(57)【要約】ヒトＫＤＲに対する特異性を有するマウスモノクローナル抗体から得られる少なくとも１つのＣＤＲを含有する抗体分子が開示される。少なくとも１つのＣＤＲはハイブリッドＣＤＲである、ＣＤＲ移植抗体も開示される。さらに、抗体分子の鎖をコードするＤＮＡ配列、ベクター、形質転換宿主細胞、およびＶＥＧＦおよび／またはＫＤＲが関与している疾患の治療における抗体分子の使用が開示される。
2005516590.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
可変ドメインが、ＣＤＲＨ１として図１のＨ１に示す配列（配列番号１）、ＣＤＲＨ２として図１のＨ２に示す配列（配列番号２）、またはＣＤＲＨ３として図１のＨ３に示す配列（配列番号３）を有するＣＤＲを含有する、重鎖を含む、ヒトＫＤＲに特異性を有する抗体分子。
【請求項２】
可変ドメインが、ＣＤＲＬ１として図１のＬ１に示す配列（配列番号４）、ＣＤＲＬ２として図１のＬ２に示す配列（配列番号５）、またはＣＤＲＬ３として図１のＬ３に示す配列（配列番号６）を有するＣＤＲを含有する、軽鎖を含む、ＫＤＲに特異性を有する抗体分子。
【請求項３】
可変ドメインが、ＣＤＲＨ１として配列番号１に示す配列、ＣＤＲＨ２として配列番号２に示す配列、またはＣＤＲＨ３として配列番号３に示す配列を有するＣＤＲを含有する、重鎖と、
可変ドメインが、ＣＤＲＬ１として配列番号４に示す配列、ＣＤＲＬ２として配列番号５に示す配列、またはＣＤＲＬ３として配列番号６に示す配列を有するＣＤＲを含有する、軽鎖と
を含む、請求項１または請求項２の抗体分子。
【請求項４】
ＣＤＲＨ１として配列番号１、ＣＤＲＨ２として配列番号２、ＣＤＲＨ３として配列番号３、ＣＤＲＬ１として配列番号４、ＣＤＲＬ２として配列番号５、およびＣＤＲＬ３として配列番号６の配列を有する、請求項３の抗体分子。
【請求項５】
ＣＤＲ移植抗体分子である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体分子。
【請求項６】
可変ドメインは、ヒトアクセプターフレームワークと非ヒトドナーＣＤＲとを含有する、請求項５の抗体分子。
【請求項７】
重鎖の可変ドメインのヒトアクセプターフレームワーク領域は、ヒト生殖細胞系の第３群フレームワーク配列に基づき、７７位と９３位に非ヒトドナー残基を含有する、請求項６の抗体分子。
【請求項８】
軽鎖の可変ドメインのヒトアクセプターフレームワーク領域は、ヒト生殖細胞系の第１群フレームワーク配列に基づき、３６、４４、６０、６６、６９、７０および７１位に非ヒトドナー残基を含有する、請求項６または請求項７の抗体分子。
【請求項９】
重鎖可変領域ｇＨ３（配列番号１５）と軽鎖可変領域ｇＬ３（配列番号１６）とを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体分子。
【請求項１０】
Ｆａｂ断片である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体分子。
【請求項１１】
配列番号１１に示す配列を有する軽鎖と、配列番号１２に示す配列を有する重鎖とを含有するＦａｂ断片である、請求項１０の抗体分子。
【請求項１２】
エフェクターまたはレポーター分子の結合を可能にするような１つ以上のアミノ酸を、その重鎖のＣ末端に有する修飾Ｆａｂ断片である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体分子。
【請求項１３】
追加のアミノ酸が、エフェクターまたはレポーター分子が結合できる１つまたは２つのシステイン残基を含有する修飾ヒンジ領域を形成している、請求項１２の抗体分子。
【請求項１４】
配列番号１１に示す配列を有する軽鎖と、配列番号１２に示す配列を有する重鎖とを含む修飾ＦａｂまたはジＦａｂ断片である、請求項１２に記載の抗体分子。
【請求項１５】
配列番号１１に示す配列を含む軽鎖を有する、ヒトＫＤＲに特異性を有する抗体分子。
【請求項１６】
配列番号５７に示す配列を含む重鎖を有する、ヒトＫＤＲに特異性を有する抗体分子。
【請求項１７】
配列番号１２に示す配列を含有する軽鎖と、配列番号５７に示す配列を含有する重鎖とを含む、ヒトＫＤＲに特異性を有する抗体分子。
【請求項１８】
ＫＤＲに対する改良された親和性を有する、配列番号〜１７のいずれか１項に記載の抗体分子の変種。
【請求項１９】
親和性成熟プロトコールにより得られる、請求項１８の変種。
【請求項２０】
マウス抗ＫＤＲモノクローナル抗体ＶＲ１６５である、請求項１〜４にいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２１】
請求項２６のモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖可変ドメインを含むキメラ抗体分子である、請求項１〜４にいずれか１項に記載の抗体分子。
【請求項２２】
抗体分子の重鎖のＣ末端にまたはその近くのアミノ酸に共有結合したエフェクターまたはレポーター分子を有する、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の抗体分子を含む化合物。
【請求項２３】
エフェクター分子を含む、請求項２２の化合物。
【請求項２４】
エフェクター分子は１つ以上のポリマーを含む、請求項２３の化合物。
【請求項２５】
１つ以上のポリマーは、任意に置換された直鎖または分岐鎖ポリアルキレン、ポリアルケニレンもしくはポリオキシアルキレンポリマー、または分岐鎖もしくは非分岐鎖ポリサッカライドである、請求項２４の化合物。
【請求項２６】
１つ以上のポリマーはメトキシポリ（エチレングリコール）である、請求項２５の化合物。
【請求項２７】
重鎖のＣ末端の１つのシステイン残基に結合した、リジル−マレイミドまたはリジルビス−マレイミド基を有する、請求項１２の抗体分子を含む化合物であって、
リジル残基の各アミノ基は、分子量約２０，０００Ｄａのメトキシポリ（エチレングリコール）残基をそれに共有結合している、上記化合物。
【請求項２８】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の抗体分子の重鎖および／または軽鎖をコードするＤＮＡ配列。
【請求項２９】
請求項２７のＤＮＡ配列を含有するクローニングベクターまたは発現ベクター。
【請求項３０】
請求項２７のＤＮＡ配列を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクター。
【請求項３１】
ｐＴＴＯＤ（ＣＤＰ７９１）である請求項３０の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクター。
【請求項３２】
請求項２９〜３１のいずれか１項に記載のベクターを用いて形質転換された宿主細胞。
【請求項３３】
請求項３２の宿主細胞を培養し、抗体分子を単離することを含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の抗体分子の産生方法。
【請求項３４】
請求項２９〜３１のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターを含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を培養し、抗体分子を単離することを含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の抗体分子の産生方法。
【請求項３５】
抗体分子はペリプラスムに標的化される、請求項３４の方法。
【請求項３６】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の抗体分子または請求項２３〜２７のいずれか１項に記載の化合物を含む、治療用または診断用組成物。
【請求項３７】
ＶＥＧＦおよび／またはＫＤＲが関与している病態を治療するのに使用される、ヒトＫＤＲに特異性を有する、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の抗体分子、または請求項２３〜２７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３８】
炎症、乾癬、リウマチ様関節炎および腫瘍増殖もしくは転移を治療するのに使用される、請求項３７の抗体分子または化合物。
【請求項３９】
ＶＥＧＦおよび／またはＫＤＲが関与している病態を治療するための薬剤を製造するための、ヒトＫＤＲに対する特異性を有する、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の抗体分子、または請求項２３〜２７のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項４０】
病態は、炎症、乾癬、リウマチ様関節炎および腫瘍増殖もしくは転移である、請求項３９の使用。
【請求項４１】
図８に示すベクターｐＴＴＯＤ（ＣＤＰ７９１）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ヒトキナーゼ挿入ドメイン含有受容体（ＫＤＲ）の抗原決定基に対する特異性を有する抗体分子に関する。この抗体分子は、ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）より大きな親和力でＫＤＲに結合し、ＶＥＧＦとＫＤＲとの相互作用を妨害する。本発明はまた、抗体分子の治療的使用と抗体分子の産生方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、抗体分子に関する。抗体分子には、２つの重鎖と２つの軽鎖がある。各重鎖と各軽鎖はそのＮ末端に可変ドメインを有する。各可変ドメインは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）と、これと交互に位置する４つのフレームワーク領域（ＦＲ）とからなる。ＣＤＲは、抗体の抗原結合特異性を決定し、可変ドメインのフレームワーク領域上に存在する比較的短いペプチド配列である。可変ドメイン中の残基は従来、カバト（Ｋａｂａｔ）らが考案したシステムに従って番号付けがされている。このシステムは、カバト（Ｋａｂａｔ）ら、１９８７、「免疫学的興味のあるタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）」、米国健康福祉省（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、ＮＩＨ、アメリカ合衆国（以後、「カバト（Ｋａｂａｔ）ら（前述）」）に記載されている。特に明記しない場合は、本明細書においてこの番号付けシステムが使用される。
