(57)【要約】減少した発現の半減期を有する当該のタンパク質を含む融合ポリペプチド、及びその融合ポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
レポータータンパク質と少なくとも２つの異なる異種タンパク質不安定化配列とを含有する融合ポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離核酸分子であって、
前記融合ポリペプチドが、前記異種タンパク質不安定化配列を欠く対応するレポータータンパク質と比較して減少した半減期を有しているか、或いは前記異種タンパク質不安定化配列の１つを有する対応するレポータータンパク質と比較して減少した半減期を有しており、ユビキチンが前記２つの異なる異種タンパク質不安定化配列の１つではない、単離核酸分子。
【請求項２】
レポータータンパク質のオープンリーディングフレームを含む核酸配列と、少なくとも２つの異種タンパク質不安定化配列を含む単離核酸分子であって、
前記異種不安定化配列の１つがｍＲＮＡ不安定化配列であり、他の１つがユビキチンではない異種タンパク質不安定化配列である、単離核酸分子。
【請求項３】
ルシフェラーゼのオープンリーディングフレームを含む核酸配列、少なくとも１つの異種不安定化配列とを含む単離核酸分子であって、
前記ルシフェラーゼの前記オープンリーディングフレーム中の大部分のコドンが、選択された宿主細胞中で優先的に使用されるコドンである、単離核酸分子。
【請求項４】
前記核酸配列と動作可能に連結したプロモーターをさらに含む、請求項１、２又は３に記載の単離核酸分子。
【請求項５】
前記プロモーターが制御可能なプロモーターである、請求項４に記載の単離核酸分子。
【請求項６】
前記プロモーターが誘導性プロモーターである、請求項５に記載の単離核酸分子。
【請求項７】
前記プロモーターが抑制プロモーターである、請求項５に記載の単離核酸分子。
【請求項８】
異種ｍＲＮＡ不安定化配列をさらに含む、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項９】
前記ｍＲＮＡ不安定化配列が前記核酸配列に対して３’にある、請求項２又は８に記載の単離核酸分子。
【請求項１０】
少なくとも前記レポータータンパク質をコードする前記核酸配列が、宿主細胞中での発現に対して最適化されている、請求項１又は２に記載の単離核酸分子。
【請求項１１】
前記レポータータンパク質がルシフェラーゼをコードする、請求項１又は２に記載の単離核酸分子。
【請求項１２】
前記レポータータンパク質が甲虫類のルシフェラーゼをコードする、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項１３】
前記レポータータンパク質がコメツキムシルシフェラーゼをコードする、請求項１２に記載の単離核酸分子。
【請求項１４】
前記レポータータンパク質が花虫類のルシフェラーゼタンパク質をコードする、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項１５】
前記異種不安定化配列がタンパク質不安定化配列である、請求項３に記載の単離核酸分子。
【請求項１６】
前記異種不安定化配列がｍＲＮＡ不安定化配列である、請求項３に記載の単離核酸分子。
【請求項１７】
核酸配列が、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号６６、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、或いは配列番号４７、配列番号４８、配列番号６６、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９又は配列番号８０によってコードされる、対応する完全長融合ポリペプチドと実質的に同じ活性を有する融合ポリペプチドをコードする、これらの断片を含む、請求項１、２又は３に記載の単離核酸分子。
【請求項１８】
ｍＲＮＡ不安定化配列をさらに含む、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項１９】
１つのタンパク質不安定化配列がＰＥＳＴ配列である、請求項１８に記載の単離分子。
【請求項２０】
１つの異種タンパク質不安定化配列がＰＥＳＴ配列である、請求項１又は２に記載の単離核酸分子。
【請求項２１】
１つの異種タンパク質不安定化配列が、哺乳動物オルニチンデカルボキシラーゼのＣ末端に由来する、請求項１又は２に記載の単離核酸分子。
【請求項２２】
１つの異種タンパク質不安定化配列が、突然変異オルニチンデカルボキシラーゼの配列である、請求項１又は２に記載の単離核酸分子。
【請求項２３】
前記突然変異オルニチンデカルボキシラーゼの配列が、ネズミのオルニチンデカルボキシラーゼの位置４２６、４２７、４２８、４３０、４３１、４３３、４３４、４３９又は４４８に対応する位置にアミノ酸置換体を有する、請求項２１に記載の単離分子。
【請求項２４】
１つの異種タンパク質不安定化配列が、ＣＬ１、ＣＬ２、ＣＬ６、ＣＬ９、ＣＬ１０、ＣＬ１１、ＣＬ１２、ＣＬ１５、ＣＬ１６、ＣＬ１７又はＳＬ１７
である、請求項１又は２に記載の単離核酸分子。
【請求項２５】
１つの異種タンパク質不安定化配列が、前記レポータータンパク質のＣ末端に存在する、請求項１又は２に記載の単離核酸分子。
【請求項２６】
１つの異種タンパク質不安定化配列が、前記レポータータンパク質のＮ末端に存在する、請求項１又は２に記載の単離核酸分子。
【請求項２７】
前記融合ポリペプチドのＮ末端にユビキチンポリペプチドをさらに含む、請求項２に記載の単離核酸分子。
【請求項２８】
前記異種タンパク質不安定化配列の１つがユビキチンのＣ末端に存在する、請求項２７に記載の単離核酸分子。
【請求項２９】
前記異種タンパク質不安定化配列の１つが、グルタミン酸又はアルギニン残基を含む、請求項２８に記載の単離核酸分子。
【請求項３０】
約２０分の発現の半減期を有する融合ポリペプチドをコードする、請求項１０に記載の単離核酸分子。
【請求項３１】
約３０分の発現の半減期を有する融合ポリペプチドをコードする、請求項１０に記載の単離核酸分子。
【請求項３２】
前記異種タンパク質不安定化配列がＰＥＳＴ配列である、請求項１５に記載の単離核酸分子。
【請求項３３】
前記異種タンパク質不安定化配列が、哺乳動物オルニチンデカルボキシラーゼのＣ末端に由来する、請求項１５に記載の単離核酸分子。
【請求項３４】
前記異種タンパク質不安定化配列が、ＣＬ１、ＣＬ２、ＣＬ６、ＣＬ９、ＣＬ１０、ＣＬ１１、ＣＬ１２、ＣＬ１５、ＣＬ１６、ＣＬ１７又はＳＬ１７である、請求項１５に記載の単離核酸分子。
【請求項３５】
請求項１、２又は３に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項３６】
前記核酸分子が制御可能なプロモーターと動作可能に連結している、請求項３５に記載のベクター。
【請求項３７】
前記プロモーターが抑制プロモーターである、請求項３５に記載のベクター。
【請求項３８】
前記核酸分子が、配列番号４９、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、或いは配列番号４９、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９又は配列番号８０によってコードされる、対応する完全長融合ポリペプチドと実質的に同じ活性を有する融合ポリペプチドをコードする、これらの断片を含む、請求項３５に記載のベクター。
【請求項３９】
請求項１、２又は３に記載の核酸分子によってコードされる融合ポリペプチド。
【請求項４０】
前記レポータータンパク質がクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ又はβ−ガラクトシダーゼである、請求項３９に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４１】
請求項３５に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項４２】
発光タンパク質を含む融合ポリペプチドをコードするベクターを用いて、安定してトランスフェクトされる、請求項４１に記載の宿主細胞。
【請求項４３】
前記ベクターを含む宿主細胞により発せられるシグナルが、１つ又は複数の前記不安定化配列を欠くベクターを含む対応する宿主細胞により発せられるシグナルより大きい、請求項４２に記載の宿主細胞。
【請求項４４】
請求項３５に記載のベクターを含む安定細胞系であって、前記レポータータンパク質により発せられるシグナルが、１つ又は複数の前記異種不安定化配列を欠くベクターを含む対応する安定細胞系により発せられるシグナル以上である、安定細胞系。
【請求項４５】
細胞中のレポータータンパク質を検出するための方法であって、
ａ）細胞と請求項３５に記載のベクターを接触させること、及び
ｂ）前記細胞又はその溶解物中の前記レポータータンパク質の存在又は量を、検出又は測定することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生化学アッセイ及び試薬の分野に関する。より詳細には本発明は、改変型レポータータンパク質、例えば蛍光レポータータンパク質、及びそれらを使用するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ルシフェラーゼは、光の光子の放出を伴う基質（ルシフェリン）の酸化を触媒する酵素である。ルシフェラーゼは、鞘翅目の節足動物及び多くの海洋生物を含む、多数の種から単離されている。ルシフェラーゼは容易に検出可能であり、その活性は高精度で定量することができるので、ルシフェラーゼ／ルシフェリン酵素／基質対は、遺伝子発現及びタンパク質局在を研究するために、広く使用されてきている。発色団を形成するまでに３０分までの時間を必要とする、他のレポータータンパク質、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）と異なり、ルシフェラーゼの産物は、ポリペプチド鎖の合成の完了直後に検出することができる（基質及び酸素も存在する場合）。ルシフェラーゼは、多数の種及び広く様々な細胞における有用なレポーターなので、ルシフェラーゼは、遺伝子の上方制御をモニタリングするのに理想的である。しかしながら、純粋なルシフェラーゼ及び純粋なＧＦＰの安定性が、遺伝子下方制御の信頼性のある検出を、機能的に妨げることがある。
【０００３】
タンパク質分解は、損傷及び非機能性タンパク質を細胞から除去するために必要である。細胞内のタンパク質分解は、細胞内で、あるタンパク質を数時間又は数日間残存させ、一方で他のタンパク質をわずか数分間しか残存させない、非常に選択的なプロセスである。近年、タンパク質分解を調節するプロセスは、研究の重要な分野となってきており、それは、タンパク質分解における重要な成分の欠如が、ヒトの疾患の原因である可能性があるという報告によって、おそらくさらに促進されるであろう（Ｂｅｎｃｅ他、２００１；ＭｃＮａｕｇｈｔ他、２００１）。
【０００４】
多数の制御回路が短い半減期を有するタンパク質（比較的「不安定な」タンパク質）を必要とするので、タンパク質分解は、損傷又は他の異常タンパク質の除去に限られるわけではない。例えばタンパク質分解は、代謝調節、細胞周期の進行、シグナル変換及び転写を含む多くの細胞プロセスにおいて、重要な制御的役割を果たす（Ｈｉｃｋｅ、１９９７；Ｊｏａｚｅｉｒｏ他、１９９９；Ｍｕｒｒａｙ他、１９８９；Ｓａｌｇｈｅｔｔｉ他、２００１）。真核生物における大部分の選択的なタンパク質分解は、プロテオソーム、ＡＴＰ依存性マルチタンパク質複合体で行われているようである。多くの分解経路では、ユビキチン、７６アミノ酸のポリペプチドと、分解される運命のタンパク質の共有結合によって、プロテオソームの分解が進行する（Ｈｅｒｓｈｋｏ他、１９９２）。
【０００５】
オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）は、ポリアミンの生合成において重要な酵素であり、非常に短い細胞内半減期を有することが知られている。実際、ネズミのオルニチンデカルボキシラーゼ（ｍＯＤＣ）は、約３０分の半減期を有する最も短寿命なタンパク質の１つである（Ｇｈｏｄａ他、１９８９；Ｇｈｏｄａ他、１９９２を参照）。ＯＤＣの急速な分解は、「ＰＥＳＴ」配列を含むそのＣ末端の独特な組成に起因している（Ｒｏｇｅｒｓ他、１９８９；Ｒｅｉｃｈｓｔｅｉｎｅｒ、１９９０）。ＰＥＳＴ配列は、プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、及びスレオニン（Ｔ）が豊富な領域を含み、塩基性アミノ酸、リシン、アルギニン、又はヒスチジンに隣接することが多い。ＰＥＳＴ配列は、事前にユビキチン化することなくＰＥＳＴ含有タンパク質を２６Ｓプロテオソームに向ける、（Ｇｉｌｏｎ他、１９９８；Ｌｅｃｌｅｒｃ他、２０００；Ｃｏｒｉｓｈ他、１９９９；Ｌｉ他、１９９８；Ｌｉ他、２０００）。ｍＯＤＣ由来のＣ末端ＰＥＳＴ含有領域が欠失することによって、その急速な分解は妨げられる（Ｇｈｏｄａ他、１９８９）。ｍＯＤＣと対照的に、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉのＯＤＣ（ＴｂＯＤＣ）は、ＰＥＳＴ配列を有しておらず、哺乳動物細胞中で発現されると、長期間存在し非常に安定している（Ｇｈｏｄａ他、１９９０）。しかしながら、ｍＯＤＣのＣ末端をＴｂＯＤＣに融合すると、不安定なタンパク質を生じる。
【０００６】
あるグループが、レポーターのコード配列を、レポーターをコードするｍＲＮＡを不安定化させるか或いはレポーターポリペプチドを不安定化させる不安定化配列に融合させることによって、不安定化レポータータンパク質を開発している。例えば、ＯＤＣのＣ末端領域（Ｃ−ＯＤＣ）は、ＧＦＰの半減期を約２６時間から約９．８時間へと減少させ（Ｃｏｒｉｓｈ、１９９９）、Ｃ−ＯＤＣの変異形を使用した場合では、２時間未満（Ｌｉ、１９９８；Ｌｉ、２０００）に減少させることが示されている。さらに、ＰＥＳＴ配列は、ホタルルシフェラーゼの半減期を、約３．６８時間から約０．８４時間へと減少させることが示されている（Ｌｅｃｌｅｒｃ他、２０００）。Ｆａｎ他（１９９７）は、ヘルペスウイルスＲＮＡ由来のＡＵが豊富な領域が存在することによって、そのＲＮＡ、並びに異種ＲＮＡに不安定性が付与され、それによってそのｍＲＮＡが不安定になることを見出した。
【０００７】
タンパク質の不安定化に使用されてきているＣ−ＯＤＣ以外のペプチドシグナルには、サイクリン阻害ボックス（Ｃｏｒｉｓｈ他、１９９９；Ｋｉｎｇ他、１９９６）、サイクリンのＰＥＳＴ豊富Ｃ末端領域（Ｍａｔｅｕｓ他、２０００）、ＣＬペプチド、例えばＣＬ１（Ｇｉｌｏｎ他、１９９８；Ｂｅｎｃｅ他、２００１）及びＮ−デグロンがある。これらのシグナルのすべては、それらを含むタンパク質をプロテオソームによる分解に向けるが、これらのタンパク質がプロテオソームに達する前にたどる経路は、異なる可能性がある。例えばＯＤＣの分解は、事前のユビキチン化なしで２６Ｓプロテオソームで起こり（Ｂｅｒｃｏｖｉｃｈ他、１９８９；Ｍｕｒａｋａｍｉ他、１９９２）、一方ＣＬペプチドチャンネルタンパク質の分解に関しては、ユビキチン結合酵素の存在に依存する経路による（Ｇｉｌｏｎ他、１９９８）。サイクリンの分解もユビキチン化依存性のプロセスである（Ｇｌｏｔｚｅｒ他、１９９１）。それにもかかわらずサイクリンは、細胞が有糸分裂を終了するときのみ不安定になる（Ｈｕｎｔ他、１９９２）。
【０００８】
１５年より前に、Ｂａｃｈｍｉｒ他（１９８６）は、Ｎ−デグロンの分解シグナルについて記載した。この筆者達は、あるアミノ酸残基が、タンパク質のＮ末端に位置する場合には、ユビキチンの結合地点として、ユビキチンリガーゼによる内部タンパク質リジン残基の使用を刺激する可能性があることを報告した。結果として、このようなＮ末端残基（不安定残基と呼ばれる）が、対応するタンパク質の劇的な不安定化を引き起こした。Ｎ末端残基の同一性と、対応するタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期の間の関係は、Ｎ末端法則として、この筆者達によって述べられている（Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ、１９９２）。この法則は、Ｎ末端Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅ又はＧｌｕを有するβ−ガラクトシダーゼ種が、２〜３０分の半減期を有した酵母菌において広く研究されてきている。同時に、他の８個のアミノ酸残基のいずれかを有するβ−ガラクトシダーゼ種は、２０時間を超える半減期を有していた（Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ、１９９２）。２分という対応する半減期を有する最も有効な不安定残基は、アルギニンであることが見出された。Ｎ末端法則は大腸菌においても働くことが報告されてきており、アルギニン残基が最も有効な不安定残基であることが見出された（Ｔｏｂｉａｓ他、１９９１）。大腸菌では、酵母菌と同様に、β−ガラクトシダーゼのＮ末端に、この残基が位置することによって、１０時間を超える半減期に代え、２分という半減期を有するタンパク質が生じた（Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ、１９９２；Ｔｏｂｉａｓ他、１９９１）。いくつかのグループは、ウサギ、マウス及びタバコにおける、Ｎ末端法則の存在を支持する、データを報告している（Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ、１９９２；Ｒｅｉｓｓ他、１９８８；Ｋｗｏｎ他、１９９８；Ｔｏｗｎｓｅｎｄ他、１９８８）。
