(57)【要約】サイトカインおよびこの受容体は、基礎研究および治療の両方において有用であることが証明されている。本発明は、「Zcytor21」と命名された新しいヒトサイトカイン受容体を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：11のアミノ酸残基24位から454位、配列番号：2のアミノ酸残基24位から376位、配列番号：5のアミノ酸残基24位から396位、配列番号：8のアミノ酸残基24位から533位、および配列番号：15のアミノ酸残基24位から444位からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項２】
配列番号：11のアミノ酸残基24位から667位、配列番号：2のアミノ酸残基24位から589位、配列番号：5のアミノ酸残基24位から609位、および配列番号：15のアミノ酸残基24位から657位からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
配列番号：2のアミノ酸配列、配列番号：5のアミノ酸配列、配列番号：8のアミノ酸配列、配列番号：11のアミノ酸配列、および配列番号：15のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４】
配列番号：11のアミノ酸残基24位から454位、配列番号：2のアミノ酸残基24位から376位、配列番号：5のアミノ酸残基24位から396位、配列番号：8のアミノ酸残基24位から533位、および配列番号：15のアミノ酸残基24位から444位からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
【請求項５】
請求項4記載の単離された核酸分子を含むベクター。
【請求項６】
請求項4記載の単離された核酸分子、転写プロモーター、および転写ターミネーターを含む発現ベクターであって、ここでプロモーターは核酸分子に使用可能に連結され、かつ核酸分子は転写ターミネーターに使用可能に連結される、発現ベクター。
【請求項７】
細菌、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、哺乳類細胞、および植物細胞からなる群より選択される、請求項6記載の発現ベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項８】
以下の段階を含む、Zcytor21タンパク質を作製する方法：
請求項6記載の発現ベクターを含み、かつZcytor21タンパク質を産生する、組換え宿主細胞を培養する段階。
【請求項９】
Zcytor21タンパク質を、培養した組換え宿主細胞から単離する段階をさらに含む、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
請求項1記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体断片。
【請求項１１】
ポリクローナル抗体、マウスのモノクローナル抗体、マウスのモノクローナル抗体に由来するヒト化抗体、およびヒトモノクローナル抗体からなる群より選択される、請求項10記載の抗体。
【請求項１２】
請求項10記載の抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体。
【請求項１３】
請求項1記載のポリペプチドを含む融合タンパク質。
【請求項１４】
免疫グロブリン部分をさらに含む、請求項13記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
有効量の請求項1記載のポリペプチド；および
薬学的に許容される賦形剤
を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は一般に、ヒト細胞で発現される新しいタンパク質に関する。特に本発明は、「Zcytor21」と命名された受容体をコードする新しい遺伝子、およびZcytor21ポリペプチドをコードする核酸分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
サイトカインは、多くの細胞種の成長および分化の調節を含む、さまざまな生物学的作用に関与する可溶性の低分子量タンパク質である（例えばAraiら、Annu. Rev. Biochem. 59：783 （1990）；Mosmann、Curr. Opin. Immunol. 3：311 （1991）；PaulおよびSeder、Cell 76：241 （1994）を参照）。サイトカイン群のタンパク質は、インターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子、および他の調節分子を含む。例えばヒトインターロイキン-17は、インターロイキン-6、細胞内接着分子1、インターロイキン-8、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、およびプロスタグランジンE2の発現を促進し、CD34+造血前駆細胞から好中球への選択的な成熟に役割を果たす、サイトカインの1種である（Yaoら、J. Immunol. 155：5483 （1995）；Fossiezら、J. Exp. Med. 183：2593 （1996））。
【０００３】
サイトカインを結合する受容体は典型的に、サイトカインに高親和性で結合し、この結合事象を、特定の受容体サブユニットの細胞質部分を介して伝達する1種類または複数の膜内在性タンパク質を含む。サイトカイン受容体は、その細胞外リガンド結合ドメインの類似性を元に複数のクラスに分類されている。例えば、インターフェロンの結合および/または作用の変換に関与する受容体の鎖は、特徴的な200残基の細胞外ドメインに基づきII型サイトカイン受容体ファミリーに属する。
【０００４】
サイトカインおよびサイトカイン受容体の明らかにされたインビボ活性から、他のサイトカイン、サイトカイン受容体、サイトカイン作動物質、およびサイトカイン拮抗物質に臨床上の可能性があることがわかる。
【発明の開示】
【０００５】
発明の概要
本発明は、以下からなる群より選択される標準アミノ酸配列と、少なくとも70%、少なくとも80%、または少なくとも90%が同一なアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドを提供する：（a）配列番号：11のアミノ酸残基24位〜667位、（b）配列番号：2のアミノ酸残基24位〜589位、（c）配列番号：5のアミノ酸残基24位〜609位、（d）配列番号：8のアミノ酸残基24位〜533位、（e）配列番号：15のアミノ酸残基24位〜657位、（f）配列番号：11のアミノ酸残基24位〜454位、（g）配列番号：2のアミノ酸残基24位〜376位、（h）配列番号：5のアミノ酸残基24位〜396位、または（i）配列番号：15のアミノ酸残基24位〜444位。これらのポリペプチドの一部は、配列番号：2、5、8、11、または15のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体と特異的に結合可能である。例示的なポリペプチドは、配列番号：11のアミノ酸残基24位〜454位、配列番号：2のアミノ酸残基24位〜376位、配列番号：5のアミノ酸残基24位〜396位、配列番号：15のアミノ酸残基24位〜444位、または配列番号：8のアミノ酸残基24位〜533位を含むポリペプチドを含む。
【０００６】
本発明は、以下からなる群より選択される、アミノ酸配列の少なくとも15残基の連続アミノ酸残基を含む、単離されたポリペプチドも提供する：（a）配列番号：11のアミノ酸残基24位〜667位（b）配列番号：2のアミノ酸残基24位〜589位、（c）配列番号：5のアミノ酸残基24位〜609位、（d）配列番号：8のアミノ酸残基24位〜533位、（e）配列番号：15のアミノ酸残基24位〜657位、（f）配列番号：11のアミノ酸残基24位〜454位、（g）配列番号：2のアミノ酸残基24位〜376位、（h）配列番号：5のアミノ酸残基24位〜396位、または（i）配列番号：15のアミノ酸残基24位〜444位。本発明はさらに、以下からなる群より選択される、アミノ酸配列の少なくとも30残基の連続アミノ酸残基を含む単離されたポリペプチドを提供する：（a）配列番号：11のアミノ酸残基24位〜667位、（b）配列番号：2のアミノ酸残基24位〜589位、（c）配列番号：5のアミノ酸残基24位〜609位、（d）配列番号：8のアミノ酸残基24位〜533位、（e）配列番号：15のアミノ酸残基24位〜657位、（f）配列番号：11のアミノ酸残基24位〜454位、（g）配列番号：2のアミノ酸残基24位〜376位、（h）配列番号：5のアミノ酸残基24位〜396位、または（i）配列番号：15のアミノ酸残基24位〜444位。例示的なポリペプチドは、アミノ酸残基（a）〜（i）を含むか、またはそれらからなるポリペプチドを含む。
【０００７】
本発明は、変種ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号：11のアミノ酸残基24位〜454位、配列番号：2のアミノ酸残基24位〜376位、配列番号：5のアミノ酸残基24位〜396位、配列番号：8のアミノ酸残基24位〜533位、またはアミノ酸残基24位〜444位と配列同一性を示し、また変種ポリペプチドのアミノ酸配列と、対応する配列番号：2、5、8、11、または15のアミノ酸配列の任意の差が、1つまたは複数の保存的アミノ酸置換に基づく可能性がある、変種Zcytor21ポリペプチドも含む。配列同一性は少なくとも70%の配列同一性、少なくとも80%の配列同一性、少なくとも90%の配列同一性、少なくとも95%配列同一性、または95%以上の配列同一性である場合がある。
【０００８】
本発明はさらに、これらのポリペプチドに特異的に結合する抗体および抗体断片を提供する。例示的な抗体は、ポリクローナル抗体、マウスのモノクローナル抗体、マウスのモノクローナル抗体に由来するヒト化抗体、およびヒトモノクローナル抗体を含む。例示的な抗体断片は、F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、scFv、および最小認識単位を含む。本発明はさらに、本明細書に記載された担体、およびペプチド、ポリペプチド、または抗体を含む組成物を含む。
【０００９】
本発明は、核酸分子が以下からなる群より選択される、Zcytor21ポリペプチドをコードする単離された核酸分子も提供する：（a）配列番号：3、6、9、12、または16ヌクレオチド配列を含む核酸分子、（b）配列番号：11のアミノ酸残基24位〜454位、配列番号：2のアミノ酸残基24位〜376位、配列番号：5のアミノ酸残基24位〜396位、配列番号：8のアミノ酸残基24位〜533位、または配列番号：15のアミノ酸残基24位〜444位を含むアミノ酸配列をコードする核酸分子、ならびに（c）配列番号：10のヌクレオチド66位〜2066位、配列番号：10のヌクレオチド135位〜1427位のヌクレオチド配列、配列番号：10のヌクレオチド配列のヌクレオチド66位〜2066位の相補物、または配列番号：10のヌクレオチド配列のヌクレオチド135位〜1427位の相補物のヌクレオチド配列を含む核酸分子と、ストリンジェントな洗浄条件でハイブリダイズした状態を維持する核酸分子。例示的な核酸分子は、核酸分子（c）にコードされるアミノ酸配列と、配列番号：11の対応するアミノ酸配列との間にある任意の差が保存的アミノ酸置換によるものである核酸分子を含む。同様に、ハイブリダイゼーションに使用される核酸分子は、配列番号：1、4、7、または14のヌクレオチド配列に由来する場合がある。
【００１０】
本発明は、これらの核酸分子を含むベクターおよび発現ベクターも含む。このような発現ベクターは、転写プロモーター、および転写ターミネーターを含む場合があり、ここでプロモーターは核酸分子に使用可能に連結され、核酸分子は転写ターミネーターに使用可能に連結される。本発明はさらに、これらのベクターおよび発現ベクターを含む組換え宿主細胞および組換えウイルスを含む。例示的な宿主細胞は、鳥類、細菌、酵母、真菌、昆虫、哺乳類、および植物の細胞を含む。このような発現ベクターを含む組換え宿主細胞を用いて、発現ベクターを含みZcytor21タンパク質を産生する、このような組換え宿主細胞を培養することによって、また任意選択で、培養した組換え宿主細胞からZcytor21タンパク質を単離することによって、Zcytor21ポリペプチドを作製することができる。本発明は、このような方法で作製されたポリペプチド産物も提供する。
【００１１】
また本発明は、薬学的に許容される担体、および少なくとも1種類の上記の発現ベクター、または上記のような発現ベクターを含む組換えウイルスを含む薬学的組成物を提供する。本発明はさらに、本明細書に記載された、薬学的に許容される担体およびポリペプチドを含む薬学的組成物を含む。
【００１２】
本発明は、（a）Zcytor21 核酸プローブを、（i）生物試料から単離された被験RNA分子、または（ii）単離されたRNA分子から合成された核酸分子、のいずれかとハイブリダイズする条件で接触させる段階（プローブは配列番号：1記載のヌクレオチド配列、またはその相補物の一部を含むヌクレオチド配列を有する）；ならびに（b）核酸プローブと、被験RNA分子、または合成された核酸分子のいずれかのハイブリッドの形成をストリンジェントな洗浄条件で検出する段階（ハイブリッドの存在は、生物試料中におけるZcytor21 RNAの存在を意味する）を含む、生物試料中のZcytor21 RNAの有無の検出法についても想定している：。例えば適切なプローブは以下のヌクレオチド配列を含む場合がある：配列番号：10のヌクレオチド配列を含む核酸分子、配列番号：10のヌクレオチド残基66位〜2066位のヌクレオチド配列や、配列番号：10のヌクレオチド残基135位〜1427位のヌクレオチド配列などを含む核酸分子。他の適切なプローブは、これらのヌクレオチド配列の相補物、またはヌクレオチド配列、またはこれらの相補物の一部からなる。
【００１３】
本発明はさらに、以下の段階を含む、生物試料中のZcytor21ポリペプチドの有無を検出する方法を提供する：（a）生物試料に、配列番号：2、5、8、11、または15のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなるポリペプチドに特異的に結合する抗体、または抗体断片を接触させる段階（接触段階は、抗体または抗体断片と生物試料の結合を可能とする条件で行う）；ならびに（b）任意の結合状態の抗体または結合状態の抗体断片を検出する段階。このような抗体または抗体断片はさらに、放射性同位元素、蛍光標識、化学発光標識、酵素標識、生物発光標識、および金コロイドからなる群より選択される検出用標識を含む場合がある。
【００１４】
本発明は、このような検出法を実施するためのキットも提供する。例えばZcytor21遺伝子発現を検出するためのキットは、核酸分子を含む容器を含む場合がある（核酸分子は（a）配列番号：10記載のヌクレオチド66位〜2066位のヌクレオチド配列を含む核酸分子、（b）配列番号：10のヌクレオチド66位〜2066位の相補物のヌクレオチド配列を含む核酸分子、（c）配列番号：10記載のヌクレオチド135位〜1427位のヌクレオチド配列を含む核酸分子、（d）配列番号：10のヌクレオチド135位〜1427位の相補物のヌクレオチド配列を含む核酸分子、ならびに（e）少なくとも8残基のヌクレオチドからなる（a）〜（d）の断片である核酸分子からなる群より選択される）。このようなキットは、対象核酸分子の存在を示すことができる1種類または複数の試薬を含む第2の容器を含む場合もある。一方、Zcytor21タンパク質を検出するためのキットは、配列番号：2、5、8、11、または15のアミノ酸配列を含む、ポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体断片を含む容器を含む場合がある。
【００１５】
本発明は、配列番号：2、5、8、11、または15のアミノ酸配列を含む、ポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体断片に特異的に結合する、抗イディオタイプ抗体、または抗イディオタイプ抗体断片も想定している。例示的な抗イディオタイプ抗体は、配列番号：11のアミノ酸残基24位〜454位、配列番号：2のアミノ酸残基24位〜376位、配列番号：5のアミノ酸残基24位〜396位、配列番号：8のアミノ酸残基24位〜533位、または配列番号：15のアミノ酸残基24位〜444位を含むポリペプチドと特異的に結合する抗体と結合する。
【００１６】
本発明は、Zcytor21の分泌シグナル配列をコードするヌクレオチド配列、および生物学的に活性なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子も提供する（Zcytor21の分泌シグナル配列は配列番号：2の残基1位〜23位のアミノ酸配列を含む）。例示的な生物学的に活性なポリペプチドは、第VIIa因子、プロインスリン、インスリン、卵胞刺激ホルモン、組織型プラスミノーゲンアクチベーター、腫瘍壊死因子、インターロイキン、コロニー刺激因子、インターフェロン、エリトロポイエチン、およびトロンボポイエチンを含む。また本発明は、Zcytor21の分泌シグナル配列およびポリペプチドを含む、融合タンパク質を提供する（Zcytor21の分泌シグナル配列は配列番号：2の残基1位〜23位のアミノ酸配列を含む）。
【００１７】
本発明は、Zcytor21ポリペプチド、および免疫グロブリン部分を含む融合タンパク質も提供する。例示的なZcytor21ポリペプチドは、配列番号：11のアミノ酸残基24位〜454位、配列番号：2のアミノ酸残基24位〜376位、配列番号：5のアミノ酸残基24位〜396位、配列番号：8のアミノ酸残基24位〜533位、または配列番号：15のアミノ酸残基24位〜444位を含むポリペプチドを含む。このような融合タンパク質では、免疫グロブリン部分は、免疫グロブリンの重鎖の定常領域（ヒトのFc断片など）の場合がある。本発明はさらに、このような融合タンパク質をコードする単離された核酸分子を含む。
【００１８】
本発明の以上の局面および他の局面は、以下の詳細な説明を参照することで明らかになる。
【００１９】
発明の詳細な説明
1．概説
本発明は「Zcytor21」と命名された新しい受容体を提供する。本発明は、Zcytor21ポリペプチドおよびZcytor21融合タンパク質、およびこれらのポリペプチドおよびタンパク質をコードする核酸分子、ならびにこれらの核酸分子およびアミノ酸配列を使用する方法も提供する。
【００２０】
Zcytor21の4種類のスプライス変種が同定されている。これらの変種はZcytor21-d2、Zcytor21-f1、Zcytor21-f5、Zcytor21-f6、およびZcytor21-g13と命名されている。表1は変種ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の対応配列の識別番号を示し、表2はZcytor21ポリペプチドの構造的特性を示す。Zcytor21遺伝子はヒト染色体3p25.3に位置する。
【００２１】
【表１】
2005508615.tif 000002
【００２２】
【表２】
2005508615.tif 000003
【００２３】
Zcytor21遺伝子は、ヒトの胚細胞腫瘍、およびヒトの皮膚細胞で発現される。PCR解析の結果、Zcytor21 mRNAが、ヒトの脳組織および気管組織に存在することがわかっている。これとは対照的に、副腎、骨格筋、膀胱、腎臓、肺、および脾臓における遺伝子発現を示す証拠は全くないかほとんどない。したがってZcytor21のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、組織を区別するために使用することができる。
【００２４】
2．定義
以下の記述では、いくつかの表現を広く用いる。以下の定義を、本発明の理解を助けるために提供する。
【００２５】
特に明記しない限り、「1つの」、「その」、および「少なくとも1つの」という表現は互換的に使用され、1つまたは複数の対象を意味する。
【００２６】
本明細書で用いられる「核酸」または「核酸分子」という表現は、デオキシリボ核酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で生じた断片、および連結、切断、エンドヌクレアーゼの作用、およびエキソヌクレアーゼの作用のいずれかによって生じた断片などのポリヌクレオチドを意味する。核酸分子は、天然のヌクレオチド（DNAおよびRNAなど）の単量体、もしくは天然のヌクレオチドの類似体（例えば天然のヌクレオチドのαエナンチオマー）、または両者の組み合わせを含む場合がある。修飾型ヌクレオチドは、糖部分に、および/またはピリミジン塩基またはプリン塩基部分に変化を有する場合がある。糖の修飾には、例えば1個または複数のヒドロキシル基のハロゲン、アルキル基、アミン、およびアジド基との置換などがあるほか、糖には、エーテルまたはエステルとして官能基が付加される場合がある。また糖部分の全体を、アザ糖や炭素環式糖類似体などの、構造的および電子的に類似の構造と置換することができる。塩基部分の修飾の例には、アルキル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンもしくはピリミジン、または他の周知の複素環式置換基などがある。核酸単量体は、ホスホジエステル結合、またはこのような連結の類似結合で連結される場合がある。ホスホジエステル結合の類似結合には、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート（phosphoroanilothioate）、ホスホラニリデート、ホスホラミデートなどがある。「核酸分子」という表現は、天然の核酸塩基、またはポリアミド主鎖に結合した修飾型の核酸塩基を含む、いわゆる「ペプチド核酸」も含む。核酸は1本鎖または2本鎖のいずれかの状態をとる。
【００２７】
「核酸分子の相補物」という表現は、相補的なヌクレオチド配列を有し、標準ヌクレオチド配列に対して逆方向の核酸分子を意味する。例えば配列5'ATGCACGGG 3'は5'CCCGTGCAT 3'に相補的である。
【００２８】
「コンティグ」という表現は、別の核酸分子に対して同一の配列または相補的な配列の連続する一続きを有する核酸分子を意味する。連続する配列は任意の核酸分子の一続きに対して、核酸分子の全体的または部分的に「重複する（overlap）」と表現される。
【００２９】
「縮重ヌクレオチド配列」という表現は、ポリペプチドをコードする標準核酸分子と比較して1つまたは複数の縮重コドンを含むヌクレオチドの配列を意味する。縮重コドンは、ヌクレオチドの異なるトリプレットを含むが、同じアミノ酸残基をコードする（すなわちGAUおよびGACのトリプレットはいずれもAspをコードする）。
【００３０】
「構造遺伝子」という表現は、メッセンジャーRNA（mRNA）に転写される核酸分子を意味する（mRNAは後に、特定のポリペプチドの特徴を有するアミノ酸配列に翻訳される）。
【００３１】
「単離された核酸分子」とは、生物体のゲノムDNAに組み込まれていない状態の核酸分子である。例えば、細胞のゲノムDNAから単離された成長因子をコードするDNA分子は単離されたDNA分子である。単離された核酸分子の別の例は、生物体のゲノムに組み込まれていない化学的に合成された核酸分子である。特定の種から単離された核酸分子は、同じ種の染色体の完全なDNA分子より小さい。
【００３２】
「核酸分子構築物」は、天然には存在しない配置で結合され並置された核酸のセグメントを含むように人工的に修飾された、1本鎖または2本鎖のいずれかの核酸分子である。
【００３３】
「線状DNA」は、遊離の5'端および3'端を有する非環状DNA分子を意味する。線状DNAは、プラスミドなどのクローン化された環状DNA分子から、酵素的切断または物理的破壊によって作製することができる。
【００３４】
「相補的DNA（cDNA）」は、mRNAテンプレートから、逆転写酵素の作用で形成される1本鎖のDNA分子である。典型的には、mRNAの一部に相補的なプライマーが逆転写の開始に使用される。当業者は、このような1本鎖のDNA分子、およびその相補的なDNA鎖を含む2本鎖のDNA分子を指して「cDNA」という表現を使用することもある。「cDNA」という表現は、RNAテンプレートから合成されたcDNA分子のクローンも意味する。
【００３５】
「プロモーター」は、構造遺伝子の転写を誘導するヌクレオチド配列である。典型的にはプロモーターは、遺伝子の5'側の非コード領域に、構造遺伝子の転写開始部位の近位に位置する。転写の開始に機能する、プロモーター内の配列エレメントは、コンセンサスヌクレオチド配列によって特徴づけられることがある。このようなプロモーターエレメントには、RNAポリメラーゼ結合部位、TATA配列、CAAT配列、分化特異的エレメント（DSE；McGeheeら、Mol. Endocrinol. 7：551 （1993））、環状AMP応答配列（CRE）、血清応答配列（SRE；Treisman、Seminars in Cancer Biol. 1：47 （1990））、グルココルチコイド応答配列（GRE）などがあり、またCRE/ATF（O'Reillyら、J. Biol. Chem. 267：19938 （1992））、AP2（Yeら、J. Biol. Chem. 269：25728 （1994））、SP1、cAMP 応答配列結合タンパク質（CREB；Loeken、Gene Expr. 3：253 （1993））、ならびにオクタマー因子（一般的にはWatsonら編、「Molecular Biology of the Gene」、第4版（The Benjamin/Cummings Publishing Company社、1987）、ならびにLemaigreおよびRousseau、Biochem. J. 303：1 （1994）を参照）などの他の転写因子の結合部位がある。仮にプロモーターが誘導的プロモーターの場合、転写速度は、誘導物質に対する反応に応じて増す。これとは対照的に、プロモーターが構成的プロモーターの場合、転写速度は誘導物質によって調節されない。また抑制的プロモーターについても知られている。
【００３６】
「コアプロモーター」は、TATAボックスおよび転写の開始点を含む、プロモーターの機能に不可欠なヌクレオチド配列を含む。この定義により、コアプロモーターは、活性を高めたり、組織特異的な活性を提供したりする特定の配列の非存在下で、検出可能な活性を有する場合もあれば有しない場合もある。
【００３７】
「調節エレメント」は、コアプロモーターの活性を調節するヌクレオチド配列である。例えば調節エレメントは、特定の細胞、組織、または細胞小器官で転写を独占的または選択的に可能とする細胞性因子と結合するヌクレオチド配列を含む場合がある。このような種類の調節エレメントは通常「細胞特異的」、「組織特異的」、または「細胞小器官特異的」に発現される遺伝子と関連している。
【００３８】
「エンハンサー」は、転写開始部位に対するエンハンサーの距離または方向にかかわらず、転写効率を高める調節エレメントの1種である。
【００３９】
「異種DNA」という表現は、任意の宿主細胞内で天然に存在しないDNA分子、またはDNA分子の集団を意味する。特定の宿主細胞に対して異種であるDNA分子は、宿主DNAが非宿主DNA（外因性DNA）と結合している限りにおいて、宿主細胞種に由来するDNA（内因性DNA）を含む場合がある。例えば、転写プロモーターを含む宿主DNAセグメントに使用可能に連結された、ポリペプチドをコードする非宿主DNAセグメントを含むDNA分子は、異種DNA分子であるとみなされる。逆に異種DNA分子は、外因性プロモーターに使用可能に連結された内因性遺伝子を含む場合がある。別の説明として、野生型細胞に由来する遺伝子を含むDNA分子は、そのDNA分子が、野生型遺伝子を欠く変異型細胞に導入されているのであれば異種DNAとみなされる。
【００４０】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合で連結されたアミノ酸残基のポリマーであり、天然の状態で作られるほか、合成的に作られることもある。約10アミノ酸残基未満のポリペプチドは一般に「ペプチド」と呼ばれる。
【００４１】
「タンパク質」は1本または複数のポリペプチド鎖を含む高分子である。タンパク質は、炭水化物官能基などの非ペプチド性成分を含む場合もある。炭水化物、および他の非ペプチド性の置換基は、タンパク質が産生される細胞によってタンパク質に付加される場合があり、また細胞の種類によって異なる。タンパク質は、本明細書では、そのアミノ酸主鎖構造によって定義され、炭水化物官能基などの置換基は通常指定しないが、それにもかかわらず存在する場合がある。
【００４２】
非宿主DNA分子にコードされたペプチドまたはポリペプチドは、「異種」のペプチドまたはポリペプチドである。
【００４３】
「統合された遺伝エレメント」は、同エレメントが細胞に人工的に導入された後に宿主細胞の染色体に組み入れられたDNAのセグメントである。本発明では、統合された遺伝エレメントは最も一般的には、細胞にエレクトロポレーションまたは他の手法で導入される線状プラスミドに由来する。統合された遺伝エレメントは、当初の宿主細胞から、その子孫へ受け継がれる。
【００４４】
「クローニングベクター」は、宿主細胞で自律的に複製する能力をもつプラスミド、コスミド、またはバクテリオファージなどの核酸分子である。クローニングベクターは典型的には、ベクターの本質的な生物学的機能を失うことなく決定可能な様式で核酸分子の挿入を可能とする、1か所または少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位、ならびにクローニングベクターで形質転換した細胞の同定および選択における使用に適した、マーカー遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む。マーカー遺伝子は典型的には、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性を提供する遺伝子を含む。
【００４５】
「発現ベクター」は、宿主細胞で発現される遺伝子をコードする核酸分子である。典型的には発現ベクターは、転写プロモーター、遺伝子、および転写ターミネーターを含む。遺伝子発現は通常、プロモーターの制御下にあり、このような状態の遺伝子は、プロモーターに「使用可能に連結された」と表現される。同様に、調節エレメントおよびコアプロモーターは、調節エレメントがコアプロモーターの活性を調節する場合に使用可能に連結される。
【００４６】
「組換え宿主」は、クローニングベクターまたは発現ベクターなどの異種核酸分子を含む細胞である。本明細書における組換え宿主の例は、発現ベクターからZcytor21を産生する細胞である。対照的に、Zcytor21は、Zcytor21の「天然の供給源」であって発現ベクターを欠く細胞によって産生される場合がある。
【００４７】
「統合型形質転換体」は、異種DNAが細胞のゲノムDNAに統合される組換え宿主細胞である。
【００４８】
「融合タンパク質」は、少なくとも2つの遺伝子のヌクレオチド配列を含む核酸分子によって発現されるハイブリッドタンパク質である。例えば融合タンパク質は、アフィニティマトリックスに結合するポリペプチドと融合したZcytor21ポリペプチドの少なくとも一部を含む場合がある。このような融合タンパク質は、大量のZcytor21をアフィニティクロマトグラフィーで単離するための手段となる。
【００４９】
「受容体」という表現は、「リガンド」と呼ばれる生物活性分子と結合する、細胞に結合した状態のタンパク質を意味する。このような相互作用には、細胞上のリガンドの作用が関与する。受容体は、膜に結合した状態で存在するほか、細胞質や核に存在する場合がある。また単量体（例えば甲状腺刺激ホルモン受容体、ベータアドレナリン作動性受容体）の場合があるほか、多量体（例えばPDGF受容体、成長ホルモン受容体、IL-3受容体、GM-CSF受容体、G-CSF受容体、エリトロポイエチン受容体、およびIL-6受容体）の場合がある。膜結合型受容体は、細胞外におけるリガンド結合ドメイン、および通常、シグナル伝達に関与する細胞内のエフェクタードメインを含む複数のドメインからなる構造を特徴とする。ある膜結合型受容体では、細胞外リガンド結合ドメインと細胞内エフェクタードメインは、完全な機能性受容体を含む別個のポリペプチド内に位置する。
【００５０】
一般に、リガンドと受容体が結合することで、受容体の立体構造が変化し、これが細胞内におけるエフェクタードメインと他の分子の相互作用を誘導する（この相互作用は後に細胞の代謝変化を招く）。受容体-リガンド相互作用と結びつくことの多い代謝現象には、遺伝子の転写、リン酸化、脱リン酸化、環状AMP産生の上昇、細胞内カルシウムの移動、膜脂質の可動化、細胞接着、イノシトール脂質の加水分解、ならびにリン脂質の加水分解などがある。
【００５１】
「分泌シグナル配列」という表現は、大型ポリペプチドの成分であるペプチド（「分泌ペプチド」）をコードするDNA配列を意味し、大型ポリペプチドを、それが合成される細胞の分泌経路に向かわせる。大型ポリペプチドは一般に、分泌経路を移動する過程で切断されて分泌ペプチドが除去される。
【００５２】
