(57)【要約】本発明は、カリウムチャネルタンパク質のＳｌｏファミリー（「マキシ」またはＢＫカリウムチャネルタンパク質としても公知）のメンバーであるＳｌｏ２およびＳｌｏ４の単離された核酸およびアミノ酸の配列を提供する。本明細書中で、Ｓｌｏ２およびＳｌｏ４に対する抗体、Ｓｌｏ２およびＳｌｏ４を検出する方法、生物学的に活性なＳｌｏ２およびＳｌｏ４を用いる、カリウムチャネルのアクチベーターおよびインヒビターをスクリーニングする方法、ならびにＳｌｏ２およびＳｌｏ４を含む電位依存性カリウムチャネルのアクチベーターおよびインヒビターについてスクリーニングするためのキットがまた、提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓｌｏカリウムチャネルのαサブユニットを含むＳｌｏ４ポリペプチドをコードする単離された核酸であって、該ポリペプチドが、以下：
（ｉ）少なくとも１つのさらなるαサブユニットと共に、電位依存性特徴を含むカリウムチャネルを形成し；そして
（ｉｉ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸にハイブリダイズし、ここで、該ハイブリダイゼーション反応は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳを含む溶液中で４２℃でインキュベートされ、そして０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを含む溶液中で６５℃で洗浄される、
単離された核酸。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、配列番号４に対して生成された抗体に特異的に結合する、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
前記カリウムチャネルが、迅速な活性化特徴をさらに含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項４】
配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項１に記載の核酸。
【請求項５】
配列番号３のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項６】
請求項１に記載の核酸であって、該核酸は、少なくとも１つのプライマー対によって増幅され、該プライマー対は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、以下：
【化１】
2005507633.tif 000014
からなる群より選択されるプライマーと同じ配列に選択的にハイブリダイズする、核酸。
【請求項７】
前記核酸によってコードされるポリペプチドが、ホモマーカリウムチャネルのαサブユニットを含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項８】
前記核酸によってコードされるポリペプチドが、ヘテロマーカリウムチャネルのαサブユニットを含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項９】
前記核酸が、配列番号４のアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含むポリペプチドをコードする、請求項１に記載の核酸。
【請求項１０】
配列番号４のアミノ酸配列をコードする核酸に、中程度にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする単離された核酸であって、ここで、該ハイブリダイゼーション条件は、４０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳを含む溶液中３７℃でのインキュベーション、および１×ＳＳＣを含む溶液中４５℃での洗浄を含む、単離された核酸。
【請求項１１】
核酸を検出する方法であって、該方法は、該核酸を、請求項１に記載の単離された核酸と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項１２】
Ｓｌｏカリウムチャネルのαサブユニットを含む、単離されたＳｌｏ４ポリペプチドであって、該ポリペプチドは、以下：
（ｉ）少なくとも１つのさらなるαサブユニットと共に、電位依存性特徴を含むカリウムチャネルを形成し；そして
（ｉｉ）高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸にハイブリダイズする核酸配列によってコードされ、ここで、該ハイブリダイゼーション反応は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳを含む溶液中４２℃でインキュベートされ、そして０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを含む溶液中６５℃で洗浄される、
単離されたＳｌｏ４ポリペプチド。
【請求項１３】
前記ポリペプチドが、配列番号４に対して生成された抗体に特異的に結合する、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記カリウムチャネルが、迅速な活性化特徴をさらに含む、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記ポリペプチドが、約１３４ｋＤ〜約１４４ｋＤの分子量を有する、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記ポリペプチドが、配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記ポリペプチドが、ホモマーカリウムチャネルのαサブユニットを含む、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが、ヘテロマーカリウムチャネルのαサブユニットを含む、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
前記ポリペプチドが、配列番号４に対して少なくとも６０％の同一性を有する配列を含む、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
請求項１２に記載のＳｌｏ４ポリペプチドに特異的に結合する、抗体。
【請求項２１】
前記抗体が結合する前記ポリペプチドが、配列番号４のアミノ酸配列を有する、請求項２０に記載の抗体。
【請求項２２】
請求項１に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項２３】
請求項２２に記載のベクターでトランスフェクトされた、宿主細胞。
【請求項２４】
カリウムチャネルを介したイオンフラックスを増大または減少させる化合物を同定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）該化合物を、Ｓｌｏ４ポリペプチドと接触させる工程であって、該ポリペプチドは、以下：
（ａ）少なくとも１つのさらなるαサブユニットと共に、電位依存性特徴を有するカリウムチャネルを形成し；そして
（ｂ）高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸にハイブリダイズする核酸配列によってコードされ、ここで、該ハイブリダイゼーション反応は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳを含む溶液中４２℃でインキュベートされ、そして０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを含む溶液中６５℃で洗浄される、工程；ならびに
（ｉｉ）該カリウムチャネルに対する該化合物の機能的効果を決定する工程、を包含する、方法。
【請求項２５】
前記機能的効果が、物理的効果である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記機能的効果が、化学的効果である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記ポリペプチドが、真核生物宿主細胞または真核生物細胞膜において発現される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記機能的効果が、イオンフラックス、イオン濃度の変化、電流の変化または電位の変化を測定することによって決定される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記機能的効果が、前記チャネルに対するリガンド結合を測定することによって決定される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記ポリペプチドが、組換え体である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
前記カリウムチャネルが、ホモマーである、請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
前記カリウムチャネルが、ヘテロマーである、請求項２４に記載の方法。
【請求項３３】
前記ポリペプチドが、配列番号４のアミノ酸配列を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項３４】
Ｓｌｏ４を含むカリウムチャネルを介したイオンフラックスを増大または減少させる化合物を同定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）Ｓｌｏ４ポリペプチドの少なくとも２５アミノ酸、またはＳｌｏ４ポリペプチドをコードする核酸の少なくとも７５ヌクレオチドのアミノ酸配列を、コンピュータシステムに入力する工程であって、該Ｓｌｏ４ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有する部分配列を含む、工程；
（ｉｉ）該アミノ酸配列によってコードされた該ポリペプチドの三次元構造を生成する工程；
（ｉｉｉ）該Ｓｌｏ４ポリペプチドを含むカリウムチャネルの三次元構造を生成する工程；
（ｉｖ）該化合物の三次元構造を生成する工程；ならびに
（ｖ）該ポリペプチドと該化合物の三次元構造とを比較して、該化合物が該ポリペプチドに結合するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項３５】
Ｓｌｏ４ポリペプチドを含むＳｌｏカリウムチャネルを介したイオンフラックスを調節して、被験体において疾患を処置する方法であって、該方法は、請求項２４または３４に記載の方法を使用して同定された化合物の治療的有効量を、該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３６】
ヒト組織におけるｈＳｌｏ４の存在を検出する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）生物学的サンプルを単離する工程；
（ｉｉ）該生物学的サンプルを、ｈＳｌｏ４と選択的に会合する、ｈＳｌｏ４特異的試薬と接触させる工程；および
（ｉｉｉ）該サンプルに選択的に会合するｈＳｌｏ４特異的試薬のレベルを検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項３７】
前記ｈＳｌｏ４特異的試薬が、ｈＳｌｏ４特異的抗体、ｈＳｌｏ４特異的オリゴヌクレオチドプライマー、およびｈＳｌｏ４核酸プローブからなる群より選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
コンピュータシステムにおいて、ヒトＳｌｏ４遺伝子の変異についてスクリーニングする方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を有するＳｌｏ４ポリペプチド、およびその保存的に改変されたバージョンをコードする第一の核酸配列を、該コンピュータに入力する工程；
（ｉｉ）該第一の核酸配列を、該第一の核酸と実質的同一性を有する第二の核酸配列と比較する工程；ならびに
（ｉｉｉ）該第一の核酸配列と該第二の核酸配列との間のヌクレオチド差異を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項３９】
前記第二の核酸配列が、疾患状態と関連する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
Ｓｌｏカリウムチャネルのαサブユニットを含むＳｌｏ２ポリペプチドをコードする単離された核酸であって、該ポリペプチドは、以下：
（ｉ）少なくとも１つのさらなるαサブユニットと共に、電位依存性特徴を含むカリウムチャネルを形成し；そして
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含む、
単離された核酸。
【請求項４１】
前記カリウムチャネルが、迅速な活性化特徴をさらに含む、請求項４０に記載の核酸。
【請求項４２】
配列番号１のヌクレオチド配列を含む、請求項４０に記載の核酸。
【請求項４３】
Ｓｌｏ２ポリペプチドをコードする単離された核酸であって、該核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、以下：
【化２】
2005507633.tif 000015
からなる群より選択されるプライマーと同じ配列に選択的にハイブリダイズするプライマーによって増幅される、
単離された核酸。
【請求項４４】
前記核酸によってコードされる前記ポリペプチドが、ホモマーカリウムチャネルのαサブユニットを含む、請求項４０に記載の核酸。
【請求項４５】
前記核酸によってコードされる前記ポリペプチドが、ヘテロマーカリウムチャネルのαサブユニットを含む、請求項４０に記載の核酸。
【請求項４６】
核酸を検出する方法であって、該方法は、該核酸を、請求項４０に記載の単離された核酸と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項４７】
Ｓｌｏカリウムチャネルのαサブユニットを含む、単離されたＳｌｏ２ポリペプチドであって、該ポリペプチドは、以下：
（ｉ）少なくとも１つのさらなるＳｌｏαサブユニットと共に、電位依存性特徴を含むＳｌｏカリウムチャネルを形成し；そして
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を有する配列を含む、
単離されたＳｌｏ２ポリペプチド。
【請求項４８】
前記カリウムチャネルが、迅速な活性化特徴をさらに含む、請求項４７に記載のポリペプチド。
【請求項４９】
約１３４ｋＤ〜約１４４ｋＤの分子量を有する、請求項４７に記載のポリペプチド。
【請求項５０】
ホモマーカリウムチャネルのαサブユニットを含む、請求項４７に記載のポリペプチド。
【請求項５１】
ヘテロマーカリウムチャネルのαサブユニットを含む、請求項４７に記載のポリペプチド。
【請求項５２】
請求項４７に記載のＳｌｏ４ポリペプチドに特異的に結合する、抗体。
【請求項５３】
請求項４０に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項５４】
請求項５３に記載のベクターでトランスフェクトされた、宿主細胞。
【請求項５５】
カリウムチャネルを介したイオンフラックスを増大または減少させる化合物を同定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）該化合物を、Ｓｌｏ４ポリペプチドと接触させる工程であって、該ポリペプチドは、以下：
（ａ）少なくとも１つのさらなるＳｌｏαサブユニットと共に、電位依存性特徴を有するＳｌｏカリウムチャネルを形成し；そして
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を有する配列を含む、工程；ならびに
（ｉｉ）該カリウムチャネルに対する該化合物の機能的効果を決定する工程、を包含する、方法。
【請求項５６】
前記機能的効果が、物理的効果である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記機能的効果が、化学的効果である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記ポリペプチドが、真核生物宿主細胞または真核生物細胞膜において発現される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
前記機能的効果が、イオンフラックス、イオン濃度の変化、電流の変化または電位の変化を測定することによって決定される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記機能的効果が、前記チャネルに対するリガンド結合を測定することによって決定される、請求項５５に記載の方法。
【請求項６１】
前記ポリペプチドが、組換え体である、請求項５５に記載の方法。
【請求項６２】
前記カリウムチャネルが、ホモマーである、請求項５５に記載の方法。
【請求項６３】
前記カリウムチャネルが、ヘテロマーである、請求項５５に記載の方法。
【請求項６４】
Ｓｌｏ２ポリペプチドを含むカリウムチャネルを介したイオンフラックスを増大または減少させる化合物を同定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列を、コンピュータシステムに入力する工程；
（ｉｉ）該アミノ酸配列によってコードされた該ポリペプチドの三次元構造を生成する工程；
（ｉｉｉ）該Ｓｌｏ２ポリペプチドを含むカリウムチャネルの三次元構造を生成する工程；
（ｉｖ）該化合物の三次元構造を生成する工程；ならびに
（ｖ）該ポリペプチドと該化合物の三次元構造とを比較して、該化合物が該ポリペプチドに結合するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項６５】
Ｓｌｏ２ポリペプチドを含むＳｌｏカリウムチャネルを介したイオンフラックスを調節して、被験体において疾患を処置する方法であって、該方法は、請求項５５または６４に記載の方法を使用して同定された化合物の治療的有効量を、該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項６６】
ヒト組織におけるｈＳｌｏ２の存在を検出する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）生物学的サンプルを単離する工程；
（ｉｉ）該生物学的サンプルを、ｈＳｌｏ２と選択的に会合する、ｈＳｌｏ２特異的試薬と接触させる工程；および
（ｉｉｉ）該サンプルに選択的に会合するｈＳｌｏ２特異的試薬のレベルを検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項６７】
前記ｈＳｌｏ２特異的試薬が、ｈＳｌｏ２特異的抗体、ｈＳｌｏ２特異的オリゴヌクレオチドプライマー、およびｈＳｌｏ２核酸プローブからなる群より選択される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
コンピュータシステムにおいて、ヒトＳｌｏ２遺伝子の変異についてスクリーニングする方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列を有するＳｌｏ２ポリペプチド、およびその保存的に改変されたバージョンをコードする第一の核酸配列を、該コンピュータに入力する工程；
（ｉｉ）該第一の核酸配列を、該第一の核酸と実質的同一性を有する第二の核酸配列と比較する工程；ならびに
（ｉｉｉ）該第一の核酸配列と該第二の核酸配列との間のヌクレオチド差異を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項６９】
前記第二の核酸配列が、疾患状態と関連する、請求項６８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
カリウムチャネルは、多くの生理学的プロセスに関与し、これらのプロセスとしては、心拍の調節、動脈の拡張、インスリンの放出、神経細胞の興奮性、および腎臓電解質輸送の調節が挙げられる。従って、カリウムチャネルは、広範な種々の動物細胞（例えば、神経組織、筋肉組織、腺組織、免疫組織、生殖組織、および上皮組織）に見出される。これらのチャネルは、特定の条件下での細胞内および／または細胞外へのカリウムの流動を可能にする。例えば、これらのチャネルの開口時でのカリウムイオンの流出は、細胞内をより陰性にし、これは、細胞に付与される脱分極電位を相殺する。これらのチャネルは、例えば、カルシウム感受性、電位ゲーティング、セカンドメッセンジャー、細胞外リガンド、およびＡＴＰ感受性によって調節される。
【０００２】
カリウムチャネルは、αサブユニットによって作製され、これらのαサブユニットは、予測された構造的類似性および機能的類似性に基づいて、８つのファミリーに分けられる（Ｗｅｉら、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ３５（７）：８０５−８２９（１９９７））。これらのファミリーのうちの３つ（Ｋｖ、Ｅａｇ関連、およびＫＱＴ（ここでは、ＫＣＮＱとも呼ばれる））は、６つの膜貫通ドメインの共通のモチーフを共有し、主に、電位によってゲートされる。他の２つのファミリーであるＣＮＧおよびＳＫ／ＩＫもまた、このモチーフを含むが、それぞれ、サイクリックヌクレオチドおよびカルシウムによってゲートされる。カリウムチャネルαサブユニットの他の３つのファミリーは、膜貫通ドメインの別々のパターン（内向き整流カリウムチャネル、Ｓｌｏカリウムチャネル、およびＴＰカリウムチャネル）を有する。Ｓｌｏファミリーカリウムチャネル（ＢＫチャネルまたは「マキシ（ｍａｘｉ）」チャネルとしても公知である）は、大きいコンダクタンスのチャネル型であり、電位依存性（ｖｏｌｔａｇｅ  ｇａｔｅｄ）であり、６〜７つの膜貫通ドメイン、孔ループドメイン、ならびに細胞質テールドメインを有し、この細胞質テールドメインは、例えば、イオン（例えば、カルシウム）のゲーティングおよびｐＨ調節（例えば、Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：３５０９−３５１５（１９９８）；Ｂｕｔｌｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：２２１−２２４（１９９３）；Ｍｅｅｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４（２５）：１４０６６−７１（１９９７）；Ｗｅｉら、Ｎｅｕｒｏｎ  １３：６７１−６８１（１９９４）を参照のこと）に関与する。カリウムチャネルの内向き整流ファミリー（Ｋｉｒ）は、２つの膜貫通ドメインを含む構造ファミリーに属する（例えば、Ｌａｇｒｕｔｔａら、Ｊｐｎ．Ｈｅａｒｔ．Ｊ．３７：６５１−６６０（１９９６）を参照のこと）。なお別の機能的に異なるファミリー（ＴＰまたは「２孔」）は、この内向き整流モチーフの２つの直列反復を含む。
【０００３】
上記のように、カリウムチャネルは、代表的には、４つのαサブユニットによって形成され、そしてホモマー（同じαサブユニットから作製される）またはヘテロマー（２以上の別々の型のαサブユニットから作製される）であり得る。さらに、カリウムチャネルは、さらなる構造的に異なる補助的（すなわち、β）サブユニットを含むことが、しばしば、見出されている（例えば、Ｋｖ、ＳｌｏおよびＫＣＮＱカリウムチャネルファミリー；例えば、ＭｃＭａｎｕｓら、Ｎｅｕｒｏｎ  １４：６４５−６５０（１９９５）；Ｓｃｈｏｐｐｅｒｌｅら、Ｎｅｕｒｏｎ  ２０：５６５−５７３（１９９８）；Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：６４５３−６４６１（１９９９）；およびＷＯ００５０４４４を参照のこと）。これらのβサブユニットは、それ自体でカリウムチャネルを形成しないが、代わりに、これらは、αサブユニットによって形成されたチャネルの機能的特性を改変するように、補助的なサブユニットとして作用する。例えば、Ｋｖβサブユニットは、細胞質性であり、そしてＫｖチャネルの表面発現を増加すること、および／または、チャネルの不活性化の速度論を改変することが知られている（Ｈｅｉｎｅｍａｎｎら、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．４９３：６２５−６３３（１９９６）；Ｓｈｉら、Ｎｅｕｒｏｎ  １６（４）：８４３−８５２（１９９６））。別の例において、ＫＣＮＱファミリーβサブユニットであるｍｉｎＫは、主に、活性化の速度論を変化させる（Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８４：８０−８３（１９９６））。
【０００４】
カリウムチャネルのＳｌｏファミリーは、相同性に基づいて、さらに２つのサブファミリーに分けられ得る。第１のサブファミリーは、Ｓｌｏ１およびＳｌｏ３を含む（例えば、Ｅｌｋｉｎｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８３：８４１５（１９８６）；Ａｔｋｉｎｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：５５１（１９９１）；Ａｄｅｌｍａｎら、Ｎｅｕｒｏｎ  ９：２０９（１９９２）（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓｌｏ１）；Ｂｕｌｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：２２１−２２４（１９９３）；Ｄｗｏｒｅｔｓｋｙら、Ｍｏｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．２７：１８９−１９３（１９９４）；Ｔｓｅｎｇ−Ｃｒａｎｋら、Ｎｅｕｒｏｎ  １３：１３１５−１３３０（１９９４）；ＭｃＣｏｂｂら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６９：Ｈ７６７−Ｈ７７７（１９９５）；Ｗａｌｌｎｅｒら、Ｒｅｃ．Ｃｈａｎ．３：１８５−１９９（１９９５）（ヒトおよびマウスＳｌｏ１）；Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：３５０９−３５１５（１９９８）；ＷＯ９９／２０７５４（ヒトおよびマウスＳｌｏ３））。Ｓｌｏ１は、カルシウムで活性化され、一方、Ｓｌｏ３は、内部ｐＨによって調節される。第２のサブファミリー由来のカリウムチャネルとしては、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  Ｓｌｏ２およびラット「ＳＬＡＣＫ」が挙げられる（Ｊｏｉｎｅｒら、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１：４６２−４６９（１９９８）（ラットＳＬＡＣＫまたはＳｌｏ２）；Ｙｕａｎら、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３：７７１−７７９（２０００）；Ｌｉｍら、Ｇｅｎｅ  ２４０：３５−４３（１９９９）（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ「Ｓｌｏ２」）を参照のこと）。第２のサブファミリーのメンバーは、同じ構造モチーフを共有し、これらもまた電位依存性であり、そしてまた、他のイオン（例えば、カルシウムまたは塩素イオン）によってもゲートされ得る（例えば、Ｊｏｉｎｅｒ（前出）、Ｙｕａｎら（前出）を参照のこと）。しかし、第２のサブファミリーのメンバーは、Ｓｌｏ１チャネルおよびＳｌｏ３チャネルに対して共有する全体的な相同性は高くないようである。
【０００５】
Ｓｌｏチャネルは、以下の範囲にわたる広範な種々の生理学的プロセスにおいて役割を果たす：腎臓塩分泌（Ｗａｎｇら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５９：４１３−３６（１９９７））、ニューロンおよび腺による分泌の調節（Ｌｉｎｇｌｅら、Ｉｏｎ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ  ４：２６１−３０１（１９９６）；Ｒｏｂｉｔａｉｌｌｅら、Ｎｅｕｒｏｎ  １１：６４５−６５５（１９９３）；Ｐｅｔｅｒｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３０７：６９３−６９６（１９８４）；ＲｏｂｉｔａｉｌｌｅおよびＣｈａｒｌｔｏｎ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１２：２９７−３０５（１９９２））、感覚認識（Ｒａｍａｎｔｈａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３：２１５−２１７（１９９９）；Ｎａｖａｒａｔｎａｍら、Ｎｅｕｒｏｎ  ５：１０７７−１０８５（１９９７））、平滑筋緊張の調節（ＢｒａｙｄｅｎおよびＮｅｌｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：５３２−５３５（１９９２））、およびニューロン興奮性の制御（Ｋｎａｕｓら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１６：９５５−９６３（１９９６）；ＲｏｂｉｔａｉｌｌｅおよびＣｈａｒｌｔｏｎ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１２：２９７−３０５（１９９２）；Ｌａｎｃａｓｔｅｒら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１１：２３−３０（１９９１）；Ｒｏｂｉｔａｉｌｌｅら、Ｎｅｕｒｏｎ  １１：６４５−６５５（１９９３））。
【０００６】
（発明の要旨）
従って、本発明は、Ｓｌｏファミリーの新規メンバーであるＳｌｏ４をコードする遺伝子およびカリウムチャネルのＳｌｏ２/４サブファミリーを、初めて提供する。さらに、本発明は、ヒトＳｌｏ２をコードする遺伝子を、初めて提示する。
【０００７】
１つの局面において、本発明は、Ｓｌｏカリウムチャネルのαサブユニットを含むＳｌｏ４ポリペプチドをコードする、単離された核酸を提供し、このポリペプチドは、（ｉ）少なくとも１つのさらなるＳｌｏαサブユニットと共に、電位依存性（ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｉｎｇ）の特徴を有するＳｌｏカリウムチャネルを形成し；そして（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列に少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む。
【０００８】
別の局面において、本発明は、Ｓｌｏ４ポリペプチドをコードする単離された核酸を提供し、この核酸は、配列番号３のヌクレオチド配列に、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする。
【０００９】
１つの実施形態において、この核酸は、配列番号４のアミノ酸配列をコードする。別の実施形態において、この核酸は、配列番号３のヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、この核酸は、配列番号３のヌクレオチド配列に、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で選択的にハイブリダイズする。
【００１０】
１つの実施形態において、この核酸は、以下からなる群より選択されるプライマーと同じ配列に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で選択的にハイブリダイズする、少なくとも１つのプライマー対によって増幅される：
【００１１】
【化３】
2005507633.tif 000002
１つの局面において、本発明は、核酸を検出する方法を提供し、この方法は、その核酸に本発明の単離されたＳｌｏ４核酸を接触させる工程を包含する。
【００１２】
１つの局面において、本発明は、本発明のＳｌｏ４核酸を含む発現ベクターを含む、宿主細胞を提供する。
【００１３】
別の局面において、本発明は、Ｓｌｏカリウムチャネルのαサブユニットを含む、単離されたＳｌｏ４ポリペプチドを提供し、このポリペプチドは、（ｉ）少なくとも１つのさらなるＳｌｏαサブユニットと共に、電位依存性の特徴を有するＳｌｏカリウムチャネルを形成し；そして（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列に少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む。
【００１４】
別の実施形態において、このカリウムチャネルは、迅速な活性化の特徴をさらに含む。
【００１５】
１つの実施形態において、このポリペプチドは、配列番号４に対して生成された抗体に特異的に結合する。別の実施形態において、このポリペプチドは、ホモマーまたはヘテロマーのカリウムチャネルのαサブユニットを含む。１つの実施形態において、このポリペプチドは、約１３４ｋＤ〜約１４４ｋＤの間の分子量を有する。
【００１６】
