(57)【要約】本発明は、カリウムチャンネルサブユニットのＫｖβ２．３をコード化する新規なヒトＤＮＡ配列、このＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質、このＤＮＡ配列を含むベクター、このベクターを含有する宿主細胞、およびヒトＫｖβ２．３サブユニットを含有するカリウムチャンネルの阻害剤およびアゴニストを特定する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質をコード化するヌクレオチドを含む単離されたＤＮＡ。
【請求項２】
配列番号３に示されるアミノ酸配列有するポリペプチドをコード化するヌクレオチドを含む、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
上記ヌクレオチドが配列番号１の１位〜１１４６位を含む、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
配列番号１の１位〜１１４６位からなるＤＮＡ配列の逆相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションし、および少なくとも１つの他のカリウムチャンネルサブユニットタンパク質と機能的なカリウムチャンネルを形成し得るカリウムチャンネルβサブユニットタンパク質をコード化する、単離されたＤＮＡ。
【請求項５】
上記単離されたＤＮＡが、ヒトＫｖβ２サブユニットをコード化し、かつ配列番号１のヌクレオチド４９９〜５４３の配列を含み、ヒトＫｖβ２サブユニットが、Ｋｖ１．１、Ｋｖ１．２、Ｋｖ１．３、Ｋｖ１．４、Ｋｖ１．５、Ｋｖ１．６、Ｋｖ１．７、Ｋｖ１．８およびＫｖ１．９からなる群から選択される少なくとも１つのヒトカリウムチャンネルαサブユニットに結合する、請求項４に記載の単離されたＤＮＡ。
【請求項６】
請求項３に記載されたＤＮＡを含む発現ベクター。
【請求項７】
請求項３に記載されたＤＮＡを含む組換え宿主細胞。
【請求項８】
単離されたヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質。
【請求項９】
配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する、請求項８に記載の単離されたタンパク質。
【請求項１０】
一アミノ酸の置換を含む、請求項９に記載のタンパク質。
【請求項１１】
２つ以上のアミノ酸置換を含み、上記アミノ酸置換が保存的置換である、請求項９に記載のタンパク質。
【請求項１２】
アミノ酸配列ＧＤＰＦＳＳＳＫＳＲＴＦＩＩＥ（配列番号６）を含み、かつ少なくとも１つの他のカリウムチャンネルサブユニットタンパク質との機能的なカリウムチャンネルを形成し得る、単離されたヒトＫｖβ２サブユニットタンパク質。
【請求項１３】
ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質に特異的に結合する抗体。
【請求項１４】
配列番号１に由来する、少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含むＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項１５】
（ａ）ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルを発現する細胞を提供すること、
（ｂ）上記細胞に８６Ｒｂを負荷すること、
（ｃ）物質の存在下および非存在下で上記細胞からの８６Ｒｂの流出を測定すること、を含み、
上記細胞からの８６Ｒｂの流出が、上記物質の非存在下と比較したとき、上記物質の存在下において異なる場合、上記物質は、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルの活性を調節するものである、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルの活性を調節する物質を特定するための方法。
【請求項１６】
（ａ）ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルを発現する細胞を提供すること、
（ｂ）上記細胞を物質にさらすこと、
（ｃ）上記細胞への上記物質の結合量を測定すること、
（ｄ）工程（ｃ）における結合量をコントロール細胞に対する上記物質の結合量と比較すること（この場合、コントロール細胞は、コントロール細胞がヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を発現しないことを除いて、工程（ａ）の細胞と実質的に同一である）、を含み、
工程（ｃ）における結合量が、コントロール細胞に対する上記物質の結合量よりも大きい場合、上記物質は、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルに結合するものである、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルに結合する物質を特定するための方法。
【請求項１７】
（ａ）ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルを発現する細胞を提供すること、
（ｂ）ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルに結合することが知られていない物質の存在下および非存在下で、上記細胞を、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルに結合することが既知の化合物にさらすこと、
（ｃ）上記物質の存在下および非存在下における上記細胞への上記化合物の結合量を測定すること、を含み、
上記物質の存在下における化合物の結合量が、上記物質の非存在下における結合量と異なる場合、上記物質は、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルと結合するものである、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルと結合する物質を特定するための方法。
【請求項１８】
（ａ）組換え発現したヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質または変異型ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質が、他のカリウムチャンネルサブユニットタンパク質と共に、機能的なカリウムチャンネルに取り込まれるように、宿主細胞においてヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質または変異型ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を組換え発現させること、
（ｂ）工程（ａ）の機能的なカリウムチャンネルの生物学的活性を物質の存在下および非存在下で測定すること、を含み、
上記物質の非存在下と比較したとき、上記物質の存在下における工程（ａ）の機能的なカリウムチャンネルの生物学的活性の変化により、上記物質が、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルの活性化剤または阻害剤であることが示される、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルの活性化剤または阻害剤を特定する方法。
【請求項１９】
上記細胞が、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ））卵母細胞、ＨＥＫ２９３およびマウスＬ細胞からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
生物学的活性が、電位依存性カリウム電流の産生、電位依存性カリウムチャンネル電流の調節、および上記細胞からの８６Ｒｂの流出からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
電位依存性カリウム電流の調節が、ゲート開閉電圧の変化、活性化速度論の変化、非活性化速度論の変化、およびテイル電流の変化からなる群から選択される電流の電気生理学的特性の変化である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
（ａ）ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルが形成されるようにアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞においてヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を発現させること、
（ｂ）上記卵母細胞のトランスメンブランポテンシャルを物質の存在下および非存在下で変化させること、
（ｃ）ステップ（ｂ）の後に膜カリウム電流を測定すること、を含み、
工程（ｃ）で測定される膜カリウム電流が、上記物質の存在下よりも、上記物質の非存在下において大きい場合、上記物質は、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルの阻害剤である、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルの阻害剤を特定する方法。
【請求項２３】
（ａ）下記
（１）ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルが細胞内で形成されるように細胞におけるヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質の発現を行わせる発現ベクター、
（２）上記細胞の形質膜の外側に結合する第１の蛍光色素、および
（３）膜電位の変化に応答して上記細胞の形質膜の一方の面から反対側の面に自由に移動する第２の蛍光色素、を含む試験細胞を提供すること、
（ｂ）上記試験細胞を物質にさらすこと、
（ｃ）上記物質にさらされた上記試験細胞における蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）量を測定すること、
（ｄ）上記物質にさらされた上記試験細胞により示されるＦＲＥＴ量を、コントロール細胞により示されるＦＲＥＴ量と比較すること、を含み、
上記試験細胞により示されたＦＲＥＴ量が、上記コントロール細胞により示されたＦＲＥＴ量よりも大きい場合、上記物質は、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルの活性化剤であり、
上記コントロール細胞は、（１）（ａ）の（１）から（３）に示される項目の少なくとも１つを含まないことを除いて、試験細胞と本質的に同じであ上記物質にさらされた細胞、または（２）上記物質にさらされなかった試験細胞のいずれかである、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルの活性化剤を特定する方法。
【請求項２４】
（ａ）下記
（１）ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルが細胞内で形成されるように細胞におけるヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質の発現を行わせる発現ベクター、
（２）上記細胞の形質膜の外側に結合する第１の蛍光色素、および
（３）膜電位の変化に応答して上記細胞の形質膜の一方の面から反対側の面に自由に移動する第２の蛍光色素、を含む試験細胞を提供すること、
（ｂ）ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルの阻害剤であることが疑われる物質に上記試験細胞をさらすこと、
（ｃ）上記物質にさらされた上記試験細胞における蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）量を測定すること、
（ｄ）上記物質にさらされた上記試験細胞により示されるＦＲＥＴ量を、コントロール細胞により示されるＦＲＥＴ量と比較すること、を含み、
上記試験細胞により示されるＦＲＥＴ量が、上記コントロール細胞により示されるＦＲＥＴ量よりも小さい場合、上記物質は、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルの阻害剤であり、
上記コントロール細胞が、（１）（ａ）の（１）から（３）に示される項目の少なくとも１つを含まないことを除いて、上記試験細胞と本質的に同じである上記物質にさらされた細胞、または（２）上記物質にさらされなかった試験細胞のいずれかである、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルの阻害剤を特定する方法。
【請求項２５】
Ｋｖβ２．３サブユニットを含有するカリウムチャンネルの活性を調節し、しかしＫｖβ２．３サブユニットを含有しないカリウムチャンネルの生物学的活性は調節しない化合物を投与することを含む、Ｋｖβ２．３サブユニットを含有するカリウムチャンネルの生物学的活性の調節を、そのような調節を必要とするヒト宿主において行う方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願に対する相互参照）
該当出願なし
【０００２】
（連邦政府補助金による研究開発に関する言及）
該当補助金なし
【０００３】
（マイクロフィッシュ添付に対する参照）
該当物なし
【０００４】
（発明の分野）
本発明は、カリウムチャンネルサブユニットをコード化する新規なヒトＤＮＡ配列、このＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質、このタンパク質を組換え細胞において発現させる方法、およびこのサブユニットを含むカリウムチャンネルの活性化剤および阻害剤を特定する方法に関する。
【０００５】
（発明の背景）
電位依存性カリウムチャンネルは、細胞膜の電位の変化に応答して開き、カリウムイオンが膜を通過することを選択的に許す膜貫通孔を形成する。電位依存性カリウムチャンネルは、多くの細胞で細胞膜電位の維持および活動電位の再分極の制御に関与していることが明らかにされている。特に、電位依存性カリウムチャンネルは、ニューロン、筋肉細胞および分泌細胞において、静止膜電位を確立し、活動電位の頻度および持続時間を調節する。脱分極後、電位依存性カリウムチャンネルは開き、カリウムの流出を許し、従って膜の再分極を許す。この挙動により、電位依存性カリウムチャンネルは、様々な疾患に関連する薬物発見に対する重要な標的になっている。その結果、多くの電位依存性カリウムチャンネルが特定され、多くがクローン化されている。それらは、その一次アミノ酸配列、組織特異的な発現パターンによって、および電気生理学的性質および薬理学的性質によって区別される。
【０００６】