「単離されたポリペプチド」は、天然の状態でポリペプチドと結合する炭水化物、脂質、または他のタンパク質性不純物などの混入性細胞成分を本質的に含まないポリペプチドである。典型的には、単離されたポリペプチドの調製物は、高度に純粋な状態（すなわち純度が少なくとも約80%、純度が少なくとも約90%、純度が少なくとも約95%、純度が95%以上、または純度が99%以上）のポリペプチドを含む。特定のタンパク質調製物が、単離されたポリペプチドを含むことを示す1つの方法は、タンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）-ポリアクリルアミドゲル電気泳動と、クーマシーブリリアントブルーによるゲルの染色によって1本のバンドの出現を確認することである。しかし「単離された」という表現は、同じポリペプチドが別の物理的状態（二量体など）で存在すること、あるいは代替的にグリコシル化された状態や誘導体の状態などであることを除外しない。
【００５３】
「アミノ末端」および「カルボキシル末端」という表現は、ポリペプチド内における位置を示すために使用される。以下の文脈で理解されるように、これらの表現は、近接性または相対位置を意味するように、ポリペプチドの特定の配列または部分に関して使用される。例えば、ポリペプチド内において標準配列に対してカルボキシル末端に位置するある配列は、標準配列のカルボキシル末端の近位に位置するが、完全なポリペプチドのカルボキシル末端に位置する必要は必ずしもない。
【００５４】
「発現」という表現は遺伝子産物の生合成を意味する。例えば構造遺伝子の場合、発現には、構造遺伝子のmRNAへの転写と、mRNAから1種類または複数のポリペプチドへの翻訳が関与する。
【００５５】
「スプライス変種」という表現は、遺伝子から転写されたRNAの別の状態を示す際に使用される。スプライス変異は、転写後のRNA分子内の、または一般性は低いものの、別個の転写後RNA分子間の、選択的スプライス部位の利用によって自然に生じ、同じ遺伝子から転写された複数のmRNAを生じる場合がある。スプライス変種は、変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする場合がある。スプライス変種という表現は本明細書で、遺伝子から転写されたmRNAのスプライス変種にコードされたポリペプチドを示す際にも用いられる。
【００５６】
本明細書で用いられる「免疫調節物質」という表現は、サイトカイン、幹細胞成長因子、リンホトキシン、補助刺激分子、造血因子、およびこれらの分子の合成類似体を含む。
【００５７】
「相補物/抗相補物の対」という表現は、非共有結合で結合された安定な対を適切な条件で形成する非同一な部分を意味する。例えば、ビオチンとアビジン（またはストレプトアビジン）は、相補物/抗相補物対の典型である。他の例示的な相補物/抗相補物の対には、受容体/リガンドの対、抗体/抗原（またはハプテンもしくはエピトープ）の対、センス/アンチセンスポリヌクレオチドの対などがある。相補物/抗相補物の対が後に解離することが望ましい場合は、相補物/抗相補物の対は好ましくは109 M-1未満の結合親和性を有する。
【００５８】
「抗イディオタイプ抗体」は、免疫グロブリンの可変領域ドメインと結合する抗体である。本明細書では、抗イディオタイプ抗体は、抗Zcytor21抗体の可変領域と結合するので、抗イディオタイプ抗体はZcytor21のエピトープと類似点を有する。
【００５９】
「抗体断片」は、F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fabなどの抗体の一部である。構造とは無関係に、抗体断片は、完全な抗体によって認識される同じ抗原と結合する。例えば抗Zcytor21モノクローナル抗体断片は、Zcytor21のエピトープと結合する。
【００６０】
「抗体断片」という表現は、軽鎖の可変領域を含むポリペプチド、重鎖および軽鎖の可変領域を含む「Fv」断片、軽鎖および重鎖の可変領域がペプチドリンカーで連結された組換え型1本鎖ポリペプチド分子（「scFvタンパク質」）、ならびに超可変領域として作用するアミノ酸残基を含む最小認識単位などの、特定の抗原と結合する合成ポリペプチドまたは遺伝子工学的に作製されたポリペプチドも含む。
【００６１】
「キメラ抗体」は、げっ歯類の抗体に由来する可変ドメインおよび相補性決定部を含み、抗体分子の残りの部分はヒト抗体に由来する組換えタンパク質である。
【００６２】
「ヒト化抗体」は、モノクローナル抗体のマウス相補性決定部が、マウスの免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域から、ヒトの可変ドメインに移された組換えタンパク質である。
【００６３】
本明細書で用いられる「治療薬」は、抗体部分と複合体を形成して、治療に有用な複合体を産生する分子または原子である。治療薬の例には、薬物、毒素、免疫調節物質、キレート剤、ホウ素化合物、光活性薬剤、または色素、および放射性同位体などがある。
【００６４】
「検出用標識」は、抗体部分と複合体を形成して、診断に有用な分子を産生可能な分子または原子である。検出用標識の例には、キレート剤、光活性薬剤、放射性同位体、蛍光性薬剤、常磁性イオン、または他のマーカー部分などがある。
【００６５】
「アフィニティタグ」という表現は、第2のポリペプチドを結合することで、第2のポリペプチドの精製または検出、または基質に対する第2のポリペプチドの結合部位の提供を可能とする、ポリペプチドのセグメントを意味する表現として本明細書で使用される。原理的には、抗体または他の特異的な結合剤が利用可能な任意のペプチドまたはタンパク質を、アフィニティタグとして使用することができる。アフィニティタグには、ポリヒスチジンの連続配列、プロテインA（Nilssonら、EMBO J. 4：1075 （1985）；Nilssonら、Methods Enzymol. 198：3 （1991））、グルタチオンSトランスフェラーゼ（SmithおよびJohnson、Gene 67：31 （1988））、Glu-Gluアフィニティタグ（Grussenmeyerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82：7952 （1985））、P物質、FLAGペプチド（Hoppら、Biotechnology 6：1204 （1988））、ストレプトアビジン結合ペプチド、または他の抗原性エピトープもしくは結合ドメインなどがある。これについては一般的にはFordら、Protein Expression and Purification 2：95（1991）を参照されたい。アフィニティタグをコードするDNA分子は業者から入手することができる（例えばPharmacia Biotech、Piscataway、NJ）。
【００６６】
「裸の抗体」は、治療薬と複合体を形成していない抗体全体であって、抗体の断片ではない。裸の抗体には、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方、ならびに特定の組換え抗体（例えばキメラ抗体およびヒト化抗体）などがある。
【００６７】
本明細書で用いられる「抗体成分」という表現は、抗体全体および抗体断片の両方を含む。
【００６８】
「免疫複合体」は、抗体成分と治療薬または検出用標識の複合体である。
【００６９】
本明細書で用いられる「抗体融合タンパク質」という表現は、抗体成分、およびZcytor21ポリペプチド成分を含む組換え分子を意味する。抗体融合タンパク質の例には、Zcytor21の細胞外ドメイン、およびFcドメインまたは抗原結合領域のいずれかを含むタンパク質などがある。
【００７０】
「標的ポリペプチド」または「標的ペプチド」は、少なくとも1つのエピトープを含むアミノ酸配列であり、標的細胞（腫瘍細胞、または感染性病原体の抗原を含む細胞など）上で発現されるアミノ酸である。T細胞は、主要組織適合性複合体分子によって、標的ポリペプチドまたは標的ペプチドに提示されたペプチドエピトープを認識し、かつ典型的には標的細胞を溶解するか、または他の免疫細胞を標的細胞の部位に動員することによって標的細胞を死滅させる。
【００７１】
「抗原ペプチド」は、主要組織適合性複合体分子と結合してMHC-ペプチド複合体を形成し、これがT細胞に認識され、T細胞に提示されることによって細胞障害性リンパ球反応を誘導するペプチドである。したがって抗原ペプチドは、適切な主要組織適合性複合体分子に結合可能であり、かつ細胞の溶解、または抗原に結合したり抗原を発現したりする標的細胞に対する、特定のサイトカインの放出などの、細胞障害性のT細胞反応を誘導可能である。このような抗原ペプチドは、抗原提示細胞上または標的細胞上で、クラスIまたはクラスIIの主要組織適合性複合体分子と結合した状態で存在する場合がある。
【００７２】
真核生物では、RNAポリメラーゼIIは、構造遺伝子の転写を触媒してmRNAを産生する。核酸分子は、RNA転写物が特異的なmRNAの配列に相補的な配列を有する、RNAポリメラーゼIIのテンプレートを含むように設計することができる。このようなRNA転写物は「アンチセンスRNA」と呼ばれ、またアンチセンスRNAをコードする核酸分子は「アンチセンス遺伝子」と呼ばれる。アンチセンスRNA分子には、mRNA分子と結合してmRNAの翻訳の抑制を誘導する能力がある。
【００７３】
「Zcytor21に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド」、または「Zcytor21アンチセンスオリゴヌクレオチド」は（a）Zcytor21遺伝子の一部と安定な3本鎖を形成する能力を有するか、または（b）Zcytor21遺伝子のmRNA転写物の一部と安定な2本鎖を形成する能力を有する配列を含むオリゴヌクレオチドである。
【００７４】
「リボザイム」は触媒中心を含む核酸分子である。この表現は、RNA酵素、自己スプライシング性RNA、自己切断性RNA、およびこれらの触媒機能を果たす核酸分子を含む。リボザイムをコードする核酸分子は「リボザイム遺伝子」と呼ばれる。
【００７５】
「外部ガイド配列」は、内因性リボザイムであるRNase Pを特定の種の細胞内mRNAに導くことで、RNase PによるmRNAの切断を導く核酸分子である。外部ガイド配列をコードする核酸分子は「外部ガイド配列遺伝子」と呼ばれる。
【００７６】
「変種Zcytor21遺伝子」という表現は、配列番号：11の改変物であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、核酸分子を意味する。このような変種は、Zcytor21遺伝子の天然の多型、ならびに配列番号：11のアミノ酸配列の保存的アミノ酸置換を含む合成遺伝子を含む。Zcytor21遺伝子の他の変種は、本明細書に記載されたヌクレオチド配列の挿入または欠失を含む核酸分子である。変種Zcytor21遺伝子は例えば、対象遺伝子が、配列番号：10のヌクレオチド配列、またはその相補物を有する核酸分子と、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするか否かを判定することによって同定することができる。
【００７７】
あるいは、変種Zcytor21遺伝子は配列比較によって同定することができる。2つのアミノ酸配列は、2つのアミノ酸配列のアミノ酸残基が、最大の一致をみるようにアライメントしたときに同一である場合、「100%アミノ酸配列同一性」を有する。同様に2つのヌクレオチド配列は、2つのヌクレオチド配列のヌクレオチド残基が、最大の一致をみるようにアライメントしたときに同一である場合、「100%ヌクレオチド配列同一性」を有する。配列比較は、DNASTAR （Madison、Wisconsin）製のLASERGENEバイオインフォマティックス・コンピューティング・スイート（bioinformatics computing suite）などに含まれるプログラムなどの標準的なソフトウェアプログラムで実施することができる。最適なアライメントを決定することによる、2つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を比較する他の方法は当技術分野で周知である（例えばPeruskiおよびPeruski、「The Internet and the New Biology：Tools for Genomic and Molecular Research」（ASM Press社、1997）、Wuら共編、「Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins」、Methods in Gene Biotechnology、p.123〜151（CRC Press社、1997）、ならびにBishop編、「Guide to Human Genome Computing」、第2版（Academic Press社、1998）を参照）。配列同一性を決定するための特定の方法については後述する。
【００７８】
変種Zcytor21遺伝子または変種Zcytor21ポリペプチドの同定に用いられる特定の方法とは無関係に、変種遺伝子もしくは、変種遺伝子にコードされるポリペプチドは、抗Zcytor21抗体に特異的に結合する能力が機能的に明らかにされる場合がある。
【００７９】
「対立遺伝子変種」という表現は、本明細書で、同じ染色体座位を占める2つまたはこれ以上の別の状態の遺伝子を意味する表現として用いられる。対立遺伝子の変化は、自然の状態で変異によって生じ、また集団内で表現型の多型を生じる場合がある。遺伝子変異は、サイレントである（コードされたポリペプチドに変化がない）場合があるほか、変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする場合がある。対立遺伝子変種という表現は本明細書において、対立遺伝子変種遺伝子にコードされたタンパク質を意味する表現としても用いられる。
【００８０】
「オーソログ」という表現は、異なる種に由来するポリペプチドまたはタンパク質の機能的対応物である、1つの種から得られるポリペプチドまたはタンパク質を意味する。オーソログ間の配列の差は、種分化の結果である。
【００８１】
「パラログ」は、生物体によって作られる、異なるが構造的に関連したタンパク質である。パラログは、遺伝子重複によって生じると考えられている。例えば、α-グロビン、β-グロビン、およびミオグロビンは相互にパラログである。
【００８２】
本発明はZcytor21遺伝子の機能性断片を含む。本明細書では、Zcytor21遺伝子の「機能性断片」は、本明細書に記載されているドメイン、または抗Zcytor21抗体と少なくとも特異的に結合するドメインである、Zcytor21ポリペプチドの一部をコードする核酸分子を意味する。
【００８３】
標準的な解析法の不正確さのため、ポリマーの分子量および長さは概数値であると理解される。このような値が「約」Xまたは「およそ」Xと表記される場合、Xの記載値は±10%で正確であると理解される。
【００８４】
3．Zcytor21をコードする核酸分子の作製
ヒトZcytor21をコードする核酸分子は、配列番号：1、4、7、10、14のいずれかに基づくポリヌクレオチドプローブを用いて、ヒトのcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることで得られる。このような手法は標準的であり、十分確立されている。
【００８５】
例として、ヒトZcytor21をコードする核酸分子はcDNAライブラリーから単離することができる。この場合、第1段階では、皮膚組織などの組織からRNAを当技術分野で周知の方法で単離することによって、cDNAライブラリーを調製する。一般にRNAの単離法は、細胞を破壊する方法、RNaseの作用によるRNAの分解を抑制する手段、ならびにRNAをDNA、タンパク質、および多糖類の混入物から分離する方法でなければならない。例えば総RNAは、組織を液体窒素中で凍結し、凍結組織を乳鉢および乳棒で摩砕して細胞を破壊し、摩砕後の組織をフェノール/クロロホルム溶液で抽出してタンパク質を除去し、ならびに塩化リチウムで選択的に沈殿させることによってRNAを残存性不純物と分けることで単離することができる（例えばAusubelら共編、Short Protocols in Molecular Biology、第3版、p.4-1〜4-6 （John Wiley & Sons、1995）［「Ausubel（1995）」］；Wuら、Methods in Gene Biotechnology、p.33〜41（CRC Press社、1997）［「Wu（1997）」］を参照）。
【００８６】
あるいは総RNAは、摩砕後の組織をグアニジウムイソチオシアナートで抽出し、有機溶媒で抽出し、ならびに分画遠心法でRNAを混入物から分離することで単離することができる（例えばChirgwinら、Biochemistry 18：52 （1979）；Ausubel （1995）、p.4-1〜4-6；Wu （1997）、p.33〜41を参照）。
【００８７】
cDNAライブラリーを構築するためには、ポリ(A)+RNAを総RNA調製物から単離しなければならない。ポリ(A)+RNAは、オリゴ(dT)-セルロースクロマトグラフィーと呼ばれる標準的な手法（例えばAvivおよびLeder、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69：1408 （1972）；Ausubel （1995）、p.4-11〜4-12を参照）で総RNAから単離することができる。
【００８８】
2本鎖cDNA分子は、当技術分野で周知の手法（例えばWu （1997）、p.41〜46を参照）でポリ(A)+RNAから合成する。また市販のキットを用いて2本鎖cDNA分子を合成することができる。例えば、このようなキットは、Life Technologies社（Gaithersburg、MD）、CLONTECH Laboratories社（Palo Alto、CA）、Promega Corporation（Madison、WI）、ならびにSTRATAGENE （La Jolla、CA）から入手することができる。
【００８９】
さまざまなクローニングベクターがcDNAライブラリーの構築に適している。例えばcDNAライブラリーは、λgt10ベクターなどのバクテリオファージに由来するベクターを用いて作製することができる。これについては例えばHuynhら、「Constructing and Screening cDNA Libraries in λgt10 and λgt11」、DNA Cloning：A Practical Approach、第1巻、Glover編、p.49 （IRL Press、1985）；Wu （1997）、p.47〜52を参照されたい。
【００９０】
あるいは2本鎖のcDNA分子を、pBLUESCRIPTベクター（STRATAGENE；La Jolla、CA）、LAMDA GEM-4（Promega社）などのプラスミドベクター、または他の市販のベクターに挿入することができる。適切なクローニングベクターはAmerican Type Culture Collection （Manassas、VA）から入手することもできる。
【００９１】
クローン化されたcDNA分子を増幅するためには、cDNAライブラリーを標準的な手法で原核生物宿主に挿入する。例えばcDNAライブラリーは、例えばLife Technologies社（Gaithersburg、MD）から入手可能なコンピテント大腸菌DH5細胞に導入することができる。
【００９２】
ヒトゲノムライブラリーは当技術分野で周知の手段で調製することができる（例えばAusubel （1995）、p.5-1〜5-6；Wu （1997）、p.307〜327を参照）。ゲノムDNAは、組織を界面活性剤サルコシル（Sarkosyl）で溶解し、溶解物をプロテイナーゼKで消化し、不溶性残渣を溶解物から遠心して除去し、核酸を溶解物からイソプロパノールを用いて沈殿させ、再懸濁後のDNAを塩化カルシウム密度勾配法で精製することで単離可能である。
【００９３】
ゲノムライブラリーの作製に適したDNA断片は、ゲノムDNAのランダム剪断によって、または制限エンドヌクレアーゼによるゲノムDNAの部分切断によって得られる。ゲノムDNA断片は、バクテリオファージまたはコスミドベクターなどのベクターに、適切な末端を提供する制限酵素切断の使用、DNA分子の望ましくない連結を回避するアルカリホスファターゼ処理の使用、および適切なリガーゼを用いた連結といった従来の方法で挿入することができる。このような操作の手法は当技術分野で周知である（例えばAusubel （1995）、p.5-1〜5-6；Wu （1997）、p.307〜327を参照）。
【００９４】
あるいはヒトゲノムライブラリーは、Research Genetics （Huntsville、AL）、およびAmerican Type Culture Collection （Manassas、VA）などの業者から入手することができる。
【００９５】
cDNAクローンまたはゲノムクローンを含むライブラリーは、配列番号：1、4、7、10、または14に基づく1つもしくは複数のポリヌクレオチドプローブを用いて、標準的な方法（例えばAusubel （1995）、p.6-1〜6-11を参照）でスクリーニングすることができる。
【００９６】
ヒトZcytor21遺伝子をコードする核酸分子は、本明細書に記載されているように、Zcytor21遺伝子のヌクレオチド配列に基づくヌクレオチド配列を有する、オリゴヌクレオチドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によっても得られる。PCRによるライブラリーの一般的なスクリーニング法は例えばYuら、「Use of the Polymerase Chain Reaction to Screen Phage Libraries」、Methods in Molecular Biology、第15巻：PCR Protocols：Current Methods and Applications、White編、p.211〜215 （Humana Press社、1993）に記載されている。またPCRで関連遺伝子を単離する手法は、例えばPreston、「Use of Degenerate Oligonucleotide Primers and the Polymerase Chain Reaction to Clone Gene Family Members」、Methods in Molecular Biology、第15巻：PCR Protocols： Current Methods and Applications、White編、p.317〜337 （Humana Press社、1993）に記載されている。
【００９７】
後述する手順で作製される抗Zcytor21抗体も、ヒトZcytor21遺伝子をコードするDNA配列をcDNAライブラリーから単離する際に使用することができる。例えば、この抗体を用いてλgt11 発現ライブラリーのスクリーニングを行うことができるほか、同抗体を用いて、ハイブリッドの選択および翻訳に続く免疫スクリーニングを行うことができる（例えばAusubel （1995）、p.6-12〜6-16；Margolisら、「Screening λ expression libraries with antibody and protein probes」、DNA Cloning 2：Expression Systems、第2版、Gloverら共編、p.1〜14 （Oxford University Press、1995）を参照）。
【００９８】
これに代わる方法として、Zcytor21遺伝子は、相互に合成を開始する長いオリゴヌクレオチド、および本明細書に記載されたヌクレオチド配列を用いて核酸分子を合成することで得られる（例えばAusubel （1995）、p.8-8〜8-9を参照）。ポリメラーゼ連鎖反応を用いる確立された手法で、長さが少なくとも2キロベースのDNA分子を合成することができる（Adangら、Plant Molec. Biol. 21：1131 （1993）、Bambotら、PCR Methods and Applications 2：266 （1993）、Dillonら、「Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes」、Methods in Molecular Biology、第15巻：PCR Protocols：Current Methods and Applications、White編、p.263〜268、（Humana Press社、1993）、ならびにHolowachukら、PCR Methods Appl. 4：299 （1995））。
【００９９】
本発明の核酸分子は、ホスホラミダイト法などのプロトコルにしたがって「遺伝子装置」で合成することもできる。化学的に合成された2本鎖DNAが遺伝子または遺伝子断片の合成などの応用に必要であれば、各相補鎖を個別に作製する。短い遺伝子（60〜80塩基対）の作製は技術的に難しくなく、相補鎖を合成して、それらをアニーリングさせることで達成することができる。しかし長い遺伝子（＞300塩基対）を作製する際は、特別の戦略が必要となる場合がある。なぜなら化学的DNA合成中の各サイクルのカップリング効率が100%であることはまずないからである。この問題を克服するためには、合成遺伝子（2本鎖）を、長さが20〜100ヌクレオチドの1本鎖断片からモジュール状に集合させる。ポリヌクレオチド合成の総説については例えばGlickおよびPasternak、Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA （ASM Press、1994）、Itakuraら、Annu. Rev. Biochem. 53：323 （1984）、ならびにClimieら、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87：633 （1990）を参照されたい。
【０１００】
Zcytor21のcDNA、またはZcytor21のゲノム断片の配列は、標準的な方法で決定することができる。本明細書に開示されたZcytor21のポリヌクレオチド配列も、Zcytor21遺伝子の5'側の非コード領域をクローン化するためのプローブまたはプライマーとして使用することができる。Zcytor21遺伝子に由来するプロモーターエレメントを用いて、異種遺伝子の発現を、例えばトランスジェニック動物、または遺伝子治療を受ける患者で誘導することができる。Zcytor21のプロモーターまたは調節エレメントを含むゲノム断片の同定は、欠失解析などの周知の手法で行われる（一般にAusubel （1995）を参照）。
【０１０１】
5'隣接配列をクローニングすることでも、米国特許第5,641,670号に記載されている「遺伝子活性化」によるZcytor21タンパク質の作製が容易となる。簡単に説明すると、細胞内における内因性Zcytor21遺伝子の発現を、少なくとも標的配列、調節配列、エキソン、および対を形成していないスプライス供与部位を含むDNA構築物をZcytor21座位に導入することによって変化させる。標的配列は、構築物と内因性Zcytor21座位との相同組換えを可能とすることで、構築物内の配列が内因性Zcytor21のコード配列と使用可能に連結された状態となる、Zcytor21の5'側の非コード配列である。このようにして、内因性Zcytor21プロモーターが他の調節配列と置換可能となるほか、他の調節配列が追加されて組織特異的な発現（または調節された発現）が促進される。
【０１０２】
4．Zcytor21変種の作製
本発明は、本明細書に開示されたZcytor21ポリペプチドをコードするDNA分子およびRNA分子を含む、さまざまな核酸分子を提供する。当業者であれば、遺伝コードの縮重性をふまえて、かなりの配列変化が、このようなポリヌクレオチド分子で可能なことを容易に認識すると思われる。例えば配列番号：12は、配列番号：11のZcytor21-d2ポリペプチドをコードする全ての核酸分子を含む、縮重ヌクレオチド配列である。当業者であれば、配列番号：12の縮重配列が、TをUと読み替えることにより配列番号：11をコードするRNA配列をも提供することを認識すると思われる。したがって本発明は、配列番号：10のヌクレオチド66位〜ヌクレオチド2066位、およびこのRNA相当物を含むZcytor21-d2ポリペプチドをコードする核酸分子を想定している。同様に本発明は、Zcytor21-f1、Zcytor21-f5、Zcytor21-f6、Zcytor21-g13、およびこれらのRNA相当物をコードするヌクレオチド配列を含むZcytor21ポリペプチドをコードする核酸分子を想定している。
【０１０３】
表3に、配列番号：3、6、9、12、および16について、縮重ヌクレオチドの位置を示すために使用される1文字コードを示す。「分解」は、コード文字で表されるヌクレオチドである。「相補物」は、相補的なヌクレオチド（群）のコードを意味する。例えばコードYは、CまたはTのいずれかを意味し、またその相補物RはAまたはGを意味し、AはTに相補的であり、またGはCに相補的である。
【０１０４】
【表３】
2005508615.tif 000004
【０１０５】
任意のアミノ酸に対する可能な全てのコドンを含む配列番号：3、6、9、12、および16に使用される縮重コドンを表4に示す。
【０１０６】
【表４】
2005508615.tif 000005
【０１０７】
当業者であれば、アミノ酸をコードする可能な全てのコドンを代表する縮重コドンを決定する際に、多少のあいまいさが持ち込まれることを理解すると思われる。例えばセリンの縮重コドン（WSN）は、状況によってはアルギニン（AGR）をコードし、またアルギニン（MGN）の縮重コドンは、状況によってはセリン（AGY）をコードする。類似の関連性はフェニルアラニンおよびロイシンをコードするコドン間に存在する。したがって、縮重配列に含まれる一部のポリヌクレオチドは変種アミノ酸配列をコードする場合があるが、当業者であれば、このような変種配列を、配列番号：2、5、8、11、および15のアミノ酸配列を参照することで容易に同定することができる。変種配列は、その機能性を、本明細書に記載された手順で容易に検討することができる。
【０１０８】
さまざまな種で「優先的コドン使用」がみられる。一般的にはGranthamら、Nucl. Acids Res. 8：1893 （1980）、Haasら、Curr. Biol. 6：315 （1996）、Wain-Hobsonら、Gene 13：355 （1981）、GrosjeanおよびFiers、Gene 18：199 （1982）、Holm、Nuc. Acids Res. 14：3075 （1986）、Ikemura、J. Mol. Biol. 158：573 （1982）、Sharp およびMatassi、Curr. Opin. Genet. Dev. 4：851 （1994）、Kane、Curr. Opin. Biotechnol. 6：494 （1995）、ならびにMakrides、Microbiol. Rev. 60：512 （1996）を参照されたい。本明細書で用いられる「優先的コドン使用」または「優先的コドン」という表現は、ある種の細胞で最も高い頻度で使用されることによって、各アミノ酸をコードする可能なコドン（表4参照）の中でも1個または少数のコドンが優先される、タンパク質の翻訳に関与するコドンを示す、当技術分野における表現である。例えばアミノ酸スレオニン（Thr）は、ACA、ACC、ACG、またはACTによってコードされる場合があるが、哺乳類細胞ではACCが通常使用される。また他の種（例えば昆虫細胞、酵母、ウイルス、または細菌）では、異なるThrコドンが優先的に使用される場合がある。特定の種における優先的なコドンを、本発明のポリヌクレオチドに、当技術分野で周知のさまざまな方法で導入することができる。例えば、優先的コドン配列を組換えDNAに導入することによって、タンパク質の翻訳の効率を特定の細胞のタイプまたは種類で上昇することで、対象タンパク質の産生を高めることができる。したがって、本明細書に開示された縮重コドン配列は、当技術分野で広く使用され、かつ本明細書に開示された、さまざまな細胞のタイプまたは種類におけるポリヌクレオチドの発現を最適化するためのテンプレートとなる。優先的コドンを含む配列を検討して、さまざまな種における発現に最適化することが可能であり、また本明細書に記載された手順で機能性を検討することができる。
【０１０９】
本発明はさらに、他の種に由来する対応物（オーソログ）に代表される変種ポリペプチドおよび核酸分子を提供する。このような種には、哺乳類、鳥類、両生類、爬虫類、魚類、昆虫類、ならびに他の脊椎動物および無脊椎動物の種などが含まれるがこれらに限定されない。マウス、ブタ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、および他の霊長類のポリペプチドを含む、他の哺乳類種に由来するZcytor21ポリペプチドは特に重要である。ヒトZcytor21のオーソログは、本発明で提供される情報および組成と、従来のクローニング法を組み合わせることでクローン化することができる。例えばZcytor21のcDNAは、Zcytor21を発現する組織または細胞種から得られるmRNAを用いて、本明細書に記載された手順でクローン化することができる。mRNAの適切な供給源は、本明細書に記載された配列を元に設計されたプローブをノーザンブロットに使用することで同定することができる。次にライブラリーを、陽性を示した組織または細胞系列のmRNAから調製する。
【０１１０】