別の実施形態において、このポリペプチドは、ヒトＳｌｏ４をコードする。別の実施形態において、このポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を有する。
【００１７】
１つの局面において、本発明は、本発明のＳｌｏ４ポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。
【００１８】
別の局面において、本発明は、カリウムチャネルを介するイオンフラックスを増加または減少させる化合物を同定するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ｉ）この化合物にＳｌｏ４ポリペプチドを接触させる工程であって、このポリペプチドは、（ａ）少なくとも１つのさらなるＳｌｏαサブユニットと共に、電位依存性の特徴を有するＳｌｏカリウムチャネルを形成し；そして（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列に少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む、工程；および（ｉｉ）このカリウムチャネルに対するこの化合物の機能的効果を決定する工程。
【００１９】
１つの実施形態において、この機能的効果は、物理的効果または化学的効果である。別の実施形態において、この機能的効果は、イオンフラックス、イオン濃度の変化、電流の変化または電位の変化を測定することによって決定される。別の実施形態において、この機能的効果は、チャネルに対するリガンド結合を測定することによって決定される。
【００２０】
１つの実施形態において、このポリペプチドは、真核生物宿主細胞または細胞膜において発現される。別の実施形態において、このポリペプチドは、組換え体である。
【００２１】
１つの局面において、本発明は、Ｓｌｏ４ポリペプチドを含むカリウムチャネルを介するイオンフラックスを増加または減少させる化合物を同定するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ｉ）Ｓｌｏ４ポリペプチドの少なくとも２５アミノ酸のアミノ酸配列またはＳｌｏ４ポリペプチドをコードする核酸の少なくとも７５ヌクレオチドをコンピュータシステムに入力する工程であって、このＳｌｏ４ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有するサブ配列を含む、工程；（ｉｉ）このアミノ酸配列によってコードされるポリペプチドの三次元構造を作成する工程；（ｉｉｉ）このＳｌｏ４ポリペプチドを含むカリウムチャネルの三次元構造を作成する工程；（ｉｖ）この化合物の三次元構造を作成する工程；および（ｖ）このポリペプチドの三次元構造とこの化合物の三次元構造を比較して、この化合物がこのポリペプチドに結合するか否かを決定する工程。
【００２２】
別の局面において、本発明は、Ｓｌｏ４ポリペプチドを含むＳｌｏカリウムチャネルを介するイオンフラックスを調節し、被験体における疾患を処置する方法を提供し、この方法は、本発明の方法を使用して同定された化合物の治療有効量をこの被験体に投与する工程を包含する。
【００２３】
別の局面において、本発明は、ヒト組織におけるｈＳｌｏ４の存在を検出する方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ｉ）生物学的サンプルを単離する工程；（ｉｉ）この生物学的サンプルに、ｈＳｌｏ４と選択的に会合するｈＳｌｏ４特異的試薬を接触させる工程；および（ｉｉｉ）このサンプルに選択的に会合するｈＳｌｏ４特異的試薬のレベルを検出する工程。
【００２４】
１つの実施形態において、このｈＳｌｏ４特異的試薬は、以下からなる群より選択される：ｈＳｌｏ４特異的抗体、ｈＳｌｏ４特異的オリゴヌクレオチドプライマー、およびｈＳｌｏ４核酸プローブ。
【００２５】
別の局面において、本発明は、コンピュータシステムにおいて、ヒトＳｌｏ４遺伝子の変異についてスクリーニングする方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を有するＳｌｏ４ポリペプチドおよびその保存的に改変されたバージョンをコードする第１の核酸配列を、コンピュータに入力する工程；（ｉｉ）この第１の核酸配列を、この第１の核酸配列に対して実質的同一性を有する第２の核酸配列と比較する工程；および（ｉｉｉ）第１の核酸配列と第２の核酸配列との間のヌクレオチドの差異を同定する工程。
【００２６】
１つの実施形態において、この第２の核酸配列は、疾患状態に関連する。
【００２７】
１つの局面において、本発明は、Ｓｌｏカリウムチャネルのαサブユニットを含むＳｌｏ２ポリペプチドをコードする、単離された核酸を提供し、このポリペプチドは、（ｉ）少なくとも１つのさらなるＳｌｏαサブユニットと共に、電位依存性の特徴を有するＳｌｏカリウムチャネルを形成し；そして（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含む。
【００２８】
別の局面において、本発明は、Ｓｌｏ２ポリペプチドをコードする単離された核酸を提供し、この核酸は、以下からなる群より選択されるプライマーと同じ配列に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で選択的にハイブリダイズする、プライマーによって増幅される：
【００２９】
【化４】
2005507633.tif 000003
１つの実施形態において、この核酸は、配列番号１のヌクレオチド配列を含む。
【００３０】
１つの局面において、本発明は、核酸を検出する方法を提供し、この方法は、その核酸に本発明の単離されたＳｌｏ２核酸を接触させる工程を包含する。
【００３１】
１つの局面において、本発明は、本発明のＳｌｏ２核酸を含む発現ベクターを含む、宿主細胞を提供する。
【００３２】
１つの局面において、本発明は、Ｓｌｏカリウムムチャネルのαサブユニットを含む、単離されたＳｌｏ２ポリペプチドを提供し、このポリペプチドは、（ｉ）少なくとも１つのさらなるＳｌｏαサブユニットと共に、電位依存性の特徴を有するＳｌｏカリウムチャネルを形成し；そして（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を有する配列を含む。
【００３３】
１つの実施形態において、このカリウムチャネルは、迅速な活性化の特徴をさらに含む。
【００３４】
１つの実施形態において、この核酸によってコードされるポリペプチドは、ホモマーまたはヘテロマーのカリウムチャネルのαサブユニットを含む。別の実施形態において、このポリペプチドは、約１３４ｋＤ〜約１４４ｋＤの間の分子量を有する。
【００３５】
１つの局面において、本発明は、本発明のＳｌｏ４ポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。
【００３６】
別の局面において、本発明は、カリウムチャネルを通るイオンフラックスを増加または減少させる化合物を同定するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ｉ）化合物を、Ｓｌｏ４ポリペプチドと接触させる工程であって、このポリペプチドが、（ａ）少なくとも１つのさらなるＳｌｏのαサブユニットと、電位依存性の特徴を有するＳｌｏカリウムチャネルを形成し；そして（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を有する配列を含む、工程；および（ｉｉ）このカリウムチャネルに対するこの化合物の機能的効果を決定する工程。
【００３７】
１つの実施形態において、この機能的効果は、物理的効果または化学的効果である。別の実施形態において、この機能的効果は、イオンフラックス、イオン濃度の変化、電流の変化または電圧の変化を測定することによって、決定される。別の実施形態において、この機能的効果は、このチャネルに結合するリガンドを測定することによって、決定される。
【００３８】
１つの実施形態において、このポリペプチドは、真核生物の宿主細胞または細胞膜において発現される。別の実施形態において、このポリペプチドは、組換えポリペプチドである。
【００３９】
別の局面において、本発明は、Ｓｌｏ２ポリペプチドを含むカリウムチャネルを通るイオンフラックスを増加または減少させる化合物を同定するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ｉ）コンピュータシステムに配列番号２のアミノ酸配列を入力する工程；（ｉｉ）このアミノ酸配列によってコード化されるポリペプチドの三次元構造を作製する工程；（ｉｉｉ）Ｓｌｏ２ポリペプチドを含むカリウムチャネルの三次元構造を作製する工程；（ｉｖ）化合物の三次元構造を作製する工程；および（ｖ）このポリペプチドの三次元構造とこの化合物の三次元構造とを比較して、この化合物がこのポリペプチドに結合するか否かを決定する工程。
【００４０】
別の局面において、本発明は、被験体において疾患を処置するために、Ｓｌｏ２ポリペプチドを含むＳｌｏカリウムチャネルを通るイオンフラックスを調節する方法を提供し、この方法は、この被験体に、本発明の方法を使用して同定された治療有効量の化合物を投与する工程を包含する。
【００４１】
別の局面において、本発明は、ヒト組織においてｈＳｌｏ２の存在を検出する方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ｉ）生物学的サンプルを単離する工程；（ｉｉ）この生物学的サンプルを、ｈＳｌｏ２と選択的に会合するｈＳｌｏ２特異的試薬と接触させる工程；および（ｉｉｉ）このサンプルと選択的に会合する、ｈＳｌｏ２特異的試薬のレベルを決定する工程。
【００４２】
１つの実施形態において、ｈＳｌｏ２特異的試薬は、ｈＳｌｏ２特異的抗体、ｈＳｌｏ２特異的オリゴヌクレオチドプライマー、およびｈＳｌｏ２核酸プローブからなる群より選択される。
【００４３】
別の局面において、本発明は、コンピュータシステムにおいて、ヒトＳｌｏ２遺伝子の変異をスクリーニングする方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ｉ）このコンピュータに、配列番号２のアミノ酸配列およびその保存的に改変されたバージョンを有するＳｌｏ２ポリペプチドをコードする、第１の核酸配列を入力する工程；（ｉｉ）この第１の核酸配列を、この第１の核酸配列とかなりの同一性を有する第２の核酸配列と比較する工程；ならびに（ｉｉｉ）これらの第１の核酸配列と第２の核酸配列との間のヌクレオチドの差異を同定する工程。
【００４４】
１つの実施形態において、第２の核酸配列は、疾患状態に関連する。
【００４５】
（発明の詳細な説明）
本発明は、初めて、Ｓｌｏ４カリウムチャネルをコードする核酸を提供する。本発明はまた、ヒトＳｌｏ２の配列を提供する。これらのポリペプチドモノマーは、カリウムチャネルのＳｌｏファミリーのメンバーであり、そしてＳｌｏ２／４サブファミリーのメンバーである。このファミリーのメンバーは、６つの膜貫通領域およびポア−ループドメイン、ならびに細胞質テイルを有する、カリウムチャネルのポリペプチドサブユニットである。
【００４６】
ヒトＳｌｏ２とヒトＳｌｏ４との両方が、心臓および中枢神経系において発現され、そしてニューロン興奮性の調節に寄与するようである。なぜなら、Ｓｌｏ２とＳｌｏ４との両方が、活動電位を生成するための代表的な閾値より低い電圧範囲で、活性化し始めるからである。これらはまた、他のＳｌｏファミリーメンバーに対してそうであるように、活動電位の再分極および不応期、ならびに神経伝達物質放出の制御に関与するようである。骨格筋、心臓および脾臓のような末梢組織における、ヒトＳｌｏ２およびヒトＳｌｏ４の発現は、これらがまた、筋肉収縮、心拍数、気道の緊張、炎症、およびリンパ球増殖の調節に関与し得ることを示す。さらに、Ｓｌｏ２およびＳｌｏ４のモジュレーターは、増加したレベルのニューロン活性または異常な神経伝達物質放出に関する、ニューロン興奮性の障害を処置する際に、有用であるはずである。これには、神経障害性の疼痛、癲癇および発作の障害、うつ病ならびに他の精神病性障害（例えば、双極性疾患および精神分裂病、片頭痛ならびに不安）が挙げられる。モジュレーターはまた、アルツハイマー病のような疾患によって引き起こされる、学習および記憶の障害を処置する際に、または老化した集団において学習および記憶を増強するために、有用であり得る。いくつかの細胞において、Ｓｌｏ２電流およびＳｌｏ４電流の増強は、より大きな過分極を引き起こし、そして脱分極に基づくカルシウム流入を減少させ、神経保護を提供する。カルシウム流入が電圧に依存しない、他の細胞においては、Ｓｌｏ２およびＳｌｏ４のブロッカーは、カルシウム移入のための駆動力を低下させ得、再度、神経保護を提供する。
【００４７】
従って、本発明は、Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４のαサブユニットを含むカリウムチャネルのアクチベーターおよびインヒビターをスクリーニングする方法を提供する。カリウムチャネル活性のこのようなモジュレーターは、障害（ＣＮＳ障害（例えば、神経障害性の疼痛、癲癇および他の発作の障害）、片頭痛、不安、精神病性疾患（例えば、精神分裂病、双極性疾患、およびうつ病））が挙げられる）を処置するために有用である。このようなモジュレーターはまた、神経保護因子として（例えば、発作を防止するために）有用である。モジュレーターはまた、アルツハイマー病のような疾患によって引き起こされる、学習および記憶の認知障害を処置する際に、または老化した集団において学習および記憶を増強するために有用であり得、さらに、神経保護を提供する。最後に、このようなモジュレーターは、筋肉の過剰収縮性、心律動異常、炎症、喘息を処置するため、および免疫抑制剤または刺激剤として、有用であり得る。
【００４８】
さらに、本発明は、Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４が直接的または間接的なレポーター分子として働く、Ｓｌｏ２およびＳｌｏ４の活性のアッセイを提供する。Ｓｌｏ２およびＳｌｏ４の、アッセイおよび検出システムにおけるレポーター分子としてのこのような使用は、広範な応用を有する。例えば、Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４は、カリウム濃度、膜電位、電流、イオンフラックス、転写、シグナル伝達、レセプタ−リガンド相互作用、セカンドメッセンジャー濃縮の、インビトロ、インビボ、およびエキソビボでの変化を測定するための、レポーター分子として使用され得る。１つの実施形態において、Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４は、特定の方向での電流（例えば、外向きまたは内向きのカリウムフロー）のインジケータとして使用され得、そして別の実施形態において、Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４は、緑色蛍光タンパク質のような第２レポーター分子への付着を介して、間接的なレポーターとして使用され得る。
【００４９】
本発明はまた、Ｓｌｏ２およびＳｌｏ４の核酸およびタンパク質の発現を検出して、Ｓｌｏ２ファミリーメンバーおよびＳｌｏ４ファミリーメンバーによって提供されるチャネルの相違の調査、ならびに障害の診断を可能にする、方法を提供する。この障害としては、ＣＮＳ障害（例えば、神経傷害性の疼痛、癲癇および他の発作の障害）、片頭痛、不安、精神病性障害（例えば、精神分裂病、双極性疾患、およびうつ病）、アルツハイマー病のような疾患によって引き起こされる、学習および記憶の認知障害、筋肉の過剰収縮性、心律動異常、炎症、および喘息が挙げられる。
【００５０】
最後に、本発明は、Ｓｌｏ２およびＳｌｏ４の遺伝子またはタンパク質の変異をスクリーニングする方法を提供する。本発明は、コンピュータを使用する、Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４における変異をスクリーニングする方法を包含するが、これらに限定されない。同様に、本発明は、Ｓｌｏ２ポリペプチドおよびＳｌｏ４ポリペプチド（例えば、ヒトＳｌｏ２およびヒトＳｌｏ４）の三次元構造を同定する方法、ならびにＳｌｏ２ポリペプチドおよびＳｌｏ４ポリペプチドの三次元構造を含む得られたコンピュータ読取り可能な画像またはデータを提供する。Ｓｌｏ２およびＳｌｏ４の遺伝子またはタンパク質の変異をスクリーニングするための他の方法としては、高密度オリゴヌクレオチドアレイ、ＰＣＲ、免疫アッセイなどが挙げられる。
【００５１】
機能的に、Ｓｌｏ２ポリペプチドおよびＳｌｏ４ポリペプチドは、Ｓｌｏカリウムチャネルのαサブユニットである。Ｓｌｏ２カリウムチャネルおよびＳｌｏ４カリウムチャネルは、カリウム選択的であり、そして電位依存性である（例えば、電圧ステップの間に開くチャネルの数は、脱分極の増加と共に増加する）。さらに、これらのチャネルは、他の手段（例えば、カルシウム、塩化物、またはｐＨ）によって調節され得る（例えば、Ｙｕａｎら、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８：７７１−７７９（２０００）を参照のこと；Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，前出、およびＢｕｔｌｅｒ，前出をまた参照のこと）。代表的に、このようなチャネルは、ヘテロメリックまたはホモメリックであり、そしてそれぞれが６または７の膜貫通ドメインを有する、４つのαサブユニットまたはモノマーを含む。ヘテロメリックＳｌｏチャネルは、１つ以上のＳｌｏ２αサブユニットまたはＳｌｏ４αサブユニットを、Ｓｌｏファミリー由来の１つ以上のさらなるαサブユニットと共に含み得る（例えば、ＭｃＭａｎｕｓら、Ｎｅｕｒｏｎ  １４：６４５−６５０（１９９５）；Ｓｃｈｏｐｐｅｒｌｅら、Ｎｅｕｒｏｎ  ２０：５６５−５７３（１９９８）；Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７５：６４５３−６４６１（１９９９）；およびＷＯ００５０４４４を参照のこと）。Ｓｌｏ２チャネルおよびＳｌｏ４チャネルはまた、ホモメリックであり得る。さらに、このようなホモメリクチャネルは、１つ以上の補助的なβサブユニットを含み得る。カリウムチャネルにおけるＳｌｏ２またはＳｌｏ４の存在はまた、ホモメリックチャネルの活性を改変し得、従って、例えば、コンダクタンスのようなチャネルの特徴を変化させることによって、チャネルの相違を増強し得る。チャネルの相違はまた、選択的にスプライシングされた形態のＳｌｏ２遺伝子およびＳｌｏ４遺伝子で増強される。
【００５２】
Ｓｌｏ２核酸は、ヒトＣＮＳ組織（小脳、大脳皮質、後頭葉、側頭葉、被殻、中隔側坐核、扁桃、尾状核、前頭葉、海馬、黒質、および視床）、骨格筋、脾臓、心臓、下垂体、卵巣、胎盤、胎児脳、および胎児脾臓で発現される（図４を参照のこと）。Ｓｌｏ４ｃＤＮＡはヒト脳で増幅され、そしてＳｌｏ４核酸は、ヒト肝臓、脳、心臓（心房）、骨格筋、脾臓、腎臓、ＧＩ管（結腸、小腸）、胎盤、肺、精巣、膀胱、胎児脳、胎児腎臓、および胎児肝臓、ならびにさらなる組織中で発現される（図７を参照のこと）。
【００５３】
構造的には、ヒトＳｌｏ２のヌクレオチド配列（配列番号１）は、約１２３５アミノ酸（配列番号２）のポリペプチドモノマーをコードし、これは、約１３９Ｋｄであり、そして約１３４Ｋｄ〜１６４Ｋｄの範囲の推定分子量をもつ。
【００５４】
本発明はまた、配列番号２に示されるヒトＳｌｏ２の多型改変体：改変体＃１、この中では、アミノ酸位置２４でセリン残基がアラニン残基を置換している；改変体＃２、この中では、アミノ酸位置３９でスレオニン残基がアラニン残基を置換している；改変体＃３、この中では、アミノ酸位置１１３でスレオニン残基がセリン残基を置換している；および改変体＃４、この中では、アミノ酸位置１１０５でリジン残基がアルギニン残基を置換している、を提供する。
【００５５】
構造的には、ヒトＳｌｏ４のヌクレオチド配列（配列番号３）は、約１１３５アミノ酸（配列番号４）のタンパク質をコードし、これは、約１３０Ｋｄであり、そして約１２５Ｋｄ〜１３５Ｋｄの範囲の推定分子量をもつ。
【００５６】
本発明はまた、配列番号４に示されるヒトＳｌｏ４の多型改変体：改変体＃１、この中では、アミノ酸位置３９でバリン残基がメチオニン残基を置換している；改変体＃２、この中では、アミノ酸位置８７でアラニン残基がセリン残基を置換している；改変体＃３、この中では、アミノ酸位置５４７でセリン残基がスレオニン残基を置換している；および改変体＃４、この中では、アミノ酸位置１０９８でイソロイシン残基がバリン残基を置換している、を提供する。
【００５７】
Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の特定領域を用いて、Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４多型改変体、種間の相同体、および対立遺伝子を同定し得る。この同定は、インビトロで、例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下および配列決定、または他のヌクレオチド配列との比較のためのコンピューターシステム中の配列情報を用いることによるか、またはＳｌｏ２またはＳｌｏ４に対して惹起された抗体を用いてなされ得る。代表的には、Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４多型改変体、オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）、および対立遺伝子の同定は、配列番号２または４、またはコア膜貫通ドメイン（ポアループおよびＳ１−Ｓ６膜貫通ドメイン）もしくはテイルドメインのような保存領域に対して、アミノ酸配列（またはこのアミノ酸配列をコードする核酸）を比較することによりなされる。代表的には、完全長アミノ酸配列において、ほぼ少なくとも６０％以上、好ましくは７０％、６５％、７５％、８０％、８５％、最も好ましくは９０−９５％またはそれ以上のアミノ酸同一性は、あるタンパク質が、Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４多型改変体、種間相同体、または対立遺伝子であることを示す。代表的には、コア膜貫通ドメイン（Ｓ１−Ｓ６＋ポアループ）またはＣ末端細胞質テイルドメインにおいて、ほぼ少なくとも６０％、６５％、７０％、または７５％、７５％以上、好ましくは８０％、８５％、最も好ましくは９０−９５％またはそれ以上のアミノ酸同一性は、あるタンパク質が、Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４多型改変体、種間相同体、または対立遺伝子であることを示す。代表的には、配列比較は、以下に論議されるように、デフォールトのパラメーターを用いるＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムを用いて実施される。
【００５８】
Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４多型改変体、種間相同体、および対立遺伝子は、推定のＳｌｏ２またはＳｌｏ４ポリペプチドモノマーを発現または同時発現すること、および電位ゲーティングのようなＳｌｏファミリー機能的特徴、および相対的に迅速な活性化および脱活性化のようなＳｌｏ２またはＳｌｏ４特徴を備えてカリウムチャネルを形成するか否かを調べることにより確認され得る。このアッセイを用いて、Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４の保存領域に対して、約６０％またはそれ以上、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％またはそれ以上のアミノ酸同一性をもつタンパク質は、Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４と同じ機能的特徴を共有し、そしてそれ故、Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４の種であることを証明する。代表的には、配列番号２または４のアミノ酸配列をもつヒトＳｌｏ２またはＳｌｏ４を、推定のＳｌｏ２またはＳｌｏ４タンパク質に対する比較におけるポジティブコントロールとして用い、Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４多型改変体、オルソログ、保存的に改変された改変体、変異体、または対立遺伝子の同定を示す。
【００５９】
Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４ヌクレオチドおよびアミノ酸配列情報はまた、コンピューターシステムにおいて、Ｓｌｏ電位依存性カリウムチャネルのモデルを構築するために用いられ得る。次に、これらのモデルを用い、Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４ポリペプチドを含む電位依存性カリウムチャネルを活性化または阻害し得る化合物を同定する。Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４ポリペプチドを含むチャネルの活性を調整するこのような化合物を用いて、チャネル活性の調整およびチャネル多様性におけるＳｌｏ２またはＳｌｏ４ポリペプチドの役割を調査し得る。
【００６０】
生物学的に活性なヒトＳｌｏ２およびヒトＳｌｏ４の単離は、Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４サブユニットを含む電位依存性カリウムチャネルのインビビターおよびアクチベーターをアッセイするための手段を初めて提供する。生物学的に活性なＳｌｏ２またはＳｌｏ４ポリペプチドは、例えば、電圧または電流における変化を測定するインビボおよびインビトロ発現を用い、Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４および／またはＳｌｏ１またはＳｌｏ３のようなその他のＳｌｏメンバーのサブユニットを含む電位依存性カリウムチャネルのインヒビターおよびアクチベーターを試験するために有用である。少なくとも１つのＳｌｏ２またはＳｌｏ４サブユニット（必要に応じて４つまでのＳｌｏ２またはＳｌｏ４サブユニット）を含むカリウムチャネルを用いて同定されたこのようなアクチベーターおよびインヒビターは、電位ゲーティング、チャネル動力学およびカリウムチャネルのコンダクタンス性質をさらに研究するために用いられ得る。このようなアクチベーターおよびインヒビターは、イオンフラックスにおける異常を含む疾患、例えば、神経障害性の痛み、てんかんおよびその他の発作障害、偏頭痛、不安のようなＣＮＡ障害、精神分裂症、双極性障害のような精神病性障害、およびうつ病を含む疾患を処置するための薬学的薬剤として有用である。このような調整剤はまた、神経保護剤（例えば、発作を防ぐため）として有用である。調整剤はまた、アルツハイマー病のような疾患により引き起こされる学習および記憶の認識障害において、または加齢集団において学習および記憶を増大するため、および神経保護を提供するために有用であり得る。最後に、このような調整剤は、筋肉の過剰収縮性、不整脈、炎症、喘息を処置するため、および免疫抑制剤または刺激剤として有用であり得る。
【００６１】
Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４核酸およびポリペプチド、およびＳｌｏ２またはＳｌｏ４ポリペプチドを含むチャネルの発現を検出する方法はまた、例えば、上記のような異常イオンフラックスを含む疾患に対する診断適用に有用である。例えば、ヒトＳｌｏ２またはＳｌｏ４をコードする遺伝子の染色体局在化を用いて、Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４により引き起こされ、かつそれにともなう疾患を同定し得る。Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４を検出する方法はまた、チャネル多様性およびチャネル活性の調整におけるＳｌｏ２またはＳｌｏ４の役割を調べるために有用である。
【００６２】
（ＩＩ．定義）
本明細書で用いられるとき、以下の用語は、他であることが特定されなければ、それらに与えられた意味をもつ。
【００６３】
「Ｓｌｏ４」は、ＳｌｏまたはＳｌｏ４カリウムチャネルのサプユニットまたはモノマーであり、そしてＳｌｏファミリーのメンバーであるポリペプチドをいう。Ｓｌｏ４がホモマーのカリウムチャネルの一部分であるとき、このチャネルは、電位ゲーティングおよび迅速脱活性化の特徴をもつ。さらに、Ｓｌｏ４がホモマーのカリウムチャネルの一部分であるとき、それは、改変された特徴を与え得る。Ｓｌｏ４は、ポアループドメインおよびＳ１−Ｓ６膜貫通ドメインを含む、配列番号４のアミノ酸６４−２８２に対応するコア膜貫通ドメインをもつ。Ｓｌｏ４はまた、配列番号４のアミノ酸３３６−１１３５からのＣ末端細胞質テイルドメインをもつ。
【００６４】
従って、用語Ｓｌｏ４は、Ｓｌｏ４多型改変体、対立遺伝子、変異体、およびオルソログ（種間相同体）をいい、これは：（１）配列番号４のＳｌｏ４アミノ酸配列、またはコア膜貫通ドメインまたはＣ末端細胞質テイルのような保存領域に対し、本明細書に記載されたパラメーターを用い、ＢＬＡＳＴのような配列比較アルゴリズムを用い、約６０％より大きいアミノ酸配列同一性、好ましくは約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％アミノ酸配列同一性を有するか；（２）配列番号４のアミノ酸配列またはその免疫原性フラグメント、およびその保存的に改変された改変体を含む免疫原に対して惹起された抗体、例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体に結合するか；（３）配列番号３の配列、およびその保存的に改変された改変体に、高度および／または中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズするか；または（４）配列番号２３−３１からなる群から選択されるプライマーセットと同じ配列に、高度および／または中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズするプライマーにより増幅される。
【００６５】
「Ｓｌｏ２」は、ＳｌｏまたはＳｌｏ４カリウムチャネルのサブユニットまたはモノマーであり、そしてＳｌｏファミリーのメンバーであるポリペプチドをいう。Ｓｌｏ２がホモマーのカリウムチャネルの一部分であるとき、このチャネルは、電位ゲーティングおよび迅速脱活性化の特徴をもつ。さらに、Ｓｌｏ２がホモマーのカリウムチャネルの一部分であるとき、それは、改変された特徴を与え得る。Ｓｌｏ２は、ポアループドメインおよびＳ１−Ｓ６膜貫通ドメインを含む、配列番号２のアミノ酸９８−３３５からのコア膜貫通ドメインをもつ。Ｓｌｏ２はまた、配列番号２のアミノ酸２８３−１２３５からのＣ末端細胞質テイルドメインをもつ。
【００６６】
従って、用語Ｓｌｏ２は、Ｓｌｏ４多型改変体、対立遺伝子、および変異体をいい、これは：（１）配列番号２のＳｌｏ２アミノ酸配列、またはコア膜貫通ドメインまたはＣ末端細胞質テイルのような保存領域に対し、本明細書に記載されたパラメーターを用い、ＢＬＡＳＴのような配列比較アルゴリズムを用い、約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するか；（２）配列番号２のアミノ酸配列またはその免疫原性フラグメント、およびその保存的に改変された改変体を含む免疫原に対して惹起された抗体、例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体に結合するか；（３）配列番号１の配列、およびその保存的に改変された改変体に、高度および／または中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズするか；または（４）配列番号５−２２からなる群から選択されるプライマーセット、特に配列番号１８−２１からなる群から選択される少なくとも１つのプライマーをもつプライマーセットと同じ配列に、高度および／または中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズするプライマーにより増幅される。
【００６７】
用語「電位依存性」活性または「電位ゲーティング」は、個々のポリペプチドモノマーまたはサブユニットで構成されるカリウムチャネルの特徴をいう。一般に、電位依存性カリウムチャネルが開く可能性は、細胞が脱分極するにつれて増大する。電位依存性カリウムチャネルは、最初、カリウムの流出を可能にする。なぜなら、それらは、代表的な細胞におけるカリウムの平衡電位（ＥＫ）よりポジティブである膜電位で開いている可能性が大きいからである。ＥＫ、すなわちカリウムの平衡電位は、細胞膜の内側および外側で見出されるカリウムの相対濃度に依存し、そして代表的には、哺乳動物細胞について−６０〜−１００ｍＶの間である。ＥＫは、カリウムイオンの正味の流れがない膜電位である。なぜなら、カリウム流入を駆動する電気的電位（すなわち、電圧電位）が、カリウムを流出する濃度勾配（［Ｋ＋］電位）によって均衡しているからである。この値はまた、カリウムの「逆電位」または「ネルンスト」電位として知られる。いくつかの電位依存性カリウムチャネルは不活性化され、それは、より高い膜電位でカリウム流出を低減し得る。カリウムチャネルはまた、それらが、ＥＫに対してネガティブな膜電位で開いたままであるとき、特定の例では、カリウム流入を可能にし得る（例えば、Ａｄａｍｓ＆Ｎｏｎｎｅｒ、ｉｎ  Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ、４０−６０頁（Ｃｏｏｋ編、１９９０）を参照のこと）。電位ゲーティングの特徴は、チャネルを通る電流流れおよびイオンフラックスにおける変化を測定する種々の技法により測定され得る。これには、例えば、外部溶液の［Ｋ＋］を変えること、およびチャネル電流の活性化電位を測定することによる（例えば、米国特許第５，６７０，３３５号を参照のこと）、異なる条件下のパッチクランプ技法または電圧クランプを用いて電流を測定することによる、および異なる条件下の放射活性標識トレーサーまたは電圧感受性色素を用いてイオンフラックスを測定することによる、がある。
