(57)【要約】新規の色素タンパク質／蛍光タンパク質およびそれらの変異体をコードする核酸組成物、並びにそれらによってコードされたタンパク質が提供される。関心対象のタンパク質は、有色かつ／または蛍光性（この特性は、タンパク質の2個またはそれ以上の残基の相互作用より発生する）であるタンパク質である。本発明のタンパク質は、非生物発光性の刺胞動物種、例えば花虫綱種から得られるか、またはウミエラ目（ウミエラ）以外の花虫綱種から得られることをさらに特徴とする。関心対象の特定のタンパク質には、hcriGFP；dendGFP；zoanRFP；scubGFP1；scubGFP2；rfloRFP；rfloGFP；mcavRFP；mcavGFP；cgigGFP；afraGFP；rfloGFP2；mcavGFP2；およびmannFPが含まれる。上記の特定のタンパク質と実質的に類似しているタンパク質または上記の特定のタンパク質の変異体も関心対象である。その核酸の断片およびそれらによってコードされたペプチド、並びに本発明のタンパク質に対する抗体、並びにトランスジェニック細胞および生物も提供される。本発明のタンパク質組成物および核酸組成物は、多様な異なる適用において有用である。最後に、そのような適用において使用するための、例えば本発明の核酸組成物を含むキットも提供される。2005509420.tif 000018
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：01、03、05、07、09、11、13、15、17、19、21、23、25、または27の少なくとも10残基長のヌクレオチド配列と、実質的に同じであるかまたは同一である残基の配列を有する核酸。
【請求項２】
配列番号：01、03、05、07、09、11、13、15、17、19、21、23、25、または27の少なくとも10残基長の配列との少なくとも約60％の配列類似性を有する、請求項1記載の核酸。
【請求項３】
配列番号：02、04、06、08、10、12、14、16、18、20、22、24、26、または28のアミノ酸配列を有する色素タンパク質および／または蛍光性タンパク質をコードする、その天然環境以外に存在する核酸。
【請求項４】
配列番号：02、04、06、08、10、12、14、16、18、20、22、24、26、または28のアミノ酸配列を有するタンパク質の変異タンパク質をコードする核酸。
【請求項５】
変異タンパク質が、野生型タンパク質と比較して少なくとも1個の点変異を含む、請求項4記載の核酸。
【請求項６】
変異タンパク質が、野生型タンパク質と比較して少なくとも1個の欠失変異を含む、請求項4記載の核酸。
【請求項７】
請求項1から6記載の選択された核酸の断片。
【請求項８】
ストリンジェントな条件の下で請求項1から7記載の核酸とハイブリダイズする、単離された核酸またはそれらの模倣体。
【請求項９】
ベクターおよび請求項1から8記載の核酸を含む構築物。
【請求項１０】
（a）発現宿主において機能性の転写開始領域；
（b）請求項1から9記載の核酸からなる群より選択される核酸；および
（c）該発現宿主において機能性の転写終結領域
を含む発現カセット。
【請求項１１】
宿主細胞への発現カセットの導入の結果として、染色体外要素の一部として存在するかまたは宿主細胞のゲノムへ組み込まれている、請求項10記載の発現カセットを含む細胞またはその子孫。
【請求項１２】
色素タンパク質および／または蛍光性タンパク質を作製する方法であって、
該タンパク質が発現されるよう、請求項11記載の細胞を増殖させる段階；および
他のタンパク質を実質的に含まない該タンパク質を単離する段階
を含む方法。
【請求項１３】
請求項1から10のいずれか一項記載の核酸によりコードされるタンパク質またはその断片。
【請求項１４】
請求項13記載のタンパク質と特異的に結合する抗体。
【請求項１５】
請求項1から10のいずれか一項記載の核酸からなる群より選択される導入遺伝子を含む、トランスジェニック細胞またはその子孫。
【請求項１６】
請求項1から10のいずれか一項記載の核酸からなる群より選択される導入遺伝子を含むトランスジェニック生物。
【請求項１７】
色素タンパク質または蛍光性タンパク質を利用する適用において、請求項13記載のタンパク質を利用することを含む改良。
【請求項１８】
色素タンパク質または蛍光性タンパク質をコードする核酸を利用する適用において、請求項1から10記載の核酸を利用することを含む改良。
【請求項１９】
請求項1から10記載の核酸および該核酸の使用に関する指示を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第119条（e）項に準じて、2001年11月13日出願の米国仮特許出願第60/332,980号（これの開示は参照として本明細書に組み入れられる）の出願日に基づく優先権を主張する。
【０００２】
序論
発明の分野
本発明の分野は、色素タンパク質および蛍光性タンパク質である。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
標識は、関心対象のタンパク質、細胞、または生物に印をつけるための道具であり、多くの生化学、分子生物学、および医学的診断適用において顕著な役割を果たしている。放射性標識、色素標識、蛍光標識、化学発光標識等を含む多様な異なる標識が開発されている。しかしながら、新規の標識の開発への関心は依然としてある。特に関心があるのは、色素タンパク質および／または蛍光性タンパク質標識を含む、新規のタンパク質標識の開発である。
【０００４】
関連文献
関心対象の米国特許には、第6,066,476号；第6,020,192号；第5,985,577号；第5,976,796号；第5,968,750号；第5,968,738号；第5,958,713号；第5,919,445号；第5,874,304号；および第5,491,084号が含まれる。関心対象の国際特許出願には、国際公開公報第00/46233号；国際公開公報第99/49019号；およびDE 197 18 640 Aが含まれる。Anderluhら、Biochemical and Biophysical Research Communications（1996）220：437-442；Dove ら、Biological Bulletin（1995）189：288-297；Fradkovら、FEBS Lett.（2000）479（3）： 127-30；Gurskayaら、FEBS Lett.,（2001）507（1）：16-20；Gurskayaら、BMC Biochem.（2001）2：6；Lukyanov,K.ら、（2000）J Biol Chemistry 275（34）：25879-25882；Macekら、Eur.J.Biochem.（1995）234：329-335；Martynovら、J Biol Chem.（2001）276： 21012-6；Matz,M.V.ら（1999）Nature Biotechnol.,17：969-973；Terskikhら、Science（2000）290：1585-8；Tsien, Annual Rev. of Biochemistry（1998）67：509-544；Tsien, Nat. Biotech. （1999）17：956-957；Wardら、J.Biol.Chem.（1979）254：781-788；Wiedermannら、Jarhrestagung der Deutschen Gesellschact fur Tropenokologie-gto.Ulm.17-19.02.1999.Poster P-4.20；Yarbroughら、Proc Natl Acad Sci U S A（2001）98：462-7も関心対象である。
【発明の開示】
【０００５】
発明の概要
新規色素／蛍光タンパク質およびそれらの変異体をコードする核酸組成物、ならびにそれらによってコードされるタンパク質が提供される。関心対象のタンパク質は、有色および／または蛍光性（この特質は、タンパク質の2個またはそれ以上の残基の相互作用により発生する）であるタンパク質である。本発明のタンパク質は、非生物発光性の刺胞動物種、例えば花虫綱種から得られるか、またはウミエラ目（Pennatulacean）（ウミエラ（sea pen））以外の花虫綱種から得られる。関心対象の特定のタンパク質には、以下の特定のタンパク質が含まれる:（1）ヘテラクチス・クリスパ（Heteractis crispa）由来の緑色蛍光性タンパク質（hcriGFP）；（2）デンドロネフチア（Dendronephthya）sp.由来の緑色蛍光性タンパク質（dendGFP）；（3）ゾアンツス（Zoanthus）sp.由来の赤色蛍光性タンパク質（zoanRFP）；（4）スコリミア・キュベンシス（Scolymia cubensis）由来の緑色蛍光性タンパク質（scubGFP1）；（5）スコリミア・キュベンシス（Scolymia cubensis）由来の緑色蛍光性タンパク質（scubGFP2）；（6）リコルデア・フロリダ（Ricordea florida）由来の赤色蛍光性タンパク質（rfloRFP）；（7）リコルデア・フロリダ（Ricordea florida）由来の緑色蛍光性タンパク質（rfloGFP）；（8）モンタストレア・カベルノサ（Montastraea cavernosa）由来の赤色蛍光性タンパク質（mcavRFP）；（9）モンタストレア・カベルノサ（Montastraea cavernosa）由来の緑色蛍光性タンパク質（mcavGFP）；（10）コンジラクチス・ギガンテア（Condylactis gigantea）由来の緑色蛍光性タンパク質（cgigGFP）；（11）アガリシア・フラギリス（Agaricia fragilis）由来の緑色蛍光性タンパク質（afraGFP）；（12）リコルデア・フロリダ（Ricordea florida）由来の緑色蛍光性タンパク質（rfloGFP2）；（13）モンタストレア・カベルノサ（Montastraea cavernosa）由来の緑色蛍光性タンパク質（mcavGFP2）；および（14）モンタストレア・アヌラリス（Montastraea annularis）由来の緑色蛍光性タンパク質ホモログ（mannFP）。上記の特定のタンパク質に実質的に類似しているか、または上記の特定のタンパク質の変異体であるタンパク質も関心対象である。核酸の断片、およびそれによってコードされるペプチドも提供され、さらに、本発明のタンパク質に対する抗体、ならびにトランスジェニック細胞およびトランスジェニック生物も提供される。本発明のタンパク質組成物および核酸組成物は、多様な異なる適用において有益である。最後に、そのような適用において使用するためのキット、例えば本発明の核酸組成物を含むキットが提供される。
【０００６】
発明の特徴
本発明は、色素タンパク質または蛍光性タンパク質をコードし、非生物発光性刺胞動物種由来である、その天然環境以外に存在する核酸を提供する。ある種の態様において、非生物発光性刺胞動物種は花虫綱種である。ある種の態様において、核酸は単離されている。ある種の態様において、核酸は、その天然環境以外に存在し、花虫綱の色素タンパク質または蛍光性タンパク質をコードし、ウミエラ目以外の花虫綱種に由来する。ある種の態様において、核酸は、配列番号：01、03、05、07、09、11、13、15、17、19、21、23、25、および27の少なくとも10残基長のヌクレオチド配列と実質的に同じであるかまたは同一である残基の配列を有する。ある種の態様において、核酸は、配列番号：01、03、05、07、09、11、13、15、17、19、21、23、25、および27からなる配列の群より選択される少なくとも10残基長の配列との少なくとも約60％の配列類似性を有する。ある種の態様において、核酸は、（a）非生物発光性刺胞動物種、または（b）ウミエラ目以外の花虫綱種のいずれかに由来する色素タンパク質および／または蛍光性タンパク質をコードする。ある種の態様において、核酸は、配列番号：02、04、06、08、10、12、14、16、18、20、22、24、26、および28からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。ある種の態様において、核酸は、（a）非生物発光性刺胞動物種または（b）ウミエラ目以外の花虫綱種のいずれかに由来する色素タンパク質および／または蛍光性タンパク質の変異タンパク質をコードし；ある種の態様において、その変異タンパク質は、野生型タンパク質と比較して少なくとも1個の点変異を含み；他の態様において、その変異タンパク質は、野生型タンパク質と比較して少なくとも1個の欠失変異を含む。
【０００７】
提供された核酸の断片も提供される。ストリンジェントな条件の下で提供された核酸とハイブリダイズする、単離された核酸またはそれらの模倣体も提供される。ベクターと本発明の核酸とを含む構築物も提供される。（a）発現宿主において機能性の転写開始領域；（b）本発明の核酸；および（c）該発現宿主において機能性の転写終結領域、を含む発現カセットも提供される。宿主細胞への発現カセットの導入の結果として染色体外要素の一部として存在するかまたは宿主細胞のゲノムへ組み込まれている本発明の発現カセットを含む細胞またはその子孫も提供される。
【０００８】
タンパク質が発現されるよう、本発明の細胞を増殖させること；および他のタンパク質を実質的に含まない該タンパク質を単離することを含む、色素タンパク質および／または蛍光性タンパク質を作製する方法も提供される。
【０００９】
本発明の核酸によりコードされたタンパク質またはその断片も提供される。
【００１０】
本発明のタンパク質と特異的に結合する抗体も提供される。
【００１１】
本発明の核酸を含む選択された導入遺伝子を含むトランスジェニック細胞またはその子孫も提供される。
【００１２】
本発明の核酸を含む導入遺伝子を含むトランスジェニック生物も提供される。
【００１３】
本発明の色素タンパク質または蛍光性タンパク質を利用する適用も提供される。
【００１４】
本発明の色素タンパク質または蛍光性タンパク質をコードする核酸を利用する適用も提供される。
【００１５】
本発明に係る核酸と該核酸の使用に関する指示とを含むキットも提供される。
【００１６】
定義
本発明に従い、当技術分野の技術の範囲内にある従来の分子生物学、微生物学、および組み換えDNA技術が利用され得る。そのような技術は、文献中に充分に説明されている。例えば、Maniatis、Fritsch、およびSambrook、「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」（1982）；「DNA Cloning：A Practical Approach」、第IおよびII巻（D.N.Glover編 1985）；「Oligonucleotide Synthesis」（M.J.Gait編 1984）；「Nucleic Acid Hybridization」（B.D.HamesおよびS.J.Higgins編（1985））；「Transcription and Translation」（B.D.HamesおよびS.J.Higgins編（1984））；「Animal Cell Culture」（R.I.Freshney編（1986））；「Immobilized Cells and Enzymes」（IRL Press,（1986））；B. Perbal、「A Practical Guide To Molecular Cloning」（1984）を参照のこと。
【００１７】
「ベクター」とは、別のDNAセグメントが、そのセグメントの複製が行われるように付加され得る、プラスミド、ファージ、またはコスミドのようなレプリコンである。
【００１８】
「DNA分子」とは、一本鎖形態または二本鎖ヘリックスのいずれかのデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミン、またはシトシン）の重合体形態をさす。この用語は、分子の一次構造および二次構造のみをさし、任意の特定の三次形態に分子構造を制限するものではない。従って、この用語には、特に直鎖状DNA分子（例えば、制限断片）、ウイルス、プラスミド、および染色体に見出される二本鎖DNAが含まれる。
【００１９】
DNA「コード配列」とは、適切な制御配列の調節下に置かれた場合に、インビボで転写されポリペプチドへと翻訳されるDNA配列である。コード配列の境界は、5'（アミノ）末端の開始コドンおよび3'（カルボキシル）末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列には、これらに制限はされないが、原核生物配列、真核生物mRNAに由来するcDNA、真核生物（例えば、哺乳動物）DNAに由来するゲノムDNA配列、および合成DNA配列が含まれ得る。ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列が、コード配列の3'に位置していてもよい。
【００２０】
本明細書において使用されるように、「ハイブリダイゼーション」という用語は、相対するの核酸鎖の残基間の水素結合によって安定化された逆平行二重鎖を形成するための、2個の核酸鎖の会合の過程をさす。
【００２１】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、短い（100塩基長未満の）核酸分子をさす。
【００２２】
「DNA制御配列」とは、本明細書において使用されるように、宿主細胞におけるコード配列の発現を提供および／または制御する、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター等のような転写および翻訳の調節配列である。
