(57)【要約】  本発明は、自動化サンプル処理のための方法および装置を供給する。本発明は、サンプルを、サンプル中の標的検体の濃度に基づいて選択される工程にて、複数の希釈手順に導入する工程を包含する。サンプルを標準化するための方法であって、該方法が、以下の工程：複数のサンプルの各々における検体の初期濃度を決定する工程；各々のサンプルの一部を装置上に導入する工程であって、その結果該各々のサンプルの一部が、該検体の初期濃度に関する該装置上の特有の位置を占める工程；および該複数のサンプルを希釈する工程であって、その結果該複数のサンプルが、検体濃度に関して標準化されるような工程、を包含する、方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルを標準化するための方法であって、該方法が、以下の工程：
複数のサンプルの各々における検体の初期濃度を決定する工程；
各々のサンプルの一部を装置上に導入する工程であって、その結果該各々のサンプルの一部が、該検体の初期濃度に関する該装置上の特有の位置を占める工程；および
該複数のサンプルを希釈する工程であって、その結果該複数のサンプルが、検体濃度に関して標準化されるような工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記各々のサンプルの一部が、ロボットで前記装置上に導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サンプルが、生物学的サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記生物学的サンプルが、便、尿、唾液、精液、血液、痰、脳脊髄、膵液、胆汁、リンパ、膿、および吸引液からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記検体が、核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸が、ヒトＤＮＡである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ヒトＤＮＡの濃度が、ｑＰＣＲによって決定される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記装置が、アレイである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記特有の位置が、ウェルまたはポロニーである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記アレイが、マイクロタイタープレートである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記マイクロタイタープレートが、複数のウェルを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記アレイが、スライドである、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記各々のサンプルの位置が、前記スライド上の異なるポロニーとして投入される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＰＣＲ反応が、前記サンプルの一部において実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記サンプルの前記一部が、経路中の最終希釈段階に位置する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記サンプルが、前記最終希釈段階で、約１０核酸分子に希釈される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記サンプルが、前記最終希釈段階で、約５核酸分子に希釈される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記サンプルが、前記最終希釈段階で、約１核酸分子に希釈される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１に記載の方法であって、サンプルの一部を分析する工程を、さらに包含する、方法。
【請求項２０】
前記サンプルが、経路中の最終希釈段階に位置する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項５に記載の方法であって、検出可能標識を有する前記核酸のサンプルにおいて、核酸配列を標識する工程をさらに包含する、方法。
【請求項２２】
前記検出可能標識が、放射性同位体、蛍光化合物、抗原性マーカー、および酵素マーカーからなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記生物学的サンプルが、細胞性物質を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項２４】