【０００９】
しかしながら、必要とされているのは、例えば高等真核生物中で使用するための、改良型組換えレポータータンパク質である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、発現の減少又は低下した、例えば実質的に減少又は低下した半減期を有する、改良型遺伝子産物、例えばレポータータンパク質を提供し、これらは、遺伝子発現、例えば上方制御又は下方制御を測定又は検出して、プロモーター活性を調べる、細胞毒性を減少させる、並びにタンパク質を局在させるのに有用である。
【００１１】
一実施形態では、本発明は、レポータータンパク質、例えばルシフェラーゼ、ＧＦＰ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ又はβ−ガラクトシダーゼを含む融合ポリペプチドをコードする、核酸配列を含む単離核酸分子（ポリヌクレオチド）であって、例えば、少なくとも２つの異種タンパク質不安定化配列をコードする、或いは少なくとも１つの異種タンパク質不安定化配列をコードし且つ少なくとも１つの異種ｍＲＮＡ不安定化配列を含む、少なくとも２つの異種不安定化配列を含む単離核酸分子を提供する。本明細書で使用する「異種」不安定化配列は、融合ポリペプチド中で使用されるレポータータンパク質の、野生型遺伝子中には見られない配列である。宿主細胞又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳混合物中に導入される本発明の核酸分子中の、１つ又は複数の不安定化配列の存在によって、１つ又は複数の不安定化配列を欠く対応レポータータンパク質遺伝子のレポーター活性と比較して、減少又は低下したレポーター活性（発現）、例えば実質的に減少又は低下したレポーター発現の半減期がもたらされる。例えば、本発明の核酸分子によってコードされる融合ポリペプチド中の１つ又は複数のタンパク質不安定化配列の存在によって、不安定化配列を欠く対応するタンパク質と比較して、融合ポリペプチドの半減期の減少又は低下がもたらされる。本発明の核酸分子中の１つ又は複数のＲＮＡ不安定化配列の存在によって、不安定化配列を欠く核酸分子と比較して、この核酸分子から転写されるｍＲＮＡの半減期の減少又は低下がもたらされる。本発明の核酸分子は、哺乳動物細胞中、さらに好ましくはヒト細胞中での発現に最適化された配列を含むことが好ましい（例えば、目的の細胞中での発現のために配列を最適化する方法を開示する、ＷＯ  ０２／１６９４４を参照のこと）。例えば、コザック配列及び／又は１つ又は複数のイントロンを導入することによって、且つ／或いは１つ又は複数の真核生物中でより頻繁に使用されるコドン、例えば核酸分子を用いて形質転換される真核生物の宿主細胞中でより頻繁に使用されるコドンへコドンの使用を変えることによって、核酸分子を真核生物細胞中での発現に対して最適化させることができる。
【００１２】
タンパク質不安定化配列は、目的とするタンパク質のＮ末端又はＣ末端に存在するとき、減少又は低下、例えば、そのタンパク質不安定化配列を欠く対応するタンパク質と比較して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％以上、例えば９９％の、目的とするタンパク質の半減期の減少又は低下をもたらす１つ又は複数のアミノ酸残基を含む。融合ポリペプチド中のタンパク質不安定化配列の存在は、当該のタンパク質の他の機能を実質的に変えないことが好ましい。一実施形態では、タンパク質不安定化配列は、約２００未満のアミノ酸残基を有する。タンパク質不安定化配列には、例えばサイクリン（例えば有糸分裂サイクリン）ウラシルペルミアーゼ又はＯＤＣに由来するＰＥＳＴ配列などのＰＥＳＴ配列、ＯＤＣなどの短寿命タンパク質、サイトカイン、リンホカインなどの初期応答性タンパク質のＣ末端領域由来の配列、癌原遺伝子（例えばｃ−ｍｙｃ又はｃ−ｆｏｓ）、ＭｙｏＤ、ＨＭＧ  ＣｏＡリダクターゼ、Ｓ−アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ、ＣＬ配列、サイクリン阻害ボックス、Ｎ−デグロン、或いはｉｎ  ｖｉｖｏでユビキチン化するタンパク質又はその断片があるが、これらだけには限られない。
【００１３】
ｍＲＮＡ不安定化配列は２つ以上のヌクレオチドを含み、ｍＲＮＡ中に存在すると、減少又は低下、例えば、実質的な減少又は低下、即ちｍＲＮＡ不安定化配列を欠き対応するタンパク質をコードするｍＲＮＡと比較して、例えば５０％、７０％或いはそれより多くの、例えば９０％又は９９％の減少又は低下を含め、少なくとも２０％の目的とするタンパク質をコードするｍＲＮＡの半減期の減少又は低下をもたらす。一実施形態では、ｍＲＮＡ不安定化配列は、約１００未満のヌクレオチドを有する。ｍＲＮＡ不安定化配列には、ステム−ループを形成する可能性があるｍＲＮＡの３’ＵＴＲ中に存在する配列、ブラジキニンＢ１受容体遺伝子の３’ＵＴＲを含む、１つ又は複数のＡＵＵＵＡ又はＵＵＡＵＵＵＡＵＵ配列があるが、これらだけには限られない。
【００１４】
一実施形態では、核酸分子は、ベクター、例えばプラスミド中に存在する。一実施形態では、核酸分子は、レポータータンパク質を含む不安定化融合ポリペプチドをコードし、この核酸分子は、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号６６、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、又はこれらの断片を含み、これらは、対応する完全長融合ポリペプチドと実質的に同じ活性を有する融合ポリペプチドをコードする。本明細書で使用する「実質的に同じ活性」は、対応する完全長融合ポリペプチドの、少なくとも約７０％、例えば８０％、９０％又はそれを超える活性である。
【００１５】
本明細書に記載するように、同じルシフェラーゼ融合ポリペプチド中の２つのタンパク質分解（ＣＬ１及びｍＯＤＣ）配列の組合せによって、ホタルルシフェラーゼの半減期が約３０分へ減少し、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの半減期が約２０分へ減少した。さらに、Ｎ−デグロンとｍＯＤＣは、これら２つの分解シグナルを同じタンパク質中で組み合わせることにより対応するタンパク質の分解速度の大幅な増加がもたらされる点で、相互に補填された。さらに、ルシフェラーゼ融合ポリペプチドのオープンリーディングフレームへｍＲＮＡ不安定化配列３’を導入することによって、配列の転写を不安定にし、ルシフェラーゼ発現の半減期を低下させた。さらに、ｍＲＮＡとタンパク質不安定化配列の組合せは、少なくとも３つの異なる細胞（ＨｅＬａ、ＣＨＯ及び２９３細胞）において、２つの異なるルシフェラーゼタンパク質の発現を短縮する際に、有効であることが示された。さらに、本発明の融合ポリペプチドの哺乳動物細胞−最適化配列を、これらの配列を含むプラスミドでトランスフェクトした細胞中に存在させることによって、融合ポリペプチドをコードするＲＮＡのより有効な翻訳がもたらされた結果、これらの細胞により発せられる光の量が増大した。したがって、本発明の融合ポリペプチドをコードする核酸分子に、コドン最適化配列を含む最適化配列、例えばレポータータンパク質の最適化配列、タンパク質不安定シグナルの最適化配列、或いはこの両方を、存在させることによって、増大したシグナルを生み出すことができる。
【００１６】
一実施形態では、核酸分子は、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つの異種タンパク質の不安定シグナルを含む、融合ポリペプチドをコードする核酸配列を含み、この融合ポリペプチドは、実質的に減少又は低下した半減期を有し、例えば、対応する野生型タンパク質の半減期と比較して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％以上、例えば９９％の、半減期の減少又は低下を有し、且つ／或いは、所望の細胞中での発現に対して核酸配列を最適化した結果として、その細胞中での発現用に最適化されていない配列によってコードされる融合ポリペプチドと比較して、より多くの光を発する。一実施形態において、レポータータンパク質としては、ルシフェラーゼ、例えば鞘翅類又は花虫類のルシフェラーゼ、例えばホタルルシフェラーゼ又はＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼなどがあり、ルシフェラーゼ融合ポリペプチドは、少なくとも１つの異種タンパク質不安定化配列を含み、対応する野生型（原型又は組換え）ルシフェラーゼと比較して、実質的に減少した半減期を有する。少なくともレポータータンパク質をコードする最適化核酸配列を使用することが好ましい、なぜなら、これらの最適化配列は、不安定化レポータータンパク質のシグナルの強度を、増大させることができるからである。
【００１７】
他の実施形態では、核酸分子は、少なくとも１つの異種ｍＲＮＡ不安定化配列を含み、少なくとも１つの異種タンパク質不安定化配列を含む融合ポリペプチドをコードする。ｍＲＮＡ不安定化配列は、融合ポリペプチドをコードする核酸配列に対して３’にあることが好ましい。一実施形態では、融合ポリペプチドの発現は、異種不安定化配列を欠く核酸分子によってコードされるポリペプチドと比較して減少する。
【００１８】
一実施形態では、核酸分子は、レポータータンパク質のオープンリーディングフレームを含む核酸配列と、少なくとも１つの異種不安定化配列とを含み、レポータータンパク質のオープンリーディングフレーム中の大部分のコドンが、特定の宿主細胞、例えばヒト細胞などの哺乳動物細胞中での発現に対して最適化される。核酸分子中のコドン最適化配列の存在によって、コドンが最適化されていない対応する核酸分子からの低発現を補填することができる。
【００１９】
本発明は、本発明の核酸分子を含むベクター及び宿主細胞、並びに核酸分子、ベクター又は宿主細胞を含むキットをさらに含む。特に本発明は、対応する安定状態のレポータータンパク質を発現する対応する安定細胞系と比較して、増大したシグナルを有する代謝回転の速いレポータータンパク質を発現する安定細胞系を提供する。
【００２０】
ルシフェラーゼなどの、代謝回転の速い（不安定化）レポータータンパク質は、少なくとも数時間の発現の半減期を有する現在利用可能なレポータータンパク質を使用することができない用途において、転写制御及び／又はシス作用制御要素を分析するための遺伝的レポーターなどとして、短寿命タンパク質の分解ドメインを同定し分析するためのツールなどとして、或いは有効な化合物のスクリーニングを促進するために使用することができる。本発明の制御可能なベクターを含む細胞は、対応する非修飾、例えば野生型レポータータンパク質を発現するベクターを含む細胞と比較して、誘導又は抑制に対してより速く応答し、増大した活性化を示す。さらに、スクリーニング用に使用する宿主細胞中に本発明のベクターが存在することは、これらの細胞が阻害的な細胞増殖、或いはベクターの修飾又は損失に対して感受性が低く、シグナルのより正確な定量を可能にする点で有利である。
【００２１】
したがって本発明は、本発明の核酸配列を含む発現カセット、及び宿主細胞中で当該核酸配列を発現することができるベクターも提供する。発現カセットは、核酸配列と動作可能に連結したプロモーター、例えば構成的又は制御可能なプロモーターを含むことが好ましい。ベクターの一実施形態では、発現カセットは、誘導性プロモーターを含む。更に、本発明の核酸分子、発現カセット又はベクターを含む、宿主細胞、例えば、植物細胞又は脊椎動物細胞などの真核細胞（これらだけには限られないが例えばヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ又はげっ歯類（例えばウサギ、ラット、フェレット又はマウス）細胞を含む哺乳動物細胞）並びにキットが提供される。
【００２２】
本発明の他の態様では、本発明の融合ポリペプチドで細胞を標識する方法を提供する。この方法では、細胞を、制御可能なプロモーターなどのプロモーターと、対応する野生型タンパク質と比較して実質的に低下した発現の半減期を有する、レポータータンパク質などの目的とするタンパク質を含む、融合ポリペプチドをコードする核酸配列とを含むベクターと接触させる。一実施形態では、トランスフェクトされた細胞を、プロモーターが融合ポリペプチドの一時的発現を誘導し、それによって一時的なレポーター標識を与える条件下で培養する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
発明の詳細な説明
定義
本明細書で使用する、用語「核酸分子」、「遺伝子」又は「核酸配列」は、ポリペプチド又はタンパク質前駆体の生成に必要なコード配列を含む、核酸、ＤＮＡ又はＲＮＡを指す。ポリペプチドは、所望のタンパク質活性が保持される限り、完全長コード配列によって、或いは当該コード配列の一部によってコードされるものでよい。
【００２４】
本明細書で使用する「核酸」は、ヌクレオチドの共有結合配列であって、１ヌクレオチドのペントースの３’位置が、ホスホジエステル基によって、隣のペントースの５’位置と結合しており、ヌクレオチド残基（塩基）が特定の配列で、即ちヌクレオチドが直列に結合している。本明細書で使用する「ポリヌクレオチド」は、約１００ヌクレオチド長より大きい配列を含む核酸である。本明細書で使用する「オリゴヌクレオチド」又は「プライマー」は、短いポリヌクレオチド、又はポリヌクレオチドの一部分である。オリゴヌクレオチドは、通常約２〜約１００塩基の配列を含む。用語「オリゴ」は、用語「オリゴヌクレオチド」の代わりに時々使用される。
【００２５】
核酸分子は、「５’末端」（５’端）及び「３’末端」（３’端）を有すると言われている。なぜなら、核酸のホスホジエステル結合は、置換モノヌクレオチドのペントース環の５’炭素及び３’炭素に生じるからである。新しい結合基が５’炭素であると思われるポリヌクレオチドの端は、その５’末端ヌクレオチドである。新しい結合が３’炭素であると思われるポリヌクレオチドの端は、その３’末端ヌクレオチドである。本明細書で使用する、末端ヌクレオチドは、３’又は５’末端の端部のヌクレオチドである。
【００２６】
ＤＮＡ分子は、「５’端」及び「３’端」を有すると言われる。なぜなら、１つのモノヌクレオチドのペントース環の５’リン酸が、ホスホジエステル結合基を介して一の方向でその近隣の３’酸素と結合するようにして、モノヌクレオチドが反応してオリゴヌクレオチドを作製するからである。したがって、オリゴヌクレオチドの端は、その５’リン酸がモノヌクレオチドのペントース環の３’酸素と結合していない場合は５’端と呼ばれ、その３’酸素が次のモノヌクレオチドのペントース環の５’リン酸と結合していない場合は３’端と呼ばれる。
【００２７】
本明細書で使用する際に、核酸配列は、大きなオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドに内存する場合でさえ、５’端及び３’端を有すると言うことがある。直線状又は環状ＤＮＡ分子では、個別の要素が「下流」又は３’要素の「上流」又は５’と呼ばれる。この用語は、ＤＮＡ鎖に沿って５’から３’へと転写が進むことを反映している。典型的には、結合された遺伝子（例えばオープンリーディングフレーム又はコード領域）の転写を指示する、プロモーター及びエンハンサー要素は、コード領域の５’又は上流に一般に位置する。しかしながら、エンハンサー要素は、プロモーター要素及びコード領域の３’に位置するときでさえも、その効果を発揮することができる。転写終了及びポリアデニル化シグナルは、コード領域の３’又は下流に位置する。
【００２８】
本明細書で使用する用語「コドン」は、ポリペプチド鎖、或いは開始又は停止シグナルに取り込まれるてい個々のアミノ酸を特定する３ヌクレオチドの配列からなる、塩基の遺伝的コード単位である。用語「コード領域」は、構造遺伝子に関して使用するとき、ｍＲＮＡ分子の翻訳の結果として新生ポリペプチド中で見られるアミノ酸をコードする、ヌクレオチド配列を指す。典型的には、コード領域は、５’側に開始メチオニンをコードするヌクレオチドトリプレット「ＡＴＧ」が、３’側には停止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）が結合している。ある場合には、コード領域は、ヌクレオチドトリプレット「ＴＴＧ」によって始まることも知られている。
【００２９】
「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、長さ又は翻訳後修飾（例えば、グリコシル化又はリン酸化）とは無関係に、アミノ酸の任意の鎖を意味する。本発明の核酸分子は、天然に存在するタンパク質又はそのポリペプチド断片の変異体をコードすることもできる。このようなタンパク質ポリペプチドは、それが由来する天然に存在する（原型又は野生型）タンパク質のアミノ酸配列と、少なくとも８５％、好ましくは９０％、及び最も好ましくは９５％又は９９％同一である、アミノ酸配列を有することが好ましい。
【００３０】