【００２３】
「プロモーター配列」とは、細胞内でRNAポリメラーゼと結合し、下流（3'方向）のコード配列の転写を開始させることができるDNA制御領域である。本発明を定義する目的のため、プロモーター配列は、転写開始部位を3'末端の境界とし、バックグラウンドを超える検出可能なレベルで転写を開始させるために必要な最少数の塩基、または要素を含むように、上流（5'方向）に拡がっている。プロモーター配列内には、転写開始部位のみならずRNAポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメインが見い出されると考えられる。真核生物のプロモーターは、常にではないが、多くの場合、「TATA」ボックスおよび「CAT」ボックスを含有しているであろう。誘導可能プロモーターを含む様々なプロモーターが、本発明の様々なベクターを駆動するために使用され得る。
【００２４】
本明細書において使用されるように、「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」という用語は、各々が特異的なヌクレオチド配列で、またはその近傍で二本鎖DNAを切断する細菌酵素をさす。
【００２５】
外因性または異種のDNAが細胞内に導入されている場合、その細胞は、そのようなDNAによって「形質転換」または「トランスフェクト」されている。形質転換DNAは、細胞のゲノムへ組み込まれて（共有結合して）いてもよく、またはそうでなくてもよい。例えば、原核生物、酵母、および哺乳動物細胞においては、形質転換DNAは、プラスミドのようなエピソーム要素上に維持され得る。真核細胞に関して、安定に形質転換された細胞とは、形質転換DNAが、染色体複製を通じて娘細胞によって受け継がれるように、染色体へ組み込まれているものである。この安定性は、形質転換DNAを含有している娘細胞の集団から構成される細胞株またはクローンを確立する真核細胞の能力によって証明される。「クローン」とは、有糸分裂によって単一の細胞または共通の祖先より派生した細胞の集団である。「細胞株」とは、多くの世代にわたりインビトロで安定に増殖することができる初代細胞のクローンである。
【００２６】
DNA構築物の「異種」領域とは、自然界において、より大きなDNA分子に関連して見出されない、そのより大きな分子中の同定可能なDNAのセグメントである。従って、異種領域が哺乳動物遺伝子をコードする場合、その遺伝子は通常、起源生物のゲノムにおいて哺乳動物ゲノムDNAと隣接していないDNAと隣接していると考えられる。もう一つの例において、異種DNAには、融合タンパク質生成物を作製するために二つの異なる起源に由来する遺伝子の一部が集められた構築物の中のコード配列が含まれる。対立遺伝子変化または天然に存在する変異事象は、本明細書において定義されるようなDNAの異種領域を生成しない。
【００２７】
本明細書において使用されるように、「レポーター遺伝子」という用語は、構築物が組織または細胞へ導入された場合に、産物が容易かつ定量的にアッセイされ得る、異種のプロモーター要素またはエンハンサー要素に付加されたコード配列をさす。
【００２８】
本明細書に記載されたアミノ酸は、「L」異性体であることが好ましい。アミノ酸配列は、一文字記号（A：アラニン；C：システイン；D：アスパラギン酸；E：グルタミン酸；F：フェニルアラニン；G：グリシン；H：ヒスチジン；I：イソロイシン；K：リジン；L：ロイシン；M：メチオニン；N：アスパラギン；P：プロリン；Q：グルタミン；R：アルギニン；S：セリン；T：トレオニン；V：バリン；W：トリプトファン；Y：チロシン；X：任意の残基）で与えられる。NH2は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基をさす。COOHは、ポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離カルボキシ基をさす。標準的なポリペプチド命名法に沿って、J Biol.Chem.,243（1969）,3552-59が使用される。
【００２９】
「免疫学的に活性な」という用語は、天然の、組換えの、または合成の色素／蛍光性タンパク質またはそれらの任意のオリゴペプチドの、適切な動物または細胞において特異的な免疫応答を誘導する能力、および特異的抗体と結合する能力を定義する。本明細書において使用されるように、「抗原性アミノ酸配列」とは、単独でまたは担体分子と会合して、哺乳動物において抗体応答を誘発することができるアミノ酸配列を意味する。抗体の抗原への結合に関連して、「特異的結合」という用語は、当技術分野においてよく理解されている用語であり、抗体が、その抗体を産生させた抗原と結合し、その他の無関係な抗原とは結合しないことさす。
【００３０】
本明細書において使用されるように、「単離された」という用語は、そのポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、または宿主細胞が天然に存在する環境とは異なる環境に存在するポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、または宿主細胞を記載することが意図される。
【００３１】
生物発光（BL）とは、暗所において充分可視であり、動物の視覚的な行動に影響を与える、生物による光の放射と定義される（例えば、Harvey, E.N.（1952）. Bioluminescence. New York：Academic Press；Cell Physiology （N. Speralakis編）pp.651-681における、Hastings,J.W.（1995）. Bioluminescence. New York：Academic Press.；Wilson,T.およびHastings,J.W.（1998）. Bioluminescence.Annu Rev Cell Dev Biol 14,197-230を参照のこと）。生物発光には、高感度の照度測定装置を使用して事実上全ての生物構造において検出され得る、いわゆる極微弱光放射（Murphy,M.E.およびSies,H.（1990）, Visible-range low-level chemiluminescence in biological systems. Meth.Enzymol.186,595-610；Radotic,K,Radenovic,C,Jeremic,M.（1998）Spontaneous ultra-weak bioluminescence in plants：origin, mechanisms and properties. Gen Physiol Biophys 17,289-308）、およびタケ成長円錐の発光（Totsune,H.,Nakano,M.,Inaba,H.（1993）. Chemiluminescence from bamboo shoot cut. Biochem.Biophys.Res Comm.194,1025-1029）、または動物卵の受精中の光の放射（Klebanoff,S. J., Froeder, C. A., Eddy, E. M.,Shapiro,B.M.（1979）. Metabolic similarities between fertilization and phagocytosis. Conservation of peroxidatic mechanism. J.Exp.Med.149,938-953；Schomer,B.およびEpel,D.（1998）. Redox changes during fertilization and maturation of marine invertebrate eggs. Dev Biol 203,1-11）のような、おそらくいかなる生態学的役割も果たさない微弱光放射は含まれない。
【００３２】
特定の態様の説明
新規色素タンパク質／蛍光タンパク質およびそれらの変異体をコードする核酸組成物、並びにそれらによってコードされるタンパク質が提供される。関心対象のタンパク質は、有色かつ／または蛍光性（この特質は、タンパク質の2個以上の残基の相互作用より発生する）であるタンパク質である。本発明のタンパク質は、非生物発光性の刺胞動物種、例えば花虫綱種から得られるか、またはウミエラ目（ウミエラ）以外の花虫綱種から得られることをさらに特徴とする。関心対象の特定のタンパク質には、以下の特定のタンパク質が含まれる:（1）ヘテラクチス・クリスパ（Heteractis crispa）由来の緑色蛍光性タンパク質（hcriGFP）；（2）デンドロネフチア（Dendronephthya）sp.由来の緑色蛍光性タンパク質（dendGFP）；（3）ゾアンツス（Zoanthus）sp.由来の赤色蛍光性タンパク質（zoanRFP）；（4）スコリミア・キュベンシス（Scolymia cubensis）由来の緑色蛍光性タンパク質（scubGFP1）；（5）スコリミア・キュベンシス（Scolymia cubensis）由来の緑色蛍光性タンパク質（scubGFP2）；（6）リコルデア・フロリダ（Ricordea florida）由来の赤色蛍光性タンパク質（rfloRFP）；（7）リコルデア・フロリダ（Ricordea florida）由来の緑色蛍光性タンパク質（rfloGFP）；（8）モンタストレア・カベルノサ（Montastraea cavernosa）由来の赤色蛍光性タンパク質（mcavRFP）；（9）モンタストレア・カベルノサ（Montastraea cavernosa）由来の緑色蛍光性タンパク質（mcavGFP）；（10）コンジラクチス・ギガンテア（Condylactis gigantea）由来の緑色蛍光性タンパク質（cgigGFP）；（11）アガリシア・フラギリス（Agaricia fragilis）由来の緑色蛍光性タンパク質（afraGFP）；（12）リコルデア・フロリダ（Ricordea florida）由来の緑色蛍光性タンパク質（rfloGFP2）；（13）モンタストレア・カベルノサ（Montastraea cavernosa）由来の緑色蛍光性タンパク質（mcavGFP2）；および（14）モンタストレア・アヌラリス（Montastraea annularis）由来の緑色蛍光性タンパク質ホモログ（mannFP）。前記の特定のタンパク質と実質的に類似しているタンパク質、または前記の特定のタンパク質の変異体も、関心対象である。核酸の断片およびそれらによってコードされるペプチドも提供され、さらに、本発明のタンパク質に対する抗体、ならびに本発明の核酸／タンパク質組成物を含むトランスジェニック細胞およびトランスジェニック生物も提供される。本発明のタンパク質組成物および核酸組成物は、多様な異なる適用において有益である。最後に、そのような適用において使用するためのキット、例えば本発明の核酸組成物を含むキットが提供される。
【００３３】
本発明をさらに記載する前に、本発明は下記の本発明の特定の態様に制限されず、特定の態様の変形物が作成されてもよく、それらも添付の特許請求の範囲内に含まれることを理解されたい。利用された語法は、特定の態様を記載するためのものであり、本発明を制限するものではないことも理解されたい。その代わり、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって確立される。
【００３４】
この明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形の「一つの（a）」、「一つの（an）」、および「その（the）」には、特記しない限り、複数形の言及が含まれる。他に定義しない限り、本明細書において使用された全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有している。
【００３５】
ある範囲の値が提供される場合には、その範囲の上限と下限との間に入るそれぞれの値（特記しない限り、下限の単位の10分の1まで）、およびその記述された範囲における他の任意の記述された値または間に入る値が、本発明に包含されることが理解される。これらのより小さな範囲の上限および下限は、記述された範囲において任意の限度が特に除外される条件において、独立にそのより小さな範囲に含まれてもよく、同様に本発明に包含される。記述された範囲が、限度の一方または両方を含む場合、含まれている限度のいずれかまたは両方を除く範囲も、本発明に含まれる。
【００３６】
他に定義しない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語は、全て、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有している。本明細書に記載されたものと類似しているかまたは等価である任意の方法、機器、および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法、機器、および材料が以下に記載される。
【００３７】
本明細書において言及された全ての刊行物は、本明細書に記載された発明に関して使用され得る、刊行物中に記載されている細胞株、ベクター、方法論、およびその他の発明の構成要素を記載かつ開示する目的のため、参照として本明細書に組み込まれる。
【００３８】
本発明のさらなる記載においては、まず本発明の核酸組成物を記載し、続いて本発明のタンパク質組成物、抗体組成物、およびトランスジェニック細胞／生物について考察する。次に、本発明のタンパク質が有益である代表的な方法の概要を提供する。
【００３９】
核酸組成物
上に要約されたように、本発明は、色素タンパク質および蛍光タンパク質ならびにそれらの変異体、ならびにこれらのタンパク質の断片および相同体をコードする核酸組成物を提供する。色素および／または蛍光性タンパク質とは、有色である、即ち着色しているタンパク質を意味し、タンパク質は蛍光性であってもよいしまたは蛍光性でなくてもよく、例えば、励起波長の光での照射に応じて、低い、中程度の、または高い蛍光を示し得る。いずれにせよ、関心対象の本発明のタンパク質は、その有色の特徴、即ち色素性および／または蛍光性特徴が、タンパク質の単一の残基、より具体的には単一の残基の単一の側鎖からではなく、タンパク質の2個またはそれ以上の残基の相互作用から発生するものであるタンパク質である。そのため、本発明の蛍光性タンパク質には、それ自体が内在性蛍光団（intrinsic fluors）としてはたらく残基、即ちトリプトファン、チロシン、およびフェニルアラニンからの蛍光のみを示すタンパク質は含まれない。そのため、本発明の蛍光性タンパク質は、その蛍光が、前記の単一残基以外のタンパク質内の何らかの構造から発生する、例えば2個またはそれ以上の残基の相互作用から発生するような蛍光性タンパク質である。
【００４０】
核酸組成物とは、本発明の色素／蛍光ポリペプチドをコードするオープン・リーディング・フレーム、即ち色素／蛍光タンパク質遺伝子を有し、適切な条件の下で、本発明に係る色素／蛍光タンパク質として発現され得るDNAの配列を含む組成物を意味する。この用語には、本発明の核酸と相同であるか、実質的に類似しているか、または同一である核酸も包含される。従って、本発明は、本発明のタンパク質をコードする遺伝子およびそのコード配列のみならず、それらの相同体も提供する。本発明の核酸は、その天然環境以外に存在し、例えば、天然に存在する環境、例えばそれらが得られる生物から単離されており、濃縮された量で存在する。
【００４１】
核酸は、（1）非生物発光性種、多くの場合には非生物発光性刺胞動物種、例えば非生物発光性花虫綱種に由来するか、または（2）ウミエラ目種ではない、即ちウミエラではない花虫綱種に由来するタンパク質をコードすることをさらに特徴とする。そのため、核酸は、これらの種がウミエラ目種でない限り、例えばレニラン（Renillan）種またはプチロサルカン（Ptilosarcan）種でない限り、生物発光性花虫綱種に由来するタンパク質をコードしてもよい。関心対象の特定の核酸は、以下の特定のタンパク質をコードするものである：（1）ヘテラクチス・クリスパ（Heteractis crispa）由来の緑色蛍光性タンパク質（hcriGFP）（Genbankアクセッション番号AF420592）；（2）デンドロネフチア（Dendronephthya）sp.由来の緑色蛍光性タンパク質（dendGFP）（Genbankアクセッション番号AF420591）；（3）ゾアンツス（Zoanthus）sp.由来の赤色蛍光性タンパク質（zoanRFP）（Genbankアクセッション番号AY059642）；（4）スコリミア・キュベンシス（Scolymia cubensis）由来の緑色蛍光性タンパク質（scubGFP1）（Genbankアクセッション番号AY037767）；（5）スコリミア・キュベンシス（Scolymia cubensis）由来の緑色蛍光性タンパク質（scubGFP2）（Genbankアクセッション番号AY037771）；（6）リコルデア・フロリダ（Ricordea florida）由来の赤色蛍光性タンパク質（rfloRFP）（Genbankアクセッション番号AY037773）；（7）リコルデア・フロリダ（Ricordea florida）由来の緑色蛍光性タンパク質（rfloGFP）（Genbankアクセッション番号AY037772）；（8）モンタストレア・カベルノサ（Montastraea cavernosa）由来の赤色蛍光性タンパク質（mcavRFP）（Genbankアクセッション番号AY037770）；（9）モンタストレア・カベルノサ（Montastraea cavernosa）由来の緑色蛍光性タンパク質（mcavGFP）（Genbankアクセッション番号AY037769）；（10）コンジラクチス・ギガンテア（Condylactis gigantea）由来の緑色蛍光性タンパク質（cgigGFP）（Genbankアクセッション番号AY03776）；（11）アガリシア・フラギリス（Agaricia fragilis）由来の緑色蛍光性タンパク質（afraGFP）；（12）リコルデア・フロリダ（Ricordea florida）由来の緑色蛍光性タンパク質（rfloGFP2）；（13）モンタストレア・カベルノサ（Montastraea cavernosa）由来の緑色蛍光性タンパク質（mcavGFP2）；および（14）モンタストレア・アヌラリス（Montastraea annularis）由来の緑色蛍光性タンパク質ホモログ（mannFP）。上記の特定の核酸から派生したもの、または上記の特定の核酸の変異体、ホモログであるものも関心対象である。
