(57)【要約】本発明は、特定の病原体または特定の腫瘍に対する抗原を負荷され、リポ多糖（ＬＰＳ）およびインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）での処理によってインターロイキン１２（ＩＬ−１２）を放出する、ＩＬ−１２放出活性型樹状細胞（ＤＣ）の使用であって、前記特定の病原体に感染した患者の治療のための、もしくは前記特定の腫瘍を有する患者の治療のための薬剤を調製するための使用を開示する。
2005538167.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の病原体または特定の腫瘍に対する抗原を負荷され、リポ多糖（ＬＰＳ）およびインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）での処理によってインターロイキン１２（ＩＬ−１２）を放出する、ＩＬ−１２放出活性型樹状細胞（ＤＣ）の使用であって、前記特定の病原体に感染した患者の治療のための、もしくは前記特定の腫瘍を有する患者の治療のための薬剤を調製するための使用。
【請求項２】
前記治療が骨髄移植後に実施されることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記特定の腫瘍が進行性悪性腫瘍であることを特徴とする、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記ＤＣが、前記特定の病原体に感染した患者、または前記特定の腫瘍を有する患者、または骨髄提供者より採取されたＤＣであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
ＤＣが、前記特定の腫瘍を有する前記患者の腫瘍細胞より得られた抗原を負荷されたことを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
ＤＣがさらにトレーサー抗原を負荷される、請求項１〜５のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
前記トレーサー抗原がスカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）であることを特徴とする、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
ＤＣがさらにアジュバント、特に破傷風トキソイドを負荷されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
ＤＣがインビトロで末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）より作製されたことを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）を発現する樹状細胞（ＤＣ）の使用に関する。
【０００２】
腫瘍に関連する抗体の同定技術の開発は大きな発展を遂げたものの、これら抗体を送達するための従来の方法は、多くの場合、未完成かつ不十分である。原則的に入手可能なほとんどのアジュバントは実験的に発見されたが、その免疫刺激作用の機構はほとんど解明されていない。さらに、前臨床研究により、ほとんどの従来のアジュバントは数種類の免疫応答の誘発を支持するが、ＣＴＬ活性のごとき他の重要な免疫系の武器を誘発しないことが示唆された。特に、細胞溶解性抗腫瘍免疫は、かかるアジュバントによって達成されることができなかった。
【０００３】
このことは、ＤＣをアジュバントとして利用することに繋がった。かかる試験では、実験マウス腫瘍系で腫瘍拒絶を引き起こす腫瘍関連抗体でＤＣをインビトロでパルスし、患者における抗腫瘍免疫を増大させる。ＤＣは抗体を末梢系で捕獲し、加工し、リンパ系器官に移動し、リンパ球共刺激分子を発現し、サイトカインを分泌することで、免疫応答を開始させ、誘導する。
【０００４】
抗原は、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子上でＤＣによって提示される。生合成成熟の間にペプチドを結合することで、細胞内および周辺のタンパク質組成物の最新の提示をし続ける。細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）のＴ細胞受容体は、ＭＨＣクラスＩ分子に結合した抗原性ペプチドを認識するが、ＭＨＣクラスＩＩペプチド複合体はヘルパーＴリンパ球（ＨＴＬ）によって認識される。
【０００５】
成熟刺激には、ＩＬ−１２放出を特徴とする１型ＨＴＬ極性化を引き起こし[Cella, 1996]、次いで、細胞溶解性免疫の進行を補助するものもある。その他のものはそうせずに、体液性免疫を補助する２型ＨＴＬ極性化を支持する。リポ多糖（ＬＰＳ）は、ＤＣからＩＬ−１２を分泌させる典型的な成熟刺激物質である[Hilkens, 1997]。しかし、ＬＰＳでの成熟後、ＤＣはＩＬ−１２を一過的に産生するだけで、さらなる刺激に対して応答しなくなることが示された[Langenkamp, 2000]。サイトカイン産生の枯渇は、Ｔ−リンパ球の極性化過程に影響を及ぼす。刺激直後、ＤＣは強い１型ＨＴＬ応答で刺激されるが、後の時点では、同じ細胞が選択的に２型ＨＴＬで刺激される。
【０００６】
WO 01/39600 A1には、ＤＣを成熟させるために使用される、抗炎症剤としてのHsp27の使用が記載されている。しかし、これらのＤＣは腫瘍抗原を負荷されず、むしろ抗原接触が成熟後でしか起こらない。従って、この文書中では、成熟前の抗原の負荷は起こりえないとされている。
【０００７】
WO 01/09288 A1には、ＤＣのｉ．ａ．は培養培地中のＴＮＦ−αの添加によって作られることが記載されている。しかし、ＴＮＦ−αは完全なヘテロ２量体ＩＬ−１２分子ではなく、２つのサブユニットのうち１つだけを刺激することが知られている。さらに、WO 01/09288 A1によれば、抗原接触はＤＣの成熟後にのみ有効となり、そこに記載の細胞はいずれの場合も特定の病原体または特定の腫瘍に対して負荷しない。
【０００８】