ポリペプチド分子は、「アミノ末端」（Ｎ末端）及び「カルボキシ末端」（Ｃ末端）を有すると言われている。なぜなら、ペプチド結合は、第１のアミノ酸残基の骨格アミノ基と、第２のアミノ酸残基の骨格カルボキシル基の間に生じるからである。ポリペプチド配列に関する、用語「Ｎ末端」及び「Ｃ末端」は、それぞれポリペプチドのＮ末端及びＣ末端領域の一部分を含む、ポリペプチドの領域を指す。ポリペプチドのＮ末端領域の一部分を含む配列は、ポリペプチド鎖のＮ末端半分に主に由来するアミノ酸を含むが、このような配列に限られるわけではない。例えば、Ｎ末端配列は、ポリペプチドのＮ末端半分とＣ末端半分の両方に由来する塩基を含むポリペプチド配列の内在部分を含むことができる。同じことが、Ｃ末端領域に当てはまる。Ｎ末端及びＣ末端領域は、最終的なポリペプチドのＮ末端とＣ末端をそれぞれ画定する、アミノ酸を含むことができるが、その必要はない。
【００３１】
本明細書で使用する用語「野生型」は、天然に存在する源から単離したその遺伝子又は遺伝子産物の特性を有する、遺伝子又は遺伝子産物を指す。野生型遺伝子は、ある一群中で最も頻繁に観察される遺伝子であり、それ故、任意に遺伝子の「野生型」の形態と称される。対照的に、用語「突然変異型」は、野生型の遺伝子又は遺伝子産物と比較して、配列及び／又は機能的性質の変化（即ち、変化した特性）を示す、遺伝子又は遺伝子産物を指す。天然に存在する突然変異型を単離することができ、野生型の遺伝子又は遺伝子産物と比較した際、これらが変化した特性を有する事実により、これらが同定されることを記す。
【００３２】
本明細書で使用する、用語「組換えタンパク質」又は「組換えポリペプチド」は、組換えＤＮＡ分子から発現されるタンパク質分子を指す。対照的に、用語「原型タンパク質」は、天然に存在する（即ち、非組換え）源から単離したタンパク質を示すために、本明細書で使用する。分子生物学の技法を使用して、原型のタンパク質と比較して同一の性質を有する、組換え形のタンパク質を生成することができる。
【００３３】
用語「融合ポリペプチド」は、異種配列（例えば非ルシフェラーゼアミノ酸又はタンパク質）と結合した目的のタンパク質（例えばルシフェラーゼ）を含む、キメラタンパク質を指す。
【００３４】
本明細書で使用する、用語「細胞」、「細胞系」、「宿主細胞」は互換的に使用され、このような名称はすべて、これらの名称の子孫又は潜在的子孫を含む。「形質転換細胞」は、例えば一過性トランスフェクションによって、その中に（或いはその祖先中に）本発明の核酸分子が導入されている、細胞を意味する。本発明の核酸分子合成遺伝子を、適切な細胞系に導入して、合成遺伝子によってコードされるタンパク質又はポリペプチドを生成することができる、安定的にトランスフェクトされた細胞系を作製することができる。このような細胞系を構築するための、ベクター、細胞、及び方法は当分野でよく知られている。用語「形質転換体」又は「形質転換細胞」は、形質導入の数とは無関係に元々形質転換されている細胞に由来する、初代形質転換細胞（ｐｒｉｍａｒｙ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｃｅｌｌｓ）を含む。すべての子孫が、意図的又は偶然の突然変異のために、ＤＮＡ含量（ＤＮＡ  ｃｏｎｔｅｎｔ）が正確に同一でないことがある。それにもかかわらず、元々形質転換されている細胞においてスクリーニングしたのと同じ機能を有する、突然変異した子孫は、形質転換体の定義中に含まれる。
【００３５】
核酸は、異なる型の突然変異を含むことが知られている。「点」突然変異は、野生型配列からの１塩基位置におけるヌクレオチドの配列の変化を指す。突然変異は、１つ又は複数の塩基の挿入又は欠失を指すこともでき、したがってその核酸配列は、野生型配列と異なる。
【００３６】
用語「相同性」は、相補性の程度を指す。部分的な相同性又は完全な相同性（即ち、同一性）がある。相同性は、配列分析用ソフトウェア（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ．１７１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ．Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ５３７０５）を使用して、測定されることが多い。このようなソフトウェアは、様々な置換体、欠失体、挿入体、及び他の修飾体に相補性の程度を割り当てることによって、類似の配列をマッチさせる。保存的置換は典型的には、以下の群：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リシン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシン中の置換を含む。
【００３７】
用語「単離」は、「単離オリゴヌクレオチド」又は「単離ポリヌクレオチド」などのように核酸に関して使用するとき、核酸の源と通常関係がある少なくとも１つの汚染物質から、同定され分離された核酸配列を指す。したがって、単離核酸は、天然で見られるものとは異なる形態又は環境で存在する。対照的に、非単離核酸（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ）は、それらが天然に存在する状態で見られる。例えば、所与のＤＮＡ配列（例えば遺伝子）は、近隣遺伝子と隣接して宿主細胞の染色体上に見られ、ＲＮＡ配列（例えば、特異的タンパク質をコードする特異的ｍＲＮＡ配列）は、無数のタンパク質をコードする多数の他のｍＲＮＡとの混合物として、細胞中で見られる。しかしながら、単離核酸は、例えばその核酸を通常発現する細胞中の核酸を含み、その核酸は天然細胞のそれと異なる染色体位置に位置するか、或いはそれ以外の場合は、天然で見られるものとは異なる核酸配列の側面に位置する。単離核酸又はオリゴヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖の形態で存在することができる。単離核酸又はオリゴヌクレオチドを、タンパク質を発現させるために使用するとき、オリゴヌクレオチドは、最低限センス鎖又はコード鎖を含むが（即ち、オリゴヌクレオチドは一本鎖であってよい）、センス鎖とアンチセンス鎖の両方を含んでもよい（即ち、オリゴヌクレオチドは二本鎖であってよい）。
【００３８】
用語「単離」は、「単離タンパク質」又は「単離ポリペプチド」などのようにポリペプチドに関して使用するとき、核酸の源と通常関係がある少なくとも１つの汚染物質から、同定され分離されたポリペプチドを指す。したがって、単離ポリペプチドは、天然で見られるものとは異なる形態又は環境で存在する。対照的に、非単離ポリペプチド（例えば、タンパク質及び酵素）は、それらが天然に存在する状態で見られる。
【００３９】
用語「精製」又は「精製する」は、タンパク質又は核酸などの目的の成分から汚染物質を除去するプロセスの結果を意味する。したがって、精製した成分のパーセントはサンプル中で増加している。
【００４０】
本明細書で使用する、用語「動作可能に連結した」は、所与の遺伝子の転写及び／又は所望のタンパク質分子の合成を指示することができる核酸分子が生成されるような方式での核酸配列の連結を指す。この用語は、機能的（例えば、酵素活性がある、結合パートナーに結合することができる、阻害することができるなどの）タンパク質又はポリペプチドが生成されるような方式の、アミノ酸をコードする配列の連結も指す。
【００４１】
用語「組換えＤＮＡ分子」は、天然では通常は一緒に見られない少なくとも２つのヌクレオチド配列を含む、ハイブリッドＤＮＡ配列を意味する。用語「ベクター」は、ＤＮＡの断片を挿入又はクローニングすることができる核酸分子に関して使用され、それを使用してＤＮＡセグメントを細胞中に移動させ、細胞中で複製させることができる。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、ウイルス、コスミドなどに由来するものであってよい。
【００４２】
本明細書で使用する、用語「組換えベクター」及び「発現ベクター」は、所望のコード配列と、特定の宿主生物中で動作可能に連結したコード配列の発現に必要とされる適切なＤＮＡ又はＲＮＡ配列とを含むＤＮＡ又はＲＮＡ配列を指す。原核生物の発現ベクターには、プロモーター、リボソーム結合部位、宿主細胞中での自律的複製の複製起点、及び考えられる他の配列、例えば任意選択のオペレーター配列、任意選択の制限酵素部位がある。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼがＤＮＡに結合してＲＮＡ合成を開始することを指示する、ＤＮＡ配列として定義される。真核生物の発現ベクターには、プロモーター、場合によってはポリアデニル化シグナル、及び場合によってはエンハンサー配列がある。
【００４３】
タンパク質又はポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドは、遺伝子のコード領域を含む核酸配列を意味する。即ち、別言すれば、核酸配列は遺伝子産物をコードする。コード領域は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はＲＮＡ形態で存在することができる。ＤＮＡ形態で存在するとき、オリゴヌクレオチドは一本鎖（即ち、センス鎖）、又は二本鎖であってよい。エンハンサー／プロモーター、スプライシング接合部、ポリアデニル化シグナルその他などの、適切な調節要素は、適切な転写の開始及び／又は第一次ＲＮＡ転写産物の正確なプロセシングを可能にする必要がある場合、遺伝子のコード領域の非常に近くに配置することができる。或いは、本発明の発現ベクター中で使用されるコード領域は、内因性のエンハンサー／プロモーター、スプライシング接合部、介在配列、ポリアデニル化シグナルなどを含むことができる。他の実施形態では、コード領域は、内因性調節要素と外因性調節要素の組合せを含むことができる。
【００４４】
用語「転写制御要素」又は「転写制御配列」は、核酸配列の発現のいくつかの側面を調節する、遺伝要素又は配列を指す。例えば、プロモーターは、動作可能に連結したコード領域の転写の開始を容易にする制御要素である。他の制御要素には、転写因子結合部位、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、終了シグナル及びエンハンサー要素があるが、これらだけには限られない。
【００４５】
真核生物の転写調節シグナルは、「プロモーター」及び「エンハンサー」要素を含む。プロモーター及びエンハンサーは、転写と関係がある細胞タンパク質と特異的に相互作用する、ＤＮＡ配列の短いアレイからなる。プロモーター及びエンハンサー要素は、酵母菌、昆虫及び哺乳動物細胞中の遺伝子を含む、様々な真核生物源から単離されている。プロモーター及びエンハンサー要素は、ウイルスからも単離されており、プロモーターなどの類似の調節要素が、原核生物中でも見られる。個々のプロモーター及びエンハンサーの選択は、目的のタンパク質を発現させるために使用する細胞種に依存する。真核生物のプロモーター及びエンハンサーの中には、広い宿主範囲を有するものもあるが、細胞型の限られた亜群中で機能的なものもある。例えば、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサーは、多くの哺乳動物種由来の広く様々な細胞種において非常に活性があり、哺乳動物細胞中でのタンパク質の発現に広く使用されている。広範囲の哺乳動物細胞型において活性なプロモーター／エンハンサー要素の２つの他の例は、ヒト伸長因子１遺伝子（Ｕｅｔｓｕｋｉ他、１９８９；Ｋｉｍ他、１９９０；及びＭｉｚｕｓｈｉｍａ及びＮａｇａｔａ、１９９０）、及びラウス肉腫ウイルスの長い末端繰り返し配列（Ｇｏｒｍａｎ他、１９８２）、並びにヒトサイトメガロウイルス（Ｂｏｓｈａｒｔ他、１９８５）由来のものである。
【００４６】
用語「プロモーター／エンハンサー」は、プロモーター機能とエンハンサー機能の両方（即ち、前記のようなプロモーター要素及びエンハンサー要素により与えられる機能）を付与ができる配列を含む、ＤＮＡのセグメントを示す。例えば、レトロウイルスの長い末端繰り返し配列は、プロモーター機能とエンハンサー機能の両方を含む。エンハンサー／プロモーターは、「内因性」又は「外因性」又は「異種」であってよい。「内因性」エンハンサー／プロモーターは、ゲノム中の所与の遺伝子と本来的に連結しているものである。「外因性」又は「異種」エンハンサー／プロモーターは、遺伝子の転写が連結したエンハンサー／プロモーターによって指示されるように、遺伝的操作（即ち、分子生物学的技法）によって、遺伝子と並んで配置される。
【００４７】
発現ベクターにおける「スプライシングシグナル」の存在は、真核宿主細胞中で組換え転写産物の高レベルの発現をもたらすことが多い。スプライシングシグナルは、第一次ＲＮＡ転写産物由来のイントロンの除去を仲介し、スプライスドナー及びアクセプター部位からなる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９）。一般的に使用されているスプライスドナー及びアクセプター部位は、ＳＶ４０の１６ＳＲＮＡ由来のスプライス接合部である。
【００４８】
真核細胞中の組換えＤＮＡ配列の効率的な発現には、効率的な終了及び生成した転写産物のポリアデニル化を指示する、シグナルの発現が必要である。転写終了シグナルは一般に、ポリアデニル化シグナルの下流で見られ、数百のヌクレオチド長である。本明細書で使用する、用語「ポリ（Ａ）部位」又は「ポリ（Ａ）配列」は、終了と新生ＲＮＡ転写産物のポリアデニル化の両方を指示するＤＮＡ配列を示す。ポリ（Ａ）尾部を欠く転写産物は不安定であり、急速に分解するので、組換え転写産物の効率的なポリアデニル化が望まれる。発現ベクターにおいて使用されるポリ（Ａ）シグナルは、「異種」又は「内因性」であってよい。内因性ポリ（Ａ）シグナルは、ゲノム中の所与の遺伝子のコード領域の３’端において自然に見られるものである。異種ポリ（Ａ）シグナルは、ある遺伝子から単離され他の遺伝子の３’に配置されたものである。一般的に使用されている異種ポリ（Ａ）シグナルは、ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナルである。ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナルは、２３７ｂｐのＢａｍＨＩ／ＢｃｌＩ制限断片に含まれ、終了とポリアデニル化の両方を指示する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９）。
【００４９】
真核生物の発現ベクターは、「ウイルスレプリコン」又は「ウイルス複製起点」も含むことができる。ウイルスレプリコンは、適切な複製因子を発現する宿主細胞中でのベクターの染色体外複製を可能にする、ウイルスＤＮＡ配列である。ＳＶ４０又はポリオーマウイルスの複製起点を含むベクターは、適切なウイルスＴ抗原を発現する細胞中で、多くのコピー数（１０４コピー／細胞まで）複製する。対照的に、ウシ乳頭腫ウイルス又はエプスタインバーウイルス由来のレプリコンを含むベクターは、少ないコピー数で（約１００コピー／細胞）染色体外において複製する。
【００５０】
用語「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」は、人為的環境、及び人為的環境中で起こるプロセス又は反応を指す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ環境には、試験管及び細胞溶解物があるが、これらだけには限られない。用語「ｉｎ  ｓｉｔｕ」は、細胞培養を指す。用語「ｉｎ  ｖｉｖｏ」は、自然環境（例えば、動物又は細胞）、及び自然環境中で起こるプロセス又は反応を指す。
【００５１】
用語「発現系」は、目的とする遺伝子の発現を測定する（例えば、検出する）ための、任意のアッセイ又は系を指す。分子生物学の分野の当業者は、任意の広く様々な発現系を使用することができることを理解しているであろう。広範囲の適切な哺乳動物細胞が、広範囲の源（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＤ）から入手可能である。形質転換又はトランスフェクションの方法、及び発現媒体の選択は、選択する宿主系に依存するであろう。形質転換及びトランスフェクションの方法は、例えばＡｕｓｕｂｅｌ他、１９９２中に記載されている。発現系は、目的の遺伝子（例えば、レポーター遺伝子）が制御配列と連結している、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ遺伝子発現アッセイを含み、遺伝子の発現を阻害又は誘導する物質を用いた処理の後にモニタリングする。遺伝子発現の検出は、発現したｍＲＮＡ又はタンパク質（例えば、レポーター遺伝子の検出可能な産物）の検出（これだけには限らない）を含む任意の適切な手段によるもの、或いは目的とする遺伝子を発現する細胞の表現型の検出可能な変化によるものであってよい。発現系は、切断事象又は他の核酸又は細胞の変化を検出する、アッセイを含むこともできる。
【００５２】
本明細書で同定したすべてのアミノ酸残基は、天然のＬ型立体配座のものである。標準的なポリペプチドの命名法に従うと、アミノ酸残基の略語は、以下の対応表中に示す通りである。
【００５３】
【表１】
2005538724.tif 000002
【００５４】