【００４２】
前記の特定の核酸組成物に加え、上記配列のホモログも関心対象である。本発明の核酸のホモログに関して、相同遺伝子の起源は、植物もしくは動物の任意の種であってよく、または配列が、完全もしくは部分的に合成であってもよい。ある種の態様において、ホモログ間の配列類似性は、少なくとも約20％であり、時には少なくとも約25％であり、30％、35％、40％、50％、60％、70％、またはそれ以上、例えば75％、80％、85％、90％、95％、またはそれ以上であってもよい。配列類似性は、保存されたモチーフ、コーディング領域、隣接領域等のようなより大きい配列のサブセットであり得る参照配列に基づき計算される。参照配列は、少なくとも約18nt長、より一般的には少なくとも約30nt長であると考えられるが、比較される完全配列にまで及んでいてもよい。Altschulら（1990）、J.Mol.Biol.215：403-10に記載されたBLAST（デフォルト設定、即ちパラメータw＝4およびT＝17を使用）のような、配列分析のためのアルゴリズムが、当技術分野において既知である。本明細書に提供された配列は、データベース検索において関連核酸および相同核酸を認識するために不可欠である。ある種の態様において特に関心があるのは、配列番号：01、03、05、07、09、11、13、15、17、19、21、23、25、または27として同定される核酸と実質的に同じ長さの核酸であり（実質的に同じ長さ、とは、長さの差が、約20個数（number）％を超えないこと、一般的には約10個数％を超えないこと、より一般的には約5個数％を超えないことを意味する）；かつ、核酸の全長にわたり少なくとも約90％、一般的には少なくとも約95％、より一般的には少なくとも約99％のこれらの配列のうちのいずれかとの配列同一性を有しているものである。多くの態様において、核酸は、配列番号：01、03、05、07、09、11、13、15、17、21、23、25、27の配列と実質的に類似している（即ち、同じである）か、または同一である配列を有している。実質的に類似している、とは、配列同一性が、一般に、少なくとも約60％、一般的には少なくとも約75％、多くの場合には少なくとも約80％、85％、90％、またはさらには95％であることを意味する。
【００４３】
前記の核酸によってコードされるタンパク質をコードするが、遺伝暗号の縮重により前記の核酸と配列が異なっている核酸も、提供される。
【００４４】
ストリンジェントな条件の下で前記の核酸とハイブリダイズする核酸も提供される。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、50℃またはそれ以上および0.1×SSC（15mM塩化ナトリウム／1.5mMクエン酸ナトリウム）におけるハイブリダイゼーションである。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のもう一つの例は、溶液：50％ホルムアミド、5×SSC（150 mM NaCl、15mMクエン酸三ナトリウム）、50mMリン酸ナトリウム（pH7.6）、5×デンハルト溶液、10％デキストラン硫酸、および20μg/ml変性剪断サケ精子DNAにおける42℃での一晩のインキュベーション、それに続く約65℃での0.1×SSCにおけるフィルターの洗浄である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、上記の代表的な条件と少なくとも同等にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件であって、上記の特定のストリンジェントな条件と比べて少なくとも約80％ストリンジェントである場合、典型的には少なくとも約90％ストリンジェントである場合、その条件は少なくとも同等にストリンジェントであると見なされる。その他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、当技術分野において既知であり、それらも本発明のこの特定の態様の核酸を同定するために利用され得る。
【００４５】
本発明のタンパク質の変異体をコードする核酸も提供される。変異核酸は、当技術分野において慣例的である周知の技術を使用して、無作為突然変異誘発または標的突然変異誘発により生成され得る。いくつかの態様において、相同体または変異体をコードする核酸によってコードされる色素タンパク質または蛍光性タンパク質は、野生型の蛍光性タンパク質と同じ蛍光特性を有している。その他の態様において、相同体または変異核酸は、本明細書により詳細に記載されるように、改変されたスペクトル特性を有する色素タンパク質または蛍光性タンパク質をコードする。
【００４６】
特に関心がある変異体の一つのカテゴリは、非凝集性変異体である。多くの態様において、非凝集性変異体は、天然に存在するタンパク質または変異体の非凝集性変異体を作製するのに十分な様式で、例えば電荷を逆転させるかまたは中和するため、N末端残基の側鎖上に出現する電荷を調整するN末端の変異によって、野生型配列と異なっている（ここで、ある特定のタンパク質は、米国特許出願第60/270,983号（これの開示は参照として本明細書に組み込まれる）に報告されたアッセイを使用して非凝集性であると決定された場合に、非凝集性であると見なされる）。
【００４７】
特に関心がある変異体のもう一つのカテゴリは、改変オリゴマー形成変異体（modulated oligomerization mutant）である。ある変異体は、オリゴマー形成特性が野生型タンパク質と比較して異なる場合、改変オリゴマー形成変異体であると見なされる。例えば、ある特定の変異体が、野生型よりオリゴマー形成の程度が高いかまたは低い場合、それは、オリゴマー形成変異体であると見なされる。特に関心があるのは、オリゴマー形成しない、即ち生理学的（例えば、細胞内）条件下で単量体であるか、または野生型よりオリゴマー形成の程度が低い、例えば細胞内条件下で二量体もしくは三量体であるオリゴマー形成変異体である。
【００４８】
本発明の核酸は、cDNAもしくはゲノムDNAまたはそれらの断片であり得る。ある種の態様において、本発明の核酸は、特定の蛍光性のタンパク質およびポリペプチドをコードするオープン・リーディング・フレーム1個以上、並びにイントロンを含み、さらに、コーディング領域より最大約20kb大きく、いずれの方向であってもよい、発現の制御に関与する隣接5'および3'非コーディング・ヌクレオチド配列を含む。本発明の核酸は、より詳細に後述されるように、染色体外維持または宿主ゲノムへの組み込みのための適切なベクターに導入され得る。
【００４９】
「cDNA」という用語は、本明細書において使用されるように、天然型成熟mRNA種に見出される配列要素（配列要素とは、エキソン並びに5'および3'非コーディング領域である）の配置を共有している全ての核酸を含むものとする。通常、mRNA種は、隣接したエキソンを有し、介在するイントロンが存在する場合、それは、タンパク質をコードする連続的なオープン・リーディング・フレームを作出するため、核RNAスプライシングにより除去される。
【００５０】
関心対象のゲノム配列は、天然型染色体に通常存在するイントロンを全て含む、表に記載された配列において定義されるような開始コドンと終止コドンとの間に存在する核酸を含む。それは、成熟mRNAに見出される5'および3'非翻訳領域をさらに含んでいてもよい。それは、転写される領域の5'または3'末端のいずれかに、約1kb（それ以上であってもよい）の隣接ゲノムDNAを含む、プロモーター、エンハンサー等のような特異的な転写および翻訳の制御配列をさらに含んでいてもよい。ゲノムDNAは、100kbp以下の、隣接染色体配列を実質的に含まない断片として単離されていてもよい。コーディング領域の3'もしくは5'のいずれかに隣接するゲノムDNA、または時にはイントロンに見出されるような内部制御配列は、適正な組織特異的および段階特異的な発現に必要とされる配列を含有している。
【００５１】
本発明の核酸組成物は、本発明のタンパク質の全部または一部をコードし得る。二本鎖または一本鎖の断片は、従来の方法によるオリゴヌクレオチドの化学合成、制限酵素消化、PCR増幅等によってDNA配列より入手され得る。大抵、DNA断片は、少なくとも約15nt、通常は少なくとも約18ntまたは約25 ntであると考えられるが、少なくとも約50ntであってもよい。いくつかの態様において、本発明の核酸分子は、約100nt、約200nt、約300nt、約400nt、約500nt、約600nt、約700nt、または約720ntの長さであり得る。本発明の核酸は、本発明のタンパク質の断片または完全長タンパク質をコードすることができ、例えば、本発明の核酸は、約25aa、約50aa 、約75aa 、約100aa 、約125aa、約150aa、約200aa、約210aa、約220aa、約230aa、または約240aa、最大でタンパク質全体の長さまでのポリペプチドをコードし得る。
【００５２】
本発明の核酸は、一般には完全染色体以外として、単離され実質的に純粋に入手される。一般的には、DNAは、本発明の核酸またはその断片を含まない他の核酸配列を実質的に含まずに得られ、一般には少なくとも約50％、一般的には少なくとも約90％純粋であり、典型的には「組換え型」である、即ち天然に存在する染色体においては通常連結していない1個以上のヌクレオチドと隣接しているであろう。
【００５３】
本発明のポリヌクレオチド（例えば、配列番号：01、03、05、07、09、11、13、15、17、19、21、23、25、27の配列を有するポリヌクレオチド等）、対応するcDNA、全長遺伝子、および本発明のポリヌクレオチドの構築物が提供される。これらの分子は、当業者に既知の多数の異なるプロトコルにより合成的に作製され得る。適切なポリヌクレオチド構築物は、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第2版、（1989）Cold Spring Harbor Press、Cold Spring Harbor、NYに記載されたような標準的な組み換えDNA技術を使用して、そして米国保健社会福祉省（United States Dept. of HHS）国立衛生研究所（National Institute of Health）（NIH）の組換えDNA研究に関するガイドライン（Guidelines for Recombinant DNA Research）に記載された現行の規制の下で、精製される。
【００５４】
第二のタンパク質、例えば分解配列、シグナル・ペプチド等と融合した、本発明のタンパク質またはその断片の融合タンパク質をコードする核酸も、提供される。融合タンパク質は、本発明のポリペプチドまたはその断片、ならびに本発明のポリペプチドのN末端および／またはC末端とインフレームで（in-frame）融合した非花虫綱ポリペプチド（「融合パートナー」）を含み得る。融合パートナーには、その融合パートナーに特異的な抗体と結合することができるポリペプチド（例えば、エピトープ・タグ）；抗体またはそれらの結合性断片；触媒機能を提供するか、または細胞応答を誘導するポリペプチド；リガンドもしくは受容体またはそれらの模倣体等が含まれるが、これらに制限はされない。そのような融合タンパク質において、融合パートナーは、一般に、融合タンパク質の対象花虫綱部分と天然には会合しておらず、かつ典型的に花虫綱タンパク質またはその誘導体／断片ではなく、即ち花虫綱種には見出されない。
【００５５】
増幅、タンパク質生産等を含む、多数の異なる適用のために使用され得る、ベクターに挿入された本発明の核酸を含む構築物も提供される。プラスミドを含むウイルス・ベクターおよび非ウイルス・ベクターが、調製され使用され得る。ベクターの選択は、増幅が望まれる細胞の型および増幅の目的に依存するであろう。ある種のベクターは、所望のDNA配列を増幅し、大量に作製するために有用である。培養細胞における発現に適しているベクターも存在する。さらに、完全な動物またはヒトの体内の細胞における移入および発現に適しているベクターも存在する。適切なベクターの選択は、十分に当技術分野の技術の範囲内にある。多くのそのようなベクターが、市販されている。構築物を調製するためには、部分的または完全長のポリヌクレオチドが、典型的にベクター内の切断された制限酵素部位へのDNAリガーゼによる付加によって、ベクターへと挿入される。または、所望のヌクレオチド配列は、インビボにおける相同的組み換えによって挿入され得る。典型的には、これは、ベクターの所望のヌクレオチド配列の両側に相同領域を付加することにより達成される。相同領域は、例えば、オリゴヌクレオチドのライゲーションによって、または相同領域および所望のヌクレオチド配列の一部の両方を含むプライマーを使用した、ポリメラーゼ連鎖反応によって追加される。
【００５６】
適用の中でも、とりわけ本発明のタンパク質の合成において有益である発現カセットまたは発現系も提供される。発現のため、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる遺伝子産物は、例えば細菌、酵母、昆虫、両生動物、および哺乳動物の系を含む任意の便利な発現系において発現される。適当なベクターおよび宿主細胞は、米国特許第5,654,173号に記載されている。発現ベクターにおいて、本発明のポリヌクレオチド、例えば配列番号：01、03、05、07、09、11、13、15、17、19、21、23、25、または27に示されるポリヌクレオチドは、所望の発現特性を得るため、適宜制御配列と連結される。これらの制御配列には、プロモーター（センス鎖の5'末端、またはアンチセンス鎖の3'末端に付加される）、エンハンサー、ターミネーター、オペレーター、リプレッサー、およびインデューサーが含まれ得る。プロモーターは、制御型または構成型であってもよい。いくつかの状況においては、組織特異的プロモーターまたは発達段階特異的プロモーターのような、条件活性プロモーターを使用することが望まれ得る。これらは、ベクターとの連結に関する前記の技術を使用して、所望のヌクレオチド配列に連結される。当技術分野において既知の任意の技術が使用され得る。換言すると、発現ベクターは、誘導可能であるか、または構成型であってもよい、転写および翻訳の開始領域（コード領域が、転写開始領域の転写調節下で機能可能に連結されている）、ならびに転写および翻訳の終結領域を提供するであろう。これらの調節領域は、本発明の核酸が得られる本発明の種に在来するものであってもよいし、または外因的な起源に由来してもよい。
【００５７】
発現ベクターは、一般に、異種タンパク質をコードする核酸配列の挿入を提供するため、プロモーター配列の近傍に位置する便利な制限部位を有している。発現宿主において機能する選択可能マーカーが存在してもよい。発現ベクターは、とりわけ前記の融合タンパク質の生産のために使用され得る。
【００５８】
転写開始領域、遺伝子またはその断片、および転写終結領域を含む発現カセットが調製され得る。特に関心対象であるのは、通常は少なくとも8アミノ酸長、より通常には少なくとも約15アミノ酸長〜約25アミノ酸長、最大で遺伝子の完全なオープン・リーディング・フレームの長さまでの、機能性のエピトープまたはドメインの発現を可能にする配列の使用である。DNAの導入の後、構築物を含有している細胞が選択可能なマーカーによって選択され、その細胞が増幅され、次いで発現のために使用され得る。
【００５９】
前記の発現系は、発現の目的に依って、従来の方式に従い原核生物または真核生物を用いて利用され得る。タンパク質の大量生産のためには、大腸菌、枯草菌（B.subtilis）、出芽酵母（S.cerevisiae）のような単細胞生物、バキュロウイルス・ベクターと組み合わされた昆虫細胞、または脊椎動物のような高等生物の細胞、例えばCOS7細胞、HEK293、CHO、アフリカツメガエル（Xenopus）卵母細胞等が、発現宿主細胞として使用され得る。いくつかの状況においては、発現したタンパク質が、在来の折り畳みおよび翻訳後修飾の恩恵を得ると考えられる真核細胞において遺伝子を発現させることが望ましい。小さなペプチドは、実験室において合成することもできる。完全タンパク質配列のサブセットであるポリペプチドは、機能にとって重要なタンパク質の部分を同定し検討するために使用され得る。
【００６０】
関心対象の特定の発現系には、細菌、酵母、昆虫細胞、および哺乳動物細胞に由来する発現系が含まれる。これらの各カテゴリーからの代表的な系を、以下に挙げる。
