(57)【要約】  本発明は，ホスファターゼポリペプチド，ホスファターゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列，ならびに種々のホスファターゼ関連疾病および状態の診断および診断に有用な種々の産物および方法に関する。バイオインフォマティクス戦略を用いて，ＭＡＰキナーゼホスファターゼＰＴＰおよびＳＴＰの哺乳動物のメンバーが単離され，その蛋白質構造が推定された。
2005509418.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスファターゼポリペプチドをコードする，単離された，濃縮された，または精製された核酸分子であって，前記核酸分子は，
（ａ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする；
（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の相補体である；
（ｃ）ストリンジェントな条件下で（ａ）のヌクレオチド分子にハイブリダイズし，かつホスファターゼポリペプチドをコードする；
（ｄ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするが，ただし，前記ポリペプチドは，Ｎ末端ドメイン，Ｃ末端触媒ドメイン，触媒ドメイン，Ｃ末端ドメイン，コイルドコイル構造領域，プロリンリッチ領域，スペーサー領域およびＣ末端テールの全部ではないが１またはそれ以上を欠失しており；または
（ｅ）（ｄ）のヌクレオチド配列の相補体である，
のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする核酸分子。
【請求項２】
宿主細胞において転写を開始させるのに有効なベクターまたはプロモーターをさらに含む，請求項１記載の核酸分子。
【請求項３】
前記核酸分子が，哺乳動物から単離された，濃縮された，または精製されたものである，請求項１記載の核酸分子。
【請求項４】
前記哺乳動物がヒトである，請求項３記載の核酸分子。
【請求項５】
ストリンジェントな条件下で配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するホスファターゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する核酸を含む，請求項１記載の核酸分子。
【請求項６】
単離され，濃縮され，または精製されたホスファターゼポリペプチドであって，
（ａ）配列番号２に記載される配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列であって，ただし，ポリペプチドは，Ｎ末端ドメイン，Ｃ末端触媒ドメイン，触媒ドメイン，Ｃ末端ドメイン，コイルドコイル構造領域，プロリンリッチ領域，スペーサー領域およびＣ末端テイルからなる群より選択されるドメインの全部ではないが１またはそれ以上を欠失しているアミノ酸配列，
を含むポリペプチド。
【請求項７】
前記ポリペプチドが，哺乳動物から単離され，精製され，または濃縮されたものである，請求項６記載のホスファターゼポリペプチド。
【請求項８】
前記哺乳動物がヒトである，請求項７記載のホスファターゼポリペプチド。
【請求項９】
ホスファターゼポリペプチドまたは前記ポリペプチドのドメインに対して特異的結合親和性を有する抗体または抗体フラグメントであって，前記ポリペプチドは，配列番号２に記載されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする抗体または抗体フラグメント。
【請求項１０】
請求項９記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項１１】
請求項６記載のポリペプチドに結合する抗体および負対照抗体を含むキット。
【請求項１２】
ホスファターゼポリペプチドの活性を調節する物質を同定する方法であって，
（ａ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列と実質的に同一のホスファターゼポリペプチドを試験物質と接触させ；
（ｂ）前記ポリペプチドの活性を測定し；そして
（ｃ）前記物質が前記ポリペプチドの活性を調節するか否かを判定する，
の各工程を含む方法。
【請求項１３】
細胞においてホスファターゼポリペプチドの活性を調節する物質を同定する方法であって，
（ａ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列と実質的に同一の配列を有するホスファターゼポリペプチドを発現させ；
（ｂ）前記細胞に試験物質を加え；そして
（ｃ）細胞表現型または前記ポリペプチドと天然の結合パートナーとの間の相互作用の変化をモニターする，
の各工程を含む方法。
【請求項１４】
治療を必要とする患者に，配列番号２に記載されるアミノ酸配列と実質的に同一のホスファターゼの活性を調節する物質を投与することにより疾病または疾患を治療する方法。
【請求項１５】
前記疾病または疾患が，癌，免疫関連疾病および疾患，心臓血管疾病，脳またはニューロン関連疾病，代謝性疾患および炎症性疾患からなる群より選択される，請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記疾病または疾患が，組織の癌；血液または造血細胞起源の癌；乳，結腸，肺，前立腺，子宮頚部，脳，卵巣，膀胱または腎臓の癌からなる群より選択される，請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記疾病または疾患が，中枢神経系または末梢神経系疾病，片頭痛；痛み；性的機能不全；気分障害；注意障害；認識障害；低血圧症；高血圧症；精神病性疾患；神経性疾患および運動異常症からなる群より選択される，請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
前記疾病または疾患が，炎症性疾患，例えば慢性関節リウマチ，慢性炎症性腸疾病，慢性炎症性骨盤疾病，多発性硬化症，ぜん息，変形性関節症，乾癬，アテローム性動脈硬化症，鼻炎，自己免疫，および臓器移植拒絶からなる群より選択される，請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
前記物質がインビトロでホスファターゼ活性を調節する，請求項１５記載の方法。
【請求項２０】
前記物質がホスファターゼ阻害剤である，請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
疾病または疾患の診断道具として試料中においてホスファターゼポリペプチドを検出する方法であって，
（ａ）前記試料を，ハイブリダイゼーションアッセイ条件下で配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するホスファターゼポリペプチドの核酸標的領域とハイブリダイズする核酸プローブと接触させ，前記プローブは，核酸配列，そのフラグメント，または前記配列およびフラグメントの相補体を含み；そして
（ｂ）標的領域：プローブハイブリッドの存在または量を前記疾病または疾患の指標として検出する，
の各工程を含む方法。
【請求項２２】
前記疾病または疾患が，癌，免疫関連疾病および疾患，心臓血管疾病，脳またはニューロン関連疾病，代謝性疾患および炎症性疾患からなる群より選択される，請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記疾病または疾患が，組織の癌；血液または造血細胞起源の癌；乳，結腸，肺，前立腺，子宮頚部，脳，卵巣，膀胱または腎臓の癌からなる群より選択される，請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記疾病または疾患が，中枢神経系または末梢神経系疾病，片頭痛，痛み；性的機能不全；気分障害；注意障害；認識障害；低血圧症；高血圧症；精神病性疾患；神経性疾患；および運動異常症からなる群より選択される，請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
前記疾病または疾患が，炎症性疾患，例えば慢性関節リウマチ，慢性炎症性腸疾病，慢性炎症性骨盤疾病，多発性硬化症，ぜん息，変形性関節症，乾癬，アテローム性動脈硬化症，鼻炎，自己免疫，および臓器移植拒絶からなる群より選択される，請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
配列番号２の配列を有するホスファターゼポリペプチドのドメインをコードする核酸分子を含む，単離された，濃縮されたまたは精製された核酸分子。
【請求項２７】
配列番号２に記載されるポリペプチドと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む，ホスファターゼポリペプチドをコードする単離された，濃縮されたまたは精製された核酸分子。
【請求項２８】
分子が，配列番号１の配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を含む，請求項１記載の単離された，濃縮されたまたは精製された核酸分子。
【請求項２９】
配列番号２のポリペプチドをコードする核酸配列の約１０−３０個の連続するヌクレオチド塩基から本質的になる，単離された，濃縮されたまたは精製された核酸分子。
【請求項３０】
配列番号１の核酸配列の約１０−３０個の連続するヌクレオチド塩基から本質的になる，請求項２９記載の単離された，濃縮されたまたは精製された核酸分子。
【請求項３１】
請求項１記載の核酸分子を含む組換え細胞。
【請求項３２】
請求項１記載の核酸分子を含むベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は，ホスファターゼポリペプチド，ホスファターゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列，ならびに種々のホスファターゼ関連疾病および状態の診断および治療に有用な種々の産物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
以下の発明の背景の記載は本発明の理解を助けるために提供され，本発明に対する先行技術であるかまたはそれを記述すると認めるものではない。
【０００３】
細胞シグナル伝達は，各種の細胞プロセスを制御する外部刺激を細胞内部にリレーするための基本的メカニズムである。シグナル伝達の重要な生物化学メカニズムの一つは蛋白質キナーゼによる蛋白質の可逆的リン酸化であり，これは，成熟蛋白質の構造と機能を変化させることによりその活性を制御することができる。真核生物で最も良く特性決定されている蛋白質キナーゼは，セリン，トレオニンおよびチロシン残基のアルコール部分で蛋白質をリン酸化する。これらのキナーゼは，セリンおよびトレオニンのリン酸化に特異的なものと，チロシンのリン酸化に特異的なものの２グループに大別される。
【０００４】
所定の基質のリン酸化状態はまた，蛋白質ホスファターゼ，すなわち，蛋白質キナーゼにより所定の基質に加えられたリン酸基の除去を担う一群の蛋白質によっても制御される。蛋白質ホスファターゼもまた，セリン／トレオニン，またはチロシンのいずれかに特異的であるとして分類することができる。このファミリーのいくつかのメンバーは，チロシンのみを脱リン酸化することができ，"蛋白質チロシンホスファターゼ"（"ＰＴＰ"）として知られており，他のものはチロシンならびにセリンおよびトレオニンを脱リン酸化することができ，"二重特異性ホスファターゼ"（"ＤＳＰ"）と称され；第３のファミリーはセリンまたはトレオニンのみをリン酸化する（"ＳＴＰ"）。これらは，Ｆａｕｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９９６  Ｎｏｖ  ２１（１１）：４１３−７）およびＭａｒｔｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ．１９９８  Ｆｅｂ  ２８；８（１）：２−１１）に記載される。これらの蛋白質は，共通の触媒コア構造を含む２５０−３００アミノ酸ドメインを共有する。関連するホスファターゼは，チロシンホスファターゼ，二重特異性ホスファターゼ，およびミオチューブラリン様（ｍｙｏｔｕｂｕｌａｒｉｎ−ｌｉｋｅ）ホスファターゼ（（Ｆａｕｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，；およびＭａｒｔｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，上掲）の別個のサブファミリーに分類される。
【０００５】
ホスファターゼは，上流のレギュレータと相互作用すると考えられている種々の非触媒ドメインを有する。例としては，ＳＨ３含有蛋白質との相互作用のためのプロリンリッチドメイン，またはＲａｃ，Ｒｈｏ，およびＲａｂ等の小さいＧ蛋白質との相互作用のための特異的ドメインが含まれる。これらの相互作用は，種々の細胞表面レセプターの活性化等の外部刺激，例えば，チロシンキナーゼ，サイトカインレセプター，ＴＮＦレセプター，Ｆａｓ，Ｔ細胞レセプター，ＣＤ２８，またはＣＤ４０に応答した独特の生化学的経路の間をクロストークするためのメカニズムを提供するかもしれない。
【０００６】
ホスファターゼは，種々の細胞応答，例えば，成長因子，サイトカインおよびホルモンに対する応答，酸化−，ＵＶ−，または照射−関連ストレス経路，炎症性シグナル（例えばＴＮＦα），アポトーシス刺激（例えばＦａｓ），ＴおよびＢ細胞共刺激，細胞骨格構造の制御，および細胞トランスフォーメーション等の制御において関与することが示唆されている（ＴＨＥ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＰＨＯＳＰＨＡＴＡＳＥ  ＦＡＣＴＢＯＯＫ，Ｔｏｎｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，２０００を参照）。
【０００７】
したがって，その不適切な活性が癌または他の疾患につながりうる追加のホスファターゼを同定し，これらの疾患の適切な治療をも同定することが必要とされている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
本発明にしたがうホスファターゼの特徴を記載するために，以下の略号を用いる：
ＤｓＰＴＰ  二重特異性蛋白質ホスファターゼ
ＤＵＳ  二重特異性ホスファターゼ
ＭＫＰ  ＭＡＰキナーゼホスファターゼ
ＭＴＭ  筋細管ミオパシー（ミオチューブラリン）ホスファターゼ
ＰＴＰ  蛋白質チロシンホスファターゼ
ＳＴＰ  セリントレオニンホスファターゼ
ＰＴＥＮ  ホスファターゼおよびテンシンホモログ
【０００９】
"モチーフ抽出"バイオインフォマティクスのスクリプトを使用することにより，我々は，ホスファターゼファミリーのある種の追加の哺乳動物メンバーを同定し，これは本明細書に記載される。本発明は，５個のホスファターゼの部分配列または完全配列，ならびにこれらの分類，予測されたまたは推定された蛋白質構造，およびこれらの蛋白質の生物学的および治療上の関連性を解明する戦略を提供する。これらの新規蛋白質には，ＳＴＰグループの３種類，ＤＳＰグループの１種類，およびｃＰＴＰグループの１種類のホスファターゼポリペプチドが含まれる。新規蛋白質を確立されたファミリーに属するとして分類することは，各蛋白質の残りの非触媒部分に存在するモチーフの予測におけるのみならず，これらの蛋白質の制御，基質，およびシグナリング経路においても，非常に正確であることが証明された。
【００１０】
本発明の１つの観点は，配列番号２のアミノ酸配列を有するホスファターゼポリペプチドをコードする，単離された，濃縮された，または精製された核酸分子を特徴とする。
【００１１】
核酸に関して"単離された"とは，互いに結合した１０個（好ましくは２１個，より好ましくは３９個，最も好ましくは７５個）またはそれ以上のヌクレオチドのポリマーを意味し，天然起源から単離された，またはセンス鎖または相補的なアンチセンス鎖として合成されるＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。本発明のある態様においては，より長い核酸が好ましく，例えば，３００，６００，９００，１２００，１５００，またはそれ以上のヌクレオチドのもの，および／または配列番号１の配列と，少なくとも５０％，６０％，７５％，８０％，８５％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％または９９％の同一性を有するものが好ましい。
【００１２】
核酸とは，限定されないが，ＤＮＡ，ＲＮＡまたはｃＤＮＡを意味し，核酸がＲＮＡである場合にはチミンがウラシルであることが理解される。
【００１３】
本発明の単離された核酸は，これが自然には純粋なまたは分離された状態で見いだされないという点において独特である。"単離された"との用語の使用は，天然に生ずる配列がその通常の細胞環境（すなわち染色体）から除かれていることを表す。すなわち，配列は，無細胞溶液中にあってもよく，または異なる細胞環境に置かれていてもよい。この用語は，この配列が存在する唯一のヌクレオチド鎖であることを意味するものではなく，天然にこれに付随する非ヌクレオチド物質を本質的に含まず（好ましくは約９０％純粋，より好ましくは少なくとも約９５％純粋），したがって，単離された染色体とは区別されることを意味する。
【００１４】
核酸に関連して，"濃縮された"との用語の使用は，特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列が，目的とする細胞または溶液中に存在する総ＤＮＡまたはＲＮＡ中で，正常または疾病細胞，またはこの配列が由来する細胞におけるより有意に高い割合（２−５倍）を占めることを意味する。これは，存在する他のＤＮＡまたはＲＮＡの量の優先的減少，または特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列の量の優先的増加，またはこれらの２つの組み合わせにより，人が生じさせることができる。しかし，濃縮されたとは，他のＤＮＡまたはＲＮＡ配列が存在しないことを意味するものではなく，単に，目的とする配列の相対的な量が有意に増加されていることを意味することに注意すべきである。"有意に"との用語は，増加のレベルがそのような増加を作成した人にとって有用であることを示すために用いられ，一般に，他の核酸に比べて少なくとも約２倍，より好ましくは少なくとも５倍，より好ましくは少なくとも１０倍またはさらにそれ以上増加していることを意味する。またこの用語は，他の起源からのＤＮＡまたはＲＮＡが存在しないことを意味するものではない。他の起源のＤＮＡは，例えば，酵母または細菌ゲノム，またはクローニングベクター，例えばｐＵＣ１９からのＤＮＡでありうる。この用語は，１つのｍＲＮＡのレベルが他の種のｍＲＮＡと比較して自然に増加している天然に生ずる事象，例えばウイルス感染または腫瘍タイプの成長から区別される。すなわち，この用語は，人が所望の核酸の比率を上昇させることを意図する状況のみをカバーする。
【００１５】
ある目的のためには，ヌクレオチド配列が精製された形であることも有利である。核酸に関して，"精製された"との用語は，絶対的純度（例えば均一な調製物）を要求するものではない。むしろ，これは配列が天然の環境におけるより比較的純粋であることを示す（天然のレベルと比較して，このレベルは，例えばｍｇ／ｍＬで少なくとも２−５倍高い）。ｃＤＮＡライブラリから単離された個々のクローンは，電気泳動的に均一にまで精製することができる。これらのクローンから得られた本発明のＤＮＡ分子は，総ＤＮＡからまたは総ＲＮＡから直接得ることができる。ｃＤＮＡクローンは天然に生じず，好ましくは部分的に精製した天然に生ずる物質（メッセンジャーＲＮＡ）の操作により得る。ｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリの構築は，合成物質（ｃＤＮＡ）の作成を含み，純粋な個々のｃＤＮＡクローンは，ｃＤＮＡライブラリを有する細胞のクローン選択により合成ライブラリから単離することができる。すなわち，ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリを構築し，個々のｃＤＮＡクローンを単離することを含む工程により，天然のメッセンジャーのおよそ１０6倍の精製が得られる。すなわち，少なくとも１桁，好ましくは２または３桁，より好ましくは４または５桁の精製が明示的に企図される。
【００１６】
"ホスファターゼポリペプチド"とは，配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド中の，３２個（好ましくは４０，より好ましくは４５，最も好ましくは５５個）またはそれ以上の連続するアミノ酸を意味する。ある観点においては，１００，２００，３００，４００，４５０，５００，５５０，６００，７００，８００，９００個またはそれ以上のアミノ酸のポリペプチドが好ましい。ホスファターゼポリペプチドは，ポリペプチドの機能的活性が保持される限り，全長核酸配列または全長核酸配列の任意の部分（例えば，本明細書において定義される"フラグメント"），例えば，触媒ドメイン（本明細書において定義される）またはその一部によりコードされることができる。遺伝コードの縮重のため，多数の異なる核酸配列が同じアミノ酸配列をコードしうることは当該技術分野においてよく知られている。同じく，アミノ酸の保存的変更を行って，元の機能を保持している蛋白質またはポリペプチドを得ることができることも，当該技術分野においてよく知られている。そのような置換には，アミノ酸を類似の物理化学的特性を有する残基で置き換えること，例えば，１つの脂肪族残基（Ｉｌｅ，Ｖａｌ，ＬｅｕまたはＡｌａ）を別のもので，または塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇ，酸性残基ＧｌｕおよびＡｓｐ，アミド残基ＧｌｎおよびＡｓｎ，ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｙｒ，または芳香族残基ＰｈｅおよびＴｙｒの間で置き換えることが含まれる。蛋白質全体にあったとしてもわずかの影響しか与えないアミノ酸の交換を作成することに関するさらなる情報は，Ｂｏｗｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９０，２４７，１３０６−１３１０に見いだすことができる（図面および表を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）。すべての場合において，すべての順列がこの開示によりカバーされることが意図される。
【００１７】
本発明のホスファターゼペプチドのアミノ酸配列は，配列番号２のアミノ酸配列またはそのフラグメントを有する配列に実質的に類似するであろう。
【００１８】
配列番号２の配列に実質的に類似する配列は，好ましくは，配列番号２の配列と，少なくとも５０％，６０％，７５％，８０％，８５％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％または９９％の同一性を有するであろう。好ましくは，ホスファターゼポリペプチドは，上述の配列の１つと，少なくとも約９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％または９９％の同一性を有するであろう。
【００１９】
"同一性"とは，その類似性または関係の尺度である配列の性質を意味する。同一性は，同一である残基の数を，既知の配列または既知の配列のドメイン中の残基の総数で割り，１００を乗ずることにより測定する。"ギャップ"とは，アミノ酸の付加または欠失により生じたアラインメント中の空間である。すなわち，完全に同一の配列の２つのコピーは１００％の同一性を有するが，より低い程度に保存され，欠失，付加または置換を含む配列はより低い程度の同一性を有するであろう。当業者は，標準的なパラメータを用いて配列の同一性を決定するためのいくつかのコンピュータプログラム，例えば，Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴまたはＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２），ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０），およびスミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７）が利用可能であることを認識するであろう。好ましくは，これらのプログラムのデフォルト設定を用いるが，当業者は，これらの設定を変更することが必要であるか否かを認識しており，どのようにして変更するかがわかる。
【００２０】
"類似性"は，同一の残基の数と保存的に置換された残基の数（Ｂｏｗｉｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，２４７，１３０６−１３１０を参照（図面および表を含め，その全体を本明細書の一部としてここに引用する）との合計を残基とギャップの総数で割り，１００を乗ずることにより測定することができる。
【００２１】
好ましい態様においては，本発明は，以下のヌクレオチド配列を含むホスファターゼポリペプチドをコードする，単離された，濃縮されたまたは精製された核酸分子を特徴とする：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする；
（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の相補体である；
（ｃ）（ａ）のヌクレオチド分子に高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし，かつ天然に生ずるホスファターゼポリペプチドをコードする；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列であって，ただしＮ末端ドメイン，触媒ドメイン，Ｃ末端触媒ドメイン，Ｃ末端ドメイン，コイルドコイル構造領域，プロリンリッチ領域，スペーサー領域，およびＣ末端テールからなる群より選択されるドメインの全部ではないが１またはそれ以上を欠失しているアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする；および
（ｅ）（ｄ）のヌクレオチド配列の相補体である。
【００２２】
好ましい態様においては，本発明は，配列番号１の配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を含む，単離された，濃縮されたまたは精製された核酸分子を特徴とする。好ましくは，配列は，上述の配列と少なくとも５０％，６０％，７５％，８０％，８５％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％または９９％の同一性を有する。
【００２３】
"相補体"との用語は，互いに多くの望ましい相互作用を形成しうる２つのヌクレオチドを表す。例えば，アデニンはチミンと２つの水素結合を形成することができるため，チミンに相補的である。同様に，グアニンとシトシンは３つの水素結合を形成することができるため，相補的である。あるヌクレオチド配列は，第１の配列のすべてのヌクレオチドが第２の配列のすべてのヌクレオチドと相補的である場合，他のヌクレオチド配列の相補体である。
【００２４】
所望の特異性および選択性に応じて，種々の低いまたは高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を用いることができる。これらの条件は，当業者にはよく知られている。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下では，高度に相補的な核酸配列のみがハイブリダイズする。好ましくは，そのような条件は，２０個の連続するヌクレオチド中に１または２個のミスマッチを有する核酸のハイブリダイゼーションを防止し，より好ましくは，そのような条件は，５０個の連続するヌクレオチド中に１または２個のミスマッチを有する核酸のハイブリダイゼーションを防止し，最も好ましくは，そのような条件は，１００個の連続するヌクレオチド中に１または２個のミスマッチを有する核酸のハイブリダイゼーションを防止する。場合によっては，この条件は，全長配列中に５個のミスマッチを有する核酸のハイブリダイゼーションを防止する。
【００２５】
ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件とは，少なくとも以下の程度にストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件を意味する：５０％ホルムアミド，５ＸＳＳＣ，５０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4，ｐＨ６．８，０．５％ＳＤＳ，０．１ｍｇ／ｍＬ超音波処理サケ精子ＤＮＡ，および５Ｘデンハルト溶液中で４２℃で一夜のハイブリダイゼーション；２ＸＳＳＣ，０．１％ＳＤＳで４５℃での洗浄；および０．２ＸＳＳＣ，０．１％ＳＤＳで４５℃での洗浄。いくつかの最もストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件においては，２回目の洗浄は，０．１ＸＳＳＣで７０℃までの温度で行うことができる（Ｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９８７）Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｇ４２１（図面および表を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）。しかし，他の用途は，これらの条件の組の間に入る条件の使用を必要とするかもしれない。所望のハイブリダイゼーションを達成するのに必要な条件を決定する方法は当業者にはよく知られており，いくつかの因子，例えば，限定されないが，ハイブリダイズすべき配列および試験すべき試料に基づく。低いストリンジェンシーの洗浄条件は，しばしば洗浄工程の間により低い温度，例えば，６５℃，６０℃，５５℃，５０℃，または４２℃を用いる。
【００２６】
"ドメイン"との用語は，特定の機能を含むポリペプチドの領域を表す。例えば，シグナル伝達蛋白質のＮ末端またはＣ末端ドメインは，例えば，限定されないが，シグナル伝達分子を細胞の異なる領域に局在させる分子に結合し，特定の細胞シグナルを伝播するのに直接関与する他のシグナリング分子に結合する，等の機能を提供することができる。あるドメインは蛋白質の残部と別々に発現させてそれ自身で機能することができるが，他のドメインはその機能を保持するためには無傷の蛋白質の一部のままでなければならない。後者は蛋白質の機能的領域とも称され，これもまたドメインと関連する。
【００２７】
"Ｎ末端ドメイン"との用語は，蛋白質ホスファターゼの開始メチオニンと触媒的ドメインとの間に位置する触媒外領域を表す。Ｎ末端ドメインは，蛋白質配列を非重複蛋白質データベースに対してスミス−ウォーターマンアラインメントを行い，触媒的ドメインのＮ末端境界を規定することにより同定することができる。Ｎ末端ドメインは，その長さに応じて，ホスファターゼ機能において制御的役割を果たすかまたは果たさない。"触媒ドメイン"とは，典型的には２５−３００アミノ酸の長さであり，高エネルギーリン酸ドナー分子，例えばＡＴＰまたはＧＴＰから，それ自身（自己リン酸化）または他の蛋白質（外因性リン酸化）へのリン酸転移反応を担う蛋白質ホスファターゼの領域を表す。蛋白質ホスファターゼの触媒ドメインは高度に保存されたアミノ酸残基を含む１２個のサブドメインから構成され，正しいポリペプチドのフォールディングおよび触媒を担う。触媒ドメインは，蛋白質配列を非重複蛋白質データベースに対してをスミス・ウォーターマンアライメントさせた後に同定することができる。
【００２８】
本明細書において用いる場合，"触媒活性"との用語は，ホスファターゼ触媒ドメインが基質をリン酸化する速度を規定する。触媒活性は，例えば，リン酸化された生成物に変換される基質の量を時間の関数として決定することにより測定することができる。触媒活性は，時間を一定にして定められた時間の後にリン酸化された基質の濃度を決定することにより，本発明の方法により測定することができる。基質のリン酸化は，蛋白質ホスファターゼの活性部位において生ずる。活性部位は，通常は，基質が蛋白質ホスファターゼに結合し，リン酸化される空洞である。
【００２９】
本明細書において用いる場合，"基質"との用語は，本発明のホスファターゼによりリン酸化される分子を表す。ホスファターゼは，リン酸化されたセリン／トレオニンまたはチロシンアミノ酸からリン酸基を除去する。分子は別の蛋白質またはポリペプチドであってもよい。
【００３０】
"Ｃ末端ドメイン"との用語は，蛋白質ホスファターゼの触媒ドメインまたは最後の（Ｃ末端に最も近い位置の）機能的ドメインとカルボキシ末端アミノ酸残基との間に位置する領域を表す。"機能的"ドメインとは，他の蛋白質に対するアミノ酸配列ホモロジーから，または特定の構造的コンフォメーションを与えるであろうアミノ酸配列の存在（例えばＮ末端ドメイン）により，制御的または触媒的役割を果たすであろう，ポリペプチドの任意の領域を意味する。Ｃ末端ドメインは，非重複蛋白質データベースに対して蛋白質配列のスミス−ウォーターマンアラインメントを用いて，触媒ドメインまたは任意の機能的なＣ末端の触媒外ドメインのＣ末端境界を規定することにより同定することができる。その長さおよびアミノ酸組成に依存して，Ｃ末端ドメインは，ホスファターゼ機能において制御的機能を果たすかもしれないし果たさないかもしれない。本発明のいくつかのホスファターゼについては，Ｃ末端ドメインはまた触媒ドメインを含むかもしれない（上述）。
【００３１】
本明細書において用いる場合，"Ｃ末端テール"との用語は，ホモロジーにより，その最も近いホモログのＣ末端アミノ酸を越えて伸長または突出している蛋白質ホスファターゼのＣ末端ドメインを表す。Ｃ末端テールは，蛋白質配列を非重複蛋白質データベースに対してスミス−ウォーターマン配列アラインメントを用いることにより，またはＤＮＡＳｔａｒプログラムＭｅｇａｌｉｇｎを用いる相同な配列の多重配列アラインメントにより，同定することができる。Ｃ末端テールは，その長さに依存して，ホスファターゼ機能において制御的役割を果たすかもしれないし果たさないかもしれない。
【００３２】
本明細書において用いる場合，"コイルドコイル構造領域"との用語は，コンピュータアルゴリズム，例えばＣＯＩＬＳ（Ｌｕｐａｓ，Ａ．（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２６６：５１３−５２５）により推定してコイルドコイル構造をとる可能性が高いポリペプチド配列を表す。コイルドコイルは，平行な２または３個の両親媒性α−ヘリックスから形成される。コイルドコイルは，他のポリペプチドのコイルドコイルドメインと結合してホモ二量体またはヘテロ二量体を生ずることができる（Ｌｕｐａｓ，Ａ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：１１６２−１１６４）。
【００３３】
本明細書において用いる場合，"プロリンリッチ領域"との用語は，蛋白質ホスファターゼの，所定のアミノ酸長さにわたるプロリン含量が蛋白質において見いだされるこのアミノ酸の平均含量より高い（すなわち，＞１０％）領域を表す。プロリンリッチ領域は，アミノ酸配列を目で調べることにより容易に識別され，標準的なコンピュータ配列分析プログラム，例えばＤＮＡＳｔａｒプログラムＥｄｉｔＳｅｑにより定量することができる。プロリンリッチ領域は，制御蛋白質と蛋白質との相互作用に関与することが示されている。
【００３４】
本明細書において用いる場合，"スペーサー領域"との用語は，予測される機能的ドメインの間に位置する蛋白質ホスファターゼの領域を表す。スペーサー領域は，データベース中の任意のアミノ酸配列に対する検出可能なホモロジーを有しない。これは，非重複蛋白質データベースに対して蛋白質配列のスミスウォーターマンアラインメントを用いて，これを挟む機能的ドメインのＣおよびＮ末端境界を規定することにより同定することができる。スペーサー領域は，蛋白質ホスファターゼ機能において基本的な機能を果たすかもしれず果たさないかもしれない。
【００３５】
本明細書において用いる場合，"挿入物"との用語は，密接なホモログ中にはない蛋白質ホスファターゼの一部を表す。挿入物は，エクソンの選択的スプライシングの産物であるかもしれないしそうではないかもしれない。挿入物は，蛋白質配列の非重複蛋白質データベースに対するスミス−ウォーターマン配列アラインメントを用いて，またはＤＮＡＳｔａｒプログラムＭｅｇａｌｉｇｎを用いる相同な配列の多重配列アラインメントにより，同定することができる。挿入物は，蛋白質−蛋白質相互作用のための新規な伝達手段を提示することにより，またはそのような相互作用を妨害することにより，機能的役割を果たすかもしれない。
【００３６】
"シグナル伝達経路"との用語は，細胞外シグナルを細胞膜を通して伝播し，細胞内シグナルとなる分子を表す。このシグナルは，次に細胞性応答を刺激することができる。シグナル伝達プロセスに関与するポリペプチド分子は，典型的にはレセプターおよび非レセプター蛋白質チロシンホスファターゼ，レセプターおよび非レセプター蛋白質ホスファターゼ，ＳＲＣホモロジー２および３ドメインを含むポリペプチド，ホスホチロシン結合蛋白質（ＳＲＣホモロジー２（ＳＨ２）およびホスホチロシン結合（ＰＴＢおよびＰＨ）ドメイン含有蛋白質），プロリンリッチ結合蛋白質（ＳＨ３ドメイン含有蛋白質），ＧＴＰａｓｅ，ホスホジエステラーゼ，ホスホリパーゼ，プロリルイソメラーゼ，プロテアーゼ，Ｃａ２＋結合蛋白質，ｃＡＭＰ結合蛋白質，グアニルシクラーゼ，アデニリルシクラーゼ，ＮＯ生成蛋白質，ヌクレオチド交換因子および転写因子である。
【００３７】
別の好ましい態様においては，本発明は，ホスファターゼポリペプチドをコードし，宿主細胞において転写を開始するのに有効なベクターまたはプロモーターをさらに含む，単離された，濃縮されたまたは精製された核酸分子を特徴とする。本発明はまた，組換え核酸を特徴とし，これは好ましくは細胞または生物内にある。組換え核酸は，配列番号１の配列，またはその機能的誘導体，および宿主細胞において転写を開始させるのに有効なベクターまたはプロモーターを含むことができる。あるいは，組換え核酸は，細胞において機能的な転写開始領域，ホスファターゼポリペプチドをコードするＲＮＡ配列に相補的な配列および細胞において機能的な転写終止領域を含んでいてもよい。特定のベクターおよび宿主細胞の組み合わせは本明細書において議論される。
【００３８】
"ベクター"との用語は，細胞にトランスフェクトすることができ，細胞ゲノム中でまたはそれとは独立に複製しうる一本鎖または二本鎖の環状核酸分子を表す。環状二本鎖核酸分子は，制限酵素で処理することにより切断し，したがって直鎖状にすることができる。核酸ベクターの分類，制限酵素，および制限酵素により切断されるヌクレオチド配列の知識は，当業者には容易に入手可能である。ホスファターゼをコードする核酸分子は，ベクターを制限酵素で切断し，２つの断片を一緒にライゲーションすることにより，ベクター中に挿入することができる。
【００３９】
"トランスフェクトする"との用語は，核酸ベクターまたは他の核酸分子を細胞性生物中に挿入する多数の方法を規定する。これらの方法には，種々の手法が含まれ，例えば，細胞を高濃度の塩，電界，界面活性剤，またはＤＭＳＯで処理することにより，細胞の外膜または壁を目的の核酸分子に対して透過性にすること，または種々のウイルス伝達戦略を用いることが含まれる。
【００４０】
本明細書において用いる場合，"プロモーター"との用語は，遺伝子配列の発現に必要な核酸配列を表す。プロモーター領域は生物によって様々であるが，種々の生物について当業者によく知られている。例えば，原核生物においては，プロモーター領域は，プロモーター（ＲＮＡ転写の開始を指示する）ならびに，ＲＮＡに転写されたときに合成の開始を合図するＤＮＡ配列の両方を含む。そのような領域は，通常は転写および翻訳の開始に関与する５’非コーディング配列，例えばＴＡＴＡボックス，キャッピング配列，ＣＡＡＴ配列等を含む。
【００４１】