【００６８】
「大きいコンダクタンス」は、特定のカリウムチャネルのコンダクタンスをいう。ネイティブな細胞では、これらのチャネルのコンダクタンスは、ほぼ４０から５０ｐＳ〜２００ｐＳを超える範囲である（例えば、Ｌａｔｏｒｒｅら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏ．５１：３８５−３９９（１９８９１）を参照のこと）。例えば、Ｓｌｏ１およびＳｌｏ３チャネルは、この範囲の上限近傍のコンダクタンスをもち、その一方、Ｓｌｏ２チャネルは、下限に近いコンダクタンスをもつ。
【００６９】
「ホモマーチャネル」は、同一のαサブユニットから構成されるＳｌｏ２またはＳｌｏ４チャネルをいい、その一方、「ヘテロマーチャネル」は、少なくとも１つのＳｌｏ２またはＳｌｏ４αサブユニットと、Ｓｌｏ１またはＳｌｏ３のような別のＳｌｏファミリーからの少なくとも１つの他の型のαサブユニットとから構成されるＳｌｏチャネルをいう。ホモマーおよびヘテロマーチャネルの両方は、補助的なβサブユニットを含み得る。代表的には、このチャネルは、４つのαサブユニットから構成され、そしてこのチャネルはホモマーまたはヘテロマー性である。
【００７０】
「βサブユニット」は、αサブユニットから構成されるカリウムチャネルの補助的サブユニットであるポリペプチドモノマーである；しかし、βサブユニット単独ではチャネルを形成し得ない（例えば、米国特許第５，７７６，７３４号を参照のこと）。βサブユニットは、例えば、αサブユニットが細胞表面に到達するのを補助することによりチャネルの数を増加すること、活性化動力学を変えること、およびチャネルに結合する天然リガンドの感受性を変えることが知られている。βサブユニットは、ポア領域の外側に存在し、そしてポア領域を含むαサブユニットと会合し得る。それらはまた、このポア領域の外部出入口に寄与し得る。
【００７１】
Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４を含むチャネルに影響する化合物を試験するためのアッセイの文脈における、用語「機能的効果」は、間接的または直接的にチャネルの影響下にある任意のパラメーターの決定を含む。それは、例えば、リガンド結合のような直接的物理的効果、例えば、イオンフラックスおよび膜電位における変化のような間接的な化学的または表現型効果、および転写またはホルモン放出の増加または減少のような他の生理学的効果を含む。「機能的効果」は、インビトロ活性（例えば、単離されたタンパク質、細胞溶解物または細胞膜を用いる生化学的またはリガンド結合アッセイ）、インビボ活性（細胞および動物を基礎にしたアッセイ）、およびエキソビボ活性を含む。
【００７２】
「機能的効果を決定すること」は、Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４サブユニット、またはＳｌｏ２またはＳｌｏ４サブユニットを含むチャネルに対して直接的物理的効果（例えば、リガンド結合）、またはＳｌｏ２またはＳｌｏ４サブユニットを含むチャネルに対して間接的化学的または表現型効果（例えば、細胞または細胞膜中の増加または減少イオンフラックス）をもつ化合物の効果を調べることをいう。このイオンフラックスは、チャネルを通る任意のイオンおよびそのアナログ、例えば、カリウム、ルビジウムであり得る。好ましくは、この用語は、Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４を含むチャネルに対する化合物の機能的効果、例えば、放射活性同位元素、電流の大きさ、膜電位、電流流れ、コンダクタンス、転写、タンパク質結合、リン酸化、脱リン酸化、二次的メッセンジャー濃度（ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、Ｃａ２＋、ＩＰ３）、リガンド結合を含むイオンフラックスにおける変化、イオン濃度における変化、およびホルモンおよび神経伝達物質放出のようなその他の生理学的効果、ならびに電圧および電流における変化をいう。このような機能的効果は、当業者に公知の任意の手段、例えば、パッチクランピング、電圧−感受性色素、イオン感受性色素、総細胞電流、放射活性同位元素流出、誘導マーカーなどにより測定され得る。
【００７３】
Ｓｌｏ２ポリペプチドまたはＳｌｏ４ポリペプチドを含む電位依存性カリウムチャネルの「インヒビター」、「アクチベータ」または「モジュレータ」とは、Ｓｌｏ２チャネル機能またはＳｌｏ４チャネル機能についてのインビトロアッセイおよびインビボアッセイを使用して同定された阻害分子または活性化分子をいう。インヒビターは、チャネルを減少させるか、ブロックするか、妨げるか、活性化を遅らせるか、不活性化するか、脱感作するか、または下方制御する、化合物（例えば、アンタゴニスト）である。アクチベータは、チャネル活性を増加させるか、開くか、活性化するか、促進するか、活性化を増大するか、感作するかまたは上方制御する化合物（例えば、アゴニスト）である。インヒビターおよびアクチベータについてのこのようなアッセイは、例えば、細胞、細胞抽出物または細胞膜においてＳｌｏ２ポリペプチドまたはＳｌｏ４ポリペプチドを発現させ、次いでこのチャネルを通るイオンのフラックスを測定し、分極（すなわち、電位）の変化を決定する工程を包含する。あるいは、内因性Ｓｌｏ２チャネルまたはＳｌｏ４チャネルを発現する細胞が、このようなアッセイにおいて使用され得る。天然に存在するかもしくは組換えの単離されたＳｌｏ２含有チャネルもしくはＳｌｏ４含有チャネル、またはＳｌｏ２サブユニットもしくはＳｌｏ４サブユニット、あるいはこれらを含む細胞抽出物もまた、このようなモジュレータを同定するために、リガンド結合アッセイにおいて使用され得る。阻害の程度を試験するために、Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４のサブユニットまたはチャネルを含むサンプルまたはアッセイ物は、電位アクチベータまたはインヒビターで処理され、そしてこのインヒビターを含まないコントロールサンプルと比較される。コントロールサンプル（インヒビターで処理されていない）は、１００％に対する相対的なＳｌｏ２活性値またはＳｌｏ４活性値に割り当てられる。Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４を含むチャネルの阻害は、コントロールに対するＳｌｏ２活性値またはＳｌｏ４活性値が、約９０％、好ましくは５０％、より好ましくは２５〜０％である場合に、達成され得る。Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４を含むチャネルの活性化は、コントロールに対するＳｌｏ２活性値またはＳｌｏ４活性値が、１１０％、より好ましくは１５０％、最も好ましくは少なくとも２００〜５００％以上、または１０００％以上である場合に、達成され得る。
【００７４】
「生物学的に活性な」Ｓｌｏ２ポリペプチドまたはＳｌｏ４ポリペプチドとは、上記のように試験された電位依存特性および迅速な非活性化特性を有するカリウムチャネルを形成する能力を有する、Ｓｌｏ２ポリペプチドまたはＳｌｏ４ポリペプチドをいう。
【００７５】
用語「単離された」、「精製された」または「生物学的に純粋な」とは、物質がそのネイティブの状態で見出される場合に通常はこの物質に伴う成分を実質的にも本質的にも含まない物質をいう。純度および均質性は、代表的に、分析化学技術（例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィー）を使用して決定される。調製物中に存在する優性種であるタンパク質は、実質的に純粋である。特に、単離されたＳｌｏ２核酸またはＳｌｏ４核酸は、Ｓｌｏ２遺伝子またはＳｌｏ４遺伝子に隣接し、かつＳｌｏ２またはＳｌｏ４以外のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームから分離される。用語「精製された」とは、核酸またはタンパク質が、電気泳動ゲルにおいて本質的に１つのバンドを生じることを意味する。特に、この用語は、核酸またはタンパク質が、少なくとも８５％純粋、より好ましくは少なくとも９５％純粋、最も好ましくは少なくとも９９％純粋であることを意味する。単離または精製されたＳｌｏ２およびＳｌｏ４は、組換え体であっても天然に存在するものであってもよい。
【００７６】
用語「試験化合物」または「薬物候補」または「モジュレータ」または文法上の等価物は、本明細書中で使用される場合、リンパ球の活性化を直接または間接的に調節する能力について試験される、天然に存在するかまたは合成のいずれかの、任意の分子（例えば、タンパク質、オリゴペプチド（例えば、約５〜約２５アミノ酸長、好ましくは約１０〜２０アミノ酸長、または１２〜１８アミノ酸長、好ましくは１２、１５または１８アミノ酸長）、低有機分子、多糖、脂質（例えば、スフィンゴリピド）、脂肪酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドなど）を表す。この試験化合物は、十分な範囲の多様性を提供する、試験化合物のライブラリーの形態（例えば、コンビナトリアルライブラリーまたはランダムライブラリー）であり得る。試験化合物は、必要に応じて、融合パートナー（例えば、標的化化合物、レスキュー化合物、二量化化合物、安定化化合物、アドレス可能化合物、および他の機能的部分）に連結される。簡便には、有用な特性を有する新たな化学的実体は、いくらかの望ましい特性または活性（例えば、阻害活性）を有する試験化合物（「リード化合物」と称される）を同定し、このリード化合物の改変体を生成し、そしてこれらの改変化合物の特性および活性を評価することによって、作製される。しばしば、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）法が、このような分析のために用いられる。
【００７７】
「低有機分子」とは、天然に存在するかまたは合成のいずれかの、約５０ダルトンより大きくかつ約５０００ダルトン未満の分子量、好ましくは、約２０００ダルトン未満の分子量、好ましくは約１００ダルトンと約１０００ダルトンとの間の分子量、より好ましくは約２００ダルトンと約５００ダルトンとの間の分子量を有する、有機分子をいう。
【００７８】
用語「疼痛」とは、全てのカテゴリーの疼痛をいい、これには、刺激または神経反応の点から記載される疼痛（例えば、体性疼痛（有害刺激に対する正常な神経反応）および神経障害性疼痛（しばしば明確な有害インプットを伴わない、損傷または変更された感覚経路の異常な反応）；時間的に分類される疼痛（例えば、慢性の疼痛および急性の疼痛）；その重篤度の点から分類される疼痛（例えば、軽い、中程度または重篤）；および疾患状態または疾患症状の症状または結果である疼痛（例えば、炎症性疼痛、癌疼痛、ＡＩＤＳ疼痛、関節症、偏頭痛、三叉神経痛、心臓虚血および糖尿病性ニューロパシー）が挙げられる（例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｐｐ．９３−９８（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１２ｔｈ  ｅｄ．１９９１）；Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ．４２：１４８１−１４８５（１９９９）（各々が本明細書中でその全体が参考として援用される）を参照のこと）。
【００７９】
上記のように、「体性」疼痛とは、有害刺激（例えば、傷害または疾病（例えば、外傷、やけど、感染、炎症または疾患プロセス（例えば、癌）））に対する正常な神経反応をいい、皮膚疼痛（例えば、皮膚、筋肉または関節由来）および内臓疼痛（例えば、器官由来）の両方を含む。
【００８０】
上記のように、「神経障害性」疼痛とは、傷害から生じる疼痛または末梢および／もしくは中枢感覚経路の慢性的な変化をいい、ここでこの疼痛は、しばしば、明らかな有害インプットを伴わずに発生または存在する。
【００８１】
「核酸」とは、一本鎖形態または二本鎖形態のいずれかの、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそのポリマーをいう。この用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、そして参照ヌクレオチドと類似の様式で代謝される、既知のヌクレオチドアナログまたは改変された骨格残基もしくは結合を含む、合成核酸、天然に存在する核酸および天然に存在しない核酸を包含する。このようなアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、キラルなメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８２】
特に明記されない限り、特定の核酸配列はまた、それらの保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換）および相補配列、ならびに明確に示された配列を暗に包含する。詳細には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（または全ての）コドンの三番目の位置が、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を作製することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。用語、核酸は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドと交換可能に使用される。
【００８３】
特定の核酸配列はまた、「スプライス改変体」を暗に包含する。同様に、核酸によりコードされる特定のタンパク質は、この核酸のスプライス改変体によりコードされる任意のタンパク質を暗に包含する。「スプライス改変体」は、この名前が示すように、遺伝子の選択的スプライシングの産物である。転写の後、最初の核酸転写物は、異なる（変更された）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするように、スプライシングされ得る。スプライス改変体の産生のためのメカニズムは変化するが、エキソンの選択的スプライシングを含む。読過し転写により同じ核酸から誘導された代替のポリペプチドもまた、この定義に含まれる。スプライシング反応の任意の産物（組換え形態のスプライス産物を含む）は、この定義に含まれる。カリウムチャネルスプライス改変体の例は、Ｌｅｉｃｈｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（５２）：３５０９５−３５１０１（１９９８）で考察される。
【００８４】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを言及するために、本明細書中で交換可能に使用される。この用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学模倣物である、アミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーに用いられる。
【００８５】
用語「アミノ酸」とは、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と類似の様式で機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣物をいう。天然に存在するアミノ酸は、遺伝コードによりコードされるアミノ酸、ならびに後に改変されるアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメートおよびＯ−ホスホセリン）である。アミノ酸アナログとは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造（すなわち、水素に結合したα炭素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基）を有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）をいう。このようなアナログは、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と類似の様式で機能する化合物をいう。
【００８６】
アミノ酸は、本明細書中で、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される一般的に公知の三文字記号または一文字記号のいずれかで表され得る。同様に、ヌクレオチドは、それらの一般的に受け入れられている一文字コードにより表され得る。
【００８７】
「保存的に改変された改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に用いられる。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、またはその核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一の配列をいう。遺伝コードの縮重に起因して、多数の機能的に同一の核酸は、任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵの全ては、アミノ酸アラニンをコードする。従って、アラニンがコドンにより特定される全ての位置において、このコドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく記載される対応するコドンのいずれかに変更され得る。このような核酸バリエーションは、「サイレントなバリエーション」であり、これは保存的に改変されたバリエーションの一種である。ポリペプチドをコードする本明細書中の全ての核酸配列はまた、核酸の全ての可能なサイレントなバリエーションを表す。当業者は、核酸中の各コドン（通常はメチオニンのみのコドンであるＡＵＧ、および通常はトリプトファンのみのコドンであるＴＧＧを除く）は、機能的に同一の分子を生じる用に改変され得ることを認識する。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレントなバリエーションは、記載される各々の配列に暗に含まれる。
【００８８】
アミノ酸配列について、当業者は、核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の配列に対する個々の置換体、欠失体または付加体（これはコードされた配列中の単一のアミノ酸または少数のアミノ酸を変更、負荷または欠失する）が、この変更により化学的に類似のアミノ酸でのアミノ酸の置換が生じている「保存的に改変された改変体」であることを認識する。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は、当該分野で周知である。さらに、このような保存的に改変された改変体は、本発明の多型改変体、種間ホモログおよび対立遺伝子を排除しない。
【００８９】
以下の８グループは、各々、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）。
（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照のこと）。
【００９０】
高分子構造（例えば、ポリペプチド構造）は、種々のレベルの構成の点から記載され得る。この構成の一般的な考察については、例えば、Ａｌｂｅｒｔｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ（第３版、１９９４）、ならびにＣａｎｔｏｒおよびＳｃｈｉｍｍｅｌ、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｐａｒｔ  Ｉ：Ｔｈｅ  Ｃｏｍｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（１９８０）を参照のこと。「一次構造」とは、特定のペプチドのアミノ酸配列をいう。「二次構造」とは、ポリペプチド内の局所的に整列した三次元構造をいう。これらの構造は、ドメインとして一般的に知られている。ドメインは、ポリペプチドの緻密な単位を形成し、代表的には約１８〜３５０アミノ酸長であるポリペプチドの部分（例えば、膜貫通領域、孔ループドメインおよびＣ末端テールドメイン）である。代表的なドメインは、より少ない構成部分（例えば、βシートおよびαへリックスのストレッチ）の部分から構成される。「三次構造」とは、ポリペプチドモノマーの完全な三次元構造をいう。「四次構造」とは、独立した三次単位の非共有結合的な会合により形成される三次元構造をいう。異方性の用語はまた、エネルギー用語として公知である。
【００９１】
「標識」は、分光法的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段または化学的手段により検出可能な組成物である。有用な標識としては、例えば、３２Ｐ、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡで一般的に使用される酵素）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテン、および抗血清またはモノクローナル抗体が利用可能なタンパク質が挙げられる（例えば、配列番号２または４のポリペプチドは、例えば、ペプチドに放射性標識を組み込むことによって検出可能にされ、そしてこのペプチドと特異的に反応する抗体を検出するために使用される）。
【００９２】
本明細書中で使用される場合、「核酸プローブまたはオリゴヌクレオチド」は、１つ以上のタイプの化学結合を介して（通常は相補性塩基対形成または水素結合形成を介して）、標的核酸の相補配列に結合し得る核酸として定義される。本明細書中で使用される場合、プローブは、もとの塩基（すなわち、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴ）または改変された塩基（７−デアザグアノシン、イノシンなど）を含み得る。さらに、プローブ中の塩基は、これがハイブリダイゼーションを妨害しない限り、ホスホジエステル結合以外の結合により連結され得る。従って、例えば、プローブは、構成塩基がホスホジエステル結合ではないペプチド結合により連結されている、ペプチド核酸であり得る。このプローブは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存して、プローブ配列に対して完全な相補性を欠く標的配列に結合し得ることが、当業者に理解される。プローブは、好ましくは、同位体、発色団、蛍光団、色素原で直接標識されるか、または例えば、ストレプトアビジン複合体が後に結合し得るビオチンで間接的に標識される。プローブの有無についてアッセイすることによって、選択配列またはサブ配列の有無が検出され得る。
【００９３】
「標識核酸プローブまたはオリゴヌクレオチド」は、リンカーまたは化学結合を介して共有結合的に、またはイオン結合、ファンデルワールス結合、静電結合または水素結合を介して非共有結合的にのいずれかで、標識に結合された核酸プローブまたはオリゴヌクレオチドであり、その結果、このプローブの存在は、このプローブに結合した標識の存在を検出することによって検出され得る。
【００９４】
例えば、細胞または核酸、タンパク質、あるいはベクターに対する参照として使用される場合、用語「組換え体」は、この細胞、核酸、タンパク質、またはベクターが異種の核酸もしくはタンパク質の導入またはネイティブな核酸もしくはタンパク質の変更によって改変されていること、あるいはこの細胞がそのように改変された細胞由来であることを示す。よって、例えば、組換え体細胞は、細胞のネイティブな（非組換え体）形態内で見出されない遺伝子を発現するか、またはさもなくば、異常に発現されるか、低く発現されるか、もしくは全く発現されないネイティブな遺伝子を発現する。
【００９５】
「プロモーター」は、核酸の転写を指向する、核酸コントロール配列のアレイとして定義される。本明細書中で使用される場合、例えば、ポリメラーゼＩＩ型プロモーター、ＴＡＴＡエレメントの場合において、プロモーターは、転写開始部位のそばに必要な核酸配列を含む。プロモーターはまた、必要に応じて遠位のエンハンサーエレメントまたはリプレッサーエレメントを含み、これは、転写開始部位から数千塩基対ほど離れて位置され得る。「構成的」プロモーターは、ほとんどの環境条件および発生条件下で活性なプロモーターである。「誘導可能な」プロモーターは、環境的調節または発生的調節下で活性なプロモーターである。用語「作動可能に連結される（された）」は、核酸発現制御配列（例えば、プロモーター、または転写因子結合部位のアレイ）と第２の核酸配列との間の機能的な連結をいい、ここで、この発現制御配列は、第２の配列に対応する核酸の転写を指向する。
【００９６】
核酸の一部を参照して使用される場合、用語「異種」は、この核酸が、天然では互いに同一の関係において見出されない２つ以上のサブ配列を含むことを示す。例えば、核酸は、典型的には組換え的に生成され、新たな機能的核酸（例えば、ある供給源由来のプロモーターおよび別の供給源由来のコード領域）を作製するために、整列された無関係の遺伝子由来の２つ以上の配列を有する。同様に、異種タンパク質は、このタンパク質が、天然では互いに同一の関係において見出されない２つ以上のサブ配列を含むことを示す（例えば、融合タンパク質）。
【００９７】
「発現ベクター」は、宿主細胞中で特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントを有して、組み換え的または合成的に産生された核酸構築物である。この発現ベクターは、プラスミド、ウイルスまたは核酸フラグメントの一部であり得る。典型的には、発現ベクターは、プロモーターに作動可能に連結された、転写されるべき核酸を含む。
【００９８】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の観点において、用語「同一」または「同一」パーセントは、比較ウインドウ（すなわち、以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用して測定されるかもしくは手動の整列および可視的検査によって測定される場合の設計された領域）にわたる最大の一致について比較および整列される場合、同一である２つ以上の配列またはサブ配列、または同一であるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの特定のパーセントを有する（すなわち、配列番号２または４の特定の領域にわたって、６０％同一、好ましくは、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一）２つ以上の配列またはサブ配列をいう。次いで、このような配列を、「実質的に同一」という。この定義はまた、試験配列の補体をいう。好ましくは、同一性は、少なくとも約２５個のアミノ酸もしくはヌクレオチドの長さである領域にわたって、またはより好ましくは、５０〜１００個のアミノ酸もしくはヌクレオチドの長さである領域にわたって、存在する。
【００９９】
配列比較について、典型的には、１つの配列は、試験配列が比較される参照配列として働く。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列は、コンピューターに入力され、必要ならば、サブ配列座標が設計され、そして配列アルゴリズムプログラムパラメータが設計される。デフォルトプログラムパラメータが使用され得るか、または代替のパラメータが設計され得る。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列と比較して試験配列の同一性配列パーセントを計算する。Ｓｌｏ２核酸およびタンパク質ならびにＳｌｏ４核酸およびタンパク質に対する核酸およびタンパク質の配列比較のために、ＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムならびに以下で議論されるデフォルトパラメータが使用される。
【０１００】
本明細書中で使用される場合、「比較ウインドウ」は、２０〜６００、通常には約５０〜約２００、より通常には約１００〜約１５０からなる群より選択される連続する位置のいずれか１つの番号のセグメントに対する参照を含み、ここで、配列は、２つの配列が最適に整列される後に同数の連続する位置の参照配列に比較され得る。比較のための配列の整列の方法は、当該分野において周知である。比較のための配列の最適な整列は、例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性整列アルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の同様の方法にための検索、これらのアルゴリズムのコンピューター化した実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）、または手動の整列および可視的検査によって、実施され得る（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．１９９５  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を参照のこと）。
【０１０１】
配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するために適切なアルゴリズムの好ましい例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれＡｌｔｓｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９７７）およびＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載される。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０を本明細書中に記載されるパラメータとともに使用して、本発明の核酸およびタンパク質についての配列同一性パーセントを決定する。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を介して公的に利用可能である。このアルゴリズムは、クエリ配列中において長さＷの短いワードを同定することによって高スコアの配列対（ＨＳＰ）を最初に同定することを包含し、このワードは、データベース配列中の同一長のワードを用いて整列される場合に、一致するか、またはいくつかの陽性値閾値スコアＴを満足するかのいずれかである。Ｔは、近傍ワードスコア閾値としていわれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、上述）。これらの最初の近傍ワードヒットは、これらを含むより長いＨＳＰを見出すために検索を開始するためのシーズとして働く。ワードヒットは、累積整列スコアが増加され得る限り、各配列にそって両方向に伸長される。累積スコアは、核酸配列について、パラメータＭ（一致する残基の対に対する報酬スコア；常に＞０）およびＮ（一致する残基の対に対するペナルティースコア；常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列について、スコア付けマトリクスを使用して、蓄積スコアを計算する。各方向におけるワードヒットの伸長は、以下の場合に中止される：蓄積整列スコア付けが最大達成値からの量Ｘまで低下する場合；１以上のネガティブスコア付け残基整列の蓄積に起因して、蓄積スコアがゼロ以下になる場合；または、いずれかの配列の末端に達する場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、整列の感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、ワード長（Ｗ）が１１、期待値（Ｅ）が１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４をデフォルトとして使用し、そして両鎖の比較する。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、ワード長が３、および期待値（Ｅ）が１０、そしてＢＬＯＳＵＭ６２スコア付けマトリクス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５（１９８９）を参照のこと）整列（Ｂ）が５０、期待値（Ｅ）が１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４をデフォルトとして使用し、そして両鎖を比較する。
