(57)【要約】本発明は、過剰増殖性疾患を有する対象を治療するための、遺伝的に改変された間葉系幹細胞を含む組成物の使用、およびそれを作製するための方法に関する。いくつかの態様は、作用物質単独での全身送達を回避しながら、作用物質の局所送達を可能にする。生体物質を腫瘍部位で局所的に産生させるためにストローマ前駆体を用いることもできる。腫瘍微小環境または増殖を誘導するその他の微小環境は、他の組織に比してストローマ前駆体の生着を選択的に促進する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗癌物質を産生するように遺伝的に改変されたストローマ細胞前駆体を含む組成物。
【請求項２】
抗癌物質がサイトカイン、ホルモン、細胞外マトリックス成分、酵素、シグナル伝達分子、血管新生阻害ポリペプチドまたは腫瘍崩壊ウイルスである、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
遺伝的に改変されたストローマ細胞前駆体がIFN-αまたはIFN-βを産生する、請求項1記載の組成物。
【請求項４】
治療物質が遺伝的に改変されたストローマ細胞前駆体から分泌される、請求項1記載の組成物。
【請求項５】
治療物質が遺伝的に改変されたストローマ細胞前駆体の細胞表面に発現される、請求項1記載の組成物。
【請求項６】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項1記載の組成物。
【請求項７】
ストローマ細胞前駆体が発現カセットのゲノム組込みによって遺伝的に改変される、請求項1記載の組成物。
【請求項８】
ストローマ細胞前駆体がエピソーム性発現ベクターによって遺伝的に改変される、請求項1記載の組成物。
【請求項９】
発現ベクターがウイルス発現ベクターである、請求項8記載の組成物。
【請求項１０】
抗癌遺伝子産物を発現するように操作されたストローマ細胞前駆体を含む抗癌組成物であって、該ストローマ細胞前駆体が過剰増殖性細胞増殖を行っている生物の領域に選択的に局在する、抗癌組成物。
【請求項１１】
ストローマ細胞前駆体が腫瘍内に生着する、請求項10記載の組成物。
【請求項１２】
抗癌遺伝子産物が、血管内に投与された場合に毒性を有する、請求項10記載の組成物。
【請求項１３】
抗癌遺伝子産物がストローマ細胞前駆体から分泌される、請求項10記載の組成物。
【請求項１４】
抗癌遺伝子産物がストローマ細胞前駆体の細胞表面に発現される、請求項10記載の組成物。
【請求項１５】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項10記載の組成物。
【請求項１６】
ストローマ細胞前駆体が発現カセットのゲノム組込みによって遺伝的に改変される、請求項10記載の組成物。
【請求項１７】
ストローマ細胞前駆体がエピソーム性発現ベクターによって遺伝的に改変される、請求項10記載の組成物。
【請求項１８】
抗癌遺伝子産物がIFN-α、IFN-β、IFN-γまたはそれらの組み合わせである、請求項10記載の組成物。
【請求項１９】
発現ベクターがウイルス発現ベクターである、請求項17記載の組成物。
【請求項２０】
癌を有する対象の治療のための方法であって、
a）ストローマ細胞前駆体をドナーから単離する段階；
b）単離されたストローマ細胞前駆体をインビトロで増殖させる段階；
c）1つまたは複数の単離されたストローマ細胞前駆体を治療物質を発現するように遺伝的に改変する段階；および
d）遺伝的に改変されたストローマ細胞前駆体を該対象に導入する段階、
を含む方法。
【請求項２１】
遺伝的に改変されたストローマ細胞前駆体が注射によって導入される、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
遺伝的に改変されたストローマ細胞前駆体が血管内注射によって導入される、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
遺伝的に改変されたストローマ細胞前駆体が腫瘍内注射によって導入される、請求項21記載の方法。
【請求項２４】
ドナーが治療を受ける対象である、請求項20記載の方法。
【請求項２５】
ドナーが異種ドナーである、請求項20記載の方法。
【請求項２６】
遺伝的に改変されたストローマ細胞前駆体を患者に導入する段階を含む、患者に治療物質を送達する方法。
【請求項２７】
患者が癌患者である、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
癌患者が慢性骨髄性白血病を有する、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
癌患者が黒色腫を有する、請求項27記載の方法。
【請求項３０】
癌患者が乳癌を有する、請求項27記載の方法。
【請求項３１】
癌患者が卵巣癌を有する、請求項27記載の方法。
【請求項３２】
癌患者が脳の癌を有する、請求項27記載の方法。
【請求項３３】
遺伝的に改変されたストローマ細胞前駆体を投与する段階を含む、腫瘍増殖を低下させる方法。
【請求項３４】
遺伝的に改変されたストローマ細胞前駆体が注射によって投与される、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
注射が血管内注射である、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
注射が腫瘍内注射である、請求項34記載の方法。
【請求項３７】
ストローマ細胞前駆体がINF-αまたはINF-βを発現する、請求項33記載の方法。
【請求項３８】
ストローマ細胞前駆体がINF-αを発現する、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
ストローマ細胞前駆体がINF-βを発現する、請求項37記載の方法。
【請求項４０】
遺伝的に改変されたストローマ細胞前駆体を投与する段階を含む、癌を有する患者における腫瘍組織量を減少させる方法。
【請求項４１】
遺伝的に改変されたストローマ細胞前駆体が注射によって投与される、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
注射が血管内注射である、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
注射が腫瘍内注射である、請求項41記載の方法。
【請求項４４】
ストローマ細胞前駆体がINF-αまたはINF-βを発現する、請求項40記載の方法。
【請求項４５】
ストローマ細胞前駆体がINF-αを発現する、請求項44記載の方法。
【請求項４６】
ストローマ細胞前駆体がINF-βを発現する、請求項44記載の方法。
【請求項４７】
遺伝的に改変されたストローマ細胞前駆体を投与する段階を含む、転移性癌を治療する方法。
【請求項４８】
遺伝的に改変されたストローマ細胞前駆体が注射によって投与される、請求項47記載の方法。
【請求項４９】
注射が血管内注射である、請求項48記載の方法。
【請求項５０】
注射が腫瘍内注射である、請求項48記載の方法。
【請求項５１】
ストローマ細胞前駆体がINF-αまたはINF-βを発現する、請求項47記載の方法。
【請求項５２】
ストローマ細胞前駆体がINF-αを発現する、請求項51記載の方法。
【請求項５３】
ストローマ細胞前駆体がINF-βを発現する、請求項51記載の方法。
【請求項５４】
遺伝的に改変されたストローマ細胞前駆体を投与する段階を含む、手術不能の腫瘍を手術可能にする方法。
【請求項５５】
遺伝的に改変されたストローマ細胞前駆体が注射によって投与される、請求項54記載の方法。
【請求項５６】
注射が血管内注射である、請求項55記載の方法。
【請求項５７】
注射が腫瘍内注射である、請求項55記載の方法。
【請求項５８】
ストローマ細胞前駆体がINF-αまたはINF-βを発現する、請求項54記載の方法。
【請求項５９】
ストローマ細胞前駆体がINF-αを発現する、請求項58記載の方法。
【請求項６０】
ストローマ細胞前駆体がINF-βを発現する、請求項58記載の方法。
【請求項６１】
遺伝的に改変されたストローマ細胞前駆体を投与する段階を含む、癌患者の生存性を高める方法。
【請求項６２】
遺伝的に改変されたストローマ細胞前駆体が注射によって投与される、請求項61記載の方法。
【請求項６３】
注射が血管内注射である、請求項62記載の方法。
【請求項６４】
注射が腫瘍内注射である、請求項63記載の方法。
【請求項６５】
ストローマ細胞前駆体がINF-αまたはINF-βを発現する、請求項61記載の方法。
【請求項６６】
ストローマ細胞前駆体がINF-αを発現する、請求項65記載の方法。
【請求項６７】
ストローマ細胞前駆体がINF-βを発現する、請求項65記載の方法。
【請求項６８】
遺伝的に改変されたストローマ細胞前駆体を投与する段階を含む、過剰増殖性疾患を抑制する方法。
【請求項６９】
遺伝的に改変されたストローマ細胞前駆体が注射によって投与される、請求項68記載の方法。
【請求項７０】
注射が血管内注射である、請求項69記載の方法。
【請求項７１】
注射が腫瘍内注射である、請求項69記載の方法。
【請求項７２】
ストローマ細胞前駆体がINF-αまたはINF-βを発現する、請求項68記載の方法。
【請求項７３】
ストローマ細胞前駆体がINF-αを発現する、請求項72記載の方法。
【請求項７４】
ストローマ細胞前駆体がINF-βを発現する、請求項72記載の方法。
【請求項７５】
治療用細胞を腫瘍内に生着させる方法であって、
a）ストローマ細胞前駆体を単離する段階；
b）単離されたストローマ細胞前駆体をインビトロで増殖させる段階；
c）1つまたは複数の単離されたストローマ細胞前駆体を治療物質を発現するように遺伝的に改変する段階；および
d）該遺伝的に改変されたストローマ細胞前駆体を対象に投与する段階、
を含む方法。
【請求項７６】
遺伝的に改変されたストローマ細胞前駆体が注射によって投与される、請求項75記載の方法。
【請求項７７】
注射が血管内注射である、請求項76記載の方法。
【請求項７８】
注射が腫瘍内注射である、請求項77記載の方法。
【請求項７９】
ストローマ細胞前駆体がINF-α、INF-β、またはそれらの組み合わせを発現する、請求項75記載の方法。
【請求項８０】
ストローマ細胞前駆体がINF-αを発現する、請求項79記載の方法。
【請求項８１】
ストローマ細胞前駆体がINF-βを発現する、請求項79記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2002年3月2日に出願された米国仮特許出願第60／361,465号（これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる）の優先権による恩典を主張するものである。
【０００２】
米国政府は、米国国立衛生研究所（National Institutes of Health）による助成金番号CA55164、CA16672およびCA49639により、本発明における権利を有すると考えられる。
【０００３】
1．発明の分野
本発明は一般に、遺伝子治療、細胞生物学および癌治療の分野に関する。より詳細には、本発明は、抗癌物質を局所的に生産すること、および／または腫瘍に対して送達することによる、細胞を介した治療法のための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
2．関連技術の説明
細胞の成長および増殖を制御するタンパク質およびその他の生体物質はしばしば、正常組織および罹患組織において局所的に産生される。通常、これらの物質は短い物理的距離にわたりパラクリン的またはオートクリン的な様式で作用するが、それらが産生部位から離れると（特にそれらが循環系に到達した場合には）急速に不活性化および／または分解される。この機序により、望ましくない全身的な影響を回避しながら局所的効果を得ることが可能となる。これらの分子の分解に対する感受性、または循環系に高レベルにある場合のこれらの分子の毒性により、これらの分子の治療的応用は制限される。
【０００５】
タンパク質またはその他の生体物質を用いる、癌などの疾患の治療における課題の一つは、大量の治療物質を長時間にわたって送達する必要があることである。罹患した細胞、組織、臓器または生物に関する研究を通じて発見された種々のペプチド、タンパク質または化合物のうち多くに関しては、化合物を疾患の治療のために十分な量として生産することが可能でない、または商業的に実現可能でない。これらの化合物、特にタンパク質の例は数多く報告されている。
【０００６】
免疫系の抗癌作用を刺激する目的で、遺伝的に改変された線維芽細胞または類似の細胞を腫瘍に投与することに基づく、細胞療法を用いる治療方法が知られている。また別の方法は、インビボでの生体物質の全身レベルを高めるために体内に投与された、遺伝的に改変された線維芽細胞またはその他の細胞を基盤とする。しかし、これらの方法はいずれも完全に満足できるものではなく、このため、改良された新たな方法が求められている。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
このため、本発明によれば、治療物質を産生するように遺伝的に改変された、ストローマ細胞前駆体（stromal cell precursor）、間葉系幹細胞（mesenchymal stem cell）またはそれらの前駆体を含む組成物が提供される。治療物質の産生は、1つまたは複数の改変細胞もしくは遺伝子改変細胞が選択的に局在する領域、または体内の微小環境が本発明の改変細胞もしくは非改変細胞の成長および／もしくは増殖をもたらす領域に限局的である（そしてそれらによって産生される）と考えられる。微小環境の例には、組織および／または臓器内の腫瘍または創傷のほか、疾患または細胞増殖に付随するその他の増殖状態が非制限的に含まれる。治療物質の局所産生は通常、物質の局所濃度の上昇をもたらすと考えられる。1つの態様において、治療物質は抗癌物質または増殖阻害物質である。抗癌物質には、サイトカイン、ホルモン、細胞外マトリックス成分、酵素、シグナル伝達分子または血管新生阻害ポリペプチドが非制限的に含まれる。個別の態様において、治療物質はインターフェロン-α、インターフェロン-β（IFN-αまたはIFN-β）、MDA7などであってもよい。治療物質は遺伝子改変細胞（例えば、ストローマ細胞前駆体または間葉系幹細胞）から分泌されてもよく、その表面に発現されてもよい。いくつかの態様において、分泌される物質は、ストローマ細胞前駆体、MSCまたはそれらの前駆体を遺伝的に改変するために用いられる遺伝子によってコードされる酵素の作用によって生成される。さまざまな態様において、本発明の組成物は薬学的に許容される担体をさらに含むと考えられる。また別の態様において、物質は増殖因子、または創傷治癒を誘導する、迅速化するもしくは別の様式で増強するその他の作用物質であってもよい。
【０００８】
いくつかの態様においては、発現ベクターを宿主細胞のゲノムに組み込むこと、または付随させることができる。発現ベクターは、治療物質（例えば、IFN-α、IFN-β、腫瘍崩壊ウイルスをコードする核酸など）または治療物質を生成する酵素を発現しうる。1つの態様において、発現ベクターは宿主細胞のゲノムに組み込むことができる。また別の態様において、発現ベクターは細胞内でエピソーム性に維持される。発現ベクターは、ウイルス発現ベクター、プラスミドを基盤とする発現ベクター、またはその他の既知の発現系のいずれでもよい。
【０００９】
さまざまな態様が、疾患を有する対象または患者の治療方法を含む。特定の態様において、対象または患者は癌と診断されている。さまざまな態様において、遺伝的改変のための細胞の源は治療を受ける対象であり、また別の態様において、遺伝的改変のための細胞の源は治療を受ける対象以外の者である。いくつかの態様において、本方法は癌を有する対象の治療を含み、これにはストローマ細胞前駆体または間葉系幹細胞を対象から単離すること；単離されたストローマ細胞前駆体または間葉系幹細胞をインビトロで増殖させること；単離されたストローマ細胞前駆体または間葉系幹細胞の1つまたは複数を、治療物質を発現するように遺伝的に改変すること；および、遺伝的に改変されたストローマ細胞前駆体または間葉系幹細胞を対象の体内に戻すことが含まれる。また別の態様において、遺伝子改変細胞は注射によって対象に導入される。さらに別の態様において、細胞（これは遺伝的に改変されたものでも改変されていないものでもよい）は血管内注射または腫瘍内注射によって導入される。いくつかの態様において、本発明の細胞は頸動脈への注射によって投与される。頸動脈に注入された本発明の細胞は、脳腫瘍内または他の増殖性細胞の集団内に生着すると考えられる。特定の態様においては、本発明の細胞が、さまざまな神経疾患または外傷または外科手術によって引き起こされた脳内の創傷または損傷内に生着することを想定している。
【００１０】
また、1つまたは複数の遺伝的に改変されたストローマ細胞前駆体、間葉系幹細胞またはそれらの前駆体を対象に導入することを含む、癌細胞への治療物質の送達のための方法も提供される。いくつかの態様において、対象は例えば、慢性骨髄性白血病、黒色腫または任意の他の癌、前癌もしくは増殖性状態を有しうる。そのほかの態様において、記載される方法に、造血細胞へと分化する幹細胞または標的領域の間葉性要素に局在しない細胞ではなく、ストローマの間葉性要素へと分化する、またはそれと結合（associate）する、遺伝的に改変されたストローマ細胞前駆体、幹細胞（例えば、間葉系幹細胞）またはそれらの前駆体を用いてもよい。本発明の細胞が、細胞増殖を支持または誘導する微小環境に、選択的に局在、結合および／または生着してもよい。
【００１１】
さまざまなその他の態様は、腫瘍増殖を低下させる方法、腫瘍組織量（tumor burden）を減少させる方法、転移性癌を治療する方法、対象の生存性を高める方法、疾患の症状を軽減する方法、および／または過剰増殖性疾患を抑制する方法を含み、これらはそれぞれ本発明の組成物を投与することによって達成される。いくつかの態様において、体内の特定の環境に応答してストローマの間葉性要素へと分化する、それと結合する、または増殖する、遺伝的に改変されたストローマ細胞前駆体、間葉系幹細胞またはそれらの前駆体は注射によって投与される。また別の態様において、細胞は血管内注射または腫瘍内注射によって投与される。さまざまな態様において、ストローマ細胞前駆体または間葉系幹細胞は、INF-α、INF-βおよび／もしくはMDA7、または直接的もしくは間接的な細胞外の機構または経路を介して作用するその他のタンパク質を発現する。
【００１２】
さまざまな態様が、治療用細胞を腫瘍内に生着させる方法であって、腫瘍マトリックスの間葉性要素に局在または生着するストローマ細胞前駆体、間葉系幹細胞またはその他の細胞種を単離すること；単離された細胞をインビトロで増殖させること；細胞の1つまたは複数を、細胞が本明細書に記載の治療物質を発現するように遺伝的に改変すること；および遺伝子改変細胞を患者または対象に投与することを含む方法を含む。投与は血管内注射によることが好ましい。
【００１３】
「1つの（a）」または「1つの（an）」という語の使用は、特許請求の範囲および／または明細書において、「含む（comprising）」という用語とともに用いられる場合には、「1つ（one）」を意味しうるが、これは「1つまたはそれ以上の」「少なくとも1つの」および「1つまたは複数の」という意味と矛盾しない。
【００１４】
本発明のその他の目的、特徴および利点は以下の詳細な説明によって明らかになると考えられる。しかし、この詳細な説明および具体例は、本発明の特定の態様を示しているものの、本発明の精神および範囲に含まれるさまざまな変更および修正がこの詳細な説明から当業者には明らかになると考えられるため、例示のみを目的として提示されていることが理解される必要がある。
【００１５】
図面は本明細書の一部をなし、本発明のある特定の局面をさらに示すために含められる。本発明は、これらの図面の1つまたは複数を、本明細書に提示する個々の態様の詳細な説明と併せて参照することにより、さらに良く理解されると考えられる。
【００１６】
例示的な態様の説明
本発明のさまざまな利点のうち1つは、作用物質を体内の特定の部位で発現させうることである。局所的な産生により、治療物質を産生する細胞と治療物質の標的との間の距離は極めて短くなる。さらに、局所濃度が高くなることで、生物または患者に対する毒性を低くして治療効果を生じることができる。このため、短寿命の作用物質を、分解または失活を最小限に抑えながら標的細胞に対して投与することができるが、作用物質は必ずしも短寿命でなくともよい。本発明はまた、体循環中または臓器系の中にある作用物質の量を制限することもできる。
【００１７】
さまざまな態様において、本発明は、細胞増殖、ならびに増殖因子および細胞増殖（例えば、癌、創傷および転移領域といった過剰増殖状態）のその他の生物的または非生物的なメディエーターと関連のある体内の部位またはその内部での、生体物質または治療物質の送達または生産のための方法を提供する。骨髄から単離されたある種の細胞（例えば、ストローマ細胞前駆体または間葉系幹細胞―MSC、この略号は1つの細胞も複数の細胞も含みうる）は、細胞増殖の亢進を特徴とする生物体内の部位に選択的に生着し、そこで増殖することができる。ストローマ細胞前駆体またはMSCは、インビトロで維持し、治療を目的として遺伝的に改変し、対象に投与して、インビボでの疾患の治療に用いることができる。さらに、非遺伝的または遺伝的に改変された細胞は、増殖性細胞、過剰増殖性細胞、癌細胞または腫瘍細胞の内部または周囲に生着して、増殖性細胞の増殖性、転移性またはその他の病的な特性を抑制することができる。ストローマ細胞前駆体またはMSC、および遺伝的に改変されたストローマ細胞前駆体またはMSCは、疾病状態に関与する細胞の増殖を抑制させるため、低下させるため、または緩徐化するための治療方法に用いうる。このアプローチは、さまざまな生体物質または治療物質の薬物動態を改良する手段としてだけでなく、体内のこのような部位における微小環境を改変するためのより一般的なツールとしても有用であると考えられる。また別の態様においては、細胞増殖または過剰増殖が起こっている微小環境（例えば、腫瘍微小環境）などの適切な微小環境の内部または周囲にある場合に、細胞、組織、臓器の間葉性要素および／または細胞マトリックスもしくは腫瘍マトリックスへと分化するか、それらまたはその内部に生着または結合する、種々の多能性細胞、前駆体または幹細胞を想定している。
【００１８】
本発明のさまざまな利点のいくつかには、ストローマ細胞前駆体またはMSCを単離して増殖させることの容易さが含まれる。また、ストローマ細胞前駆体またはMSCを、インビトロで遺伝子導入用媒介物、特にAAVまたはアデノウイルスに効率良く感染させることもできるが、他の既知の遺伝子導入用媒介物を除外するわけではない。移植すると、本発明の治療用細胞組成物は、臓器、組織、腫瘍および骨髄の内部にある標的部位に復帰または局在する。このため、増殖性細胞集団に標的指向機能が付与される。ストローマ細胞前駆体またはMSCは、標的組織に生着し、臓器、組織、骨髄、腫瘍、癌または標的細胞集団の細胞構造の内部または周囲に組み込まれることができる。ストローマ細胞前駆体またはMSCは、標的の内部または周囲に組み込まれ、その部位に長期間維持されうる。このため、本発明の細胞は、治療しようとする領域、位置または場所に生着しうる。生着した細胞は、疾病状態の治療的または予防的な処置のための作用物質、特にIFN-αおよびIFN-βを産生することができる。
【００１９】
本発明の態様は、治療物質の送達用に遺伝的に改変されたストローマ細胞前駆体またはMSCを含む組成物、ならびにその作製および使用のための方法を含む。本発明のいくつかの態様においては、ストローマ細胞前駆体またはMSCを、体内の標的部位（例えば、腫瘍部位、骨髄）で生体物質を産生するように改変することができる。腫瘍微小環境は一般に、ストローマ細胞前駆体もしくはMSCまたはそれらの前駆体の生着を促すと考えられる。いくつかの態様において、MSCは、治療物質（例えば、インターフェロン-ベータ（IFN-β）、インターフェロン-アルファ（IFN-α）または悪性細胞もしくは過剰増殖性細胞の増殖を抑制するその他の治療物質（以下を参照）を発現するような様式で改変される。それが効果を発揮するには通常、ストローマ細胞前駆体またはMSCが腫瘍または周囲組織に組み込まれることが必要であり、これは生体物質（例えば、IFN-βまたはIFN-α）の全身送達によっては達成されないと考えられる。代替的な態様において、MSC以外の細胞も想定している。本発明の範囲内で用いうる他の細胞には、ストローマ細胞前駆体もしくは幹細胞全般、胚性幹細胞、神経幹細胞、または胎盤、胚、包皮、肝臓、腎臓、肺、脾臓、腸管、皮膚、脳、脊髄、神経組織、性腺などの他の組織に由来する幹細胞が非制限的に含まれる。それぞれの細胞種は、その特定の幹細胞または細胞に特有の何らかの標的指向性を有すると考えられ、これをさまざまな細胞系譜に由来する疾患のターゲティングにうまく利用することができる。本発明の実施に有用な細胞種は一般に、増殖性細胞集団の間葉性要素に生着する、またはそれと結合すると考えられる。
【００２０】