WO 02/34887 A2には、２つの異なるクラスの核酸アジュバント、すなわち、一方はCpG、他方はPoly-I:Cが、ＤＣの刺激に使用されている。しかし、Poly-I:CおよびCpGは、ヒトＤＣでＩＬ−１２を非常に低効率でしか放出することができない。さらに、この文書によれば、ＩＬ−１２の放出を伴うＤＣの病原体または腫瘍特異的「負荷」は、記載されていない。
【０００９】
WO 01/51077 A1には、ＣＣＲ５アゴニストおよびアンタゴニストによるＩＬ−１２の産生の調節方法が記載されているが、そこが、特異的に「負荷された」ＤＣの始まりである。
【００１０】
Wang et al. (Zhonghua xue ye xue za zhi, 21(7), (2000), pp. 345-348)には、ＤＣと培養した後のCD(4)(+)細胞の増殖が、免疫療法の経過を確認する道具として良い指標であることが記載されている。ＰＢＭＣのＤＣをＸＧ−７細胞株の腫瘍抗原を負荷すると、ＤＣより多くのCD(4)(+)細胞を刺激することができる。しかし、この文書には、成熟刺激物質の投与について記載されていない。
【００１１】
従って、本発明の目的は、ＤＣを用いたウイルス感染および腫瘍を治療するための改良された方法を提供することである。
【００１２】
そこで、本発明は、特定の病原体または特定の腫瘍に対する抗原を負荷され、リポ多糖（ＬＰＳ）およびインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）での処理によってインターロイキン１２（ＩＬ−１２）を放出する、ＩＬ−１２放出活性型樹状細胞（ＤＣ）の使用であって、前記特定の病原体に感染した患者の治療のための、もしくは前記特定の腫瘍を有する患者の治療のための薬剤を調製するための使用を提供する。
【００１３】
ＤＣにてＩＬ−１２の放出を誘導することは可能であるが、この考えは腫瘍の患者の治療や重度のウイルス感染患者の治療に適当で必要であるとは考えられない。これは、主に、ＤＣのＩＬ−１２放出は一過的なものであるためで、限られた時間窓中でのみ、腫瘍または病原体に対する十分な細胞免疫応答を誘導するのに適当である。意外なことに、本発明にて、この概念を適用し、ＤＣからの大量のＩＬ−１２の分泌を引き起こすこと、例えば、ウシ胎仔血清を含まない培養条件下でＬＰＳおよびＩＦＮ−γの組み合わせに晒すことによって、いずれの主要な毒性副作用なく、長期間、疾病が安定化することが示されうる。しかし、ＩＬ−１２の放出が行われている状態、すなわち、腫瘍または病原体特異的ＩＬ−１２放出ＤＣの調整後すぐに、または少なくとも１〜１０、特にその後２〜６時間、理想的には調製完了後２時間で、本発明に記載のＤＣを送達することが重要である。従って、本発明は、本発明に従い、腫瘍患者または特定の病原体に感染している患者に、有効量のＤＣを投与する方法にも関する。
【００１４】
実際のところ、本発明で提供される治療は耐えやすいものである。従って、もはやＩＬ−１２を産生しない枯渇型ＤＣと対照的な活性型ＤＣは、インビトロモデルにてヒトにおける細胞溶解性免疫を、またマウス腫瘍モデルにて腫瘍拒絶を誘導することができることが、本発明により示されうる。本発明の臨床フェーズＩの第１の予備実験の結果は、本発明の実施例の節で報告され、癌の治療のためのＩＬ−１２分泌ＤＣ−ＡＴＩＴ（抗腫瘍免疫療法）免疫療法の実現可能性と毒性の欠如を示す。
【００１５】
ＤＣよりＩＬ−１２放出を誘発するもう１つの方法は、ＤＣの表面のＣＤ４０分子とそのリガンドＣＤ４０Ｌとの相互作用によって介在されるシグナルの伝達である。ＬＰＳとＩＦＮ−γの組み合わせは、本発明のフェーズＩ試験用の治療方法において最前のＩＬ−１２刺激を示す。
【００１６】
本発明の使用または方法は、本発明のＤＣでの治療前に、骨髄移植を受けた患者であって、骨髄移植の途中で免疫不全によって引き起こされるウイルス感染を患う患者にも好適である。
【００１７】
本発明は、広範囲の病原体または腫瘍に使用されうる。好ましくは、本発明に従ってＤＣで治療される特定の腫瘍は、固形進行性悪性腫瘍である。原理上、あらゆる段階のあらゆる腫瘍が、本発明のＤＣで誘導される細胞溶解性免疫応答の標的となりうる。
【００１８】
本発明は、好ましくは、自己ＤＣを用いて実施される。従って、前記特定の病原体に感染した患者または前記特定の腫瘍を有する患者より、もしくは骨髄移植の際に骨髄ドナーから採取されたのＤＣまたはＤＣの前駆細胞を使用することが好ましい。これらの自己ＤＣは患者の免疫系によって「自己」として認識されるため、拒絶反応の最小化に関連する。
【００１９】
ＤＣの負荷は、腫瘍または病原体に特異的なあらゆる抗原または抗原混合物、例えば、単離された、もしくは化学的または組み換え的に産生されたポリペプチドで実施されうる。しかし、好ましくは、ＤＣは前記特定の腫瘍を有する前記患者の腫瘍細胞溶解物に由来する抗原を負荷される。かかる自己腫瘍調製は、本発明の臨床試験において顕著な成功を示す。
【００２０】
ＤＣの投与の適切な追跡および制御、ならびにそれに対する患者の免疫応答のために、ＤＣをトレーサー抗原、特にスカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）をさらに負荷することが好ましい。原理上は、ヒト免疫系が以前に遭遇したことのない抗原である各新抗原がトレーサー抗原として適当である。
【００２１】
本発明への免疫応答をさらに増強するために、アジュバント、特に破傷風トキソイドでＤＣをさらに負荷することも好ましいであろう。原理上、各リコール抗原は、強い免疫応答に対する抗原であり、以前日常的な予防接種に使用されていることから、アジュバント抗原として適当であることが期待されうる。
【００２２】
ＤＣのソースは重要ではない。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からＤＣを単離するのは標準的な技術であるため、本発明に従って末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、特に負荷後ＤＣが移動した患者のＰＢＭＣから使用するＤＣを得ることも好ましい。
【００２３】
本発明に従って活性化した細胞は、特定の病原体または特定の腫瘍に対する抗原を負荷され、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）を放出するＤＣである。