【０１０２】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列の間の類似性の統計学的分析を実施する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７（１９９３）を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの測定は、最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列の間の一致および２つのアミノ酸配列の間の一致が偶然生じることによる確率の指標を提供する。例えば、試験核酸の参照核酸に対する比較における最小和確率が約０．２未満、より好ましくは、約０．０１未満、最も好ましくは、約０．００１未満である場合、核酸は、参照配列に対して類似するとみなされる。
【０１０３】
２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であることの指標は、以下に示されるように、第１位の核酸によってコードされるポリペプチドが第２の核酸によってコードされるポリペプチドに対して惹起される抗体と免疫学的に交差反応することである。よって、例えば、２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合、ポリペプチドは、典型的には、第２のポリペプチドに実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、以下に記載されるように、ストリンジェントな条件下で２つの分子またはこれらの相補体が互いにハイブリダイズすることである。２つの核酸配列が実質的に同一であることのなお別の指標は、同一のプライマーがこの配列を増幅するために使用されることである。
【０１０４】
句「選択的に（または特異的に）ハイブリダイズする」は、その配列が複合体混合物（例えば、総細胞性ＤＮＡもしくはＲＮＡまたはライブラリーＤＮＡもしくはＲＮＡ）中に存在する場合、分子が、ストリンジェントなハイブリダイズ条件下で特定のヌクレオチド配列にのみ結合、二重化（ｄｕｐｌｅｘ）またはハイブリダイズすることをいう。
【０１０５】
句「ストリンジェントなハイブリダイズ条件」は、プローブが、典型的には、核酸の複合体混合物においてその標的サブ配列にハイブリダイズするが他の配列には結合しない条件をいう。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、そして異なる環境において異なる。配列は、長ければ長いほど、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ｐｒｏｂｅｓ，”Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓｓａｙｓ”（１９９３）に見出される。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度ｐＨでの特定の配列についての熱融解点（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低く選択される。このＴｍは、標的に対して相補的であるプローブの５０％が、平衡にて（標的配列が過度に存在する場合、Ｔｍにて、プローブの５０％が平衡で占められる）標的配列に（規定されたイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度の下で）ハイブリダイズする温度である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような脱安定化剤の添加を用いて達成され得る。選択的または特異的なハイブリダイゼーションについて、ポジティブなシグナルは、バックグラウンドの少なくとも２倍、好ましくは、バックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍である。例示的ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、以下であり得る：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳを４２℃でインキュベーションするか、または、５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳを６５℃でインキュベーションして、６５℃での０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で洗浄する。
【０１０６】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、これらがコードするポリペプチドが実質的に同一である場合、なお実質的に同一である。このことは、例えば、核酸のコピーが、遺伝子コードによって可能にされる最大コドン縮重を用いて作製される場合に、生じる。このような場合において、核酸は、典型的には、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。例示的な「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、３７℃での４０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝液中でのハイブリダイゼーション、および４５℃での１×ＳＳＣ中での洗浄を含む。ポジティブなハイブリダイゼーションは、バックグラウンドの少なくとも２倍である。当業者は、代替的なハイブリダイゼーション条件および洗浄条件が同様のストリンジェンシーの条件を提供するために利用され得ることを、容易に認識する。ハイブリダイゼーションパラメータを決定するためのさらなる指針は、多くの参考文献（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．）に提供される。
【０１０７】
ＰＣＲについて、約３６℃の温度は、低ストリンジェンシー増幅について典型的であるが、アニーリング温度は、プライマーの長さに依存して約３２℃と４８℃との間を変化し得る。高ストリンジェンシーＰＣＲ増幅について、約６２℃の温度が典型的であるが、高ストリンジェンシーアニーリング温度は、プライマーの長さおよび特異性に依存して、約５０℃〜約６５℃にわたり得る。高ストリンジェンシー増幅および低ストリンジェンシー増幅の両方について典型的なサイクル条件は、９０℃〜９５℃で３０秒間〜２分間の変性相、３０秒間〜２分間続けるアニーリング相、および約７２℃で１〜２分間の伸長相を含む。低ストリンジェンシー増幅反応および高ストリンジェンシー増幅反応についてのプロトコルおよび指針は、例えば、Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．に提供される。
【０１０８】
「抗体」は、抗原を特異的に結合および認識する、免疫グロブリン遺伝子またはそのフラグメント由来のフレームワーク領域を含むポリペプチドをいう。認識される免疫グロブリン遺伝子は、κ、λ、α、γ、δ、εおよびμの定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖は、κまたはλのいずれかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δまたはεとして分類され、これらは、順番に、それぞれ免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを規定する。
【０１０９】
例示的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、テトラマーを含む。各テトラマーは、ポリペプチド鎖の同一な２つの対から構成され、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端は、抗原認識について主要な原因である約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域を規定する。用語可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）は、それぞれこれらの軽鎖および重鎖をいう。
【０１１０】
抗体は、例えば、インタクトな免疫グロブリン、または種々のペプチダーゼでの消化によって生成される十分に特徴付けられた多くのフラグメントとして、存在する。よって、例えば、ペプシンは、ジスルフィド結合のある抗体をヒンジ領域で消化して、ＦａｂのダイマーであるＦ（ａｂ）’２（これ自体は、ジスルフィド結合によってＶＨ−ＣＨ１に連結された軽鎖である）を生成する。Ｆ（ａｂ）’２は、穏やかな条件下で還元されてヒンジ領域中のジスルフィド結合が崩壊され得、これにより、Ｆ（ａｂ）’２ダイマーからＦａｂ’モノマーに変換される。Ｆａｂ’モノマーは、ヒンジ領域の一部を有する必須のＦａｂである（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ  ｅｄ．，３ｄ  ｅｄ．１９９３）を参照のこと）。種々の抗体フラグメントがインタクトな抗体の消化の観点で規定されるが、当業者は、このようなフラグメントが、化学的にか、または組換えＤＮＡ方法論を使用するかのいずれかによって、デノボで合成され得ることを理解する。よって、本明細書中で使用される場合、用語抗体はまた、抗体全体の改変によって生成される抗体フラグメント、または組換えＤＮＡ方法論を使用してデノボで合成される抗体フラグメント（例えば、単鎖Ｆｖ）もしくはファージディスプレイライブラリー（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０）を参照のこと）を使用して同定された抗体フラグメントを含む。
【０１１１】
モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の調製について、任意の公知の技術（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５）；Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２（１９８３）；Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５）ｐｐ．７７−９６を参照のこと）が使用され得る。単鎖抗体の生成についての技術（米国特許第４，９４６，７７８号）を適用して、本発明のポリペプチドに対する抗体を生成し得る。また、トランスジェニックマウス、または他の生物（例えば、他の哺乳動物）を使用して、ヒト化抗体を発現させ得る。あるいは、ファージディスプレイ技術を使用して、選択された抗原に特異的に結合する抗体および異種性Ｆａｂフラグメントを同定し得る。（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）を参照のこと）。
【０１１２】
「抗Ｓｌｏ２」抗体または「抗Ｓｌｏ４」抗体は、Ｓｌｏ２もしくはＳｌｏ４の遺伝子、ｃＤＮＡ、またはそのサブ配列によってコードされるポリペプチドと特異的に結合する抗体または抗体フラグメントである。
【０１１３】
「キメラ抗体」は、（ａ）抗原の結合部位（可変領域）が、異なるクラスまたは改変されたクラスの定常領域、エフェクター機能／エフェクター種、またはキメラ抗体に新しい特性を与える全体として異なった分子（例えば、酵素、トキシン、ホルモン、増殖因子、薬物など）に連結されるように、定常領域またはその一部が、変更、置換または交換された、抗体分子；あるいは（ｂ）可変領域、またはその一部が、異なるか、または変更された抗原特異性を有する可変領域で、変更、置換または交換された、抗体分子である。
【０１１４】
「免疫アッセイ」との用語は、抗原と特異的に結合する抗体を使用するアッセイである。この免疫アッセイは、抗原を単離、標的、および／または定量するために、特定の抗体の特異的結合特性を使用することによって特徴付けられる。
【０１１５】
抗体に「特異的に（または選択的に）結合する」または「〜と特異的に（または選択的に）免疫反応性」との句は、タンパク質またはペプチドについて言及する場合、タンパク質および他の生物製剤の異種集団中における、タンパク質の存在の決定因子である結合反応性をいう。従って、示された免疫アッセイ条件下で、特定の抗体は、バックグラウンドの少なくとも２倍で特定のタンパク質に結合し、そしてサンプル中に存在する他のタンパク質に有意な量で実質的に結合しない。このような条件における抗体への特異的な結合は、特定のタンパク質に対する特異性について選択される抗体を必要とし得る。例えば、抗体（例えば、配列番号２または配列番号４に示されるようなＳｌｏ２またはＳｌｏ４に対して惹起される、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、またはそれらのスプライス改変体もしくは一部）は、Ｓｌｏ２ファミリーメンバーもしくはＳｌｏ４ファミリーメンバーと特異的に免疫反応性であるか、または他のＳｌｏタンパク質と特異的に免疫反応性でない、これらのポリクローナル抗体のみを得るように選択され得る。この選択は、他のＳｌｏファミリーメンバーのような分子と交差反応する抗体を、差し引くことによって達成され得る。さらに、ヒトＳｌｏ２多型またはヒトＳｌｏ４多型の改変体、対立遺伝子、および保存的に改変された改変体に対して惹起される、抗体（例えば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体）は、他のＳｌｏ２オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）またはＳｌｏ４オルソログ（例えば、ラットＳｌｏ２（ラットＳＬＡＣＫ））ではなく、ヒトＳｌｏ２またはヒトＳｌｏ４を認識するこれらの抗体のみを得るように選択され得る。種々の免疫アッセイのフォーマットを使用して、特定のタンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択し得る。例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイを規定どおりに使用して、タンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択する（特異的な免疫反応性を決定するために使用され得る、免疫アッセイフォーマットおよび免疫アッセイ条件の説明について、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８８）を参照のこと）。代表的に、特異的な反応または選択的な反応は、バックグラウンドシグナルまたはバックグラウンドノイズの少なくとも２倍であり、そしてより代表的に、バックグランドよりも１０〜１００倍高い。
【０１１６】
「〜と選択的に結合する」との句は、上で規定されるように、互いに「選択的にハイブリダイズする」核酸の能力、または上で規定されるように、タンパク質に選択的に（または特異的に）結合する抗体の能力をいう。
【０１１７】
「宿主細胞」は、発現ベクターを含み、そしてその発現ベクターの複製または発現を支持する、細胞を意味する。宿主細胞は、原核生物細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）または真核生物細胞（例えば、酵母、昆虫、両生類、または哺乳動物の細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａなど））（例えば、培養細胞、移植片、およびインビボの細胞）であり得る。
【０１１８】
本明細書中で使用される場合、「生物学的サンプル」は、Ｓｌｏ２ポリペプチドもしくはＳｌｏ４ポリペプチドまたはＳｌｏ２タンパク質もしくはＳｌｏ４タンパク質をコードする核酸を含む、生物学的組織または生物学的流体のサンプルである。このようなサンプルとしては、ヒトから単離された組織が挙げられるが、これに限定されない。生物学的なサンプルとしてはまた、組織の切片（例えば、組織学的目的のために得られた凍結切片）が挙げられる。生物学的サンプルは、代表的に、以下から得られる：好ましくは、真菌、植物、昆虫、原生動物、鳥類、魚類、爬虫類のような真核生物、そして好ましくは、ラット、マウス、ウシ、イヌ、モルモットまたはウサギのような哺乳動物、そして最も好ましくは、チンパンジーまたはヒトのような霊長類。
【０１１９】
（ＩＩＩ．ＳＬＯ２ポリペプチドまたはＳＬＯ４ポリペプチドをコードする遺伝子の単離）
（Ａ．一般的な組換えＤＮＡ法）
本発明は、組換え遺伝子学の分野の慣用的な技術に依存する。本発明における一般的な使用方法を開示する基本的な教科書としては、以下が挙げられる：Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９０）；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９４）。
【０１２０】
核酸について、大きさは、キロベース（Ｋｂ）または塩基対（ｂｐ）のいずれかで与えられる。核酸の大きさは、アガロースもしくはアクリルアミドゲル電気泳動から、配列決定された核酸から、または公開されたＤＮＡ配列から推定すある。タンパク質について、大きさは、キロダルトン（ｋＤ）またはアミン酸残基の数で与えられる。タンパク質の大きさは、ゲル電気泳動から、配列決定されたタンパク質から、誘導されたアミノ酸配列から、または公開されたタンパク質配列から推定される。
【０１２１】
市販されていないオリゴヌクレオチドは、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ＆  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｓ．２２：１８５９〜１８６２（１９８１）によって最初に記載された、固相ホスホラミダイトトリエステル方法に従って、Ｖａｎ  Ｄｅｖａｎｔｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：６１５９〜６１６８（１９８４）に記載されるような自動化合成器を使用して、化学的に合成され得る。Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｒｅａｎｉｅｒ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．２５５：１３７〜１４９（１９８３）に記載されるように、ネイティブアクリルアミドゲル電気泳動または陰イオン交換ＨＰＬＣのいずれかによって、オリゴヌクレオチドが、精製される。
【０１２２】
クローン化した遺伝子および合成オリゴヌクレオチドの配列は、例えば、Ｗａｌｌａｃｅら、Ｇｅｎｅ  １６：２１〜２６（１９８１）の二重鎖テンプレートを配列決定するための連鎖終止方法を使用して、クローニング後に確認され得る。
【０１２３】
（Ｂ．Ｓｌｏ２ポリペプチドまたはＳｌｏ４ポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列の単離のためのクローニング方法）
一般に、Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４をコードする核酸配列および関連する核酸配列ホモログを、ｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムＤＮＡライブラリーからクローニングするか、またはオリゴヌクレオチドプライマーを用いる増幅技術を使用して単離する。例えば、Ｓｌｏ２配列またはＳｌｏ４配列は、代表的に、核酸プローブまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズさせることによって、ヒト核酸（ゲノムまたはｃＤＮＡ）ライブラリーから単離され、この配列は、配列番号１または配列番号３から誘導され得る。Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４のＲＮＡおよびｃＤＮＡが単離され得る適切な組織は、例えば、全脳のような神経系組織、またはＳｌｏ２またはＳｌｏ４が発現される任意の他の組織である（例えば、図４および７を参照のこと）。
【０１２４】
プライマーを使用する増幅技術をまた使用して、Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４を増幅および単離し得る。以下のプライマーもまた使用して、ヒトＳｌｏ２の配列を増幅し得る。
【０１２５】
【化５】
2005507633.tif 000004
以下のプライマーを使用して、Ｓｌｏ４を増幅し得る。
【０１２６】
【化６】
2005507633.tif 000005
これらのプライマーを使用して、例えば、全長配列または１〜数百のヌクレオチドのプローブのいずれかを増幅し得、次いで、これらを使用して、全長Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４についてライブラリーをスクリーニングする。
【０１２７】
Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４ファミリーメンバーをコードする核酸はまた、プローブとして抗体を使用して発現ライブラリーから単離され得る。このようなポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、配列番号２または４の配列、またはその免疫原性部分（例えば、Ｓｌｏ２のアミノ酸３３６〜１２３５およびＳｌｏ４のアミノ酸３２３〜１１３５に位置する、Ｃ末端テイル領域）を使用して惹起され得る。
【０１２８】
Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４の保存領域に対して実質的に同一である、Ｓｌｏ２およびＳｌｏ４の多型改変体、オルソログ、および対立遺伝子は、ライブラリーをスクリーンングすることによって、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４の核酸プローブおよびオリゴヌクレオチドを使用して単離され得る。あるいは、発現ライブラリーを使用して、ヒトＳｌｏ２もしくはヒトＳｌｏ４またはそれらの免疫原性部分（例えば、ヒトＳｌｏ２またはＳｌｏ４のテイル（Ｃ末端）領域）に対して作製された抗血清または精製された抗体を免疫学的に用いて（これらはまた、Ｓｌｏ２ホモログまたはＳｌｏ４ホモログを認識し、そして選択的に結合する）、発現されたホモログを検出することによって、Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４の多型改変体、オルソログ、および対立遺伝子をクローニングし得る。
【０１２９】
ｃＤＮＡライブラリーを作製するために、Ｓｌｏ２  ｍＲＮＡまたはＳｌｏ４  ｍＲＮＡが豊富な供給源（例えば、全脳）を選択するべきである。次いで、ｍＲＮＡを、逆転写酵素を使用してｃＤＮＡにし、組換えベクターにライゲーションし、そして増殖、スクリーニングおよびクローニングのために組換え宿主にトランスフェクトした。ｃＤＮＡライブラリーを作製およびスクリーニングするための方法は、周知である（例えば、Ｇｕｂｌｅｒ  ＆  Ｈｏｆｆｍａｎ、Ｇｅｎｅ  ２５：２６３〜２６９（１９８３）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；Ａｕｓｕｂｅｌら、前出を参照のこと）。
【０１３０】
ゲノムライブラリーのために、ＤＮＡを、組織から抽出し、そして機械により剪断するかまたは酵素により消化するかのいずれかにより、約１２〜２０ｋｂのフラグメントを得る。次いで、このフラグメントを、勾配遠心法により、所望でない大きさから分離し、そしてバクテリオファージλベクター中に構築した。これらのベクターおよびファージは、インビトロでパッケージングされる。組換えファージは、Ｂｅｎｔｏｎ  ＆  Ｄａｖｉｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９６：１８０〜１８２（１９７７）に記載されるようなプラークハイブリダイゼーションによって分析される。コロニーハイブリダイゼーションが、Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，７２：３９６１〜３９６５（１９７５）において、一般的に記載されるように実施される。
【０１３１】
Ｓｌｏ２核酸またはＳｌｏ４核酸およびそれらのオルソログ、対立遺伝子、変異体、多型改変体、ならびに保存的に改変された改変体を単離する別の方法は、合成オリゴヌクレオチドプライマーの使用とＲＮＡテンプレートまたはＤＮＡテンプレートの増幅とを組み合わせる（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編、１９９０）を参照のこと）。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）のような方法を使用して、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ゲノムライブラリー、またはｃＤＮＡライブラリーから直接、ヒトＳｌｏ２またはヒトＳｌｏ４の核酸配列を増幅し得る。縮重オリゴヌクレオチドを消化して、本明細書中で提供される配列を使用して、Ｓｌｏ２ホモログまたはＳｌｏ４ホモログを増幅し得る。制限エンドヌクレアーゼ部位は、このプライマー中に取り込まれ得る。ポリメラーゼ連鎖反応またはインビトロでのその他の増幅方法はまた、例えば、発現されるタンパク質をコードする核酸配列をクローニングするため、生理学的サンプル中でのＳｌｏ２またはＳｌｏ４をコードするｍＲＮＡの存在を検出するためのプローブとして使用する核酸を作製するため、核酸を配列決定するため、または他の目的のために有用であり得る。ＰＣＲ反応によって増幅される遺伝子は、アガロースゲルから精製され、そして適切なベクターにクローニングされ得る。
【０１３２】
Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４の遺伝子発現はまた、例えば、以下の当該分野で公知の技術によって分析され得る：ｍＲＮＡの逆転写および増幅、総ＲＮＡまたはポリＡ＋ＲＮＡの単離、ノザンブロッティング、ドットブロッティング、インサイチュハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅ保護、高密度ポリヌクレオチドアレイ技術など。
【０１３３】
合成オリゴヌクレオチドを使用して、プローブとしての使用またはタンパク質の発現のために、組換えＳｌｏ２遺伝子またはＳｌｏ４遺伝子を構築し得る。この方法は、遺伝子のセンス鎖および非センス鎖の両方を示す、一連の重複オリゴヌクレオチド（通常、４０〜１２０ｂｐの長さ）を使用して実施される。次いで、これらのＤＮＡフラグメントをアニーリングし、ライゲーションし、そしてクローニングする。あるいは、増幅技術により、正確なプライマーを使用して、Ｓｌｏ２遺伝子またはＳｌｏ４遺伝子の特定の部分配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）を増幅し得る。次いで、この特定の部分配列を、発現ベクターにライゲーションする。
【０１３４】
Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４をコードする核酸は、代表的に、複製および／または発現のために原核生物細胞または真核生物細胞に形質転換する前に、中間ベクター中にクローニングされる。これらの中間ベクターは、代表的に、原核生物ベクター（例えば、プラスミド）、またはシャトルベクターである。
【０１３５】
（Ｃ．原核生物および真核生物における発現）
クローン化された遺伝子（例えば、Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４をコードするこれらのｃＤＮＡ）の高レベルの発現を得るために、本発明者は、代表的に、転写を指向する強力なプロモーター、転写／翻訳のターミネーター、およびタンパク質をコードする核酸のための場合、翻訳開始のためのリボソーム結合部位を含む、発現ベクターに、Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４をサブクローニングする。適切な細菌のプロモーターは、当該分野で周知であり、そして例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、およびＡｕｓｕｂｅｌら（前出）に記載されている。Ｓｌｏ２タンパク質またはＳｌｏ４タンパク質を発現するための細菌の発現系は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ（Ｐａｌｖａら、Ｇｅｎｅ  ２２：２２９〜２３５（１９８３）；Ｍｏｓｂａｃｈら、Ｎａｔｕｒｅ  ３０２：５４３〜５４５（１９８３））において利用可能である。このような発現系のためのキットは、市販されている。哺乳動物の細胞、酵母、および昆虫の細胞に関する、真核生物発現系は、当該分野で周知であり、そしてまた市販されている。
【０１３６】
異種核酸の発現を指向するために使用されるプロモーターの選択は、特定の用途に依存する。好ましくは、このプロモーターが、天然の設定における転写開始部位に由来する場合、このプロモーターは、この異種転写開始部位からほぼ同一の距離に配置される。しかし、当該分野で公知であるように、この距離にあるいくつかのバリエーションは、プロモーター機能を失うことなく適用される。
【０１３７】
このプロモーターに加えて、この発現ベクターは、代表的に、宿主細胞中で、Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４をコードする核酸の発現のために必要とされるさらなるエレメントを全て含む、転写ユニットまたは発現カセットを含む。従って、代表的な発現カセットは、Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４およびこの転写物の有効なポリアデニル化に必要とされるシグナルをコードする核酸配列に作動可能に連結されるプロモーター、リボソーム結合部位、および翻訳終結を含む。このカセットのさらなるエレメントは、エンハンサーを含み得、そしてゲノムＤＮＡが構造遺伝子として使用される場合、機能的なスプライシングのドナー部位およびアクセプター部位を有するイントロンを含み得る。
【０１３８】
プロモーター配列に加えて、この発現カセットはまた、有効な終結のために提供される、この構造遺伝子の下流にある転写終結領域も含まなければならない。この終結領域は、プロモーター配列として同一の遺伝子から得られても、または異なる遺伝子から得られてもよい。
【０１３９】
細胞に遺伝情報を輸送するために使用される特定の発現ベクターは、特に重要ではない。真核生物細胞または原核生物細胞における発現のために使用される任意の従来のベクターが、使用され得る。標準的な細菌発現ベクターとしては、プラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２に基づくプラスミド、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄ）、および融合発現系（例えば、ＭＢＰ、ＧＳＴ、およびＬａｃＺ）が挙げられる。エピトープタグもまた、組換えタンパク質に添加されて、好都合な単離方法を提供し得る（例えば、ｃ−ｍｙｃ）。
【０１４０】
真核生物ウイルス由来の調節エレメントを含む発現ベクターは、代表的に、真核生物発現ベクター（例えば、ＳＶ４０ベクター、パピローマウイルスベクター、およびエプスタイン−バーウイルス由来のベクター）中で使用される。他の例示的な真核生物ベクターとしては、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、ならびにＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腺癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核生物細胞中での発現に対して有効性が示された他のプロモーターの指向下にてタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターが挙げられる。
【０１４１】
真核生物ベクターからのタンパク質発現はまた、誘導性プロモーターを使用して調節され得る。誘導性プロモーター内において、発現レベルが、誘導剤に対する応答エレメントのプロモーターへの組込みによって、誘導剤（例えば、テトラサイクリンまたはエクジソン）の濃度に対して滴定される。一般的に、高いレベルの発現は、誘導剤の存在下でのみ誘導性プロモーターから得られる；基底の発現レベルは最小である。誘導性発現ベクターは、しばしば、目的タンパク質の発現が真核生物細胞に対して有害である場合、選択される。
【０１４２】
いくつかの発現系は、遺伝子増幅を提供するマーカー（例えば、チミジンキナーゼおよびジヒドロ葉酸還元酵素）を有する。あるいは、遺伝子増幅を含まない高収集率の発現系（例えば、昆虫細胞におけるバキュロウイルスベクター）もまた、ポリヘドリンプロモーターまたは他の強力なバキュロウイルスプロモーターの指向下で、Ｓｌｏ２コード配列またはＳｌｏ４コード配列に適切である。
【０１４３】