前記分析工程が、列挙されたＬＯＨ、ＤＮＡ完全アッセイ、変異検出、発現アッセイ、およびＦＩＳＨからなる群から選択されるアッセイを実施する工程を包含する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記アッセイが、ｐ５３、ｒａｓ、ＡＰＣ、ＤＣＣ、およびＢＡＴ−２６からなる群から選択される遺伝子座での変異を検出する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記分析工程が、ウイルス検出アッセイを実施する工程を包含する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
前記ウイルスアッセイが、ＨＩＶウイルスまたはＨＰＶウイルスを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
サンプル希釈の自動化のためのコンピュータープログラム可能な方法であって、該方法は、以下の工程：
経路中の一連の希釈点に沿ったサンプルの自動化希釈のためのプログラムされたアルゴリズムに対応するデータを入力する工程；
少なくとも一つのサンプルの所定の初期濃度に対応するデータを入力する工程；
該経路中で一連の希釈点に沿って該サンプルを導入するための適切な入口点を決定する工程であって；ここで該適切な入口点は、該サンプルの該初期濃度によって決定される、工程；および、
命令を自動化デバイスに送る工程であって、該自動化デバイスは、該経路中で該一連の希釈点に沿って該サンプルを希釈することができる、工程、
を包含する、方法。
【請求項２９】
サンプルを導入するための、前記適切な入口点が、複数のサンプルについて決定されるような、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
サンプル希釈を自動化するための方法であって、該方法は、サンプルを自動化希釈手順に導入する工程を包含し、該自動化希釈手順は、複数の希釈工程を包含し、ここで該サンプルは、該サンプル濃度によって決定される希釈工程にて導入される、方法。
【請求項３１】
複数のサンプルが、前記自動化希釈手順に導入され、各々のサンプルが、その濃度によって決定される工程にて導入される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
サンプルを標準化するための方法であって、該方法は、以下の工程：
経路中で所定の一連の希釈段階を提供する、工程；
サンプル中の検体の初期濃度を決定する、工程；
該サンプルの一部を装置上の特有の位置に導入する工程であって、ここで該特有の位置が、該検体の該初期濃度によって決定される、工程；および
該サンプルを希釈する工程であって、その結果、該サンプル中の該検体の最終濃度が、標準化される、工程、
を包含する、方法。
【請求項３３】
前記希釈工程が、連続的に行われる、請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は米国特許出願番号６０／３３１，６５４（２００１年１１月２０日出願）の利益および優先権を主張し、この開示は本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の技術分野）
本発明は分析のための生物学的サンプルの調製のための方法および装置に一般に関する。より詳細には、本発明は核酸サンプル調製を自動化するための方法および装置に関する。本発明はその後の分析のためのサンプルの濃度を標準化するのに特に有用である。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
核酸サンプルは、疾患のスクリーニングおよび診断について使用される頻度が増加している。寄生性疾患、感染性疾患、遺伝性疾患、または散在性疾患の証拠が、異なる生物源（便を含む）からの核酸サンプルに見出され得る。例えば、便から調製された核酸サンプルは、結腸直腸癌を示唆する指標のために分析され得る。
【０００４】
しかし、生物学的サンプルから代表的に得られる核酸の可変量および予測不能の量は、自動化診断アッセイのための核酸の供給源として生物学的サンプル（例えば、臨床的サンプル）を使用する場合、重大な問題である。患者および／または生物学的サンプルの型に依存して、標準化された核酸調製手順から得られるヒト核酸標的の濃度は、サンプル全部にわたって１０，０００倍も変化し得る。この可変性は、自動化された核酸調製および分析を複雑にする。
【０００５】
これらの問題を解決するための試みがなされてきた。例えば、マルチウェルプレートを用いる自動化アッセイが、少なくとも１つのウェルにおける核酸濃度が、実施されるアッセイの型に適切であることを確かめるために、核酸サンプルの複数の希釈物に対して、代表的に実施される。しかし、このようなアプローチは、予測できない結果を産み出し、アッセイ物質を浪費する。さらに、これらのアプローチは、単一のアッセイについて多数のデポジットの分析を必要とする。当該分野で利用可能な方法および装置は、サンプルの操作の量を最小限にし、自動化核酸分析のために必要なサンプルの分析の量を減らすような予想可能および再生産可能な溶液を提供しない。従って、自動化サンプル調製のための、そしてより詳細には自動化核酸サンプル調製のための、方法および装置について当該分野で必要性が残っている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、一般的に自動化サンプル処理のための方法および装置を提供する。本発明は、具体的には、ひとつの供給源由来、または多数の供給源からのいずれかである、複数のサンプルを処理するのに有用であり、同時に、続く分析のための等しく希釈されたサンプルを生成するのに有用である。