多くの電位依存性カリウムチャンネルは、それぞれが６つの膜貫通セグメントを含有する４つの孔形成性の電流運搬αサブユニットの四量体であると考えられている。四量体を構成するαサブユニットは、（ホモ四量体の場合）同じであり得るか、または（ヘテロ四量体の場合）異なり得る。四量体を構成する膜貫通αサブユニットは、αサブユニットの挙動を変化させ得るさらなる細胞質のβサブユニットと、それらの細胞内ドメインを介してときには会合することがある。βサブユニットは、αサブユニットの表面発現を増大させ得るか、またはαサブユニットの生物物理的性質（例えば、電圧依存性または速度論）を変化させ得る。電位依存性カリウムチャンネルの総説については、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、１９９７、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１８：４７４〜４８３；Ｊａｎ＆Ｊａｎ、１９９７、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５０５：２６７〜２８２；Ｃａｔｔｅｒａｌｌ、１９９５、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：４９３〜５３１を参照のこと。カリウムチャンネルβサブユニットの総説については、Ｐｏｎｇｓ他、１９９９、Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６８：３４４〜３５５を参照のこと。
【０００７】
電位依存性カリウムチャンネルのαサブユニットは、無脊椎動物および脊椎動物の分岐に先立つ古代の進化系統を有するようである。４つのサブファミリー（Ｓｈａｋｅｒ、Ｓｈａｂ、ＳｈａｗおよびＳｈａｌ；これらはまた、それぞれ、Ｋｖ１チャンネル、Ｋｖ２チャンネル、Ｋｖ３チャンネルおよびＫｖ４チャンネルとして知られている）が、最初にショウジョウバエで発見されたが、その後、マウスおよびヒトにおいて保存されていることが見出された。これらのサブファミリーはそれぞれが複数のメンバーを含む。それぞれのαサブユニットは、類似する全体的な構造を有する：６個の膜貫通ドメイン（Ｓ１〜Ｓ６）、Ｓ５とＳ６との間に存在する孔形成領域、および細胞内のアミノ末端およびカルボキシ末端。構造における類似性にもかかわらず、これらの４つのサブファミリーは、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞において発現させたとき、独立して機能し、異なる性質を有するチャンネルを生じさせるようである。例えば、Ｓｈａｌチャンネルは一時的な（Ａ型）カリウム電流を流し、ＳｈａｗチャンネルおよびＳｈａｂチャンネルは遅延整流器型電流を流し、Ｓｈａｋｅｒサブファミリーの種々のメンバーはＡ型電流または遅延整流器型電流のいずれかを流す。Ｓｈａｗチャンネルは不活性化を示さず、これに対して、Ｓｈａｂチャンネルおよび遅延整流器型Ｓｈａｋｅｒチャンネルはゆっくり不活性化する。いくつかのＳｈａｋｅｒチャンネルは、チャンネルの内側の口を塞ぐことによって「不活性化ボール」として作用するアミノ末端の細胞質ドメインが存在するために、非常に速く不活性化する。これらのサブファミリーの電圧感受性は、それらのイオン選択性および薬理学的性質が異なるように異なる（Ｓａｌｋｏｆｆ他、１９９２、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５：１６１〜１６６）。
【０００８】
カリウムチャンネルβサブユニットは、ウシの脳からα−デンドロトキシン標識複合体におけるαサブユニットと同時に精製されるポリペプチドとして最初に特定された（Ｓｃｏｔｔ他、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：１６３７〜１６４１）。続いて、哺乳動物のβサブユニットのいくつかのサブタイプが特定された。Ｋｖβ１およびＫｖβ３が、組織特異的な選択的スプライシングによって同じ遺伝子から生じる（Ｅｎｇｌａｎｄ他、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２８５３１〜２８５３４）。２つのＫｖβ２サブユニットが報告されている：Ｋｖβ２．１（ＭｃＣｏｒｍａｃｋ＆ＭｃＣｏｒｍａｃｋ、１９９４、Ｃｅｌｌ、７９：１１３３〜１１３５；ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｕ３３４２９および同ＡＦ０２９７４９）およびＫｖβ２．２（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＦ０４４２５３）。免疫学的研究により、Ｋｖβ１、Ｋｖβ２．１およびＫｖβ２．２は、Ｓｈａｋｅｒ（Ｋｖ１．１、Ｋｖ１．２、Ｋｖ１．３、Ｋｖ１．５、Ｋｖ１．６）αサブユニットおよびＳｈａｌ（Ｋｖ４．２）サブユニットと選択的に相互作用するが、Ｓｈａｂ（Ｋｖ２．１）サブユニットまたはＳｈａｗ（Ｋｖ３．１）サブユニットと相互作用しないことが明らかにされた（Ｎａｋａｈｉｒａ他、１９９６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：７０８４〜７０８９）。別の研究（Ｒｈｏｄｅｓ他、１９９６、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７：８２４６〜８２５８）では、Ｋｖβ１およびＫｖβ２．１が、ラットの脳において、Ｋｖ１．１、Ｋｖ１．２、Ｋｖ１．４、Ｋｖ１．６およびＫｖ２．１のαサブユニットと会合することが見出されたという点で、同一ではないが、類似する結果が報告された。
【０００９】
βサブユニットは、αサブユニットによって形成されるカリウムチャンネルの機能または発現に影響を及ぼし得る。Ｋｖβ１またはＫｖβ３がアフリカツメガエル卵母細胞においていくつかのαサブユニットと同時に発現したとき、αサブユニットはより速い不活性化速度論を示す。Ｋｖβ１はＫｖ１．１αサブユニットの不活性化速度を１００倍以上増大させた；Ｋｖβ３はＫｖ１．４の不活性化速度を４倍〜７倍増大させたが、Ｋｖ１．１に対する作用はなかった（Ｍｏｒａｌｅｓ他、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：６２７２〜６２７７）。ＨＥＫ２９３細胞およびマウスＬ細胞にトランスフェクションされたヒトＫｖ１．５αサブユニットによって運ばれるカリウム電流の差は、Ｌ細胞には内因性のＫｖβ２．１サブユニットが存在するが、ＨＥＫ２９３細胞にはそのようなサブユニットが存在しないためであった（Ｕｅｂｅｌｅ他、１９９６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２４０６〜２４１２）。ヒトＫｖβ２．１は、不活性化性質を調節し、Ｋｖ１．４αサブユニットによって運ばれるカリウム電流の振幅を増大させることが示された（ＭｃＣｏｒｍａｃｋ他、１９９５、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３７０：３２〜３６）。Ｋｖβ２．１およびＫｖ１．２の同時発現は、Ｎ結合型グリコシル化、細胞表面の発現、およびＫｖ１．２αサブユニットの安定性を促進した（Ｓｈｉ他、１９９５、Ｎｅｕｒｏｎ、１６：８４３〜８５２）。
【００１０】
知られているサブユニットに関連する他の新規なカリウムチャンネルβサブユニット、特に、限定された組織発現を示すカリウムチャンネルβサブユニットを発見することは望ましい。そのような新規なサブユニットは、薬物発見に対する注目される標的であり、イオンチャンネルの生物学についてより多くを理解するための有益な研究道具である。
【００１１】
（図面の簡単な説明）
図１Ａから図１Ｃは、Ｋｖβ２．３をコード化するＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。配列番号１の逆相補体が図において下段のＤＮＡ配列として示され、これは配列番号２である。Ｋｖβ２．３タンパク質のアミノ酸配列が示され、これは配列番号３である。ｔａａ停止コドンが配列番号１の１１４７位〜１１４９位に存在する。
【００１２】
図２は、ヒトＫｖβ２．３（配列番号３）、ヒトＫｖβ２．１（配列番号４）およびヒトＫｖβ２．２（配列番号５）のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【００１３】
図３Ａから図３Ｂは、視床の視床沈核におけるＫｖβ２．３発現のインシトゥハイブリダイゼーションによる局在の研究を示す。図３Ａには、Ｋｖβ２．３のアンチセンスプローブを使用したときの結果が示され、図３Ｂには、センスプローブを使用したときの結果が示される。明るい領域の存在は、プローブがハイブリダイゼーションしたことを示す。
【００１４】
図４は、視床の様々な領域におけるＫｖβ２．３発現のインシトゥハイブリダイゼーションによる局在の研究を示す。
【００１５】
図５Ａから図５Ｂは、ヒトＫｖβ２．３ｃＤＮＡの各エキソンの対応するゲノム配列とのアラインメントを示す。示される配列はすべて、配列番号１の部分である。
【００１６】
（発明の概要）
本発明は、カリウムチャンネルβサブユニットＫｖβ２．３をコード化する新規な単離されたヒトＤＮＡ配列に関する。本発明のＤＮＡは、配列番号１として示されるヌクレオチド配列、ならびにそのような配列の一部分、例えば、そのコード配列（配列番号１の１位〜１１４６位）を含む。新規なＤＮＡ配列によってコードされる単離されたＫｖβ２．３タンパク質もまた提供する。本発明のＫｖβ２．３タンパク質は、配列番号３として示されるアミノ酸配列、ならびにヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質と実質的に同じ生物学的活性を保持するそのフラグメントを含む。Ｋｖβ２．３タンパク質を組換えシステムにおいて発現させる方法もまた、Ｋｖβ２．３タンパク質を含むカリウムチャンネルの活性化剤および阻害剤を特定する方法と同様に提供される。
【００１７】
（発明の詳細な説明）
本発明のために、
「他のタンパク質を実質的に含まない」は、他のタンパク質を少なくとも９０％（好ましくは９５％、より好ましくは９９％、さらにより好ましくは９９．９％）含まないことを意味する。従って、他のタンパク質を実質的に含まないヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質調製物は、その全タンパク質の百分率として、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質でないタンパク質を多くても１０％（好ましくは多くても５％、より好ましくは多くても１％、さらにより好ましくは多くても０．１％）含む。所与のヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質調製物が他のタンパク質を実質的に含まないかどうかは、タンパク質の純度を評価する従来の技術によって、例えば、適切な検出法（例えば、銀染色または免疫ブロッティング）と組み合わせたドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）などによって明らかにすることができる。
【００１８】
「他の核酸を実質的に含まない」は、他の核酸を少なくとも９０％（好ましくは９５％、より好ましくは９９％、さらにより好ましくは９９．９％）含まないことを意味する。従って、他の核酸を実質的に含まないヒトＫｖβ２．３サブユニットＤＮＡ調製物は、その全核酸の百分率として、ヒトＫｖβ２．３をコード化しない核酸を多くても１０％（好ましくは多くても５％、より好ましくは多くても１％、さらにより好ましくは多くても０．１％）含む。所与のヒトＫｖβ２．３サブユニットＤＮＡ調製物が他の核酸を実質的に含まないかどうかは、核酸の純度を評価する従来の技術によって、例えば、適切な検出法（例えば、臭化エチジウム染色）と組み合わせたアガロースゲル電気泳動などによって、または配列決定によって明らかにすることができる。
【００１９】
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が別の化学的に類似するアミノ酸残基により置換されることを示す。そのような保存的置換の例には、疎水性残基（イソロイシン、ロイシン、バリンまたはメチオニン）相互の置換；同じ荷電の極性残基相互の置換（例えば、リシンのアルギニンへの置換、アスパラギン酸のグルタミン酸への置換）；芳香族アミノ酸（トリプトファン、チロシンまたはフェニルアラニン）相互の置換がある。
【００２０】
ポリペプチドは、機能的なカリウムチャンネルを構成する複合体が形成されるように、そのポリペプチドが別のカリウムチャンネルサブユニット（１つまたは複数）（例えば、αサブユニットまたは別のＫｖβサブユニット）と組み合わせられ得る場合、「ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質と実質的に同じ生物学的活性」を有する。この場合、ポリペプチドは、（そのような他のサブユニット（１つまたは複数）単独と比較したとき）、Ｋｖβ２．３タンパク質がそのような他のサブユニットにもたらす電気生理学的性質または薬理学的性質と類似する変化した電気生理学的性質または薬理学的性質（例えば、活性化または不活性化の変化した速度論および／または電圧依存性）を複合体にもたらし、ポリペプチドは、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡのような標準的なプログラムにより測定されたとき、配列番号３に対する同一性が少なくとも約５０％（好ましくは７５％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９７％）であるアミノ酸配列を有する。ポリペプチドが組み合わせられ得る他のカリウムチャンネルサブユニットの例には、様々なαサブユニット、例えば、Ｓｈａｋｅｒ（例えば、Ｋｖ１．１、Ｋｖ１．２、Ｋｖ１．３、Ｋｖ１．４、Ｋｖ１．５、Ｋｖ１．６、Ｋｖ１．７、Ｋｖ１．８またはＫｖ１．９）、Ｓｈａｂ（例えば、Ｋｖ２．１、Ｋｖ２．２）、Ｓｈａｗ（例えば、Ｋｖ３．１、Ｋｖ３．２、Ｋｖ３．３またはＫｖ３．４およびすべての関連するスプライス変化体）、およびＳｈａｌ（例えば、Ｋｖ４．１、Ｋｖ４．２またはＫｖ４．３およびすべての関連するスプライス変化体）などがある。
【００２１】
「機能的なカリウムチャンネル」は、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を少なくとも含むか、またはヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質と実質的に同じ生物学的活性を有するポリペプチドを少なくとも含み、好ましくはまた、カリウムチャンネルαサブユニットタンパク質をも少なくとも含む膜貫通タンパク質複合体であって、膜を横断するカリウムイオンまたはルビジウムイオンの移動を選択的に可能にする膜貫通タンパク質複合体を示す。
【００２２】
本発明は、ヒトＫｖβ２．３タンパク質をコード化するＤＮＡの特定およびクローニングに関する。Ｋｖβ２．３をコード化するｃＤＮＡが、ＲＴ−ＰＣＲ法を使用して、Ｋｖβ２ファミリーの他の知られているメンバーに対して相同的な配列を増幅することによってヒトの脳ｍＲＮＡから特定された。ノーザンブロット分析により、ヒトＫｖβ２．３の発現が中枢神経系に限定され、最も強い発現が視床において見出されることが明らかにされた。インシトゥハイブリダイゼーション研究により、主要な視床の核はすべて、変化を受けにくい発現を示すことが明らかにされた。尾状核、被殻および淡蒼球などの脳幹神経節の領域では発現が認められなかった。黒質ではシグナルが認められなかった。外側の主要な視床の核に加えて、強い発現が視床沈核で認められた。図４を参照のこと。下記の表には、発現を示す＋の記号、および発現がないことを示す−の記号を用いて、図４の結果がまとめられている。
【００２３】
【表１】
2005503104.tif 000002
【００２４】