【０００３】
カバト（Ｋａｂａｔ）による残基の指定は、必ずしもアミノ酸残基の線状の番号付けと直接的に一致しない。実際の線状のアミノ酸配列は、基本的な可変ドメイン構造であるフレームワーク又はＣＤＲ何れかの、短縮、またはそれら構造要素への挿入に対応して、厳密なカバト（Ｋａｂａｔ）番号付けより、少ないかまたは多いアミノ酸を含む。残基の正しいカバト（Ｋａｂａｔ）による番号付けは、ある抗体について、その抗体の配列中の相同性を「標準」カバト（Ｋａｂａｔ）番号配列と残基について照合することにより決定される。
【０００４】
重鎖可変ドメインのＣＤＲは、カバト（Ｋａｂａｔ）の番号付けによると、残基３１〜３５（ＣＤＲＨ１）、残基５０〜６５（ＣＤＲＨ２）および残基９５〜１０２（ＣＤＲＨ３）に位置する。
軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、カバト（Ｋａｂａｔ）の番号付けによると、残基２４〜３４（ＣＤＲＬ１）、残基５０〜５６（ＣＤＲＬ２）および残基８９〜９７（ＣＤＲＬ３）に位置する。
【０００５】
ＣＤＲ移植抗体の構築は、ヨーロッパ特許出願ＥＰ−Ａ−０２３９４００号に記載されており、これは、長いオリゴヌクレオチドを使用する部位特異的突然変異の誘発により、マウスモノクローナル抗体（Ｍａｂ）のＣＤＲを、ヒト免疫グロブリンの可変ドメインのフレームワーク領域に移植する方法を開示している。
【０００６】
ＣＤＲ移植によるヒト化Ｍａｂについての初期の研究は、合成抗原（例えばＮＰ）を認識するＭａｂについて行われた。しかし、リゾチームを認識するマウスＭａｂとヒトＴ細胞上の抗原を認識するラットＭａｂがＣＤＲ移植によりヒト化された例が、それぞれベルホーエン（Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ）ら（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９、１５３４−１５３６、１９９８）とリーチマン（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ）ら（Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３−３２４）に記載されている。
【０００７】
リーチマン（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ）らは、ＣＤＲ単独の移転（カバト（Ｋａｂａｔ）（カバト（Ｋａｂａｔ）らについては前述した）とウー（Ｗｕ）ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ，１３２，２１１−２５０，１９７０）により記載されている）は、ＣＤＲ移植産物に充分な抗原結合活性を与えるのに充分ではないことを見いだした。ドナーのフレームワーク領域の残基と一致するように、多くのフレームワーク残基を変更しなければならないことが見いだされた。改変する必要があるフレームワーク残基を選択するための提唱された基準は、国際特許出願ＷＯ９０／０７８６１号に記載されている。
ボーハン（Ｖａｕｇｈａｎ）ら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６，５３５−５３９，１９９８）を含む、ＣＤＲ移植抗体を考察する多くの論評が公表されている。
【０００８】
ＶＥＧＦは、ＰＤＧＦとの構造類似性を有する２つの２３ｋＤサブユニットのホモダイマー糖タンパク質である。これは、脈管形成（新しい血管系の確立）において重要な発展的役割を有し、血管形成（既存の血管からの新しい血管の形成）に関与している。血管形成は、既存の血管からの毛細管内皮細胞の増殖、移行、および組織浸潤を伴なう。正常な生理学的プロセス、例えば胚成長、濾胞増殖（黄体形成を含む）および創傷治癒、において重要な役割を果たす以外に、血管形成は、炎症、乾癬、リウマチ様関節炎および腫瘍増殖と転移を含む多くの病状で生じる（フォークマン（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ）とクラグスブルン（Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ，Ｍ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５：４４２−４４７，１９８７）。例えば、腫瘍は、血管形成を介してあてられる血液の供給がなければ、あるサイズ以上に増殖できないと広く考えられている。
【０００９】
ＶＥＧＦは、内皮細胞に特異的な血管形成のインデューサーである点で、インビボの血管形成の可能なレギュレーターとされている他の因子とは異なる。
ｍＲＮＡの選択的スプライシングから生じる、ＶＥＧＦの５つの異なるモノマーアイソフォームが存在する。このアイソフォームには、２つの膜結合型（ＶＥＧＦ206 とＶＥＧＦ189）および３つの可溶性型（ＶＥＧＦ165、ＶＥＧＦ121、およびＶＥＧＦ145）がある。ヒト胎盤を除くすべての組織で、ＶＥＧＦ165 が最も豊富に存在するアイソフォームである。
【００１０】
ＶＥＧＦの作用は、２つの高親和性チミジンキナーゼ受容体である、ｆｍｓ様チミジンキナーゼ受容体（ＦＬＴ−１またはＶＥＧＦＲ−１、シブヤ（Ｓｈｉｂｕｙａ  Ｍ．）ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，５，５１９−５２４，１９９０）とＫＤＲ（またはＶＥＧＦＲ−２、ターモン（Ｔｅｒｍａｎ）ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，６，１６７７−１６８３，１９９１）との相互作用により媒介される。ＫＤＲとＦＬＴ−１の両方は、膜の両側にまたがる受容体であり、それぞれ細胞外リガンド結合領域に７つの免疫グロブリン様ドメイン、細胞内チロシンキナーゼドメイン、および膜貫通ドメインを含有する。膜貫通ドメインは、受容体をそれが発現される細胞の細胞膜に受容体を固定する役割を担う。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ＲＮＡレベルとタンパク質レベルの両方で、腫瘍内のＶＥＧＦとその受容体が過剰発現されているという報告がいくつかある（ドボラク（Ｄｖｏｒａｋ）ら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，２３７，９７，１９９９）。ＶＥＧＦの発現は低酸素に応答してアップレギュレートされるが、これはしばしば腫瘍内で起き、リガンド濃度の上昇は、その受容体の発現を誘導する。ヒト腫瘍中のＫＤＲ発現の上昇を示す研究例として、乳癌（ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）ら、Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．，２６，８６，１９９５）；結腸癌（タカハシ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５５，３９６４，１９９５）；腎癌（タカハシ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ）ら、ＢＢＲＣ  ２５７，８５５，１９９９）および消化管の腺癌（ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５３，４７２７、１９９３）がある。ＫＤＲに結合したＶＥＧＦを特異的に認識する抗体を使用するより最近の研究では、非小細胞肺癌におけるＶＥＧＦ／ＫＤＲ血管形成経路のアップレギュレーションが観察された（コウコウラキス（Ｋｏｕｋｏｕｒａｋｉｓ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６０，３０８８，２０００）。
【００１２】
多くの実験的証拠が、インビボでＶＥＧＦ活性と腫瘍血管形成とが因果関係を有することを証明している。キム（Ｋｉｍ）らは、抗ＶＥＧＦ中和Ｍａｂを担癌ヌードマウスに注入することで、腫瘍増殖が抑制されることを証明した（Ｎａｔｕｒｅ  ３６２，８４１，１９９３）。優性陰性マウスＫＤＲ（ＦＬＫ−１）のレトロウイルスでの発現もまた、マウスにおいて腫瘍増殖を阻害した（ミラウア（Ｍｉｌｌａｕｅｒ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６７，５７６，１９９３）。同様に、ＶＥＧＦアンチセンス（チェング（Ｃｈｅｎｇ）ら、ＰＮＡＳ，９３，８５０２，１９９６）、抗ＦＬＴ−１抗体（ウィッテ（Ｗｉｔｔｅ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔ．Ｒｅｖ．，１７，１５５，１９９８）、および可溶性ＦＬＴ−１の発現（ゴールドマン（Ｇｏｌｄｍａｎ）ら、ＰＮＡＳ，９５，８７９５，１９９８）のすべてが、マウスモデルで腫瘍増殖を阻害した。
【００１３】
いくつかの実験的証拠が、血管形成に関するＶＥＧＦの生物学的作用が主にＫＤＲ受容体により仲介されることを示唆している（総説については、ラリビー（Ｌａｒｒｉｖｅｅ）とカーサン（Ｋａｒｓａｎ）、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，５，４４７，２０００を参照）。