【０００７】
本発明の方法は、複数のサンプルを標準化するのに有用である。本発明に従って、方法は、複数のサンプルの各々における検体の初期の濃縮を決定する工程を包含する。本発明の方法はさらに、各々のサンプルの一部が、検体の初期の濃度に関して装置において特有の位置を占めるように、装置上の各々のサンプルの一部を導入する工程を包含する。本発明の方法はさらに、検体濃度に関して標準化されるように装置上の各々のサンプルの一部を希釈する工程を包含する。
【０００８】
本発明は、一般的に、サンプルを、複数の工程を有する自動化液体操作手順に導入または置く工程を包含する。例えば、自動化液体操作手順は、あらかじめ決定された経路においての一連の希釈工程または希釈段階である。本発明に従って、サンプルは、この経路においてサンプル特有の希釈段階または希釈点で、この手順に導入される。この経路におけるサンプル特有の希釈段階または希釈点は、サンプルの特性によって決定される。例えば、サンプルの初期の特性（例えば、核酸濃度）が、好ましくは決定され、その結果、サンプルが、自動化希釈手順の適切な工程で希釈点において導入され得るか、またはデポジットされ得る。希釈経路における１つの工程は、経路における後の、特有の異なる希釈位置であらかじめ決定された希釈濃度を含むサンプルを作り出すために、適切な希釈段階でサンプルを導入する工程または置く工程を包含する。
【０００９】
本発明は、以前に自動化が困難だったサンプルを標準化するための方法および装置を提供する。均一のサンプルの生成を自動化するための効率的で効果的な溶液は、多くのアッセイが、個々のサンプル分析および希釈工程を包含する特定の核酸濃度を必要とするという事実によって制限されてきた。例えば、生物学的サンプルからの身体の変異体の検出はまた、野生型配列、または異種性の高いＤＮＡの存在下で少量の突然変異ＤＮＡを検出する能力を引き起こす。結果として、便サンプルからの初期段階の結腸直腸癌の分析のために、１％に満たない突然変異ＤＮＡを検出する必要がある。これらの制限はまた、まれな伝染病、すなわち病原体の検出について真実である。異なる開始濃度のサンプルが、経路における異なる希釈段階で導入される。
【００１０】
本発明の方法および装置は、複数のサンプルの処理を自動化するのに有用である。特定の実施形態において、本発明の方法および装置は、アレイ中の複数のサンプルの自動化処理を包含する。また、本発明の特定の実施形態は、２次元以上の次元のアレイを含む。本発明の方法および装置は、デジタル増幅反応のための核酸サンプルの処理に特に有用である。本発明の方法および装置はまた、下流分析技術およびその技術的感度に関連するＤＮＡ異種性の調節に有用である。さらに、本発明は、標的配列を濃縮することにより、微量なＤＮＡ標的を検出する能力を提供する。例えば、１％の変異体集団が検出され得る場合（例えば、突然変異反応に特異的な固相の小型の塩基配列決定を用いて）、０．０５〜０．１％の変異体（おのおの２０倍〜１０倍の濃縮の後）を検出することもまた可能であり得る。本発明の方法および装置はまた、遺伝子型試験、例えば、ＨＩＶ遺伝型試験のような、レトロウイルス検出試験を介しての、変異体の検出に有用である。他の実施形態において、本発明の方法および装置は、法医学試験、インビトロでの出生前診断、循環細胞の分析、およびサンプルの希釈を含み得る任意の他のアッセイまたは試験に関して使用され得る。
【００１１】
本発明の１つの実施形態において、複数のサンプル（例えば、複数の患者から得られたサンプル）を自動的に処理して、分析的分析のための均一なサンプルを生成する。本発明によると、各々のサンプルは、これらのサンプルが、希釈経路における種々の異なった段階で導入されるように、異なる初期のサンプル濃度を有し得る。本発明の別の実施形態において、単一の患者からの１つ以上のサンプルを、自動的に加工されて多数の分析のための分析（ａｎａｌｙｓｅｓ）についての均質なサンプルを作り出す。
【００１２】
本発明により企図される構造は、種々のフォーマット（例えば、標準マイクロタイタープレートフォーマット（例えば、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、および１５３６ウェルプレート）、特定のアッセイのために特に設計された非標準マイクロタイタープレート、および離れた場所または特有の場所でのサンプルの連続的な投入のためのスライドまたは他の表面を含む。さらに、形式は、標準フォーマットおよび微小流体性（ｍｉｃｒｏｆｌｕｄｉｃ）フォーマットを含む。ロボット工学の液体操作子が、現在全てのこれらのフォーマットを扱い得、特定のアッセイに基づく非標準フォーマットを扱うように適合され得る。熱的サイクラー（ＰＣＲについての）の制限は、現在３８４ウェルプレートである。しかし、本発明は、マイクロタイタープレートを含む、熱的循環追加フォーマットのために適合した装置を企図する。本発明はまた、他のマイクロタイタープレートフォーマット（非標準マイクロタイタープレートフォーマットを含む）を含む自動化手順を企図する。
【００１３】