例示的な態様（そのいくつかは以下の実施例の項に記載されている）は、生体物質を改変MSCの場所で産生させ、生体物質のみの全身送達とは量的に異なる影響を生じさせうることを示している。このため、ストローマ細胞前駆体またはMSCを、疾患、例えば癌の治療における治療物質の送達媒体として用いることができる。いくつかの態様においては、遺伝的に改変されたストローマ細胞前駆体またはMSCを局所投与する。また別の態様においては、遺伝的に改変されたストローマ細胞前駆体またはMSCを全身投与によって送達する。
【００２１】
本明細書に提示する非制限的な例は、治療用遺伝子（例えば、ヒトIFN-β遺伝子）の形質導入による腫瘍微小環境への送達システムとしての、ストローマ細胞前駆体またはMSCの治療的能力を示している。遺伝的に改変されたストローマ細胞前駆体またはMSCは、増殖性細胞および過剰増殖性細胞の内部および周囲の位置、ならびにストローマ細胞前駆体またはMSCが局在することが知られた体内の他の部位、例えば、間葉ストローマの補助を必要とする部位、骨髄、骨折、創傷、リモデリング中の組織、および細胞交代の亢進を特徴とするその他の位置などを非制限的に含む、生物体内部の他の部位にも局在しうる。
【００２２】
IFN-αは慢性骨髄性白血病（chronic myelogenous leukemia：CML）患者において血液学的寛解を誘導しうるが、持続的に細胞遺伝学的な完全寛解が得られるのは患者のうちごくわずかな割合に過ぎない。これは主として、活性部位と提唱されている骨髄で、このリンホカインを高濃度の治療量として持続させることができないことに起因する。さらに、IFN-αの全身投与を受ける患者は衰弱性の副作用に曝され、これがこの薬剤の高用量投与を続ける妨げになっているが、このことは制御された高レベルのIFN-αの局所産生により、全身性副作用を伴わずに細胞遺伝学寛解が得られる可能性を示唆している。本発明の組成物および方法は、高レベルの持続的な発現を局所的な様式で達成するための手段として用いることができる。
【００２３】
I．ストローマ細胞前駆体または間葉系幹細胞（MSC）
骨髄由来の間葉細胞は骨内部に認められる多能性細胞であり、さまざまな環境的影響に応じて、特有な種類の結合組織（すなわち、特化した要素を支える身体の組織；特に脂肪組織、疎性結合組織、骨組織、軟骨組織、弾性組織および線維性結合組織）のうち任意のものに分化することができる。本発明の態様は、インビトロで単離された、操作された、および／または遺伝的に改変された細胞種を用いての、標的部位でのストローマの間葉性要素の形成またはそれとの結合にかかわる。間葉性要素の結合または形成は、標的部位の内部または周囲の環境、例えば癌細胞微小環境などによって影響される。ストローマ細胞前駆体などの他の細胞種がストローマの間葉性要素へと分化してもよく、またはそれと結合してもよい。これらの細胞種には、MSCの前駆体、および、ストローマの間葉性要素に生着する能力またはそれと結合する能力を有するその他の多能性細胞が含まれる。増殖性細胞と関係のある微小環境（例えば、癌微小環境または腫瘍微小環境）による影響を受けた場合に、ストローマの間葉性要素の細胞を形成する能力またはそれと結合する能力を備えた任意の細胞を、本発明の文脈において用いることができる。
【００２４】
すべての組織ではないにせよ、ほとんどの組織の細胞は、増殖能力および分化能力の点で階層的に構成されている（Weissman, 2000、これは参照として本明細書に組み入れられる）。この階層性は、血液、皮膚および消化管のように自発的な細胞交代が高度な組織で全面的に発揮される。これらの組織では、短寿命の終末分化細胞が、自己再生性のある幹細胞の一区画により維持されてきた未分化前駆体によって連続的に置き換えられる。これに対して、結合組織の細胞交代は少なく、その階層的な構成は、創傷治癒時または損傷後の再生時のように新たな機能性細胞の必要性が高まった時のみに明らかとなる。骨髄由来の間葉系幹細胞（Fridenshteinら、1968；Caplan, 1991）は、高い増殖能を備えた前駆体であり（Colterら、2000）、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞（Pittengerら、1999）に分化しうるほか、おそらく他の細胞種にも分化しうる（Woodburyら、2000）。
【００２５】
動物試験および臨床試験による最近のデータからは、代謝性骨疾患における多発性骨折または出生前発育時の急速に成長する胚のように、細胞交代および組織リモデリングの亢進を特徴とする状態は、全身性に送達されたMSCの生存および増殖のために必要な有効なシグナルを生じることが示されている（Liechtyら、2000；Horwitzら、1999）。それと関連した意味で、増殖中の腫瘍における悪性細胞の増殖には、支持的な間葉ストローマの形成が必要である（HanahanおよびWeinberg、2000）。腫瘍ストローマ形成の過程は創傷治癒と類似しており（Dvorak, 1986）、間葉細胞の高度の増殖を伴う組織リモデリングが生じる（Kuniyasuら、2001）。本発明のいくつかの態様において、外因性に投与されたMSCは一般に、腫瘍部位に選択的に生着し、ストローマ線維芽細胞の集団を導くと考えられる。このため、遺伝子改変MSCによる腫瘍内での生体物質の局所産生に基づく治療戦略の開発が可能になる。また別の態様においては、同じく外因性に投与されたストローマ細胞前駆体が、腫瘍部位に選択的に生着し、ストローマ線維芽細胞の集団を導くと考えられる。
【００２６】
本明細書に記載の方法のためのストローマ細胞前駆体またはMSCは、骨髄中の他の細胞またはその他の間葉系幹細胞の源から回収することができ、そのような方法の例については、DeansおよびMoseley（2000）を参照されたい（これは参照として本明細書に組み入れられる）。骨髄細胞は、腸骨稜、大腿骨、脛骨、脊椎、肋骨またはその他の骨髄腔から入手しうる。ヒト間葉系幹細胞のその他の源には、胚卵黄嚢、胎盤、臍帯、胎児および青年期の皮膚、ならびに血液が含まれる。培養コロニーにおける間葉系幹細胞の存在は、一意的なモノクローナル抗体によって同定される特異的な細胞表面マーカーによって検証することができ、これについては、例えば米国特許第5,486,359号を参照されたい。これらの単離された間葉細胞集団は、間葉系幹細胞のみに付随するエピトープ上の特徴を示し、培養下で分化せずに再生する能力を有するほか、インビトロまたはインビボの損傷組織部位で誘導された場合に特定の間葉系譜に分化する能力も有する。
【００２７】
いくつかの態様においては、MSCの部分集団を用いうる。過去の報告により、MSCの単細胞由来のコロニーが、紡錘状細胞および大型の平坦細胞という少なくとも2種類の形態的に異なる細胞種を含むことが示されている。最近、形態的に異なる第3のMSC細胞種として小型MSCが同定された（Colterら、2000、これは参照として本明細書に組み入れられる）。細胞を非常に低い密度でプレーティングすることにより、この形態的に異なる第3の細胞種の検出および単離が可能である。この小型MSC細胞種は、極めてサイズが小さいこと、複製速度が高いこと、および多系譜への分化能が高いことを特徴とする。また、これらの細胞を、特有の表面エピトープおよび発現されるタンパク質によって同定することもできる。いくつかの態様においては、特定の細胞集団または部分集団に関して単離または富化された、細胞の部分集団を用いることができる。代替的な態様においては、遺伝的に改変された小型MSCを含む組成物を用いることができる。
【００２８】
間葉系幹細胞集団は対象から単離してもよく（自己性）、別のものから与えてもよい（異種性）。MSC、またはMSCがほとんどを占める細胞集団を単離するためには、自己または異種ドナーからのMSCの回収に有用な任意の工程を用いうる。1つの局面において、MSCの単離方法は、MSCを含む組織試料、好ましくは骨髄を用意する段階；MSCを標本から、例えば密度勾配遠心によって単離する段階；単離された細胞を、MSCを分化させずにその増殖を誘発する上に、培養した場合にMSCの基質表面に対する選択的付着を可能にする培地に添加する段階；標本-培地混合物を培養する段階；および、非付着性物質を基質表面から除去する段階を含む。
【００２９】
簡潔に述べると、骨髄吸引物または末梢血試料を採取し、PBSで1回すすぎ洗いをする。この結果得られた培養物を、25％FCSを加えたRPMIを入れたプラスチック製組織培養皿にプレーティングする。7日後に骨髄細胞をラバーポリスマンによって懸濁化した上で、抗sh2抗体、抗sh3抗体、抗sh4抗体（MSCのマーカー）と反応させ、洗浄した後に、磁性マイクロビーズ試薬をsh2,3,4抗体と結合させるために反応させ、この混合物を磁気濃縮カラムに通す。15〜18日後に線維芽細胞に似た形態を示す個々のコロニーが成長するが、これらをさらに1週間増殖させる。
【００３０】
感染のためには、MSCをPBSで1回すすぎ洗いした後に、遺伝子送達媒体（例えば、AAV、アデノウイルス、リポソーム）を含むRPMI中でインキュベートする。そのようにして感染を進行させる。指定した期間の後に、25％FCSを含む新たな培地を添加する。48時間後に細胞を、対照遺伝子（例えば、β-galの場合はx-gal染色 ）または目的の治療用遺伝子（例えば、イムノブロット法）の発現に関して分析する。十分な細胞数が得られるまで、これらの感染細胞を増殖させる。
【００３１】
II．核酸を用いた発現系
本発明の細胞の遺伝的改変は、核酸を用いた発現ベクターまたは発現系の取り込みおよび維持によって行える。発現ベクターは宿主細胞ゲノムに組み込まれてもよく、またはエピソーム性に維持されてもよい。
【００３２】
さまざまな態様において、治療用遺伝子をコードするDNAセグメントを含む組換えベクターが用いられる。発現ベクターは目的の細胞への導入後に染色体に組み込まれてもよく、またはエピソーム性に維持されてもよい。「ベクター」という用語は、細胞への導入のために核酸配列を内部に挿入し、細胞内でそれを複製および／または発現させることが可能な、担体核酸分子のことを指して用いられる。核酸配列は「外因性」であってもよく、このことはベクターが導入される細胞に対してそれが外来性であること、または配列は細胞内の配列に対して同種性であるが宿主細胞内の通常は認められない位置にあることを意味する。ベクターには、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルスおよび植物ウイルス）および人工染色体（例えば、YAC）が含まれる。当業者は、標準的な組換え法によってベクターを構築するやり方を十分に把握していると考えられ、これはSambrookら（2001）およびAusubelら（1994）に記載されている（これらは参照として本明細書に組み入れられる）。
【００３３】
「発現ベクター」という用語は、転写されうるRNAをコードする核酸を含む、任意の種類の遺伝子構築物のことを指す。場合によっては、RNA分子は続いてタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドへと翻訳される。また別の場合には、これらの配列は翻訳されず、これは例えば、アンチセンス分子またはリボザイムの作製の場合である。発現ベクターは種々の「制御配列」（これは、特定の宿主細胞における機能的に結合したコード配列の転写のために、およびおそらくは翻訳のためにも必要な核酸配列のことを指す）を含むことができる。転写および翻訳を司る制御配列に加えて、ベクターおよび発現ベクターが、他の機能を果たす核酸配列（それについては以下に述べる）を含んでもよい。
【００３４】
A．プロモーターおよびエンハンサー
「プロモーター」とは、転写の開始および速度を制御する核酸配列の一領域である制御配列のことである。これは、核酸配列の特異的な転写を開始させるための、RNAポリメラーゼおよびその他の転写因子などの調節性のタンパク質および分子が結合しうる遺伝因子を含んでもよい。「機能的に配置された」「機能的に結合した」「制御下にある」および「転写制御下にある」という語句は、プロモーターが、その配列の転写開始および／または発現を制御する上で、核酸配列に対して正しい機能的な位置および／または向きにあることを意味する。
【００３５】
プロモーターは一般に、RNA合成のための開始部位の位置を特定する働きをする配列を含む。この最もよく知られた例はTATAボックスであるが、TATAボックスを持たないプロモーター、例えば、哺乳動物のターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーターおよびSV40後期遺伝子のプロモーターなどでは、開始部位にまたがる独立したエレメントそれ自体が開始場所を固定する役割を果たす。さらに別のプロモーターエレメントは転写開始の頻度を調節する。通常、これらは開始部位の30〜110bp上流の領域に位置するが、多くのプロモーターが開始部位の下流に機能性エレメントを含むことも示されている。コード配列を「プロモーターの制御下」に置くためには、転写リーディングフレームの転写開始部位の5'末端を選択したプロモーターの「下流」（すなわち、3'側）に配置する。この「上流」プロモーターがDNAの転写を誘発し、コードされたRNAの発現を促す。
【００３６】
プロモーターエレメント間の間隔は自由度が高いことがしばしばであり、プロモーター機能はエレメントが相互に転置されたり順序が逆になっても保たれる。tkプロモーターの場合には、プロモーターエレメント間の間隔を50bpまでは活性を低下させずに延長することができる。プロモーターに応じて、個々のエレメントは転写活性化に関して協同的に作用することも独立して作用することもある。プロモーターは「エンハンサー」（この用語は核酸配列の転写活性化に関与するシス作用性調節配列のことを指す）とともに用いてもよく、これを伴わずに用いてもよい。
【００３７】
プロモーターは核酸配列に自然下で付随するものでもよく、この場合には、コード性セグメントおよび／またはエクソンの上流に位置する5'非コード配列を単離することによって入手しうる。このようなプロモーターは「内因性」と称しうる。同様に、エンハンサーが核酸配列に自然下で付随し、その配列の下流または上流に位置するものでもよい。または、コード性核酸セグメントを組換えプロモーターまたは異種プロモーター（これは天然の環境にある核酸配列には自然下では付随していないプロモーターのことを指す）の制御下に置くことにより、ある種の利点が得られると考えられる。同じく、組換えエンハンサーまたは異種エンハンサーとは、天然の環境にある核酸配列には自然下では付随していないエンハンサーのことを指す。このようなプロモーターまたはエンハンサーには、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、および任意の他のウイルスまたは原核細胞もしくは真核細胞から単離されたプロモーターまたはエンハンサー、および「天然性」でないプロモーターまたはエンハンサー、すなわち異なる転写調節領域の異なるエレメントおよび／または発現を変化させる変異を含むものが含まれうる。例えば、組換えDNAの構築に最もよく用いられるプロモーターには、β-ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースおよびトリプトファン（trp）のプロモーター系が含まれる。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成的に作製することに加えて、組換えクローニングおよび／または核酸増幅技術（PCR（商標）を含む）を本明細書に開示する組成物とともに用いて配列を作製することもできる（米国特許第4,683,202号および第5,928,906号を参照、これらはそれぞれ参照として本明細書に組み入れられる）。さらに、ミトコンドリア、葉緑体といった非核性オルガネラの内部にある配列の転写および／または発現を導く制御配列を用いることも想定している。
【００３８】
当然ながら、発現用に選択した細胞種においてDNAセグメントの発現を有効に導くプロモーターおよび／またはエンハンサーを用いることが重要と考えられる。分子生物学の当業者は一般に、タンパク質発現のためのプロモーター、エンハンサーおよび細胞種の組み合わせの使用について把握している（例えばSambrookら（2001）を参照、これは参照として本明細書に組み入れられる）。用いるプロモーターは、構成性のもの、組織特異的なもの、誘導性のもの、および／または、導入したDNAセグメントの高レベルの発現を導く適切な条件下で有用なものでよい。プロモーターは異種性でも内因性でもよい。
【００３９】
さらに、発現を行わせるには、プロモーター／エンハンサーの任意の組み合わせ（例えば、真核生物プロモーターデータベースEPDB、http://www.epd.isb-sib.ch/）を用いうると考えられる。T3、T7またはSP6細胞質発現系は、可能と考えられる別の態様である。真核細胞は、適切な細菌ポリメラーゼが送達用複合体の一部または別の遺伝子発現用構築物として与えられれば、ある種の細菌プロモーターからの細胞質転写に耐えうる。
【００４０】
表Aには、本発明の文脈においてRNAの発現の調節に用いうる、エレメント／プロモーターの非制限的な例を列挙している。表Bは、特定の刺激に応じて活性化されうる核酸配列の領域である、誘導性エレメントの非制限的な例を示している。
【００４１】
（表Ａ）プロモーターおよび／またはエンハンサー
2005531507.tif 000002
2005531507.tif 000003
【００４２】
（表Ｂ）誘導性エレメント
2005531507.tif 000004
【００４３】
組織特異的プロモーターまたはエレメントの実体、ならびにそれらの活性を特徴づけるためのアッセイは当業者に周知である。このような領域の非制限的な例には、ヒトLIMK2遺伝子（Nomotoら、1999）、ソマトスタチン受容体2遺伝子（Krausら、1998）、マウス精巣上体レチノイン酸結合遺伝子（Lareyreら、1999）、ヒトCD4（Zhao-Emonetら、1998）、マウスα2（XI）コラーゲン（Tsumakiら、1998）、D1Aドーパミン受容体遺伝子（Leeら、1997）、インスリン様増殖因子II（Wuら、1997）およびヒト血小板内皮細胞接着分子-1（Almendroら、1996）が含まれる。
【００４４】
B．開始シグナルおよびリボソーム内部結合部位
コード配列の効率的な翻訳のために特定の開始シグナルが必要なことがある。これらのシグナルにはATG開始コドンまたは隣接配列が含まれる。ATG開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルを与えることが必要なこともある。当業者は容易にこれを判断して必要なシグナルを用意することができると考えられる。挿入物全体を確実に翻訳させるためには開始コドンが所望のコード配列のリーディングフレームと「インフレーム」になければならないことはよく知られている。外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは天然のものでも合成性でもよい。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメントを含めることによって高めうる。
【００４５】
本発明のいくつかの態様においては、多遺伝子性または多シストロン性のメッセージを作製するためにリボソーム内部進入部位（internal ribosome entry sites：IRES）エレメントが用いられる。IRESエレメントは、リボソームスキャニングモデルによる5'メチル化Cap依存的な翻訳を回避して、内部部位で翻訳を開始させることが可能である（PelletierおよびSonenberg, 1988）。IRESエレメントは、ピコルナウイルス科の2つのメンバー（ポリオウイルスおよび脳心筋炎ウイルス）のものが記載されており（PelletierおよびSonenberg, 1988）、哺乳動物メッセージ由来のものも同様である（MacejakおよびSarnow, 1991）。IRESエレメントは異種オープンリーディングフレームとの連結が可能である。IRESによって隔てられた複数のオープンリーディングフレームを一緒に転写させ、多シストロン性メッセージを作製することができる。IRESエレメントの作用により、各オープンリーディングフレームをリボソームに接近させ、効率的な翻訳を行わせることが可能である。単一のプロモーター／エンハンサーを用いて複数の遺伝子を効率的に発現させ、単一のメッセージとして転写させることが可能である（米国特許第5,925,565号および第5,935,819号を参照されたい。これらはそれぞれ参照として本明細書に組み入れられる）。
【００４６】
C．マルチクローニングサイト
ベクターはマルチクローニングサイト（multiple cloning site：MCS）を含むことができ、これは多数の制限酵素部位を含む核酸領域であり、その任意のものを標準的な組換え技術と併せて用いることでベクターを消化することができる（例えば、Carbonelliら、1999、Levensonら、1998およびCocea, 1997を参照。これらは参照として本明細書に組み入れられる）。「制限酵素消化」とは、核酸分子の特定の部位のみに働く酵素による核酸分子の触媒性切断のことを指す。これらの制限酵素の多くは市販されている。このような酵素の使用は当業者に認識されている。しばしばベクターは、外因性配列をベクターと連結させるために、MCS内部に切れ目を入れる制限酵素による直鎖状化または断片化を受ける。「連結」とは、2つの核酸断片間にホスホジエステル結合を形成させる工程のことを指す（この2つは互いに連続しても連続しなくてもよい）。制限酵素および連結反応に関する技法は、組換え技術の当業者には周知である。
【００４７】
D．スプライシング部位
転写された真核生物RNA分子の大部分はRNAスプライシングを受け、イントロンが一次転写物から除去される。真核生物ゲノム配列を含むベクターは、タンパク質発現用の転写物が正しいプロセシングを受けるためにスプライス供与部位および／またはスプライス受容部位を要することがある（例えば、Chandlerら、1997を参照されたい。これは参照として本明細書に組み入れられる）。
【００４８】
E．終結シグナル
本発明のベクターまたは構築物は一般に、少なくとも1つの終結シグナルを含むと考えられる。「終結シグナル」または「ターミネーター」は、RNAポリメラーゼによるRNA転写物の特異的終結に関与するDNA配列を含む。このため、いくつかの態様においては、RNA転写物の産生を終了させる終結シグナルを想定している。望ましいメッセージレベルを達成するためにターミネーターがインビボで必要な場合もある。
【００４９】
真核生物系では、ターミネーター領域が、新たな転写物の部位特異的切断によってポリアデニル化部位を露出させるための特異的なDNA配列を含んでもよい。これがシグナルとなり、特化した内因性ポリメラーゼが転写物の3'末端に約200個のA残基（ポリA）を付加する。このポリA尾部で修飾されたRNA分子はより安定化し、より効率的に翻訳されるように思われる。したがって、真核生物に関係する他の態様において、ターミネーターはRNAの切断のためのシグナルを含む方が好ましく、さらに、ターミネーターシグナルがメッセージのポリアデニル化を促すことが好ましい。ターミネーターおよび／またはポリアデニル化部位エレメントは、メッセージのレベルを高め、カセットから他の配列への読み過しを最小限に減らす役割を果たす。
【００５０】
本発明における使用が想定されるターミネーターには、例えば、遺伝子の終結配列（例えば、ウシ成長ホルモンのターミネーターなど）またはウイルス終結配列（例えばSV40ターミネーターなど）を非制限的に含む、本明細書に記載した、または当業者に知られた、任意の既知の転写ターミネーターが含まれる。いくつかの態様において、終結シグナルは、配列切断などのために転写可能または翻訳可能な配列を欠いたものでもよい。
【００５１】
F．ポリアデニル化シグナル
発現において、特に真核生物での発現においては、転写物の適切なポリアデニル化を行わせるためにポリアデニル化シグナルを含めることが一般的と考えられる。ポリアデニル化シグナルの性質は本発明を首尾良く実施するために特に重要ではないと考えられ、このような任意の配列を用いることができる。好ましい態様には、便利でしかもさまざまな標的細胞でうまく働くことが知られている、SV40ポリアデニル化シグナルまたはウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルが含まれる。ポリアデニル化は転写物の安定性を高める、または細胞質輸送を容易にすると考えられる。
【００５２】
G．複製起点
ベクターを宿主細胞内で増殖させるためには、複製がその部位で開始される特定の核酸配列である複製起点部位（しばしば「ori」と呼ばれる）を1つまたは複数含めるとよい。または、宿主細胞が酵母であれば、自律複製配列（autonomously replicating sequence：ARS）を用いることもできる。
【００５３】
H．選択マーカーおよびスクリーニング用マーカー
本発明のいくつかの態様において、本発明の核酸構築物を含む細胞は、発現ベクターにマーカーを含めることにより、インビトロまたはインビボで同定しうる。このようなマーカーは、発現ベクターを含む細胞の容易な同定を可能にする識別可能な変化を細胞に付与すると考えられる。一般に、選択マーカーとは、選択を可能にする性質を付与するもののことである。陽性選択マーカーとは、マーカーの存在によってその選択が可能になるものであり、一方、陰性選択マーカーとはその存在によってその選択が妨げられるもののことである。陽性選択マーカーの一例は薬剤耐性マーカーである。