好ましい態様においては，単離された核酸は，配列番号１の核酸配列を含むか，本質的にそれからなるか，またはそれからなり，かつ，配列番号２に記載されるアミノ酸配列，その機能的誘導体，または配列番号２の少なくとも３５，４０，４５，５０，６０，７５，１００，２００，または３００個の連続するアミノ酸をコードする。核酸は，ｃＤＮＡクローニングにより，またはサブトラクティブハイブリダイゼーションにより，天然の起源から単離することができる。天然の起源は哺乳動物であることができ，好ましくはヒト，好ましくは血液，精液または組織であり，核酸はトリエステル法によりまたは自動化ＤＮＡ合成機を用いることにより合成してもよい。
【００４２】
"哺乳動物"とは，好ましくはマウス，ラット，ウサギ，モルモット，ヒツジ，およびヤギ等の生物を表し，より好ましくはネコ，イヌ，有尾サル，および無尾サルを表し，最も好ましくはヒトを表す。
【００４３】
さらに別の好ましい態様においては，核酸は，例えば，追加のポリペプチドの同定およびクローニングを容易にするためのハイブリダイゼーションプローブを設計するのに，追加のポリペプチドのクローニングを容易にするためのＰＣＲプローブを設計するのに，ポリペプチド領域に対する抗体を得るために，およびアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計するのに有用な，保存されたまたは独特の領域である。
【００４４】
"保存された核酸領域"とは，ホスファターゼポリペプチドをコードする２つまたはそれ以上の核酸に存在する領域を意味し，特定の核酸配列は低いストリンジェンシー条件下でこの領域にハイブリダイズすることができる。ホスファターゼポリペプチドをコードする核酸のスクリーニングに適した低ストリンジェンシー条件の例は，Ｗａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１５２：３９９−４０７（１９８７）およびＷａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１５２：４１５−４２３（１９８７）（図面および表を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）に提供される。好ましくは，保存領域は，２０ヌクレオチド中５個以下で異なり，より好ましくは２０ヌクレオチド中２個，最も好ましくは２０ヌクレオチド中１個が異なる。
【００４５】
"独特の核酸領域"とは，ホスファターゼポリペプチドをコードする核酸中に存在し，天然に生ずる任意の他のポリペプチドをコードする配列中には存在しない配列を意味する。そのような領域は，好ましくは配列番号２の全長アミノ酸配列に記載される３２個（好ましくは４０個，より好ましくは４５個，最も好ましくは５５個）またはそれ以上の連続するアミノ酸をコードする。特に，独特の核酸領域は，好ましくは哺乳動物起源のものである。
【００４６】
本発明の別の観点は，試料において，配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するホスファターゼポリペプチドをコードする核酸を検出するための核酸プローブを特徴とする。核酸プローブは，配列番号１に記載される配列，またはその機能的誘導体にハイブリダイズするであろうヌクレオチド塩基配列を含む。
【００４７】
好ましい態様においては，核酸プローブは，配列番号２に記載される全長配列またはその機能的誘導体の，少なくとも１２，３２，７５，９０，１０５，１２０，１５０，２００，２５０，３００または３５０個の連続するアミノ酸をコードする核酸にハイブリダイズする。
【００４８】
プローブを使用する方法には，ハイブリダイゼーションが生ずるような条件下で試料を核酸プローブと接触させ，ホスファターゼＲＮＡに結合したプローブの存在または量を検出することにより，試料中のホスファターゼＲＮＡの存在または量を検出することが含まれる。プローブとホスファターゼポリペプチドをコードする核酸配列との間に形成される核酸デュープレックスを，検出された核酸の配列の同定において用いることができる（Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｋｒｉｃｋａ，ｅｄ．，ｐ．２７５，１９９２（図面および表を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）。そのような方法を実施するためのキットは，その中に核酸プローブが置かれている容器手段を含むように構築することができる。
【００４９】
別の観点においては，本発明は，配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するホスファターゼポリペプチドをコードする核酸分子を含む組換え細胞または組織を記述する。そのような細胞においては，核酸は遺伝的制御要素の制御下にあってもよく，または外来性プロモーターを含む外来性制御要素の制御下にあってもよい。"外来性"とは，通常はホスファターゼポリペプチドのコーディング配列とインビボで転写的にカップリングしていないプロモーターを意味する。
【００５０】
ポリペプチドは，好ましくは，配列番号２に記載される全長アミノ酸配列によりコードされる蛋白質のフラグメントである。"フラグメント"とは，ホスファターゼポリペプチド中に存在するアミノ酸配列を意味する。好ましくは，そのような配列は，配列番号２に記載される全長配列の，少なくとも３２，４５，５０，６０，１００，２００，または３００個の連続するアミノ酸を含む。
【００５１】
別の観点においては，本発明は，配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有する，単離された，濃縮されたまたは精製されたホスファターゼポリペプチドを特徴とする。
【００５２】
ポリペプチドに関して"単離された"とは，互いに結合した６個（好ましくは１２個，より好ましくは１８個，最も好ましくは２５，３２，４０，または５０個）またはそれ以上のアミノ酸のポリマーを意味し，天然起源から単離されたポリペプチドまたは合成されたポリペプチドが含まれる。ある種の観点においては，より長いポリペプチド，例えば，配列番号２に記載される全長配列の，１００，２００，３００，４００，４５０，５００，５５０，６００，７００，８００，９００個またはそれ以上の連続するアミノ酸を含むものが好ましい。
【００５３】
本発明の単離されたポリペプチドは，天然には純粋なまたは分離された形で見いだされない点において独特である。"単離された"との用語の使用は，天然に生ずる配列がその正常な細胞性環境から除かれていることを示す。すなわち，配列は，無細胞溶液中にあってもよく，異なる細胞性環境に置かれていてもよい。この用語は，その配列が存在する唯一のアミノ酸鎖であることを意味するものではなく，配列が天然にこれに付随する非アミノ酸物質を本質的に含まない（少なくとも約９０％純粋，より好ましくは少なくとも約９５％またはそれ以上純粋）ことを意味する。
【００５４】
ポリペプチドに関して使用する場合，"濃縮された"との用語は，特定のアミノ酸配列が，正常または疾病細胞におけるより，または配列が由来する細胞におけるより，目的とする細胞または溶液中に存在する総アミノ酸配列の有意に高い割合（２−５倍）を占めることを意味する。これは，存在する他のアミノ酸配列の量の優先的減少により，または目的とする特定のアミノ酸配列の量の優先的増加により，またはこれら２つの組み合わせにより，人が生じさせることができる。しかし，濃縮されたとは，他のアミノ酸配列が存在しないことを意味するものではなく，単に目的とする配列の相対的な量が有意に増加していることを意味することに注意すべきである。本明細書において"有意"にとの用語は，増加のレベルがそのような増加を作成した人にとって有用であることを示し，一般に，他のアミノ酸配列と比較して少なくとも約２倍，より好ましくは少なくとも５−１０倍，またはそれより多い増加を意味する。この用語はまた，他の起源からのアミノ酸配列が存在しないことを意味するものではない。アミノ酸配列の他の起源は，例えば，酵母または細菌のゲノム，またはクローニングベクター，例えばｐＵＣ１９によりコードされるアミノ酸配列を含みうる。この用語は，人が介在して所望のアミノ酸配列の比率を増加させる状況のみをカバーすることを意味する。
【００５５】
ある目的のためには，アミノ酸配列が精製された形であることも有利である。ポリペプチドに関して"精製された"との用語は絶対的純度（例えば均一調製物）を要求するものではなく，この用語は配列が天然の環境におけるより比較的純粋であることを示す。天然のレベルと比較して，このレベルは少なくとも２−５倍高くあるべきである（例えばｍｇ／ｍＬで）。少なくとも１桁の精製，好ましくは２または３桁，より好ましくは４または５桁の精製が明示的に意図される。物質は，好ましくは機能的に有意なレベルで夾雑物を含まず，例えば，９０％，９５％，または９９％純粋である。
【００５６】
好ましい態様においては，ホスファターゼポリペプチドは，配列番号２に記載される全長アミノ酸配列によりコードされる蛋白質のフラグメントである。好ましくは，ホスファターゼポリペプチドは，配列番号２に記載される全長配列，またはその機能的誘導体の，少なくとも３２，４５，５０，６０，１００，２００，または３００個の連続するアミノ酸を含む。
【００５７】
好ましい態様においては，ホスファターゼポリペプチドは，
（ａ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列；および
（ｂ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列であって，ただし，Ｃ末端触媒ドメイン，Ｎ末端ドメイン，触媒ドメイン，Ｃ末端ドメイン，コイルドコイル構造領域，プロリンリッチ領域，スペーサー領域，およびＣ末端テールからなる群より選択されるドメインの１またはそれ以上が欠失している配列；
を有するアミノ酸配列を含む。
【００５８】
ポリペプチドは，当該技術分野においてよく知られる方法により，天然の起源から単離することができる。天然の起源は哺乳動物であることができ，好ましくはヒト，血液，精液，または組織であり，またはポリペプチドは自動化ポリペプチド合成機を用いて合成してもよい。
【００５９】
ある態様においては，本発明は，配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有する組換えホスファターゼポリペプチドを含む。"組換えホスファターゼポリペプチド"とは，その存在位置（例えば，天然に見いだされる物とは異なる細胞または組織に存在），純度または構造において天然に生ずるポリペプチドと区別されるように，組換えＤＮＡ技術により製造されるポリペプチドを意味する。一般に，そのような組換えポリペプチドは，天然に通常観察される量とは異なる量で細胞中に存在するであろう。
【００６０】
宿主細胞中で発現させるべきポリペプチドは，異種蛋白質からの領域を含む融合蛋白質であってもよい。そのような領域を含むことにより，例えば，分泌させ，安定性を改良し，またはポリペプチドの精製を容易にすることができる。例えば，適当なシグナルペプチドをコードする配列を発現ベクター中に組み込むことができる。シグナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡ配列を，ポリペプチドがシグナルペプチドを含む融合蛋白質として翻訳されるように，ポリヌクレオチド配列にインフレームで融合させることができる。意図する宿主細胞において機能的であるシグナルペプチドは，ポリペプチドの細胞外分泌を促進する。好ましくは，シグナル配列はポリペプチドが細胞から分泌される際にポリペプチドから切断される。すなわち，ホスファターゼポリペプチドのＮ末端が運搬ペプチドに融合されている好ましい融合蛋白質を作成することができる。
【００６１】
１つの態様においては，ポリペプチドは，ポリペプチドの精製を容易にするために用いられる異種領域を含む融合蛋白質を含む。そのような機能のために用いられる入手可能なペプチドの多くは，融合蛋白質が結合パートナーに選択的に結合することを可能とする。好ましい結合パートナーには，プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインの１またはそれ以上が含まれ，これは，ＩｇＧ結合セファロース等のアフィニティークロマトグラフィーにより容易に均一にまで精製される。あるいは，多くのベクターは，標的蛋白質のＮ末端またはＣ末端で発現されることができるヒスチジン残基のストレッチを有するという利点を有しており，したがって，金属キレート化クロマトグラフィーにより目的とする蛋白質を回収することができる。蛋白質加水分解酵素，例えばエンテロホスファターゼ，ファクターＸプロコラゲナーゼまたはトロンビンの認識部位をコードするヌクレオチド配列をホスファターゼポリペプチドの配列のすぐ上流に配置すると，融合蛋白質を切断して成熟ホスファターゼポリペプチドを得ることができる。融合蛋白質結合パートナーのさらなる例には，限定されないが，酵母Ｉ−因子，ｓｆ９昆虫細胞におけるミツバチメラチンリーダー，６−Ｈｉｓタグ（配列番号３），チオレドキシンタグ，ヘマグルチニンタグ，ＧＳＴタグ，およびＯｍｐＡシグナル配列タグが含まれる。当業者には理解されるように，ペプチドを認識しこれに結合する結合パートナーは，任意のイオン，分子または化合物であることができ，例えば金属イオン（例えば金属アフィニティーカラム），抗体，またはそのフラグメント，およびペプチドに結合する任意の蛋白質またはペプチド，例えばＦＬＡＧタグが含まれる。
【００６２】
抗体
別の観点においては，本発明は，ホスファターゼポリペプチドまたはホスファターゼポリペプチドドメインまたはフラグメントに対して特異的結合親和性を有する抗体（例えば，モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体）を特徴とし，ここで，ポリペプチドは，配列番号２に記載されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一の配列を有する群から選択される。"特異的結合親和性"とは，抗体が，特定の条件下において，他のポリペプチドに結合するより高い親和性をもって標的ホスファターゼポリペプチドに結合することを意味する。抗体または抗体フラグメントは，他のポリペプチドに結合しうる領域を含むポリペプチドである。抗体を用いて，ホスファターゼポリペプチドの内因性起源を同定し，細胞サイクル制御をモニターすることができ，または，ホスファターゼポリペプチドの細胞中の免疫局在化に用いることができる。
【００６３】
"ポリクローナル"との用語は，抗原またはその抗原性機能的誘導体で免疫した動物の血清から誘導される抗体分子の異成分集団である抗体を表す。ポリクローナル抗体の製造のためには，種々の宿主動物に抗原を注射することにより免疫することができる。宿主の種により，種々のアジュバントを用いて免疫学的応答を増加させることができる。
【００６４】
"モノクローナル抗体"は，特定の抗原に対する抗体の実質的に均一な集団である。モノクローナル抗体は，培養連続細胞株による抗体分子の生成を与える任意の技術により得ることができる。モノクローナル抗体は，当業者に知られる方法により得ることができる（Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７，１９７５，および米国特許４，３７６，１１０（これらの両方は，図面または表を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する））。
【００６５】
本発明の抗体には，"ヒト化"モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体が含まれる。ヒト化抗体は，抗体の非ヒト（典型的にはネズミ）相補性決定領域が非ヒト（例えばネズミ）免疫グロブリンの重および軽可変鎖からヒト可変ドメイン中に移され，次にネズミ対応物のフレームワーク領域中のいくつかのヒト残基が置き換えられている組換え蛋白質である。本発明にしたがうヒト化抗体は，治療方法において用いるのに適している。ネズミ免疫グロブリン可変ドメインをクローニングする一般的手法は，例えば刊行物（Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：３８３３（１９８９））に記載されている。ヒト化モノクローナル抗体を製造する手法は，例えば，Ｊｏｎｅｓら（Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２（１９８６）），Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８）），Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４（１９８８）），Ｃａｒｔｅｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４２８５（１９９２）），Ｓａｎｄｈｕ（Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：４３７（１９９２）），およびＳｉｎｇｅｒら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１５０：２８４４（１９９３））に記載されている。
【００６６】
"抗体フラグメント"との用語は，特定の分子に対して特異的結合親和性を表示する抗体の一部，しばしば超可変領域および周囲の重鎖および軽鎖の一部を表す。超可変領域は，抗体のポリペプチド標的に物理的に結合する部分である。
【００６７】
本発明の抗体フラグメントには，"一本鎖抗体"が含まれる。この記載において用いられる語句は，特異性をもって抗原と結合し，抗体の重鎖および軽鎖からの可変または超可変領域を含む線状ポリペプチドを示す。そのような一本鎖抗体は，一般的な方法論により製造することができる。ＦｖフラグメントのＶｈおよびＶｌ領域を共有結合させ，ジスルフィド結合を導入することにより安定化させる。Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３６２（１９９０））を参照。あるいは，ペプチドリンカーを挿入することによりＶｈおよびＶｌ領域を結合させることができる。Ｖｈ，Ｖｌおよびペプチドリンカー配列をコードする遺伝子は，組換え発現ベクターを用いて構築し発現させることができる。Ｃｏｌｃｈｅｒら（Ｊ．Ｎａｔ’ｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８２：１１９１（１９９０））を参照。ＶｈおよびＶｌ抗体鎖からの超可変領域を含むアミノ酸配列もまた，ジスルフィド結合またはペプチドリンカーを用いて構築することができる。
【００６８】
本発明のホスファターゼポリペプチドに対して特異的結合親和性を有する抗体または抗体フラグメントは，試料をホスファターゼ−抗体免疫複合体の形成に適した条件下で抗体で探索し，ホスファターゼポリペプチドに結合した抗体の存在および／または量を検出することにより，試料中のホスファターゼポリペプチドの存在および／または量を検出する方法において用いることができる。そのような方法を実施するための診断キットは，ホスファターゼに特異的な抗体または抗体フラグメント，ならびに抗体の結合パートナーまたは抗体それ自体のコンジュゲートを含むように構築することができる。
【００６９】
本発明のホスファターゼポリペプチドに対して特異的結合親和性を有する抗体または抗体フラグメントは，原核生物または真核生物から単離，濃縮，または精製することができる。当業者に知られる日常的な方法により，原核生物および真核生物の両方において，抗体または抗体フラグメントを製造することができる。ポリペプチド分子である抗体の精製，濃縮および単離は，上に記載される。
【００７０】
本発明のホスファターゼポリペプチドに対して特異的結合親和性を有する抗体は，免疫複合体が形成するような条件下で試料を抗体と接触させ，ホスファターゼポリペプチドに結合した抗体の存在および／または量を検出することにより，試料中のホスファターゼポリペプチドの存在および／または量を検出するための方法において用いることができる。そのような方法を実施するための診断キットは，抗体を含む第１の容器および抗体の結合パートナーおよび標識（例えば放射性同位体）を含む第２の容器を含むように構築することができる。診断キットはまた，ＦＤＡに認可された使用の通知およびその指針を含んでいてもよい。
【００７１】
別の観点においては，本発明は，ホスファターゼポリペプチドまたはホスファターゼポリペプチドドメインに対して特異的結合親和性を有する抗体を産生するハイブリドーマを特徴とし，ここで，ポリペプチドは，配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有する群から選択される。"ハイブリドーマ"とは，抗体，例えば本発明のホスファターゼに対する抗体を分泌しうる不死化細胞株を意味する。好ましい態様においては，ホスファターゼに対する抗体は，本発明のホスファターゼポリペプチドに特異的に結合することができるアミノ酸の配列を含む。
【００７２】
別の観点においては，本発明はまた，上述したいずれかの核酸分子によりコードされるポリペプチドに結合する抗体，および負対照抗体を含むキットに関する。
【００７３】
"負対照抗体"との用語は，特異的結合親和性を有する抗体と類似の起源に由来するが，本発明のポリペプチドに対して結合親和性を示さない抗体を表す。
【００７４】
別の観点においては，本発明は，配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有する群から選択されるホスファターゼポリペプチドに結合することができるホスファターゼポリペプチド結合剤を特徴とする。結合剤は，好ましくは，本発明のホスファターゼポリペプチド上に存在するエピトープを認識する精製された抗体である。他の結合剤には，ホスファターゼポリペプチドに結合する分子およびホスファターゼポリペプチドに結合する類似の分子が含まれる。そのような結合剤は，ホスファターゼ結合パートナー活性を測定するアッセイを用いて同定することができる。
【００７５】
ホスファターゼポリペプチドを検出するためのスクリーニング方法
本発明はまた，本発明のホスファターゼポリペプチドまたは同等の配列を含むヒト細胞をスクリーニングする方法を特徴とする。該方法は，当該技術分野において日常的かつ標準的な技術，例えば本発明のホスファターゼの同定のために本明細書において記載される技術（例えば，クローニング，サザンまたはノザンブロット分析，インシトゥーハイブリダイゼーション，ＰＣＲ増幅等）を用いて，ヒト細胞において新規ポリペプチドを同定することを含む。
【００７６】
ホスファターゼ活性を調節する物質を同定するためのスクリーニング方法
別の観点においては，本発明は，ホスファターゼ活性を調節する物質を同定する方法を特徴とする。該方法は，（ａ）配列番号２に記載される配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むホスファターゼポリペプチドを試験物質と接触させ；（ｂ）前記ポリペプチドの活性を測定し；そして（ｃ）前記物質が前記ポリペプチドの活性を調節するか否かを判定する，の各工程を含む。より好ましくは，配列は，挙げられる配列と少なくとも約９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％または９９％の同一性を有する。
【００７７】
"調節する"との用語は，化合物が本発明のホスファターゼの機能を変化させる能力を表す。調節剤は，好ましくは，ホスファターゼに暴露される化合物の濃度に依存して本発明のホスファターゼの活性を活性化するかまたは阻害する。
【００７８】
"調節する"との用語はまた，ホスファターゼと天然の結合パートナーとの間に複合体が形成される確率を増加または減少させることにより，本発明のホスファターゼの機能を変更することを表す。調節剤は，好ましくは，ホスファターゼと天然の結合パートナーとの間にそのような複合体が形成される確率を増加させ，より好ましくは，ホスファターゼに暴露される化合物の濃度に依存してホスファターゼと天然の結合パートナーとの間に複合体が形成される確率を増加または減少させ，最も好ましくは，ホスファターゼと天然の結合パートナーとの間に複合体が形成される確率を減少させる。
【００７９】
"活性化する"との用語は，ホスファターゼの細胞活性を増加させることを表す。阻害するとの用語は，ホスファターゼの細胞活性を減少させることを表す。ホスファターゼ活性は，好ましくは，天然の結合パートナーと相互作用し，その後，リン酸化された基質からリン酸を除去することである。
【００８０】
"複合体"との用語は，互いに結合した少なくとも２つの分子の集合を表す。シグナル伝達複合体は，しばしば，互いに結合した少なくとも２つの蛋白質分子を含む。
【００８１】
"天然の結合パートナー"との用語は，細胞中でホスファターゼに結合するポリペプチド，脂質，小分子，または核酸を表す。ホスファターゼと天然の結合パートナーとの間の相互作用の変化は，相互作用が形成される確率の増加または減少，またはホスファターゼ／天然の結合パートナー複合体の濃度の増加または減少として現れることができる。
【００８２】
本明細書において用いる場合，"接触させる"との用語は，試験化合物を含む溶液を，本発明の方法の細胞を浸している液体培地と混合することを表す。化合物を含む溶液はまた，該方法の細胞内への試験化合物の取り込みを容易にする他の成分，例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含んでいてもよい。試験化合物を含む溶液は，輸送装置，例えば，ピペットに基づく装置またはシリンジに基づく装置を用いて，細胞を浸している培地に加えることができる。
【００８３】
別の観点においては，本発明は，細胞においてホスファターゼ活性を調節する物質を同定する方法を特徴とする。該方法は，（ａ）細胞においてホスファターゼポリペプチドを発現させ，ここで前記ポリペプチドは，配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有し；（ｂ）試験物質を前記細胞に加え；そして（ｃ）細胞表現型または前記ポリペプチドと天然の結合パートナーとの間の相互作用の変化をモニターする，の各工程を含む。
【００８４】
本明細書において用いる場合，"発現"との用語は，細胞中でホスファターゼ遺伝子を含む核酸ベクターから本発明のホスファターゼが産生されることを表す。本明細書に記載されるように，核酸ベクターを，当該技術分野においてよく知られる手法を用いて細胞中にトランスフェクトする。
【００８５】
本発明の別の観点は，本発明のホスファターゼポリペプチドに結合する化合物を同定する方法に関する。該方法は，ホスファターゼポリペプチドを化合物と接触させ，化合物がホスファターゼポリペプチドに結合するか否かを判定することを含む。結合は，当業者によく知られる結合アッセイ，例えば，限定されないが，ゲルシフトアッセイ，ウエスタンブロット，放射性標識競合アッセイ，ファージに基づく発現クローニング，クロマトグラフィーによる共分画，共沈澱，架橋，相互作用トラップ／ツーハイブリッド分析，サウスウエスタン分析，ＥＬＩＳＡ等により判定することができる。このようなアッセイは，例えば，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９９，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（その全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている。スクリーニングすべき化合物には，限定されないが，細胞外，細胞内，生物学的または化学的起源の化合物が含まれる。
【００８６】
本発明の方法はまた，標識，例えば放射性標識（例えば125Ｉ，35Ｓ，32Ｐ，33Ｐ，3Ｈ），蛍光標識，化学発光標識，酵素標識および免疫学的標識に結合した化合物を包含する。そのような試験において用いるホスファターゼポリペプチドは，溶液中で遊離であってもよく，固体支持体に結合していてもよく，細胞表面上に存在してもよく，細胞内に存在してもよく，または細胞の一部に付随していてもよい。当業者は，例えば，ホスファターゼポリペプチドと試験化合物との間の複合体の形成を測定することができる。あるいは，当業者は，試験化合物により引き起こされる，ホスファターゼポリペプチドとその基質との間の複合体形成の減少を調べることができる。
【００８７】
他のアッセイを用いて，酵素活性を調べることができる。これには，限定されないが，測光法，放射線法，ＨＰＬＣ，電気化学的方法等が含まれ，これは，例えば，Ｅｎｚｙｍｅ  Ａｓｓａｙｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄｓ．Ｒ．Ｅｉｓｅｎｔｈａｌ  ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｄａｎｓｏｎ，１９９２，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（その全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている。
【００８８】
本発明の別の観点は，ホスファターゼポリペプチドを化合物と接触させ，化合物がホスファターゼポリペプチドの活性を調節するか否かを判定することを含む，ホスファターゼポリペプチドの活性を調節する（すなわち，増加または減少させる）化合物を同定する方法に関する。これらの化合物はまた，"蛋白質ホスファターゼの調節剤"と称される。試験化合物の存在下における活性を，試験化合物の非存在下における活性に対して測定する。試験化合物を含む試料の活性が試験化合物を含まない試料の活性より高い場合，その化合物は活性を増加させたのであろう。同様に，試験化合物を含む試料の活性が試験化合物を含まない試料の活性より低い場合，その化合物は活性を阻害したのであろう。
【００８９】
本発明は，種々の薬剤スクリーニング手法のいずれかにおいてホスファターゼポリペプチドを用いて化合物をスクリーニングするのに特に有用である。スクリーニングすべき化合物には，限定されないが，細胞外，細胞内，生物学的または化学的起源のものが含まれる。そのような試験において用いるホスファターゼポリペプチドは，任意の形状であることができ，好ましくは，溶液中で遊離しているか，固体支持体に結合しているか，細胞表面上に存在するか，または細胞内に存在する。当業者は，例えば，ホスファターゼポリペプチドと試験化合物の間の複合体の形成を測定することができる。あるいは，当業者は，試験化合物により引き起こされる，ホスファターゼポリペプチドとその基質との間の複合体形成の減少を調べることができる。
【００９０】
本発明のホスファターゼポリペプチドの活性は，例えば，化学的に合成されたペプチドリガンドに結合するかまたはそれにより活性化される能力を調べることにより決定することができる。あるいは，ホスファターゼポリペプチドの活性は，カルシウム等の金属イオン，ホルモン，ケモカイン，神経ペプチド，神経伝達物質，ヌクレオチド，脂質，臭気物質，および光子に結合する能力を調べることによりアッセイすることができる。すなわち，ホスファターゼポリペプチドの活性の調節剤は，ホスファターゼの機能，例えばホスファターゼの結合特性またはシグナル伝達等の活性または膜局在を変化させるであろう。
【００９１】
本発明の方法の種々の態様においては，アッセイは，酵母成長アッセイ，エクオリンアッセイ，ルシフェラーゼアッセイ，有糸分裂促進アッセイ，ＭＡＰホスファターゼ活性アッセイ，ならびに当該技術分野において一般に知られている結合または機能に基づくホスファターゼ活性の他のアッセイの形をとることができる。これらの態様のいくつかにおいては，本発明は，レセプターおよび非レセプター蛋白質チロシンホスファターゼ，レセプターおよび非レセプター蛋白質ホスファターゼ，ＳＲＣホモロジー２および３ドメインを含有するポリペプチド，ホスホチロシン結合蛋白質（ＳＲＣホモロジー２（ＳＨ２）およびホスホチロシン結合（ＰＴＢおよびＰＨ）ドメイン含有蛋白質），プロリンリッチ結合蛋白質（ＳＨ３ドメイン含有蛋白質），ＧＴＰａｓｅｓ，ホスホジエステラーゼ，ホスホリパーゼ，プロリルイソメラーゼ，プロテアーゼ，Ｃａ２＋結合蛋白質，ｃＡＭＰ結合蛋白質，グアニルシクラーゼ，アデニリルシクラーゼ，ＮＯ生成蛋白質，ヌクレオチド交換因子，および転写因子の任意のものを含む。本発明にしたがうホスファターゼの生物学的活性には，限定されないが，天然のまたは合成のリガンドの結合，ならびに当該技術分野において知られるホスファターゼの機能的活性のいずれかが含まれる。ホスファターゼ活性の非限定的例には，ホスファターゼ結合相互作用および／またはシグナル伝達に及ぼす影響を含む種々の形の貫膜シグナリングが含まれる。
【００９２】
本発明の調節剤は，種々の化学構造を示し，これは一般に，天然のホスファターゼリガンドの模倣体，およびホスファターゼのペプチドおよび非ペプチドアロステリックエフェクターに分類することができる。本発明は適切な調節剤の起源を限定するものではなく，これは，天然起源，例えば植物，動物または無機抽出物，または非天然起源，例えば小分子ライブラリ（コンビナトリアル化学方法により構築したライブラリを含む）およびペプチドライブラリから得ることができる。
【００９３】
ホスファターゼをコードするｃＤＮＡを薬剤発見において用いることはよく知られている。ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）において１日に数千種類の未知の化合物を試験することができるアッセイが詳細に提供されている。文献は，薬剤発見のためにＨＴＳ結合アッセイにおいて放射性標識リガンドを使用する例を多数記載している（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，１９９１，１１，１４７−１８４を参照；総説については，Ｓｗｅｅｔｎａｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，１９９３，５６，４４１−４５５）。結合アッセイＨＴＳのためには，組換えレセプターが好ましい。これは特異性がより高く（より高い相対純度），大量のレセプター材料を生成する能力を提供し，広範な種類のフォーマットで用いることができるためである（Ｈｏｄｇｓｏｎ，Ｂｉｏｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９２，１０，９７３−９８０を参照；その全体を本明細書の一部としてここに引用する）。
【００９４】
組換えレセプターの機能的発現には種々の異種システムが利用可能であり，当業者にはよく知られている。そのようなシステムには，細菌（Ｓｔｒｏｓｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９９２，１３，９５−９８），酵母（Ｐａｕｓｃｈ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９７，１５，４８７−４９４），何種類かの昆虫細胞（Ｖａｎｄｅｎ  Ｂｒｏｅｃｋ，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌｏｇｙ，１９９６，１６４，１８９−２６８），両生類細胞（Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９７，８，６２９−６３４）およびいくつかの哺乳動物細胞株（ＣＨＯ，ＨＥＫ２９３，ＣＯＳ等；Ｇｅｒｈａｒｄｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１９９７，３３４，１−２３を参照）が含まれる。これらの例は他の可能な細胞発現システム，例えば線虫から得られる細胞株を使用することを排除するものではない（ＰＣＴ出願ＷＯ９８／３７１７７）。
【００９５】
発現されたホスファターゼを，その規定されたリガンド（この場合にはこれを活性化する対応するペプチド）とともにＨＴＳ結合アッセイにおいて用いることができる。同定されたペプチドは，適当な放射性同位体，例えば，限定されないが，125Ｉ，3Ｈ，35Ｓまたは32Ｐで，当業者によく知られる方法により標識する。あるいは，ペプチドは，適当な蛍光誘導体を用いてよく知られる方法により標識してもよい（Ｂａｉｎｄｕｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．Ｒｅｓ．，１９９４，３３，３７３−３９８；Ｒｏｇｅｒｓ，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ，１９９７，２，１５６−１６０）。組換え蛋白質を発現する細胞株から作成した膜調製物において，レセプターに特異的に結合する放射活性リガンドは，いくつかの標準的な方法の１つ，例えば，レセプター−リガンド複合体を濾過して結合したリガンドを未結合リガンドから分離する方法において，ＨＴＳアッセイにより検出することができる（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．，１９９１，１１，１４７−１８４．；Ｓｗｅｅｔｎａｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，１９９３，５６，４４１−４５５）。別の方法としては，シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）またはそのような分離を必要としないフラッシュプレート（ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ）フォーマットが挙げられる（Ｎａｋａｙａｍａ，Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ．Ｄｅｖ．，１９９８，１，８５−９１；Ｂｏｓｓｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，１９９８，３，２８５−２９２．）。蛍光リガンドの結合は，例えば，蛍光エネルギー転移（ＦＲＥＴ），結合したリガンドの直接分光蛍光分析，または蛍光分極等の種々の方法により検出することができる（Ｒｏｇｅｒｓ，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ，１９９７，２，１５６−１６０；Ｈｉｌｌ，Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ．Ｄｅｖ．，１９９８，１，９２−９７）。
【００９６】
ホスファターゼおよび異種ホスファターゼポリペプチドの機能的発現に必要な天然の結合パートナーは，宿主細胞の天然の構成物であってもよく，またはよく知られる組換え技術により導入してもよい。ホスファターゼポリペプチドは無傷であってもよく，キメラであってもよい。ホスファターゼ活性化により他の天然蛋白質が刺激または阻害され，これらの事象を測定可能な応答に連結させることができる。
【００９７】
そのような生物学的応答の例には，限定されないが，以下のものが含まれる：特別に遺伝子工学処理した酵母細胞において制限栄養の非存在下で生存する能力（Ｐａｕｓｃｈ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９７，１５，４８７−４９４）；蛍光色素により測定される細胞内Ｃａ2+濃度の変化（Ｍｕｒｐｈｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ．Ｄｅｖ．，１９９８，１，１９２−１９９）。蛍光の変化を用いてリガンド誘導性の膜電位または細胞内ｐＨの変化をモニターすることもできる。このような目的のためにＨＴＳのための自動化システムが記載されている（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，１９９６，１，７５−８０）。共通のセカンドを測定するためのアッセイもまた利用可能であるが，これらは一般的にはＨＴＳには好ましくない。
【００９８】
本発明は，ホスファターゼポリペプチドに結合するリガンドの阻害剤をスクリーニングし同定する多数のアッセイを企図する。１つの例においては，ホスファターゼポリペプチドを固定化し，候補調節剤，例えば阻害剤化合物の存在下および非存在下において，結合パートナーとの相互作用を評価することができる。別の例においては，ホスファターゼポリペプチドとその結合パートナーとの間の相互作用は，溶液アッセイにおいて，候補阻害剤化合物の存在下および非存在下の両方で評価することができる。いずれのアッセイにおいても，阻害剤はホスファターゼポリペプチドとその天然の結合パートナーとの間の結合を減少させる化合物として同定される。別の企図されるアッセイには，ＰＣＴ国際公開ＷＯ９５／２０６５２（１９９５年８月３日公開；図面および表を含め本明細書の一部としてここに引用する）に記載されるような，トランスフォームしたまたはトランスフェクトした宿主細胞におけるポジティブシグナルの検出により蛋白質／蛋白質相互作用の阻害剤を同定する，ジハイブリッドアッセイの変種が含まれる。