本発明は、対応する親（例えば野生型）ポリペプチドと比較して減少した、例えば実質的に減少した発現の半減期を有する、目的のタンパク質を含む、融合ポリペプチドをコードする核酸配列を含有する核酸分子を含む組成物、並びにこの分子を使用して、融合ポリペプチドを生成するための方法を提供する。本発明は、このような核酸分子によってコードされる融合ポリペプチドも提供する。本発明は、目的とするタンパク質の発現の半減期、例えばレポータータンパク質の半減期を減少させるために用いることができる。特に本発明は、目的とするタンパク質を含む融合ポリペプチドをコードする核酸配列と、異種不安定化配列、例えば１つ又は複数の異種タンパク質不安定化配列、及び／又は１つ又は複数の異種ｍＲＮＡ不安定化配列の組合せとを含み、コードされている融合ポリペプチドの発現の半減期における実質的な減少をもたらす、単離核酸分子を提供する。異種タンパク質不安定化配列は、目的とするタンパク質のＮ末端又はＣ末端、或いはＮ末端及びＣ末端に存在してよい。異種タンパク質不安定化配列は、２個以上、例えば３〜２００個、即ち３と２００の間の任意の整数個のアミノ酸残基を含むことができるが、長い配列中、例えば５残基長を超える配列中の、すべての残基が、連結アミノ酸配列を不安定状態にすることができるわけではない。任意の１つのタンパク質不安定化配列の多数のコピーを、目的とするタンパク質と共に使用することもできる。一実施形態では、異なるタンパク質不安定化配列、例えばＣＬ配列とＰＥＳＴ配列の組合せを使用する。異種ｍＲＮＡ不安定化配列は、本発明の融合ポリペプチドのコード領域に対して３’であることが好ましい。異種ｍＲＮＡ不安定化配列は、５個以上、例えば６〜１００個、即ち６と１００個の間の任意の整数個のヌクレオチドを含むことができるが、長い配列中、例えば１０ヌクレオチドを超える配列中のすべての残基が連結ヌクレオチド配列を不安定状態にすることができるわけではない。任意の１ｍＲＮＡ不安定化配列の多数のコピーを使用することができる。一実施形態では、異なるｍＲＮＡ不安定化配列を使用する。
【００５５】
場合によっては、第２のポリペプチドを、目的とするタンパク質と異種タンパク質不安定化配列、例えば目的とするタンパク質のＮ末端に存在する不安定化配列と含む融合ポリペプチドのＮ末端に融合させることができる。一実施形態では、第２のポリペプチドは、細胞又は細胞抽出物中に存在する酵素によって、Ｃ末端残基の後ろで切断されるポリペプチドであり、例えばそのＮ末端に異種タンパク質不安定化配列を有する目的タンパク質を含む融合ポリペプチドを生じる。一実施形態では、第２のポリペプチドはユビキチンである。
【００５６】
一実施形態では、Ｎ末端の異種タンパク質不安定化配列は、サイクリン阻害ボックス又はＮ−デグロンである。一実施形態では、Ｃ末端の異種タンパク質不安定化配列は、ＣＬペプチド、ＣＬ１、ＣＬ２、ＣＬ６、ＣＬ９、ＣＬ１０、ＣＬ１１、ＣＬ１２、ＣＬ１５、ＣＬ２１６、又はＣＬ１７、ＳＬ１７（参照により明確に本明細書に組み込まれる、Ｇｉｌｏｎ他、１９９８の表１を参照のこと）、Ｃ−ＯＤＣ又は突然変異Ｃ−ＯＤＣ、例えばＨＧＦＸＸＸＭＸＸＱＸＸＧＴＬＰＭＳＣＡＱＥＳＧＸＸＲＨＰＡＡＣＡＳＡＲＩＮＶ（ｍＯＤＣの残基４２３〜４６１に対応）などの配列であって、「Ｘ」で示す位置の１つ又は複数の残基が天然に存在する残基ではなく、置換によって、非置換配列を有するタンパク質と比較して、その置換配列を有するタンパク質の安定性の低下がもたらされる配列である。例えば、ＯＤＣの残基４２６、４２７、４２８、４３０、４３１、４３３、４３４、又は４４８に対応する残基に非保存的置換、例えばプロリン、アスパラギン酸又はグルタミン酸からアラニンへの置換を有する、突然変異Ｃ−ＯＤＣを含む融合ポリペプチドは、例えば非置換Ｃ−ＯＤＣを有する融合ポリペプチドと比較して、低下した安定性を有する融合ポリペプチドを生じ得る。
【００５７】
本発明は、任意の核酸配列、例えばｃＤＮＡなどの純粋な配列又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで遺伝子操作された配列で使用することができるが、レポーター遺伝子、及び選択マーカーなどの、レポーター遺伝子の発現と関係がある他の遺伝子に特に有用である。好ましい遺伝子には、ラクタマーゼ（β−ｇａｌ）、ネオマイシン耐性（Ｎｅｏ）、ＣＡＴ、ＧＵＳ、ガラクトピラノシド、ＧＦＰ、キシロシダーゼ、チミジンキナーゼ、アラビノシダーゼなどをコードする遺伝子があるが、これらだけには限られない。本明細書で使用する、「マーカー遺伝子」又は「レポーター遺伝子」は、遺伝子を発現する細胞に異なる表現型を与え、それによってその遺伝子を有する細胞を、その遺伝子を有していない細胞と区別するのを可能にする遺伝子である。このような遺伝子は、選択マーカー又はスクリーニングマーカーのいずれかをコードすることができ、それは、マーカーが、化学的手段、即ち選択物質（例えば、除草剤、抗生物質など）を使用することによって、「選択」できる形質を与えるかどうか、或いはマーカーが、観察又は試験によって、即ち「スクリーニング」によって識別できる、単なる「レポーター」形質であるかどうかに依存する。本開示の要素を、特定のマーカー遺伝子の使用により詳細に例示する。勿論、適切なマーカー遺伝子又はレポーター遺伝子の多くの例が当分野で知られており、本発明を実施する際に使用することができる。したがって、以下の考察は網羅的なものではなく例示的なものであることは理解されよう。本明細書に開示する技法、及び当分野で知られている一般的な組換え技法に照らし、本発明は任意の遺伝子の改変を可能にする。
【００５８】
代表的な遺伝子には、ｎｅｏ遺伝子、β−ｇａｌ遺伝子、ｇｕｓ遺伝子、ｃａｔ遺伝子、ｇｐｔ遺伝子、ｈｙｇ遺伝子、ｈｉｓＤ遺伝子、ｂｌｅ遺伝子、ｍｐｒｔ遺伝子、ｂａｒ遺伝子、ニトリラーゼ遺伝子、突然変異アセトラクテート合成酵素遺伝子（ＡＬＳ）又はアセト酸合成酵素遺伝子（ＡＡＳ）、メトトレキセート耐性ｄｈｆｒ遺伝子、ダラポンデハロゲナーゼ遺伝子、５−メチルトリプトファンに対する耐性を与える突然変異アントラニル酸合成酵素遺伝子（ＷＯ９７／２６３６６）、Ｒ−遺伝子座の遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子、ｘｙｌＥ遺伝子、α−アミラーゼ遺伝子、チロシナーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ（ｌｕｅ）遺伝子、（例えば、Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓのルシフェラーゼ遺伝子、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、又はコメツキムシルシフェラーゼ（Ｐｙｒｏｐｈｏｒｕｓ  ｐｌａｇｉｏｐｈｔｈａｌａｍｕｓ）遺伝子、エクオリン遺伝子、又は緑色蛍光タンパク質遺伝子があるが、これらだけには限られない。用語、選択マーカー又はスクリーニングマーカー遺伝子には、形質転換細胞を同定又は選択する手段としてその分泌を検出することができる、「分泌性マーカー」をコードする遺伝子も含まれる。この例としては、抗体の相互作用によって同定することができる分泌性抗原をコードするマーカー、或いはさらに、その触媒活性によって検出することができる分泌性酵素がある。分泌性タンパク質は、例えばＥＬＩＳＡによって検出できる、小さな分散性タンパク質、及び細胞膜中に挿入又は捕獲されるタンパク質を含む、複数のクラスに分類される。
【００５９】
一実施形態では、融合ポリペプチドをコードする核酸配列は、特定細胞中での発現のために最適化される。例えば核酸配列は、野生型配列のコドンを、特定の（選択した）細胞中で優先的に使用されるコドンと置換することによって最適化される。好ましいコドンは、選択細胞中での比較的高いコドン使用頻度を有しており、コドンの導入によって、相対的に転写因子結合部位の導入がもたらされることがほとんどなく、相対的に他の望ましくない構造的属性がもたらされることもほとんどないものが好ましい。したがって、最適化核酸の産物は、改善されたコドン使用頻度による改善された発現レベル、及び望ましくない転写制御配列の数の減少による不適切な転写挙動の低減された危険性を有する。
【００６０】
最適化されている本発明の単離核酸分子は、対応する野生型核酸配列の組成と３０％、３５％、４０％又は４５％を超える、例えば５０％、５５％、６０％又はそれを超えるコドンが異なるコドン組成を有することができる。本発明で使用するのに好ましいコドンは、特定生物中の同じアミノ酸の少なくとも１つの他のコドンより頻繁に使用されるコドンであり、より好ましいコドンは、その生物において使用頻度の低いコドンでなく、核酸分子の発現のクローニング又はスクリーニングのために使用される生物においても使用頻度の低いコドンでない。さらに、あるアミノ酸（別言すれば、３個以上のコドンを有するアミノ酸）に好ましいコドンは、他の（好ましくない）コドンより頻繁に使用される、２個以上のコドンを含むことができる。ある１種の生物中で別の種の生物中より頻繁に使用される核酸分子中のコドンの存在は、このコドンをより頻繁に使用する生物の細胞中に導入された場合、野生型又はこの細胞中の親核酸配列の発現を超えるレベルで、この細胞中において発現される核酸分子が生じる。
【００６１】
本発明の一実施形態では、異なるコドンは哺乳動物中でより頻繁に使用されるコドンであり、他の実施形態では、異なるコドンは植物中でより頻繁に使用されるコドンである。特定の型の哺乳動物、例えばヒトは、他の型の哺乳動物と異なる組の好ましいコドンを有することができる。同様に、特定の型の植物は、他の型の植物と異なる組の好ましいコドンを有することができる。本発明の一実施形態では、異なるコドンの大部分は、所望の宿主細胞において好ましいコドンである。哺乳動物（例えばヒト）及び植物の好ましいコドンは、当分野で知られている（例えば、Ｗａｄａ他、１９９０）。例えば、好ましいヒトコドンには、
2005538724.tif 000003
があるが、これらだけには限られない（Ｗａｄａ他、１９９０）。したがって、一実施形態では、本発明の合成核酸分子は、多数の好ましいヒトコドン、例えばＣＧＣ、ＣＴＧ、ＴＣＴ、ＡＧＣ、ＡＣＣ、ＣＣＡ、ＣＣＴ、ＧＣＣ、ＧＧＣ、ＧＴＧ、ＡＴＣ、ＡＴＴ、ＡＡＧ、ＡＡＣ、ＣＡＧ、ＣＡＣ、ＧＡＧ、ＧＡＣ、ＴＡＣ、ＴＧＣ、ＴＴＣ、又はこれらの任意の組合せを有することによって、野生型核酸配列と異なるコドン組成を有する。例えば、本発明の核酸分子は、野生型核酸配列と比較して、多数のＣＴＧ又はＴＴＧロイシン−コードコドン、ＧＴＧ又はＧＴＣバリン−コードコドン、ＧＧＣ又はＧＧＴグリシン−コードコドン、ＡＴＣ又はＡＴＴイソロイシン−コードコドン、ＣＣＡ又はＣＣＴプロリン−コードコドン、ＣＧＣ又はＣＧＴアルギニン−コードコドン、ＡＧＣ又はＴＣＴセリン−コードコドン、ＡＣＣ又はＡＣＴスレオニン−コードコドン、ＧＣＣ又はＧＣＴアラニン−コードコドン、又はこれらの任意の組合せを有することができる。同様に、植物中でより頻繁に使用される多数のコドンを有する核酸分子は、これらだけに限られないが、
2005538724.tif 000004
又はこれらの任意の組合せを含む、多数の植物コドンを有することによって、野生型又は親核酸配列と異なるコドン組成を有する（Ｍｕｒｒａｙ他、１９８９）。好ましいコドンは、異なる型の植物では異なる可能性がある（Ｗａｄａ他、１９９０）。
【００６２】
本発明の融合ポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子は、任意に転写制御配列、例えばエンハンサー、プロモーター及び転写終了配列と動作可能に連結して、発現カセットを形成する。核酸分子は、ベクター、例えばプラスミド又はウイルスベクター（それらは任意に選択マーカー遺伝子を有する）へ導入され、このベクターは目的とする細胞、例えば植物（双子葉植物又は単子葉植物）、真菌、酵母菌又は哺乳動物細胞中に導入される。好ましい宿主細胞は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３、Ｈｅｌａ、ＣＶ−１、及びＮＩＨ３Ｔ３細胞などの、哺乳動物細胞である。
【００６３】
コードされている融合ポリペプチドの発現は、これらだけに限られないが、制御可能なプロモーター、例えばｔｅｔプロモーター、ｈｓｐ７０プロモーターなどの誘導性プロモーター又は抑制プロモーター、及びＣＲＥによって制御される合成プロモーターを含む、任意のプロモーターによって制御することができる。例えば、ｔｅｔ制御系では、野生型ルシフェラーゼの発光シグナルは１６〜１７時間で消失したが、一方で、異種不安定化配列を含む融合ポリペプチドのシグナルは、４時間で同じレベルまで消失した。
【００６４】
本発明の一実施形態では、単離核酸分子は、レポータータンパク質及び少なくとも２つの不安定化配列を含む融合ポリペプチドをコードする、核酸配列であって、この核酸配列が、特定の生物、例えば植物又はヒトで優先的に見られ、より好ましくは高発現タンパク質、例えば高発現ヒトタンパク質において優先的に見られるコドンを含む合成配列である単離核酸分子である。
【００６５】
１つの好ましい実施形態では、本発明は、発光タンパク質、例えばルシフェラーゼを含む融合ポリペプチドをコードする核酸配列と、異種タンパク質及び／又はｍＲＮＡ不安定化配列の組合せとを含む、単離核酸分子を提供する。少なくとも発光タンパク質をコードする配列は、ヒト細胞中での発現のために最適化することが好ましい。
【００６６】
以下の非制限的な実施例によって、本発明をさらに詳細に記載する。
【実施例１】
【００６７】
材料及び方法
細菌細胞及びプラスミド
大腸菌ＪＭ１０９細胞を使用して、プラスミドを増殖させた。細菌培養物を３７℃においてＬＢブロス中で通常通り増殖させ、必要なときは１００μｇ／ｍｌのアンピシリン又は３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを加えた。プラスミドＤＮＡの抽出及び精製は、Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して行った。
【００６８】
ｐＧＥＭ（登録商標）Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ＰＣＲ産物をクローニングした。プラスミドｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクター、及びｐＳＰ−ｌｕｃ＋ＮＦ融合ベクターを、ホタルルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡの源として使用した（Ｐｒｏｍｅｇａ）。
【００６９】
ＤＮＡ修飾酵素
制限酵素ＡｇｅＩ、ＡｐａＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｓｔＥＩＩ、Ｂｓｔ９８Ｉ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＮｃｏＩ、ＮｏｔＩ、ＳｃａＩ、ＸｂａＩ及びＸｍｎＩ、並びにＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ及びＳ１ヌクレアーゼを、Ｐｒｏｍｅｇａから得た。Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ及びＥｘｐａｎｄ（商標）Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍにより供給された。
【００７０】
オリゴヌクレオチド
ポリメラーゼ連鎖反応のために使用したオリゴヌクレオチド並びにクローニング及び塩基配列決定のために使用したオリゴヌクレオチドを表１に列挙する。すべてのオリゴヌクレオチドは、Ｐｒｏｍｅｇａで合成した。
【００７１】
代表的ないくつかのこれらのＤＮＡ構築体を図１１に概略的に示す。
【００７２】
ｐＧＥＭ−Ｌｕｃ５は、ｐＧＥＭ（登録商標）Ｔ  Ｅａｓｙベクターに、ホタルルシフェラーゼをコードする断片をクローニングすることによって構築し、この断片はプライマーＬｕｃＮ及びＬｕｃＣ（表１）を使用して、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクターから増幅させた。
【００７３】
ｐＬｕｃ１１は、プラスミドｐＵｂｉｑＧＦＰ２３の大きなＮｏｔＩ−ＢｇｌＩＩ断片と、プラスミドｐＧＥＭ−Ｌｕｃ５の小さなＢｇｌＩＩ−ＮｏｔＩ断片を接合することによって構築した。
【００７４】
ｐＥＴｗｔＬｕｃ１はプラスミドｐＥＴ２８ｂ（＋）の誘導体であり、プラスミドｐＳＰ−ｌｕｃ＋ＮＦ融合ベクターの小さなＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＶ断片を、プラスミドｐＥＴ２８ｂ（＋）のＮｃｏＩ−Ｅｃｌ１３６ＩＩ断片の代わりに含む。
【００７５】
ｐｗｔＬｕｃ１は、プラスミドｐＬｕｃ１１の大きなＮｏｔＩ−ＳｃａＩ断片と、プラスミドｐＥＴｗｔＬｕｃ１の小さなＳｃａｌ−ＮｏｔＩ断片を接合することによって生成させた。
【００７６】
ｐＬｕｃ−ＰＥＳＴ１０は、プラスミドｐＬｕｃ１１の大きなＮｏｔＩ−ＥｃｏＲＩ断片と、マウスオルニチンデカルボキシラーゼ（ｍＯＤＣ）の突然変異Ｃ末端領域をコードする合成ＤＮＡ断片を、接合することによって生成させ、この合成断片は、オリゴヌクレオチドＰＥＳＴ−５’、ＰＥＳＴ−３’、５’−ＰＥＳＴ及び３’−ＰＥＳＴ（表１）によって形成された。
【００７７】
ｐＴ７ＬｕｃＰＥＳＴ１０は、プラスミドｐＬｕｃ−ＰＥＳＴ１０の大きなＢｇｌＩＩ−ＳｃａＩ断片と、プラスミドｐＥＴｗｔＬｕｃ１の小さなＳｃａＩ−ＢｇｌＩＩ断片を接合することによって生成させた。
【００７８】
ｐＬｕｃΔＲＩ１７は、ＥｃｏＲＩ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ及びリガーゼを用いて、プラスミドｐＬｕｃ１１を処理することによって構築した。
【００７９】