本発明のさらなる局面および利点は、以下の詳細な説明の考察に対して明らかである。
【００１４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、希釈過程において必要な工程を最小限にするための方法および装置を提供する。本発明はまた、希釈過程を自動化するための方法および装置を提供する。本発明は、検体が、所定の標的濃度に希釈されるように、所定の希釈経路における、サンプル特有の（または濃度特有の）希釈位置にサンプルが導入される工程を決定するための方法を提供する。具体的には、本発明は、検体のサンプル濃度を決定することおよび、この検体の濃度に基づいて、続いて、希釈経路におけるどの位置に、またはどの点にサンプルが導入されるべきかを決定することを包含する。
【００１５】
生物学的サンプルの分析は、診断アッセイのようなアッセイのための物質（例えば、核酸）の所定の量をしばしば必要とする。従って、均一な濃度のサンプルを作り出すための自動化手順は、効率的に多数のサンプルを処理するために有用である。本発明は、自動化希釈手順のために必要となる操作の数を減らすための方法を提供する。本発明によれば、サンプル濃度が決定され、そしてこのサンプル濃度が、一連の希釈点の間の複数の連続した希釈工程を包含する、所定の希釈経路にサンプルを導入する適切な導入位置または入口点を決定するのに用いられる。例えば、１０，０００倍の希釈は、サンプルを、希釈経路の第１の位置または点から、希釈経路の第５の位置または点に持っていく４つの連続した１０倍希釈工程を包含する経路において、得られ得る。本発明によれば、サンプルまたはサンプルの一部は、そのサンプルまたはサンプルの一部中の検体の初期濃度に対応する装置（例えば、スライドまたはマイクロタイタープレート）における特有の位置に導入される。従って、本発明の方法は、経路における所定の一連の希釈段階を提供する工程を包含する。このように、サンプル中の検体の初期濃度が決定した後、サンプルの一部は、経路における適切なサンプル特有の希釈点または希釈位置に導入される。例えば、核酸サンプルでは、経路における適切なサンプル特有の希釈位置または希釈点は、サンプルの核酸濃度によって決定される。その後、このサンプルは、希釈経路に沿うそれぞれの段階で順番に希釈される。本発明によれば、サンプルは、サンプルの初期濃度に関わらず、経路において異なる最終希釈点に希釈される。
【００１６】
特定の実施形態において、サンプルは、生物学的サンプルである。例えば、生物学的サンプルは、便、尿、唾液、精液、血液、痰、脳脊髄、膵液、胆汁、リンパ、膿、および／もしくは吸引液体である（かまたはこれらに由来し得る）。生物学的サンプルは、１患者から得られる１つの核酸サンプルまたは複数の患者から得られる複数の核酸サンプルであり得る。関連した実施形態において、核酸サンプルは、ヒトＤＮＡまたは動物ＤＮＡを含む。特定の実施形態において、生物学的サンプルはまた、細胞物質を含む。別の実施形態において、サンプルは、非生物学的サンプルであり得る。さらなる実施形態において、本発明の方法および装置は、非ヒトサンプルの希釈を自動化するのに有用である。例えば、ウイルスサンプル（例えば、インタクトなウイルス、ウイルス核酸、またはウイルスタンパク質）は、本発明の方法を用いて希釈され得る。
【００１７】
一般的に、本発明によれば、サンプル中の検体の濃度が決定される。例えば、本発明の１つの実施形態において、ヒトＤＮＡを含む核酸サンプルを含む方法および装置のために、ヒトＤＮＡ濃度は、ｑＰＣＲによって決定され得る。しかし、サンプルの濃度は、当業者に公知の任意の手段により、決定され得、希釈されるべきサンプルに基づいて変わり得る。
【００１８】
複数のサンプルを標準化するための方法および装置は、装置上の希釈点または希釈位置のアレイにわたってサンプルの一部を入れることを包含する。本発明の実施形態は、２以上の次元を構成するアレイのような装置を企図する。また、本発明の方法および装置は、ウェルまたはポロニーのような装置上の分離した、特有の位置を有する。ポロニーは，例えば、スライドまたは他の表面上に導入されたデポジットである。一般的に、各々のデポジットまたはサンプルの集合は、サンプルまたは液体の表面張力の結果として、スライド上に（または他の表面上に）ポロニーまたは液滴を形成する。このように、本発明の装置は、アレイを含み、このアレイは、マイクロタイタープレートのような、少なくとも１つのウェルを有する、任意の標準的なプレートであり得る。本発明の別の実施形態において、装置は、アレイを含み、このアレイは、スライドの表面上のポロニーのアレイにわたってサンプルデポジットを受容することができるスライドを含む。さらに、各々のポロニーは、サンプル中の検体の初期の濃度に対応する、装置上の特有の位置を占める。
【００１９】
本発明はまた、サンプル上でＰＣＲ反応を実施することを包含する。特定の実施形態において、ＰＣＲ反応が、希釈経路における最終希釈段階でのサンプルの一部で実施される。また、本発明の特定の実施形態において、サンプルは、最終希釈段階で、約１０核酸分子に希釈される。本発明の別の実施形態において、サンプルは、最終希釈段階で、約５核酸分子に希釈される。本発明のさらに別の実施形態において、サンプルは、最終希釈段階で、約１核酸分子に希釈される。
【００２０】