Zcytor21をコードするcDNAは、完全もしくは部分的なヒトcDNAの探索や、開示された配列に基づく1組または複数の縮重プローブを用いるといった、さまざまな方法で単離することができる。cDNAは、本明細書に記載された代表的なヒトZcytor21配列から設計されたプライマーを用いた、ポリメラーゼ連鎖反応でクローン化することもできる。またcDNAライブラリーを用いて、宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトすることが可能であり、また対象cDNAの発現は、Zcytor21ポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。
【０１１１】
当業者であれば、配列番号：10の配列がヒトZcytor21の1本の対立遺伝子であること、また対立遺伝子の変化および選択的スプライシングが起こると予想されることを理解すると思われる。この配列の対立遺伝子変種は、異なる個体に由来するcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーを、標準的な手順で探索することによってクローン化することができる。サイレント変異を含む変種、および変異がアミノ酸配列の変化を生じる変種を含む、本明細書に開示されたヌクレオチド配列の対立遺伝子変種は本発明の範囲に含まれる。これは、本明細書に開示されたアミノ酸配列の対立遺伝子変種であるタンパク質についても同様である。Zcytor21ポリペプチドの特徴を保持する、選択的スプライシングを受けたmRNAから生じたcDNA分子は本発明の範囲に含まれる。これは、このようなcDNAおよびmRNAにコードされたポリペプチドについても同様である。これらの配列の対立遺伝子変種およびスプライス変種は、さまざまな個体または組織に由来するcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーを、当技術分野で周知の標準的な手順で探索することによって、クローン化することができる。
【０１１２】
本発明のある態様では、単離された核酸分子は、本明細書に開示されたヌクレオチド配列を含む核酸分子と、ストリンジェントな条件でハイブリダイズすることが可能である。Zcytor21-d2をテンプレートとして用いることで、このような核酸分子は、ストリンジェントな条件で、配列番号：10のヌクレオチド配列を含む核酸分子と、配列番号：10のヌクレオチド66位〜2066位のヌクレオチド配列、配列番号：10のヌクレオチド135位〜1427位のヌクレオチド配列からなる核酸分子と、ハイブリダイズすることが可能であるか、または、配列番号：10のヌクレオチド配列、配列番号：10のヌクレオチド66位〜2066位、もしくは配列番号：10のヌクレオチド135位〜1427位のヌクレオチド配列のいずれかと相補的なヌクレオチド配列を含む核酸分子と、ハイブリダイズすることが可能である。一般にストリンジェントな条件は、特定の配列に関して一定のイオン強度およびpHでの熱融点（Tm）より約5℃低く選択される。Tmは、標的配列の50%が、完全にマッチしたプローブとハイブリダイズする（一定のイオン強度およびpHにおける）温度である。
【０１１３】
DNA-DNA、RNA-RNA、およびDNA-RNAなどの核酸分子の対は、対象ヌクレオチド配列がある程度の相補性をもつ場合にハイブリダイズすることが可能である。ハイブリッドは、二重鎖内にミスマッチのある塩基対を許容する場合があるが、ハイブリッドの安定性はミスマッチの程度の影響を受ける。ミスマッチを含むハイブリッドのTmは、1〜1.5%の塩基対のミスマッチにつき1℃低下する。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを変えることで、ハイブリッド中に存在するミスマッチの程度を制御することが可能となる。ストリンジェンシーの程度は、ハイブリダイゼーション温度を上昇し、またハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度を低下すると上昇する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、ハイブリッドのTmより約5℃〜25℃低い温度、および最大1 MのNa+を含むハイブリダイゼーション緩衝液を含む。低温における、より高い程度のストリンジェンシーは、ハイブリッドのTmを、緩衝液中1%ごとにつき約1℃低下させる、ホルムアミドを添加することで達成される。一般に、このようなストリンジェントな条件は温度が20℃〜70℃であり、また最大6×SSC、および0〜50%のホルムアミドを含むハイブリダイゼーション緩衝液を用いる。より高い程度のストリンジェンシーは、40℃〜70℃の温度で、最大4×SSCおよび0〜50%のホルムアミドを含むハイブリダイゼーション緩衝液を用いることで達成することができる。高度にストリンジェントな条件は典型的には、温度が42〜70℃で、ハイブリダイゼーション緩衝液が最大1×SSCおよび0〜50%のホルムアミドを含む。さまざまな程度のストリンジェンシーをハイブリダイゼーション時および洗浄時に用いることで、標的配列に対する最大の結合特異性を達成することができる。典型的には、ハイブリダイゼーション後の洗浄は、ハイブリダイズしないポリヌクレオチドプローブを、ハイブリダイズした複合体から除去するために、ストリンジェンシーの程度を高めて実施される。
【０１１４】
上記の条件は手引きであり、これらの条件を特定のポリペプチドハイブリッドを使用するために適合させることは当業者の能力の範囲内にある。特定の標的配列のTmは、標的配列の50%が、完全にマッチしたプローブ配列とハイブリダイズする（一定条件における）温度である。Tmに影響する条件には、ポリヌクレオチドプローブの長さおよび塩基対組成、ハイブリダイゼーション溶液のイオン強度、ならびにハイブリダイゼーション溶液中における不安定化薬剤の有無などがある。Tmを計算するための数多くの方程式が当技術分野で周知であり、さまざまな長さのDNA、RNA、およびDNA-RNAハイブリッド、およびポリヌクレオチドプローブの配列に特異的である（例えばSambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第2版 （Cold Spring Harbor Press、1989）；Ausubelら共編、Current Protocols in Molecular Biology （John Wiley and Sons社、1987）；BergerおよびKimmel共編、Guide to Molecular Cloning Techniques （Academic Press社、1987）；ならびにWetmur、Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26：227 （1990）を参照）。OLIGO 6.0 （LSR；Long Lake、MN）、およびPrimer Premier 4.0 （Premier Biosoft International；Palo Alto、CA）などの配列解析ソフトウェアならびにインターネット上のウェブサイトは、任意の配列の解析、および使用者が決定した基準におけるTmの計算に利用できるツールである。このようなプログラムは、一定の条件下における任意の配列を解析して、適切なプローブ配列を同定することもできる。典型的には、長い（＞50塩基対）ポリヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションは、Tm計算値より約20℃〜25℃低い温度で実施される。短い（＜50塩基対）プローブの場合、ハイブリダイゼーションは通常、Tmまたは5℃〜10℃低い温度で実施される。こうすることでDNA-DNAハイブリッド、およびDNA-RNAハイブリッドのハイブリダイゼーション速度が最大となる。
【０１１５】
ポリヌクレオチド配列の長さは、ハイブリッドの形成の速度および安定性に影響を及ぼす。短い（＜50 塩基対）プローブ配列では、相補的な配列で速やかに平衡に至るが、安定性に劣るハイブリッドが形成される場合がある。数分〜数時間の任意の範囲のインキュベーション時間が、ハイブリッド形成の達成に使用される場合がある。長いプローブ配列は、より緩やかに平衡に至るが、より低温であってもより安定な複合体を形成する。インキュベーションは一晩か、またはさらに長く続けることができる。一般にインキュベーションは、計算されたCot時間の3倍に相当する時間行われる。ポリヌクレオチド配列が解離するまでに要する時間であるCot時間は、特定の配列を対象に当技術分野で周知の方法で計算することができる。
【０１１６】
ポリヌクレオチド配列の塩基対組成は、ハイブリッド複合体の熱安定性に影響を及ぼすことによって、ハイブリダイゼーション温度およびハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度の選択に影響する。A-T対はG-C対と比較して、塩化ナトリウムを含む水溶液中で安定性に劣る。したがってG-C含量が多くなるほど、より安定なハイブリッドとなる。配列中におけるG残基とC残基の均等な分布は、ハイブリッドの安定性にプラスに寄与する。また塩基対組成を操作して任意の配列のTmを変えることができる。例えば、デオキシシチジンに代えて5-メチルデオキシシチジンを使用し、またチミジンに代えて5-ブロモデオキシウリジンを使用することでTmを上昇させることができる、グアノシンに代えて7-デアザ-2'-デオキシグアノシンを使用すると、Tmに対する依存性を低くすることができる。
【０１１７】
ハイブリダイゼーション緩衝液のイオン濃度もハイブリッドの安定性に影響を及ぼす。ハイブリダイゼーション緩衝液は一般に、デンハルト液（Sigma Chemical Co.、St. Louis、Mo.）、変性サケ精子DNA、tRNA、粉乳（BLOTTO）、ヘパリン、またはSDSなどのブロッキング剤、およびSSC （1×SSC：0.15 M 塩化ナトリウム、15 mM クエン酸ナトリウム）、またはSSPE （1×SSPE：1.8 M NaCl、10 mM NaH2PO4、1 mM EDTA、pH 7.7）などのNa+源を含む。ハイブリダイゼーション緩衝液は通常10 mM〜1 MのNa+を含む。ホルムアミド、テトラアルキルアンモニウム塩、グアニジウム陽イオン、またはチオシアナート陽イオンなどの不安定化剤または変性剤をハイブリダイゼーション溶液に添加すると、ハイブリッドのTmが変化する。通常ホルムアミドは、インキュベーションを、より簡便で低温で実施することを可能とするために最大50%の濃度で使用される。ホルムアミドには、RNAプローブを用いる際に、非特異的なバックグラウンドを低下させる作用もある。
【０１１８】
例として、変種Zcytor21ポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号：10のヌクレオチド配列（またはその相補物）を有する核酸分子と、50% ホルムアミド、5×SSC、50 mM リン酸ナトリウム（pH 7.6）、5×デンハルト液（100×デンハルト液：2% （w/v） Ficoll 400、2% （w/v）ポリビニルピロリドン、および2% （w/v）ウシ血清アルブミン）、10% デキストラン硫酸、および20 μg/ml 変性剪断サケ精子DNAを含む溶液中で、42℃で一晩ハイブリダイズさせることが可能である。当業者であれば、これらのハイブリダイゼーション条件をさまざまに変えることができる。例えば、ハイブリダイゼーション混合物を、より高い温度（約65℃など）で、ホルムアミドを含まない溶液中でインキュベートすることができる。また、あらかじめ混合してあるハイブリダイゼーション溶液（例えばCLONTECH Laboratories社製のEXPRESSHYB Hybridization Solution）を利用することが可能であり、またハイブリダイゼーションを製造業者の指示書にしたがって実施することができる。
【０１１９】
ハイブリダイゼーション後に核酸分子を洗浄し、ハイブリダイズしていない核酸分子をストリンジェントな条件、または高度にストリンジェントな条件で除去することができる。典型的なストリンジェントな洗浄条件には、0.5〜2×SSC、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含む溶液中での55℃〜65℃における洗浄がある。例として、変種Zcytor21-d2ポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号：10のヌクレオチド66位〜2066位のヌクレオチド配列（またはこの相補物）を含む核酸分子とハイブリダイズした状態を、洗浄時のストリンジェンシーが0.5〜2×SSC 、0.1% SDS（55℃〜65℃）（0.5×SSC 、0.1% SDS（55℃）、または2×SSC 、0.1% SDS（65℃）を含む）に相当するストリンジェントな洗浄条件で維持する。当業者であれば同等の条件を、例えば洗浄液中においてSSCをSSPEに代えることで容易に考案することができる。
【０１２０】
典型的な高度にストリンジェントな洗浄条件には、0.1〜0.2×SSC、0.1% ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の溶液中における50℃〜65℃での洗浄が含まれる。例えば、変種Zcytor21-d2ポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号：10のヌクレオチド66位〜2066位のヌクレオチド配列（またはこの相補物）を含む核酸分子とハイブリダイズした状態を、洗浄時のストリンジェンシーが0.1〜0.2×SSC、0.1% SDS（50〜65℃）（0.1x SSC、0.1% SDS（50℃）、または0.2×SSC、0.1% SDS（65℃）を含む）に相当する、高度にストリンジェントな洗浄条件で維持する。
【０１２１】
本発明は、配列番号：2、5、8、11、および15のポリペプチド、またはこれらのオーソログに実質的に類似の配列同一性を有する、単離されたZcytor21ポリペプチドも提供する。「実質的に類似の配列同一性」という表現は、本明細書では、配列番号：2、5、8、11、および15、またはこれらのオーソログの配列に対する配列同一性が少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または95%以上であるポリペプチドを意味する表現として用いられる。
【０１２２】
本発明は、以下の2つの基準を用いて同定可能なZcytor21変種核酸分子も想定している：コードされたポリペプチドと、本明細書に開示されたアミノ酸配列との類似性の判定、ならびに上述のハイブリダイゼーションアッセイ法。例として、Zcytor21-d2変種は、（1）配列番号：10のヌクレオチド66位〜2066位のヌクレオチド配列（またはこの相補物）を含む核酸分子と、洗浄時のストリンジェンシーが0.5〜2×SSC、0.1% SDS（55℃〜65℃）に相当するストリンジェントな洗浄条件でハイブリダイズした状態を維持する核酸分子、ならびに（2）配列番号：11のアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または95%以上の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を含む。あるいは、Zcytor21-d2変種は、（1）配列番号：10のヌクレオチド66位〜2066位のヌクレオチド配列（またはこの相補物）を含む核酸分子と、洗浄時のストリンジェンシーが0.1〜0.2×SSC、0.1% SDS（50〜65℃）に相当する高度にストリンジェントな洗浄条件で、ハイブリダイズした状態を維持する核酸分子、ならびに（2）配列番号：11のアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または95%以上の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を特徴とする場合がある。
【０１２３】
パーセント配列同一性は従来の方法で決定される。これについては例えばAltschulら、Bull. Math. Bio. 48：603 （1986）、ならびにHenikoffおよびHenikoff、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：10915 （1992）を参照されたい。簡単に説明すると、2つのアミノ酸配列を、ギャップオープニングペナルティ 10、ギャップエクステンションペナルティ 1、および表5（アミノ酸を標準的な1文字コードで表示）に示すHenikoffおよびHenikoff（前掲）のスコアリングマトリックス「BLOSUM62」を用いて、アライメントスコアが最適になるようにアライメントする。パーセント同一性は、以下の式で計算される：（［同一なマッチの総数］/［長い方の配列の長さ＋2つの配列をアライメントする目的で長い方の配列に導入されたギャップ数］）×（100）。
【０１２４】
【表５】
2005508615.tif 000006
【０１２５】
当業者であれば、2つのアミノ酸配列をアライメントするために多くの確立されたアルゴリズムを利用できることを理解する。PearsonおよびLipmanによる「FASTA」類似性探索アルゴリズムは、本明細書に開示されたアミノ酸配列と、推定Zcytor21変種アミノ酸配列で共有される同一性レベルを調べるための、適切なタンパク質アライメント法である。FASTAアルゴリズムについてはPearsonおよびLipman、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85：2444 （1988）、ならびにPearson、Meth. Enzymol. 183：63 （1990）に記載されている。簡単に説明すると、FASTAでは最初に、クエリ配列（例えば配列番号：11）と、最高密度の同一性（ktup変数が1の場合）か、同一性の対（ktup＝2の場合）のいずれかを有する被験配列との間で共有される領域を、保存的アミノ酸の置換、挿入、または欠失を考慮することなく同定することで配列類似性が明らかにされる。次に同一性密度の最も高い10の領域を、全ての対になったアミノ酸の類似性をアミノ酸置換マトリックスで比較することで再びスコア化し、同領域の末端を「切り詰める」ことで、最高のスコアに寄与する残基のみを含むようにする。仮にスコアが「カットオフ」値（所定の公式で配列の長さとktup値を元に計算される）より大きい複数の領域が存在すれば、切り詰められた当初の領域を調べて、対象領域が連結して、ギャップを含む適切なアライメントを形成可能か否かを判定する。最後に2つのアミノ酸配列の最高スコアリング領域を、アミノ酸の挿入および欠失を可能とする改変Needleman-Wunsch-Sellersアルゴリズム（NeedlemanおよびWunsch、J. Mol. Biol. 48：444 （1970）；Sellers、SIAM J. Appl. Math. 26：787 （1974））を用いてアライメントする。FASTA解析の例示的なパラメータは、ktup＝1、ギャップオープニングペナルティ＝10、ギャップエクステンションペナルティ＝1、および置換マトリックス＝BLOSUM62である。これらのパラメータは、Pearson、Meth. Enzymol. 183：63 （1990）の補遺2に説明されているように、スコアリングマトリックスファイル（「SMATRIX」）を改変することでFASTAプログラムに導入することができる。
【０１２６】
FASTAを使用して、上述の比を用いて核酸分子の配列同一性を決定することもできる。ヌクレオチド配列を比較する場合は、ktup値を1〜6、好ましくは3〜6、最も好ましくは3にするとよい（他のパラメータセットは上述の通り）。
【０１２７】
本発明は、本明細書に開示されたアミノ酸配列と比較して保存的アミノ酸変化を有するポリペプチドをコードする核酸分子を含む。例えば、Zcytor21のアミノ酸配列中のアルキルアミノ酸がアルキルアミノ酸に置換されているか、Zcytor21のアミノ酸配列の芳香族アミノ酸が芳香族アミノ酸に置換されているか、Zcytor21のアミノ酸配列の硫黄含有アミノ酸が硫黄含有アミノ酸に置換されているか、Zcytor21のアミノ酸配列の水酸基含有アミノ酸が水酸基含有アミノ酸に置換されているか、Zcytor21のアミノ酸配列の酸性アミノ酸が酸性アミノ酸に置換されているか、Zcytor21のアミノ酸配列の塩基性アミノ酸が塩基性アミノ酸に置換されているか、またはZcytor21のアミノ酸配列の二塩基性で1個のカルボキシル基を持つアミノ酸が二塩基性で1個のカルボキシル基を持つアミノ酸に置換されている、配列番号：2、5、8、11、または15の1つまたは複数のアミノ酸置換を含む変種を入手することができる。一般的なアミノ酸のなかで、例えば「保存的アミノ酸置換」は、以下のグループの各アミノ酸間の置換によって説明される：（1）グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、（2）フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、（3）セリンおよびスレオニン、（4）アスパラギン酸およびグルタミン酸、（5）グルタミンおよびアスパラギン、ならびに（6）リシン、アルギニン、およびヒスチジン。
【０１２８】
BLOSUM62の表は、500を超えるのグループの関連タンパク質の高度に保存された領域を代表する、タンパク質配列セグメントの約2,000の局所的マルチプルアライメントに由来するアミノ酸置換マトリックスである（HenikoffおよびHenikoff、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89：10915 （1992））。したがってBLOSUM62置換頻度を用いて、本発明のアミノ酸配列に導入可能な保存的アミノ酸置換を決定することができる。化学的特徴（上述）のみを元にアミノ酸置換を設計することは可能であるが、「保存的アミノ酸置換」という表現は、好ましくは-1を上回るBLOSUM62値で示される置換を意味する。例えばアミノ酸置換は、置換が0、1、2、または3のBLOSUM62値で特徴づけられる場合は保存的である。この系では、好ましい保存的アミノ酸置換は、少なくとも1（例えば1、2、または3）のBLOSUM62値によって決定されるが、より好ましい保存的アミノ酸置換は、少なくとも2（例えば2または3）のBLOSUM62値によって決定される。
【０１２９】
Zcytor21の特定の変種は、対応するアミノ酸配列（例えば配列番号：2、5、8、11、または15）に対して少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または95%以上の配列同一性を有し、アミノ酸配列の変化は1個または複数の保存的アミノ酸置換により特徴付けられる。
【０１３０】
Zcytor21遺伝子の保存的アミノ酸変化は例えば、配列番号：10に記載されたヌクレオチドを別のヌクレオチドと置換することで導入することができる。このような「保存的アミノ酸」の変種は、オリゴヌクレオチドを利用する変異誘発法、リンカースキャニング変異誘発法、ポリメラーゼ連鎖反応などを用いる変異誘発法で得られる（Ausubel （1995）、p.8-10〜8-22；およびMcPherson編、Directed Mutagenesis：A Practical Approach （IRL Press、1991）を参照）。変種Zcytor21ポリペプチドは、抗Zcytor21抗体に特異的に結合する能力を指標として同定することができる。
【０１３１】
本発明のタンパク質は、非天然のアミノ酸残基を含む場合もある。非天然のアミノ酸には、トランス-3-メチルプロリン、2,4-メタノプロリン、シス-4-ヒドロキシプロリン、トランス-4-ヒドロキシプロリン、N-メチルグリシン、アロ-スレオニン、メチルスレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、3-および4-メチルプロリン、3,3-ジメチルプロリン、tert-ロイシン、ノルバリン、2-アザフェニルアラニン、3-アザフェニルアラニン、4-アザフェニルアラニン、および4-フルオロフェニルアラニンなどが含まれるがこれらに限定されない。非天然のアミノ酸残基をタンパク質に導入する複数の方法が当技術分野で周知である。例えば、化学的にアミノアシル化されたサプレッサーtRNAを用いてナンセンス変異が抑制されたインビトロ系を使用することができる。アミノ酸およびアミノアシル化されたtRNAを合成する方法は当技術分野で周知である。ナンセンス変異を含むプラスミドの転写および翻訳は通常、大腸菌S30抽出物、ならびに市販の酵素および他の試薬を含む無細胞系で実施される。タンパク質はクロマトグラフィーで精製される。これについては例えばRobertsonら、J. Am. Chem. Soc. 113：2722 （1991）、Ellmanら、Methods Enzymol. 202：301 （1991）、Chungら、Science 259：806 （1993）、およびChungら、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90：10145 （1993）を参照されたい。
【０１３２】
第2の方法では、変異を含むmRNAと、化学的にアミノアシル化されたサプレッサーtRNAのマイクロインジェクションによって、ツメガエル（Xenopus）の卵母細胞で翻訳を行う（Turcattiら、J. Biol. Chem. 271：19991 （1996））。第3の方法では、大腸菌細胞を、置換される天然アミノ酸（例えばフェニルアラニン）の非存在下で、かつ所望の非天然のアミノ酸（群）（例えば2-アザフェニルアラニン、3-アザフェニルアラニン、4-アザフェニルアラニン、または4-フルオロフェニルアラニン）の存在下で培養する。これらの非天然のアミノ酸は、タンパク質中で天然のアミノ酸に代わって取り込まれる。これについてはKoideら、Biochem. 33：7470 （1994）を参照されたい。天然のアミノ酸残基は、インビトロ化学修飾法で非天然の種に変換することができる。化学修飾を部位特異的変異誘発法と組み合わせて、置換の範囲をさらに拡張することができる。（Wynn およびRichards、Protein Sci. 2：395 （1993））。
【０１３３】
限られた数の非保存的アミノ酸、遺伝コードにコードされていないアミノ酸、非天然のアミノ酸、ならびに非天然のアミノ酸をZcytor21のアミノ酸残基と置換することができる。
【０１３４】
本発明のポリペプチド中の必須アミノ酸は、部位特異的変異誘発法、またはアラニン-スキャニング変異誘発法（CunninghamおよびWells、Science 244：1081 （1989）、Bassら、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 88：4498 （1991）、CoombsおよびCorey、「Site Directed Mutagenesis and Protein Engineering」、Proteins：Analysis and Design、Angeletti編、p.259〜311 （Academic Press社、1998））などの当技術分野で周知の手順で同定することができる。後者の手法では、1つのアラニン変異を、分子内のあらゆる残基に導入し、結果として得られた変異体分子を対象に生物学的活性の検討を行って、同分子の活性に重要なアミノ酸残基を同定する。これについてはHiltonら、J. Biol. Chem. 271：4699 （1996）も参照されたい。
【０１３５】
配列解析は、Zcytor21のリガンド結合領域を詳細に決定する際に用いることができるが、Zcytor21の結合活性に役割を果たすアミノ酸は、核磁気共鳴、結晶解析、電子線回折、または推定接触部位のアミノ酸の変位を伴う光親和性ラベリングなどの手法で決定されるように、構造の物理的解析によって決定することもできる。これについては例えばde Vosら、Science 255：306 （1992）、Smithら、J. Mol. Biol. 224：899 （1992）、およびWlodaverら、FEBS Lett. 309：59 （1992）を参照されたい。
【０１３６】
複数のアミノ酸置換を、Reidhaar-OlsonおよびSauer （Science 241：53 （1988））、またはBowieおよびSauer （Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86：2152 （1989））に記載されている方法などの、既知の変異誘発法およびスクリーニング法で作製して検討することができる。簡単に説明すると、著者らは、ポリペプチド中の2か所またはそれ以上の位置を同時にランダム化し、機能性ポリペプチドを選択した後に、変異が誘発されたポリペプチドの配列を決定することで、各位置における可能な置換の範囲を決定する方法について説明している。使用可能な他の方法には、ファージディスプレイ（例えばLowmanら、Biochem. 30：10832 （1991）、Ladnerら、米国特許第5,223,409号、Huse、国際公開公報第92/06204号、ならびに領域特異的変異誘発法（Derbyshireら、Gene 46：145 （1986）、およびNerら、DNA 7：127、（1988））などがある。さらに、ビオチンまたはFITCで標識されたZcytor21を、Zcytor21のリガンドの発現クローニングに使用することができる。
【０１３７】
開示されたZcytor21のヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の変種は、Stemmer、Nature 370：389 （1994）、Stemmer、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 91：10747 （1994）、および国際公開公報第97/20078号に記載されているDNAシャッフリングによって作製することができる。簡単に説明すると、変種DNA分子を、親DNAのランダム断片化と、これに続くPCRによる再結合によって、ランダムに導入された点変異を得る、インビトロ相同組換えによって作製する。この手法は、対立遺伝子変種や異なる種に由来するDNA分子などの親DNA分子のファミリーを用いて改変することで、付加的な変化を同プロセスに導入することができる。変異誘発、およびアッセイ法の追加的な繰り返しに続く、所望の活性の選択またはスクリーニングは、有害な変化を同時に排除しながら、所望の変異を選択することによって配列の速やかな「進化」をもたらす。
【０１３８】
本明細書に開示された変異誘発法を、高スループットの自動化スクリーニング法と組み合わせることで、宿主細胞における、クローン化され変異が誘発されたポリペプチドの活性を検出することができる。生物学的に活性のあるポリペプチド、または抗Zcytor21抗体に結合するポリペプチドをコードする、変異が誘発されたDNA分子を宿主細胞から回収して最新装置で高速に配列を決定することができる。このような方法は、対象ポリペプチド内の個々のアミノ酸残基の重要性の迅速な決定を可能とし、また構造が未知のポリペプチドに応用することができる。
【０１３９】
本発明は、Zcytor21ポリペプチド、およびこのような機能性断片をコードする核酸分子の「機能性断片」も含む。常用的な核酸分子の欠失解析を行うことで、Zcytor21ポリペプチドをコードする核酸分子の機能性断片が得られる。例として、配列番号：10のヌクレオチド66位〜2066位のヌクレオチド配列を含むDNA分子をBal31ヌクレアーゼで切断することで、一連の入れ子状態の欠失体が得られる。次に同断片を、発現ベクターに適切な読み枠で挿入し、発現されたポリペプチドを単離して、抗Zcytor21抗体結合能力を検討する。エキソヌクレアーゼ切断に代わる1つの方法では、オリゴヌクレオチド標的変異誘発法を用いて、所望の断片の産生を特定するために欠失または停止コドンを導入する。あるいは、Zcytor21遺伝子特定の断片をポリメラーゼ連鎖反応で合成することができる。機能性断片の例はZcytor21の細胞外ドメインである（すなわち配列番号：11のアミノ酸残基24位〜454位、配列番号：2のアミノ酸残基24位〜376位、配列番号：5のアミノ酸残基24位〜396位、配列番号：8のアミノ酸残基24位〜533位、または配列番号：15のアミノ酸残基24位〜444位）。
【０１４０】
このような一般的な方法は、HorisbergerおよびDi Marco、Pharmac. Ther. 66：507 （1995）で解説されている、インターフェロンのいずれかの末端、または両端の切断に関する研究によって代表される。また、タンパク質の機能解析の標準的な手法は例えばTreuterら、Molec. Gen. Genet. 240：113 （1993）、Contentら、「Expression and preliminary deletion analysis of the 42 kDa 2-5A synthetase induced by human interferon」、Biological Interferon Systems、Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems、Cantell編、p.65〜72 （Nijhoff、1987）、Herschman、「The EGF Receptor」、Control of Animal Cell Proliferation、第1巻、Boyntonら共編、p.169〜199 （Academic Press、1985）、Coumailleauら、J. Biol. Chem. 270：29270 （1995）；Fukunagaら、J. Biol. Chem. 270：25291 （1995）；Yamaguchiら、Biochem. Pharmacol. 50：1295 （1995）、ならびにMeiselら、Plant Molec. Biol. 30：1 （1996）で説明されている。