【００６１】
細菌
細菌における発現系には、Changら、Nature（1978）275：615；Goeddelら、Nature（1979）281：544；Goeddelら、Nucleic Acids Res.（1980）8：4057；欧州特許第0 036,776号；米国特許第4,551,433号；DeBoerら、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)（1983）80：21-25；およびSiebenlistら、Cell（1980）20：269に記載されたものが含まれる。 
【００６２】
酵母
酵母における発現系には、Hinnenら、Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）（1978）75：1929；Itoら、J.Bacteriol.（1983）153：163；Kurtzら、Mol.Cell.Biol.（1986）6：142；Kunzeら、J.Basic Microbiol.（1985）25：141；Gleesonら、J.Gen.Microbiol.（1986）132：3459；Roggenkampら、Mol.Gen.Genet.（1986）202：302；Dasら、J.Bacteriol.（1984）158：1165；De Louvencourtら、J.Bacteriol.（1983）154：737；Van den Bergら、Bio/Technology（1990）8：135；Kunzeら、J.Basic Microbiol.（1985）25：141；Creggら、Mol.Cell.Biol.（1985）5：3376；米国特許第4,837,148号および第4,929,555号；BeachおよびNurse、Nature（1981）300：706；Davidowら、Curr.Genet.（1985）10：380；Gaillardinら、Curr.Genet.（1985）10：49；Ballanceら、Biochem.Biophys.Res.Commun.（1983）112：284-289；Tilburnら、Gene（1983）26：205-221；Yeltonら、Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）（1984）81：1470-1474；KellyおよびHynes、EMBO J.（1985）4：475479；欧州特許第0 244,234号；および国際公開公報第91/00357号に記載されたものが含まれる。
【００６３】
昆虫細胞
昆虫における異種遺伝子の発現は、米国特許第4,745,051号；The Molecular Biology Of Baculoviruses（1986）（W.Doerfler編）における、Friesenら、The Regulation of Baculovirus Gene Expression；欧州特許第0 127,839号；欧州特許第0 155,476号；およびVlakら、J.Gen.Virol.（1988）69：765-776；Millerら、Ann.Rev.Microbiol.（1988）42：177；Carbonellら、Gene（1988）73：409；Maedaら、Nature（1985）315：592-594；Lebacq-Verheydenら、Mol.Cell.Biol.（1988）8：3129；Smithら、Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）（1985）82：8844；Miyajimaら、Gene（1987）58：273；およびMartinら、DNA（1988）7：99に記載されたようにして達成される。多数のバキュロウイルス株およびバリアント、ならびに対応する許容性昆虫宿主細胞が、Luckowら、Bio/Technology（1988）6：47-55、Millerら、Generic Engineering（1986）8：277-279、およびMaedaら、Nature（1985）315：592-594に記載されている。
【００６４】
哺乳動物細胞
哺乳動物発現は、Dijkemaら、EMBO J.（1985）4：761、Gormanら、Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）（1982）79：6777、Boshartら、Cell（1985）41：521、および米国特許第4,399,216号に記載されたようにして達成される。哺乳動物発現のその他の特質は、HamおよびWallace,Meth.Enz.（1979）58：44、BarnesおよびSato、Anal.Biochem.（1980）102：255、米国特許第4,767,704号、第4,657,866号、第4,927,762号、第4,560,655号、国際公開公報第90/103430号、国際公開公報第87/00195号、米国再発行特許第30,985号に記載されたようにして促進される。
【００６５】
上記の宿主細胞、またはその他の適切な宿主細胞もしくは宿主生物のいずれかが、本発明のポリヌクレオチドまたは核酸を複製、および／または発現させるために使用される場合、得られる複製した核酸、RNA、発現したタンパク質またはポリペプチドは、宿主細胞または宿主生物の産物として、本発明の範囲内に含まれる。産物は、当技術分野において既知の任意の適切な手段によって回収される。
【００６６】
選択されたポリヌクレオチドに対応する遺伝子が同定された後、その発現は、その遺伝子が天然に存在している細胞において制御され得る。例えば、細胞の内因性遺伝子が、細胞におけるその遺伝子の発現を少なくとも増強するのに十分な位置で細胞のゲノムに挿入された外因性制御配列により制御され得る。制御配列は、米国特許第5,641,670号および第5,733,761号（これらの開示は参照として本明細書に組み込まれる）に開示されたような相同的組み換えによってゲノムへ組み込まれるよう設計されてもよいし、または国際公開広報第99/15650号（これの開示は参照として本明細書に組み込まれる）に開示されたような非相同的組み換えによってゲノムへ組み込まれるよう設計されてもよい。そのため、上記の組み込まれた特許文献に記載されたような、所望のタンパク質をコードする遺伝子を既に含んでいる細胞のゲノムへの制御配列の組み込みによる、コーディング核酸自体を操作することのない本発明のタンパク質の作製も、本発明に包含される。
【００６７】
本発明の核酸のホモログも提供される。ホモログは、多数の方法のいずれかによって同定される。提供されたcDNAの断片は、目的の標的生物に由来するcDNAライブラリーに対するハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る（この場合、低ストリンジェンシー条件が使用される）。プローブは、大きな断片、または1個以上の短い縮重プライマーであり得る。配列類似性を有する核酸は、低ストリンジェンシー条件下、例えば50℃および6×SSC（0.9M塩化ナトリウム／0.09Mクエン酸ナトリウム）でのハイブリダイゼーションによって検出され、55℃、1×SSC（0.15M塩化ナトリウム／0.015Mクエン酸ナトリウム）での洗浄に供された場合に結合し続ける。配列同一性は、ストリンジェントな条件の下、例えば50℃以上および0.1×SSC（15mM塩化ナトリウム／1.5mMクエン酸ナトリウム）でのハイブリダイゼーションにより決定され得る。提供された配列との実質的な同一性を有する領域を有する核酸、例えば対立遺伝子バリアント、遺伝学的に改変された遺伝子のバージョン等は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下で提供された配列と結合する。DNA配列のプローブ、特に標識されたプローブを使用することにより、相同遺伝子または関連遺伝子を単離することが可能である。
【００６８】
本発明のゲノム配列のプロモーター要素も関心対象である（ここで、例えば本発明のタンパク質遺伝子が発現している細胞／組織における発現の制御を提供する、エンハンサー結合部位を含む5'隣接領域の配列が、プロモーター要素のため利用され得る）。
【００６９】
PCR用プライマー、ハイブリダイゼーション・スクリーニング・プローブ等として有用な、本発明の核酸の小さいDNA断片も提供される。より大きいDNA断片、即ち100ntを超える断片は、先のセクションに記載されたような、コードされたポリペプチドの作製に有用である。幾何級数的PCRのような幾何級数的増幅反応における使用には、プライマー対が使用される。プライマー配列の正確な組成は、本発明にとって重大ではないが、大部分の適用の場合、プライマーは、当技術分野において既知のようなストリンジェントな条件の下で本発明の配列とハイブリダイズするであろう。少なくとも約50nt、好ましくは少なくとも約100ntの増幅産物が生成するであろうプライマー対を選択することが好ましい。プライマー配列の選択のためのアルゴリズムは一般に既知であり、商業的なソフトウェア・パッケージ内に入手可能である。増幅プライマーは、DNAの相補鎖にハイブリダイズし、相互の方に向かって反応を開始させるであろう。
【００７０】
DNAは、生物学的標本中の遺伝子の発現を同定するためにも使用され得る。ゲノムDNAまたはRNAのような特定のヌクレオチド配列の存在に関して細胞を探索する様式は、文献中に充分に確立されている。簡単に説明すると、DNAまたはmRNAは細胞試料から単離される。mRNAは、逆転写酵素を使用して相補DNA鎖を形成させ、続いて、本発明のDNA配列に特異的なプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応増幅を行うRT-PCRにより増幅され得る。または、mRNA試料は、ゲル電気泳動により分離され、適当な支持体、例えばニトロセルロース、ナイロン等へ転写され、次いで本発明のDNAの断片をプローブとして用い探索される。オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ法、インサイチューハイブリダイゼーション、および固体チップ上にアレイ化されたDNAプローブとのハイブリダイゼーションのようなその他の技術も、有用であり得る。本発明の配列とハイブリダイズするmRNAの検出は、試料中の花虫綱タンパク質遺伝子発現の指標となる。
【００７１】
隣接するプロモーター領域およびコード領域を含む本発明の核酸は、プロモーター強度、コードされるタンパク質の配列、コードされるタンパク質の蛍光特性を含むコードされるタンパク質の特性等において、標的とする変化を発生させるための、当技術分野において既知の様々な方式で変異させられ得る。そのように変異させたDNA配列またはタンパク質産物は、通常は、本明細書に提供される配列と実質的に類似していると考えられ、例えば、少なくとも1個のヌクレオチドまたはアミノ酸がそれぞれ異なると考えられ、少なくとも2個、しかし最高約10個のヌクレオチドまたはアミノ酸が異なっていてもよい。配列の変化は、置換、挿入、欠失、またはそれらの組み合わせであり得る。欠失には、ドメインまたはエクソンの欠失、例えば10aa残基、20aa残基、50aa残基、75aa残基、100aa残基、150aa残基、またはそれ以上の範囲の欠失のような、より大きな変化をさらに含み得る。クローニングされた遺伝子のインビトロ突然変異誘発のための技術は、既知である。部位特異的突然変異誘発のためのプロトコルの例は、Gustinら（1993）、Biotechniques 14：22；Barany（1985）、Gene 37：111-23；Colicelliら（1985）、Mol.Gen.Genet.199：537-9；およびPrentkiら（1984）、Gene 29：303-13に見出され得る。部位特異的突然変異誘発のための方法は、Sambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、CSH Press 1989年、pp.15.3-15.108；Weinerら（1993）、Gene 126：35-41；Sayersら（1992）、Biotechniques 13：592-6；JonesおよびWinistorfer（1992）、Biotechniques 12：528-30；Bartonら（1990）、Nucleic Acids Res 18：7349-55；MarottiおよびTomich（1989）、Gene Anal.Tech.6：67-70；およびZhu（1989）、Anal Biochem 177：120-4に見出され得る。そのように変異させた核酸誘導体は、特定の色素／蛍光性タンパク質の構造−機能関係を研究するため、またはその機能もしくは制御に影響を与えるタンパク質の特性を改変するために使用され得る。
【００７２】
多くの態様において特に関心があるのは、色素タンパク質（例えば、蛍光を有していたとしてもほとんど有していない着色タンパク質）を蛍光性変異体へと変異させるのに有用な、以下の特異的突然変異誘発プロトコルである。このプロトコルにおいて、候補タンパク質の配列は、Matzら、「非生物発光性花虫綱種由来の蛍光性タンパク質（Fluorescent proteins from non-bioluminescent Anthozoa species）」Nature Biotechnology（1999年10月）17：969-973に報告されたプロトコルに従い、エクオレア・ビクトリア（Aequorea victoria）野生型GFPのアミノ酸配列と整列させられる。整列させられた色素タンパク質の残基148位が同定され、次いで、例えば部位特異的突然変異誘発によってSerへと変化させられ、それによって、野生型色素タンパク質の蛍光変異体が作製される。例えば、148位の天然型Ala残基のSerへの置換によって蛍光性タンパク質へと変異させられた、野生型タンパク質が色素タンパク質である下記のNFP-7を参照のこと。
【００７３】
本発明の核酸のヒト化型も、関心対象である。本明細書において使用されるように、「ヒト化」という用語は、ヒト細胞におけるタンパク質の発現のためのコドンを最適化するために、核酸配列に対してなされる変化をさす（Yangら、Nucleic Acids Research 24 （1996）,4592-4593）。タンパク質のヒト化を記載している米国特許第5,795,737号（その開示は参照として本明細書に組み込まれる）も、参照されたい。
【００７４】
タンパク質／ポリペプチド組成物
色素タンパク質および／または蛍光性タンパク質並びにそれらの変異体、並びにそれらに関連したポリペプチド組成物も、本発明によって提供される。本発明のタンパク質は色素タンパク質であるため、それらは、蛍光性、低蛍光性、または非蛍光性であり得る着色タンパク質である。本明細書において使用されるように、色素タンパク質および蛍光性タンパク質という用語は、ウミシイタケ（Renilla）ルシフェラーゼのようなルシフェラーゼは含まず、光、例えば白色光または特定の波長の光（または、励起波長のような狭域波長帯）を照射された場合に、呈色するか、または着色されるか、かつ／または蛍光を発する任意のタンパク質をさす。ポリペプチド組成物という用語は、本明細書において使用されるように、全長タンパク質およびその一部または断片の両方をさす。この用語には、より詳細に後述されるような、天然に存在するタンパク質および天然に存在するタンパク質の変異体と相同であるか、または実質的に類似している、天然に存在するタンパク質のバリエーションも含まれる。本発明のポリペプチドは、天然環境以外に存在する。
【００７５】
多くの態様において、本発明のタンパク質は、約300nm〜700nm、通常は約350nm〜650nm、より通常には約400nm〜600nmの範囲の吸光極大を有している。本発明のタンパク質が蛍光性タンパク質である場合、即ち、ある波長の光により励起された後、別の波長で光を放射することができる場合、本発明のタンパク質の放射スペクトルは、典型的には約400nm〜800nm、通常は約425nm〜775nm、より通常には約450nm〜750nmの範囲である一方、本発明のタンパク質の励起スペクトルは、典型的には約300nm〜700nm、通常は約350nm〜650nm、より通常には約400nm〜600nmの範囲である。本発明のタンパク質は、一般に約10,000〜50,000、通常は約15,000〜45,000の範囲の極大吸光係数を有している。本発明のタンパク質は、典型的には、約150〜300アミノ酸残基長、一般的には約200〜300アミノ酸残基長であり、一般には、約15kDa〜35kDa、通常は約17.5kDa〜32.5 kDaの範囲の分子量を有している。
【００７６】
ある種の態様において、本発明のタンパク質は明るい（明るいとは、通常の方法（例えば、視覚的スクリーニング、分光測光法、分光蛍光分析、蛍光顕微鏡検、FACS機等）により、色素タンパク質およびそれらの蛍光性変異体が検出され得ることを意味する）。特定の蛍光性タンパク質の蛍光輝度は、極大吸光係数を掛けた量子収量により決定される。色素タンパク質の輝度は、その極大吸光係数によって表され得る。
【００７７】
ある種の態様において、本発明のタンパク質は、宿主細胞における発現の後、迅速に折り畳まれる。迅速な折り畳みとは、タンパク質が、色素性または蛍光性を生じる三次構造に短時間で達することを意味する。これらの態様において、タンパク質は、一般に約3日を超えない期間、通常は約2日を超えない期間、より通常には約1日を超えない期間に折り畳まれる。
【００７８】