【００９９】
本発明により企図される調節剤の候補には，潜在的活性化剤または潜在的阻害剤のいずれかのライブラリから選択される化合物が含まれる。小分子調節剤の同定に用いられる多くの多様なライブラリが存在し，これには，例えば，（１）化学ライブラリ，（２）天然産物ライブラリ，および（３）ランダムペプチド，オリゴヌクレオチドまたは有機分子から構成されるコンビナトリアルライブラリが含まれる。化学ライブラリはランダムな化学構造から構成され，その一部は既知の化合物の類似体または他の薬剤発見スクリーニングにおいて"ヒット"または"リード"として同定された化合物の類似体であるが，別のものは天然産物から誘導され，さらに別のものは，無指向性有機合成化学から生ずる。天然産物ライブラリは，（１）土壌，植物または海洋生物からの培養液の発酵および抽出，または（２）植物または海洋生物の抽出，によりスクリーニング用の混合物を作成するために用いられる，微生物，動物，植物，または海洋生物の収集物である。天然産物ライブラリには，ポリケタイド，非リボソームペプチド，およびそれらの変種（天然に生じない）が含まれる。総説については，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：６３−６８（１９９８）を参照。コンビナトリアルライブラリは，混合物としての多数のペプチド，オリゴヌクレオチド，または有機化合物から構成される。これらのライブラリは，伝統的自動化合成法，ＰＣＲ，クローニング，または私有の合成法により比較的容易に製造することができる。特に興味深いものは非ペプチドコンビナトリアルライブラリである。さらに興味深い他のライブラリには，ペプチド，蛋白質，ペプチド模倣物，多重平行合成収集物，リコンビナトリアル，およびポリペプチドライブラリが含まれる。コンビナトリアルケミストリおよびこれから作成されるライブラリの総説については，Ｍｙｅｒｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７０１−７０７（１９９７）を参照。本明細書に記載される，種々のライブラリを用いる調節剤の同定により，候補物質である"ヒット"（または"リード"）を改変して，"ヒット"が活性を調節する能力を最適化することができる。
【０１００】
本発明により企図される他の候補阻害剤を設計することができ，これには溶解性型の結合パートナー，ならびにキメラ，または融合蛋白質等の結合パートナーが含まれる。本明細書において用いる場合，"結合パートナー"は，上述したような天然の結合パートナーならびにキメラポリペプチド，天然のリガンド以外のペプチド調節剤，抗体，抗体フラグメント，および同定されたホスファターゼ遺伝子の発現産物に免疫特異的な抗体ドメインを含む改変型化合物を広く包含する。
【０１０１】
ホスファターゼポリペプチドの特異的ペプチドリガンドを同定するために他のアッセイを用いることができ，これには，試験リガンドの標的蛋白質への直接結合の測定により標的蛋白質のリガンドを同定するアッセイ，ならびにイオンスプレー質量分析計／ＨＰＬＣ方法を用いてアフィニティー限外濾過により標的蛋白質のリガンドを同定するアッセイ，または他の物理学的および分析的方法が含まれる。あるいは，そのような結合相互作用は，Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４０：２４５−２４６（１９８９），およびＦｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：２８６−２９２（１９９４）（いずれも本明細書の一部としてここに引用する）に記載される酵母ツーハイブリッド系を用いて間接的に評価することができる。ツーハイブリッド系は２つの蛋白質またはポリペプチドの間の相互作用を検出するための遺伝子アッセイである。これを用いて，目的とする既知の蛋白質または線引きされたドメインまたは相互作用に重要な残基に結合する蛋白質を同定することができる。この方法論の変形が，ＤＮＡ結合蛋白質をコードする遺伝子のクローニング，蛋白質に結合するペプチドの同定，および薬剤のスクリーニング用に開発されている。ツーハイブリッド系は，１対の相互作用する蛋白質が転写活性化ドメインをレポーター遺伝子の上流活性化配列（ＵＡＳ）に結合するＤＮＡ結合ドメインの近くに配置させる能力を利用しており，一般に酵母において行われる。アッセイにおいては，（１）第１の蛋白質に融合されたＤＮＡ結合ドメイン，および（２）第２の蛋白質に融合された活性化ドメイン，をコードする２つのハイブリッド遺伝子を構築することが必要である。ＤＮＡ結合ドメインは，第１のハイブリッド蛋白質をレポーター遺伝子のＵＡＳにターゲティングする。しかし，ほとんどの蛋白質は活性化ドメインを有していないため，このＤＮＡ結合ハイブリッド蛋白質はレポーター遺伝子の転写を活性化しない。活性化ドメインを含む第２のハイブリッド蛋白質は，ＵＡＳに結合しないため，それ自身ではレポーター遺伝子の発現を活性化しない。しかし，両方のハイブリッド蛋白質が存在する場合には，第１の蛋白質と第２の蛋白質との非共有結合的相互作用が活性化ドメインをＵＡＳにつなぎ，レポーター遺伝子の転写を活性化させる。例えば，第１の蛋白質が，他の蛋白質または核酸と相互作用することが知られているホスファターゼ遺伝子産物，またはそのフラグメントである場合，このアッセイを用いて結合相互作用に干渉する薬剤を検出することができる。異なる試験薬剤を系に添加してレポーター遺伝子の発現をモニターする。阻害剤が存在すると，レポーターシグナルが発生しない。
【０１０２】
ホスファターゼポリペプチド遺伝子産物の機能が未知であり，遺伝子産物に結合するリガンドが知られていない場合においても，酵母ツーハイブリッドアッセイを用いて遺伝子産物に結合する蛋白質を同定することができる。ホスファターゼポリペプチドまたはそのフラグメントに結合する蛋白質を同定するアッセイにおいては，ホスファターゼポリペプチド（またはフラグメント）およびＵＡＳ結合ドメイン（すなわち，第１の蛋白質）の両方をコードする融合ポリヌクレオチドを用いることができる。さらに，それぞれが活性化ドメインに融合された異なる第２の蛋白質をコードする多数のハイブリッド遺伝子を製造し，アッセイにおいてスクリーニングすることができる。典型的には，第２の蛋白質は総ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ融合ライブラリの１またはそれ以上のメンバーによりコードされ，ここで，それぞれの第２の蛋白質のコーディング領域は活性化ドメインに融合されている。この系は広範な種類の蛋白質に適用することができ，第２の結合蛋白質の同一性または機能を知ることすら必要ではない。この系は非常に感度が高く，他の方法では明らかにされない相互作用を検出することができる。過渡的相互作用であっても，転写を誘発して安定なｍＲＮＡを生成し，これは繰り返し翻訳されてレポーター蛋白質を生成することができる。
【０１０３】
他のアッセイを用いて，標的蛋白質に結合する薬剤を検索してもよい。試験リガンドの標的蛋白質への直接結合を同定する１つのそのようなスクリーニング方法が，米国特許５，５８５，２７７（本明細書の一部としてここに引用する）に議論されている。この方法は，蛋白質は一般に折り畳まれた状態と折り畳まれていない状態の混合物として存在し，２つの状態の間で継続的に交替しているという原理に基づく。試験リガンドが折り畳まれた形の標的蛋白質に結合する場合（すなわち，試験リガンドが標的蛋白質のリガンドである場合），リガンドに結合した標的蛋白質分子は折り畳まれた状態のままである。すなわち，折り畳まれた標的蛋白質は，標的蛋白質に結合する試験リガンドの存在下で，リガンドの非存在下におけるよりも多く存在する。リガンドの標的蛋白質への結合は，折り畳まれた状態と折り畳まれていない状態の標的蛋白質とを区別する任意の方法により検出することができる。このアッセイを行うためには，標的蛋白質の機能がわかっている必要はない。この方法により事実上すべての薬剤，例えば，限定されないが，金属，ポリペプチド，蛋白質，脂質，多糖類，ポリヌクレオチドおよび小有機分子を試験リガンドとして評価することができる。
【０１０４】
標的蛋白質のリガンドを同定する別の方法は，Ｗｉｅｂｏｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６９：１６８３−１６９１（１９９７）（本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている。この手法は，１回に溶液相中の２０−３０種類の薬剤のコンビナトリアルライブラリを標的蛋白質に対する結合についてスクリーニングする。簡単な膜洗浄により標的蛋白質に結合する薬剤を他のライブラリ成分から分離する。次にフィルター上に保持された特定の選択された分子を標的蛋白質から遊離させ，ＨＰＬＣおよび気体補助エレクトロスプレー（イオンスプレー）イオン化質量分析により分析する。この方法は，標的蛋白質に対して最も高い親和性を有するライブラリ成分を選択し，特に小分子ライブラリについて有用である。
【０１０５】
本発明の好ましい態様においては，ホスファターゼ活性を調節する化合物をスクリーニングする方法は，試験化合物をホスファターゼポリペプチドと接触させ，化合物とホスファターゼポリペプチドとの間の複合体の存在についてアッセイすることを含む。そのようなアッセイにおいては，典型的にはリガンドを標識する。適当にインキュベートした後，遊離のリガンドを結合した形のリガンドから分離する。遊離のまたは複合体を形成していない標識の量は，特定の化合物がホスファターゼポリペプチドに結合する能力の尺度である。
【０１０６】
本発明の別の態様においては，ホスファターゼポリペプチドに対して適切な結合親和性を有する化合物のハイスループットスクリーニングを用いる。簡単には，多数の様々な小ペプチド試験化合物を固体支持体上で合成する。ペプチド試験化合物をホスファターゼポリペプチドと接触させ，洗浄する。次に，結合したホスファターゼポリペプチドを当該技術分野においてよく知られる方法により検出する。精製した本発明のポリペプチドを，上述した薬剤スクリーニング手法において用いるために，直接プレート上にコーティングすることもできる。さらに，非中和抗体を用いて蛋白質を捕獲し，これを固体支持体上に固定化することができる。
【０１０７】
本発明の別の態様は，本発明のポリペプチドに結合しうる中和抗体がポリペプチドに対する結合について試験化合物と特異的に競合する，競合スクリーニングアッセイを用いることを含む。このようにして，抗体を用いて，ホスファターゼポリペプチドと１またはそれ以上の抗原性決定基を共有するペプチドの存在を検出することができる。放射性標識した競合結合実験は，Ａ．Ｈ．Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，１９９７，ｖｏｌ．４１，ｎｏ．１０．ｐｐ．２１２７−２１３１に記載されており，この開示はその全体を本明細書の一部としてここに引用する。
【０１０８】
治療方法
本発明は，治療を必要とする患者に，配列番号２に記載されるアミノ酸配列と実質的に同一のホスファターゼポリペプチドおよび本発明の他のいずれかのホスファターゼポリペプチドを投与することにより，疾病または疾患を治療する方法を含む。"遺伝子治療"の節で議論されるように，本発明のホスファターゼポリペプチドはまた，ホスファターゼポリペプチドをインビボで発現させるための適当なポリヌクレオチド手段を投与することにより，間接的に投与してもよい。好ましくは，ホスファターゼポリペプチドは，上述の配列の１つと９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％または９９％の同一性を有するであろう。
【０１０９】
別の観点においては，本発明は，治療を必要とする患者に，配列番号２に記載される配列からなる群より選択される配列と実質的に同一のホスファターゼまたは本発明の他のいずれかのホスファターゼポリペプチドの活性を調節する物質を投与することにより疾病または疾患を治療する方法を提供する。好ましくは，疾病は，慢性関節リウマチ，アテローム性動脈硬化症，自己免疫疾患，臓器移植，心筋梗塞，心筋症，発作，腎不全，酸化的ストレス関連神経変性性疾患，代謝性および生殖疾患，および癌からなる群より選択される。より詳細には，これらの疾病には，組織または造血細胞起源の癌；中枢神経または末梢神経系疾病および状態，例えば，片頭痛，痛み，性的機能不全，気分障害，注意障害，認識障害，低血圧症，および高血圧症；精神病性および神経学的疾患，例えば，不安，精神分裂病，躁うつ病，せん妄，痴呆，重症の精神遅滞および運動異常症，例えば，ハンチントン病またはツレット症候群；神経変性性疾病，例えば，アルツハイマー病，パーキンソン病，多発性硬化症，および筋萎縮性側方硬化症；ＨＩＶ−１，ＨＩＶ−２または他のウイルスまたはプリオン体または真菌または細菌生物により引き起こされるウイルスまたは非ウイルス感染；代謝性疾患，例えば糖尿病および肥満，およびこれらに関連する症候群，特に，心臓血管疾患，例えば，再灌流再狭窄，冠状動脈血栓症，凝固疾患，制御されない細胞成長疾患，アテローム性動脈硬化症；眼性疾病，例えば緑内障，網膜症，および黄斑変性；炎症性疾患，例えば，慢性関節リウマチ，慢性炎症性腸疾病，慢性炎症性骨盤疾病，多発性硬化症，ぜん息，変形性関節症，乾癬，アテローム性動脈硬化症，鼻炎，自己免疫，および臓器移植拒絶が含まれる。
【０１１０】
好ましい態様においては，本発明は，治療を必要とする患者に，配列番号２のアミノ酸配列を有するホスファターゼポリペプチドの活性を調節する物質を投与することにより，疾病または疾患を治療または予防する方法を提供する。好ましくは，疾病は，慢性関節リウマチ，アテローム性動脈硬化症，自己免疫疾患，臓器移植，心筋梗塞，心筋症，発作，腎不全，酸化的ストレス関連神経変性性疾患，代謝性および生殖疾患，および癌からなる群より選択される。より詳細には，これらの疾病には，組織または造血細胞起源の癌；中枢神経または末梢神経系疾病および状態，例えば，片頭痛，痛み，性的機能不全，気分障害，注意障害，認識障害，低血圧症，および高血圧症；精神病性および神経学的疾患，例えば，不安，精神分裂病；躁うつ病，せん妄，痴呆，重症の精神遅滞および運動異常症，例えば，ハンチントン病，またはツレット症候群；神経変性性疾病，例えばアルツハイマー病，パーキンソン病，多発性硬化症，および筋萎縮性側方硬化症；ＨＩＶ−１，ＨＩＶ−２または他のウイルスまたはプリオン体または真菌または細菌生物により引き起こされるウイルスまたは非ウイルス感染；代謝性疾患，例えば，糖尿病および肥満，およびこれらに関連する症候群，特に，心臓血管疾患，例えば，再灌流再狭窄，冠状動脈血栓症，凝固疾患，制御されない細胞成長疾患，アテローム性動脈硬化症；眼性疾病，例えば，緑内障，網膜症，および黄斑変性；炎症性疾患，例えば，慢性関節リウマチ，慢性炎症性腸疾病，慢性炎症性骨盤疾病，多発性硬化症，ぜん息，変形性関節症，乾癬，アテローム性動脈硬化症，鼻炎，自己免疫，および臓器移植拒絶が含まれる。好ましくは，疾病は，癌，免疫関連疾病および疾患，心臓血管疾病，脳またはニューロン関連疾病，および代謝性疾患からなる群より選択される。より詳細には，これらの疾病には，組織または造血細胞起源の癌；中枢神経または末梢神経系疾病および状態，例えば，片頭痛，痛み，性的機能不全，気分障害，注意障害，認識障害，低血圧症，および高血圧症；精神病性および神経学的疾患，例えば不安，精神分裂病，躁うつ病，せん妄，痴呆，重症の精神遅滞および運動異常症，例えばハンチントン病またはツレット症候群；神経変性性疾病，例えばアルツハイマー病，パーキンソン病，多発性硬化症，および筋萎縮性側方硬化症；ＨＩＶ−１，ＨＩＶ−２または他のウイルスまたはプリオン体または真菌または細菌生物により引き起こされるウイルスまたは非ウイルス感染；代謝性疾患，例えば糖尿病および肥満およびこれらに関連する症候群，特に，心臓血管疾患，例えば再灌流再狭窄，冠状動脈血栓症，凝固疾患，制御されない細胞成長疾患，アテローム性動脈硬化症；眼性疾病，例えば緑内障，網膜症，および黄斑変性；炎症性疾患，例えば慢性関節リウマチ，慢性炎症性腸疾病，慢性炎症性骨盤疾病，多発性硬化症，ぜん息，変形性関節症，乾癬，アテローム性動脈硬化症，鼻炎，自己免疫，および臓器移植拒絶が含まれる。
【０１１１】
本発明はまた，治療を必要とする患者に，配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するホスファターゼポリペプチドの活性を調節する物質を投与することにより，疾病または疾患を治療または予防する方法を特徴とする。好ましくは，疾病は，慢性関節リウマチ，アテローム性動脈硬化症，自己免疫疾患，臓器移植，心筋梗塞，心筋症，発作，腎不全，酸化的ストレス関連神経変性性疾患，代謝性および生殖疾患，および癌からなる群より選択される。最も好ましくは，免疫関連疾病および疾患は，慢性関節リウマチ，慢性炎症性腸疾病，慢性炎症性骨盤疾病，多発性硬化症，ぜん息，変形性関節症，乾癬，アテローム性動脈硬化症，鼻炎，および臓器移植からなる群より選択される。
【０１１２】
ホスファターゼ関連疾患または疾病の治療に有用な物質は，好ましくは，問題とする疾病または疾患の治療に対応する活性についての１またはそれ以上のインビトロアッセイにおいて陽性の結果を示す（そのようなアッセイの例は，本明細書，例えば実施例９において提供され参照される）。望ましい活性についてスクリーニングすることができる物質の例は，明細書の全体，例えば本節（ホスファターゼ活性を調節する物質を同定するためのスクリーニング方法）に提供され参照される。ホスファターゼの活性を調節する物質は，好ましくは，限定されないが，アンチセンスオリゴヌクレオチド，リボザイム，および本節および以下の実施例９に引用される方法およびスクリーニング，および他のいずれかの適当な方法により判定される，蛋白質ホスファターゼの他の阻害剤を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムの使用は，以下の"遺伝子治療"の節でさらに詳細に説明される。
【０１１３】
"予防する"との用語は，生物が異常な状態に罹患するかこれを発達させる可能性を減少させることを表す。
【０１１４】
"治療する"との用語は，生物において治療効果を有し，異常な状態を少なくとも部分的に緩和するかまたは排除することを表す。
【０１１５】
"治療効果"との用語は，異常な状態を引き起こすかまたはこれに寄与する阻害または活性化率を表す。治療効果は，異常な状態の１またはそれ以上の症状をある程度緩和する。異常な状態の治療に関して，治療効果は，以下の１またはそれ以上を表すことができる：（ａ）細胞の増殖，成長，および／または分化の増加または減少；（ｂ）細胞死の活性化または阻害（すなわち，遅延または停止）；（ｃ）変性の阻害；（ｄ）異常な状態に伴う１またはそれ以上の症状のある程度の緩和；および（ｅ）影響を受けた細胞の集団の機能の増強。異常な状態に対して有効性を示す化合物は，本明細書に記載されるようにして同定することができる。
【０１１６】
"異常な状態"との用語は，生物の細胞または組織における，その生物における正常な機能からはずれた機能を表す。異常な状態は，細胞増殖，細胞分化，または細胞生存に関連しうる。異常な状態には，細胞サイクルの不規則な進行，例えば，有糸分裂および減数分裂を通じた正常細胞サイクルの不規則な進行も含まれる。
【０１１７】
異常な細胞増殖状態には，癌，例えば繊維性およびメサンギウム疾患，異常な新脈管形成および脈管形成，創傷治癒，乾癬，真性糖尿病，および炎症が含まれる。
【０１１８】
異常な分化状態には，限定されないが，神経変性性疾患，遅い創傷治癒速度，および遅い組織移植治癒速度が含まれる。
【０１１９】
異常な細胞生存状態は，プログラムされた細胞死（アポトーシス）経路が活性化されているかまたは排除されている状態に関連する。多くの蛋白質ホスファターゼがアポトーシス経路に関連している。蛋白質ホスファターゼのいずれかの機能の異常は，細胞の不死または未成熟細胞死につながりうる。
【０１２０】
シグナル伝達プロセスにおけるホスファターゼの機能に関連して，"異常な"との用語は，生物において過剰発現または過小発現されているか，その触媒活性が野生型蛋白質ホスファターゼ活性より低いかまたは高いように変異しているか，天然の結合パートナーともはや相互作用できないように変異しているか，別の蛋白質ホスファターゼまたは蛋白質ホスファターゼによりもはや修飾されないか，または天然の結合パートナーともはや相互作用しない，ホスファターゼを表す。
【０１２１】
"投与する"との用語は，化合物を生物の細胞または組織内に取り込ませる方法に関連する。異常な状態は，生物の細胞または組織が生物中または生物外に存在する場合，予防または治療することができる。生物の外に存在する細胞は，細胞培養皿中で維持または成長させることができる。生物中に含まれる細胞については，当該技術分野には化合物を投与する多くの手法が存在し，例えば，限定されないが，経口，非経口，経皮，注入およびエアロゾル外用が含まれる。生物外の細胞については，当該技術分野には化合物を投与する多数の手法が存在し，例えば，限定されないが，細胞マイクロインジェクション手法，トランスフォーメーション手法，および担体手法が含まれる。
【０１２２】
異常な状態はまた，シグナル伝達経路に異常を有する一群の細胞を有する生物に化合物を投与することにより，予防または治療することができる。次に，化合物の投与が生物機能に及ぼす影響をモニターすることができる。生物は，好ましくはマウス，ラット，ウサギ，モルモット，またはヤギであり，より好ましくは有尾サルまたは無尾サルであり，最も好ましくはヒトである。
【０１２３】
別の観点においては，本発明は，疾病または疾患の診断道具として，試料中においてホスファターゼポリペプチドを検出する方法を特徴とする。該方法は，（ａ）試料を，ハイブリダイゼーションアッセイ条件下で，配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するホスファターゼポリペプチドの核酸標的領域にハイブリダイズする核酸プローブと接触させ，ここで，前記プローブは，ポリペプチド，そのフラグメントをコードする核酸配列，および配列およびフラグメントの相補体を含み；そして（ｂ）プローブ：標的領域ハイブリッドの存在または量を疾病の指標として検出する，
の各工程を含む。
【０１２４】
本発明の好ましい態様においては，疾病または疾患は，慢性関節リウマチ，動脈硬化症，自己免疫疾患，臓器移植，心筋梗塞，心筋症，発作，腎不全，酸化的ストレス関連神経変性性疾患，代謝性疾患，例えば糖尿病，生殖疾患，例えば不妊症，および癌からなる群より選択される。
【０１２５】
ホスファターゼ"標的領域"とは，配列番号１に記載されるヌクレオチド塩基配列，または核酸プローブが特異的にハイブリダイズするであろう対応する全長配列，その機能的誘導体，またはそのフラグメントまたはそのドメインである。特異的なハイブリダイゼーションとは，他の核酸の存在下において，プローブが本発明のホスファターゼの核酸標的領域にのみ検出可能なようにハイブリダイズすることを示す。予測標的領域は，当該技術分野においてよく知られる，データベース中の最も近い関連配列のアラインメントおよび比較からなる方法により同定することができる。
【０１２６】
好ましい態様においては，核酸プローブは，配列番号２に記載されるアミノ酸配列，または対応する全長アミノ酸配列またはそれらの機能的誘導体の，少なくとも６，１２，７５，９０，１０５，１２０，１５０，２００，２５０，３００または３５０個の連続するアミノ酸をコードするホスファターゼ標的領域にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション条件は，他の核酸分子の存在下でホスファターゼ遺伝子とのみハイブリダイゼーションが生ずるような条件であるべきである。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下では，高度に相補的な核酸配列のみがハイブリダイズする。好ましくは，そのような条件は，２０個の連続するヌクレオチド中に１または２個のミスマッチを有する核酸のハイブリダイゼーションを防止する。そのような条件は上で定義される。
【０１２７】
試料中のホスファターゼ遺伝子の検出により診断することができる疾病には，ホスファターゼ核酸（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）が正常細胞と比較して増幅されている疾病が含まれる。"増幅"とは，正常細胞と比較して，細胞中でホスファターゼＤＮＡまたはＲＮＡの数が増加していることを意味する。正常細胞においては，ホスファターゼは典型的には１コピーの遺伝子として見いだされる。選択された疾病においては，ホスファターゼ遺伝子の染色体位置が増幅されて，遺伝子の多数のコピーまたは増幅が生ずる。遺伝子増幅は，そのようなホスファターゼＲＮＡを増幅させることができ，またはホスファターゼＲＮＡはホスファターゼＤＮＡの増幅なしに増幅することができる。
【０１２８】
ＲＮＡに関する場合，"増幅"は，細胞においてホスファターゼＲＮＡが検出可能なように存在することでありうる。ある正常細胞においては，ホスファターゼＲＮＡの基底発現がないためである。他の正常細胞においては，ホスファターゼの発現の基底レベルが存在し，したがってこれらの場合には増幅は基底レベルと比較して少なくとも１−２倍，好ましくはそれより多い，ホスファターゼＲＮＡの検出である。
【０１２９】
試料中のホスファターゼ核酸の検出により診断することができる疾病には，好ましくは癌が含まれる。本発明の核酸探索方法に適した試験試料には，例えば，細胞または細胞の核酸抽出物，または体液が含まれる。上述の方法において用いられる試料は，アッセイフォーマット，検出方法，およびアッセイする組織，細胞または抽出物の性質により様々でありうる。細胞の核酸抽出物を調製する方法は当該技術分野においてよく知られており，用いる方法に適合した試料を得るために容易に適合させることができる。
【０１３０】
別の観点においては，本発明は，疾病または疾患の診断道具として，試料中のホスファターゼポリペプチドを検出する方法を特徴とする。該方法は，（ａ）試料中のホスファターゼポリペプチドをコードする核酸標的領域を，ホスファターゼポリペプチド，またはその１またはそれ以上フラグメントをコードする対照核酸標的領域と比較し，ここで，ホスファターゼポリペプチドは，配列番号２に記載されるアミノ酸配列，またはその１またはそれ以上のフラグメントを有しており；そして（ｂ）標的領域と対照標的領域との間の配列または量の相違を疾病または疾患の指標として検出することを含む。好ましくは，疾病は，癌，免疫関連疾病および疾患，心臓血管疾病，脳またはニューロン関連疾病，および代謝性疾患からなる群より選択される。より詳細には，これらの疾病には，組織，または造血細胞起源の癌；中枢神経または末梢神経系疾病および状態，例えば，片頭痛，痛み，性的機能不全，気分障害，注意障害，認識障害，低血圧症，および高血圧症；精神病性および神経学的疾患，例えば，不安，精神分裂病，躁うつ病，せん妄，痴呆，重症の精神遅滞および運動異常症，例えば，ハンチントン病またはツレット症候群；神経変性性疾病，例えば，アルツハイマー病，パーキンソン病，多発性硬化症，および筋萎縮性側方硬化症；ＨＩＶ−１，ＨＩＶ−２または他のウイルスまたはプリオン体または真菌または細菌生物により引き起こされるウイルスまたは非ウイルス感染；代謝性疾患，例えば糖尿病および肥満，およびこれらに関連する症候群，特に，心臓血管疾患，例えば，再灌流再狭窄，冠状動脈血栓症，凝固疾患，制御されない細胞成長疾患，アテローム性動脈硬化症；眼性疾病，例えば，緑内障，網膜症，および黄斑変性；炎症性疾患，例えば，慢性関節リウマチ，慢性炎症性腸疾病，慢性炎症性骨盤疾病，多発性硬化症，ぜん息，変形性関節症，乾癬，アテローム性動脈硬化症，鼻炎，自己免疫，および臓器移植拒絶が含まれる。
【０１３１】
本明細書において用いる場合，"比較する"との用語は，試料から単離された核酸標的領域と対照核酸標的領域との間の不一致を同定することを表す。不一致は，ヌクレオチド配列における，例えば挿入，欠失，または点突然変異であってもよく，または所定のヌクレオチド配列の量におけるものであってもよい。配列におけるこれらの不一致を判定する方法は当業者にはよく知られている。"対照"核酸標的領域とは，正常細胞，例えば，先に記載したような疾病を有しない細胞において見いだされる配列または配列の量を表す。
【０１３２】
使用方法
本発明の配列は，コードされる蛋白質ホスファターゼの触媒活性を阻害し，以下の疾病の治療に潜在的有用性を有する小分子化合物のスクリーニングに有用であろう：組織または血液の癌，例えば，乳，結腸，肺，前立腺，子宮頚部，脳，卵巣，膀胱または腎臓の癌；中枢神経または末梢神経系疾病および状態，例えば，片頭痛，痛み，性的機能不全，気分障害，注意障害，認識障害，低血圧症，および高血圧症；精神病性および神経学的疾患，例えば不安，精神分裂病，躁うつ病，せん妄，痴呆，重症の精神遅滞および運動異常症，例えばハンチントン病またはツレット症候群；神経変性性疾病，例えばアルツハイマー病，パーキンソン病，多発性硬化症，および筋萎縮性側方硬化症；ＨＩＶ−１，ＨＩＶ−２または他のウイルスまたはプリオン体または真菌または細菌生物により引き起こされるウイルスまたは非ウイルス感染；代謝性疾患，例えば糖尿病および肥満およびこれらに関連する症候群，特に，心臓血管疾患，例えば再灌流再狭窄，冠状動脈血栓症，凝固疾患，制御されない細胞成長疾患，アテローム性動脈硬化症；眼性疾病，例えば緑内障，網膜症，および黄斑変性；炎症性疾患，例えば慢性関節リウマチ，慢性炎症性腸疾病，慢性炎症性骨盤疾病，多発性硬化症，ぜん息，変形性関節症，乾癬，アテローム性動脈硬化症，鼻炎，自己免疫，および臓器移植拒絶。
【０１３３】
上述した本発明の概要は限定的なものではなく，本発明の他の特徴および利点は，以下の本発明の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。    
【発明を実施するための最良の形態】
【０１３４】
図面の簡単な説明
図１は，ヒト蛋白質ホスファターゼＳＧＰ０３７（配列番号１）のヌクレオチド配列を示す。
【０１３５】
図２は，配列番号１によりコードされるヒト蛋白質ホスファターゼＳＧＰ０３７のアミノ酸配列（配列番号２）を提供する。
【０１３６】
発明の詳細な説明
本発明は，新規なポリペプチド，これらのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の単離および特徴付け，種々のポリペプチド関連疾病および状態，例えば癌の診断および治療に有用な化合物を同定するのに用いることができる種々の産物およびアッセイ方法に関する。ポリペプチド，好ましくはホスファターゼ，およびそのようなポリペプチドをコードする核酸は，本明細書に記載される配列が与えられれば，よく知られる標準的な合成手法を用いて製造することができる。以下の表１−４を参照すると，本発明の遺伝子をより理解することができる。本発明はさらに，多数の異なる態様，例えば以下に記載される態様を提供する。
【０１３７】
核酸
マップされた遺伝子の染色体の位置と癌における関与が示唆されているアンプリコンとの関連づけは，文献検索（ＰｕｂＭｅｄｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ），ＯＭＩＭ検索（ＯｎｌｉｎｅＭｅｎｄｅｌｉａｎＩｎｈｅｒｉｔａｎｃｅｉｎＭａｎ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｏｍｉｍ／ｓｅａｒｃｈｏｍｉｍ．ｈｔｍｌ）およびＫｎｕｕｔｉｌａ，ｅｔ  ａｌ．により維持されている癌アンプリコンの包括的データベース（Ｋｎｕｕｔｉｌａ，ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｎｅｏｐｌａｓｍｓ．Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ａｍ  Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ  １５２：１１０７−１１２３，１９９８．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｅｌｓｉｎｋｉ．ｆｉ／−ｌｅｌｗｗｗ／ＣＭＧ．ｈｔｍｌ）に基づく。マップされた遺伝子の多くについて，Ｋｎｕｕｔｉｌａからの細胞遺伝学的領域が示されており，続いて，増幅が報告されている事例の数および調べた事例の総数が示されている。
【０１３８】
一塩基多型については，ＮＣＢＩで維持されているｄｂＳＮＰ（一塩基多型のデータベース）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）においてＳＮＰが記録されている場合に，受託番号が与えられる。本出願において用いた配列のいずれもｄｂＳＮＰで表されたＳＮＰｓを有していない。
【０１３９】
核酸プローブ，ホスファターゼを検出するための方法およびキット
本発明はさらに，核酸プローブおよびその用途を提供する。本発明の核酸プローブを用いて，通常のハイブリダイゼーション方法により適当な染色体またはｃＤＮＡライブラリを探索して，本発明の他の核酸分子を得ることができる。染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリは，当該技術分野において認識されている方法にしたがって，適当な細胞から調製することができる（"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ"，第２版．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，＆Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｄｓ．，１９８９を参照）。
【０１４０】
別の方法においては，目的とするポリペプチドのアミノ酸配列のＮ末端，およびＣ末端部分に対応するヌクレオチド配列を有する核酸プローブを得るために化学合成を行うことができる。合成した核酸プローブを，ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においてプライマーとして使用して，認識されているＰＣＲ手法にしたがって，本質的にＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，"Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ"，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｍｉｃｈａｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９０にしたがって，適当な染色体またはｃＤＮＡライブラリを用いて，本発明のフラグメントを得ることができる。
【０１４１】
当業者は，本明細書に開示される配列に基づいて，当該技術分野において知られるコンピュータアラインメントおよび配列分析の方法を用いて，そのようなプローブを容易に設計することができる（"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ"，１９８９，上掲）。本発明のハイブリダイゼーションプローブは，標準的な標識技術，例えば放射性標識，酵素標識，蛍光標識，ビオチン−アビジン標識，化学発光等を用いる技術により，標識することができる。ハイブリダイゼーション後，プローブは既知の方法を用いて可視化することができる。
【０１４２】
本発明の核酸プローブはＲＮＡならびにＤＮＡプローブを含み，そのようなプローブは，例えば当該技術分野において知られる技術を用いて生成される。核酸プローブは，固体支持体上に固定化してもよい。そのような固体支持体の例としては，限定されないが，プラスチック，例えばポリカーボネート，複合炭水化物，例えばアガロースおよびセファロース，およびアクリル樹脂，例えばポリアクリルアミドおよびラテックスビーズが含まれる。核酸プローブをそのような固体支持体に結合させる技術は当該技術分野においてよく知られている。
【０１４３】
本発明の核酸探索方法に適した試験試料には，例えば，細胞または細胞の核酸抽出物，または体液が含まれる。上述の方法において用いられる試料は，アッセイフォーマット，検出方法，およびアッセイすべき組織，細胞，または抽出物の性質により様々であろう。細胞の核酸抽出物を調製する方法は当該技術分野においてよく知られており，用いる方法に適合する試料を得るために容易に適合させることができる。
【０１４４】
試料中で本発明の核酸の存在を検出する１つの方法は，（ａ）前記試料をハイブリダイゼーションが生ずるような条件下で上述の核酸プローブと接触させ，そして（ｂ）前記核酸分子に結合した前記プローブの存在を検出する，ことを含む。当業者は，当該技術分野において知られる技術にしたがって，上述のように核酸プローブを選択するであろう。試験すべき試料には，限定されないが，ヒト組織のＲＮＡ試料が含まれる。
【０１４５】
試料中で本発明の核酸の存在を検出するためのキットは，その中に上述の核酸プローブが置かれている少なくとも１つの容器手段を含む。キットはさらに，以下の１またはそれ以上を含む他の容器を含んでいてもよい：洗浄試薬および結合した核酸プローブの存在を検出することができる試薬。検出試薬の例としては，限定されないが，放射性標識プローブ，酵素標識プローブ（西洋ワサビペルオキシダーゼ，アルカリホスファターゼ），および親和性標識プローブ（ビオチン，アビジン，またはストレプトアビジン）が挙げられる。好ましくは，キットはさらに使用の指針を含む。
【０１４６】
詳細には，コンパートメント化されたキットには，試薬が別々の容器に入れられている任意のキットが含まれる。そのような容器には，小ガラス容器，プラスチック容器またはプラスチックまたは紙のストリップが含まれる。そのような容器は，試料および試薬が互いに夾雑しないように，かつ各容器の薬剤または溶液を定量的様式で１つのコンパートメントから別のコンパートメントに加えることができるように，１つのコンパートメントから別のコンパートメントに試薬を有効に移すことができるものである。そのような容器には，試験試料を入れる容器，アッセイにおいて用いるプローブまたはプライマーを含有する容器，洗浄試薬（例えばリン酸緩衝化食塩水，Ｔｒｉｓ緩衝液等）を含有する容器，およびハイブリダイズしたプローブ，結合した抗体，増幅産物等を検出するために用いられる試薬を含有する容器が含まれる。当業者は，本発明において記載される核酸プローブを，当該技術分野においてよく知られる確立されたキットフォーマットの１つに容易に組み込むことができることを容易に認識するであろう。
【０１４７】
本発明にしたがうポリペプチドの分類
本発明の多数の蛋白質ホスファターゼについて，これが属する蛋白質クラスおよびファミリーの分類，非触媒的蛋白質モチーフの概要，ならびに染色体位置が提供される。この情報は，各蛋白質についての機能，制御および／または治療的有用性を決定するのに有用である。染色体領域の増幅を種々の癌と関連づけることができる。本明細書において議論されるアンプリコンについては，情報源はＫｎｕｕｔｉｌａ，ｅｔ  ａｌ（Ｋｎｕｕｔｉｌａ  Ｓ，Ｂｊｏｒｋｑｖｉｓｔ  Ａ−Ｍ，Ａｕｔｉｏ  Ｋ，Ｔａｒｋｋａｎｅｎ  Ｍ，Ｗｏｌｆ  Ｍ，Ｍｏｎｎｉ  Ｏ，Ｓｚｙｍａｎｓｋａ  Ｊ，Ｌａｒｒａｍｅｎｄｙ  ＭＬ，Ｔａｐｐｅｒ  Ｊ，Ｐｅｒｅ  Ｈ，Ｅｌ−Ｒｉｆａｉ  Ｗ，Ｈｅｍｍｅｒ  Ｓ，Ｗａｓｅｎｉｕｓ  Ｖ−Ｍ，Ｖｉｄｇｒｅｎ  Ｖ＆Ｚｈｕ  Ｙ：ＤＮＡ  ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｎｅｏｐｌａｓｍｓ．Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １５２：１１０７−１１２３，１９９８．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｅｌｓｉｎｋｉ．ｆｉ／〜ｌｇｌ＿ｗｗｗ／ＣＭＧ．ｈｔｍｌ）であった。
【０１４８】
ホスファターゼ分類および蛋白質ドメインは，しばしば，経路，細胞での役割，または上流または下流の制御のメカニズムを反映する。また，疾病関連性遺伝子は，しばしば関連する遺伝子のファミリーにおいて生ずる。例えば，ホスファターゼファミリーの１つのメンバーがオンコジンまたは腫瘍サプレッサーとして機能する場合，または，免疫，神経，心臓血管，または代謝性疾患において破壊されていることが見いだされている場合，他のファミリーメンバーはしばしば関連する役割を果たすであろう。
【０１４９】
