(57)【要約】糞便DNAにおける変異の検出は、平均的リスク集団において結腸直腸癌を検出するための有望な非侵襲的手法である。本技術の最初の実用的用途の1つは、ミスマッチ修復欠損を有する散発性癌に対するマイクロサテライトマーカーの検査を含む。そのような癌は、ほぼ必ず近位結腸で発生するため、この検査は遠位結腸直腸病変のみを検出するS字結腸鏡の補助として有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者から単離された糞便試料を、平均0から100のBAT26対立遺伝子を含む複数の部分標本に分割する段階；
第1のプライマーおよび第2のプライマーを用いて該部分標本中の該BAT26対立遺伝子を増幅し、増幅された鋳型を形成する段階；
第1のプライマーおよび第3のプライマーを用いて増幅された鋳型を増幅し、増幅されたサブ鋳型を形成する段階；
各部分標本の増幅されたサブ鋳型のサイズを分析する段階であって、少なくとも1つの部分標本中で増幅されたサブ鋳型のサイズが変化していれば患者にミスマッチ修復欠損近位結腸直腸癌があることを示し、サイズの変化は非癌患者の野生型BAT26対立遺伝子から増幅されたサブ鋳型のサイズと比較して決定する段階、
を含む、近位結腸直腸癌の検出方法。
【請求項２】
野生型のサイズの増幅サブ鋳型のみを有する部分標本と比較してサイズの変化した増幅サブ鋳型を有する部分標本の割合を決定する段階であって、該部分標本は、単一の糞便試料から分割されたものであり、0.01から0.11の割合は散発性癌を意味する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
第1のプライマーが、
2005516603.tif 000014
である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
第2のプライマーが、
2005516603.tif 000015
である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
第3のプライマーが、
2005516603.tif 000016
である、請求項1記載の方法。
【請求項６】
第1のプライマーが、
2005516603.tif 000017
であり、かつ第2のプライマーが、
2005516603.tif 000018
であり、かつ第3のプライマーが、
2005516603.tif 000019
である、請求項1記載の方法。
【請求項７】
第3のプライマーが標識されている、請求項1記載の方法。
【請求項８】
第3のプライマーがフルオレセインで標識されている、請求項1記載の方法。
【請求項９】
第3のプライマーが標識されている、請求項6記載の方法。
【請求項１０】
第3のプライマーがフルオレセインで標識されている、請求項6記載の方法。
【請求項１１】
第3のプライマーが標識されている、請求項7記載の方法。
【請求項１２】
第3のプライマーがフルオレセインで標識されている、請求項7記載の方法。
【請求項１３】
分割する段階が希釈によって行われる、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
10から150の部分標本におけるBAT26対立遺伝子が増幅および分析される、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
15から100の部分標本におけるBAT26対立遺伝子が増幅および分析される、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
25から80の部分標本におけるBAT26対立遺伝子が増幅および分析される、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
部分標本が、平均で0から20のBAT26対立遺伝子を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
部分標本が、平均で0.1から10のBAT26対立遺伝子を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１９】
近位結腸直腸腫瘍を検出するために請求項1の方法を行ない、かつ遠位結腸直腸腫瘍を検出するためにS字結腸鏡検査を行なう段階を含む、患者の近位および遠位の結腸直腸腫瘍をスクリーニングする方法。