【００５４】
通常、薬剤選択マーカーを含めることは形質転換体のクローニングおよび同定に役立ち、例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、DHFR、GPT、ゼオシンおよびヒスチジノールは有用な選択マーカーである。形質転換体を条件の実行に基づいて識別することを可能にする表現型を付与するマーカーのほかに、GFP（その基盤は比色分析である）などのスクリーニング用マーカーを含む別の種類のマーカーも想定している。または、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（tk）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）などのスクリーニング用酵素を用いることもできる。当業者は、免疫マーカーを用いる手法（おそらくはFACS分析と組み合わせて）も周知していると考えられる。用いるマーカーの種類は、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現される限り、特に重要ではないと考えられる。選択マーカーおよびスクリーニング用マーカーのそのほかの例は当業者に周知である。
【００５５】
I．プラスミドベクター
いくつかの態様においては、宿主細胞の形質転換に用いるためのプラスミドベクターを想定している。一般的には、宿主細胞との適合性がある種に由来するレプリコンおよび制御配列を含むプラスミドベクターが、そのような宿主とともに用いられる。ベクターは通常、複製部位のほかに、形質転換細胞における表現型選択を可能にする標識配列を有する。非制限的な例においては、大腸菌がしばしば、大腸菌種に由来するプラスミドであるpBR322の派生物を用いて形質転換される。pBR322はアンピシリンおよびテトラサイクリンに対する耐性遺伝子を含んでおり、このため、形質転換細胞を同定するための簡便な手段となる。pBRプラスミド、またはその他の微生物性プラスミドもしくはファージは、例えば、微生物が自らのタンパク質を発現するために用いうるプロモーターなども含む必要がある、または含むように改変される必要がある。
【００５６】
さらに、宿主微生物との適合性があるレプリコンおよび制御配列を含むファージベクターを、形質転換ベクターとして、そのような宿主とともに用いることもできる。例えば、ファージラムダGEM（商標）-11を組換えファージベクターの作製に用い、これを例えば大腸菌LE392などの宿主細胞の形質転換に用いることもできる。
【００５７】
そのほかの有用なプラスミドベクターには、pINベクター（InouyeおよびInouye, 1985）；およびpGEXベクターが含まれ、これは後に精製および分離または切断を行うためのグルタチオンS-トランスフェラーゼ（glutathione S-transferase：GST）可溶性融合タンパク質の作製に用いるために用いられる。その他の適した融合タンパク質にはβ-ガラクトシダーゼ、ユビキチンなどとのものがある。
【００５８】
発現ベクターを含む細菌宿主細胞、例えば大腸菌を、さまざまな適した培地のうち任意のもの、例えばLBの中で増殖させる。ある種のベクター中の組換えタンパク質の発現は、当業者が理解しているように、宿主細胞をその特定のプロモーターに対して特異的な物質と接触させることにより、例えば、IPTGを培地に添加することにより、またはインキュベーションをより高温に切り替えることによって誘導しうる。細菌をさらに一定期間、一般には2〜24時間培養した後に、細胞を遠心によって収集し、残った培地を除去するために洗浄する。
【００５９】
J．ウイルスベクター
ある種のウイルスは、受容体を介したエンドサイトーシスによって細胞に感染または進入し、宿主細胞ゲノムに組み込まれてウイルス遺伝子を安定的かつ効率的に発現する能力があることから、外来性核酸を細胞（例えば、哺乳動物細胞）に導入するための魅力のある候補となっている。本発明の核酸の送達に用いうるウイルスベクターの非制限的な例を以下に述べる。
【００６０】
1．AAVベクター
核酸を、アデノウイルスの助けを借りたトランスフェクションを用いて細胞に導入することができる。アデノウイルスと組み合わせた系を用いた細胞系で高いトランスフェクション効率が報告されている（KelleherおよびVos, 1994；Cottenら、1992；Curiel, 1994）。アデノ随伴ウイルス（adeno-associated virus：AAV）は、組込み頻度が高い上に非分裂性細胞を感染させることが可能であり、そのため例えば組織培養下（Muzyczka, 1992）またはインビボの哺乳動物細胞への遺伝子の送達に有用であることから、本発明に用いる上で魅力のあるベクター系である。AAVが感染性を有する宿主の範囲は広い（Tratschinら、1984；Laughlinら、1986；Lebkowskiら、1988；McLaughlinら、1988）。rAAVベクターの作製および使用に関する詳細は、米国特許第5,139,941号および第4,797,368号に記載されており、これらはそれぞれ参照として本明細書に組み入れられる。
【００６１】
2．アデノウイルスベクター
核酸の送達のためのある特定の方法では、アデノウイルス発現ベクターを用いる。アデノウイルスベクターはゲノムDNAへの組込み能力が低いことが知られているが、この特徴は、これらのベクターによって得られる遺伝子導入の効率の高さによって補われる。「アデノウイルス発現ベクター」には、（a）構築物のパッケージングを支える、および（b）内部にクローニングされた組織特異的または細胞特異的な構築物を最終的に発現する、のに十分なアデノウイルス配列を含む構築物が含まれる。36kbの直鎖状二本鎖DNAウイルスであるアデノウイルスの遺伝子構成は知られているため、アデノウイルスDNAの大きな部分を最長7kbの外来配列によって置き換えることが可能である（GrunhausおよびHorwitz, 1992）。
【００６２】
3．レトロウイルスベクター
レトロウイルスは、自らの遺伝子を宿主ゲノムに組み込み、多くの量の外来遺伝物質を運び、広範囲の種および細胞種を感染させるとともに、特殊な細胞系にパッケージングされる能力があるため、本明細書に記載した方法における遺伝的改変のための送達ベクターとして有望である（Miller, 1992）。
【００６３】
レトロウイルスベクターを構築するためには、核酸（例えば、目的の治療用遺伝子をコードするもの）をウイルスゲノム中の特定のウイルス配列の位置に挿入して、複製能が欠損したウイルスを作製する。ビリオンを作製するためには、gag遺伝子、pol遺伝子およびenv遺伝子を含むがLTRおよびパッケージング成分は含まないパッケージング細胞系を構築する（Mannら、1983）。cDNAをレトロウイルスLTRおよびパッケージング配列とともに含む組換えプラスミドを特殊な細胞系に導入すると（例えば、リン酸カルシウム沈殿により）、パッケージング配列が組換えプラスミドのRNA転写物をウイルス粒子内にパッケージングし、それが続いて培地中に分泌される（NicolasおよびRubenstein, 1988；Temin, 1986；Mannら、1983）。続いて、組換えレトロウイルスを含む培地を収集し、選択的には濃縮した上で遺伝子導入に用いる。レトロウイルスベクターは幅広いさまざまな細胞種を感染させうる。しかし、組込みおよび安定的な発現には宿主細胞の分裂が必要である（Paskindら、1975）。
【００６４】
レンチウイルスは複合的なレトロウイルスであり、共通のレトロウイルス遺伝子gag、polおよびenvに加えて、調節機能または構造機能を備えた他の遺伝子を含む。レンチウイルスベクターは当技術分野で周知である（例えば、Naldiniら、1996；Zuffereyら、1997；Blomerら、1997；米国特許第6,013,516号および第5,994,136号を参照のこと）。レンチウイルスの例をいくつか挙げると、ヒト免疫不全ウイルス：HIV-1、HIV-2およびサル免疫不全ウイルス：SIVがある。レンチウイルスベクターは、HIVビルレンス遺伝子を多重的に減弱させること、例えば遺伝子env、vif、vpr、vpuおよびnefを除去してベクターを生物学的に安全にすることによって作製されている。
【００６５】
組換えレンチウイルスベクターは非分裂性細胞を感染させることができ、インビボ遺伝子導入およびエクスビボ遺伝子導入の両方ならびに核酸配列の発現のために用いることができる。例えば、非分裂性細胞を感染させうる組換えレンチウイルスであって、適した宿主細胞にパッケージング機能、すなわちgag、polおよびenv、さらにはrevおよびtatを有する2種類またはそれ以上のベクターをトランスフェクトさせるものが、米国特許第5,994,136号に記載されており、これは参照として本明細書に組み入れられる。エンベロープタンパク質に、特定の細胞種の受容体に対するターゲティング用の抗体または特定のリガンドを結合させることにより、組換えウイルスのターゲティングを行うことができる。目的の配列（調節領域を含む）を、例えば、特定の標的細胞上の受容体に対するリガンドをコードする別の遺伝子とともにウイルスベクターに挿入することにより、ベクターは標的特異的となる。
【００６６】
4．他のウイルスベクター
別のウイルスベクターを、本発明における核酸構築物および遺伝子改変法として用いることもできる。ワクシニアウイルス（Ridgeway, 1988；BaichwalおよびSugden, 1986；Couparら、1988）、シンドビスウイルス、サイトメガロウイルスおよび単純ヘルペスウイルスなどのウイルスに由来するベクターを用いうる。それらは種々の哺乳動物細胞に魅力のある特徴をいくつか与える（Friedmann, 1989；Ridgeway, 1988；BaichwalおよびSugden, 1986；Couparら、1988；Horwichら、1990）。
【００６７】
5．改変ウイルスを用いる送達
送達しようとする核酸を、特異的結合リガンドを発現するように操作された感染性ウイルス内に収容することもできる。このため、ウイルス粒子は標的細胞のコグネイト受容体と特異的に結合し、その内容物を細胞に送達すると考えられる。ウイルスエンベロープに対するラクトース残基の化学的付加によるレトロウイルスの化学修飾に基づく、レトロウイルスベクターの特異的ターゲティングを可能にするように設計された新規なアプローチが開発された。この修飾により、シアロ糖タンパク質受容体を介した肝細胞の特異的感染が可能になる。
【００６８】
レトロウイルスエンベロープタンパク質に対するビオチン化抗体および特異的細胞受容体に対するビオチン化抗体を用いる、組換えレトロウイルスのターゲティングのためのもう1つのアプローチも開発されている。抗体はストレプトアビジンを用いることにより、ビオチン成分と結合した（Rouxら、1989）。主要組織適合性複合体クラスI抗原およびクラスII抗原に対する抗体を用いて、彼らは、そのような表面抗原を有するさまざまなヒト細胞が同種指向性ウイルスにインビトロで感染することを示している（Rouxら、1989）。
【００６９】
B．ベクター送達および細胞形質転換
本発明に用いる細胞の形質転換を目的とする核酸送達のために適した方法には、核酸（例えば、DNA）を細胞に導入することができる、本明細書に記載したような、または当業者に周知であるような、事実上すべての方法が含まれると考えられる。このような方法には、エクスビボでのトランスフェクション（Wilsonら、1989；Nabelら、1989）、電気穿孔（米国特許第5,384,253号、これは参照として本明細書に組み入れられる；Tur-Kaspaら、1986；Potterら、1984）；リン酸カルシウム沈殿（GrahamおよびVan Der Eb, 1973；ChenおよびOkayama, 1987；Rippeら、1990）；DEAE-デキストランを用いた後にポリエチレングリコールを用いること（Gopal, 1985）；直接的な超音波ローディング（Fechheimerら、1987）；リポソームを介したトランスフェクション（NicolauおよびSene, 1982；Fraleyら、1979；Nicolauら、1987；Wongら、1980；Kanedaら、1989；Katoら、1991）および受容体を介したトランスフェクション（WuおよびWu, 1987；WuおよびWu, 1988）など；ならびにこのような方法の任意の組み合わせによる、DNAの直接的送達が非制限的に含まれる。これらのような技法の適用により、細胞を安定的または一時的に形質転換させることができる。
【００７０】
1．エクスビボ形質転換
生物からエクスビボ状況下で採取した細胞をトランスフェクトするための方法は当業者に周知である。例えば、イヌ内皮細胞がインビトロでのレトロウイルス遺伝子導入によって遺伝的に改変され、イヌに移植されている（Wilsonら、1989）。もう1つの例では、ユカタンミニブタ内皮細胞がインビトロでレトロウイルスによってトランスフェクトされ、ダブルバルーンカテーテルを用いて動脈内に移植された（Nabelら、1989）。このため、細胞または組織を採取して、本発明の核酸を用いてエクスビボでトランスフェクトすることが想定される。特別な局面においては、細胞を生物の内部に配置することも考えられる。
【００７１】
2．電気穿孔
本発明のいくつかの態様において、核酸は電気穿孔法によってオルガネラ、細胞、組織または生物体に導入される。電気穿孔法では、細胞およびDNAの懸濁液を高電圧放電に曝露させる。この方法のいくつかの変法では、ある種の細胞壁分解酵素、例えばペクチン分解酵素を用いて、標的レシピエント細胞が非処理細胞よりも電気穿孔による形質転換を受けやすくなるようにする（米国特許第5,384,253号、これは参照として本明細書に組み入れられる）。または、機械的創傷によってレシピエント細胞が形質転換を受けやすくなるようにすることもできる。
【００７２】
電気穿孔法を用いた真核細胞のトランスフェクションはよく成功している。このようにして、マウスのプレBリンパ球に対してヒトκ-免疫グロブリン遺伝子がトランスフェクトされており（Potterら、1984）、ラット肝細胞に対してクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子がトランスフェクトされている（Tur-Kaspaら、1986）。
【００７３】
3．リン酸カルシウム
本発明の別の態様では、リン酸カルシウム沈殿を用いて細胞に核酸を導入する。この技法を用いて、ヒトKB細胞に対してアデノウイルス5 DNAがトランスフェクトされている（GrahamおよびVan Der Eb, 1973）。同じくこのようにして、マウスL（A9）細胞、マウスC127細胞、CHO細胞、CV-1細胞、BHK細胞、NIH3T3細胞およびHeLa細胞に対してネオマイシンマーカー遺伝子がトランスフェクトされており（ChenおよびOkayama, 1987）、ラット肝細胞に対して種々のマーカー遺伝子がトランスフェクトされている（Rippeら、1990）。
【００７４】
4．DEAE-デキストラン
もう1つの態様において、DEAEデキストランを用いた後にポリエチレングリコールを用いることにより、核酸は細胞内に送達される。このようにして、レポータープラスミドがマウス骨髄腫細胞および赤白血病細胞に導入されている（Gopal, 1985）。
【００７５】
5．超音波ローディング
本発明のまた別の態様は、直接的な超音波ローディングによる核酸の導入を含む。超音波ローディングにより、LTK−線維芽細胞に対してチミジンキナーゼ遺伝子がトランスフェクトされている（Fechheirnerら、1987）。
【００７６】
6．リポソームを介したトランスフェクション
本発明のさらにもう1つの態様では、核酸を、脂質複合体、例えばリポソームなどの内部に封入する。リポソームはリン脂質二分子膜および内部の水性媒質を特徴とする小胞状構造である。多重層リポソームは水性媒質によって隔てられた多数の脂質層を有する。それらはリン脂質を水溶液の範囲を超えて懸濁化すると自発的に形成される。脂質成分が自己再配列した後に閉鎖構造が形成され、脂質二分子層の間に水および溶解した溶質が封入される（GhoshおよびBachhawat, 1991）。Lipofectamine（Gibco BRL）またはSuperfect（Qiagen）との複合体を形成した核酸も想定している。
【００７７】
インビトロでのリポソームを介した核酸送達および外来DNAの発現は非常にうまくいっている（NicolauおよびSene, 1982；Fraleyら、1979；Nicolauら、1987）。リポソームを介した外来DNAの送達および発現を培養ニワトリ胚、HeLa細胞および肝癌細胞で実施可能であることも示されている（Wongら、1980）。
【００７８】
本発明のいくつかの態様において、リポソームを凝集性ウイルス（hemagglutinating virus：HVJ）と複合体化することもできる。これにより、リポソームに封入したDNAの細胞膜との融合が助長され、細胞への進入が促進されることが示されている（Kanedaら、1989）。また別の態様において、リポソームを核内非ヒストン性染色体タンパク質（HMG-1）と複合体化すること、または併せて用いることもできる（Katoら、1991）。さらに別の態様において、リポソームをHVJおよびHMG-1の両方と複合体化すること、または併せて用いることもできる。また別の態様において、送達媒体はリガンドおよびリポソームを含みうる。
【００７９】
7．受容体を介したトランスフェクション
さらにまた、受容体を介した送達媒体によって核酸を標的細胞に送達することもできる。これらは、標的細胞で起こると考えられる受容体を介したエンドサイトーシスによる巨大分子の選択的取り込みを利用している。さまざまな受容体が細胞種特異的に分布していることを考えれば、この送達方法は本発明に対して別の度合いの特異性を付け加えるものである。
【００８０】
受容体を介したある種の遺伝子ターゲティング用媒体は、細胞受容体特異的なリガンドおよび核酸結合物質を含む。また別のものは、送達しようとする核酸を機能的に結合させた細胞受容体特異的リガンドを含む。受容体を介した遺伝子導入の目的にはいくつかのリガンドが用いられており（WuおよびWu, 1987；Wagnerら、1990；Peralesら、1994；Myers、欧州特許第0273085号）、これによってこの技法の実施可能性が立証されている。別の哺乳動物細胞種を用いた状況での特異的送達も記載されている（WuおよびWu, 1993；これは参照として本明細書に組み入れられる）。本発明のいくつかの局面において、リガンドは、標的細胞集団の表面に特異的に発現される受容体に対応するように選択されると考えられる。
【００８１】
また別の態様において、細胞特異的な核酸ターゲティング用媒体の核酸送達媒体成分は、特異的結合リガンドをリポソームと組み合わせたものを含む。送達しようとする核酸をリポソーム内部に収容し、特異的結合リガンドをリポソーム膜内に機能的に組み入れる。これにより、リポソームは標的細胞の受容体と特異的に結合し、その内容物を細胞に送達すると考えられる。このような系は、例えば、上皮増殖因子（EGF）を受容体を介した細胞への核酸の送達に用い、その細胞がEGF受容体のアップレギュレーションを示すといった系を用いて、機能することが示されている。
【００８２】
さらに別の態様において、ターゲティング用送達媒体の核酸送達媒体成分はリポソーム単独でもよく、これは細胞特異的結合を導く1つまたは複数の脂質または糖タンパク質を含むことが好ましいと考えられる。例えば、ガラクトース末端アシアロガングリオシドの一つであるラクトシル-セラミドをリポソームに組み入れることで、肝細胞によるインスリン遺伝子の取り込みの増加が観察されている（Nicolauら、1987）。組織特異的な形質転換を行う本発明の構築物を、同様の様式で標的細胞内に特異的に送達することが可能と考えられる。
【００８３】
8．微粒子銃法
微粒子銃法は、核酸を少なくとも1つのオルガネラ、細胞、組織または生物体に導入するために用いうる（米国特許第5,550,318号；第5,538,880号；および第5,610,042号；ならびにPCT出願・国際公開公報第94／09699号；これらはそれぞれ参照として本明細書に組み入れられる）。この方法は、DNAをコーティングした微粒子を高速に加速し、細胞を死滅させずに細胞膜を貫通させて細胞内に入れることが可能なことに依拠している（Kleinら、1987）。当技術分野で知られた微粒子銃法にはさまざまなものがあり、その多くを本発明に適用することができる。
【００８４】
この微粒子銃法では、1つまたは複数の粒子を少なくとも1つの核酸でコーティングし、推進力を与えることによって細胞内に導入することができる。微粒子を加速するための装置はいくつか開発されている。このような装置の一つは、高電圧放電によって電流を発生させ、それを原動力とすることに依拠している（Yangら、1990）。用いる微粒子は、タングステンまたは金の粒子またはビーズといった生物的に不活性な物質からなっている。粒子の例にはタングステン、白金が含まれ、金が好ましい。場合によっては、微粒子銃法を用いたレシピエント細胞へのDNA送達のために、金属粒子表面へのDNA沈着は必要でないと考えられる。しかし、粒子がDNAでコーティングされるのではなく、DNAを含んでもよい。DNAをコーティングした粒子は粒子銃法によるDNA送達のレベルを高めると思われるが、それ自体が不可欠なわけではない。
【００８５】
射入（bombardment）のためには、懸濁液中の細胞をフィルターまたは固形培地上に濃縮させる。射入を受ける細胞を、微粒子ストッピングプレート（stopping plate）の下に適切な距離をおいて配置する。
【００８６】
DNAを加速によって細胞（例えば、植物細胞）内に送達するための1つの例示的な態様は、バイオリスティック粒子送達システム（Biolistics Particle Delivery System）であり、これはDNAをコーティングした粒子または細胞を、細胞で覆われたフィルター面に向かって、ステンレス鋼またはNytexスクリーンなどのスクリーンを通して射出する目的に用いることができる。スクリーンはレシピエント細胞が大きな塊として送達されないように粒子を分散させる。射出装置と射入を受ける細胞との間にスクリーンが介在することにより、射出塊のサイズが小さくなるほか、過度に大きい射出物によってレシピエント細胞が受ける損傷が軽減されることによって形質転換頻度の上昇にもつながると考えられている。
【００８７】
C．宿主細胞
本発明の宿主細胞には、ストローマ細胞前駆体または間葉系幹細胞のほか、本発明の標的部位の間葉性要素に生着するかそれと結合する、始原細胞、前駆体またはその他の幹細胞が含まれる。本明細書で用いる場合、「細胞」「細胞系」および「細胞培養物」という用語は互換的に用いうる。これらの用語はいずれも、その子孫、すなわち以降の任意およびすべての世代も含む。人為的または偶発的な変異のために、すべての子孫が同一でなくてもよいことは認識されている。治療物質をコードする異種核酸配列を発現させる文脈において、「宿主細胞」は真核細胞のことを指し、これにはベクターの複製および／またはベクターによりコードされる異種遺伝子の発現を行える形質転換可能な任意の細胞が含まれる。宿主細胞はベクターのレシピエントとして用いることができ、用いられている。宿主細胞は「トランスフェクトさせること」または「形質転換を行うこと」ができ、これは外因性核酸を宿主細胞に移入または導入する工程のことを指す。形質転換細胞には、初代対象細胞およびその子孫が含まれる。本明細書で用いる場合、「操作された（engineered）」「遺伝的に改変された（genetically modified）」「遺伝的に改変された（genetically altered）」および「組換え（recombinant）」細胞または宿主細胞という用語は、ベクターなどの外因性核酸配列が導入された細胞のことを指すことを意図している。したがって、組換え細胞は、組換え的に導入された核酸を含まない天然細胞とは区別しうる。本発明のさまざまな態様において、宿主細胞は、幹細胞、幹細胞の前駆体、または何らかの程度の分化を引き起こす何らかの生理的変化を来した幹細胞のうち1つまたは複数であってよい。いくつかの態様において、宿主細胞はMSCまたはそれらの前駆体であってよい。
【００８８】
いくつかの態様においては、RNAまたはタンパク質配列を別の選択されたRNAまたはタンパク質配列とともに同じ宿主細胞内で共発現させることを考えている。共発現は、宿主細胞に2種類またはそれ以上の組換えベクターを同時トランスフェクトすることによって行いうる。または、RNAに関する複数の異なるコード領域を含むように単一の組換えベクターを構築し、続いてそれを、その単一のベクターをトランスフェクトした宿主細胞で発現させることもできる。
【００８９】
組織は生物体の部分でもよく、またはそれから分離されたものでもよい。いくつかの態様において、組織には、脂肪細胞、肺胞、エナメル芽細胞、軸索、基底細胞、血液、リンパ球、血管、骨、骨髄、脳、乳房、軟骨、子宮頸部、結腸、角膜、胚、子宮内膜、内皮、上皮、食道、筋膜、線維芽細胞、濾胞、神経節細胞、グリア細胞、杯細胞、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、筋肉、ニューロン、卵巣、膵臓、末梢血、前立腺、皮膚、皮膚、小腸、脾臓、幹細胞、胃、精巣、葯、腹水組織、穂軸、穂、花、殻、仁、葉、分裂細胞、花粉、根尖、根、絹、茎、およびそれらすべての癌が非制限的に含まれる。
