(57)【要約】本発明は、補酵素と触媒的に不活性の補酵素結合プロテインを含む試薬の検知の用途を含む、酵素によるサンプル中の検体の検知のための方法および試薬システムに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程：
（ａ）補酵素および補酵素結合性の触媒的に不活性のタンパク質（結合タンパク質）を含有する検出試薬に試料を接触させ、その際、補酵素が検体との反応によって変化しかつこの変化した補酵素が触媒的に不活性のタンパク質と結合し、そして、
（ｂ）補酵素−結合タンパク質複合体の変化によって検体の反応を検出すること
を含む、酵素反応による試料中の検体を検出するための方法。
【請求項２】
酵素反応がレドックス反応であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
検出試薬が酵素をさらに含んでいることを特徴とする請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
酵素としてオキシドレダクターゼを使用し、かつ、酸化または還元による補酵素の変化を検出することを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
酵素としてグルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．４７）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２７，１．１．１．２８）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．３７）、グリセロールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．６）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１）またはアミノ酸デヒドロゲナーゼ、たとえばＬ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．５）、から選択されたデヒドロゲナーゼを使用することを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
フラビン誘導体、ニコチン誘導体およびキノン誘導体から選択された補酵素を使用することを特徴とする請求項１、２、３、４または５記載の方法。
【請求項７】
ＦＡＤ、ＦＡＤＨ2、ＦＭＮ、ＦＭＮＨ2、補酵素Ｑ、ＰＱＱ、ＮＡＤ+、ＮＡＤＨ／Ｈ+、ＮＡＤＰ+およびＮＡＤＰＨ／Ｈ+から選択された補酵素を使用することを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
補酵素結合性の触媒的に不活性のタンパク質として不活化酵素を使用することを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６または７記載の方法。
【請求項９】
不活化オキシドレダクターゼを使用することを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
不活化デヒドロゲナーゼを使用することを特徴とする請求項８または９記載の方法。
【請求項１１】
不活化酵素がアミノ酸配列における突然変異を示していることを特徴とする請求項８、９または１０記載の方法。
【請求項１２】
触媒中心における突然変異が存在することを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
不活化酵素が化学修飾を含むことを特徴とする請求項８、９または１０記載の方法。
【請求項１４】
触媒中心における化学修飾が存在することを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
補酵素の変化を光学的方法によって検出することを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４記載の方法。
【請求項１６】
補酵素の変化を蛍光の測定によって検出することを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
体液中の検体を測定することを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６記載の方法。
【請求項１８】
酵素および酵素基質から選択された検体を測定することを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７記載の方法。
【請求項１９】
血液中のグルコースの測定を実施することを特徴とする請求項１７または１８記載の方法。
【請求項２０】
検出試薬をゲルマトリックス中に挿入して使用することを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９記載の方法。