【００２４】
本発明に従って活性化した細胞を、好ましくは、腫瘍細胞の抗原を負荷してもよい。その抗原を腫瘍細胞または腫瘍組織の溶解によって作成しても、腫瘍抗原をいずれかの組み換え発現系にて作成しても、または腫瘍抗原由来の小ペプチドを化学合成によって作成してもよい。
【００２５】
好ましい具体例に従って、本発明に従って活性化されたＤＣを、さらにトレーサー抗体を負荷することができる。
【００２６】
本発明は、以下の実施例および図面によってさらに説明されるが、それらに限定されない。
【実施例】
【００２７】
方法
ヒト樹状細胞の作製
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をleukapharesis (Amicus, Baxter, Vienna, Austria)によって回収する。leukapharesis生成物をＰＢＳで１：５に希釈し、Ficoll-Hypaque (Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden)を下に重層する。グラディエントを2200rpmで、18℃〜20℃で30分間ブレーキをかけずに遠心する。ＰＢＭＣ層を別の遠心管に移し、細胞を過剰量のＰＢＳで洗浄する。ＰＢＭＣをSysmex F820 (Sysmex, Kobe, Japan)装置で計数し、適当なアリコートにて凍結する。ＤＣ作製のために、１アリコートのＰＢＭＣを解凍し、計数する。１００万個のＤＣ／ｍｌを１％プールヒトＡＢ型血漿 (Octaplas, Octapharm, Vienna, Austria)を加えたＡＩＭ−Ｖ培地(Invitrogen Corporation, Bethesda, MD)中で、３７℃にて２時間、加湿したインキュベーターで培養する。プレートを注意深くリンスすることによって非接着細胞を除去する。２％ヒト血漿、400 U/ml IL-4 (Pan Biotech GmbH, Aidenbach, Germany)、および1000 U/ml GM-CSF (Roche, Basel, Switzerland)を加えたＡＩＭ−Ｖ培地中で、接着細胞を５日間培養する。５日目に、細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄し、無血漿ＡＩＭ−Ｖ中に再懸濁する。１００万個のＤＣ／ｍｌを１〜１０μｇの抗原に３７℃で２時間晒す。洗浄せずに、ＤＣ培養物を追加し、終濃度200 U/ml LPS (US Pharmacopeia, Rockville, MD)、50 ng/ml IFN-γ (Boehringer Ingelheim, Vienna, Austria)、400 U/ml IL-4, 1000 U/ml GM-CSF、およびヒト血漿を終濃度２％とする。活性型ＩＬ−１２放出ＤＣとして使用するためには細胞を３７℃で２時間、枯渇型ＤＣとして使用するためには４８時間インキュベートする。成熟工程の完了後、ＤＣをＰＢＳで２回洗浄する。
【００２８】
マウス樹状細胞の作製
ヒトＤＣとは対照に、ネズミＤＣを骨髄幹細胞および作成する。この手順以外はヒト系と同様である。Balb/cマウスのマウス骨髄幹細胞を、長骨から、骨の末端を切断し、骨幹を小シリンジで流すことによって回収する。骨髄細胞を、5 ng/mlネズミＩＬ−４および3 ng/mlネズミＧＭ−ＣＳＦ(いずれもInvitrogen Corporation, Bethesda, MDより購入)の存在下、１０％ウシ胎仔血清(PAA Laboratories, Linz, Austria)含有ＲＰＭＩ培地(Invitrogen Corporation, Bethesda, MD)中、２４ウェルプレートで、密度106 DCs/ウェルにて、６日間培養する。抗原の負荷をヒトＤＣと同様の方法で行う（上記参照）。成熟用に、ＬＰＳを100 ng/mlの濃度で使用し、ネズミＩＦＮ−γ (Invitrogen Corporation, Bethesda, MD)を10 ng/mlの濃度で使用する。全ての動物実験には、University of Vienna Medical Schoolの動物安全委員会で承認されている。
【００２９】
免疫表現型のタイピング
標準的な手順に従って、成熟前後に免疫表現型を分析する。50μlの4％IgG溶液を各試験管に添加することにより、IgG-Fc受容体を遮断する。ヒトＤＣの分析には、以下のＭＡＢペアを用いる：IgG FITC-IgG PE; CD45 FITC-CD14 PE; MHCII FITC-MHCI PE; CD1a FITC-CD83 PE; CD86 FITC-CD80 PE。ＭＡＢは、DAKO, Glostrup, Denmark、Immunotech, Marseille, France、またはInvitrogen Corporation, Bethesda, MDより購入した。FACScan装置(Becton Dickinson, San Jose, CA)を用いてフローサイトメトリーを行う。
【００３０】
混合白血球反応
前記のように、勾配遠心法によって末梢血よりＰＢＭＣを単離し、ＡＩＭ−Ｖ／２％ヒト血漿に再懸濁する。ＤＣ(10,000、2,000、または400)を９６ウェル丸底プレートに３連（100μl／ウェル）で入れ、100μlの培地中の105個の同種ＭＮＣを各ウェルに加える。正の参照として、105個のＭＮＣを100μlの培地中でブドウ球菌（Staphylococcal）エンテロトキシンＡ／Ｂ(SEA/SEB, Toxin Technologies Inc., Sarasota, FL)で、終濃度100ng/mlにて刺激する。混合した細胞を４日間インキュベートする。４日目に25μlの３Ｈチミジン溶液(NEN Life Science Products, Boston, MA)を各ウェルに加え、細胞をさらに１８時間インキュベートする。最後に、細胞をSkatron (Skatron, Lier, Norway)回収装置で回収し、取り込まれた３ＨチミジンをTrilux beta-counter (Wallac Oy, Turku, Finland)でカウントする。
【００３１】
ＩＬ−１２  ＥＬＩＳＡ