（１つのＶＥＧＦＲ型のみを発現する細胞株で）ＫＤＲ単独のＶＥＧＦ媒介活性化が、細胞増殖と移動を引き起こすのに充分であることが証明された（ワルテンバーガー（Ｗａｌｔｅｎｂｕｒｇｅｒ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，２６９８８，１９９４）。逆にＦＬＴ−１単独を活性化すると、細胞増殖は見られず、相反して細胞移動が観察された。
【００１４】
受容体選択的なＶＥＧＦ変異体を利用する実験により、ＫＤＲ連結反応が分裂促進因子活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）を活性化し、増殖、移動および血管透過性を引き起こすことが証明された（ケイト（Ｋｅｙｔ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，５６３８，１９９６）。ＦＬＴ−１選択的な変異体は、これらの測定法で不活性化であった。
ＫＤＲとの相互作用をブロックするがＦＬＴ−１との相互作用はブロックしない抗ＶＥＧＦ  Ｍａｂは、ＶＥＧＦ誘導性の血管透過性を阻害できたが、非ブロック性抗ＶＥＧＦ抗体は効果がなかった（ブレッケン（Ｂｒｅｋｋｅｎ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６０，５１１７，２０００）。
【００１５】
ハイブリドーマ技術によるマウスＶＥＧＦ受容体であるＦＬＫ−１に対するＭａｂの産生が記載されている（ＷＯ９４／１１４９９号）。これらは、ＶＥＧＦと受容体との相互作用をブロックすることにより、ＦＬＫ−１受容体活性化が阻害されることを証明した。受容体活性化のこの阻害は、いくつかのモデルでＶＥＧＦ誘導性血管形成を阻害するのに有効であった。さらにこの抗ＦＬＫ−１抗体は、いくつかのマウス異種移植片腫瘍を治療するのに有効であった。しかし、ＦＬＫ−１に結合するすべての抗体が、治療的効果に充分な親和力でＫＤＲに結合することはないであろう。
【００１６】
ＶＥＧＦ−ＫＤＲ結合はまた、ＰＩ３−キナーゼ−Ａｋｔキナーゼシグナル伝達経路のＫＤＲの媒介による活性化を介して新たに形成された血管のアポトーシスを阻害する（Ａｋｔキナーゼは、細胞の生存に関与するＰＩ３−キナーゼ経路の公知の下流のキナーゼである、ガーバー（Ｇｅｒｂｅｒ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，３０３３６，１９９８）。動物モデルもまた、ＶＥＧＦ−ＫＤＲ相互作用をブロックすることが、この抗アポトーシス応答を阻止する上で有効であることを証明した。
現在、ＫＤＲはＶＥＧＦの作用を媒介する最も重要な受容体であると考えられており、血管形成の促進と新血管の生存におけるその役割が一般的に認識されているようである。
【００１７】
従って、ＫＤＲに結合しＶＥＧＦによるその活性化をブロックすることができる抗体は、ＶＥＧＦおよび／またはＫＤＲが関与していると考えられている病態の治療において、治療的価値があるであろう。例えば、炎症、乾癬、リウマチ様関節炎、および腫瘍増殖の症例である。また、このような治療効果を達成するには、ＫＤＲ受容体との相互作用をブロックすることが最善であるとの強い主張がなされている。繰り返し使用でき、容易かつ効率的に産生できるそのような抗体分子に対するニーズがある。また、ＫＤＲに対して高親和性を有し、ヒトにおける免疫原性が低い抗体分子に対するニーズがある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
第１の態様において本発明は、可変ドメインが、ＣＤＲＨ１として図１のＨ１に示す配列（配列番号１）、ＣＤＲＨ２として図１のＨ２に示す配列（配列番号２）、またはＣＤＲＨ３として図１のＨ３に示す配列（配列番号３）を有するＣＤＲ（カバト（Ｋａｂａｔ）ら（前述）により規定されたもの）を含有する重鎖を含む、ＫＤＲに特異性を有する抗体分子を提供する。
本発明の第１の態様の抗体分子は、重鎖可変ドメインにＨ１、Ｈ２およびＨ３（配列番号１〜配列番号３）から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含有する。好ましくはこの抗体分子は、重鎖可変ドメインに少なくとも２つの、さらに好ましくは３つすべてのＣＤＲを含有する。
【００１９】
本発明の第２の態様において本発明は、可変ドメインが、ＣＤＲＬ１として図１のＬ１に示す配列（配列番号４）、ＣＤＲＬ２として図１のＬ２に示す配列（配列番号５）、またはＣＤＲＬ３として図１のＬ３に示す配列（配列番号６）を有するＣＤＲ（カバト（Ｋａｂａｔ）ら（前述）により規定されたもの）を含有する軽鎖を含む、ヒトＫＤＲに特異性を有する抗体分子を提供する。
本発明の第２の態様の抗体分子は、軽鎖可変ドメインにＬ１、Ｌ２およびＬ３（配列番号４〜配列番号６）から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含有する。好ましくはこの抗体分子は、軽鎖可変ドメインに少なくとも２つの、さらに好ましくは３つすべてのＣＤＲを含有する。
【００２０】
本発明の第１の態様と第２の態様の抗体分子は、好ましくはそれぞれ相補的軽鎖または相補的重鎖を有する。
好ましくは本発明の第１の態様と第２の態様の抗体分子は、可変ドメインが、ＣＤＲＨ１として図１のＨ１に示す配列（配列番号１）、ＣＤＲＨ２として図１のＨ２に示す配列（配列番号２）、またはＣＤＲＨ３として図１のＨ３に示す配列（配列番号３）を有するＣＤＲ（カバト（Ｋａｂａｔ）ら（前述）により規定されたもの）を含有する重鎖と、可変ドメインが、ＣＤＲＬ１として図１のＬ１に示す配列（配列番号４）、ＣＤＲＬ２として図１のＬ２に示す配列（配列番号５）、またはＣＤＲＬ３として図１のＬ３に示す配列（配列番号６）を有するＣＤＲ（カバト（Ｋａｂａｔ）ら（前述）により規定されたもの）を含有する軽鎖とを、含む。
【００２１】
上記の配列番号１〜６（図１）に示すＣＤＲは、マウスモノクローナル抗体ＶＲ１６５から得られる。本発明はまた、マウスモノクローナル抗体ＶＲ１６５を提供する。ＶＲ１６５抗体の可変ドメインの配列を、図２に示す（配列番号７と８）。ＶＲ１６５の軽鎖定常領域はカッパであり、重鎖定常領域はＩｇＧ２ａである。このマウス抗体を、以後「ドナー抗体」と呼ぶ。
【００２２】
第２の別の好適な実施態様において、本発明の第１および第２の態様の抗体は、キメラマウス／ヒト抗体分子であり、以後キメラＶＲ１６５抗体分子と呼ぶ。キメラＶＲ１６５抗体分子は、マウスＭａｂ  ＶＲ１６５の可変ドメイン（配列番号７と８）およびヒト定常ドメインを含む。好ましくはキメラＶＲ１６５抗体分子は、軽鎖中にヒトＣカッパドメイン（ヒーター（Ｈｉｅｔｅｒ）ら、Ｃｅｌｌ，２２，１９７−２０７，１９８０；ジーンバンク（ＧｅｎｅＢａｎｋ）受け入れ番号Ｊ００２４１）、および重鎖中にヒトガンマ４ドメイン（フラナガン（Ｆｌａｎａｇａｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ，３００，７０９−７１３，１９８２）を含む。
【００２３】
第３の別の好適な実施態様において、本発明の第１および第２の態様の抗体は、ＣＤＲ移植抗体分子である。本明細書において「ＣＤＲ移植抗体分子」という用語は、重鎖および／または軽鎖が、アクセプター抗体（例えば、ヒト抗体）の重鎖および／または軽鎖可変領域フレームワーク中に移植されたドナー抗体（例えば、マウスＭａｂ）からなる１つ以上のＣＤＲを含有する抗体分子を意味する。
そのようなＣＤＲ移植抗体は、好ましくは上記のヒトアクセプターフレームワーク領域ならびに１つ以上のドナーＣＤＲを有する可変ドメインを含有する。
【００２４】
ＣＤＲを移植する際、ＣＤＲを得るドナー抗体のクラス／タイプを考慮して適切なアクセプター可変領域フレームワーク配列を使用すればよく、このようなフレームワーク配列としては、マウス、霊長類およびヒトのフレームワーク領域を含む。本発明で使用されるヒトフレームワークの例は、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩ、ＥＵ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＬＡＹおよびＰＯＭである（カバト（Ｋａｂａｔ）ら（前述））。例えば、ＫＯＬとＮＥＷＭは重鎖のために使用することができ、ＲＥＩは軽鎖のために、そしてＥＵ、ＬＡＹおよびＰＯＭは、重鎖と軽鎖の両方に使用することができる。
【００２５】
重鎖の好適なフレームワーク領域は、図３に示すヒト生殖細胞系の第３群フレームワーク領域である（ＶＨ３−７  ＧＬ、配列番号９）。軽鎖の好適なフレームワーク領域は、図３に示すヒト生殖細胞系配列第３群フレームワーク領域である（Ａ３０  ＧＬ、配列番号１０）。
本発明のＣＤＲ移植抗体において、アクセプター抗体として、ドナー抗体鎖に相同的な鎖を有するものを使用することが好ましい。アクセプター重鎖および軽鎖は、必ずしも同じ抗体から得られる必要は無く、所望であれば、異なる鎖から得られるフレームワークを有する複合鎖を含むものでもよい。
【００２６】
また、本発明のＣＤＲ移植抗体においてフレームワーク領域は、アクセプター抗体のものと全く同じ配列を有する必要は無い。例えば、まれな配列を、そのアクセプター鎖のクラスまたはタイプでより頻繁に存在する残基に変えてもよい。あるいはアクセプターフレームワーク領域中の選択された残基を、ドナー抗体の同じ位置に見い出される残基に一致するように変えてもよい。そのような変更は、ドナー抗体の親和性を回復するために必要最小限にすべきである。変化させる必要があるアクセプターフレームワーク領域中の残基を選択するためのプロトコールは、ＷＯ９１／０９９６７号に記載されている。
【００２７】
本発明のＣＤＲ移植抗体分子において、アクセプター重鎖がヒト生殖細胞系の第３群フレームワーク領域（図３に示す）（配列番号９）を有する場合には、好ましくは重鎖のアクセプターフレームワーク領域は、１つ以上のドナーＣＤＲ以外に、７７および９３位（カバト（Ｋａｂａｔ）ら（前述）に従う）にドナー残基を有する。
