(57)【要約】本発明は、成熟した全長24kDa 線維芽細胞成長因子-2またはその類似体のアミノ酸配列のフラグメントに関する。このフラグメントは、培養細胞の遊走を抑制し、並びに血管新生、腫瘍成長、またはインビボでの細胞の遊走に関与するその他の任意のプロセスを抑制する活性を有する。このフラグメントは、成熟した全長24kDA 線維芽細胞成長因子-2によって示される活性とは異なり、細胞増殖を促進しない。本発明はまた、このフラグメントをコードするDNA 分子、このDNA 分子を含む発現ベクター及び形質転換した宿主、並びにこの形質転換した宿主の培養によりこのタンパク質を産生する方法に関する。さらに、本発明は、24kDa 線維芽細胞成長因子フラグメント及び薬剤として許容される担体から成る治療用組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５の核酸分子を含む単離核酸分子。
【請求項２】
請求項１の単離核酸に相補な核酸分子を含む、単離核酸分子。
【請求項３】
前記核酸分子が検出可能な基に共有結合している、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項４】
前記検出可能基が放射性標識及び蛍光基から成る群から選択される、請求項３に記載の単離核酸分子。
【請求項５】
前記核酸分子が１つ以上の発現制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項６】
前記核酸配列が１つ以上の欠失を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項７】
請求項１に記載の核酸を含むベクター。
【請求項８】
請求項１に記載のベクターを含み、それによって前記細胞が前記核酸を発現できる、組み換え型宿主細胞。
【請求項９】
前記宿主が、原核及び真核宿主から成る群から選択される、請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
配列番号２のアミノ酸ポリペプチドを含む単離ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１０に記載のポリペプチドを薬剤として有効量含む医薬品組成物。
【請求項１２】
前記医薬品組成物がさらに薬剤として許容される担体を１つ以上含む、請求項１１に記載の医薬品組成物。
【請求項１３】
少なくとも二つの成分から成る融合タンパク質であって、前記融合タンパク質の一つの成分が請求項１０に記載のポリペプチドである融合タンパク質。
【請求項１４】
一つの単量体が請求項１０に記載のポリペプチドである、二量体。
【請求項１５】
少なくとも一つの単量体が請求項１０に記載のポリペプチドである、多量体。
【請求項１６】
ａ）腫瘍の成長、腫瘍の浸潤または転移、乳癌、肺癌、アテローム性動脈硬化症、バルーン血管形成術後の血管再狭窄、血管外傷に伴う新生内膜形成、血管グラフト再狭窄、慢性炎症状態に伴う線維症、肺線維症、化学療法が誘因となる線維症、瘢痕及び線維症を伴う創傷治癒、乾癬、深部静脈血栓症、網膜症または血管新生が病因となる任意の疾患または症状のうち一つ以上の疾患または症状のリスクがある、または徴候を示す患者を提供すること、
ｂ）配列番号２のポリペプチドを含む医薬品組成物を提供すること、及び
ｃ）前記医薬品組成物を前記患者に投与すること、
を含む治療方法。
【請求項１７】
前記医薬品組成物が、経口、経鼻、経肺、非経口、腹腔内、経皮、局所、吸入、または、皮下、静脈内、あるいは筋肉内注射によって投与される、請求項１６に記載の治療方法
。
【請求項１８】
血管新生反応を抑制し、更に細胞遊走を抑制する生物学的活性を有するポリペプチド産生の方法であって、前記方法が、
ａ）好適な栄養条件で、配列番号５の核酸分子で形質転換または形質移入された宿主細胞を生育すること、及び
ｂ）前記核酸分子の発現によるポリペプチド産物を単離すること、を含む方法。
【請求項１９】
配列番号２のアミノ酸ポリペプチド結合分子または前記結合分子を発現する細胞に結合したりまたは単離するために有用な結合リガンドであって、前記リガンドが、配列番号２によるポリペプチド、ペプチド、またはペプチド多量体を含み、前記ポリペプチド、ペプチド、またはペプチド多量体が、固形支持体またはキャリア上に固定化されている結合リガンド。
【請求項２０】
抗血管新生、腫瘍抑制、及び抗遊走活性を含む少なくとも一つのポリペプチドをコードする核酸分子を少なくとも一つ含む組成物。
【請求項２１】
抗血管新生、腫瘍抑制、及び抗遊走活性を含むポリペプチドを少なくとも一つ含む組成物。
【請求項２２】
配列番号２のアミノ酸ポリペプチドを複合混合物から単離する方法であって、前記方法が、
（ａ）前記混合物に請求項１９に記載の結合リガンドを接触させる工程、
（ｂ）前記混合物中の任意の物質を前記リガンドに結合させる工程、
（ｃ）非結合物質をリガンドから除去する工程、及び
（ｄ）結合した配列番号２のアミノ酸ポリペプチド結合分子を溶出工程、を含む方法。
【請求項２３】