染色体位置は，腫瘍アンプリコンまたは腫瘍サプレッサー遺伝子座についての候補標的を同定することができる。有力な腫瘍アンプリコンの概要は文献から入手可能であり，隣接する領域に位置するホスファターゼ遺伝子の増幅されたコピーを含むことを実験的に確認すべき腫瘍タイプを同定することができる。
【０１５０】
本発明のポリペプチドのより詳細な特性決定，例えば潜在的な生物学的および臨床的意味は，例えば実施例２および３に提供される。
【０１５１】
ホスファターゼ活性を示すポリペプチドの分類
本明細書に記載されるポリペプチドは，セリン−トレオニンホスファターゼ（ＳＴＰ）の群に属する。この分類は，少なくとも部分的には，このクラスのホスファターゼの触媒ドメインを構築している保存されたコアアミノ酸配列モチーフによる。
【０１５２】
ＳＴＰグループ
本明細書において記載される新規なＳＴＰホスファターゼポリペプチドはＳＧＰ０３７（配列番号２）であり，これは例えば，表１−４にさらに詳細に開示される。
【０１５３】
セリン−トレオニンホスファターゼは，ＰＰ１，ＰＰ２Ａ，ＰＰ２Ｂ，およびＰＰ２Ｃで表される４つの主要なクラスに分けることができる。ＰＰ２ａは多制御サブユニットに付随して見いだされ，その不活性化はウイルス成分，例えばスモールＴ抗原によるトランスフォーメーションにつながりうる。制御サブユニットの１つにおける変異は結腸直腸癌に関連づけられており，腫瘍サプレッサーとしての役割と一致する（Ｔａｋａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｕｔ  ２０００  ４７：２６８−７１）。最近，ＰＰ２ａはＴリンパ球の活性化における関与が示唆されている（Ｃｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２０００  １３：３１３−２２）。ＰＰ１は，種々の細胞機能，例えば低酸素症に対する応答，アポトーシスおよび細胞質分裂における関与が示唆されている（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ２０００  ９７：１２０９１−９６，Ａｙｌｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊ  ２０００  １９２２３７−４６，Ｏｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．２０００  ６８：１３５０−５８）。最後に，糖尿病ラットにおける研究は，対照と比較して低下したＰＰ１活性および上昇したＰＰ２Ａ活性を示す（Ｂｅｇｕｍ  ａｎｄ  Ｒａｇｏｌｉａ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  １９９８  ４７：５４−６２）。本明細書に記載される３つの新規なＳＴＰは，ＰＰ２Ｃサブファミリーに最も関連している。ＰＰ２Ｃホスファターゼは，多くの細胞プロセス，例えば，インテグリンシグナル伝達の調節（Ｌｅｕｎｇ−Ｈａｇｅｓｔｅｉｊｎ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．２００１  Ｍａｙ１；２０（９）：２１６０−２１７０）；ＴＡＫ１シグナリング経路の制御（Ｈａｎａｄａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００１  Ｆｅｂ２３；２７６（８）：５７５３−９），細胞チャネルの制御（Ｔｒａｖｉｓ  Ｓ．Ｍ，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９７  Ｓｅｐ３０；９４（２０）：１１０５５−６０）およびサイクリン依存性キナーゼおよびＲａｓ経路の制御（Ｃｈｅｎｇ  Ａ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０００  Ｎｏｖ３；２７５（４４）：３４７４４−３４７４９；Ｓａａｖｅｄｒａ  Ｈ．Ｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２０００  Ａｕｇ１０；１９（３４）：３９４８−５４）に関与している。研究は，種々の疾病，例えば，発癌，炎症性疾病，および代謝性疾病においてセリントレオニンホスファターゼが関与する可能性を示唆する。
【０１５４】
本発明にしたがう治療方法：
診断：
本発明は，疾病または疾患の診断道具として，試料中のポリペプチドを検出する方法を提供する。該方法は，（ａ）試料を，ハイブリダイゼーションアッセイ条件下で，配列番号２のポリペプチドの核酸標的領域にハイブリダイズする核酸プローブと接触させ，前記プローブは，ポリペプチドをコードする核酸配列，そのフラグメント，および配列の相補体およびフラグメントを含み；そして（ｂ）プローブ：標的領域ハイブリッドの存在または量を疾病の指標として検出する，の各工程を含む。
【０１５５】
本発明の好ましい態様においては，疾病または疾患は，慢性関節リウマチ，アテローム性動脈硬化症，自己免疫疾患，臓器移植，心筋梗塞，心筋症，発作，腎不全，酸化的ストレス関連神経変性性疾患，代謝性疾患，例えば糖尿病，生殖疾患，例えば不妊症，および癌からなる群より選択される。
【０１５６】
ハイブリダイゼーション条件は，他の核酸分子の存在下においてその遺伝子とのみハイブリダイゼーションが生ずるような条件であるべきである。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下では，高度に相補的な核酸配列のみがハイブリダイズする。好ましくは，そのような条件は，２０個の連続するヌクレオチド中に１または２個のミスマッチを有する核酸のハイブリダイゼーションを防止する。そのような条件は上で定義される。
【０１５７】
試料中の遺伝子の検出により診断することができる疾病には，核酸（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）が正常細胞と比較して増幅されている疾病が含まれる。"増幅"とは，正常細胞と比較して，細胞中でＤＮＡまたはＲＮＡの数が増加していることを意味する。
【０１５８】
ＲＮＡに関する場合，"増幅"は，細胞においてＲＮＡが検出可能なように存在することでありうる。ある正常細胞においては，ＲＮＡの基底発現がないためである。他の正常細胞においては，発現の基底レベルが存在し，したがってこれらの場合には増幅は基底レベルと比較して少なくとも１−２倍，好ましくはそれより多い検出である。
【０１５９】
試料中の核酸の検出により診断することができる疾病には，好ましくは，癌が含まれる。本発明の核酸探索方法に適した試験試料には，例えば，細胞または細胞の核酸抽出物，または体液が含まれる。上述の方法において用いられる試料は，アッセイフォーマット，検出方法，およびアッセイする組織，細胞または抽出物の性質により様々でありうる。細胞の核酸抽出物を調製する方法は，当該技術分野においてよく知られており，用いる方法に適合した試料を得るために容易に適合させることができる。
【０１６０】
抗体，ハイブリドーマ，ホスファターゼの検出のための使用方法およびキット
本発明は，本発明のホスファターゼに対して結合親和性を有する抗体に関する。ポリペプチドは，配列番号２に記載されるアミノ酸配列，またはその機能的誘導体，またはその少なくとも９個の連続するアミノ酸（好ましくは，その少なくとも２０，３０，３５，または４０個の連続するアミノ酸）を有することができる。
【０１６１】
本発明はまた，本発明のホスファターゼに対して特異的結合親和性を有する抗体に関する。そのような抗体は，本発明のホスファターゼに対するその結合親和性を他のポリペプチドに対する結合親和性と比較することにより単離することができる。本発明のホスファターゼに選択的に結合する抗体を，本発明のホスファターゼと他のポリペプチドとを区別することを必要とする方法において用いるために選択することができる。そのような方法には，限定されないが，他のポリペプチドを含む組織におけるホスファターゼ発現の変化の分析が含まれる。
【０１６２】
本発明のホスファターゼは，種々の手順および方法，例えば抗体の生成，医薬組成物の同定，およびＤＮＡ／蛋白質相互作用の研究において用いることができる。
【０１６３】
本発明のホスファターゼは，抗体またはハイブリドーマを生成するために用いることができる。当業者は，抗体が望まれる場合，そのようなペプチドを本明細書に記載されるように生成し，免疫原として用いることができることを認識するであろう。本発明の抗体には，モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体，ならびにこれらの抗体のフラグメント，およびヒト化型が含まれる。本発明の抗体のヒト化型は，キメラ化またはＣＤＲグラフティング等の当該技術分野において知られる手法の１つを用いて生成することができる。
【０１６４】
本発明はまた，上述のモノクローナル抗体またはその結合フラグメントを産生するハイブリドーマに関する。ハイブリドーマは，特定のモノクローナル抗体を分泌することができる不死化細胞株である。
【０１６５】
一般に，モノクローナル抗体およびハイブリドーマを製造する手法は当該技術分野においてよく知られている（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，"Ｍｏｎｏｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ"，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８４；Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３５：１−２１，１９８０）。抗体を生成することが知られている任意の動物（マウス，ウサギ等）を，選択されたポリペプチドで免疫することができる。免疫の方法は当該技術分野においてよく知られている。そのような方法には，ポリペプチドの皮下または腹膜内注射が含まれる。当業者は，免疫に用いるポリペプチドの量は，免疫する動物，ポリペプチドの抗原性，および注入部位により様々であることを認識するであろう。
【０１６６】
ポリペプチドは，ペプチドの抗原性を増加させるために，修飾するかまたはアジュバント中で投与することができる。ポリペプチドの抗原性を増加させる方法は当該技術分野においてよく知られている。そのような方法には，抗原を異種蛋白質（例えばグロブリンまたはβ−ガラクトシダーゼ）とカップリングさせるか，または免疫の間にアジュバントを含めることが含まれる。
【０１６７】
モノクローナル抗体については，免疫した動物から脾臓細胞を切除し，ミエローマ細胞，例えばＳＰ２／０−Ａｇｌ４ミエローマ細胞と融合させ，モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞とさせる。当該技術分野においてよく知られる多数の方法の任意のものを用いて，所望の特性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定することができる。これらには，ハイブリドーマをＥＬＩＳＡアッセイ，ウエスタンブロット分析，またはラジオイムノアッセイを用いてスクリーニングすることが含まれる（Ｌｕｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１７５：１０９−１２４，１９８８）。所望の抗体を分泌するハイブリドーマをクローニングし，当該技術分野において知られる方法を用いてクラスおよびサブクラスを決定する（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，"Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ"，上掲，１９８４）。
【０１６８】
ポリクローナル抗体については，免疫した動物から抗体を含有する抗血清を単離し，上述の方法の１つを用いて所望の特異性を有する抗体の存在についてスクリーニングする。上述の抗体は，検出可能なように標識することができる。抗体は，放射性同位体，アフィニティー標識（例えばビオチン，アビジン等），酵素標識（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ，アルカリホスファターゼ等），蛍光標識（例えばＦＩＴＣまたはローダミン等），常磁性原子等を用いて，検出可能なように標識することができる。そのような標識を行う方法は当該技術分野においてよく知られている。例えば，Ｓｔｅｍｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．１８：３１５，１９７０；Ｂａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．６２：３０８，１９７９；Ｅｎｇｖａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０９：１２９，１９７２；Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１３：２１５，１９７６を参照。本発明の抗体は，二次標識された抗ウサギ抗体を用いて間接的に標識してもよい。本発明の標識された抗体は，インビトロ，インビボ，およびインシトゥーアッセイに用いて，特定のペプチドを発現する細胞または組織を同定することができる。
【０１６９】
上述の抗体は，固体支持体上に固定化してもよい。そのような固体支持体の例には，プラスチック，例えばポリカーボネート，複合炭水化物，例えばアガロースおよびセファロース，アクリル樹脂，例えばポリアクリルアミドおよびラテックスビーズが含まれる。抗体をそのような固体支持体にカップリングさせる技術は当該技術分野においてよく知られている（Ｗｅｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ"４ｔｈＥｄ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １０，１９８６；Ｊａｃｏｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．３４，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９７４）。本発明の固定化された抗体は，インビトロ，インビボ，およびインシトゥーアッセイに，ならびに免疫クロマトグラフィーに用いることができる。
【０１７０】
さらに，当業者は，合理的に設計された抗ペプチドペプチドを生成するために，現在利用可能な方法，並びに抗体に関して本明細書に記載される技術，方法およびキットを容易に適合させて，特定のペプチド配列に結合しうるペプチドを容易に生成することができる（Ｈｕｒｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，"Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ"，Ｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，ＮＹ，ｐｐ．２８９−３０７，１９９２；Ｋａｓｐｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８：９２３０−９２３８，１９８９）。
【０１７１】
抗ペプチドペプチドは，本発明のホスファターゼのペプチド配列中に見いだされる塩基性アミノ酸残基を，疎水性および非荷電極性基を維持しながら酸性残基で置き換えることにより生成することができる。例えば，リジン，アルギニン，および／またはヒスチジン残基をアスパラギン酸またはグルタミン酸で置き換え，およびグルタミン酸残基をリジン，アルギニンまたはヒスチジンで置き換える。
【０１７２】
本発明はまた，試料中においてホスファターゼポリペプチドを検出する方法を包含する。該方法は，（ａ）試料を，免疫複合体が形成するような条件下で上述の抗体と接触させ，そして（ｂ）ポリペプチドに結合した前記抗体の存在を検出する，ことを含む。詳細には，該方法は，試験試料を１またはそれ以上の本発明の抗体とインキュベートし，抗体が試験試料に結合するか否かをアッセイすることを含む。試料中で本発明のホスファターゼのレベルが正常なレベルと比較して変化していることは疾病を示すかもしれない。
【０１７３】
抗体を試験試料とインキュベートする条件は様々である。インキュベーション条件は，アッセイにおいて用いられるフォーマット，用いられる検出方法，およびアッセイにおいて用いられる抗体のタイプおよび性質によって異なる。当業者は，慣用的に入手可能な免疫学的アッセイフォーマット（例えばラジオイムノアッセイ，酵素結合イムノソルベントアッセイ，拡散に基づくオクタロニー，またはロケット免疫蛍光アッセイ）の任意のものを，本発明の抗体を用いるために容易に適合させることができることを認識するであろう。そのようなアッセイの例は，Ｃｈａｒｄ（"Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓｙ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ"，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８６），Ｂｕｌｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（"Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ"，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ，ＦＬＶｏｌ．１，１９８２；Ｖｏｌ．２，１９８３；Ｖｏｌ．３，１９８５），Ｔｉｊｓｓｅｎ（"Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓｙｓ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ"，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８５）に見いだすことができる。
【０１７４】
本発明の免疫学的アッセイ試験試料には，細胞，蛋白質または細胞の膜抽出物，または体液，例えば血液，血清，血漿または尿が含まれる。上述の方法において用いられる試験試料は，アッセイフォーマット，検出方法の性質およびアッセイすべき試料として用いられる組織，細胞または抽出物により様々であろう。蛋白質抽出物または細胞の膜抽出物を製造する方法は当該技術分野においてよく知られており，用いるシステムにより試験しうる試料を得るために容易に適合させることができる。
【０１７５】
キットは，先に記載した検出方法を実施するために必要な全ての試薬を含む。キットは，（ｉ）上述の抗体を含む第１の容器手段，および（ｉｉ）抗体の結合パートナーと標識を含むコンジュゲートを含む第２の容器手段を含むことができる。別の好ましい態様においては，キットは以下の１またはそれ以上を含む１またはそれ以上の他の容器をさらに含む：洗浄試薬および結合した抗体の存在を検出しうる試薬。
【０１７６】
検出試薬の例には，限定されないが，標識二次抗体が含まれ，あるいは，一次抗体が標識されている場合には，標識された抗体と反応しうる発色団，酵素，または抗体結合試薬が含まれる。コンパートメント化キットは核酸プローブキットについて上述したようなものでもよい。当業者は，本発明に記載される抗体を，当該技術分野においてよく知られる確立されたキットフォーマットの１つに容易に取り込ませることができることを容易に認識するであろう。
【０１７７】
ホスファターゼと相互作用する化合物の単離
本発明はまた，本発明の蛋白質ホスファターゼに結合しうる化合物を検出する方法に関する。該方法は，化合物を本発明のホスファターゼとともにインキュベートし，ホスファターゼに結合した化合物の存在を検出することを含む。化合物は，複雑な混合物，例えば，血清，体液，または細胞抽出物中に存在していてもよい。
【０１７８】
本発明はまた，ホスファターゼの活性またはホスファターゼの結合パートナーの活性のアゴニストまたはアンタゴニストを検出する方法に関する。該方法は，本発明のホスファターゼを産生する細胞を化合物の存在下でインキュベートし，ホスファターゼ活性またはホスファターゼ結合パートナーの活性のレベルの変化を検出することを含む。このようにして同定される化合物は，化合物の存在を示す活性の変化を生ずるであろう。化合物は，複雑な混合物，例えば，血清，体液，または細胞抽出物中に存在していてもよい。いったん化合物が同定されれば，当該技術分野においてよく知られる技術を用いてこれを単離することができる。
【０１７９】
ポリペプチド活性の調節：
本発明はさらに，治療を必要とする患者に，配列番号２のポリペプチド，その機能的誘導体，およびそのフラグメントの活性を調節する物質を投与することにより，疾病または異常な状態を治療する方法を提供する。好ましくは，疾病は，慢性関節リウマチ，アテローム性動脈硬化症，自己免疫疾患，臓器移植，心筋梗塞，心筋症，発作，腎不全，酸化的ストレス関連神経変性性疾患，代謝性および生殖疾患，および癌からなる群より選択される。
【０１８０】
疾患または疾病の治療に有用な物質は，好ましくは，問題とする疾病または疾患の治療に対応する活性についての１またはそれ以上のアッセイにおいて陽性の結果を示す。ポリペプチドの活性を調節する物質は，好ましくは，限定されないが，アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび蛋白質ホスファターゼの阻害剤を含む。
【０１８１】
"予防する"との用語は，生物が異常な状態に罹患するかこれを発達させる可能性を減少させることを表す。
【０１８２】
"治療する"との用語は，生物において治療効果を有し，異常な状態を少なくとも部分的に緩和するかまたは排除することを表す。
【０１８３】
"治療効果"との用語は，異常な状態を引き起こすかまたはこれに寄与する阻害または活性化率を表す。治療効果は，異常な状態の１またはそれ以上の症状をある程度緩和する。異常な状態の治療に関して，治療効果は，以下の１またはそれ以上を表すことができる：（ａ）細胞の増殖，成長，および／または分化の増加または減少；（ｂ）細胞死の活性化または阻害（すなわち，遅延または停止）；（ｃ）変性の阻害；（ｄ）異常な状態に伴う１またはそれ以上の症状のある程度の緩和；および（ｅ）影響を受けた細胞の集団の機能の増強。異常な状態に対して有効性を示す化合物は，本明細書に記載されるようにして同定することができる。
【０１８４】
"異常な状態"との用語は，生物の細胞または組織における，その生物における正常な機能からはずれた機能を表す。異常な状態は，細胞増殖，細胞分化，または細胞生存に関連しうる。異常な状態にはまた，変則的な細胞サイクル進行，すなわち有糸分裂および減数分裂を通る正常な細胞サイクル進行が変則的であることが含まれる。
【０１８５】
異常な細胞増殖状態には，癌，例えば繊維性およびメサンギウム疾患，異常な新脈管形成および脈管形成，創傷治癒，乾癬，真性糖尿病，および炎症が含まれる。
【０１８６】
異常な分化状態には，限定されないが，神経変性性疾患，遅い創傷治癒速度，および遅い組織移植治癒速度が含まれる。
【０１８７】
異常な細胞生存状態は，プログラムされた細胞死（アポトーシス）経路が活性化されているかまたは排除されている状態に関連する。多くの蛋白質ホスファターゼがアポトーシス経路に関連している。蛋白質ホスファターゼのいずれかの機能の異常は，細胞の不死または未成熟細胞死につながりうる。
【０１８８】
シグナル伝達プロセスにおけるホスファターゼポリペプチドの機能に関連して，"異常な"との用語は，生物において過剰発現または過小発現されているか，その触媒活性が野生型蛋白質ホスファターゼ活性より低いかまたは高いように変異しているか，天然の結合パートナーともはや相互作用できないように変異しているか，別の蛋白質キナーゼまたは蛋白質ホスファターゼによりもはや修飾されないか，または天然の結合パートナーともはや相互作用しない，ホスファターゼを表す。
【０１８９】
"投与する"との用語は，化合物を生物の細胞または組織内に取り込ませる方法に関連する。異常な状態は，生物の細胞または組織が生物中または生物外に存在する場合，予防または治療することができる。生物の外に存在する細胞は，細胞培養皿中で維持または成長させることができる。生物中に含まれる細胞については，当該技術分野には化合物を投与する多くの手法が存在し，例えば，限定されないが，経口，非経口，経皮，注入およびエアロゾル外用が含まれる。生物外の細胞については，当該技術分野には化合物を投与する多数の手法が存在し，例えば，限定されないが，細胞マイクロインジェクション手法，トランスフォーメーション手法，および担体手法が含まれる。
【０１９０】
異常な状態はまた，シグナル伝達経路に異常を有する一群の細胞を有する生物に化合物を投与することにより，予防または治療することができる。次に，化合物の投与が生物機能に及ぼす影響をモニターすることができる。生物は，好ましくはマウス，ラット，ウサギ，モルモット，またはヤギであり，より好ましくは有尾サルまたは無尾サルであり，最も好ましくはヒトである。
【０１９１】
ホスファターゼ関連活性の促進またはアンタゴナイズ
本発明はまた，哺乳動物においてホスファターゼ関連活性を調節する方法を包含する。該方法は，前記哺乳動物に，配列番号２のアミノ酸配列，その機能的誘導体，およびそのフラグメントに対するアゴニストまたはアンタゴニストを，前記調節を行うのに十分な量で投与することを含む。本発明はまた，ホスファターゼに関連する機能をアゴナイズまたはアンタゴナイズするのに十分な量のアゴニストまたはアンタゴニストを哺乳動物に投与することを含む，哺乳動物において，上述のポリペプチド活性のアゴニストまたはアンタゴニストを用いて疾病を治療する方法を含む。
【０１９２】
治療を行うために，ホスファターゼ遺伝子と特定の疾病状態との関連性を評価することができる。本発明の１つの態様にしたがえば，マイクロアレイ発現分析を実施して，本発明にしたがう種々のホスファターゼ遺伝子の発現プロファイルを確立し，このことにより，その発現がある種の疾病状態と相関する遺伝子を同定することができる。
【０１９３】
種々のホスファターゼファミリーは広範な機能が示唆されているため，そのような治療は，広範な範囲の疾病，例えば，癌，病態生理学的低酸素症，心臓血管疾患，パピヨン−ルフェーヴル症候群，コウデン疾病，外胚葉性形成異常，メビウス症候群，ブヨルンスタッド症候群，バナヤン−ゾナナ症候群，精神分裂病および過誤腫について実施することができる。特に重要なものは，種々のタイプの癌の治療である。したがって，本発明は，乳癌，尿生殖器癌，前立腺癌，頭頚部癌，肺癌，滑膜肉腫，腎臓細胞癌腫，非小細胞肺癌，肝細胞癌腫，膵臓内分泌腫瘍，胃癌，神経膠芽細胞腫，結腸直腸癌，および甲状腺癌等の病理を治療する方法を提供する。
【０１９４】
例えば，種々の組織起源のＲＮＡ試料から作成したｃＤＮＡをナイロン膜にスポットし，目的とするホスファターゼ遺伝子に由来する放射性標識プローブでハイブリダイズさせることができる。
【０１９５】
実施例３に記載される方法と類似の方法において生成された発現データに基づいて，多くの比較および相関分析の方法を実施することができることが理解されるであろう。これらの方法は上述の議論に基づいて当業者には明らかであり，したがって，本発明の範囲内に含まれる。同様に，これらの比較および相関分析から導かれる推論を用いて，本発明にしたがう治療方法または投与計画を具体化することができる。例えば，正常組織および疾病組織の試料の対を用いて発現アレイを作成すると，得られるデータはある種の疾病状態においてどのホスファターゼ遺伝子が異なるように発現されているかを特定して示し，このことにより，本発明にしたがう治療方法の標的を形成するであろう。すなわち，インビボまたはインビトロのいずれかでこれらの活性を制御することができる調節剤または薬剤を同定することができ，所定の疾病状態の治療において用いることができる。
【０１９６】
本発明にしたがえば，疾病または疾患の診断道具として，本明細書に開示されるホスファターゼ遺伝子配列から誘導されるヌクレオチドプローブ，例えば本明細書に記載されるものを用いて，試料中においてホスファターゼを検出する方法が提供される。種々のホスファターゼファミリーは広範な機能が示唆されているため，広範な種類の疾病，例えば，癌，病態生理学的低酸素症，心臓血管疾患，パピヨン−ルフェーヴル症候群，コウデン疾病，外胚葉性形成異常，メビウス症候群，ブヨルンスタッド症候群，バナヤン−ゾナナ症候群，精神分裂病および過誤腫について，そのような診断の尺度を用いることができる。特に重要なものは，種々のタイプの癌の診断である。本発明の診断方法を用いて，乳癌，尿生殖器癌，前立腺癌，頭頚部癌，肺癌，滑膜肉腫，腎臓細胞癌腫，非小細胞肺癌，肝細胞癌腫，膵臓内分泌腫瘍，胃癌，神経膠芽細胞腫，結腸直腸癌，および甲状腺癌について試験することができる。
【０１９７】
同様の特徴において，正確な診断を行うために，ホスファターゼ遺伝子と特定の疾病状態との関連性の程度を判定することは有用である。そのような判定は，本発明の１つの態様にしたがってマイクロアレイ発現分析を実施することにより行うことができる。その発現がある種の疾病状態と関連するホスファターゼ遺伝子は，上述した方法により同定することができる。
【０１９８】
マイクロアレイデータから得られたデータはまた，特定の病因に罹患しているかもしれない患者を診断するのに用いることができる。したがって，本発明にしたがって黒色腫に関連する癌状態を診断する方法は，試験試料（患者から集めることができる）を配列番号１により表される蛋白質をコードする核酸配列とハイブリダイズすることができるヌクレオチドプローブと接触させ；次に，ハイブリダイズしたプローブ：標的の対の存在を検出し，神経芽細胞腫に関連する癌状態の指標としてそのようなハイブリダイゼーションのレベルを定量することである。すなわち，本発明の好ましい態様にしたがう発現分析は，開示される診断方法に特異性および有効性を付与する。
【０１９９】
上述したように，本明細書に記載される方法と類似の方法において生成された発現データに基づいて，多くの比較および相関分析の方法を実施することができる。これらも必然的に本発明の範囲内に含まれる。同様に，これらの比較および相関分析から導かれる推論を用いて，本発明にしたがう診断方法を具体化することができる。注目すべき１つのシナリオは，正常組織と疾病組織の試料の対を用いて発現アレイを作成すると，得られるデータはある種の疾病状態においてどのホスファターゼ遺伝子が異なるように発現されているかを特定して示し，このことにより，上述の診断方法において用いられる診断マーカーとして働くことができる。
【０２００】
本発明にしたがえば，疾病または疾患の診断道具として，試料中でホスファターゼを検出する別の方法が提供される。該方法は，本発明に開示されるホスファターゼ遺伝子，例えば図２に挙げられるアミノ酸配列をコードする遺伝子の核酸標的領域を制御領域と比較し；そして次に，標的領域と制御領域との間の配列または量の相違を，疾病または疾患の指標として検出することを含む。この方法はまた，広範な種類の疾病，例えば，癌，病態生理学的低酸素症，心臓血管疾患，パピヨン−ルフェーヴル症候群，コウデン疾病，外胚葉性形成異常，メビウス症候群，ブヨルンスタッド症候群，バナヤン−ゾナナ症候群，精神分裂病および過誤腫の診断に用いることができる。特に重要なものは種々のタイプの癌の診断である。上述の診断方法において述べたように，この特定の方法を同様に用いて，乳癌，尿生殖器癌，前立腺癌，頭頚部癌，肺癌，滑膜肉腫，腎臓細胞癌腫，非小細胞肺癌，肝細胞癌腫，膵臓内分泌腫瘍，胃癌，神経膠芽細胞腫，結腸直腸癌，および甲状腺癌について試験することができる。
【０２０１】
標的領域は，ホスファターゼ遺伝子中の目的とする任意の特定の領域であることができ，例えば，上流の制御領域が含まれる。ホスファターゼのファミリーにおいては，上流の制御領域の配列の変動はしばしば機能的な関連性を有しており，そのいくつかは，ある種の疾病状態を引き起こすのに重要であるかもしれない。ある種のホスファターゼ遺伝子における標的領域の量の変化，例えば，レセプター結合部位等の制御領域のコピー数の変化もまた，機能的分化のメカニズムを表し，したがって，ある種の疾病状態と関連しているであろう。したがって，標的領域の配列および量を対照領域と比較してそのような相違を検出することは，疾病状態の検出に有効につながるであろう。
【０２０２】
本発明の１つの態様においては，マイクロアレイ実験を用いて，疾病状態と１組のホスファターゼ遺伝子の間の標的領域の変動との間の潜在的な関連性を同定することができる。例えば，目的とするホスファターゼ遺伝子の，それぞれ所定の標的領域および対照領域に対応する核酸プローブを作成することができる。正常組織および疾病組織からの試料を用いて，上でおよび実施例３で議論されるように，マイクロアレイを作成することができる。このように作成されたアレイにこれらのプローブをハイブリダイズさせることにより，目的とする領域の正常および疾病状態における比較プロファイルが得られ，標的領域と対照領域との，問題とする疾病に特徴的な相違の定義を導くことができる。次に，そのような定義は，本発明にしたがう副次的に言及される診断方法において用いられるような，疾病状態の指標として働くことができる。多くの同等または類似の方法を用いて，この方法にしたがう診断を実施することができることが理解されるであろう。これらは，本明細書に提供される実施例に基づいて当業者には明らかであり，したがって，本発明の範囲内に含まれる。
【０２０３】
疾病の新規な治療を発見することをめざして，生物医学研究者および化学者は，蛋白質ホスファターゼの機能を阻害する分子を設計し，合成し，試験してきた。いくつかの小さい有機分子は蛋白質ホスファターゼの機能を調節する化合物の一群を形成する。蛋白質ホスファターゼの機能を阻害することが報告されている分子の例としては，限定されないが，ビス単環式，二環式または複素環式アリール化合物（ＰＣＴ  ＷＯ９２／２０６４２，１９９２年１１月２６日公開，Ｍａｇｕｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．），ビニレン−アザインドール誘導体（ＰＣＴ  ＷＯ９４／１４８０８，１９９４年７月７日公開，Ｂａｌｌｉｎａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．），１−シクロプロピル−４−ピリジル−キノロン類（米国特許５，３３０，９９２），スチリル化合物（米国特許５，２１７，９９９），スチリル置換ピリジル化合物（米国特許５，３０２，６０６），ある種のキナゾリン誘導体（欧州特許出願０５６６２６６Ａ１），セレオインドール類およびセレニド類（ＰＣＴ  ＷＯ９４／０３４２７，１９９４年２月１７日公開，Ｄｅｎｎｙ  ｅｔ  ａｌ．），三環式ポリヒドロキシ化合物（ＰＣＴ  ＷＯ９２／２１６６０，１９９２年１２月１０日公開，Ｄｏｗ），およびベンジルホスホン酸化合物（ＰＣＴ  ＷＯ９１／１５４９５，１９９１年１０月１７日公開，Ｄｏｗ  ｅｔ  ａｌ）が挙げられる。
【０２０４】
細胞膜を横切ることができ，酸加水分解に耐性の化合物は，患者に経口投与された後に高度に生物利用性となることができるため，治療剤として利点を有する可能性がある。しかし，これらの蛋白質ホスファターゼ阻害剤の多くは，蛋白質ホスファターゼの機能を弱くしか阻害しない。さらに，多くは種々の蛋白質ホスファターゼを阻害し，したがって，疾病の治療剤として多くの副作用を引き起こすであろう。
【０２０５】
しかし，ある種のインドリノン化合物は，酸耐性であり膜透過性である有機分子の一群を形成する。ＷＯ９６／２２９７６（１９９６年８月１日公開，Ｂａｌｌｉｎａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．）は，オキシインドール環に融合したテトラリン，ナフタレン，キノリン，およびインドール置換基を有する水溶性インドリノン化合物を記載する。これらの二環式置換基は，さらに，ヒドロキシル化アルキル，リン酸，およびエーテル成分等の極性成分で置換されている。"Ｉｎｄｏｌｉｎｏｎｅ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｄｅｓｅａｓｅｓ"と題するＴａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許出願０８／７０２，２３２および"Ｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅ−Ｚ−Ｉｎｄｏｌｉｎｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｄｅｓｅａｓｅｓ"と題するＴａｎｇ  ｅｔ  ａｌの米国特許５，８８０，１４１（米国特許出願０８／４８５，３２３），国際公開ＷＯ９６／４０１１６，（１９９６年１２月  １９日公開，Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）および国際公開ＷＯ９６／２２９７６（１９９６年８月１日公開，Ｂａｌｌｉｎａｒｉ  ｅｔ  ａｌ）（これらはすべて，図面および表を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）は，オキシインドール環に融合した他の二環式成分ならびに単環式成分を有するインドリノン化合物のインドリノン化学ライブラリを記載する。"Ｉｎｄｏｌｉｎｏｎｅ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｄｅｓｅａｓｅｓ"と題するＴａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．の出願０８／７０２，２３２（１９９６年８月２３日出願），"Ｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅ−Ｚ−Ｉｎｄｏｌｉｎｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｄｅｓｅａｓｅｓ"と題するＴａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許５，８８０，１４１（米国特許出願０８／４８５，３２３，１９９５年６月７日出願），およびＷＯ９６／２２９７６（１９９６年８月１日公開，Ｂａｌｌｉｎａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．）は，インドリノンの合成方法，細胞におけるインドリノン化合物の生物学的活性を試験する方法およびインドリノン誘導体の阻害パターンを教示する。
【０２０６】