適当な数のウェルをＰＢＳ中のＩＬ−１２抗体(Invitrogen Corporation, Bethesda, MD)でコートし、プレートを４℃で一晩インキュベートする。翌日、プレートを洗浄する。250μlのブロッキング溶液(ＰＢＳ中の2％ウシ血清アルブミン)を加え、プレートを室温で３時間インキュベートする。プレートを再び洗浄し、サンプルおよびＩＬ−１２標準(Invitrogen Corporation, Bethesda, MD)を適当な希釈度にて加える。標準濃度は2500、500、100、20、4 pg/mlである。プレートを室温で一晩インキュベートする。さらなる洗浄操作の後、75μlのビオチン化ＩＬ−１２抗体溶液(Invitrogen Corporation, Bethesda, MD)を加え、室温で４時間インキュベートし、再洗浄し、75μlのストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ(Chemicon, Temecula, CA)溶液を加える。室温で１時間インキュベートした後、100μlのジエタノールアミンバッファー(48 mlの10M ジエタノールアミン、0.25 mlの1M MgCl2、20mlの3M HCl、pH＝9.8に合わせ、水で500mlとする)中のＰＮＰＰを加え、プレートを暗所にて、室温で50分間インキュベートする。最後に、50μlの3M NaOHを加え反応を停止させ、ELISAプレートリーダー(Anthos, Salzburg, Austria)で、690nmの参照波長を用いて405nmでプレートを測定する。
【００３２】
細胞溶解性免疫応答のインビトロ誘導
Ｂ９５．８細胞により産生されたＥＢＶを用いてＢリンパ球を感染させることにより、ＥＢＶ形質転換リンパ芽球腫Ｂ細胞株（ＬＣＬ）を作成した。10％ウシ胎仔血清(PAA Laboratories, Linz, Austria)およびＬ−グルタミン添加ＲＰＭＩ培地中でＬＣＬを生育した。連続増殖する培養物を４％ヒト血漿添加ＲＰＭＩ培地に移した。滅菌水中での５回の凍結解凍サイクルによりＬＣＬの溶解物を調製した。遠心によってタンパク質溶液より粒状成分を除去した。Bio-Rad protein assay (Bio-Rad, Munich, Germany)を用いて、製造業者の説明書に従って、タンパク質濃度を測定した。自己リンパ球を、ＬＣＬ由来の可溶性タンパク質を負荷したＤＣに、あらかじめ最適化した割合５：１にて晒した。負の対照として、負荷していないＤＣを用いた。1％ヒト血漿、および10 ng/ml IL-2 ("Proleukin", Chiron, Emeryville, USA)添加X-VIVO 15培地(Bio-Whittaker, Watersville, MD)中で、開始濃度1 x 106リンパ球／ｍｌにて培養物を保存した。リンパ球を週１回、４週間再刺激した。Coulter Z2装置(Coulter, Hialeah, FL)を用いて細胞数を測定した。標準的な手順に従って、ＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８に対するモノクローナル抗体(すべてInvitrogen Corporation, Bethesda, MDより購入)を用いたフローサイトメトリーによって、リンパ球小集団分布を分析した。
【００３３】
Ｔリンパ球培養物中で生じた細胞溶解活性を、新鮮な自己および同種標的細胞に対して測定した。培地中でＬＣＬを洗浄し、80 μM EuCl3 (Fluka, Buchs, Switzerland)、400 μM DTPA-Na2、250 μg/ml 硫酸デキストラン (MW 500,000)、50 mM Hepes (pH 7.4)、93 mM NaCl、2 mM MgCl2、および5 mM KCl (全てMerck, Darmstadt, Germany製)を含む１ｍｌバッファーに再懸濁し、回転輪上で4℃にて15分以内でインキュベートした。次いで、20 μl CaCl2を加え、さらに5分間インキュベーションを続け、50 mM Hepes (pH 7.4)、93 mM NaCl、2 mM MgCl2、5mM KCl、2 mM CaCl2、および10 mM グルコースを含むバッファーで３回洗浄した。沈殿物を20mlの培地に再懸濁し、加振台上で、75 cm2組織培養フラスコ中にて、37℃で40分間プレインキュベートした。最後に、細胞を再び洗浄し、培地に再懸濁し、5 x 104/mlとした。100 μlのこの細胞懸濁物を、適当数の９６ウェル丸底プレートのウェルに移した。さらなるウェルを、ＬＣＬからのＥｕの自然および最大放出（後者は細胞を１％  Triton X-100で溶解することによる）測定用に準備した。前刺激したＴリンパ球を回収し、１回洗浄し、エフェクター／標的比が25/1、12.5/1、および6.25/1 (最終体積200 μl)となるように調整した。プレートをブレーキなしで500rpmで5分間遠心した。４時間の37℃でインキュベートした後、プレートを再び遠心し、25μlの上清を９６ウェル平底プレートに移し、４℃で保存した。測定前に、200μlの増強溶液を加え、プレートを注意深く振盪し、蛍光をWallac 1420 VICTOR multilabel counter (Wallac, Turku, Finland)での時間分解蛍光分析によって分析した。結果を以下の式によって特異的溶解のパーセントとして算出した：(実測カウント−自然放出) x 100 / (最大放出−自然放出)。
【００３４】
マウス腫瘍モデル
Balb/cマウスと同型のマウス腫瘍細胞株K-Balbを用いた。レトロウイルス遺伝子転移により、この細胞株がネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（NPT）を発現するように操作した。この異種タンパク質は、免疫化試験において人工的腫瘍抗原として働く。３つの抗原ソースを用いた。１つ目は、市販の細菌発現系(Qiagen, Hilden, Germany)にて、製造業者の推奨に従って、タンパク質精製用のヒスチジンタグを有する組み換えNPTタンパク質を作製した。２つ目は、Ｈ２ｂ分子に結合しBalb/cマウスのＤＣによって提示される可能性の高い９量体ペプチド関してNPTの配列を分析した。この分析には、「ＭＨＣリガンドおよびペプチドモチーフのSYFPEITHIデータベース」(http://syfpeithi.bmi-heidelberg.com)を用いた。２つのペプチドGYDWAQQTIおよびPVLFVKTDLは、高い結合可能性を有することが明らかとなった。第３の抗原ソースは、５回の凍結溶解サイクルの後、遠心操作により粒状成分を溶解物から除去することによって得られた全腫瘍細胞溶解物である。ＬＣＬ由来の溶解物のタンパク質濃度と同様の方法（前記）で、これらの溶解物のタンパク質濃度を測定した。