ｐＳＰＵｂｉｑＬｕｃ１は、プラスミドｐＳＰ−ｌｕｃ＋ＮＦ融合ベクターのＢｓｔＥＩＩ−線状化ＤＮＡと、ユビキチンをコードするプラスミドｐＵｂｉｑＧＦＰ２３の断片とを組み合わせることによって生成させた。ユビキチン断片は、ＰＣＲ及びプライマーユビキチン５’ｗｔ／ＢｓｙｔＥＩＩ及びユビキチン３’ｗｔ／ＢｓｔＥＩＩ（表１）、並びにＢｓｔＥＩＩによるその後の処理を使用して調製した。
【００８０】
ｐＥＴＵｂｉｑＬｕｃは、プラスミドｐＥＴＢｉｒＡの大きなＮｃｏＩ−Ｅｃｌ１３６ＩＩ断片と、プラスミドｐＳＰＵｂｉｑＬｕｃ１の小さなＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＶ断片とを接合することによって構築した。
【００８１】
ｐＵｂｉｑＬｕｃ１５は、ｐＵｂｉｑＧＦＰ２３をＡｇｅＩ、Ｓ１ヌクレアーゼ及びＸｂａＩで処理することによって生成させた、プラスミドｐＵｂｉｑＧＦＰ２３の大きな断片と、ｐＧＬ３−ＢａｓｉｃベクターをＮｃｏＩ、Ｓ１ヌクレアーゼ及びＸｂａＩで処理することによって作製した、プラスミドｐＧＬ３  Ｂａｓｉｃベクターの小さな断片とを接合することによって調製した。
【００８２】
ｐＵｂｉｑ（Ｙ）Ｌｕｃｌ９は、プラスミドｐＵｂｉｑＧＦＰ２３の大きなＸｂａｌ−ＸｍｎＩ断片と、プラスミドｐＳＰＵｂｉｑＬｕｃ１の小さなＸｂａＩ−ＸｍｎＩ断片とを組み合わせることによって生成させた。
【００８３】
ｐＴ７Ｕｂｉｑ（Ｉ）Ｌｕｃ１９．１、ｐＴ７Ｕｂｉｑ（Ｅ）Ｌｕｃ１９．１及びｐＴ７Ｕｂｉｑ（Ｍ）Ｌｕｃ１９．２は、プラスミドｐＵｂｉｑ（Ｙ）Ｌｕｃ１９の大きなＢａｍＨＩ−ＡｐａＩ断片と、ＢａｍＨＩ−ＡｐａＩ処理ＤＮＡ断片とを組み合わせることによって生成させ、ＤＮＡ断片は、プラスミドｐＵｂｉｑＬｕｃ１５、並びにプライマーＵｂｉ−Ｌｕｃ５’ｗ／Ｌｉｎｋｅｒ及びＵｂｉ−Ｌｕｃ３’とリンカー、或いはＵｂｉ−Ｌｕｃ３’ｗ／Ｌｉｎｋｅｒ  Ｇｌｕ又はＵｂｉ−Ｌｕｃ３’ｗ／Ｌｉｎｋｅｒ  Ｍｅｔ（表１）を然るべく使用して、ＰＣＲによって増幅させた。
【００８４】
ｐＴ７Ｕｂｉｑ（Ｙ）Ｌｕｃ１９．２は、プラスミドｐＴ７Ｕｂｉｑ（Ｉ）Ｌｕｃ１９．１の大きなＢａｍＨＩ−ＸｍｎＩ断片と、プラスミドｐＵｂｉｑ（Ｙ）Ｌｕｃ１９の小さなＢａｍＨＩ−ＸｍｎＩ断片とを接合することによって生成させた。
【００８５】
ｐＵｂｉｑ（Ｒ）Ｌｕｃ１３は、プラスミドｐＵｂｉｑ（Ｙ）Ｌｕｅ１９の大きなＢｓｔＥＩＩ−ＸｍｎＩ断片と、ＢｓｔＥＩＩ−ＸｍｎＩ処理ＤＮＡ断片を組み合わせることによって生成させ、ＤＮＡ断片は、プラスミドｐＵｂｉｑ（Ｙ）Ｌｕｃ１９、並びにプライマーユビキチン５’ｗｔ／ＢｓｙｔＥＩＩ及びＵｂｉｑ（Ｒ）（表１）を使用して、ＰＣＲによって増幅させた。
【００８６】
ｐＵｂｉｑ（Ａ）Ｌｕｃ２、ｐＵｂｉｑ（Ａｓｐ２）Ｌｕｃ１６、ｐＵｂｉｑ（Ｆ）Ｌｕｃ１０、ｐＵｂｉｑ（Ｈｉｓ２）Ｌｕｃ３、ｐＵｂｉｑ（Ｈ）Ｌｕｃ１１、ｐＵｂｉｑ（Ｌ）Ｌｕｃ２３、ｐＵｂｉｑ（Ｋ）Ｌｕｃ４、ｐＵｂｉｑ（Ｎ）Ｌｕｃ２５、ｐＵｂｉｑ（Ｑ）Ｌｕｃ３６及びｐＵｂｉｑ（Ｗ）Ｌｕｃ１６は、プラスミドｐＵｂｉｑ（Ｒ）Ｌｕｃ１３の大きなＢｓｔＥＩＩ−ＸｍｎＩ断片と、ＢｓｔＥＩＩ−ＸｍｎＩ処理ＤＮＡ断片を組み合わせることによって構築し、ＤＮＡ断片は、プラスミドｐＵｂｉｑ（Ｙ）Ｌｕｃ１９、並びにプライマーユビキチン５’ｗｔ／ＢｓｙｔＥＩＩ、及びＡｌａ又はＡｓｐ、又はＰｈｅ、又はＨｉｓ２、又はＨｉｓ、又はＬｅｕ、又はＬｙｓ、又はＡｓｎ、又はＧｌｎ、又はＴｒｐ（表１）をそれぞれ使用して、ＰＣＲによって増幅させた。
【００８７】
ｐＵｂｉｑ（Ｈ）ΔＬｕｃ１８は、プラスミドｐＵｂｉｑ（Ｈ）Ｌｕｃ１１をＢｓｔＥＩＩ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ及びリガーゼで処理することによって構築した。
【００８８】
ｐＵｂｉｑ（Ｅ）ΔＬｕｃ６は、プラスミドｐＵｂｉｑ（Ｈ）ΔＬｕｃ１８の大きなＳｃａＩ−ＸｍｎＩ断片と、ＳｃａＩ−ＸｍｎＩ処理ＰＣＲ増幅断片を接合することによって生成させた。これらの断片は、プライマーユビキチン５’ｗｔ／ＢｓｙｔＥＩＩ、並びにＵｂｉｑ（Ｅ）ｄｅｌ５’又はＵｂｉｑ（Ｅ）ｄｅｌ３’及びＬｕｃＣ（表１）を使用して、別のＤＮＡ断片としてプラスミドｐＴ７Ｕｂｉｑ（Ｅ）Ｌｕｃ１９．１から増幅させ、次いでこれらの断片を、プライマーユビキチン５’ｗｔ／ＢｓｙｔＥＩＩ及びＬｕｃＣを使用した、別のＰＣＲにおいて組み合わせた。
【００８９】
ｐＴ７Ｕｂｉｑ（Ｅ）ＬｕｃＰＥＳＴ２３は、プラスミドｐＴ７Ｕｂｉｑ（Ｉ）Ｌｕｃ１９．１の大きなＢｓｔ９８Ｉ−ＳｃａＩ断片と、プラスミドｐＬｕｃ−ＰＥＳＴ１０の小さなＢｓｔ９８Ｉ−ＳｃａＩ断片を接合することによって生成させた。
【００９０】
ｐＵｂｉｑ（Ｒ）Ｌｕｃ−ＰＥＳＴ１２及びｐＵｂｉｑ（Ｙ）Ｌｕｃ−ＰＥＳＴ５は、プラスミドｐＬｕｃ−ＰＥＳＴ１０の小さなＢｓｔ９８Ｉ−ＳｃａＩ断片と、プラスミドｐＵｂｉｑ（Ｒ）Ｌｕｃ１３及びｐＵｂｉｑ（Ｙ）Ｌｕｃ１９の大きなＢｓｔ９８Ｉ−ＳｃａＩ断片とを接合することによって然るべく生成させた。
【００９１】
ｐＧＥＭｈＬｕｃ＋５は、ｐＧＥＭ（登録商標）Ｔ  Ｅａｓｙベクターに、ホタルルシフェラーゼをコードする断片をクローニングすることによって構築し、この断片は、最適化ホタルルシフェラーゼの配列を有する鋳型、並びにプライマーＬｕｃ＋Ｎ及びＬｕｃ＋Ｃ（表１）を使用して増幅させた。
【００９２】
ｐｈＬｕｃ＋ＰＥＳＴ１は、プラスミドｐＧＥＭｈＬｕｃ＋５の小さなＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片と、プラスミドｐＬｕｃ−ＰＥＳＴ１０の大きなＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を接合することによって生成させた。
【００９３】
ｐＴ７Ｕｂｉｑ（Ｅ）ｈＬｕｃ＋ＰＥＳＴ８０は、プラスミドｐＴ７Ｕｂｉｑ（Ｉ）Ｌｕｃ１９．１の小さなＢｓｔＥＩＩ−ＶｓｐＩ断片と、プラスミドｐｈＬｕｃ＋ＰＥＳＴ１の大きなＢｓｔＥＩＩ−ＶｓｐＩ断片を接合することによって生成させた。
【００９４】
ヒトｈｓｐ７０遺伝子（Ｐｈｓｐ７０）のプロモーターを含む配列を、ＰＣＲ及びプライマー
【化１】
2005538724.tif 000005
を使用して、ヒト染色体ＤＮＡから増幅させた。
【００９５】
ＵＴＲ不安定化配列は、プライマー
【化２】
2005538724.tif 000006
を使用して構築した。
【００９６】
ＢＫＢ不安定化配列は、プライマー
【化３】
2005538724.tif 000007
を使用して構築した。
【００９７】
突然変異ｍＯＤＣ  ＰＥＳＴ配列（ＨＧＦＰＰＥＭＥＥＱＡＡＧＴＬＰＭＳＣＡＱＥＳＧＭＤＲＨＰＡＡＣＡＳＡＲＩＮＶ（ｍＯＤＣの残基４２３〜４６１に対応；配列番号７）は、プライマー
【化４】
2005538724.tif 000008
を使用して構築した。
【００９８】
ＣＬ１配列（ＡＣＫＮＷＦＳＳＬＳＨＦＶＩＨＬ；配列番号１２）は、オリゴヌクレオチド
【化５】
2005538724.tif 000009
を使用して構築した。
【００９９】
最適化ＰＥＳＴ配列（ｈＰＥＳＴ）は、以下の配列を有する：
【化６】
2005538724.tif 000010
【０１００】
ＵＴＲ配列を有する最適化ＣＬ１及びｈＰＥＳＴは、以下の配列を有する：
【化７】
2005538724.tif 000011
【０１０１】
ｐＧＥＭ−ｈＲＬ３は、ｐＧＥＭ（登録商標）Ｔ  Ｅａｓｙベクターに、ＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼをコードするＰＣＲ増幅させた最適化配列をクローニングすることによって構築し、この配列はプライマーｈＲＬＮ及びｈＲＬＣ（表１）を使用して、ｐｈＲＬ−ＴＫから増幅させた。
【０１０２】
ｐｈＲＬ−ＰＥＳＴ１５は、プラスミドｐＬｕｃ−ＰＥＳＴ１０の大きなＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片と、プラスミドｐＧＥＭ−ｈＲＬ３の小さなＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片を接合することによって生成させた。
【０１０３】
ｐｈＲＬΔＲＩ−ＰＥＳＴ１は、プラスミドｐｈＲＬ−ＰＥＳＴ１５をＥｃｏＲＩ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ及びリガーゼで処理することによって構築した。
【０１０４】
ｐＴ７Ｕｂｉｑ（Ｅ）ｈＲＬ−ＰＥＳＴ６５及びｐＵｂｉｑ（Ｒ）ｈＲＬ−ＰＥＳＴ４５は、プラスミドｐｈＲＬ−ＰＥＳＴ１５の大きなＢｓｔＥＩＩ−ＶｓｐＩ断片と、プラスミドｐＴ７Ｕｂｉｑ（Ｅ）Ｌｕｃ１９．１及びｐＵｂｉｑ（Ｒ）Ｌｕｃ１３の小さなＢｓｔＥＩＩ−ＶｓｐＩ断片とを然るべく接合することによって生成させた。
【０１０５】
ｐＵｂｉｑ（Ａ）ｈＲＬ１、ｐＵｂｉｑ（Ｈ）ｈＲＬ１、ｐＵｂｉｑ（Ｆ）ｈＲＬ１は、プラスミドｐｈＲＬΔＲＩ−ＰＥＳＴ１の大きなＢｓｔ９８Ｉ−ＢｓｔＥＩＩ断片と、プラスミドｐＵｂｉｑ（Ａ）Ｌｕｃ２又はｐＵｂｉｑ（Ｈｉｓ２）Ｌｕｃ３又はｐＵｂｉｑ（Ｆ）Ｌｕｃ１０の小さなＢｓｔ９８Ｉ−ＢｓｔＥＩＩ断片とを然るべく接合することによって生成させた。
【０１０６】
ｐＵｂｉｑ（Ｅ）ｈＲＬ１及びｐＵｂｉｑ（Ｒ）ｈＲＬ１は、プラスミドｐｈＲＬΔＲＩ−ＰＥＳＴ１の大きなＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＶ断片と、プラスミドｐＴ７Ｕｂｉｑ（Ｅ）ｈＲＬ−ＰＥＳＴ６５又はｐＵｂｉｑ（Ｒ）ｈＲＬ−ＰＥＳＴ４５の小さなＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＶ断片とを然るべく接合することによって生成させた。
【０１０７】
ｐＧＥＭ−ｔｅｔＯ１は、ｐＧＥＭ（登録商標）Ｔ  Ｅａｓｙベクターに、ｈＣＭＶ最少プロモーター、及びヘプタマー化した上流のｔｅｔ−オペレーター（Ｇｏｓｓｅｎ、１９９２）をコードするＰＣＲ増幅させた配列をクローニングすることによって構築し、この配列はプライマーｔｅｔＯ−３’及びｔｅｔＯ−５’（表１）を使用して、ｐＵＨＤ１０−３から増幅させた。
【０１０８】
ｐｔｅｔＯ−ｈＲＬ９は、プラスミドｐｔｅｔＯ−ｈＲＬ１−ＰＥＳＴ１をエンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ及びリガーゼで処理することによって生成させた。
【０１０９】
ｐｔｅｔＯ−ｈＲＬ−ＰＥＳＴ１は、プラスミドｐｈＲＬ−ＰＥＳＴ１５の大きなＮｈｅＩ−ＶｓｐＩ断片と、プラスミドｐＧＥＭ−ｔｅｔＯ１の小さなＮｈｅＩ−ＶｓｐＩ断片とを接合することによって生成させた。
【０１１０】
ｐｔｅｔＯ−Ｔ７Ｕｂｉｑ（Ｅ）ｈＲＬ−ＰＥＳＴ１５は、プラスミドｐＴ７Ｕｂｉｑ（Ｅ）ｈＲＬ−ＰＥＳＴ６５の大きなＮｈｅＩ−ＶｓｐＩ断片と、プラスミドｐＧＥＭ−ｔｅｔＯ１の小さなＮｈｅＩ−ＶｓｐＩ断片とを接合することによって生成させた。
【０１１１】
ｐｔｅｔＯ−Ｕｂｉｑ（Ｅ）ｈＲＬ−ＰＥＳＴ６は、プラスミドｐｔｅｔＯ−Ｔ７Ｕｂｉｑ（Ｅ）ｈＲＬ−ＰＥＳＴ１５をＸｂａＩ及びＥｃｏ４７ＩＩＩ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ及びリガーゼで処理することによって構築した。
【０１１２】
ｐｔｅｔＯ−Ｕｂｉｑ（Ｅ）ｈＲＬ−ＰＥＳＴ−ＵＴＲ１３は、プラスミドｐｔｅｔＯ−Ｕｂｉｑ（Ｅ）ｈＲＬ−ＰＥＳＴ６の大きなＭｕｎｉ−ＸｂａＩ断片と、オリゴヌクレオチドＡＵＵＵ及びアンチ−ＡＵＵＵ（表１）によって形成されたアダプターを接合することによって作製した。
【０１１３】
ｐｔｅｔＯ−ｈＲＬ−ＰＥＳＴ−ＵＴＲ１２は、プラスミドｐｔｅｔＯ−Ｕｂｉｑ（Ｅ）ｈＲＬ−ＰＥＳＴ−ＵＴＲ１３の大きなＰｓｔＩ−ＫｐｎＩ断片と、プラスミドｐｔｅｔＯ−ｈＲＬ−ＣＬ１−ＰＥＳＴ１１の小さなＰｓｔＩ−ＫｐｎＩ断片を接合することによって作製した。
【０１１４】
ｐｔｅｔＯ−Ｕｂｉｑ（Ｅ）ｈＲＬ−ＰＥＳＴ−ＢＫＢ２４は、プラスミドｐｔｅｔＯ−Ｔ７Ｕｂｉｑ（Ｅ）ｈＲＬ−ＰＥＳＴ１５の大きなＭｕｎｉ−ＨｐａＩ断片と、オリゴヌクレオチド３’−ＢＫＢ１及び５’−ＢＫＢ１ｒｅｖ（表１）によって形成されたアダプターを接合することによって作製した。
【０１１５】
ｐｔｅｔＯ−Ｔ７Ｕｂｉｑ（Ｅ）ｈＲＬ−ＰＥＳＴ−ＵＴＲ−ＢＫＢ８は、プラスミドｐｔｅｔＯ−Ｕｂｉｑ（Ｅ）ｈＲＬ−ＰＥＳＴ−ＢＫＢ２４の大きなＮｈｅＩ−Ｍｕｎｉ断片と、プラスミドｐｔｅｔＯ−Ｕｂｉｑ（Ｅ）ｈＲＬ−ＰＥＳＴ−ＵＴＲ１６の小さなＮｈｅＩ−Ｍｕｎｉ断片を接合することによって生成させた。
【０１１６】
ｐｔｅｔＯ−Ｕｂｉｑ（Ｅ）ｈＲＬ−ＰＥＳＴ−ＵＴＲ１６は、プラスミドｐｔｅｔＯ−Ｕｂｉｑ（Ｅ）ｈＲＬ−ＰＥＳＴ６の大きなＭｕｎＩ−ＸｂａＩ断片と、オリゴヌクレオチドＡＵＵＵ（配列番号３）及びアンチ−ＡＵＵＵ（配列番号４）によって形成されたＤＮＡ断片を接合することによって生成させた。
【０１１７】
ｐｔｅｔＯ−ｈＲＬ−ＣＬ１−ＰＥＳＴ１１は、プラスミドｐｔｅｔＯ−ｈＲＬ−ＰＥＳＴ１の大きなＥｃｏＲＩ断片と、オリゴヌクレオチドＣＬ１−Ｎ−最終（配列番号６４）及びＲｅｖ−ＣＬ１−Ｎ−最終（配列番号６５）によって形成されたＤＮＡ断片を接合することによって生成させた。
【０１１８】
ｐｔｅｔＯ−ｈＲＬ−ＣＬ１−ＰＥＳＴ−ＵＴＲ１は、プラスミドｐｔｅｔＯ−Ｕｂｉｑ（Ｅ）ｈＲＬ−ＰＥＳＴ−ＵＴＲ１６の大きなＰｓｔＩ−ＫｐｎＩ断片と、プラスミドｐｔｅｔＯ−ｈＲＬ−ＣＬ１−ＰＥＳＴ１１の小さなＰｓｔＩ−ＫｐｎＩ断片を接合することによって生成させた。
【０１１９】
ｐＧＥＭ−Ｐｈｓｐ７０−３は、ｐＧＥＭ（登録商標）Ｔ  Ｅａｓｙベクターに、ＰＣＲ増幅させた配列をクローニングすることによって構築し、この配列はプライマーｈｓｐ７０−５’及びｈｓｐ７０−３’（表１）を使用して、ヒトＤＮＡから増幅させた。
【０１２０】
ｐＰｈｓｐ７０−ｈＲＬ−ＰＥＳＴ１５は、プラスミドｐｔｅｔＯ−ｈＲＬ−ＰＥＳＴ１の大きなＮｈｅＩ−ＶｓｐＩ断片と、プラスミドｐＧＥＭ−Ｐｈｓｐ７０−３の小さなＮｈｅＩ−ＶｓｐＩ断片を接合することによって生成させた。
【０１２１】
ｐＰｈｓｐ７０−ｈＲＬ７は、プラスミドｐＰｈｓｐ７０−ｈＲＬ−ＰＥＳＴ１５をＥｃｏＲＩ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ及びリガーゼで処理することによって構築した。
【０１２２】
ｐＰｈｓｐ７０−Ｕｂｉｑ（Ｅ）ｈＲＬ−ＰＥＳＴ１は、プラスミドｐｔｅｔＯ−Ｕｂｉｑ（Ｅ）ｈＲＬ−ＰＥＳＴ６の大きなＮｈｅＩ−ＶｓｐＩ断片と、プラスミドｐＧＥＭ−Ｐｈｓｐ７０−３の小さなＮｈｅＩ−ＶｓｐＩ断片を接合することによって生成させた。
【０１２３】
ｐＰｈｓｐ７０−Ｕｂｉｑ（Ｅ）ｈＲＬ−ＰＥＳＴ−ＵＴＲ１０は、プラスミドｐｔｅｔＯ−Ｕｂｉｑ（Ｅ）ｈＲＬ−ＰＥＳＴ−ＵＴＲ１６の大きなＮｈｅＩ−ＶｓｐＩ断片と、プラスミドｐＧＥＭ−Ｐｈｓｐ７０−３の小さなＮｈｅＩ−ＶｓｐＩ断片を接合することによって生成させた。
【０１２４】
ｐＰｈｓｐ７０−Ｔ７Ｕｂｉｑ（Ｅ）ｈＲＬ−ＰＥＳＴ−ＢＫＢ５は、プラスミドｐｔｅｔＯ−Ｔ７Ｕｂｉｑ（Ｅ）ｈＲＬ−ＰＥＳＴ−ＢＫＢ２４の大きなＮｈｅＩ−ＶｓｐＩ断片と、プラスミドｐＧＥＭ−Ｐｈｓｐ７０−３の小さなＮｈｅＩ−ＶｓｐＩ断片を接合することによって生成させた。
【０１２５】
ｐＰｈｓｐ７０−Ｔ７Ｕｂｉｑ（Ｅ）ｈＲＬ−ＰＥＳＴ−ＵＴＲ−ＢＫＢ７は、プラスミドｐｔｅｔＯ−Ｔ７Ｕｂｉｑ（Ｅ）ｈＲＬ−ＰＥＳＴ−ＵＴＲ−ＢＫＢ８の大きなＮｈｅＩ−ＶｓｐＩ断片と、プラスミドｐＧＥＭ−Ｐｈｓｐ７０−３の小さなＮｈｅＩ−ＶｓｐＩ断片を接合することによって生成させた。
【０１２６】
ｐＬｕｃＣＬ１−２５は、プラスミドｐＬｕｃ１１の大きなＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ断片と、オリゴヌクレオチドＣＬ１（配列番号６２）及びＲｅｖ−ＣＬ１（配列番号６３）によって形成されたＤＮＡ断片を接合することによって生成させた。
【０１２７】
ｐＬｕｃＣＬ１−ＰＥＳＴ９は、プラスミドｐＬｕｃ−ＰＥＳＴ１０の大きなＥｃｏＲＩ断片と、オリゴヌクレオチドＣＬ１−Ｎ（配列番号６４）及びＲｅｖ−ＣＬ１−Ｎ（配列番号６５）によって形成されたＤＮＡ断片を接合することによって生成させた。
【０１２８】
ｐＣＬ１−Ｌｕｃ１は、プラスミドｐＬｕｃΔＲＩ１７の大きなＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩ断片と、オリゴヌクレオチドＣＬ１−Ｎ−最終（配列番号６４）及びＲｅｖ−ＣＬ１−Ｎ−最終（配列番号６５）によって形成されたＤＮＡ断片を接合することによって生成させた。
【０１２９】
ｐｈＬｕｃ＋ＣＬ１−ＰＥＳＴ１３は、プラスミドｐｈＬｕｃ＋ＰＥＳＴ１の大きなＥｃｏＲＩ断片と、オリゴヌクレオチドＣＬ１−Ｎ−最終（配列番号６４）及びＲｅｖ−ＣＬ１−Ｎ−最終（配列番号６５）によって形成されたＤＮＡ断片を接合することによって生成させた。
【０１３０】
ｐＰｈｓｐ７０ｈＬｕｃ＋ＰＥＳＴ２は、プラスミドｐｈＬｕｃ＋ＰＥＳＴ１の大きなＥｃｏＲＩ−ＮｈｅＩ断片と、プラスミドｐＰｈｓｐ７０ｈＲＬ−ＰＥＳＴ１５の小さなＥｃｏＲＩ−ＮｈｅＩ断片を接合することによって生成させた。
【０１３１】
ｐＰｈｓｐ７０ｈＬｕｃ＋１４は、プラスミドｐＰｈｓｐ７０ｈＬｕｃ＋ＰＥＳＴ２をＥｃｏＲＩ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ及びリガーゼで処理することによって構築した。
【０１３２】