この発現パターンから、ヒトＫｖβ２．３の活性を変化させることは、感覚障害、精神病および診断（例えば、痛み障害、情動障害、精神病障害、摂食障害およびノイローゼ）に関して治療的関連性を有し得ることが示唆される。
【００２５】
視床沈核におけるＫｖβ２．３発現のより詳細な研究が注目された。図３は、Ｋｖβ２．３転写物が視床沈核に存在することを示している。視床の視床沈核は頭頂葉に情報を出しており、視床沈との連絡の喪失は感覚の欠如をもたらすので、視床沈核におけるＫｖβ２．３の発現が認められたことは、Ｋｖβ２．３の作用を調節する薬剤は、様々な感覚欠如を処置するために有用であることを示唆する。
【００２６】
本発明は、他の核酸を実質的に含まない、ヒトＫｖβ２．３サブユニットをコード化するＤＮＡを提供する。本発明はまた、ヒトＫｖβ２．３サブユニットをコード化する単離されたＤＮＡ分子および／または組換えＤＮＡ分子を提供する。本発明は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含む、他の核酸を実質的に含まないＤＮＡ分子を提供する。
【００２７】
本発明には、配列番号１のコード領域を含む単離されたＤＮＡ分子、ならびに配列番号１のコード領域を含む、他の核酸を実質的に含まないＤＮＡ分子が包含される。従って、本発明には、配列番号１の１位〜１１４６位（コード配列）を含む配列を有する単離されたＤＮＡ分子、ならびに配列番号１の１位〜１１４６位（コード配列）を含む配列を有する、他の核酸を実質的に含まないＤＮＡ分子が包含される。
【００２８】
また、配列番号１の１位〜１１４６位を含むヌクレオチド配列を有する組換えＤＮＡ分子も包含される。ヒトＫｖβ２．３サブユニットをコード化する本発明の新規なＤＮＡ配列は、全体または一部を他のＤＮＡ配列（すなわち、ヒトＫｖβ２．３サブユニットが自然の状態では連結されていないＤＮＡ配列）と連結させて、ヒトＫｖβ２．３サブユニットをコード化する「組換えＤＮＡ分子」を形成させることができる。そのような他の配列には、転写または翻訳を制御する様々なＤＮＡ配列、例えば、翻訳開始配列、内部リボソーム進入部位、ＲＮＡポリメラーゼＩＩに対するプロモーター、転写終結配列もしくは翻訳終結配列、エンハンサー配列、微生物における複製を制御する配列、抗生物質抵抗性を付与する配列、またはポリペプチド「標識」（例えば、ポリヒスチジン領域、ＦＬＡＧエピトープもしくはｍｙｃエピトープなど）をコード化する配列などを挙げることができる。本発明の新規なＤＮＡ配列は、プラスミド、コスミド、ウイルスベクター、Ｐ１人工染色体または酵母人工染色体などのベクターに挿入することができる。
【００２９】
図１Ａから図１Ｃおよび図２は、Ｋｖβ２．３タンパク質が、Ｋｖβ２．１またはＫｖβ２．２において見出されない１５アミノ酸の挿入（配列番号３の１６７位〜１８１位）を含むことを示している。この挿入部の配列は、ＧＤＰＦＳＳＳＫＳＲＴＦＩＩＥ（配列番号６）である。この挿入部は、ヒト第１染色体のゲノムＤＮＡの配列において特定された、これまで発見されなかったエキソン（配列番号１の５０２位〜５４６位）によってコードされる。この新しい配列は、Ｋｖβ２遺伝子のオープンリーディングフレームをコード化する第１０エキソンによってコードされる。これらのエキソンのそれぞれとｃＤＮＡ配列とのアラインメントが図５Ａから図５Ｂに示される。
【００３０】
従って、本発明により、ヒトＫｖβ２サブユニットをコード化するＤＮＡ配列が提供される。この場合、ＤＮＡは配列番号１の５０２位〜５４６位の配列を含み、Ｋｖβ２サブユニットは、機能的なカリウムチャンネルが形成されるように、Ｋｖ１．１、Ｋｖ１．２、Ｋｖ１．３、Ｋｖ１．４、Ｋｖ１．５、Ｋｖ１．６、Ｋｖ１．７、Ｋｖ１．８およびＫｖ１．９からなる群から選択される少なくとも１つのヒトカリウムチャンネルαサブユニットに結合する。
【００３１】
本発明には、高ストリンジェントな条件下で配列番号１の逆相補体にハイブリダイゼーションするＤＮＡ配列が包含される。この場合、ハイブリダイゼーションするＤＮＡ配列は、ヒトＫｖβ２サブユニットタンパク質と実質的に同じ生物学的活性を有するポリペプチドをコード化するか、または少なくとも１つの他のカリウムチャンネルサブユニットタンパク質との機能的なカリウムチャンネルを形成し得るポリペプチドをコード化する。例として（限定ではなく）、高ストリンジェントな条件を使用する手法は下記の通りである：ＤＮＡを含有するフィルターの予備ハイブリダイゼーションが、６ＸＳＳＣ、５Ｘデンハルト溶液および１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡからなる緩衝液において６５℃で２時間から一晩行われる。フィルターは、１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡおよび５〜２０Ｘ１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識プローブを含有する予備ハイブリダイゼーション混合物において６５℃で１２時間から４８時間ハイブリダイゼーションされる。フィルターの洗浄が、２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含有する溶液において３７℃で１時間行われる。この後、０．１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおける洗浄が５０℃で４５分間行われ、その後、オートラジオグラフィーが行われる。
【００３２】
高ストリンジェントな条件を使用する他の手法には、５ＸＳＳＣ、５Ｘデンハルト溶液、５０％ホルムアミドにおいて４２℃で１２時間から４８時間行われるハイブリダイゼーション、または０．２ＸＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳにおいて６５℃で３０分間から６０分間行われる洗浄工程のいずれかが含まれる。
【００３３】
高ストリンジェントなハイブリダイゼーションを行うための前記手法において述べられた試薬は、当該技術では十分に知られている。これらの試薬の組成の細部は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）に見出すことができる。前記に加えて、使用され得る高ストリンジェントな他の様々な条件が、当該技術では十分に知られている。
【００３４】
遺伝暗号の縮重により、２つのアミノ酸を除くすべてについて、２つ以上のコードが１つの特定のアミノ酸をコード化するようになる。これにより、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質をコード化する合成ＤＮＡで、合成ＤＮＡのヌクレオチド配列が配列番号１のヌクレオチド配列と著しく異なるヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質をコード化し、しかし依然として配列番号１と同じヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質をコード化する合成ＤＮＡの構築が可能になる。そのような合成ＤＮＡは本発明の範囲に含まれるものとする。
【００３５】
配列番号１の変異型形態は発明の範囲に含まれるものとする。特に、野生型のＫｖβ２．３タンパク質が他のカリウムチャンネルサブユニットと組み合わさることにより形成されるカリウムチャンネルと比較したとき、変化した電圧感受性、電流搬送性質、薬理学的性質または他の性質を有するカリウムチャンネルを、他のカリウムチャンネルサブユニットと一緒になったときに生じさせるタンパク質をコード化する配列番号１の変異型形態は本発明の範囲に含まれる。そのような変異型形態は、ヌクレオチドの欠失、置換または付加を有することによって配列番号１とは異なり得る。
【００３６】
また、本発明の範囲内には、配列番号１に対応する配列を有するＲＮＡ分子が含まれるものとする。配列番号１の逆相補体であるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）またはその一部分もまた本発明の範囲に含まれる。さらに、少数の位置が非天然ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチド（イノシン、メチル−シトシンまたはデア−ザグノシンなど）で置換されている、配列番号１に基づくポリヌクレオチドは本発明の範囲に含まれるものとする。本発明のポリヌクレオチドはまた、非天然型の結合がヌクレオチド間に存在する、配列番号１に基づく配列を含むことができる。そのような非天然型の結合には、例えば、メチルホスホナート、ホスホロチオアート、ホスホロジチオナート、ホスホロアミダイトおよびリン酸エステルを挙げることができる。本発明のポリヌクレオチドはまた、ヌクレオチド間の結合としてデホスホ結合（例えば、シロキサン架橋、カーボナート架橋、カルボキシメチルエステル架橋、アセトアミダート架橋、カルバマート架橋およびチオエーテル架橋）を有する、配列番号１に基づく配列を含むことができる。存在し得る他のヌクレオチド間の結合には、Ｎ−ビニル結合、メタクリルオキシエチル結合、メタクリルアミド結合またはエチレンイミン結合が含まれる。配列番号１に基づくペプチド核酸もまた本発明に含まれる。
【００３７】
本発明の別の局面には、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質をコード化するＤＮＡ配列を含有し、かつ／または発現するように操作された宿主細胞が含まれる。そのような組換え宿主細胞は、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を産生させるために好適な条件のもとで培養することができる。ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質をコード化するＤＮＡを含有する発現ベクターを、組換え宿主細胞におけるヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質の発現のために使用することができる。組換え宿主細胞は原核生物性または真核生物性であり得るが、これらには、大腸菌などの細菌、酵母などの菌類、哺乳動物細胞（ヒト起源、ウシ起源、ブタ起源、サル起源および齧歯類起源の細胞株を含むが、これらに限定されない）、アフリカツメガエル卵母細胞などの両生類細胞、および昆虫細胞（ショウジョウバエおよびカイコに由来する細胞株を含むが、これらに限定されない）が含まれるが、これらに限定されない。ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質の組換え発現に好適であり、一般に入手可能な細胞および細胞株には、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＴＫ−）（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１．３）、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１．２）、２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５７３）、Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ８６）、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１７１）、ＣＰＡＥ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２０９）、Ｓａｏｓ−２（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−８５）、ＡＲＰＥ−１９ヒト網膜色素上皮（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２３０９）、アフリカツメガエル黒色素胞およびアフリカツメガエル卵母細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【００３８】
様々な哺乳動物発現ベクターを、組換えヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を哺乳動物細胞において発現させるために使用することができる。好適である市販の哺乳動物発現ベクターには、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐｃＤＮＡＩおよびｐｃＤＮＡＩａｍｐ、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＲ３．１（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７１９８）、ｐＩＺＤ３５（ＡＴＣＣ３７５６５）ならびにｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）が含まれるが、これらに限定されない。別の好適なベクターには、ＰＴ７ＴＳ卵母細胞発現ベクターがある。
【００３９】
組換え細胞における発現の後、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質は、他のタンパク質を実質的に含まないレベルに、従来の技術によって精製することができる。使用され得る技術には、硫酸アンモニウム沈殿、疎水性相互作用または親水性相互作用のクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、調製用ゲル電気泳動およびアルコール沈殿が含まれる。時には、タンパク質の変性工程および／またはリフォールディング工程をそのような技術に加えて用いることは好都合であり得る。
【００４０】
ある種の電位依存性カリウムチャンネルサブユニットは、高レベルで適正に発現し、かつ膜に挿入されるためには、他の電位依存性カリウムチャンネルサブユニットの発現を必要とすることが見出されている。例えば、ＫＣＮＱ３の同時発現は、アフリカツメガエル卵母細胞におけるＫＣＮＱ２の発現を高めるようである（Ｗａｎｇ他、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８２：１８９０〜１８９３）。また、いくつかの電位依存性カリウムチャンネルＫｖ１αサブユニットの発現は、他の関連するαサブユニットまたはＫｖβ２サブユニットを必要とする（Ｓｈｉ他、１９９５、Ｎｅｕｒｏｎ、１６：８４３〜８５２）。従って、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質の組換え発現は、ある種の状況下では、他のカリウムチャンネルタンパク質の同時発現から利益を受けることができる。また、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質の同時発現は、他のカリウムチャンネルサブユニットタンパク質の発現を増大させることがある。従って、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質および他のカリウムチャンネルタンパク質の同時発現は本発明の範囲に含まれるものとする。
【００４１】