本発明の実施形態はまた、サンプルを分析する工程を包含する。１つの実施形態において、経路中の最終希釈段階のサンプルが、分析される。しかし、サンプルは、経路中の任意の希釈段階で単離および分析され得る。サンプルを分析することは、サンプルに対してアッセイを実施する工程を包含し得る。例えば、有用なアッセイとしては、列挙されたＬＯＨ、ＤＮＡ完全性アッセイ、変異体検出、発現アッセイ、およびＦＩＳＨが挙げられる。しかし、任意のアッセイまたは分析技術が、利用され得、そして標的サンプルに依存し得る。また、特定のアッセイは、ｐ５３、ｒａｓ、ＡＰＣ、ＤＣＣ、およびＢＡＴ−２６からなる群から選択された遺伝子座での変異体を検出し得る。本発明の方法および装置はまた、レトロウイルス検出試験またはレトロウイルス検出アッセイを実施する工程を包含する。例えば、特定の試験またはアッセイは、ウイルスを遺伝子型決定する（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）ため、例えば、ＨＩＶウイルスサンプルまたはＨＰＶウイルスサンプル内の変異または改変体を検出するために行われ得る。
【００２１】
また、本発明の方法は、検出可能標識で、核酸サンプル中の核酸配列を標識する工程を包含する。検出可能標識の例としては、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、抗原性マーカー、および酵素マーカーが挙げられる。他の検出可能マーカーが、用いられ得、当業者に公知である。
【００２２】
本発明の方法はまた、サンプル希釈の自動化のための、コンピュータープログラム可能な方法を含む。一般的に、本発明の方法は、経路中の一連の希釈点に沿った、サンプルの自動化希釈のためのプログラムされたアルゴリズムに対応するデータを入力することを包含する。これらの方法はまた、少なくとも１つのサンプルの所定の初期濃度に対応するデータを入力することを包含する。さらに、これらの方法は経路中の一連の希釈点に沿ってサンプルを導入するための適切な入口点を決定する工程を包含する。本発明によれば、適切な入口点が、サンプルの初期の濃度によって決定される。さらに、これらの方法は、コンピューターまたは自動装置デバイスに指示を送ることを包含し、このコンピューターまたは自動装置デバイスは、サンプルを経路中の特定の段階に導入し得、経路中の希釈段階に沿ってサンプルを希釈し得る。関連した実施形態において、全ての情報およびデータは、可視ディスプレイまたは音響機器で表示される。関連した実施形態において、これらの方法は、コンピュータープログラム可能な方法で使用するために、サンプルの初期濃度のような、データを入力するためのインプットモジュールを含む。さらに、関連した実施形態において、全ての情報およびデータは、有線ネットワークまたは無線ネットワーク上でユーザーに提供され得る。
【００２３】
本発明は、均一な濃度のサンプルを生成するのと並行して、複数の患者サンプルを処理するための方法および装置を提供する。本発明によれば、異なる開始濃度の物質を有する検体を含むサンプルを、異なる工程で、経路（または自動化連続希釈手順）中の一連の希釈点に導入する。例えば、より濃縮された患者サンプルは、希釈手順においてより早く導入され、希釈手順のより遅くに導入されるあまり濃縮されていない患者サンプルよりも多くの希釈工程を経る。患者サンプルの適切な導入は、あらかじめ決定されたアルゴリズムにより決定され得るか、またはユーザーによって操作され得る。
【００２４】
内部コントロールは、並行なサンプル間の希釈工程における変動性について希釈プロファイルおよびコントロールをモニタリングするために用いられ得る。例えば、既知の量の蛍光マーカーまたは他のマーカーが、希釈経路における、ある段階で、好ましくは最初の段階で、導入され得る。マーカーの量は、希釈経路における１つ以上の希釈段階で決定され、そして参照の量、またはこの希釈経路における同じ段階にある並行サンプルにおけるマーカーの量と比較される。変化の量は、並行サンプル中の希釈経路の再現性の指標である。
【００２５】
本発明は特に、サンプルデポジットの２次元アレイ（例えば、試験管の２次元アレイ、２次元マルチウェルプレート、サンプルチャンバーの２次元アレイ、または他のサンプル容器の２次元の構成）を用いて実施される、希釈経路または自動化希釈手順における、一連の希釈点の状況において有用である。本発明の１つの利点は、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレートおよび／または１５３６ウェルプレートを含む標準マルチウェルプレートのための標準自動装置および標準ロボット機器を用いて実施され得ることである。また、本発明の他の利点は、スライドを用いて実施され得ることである。例えば、一連の希釈点に沿うデポジットが、ポロニーとしてスライド上で導入され得る。従って、スライド上または任意の他の適切な表面上のポロニーの使用は、マルチウェルプレートにおいて従来必要とされる、固定された寸法もしくはチャンバーまたは実質的に固定された寸法もしくはチャンバーを必要とすることなしに、単離されたサンプルの分配を提供する。
【００２６】