ｐＰｂｓｐ７０ｈＲＬ−ＣＬ１−ＰＥＳＴ−ＵＴＲ４は、プラスミドｐｔｅｔＯ−ｈＲＬ−ＣＬ１−ＰＥＳＴ−ＵＴＲ１の大きなＶｓｐＩ−ＮｈｅＩ断片と、プラスミドｐＧＥＭ−Ｐｈｓｐ７０−３の小さなＶｓｐＩ−ＮｈｅＩ断片を接合することによって生成させた。
【０１３３】
ｐＰｈｓｐ７０ｈＬｕｃ＋ＣＬ１−ＰＥＳＴ１２、ｐＰｈｓｐ７０ｈＬｕｃ＋ＣＬ１−ＰＥＳＴ−ＵＴＲ５は、プラスミドｐｈＬｕｃ＋ＣＬ１−ＰＥＳＴ１３の小さなＥｃｏＲＩ−ＮｈｅＩ断片と、プラスミドｐＰｈｓｐ７０ｈＲＬ−ＰＥＳＴ１５及びｐＰｈｓｐ７０ｈＲＬ−ＣＬ１−ＰＥＳＴ−ＵＴＲ４それぞれの大きなＥｃｏＲＩ−ＮｈｅＩ断片を接合することによって作製した。
【０１３４】
ｐＰｈｓＰ７０ＭｈＬｕｃ＋２７、ｐＰｈｓｐ７０ＭｈＬｕｃ＋ＰＥＳＴ２５、ｐＰｈｓｐ７０ＭｈＬｕｃ＋ＣＬ１−ＰＥＳＴ３２及びｐＰｈｓｐ７０ＭｈＬｕｃ＋ＣＬ１−ＰＥＳＴ−ＵＴＲ１９は、オリゴヌクレオチドＮ−Ｍ及びＭ−Ｃ（表１）によって形成されたＤＮＡ断片を、ＢｓｔＥＩＩ及びＢｇｌＩＩで処理した、それぞれプラスミドｐＰｈｓｐ７０ｈＬｕｃ＋１４、ｐＰｈｓｐ７０ｈＬｕｃ＋ＰＥＳＴ２、ｐＰｈｓｐ７０ｈＬｕｃ＋ＣＬ１−ＰＥＳＴ１２及びｐＰｈｓｐ７０ｈＬｕｃ＋ＣＬ１−ＰＥＳＴ−ＵＴＲ５にクローニングすることによって構築した。
【０１３５】
ｐｈＲＬ−ＰＥＳＴ１４は、プラスミドｐｈＲＬ−ＰＥＳＴ１５の大きなＥｃｏＲＶ−ＮｈｅＩ断片と、プラスミドｐｈＲＬ−ＴＫの小さなＥｃｏＲＶ−ＮｈｅＩ断片とを接合することによって構築した。
【０１３６】
ｐＧＬ３−ｈＲＬ−ＰＥＳＴ３は、プラスミドｐＧＬ３−Ｕｂｉｑ（Ｅ）ｈＲＬ−ＰＥＳＴ２の大きなＢｓｔ９８Ｉ−ＸｂａＩ断片と、プラスミドｐｈＲＬ−ＰＥＳＴ１４の小さなＢｓｔ９８Ｉ−ＸｂａＩ断片とを接合することによって構築した。
【０１３７】
ｐＧＬ３−ｈＲＬ１１は、プラスミドｐＧＬ３−ｈＲＬ−ＰＥＳＴ３の大きなＢｓｔ９８Ｉ−ＥｃｏＲＶ断片と、プラスミドｐｈＲＬ３の小さなＢｓｔ９８Ｉ−ＥｃｏＲＶ断片とを接合することによって構築した。
【０１３８】
ｐＧＬ３−ｈＲＬ−ＣＬ１−ＰＥＳＴ−ＵＴＲ２３は、プラスミドｐＧＬ３−ｈＲＬ−ＰＥＳＴ３の大きなＢｓｔ９８Ｉ−ＥｃｏＲＶ断片と、プラスミドｐｔｅｔＯ−ｈＲＬ−ＣＬ１−ＰＥＳＴ−ＵＴＲ１の小さなＢｓｔ９８Ｉ−ＥｃｏＲＶ断片とを接合することによって構築した。
【０１３９】
ｐＧＬ３−ｈＲＬ−ＰＥＳＴ−ＵＴＲ６は、プラスミドｐＧＬ３−ｈＲＬ−ＰＥＳＴ３の大きなＢｓｔ９８Ｉ−ＥｃｏＲＶ断片と、プラスミドｐｔｅｔＯ−Ｕｂｉｑ（Ｅ）ｈＲＬ−ＰＥＳＴ−ＵＴＲ１６の小さなＢｓｔ９８Ｉ−ＥｃｏＲＶ断片を接合することによって構築した。
【０１４０】
ｐＧＬ３−ｈＲＬ−ＣＬ１−ＰＥＳＴ７は、プラスミドｐＧＬ３−ｈＲＬ−ＰＥＳＴ３の大きなＢｓｔ９８Ｉ−ＥｃｏＲＶ断片と、プラスミドｐｔｅｔＯ−ｈＲＬ−ＣＬ１−ＰＥＳＴ１１の小さなＢｓｔ９８Ｉ−ＥｃｏＲＶ断片とを接合することによって構築した。
【０１４１】
最適化ＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼＤＮＡは、以下の配列を有する：
【化８】
2005538724.tif 000012
【０１４２】
最適化ホタルルシフェラーゼＤＮＡは、以下の配列を有する：
【化９】
2005538724.tif 000013
【０１４３】
最適化突然変異ホタルルシフェラーゼＤＮＡは、以下の配列を有する：
【化１０】
2005538724.tif 000014
【０１４４】
他の最適化ホタルルシフェラーゼ配列は、ｈｌｕｃ＋を含む：
【化１１−１】
2005538724.tif 000015
【化１１−２】
2005538724.tif 000016
【０１４５】
最適化ＧＦＰ配列は、以下の配列を有する：
【化１２】
2005538724.tif 000017
【０１４６】
最適化ホタルルシフェラーゼ（ｈｌｕｃ＋（５ｆ２））−最適化ＰＥＳＴ配列（ｈｌｕｃ＋（５ｆ２）−ｈＰＥＳＴ）は、以下の配列を有する：
【化１３】
2005538724.tif 000018
【０１４７】
最適化ホタルルシフェラーゼ（ｈｌｕｃ＋（５ｆ２））−最適化ＣＬ１−最適化ＰＥＳＴ配列（ｈｌｕｃ＋（５ｆ２）−ｈＣＬ１−ｈＰＥＳＴ）は、以下の配列を有する：
【化１４】
2005538724.tif 000019
【０１４８】
最適化ホタルルシフェラーゼ（ｈｌｕｃ＋）−最適化ＰＥＳＴ配列（ｈｌｕｃ＋−ｈＰＥＳＴ）は、以下の配列を有する：
【化１５】
2005538724.tif 000020
【０１４９】
最適化ホタルルシフェラーゼ（ｈｌｕｃ＋）−最適化ＣＬ１−最適化ＰＥＳＴ配列（ｈｌｕｃ＋−ｈＣＬ１−ｈＰＥＳＴ）は、以下の配列を有する：
【化１６】
2005538724.tif 000021
【０１５０】
最適化Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ−最適化ＰＥＳＴ配列（ｈＲｅｎｉｌｌａ−ｈＰＥＳＴ）は、以下の配列を有する：
【化１７】
2005538724.tif 000022
【０１５１】
最適化Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ−最適化ＣＬ１−最適化ＰＥＳＴ配列（ｈＲｅｎｉｌｌａ−ｈＣＬ１−ｈＰＥＳＴ）は、以下の配列を有する：
【化１８】
2005538724.tif 000023
【０１５２】
最適化Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ−最適化ＣＬ１−最適化ＰＥＳＴ−ＵＴＲ配列（ｈＲｌｕｃ−ｈＣＬ１−ｈＰＥＳＴ−ＵＴＲ）は、以下の配列を有する：
【化１９】
2005538724.tif 000024
【０１５３】
最適化ホタルルシフェラーゼ−最適化ＣＬ１−最適化ＰＥＳＴ−ＵＴＲ配列（ｈｌｕｃ＋−ｈＣＬ１−ｈＰＥＳＴ−ＵＴＲ）は、以下の配列を有する：
【化２０】
2005538724.tif 000025
【０１５４】
最適化コメツキムシ配列は、以下のものを含む：
【化２１−１】
2005538724.tif 000026
【化２１−２】
2005538724.tif 000027
【化２１−３】
2005538724.tif 000028
【化２２】
2005538724.tif 000029
【０１５５】
【表２−１】
2005538724.tif 000030
【表２−２】
2005538724.tif 000031
【０１５６】
ＤＮＡの塩基配列決定
プラスミドＤＮＡの配列を、Ｌｕｃ５’又はＬｕｃ３’プライマー（表１）を使用して、ＡＢＩ  Ｐｒｉｚｍモデル３７７でＤＮＡの塩基配列を決定することによって確認した。
【０１５７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現
ＴＮＴ（登録商標）ＳＰ６結合小麦麦芽抽出物系とＴＮＴ（登録商標）Ｔ７結合網状赤血球溶解物系（Ｐｒｏｍｅｇａ）の両方を使用して、ホタルルシフェラーゼ及びその融合タンパク質をｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現させた。［３Ｈ］−ロイシンを反応混合物に含ませた。終了時に、反応混合物を２部割した。第１の部分を使用して、「ルシフェラーゼアッセイの条件」という表題の項に記載されているようにルシフェラーゼ活性を測定し、第２の部分を使用して、合成されたルシフェラーゼの量を測定した。第２の部分中に含まれていたタンパク質を、４〜２０％Ｔｒｉｓ−グリシンゲル（Ｎｏｖｅｘ）を使用するＳＤＳゲル電気泳動によって分離した。電気泳動が終了した後、ゲル上の目的タンパク質の位置を、オートラジオグラフィーによって測定した。次いで、目的タンパク質を含むバンドをゲルから切り出し、取り込まれた放射活性の量を液体シンチレーションによって測定した。発光データと放射活性の量の比を使用して、比活性（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を特徴付けした。
【０１５８】
哺乳動物細胞
ヒト腺癌細胞系ＨｅＬａ、アフリカミドリザル腎臓細胞系ＣＯＳ−７、チャイニーズハムスター卵巣細胞系ＣＨＯ−Ｋ１、及びヒト胚腎臓２９３細胞を、ＡＴＣＣから得た。すべての細胞系が、５％ウシ胎児血清及び抗生物質混合物（ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ；ストレプトマイシン、１００μｇ／ｍｌ；アンホテリシンＢ、０．２５μｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地で維持された。
【０１５９】
一過性トランスフェクション及びシクロヘキシミドによる処理
トランスフェクション用に、Ｔ２５フラスコ中で細胞を集密状態まで増殖させた（Ｆａｌｋｏｎ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｏｘｆｏｒｄ）。トランスフェクションは、８μｇのプラスミドＤＮＡ及び２０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）と混合した１ｍｌの無血清ＲＰＭＩ−１６４０中で行った。ＣＨＯ細胞はトランスフェクション培地中で３０分間インキュベートし、ＨｅＬａ細胞は１時間、ＣＯＳ−７細胞は５時間インキュベートした。インキュベーションの後、トリプシン−ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を用いて細胞をトリプシン処理し、遠心分離によって回収した。それぞれのＴ２５フラスコから回収した細胞を、５％ウシ胎児血清及び抗生物質混合物を含む１０ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０培地に再懸濁させ、９６ウェルプレート（１００μｌ／ウェル）に移し、異なる物質で処理する前に１２〜１６時間増殖させた。シクロヘキシミド（Ｓｉｇｍａ）又はドキシサイクリンを、異なるウェルに異なる回数加えた（最終濃度は、それぞれ１００μｇ／ｍｌと２μｇ／ｍｌであった）。熱誘導用に、細胞を１時間４２℃に移し、次いで３７℃で異なる時間インキュベートした。インキュベーションの後、ホタルルシフェラーゼの誘導体を発現する細胞を含むプレートを、７０℃に移した。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを発現する細胞の場合、培養培地を、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）からの溶解バッファーと交換した。
【０１６０】
ルシフェラーゼアッセイの条件
ホタルルシフェラーゼの活性を測定するために、凍結／解凍によって細胞を溶解させた。それぞれのウェル（１００μｌ）からの溶解物を、１００μｌのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含む不透明な９６ウェルプレート（Ｆａｌｋｏｎ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｏｘｆｏｒｄ）の対応するウェルに移し、ＭＬＸマイクロタイタープレート照度計（Ｄｙｎｅｘ）を使用して、発光強度を測定した。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの活性を、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）からの１００μｌのアッセイ試薬と、４０μｌのサンプルを混合させることによって測定した。
【０１６１】
Ｔｅｔ−Ｏｆｆシステム
ＣＭＶ最少プロモーター、及びヘプタマー化した上流のｔｅｔ−オペレーター（Ｇｏｓｓｅｎ他、１９９２）を含むＤＮＡ断片を、プライマー：
【化２３】
2005538724.tif 000032
を用いたＰＣＲによって、プラスミドｐＵＨＤ１０−３から増幅させた。増幅させた断片を使用して、ＣＭＶプロモーターをＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼコードプラスミドに置換した。ＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼコードプラスミドとプラスミドｐＵＨＤ１５−１を４．５：１の割合で含む混合物を用いて、ＨｅＬａ細胞をトランスフェクトした。プラスミドｐＵＨＤ１５−１は、テトラサイクリン抑制因子と、テトラサイクリンオペレーター配列に融合させた最少プロモーターを刺激するＨＳＶ由来のＶＰ１６のＣ末端ドメインとを含むハイブリッドトランスアクチベーターをコードする。ドキシサイクリンの存在下では、ハイブリッドトランスアクチベーターの活性は阻害される。
【０１６２】
ＣＲＥシステム
Ｄ２９３細胞は、誘導時に多量のｃＡＭＰを生成する２９３細胞の単離された亜群である。ｐＧＬ−３プラスミドは、転写の増大によってｃＡＭＰ誘導に応答する多数のＣＲＥを含む。Ｄ２９３細胞をトリプシン処理し、７．５×１０３個の細胞を９６ウェルプレートのウェルに加えた。一晩のインキュベーションの後、トランスフェクト細胞の培地を除去し、イソプロテレノール（Ｉｓｏ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ＃４２０３５５、最終濃度１μＭ）、及びＲＯ（Ｒｏ−２０−１７２４、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ＃５５７５０２、最終濃度１００μＭ）を含む培地と交換した。ＩｓｏはｃＡＭＰ経路を誘導し、ＲＯはｃＡＭＰの分解を防ぐ。プレートはインキュベーターに戻した。Ｉｓｏ／ＲＯ後の時点ｔ＝０、３、６、９及び１２時間からの、サンプルを回収した。Ｉｓｏ／ＲＯの添加後６時間又は２４時間で、プロスタグランジンＥ１（ＰＧＥ１、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ＃５３８９０３、最終濃度１．０μＭ）を細胞に加えた。次いで、Ｉｓｏ／ＲＯの添加（即ち、実験開始）後２４、２７、３０、３３、及び３６時間の時点で、サンプルを回収した。
【０１６３】
コメツキムシの実験用に、不安定化配列と共にコドン最適化赤色（ＣＢＲ）又は緑色（ＣＢＧ）コメツキムシ配列を用いて、Ｄ２９３細胞を一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後に、細胞をトリプシンで処理し、７．５×１０３個の細胞を９６ウェルプレートのウェルに加えた。一晩のインキュベーションの後、トランスフェクト細胞の培地を除去し、イソプロテレノールを含む培地と交換した。誘導後の時点ｔ＝０、１．５、３、４．５、６、及び７．５時間で、サンプルを回収した。
【０１６４】
サンプルの相対的光単位（ＲＬＵ）を測定するために、２０μｌの不活性溶解バッファーをそれぞれのウェルに加え、二重ルシフェラーゼアッセイを行い、ＲＬＵを収集した。誘導倍数を測定するために、薬剤処理したウェルからのＲＬＵを、未処理ウェルからのＲＬＵで割った。
【０１６５】
安定細胞系
Ｄ２９３細胞をプラスミドでトランスフェクトし、次いで６００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培地中で増殖させた。安定的にトランスフェクトした細胞の個々の系は、Ｇ４１８含有培地で増殖させた群由来の個々の細胞を、９６ウェルプレートのウェルに接種し、Ｇ４１８含有培地中に接種した細胞を増殖させることによって生成させた。
【０１６６】
結果
ユビキチン−ホタルルシフェラーゼ融合体の構築及び脱ユビキチン化の分析
そのＮ末端に望ましいアミノ酸残基を有すると思われる、ルシフェラーゼ種を作製するために、Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ及び共著者によって初期に記載された手法を使用した（Ｂａｃｈｍａｉｒ他、１９８６）。この手法は、細胞中においてユビキチンを特異的にプロセシングするプロテアーゼが、Ｎ末端にユビキチンを含む融合タンパク質を切断する能力を使用する。このような切断は、ユビキチンの最後のアミノ酸残基の直後で起こる。Ｂａｃｈｍａｉｒ他（１９８６）によれば、このような脱ユビキチン化は、切断部位の直後に位置する残基の同一性とは無関係に起こる。
【０１６７】
プラスミドｐＵｂｉｑ（Ｙ）Ｌｕｃ１９及びｐＳＰＵｂｉｑＬｕｃ１は、ユビキチン配列の直後にチロシン残基を含む、ユビキチン−ホタルルシフェラーゼ融合体タンパク質をコードする。プラスミドｐＵｂｉｑ（Ｙ）Ｌｕｃ１９は、哺乳動物細胞中で発現され、融合タンパク質をコードする配列の上流にＣＭＶの初期プロモーター、及び下流にＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを有するように設計した。プラスミドｐＳＰＵｂｉｑＬｕｃ１は、ｐＵｂｉｑ（Ｙ）Ｌｕｃ１９と同じタンパク質をコードするが、バクテリオファージＳＰ６のＤＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーターを有する。したがって、プラスミドｐＳＰＵｂｉｑＬｕｃ１は、融合タンパク質をコードするｍＲＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成するために使用することができる。これらのプラスミドの両方を使用して、真核細胞中、特に哺乳動物細胞中では、ユビキチン−ホタルルシフェラーゼ融合体タンパク質が脱ユビキチン化を経ることを確認した。
【０１６８】