【請求項２０】
ヘミネストPCRを行なうためのプライマーのセットを含むキットであって、該セットは第1のプライマー
2005516603.tif 000020
および第2のプライマー
2005516603.tif 000021
および第3のプライマー
2005516603.tif 000022
を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
米国国立衛生研究所からの助成金CA62924、CA43460、およびGM07184により支援されている基礎となる研究の支援により、米国政府は本発明に対して特定の権利を保持している。
【０００２】
本願は、2002年2月1日付け米国特許出願第60/352,869号に基づく優先権を主張する。
【０００３】
発明の技術分野
本発明は診断用遺伝子解析に関する。特に、結腸直腸癌における遺伝子の変化の検出に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
結腸鏡検査、S字結腸鏡検査、および二重造影バリウム注腸法は、腫瘍形成のすぐれた検査法であるが、侵襲的であり、習熟した作業者が必要で、患者のコンプライアンスを必要とするという制限がある1。糞便潜血反応(FOBT)は、特にS字結腸鏡検査の補助として、非侵襲的かつ有用である。しかし、FOBTの比較的高い偽陽性率および他の問題のために、より特異的な非侵襲性検査が求められている。この点で、糞便DNAにおける変異のアッセイ法は、特に有望である２。この分野の以前の研究の大部分は、遠位の結腸および直腸の、より一般的な病変に注目してきた（3およびその中の参考文献）。患者の近位癌を検出する方法が当技術分野で必要とされている。近位癌は肛門から遠いために、検出が最も困難なはずである。
【発明の開示】
【０００５】
発明の概要
本発明の1つの態様では、近位結腸直腸癌の検出方法が提供される。患者から単離された糞便試料を分割して、複数の部分標本を作製する。部分標本を平均して0から100のBAT26対立遺伝子を含む。部分標本中のBAT26対立遺伝子は、第1のプライマーおよび第2のプライマーを用いて増幅し、増幅された鋳型を形成する。増幅された鋳型自身を第1のプライマーおよび第3のプライマーを用いて増幅し、増幅されたサブ鋳型を形成する。各部分標本中の増幅されたサブ鋳型のサイズを解析する。少なくとも1つの部分標本中の、増幅されたサブ鋳型のサイズの変化は、患者がミスマッチ修復欠損近位結腸直腸癌を有することを示す。サイズの変化は、非癌患者から得られた野生型BAT26対立遺伝子から増幅されたサブ鋳型のサイズと比較して決定する。
【０００６】
本発明の他の態様では、患者における近位および遠位の直腸結腸腫瘍のスクリーニング方法が提供される。患者から単離された糞便試料を分割し、複数の部分標本を作製する。部分標本は、平均して0から100のBAT26対立遺伝子を含む。部分標本中のBAT26対立遺伝子を、第1のプライマーおよび第2のプライマーを用いて増幅し、増幅された鋳型を形成する。増幅された鋳型自身を第1のプライマーおよび第3のプライマーを用いて増幅し、増幅されたサブ鋳型を形成する。各部分標本中の増幅されたサブ鋳型のサイズを解析する。少なくとも1つの部分標本中の、増幅されたサブ鋳型のサイズの変化は、患者がミスマッチ修復欠損近位結腸直腸癌を有することを示す。サイズの変化を、非癌患者から得られた野生型BAT26対立遺伝子から増幅されたサブ鋳型のサイズと比較して決定する。遠位直腸結腸腫瘍を検出するために、S字結腸鏡検査を行なう。
【０００７】
本発明は、ヘミネストPCR (hemi-nested PCR)を実行するためのプライマーセットを含むキットも提供する。セットの第1のプライマーは、配列
2005516603.tif 000002
を含む。セットの第2のプライマーは、配列
2005516603.tif 000003
を含む。セットの第3のプライマーは、配列
2005516603.tif 000004
を含む。
【０００８】
本発明の詳細な説明