そのような同時発現は、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質をコード化する発現ベクターを、別のカリウムチャンネルサブユニットタンパク質を自然の状態で発現する細胞にトランスフェクションすることによって達成することができる。あるいは、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質をコード化する発現ベクターを、別のカリウムチャンネルサブユニットタンパク質をコード化する発現ベクターが同様にトランスフェクションされている細胞にトランスフェクションすることができる。好ましくは、そのような細胞は、他のカリウムチャンネルサブユニットタンパク質を自然の状態で発現しない。好ましい実施形態において、そのような他のカリウムチャンネルサブユニットタンパク質はカリウムチャンネルαサブユニットである。
【００４２】
本発明には、他のタンパク質を実質的に含まないヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質が包含される。全長のヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質のアミノ酸配列が配列番号３に示される。従って、本発明には、配列番号３のアミノ酸配列を有する、他のタンパク質を実質的に含まないヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質が包含される。本発明にはまた、配列番号３のアミノ酸配列を有する単離されたヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質が包含される。
【００４３】
ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質の変異型形態は本発明の範囲に含まれるものとする。特に、他のカリウムチャンネルサブユニットと一緒になったとき、変化した電気生理学的性質または薬理学的性質を有するカリウムチャンネルを生じさせる配列番号３の変異型形態が本発明の範囲に含まれる。ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質の変異型形態は、配列番号３と比較したとき、アミノ酸の置換、欠失または付加を含有する。
【００４４】
多くのタンパク質と同様に、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質のアミノ酸の多くを修飾し、元のタンパク質の場合と実質的に同じ生物学的活性を依然として保持させることが可能である。従って、本発明には、アミノ酸の欠失、付加または置換を有するが、天然に存在するヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質と実質的に同じ生物学的活性を依然として保持する修飾されたヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質が包含される。一アミノ酸の置換は、通常、タンパク質の生物学的活性を変化させないことが一般には受け入れられている（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ（Ｗａｔｓｏｎ他、１９８７、第４版、Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．）、２２６頁；Ｃｕｎｎｉｇｈａｍ＆Ｗｅｌｌｓ、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１０８１〜１０８５を参照のこと）。従って、本発明には、１個のアミノ酸置換が配列番号３において行われているポリペプチドで、天然に存在するヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質と実質的に同じ生物学的活性を依然として保持するポリペプチドが包含される。本発明にはまた、２つ以上のアミノ酸置換が配列番号３において行われているポリペプチドで、天然に存在するヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質と実質的に同じ生物学的活性を依然として保持するポリペプチドが包含される。特に、本発明には、上記に記載された置換が保存的置換である実施形態が包含される。
【００４５】
本発明のヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質は、様々な翻訳後修飾、例えば、共有結合した炭水化物、リン酸化、ミリストイル化、パルミトイル化などを含むことができる。
【００４６】
本発明にはまた、キメラなヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質が包含される。キメラなヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質は、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質に由来しないポリペプチド配列に融合されたヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質の少なくとも一部分の連続したポリペプチド配列からなる。
【００４７】
本発明にはまた、単離されたヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質および単離されたサブユニットをコード化するＤＮＡが包含される。用語「単離された」の使用は、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質またはＤＮＡが、その通常の細胞環境から取り出されていることを示す。従って、単離されたヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質は無細胞溶液の状態であってもよく、またはヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質が自然の状態で存在する環境とは異なる細胞環境に置かれていてもよい。単離されたの用語は、単離されたヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質が、（単離されたの意味の１つではあるが）存在する唯一のタンパク質であることを示すのではなく、むしろ、単離されたヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質が、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質と自然の状態で会合する非アミノ酸物質（例えば、核酸、脂質、炭水化物）を少なくとも９５％含まないことを意味する。他のタンパク質を少なくとも９０％（好ましくは９５％、さらにより好ましくは９５％）含まないヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質もまた、単離されたヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質である。
【００４８】
いくつかのカリウムチャンネルサブユニットは相互作用して、ヘテロマー複合体を形成し得ることが知られている。例えば、ＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３は組み合わされて、ヘテロマーのカリウムチャンネルを形成することができる（Ｗａｎｇ他、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８２：１８９０〜１８９３）。従って、本発明のヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質もまた、他のタンパク質とのヘテロマー構造で、機能的なカリウムチャンネルを構成するヘテロマー構造を形成し得る可能性が高い考えられる。従って、本発明には、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含むそのようなヘテロマーが包含される。好ましいヘテロマーは、本発明のヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質がヒトカリウムチャンネルαサブユニットおよび／またはＫｖβサブユニットとのヘテロマーを形成するヘテロマーである。
【００４９】
ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質をコード化するＤＮＡは、この分野で十分に知られている方法によって得ることができる。例えば、全長のヒトＫｖβ２．３タンパク質をコード化するｃＤＮＡフラグメントを、好適なプライマー対を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することによってヒト脳ｃＤＮＡライブラリーから単離することができる。そのようなプライマー対は、配列番号１として図１Ａから図１Ｃに示される、ヒトＫｖβ２．３タンパク質をコード化するＤＮＡ配列に基づいて選択することができる。好適なプライマーは、例えば、
【００５０】
【化１】
2005503104.tif 000003
である。
【００５１】
上記のプライマーは単なる例示であることが意味される。当業者は、他の好適なプライマーを配列番号１に基づいて容易に設計することができる。そのようなプライマーは、この分野で十分に知られているオリゴヌクレオチド合成法によって作製することができる。
【００５２】
ＰＣＲ反応は、ＡｍｐｌｉＴａｑ、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＧｏｌｄまたはＶｅｎｔポリメラーゼ（これらに限定されない）を含む様々な熱安定性酵素を用いて行うことができる。ＡｍｐｌｉＴａｑの場合、反応は、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、２．０ｍＭのＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、５０ｍＭのＫＣｌ、０．２μＭの各プライマー、１０ｎｇのＤＮＡテンプレート、０．０５ユニット／μｌのＡｍｐｌｉＴａｑにおいて行うことができる。反応物は９５℃で３分間加熱され、その後、９５℃で２０秒間、６２℃で２０秒間、７２℃で３分間（これらに限定されない）を含む好適なサイクル処理パラメーターを使用して３５回のサイクル処理が行われる。これらの条件に加えて、様々な好適なＰＣＲプロトコルを、ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（編者：Ｃ．Ｗ．ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＧ．Ｓ．Ｄｖｅｋｓｌｅｒ、１９９５、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）またはＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｍｉｃｈａｅｌ他編、１９９０、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）に見出すことができる。
【００５３】
本発明のＫｖβ２．３チャンネルサブユニットは他のカリウムチャンネルβサブユニットに対する相同性（図２を参照のこと）を有するので、所望するＫｖβ２．３サブユニットが実際に得られたことを確認するために、本明細書中に記載される方法により得られたＰＣＲフラグメントを配列決定することが望ましい。特に、ＰＣＲフラグメントが、Ｋｖβ２．３ではなく、Ｋｖβ２．１またはＫｖβ２．２をコード化しないことを確保することが望ましい。
【００５４】
これらの方法によって、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質をコード化するｃＤＮＡを得ることができる。このｃＤＮＡは、好適なクローニングベクターまたは発現ベクター（例えば、哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ））にサブクローニングすることができる。その後、このサブユニットまたはその一部をコード化する発現ベクターを好適な宿主細胞にトランスフェクションして、宿主細胞を好適な条件下で生育させることによって、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を産生させることができる。その後、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を、この分野で十分に知られている方法によって単離することができる。
【００５５】
上記に記載されたＰＣＲ法の代わりとして、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質をコード化するｃＤＮＡクローンを、プローブとしてヒトＫｖβ２．３サブユニットに特異的なオリゴヌクレオチドを使用し、オリゴヌクレオチドプローブを用いてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることに関してこの分野で十分に知られている方法を使用してｃＤＮＡライブラリーから単離することができる。そのような方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．Ｍ．他（編）、１９８５、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｒｃｈ（ＭＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕ．Ｋ．、第Ｉ巻、第ＩＩ巻）に記載される。ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質に特異的であり、かつｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用され得るオリゴヌクレオチドは、配列番号１に基づいて、特に、配列番号１のヌクレオチド５０２〜５４６に基づいて容易に設計することができる。そのようなオリゴヌクレオチドは、この分野で十分に知られている方法によって合成することができる。
【００５６】
ヒトＫｖβ２．３サブユニットの遺伝子を含有するゲノムクローンを、ヒトゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲによって、またはＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）から得られる市販のＰＡＣライブラリーもしくはＢＡＣライブラリーから得ることができる。あるいは、ゲノムライブラリーを、例えば、Ｐ１人工染色体ベクターにおいて調製することができ、そのようなゲノムライブラリーから、ヒトＫｖβ２．３サブユニットの遺伝子を含有するゲノムクローンを、本明細書中に開示されるヒトＫｖβ２．３サブユニットのＤＮＡ配列に基づくプローブを使用して単離することができる。そのようなライブラリーの調製方法は当該技術では知られている（例えば、Ｉｏａｎｎｏｕ他、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．６：８４〜８９を参照のこと）。
【００５７】
本発明の新規なＤＮＡ配列は様々な診断方法において使用することができる。本発明は、患者がヒトＫｖβ２．３サブユニットの遺伝子に変異を有するかどうかを明らかにするための診断方法を提供する。広い意味で、そのような方法は、患者に由来するヒトＫｖβ２．３サブユニットの遺伝子内または遺伝子付近の領域のＤＮＡ配列を決定すること、およびその配列を、非罹患者（すなわち、診断されている状態を有しない人）に由来するヒトＫｖβ２．３サブユニットの遺伝子の対応する領域から得られる配列と比較することを含む。この場合、患者由来の遺伝子のＤＮＡ配列と非罹患者由来の遺伝子のＤＮＡ配列との配列の違いにより、ヒトＫｖβ２．３サブユニットの遺伝子における変異を患者が有することが示される。