【００３５】
1 μg/mlの合成NPT由来ペプチド、組み換えNPTタンパク質、または10 μg/ml K-Balb-NPT溶解物を用いて、無血清培地中で２時間培養することにより、ＤＣに負荷した。次いで、前洗浄せずに血清を培養物に加え、ＤＣにＬＰＳ／ＩＦＮ−γ成熟刺激を２または２４時間与えた。成熟後、ＤＣをＰＢＳで２回洗浄し、NaCl中で107 DCs/mlとなるよう回収した。抗原を負荷され成熟した100万個のＤＣを、５匹のマウス群のうち、毛を剃ったBalb/cマウスの背中に皮下注射した。免疫化を１週間後とさらに２週間後に繰り返し、少なくとも接種前１週間はウシ胎仔血清を含まない培地中で培養した106 K-BalbまたはK-Balb-NPT細胞でマウスを攻撃した。マウスの逆側の脇腹に皮下的に腫瘍細胞を注射し、腫瘍の成長をモニターした。
【００３６】
臨床試験の設計
全ての従来型の処置の選択肢が尽きた幼児期の固形腫瘍を有する小児科の患者を採用した。腫瘍組織を外科的に得て、機械的に破砕し、単一細胞懸濁物を得た。診断実験室において、腫瘍細胞の細胞遺伝学的異常に関する有益なマーカーを用いた標準手順による蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）により、腫瘍およびストロマ細胞の比を評価した。単一細胞懸濁物は50〜90％の腫瘍細胞を含んでいた。St. Anna Children's Hospital, Vienna, Austriaの倫理委員会はこの臨床試験を承認した。
【００３７】
末梢血単核細胞を患者から白血球除去法（leukapheresis）により回収し、上記のようにＤＣを得た。５回の凍結融解サイクルおよび遠心による特定の成分の除去によって得られた10 μg/106 DCs/mlの自己腫瘍細胞溶解物でＤＣに負荷した。可溶性タンパク質の濃度を、ＬＣＬ由来の溶解物について記載のように測定した。さらに、遅延型過敏症（ＤＴＨ）試験においてトレーサー抗原として用いたスカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、およびアジュバントとして用いた破傷風トキソイド（ＴＴ）でＤＣに負荷した(両物質はCalbiochem, San Diego, CAより購入)。次いで、ＤＣにＬＰＳ／ＩＦＮ−γ刺激を２時間与えた。抗原を負荷したＤＣを３回洗浄し、放射線照射した自己腫瘍細胞と１：１の比にて混合した。１週間間隔で３週間、３回の注射の後３週間の休止期間にて、ＤＣ(1〜10 x 106/m2)を腫瘍のないリンパ節の近くに注射した。この手順を３回繰り返した。さらに、患者がＩＦＮ−γで処置を受けることで、ＭＨＣクラスＩ分子の発現が増大し、それによって細胞溶解性免疫からの回避が阻止された。腫瘍ワクチンを使用した３週間の間、標準用量にて、１週間に３回の皮下注射によりＩＦＮ−γを投与した。
【００３８】
適当な方法による処置の前後に、臨床および実験室のパラメーターの基本的な評価、ならびに疾病モニタリングを行った。臨床的に必要であれば他の診断を行った。処置の副作用をＷＨＯ基準に従って評価した。ＫＬＨに対する、および放射線照射した腫瘍細胞に対するＤＴＨ試験を用いて、免疫法の効率を評価した。腫瘍細胞溶解物（100 μl NaCl中、1 μg）、ＫＬＨ（100 μl NaCl中、1 μg）、100 μl  ＤＣ培養培地、または100 μl  NaClを皮内注射した。注射部位における腫れと赤みを免疫応答の誘導の基準として用いた。
【００３９】
結果
１．  ヒト樹状細胞の分析
１．１．  免疫表現型
未成熟なＤＣを作製し、ＬＰＳ／ＩＦＮ−γ成熟刺激に付した。成熟前後に、ＤＣマーカーＣＤ８３の上方制御、共刺激分子ＣＤ８０およびＣＤ８６の上方制御、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ分子の上方制御、ならびに単球マーカーＣＤ１４の下方制御に関して免疫表現型を分析した。未成熟ＤＣ、共通の白血球マーカーＣＤ４５、およびアイソタイプ対照にて上方制御されるとされているＣＤ１ａ分子の分析も含まれる。ＣＤ１ａ以外の全てのマーカーは典型的に期待される調節を示し、このことは、ウシ血清の代わりにヒト血漿を添加した培地中で培養したＤＣの特徴であると思われる（図１）。
【００４０】
１．２．  混合白血球反応
ＤＣの刺激許容量を分析するために、成熟ＤＣを同種ＰＢＭＣと共培養した。ＬＰＳ／ＩＦＮ−γ成熟刺激に晒されたＤＣは、超抗原ＳＥＡおよびＳＥＢを増殖刺激として用いた場合と同程度、同種リンパ球の増殖を誘導できることが一貫して示された（図２）。
【００４１】
１．３．  ＩＬ−１２分泌
ＬＰＳ／ＩＦＮ−γ成熟刺激に晒して２４時間後のＤＣ培養物の上清を回収し、ＩＬ−１２  ｐ７０ヘテロ２量体分子の濃度を測定した。平均ＩＬ−１２濃度は2.4±0.4 ng/106DCs/mlであった（図３）。２時間成熟させ、２４時間再培養したＤＣは、２４時間成熟させたＤＣとほぼ同量のＩＬ−１２  ｐ７０ヘテロ２量体を生成した。
【００４２】
２．  インビトロでの細胞溶解性免疫の産生
ＤＣをＬＣＬ溶解物由来の可溶性タンパク質を負荷し、それを用いて自己Ｔリンパ球を刺激した。１週間間隔で４回刺激を繰り返した。刺激の日、細胞数を記録し、ＨＴＬおよびＣＴＬのパーセントを測定した。２８日目に、培養物の細胞溶解活性をＣＴＬアッセイで分析した。ＩＬ−１２分泌「活性型」ＤＣの刺激許容量を、これ以上ＩＬ−１２を放出しない「枯渇型」ＤＣの刺激許容量と同等と比較した。
【００４３】
２．１．  Ｔ−リンパ球の抗原特異的拡大