【０１４１】
本発明は、本明細書に開示されたアミノ酸配列と比較して、アミノ酸の変化を有するZcytor21遺伝子の機能性断片も想定している。変種Zcytor21遺伝子は、開示されたヌクレオチド配列およびアミノ酸配列における同一性のレベルを上述の手順で決定することで、構造を元に同定することができる。構造を基礎とする、変種遺伝子を同定する別の方法では、潜在的変種Zcytor21遺伝子をコードする核酸分子が、配列番号：10などのZcytor21 ヌクレオチド配列を含む核酸分子とハイブリダイズするか否かを判定する。
【０１４２】
本発明は、本明細書に記載された、Zcytor21ポリペプチドのエピトープ含有部分を含むポリペプチド断片またはペプチドも提供する。このような断片またはペプチドは、タンパク質全体が免疫原として使用される場合に抗体応答を誘発するタンパク質の一部である「免疫原性エピトープ」を含む場合がある。免疫原性のエピトープ含有ペプチドは標準的な方法（例えばGeysenら、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 81：3998 （1983）を参照）で同定することができる
【０１４３】
対照的に、ポリペプチド断片またはペプチドは、抗体が特異的に結合可能なタンパク質分子の領域である「抗原性エピトープ」を含む場合がある。あるエピトープは直線状または連続したアミノ酸を含み、このようなエピトープの抗原性は変性剤によって破壊されない。タンパク質のエピトープを擬態しうる比較的短い合成ペプチドを用いて、同タンパク質に対する抗体の産生を高められることが知られている（例えばSutcliffeら、Science 219：660 （1983）を参照）。したがって、本発明の抗原性エピトープ含有ペプチド（およびポリペプチド）は、本明細書に記載されたポリペプチドに結合する抗体の産生に有用である。
【０１４４】
抗原性エピトープ含有ペプチドおよびポリペプチドは、本明細書に開示されたアミノ酸配列の少なくとも4〜10残基のアミノ酸、少なくとも10〜15残基のアミノ酸、または約15〜約30残基のアミノ酸を含む場合がある。このようなエピトープ含有ペプチドおよびポリペプチドは、本明細書に記載されるように、Zcytor21ポリペプチドを断片化するか、または化学的なペプチド合成法によって作製することができる。またエピトープは、ランダムペプチドライブラリーを対象としたファージディスプレイ法で選択することができる（例えばLaneおよびStephen、Curr. Opin. Immunol. 5：268 （1993）、ならびにCorteseら、Curr. Opin. Biotechnol. 7：616 （1996）を参照）。エピトープを同定し、エピトープを含む短いポリヌクレオチドから抗体を作製する標準的な方法は、例えばMole、「Epitope Mapping」、Methods in Molecular Biology、第10巻、Manson編、p.105〜116 （The Humana Press社、1992）、Price、「Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies」、Monoclonal Antibodies：Production, Engineering, and Clinical Application、RitterおよびLadyman共編、p.60〜84 （Cambridge University Press、1995）、ならびにColiganら共編、Current Protocols in Immunology、p.9.3.1〜9.3.5、およびp.9.4.1〜9.4.11 （John Wiley & Sons、1997）で説明されている。
【０１４５】
上述の用途に加えて、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、遺伝学および分子生物学、タンパク質化学、ならびに抗体の産生および解析に関連する課程を対象とした実験実習課目のキットに含まれる教育用ツールとして有用である。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの配列が固有であるため、Zcytor21分子を標準品または検証目的の「未知標品」として使用することができる。有利なことに本発明は、解析に適した4種類のZcytor21変種を提供する。例としてZcytor21ポリヌクレオチドを、例えばZcytor21が発現される遺伝子である融合構築物を含む、細菌、ウイルス、または哺乳類における発現用の発現構築物の調製法；ポリヌクレオチドの制限エンドヌクレアーゼ切断部位の決定法；組織におけるZcytor21のポリヌクレオチドのmRNAおよびDNAの位置の決定法（ノーザンブロッティングおよびサザンブロッティング、ならびにポリメラーゼ連鎖反応による）；ならびに関連するポリヌクレオチドおよびポリペプチドの核酸ハイブリダイゼーションによる同定法を学生に教示するための教材として使用することができる。例として学生は、配列番号：10のヌクレオチド66位〜2066位のヌクレオチド配列を含む核酸分子をBamHIで切断することによって、約475塩基対と1526塩基対の2種類の断片が生じることを、またXhoIによる切断で約963塩基対と1038塩基対の断片が得られることを理解すると思われる。
【０１４６】
Zcytor21ポリペプチドは、抗体の調製法；ウェスタンブロッティングによるタンパク質の同定法；タンパク質の精製法；発現Zcytor21ポリペプチドの、総発現タンパク質に対する比としての重量の決定法；ペプチド切断部位の同定法；アミノ末端およびカルボキシル末端におけるタグの結合法；アミノ酸配列解析法、ならびに天然型タンパク質およびタグ付加型タンパク質（プロテアーゼ阻害）の両方の生物学的活性の、インビトロおよびインビボにおけるモニタリングに限定されない方法を教えるための教材として使用することができる。例えば学生は、糖鎖が付加していないZcytor21のヒドロキシルアミンによる消化によって、おおよその分子量が36361と38465の2つの断片が得られること、また糖鎖が付加していないZcytor21の穏和な酸加水分解による消化によって、おおよその分子量が18042、45959、および10842である断片が得られることを理解すると思われる。
【０１４７】
Zcytor21ポリペプチドは、高次構造（特に4つのαらせん）を決定するための質量分析や円二色性、原子レベルにおける詳細な3次元構造を決定するためのX線結晶解析、溶液中のタンパク質の構造を明らかにするための核磁気共鳴スペクトル法などの分析スキルを教えるために使用することもできる。例えば、Zcytor21を含むキットを学生に与えて解析させることができる。指導担当者は、このようなアミノ酸配列の正体を知っているので、タンパク質を、学生のスキルを見極めるための、または学生のスキル向上のための標品として学生に与えることで、指導担当者は、学生がポリペプチドを正確に解析したか否かを知ることができると思われる。全てのポリペプチドは固有であるので、Zcytor21の教育的価値はそれ自体に固有となる。
【０１４８】
Zcytor21に特異的に結合する抗体は、アフィニティクロマトグラフィーカラムを調製して、Zcytor21を精製し、抗体をコードするポリヌクレオチドをクローン化して配列を決定する方法について学生を指導するための教材として、またヒト化抗体の設計法を学生に教える実習科目として使用することができる。したがってZcytor21の遺伝子、ポリペプチド、または抗体は、学生が分子生物学分野におけるスキルを獲得するために、試薬業者によって包装されて教育機関に販売される場合がある。個々の遺伝子およびタンパク質は固有なので、個々の遺伝子およびタンパク質は、学生にとって実験実習課目における独自の問題ならびに学習経験となる。Zcytor21の遺伝子、ポリペプチド、または抗体を含む、このような教育用キットは、本発明の範囲内に含まれるとみなされる。
【０１４９】
変種および融合タンパク質を含む任意のZcytor21ポリペプチドについては、当業者であれば、変種をコードする完全に縮重したポリヌクレオチド配列を、表3および表4記載の一連の情報を用いて容易に作製することができる。また当業者であれば、標準的なソフトウェアを使用して、本明細書に記載されたヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を元にZcytor21変種を考案することができる。したがって本発明は、以下の配列の少なくとも1つを提供するデータ構造で暗号化されたコンピュータ可読のメディアを含む：配列番号：1、配列番号：2、配列番号：3、配列番号：4、配列番号：5、配列番号：6、配列番号：7、配列番号：8、配列番号：9、配列番号：10、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：14、配列番号：15、および配列番号：16。適切な形状のコンピュータ可読メディアには、磁気メディアや光可読性メディアなどがある。磁気メディアの例には、ハード型（固定ドライブ）、ランダムアクセスメモリ（RAM）チップ、フロッピーディスク、デジタルリニアテープ（DLT）、ディスクキャッシュ、およびZIPディスクなどがある。光可読メディアには、コンパクトディスク（例えば読み出し専用CD（ROM）、書き換え可能（RW）CD、記録可能CD）、ならびにデジタル多用途/ビデオディスク（DVD）（例えばDVD-ROM、DVD-RAM、およびDVD+RW）などがある。
【０１５０】
5．Zcytor21ポリペプチドの作製
完全長のポリペプチド、機能性断片、および融合タンパク質を含む本発明のポリペプチドは、従来の手法によって組換え宿主細胞で作製することができる。Zcytor21遺伝子を発現させるためには、ポリペプチドをコードする核酸分子を、発現ベクター上における転写発現を制御する調節配列に使用可能に連結した後に、宿主細胞に導入しなければならない。プロモーターやエンハンサーなどの転写調節配列に加えて、発現ベクターは、翻訳調節配列や、発現ベクターを有する細胞の選択に適したマーカー遺伝子を含む場合がある。
【０１５１】
真核細胞における外来タンパク質の産生に適した発現ベクターは通常、（1）細菌宿主における発現ベクターの成長および選択用に細菌の複製起点および抗生物質耐性マーカーをコードする、原核生物のDNAエレメント；（2）プロモーターなどの、転写の開始を制御する真核生物のDNAエレメント；ならびに（3）転写終結配列/ポリアデニル化配列などの、転写物のプロセシングを制御するDNAエレメントを含む。上述したように、発現ベクターは、異種ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に導く分泌配列をコードするヌクレオチド配列を含む場合がある。例えばZcytor21発現ベクターは、Zcytor21遺伝子、および任意の分泌関連遺伝子に由来する分泌配列を含む場合がある。
【０１５２】
本発明のZcytor21タンパク質は哺乳類細胞で発現可能である。適切な哺乳類宿主細胞の例には、アフリカミドリザルの腎細胞（Vero；ATCC CRL 1587）、ヒト胚の腎細胞（293 HEK；ATCC CRL 1573）、ベビーハムスターの腎細胞（BHK-21、BHK-570；ATCC CRL 8544、ATCC CRL 10314）、イヌの腎細胞（MDCK；ATCC CCL 34）、チャイニーズハムスターの卵巣細胞（CHO-K1；ATCC CCL61；CHO DG44 （Chasinら、Som. Cell. Molec. Genet. 12：555、1986））、ラットの下垂体細胞（GE1；ATCC CCL82）、HeLa S3細胞（ATCC CCL2.2）、ラットの肝腫瘍細胞（H-4-II-E；ATCC CRL 1548）、SV40で形質転換したサル腎細胞（COS-1；ATCC CRL 1650）、およびマウスの胚細胞（NIH 3T3；ATCC CRL 1658）などがある。
【０１５３】
哺乳類宿主の場合、転写および翻訳の調節シグナルは、調節シグナルが高レベルで発現する特定の遺伝子と関連している、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、シミアンウイルスなどのウイルス供給源に由来する場合がある。適切な転写用および翻訳用の調節配列は、アクチン、コラーゲン、ミオシン、およびメタロチオネインの遺伝子などの哺乳類の遺伝子からも得られる。
【０１５４】
転写調節配列は、RNA合成の開始を十分誘導するプロモーター領域を含む。適切な真核生物のプロモーターには、マウスのメタロチオネインI遺伝子のプロモーター（Hamerら、J. Molec. Appl. Genet. 1：273 （1982））、ヘルペスウイルスのTKプロモーター（McKnight、Cell 31：355 （1982））、SV40の初期プロモーター（Benoistら、Nature 290：304 （1981））、ラウス肉腫ウイルスのプロモーター（Gormanら、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 79：6777 （1982））、サイトメガロウイルスのプロモーター（Foeckingら、Gene 45：101 （1980））、ならびにマウスの乳腺腫瘍ウイルスのプロモーター（一般的にはEtcheverry、「Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture」、Protein Engineering：Principles and Practice、Clelandら共編、p.163〜181 （John Wiley & Sons社、1996）を参照）などがある。
【０１５５】
あるいは、バクテリオファージT3 RNA ポリメラーゼのプロモーターなどの原核生物のプロモーターを用いて、哺乳類細胞におけるZcytor21遺伝子発現を制御することができる（この原核生物のプロモーターが真核生物のプロモーターによって調節される場合）（Zhouら、Mol. Cell. Biol. 10：4529 （1990）、およびKaufmanら、Nucl. Acids Res. 19：4485 （1991））。
【０１５６】
発現ベクターは、リン酸カルシウムトランスフェクション法、リポソームを用いるトランスフェクション法、微粒子銃輸送法、エレクトロポレーションなどの、さまざまな標準的な手法で宿主細胞に導入することができる。形質転換細胞を選択して増殖させることで、宿主細胞のゲノムに安定に組み込まれた発現ベクターを含む組換え宿主細胞が得られる。ベクターを真核細胞に導入する手法、および優性選択マーカーを用いて安定形質転換体を選択する手法は例えばAusubel （1995）、およびMurray編、Gene Transfer and Expression Protocols （Humana Press、1991）に記載されている。
【０１５７】
例えば1つの適切な選択マーカーは、抗生物質ネオマイシンに対する耐性を提供する遺伝子である。この場合、選択はG-418などのネオマイシン系の薬剤の存在下で行われる。選択系を用いて、対象遺伝子の発現レベルを上昇させることもできる（「増幅」と呼ばれる過程）。増幅は、形質転換体を低レベルの選択用薬剤の存在下で培養した後に、選択用薬剤を増量して、高レベルの導入遺伝子の産物を産生する細胞を選択することで行われる。適切な増幅可能な選択マーカーの1つは、メトトレキセートに対する耐性もたらすジヒドロ葉酸還元酵素である。他の薬剤耐性遺伝子（例えばハイグロマイシン耐性、多剤耐性、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ）を使用することもできる。あるいは、緑色蛍光タンパク質や、CD4、CD8、クラスIのMHC、胎盤アルカリホスファターゼなどの細胞表面タンパク質などの表現型の変化を導入するマーカーを用いて、非トランスフェクト細胞と、トランスフェクト細胞とを、FACSソーティングや磁気ビーズ分離法などの手段で識別することができる。
【０１５８】
Zcytor21ポリペプチドを、ウイルス輸送系を用いて培養哺乳類細胞に作製させることもできる。この目的における例示的なウイルスには、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、およびアデノ関連ウイルス（AAV）などがある。2本鎖DNAウイルスであるアデノウイルスは現在、異種核酸の輸送に用いられる最も詳しく研究されている遺伝子輸送用ベクターである（例えばBeckerら、Meth. Cell Biol. 43：161 （1994）、ならびにDouglasおよびCuriel、Science & Medicine 4：44 （1997）を参照）。アデノウイルス系の利点は、比較的長いDNA挿入物を収容することができること、高力価で成長可能なこと、広範囲の哺乳類細胞種に感染可能なこと、ならびに、さまざまなプロモーターを含む多数の利用可能なベクターの使用を可能とする柔軟性である。
【０１５９】
アデノウイルスゲノムの一部を欠失させることで、異種DNAの長い挿入物（最長7 kb）を収容することができる。このような挿入物は、直接連結によって、または同時にトランスフェクトされたプラスミドとの相同組換えによって、ウイルスDNAに導入することができる。1つの選択肢は、本質的なE1遺伝子をウイルスベクターから欠失させて、E1遺伝子が宿主細胞から提供されない限り、複製不能とすることである。例えば、アデノウイルスベクターを感染させたヒト293細胞（ATCC Nos. CRL-1573、45504、45505）は、接着性細胞として、または懸濁培養物中で比較的高い細胞密度で成長させることで、かなりの量のタンパク質を産生させることができる（Garnierら、Cytotechnol. 15：145 （1994）を参照）。
【０１６０】
Zcytor21は、鳥類、真菌、昆虫、酵母、または植物細胞などの他の高等真核細胞で発現させることもできる。バキュロウイルス系は、クローン化されたZcytor21遺伝子を昆虫細胞に導入するための有効な手段となる。適切な発現ベクターは、Autographa californica核多角体病ウイルス（AcMNPV）を元にし、ショウジョウバエの熱ショックタンパク質（hsp）70プロモーター、Autographa californica核多角体病ウイルスの極初期遺伝子のプロモーター（ie-1）および後発型初期39Kプロモーター、バキュロウイルスのp10プロモーター、ならびにショウジョウバエのメタロチオネインプロモーターなどの既知のプロモーターを含む。組換えバキュロウイルスを作製する第2の方法では、Luckow （Luckowら、J. Virol. 67：4566 （1993））に記載されたトランスポゾンをベースとした系を用いる。輸送用ベクターを利用するこの系は、BAC-to-BACキットとして販売されている（Life Technologies、Rockville、MD）。この系では、Zcytor21ポリペプチドをコードするDNAを「バクミド（bacmid）」と呼ばれる大型プラスミドとして大腸菌内で維持されるバキュロウイルスゲノムに移動させる、Tn7トランスポゾンを含む輸送用ベクターPFASTBAC （Life Technologies）を用いる。これについてはHill-PerkinsおよびPossee、J. Gen. Virol. 71：971 （1990）、Bonningら、J. Gen. Virol. 75：1551 （1994）、ならびにChazenbalkおよびRapoport、J. Biol. Chem. 270：1543 （1995）を参照されたい。また輸送用ベクターは、発現されるZcytor21ポリペプチドのC末端またはN末端におけるエピトープタグ（例えばGlu-Gluエピトープタグ（Grussenmeyerら、Proc. Nat'l Acad. Sci. 82：7952 （1985）））をコードするDNAとの読み枠の合った融合物を含む場合がある。当技術分野で周知の手法で、Zcytor21遺伝子を含む輸送用ベクターで大腸菌を形質転換し、組換えバキュロウイルスの指標となる中断されたlacZ遺伝子を含むバクミドのスクリーニングを行う。次に、組換えバキュロウイルスゲノムを含むバクミドDNAを一般的な手法で単離する。
【０１６１】
例示的なPFASTBACベクターは、かなりの程度改変することができる。例えばポリヘドリンプロモーターを除去し、バキュロウイルス感染の初期に発現され、分泌タンパク質を発現させるために有利なことがわかっているバキュロウイルスの塩基性タンパク質プロモーター（Pcor、p6.9、またはMPプロモーターとしても知られる）と置換することが可能である（例えばHill-PerkinsおよびPossee、J. Gen. Virol. 71：971 （1990）、Bonningら、J. Gen. Virol. 75：1551 （1994）、ならびにChazenbalkおよびRapoport、J. Biol. Chem. 270：1543 （1995）を参照）。このような輸送用ベクター構築物では、短い、または長いバージョンの塩基性タンパク質プロモーターを使用することができる。また輸送用ベクターは、天然のZcytor21分泌シグナル配列が、昆虫タンパク質に由来する分泌シグナル配列と置換するように構築することができる。例えばエクジステロイドグルコシルトランスフェラーゼ（Ecdysteroid Glucosyltransferase; EGT）、ミツバチのメリチン（Melittin）（Invitrogen Corporation；Carlsbad、CA）、またはバキュロウイルスgp67 （PharMingen：San Diego、CA）に由来する分泌シグナル配列を構築物に使用して、天然のZcytor21分泌シグナル配列を置換することができる。
【０１６２】
組換えウイルスまたはバクミドは、宿主細胞をトランスフェクトするために使用される。適切な昆虫宿主細胞には、ヨトウガ（Spodoptera frugiperda）の蛹卵巣細胞系列IPLB-Sf-21に由来する細胞系列（Sf9（ATCC CRL 1711）、Sf21AE、およびSf21 （Invitrogen Corporation；San Diego、CA）など）、ならびにショウジョウバエのSchneider-2細胞、およびイラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）に由来するHIGH FIVEO細胞系列（Invitrogen）（米国特許第5,300,435号）などがある。市販の無血清培地を使用して、細胞を成長および維持することができる。適切な培地は、Sf9細胞用のSf900 II（商標）（Life Technologies）、またはESF 921（商標）（Expression Systems）；ならびにイラクサギンウワバ細胞用のEx-cellO405（商標）（JRH Biosciences、Lenexa、KS）、またはExpress FiveO（商標）（Life Technologies）である。組換えウイルスを使用する場合は、細胞は通常、組換えウイルスストックを、感染多重度（MOI）が0.1〜10、より典型的には約3で添加する時期に相当する、約2〜5×105細胞から1〜2×106細胞の播種密度から成長させる。
【０１６３】
バキュロウイルス系で組換えタンパク質を作製するための確立された手法は、Baileyら、「Manipulation of Baculovirus Vectors」、Methods in Molecular Biology、第7巻：Gene Transfer and Expression Protocols、Murray編、p.147〜168 （The Humana Press社、1991）、Patelら、「The baculovirus expression system」、DNA Cloning 2：Expressions Systems、第2版、Gloverら共編、p.205〜244 （Oxford University Press、1995）、Ausubel （1995）、p.16〜37〜16-57、Richardson編、Baculovirus Expression Protocols （The Humana Press社、1995）、ならびにLucknow、「Insect Cell Expression Technology」、Protein Engineering：Principles and Practice、Clelandら共編、p.183〜218 （John Wiley & Sons社、1996）に記載されている。
【０１６４】
酵母細胞を含む真菌細胞を用いて、本明細書に記載された遺伝子を発現させることもできる。この点において特に重要な酵母には、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、およびピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）などがある。酵母における発現に適したプロモーターには、GAL1（ガラクトース）、PGK（ホスホグリセリン酸キナーゼ）、ADH（アルコール脱水素酵素）、AOX1（アルコールオキシダーゼ）、HIS4（ヒスチジノール脱水素酵素）などに由来するプロモーターがある。多くの酵母クローニングベクターが設計されており、容易に入手することができる。このようなベクターには、YIpをベースとしたベクター（YIp5など）、YRpベクター（YRp17など）、YEpベクター（YEp13など）、YCpベクター（YCp19など）などがある。出芽酵母（S. cerevisiae）細胞を外因性DNAで形質転換して、そこから組換えポリペプチドを作製する方法は、例えばKawasaki、米国特許第4,599,311号、Kawasakiら、米国特許第4,931,373号、Brake、米国特許第4,870,008号、Welchら、米国特許第5,037,743号、ならびにMurrayら、米国特許第4,845,075号で説明されている。形質転換細胞は、通常薬剤耐性か、または特定の栄養源（例えばロイシン）の非存在下における成長能力である選択マーカーで判定される表現型で選択される。分裂酵母における使用に適したベクター系は、グルコース含有培地における成長による、形質転換細胞の選択を可能とする、Kawasakiら（米国特許第4,931,373号）で説明されているPOT1ベクター系である。酵母使用に適した他のプロモーターおよびターミネーターには、解糖系酵素の遺伝子群由来（例えばKawasaki、米国特許第4,599,311号、Kingsmanら、米国特許第4,615,974号、およびBitter、米国特許第4,977,092号を参照）、ならびにアルコール脱水素酵素遺伝子由来のものなどがある。これについては米国特許第号4,990,446号、第5,063,154号、第5,139,936号、および第4,661,454号も参照されたい。
【０１６５】
ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、クルイベロマイセス・フラジリス（Kluyveromyces fragilis）、ウスティラゴ・メイディス（Ustilago maydis）、ピキア・パストリス、ピキア・メタノリカ、ピキア・ギレルモンディ（Pichia guillermondii）、ならびにカンジダ・マルトーサ（Candida maltosa）を含む他の酵母の形質転換系は当技術分野で周知である。これについては例えばGleesonら、J. Gen. Microbiol. 132：3459 （1986）、およびCregg、米国特許第4,882,279号を参照されたい。アスペルギルス（Aspergillus）細胞は、McKnightら、米国特許第4,935,349号に記載の方法で使用される場合がある。アクレモニウム・クリソジェナム（Acremonium chrysogenum）の形質転換法については、Suminoら、米国特許第5,162,228号で開示されている。パンカビ属（Neurospora）の形質転換法については、米国特許第4,486,533号で開示されている。
【０１６６】
例えば、組換えタンパク質を産生させるための宿主としてピキア・メタノリカを使用することは、Raymond、米国特許第5,716,808号、Raymond、米国特許第5,736,383号、Raymondら、Yeast 14：11-23 （1998）、ならびに国際公開公報第97/17450号、国際公開公報第97/17451号、国際公開公報第98/02536号、および国際公開公報第98/02565号で説明されている。ピキア・メタノリカの形質転換に使用されるDNA分子は通常、形質転換に先だって完全に線状化される2本鎖の環状プラスミドとして調製される。ピキア・メタノリカにおけるポリペプチド産生に関して、プラスミドのプロモーターおよびターミネーターは、ピキア・メタノリカのアルコール利用遺伝子（AUG1またはAUG2）などの、ピキア・メタノリカの遺伝子のプロモーターおよびターミネーターの場合がある。他の有用なプロモーターには、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（DHAS）、ギ酸脱水素酵素（FMD）、およびカタラーゼ（CAT）の遺伝子群のプロモーターなどがある。宿主染色体へのDNAの組込みを促進するためには、プラスミドの発現セグメントの全体が、両末端において宿主DNA配列と隣接していることが好ましい。ピキア・メタノリカに使用される適切な選択マーカーは、ホスホリボシル-5-アミノイミダゾールカルボキシラーゼ（AIRC；EC 4.1.1.21）をコードし、アデニンの非存在下でade2宿主細胞の成長を可能とする、ピキア・メタノリカのADE2遺伝子である。メタノールの使用を最小限に抑えることが望ましい大規模な工業的な方法の場合は、両方のメタノール利用遺伝子（AUG1およびAUG2）が欠失した宿主細胞を使用するとよい。分泌型タンパク質を産生させる場合は、宿主細胞から空胞プロテアーゼ遺伝子（PEP4およびPRB1）を欠失させる。エレクトロポレーションによって、対象ポリペプチドをコードするDNAを含むプラスミドがピキア・メタノリカ細胞へ導入されやすくなる。ピキア・メタノリカの細胞は、指数関数的に減衰するパルス電場を用いるエレクトロポレーション（電界強度が2.5〜4.5 kV/cm、好ましくは約3.75 kV/cm、また時定数（t）が1〜40ミリ秒、最も好ましくは約20ミリ秒）で形質転換可能である。
【０１６７】
発現ベクターは、植物のプロトプラスト、植物体の組織、または単離された植物細胞に導入することもできる。発現ベクターを植物組織に導入する方法には、植物組織の、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を用いた直接感染法または共培養法、微粒子銃輸送法、DNA注入法、エレクトロポレーション法などがある。これについては例えばHorschら、Science 227：1229 （1985）、Kleinら、Biotechnology 10：268 （1992）、およびMikiら、「Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants」、Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology、Glickら共編、p.67〜88 （CRC Press、1993）を参照されたい。
【０１６８】
あるいは、Zcytor21遺伝子を原核生物の宿主細胞で発現させることができる。Zcytor21ポリペプチドを原核生物宿主で発現させるために使用可能な適切なプロモーターは当技術分野で周知であり、T4、T3、Sp6、およびT7のポリメラーゼを認識可能なプロモーター、バクテリオファージλのPRおよびPLのプロモーター、大腸菌プロモーターのtrp、recA、熱ショック、lacUV5、tac、lpp-lacSpr、phoA、およびlacZ、枯草菌（B. subtilis）のプロモーター、バチルス（Bacillus）のバクテリオファージのプロモーター、ストレプトマイセスのプロモーター、バクテリオファージラムダのintプロモーター、pBR322のblaプロモーター、ならびにクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のCATプロモーターなどがある。原核生物のプロモーターについてはGlick、J. Ind. Microbiol. 1：277 （1987）、Watsonら、Molecular Biology of the Gene、第4版 （Benjamin Cummins、1987）、ならびにAusubelら （1995）で概説されている。
【０１６９】
適切な原核生物宿主には大腸菌および枯草菌などがある。大腸菌の適切な株にはBL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、BL21(DE3)pLysE、DH1、DH4I、DH5、DH5I、DH5IF'、DH5IMCR、DH10B、DH10B/p3、DH11S、C600、HB101、JM101、JM105、JM109、JM110、K38、RR1、Y1088、Y1089、CSH18、ER1451、およびER1647などがある（例えばBrown編、Molecular Biology Labfax （Academic Press、1991）を参照）。枯草菌の適切な株にはBR151、YB886、MI119、MI120、およびB170などがある（例えばHardy、「Bacillus Cloning Methods」、DNA Cloning：A Practical Approach、Glover編（IRL Press、1985）を参照）。