【００９０】
いくつかの態様において、宿主細胞または組織は、少なくとも1つの生物体に含まれるものでもよい。いくつかの態様において、生物体は、当業者によって理解されるように、原核生物（例えば、真正細菌、古細菌）または真核生物でありうるが、これには制限されない（例えば、ウェブページhttp://phylogeny.arizona.edu/tree/phylogeny.htmlを参照のこと）。
【００９１】
さまざまな細胞系および培養物を宿主細胞として利用することができ、それらは生きた状態の培養物および遺伝物質の保管機関であるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection：ATCC）（www.atcc.org）から入手することもでき、または治療を必要とする対象もしくは治療を必要とする対象ではないドナー対象から得た組織試料から入手した初代培養物でもよい。当業者はベクターの基本骨格および所望の結果に基づき、適した宿主を決定することができる。例えば、プラスミドまたはコスミドは、多数のベクターの複製のために原核宿主細胞に導入することができる。ベクターの複製および／または発現のために利用しうる細胞種には、細菌、例えば大腸菌（例えば、大腸菌RR1株、大腸菌LE392株、大腸菌B株、大腸菌X1776株（ATCC番号31537）ならびに大腸菌W3110株（F-、λ-、原栄養性、ATCC番号273325）、DH5α株、JM109株およびKC8株、枯草菌などの桿菌；ならびにネズミチフス菌、霊菌などのその他の腸内細菌、種々のシュードモナス属細菌、さらにはさまざまな市販の細菌宿主（例えばSURE（登録商標）コンピテント細胞およびSOLOPACK（商標）ゴールド細胞（STRATAGENE（登録商標）, La Jolla）など）などが非制限的に含まれる。いくつかの態様においては、大腸菌LE392株などの細菌細胞をファージウイルス用の宿主細胞として特に想定している。
【００９２】
ベクターの複製および／または発現のための真核宿主細胞の例には、HeLa細胞、NIH3T3細胞、ジャーカット細胞、293細胞、Cos細胞、CHO細胞、Saos細胞およびPC12細胞が非制限的に含まれる。さまざまな細胞種および生物由来の多くの宿主細胞を用いることができ、これらは当業者に周知であると考えられ る。同様に、ウイルスベクターを真核宿主細胞または原核宿主細胞、特にベクターの複製 または発現を許容するものと組み合わせて用いることもできる。本発明のさまざまな態様においては幹細胞が宿主細胞として用いられ、いくつかの態様においてはMSCが宿主細胞として用いられる。
【００９３】
ある種のベクターには、原核細胞および真核細胞の両方での複製および／または発現を可能にする制御配列を用いうる。当業者は上記の宿主細胞のあらゆるものを、それを維持するとともにベクターの複製を許容しながらインキュベートする条件をさらに認識していると考えられる。また、ベクターの大規模生産、ならびにベクターによってコードされる核酸、およびそのコグネイトポリペプチド、タンパク質またはペプチドの生産を可能にする技法および条件も、認識され、知られている。
【００９４】
III．治療用遺伝子
本発明の遺伝子改変細胞によって発現される治療用遺伝子は、癌などの疾患およびその他の増殖性状態の治療的または予防的な処置に用いることができる。治療用遺伝子は目的の細胞に対する直接的な効果を有してもよく、および／または、免疫応答などの身体の生物学的プロセスを惹起、誘発もしくは増強させてもよい。
【００９５】
本発明の諸態様には、さまざまなクラスの治療用遺伝子を用いることができる。治療用遺伝子には、サイトカイン、ホルモン、毒素、細胞外マトリックス成分、酵素、細胞表面分子、治療活性のあるペプチド（例えば、アンジオスタチン）などが非制限的に含まれうる。
【００９６】
A．サイトカイン
本発明に用いることが想定される生物学的修飾物質の1つのクラスには、インターロイキン1（interleukin 1（IL-1））、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、INF-α、INF-β、γ-インターフェロン、アンジオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、METH-1、METH-2、Flk2／F1t3リガンド、GM-CSF、G-CSF、M-CSFおよび腫瘍壊死因子（tumor necrosis factor：TNF）などのインターロイキンおよびサイトカインが含まれる。
【００９７】
インターフェロン（IFN）は当初、標的細胞における抗ウイルス活性を誘導することが見いだされた可溶性タンパク質である。以来、IFNは細胞分裂を抑制し、免疫応答を調節することが判明している。IFN-αは進行性黒色腫における奏功率が20％であり、黒色腫のリスクが高いが発病していない患者の42％で改善をもたらす。
【００９８】
本発明のさまざまな態様において、黒色腫分化関連タンパク質7（melanoma differentiation associated protein：MDA7）を、ストローマ細胞前駆体またはMSCの改変に用いることを明確に想定している。MDA7-MSCまたはストローマ細胞前駆体は本明細書に記載したさまざまな方法に用いうる。MDA7は黒色腫細胞にインターフェロンおよびメゼリン（mezerin）を投与した後に同定されており、JiangおよびFisherは増殖能の喪失および終末分化を指摘している（Jiangら、1996）。JiangおよびFisherは、ヒト黒色腫細胞における新規サブトラクションハイブリダイゼーションの手法を開発し、これにより、増殖により制御される分化およびアポトーシスに関与する一連の黒色腫分化関連（MDA）遺伝子が同定され、クローニングされた。同定されたMDA遺伝子の1つであるMDA7は新規遺伝子であることが述べられ、この遺伝子の発現はヒト黒色腫細胞における終末分化の誘導と相関した（Jiangら、1996；Jiangら、1995）。MDA7遺伝子は増殖中の正常メラノサイトでは高レベルに発現されることが指摘されたが、その発現は疾患が転移性疾患に進行するのに伴って低下した。Jiangら（1995および1996）はその後、MDA7がさまざまな腫瘍細胞で発現されると増殖抑制およびアポトーシスを引き起こすことを示した。これはその後、別の複数のグループによって確認された。さらに、いくつかのグループは、MDA7遺伝子が腫瘍細胞の細胞死を効果的に誘導し、正常細胞には明らかな毒性を与えないことを確かめた（Saekiら、2000；Saekiら、2002）。MDA7遺伝子は最近、サイトカインのIL-10ファミリーと関係する遺伝子のクラスターを含む領域である染色体1q32にマッピングされた（Mhashilkarら、2001）。MDA7は現在はインターロイキン-24として分類されており、IL-20受容体およびIL-22受容体と結合し、その後に細胞シグナル伝達を媒介することが示されている。強力な抗腫瘍活性がある上、正常細胞に毒性を及ぼさず癌細胞に対する選択性があると考えられることから、この遺伝子は癌の治療に有効な可能性のある新規腫瘍抑制遺伝子であることが提唱されている。
【００９９】
B．ホルモン
さらに別の態様は、生物学的修飾物質としてのホルモンの使用を含む。例えば、以下のホルモンまたはステロイドを本発明に組み込むことができる：プレドニゾン、プロゲステロン、エストロゲン、アンドロゲン、ゴナドトロピン、ACTH、CGH、またはセクレチンなどの消化管ホルモン。
【０１００】
C．毒素
本発明のいくつかの態様において、治療物質には一般に、植物由来、真菌由来または細菌由来の毒素が含まれると考えられ、これには例えば、リシンA鎖（Burbage, 1997）、リボソーム不活性化タンパク質、α-サルシン、アスペルギリン、レストリコシン（restrictocin）、リボヌクレアーゼ、ジフテリア毒素A（Masudaら、1997；Lidor, 1997）、百日咳毒素Aサブユニット、大腸菌エンテロトキシン毒素Aサブユニット、コレラ毒素Aサブユニット、およびシュードモナス毒素c末端などがある。最近、融合タンパク質調節性ジフテリア毒素A鎖遺伝子を含むプラスミドのトランスフェクションが癌細胞に対する細胞傷害性を有することが示された。このため、調節性毒素遺伝子の遺伝子導入を疾患の治療にも応用しうると考えられる（Masudaら、1997）。
【０１０１】
D．ケモカイン
ケモカインを本発明に用いることもできる。ケモカインは一般に、免疫エフェクター細胞をケモカイン発現部位に動員させる化学誘引物質として作用する。これは、他の免疫系成分を治療部位に動員させる目的で、特定のケモカイン遺伝子を例えばサイトカイン遺伝子とともに発現させるためには有益と考えられる。このようなケモカインには、RANTES、MCAF、MIP1-α、MIP1-βおよびIP-10が含まれる。当業者は、ある種のサイトカインも化学誘引作用を有することが知られていて、それらをケモカインという用語で分類しうることを認識していると考えられる。
【０１０２】
E．細胞周期調節物質
細胞周期調節物質は、他の遺伝子と組み合わせると有益な可能性がある。このような細胞周期調節物質には、p27、p16、p21、p57、p18、p73、p19、p15、E2F-1、E2F-2、E2F-3、p107、p130およびE2F-4が含まれる。その他の細胞周期調節物質には、血管新生阻害タンパク質、可溶性Fltl（ドミナントネガティブ可溶性VEGF受容体）、可溶性Wnt受容体、可溶性Tie2／Tek受容体、マトリックスメタロプロテアーゼ2の可溶性ヘモペキシンドメイン、および他の血管形成性サイトカインの可溶性受容体（例えば、VEGFR1／KDR、VEGFR3／Flt4、いずれもVEGF受容体）が含まれる。
【０１０３】
F．アポトーシスの誘導物質
アポトーシスの誘導物質、例えばBax、Bak、Bcl-X、Bad、Bim、Bik、Bid、Harakiri、Ad E1B、Bad、ICE-CED3プロテアーゼ、TRAIL、SARP-2およびアポプチンなども、同様に本発明に従って利用しうると考えられる。
【０１０４】
G．腫瘍抑制物質
腫瘍抑制物質も本発明に従って用いうると考えられ、これにはp53、p16、CCAM、p21、p15、BRCA1、BRCA2、IRF-1、PTEN（MMAC1）、RB、APC、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、zac1、p73、VHL、FCC、MCC、DBCCR1、DCP4およびp57が非制限的に含まれる。
【０１０５】
H．一本鎖抗体
さらにもう1つの態様において、治療物質には一本鎖抗体が含まれうる。一本鎖抗体の作製のための方法は当業者に周知である。当業者はこのような方法については米国特許第5,359,046号を参照されたい（これは参照として本明細書に組み入れられる）。一本鎖抗体は、重鎖および軽鎖の可変ドメインを短いペプチドリンカーを用いて互いに融合させ、それによって単一分子上に抗原結合部位を再構築することによって作製される。
【０１０６】
一本鎖抗体可変断片（single-chain antibody variable fragment：scFv）は、1つの可変ドメインのC末端が別のもののN末端と15〜25アミノ酸のペプチドまたはリンカーによってつながれたものであり、抗原結合性または結合の特異性を明らかに損なわないように開発された（Bedzykら、1990；Chaudharyら、1990）。これらのFvは天然の抗体の重鎖および軽鎖に存在する定常領域（Fc）を欠いている。
【０１０７】
癌遺伝子、増殖因子、ホルモン、酵素、転写因子または受容体などのさまざまな分子に対する抗体を想定している。また、血清を標的とする、血管新生因子（VEGF／VSP、βFGF、αFGFなど）および血管新生に必要な内皮抗原（すなわち、V3インテグリン）に対する分泌抗体も想定している。特に想定しているのは、トランスフォーミング増殖因子および血小板由来増殖因子などの増殖因子である。
【０１０８】
ゲノムDNAの部分をcDNAまたは合成配列と組み合わせて、特定の構築物を構築することも有益と考えられる。例えば、最終的な構築物中にイントロンが必要とされる場合には、ゲノムクローンを用いることが必要と考えられる。cDNAまたは合成ポリヌクレオチドは、構築物の残りの部分に対して、より好都合な制限部位を付与することができ、そのため残りの配列のために用いられると考えられる。
【０１０９】
アンチセンス構築物の標的となる具体的な癌遺伝子には、ras、myc、neu、raf、erb、src、fms、jun、trk、ret、hst、gsp、bcl-2およびablがある。同じく有用と想定されるものには、抗アポトーシス遺伝子および血管新生プロモーターがあると考えられる。
【０１１０】
本明細書に述べたように、任意の特定の1つの遺伝子を任意の他の1つの特定の遺伝子と組み合わせることも想定している。
【０１１１】
I．細胞溶解性または腫瘍崩壊ウイルス
いくつかの態様において、遺伝子改変細胞は細胞溶解性ウイルスまたは腫瘍崩壊ウイルスを産生しうる。このような細胞は通常、腫瘍微小環境に局在すると考えられ、そこで、改変細胞によって産生されたウイルスは一般に周囲の細胞を感染させると考えられる。いくつかの態様において、ウイルスは過剰増殖性細胞または腫瘍細胞を選択的または選択的に溶解または死滅させると考えられる。複数の細胞溶解性ウイルスまたは腫瘍崩壊ウイルスが知られている。腫瘍崩壊ウイルスの例には、変異型アデノウイルス（Heiseら、1997）、変異型ワクシニアウイルス（Gnantら、1999）および変異型レオウイルス（Coffeyら、1998）が含まれる。遺伝子治療に用いるためのウイルスベクターの例には、変異型ワクシニアウイルス（Lattimeら、1996）、変異型単純ヘルペスウイルス（Todaら、1998）、変異型アデノウイルス（米国特許第5,698,443号）および変異型レトロウイルス（Anderson, 1998）が含まれ、これらはそれぞれ参照として本明細書に組み入れられる。
【０１１２】
J．併用療法
多くの治療法において、複数の機能を持つ治療物質を提供することが有益と考えられる。このような「併用」療法は、状態、疾患またはその他の異常生理状態の複数の様相を治療する上で特に重要なことがある。例えば、多剤耐性（multidrug resistant：MDR）癌を治療する場合。このため、本発明の1つの局面は、治療用化合物を疾患の治療のために組織、臓器または生物体の内部の適切な部位に送達するために遺伝的に改変された幹細胞を利用し、その一方で、第2の治療法（標的指向性またはそうでないもの）も提供される。
【０１１３】
非標的指向性治療は、数分から数週の範囲にある間隔をおいて、遺伝子改変幹細胞による治療の前に行っても後に行ってもよい。別の作用物質および遺伝的改変幹細胞を目的部位に別々に投与する態様においては、一般に、各送達時点の間隔がかなり長い期間でも無効とはならず、作用物質および遺伝子改変幹細胞が治療部位に対して依然として有益な相乗効果を発揮しうることが保証されると考えられる。このような場合には、細胞を両方の治療手段と互いに約12〜24時間以内、より好ましくは互いに約6〜12時間以内に接触させることが想定され、遅延時間が約12時間に過ぎないことが最も好ましい。しかし、ある種の状況では、治療のための期間を著しく延長させ、各投与の間に数日（2日、3日、4日、5日、6日または7日）から数週（1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週または8週）の間隔をおくことが望ましいと考えられる。
【０１１４】
また、いずれかの作用物質の複数回の投与が望ましい場合も考えられる。遺伝子改変幹細胞による作用物質を「A」、他方の作用物質を「B」として以下に例示したように、さまざまな組み合わせを用いることができる：
2005531507.tif 000005
【０１１５】
その他の組み合わせも想定している。例えば、本発明の状況下で、本発明の遺伝子改変幹細胞を、化学療法または放射線療法による介入を含む、非標的指向性抗癌物質とともに用いることが可能と考えられる。細胞を死滅させるため、細胞増殖を抑制するため、転移を抑制するため、血管新生を阻害するため、または別の様式で腫瘍細胞の悪性表現型を好転もしくは減少させるために、本発明の方法および組成物を用いて、「標的」細胞を、本明細書に記載の遺伝子改変幹細胞による作用物質、および少なくとも1つの他の作用物質と接触させることが一般に考えられる；これらの組成物はこのような目標を達成するための併用有効量として提供されると考えられる。この工程は、治療のための標的となる部位を遺伝子改変幹細胞および他の作用物質または因子に同時に曝露させることを含みうる。これは、両方の作用物質を含む単一の組成物もしくは薬理製剤を投与することにより、または、一方の組成物が遺伝子改変幹細胞を含み、他方が他の作用物質を含む、2つの異なる組成物または製剤を同時に投与することによって達成しうる。
【０１１６】
併用療法に用いるのに適した作用物質または因子は、治療活性を有する任意の化合物または治療方法である。例えば、「抗癌物質」とは、抗癌活性を有する作用物質のことを指す。これらの化合物または方法には、アルキル化剤、トポイソメラーゼI阻害薬、トポイソメラーゼII阻害薬、RNA／DNA代謝拮抗薬、DNA代謝拮抗薬、有糸分裂阻害薬のほか、細胞に適用した際にDNA損傷を誘導するDNA損傷性物質が含まれる。
【０１１７】
アルキル化剤の例には、特に、クロロアンブシル、シス白金、シクロジソン（cyclodisone）、フルロドパン（flurodopan）、メチルCCNU、ピペラジンジオン、テロキシロン（teroxirone）が含まれる。トポイソメラーゼI阻害薬には、カンプトテシンおよびカンプトテシン誘導体、さらにはモルホリノドキソルビシンなどの化合物が含まれる。トポイソメラーゼII阻害薬の例にはドキソルビシン、ピラゾロアクリジン、ミトキサントロンおよびルビダゾンがある。RNA／DNA代謝拮抗薬には、L-アラノシン、5-フルオロウラシル、アミノプテリン誘導体、メトトレキサートおよびピラゾフリン（pyrazofurin）が含まれる；一方、DNA代謝拮抗薬の群には、例えば、ara-C、グアノゾール（guanozole）、ヒドロキシ尿素、チオプリンが含まれる。代表的な有糸分裂阻害薬にはコルヒチン、リゾキシン、タキソールおよび硫酸ビンブラスチンがある。その他の作用物質および因子には、DNA損傷を誘導する放射線および波動、例えばγ線照射、X線、UV照射、マイクロ波、電子放射（electronic emission）などが含まれる。「化学療法薬」とも呼ばれる種々の抗癌物質は、DNA損傷を誘導する働きがあり、これらはすべて、本明細書に開示した併用治療法に有用であると考えている。有用であると考えている化学療法薬には、例えば、アドリアマイシン、ブレオマイシン、5-フルオロウラシル（5FU）、エトポシド（VP-16）、カンプトテシン、アクチノマイシン-D、マイトマイシンC、シスプラチン（CDDP）、ポドフィロトキシン、ベラパミル、さらには過酸化水素が含まれる。本発明はまた、X線とシスプラチンの併用またはシスプラチンとエトポシドの併用といった、1つまたは複数のDNA損傷性物質（放射線を基盤とするものと実体のある化合物との別を問わない）の併用も含む。
【０１１８】
当業者は「レミントン薬学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」第15版、第33章、特にp. 624-652を参照されたい。治療しようとする対象の状態に応じて、用量のある程度の変更が必要と思われる。投与を担当する人物は、いかなる場合にも、個々の対象に対する適切な投与量を決定することになる。さらに、ヒトへの投与の場合には、製剤は、FDAの生物製剤部（Office of Biologics）の基準で要求されているような、無菌性、発熱性、一般的安全性および純度に関する基準を満たす必要がある。
【０１１９】
本発明のいくつかの態様において、癌、前癌または過剰増殖性状態を有する患者における遺伝的に改変された幹細胞による治療物質の局所送達は一般に、幹細胞の選択的局在によって目的部位へと向けられると考えられる。同様に、化学療法または放射線療法を対象の身体の特定の罹患領域に向けることもできる。または、ある種の状況下、例えば、広範な転移が起こっている状況下では、化合物および／または作用物質の全身送達が適切であると考えられる。
【０１２０】
遺伝子改変幹細胞による治療法を化学療法および放射線療法と併用することに加えて、遺伝子療法との併用も有益であると考えている。例えば、p53、p16、p2l、Rb、APC、DCC、NF-1、NF-2、BCRA2、p16、FHIT、WT-1、MEN-I、MEN-II、BRCA1、VHL、FCCもしくはMCC、または癌遺伝子ras、myc、neu、raf、erb、src、fms、jun、trk、ret、gsp、hst、bcl、ablのアンチセンス型、または上記の遺伝子の任意のものが本発明の範囲に含まれる。
【０１２１】
V．疾病状態
本発明は、肝炎およびこれに類するもの、良性腫瘍および悪性腫瘍を含む、過剰増殖性障害を伴う疾病状態の治療を取り扱う。このような疾患には、血液悪性腫瘍、肝炎、再狭窄、癌、多剤耐性癌、原発性、乾癬、炎症性腸疾患、関節リウマチ、変形性関節症および転移性腫瘍が含まれる。
【０１２２】
特に、本発明は、前立腺癌、肺癌、脳の癌、神経膠腫、神経芽腫、皮膚癌、肝臓癌、乳癌、リンパ系癌、多発性骨髄腫、リンパ腫、胃癌、精巣癌、卵巣癌、膵臓癌、骨悪性腫瘍、骨髄悪性腫瘍、頭頸部癌、子宮頸癌、食道癌、眼悪性腫瘍、胆嚢癌、腎臓癌、副腎癌、心臓悪性腫瘍、結腸癌、直腸癌および血液悪性腫瘍を含む、ヒトの癌の治療を対象とする。本発明の組成物または方法によって治療しうると思われるその他の疾患には、腎細胞癌；C型肝炎（Gariniら、2001）、HIV-1（Hatzakisら、2001）などのウイルス感染症；エルトハイム・チェスター病（Esmaliら、2001）、血小板減少性紫斑病（Dikiciら、2001）、マールブルグ出血熱（Kolokol'tsovら、2001）も含まれうる。いくつかの態様において、方法および組成物は、CMLを有する対象の治療に用いられる。他の態様において、本発明の方法および組成物は黒色腫を有する対象の治療に用いられる。
【０１２３】
いくつかの態様において、本発明の細胞は、ニューロン、肝臓、腎臓および身体の任意の他の臓器または組織などの損傷組織を修復するために用いうる。
【０１２４】
A．慢性骨髄性白血病（CML）
CMLは、成熟顆粒球細胞へと分化しうる形質転換した造血幹細胞のクローン性増殖によって生じる。フィラデルフィア染色体（Ph）は本疾患の顕著な特徴であり、これは相互転座t（9：22）のためにキメラ性Bcr-Abl遺伝子（これは白血病発症に中心的な役割を果たすと思われる）が生じたものである。Bcr-Abl発現を伴うクローン性増殖の誘導は、一部には、チロシンキナーゼ活性の上昇に起因するように思われる。さらに、CML患者のCD34＋骨髄細胞はコロニー刺激因子に反応するが、ストローマに対するその接着性は損なわれており、このためにストローマ抑制性シグナルに対する感度が低下する。現在は同種骨髄移植がCML患者に対する唯一の根治療法であるが、これを適用しうるのはHLAの一致するドナーがいる比較的若い患者のみである。組換えINFαによるCMLの治療はこの10年間にわたってCML治療のための「標準的診療行為（standard of care）」となっており、この結果、新たに診断されたCML患者では血液学的寛解が高頻度に得られているが、細胞遺伝学的に高度または完全な寛解が得られる割合は低い（Strander, 1986に総説がある）。Bcr-Abl RT-PCR陰性が観察されたのはごく少数の患者に過ぎなかった（Guoら、2002；Kantarjianら、2003）。最近のある研究では、IFNαとAra-Cとの併用により、完全な血液学的寛解（complete hematological remission：CHR）が患者の69％で誘導されたが、PCR陰性が得られた例は皆無であった（S. O'Brien、私信による）。
【０１２５】