細胞混合物から配列番号２のアミノ酸ポリペプチド結合部位またはレセプターを発現する細胞を単離または濃縮する方法であって、前記方法が、
（ａ）前記細胞混合物に請求項１９に記載の結合リガンドを接触させる工程、
（ｂ）前記結合部位またはレセプターを発現する任意の細胞を前記結合リガンドに結合させる工程、
（ｃ）前記リガンドに結合した細胞を非結合細胞から分離する工程、及び
（ｄ）前記結合細胞を除去する工程
を含み、これによって、配列番号２のアミノ酸ポリペプチド結合部位を発現する細胞を単離または濃縮する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野は、２４，０００ダルトン形態の線維芽細胞成長因子−２（２４ｋＤａ  ＦＧＦ−２）に関する生化学及び医学である。特に、本発明は、真核細胞の遊走を抑制するが、全長２４ｋＤａ  ＦＧＦ−２に関連する成長促進作用を欠如する、２４ｋＤａ  ＦＧＦ−２の任意及び全ての部分に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願は、２００２年４月８日に出願され、本願にその全文を参考文献として編入している、「細胞遊走を抑制する切断型２４ｋＤａ塩基性線維芽細胞成長因子（２４ｋＤＡ  ＦＧＦ−２）」と題する、米国仮出願番号６０／３７０，２１２の優先権を主張するものである。
【０００３】
本発明は、米国国立保健研究所（ＮＩＨ）傘下の国立心肺液研究所からの助成金と委託によって資金が一部供給されており、本発明のある程度の権利はアメリカ合衆国政府に提供される。
【０００４】
本出願には様々な出版物が引用されているが、その大部分は括弧内の番号によって参照されている。これらの出版物の詳細な引用は、発明の詳細な説明の末尾に提供している。これらの出版物の開示は、その全文を参考文献として本出願に編入している。
【０００５】
ポリペプチド成長因子は、様々な細胞の成長と遊走を促進する（１）。内皮細胞の成長、遊走、並びに浸潤を促進するこれらのポリペプチド成長因子の一つは、塩基性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ−２）である（２−５）。ＦＧＦ−２は、共通ドメインを共有する少なくとも９個の別々の遺伝子産物から成る、線維芽細胞成長因子の大ファミリーの一部である。ＦＧＦ−２の単一コピー遺伝子は、２４、２２．５、２２、及び１８ｋＤａの複数型タンパク質をコードし、これらの３つの分子量の高いＦＧＦ−２（「ｈｍｗＦＧＦ−２」）は、ＡＵＧコドンの上流にあるＣＵＧ開始部位での翻訳開始によって産生される（図１）（６；７）。２４ｋＤａ  ＦＧＦ−２型は、アミノ末端にさらに５５個のアミノ酸を加えた１８ｋＤａ  ＦＧＦ−２から構成される。ｍＲＮＡの構造は、その合成が翻訳によって制御されていることを示す。１８ｋＤａとｈｍｗＦＧＦ−２では細胞内での所在位置と見かけ上の機能が異なっている。１８ｋＤａ  ＦＧＦ−２は、ほとんどが細胞質に存在し、細胞表面に搬出されて、そこで基底膜または基質ヘパリン及びヘパランと関連して細胞外基質に局在化する（８；９）。対照的に、これまで研究されている培養細胞の培地中には、ｈｍｗＦＧＦ−２は殆ど検出されないか、あるいはその存在量は極めて低い。その代わり、細胞ｈｍｗＦＧＦ−２の大部分が直接に核に転座される（１０；１１）。核転座に関連する残基は、ｈｍｗＦＧＦ−２のアミノ末端領域内にあるいくつかの部位に発見されるＲＧ反復である（１２）。したがって、１８ｋＤａ  ＦＧＦ−２は、内皮細胞行動の外部制御因子であると見なされ、ｈｍｗＦＧＦ−２は、核内自己分泌シグナルを産生すると考えられている。
【０００６】
我々は、外因的に投与された組み換え型２４ｋＤａ  ＦＧＦ−２は、細胞増殖の促進と遊走抑制という２つの方法によって細胞行動を制御できることを立証した（１３）。増殖の増加は、１８ｋＤａ  ＦＧＦ−２によって促進される増加と同等であり、これは、この促進は、アミノ末端に追加されたペプチドとは無関係であることを示している。一方、遊走効果は、１８ｋＤａ  ＦＧＦ−２のそれとは逆であった。１８ｋＤａ  ＦＧＦ−２は、細胞運動を促進するが、２４ｋＤａ  ＦＧＦ−２は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）及びインスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）などの細胞遊走を促進する関連性のないマイト
ジェン（分裂促進因子）の存在下においてさえ、遊走を内皮細胞では５０％、乳癌ＭＣＦ−７細胞では７０％以上も抑制する。我々は、アミノ末端（アミノ末端５５アミノ酸、「ＡＴＥ」）に特異的な抗体または２４ｋＤａ  ＦＧＦ−２の１８ｋＤａ領域に対する抗体を用いて、ＡＴＥに対する遊走抑制と２４ｋＤａ  ＦＧＦ−２の１８ｋＤａドメインに対する成長促進場所を突きとめた。したがって、２４ｋＤａ  ＦＧＦ−２は、１８ｋＤａ  ＦＧＦ−２とは別に細胞行動を影響し、１８ｋＤａ  ＦＧＦ−２には存在しないＡＴＥ領域にこの相違の原因があると結論した。
【０００７】