ホスファターゼ活性を調節することができる物質の他の例には，限定されないが，チロホスチン，キナゾリン，キノキソリン，およびキノリンが含まれる。上述のキナゾリン，チロホスチン，キノリン，およびキノキソリンには，よく知られる化合物，例えば文献に記載される化合物が含まれる。例えば，キナゾリン類を記載する代表的刊行物には，Ｂａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，欧州特許公開０５２０７２２Ａ１；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許．４，４４７，６０８；Ｋａｂｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許．４，７５７，０７２；Ｋａｕｌ  ａｎｄ  Ｖｏｕｇｉｏｕｋａｓ，米国特許５，３１６，５５３；Ｋｒｅｉｇｈｂａｕｍ  ａｎｄ  Ｃｏｍｅｒ，米国特許４，３４３，９４０；Ｐｅｇｇ  ａｎｄ  Ｗａｒｄｌｅｗｏｒｔｈ，欧州特許公開０５６２７３４Ａ１；Ｂａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ．ｏｆ  Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３２，３２７；Ｂｅｒｔｉｎｏ，Ｊ．Ｒ．，（１９７９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３，２９３−３０４；Ｂｅｒｔｉｎｏ，Ｊ．Ｒ．，（１９７９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ９（２  ｐａｒｔ１），２９３−３０４；Ｃｕｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５３，３６１−３６８；Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４３，１１１７−１１２３；Ｆｅｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４４（２），１７３−１７８；Ｆｒｙｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６５，１０９３−１０９５；Ｊａｃｋｍａｎｅｔ  ａｌ．，（１９８１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５１，５５７９−５５８６；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２９（６），１１１４−１１１８；Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｓｋｉｂｏ，（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６（２３），７３５５−７３６２；Ｌｅｍｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４，３５１１−３５１８；Ｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｅｎｇ，（１９７５）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  １９７５，４１５−５２２；Ｍａｘｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １７，１８９−１９６；Ｍｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４５，３２５−３３０；Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ａｎｄ  Ｃａｓｔｌｅ，Ｊ．（１９８０）Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｈｅｍ．１７（１９），１４８９−１５９６；Ｒｅｅｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ４７（１１），２９９６−２９９９；Ｓｃｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２３，Ａ６５；Ｓｉｋｏｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２３，２８９−２９５；Ｓｉｋｏｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７２，３４４−３５５（これらすべては，図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）が含まれる。
【０２０７】
キノキサリン類は，Ｋａｕｌ  ａｎｄ  Ｖｏｕｇｉｏｕｋａｓ，米国特許５，３１６，５５３（図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載される。
【０２０８】
キノリン類は，Ｄｏｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７，２６２７−２６２９；ＭａＧｕｉｒｅ，Ｊ．（１９９４）Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７，２１２９−２１３１；Ｂｕｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６，４２５−４３２，およびＢｕｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２，１７７１−１７７４（これらすべては，図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載される。
【０２０９】
チロホスチン類は，Ａｌｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９１，１４１−１５６；Ａｎａｆｉ  ｅｔ  ａｌ．．（１９９３）Ｂｌｏｏｄ  ８２：１２，３５２４−３５２９；Ｂａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１０２，５４３−５５５；Ｂｉｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ａｍｅｒ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｏｃ．ｐｐ．６３６３−６１４３：Ｃ７２１−Ｃ７３０；Ｂｒｕｎｔｏｎｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｓｃｈ．３３，５５８；Ｂｒｙｃｋａｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９，２５５−２６１；Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５３，５３−６０；Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１（５），２７１７−２７２４；Ｇａｚｉｔ  ｅｔ  ａｌ．．（１９８９）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３２，２３４４−２３５２；Ｇａｚｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６，３５５６−３５６４；Ｋａｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ  ５，２１３−２２２；Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７５，４１３−４１８；Ｋｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ７４，１９７−２０２；Ｌｅｖｉｔｚｋｉ，Ａ．，（１９９２）Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．６，３２７５−３２８２；Ｌｙａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４，１４５０３−１４５０９；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｔｈｅ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ２２，３３５−３４５；Ｐｉｌｌｅｍｅｒｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５０，８０−８５；Ｐｏｓｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ４５，６７３−６８３；Ｒｅｎｄｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ４４（５），８８１−８８８；Ｓａｕｒｏ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍａｓ，（１９９３）Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ５３，３７１−３７６；Ｓａｕｒｏ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍａｓ，（１９９３）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ２６７（３），１１９−１１２５；Ｗｏｌｂｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（３６），２２４７０−２２４７２；およびＹｏｎｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ５１，４４３０−４４３５；（これらはすべて，図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載される。
【０２１０】
調節剤として用いることができる他の化合物には，オキシインドリノン，例えば，米国特許出願０８／７０２，２３２（１９９６年８月２３日出願，図面を含め本明細書の一部としてここに引用する）に記載されるものが含まれる。
【０２１１】
組換えＤＮＡ技術
ホスファターゼ核酸分子を含むＤＮＡ構築物およびこれらの構築物を含む細胞：
本発明はまた，宿主細胞において転写を開始するのに有効なプロモーターおよび上述の核酸分子を５’から３’方向に含む組換えＤＮＡ分子に関する。さらに，本発明は，ベクターおよび上述の核酸分子を含む組換えＤＮＡ分子に関する。本発明はまた，細胞において機能的な転写領域，上述のポリペプチドに対応するアミノ酸配列をコードするＲＮＡ配列に相補的な配列，および前記細胞において機能的な転写終止領域を含む核酸分子に関する。上述の分子は，単離されたおよび／または精製されたＤＮＡ分子でありうる。
【０２１２】
本発明はまた，上述の核酸分子を含み，したがってポリペプチドを発現しうる細胞または生物に関する。ポリペプチドは，そのポリペプチドを発現するよう変更されている細胞から精製することができる。細胞が，細胞が通常は産生しないかまたは細胞が通常はより低いレベルで産生する蛋白質を産生するように遺伝子操作により作成されている場合，細胞は"所望のポリペプチドを発現するよう変更されている"と言われる。当業者は，ゲノム，ｃＤＮＡ，または合成配列のいずれかを真核生物または原核生物細胞のいずれかに導入して発現させるための方法を容易に適用することができる。
【０２１３】
核酸分子，例えばＤＮＡは，これが転写および翻訳制御情報を含むヌクレオチド配列を含み，かつそのような配列がポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に"動作可能なように連結されている"場合，ポリペプチドを"発現しうる"と言われる。動作可能な連結とは，制御ＤＮＡ配列および発現が求められているＤＮＡ配列が，遺伝子配列の発現を可能とするような様式で接続されているような連結である。遺伝子配列の発現に必要な制御領域の詳細な性質は生物によって異なるであろうが，これは一般にプロモーター領域を含む。原核生物においては，プロモーター領域は，プロモーター（ＲＮＡ転写の開始を指示する）ならびにＲＮＡに転写されたときに合成の開始を合図するであろうＤＮＡ配列の両方を含む。そのような領域は，通常は転写および翻訳の開始に関与する５’−非コーディング配列，例えばＴＡＴＡボックス，キャッピング配列，ＣＡＡＴ配列等を含むであろう。
【０２１４】
所望の場合には，本発明のホスファターゼをコードする配列の３’側の非コーディング領域を上述の方法により得ることができる。この領域は，その転写終止制御配列，例えば終止およびポリアデニル化のために保持することができる。すなわち，本発明のホスファターゼをコードするＤＮＡ配列に天然に隣接している３’領域を保持することにより，転写終止シグナルを提供することができる。発現宿主細胞において転写終止シグナルが十分に機能性でない場合には，宿主細胞において機能的な３’領域で置き換えることができる。
【０２１５】
２つのＤＮＡ配列（例えば，プロモーター領域配列および本発明のホスファターゼをコードする配列）は，２つのＤＮＡ配列の間の連結の性質が，ホスファターゼ配列が転写されることを可能とする場合，すなわち，連結が，（１）フレームシフト変異を導入しない，（２）プロモーター領域配列が本発明のホスファターゼをコードする遺伝子配列の転写を指示する能力を妨害しない，または（３）本発明のホスファターゼの遺伝子配列がプロモーター領域配列により転写されることを妨害しない場合，動作可能なように連結されていると言われる。すなわち，プロモーター領域は，プロモーターがそのＤＮＡ配列の転写を行うことができる場合，ＤＮＡ配列に動作可能なように連結されているであろう。すなわち，本発明のホスファターゼをコードする遺伝子を発現させるためには，適当な宿主により認識される転写および翻訳シグナルが必要である。
【０２１６】
本発明は，本発明のホスファターゼ（またはその機能的誘導体）をコードする遺伝子を原核生物または真核生物細胞のいずれかにおいて発現させることを包含する。原核生物宿主は，一般に，組換え蛋白質の製造において非常に有効でありかつ便利であり，したがって，本発明のホスファターゼのための１つの好ましい発現システムである。原核生物は，しばしばＥ．ｃｏｌｉの種々の株により代表される。しかし，他の細菌株等の他の微生物株もまた用いることができる。
【０２１７】
原核生物系においては，宿主と適合性のある種に由来する複製部位および制御配列を含むプラスミドベクターを用いることができる。適当なプラスミドベクターの例には，ｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１１８，ｐＵＣ１１９等が含まれ，適当なファージまたはバクテリオファージベクターの例には，λｇｔｌ０，λｇｔ１１等が含まれ，適当なウイルスベクターの例には，ｐＭＡＭ−ｎｅｏ，ｐＫＲＣ等が含まれる。好ましくは，本発明の選択されたベクターは，選択された宿主細胞において複製する能力を有する。
【０２１８】
認められている原核生物宿主には，細菌，例えばＥ．ｃｏｌｉ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，Ｓｅｒｒａｔｉａ等が含まれる。しかし，そのような条件下においては，ポリペプチドはグリコシル化されない。原核生物宿主は発現プラスミド中のレプリコンおよび制御配列と適合性でなければならない。
【０２１９】
本発明のホスファターゼ（またはその機能的誘導体）を原核生物細胞において発現させるためには，本発明のホスファターゼをコードする配列が，機能的原核生物プロモーターと動作可能なように連結されていることが必要である。そのようなプロモーターは，構成的であってもよく，より好ましくは制御可能（すなわち，誘導可能または抑制解除可能）である。構成的プロモーターの例には，バクテリオファージλのｉｎｔプロモーター，ｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子配列のｂｌａプロモーター，およびｐＰＲ３２５のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子配列のｃａｔプロモーター等が含まれる。誘導可能な原核生物プロモーターの例には，バクテリオファージλの主要右および左プロモーター（ＰLおよびＰR），Ｅ．ｃｏｌｉのｔｒｐ，ｒｅｃＡ，ｌａｃＺ，ｌａｃＩ，およびｇａｌプロモーター，α−アミラーゼ（Ｕｌｍａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６２：１７６−１８２，１９８５）およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのσ−２８−特異的プロモーター（Ｇｉｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．．Ｇｅｎｅ  Ｓｅｑｅｕｃｎｅ  ３２：１１−２０，１９８４），Ｂａｃｉｌｌｕｓのバクテリオファージのプロモーター（Ｇｒｙｃｚａｎ，Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂａｃｉｌｌｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，１９８２），およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓプロモーター（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０３：４６８−４７８，１９８６）が含まれる。原核生物プロモーターは，Ｇｌｉｃｋ（Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔ．１：２７７−２８２，１９８７），Ｃｅｎａｔｉｅｍｐｏ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ６８：５０５−５１６，１９８６），およびＧｏｔｔｅｓｍａｎ（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：４１５−４４２，１９８４）により概説されている。
【０２２０】
原核生物細胞における適切な発現には，遺伝子コーディング配列の上流にリボソーム結合部位の存在が必要である。そのようなリボソーム結合部位は，例えば，Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５：３６５−４０４，１９８１）に記載されている。制御配列，発現ベクター，トランスフォーメーション方法等の選択は，遺伝子を発現させるために用いられる宿主細胞のタイプに依存する。本明細書において用いる場合，"細胞"，"細胞株"および"細胞培養"は互換的に用いることができ，そのような名称はすべて子孫を含む。すなわち，"トランスフォーマント"または"トランスフォームした細胞"との語句は，継代の数にかかわらず，初代対象細胞およびここから誘導された培養物を含む。また，意図的なまたは偶然の変異のために，すべての子孫がＤＮＡ含有物において精密に同一ではないかもしれないことが理解される。しかし，定義されるように，変異体子孫は元々のトランスフォームした細胞と同じ機能性を有する。
【０２２１】
本発明の発現システムにおいて用いることができる宿主細胞は，目的とするホスファターゼポリペプチドの発現において用いるのに適当である限り，特に限定されない。適当な宿主はしばしば真核生物細胞を含むことができる。好ましい真核生物宿主には，例えば，酵母，真菌，昆虫細胞，哺乳動物細胞（インビボまたは組織培養のいずれか）が含まれる。宿主として有用でありうる哺乳動物細胞には，ＨｅＬａ細胞，繊維芽細胞由来の細胞，例えばＶＥＲＯまたはＣＨＯ−Ｋ１，またはリンパ球由来の細胞，およびこれらの誘導体が含まれる。好ましい哺乳動物宿主細胞には，ＳＰ２／０およびＪ５５８Ｌ，ならびに神経芽細胞腫細胞株，例えばＩＭＲ３３２が含まれ，これらは正しい翻訳後プロセシングのよりすぐれた能力を提供することができる。
【０２２２】
さらに，植物細胞もまた宿主として利用可能であり，植物細胞と適合しうる制御配列，例えばカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓおよび１９Ｓ，およびノパリンシンターゼプロモーターおよびポリアデニル化シグナル配列が利用可能である。他の好ましい宿主は昆虫細胞，例えば，Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｌａｒｖａｅである。昆虫細胞を宿主として用いる場合，ショウジョウバエアルコールデヒドロゲナーゼプロモーターを用いることができる（Ｒｕｂｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１４５３−１４５９，１９８８）。あるいは，バキュロウイルスベクターを，昆虫細胞において本発明のホスファターゼを大量に発現するよう遺伝子工学処理することができる（Ｊａｓｎｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１６５３，１９８７；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．８，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｓｅｔｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，ｐｐ．２７７−２９７，１９８６）。
【０２２３】
酵母がグルコースの豊富な培地中で成長するときに大量に産生される解糖系酵素をコードする活発に発現されている配列からのプロモーターおよび終止要素を組み込んだ一連の酵母発現システムの任意のものを用いることができる。既知の解糖系遺伝子配列はまた，非常に効率的な転写制御シグナルを提供することができる。酵母は，翻訳後修飾を行うこともできる点において，実質的な利点を与える。強いプロモーター配列および高コピー数プラスミドを用いる多くの組換えＤＮＡ戦略が存在し，これを酵母において所望の蛋白質を製造するために用いることができる。酵母はクローン化された哺乳動物遺伝子のリーダー配列を認識して，リーダー配列を有するペプチド（すなわちプレペプチド）を分泌する。哺乳動物宿主における本発明のホスファターゼの発現にはいくつかの可能なベクター系が利用可能である。
【０２２４】
宿主の性質に応じて，広範な種類の転写および翻訳制御配列を用いることができる。転写および翻訳制御シグナルは，制御シグナルが高レベルの発現を有する特定の遺伝子配列に関連しているウイルス起源，例えばアデノウイルス，ウシパピローマウイルス，サイトメガロウイルス，サルウイルス等から誘導することができる。あるいは，哺乳動物発現産物，例えばアクチン，コラーゲン，ミオシンなどからのプロモーターを用いることができる。転写開始制御シグナルは，遺伝子配列の発現を調節することができるように，抑制または活性化を可能とするものを選択することができる。興味深いものは，温度を変化させることにより発現を抑制または開始することができるように温度感受性であるか，化学物質（例えば代謝産物）制御を行うことができる制御シグナルである。
【０２２５】
本発明のホスファターゼの真核生物宿主における発現には，真核生物制御領域を使用することが必要である。そのような領域は，一般に，ＲＮＡ合成の開始を指示するのに十分なプロモーター領域を含む。好ましい真核生物プロモーターには，例えば，マウスメタロチオネインＩ遺伝子配列のプロモーター（Ｈａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：２７３−２８８，１９８２）；ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｃｅｌｌ  ３１：３５５−３６５，１９８２）；ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２９０：３０４−３１，１９８１）；および酵母ｇａｌ４遺伝子配列プロモーター（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７９：６９７１−６９７５，１９８２；Ｓｉｌｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８１：５９５１−５９５５，１９８４）が含まれる。
【０２２６】
真核生物ｍＲＮＡの翻訳は，最初のメチオニンをコードするコドンから開始される。この理由のため，真核生物プロモーターと，本発明のホスファターゼ（またはその機能的誘導体）をコードするＤＮＡ配列との間の連結には，メチオニンをコードしうる介在コドン（すなわちＡＵＧ）が含まれないことを確実にすることが好ましい。そのようなコドンの存在は，融合蛋白質（ＡＵＧコドンが本発明のホスファターゼのコーディング配列と同じリーディングフレームにある場合）またはフレームシフト変異（ＡＵＧコドンが本発明のホスファターゼのコーディング配列と同じリーディングフレームにない場合）の形成のいずれかをもたらす。
【０２２７】
本発明のホスファターゼをコードする核酸分子および動作可能なように連結されたプロモーターは，レシピエントである原核生物または真核生物細胞中に，非複製ＤＮＡまたはＲＮＡ分子のいずれかとして導入することができ，これは，直線状分子またはより好ましくは閉環状分子のいずれでもよい。そのような分子は自己複製することができないため，遺伝子の発現は導入された配列の過渡的発現により生ずる。あるいは，導入されたＤＮＡ配列が宿主染色体中にインテグレートされることにより永久発現が得られる。
【０２２８】
所望の遺伝子配列を宿主細胞染色体中にインテグレートしうるベクターを用いることができる。導入されたＤＮＡをその染色体中に安定にインテグレートしている細胞は，発現ベクターを含有する宿主細胞の選択を可能とする１またはそれ以上のマーカーを導入することにより選択することができる。マーカーは，栄養要求性宿主に対する栄養，殺生物剤耐性（例えば抗生物質，または重金属，例えば銅）等を提供することができる。選択マーカー遺伝子配列は，発現させるべきＤＮＡ遺伝子配列に直接連結してもよく，または同じ細胞にコトランスフェクションにより導入してもよい。ｍＲＮＡの最適な合成には追加の要素も必要であろう。これらの要素には，スプライシングシグナル，ならびに転写プロモーター，エンハンサー，および終止シグナルが含まれる。そのような要素を組み込んだｃＤＮＡ発現ベクターには，Ｏｋａｙａｍａ（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２８０−２８９，１９８３）により記載されるものが含まれる。
【０２２９】
導入された核酸分子は，レシピエント宿主中で自己複製可能なプラスミドまたはウイルスベクター中に取り込ませることができる。この目的のために広範な種類のベクターの任意のものを用いることができる。特定のプラスミドまたはウイルスベクターの選択において重要な因子には，ベクターを含むレシピエント細胞を認識しベクターを含まないレシピエント細胞から選択することの容易性；特定の宿主において所望されるベクターのコピー数；およびベクターを異なる種の宿主細胞間で"シャトル"しうることが望ましいか否かが含まれる。
【０２３０】
好ましい原核生物ベクターには，Ｅ．ｃｏｌｉ中で複製しうるプラスミド（例えば，ｐＢＲ３２２，ＣｏｌＥｌ，ｐＳＣ１０１，ｐＡＣＹＣ１８４，πＶＸ；"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ"，１９８９，上掲）などのプラスミドが含まれる。Ｂａｃｉｌｌｕｓプラスミドには，ｐＣ１９４，ｐＣ２２１，ｐＴ１２７等が含まれる（Ｇｒｙｃｚａｎ，Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂａｃｉｌｌｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ｐｐ．３０７−３２９，１９８２）。適当なＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓプラスミドには，ｐ１Ｊ１０１（Ｋｅｎｄａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：４１７７−４１８３，１９８７），およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓバクテリオファージ，例えばΦＣ３１（Ｃｈａｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｉｘｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍｏｎ  Ａｃｔｉｎｏｍｙｃ  ｅｔ  ａｌｅｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｋａｄｅｍｉａｉ  Ｋａｉｄｏ，Ｂｕｄａｐｅｓｔ，Ｈｕｎｇａｒｙ，ｐｐ．４５−５４，１９８６）が含まれる。ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓプラスミドはＪｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．８：６９３−７０４，１９８６），およびＩｚａｋｉ（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．３３：７２９−７４２，１９７８）により概説されている。
【０２３１】
好ましい真核生物プラスミドには，例えば，ＢＰＶ，ワクチニア，ＳＶ４０，２−ミクロンサークル等，またはそれらの誘導体が含まれる。そのようなプラスミドは当該技術分野においてよく知られている（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉａｍｉ  Ｗｎｔｒ．Ｓｙｍｐ．１９：２６５−２７４，１９８２；Ｂｒｏａｃｈ，"Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：Ｌｉｆｅ  Ｃｙｃｌｅ  ａｎｄ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ"，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐ．４４５−４７０，１９８１；Ｂｒｏａｃｈ，Ｃｅｌｌ  ２８：２０３−２０４，１９８２；Ｂｏｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．１０：３９−４８，１９８０；Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｖｏｌ．３，Ｇｅｎｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ｐｐ．５６３−６０８，１９８０）。
【０２３２】
構築物を含有するベクターまたは核酸分子を発現用に用意した後，ＤＮＡ構築物は，種々の適当な手段，すなわち，トランスフォーメーション，トランスフェクション，コンジュゲーション，プロトプラスト融合，エレクトロポレーション，粒子銃技術，リン酸カルシウム沈澱，直接マイクロインジェクション等により，適当な宿主細胞中に導入することができる。ベクターを導入した後，レシピエント細胞を，ベクター含有細胞の成長を選択する選択培地中で成長させる。クローニングされた遺伝子の発現により，本発明のホスファターゼまたはそのフラグメントが産生される。これは，トランスフォームした細胞中でそのまま起こるか，またはこれらの細胞を分化させるよう誘導した後に起こる（例えば，ブロモデオキシウラシルを神経芽細胞腫等に投与することにより）。本発明のペプチドを形成するために，種々のインキュベーション条件を用いることができる。最も好ましい条件は，生理学的条件を模倣した条件である。
【０２３３】
トランスジェニック動物：
本発明に関連するトランスジェニック動物の製造には，種々の方法が利用可能である。ＤＮＡを受精可能卵の前核に注入した後，雄前核と雌前核を融合させるか，またはＤＮＡを胚性細胞（例えば，２細胞胚の核）の核に注入した後，細胞分裂を開始させることができる（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４４３８−４４４２，１９８５）。本発明の無機イオンレセプターヌクレオチド配列を有するよう改変したウイルス，特にレトロウイルスを胚に感染させることができる。
【０２３４】
胚の内部細胞塊から誘導され培養中で安定化させた多能性幹細胞を，培養中で操作して本発明のヌクレオチド配列を取り込ませることができる。トランスジェニック動物は，そのような細胞を胚盤胞中に移植し，これを仮母に移植し，分娩させることにより製造することができる。トランスジェニック実験に適当な動物は，標準的な商業的供給源，例えばＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ），Ｔａｃｏｎｉｃ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ），Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）等から入手することができる。
【０２３５】
齧歯類胚を操作する方法およびＤＮＡを接合子の前核に注入する方法は，当業者によく知られている（Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，上掲）。魚，両生類卵および鳥類のためのマイクロインジェクション法は，Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ  ａｎｄ  Ｃｈｏｕｒｒｏｕｔ（Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ  ４７：８９７−９０５，１９９１）に詳述されている。ＤＮＡを動物の組織中に導入する他の方法は，米国特許，４，９４５，０５０（Ｓａｎｄｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０年７月３０日）に記載されている。
【０２３６】
一例にすぎないが，トランスジェニックマウスを製造するためには，雌マウスを過剰排卵誘発する。雌を雄といっしょに置き，交配した雌をＣＯ2窒息または頚部脱臼により殺し，切除した卵管から胚を回収する。まわりの丘細胞を除去する。次に，前核胚を洗浄し，注入時まで保存する。ランダムな周期の成人雌を精管切除雄と対にする。レシピエント雌はドナー雌と同じ時に交配させる。次に胚を外科的に移す。トランスジェニックラットを製造する方法はマウスの場合と類似する方法である（Ｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６３：１０９９−１１１２，１９９０）。
【０２３７】
胚性幹（ＥＳ）細胞を培養し，次にエレクトロポレーション，リン酸カルシウム／ＤＮＡ沈澱および直接注入等の方法を用いてＤＮＡをＥＳ細胞中に導入することによりトランスジェニック動物を製造する方法もまた当業者によく知られている（Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，ｅｄ．，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７）。
【０２３８】
ランダム遺伝子インテグレーションを含む場合には，本発明の配列を含むクローンを耐性をコードする遺伝子とともにコトランスフェクトすることができる。あるいは，ネオマイシン耐性をコードする遺伝子を，本発明の配列に物理的に連結させることができる。所望のクローンのトランスフェクションおよび単離は，当業者によく知られるいくつかの方法のいずれかを用いて実施することができる（Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，上掲）。
【０２３９】
ＥＳ細胞中に導入されたＤＮＡ分子はまた，相同組換えのプロセスにより染色体中にインテグレートされることができる（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２８８−１２９２，１９８９）。組換え事象のポジティブ選択（すなわち，ｎｅｏ耐性）および二重ポジティブ−ネガティブ選択（すなわち，ｎｅｏ耐性およびガンシクロビル耐性）の方法，および続くＰＣＲによる所望のクローンの同定は，Ｃａｐｅｃｃｈｉ，上掲およびＪｏｙｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  ３３８：１５３−１５６，１９８９）に記載されており，これらの教示は，図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する。この方法の最後の段階は，標的とするＥＳ細胞を胚盤胞中に注入し，胚盤胞を擬妊娠雌に移すことである。得られるキメラ動物を繁殖させ，子孫をサザンブロッティングにより分析して，トランスジンを有する個体を同定する。非齧歯類哺乳動物および他の動物の製造方法は別の者により議論されている（Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ  ａｎｄ  Ｃｈｏｕｒｒｏｕｔ，上掲；Ｐｕｒｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２８１−１２８８，１９８９；ａｎｄ  Ｓｉｍｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１７９−１８３，１９８８）。
【０２４０】
すなわち，本発明は，本発明のホスファターゼをコードするトランスジンまたはホスファターゼの発現に影響する遺伝子を含有するトランスジェニックの非ヒト哺乳動物を提供する。そのようなトランスジェニックの非ヒト哺乳動物は，ホスファターゼの導入の効果を研究するため，またはホスファターゼの発現を制御（すなわち，追加の遺伝子，アンチセンス核酸，またはリボザイムの導入により）するためのインビボ試験系として特に有用である。
【０２４１】
"トランスジェニック動物"とは，細胞中に人工的に挿入されたＤＮＡを含む細胞を有する動物である。該ＤＮＡは，その細胞から発生した動物のゲノムの一部となる。好ましいトランスジェニック動物は，霊長類，マウス，ラット，ウシ，ブタ，ウマ，ヤギ，ヒツジ，イヌおよびネコである。トランスジェニックＤＮＡは，ヒトキナーゼをコードすることができる。動物における自然の発現は，レセプターの発現を減少させるのに有効な量のアンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡを与えることにより減少させることができる。
【０２４２】
遺伝子治療
本発明のホスファターゼまたはその遺伝子配列は，遺伝子治療においても有用である（総説としてＭｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３５７：４５５−４６０，１９９２）。Ｍｉｌｌｅｒは，進歩により，ポジティブな初期の結果を示したヒト遺伝子治療に対する実用的なアプローチが得られたと述べている。遺伝子治療の基本的な科学はＭｕｌｌｉｇａｎ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３１，１９９３）に記載されている。
【０２４３】
１つの好ましい態様においては，ホスファターゼのコーディング配列を含む発現ベクターを細胞に挿入し，細胞をインビトロで成長させ，次にこれを大量に患者に注入する。別の好ましい態様においては，選択されたプロモーター（例えば，強いプロモーター）を含むＤＮＡセグメントを，本発明のホスファターゼをコードする内因性遺伝子を含む細胞中に，プロモーターセグメントが内因性ホスファターゼ遺伝子の発現を増強する様式で移送する（例えば，プロモーターセグメントをこれが内因性ホスファターゼ遺伝子に直接連結するように細胞内に移送する）。
【０２４４】
遺伝子治療は，腫瘍を標的とするホスファターゼｃＤＮＡを含むアデノウイルスの使用を含むことができる。全身ホスファターゼは，遺伝子工学処理した細胞の移植，ホスファターゼをコードするウイルスの注入，または裸のホスファターゼＤＮＡの適当な組織への注入により増加する。
【０２４５】
そのような複合体の活性を調節するために，標的細胞集団を，蛋白質複合体の１またはそれ以上の変更された形の成分を導入することにより改変することができる。例えば，標的細胞中における複合体成分の活性を減少させるか阻害することにより，そのような状態につながる異常なシグナル伝達事象を減少させ，阻害し，または逆転させることができる。蛋白質複合体の他の成分と相互作用する能力を保持しているが，シグナル伝達において機能することができない成分の欠失またはミスセンス変異体を用いて，異常な，有害なシグナル伝達事象を阻害することができる。
【０２４６】
ウイルス，例えばレトロウイルス，ワクチニアウイルス，アデノウイルス，アデノ随伴ウイルス，ヘルペスウイルス，いくつかのＲＮＡウイルス，またはウシパピローマウイルスに由来する発現ベクターを用いて，本発明の組換えホスファターゼをコードするヌクレオチド配列（例えばｃＤＮＡ）を標的細胞集団（例えば腫瘍細胞）に輸送することができる。当業者によく知られる方法を用いて，コーディング配列を含む組換えウイルスベクターを構築することができる（Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）。あるいは，蛋白質配列をコードする組換え核酸分子を裸のＤＮＡとしてまたは再構築系，例えば標的細胞への輸送のためのリポソームまたは他の脂質系において用いることができる（例えば，Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：３８７−８，１９８９）。ヒト遺伝子治療において用いるための，プラスミドＤＮＡを細胞内に直接輸送するいくつかの他の方法が存在し，これはプラスミドＤＮＡを蛋白質に複合体化させることによりＤＮＡを細胞上のレセプターにターゲティングすることを含む（Ｍｉｌｌｅｒ，上掲）。
【０２４７】