本発明の方法および装置はまた、枝分かれした経路または二又に分かれた経路を含む一連の希釈経路を含む。例えば、枝分かれした経路または二又に分かれた経路の使用は、包括的な分析および研究のためのサンプルの大規模な希釈および分配を提供する。さらに、本発明の方法および装置はまた、個々に制御されかつアドレス指定可能な経路を含む。例えば、特定の経路は、サンプルの特定の特性に基づいて除外され得る。
【００２７】
図１は、連続的希釈過程を示し、ここで開始サンプルは、列Ａに導入され、列Ｃに向かうアレイを横切って動く一連の２倍希釈を経て段階的に希釈される。このような希釈手順は、少ない数の工程で大きな割合の希釈に帰し得る。例えば、各々の工程が２倍希釈を包含する、１２工程の希釈手順は、２１２（すなわち４０９６倍）の希釈に帰し、５０，０００ｐｇ／１００μｌの初期のＤＮＡ濃度を有するサンプルを１２ｐｇ／１００μｌに希釈する。当業者は、希釈係数が、各々の工程でサンプルウェルの所定の大きさに適切な条件であれば、各々の希釈工程が、異なる希釈係数（例えば、５倍希釈、１０倍希釈、または他の希釈係数）を含み得ることを理解する。従って、適切な希釈スキームが、任意の適用のために設計され得る。
【００２８】
希釈を計算する一般的に適用可能な等式は以下のとおりである：
Ｃｆ＝Ｎ（ｘ）；Ｃｆは最終濃度である
Ｎ＝列から列に移る度の希釈係数
ｘ＝希釈の回数（投入する行に依存する）
図１に示した実施例は、異なるサンプルの初期の濃度が同じである、希釈手順を例示する。しかし、多くの状況において、生物学的サンプルの初期の濃度は、あるサンプルと次のサンプルとで大きく異なる。本発明に従って、異なる濃度を有するサンプルが、連続的な希釈過程における異なる工程で希釈アルゴリズムに導入される。例えば、図２は、異なる初期の濃度を有する５つのサンプルが、５つの異なる段階で希釈手順に導入され、同一の最終濃度に帰する希釈過程を示す。この実施例において、Ｐ１の初期の濃度を有する他のサンプルを、列Ａに導入する。同様に、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、およびＰ５の初期の濃度を有する他のサンプルを、丁寧に列Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦに導入される。この方法の利点は、均質な自動化希釈手順が、２次元アレイを横切って実施されるが、個々に区別された希釈が、希釈手順において異なる工程で個々のサンプルを導入することにより得られることである。
【００２９】
従って、図２は、開始サンプルは、列Ａから列Ｆの１つに導入され、列Ｆへ向かうアレイを横切って動く一連の希釈を経て段階的に希釈される連続的な希釈過程を示す。このアレイに示されていないが、当業者は、サンプルの特性に基づいて、仮定的な列Ｇ、Ｈなど（示さず）において、さらなる希釈が段階的に続き得ることを理解する。
【００３０】
また、サンプルが適切なウェル（マイクロタイタープレートのような、実質的に固定された寸法を備える装置の場合）またはポロニー（スライドのような、装置の場合）中に導入され、または投入（ｄｅｐｏｓｉｔ）された後、サンプルが段階的自動化連続希釈過程において希釈された後、各々の行（Ｐ１〜Ｐ５）において最終希釈サンプルまたは最終希釈デポジットは、実質的に同じ濃度を有する。結果として、実施例２で供されるように、初期のＰ１におけるサンプル濃度は、初期のＰ２よりも大きく、初期のＰ２は初期のＰ３よりも大きくなど、これが初期のＰ５まで続く。しかし、最終のＰ１〜Ｐ５におけるサンプルの濃度は、実質的に等しい。
【００３１】
従って、式：ｎ＝Ｌｏｇ２Ｃ初期／Ｃ最終、ここでｎ＝希釈の回数、ＣＣ初期＝初期の濃度およびＣ最終＝最終濃度：を用いて、本方法または装置のユーザーは、所望される最終濃度を達成するのに必要な希釈の回数を決定し得る。
【００３２】
当業者は、希釈手順において続く工程が、二次元アレイにおいて隣接している必要がないことを理解する。例えば、初期の希釈工程が、列５で実施され得、第２の希釈工程が列２においてであり得、第３が列８においてであり得る。しかし、二次元アレイを横切る連続した列に、連続した希釈工程を割り当てることが一般的により便利である。
【００３３】
当業者はまた、二次元アレイが、説明の便利さおよび簡明さのための列および行を有するように記載されることを理解する。本発明は、サンプルウェルのアレイを横切る、任意の方向において希釈工程を実施することにより行われ得る。例えば、本発明はまた、異なる希釈工程を、２次元アレイにおける異なる列とは対照的に異なる行に割り当てることにより実行され得る。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態において、サンプル特有の希釈工程は、あまり大きく異ならず、この希釈工程は、あまり大きく異ならない初期濃度を有する、異なるサンプルについて、多数の入口点を提供する。より好ましくは、サンプル特有の希釈工程が、所定のサンプル調製のために一般的に得られる、異なる初期の濃度の範囲に対応して、選ばれる。
【００３５】
本発明の一つの実施形態において、自動化希釈手順は、異なる濃度の患者サンプルから、等しく希釈されたサンプルの大規模な並行なアレイを作り出すのに有用である。これは図３において例示され、ここで希釈されたサンプルは、診断の分析のために、サンプルのアレイ（例えば、他のマルチウェルプレート）に移される。この実施例において、異なるサンプルは、同じ診断試験（例えば、同じマーカーを探す）を用いて全てアッセイされる。しかし、代替の実施形態において、診断アッセイは、希釈手順における最終サンプルの工程で（例えば、希釈アレイにおける最終希釈工程を包含する列で）直接実施され得る。