最近、標的指向性キナーゼ阻害薬（STI571, Imatinib, Gleevec）がCMLの治療に導入された。造血細胞の形質転換にはBcr-Ablのチロシンキナーゼ活性が必要であり、STI571（特異的チロシンキナーゼ阻害薬の名称に因む）はBcr-Abl、Tel／AblおよびV-Ablキナーゼ活性を阻害し、これらのABL癌遺伝子のいずれかによって形質転換された細胞の増殖および生存を抑制する（Kantarjianら、1995）。STI571はヒト白血病細胞を注入したマウスを治癒させうるが、治療を開始した時点で大きな腫瘍を有している場合は治療が奏功しない（Broxmeyerら、1983）。重要なことに、STI571は慢性期CML患者において高率に（＞90％）血液学的寛解を誘導する上、再発率が低い。細胞遺伝学な完全寛解は患者の95％に認められたが、RT-PCR陰性が得られたのは8％に過ぎなかった（S. O'Brien、私信による）。STI571はIFNα抵抗性のCML患者での有効性が高い（このことは交差耐性が存在しないことを示唆する）が、CMLの芽球転化を起こしたCMLまたはPh陽性の急性リンパ性白血病（acute lymphocytic leukemia：ALL）における有効性は限定的に過ぎない。STIを介した薬剤耐性の機序を詳述した報告は数多く発表されている（Blagosklonny 2002）。Bcr-Abl遺伝子の増幅、p210 Bcr-Ablタンパク質の増加、およびAKT／STAT5シグナル伝達の欠損が、STI耐性の考えられる機序として同定されている。最も注目すべきこととして、Bcr-Ablの変異はSTI耐性と相関することが示されている。STI571に対する耐性が観察されており、PCR陰性の頻度が低いことから、CML細胞がSTI耐性を獲得しうること、および本疾患を治癒させるための代替的なアプローチが依然として必要なことが示唆される。STI571と他の薬剤との併用を検討するための数多くの調査が進行中である。
【０１２６】
STI571が用いられる以前には、CMLに対する標準的診療行為はINFαの全身投与であった。INFαの全身送達に伴う主な問題は、インビボでの半減期が短く、そのため、治療効果を得るためには薬剤の大量のボーラス注射が必要なことである。これはかなりの副作用を伴い、多くの患者が最大の効果を得るのに必要な投与量（5MU／m2、1日4回皮下）に耐えることができなかった。毎日の投与に代わる選択肢の1つとして、ポリエチレングリコールコーティング（PEG-INFα）を含むINFαの長時間作用型製剤が開発された。このコーティングは（毎日の投与の代わりに）週1回の投与を可能にすると称されている。しかし、製剤のこの変化は治療に対するCMLの反応に大きな影響を及ぼさなかった。IFNαと低用量Ara-Cとの併用はIFNα単独よりも優れていることが判明した。以上を総合すると、INFαの全身投与は有効であるが、その有用性は一部には、必要な大量の外因性投与に患者が耐えられないために限定される。一般に、用量が増えるほど臨床的有効性は高くなるが、高濃度を維持できたのはCMLに対してINFαを投与された患者の30％未満であり、全般的な奏功率は高かったものの長期寛解が得られた患者はわずかであった。IFNαは今日まで長年にわたってCMLに用いられてきたため、細胞遺伝学的な完全寛解（CCR）の臨床的意義に関する検討が可能であった。Bacigalupoら（2001）は、CCRが5年時点でCML患者の42％で、8年時点では50％で失われたことを報告しており、このことはCCRによる無病生存期間の延長が予想されるのはそれを達成した患者の半数に過ぎないことを意味する。STI571を投与された患者に関する同様のデータはまだ得られていず、これが得られるまでには数年を要すると考えられる。しかし、CMLに対する同種BMT後にはPCR陽性例の再出現に続いて再発が高頻度に起こっており、このことは、STI571を投与されたCML患者の大半でPCR陰性が得られなかったことが再発率の高さにつながる可能性を示唆している。
【０１２７】
INFαが奏功性の患者においてその抗白血病作用を発揮する機序はまだほとんど解明されていない。CMLストローマおよびCML患者の細胞に対するINFαのインビトロ作用に関しては、CML始原細胞の増殖抑制、ストローマに対する接着性の回復、ストローマ性サイトカインの産生調節、および、CMLにおける白血病クローンの増殖制御と関連づけられている細胞免疫監視機構を含む、さまざまなものが報告されている。興味深いことに、Jeffrey Molldrem博士は最近、白血病標的細胞表面にある造血性抗原PR1を認識してそれらを死滅させるCML特異的細胞傷害性Tリンパ球（CTL）の存在を示した。PR1特異的T細胞の存在とIFNα投与および同種骨髄移植後の臨床効果との間には強い相関が認められている。
【０１２８】
INFαの全身送達に代わる選択肢の1つとして、その遺伝子の内因的な組込みおよび発現による、すなわちINFαを発現する移植ドナー細胞の使用による、このタンパク質のオートクリン的またはパラクリン的な産生が考えられる。しかし、ドナー細胞はいくつかの基準を満たさねばならない：（1）細胞を容易に入手しうる、（2）エクスビボである程度の期間にわたり生存する、（3）導入遺伝子を効率的に発現する、および（4）宿主免疫応答を誘発しない。CML単核細胞、臍帯血、CD34+細胞および線維芽細胞におけるINFαの一時的または安定的な発現を用いた遺伝子導入および発現の検討により、他の細胞種が生物活性のあるリンパ球を発現しうること、および外因性INFαが全身投与したINFαと同じように作用することが示されている。1件の報告では、担癌マウスの側腹後部にINFα発現性の線維芽細胞を移植したところ、腫瘍形成性が低下し、インビボでのKU182 CML細胞系の増殖が強くされたことが示されている。しかし、線維芽細胞または造血細胞をドナー細胞として用いることは以上に挙げた基準を満たさない。いくつかの態様において、その源は骨髄由来のドナー細胞および間葉系幹細胞であると考えている。骨髄ストローマ細胞は、骨髄微小環境に必須の構造的および機能的な構成要素を形成する上に造血にも欠かせない多能性幹細胞である。これらの細胞は骨髄、骨、軟骨および結合組織に対して持続的な前駆体としての役割を果たし、詳細に研究されている。それらは造血性抗原CD34およびCD45を発現せず、白血病患者から増殖させたMSCはクローン細胞を含まないことが判明している。MSCは、患者またはマウス骨髄から入手して、プラスチックに対する接着性によって単離し、インビトロで長期間にわたり培養、増殖および操作を行って、同一患者に自己移植することが容易である。これまでの研究で、同系マウス由来のMSCを静脈内経路を介して他のマウスに移植するとMSCが元の骨髄部位に輸送され、照射を受けた骨髄の再増殖に寄与することが示されている。骨形成不全症の患者では、同種MSCが宿主骨髄中に7％の頻度で最長18カ月にわたって認められ、骨密度に大きく寄与した上、特発骨折を減少させた。霊長類およびヒトを対象とした他の研究でも、MSCは骨髄に戻り、増殖して長期間にわたり生存しうることが確かめられている。
【０１２９】
導入遺伝子の効率的な長期的発現を導くベクターの作製に関しては大きな進展がみられる。組換えアデノ随伴ウイルス（AAV）は遺伝子送達のための媒体を代表するものであり、インビボおよびエクスビボでの遺伝子治療の用途に有望である。組換えAAVはウイルスタンパク質をコードする配列を含まず、染色体DNAに組み込まれる能力がある。野生型AAVまたはヘルパーアデノウイルスの明らかな混入を伴わずにAAVを作製することを可能にする作製および精製の手順が現在では得られている。最近、規模拡大が可能な上にAAV血清型a2および5に対して適用しうる、イオン交換クロマトグラフに基づく新たなベクター精製方法が記載されている。AAVはニューロンおよび筋肉といった分裂終了細胞を感染させうることが示されている。AAVを用いて種々の臓器および組織に対して行われた研究により、効率的で安定的な長期的遺伝子発現（最長1.5年）が得られる一方、AAVに伴う細胞応答はほとんど誘発されないことが示されている。Wilsonらによる最新の研究からは、ラパマイシン誘導性プロモーターを有するAAVを用いたマウスモデルにおけるヒト成長ホルモン（hGH）遺伝子の厳密な調節下での発現が示されている。彼らのデータは、薬剤投与から6時間後にはhGHレベルが検出可能になり、薬剤が存在する限り高レベルの発現が維持されることを示唆している。ラパマイシンが排出されるとhGHレベルは直ちに低下する。さらに、ラパマイシンを再投与するとhGHが急速に再合成されて発現レベルがそれに応じて上昇するが、このサイクルを1回のAAV投与から最長300日にわたって毎日、毎週または毎月繰り返すことができる。
【０１３０】
遺伝子治療による治療用タンパク質の送達は、高価な組換えタンパク質の頻回な注射を治療用遺伝子の低頻度または1回の送達に代えることを可能にすることにより、さまざまな疾患の治療の有効性、利便性および費用対効果を改善する可能性がある。薬物動態の弱点、治療域の狭さ、または全身副作用のために注射による投与で効果を得られなかったタンパク質の送達を可能にすることにより、治療しうる疾患の範囲も拡がる可能性がある。いくつかの態様において、薬物調節性プロモーターの制御下でIFNαを発現する組換えAAVを構築することもできる。この構築物はMSCを感染させるために利用しうる。増殖後にこれらのMSCを、定着したCMLを含む動物に移植することが考えられる。INFαを発現するMSCの使用により、INFαの全身注射を長期にわたって毎日行う必要性が軽減されるとともに、局所的に部位特異的な様式で薬物調節性の高レベル発現を行わせ、それによって全身副作用を軽減することも可能になると考えられる。
【０１３１】
B．黒色腫
皮膚黒色腫は、女性の肺癌を除き、他のあらゆる固形腫瘍を上回る速度で世界的に増加している。再発性黒色腫における化学療法の有効性は極めて乏しい。固形腫瘍の中でも特有な点は、INFαなどの免疫調節療法に対する感受性にある。基底細胞癌（BCC）および扁平細胞癌（SCC）（併せて非黒色腫性皮膚癌として知られる）および悪性黒色腫は、最も頻度の高い皮膚悪性腫瘍である。治療には癌の完全消失、正常機能の維持または回復という3つの目標がある。再発または転移のリスクは、その腫瘍が高リスクであるかそれとも低リスクであるかを決定づける。治療アプローチの選択は、腫瘍の位置、サイズ、境界および増殖速度によって決まる。標準的な治療アプローチには、主として低リスク腫瘍に対して用いられる表面焼灼法（電気乾固および掻爬および冷凍療法）、および、高リスク腫瘍の治療のために用いられる全層手技（モース顕微鏡下手術、切除手術および放射線療法）がある。
【０１３２】
黒色腫に対する免疫応答の性質が明らかにされるのに伴って、より特異的な免疫操作に臨床的に取り組める可能性が高くなると考えられる。転移性悪性黒色腫の一部の患者でINF-α、IL-2、LAK細胞、TIL細胞、腫瘍ワクチンなどによって完全寛解および部分寛解が誘導されている事実は、これらの物質が黒色腫の治療に役割を果たす可能性を明らかに示している。これらの手法に対する全般的奏功率は20％程度の範囲に過ぎないため、改良された治療方法が求められている。
【０１３３】
INF-αは転移性黒色腫に対して有効なことが報告されている。悪性黒色腫および他の癌の抑制における免疫機構の役割がいくつかの研究によって示唆されている。IFN-αの投与は腫瘍細胞近傍へのCD4＋細胞の動員を引き起こすことが示されている。いくつかの態様においては、本発明の遺伝子改変細胞を用いて黒色腫を治療する方法を想定している。増殖性細胞または過剰増殖性細胞のストローマ性要素を形成しうる、またはそれと結合しうる、遺伝的に改変されたMSCまたは前駆体の局在は、INF-αなどの治療物質の局所的かつより高い局所濃度での産生をもたらし、腫瘍または癌の位置での局所的な生物学的応答を誘発、増大または増強させうると考えられる。特定の態様において、本発明の細胞はINF-αまたはINF-βを発現しうる。
【０１３４】
VI．医薬製剤
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体中に溶解または分散された、1つまたは複数の遺伝子改変細胞の有効量または付加的な物質を含む。「薬学的または薬理学的に許容される」という語句は、例えばヒトなどの動物に対して適切に投与した場合に、有害な、アレルギー性の、またはその他の不都合な反応を生じさせない、分子的実体および組成物のことを指す。少なくとも1つの遺伝子改変細胞または付加的な有効成分を含む薬学的組成物の調製は本開示に鑑みて当業者には周知であると考えられ、その例は「レミントン薬学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」第18版、Mack Printing Company, 1990に記載されている（これは参照として本明細書に組み入れられる）。さらに、動物（例えば、ヒト）への投与の場合、製剤が、FDAの生物製剤部（Office of Biologics）の基準で要求されているような、無菌性、発熱性、一般的安全性および純度に関する基準を満たす必要があることも理解されるであろう。
【０１３５】
本明細書で用いる「薬学的に許容される担体」には、任意およびすべての溶媒、分散媒、コーティング剤、界面活性剤、抗酸化物質、保存料（例えば、抗菌薬、抗真菌薬）、等張化剤、吸収遅延剤、塩、保存料、薬物、薬物安定化剤、ゲル、結合剤、添加剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、着香料、色素などの物質ならびにそれらの組み合わせが含まれ、これらは当業者に周知であると考えられる（例えば、「レミントン薬学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」第18版、Mack Printing Company, 1990, pp.1289-1329を参照されたい。これは参照として本明細書に組み入れられる）。従来の担体が有効成分と適合しない場合を除き、治療的または薬学的な組成物におけるその使用を想定している。
【０１３６】
遺伝子改変細胞は、それが固体、液体またはエアロゾルのうちいずれの形態で投与されるか、およびそれが注射などの投与経路用に無菌状態である必要があるか否かに応じて、さまざまな種類の担体を含みうる。本発明は、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病変内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸腔内、気管内、鼻内、硝子体内、腟内、直腸内、局所外用性、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜性、心膜内、臍帯内、眼内、経口性、局所外用性、局所性、吸入（例えば、エアロゾル吸入）、注射、注入、持続注入、標的細胞への直接的な局所潅流により、カテーテルにより、洗浄液により、クリーム剤として、脂質組成物（例えば、リポソーム）として、または他の方法もしくは以上の任意の組み合わせによって投与することができ、これは当業者に周知であると考えられる（例えば、「レミントン薬学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」第18版、Mack Printing Company, 1990を参照されたい。これは参照として本明細書に組み入れられる）。
【０１３７】
動物または患者に対して投与する本発明の組成物の実際の投与量は、体重、疾患の重症度、治療しようとする疾患の種類、過去または現在の治療的介入、患者の特発性疾患、および投与の経路などの身体的および生理的な要因によって決定しうる。投与を担当する医師は、いかなる場合にも、組成物中の有効成分の濃度および個々の対象に対する適切な投与量を決定することになると考えられる。
【０１３８】
いくつかの態様において、薬学的組成物は例えば、有効化合物を少なくとも約0.1％含みうる。また別の態様において、有効化合物は単位体の重量の約2％〜約75％、または例えば約25％〜約60％、およびそれらから導き出せる任意の範囲を構成しうる。別の非制限的な例において、1回の投与当たりの用量が、約1μg／kg／体重、約5μg／kg／体重、約10μg／kg／体重、約50μg／kg／体重、約100μg／kg／体重、約200μg／kg／体重、約350μg／kg／体重、約500μg／kg／体重、約1mg／kg／体重、約5mg／kg／体重、約10mg／kg／体重、約50mg／kg／体重、約100mg／kg／体重、約200mg／kg／体重、約350mg／kg／体重、約500mg／kg／体重、約1000mg／kg／体重またはそれ以上、およびそれらから導き出せる任意の範囲であってもよい。本明細書に列挙した数から導き出せる範囲の非制限的な例として、約5mg／kg／体重〜約100mg／kg／体重、約5μg／kg／体重〜約500mg／kg／体重などの範囲を、上記の数に基づいて投与することができる。
【０１３９】
いかなる場合にも、組成物は、1つまたは複数の成分の酸化を遅らせるために種々の抗酸化物質を含みうる。さらに、パラベン（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールまたはそれらの組み合わせを非制限的に含む、種々の抗菌薬および抗真菌薬などの保存料により、微生物の作用を防止することもできる。
【０１４０】
遺伝子改変細胞は組成物中に遊離塩基、中性形態または塩形態として配合することができる。薬学的に許容される塩には、タンパク質組成物の遊離アミノ基と形成されたものなどの酸付加塩、または塩酸もしくはリン酸などの無機酸、もしくは酢酸、シュウ酸、酒石酸もしくはマンデル酸などの有機酸と形成されたものが含まれる。遊離カルボキシル基と形成される塩は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムもしくは水酸化第二鉄などの無機塩基；またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジンもしくはプロカインなどの有機塩基から生じるものでもよい。
【０１４１】
組成物が液体形態にある態様において、担体は、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、脂質（例えば、トリグリセリド、植物油、リポソーム）およびそれらの組み合わせを非制限的に含む溶媒または分散媒であってよい。適切な流動性は、レシチンなどのコーティング剤の使用により；液体ポリオールまたは脂質などの担体中への分散による必要な粒径の維持により；ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤の使用により；またはこのような方法の組み合わせにより、維持することができる。多くの場合には、例えば糖、塩化ナトリウムまたはそれらの組み合わせなどの等張化剤を含めることが好ましいと考えられる。
【０１４２】
また別の態様において、点眼薬、点鼻液または点鼻スプレー、エアロゾルまたは吸入薬を本発明に用いることもできる。このような組成物は一般に標的組織型に対する適合性があるように設計される。非制限的な一例において、点鼻液は通常、小滴または噴霧薬として鼻腔内に投与するように設計された水性溶液である。点鼻液は、正常な線毛作用が維持されるように、多くの点で鼻汁分泌と類似するように調製される。すなわち、好ましい態様において、点鼻液は通常、等張性である、またはpHが約5.5〜約6.5に維持されるように幾分緩衝化される。さらに、眼用製剤に用いるものと同様の抗菌性保存料、薬物または適切な薬物安定化剤を、必要に応じて製剤中に組み入れることもできる。例えば、さまざまな市販の鼻用製剤が知られており、これには抗生物質または抗ヒスタミン薬などの薬物が含まれる。
【０１４３】
いくつかの態様において、遺伝子改変細胞は、経口摂取などの経路による投与のために調製される。これらの態様において、固体組成物は、例えば、溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤（例えば、硬ゼラチンカプセル剤または軟ゼラチンカプセル剤）、徐放性製剤、口腔内投与用組成物、トローチ剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、オブラート剤またはそれらの組み合わせを含みうる。経口投与用組成物を食事用の食品に直接組み入れることもできる。経口投与用の好ましい担体には、不活性希釈剤、吸収性の可食担体またはそれらの組み合わせが含まれうる。本発明のその他の局面において、経口用組成物をシロップ剤またはエリキシル剤として調製することもできる。シロップ剤またはエリキシル剤は、例えば、少なくとも1つの有効物質、甘味剤、保存料、着香料、色素、保存料またはそれらの組み合わせを含みうる。
【０１４４】
いくつかの好ましい態様において、経口投与用組成物は、1つまたは複数の結合剤、添加剤、崩壊剤、潤滑剤、着香料およびそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様において、組成物は以下のうち1つまたは複数を含みうる：結合剤、例えば、トラガカントゴム、アラビアゴム、コーンスターチ、ゼラチンまたはそれらの組み合わせ；添加剤、例えば、例えば、第二リン酸カルシウム、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムまたはそれらの組み合わせ；崩壊剤、例えば、コーンスターチ、バレイショデンプン、アルギン酸またはそれらの組み合わせ；潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム；甘味剤、例えば、スクロース、ラクトース、サッカリンまたはそれらの組み合わせ；着香料、例えば、ペパーミント、ウィンターグリーン油、チェリーの風味物質、オレンジの風味物質など；または以上のものの組み合わせ。投薬単位剤形がカプセルである場合には、それは上記の種類の物質に加えて、液体担体などの担体を含みうる。種々の他の材料が、コーティング剤として、または別の様式で投薬単位の物理的形態を変化させるために存在してもよい。例えば、錠剤、丸剤またはカプセル剤をセラック、糖またはその両方でコーティングすることができる。
【０１４５】
その他の投与様式に適したほかの製剤には坐薬が含まれる。坐薬はさまざまな重量および形状の固体投与剤形であり、通常は薬用として、直腸、膣または尿道に挿入される。挿入後に坐薬は体腔液中に軟化、融解または溶解する。一般に、坐薬用の従来の担体には、例えば、ポリアルキレングリコール、トリグリセリドまたはそれらの組み合わせが含まれる。いくつかの態様において、坐薬は、例えば、有効成分を約0.5％〜約10％の範囲、好ましくは約1％〜約2％の範囲で含む混合物から構成されうる。
【０１４６】
滅菌注射液は、遺伝子改変細胞および／または有効化合物の必要量を、上に挙げた種々の他の成分（必要に応じて）とともに適切な溶媒中に組み入れた後に濾過滅菌を行うことによって調製される。一般に、分散液は、滅菌した種々の有効成分を、基本的な分散媒および／または他の成分を含む滅菌媒体中に組み入れることによって調製される。滅菌注射用溶液、懸濁液または乳濁液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、有効成分の粉末のほかに所望の付加的な成分があらかじめ滅菌濾過した液体媒質から得られる、真空乾燥法および凍結乾燥法である。液体媒質は、必要であれば適した緩衝化を行うべきであり、液体希釈剤は十分な食塩水またはグルコースとともに注入する前にまず等張化しておく。高度に濃縮された直接注入用の製剤も想定しており、この場合には極めて急速な浸透を行わせて小さな領域に高濃度の有効物質を送達するために、DMSOを溶媒として用いることが考えられる。
【０１４７】
組成物は、製造および貯蔵の条件下で安定である上に、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に抗して保存される必要がある。エンドトキシンによる汚染は、安全なレベルに最小限に、例えば、0.5ng／mgタンパク質未満に保たれる必要がある。
【０１４８】
特定の態様においては、組成物中に吸収を遅らせる物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチンまたはそれらの組み合わせを用いることにより、注射用組成物の持続的な吸収を行わせることができる。
【０１４９】
VII．実施例
以下の実施例は本発明の好ましい態様を示すために含められる。当業者には、以下の実施例に開示される技法が、本発明の実施において十分に機能することが本発明者らによって見いだされた技法であって、このためその実施のための好ましい態様を構成することが理解される必要がある。しかし、当業者は、本開示に鑑みて、開示された特定の態様に多くの変更を加えることができ、それでもなお本発明の精神および範囲を逸脱することなく同様または類似の結果を得ることができることも理解する必要がある。
【０１５０】
実施例1
材料および方法
細胞の単離および培養
ヒトMSCを、同種骨髄移植のために骨髄採取を受ける正常個体の骨髄から、施設内指針に従ってインフォームドコンセントを得た上で、承認されたプロトコールを用いて単離した。単核細胞をFicoll-Hypaque勾配（Sigma, St. Louis, Missouri）を用いた遠心処理によって分離し、20％ウシ胎仔血清（Gibco BRL, Rockville, Maryland）、L-グルタミンおよびペニシリン-ストレプトマイシン混合物（Flow Laboratories, Rockville, Maryland）を含むα-MEM培地中に再懸濁した後に、初期播種密度1×10６個／cm２でプレーティングした。3日後にPBSで洗浄することによって非付着細胞を除去し、付着細胞の単層を集密に達するまで培養した。続いて細胞をトリプシン処理し（0.25％トリプシン、0.1％EDTAを含む）、5,000〜6,000個／cm２の密度で継代培養した上で、3〜4回の継代中に検討に用いた。
【０１５１】