図１に示すように、小麦麦芽系のｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系、及び一過的にトランスフェクトした哺乳動物細胞において、ユビキチン−ホタルルシフェラーゼ融合体タンパク質をコードする組換え遺伝子の発現によって、野生型ホタルルシフェラーゼで予想される分子量を有するタンパク質の蓄積がもたらされた。これらの実験における対照の野生型ホタルルシフェラーゼは、プラスミドｐＥＴＵｂｉｑＬｕｃ又はｐｗｔＬｕｃ１によってコードされていた。大きなバンドに加えて、小麦麦芽ベース系において生成させたタンパク質のオートラジオグラフには、小さなバンドも存在した。この小さなバンドは、脱ユビキチン化されなかった完全長の組換えタンパク質に対応する。ＣＨＯ細胞を使用して行ったいくつかの実験では、小さなバンドは、小麦麦芽ベース系より非常に弱かったか、或いは完全に検出不能であり、哺乳動物細胞中では、ルシフェラーゼの脱ユビキチン化が、非常に急速に効率良く起こることが示唆される。
【０１６９】
野生型ルシフェラーゼとその誘導体の比放射能の比較
Ｓｕｎｇ他（１９９５）は、ホタルルシフェラーゼＮ末端領域の修飾によって、酵素活性を妨害する可能性があることを報告した。したがって、脱ユビキチン化プロセスの結果として生じたルシフェラーゼ種は、野生型ルシフェラーゼのそれとは異なる酵素活性を有する可能性がある。ルシフェラーゼ融合タンパク質の比活性（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を評価し、それらを野生型ルシフェラーゼの比活性と比較するために、プラスミドｐＴ７Ｕｂｉｑ（Ｙ）Ｌｕｃ１９．２及びｐＴ７Ｕｂｉｑ（Ｅ）Ｌｕｃ１９．１を、真核生物のプロモーターに加え、それらがバクテリオファージＴ７のプロモーターを有するように構築した。結果として、これらのプラスミドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系でルシフェラーゼ融合タンパク質の合成を指示する。プラスミドｐＴ７Ｕｂｉｑ（Ｙ）Ｌｕｃ１９．２は、プラスミドｐＵｂｉｑ（Ｙ）Ｌｕｃ１９によってコードされるタンパク質と、まったく同じタンパク質をコードする。プラスミドｐＴ７Ｕｂｉｑ（Ｅ）Ｌｕｃ１９．１は、プラスミドｐＴ７Ｕｂｉｑ（Ｙ）Ｌｕｃ１９．２によってコードされるタンパク質とただ１つの位置が異なる、ユビキチン−ホタルルシフェラーゼ融合タンパク質をコードする。ユビキチンの最後のアミノ酸残基の直後に位置するこの位置において、プラスミドｐＴ７Ｕｂｉｑ（Ｅ）Ｌｕｃ１９．１によってコードされるタンパク質は、チロシン残基の代わりにグルタミン酸残基を有する。さらに、バクテリオファージＴ７のプロモーターを有し、野生型ホタルルシフェラーゼ、又はホタルルシフェラーゼ及び突然変異形のＣ−ＯＤＣを含む融合タンパク質をコードする、プラスミドｐＥＴｗｔＬｕｃ１及びｐＴ７Ｌｕｃ−ＰＥＳＴ１０をそれぞれ構築した。
【０１７０】
野生型ルシフェラーゼ、及びルシフェラーゼ融合タンパク質をコードするプラスミドを、ウサギ網状赤血球ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系において使用して、それぞれの反応混合物に蓄積したルシフェラーゼ活性を測定し、対応するルシフェラーゼ種中に取り込まれた放射活性ロイシンの量によって、これらの活性を標準化した。図１（パネルＣ）に示すデータは、ＣＨＯ細胞中で見られたのと同様に、脱ユビキチン化形のルシフェラーゼのみが、プラスミドｐＴ７Ｕｂｉｑ（Ｙ）Ｌｕｃ１９．２又はｐＴ７Ｕｂｉｑ（Ｅ）Ｌｕｃ１９．１のいずれかを補った、ウサギ網状赤血球ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系において蓄積したことを実証する。これらの混合物中の、遊離ユビキチンの電気泳動移動度を有する、小さなタンパク質の存在によって、完全長ユビキチン−ルシフェラーゼ融合体がこれらの反応において生成され、効率良く脱ユビキチン化されたことが証明される。反対にプラスミドｐＴ７Ｌｕｃ−ＰＥＳＴ１０の場合は、完全長タンパク質の蓄積を観察した。それにもかかわらず、図２に示すデータは、２つの脱ユビキチン化形のルシフェラーゼは、野生型ルシフェラーゼ及びプラスミドｐＴ７Ｌｕｃ−ＰＥＳＴ１０によってコードされるタンパク質の比活性と、本質的に同じ比活性を有することを実証する。
【０１７１】
Ｎ−デグロン及びｍ−ＯＤＣのＣ末端の突然変異による、ルシフェラーゼ不安定化の有効性の比較
プラスミドｐＵｂｉｑ（Ｙ）Ｌｕｃ１９によってコードされるタンパク質の半減期を、哺乳動物細胞において測定し、野生型ルシフェラーゼ、並びにホタルルシフェラーゼ及び突然変異形のＣ−ＯＤＣ（Ｌｕｃ−ＰＥＳＴ１０）を含む融合タンパク質の半減期と比較した。それぞれプラスミドｐＵｂｉｑ（Ｙ）Ｌｕｃ１９又はｐｗｔＬｕｃ１又はｐＬｕｃ−ＰＥＳＴ１０を用いて一過的にトランスフェクトした細胞によって発せられた発光を評価することによって、この比較を行い、次いで異なる時間、これらをタンパク質合成阻害剤シクロヘキシミドに曝した。この実験では、シクロヘキシミドを暴露の７．５分以内にタンパク質合成の完全な阻害を引き起こした濃度（１００μｇ／ｍｌ）で使用した。図３に示す結果は、ＣＯＳ−７細胞中では、Ｕｂｉｑ（Ｙ）Ｌｕｃ融合タンパク質は、野生型ルシフェラーゼ及びＬｕｃ−ＰＥＳＴ融合タンパク質の半減期と比較して、中程度の半減期を有することを実証する。これらの細胞中でのＵｂｉｑ（Ｙ）Ｌｕｃの推定半減期は、約１７０〜２００分であり、この半減期は、大腸菌及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてＮ末端にチロシン残基を含むβ−ガラクトシダーゼに関して、Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ（１９９２）によって報告された半減期（それぞれ２分と１０分）よりはるかに長い。同時に、ＣＯＳ−７細胞中での野生型ルシフェラーゼの半減期（約７時間）は、大腸菌及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける野生型β−ガラクトシダーゼの半減期（それぞれ１０時間及び２０時間を超える）より短く、ＣＯＳ−７細胞中では、Ｎ−デグロン開始型の分解が、酵母菌及び細菌中ほど効率良く起こらないことが示唆された。これらの細胞中でのＬｕｃ−ＰＥＳＴの半減期（約１２０分）が、Ｕｂｉｑ（Ｙ）Ｌｕｃの半減期より短いという事実によって、プロテオソームのタンパク質分解能は、Ｕｂｉｑ（Ｙ）Ｌｕｃの半減期を測定するための制限的なパラメータではないことが示唆される。ＣＨＯ細胞又はＨｅＬａ細胞を使用して同じ分析を行うと、これらの細胞中での３つすべてのタンパク質の分解が、ＣＯＳ−７細胞中より、わずかに速く起こることが見出された（図７参照）。
【０１７２】
異なる細胞系におけるＮ末端法則の分析
哺乳動物細胞におけるＮ末端法則が、酵母菌及び大腸菌における同じ法則と、どの程度異なる可能性があるかを理解するために、ユビキチン−ホタルルシフェラーゼ融合タンパク質をコードする一組のプラスミド、即ちｐＵｂｉｑ（Ｙ）Ｌｕｃ１９、ｐＴ７Ｕｂｉｑ（Ｙ）Ｌｕｃ１９．２及びｐＴ７Ｕｂｉｑ（Ｅ）Ｌｕｃ１９．１を作製した（プラスミドのリストに関しては、表２を参照）。これらのプラスミドによってコードされるタンパク質には、それらの配列にただ１つの相違がある；ユビキチン配列の直後に位置するアミノ酸残基。したがって、脱ユビキチン化によって、これらのタンパク質は、第１のＮ末端アミノ酸残基のみが異なるホタルルシフェラーゼ種を生じるはずである。プラスミド自体には、融合タンパク質コード領域の上流に位置する他の領域の違いがある。これらのプラスミドのいくつかは、他のバクテリオファージＴ７プロモーターを有する（プラスミド名ｐＴ７Ｕｂｉｑ（Ｘ）Ｌｕｃ）。それにもかかわらず、図３に示すように（プラスミドｐＴ７Ｕｂｉｑ（Ｙ）Ｌｕｃ１９．２及びｐＵｂｉｑ（Ｙ）Ｌｕｃ１９に関する曲線を参照）、バクテリオファージＴ７プロモーターの存在又は不在は、対応するタンパク質の安定性に対してまったく影響がなかった。
【０１７３】
【表３】
2005538724.tif 000033
【０１７４】
表２に列挙するプラスミドによってコードされるタンパク質の安定性を、３つの異なる種、ハムスター（ＣＨＯ）、サル（ＣＯＳ−７）及びヒト（ＨｅＬａ）由来の細胞系を使用して分析した。１つの例外、ＨｅＬａ細胞中のＵｂｉｑ（Ｍ）Ｌｕｃ以外で、すべてのユビキチン含有ホタルルシフェラーゼ融合タンパク質が、野生型ルシフェラーゼより速く分解したことが観察された（図４）。ルシフェラーゼのＮ末端に位置するアミノ酸残基と対応するタンパク質の半減期の間の関係のパターンは、実験毎に本質的に変わらない状態であった。３つすべての細胞系に関して、グルタミン酸残基が、試験したすべての残基の中で最も有効な不安定残基であることが明らかとなった。アスパラギン酸も、非常に有効な不安定残基であることを見出した。同時に、３つすべての細胞系で、塩基性アミノ酸残基が、比較的弱い不安定性を有することを見出した。ＣＨＯ細胞では、最も安定性のある構築体の半減期と最も安定性のない構築体の半減期の間の差は、ＣＯＳ−７細胞及びＨｅＬａ細胞において測定した半減期間の差の約１／２であった。したがって、異なる細胞系では、Ｎ末端法則は、タンパク質の運命を決定する点で異なる役割を有する可能性がある。
【０１７５】
一般的に、特定のタンパク質の半減期と、このタンパク質を生成する細胞の発光性との間で相関関係が観察された。実際、図４では、ホタルルシフェラーゼ融合タンパク質の発光強度と半減期との間の関係を示す大部分の記号は、直線に沿って位置する傾向がある。それにもかかわらず、このような関係が観察されない場合もあった。例えば、ＣＯＳ−７細胞では、プラスミドｐＵｂｉｑ（Ａ）Ｌｕｃ２によってコードされるタンパク質は、これらの細胞中でのその半減期に基づいて予想される発光よりはるかに少ない発光を生じた。さらに、同じタンパク質がＣＨＯ又はＨｅＬａ細胞中で生成された場合、一般的法則からの著しい逸脱は観察されなかった。この現象が起こる際のトランスフェクション効率の不一致について考えられる役割に対しては、ホタルルシフェラーゼ融合タンパク質をコードするプラスミドに加えて、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼをコードする同量のプラスミドを、それぞれのトランスフェクション混合物に導入することによって対処した。トランスフェクト細胞中でのＲｅｎｉｌｌａ発光は、トランスフェクション効率の指標として使用し、同じ細胞によって生じたホタル発光を標準化した。標準化によって観察された不一致がなくなることはなく、このような不一致は、特定のタンパク質−細胞ペアの生物学的特性を反映する可能性があることが示唆された。
【０１７６】
タンパク質構造に関するＮ末端法則の依存性
哺乳動物細胞内のタンパク質の運命を決定する際の、Ｎ末端残基の優勢を理解するために、Ｎ末端に同じアミノ酸残基を有するが、ホタルルシフェラーゼと結合したペプチド配列が異なる、ルシフェラーゼ融合タンパク質の安定性を比較した。図５に示すように、プラスミドｐＵｂｉｑ（Ｅ）ΔＬｕｃ６及びｐＵｂｉｑ（Ｈ）ΔＬｕｃ１８によってコードされるタンパク質は、それぞれプラスミドｐＴ７Ｕｂｉｑ（Ｅ）Ｌｕｃ１９．１及びｐＵｂｉｑ（Ｈｉｓ２）Ｌｕｃ３によってコードされるタンパク質と比較すると、４個のアミノ酸の欠失がある。プラスミドｐＵｂｉｑＬｕｃ１５によってコードされるタンパク質では、１個のグルタミン酸残基が、ｐＵｂｉｑ（Ｙ）Ｌｕｃ１９によってコードされるタンパク質中で見られる残基を置換している。
【０１７７】
図６に示すデータは、同じＮ末端残基を有するタンパク質は、以下の配列の構造に応じて、劇的に異なる半減期を有する可能性があることを明らかにしている。例えば、ＣＯＳ−７細胞では、プラスミドｐＵｂｉｑ（Ｙ）Ｌｕｃ１９によってコードされるタンパク質の半減期は約１４０分であり、一方プラスミドｐＵｂｉｑＬｕｃ１５によってコードされるタンパク質の半減期は約７時間であった。実験に使用する細胞に応じて、この違いは劇的ではなくなると思われる。実際、同じタンパク質をＣＨＯ細胞中で分析すると、それぞれ約１９０分及び約２４０分の半減期を有していた。驚くことに、Ｎ末端に位置するアミノ酸残基に応じて、以下の配列の変化の影響が異なる可能性がある。実際、Ｎ末端にヒスチジン残基を有するタンパク質中の、４個のアミノ酸残基の欠失によって、タンパク質の不安定化がもたらされた（ＣＯＳ−７細胞では、半減期が約３００分から約１２０分へ減少し、ＣＨＯ細胞では、約３２０分から約２００分へ減少した）。同時に、Ｎ末端位置がアスパラギン酸残基によって占められると、同じ欠失によって、ＣＯＳ−７細胞においてタンパク質の安定化がもたらされ（半減期は約６０分から約２００分に変化した）、ＣＨＯ細胞中の対応するタンパク質の安定性に対しては本質的に影響がなかった。したがって、Ｎ末端残基は、タンパク質の安定性を決定する際に重要な役割を果たすが、それは支配的な因子ではない。
【０１７８】
ホタルルシフェラーゼのレポーター的性質の最適化
ＯＤＣの分解は事前のユビキチン化なしに２６Ｓプロテオソームで起こる（Ｂｅｒｃｏｖｉｃｈ他、１９８９；Ｍｕｒａｋａｍｉ他、１９９２）ことが報告されてきており、一方、Ｎ−デグロンによって指示される分解は、ユビキチン依存性プロセスであることが報告された。同じタンパク質中のＮ−デグロンとＣ−ＯＤＣの組合せが、２つの異なる経路によるプロテオソームでの組換えタンパク質の分解を指示し、それによってタンパク質の半減期をさらに低下させることができるかどうかを判定するために、３つのプラスミド、ｐＵｂｉｑ（Ｙ）Ｌｕｃ−ＰＥＳＴ５、ｐＵｂｉｑ（Ｒ）Ｌｕｃ−ＰＥＳＴ１２及びｐＴ７Ｕｂｉｑ（Ｅ）Ｌｕｃ−ＰＥＳＴ２３を構築した。これらのプラスミドによってコードされるタンパク質の配列は、ユビキチン配列の最後のアミノ酸残基の直後に続く位置のみが異なる。その位置では、プラスミドｐＵｂｉｑ（Ｙ）Ｌｕｃ−ＰＥＳＴ５によってコードされるタンパク質はチロシンを有し、プラスミドｐＵｂｉｑ（Ｒ）Ｌｕｃ−ＰＥＳＴ１２によってコードされるタンパク質はアルギニンを有し、プラスミドｐＴ７Ｕｂｉｑ（Ｅ）Ｌｕｃ−ＰＥＳＴ２３によってコードされるタンパク質は、グルタミン酸残基を有する。これらのプラスミドによってコードされるタンパク質の安定性は、ＨｅＬａ（図７）、ＣＯＳ−７及びＣＨＯ細胞で試験した。この分析によって、すべての細胞系で、２つの分解シグナルを有するタンパク質は、ただ１つのシグナルを含むタンパク質よりも安定性が低かったことが明らかになった。例えば、ＨｅＬａ細胞では、ユビキチン−ルシフェラーゼ融合タンパク質Ｕｂｉｑ（Ｅ）Ｌｕｃ又はＬｕｃ−ＰＥＳＴ１０は、それぞれ７０分及び６５分の半減期を有していた（図４及び図７）。同時に、プラスミドｐＵｂｉｑ（Ｙ）Ｌｕｃ−ＰＥＳＴ５、ｐＵｂｉｑ（Ｒ）Ｌｕｃ−ＰＥＳＴ１２及びｐＴ７Ｕｂｉｑ（Ｅ）Ｌｕｃ−ＰＥＳＴ２３によってコードされるタンパク質の半減期は、それぞれ５５、４０及び３０分であった。さらに、同じタンパク質中の２つの分解シグナルの組合せによって、細胞系毎のより一貫した分解がもたらされた。例えば、３つの異なる細胞系を使用して、Ｎ−デグロンのみを含むタンパク質Ｕｂｉｑ（Ｅ）Ｌｕｃの半減期を測定すると、その値は７０〜１５０分で変化した（図４）。同じ細胞系を使用して、プラスミドｐＴ７Ｕｂｉｑ（Ｅ）Ｌｕｃ−ＰＥＳＴ２３によってコードされるタンパク質の半減期を測定すると、その半減期はＨｅＬａ細胞に関しては３０分であり（図７）、ＣＯＳ−７細胞に関しては４５分であり、ＣＨＯ細胞に関しては４０分であった。ルシフェラーゼ及び他のタンパク質不安定化配列の組合せをコードするプラスミドでトランスフェクトした細胞からの、発光データを図８に示す。ルシフェラーゼ融合タンパク質中にＣＬ−１及びＰＥＳＴが存在することによって、ＣＬ−１又はＰＥＳＴ配列を有するルシフェラーゼ融合タンパク質と比較して、低い半減期を有するタンパク質がもたらされた。
【０１７９】
最適化コドン配列が、ルシフェラーゼ融合タンパク質をコードするプラスミドでトランスフェクトした細胞において発せられる光の量を増大させることができるかどうかを判定するために、プラスミドｐＴ７Ｕｂｉｑ（Ｅ）ｈＬｕｃ＋ＰＥＳＴ８０を構築した。このプラスミドは、プラスミドｐＴ７Ｕｂｉｑ（Ｅ）Ｌｕｃ−ＰＥＳＴ２３によってコードされるタンパク質と同じタンパク質をコードするが、ヒト細胞中での発現に対し最適化されたルシフェラーゼコード配列を含む。結果として、融合タンパク質の翻訳は、このタンパク質がプラスミドｐＴ７Ｕｂｉｑ（Ｅ）ｈＬｕｃ＋ＰＥＳＴ８０によってコードされると、プラスミドｐＴ７Ｕｂｉｑ（Ｅ）Ｌｕｃ−ＰＥＳＴ２３によってコードされる時より効率良く進む。図７に示すように、プラスミドｐＴ７Ｕｂｉｑ（Ｅ）ｈＬｕｃ＋ＰＥＳＴ８０でトランスフェクトした細胞の発光は、野生型ホタルルシフェラーゼを生成する細胞の発光に匹敵するようになる。したがって、コドン最適化配列は、不安定化配列を非最適化コドン配列と組合わせた場合比較して、不安定化配列と共に取り込まれると発現の消失を補う。
【０１８０】
ルシフェラーゼ及びタンパク質不安定化配列を含む融合ポリペプチドのｍＲＮＡ中のｍＲＮＡ不安定化配列が、最適化配列によってコードされるルシフェラーゼの発現の半減期をさらに減少させることができるかどうかを判定するために、最適化Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ配列に連結したプロモーターと、様々な不安定化配列の組合せとを有する、プラスミドを試験した（図９）。一般に、不安定化配列の数が増大するほど、コードされているタンパク質の発現の半減期は短くなる。
【０１８１】