本発明のＣＤＲ移植抗体分子において、アクセプター軽鎖がヒト第１群フレームワーク領域（図３に示す）（配列番号１０）を有する場合には、好ましくは軽鎖のアクセプターフレームワーク領域は、３６、４４、６０、６６、６９、７０および７１位（カバト（Ｋａｂａｔ）ら（前述）に従う）にドナー残基を有する。
ドナー残基は、ドナー抗体、すなわち元々ＣＤＲを得た抗体に由来する残基である。
【００２８】
本発明の抗体分子は、完全長重鎖と軽鎖とを有する完全な抗体分子；その断片、例えばＦａｂ、修飾Ｆａｂ、ジＦａｂ、ジ（修飾Ｆａｂ）、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ'）2、またはＦｖ断片；軽鎖または重鎖モノマーまたはダイマー；１本鎖抗体、例えば重鎖と軽鎖の可変ドメインがペプチドリンカーにより連結された１本鎖Ｆｖを含むことができる。同様に、重鎖と軽鎖の可変領域は、適宜他の抗体ドメインと組合せてもよい。
【００２９】
本発明の抗体分子は、好ましくはＦａｂ断片である。Ｆａｂ断片は、好ましくは配列番号１１（図４）に示す配列を有する軽鎖と、配列番号１２（図５）に示す配列を有する重鎖とを含有する。配列番号１１と配列番号１２に示すアミノ酸配列は、好ましくは、それぞれ配列番号１３と配列番号１４（図４と図５）に示すヌクレオチド配列によりコードされる。
【００３０】
また、本発明の抗体分子は、エフェクターまたはレポーター分子の結合を可能にするような１つ以上のアミノ酸の重鎖のＣ末端への付加により修飾された、修飾Ｆａｂ断片であってもよい。追加のアミノ酸は、好ましくはエフェクターまたはレポーター分子が結合される１つまたは２つのシステイン残基を含有する修飾ヒンジ領域を形成する。そのような修飾Ｆａｂ断片は、好ましくは配列番号１１に示す配列を有する軽鎖と、配列番号１２に示す配列を有する重鎖とを含有する。配列番号１１と配列番号１２に示すアミノ酸配列は、好ましくはそれぞれ配列番号１３と配列番号１４に示すヌクレオチド配列によりコードされる。
【００３１】
さらに、本発明の抗体分子は、Ｆａｂ重鎖の他の重鎖およびエフェクター若しくはレポーター分子への結合を可能にするような１つ以上のアミノ酸の各Ｆａｂ重鎖のＣ末端への付加により修飾された、ジ（修飾Ｆａｂ）断片である。追加のアミノ酸は、好ましくは他のＦａｂ、エフェクターまたはレポーター分子への結合のための、１つ、２つまたは３つのシステイン残基を含有する修飾ヒンジ領域を形成する。
【００３２】
好適なエフェクター基はポリマー分子であり、これは、インビボでのその半減期を長くするために、修飾Ｆａｂまたはジ（修飾Ｆａｂ）断片に結合される。
ポリマー分子は一般に、合成のまたは天然に存在するポリマー、例えば任意に置換された直鎖または分岐鎖ポリアルキレン、ポリアルケニレンもしくはポリオキシアルキレンポリマー、または分岐もしくは非分岐ポリサッカライド、例えばホモもしくはヘテロポリサッカライドである。
【００３３】
上記合成ポリマー上に存在し得る任意の置換基としては、１つ以上のヒドロキシ、メチルまたはメトキシ基がある。合成ポリマーの具体例には、任意に置換された直鎖または分岐鎖のポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）、またはこれらの誘導体、特に任意に置換されたポリ（エチレングリコール）例えばメトキシポリ（エチレングリコール）またはその誘導体がある。
【００３４】
具体的な天然に存在するポリマーには、乳糖、アミロース、デキストラン、グリコーゲンまたはこれらの誘導体がある。本明細書において「誘導体」とは、反応性誘導体、例えばチオール選択反応基、例えばマレイミドなどを含むものとする。反応基は、直接またはリンカーセグメントを介してポリマーに結合してもよい。そのような基の残基は、ある場合には、抗体断片とポリマーの間の結合基として生成物の一部を構成する。
【００３５】
ポリマーのサイズは、必要に応じて変更することができるが、一般に平均分子量が５００Ｄａ〜５００００Ｄａ、好ましくは５０００〜４００００Ｄａ、さらに好ましくは２５０００〜４００００Ｄａの範囲である。ポリマーサイズは特に、製品の使用目的に基づいて選択される。
特に好適なポリマーには、ポリアルキレンポリマー、例えばポリ（エチレングリコール）、または特にメトキシポリ（エチレングリコール）またはこれらの誘導体、特に約２５０００Ｄａ〜約４００００Ｄａの範囲の分子量を有するものである。
【００３６】
修飾した抗体断片に結合している各ポリマー分子は、断片中に存在するシステイン残基のイオウ原子に共有結合することができる。共有結合は、一般にジスルフィド結合、または特にイオウ−炭素結合である。
必要に応じて、抗体断片は、それに１つ以上の他のエフェクターまたはレポーター分子が結合しているものでもよい。エフェクターまたはレポーター分子は、断片中に存在する任意の利用可能なアミノ酸側鎖または末端アミノ酸官能基（例えば、任意の遊離のアミノ、イミノ、ヒドロキシル、またはカルボキシル基）を介して、抗体断片に結合することができる。
【００３７】
活性化されたポリマーは、上記のポリマー修飾抗体断片の調製において出発物質として使用される。活性化ポリマーは、チオール反応性基を含有する任意のポリマー［例えばα−ハロカルボン酸またはエステル（例えば、ヨードアセトアミド）、イミド（例えば、マレイミド）、ビニルスルホンまたはジスルフィド］である。そのような出発物質は市販されている（例えば、シアウォーターポリマーズ社（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｉｎｃ．）、フンツビル（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ）、アラバマ州、アメリカ合衆国）か、または市販の出発物質から従来の化学的方法を使用して調製される。
【００３８】
ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）残基の結合については、「ポリ（エチレングリコール）化学、生物技術的および生物医学的応用（Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、１９９２、ミルトン・ハリス（Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ）（編）、プレヌムプレス（Ｐｒｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、「ポリ（エチレングリコール）化学および生物医学的応用（Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、１９９７、ミルトン・ハリス（Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ）とザリプスキー（Ｓ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ）（編）、米国化学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）、ワシントンディーシー、および「生物医科学のための生物結合タンパク質結合法（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、１９９８、アスラム（Ｍ．Ａｓｌａｍ）とデント（Ａ．Ｄｅｎｔ）、グローブパブリッシャーズ（Ｇｒｏｖｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）、ニューヨークを参照されたい。
【００３９】
エフェクターまたはレポーター分子に結合した抗体断片を得たい場合、このような断片は、標準的な化学的方法または組換えＤＮＡ法により調製される。これらの方法において、抗体断片は、適宜、活性化ポリマーと反応させる前または後に、直接または結合剤を介して、エフェクターまたはレポーター分子に結合される。具体的な化学的方法としては、例えばＷＯ９３／０６２３１号、ＷＯ９２／２２５８３号、ＷＯ９０／０９１９５号およびＷＯ８９／０１４７６号に記載する方法がある。あるいは、エフェクターまたはレポーター分子がタンパク質またはポリペプチドである場合には、組換えＤＮＡ法、例えばＷＯ８６／０１５３３号およびＥＰ−Ａ−０３９２７４５号に記載の方法を使用して結合される。
【００４０】
本発明の修飾Ｆａｂ断片またはジＦａｂは、好ましくはＥＰ−Ａ−０９４８５４４号およびＥＰ−Ａ−１０９００３７号に記載の方法に従って、ＰＥＧ化される(すなわち、ＰＥＧ（ポリ（エチレングリコール））またはｍＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール））がそれらに共有結合される）。本発明の抗体分子は、好ましくは図６に示すようなＰＥＧ化された修飾Ｆａｂ断片、またはＰＥＧ化されたジ（修飾Ｆａｂ）断片である。図６に示すように修飾Ｆａｂ断片は、修飾ヒンジ領域で単一のチオール基に共有結合したマレイミド基を有する。リジン残基は、マレイミド基に共有結合されている。リジン残基上の各アミン基に、約２０，０００Ｄａの分子量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）ポリマーが結合される。従って全エフェクター分子の総分子量は約４０，０００Ｄａである。同様に各ｍＰＥＧを、ＥＰ−Ａ−１０９０００３７号に記載のようにビスマレイミドリンカーに共有結合されたリジン残基に結合すると、本発明のＰＥＧ化ジ（修飾Ｆａｂ）が形成される。
【００４１】
図６に記載の化合物において抗体部分の重鎖は、好ましくは配列番号１２の配列を有し、軽鎖は配列番号１１の配列を有する。
【００４２】