A375SM細胞系およびMDA 231細胞系は、J. Fidler博士（Department of Cancer Biology, M. D. Anderson Cancer Centrum, Houston, Texas）による寄贈を受けた。細胞は10％FCS、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、L-グルタミン、ビタミン溶液（Life Technologies, Inc., Grand Island, New York）およびペニシリン-ストレプトマイシン混合物を含むα-MEM中で維持した。
【０１５２】
アデノウイルスベクターおよびMSC形質導入
アデノウイルス（AdV）は、細菌プラスミド組換えシステムAd Easy（Qbiogene）を用いて作製した。簡潔に述べると、β-ガラクトシダーゼ（β-gal）の遺伝子を、Not1／HindIIIで消化したAd CMVシャトル中にクローニングした。ヒトIFN-β遺伝子はInvivoGen（San Diego, California）から購入し、CLAIで消化した上で充填処理を行って平滑末端化した。この平滑末端プラスミドをさらにBglIIで消化し、hIFN-βを含む570bp断片を遊離させ、この小片をpShuttle CMVのBglII／EcoRV部位にサブクローニングした。正しいリーディングフレームおよび考えられる変異を決定するためにこれらの2つのクローンのシークエンシングを行った。この2つのプラスミドをPmeIで直鎖状化し、子ウシアルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化して、フェノール-クロロホルム処理を2回行って抽出した上で、PacIにより消化したpAdEASY-1と混合した。これらの2つの直鎖状化プラスミドを電気穿孔法によって細菌に導入し、Kan+寒天上にプレーティングして、カナマイシン耐性クローンを採取し、AdEASY配列に関して分析した。本発明者らは、各遺伝子（β-gal、IFN-β）に関して4種類のクローンを同定し、これらのプラスミドを3mlのミニプレップ方式で増殖させ、Fugene6を用いて293細胞にトランスフェクトした。18〜20日後にプラークを溶出させ、組換えウイルスを培養物から回収した。本発明者らは2回の増幅を行い、IFN-βを発現することがELISA（Fujirebio Inc, Tokyo, Japan）により同定されたウイルス、またはβ-galを発現するウイルス（組織化学的染色により検出）を選択した。MSCをMOI＝3000のAdVとともに2時間インキュベートした。MSCは感染後の最初の24時間でMSC 10６個当たり3〜4×10４ IUのIFN-βを産生した。MSCにおけるβ-gal発現は組織化学的染色により判定したが、90％を上回るMSCが陽性であった。
【０１５３】
インビトロ増殖抑制アッセイ法
細胞単層をPBSで洗浄し、トリプシン処理によって採取して、10％FCSを含むRPMI 1640中に再懸濁した。細胞を培地200μl中にある状態で3000個／ウェルの密度で96ウェルプレートにプレーティングした。一晩おいて細胞をプレーティングに付着させた後、IFN-βを含む培地をさまざまな希釈度で添加した（0〜10,000 IU／mlの範囲）。各希釈度毎に8個のウェルを用いた。IFN-βの最初の添加時に1枚のプレートをMTSアッセイ（Promega Inc, Madison, Wisconsin）によって読み取り、初期対照とした。IFN-β（Avonex, Biogen, Inc）を含む培地は毎日交換し、5日後にMTSを用いてアッセイ物の読み取りを行った。吸光度は490nmで測定した。結果は増殖率（％）＝（ODｅｘｐ-ODｉｎｉ）／（ODｆｉｎ-ODｉｎｉ）×100として算出した。ODｆｉｎは処理していないウェルのA490に対応し、ODｉｎｉは初期対照に対応し、ODｅｘｐは種々の濃度のIFNにより5日間処理したウェルに対応する。
【０１５４】
MDA 231細胞およびA375SM黒色腫細胞とMSCとのインビトロでの共培養
A375SM黒色腫細胞（5×10４個／ウェル）またはMDA 231乳癌細胞（10５個／ウェル）を、6ウェルプレート中にて、単独で培養するか、またはMSCおよびIFN-β-MSCのそれぞれとともに比10：1で培養した。5日後に細胞をトリプシン処理し、算定した上で70％エタノールにより固定した。続いて細胞をPE（Sigma）で標識し、細胞のDNA含量をFACScanフローサイトメーター（Becton-Dickinson, San Jose, California）を用いて分析した。MSC（二倍体細胞）およびA375細胞またはMDA 231細胞（異数体細胞）の相対数をModFitソフトウエア（Verity Software House, Inc., Maine）を用いて決定した。
【０１５５】
Ovar-3細胞、SKOV-3細胞およびHey細胞とMSCとのインビトロでの共培養：
間葉系幹細胞を、IFN-β遺伝子を有するアデノウイルスに感染させ（MSC-IFN-β）、40,000 IU／細胞5×10５個／ 24時間のレベルで産生させた。MSCの別のフラスコには、トランスフェクト細胞が95〜100％のレベルとなるように、β-ガラクトシド遺伝子を有するアデノウイルスを感染させた（MSC-βGAL）。24時間後に、細胞単層をPBSで洗浄した上でトリプシン-EDTAを用いて採取し、その後にすべての細胞系を10％FBSを含むRPMI 1640中に再懸濁した。OVAR-3細胞、SKOV-3細胞またはHey細胞を4mlの培地中に、単独で、またはMSC-IFNβもしくはMSC-βgalとそれぞれ比1：1または10：1で混合した上で、6ウェルプレート中に4×10４個／ウェルの開始濃度でプレーティングした。5日後に細胞をトリプシン処理し、算定した上で70％エタノールにより固定した。続いて細胞をPE（Sigma）で標識し、細胞のDNA含量をFACScanフローサイトメーター（Becton-Dickinson, San Jose, California）を用いて分析した。MSC（二倍体細胞）および卵巣癌細胞（異数体細胞）の相対数をModFitソフトウエア（Verity Software House, Inc., ME）を用いて決定した。
【０１５６】
動物、細胞投与、腫瘍および生存分析
雌性C.B-17 SCIDマウスをHarlan社（Indianapolis, Indiana）から購入した。マウスは施設内指針に従い、承認されたプロトコール下で用いた。細胞は200μlのPBS中に懸濁した上で側部尾静脈内に投与した。腫瘍組織量は肺全体の重量を測定することによって決定した。肺重量の差は両側t検定によって判定した。生存性はMDA 231細胞またはA375SM細胞の注射日から死亡日までにわたって評価した。生存性の差は両側ログランク検定により判定した。統計分析はStatisticaソフトウエア（StatSoft, Inc., Tulsa, Oklahoma）を用いて行った。
【０１５７】
組織の加工処理および画像化試験
肺およびその他の臓器は、ブワン液中で固定するかOTCコンパウンド（Miles, Inc., Elkhart, Indiana）中に包埋した後に、液体窒素中で急速凍結させ、-80℃で保存した。さらに、マウス数匹の肺全体を直ちにX-Gal染色によってβ-ガラクトシダーゼに関して染色した。凍結組織を切片化し（6〜8μm）、H&EまたはX-Gal組織化学染色用に処理した。画像化はCCDカメラ（Hamamatsu Corp., Bridgewater, New Jersey）を装着したZeiss Axioplan2顕微鏡（Carl Zeiss, Inc., Thornwood, New York）を用いて行い、Adobe Photoshopソフトウエア（Adobe Systems, Inc., San Jose, California）を用いて処理した。
【０１５８】
X-Gal組織化学染色
肺全体を0.5％グルタルアルデヒド中で10分間固定してPBSで洗浄した。続いて組織を、1M MgCl2、30mMフェリシアン化カリウムおよび30mMフェロシアン化カリウムを含む2％X-Gal溶液（Sigma）中で一晩インキュベートし、10％中性緩衝ホルマリン中で再び固定した。組織をエタノールで脱水し、キシレンに短時間曝露させた後にパラフィン中に包埋し、5μm厚に切片化してスライドとした。続いて、スライドを脱パラフィン処理し、エオジンまたはヌクレアファストレッド（Nuclear Fast red）で対比染色した。または、凍結組織から得たスライドを冷アセトン／エタノール1：1により20分間固定し、X-Galで染色した。
【０１５９】
マウス血漿中のIFN-β濃度の測定
肺にMDA 231転移が定着したマウスに対して、10６個のMSC-IFN-βを静脈内または皮下に注射した。別のマウスには40,000 IUまたは100,000 IUのIFN-β（Avonex, Biogen, Inc）を皮下投与した。尾静脈の切れ目から、ヘパリンを加えたキャピラリー内に血液200μlを適切な間隔で採取した。血液を直ちに遠心して細胞を除去し、血漿を-80℃で保存した。IFN-βの血漿中濃度は、ELISA（Fujirebio Inc, Tokyo, Japan）により、IFN-β1aのNIH基準を用いて評価した。
【０１６０】
蛍光色素SP-DiIによるMSCの標識
蛍光色素SP-DiI（Molecular Probes, Eugene, OR）をジメチルホルムアミド（Sigma）中に濃度2.5mg／mlで溶解した。続いてSP-DiI色素を培地に最終濃度10μg／mlとなるように添加した。MSC（4×10６個）を、SP-DiIを加えた培地25mlとともにT175フラスコ内で48時間インキュベートした。続いて細胞をPBSで洗浄し、色素を含まない培地中で4時間インキュベートして試験に用いた。
【０１６１】
腫瘍測定および動物の生存期間の判定
腫瘍をキャリパーにより測定し、直交する2つの径の幾何平均として腫瘍面積を算出した。生存期間は細胞の注入日から、死亡日、または腫瘍径が15mmを超えたこと、腫瘍の潰瘍化または出血のために副次的にマウスを屠殺しなければならなくなった時点までとして計測した。生存期間の差はログランク検定により判定した。
【０１６２】
ASO2抗体を用いた免疫組織化学
スライドを冷アセトン中で固定し、内因性ペルオキシダーゼを3％過酸化水素を含むメタノール溶液によりブロックした。非特異的結合は、ヤギ抗マウス抗体のF(ab2) IgG断片（Jackson, West Grove, PA；1：10希釈）、5％ウマ血清および1％ヤギ血清（PBS中）との4℃での24時間のインキュベーションによってブロックした。一次抗体としてマウス抗ヒトAS 02抗体（Dianova, Inc., Hamburg、Germany；1：20希釈）を4℃で一晩用い、続いてペルオキシダーゼ結合ラット抗マウスIgG1抗体（PharMingen, San Diego, CA；1：600希釈）を室温で1時間用いた。陽性反応を安定な3,3'-ジアミノベンジジン（Research Genetics, Huntsville, AL）によって可視化した。
【０１６３】
BrdUrdに関する免疫蛍光染色
200μlの10mM BrdUrd（Sigma）をPBS中に溶解してマウスに静脈内投与し、4時間後および2時間後に屠殺した。スライドは4％パラホルムアルデヒドで固定し、0.1％Triton X-100（PBS中）で処理して、37℃の2N HClと30分間インキュベートした後に0.1M Trisで洗浄した。続いてスライドを一次抗体としてマウス抗BrdUrd抗体（Becton Dickinson, Mountain View, CA；1：100希釈）とともに4℃で一晩インキュベートし、その後に二次抗体としてヤギ抗マウスAlexa 488抗体（Molecular Probes, Eugene, OR；1：400希釈）と室温で1時間インキュベートした上で、マウント用培地（Vector）によりマウントした。
【０１６４】
実施例2
ヒト骨髄由来MSCとA375SM黒色腫細胞との相互作用
以下の例示的な検討では、マウス異種移植片モデルにおけるヒト骨髄由来MSCとヒト由来のA375SM黒色腫細胞（Kozlowskiら、1984）との相互作用について述べる。Mscを、同種骨髄移植のために骨髄採取を受ける正常個体から、Pittengerの方法に従い（Pittengerら、1999、これは参照として本明細書に組み入れられる）、承認されたプロトコールの下で単離した。MSCを蛍光色素SP-DiI14で標識し、A375SM黒色腫細胞とあらかじめ混合した上でヌードマウスに皮下注射した。
【０１６５】
雄性無胸腺ヌードマウス（NCr-nu）は、米国国立癌研究所-Frederick癌研究開発センター（National Cancer Institute-Frederick Cancer Research and Development Center）（Frederick, MD）の動物生産部門から購入した。続いて、腫瘍（n＝10）を、蛍光顕微鏡によって、および、マウス組織ともヒト黒色腫細胞とも交差反応を行わないヒト線維芽細胞に対して特異的な抗体（Saalbachら、1996に記載）を用いた免疫組織化学法によって検査した。スライドをアセトンで固定し、内因性ペルオキシダーゼを3％過酸化水素を含むメタノール溶液によりブロックした。非特異的結合は、ヤギ抗マウス抗体のF(ab2) IgG断片（Jackson, West Grove, PA）の1：10希釈物、5％ウマ血清および1％ヤギ血清（PBS中）との4℃での24時間のインキュベーションによってブロックした。一次抗体としてマウス抗ヒトAS 02抗体（Dianova, Inc., Germany）を1：20希釈して4℃で一晩用い、続いてペルオキシダーゼ結合ラット抗マウスIgG1抗体（PharMingen, San Diego, CA）を1：600希釈して室温で1時間用いた。陽性反応は安定なDAB（Research Genetics, Huntsville, AL）によって可視化した。
【０１６６】
これらの検討により、MSC由来の線維芽細胞のかなりの部分が腫瘍構造に取り込まれ、線維性被膜を腫瘍周囲に形成することが判明した。腫瘍被膜内のMSC由来の線維芽細胞の多くは蛍光色素を消失していた。SP-DiI蛍光色素は細胞膜と強固に結合し、インビボで近傍細胞には移行しないため（Johanssonら、1999）、標識MSCの蛍光強度が低下するのは、親細胞の膜が2つの娘細胞に均等に分配される細胞分裂時のみである。反復的な細胞分裂によって蛍光シグナルはさらに減少し、最終的には周囲の非標識細胞と区別不能になる。腫瘍被膜内のMSC由来の細胞の蛍光強度の消失が観察されたことは、その増殖および細胞分裂に起因する可能性がある。
【０１６７】
腫瘍内でのMSC増殖に関する直接的な証拠は、インビボBrdU標識によって得られた。簡潔に述べると、インビボBrdU標識法は以下を含む：200μlの10mM BrDU（Sigma, St. Louis, MO）をPBS中に溶解したものをマウスに静脈内投与し、その4時間後および2時間後に屠殺した。スライドを4％パラホルムアルデヒドで固定し、0.1％Triton X-100（PBS中）で処理して、37℃の2N HClと30分間インキュベートした後に0.1M Trisで洗浄した。続いてスライドを一次抗体としてマウス抗BrdUrd抗体（Becton Dickinson, Mountain View, CA）を1：100希釈して4℃で一晩インキュベートし、その後に二次抗体としてヤギ抗マウスAlexa 488抗体（Molecular Probes, Eugene, OR）を1：400希釈したものと室温で1時間インキュベートした。黒色腫細胞とSP-DiIで標識したMSCとの混合物に由来する腫瘍を有するマウスに対してBrdUを静脈内注射した。増殖性細胞はBrdUの免疫蛍光によって同定された。この方法により、BrdU陽性核を有するSP-DiI標識MSCが腫瘍内に明らかに認められた。これに対して、A375SM黒色腫細胞を伴わずに単独で皮下注射したMSCはBrdUを取り込まなかった。これらの結果は、骨髄性MSCが、悪性細胞と同時注入された場合に腫瘍ストローマ形成に寄与することを示している。このプロセスには、MSCの腫瘍構造内への受動的な取り込みだけでなく、それらの増殖も関与する。
【０１６８】
実施例3
MSCは静脈内投与後に腫瘍ストローマ形成に寄与する
さらなる例示的な検討では、MSCが静脈内投与後に腫瘍ストローマ形成に寄与するか否かを取り扱った。肺に増殖性のA375SM黒色腫が定着したマウスに対して、MSCを尾静脈から注入し、1日後、8日後および60日後に屠殺した。続いて、黒色腫結節および肺実質におけるMSC由来細胞の分布を免疫組織化学的に調べた。MSCは静脈内投与から1日後には肺実質および腫瘍結節内にランダムに分布していた。しかし、8日後にはMSCは主として腫瘍内に認められ、正常肺からは消失していた。同様に、注射60日後にもMSCは腫瘍内には検出されたが肺実質中には検出されなかった。後者の2つの時点でMSCが肺ではなく腫瘍内に選択的に分布したことは、腫瘍微小環境はその生存およびストローマへの組み入れを支持するが、正常肺実質は支持しないことを示している。さらに、腫瘍内のMSCの割合は試験期間中ほぼ安定していた。各時点で5つの陽性腫瘍を評価した。陽性細胞の数が最も多いと肉眼で判断した腫瘍領域からの5つの視野（×100）で細胞数を算定した。結果は平均±semとして表した（第1日：3 +/- 2％、第8日：11 +/- 2％、第60日：5 +/- 1％）。腫瘍のサイズが第1日から第60日までの間に増大したため、個々の腫瘍結節内のMSC由来細胞の絶対数も、おそらくは増殖のために、この期間中に増加したはずである。
【０１６９】
実施例4
静脈内注射したMSCは皮下腫瘍内に組み込まれる
また別の例示的な検討では、静脈内注射したMSCが皮下腫瘍内に組み込まれうるか否かを明らかにした。A375SM黒色腫を有するマウスに対して、非標識MSCを20日の期間にわたって5回投与した（1回の投与につき10６個）。マウスを15〜20日後に屠殺し、腫瘍、肝臓、脾臓および肺を免疫組織化学的に評価した。MSC由来の線維芽細胞は腫瘍の55％で一定して同定されたが、数匹のマウスで脾臓内に陽性細胞が稀に認められたことを除き、他の臓器では認められなかった。
【０１７０】
実施例5
抗癌物質の生産のための細胞性媒体としてのMSC
さらに別の例示的な検討では、ヒトβ-インターフェロン（IFN-β）遺伝子を有するアデノウイルスベクターを用いた形質導入による抗癌物質の生産のための細胞媒体としてのMSCの治療的能力を明らかにした。アデノウイルスは細菌プラスミド組換えシステムAd Easy（Qbiogene、Carlsbad、CA）を用いて作製した。IFN-β遺伝子（InvivoGen, San Diego, CAから購入）をAd CMVシャトル中にクローニングした。このプラスミドをPmeIで直鎖状化し、PacIで消化したpAdEASY-1と混合した上で電気穿孔法により細菌に導入した。選択したクローンを採取し、AdEASY配列に関して分析した上でFugene6を用いて293細胞にトランスフェクトし、その後に組換えウイルスを培養物から回収した。2回の増幅を行った後に、IFN-βを発現することがELISA（Fujirebio Inc, Tokyo, Japan）によって同定されたウイルスを以後の検討に用いた。MSCをMOI 50のアデノウイルスとともに2時間インキュベートした。MSCはインビトロで、形質導入後の最初の24時間に細胞10６個当たり4〜5×10４ IUのIFN-βを産生した。まず、共培養系におけるIFN-β産生性MSC（IFN-β-MSC）のA375SM黒色腫細胞に対する作用をインビトロ条件下で判定し、Biogen社の5×10４ IUのAvonexを1日置きに皮下注射した。これらの検討により、IFN-β-MSCが悪性細胞の増殖を直接抑制し、この作用には宿主免疫系が必要でないことが示された。図1。
【０１７１】
インビボ試験に関しては、A375SM黒色腫細胞（10６個）を、5×10５個、10５個または10４個のIFN-β-MSCとともにヌードマウスの同じ部位に皮下注射した。これらの数は悪性細胞の比率が50％、10％および1％であることに相当し、これらは生体内分布試験で腫瘍内に認められたMSCの頻度に対応する（腫瘍内の全細胞のうち3〜11％）。IFN-β-MSCはこれらのすべての群において腫瘍増殖を抑制し、動物の寿命を延長させた（図2）。A375SM黒色腫（5×10４個）を単独で、またはMSCおよびIFN-β-MSCのそれぞれ（104個）と混合した上で、6ウェルプレート中で72時間増殖させた。続いて細胞をトリプシン処理して算定した。MSC（二倍体細胞）およびA375細胞（異数体細胞）の相対数は、細胞をPE（Sigma）で標識し、細胞のDNA含量をFACScanフローサイトメーター（Becton-Dickinson, San Jose, California）を用いて分析した後に、ModFitソフトウエア（Verity Software House, Inc., Maine）を用いて決定した。注目すべきことに、IFN-β-MSCは1％（104個）でも腫瘍増殖抑制を発揮し、生存期間の有意な延長を引き起こした（図2）。これに対して、腫瘍部位の対側の側腹部に皮下注射した50倍も多くのIFN-β-MSC（5×10５個）により、または対応する用量のIFN-βの皮下投与によって与えた全身レベルのIFNは、腫瘍増殖にも生存性にも効果を及ぼさなかった。これらのデータは、腫瘍微小環境における局所的なインターフェロン産生が悪性細胞の抑制には不可欠であり、これは遠隔部位から送達された血清中の対応する全身レベルのIFN-βによっては置き換えられないことを示している。
【０１７２】
実施例6
静脈内に投与されたIFN-β-MSC
さらにもう1つの例では、すでに定着した転移性黒色腫モデルにおける静脈内投与したIFN-β-MSCの有効性を明らかにするために、臨床的に意味のある状況について検討した。A375SM黒色腫細胞を静脈内注射したマウスの肺で腫瘍結節を発達させ、その後、マウスに対して同数のIFN-β-MSCを2種類の経路のうち一方によって投与した。一方の群にはIFN-β-MSCを尾静脈からの静脈内注射として投与し、もう一方の群には側腹への皮下注射として投与した。本発明者らの分布データに基づき、本発明者らは静脈内注射したMSCが血流に乗って自由に移動し、腫瘍ストローマに取り込まれて、腫瘍微小環境内で局所的にIFN-βを産生すると予想した。その反対に、皮下注射したIFN-β-MSCは注射部位から移動せず、全身レベルのIFN-βを産生する。IFN-β-MSCの静脈内注射による腫瘍内でのIFN-βの局所産生は動物の生存期間を有意に延長させた（p＝0.023）。これに対して、皮下注射した同数のIFN-β-MSCによって与えた全身レベルのIFN-βは効果がなかった（p＝0.21）。予想した通り、本試験における腫瘍抑制は永続的ではなく、これは従来のアデノウイルスベクターによって得られるIFN-β発現が比較的短寿命であることに対応していた。しかし、この障害はタンパク質発現が調節下にある安定的なトランスフェクション系によって克服可能である。
【０１７３】
外因性に投与されたMSCは悪性細胞の存在下で選択的に生存して増殖し、ストローマ性線維芽細胞として腫瘍構造に組み入れられる。このプロセスは、腫瘍微小環境内部でのFGF、PDGF、EGF、TGF-βなどのパラクリン増殖因子またはその他のメディエーターの局所濃度の高さが関係している可能性がある（HanahanおよびWeinberg、2000）。少なくともインビトロでは、MSCの増殖がこれらの分子の濃度に依存することが示されている。
【０１７４】
IFN-βには広範囲にわたる生物活性があり、間接的な免疫調節特性（Kuznetsovら、1997）および血管新生阻害特性により、または悪性細胞に対する直接的な増殖抑制作用により、腫瘍縮退を誘導することができる（Le Bonら、2001）。IFN-β-MSCはインビトロで黒色腫細胞の増殖を直接抑制し、この作用には免疫系を必要としない。さらに、IFN-β-MSCによって産生されるヒトIFN-βは種特異的であり、マウス由来の内皮細胞または残存性の免疫細胞には直接的な影響を及ぼさない（Johnsら、1992）。このため、このインビボモデルで認められた腫瘍抑制は、ヒト腫瘍細胞に対するヒトIFN-β-MSCの直接的な増殖抑制作用に関係すると考えられる。
【０１７５】
臨床試験により、IFN-βの血清中濃度は、最大耐容量の全身投与後でも、インビトロで観察された増殖抑制作用を得るために必要な値を大きく下回ることが示されている（Qinら、2001）。このことは、悪性細胞に対するIFN-βの直接的な増殖抑制作用が患者で生じることは仮にあっても稀であることを示唆しており、これは臨床試験でこの生体物質の有効性が期待を裏切ったことの説明になると考えられる（Salmonら、1996）。腫瘍微小環境内でのMSCによるIFN-βの局所産生のための組成物および方法を提供する本発明の態様は、この限界を克服し、細胞増殖および分化に対する短距離作用パラクリン調節物質としてのIFN-βの生理的役割を模倣することを可能にする（EinhomおよびGrander, 1996）。IFN-βレベルの局所的低下がある種の腫瘍の周囲の組織で検出されており、これが悪性腫瘍の増殖をさらに促す可能性があることも興味深い（Hertzogら、1994；Kuniyasuら、2000）。生理的条件下では、IFN-βは細胞によって産生され、同じ領域に空間的に位置する近傍に影響を及ぼすが、その一方で、身体の他の部分の細胞を制御する調節機構には干渉しない。このため、おそらく、IFN-βの全身投与ではこの生理的機能を得ることはできないと考えられる。同じアプローチを他の物質の送達に用いることもできる。