本発明者らの発明した方法は、得られた産物が選択した検出方法で検出可能な分析物配列をある割合で有するように、少数の鋳型分子を別々に増幅する段階を含む。その限界では、単一の鋳型分子が増幅され、その産物は完全に変異または完全に野生型(WT)となり得る。これらの増幅産物の均一性のために、既存の技術でこれらを区別することが容易になる。BAT26は、ミスマッチ修復欠損結腸直腸癌において極端に高い割合で変化しているマイクロサテライトマーカーであることが判明しているため、分析のための対立遺伝子として選択された。マイクロサテライト不安定性の同様に高頻度の標的である他のマーカーも使用できる。例えば、BAT25, D2S123, D5S346, およびD17S250, FGA, D18S35, およびTP53-DIの任意のものが使用できる。
【０００９】
本方法は、多数の増幅産物を簡単にかつ確実に分析することを必要とする。別々に増幅された産物（反応）の適当な数は10から150、より好ましくは15から100、またはさらに好ましくは25から80の範囲である。分析される反応の数が多い程、検出感度が上昇する。
【００１０】
生体試料は、実際的に使用可能な数の希釈された試料が総鋳型分子と比較してある割合で選択された遺伝子配列（分析物）を含み、これにより使用する分析技術が分析物を検出できるところまで希釈する。希釈された試料の実際的に使用可能な数は分析方法のコストに依存する。通常は、希釈された試料の少なくとも1/50が分析物を検出可能な割合で含むことが望ましい。希釈された試料の少なくとも1/10、1/5、3/10、2/5、1/2、3/5、7/10、4/5、または9/10が、分析物を検出可能な割合で有する可能性がある。有用な情報を提供する試料の割合が高いほど、全体のアッセイ法がより経済的になる。過剰に希釈すると、多くの試料が分析されるがシグナルを提供しないことになるので、やはり経済性が低下する。アッセイ試料の各々が、平均0から100のBAT26鋳型を有するところまでの希釈が特に好ましい希釈の度合いである。より好ましくは、アッセイ試料または部分試料は、0から50のBAT26鋳型を含む。さらに好ましくは、部分試料は平均0から20のBAT26鋳型を含む。より濃縮された試料から、糞便試料の希釈を行う事ができる。または、薄い鋳型核酸源が使用でき、その場合は希釈なしに試料を分割できる。全ての試料が増幅可能な鋳型分子を含んでもよい。
【００１１】
分析する試料中に比較的低レベルで存在するマイクロサテライトのサイズ変化のような変異を検出するために、デジタル増幅が使用できる。検出限界は、分析できるウェルの数および増幅に使用するポリメラーゼの内因性変異によって規定される。384ウェルのPCRプレートは市販されており、1536ウェルのプレートも出始めており、理論的には変異検出の感度は〜0.1％レベルとなる。増幅はマイクロアレイの形式で実施可能なため、感度がさらに1ケタ上昇する可能性がある。この感度は、最終的にはポリメラーゼのエラーによって限定される。
【００１２】
分析すべき対立遺伝子を転写する場合、増幅はRNA鋳型から生成したRT-PCR産物、またはゲノムDNAで行う事ができる。mRNAから増幅鋳型を作製する方法は当技術分野で周知であり、任意のそのような方法が利用できる。
【００１３】
1つの好ましい態様では、希釈された各試料は平均2分の1の鋳型分子を有する。これは、希釈された試料の半数が、1つの鋳型分子を有する事と同一である。これは、増幅によって経験的に決定できる。分析物（選択された遺伝子配列）または参照遺伝子配列のいずれかがこの決定に使用できる。使用される分析方法が20％のレベルで存在する分析物を検出できるならば、希釈されたアッセイ試料のうちのかなりの数が、分析物を20％より多く含むように希釈する必要がある。使用する分析方法が、検出するために100％の分析物レベルを必要とするならば、単一鋳型分子のレベルまでの希釈が必要となる。
【００１４】
本発明の方法は、意味のある結果を得るために、多数の試料の分析を必要とする。好ましくは、少なくとも10の希釈されたアッセイ試料が増幅および分析される。より好ましくは、少なくとも15、20、25、30、40、50、75、100、500、または1000の希釈されたアッセイ試料が増幅および分析される。他の全ての方法と同じく、ある時点までは、試料数が増加すると決定の精度は上昇する。多数の試料の分析が必要なため、操作段階、特に試料の移動段階を削減することが望ましい。したがって、増幅と分析の段階が、同一容器中で行われるのが好ましい。従って、方法はインサイチュー、または「1ポット」法となる。
【００１５】