【請求項２１】
ゲルマトリックスを少なくとも部分的に光学的に透明な支持体に塗布することを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
ゲルマトリックスが膜厚≦５０μｍ、特に≦５μｍを有することを特徴とする請求項１７または１８記載の方法。
【請求項２３】
（ａ）補酵素および
（ｂ）補酵素結合性の触媒的に不活性のタンパク質
を含有する試料中の検体を検出するための試薬システム。
【請求項２４】
酵素をさらに含有する請求項２３記載の試薬システム。
【請求項２５】
検出試薬を収容するための支持体をさらに含有する請求項２３または２４記載の試薬システム。
【請求項２６】
検出試薬がゲルマトリックス中に挿入されていることを特徴とする請求項２３、２４または２５記載の試薬システム。
【請求項２７】
支持体が少なくとも部分的に光学的に透明であることを特徴とする請求項２３、２４、２５または２６記載の試薬システム。
【請求項２８】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２記載の方法への、請求項２３、２４、２５または２７記載の試薬システムの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、補酵素および補酵素結合性の触媒的に不活性のタンパク質を含有する検出試薬の使用を含む、酵素反応による試料中の検体の検出のための方法および試薬システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素的方法による検体、たとえば血液中のグルコースの検出は公知である。この場合、測定すべき検体を、酵素反応によって検出可能な、たとえば還元可能もしくは酸化可能な、補酵素を含有する検出試薬と接触させる。補酵素の還元もしくは酸化により生じる酸化還元当量はメディエーターに伝達されることができ、その際、この酸化還元当量は別の工程で電気化学的にかもしくは測光法によって検出される。較正により、その測定値と測定すべき検体の濃度との直接の関係が得られる。
【０００３】
上記酵素的反応の検出の場合にしばしば生じる問題は、メディエーターが、検出反応の低い安定性と障害に対する高い感受性をもたらす複雑な反応混合物の使用を必要とし、その一方でメディエーターが、主として検出を実施できるようにするために、または十分な検出精度を達成するために頻繁に必要とされる点である。
【発明の開示】
【０００４】
本発明の課題は、従来の技術における上記欠点を少なくとも部分的に回避することである。殊に、メディエーターの不在下にも信頼しうる測定結果が得られる、障害を被りやすくなくかつ感度の高い検体の検出方法が提供されるべきである。
【０００５】
この課題は、酵素的な検出試薬のその他の成分に、補酵素結合性の触媒的に不活性のタンパク質が添加されることによって解決される。この触媒的に不活性のタンパク質は殊に、検体の反応によって変化した補酵素と結合することができ、かつしたがって該補酵素の検出性を特に光学的方法によって改善することができる。
【０００６】
したがって本発明の対象は、次の工程：
（ａ）補酵素および補酵素結合性の触媒的に不活性のタンパク質を含有する検出試薬に試料を接触させ、その際、補酵素が検体との反応によって変化しかつこの変化した補酵素が触媒的に不活性のタンパク質と結合し、そして、
（ｂ）補酵素の変化によって検体の反応を検出すること
を含む、酵素反応による試料中の検体を検出するための方法である。
【０００７】
本発明のもう１つの対象は、
（ａ）補酵素および
（ｂ）補酵素結合性の触媒的に不活性のタンパク質
を含有する、試料中の検体を検出するための試薬システムである。
【０００８】
本発明によって、酵素反応による検体の簡単な定性的もしくは定量的測定が可能となる。この方法は、補酵素の関与下に酵素反応によって検出されうる任意の検体の検出に適当である。本発明による方法は、公知の方法に対して、検出試薬に補酵素結合性の触媒的に不活性のタンパク質が添加され、その際、改善された検出感度が得られることによって特徴づけられる。所望のテスト形式に応じて改善された検出性が検体の定性的および／または定量的測定の場合に改善された感度が可能となるように、検出試薬は触媒的に不活性のタンパク質を十分な量で含有する。本発明による方法の場合には有利に、酵素反応によって変化した補酵素の直接の検出が行われるので、メディエーターまたは、補酵素の再生をもたらすことができる他の物質の存在は多くの場合に必要ではない。
【０００９】
上記方法および検出系によって、きわめて少ない試料量、たとえば試料量≦１μｌ、特に≦０．１μｌの使用が可能になる。必要に応じて試料は、検出試薬と接触させる前になお希釈することができる。
【００１０】