【０１７６】
実施例7
MSCのインビボ検出
MSCを、DeansおよびMoseley、2000（これは参照として本明細書に組み入れられる）に記載された通りに骨髄から採取した。MSCは線維芽細胞様の形態を有し、プラスチックに付着する。通常、1×10７個のMSC／10mlの骨髄または末梢血。MSCを25％FCSを含むRPMI中で培養したが、それらは80％の集密度に達した時点で1回継代することを必要とする。これらの細胞はSP-DILおよびPKH26（Konoplevaら、1999）などの膜結合性色素で標識可能である。これらの色素はUV励起下で蛍光を発するために、それらにより、インビボでのモニタリングが可能になる。SP-DILで標識したMSCをnu／nuマウスまたはBalbC／nuマウスに注入し、ある期間の後に採取した組織および臓器の凍結切片中にて検出することが可能である。SP-Dilで標識したMSCは、尾静脈注射から30日後に脾臓、肺および骨髄で検出されうる。
【０１７７】
さらに、MSCを免疫組織化学法を用いて検出することもできる。簡潔に述べると、抗ヒトAS-02抗体は間葉由来の細胞を認識しうる（Liechtyら、2000）；このため、パラフィン固定試料中のMSCを同定可能である上に、インビボで細胞分裂のためにPKH-26膜標識を消失したMSCを確認することもできる。MSCは尾静脈注射から60日後のマウス組織中でAS-02染色によって同定しうるが、PKH-26標識細胞は存在するものの多くはないと考えられる。移植マウスにおけるMSCの生着および維持は、遺伝子が標識されたMSCを用いることによって示される。簡潔に述べると、MSCをAAV-gal構築物に感染させ、FACSソーターを用いて均一になるようにこれらの細胞を選別した。これらの細胞を増殖させ、マウスに静脈内注射した。注射後のさまざまな時点で、Mariniら（1995）（これは参照として本明細書に組み入れられる）に記載された通りに、マウスの臓器および組織を、βgalプライマーを用いるPCR（商標）分析に供した。βgal+アンプライマーが、注射から7日後、1カ月後、2カ月後および3カ月後のMSC注入マウスの組織中で検出された。注目されることに、ある種の組織はβgalアンプライマーに関して陰性であり、最初に（脳、腎臓などで）検出されたMSCが消失したことは宿主におけるMSCの選択的増殖を示唆する。βgal遺伝子を持たないMSCを注入したマウスはβgalアンプライマーに関して陰性であった。
【０１７８】
実施例8
IFN-αを発現する組換えAAV
IFN-αを発現する組換えAAVの構築。MFP1ベクターは、ミフプリストン（mifpristone）応答配列、および変異型CMVエンハンス／プロモーター構築物のエンハンサー部位にクローニングされたトランス活性化GAL4タンパク質を含む。活性化ドメインは、RZF／B断片がMFP応答配列（Moravcovaら、2000）由来の活性化ドメインと融合したものからなる。IRES部位により、単一の最小インターロイキン-2プロモーターによる2つの要素の連結発現が可能となる。続いて、このMEP調節性プロモーターを、IFN-α-2B遺伝子を含むAAV-1ベースのプラスミド中にクローニングした（AAV-gal4hPRL-65ADと称する）。陽性対照として、IFN-α遺伝子の発現をもたらすCMVプロモーターを含むAAVを構築した（図3に示したベクターの図）。Wilsonら（1989）によって作製された293パッケージング系はREP機能およびCAP機能（pAV1H）の両方をトランス性に含む。ヘルパープラスミド（pFD13、アデノウイルスゲノムの必須領域を含む）との同時トランスフェクションにより、MFP調節性のIFN-α-AAV-1構築物をトランスフェクションの96時間後に採取し、これを可溶化した上でCsCl精製を2回行った（Caoら、2000）。組換えAAV-IFNの力価を293細胞で評価し、ゲノム当量（GE）の数値および大きさを決定するためにDNAハイブリダイゼーションによって分析した。ベクター調製物は、ペンシルバニア大学ヒト遺伝子治療研究所（UPenn Institute of Human Gene Therapy）のJim Wilson氏によって提供される。CMV作動性GFPベクターを用いてインビトロでAAVがMSCを感染させる能力は強いGFPシグナルがMSCで検出されることによって示され、10５ GEであればMSCの85％を上回る割合にGFP発現を付与するのに十分である。
【０１７９】
実施例9
誘導性AAVベクター
薬物誘導性AAVベクターによる調節性発現。IFN-αをMFP調節性プロモーターの制御下で発現するAAV構築物を用いて、正常ドナーMSCをインビトロで感染させた。簡潔に述べると、MSCを10３ GEのAAV-IFN-αおよび10３GEのAAV-gal4prlMFPに感染させ、さらに10日間増殖させた。これらの細胞を12ウェル培養皿に継代培養し、MFP（0.1％ETOH中に溶解）または溶媒担体を指定濃度で添加した。MFP調節性AAVを感染させたMSCは、MFPに対する曝露から18時間後にようやくIFN-αを発現する（図4A）。3種類の薬物濃度について検討したが、それぞれの用量は以前のものの10分の1未満であり、10−７Mという初期用量はヒトでの化学物質性流産のために一般に投与される用量より3 log未満である。注目されることは、MFPの1回の添加によってIFN-α発現が8〜10日延長し、薬物添加から4〜5日後にピークとなることである。このデータは、IFN-αの連続的発現のためにはMFPを週に2〜3回投与すればよいことを示唆している。IFN-α発現の反復的な誘導を示すために、これと同じAAV-IFN-α感染MSCに対して10−８M MFPによる誘導を行った。10日後にIFN-αレベルはバックグラウンド活性に至り、そこで本発明者らはさらに3日待った上で、10−８M MFPをもう1回投与した。IFNα誘導が再び起こり、これは1回目の発現と同程度の強度および期間にわたって誘導されることが認められた（図4B）。
【０１８０】
実施例10
MSCにより産生されたIFN-αのCML細胞に対する生物学的作用
MSCにより産生されたIFN-αのCML細胞系および患者試料に対する生物学的作用。このMSCにより産生されたIFN-αのCML（bcr／abl +）細胞系および患者試料に対する生物活性を評価した。陽性対照として、試験全体にわたり、医薬品級組換えIFN-α（イントロンA、Plough Schering）とMSCにより産生されたIFN-αとの比較を行った。CML細胞系K562およびBV173（いずれの細胞系もbcr／ablを過剰発現する、Mariniら、1999）は、1000UのイントロンAとともに培養するか、またはIFN-αを発現するように誘導したMSCと共培養すると、増殖抑制を受ける。さらに、10日後に本発明者らは、共培養の設定で、極めて少数の生存性K562またはBV173細胞（トリパンブルーにより判断）を見いだした。MSCにより産生されたIFN-αがBCR-ABL+CML幹細胞に対しても活性を有することを確かめるために、CD34を多く含むCML幹細胞を入手し、1000UのイントロンAの存在下で培養するか、IFN-αを発現するように誘導したMSCと共培養した。図6に示したように、どちらのリンホカイン（イントロンAおよびMSCにより産生されたIFN-α）も、CD34+CML幹細胞の増殖および生存性の抑制に同程度に有効であり、このことからMSCにより産生されたIFN-αがイントロンAと同程度に有効であることが示唆された。この仮説をさらに検証するために、2例のCML患者から得た流血中の芽細胞をMSCにより産生されたIFN-αを含む培地中で培養するとともにイントロンA培養物を用意したところ、図7に示したように、1000UのイントロンAと培養したCML芽細胞と、IFN-αを発現するように誘導したMSCの存在下で培養したCML芽細胞は同程度の増殖抑制を受ける。興味深い点は、CML芽細胞をMSC支持細胞層上で培養すると芽細胞がはるかに高度に増殖し、生存性および増殖が高まることである。MSCにより産生されたIFN-αがイントロンAと同じ生物活性を有することを確かめるため、患者試料をMHCクラスI発現のアップレギュレーションに関して検査した。細胞免疫監視機構の増強CMLにおける白血病クローンの増殖抑制と関連づけられているため、クラスIアップレギュレーションはCML細胞に対するIFN-α活性の重要な機能であると考えられている（le Coutreら、2000）。患者試料は、イントロンAの存在下で増殖させた場合、またはIFN-αを発現するように誘導したMSC支持細胞層上で共培養した場合、またはIFN-αを発現するMSCの上清をこれらの患者試料用の培地として用いた場合に、クラスIをアップレギュレートする。このデータは、MSCにより産生されIFN-αおよびイントロンAの両方が同程度の生物活性を有することを示唆している。
【０１８１】
実施例11
インビボ試験
インビボ試験。CMLのインビボ培養モデルに着手するために、2つのBCR-ABL+細胞系、K562（これはnu／nuマウスの骨髄外で増殖する）またはBV173（BalbC／nuマウスの骨髄内で増殖する）をそれぞれのマウスに注入した。図8に示した通り、用量5×10６個のK562細胞ではマウスは約30日で死亡し、一方、100万個のK562細胞は45日以内で致死性であり、50万個のK562の静脈内注射は60日で致死性であった。BV173細胞系を用いて、本発明者らは3種類の細胞用量を検討し、100万個のBV173細胞でマウスを45日以内に死亡させるには十分であるが、5×10５個のBV173細胞ではマウスは60日以上にわたって生存し、マウス1匹は依然として生存していることを見いだした。このデータによれば、致死性細胞用量を投与し、その間に細胞療法（IFN-αを発現するMSC）を実施しうることが可能と考えられる。MSCを細胞療法に用いる代わりに、AAVベクターを筋肉に直接注入し、それによってIFN-αの全身的な分泌を可能にすることもできる。この送達経路の評価は、10１０GEのAAV-CMV-IFN-αまたは5×10１０GEのAAV-Ga14hPRL-65ADおよび5×10１０GEのAAV-G5E-IFN-αのマウス四頭筋への筋肉内注射によって行った。マウスから毎週採血し、Biosource ELISAキットを用いて血清をIFN-α発現に関して分析した。図9に示したように、循環レベルのhIFN-αが末梢血に検出され、さらに重要なことに、これはこれらのnu／nuマウスでみられる高いバックグラウンドレベルを上回って同定された。構成性に発現されるIFN-α（AAV-CMV-IFN-α）を注入した3匹のマウスでは2600pg／mlを上回るhIFN-αが検出され（これが最大レベルに達するには2週間を要した）、この活性は測定を行った2カ月間にわたり一定に保たれた。さらに、誘導性AAVを注入したマウスではIFN-αの薬物依存的な誘導が認められ、図9ではマウス6および7が類似した誘導曲線を有している。注目されることは、MFPの1回の適用（IP投与）により、IFN-α活性の単一のピークが生じ、それが7日間をかけて減衰したことである。誘導性AAVを注入したがMFPは投与していない対照マウスでは、IFN-αはバックグラウンドレベルであった。これらのデータは、MSCを単離し、インビトロで増殖させた上でAAVベクターに感染させることが可能なことを示唆している。このベクターは、医薬品級イントロンAと同程度の生物特性を有すると考えられる生物活性IFN-αの薬物誘導性分泌を引き起こすことができる。MSCにより産生されるIFN-αで処理したCML細胞系および患者試料は増殖停止状態となり、K562／BV173 CML細胞系はヌードマウスに静脈内注射すると致死的である。このマウスモデルを用いたところ、循環レベルのヒトIFN-αが検出された。ヒトMSCを分子的、蛍光的および免疫組織化学的なアプローチによって検出することもできる。
【０１８２】
実施例12
MSCの採取、培養および感染
MSCの採取、培養および感染のための例示的な方法。簡潔に述べると、骨髄吸引試料または末梢血試料を採取し、PBSで1回すすぎ洗いをする。この結果得られた培養物を、25％FCSを加えたRPMIを入れた組織培養用プラスチック製容器にプレーティングする。7日後に骨髄細胞をラバーポリスマンによって懸濁化した上で、抗sh2抗体、抗sh3抗体、抗sh4抗体（MSCのマーカー）と反応させ、洗浄した後に、磁性マイクロビーズ試薬をsh2,3,4抗体と結合させるために反応させ、この混合物を磁気濃縮カラムに通す。15〜18日後に線維芽細胞に似た形態を示す個々のコロニーが成長するが、これらをさらに1週間増殖させる。感染のためには、MSCをPBSで1回すすぎ洗いした後に、1000〜10,000ゲノム量のAAVβgalまたはAAV-IFNを含むRPMI（200μl）中でインキュベートする。感染を4時間進行させた後に、25％FCSを含む新たな培地を添加する。48時間後に、X-gal組織化学染色により、またはMariniら（1999）のようなCM-FDGを用いるFACSによる分析により、細胞をβgal発現に関して分析する。これらのAAV感染細胞を、十分な細胞数が得られるまで増殖させる。AAV感染MSCからのIFN-α発現を誘導するためには、0.1％ETOH中に懸濁化した（10−７、10−８、10−９M）MFPを含む培地を細胞に与える。18時間後に細胞を1回洗い、新たな培地を添加する。6〜24時間後に上清を収集し、Quantikine IFNαELISA（Biosource International Inc Camarillio CA）により分析する。
【０１８３】
実施例13
MSCの検出
対象に投与したMSC細胞を検出する目的には、十分な感度を与えるとともに正確な同定を可能にすると考えられる3種類の技法を組み合わせている。
【０１８４】
a．MSCの膜標識：33μM SP-DILまたは50μM PKH-26を含む培地中でMSCを10分間培養し、その後に細胞を3回洗浄し、試料をサイトスピン処理にかけて、画像解析により膜染色を確認する。
【０１８５】
b．免疫組織化学検出：（Sigma, St Louis, MO）から購入したAS-02抗体を、サイトスピン処理した細胞、凍結切片またはパラフィン包埋組織と反応させる。洗浄後に西洋ワサビペルオキシダーゼ二次抗マウスIgGを反応させ、インキュベーションおよび洗浄の後にDDAB色素（Vectastain）を添加し、暗褐色の沈殿物が形成された時点で反応を終了させる。
【０１８６】
c. PCR（商標）：ヒトまたはマウスの組織を秤量し（湿重量で10mgの組織を用いる）、Trizol中で可溶化して、単離した後にDNAを等量に分け、Mariniら（1995）に記載されたようにβgalに対するプライマーを用いるPCR（商標）に供する。
【０１８７】
実施例14
遺伝子改変MSCの移植、またはマウスモデルへの直接的な筋肉内注射
遺伝子改変MSCの移植、またはマウスモデルへの直接的な筋肉内注射：簡潔に述べると、2×10６〜1×10７個の遺伝子改変MSCをnu／nuまたはBalb／C／nuマウスに尾静脈から静脈内注射する。1群当たり5匹のマウスを用い、7日、4週、8週、12週、6カ月の時点でマウスを屠殺し、臓器および組織を採取して組織検査およびX-gal染色を行う。さらに、これらのマウスの骨髄を洗浄してインビトロでさらに5〜7日間培養した上で、X-gal+細胞に関して分析する。IFN-α発現の分析のためには、1×10１０ G.E.／匹のベクターを四頭筋肉内に注射し、10〜20日後に6μg／匹のMFPを腹腔内注射するか胃管により与える。MSC注射またはAAV注射の48時間後から薬物の週3回の投与を開始し、血液試料（150〜200μl）を毎週採取してIFN-αの発現および量に関して分析する。または、5〜8週後にβgal+ MSCに対して、より感度の高い別の2種類のβgalアッセイ、すなわち化学発光βgalアッセイ（Tropix Inc. Bostonkon, MA）およびRT-PCRを用いる。
【０１８８】
実施例15
CMLモデル
CMLモデルの作製および遺伝子改変MSCの検討：本発明者らがIFN-α発現MSCの検討を行えるCMLモデルを作製する目的には、nu／nuマウスまたはBalbC／nuマウスのモデルで増殖する2種類のCML細胞系が用いられる。簡潔に述べると、K562細胞またはBV173をそれぞれのマウス（nu／nuおよびBalbC／nu）に静脈内注射する。ある程度の期間をおいた後に、2×10６個／匹の遺伝子改変MSCを注入し、治療法を開始する。対照として、CML細胞系を注入したマウスに3000UのイントロンAを毎日注射するが、これは細胞療法の方が有効性が高いかどうかを判定する上では重要な対照である。別の対照として、CMV-IFN-αを発現するMSC（IFN-αの最大レベルを決定するため）およびIFNαを誘導性に発現するが誘導を行っていないMSCを注入したマウスを用いる。
【０１８９】
CML細胞の注射からIFN-α誘導を開始するまでの最適な時間を決定する。評価を行う時点は、投与直後のMFP活性化時点（1日または2日）または10日、2週（この時点ではMSCがすでに生着している）である。3種類のエンドポイントに関してモニタリングを行う：）毎日の体重計測値を記録すること、これは本発明者らがこれらのCML細胞系が死亡を引き起こす前に消耗症候群（重量減少）を引き起こすことを観察しているためである、b）エンドポイントとしての死亡（死亡日）も記録する、およびc）瀕死の動物が観察された場合にはこの動物を屠殺し、血液を採取して（IFN-α発現レベルのため、およびCMLの循環レベルの測定のため）、組織、臓器をMSCの生着（As-02またはSh2,3,4抗体を使用）およびK562細胞またはBV173細胞の有無（CD45抗体を使用）の判定のための病理学的検査に供する。マウスの生存期間の延長について観察する場合には、マウスにMSCの反復投与（2×10６個のMSC／匹）による多回投与を行ってもよく、この手法はMSCのより高レベルの生着を可能にすると考えられる。または、マウスに遺伝子改変MSCを生着させ（注射から30日間待機する）、その後にCML細胞を注入することもできる。
【０１９０】
または、新たな患者のCD34+ CML細胞を、抗CD34+マイクロビーズおよびMACS濃縮法を用いて単離する。続いて、これらの細胞を4gyを照射したNOD-SCIDマウス（Thiesingら、2000）に注入する。生着を確実に行わせるために、10単位／匹の幹細胞因子を1回注射する。注射後のさまざまな時点でPBを採取し、遠心した上でCD45+（ヒト骨髄性細胞のマーカー）およびCD33+に関して分析する。それぞれのマウスが検出可能なCD45+ CML細胞を発現した時点で、これらのマウスを以後の検討に用いる。または、KU812細胞を培養下で増殖させ、PBSですすぎ洗いを行った後に1×10７個／匹を皮下注射する（Oguraら、1990）。注入して4週間後に腫瘍を摘出し、分離させて単細胞浮遊液とした後に静脈内注射する。これらの培養KU812細胞は腫瘍形成性となり、マウスは30日で死亡する。この間の遺伝子MSCについて調べる。
【０１９１】
第2の選択肢としては、レトロウイルスで形質転換させたCML白血病を用いる（Pearら、1998）。簡潔に述べると、マウス細胞を採取して、bcr／ablを発現するレトロウイルスベクターに感染させた後に、これらの細胞の同系マウスへの戻し移植を行うと、30〜45日以内にこれらのマウスではbcr／ablを発現する骨髄性細胞が優勢となる。
【０１９２】
実施例16
MSC-IFNの静脈内注射
16匹のSCIDマウスを4つの群（それぞれマウス4匹）に分けた。第1群のマウスには腫瘍細胞を注入せず、健常対照として用いた。第2、3、4群には2×10６個のMDA 231乳癌細胞を第1日（d1）に尾静脈から投与した。マウスには処置を行わないか（第2群）、第8日から処置を開始した。処置は50,000 IUのβ-IFN（IFN sc）の隔日の皮下注射（第3群）、またはβ-IFNをトランスフェクトした1×10６個のMSC（MSC-IFN）の4回の静脈内注射を尾静脈から毎週行うこと（第4群）からなる。マウスを第30日に屠殺し、肺の写真を撮影し、秤量した上でヘマトキシリン／エオジン（H&E）染色を行った（図10）。
【０１９３】
上記の試験および図10によるマウスの肺の重量（平均およびSEM）を測定した（図11）。MSC-IFNの静脈内注射（第4群）は肺におけるMDA 231転移の増殖を有意に抑制した（p＝0.0073）。これに対してβ-IFNの皮下注射は有効でなかった（p＝0.14）。同じく、MDA 231腫瘍が肺にある非処置マウスと肺に腫瘍がない健常マウスの肺重量の間にも有意差が認められた。これは、肺重量が実際に腫瘍組織量を反映し、本発明者らのモデルにおける治療的有効性の指標として用いうることを裏づけるものである（図10も参照のこと）。
【０１９４】
肺に増殖性のMDA 231腫瘍があるマウス、およびMSC-IFNまたはIFNによる処置を行ったマウスの生存性も評価した（図12）。SCIDマウス（30匹）に2×10６個のMDA 231乳癌細胞を第1日に注入し、これを3つの群に分けた。第1群には処置を行わず、対照として用いた。第2群には、第8日から第28日まで50,000 IUのIFN-βの隔日の皮下注射（sc）による処置を行った。第3群には第8日から第28日まで、1×10６個のMSC-IFNの4回の静脈内注射（iv）による処置を週1回ずつ行った。単回投与分のMSC-IFN（1×10６個）は、注入前のインビトロ測定では24時間に約50,000 IUのIFNを産生した。マウスが死亡するまで経過を観察した。処置マウスと生存性をログランク検定によって非処置対照と比較した。MSC-IFNの静脈内投与は生存期間を延長させたが（p＝0.00143）、IFNは有効でなかった（p＝0.31）。
【０１９５】
IFN（0.1％FCSを含むPBS 200μl中に50,000 IU）の皮下注射（sc）、またはMSC-IFN（50,000 IUのIFNをインビトロで産生するMSCが1×10６個）の静脈内注射（iv）を、肺に増殖性のMDA 231腫瘍があるSCIDマウスに対して行った。その後、マウスにおけるヒトIFNの血漿レベルをさまざまな時点に測定した。尾静脈に切れ目を入れ、ヘパリンを加えたキャピラリー内に血液を採取した後に、血液細胞を除去するために直ちに遠心処理を行った。血漿を分析時まで-80℃で保存した。INF濃度はELISAキット（Fugirebio）により測定した。その結果は、MSC-IFNの皮下投与または静脈内投与が、IFN自体の皮下投与よりもIFNの全身（血漿）レベルを低下させることを示している（図13）。
【０１９６】
このマウスモデルは、IFNの全身投与に対する感受性がない乳癌に関する臨床的な状況を反映している。IFNの全身投与とは対照的に、MSC-IFNはSCIDマウスの肺におけるMDA 231乳癌転移の増殖抑制に対する有効性が高かった。MSC-IFNを投与したマウスで観測されたIFN血漿レベルは、IFN scによる処置を受けたマウスで観測された値よりも低かった。ここで認められた抗腫瘍効果は、全身レベルのIFNに関係するものではなく、局所的に産生されたIFNのパラクリン作用を介して働くMSC-IFNの治療的有益性を例示していると考えられる。
【０１９７】
実施例17
MSCは腫瘍に生着するが健常動物の肺およびその他の臓器には生着しない
静脈内注射したMSCが実際に腫瘍に生着することを確かめるために、マウスに対して10６個のMSC-Galの静脈内注射を3回行い、その子孫をX-Galに対する組織化学染色によって追跡した。一方の群のマウス（n＝5）は肺にMDA 231転移が定着したものとし、もう一方の群（n＝5）は腫瘍がないものとした。組織化学染色はMSC-Galの最終投与から14日後に行った（図15A〜15C）。肺における腫瘍の検査により、多数のX-Gal陽性細胞が認められた（図15A）。これらの細胞はコロニーを形成し、腫瘍構造に組み込まれたが、このことはMSCが血管外空間に到達して腫瘍の結合性ストローマの発達に寄与することが可能なことを示している。それぞれのコロニーは、その場で周囲微小環境からのシグナルの影響を受けて増殖する、単一または極めて少数のMSCから派生した可能性が高い。
【０１９８】
さらに、MSC-Galを腫瘍のない健常マウスに静脈内注射したところ（図15B）、極めて少数の個々のX-Gal陽性細胞が肺内部に散在して認められた。これらのX-Gal陽性細胞は増殖の徴候も正常肺実質への組込みの徴候も示さなかった。同様に、いずれの群のマウスも、検討した他の臓器（肝臓、脾臓、腎臓、筋肉）では組織中へのMSC-Gal組込みの徴候を示さず（図15C）、肝内に極めて少数の個々のX-Gal陽性細胞が観察されたのみであった。これらの結果から、MSCのインビボでの生着および増殖に対する腫瘍微小環境の役割が裏づけられた。
【０１９９】
実施例18
IFN-βおよびMSC-IFN-βはOVAR-3細胞、SKOV-3細胞およびHEY細胞のインビトロでの増殖を抑制する