最も簡単な形においては，遺伝子輸送は，単にマイクロインジェクション工程により細胞の核内に最小量のＤＮＡを注入することにより行うことができる（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ  ２２：４７９−８８，１９８０）。組換え遺伝子は，いったん細胞内に導入されると，転写および翻訳に関する細胞の正常なメカニズムにより認識されることができ，遺伝子産物が発現される。より多数の細胞にＤＮＡを導入するための他の方法も試みられている。これらの方法には，ＤＮＡをＣａＰＯ4で沈澱させピノサイトーシスにより細胞中に取り込ませるトランスフェクション（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７：２７４５−５２，１９８７）；細胞を高圧パルスに暴露して膜に穴をあけるエレクトロポレーション（Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：１３１１−２６，１９８７）；ＤＮＡを親油性ベヒクル中に封入し，これを標的細胞と融合させるリポフェクチン／リポソーム融合（Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８４：７４１３−７４１７，１９８７）；および小さい発射体に結合させたＤＮＡを用いる粒子衝撃（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：９５６８−９５７２，１９９０）が含まれる。ＤＮＡを細胞内に導入する他の方法は，ＤＮＡを化学的に修飾した蛋白質にカップリングさせることである。
【０２４８】
また，アデノウイルス蛋白質がエンドソームを不安定化させ，ＤＮＡの細胞への取り込みを促進しうることが示されている。アデノウイルスをＤＮＡ複合体を含む溶液と混合するか，または蛋白質架橋試薬を用いてアデノウイルスに共有結合したポリリジンにＤＮＡを結合させることにより，組換え遺伝子の取り込みおよび発現が実質的に改良される（Ｃｕｒｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６：２４７−５２，１９９２）。
【０２４９】
本明細書において用いる場合，"遺伝子輸送"とは，外来核酸分子を細胞中に導入する工程を意味する。遺伝子輸送は，一般に，遺伝子によりコードされる特定の産物の発現を可能とするために行われる。産物には，蛋白質，ポリペプチド，アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ，または酵素的に活性なＲＮＡが含まれる。遺伝子輸送は，培養細胞中で，または動物への直接投与により行うことができる。一般に，遺伝子輸送には，核酸を非特異的レセプター媒介性相互作用により標的細胞と接触させ，核酸を膜を通してまたはエンドサイトーシスにより細胞内に取り込ませ，核酸を原形質膜またはエンドソームから細胞質内に放出させる工程が含まれる。さらに，発現には，核酸が細胞の核に移動し，転写のための適当な核因子に結合することが必要である。
【０２５０】
本明細書において用いる場合，"遺伝子治療"とは，遺伝子輸送の１つの形であり，本明細書において用いられる遺伝子輸送の定義の中に含まれ，特にインビボでまたはインビトロで細胞から治療用産物を発現させるための遺伝子治療を表す。遺伝子輸送は，細胞でエクスビボで行い，次に患者に移植することにより，または，核酸または核酸蛋白質複合体を患者に直接投与することにより，行うことができる。
【０２５１】
別の好ましい態様においては，ホスファターゼポリペプチドをコードする核酸配列を有するベクターが提供され，ここで，核酸配列は特定の組織においてのみ発現される。組織特異的遺伝子発現を行う方法は，国際公開ＷＯ９３／０９２３６（１９９２年１１月３日出願，１９９３年５月１３日公開）に記載される。
【０２５２】
上述したすべてのベクターにおいて，本発明のさらに別の観点は，ベクターに含まれる核酸配列が，核酸の配列の一部または全てについて，上で定義したような付加，欠失または修飾を含んでいてもよいことである。
【０２５３】
本発明のホスファターゼポリペプチドの発現（過剰発現を含む）は，ポリペプチドをコードするｍＲＮＡに結合しその発現を阻害するアンチセンス分子を投与することにより阻害することができる。あるいは，ｍＲＮＡを切断するリボザイムを用いて同様の様式で発現を阻害することができる。アンチセンスおよびリボザイム技術を用いて遺伝子発現を制御する一般的方法，またはこのようにして外因性遺伝子を発現させる遺伝子治療方法は当該技術分野においてよく知られている。これらの各方法は，例えば，本発明のホスファターゼポリペプチドのアンチセンスまたはリボザイム転写産物のいずれかをコードするベクター等のシステムを利用する。
【０２５４】
"リボザイム"との用語は，触媒的特性を有する１またはそれ以上のＲＮＡのＲＮＡ構造を表す。リボザイムは，一般に，エンドヌクレアーゼ，リガーゼまたはポリメラーゼ活性を示す。リボザイムは多数のＲＮＡ自己切断反応を媒介する構造化されたＲＮＡ分子である。異なる二次構造を有する種々のタイプのトランス作用性リボザイム，例えば"ハンマーヘッド"および"ヘアピン"タイプのものが同定されている。種々のリボザイムが特性決定されている。例えば，米国特許５，２４６，９２１，５，２２５，３４７，５，２２５，３３７および５，１４９，７９６を参照。デオキシリボオリゴヌクレオチドとリボオリゴヌクレオチドとを含む，触媒活性を有する混合リボザイムが記載されている（Ｐｅｒｒｅａｕｌｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４４：５６５−５６７（１９９０））。
【０２５５】
本明細書において用いる場合，"アンチセンス"とは，ゲノムＤＮＡおよび／または本発明のホスファターゼポリペプチドをコードするｍＲＮＡと，特異的にハイブリダイズし，例えば細胞条件下で結合して，例えば，転写および／または翻訳を阻害することによりその蛋白質の発現を阻害する，核酸分子またはその誘導体を表す。結合は一般的な塩基対相補性によるものでもよく，または，例えば，ＤＮＡデュープレックスへの結合の場合には，二重ヘリックスの主溝における特異的相互作用によるものでもよい。
【０２５６】
１つの観点においては，アンチセンス構築物は，エクスビボで生成され，細胞中に導入されたときに，限定されないが，本発明のホスファターゼポリヌクレオチドのｍＲＮＡおよび／またはゲノム配列とハイブリダイズすることにより遺伝子発現を阻害しうる核酸である。
【０２５７】
アンチセンス方法は，ホスファターゼポリペプチドｍＲＮＡに相補的であり，本発明のホスファターゼポリヌクレオチド，例えば，配列番号１に基づくオリゴヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）の設計を含むことができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは，ホスファターゼポリペプチドのｍＲＮＡ転写産物に結合し，翻訳を妨害する。
【０２５８】
完全な相補性が好ましいが，必要ではない。本明細書において用いる場合，ＲＮＡの一部に"相補的な"配列とは，ＲＮＡとハイブリダイズして安定なデュープレックスを形成するのに十分な相補性を有する配列を意味する。二本鎖アンチセンス核酸の場合には，デュープレックスＤＮＡの一本鎖を試験するか，またはトリプレックス形成をアッセイすることができる。ハイブリダイズする能力は，相補性の程度とアンチセンス核酸の長さの両方に依存する。一般に，ハイブリダイズする核酸が長いほど，ＲＮＡとより多い塩基ミスマッチを含むことができ，なお安定なデュープレックス（または場合によりトリプレックス）を形成することができる。当業者は，ハイブリダイズした複合体の融点を決定する標準的な方法を用いることにより，ミスマッチの許容可能な程度を確かめることができる。
【０２５９】
一般に，メッセージの５’末端，例えばＡＵＧ開始コドンまでおよびこれを含む５’非翻訳配列に相補的なオリゴヌクレオチドは，翻訳の阻害において最も有効に作用するはずである。しかし，ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に相補的な配列も同様にｍＲＮＡの翻訳の阻害に有効であることが示されている（Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３７２：３３３）。ｍＲＮＡのコーディング領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは比較的有効性の低い翻訳の阻害剤であるが，本発明にしたがって用いることが可能である。ホスファターゼポリペプチドのｍＲＮＡの５’，３’またはコーディング領域のいずれにハイブリダイズするよう設計されているかにかかわらず，アンチセンス核酸は少なくとも６ヌクレオチドの長さであるべきであり，好ましくは約１００ヌクレオチドより短く，より好ましくは約５０または３０ヌクレオチドより短い。典型的には，これらは１０−２５ヌクレオチドの長さであるべきである。このような原則は，現場の者に適当なオリゴヌクレオチドを選択する上での情報を与えるであろう。好ましい態様においては，アンチセンス配列は，配列番号１からなる群より選択される核酸配列またはこれらのドメインの，約１０−３０個の，より好ましくは１５−２５個の連続するヌクレオチド塩基を含むか，これからなるか，または本質的にこれからなるオリゴヌクレオチド配列から選択される。
【０２６０】
別の好ましい態様においては，本発明は，配列番号２のポリペプチドをコードする核酸配列の，約１０−３０個の，より好ましくは１５−２５個の連続するヌクレオチド塩基を含むか，これからなるか，本質的にこれからなる，単離された，濃縮されたまたは精製された核酸分子を含む。
【０２６１】
本発明の配列を用いてアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計することができる。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドを，標的ホスファターゼを発現する細胞に投与して，標的ＲＮＡまたは蛋白質のレベルを内部対照ＲＮＡまたは蛋白質のレベルと比較することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて得られる結果はまた，適当な対照オリゴヌクレオチドを用いて得られる結果と比較することができる。好ましい対照オリゴヌクレオチドは，試験オリゴヌクレオチドとほぼ同じ長さのオリゴヌクレオチドである。標的ＲＮＡまたは蛋白質のレベルを減少させるアンチセンスオリゴヌクレオチドを選択する。
【０２６２】
オリゴヌクレオチドは，ＤＮＡまたはＲＮＡ，またはこれらのキメラ混合物または誘導体または改変体であることができ，一本鎖でも二本鎖でもよい。オリゴヌクレオチドは，塩基成分，糖成分，またはホスフェート骨格において修飾して，例えば，分子の安定性またはハイブリダイゼーションを改良することができる。オリゴヌクレオチドは，結合した他の基，例えばペプチド（例えば，インビボで宿主細胞レセプターにターゲティングするため），または細胞膜（例えば，Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３−６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：６４８−６５２；ＰＣＴ国際公開ＷＯ８８／０９８１０（１９８８年１２月１５日公開）を参照），または血液脳関門（例えば，ＰＣＴ国際公開ＷＯ８９／１０１３４（１９８８年４月２５日公開）を参照）を越える輸送を容易にする試薬，ハイブリダイゼーション励起性切断試薬（例えば，Ｋｒｏｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８−９７６を参照）またはインターカレート剤（例えば，Ｚｏｎ（１９８８）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９を参照）を含むことができる。この目的のために，オリゴヌクレオチドを他の分子，例えば，ペプチド，ハイブリダイゼーション励起性架橋剤，輸送剤，ハイブリダイゼーション励起性切断剤等とコンジュゲートさせることができる。
【０２６３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは，５−フルオロウラシル，５−ブロモウラシル，５−クロロウラシル，５−ヨードウラシル，ヒポキサンチン，キサンチン，４−アセチルシトシン，および５−（カルボキシヒドロキシエチル）ウラシルなどの成分から選択される少なくとも１つの修飾塩基成分を含むことができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた，限定されないが，アラビノース，２−フルオロアラビノース，キシルロースおよびヘキソースを含む群から選択される少なくとも１つの修飾糖成分を含んでいてもよい。
【０２６４】
さらに別の態様においては，アンチセンスオリゴヌクレオチドは，ホスホロチオエート，ホスホロジチオエート，ホスホルアミドチオエート，ホスホルアミデート，ホスホルジアミデート，メチルホスホネート，アルキルホスホトリエステル，およびホルムアセタールまたはこれらの類似体からなる群より選択される少なくとも１つの修飾ホスフェート骨格を含む（米国特許５，１７６，９９６；５，２６４，５６４；および５，２５６，７７５も参照）。
【０２６５】
さらに別の態様においては，アンチセンスオリゴヌクレオチドはα−アノマーオリゴヌクレオチドである。α−アノマーオリゴヌクレオチドは，通常のβ−ユニットとは異なり，相補的ＲＮＡと，鎖が互いにパラレルに走る特別の二本鎖ハイブリッドを形成する（Ｇａｕｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１）。オリゴヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６１３１−６１４８），またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１５：３２７−３３０）である。
【０２６６】
また適しているものは，ポリセリン，ポリトレオニン等のポリペプチドであるペプチジル核酸であり，これには側鎖の位置で核酸（Ｔ，Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｕ）で置換された種々のアミノ酸を含むコポリマーが含まれる。このようなポリマーの鎖は，天然のＤＮＡ／ＲＮＡと同じ様式で相補塩基を介してハイブリダイズすることができる。あるいは，本発明のアンチセンス構築物は，例えば，細胞内で転写されたときに本発明のホスファターゼポリペプチドをコードする細胞ｍＲＮＡの少なくとも独特の部分に相補的なＲＮＡを生成する発現プラスミドまたはベクターとして輸送することができる。
【０２６７】
領域配列をコードするホスファターゼポリペプチドに相補的なアンチセンスヌクレオチドを用いることができるが，転写された非翻訳領域に相補的なものが最も好ましい。
【０２６８】
別の好ましい態様においては，遺伝子置換の方法が記載される。本明細書において用いる場合，"遺伝子置換"とは，インビボで発現しうる核酸配列を動物に供給し，このことによりその動物に欠失しているかまたは不完全な内因性遺伝子の機能を提供することを意味する。
【０２６９】
医薬処方および投与経路
本明細書に記載される化合物，例えば，本発明のホスファターゼポリペプチド，アンチセンス分子，リボザイム，および本発明のホスファターゼポリペプチドの活性を調節する他のいずれかの化合物は，それ自体で，または医薬組成物中でヒト患者に投与することができる。医薬組成物では，組み合わせ療法におけるように，化合物が他の活性成分と混合されているか，または適当な担体または賦形剤と混合されている。本発明の化合物の処方および投与の手法は"Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，"Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡの最新版に見いだすことができる。
【０２７０】
投与経路：
投与の適当な経路には，例えば，経口，直腸，経粘膜，または腸投与；非経口輸送，例えば筋肉内，皮下，静脈内，骨髄内注入，ならびに鞘内，直接心室内，腹膜内，鼻腔内，または眼内注射が含まれる。
【０２７１】
あるいは，化合物を全身ではなく局所的に投与してもよく，これには，例えば，化合物を，しばしばデポ製剤または徐放製剤として直接固体腫瘍に注射することが含まれる。
【０２７２】
さらに，薬物はターゲティングされたドラッグデリバリーシステムにおいて，例えば腫瘍特異的抗体により被覆されたリポソーム中で投与してもよい。リポソームは腫瘍にターゲティングされ，選択的に取り込まれるであろう。
【０２７３】
組成物／処方：
本発明の医薬組成物は，当該技術分野においてよく知られる方法，例えば，限定されないが，慣用の混合，溶解，顆粒化，糖衣作成，研和，乳化，カプセル封入，捕捉，または凍結乾燥により製造することができる。
【０２７４】
すなわち，本発明にしたがって使用するための医薬組成物は，活性化合物を薬剤として使用することができる製品に加工することを容易にする賦形剤および補助剤を含む，１またはそれ以上の生理学的に許容しうる担体を用いて，慣用の方法で製剤することができる。適切な処方は，選択される投与経路に依存する。
【０２７５】
注射用には，本発明の薬剤を水性溶液，好ましくはハンクス溶液，リンゲル溶液，または生理的食塩緩衝液等の生理学的に適合性の緩衝液中で処方することができる。経粘膜投与用には，浸透すべき障壁に適した浸透剤が処方に用いられる。そのような浸透剤は当該技術分野において一般に知られている。
【０２７６】
経口投与のためには，化合物を当該技術分野においてよく知られる薬学的に許容しうる担体と混合することにより化合物を容易に処方することができる。そのような担体は，本発明の化合物を，治療すべき患者による経口摂取のための錠剤，丸薬，糖衣剤，カプセル，液体，ゲル，シロップ，スラリー，懸濁液等として処方することを可能とする。適当な担体には，特に，ラクトース，ショ糖，マンニトール，またはソルビトール等の糖類；トウモロコシデンプン，小麦デンプン，米デンプン，およびジャガイモデンプン等のセルロース製品，ゼラチン，トラガカントゴム，メチルセルロース，ヒドロキシプロピルメチルセルロース，カルボキシメチルセルロースナトリウム，および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）等の増量剤などの賦形剤が含まれる。所望の場合には，架橋されたポリビニルピロリドン，寒天，またはアルギン酸またはその塩，例えばアルギン酸ナトリウム等の崩壊剤を加えてもよい。
【０２７７】
糖衣剤のコアは，適当なコーティングとともに供給される。この目的のためには，濃縮された糖溶液を用いることができる。これは，アラビアゴム，タルク，ポリビニルピロリドン，カルボポールゲル，ポリエチレングリコール，および／または二酸化チタン，ラッカー溶液，および適当な有機溶媒または溶媒混合物を任意に含むことができる。識別のため，あるいは活性化合物の用量の異なる組合せを特徴づけるため，染料または色素を錠剤または糖衣剤コーティングに添加してもよい。
【０２７８】
経口で使用することができる医薬製剤は，ゼラチンから作成されるプッシュフィットカプセル，ならびにゼラチンおよびグリセロール，ソルビトール等の可塑剤から作成される密封軟カプセルを含む。プッシュフィットカプセルは，活性成分を，ラクトース等の増量剤，デンプン等の結合剤，および／またはタルクおよびステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤，さらに任意に安定剤との混合物中に含むことができる。軟カプセルにおいては，活性化合物は脂肪油，流動パラフィン，または液体ポリエチレングリコール等の適当な液体中に溶解または懸濁することができる。さらに安定剤を添加してもよい。経口投与用のすべての処方は，そのような投与に適当な用量で調製すべきである。
【０２７９】
口内投与のためには，組成物は，慣用的な方法で錠剤またはトローチ剤の形にすることができる。
【０２８０】
吸入による投与用には，本発明に従って用いられる化合物は，噴射剤，例えば，ジクロロジフルオロメタン，トリクロロフルオロメタン，ジクロロテトラフルオロエタン，二酸化炭素または他の適当な気体を用いて，加圧されたパックまたはネブライザーからエアーゾルスプレイの形状で便利に輸送される。加圧されたエアーゾルの場合，用量単位は計量された量を送達するべく備えられたバルブにより調節することができる。例えば吸入器または注入器において使用するためのゼラチン製のカプセルおよびカートリッジは，化合物の粉末混合物と，ラクトースまたはデンプン等の適当な粉末基剤とを含むよう処方することができる。
【０２８１】
化合物は，例えばボーラス注射または連続注入による非経口投与用に処方することができる。注射用の処方は，単位用量にて，例えばアンプルにて，あるいは添加された保存料と共に多用量容器中で提供することができる。組成物は油性または水性のベヒクル中で，懸濁液，溶液，または乳濁液等の形状をとることができ，懸濁剤，安定剤および／または分散剤等の製剤物質を含んでいてもよい。
【０２８２】
非経口投与用の薬剤処方は，水溶性の形態の活性化合物の水性溶液を含む。さらに，活性化合物の懸濁液は，適当な油性の注入用懸濁液として調製することができる。適切な親油性溶媒またはベヒクルには，ゴマ油等の脂肪油，オレイン酸エチルまたはトリグリセリド等の合成脂肪酸エステル，またはリポソーム等を含む。水性の注射用懸濁液は，カルボキシメチルセルロースナトリウム，ソルビトール，またはデキストラン等の，懸濁液の粘度を増加させる物質を含んでいてもよい。任意に，懸濁液はまた，高度に濃縮された溶液の調製を可能にする，当該化合物の溶解性を増加させる適当な安定剤または薬剤を含んでいてもよい。
【０２８３】
あるいは，活性成分は粉体の形態であって，使用前に適当なベヒクル，例えば発熱物質を含まない滅菌水を用いて構成することができる。
【０２８４】
化合物はまた，例えばカカオバターまたは他のグリセリド等の慣用の坐剤基剤を用いて，坐剤または停留浣腸等の直腸用組成物に処方することができる。
【０２８５】
上述した処方に加えて，化合物はまたデポ製剤として処方することができる。そのような長時間作用性の処方は，埋込み（例えば皮下または筋肉内への）によるか，または筋肉内注射により投与することができる。すなわち，例えば，化合物は，適当な高分子性または疎水性物質と共に（例えば許容される油剤中の乳濁液として），イオン交換樹脂と共に，溶けにくい塩等の溶けにくい誘導体として，処方することができる。
【０２８６】
本発明の化合物のための薬学的担体は，ベンジルアルコール，非極性界面活性剤，水混和性有機ポリマーおよび水性相を含む共溶媒系であってもよい。共溶媒系はＶＰＤ共溶媒系であってもよい。ＶＰＤは，３％（ｗ／ｖ）ベンジルアルコール，８％（ｗ／ｖ）非極性界面活性剤ポリソルベート８０，および６５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール３００を純粋エタノール中に作成した溶液である。ＶＰＤ共溶媒系（ＶＰＤ：Ｄ５Ｗ）は，ＶＰＤを５％デキストロースの水溶液中に１：１で希釈したものである。この共溶媒系は疎水性化合物をよく溶解し，それ自体，全身投与に際して低い毒性を示す。本来，共溶媒系の比率は，その溶解性および毒性特性を破壊することなく相当変化させることができる。さらに，共溶媒成分の同一性も変化させることができる。例えば，他の低毒性非極性界面活性剤をポリソルベート８０の代わりに用いることができ，ポリエチレングリコールの分画サイズは様々でありうる。他の生体適合性ポリマー，例えばポリビニルピロリドンをポリエチレングリコールの代わりに用いることができ，他の糖または多糖類をデキストロースの代わりに用いることができる。
【０２８７】
あるいは，疎水的医薬化合物のための他の輸送系を用いてもよい。リポソームおよび乳剤は，疎水的薬剤のための輸送用ベヒクルまたは担体の例としてよく知られている。さらに，ある種の有機溶媒，例えばジメチルスルホキシドもまた用いることができるが，しばしば毒性がより高くなる。さらに，化合物は，持続放出系，例えば治療薬剤を含む固体疎水性ポリマーの準透過性マトリックスを用いて輸送することができる。種々の持続放出材料が当業者にはよく知られている。持続放出カプセルはその化学的性質に応じて，数週間から１００日を越える期間，化合物を放出する。治療薬剤の化学的性質および生物学的安定性に応じて，さらに別の蛋白質安定化戦略を用いてもよい。
【０２８８】
医薬組成物はまた，適当な固体またはゲル相の担体または賦形剤を含んでいてもよい。そのような担体または賦形剤の例には，限定されないが，炭酸カルシウム，リン酸カルシウム，種々の糖，澱粉，セルロース誘導体，ゼラチン，およびポリエチレングリコール等の高分子が含まれる。
【０２８９】
本発明のチロシンまたはセリン／トレオニンホスファターゼ調節化合物の多くは，薬学的に適合性のカウンターイオンとの塩として提供される。薬学的に適合性の塩は，多くの酸，例えば，限定されないが，塩酸，硫酸，酢酸，乳酸，酒石酸，リンゴ酸，クエン酸等を用いて形成することができる。塩は，水性または他のプロトン性溶媒において，対応する遊離塩基の形よりもより溶解性である傾向にある。
【０２９０】
適切な投与計画：
本発明において使用するのに適した医薬組成物には，活性成分がその意図される目的を達成するのに有効な量で含まれている組成物が含まれる。より詳細には，治療上有効量とは，疾病の症状を予防，緩和または改善するのに，または治療している被験者の生存を長くするのに有効な化合物の量を意味する。本発明の化合物の治療上有効量の決定は，特に本明細書に提供される詳細な開示に鑑みて，十分に当業者の能力の範囲内である。
【０２９１】
患者に投与すべき化合物の投与量および生物に化合物を投与するモードを決定する方法は，米国特許出願０８／７０２，２８２（１９９６年８月２３日出願）および国際出願ＷＯ９６／２２９７６（１９９６年８月１日公開）（この両方について，図面および表を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）に開示されている。当業者は，そのような記載が本発明に適用可能であり，容易に適合させることができることを理解するであろう。
【０２９２】
適切な投与量は，種々の因子，例えば，治療する疾病のタイプ，用いられる特定の組成物および患者のサイズおよび生理学的状態に依存する。本明細書に記載される化合物についての治療上有効量は，最初は培養細胞および動物モデルから見積もることができる。例えば，容量は，動物モデルにおいて，培養細胞アッセイにおいて決定されたＩＣ50を最初に考慮した循環濃度範囲を達成する用量を処方することができる。動物モデルのデータを用いて，ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。
【０２９３】
本発明の方法において用いられる任意の化合物について，治療上有効な用量は，最初は細胞培養アッセイから見積もることができる。例えば，動物モデルにおいて，培養細胞において決定されたＩＣ50（すなわちチロシンまたはセリン／トレオニンホスファターゼ活性の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む循環濃度範囲を達成するような用量を処方することができる。そのような情報は，ヒトまたは他の被験体における有用な用量のさらに正確な決定のために用いることができる。
【０２９４】
本明細書に記載される化合物の毒性および治療有効性は，培養細胞または実験動物における標準的な薬理学的方法，例えばＬＤ50（集団の５０％に致死的な用量）およびＥＤ50（集団の５０％に治療上有効な用量）を決定することにより，決定することができる。毒性と治療上有効性の用量の比は治療指数であり，ＬＤ50とＥＤ50の比率として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。これらの培養細胞アッセイおよび動物研究から得られるデータは，ヒトにおいて用いるための投与量の範囲を定式化するために用いることができる。このような化合物の投与量は，好ましくは，ＥＤ50を含み毒性がほとんどまたは全くない循環濃度の範囲内にある。投与量は，用いる投与形態および用いる投与経路により，この範囲内で様々でありうる。正確な処方，投与経路，および投与量は，個々の医師が，患者の状態を考慮して選択することができる（例えば，Ｆｉｎｇｌ  ｅｔ  ａｌ．１９７５，"Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ"，Ｃｈ．１，ｐ．１を参照）。
【０２９５】
毒性研究は，血液細胞組成を測定することにより実施することもできる。例えば，以下のようにして，適当な動物モデルにおいて毒性研究を行うことができる１）化合物をマウスに投与し（未処置対照マウスも用いなければならない）；２）各処置群の１匹のマウスの尾部静脈から定期的に血液試料を採取し；そして３）試料を，赤血球および白血球数，血液細胞組成物，およびリンパ球対多形核細胞のパーセントについて分析する。各用量計画および対照からの結果の比較は，毒性が存在するか否かを示す。
【０２９６】
各毒性研究の終わりに動物を犠牲にすることにより（好ましくは，ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃ．Ｐａｎｅｌ  ｏｎ  Ｅｕｔｈａｎａｓｉａ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃ．／２０２：２２９−２４９，１９９３にしたがって），さらなる研究を実施することができる。次に，各処置群の代表的動物を，肉眼剖検により転移の直接証拠，異常な不健康，または毒性について調べることができる。組織の肉眼異常を記録し，組織を組織学的に調べる。体重または血液成分の減少を引き起こす化合物，および主要な臓器に有害な影響を有する化合物はあまり好ましくない。一般に，有害な影響が大きければ大きいほど，化合物はより好ましくない。
【０２９７】
癌の治療においては，疎水性薬剤の予測される１日用量は１−５００ｍｇ／日，好ましくは，１−２５０ｍｇ／日，最も好ましくは，１−５０ｍｇ／日の範囲である。薬剤は，活性成分の血漿レベルが治療の有効性を維持するのに十分であるかぎり，より少ない頻度で投与することができる。
【０２９８】
血漿レベルは薬剤の有効性を反映するはずである。一般に，化合物が強力であればあるほど，有効性を達成するのに必要な血漿レベルは低い。
【０２９９】
薬剤および代謝産物の血漿半減期および血漿，腫瘍，および主要な臓器における生物学的分布を決定して，疾患を阻害するのに最も適当な薬剤の選択を容易にすることができる。そのような測定を実施することができる。例えば，薬剤で処置した動物の血漿についてＨＰＬＣ分析を行い，Ｘ線，ＣＡＴスキャン，およびＭＲＩ等の検出方法を用いて放射性標識した化合物の位置を決定することができる。スクリーニングアッセイにおいて強力な阻害活性を示すが，不十分な薬物動力学的特性を有する化合物は，化学構造の変更および再試験により最適化することができる。この点に関しては，優れた薬物動力学的特性を示す化合物をモデルとして用いることができる。
【０３００】
投与量および間隔は，個々に，活性成分がホスファターゼ調節効果を維持するのに十分な血漿レベル，すなわち最小有効濃度（ＭＥＣ）を与えるよう調節することができる。ＭＥＣは，各化合物について異なるが，インビトロのデータ，例えば，限定されないが，本明細書に記載されるアッセイを用いて，ホスファターゼの５０−９０％の阻害を達成するのに必要な濃度から見積もることができる。ＭＥＣを達成するのに必要な投与量は，個々の特性および投与経路に依存するであろう。しかし，血漿濃度はＨＰＬＣアッセイまたはバイオアッセイを用いて決定することができる。
【０３０１】
投与間隔もまた，ＭＥＣ値を用いて決定することができる。化合物は，１０−９０％の時間，好ましくは３０−９０％の時間，最も好ましくは５０−９０％の時間，ＭＥＣより高い血漿レベルを維持する投与計画を用いて投与すべきである。
【０３０２】
局所投与または選択的取り込みの場合には，薬剤の有効な局所濃度は血漿濃度とは関係ないであろう。
【０３０３】
投与される特定の組成物の量は，もちろん，治療中の患者，患者の体重，苦痛の激しさ，投与方法，および担当医師の判断に依存するであろう。
【０３０４】
包装：
組成物は，所望の場合には，活性成分を含む１またはそれ以上の単位用量形を含んでいてもよいパックまたはディスペンサー装置中で提供することができる。パックは，例えば，ブリスターパックなどの金属またはプラスチック箔を含むことができる。パックまたはディスペンサー装置には，投与の指示が添付されていてもよい。パックまたはディスペンサー装置はまた，薬剤の製造，使用，または販売を規制する政府機関によって規定された形式の，容器に付随した注意書が添付されていてもよく，その注意書はヒトまたは獣医学的投与用のポリヌクレオチドの形状の当該機関による承認を反映するものである。そのような注意書は，例えば米国食品医薬品局により処方箋調剤薬として承認されたラベルによるものか，または承認された製品に差込まれたものでもよい。適合した薬学的担体中に処方された，本発明の化合物を含む組成物もまた製造され，適当な容器内に配置され，さらに指示された条件による処置のためにラベルを付すことができる。ラベル上に示される適切な状態としては，腫瘍の治療，新脈管形成の阻害，線維症，糖尿病等の治療が挙げられる。
【０３０５】
機能的誘導体
本発明はまた，本発明のポリペプチドまたは核酸の機能的誘導体を提供する。"機能的誘導体"は，本発明のポリペプチドまたは核酸の"化学的誘導体"，"フラグメント"または"変種"を意味し，これらの用語は以下に定義される。機能的誘導体は，蛋白質の機能の少なくとも一部，例えば蛋白質に特異的な抗体との反応性，非触媒ドメインにより媒介される酵素活性または結合活性を保持しており，これにより本発明にしたがう有用性を有する。遺伝コードの縮重のため，多くの異なる核酸配列が同じアミノ酸配列をコードすることができることは当該技術分野においてよく知られている。同じく，アミノ酸を保存的に変更して，元の機能性的を保持する蛋白質またはポリペプチドを得ることができることも当該技術分野においてよく知られている。いずれの場合においても，すべての順列が本明細書の開示によりカバーされることが意図される。
【０３０６】
本明細書に記載される単離された核酸分子の機能的等価物も本発明の範囲内に含まれる。遺伝コードの縮重のため，あるコドンを同じアミノ酸を規定する他のコドンで置き換え，同じ蛋白質を生じさせることができる。既知のアミノ酸は，メチオニンおよびトリプトファンを除き，２以上のコドンによりコードすることができるため，核酸配列は実質的に様々でありうる。すなわち，本発明の遺伝子の一部または全部を合成して，配列番号１に記載される核酸配列と有意に異なる核酸配列を得ることができる。しかし，これによりコードされるアミノ酸配列は保存される。
【０３０７】
さらに，核酸配列は，配列番号１に記載される核酸の式またはその誘導体の５’−末端および／または３’−末端で少なくとも１つのヌクレオチドを付加，欠失または置換することにより得られるヌクレオチド配列を含んでいてもよい。その付加，欠失または置換が，ヌクレオチド配列によりコードされる，配列番号２に記載されるアミノ酸配列を変更しない限り，任意のヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをこのように用いることができる。例えば，本発明は，本発明の核酸配列またはその誘導体の５’−末端に開始コドンとしてＡＴＧを付加することにより，または本発明のヌクレオチド配列またはその誘導体の３’−末端に終止コドンとしてＴＴＡ，ＴＡＧまたはＴＧＡを付加することにより得られる任意の核酸配列を含むことを意図する。さらに，本発明の核酸分子は，必要に応じて，これらの５’−末端および／または３’−末端に付加された制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有することができる。
【０３０８】
所定の核酸配列のそのような機能的変更により，これに融合した外来核酸配列によりコードされる異種蛋白質の分泌および／またはプロセシングが促進される機会が与えられる。したがって，遺伝コードにより許容される本発明のホスファターゼ遺伝子およびそのフラグメントのヌクレオチド配列のすべての変種は本発明に含まれる。
【０３０９】
さらに，コドンを削除するかまたは１またはそれ以上のコドンを縮重コドン以外のコドンと置換して，構造的に改変されているが，未改変核酸分子により産生されるポリペプチドと実質的に同じ有用性または活性を有するポリペプチドを製造することが可能である。当該技術分野において認識されているように，２つのポリペプチドは機能的に同等であり，これらの核酸分子の間の相違が遺伝コードの縮重に関連しない場合であっても，これらの製造を生じさせる２つの核酸分子も機能的に同等である。
【０３１０】
複合体の"化学的誘導体"は，通常は蛋白質の一部ではない追加の化学的成分を含む。蛋白質またはペプチドの共有結合修飾は，本発明の範囲内に含まれる。そのような修飾は，以下に記載するように，ペプチドの標的アミノ酸残基を選択された側鎖または末端残基と反応しうる有機誘導化剤と反応させることにより，分子中に導入することができる。
【０３１１】
システイン残基は，最も一般的にはアルファ−ハロアセテート（および対応するアミン），例えばクロロ酢酸またはクロロアセトアミドと反応させて，カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。システイン残基は，ブロモトリフルオロアセトン，クロロアセチルホスフェート，Ｎ−アルキルマレイミド，３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド，メチル２−ピリジルジスルフィド，ｐ−クロロ水銀ベンゾエート，２−クロロ水銀−４−ニトロフェノール，またはクロロ７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールと反応させることにより誘導化する。
【０３１２】
ヒスチジン残基は，ｐＨ５．５−７．０でジエチルプロカーボネートと反応させることにより誘導化することができる。これは，この薬剤がヒスチジンの側鎖に比較的特異的であるためである。臭化パラブロモフェナシルもまた有用である。反応は，好ましくは，０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中でｐＨ６．０で行う。
【０３１３】
リジンおよびアミノ末端残基はコハク酸または他のカルボン酸無水物と反応させる。これらの薬剤による誘導化は，リジン残基の電荷を逆転させる効果を有する。１級アミン含有残基を誘導化するための他の適当な試薬には，イミドエステル，例えば，メチルピコリンイミデート；ピリドキサールホスフェート；ピリドキサール；クロロホウ化水素；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソウレア；２，４−ペンタンジオン；およびトランスアミナーゼに触媒されるグリオキシレートとの反応が含まれる。
【０３１４】
アルギニン残基は慣用的な試薬の１つまたはいくつかと反応させることにより修飾する。これには，例えば，フェニルグリオキサール，２，３−ブタンジオン，１，２−シクロヘキサンジオン，およびニンヒドリンがある。アルギニン残基の誘導化には，グアニジン官能基の高いｐＫａのため，反応をアルカリ条件中で行うことが必要である。さらに，これらの試薬はリジンの基ならびにアルギニンアルファアミノ基とも反応することができる。
【０３１５】
チロシン残基は，芳香族性ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンと反応させることにより光学的標識を導入するための修飾のよく知られる標的である。最も一般的には，Ｎ−アセチルイミダゾールおよびテトラニトロメタンを用いて，それぞれＯ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体を生成する。
【０３１６】
カルボキシル側鎖（アスパラギン酸およびグルタミン酸）は，カルボジイミド（Ｒ’−Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｒ’），例えば１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル（４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドと反応させることにより，選択的に修飾する。さらに，アスパラギン酸およびグルタミン酸残基は，アンモニウムイオンと反応させることにより，アスパラギンおよびグルタミン残基に変換する。
【０３１７】
グルタミンおよびアスパラギン残基は，しばしば脱アミド化して，対応するグルタミン酸およびアスパラギン酸残基に変換する。あるいは，これらの残基をより穏和な酸性条件下で脱アミド化する。これらの残基のいずれの形も本発明の範囲内である。
【０３１８】
