten Cate）,口腔組織学  第５版（Oral Histology, Fifth Ed.）, Mosby Inc. 1998
ヴィレック, J. L., J. P. マクナマラ, 他（Vierck, J. L., J. P. McNamara, et al.）(1996). In Vitro Cell Dev Biol Anim 32(9): 564-72.
ワイナー J, ユング CK, シャケル I, ウィリアムズ PM.（Winer J, Jung CK, Shackel I, Williams PM.） Anal Biochem (1999) 270:41-49
【図面の簡単な説明】
【０１６１】
【図１】図１は歯嚢の免疫表現型を示す。免疫ペルオキシダーゼ反応性に基づく試験が、歯嚢の切片を用いて実施された。抗体；α）Ｎｏｔｃｈ−１β）ネスチン。
【図２】図２は、α）１４日後の代表的なコロニーを示す。β）およびγ）は、β）ネスチンおよびγ）Ｎｏｔｃｈ−１についての代表的な染色パターンを有する、培養ＤＦＳＣの免疫表現型を特徴づける。
【図３ａ】図３ａはＭＳＣＢＭバレットキット（ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ）で成長させた培養ＢＭＳＣおよびＤＦＳＣを用いたＱＰＣＲを示す。相対濃度の値はデルタ／デルタ法（ワイナー（Ｗｉｎｅｒ）ら、１９９９）を用いて計算し、ＢＭＳＣ由来の総ＲＮＡをキャリブレーターとして使用した。ハウスキーピング遺伝子はＧＡＰＤＨであった。
【図３ｂ】図３ｂはＭＳＣＢＭバレットキット（ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ）、２０%ＦＣＳ添加Ｄ−ＭＥＭ、およびノックアウトＤ−ＭＥＭ（無血清培地）で成長させた培養ＤＦＳＣを用いたＱＰＣＲを示す。数値はＭＳＣＢＭバレットキット（ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ）で培養したＤＦＳＣから得た総ＲＮＡを用いて計算した。
【図４】図４はＤＦＳＣおよびＢＭＳＣのｉｎ ｖｉｔｒｏの分化を示す；培養ＤＦＳＣ（α、β）およびＢＭＳＣ（γ）の接着層は、１０%ＦＣＳ、Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸、無機リン酸、およびデキサメタゾンを含むＤＭＥＭを用いた５（β）および６週間（α、γ）の誘導後のカルシウム蓄積の指標として、アリザリンレッド染色で示す。
【図５】図５はＤＦＳＣの新規の嚢組織膜（ＦＴＭ）へのｉｎ ｖｉｔｒｏの分化を示す；培養ＤＦＳＣの層を有する培養瓶を、１０%ＦＣＳ、Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸、無機リン酸、およびデキサメタゾンを含むＤＭＥＭを用いた５週間の誘導後のカルシウム蓄積の指標として、アリザリンレッド染色で示す。
【図６】図６はデキサメタゾンありおよび無しの培地で培養したＤＦＳＣ由来のｃＤＮＡを用いたＱＰＣＲを示す；略語は上記参照。
【図７】図７はＦＴＭ切片を用いたＨＥ染色およびトリクローム染色を示す。
【図８】図８は培養幹細胞と足場の固定切片を示す（ヘキスト３３２５８で染色）。
【図９】図９はＰＬＬＡ−ポリマー孔隙構造を示す（倍率８０倍）。
【図１０】図１０は、歯発生の要約を示す。
【図１１】図１１は歯の発生を説明する。
【図１】
2005516616.tif 000011
【図２】
2005516616.tif 000012
【図３ａ】
2005516616.tif 000013
【図３ｂ】
2005516616.tif 000014
【図４】
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【図５】
2005516616.tif 000016
【図６】
2005516616.tif 000017