本発明は、線維芽細胞成長因子の切断型であり、したがって、独立分子として説明されたことは未だかつてない。全長線維芽細胞成長因子は、抑制活性と増殖活性、即ち、細胞を刺激して成長させるという、癌治療において好ましくない作用を有する。成長因子は、プロ遊走性及びプロ血管新生性であると考えられ、したがって血管機能不全症患者において血管新生を促進するために使用できる。本発明の予想しなかった結果には、好ましくない増殖活性から抑制活性を切り離し、したがって切断型成長因子を抗血管新生または抗遊走化合物としての使用を可能にしたことを含む。本発明は、抗血管新生性であるのみではなく、腫瘍細胞に対しても有効である。したがって、抗血管新生治療に感受性のない腫瘍は、本発明に応答性があろう。
【０００８】
上記文書の引用は、前述のいずれもが当該従来技術であることを意味するものではない。これらの文書の日付に関する全ての記載または内容に関する記述は、出願人に入手可能であった情報に基づくものであり、これらの文書の日付または内容が正確であることを意味するものではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、切断型２４ｋＤａ塩基性線維芽細胞成長因子を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の概要）
本発明は、細胞浸潤及び／または血管新生を抑制するに十分な投与量のオリゴペプチド、化学誘導体またはペプチド擬態を含む組成物を被験体に投与することによって、好ましくない制御不能なこの浸潤及び／または血管新生によって媒介される疾患とプロセスを治療するための方法並びに組成物を提供する。本発明は、特に腫瘍の成長、網膜症に起因する血管発生、あるいは血管形成に拠るその他の疾患の治療と抑制に有効である。血管新生前の転移腫瘍を有するヒトまたは被験体に対する本組成物の投与は、これらの腫瘍の成長または増大を防止する。
【００１１】
したがって、本発明は、全長２４ｋＤａ線維芽細胞成長因子の任意の部分を含む新規タンパク質、図８Ａに示す全長２４ｋＤａ線維芽細胞成長因子のアミノ酸配列（配列番号１）に関する。本発明は、インビトロで哺乳類細胞の遊走を抑制し、血管、腫瘍成長、あるいはインビボでの細胞遊走に拠る生理的または病理的応答を減少または完全にブロックする、全長２４ｋＤａ線維芽細胞成長因子の任意部分（連続または不連続）、あるいは置換変異体、付加変異体またはそれらの化学的誘導体に関する。好ましくは、ＡＴＥ＋３１切断型タンパク質は、図８Ｂに示すようなアミノ酸配列（配列番号２）を有し、ＡＴＥ＋３３切断型タンパク質は、図８Ｃに示すようなアミノ酸配列を有する（配列番号３）。インビボ法には、細胞の遊走及び腫瘍及び血管の成長をインビボで変調するために有効な量の、（薬剤として許容される希釈剤、アジュバント、賦形剤、担体等中に製剤化されたポリペプチドを含む）医薬品組成物を、被験体に投与することが特に好ましい。
【００１２】
本発明はさらに腫瘍成長または血管新生を抑制するために有効な医薬品組成物に関し、
この組成物はタンパク質、変異体、または、ペプチド擬態または多量体ペプチド含む化学誘導体、並びに薬剤として許容される担体または賦形剤を含む。
【００１３】
好ましくない細胞遊走、浸潤、遊走誘発性増殖、または血管新生に関連する疾患または症状を有する被験者において、細胞遊走、浸潤、遊走誘発性細胞増殖、または血管新生を抑制するための方法がさらに提供され、この方法は前述する医薬品組成物の有効量を被験者に投与することを含む。
【００１４】
前述の方法のいずれにおいても、治療される疾患または症状は、原発性腫瘍成長、腫瘍浸潤または転移、アテローム性動脈硬化症、バルーン血管形成術後の血管再狭窄、血管外傷に伴う新生内膜形成、血管グラフト再狭窄、慢性炎症状態に伴う線維症、肺線維症、化学療法が誘因となる線維症、瘢痕及び線維症を伴う創傷治癒、乾癬、深部静脈血栓症、網膜症または血管新生が病因となる任意の疾患または症状であり得る。
【００１５】
有効量のポリペプチドとは本願では、当業者には理解されるように、細胞成長率または遊走、血管新生、または腫瘍サイズにおいて再現可能な（顕微鏡または肉眼観察並びに細胞倍加時間の推定、あるいは核酸合成検定法によって決定されるような）変化を達成するために必要であると経験的に決定されるポリペプチドの量として定義される。有効投与量は、約１ｎｇ／ｋｇ体重〜約１０ｇ／ｋｇ体重、好ましくは約１μｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、さらに好ましくは、約１００μｇ／ｋｇ体重〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。
【００１６】