本発明による方法および検出系は、任意の検体、たとえば生体試料、たとえば体液、たとえば血液、血清、血しょうまたは尿、しかしまた廃水試料または食品中のパラメータの測定に適当である。この方法は、たとえばキュベット中での、湿式テストとして実施することもできるし、適当な試薬支持体上の乾式テストとして実施することもできる。
【００１１】
検体として、酵素反応によって測定されうる任意の生物学的もしくは化学的な物質、たとえば酵素または酵素基質が選択されることができ、その際、反応、殊にレドックス反応が含まれる。適当な検体の例は、たとえばグルコース、乳酸、リンゴ酸、グリセリン、アルコール、コレステロール、トリグリセリド、アスコルビン酸、システイン、グルタチオン、ペプチド等である。
【００１２】
酵素反応は好ましくは、検出すべき補酵素の還元もしくは酸化が行われるレドックス反応である。酵素基質を検出するためのこのような反応には、検出試薬中の酵素として好ましくはオキシドレダクターゼが使用される。特に有利に酵素として、たとえばグルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．４７）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２７，１．１．１．２８）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．３７）、グリセロールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．６）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１）またはアミノ酸デヒドロゲナーゼ、たとえばＬ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．５）、から選択されたデヒドロゲナーゼが使用される。さらなる適当な酵素は、オキシダーゼ、たとえばグルコースオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．４）またはコレステロールオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．６）である。
【００１３】
検体として酵素が検出されるべき場合には、検出試薬中の酵素の存在はたいてい必要ではない。このような場合には、試料中に検体として存在する酵素によってもたらされる補酵素の変化が検出される。この場合にも検出反応は好ましくは還元または酸化であり、酵素としてオキシドレダクターゼが検出される。
【００１４】
本発明の意味するところの補酵素は好ましくは、共有もしくは非共有により酵素に結合しており、かつ、検体の変換によって変化する、たとえば酸化もしくは還元される有機分子である。補酵素の有利な例は、フラビン誘導体、ニコチン誘導体およびキノン誘導体、たとえばフラビンヌクレオシド誘導体、たとえばＦＡＤ、ＦＡＤＨ2、ＦＭＮ、ＦＭＮＨ2など、ニコチンヌクレオシド誘導体、たとえばＮＡＤ+、ＮＡＤＨ／Ｈ+、ＮＡＤＰ+、ＮＡＤＰＨ／Ｈ+など、またはユビキノン、たとえば補酵素Ｑ、ＰＱＱなどである。補酵素としてＮＡＤＨ／Ｈ+が特に有利である。
【００１５】
検体との反応による補酵素の変化は、基本的に任意の方法で検出することができる。この場合には従来の技術で公知の基本的に全ての方法が、酵素反応の検出に使用することができる。しかしながら、補酵素の変化は光学的方法によって検出されることが好ましい。光学的検出方法には、たとえば吸光度、蛍光、円二色性（ＣＤ）、旋光分散（ＯＲＤ）の測定または屈折率測定が含まれる。特に好ましくは補酵素の変化は蛍光の測定によって検出される。蛍光測定は高感度であり、かつ小型化されたシステムにおける検体のわずかな濃度の検出でさえ可能にする。
【００１６】
触媒的に不活性のタンパク質への補酵素の結合によって、特に光学的方法による、検出性の改善がもたらされる。たとえば触媒的に不活性のタンパク質への補酵素の結合は、酵素の改善された蛍光発生量を特にもたらす。
【００１７】
本発明による方法または検出系は、湿式テストを含むことができ、その際、試薬は、たとえば水性もしくは非水性の液体中の溶液もしくは懸濁液の形でか、または粉末もしくは凍結乾燥体（Lyophilisat）として存在する。しかしながら、本発明による方法および検出系は乾式テストであることが好ましく、その際、試薬は支持体上に塗布されている。この支持体には、たとえば吸収可能および／または膨潤可能な材料であるテストストリップが含まれることができ、このテストストリップは検査すべき試料液体で湿らされる。
【００１８】
補酵素結合性の触媒的に不活性のタンパク質は、酵素による検出反応の生成物として生じる補酵素に結合することができ、その際、この補酵素の結合によって補酵素−反応生成物の改善された検出性がもたらされる。触媒的に不活性のタンパク質は好ましくは、触媒的に不活性であるが、依然として補酵素−結合部位をもつ不活化酵素または不活化酵素のフラグメントである。好ましくは不活化オキシドレダクターゼ、たとえば不活化デヒドロゲナーゼが使用される。ＮＡＤＨ結合性の不活化デヒドロゲナーゼ、たとえばグルコースデヒドロゲナーゼの使用が特に有利である。