二官能性薬剤による誘導化は，例えば，蛋白質の成分ペプチドを互いに，または複合体中の他の蛋白質と，または水不溶性支持体マトリクスと，または他の高分子担体と架橋するのに有用である。一般に用いられる架橋薬剤としては，例えば，１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン，グルタルアルデヒド，Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル，例えば，４−アジドサリチル酸のエステル，ホモ二官能性イミドエステル（３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）等のジスクシンイミジルエステルを含む），および二官能性マレイミド，例えばビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンが挙げられる。メチル−３−［ｐ−アジドフェニル）ジチオールプロピオイミデート等の誘導化薬剤により，光の存在下で架橋を形成しうる光活性化可能な中間体が得られる。あるいは，反応性の水不溶性マトリクス，例えば臭化シアン活性化炭水化物および米国特許３，９６９，２８７；３，６９１，０１６；４，１９５，１２８；４，２４７，６４２；４，２２９，５３７；および４，３３０，４４０に記載される反応性基質を蛋白質固定化のために用いることができる。
【０３１９】
他の修飾としては，プロリンおよびリジンのヒドロキシル化，セリンまたはトレオニン残基のヒドロキシル基のリン酸化，リジン，アルギニン，およびヒスチジン側鎖のアルファアミノ基のメチル化（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６（１９８３）），Ｎ末端アミンのアセチル化，および場合によりＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
【０３２０】
そのような誘導化された成分は，安定性，溶解性，吸収，生物学的半減期等を改良することができる。あるいは，これらの成分は，蛋白質複合体の望ましくない副作用を排除するかまたは緩和することができる。そのような効果を媒介しうる成分は，例えば，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９０）に開示されている。
【０３２１】
"フラグメント"との用語は，これが由来する全長ポリペプチドより短い長さを有する蛋白質または複合体のアミノ酸配列に由来するポリペプチドを示すものとして用いられる。そのようなフラグメントは，例えば，全長蛋白質の蛋白質分解性切断により製造することができる。好ましくは，フラグメントは，蛋白質をコードするＤＮＡ配列を適当に改変して，Ｃ末端，Ｎ末端，および／または天然配列中の１またはそれ以上の部位において１またはそれ以上のアミノ酸を除去することにより，組換えにより得る。蛋白質のフラグメントは，本明細書に記載されるように，シグナル伝達を調節するように作用する物質のスクリーニングに有用である。そのようなフラグメントは，天然の複合体の１またはそれ以上の特徴的部分を保持しているであろうことが理解される。そのような保持される特徴の例としては，触媒的活性；基質特異性；無傷の細胞中における他の分子との相互作用；制御機能；または天然の複合体またはそのエピトープに対する抗体との結合が挙げられる。
【０３２２】
本発明の範囲内に入ることが意図される別の機能的誘導体は，天然のポリペプチドに対して，１またはそれ以上のアミノ酸を欠失しているか，追加のまたは置換されたアミノ酸を含む"変種"ポリペプチドである。変種は，蛋白質のＤＮＡコーディング配列を適当に改変して，Ｃ末端，Ｎ末端，および／または天然配列中の１またはそれ以上の部位において１またはそれ以上のアミノ酸のためのコドンを付加，除去，および／または改変することにより，天然に生ずる複合体成分から誘導することができる。追加，置換および／または追加アミノ酸を有するそのような変種は，上述するように，天然の蛋白質の１またはそれ以上の特徴的部分を保持していることが理解される。
【０３２３】
アミノ酸残基が除去，挿入および／または置換されている蛋白質の機能的誘導体は，当業者によく知られる標準的な手法を用いて製造することができる。例えば，機能的誘導体の改変された成分は，改変されたコード配列を生成するように，ＤＮＡコード配列中のヌクレオチドを修飾する部位特異的突然変異手法（Ａｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，ＤＮＡ  ２：１８３に例示されている）を用いて，その後上述したような手法を用いてこの組換えＤＮＡを原核生物または真核生物宿主細胞中で発現させることにより，製造することができる。あるいは，アミノ酸が削除，挿入および／または置換されている蛋白質は，当該技術分野においてよく知られる方法を用いて，直接化学合成により便利に製造することができる。蛋白質の機能的誘導体は，典型的には天然の蛋白質と同じ質の生物学的活性を示す。
【０３２４】
本発明はまた，核酸配列が天然の複合体の１またはそれ以上の特徴的部分を含む本発明にしたがうホスファターゼをコードするか否かを検出する方法を提供する。記載されるように，そのような保存された特徴の例には以下のものが含まれる：触媒活性；基質特異性；無傷の細胞における他の分子との相互作用；制御機能；または天然の複合体に特異的な抗体またはそのエピトープとの結合。したがって，本発明は，所定の核酸分子によりコードされるポリペプチドホスファターゼの１またはそれ以上の特徴，特に，触媒ドメインの存在を分析するアッセイを提供する。
【０３２５】
この目的のため，適当なアッセイは，ホスファターゼ蛋白質を精製し定量することから開始することができる。次に，例えば，一連の希釈を行い，加水分解しうる基質，および任意にポリペプチドの触媒活性を増加させることができる還元剤を含む緩衝液（例えばＡＢＴ緩衝液）中でインキュベートすることにより，蛋白質をアッセイすることができる。好ましくは，基質はｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）であり，還元剤はジチオスレイトール（ＤＴＴ）であり，ｍＭ濃度はそれぞれ４Ｘおよび１Ｘであうｒ。インキュベーションは，活性により，室温で約２分間から一夜でありうる。反応を停止するためには，ＮａＯＨを加え，これは約１００μｌの１０ＮＮａＯＨでありうる。懸濁液を遠心分離し，上清をＯＤ４１０ｎＭで分析して，蛋白質ホスファターゼが触媒特性を示すか否かを判定することができる。
【０３２６】
表およびその記載
表１は，各遺伝子の名前，各遺伝子の分類，配列中のオープンリーディングフレームの位置，および対応するペプチドの長さを表す。データは，上から下に，以下のものを表す："遺伝子名"，"ＩＤ＃ｎａ"，"ＩＤ＃ａａ"，"ＦＬ／Ｃａｔ"，"スーパーファミリー"，"グループ"，"ファミリー"，"ＮＡ長さ"，"ＯＲＦ開始"，"ＯＲＦ終了"，"ＯＲＦ長さ"，および"ＡＡ長さ"。"遺伝子名"は，ホスファターゼまたはホスファターゼ様酵素をコードする配列に与えられた名前を表す。各遺伝子は，"ＳＧＰ"名称およびその後の番号により表される。ＳＧＰ名は，通常は，１つの連続配列（"コンティグ"）に構築された多数の重複配列を表す。"ＩＤ＃ｎａ"および"ＩＤ＃ａａ"は，本明細書において各核酸およびアミノ酸配列に与えられた同定番号を表す。"ＦＬ／Ｃａｔ"は，遺伝子の長さを表し，ＦＬは全長を，"Ｃａｔ"は触媒ドメインのみが示されていることを表す。このカラム中の"Ｐａｒｔｉａｌ"とは，配列が部分的蛋白質ホスファターゼ触媒ドメインをコードすることを示す。"スーパーファミリー"とは，遺伝子が二重特異性ホスファターゼ，蛋白質チロシンホスファターゼまたはセリントレオニンホスファターゼであるかを識別する。"グループ"および"ファミリー"は，配列ホモロジーにより定義され，先に確立されている系統発生分析に基づく蛋白質ホスファターゼの分類を表す（Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｈｏｓｐａｔａｓｅ  Ｆａｃｔｓｂｏｏｋ，Ｎｉｃｋ  Ｔｏｎｋｓ，Ｓｈｉｒｉｓｈ  Ｓｈｅｎｏｌｉｋａｒ，Ｈａｒｒｙ  Ｃｈａｒｂｏｎｎｅａｕ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒ，２０００）。"ＮＡ長さ"は，対応する核酸配列の長さをヌクレオチドで表す。"ＯＲＦ開始"は，オープンリーディングフレームの開始ヌクレオチドを表す。"ＯＲＦ終了"は，オープンリーディングフレームの終止コドンを除く最後のヌクレオチドを表す。"ＯＲＦ長さ"は，オープンリーディングフレームの長さをヌクレオチドで表す。"ＡＡ長さ"は，対応する核酸配列においてコードされるペプチドの長さをアミノ酸で表す。
【０３２７】
【表１】
2005509418.tif 000003
【０３２８】
表２は，本明細書に記載される遺伝子の以下の特徴を示す：染色体位置，一塩基多型（ＳＮＰｓ），ｄｂＥＳＴにおける表示，および反復領域。示されるデータは，上から下に，以下のとおりである："遺伝子名"，"ＩＤ＃ｎａ"，"ＩＤ＃ａａ"，"ＦＬ／Ｃａｔ"，"スーパーファミリー"，"グループ"，"ファミリー"，"染色体"，"ＳＮＰｓ"，"ｄｂＥＳＴ＿ヒット"，および"反復"。最初の７つのカラム（すなわち，"遺伝子名"，"ＩＤ＃ｎａ"，"ＩＤ＃ａａ"，"ＦＬ／Ｃａｔ"，"スーパーファミリー"，"グループ"，"ファミリー"）の内容は，表１について上述したとおりである。"染色体"は，遺伝子の細胞遺伝学的位置を表す。"ＳＮＰｓ"カラムの情報は，候補一塩基多型（ＳＮＰｓ）の核酸位置および縮重性を示す。"ｄｂＥＳＴヒット"は，対応する遺伝子に対して少なくとも１００ｂｐの１００％同一性を含む，ＥＳＴの公共のデータベース（ｄｂＥＳＴ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｂＥＳＴ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）中の登録物の受託番号を示す。これらのＥＳＴはｄｂＥＳＴのｂｌａｓｔｎにより同定した。"反復"は，複雑性が低く，いくつかの別々の遺伝子中に存在する約２１ｂｐの長さの短い配列の位置に関する情報を含む。これらの反復は，ＮＣＢＩ（ｎｒｎａ）の非重複核酸データベースに対するＤＮＡ配列のｂｌａｓｔｎにより同定した。この反復カラムに含まれるためには，配列は典型的にはその長さにわたり１００％同一性を有し，典型的には少なくとも５つの異なる遺伝子中に存在する。
【０３２９】
【表２】
2005509418.tif 000004
【０３３０】
表３は，ホスファターゼ触媒ドメインの程度および境界を示す。行の表題は以下のとおりである："遺伝子名"，"ＩＤ＃ｎａ"，"ＩＤ＃ａａ"，"ＦＬ／Ｃａｔ"，"ドメイン""Ｐｈｏｓ開始""Ｐｈｏｓ終了"，"プロファイル開始""プロファイル終了"，"他のドメイン"および"ＳＨ２境界"。行"遺伝子名"，"ＩＤ＃ｎａ"，"ＩＤ＃ａａ"，"ＰＬ／Ｃａｔ"の内容は表１について上述したとおりである。"Ｐｈｏｓ開始"，"Ｐｈｏｓ終了"，"プロファイル開始"および"プロファイル終了"は，隠れマルコフモデルを用いて得た，触媒範囲の境界を規定するデータを表す（ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）。蛋白質全体中の触媒ドメインの境界は，"Ｐｈｏｓ開始"および"Ｐｈｏｓ終了"の行で示される。３つのプロファイルを用いた。１つは１７３アミノ酸の長さの二重特異性ホスファターゼ（ＤＳＰ）について；１つは３０１アミノ酸の長さのＳＴＰについて；１つは２６４アミノ酸の長さＰＴＰについてである。（用いたプロファイルはｈｔｔｐ：／／ｐｆａｄ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／に示される）。プロファイルが全長触媒ドメインを認識する蛋白質は，"プロファイル開始"が１であり，プロファイル終了は３つのファミリーについて以下のとおりである：ＤＳＰは１７３，ＳＴＰは３０１，ＰＴＰは２６４。部分的触媒ドメインを有する遺伝子は，プロファイル開始が１より大きく（ホスファターゼドメインの開始が欠失していることを示す），および／または"プロファイル終了が"２６１より小さい（ホスファターゼドメインのＣ末端が欠失していることを示す）。"他のドメイン"のカラムは，ＰＦＡＭ検索（ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／）により新規ホスファターゼ蛋白質において同定された非ホスファターゼドメインを表す。
【０３３１】
【表３】
2005509418.tif 000005
【０３３２】
表４は，非重複蛋白質配列のＮＣＢＩデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｎｔｒｅｚ／ｐｒｏｔｅｉｎ．ｈｔｍｌ）に対するアミノ酸配列のスミス・ウォーターマン類似性検索（マトリックス：Ｐａｍｌ００；ギャップオープン／イクステンションペナルティー１２／２）の結果を示す。行の標題は以下のとおりである："遺伝子名"，"ＩＤ＃ｎａ"，"ＩＤ＃ａａ"，"ＦＬ／Ｃａｔ"，"スーパーファミリー"，"グループ"，"ファミリー"，"Ｐスコア"，"ａａ長さ"，"ａａＩＤマッチ"，"％同一性"，"％類似性"，"ＡＣＣ＃ｎｒａａマッチ"，"説明"。次のカラム："遺伝子名"，"ＩＤ＃ｎａ"，"ＩＤ＃ａａ"，"ＦＬ／Ｃａｔ"，"ファミリー"の内容は表１について上述したとおりである。"Ｐスコア"はスミス・ウォーターマン確率スコアを表す。この数値はアラインメントが偶然により生ずるおよその確率を表す。すなわち，非常に低い数値，例えば２．１０Ｅ−６４は，クエリーとデータベース標的との間に非常に顕著なマッチがあることを示す。"ａａ長さ"は，蛋白質の長さをアミノ酸で表す。"ａａＩＤマッチ"は，アラインメント中で同一であるアミノ酸の数を示す。"％同一性"は，アラインメントした領域にわたって同一であるヌクレオチドのパーセントを示す。"％類似性"は，アラインメント全体にわたって類似するアミノ酸のパーセントを示す。"ＡＣＣ＃ｎｒａａマッチ"は，非重複蛋白質のＮＣＢＩデータベース中で最も類似する蛋白質の受託番号を示す。"説明"は，非重複蛋白質ＮＣＢＩデータベース中で最も類似する蛋白質の名前を含む。
【０３３３】
【表４】
2005509418.tif 000006
【実施例１】
【０３３４】
以下の実施例は限定ではなく，本発明の種々の観点および特徴の代表的なものにすぎない。以下の実施例は，本発明のセリン／トレオニンホスファターゼの単離および特徴付けを示す。
【０３３５】
実施例１：ゲノムＤＮＡからの蛋白質ホスファターゼ遺伝子の同定および特徴付け
材料および方法
ＳＧＰ０３７は，Ｃｅｌｅｒａヒトゲノム配列データベースから隠れマルコフモデル（ＨＭＭＲ）を用いて同定された。新規ホスファターゼは，Ｃｅｌｅｒａヒトゲノム配列データベースから，および公共のＨｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｐｒｏｊｅｃｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から，隠れマルコフモデル（ＨＭＭＲ）を用いて同定した。ゲノムデータベース登録物は，６つのオープンリーディングフレームに翻訳し，ＨＭＭＲ２．１のフィールドプログラム可能アレイ（ＦＰＧＡ）加速版を有するＴｉｍｅｌｏｇｉｃ  Ｄｅｃｙｐｈｅｒボックスを用いて，モデルに対してこれらを検索した。ＨＭＭＲプロファイルに対してアラインメントした，予測された蛋白質配列をコードするＤＮＡ配列を，元のゲノムデータベースから抽出した。次に，核酸配列をＰａｎｇｅａ  Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇツールを用いてクラスター化し，反復登録物を排除した。次に推定蛋白質ホスファターゼ配列を一連のクエリーおよびフィルターを通して順番に走らせて，新規蛋白質ホスファターゼ配列を同定した。特に，ＨＭＭＲで同定された配列は，ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸを用いて，既知のヒト蛋白質ホスファターゼおよびすべてのその後の新規蛋白質ホスファターゼ配列をそれが同定されるにつれて含有するヌクレオチドおよびアミノ酸レポジトリに対して検索した。出力はスプレッドシートで表示して，手動検査で既知の遺伝子を排除することを容易にした。２つのモデル，すなわち，"完全"モデルおよび"部分"またはスミス・ウォーターマンモデルを開発した。部分モデルを用いて準触媒的ホスファターゼドメインを同定し，完全モデルを用いて完全触媒ドメインを同定した。次に選択したヒットをＢＬＡＳＴＮを用いて公共ｎｒｎａおよびＥＳＴデータベースに対してクエリーを行い，これらが実際にユニークであることを確認した。場合によっては，新規遺伝子は，先に同定されている齧歯類または脊椎動物蛋白質ホスファターゼのオルトログであると判定された。
【０３３６】
部分ＤＮＡ配列の延長による全長オープンリーディングフレームの包含は，いくつかの方法により行った。表５に示されるｃＤＮＡデータベースを繰り返しｂｌａｓｔｎ検索して，ゲノム配列を延長したｃＤＮＡを見いだした。"ＬｉｆｅＧｏｌｄ"データベースはＩｎｃｙｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｃｙｔｅ．ｃｏｍ／）から入手した。ＮＣＢＩデータベースはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から入手した。すべてのｂｌａｓｔｎ検索は，ｂｌｏｓｕｍ６２マトリクスを用い，ヌクレオチドミスマッチについてのペナルティー３，およびヌクレオチドマッチのリウォード１を用いて行った。ギャップ付きｂｌａｓｔアルゴリズムは以下に記載されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｆ．，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，Ａｌｅｊａｎｄｒｏ  Ａ．Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｊｉｎｇｈｕｉ  Ｚｈａｎｇ，Ｚｈｅｎｇ  Ｚｈａｎｇ，  Ｗｅｂｂ  Ｍｉｌｌｅｒ，  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｊ．  Ｌｉｐｍａｎ  （１９９７），"Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ"，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）。
【０３３７】
部分ＤＮＡ配列の伸長による全長オープンリーディングフレームの包含はまた，ゲノムデータベースの検索の繰り返しにより行った。第１の方法は，スミス−ウォーターマンアルゴリズムを用いて，最も近い蛋白質ホモログまたはオルトログを部分配列に対して蛋白質−蛋白質検索を行った。標的データベースは，Ｇｅｎｅｓｃａｎおよびヒトゲノムプロジェクト（ＨＧＰ）ならびにＣｅｌｅｒａから得られた全ヒトゲノム配列のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）予測からなる。検索したゲノムデータベースの完全なセットは以下の表６に示される。潜在的な延長をコードするゲノム配列は，ＮＣＢＩ非重複データベースに対するｂｌａｓｔｘ分析を行ってヒットの新規性を確認することによりさらに評価した。延長するゲノム配列は，ＤＮＡＳｔａｒのＳｅｑｍａｎプログラムを用いて潜在的イントロンを削除した後にｃＤＮＡ配列中に組み込んだ。スミス−ウォーターマン検索について用いたデフォルトのパラメータは以下のとおりである。マトリクス：ｂｌｏｓｕｍ６２；ギャップオープニングペナルティー：１２；ギャップ延長ペナルティー：２．Ｇｅｎｅｓｃａｎ予測は，Ｇｅｎｅｓｃａｎプログラムを，Ｃｈｒｉｓ  Ｂｕｒｇｅ  ａｎｄ  Ｓａｍ  Ｋａｒｌｉｎ（"Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ"，ＪＭＢ（１９９７）２６８（１）：７８−９４）に詳細が記載されるように用いて行った。ゲノムＤＮＡからのＯＲＦの予測は，標準的な６フレーム翻訳を用いて行った。
【０３３８】
ゲノム配列からＤＮＡ伸長を規定する別の方法は，Ｇｅｎｅｓｃａｎプログラムを用いてゲノムデータベースを繰り返し検索してエクソンスプライシングを予測した。次にこれらの予測された遺伝子を，関連するホスファターゼに対するホモロジーに基づいてこれらが部分遺伝子の"本物の"延長であるかを見ることにより評価した。
【０３３９】
別の方法は，Ｇｅｎｅｗｉｓｅプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／Ｗｉｓｅ２／）を使用して，最も近いオルトログ／ホモログに対するホモロジーに基づいて潜在的ＯＲＦを予測することを含む。Ｇｅｎｅｗｉｓｅは，２つの入力，すなわち相同の蛋白質と目的とする遺伝子を含むゲノムＤＮＡを必要とする。ゲノムＤＮＡはＣｅｌｅｒａおよびヒトゲノムプロジェクトのデータベースのｂｌａｓｔｎ検索により同定した。オルトログは，ＮＣＢＩ非重複蛋白質データベース（ＮＲＡＡ）をｂｌａｓｔｐ検索することにより同定した。Ｇｅｎｅｗｉｓｅは，蛋白質配列をゲノムＤＮＡ配列と比較し，イントロンおよびフレームシフトエラーを得ることができる。
【０３４０】
【表５】
2005509418.tif 000007
【０３４１】
【表６】
2005509418.tif 000008
【０３４２】
結果
Ｇｅｎｅｗｉｓｅを用いて延長した遺伝子については，蛋白質オルトログおよびゲノムＤＮＡの受託番号が記載されている（Ｇｅｎｅｗｉｓｅはゲノム配列から標的遺伝子のコーディング配列を組み立てるためにオルトログを用いる）。オルトログのアミノ酸配列は，蛋白質のＮＣＢＩ非重複データベースから得た（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｎｔｒｅｚ／ｐｒｏｔｅｉｎ．ｈｔｍｌ）。ゲノムＤＮＡは２つの起源，すなわち，ＣｅｌｅｒａおよびＮＣＢＩ−ＮＲＮＡからのものであり，これは以下に示される。ｃＤＮＡ起源もまた以下に示される。略号：ＨＧＰ：ヒトゲノムプロジェクト；ＮＣＢＩ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ。
【０３４３】
ＳＧＰ０３７，配列番号１および２
ＳＧＰ０３７の核酸配列は，遺伝子Ｔ０１３６１およびＡＡＦ２６９５３をホモログとして用いてＣｅｌｅｒａゲノムＤＮＡ１７００００６２８４１０１０および１８１００００６６３６５０７０についてＧｅｎｅｗｉｓｅアルゴリズムを走らせることにより得られた。配列は，Ｉｎｃｙｔｅコンセンサス配列８１２４１９６ＣＢ１を用いて確認した。
【０３４４】
ＳＧＰ０３７（配列番号１）は１１９２ヌクレオチドの長さである。オープンリーディングフレームは位置１で開始し，位置１１９２で終了し，１１９２ヌクレオチドの長さのＯＲＦを与える。予測蛋白質は３７２アミノ酸の長さである（配列番号２）。この配列は全長（開始メチオニンから終止コドンまで）である。これは次のように分類される（スーパーファミリー／グループ／ファミリー）：セリンホスファターゼ，ＳＴＰ，ＰＰ２Ｃ。この遺伝子は染色体位置４ｑ２１にマップされる。染色体領域４ｑ２１（ｔ（４；１１）（ｑ２１；ｐ１５））の周囲の転座は，急性リンパ芽球性白血病と関連づけられている（Ｍｅｃｕｃｃｉ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ  Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．２０００  Ｊｕｎ；１０９（４）：７８８−９３）。この遺伝子は一塩基多型候補を含まない。公共ドメイン（ｄｂＥＳＴ）中のこの遺伝子についてのＥＳＴには以下のものが含まれる：ＢＧ７４２２４４，ＢＩ４３８２７３．１，ＢＧ７１３９５０．１，ＢＦ６７１９６６．１。この遺伝子は反復を含まない。
【０３４５】
実施例２：予測蛋白質
ＳＧＰ０３７（ＩＤ＃ＮＡ＿１，ＩＤ＃ＡＡ＿２）は，３７２アミノ酸の長さの蛋白質をコードする。これは，セリントレオニンホスファターゼであると分類される。この蛋白質中のホスファターゼドメインは，プロファイル位置１２からプロファイル位置３０１まで（ほぼ全長触媒ドメイン），ＰＰ２Ｃホスファターゼについての隠れマルコフプロファイルとマッチする。コードされる蛋白質のホスファターゼ触媒領域の位置はアミノ酸１０４からアミノ酸３３９である。この蛋白質配列を用いたアミノ酸配列の公共データベース（ＮＲＡＡ）のスミス・ウォーターマン検索の結果は以下のとおりである。ＳＧＰ０３７は，ＮＰ＿１９７８７６．１（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来の蛋白質ホスファターゼ２Ｃ様蛋白質）と３５％同一である。Ｐ値＝３．６０Ｅ−３５；同一のアミノ酸の数＝９０；パーセント同一性＝３５％；パーセント類似性＝５６％。
【０３４６】
実施例３．新規哺乳動物蛋白質ホスファターゼの発現分析
Ｉｎｃｙｔｅ  ｃＤＮＡデータベースのＢＬＡＳＴ分析は，ＳＧＰ０３７が前立腺上皮，脳組織，小腸および結腸に由来するｃＤＮＡ中に存在することを示した。
【０３４７】
実施例４：哺乳動物蛋白質ホスファターゼの染色体位置
いくつかの情報源を用いて，本発明の遺伝子のそれぞれの染色体上の位置に関する情報を得た。Ｃｅｌｅｒａブラウザ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌｅｒａ．ｃｏｍ）を用いて，ｃｅｌｅｒａコンフィギュレーションを特定の細胞遺伝学的バンドに位置決定した。また，核酸配列の受託番号を用いてＵｎｉｇｅｎｅデータベースを検索した。Ｕｎｉｇｅｎｅサーチエンジンを含むサイトは，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＵｎｉＧｅｎｅ／Ｈｓ．Ｈｏｍｅ．ｈｔｍｌである。Ｕｎｉｇｅｎｅデータベース中のマップ位置の情報は，いくつかの情報源，例えば，ｔｈｅ  Ｏｎｌｉｎｅ  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ（ＯＭＩＭ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｏｍｉｍ／ｓｅａｒｃｈｏｍｉｍ．ｈｔｍｌ），Ｔｈｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｇｄｂ．ｉｎｆｏｂｉｏｇｅｎ．ｆｒ／ｇｄｂ／ｓｉｍｐｌｅＳｅａｒｃｈ．ｈｔｍｌ），およびｔｈｅ  Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｈｕｍａｎ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｍａｐ（ｈｔｔｐ：／／ｃａｒｂｏｎ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ：８０００／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃｏｎｔｉｇ／ｓｔｓ＿ｉｎｆｏ？ｄａｔａｂａｓｅ＝ｒｅｌｅａｓｅ）から得た。ＵｎｉｇｅｎｅがＥＳＴをマップしなかった場合には，既にマップされている配列を含むデータベース，例えばｄｂｓｔｓおよびｈｔｇｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌａｓｔｄａｔａｂａｓｅｓ．ｈｔｍｌ）に対して目的とする遺伝子についての核酸をクエリーとして用いた。核酸配列はＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ／ｎｐｈ−ｎｅｗｂｌａｓｔ）でＢＬＡＳＴ−２を用いて検索し，これを用いてｄｂｓｔｓまたはｈｔｇｓのいずれかにクエリーを行った。これらの方法のいずれかにより細胞遺伝学的領域を同定した後，ＯＭＩＭを細胞遺伝学的位置で検索することにより，疾病との関連を確立する。ＯＭＩＭは，疾病により系統づけられた細胞遺伝学的マップ位置の検索可能なカタログを維持する。また，細胞遺伝学的領域についての入手可能な文献の徹底的な検索は，Ｍｅｄｌｉｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＰｕｂＭｅｄ／ｍｅｄｌｉｎｅ．ｈｔｍｌ）を用いて行う。マップされた部位とヒト癌において見いだされる染色体異常との関連についての参考文献は，Ｋｎｕｕｔｉｌａ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ，１９９８，１５２：１１０７−１１２３に見いだすことができる。
【０３４８】
以下の節は，本発明に含まれるホスファターゼについて確立された染色体位置にマップされる種々の疾病および／または疾患を記載する。本発明のホスファターゼポリヌクレオチドを用いて，関連性のある疾病および／または疾患を有するかまたはそれを発達させるリスクを有する個人を同定することができる。本明細書において議論されるように，本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは，ホスファターゼ活性を調節し，したがって種々の疾病および／または疾患を改善する化合物を同定するのに有用である。
【０３４９】
結果：
Ｃｅｌｅｒａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍブラウザを用いて，ＳＧＰ０３７の細胞遺伝地図の位置は４ｑ２１であると決定された。この領域中の変異は，ぞうげ質形成不全症を伴う常染色体優性の難聴における関与が示唆されている（ＯＭＩＭ＃６０５５９４，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｈｔｂｉｎ−ｐｏｓｔ／Ｏｍｉｍ／ｄｉｓｐｍｉｍ？６０５５９４）。
【０３５０】
実施例５：一塩基多型（ＳＮＰｓ）候補
材料および方法
ヒトＤＮＡにおける最も一般的な変種は一塩基多型（ＳＮＰｓ）であり，これは，約１００−３００塩基に１回生ずる。ＳＮＰｓは大規模の関連遺伝学研究を容易にすると予測されているため，最近，ＳＮＰの発見および検出に多大な興味がもたれている。本明細書に記載される遺伝子の候補ＳＮＰｓは，核酸配列を公共のデータベースに記録されているＳＮＰｓを含む配列に対してｂｌａｓｔｎ検索することにより同定した（ｄｂＳＮＰ，ＮＣＢＩ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｈｎ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰ／ｓｎｐｂｌａｓｔｐｒｅｔｔｙ．ｈｔｍｌ）。ＳＮＰ含有配列についてｄｂＳＮＰ受託番号が与えられている。ＳＮＰｓはまた，発現遺伝子（ｄｂＥＳＴ，ＮＲＮＡ）およびゲノム配列（すなわちＮＲＮＡ）のいくつかのデータベースを一塩基対ミスマッチについて比較することにより同定した。結果は，表２の"ＳＮＰｓ"のカラムに示される。これらは候補ＳＮＰｓである。ヒト集団におけるこれらの実際の頻度は決定していない。以下のコードはそれぞれのＤＮＡ配列を表す標準である：
Ｇ＝グアノシン
Ａ＝アデノシン
Ｔ＝チミジン
Ｃ＝シチジン
Ｒ＝ＧまたはＡ，（プリン）
Ｙ＝ＣまたはＴ，（ピリミジン）
Ｋ＝ＧまたはＴ，（ケト）
Ｗ＝ＡまたはＴ，（弱）（２つの水素結合）
Ｓ＝ＣまたはＧ，（強）（３つの水素結合）
Ｍ＝ＡまたはＣ，（アミノ）
Ｂ＝Ｃ，ＧまたはＴ（すなわち，Ａ以外）
Ｄ＝Ａ，ＧまたはＴ（すなわち，Ｃ以外）
Ｈ＝Ａ，ＣまたはＴ（すなわち，Ｇ以外）
Ｖ＝Ａ，ＣまたはＧ（すなわち，Ｔ以外）
Ｎ＝Ａ，Ｃ，ＧまたはＴ，（任意）
Ｘ＝Ａ，Ｃ，ＧまたはＴ
相補的ＤＮＡ鎖
ＧＡＴＣＲＹＷＳＫＭＢＶＤＨＮＸ（配列番号４）
＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋
ＣＴＡＧＹＲＳＷＭＫＶＢＨＤＮＸ
【０３５１】
例えば，２つのバージョンの遺伝子が存在し，一方は所定の位置に"Ｃ"を有し，他方は同じ位置に"Ｔ”を有する場合，その位置はＹと表され，これはＣまたはＴを意味する。ＳＮＰｓは，遺伝子に付随する遺伝性の特徴を同定するために重要であろう。
【０３５２】
結果
ＳＧＰ０３７はｄｂＳＮＰ中の多型に対応するＳＮＰを含まない。
【０３５３】
実施例６：哺乳動物蛋白質ホスファターゼをコードするｃＤＮＡの単離
材料および方法
新規クローンの同定
総ＲＮＡは，原発性腫瘍，正常および腫瘍細胞株，正常ヒト組織，およびソートしたヒト造血細胞からＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ（Ｐ．Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ  ａｎｄ  Ｎ．Ｓａｃｃｈｉ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２，１５６（１９８７））のグアニジン塩／フェノール抽出プロトコルを用いて単離する。これらのＲＮＡを用いて，Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｐｒｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ；Ｇｅｒａｒｄ，ＧＦ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９），ＦＯＣＵＳ  １１，６６）を用いて，製造元により推奨される条件で一本鎖ｃＤＮＡを生成する。典型的な反応においては，６０μｌの反応容量中で１０μｇの総ＲＮＡおよび１．５μｇのオリゴ（ｄＴ）12-18を用いる。生成物をＲＮａｓｅＨで処理し，Ｈ2Ｏで１００μｌに希釈する。続くＰＣＲ増幅のためには，１−４μｌのこのｓｓｃＤＮＡを各反応において用いる。
【０３５４】
縮重オリゴヌクレオチドは，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３９４８ＤＮＡ合成機で確立されたホスホルアミダイト化学を用いて合成し，エタノールで沈澱させ，精製せずにＰＣＲ用に用いる。これらのプライマーは，いくつかの蛋白質ホスファターゼの触媒ドメイン中の保存モチーフのセンスおよびアンチセンス鎖に由来する。縮重ヌクレオチド残基の表示は以下のとおりである：Ｎ＝Ａ，Ｃ，Ｇ，またはＴ；Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｙ＝ＣまたはＴ；Ｈ＝Ａ，ＣまたはＴ，Ｇではない；Ｄ＝Ａ，ＧまたはＴ，Ｃではない；Ｓ＝ＣまたはＧ；およびＷ＝ＡまたはＴ。
【０３５５】
ＰＣＲ反応は，多数の一本鎖ｃＤＮＡに適用される縮重プライマーを用いて行う。プライマーをそれぞれ最終濃度５μＭで，１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ８．３，５０ｍＭ  ＫＣｌ，１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2，各２００μＭデオキシヌクレオシド三リン酸，０．００１％ゼラチン，１．５Ｕ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ），および１−４μｇのｃＤＮＡを含む混合物に加える。９５℃で３分間変性させた後，サイクルの条件は，９４℃で３０秒間，５０℃で１分間，および７２℃で１分４５秒間を３５サイクルである。３００−３５０ｂｐの間に移動したＰＣＲフラグメントをＧｅｎｅＣｌｅａｎキット（Ｂｉｏ１０１）を用いて２％アガロースゲルから単離し，製造元のプロトコルにしたがってｐＣＲＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）中にＴ−Ａクローニングする。
【０３５６】
Ｑｉａｇｅｎカラムを用いるミニプラスミドＤＮＡ調製用にコロニーを選択し，サイクルシークエンシング染料ターミネータキットおよびＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ，ＦＳ（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いてプラスミドＤＮＡを配列決定する。配列決定反応生成物はＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７７  ＤＮＡシークエンサーにかけ，ＢＬＡＳＴアラインメントアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０）を用いて分析する。
【０３５７】
追加のＰＣＲ戦略を用いて，正確なまたはほぼ正確なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて種々のＰＣＲフラグメントまたはＥＳＴを接続する。ＰＣＲ条件は上述したとおりであるが，ただし，アニーリング温度は，式：Ｔｍ＝４（Ｇ＋Ｃ）＋２（Ａ＋Ｔ）を用いて各オリゴ対について計算する。
【０３５８】
ｃＤＮＡクローンの単離：
ヒトｃＤＮＡライブラリをホスファターゼ関連遺伝子に対応するＰＣＲまたはＥＳＴフラグメントで探索する。プローブをランダムプライミングにより32Ｐで標識し，ライブラリスクリーニングの標準的手法にしたがって，２ｘ１０6ｃｐｍ／ｍＬで用いる。プレハイブリダイゼーション（３時間）およびハイブリダイゼーション（一夜）は，５ＸＳＳＣ，５Ｘデンハルト溶液，２．５％硫酸デキストラン，５０ｍＭＮａ2ＰＯ4／ＮａＨＰＯ4，ｐＨ７．０，５０％ホルムアミド，１００ｍｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡ中で４２℃で行う。ストリンジェントな洗浄は，６５℃で，０．１ＸＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で行う。ＤＮＡ配列決定は，サイクルシークエンシング染料ターミネータキットを用い，ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼＦＳ（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて両方の鎖について行う。配列決定反応生成物をＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７７  ＤＮＡシークエンサーにかける。
【０３５９】
実施例７：蛋白質ホスファターゼ遺伝子発現
発現ベクターの構築
ヒトｃＤＮＡのいくつかから発現構築物を作成する：ａ）ｐＣＤＮＡ発現ベクター中の完全長クローン；ｂ）ＧＳＴ発現カセットのＣ末端に融合させた新規ホスファターゼの触媒ドメインを含むＧＳＴ融合構築物；およびｃ）ｐＣＤＮＡベクター中に挿入されたホスファターゼドメイン中の予測触媒部位にＣｙｓからＳｅｒ（ＣからＳ）変異を含む完全長クローン。
【０３６０】
ホスファターゼの"ＣからＳ"変異体は優性負の構築物として機能するかもしれず，これらの新規ホスファターゼの機能を解明するために用いられる。
【０３６１】
実施例８：蛋白質ホスファターゼに対する特異的免疫試薬の作成
材料および方法
単離されたホスファターゼポリペプチドに対応するＫＬＨ−またはＭＡＰ−コンジュゲート化合成ペプチドに対する特異的免疫試薬をウサギで生成させる。Ｃ末端ペプチドをグルタルアルデヒドでＫＬＨとコンジュゲートさせ，遊離Ｃ末端を残す。内部ペプチドは，ブロックされたＮ末端を用いてＭＡＰ−コンジュゲートさせる。追加の免疫試薬はまた，細菌で発現させた各新規ＰＴＰまたはＳＴＰの細胞質ドメインを含むＧＳＴ融合蛋白質でウサギを免疫することにより生成することができる。
【０３６２】
内因性起源について試験する前に，最初に，種々の免疫血清を，組換え蛋白質に対する反応性および選択性について試験する。
【０３６３】
ウエスタンブロット
ＳＤＳ  ＰＡＧＥ上の蛋白質をイモビロン膜に移す。洗浄緩衝液はＰＢＳＴ（標準的リン酸緩衝化食塩水，ｐＨ７．４＋０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）である。ブロッキングおよび抗体インキュベーション緩衝液はＰＢＳＴ＋５％ミルクである。抗体希釈は１：１０００から１：２０００の範囲である。
【０３６４】
実施例９：蛋白質ホスファターゼの組換え発現および生物学的アッセイ
材料および方法
哺乳動物細胞におけるホスファターゼの過渡的発現