本発明のポリペプチドのインビボ投与を含む方法では、ポリペプチドは、薬剤として許容される適切な溶媒、例えば、薬剤として許容される希釈剤、アジュバント、賦形剤または担体を用いて任意の好適な方法で投与するように考案されている。したがって、本発明はさらに、例えば、本発明のポリペプチドを１つ以上含む医薬品組成物などの組成物を含む。医薬品組成物とは、例えば経口、局所、非経口（皮下注射、静脈内、筋肉内、大槽内注射または輸液法を含むがこれに限定されるものではない）、吸入スプレー、または直腸経由で、従来の非毒性担体、希釈剤（炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、乳糖、リン酸カルシウム、リン酸ナトリウム、カオリン、水を含むがこれに限定されるものではない）、アジュバント、溶媒、さらに香味剤、保存剤、造粒剤と崩壊剤、結合剤、遅延物質、油、懸濁剤、分散剤または湿潤剤、抗酸化剤、及び乳化剤等を含むがこれに限定されるものではないその他を含む単位投与量の製剤として哺乳類宿主に投与することのできる組成物を意味する。
【００１７】
本発明のポリペプチドの定義は、それらの変異体をその範囲に含むことを意図する。考案されたポリペプチド変異体は、当業者によって識別されるような、ポリペプチドの抑制活性の維持に障害とならない保存的置換によって、そのポリペプチドの正確なアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する、精製及び単離ポリペプチドを含む。用語「変異体」は、ポリペプチドを指して使用する場合は、さらに付加アミノ酸を有するポリペプチドを含むことを意図し、翻訳及び／または分泌を促進するためのメチオニン及び／リーダー配列の付加、精製を促進するためのペプチド配列の付加（例えば、ポリヒスチジン配列及び／または抗体精製用のエピトープ）、並びに、融合タンパク質を産生するためのポリペプチドコード配列の付加を含むがこれに限定されるものではない。用語「変異体」はまた、アミノ末端、カルボキシ末端、または哺乳類配列の間で保存されていないアミノ酸内部にアミノ酸欠失を有し、この欠失が生じたポリペプチドの抑制活性の維持に障害とならないポリペプチドを含むことを意図する。
【００１８】
用語「変異体」はまた、ポリペプチドの抑制活性の維持に障害とならない１つ以上のアミノ酸残基に対する修飾を有するポリペプチドを含むことを意図する。そのような修飾は
、グリコシル化及びその他の置換基の付加（例えば、標識、血清半減期を増加する化合物（例えば、ポリエチレングリコール）等）を含む。
【００１９】
さらにほかの態様では、本発明は本発明のポリペプチドの類似体を含む。用語「類似体」は、１つ以上のアミノ酸挿入、内部アミノ酸欠失、及び／または非保存アミノ酸置換（交換）を含む変更を有するポリペプチドを意味する。類似体の定義は、そのような変更を具現する類似ポリペプチドの変種をその範囲に含む。用語「突然変異体」は、本願のポリペプチドに関して使用する場合は、一般的に２４ｋＤａ  ＦＧＦ−２、類似体、及び類似体の変種を指すことを意図する。
【００２０】
本発明はまた、２４ｋＤａ  ＦＧＦ−２をコードするｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡ、それらの生物活性フラグメント、並びにこれと同一物をコードするＤＮＡを含むがそれに限定はされない、本発明のポリペプチド全てをコードする精製及び単離ポリヌクレオチド（即ち、核酸）を提供する。遺伝コードの縮退により本発明の特徴となっているポリヌクレオチドは、本発明の範囲内にある。全長２４ｋＤａ線維芽細胞成長因子のＤＮＡ配列を図９Ａ（配列番号４）、さらに本発明のＡＴＥ＋３１切断型タンパク質のアミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列を図９Ｂ（配列番号５）、そしてＡＴＥ＋３３切断型タンパク質のアミノ酸配列を図９Ｃ（配列番号６）に示す。
【００２１】
本発明のほかの態様は、本発明の核酸を含むベクター、及び本発明の核酸またはベクターで形質転換または形質移入された宿主細胞を含む。本発明の好ましいベクターは、このベクターで形質転換または形質移入された原核または真核宿主細胞がそれによってコードされているポリペプチドを発現できるように、本発明の核酸が適切なプロモーター並びに転写及び／またはそれに引き続く翻訳を制御する他の制御配列に作動可能に連結されている発現ベクターである。
【００２２】
本発明に関連する態様では、原核及び真核細胞のような宿主細胞、特に単細胞の宿主細胞は、本発明のポリペプチドを発現するように修飾される。宿主細胞は、その中で本発明のポリペプチドの発現を可能にするように、本発明の単離ＤＮＡで安定的に形質転換または形質移入され得る。したがって、本発明はさらに、本発明のポリペプチドを作製する方法を含む。好ましい方法では、本発明の核酸またはベクターは宿主細胞内で発現され、そして本発明のポリペプチドは、宿主細胞または宿主細胞の生育培地から精製される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
（発明の詳細な説明）
本発明者らは、塩基性線維芽細胞成長因子の２４ｋＤＡ、２２．５ｋＤＡ、並びに２２ｋＤａ  ＦＧＦ−２型が培養細胞の遊走を抑制することを以前に測定した。
【００２４】