本発明の抗体分子の定常領域ドメインは、もし存在するなら、抗体分子の提唱された機能、特に必要とされることがあるエフェクター機能を考慮して選択される。例えば、定常領域ドメインは、ヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭドメインでもよい。特にヒトＩｇＧ定常領域ドメインが使用され、特に抗体分子が治療用途で使用され、かつ抗体エフェクター機能が必要な時には、ＩｇＧ１とＩｇＧ３イソタイプが使用される。また、抗体分子が治療目的で使用されかつ抗体エフェクター機能が必要無い時には（例えば、単にＶＥＧＦによるＫＤＲ結合をブロックするため）、ＩｇＧ２とＩｇＧ４イソタイプが使用される。
【００４３】
また本発明の抗体分子は、それに結合したエフェクターまたはレポーター分子を有するものでもよい。例えば本発明の抗体分子は、重金属原子をキレート結合するための巨大環、又は共有結合による架橋構造でそれに結合させた毒素（例えば、リシン）を有するものでもよい。あるいは組換えＤＮＡ技術を使用して、完全な免疫グロブリン分子のＦｃ断片（ＣＨ２、ＣＨ３およびヒンジドメイン）、ＣＨ２とＣＨ３ドメイン、またはＣＨ３ドメインが、ペプチド結合、機能性非免疫グロブリンタンパク質（例えば、酵素または毒素分子）で置換されているか、またはそれら断片又はドメインにそれら結合又はタンパク質が結合している、抗体分子を産生してもよい。
【００４４】
本発明の抗体分子の結合親和性は０．４×１０-10 Ｍである。好ましくは本発明の抗体分子は、重鎖可変ドメインｇＨ３（配列番号１５）と軽鎖可変ドメインｇＬ３（配列番号１６）を含む。これらの軽鎖と重鎖の可変ドメインの配列を図７に示す。
【００４５】
本発明はまた、ＫＤＲに対する親和性が改良されている本発明の抗体分子の異形体に関する。そのような異形体は、ＣＤＲの変異（ヤング（Ｙａｎｇ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５４，３９２−４０３，１９９５）、鎖シャフリング（マークス（Ｍａｒｋｓ）ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，７７９−７８３，１９９２）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の変異株の使用（ロウ（Ｌｏｗ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５０，３５９−３６８，１９９６）、ＤＮＡシャフリング（パッテン（Ｐａｔｔｅｎ）ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｃｈｎｏｌ．，８，７２４−７３３，１９９７）、ファージディスプレー（トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５６，７７−８８，１９９６）および有性ＰＣＲ（クラメリ（Ｃｒａｍｅｒｉ）ら、Ｎａｔｕｒｅ，３９１，２８８−２９１，１９９８）を含む多くの親和性成熟プロトコールにより得ることができる。ボーハン（Ｖａｕｇｈａｎ）ら（前述）は、親和性成熟のこれらの方法を考察している。
【００４６】
本発明はまた、本発明の抗体分子の重鎖および／または軽鎖をコードするＤＮＡ配列、例えば本明細書の図に記載のものを提供する。
本発明のＤＮＡ配列は、合成ＤＮＡ（例えば化学工程により産生される）、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはこれらの任意の組合せを含んでよい。
本発明はまた、本発明の１つ以上のＤＮＡ配列を含むクローニングベクターまたは発現ベクターに関する。好ましくはクローニングベクターまたは発現ベクターは、それぞれ本発明の抗体分子の軽鎖と重鎖とをコードする２つのＤＮＡ配列を含む。
好適な実施態様において本発明は、本発明のＤＮＡ配列を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターを提供する。好ましくはこの発現ベクターは、図８に概略的に図示したｐＴＴＯＤ（ＣＤＰ７９１）である。
【００４７】
ベクターを構築する一般的な方法、トランスフェクション法、および培養法は、当業者に公知である。この点については、「分子生物学の現代のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、１９９９，アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら（編）、ウィレイインターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ニューヨーク、およびコールドスプリングハーバーパブリッシング（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）製のマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）マニュアルを参照されたい。
【００４８】
本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列は、当業者に公知の方法により得ることができる。例えば抗体重鎖と軽鎖の一部またはすべてをコードするＤＮＡ配列は、決定されたＤＮＡ配列からまたはその対応するアミノ酸配列に基づき、必要に応じて合成することができる。
アクセプターフレームワーク配列をコードするＤＮＡは、当業者が広く利用することができ、その公知のアミノ酸配列に基づき容易に合成することができる。
【００４９】
分子生物学の標準的方法を使用して、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列が調製される。所望のＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成法を使用して完全にまたは部分的に合成される。部位特異的突然変異誘発技術およびポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）法が、適宜使用される。
【００５０】
任意の適当な宿主細胞／ベクター系が、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列を発現するために使用される。細菌、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および他の微生物系は、抗体断片、例えばＦａｂ、ジ（修飾Ｆａｂ）およびＦ（ａｂ'）2 断片、および特にＦｖ断片と１本鎖抗体断片（例えば、１本鎖Ｆｖ）の発現のために一部使用される。真核生物（例えば、哺乳動物）宿主細胞発現系は、完全な抗体分子を含むより大きな抗体分子の産生のために使用される。適当な哺乳動物宿主細胞としては、ＣＨＯ、骨髄腫またはハイブリドーマ細胞がある。
本発明はまた、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡからタンパク質を発現させるのに適した条件下で、本発明のベクターを含む宿主細胞を培養し、抗体分子を単離することを含む、本発明の抗体分子の産生法を提供する。
【００５１】
好ましくは本発明の抗体分子の産生方法は、ＤＮＡ配列からタンパク質を発現させるのに適した条件下で、本発明のＤＮＡ配列を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を培養し、抗体分子を単離することを含む。抗体分子は細胞から分泌されるか、または適当なシグナル配列によりペリプラスムに対して標的化される。あるいは、抗体分子は細胞の細胞質内で蓄積される。抗体分子は、好ましくはペリプラスムに対して標的化されたものである。産生される抗体分子および使用される方法に依存して、抗体分子を再び折り畳み、機能的なコンフォメーションをとらせることが好ましい。抗体分子を再折り畳みさせる方法は、当業者に公知である。
【００５２】
抗体分子は、重鎖または軽鎖ポリペプチドのみを含有してもよく、この場合、宿主細胞をトランスフェクトするのに重鎖または軽鎖ポリペプチドのコード配列のみを使用する必要がある。重鎖と軽鎖の両方を含む生成物の産生においては、細胞株は、２つのベクター、軽鎖ポリペプチドをコードする第１のベクターと、重鎖ポリペプチドをコードする第２のベクターとでトランスフェクトされる。あるいは、軽鎖と重鎖ポリペプチドをコードする配列を含む単一のベクターを使用してもよい。
【００５３】
本発明はまた、本発明の抗体分子を薬剤学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体とともに含む、治療用または診断用組成物を提供する。
本発明はまた、本発明の抗体分子を、薬剤学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体とともに含む、治療用または診断用組成物の調製法を提供する。
抗体分子は、治療用または診断用組成物の唯一の活性成分であってもよく、他の抗体成分（例えば抗Ｔ細胞、抗ＩＦＮγ、または抗ＬＰＳ抗体）、または非抗体成分（例えば、キサンチン）を含む他の活性成分と共に加えられるものでもよい。
【００５４】
医薬組成物は好ましくは、治療的に有効量の本発明の抗体を含む。本明細書において「治療的に有効量」とは、標的の疾患または症状を治療、緩和または予防するか、または検出可能な治療効果または予防効果を示すのに必要な治療薬の量を意味する。任意の抗体について、治療的に有効用量は、まず細胞培養物アッセイまたは動物モデル（通常、げっ歯類、ウサギ、イヌ、ブタまたは霊長類）で推定することができる。この動物モデルはまた、適切な濃度範囲および投与経路を決定するのにも使用される。そのような情報は次に、ヒトでの投与のための有用な用量および経路を決定するのに使用することができる。
【００５５】
ヒト被験体の正確な有効量は、疾患の重症度、被験体の全身の健康状態、被験体の年齢、体重および性、食事、投与時間および頻度、薬剤組合せ、反応感受性および治療に対する耐性／応答に依存する。この量は、ルーチンの実験により決定することができ、臨床医により判定される。一般に有効量は、０．０１mg/kg〜５０mg/kg、好ましくは０．１mg/kg〜２０mg/kg、さらに好ましくは約１５mg/kgである。
【００５６】