活性型ＤＣを刺激に用いた場合には531±198百万個のリンパ球が、枯渇型ＤＣを刺激に用いた場合には318±228百万個のリンパ球が生じ、ほぼ同等のリンパ球の抗原特異的拡大が認められた（図４）。枯渇型ＤＣに晒すよりも増殖する傾向にある活性型ＤＣに晒されたＴリンパ球でさえ、初期では抗原特異的Ｔリンパ球の成長速度には大きな違いは見られなかった。
【００４４】
２．２．  抗原特異的拡大中のＴ−リンパ球小集団の分布
各再刺激時間において、ＣＤ３陽性Ｔ−リンパ球の小集団分布を、免疫表現型のタイピングにより測定した（図５）。ＩＬ−１２分泌活性型ＤＣ（n＝10）を使用した場合、ＣＤ８陽性ＣＴＬの相対増加（23±6％から56±7％）に伴うＣＤ４陽性ＨＴＬのパーセントの段階的な減少（77±4％から44±7％）が認められた。一方、枯渇型ＤＣ（n＝10）を用いてＴリンパ球を刺激した場合、ＨＴＬのパーセント（７日に79±4％、２８日に73±3％）およびＣＴＬのパーセント（７日に21±4、２８日に27±3％）はいずれも安定したままであった。このことは、枯渇型ＤＣで刺激した培養物を活性型ＤＣで刺激した培養物と比較した場合、ＨＴＬのパーセントを著しく増大させる（２８日に、p＝0.0016）。枯渇型ＤＣでの刺激と比べて、活性型ＤＣで刺激後顕著に増大したＣＴＬのパーセントを比較することにより、逆の効果が見出される（２８日に、p＝0.0016）。
【００４５】
２．３．  抗原特異的拡大後のＴ−リンパ球の細胞溶解活性
Ｔリンパ球を、ＬＣＬ溶解物を負荷したＩＬ−１２分泌活性型ＤＣ（n＝3）、またはＩＬ−１２を分泌しない枯渇型ＤＣ（n＝5）に晒した。週１回、４週間、培養物を再刺激し、２８日目に細胞溶解活性の分析に付した。最高エフェクター／標的比は２５／１にて、特異的溶解は活性型ＤＣで刺激後55±9％に達したが、一方枯渇型ＤＣで刺激後は12±5％であった(p＝0.0034)。エフェクター／標的比１２．５／１（27±7％対7±2％, p＝0.0125）および６．２５／１（30±8％対4±1％, p＝0.0047）において、同じ傾向が明らかであった。
【００４６】
３．  ネズミ樹状細胞の分析
３．１．  免疫表現型
ネズミＤＣをＬＰＳ／ＩＦＮ−γで成熟させ、未成熟および成熟ＤＣの免疫表現型を分析した。ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＭＨＣ  ＩＩ、ＣＤ８０、ＣＤ４０、ＣＤ８６に対するＭＡＢを用いて、ＤＣの成熟状態の特性を明らかにした。典型的なＣＤ１１ｂ／ＣＤ１１ｃ表現型の成熟ＤＣを常に検出した。また、ＣＤ４０およびＭＨＣ  ＩＩ分子と同様に、共刺激分子ＣＤ８０およびＣＤ８６の上方制御も見られた。
【００４７】
３．２．  ＩＬ−１２分泌
ＤＣ培養上清の内容を、ＬＰＳ／ＩＦＮ−γ成熟刺激に晒して１日後に、ＩＬ−１２の存在について分析した。ＬＰＳ／ＩＦＮ−γ刺激の２時間後にＤＣを洗浄し、ＤＣ培養培地中で２４時間再培養するか（活性型ＤＣ）、またはＬＰＳ／ＩＦＮ−γを除去しない培地中で２４時間置いた（枯渇型ＤＣ）。概して、約2ng/106 DCs/mlを検出した（図８）。２時間成熟させたＤＣは、２４時間成熟させたＤＣとほぼ等量のＩＬ−１２  ｐ７０ヘテロ２量体を生成した。
【００４８】
４．  マウス腫瘍モデルにおける抗腫瘍免疫の誘導
インビトロにおける細胞溶解性免疫応答の誘導におけるＩＬ−１２の重要な役割に関する示唆的な証拠を得たが、これらのデータをインビボで確認することが試みられた。その目的のために、特定のモデル抗原に対して免疫化させたマウス腫瘍モデルを設計した。マウス腫瘍細胞株K-Balbを、ネオマイシン類似体Ｇ４１８に対する耐性を付与する細菌タンパク質NPTを発現するように操作した。また、組み換えNPTタンパク質をバクテリア発現系にて作製し。アフィニティー精製した。最後に、エピトープ予測ソフトウェアを用いて、高い確率でBalb/cマウスのＤＣの抗原提示Ｈ−２ｂ分子に結合するとされる、NPT由来の９量体ペプチドを同定した。
【００４９】
未成熟ＤＣを合成NPT由来の９量体ペプチド、組み換えNPTタンパク質、またはK-Balb-NPTより反復凍結／融解法で得た可溶性タンパク質を負荷した。負荷したＤＣをＬＰＳ／ＩＦＮ−γに２時間晒し、ＩＬ−１２分泌活性型ＤＣとして５匹のマウス群の動物に注射するか、またはＬＰＳ／ＩＦＮ−γで２４時間成熟させ、洗浄し、ＩＬ−１２放出能を失った枯渇型ＤＣとして注射した。対照群において、放射線照射したK-Balb-NPT腫瘍細胞、組み換えNPTタンパク質、NPT由来の合成ペプチドまたは未負荷のＤＣを注射した。免疫化したマウスをNPT遺伝子組み換えK-Balb-NPT細胞またはK-Balb野生型細胞で攻撃し、腫瘍成長をモニターした（図９）。
【００５０】
免疫化計画とは無関係に、野生型K-Balb腫瘍細胞で攻撃されたマウスでは、進行的に増殖する腫瘍となっていた。対照群では、未負荷のＤＣで免疫後、１匹のマウスを除いて同様であった。最も重要なことには、ＩＬ−１２分泌活性型ＤＣで免疫化してK-Balb-NPT腫瘍細胞で攻撃したマウスの群において、ほとんどのマウスが腫瘍を拒絶した（K-Balb-NPT溶解物を負荷したＤＣで免疫化したマウスの3/5、組み換えNPTタンパク質を負荷したＤＣで免疫化したマウスの5/5、合成ペプチドを負荷したＤＣで免疫化したマウスの4/5）。一方、枯渇型ＤＣで免疫化したほぼ全てのマウスは、K-Balb-NPT腫瘍を拒絶することができなかった(K-Balb-NPT溶解物を負荷したＤＣで免疫化したマウスの1/5、組み換えNPTタンパク質を負荷したＤＣで免疫化したマウスの0/5、合成ペプチドを負荷したＤＣで免疫化したマウスの1/5)。K-Balb野生型腫瘍細胞で攻撃した全てのマウスは、進行的に腫瘍を成長させたことから、K-Balb-NPT腫瘍細胞が発現するNPTタンパク質に対する抗原特異的拒絶反応に関する証拠を提供する。
【００５１】
ＩＬ−１２分泌ＤＣ免疫療法の実現可能性と毒性の欠如を示すためのフェーズＩ試験。
従来の処置の選択肢がそれ以上ない固形小児悪性腫瘍を患う患者がこの試験に含まれる。主な目的は、ＤＣ−ＡＴＩＴの実現可能性と毒性を評価することである。２０人の患者が研究に登録し、１２人が処置を完了した。個々のＤＣ−ＡＴＩＴ免疫療法は、成熟または未成熟なＤＣのそれぞれに典型的な免疫表現型、1〜5 ngのIL-12/106 DCs/mlの放出、および混合白血球反応における十分な刺激許容量を含む全ての質的な基準を満たした。ＤＣ−ＡＴＩＴ免疫療法は、処置計画を完了させるのに十分な量でもたらされうる。