代表的に発現ベクター中に含まれるエレメントとしてはまた、Ｅ．ｃｏｌｉ中で機能するレプリコン、組換えプラスミドを保有する細菌の選択を可能にするために抗生物質耐性をコードする遺伝子、および真核生物配列の挿入を可能にするプラスミドの非必須領域中の特有の制限部位が挙げられる。選択される特定の抗生物質耐性遺伝子は重要ではなく、当該分野で公知の任意の多くの耐性遺伝子が適切である。原核生物配列は、好ましくは、それらが必要な場合に真核生物細胞中でＤＮＡの複製を妨害しないように、選択される。
【０１４４】
標準的なトランスフェクト方法が、大量のＳｌｏ２タンパク質またはＳｌｏ４タンパク質を発現する細菌細胞株、哺乳動物細胞株、酵母細胞株または昆虫細胞株を生成するために使用され、これらのタンパク質はその後、標準的な技術を使用して精製される（例えば、Ｃｏｌｌｅｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７６１９−１７６２２（１９８９）；Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１８２（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ編，１９９０）を参照のこと）。真核生物細胞および原核生物細胞の形質転換が、標準的な技術に従って実施される（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｂａｃｔ．１３２：３４９−３５１（１９７７）；Ｃｌａｒｋ−Ｃｕｒｔｉｓｓ  ＆  Ｃｕｒｔｉｓｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １０１：３４７−３６２（Ｗｕら編，１９８３）を参照のこと）。
【０１４５】
外来ヌクレオチド配列を宿主細胞に導入するための周知の手順のうちのいずれかが使用され得る。これらとしては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）、リポソーム、マイクロインジェクション、プラズマベクター、ウイルスベクター、およびクローン化されたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、もしくは他の外来遺伝子材料を宿主細胞に導入するための他の周知の方法のいずれかの使用が挙げられる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと）。使用される特定の遺伝子操作手順がＳｌｏ２またはＳｌｏ４を発現し得る宿主細胞に少なくとも１つの遺伝子を好首尾に導入し得ることのみが、必要である。
【０１４６】
発現ベクターが細胞に導入された後、トランスフェクトされた細胞は、Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４の発現に有利な条件下で培養され、Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４は、以下に同定される標準的な技術を使用して培養物から回収される。
【０１４７】
（ＩＶ．Ｓｌｏ２ポリペプチドまたはＳｌｏ４ポリペプチドの精製）
天然に存在するＳｌｏ２もしくはＳｌｏ４または組換えＳｌｏ２もしくはＳｌｏ４のいずれかが、機能アッセイにおける使用のために精製され得る。天然に存在するＳｌｏ２もしくはＳｌｏ４のモノマーが、例えば、ヒト組織（例えば、脳全体または大脳皮質）およびＳｌｏ２ホモログもしくはＳｌｏ４ホモログの任意の他の供給源から、精製され得る。組換えＳｌｏ２もしくは組換えＳｌｏ４のモノマーが、任意の適切な発現系から精製され得る。
【０１４８】
Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４のモノマーは、標準的な技術（硫酸アンモニウムのような基質を用いた選択的沈降；カラムクロマトグラフィー、免疫精製方法などが挙げられる）によって、実質的に純粋になるまで精製され得る（例えば、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  （１９８２）；米国特許第４，６７３，６４１号；Ａｕｓｕｂｅｌら，前出；およびＳａｍｂｒｏｏｋら，前出を参照のこと）。
【０１４９】
組換えＳｌｏ２または組換えＳｌｏ４のモノマーが精製される場合、多数の手順が使用され得る。例えば、確立された分子接着特性を有するタンパク質は、Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４のモノマーに可逆的に融合し得る。適切なリガンドを用いて、Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４のモノマーは、精製カラムに選択的に吸着され得、次いで、相対的に純粋な形態でカラムから遊離される。次いで、この融合タンパク質は、酵素活性によって取り外される。最終的に、Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４のモノマーが、免疫アフィニティーカラムを用いて精製され得る。
【０１５０】
（Ａ．組換え細菌からのＳｌｏ２モノマーまたはＳｌｏ４モノマーの精製）
組換えタンパク質は、代表的にプロモーター誘導の後に、形質転換された細菌中で大量に発現されるが；発現は構成的であり得る。ＩＰＴＧでのプロモーター誘導は、誘導性プロモーター系の１つの例である。細菌を、当該分野で標準的な手順に従って増殖させる。新しい細菌細胞または凍結細菌細胞を、タンパク質の単離のために使用する。
【０１５１】
細菌中で発現されるタンパク質は、不溶性の凝集体（「封入体」）を形成し得る。いくつかのプロトコルが、Ｓｌｏ２モノマーまたはＳｌｏ４モノマーの封入体の精製に適切である。例えば、封入体の精製は、代表的に、細菌細胞の破壊による（例えば、５０ｍＭ  ＴＲＩＳ／ＨＣＬ（ｐＨ  ７．５）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  ＡＴＰ、および１ｍＭ  ＰＭＳＦの緩衝液中でのインキュベーションによる）、封入体の抽出、分離および／または精製を含む。細菌懸濁物は、Ｆｒｅｎｃｈ  Ｐｒｅｓｓを介した２〜３回の通過を使用して溶解され得るか、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（Ｂｒｉｎｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いてホモジナイズされ得るか、または氷上で超音波処理され得る。細菌を溶解する代替の方法が、当業者に明らかである（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；Ａｕｓｕｂｅｌら、前出）。
【０１５２】
必要である場合、封入体が可溶化され、そして溶解された細胞懸濁物は、代表的に遠心分離されて、所望されない不溶性物体を除去する。封入体で形成されるタンパク質は、適合性の緩衝液を用いた希釈または透析によって再生され得る。適切な溶媒としては、尿素（約４Ｍ〜約８Ｍ）、ホルムアミド（容量／容量基準で、少なくとも約８０％）、および塩酸グアニジン（約４Ｍ〜約８Ｍ）が挙げられるが、これらに限定されない。凝集形成タンパク質を可溶化し得るいくつかの溶媒（例えば、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、７０％  ギ酸）は、免疫原性および／または活性の欠失を伴なう、タンパク質の不可逆的な変性の可能性に起因して、この手順における使用に適切ではない。塩酸グアニジンおよび類似の薬剤が変性剤であるが、その変性は不可逆性ではなく、そしてこれらの変性剤の除去（例えば、透析による）または希釈の際に、再生が生じ得、免疫学的に活性なタンパク質および／または生物学的に活性なタンパク質の再形成を可能にする。他の適切な緩衝液が、当業者に公知である。ヒトＳｌｏモノマーは、標準的な分離技術によって（例えば、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース樹脂を用いて）、他の細菌タンパク質から分離される。
【０１５３】
あるいは、細菌ペリプラズムからＳｌｏ２モノマーまたはＳｌｏ４モノマーを精製することが可能である。細菌の溶解後、Ｓｌｏ２モノマーまたはＳｌｏ４モノマーが細菌のペリプラズムに輸送され、細菌のペリプラズム画分が、当業者に公知の他の方法に加えて、冷却浸透圧衝撃によって単離され得る。ペリプラズムから組換えタンパク質を単離するために、細菌細胞は遠心分離されて、ペレットを形成する。このペレットは、２０％  スクロースを含む緩衝液に再懸濁される。細胞を溶解するために、細菌は遠心分離され、そのペレットは、氷冷５ｍＭ  ＭｇＳＯ４中に再懸濁され、そして約１０分間氷浴中で維持される。細胞懸濁液は遠心分離され、そして上清がデカントされ、そして保存される。上清に存在する組換えタンパク質は、当業者に周知の標準的な分離技術によって、宿主タンパク質から分離され得る。
【０１５４】
（Ｂ．Ｓｌｏ２モノマーまたはＳｌｏ４モノマーを精製するための、標準的なタンパク質分離技術）
（可溶性分画）
特にタンパク質混合物が複雑である場合の最初の工程において頻繁にあるように、最初の塩分画は、目的の組換えタンパク質から、多くの所望されない宿主タンパク質（または細胞培養培地由来のタンパク質）を分離し得る。好ましい塩は、硫酸アンモニウムである。硫酸アンモニウムは、タンパク質混合物中の水量を効率的に低減することによって、タンパク質を沈降する。次いで、タンパク質は、その可溶性に基づいて沈降する。より疎水性のタンパク質は、おそらくより低い硫酸アンモニウム濃度で沈降するようである。代表的なプロトコルは、生じる硫酸アンモニウム濃度が２０〜３０％の間であるように、飽和硫酸アンモニウムをタンパク質溶液に添加する工程を包含する。この濃度は、ほとんどの疎水性タンパク質を沈降する。次いで、沈降物が破棄され（目的のタンパク質が疎水性でない限り）、そして硫酸アンモニウムが、目的のタンパク質を沈降することが既知の濃度まで、その上清に添加される。次いで、沈降物が緩衝液中で可溶化され、そして過剰の塩が、必要である場合、透析またはダイアフィルトレーションのいずれかを介して除去される。タンパク質の可溶性に依存する他の方法（例えば、冷エタノール沈降）が、当業者に周知であり、そして複雑なタンパク質混合物を分画するために使用され得る。
【０１５５】
（サイズ差次的濾過（ｓｉｚｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ））
Ｓｌｏ２モノマーまたはＳｌｏ４モノマーの分子量を使用して、異なる孔サイズのメンブレン（例えば、ＡｍｉｃｏｎメンブレンまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅメンブレン）を介した限外濾過を用いてより大きなサイズおよびより小さなサイズのタンパク質から、これらのモノマーを単離し得る。最初の工程として、タンパク質混合物を、目的のタンパク質の分子量よりも小さい分子量カットオフを有する孔サイズのメンブレンを介して、限外濾過する。次いで、その限界濾過の保持物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を、目的のタンパク質の分子量よりも大きい分子カットオフを有するメンブレンに対して限外濾過する。組換えタンパク質はそのメンブレンを通過して濾液に入る。次いで、濾液を、以下に記載されるようにクロマトグラフにかけ得る。
【０１５６】
（カラムクロマトグラフィー）
Ｓｌｏ２モノマーまたはＳｌｏ４モノマーはまた、そのサイズ、表面の正味の電荷、疎水性、およびリガンドに対する親和性に基づいて、他のタンパク質から分離され得る。さらに、タンパク質に対して惹起された抗体がカラムマトリクスに結合体化され得、そしてそのタンパク質が免疫精製される。これらの方法の全てが当該分野で周知である。クロマトグラフィー技術を、任意のスケールにて、かつ多くの異なる製造業者（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）からの装置を用いて実行し得ることは、当業者に明らかである。
【０１５７】
（Ｖ．Ｓｌｏ２ポリペプチドまたはＳｌｏ４ポリペプチドの免疫学的検出）
核酸ハイブリダイゼーション技術を用いてＳｌｏ２遺伝子またはＳｌｏ４遺伝子およびＳｌｏ２遺伝子発現またはＳｌｏ４遺伝子発現の検出に加えて、本発明のＳｌｏ２モノマーまたはＳｌｏ４モノマーを検出するために、免疫アッセイもまた、使用し得る。免疫アッセイを使用して、ｈＳｌｏ２モノマーまたはＳｌｏ４モノマーを定性的または定量的に分析し得る。適用可能な技術の一般的な全体像は、Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８８）に見出され得る。
【０１５８】
（Ａ．Ｓｌｏ２モノマーまたはＳｌｏ４モノマーに対する抗体）
Ｓｌｏ２モノマーもしくはＳｌｏ４モノマー、またはヒトＳｌｏ２もしくはＳｌｏ４のような特定の種由来のＳｌｏ２モノマーもしくはＳｌｏ４モノマーと特異的に反応するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を生成する方法が、当業者に公知である（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９１）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，前出；Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第２版．１９８６）；ならびにＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５）を参照のこと）。このような技術としては、ファージまたは類似のベクターにおける組換え抗体のライブラリーからの抗体の選択による抗体調製、ならびにウサギもしくはマウスを免疫することによるポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の調製が挙げられる（例えば、Ｈｕｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）；Ｗａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６（１９８９）を参照のこと）。
【０１５９】
Ｓｌｏ２モノマーまたはＳｌｏ４モノマーの一部を含む多数の免疫原が、Ｓｌｏ２モノマーまたはＳｌｏ４モノマーと特異的に反応性である抗体を生成するために使用され得る。例えば、組換えＳｌｏ２モノマーもしくは組換えＳｌｏ４モノマーまたはそれらの抗原性フラグメント（例えば、保存領域（例えば、ポアループまたはＣ末端テイルドメインを参照のこと））が、本明細書中に記載されるように単離され得る。組換えタンパク質は、上記のように真核生物細胞または原核生物細胞中で発現され得、そして一般的に上記のように精製される。組換えタンパク質は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の産生のための好ましい免疫原である。あるいは、本明細書中に開示される配列由来の合成ペプチドおよびキャリアタンパク質に結合体化された合成ペプチドが、免疫原として使用され得る。天然に存在するタンパク質もまた、純粋な形態または純粋ではない形態のいずれかで使用され得る。次いで、生成物は抗体を産生し得る動物に注射される。モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれかが、タンパク質を測定するための免疫アッセイにおけるその後の使用のために、産生され得る。
【０１６０】
ポリクローナル抗体の産生方法は、当業者に公知である。マウス（例えば、ＢＡＬＢ／Ｃマウス）またはウサギの近交系の系統が、標準的なアジュバント（例えば、フロイントアジュバント）を用いて、そして標準的な免疫プロトコルを使用して、そのタンパク質で免疫される。免疫原調製物に対する動物の免疫応答は、試験採血し、そしてβサブユニットに対する反応性の力価を決定することによって、モニターされる。免疫原に対する抗体の適切に高い力価が得られた場合、血液を動物から収集し、そして抗血清を調製する。そのタンパク質に対して反応性の抗体を富化するための抗血清のさらなる分画が、所望される場合に、実行され得る（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前出を参照のこと）。
【０１６１】
モノクローナル抗体は、当業者が精通する種々の技術によって獲得され得る。簡単に言うと、所望の抗原で免疫した動物由来の脾細胞を、通常、骨髄腫細胞での融合によって不死化する（Ｋｏｈｌｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９  （１９７６）を参照のこと）。代替の不死化方法としては、エプスタイン−バーウイルス、癌遺伝子もしくはレトロウイルスを用いたトランスフォーメーション、または当該分野で周知の他の方法が挙げられる。単一の不死化細胞から生じるコロニーを、所望の特異性の抗体の産生および抗原に対する親和性についてスクリーニングし、そして、そのような細胞によって生成されるモノクローナル抗体の収量は、種々の技術（脊椎動物宿主の腹腔への注射を含む）によって増強され得る。あるいは、Ｈｕｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）によって概説される一般的な手順に従って、ヒトＢ細胞からＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって、モノクローナル抗体またはその結合フラグメントをコードするＤＮＡ配列を単離し得る。
【０１６２】
モノクローナル抗体およびポリクローナル血清は、回収され、そして、イムノアッセイ（例えば、固体支持体に固定化された免疫原を用いる固相イムノアッセイ）で、免疫原タンパク質に対して、滴定される。典型的に、１０４以上の力価を有するポリクローナル抗血清が、選択され、そして、競合的結合イムノアッセイを使用して、非Ｓｌｏファミリータンパク質および他のＳｌｏファミリータンパク質に対するそれらの交差反応性について、試験する。特異的ポリクローナル抗血清およびモノクローナル抗体は、通常は少なくとも約０．１ｍＭのＫｄ、より通常は少なくとも約１μＭのＫｄ、好ましくは少なくとも約０．１μＭまたはより小さいＫｄ、および最も好ましくは０．０１μＭまたはより小さいＫｄで、結合する。特定のＳｌｏ２オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）またはＳｌｏ４オルソログ（例えば、ヒトＳｌｏ２またはヒトＳｌｏ４）に対してのみ特異的である抗体はまた、種（例えば、非ヒト哺乳動物）から他の交差反応性オルソログを取り去ることによって、作製され得る。
【０１６３】
一旦、Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４に対する特異的な抗体が利用可能となると、ポリペプチドは、種々のイムノアッセイ方法によって、検出され得る。免疫学的手順およびイムノアッセイの手順の総覧として、Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ＳｔｉｔｅｓおよびＴｅｒｒ編、第７版、１９９１）を参照のこと。さらに、本発明のイムノアッセイは、任意のいくつかの構成において実施され得、そして、これらの構成は、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ｍａｇｇｉｏ編、１９８０）；ならびＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，前出中で、広範に概説されている。
【０１６４】
（Ｂ．免疫学的結合アッセイ）
本発明のＳｌｏ２ポリペプチドまたはＳｌｏ４ポリペプチドは、多くの広く認識された免疫学的結合アッセイ（米国特許第４，３６６，２４１号、同第４，３７６，１１０号、同第４，５１７，２８８号および同第４，８３７，１６８号を参照のこと）のいずれかを使用することで、検出および／または定量され得る。一般的なイムノアッセイの総覧として、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３７巻（Ａｓａｉ編、１９９３）；Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ＳｔｉｔｅｓおよびＴｅｒｒ編、第７版、１９９１）もまた参照のこと。免疫学的結合アッセイ（または、イムノアッセイ）は、典型的に、選択されたタンパク質または抗原（この場合は、Ｓｌｏ２もしくはＳｌｏ４、またはこれらの抗原性部分配列）に特異的に結合する抗体を、使用する。この抗体（例えば、抗Ｓｌｏ２または抗Ｓｌｏ４）は、当業者に周知で、そして上記されるような多くの手段のいずれかによって、生成され得る。
【０１６５】
イムノアッセイはまた、抗体および抗原によって形成される複合体に特異的に結合し、そしてその複合体を標識するための標識剤をしばしば使用する。この標識剤は、それ自体が、抗体／抗原複合体を含む成分の１つであり得る。従って、この標識剤は、標識Ｓｌｏ２ポリペプチドもしくは標識Ｓｌｏ４ポリペプチド、または標識抗Ｓｌｏ２抗体もしくは標識抗Ｓｌｏ４抗体であり得る。あるいは、この標識剤は、二次抗体のような第３の成分であり得、この第３の成分は、抗体／Ｓｌｏ２または抗体／Ｓｌｏ４複合体に特異的に結合する（二次抗体は、典型的に、一次抗体が由来する種の抗体に特異的である）。免疫グロブリンの定常領域（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧ）に特異的に結合する能力を有する他のタンパク質もまた、標識剤として使用され得る。これらのタンパク質は、様々な種由来の免疫グロブリン定常領域と、強い非免疫原性反応性を示す（例えば、Ｋｒｏｎｖａｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１１：１４０１〜１４０６（１９７３）；Ａｋｅｒｓｔｒｏｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：２５８９〜２５４２（１９８５）を参照のこと）。この標識剤は、検出可能な成分（例えば、ビオチン）を用いて修飾され得、別の分子（例えば、ストレプトアビジン）が、この検出可能な成分に特異的に結合し得る。種々の検出可能成分が、当業者に周知である。
【０１６６】
アッセイを通して、インキュベーション工程および／または洗浄工程が、各回に試薬をあわせた後で、必要とされ得る。インキュベーション工程は、約５秒から数時間、好ましくは約５分から約２４時間まで変動し得る。しかし、インキュベーション時間は、アッセイ形式、抗原、溶液の容積、濃度などに依存する。このアッセイは、一定範囲の温度にわたって（例えば１０℃〜４０℃）実施され得るが、通常、このアッセイは、周囲温度にて実施される。
【０１６７】
（非競合的アッセイ形式）
サンプル中のＳｌｏ２またはＳｌｏ４を検出するためのイムノアッセイは、競合的または非競合的のいずれかであり得る。非競合的イムノアッセイは、抗原量が直接測定される、アッセイである。１つの好ましい「サンドイッチ」アッセイにおいて、例えば、抗Ｓｌｏ２サブユニット抗体または抗Ｓｌｏ４サブユニット抗体は、これらが固定化される固体基材上へ、直接結合され得る。次いで、これらの固定化された抗体は、試験サンプル中に存在するＳｌｏ２またはＳｌｏ４を捕捉する。Ｓｌｏ２モノマーまたはＳｌｏ４モノマーは、このように固定化され、次いで、標識剤（例えば、標識を有する二次Ｓｌｏ２抗体または二次Ｓｌｏ４抗体）によって結合される。あるいは、二次抗体は標識を欠如し得るが、二次抗体は、二次抗体が由来する種の抗体に特異的である標識された三次抗体によって、順番に結合される。この二次抗体または三次抗体は典型的に、検出可能な成分を提供するために、別の分子（例えば、ストレプトアビジン）が特異的に結合する、検出可能な成分（例えば、ビオチン）によって改変される。
【０１６８】
（競合的アッセイ形式）
競合的アッセイ法において、サンプル中に存在するＳｌｏ２量またはＳｌｏ４量は、サンプル中に存在する未知のＳｌｏ２またはＳｌｏ４によって、抗Ｓｌｏ２抗体または抗Ｓｌｏ４抗体から置換された（競合で離れた（ｃｏｍｐｅｔｅｄ  ａｗａｙ））、既知の添加された（外因性の）Ｓｌｏ２量またはＳｌｏ４量を測定することによって、間接的に測定される。１つの競合的アッセイにおいて、既知量のＳｌｏ２またはＳｌｏ４がサンプルに添加され、次いで、このサンプルは、Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４に特異的に結合する抗体と、接触させられる。この抗体へ結合した外因性のＳｌｏ２量または外因性のＳｌｏ４量は、サンプル中に存在するＳｌｏ２濃度またはＳｌｏ４濃度に反比例する。特に好ましい実施形態において、抗体は、固体基材上に固定化される。抗体に結合されたＳｌｏ２量またはＳｌｏ４量は、Ｓｌｏ２／抗体複合体またはＳｌｏ４／抗体複合体中に存在するＳｌｏ２量またはＳｌｏ４量を測定すること、あるいは、残存する非複合体化タンパク質量を測定することのいずれかによって、決定され得る。Ｓｌｏ２量またはＳｌｏ４量は、標識Ｓｌｏ２分子または標識Ｓｌｏ４分子を提供することによって、検出され得る。
【０１６９】
ハプテン阻害アッセイは、別の好ましい競合的アッセイである。このアッセイにおいて、既知のＳｌｏ２またはＳｌｏ４は、固体基材に固定化される。既知量の抗Ｓｌｏ２抗体または抗Ｓｌｏ４抗体がサンプルに添加され、次いで、このサンプルは、固定化Ｓｌｏ２または固定化Ｓｌｏ４に接触させられる。既知の固定化Ｓｌｏ２または固定化Ｓｌｏ４に結合された、抗Ｓｌｏ２抗体または抗Ｓｌｏ４抗体の量は、サンプル中に存在するＳｌｏ２量またはＳｌｏ４量に反比例する。再び、固定化された抗体量は、抗体の固定化された画分または溶液中に残存する抗体の画分のいずれかの検出によって、検出され得る。検出は、抗体が標識されいている場合は直接的であり得、または、上記したように、抗体へ特異的に結合する標識成分の引き続く添加によって、間接的であり得る。
【０１７０】
（交差反応性の決定）
競合的結合形式におけるイムノアッセイはまた、Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４についての交差反応性を決定するために用いられ得る。例えば、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列、あるいはそれらの免疫原性領域（例えば、保存領域（例えば、孔ループ（ｐｏｒｅ  ｌｏｏｐ）ドメインまたはテイル（ｔａｉｌ）ドメイン））に、少なくとも部分的に対応する、Ｓｌｏ２タンパク質またはＳｌｏ４タンパク質は、固体支持体に固定され得る。他のＳｌｏファミリーメンバーのような、他のタンパク質は、固定された抗原との抗血清の結合と競合するように、アッセイに添加される。添加タンパク質が、固定されたタンパク質との抗血清の結合と競合する能力は、Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４、あるいはそれらの免疫原性部分が、それら自体と競合する能力と比較される。上記のタンパク質についての交差反応性の割合は、標準的な計算を用いて計算される。上に列挙された、各々の添加タンパク質と、１０％未満の交差反応性を有する抗血清が、選択され、そしてプールされる。交差反応抗体は、考慮された添加タンパク質（例えば、遠縁で関連するホモログ）との免疫吸収（ｉｍｍｕｎｏａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）によって、プールされた抗血清から、必要に応じて除去される。Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４にのみか、あるいはＳｌｏ２またはＳｌｏ４の特定のオルソログ（例えば、ヒトＳｌｏ４またはヒトＳｌｏ４）にのみ特異的に結合する抗体もまた、この方法論を使用して作製され得る。
【０１７１】
次いで、免疫吸収され、そしてプールされた抗血清は、第２のタンパク質（おそらくＳｌｏ２またはＳｌｏ４、あるいはそれらの対立遺伝子、オルソログ、または多型性改変体であると考えられる）を、免疫原タンパク質と比較するために、上記のような競合的結合イムノアッセイにおいて用いられる。この比較を行うために、この２つのタンパク質は、広範な濃度でそれぞれアッセイされ、そして固定されたタンパク質との抗血清の結合の５０％を阻害するために必要とされる、各タンパク質の量が決定される。結合の５０％を阻害するために必要とされる第２タンパク質の量が、結合の５０％を阻害するために必要とされるＳｌｏ２またはＳｌｏ４によってコードされるタンパク質の量の１０倍未満である場合、この第２タンパク質は、それぞれＳｌｏ２免疫原またはＳｌｏ４免疫原に対して産生されたポリクローナル抗体に、特異的に結合するという。
【０１７２】
（他のアッセイ形式）
ウエスタンブロット（イムノブロット）分析は、サンプル中のＳｌｏ２またはＳｌｏ４の存在を検出および定量するために用いられる。この技術は、一般に、分子量に基づくゲル電気泳動によってサンプルタンパク質を分離する工程、分離されたタンパク質を適切な固体支持体（例えば、ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター、または誘導体化されたナイロンフィルター）に転写する工程、およびＳｌｏ２またはＳｌｏ４と特異的に結合する抗体とともにこのサンプルをインキュベートする工程を含む。抗Ｓｌｏ２抗体または抗Ｓｌｏ４抗体は、この固体支持体上のＳｌｏ２またはＳｌｏ４と特異的に結合する。これらの抗体は、直接的に標識化され得るか、あるいは以後に、抗Ｓｌｏ２抗体または抗Ｓｌｏ４抗体と特異的に結合する標識化された抗体（例えば、標識化されたヒツジ抗マウス抗体）を用いて検出され得る。
【０１７３】
他のアッセイ形式として、リポソームイムノアッセイ（ＬＩＡ）（これは、特定の分子（例えば、抗体）と結合し、そしてカプセルに内包された試薬またはマーカーを放出するように設計された、リポソームを用いる）が挙げられる。次いで、放出された化学物質は、標準的な技術（Ｍｏｎｒｏｅら、Ａｍｅｒ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｄ．Ｒｅｖ．５：３４〜４１（１９８６）を参照のこと）に従って検出される。
【０１７４】
（非特異的結合の減少）
当業者は、イムノアッセイにおける非特異的結合を最小化することがしばしば望ましいことを、理解する。特に、アッセイが、固体支持体上に固定された抗原または抗体を含む場合、基材との非特異的結合の量を最小化することが望ましい。このような非特異的結合を減少させる手段は、当業者に周知である。代表的に、この技術は、タンパク質性（ｐｒｏｔｅｉｎａｃｅｏｕｓ）の組成物で基材をコーティングする工程を含む。特に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、脱脂粉乳、およびゼラチンのようなタンパク質組成物が広範に用いられ、粉乳がもっとも好ましい。
【０１７５】
（標識）
このアッセイで用いられる特定の標識または検出可能な基は、このアッセイで用いられる抗体の特異的結合に有意に干渉しない限り、本発明の重要な側面ではない。検出可能な基は、検出可能な物理的性質または化学的性質を有する任意の物質であり得る。このような検出可能な標識は、イムノアッセイの分野においてよく開発されており、そして一般に、このような方法において有用な任意の標識の殆どは、本発明に適用され得る。従って、標識は、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、光学的手段、または化学的手段によって検出可能である任意の組成物である。本発明において有用な標識として、磁気ビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳＴＭ）、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ）、ローダミンなど）、放射標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、および、ＥＬＩＳＡにおいて一般に用いられる他の酵素）、ならびに、金コロイドまたは着色されたガラスビーズもしくはプラスチックビーズ（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）のような比色標識が挙げられる。
【０１７６】
この標識は、当該分野において周知の方法に従って、このアッセイの所望の成分に、直接的または間接的に結合され得る。上記のように、多種多様な標識が用いられ得、標識の選択は、必要とされる感度、化合物との結合の容易性、安定性要件、利用可能な器具、および処分の設備に依存する。
【０１７７】
非放射活性標識は、間接的な手段によってしばしば結合される。一般に、リガンド分子（例えば、ビオチン）は、分子と共有結合される。次いで、このリガンドは、別の分子（例えば、ストレプトアビジン）（これは、固有に検出可能であるか、あるいは、検出可能な酵素、蛍光化合物、または化学発光性化合物のようなシグナル系と共有結合されるかのいずれかである）と結合する。このリガンドおよびそれらの標的は、ｈＳｌｏ２またはｈＳｌｏ４を認識する抗体、または抗ｈＳｌｏ２抗体または抗ｈＳｌｏ４抗体を認識する二次抗体と、任意に適切に組み合わせて用いられ得る。
【０１７８】