組成物は、個々に患者に投与されるか、または他の物質、薬剤またはホルモンと組合せて投与される。
本発明の抗体分子が投与される用量は、治療すべき症状の性質、中和すべきＶＥＧＦのレベル、または所望のレベルより高くなる事が予測される程度に、および抗体分子が予防的に使用されるのか、または既存の症状を治療するために使用されるのかに依存する。用量はまた、患者の年齢と症状に従って選択される。
【００５７】
すなわち例えば、生成物が、慢性炎症性疾患（例えばリウマチ様関節炎）の治療用または予防用である場合、本発明の抗体分子の適当な用量は、０．５〜５０mg/kgの範囲、好ましくは１〜２０mg/kg、最も好ましくは約１５mg/kgである。投与頻度は、抗体分子の半減期とその効果の持続時間に依存する。
抗体分子の半減期が短い（例えば、２〜１０時間）時、１日に１回以上投与することが必要かも知れない。あるいは抗体分子の半減期が長い（例えば２〜１５日）なら、１日、１週間、または１もしくは２ヶ月に１回の投与でいいかも知れない。
【００５８】
医薬組成物はまた、抗体の投与のための薬剤学的に許容される担体を含有してもよい。担体は、組成物を投与されている個体に有害な抗体の産生を誘導してはならず、毒性を有するものであってもならない。適当な担体は、大きく、ゆっくり代謝される巨大分子であり、例えばタンパク質、ポリペプチド、リポソーム、ポリサッカライド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、および不活性化ウイルス粒子などである。
薬剤学的に許容される塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、および硫酸塩のような鉱酸の塩、または酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩および安息香酸塩のような有機酸の塩が使用できる。
【００５９】
治療用組成物中の薬剤学的に許容される担体は、水、食塩水、グリセロールおよびエタノールのような液体をさらに含有してもよい。さらに湿潤剤または乳化剤またはｐＨ緩衝物質のような補助物質が、そのような組成物中に存在してもよい。そのような担体は、患者による摂取のために、医薬組成物を、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、シロップ剤、スラリー剤および懸濁剤として製剤化することを可能にする。
【００６０】
好適な投与のための形態としては、例えば注射または注入（例えば、ボーラス注入または連続的注入）による非経口投与に適した形態がある。生成物が注射または注入用である場合、生成物は、油状または水性ビヒクル中の懸濁物、溶液またはエマルジョンの形態でもよく、調剤化物質、例えば懸濁剤、保存剤、安定剤および／または分散剤を含有してもよい。あるいは抗体分子は、適切な無菌液体と共に使用して溶解するための乾燥形態でもよい。
いったん調製されると、本発明の組成物は直接被験体に投与される。治療される被験体は動物でもよい。しかし、組成物はヒト被験体への投与に適合することが好ましい。
【００６１】
本発明の医薬組成物は、任意の経路、特に限定されないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、くも膜下、脳室内、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、経皮（ｔｒｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）（例えばＷＯ９８／２０７３４号を参照）、皮下、腹腔内、鼻内、腸内、局所的、舌下、膣内、または直腸経路で投与してもよい。本発明の医薬組成物を投与するのにハイポスプレーを使用してもよい。典型的には治療用組成物は、注射剤として、液剤または懸濁剤として調製される。注射前に液体ビヒクルに溶解または懸濁するのに適した固体型も調製される。
組成物の直接送達は一般に、注入、皮下、腹腔内、静脈内または筋肉内で、または組織の間質スペースに投与されるであろう。組成物はまた病変中に投与することができる。投与処理は単回投与または複数回投与スケジュールでもよい。
【００６２】
組成物中の活性成分は、抗体分子であることは理解されるであろう。従ってこれは、消化管中で分解を受けやすい。すなわち消化管を使用する経路で組成物を投与するなら、組成物は、分解から抗体を防御するが、消化管から吸収されたら抗体を放出する物質を含有する必要がある。
薬剤学的に許容される担体の詳細な考察は、レミントンの薬剤科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）（マックパブリッシング社（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、ニュージャージー州、１９９１）に記載されている。
【００６３】
また本発明の抗体は、遺伝子治療を利用して投与されるであろう。このために、適切なＤＮＡ成分の制御下で抗体分子の重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡ配列が、ＤＮＡ配列から抗体鎖が発現され、ｉｎ  ｓｉｔｕで組み立てられるように患者に投与される。
【００６４】
本発明はまた、ＶＥＧＦおよび／またはＫＤＲが関与している疾患の治療に使用される本発明の抗体分子を提供する。
本発明はさらに、ＶＥＧＦおよび／またはＫＤＲが関与している治療のための薬剤を製造するための、本発明の抗体分子の使用を提供する。
本発明の抗体分子は、ヒトまたは動物の体に存在する生物学的に活性なＫＤＲのレベルを低下させることが望まれる治療法で使用される。ＶＥＧＦは、体内を循環していたり体の特定の部位で望ましくない高いレベルで存在することがある。
【００６５】
例えば、ＶＥＧＦ（および従ってＫＤＲ）は、多くの病状（炎症、乾癬、リウマチ様関節炎、および腫瘍増殖と転移を含む）に関与している。
本発明はまた、本発明の抗体分子の有効量を被験体に投与することを含む、ＶＥＧＦおよび／またはＫＤＲが関与している疾患にかかっているかまたはそのリスクのあるヒトまたは動物被験体の治療法を提供する。
本発明の抗体分子はまた、診断、例えば高レベルのＫＤＲを伴なう病状のインビボ診断およびイメージングのために使用することができる。
本発明はさらに、添付の図面を参照する以下の実施例で例示のためにのみ記載される。
【実施例】
【００６６】
（モノクローナル抗体産生と選択）
インハウス免疫プログラムを開始して、そのリガンドＶＥＧＦとの相互作用をブロックするのに有効なヒトＫＤＲに対する抗体を選択した。完全長ヒトＫＤＲ、精製ヒトＫＤＲ−ヒトＦｃ融合タンパク質、およびこれらの融合タンパク質をコードするＤＮＡでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を含む種々の免疫原を用いて、マウスを免疫した。細胞／タンパク質免疫原で免疫した動物からの全部で１９の融合体と、ＤＮＡで免疫した動物からの４つの融合体から、約２３、０００個のウェルを、ヒト７−ドメインＫＤＲ−Ｆｃへの結合について１次ＥＬＩＳＡフォーマットでスクリーニングした。次に約８００の抗体を、ヒト７−ドメインＫＤＲ−Ｆｃへの１２５−Ｉ  ＶＥＧＦ結合のブロッキングを測定する放射免疫定量法の２次スクリーニングにかけた。３次スクリーニングにより、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）からのＶＥＧＦ刺激組織因子放出のブロッキングを測定した。このスクリーニングカスケードから、抗体ＶＲ１６５が選択された（データは示していない）。
【００６７】
（ＶＲ１６５の遺伝子クローニング）
ＶＲ１６５を発現するハイブリドーマ細胞からＲＮＡを調製し、ＤＮＡに逆転写した。次にこれを一連のＰＣＲ反応の鋳型として使用して、Ｖ領域配列を増幅した。保存された重鎖および軽鎖シグナル配列内でアニーリングするように設計された縮重プライマープールをフォーワードプライマーとして使用し、フレームワーク４／Ｃ領域ジャンクションをコードするプライマーをリバースプライマーとした。こうして、重鎖と軽鎖の両方のＶ領域遺伝子を増幅し、次にクローン化し配列決定した。ＤＮＡ配列を翻訳してＶＲ１６５  Ｖ領域アミノ酸配列を得て、これは、Ｎ末端配列決定により決定されたタンパク質配列と比較して確認した。次にマウスＶ領域遺伝子を、発現ベクターｐＭＲ１０．１とｐＧａｍｍａ−４中にサブクローン化した。これらは、ヒトカッパ軽鎖とｇａｍｍａ−４重鎖の定常領域遺伝子をコードするゲノムＤＮＡを含有するそれぞれ軽鎖と重鎖の発現のための別々のベクターである。ＣＨＯ細胞への同時トランスフェクションにより、キメラＶＲ１６５抗体が得られる。
【００６８】
（ＣＤＲ移植配列の設計）
免疫原性を低下させ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現を促進するために、ＶＲ１６５をヒトフレームワークにＣＤＲ移植した。サブグループＶＨIIIとＶＬＩから、ヒト生殖細胞系アクセプターフレームワークを選択した。重鎖アクセプターフレームワークは、ヒト生殖細胞系配列ＶＨ３−７であり、ヒトＪＨ領域生殖細胞系ＪＨ４のこの部分から来るフレームワーク４を有する。軽鎖アクセプターフレームワークは、ヒト生殖細胞系配列Ａ３０であり、ヒトＪＫ領域生殖細胞系ＪＫ１のこの部分から来るフレームワーク４を有する。整列すると、ドナーとアクセプター重鎖の間に１５のフレームワークの差があることを示す。これらの位置のそれぞれで、抗原結合に寄与する残基の可能性について分析した；重要であると考えられたら、マウスドナー残基を保持した。軽鎖整列は、ドナーとアクセプター重鎖の間に２４のフレームワークの差があることを示す。マウス残基が抗原結合に寄与する可能性を、再度分析した。こうして、ＶＨ移植片を設計し、３つのＶＬ移植片を得た（図９、配列番号１７〜２２）。各場合に、移植片１は、マウスフレームワーク残基の無い移植片である。移植片ｇＨ３はまた、ＣＤＲ−Ｈ２のＣ末端に追加のヒト残基を含有する。ＣＤＲのこの部分は、抗原結合表面ではない。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で頻繁に使用されるコドンを使用し、「まれ」な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドンを避けて、移植配列をコードするように遺伝子を設計した（ワダ（Ｗａｄａ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９、１９８１−８６、１９９１）。さらなる遺伝子操作を促進するために、間隔を置いてＤＮＡ配列中に制限部位を導入した。図１０は、ｇＨ１とｇＬ１の遺伝子の設計を示す（配列番号２３と配列番号２４）。遺伝子を構築するのに使用したオリゴヌクレオチドを図１１に示す（配列番号２５〜４０）。