【０１７０】
Zcytor21ポリペプチドを大腸菌などの細菌で発現させる場合は、ポリペプチドを不溶性の顆粒として保持させることがあるほか、細菌の分泌配列によって細胞膜周辺腔に向かわせることがある。前者の場合は、細胞を溶解し、顆粒を回収し、例えばグアニジンイソチオシアナートまたは尿素を用いて変性させる。次に、尿素、ならびに還元型グルタチオンおよび酸化型グルタチオンの組み合わせの溶液に対する透析を行い、次に緩衝食塩水溶液に対する透析を行うなどして、変性剤を希釈することで、変性ポリペプチドを再び折りたたんで二量体化することができる。後者の場合は、細胞を（例えば超音波処理または浸透圧ショックによって）破壊して、細胞膜周辺腔の内容物を放出させてタンパク質を回収することにより、変性および再折りたたみ段階を必要とすることなく、ポリペプチドを細胞膜周辺腔から可溶性および機能性の状態で回収することができる。
【０１７１】
タンパク質を原核生物宿主で発現させる方法は当技術分野で周知である（例えばWilliamsら、「Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies」、DNA Cloning 2：Expression Systems、第2版、Gloverら共編、p.15 （Oxford University Press、1995）、Wardら、「Genetic Manipulation and Expression of Antibodies」、Monoclonal Antibodies：Principles and Applications、p.137 （Wiley-Liss社、1995）、ならびにGeorgiou、「Expression of Proteins in Bacteria」、Protein Engineering：Principles and Practice、Clelandら共編、p.101 （John Wiley & Sons社、1996）を参照）。
【０１７２】
発現ベクターを細菌、酵母、昆虫、および植物の細胞に導入する標準的な方法は例えばAusubel （1995）に記載されている。
【０１７３】
哺乳類細胞系が産生する外来タンパク質を発現させて回収する一般的な方法は例えばEtcheverry、「Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture」、Protein Engineering：Principles and Practice、Clelandら共編、p.163 （Wiley-Liss社、1996）で説明されている。細菌系で作られたタンパク質を回収する標準的な手段は例えばGrisshammerら、「Purification of over-produced proteins from E.coli cells」、DNA Cloning 2：Expression Systems、第2版、Gloverら共編、p.59〜92 （Oxford University Press、1995）で提供されている。組換えタンパク質をバキュロウイルス系から単離する確立された方法は、Richardson編、Baculovirus Expression Protocols （The Humana Press社、1995）に記載されている。
【０１７４】
別の方法として、本発明のポリペプチドは、専用の固相合成法、部分固相法、断片濃縮法、または従来型の溶液合成法で合成することができる。このような合成法は当技術分野で周知である（例えばMerrifield、J. Am. Chem. Soc. 85：2149 （1963）、Stewartら、「Solid Phase Peptide Synthesis」（第2版）、（Pierce Chemical社、1984）、BayerおよびRapp、Chem. Pept. Prot. 3：3 （1986）、Athertonら、Solid Phase Peptide Synthesis：A Practical Approach （IRL Press、1989）、FieldsおよびColowick、「Solid-Phase Peptide Synthesis」、Methods in Enzymology Volume 289 （Academic Press、1997）、ならびにLloyd-Williamsら、Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins （CRC Press社、1997）を参照）。「天然化学連結（native chemical ligation）」、および「発現タンパク質連結」などの化学的全合成の多様な方法も標準的である（例えばDawsonら、Science 266：776 （1994）、Hackengら、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 94：7845 （1997）、Dawson、Methods Enzymol. 287：34 （1997）、Muirら、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95：6705 （1998）、ならびにSeverinovおよびMuir、J. Biol. Chem. 273：16205（1998）を参照）。
【０１７５】
本発明のペプチドおよびポリペプチドは、配列番号：2、配列番号：5、配列番号：8、配列番号：11、配列番号：15の少なくとも6残基、少なくとも9残基、または少なくとも15残基の連続アミノ酸残基を含む。例としてポリペプチドは、以下の任意のアミノ酸配列の少なくとも6残基、少なくとも9残基、または少なくとも15残基の連続アミノ酸残基を含む場合がある：（a）配列番号：11のアミノ酸残基24位〜667位、（b）配列番号：2のアミノ酸残基24位〜589位、（c）配列番号：5のアミノ酸残基24位〜609位、（d）配列番号：8のアミノ酸残基24位〜533位、（e）配列番号：15のアミノ酸残基24位〜657位、（f）配列番号：11のアミノ酸残基24位〜454位、（g）配列番号：2のアミノ酸残基24位〜376位、（h）配列番号：5のアミノ酸残基24位〜396位、または（i）配列番号：15のアミノ酸残基24位〜444位。本発明のある態様では、このようなポリペプチドは、上記アミノ酸配列の20残基、30残基、40残基、50残基、100残基、またはこれ以上の連続残基を含む。例えばポリペプチドは、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも30残基の連続アミノ酸残基を含む場合がある：（a）配列番号：11のアミノ酸残基24位〜667位、（b）配列番号：2のアミノ酸残基24位〜589位、（c）配列番号：5のアミノ酸残基24位〜609位、（d）配列番号：8のアミノ酸残基24位〜533位、（e）配列番号：15のアミノ酸残基24位〜657位、（f）配列番号：11のアミノ酸残基24位〜454位、（g）配列番号：2のアミノ酸残基24位〜376位、（h）配列番号：5のアミノ酸残基24位〜396位、または（i）配列番号：15のアミノ酸残基24位〜444位。このようなペプチドおよびポリペプチドをコードする核酸分子は、ポリメラーゼ連鎖反応用のプライマーおよびプローブとして有用である。
【０１７６】
6．Zcytor21融合タンパク質および複合体の作製
Zcytor21類似体の1つの一般的なクラスは、本明細書に開示されたアミノ酸配列の変異であるアミノ酸配列を有する変種である。別の一般的なクラスのZcytor21類似体は、後述する抗イディオタイプ抗体、およびこの断片によって提供される。また、抗イディオタイプ可変ドメインを含む組換え抗体を類似体として使用することができる（例えばMonfardiniら、Proc. Assoc. Am. Physicians 108：420 （1996）を参照）。抗イディオタイプZcytor21抗体の可変ドメインはZcytor21に似ているので、これらのドメインはZcytor21結合活性を提供する。抗イディオタイプの触媒性抗体を作製する方法は当技術分野で周知である（例えばJoronら、Ann. NY Acad. Sci. 672：216 （1992）、Fribouletら、Appl. Biochem. Biotechnol. 47：229 （1994）、ならびにAvalleら、Ann. NY Acad. Sci. 864：118 （1998）を参照）。
【０１７７】
Zcytor21類似体を同定する別の方法は、コンビナトリアルライブラリーの使用によって提供される。ファージディスプレイおよび他のコンビナトリアルライブラリーの構築法およびスクリーニング法は例えばKayら、Phage Display of Peptides and Proteins （Academic Press、1996）、Verdine、米国特許第5,783,384号、Kayら、米国特許第5,747,334号、ならびにKauffmanら、米国特許第5,723,323号に記載されている。
【０１７８】
Zcytor21ポリペプチドには、インビボとインビトロの両方における用途がある。例として、可溶性のZcytor21を細胞培養用培地に添加して、培養細胞によって産生されるZcytor21リガンドの作用を抑制することができる。
【０１７９】
Zcytor21の融合タンパク質は、組換え宿主でZcytor21を発現させるために、および産生されたZcytor21を単離するために使用することができる。後述するように、特定のZcytor21融合タンパク質は診断および治療にも使用できる。ある種類の融合タンパク質は、組換え宿主細胞からポリペプチドを導くペプチドを含む。Zcytor21ポリペプチドを真核生物宿主細胞の分泌経路に導くために分泌シグナル配列（シグナルペプチド、リーダー配列、プレプロ配列、またはプレ配列とも呼ばれる）がZcytor21発現ベクターに提供される。分泌シグナル配列はZcytor21に由来する場合があるが、適切なシグナル配列は別の分泌タンパク質に由来する場合もあるほか、新規に合成される場合もある。分泌シグナル配列とZcytor21コード配列を、2つの配列が正しい読み枠で連結され、新規に合成されたポリペプチドが宿主細胞の分泌経路に入るように配置されるように、使用可能に連結する。分泌シグナル配列は一般に、対象ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の5'側に配置されるが、ある分泌シグナル配列は、対象ヌクレオチド配列上の別の場所に配置される場合がある（例えばWelchら、米国特許第5,037,743号；Hollandら、米国特許第5,143,830号を参照）。
【０１８０】
哺乳類細胞で産生されるZcytor21または他のタンパク質の分泌シグナル配列（例えば米国特許第5,641,655号に記載されている組織型プラスミノーゲンアクチベーターのシグナル配列など）は、組換え哺乳類宿主におけるZcytor21の発現に有用であるが、酵母細胞における発現には酵母のシグナル配列が好ましい。適切な酵母のシグナル配列の例は、酵母接合フェロモンα因子（MFα1遺伝子にコードされる）、インベルターゼ（SUC2遺伝子にコードされる）、または酸ホスファターゼ（PHO5遺伝子にコードされる）に由来する配列である。これについては例えばRomanosら、「Expression of Cloned Genes in Yeast」、DNA Cloning 2：A Practical Approach、第2版、GloverおよびHames共編、p.123〜167 （Oxford University Press、1995）を参照されたい。
【０１８１】
細菌細胞では、発現タンパク質の毒性を低下させて安定性を高め、また回収を容易にするために、異種タンパク質を融合タンパク質として発現させることが望ましい場合がある。例えばZcytor21は、グルタチオンS-トランスフェラーゼのポリペプチドを含む融合タンパク質として発現させることができる。グルタチオンS-トランスフェラーゼ融合タンパク質は通常可溶性であり、固定化グルタチオンカラム上を用いて、大腸菌溶解物から容易に精製することができる。類似の方法では、マルトース結合タンパク質ポリペプチドを含むZcytor21融合タンパク質を、アミロース樹脂カラムで単離することができる。またC末端が切断されたプロテインA遺伝子を含む融合タンパク質は、IgG-セファロースを用いて精製することができる。異種ポリペプチドを融合タンパク質として細菌細胞中で発現させる確立された手法は、例えばWilliamsら、「Expression of Foreign Proteins in E.coli Using Plasmid Vectors and Purification of Specific Polyclonal Antibodies」、DNA Cloning 2：A Practical Approach、第2版、GloverおよびHames共編、p.15〜58 （Oxford University Press、1995）に記載されている。また、市販の発現系を利用することができる。例えばPINPOINT Xaタンパク質精製システム（Promega社；Madison、WI）は、発現中にビオチン化されるポリペプチドを含む融合タンパク質を、アビジンを含む樹脂によって単離する方法である。
【０１８２】
原核生物または真核細胞のいずれかで発現される異種ポリペプチドを単離するために有用なペプチドタグには、ポリヒスチジンタグ（ニッケル-キレート樹脂に親和性を有する）、c-mycタグ、カルモジュリン結合タンパク質（カルモジュリンアフィニティクロマトグラフィーで単離される）、P物質、RYIRSタグ（抗RYIRS抗体と結合する）、Glu-Gluタグ、ならびにFLAGタグ（抗FLAG抗体と結合する）などがある。これについては例えばLuoら、Arch. Biochem. Biophys. 329：215 （1996）、Morgantiら、Biotechnol. Appl. Biochem. 23：67 （1996）、ならびにZhengら、Gene 186：55 （1997）を参照されたい。このようなペプチドタグをコードする核酸分子は例えばSigma-Aldrich社（St. Louis、MO）から入手することができる。
【０１８３】
本発明は、本発明のZcytor21ポリペプチドに含まれる分泌シグナル配列を、他のポリペプチドを分泌経路に導くために使用することも想定している。シグナル融合ポリペプチドは、例えば配列番号：2のアミノ酸残基1位〜23位に由来する分泌シグナル配列が、当技術分野で周知の方法、および本明細書に開示された方法で別のポリペプチドに使用可能に連結されるように作製することができる。本発明の融合ポリペプチドに含まれる分泌シグナル配列は好ましくは、アミノ末端に追加ペプチドが融合されることで、追加ペプチドを分泌経路に誘導する。このような構築物は当技術分野で数多くの応用が可能である。例えば、このような新しい分泌シグナル配列の融合構築物は、通常は非分泌性のタンパク質（受容体など）の活性成分の分泌を誘導する。このような融合体を、トランスジェニック動物、または培養した組換え宿主に使用することで、ペプチドを分泌経路に導くことができる。後者に関しては、例示的なポリペプチドには第VIIa因子、プロインスリン、インスリン、卵胞刺激ホルモン、組織型プラスミノーゲンアクチベーター、腫瘍壊死因子、インターロイキン（例えばインターロイキン-1（IL-1）、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、およびIL-21）、コロニー刺激因子（例えば顆粒球-コロニー刺激因子（G-CSF）、および顆粒球マクロファージ-コロニー刺激因子（GM-CSF））、インターフェロン（例えばインターフェロン-α、-β、-γ、-ω、-δ、-ε、および-τ）、「S1因子」と命名された幹細胞成長因子、エリトロポイエチン、ならびにトロンボポイエチンなどの薬学的に活性のある分子などがある。本発明の融合ポリペプチドに含まれるZcytor21分泌シグナル配列は好ましくは、アミノ末端に追加アミノ酸が融合されることで、追加アミノ酸を分泌経路に誘導する。Zcytor21分泌シグナル配列を含む融合タンパク質は、標準的な手法で構築することができる。
【０１８４】
融合タンパク質の別の状態は、Zcytor21ポリペプチド、および2つまたは3つの定常領域ドメイン、およびヒンジ領域を含むが可変領域を含まない免疫グロブリンの重鎖定常領域（通常Fc断片）を含む。例としてChangら、米国特許第5,723,125号では、ヒトインターフェロンおよびヒト免疫グロブリンのFc断片を含む融合タンパク質について報告されている。インターフェロンのC末端は、Fc断片のN末端にペプチドリンカー部分で連結される。ペプチドリンカーの例は、免疫学的に不活性なT細胞不活性配列を主に含むペプチドである。例示的なペプチドリンカーのアミノ酸配列は、
2005508615.tif 000007
である。この融合タンパク質では、示されているFc部分は溶液中で安定で、補体活性化活性をわずかにもつか、全くもたないヒトのγ4鎖である。したがって本発明は、Zcytor21部分のC末端がFc断片のN末端に、配列番号：13のアミノ酸配列を含むペプチドなどのペプチドリンカーを介して結合される、Zcytor21部分およびヒトFc断片を含むZcytor21融合タンパク質を想定している。Zcytor21部分はZcytor21分子、またはこの断片の場合がある。例えば融合タンパク質は、Fc断片（例えばヒトFc断片）、および配列番号：11のアミノ酸残基24位〜454位、配列番号：2のアミノ酸残基24位〜376位、配列番号：5のアミノ酸残基24位〜396位、配列番号：8のアミノ酸残基24位〜533位、または配列番号：15のアミノ酸残基24位〜444位を含む場合がある。
【０１８５】
別の変形例では、Zcytor21融合タンパク質は、IgG配列のアミノ末端に共有結合で連結したZcytor21部分であるIgG配列、およびZcytor21部分のアミノ末端に共有結合で連結されたシグナルペプチドを含む（IgG配列は、以下の順序のエレメントからなる：ヒンジ領域、CH2ドメイン、およびCH3ドメイン）。したがってIgG配列はCH1ドメインをもたない。Zcytor21部分は、Zcytor21リガンドとの結合能力などの、本明細書に記載されたZcytor21活性を示す。抗体部分と非抗体部分の両方を含む融合タンパク質を作製する、このような一般的な方法はLaRochelleら、欧州特許第742830号（国際公開公報第95/21258号）に記載されている。
【０１８６】
Zcytor21部分およびFc部分を含む融合タンパク質は、例えばインビトロアッセイ法のツールとして使用することができる。例えば、生物試料中のZcytor21リガンドの有無は、Zcytor21部分がリガンドとの結合に使用され、プロテインA、または抗Fc抗体などの高分子が、固相支持体に対する融合タンパク質の結合に使用される、Zcytor21-免疫グロブリン融合タンパク質を用いて判定することができる。このような系は、Zcytor21リガンドとその受容体の結合に干渉する作動物質および拮抗物質を同定するために使用することができる。
【０１８７】
抗体融合タンパク質の他の例には、抗原結合ドメイン、およびZcytor21の細胞外ドメインを含むZcytor21断片を含むポリペプチドなどがある。このような分子を用いて、Zcytor21の結合活性に有利になるように特定の組織を標的とすることができる。
【０１８８】
本発明はさらに、さまざまな他のポリペプチド融合体を提供する。例えば、生物学的機能をもたらすドメイン（群）の一部または全体を、本発明のZcytor21と、サイトカイン受容体ファミリーの別の受容体に由来する機能的に同等のドメイン（群）との間で交換することができる。ポリペプチド融合体を組換え宿主細胞で発現させて、さまざまなZcytor21融合類似体を作製することができる。Zcytor21ポリペプチドは、精製用のアフィニティタグ、および標的ドメインなどの2つまたはこれ以上の部分もしくはドメインに融合させることができる。ポリペプチド融合体は、1か所または複数の切断部位を特にドメイン間に含む場合がある。これについては例えばTuanら、Connective Tissue Research 34：1 （1996）を参照されたい。
【０１８９】
融合タンパク質は、融合タンパク質の各成分を調製して、これらを化学的に結合することによって、当技術分野で周知の方法で調製することができる。あるいは、融合タンパク質の両成分を適切な読み枠でコードするポリヌクレオチドを、既知の手法で作製して、本明細書に記載された方法で発現させることができる。融合タンパク質の酵素的切断および化学的切断の一般的な方法は例えばAusubel （1995）、p.16-19〜16-25に記載されている。
【０１９０】
Zcytor21ポリペプチドを用いて、Zcytor21リガンドを同定および単離することができる。例えば、本発明のタンパク質およびペプチドをカラム上に固定化して、カラムに流した生物試料に由来するリガンドを結合させることができる（Hermansonら共編、Immobilized Affinity Ligand Techniques、p.195〜202 （Academic Press、1992））。
【０１９１】
Zcytor21ポリペプチドの活性は、細胞外の酸性化速度、または受容体の結合、およびこれに続く生理学的細胞反応に関連するプロトン排出を測定する、シリコンベースのバイオセンサーであるマイクロ生理機能測定装置（microphysiometer）によって観察することができる。例となる装置はMolecular Devices（Sunnyvale、CA）製のCYTOSENSOR Microphysiometerである。細胞の増殖、イオン輸送、エネルギー生産、炎症反応、調節的活性化および受容体の活性化などの、さまざまな細胞反応を同方法で測定することができる（例えばMcConnellら、Science 257：1906 （1992）、Pitchfordら、Meth. Enzymol. 228：84 （1997）、Arimilliら、J. Immunol. Meth. 212：49 （1998）、Van Liefdeら、Eur. J. Pharmacol. 346：87 （1998）を参照）。マイクロ生理機能測定装置は、真核生物、原核生物、接着性細胞、または非接着性細胞のアッセイ法に使用することができる。マイクロ生理機能測定装置は、細胞培地中における細胞外の酸性化の変化を経時的に測定することによって、Zcytor21の作動物質、リガンド、または拮抗物質を含む、さまざまな刺激に対する細胞反応を直接測定する。
【０１９２】
例えばマイクロ生理機能測定装置は、Zcytor21ポリペプチドを発現しない対照の真核生物細胞と比較したときの、Zcytor21を発現する真核生物細胞の反応の測定に使用される。Zcytor21調節性刺激に反応する適切な細胞には、Zcytor21発現ベクターを含む組換え宿主細胞、ならびに天然の状態でZcytor21を発現する細胞などがある。細胞外における酸性化は、Zcytor21によって調節される細胞反応の1つの尺度となる。また、この方法で、リガンド、Zcytor21のリガンドの作動物質および拮抗物質を同定することができる。例えば、Zcytor21ポリペプチドを発現する細胞を提供し、被験化合物の非存在下で細胞の第1の部分を培養し、被験化合物の存在下で細胞の第2の部分を培養し、ならびに第2の部分が、第1の部分と比較して細胞反応を示すかどうかを判定することによって、分子をZcytor21のリガンドの作動物質として同定することができる。
【０１９３】
あるいは固相系を用いて、Zcytor21のリガンド、またはZcytor21のリガンドの作動物質または拮抗物質を同定することができる。例えば、Zcytor21ポリペプチドまたはZcytor21融合タンパク質は、市販のバイオセンサー装置（BIACORE、Biacore AB；Uppsala、Sweden）の受容体チップの表面に固定することができる。このような装置の用途については例えばKarlsson、Immunol. Methods 145：229 （1991）、ならびにCunninghamおよびWells、J. Mol. Biol. 234：554 （1993）に記載されている。
【０１９４】
簡単に説明すると、Zcytor21のポリペプチドまたは融合タンパク質を、アミンまたはスルフヒドリルの化学を用いて、フローセル中で金フィルムに結合するデキストラン繊維に共有結合で結合させる。次に被験試料がセルを通過する。仮にリガンドが試料中に存在すれば、固定化されたポリペプチドまたは融合タンパク質にリガンドが結合して、媒体の屈折率が変化する。この変化は、金フィルムの表面プラスモン共鳴の変化として検出される。この系では、結合親和性を計算する元となるオン速度およびオフ速度の決定と、結合の化学量論的関係の評価が可能となる。この系を用いて、抗体-抗原の相互作用、および他の相補物/抗相補物対の相互作用を調べることもできる。
【０１９５】
Zcytor21結合ドメインの性質はさらに、Zcytor21のリガンドの作動物質の推定接触部位のアミノ酸の変異に関連した、核磁気共鳴、結晶解析、電子線回折、または光親和性ラベリングなどの手法で決定されるように、構造の物理的解析によって明らかにすることができる。これについては例えばde Vosら、Science 255：306 （1992）、Smithら、J. Mol. Biol. 224：899 （1992）、ならびにWlodaverら、FEBS Lett. 309：59 （1992）を参照されたい。
【０１９６】
本発明は、Zcytor21ポリペプチドがポリマーと連結された、化学的に修飾されたZcytor21の組成も想定している。例示的なZcytor21ポリペプチドは、配列番号：11のアミノ酸残基24位〜454位、配列番号：2のアミノ酸残基24位〜376位、配列番号：5のアミノ酸残基24位〜396位、配列番号：8のアミノ酸残基24位〜533位、または配列番号：15のアミノ酸残基24位〜444位を含むポリペプチドなどの、機能性の膜貫通ドメインをもたない可溶性のポリペプチドである。通常このようなポリマーは水溶性であり、このためZcytor21複合体は、生理学的環境などの水性環境で沈殿しない。適切なポリマーの例は、アシル化用の活性エステルや、アルキル化用のアルデヒドなどの1つの反応基をもつように修飾されたポリマーである。このようにすることで重合の程度を制御することができる。反応性アルデヒドの例は、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、またはモノ（C1-C10）アルコキシ、またはこのアリールオキシ誘導体である（例えばHarrisら、米国特許第5,252,714号を参照）。このようなポリマーは分枝状でも非分枝状でもよい。またポリマーの混合物を用いてZcytor21複合体を作製することができる。
【０１９７】
治療に使用されるZcytor21複合体は、薬学的に許容される水溶性ポリマー部分を含む場合がある。適切な水溶性ポリマーには、ポリエチレングリコール（PEG）、モノメトキシ-PEG、モノ-（C1-C10）アルコキシ-PEG、アリールオキシPEG、ポリ-（N-ビニルピロリドン）PEG、トレシルモノメトキシPEG、PEGプロピオンアルデヒド、ビス-スクシニミジルカーボネートPEG、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール、デキストラン、セルロース、または他の炭水化物をベースとしたポリマーなどがある。適切なPEGの分子量は、例えば5,000、12,000、20,000、および25,000を含む約600〜約60,000の場合がある。Zcytor21複合体は、このような水溶性ポリマーの混合物を含む場合もある。
【０１９８】
Zcytor21複合体の一例は、Zcytor21のN末端部分に結合したZcytor21部分およびポリアルキルオキシド部分を含む。PEGは1つの適切なポリアルキルオキシドである。例として、Zcytor21はPEGで固定化される場合がある（この過程は「PEG化（PEGylation）」として知られる）。Zcytor21のPEG化は、当技術分野で周知の任意のPEG化反応で実施することができる（例えば欧州特許第0 154 316号、Delgadoら、Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9：249 （1992）、DuncanおよびSpreafico、Clin. Pharmacokinet. 27：290 （1994）、ならびにFrancisら、Int J Hematol 68：1 （1998）を参照）。例えばPEG化は、反応性ポリエチレングリコール分子のアシル化反応、またはアルキル化反応で行われる。別の方法では、PEGの末端のヒドロキシ基またはアミノ基が活性化リンカーと置換された活性化PEGを濃縮することで、Zcytor21複合体を生成する（例えばKarasiewiczら、米国特許第5,382,657号を参照）。
【０１９９】
アシル化によるPEG化には通常、PEGの活性エステル誘導体を、Zcytor21ポリペプチドと反応させる段階が必要である。活性化PEGエステルの一例は、N-ヒドロキシスクシニミドにエステル化させたPEGである。本明細書で用いられる、「アシル化」という表現は、Zcytor21と水溶性ポリマーとの連結（アミド、カルバミン酸塩、ウレタンなど）を含む。アシル化によってPEG化されたZcytor21の調製法は通常、（a）Zcytor21ポリペプチドにPEG（PEGのアルデヒド誘導体の反応性エステルなど）を、1個または複数のPEG基がZcytor21と結合する条件で反応させる段階、ならびに（b）反応産物（群）を得る段階を含む。一般に、アシル化反応の最適な反応条件は、既知のパラメータ、および所望の結果を元に決定される。例えばPEG：Zcytor21の比が大きいほど、ポリPEG化されたZcytor21産物の割合は大きくなる。
【０２００】
アシル化によるPEG化の産物は典型的には、リシンのε-アミノ基がアシル連結基でPEG化されているポリPEG化Zcytor21産物である。連結基の一例はアミドである。典型的には、結果として得られるZcytor21は、少なくとも95%がモノPEG化、ジPEG化、またはトリPEG化されているが、反応条件に依存して、高度にPEG化した一部の種が形成される場合がある。PEG化された種は、複合体を形成していないZcytor21ポリペプチドから、透析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーなどの標準的な精製法で分離することができる。
【０２０１】
アルキル化によるPEG化では一般に、還元剤の存在下でPEGの最終アルデヒド誘導体をZcytor21と反応させる。PEG基はポリペプチドに、-CH2-NH基を介して結合する場合がある。
【０２０２】
モノPEG化産物を生じる還元的アルキル化を介する誘導体化は、誘導体化に利用できる、さまざまな種類の一級アミノ基の反応性の差異を利用する。典型的には、この反応は、リシン残基のε-アミノ基と、タンパク質のN末端残基のα-アミノ基とのpKaの差を利用することが可能であるpHで行われる。このような選択的な誘導体化によって、タンパク質に対する、アルデヒドなどの反応基を含む水溶性ポリマーの結合が制御される。ポリマーとの結合は、もっぱらタンパク質のN末端で生じ、リシン側鎖のアミノ基などの他の反応基は大きく修飾されない。本発明は、Zcytor21モノポリマー複合体の実質的に均一な調製物を提供する。
【０２０３】
モノポリマーであるZcytor21複合体分子の実質的に均一な集団を生じる還元的アルキル化は、以下の段階を含む場合がある：（a）Zcytor21ポリペプチドを、Zcytor21のアミノ末端におけるα-アミノ基の選択的な修飾を可能とするために適したpHにおける還元的アルキル化条件で、反応性PEGと反応させる段階、ならびに（b）反応産物（群）を得る段階。還元的アルキル化に使用される還元剤は、水溶液中で安定であるべきであり、還元的アルキル化の初期段階で形成されたシッフ塩基のみを還元可能である。例示的な還元剤には、水素化ホウ素ナトリウム、水素化シアノホウ素ナトリウム、ジメチルアミンボラン、トリメチルアミンボラン、およびピリジンボランなどがある。
【０２０４】
モノポリマーのZcytor21複合体の実質的に均一な集団の場合、還元的アルキル化反応の条件は、Zcytor21のN末端に対する水溶性ポリマー部分の選択的な結合を可能とする条件である。このような反応条件は一般に、リシンのアミノ基とN末端のαアミノ基の間にpKaの差を生じる。このpHは、ポリマーと、使用されるタンパク質との比にも影響を及ぼす。一般に、このpHが低い場合は、タンパク質に対する大過剰のポリマーが望ましい。というのは、N末端のα基の反応性が低ければ、最適条件を達成するために必要なポリマーは多くなるからである。このpHが高い場合は、ポリマー：Zcytor21の比は必ずしも大きい必要はない。これは、より多くの反応基が利用可能なためである。典型的には、pHの範囲は3〜9、または3〜6である。
【０２０５】