【００５８】
本発明はまた、ヒトＫｖβ２．３サブユニットの変異型形態を有する患者を特定するために、またはヒトＫｖβ２．３サブユニットをコード化するＲＮＡの発現レベルを明らかにするために、またはヒトＫｖβ２．３サブユニットに相同的な遺伝子を他の種から単離するために、診断方法において使用することができる、配列番号１に基づくオリゴヌクレオチドプローブを提供する。特に、本発明には、配列番号１の少なくとも約１０個または１５個または１８個の連続したヌクレオチドを含むＤＮＡオリゴヌクレオチドが包含される。この場合、オリゴヌクレオチドプローブは、前記の少なくとも約１０個または１５個または１８個の連続したヌクレオチド以外に、配列番号１に由来する５個を越える連続したヌクレオチドの領域を含まない。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブは、配列番号１の５０２位〜５４６位のヌクレオチド配列の少なくとも一部（好ましくは、少なくとも１０個の連続したオリゴヌクレオチド）を含む。オリゴヌクレオチドは他の核酸を実質的に含まない。また、本発明により、対応するＲＮＡオリゴヌクレオチドも提供される。ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドはキットに含めることができる。
【００５９】
本発明は、様々な細胞タイプにおけるヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質の組換え発現を可能にする。そのような組換え発現により、このタンパク質の研究が可能になり、その結果、様々な疾患におけるその生化学的活性およびその役割が解明され得るようになる。
【００６０】
本発明はまた、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルの生物学的活性を測定するアッセイの開発を可能にする。組換え発現されたヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を使用するそのようなアッセイが特に注目される。そのようなアッセイは、化合物のライブラリーまたは化合物の他の供給源をスクリーニングして、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルの活性の活性化剤または阻害剤である化合物を特定するために使用することができる。そのような特定された化合物は、カリウムチャンネルの活性を増強または抑制することが有益である疾患を有する患者を処置するために使用され得る医薬品を開発するための「リード化合物」として役立ち得る。
【００６１】
上記に記載されるアッセイの様々な様式において、変異型のヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルが使用され、変異型カリウムチャンネルの活性の阻害剤または活性化剤が特定される。好ましくは、これらの阻害剤または活性化剤は、変異型のＫｖβ２．３を含有するカリウムチャンネルに影響を及ぼすのと同じように、野生型のＫｖβ２．３を含有するカリウムチャンネルに影響を及ぼさない。
【００６２】
ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を組換え発現するための好適な細胞株は、内因性のカリウムチャンネルを発現しない細胞株である（例えば、ＣＶ−１、ＮＩＨ−３Ｔ３、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＯＳ−７）。そのような細胞株は、カリウムチャンネルを通過し得るイオンの８６Ｒｂを負荷することができる。８６Ｒｂが負荷された細胞は、物質のコレクション（例えば、コンビナトリアルライブラリー、天然産物、医薬化学によって作製されたリード化合物のアナログ）、および確認された８６Ｒｂ流出を変化させることができるそのような物質にさらすことができる。そのような物質は、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルの活性化剤または阻害剤であると考えられる。
【００６３】
ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルの活性化剤または阻害剤は、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルに結合し得る物質であると考えられる。従って、１つのタイプのアッセイにより、物質コレクションの１つ以上がそのような結合を可能にするかどうかが明らかにされる。
【００６４】
従って、本発明により、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルに結合する物質を特定するための方法が提供される。この方法は、
（ａ）ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルを発現する細胞を提供すること、
（ｂ）細胞を物質にさらすこと、
（ｃ）細胞に対する物質の結合量を測定すること、
（ｄ）工程（ｃ）における結合量をコントロール細胞に対する物質の結合量と比較すること（この場合、コントロール細胞は、コントロール細胞がヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を発現しないことを除いて、工程（ａ）の細胞と実質的に同一である）、を含む；
この場合、工程（ｃ）における結合量が、コントロール細胞に対する物質の結合量よりも大きい場合、その物質は、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルに結合する。
【００６５】
工程（ａ）の細胞と実質的に同一であるコントロール細胞の例には、工程（ａ）のヒトＫｖβ２．３タンパク質を含有するカリウムチャンネルを発現する細胞を得るためにＫｖβ２．３タンパク質をコード化する発現ベクターでトランスフェクションされている元の細胞株がある。
【００６６】
このアッセイの別の型では、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルに結合することが既知の化合物が使用される。新しい結合物質が、これらの既知の化合物が結合することを増強または阻止するその能力によって特定される。このような能力を有する物質はそれ自体、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルの阻害剤または活性化剤であると考えられる。
【００６７】
従って、本発明には、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルと結合する物質、従って、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルの阻害剤または活性化剤であると考えられる物質を特定する方法が包含される。この方法は、
（ａ）ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルを発現する細胞を提供すること、
（ｂ）ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルに結合することが知られていない物質の存在下および非存在下で、細胞を、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルに結合することが既知の化合物にさらすこと、
（ｃ）物質の存在下および非存在下における細胞に対する化合物の結合量を測定すること、を含み、
この場合、物質の存在下における化合物の結合量が、物質の非存在下における結合量と異なる場合、その物質は、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルと結合し、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルの阻害剤または活性化剤であると考えられる。
【００６８】
一般に、そのような既知の化合物は、カリウムチャンネルに対するその結合の測定を容易にするために、（例えば、放射能により、酵素的に、蛍光的に、免疫学的に）標識される。
【００６９】
上記に記載された方法における用語「化合物」および頭語「物質」の使用は、単なる区別のためだけである。化合物および物質が異なる化学的クラスに属さなければならないことを示すことを意味していない。例えば、化合物および物質はともに、医薬品として典型的に使用されるタイプの低分子量の有機化合物であり得る。
【００７０】
本明細書中に記載される結合アッセイにおいて、１つの可能性ではあるが、特定された物質は、Ｋｖβ２．３サブユニットに対して直接的に結合する必要はない。特定された物質はまた、カリウムチャンネルの他のサブユニット（例えば、αサブユニット）に結合することができる。そのような場合、そのようなチャンネルがＫｖβ２．３サブユニットを含有しないとき、物質がカリウムチャンネルに結合するかどうかを明らかにするためのコントロール実験を行うことは注目され得る。これは、細胞が、Ｋｖβ２．３をコード化する発現ベクターでトランスフェクションされているので、Ｋｖβ２．３を発現する場合に行うことができる。その場合、適切なコントロール細胞は、Ｋｖβ２．３をコード化するこの発現ベクターによってトランスフェクションされていないが、それ以外のサブユニット、すなわち、カリウムチャンネルのαサブユニットを発現する元の細胞である。そのような場合、Ｋｖβ２．３サブユニットはαサブユニットの立体配座的変化を誘導し、その結果、αサブユニットがこの誘導された立体配座状態にあるとき、物質がαサブユニットと結合するようになり、しかし、そうでないときには結合しないと考えられる。
【００７１】
物質が上記の方法によって特定されると、その物質は、それが阻害剤または活性化剤であるかどうかを明らかにするために、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルの生物学的活性に対する物質の作用を（存在する場合には）測定する様々な試験で、例えば、本明細書中に記載される試験などでアッセイすることができる。
【００７２】
特定の実施形態において、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルと結合することが既知の化合物は、α−デンドロトキシン、カリブドキシン、イベリオトキシン、マルガトキシン、マスト細胞脱顆粒ペプチド、ハナトキシン、ホンゴトキシン、ノキシウストキシンおよびコレオリドからなる群から選択される。
【００７３】
本発明には、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルの活性化剤または阻害剤を特定する方法が包含される。この方法は、
（ａ）組換え発現したヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質または変異型ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質が他のカリウムチャンネルサブユニットタンパク質との機能的なカリウムチャンネルに取り込まれるように宿主細胞においてヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質または変異型ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を組換え発現させること、
（ｂ）工程（ａ）の機能的なカリウムチャンネルの生物学的活性を物質の存在下および非存在下で測定すること、を含み、
この場合、物質の非存在下と比較したとき、物質の存在下における工程（ａ）の機能的なカリウムチャンネルの生物学的活性の変化により、その物質が、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルの活性化剤または阻害剤であることが示される。
【００７４】
上記に記載される方法によって特定される物質は、ヒトＫｖβ２．３サブユニットを含有しないカリウムチャンネルの生物学的活性に影響を及ぼさないことが好ましい。これは、好適なコントロールを操作することによって、例えば、宿主細胞が、Ｋｖβ２．３を組換え発現するようにＫｖβ２．３でトランスフェクションされる前に宿主細胞を用いたアッセイを実施することによって明らかにすることができる。コントロール細胞はまた、Ｋｖβ２．３以外のカリウムチャンネルβサブユニットでトランスフェクションされた細胞であり得る。
【００７５】
カリウムチャンネルの他のサブユニット（例えば、αサブユニットなど）を組換え発現することは好都合であり得る。あるいは、そのような他のサブユニットを内因性に発現する宿主細胞を使用することは好都合であり得る。
【００７６】
特定の実施形態において、生物学的活性は、電位依存性カリウム電流の産生もしくは調節、または８６Ｒｂの流出である。「調節」により、例えば、ゲート開閉電圧、活性化または非活性化または不活性化の速度論、テイル電流、イオン選択性などの電流の電気生理学的特徴の変化が意味される。
【００７７】
好ましい宿主細胞はアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞である。特定の実施形態において、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質をコード化するベクターが、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質の発現を卵母細胞において生じさせるためにアフリカツメガエルの卵母細胞に移される。あるいは、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質をコード化するＲＮＡをインビトロで調製して、卵母細胞内に注入することができ、これによってもまた、卵母細胞におけるヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質の発現がもたらされる。ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を卵母細胞において発現させ、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質および他のカリウムチャンネルサブユニット（そのような他のサブユニットもまた卵母細胞に移すことができる）を含有するカリウムチャンネルを形成させた後、膜電流が、トランスメンブランポテンシャルを変化させた後に測定される。膜電流の変化は、カリウムチャンネルが開くか、または閉じ、これにより、それぞれ、カリウムイオンの流れが許されたとき、または阻害されたときに観測される。卵母細胞での類似する研究が、ＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３のカリウムチャンネルについて、Ｗａｎｇ他、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８２：１８９０〜１８９３に報告され、ｍｉｎＫ含有チャンネルについて、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ＆Ｍｉｌｌｅｒ、１９９１、Ｎｅｕｒｏｎ、７：４０３〜４０８によって報告された。これらの参考文献およびそれらに引用される参考文献は、そのような研究を行う方法に関して参考のために考慮することができる。