本発明者は、腫瘍成長、血管新生、並びに浸潤のインヒビターとして作用する２４ｋＤＡ  ＦＧＦ−２の切断型をここに同定した。このタンパク質は、（ａ）細胞浸潤、（ｂ）転移部位を含む腫瘍部位における血管新生、（ｃ）限定はされないが網膜症などのその他の病態を誘導する血管形成、の強力かつ特異的なインヒビターである。
【００２５】
（組成物のインビトロ試験）
遊走及び成長アッセイ法  遊走アッセイ法では、ＭＣＦ−７細胞または内皮細胞をトリプシンで収集、カウント、遠心分離してから、０．５ｍｌのダルベッコ変法イーグル培地／０．５％ウシ血清アルブミン中で１  ｘ  １０5 細胞になるように再懸濁した。細胞を、６．５ｍｍトランスウェル（Ｃｏｓｔａｒ）からなる２つのチェンバーを隔てる８．０μｍポアサイズのポリカーボネート膜を含むボイデンチェンバーの上部ウェルに添加した。上部ウェルを、１０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−２（Ｓｉｇｍａ）または１０ｎｇ／ｍｌのＶ
ＥＧＦ（Ｓｉｇｍａ）を化学誘引物質として加えた、０．７５ｍｌのダルベッコ変法イーグル培地／０．５％ウシ血清アルブミンを含む下部チェンバー内に配置した。どちらのチェンバーも適切な濃度の２４ｋＤａ  ＦＧＦ−２または切断型を含んだ。５％ＣＯ２中、３７℃で４〜６時間インキュベートした後、上部膜表面にある非遊走細胞を綿棒で除去して、フィルタを横断してフィルタの下方表面上に拡がった拡がった細胞を固定してからＤｉｆｆ−Ｑｕｉｋ（Ｄａｄｅ−Ｂｅｈｒｉｎｇ）で染色した。フィルタをスライドグラスにマウントして、４位相差顕微鏡写真／膜を１００倍の倍率で撮影した。視野当たりの細胞数をコンタクトシートからカウントして、その結果を２４ｋＤａ  ＦＧＦ−２を添加しなかった対照チェンバーと比較した。
【００２６】
成長率を測定するには、ＭＧＦ−７細胞（６  ｘ  １０３）を成長培地に４８時間播種して、培地を、１ｍＭピルビン酸ナトリウムと０．３％ラクトアルブミン加水分解産物＋成長因子または０．３％ラクトアルブミン加水分解産物のみ（成長因子を加えない）で補充したフェノールレッドフリー変法イーグル培地を含むアッセイ用培地に交換して、培養物をさらに２４時間インキュベートした。実験終了の２時間前に、３Ｈ‐チミジンを加えた。培養物をＰＢＳで洗浄してから、氷冷メタノール（２倍）、５％トリクロロ酢酸を２回、各１０分加えて、０．３Ｎ  ＮａＯＨでＤＮＡを抽出した。取り込まれたｃｐｍ数を液体シンチレーションで測定した。
【００２７】
（２４  ＦＧＦ−２切断型のインビボ試験）
マトリゲルプラグアッセイを用いる血管新生のインビボ評価  氷冷マトリゲル（５００μＬ）（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｂｅｄｆｏｒｄ，  ＭＡ）にヘパリン（５０μｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ−２（４００ｎｇ／ｍｌ）、並びにＡＴＥ＋３１を指示通りに混合した。マトリゲル混合物を、４〜８週齢のメス胸腺欠損Ｎｃｒヌードマウスの腹部正中線付近部位に、マウス１匹当たり３箇所、皮下注射した。注射部位は、各動物が陽性対照プラグ（ＦＧＦ−２及びヘパリン）、陰性対照プラグ（ヘパリン＋緩衝液）、並びに試験する処理を含むプラグ(FGF-2、ヘパリン、ATE ＋３１).を受容するように選択した。全ての処理は３組で試験した。注射５日後に動物を頸椎脱臼で屠殺した。マウス皮膚は、腹部正中線に沿って剥離して、マトリゲルプラグを回収して、高分解能で直ちにスキャンした。次にプラグを水中に分散して、３７℃で一晩インキュベートした。ヘモグロビン量は、Ｄｒａｂｋｉｎ試薬（Ｓｉｇｍａ）を用いて測定した。
ＡＴＥ＋３１の腫瘍成長に対する影響のインビボ評価  ２ｘ１０6 個のＭａｔＬｙＬｕ前立腺癌細胞を４００ｎＭ  ＡＴＥ＋３１が存在する場合または存在しない場合に０．５ｍｌのマトリゲル中に移植して、このゲルを４〜８週齢のメス胸腺欠損Ｎｃｒヌードマウスの腹部正中線付近部位の皮下に配置した。７日後にこのゲルを回収して、写真撮影並びに計量した。各動物に細胞もタンパク質も含まない、細胞のみ、そして細胞とタンパク質を含むマトリゲルを注射して、それぞれの相対重量を同一個体で比較した。
【００２８】
（治療薬の組成と方法）
本発明の好ましい動物被験体は哺乳類である。本発明は、ヒト被験者の治療に特に有効である。用語「治療する」とは、被験体に、細胞遊走に対する抑制活性を有し、腫瘍発生及び血管新生の抑制を誘導する任意の切断型２４ｋＤａ  ＦＧＦ−２を含む医薬品組成物を投与することを意味する、
本発明の医薬品組成物は、その切断型（複数でもよい）を薬剤として許容される賦形剤または担体と併用して、所期の目的を達成するための任意の手段によって投与することができる。投与量及びレジメンは、これらの特定の疾患のいずれかを治療する臨床分野の当業者によって容易に決定され得る。好ましい量は以下に説明する。
【００２９】
投与は、非経口、皮下（ｓｃ）、静脈内（ｉｖ）、筋肉内、腹腔内、経皮、局所あるい
は吸入ルートを用いることができる。あるいは、または同時に、経口ルートで投与してもよい。投与量は、レシピエントの年齢、健康状態、及び体重、併用療法の種類、適応される場合は、処置の頻度、並びに所望する効果の本質に依存する。