【図７】
2005516616.tif 000018
【図８】
2005516616.tif 000019
【図９】
2005516616.tif 000020
【図１０】
2005516616.tif 000021
【図１１】
2005516616.tif 000022
【手続補正書】
【提出日】平成16年10月26日(2004.10.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
歯または智歯の歯嚢から単離された非胚性組織から得ることができる、ｉｎ ｖｉｔｒｏで自己再生でき、かつ分化することができる幹細胞。
【請求項２】
内胚葉性、外胚葉性、および中胚葉性系譜の細胞に分化することができる請求項１の幹細胞。
【請求項３】
歯周靱帯様膜構造に分化することができる請求項１及び２のいずれかの幹細胞。
【請求項４】
石灰化組織様構造に分化することができる請求項１〜３のいずれかの幹細胞。
【請求項５】
ヒト細胞である請求項１〜４のいずれかの幹細胞。
【請求項６】
請求項１〜５いずれかの幹細胞から得ることができる間葉系幹細胞。
【請求項７】
ａ）請求項１〜６のいずれかの幹細胞、
ｂ）前記幹細胞の増殖を支持することができる培地、
ｃ）前記幹細胞の、血管または他の脈管を有する生体膜を構築する細胞への増殖を支持することができる培地。
：を含む培養物。
【請求項８】
さらに増殖因子または系譜決定因子を含む、請求項７の培養物。
【請求項９】
・細胞を歯嚢から得る
・細胞を培養する
段階を含む、請求項１〜６のいずれかの幹細胞を単離する方法。
【請求項１０】
・歯嚢からクローン原性細胞を得る
・当該細胞を異なる培地中で培養する
・前記培養細胞をクローン密度に希釈する；
・前記希釈細胞を培養する；
・単一の細胞を有するこれらの培養物を増殖させる
段階を含む、クローン性幹細胞を単離する請求項９の方法。
【請求項１１】
請求項１０の方法によって得ることができるクローン性幹細胞株。
【請求項１２】
目的の遺伝子またはタンパク質を発現するよう遺伝子組み換えされた請求項１の幹細胞。
【請求項１３】
（ａ）請求項１〜５のいずれかの幹細胞に少なくとも一つのマーカー遺伝子または目的遺伝子を含むＤＮＡ構築物を遺伝子導入する；
（ｂ）この幹細胞におけるマーカー遺伝子または目的遺伝子の発現について選択する；
（ｃ）（ｂ）で選択された幹細胞を培養する
段階を含む遺伝子組み換えされた請求項１２の幹細胞を作製する方法。
【請求項１４】
請求項１３の方法によって得ることができる遺伝子組み換えされた幹細胞。
【請求項１５】
・請求項１の幹細胞を、系譜決定因子である物質を含むと思われる試料と接触させる；および
・そのように接触させた細胞の系譜を、ｍＲＮＡ発現、抗原発現、または他の方法によって判定する；ここでその接触させた細胞の系譜は、前記試料中の系譜決定因子の存在または活性を示す
段階を含む、系譜決定因子である物質の存在または活性を検出するための方法。
【請求項１６】
・系譜決定されていない細胞として幹細胞を維持する培地中で、請求項１の幹細胞を培養すること；
・供試する物質、化合物、または因子を加えること；および
・ｍＲＮＡ発現、抗原発現、または他の方法によって、そのように接触させた細胞の系譜を判定すること
を含む、系譜決定されていない細胞の系譜決定を調節する、物質、化合物、または因子の能力を試験する方法。
【請求項１７】
・系譜決定されていない細胞として幹細胞を維持する培地中で、請求項１の幹細胞を培養すること、
・供試する物質、化合物、または因子を加えること；および
・ｍＲＮＡ発現、抗原発現、または他の方法によって、そのように接触させた細胞の系譜を判定すること
：を含む、系譜決定されていない細胞の系譜決定を調節する能力について、物質、化合物、または因子をスクリーニングするための分析システム。
【請求項１８】