分析の開始材料として使用できる生体試料は、DNAまたはmRNAが単離できる任意の組織または体の試料でよい。好ましい供給源には、便、血液、およびリンパ節が含まれる。好ましくは、生体試料は無細胞溶解物である。
【００１６】
野生型のサイズの増幅されたBAT26サブ鋳型を含む部分試料と比較して、変化したサイズの増幅BAT26サブ鋳型を有する部分試料の割合が決定できる。0.01から0.11の間の割合となる糞便試料は散発性癌を示す。
【００１７】
BAT26対立遺伝子の増幅には任意のプライマーが使用できる。BAT26対立遺伝子の増幅のために特に好ましいプライマーには、
2005516603.tif 000005
2005516603.tif 000006
および
2005516603.tif 000007
が含まれる。プライマーは、当技術分野で周知の任意の検出可能標識で標識できる。特に好ましいのはフルオレセインであるが、高度に検出可能で都合の良い他の標識も使用できる。
【００１８】
上記の開示は、本発明を一般的に説明するものである。説明のためにのみ提供され、本発明の範囲を限定する意図はない以下の具体的実施例を参照することによって、より完全な理解が得られる。
【００１９】
実施例1
インフォームド・コンセントが得られた近位結腸癌（盲腸および右結腸曲の間）の患者46人、近位腺腫の患者19人、および結腸鏡検査で正常な69人の患者からの、合計134の糞便試料が分析された。後者で結腸鏡検査が行なわれた理由には、糞便潜血反応陽性、直腸出血、または結腸直腸腫瘍の既往歴もしくは家族歴が含まれる。
【００２０】
手術または結腸鏡検査の準備のために緩下剤治療を開始する前に、糞便試料が得られた。試料は直ちに-20℃に保存し、無作為に選択された1から10 gの部分試料が48時間以内に-80℃に移動された。家族性腺腫性ポリポーシスまたは遺伝性非ポリープ性結腸癌の患者はいなかった。BAT26のモノヌクレオチド領域がほぼ全てのミスマッチ欠損腫瘍において変化していることが示されているので4、本発明者らはBAT26マーカーを、マイクロサテライトの不安定性の指標として使用した。BAT26遺伝子座に特異的なオリゴヌクレオチドを使ったハイブリッドキャプチャーを用いて、便からDNAが生成された。その後、デジタルPCRに基づく方法5を用いて、各々の糞便DNA試料の濃度および変異割合を分析した。簡単に述べると、DNAの限界希釈を用いて、各試料中のBAT26遺伝子の濃度を決定した。この決定には、便のDNAをフルオレセイン標識プライマーを使ったPCRの鋳型として用い、産物はキャピラリー電気泳動によって分離した。その後、〜7の鋳型分子が各ウェルに存在するようにDNA試料を希釈した。各反応で少数の鋳型分子のみを分析することによって、BAT26配列の信号雑音比（変異/野生型）を最大化した。各患者あたり72のウェルを分析して、各アッセイ法あたり〜500の鋳型分子を評価することができた。この分析はロボットを用いて自動化しており、72のウェルの全てのPCR産物は、192キャピラリー装置中で平行して分析した。
【００２１】
糞便DNA分析は、盲検法で行なった。分析された134の試料のうち、17はBAT26変異を有することが判明した。このアッセイ法の結果の例は図1に示されている。BAT26試験が陽性だった17の糞便DNA試料は全て、結腸直腸癌の患者に由来するものだったことが、その後に決定された（表1）。
【００２２】
近位病変をもつ癌患者では、BAT26糞便DNA検査の臨床的感度は37％（46のうち17、95％信頼区間は23％から52％）であり、結腸鏡検査で正常な69人または腺腫の19人の患者には陽性はなかった。したがって、特異性は100％であり、95％信頼区間は95％から100％だった。糞便DNAと腫瘍との間のBAT26変化の一致率を決定するために、65の腫瘍全て（46の癌および19の腺腫）のパラフィン包埋検体から腫瘍病変を顕微解剖した。適当な質のDNAが57の病変から回収され、BAT26変異を有する症例が18例観察されたが、これらは全て癌患者だった。これらの18の症例のうち17例は糞便検査が陽性であり、その全てにおいて便と糞便DNAにおけるBAT26サイズの変化は同一だった（図1）。
【００２３】