【００３６】
本発明の別の実施形態において、自動化希釈手順は、図４に例示されるように、単一の患者からの等しく希釈されたサンプルの大規模の並行なアレイを作り出すのに有用である。この実施例において、これらのサンプルは、異なるアッセイ（例えば、異なる診断マーカーについて）を用いて試験される。
【００３７】
本発明の別の実施形態において、自動化希釈方法および装置は、その後の分析のためのサンプルを作り出すのに有用である。例えば、図５に表されたように、サンプルは、希釈プレート上の適切な列においてデポジット中のサンプル濃度に基づいて導入される。そしてその後、サンプルを、アレイを横切って動く一連の希釈を経て段階的に希釈する。一般的に、最終希釈サンプルまたは最終希釈デポジット（例えば、右側の最終列）が分析される場合、このサンプルまたはデポジット中に多重ＰＣＲ反応を行うために、十分な量がなければならない。また、図５に示されるように、特定の実施形態において、リアルタイム定量的ＰＣＲ分析が、当業者に公知の手段（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）分析を実施するような）によって、特定の異なった希釈点で既知のサンプル濃度を有する、一つまたは複数のサンプルにおいて実施され得る。別の実施形態において、特定の希釈濃度を有する一つまたは複数のサンプルは、遺伝子発現分析、遺伝子型決定、ウイルスもしくは病原体の検出／定量、および／または変異体スクリーニングについて評価し得る。当業者は、検出アッセイが、希釈経路での任意の一つ以上の点または段階で実施され得ることを理解する。１つの実施形態において、最後の２つ〜５つの希釈点または希釈段階が、アッセイされる。
【００３８】
また、特定の実施形態において、ＰＣＲ反応を、特定のサンプル濃度を有する一つまたは複数のサンプルで実施し得る。一般的に必要とされるＰＣＲの数は、変異体濃縮および分析感度に依存し、従って、変異体集団の検出可能性へ導く。以下の表は、必要とされるＰＣＲの数と、変異体の濃縮の程度および分析感度の程度と、変異体集団を検出する可能性との間の関係の代表的な実証を提供する。
【００３９】
【表１】
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（１）全分子（変異体＋野生型）に対する変異体分子（コピー）のパーセンテージ
（２）ＤＮＡの不均一集団における変異体の検出のために必要とされる分析感度に相当する。
（３）１分子／ＰＣＱに相当する。これは変異体％（変異体分子が存在する場合）が１００％であることを意味する。
（４）変異体を検出するために必要な実施＞１００ＰＣＲ。
表Ａは、１００ＰＣＲあたりに検出可能な名目上の変異反応を示す。実際の濃縮および変異体検出可能性は、開始サンプルにおける分子のＰｏｉｓｓｏｎ分布に起因して、そして操作（例えば、ピペッティング、希釈、ＰＣＲ反応の調製、可変性ＰＣＲ効率など）の間の配布の結果として変わり得る（正または負）。表Ａが示すように、開始変異不均一性は、全分子（変異体および野生型）に対する変異体分子（コピー）のパーセンテージである。変異体のパーセンテージは、ＤＮＡの不均一な集団における変異の検出のために必要とされる分析感度に等しい。また、１コピー／ＰＣＲは、１ＰＣＲ当たり一分子に等しく、これはまた、１００％の変異体パーセンテージ（変異体分子が存在している場合）に等しい。また、合計１００ＰＣＲ当たりの変異体のＰＣＲの名目上の数が、約１より小さいならば、これは、１００を超えるＰＣＲが、変異体を検出するために、行われなければならないことの表れである。
【００４０】
本発明の方法および装置は、核酸サンプル調製のために特に有用である。本発明に従って、患者サンプルは、サンプル中の患者（例えばヒト）核酸の濃度に基づいて適切な希釈工程で希釈手順に導入され得る。サンプル中の患者核酸の量は、当該分野で公知の方法に従って決定され得る。サンプルが患者細胞（例えば血液）から調製される場合、サンプル中の核酸の量は、サンプル中の患者核酸の量を示し、これは、例えば２６０ｎｍでのＵＶ吸収により、または定量方法に基づく標準染料を使用することにより、測定され得る。対照として、サンプルが、便サンプルから調製される場合、患者核酸の量は、細菌核酸の量より、はるかに少ない。従って、患者核酸の量は、ヒト特異的（またはより一般的には、標的特異的）オリゴヌクレオチドプローブを用いて、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により決定される。あるいは、患者核酸を、当業者に公知の標準的技術を用いて、細菌核酸を除くことにより精製し得る。精製された患者核酸は、上記のようにまたは当業者に公知の任意の他の手段により、定量化され得る。
【００４１】