【００１９】
酵素の不活化は、アミノ酸配列における突然変異、たとえば個々のアミノ酸もしくはいくつかのアミノ酸の断片の欠失、挿入および／または置換によってもたらされることができる。特に有利な実施態様の場合には突然変異は酵素の触媒中心で行われる。たとえばグルコースデヒドロゲナーゼは、第１４７位における、触媒活性にとって必須のヒスチジン基で、たとえばセリンまたはトリプトファンに突然変異させることができる。その結果は、実質的な触媒活性をもたないＮＡＤＨ結合性のタンパク質である。その一方で酵素の不活化は化学修飾、たとえば触媒中心における化学修飾によっても行われることができ、その化学修飾によって触媒活性が少なくとも十分に取り除かれるのに対して、補酵素の結合についての能力は維持されたままである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
特に有利な実施態様の場合には検出試薬はマトリックス、たとえば吸収性材料またはゲルマトリックス、中に挿入されて使用される。ゲルマトリックスは好ましくは膜厚≦５０μｍ、特に≦５μｍを有し、かつ支持体、たとえば少なくとも部分的に光学的に透明な支持体、上に塗布されている。ゲルマトリックスは、光重合性モノマー、たとえばアクリルモノマー、たとえばアクリルアミドおよび／またはアクリル酸エステル、たとえばポリエチレングリコールジアクリレート、あるいはビニル芳香族モノマー、たとえば４−ビニルベンゼンスルホン酸、あるいはこれらの組合せ物を基礎として構成されているポリマーであることが好ましい。このようなゲルマトリックスの製造のために、補酵素、触媒的に不活性のタンパク質、１種以上の光重合性モノマーならびに場合によっては酵素、光重合開始剤および／または不反応性成分を含む試薬を含有する液体が、少なくとも部分的に光学的に透明な支持体、たとえばプラスチックフィルム上に塗布されることができ、かつ、支持体上でその１種のモノマーもしくは数種のモノマーの重合があらかじめ決められた膜厚が得られるまで行われるようにたとえば紫外線で裏側から照射されることができる。この膜厚は、試薬への吸収性材料の添加によって、および／または照射時間および／または照射強度によって制御することができる。過剰量の試薬は、重合後に除去されることができ、かつ再使用されることができる。
【００２１】
その一方でこのマトリックスは、液状の試薬が支持体に塗布され、その箇所で適当な方法で、たとえばドクターを用いて、所望の厚さにされ、かつさらに乾燥されるかもしくは完全に重合される従来のコーティング方法によって製造されることもできる。
【００２２】
ゲルマトリックスへの重合導入後に触媒的に不活性のタンパク質および場合によっては酵素は、保護された微環境の中に存在する。高分子のゲルマトリックスが十分に架橋されることによってこのタンパク質の分子は固定化された形で存在する。低分子の物質ないしはグルコースまたは他の検体あるいはまた補酵素は、自由にこのポリマー網状構造を通り抜けて拡散することができる。
【００２３】
補酵素がマトリックス中へと拡散することができるようにするために、触媒的に不活性のタンパク質および場合によっては酵素を補酵素と一緒にマトリックス中に重合導入してもよいし、マトリックスを重合の後で補酵素の溶液と接触させてもよい。反応によって変化した、たとえば還元もしくは酸化された補酵素は、この不活性のタンパク質への結合によって、かつ場合によっては付加的にこのゲルマトリックス中への挿入によって、障害の影響から最適に保護されている。
【００２４】
さらに本発明を次の実施例により詳説する。
【実施例】
【００２５】
例：キュベット中の不活化グルコース／ＮＡＤ+／乳酸デヒドロゲナーゼを用いたＮＡＤＨ蛍光によるラクタート検出
グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧｌｕｃＤＨ）の不活化
第１４７位におけるＧｌｕｃＤＨの必須のヒスチジンを公知方法でセリンと交換した。
【００２６】
ラクタート検出
不活化ＧｌｕｃＤＨ１００ｍｇ／ｍｌをｐＨ７の緩衝液に溶解し、かつ相応の量のＮＡＤ+および触媒量の乳酸デヒドロゲナーゼで処理した。増量しながらラクタートが添加されると、視覚的に蛍光の増大を紫外線ランプ（励起波長３６６ｎｍ）下に認めることができた。不活化酵素なしでは、匹敵する蛍光は観察することはできなかった。
【国際調査報告】
2005528897.tif 000002
2005528897.tif 000003
2005528897.tif 000004
2005528897.tif 000005
2005528897.tif 000006
2005528897.tif 000007