IFN-βおよびMSC-IFN-βはいずれも、OVAR-3細胞、SKOV-3細胞およびHEY卵巣癌細胞のインビトロでの増殖を濃度依存的な様式で抑制した。しかし、IFN-βに対する感受性が最も高かったのはOVAR-3細胞であり（IC50が5 IU／ml）、次いでSKOV-3細胞（IC50が100 IU／ml）、Hey細胞（IC50が1000 IU／ml）の順であった（図16A、C、E）。また、OVAR-3細胞およびSKOV-3細胞はともに増殖抑制に加えて細胞死の徴候も示した。これらの結果は、図16B、DおよびFに示された共培養アッセイの結果と一致していた。さらに、予想された通り、正常MSC（MSC-βgal）は腫瘍細胞の増殖に寄与し、これによって以前の結果が裏づけられた。
【０２００】
実施例19
マウスへのIFN-βおよびMSC-IFNの投与後のIFN-βの血漿中濃度
組換えIFN-βは腹腔内注射後に急速に分解された。実際、ベースラインレベルに24時間以内に達しており、これは組換えIFN-βが全身的なレベルを維持できないことを示している（図17）。しかし、MSC-IFN-βの腹腔内注射後には検出可能なレベルのIFN-βが少なくとも6日間にわたって血中に認められた。これらのデータは、MSC-IFN-βがIFN-βの産生／血中レベルを維持しうることを立証するものである。
【０２０１】
実施例20
卵巣癌OVAR-3、SKOV-3およびHEYにおけるMSC-IFN-βのインビボでの有効性
卵巣癌OVAR-3、SKOV-3およびHEYにおけるMSC-IFN-βのインビボでの有効性を、SCIDマウス異種移植片モデルを用いて調べた。腫瘍細胞の腹腔内注射により、腫瘍をマウスの腹腔内に定着させた。細胞は1mlのPBS中に含めて注入した（OVAR-3は5×10６個、SKOV-3は6×10６個）。15日後に腫瘍が定着し、処置を開始した。これは5×10５個のMSC-IFNβの5回の腹腔内注射を週1回ずつ行うことからなる。対照群には処置を行わないか、5×10５個のMSC-βgal（1mlのPBS中）の腹腔内注射を5回行った。さらに1つの群では、40,000 IUのIFN-β（1mlのPBS中）の腹腔内注射を第15日から第48日まで隔日に行って刺激し、MSC-IFN-βとIFN-βによる従来の治療と比較した。動物の経過を死亡時まで観察し、生存性をログランク検定によって解析した。
【０２０２】
OVAR-3マウスでは、MSC-IFN-βは腫瘍増殖を抑制し、対照（p＝）に比して生存期間を延長させた（p＝）（図18）。しかし、全身投与したIFN-βにも生存性に対する効果があり（p＝）、これはこれらの細胞のIFN-βに対する感受性の上昇のためであった。
【０２０３】
SKOV-3マウスでは、MSC-IFN-βは腫瘍増殖を抑制し、対照（p＝0.0149）に比して生存期間を延長させた（p＝0.000014）（図18）。しかし、全身投与したIFN-βも同じく生存期間を幾分延長させた（p＝0.0343）。これも同様に、これらの細胞のIFN-βに対する感受性が原因であり得る。
【０２０４】
実施例21
MSCの生着
腹腔内注射したMSCが腫瘍内に生着することを確かめるために、マウスに対して5×10５個のMSC-βgalを静脈内注射を5回行い、その子孫をX-gal染色により組織化学的に追跡した。一方の群のマウス（各細胞種に関してn＝5）は、腹腔内にOVAR-3またはSVOV-3癌が定着したものとした。もう一方の群（n＝3）は腫瘍がないものとした。MSC-βgalの最終投与から14日後に組織化学染色を行った（図19）。腫瘍には多数のX-gal陽性細胞が認められ、これはコロニーを形成しており、腫瘍構造に組み込まれた（図19A）。それぞれのコロニーは、その場で周囲微小環境からのシグナルの影響を受けて増殖する、単一または極めて少数のMSCから派生した可能性が非常に高い。しかし、MSC-βgalを腫瘍のない健常マウスに腹腔内注射したところ、極めて少数の個々のX-gal陽性細胞が認められたのみであった（図19D）。さらに、これらのMSCは増殖の徴候も正常肺実質への組込みの徴候も示さなかった。卵巣癌を有するマウスにおける他の臓器（肝臓、脾臓、腎臓、筋肉）もMSC-βgalの生着を示さず（図19C）、肝内に極めて少数の個々のX-gal陽性細胞が観察されたのみであった。これにより、MSCのインビボでの生着がうまくいくためには腫瘍微小環境が重要な役割を果たすことが裏づけられた。
【０２０５】
実施例22
STI耐性KBM5細胞に対するIFN-αおよびSTI571の作用
STI耐性KBM5細胞に対するIFNαおよびSTI571の作用に関して検討した。KBM-STI細胞は、少なくとも0.5、1.0および2.0μmolという検討したSTI571の濃度ではSTI571に対して耐性であることが確認されており、一方、KBM5細胞は非常に感受性が高い。組換えIFNα（2,000、5,000および10,000 U）はKBM5細胞に対して顕著な増殖抑制作用を及ぼすが、KBM5-STI細胞に対しては作用せず、インビトロでSTIの作用を増強しない（図20A〜20B）。これらのインビトロのデータからは、STI耐性CMLにおけるIFNαの明らかなインビボでの作用（例えば、CML特異的な細胞傷害性T細胞の生成によるもの）は否定されない（Molldremら、2000）。
【０２０６】
実施例23
CMLの異種移植片モデルにおける遺伝子改変MSC
CMLのインビボモデルに着手するために、KBM5 BCR-ABL+細胞系を用いた（これはscidマウスで骨髄外腫瘍および骨髄内の白血病の両方を定着させる）。KBM5細胞は、特徴が詳細に解明されているCML骨髄性急性転化細胞から得た。STI571耐性サブラインを樹立した。2×10７個のKBM5細胞の投与により、SCIDマウスは45〜60日で死亡した。マウスに2×10７個のKBM5細胞を注入して10日間かけて生着させた後、GFP（対照）またはMFP誘導性INFαのいずれかを発現する2×10６個のMSCをマウスの尾静脈に注入して生着させた。対照として、KBM5細胞を注入したマウスにも1,000 Uの組換えイントロンAを隔日注射した。MSC注入の3日後にマウスにMFPを皮下注射した。図21に示した通り、KBM5白血病細胞を投与したマウスは疾患のために第45〜55日に死亡した。剖検の結果、これらのマウスには脾腫ならびに肺および骨髄へのKBM5細胞の浸潤がみられた（非提示データ）。4回のGFP-MSC注射を行ったKBM5生着マウスは対照マウスと同じ早さで死亡し、イントロンAの週1回の注射を3回行ったマウスでは生存期間が2〜5日延長したが、この期間は対照に比して統計的に有意ではなかった。しかし、IFNα-MSCを投与したKBM5生着マウスでは45日から85日へという生存期間の有意な延長が認められ、このことからINFαを発現するMSCがKBM5の抑制をもたらしたことが示唆された。マウスの身体的外観および剖検の結果からもこの所見は裏づけられた（非提示データ）。MSCを細胞療法として用いる代わりに、AAVベクターを筋肉に直接注入し、それによってIFN-αの全身的な分泌を可能にすることもできる。この送達経路を、10１０GEのAAV-CMV-IFN-αまたは5×10１０GEのAAV-Ga14hPRL-65ADおよび5×10１０GEのAAV-G5E-IFNαのマウス四頭筋への筋肉内注射によって評価した。マウスから毎週採血し、Biosource ELISAキットを用いて血清をIFNα発現に関して分析した。図22に示したように、循環レベルのhIFN-αが末梢血に検出された。構成性に発現されるIFN-α（AAV-CMV-IFNα）を注入した3匹のマウスでは2600pg／mlを上回るhIFN-αが検出され（これが最大レベルに達するには2週間を要した）、この活性は測定を行った2カ月間にわたり一定に保たれた。さらに、誘導性AAVを注入したマウスではIFN-αの薬物依存的な誘導が認められた（図6および7）。注目されることは、MFPの1回の適用（IP投与）により、IFN-α活性の単一のピークが生じ、それが7日間をかけて減衰したことである。誘導性AAVを注入したがMFPは投与していない対照マウスでは、IFN-αはバックグラウンドレベルであった。AAV-INFαのこの筋肉内注射法はINFαの高レベルの全身性発現をもたらす。
【０２０７】
実施例24
MDA7-MSCはSTI耐性KBM5細胞を選択的に抑制する
MSCに対して、Sunil Chada博士（Introgen, Houston, TX）から提供されたβ-gal MDA7アデノウイルスを、50、500、5,000および25,000 MOIで感染させた。実験はすべて2回ずつ行い、対照およびMDA7-MSCからの上清を入手し、KBM5細胞およびKBM5-STI細胞に添加した上で24および72時間の時点でアッセイした。β-gal MDA7-MSCおよび対照MSCとKBM5細胞（STI感受性）およびKBM5-STI細胞（STI耐性）との共培養も、12ウェルプレート中でMSCを集密に近い状態まで増殖させ、このMSC上に0.125×10６個／mLをプレーティングすることによって行った。すべてのウェルを24および72時間の時点でアッセイした。図23に示した通り、KBM5-STI耐性細胞はMDA7-MSCおよび共培養物由来の上清に対しては高度の感受性を示したが、親KBM5細胞の感受性はそれよりも低いように思われた。これらの結果には裏づけを要するが、MDA7がSTI耐性KBM5細胞に対して有効である可能性を示唆する。重要なことに、MSCに対するMDA7の有害作用は認められず、その増殖は影響を受けなかった。
【０２０８】
本明細書中に開示および請求したすべての組成物および／または方法は、本開示に鑑みて、必要以上の実験を行わずに作製および実施を行うことができる。本発明の組成物および方法を好ましい態様によって説明してきたが、当業者には、本発明の概念、精神および範囲を逸脱することなく、本明細書に記載した組成物および／または方法に対して、ならびに工程または一連の工程に、変更を加えうることは明らかであると考えられる。より詳細には、化学的にも生理的にも類縁関係にある特定の物質を本明細書に記載の物質の代わりに用いても同一または類似の結果が得られることは明らかであると考えられる。当業者にとって明白なこのようなすべての類似した代替物および変更は、添付する特許請求の範囲によって規定されるように、本発明の精神、範囲および概念の範囲内にあると考えられる。
【０２０９】
VIII．参考文献
以下の参考文献は、本明細書中に記載したものを補足する例示的な手順上またはその他の詳細を提供する範囲において、参照として明確に本明細書に組み入れられる。
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【図面の簡単な説明】
【０２１０】
【図１Ａ−１Ｃ】A375SM黒色腫細胞のインビトロでの増殖を抑制した、INF-βを産生する間葉幹細胞（MSC）（INF-β-MSC）の一例を示している。A375SM黒色腫細胞を単独で培養するか、操作していないMSCおよびINF-β-MSCとともに72時間培養した（図1A）。二倍体性MSCおよび異数体性A375SM黒色腫細胞の数をフローサイトメトリー（図1B）および細胞数算定によって評価した。INF-β-MSCは、A375SM細胞単独の場合またはA375SM細胞を非形質転換MSCと共培養した場合と比較して、A375SM黒色腫細胞の増殖を直接抑制した（図1C）。
【図２Ａ−２Ｄ】腫瘍内でのINF-MSCによるINF-βの局所産生はインビボでの腫瘍増殖の抑制に有効であるが、全身レベルのINF-βは有効でないという一例を示している。IFN-β-MSCを10６個のA375SM黒色腫細胞とともに同じ部位に皮下注射するか、細胞を2つの別の部位（被験動物の反対の側）に皮下注射した。腫瘍増殖が抑制され（図2A）、動物の生存期間が延長した（図2C）のは、A375SM黒色腫細胞をINF-β-MSCともに同じ部位に同時注射した場合のみであった。同時注射したINF-β-MSCは、悪性細胞の最初の数の1％、10％または50％に相当する投与量で有効であった。しかし、最も多数のINF-β-MSC（50％）を遠隔部位（被験マウスの腫瘍とは反対の側）に皮下注射するか、対応する用量のIFN-β（5×10４ IU、隔日）の皮下投与を行うことによって全身レベルのINF-βを与えた場合には効果はなかった。同様に、黒色腫細胞と、β-ガラクトシダーゼ遺伝子（β-Gal）を保有する対照アデノウイルスによる形質導入を施した50％MSCとの同時注射も有効でなかった。生存性の違いはログランク検定によって比較した。被験動物2匹は細胞注射から150日後にも生存しており、腫瘍を有していなかった。腫瘍サイズは1群当たりマウス5匹の平均である。（図2D）肺にA375転移性黒色腫を有するマウスにINF-β-MSCの静脈内注射または皮下注射を行った後の生存性。マウスに10６個のA375SM黒色腫細胞を静脈内注射し、その10日後にINF-β-MSCの週4回の静脈内（iv）投与または皮下（sc）投与を開始した。被験マウスを肺の黒色腫転移が原因で死亡するまで観察した。静脈内に注射したINF-β-MSCは肺腫瘍の内部でINF-βを局所的に産生し、これは生存期間の延長と有意に相関した（P＝0.021）。これに対して、皮下注射した同数のINF-β-MSCによって与えた血清中の全身レベルのINF-βは有効でなかった（P＝0.4）。INF-β-MSCを静脈内注射したマウスとINF-β-MSCを皮下注射したマウスの生存性の間には有意差があった（P＝0.023）。100日間にわたる試験後にそれ以上の死亡はなく、130日時点で屠殺した残りのマウスにはいずれも腫瘍がなかった。
【図３】AAVの代表的なマップを示している。IFN-αを産生する3種類のAAVを示している。AAV-CMA-IFN-αは構成性発現カセットである。残る2つのAAVは、MFP誘導系の構成要素である。AAV-ga14PRL-65A1Dは融合性転写因子（GAL4および65AD）を発現し、一方、AAV-G5E1b-huIFNはキメラ性プロモーター（gal4結合性エレメントを含む）およびヒトインターフェロンα-2B転写単位を含む。
【図４Ａ−４Ｂ】図4A．MSCによるMFP依存的なIFN-α誘導の例。MSCをAAV-ga14PRL-65ADおよびAAV-G5E1b-huIFNのそれぞれに感染させた上で増殖させた。10日後に細胞を12ウェル培養皿に分割して入れ、MFP（0.1％ETOH中に溶解）または担体を含む培地を与えた。18時間後にMFP含有培地を除去し、細胞を洗った。200μlの試料を毎日採取し、培地をBiosource ELISA IFN-αキットを用いてヒトIFN-αの発現に関して分析した。図4Bは、反復的なMFP依存的IFN-α誘導の例を示している。図4Aでの検討に用いたMSCをIFN-α発現のベースラインレベルの決定のために観測し、ベースラインが得られた後に細胞をさらに5日間安置した後、上記と同じくMFP（10−８M）を含む培地を与えた。試料を毎日採取し、Biosource ELISA IFN-αキットを用いてIFN-α産生に関して分析した。示したデータは2回の試験の平均である。
【図５】IFN-αを発現するMSCはCML細胞系K562およびBV173の増殖を抑制する。K562細胞系およびBV173細胞系を、あらかじめMFP誘導性AAVに感染させた上で10−８M MFPによる誘導を加えたMSC支持細胞層の上で増殖させるか、またはMSC層の上で増殖させ、1000UのInteron Aを含む培地を与えた。アリコートを毎日採取し、生存度（トリパンブルーを使用）および細胞数に関して算定した。対照ウェルは、誘導を加えていないMSC上で増殖させたCML細胞系である。示したデータは各時点／日に算定した3つのウェルの値+/-SEMを反映している。
【図６】IFN-αを発現するMSCはCML慢性期CD34+細胞のインビトロでの生存度を低下させる。慢性期CML患者のCD34+細胞を、AUTOMACS装置を用いて磁気的にCD34に関して濃縮した。精製したCML CD34+細胞を、IFN-αを発現するように誘導したMSCの支持細胞層上、または感染させていないMSC支持細胞層上で、1000UのInteron Aを添加した上で増殖させた。細胞生存度はトリパンブルー排除法を用いてアッセイした。対照ウェルはMSC支持細胞層を含むが、MFPもイントロンAも添加しなかった。細胞数は毎日記録し、各データ点は3つのウェルの算定値+/-SEMを表している。
【図７】MSCS-IFNを発現する支持細胞層上で共培養した場合に増殖抑制を受けるCML芽細胞の一例を示している。2例のCML患者の試料をFicollで濃縮し、CML芽細胞を、IFN-αを発現するMSC、IFN-αを発現しないMSC、感染させたが誘導を加えていないMSC、または感染させていないMSCにInteron A（1000U／ml）を外因性に添加したMSCの共培養物に加えた。細胞数を第3日にアッセイした。このデータは、MSCがIFN-αを発現するように誘導されたこと、ならびにCML芽細胞のインビトロでの増殖を抑制するにはInteron Aの添加で十分であることを示唆している。興味深い点は、IFN-αの非存在下でMSC支持細胞層上で共培養したCML芽細胞が増殖の亢進を示したことであり、これはMSC支持細胞層に増殖を促進する役割があることを示唆している。
【図８】CML細胞系を移植した後のマウスの生存期間に対する細胞投与量の影響の例を示している。再現性のあるエンドポイントを生じる細胞の投与量を決定するために、K562またはBV173 CML細胞を3種類の投与量（5×10６個、1×10６個および5×10５個）でマウスに静脈内注射し、マウスを毎日モニターした。データは、細胞接種後に死亡が認められた日を各細胞系について表している。
【図９】筋肉内注射後のIFN-αの全身性発現の一例を示している。IFN-αを発現するAAVの直接的な筋肉内注射の後のBalbC／nuマウスにおけるIFN-αのインビボ発現をモニターする目的。AAV-CMV-IFN-α 10１０ G.E.／匹、WFP誘導性AAV 5×10１０ G.E.／ea／匹をマウスの四頭筋に注射した。MFP（6μg／1匹）は腹腔内注射するか胃管により投与した。血液200μlを毎週採取し、IFN-αの発現に関してBioSource IFN-α Elisaを用いてアッセイした。示した結果は血中に検出されたIFN-αのpg／ml値である。
【図１０】SCIDマウスの肺への乳癌MDA 231の転移に対するIFN-MSCの静脈内投与の効果の一例を示している。
【図１１】静脈内注射したMSC-IFNβがSCIDマウスの肺への乳癌（MDA 231）転移を抑制するという一例を示している。
【図１２】MSC-IFNβを静脈内投与した転移性乳癌（MDA 231）を有するマウスが長期生存するという一例を示している。
【図１３】IFN-βまたはMSC-IFNβをSCIDマウスに投与した後のIFN-βの血漿レベルを示している。
【図１４Ａ−１４Ｃ】MDA 231またはA375SM腫瘍が肺にあるマウスの生存期間をMSC-IFN-βは延長させるが、全身投与したIFN-βは延長させないことを示している。（図14A）MDA 231癌の肺転移が定着したマウスに10６個のMSC-IFN-βまたはMSC-Galを3回静脈内注射した。別の群には100,000 IUのIFNβを試験期間全体にわたって1日おきに皮下投与した。マウスが死亡するまで経過を観察した。静脈内注射したMSC-IFN-βは、非投与対照の生存期間と比べて生存期間を有意に延長させた（P＝0.00143）。これに対して、IFN-βもMSC-Galも生存期間に対する効果はなかった（それぞれP＝0.31およびP＝0.51）。（図14B）A375SM黒色腫の肺転移が定着したマウスにMSC-IFN-βを投与するか40,000IU IFN-βを毎日皮下注射した場合の生存性。IFN-βは非投与群の生存に比して生存に対する有意な効果はなかった（P＝0.06）。MSC-IFN-βは静脈内投与するか皮下投与した。静脈内注射したMSC-IFN-βは生存期間を有意に延長した（P＝0.0012）。これに対して、皮下注射したMSC-IFN-βはまったく効果がなかった（P＝0.539）。このことは、腫瘍の抑制が、血流を介して腫瘍に到達し、そこに生着したMSC-IFN-βの局所的作用によって媒介されることを示している。一方、皮下注射したMSC-IFN-βから循環系に遊離した全身レベルのIFN-βには効果がなかった。
【図１５Ａ−１５Ｃ】MSC-GalがMDA 231腫瘍内に生着するが他の臓器には生着しないことを示している。MDA 231腫瘍が肺に定着したマウス（n＝5）または健常マウス（n＝5）に対して10６個のMSC-Galを週3回静脈内注射した。最終投与から14日後にマウスを屠殺し、各臓器から作製したスライド10枚をX-Gal染色によって検査した（図15A、15Bおよび15C）。A）肺内のMDA 231腫瘍はX-Gal陽性細胞のコロニーを多数含んでいた（スライド1枚当たり4±2コロニー、a中の矢印）。（図15B）これに対して、正常肺には極めて少数の個々のX-Gal陽性細胞が検出されたのみであった（スライド1枚当たり細胞1個未満、図15B中の矢印）。（図15C）X-Gal陽性細胞は脾臓、腎臓および筋肉のいずれにも検出されず、肝臓でわずかな陽性細胞が検出された（スライド1枚当たり2±1個）。このことは、MSCが腫瘍微小環境内に選択的に生着し、検討した他の臓器には生着しないことを示している。
【図１６Ａ−１６Ｆ】IFN-βおよびMSC-IFN-βはOVAR-3細胞、SKOV-3細胞およびHEY細胞のインビトロでの増殖を抑制する。（図16A）OVAR-3、（図16C）SKOV-3および（図16E）HEY細胞を種々の濃度のIFN-βの存在下で培養した。IFN-βの影響は、IFN-βに曝露させていない対照細胞の増殖に対する百分率として表している。結果（平均±SEM）は、IFN-βによる細胞増殖の濃度依存的な抑制を示している。（図16B）OVAR-3、（図16D）SKOV-3および（図16F）HEY細胞をMSC-βgalまたはMSC-IFN-βとともに10：1の比で共培養した。細胞を算定し、共培養物中の相対数をフローサイトメトリーによって決定した。結果（平均±SEM）は対照細胞（単独で培養）に対する百分率として表している。MSC-IFN-βとの共培養物では細胞の増殖が有意に抑制された。これらの結果は、IFN-βおよびMSC-IFN-βが、この効果を得るために免疫系の別の構成要素を必要とせずに、悪性細胞の増殖を直接抑制することを示している。
【図１７Ａ−１７Ｂ】IFN-βまたはMSC-IFN-βの腹腔内注射後の血清レベル。（図17A）40,000 IUのIFN-βの腹腔内注射後のIFN-βの血清レベル。急速に分解されて、24時間以内にベースラインのレベルとなることに注目されたい。このことは組換えIFN-βが全身レベルを維持できないことの裏づけとなる。（図17B）5×10５個のMSC-IFN-βの腹腔内注射後のIFN-βの血清レベル。ELISAの結果によれば、細胞1個当たりウイルス粒子50,000個のAd IFN-βを感染させた後に、5×10５個のMSCは24時間で40,000 IUのIFN-βを産生した。このグラフは、MSC-IFN-βの腹腔内注射によって検出可能なレベルのIFN-βが少なくとも6日間生じることを示しており、これはMSC-IFN-βがIFN-β産生／血中レベルを維持させうることを実証している。
【図１８Ａ−１８Ｂ】MSC-IFN-βの腹腔内投与は卵巣癌を有するマウスの生存を有意に向上させる。卵巣癌が定着したマウス（各細胞系につきn＝5）に対して5×10５個のMSC-IFN-βまたはMSC-βgalの腹腔内注射を5回行った。さらに、1つの群には40,000 IUのIFN-βを33日間にわたり毎日腹腔内投与した。対照マウスには何も投与しなかった。（図18A）OVAR-3マウスの生存曲線。（図18B）SKOV-3マウスの生存曲線。これはMSC-IFN-βが卵巣癌マウスの生存性を高めうることを示している。
【図１９Ａ−１９Ｃ】MSC-βgalは腫瘍に生着するが他の臓器には生着しない。卵巣癌が定着したマウス（各細胞系につきn＝5）および正常マウス（n＝3）に対して5×10５個のMSC-βgalの腹腔内注射を5回行った。1群（細胞系）につきマウス1匹を極度に病状が悪化した時点または最終投与から14日後（正常群）に屠殺した。各臓器から作製したスライド10枚をX-Gal染色により検査した。（図19A）OVAR-3および（図19B）SKOV-3の腫瘍全体は、矢印によって示したようにX-gal陽性細胞のコロニーを数多く含んでいた。このスライドはいくつかのコロニーも含んでおり、これは倍率4倍および100倍で示されている。（図19C）卵巣癌を有するマウスの臓器。X-gal陽性細胞は脾臓、腎臓、筋肉および肝臓のいずれにも検出されなかった。（d）MSC-βgalを注入した正常マウス由来の組織のスライド。この場合も、X-gal陽性細胞は脾臓、腎臓および筋肉では検出されず、少数のX-gal陽性細胞が肝臓で観察された（スライド1枚当たり2±1個）。このことはMSCが腫瘍微小環境内に選択的に生着し、検討した他の臓器には生着しないことを示している。
【図２０Ａ−２０Ｂ】STIおよびIFN-αによるSTI感受性KBM5細胞（図20A）およびSTI抵抗性KBM5／STI細胞（図20B）の増殖抑制。
【図２１】MSC-IFN-αのインビボでの検討。
【図２２】筋肉内注射によるIFN-αの全身性発現。
【図２３】MDA7-MSCとの共培養またはMDA7-MSC由来の上清によるSTI抵抗性KBM5／STI細胞の増殖抑制。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際調査報告】
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