図１０及び１２〜１６は、不安定化配列の様々な組合せを有するプラスミド由来の、最適化Ｒｅｎｉｌｌａ、ホタル又はコメツキムシルシフェラーゼ配列の発現の誘導後の発光を示す。より多くの不安定化配列を有するプラスミドは一般に、不安定化配列をまったく有していなかったか、或いは少数有していたプラスミドより良い応答プロフィールを有していた、即ち、不安定化レポーターは応答が速く、それらの相対的活性は、より安定性のある誘導体より高い。
【０１８２】
図１３は、レポーターが２つの後の刺激に応答することができ、不安定化レポーターは、（２つの刺激が比較的短時間に生じるとき）後の刺激を検出するのに、安定レポーターより適していることを実証する。なぜなら、安定レポーターには反応するための時間がないからである。図１３の下部グラフでは、安定型の最適化ホタルルシフェラーゼに対応する曲線が、増大し続けている。一方、不安定化タンパク質に対応する曲線は、最大値に達した後、低下し始め、ｈＣＧを加えた後でのみ、再度増大し始める。
【０１８３】
安定的にトランスフェクトした細胞系の不安定化レポータータンパク質を、検出することができるかどうかを判定するために、Ｄ２９３細胞を、ｃＡＭＰ制御プロモーターの調節下において、ルシフェラーゼコード配列を含むプラスミドを用いてトランスフェクトした。プラスミドｐＣＲＥ−ｈＬｕｃ＋Ｋａｎ１８は、安定型のホタルルシフェラーゼをコードし、プラスミドｐＣＲＥ−ｈＬｕｃＰ＋Ｋａｎ８は、Ｃ末端にＰＥＳＴ配列を有するルシフェラーゼ融合体をコードし、プラスミドｐＣＲＥ−ｈＬｕｃＣＰ＋Ｋａｎ２８は、ＣＬ１−ＰＥＳＴ配列、及びｍＲＮＡ不安定化配列（ＵＴＲ）を有するｍＲＮＡを有する、ホタルルシフェラーゼ融合ポリペプチドをコードする。Ｇ４１８耐性クローンを１０μＭのホルスコリンで７時間処理し、或いはホルスコリン無培地で同じ時間インキュベートした。インキュベーション時間が終了した後、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ試薬を使用して、発光を測定した（図１４）。不安定構築体を有する安定クローンは一般に、安定構築体を有する安定クローンと同程度の明るさであった。
【０１８４】
考察
Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ及び共著者は、酵母菌及び大腸菌細胞中では、Ｎ末端残基の同一性と対応するタンパク質の半減期の間に、明確な相関関係があると決定した（Ｎ末端法則）。これらの発見によって、タンパク質のＮ末端に位置する残基は、細菌及び酵母菌細胞中のタンパク質の運命を決定する際に、重要な役割を果たすことが示唆された。本明細書のデータによって、異なる哺乳動物細胞では、Ｎ末端残基の同一性に応じて、ホタルルシフェラーゼ融合タンパク質の半減期が４２０〜７０分で変わる可能性があることが実証され、Ｎ末端法則が哺乳動物細胞において機能することが示唆された。それにもかかわらず、哺乳動物細胞におけるＮ末端法則は、酵母菌及び大腸菌に関して初期に記載されたＮ末端法則とは驚くほど異なっている。実際、アルギニン及びリシン残基は、酵母菌及び大腸菌において最も不安定な残基として同定された（Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ、１９９２）。対照的に、これらの残基は、哺乳動物細胞中ではちょうど中程度に不安定であった。試験したすべての細胞系で、グルタミン酸残基は、ホタルルシフェラーゼの安定性に対して最も劇的な影響があった。一方、Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ（１９９２）によれば、酵母菌中ではこの残基は中程度な不安定効果があり、大腸菌中ではグルタミン酸には、まったく不安定効果がなかった。
【０１８５】
データによって、宿主細胞の性質以外に、タンパク質の構造が、Ｎ末端法則に対して影響がある可能性があることが実証される。実際、脱ユビキチン化の後それがＮ末端になる領域に小さな欠失を導入することによって、ヒスチジン及びグルタミン酸残基の相対的不安定性が変わる可能性がある。結果として、ＣＯＳ−７細胞では、Ｎ末端ヒスチジン残基を有するルシフェラーゼ融合タンパク質は、Ｎ末端にグルタミン酸残基を有する対応するタンパク質より、さらに一層不安定になった。この影響は細胞特異的であったことを述べることは重要である。ＣＨＯ細胞では、同じ欠失によって、Ｎ末端ヒスチジン残基を有するタンパク質の半減期が減少したが、Ｎ末端グルタミン酸残基を有するタンパク質の半減期は変わらず（図６参照）、結果として、ヒスチジンより有効な不安定残基としての、グルタミン酸の状態は変わらなかった。
【０１８６】
さらに、ｍＯＤＣ断片をホタルルシフェラーゼのＣ末端に加えることによって、対応するタンパク質の半減期が変わったが、同時に、アルギニン及びチロシンと比較して、グルタミン酸残基の不安定効果が変わることはなかった。さらにグルタミン酸は、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの場合、最も有効な不安定残基であるようである（データ示さず）。したがって、１タンパク質を決定するＮ末端法則によって、他のタンパク質の不安定化に対する有用な指針を与えることができる。
【０１８７】
哺乳動物細胞では、Ｎ−デグロン依存性の分解経路は、それが酵母菌細胞中で働くよりも有効には働かない可能性がある。実際、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ又はＡｓｎをβ−ガラクトシダーゼのＮ末端に配置することによって、Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ及び共著者（Ｂａｃｈｍａｉｒ他、１９８６）は、酵母菌中のβ−ガラクトシダーゼの半減期を、２０時間から２〜３分に減少させることができた。同時に、哺乳動物細胞では、Ｎ末端にグルタミン酸を有していても、ホタルルシフェラーゼは、４５〜５０分を超える半減期を有していた。Ｃ−ＯＤＣ中に含まれるタンパク質分解シグナルと比較すると、Ｎ−デグロン単独では、タンパク質の不安定化のための優れた手法は与えない。それにもかかわらず、データによって、Ｎ−デグロンとＣ−ＯＤＣは互いに補うことができ、同じタンパク質でこの２つの分解シグナルの組み合わせることによって、高速のタンパク質分解がもたらされることが実証される。分解シグナルのこの組合せを使用することによって、哺乳動物細胞中において、現在記載されているレポータータンパク質の中で最も短い半減期を有する、ホタルルシフェラーゼを生成させた。対照的に、リステリオシン０及びネズミＣ−ＯＤＣ由来の分解シグナルを有するタンパク質は、ネズミＣ−ＯＤＣ由来の分解シグナルを有するタンパク質と同等の、タンパク質分解速度を有していた（データ示さず）。
【０１８８】
細胞中のレポータータンパク質の速い代謝回転は、細胞中の迅速なプロセスを調べるのに、非常に重要な場合がある。さらに、不安定化レポーターは、高スループットスクリーニング実験の時間を大幅に減少させることができる。不安定化レポータータンパク質の１つの主な欠点は、細胞中のこのようなタンパク質の量が少ないために、検出及び分析に利用可能なシグナルが、野生型レポータータンパク質によって生じるシグナルより弱くなるという事実と関係がある。例えば、Ｎ−デグロンとＣ−ＯＤＣの両方を有するホタルルシフェラーゼ融合タンパク質を生成する細胞は、野生型ルシフェラーゼを生成する同じ細胞より、ほぼ１０倍弱い光を発する（図７参照）。それにもかかわらず、レポータータンパク質をコードする配列の最適化によって、この制限を克服するための有用な手法が与えられる。実際、この手法を使用することによって、不安定化ホタルルシフェラーゼを生成する細胞により発せられるシグナルが、レポーターの半減期に影響を与えずに約８倍増大した。
2005538724.tif 000034
2005538724.tif 000035
【０１８９】
すべての刊行物、特許及び特許出願は、参照として本明細書に組み込まれる。前述の明細書中では、本発明をそのいくつかの好ましい実施形態に関して記載し、多くの詳細を例示の目的で述べてきたが、本発明には追加的な実施形態が施され、本明細書のいくつかの詳細は、本発明の基本原則から逸脱せずに相当に変えることができることは、当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１９０】
【図１Ａ】プラスミドｐｗｔＬｕｃ１（レーン２）、ｐＵｂｉｑ（Ｙ）Ｌｕｃ１９（レーン３）又はｐＬｕｃ−ＰＥＳＴ１０（レーン４）を含むＣＨＯ細胞の溶解物、或いはプラスミドを含まないＣＨＯ溶解物（レーン５）を４〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、ＩｍｍｏｂｉｌｏｎＰ膜上に移し、ウサギ抗ホタルルシフェラーゼ及びアルカリホスファターゼと結合した抗ウサギ抗体を用いて、ルシフェラーゼ種を検出したことを示す図である。レーン１は、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＳｅｅ  Ｂｌｕｅ  Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄに対応する。
【図１Ｂ】プラスミドｐｗｔＬｕｃ１（レーン１）又はｐＥＴＵｂｉｑＬｕｃ（レーン２）を使用して得たｍＲＮＡを含むか、或いは外来のｍＲＮＡを含まない（レーン３）小麦麦芽抽出物を用いて翻訳したタンパク質を４〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、オートラジオグラフィーによってタンパク質を目に見える状態にしたことを示す図である。
【図１Ｃ】プラスミドｐＥＴｗｔＬｕｃ１（レーン１）、ｐＴ７Ｕｂｉｑ（Ｙ）Ｌｕｃ１９．２（レーン２）、ｐＴ７Ｕｂｉｑ（Ｅ）Ｌｕｃ１９．１（レーン３）又はｐＴ７Ｌｕｃ−ＰＥＳＴ１０（レーン４）を含む、ＴＮＴ（登録商標）Ｔ７結合網状赤血球溶解物を４〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、オートラジオグラフィーによってタンパク質を目に見える状態にしたことを示す図である。
【図２】野生型ホタルルシフェラーゼ、及びホタルルシフェラーゼを含む融合タンパク質をコードするプラスミドを、ＴＮＴ（登録商標）Ｔ７結合網状赤血球溶解物系中で発現させたことを示す図である。比放射能は、それぞれの混合物中に蓄積した全体のルシフェラーゼ活性と、それぞれのタンパク質中に取り込まれた［３Ｈ］−ロイシンの量の間の比として測定した。
【図３】野生型ホタルルシフェラーゼ（ｐｗｔＬｕｃ１）、ユビキチン−ルシフェラーゼ融合タンパク質（ｐＵｂｉｑ（Ｙ）Ｌｕｃ１９及びｐＴ７Ｕｂｉｑ（Ｙ）Ｌｕｃ１９．２）、又はホタルルシフェラーゼを含む融合タンパク質、及び突然変異形のＣ−ＯＤＣ（ｍＯＤＣ）（ｐＬｕｃ−ＰＥＳＴ１０）をコードするプラスミドを用いて、一過的にトランスフェクトした細胞を、シクロヘキシミド（１００μｇ／ｍｌ）によって異なる時点で処理したことを示す図である。インキュベーションの終了時に、安定性を定義するために、細胞を溶解させ、蓄積したルシフェラーゼの活性を、ＭＬＸマイクロタイタープレート照度計を使用して測定した。
【図４】ユビキチン−ルシフェラーゼ融合タンパク質をコードするプラスミドを用いてトランスフェクトした、ＣＨＯ（Ａ）、ＣＯＳ−７（Ｂ）、及びＨｅＬａ（Ｃ）細胞を、シクロヘキシミドによって異なる時点で処理したことを示す図である。細胞の発光を測定して、対応するタンパク質の安定性を決定した。シクロヘキシミドによって処理しなかった対照細胞を使用して、バックグラウンドルシフェラーゼ活性を測定した。
【図５】ユビキチン−ルシフェラーゼ融合タンパク質の部分的アミノ酸配列を、タンパク質の半減期の測定におけるＮ末端残基の相対的な重要性を確定する際に、評価したことを示す図である。影付き／ボックス状領域は、ユビキチン及びルシフェラーゼ配列を示す。太線は欠失の位置を示す。
【図６】ＣＨＯ（Ａ）及びＣＯＳ−７（Ｂ）細胞を、野生型ホタルルシフェラーゼ（ｐｗｔＬｕｃ１）、又は異なるＮ末端ルシフェラーゼアミノ酸残基を有する、ユビキチン−ルシフェラーゼ融合タンパク質をコードするプラスミドを用いて、一過的にトランスフェクトしたことを示す図である。トランスフェクション後２４時間で、細胞をシクロヘキシミド（１００μｇ／ｍｌ）によって異なる時点で処理し、インキュベーションの終了時に、蓄積したルシフェラーゼの発光を測定した。
【図７】ＨｅＬａ細胞を、野生型ルシフェラーゼ（ｐｗｔＬｕｃ１）、ルシフェラーゼ及びｍＯＤＣを含む融合タンパク質（ｐＬｕｃ−ＰＥＳＴ１０）、或いはユビキチン、ホタルルシフェラーゼ、及びｍＯＤＣを含む融合タンパク質をコードするプラスミド（ｐＵｂｉｑ（Ｙ）Ｌｕｃ−ＰＥＳＴ５、ｐＵｂｉｑ（Ｒ）Ｌｕｃ−ＰＥＳＴ１２、ｐＴ７Ｕｂｉｑ（Ｅ）Ｌｕｃ−ＰＥＳＴ２３及びｐＴ７Ｕｂｉｑ（Ｅ）ｈＬｕｃ＋ＰＥＳＴ８０）を用いて、トランスフェクトしたことを示す図である。トランスフェクション後２４時間で、細胞をシクロヘキシミド（１００μｇ／ｍｌ）によって異なる時点で処理した。細胞の発光を測定して、対応するルシフェラーゼの安定性を決定した（Ａ）。シクロヘキシミドによって処理しなかった対照細胞を使用して、異なる構築体のルシフェラーゼ活性を比較した（Ｂ）。
【図８】ＣＨＯ細胞を、様々なプラスミドを用いて、一過的にトランスフェクトしたことを示す図である。トランスフェクション後２４時間で、細胞をシクロヘキシミド（１００μｇ／ｍｌ）によって異なる時点で処理した。インキュベーション後、蓄積したルシフェラーゼによる発光を測定した。シクロヘキシミドによって処理しなかった対照細胞を使用して、バックグラウンドルシフェラーゼ活性を測定した。
【図９】ドキシサイクリン（２μｇ／ｍｌ）（Ａ）又はシクロヘキシミド（１００μｇ／ｍｌ）（Ｂ）処理後の、ｔｅｔ誘導系におけるルシフェラーゼ融合タンパク質の性質の比較を示す図である。ドキシサイクリン又はシクロヘキシミドによって処理しなかった、対照細胞からの発光のデータは図Ｃに示す。
【図１０Ａ】熱ショック誘導系におけるＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ（Ａ）及びホタルルシフェラーゼ（Ｂ）の、ルシフェラーゼ融合タンパク質の性質の比較を示す図である。
【図１０Ｂ】熱ショック誘導系におけるＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ（Ａ）及びホタルルシフェラーゼ（Ｂ）の、ルシフェラーゼ融合タンパク質の性質の比較を示す図である。
【図１１】選択したベクターの概略図である。
【図１２Ａ】Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼベクター、多数のＣＲＥ、ホルスコリン（１０μＭ）及びイソプロテレノール（０．２５μＭ）を用いて一過的にトランスフェクトしたＤ２９３細胞中での、発光の誘導を示す図である。
【図１２Ｂ】Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼベクター、多数のＣＲＥ、ホルスコリン（１０μＭ）及びイソプロテレノール（０．２５μＭ）を用いて一過的にトランスフェクトしたＤ２９３細胞中での、発光の誘導を示す図である。
【図１３Ａ】安定及び不安定型ホタルルシフェラーゼをコードするベクターを用いて一過的にトランスフェクトした、ｈＣＧ−Ｄ２９３細胞の発光の概略を示す図である。細胞はイソプロテレノール（１μＭ）及びＲｏ−２０−１７２４（１００μＭ）で処理し、或いはイソプロテレノール（１μＭ）及びＲｏ−２０−１７２４（１００μＭ）、次にヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）（１０ｎｇ／ｍｌ）及びＲｏ−２０−１７２４（１００μＭ）で処理した。矢印は、細胞培養物に化学物質を加えた、時点を示す。
【図１３Ｂ】安定及び不安定型ホタルルシフェラーゼをコードするベクターを用いて一過的にトランスフェクトした、ｈＣＧ−Ｄ２９３細胞の発光の概略を示す図である。細胞はイソプロテレノール（１μＭ）及びＲｏ−２０−１７２４（１００μＭ）で処理し、或いはイソプロテレノール（１μＭ）及びＲｏ−２０−１７２４（１００μＭ）、次にヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）（１０ｎｇ／ｍｌ）及びＲｏ−２０−１７２４（１００μＭ）で処理した。矢印は、細胞培養物に化学物質を加えた時点を示す。
【図１４】不安定ベクターを用いて安定的にトランスフェクトしたＤ２９３細胞における、発光対誘導倍数を示す図である。細胞はホルスコリン（１０μＭ）を用いて７時間処理し、或いはホルスコリン無培地でインキュベートした。すべてのベクターは、ｃＡＭＰ制御プロモーターの調節下にあった。
【図１５】ＣＲＥ系において不安定化配列と共に、コドン最適化ホタルシフェラーゼ又はＲｅｎｉｌｌａシフェラーゼを用いてトランスフェクトした２９３細胞におけるイソプロテレノール及びプロスタグランジンＥ１（ＰＧＥ１）による誘導倍数を示す図である。（Ａ）〜（Ｂ）：Ｉｓｏ／Ｒｏの２４時間後にＰＧＥ１を加え；（Ｃ）〜（Ｄ）：Ｉｓｏ／Ｒｏの６時間後にＰＧＥ１を加えた。
【図１６】ＣＲＥ系において不安定化配列と共に、赤色（ＣＢＲ）（Ｂ）又は緑色（ＣＢＧ）（Ａ）コメツキムシ配列を用いてトランスフェクトした２９３細胞における、イソプロテレノールによる誘導倍数を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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