【００５２】
表１：
臨床フェーズＩ  ＤＣ−ＡＴＩＴ試験に含まれる患者
【表１】
2005538167.tif 000003
【００５３】
処置は耐容性が良好であり、外来診療で実施されうる。処置の毒性の高い副作用は認められなかった。ＩＦＮ−γ処置に伴って最も起こりやすい微熱は、腫瘍細胞でのＭＨＣクラスＩ分子のin situでの上方調節によるものであり、解熱剤によって制御可能であった。ＤＣの注射部位での痒みは、抗ヒスタミン剤で局所的に処置した。
【００５４】
ＤＣ−ＡＴＩＴへの応答に関するインビボアッセイとして、遅延型過敏症試験を実施した。放射線照射した自己腫瘍細胞またはトレーサー抗原ＫＬＨ、ならびに培地対照および負の対照で患者を皮内注射した。処置を完了した全ての患者は、ＫＬＨに対して正の応答を示した。このことは、ＤＣ−ＡＴＩＴは免疫誘発能を有するという説得力のある証拠を提供する。しかし、抗腫瘍免疫はこれらのアッセイで検出できなかった。対照の注射では全く応答が生じなかった。
【００５５】
全ての患者が進行性疾患に罹っており、化学および放射線療法、ならびに度重なる外科手術の履歴がある。従って、この試験において、客観的な腫瘍の退行は認められなかった。しかし、数人の患者は長期間安定した疾病に罹っていた。
【００５６】
結論
ＤＣによるＩＬ分泌の誘導の成功は、抗腫瘍ＣＴＬ活性を支える１型ＨＴＬ応答の生成に重要な役割を果たしているようである[Cella, 1996]. ＬＰＳに応答して、ＤＣは成熟後約１８〜２０時間までに、一過的にしかＩＬ−１２を産生しない[Langenkamp, 2000]。よって、成熟誘導後早い時期に採取されたＤＣは強い１型ＨＴＬ極性化を誘導するが、遅い時期に採取された同じ細胞は２型ＨＴＬ極性化細胞を刺激する。これらの発見は、エフェクター細胞機能の発生の動的な調節を示す。
【００５７】
ＩＬ−１２分泌活性型ＤＣは、ＣＴＬおよびＨＴＬの拡大を同程度誘発できることが認められた。一方、ＩＬ−１２の放出能を失った枯渇型ＤＣは、ＨＴＬを圧倒的に拡大する。その結果、活性化ＤＣへの曝露によって刺激されたＴリンパ球は、標的細胞の抗原特異的溶解能を獲得したが、枯渇型ＤＣではそうではなかった。２つのモデル系を用いてこれを立証した。１つは、自己Ｔリンパ球の刺激のためにＥＢＶ形質転換ＬＣＬに由来の可溶性タンパク質を負荷したＤＣを用いたヒトのインビトロモデルである。ＬＣＬの抗原特異的溶解がこの系で示されうる。第２のモデルはネズミ腫瘍モデルである。活性型の抗原を負荷したＤＣで免疫化後、マウスは腫瘍攻撃から保護されるが、枯渇型ではそうではないことが見出された。さらに、臨床フェーズＩパイロット試験を実施し、ＩＬ−１２分泌ＤＣの実現可能性と、毒性の欠如に関する証拠が提供された。
【００５８】
ＣＴＬによって介在される細胞溶解性免疫応答は、ＭＨＣクラスＩ分子を介した抗原提示に依存し、ここに、該分子は内在的に合成される自己タンパク質または細胞内感染の過程の非自己タンパク質のいずれかの細胞質タンパク質から抗原性ペプチドをもたらす。現在のパラダイムは、専門的抗原提示ＤＣのみが１次免疫応答を誘導することができることを保持する。従って、ＤＣ自体が感染しておらず、非自己抗原を内在的に合成させないまたはできない場合、ＤＣはこれらの抗原をＣＴＬに提示するために、感染した体細胞から取り出さなければならないだろう。しかし、大きな一連の証拠は、外来的にもたらされ、取り出された抗原が、ＤＣにおいて、まずはＭＨＣクラスＩＩ抗原提示経路に集められるという概念を支持する。この明確な矛盾を解決するために、交差提示の概念が提唱された。インビトロおよびインビボの証拠によって支持され、ＤＣによるＭＨＣクラスＩ抗原提示経路における外来抗原の提示を意味する。しかし、最近、交差提示の重要性についてはよく議論されている。
【００５９】
近年、エクスビボで腫瘍関連またはウイルス由来の抗原を負荷されたＤＣは、抗腫瘍免疫療法、または免疫力低下患者でのウイルス感染の養子免疫療法において、治療目的で使用された。これに関連して、抗原は頻繁に可溶性タンパク質として使用されるため、交差提示はかなり重要である。これらの抗原に晒されたＤＣは、交差提示経路ではなく食作用によってそれらを取り込み、ＭＨＣクラスＩＩ経路にて限定的に処理されることから、それらは細胞溶解性免疫を引き起こさないとされる。しかし、交差提示の有利な状態は、ほとんど定義されておらず、細胞溶解性抗腫瘍または抗ウイルス免疫を引き起こすＣＴＬへの外来抗原の交差提示ほとんどの証拠は間接的である。
【００６０】
抗腫瘍および抗ウイルス免疫において、多くの腫瘍またはウイルス感染細胞はＭＨＣクラスＩＩ分子ではなくＭＨＣクラスＩ分子を発現することから、ＣＴＬの役割は注目を集めた。さらに、ＣＴＬは、ペプチド−ＭＨＣクラスＩ複合体の認識の際に細胞を直接溶解することができ、また、インビボでの大きな塊の除去能が示された。インビトロで刺激を受けたＭＨＣクラスＩ制限抗原に特異的なＣＴＬ株およびクローンが腫瘍宿主に戻された際に、抗腫瘍または抗ウイルス免疫を介在できるという抗原養子免疫伝達研究によって、この優先性は支持されてきた。さらに、近年の報告により、ＤＣに負荷した腫瘍ペプチドを用いた免疫化が増殖性抗腫瘍[Nestle, 2001]および抗ウイルス免疫を生じることが示唆された[De-Bruijn, 1998]。
【００６１】