関心対象の特定のタンパク質には、以下の特定のタンパク質が含まれる：（1）ヘテラクチス・クリスパ（Heteractis crispa）由来の緑色蛍光性タンパク質（hcriGFP）；（2）デンドロネフチア（Dendronephthya）sp.由来の緑色蛍光性タンパク質（dendGFP）；（3）ゾアンツス（Zoanthus）sp.由来の赤色蛍光性タンパク質（zoanRFP）；（4）スコリミア・キュベンシス（Scolymia cubensis）由来の緑色蛍光性タンパク質（scubGFP1）；（5）スコリミア・キュベンシス（Scolymia cubensis）由来の緑色蛍光性タンパク質（scubGFP2）；（6）リコルデア・フロリダ（Ricordea florida）由来の赤色蛍光性タンパク質（rfloRFP）；（7）リコルデア・フロリダ（Ricordea florida）由来の緑色蛍光性タンパク質（rfloGFP）；（8）モンタストレア・カベルノサ（Montastraea cavernosa）由来の赤色蛍光性タンパク質（mcavRFP）；（9）モンタストレア・カベルノサ（Montastraea cavernosa）由来の緑色蛍光性タンパク質（mcavGFP）；（10）コンジラクチス・ギガンテア（Condylactis gigantea）由来の緑色蛍光性タンパク質（cgigGFP）；（11）アガリシア・フラギリス（Agaricia fragilis）由来の緑色蛍光性タンパク質（afraGFP）；（12）リコルデア・フロリダ（Ricordea florida）由来の緑色蛍光性タンパク質（rfloGFP2）；（13）モンタストレア・カベルノサ（Montastraea cavernosa）由来の緑色蛍光性タンパク質（mcavGFP2）；および（14）モンタストレア・アヌラリス（Montastraea annularis）由来の緑色蛍光性タンパク質ホモログ（mannFP）。
【００７９】
前記で提供される本発明の特定のアミノ酸配列、すなわち配列番号：02、04、06、08、10、12、14、16、18、20、22、24、26、または28と配列が異なる、相同体またはタンパク質（またはそれらの断片）も提供される。相同体とは、D.G.HigginsおよびP.M.Sharp、「Fast and Sensitive multiple Sequence Alignments on a Microcomputer」（1989）CABIOS、5：151-153に記載されているDNAstar（1998）クラスタル・アルゴリズムであるMegAlign（使用されるパラメータは、ktuple 1、ギャップ・ペナルティ（gap penalty）3、ウィンドウ（window）5、および保存対角（diagonals saved）5である）を使用して決定されるように、本発明のタンパク質と少なくとも約10％、通常は少なくとも約20％、より通常には少なくとも約30％、そして多くの態様においては少なくとも約35％、通常には少なくとも約40％、より通常には少なくとも約60％の、アミノ酸配列同一性を有するタンパク質を意味する。多くの態様において、関心対象の相同体は、はるかに高い配列同一性、例えば65％、70％、75％、80％、85％、90％、またはそれ以上を有する。
【００８０】
野生型タンパク質と実質的に同一のタンパク質も提供される（実質的に同一とは、タンパク質が、野生型タンパク質の配列と少なくとも約60％、通常は少なくとも約65％、より通常には少なくとも約70％のアミノ酸配列同一性を有することを意味し、いくつかの例において、同一性ははるかに高く、例えば75％、80％、85％、90％、95％、またはそれ以上であり得る）。
【００８１】
多くの態様において、本発明の相同体は、β-can折り畳みを含む、前記で提供される特定の配列に見出される構造的特質を有している。
【００８２】
上記に記載された天然に存在するタンパク質の変異体であるタンパク質も提供される。変異体は、野生型の（例えば、天然に存在する）タンパク質の生物学的特性を保持するか、または野生型のタンパク質と異なる生物学的特性を有してもよい。本発明のタンパク質の「生物学的特性」という用語には、吸光極大、放射極大、極大吸光係数、輝度（例えば、野生型タンパク質またはA.ビクトリア（victoria）由来の緑色蛍光性タンパク質のような別の参照タンパク質と比較したもの）等のようなスペクトル特性；インビボおよび／またはインビトロの安定性（例えば、半減期）等が含まれるが、これらに制限はされない。変異体は、単一のアミノ酸変化、1個または複数のアミノ酸の欠失、N末端短縮、C末端短縮、挿入等を含む。
【００８３】
変異体は、分子生物学の標準的な技術、例えば無作為突然変異誘発および標的突然変異誘発を使用して生成され得る。いくつかの変異体は、本明細書に記載されている。実施例に案内が提供されることを考慮すると、標準的な技術を使用して、当業者は極めて多様な追加の変異体を容易に製造し、生物学的特性が改変されているか否かを試験することができる。例えば、蛍光強度は、様々な励起波長で分光測光器を使用して測定され得る。
【００８４】
天然に存在するタンパク質であるこれらの本発明のタンパク質は、天然には存在しない環境に存在し、例えばその天然に存在する環境から分離されている。ある種の態様において、本発明のタンパク質は、その天然に存在する環境と比較して本発明のタンパク質が濃縮されている組成物の中に存在する。例えば、精製されたタンパク質が提供される（ここで、精製された、とは、タンパク質が、目的の色素タンパク質／蛍光タンパク質以外のタンパク質を実質的に含まない組成物の中に存在することを意味する（ここで、実質的に含まない、とは、組成物の90％未満、一般的には60％未満、より一般的には50％未満が、目的の色素タンパク質またはその変異体以外のものからなることを意味する））。本発明のタンパク質は、単離物（これは、タンパク質が、他のタンパク質およびオリゴ糖、ポリヌクレオチド、およびそれらの断片等のような他の天然に存在する生物学的分子を実質的に含まないことを意味する）として存在してもよい（この例において、「実質的に含まない」という用語は、単離されたタンパク質を含有している組成物の70％未満、一般的には60％未満、より一般的には50％未満が、他の何らかの天然に存在する生物学的分子であることを意味する）。ある種の態様において、タンパク質は、実質的に純粋な形態で存在する（ここで、「実質的に純粋な形態」とは、少なくとも95％、一般的には少なくとも97％、より一般的には少なくとも99％純粋であることを意味する）。
【００８５】
天然に存在するタンパク質に加え、天然に存在するタンパク質から変異したポリペプチド、例えば前記の変異タンパク質も提供される。一般に、そのようなポリペプチドには、全長タンパク質およびその断片、特に生物学的活性を有する断片および／または機能性ドメインに相当する断片等を含み、本発明のポリペプチドの他のタンパク質またはその一部との融合体を含む、本発明の野生型タンパク質をコードする遺伝子のオープン・リーディング・フレーム（ORF）によりコードされたアミノ酸配列が含まれる。関心対象の断片は、典型的には、少なくとも10aa長、一般的には少なくとも約50aa長であり、300aa長またはそれ以上であってもよいが、一般的には約1000aa長を超えず、また、少なくとも約10aa長、一般的には少なくとも約15aa長、多くの態様においては少なくとも約50aa長の本発明のタンパク質と同一のアミノ酸のストレッチを有すると考えられる。いくつかの態様において、本発明のポリペプチドは、約25aa長、約50aa長、約75aa長、約100aa長、約125aa長、約150aa長、約200aa長、約210aa長、約220aa長、約230aa長、または約240aa長であり、最大で完全タンパク質である。いくつかの態様において、タンパク質断片は、野生型タンパク質の生物学的特性の全部または実質的に全部を保持している。
【００８６】
本発明のタンパク質およびポリペプチドは、天然に存在する起源から入手されてもよいし、または合成的に作製されてもよい。例えば、野生型タンパク質は、そのタンパク質を発現している生物学的種、例えば既に列挙された特定のもののような非生物発光性の刺胞動物種、例えば花虫綱種に由来し得る。本発明のタンパク質は、前記のように、適当な宿主において、目的のタンパク質をコードする組換え遺伝子または核酸コーディング配列を発現させることにより、合成的に導出されてもよい。任意の便利なタンパク質精製手法が使用され得るが、適当なタンパク質精製方法論は、Guide to Protein Purification（Deuthser編）（Academic Press, 1990）に記載されている。例えば、最初の起源から溶解物を調製し、HPLC、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティ・クロマトグラフィー等を使用して精製することができる。
【００８７】
抗体組成物
本発明の蛍光性タンパク質と特異的に結合する抗体も提供される。適当な抗体は、本発明のタンパク質の全部または一部を含むペプチドで宿主動物を免疫感作することにより得られる。適当な宿主動物には、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ハムスター、ウサギ等が含まれる。タンパク質免疫原の起源は、一般には、刺胞動物種、特に非生物発光性の花虫綱種のような刺胞動物種、またはウミエラ目以外の花虫綱種であろう。宿主動物は、一般には、免疫原とは異なる種、例えばマウス等であろう。
【００８８】
免疫原には、完全タンパク質、またはその断片および誘導体が含まれ得る。好ましい免疫原には、タンパク質の全部または一部（これらの残基は、天然型標的タンパク質に見出される翻訳後修飾を含有している）が含まれる。免疫原は、当技術分野において既知の多様な手段、例えば、従来の組み換え法を使用したクローニングされた遺伝子の発現、起源の花虫綱種からの単離等により作製される。
【００８９】
ポリクローナル抗体の調製のための第一段階は、約1％未満の汚染物質を含む、好ましくは実質的に純粋な形態で存在すると考えられる標的タンパク質による、宿主動物の免疫化である。免疫原には、完全な標的タンパク質、その断片または誘導体が含まれ得る。宿主動物の免疫応答を増加させるため、標的タンパク質は、アジュバントと組み合わせられてもよく、適当なアジュバントには、ミョウバン、デキストラン、硫酸塩、高分子重合体陰イオン、油水乳剤、例えばフロイントのアジュバント、フロイントの完全アジュバント等が含まれる。標的タンパク質は、合成担体タンパク質または合成抗原に抱合させられてもよい。多様な宿主が、ポリクローナル抗体を作製するために免疫化され得る。そのような宿主には、ウサギ、モルモット、げっ歯動物、例えばマウス、ラット、ヒツジ、ヤギ等が含まれる。標的タンパク質は、通常は皮内に初回用量を投与された後、1回または複数回、通常は少なくとも2回の付加的な追加用量を投与される。免疫化の後、宿主から血液が収集され、続いて血球から血清の分離が行われる。得られた抗血清の中に存在するIgは、アンモニウム塩分画、DEAEクロマトグラフィー等のような既知の方法を使用してさらに分画され得る。
【００９０】
モノクローナル抗体は、従来の技術によって作製される。一般に、免疫化された宿主動物の脾臓および／またはリンパ節が、プラズマ細胞の起源を提供する。プラズマ細胞は、ハイブリドーマ細胞を作製するため、骨髄腫細胞との融合によって不死化される。産生される抗体が所望の特異性を有することを確認するため、個々のハイブリドーマに由来する培養上清が、標準的な技術を使用してスクリーニングされる。ヒト・タンパク質に対するモノクローナル抗体の作製に適した動物には、マウス、ラット、ハムスター等が含まれる。マウス・タンパク質に対する抗体を生成させるための動物には、一般に、ハムスター、モルモット、ウサギ等が考えられる。抗体は、従来の技術、例えば不溶性支持体、プロテインAセファロース等と結合したタンパク質を使用したアフィニティ・クロマトグラフィーによって、ハイブリドーマ細胞上清または腹水より精製され得る。
【００９１】
抗体は、通常の多量体構造ではなく、単鎖として作製されてもよい。単鎖抗体は、Jostら（1994）J.B.C.269：26267-73、およびその他に記載されている。重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域をコードするDNA配列が、グリシンおよび／またはセリンを含む、小さな中性アミノ酸を少なくとも約4アミノ酸コードするスペーサーへ連結される。この融合体によってコードされるタンパク質は、元の抗体の特異性および親和性を保持する機能性可変領域の組み立てを可能にする。
【００９２】
ある種の態様において、ヒト化抗体も関心対象である。抗体をヒト化する方法は、当技術分野において既知である。ヒト化抗体は、遺伝子導入したヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子を有する動物の産物であり得る（例えば、国際特許出願、国際公開公報第90/10077号および第90/04036号を参照のこと）。または、関心対象の抗体を組替えDNA技術によって設計して、CH1、CH2、CH3、ヒンジ・ドメイン、および／またはフレームワーク・ドメインを、対応するヒトの配列に置換してもよい（国際公開公報第92/02190号を参照のこと）。
【００９３】
キメラ免疫グロブリン遺伝子の構築のためのIg cDNAの使用は、当技術分野において既知である（Liuら（1987）P.N.A.S.84：3439および（1987）J.Immunol.139：3521）。mRNAが、抗体を産生するハイブリドーマまたはその他の細胞から単離され、cDNAを作製するために使用される。関心対象のcDNAは、特異的プライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応によって増幅され得る（米国特許第4,683,195号および第4,683,202号）。または、ライブラリーが作成され、関心対象の配列を単離するためにスクリーニングされる。抗体の可変領域をコードするDNA配列は、次いで、ヒト定常領域配列と融合させられる。ヒト定常領域遺伝子の配列は、Kabatら（1991）Sequences of Proteins of Immunological Interest、N.I.H.刊行物第91-3242号に見出すことができる。ヒトC領域遺伝子は、既知のクローンより容易に入手可能である。アイソタイプの選択は、補体結合、または抗体依存性細胞毒性における活性のような所望のエフェクター機能によって導かれると考えられる。好ましいアイソタイプは、IgG1、IgG3、およびIgG4である。ヒト軽鎖定常領域であるκまたはλのいずれかが使用され得る。次いで、キメラ・ヒト化抗体が、従来の方法によって発現させられる。
【００９４】
Fv、F(ab')2、およびFabのような抗体断片は、完全なタンパク質の切断によって、例えばプロテアーゼまたは化学的切断によって調製され得る。または、切断型遺伝子が設計される。例えば、F(ab')2断片の一部をコードするキメラ遺伝子は、H鎖のCH1ドメインおよびヒンジ・ドメインをコードするDNA配列の後に、切断型分子を生じるための翻訳終止コドンを含むと考えられる。
【００９５】
後に続くV領域セグメントのヒトC領域セグメントへの連結のために、有用な制限部位をJ領域へ導入するためのプライマーとして使用するためのオリゴヌクレオチドを設計するために、HおよびLのJ領域のコンセンサス配列が使用され得る。C領域cDNAは、ヒト配列内の類似の位置に制限部位を置くための、部位特異的突然変異誘発により改変され得る。
【００９６】
発現ベクターには、プラスミド、レトロウイルス、YAC、EBV由来エピソーム等が含まれる。便利なベクターは、任意のVHまたはVL配列が容易に挿入され、かつ発現させられるよう設計された適切な制限部位を有する、機能的に完全なヒトCHまたはCL免疫グロブリン配列をコードするものである。そのようなベクターにおいては、スプライシングが、通常は、挿入されたJ領域内のスプライス供与部位と、ヒトC領域の前に位置するスプライス受容部位との間に起こり、そしてヒトCHエクソン内に存在するスプライス領域においても起こる。ポリアデニル化および転写終結は、コード領域の下流の在来の染色体部位において起こる。得られたキメラ抗体は、レトロウイルスLTR、例えばSV-40初期プロモーター（Okayamaら（1983） Mol.Cell.Bio.3：280）、ラウス肉腫ウィルスLTR（Gormanら（1982）P.N.A.S.79：6777）、およびモロニーマウス白血病ウィルスLTR（Grosschedlら（1985） Cell 41：885）；在来のIgプロモーター等を含む、任意の強力なプロモーターに接続され得る。
【００９７】
トランスジェニック
本発明の核酸は、トランスジェニック非ヒト植物もしくは動物、または細胞株における部位特異的遺伝子改変を生じるために使用され得る。本発明のトランスジェニック細胞は、導入遺伝子として存在する本発明による核酸を1個または複数含んでいる（この定義には、導入遺伝子を含むよう形質転換された親細胞およびそれらの子孫が含まれる）。多くの態様において、トランスジェニック細胞は、本発明に係る核酸を通常は保有または含有していない細胞である。トランスジェニック細胞が本発明の核酸を天然に含有している態様においては、その核酸は、細胞内の天然の位置ではない位置に存在すると考えられ、即ち細胞のゲノム物質内に非天然の位置で組み込まれているであろう。内因性遺伝子座を改変したトランスジェニック動物は、相同的組み換えを介して作製され得る。または、核酸構築物は、ゲノム内へ無作為に組み込まれる。安定的な組み込みのためのベクターには、プラスミド、レトロウイルスおよびその他の動物ウイルス、YAC等が含まれる。