この分子はまた、例えば、酵素または発蛍光団との結合によって、シグナル発生化合物と直接的に結合され得る。標的としての目的の酵素は、主に、ヒドロラーゼ（特に、ホスファターゼ、エステラーゼおよびグリコシダーゼ）またはオキシダーゼ（特に、ペルオキシダーゼ）である。蛍光化合物としては、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン（ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ）などが挙げられる。化学発光性化合物としては、ルシフェリン、および２，３−ジヒドロフタラジンジオン（例えば、ルミノール）が挙げられる。用いられ得る種々の標識化系またはシグナル発生系の総説として、米国特許第４，３９１，９０４号を参照のこと。
【０１７９】
標識を検出する手段は、当業者に周知である。従って、例えば、標識が放射標識である場合、検出手段としては、オートラジオグラフィーにおけるような、シンチレーションカウンターまたは写真フィルムが挙げられる。標識が蛍光標識である場合、この標識は、適切な波長の光で蛍光色素を励起する工程、および、得られる蛍光を検出する工程によって、検出され得る。この蛍光は、写真フィルムによってか、電子感知器（例えば、電荷結合素子（ＣＣＤ））の使用によってか、または光電子増倍管などによって、視覚的に検出され得る。同様に、酵素標識は、酵素に適切な基材を提供する工程によって、および、得られる反応生成物を検出する工程によって、検出され得る。最後に、単純な比色標識は、標識に関連する色を観察する工程によって、容易に検出され得る。従って、種々のディップスティックアッセイにおいて、結合された金はしばしば桃色を呈し、一方、種々の結合されたビーズは、そのビーズの色を呈す。
【０１８０】
いくつかのアッセイ形式は、標識化された成分の使用を必要としない。例えば、凝集アッセイは、標的抗体の存在を検出するために用いられ得る。この場合、抗原でコーティングされた粒子は、標的抗体を含むサンプルによって凝集される。この形式では、いかなる成分も標識化される必要がなく、そして、標的抗体の存在は、単なる目視検査によって検出される。
【０１８１】
（ＶＩ．Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４のモジュレーターについてのアッセイ）
（Ａ．アッセイ）
（序論）
ヒトＳｌｏ２またはヒトＳｌｏ４、ならびに対立遺伝子、オルソログ、および多型性改変体は、カリウムチャネルのサブユニットである。Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４を含むカリウムチャネルの活性は、種々のインビトロアッセイおよびインビボアッセイ（例えば、電流の測定、膜電位の測定、リガンド結合の測定、イオンフラックス（例えば、カリウムまたはルビジウム）の測定、イオン濃度の測定、第２メッセンジャーおよび転写レベルの測定、カリウム依存性酵母増殖アッセイの使用、リガンド結合の測定、ならびに、例えば、電圧感受性色素、イオン感受性色素（例えば、カリウム感受性色素）の使用、放射性トレーサー、ならびにパッチクランプ電気生理学）を用いて評価され得る。
【０１８２】
さらに、このようなアッセイを使用して、Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４を含むチャネルのインヒビターおよびアクチベーターについて試験し得る。このようなカリウムチャネルのモジュレーターは、カリウムチャネルが関与する種々の障害を処置するために有用である。このようなカリウムチャネル活性のモジュレーターは、ＣＮＳ障害（例えば、神経障害性疼痛、てんかん、および他の痙攣（ｓｅｉｚｕｒｅ）障害）、片頭痛、不安症、精神病性障害（例えば、精神分裂病、双極性障害、およびうつ病）を含む障害を処置するために有用である。このようなモジュレーターはまた、神経保護剤として（例えば、発作を予防するために）有用である。モジュレーターはまた、アルツハイマー病のような疾患によって引き起こされる学習および記憶の認知障害の処置において、または、高齢集団において学習および記憶を高めるため、同時に神経保護を提供するために、有用であり得る。最終的には、このようなモジュレーターは、筋肉の過剰収縮性（ｈｙｐｅｒｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｉｔｙ）、心律動異常、炎症、ぜん息を処置するために、および、免疫抑制薬または刺激薬として、有用であり得る。
【０１８３】
このようなモジュレーターはまた、Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４によって提供されるチャネル多様性の研究のため、およびＳｌｏ２またはＳｌｏ４によって提供されるカリウムチャネル活性の制御／調節のために、有用である。
【０１８４】
Ｓｌｏカリウムチャネルのモジュレーターは、組換えかまたは天然に存在するものかのいずれかである、生物学的に活性なＳｌｏ２またはＳｌｏ４、好ましくは、ヒトＳｌｏ２またはＳｌｏ４を使用して試験される。Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４は、単離され得るか、細胞において同時発現もしくは発現され得るか、または細胞由来の膜において発現され得る。このようなアッセイにおいて、Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４は、単独で発現されて、ホモマーのカリウムチャネルを形成するか、または第二のαサブユニット（例えば、別のＳｌｏファミリーメンバー（例えば、Ｓｌｏ１またはＳｌｏ３））と同時発現されて、ヘテロマーのカリウムチャネルを形成する。Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４のポリペプチドはまた、さらなるβサブユニットと共に発現され得る。モジュレーターは、本明細書中に記載されるインビトロアッセイまたはインビボアッセイの一つを使用して試験される。
【０１８５】
カリウムチャネルの潜在的なインヒビターまたはアクチベーターで処理されたサンプルまたはアッセイを、試験化合物なしのコントロールサンプルと比較して、調節の程度を試験する。コントロールサンプル（アクチベーターによってもインヒビターによっても処理されていない）を、相対的カリウムチャネル活性値１００と割り当てる。Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４のポリペプチドを含むチャネルの阻害は、コントロールと比較したカリウムチャネル活性値が、約９０％、好ましくは５０％、より好ましくは２５％である場合に達成される。Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４のポリペプチドを含むチャネルの活性化は、コントロールと比較したカリウムチャネル活性値が、１１０％、より好ましくは１５０％、より好ましくは２００％高い場合に達成される。イオンフラックスを増加させる化合物は、Ｓｌｏ２もしくはＳｌｏ４のポリペプチドを含むチャネルを開口する可能性を増加させることによって、Ｓｌｏ２もしくはＳｌｏ４のポリペプチドを含むチャネルを閉口する可能性を減少させることによって、チャネルを通したコンダクタンスを増加させることによって、および／または、イオンを通過させることによって、イオン電流密度における検出可能な増加を引き起こす。
【０１８６】
好ましくは、アッセイに使用されるＳｌｏ２またはＳｌｏ４のポリペプチドは、配列番号２もしくは４に示される配列、またはそれらの保存的に改変された改変体を有する。あるいは、アッセイのＳｌｏ２またはＳｌｏ４は、真核生物由来であり、かつ、ヒトＳｌｏ２またはＳｌｏ４の保存領域（例えば、孔ループ（ｐｏｒｅ  ｌｏｏｐ）またはテイルドメインを参照のこと）に対して実質的なアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸部分配列を含む。一般に、アミノ酸配列同一性は、少なくとも６０％、好ましくは、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％、最も好ましくは、少なくとも９５％以上である。
【０１８７】
（インビトロアッセイ）
カリウムチャネル調節活性を有する化合物を同定するためのアッセイは、インビトロで実施され得る（例えば、結合アッセイ）。精製された組換えかまたは天然に存在するＳｌｏ２もしくはＳｌｏ４のタンパク質、またはＳｌｏ２もしくはＳｌｏ４のタンパク質を含むチャネルを、本発明のインビトロ方法において使用し得る。精製されたＳｌｏ２もしくはＳｌｏ４のタンパク質、またはそれらを含むチャネルに加えて、組換えかまたは天然に存在するＳｌｏ２またはＳｌｏ４のタンパク質は、細胞溶解産物または細胞膜の一部であり得る。以下に記載するように、アッセイは、固体状態または可溶性のいずれでもあり得る。好ましくは、このタンパク質または膜を、共有結合または非共有結合のいずれかで、固体支持体に結合する。しばしば、本発明のインビトロアッセイは、非競合的または競合的のいずれかでの、リガンド結合アッセイもしくは毒素結合アッセイまたはリガンド親和性アッセイである。他のインビトロアッセイは、このタンパク質またはチャネルの分光学的（例えば、蛍光、吸光度、屈折率）特性、流体力学的（例えば、形状）特性、クロマトグラフィ特性または溶解度特性における変化を測定する工程を包含する。細胞膜または溶解産物はまた、以下に記載されるように、Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４のポリペプチドを含むカリウムチャネルを発現する細胞または膜の分極（すなわち、電位）における変化を測定するために使用され得る。
【０１８８】
（インビボアッセイ）
別の実施形態では、Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４のタンパク質を、細胞において発現させ、そして機能的（例えば、物理的および化学的または表現型的）変化をアッセイして、カリウムチャネルモジュレーターを同定する。例えば、細胞に基づくアッセイまたは動物に基づくアッセイを使用して、イオンフラックスにおける変化は、Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４のポリペプチドを含むカリウムチャネルを発現する細胞または膜の分極（すなわち、電位）の変化を決定することによって評価され得る。細胞の分極における変化を決定するための好ましい手段は、電圧クランプおよびパッチクランプ技術（例えば、「細胞付着」モード、「裏返し（ｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔ）」モード、および「細胞全体」モード）で、電流における変化を測定すること（それによって、分極における変化を測定すること）による（例えば、Ａｃｋｅｒｍａｎら，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３６：１５７５−１５９５（１９９７）を参照のこと）。細胞全体での電流は、標準的な方法（例えば、Ｈａｍｉｌら，ＰＦｌｕｇｅｒｓ．Ａｒｃｈｉｖ．３９１：８５（１９８１）を参照のこと）を使用して、都合よく決定される。他の公知のアッセイとしては、以下が挙げられる：電圧感受性色素またはイオン感受性色素を使用する、放射性標識ルビジウムフラックスアッセイおよび蛍光アッセイ（例えば、Ｖｅｓｔｅｒｇａｒｒｄ−Ｂｏｇｉｎｄら，Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｉｏｌ．８８：６７−７５（１９８８）；Ｄａｎｉｅｌら，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｍｅｔｈ．２５：１８５−１９３（１９９１）；Ｈｏｌｅｖｉｎｓｋｙら，Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３７：５９−７０（１９９４）を参照のこと）。Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４のポリペプチドを含むチャネルタンパク質を通したカリウムフラックスを阻害または増加させ得る化合物についてのアッセイは、本発明のチャネルを有する細胞と接触しているかまたはその細胞を含む浴槽溶液に、化合物を適用することによって実施され得る（例えば、Ｂｌａｔｚら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２３：７１８−７２０（１９８６）；Ｐａｒｋ，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．４８１：５５５−５７０（１９９４）を参照のこと）。一般に、試験される化合物は、１ｐＭ〜１００ｍＭの範囲で存在する。
【０１８９】
チャネル機能に対する試験化合物の効果を、電流もしくはイオンフラックスにおける変化によってか、または、電流およびフラックスにおける変化の結果によって、測定し得る。電流またはイオンフラックスにおける変化は、カリウムイオンまたはルビジウムイオンのようなイオンのフラックスにおける増加または減少のいずれかによって測定される。イオンは、種々の標準的な方法において測定され得る。イオンは、直接的に、イオンの濃度変化（例えば、細胞内濃度の変化）によってか、または間接的に、膜電位によるかもしくはイオンの放射性標識によって、測定され得る。イオンフラックスに対する試験化合物の結果は、大いに変動し得る。従って、任意の適切な生理学的変化を使用して、本発明のチャネルに対する試験化合物の影響を評価し得る。
【０１９０】
例えば、試験化合物の効果を、リガンド結合アッセイもしくは毒素結合アッセイによって測定し得る。伝達物質放出（例えば、ドパミン）、細胞内カルシウム変化、ホルモン放出（例えば、インスリン）、既知および未特定の遺伝子マーカーの両方に対する転写変化（例えば、ノーザンブロット）、細胞容量変化（例えば、赤血球）、免疫応答（例えば、Ｔ細胞活性化）、細胞代謝の変化（例えば、細胞の増殖またはｐＨの変化）、および細胞内第二メッセンジャー（例えば、サイクリックヌクレオチド）の変化のような、種々の効果もまた測定され得る。
【０１９１】
Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４のオルトログ、対立遺伝子、多型性改変体、および保存的に改変された改変体は、一般的に、上記のような、Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４のポリペプチドを含むチャネルに実質的に類似した特性を付与する。好ましい実施形態では、Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４のホモログであると予想される化合物と接触して配置された細胞を、真核生物細胞（例えば、Ｘｅｎｏｐｕｓ（例えば、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞、または、哺乳動物細胞（例えば、ＣＣＨＯ細胞またはＨｅＬａ細胞））におけるイオンフラックスの増加または減少についてアッセイする。Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４に類似した様式で、化合物により影響を及ぼされるチャネルは、Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４のホモログまたはオルトログとみなされる。
【０１９２】
（動物モデル）
動物モデルはまた、カリウムチャネルモジュレーターについてのスクリーニングにおいて用途を見出す。トランスジェニック動物技術（適切な遺伝子標的化ベクターでの相同組換えの結果としての遺伝子ノックアウト技術または遺伝子の過剰発現を含む）は、Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４のタンパク質の不在または発現増加を生じさせる。所望される場合には、Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４のタンパク質の組織特異的発現またはノックアウトが必要とされ得る。このような方法によって作製されたトランスジェニック動物は、異常なイオンフラックスの動物モデルとしての用途を見出し、そしてさらに、カリウムチャネルのモジュレーターについてのスクリーニングにおいて有用である。
【０１９３】
（Ｂ．モジュレーター）
Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４のサブユニットを含むＳｌｏチャネルのモジュレーターとして試験される化合物は、任意の有機低分子化合物、または生物学的実体（例えば、タンパク質（例えば、ペプチドまたは抗体）、糖、核酸（例えば、アンチセンス分子）、または脂質）であり得る。あるいは、超節因子は、Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４サブユニットの遺伝子改変バージョンであり得る。代表的に、試験化合物は、有機低分子、抗体、アンチセンス分子およびペプチドである。本質的に任意の化合物が、本発明のアッセイにおいて、潜在的なモジュレーターまたはリガンドとして使用され得るが、しばしば大半の化合物は、水中に溶解され得るか、または有機（特に、ＤＭＳＯに基づく）溶液が使用される。アッセイは、アッセイ工程を自動化すること、および都合のよい任意の供給源からアッセイに化合物を提供すること（これらは、代表的には並行して実行される）によって、大規模な化学ライブラリーをスクリーニングするように設計される（例えば、ロボットアッセイにおいて、マイクロタイタープレート上でのマイクロタイター形式において）。多くの化合物供給業者が存在することが理解され、これらとしては、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｋａ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  Ａｎａｌｙｔｉｋａ（Ｂｕｃｈｓ  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）などが挙げられる。
【０１９４】
一つの好ましい実施形態では、ハイスループットスクリーニング方法は、多数の潜在的治療化合物（潜在的なモジュレーターまたはリガンド化合物）を含む、コンビナトリアル化学ライブラリーまたはペプチドライブラリーを提供する工程を包含する。次いで、このような「コンビナトリアル化学ライブラリー」または「リガンドライブラリー」を、本明細書中に記載のように、１つ以上のアッセイにおいてスクリーニングして、所望される特徴的な活性を示すライブラリーメンバー（特に、化学種またはサブクラス）を同定する。このようにして同定された化合物は、従来の「リード化合物」として供され得るか、またはそれ自体が、潜在的な治療薬もしくは実際の治療薬として使用され得る。
【０１９５】
コンビナトリアル化学ライブラリーは、試薬のような多数の化学的「ビルディングブロック（ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｂｌｏｃｋ）」を組合わせることにより、化学的合成または生物学的合成のいずれかによって生成される多様な化合物の集合である。例えば、直線的なコンビナトリアル化学ライブラリー（例えば、ポリペプチドライブラリー）は、所定の化合物の長さ（すなわち、ポリペプチド化合物におけるアミノ酸の数）について、あらゆる可能な様式で化学的ビルディングブロック（アミノ酸）のセットを組合わせることによって形成される。数百万の化合物が、化学的ビルディングブロックのこのようなコンビナトリアル混合を通して合成され得る。
【０１９６】
コンビナトリアル化学ライブラリーの調製およびスクリーニングは、当業者に周知である。このようなコンビナトリアル化学ライブラリーとしては、ペプチドライブラリー（例えば、米国特許第５，０１０，１７５号、Ｆｕｒｋａ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．３７：４８７−４９３（１９９１）およびＨｏｕｇｈｔｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８４−８８（１９９１）を参照のこと）が挙げられるが、これに限定されない。化学的多様性ライブラリーを生成するための他の化学もまた使用され得る。このような化学としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ペプトイド（ｐｅｐｔｏｉｄ）（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ  ９１／１９７３５）、コードペプチド（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ  ９３／２０２４２）、無作為生体オリゴマー（ｒａｎｄｏｍ  ｂｉｏ−ｏｌｉｇｏｍｅｒ）（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ  ９２／０００９１）、ベンゾジアゼピン（例えば、米国特許第５，２８８，５１４号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチドのようなダイバーソマー（ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒ）（Ｈｏｂｂｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６９０９−６９１３（１９９３））、ビニローグ（ｖｉｎｙｌｏｇｏｕｓ）ポリペプチド（Ｈａｇｉｈａｒａら，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：６５６８（１９９２））、グルコース足場を有する非ペプチド性ペプチド模倣物（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎら，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：９２１７−９２１８（１９９２））、小化合物ライブラリーの類似有機合成（Ｃｈｅｎら，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：２６６１（１９９４））、オリゴカルバメート（ｏｌｉｇｏｃａｒｂａｍａｔｅ）（Ｃｈｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３（１９９３））、および／またはペプチジルホスホネート（Ｃａｍｐｂｅｌｌら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５９：６５８（１９９４））、核酸ライブラリー（Ａｕｓｕｂｅｌ，ＢｅｒｇｅｒおよびＳａｍｂｒｏｏｋ（すべて前出）を参照のこと）、ペプチド核酸ライブラリー（例えば、米国特許第５，５３９，０８３号を参照のこと）、抗体ライブラリー（例えば、Ｖａｕｇｈｎら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４（３）：３０９−３１４（１９９６）およびＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７を参照のこと）、炭水化物ライブラリー（例えば、Ｌｉａｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４：１５２０−１５２２（１９９６）および米国特許第５，５９３，８５３号を参照のこと）、有機低分子ライブラリー（例えば、ベンゾジアゼピン，Ｂａｕｍ  Ｃ＆ＥＮ，１月１８日，３３頁（１９９３）；イソプレノイド，米国特許第５，５６９，５８８号；チアゾリジノンおよびメタチアザノン（ｍｅｔａｔｈｉａｚａｎｏｎｅ），米国特許第５，５４９，９７４号；ピロリジン，米国特許第５，５２５，７３５号および同第５，５１９，１３４号；モルホリノ化合物，米国特許第５，５０６，３３７号；ベンゾジアゼピン，同第５，２８８，５１４号などを参照のこと）。
【０１９７】
コンビナトリアルライブラリーの調製のためのデバイスは、市販されている（例えば、３５７  ＭＰＳ，３９０  ＭＰＳ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈ，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ  ＫＹ，Ｓｙｍｐｈｏｎｙ，Ｒａｉｎｉｎ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ，４３３Ａ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，９０５０  Ｐｌｕｓ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡを参照のこと）。さらに、多数のコンビナトリアルライブラリー自体が、市販されている（例えば、ＣｏｍＧｅｎｅｘ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．，Ａｓｉｎｅｘ，Ｍｏｓｃｏｗ，Ｒｕ，Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＣｈｅｍＳｔａｒ，Ｌｔｄ，Ｍｏｓｃｏｗ，ＲＵ，３Ｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｅｘｔｏｎ，ＰＡ，Ｍａｒｔｅｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤなどを参照のこと）。
【０１９８】
一つの実施形態では、本発明は、ハイスループット形式での固相に基づくインビトロアッセイを提供する。ここでは、ヒトのＳｌｏ２またはＳｌｏ４のサブユニットを含むＳｌｏチャネルを発現する細胞または組織を、固相基材に付着させる。本発明のハイスループットアッセイでは、１日に、数千もの異なるモジュレーターまたはリガンドに対してスクリーニングすることが可能である。特に、マイクロタイタープレートの各ウェルを使用して、選択された潜在的モジュレーターに対して別個のアッセイを実行し得るか、または、濃度またはインキュベーション時間の効果を観察する場合には、５〜１０個毎のウェルで単一のモジュレーターを試験し得る。従って、単一の標準的なマイクロタイタープレートは、約９６個のモジュレーターをアッセイし得る。１５３６ウェルプレートを使用する場合、単一のプレートで、約１００〜約１５００個の異なる化合物を容易にアッセイし得る。１日につき多数のプレートをアッセイすることが可能である；約６，０００個、２０，０００個、５０，０００個または１００，０００個までか、またはそれより多くの異なる化合物についてのアッセイスクリーニングが、本発明の組み込み型システムを使用して可能である。
【０１９９】
（Ｃ．固体状態および可溶性のハイスループットアッセイ）
一つの実施形態において、本発明は、例えば、天然に存在するかまたは組換えのいずれかである、Ｓｌｏ２もしくはＳｌｏ４のポリペプチドを含む単離されたカリウムチャネル；Ｓｌｏ２もしくはＳｌｏ４のカリウムチャネルを含む膜、またはＳｌｏ２もしくはＳｌｏ４のポリペプチドを含むカリウムチャネルを発現する細胞もしくは組織を使用する、ハイスループット可溶性アッセイを提供する。別の実施形態では、本発明は、ハイスループット形式での固相に基づくインビトロアッセイを提供する。ここでは、Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４のカリウムチャネルを、固相基材に付着させる。別のアッセイでは、チャネルを含む細胞膜または細胞を、固相基材に付着させ得る。さらに別の実施形態では、試験化合物を、固相基材に付着させる。
【０２００】
本発明のハイスループットアッセイにおいて、１日で数千の異なるモジュレーターまたはリガンドをスクリーニングすることが可能である。詳細には、マイクロタイタープレートの各ウェルを使用して、選択された潜在的モジュレーターに対する別々のアッセイを行い得るか、または濃度効果もしくはインキュベーション時間効果が観察される場合、５〜１０のウェル毎に、単一のモジュレーターを試験し得る。従って、単一の標準マイクロタイタープレートで、約１００（例えば、９６）のモジュレーターをアッセイし得る。１５３６ウェルプレートを使用する場合、単一のプレートは、約１００〜約１５００の異なる化合物を容易にアッセイし得る。本発明の一体化されたシステムを使用して、１日あたり多くのプレートをアッセイすることが可能であり；約６，０００、２０，０００、５０，０００、または１００，０００より多くの異なる化合物についてのスクリーニングアッセイを行うことが可能である。
【０２０１】
目的のチャネル、または目的のチャネルを含む細胞もしくは膜は、固体状態成分に、直接または間接的に、共有結合または非共有結合を介して（例えば、タグ（ｔａｇ）を介して）結合され得る。このタグは、種々の成分のいずれかであり得る。一般的には、タグを結合する分子（タグバインダー）は、固体支持体に固定され、そして目的のタグ化された分子（例えば、目的の味覚伝達分子）は、タグとタグバインダーとの相互作用により固体支持体に結合される。
【０２０２】
多数のタグおよびタグバインダーは、文献に十分に記載されている公知の分子相互作用に基づいて、使用され得る。例えば、タグが天然のバインダー（例えば、ビオチン、プロテインＡ、またはプロテインＧ）を有する場合、これらは、適切なタグバインダー（アビジン、ストレプトアビジン、ノイトラビジン（ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）、免疫グロブリンのＦｃ領域など）と組み合わせて使用され得る。ビオチンのような天然バインダーを有する分子に対する抗体はまた、広く利用可能であり、そして適切なタグバインダーである；ＳＩＧＭＡ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  １９９８  ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ＳＩＧＭＡ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ．）を参照のこと。
【０２０３】
同様に、任意のハプテン化合物または抗原性化合物を、適切な抗体を組み合わせて使用して、タグ／タグバインダー対を形成し得る。数千の特異的抗体が市販されており、多くのさらなる抗体が文献に記載されている。例えば、１つの一般的な構成において、このタグは、一次抗体であり、そしてタグバインダーは、この一次抗体を認識する二次抗体である。抗体−抗原相互作用に加えて、レセプター−リガンド相互作用もまた、タグおよびタグ−バインダー対として適切である。例えば、細胞膜レセプターのアゴニストおよびアンタゴニスト（例えば、トランスフェリン、ｃ−ｋｉｔ、ウイルスレセプターリガンド、サイトカインレセプター、ケモカインレセプター、インターロイキンレセプター、免疫グロブリンレセプターおよび抗体、カドヘリンファミリー、インテグリンファミリー、セレクチンファミリーなどのような細胞レセプター−リガンド相互作用）；例えば、Ｐｉｇｏｔｔ＆Ｐｏｗｅｒ，Ｔｈｅ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｆａｃｔｓ  Ｂｏｏｋ  Ｉ（１９９３）を参照のこと。同様に、毒素および毒物、ウイルスエピトープ、ホルモン（例えば、アヘン剤、ステロイドなど）、細胞内レセプター（例えば、ステロイド、甲状腺ホルモン、レチノイドおよびビタミンＤ；ペプチドを含む、種々の小リガンドの効果を媒介するレセプター）、薬物、レクチン、糖類、核酸（線状ポリマーおよび環状ポリマーの配置）、オリゴ糖類、タンパク質、リン脂質および抗体は、全て種々の細胞レセプターと相互作用し得る。
【０２０４】
合成ポリマー（例えば、ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリウレア、ポリアミド、ポリエチレンイミン、ポリアリーレンスルフィド、ポリシロキサン、ポリイミド、およびポリアセテート）はまた、適切なタグまたはタグバインダーを形成し得る。多くのその他タグ／タグバインダー対はまた、本明細書の開示を検討する際に当業者に明らかになるように、本明細書に記載されるアッセイ系において有用である。
【０２０５】
ペプチド、ポリエーテルなどのような一般的なリンカーはまた、タグとして役立ち得、そしてこれらとしては、約５〜２００の間のアミノ酸のポリｇｌｙ配列のような、ポリペプチド配列を含む。このような可撓性のリンカーは、当業者に公知である。例えば、ポリ（エチレングリコール）リンカーは、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａｂａｍａから入手可能である。これらのリンカーは、必要に応じてアミド結合、スルフヒドリル結合、またはヘテロ官能性結合を有する。
【０２０６】