【００７８】
ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルの阻害剤は、物質または物質のコレクションに卵母細胞をさらし、物質が、物質の非存在下で観測された膜電流を遮断し得るか、または減少させ得るかどうかを明らかにすることによって特定することができる。
【００７９】
従って、本発明により、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルの阻害剤を特定する方法が提供される。この方法は、
（ａ）ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルが形成されるようにアフリカツメガエル卵母細胞においてヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を発現させること、
（ｂ）卵母細胞のトランスメンブランポテンシャルを物質の存在下および非存在下で変化させること、
（ｃ）工程（ｂ）の後の膜カリウム電流を測定すること、を含み、
この場合、工程（ｃ）で測定される膜カリウム電流が、物質の存在下よりも、物質の非存在下で大きい場合、その物質は、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルの阻害剤である。
【００８０】
アフリカツメガエル卵母細胞が上記の方法における使用に好ましいが、他のタイプの真核生物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞）もまた使用することができる。
【００８１】
本発明にはまた、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルの活性化剤および阻害剤を特定するためのアッセイで、第１の蛍光色素と第２の蛍光色素との間における蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）に基づくアッセイが包含される。この場合、第１の色素は、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルを発現する細胞の形質膜の一方の側（一般には外側）に結合し、第２の色素は、膜電位の変化に応答して膜の一方の面から反対側の面に自由に移動する。いくつかの実施形態において、第１の色素は細胞の形質膜に対して不透過性であり、形質膜の細胞外表面に主に結合する。第２の色素は形質膜内に捕捉されるが、膜内を自由に拡散する。膜の正常（すなわち、負）の静止電位において、第２の色素は形質膜の細胞外面の内側表面に主に結合し、従って、第２の色素は第１の色素の非常に近いところに置かれる。このように近くに接近することにより、２つの色素間に大きい量のＦＲＥＴの発生が可能になる。膜が脱分極した後、第２の色素は、膜の細胞外面から細胞内面に移動し、従って色素間の距離が大きくなる。この増大した距離は、第１の色素に由来する蛍光放射の対応する増大、および第２の色素に由来する蛍光放射の対応する減少を伴うＦＲＥＴの減少をもたらす。このようにして、２つの色素間のＦＲＥＴ量を使用して、膜の脱分極状態を測定することができる。この技術の説明については、Ｇｏｎｚａｌｅｚ＆Ｔｓｉｅｎ、１９９７、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ、４：２６９〜２７７を参照のこと。Ｇｏｎｚａｌｅｚ＆Ｔｓｉｅｎ、１９９５、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．６９：１２７２〜１２８０、および米国特許第５，６６１，０３５号もまた参照のこと。
【００８２】
いくつかの実施形態において、第１の色素は、蛍光ドナーとして作用する蛍光性レクチンまたは蛍光性リン脂質である。そのような第１の色素の例には、クマリン標識されたホスファチジルエタノールアミン（例えば、Ｎ−（６−クロロ−７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボキサミドアセチル）−ジミリストイルホスファチジルエタノールアミンまたはＮ−（７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾル−４−イル）−ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン）；蛍光標識されたレクチン（例えば、蛍光標識されたコムギ胚芽凝集素）がある。いくつかの実施形態において、第２の色素は、蛍光アクセプターとして作用するオキソノールである。そのような第２の色素の例には、ビス（１，３−ジアルキル−２−チオバルビツラート）トリメチンオキソノール（例えば、ビス（１，３−ジヘキシル−２−チオバルビツラート）トリメチンオキソノール）またはペンタメチンオキソノールアナログ（例えば、ビス（１，３−ジヘキシル−２−チオバルビツラート）ペンタメチンオキソノールもしくはビス（１，３−ジブチル−２−チオバルビツラート）ペンタメチンオキソノール）がある。本発明における使用に好適な様々な色素を合成する方法については、Ｇｏｎｚａｌｅｚ＆Ｔｓｉｅｎ、１９９７、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ、４：２６９〜２７７を参照のこと。いくつかの実施形態において、アッセイは、一重項酸素による光力学的損傷を軽減するために、天然カロテノイド（例えば、アスタキサンチン）を含むことができる。
【００８３】
上記に記載されたアッセイは、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルの活性化剤および阻害剤を発見するために利用することができる。そのようなアッセイでは、一般に、例えば、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質および他のカリウムチャンネルサブユニットをコード化する発現ベクターを用いたトランスフェクションによって、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルを発現する細胞が用いられる。そのような細胞において、膜電位の増大（すなわち、脱分極）により、カリウムチャンネルが開き得る。これはカリウムの流出を生じさせ、この結果、脱分極をうち消す。すなわち、細胞は再分極することになる。ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルの阻害剤の存在は、この再分極を妨げるか、または減少させる。従って、膜電位は、阻害剤の存在下では、より正側になることになる。カリウムチャンネルの活性化剤はこのチャンネルを開けさせ、従って、膜電位を過分極させることになる。Ｋｖβ２．３タンパク質を含有するカリウムチャンネルの阻害剤およびアゴニストによって引き起こされる膜電位の変化（脱分極および過分極）を、上記に記載されたＦＲＥＴを使用するアッセイによってモニターすることができる。
【００８４】
従って、本発明により、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルの活性化剤を特定する方法が提供される。この方法は、
（ａ）下記：
（１）ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルが細胞内で形成されるように細胞におけるヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質の発現を行わせる発現ベクター、
（２）細胞の形質膜の外側に結合する第１の蛍光色素、および
（３）膜電位の変化に応答して細胞の形質膜の一方の面から反対側の面に自由に移動する第２の蛍光色素、を含む試験細胞を提供すること、
（ｂ）試験細胞を物質にさらすこと、
（ｃ）物質にさらされた試験細胞における蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）量を測定すること、
（ｄ）物質にさらされた試験細胞により示されるＦＲＥＴ量を、コントロール細胞により示されるＦＲＥＴ量と比較すること、を含み、
この場合、試験細胞により示されるＦＲＥＴ量が、コントロール細胞により示されるＦＲＥＴ量よりも大きい場合、その物質は、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルの活性化剤であり、
この場合、コントロール細胞は、（１）（ａ）の（１）から（３）に示される項目の少なくとも１つを含まないことを除いて試験細胞と本質的に同じであるが、物質にさらされた細胞、または（２）物質にさらされなかった試験細胞のいずれかである。
【００８５】
本発明によりまた、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルの阻害剤を特定する方法が提供される。この方法は、
（ａ）下記：
（１）ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルが細胞内で形成されるように細胞におけるヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質の発現を行わせる発現ベクター、
（２）細胞の形質膜の外側に結合する第１の蛍光色素、および
（３）膜電位の変化に応答して細胞の形質膜の一方の面から反対側の面に自由に移動する第２の蛍光色素、を含む試験細胞を提供すること、
（ｂ）ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルの阻害剤であることが疑われる物質に試験細胞をさらすこと、
（ｃ）物質にさらされた試験細胞における蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）量を測定すること、
（ｄ）物質にさらされた試験細胞により示されるＦＲＥＴ量を、コントロール細胞により示されるＦＲＥＴ量と比較すること、を含み、
この場合、試験細胞により示されるＦＲＥＴ量が、コントロール細胞により示されるＦＲＥＴ量よりも小さい場合、その物質は、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルの阻害剤であり、
この場合、コントロール細胞は、（１）（ａ）の（１）から（３）に示される項目の少なくとも１つを含まないことを除いて試験細胞と本質的に同じであるが、物質にさらされた細胞、または（２）物質にさらされなかった試験細胞のいずれかである。
【００８６】
上記に記載されたアッセイの変形において、細胞の膜電位を自身で定常状態に到達させる代わりに、膜電位は、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルが開く電位に人為的に設定される。これは、例えば、知られている方法で外側のＫ＋濃度を変化させること（例えば、増大させた外側のＫ＋濃度）によって行うことができる。ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有する開いたカリウムチャンネルを有するそのような細胞が阻害剤にされた場合、カリウムチャンネルは閉じ、細胞の膜電位は脱分極する。この脱分極は、ＦＲＥＴの減少として観測することができる。
【００８７】
従って、本発明により、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルの阻害剤を特定する方法が提供される。この方法は、
（ａ）下記：
（１）ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルが細胞内で形成されるように細胞におけるヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質の発現を行わせる発現ベクター、
（２）細胞の形質膜の外側に結合する第１の蛍光色素、および
（３）膜電位の変化に応答して細胞の形質膜の一方の面から反対側の面に自由に移動する第２の蛍光色素、を含む細胞を提供すること、
（ｂ）ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルにより形成されるイオンチャンネルが開くように細胞の膜電位を調節すること、
（ｃ）試験細胞における蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）量を測定すること、
（ｄ）細胞を物質にさらすこと、
（ｅ）物質にさらされた試験細胞におけるＦＲＥＴ量を測定すること、
を含み、
この場合、物質にさらされた試験細胞により示されるＦＲＥＴ量が、物質にさらされなかった細胞により示されるＦＲＥＴ量よりも小さい場合、その物質は、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルの阻害剤である。
【００８８】
上記に記載される方法の特定の実施形態において、工程（ａ）の細胞は２つに分けられ、一方が、工程（ｅ）の測定値を生じさせるために物質にさらされ、もう一方は、工程（ｃ）の測定値を生じさせるために物質にさらされない。
【００８９】
上記に記載される方法の特定の実施形態において、発現ベクターが試験細胞にトランスフェクションされる。
【００９０】
上記に記載される方法の特定の実施形態において、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する。上記に記載される方法の特定の実施形態において、発現ベクターは、配列番号１の１位〜１１４６位を含む。
【００９１】
上記に記載される方法の特定の実施形態において、第１の蛍光色素は、蛍光性レクチン；蛍光性リン脂質；クマリン標識されたホスファチジルエタノールアミン；Ｎ−（６−クロロ−７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボキサミドアセチル）−ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン；Ｎ−（７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾル−４−イル）ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン；および蛍光標識されたコムギ胚芽凝集素からなる群から選択される。
【００９２】
上記に記載される方法の特定の実施形態において、第２の蛍光色素は、蛍光アクセプターとして作用するオキソノール；ビス（１，３−ジアルキル−２−チオバルビツラート）トリメチンオキソノール；ビス（１，３−ジヘキシル−２−チオバルビツラート）トリメチンオキソノール；ビス（１，３−ジアルキル−２−チオバルビツラート）クアトラメチンオキソノール；ビス（１，３−ジアルキル−２−チオバルビツラート）ペンタメチンオキソノール；ビス（１，３−ジヘキシル−２−チオバルビツラート）ペンタメチンオキソノール；ビス（１，３−ジブチル−２−チオバルビツラート）ペンタメチンオキソノール；およびビス（１，３−ジアルキル−２−チオバルビツラート）ヘキサメチンオキソノールからなる群から選択される。
【００９３】