【００９８】
本発明のトランスジェニック生物には、内因性遺伝子の発現が、排除されない場合には少なくとも減少している、内因性ノックアウトである細胞および多細胞生物、例えば植物および動物が含まれる。関心対象のトランスジェニック生物には、タンパク質またはそのバリアントが、それが通常発現しない細胞または組織において発現しており、かつ／またはそのような細胞または組織において通常は存在しないレベルで発現している、細胞および多細胞生物、例えば植物および動物も含まれる。
【００９９】
相同的組替えのためのDNA構築物は、所望の（1個以上の）遺伝学的改変を有しており、標的遺伝子座と相同な領域を含む、本発明の遺伝子の少なくとも一部を含むと考えられる。無作為組み込みのためのDNA構築物には、組み換えを媒介するための相同領域が含まれている必要はない。都合のよいことには、ポジティブ選択およびネガティブ選択のためのマーカーが含まれる。相同的組替えを介して標的遺伝子を改変した細胞を産生するための方法は、当技術分野において既知である。哺乳動物細胞をトランスフェクトするための様々な技術については、Keownら（1990）、Meth.Enzymol.185：527-537を参照のこと。
【０１００】
胚性幹（ES）細胞については、ES細胞株が使用されてもよいし、または胚細胞が、例えばマウス、ラット、モルモット等の宿主から新鮮に得られてもよい。そのような細胞は、適切な繊維芽細胞フィーダー層の上で増殖させられるか、または白血病阻止因子（LIF）の存在下で増殖させられる。ESまたは胚細胞が形質転換された場合、それらはトランスジェニック動物を作製するために使用され得る。形質転換の後、細胞は、適切な培地中でフィーダー層上に播かれる。構築物を含有している細胞は、選択培地を利用することにより検出され得る。コロニーが増殖するのに十分な時間の後、それらは選び取られ、構築物の相同的組み換えまたは組み込みの発生に関して分析される。次いで、陽性であるコロニーが、胚操作および胚盤胞注入のために使用され得る。胚盤胞は、4〜6週齢の過排卵雌より得られる。ES細胞がトリプシン処理され、改変した細胞が胚盤胞の胞胚腔へと注入される。注入の後、胚盤胞が偽妊娠雌の各子宮角に戻される。次いで、雌を満期に到達させ、得られた子孫を構築物に関してスクリーニングする。発現型の異なる胚盤胞および遺伝学的に改変した細胞を提供することにより、キメラ子孫は容易に検出され得る。
【０１０１】
キメラ動物は、改変遺伝子の存在に関してスクリーニングされ、改変を有している雄および雌がホモ接合性子孫を作製するために交配される。遺伝子改変が、発達中のある時点で致死を引き起こす場合には、組織または器官が、同種異系もしくは類遺伝子性の移植片もしくは移植物として、またはインビトロ培養物中に維持され得る。トランスジェニック動物は、実験動物、家畜等の任意の非ヒト哺乳類であり得る。トランスジェニック動物は、機能研究、薬物スクリーニング等において使用され得る。トランスジェニック動物の使用の代表的な例には、下記のものが含まれる。
【０１０２】
トランスジェニック植物は、類似の様式で作製され得る。トランスジェニック植物細胞およびトランスジェニック植物体を調製する方法は、米国特許第5,767,367号；第5,750,870号；第5,739,409号；第5,689,049号；第5,689,045号；第5,674,731号；第5,656,466号；第5,633,155号；第5,629,470号；第5,595,896号；第5,576,198号；第5,538,879号；第5,484,956号（これらの開示は本明細書に参照として組み込まれる）に記載されている。トランスジェニック植物体を作製する方法は、Plant Biochemistry and Molecular Biology（LeaおよびLeegood編、John Wiley＆Sons）（1993）pp.275-295にも概説されている。簡潔には、植物種の性質に依って適当な植物細胞または組織が収穫される。そのため、ある種の例においては、プロトプラストが単離されると考えられ、そのようなプロトプラストは多様な異なる植物組織、例えば葉、胚軸、根等より単離され得る。プロトプラスト単離のためには、収穫された細胞が、細胞壁を除去するためセルラーゼの存在下でインキュベートされる（ここで、正確なインキュベーション条件は、細胞の由来した植物および／または組織の型に依って変動する）。次いで、ふるい分けおよび遠心分離により、得られた細胞砕片から、得られたプロトプラストが分離される。プロトプラストを使用する代わりに、体細胞を含む胚形成外植片が、トランスジェニック宿主の調製のために使用されてもよい。細胞または組織の収穫の後、関心対象の外因性DNAが、植物細胞へ導入され、そのような導入には、多様な異なる技術が利用可能である。単離されたプロトプラストを得ることにより、多価陽イオン、例えばPEGまたはPLO存在下における、関心対象の外因性コード配列を含む、裸のDNA、例えばプラスミドとのプロトプラストのインキュベーション；および関心対象の外因性配列を含む裸のDNAの存在下での、プロトプラストの電気穿孔を含む、DNA媒介性の遺伝子移入プロトコルを介した導入の機会が生じる。次いで、外因性DNAの取り込みに成功したプロトプラストを選択し、カルスへ成長させ、適切な量および比率の刺激因子、例えばオーキシンおよびサイトカイニンとの接触を通じて、最終的にはトランスジェニック植物体へと成長させる。胚形成外植片を用いる場合、標的体細胞に外因性DNAを導入する便利な方法は、粒子加速プロトコルまたは「遺伝子銃」プロトコルの使用を介したものである。次いで、得られた外植片を、キメラ植物体へと成長させ、交雑させ、トランスジェニック子孫を得る。前記の裸のDNAアプローチの代わりに、トランスジェニック植物を作製するもう一つの便利な方法は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）により媒介される形質転換である。アグロバクテリウムにより媒介される形質転換では、外因性DNAを含む共組み込み（co-integrative）またはバイナリー・ベクターを調製し、次いで、適切なアグロバクテリウム株、例えばA.ツメファシエンス（A.tumefaciens）へと導入する。次いで、得られた細菌を、調製したプロトプラストまたは組織外植片、例えばリーフディスクと共にインキュベートし、カルスを作製する。次いで、カルスを選択条件下で成長させ、選択し、根および苗条の成長を誘導するための成長培地に供し、最終的にはトランスジェニック植物体を作製する。
【０１０３】
有用性
本発明の非凝集性色素タンパク質およびその蛍光性変異体は、多様な異なる適用において有益であるが、適用は、タンパク質が色素タンパク質であるかまたは蛍光性タンパク質であるかに依って必然的に異なる。これらの各タンパク質型の代表的な用途を以下に記載するが、以下に記載された用途は、単なる代表的なものであり、本発明のタンパク質の使用を下記のものに制限するものでは決してない。
【０１０４】
色素タンパク質
本発明の色素タンパク質は、多様な異なる適用において有益である。一つの関心対象の適用は、問題としている特定の組成物に色または色素を付与することができる着色料としての本発明のタンパク質の使用である。ある種の態様において特に関心対象であるのは、無毒の色素タンパク質である。本発明の色素タンパク質は、問題とする多様な異なる組成物に取り込まれ得る（問題とする組成物の代表には、食物組成物、医薬品、化粧品、生物、例えば動物および植物等が含まれる）。着色料または色素として使用される場合、所望の色または色素を付与するために十分な量の色素タンパク質が、問題とする組成物に取り込まれる。色素タンパク質は、任意の便利なプロトコルを使用して、問題とする組成物に取り込まれてもよく、利用される特定のプロトコルは、少なくとも部分的には、着色すべき問題とする組成物の性質に必然的に依存すると考えられる。利用され得るプロトコルには、混和、拡散、摩擦、噴霧、注入、および入れ墨等が含まれるが、これらに制限はされない。
【０１０５】
色素タンパク質は、分析物検出アッセイ法、例えば関心対象の生物学的分析物に関するアッセイ法における標識としても有益であり得る。例えば、色素タンパク質は、分析物に特異的な抗体またはその結合性断片を含む付加体に取り込まれ、その後、米国特許第4,302,536号（この開示は参照として本明細書に組み込まれる）に記載されるように、複合試料中の関心対象の分析物に関する免疫アッセイ法において利用され得る。抗体またはその結合性断片の代わりに、本発明の色素タンパク質またはその色素生産性断片は、当業者には容易に明らかであるように、関心対象の分析物と特異的に結合するリガンド、またはその他の成分（moiety）、増殖因子、ホルモン等と抱合されてもよい。
【０１０６】
さらなる他の態様において、本発明の色素タンパク質は、組替えDNA適用、例えば前記のようなトランスジェニック細胞およびトランスジェニック生物の作製において、選択可能マーカーとして使用され得る。そのため、成功プロトコルまたは非成功プロトコルのいずれかのために、選択可能マーカーとして本発明の色素タンパク質の発現を利用するため、特定のトランスジェニック作製プロトコルを設計することが可能である。従って、特定のプロセスによって作製されたトランスジェニック生物の発現型における、本発明の色素タンパク質の色の出現は、特定の生物が、多くの場合、生物における導入遺伝子の発現を提供する様式で組み込まれる、関心対象の導入遺伝子の保有に成功したことを示すために使用され得る。選択可能マーカーとして使用される場合、本発明の色素タンパク質をコードする核酸は、より詳細に上記で記載されたトランスジェニック産生プロセスにおいて利用され得る。本発明のタンパク質が選択可能マーカーとして利用され得る特定の関心対象のトランスジェニック生物には、トランスジェニック植物、トランスジェニック動物、トランスジェニック細菌、トランスジェニック真菌等が含まれる。
【０１０７】
さらなる他の態様において、本発明の色素タンパク質（および蛍光性タンパク質）は、国際公開公報第00/46233号に記載されたタンパク質の用途と類似の様式で、日焼け止め、選択的フィルター等として有益である。
【０１０８】
蛍光性タンパク質
本発明の蛍光性タンパク質（および前記の本発明のその他の構成要素）は、以下のものを含むがこれらに制限はされない、多様な異なる適用において有益である。第一の関心対象の適用は、蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）の適用における本発明のタンパク質の使用である。これらの適用において、本発明のタンパク質は、第二の蛍光性タンパク質または染料、例えばMatzら、Nature Biotechnology（1999年10月）17：969-973に記載されたような蛍光性タンパク質、例えば米国特許第6,066,476号；第6,020,192号；第5,985,577号；第5,976,796号；第5,968,750号；第5,968,738号；第5,958,713号；第5,919,445号；第5,874,304号（これらの開示は参照として本明細書に組み込まれる）に記載されたようなエクオリア・ビクトリア（Aequoria victoria）由来の緑色蛍光性タンパク質またはその蛍光性変異体、その他の蛍光染料、例えばクマリンおよびその誘導体、例えば7-アミノ-4-メチルクマリン、アミノクマリン、ボディピー（Bodipy）FLのようなボディピー（bodipy）染料、カスケードブルー（cascade blue）、フルオレセインおよびその誘導体、例えばフルオレセイン・イソチオシアネート、およびオレゴングリーン（Oregon green）、ローダミン染料、例えばテキサスレッド、テトラメチルローダミン、エオシン、およびエリスロシン、シアニン染料、例えばCy3およびCy5、ランタニド・イオンの大環状キレート、例えば量子染料（quantum dye）等、化学発光染料、例えば米国特許第5,843,746号；第5,700,673号；第5,674,713号；第5,618,722号；第5,418,155号；第5,330,906号；第5,229,285号；第5,221,623号；第5,182,202号（これらの開示は本明細書に参照として組み込まれる）に記載されたものを含むルシフェラーゼと組み合わされて、供与体および／または受容体として機能する。本発明の蛍光性タンパク質を利用したFRETアッセイ法が使用され得る特定の例には、多数の異なる事象のバイオセンサーとしての、タンパク質−タンパク質相互作用、例えば哺乳動物ツー・ハイブリッド系、転写因子の二量体化、膜タンパク質の多量体化、多重タンパク質の複合体形成等の検出（この場合、ペプチドまたはタンパク質が、本発明の蛍光性タンパク質を含むFRET蛍光組合せと共有結合的に連結され、連結されるペプチドまたはタンパク質は、例えばカスパーゼ媒介切断などのためのプロテアーゼ特異的基質であるか、FRETを増加または減少させるシグナル、例えばPKA制御ドメイン（cAMPセンサー）、リン酸化（例えば、リンカー内にリン酸化部位が存在するか、またはリンカーが別のタンパク質のリン酸化／脱リン酸化ドメインとの結合特異性を有するか、またはリンカーがCa2+結合ドメインを有する場合）の受容によりコンフォメーション変化を起こすリンカーである）が含まれるが、これらに制限はされない。本発明のタンパク質が有益である代表的な蛍光共鳴エネルギー転移またはFRETの適用には、米国特許第6,008,373号；第5,998,146号；第5,981,200号；第5,945,526号；第5,945,283号；第5,911,952号；第5,869,255号；第5,866,336号；第5,863,727号；第5,728,528号；第5,707,804号；第5,688,648号；第5,439,797号（これらの開示は本明細書に参照として組み込まれる）に記載されたものが含まれるが、これらに制限はされない。
【０１０９】
本発明の蛍光性タンパク質は、原核細胞および真核細胞におけるバイオセンサーとして、例えばCa2+イオン指示薬として；pH指示薬として、リン酸化指示薬として、その他のイオン、例えばマグネシウム・イオン、ナトリウム・イオン、カリウム・イオン、塩素イオン、およびハロゲン・イオンの指示薬としても有益である。例えば、Caイオンの検出に関して、EF-ハンド・モチーフを含有しているタンパク質は、Ca2+との結合により、細胞質ゾルから膜へと移動することが既知である。これらのタンパク質は、タンパク質の他の領域との疎水性相互作用によって分子内に埋め込まれているミリストイル基を含有している。Ca2+の結合は、ミリストイル基を露出させるコンフォメーション変化を誘導し、次いでミリストイル基が脂質二重層への挿入に利用可能となる（「Ca2+-ミリストイル・スイッチ」と呼ばれる）。そのようなEF-ハンド含有タンパク質のフルオレセント・プロテイン（FP）との融合体は、共焦点顕微鏡検によって細胞質ゾルから原形質膜への移動をモニタリングすることにより、細胞内 Ca2+の指示薬となり得る。この系において使用するのに適したEF-ハンド・タンパク質には、リカバリン（recoverin）（1-3）、カルシニューリンB、トロポニンC、ビシニン（visinin）、ニューロカルシン（neurocalcin）、カルモジュリン、パルブアルブミン等が含まれるが、これらに制限はされない。pHについては、ヒサクトフィリン（hisactophilins）に基づく系が使用され得る。ヒサクトフィリンは、ジクチオステリウム（Dictyostelium）に存在することが既知である、ミリストイル化されたヒスチジンリッチなタンパク質である。それらのアクチンおよび酸性脂質との結合は、細胞質pH変動の範囲内で鮮明にpH依存的である。生細胞において、膜結合は、ヒサクトフィリンとアクチン・フィラメントとの相互作用より優先されるようである。pH≦6.5においては、それらは、原形質膜および核へと移行する。対照的に、pH7.5においては、それらは、細胞質空間全体に均一に分布する。この分布の変化は可逆的であり、分子表面上のループ内に露出したヒスチジン・クラスターに起因する。細胞質pH変動の範囲内での細胞内分布の復帰は、ヒスチジン残基の6.5というpKと合致する。細胞分布は、タンパク質のミリストイル化には依存しない。FP（フルオレセント・プロテイン）をヒサクトフィリンと融合させることによって、融合タンパク質の細胞内分布は、レーザー走査型共焦点顕微鏡検、または標準的な蛍光顕微鏡検によって追跡され得る。定量的蛍光分析は、細胞のライン・スキャン（line scans）（レーザー走査型共焦点顕微鏡検）またはその他の電子データ分析（例えば、メタモルフ（metamorph）ソフトウェア（Universal Imaging社）を使用）を実行し、細胞集団において収集されたデータの平均をとることにより実施され得る。細胞質ゾルから原形質膜へのヒサクトフィリン-FPの実質的なpH依存性の再分布は、1分〜2分以内に起こり、5分〜10分後には定常状態レベルに達する。逆反応は同様のタイムスケールで起こる。そのため、類似の様式で働くヒサクトフィリン-蛍光性タンパク質融合タンパク質は、哺乳動物生細胞におけるリアルタイムの細胞質ゾルpH変化をモニタリングするために使用され得る。そのような方法は、高処理量の（high throughput）適用、例えば���殖因子受容体活性化（例えば、上皮増殖因子または血小板由来増殖因子）、走化刺激／細胞運動の結果としてのpH変化の測定において、セカンドメッセンジャーとしての細胞内pH変化の検出において、pH操作実験における細胞内pHのモニタリング等において有益である。PKC活性の検出のため、レポーター系は、MARCKS（ミリストイル化アラニンリッチCキナーゼ基質）と呼ばれる分子がPKC基質であるという事実を活用する。それは、ミリストイル化、および負の電荷を有する原形質膜と静電相互作用によって結合する、正の電荷を有するアミノ酸の領域（ED-ドメイン）によって原形質膜につながれている。PKC活性化により、PKCによってED-ドメインはリン酸化され、それにより負に荷電し、静電的反発の結果として、MARCKSが原形質膜から細胞質へと移動する（「ミリストイル-静電スイッチ」と呼ばれる）。MARCKSのミリストイル化モチーフからED-ドメインまでの範囲にわたるMARCKSのN末端の、本発明の蛍光性タンパク質との融合体は、PKC活性の検出系となる。PKCによってリン酸化されると、融合タンパク質は、原形質膜から細胞質ゾルへと移動する。この移動は、標準的な蛍光顕微鏡検または共焦点顕微鏡検によって、例えばセロミクス（Cellomics）技術、またはその他のハイ・コンテンツ・スクリーニング系（High Content Screening systems）（例えば、Universal Imaging社/Becton Dickinson）を使用して追跡される。上記のレポーター系は、ハイ・コンテンツ・スクリーニングにおける適用、例えばPKC阻害剤のスクリーニングにおける適用、およびこのシグナル伝達経路を妨害する可能性のある試薬に関する多くのスクリーニング・シナリオにおける、PKC活性の指示薬としての適用を有している。蛍光性タンパク質をバイオセンサーとして使用する方法には、米国特許第972,638号；第5,824,485号、および第5,650,135号（ならびに、これらの中に引用された参照）に記載されたものも含まれ、これらの開示は参照として本明細書に組み込まれる。