考慮すべき別の因子は水溶性ポリマーの分子量である。一般に、ポリマーの分子量が大きくなるほど、タンパク質に結合可能なポリマー分子の数は少なくなる。PEG化反応の場合、典型的な分子量は約2 kDa〜約100 kDa、約5 kDa〜約50 kDa、または約12 kDa〜約25 kDaである。Zcytor21に対する水溶性ポリマーのモル比は一般に、1：1〜100：1の範囲にある。典型的には、Zcytor21に対する水溶性ポリマーのモル比は、ポリPEG化の場合は1：1〜20：1であり、モノPEG化の場合は1：1〜5：1である。
【０２０６】
ポリペプチドおよび水溶性ポリマー部分を含む複合体を作製する一般的な方法は当技術分野で周知である。これについては例えばKarasiewiczら、米国特許第5,382,657号、Greenwaldら、米国特許第5,738,846号、Nieforthら、Clin. Pharmacol. Ther. 59：636 （1996）、Monkarshら、Anal. Biochem. 247：434 （1997）を参照されたい。
【０２０７】
本発明は、本明細書に記載されたペプチドまたはポリペプチドを含む組成物を想定している。このような組成物はさらに担体を含む場合がある。担体は、従来の有機担体または無機担体の場合がある。担体の例には水、緩衝液、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油などがある。
【０２０８】
7．Zcytor21ポリペプチドの単離
本発明のポリペプチドは、混入する高分子（特に他のタンパク質および核酸）に関して少なくとも約80%の純度に、少なくとも約90%の純度に、少なくとも約95%の純度に、または95%を超える純度に精製可能であり、感染性物質および発熱性物質を含まない。本発明のポリペプチドは、99.9%以上の純度である薬学的に純粋な状態に精製することもできる。ある調製物では、精製されたポリペプチドは、他のポリペプチド（特に動物起源の他のポリペプチド）を実質的に含まない。
【０２０９】
分画法および/または従来の精製法で、天然供給源（例えば皮膚組織）から精製されたZcytor21の調製物、合成Zcytor21ポリペプチド、および組換えZcytor21ポリペプチド、ならびに組換え宿主細胞から精製された融合Zcytor21ポリペプチドが得られる。一般に、硫酸アンモニウム沈殿、および酸またはカオトロープ（chaotrope）による抽出で試料を分画することができる。例示的な精製法には、ヒドロキシアパタイト法、サイズ排除法、FPLC法、および逆相高速液体クロマトグラフィー法などがある。適切なクロマトグラフィー用媒体には、誘導体化デキストラン、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、専用のシリカなどがある。PEI、DEAE、QAE、およびQの各誘導体が適している。例示的なクロマトグラフィー用媒体は、Phenyl-Sepharose FF（Pharmacia）、Toyopearl butyl 650（Toso Haas、Montgomeryville、PA）、Octyl-Sepharose（Pharmacia）などの、フェニル基、ブチル基、もしくはオクチル基で誘導体化された媒体；またはAmberchrom CG 71（Toso Haas）などのポリアクリル樹脂を含む。適切な固相支持体には、使用時の条件では不溶性となるガラスビーズ、シリカベースの樹脂、セルロース樹脂、アガロースビーズ、架橋アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、架橋ポリアクリルアミド樹脂などがある。このような支持体は、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、および/または炭水化物部分によるタンパク質の結合を可能とする反応基で修飾することができる。
【０２１０】
カップリング化学の例には、臭化シアン活性化、N-ヒドロキシスクシニミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、ヒドラジド活性化、ならびにカルボジイミドカップリング化学のためのカルボキシル誘導体、およびアミノ誘導体などがある。以上の、また他の固体媒体は当技術分野で周知であり、広く使用されており、また業者から入手することができる。ポリペプチドを単離および精製するための特定の方法の選択は、常用的な設計の問題であり、選択された支持体の性質によって部分的に決定される。これについては例えば、Affinity Chromatography：Principles & Methods（Pharmacia LKB Biotechnology、1988）、およびDoonan、Protein Purification Protocols（The Humana Press 1996）を参照されたい。
【０２１１】
Zcytor21の単離および精製の別の変形例を当業者は考案することができる。例えば、後述する手法で得られる抗Zcytor21抗体を用いて、免疫アフィニティーによる精製で大量のタンパク質を単離することができる。
【０２１２】
本発明のポリペプチドは、特定の性質を利用して単離することもできる。例えば、固定化金属イオン吸着（IMAC）クロマトグラフィーによって、ポリヒスチジンタグを含むタンパク質を含む、ヒスチジンに富むタンパク質を精製することができる。簡単に説明すると、最初にゲルに二価金属イオンを充填し、キレートを形成する（Sulkowski、Trends in Biochem. 3：1 （1985））。ヒスチジンに富むタンパク質は、このようなマトリックスに、使用される金属イオンに依存して、さまざまな親和性で吸収され、競合溶出（competitive elution）、pHの低下、または強力なキレート剤の使用で溶出される。他の精製法には、レクチンアフィニティクロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーによるグリコシル化されたタンパク質の精製などがある（M. Deutscher編、Meth. Enzymol. 182：529 （1990））。本発明の別の態様では、対象ポリペプチドとアフィニティタグ（例えば免疫グロブリンドメインであるマルトース結合タンパク質）を融合することで、精製の効率を高めることができる。
【０２１３】
Zcytor21ポリペプチド、またはこの断片は、上述の化学合成で調製することができる。Zcytor21ポリペプチドは単量体または多量体の場合があり、グリコシル化された状態の場合、またはグリコシル化されていない状態の場合があり；PEG化されている場合、またはPEG化されていない場合があり；先頭のメチオニンアミノ酸残基を含む場合もあれば含まない場合もある。
【０２１４】
8．Zcytor21タンパク質に対する抗体の産生
Zcytor21に対する抗体は、例えばZcytor21発現ベクターの産物、または天然供給源から抗原として単離されたZcytor21を使用することで得られる。特に有用な抗Zcytor21抗体は、Zcytor21に「特異的に結合する」。抗体は、抗体が以下の2つの特徴の少なくとも1つを示す場合に、特異的に結合するとみなされる：（1）抗体がZcytor21に、結合活性の閾値レベルで結合する、ならびに（2）抗体が、Zcytor21に関連するポリペプチドと有意に交差反応しない。
【０２１５】
第1の特徴に関しては、抗体は、Zcytor21のポリペプチド、ペプチド、またはエピトープに106 M-1またはこれ以上、好ましくは107 M-1またはこれ以上、より好ましくは108 M-1またはこれ以上、また最も好ましくは109 M-1またはこれ以上の結合親和性（Ka）で結合する場合に特異的に結合する。抗体の結合親和性は、当業者であれば例えばスキャッチャード（Scatchard）解析（Scatchard、Ann. NY Acad. Sci. 51：660 （1949））によって容易に決定することができる。第2の特徴に関しては、抗体は、例えば抗体が標準的なウェスタンブロット解析でZcytor21を検出するが、現時点で既知のポリペプチドを検出しない場合に、関連ポリペプチド分子と有意に交差反応しない。既知の関連ポリペプチドの例には、既知のサイトカイン受容体が含まれる。
【０２１６】
抗Zcytor21抗体は、抗原性Zcytor21エピトープ含有ペプチドおよびポリペプチドで作製することができる。本発明の抗原性エピトープ含有ペプチド（およびポリペプチド）は、配列番号：2、または本明細書に開示された別のアミノ酸配列に含まれる少なくとも9アミノ酸、または15〜約30アミノ酸の配列を含む。しかし、30〜50アミノ酸、または本発明のポリペプチドの全アミノ酸配列までを含む任意の長さを含む、本発明のアミノ酸配列のより大きな部分を含むペプチドまたはポリペプチドも、Zcytor21に結合する抗体を誘導するために有用である。エピトープ含有ペプチドのアミノ酸配列が、水性溶媒中で実質的な溶解性を提供するように選択されることが望ましい（すなわち配列は比較的親水性の残基を含むが、疎水性残基は通常避けられる）。また、プロリン残基を含むアミノ酸配列も抗体産生に望ましい場合がある。
【０２１７】
例として、Zcytor21の潜在的な抗原性部位は、LASERGENE（DNASTAR； Madison、WI）のPROTEANプログラム（バージョン3.14）で実行されるJameson-Wolf法（JamesonおよびWolf、CABIOS 4：181 （1988））で同定されている。同解析では、デフォルトのパラメータが使用された。
【０２１８】
Jameson-Wolf法では、タンパク質構造予測の6つの主なサブルーチンと組み合わせることで、潜在的な抗原決定基が推定される。簡単に説明すると、Hopp-Woods法（Hoppら、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 78：3824 （1981））が、局所的親水性が最も大きい領域を示すアミノ酸配列の同定に最初に用いられた（パラメータ：7つの残基の平均）。第2の段階では、Eminiによる方法（Eminiら、J. Virology 55：836 （1985））で表面確率が計算された（パラメータ：表面決定閾値（0.6）＝1）。第3に、Karplus-Schultz法（KarplusおよびSchultz、Naturwissenschaften 72：212 （1985））で主鎖の柔軟性が推定された（パラメータ：柔軟性閾値（0.2）＝1）。解析の第4および第5の段階では、2次構造の推定がChou-Fasmanの方法（Chou、「Prediction of Protein Structural Classes from Amino Acid Composition」、Prediction of Protein Structure and the Principles of Protein Conformation、Fasman編、p.549〜586 （Plenum Press、1990）、ならびにGarnier-Robson、Garnierら、J. Mol. Biol. 120：97 （1978））でデータに適用された（Chou-Fasmanパラメータ：高次構造表＝64タンパク質；α領域の閾値＝103；β領域の閾値＝105；Garnier Robsonパラメータ：αおよびβの決定定数＝0）。第6のサブルーチンでは、柔軟性パラメータ、および疎水性親水性指標/溶媒接触性因子が組み合わせられて、「抗原性指標」と命名された表面輪郭値が決定された。最後に、内部領域に対する表面領域の運動に由来する、追加的な自由エネルギーを説明するために、各ピーク値の20%、40%、60%、または80%を加えることによって主要表面ピークを広げるピーク拡張関数が、抗原性指標に適用された。しかし、この計算は、らせん状領域中に存在する任意の主要ピークには適用されなかった。というのは、らせん状領域は柔軟性に劣る傾向があるからである。
【０２１９】
この解析の結果は、配列番号：11の以下のアミノ酸配列が、適切な抗原性分子となる可能性があることを示していた：アミノ酸44位〜52位、アミノ酸101位〜109位、アミノ酸121位〜136位、アミノ酸141位〜180位、アミノ酸250位〜261位、アミノ酸313位〜328位、アミノ酸477位〜488位、アミノ酸562位〜574位、アミノ酸597位〜622位、およびアミノ酸641位〜652位。本発明は、Zcytor21-d2に対する抗体を作製するために、これらの抗原性アミノ酸配列の任意の1つの使用を想定している。本発明は、これらの抗原性分子の少なくとも1つを含むポリペプチドも想定している。類似の解析を、本明細書に開示された他のZcytor21のアミノ酸配列を対象に実施することができる。
【０２２０】
組換えZcytor21タンパク質、または天然供給源から単離されたZcytor21に対するポリクローナル抗体は、当技術分野で周知の方法で調製することができる。これについては例えばGreenら、「Production of Polyclonal Antisera」、Immunochemical Protocols （Manson編）、p.1〜5 （Humana Press、1992）、およびWilliamsら、「Expression of foreign proteins in E.coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies」、DNA Cloning 2：Expression Systems、第2版、Gloverら共編、p.15 （Oxford University Press、1995）を参照されたい。Zcytor21ポリペプチドの免疫原性は、ミョウバン（水酸化アルミニウム）、またはフロインドの完全アジュバントもしくは不完全アジュバントなどのアジュバントを使用することで高めることができる。免疫化に有用なポリペプチドは、Zcytor21、もしくはこの一部と、免疫グロブリンのポリペプチドとの融合体、またはマルトース結合タンパク質との融合体などの融合ポリペプチドも含む。ポリペプチドの免疫原は、完全長の分子、またはこの一部の場合がある。仮にポリペプチド部分が「ハプテン様」の場合、このような部分は、免疫化用の高分子担体（キーホールリンペットヘモシニアン（KLH）、ウシ血清アルブミン（BSA）、または破傷風トキソイドなど）に有利に結合または連結することができる。
【０２２１】
ポリクローナル抗体は通常、ウマ、ウシ、イヌ、ニワトリ、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、ヤギ、またはヒツジなどの動物で産生されるが、本発明の抗Zcytor21抗体は、類人猿の抗体に由来する場合もある。診断的および治療的に有用な抗体をヒヒで作製する一般的な手法は例えばGoldenbergら、国際公開公報第91/11465号、およびLosmanら、Int. J. Cancer 46：310 （1990）に記載されている。
【０２２２】
あるいは、モノクローナル抗Zcytor21抗体を作製することができる。特定の抗原に対するげっ歯類のモノクローナル抗体は当技術分野で周知の方法で得られる場合がある（例えばKohlerら、Nature 256：495 （1975）、Coliganら共編、Current Protocols in Immunology、第1巻、p.2.5.1〜2.6.7 （John Wiley & Sons 1991）［「Coligan」］、Picksleyら、「Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli」、DNA Cloning 2：Expression Systems、第2版、Gloverら共編、p.93 （Oxford University Press、1995）を参照）。
【０２２３】
簡単に説明すると、モノクローナル抗体は、Zcytor21遺伝子産物を含む組成物をマウスに注射し、血清試料を除去することで抗体産生の有無を確認し、脾臓を除去してBリンパ球を入手し、Bリンパ球と骨髄腫細胞を融合してハイブリドーマを作製し、ハイブリドーマをクローン化し、対象抗原に対する抗体を産生する陽性クローンを選択し、ならびにハイブリドーマ培養物から抗体を単離することで得られる。
【０２２４】
また本発明の抗Zcytor21抗体は、ヒトモノクローナル抗体に由来する場合がある。ヒトモノクローナル抗体は、抗原性刺激に反応して特定のヒト抗体を産生するように作製したトランスジェニックマウスから得られる。この手法では、ヒトの重鎖および軽鎖の座位のエレメントが、内因性の重鎖および軽鎖の座位の標的破壊を含む胚幹細胞系列に由来するマウスの系列に導入される。このようなトランスジェニックマウスは、ヒト抗原に特異的なヒト抗体を合成可能であり、同マウスを使用して、ヒト抗体を分泌するハイブリドーマを作製することができる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得る方法は、例えばGreenら、Nature Genet. 7：13 （1994）、Lonbergら、Nature 368：856 （1994）、ならびにTaylorら、Int. Immun. 6：579 （1994）で説明されている。
【０２２５】
モノクローナル抗体は、さまざまな既知の手法でハイブリドーマ培養物から単離して精製することができる。このような単離法には、プロテインAセファロースを用いるアフィニティクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ならびにイオン交換クロマトグラフィーなどがある（例えばColigan、p.2.7.1〜2.7.12およびp.2.9.1〜2.9.3；Bainesら、「Purification of Immunoglobulin G （IgG）」、Methods in Molecular Biology、第10巻、p.79〜104 （The Humana Press社、1992）を参照）。
【０２２６】
特定の用途に関しては、抗Zcytor21抗体の断片を調製することが望ましい場合がある。このような抗体断片は例えば、抗体のタンパク質分解性加水分解によって得られる。抗体断片は、従来の方法による、抗体全体のペプシンまたはパパインによる消化によって得られる。例として抗体断片は、ペプシンによる抗体の酵素的切断で、F(ab')2と命名された5S断片を得ることで作製することができる。この断片をチオール還元剤でさらに切断することで3.5S Fab'一価断片が得られる。選択的に、この切断反応を、ジスルフィド結合の切断を導く、スルフヒドリル基に対するブロッキング基を用いて実施することができる。別の方法として、ペプシンによる酵素的切断で、2つの一価Fab断片およびFc断片が直接得られる。以上の方法は例えばGoldenberg、米国特許第4,331,647号、Nisonoffら、Arch Biochem. Biophys. 89：230 （1960）、Porter、Biochem. J. 73：119 （1959）、Edelmanら、Methods in Enzymology、第1巻、p.422 （Academic Press、1967）、ならびに
Coligan、p.2.8.1〜2.8.10および2.10.〜2.10.4で説明されている。
【０２２７】
重鎖の分離による一価の軽鎖-重鎖断片の形成、断片のさらなる切断、または他の酵素的、化学的、または遺伝的な手法などの、他の抗体切断法は、断片が、完全な抗体によって認識される抗原に結合する限りにおいて用いられる。
【０２２８】
例えばFv断片は、VH鎖およびVL鎖が結合した状態の断片である。この結合はInbarら、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69：2659 （1972）で説明されているように非共有結合性である。あるいは可変鎖は、分子間ジスルフィド結合、または化学物質（グルタルアルデヒドなど）による架橋によって連結可能である（例えばSandhu、Crit. Rev. Biotech. 12：437 （1992）を参照）。
【０２２９】
Fv断片は、ペプチドリンカーで連結されるVH鎖およびVL鎖を含む場合がある。このような1本鎖抗原結合タンパク質（scFv）は、オリゴヌクレオチドで連結されるVHドメインおよびVLドメインをコードするDNA配列を含む構造遺伝子を構築することで調製される。この構造遺伝子は、発現ベクターに挿入されて、次に大腸菌などの宿主細胞に導入される。組換え宿主細胞は、2つのVドメインを結合するリンカーペプチドを伴う1本のポリペプチド鎖を合成する。scFvを作製する方法は例えばWhitlowら、Methods：A Companion to Methods in Enzymology 2：97 （1991）で説明されている（Birdら、Science 242：423 （1988）、Ladnerら、米国特許第4,946,778号、Packら、Bio/Technology 11：1271 （1993）、およびSandhu、前掲、も参照）。
【０２３０】
例としてscFvは、リンパ球をZcytor21ポリペプチドにインビトロで曝露することによって、またファージベクターまたは類似のベクターの抗体ディスプレイライブラリーを選択することによって得られる（例えば、固定化または標識されたZcytor21のタンパク質またはペプチドを使用する）。潜在的なZcytor21ポリペプチド結合ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子は、ファージ上（ファージディスプレイ）、または細菌（大腸菌）上に提示されたランダムペプチドライブラリーをスクリーニングすることで得られる。ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ランダム変異誘発法や、ランダムポリヌクレオチド合成法などの、いくつかの方法で得られる。このようなランダムペプチドディスプレイライブラリーを用いて、リガンドもしくは受容体などのタンパク質もしくはポリペプチド、生物由来の高分子もしくは合成高分子、または有機性基質もしくは無機性基質の場合がある既知の標的と相互作用するペプチドのスクリーニングを行うことができる。このようなランダムペプチドディスプレイライブラリーを作製およびスクリーニングする手法は当技術分野で周知であり（Ladnerら、米国特許第5,223,409号、Ladnerら、米国特許第4,946,778号、Ladnerら、米国特許第5,403,484号、Ladnerら、米国特許第5,571,698号、およびKayら、Phage Display of Peptides and Proteins （Academic Press社、1996））、かつランダムペプチドディスプレイライブラリー、およびこのようなライブラリーをスクリーニングするためのキットは、例えばCLONTECH Laboratories社（Palo Alto、CA）、Invitrogen社（San Diego、CA）、New England Biolabs社（Beverly、MA）、ならびにPharmacia LKB Biotechnology社 （Piscataway、NJ）から市販されている。ランダムペプチドディスプレイライブラリーを、本明細書に開示されたZcytor21の配列を用いてスクリーニングすることで、Zcytor21に結合するタンパク質を同定することができる。
【０２３１】
別の形状の抗体断片は、1つの相補性決定領域（CDR）をコードするペプチドである。CDRペプチド（「最小認識単位」）は、対象抗体のCDRをコードする遺伝子を構築することで得られる。このような遺伝子は例えば、ポリメラーゼ連鎖反応で、抗体産生細胞のRNAに由来する可変領域を合成することによって調製される（例えばLarrickら、Methods：A Companion to Methods in Enzymology 2：106 （1991）、Courtenay-Luck、「Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies」、Monoclonal Antibodies：Production, Engineering and Clinical Application、Ritterら共編、p.166 （Cambridge University Press、1995）、ならびにWardら、「Genetic Manipulation and Expression of Antibodies」、Monoclonal Antibodies：Principles and Applications、Birchら共編、p.137 （Wiley-Liss社、1995）を参照）。
【０２３２】
あるいは、抗Zcytor21抗体は、「ヒト化」モノクローナル抗体に由来する場合がある。ヒト化モノクローナル抗体は、マウスの相補性決定部を、マウスの免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域からヒトの可変ドメインに移すことによって作製される。次にヒト抗体の典型的な残基が、マウスの対応物のフレームワーク領域において置換される。ヒト化モノクローナル抗体に由来する抗体成分の用途は、マウスの定常領域の免疫原性に関連する潜在的な問題を除く。マウス免疫グロブリンの可変ドメインをクローン化する一般的な手法は、例えばOrlandiら、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86：3833 （1989）に記載されている。ヒト化モノクローナル抗体を作製する手法は例えばJonesら、Nature 321： 522 （1986）、Carterら、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89：4285 （1992）、Sandhu、Crit. Rev. Biotech. 12：437 （1992）、Singerら、J. Immun. 150：2844 （1993）、Sudhir編、Antibody Engineering Protocols （Humana Press社、1995）、Kelley、「Engineering Therapeutic Antibodies」、Protein Engineering：Principles and Practice、Clelandら共編、p.399〜434 （John Wiley & Sons社、1996）、ならびにQueenら、米国特許第5,693,762号（1997）に記載されている。
【０２３３】
ポリクローナル抗イディオタイプ抗体は、抗Zcytor21抗体または抗体断片を用いて、動物を標準的な手法で免疫化することによって調製することができる。これについては例えばGreenら、「Production of Polyclonal Antisera」、Methods In Molecular Biology：Immunochemical Protocols、Manson編、p.1〜12 （Humana Press、1992）を参照されたい。またColigan、p.2.4.1〜2.4.7も参照されたい。あるいはモノクローナル抗イディオタイプ抗体は、抗Zcytor21抗体または抗体断片を免疫原として用いて、上述の手法で調製することができる。別の方法では、ヒト化抗イディオタイプ抗体、または類人猿の抗イディオタイプ抗体を上述の手法で調製することができる。抗イディオタイプ抗体を作製する方法は例えばIrie、米国特許第5,208,146号、Greeneら、米国特許第5,637,677号、ならびにVarthakaviおよびMinocha、J. Gen. Virol. 77：1875 （1996）に記載されている。
【０２３４】
9．遺伝子発現および遺伝子構造を検出するためのZcytor21ヌクレオチド配列の使用
核酸分子を用いて、生物試料中のZcytor21遺伝子の発現を検出することができる。適切なプローブ分子には、配列番号：1、4、7、10、もしくは14のヌクレオチド配列、またはこの一部を含む2本鎖核酸分子、ならびに配列番号：1、4、7、10、もしくは14のヌクレオチド配列、またはこの一部の相補物を有する1本鎖の核酸分子などがある。プローブ分子はDNA、RNA、オリゴヌクレオチドなどの場合がある。本明細書で用いられる「一部（portion）」という表現は、少なくとも8個のヌクレオチドから少なくとも20個またはこれ以上のヌクレオチドを意味する。例示的なプローブは、他のサイトカイン受容体遺伝子の匹敵する領域との配列類似性が低いZcytor21遺伝子の領域と結合する。
【０２３５】
基本的なアッセイ法では、1本鎖のプローブ分子を、生物試料から単離されたRNAと共に、プローブと標的Zcytor21のRNA種との塩基対形成を促す温度およびイオン強度の条件でインキュベートする。未結合状態のプローブをハイブリダイズした分子から分離した後に、ハイブリッドの量を検出する。
【０２３６】
RNAを検出する、確立したハイブリダイゼーション法には、ノーザン解析、およびドット/スロットブロットハイブリダイゼーションなどがある（例えばAusubel（1995）、p.4-1〜4-27、およびWuら編、「Analysis of Gene Expression at the RNA Level」、Methods in Gene Biotechnology、p.225〜239 （CRC Press社、1997）を参照）。核酸プローブは、検出目的で、32Pまたは35Sなどの放射性同位体で標識することができる。あるいはZcytor21のRNAを、非放射性ハイブリダイゼーション法で検出することができる（例えばIsaac編、「Protocols for Nucleic Acid Analysis by Nonradioactive Probes」（Humana Press社、1993）を参照）。典型的には、非放射性検出は、発色基質または化学発光性基質の酵素的変換によって達成される。例示的な非放射性部分には、ビオチン、フルオレセイン、およびジゴキシゲニンなどがある。
【０２３７】
Zcytor21のオリゴヌクレオチドプローブはインビボ診断にも有用である。例として18F標識オリゴヌクレオチドを被験者に投与して、陽電子放射断層撮影法で可視化することができる（Tavitianら、Nature Medicine 4：467 （1998））。
【０２３８】
数多くの診断手順で、検出法の感度を高めるためにポリメラーゼ連鎖反応（PCR）が利用されている。PCRを行う際の標準的な手段は周知である（一般的にはMathew編、「Protocols in Human Molecular Genetics」（Humana Press社、1991）、White編、「PCR Protocols：Current Methods and Applications」（Humana Press社、1993）、Cotter編、「Molecular Diagnosis of Cancer」（Humana Press社、1996）、HanausekおよびWalaszek共編、「Tumor Marker Protocols」（Humana Press社、1998）、Lo編、「Clinical Applications of PCR 」（Humana Press社、1998）、ならびにMeltzer編、「PCR in Bioanalysis」（Humana Press社、1998）を参照）。
【０２３９】
PCRプライマーを設計して、他のタンパク質（他のサイトカイン受容体タンパク質など）に同等の領域に対する配列類似性が低いZcytor21遺伝子の一部を増幅することができる。
【０２４０】
診断アッセイ法に用いるPCRの1つの変形例は逆転写酵素PCR（RT-PCR）である。RT-PCR法では、RNAを生物試料から単離し、cDNAに逆転写し、このcDNAをZcytor21プライマーとともにインキュベートする（例えばWuら共編、「Rapid Isolation of Specific cDNAs or Genes by PCR」、Methods in Gene Biotechnology、p.15〜28 （CRC Press社、1997）を参照）。次に標準的な手法でPCRを行って産物を解析する。
【０２４１】
例としてRNAは、上述のグアニジウム-チオシアナート細胞溶解法で生物試料から単離される。あるいは、固相法でmRNAを細胞溶解物から単離することができる。逆転写反応は、ランダムオリゴヌクレオチド、dTの短いホモポリマー、またはZcytor21アンチセンスオリゴマーを用いて、単離されたRNAで開始することができる。オリゴdTプライマーには、対照標的配列となる、さまざまなmRNAヌクレオチド配列が増幅されるという利点がある。Zcytor21配列は、2本の隣接オリゴヌクレオチドプライマー（通常20塩基の長さ）を用いるポリメラーゼ連鎖反応によって増幅される。
【０２４２】
PCR増幅産物は、さまざまな方法で検出することができる。例えばPCR産物をゲル電気泳動で分画して、臭化エチジウム染色で可視化することができる。あるいは分画後のPCR産物をメンブレンにトランスファーし、検出可能に標識されたZcytor21プローブとハイブリダイズさせ、オートラジオグラフィーで調べることができる。別の方法には、ジゴキシゲニン標識デオキシリボ核酸三リン酸の使用による化学発光の検出、およびC-TRAK熱量測定アッセイ法などがある。
【０２４３】
Zcytor21発現の別の検出法は、1本鎖のDNA標的が、過剰のDNA-RNA-DNAキメラプローブと結合して複合体を形成し、このRNA部分がRNAase Hによって切断され、切断されたキメラプローブの有無を確認する、サイクリングプローブ法である（例えばBeggsら、J. Clin. Microbiol. 34：2985 （1996）、Bekkaouiら、Biotechniques 20：240 （1996）を参照）。Zcytor21配列を検出する別の方法では、核酸配列ベースの増幅、交差ハイブリダイゼーションによるテンプレートの協同増幅、ならびにリガーゼ連鎖反応などの方法を用いることができる（例えばMarshallら、米国特許第5,686,272号（1997）、Dyerら、J. Virol. Methods 60：161 （1996）、Ehrichtら、Eur. J. Biochem. 243：358 （1997）、ならびにChadwickら、J. Virol. Methods 70：59 （1998）を参照）。他の標準的な方法は当技術分野で周知である。