【００３０】
本発明の範囲に含まれる組成物は、所期目的の達成に有効な量の切断型２４ｋＤａ  ＦＧＦ−２タンパク質を含む全ての組成物を含む。個々のニーズは異なるが、各成分の有効量の最適範囲の決定は、当該分野の範囲内である。典型的な投与量は、さらに好ましい投与量は、特定の用途に応じて以下に説明するが、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重から成る。
【００３１】
前述のように、この新しい製剤は、薬理活性のあるタンパク質の他に、当該分野で公知であるように調剤に使用でき、活性化合物のプロセシングを促進する賦形剤や補助剤を含む薬剤として許容できる好適な担体を含んでもよい。注射または経口投与に好適な溶液は、約０．０１〜９９％の活性化合物（複数でもよい）を賦形剤と共に含み得る。
【００３２】
本発明の製剤は、自明の方法、例えば、従来の混合、顆粒化、溶解、または凍結乾燥加工の手段によって製造される。好適な賦形剤は、その全てが当該分野に公知である、充填剤、結合剤、崩壊剤、補助剤、及び安定剤を含み得る。非経口投与用に好適な剤形は、水溶性、例えば、水溶性塩の状態にあるタンパク質の水溶液を含む。さらに、適切な油性注射用懸濁液として活性化合物の懸濁液を投与してもよい。好適な親油性溶剤または溶媒は、例えば、ゴマ油、またはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル等の脂肪油を含む。懸濁液の粘度を増加する物質を含み得る水性注射用懸濁液。
【００３３】
本発明による全身投与用の剤形は、経腸、非経口、または局所投与用に製剤化することができ、３種類の剤形のいずれも、活性成分の全身投与を達成するために同時に使用できる。
【００３４】
局所投与には、本発明のタンパク質は、皮膚に対する緩和効果並びに活性成分を直接患部に投与する手段の両方を兼ね備える軟膏剤または外用薬のような局所用溶媒中に組み入れることができる。
【００３５】
活性成分の担体は、スプレー用または非スプレー用の形態であり得る。非スプレー用の形態は、局所投与に固有な担体を含み、好ましくは水よりも動的粘度の高い半固体または固体であり得る。好適な剤形は、溶液、懸濁液、エマルジョン、クリーム、外用薬、粉末、リニメント剤、軟膏剤等を含むが、これらに限定されるものではない。所望に応じて、これらは滅菌してもよく、あるいは例えば、保存剤、安定剤、湿潤剤、緩衝剤、または浸透圧などを影響する塩のような補助剤と混合してもよい。非スプレー局所用の製剤のための好ましい溶媒の例としては、軟膏用基材、例えば、プリエチレングリコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）、ＨＥＢクリーム等の従来のクリーム、ジェル、並びに石油ゼリー等がある。
【００３６】
本発明による切断型２４ｋＤａ  ＦＧＦ−２タンパク質（複数でもよい）用の薬剤として許容されるその他の担体は、活性タンパク質が脂肪層に付着する同心性の水層から成る小体中に分散されているかあるいは多様に存在する状態で活性タンパク質が含まれている医薬品組成物である、リポソームである。この活性タンパク質は、好ましくは水層及び脂肪層内、内側または外側、あるいはいずれの場合でも、一般的にリポソーム懸濁液として知られる非均質系に含まれる。
【００３７】
発明の概要を説明したので、以下の例を参照することによってさらに理解が容易となろう。但し、以下の例は例示手段として提供されるものであり、本発明を限定するものでは
ない。
【実施例１】
【００３８】
２４ｋＤａ  ＦＧＦ−２の切断型は、停止コドンを２４ｋＤａ  ＦＧＦ−２  ｃＤＮＡ内に配置する欠失突然変異誘発によって作成した。これらの切断の２４ｋＤａ  ＦＧＦ−２の成長促進作用に対する影響を測定するために、ペプチドをＭＣＦ−７細胞に添加して、チミジン取り込みによって測定される細胞増殖率を２４ｋＤａと１８ｋＤａ  ＦＧＦ−２について比較した（図２）。２４ｋＤａ  ＦＧＦ−２は、１８ｋＤａ  ＦＧＦ−２と同等に増殖を促進した（８〜１０倍）。しかしながら、２４ｋＤＡ  ＦＧＦ−２の切断型のいずれについても、２４または１８ｋＤａ  ＦＧＦ−２に使用したものと同一濃度において増殖促進は観察されなかった。ＡＴＥ＋３１濃度を１  ｘ  １０-9に増加しても増殖は促進されなかった。したがって、２４ｋＤａＦＧＦ−２の成長促進効果は、２４ｋＤａＦＧＦ−２のカルボキシ末端部分に依存する。しかし、これは遊走の抑制については当てはまらなかった。ボイデンチェンバー法及び化学誘引物質としてＩＧＦ−１を用いて、我々は、６．６ｘ１０-11   ＭのＡＴＥ＋３３が存在するとＭＣＦ−７細胞の遊走は、対照の３５．５±８％まで減少し、３．３ｘ１０-10   ＭのＡＴＥ＋３１が存在すると２２．３±５％まで減少することを観察した。切断型タンパク質は、大型分子の５倍の濃度を必要としたが、３．３ｘ１０-10   ＭのＡＴＥ＋３１が存在する場合の運動性の低下は、全長２４ｋＤａ  ＦＧＦ−２が存在する場合に観察される最大効果（２２±６％）に等しかった。