上記に記載される方法の特定の実施形態において、細胞は真核生物細胞である。別の実施形態において、細胞は哺乳動物細胞である。他の実施形態において、細胞は、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＴＫ−）（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１．３）、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１．２）、２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５７３）、Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ８６）、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１７１）、アフリカツメガエル黒色素胞またはアフリカツメガエル卵母細胞である。
【００９４】
上記に記載される方法の特定の実施形態において、コントロール細胞は項目（ａ）（１）を含まないが、項目（ａ）（２）および項目（ａ）（３）を含む。
【００９５】
ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルの活性化剤または阻害剤を特定するアッセイにおいて、ヒトＫｖβ２．３サブユニットに加えて別のカリウムチャンネルサブユニットを同時に発現させることは好都合であり得る。特に、αサブユニットなどのカリウムチャンネルサブユニットを同時に発現させることが好都合であり得る。好ましくは、これは、そのような他のサブユニットをコード化する発現ベクターを細胞に同時トランスフェクションすることによって行われる。
【００９６】
上記に記載される方法は、「１つの」物質が、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルの活性化剤または阻害剤であるかどうかを試験することに明確に関しているが、そのような方法は、物質のコレクション（例えば、コンビナトリアルライブラリー、ファージディスプレーライブラリー、天然産物のコレクション）を試験して、そのようなコレクションのメンバーの複数が、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルの活性化剤または阻害剤であるかどうかを明らかにするために適合化され得ることは当業者には明かである。従って、物質のコレクションまたはそのようなコレクションの個々のメンバーを、上記に記載される方法における物質として使用することは、本発明の範囲内である。特に、カリウムイオンチャンネルの調節に関係することが知られている化学構造を取り込むために設計されたライブラリー、例えば、カリウムチャンネルの活性化剤に関するジヒドロベンゾピランライブラリー（国際特許出願公開ＷＯ９５／３０６４２）またはカリウムチャンネルの阻害剤に関するビフェニル誘導体ライブラリー（国際特許出願公開ＷＯ９５／０４２７７）は特に注目されることが予想される。
【００９７】
本発明には、本明細書中に記載される方法によって特定された、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含むカリウムチャンネルの活性化剤または阻害剤を含む医薬組成物が包含される。活性化剤または阻害剤は、一般には、医薬組成物を得るために、医薬適合性のキャリアと一緒にされる。そのようなキャリアの様々な例、および活性化剤または阻害剤およびキャリアを含有する医薬組成物の配合方法の様々な例を、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版、１９９０、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ）に見出すことができる。効果的な投与に好適な医薬適合性の組成物を得るために、そのような組成物は、治療効果的な量の活性化剤または阻害剤を含有する。
【００９８】
治療用または予防用の組成物は、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルの活性が異常である状態を処置または防止するために十分な量で個体に投与される。効果的な量は、個体の状態、体重、性別および年齢などの様々な要因に従って変化し得る。他の要因には、投与様式が含まれる。適切な量は通常の医師によって決定され得る。一般に、効果的な量は、成人１日あたり約０．０１ｍｇから約１，０００ｍｇであり、好ましくは約０．１ｍｇから約２５０ｍｇであり、さらにより好ましくは約１ｍｇから約５０ｍｇである。
【００９９】
組成物は、適切な投薬量で単独で使用することができる。あるいは、他の薬剤との同時投与または連続投与が望ましいことがある。
【０１００】
組成物は、従来の投与用ビヒクルにおける非常に様々な治療投薬形態物で投与することができる。例えば、組成物は、錠剤、カプセル（それぞれが徐放性および持続放出性の配合物を含む）、ピル、粉末剤、顆粒、エリキシル剤、チンキ剤、溶液剤、懸濁剤、シロップおよびエマルションのような経口投薬形態物で投与することができ、または注射によって投与することができる。同様に、組成物はまた、静脈内（ボーラスおよび注入の両方）、腹腔内、皮下、閉塞を伴う局所的もしくは閉塞を伴わない局所的、または筋肉内の形態物で投与することができる。これらはすべて、製薬分野の当業者には十分に知られている形態物が使用される。
【０１０１】
組成物は単回日用量で投与することができ、または１日投薬量の総量を、１日あたり２回、３回、４回もしくはそれ以上の分割された用量で投与することができる。さらに、組成物は、好適な鼻腔内ビヒクルを局所的に使用することによって鼻腔内形態物で投与することができ、または当業者に十分に知られている経皮パッチのそのような形態物を使用して経皮経路により投与することができる。経皮送達システムの形態で投与されるためには、投薬は、当然のことではあるが、投薬期間中を通して、断続的ではなく、連続している。
【０１０２】
本発明の組成物を利用する投薬法は、患者のタイプ、種、年齢、体重、性別および医学的状態；処置される状態の重篤度；投与経路；患者の腎機能、肝機能および心臓血管機能；ならびに用いられるその特定の化合物を含む様々な要因に従って選択される。通常の医師は、状態の進行を妨げるか、または打ち消すか、または停止させるために必要とされる組成物の効果的な量を容易に決定し、処方することができる。毒性を伴うことなく効き目をもたらす範囲に含まれる組成物濃度を達成することにおける最適な精度は、標的部位に対する組成物の利用性の速度論に基づく投薬法を必要とする。これには、組成物の分布、平衡および排出を検討することが含まれる。
【０１０３】
ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルの阻害剤および活性化剤は、過度または不十分なカリウムチャンネル活性を伴う様々な疾患を処置するために有用である。
【０１０４】
本発明の阻害剤は、感覚障害、精神病、痛み障害、情動障害、精神病的障害、摂食障害およびノイローゼなどの様々な疾患を処置することにおいて有用であることが期待される。カルシウムチャンネルβサブユニットの結晶構造（Ｇｕｌｂｉｓ他、１９９９、Ｃｅｌｌ、９７：９４３〜９５２）から、Ｋｖβ２．３に特徴的なアミノ酸配列（ＧＤＰＦＳＳＳＫＳＲＴＦＩＩＥ、配列番号６）が、細胞の酸化還元電位をチャンネルの活性に共役させることに関与すると考えられるタンパク質の三次元構造の領域に存在することが明かである。従って、本発明の阻害剤および活性化剤はまた、イオンチャンネル活性のこの酸化還元調節を脱共役または増強することが望ましい状態において有用であることが期待される。
【０１０５】
本発明には、Ｋｖβ２．３サブユニットを含有するカリウムチャンネルの生物学的活性の調節を、そのような調節を必要とするヒト宿主において行う方法が包含される。この方法は、Ｋｖβ２．３サブユニットを含有するカリウムチャンネルの活性を調節し、しかしＫｖβ２．３サブユニットを含有しないカリウムチャンネルの生物学的活性は調節しない化合物を投与することを含む。
【０１０６】
本発明のＫｖβ２．３サブユニットを含有するカリウムチャンネルは、他のイオンチャンネルの活性化剤および阻害剤を特定するために設計されたスクリーニングとの組合せにおいて有用である。標的のイオンチャンネルと特異的に相互作用する潜在的な医薬品を特定するために化合物をスクリーニングするとき、特定される化合物は標的のイオンチャンネルに対してできる限り特異的であることを確保することが必要がある。このためには、標的のイオンチャンネルに類似するイオンチャンネルのできる限り多数に対して化合物をスクリーニングすることが必要である。従って、イオンチャンネルＡと相互作用する潜在的な医薬品である化合物を見つけるためには、化合物がイオンチャンネルＡ（「プラス標的」）と相互作用し、イオンチャンネルＡを介して所望する薬理学的作用をもたらすことを確保することは十分ではない。化合物がイオンチャンネルＢ、Ｃ、Ｄなど（「マイナス標的」）と相互作用しないことを明らかにすることもまた必要である。一般に、スクリーニングプログラムの一部として、できる限り多くのマイナス標的を有することは重要である（Ｈｏｄｇｓｏｎ、１９９２、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：９７３〜９８０（９８０において）を参照のこと）。ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質をコード化するＤＮＡ、およびヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を発現するように操作されている組換え細胞は、それらが、他のイオンチャンネルと特異的に相互作用する化合物を特定するために設計されたスクリーニングにおける「マイナス標的」として使用され得るという点で有用である。例えば、Ｗａｎｇ他（１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８２：１８９０〜１８９３）は、ＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３が、「Ｍチャンネル」として知られているヘテロマーのカリウムイオンチャンネルを形成することを示した。Ｍチャンネルは、薬物開発に対する重要な標的である。これは、ＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３における変異が、癲癇を生じさせることに関わっているからである（Ｂｉｅｒｖｅｒｔ他、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７９：４０３〜４０６；Ｓｉｎｇｈ他、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１８：２５〜２９；Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ他、Ｎａｔｕｒｅ、１９９８、３９６：６８７〜６９０）。Ｍチャンネルの活性化剤または阻害剤を特定するために設計されたスクリーニングプログラムは、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルをマイナス標的として使用することによって大きな利益を受ける。
【０１０７】
本発明にはまた、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質に対する抗体が包含される。そのような抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。本発明の抗体は、この分野で十分に知られている方法によって、全長のヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質に対して、または好適なキャリア（例えば、血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニン）に結合された好適な抗原性フラグメントに対して惹起させることができる。タンパク質の好適な抗原性フラグメントを特定する様々な方法が当該技術では知られており、これらはヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質に適用することができる。例えば、Ｈｏｐｐ＆Ｗｏｏｄｓ、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８：３８２４〜３８２８；Ｊａｍｅｓｏｎ＆Ｗｏｌｆ、１９８８、ＣＡＢＩＯＳ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、４：１８１〜１８６を参照のこと。
【０１０８】
ポリクローナル抗体を作製する場合、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質または抗原性フラグメントが、好適なキャリアに結合されて、例えば、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ラット、マウスなどの適切な非ヒト宿主動物に定期的に注射される。動物は定期的に採血され、得られた血清が、注射されたサブユニットまたは抗原性フラグメントに対する抗体の存在について試験される。注射は、筋肉内、腹腔内、皮下などに行うことができ、アジュバントを伴うことができる。
【０１０９】
モノクローナル抗体を作製する場合、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質または抗原性フラグメントが、好適なキャリアに結合されて、ポリクローナル抗体を作製するための上記のような適切な非ヒト宿主動物に注射される。モノクローナル抗体の場合、動物は、一般にはマウスである。動物の脾臓細胞が、その後、Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５〜４９７に記載されるように、多くの場合にはミエローマ細胞との融合によって不死化される。モノクローナル抗体の作製の説明については、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（編者：Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８８）を参照のこと。
【０１１０】
遺伝子治療を、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を標的器官の細胞に導入するために使用することができる。ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質をコード化するヌクレオチドは、受容細胞の感染によるヌクレオチドの移入を媒介するウイルスベクター内に連結することができる。好適なウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、レンチウイルスおよびポリオウイルスに基づくベクターが含まれる。あるいは、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質をコード化するヌクレオチドは、リガンド−ヌクレオチド結合体を使用する受容体媒介による標的化移入、リポフェクション、膜融合または直接的な顕微注入を含む非ウイルス技術によって遺伝子治療のために細胞内に移すことができる。これらの手法およびその変法は、エクスビボ遺伝子治療ならびにインビボ遺伝子治療のために好適である。ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質を用いた遺伝子治療は、カリウムチャンネルの活性を上昇させることが有益である疾患を処置するために特に有用である。
【０１１１】