ホスファターゼ構築物を含むｐｃＤＮＡ発現プラスミド（１０μｇＤＮＡ／１００ｍｍプレート）をリポフェクタミン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）とともに２９３細胞中に導入する。７２時間後，細胞を０．５ｍＬの可溶化緩衝液（２０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．３５，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１０％グリセロール，１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2，１ｍＭ  ＥＧＴＡ，２ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル，１μｇ／ｍＬアプロチニン）中に回収する。試料アリコートを６％アクリルアミド／０．５％ビスアクリルアミドゲルのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で分離し，電気泳動的にニトロセルロースに移す。非特異的結合は，ブロットをＢｌｏｔｔｏ（５％ｗ／ｖ無脂乾燥ミルクおよび０．２％ｖ／ｖ  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（Ｓｉｇｍａ）を含有するリン酸緩衝化食塩水）中でプレインキュベートすることによりブロックし，種々の抗ペプチドまたは抗ＧＳＴ融合蛋白質特異的抗血清を用いて組換え蛋白質を検出した。
【０３６５】
インビトロホスファターゼアッセイ
ホスファターゼ発現構築物でトランスフェクトした３日後，１０ｃｍプレートの２９３細胞をＰＢＳで洗浄し，氷上でホスファターゼ阻害剤を含む２ｍＬのＰＢＳＴＤＳで可溶化する（１０ｍＭ  ＮａＨＰＯ4，ｐＨ７．２５，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，０．５％デオキシコール酸，０．１％ＳＤＳ，０．２％アジ化ナトリウム，１ｍＭ  ＮａＦ，１ｍＭ  ＥＧＴＡ，４ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム，１％アプロチニン，５μｇ／ｍＬロイペプチン）。細胞断片を遠心分離（１２０００ｘｇ，１５分間，４℃）により除去し，溶解物をプロテインＡセファロースの１：１スラリー５０μｌとともにそれぞれ１時間２回インキュベートすることにより前精製する。０．５ｍＬの精製上清を，１０μｌのプロテインＡ精製ホスファターゼ特異的抗血清（ＧＳＴ融合蛋白質または抗ペプチド抗血清から生成）プラス５０μｌのプロテインＡ−セファロースの１：１スラリーで，４℃で２時間インキュベートする。次にビーズをＰＢＳＴＤＳ中で２回，ＨＮＴＧ（２０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０，１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，１０％グリセロール）中で２回洗浄する。
【０３６６】
セファロースビーズ上の免疫精製ホスファターゼを２０μｌのＨＮＴＧ＋３０ｍＭ  ＭｇＣｌ2，１０ｍＭ  ＭｎＣｌ2，および２０μＣｉ［α32Ｐ］ＡＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）中に再懸濁する。ホスファターゼ反応は室温で３０分間実施し，５０ｍＭ  ＥＤＴＡを補充したＨＮＴＧを加えることにより停止させる。試料をＨＮＴＧ中で６回洗浄し，ＳＤＳ試料緩衝液中で５分間煮沸し，６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび続くオートラジオグラフィーにより分析する。リン酸化アミノ酸の分析は，ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから切り出した32Ｐ−標識バンドの標準的２Ｄ法により行う。
【０３６７】
細菌で発現させたホスファターゼのＧＳＴ融合構築物についても同様のアッセイを行う。
【０３６８】
実施例１０：サザンブロッティングによる遺伝子増幅の証明
材料および方法
ナイロン膜はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍから購入する。変性溶液は，０．４ＭＮａＯＨおよび０．６Ｍ  ＮａＣｌを含む。中和溶液は，０．５ＭＴｒｉｓ−ＨＣＬ，ｐＨ７．５および１．５ＭＮａＣｌを含む。ハイブリダイゼーション溶液は，５０％ホルムアミド，６ＸＳＳＰＥ，２．５Ｘデンハルト溶液，０．２ｍｇ／ｍＬ変性サケＤＮＡ，０．１ｍｇ／ｍＬ酵母ｔＲＮＡ，および０．２％ドデシル硫酸ナトリウムを含む。制限酵素はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍから購入する。放射性標識プローブは，ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＰｒｉｍｅ−ｉｔＩＩキットを用いて調製する。プローブテンプレートに用いるベータアクチンＤＮＡフラグメントはＣｌｏｎｔｅｃｈから購入する。
【０３６９】
種々の腫瘍細胞株（例えば，ＭＣＦ−７，ＭＤＡ−ＭＢ２３１，Ｃａｌｕ−６，Ａ５４９，ＨＣＴ−１５，ＨＴ−２９，Ｃｏｌｏ２０５，ＬＳ−１８０，ＤＬＤ−１，ＨＣＴ−１１６，ＰＣ３，ＣＡＰＡＮ−２，ＭＩＡ−ＰａＣａ−２，ＰＡＮＣ−１，ＡｓＰｃ−１，ＢｘＰＣ−３，ＯＶＣＡＲ−３，ＳＫＯＶ３，ＳＷ６２６およびＰＡ−１），および２つの正常細胞株から，ゲノムＤＮＡを単離する。
【０３７０】
各ゲノムＤＮＡ試料の１０μｇのアリコートをＥｃｏＲＩ制限酵素で消化し，別の１０μｇの試料をＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で消化する。制限酵素消化したＤＮＡ試料を０．７％アガロースゲルに負荷し，電気泳動分離した後，標準的方法によりＤＮＡをナイロン膜にキャピラリー移動させる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。
【０３７１】
実施例１１：ファージディスプレイによる蛋白質−蛋白質相互作用の検出
材料および方法
ファージディスプレイは，所望のおとりに対する親和性に基づいて分子相互作用を単離する方法を提供する。ファージ被覆蛋白質への融合としてクローニングされたｃＤＮＡフラグメントは，ファージの表面にディスプレイされる。おとりと相互作用するファージをアフィニティー精製により濃縮し，個々のクローンからの挿入ＤＮＡを分析する。
【０３７２】
Ｔ７ファージディスプレイライブラリ
すべてのライブラリは，Ｔ７Ｓｅｌｅｃｔｌ−ｌｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）中で，製造元の指針にしたがって構築する。
【０３７３】
おとりの提示
おとりとして用いるべき蛋白質ドメインは，ＧＳＴへのＣ末端融合体として作成し，Ｅ．ｃｏｌｉで発現させる。ペプチドは化学的に合成し，長鎖スペーサービオチン試薬を用いてＮ末端でビオチン化する。
【０３７４】
選択
ＰａｎＭｉｘおよびＥ．ｃｏｌｉ阻害剤カクテル（ＳｉｇｍａＰ−８４６５）を補充した，新たに調製したライブラリ（１０10−１０12ｐｆｕ）のアリコートを，固定化したおとりとともに室温で１−２時間インキュベートする。未結合ファージを洗浄緩衝液でよく洗浄する（少なくとも４回）。３−４ラウンドの選択の後，結合したファージを１００μｌの１％ＳＤＳ中に溶出し，アガロースプレートに播種して，単一プラークを得る。
【０３７５】
挿入ＤＮＡの同定
個別のプラークを２５μｌの１０ｍＭＥＤＴＡ中に取り出し，７０℃で１０分間加熱することによりファージを破壊する。２μｌの破壊ファージを５０μｌのＰＣＲ反応混合物に加える。３５ラウンドの熱サイクル（９４℃，５０秒間；５０℃，１分間；７２℃，１分間）により挿入ＤＮＡを増幅する。
【０３７６】
緩衝液の組成
１０ｘＰａｎＭｉｘ
５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
１０％無脂乾燥乳（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ）
１０ｍＭＥＧＴＡ
２５０ｍＭＮａＦ
２５０μｇ／ｍＬヘパリン（ｓｉｇｍａ）
２５０μｇ／ｍＬ，剪断し，沸騰させたサケ精子ＤＮＡ（ｓｉｇｍａ）
０．０５％アジ化ナトリウム
ＰＢＳ中で調製する。
【０３７７】
洗浄緩衝液
ＰＢＳ，以下のもので補充：
０．５％ＮＰ−４０
２５μｇ／ｍＬヘパリン
ＰＣＲ反応混合物
１．０ｍＬ  １０ｘＰＣＲ緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，１５ｍＭＭｇを含む）
各０．２ｍＬのｄＮＴＰｓ（１０ｍＭ保存液）
０．１ｍＬ  Ｔ７ＵＰプライマー（１５ｐｍｏｌ／Ｌ）ＧＧＡＧＣＴＧＴＣＧＴＡＴＴＣＣＡＧＴＣ（配列番号５）
０．１ｍＬ  Ｔ７ＤＮプライマー（１５ｐｍｏｌ／Ｌ）ＡＡＣＣＣＣＴＣＡＡＧＡＣＣＣＧＴＴＴＡＧ（配列番号６）
０．２ｍＬ  ２５ｍＭＭｇＣｌ2またはＭｇＳＯ4，ＥＤＴＡ補償用
蒸留水で１０ｍＬとする
反応液５０μｌあたり１ユニットのＴａｑポリメラーゼを加える
ライブラリ：Ｔ７Ｓｅｌｅｃｔｌ−Ｈ４４１
【０３７８】
化合物の評価
所定の任意の一連の化合物について，生物学的活性のスペクトルを観察することができることが理解されるであろう。１つの好ましい態様においては，本発明は，細胞シグナル伝達に関連する蛋白質酵素，好ましくは蛋白質ホスファターゼ，最も好ましくは蛋白質チロシンホスファターゼを調節する能力を示す化合物に関する。以下に記載されるアッセイを用いて，最適な程度の所望の活性を示す化合物を選択する。
【０３７９】
本明細書において用いる場合，"最適な程度の所望の活性"との語句は，疾患に罹患している動物またはヒト患者に治療上有効量の本発明の化合物を可能な最低の投与量で与えるような，細胞シグナル伝達を媒介し特定の疾患と関連する蛋白質酵素に対する最高の治療指数（上で定義）を表す。
【０３８０】
阻害的活性を決定するためのアッセイ
当該技術分野において知られる種々の方法を用いて，本発明の化合物による蛋白質酵素，特に蛋白質ホスファターゼの活性の阻害を同定，評価またはアッセイすることができる。例えば，限定されないが，ホスファターゼに関しては，そのようなアッセイは，培養標的細胞を化合物に暴露し，（ａ）細胞溶解物を生化学的に分析して，リン酸化された蛋白質のレベルおよび／または種類を評価する；または（ｂ）試験物質に暴露されていない対照細胞と比較して，処理細胞における発現型のまたは機能的変化を評点することを含む。
【０３８１】
シグナル伝達レセプターの天然のリガンドの模倣体を同定または評価する際には，細胞を本発明の化合物に暴露し，天然のリガンドにのみ暴露された正対照，および化合物にも天然のリガンドにも暴露されていない負対照と比較する。天然のリガンドの非存在下で基底レベルでリン酸化されることが知られているレセプター，例えばインスリンレセプターについては，アッセイはリガンドの非存在下で行うことができる。リガンド誘導性シグナル伝達の阻害剤または促進剤を同定または評価する際には，細胞を天然のリガンドの存在下で本発明の化合物に暴露し，本発明の化合物に暴露されていない対照と比較する。
【０３８２】
以下に記載されるアッセイは，本発明の化合物がホスファターゼ活性を阻害する能力を評価する一次スクリーニングとして用いることができる。また，アッセイを用いて，ある範囲の濃度，例えば１００μＭ−１ｐＭの範囲を試験し，リン酸化またはシグナル伝達の量が対照と比較して５０％減少するか増加する濃度（ＩＣ50）を計算することにより，化合物の相対的効力を評価することができる。
【０３８３】
生化学的アッセイ
１つの態様においては，シグナル伝達の間にチロシン残基においてリン酸化または脱リン酸化される基質分子を有する標的細胞を本発明の化合物および放射性標識したリン酸に暴露し，その後，これを溶解して目的とする基質を含む細胞内容物を放出させる。基質は，ドデシルリン酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）技術を一次元または二次元で用いて細胞溶解物の蛋白質成分を分離し，Ｘ線フィルムに暴露してリン酸化された蛋白質の存在を検出することにより分析することができる。放射性標識を用いない同様の手法においては，ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した蛋白質成分をニトロセルロース膜に移し，抗ホスホチロシン（抗ｐＴｙｒ）抗体を用いてｐＴｙｒの存在を検出する。あるいは，細胞溶解物を固体支持体に結合した基質特異的結合抗体とともにインキュベートすることにより目的とする基質を最初に単離し，次に非結合細胞成分を洗い流し，抗ｐＴｙｒ抗体により固体支持体上のｐＴｙｒの存在または非存在を評価することが好ましい。この好ましい方法は，自動化ロボットシステムによりマイクロタイタープレートフォーマットで容易に行うことができ，このことにより，大量の試料を適当な短い時間枠で試験することができる。
【０３８４】
抗ｐＴｙｒ抗体は，放射性物質で標識することにより検出することができ，これはオートラジオグラフィーによるその検出を容易にする。あるいは，抗ｐＴｙｒ抗体を酵素，例えば西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲート化させ，次にその酵素の適当な基質を加えることにより検出する。基質の選択は当業者には明らかである。さらに別の方法は，ｐＴｙｒ抗体を認識する二次抗体と反応させることにより抗ｐＴｙｒ抗体を検出することを含む。この二次抗体は，放射性物質または先に記載した酵素で標識する。当該技術分野において知られる，抗体を検出する他の任意の方法を用いることができる。
【０３８５】
上述の方法はまた，シグナル伝達基質分子を含む細胞溶解物およびホスファターゼが本発明の化合物およびキナーゼと混合されている無細胞系において用いることもできる。基質は，アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を加えてキナーゼ反応を開始することによりリン酸化される。化合物の活性を評価するためには，反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ手法により分析することができ，またはこれを固体支持体に結合した基質−特異的結合抗体に加えて，分離されたまたは捕捉された基質について上述した検出方法を実施して，ｐＴｙｒの存在または非存在を評価することができる。結果を化合物を加えない反応混合物から得られた結果と比較する。無細胞系には，天然のリガンドまたはその種類についての知識は必要ではない。例えば，Ｐｏｓｎｅｒ  ｅｔ．ａｌ，（米国特許５，１５５，０３１）は，基質としてインスリンレセプターを，標的細胞としてラット脂肪細胞を用いて，過バナジン酸がＰＴＰ活性を阻害する能力を示すことを記載する。Ｂｕｒｋｅ  ｅｔ．ａｌ．（１９９４，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２０４：１２９−１３４）は，自己リン酸化インスリンレセプターおよび組換えＰＴＰ１Ｂを用いてホスホチロシル模倣体の阻害的活性を評価することを記載する。
【０３８６】
基質蛋白質のリン酸化または脱リン酸化を測定することに加えて，第２のメッセンジャーの産生の活性化または調節，細胞のイオンレベルの変化，シグナリング分子の会合，解離または移動，遺伝子または特異的遺伝子の転写または翻訳の誘導をモニターすることができる。これらの生化学的アッセイは，これらの目的のために開発された慣用の手法を用いて行うことができる。
【０３８７】
生物学的アッセイ
本発明の化合物がシグナル伝達を制御するＰＴＰの活性を調節する能力はまた，リガンド結合に関連する形態学的または機能的変化を評点することにより測定することができる。当該技術分野において知られる任意の定性的または定量的手法を適用して，シグナリング経路においてホスファターゼの制御下にある細胞プロセスを観察および測定することができる。そのような細胞プロセスには，限定されないが，同化および異化プロセス，細胞増殖，細胞分化，細胞接着，細胞移動および細胞死が含まれる。
【０３８８】
バナジン酸のホスファターゼ阻害剤としての種々の生物学的効果を研究するために用いられてきた手法を，本発明の化合物について用いるために適合させることができる。例えば，バナジン酸は，ラット脂肪細胞においてグルコースおよびグルコース類似体のインスリン感受性促進性輸送システムを活性化することが示されている（Ｄｕｂｙａｋ  ｅｔ．ａｌ．，１９８０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５６：５３０６−５３１２）。本発明の化合物の活性は，化合物に暴露したラット脂肪細胞におけるグルコース類似体，例えば２−デオキシ−3Ｈ−グルコースの輸送の速度の増加を測定することにより評価することができる。バナジン酸はまた，インスリンがラット脂肪細胞におけるグルコース酸化に及ぼす影響を模倣する（Ｓｈｅｃｈｔｅｒ  ｅｔ．ａｌ．，１９８０，Ｎａｔｕｒｅ，２８４：５５６−５５８）。本発明の化合物は，14Ｃ−グルコースの14ＣＯ2への変換を測定することにより，グルコース酸化の刺激について試験することができる。さらに，ナトリウムオルトバナジン酸がエリスロポエチン媒介性細胞増殖に及ぼす影響は，ＤＮＡ合成の間のトリチル化チミジンの取り込みにより評価して，ＤＮＡ含量に基づく細胞サイクル分析により評価されている（Ｓｐｉｖａｋ  ｅｔ．ａｌ．，１９９２，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２０：５００−５０４）。同様に，細胞増殖において役割を果たすホスファターゼに対する本発明の化合物の活性は，細胞サイクル分析により評価することができる。
【０３８９】
本発明の化合物の活性はまた，シグナル伝達の機能不全により引き起こされるかこれに関連する疾患の実験モデルを用いて動物において評価することができる。例えば，本発明の化合物の活性は，非肥満性糖尿病マウス（Ｌｕｎｄ  ｅｔ．ａｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ，３４５：７２７−７２９），ＢＢＷｉｓｔａｒラットおよびストレプトゾトシン誘導性糖尿病ラット（Ｓｏｌｏｍｏｎ  ｅｔ．ａｌ．，１９８９，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，２９７：３７２−３７６）において，インスリンレセプターシグナル伝達に及ぼす化合物の影響について試験することができる。ホスファターゼはシグナル伝達の機能不全において重要な役割を果たし，細胞トランスフォーメーションにつながりうるため，化合物の活性は，動物発癌性実験において評価することもできる。例えば，オカダイン酸（ホスファターゼ阻害剤）は，マウス皮膚において腫瘍形成を促進することが示されている（Ｓｕｇａｎｕｍａ  ｅｔ．ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８５：１７６８−１７７１）。
【０３９０】
これらの細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータを用いて，ヒトにおいて用いるためのある範囲の投与量を処方することができる。本発明の化合物の投与量は，毒性がほとんどまたは全くない循環濃度の範囲内でなければならない。投与量は，用いられる投与量の形態および投与経路に依存して，この範囲内で様々でありうる。
【０３９１】
ホスホチロシン酵素結合イムノソルベントアッセイ
このアッセイを用いて，本発明の化合物がインスリンレセプター（ＩＲ）上のホスホチロシン（ｐＴｙｒ）残基の脱リン酸化を阻害する能力を試験することができる。当業者は，異なる標的細胞および結合抗体を用いることにより，他の基質分子，例えば血小板由来成長因子レセプターをこのアッセイにおいて用いることができることを認識するであろう。アッセイにおいて異なる基質分子を用いることにより，異なる蛋白質チロシン酵素に対する本発明の化合物の活性を評価することができる。ＩＲの場合，内因性キナーゼ活性はインスリン結合がない場合であっても低いレベルで活性がある。したがって，ＩＲのリン酸化を刺激するためにはインスリンは必要ではない。すなわち，化合物に暴露した後，細胞溶解物を調製し，抗インスリンレセプター抗体で被覆したマイクロタイタープレートに加えることができる。抗ｐＴｙｒ抗体および酵素結合二次抗体を用いて捕捉されたインスリンレセプターのリン酸化のレベルを検出する。
【０３９２】
化合物−ＰＴＰのＩＣ５０を決定するためのアッセイ方法
本発明の種々の化合物の活性のレベルおよび１またはそれ以上のＰＴＰに及ぼす影響を決定するためには，以下のインビトロアッセイ方法が好ましい。当該技術分野においてよく知られる手法を用いて，任意のＰＴＰについて同様のアッセイを設計することができる。
【０３９３】
本明細書に記載される触媒的アッセイは，９６−ウエルフォーマットで行う。一般的方法は，最初に，広範囲の緩衝液ｐＨにわたってイオン強度の変動を最少にした３成分緩衝液系を用いて，ＰＴＰの最適ｐＨを決定する。次に，各特異的基質−ＰＴＰ系についてミカエリス−メンテン定数，すなわちＫｍを決定する。次にこのＫｍ値を化合物スクリーニングの基質反応濃度として用いる。最後に，試験ＰＴＰを種々の濃度の化合物に１５分間暴露し，基質と１０分間反応させる。結果はパーセント阻害対化合物濃度としてプロットし，プロットの内挿からＩＣ50を求める。
【０３９４】
以下の材料および試薬を用いた。
１．特に示さない限り，アッセイ緩衝液をすべてのアッセイ溶液の溶媒として用いた。
成分                                            濃度
アセテート（Ｆｉｓｈｅｒ                        １００ｍＭ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａ３８，５００）
ビス−ｔｒｉｓ（ＳｉｇｍａＢ−７５３５）              ５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ（Ｆｉｓｈｅｒ                            ５０ｍＭ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＢＰ１５２−５）
グリセロール（Ｆｉｓｈｅｒ                        １０％（ｖ／ｖ）
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＢＰ２２９−１）
＊ＤＴＴ使用直前に１ｍＭを加える
２．９６ウエルイージーウォッシュプレート（Ｃｏｓｔａｒ３３６９）
３．ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ７３８−３７９）
４．フルオレセインジホスフェート（ＦＤＰ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｆ−２９９９）
５．０．２２μねじ蓋濾過システム５００ｍｌ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳＣＧＰＵ０５ＲＥ）
６．１０Ｎ  ＮａＯＨ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＳＳ２５５−１）
７．１０Ｎ  ＨＣｌ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａ１４４−５００）
８．化合物は，ＤＭＳＯ（ＳｉｇｍａＤ−５８７９）に５または１０ｍＭ濃度で溶解し，小さいアリコートで−２０℃で保存した。
【０３９５】
方法
すべてのアッセイは，ｐＮＰＰまたはＦＤＰを基質として用いて行う。用いた各ＰＴＰについて最適ｐＨを決定する。
【０３９６】
ＰＴＰアッセイ
ＰＴＰａｓｅ活性は，適当な濃度のｐＮＰＰまたはＦＤＰを基質として含む１００μｌの反応混合物中で２５℃でアッセイする。反応は，ＰＴＰを加えることにより開始し，１０分後に５０μｌの１Ｎ  ＮａＯＨを加えることにより停止する。基質の非酵素的加水分解は，酵素を加えない対照を測定することにより補正する。生成したｐ−ニトロフェノールの量は，４１０ｎｍの吸収から決定する。速度論的パラメータＫｍを決定するためには，種々の基質濃度で初速度を測定し，データをミカエリス等式
速度＝（Ｖｍａｘ×［Ｓ］）／（Ｋｍ＋［Ｓ］）
［Ｓ］＝基質反応濃度
に適合させる。
【０３９７】
阻害実験
化合物がＰＴＰに及ぼす影響は，２５℃でｐＮＰＰまたはＦＤＰを基質として用いて評価する。ＰＴＰを種々の濃度の化合物とともに１５分間プレインキュベートする。次に基質を固定濃度（通常は先に計算されたＫｍと等しい）で加える。１０分後，ＮａＯＨを加えて反応を停止する。ｐＮＰＰの加水分解は，Ｂｉｏｔｅｋ  Ｐｏｗｅｒｗａｖｅ  ２００マイクロプレートスキャニング分光光度計で４１０ｎｍで追跡する。パーセント阻害は，以下のように計算する：
パーセント阻害＝［（対照シグナル−化合物シグナル）／対照シグナル］ｘ１００％
次に，パーセント阻害対化合物濃度のプロットを内挿することによりＩＣ５０を決定する。
【０３９８】
細菌ＧＳＴ−ＰＴＰ融合蛋白質発現のために設計したプラスミドは，ＰＣＲ生成ヒトＰＴＰフラグメントをｐＧＥＸベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）中に挿入することにより作成する。次に，これらの構築物のいくつかを用いて，Ｓｆ−９昆虫細胞における発現用にホスファターゼをｐＦａｓｔＢａｃ−１中にサブクローニングする。ＰＴＰ遺伝子の最初の増幅に用いたオリゴヌクレオチドは以下に示される。ｃＤＮＡｓは，Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入したＲＮＡで，Ｇｉｌｂｏ  ＢＲＬ  ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔプレ増幅システムを用いて調製する。
【０３９９】
結論
当業者は，本発明は，その目的を実施し，記載される結果および利点，ならびに本明細書に固有のものを得るのによく適合していることを容易に理解するであろう。本明細書に記載される分子複合体および方法，手順，処理，分子，特定の化合物は，現在のところ好ましい態様の代表的なものであり，例示的なものであって，本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者は，本発明の範囲および精神から逸脱することなく，本明細書に開示される本発明に対して種々の置換および改変をなすことができることを容易に理解するであろう。
【０４００】
本明細書において言及されるすべての特許および刊行物は，本発明の属する技術分野の技術者のレベルを示す。すべての特許および刊行物は，それぞれの刊行物が特定的に個々に本明細書の一部としてここに引用されることと同じ程度に，本明細書の一部として引用される。
【０４０１】
本明細書に例示的に記載されている発明は，本明細書に特定的に開示されていない任意の要素または限定なしでも適切に実施することができる。すなわち，例えば，本明細書における各例において，"・・・を含む"，"・・・から本質的になる"および"・・・からなる"との用語は，他の２つのいずれかと置き換えることができる。本明細書において用いた用語および表現は，説明の用語として用いるものであり，限定ではない。そのような用語および表現の使用においては，示されかつ記載されている特徴またはその一部の等価物を排除することを意図するものではなく，特許請求の範囲に記載される本発明の範囲中で種々の変更が可能であることが理解される。すなわち，好ましい態様および任意の特徴により本発明を特定的に開示してきたが，当業者には本明細書に記載される概念の変更および変種が可能であり，そのような変更および変種も特許請求の範囲に定義される本発明の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。
【０４０２】
さらに，発明の特徴および局面がマーカッシュグループの用語で記載されている場合，当業者は，本発明が，マーカッシュグループのメンバーの個々のメンバーまたはサブグループに関してもまた記載されていることを認識するであろう。例えば，Ｘが，臭素，塩素およびヨウ素からなる群より選択されるとして記載されている場合，Ｘが臭素である特許請求の範囲およびＸが臭素および塩素である特許請求の範囲も完全に記載されている。
【０４０３】
遺伝コードの縮重の観点から，核酸の他の組み合わせもまた本明細書のペプチドおよび蛋白質をコードする。例えば，ＧＣＴ，ＧＣＣ，ＧＣＡ，ＧＣＧの４つの核酸配列はすべてアミノ酸アラニンをコードする。したがって，あるアミノ酸について平均で３つのコドンが存在し，１００アミノ酸の長さのポリペプチドは平均で３100，すなわち５ｘ１０47種類の核酸配列によりコードされるであろう。すなわち，日常的な方法を用いて過度の実験なしに，核酸配列を改変して第１の核酸配列によりコードされるものと同じポリペプチドをコードする第２の核酸配列を形成することができる。すなわち，特許請求の範囲に記載されるペプチドおよび蛋白質をコードするすべての可能な核酸もまた，コドン使用，特にヒトにおいて好ましいものを完全に考慮してこれらがすべて書き出されているように，本明細書に完全に記載されている。さらに，ポリペプチドの有意な活性が変更しない配列の領域内において，ポリペプチドのアミノ酸配列，またはそのようなポリペプチドをコードする対応する核酸配列の変更が生ずるよう設計しまたは選択することができる。例えば，ポリペプチドの活性部位と離れたβターン中で，アミノ酸変化を生じさせることができる。また，欠失（例えば活性部位に影響を与えないポリペプチドのセグメントまたはそのようなポリペプチドをコードする対応する核酸配列を除去する）および付加（例えば，活性部位の機能に影響を与えずに，ポリペプチド配列により多くのアミノ酸を付加する，例えばＧＳＴ融合蛋白質を形成する，または活性部位の機能に影響を与えずにそのようなポリペプチドをコードする対応する核酸配列に付加する）もまた本発明の範囲内である。ポリペプチドに対するそのような変更は，当業者が日常的な方法を用いて過度の実験なしに行うことができる。すなわち，本発明のペプチドまたは蛋白質の有意な活性に影響を与えないと容易に決定することができるすべての可能な核酸および／またはアミノ酸配列もまた本明細書に完全に記載されている。
【０４０４】
本明細書においては，本発明を広くかつ一般的に記載している。一般的開示に含まれるより狭い種および亜属のそれぞれのグループもまた本発明の一部を形成する。これには，除かれたものが具体的に記載されているか否かにかかわらず，属から任意の主題を除く「ただし・・・」またはネガティブ限定を含む発明の一般的記載が含まれる。
【０４０５】
他の態様は以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【０４０６】
【図１】図１は，ヒト蛋白質ホスファターゼＳＧＰ０３７（配列番号１）のヌクレオチド配列を示す。
【図２】図２は，配列番号１によりコードされるヒト蛋白質ホスファターゼＳＧＰ０３７のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図１】
2005509418.tif 000009
【図２】
2005509418.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成16年9月6日(2004.9.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスファターゼポリペプチドをコードする，単離された，濃縮された，または精製された核酸分子であって，前記核酸分子は，
（ａ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする；
（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の相補体である；
（ｃ）ストリンジェントな条件下で（ａ）のヌクレオチド分子にハイブリダイズし，かつホスファターゼポリペプチドをコードする；
（ｄ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするが，ただし，前記ポリペプチドは，Ｎ末端ドメイン，Ｃ末端触媒ドメイン，触媒ドメイン，Ｃ末端ドメイン，コイルドコイル構造領域，プロリンリッチ領域，スペーサー領域およびＣ末端テールの全部ではないが１またはそれ以上を欠失しており；または
（ｅ）（ｄ）のヌクレオチド配列の相補体である，
のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする核酸分子。
【請求項２】
宿主細胞において転写を開始させるのに有効なベクターまたはプロモーターをさらに含む，請求項１記載の核酸分子。
【請求項３】
前記核酸分子が，哺乳動物から単離された，濃縮された，または精製されたものである，請求項１記載の核酸分子。
【請求項４】
前記哺乳動物がヒトである，請求項３記載の核酸分子。
【請求項５】
ストリンジェントな条件下で配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するホスファターゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する核酸を含む，請求項１記載の核酸分子。
【請求項６】
単離され，濃縮され，または精製されたホスファターゼポリペプチドであって，
（ａ）配列番号２に記載される配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列であって，ただし，ポリペプチドは，Ｎ末端ドメイン，Ｃ末端触媒ドメイン，触媒ドメイン，Ｃ末端ドメイン，コイルドコイル構造領域，プロリンリッチ領域，スペーサー領域およびＣ末端テイルからなる群より選択されるドメインの全部ではないが１またはそれ以上を欠失しているアミノ酸配列，
を含むポリペプチド。
【請求項７】
前記ポリペプチドが，哺乳動物から単離され，精製され，または濃縮されたものである，請求項６記載のホスファターゼポリペプチド。
【請求項８】
前記哺乳動物がヒトである，請求項７記載のホスファターゼポリペプチド。
【請求項９】
ホスファターゼポリペプチドまたは前記ポリペプチドのドメインに対して特異的結合親和性を有する抗体または抗体フラグメントであって，前記ポリペプチドは，配列番号２に記載されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする抗体または抗体フラグメント。
【請求項１０】
請求項９記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項１１】
請求項６記載のポリペプチドに結合する抗体および負対照抗体を含むキット。
【請求項１２】
ホスファターゼポリペプチドの活性を調節する物質を同定する方法であって，
（ａ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列と実質的に同一のホスファターゼポリペプチドを試験物質と接触させ；
（ｂ）前記ポリペプチドの活性を測定し；そして
（ｃ）前記物質が前記ポリペプチドの活性を調節するか否かを判定する，
の各工程を含む方法。
【請求項１３】
細胞においてホスファターゼポリペプチドの活性を調節する物質を同定する方法であって，
（ａ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列と実質的に同一の配列を有するホスファターゼポリペプチドを発現させ；
（ｂ）前記細胞に試験物質を加え；そして
（ｃ）細胞表現型または前記ポリペプチドと天然の結合パートナーとの間の相互作用の変化をモニターする，
の各工程を含む方法。
【請求項１４】
配列番号２に記載されるアミノ酸配列と実質的に同一の配列を有するホスファターゼの活性を調節する物質を含む、疾病または疾患を治療するための医薬組成物。
【請求項１５】
前記疾病または疾患が，癌，免疫関連疾病および疾患，心臓血管疾病，脳またはニューロン関連疾病，代謝性疾患および炎症性疾患からなる群より選択される，請求項１４記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記疾病または疾患が，組織の癌；血液または造血細胞起源の癌；乳，結腸，肺，前立腺，子宮頚部，脳，卵巣，膀胱または腎臓の癌からなる群より選択される，請求項１５記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記疾病または疾患が，中枢神経系または末梢神経系疾病，片頭痛；痛み；性的機能不全；気分障害；注意障害；認識障害；低血圧症；高血圧症；精神病性疾患；神経性疾患および運動異常症からなる群より選択される，請求項１５記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記疾病または疾患が，炎症性疾患，例えば慢性関節リウマチ，慢性炎症性腸疾病，慢性炎症性骨盤疾病，多発性硬化症，ぜん息，変形性関節症，乾癬，アテローム性動脈硬化症，鼻炎，自己免疫，および臓器移植拒絶からなる群より選択される，請求項１５記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記物質がインビトロでホスファターゼ活性を調節する，請求項１５記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記物質がホスファターゼ阻害剤である，請求項１９記載の医薬組成物。
【請求項２１】
疾病または疾患の診断道具として試料中においてホスファターゼポリペプチドを検出する方法であって，
（ａ）前記試料を，ハイブリダイゼーションアッセイ条件下で配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するホスファターゼポリペプチドの核酸標的領域とハイブリダイズする核酸プローブと接触させ，前記プローブは，核酸配列，そのフラグメント，または前記配列およびフラグメントの相補体を含み；そして
（ｂ）標的領域：プローブハイブリッドの存在または量を前記疾病または疾患の指標として検出する，
の各工程を含む方法。
【請求項２２】
前記疾病または疾患が，癌，免疫関連疾病および疾患，心臓血管疾病，脳またはニューロン関連疾病，代謝性疾患および炎症性疾患からなる群より選択される，請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記疾病または疾患が，組織の癌；血液または造血細胞起源の癌；乳，結腸，肺，前立腺，子宮頚部，脳，卵巣，膀胱または腎臓の癌からなる群より選択される，請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記疾病または疾患が，中枢神経系または末梢神経系疾病，片頭痛，痛み；性的機能不全；気分障害；注意障害；認識障害；低血圧症；高血圧症；精神病性疾患；神経性疾患；および運動異常症からなる群より選択される，請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
前記疾病または疾患が，炎症性疾患，例えば慢性関節リウマチ，慢性炎症性腸疾病，慢性炎症性骨盤疾病，多発性硬化症，ぜん息，変形性関節症，乾癬，アテローム性動脈硬化症，鼻炎，自己免疫，および臓器移植拒絶からなる群より選択される，請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
配列番号２の配列を有するホスファターゼポリペプチドのドメインをコードする核酸分子を含む，単離された，濃縮されたまたは精製された核酸分子。
【請求項２７】
配列番号２に記載されるポリペプチドと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む，ホスファターゼポリペプチドをコードする単離された，濃縮されたまたは精製された核酸分子。
【請求項２８】
分子が，配列番号１の配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を含む，請求項１記載の単離された，濃縮されたまたは精製された核酸分子。
【請求項２９】
配列番号２のポリペプチドをコードする核酸配列の約１０−３０個の連続するヌクレオチド塩基から本質的になる，単離された，濃縮されたまたは精製された核酸分子。
【請求項３０】
配列番号１の核酸配列の約１０−３０個の連続するヌクレオチド塩基から本質的になる，請求項２９記載の単離された，濃縮されたまたは精製された核酸分子。
【請求項３１】
請求項１記載の核酸分子を含む組換え細胞。
【請求項３２】
請求項１記載の核酸分子を含むベクター。                                                                
【国際調査報告】
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