タグバインダーは、現在利用可能な種々の方法のいずれかを使用して固体基材の固定される。固体基材は、一般的には基材の全てまたは一部を化学薬品に曝露することにより誘導体化されるかまたは官能基化され、この化学薬品は、化学基を、タグバインダーの一部と反応性である表面に固定する。例えば、より長い鎖部分への結合に適した基としては、アミン、ヒドロキシル、チオール、およびカルボキシル基が挙げられる。アミノアルキルシランおよびヒドロキシアルキルシランを使用して、種々の表面（例えば、ガラス表面）を官能基化し得る。このような固相生体高分子アレイの構築は、文献に十分に記載される。例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４（１９６３）（例えば、ペプチドの固相合成を記載する）；Ｇｅｙｓｅｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈ．１０２：２５９−２７４（１９８７）（ピン上の固相成分の合成を記載する）；Ｆｒａｎｋ＆Ｄｏｒｉｎｇ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４４：６０３１６０４０（１９８８）（セルロースディスク上の種々のペプチド配列の合成を記載する）；Ｆｏｄｏｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：７６７−７７７（１９９１）；Ｓｈｅｌｄｏｎら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９（４）：７１８−７１９（１９９３）；およびＫｏｚａｌら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２（７）：７５３−７５９（１９９６）（全て固体基材に固定された生体高分子のアレイを記載する）。基材にタグバインダーを固定するための非化学的アプローチとしては、その他の一般的な方法（例えば、加熱、ＵＶ照射による架橋など）が含まれる。
【０２０７】
（ＶＩＩ．ＳＬＯ２またはＳＬＯ４を使用する、コンピュータ支援薬物設計）  Ｓｌｏ２チャネルまたはＳｌｏ４チャネルの活性を調節する化合物に関するさらに別のアッセイは、コンピュータ支援薬物設計を含み、ここでコンピュータシステムは、アミノ酸配列によりコードされる構造情報に基づいて、Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４の３次元構造を生成するために使用される。入力アミノ酸配列は、コンピュータプログラムにおいて予め確立されたアルゴリズムと直接的かつ能動的に相互作用して、そのタンパク質の２次、３次、および４次の構造モデルを生じる。次いで、タンパク質構造のモデルは、例えば、リガンドまたはその他のカリウムチャネルサブユニットを結合する能力を有する構造の領域を同定するために試験される。次いで、これらの領域を使用して、Ｓｌｏ２もしくはＳｌｏ４が他のカリウムチャネルサブユニットと相互作用するタンパク質または領域に結合するリガンドを同定するために使用される。
【０２０８】
このタンパク質の３次元構造モデルは、少なくとも２５、５０、７５または１００またはそれより多くのアミノ酸残基のチャネルタンパク質アミノ酸配列またはＳｌｏ２またはＳｌｏ４モノマーをコードする対応する核酸配列を、コンピューターシステムに入力することにより、生成される。このモノマーの各々のアミノ酸配列は、配列番号２もしくは４、およびその保存的に改変されたバージョン、または保存された領域（例えば、孔ループまたはテールドメイン）を含むその免疫原性部分からなる群から選択される。このアミノ酸配列は、各タンパク質の一次配列または部分配列を示し、このアミノ酸配列は、このタンパク質の構造情報をコードする。少なくとも２５、５０、７５または１００残基のアミノ酸配列（または、２５、５０、７５または１００アミノ酸をコードするヌクレオチド配列）は、コンピュータキーボード、コンピュータ読み取り可能な基材からコンピュータシステムに入力される。コンピュータ読み取り可能な基材としては、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、およびチップ）、光媒体（例えば、ＣＤ  ＲＯＭ）、インターネットサイトにより配信される情報、ならびにＲＡＭが挙げられるが、これらに限定されない。次いで、チャネルタンパク質の３次元構造モデルは、アミノ酸配列とコンピュータシステムとの相互作用により、当業者に公知のソフトウエアを使用して生成される。次いで、得られた３次元コンピュータモデルは、コンピュータ読み取り可能基材に保存され得る。
【０２０９】
このアミノ酸配列は、モノマーの２次、３次および４次構造ならびに４つのモノマーを含むヘテロマーカリウムチャネルタンパク質を形成するために必要な情報をコードする一次構造を示す。ソフトウエアは、この１次配列によりコードされる特定のパラメータを調べて構造モデルを生成する。これらのパラメータは、「エネルギー項」または異方性項と呼ばれ、主に静電ポテンシャル、疎水性ポテンシャル、溶媒接近可能表面、および水素結合を含む。二次エネルギー項は、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａａｌｓポテンシャルを含む。生物学的分子は、累積様式において、エネルギー項を最小にする構造を形成する。従って、コンピュータプログラムは、１次構造またはアミノ酸配列によりコードされるこれらの項を使用して、２次構造モデルを生成する。
【０２１０】
次いで、２次構造によりコードされるタンパク質の３次構造は、２次構造のエネルギー項を元にして形成される。ユーザは、この時点で、そのタンパク質が膜結合性もしくは可溶性のどちらであるか、体内での位置、およびその細胞の位置（例えば、細胞質、表面または核）のようなさらなる変数を入力し得る。これらの変数は、２次構造のエネルギー項と共に、３次構造のモデルを形成するために使用される。３次構造モデリングにおいて、コンピュータプログラムは、同種の２次構造の疎水性面を照合し、そして同種の２次構造の親水性面を照合する。
【０２１１】
一旦、構造が生成されると、有力なリガンド結合領域が、コンピュータシステムにより同定される。有力なリガンドについての３次元構造は、上記のように、アミノ酸配列もしくはヌクレオチド配列、または化合物の化学式を入力することにより生成される。有力なリガンドの３次元構造は、次いでＳｌｏ２またはＳｌｏ４に結合するリガンドを同定するためにＳｌｏ２またはＳｌｏ４タンパク質の３次元構造と比較される。タンパク質とリガンドとの結合親和性は、どのリガンドがタンパク質に対する結合の増大した可能性を有するかを決定するために、エネルギー項を使用して決定される。
【０２１２】
コンピュータシステムはまた、Ｓｌｏ２遺伝子またはＳｌｏ４遺伝子の変異、多形改変体、対立遺伝子および種間ホモログについてスクリーニングするために使用される。このような変異は、疾患状態に関連し得る。一旦、改変体が同定されると、診断アッセイを使用して、疾患状態に関連したこのような変異した遺伝子を有する患者を同定し得る。変異したＳｌｏ２遺伝子またはＳｌｏ４遺伝子の同定は、第１の核酸（例えば、配列番号１または３）またはＳｌｏ２またはＳｌｏ４をコードするアミノ酸配列（例えば、配列番号２または４）、および保存的に改変されたそれらのバージョン、または保存領域を含むアミノ酸配列（例えば、孔ループまたはテールドメイン）の入力を受信することを含む。この配列は、上記のようにコンピュータシステムに入力される。第１の核酸またはアミノ酸配列は、次いで第１の配列との実質的な同一性を有する第２の核酸またはアミノ酸配列と比較される。この第２の配列は、上記の様式でコンピュータシステムに入力される。一旦この第１の配列および第２の配列が比較されると、これらの配列の間のヌクレオチドまたはアミノ酸の差異が.同定される。このような配列は、Ｓｌｏ２遺伝子またはＳｌｏ４遺伝子（好ましくはヒトのＳｌｏ２遺伝子またはＳｌｏ４遺伝子）おける対立遺伝子の差異および疾患状態に関連する変異を示し得る。上記の第１および第２の配列は、コンピュータ読み取り可能な基材に保存され得る。
【０２１３】
Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４モノマーをコードする核酸を、高密度オリゴヌクレオチドアレイ技術（例えば、ＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭ）と共に使用して、本発明におけるＳｌｏ２またはＳｌｏ４のホモログ、オルソログ、対立遺伝子、保存的に改変された改変体、および多型改変体を同定し得る。同定されるホモログが、公知の疾患に関連する場合、これらのホモログは、ＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭと共に診断ツールとして生物学的サンプル中における疾患を検出する際に使用され得る（例えば、Ｇｕｎｔｈａｎｄら、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  １４：８６９−８７６（１９９８）；Ｋｏｚａｌら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：７５３−７５９（１９９６）；Ｍａｔｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２４：１１０−１０６  （１９９５）；Ｌｏｃｋｈａｒｔら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１６７５−１６８０（１９９６）；Ｇｉｎｇｅｒａｓら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．８：４３５−４４８（１９９８）；Ｈａｃｉａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：３８６５−３８６６（１９９８）を参照のこと。
【０２１４】
（ＶＩＩＩ．細胞トランスフェクションおよび遺伝子治療）
本発明は、インビトロおよびインビボでの細胞のトランスフェクションのためのＳｌｏ２またはＳｌｏ４の核酸を提供する。これらの核酸は、以下に記載されるような標的細胞および生物のトランスフェクションのために多数の周知のベクターのいずれかに挿入され得る。この核酸は、ベクターと標的細胞との相互作用により、エキソビボまたはインビボで細胞にトランスフェクトされる。Ｓｌｏ２またはＳｌｏ４の核酸は、プロモーターの制御下で、次いで本発明のＳｌｏ２モノマーまたはＳｌｏ４モノマーを発現し、これによりＳｌｏ２またはＳｌｏ４遺伝子の非存在、部分的不活化、または異常発現の影響を緩和する。組成物は、患者における治療的応答を惹起するのに十分な量で患者に投与される。これを達成するために適切な量は、「治療有効用量または治療有効量」として定義される。
【０２１５】
このような遺伝子治療手順は、多数の状況において、後天性および先天性の遺伝子欠損、癌、およびウイルス感染を修正するために使用されてきた。ヒトにおいて人工遺伝子を発現する能力は、その他の治療による処置に影響を受けない多くの疾患を含む、多くの重要なヒトの疾患の予防および／または治癒を促進する（遺伝子治療手順の概説については、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：８０８−８１３（１９９２）；Ｎａｂｅｌ＆Ｆｅｌｇｎｅｒ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：２１１−２１７（１９９３）；Ｍｉｔａｎｉ＆Ｃａｓｋｅｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：１６２−１６６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９２６−９３２（１９９３）；Ｄｉｌｌｏｎ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：１６７−１７５（１９９３）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３５７：４５５−４６０（１９９２）；Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６（１０）：１１４９−１１５４（１９９８）；Ｖｉｇｎｅ，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ８：３５−３６（１９９５）；Ｋｒｅｍｅｒ＆Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ５１（１）：３１−４４（１９９５）；Ｈａｄｄａｄａら，ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （Ｄｏｅｒｆｌｅｒ＆Ｂｏｅｈｍ編，１９９５）；およびＹｕら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：１３−２６（１９９４）を参照のこと）。
【０２１６】
遺伝子または遺伝物質の細胞への送達は、疾患の遺伝子治療処置における第１の段階である。多数の送達方法が当業者に周知である。好ましくは、核酸は、インビボまたはエキソビボの遺伝子治療用途のために投与される。非ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡプラスミド、裸の核酸、および送達ビヒクル（例えばリポソーム）と複合体化した核酸が挙げられる。ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡウイルスおよびＲＮＡウイルスが挙げられ、これらは、細胞への送達後もエピソームゲノムまたは組み込まれたゲノムのいずれかを有する。
【０２１７】
核酸の非ウイルス送達の方法としては、リポフェクション、マイクロ注入、バイオリスティクス（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）、ビロソーム（ｖｉｒｏｓｏｍｅ）、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸結合体、裸のＤＮＡ，人工ビリオン、およびＤＮＡの因子増強取り込みが挙げられる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、米国特許第４，９４６，７８７号；および米国特許第４，８９７，３５５号に記載され、そしてリポフェクション試薬は、市販されている（例えば、ＴｒａｎｓｆｅｃｔａｍＴＭおよび  ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎＴＭ）。ポリヌクレオチドの効率的なレセプター認識リポフェクションに適切なカチオン性脂質および中性脂質としては、Ｆｅｌｇｎｅｒの脂質（ＷＯ９１／１７４２４、ＷＯ９１／１６０２４）が挙げられる。送達は、細胞へ（エキソビボ投与）かまたは標的組織へ（インビボ投与）の送達であり得る。
【０２１８】
脂質：核酸複合体（イムノリピド複合体のような標的化リポソームを含む）の調製は、当業者に周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４０４−４１０（１９９５）；Ｂｌａｅｓｅら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：２９１−２９７（１９９５）；Ｂｅｈｒら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：３８２−３８９（１９９４）；Ｒｅｍｙら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：６４７−６５４（１９９４）；Ｇａｏら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：７１０−７２２（１９９５）；Ａｈｍａｄら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：４８１７−４８２０（１９９２）；米国特許第４，１８６，１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号、および同第４，９４６，７８７号を参照のこと）。
【０２１９】
核酸の送達のためのＲＮＡウイルスベースまたはＤＮＡウイルスベースの系の使用は、ウイルスを体内の特定の細胞に標的化し、そしてウイルスのペイロード（ｐａｙｌｏａｄ）を核へ輸送するための高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、直接患者に投与されるか（インビボ）、またはウイルスベクターを使用してインビトロで細胞を処理するために使用され得、改変された細胞が患者に投与される（エキソビボ）。核酸の送達のための従来のウイルスベースの系は、遺伝子移入のためにレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよび単純疱疹ウイルスのベクターを含み得た。ウイルスベクターは、現在では最も有効で多目的な、標的細胞および組織への遺伝子移入方法である。宿主ゲノムへの取り込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルス遺伝子移動方法で可能であり、しばしば挿入された導入遺伝子の長期の発現をもたらす。さらに、高い導入効率が、多くの異なる細胞型および標的組織において観察された。
【０２２０】
ウイルス（例えば、レトロウイルス）の向性は、外来エンベロープタンパク質を組み込み、標的細胞の潜在的標的集団を増殖させることにより改変され得る。レンチウイルスベクターは、分裂していない細胞を形質導入し得るか、または分裂していない細胞に感染し得、そして代表的には高いウイルス力価を生じ得るレトロウイルスベクターである。従って、レトロウイルス遺伝子移入系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、６〜１０ｋｂまでの外来配列についてのパッケージング能を有するシス作用性長末端反復から構成される。最小のシス作用性ＬＴＲが、ベクターの複製およびパッケージングに十分であり、次いで、このＬＴＲは、標的細胞へ治療遺伝子を組み込むために用いられて、永続的な導入遺伝子発現が提供される。広く用いられるレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ｇｉｂｂｏｎ  ａｐｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ）（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびこれらの組み合わせ（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１−２７３９（１９９２）；Ｊｏｈａｎｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５−１６４０（１９９２）；Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔら，Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８−５９（１９９０）；Ｗｉｌｓｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４−２３７８（１９８９）；Ｍｉｌｌｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０−２２２４（１９９１）；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照のこと）に基づくベクターが挙げられる。
【０２２１】
核酸の一時的な発現が好ましい適用において、アデノウイルスベースの系が、代表的には用いられる。アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞型において非常に高い形質導入効率の能力があり、細胞分裂を要しない。このようなベクターを用いて、高い力価および高いレベルの発現が得られた。このベクターは、比較的単純な系において多量に生成することができる。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターはまた、標的核酸を用いて細胞を形質導入するために（例えば、核酸およびペプチドのインビトロ生成において、ならびにインビボおよびエキソビボでの遺伝子治療手順のために）用いられる（例えば、Ｗｅｓｔら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６０：３８−４７（１９８７）；米国特許第４，７９７，３６８号；ＷＯ９３／２４６４１；Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７９３−８０１（１９９４）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）を参照のこと）。組換えＡＡＶベクターの構築は、多くの刊行物（米国特許第５，１７３，４１４号；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５：３２５１−３２６０（１９８５）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔ＆Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６４６６−６４７０（１９８４）；およびＳａｍｕｌｓｋｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２−３８２８（１９８９）が挙げられる）において記載される。
【０２２２】
遺伝子治療ベクターは、以下に記載されるように、個々の患者への投与により（代表的には、全身性投与（例えば、静脈内注入、腹腔内注入、筋肉内注入、皮下注入、または頭蓋内注入）により、または局所投与により）インビボで送達され得る。あるいは、ベクターは、エキソビボで個々の患者から外植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄吸引、組織生検）または万能給血者の造血幹細胞に送達され得、続いて、（通常は、ベクターが組み込まれた細胞を選択した後に）患者に細胞が再移植され得る。
【０２２３】
診断、研究、または遺伝子治療（例えば、トランスフェクトした細胞の宿主生物への再注入による）のためのエキソビボ細胞トランスフェクションは、当業者に周知である。好ましい実施形態において、細胞が、被験体生物から単離され、核酸（遺伝子またはｃＤＮＡ）を用いてトランスフェクトされ、被験体生物（例えば、患者）に再注入されて戻される。エキソビボトランスフェクションに適切な種々の細胞型が、当業者に周知である（例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙら，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（第３版、１９９４）および患者から細胞を単離し、培養する方法の議論については、そこに引用される参考文献を参照のこと）。
【０２２４】
治療核酸を含むベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソームなど）はまた、インビボで細胞を形質導入するために、生物に直接投与され得る。あるいは、裸のＤＮＡが投与され得る。投与は、分子を導入して、血液または組織細胞に最終的に接触させるために通常用いられる任意の経路による。このような核酸を投与する適切な方法が利用可能であり、かつ当業者に周知である。１を超える経路が特定の組成物を投与するために用いられ得るが、特定の経路が、しばしば、別の経路より即座かつより有効な反応を提供し得る。
【０２２５】
投与は、分子を導入して、血液または組織細胞に最終的に接触させるために通常用いられる任意の経路による。核酸は、任意の適切な様式で、好ましくは、薬学的に受容可能なキャリアとともに投与される。このような核酸を投与する適切な方法が利用可能であり、かつ当業者に周知である。１を超える経路が特定の組成物を投与するために用いられ得るが、特定の経路が、しばしば、別の経路より即座かつより有効な反応を提供し得る。
【０２２６】
（ＩＸ．薬学的組成物および投与）
薬学的に受容可能なキャリアは、投与される特定の組成物（例えば、核酸、タンパク質、調節性化合物または形質導入された細胞）、およびこの組成物を投与するために用いられる特定の方法により、一部決定される。従って、本発明の薬学的組成物の広範な適切な処方が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１７版，１９８９）。投与は、任意の従来の様式（例えば、注射、経口投与、吸入、経皮適用または直腸投与による）であり得る。
【０２２７】
経口投与に適切な処方物は、以下からなり得る：（ａ）液体溶液（例えば、希釈液（例えば、水、生理食塩水またはＰＥＧ４００）中に懸濁された、有効量のパッケージングされた核酸）；（ｂ）カプセル、サシェまたは錠剤（各々が、液体、固体、顆粒またはゼラチンとして所定量の活性成分を含む）；（ｃ）適切な液体中の懸濁物；および（ｄ）適切な乳濁液。錠剤形態は、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、コーンスターチ、ポテトスターチ、微結晶セルロース、ゼラチン、コロイド性二酸化ケイ素、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、および他の賦形剤、着色剤、充填剤、結合剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤、矯味矯臭剤、色素、崩壊剤、および薬学的に適合性のキャリアのうちの１以上を含み得る。ロゼンジ形態は、香料（ｆｌａｖｏｒ）（例えば、スクロース）中に活性成分を含み得、ならびに、香錠は、活性成分に加えて、当該分野で公知のキャリアを含む不活性基剤（例えば、ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシア乳濁液、ゲルなど）中に活性成分を含む。
【０２２８】
選択した化合物（単独か、または他の適切な成分と組み合わせられる）は、吸入を介して投与されるエアロゾル処方物（すなわち、霧状にされ得る）に作製され得る。エアロゾル処方物は、加圧された受容可能なプロペラント（例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素など）に入れられ得る。
【０２２９】
例えば、関節内（関節中）経路、静脈内経路、筋肉内経路、皮内経路、腹腔内経路、および皮下経路のような非経口投与に適切な処方物としては、水性および非水性の、等張滅菌注射溶液（これは、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、および処方物を意図されたレシピエントの血液と等張性にする溶質を含み得る）、水性および非水性の滅菌懸濁液（懸濁剤、可溶化剤、濃稠化剤、安定化剤ならびに保存剤を含み得る）が挙げられる。本発明の実施において、組成物は、例えば、静脈内注入、経口投与、局所投与、腹腔内投与、嚢内投与、または髄腔内投与により投与され得る。非経口投与および静脈内投与は、好ましい投与方法である。推奨される処方物は、単位用量または複数用量が密封された容器（例えば、アンプルおよびバイアル）中で与えられ得る。
【０２３０】
注射溶液および懸濁液は、滅菌粉末、顆粒および以前記載された種類の錠剤から調製され得る。エキソビボ治療のための核酸により形質導入された細胞はまた、上記のように、静脈内投与または非経口投与され得る。
【０２３１】
本発明の状況において、患者に投与される用量は、経時的に患者に有益な治療的応答をもたらすに十分であるはずである。この用量は、用いられる特定のベクターの効率および患者の状態、ならびに処置される患者の体重または表面積により決定され得る。用量の大きさはまた、特定のベクターの投与に付随する任意の有害な副作用の存在、性質、および程度、または特定の患者における形質導入された細胞型により決定される。
【０２３２】
Ｓｌｏ２サブユニットまたはＳｌｏ４サブユニットを含むＳｌｏチャネルの減少した発現または異常な発現に起因した状態の処置または予防において投与されるベクターの有効量を決定する際に、医師は、ベクターの循環血漿レベル、ベクター毒性、疾患の進行度および抗ベクター抗体の生成を評価する。一般に、ベクターに由来する裸の核酸に等しい用量は、代表的な７０ｋｇの患者に対して、約１μｇ〜約１００μｇであり、レトロウイルス粒子を含むベクターの用量は、等価な量の治療核酸を生じるように計算される。
【０２３３】
投与のために、本発明の化合物および形質導入細胞が、患者の体重および全体的な健康状態に対して適用される、インヒビター、ベクターまたは形質導入細胞型のＬＤ５０、および種々の濃度のインヒビター、ベクターまたは細胞型の副作用により決定される割合で投与され得る。投与は、単回用量または分割された用量を介して達成され得る。
【０２３４】
（Ｘ．キット）
ヒトＳｌｏ２またはＳｌｏ４およびそれらのホモログは、カリウムチャネルの発現および調節を試験するために有用なツールである。ｈＳｌｏ２核酸またはｈＳｌｏ４核酸に特異的にハイブリダイズするヒトＳｌｏ２特異的またはＳｌｏ４特異的試薬（例えば、ｈＳｌｏ２またはｈＳｌｏ４のプローブおよびプライマー）、ならびにｈＳｌｏ２タンパク質またはｈＳｌｏ４タンパク質に特異的に結合するｈＳｌｏ２特異的試薬またはｈＳｌｏ４特異的試薬（例えば、ｈＳｌｏ２抗体またはｈＳｌｏ４抗体）は、発現および調節を試験するために用いられる。
【０２３５】
サンプル中のｈＳｌｏ２またはｈＳｌｏのＤＮＡおよびＲＮＡの存在についての核酸アッセイとしては、例えば、サザン分析、ノーザン分析、ドットブロット、ＲＮａｓｅ保護、Ｓ１分析、増幅技術（例えば、ＰＣＲおよびＬＣＲ）、およびインサイチュハイブリダイゼーションのような当業者に公知の多くの技術が挙げられる。例えば、インサイチュハイブリダイゼーションにおいて、標的核酸は、その後の解釈および分析にのために細胞形態を維持しながら細胞内のハイブリダイゼーションに利用可能であるようなその細胞周辺から遊離される。以下の論文は、インサイチュハイブリダイゼーションの分野の概説を提供する：Ｓｉｎｇｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２３０−２５０（１９８６）；Ｈａａｓｅら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第ＶＩＩ巻，１８９−２２６頁（１９８４）；およびＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｈａｍｅｓら編、１９８７）。さらにｈＳｌｏ２タンパク質またはｈＳｌｏ４タンパク質は、上記の種々の免疫アッセイ技術を用いて検出され得る。試験サンプルは、代表的には、ポジティブコントロール（例えば、組換えＳｌｏ２モノマーまたは組換えＳｌｏ４モノマーを発現するサンプル）およびネガティブコントロールの両方と比較され得る。
【０２３６】
本発明はまた、本発明のカリウムチャネルのモジュレーターをスクリーニングするためのキットを提供する。このようなキットは、容易に入手可能な材料および試薬から調製され得る。例えば、このようなキットは、以下の材料のうちのいずれか１以上を含み得る：Ｓｌｏ２モノマーまたはＳｌｏ４モノマー、反応チューブ、およびＳｌｏ２またはＳｌｏ４を含むカリウムチャネルの活性を試験するための説明書。広範なキットおよび構成成分が、キットの意図されたユーザーおよびこのユーザーの特定の必要性に依存して、本発明に従って調製され得る。例えば、キットは、Ｓｌｏ２モノマーまたはＳｌｏ４モノマーを含むカリウムチャネルの活性を測定するためのインビトロアッセイまたはインビボアッセイのためにテーラーメイドで作製され得る。
【０２３７】
本明細書中に引用された全ての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物または特許出願が、具体的かつ個々に援用されることが示されているかのように、本明細書中に参考として援用される。
【０２３８】
前述の発明は、理解を明瞭にする目的で例示および例によって幾分詳細に記載されてきたが、本発明の教示に鑑みて、特定の変更および改変が、添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明に対して行われ得ることは、当業者に容易に明らかである。
【０２３９】
（実施例）
以下の実施例は、例示のみにより提供されるのであって、限定されるものとして提供されない。当業者は、本質的に類似の結果が得られるように、変更または改変され得る種々の重要ではないパラメーターを認識する。
【０２４０】
（実施例１：ヒトＳｌｏ２のクローニングおよび発現）
（Ａ．クローニング）
ヒトＳｌｏ２配列のフラグメントを、ヒトＳｌｏ１（大きいコンダクタンスのカルシウム活性化カリウムチャネル）のアミノ酸配列に対する相同性を検索するために、ＢＬＡＳＴにより、ＮＣＢＩのヒトＥＳＴデータベースにおいて同定した。Ｓｌｏ２の１つのＥＳＴであるＲ８７８５５を同定し、取り寄せ、完全に配列決定した。このクローンは、Ｓｌｏ１配列（Ｓｌｏ１は、長さが３Ｋｂを超える）に含まれる長いＣ末端細胞質ドメインに対して相同性を有する、約７００ｂｐの配列を含んでいた。この遺伝子の５’末端も３’末端も、このクローン中には存在せず、このことは、このクローンがＳｌｏ２遺伝子のごく小さなフラグメントを示すことが示唆される。ｃＤＮＡを、既にＳｌｏ２と名付けられたＣ．ｅｌｅｇａｎｓカリウムチャネルと最も大きな相同性を共融したので、Ｓｌｏ２と名付けた。しかし、ヒトＳｌｏ２およびＣ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子は、オルソログではないことに注意のこと。
【０２４１】