上記の結果は、糞便DNA検査にとっていくつかの重要な意味を有する。まず、この結果は便における変異が、癌患者を同定するために使用できるという強力な証拠を提供する。腫瘍にBAT26変異を有する18例のうちの17例が糞便DNA検査で陽性であるという事実は、偽陽性率がゼロであることを合わせると、特に注目に値する。第2に、この結果は近位癌は糞便DNA分析の障害とはならないことを示す。第3に、糞便全体ではなく糞便の小さな部分標本を効果的に分析できることが明らかであり、分析のための検体の採取および保管が容易になる。最後に、糞便DNAにおける変異DNA分子の割合は、1.1％から10.6％の範囲だった。したがって、変異の大部分を検出するためには、糞便DNA変異を評価する技術はこれよりも高い感度である必要はない。偽陰性だった1つの試料では、糞便DNAにおいてさらに2000のBAT26遺伝子を分析して感度を5倍に上げても、変異は検出されなかった。
【００２４】
この結果の1つの実用的用途は、BAT26とS字結腸鏡検査を組み合せることである。費用効果の高いモデルでは、非再水和FOBTと組み合せたS字結腸鏡検査は、CRCスクリーニングには結腸鏡検査よりも効果的である可能性を示す1。BAT26アッセイ法の感度は非水和FOBTと同様であるが、より高価である。この費用面での不都合は、BAT26検査のほうが少なからずより特異的であり、このため偽陽性のFOBTの患者のかなりの割合では引き続く結腸鏡検査が不要であるという事実で埋め合わせられる。さらに、BAT26検査では、患者は検査前に食事の習慣を変更する必要がなく、複数の糞便試料を提供する必要もないので、コンプライアンスが向上する可能性がある。
【００２５】
（表１）BAT26変化に関する糞便DNAの分析結果
2005516603.tif 000008
【００２６】
実施例2
PCR
各反応液には、1 × PCR緩衝液（Invitrogen, Carlsbad, CA）、0.9μMオリゴヌクレオチドF1およびR1、および0.005 U/μL Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen, Carlsbad, CA)が含まれていた。各糞便試料につき1つのPCR反応液を調製し、標準的な96ウェルPCRプレートの12ウェル6列である72のウェルに反応液を分注した。各ウェルには、ポアソン分布で分布する約7のBAT26鋳型が含まれていた。94℃で2分間最初の変性を行なった後、以下のようにして増幅を行なった：94℃で15秒、56℃で15秒、70℃で15秒を60サイクル。プライマーF1およびR2が使用されたこと以外は上記と同じ組成のPCR反応液10μLに、反応液1μLを添加した。94℃で2分間変性させた後、反応液に94℃で15秒、56℃で15秒、70℃で15秒のサイクルを15サイクル行なった。プライマー配列は、
2005516603.tif 000009
だった。
【００２７】
キャピラリー電気泳動
PCR反応液は、1μLを9μLのホルムアミドに添加することによって分析した。試料は、192ウェルのキャピラリー電気泳動系SCE-9610（SpectruMedix Corporation, State College, PA）上で分析した。
【００２８】
参考文献
以下の開示は、全ての目的のために、参照として本明細書に組み入れられる。
2005516603.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【００２９】
（図１）BAT26アッセイ法。単一の患者のキャピラリー電気泳動図の代表例。キャピラリー1および2は正常なBAT26対立遺伝子、キャピラリー3および4は変異および正常BAT26対立遺伝子の両方を含んでいた。キャピラリー5はこの患者の癌から得られたPCR増幅DNAを含んでいた。野生型および変異のピークの例は、それぞれ緑および赤の矢印で示されている。フルオレセイン標識プライマーにより糞便または腫瘍DNAをヘミネスト増幅した後、各患者について72のキャピラリーが解析された。最初の増幅は、
2005516603.tif 000011
および
2005516603.tif 000012
を用いて行なった。第1の増幅の小さな部分標本をF1および
2005516603.tif 000013
を用いたヘミネスト増幅の鋳型として用いた。
【図１】
2005516603.tif 000023
【配列表】
2005516603000001.app
【国際調査報告】
2005516603.tif 000024
2005516603.tif 000025