【００６９】
（移植配列の遺伝子の構築）
ＰＣＲ組み立て法を使用して、ＣＤＲ移植ｇＨ１とｇＬ１  Ｖ領域遺伝子を構築した。１０mMトリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５mM ＭｇＣｌ2、５０mM ＫＣｌ、０．００１％ゼラチン、０．２５mMの各デオキシリボヌクレオシド三リン酸、１pmolの各「内部」プライマー（Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４）、１０pmolの各「外部」プライマー（Ｆ１、Ｒ１）、および１単位のＴａｑポリメラーゼ（アンプリタク（ＡｍｐｌｉＴａｑ）、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）、カタログ番号Ｎ８０８−０１７１）を含有する１００μlの反応容量を準備した。ＰＣＲサイクルパラメータは、９４℃で１分、５５℃で１分、および７２℃で１分を３０サイクルであった。次に反応生成物を１．５％のアガロースゲルで流し、切り出し、キアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ）スピンカラム（キアクイック（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）ゲル抽出キット、カタログ番号２８７０６）を使用して回収した。３０μlの容量でＤＮＡを溶出した。次にアリコート（１μl）のｇＨ１とｇＬ１  ＤＮＡを、インビトロゲン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）トポタ（ＴＯＰＯ  ＴＡ）クローニングベクターｐＣＲ２．１  ＴＯＰＯ（カタログ番号Ｋ４５００−０１）中に製造業者の説明書に従ってクローン化した。この非発現ベクターは、多量のクローンの配列決定を促進するためのクローニング中間体とした。ベクター特異的プライマーを使用するＤＮＡ配列決定を使用して、ｇＨ１とｇＬ１を含有する正しいクローンを同定して、プラスミドｐＣＲ２．１（ｇＨ１）、およびｐＣＲ２．１（ｇＬ１）を作成した（図１２を参照）。
【００７０】
オリゴヌクレオチドカセット置換法を使用して、ヒト化移植片ｇＨ２とｇＬ２を作成した。図１３は、オリゴヌクレオチドカセットの設計を示す（配列番号４１と配列番号４３）。各変種を構築するために、ベクター（ｐＣＲ２．１（ｇＨ１）またはｐＣＲ２．１（ｇＬ１））を、記載の制限酵素で切断（図１３、制限部位に下線）し、大きいベクター断片をアガロースからゲル精製し、オリゴヌクレオチドカセットとの結合に使用した。図１４は、カセットに使用したオリゴヌクレオチドの配列を示す（配列番号４５〜４６および配列番号４９〜５０）。対を、１２．５mMトリス塩酸（ｐＨ７．５）、２．５mM ＭｇＣｌ2、２５mM ＮａＣｌ、０．２５mMジチオエリトリトールを含有する２００μlの容量中０．５pmol/μlの濃度で混合し、水浴（容量５００ml）中で９５℃で３分加熱して、次に室温までゆっくり冷却することにより、アニーリングした。次にアニーリングしたオリゴヌクレオチドカセットを水で１０倍希釈した後、適切な切断したベクター中に結合した。ＤＮＡ配列決定を使用して、正しい配列を確認し、プラスミドｐＣＲ２．１（ｇＨ２）とｐＣＲ２．１（ｇＬ２）を作成した。
【００７１】
変種ｇＨ３とｇＬ３を、同様にｇＨ２とｇＬ２から構築した。カセットとオリゴヌクレオチドを図１３と１４に示す（配列番号４２と配列番号４４、配列番号４７〜４８、および配列番号５１〜５２）。ｐＣＲ２．１ベクター骨格中のＰｖｕＩ部位の存在のために、ｇＬ３の構築には修飾法が必要であった。ｐＣＲ２．１（ｇＬ２）をＡａｔIIとＳｆｕＩで切断すると、ＰｖｕＩ−ＡａｔIIアニーリングしたカセットが結合したベクター分子と、これもｐＣＲ２．１（ｇＬ２）から調製された２２５塩基対のＳｆｕＩ−ＰｖｕＩ断片が作成された。ＤＮＡ配列決定を使用して、正しい配列を確認して、プラスミドＰＣＲ（ｇＨ３）とｐＣＲ２．１（ｇＬ３）を作成した。
【００７２】
次に３つの重鎖移植片のそれぞれを、発現ベクターｐＧａｍｍａ−４中にＨｉｎｄIII−ＡｐａＩ断片としてサブクローニングした。３つの軽鎖移植片のそれぞれを、発現ベクターｐＭＲ１０．１中にＳｆｕＩ−ＢｓｉＷＩ断片としてサブクローニングした。図１５は、これらの発現ベクターの地図を示す。ＣＨＯ細胞への同時トランスフェクションにより、抗体を一過性に発現させた。移植した鎖とキメラ鎖のすべての組合せを発現させ、２重キメラ抗体に対して比較した。
結合を、ＫＤＲ結合ＥＬＩＳＡ、ＫＤＲへの標識ＶＥＧＦ結合の阻害の放射免疫定量法、およびＫＤＲ結合のビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）アッセイにより測定した。移植したすべての型は、ＥＬＩＳＡと放射免疫定量法で良好に機能し、キメラに似た活性を示した。ビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）分析から、移植片ｇＬ３ｇＨ３を最適として選択（データは示していない）し、これを以後ｇ１６５と呼ぶ。
【００７３】
（プラスミドｐＴＴＯＤの構築）
プラスミドｐＴＴＯ−１を以下のように構築した。
【００７４】
（ａ）ｐＴＴＱ９ポリリンカーの置換
プラスミドｐＴＴＱ９をアマシャム（Amersham）から得た。アリコート（２μｇ）を制限酵素ＳａｌＩとＥｃｏＲＩで消化し、消化物を１％アガロースゲルに流し、大きいＤＮＡ断片（４５２０bp）を精製した。２つのオリゴヌクレオチドを合成し、これらはアニーリングすると、ＯｍｐＡポリリンカー領域をコードする。この配列は、ｐＴＴＱ９の制限切断により作成されたＳａｌＩとＥｃｏＲＩ末端に適合する粘着末端を有する。このオリゴヌクレオチド「カセット」をｐＴＴＱ９ベクター中にクローニングすると、ＳａｌＩ部位は再生されないが、ＥｃｏＲＩ部位は維持される。このカセットは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）外膜タンパク質Ｏｍｐ−Ａのシグナル配列の最初の１３アミノ酸をコードし、これは、ＯｍｐＡ遺伝子のシャインダルガルノ（Ｓｈｉｎｅ  Ｄａｌｇａｒｎｏ）リボゾーム結合部位が先行する。さらに、酵素ＸｂａＩ、ＭｕｎＩ、ＳｔｙＩおよびＳｐｌＩの制限部位が存在する。ＭｕｎＩとＳｔｙＩ部位は、ＯｍｐＡシグナル配列のコード領域内に有り、遺伝子の挿入のための５’クローニング部位となる。このカセットを構成する２つのオリゴヌクレオチドを、５pmol/μlの濃度で混合し、水浴中で９５℃で３分加熱して、次に室温までゆっくり冷却することにより、アニーリングした。次にアニーリングした配列を、ＳａｌＩ／ＥｃｏＲＩ切断したｐＴＴＱ９に連結した。得られたプラスミド中間体（ｐＴＱＯｍｐと呼ぶ）をＤＮＡ配列決定により証明した。
【００７５】
（ｂ）断片調製と連結
プラスミドｐＡＣＹＣ１８４からの１つのＤＮＡ断片を、ｐＴＱＯｍｐから作成した２つの断片に連結して、プラスミドｐＴＴＯ−１を構築した。プラスミドｐＡＣＹＣ１８４はニューイングランドバイオラボズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）から得られた。アリコート（２μｇ）を制限酵素ＳｔｙＩで完全に消化し、次に大豆ヌクレアーゼ（Ｍｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ）を用いて処理した；この処理により、５’塩基オーバーハングを切断して、平滑末端を作成する。フェノール抽出とエタノール沈殿後、ＤＮＡを酵素ＰｖｕIIで切断し、２３４８、１０８１、４１２および４０３bpの断片を生成した。アガロースゲル電気泳動後に２３４８bp断片を精製した。この断片は、テトラサイクリン耐性マーカーとｐ１５Ａ複製開始点をコードする。次に断片を子ウシ小腸アルカリホスファターゼで処理して、５’末端リン酸を除去し、こうしてこの分子の自己連結を防止した。
【００７６】
アリコート（２μｇ）のプラスミドｐＴＱＯｍｐを酵素ＳｓｐＩとＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル電気泳動後に２０４０bpと１７０bpの不要な断片から２３５０bp断片を精製した；この断片は、転写停止領域とｌａｃＩq 遺伝子とをコードする。別のアリコート（２μｇ）のｐＴＱＯｍｐをＥｃｏＲＩとＸｍｎＩで消化して、２２８９、１６７０、３５０および２５０bpの断片を作成した。ｔａｃプロモーター、ＯｍｐＡシグナル配列、および複クローニング部位をコードする３５０bp断片をゲル精製した。
次に、ほぼ等モル量の各断片を使用して３つの断片を連結して、プラスミドｐＴＴＯ−１を作成した。すべてのクローニングジャンクションをＤＮＡ配列決定により証明した。
【００７７】
（ｃ）プラスミドｐＴＴＯＤの産生