【０２４４】
Zcytor21のプローブおよびプライマーを使用して、組織試料中のZcytor21遺伝子発現の検出および局在決定を行うこともできる。このようなインサイチューハイブリダイゼーションの方法は当技術分野で周知である（例えばChoo編、「In Situ Hybridization Protocols」（Humana Press社、1994）、Wuら共編、「Analysis of Cellular DNA or Abundance of mRNA by Radioactive In Situ Hybridization （RISH）」、Methods in Gene Biotechnology、p.259〜278 （CRC Press社、1997）、ならびにWuら共編、「Localization of DNA or Abundance of mRNA by Fluorescence In Situ Hybridization （RISH）」、Methods in Gene Biotechnology、p.279〜289 （CRC Press社、1997）を参照）。他のさまざまな診断法が当技術分野で周知である（例えばMathew編、「Protocols in Human Molecular Genetics」（Humana Press社、1991）、ColemanおよびTsongalis、「Molecular Diagnostics」（Humana Press社、1996）、ならびにElles、「Molecular Diagnosis of Genetic Diseases」（Humana Press社、1996））。適切な被験試料には、血液、尿、唾液、組織生検、および剖検材料などが含まれる。
【０２４５】
サイトカイン受容体の変異は特定の疾患と関連する。例えば、サイトカイン受容体の多型は、肺胞タンパク質症、家族性周期性発熱、ならびに赤白血病と関連する。Zcytor21遺伝子は、ヒト染色体3p25.3に位置する。この領域は、ファンコーニ貧血、色素性乾皮症、マルファン様結合組織疾患、ならびに心筋症を含む、さまざまな障害および疾患に関連する。したがってZcytor21のヌクレオチド配列は、さまざまな病気の連鎖に基づく検査、および被験者の染色体がZcytor21遺伝子に変異を含むか否かの判定に使用することができる。Zcytor21遺伝子座位における検出可能な染色体異常には、異数性、遺伝子コピー数の変化、挿入、欠失、制限酵素切断部位の変化、ならびに再編成が含まれるがこれらに限定されない。特に重要な変化は、Zcytor21遺伝子を不活性化する遺伝的変化である。
【０２４６】
本発明は、診断的応用に用途を見出すと考えられる試薬も提供する。例えばZcytor21の遺伝子、Zcytor21 DNAもしくはRNA、またはこのサブ配列を含むプローブは、Zcytor21遺伝子がヒト染色体上に存在するか否か、または遺伝子変異が生じているか否かの判定に使用することができる。Zcytor21のゲノムDNAの一部を含むヒトゲノムDNAの断片のアノテーションに基づき、Zcytor21は第3染色体のp25.3領域に位置するとされている。Zcytor21の遺伝子座位において検出可能な染色体異常は、異数性、遺伝子コピー数変化、異型接合性の消失（LOH）、転座、挿入、欠失、制限酵素切断部位の変化および再編成を含むがこれらに限定されない。このような異常は、本発明のポリヌクレオチドを用いて、制限酵素切断断片多型（RFLP）解析、PCR法を利用する短いタンデムリピート（STR）解析、ならびに当技術分野で周知の他の遺伝子連鎖解析法などの分子遺伝学的手法で検出することができる（Sambrookら、前掲；Ausubelら、前掲；Marian、Chest 108：255〜65、1995）。
【０２４７】
遺伝子の位置に関する正確な知識は、以下を始めとするいくつかの目的に有用な場合がある：（1）配列が既存のコンティグの一部か否かを判定し、YAC、BAC、またはcDNAクローンなどのさまざまな状態において、付加的な周囲の遺伝子配列を得ること；（2）同じ染色体領域との連鎖を示す遺伝性疾患に関する、可能性のある候補遺伝子を提供すること；ならびに（3）特定の遺伝子がどのような機能をもつかということを決定する一助となるモデル生物（マウスなど）を相互参照すること。
【０２４８】
zcytor21遺伝子は第3染色体のp25.3領域に位置する。機能が既知の複数の遺伝子が、ヒトの病気と関連する同領域にマップされている。したがってzcytor21遺伝子が染色体p25.3にマップされることから、本発明のzcytor21のポリヌクレオチドプローブを用いて、第3染色体モノソミーおよび他の染色体p25.3欠失の有無を検出および診断することが可能であり、そして特に第3染色体のモノソミーならびにp25.3における欠失および染色体異常（欠失、再編成、および染色体切断、ならびに転座を含む）は腫瘍に関連する場合がある。したがってzcytor21遺伝子がこの重要な領域にマップされることから、本発明のzcytor21ポリヌクレオチドプローブを用いて、上記疾患と関連する染色体の欠失、転座、および再編成を検出することができる。これについてはOnline Mendellian Inheritance of Man （OMIM（商標）、National Center for Biotechnology Information、National Library of Medicine、Bethesda、MD）の遺伝子マップ、ならびに、これに含まれる、ヒト第3染色体の同領域、および公的に利用できるワールドワイドウェブのサーバー上にあるp25.3に関する参考文献を参照されたい。これらは全て、zcytor21遺伝子と同じ染色体領域との連鎖を示す遺伝性疾患の可能性のある候補遺伝子となる。したがってzcytor21のポリヌクレオチドプローブを用いて、この欠損に関連する異常または遺伝子型を検出することができる。
【０２４９】
診断は、疾患の種類および適切な関連療法を決定することにおいて、または遺伝カウンセリングの補助において、医師を補助しうる。したがって本発明の抗zcytor21抗体、ポリヌクレオチド、およびポリペプチドをzcytor21のポリペプチド、mRNA、または抗zcytor21抗体の検出に使用することで、マーカーとして作用し、また当技術分野で周知の方法、および本明細書に記載された方法で本明細書に記載されているように、遺伝病または癌の検出に直接使用することができる。さらに、zcytor21のポリヌクレオチドプローブを用いて、染色体p25.3の欠失に関連する異常または遺伝子型、第3染色体モノソミー、および上述のヒトの病気に関連する転座、または腫瘍の悪性化の進行に関与する他の転座およびLOH、または悪性腫瘍における染色体再編成との関与が推定される他のp25.3変異；または他の癌を検出することができる。同様に、zcytor21のポリヌクレオチドプローブを用いて、染色体p25.3トリソミーに関連する異常または遺伝子型、およびヒトの疾患または自然流産に関連する染色体欠損を検出することができる。これらはいずれも、zcytor21遺伝子と同じ染色体領域との連鎖を示す遺伝性疾患の可能性のある候補遺伝子となる。したがってzcytor21のポリヌクレオチドプローブを用いて、この欠損が関連する異常または遺伝子型を検出することができる。
【０２５０】
当業者であれば、zcytor21のポリヌクレオチドプローブが、異型接合性の消失（LOH）、染色体の獲得（例えばトリソミー）、転座、染色体の欠損（モノソミー）、DNA増幅などに関連する第3染色体全体の異常の診断に特に有用であることを理解すると思われる。zcytor21遺伝子が位置する染色体座位p25.3内における転座はヒトの病気に関連することが知られている。例えばp25.3欠失、モノソミー、および転座は、上述の特定のヒトの病気に関連する。したがってzcytor21遺伝子が、この重要な領域にマップされることから、本発明のzcytor21のポリヌクレオチドプローブを用いて、上述のp25.3の転座、欠失、およびトリソミーなどと関連する異常または遺伝子型を検出することができる。
【０２５１】
上述したように、zcytor21遺伝子そのものの欠損は、ヒトの遺伝性の疾患状態を招く場合がある。本発明のポリペプチド、拮抗物質、作動物質、ポリヌクレオチド、および抗体などの本発明の分子は、zcytor21遺伝子欠損に関連する検出、診断、予防、および治療に有用な場合がある。またzcytor21ポリヌクレオチドプローブを用いて、zcytor21染色体座位における患者と非患者間の対立遺伝子の差を検出することができる。したがってzcytor21の配列を、法医学的なDNAプロファイリングの診断に使用することができる。
【０２５２】
タンパク質切断試験は、翻訳終了変異が、コードタンパク質の一部のみを生じる、遺伝子の不活性化を検出する際にも有用である（例えばStoppa-Lyonnetら、Blood 91：3920（1998）を参照）。この方法に従い、RNAを生物試料から単離し、cDNAの合成に使用する。次にPCRでZcytor21標的配列を増幅し、RNAポリメラーゼプロモーター、翻訳開始配列、および読み枠の合ったATGトリプレットを導入する。PCR産物をRNAポリメラーゼで転写し、転写物をT7共役網状赤血球溶解物系（T7-coupled reticulocyte lysate system）でインビトロで翻訳する。次に、翻訳産物をSDS-PAGEで分画して翻訳産物の長さを決定する。タンパク質の切断試験については例えばDracopoliら共編、「Current Protocols in Human Genetics」、p9.11.1〜9.11.18（John Wiley & Sons、1998）で説明されている。
【０２５３】
本発明は、Zcytor21遺伝子発現の診断アッセイ法を行って、Zcytor21遺伝子の変異を検出するためのキットも想定している。このようなキットは、配列番号：10のヌクレオチド135位〜1427位のヌクレオチド配列、配列番号：10のヌクレオチド配列またはこの一部を含む2本鎖の核酸分子、ならびに配列番号：10のヌクレオチド配列またはこの一部の相補物を有する1本鎖の核酸分子などの核酸プローブを含む。核酸プローブは、配列番号：1、4、7、または14のヌクレオチド配列を元にすることも可能である。プローブ分子は、DNA、RNA、オリゴヌクレオチドなどの場合がある。キットは、PCR用の核酸プライマーを含む場合がある。
【０２５４】
このようなキットは、上述の核酸診断アッセイ法を行うための全ての要素を含む場合がある。キットは、Zcytor21プローブまたはプライマーを含む少なくとも1つの容器を含む。キットは、Zcytor21配列の有無を指示する能力のある1種またはこれ以上の試薬を含む第2の容器を含む場合もある。このような指示薬の例には、放射性標識、蛍光色素、化学発光剤などの検出用標識がある。キットは、Zcytor21遺伝子発現を検出するためにZcytor21プローブおよびプライマーが使用される旨を、使用者に伝えるための手段を含む場合もある。例えば書面による指示書には、同梱された核酸分子が、Zcytor21をコードする核酸分子か、Zcytor21をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子のいずれかを検出するために使用可能であることが記載される場合がある。書記情報（written material）は、容器に直接記載される場合があるほか、添付文書の状態で提供される場合がある。
【０２５５】
10．Zcytor21を検出するための抗Zcytor21抗体の用途
本発明は、Zcytor21の有無に関して生物試料をインビトロでスクリーニングするための抗Zcytor21抗体の使用を想定している。ある種のインビトロアッセイ法では、抗Zcytor21抗体が液相で使用される。例えば、生物試料中におけるZcytor21の有無は、生物試料を、微量の標識Zcytor21および抗Zcytor21抗体と、Zcytor21とその抗体の結合を促す条件下で混合することにより調べることができる。試料中のZcytor21と抗Zcytor21の複合体は、複合体に、Fc抗体などの抗体、またはブドウ球菌（Staphylococcus）のプロテインAと結合する固定化されたタンパク質を接触させることにより、反応混合物から調製することができる。生物試料中のZcytor21の濃度は、抗体に結合した標識されたZcytor21の量に逆比例し、また遊離の標識されたZcytor21の量に直接関連する。例示的な生物試料には、血液、尿、唾液、組織生検、および剖検材料などがある。
【０２５６】
あるいは、抗Zcytor21抗体が固相担体に結合されているインビトロアッセイ法を行うことができる。例えば、抗体をポリマー（アミノデキストランなど）に結合させることで、抗体を、ポリマーでコートされたビーズ、プレート、またはチューブなどの不溶性支持体に連結することが可能である。他の適切なインビトロアッセイ法は当業者に容易に明らかとなる。
【０２５７】
別の方法では、抗Zcytor21抗体を用いて、生検標本から調製された組織切片中のZcytor21を検出することができる。このような免疫化学的検出を用いて、Zcytor21の相対量を決定すること、ならびに調査対象組織中におけるZcytor21の分布を決定することが可能となる。一般的な免疫化学的手法は当技術分野で周知である（例えばPonder、「Cell Marking Techniques and Their Application」、Mammalian Development：A Practical Approach、Monk編、p.115〜138 （IRL Press、1987）、Coligan、p.5.8.1〜5.8.8、Ausubel （1995）、p.14.6.1〜14.6.13 （Wiley Interscience、1990）、およびManson編、「Methods In Molecular Biology」、第10巻：Immunochemical Protocols （The Humana Press社、1992））。
【０２５８】
免疫化学的検出法は、生物試料に抗Zcytor21抗体を接触させ、次にこの生物試料に、抗体と結合する検出可能に標識された分子を接触させることで実施することができる。例えば、検出可能に標識された分子は、抗Zcytor21抗体に結合する抗体部分を含む場合がある。あるいは抗Zcytor21抗体は、アビジン/ストレプトアビジン（またはビオチン）と複合体を形成することが可能であり、また検出可能に標識された分子はビオチン（またはアビジン/ストレプトアビジン）を含む場合がある。この基本技術の数多くの変形例は当技術分野で周知である.
【０２５９】
あるいは、抗Zcytor21抗体は、検出用標識と複合体を形成して、抗Zcytor21免疫複合体を形成可能である。適切な検出用標識は、例えば、放射性同位元素、蛍光標識、化学発光標識、酵素標識、生物発光標識、または金コロイドを含む。このような検出可能に標識された免疫複合体を作製および検出する方法は当技術分野で周知であり、以下にさらに詳述する。
【０２６０】
このような検出用標識は、オートラジオグラフィーで検出される放射性同位元素の場合がある。本発明の目的に特に有用な同位元素は3H、125I、131I、35S、および14Cである。
【０２６１】
抗Zcytor21免疫複合体は、蛍光化合物で標識することができる。蛍光標識された抗体の有無は、免疫複合体を適切な波長の光に曝露し、結果として生じる蛍光を検出することで判定される。蛍光標識化合物には、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o-フタルアルデヒド、およびフルオレサミンなどがある。
【０２６２】
あるいは抗Zcytor21免疫複合体は、抗体成分に化学発光化合物を結合させることで検出可能に標識することができる。化学発光性タグを有する免疫複合体の有無は、化学反応の過程で生じる発光の有無を検出することで決定される。化学発光標識化合物の例には、ルミノール、イソルミノール、芳香性アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、ならびにシュウ酸エステルなどがある。
【０２６３】
同様に、生物発光化合物を用いて、本発明の抗Zcytor21免疫複合体を標識することができる。生物発光は、触媒性タンパク質が化学発光反応の効率を高める、生物系におけるある種の化学発光である。生物発光タンパク質の有無は、発光の有無を検出することで判定される。標識に有用な生物発光化合物には、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、およびエクオリンなどがある。
【０２６４】
あるいは抗Zcytor21免疫複合体は、抗Zcytor21抗体成分に酵素を連結することで、検出可能に標識することができる。抗Zcytor21酵素複合体を、適切な基質の存在下でインキュベートすると、酵素部分が基質と反応して、例えば分光光度的、蛍光定量的、または可視的な手段によって検出可能な化合物の一部を生じる。多特異的な免疫複合体を検出可能に標識するために使用可能な酵素の例には、β-ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、およびアルカリホスファターゼなどがある。
【０２６５】
当業者であれば、本発明で使用可能な他の適切な標識を熟知していると考えられる。マーカー部分と抗Zcytor21抗体との結合は当技術分野で周知の標準的な手法で達成することができる。結合に典型的な方法はKennedyら、Clin. Chim. Acta 70：1 （1976）、Schursら、Clin. Chim. Acta 81：1 （1977）、Shihら、Int'l J. Cancer 46：1101 （1990）、Steinら、Cancer Res. 50：1330 （1990）、およびColigan、前掲、に記載されている。
【０２６６】
また、免疫化学的検出の利便性および汎用性は、アビジン、ストレプトアビジン、およびビオチンと複合体を形成した抗Zcytor21抗体を用いることで高めることができる（例えばWilchekら共編、「Avidin-Biotin Technology」、Methods In Enzymology、第184巻 （Academic Press、1990）、およびBayerら、「Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology」、Methods In Molecular Biology、第10巻、Manson編、p.149〜162 （The Humana Press社、1992）を参照）。
【０２６７】
免疫アッセイ法を行うための方法は十分に確立されている。これについては例えばCookおよびSelf、「Monoclonal Antibodies in Diagnostic Immunoassays」、Monoclonal Antibodies：Production, Engineering, and Clinical Application、RitterおよびLadyman共編、p.180〜208（Cambridge University Press、1995）、Perry、「The Role of Monoclonal Antibodies in the Advancement of Immunoassay Technology」、Monoclonal Antibodies：Principles and Applications、BirchおよびLennox共編、p.107〜120 （Wiley-Liss社、1995）、ならびにDiamandis、Immunoassay （Academic Press社、1996）を参照されたい。
【０２６８】
本発明は、Zcytor21遺伝子発現を対象とした免疫学的診断アッセイ法を行うためのキットも想定している。このようなキットは、抗Zcytor21抗体または抗体断片を含む少なくとも1個の容器を含む。キットは、Zcytor21抗体または抗体断片の有無を指示可能な1種または複数の試薬を含む第2の容器を含む場合もある。このような指示薬の例には、放射性標識、蛍光標識、化学発光標識、酵素標識、生物発光標識、金コロイドなどの検出用標識などがある。キットは、Zcytor21タンパク質を検出するためにZcytor21抗体または抗体断片が用いられる旨を、使用者に伝える手段を含む場合もある。例えば書面による指示書には、同梱された抗体または抗体断片が、Zcytor21の検出に使用可能なことが記載されている場合がある。書記情報は、容器に直接記載される場合があるほか、添付文書の状態で提供される場合がある。
【０２６９】
11．Zcytor21活性を有するポリペプチドの治療的用途
Zcytor21活性を有するアミノ酸配列を用いて、Zcytor21のリガンドと結合させることでZcytor21リガンドと内因性Zcytor21受容体の結合を妨げることにより免疫系を調節することができる。例として、Zcytor21活性を有するポリペプチドを用いて、例えば乾癬に関連する細胞の増殖、または腫瘍の成長（例えば黒色腫）を抑制することができる。抗Zcytor21抗体などのZcytor21拮抗物質を用いて、Zcytor21リガンドと内因性Zcytor21受容体の結合を抑制することによって免疫系を調節することもできる。
【０２７０】
したがって本発明は、Zcytor21活性を有するタンパク質、ポリペプチド、およびペプチド（Zcytor21ポリペプチド、Zcytor21類似体（例えば抗Zcytor21抗イディオタイプ抗体）、およびZcytor21融合タンパク質など）の、適量のZcytor21ポリペプチドを欠く被験者、または過剰のZcytor21リガンドを産生する被験者に対する用途を含む。Zcytor21拮抗物質（例えば抗Zcytor21抗体）を用いて、過剰なZcytor21リガンドまたはZcytor21のいずれかを産生する被験者を治療することもできる。このような分子は、処置を必要としている任意の被験者に投与することが可能であり、また本発明は、獣医学的使用およびヒトの治療における使用の両方を想定している。例示的な被験対象には、家畜およびヒト患者などの哺乳類の被験対象が含まれる。
【０２７１】
一般に、投与されるZcytor21（またはZcytor21の類似体もしくは融合タンパク質）の用量は、被験者の年齢、体重、身長、性別、医学的な全身状態、および既往歴のような因子に応じて変動する。典型的には、約1 pg/kg〜10 mg/kg（薬剤量/被験者体重）範囲の用量のZcytor21ポリペプチドをレシピエントに提供することが望ましいが、状況に応じて低用量または高用量が投与される場合もある。
【０２７２】
被験者に対するZcytor21ポリペプチドの投与は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜内、髄腔内へ局所カテーテルを経由した潅流によって、または直接病巣内注射によって行うことができる。注射によって治療用タンパク質を投与する場合は、投与は持続点滴か、または単回もしくは複数回のボーラスで行うことができる。
【０２７３】
他の投与経路には、経口、経粘膜、肺内、および経皮などがある。経口投与は、ポリエステル微粒子、ゼイン微粒子、プロテイノイド微粒子、ポリシアノアクリレート微粒子、および脂質ベースの系に適している（例えばDiBaseおよびMorrel、「Oral Delivery of Microencapsulated Proteins」、Protein Delivery：Physical Systems、SandersおよびHendren共編、p.255〜288 （Plenum Press 1997）を参照）。鼻腔内投与の実行可能性は、インスリン投与のような様式で例示される（例えばHinchcliffeおよびIllum、Adv. Drug Deliv. Rev. 35：199 （1999）を参照）。Zcytor21を含む乾燥粒子または液状粒子は、乾燥粉末分散装置、液体エアロゾル発生装置、またはネブライザーを補助的に用いて調製して吸入させることができる（例えばPettitおよびGombotz、TIBTECH 16：343 （1998）；Pattonら、Adv. Drug Deliv. Rev. 35：235 （1999））。この手法は、エアロゾル化されたインスリンを肺に送り込む携帯式の電動吸入装置の1種である、AERX糖尿病管理システムによって示される。研究の結果、48,000 kDaもの大きさのタンパク質が、低周波数の超音波を利用することで、皮膚を介して治療濃度で輸送されたことが明らかになっている。これは経皮投与の実行可能性を示す事実である（Mitragotriら、Science 269：850 （1995））。エレクトロポレーションを利用した経皮輸送は、Zcytor21結合活性を有する分子を投与する別の手段となる（Pottsら、Pharm. Biotechnol. 10：213 （1997））。
【０２７４】
Zcytor21結合活性を有するタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを含む薬学的組成物は、治療用タンパク質が薬学的に許容される担体の混合物と混合される、薬学的に有用な組成物を調製する既知の方法で、製剤化することができる。組成物は、その投与がレシピエント患者によって耐えられる場合に「薬学的に許容される担体」と表現される。無菌性のリン酸緩衝食塩水は、薬学的に許容される担体の一例である。他の適切な担体は当技術分野で周知である。これについては例えばGennaro編、「Remington's Pharmaceutical Sciences」、第19版 （Mack Publishing Company、1995）を参照されたい。
【０２７５】
治療の目的のために、Zcytor21結合活性を有する分子、および薬学的に許容される担体を治療有効量で患者に投与する。Zcytor21結合活性を有するタンパク質、ポリペプチド、またはペプチド、ならびに薬学的に許容される担体の組み合わせは、投与される量が生理学的に有意な場合に「治療有効量」で投与されると表現される。薬剤は、その存在が、レシピエント患者の生理機能上、検出可能な変化をもたらすのであれば生理学的に有意である。例えば、炎症の治療に使用される薬剤は、その存在が炎症反応を緩和するのであれば生理学的に有意である。別の例として、腫瘍細胞の成長の抑制に使用される薬剤は、同薬剤の投与が腫瘍細胞数の減少、転移の減少、固形腫瘍の大きさの縮小、または腫瘍の壊死の増加をもたらすのであれば生理学的に有意である。
【０２７６】
Zcytor21（またはZcytor21類似体もしくは融合タンパク質）を含む薬学的組成物は、液状、エアロゾル状、または固体状で提供することができる。液状の例は、注射溶液および経口の懸濁剤である。例示的な固体状には、カプセル、錠剤、および徐放性の形状などが含まれる。後者の形状の例は小型浸透圧ポンプおよびインプラントである（Bremerら、Pharm. Biotechnol. 10：239 （1997）；Ranade、「Implants in Drug Delivery」、Drug Delivery Systems、RanadeおよびHollinger共編、p.95〜123 （CRC Press、1995）；Bremerら、「Protein Delivery with Infusion Pumps」、Protein Delivery：Physical Systems、SandersおよびHendren共編、p.239〜254 （Plenum Press、1997）；Yeweyら、「Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant」、Protein Delivery：Physical Systems、SandersおよびHendren共編、p.93〜117 （Plenum Press、1997））。
【０２７７】
リポソームは、治療用ポリペプチドを被験者に、静脈内、腹腔内、髄腔内、筋肉内、皮下に、または経口投与、吸入、もしくは鼻腔内への投与で送り込む手段となる。リポソームは、水性領域を囲む1種または複数の脂質二重層を含むマイクロカプセルの小胞である（一般的にはBakker-Woudenbergら、Eur. J. Cliff. Microbiol. Infect. Dis. 12 （Suppl. 1）：S61 （1993）、Kim、Drugs 46：618 （1993）、およびRanade、「Site Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers」、Drug Delivery Systems、RanadeおよびHollinger共編、p.3〜24 （CRC Press、1995）を参照）。リポソームは組成が細胞膜と似ているため、安全に投与することが可能であり、また生分解性をもつ。調製法に依存して、リポソームは単層または多層の場合がある。またリポソームは0.02 μm〜10 μm超の範囲の直径で大きさが変動する。さまざまな薬剤をリポソームに包み込むことができる。疎水性薬剤は二重層に分配され、親水性薬剤は内部の水性空間（群）に分配される（例えばMachyら、「Liposomes In Cell Biology And Pharmacology」（John Libbey、1987）、およびOstroら、American J. Hosp. Pharm. 46：1576 （1989）を参照）。またリポソームの大きさ、二重層の数、脂質組成、ならびにリポソームの電荷および表面の特性を変化させることで、包まれた薬剤の治療的応用を調節することが可能である。
【０２７８】
リポソームは、実質的にあらゆる種類の細胞に吸着し、包まれた薬剤を緩やかに放出することができる。あるいは、吸収されたリポソームは、食作用をもつ細胞に飲食作用で取り込まれる場合がある。エンドサイトーシスに続いて、リポソーム脂質がリソソーム内で分解され、包まれた薬剤が放出される（Scherphofら、Ann. N.Y. Acad. Sci. 446：368 （1985））。静脈内投与後に、少量のリポソーム（0.1〜1.0 μm）は通常、肝臓および脾臓に主に位置する網内系細胞に取り込まれる（3.0 μmより大きなリポソームは肺に蓄積する）。このような、より小さなリポソームが網内系の細胞に選択的に取り込まれることは、化学治療薬をマクロファージや肝臓の腫瘍に輸送する際に利用されてきた。
【０２７９】
網内系は、大用量のリポソーム粒子での飽和、または薬学的手段による選択的なマクロファージの不活性化を含む複数の方法により迂回することができる（Claassenら、Biochim. Biophys. Acta 802：428 （1984））。また、糖脂質またはポリエチレングリコールで誘導体化されたリン脂質がリポソーム膜に取り込まれると、網内系による取り込みが有意に減少することが報告されている（Allenら、Biochim. Biophys. Acta 1068：133 （1991）；Allenら、Biochim. Biophys. Acta 1150：9 （1993））。
【０２８０】
リポソームは、リン脂質組成を変化させたり、リポソームに受容体やリガンドを挿入したりすることにより特定の細胞または器官を標的とするために、調製することもできる。例えば、非イオン性界面活性剤を多量に含むように調製されたリポソームが、肝臓を標的として使用されることが報告されている（Hayakawaら、日本国特許第04-244,018号；Katoら、Biol. Pharm. Bull. 16：960 （1993））。これらの製剤は、メタノール中でダイズホスファチジルコリン、α-トコフェロール、およびエトキシル化された水素化ヒマシ油（HCO-60）を混合し、同混合物を真空下で濃縮した後に、水と混合して再構成することで調製された。ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）とダイズ由来のステリルグルコシド混合物（SG）、およびコレステロール（Ch）のリポソーム製剤は肝臓を標的とすることが報告されている（Shimizuら、Biol. Pharm. Bull. 20：881 （1997））。
【０２８１】
あるいは、さまざまな標的リガンドをリポソームの表面に結合させることができる（抗体、抗体断片、炭水化物、ビタミン、および輸送タンパク質など）。例えばリポソームを、分枝型ガラクトシル脂質誘導体で修飾して、もっぱら肝細胞表面で発現されるアシアロ糖タンパク質（ガラクトース）受容体を標的とすることができる（KatoおよびSugiyama、Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14：287 （1997）；Murahashiら、Biol. Pharm. Bull. 20：259 （1997））。同様にWuら、Hepatology 27：772 （1998）では、リポソームをアシアロフェツインで標識すると、リポソームの血漿半減期が短くなり、アシアロフェツインで標識されたリポソームの肝細胞による取り込みが大きく促進されることが報告されている。一方、分枝型ガラクトシル脂質誘導体を含むリポソームの肝細胞への蓄積は、アシアロフェツインを事前に注入することで阻害可能である（Murahashiら、Biol. Pharm. Bull. 20：259 （1997））。ポリアコニチル化されたヒト血清アルブミンリポソームは、リポソームを肝細胞に向かわせる別の方法となる（Kampsら、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 94：11681 （1997））。またGehoら、米国特許第4,603,044号では、肝臓の特異化した代謝性細胞と関連する肝胆道受容体に対する特異性を有する、肝細胞を標的とするリポソーム小胞輸送系について記載されている。