ヒトＳｌｏ２遺伝子の３’末端は、テンプレートとしてヒト海馬ｃＤＮＡを用いてＲＡＣＥ  ＰＣＲをネストで（ｎｅｓｔｅｄ）２回行ってクローニングした。ＲＡＣＥ  ＰＣＲは、遺伝子特異的オリゴを、ｃＤＮＡのプールに存在する非特異的タグに対するオリゴとともに用いて、そのプールに由来する遺伝子の末端を増幅する技術である。１回目において、用いた遺伝子特異的センスプライマーは、５’−ＣＡＣＣＡＣＧＧＡＧＣＴＣＡＣＣＣＡＣＣＣＴＴＣＣ−３’（１）（配列番号５）であった。次いで、この反応系の少量のアリコートを、（１）の３’側をネスト化したＳｌｏ２遺伝子特異的センスオリゴ：５’−ＣＧＣＧＴＣＴＴＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣＡＴＧＴＴＧＧＡＣ−３’（２）（配列番号６）を用いて再増幅した。両方の遺伝子特異的オリゴを、Ｒ８７８５５  ＥＳＴクローンの配列から得た。約６００ｂｐ〜約２Ｋｂにわたる４つのｃＤＮＡを単離し、配列決定した。約１．８Ｋｂのフラグメントを配列決定し、Ｓｌｏ２コード領域の３’末端および３’ＵＴＲ配列を含むことが見出された。
【０２４２】
数回の５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲを用いて、ヒトＳｌｏ２の５’末端の大部分をクローニングした。まず、２回のネスト５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲを用いて、Ｒ８７８５５  ＥＳＴ配列に基づくＳｌｏ２特異的アンチセンスオリゴを用いて、ヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーから約５００ｂｐのＳｌｏ２フラグメントを増幅した。最初の回において、使用した遺伝子特異的アンチセンスオリゴは、５’−ＣＴＧＧＴＡＧＡＧＣＡＧＴＧＴＧＴＣＣＡＡＣＡＴＧＣＴＧ−３’（３）（配列番号７）であった。この反応系の少量のアリコートを、より大きな５’Ｓｌｏ２アンチセンスオリゴ：５’−ＡＣＴＧＣＡＴＧＡＡＧＣＧＣＡＴＧＴＴＧＧＡＡＧＧＧＴＧ−３’（４）（配列番号８）を用いて再増幅して、フラグメントを得た。このフラグメントは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  Ｓｌｏ２遺伝子に対する有意な相同性を含んでいたが、明らかに、５’完全ｃＤＮＡを示さなかった。
【０２４３】
２つの新たなＳｌｏ２アンチセンスオリゴを、この約５００ｋｂフラグメントの５’末端に基づいて設計した。
【０２４４】
２回のネスト（ネスティド（ｎｅｓｔｅｄ））５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲを用い、これらのオリゴを使用して約１Ｋｂの長さのフラグメントを得た。１回目に用いた遺伝子特異的アンチセンスオリゴは、５’−ＣＣＣＡＴＴＧＣＣＧＧＣＣＧＴＣＴＣＴＧＣＣＧＡＧ−３’（５）（配列番号９）であった。この反応物の小さなアリコートを、より５’のＳｌｏ２アンチセンスオリゴ５’−ＣＴＴＧＡＡＣＣＣＧＴＡＧＧＣＣＴＴＧＧＣＧＴＣＴＴＣ−３’（６）（配列番号１０）を用いて増幅して、１Ｋｂのフラグメントを得た。これらのフラグメントは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  Ｓｌｏ２に対して３０％を超える同一性を有し、Ｓｌｏ１に対しては低いレベルの相同性を有するアミノ酸をコードしていた。これらのフラグメントは、不完全なｃＤＮＡを示した。なぜならば、このフラグメントは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  Ｓｌｏ２遺伝子の中央（これは、ヒトＳｌｏ２フラグメントに相同な領域の上流の１Ｋｂを超えるコード配列を含む）に対して相同であるからである。この５’ＰＣＲを、上記５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲフラグメントから得た、最も５’側の配列に基づく２つの新規のヒトＳｌｏ２特異的アンチセンスオリゴを用いて繰り返した。用いたこの新規のオリゴは、１回目において、５’−ＣＡＣＡＣＣＡＣＧＴＧＧＴＣＡＧＣＡＡＡＣＴＴＧＡＣＧ−３’（７）（配列番号１１）であり、そして２回目において、５’−ＧＣＡＧＴＴＧＧＧＧＧＣＧＡＡＧＴＣＣＴＴＣＡＣＧＧ−３’（８）（配列番号１２）であった。約１．２Ｋｂのフラグメントを、２回目の反応物から単離し、そして配列決定した。このバンドは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  Ｓｌｏ２の５’領域に対する相同性を含むが、明白な開始コドンを含まないことが見出された。新規にクローン化したラット遺伝子であるラットＳＬＡＣＫ（Ｊｏｉｎｅｒら、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１：４６２−９（１９９８））に対する比較もまた、ヒトＳｌｏ２配列が、おそらく５’不完全であったことを示した。Ｊｏｉｎｅｒらによりクローン化されたｃＤＮＡは、９０％を超えるアミノ酸同一性を共有するヒトＳｌｏ２のラットオルソオグであるようであった。
【０２４５】
上記の全てのＲＡＣＥ  ＰＣＲを産物を、比較的標準的な条件のセットの下で、生成した。変性を、９５℃にて１５秒間実行し、７２〜６０℃の範囲の温度にて１５秒間アニーリングし、そして伸長を、産物の長さに依存して７２℃にて９０秒〜３分間実行した。３５〜４０サイクルのＰＣＲからなる１回目のＲＡＣＥ反応は、２０〜３０サイクルからなる再増幅をネストした。
【０２４６】
５’側が不完全である（しかしその他は全長である）ヒトＳｌｏ２配列を含むクローンを、オーバーラップ（ｏｖｅｒｌａｐ）伸長ＰＣＲを用いて構築し、そして３つのＳｌｏ２フラグメントを、ヒト海馬ｃＤＮＡから増幅した。約１．３Ｋｂの５’フラグメントを、センスオリゴ５’−ＣＡＣＣＴＴＣＡＡＧＧＡＧＣＧＧＣＴＣＡＡＧＣＴＧ−３’（９）（配列番号１３）およびアンチセンスオリゴ５’−ＧＡＣＧＴＧＴＧＣＡＣＣＡＧＣＡＧＧＧＴＧＡＴＧＡＧ−３’（１０）（配列番号１４）を用いて増幅した。Ｓｌｏ２配列の中央を、オリゴ（センス）５’−ＧＴＴＴＣＡＣＧＴＣＡＡＧＴＴＴＧＣＴＧＡＣＣＡＣＧ−３’（１１）（配列番号１５）およびオリゴ（アンチセンス）５’−ＣＣＧＴＡＣＧＴＧＣＧＧＡＴＣＣＡＣＡＧＧＴＣＧ−３’（１２）（配列番号１６）を用いて１．５５Ｋｂフラグメントとして増幅した。Ｓｌｏ２コード配列の３’末端を、センスオリゴ５’−ＣＧＴＧＡＡＧＧＡＣＴＡＣＡＴＧＡＴＣＡＣＣＡＴＣ−３’（１３）（配列番号１７）およびアンチセンスオリゴ
【０２４７】
【化７】
2005507633.tif 000006
（１４）（配列番号１８）を用いて増幅して、８００ｂｐのフラグメントを生成した。後者のオリゴは、予想Ｓｌｏ２終止コドンおよびＳｌｏ２コードの３’末端（太字）、ならびに５’末端にサブクローニングのためのＸｂａＩ部位を含む。Ｓｌｏ２に対応する太字の配列のみを、Ｓｌｏ２を増幅するために用いることに注目すべきである。これらのフラグメントを、２回の標準的なオーバーラップ伸長ＰＣＲを用いて、単一のフラグメントにアセンブルした。初めに、５’および中央のフラグメントを混合し、そしてオリゴ９および１２を用いて増幅して、約２．８Ｋｂのフラグメントを生成した。同様に、中央および３’末端のフラグメントを混合し、そしてオリゴ１１および１４を用いて増幅して、約２．３Ｋｂのフラグメントを生成した。次いで、これらの２つのより大きなフラグメントを混合し、そしてオリゴ９および１４を用いて増幅して、全ての既知のヒトＳｌｏ２配列を含む３．５Ｋｂのフラグメントを生成した。このフラグメントをプラスミドベクターにクローン化し、そして複数のクローンを配列決定して、この領域に関する最終的なヒトＳｌｏ２配列を決定した。Ｓｌｏ２のコード領域を増幅するために用いた条件は、Ｓｌｏ２  ＲＡＣＥ反応について上記した条件に類似した。１つの顕著な例外は、所望のフラグメントの大きなサイズに起因して、より長い伸長時間（４分）がオーバーラップ反応の間に許容されたことである。
【０２４８】
ヒトＳｌｏ２についての潜在的な５’末端を、公に利用可能なヒトゲノムＤＮＡ配列に対してラットＳＬＡＣＫ配列をＢＬＡＳＴ検索することにより同定した。ラットＳｌａｃｋのアミノ酸１〜５２をコードするＤＮＡ配列に対して相同なエキソンを同定した。Ｒａｔ  ＳＬＡＣＫに対する相同性に基づいて、このエキソンは、ヒトＳｌｏ２コード配列の５’末端を含んでいた。完全な推定ヒトＳｌｏ２コード配列を、本明細書中に記載される３．５Ｋｂ構築物の配列、５’末端エキソン、およびＢＬＡＳＴ検索において同定した２つの他のエキソンを用いて構築した。この完全コード配列  対  ヒトＳｌｏ２ゲノム配列のＢＬＡＳＴ分析は、ｈＳｌｏ２コード配列が、少なくとも３０のエキソンに分割されることを示す。このｃＤＮＡ配列は、クローン化ｃＤＮＡなしには、ゲノムＤＮＡから予想され得なかった。
【０２４９】
Ｓｌｏ２の５’末端を、オーバーラップ伸長ＰＣＲスクリーニングを用いてヒト脳ｃＤＮＡから増幅した。開始コドンおよびＳｌｏ２の最初の２００ｂｐを含むフラグメントを、センスオリゴ
【０２５０】
【化８】
2005507633.tif 000007
（１５）（配列番号１９）およびアンチセンスオリゴ５’−ＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＧＡＧＴＣＣＡＧＧＣＴＧＡＡ−３’（１６）（配列番号２０）を用いて増幅した。Ｓｌｏ２に一致する１５の太字の塩基のみを、Ｓｌｏ２の増幅のために用い；５’の塩基は、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列を追加し、そして発現ベクター構築のためにのみ含まれる。第１のフラグメントおよび３．５ＫｂのＳｌｏ２クローン中の固有のＨｉｎｄ  ＩＩＩ制限部位をオーバーラップした約４００ｂｐの第２のフラグメントを、オリゴ５’−ＣＧＴＧＧＧＣＣＡＧＡＧＧＣＴＴＣＣＴＧＴＡＧＡＡ−３’（１７）（配列番号２１）および５’−ＧＣＴＣＣＣＡＧＡＴＧＴＴＧＣＣＴＴＴＧＴＡＧＣＴＧ−３’（１８）（配列番号２２）を用いて増幅した。これらの２つのフラグメントを混合し、そしてオリゴ１５および１８を用いて増幅して、Ｓｌｏ２の開始メチオニンおよび固有のＳｌｏ２  Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ部位の両方を含む、約５５０ｂｐのフラグメントを生成した。このフラグメントを、標準的なプラスミドにクローン化し、そして３つのクローンを配列決定した。各クローンは、本発明者らのｃＤＮＡおよびゲノム情報から導き出したコンセンサスヒトＳｌｏ２と同一であった。次いで、５’末端フラグメントおよび３．５Ｋｂ  Ｓｌｏ２フラグメントを、標準的なＤＮＡクローニング法によって、これらに共通するＨｉｎｄ  ＩＩＩ制限部位で連結することにより、全長Ｓｌｏ２コード領域をアセンブルした。
【０２５１】
最近、大きいが部分的なヒトＳｌｏ２  ｃＤＮＡが、ＮＣＢＩデータベースに登録された（ＫＩＡ１４２２、登録番号ＡＢ０３７８４３）。このクローンは、いくつかのキー溝（ｋｅｙ  ｗａｙ）において、上記完全ヒトＳｌｏ２クローンとは異なる（図１を参照のこと）。最も重要なことだが、これは、３’末端で不完全である。ヒトＳｌｏ２のカルボキシ末端の１２７のアミノ酸をコードするＤＮＡは、ＫＩＡＡ１４２２から失われている。さらに、ＫＩＡＡ１４２２は、代替的な５’末端を有する。このＫＩＡＡ１４２２リーディングフレームは、５’末端でオープンなままであるので、ＫＩＡＡ１４２２  ｃＤＮＡは、完全な代替的な５’末端を有するクローン（内部メチオニンコドンの１つで開始するタンパク質を有する）を示すか否か、あるいは、これは５’が不完全なクローンを示すか否か、不明確である。最終的に、ＫＩＡＡ１４２２は、ｈＳｌｏ２配列中のアミノ酸６５０の等価な位置に、２つのアミノ酸挿入（ＧＴ）を含む。
【０２５２】
上記に列挙した、番号を付けたオリゴヌクレオチドを、種々の組み合わせで用い、上記の条件を使用して、ヒト脳ｃＤＮＡのような適切なテンプレートからｈＳｌｏ２  ｃＤＮＡの部分を増幅し得る。オリゴ１４〜１７は、ＫＩＡＡ１４２２配列に含まれず、そしてこれらのオリゴの少なくとも１つを含むオリゴ対を用いて、ＫＩＡＡ１４２２配列から誘導され得ないフラグメントを増幅し得る。オリゴ１７を、１８、８、７、６、５、４、３および１４と対合させて、それぞれ、約４１５ｂｐ、１．２５Ｋｂ、１．３Ｋｂ、２．１９Ｋｂ、２．２３Ｋｂ、２．５９Ｋｂ、２．７４Ｋｂおよび３．５８Ｋｂのフラグメントを生成し得る。上記の組み合わせにおいて、１７の代わりにオリゴ１５を用いて、上記に列挙したものよりも、約１５０ｂｐより長いフラグメントを生成し得る。さらに、オリゴ１４を、９、１１、１、２および１３と対合させて、それぞれ、約３．４９Ｋｂ、２．２９Ｋｂ、１．０３Ｋｂ、８８０ｂｐおよび８３０ｂｐのフラグメントを生成し得る。上記に列挙したオリゴ対は、ＫＩＡＡ１４２２を増幅しない。これらの増幅物の少なくとも１つが、１つの遺伝子から得られ得、そしてこのフラグメントの配列が、ヒトＳｌｏ２の配列に実質的に同一である場合、この配列を、ヒトＳｌｏ２の一種とみなすべきである。ＫＩＡＡ１４２２およびヒトＳｌｏ２の両方を増幅する他の顕著な対は、９＋１０および１１＋１２であり、これらを、３．５Ｋｂの５’側が不完全なヒトＳｌｏ２クローンの産生に用いた。
【０２５３】
（Ｂ．ｍＲＮＡ発現）
オリゴ１３および１４を用いて生成した３２Ｐ−標識ＰＣＲフラグメントを用いて調査したノーザンブロットおよびｍＲＮＡドットブロットを、図３に示す。ノーザンブロットにおいて、約５Ｋｂの顕著なバンド（約６Ｋｂに見えるあまり強くないバンドを伴う）が、脳において見られる。類似のバンドが、より低い強度ではあるが、骨格筋において見られる。かすかなシグナルが、心臓および脾臓において見られる。ｍＲＮＡドットブロットは、中枢神経系におけるヒトＳｌｏ２の広範な発現を示す。発現は、小脳、大脳皮質、後頭葉、側頭葉、被殻および中隔側坐核において最も高い。有意なレベルの発現はまた、胎児脳、扁桃、尾状核、前頭葉、海馬、黒質および視床において見出された。ノーザンブロットにおいてＳｌｏ２を発現すると同定された末梢組織に加えて、有意なレベルの発現が、卵巣、胎盤、および胎児脾臓において見出された。
【０２５４】
（Ｃ．Ｘｅｎｏｐｕｓ発現）
ヒトＳｌｏ２の機能的発現を、Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞において試験した。Ｓｌｏ２を、ｐＯＸ発現ベクターにクローン化し、そしてランオフ（ｒｕｎ−ｏｆｆ）ｃＲＮＡ転写物を調製した。これらの転写物を、第４成熟期のＸｅｎｏｐｕｓ卵母細胞に注射し、そして２４〜４８時間に、総細胞２電極電位固定（ｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌ  ｔｗｏ−ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ  ｖｏｌｔａｇｅ  ｃｌａｍｐ）下で試験した。卵母細胞発現手順を、ＪｅｇｌａおよびＳａｌｋｏｆｆ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １７（１）：３２−４４（１９９６）に従って行った。
【０２５５】
図５ａは、ヒトＳｌｏ２を発現する卵母細胞から記録した一連の電流を示す。大きな、外向き整流電圧（ｏｕｔｗａｒｄｌｙ  ｒｅｃｔｉｆｙｉｎｇ  ｃｕｒｒｅｎｔ）が、−１００ｍＶを超える電圧ステップで見られる。類似する電流は、未注入のコントロール卵母細胞では見られなかった。ヒトＳｌｏ２電流の逆転電位は、外部カリウム濃度における変化を伴ってシフトした（図５ｂ）。示される実施例では、Ｓｌｏ２電流の逆転電位は、２ｍＭ〜５０ｍＭの外部カリウム濃度の増加に応じて、ほぼ＋７０ｍＶにシフトする。この大きなシフトは、完全にカリウム選択的であるチャネルについて予想されたシフトと、ほぼ同じくらい大きく、そしてＳｌｏ２チャネルが他のカチオンを超えてカリウムに対して高度に選択的であることを示す。これらの結果はまた、Ｓｌｏ２が電位依存性であることを示す。
【０２５６】
（実施例２：Ｓｌｏ４のクローニングおよび発現）
（Ａ．クローニング）
部分的ヒトＳｌｏ４配列は、ラットＳＬＡＣＫ配列および部分的ヒトＳｌｏ２配列を使用し、３つのデータベース（所有（ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ）データベース、ＮＣＢＩの公のＥＳＴデータベース、およびＮＣＢＩの公のＧｅｎｏｍｅ  Ｓｕｒｖｅｙ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ）のＴＢＬＡＳＴＮ検索を用いて本来同定された。所有クローン５０３５１７０は、ラットＳＬＡＣＫアミノ酸６４６〜７３０に対して６０％同一のアミノ酸を有するＳｌｏ４コード配列の短いストレッチを含んでいた。完全なクローンは、７００ｂｐ未満の挿入物を有した。この全体を配列決定し、そしてこの挿入物の殆どが、イントロン配列を恐らく表していることを決定した。２つのゲノム調査配列（Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｕｒｖｅｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）（ＧＳＳ）である、ＡＱ７０１２２８およびＡＱ８９２６００は、それぞれ、この所有クローンのちょうど５’および３’側に、相同性ラットＳＬＡＣＫを含んでいた。最終的に、公のＥＳＴクローン（ＡＩ７９１９２９）を、ＲＡＴ  ＳＬＡＣＫコード配列の３’末端に対する相同性を有し、そしてＳｌｏ４オープンリーディングフレームに関する終止コドンを含むようであることを確認した。これらのオーバーラップのない配列は、最も５’側の配列（ＡＱ７０１２２８）に基づくセンスオリゴ、５’−ＧＧＣＧＴＣＴＧＣＴＴＧＡＴＴＧＧＴＧＴＴＡＧＧＡ−３’（１９）（配列番号２３）、およびＥＳＴ配列中の終止コドンをオーバーラップするアンチセンスオリゴ、
【０２５７】
【化９】
2005507633.tif 000008
（２０）（配列番号２４）を用いて約１．５Ｋｂのフラグメントを増幅することによって、同じ遺伝子から生じたことを確認した。この増幅したクローンは、ＢＬＡＳＴ検索により同定した４つのクローンの全てに対して同一の配列を含んでいた。これはまた、その長さ全体にわたってヒトＳｌｏ２およびラットＳＬＡＣＫに対する高度な相同性を有していた。
【０２５８】
次いで、上記の完全ヒトＳｌｏ２配列を使用し、ＮＣＢＩ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＨＴＧＳ）のＴＢＬＡＳＴＮ検索を用いて、Ｓｌｏ４の２つの部分ゲノム配列（ＡＬ１３９１３７．１およびＡＬ１３８９３１．１）を発見した。ＡＬ１３８９３１．１は、Ｓｌｏ２に対する相同性を有する１０個のエキソンを含み、これらのエキソンの内３つは、本発明者らが以前に同定した配列よりも、より５’側の配列を含んでいた。最も５’側にあるエキソンは、ヒトＳｌｏ２配列のアミノ酸４４９〜４８４に対する相同性を含んでいた。Ｓｌｏ４コード配列の５’末端をクローン化するために、アンチセンスオリゴを、５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲに使用するために、この新規の配列に基づいて設計した。Ｓｌｏ４特異的アンチセンスオリゴ５’−ＣＣＣＧＧＡＧＣＡＴＣＴＡＣＣＧＴＡＣＡＴＣＴＴＣ−３’（２１）（配列番号２５）を用いる単回のＲＡＣＥ  ＰＣＲは、ヒト脳ｃＤＮＡに由来する約８００ｂｐのフラグメントを生じた。このフラグメントは、Ｓｌｏ４コード配列を、ほぼ５００ｂｐまで、Ｓｌｏカリウムチャネルのポア−ループ（ｐｏｒｅ−ｌｏｏｐ）モチーフに対して高度に相同な領域へ伸長させた。
【０２５９】
Ｓｌｏ４コード配列の５’末端を、第１の５’ＲＡＣＥ試行において得られた新規の配列に基づくＳｌｏ４特異的アンチセンスオリゴを使用する、２回のネストの５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲを用いてクローン化した。用いたＳｌｏ４特異的オリゴは、１回目および２回目において、それぞれ、５’−ＣＣＡＧＣＴＧＴＴＣＡＡＡＣＴＧＴＡＴＧＧＧＴＡＧ−３’（２２）（配列番号２６）および５’−ＧＣＴＴＧＧＡＧＧＡＣＣＡＴＧＴＴＴＣＡＧＧＡＧＴ−３’（２３）（配列番号２７）であった。これらの増幅および第１回目のＳｌｏ４  ５’ＲＡＣＥ試行のための条件は、Ｓｌｏ２についての上記した条件に類似した。約９００ｂｐのフラグメントを、２回目の反応から単離し、そしてＳｌｏ４コード配列の５’末端を含むことを決定した。このフラグメントは、ヒトＳｌｏ２の５’コード領域に対して実質的な相同性を有する、長いオープンリーディングフレームを含む。終止コドンは、メチオニンコドンのすぐ上流でオープンリーディングフレームを停止し、このことは、これが、Ｓｌｏ４の開始メチオニンであることを示す。
【０２６０】
完全なＳｌｏ４コード配列を、開始メチオニンコドンをオーバーラップするセンスオリゴ、
【０２６１】
【化１０】
2005507633.tif 000009
（２４）（配列番号２８）、および終止コドンをオーバーラップするアンチセンスオリゴ、オリゴ番号２０を用いて、単一のフラグメントにおいて増幅した。オリゴ２０および２４において太字で列挙した塩基のみが、Ｓｌｏ４  ＤＮＡ配列に一致する。オリゴ２０において、５’末端の更なる塩基は、サブクローニングを補助するためにＸｂａＩ制限部位を付加する。オリゴ２４において、５’末端の更なる塩基は、サブクローニングのためのＭｕｎＩ部位、およびＳｌｏ４メチオニンコドンでの翻訳開始を促進するためのＫｏｚａｋ配列を付加する。太字で与えた領域のみが、Ｓｌｏ４の増幅のために用いられ；他の塩基は、増幅を得るために存在する必要はない。
【０２６２】
２つのさらなるＳｌｏ４特異的センスオリゴおよび１つのＳｌｏ４特異的アンチセンスオリゴを、Ｓｌｏ４を増幅するために用い得る：
【０２６３】
【化１１】
2005507633.tif 000010
。
【０２６４】
これらのオリゴを、ヒト脳のような適切なｃＤＮＡ供給源から種々のＳｌｏ４フラグメントを増幅するために、上記に列挙した他のＳｌｏ４オリゴと組合わせて使用し得る。２４を、２３、２２、２１、２７、または２０と共に用いて、それぞれ、約７８０ｂｐ、８３０ｂｐ、１．４６Ｋｂ、１．９８Ｋｂおよび３．４Ｋｂのフラグメントを生成し得る。２５を、２１、２７、または２０と共に用いて、それぞれ、２５０ｂｐ、７８０ｂｐおよび２．２Ｋｂ付近のバンドを生成し得る。１９を、２７または２０と共に用いて、約４２０ｂｐおよび１．８５Ｋｂのフラグメントを生成し得る。最後に、２６を、２０と共に用いて、約６００ｂｐのフラグメントを生成し得る。これらの増幅物の少なくとも１つが、１つの遺伝子から得られ得、そしてこのフラグメントの配列が、ヒトＳｌｏ４の配列に実質的に同一である場合、この配列を、ヒトＳｌｏ４の一種とみなすべきである。
【０２６５】
（Ｂ．ｍＲＮＡ発現）
３２Ｐ−標識Ｓｌｏ４  ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズしたヒトノーザンブロットおよびドットブロットを、図７に示す。ノーザンブロットにおいて、約５．５Ｋｂの転写物を殆どの組織において標識した。発現は、肝臓で最も高く、高レベルの発現はまた、脳および心臓でも見出される。より低いレベルの発現を、骨格筋、結腸、脾臓、腎臓、小腸、胎盤および肺において検出する。約９Ｋｂおよび１３Ｋｂのより大きな転写物は、脳および心臓で見られる。これらは、選択的転写物または不完全にプロセスされた転写物を表し得る。４．５Ｋｂの転写物が、肺において見られ、そして選択的転写物を表し得る；これは、完全なＳｌｏ４タンパク質をコードするのに十分に長い。最も高いレベルの発現が、ドットブロットにおいて、肝臓、胎児脳、胎児腎臓および胎児肝臓で見られる。高レベルの発現はまた、精巣、胎児肺、大部分の脳領域、心房、ＧＩ管、肺、胎盤および膀胱において見られる。発現は、ブロットにおいて、多くの他の組織で検出可能である。（Ａ）におけるノーザンの結果との比較に基づいて、これらの低いシグナルは、Ｓｌｏ４発現を表し、バックグラウンドの非特異的ハイブリダイゼーションを表さないようである。
【０２６６】
（Ｃ．Ｘｅｎｏｐｕｓ発現）
ヒトＳｌｏ４の機能的発現を、Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞において試験した。Ｓｌｏ４を、ｐＯＸ発現ベクターにクローン化し、そしてランオフ（ｒｕｎ−ｏｆｆ）ｃＲＮＡ転写物を調製した。これらの転写物を、第４成熟期のＸｅｎｏｐｕｓ卵母細胞に注入し、そして２４〜４８時間後に、総細胞２電極電位固定（ｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌ  ｔｗｏ−ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ  ｖｏｌｔａｇｅ  ｃｌａｍｐ）下で試験した。卵母細胞発現手順を、ＪｅｇｌａおよびＳａｌｋｏｆｆ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １７（１）：３２−４４（１９９６）に従って行った。
【０２６７】
図６は、ヒトＳｌｏ４を用いて行ったのと類似の実験のセットを示す。Ｓｌｏ２について観察されたように、大きな、外向き整流カリウム電圧（ｏｕｔｗａｒｄｌｙ  ｒｅｃｔｉｆｙｉｎｇ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｃｕｒｒｅｎｔ）が、分極電圧ステップで見られる。Ｓｌｏ４についての逆転電位はまた、外部カリウム濃度の変化に非常に感受性であった。図６ｂに示されるように、２ｍＭ〜２０ｍＭの外部カリウム濃度の変化は、Ｓｌｏ４電流逆転電位を＋４５ｍＶを超えてシフトさせた。この変化は、完全にカリウム選択的なチャネルついて予想される＋４８ｍＶのシフトとほぼ同じくらい大きく、このことは、Ｓｌｏ４が、Ｓｌｏ２のように、他のカチオンを超えて非常に高いカリウム選択性であることを示す。これらの結果はまた、Ｓｌｏ４が電位依存性であることを示す。
【０２６８】
（配列表）
【０２６９】
【表１】
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2005507633.tif 000013
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、完全なヒトＳｌｏ２アミノ酸配列の、ラットＳＬＡＣＫおよび部分的なヒトｃＤＮＡ  ＫＩＡＡ１４２２のアミノ酸配列に対するアミノ酸整列である。同一の残基には影が付けられ、そしてアミノ酸の数は、左側の余白に与えられる。ヒトＳｌｏ２およびラットＳＬＡＣＫは、９３％同一であり、そして恐らく、オーソロガス遺伝子である。ヒトＳｌｏ２とラットＳＬＡＣＫとの間の分岐のパターンは、オーソロガスカリウムチャネルに関して代表的ではない。ＫＩＡＡ１４２２は、ｈＳｌｏ２遺伝子由来の部分的なｃＤＮＡであるが、いくらかの主要な様式で異なる。第１に、ＫＩＡＡ１４２２は、ヒトＳｌｏ２およびラットＳＬＡＣＫのアミノ末端からの高度な分岐である、代替のアミノ末端を有する。ＫＩＡＡ１４２２はまた、明らかに、３’末端において短縮される。ヒトＳｌｏ２のＤＮＡおよびアミノ酸配列は、ＫＩＡＡ１４２２またはラットＳＬＡＣＫから容易には推定され得ない。
【図２】
図２は、ヒトＳｌｏ２およびヒトＳｌｏ４のアミノ酸整列である。同一の残基には影が付けられ、そしてアミノ酸の数は、左側の余白に与えられる。６つの推定膜貫通ドメインに、実線で下線が引かれる。カリウムチャネル「シグネチャー配列」またはポアループに、点線で下線が引かれる。破線は、Ｓｌｏチャネルのカルシウムおよび塩化物のゲーティングに関与したテイル領域を示す（Ｙｕａｎら、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３：７７１−７７９（２０００）；Ｗｅｉら、Ｎｅｕｒｏｎ，１３：６７１−６８１（１９９４））。これら２つのアミノ酸配列は、約７０％同一である。
【図３】
図３は、Ｓｌｏカリウムチャネル遺伝子ファミリーの進化樹である。２つの主要な枝が、２つの別の遺伝子サブファミリーを規定する。ヒトＳｌｏ２およびＳｌｏ４は、ラットＳＬＡＣＫおよびＣ．ｅｌｅｇａｎｓ  Ｓｌｏ２遺伝子(ｃｅＳｌｏ２）をまた含むサブファミリー内にある。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  Ｓｌｏ２は、Ｓｌｏ２とＳｌｏ４との両方から別個に分枝していることに注目のこと。このことは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  Ｓｌｏ２が、これらの遺伝子のいずれに対してもオーソログではないことを示唆する。
【図４】
図４は、ヒトＳｌｏ２のメッセンジャーＲＮＡ発現パターンである。ブロットを、３２Ｐで標識したＳｌｏ２  ＰＣＲフラグメントでプローブし、そして標準的な高ストリンジェンシー手順でハイブリダイズした。（Ａ）Ｓｌｏ２のノーザンブロット。約５Ｋｂの強いバンドが、脳および骨格筋において見られる。６＋Ｋｂのより弱いバンドもまた存在し、そして選択的スプライス改変体または不完全にプロセスされたＲＮＡを表し得る。類似のバンドがまた、心臓および脾臓において見られる。（Ｂ）同じＳｌｏ２プローブとハイブリダイズしたｍＲＮＡドットブロット。ＣＮＳ組織、骨格筋、脾臓、心臓、下垂体および卵巣において見られる強いシグナルに注目のこと。
【図５】
図５は、Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞におけるヒトＳｌｏ２の機能的発現である。（Ａ）−１２０ｍＶの保持電位から＋４０ｍＶまで電圧ステップを脱分極することによって引き起こされた、Ｓｌｏ２電流。ステップを、２０ｍＶの増分でとり、そしてテール電流を、−６０ｍＶで測定した。Ｓｌｏ２の電流は、−８０ｍＶ程度に低い電圧において明らかに見られることに注目のこと。−１００ｍＶでの活性化は、不明瞭であり得る。なぜなら、カリウム平衡電位に近いからである。（Ｂ）Ｓｌｏ２を発現する卵母細胞から、−１６０ｍＶから＋８０ｍＶの範囲の３秒間の電圧ランプで引き起こされた電流。ランプを、２ｍＭの外部カリウム（１）または５０ｍＭの外部カリウム（２）のいずれかで実施した。５０ｍＭカリウムでの電流の反転電位における大きな正のシフト（右側の矢印）に注目のこと。−９０ｍＶの休止電圧において見られる、５０ｍＭカリウムでの大きな内向きの電流（左側の矢印）にもまた注目のこと。これは、−９０ｍＶにおけるＳｌｏ２の有意な活性化を示す。これは、５０ｍＭのカリウムによってマスクを外され、これは、反転電位を−９０ｍＶから離してシフトさせ、カリウム移入のための大きな駆動力を提供する。
【図６】
図６は、Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞におけるヒトＳｌｏ４の機能的発現である。（Ａ）−８０ｍＶから＋８０ｍＶまで電圧ステップを脱分極することによって引き起こされた、Ｓｌｏ４電流。ステップを、−１００ｍＶの保持電位から、２０ｍＶの増分でとり、そしてテール電流を、−６０ｍＶで測定した。Ｓｌｏ４の電流は、−６０ｍＶで明らかに見られ、そしていくらかのＳｌｏ４電流は、−８０ｍＶにおいてさえ存在する。（Ｂ）Ｓｌｏ４を発現する卵母細胞から、−１６０ｍＶから＋８０ｍＶの範囲の３秒間の電圧ランプで引き起こされた電流。ランプを、２ｍＭの外部カリウム（１）または２０ｍＭの外部カリウム（２）のいずれかで実施した。２０ｍＭカリウムでの電流の反転電位における大きな正のシフト（右側の矢印）に注目のこと。２０ｍＭカリウムでのいくらかの内向きの電流が、−９０ｍＶの休止電圧において見られること（左側の矢印）にもまた注目のこと。これは、−９０ｍＶにおけるＳｌｏ４の活性化を示す。
【図７Ａ】
図７Ａは、３２Ｐで標識したＳｌｏ４  ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズした、ヒトノーザンブロットである。左側の余白のマークは、分子量をキロベース（Ｋｂ）で示す。レーン数は、頂部に与えられる。以下は、これらのレーンにおける組織の列挙である；１）脳全体、２）心臓、３）骨格筋、４）結腸、５）胸腺、６）脾臓、７）腎臓、８）肝臓、９）小腸、１０）胎盤、１１）肺、１２）末梢血液白血球。約５．５Ｋｂの転写物を、これらの組織の大部分において標識する。発現は、肝臓において最も高く、高レベルの発現はまた、脳および心臓において見出される。より低いレベルの発現は、骨格筋、結腸、脾臓、腎臓、小腸、胎盤および肺において検出される。約９Ｋｂおよび１３Ｋｂの、より大きな転写物は、脳および心臓において見られる。これらは、代替の転写物または不完全にプロセスされた転写物を表し得る。４．５Ｋｂの転写物が肺において見られ、そして代替の転写物を表し得る；これは、完全なＳｌｏ４タンパク質をコードするために十分に長い。
【図７Ｂ】
図７Ｂは、（Ａ）と同じプローブとハイブリダイズしたｍＲＮＡドットブロットである。最も高いレベルの発現は、肝臓、胎児脳、胎児腎臓および胎児肝臓において見られる。高レベルの発現はまた、精巣、胎児肺、脳の大部分の領域、房、ＧＩ管、肺、胎盤および膀胱において見られる。発現は、他の多くの組織において、このブロットで検出可能である。（Ａ）におけるノーザンの結果との比較に基づいて、これらの低いシグナルは、Ｓｌｏ４発現を表すようであり、そしてバックグラウンドの非特異的ハイブリダイゼーションを表さないようである。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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