・請求項１の幹細胞を、増殖因子である物質を含むと思われる試料と接触させる；および
・そのように接触させた細胞の増殖および系譜を、ｍＲＮＡ発現、抗原発現、または他の方法によって判定する；ここでその接触させた細胞の系譜決定なしの増殖は、前記試料中の増殖因子の存在または活性を示す
段階を含む、増殖因子である物質の存在または活性を検出するための方法。
【請求項１９】
・系譜決定されていない細胞として幹細胞を維持する培地中で、請求項１の幹細胞を培養すること；
・供試する物質、化合物、または因子を加えること；および
・ｍＲＮＡ発現、抗原発現、または他の方法によって、そのように接触させた細胞の増殖および系譜を判定すること
を含む、系譜決定されていない細胞の増殖を調節する、物質、化合物、または因子の能力を試験する方法。
【請求項２０】
歯周炎、腱、靱帯、筋膜、および、中皮性／内皮性細胞の血管へのまたは外胚葉性または神経組織への分化を支援するその他の種類の結合組織を再生するのに用いられる膜に、請求項１の幹細胞を培養するための方法。
【請求項２１】
インシュリン、レチノイン酸、インドメタシン、１−メチル−３−イソブチルキサンチン、テオフィリン、形質転換成長因子−β（任意の）、骨形成タンパク質（任意の）、繊維芽細胞成長因子（任意の）、上皮成長因子（任意の）、血小板由来成長因子（任意の）、血管内皮成長因子（任意の）、肝細胞成長因子、インターフェロン（任意の）、インシュリン様成長因子（任意の）、インターロイキン（任意の）、神経成長因子の群から選ばれる分化のための物質またはその組み合わせを含む任意の培地で請求項１の幹細胞を培養するための方法。
【請求項２２】
請求項１の幹細胞に目的のタンパク質または遺伝子を発現するＤＮＡまたはＲＮＡを含むベクターを遺伝子導入する段階を含む、目的のタンパク質または遺伝子のｅｘ ｖｉｖｏ投与の方法。
【請求項２３】
哺乳類における細胞の衰弱、異常および／または機能障害および／または他の疾患状態を予防するおよび／または治療するために使用される、請求項１の幹細胞、またはそれに由来する細胞または組織。
【請求項２４】
哺乳類における組織修復または移植のために使用される、請求項１の幹細胞、またはそれに由来する細胞または組織。
【請求項２５】
哺乳類における細胞の衰弱、異常および／または機能障害および／または移植および／または他の疾患状態を予防するおよび／または治療するために使用される、請求項１の幹細胞に由来する中胚葉性系譜決定された細胞。
【請求項２６】
哺乳類における組織修復または移植のために使用される、請求項１の幹細胞に由来する中胚葉性系譜決定された細胞。
【請求項２７】
・治療的に有効な量の請求項１の幹細胞、またはそれに由来する細胞または組織；および
・薬学的に受容可能な培地または担体
：を含む、哺乳類における細胞の衰弱，異常および／または機能障害の治療のための医薬組成物。
【請求項２８】
増殖因子または系譜決定因子をさらに含む、請求項２７の医薬組成物。
【請求項２９】
請求項１の幹細胞をマトリクス上で培養することによって、歯を作製するための、歯の周囲の骨／骨マトリクス歯槽骨または顎骨の形成のための、または、口内の動脈および静脈の形成のための、生分解性ポリマー、非生分解性ポリマーおよび合成ポリマーの群から選ばれるポリマーからなる、細胞外マトリクスとして用いられる足場。
【請求項３０】
足場マトリクスが、カドヘリン、ＣＡＭまたはインテグリンのような細胞結合領域配列を有する請求項２９の足場。
【請求項３１】
細胞がバイオリアクター内のマトリクスに播種される、請求項１〜６のいずれかの細胞の培養方法。
【国際調査報告】
2005516616.tif 000023
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2005516616.tif 000025
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