どちらの場合も、タンパク質の濃度をさらに５倍増加すると、抑制活性が減少した。３．３ｘ１０-10   Ｍでは、２４ｋＤａ  ＦＧＦ−２は、遊走抑制効果が低かったが、８ｘ  １０-10   ＭではＡＴＥ＋３１は、遊走を対照の６１±４％まで抑制したのみであった。２４ｋＤａ  ＦＧＦ−２の付加部分を欠失すると、抑制活性が減少した。ＡＴＥ＋２０は、３．３ｘ１０-10   Ｍでは遊走を５８％まで減少したのみであった。付加アミノ酸の除去はそれ以上の効果はなかった。ＶＥＧＦを化学誘引物質として用いる内皮細胞遊走は、３．３ｘ１０-10   ＭのＡＴＥ＋３１を加えると同様な影響があり、運動性が２４％まで減少した（データ表示なし）。これらの結果は、２４ｋＤａ  ＦＧＦ−２の遊走活性の抑制は、アミノ末端に局在しており、１８ｋＤａ  ＦＧＦ−２内に発見されている公表レセプター結合部位もヘパリン結合部位も必要としないことを立証する。
【実施例２】
【００３９】
抑制活性がＡＴＥ内の特定領域に依存するかどうかを決定するためにさらなる試みがなされたが、これにはアルギニン→アラニン置換が関与する。ＡＴＥ中には多数のアルギニンが存在するため、配列は、それぞれが３または４個のアルギニンを含む４つの領域に分離された（図３）。各領域を別々に修飾して、遊走抑制への影響を試験し、未修飾ＡＴＥ＋３１と比較した。ＡＴＥのカルボキシ末端にある２領域（３と４）におけるアルギニン→アラニン変換は、遊走速度にはほとんど影響しなかったが、これらの分子はそれでも遊走を７０〜７５％抑制した。しかし、アミノ末端の２領域（１と２）のいずれかの領域内でアルギニン→アラニン置換が生じると、ＡＴＥ＋３１の抑制活性が減少し、細胞遊走は、野生型ＡＴＥ＋３１では２０％だったのに対して、未処理培養物の５０％であった。遊走の抑制は、領域１と２を組み合わせることによってさらに減少でき、遊走の抑制は１５％以下となった。
【実施例３】
【００４０】
２４ｋＤａ  ＦＧＦ−２のアミノ末端に抑制活性が局在することは、タンパク質のこの部分とそれが影響する細胞の間に、何らかの相互作用があることを示唆する。以前の研究において、内皮、ＭＣＦ−７、及び３Ｔ３細胞内で２４ｋＤａ  ＦＧＦ−２が結合するＦＧＦレセプターがＦＧＦＲ１であることが示された。ＡＴＥ＋３１がＦＧＦＲ１との相互作用の主要な結合ドメインを含むか否かを決定するために、ヨウ素化２４ｋＤａ  ＦＧＦ−２対非標識２４ｋＤａ  ＦＧＦ−２、１８ｋＤａ  ＦＧＦ−２、またはＡＴＥ＋３１を
用いて競合結合実験が行われた（図４）。標識２４ｋＤａ  ＦＧＦ−２間の競合は、標識タンパク質の結合を用量依存性で低下させ、１００倍過剰では  結合を８１±３％低下させた。この濃度では、１８ｋＤａ  ＦＧＦ−２もまた、２４ｋＤａ  ＦＧＦ−２の結合を同様に減少した（７９±５％）。しかしながら、ＡＴＥ＋３１は、１０００倍過剰濃度でも、125 Ｉ−２４ｋＤａ  ＦＧＦ−２との結合に有意な影響はなく、２４ｋＤａ  ＦＧＦ−２のアミノ末端部分内には主要なＦＧＦＲ１結合部位が見当たらないことが示唆された。ＡＴＥ＋３１がＦＧＦＲ１制御によるシグナル伝達経路を活性化する能力を有するか否かを決定するため、リン酸化特異抗体を用いて、ＥＲＫ１／２活性化に対するその影響を分析した（図５）。ＭＣＦ−７細胞及び内皮細胞のどちらにおいても、２４ｋＤａ  ＦＧＦ−２は、濃度４×１０-11   Ｍでは、ＥＲＫ１／２のリン酸化を促進し、この応答は３Ｔ３細胞でも生じる。しかし、同一モル濃度で、ＡＴＥ＋３１は、これらの細胞においてＥＲＫ１／２リン酸化には影響しなかった。濃度を４×１０-10   Ｍまで増加してもＥＲＫリン酸化量に影響はなかった。
【実施例４】
【００４１】
血管新生に対するＡＴＥ＋３１の影響は、溶媒、４ｘ１０-11   Ｍ １８ｋＤａ  ＦＧＦ−２、並びに１８ｋＤａ  ＦＧＦ−２＋１５ｎＭ  または１５０ｎＭ  ＡＴＥ＋３１を注入したマトリゲルプラグをマウス内に移植して、血管形成の度合いを測定することによって直接に試験した。ＦＧＦ−２のみが存在する場合、プラグ全体に分布するピンク色で示されるように強力な血管新生反応が生じた（図６）。１５ｎＭのＡＴＥ＋３１が存在すると、３匹のマウス全てにおいて血管の発生量が減少し、１５０ｎＭでは、血管新生は１８ｋＤａ  ＦＧＦ−２を含まないプラグと見分けがつかなかった（図６ａ）。血管新生に対するＡＴＥ＋３１の影響についてさらに詳しい定量分析を得るために、各プラグ内のヘモグロビン量を測定した。１８ｋＤａ  ＦＧＦ−２のみが存在する場合、ヘモグロビン量は、成長因子が添加されていない対照プラグと比べて３．２倍増加した（図６ｂ）。１５ｎＭ  ＡＴＥ＋３１を添加する場合は、この増加は対照値の２．６倍となり、１５０ｎＭ
ＡＴＥ＋３１が存在する場合は対照値の１．５倍のみであった。したがって、高濃度のＡＴＥ＋３１による血管発生の純増加は、１８ｋＤａ  ＦＧＦ−２のみを含むプラグによる増加の２２％のみであった。
【実施例５】
【００４２】