本発明に従って、希釈されたサンプルは、ＤＮＡ配列決定、固相微小配列決定、プライマー伸長反応、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）ハイブリダイゼーションプローブ、オリゴヌクレオチド連結アッセイ（ＯＬＡ）、対立遺伝子特異的ＰＣＲ（ＡＳＰ）、ＭＡＬＤＩおよびＥＳＩイオン化技術を含むマススペクトロメトリー（ＭＳ）、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、微小アレイ、ならびにタンパク質切断試験（ＰＴＴ）を含む、当該分野で公知の技術を含む数多くの技術によって、アッセイされ得るか、または分析され得る。
【００４２】
本発明の他の局面および利点は、本明細書中の開示を考慮した際に明らかである。
【実施例】
【００４３】
（デジタルＰＣＲに対する自動化サンプル希釈）
デジタルＰＣＲ（ＤＩＧ−ＰＣＲ）は、単一の分子が単離され、次いでＰＣＲを用いて増幅される点までの開始ＤＮＡ溶液の希釈に基づく。しかし、希釈プロセスは、一般的に面倒である。しかし、本発明により提供される代替のアプローチは、市販されているロボット工学の流体操作子および標準マイクロタイタ−プレートフォーマットを用いて、希釈過程を自動化することであり、これは、下流分析技術のためのより大きな可撓性を提供する。より重要なことに、非常に多数の分析「ウェル」に対する必要性が排除される。これは、分析段階での患者ＤＮＡ可変性に対する、患者の標準化に起因する。このことは、本発明を用いる大生産ウェルの数の増加（すなわち、正のＰＣＲ結果に帰する）に起因する。
【００４４】
一般的なロボット工学の液体操作子を用いて、デジタルＰＣＲのために高程度の希釈を再生可能に生じるというチャレンジは、以下の因子を含む：
正確さおよび再現性を確かめるために、連続希釈に頼ること；
初期ＤＮＡ濃度の高程度の可変性を、サンプル間で予測するのを可能にすること；
５〜５０ｐｇ  ＤＮＡの範囲内（標的配列の１〜５細胞等量の範囲内）の最終濃度を標的化すること；
直接の適合可能性について、標準装置（ロボット工学の液体操作子）および消費可能（マイクロタイタープレート）フォーマットに適合させること。
【００４５】
本発明の１つの実施形態に従って、サンプルを、マイクロタイタープレートの列にロボットによって導入し、ロボット液体操作子を、行において１つのウェルから次のウェルに移す場合に、サンプルを連続して希釈し、各々の移動で等容量の新鮮な緩衝液を加える（各々の移動で２×希釈をもたらす）ようにプログラム化する。標準的なマイクロタイタープレートフォーマット（８×１２ウェル）において、これは、同時に８サンプルまでの希釈を可能にする。１つの実施例において、５０，０００ｐｇ／１００μｌの初期濃度を仮定し、ウェルＡ１で開始し、そしてウェルＡ１２に移すことによって、以下の式に従って、最終濃度１２ｐｇ／１００μｌが得られる：
Ｃｆｉｎａｌ＝Ｃｉｎｉｔｉａｌ／（２）ｎ、ここでｎ＝希釈の回数。
【００４６】
行の最後のウェルにおいて残された希釈されたＤＮＡ溶液の容量は、結果として「相同的な」または濃縮されたＤＮＡ集団を分析する元のＤＩＧ−ＰＣＲ概念と協力して、多くの並列のＰＣＲ反応を与えるのに十分である。２５０μｌの希釈されたＤＮＡの最終量が最後のウェルに残っているような実施例において、これは、１回の反応当たり５μｌのＤＮＡ溶液（例えば、全５０μｌ反応体積）を仮定する５０ＰＣＲ反応、またはより小規模のＰＣＲ反応体積を仮定する非常に多数の反応を行うのに十分である。
【００４７】
本発明の１つの局面に従って、サンプル希釈手順は、サンプルが単一の分子に希釈されることを必要としない。好ましい実施形態において、サンプルは、約５分子が存在している点に希釈される。例えば、変異がこのサンプル中で検出され得、但し、検出アッセイは、分子の２０％に存在する変異を検出するのに十分に感受性である。従って、好ましいサンプル希釈は、希釈されたサンプルに対して実施されるべき診断検出アッセイの感受性により決定される。
【００４８】
本発明は、その精神または本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形態において具体化され得る。従って、この前述の実施形態は、本明細書中に記載された本発明を限定するのではなく、全ての点で例示的に考察されるべきである。従って、本発明の範囲は前述の記載によってではなく、添付の特許請求の範囲によって示され、従って、本特許請求の範囲の意味および均等の範囲内で生じる全ての変化は、本発明に包含されるように意図される。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図１は、初期濃度を有するサンプルについての本発明の方法またはアルゴリズムを用いる連続的な希釈経路を示す概略図である。
【図２】図２は、異なる初期濃度を有するサンプルについての本発明の方法またはアルゴリズムを用いる連続的な希釈経路を示す概略図である。
【図３】図３は、多くの患者から等しく希釈されたサンプルの並行なアレイを示す概略図である。
【図４】図４は、一人の患者から等しく希釈されたサンプルの並行なアレイを示す概略図である。
【図５】図５は、希釈されたサンプルの並行なアレイおよびアレイにおける希釈されたサンプルに対してＰＣＲを実施するためのＰＣＲプレートを示す概略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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