ｐＴＴＯ−１から、ＰｖｕII（３部位）、ＥｃｏＲＶ（２部位）およびＡｐａＩ（１部位）の骨格制限部位を除去して、プラスミドｐＴＴＯＤを得た。Ｆａｂ’コード法を単純化するために、これらの変化を加えた。これらの変化を加える時に、ｌａｃＩｑ遺伝子とテトラサイクリン耐性遺伝子のコードタンパク質配列は変化させなかったが、ＤＮＡレベルの「サイレント」変化を行った。ＰＣＲ法を行い、ここでこれらの制限部位を除去した「サイレント」変化を有するプライマーを設計し、これを使用して親プラスミド（ｐＴＴＯ−１）のセクションを増幅した。次にフランキング制限部位（無変化）を使用して、親プラスミド中の配列をこれらの修飾配列で置換した。この多工程プロセスにより、プラスミドｐＴＴＯＤが作成された。遺伝子にフランクするユニークなＰｓｔＩとＥｃｏＲＩ部位を使用して、ベクターｐＴＴＯ内の既存のＦａｂ’遺伝子のｐＴＴＯＤへの移行を行い、ｐＴＴＯＤ（Ｆａｂ’）を作成した。
【００７８】
（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｆａｂ’発現プラスミドｐＴＴＯＤへのｇ１６５Ｖ領域遺伝子の挿入）
ｇ１６５配列の挿入のための開始点は、無関係のＦａｂ’の発現のための３つのベクター（ｐＴＴＯＤ（Ｆａｂ’ＩＧＳ−１）、ｐＴＴＯＤ（Ｆａｂ’ＩＧＳ−２）およびｐＴＴＯＤ（Ｆａｂ’ＩＧＳ−３））である（例えば、図１６を参照）。これらは、軽鎖遺伝子を重鎖遺伝子から分離する、いわゆるＩＧＳすなわち遺伝子内配列でのみ異なる。これらのＩＧＳ領域を図１７に示す（配列番号５３〜５５）。これらのベクターへのｇ１６５配列のクローニングは、２工程プロセスとして行った。まず、ｐＣＲ２．１（ｇＬ３）から軽鎖をＥｃｏＲＶ−ＢｓｉＷＩ断片（３９５bp）として制限切断し、ｐＴＴＯＤ（Ｆａｂ’ＩＧＳ−１）、ｐＴＴＯＤ（Ｆａｂ’ＩＧＳ−２）およびｐＴＴＯＤ（Ｆａｂ’ＩＧＳ−３）のＥｃｏＲＶ−ＢｓｉＷＩ消化からの大きいベクター断片中に挿入した。これで、クローニング中間体ｐＴＴＯＤ（ｇ１６５Ｌ  ＩＧＳ−１）、ｐＴＴＯＤ（ｇ１６５Ｌ  ＩＧＳ−２）およびｐＴＴＯＤ（ｇ１６５Ｌ  ＩＧＳ−３）が作成された。次にこれらのクローニング中間体をＰｖｕIIとＡｐａＩで切断し、大きいベクター断片を精製し、ｐＣＲ２．１（ｇＨ３）からの４３５bpのＰｖｕII−ＡｐａＩ断片を挿入した。これで、３つのＦａｂ’発現プラスミドｐＴＴＯＤ（ｇ１６５  ＩＧＳ−１）、ｐＴＴＯＤ（ｇ１６５  ＩＧＳ−２）およびｐＴＴＯＤ（ｇ１６５  ＩＧＳ−３）が作成された。
【００７９】
これらのプラスミドを宿主株Ｗ３１１０中に形質転換し、これらの３つのプラスミドによるＦａｂ’の発現を、振盪フラスコと発酵槽で比較した。図１８は、発酵槽比較の結果であり、ＩＧＳ−２変種の優れた性能を明瞭に証明している。
プラスミドｐＴＴＯＤ（ｇ１６５  ＩＧＳ−２）をｐＴＴＯＤ（ＣＤＰ７９１）と再度名付けた。この構築体のプラスミド地図を図８に示す。図１９は、このベクター中のＦａｂ’のコード領域の完全なＤＮＡとタンパク質配列、および５’と３’フランキング配列の一部を示す（配列番号５６）。
【００８０】
（ＣＤＲ移植ＶＲ１６５ベースの修飾ＦａｂのＰＥＧ化）
精製し修飾Ｆａｂは、ｍＰＥＧの分岐分子に部位特異的に結合した。これは、修飾Ｆａｂの端を切り取ったヒンジ領域中の単一のシステイン残基の活性化と、次に、既に記載されているように（チャップマン（Ａ．Ｐ．Ｃｈａｐｍａｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７，７８０−７８３，１９９９）（ｍＰＥＧ）リジルマレイミドと反応させて行った。ＰＥＧ化分子を図６に示す。あるいは、ＥＰ−Ａ−１０９００３７号に記載されているように、活性化Ｆａｂを（ｍＰＥＧ）リジルビスマレイミドと反応させると、ＰＥＧ化ジ（修飾Ｆａｂ）が得られる（以後ＤＦＭと呼ぶ）。
【００８１】
（裸のおよびＰＥＧ化断片のビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）活性）
ヒトＦｃに融合した７つのＩｇドメインヒトＫＤＲを、抗Ｆｃで被覆したチップ上に捕捉し、ＣＤＲ移植抗体ｇ１６５の種々の断片とマウス親抗体ＶＲ１６５とを、親和性測定のために流した。以下の表は、得られた結果を要約する。このアッセイフォーマットで、２価の種の低いオフレート（Ｋd）で示される２価の利点がある。移植したＤＦＭの親和性は、マウスＩｇＧと非常によく似ており、ＤＭＦ−ＰＥＧは親和性のわずかな低下を示す。ｇ１６５  ＤＦＭ-ＰＥＧ分子のＫＤは、このアッセイでは約４×１０-11Ｍである。
【００８２】
【表１】
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【００８３】
（放射免疫定量法）
ＫＤＲへのＶＥＧＦ結合をブロックする断片の能力を、放射免疫定量法で測定した。ポリクローナル抗Ｆｃを使用して、マイクロタイタープレート中のヒトＦｃに融合した７つのＩｇドメインＫＤＲを補足し、抗体または断片を加え、次に１２５−Ｉ標識ＶＥＧＦを加えた。このアッセイの結果を図２０に示す。このアッセイの構成においてＦａｂ’に対するＤＦＭの優れたブロッキング性能により証明される２価の利点がる。ビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）試験で見られたように、ＤＦＭ-ＰＥＧ構築体は裸のＤＦＭと比較して活性のわずかな低下を示す。
【００８４】
（細胞ベースのアッセイ）
分子ｇ１６５  ＤＦＭ  ＰＥＧはまた、細胞ベースのアッセイで活性を示した。ＫＤＲのＶＥＧＦ刺激をブロックする能力は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（クラウス（Ｃｌａｕｓｓ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，１７６２９−１７６３４，１９９６）による組織因子放出を介して証明された。活性はまた、ヒト微小血管内皮細胞（カニンガム（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ）ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ，２７６，Ｃ１７６−１８１，１９９９）におけるＶＥＧＦ介在Ｃａ2+動員の阻害により証明した。
【００８５】
上記例は例示のためのみであって、請求の範囲により規定される本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】ＶＲ１６５マウスモノクローナル抗体遺伝子の重鎖および軽鎖Ｖ領域のＣＤＲ配列を示す（配列番号１〜６）。
【図２】マウスモノクローナル抗体ＶＲ１６５  ＶＨおよびＶＬドメインのタンパク質配列を示す（配列番号７と配列番号８）。
【図３】ヒト生殖細胞系アクセプターフレームワークとして選択されたＶ領域タンパク質配列を示す。ＶＨ３−７  ＧＬはヒト生殖細胞系ＶＨ遺伝子である（配列番号９）。Ａ３０  ＧＬはヒトＶＬ生殖細胞系配列Ａ３０遺伝子を意味する（配列番号１０）。各場合にフレームワーク４の生殖細胞系配列は、それぞれヒト生殖細胞系ＪH４とＪK１により提供される。
【図４】ＣＤＰ７９１  Ｆａｂ軽鎖のアミノ酸配列とヌクレオチド配列を示す（配列番号１１と配列番号１３）。
【図５】ＣＤＰ７９１  Ｆａｂ重鎖のアミノ酸配列とヌクレオチド配列を示す（配列番号１２と配列番号１４）。
【図６】システイン残基を介してリジル−マレイミドリンカーに共有結合した抗体ＶＲ１６５から得られる修飾Ｆａｂ断片の構造を示し、リジル残基上の各基は、メトキシＰＥＧ残基（ｎは約４２０である）が共有結合している。
【図７】最適化したＣＤＲ移植ＶＨとＶＬドメイン遺伝子のタンパク質配列を示す（配列番号１５と配列番号１６）。
【図８】移植片ｇＬ３とｇＨ３の間にＩＧＳ−２変種を含有する最適化ｐＴＴＯＤ（ＣＤＰ７９１）プラスミドを示す。
【図９】記載のＶＨとＶＬ移植片のタンパク質配列を示す（ｇＨ１〜３とｇＬ１〜３、配列番号１７〜２２）。移植片ｇＨ１は、マウスフレームワーク残基を含有しない。移植片ｇＨ２は、７７位と９３位（カバト（Ｋａｂａｔ）番号付け）の間にマウス残基を含有する。ＴとＳの両方とも、７７位でヒト生殖細胞系配列に共通であり、従ってＴの含有はヒト残基と一致する。９３位のＶは、ＶＨ／ＶＬインターフェースで重要である可能性がある。６０と６２におけるヒト残基の含有は、ＣＤＲ−Ｈ２のＣ末端部分の変化である。移植片ｇＬ２は、６０、６６、６９、７０および７１（カバト（Ｋａｂａｔ）番号付け）位にマウス残基を含有する。移植片ｇＬ３は、３６と４４位に追加のマウス残基を含有する。
【図１０】ｇＨ１とｇＬ１移植片をコードする遺伝子の設計を示す（配列番号２３と配列番号２４）。
【図１１】ｇＬ１とｇＨ１移植片をコードする遺伝子を組み立てるのに使用されるオリゴヌクレオチドを示す（配列番号２５〜４０）。
【図１２】ｇＨ１とｇＬ１移植片を含有する、それぞれプラスミドｐＣＲ２．１（ｇＨ１）とｐＣＲ２．１（ｇＬ１）を示す。
【図１３】移植片ｇＨ２、ｇＨ３、ｇＬ２およびｇＬ３の構築に使用されるオリゴヌクレオチドカセットを示す（配列番号４１〜４４）。
【図１４】移植片ｇＨ２、ｇＨ３、ｇＬ２およびｇＬ３の構築に使用されるオリゴヌクレオチド対を示す（配列番号４５〜５２）。
【図１５】ＣＨＯ細胞株中での発現を可能にするために、それぞれＶＨとＶＬ移植片がサブクローン化された、プラスミドｐＧａｍｍａ４とｐＭＲ１０．１を示す。
【図１６】この場合ＩＧＳ−３配列を含有する、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｆａｂ’発現プラスミドｐＴＴＯＤを示す。
【図１７】試験したＩＧＳ領域のヌクレオチド配列を示す（配列番号５３〜５５）。
【図１８】ＩＧＳ性能のＦａｂ’発酵比較の結果を示す。
【図１９】ＣＤＰ７９１  Ｆａｂ’断片のコード配列とフランキング配列を示す（配列番号５６）。
【図２０】ＫＤＲへのＶＥＧＦの結合をブロックするかどうかについて抗体断片を試験した放射免疫定量法の結果を示す。
【図２１】ｇＨ３移植ＶＲ１６５由来モノクローナル抗体の全重鎖のアミノ酸配列を示す（配列番号５７）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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