本発明には、ヒトＫｖβ２．３サブユニットタンパク質のオルソログをヒト以外の種からクローニングするための方法が包含される。一般に、そのような方法は、非ヒトのＫｖβ２．３サブユニットを含有するフラグメント（ＰＣＲの場合）を好適なＤＮＡ調製物から増幅するために、または非ヒトのＫｖβ２．３サブユニットを含有するｃＤＮＡクローンもしくはゲノムクローンを好適なライブラリーから選択するために使用され得る１対のＰＣＲプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブを配列番号１に基づいて調製することを含む。この方法の好ましい実施形態は、マウスからＫｖβ２．３サブユニットをクローニングするための方法である。
【０１１２】
マウスＫｖβ２．３サブユニットをコード化するＤＮＡを提供することによって、本発明により、Ｋｖβ２．３サブユニットの活性が異常であるヒト疾患の動物モデルを作製することが可能になる。そのような動物モデルは、変化したＫｖβ２．３サブユニット遺伝子を含有する「ノックアウト」型または「ノックイン」型のトランスジェニックマウスを作製することによって得ることができる。マウスＫｖβ２．３サブユニット遺伝子の一部を欠失させたノックアウトマウスを作製することができる。ヒト疾患を生じさせることが示された変異がマウス遺伝子に導入されているノックインマウスを作製することができる。そのようなノックアウトマウスおよびノックインマウスは、カリウムチャンネルと疾患との関係の研究における有益な道具であり、カリウムチャンネルを伴うヒト疾患に対する潜在的な医薬品または処置を試験するための重要なモデル系を提供する。
【０１１３】
従って、本発明には、トランスジェニックマウスの作製方法が包含される。この方法は、
（ａ）マウスＫｖβ２．３サブユニット遺伝子またはｃＤＮＡをクローニングする際に使用されるＰＣＲプライマーまたはオリゴヌクレオチドプローブを配列番号１に基いて設計すること、
（ｂ）ＰＣＲプライマーまたはオリゴヌクレオチドプローブを使用して、トラスジェニックマウスを作製するときに使用するために十分な大きさであるマウスＫｖβ２．３サブユニット遺伝子またはｃＤＮＡの一部を少なくともクローニングすること、
（ｃ）その天然状態から変化したマウスＫｖβ２．３サブユニット遺伝子を少なくとも１コピー有するトランスジェニックマウスを作製すること
を含む。
【０１１４】
ノックアウトマウスおよびノックインマウスの作製方法は当該技術では十分に知られている。１つの方法では、遺伝子標的化によるトランスジェニックノックアウトマウスを作製するときにおける遺伝子標的化ＥＳ細胞の使用が含まれ、これは、例えば、Ｔｈｏｍａｓ他、１９８７、Ｃｅｌｌ、５１：５０３〜５１２に記載され、他で総説されている（Ｆｒｏｈｍａｎ他、１９８９、Ｃｅｌｌ、５６：１４５〜１４７；Ｃａｐｅｃｃｈｉ、１９８９、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔ．５：７０〜７６；Ｂａｒｉｂａｕｌｔ他、１９８９、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．６：４８１〜４９２）。
【０１１５】
様々な技術が、標的化された相同的組換えを使用して、特定の変化を染色体遺伝子に挿入することによって、事実上任意の所望する変異に任意の遺伝子領域を不活性化または変化させるために利用され得る。一般に、「標的化ベクター」、すなわち、変異させることが所望される遺伝子領域の一部分を含有するプラスミドが使用される。プラスミド上の遺伝子領域のこの一部分と染色体上の対応する遺伝子領域との相同性によって、相同的組換えを、プラスミドを遺伝子領域に挿入するために、従って、遺伝子領域を破壊するために使用することができる。通常、標的化ベクターはまた選択マーカー遺伝子も含有する。
【０１１６】
１００％に近い頻度で生じる相同的な染色体外の組換えと比較して、相同的なプラスミド−染色体の組換えは、最初、１０−６から１０−３の頻度で検出されるにすぎないことが報告された（Ｌｉｎ他、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：１３９１〜１３９５；Ｓａｍｉｔｈｉｅｓ他、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ、３１７：２３０〜２３４；Ｔｈｏｍａｓ他、１９８６、Ｃｅｌｌ、４４：４１９〜４２８）。非相同的なプラスミド−染色体の相互作用はより高頻度であり、類似する相同的な挿入よりも１０５倍（Ｌｉｎ他、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：１３９１〜１３９５）から１０２倍（Ｔｈｏｍａｓ他、１９８６、Ｃｅｌｌ、４４：４１９〜４２８）大きいレベルで生じる。
【０１１７】
ネズミのＥＳ細胞における標的化組換えのこの低い割合を克服するために、様々な方法が、希な相同的組換えを検出または選択するために開発されている。相同的な変化事象を検出するための１つの方法では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が、相同的な挿入について形質転換体細胞の集団をスクリーニングし、その後、個々のクローンをスクリーニングするために使用される（Ｋｉｍ他、１９８８、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：８８８７〜８９０３；Ｋｉｍ他、１９９１、Ｇｅｎｅ、１０３：２２７〜２３３）。あるいは、相同的な挿入が生じた場合にだけ活性になるマーカー遺伝子が構築され、これにより、これらの組換え体の直接的な選択を可能にする正の遺伝子選択法が開発されている（Ｓｅｄｉｖｙ他、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：２２７〜２３１）。相同的組換え体を選択するために開発された非常に強力な方法の１つは、変化の直接的な選択が存在しない遺伝子のために開発された正負選択（ＰＮＳ）法である（Ｍａｎｓｏｕｒ他、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ、３３６：３４８〜３５２；Ｃａｐｅｃｃｈｉ、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１２８８〜１２９２；Ｃａｐｅｃｃｈｉ、１９８９、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔ．５：７０〜７６）。ＰＮＳ法は、マーカー遺伝子がそれ自身のプロモーターを有するので、高レベルで発現されない遺伝子を標的化するために、より効率的である。非相同的な組換え体が、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）遺伝子を使用し、ガンシクロビル（ＧＡＮＣ）またはＦＩＡＵ（１−（２−デオキシ−２−フルオロ−Ｂ−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−ヨードウラシル）などのヘルペス薬を用いてその非相同的な挿入に対して選択することによって選択される。この逆選択によって、生存している形質転換体における相同的組換え体の割合を増大させることができる。
【０１１８】
トランスジェニックマウスを作製する他の方法は、受精卵の雄性前核を顕微注入することを伴う。そのような方法は当該技術では十分に知られている。
【０１１９】
本発明には、ヒトＫｖβ２．３サブユニットの少なくとも一部をコード化するＤＮＡを動物のゲノムが含む非ヒトのトランスジェニック動物が包含される。この場合、非ヒトのトランスジェニック動物は、ヒトＫｖβ２．３サブユニットの一部を含有しない野生型動物と比較したとき、カリウムチャンネルの変化した生物学的活性を示す。好ましい実施形態において、非ヒトのトランスジェニック動物はマウスである。
【０１２０】
下記の非限定的な実施例は、本発明をよりよく例示するために示される。
【０１２１】
実施例１
ヒトＫｖβ２．３サブユニットの特定およびｃＤＮＡクローニング
第１鎖ｃＤＮＡを、２．５μｇのヒト脳ポリＡ＋ｍＲＮＡ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、８ｍＭのＭｇＣｌ２、３ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭの各ｄＮＴＰ、４ｍＭのＤＴＴ、１．５μｇのランダムヘキサマープライマー、１２０ユニットのＲＮＡｓｉｎおよび１２ユニットのＡＭＶ逆転写酵素を含有する４０μｌの反応液において、４２℃で９０分間合成した。
【０１２２】
その後、Ｋｖβ２．３を、ポリメラーゼ連鎖反応と、Ｋｖβ２ファミリーの他のメンバー（すなわち、Ｋｖβ２．１およびＫｖβ２．２）において保存されている配列に由来するオリゴヌクレオチドプライマーとを使用してｃＤＮＡから増幅した。使用されたプライマーの配列は、
【０１２３】
【化２】
2005503104.tif 000004
であった。
【０１２４】
ＰＣＲを、４μｌの第１鎖ｃＤＮＡ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．７５）、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）ＳＯ４、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％トリトンＸ−１００、０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、１μＭの各オリゴヌクレオチドプライマー、および５ユニットのＴａｑプラスロングポリメラーゼからなる１００μｌ容量で行った。反応は、下記のパラメーターを使用する２５サイクルであった：９４℃で１分、５６℃で２分、７２℃で３分。この方法で増幅されたｃＤＮＡは、標準的な技術によってＳｐｅＩ−ＮｏｔＩフラグメント（そのような２つの酵素に対する認識部位はプライマーに含まれていた）としてクローン化され、その後、Ｋｖβ２．３のヌクレオチド配列を決定するために、両方の鎖についてその全体が配列決定された。
【０１２５】
実施例２
ヒトＫｖβ２．３サブユニットの発現の分析
ノーザンブロット分析：ヒトの心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸、末梢血白血球、扁桃、尾状核、脳梁、海馬、全脳、黒質および視床から単離されたポリ（Ａ＋）ＲＮＡのノーザンブロットをＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）から購入し、Ｋｖβ２．３に特徴的な配列に由来する３２Ｐ標識オリゴヌクレオチドプローブでプローブした。プローブのセンス鎖の配列は、
【０１２６】
【化３】
2005503104.tif 000005
であった。
【０１２７】
プローブは、アニーリングされ、４つの［３２Ｐ］ｄＮＴＰのすべておよびＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントの存在下で埋められた２つの重なる合成オリゴヌクレオチドから構築された。ハイブリダイゼーションは、５ＸＳＳＰＥ、１０Ｘデンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡにおいて、４２℃で一晩行われた。ブロットは、２ＸＳＳＣ、０．０５％ＳＤＳにおいて、４２℃で１５分間から２０分間、３回、その後、１ＸＳＳＣ、０．０５％ＳＤＳにおいて、５０℃で１５分間から２０分間、３回から４回、逐次行われた。ハイブリダイゼーションは、ブロットをＫｏｄａｋ社のＸＡＲ  Ｘ線フィルムに感光させることによって検出された。
【０１２８】
本発明は、本明細書中に記載される特定の実施形態によって範囲が限定されるべきではない。実際、本明細書中に記載される改変に加えて、本発明の様々な改変が、前記の記載から当業者には明らかになる。そのような改変は、添付された請求項の範囲に含まれるものとする。
【０１２９】
様々な刊行物が本明細書中に引用されているが、それらの開示はその全体が参考として組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
Ｋｖβ２．３をコード化するＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図１Ｂ】
Ｋｖβ２．３をコード化するＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図１Ｃ】
Ｋｖβ２．３をコード化するＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図２】
ヒトＫｖβ２．３（配列番号３）、ヒトＫｖβ２．１（配列番号４）およびヒトＫｖβ２．２（配列番号５）のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図３Ａ】
Ｋｖβ２．３のアンチセンスプローブを使用したときの、視床の視床沈核におけるＫｖβ２．３発現のインシトゥハイブリダイゼーションによる局在の研究を示す。
【図３Ｂ】
Ｋｖβ２．３のセンスプローブを使用したときの、視床の視床沈核におけるＫｖβ２．３発現のインシトゥハイブリダイゼーションによる局在の研究を示す。
【図４】
視床の様々な領域におけるＫｖβ２．３発現のインシトゥハイブリダイゼーションによる局在の研究を示す。
【図５Ａ】
ヒトＫｖβ２．３ｃＤＮＡの各エキソンの対応するゲノム配列とのアラインメントを示す。示される配列はすべて、配列番号１の部分である。
【図５Ｂ】
ヒトＫｖβ２．３ｃＤＮＡの各エキソンの対応するゲノム配列とのアラインメントを示す。示される配列はすべて、配列番号１の部分である。
【図５Ｃ】
ヒトＫｖβ２．３ｃＤＮＡの各エキソンの対応するゲノム配列とのアラインメントを示す。示される配列はすべて、配列番号１の部分である。
【図５Ｄ】
ヒトＫｖβ２．３ｃＤＮＡの各エキソンの対応するゲノム配列とのアラインメントを示す。示される配列はすべて、配列番号１の部分である。
【図５Ｅ】
ヒトＫｖβ２．３ｃＤＮＡの各エキソンの対応するゲノム配列とのアラインメントを示す。示される配列はすべて、配列番号１の部分である。
【図１Ａ】
2005503104.tif 000006
【図１Ｂ】
2005503104.tif 000007
【図１Ｃ】
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【図２】
2005503104.tif 000009
【図３Ａ】
2005503104.tif 000010
【図３Ｂ】
2005503104.tif 000011
【図４】
2005503104.tif 000012
【図５Ａ】
2005503104.tif 000013
【図５Ｂ】
2005503104.tif 000014
【図５Ｃ】
2005503104.tif 000015
【図５Ｄ】
2005503104.tif 000016
【図５Ｅ】
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【国際公開パンフレット】
2005503104.tif 000018
2005503104.tif 000019
2005503104.tif 000020
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2005503104.tif 000069
2005503104.tif 000070
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005503104.tif 000071
【国際調査報告】
2005503104.tif 000072