本発明によって示される１つの結論は、ＬＰＳ／ＩＦＮ−γで成熟後早い段階での活性型ＤＣは、外来抗原のＣＴＬへの交差提示の状態を充足することである。一方、枯渇型ＤＣは、この能力を失ったようである。本発明に従って、ＩＬ−１２の放出を活性型ＤＣのマーカーとして用いた[Langenkamp, 2000]。しかし、ＩＬ−１２のＣＴＬに対する効果は、交差提示、ＣＴＬ拡大および細胞溶解活性も支持する１型極性化ＨＴＬによって介在されることが想像できる。細胞内抗原、例えばウイルス由来の抗原または腫瘍関連抗原に対するＴリンパ球の応答に成功したことは、ＣＴＬとＨＴＬの両方に基づく。しかし、ＨＴＬは注目されていなかったが、ほとんどの抗原特異的免疫応答の調節において、これらの細胞の中心的な役割を与えられていることが明らかとなっている。ＨＴＬは、リンホカインの合成を介してＣＴＬの発生の進行を補助すると長い間想像されてきたが、最近の証拠ではＣＴＬの補助する輸送の重要な経路は、ＨＴＬ依存的であり、ＤＣを媒介物として使用することが示された。特に、ＣＤ４０ＬおよびＣＤ４０のＨＴＬおよびＤＣ上での相互作用は、ＤＣを活性化し、ＣＴＬ前駆体に抗原を提示する、またＣＴＬ前駆体の刺激を共刺激する際に重要であるようだ。このシナリオにおいて、ＤＣは、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩによって制限されるエピトープにそれぞれ特異的なＨＴＬおよびＣＴＬ間の重要な導管となる。これに関連して、活性型ＤＣでの刺激後にＨＴＬおよびＣＴＬの増幅がほぼ同等であったが、枯渇型ＤＣではそうでなかったことの発見は、特に重要であると思われる。
【００６２】
本発明に従って用いた両方のモデル系における説得力ある証拠のために、臨床フェーズＩパイロット試験を行った。幼児期の進行性固形悪性腫瘍を患う患者を、患者の腫瘍由来の可溶性タンパク質を負荷した活性型ＩＬ−１２放出自己ＤＣで処置した。腫瘍抗原を負荷したＤＣを用いた臨床試験を。様々な新生物疾患について行った。しかし、これらの試験に用いたＤＣは、未成熟かＴＮＦαで成熟させたものかのいずれかであった。かかるＤＣはＩＬ−１２放出能を有さない。従って、この前臨床的な試験を踏まえて、これらのＤＣはこの試験において使用したＩＬ−１２分泌ＤＣより劣ると考えるべきである。本試験における全ての患者は、進行性疾患に罹っており、多くの化学または放射線療法の履歴を有する。従って、これらの患者において客観的な腫瘍の退行は認められなかった。しかし、数人の患者は長期間安定した疾病状態であった。本発明者らのＤＣ免疫療法の処置の毒性は最小であった。
【００６３】
要約すれば、ヒトインビトロモデルおよびマウスインビボ腫瘍モデルにおいて、成熟後早い時期にＩＬ−１２を分泌する活性型ＤＣは、遅い時期にＩＬ−１２分泌能を失った枯渇型ＤＣと比べて、インビトロにて細胞溶解性免疫応答の生成を支持することが見出された。活性型ＤＣは、ＣＴＬに対するＭＨＣクラスＩ上の外来抗原の交差提示が可能であるが、枯渇型ＤＣはその能力は有さない。ＣＴＬの細胞溶解活性の拡大は、ＩＬ−１２の存在に大きく依存する。本発明で提供された結果は、エクスビボで拡大された抗原特異的Ｔリンパ球を用いた、免疫力低下患者におけるウイルス感染の養子処置に重要である。臨床フェーズＩパイロット試験は、このＤＣ免疫療法での新生物疾患の処置の実現可能性と毒性の欠如を示す。
【００６４】
参考文献
Cella M et al., J.Exp Med 184:747, 1996
Hilkens CM et al., Blood 90:1920, 1997
Langenkamp A et al., Nat Immunol 1:3116, 2000
Nestle FO et al., Nat Med 7:7615, 2001
De-Bruijn ML et al., Cancer Res 58:724, 1998
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】図１：未成熟および成熟ＤＣの免疫表現型。ＬＰＳ／ＩＦＮ−γ成熟刺激に晒す前（白棒）と後（黒棒）でのＤＣの典型的な免疫表現型を示す。
【図２】図２：混合白血球反応。ＤＣをＬＰＳ／ＩＦＮ−γで成熟させて使用し、同種リンパ球中での増殖を誘発した。正の対照として、スーパー抗原ＳＥＡおよびＳＥＢを用いた。１８の独立した試験の平均±ＳＥＭを示す。
【図３】図３：ＤＣによるＩＬ−１２  ｐ７０ヘテロ２量体生成。ＤＣ培養物をＬＰＳ／ＩＦＮ−γで成熟させ、２４時間後のＩＬ−１２分泌を測定した。２３の独立した試験より得られた個々のデータ（左側）と平均±ＳＥＭを示す。
【図４】図４：自己Ｔリンパ球の抗原特異的拡大。ＬＣＬの自己可溶性溶解物で負荷した活性型（黒丸、n＝10）および枯渇型（白丸、n＝10）ＤＣを用いて、Ｔ−リンパ球の抗原特異的拡大を行った。再刺激日における絶対細胞数を平均±ＳＥＭとして、対数目盛にて示す。
【図５】図５：抗原特異的拡大中のＣＤ３−陽性Ｔ−リンパ球の小集合分布。自己ＬＣＬ由来の溶解物を負荷した活性型ＤＣ（上図、n＝10）および枯渇型ＤＣ（下図、n＝10）を用いて、自己Ｔ−リンパ球を週１回、４週間刺激した。ＣＤ３−陽性Ｔ−リンパ球を免疫表現型タイピングによって週１回測定した（ＣＤ４陽性ＨＴＬ、黒棒；ＣＤ８陽性ＣＴＬ、白棒）。再刺激の日における小集合のパーセントを平均±ＳＥＭとして示す。
【図６】図６：抗原特異的拡大後のＴリンパ球の細胞溶解活性。自己ＬＣＬ由来の溶解物を負荷した活性型ＤＣ（黒丸、n＝3）および枯渇型ＤＣ（白丸、n＝5）を用いて、自己Ｔ−リンパ球を週１回、４週間刺激した。２８日目に、拡大されたＴリンパ球集合の細胞溶解活性を分析した。特異的溶解のパーセントを、表示されたエフェクター／標的比で平均±ＳＥＭとして示す。
【図７】図７：未成熟および成熟マウスＤＣの免疫表現型。ＬＰＳ／ＩＦＮ−γ成熟刺激に晒す前（白棒）および後（黒棒）のＤＣの典型的な免疫表現型を示す。１つの代表的な試験の結果を図示する。
【図８】図８：様々なＬＰＳ／ＩＦＮ−γ刺激後の培養物上清中のＩＬ−１２  ｐ７０ヘテロ２量体の濃度。ＬＰＳ／ＩＦＮ−γ刺激の２時間後ＤＣを洗浄した後、ＤＣ培養培地で２４時間再培養するか、またはＬＰＳおよびＩＦＮ−γを除去しない培地中で２４時間置いた。３つの試験のデータを平均±ＳＥＭとして示す。
【図９】図９：モデル抗原としての腫瘍発現NPTからのマウスの保護。記載のように、５匹のマウスの群を活性型または枯渇型ＤＣ、もしくは対照試薬で免疫した。ＤＣをK-Balb−NPT溶解物（黒棒）、組み換えNPTタンパク質（斜線の棒）、またはNPT由来の合成ペプチド（白棒）を負荷した。腫瘍攻撃には、K-Balb野生型腫瘍細胞およびK-Balb−NPT腫瘍細胞を使用した。１つの代表的な試験を図示する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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