【０１１０】
本発明の蛍光性タンパク質は、顕微鏡による画像化、および電子分析を使用することによる、蛍光性レポート基を発現している細胞のアレイの、自動化スクリーニングを含む適用においても有益である。スクリーニングは、薬物発見のため、そして機能ゲノム科学の分野において使用され得る：例えば、本発明のタンパク質は、多細胞の再編成および遊走における変化、例えば内皮細胞による多細胞細管の形成（血管形成）、フルオロブロック・インサート・システム（Fluoroblok Insert System）（Becton Dickinson社）を介した細胞の遊走、創傷治癒、神経突起伸長等を検出するため、全細胞のマーカーとして使用され得る（この場合、タンパク質は、細胞活性、刺激によるキナーゼおよび転写因子の移動（プロテインキナーゼC、プロテインキナーゼA、転写因子NFkB、およびNFATなど）；サイクリンA、サイクリンB1、およびサイクリンEなどの細胞周期タンパク質、切断された基質のその後の運動を伴うプロテアーゼ切断、リン脂質などのシグナル伝達の指標としての細胞内位置の変化の、小胞体、ゴルジ装置、ミトコンドリア、ペルオキシソーム、核、核小体、原形質膜、ヒストン、エンドソーム、リソソーム、微小管、アクチンなどの細胞内構造のマーカーをハイ・コンテンツ・スクリーニングのための道具として用いる（他の蛍光性融合タンパク質と、これらの局在マーカーとの共局在を、細胞内蛍光性融合タンパク質の運動の指標として用いる、またはマーカー単独として用いる）検出等を可能にするペプチド（例えば、ターゲティング配列）およびタンパク質と融合されたマーカーとして使用される）。本発明の蛍光性タンパク質が有益である細胞アレイの自動化スクリーニングを含む適用の例には、米国特許第5,989,835号；ならびに国際公開公報第0017624号；第00/26408号；第00/17643号；および第00/03246号（これらの開示は本明細書に参照として組み込まれる）が含まれる。
【０１１１】
本発明の蛍光性タンパク質は、ハイ・スループット・スクリーニング・アッセイ法においても有益である。本発明の蛍光性タンパク質は、24時間を超える半減期を有する安定なタンパク質である。薬物発見のための転写レポーターとして使用され得る、より短い半減期を有する本発明の蛍光性タンパク質の不安定化型も提供される。例えば、本発明によるタンパク質は、より短い半減期を有するタンパク質に由来する推定タンパク質分解シグナル配列、例えばマウス・オルニチン・デカルボキシラーゼ遺伝子由来のPEST配列、マウス・サイクリンB1破壊ボックス、およびユビキチン等と融合させられ得る。不安定化タンパク質およびそれを作製するために利用され得るベクターの記載については、米国特許第6,130,313号（この開示は参照として本明細書に組み込まれる）を参照されたい。シグナル伝達経路、例えばAP1、NFAT、NFkB、Smad、STAT、p53、E2F、Rb、myc、CRE、ER、GR、およびTRE等のプロモーターは、薬物スクリーニングのための本発明の蛍光性タンパク質の不安定化型を使用して検出され得る。
【０１１２】
本発明のタンパク質は、例えば本発明のタンパク質を特定のドメイン、例えばPKCγCa結合ドメイン、PKCγDAG結合ドメイン、SH2ドメイン、およびSH3ドメイン等と融合させることによって、セカンドメッセンジャー検出剤として使用され得る。
【０１１３】
本発明のタンパク質の分泌型を、例えば分泌型先導配列を本発明のタンパク質と融合させ、本発明のタンパク質の分泌型を構築することによって、調製することができ、そして、多様な異なる適用において使用され得る。
【０１１４】
本発明のタンパク質は、蛍光標示式細胞分取適用においても有益である。そのような適用においては、本発明の蛍光性タンパク質が、細胞集団に印をつけるための標識として使用され、次いで、得られた標識細胞集団が、当技術分野において既知である、蛍光標示式細胞分取機により分取される。FACS法は、米国特許第5,968,738号および第5,804,387号（これらの開示は本明細書に参照として組み込まれる）に記載されている。
【０１１５】
本発明のタンパク質は、動物（例えば、トランスジェニック動物）におけるインビボのマーカーとしても有益である。例えば、本発明のタンパク質の発現を、組織特異的プロモーターによって駆動することができ、そのような方法は、遺伝子治療の研究において、例えば適用の中でも特に導入遺伝子発現の効率の試験において有益である。本発明のタンパク質のこのクラスの適用を例示する、トランスジェニック動物における蛍光性タンパク質の代表的な適用は、国際公開公報第00/02997号（この開示は参照として本明細書に組み込まれる）に見出される。
【０１１６】
本発明のタンパク質のさらなる適用には、細胞または動物への注入の後の、定量的測定（蛍光およびタンパク質）のための較正におけるマーカーとしての適用；細胞生存率をモニタリングするための酸素バイオセンサー機器における、マーカーまたはレポーターとしての適用；動物、ペット、玩具、食物等のためのマーカーまたは標識としての適用等が含まれる。
【０１１７】
本発明の蛍光性タンパク質は、プロテアーゼ切断アッセイ法においても有益である。例えば、切断不活化蛍光アッセイ法が、本発明のタンパク質を使用して開発され得る。この場合、本発明のタンパク質は、タンパク質の蛍光性を破壊することなく、プロテアーゼ特異的切断配列を含むよう改造される。活性化されたプロテアーゼにより蛍光性タンパク質が切断されると、機能性発色団の破壊により、蛍光は鮮明に減少するであろう。または、切断によって活性化された蛍光が、本発明のタンパク質を使用して現像され得る。この場合、本発明のタンパク質は、発色団の近傍／または内部に付加的なスペーサー配列を含有するよう設計される。機能性発色団の部分がスペーサーによって分割されるため、このバリアントの蛍光活性は有意に減少するであろう。スペーサーは、2個の同一のプロテアーゼ特異的切断部位によって構成されるであろう。活性化されたプロテアーゼによる分解によって、スペーサーが切り出され、蛍光性タンパク質の2個の残存「サブユニット」が、機能性の蛍光性タンパク質が生成するよう再び組み立てられ得る。多様な異なる型のプロテアーゼ、例えばカスパーゼ等に関するアッセイ法において、上記の型の適用の両方が開発され得る。
【０１１８】
本発明のタンパク質は、生体膜中のリン脂質組成を決定するためのアッセイ法においても、使用され得る。例えば、特定のリン脂質ラフト（raft）における膜タンパク質の共局在をも可能にする、生体膜内のリン脂質分布のパターンを特定／可視化するための、特定のリン脂質との結合を可能にする本発明のタンパク質の融合タンパク質（または本発明のタンパク質のその他の任意の種類の共有結合的修飾または非共有結合的修飾）が、本発明のタンパク質を用いて達成され得る。例えば、GRP1のPHドメインは、ホスファチジルイノシトール三リン酸（PIP3）に対する高い親和性を有しているが、PIP2に対する親和性は有していない。そのため、GRP1のPHドメインと本発明のタンパク質との間の融合タンパク質が、生体膜内のPIP3リッチな区域を特異的に標識するために構築され得る。
【０１１９】
さらにもう一つの本発明のタンパク質の適用は、蛍光性タンパク質の加齢に付随する、ある蛍光色のもう一つの色への（例えば、緑色から赤色への）スイッチが、遺伝子発現、例えば発達遺伝子発現、細胞周期依存性遺伝子発現、概日リズム特異的遺伝子発現等の活性化／不活化を決定するために使用される、蛍光タイマーとしての適用である。
【０１２０】
前記の本発明の抗体は、その他の蛍光性タンパク質からの本発明のタンパク質の区別を含む、多数の適用においても有益である。
【０１２１】
キット
典型的には、本発明のタンパク質を作成するための要素、例えば本発明のタンパク質のコーディング領域を含むベクターを含む構築物を含む、前記の適用のうちの一つ以上の実施において使用するためのキットも、本発明によって提供される。本発明のキット成分は、典型的には、適当な容器内に、適当な保存媒体、例えば緩衝溶液の中に存在する。本発明のキットには、提供されたタンパク質に対する抗体も存在し得る。ある種の態様において、キットは、各々が本発明のタンパク質をコードする複数の異なるベクター（この場合、ベクターは、異なる環境における、かつ／または異なる条件下での発現、例えば構成性発現のために設計されており、かつ哺乳動物細胞における発現のための強力なプロモーターを含む）、プロモーターのカスタム（custom）挿入およびテーラード（tailored）発現のためのマルチプル・クローニング・サイトを有するプロモーターレス・ベクター等を含む。
【０１２２】
上記の成分に加え、本発明のキットは、本発明の方法を実施するための説明をさらに含むであろう。これらの説明は、多様な形態で本発明のキット内に存在することができ、1個以上の形態がキット内に存在してもよい。これらの説明が存在し得る一つの形態は、キットの包装材の中、パッケージ・インサートの中等の適当な媒体または基体の上に印刷された情報（例えば情報が印刷された1枚以上の紙）としてである。さらにもう一つの手段は、情報が記録されたコンピューター読取可能媒体、例えばディスク、CD等であろう。さらにもう一つの存在し得る手段は、遠隔地において情報にアクセスするためにインターネットを介して使用され得る、ウェブサイト・アドレスである。任意の便利な手段が、キット内に存在し得る。 
【０１２３】
以下の実施例は、制限のためではなく、例示のために提示されるものである。
【０１２４】
実施例
Ｉ．序論
以下の実施例セクションにおいて、本発明者らは、11個の新たなGFP様タンパク質を提示する。
【０１２５】
II．材料および方法
A．試料の収集
モンタストレア・カベルノサ（Montastraea cavernosa）、コンジラクチス・ギガンテア（Condylactis gigantea）、スコルミア・キュベンシス（Scolumia cubensis）、およびリコルデア・フロリダ（Ricordea florida）の試料（100〜500mgの組織）は、国立海洋保護区（National Marine Sanctuary）の認可FKNMS-2000-009の下、フロリダ・キーズ海洋保護区（Florida Keys Marine Sanctuary）（ロング・キー（Long Key））において収集した。夜間潜水中に試料を収集し、紫外光線下での出現に基づき候補標本を選出した。その他の試料（デンドロネフチア（Dendronephthya）sp.、ヘテラクチス・クリスパ（Heteractis crispa）、ジスコソマ（Discosoma）sp.3、ゾアンツス（Zoanthus）sp.2）は、私有の海水アクアリウムから選出した。
【０１２６】
B．GFP様タンパク質のクローニングおよび発現
Chomczynski,P.およびSacchi,N.（1987）Anal Biochem 162,156-9に記載されたプロトコルに従い、組織試料から全RNAを単離した。SMART（商標）cDNA増幅キット（Clontech）を使用して全cDNAを増幅した。Matz,M.V.、Fradkov,A.F.、Labas,Y.A.、Savitsky,A.P.、Zaraisky,A.G.、Markelov,M.L.、およびLukyanov,S.A.（1999）Nat Biotechnol 17,969-73に記載されたのと全く同様にして、これらの増幅されたcDNA試料を、GFP様タンパク質をコードするcDNAの3'断片を増幅し、次いで欠けている5'隣接部を得るために使用した。完全cDNA配列を決定した後、3'および5'隣接部をクローニングするために使用されたのと同じcDNA試料を鋳型として使用して、コーディング領域を増幅した。上流（「N末端」）プライマーは、全てのフレームにおける終止コドン（太字）、および細菌リボソーム結合部位（下線）を保持している5'末端部
2005509420.tif 000002
を有し、その後に、ORFの開始コドンから開始する標的cDNA配列（20〜22塩基）を有していた。下流（「C末端」）プライマーは、22〜25塩基長であり、ORFの終止コドンの周辺のcDNAのアンチセンス配列に相当した。得られた断片を、pGEM-Tベクター・クローニング・キット（Promega）を製造業者のプロトコルに従い使用して、大腸菌JM109株を宿主として使用して、クローニングした。コロニーを、0.3mM IPTGを補足したLB／寒天／カルベニシリン・プレートで37℃で16〜20時間増殖させ、次いで4℃で2日間インキュベートした。蛍光顕微鏡を使用して蛍光性コロニーを選択し、新たなプレートに広範に播いた。同コロニーを一夜培養接種に使用した後、クローンの同一性を確認するためプラスミド単離および配列決定を行った。細菌をプレートから採集し、1mlのPBSに懸濁させ、超音波処理により破砕した。溶解物を遠心分離により浄化し、その蛍光特性をLS-50B分光蛍光光度計（Perkin Elmer Instruments）を使用して決定した。mcavRFPおよびrfloGFPについては、37℃で24時間の後、「初期」試料を採集し、37Cで24時間、それに続く4℃で4日間の後、「後期」試料を採集した。
【０１２７】
C．系統学的分析
GFP様タンパク質のアラインメント（添付のデータを参照のこと）を、タンパク質構造の制約を考慮しつつ、Matz,M.V.、Fradkov,A.F.、Labas,Y.A.、Savitsky,A.P.、Zaraisky,A.G.、Markelov,M.L.、およびLukyanov,S.A.（1999）Nat Biotechnol 17,969-73に従い構築した。次いで、整列が不充分であったN末端およびC末端の領域を除外して、タンパク質アラインメントに従いDNAアラインメントを作成した。部位の可変性が、データセットから推定されたαパラメータでのγ分布に従うと仮定して、DNA進化のHKYモデルの下で、ツリー・パズル（Tree-Puzzle）ソフトウェア（Strimmer,K.およびvon Haeseler,A.（1996）Mol.Biol.Evol.13,964-969）を使用して、系統樹を構築した。その樹は、REVモデル（Yang,Z.H.、Goldman,N.、およびFriday,A.（1994）Molecular Biology and Evolution 11,316-324）の下で、PAMLソフトウェア（Yang,Z.（2000）（University College（http://abacus.gene.ucl.ac.uk/software/paml.html）、London、England））により、最大尤度の樹であることが確認された。タンパク質アラインメント中の情報部位の数は比較的少なかったため、タンパク質アラインメントからツリー・パズルにより構築された樹（JTTモデル、（Jones,D.T.、Taylor,W.R.、およびThornton,J.M.（1992）CABIOS 8,275-282）は、トポロジーは同じであったが、比較的低い支持値（support values）を有していた。
【０１２８】
III．結果および考察
A．命名法
系統学的分析の表記の明確のため、本明細書においては、GFP様タンパク質の新たな命名法を使用している。タンパク質同定タグには、属名の最初の1文字および種名の最初の3文字からなる4文字の先頭部分、それに続く色型の同定（GFP−緑、RFP−赤、YFP−黄、CP−色素タンパク質（非蛍光性））が含まれる。種が定義されていない場合、先頭部分は属名の最初の4文字である。同一属の未同定の複数の種の場合、（dis3GFPまたはzoan2RFPのように）先頭部分に番号が付けられており；同一種に見出された同一色型の数個のタンパク質の場合、（scubGFP1およびscubGFP2のように）色定義に番号が付けられている。エクオレア・ビクトリア（Aequorea victoria）GFPおよびジスコソマ（Discosoma）sp.由来のdrFP583については、広く受け入れられている慣用名：GFPおよびDsRedが維持される。