【０２８２】
組織を標的とする、さらに一般的な方法では、標的細胞を、標的細胞で発現されるリガンドに特異的なビオチン化抗体で事前標識する（Harasymら、Adv. Drug Deliv. Rev. 32：99 （1998））。遊離の抗体を血漿から除去した後に、ストレプトアビジンを結合させたリポソームを投与する。他の方法では、標的抗体をリポソームに直接結合させる（Harasymら、Adv. Drug Deliv. Rev. 32：99 （1998））。
【０２８３】
Zcytor21結合活性を有するポリペプチドを、タンパク質の微小カプセル化の標準的な手法でリポソームで包むことができる（例えばAndersonら、Infect. Immun. 31：1099 （1981）、Andersonら、Cancer Res. 50：1853 （1990）、およびCohenら、Biochim. Biophys. Acta 1063：95 （1991）、Alvingら、「Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies」、Liposome Technology、第2版、第III巻、Gregoriadis編、p.317（CRC Press、1993）、Wassefら、Meth. Enzymol. 149：124 （1987）を参照）。上述したように、治療的に有用なリポソームは、さまざまな化合物を含む場合がある。例えばリポソームは、ポリ（エチレングリコール）の脂質誘導体を含む場合がある（Allenら、Biochim. Biophys. Acta 1150：9 （1993））。
【０２８４】
分解性のポリマー微粒子が、治療用タンパク質の高度の全身性レベルを維持するために設計されている。微粒子は、ポリ（ラクチド-コ-グリコライド）（PLG）、ポリ無水物、ポリ（オルトエステル）、非生物分解性エチルビニル酢酸ポリマーなどの分解性ポリマーから調製され、タンパク質はこれらのポリマーに包括される（GombotzおよびPettit、Bioconjugate Chem. 6：332 （1995）；Ranade、「Role of Polymers in Drug Delivery」、Drug Delivery Systems、RanadeおよびHollinger共編、p.51〜93 （CRC Press、1995）；RoskosおよびMaskiewicz、「Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery」、Protein Delivery：Physical Systems、SandersおよびHendren共編、p.45〜92（Plenum Press、1997）；Bartusら、Science 281：1161 （1998）；PutneyおよびBurke、Nature Biotechnology 16：153 （1998）；Putney、Curr. Opin. Chem. Biol. 2：548 （1998））。ポリエチレングリコール（PEG）で被覆されたナノ粒子は、治療用タンパク質の静脈内投与時の担体にもなる（例えばGrefら、Pharm. Biotechnol. 10：167 （1997）を参照）。
【０２８５】
本発明は、ポリペプチドが上述のポリマーに連結されている、Zcytor21結合活性を有する化学的に修飾されたポリペプチド、およびZcytor21拮抗物質も想定している。
【０２８６】
当業者であれば、例えばAnselおよびPopovich、「Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems」、第5版 （Lea & Febiger、1990）、Gennaro編、「Remington's Pharmaceutical Sciences」、第19版 （Mack Publishing Company、1995）、ならびにRanadeおよびHollinger、Drug Delivery Systems （CRC Press、1996）に記載されているように他の投与剤形を考案することができる。
【０２８７】
例として、薬学的組成物は、Zcytor21の細胞外ドメインをもつポリペプチド、またはZcytor21の拮抗物質（例えばZcytor21ポリペプチドに結合する抗体または抗体断片）を含む容器を含むキットとして提供される場合がある。治療用ポリペプチドは、単回用量または複数回用量の注射溶液の状態で、または注射前に再構成される無菌性粉末として提供される場合がある。あるいは、このようなキットは、治療用ポリペプチドを投与するための乾燥粉末分散装置、液体エアロゾル発生装置、またはネブライザーを含む場合がある。このようなキットは、薬学的組成物の効能・効果および用途に関する、書記情報をさらに含む場合がある。また、このような情報は、Zcytor21組成が、Zcytor21に対する感度が高いことがわかっている患者には禁忌であるという記述を含む場合がある。
【０２８８】
12．Zcytor21ヌクレオチド配列の治療的用途
本発明は、Zcytor21のヌクレオチド配列を用いて、Zcytor21を、このような処置を必要とする被験者に提供することを含む。また治療用発現ベクターは、アンチセンス分子、リボザイム、または外部ガイド配列分子などとして、Zcytor21遺伝子の発現を阻害するように提供される場合がある。
【０２８９】
Zcytor21遺伝子を被験者に導入する方法には、Zcytor21を発現する組換え宿主細胞の使用、Zcytor21をコードする裸の核酸の輸送、陽イオン性脂質担体と、Zcytor21をコードする核酸分子の使用、ならびにZcytor21を発現するウイルス（組換えレトロウイルス、組換えアデノ関連ウイルス、組換えアデノウイルス、および組換え単純ヘルペスウイルスなど）の使用を含む多数がある（例えばMulligan、Science 260：926 （1993）、Rosenbergら、Science 242：1575 （1988）、LaSalleら、Science 259：988 （1993）、Wolffら、Science 247：1465 （1990）、BreakfieldおよびDeluca、The New Biologist 3：203 （1991）を参照）。エクスビボの方法では、例えば細胞を被験者から単離し、Zcytor21遺伝子を発現するベクターをトランスフェクトした後に被験者に移植する。
【０２９０】
Zcytor21遺伝子を発現させるためには、遺伝子の転写を制御するために、Zcytor21遺伝子をコードするヌクレオチド配列をコアプロモーターに、また任意選択で調節エレメントに、使用可能に連結するように発現ベクターを構築する。発現ベクターの一般的な必要条件については上述した。
【０２９１】
あるいはZcytor21遺伝子を、例えばアデノウイルスベクター（例えばKass-Eislerら、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90：11498 （1993）、Kollsら、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 91：215 （1994）、Liら、Hum. Gene Ther. 4：403 （1993）、Vincentら、Nat. Genet. 5：130 （1993）、およびZabnerら、Cell 75：207 （1993））、アデノウイルス関連ウイルスベクター（Flotteら、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90：10613 （1993））、セムリキ森林ウイルスおよびシンドビスウイルスなどのアルファウイルス（HertzおよびHuang、J. Vir. 66：857 （1992）、RajuおよびHuang、J. Vir. 65：2501 （1991）、ならびにXiongら、Science 243：1188 （1989））、ヘルペスウイルスベクター（例えば米国特許第4,769,331号、第4,859,587号、第5,288,641号、および第5,328,688号）、パルボウイルスベクター（Koeringら、Hum. Gene Therap. 5：457 （1994））、ポックスウイルスベクター（Ozakiら、Biochem. Biophys. Res. Comm. 193：653（1993）、PanicaliおよびPaoletti、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 79：4927 （l982））、カナリアポックスウイルスまたはワクシニアウイルスなどのポックスウイルス（Fisher-Hochら、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86：317 （1989）、およびFlexnerら、Ann. N.Y. Acad. Sci. 569：86 （1989））、ならびにレトロウイルス（例えばBabaら、J. Neurosurg 79：729 （1993）、Ramら、Cancer Res. 53：83 （1993）、Takamiyaら、J. Neurosci. Res 33：493 （1992）、VileおよびHart、Cancer Res. 53：962 （1993）、VileおよびHart、Cancer Res. 53：3860 （1993）、ならびにAndersonら、米国特許第5,399,346号）を含む組換えウイルスベクターで輸送することができる。さまざまな態様で、ウイルスベクターそのもの、またはウイルスベクターを含むウイルス粒子のいずれかを、後述する方法および組成物に使用することができる。
【０２９２】
1つの系の例として、2本鎖のDNAウイルスであるアデノウイルスは、詳細に研究されている、異種核酸分子を輸送するための遺伝子輸送用ベクターである（総説としてBeckerら、Meth. Cell Biol. 43：161 （1994）；DouglasおよびCuriel、Science & Medicine 4：44 （1997）を参照）。アデノウイルス系には以下を含む複数の利点がある：（i）比較的長いDNA挿入物を収容できること、（ii）高力価で成長させることができること、（iii）広範囲の哺乳類細胞種に感染可能なこと、ならびに（iv）遍在性のプロモーター、組織特異的プロモーター、および調節可能なプロモーターを含む、多種多様なプロモーターを使用可能なこと。また、アデノウイルスは静脈内注射で投与することができる。これはウイルスが血流中で安定なためである。
【０２９３】
アデノウイルスのゲノムの一部が欠失したアデノウイルスベクターを用いることで、直接連結によって、または同時にトランスフェクトしたプラスミドとの相同組換えによって、挿入配列がウイルスDNAに組み込まれる。例示的な系では、不可欠なE1遺伝子がウイルスベクターから除かれることで、宿主細胞からE1遺伝子が提供されない限り、同ウイルスは複製できなくなる。動物体に静脈内投与する場合、アデノウイルスは主に肝臓を標的とする。E1遺伝子が欠失したアデノウイルス輸送系は宿主細胞で複製できないが、宿主の組織は、コードされた異種タンパク質を発現してプロセシングを行う。宿主細胞は、対応遺伝子が分泌シグナル配列を含む場合に異種タンパク質も分泌する。分泌タンパク質は、異種遺伝子を発現する組織（例えば高度に脈管形成した肝臓）から血流に入る。
【０２９４】
また、ウイルス遺伝子のさまざまな欠失を含むアデノウイルスベクターを用いて、ベクターに対する免疫応答を低下させたり消失させたりすることができる。このようなアデノウイルスはE1欠失型であり、かつE2AもしくはE4の欠失を含む（Luskyら、J. Virol. 72：2022 （1998）；Raperら、Human Gene Therapy 9：671 （1998））。E2bの欠失も、免疫応答を低下させることが報告されている（Amalfitanoら、J. Virol. 72：926 （1998））。アデノウイルスゲノム全体を欠失させることによって、異種DNAの極めて大きな挿入物を収容することができる。全ウイルス遺伝子を欠失させた、いわゆる「腑抜け（gutless）」アデノウイルスの作製は、異種DNAの大きな挿入物の挿入に特に有利である（総説としてYehおよびPerricaudet、FASEB J. 11：615 （1997）を参照）。
【０２９５】
治療用遺伝子を発現可能な組換えウイルスの高力価のストックは、感染哺乳類細胞から標準的な方法を用いて得られる場合がある。例えば組換え単純ヘルペスウイルスは、Brandtら、J. Gen. Virol. 72：2043 （1991）、Heroldら、J. Gen. Virol. 75：1211 （1994）、VisalliおよびBrandt、Virology 185：419 （1991）、Grauら、Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30：2474 （1989）、Brandtら、J. Virol. Meth. 36：209 （1992）、ならびにBrownおよびMacLean共編、HSV Virus Protocols （Humana Press、1997）に記載されているように、ベロ（Vero）細胞から調製することができる。
【０２９６】
あるいはZcytor21遺伝子を含む発現ベクターを、被験者の細胞に、リポソームを用いてリポフェクションによってインビボで導入することができる。マーカーをコードする遺伝子のインビボトランスフェクション用のリポソームは、合成陽イオン性脂質を用いて調製することができる（Felgnerら、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 84：7413 （1987）；Mackeyら、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85：8027 （1988））。インビボにおいて特定の臓器への外因性遺伝子の導入にリポフェクションを使用することには、実用上の利点がある。リポソームを使用すると、細胞が不均一な組織（膵臓、肝臓、腎臓、および脳など）に特に有利な、特定の細胞種のトランスフェクションが可能となる。標的化する目的で、脂質を他の分子と化学的に結合させることができる。標的ペプチド（例えばホルモンまたは神経伝達物質）、タンパク質（抗体など）、または非ペプチド分子には、リポソームを化学的に結合することができる。
【０２９７】
別の投与様式がエレクトロポレーションである。例えばAiharaおよびMiyazaki、Nature Biotechnology 16：867 （1998）では、筋肉への遺伝子輸送を目的としたインビボにおけるエレクトロポレーションの使用について実証されている。
【０２９８】
遺伝子治療の別の方法では、治療用遺伝子が、Zcytor21の発現を阻害するZcytor21のアンチセンスRNAをコードする場合がある。アンチセンス分子の適切な配列は、本明細書に開示されたZcytor21のヌクレオチド配列に由来する場合がある。
【０２９９】
あるいは、リボザイムをコードするヌクレオチド配列に調節エレメントを使用可能に連結させた、発現ベクターを構築することができる。リボザイムは、mRNA分子中の特定の標的配列に対するエンドヌクレアーゼ活性を発現するように設計することができる（例えばDraperおよびMacejak、米国特許第5,496,698号、McSwiggen、米国特許第5,525,468号、ChowriraおよびMcSwiggen、米国特許第5,631,359号、ならびにRobertsonおよびGoldberg、米国特許第5,225,337号を参照）。本発明では、リボザイムは、Zcytor21 mRNAに結合するヌクレオチド配列を含む。
【０３００】
別の方法では、発現ベクターは、調節エレメントが、RNase Pによる、Zcytor21遺伝子をコードするmRNA分子の切断を促進可能なRNA転写物の産生を誘導するように構築することができる。この方法では、内因性リボザイムであるRNase Pを細胞内mRNAの特定の種に導いた後に、細胞内リボザイムによって切断されるように、外部ガイド配列を構築することができる（例えばAltmanら、米国特許第5,168,053号、Yuanら、Science 263：1269 （1994）、Paceら、国際公開公報第96/18733号、Georgeら、国際公開公報第96/21731号、およびWernerら、国際公開公報第97/33991を参照）。例えば外部ガイド配列は、Zcytor21 mRNAに相補的な10〜15ヌクレオチド配列、ならびにNが好ましくはプリンである3'-NCCAヌクレオチド配列を含む場合がある。外部ガイド配列の転写物は、mRNAと相補的な外部ガイド配列との間で塩基対を形成することで標的mRNA種に結合し、このため塩基対形成領域の5'側に位置するヌクレオチドにおけるRNase PによるmRNAの切断を促す。
【０３０１】
一般に、組換えウイルスなどの、Zcytor21ヌクレオチド配列を有する治療用ベクターを含む組成物の用量は、被験者の年齢、体重、身長、性別、医学的な全身状態、および既往歴のような因子に依存して変動する。治療用ベクターの適切な投与経路には、静脈内注射、動脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、腫瘍内注射、および腫瘍を含む空間への注射などがある。例としてHortonら、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 96：1553 （1999）では、インターフェロン-αをコードするプラスミドDNAの筋肉内注射によって、マウスモデルの原発性腫瘍および転移性腫瘍に強力な抗腫瘍効果がみられたことについて報告されている。
【０３０２】
本発明のウイルスベクター、非ウイルスベクター、またはウイルスベクターと非ウイルスベクターの組み合わせを含む組成物を既知の方法で製剤化して、ベクターまたはウイルスが薬学的に許容される担体と混合された、薬学的に有用な組成物を調製することができる。上述したように、リン酸緩衝食塩水などの組成物は、その投与をレシピエント患者が許容する場合に「薬学的に許容される担体」と言われる。他の適切な担体は当技術分野で周知である（例えば「Remington's Pharmaceutical Sciences」、第19版（Mack Publishing社、1995）、およびGilman's the Pharmacological Basis of Therapeutics、第7版（MacMillan Publishing社、1985）を参照）。
【０３０３】
治療目的で、治療用遺伝子発現ベクター、またはこのようなベクターを含む組換えウイルス、および薬学的に許容される担体が、治療有効量で被験者に投与される。発現ベクター（またはウイルス）と薬学的に許容される担体の組み合わせは、投与される量が生理学的に有意であれば「治療有効量」で投与されると表現される。薬剤は、その存在によりレシピエント被験者の生理機能に検出可能な変化を生じるのであれば、生理学的に有意である。例えば、炎症の治療に使用される薬剤は、その存在が炎症反応を緩和するのであれば生理学的に有意である。
【０３０４】
治療用の遺伝子発現ベクターまたは組換えウイルスが投与される被験対象がヒトの場合、治療は好ましくは体細胞遺伝子治療となる。すなわち、治療用遺伝子発現ベクターまたは組換えウイルスを用いた、ヒトを対象とした好ましい治療は、ヒト生殖系列の一部を形成し、次世代に受け継がれる可能性のある核酸分子を細胞に導入すること（ヒト生殖系列の遺伝子治療）を伴わない。
【０３０５】
13．トランスジェニックマウスの作製
トランスジェニックマウスを作製することで、あらゆる組織における、または組織特異的な調節エレメント、もしくは組織に好ましい調節エレメントの制御下における、Zcytor21遺伝子の過剰発現が可能となる。Zcytor21を過剰に産生する個体を用いることで、過剰発現に起因する表現型を決定することが可能であり、またトランスジェニック動物は、過剰なZcytor21に起因するヒトの病気のモデルとなる。Zcytor21を過剰に発現するトランスジェニックマウスは、可溶性Zcytor21などのZcytor21を大型動物の乳または血液中に産生するバイオリアクターのモデルにもなる。トランスジェニックマウスを作製する方法は当技術分野で周知である（例えばJacob、「Expression and Knockout of Interferons in Transgenic Mice」、Overexpression and Knockout of Cytokines in Transgenic Mice、Jacob編、p.111〜124 （Academic Press社、1994）、MonasterskyおよびRobl共編、「Strategies in Transgenic Animal Science」（ASM Press、1995）、ならびにAbbudおよびNilson、「Recombinant Protein Expression in Transgenic Mice」、Gene Expression Systems：Using Nature for the Art of Expression、FernandezおよびHoeffler共編、p.367〜397 （Academic Press社、1999）を参照）。
【０３０６】
例えば、Zcytor21遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを作製する方法は、生殖能力がある成体雄（繁殖用雄）（B6C3f1、2〜8月齢（Taconic Farms、Germantown、NY））、精管切除した雄（不能雄）（B6D2f1、2〜8月齢（Taconic Farms））、思春期前の生殖能力のある雌（ドナー）（B6C3f1、4〜5週齢（Taconic Farms））、ならびに生殖能力がある成体雌（レシピエント）（B6D2f1、2〜4月齢（Taconic Farms））を対象に開始する。ドナーを1週間順化させた後に、約8 IU/マウスとなるように妊馬血清ゴナドトロピン（Sigma Chemical Company；St. Louis、MO）を腹腔内に注射し、46〜47時間後に、8 IU/マウスとなるようにヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG（Sigma））を腹腔内に注射して過排卵を誘導する。ドナーをホルモン注射後に繁殖用雄と交配させる。排卵は通常hCG注射の13時間以内にみられる。交尾の成功は、交配後の翌朝における膣栓の存在によって確認される。
【０３０７】
受精卵を外科用顕微鏡下で採取する。卵管を採取して卵をヒアルロニダーゼ（Sigma）を含む尿検査用スライド上に開放する。卵をヒアルロニダーゼで1回洗浄し、5% CO2、5% O2、および90% N2で37℃においてインキュベートしたWhitten's W640培地（例えばMeninoおよびO'Claray、Biol. Reprod. 77：159 （1986）、ならびにDienhartおよびDowns、Zygote 4：129 （1996）に記載）で2回洗浄する。次にこの卵を、マイクロインジェクションをするまで37℃/5% CO2インキュベーター内で保存する。
【０３０８】
Zcytor21コード配列を含む、10〜20 μgのプラスミドDNAを線状化し、ゲル精製し、10 mM Tris-HCl （pH 7.4）、0.25 mM EDTA （pH 8.0）に、最終濃度がマイクロインジェクション用の5〜10 ng/μlとになるように再懸濁する。例えばZcytor21のコード配列は、配列番号：11のアミノ酸残基24位〜454位、配列番号：2のアミノ酸残基24位〜376位、配列番号：5のアミノ酸残基24位〜396位、配列番号：8のアミノ酸残基24位〜533位、または配列番号：15のアミノ酸残基24位〜444位を含むポリペプチドをコードする場合がある。
【０３０９】
加温したCO2平衡ミネラルオイルを重層したW640培地の液滴に含まれる回収卵にプラスミドDNAを微量注入する。DNAを注射針で引き抜き（内径0.75 mm、外径1 mmのホウケイ酸塩ガラスキャピラリーから引き抜く）、個々の卵に注入する。個々の卵に一倍体前核の一方または両方に注射針を差込む。
【０３１０】
数ピコリットルのDNAを前核に注入し、注射針を、核小体に接触しないように引き抜く。この手順を、全ての卵に注入が終わるまで繰り返し行う。微量注入が成功した卵を、事前にガスを加えておいたW640培地を含む器官組織培養ディッシュに移して、37℃/5% CO2インキュベーター内で一晩保存する。
【０３１１】
翌日、2細胞胚を偽妊娠レシピエントに移す。レシピエントは、精管結紮したdudとの交尾後に交尾栓の存在によって同定する。レシピエントを麻酔して背部の左側を剪毛し、外科用顕微鏡に移す。皮膚に、胸郭、鞍部、および後肢で囲まれる腹部中央部における筋肉壁を通して、膝と脾臓の間の中間に、小さな切れ目を入れる。生殖器官を体外に出し、小さな外科的ドレープ上に置く。脂肪塊を外科的ドレープ上で広げ、小型止血小鉗子（Roboz、Rockville、MD）を脂肪塊に取り付け、マウスの背中の左側につるし、臓器が滑り込んで戻るのを防ぐ。
【０３１２】
W640と気泡が交互に続くミネラルオイルを含む、細いトランスファーピペットで、前日の注射で得られた12〜17個の健康な2細胞期の胚をレシピエントに移す。卵管膨大部の位置を確認し、膨大部と卵巣嚢との間に卵管を保持し、膨大部または卵巣嚢を断裂させないように、卵管に28ゲージの針で卵巣嚢の近傍に切れ目を入れる。
【０３１３】
ピペットを卵管中の切れ目に移し、1番目の空気泡がピペットから出るように胚を吹き込む。脂肪塊を緩やかに腹膜へ押しつけて生殖器官を滑り込ませる。腹膜壁を1回の縫合で閉鎖し、皮膚を創傷クリップで閉鎖する。個体を37℃のスライドウォーマーで最低4時間かけて回復させる。
【０３１４】
レシピエントをつがいにしてケージに戻し、19〜21日の妊娠期間をおく。誕生後は、分娩後19〜21日おいて離乳させる。離乳仔の性別を確認し、性別隔離ケージ（separate sex cages）に収容し、0.5 cmの生検試料（遺伝子型決定用）を清潔なハサミで尾から切り取る。
【０３１５】
ゲノムDNAを尾の切片から、例えばQIAGEN DNEASYキットを用いて製造業者の指示書にしたがって調製する。同じプラスミドに導入されたZcytor21遺伝子、または選択マーカー遺伝子を増幅するように設計したプライマーを使用して、ゲノムDNAをPCRで解析する。個体がトランスジェニックであることを確認した後に、トランスジェニックのメスと野生型の雄、またはトランスジェニックの雄と1匹または2匹の野生型のメス（群）を同じケージに収容することで戻し交配して近交系とする。仔が生まれて離乳したら、性別を分けて、尾から遺伝子型決定用の試料を切断する。
【０３１６】
生きた状態の動物における導入遺伝子の発現を調べるために、部分的な肝切除を行う。手術準備を、剣状突起の直下の上腹部で行う。無菌的な手法で小さな1.5cm〜2 cmの切り込みを胸骨下に入れ、肝臓の左側葉を体外に出す。4-0シルクを用いて、下葉の周囲を結紮して、体腔の外側に固定する。非外傷性クランプを用いて結び目を抑えながら、吸収性Dexon （American Cyanamid；Wayne、NJ）の第2のループを、第1の結び目の近位に配置する。Dexonの結び目から遠位部を切開し、約100 mgの切除肝組織を、滅菌ペトリ皿上に配置する。切除肝切片を14 mlのポリプロピレン製丸底チューブに移し、液体窒素で瞬間凍結後に、ドライアイス中で保存する。外科処置部位を縫合および創傷クリップで閉鎖し、個体を収容したケージを37℃に加熱したパッド上に置いて術後24時間静置する。術後は個体を毎日調べ、創傷クリップを術後7日〜10日目に除去する。Zcytor21 mRNAの発現レベルを、トランスジェニックマウスの各個体を対象に、RNA溶液ハイブリダイゼーションアッセイ法、またはポリメラーゼ連鎖反応で調べる。
【０３１７】
Zcytor21を過剰発現するトランスジェニックマウスの作製に加えて、遺伝子の発現が異常に低いか、または全く発現しないトランスジェニックマウスを作製することが有用である。このようなトランスジェニックマウスは、Zcytor21の欠損が関連した疾患の有用なモデルとなる。上述したように、Zcytor21の遺伝子発現は、アンチセンス遺伝子、リボザイム遺伝子、または外部ガイド配列遺伝子で抑制される場合がある。Zcytor21遺伝子を過小発現するトランスジェニックマウスを作製するためには、このような抑制性配列の標的をZcytor21 mRNAとする。特定の遺伝子の異常に低い発現を示すトランスジェニックマウスを作製する方法は当技術分野で周知である（例えばWuら、「Gene Underexpression in Cultured Cells and Animals by Antisense DNA and RNA Strategies」、Methods in Gene Biotechnology、p.205〜224 （CRC Press、1997）を参照）。
【０３１８】
Zcytor21遺伝子発現がほとんどないか、または全くないトランスジェニックマウスを作製する別の方法では、非機能性のZcytor21遺伝子と置換された少なくとも1つの正常なZcytor21対立遺伝子を有するマウスを作製する。非機能性のZcytor21遺伝子を設計する1つの方法では、選択マーカー遺伝子などの別の遺伝子を、Zcytor21をコードする核酸分子に挿入する。このようないわゆる「ノックアウトマウス」を作製する標準的な方法は当技術分野で周知である（例えばJacob、「Expression and Knockout of Interferons in Transgenic Mice」、Overexpression and Knockout of Cytokines in Transgenic Mice、Jacob編、p.111〜124 （Academic Press社、1994）、およびWuら、「New Strategies for Gene Knockout」、Methods in Gene Biotechnology、p.339〜365 （CRC Press、1997）を参照）。
【０３１９】
実施例1
PCRによる組織パネルにおけるヒトZcytor21の組織分布
PCRによる組織cDNAパネルにおける組織分布
「Human Rapid-Scan cDNA」パネルは24種類の成体組織を代表しており、4つの異なる濃度（1×、10×、100×、および1000×）で配列されている（Origen、Rockville、MD）。「1000×、および100×」のレベルを対象にZcytor21の転写のスクリーニングをPCRを用いて行った。センスプライマーには、5'非翻訳領域に対応するcDNA領域中に位置するzc39334
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を使用した。アンチセンスプライマーには、3'非翻訳領域に対応するcDNA領域に位置するzc39333
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を使用した。PCRは、pfuターボポリメラーゼを用いて、製造業者（Stratagene、La Jolla、CA）の推奨に従って行った。ただし、RediLoad色素（Research Genetics社、Huntsville、AL）、Wax Hot Start（Molecular Bioproducts社、San Diego、CA）、および10%（終濃度）DMSOを用いた。増幅は以下のように行った：94℃で4分間を1サイクル、94℃で30秒間を40サイクル、51℃で30秒間、および72℃で3分間に続き、72℃で7分を1サイクル。約10 μlのPCR反応産物を、1%アガロースゲルを用いる標準的なアガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後に、このゲルでサザンブロットを行い、メンブレンを標準的な方法で、開始コドンのすぐ下流に位置する翻訳領域中のcDNA領域にマップされる32P同位体標識オリゴヌクレオチドzc40458
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を用いてハイブリダイズさせた。X線フィルムを用いたオートラジオグラフィーの結果、zcytor21特異的なアンプリコンが、結腸、胚、胃、胎盤、および骨髄のみに存在することがわかった。
【０３２０】
全ての特許、特許出願、および刊行物、ならびに電子的に利用可能な情報（例えばGenBankアミノ酸配列およびヌクレオチド配列の寄託）の完全な開示は参照として本明細書に組み入れられる。前述の詳細な説明および実施例は理解を明快にする目的でのみ供与されている。そこから不必要な制限はないと理解される。当業者に明らかな変形例は、特許請求の範囲で定義される本発明の範囲に含まれるため、本発明は、提示および記載された正確な詳細には制限されない。
【配列表】
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