【０１２９】
B．新たなGFP様タンパク質
全部で14個の新たなGFP様タンパク質がクローニングされ、分光光度的に特徴決定された。これらのタンパク質のうちの11個のスペクトル特性が、図中の表1および本出願のその他の図面に要約されている。
【０１３０】
この11個のサブセットには、花虫綱GFP様タンパク質においては従来見られなかった特性を示す代表が含まれる。コンジラクチス・ギガンテア（Condylactis gigantea）（cgigGFP）およびヘテラクチス・クリスパ（Heteractis crispa）（hcriGFP）に由来する2個の緑色タンパク質は、野生型GFPのものと極めて類似しているダブルピークの励起スペクトルを保有しており、このことは、それらの発色団が中性状態とイオン化状態との間で光変換（photoconversion）を経ることを示唆している（Brejc,K.、Sixma,T.K.、Kitts,P.A.、Kain,S.R.、Tsien,R.Y.、Ormo,M.、およびRemington,S.J.（1997）Proc Natl Acad Sci U S A 94,2306-11；Palm,G.J.、Zdanov,A.、Gaitanaris,G.A.、Stauber,R.、Pavlakis,G.N.、およびWlodawer,A（1997）Nat Struct Biol 4,361-5）。赤色放射タンパク質zoan2RFPは、励起／放射曲線の形状はDsRedと極めて類似しているが、「timer」様の挙動を示し、そのDsRedの変異バリアントのものと同様に、最初は緑色に変わり、次いで赤色へと成熟する（図1AおよびB）（Terskikh,A.、Fradkov,A.、Ermakova,G.、Zaraisky,A.、Tan,P.、Kajava,A.V.、Zhao,X.、Lukyanov,S.、Matz,M.、Kim,S.、Weissman,I.、およびSiebert,P.（2000）Science 290,1585-8）。グレート・スター・コーラル（great star coral）モンタストレア・カベルノサ（Montastraea Cavernosa）（mcavRFP）およびフロリダ・コーラリモルフ（florida corallimorph）リコルデア・フロリダ（Ricordea florida）（rfloRFP）に由来する2個の赤色放射体も、「timer」表現型を示す（図1C〜F）。zoan2RFPとは対照的に、それらは、我々の細菌発現試験において完全に赤色へと成熟することができず、図1（DおよびF）に示されるような2ピーク放射スペクトルをもたらした。注目すべきことに、これらのタンパク質の両方について、より成熟した型における赤色放射帯が、未熟緑色型のものと事実上同一の主要励起ピークを有し、黄色〜橙色励起ピークは有意に小さかった（図2）。これは、赤色放射が黄色〜橙色領域において最も良好に励起される残りの橙色〜赤色タンパク質（図4、表1、スペクトルE）と著しく異なっている。この励起スペクトルの独特の形状は、（緑色タンパク質との相似による）発色団のイオン化状態の光変換によるのかもしれないし、または発色団構造のより著明な差によるのかもしれない。後者のため、mcavRFPおよびrfloRFPの赤色放射ピークの形状は、他の橙色〜赤色タンパク質と顕著に異なっており：他の広い偏向した放射ピークとは対照的に、はるかに狭くほぼ対称であるという事実（表1、図4のスペクトルEおよびFを比較せよ）。一方、エクオレア・ビクトリア（Aequorea victoria）由来のGFPにおいて、光変換の存在または欠如は、放射スペクトルの形状に対してさほど効果を及ぼさない（Heim,R.、Cubitt,A.B.、およびTsien,R.Y.（1995）Nature 373,663-4）。成熟タンパク質および未熟タンパク質の主要励起ピークの顕著な類似性より、mcavRFPおよびrfloRFPにおいては、未熟緑色型タンパク質から成熟赤色型への「一体型（built-in）」の蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）が、赤色放射を生じさせる主要メカニズムであることが示唆される。
【０１３１】
C．GFP様タンパク質の構造／スペクトル型
本発明者らの見解では、GFP様タンパク質を分類するための最良の方式は、ヒトの眼に見える色によるものである。本発明者らは、GFP様タンパク質の4個の色型（緑、黄、橙−赤、および紫−青）または色素タンパク質を区別している（表1、図14）。それらは全て「β-can」と呼ばれる同じポリペプチド鎖の折り畳みを共有している（Ormo,M.、Cubitt,A.B.、Kallio,K.、Gross,L.A.、Tsien,R.Y.、およびRemington,S.J（1996）Science 273,1392-5.；Yang,F.、Moss,L.G.、およびPhilips,G.N.,Jr.（1996）Nat Biotechnol 14,1246-51）。しかしながら、発色団構造に関しては、これらの色型の間に実質的な差が存在する（表1参照）。GFP（緑色）において、発色団は、5員環を生成させるSer-65のカルボニル炭素とGly-67のアミノ窒素との間の縮合、それに続くTyr-66メチレン架橋の脱水素の結果として、残基65-67（Ser-Tyr-Gly）により形成されている。全ての緑色タンパク質が、同じ発色団を保有していると考えられ、スペクトルの形状の差は、その環境の修飾によって説明される。表1のパネルAのような励起／放射スペクトルを有する緑色タンパク質は、シアンと呼ばれたり、青色とさえ呼ばれる場合もあるが、ヒトの眼には、精製後のこれらのタンパク質の色は明るい緑色に見えることに注意しなければならない。赤色タンパク質DsRedにおいて、発色団合成には、発色団のπ共役系を延長するさらにもう一つの段階（最初の発色団形成残基のα炭素とアミノ窒素との間の結合の脱水素）が含まれる。一方、色素タンパク質代表asulCPにおいては、環化が、5員環ではなく6員環の形成をもたらし、延長された共役パイ系を作出する重大な工程が、発色団の直前のポリペプチド鎖の破壊である。注目すべきことに、他の色素タンパク質は、細菌発現産物の変性電気泳動により証明されるように、そのような鎖の破断を含有していない（データは示していない）。これは、asulCPの発色団構造が、この色型における常例ではなく例外であることを示している。黄色zoanYFPの生化学的研究および突然変異誘発研究は、このタンパク質が、さらにもう一つの発色団構造を有していることを示した。従って、GFP様タンパク質間の著明な色の差は、発色団構造の差を示している（従って、分類に色を使用することは合理的である）が、色素タンパク質の群、そしておそらくは橙色〜赤色群に見られるように、同一色のタンパク質に異なる発色団が見出される場合もあるとの結論を下さなければならない。
【０１３２】
D．色変換の分子的基礎
DsRedにおける発色団合成経路は、GFP経路の延長型であるため、DsRedにおける付加的な自己触媒段階を損なう変異は、それを緑色タンパク質へと変換するであろうことが容易に想像され得る。実際、緑色域において放射するDsRedの少なくとも7個の異なる変異バリアントが、ランダム突然変異誘発および部位特異的突然変異誘発において見出された。2個の新たな赤色タンパク質の赤色放射も、緑色放射発色団のさらなる修飾の結果として生じるため、類似の理由がそれらにも当てはまるはずである。
【０１３３】
単一アミノ酸置換が、色素タンパク質をDsRed様赤色蛍光性タンパク質へと変換し得ることが示されている。極めて相違した発色団を含有していることが直接証明されているアネモニア・スルカタ（Anemonia sulcata）由来のasulCPについては、それは特に予想外であり、その赤色蛍光変異バリアントが、実際に、最初の発色団の代わりにDsRed様発色団を合成するよう切り替わる可能性はやはり低いと考えられる。しかしながら、この変異バリアントにおけるランダム突然変異誘発は、緑色放射型の出現をもたらした。緑色放射中間段階は、最初のasulCP自己触媒経路には存在しないため、これらの変異体における緑色放射構造の形成は、緑色asulCP変異体の励起／放射スペクトルの形状から判断して、おそらくはGFP/DsRed型の発色団形成配列の方への実質的な偏位を表している。
【０１３４】
最後に、黄色タンパク質zoanYFPも、少なくとも2個の異なるアミノ酸置換により緑色放射状態へと変換され得る。
【０１３５】
これらのデータを考え合わせると、観察された系統学的パターンについての以下のような説明が妥当であると考えられる。異なる発色団構造は、最も相違しているものですら、異なる触媒機構の長期の進化の成果ではなく、基本的に類似した自己触媒環境の補助により合成された代替産物である。asulCP色素タンパク質に関する突然変異誘発結果により例証されたように、タンパク質内のわずか2〜3個のアミノ酸の変化が、代替経路間のスイッチのように作用するのかもしれない。
【０１３６】
この明細書中に引用された全ての刊行物および特許出願は、あたかも個々の出版物または特許出願が各々参照として組み込まれると特別に個々に示されたかのごとく、参照として本明細書に組み込まれる。任意の出版物の引用は、出願日より前の開示のためであり、本発明が、先行発明のためそのような刊行物に先行している権利を有しないことの承認として解釈されるべきではない。
【０１３７】
以上、本発明を、理解の明確のため、例示および具体例によってある程度詳細に記載したが、本発明の教示を考慮することにより、添付の請求請求の範囲の本旨または範囲から逸脱することなく、ある種の変化および修飾が、本発明に対してなされ得ることは、当業者には容易に明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】新たな赤色放射体：zoan2RFP（A、B）、mcavRFP（C、D）、およびrfloRFP（E、F）の成熟過程での放射スペクトルの変化。励起波長は、各グラフに与えられている。横軸は波長（ナノメートル単位）であり、縦軸は蛍光強度である。成熟段階：A、C、E−初期；B、D、F−後期（詳細については方法を参照のこと）。3個のタンパク質は全て「timer」表現型（最初は緑色放射、後に赤色放射が生じる）を示す。zoan2RFPは、mcavRFPおよびrfloRFPより有意に速く成熟し、「初期」段階ですら、赤色放射ピークが極めて著明であり、「後期」段階までには、タンパク質が赤色へと完全に変換されることに注意されたい。対照的に、mcavRFPおよびrfloRFPは、そのような完全な成熟を経ることができない。
【図２】mcavRFP（A、B）およびrfloRFP（C、D）の励起スペクトルに関する詳細。放射がモニタリングされた波長は、グラフに与えられている。A、C：赤色放射を欠いている、未熟タンパク質における緑色放射帯の励起スペクトル；B、D：より成熟した型における赤色放射帯の励起スペクトル。横軸は波長（ナノメートル単位）であり、縦軸は蛍光強度である。いずれのタンパク質においても、未熟緑色型および成熟赤色型の主要励起ピークが、相互に事実上同一であることに注意されたい。
【図３】花虫綱GFP様タンパク質の最新データセットに関する最大尤度の系統樹。節点の数字は、クオーテット・パズリング支持値（quartet-puzzling support values）（1000パズリング試行）を意味する。外群（outgroups）と見なされたアルシオナリア（Alcyonaria）亜綱由来のタンパク質は、白抜きで表示されている。2個のル−ティング・グループ（rooting groups）をつないでいる樹の「幹」（太い灰色の線）は、アルシオナリア（Alcyonaria）亜綱とゾアンタリア（Zoantharia）亜綱の分離の前のGFP様タンパク質の多様性を反映していると推測される。A、B、C、およびDと表示された灰色のバーは、ゾアンタリア（Zoantharia）において見出されたGFP様タンパク質の4個の別個のクレードを意味する。スケール・バー：0.1置換／部位。
【図４】GFP様タンパク質ファミリー内のスペクトル特性および発色団構造の要約。ここでは、最初の出版物において提唱されたものとは異なるGFP様タンパク質の名称が使用されていることに注意されたい（最初の名称は、可能である場合には、第一カラムに括弧内に与えられている；命名法の詳細については本文を参照されたい）。
【図５】亜綱・ゾアンタリア（Zoantharia）由来のGFP様タンパク質の主要クレードの要約。
【図６】本明細書に報告されたGFP様タンパク質の励起スペクトル（実線）および放射スペクトル（点線）。励起曲線または放射曲線が取得された波長が、各グラフの説明に与えられている。横軸は波長（ナノメートル単位）であり、縦軸は蛍光強度である。2個の新たな橙色〜赤色タンパク質についてのグラフは四角で囲まれている。
【図７】最近クローニングされ分光光度的に特徴決定されたGFP様タンパク質のアラインメント。アラインメントの上の数字は、エクオレア・ビクトリア（Aequorea victoria）由来GFPによるものである。
【図８】野生型ヘテラクチス・クリスパ（Heteractis crispa）hcriGFPのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（配列番号：01および02）を提供する。
【図９】野生型デンドロネフチア（Dendronephthya）sp.dendGFPのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（配列番号：03および04）を提供する。
【図１０】野生型ゾアンツス（Zoanthus）sp.zoanRFPのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（配列番号：05および06）を提供する。
【図１１】野生型スコリミア・キュベンシス（Scolymia cubensis）scubGFP1のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（配列番号：07および08）を提供する。
【図１２】野生型スコリミア・キュベンシス（Scolymia cubensis）scubGFP2のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（配列番号：09および10）を提供する。
【図１３】野生型リコルデア・フロリダ（Ricordea florida）rfloRFPのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（配列番号：11および12）を提供する。
【図１４】野生型リコルデア・フロリダ（Ricordea florida）rfloGFPのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（配列番号：13および14）を提供する。
【図１５】野生型モンタストレア・カベルノサ（Montastraea cavernosa）mcavRFPのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（配列番号：15および16）を提供する。
【図１６】野生型モンタストレア・カベルノサ（Montastraea cavernosa）mcavGFPのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（配列番号：17および18）を提供する。
【図１７】野生型コンジラクチス・ギガンテア（Condylactis gigantea）cgigGFPのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（配列番号：19および20）を提供する。
【図１８】野生型アガリシア・フラギリス（Agaricia fragilis）afraGFPのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（配列番号：21および22）を提供する。
【図１９】野生型リコルデア・フロリダ（Ricordea florida）rfloGFP2のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（配列番号：23および24）を提供する。
【図２０】野生型モンタストレア・カベルノサ（Montastraea cavernosa）mcavGFP2のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（配列番号：25および26）を提供する。
【図２１】野生型モンタストレア・アヌラリス（Montastraea annularis）mannFPのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（配列番号：27および28）を提供する。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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