腫瘍の成長に対するこのタンパク質の影響を、２ｘ１０6 個のＭａｔＬｙＬｕ前立腺癌細胞を浸透させたマトリゲルプラグを用いて、４００ｎＭ  ＡＴＥ＋３１が存在する場合または存在しない場合について調査した。プラグを移植してから、プラグにＡＴＥ＋３１を添加して、これを動物中に７日間保留し、除去してから計量した。図７Ａでは、３匹の別々のマウスから除去されたマトリゲルプラグが、ＡＴＥ＋３１処理動物では、血管新生が（赤色で示すように）有意に減少することを示す。プラグの平均重量を図７Ｂに示す。未処理ＭａｔＬｙＬｕマトリゲルの重量は０．９０±０．２２グラムであるのに対して、ＡＴＥ＋３１処理プラグは０．５６±０．１９グラムであった。マトリゲルプラグの平均開始重量（細胞なし、またはＡＴＥ＋３１）をこれらの値から減算すると、ＡＴＥ＋３１が存在する場合の腫瘍サイズの純減少は４０±１８％である。
【実施例６】
【００４３】
皮下脂肪チェンバーモデルを使って、インビボでの腫瘍発生に対する血管新生反応に対するＡＴＥ＋３１の影響を試験した（図１１）。この技法は、個体内の腫瘍サイズ及び血管密度両方の長期間にわたる連続測定を可能にする。ＭＣＦ−７細胞に形成された直径の同じ（６００〜１０００μｍ）腫瘍スフェロイドを皮下脂肪チェンバー内に移植して、２４時間及びその後は２日ごとに、ＡＴＥ＋３１（２０ｎｇ）の１μｇ／ｍｌ溶液の２０μｌをスフェロイドに直接添加した。５日目に、スフェロイド領域内の新生血管構造の密度に相違が見られ、処理動物では限られた応答であったのに対して未処理動物は広範な血管
ネットワークを示した。血管密度の相違の他に、成長する血管の統合性がまたペプチドの存在によって影響された。高拡大率では、処理領域が血管の断片（矢印）を含むことを示す。これらの血管を通る血流のビデオ分析は、血流速度の減速を明らかにし、これは低分化な血管の形成に起因する影響であると考えられる。これらの相違は、１５日目にはさらに拡大した。１５日目までには、未処理動物の血管神経叢は極めて高密度となり、スフェロイド内のほとんどの空間を充満するが、処理動物はこの領域にほとんど血管が見られない。１５日目に行った皮膚の組織学的評価は、ＡＴＥ＋３１による広範な腫瘍成長抑制を示す。濃青色領域で表示される腫瘍を比較すると、その大きさが劇的に異なることが示される。１５日後の処理腫瘍スフェロイドの平均サイズは、未処理の７．８％のみであった（１．３ｍｍ2 対１６．８ｍｍ2 、  ｎ＝３）。
【実施例７】
【００４４】
哺乳類腫瘍細胞を用いる実験の他に、ルイス肺癌（ＬＬＣ）細胞に対してペプチドを試験した。これらの実験の目的は、ＡＴＥ＋３１が成長の速い、より病原性の強い腫瘍細胞に対して有効であるか否かを決定することであった（図１２）。最初の７日間は、未処理腫瘍スフェロイド（◆）は９倍成長したが、処理スフェロイド（黒塗りの四角）は３倍に増大した。未処理動物では次の３日間に腫瘍の増大速度は有意に増加して、最終容積は当初のスフェロイドの２８倍以上となった。対照的に、ＡＴＥ＋３１は腫瘍の成長を抑制し、処理腫瘍の用量は対照のわずか１９％であった。これは腫瘍の血管新生に反映された。移植の６日後には、未処理動物では高密度のネットワークが観察されたが、ＡＴＥ＋３１処理動物では新生血管を含む領域は小さく、散在しており、未発達であった。
【００４５】
ＬＬＣ細胞成長速度が迅速であるために、ＡＴＥ＋３１が血管新生の抑制とは別に腫瘍成長を抑制できるか否かを決定することができた。これによって、新生血管が腫瘍中に浸潤する前に、スフェロイドサイズが測定可能なサイズに増加することを可能とする（これは移植後約２〜３日で生じる。図１２は、蛍光標識細胞を含むスフェロイドが明瞭なエッジを有する強烈な蛍光体として見え、その平均面積は６．９±０．５ｍｍ2 であることを示す（図１２Ａ）。４８時間後、対照動物のスフェロイドは拡大して、スフェロイドの内部コアが見えなくなった、大きくかつ極めて不明瞭な構造となった（図１２Ｂ、面積＝１９．８ｍｍ2 ）しかしながら、ＡＴＥ＋３１処理は、拡大を軽減し、スフェロイド体は無傷のままである（図１２Ｃ）。有意な変化は観察されなかった（６．１±１．６ｍｍ2 ）。したがって、腫瘍成長の抑制は、血管系が存在しなくても生じることが可能であり、ＡＴＥ＋３１が抗血管新生分子であるだけではないことを示す。
【００４６】
本発明を十分に説明したので、同じことを広範なこれに相応するさまざまなパラメータ、濃度、及び条件内で、本発明の精神と範囲を逸脱することなく、また必要以上の実験を行うことなく本発明を行うことができることは当業者には理解されよう。
【００４７】
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【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１は、２４ｋＤａ  ＦＧＦ−２、２４ｋＤａ  ＦＧＦ−２のペプチド配列、及び２４ｋＤａ  ＦＧＦ−２のヌクレオチド配列模式図を示す。
【図２】図２は、２４ｋＤａ  ＦＧＦ−２切断型の細胞遊走及び増殖に対する影響を示す。Ａ．  ２４ｋＤａ  ＦＧＦ−２、ＡＴＥ＋３１（アミノ末端＋３１アミノ酸）、ＡＴＥ＋２０（アミノ末端＋２０アミノ酸）、及びＡＴＥ（アミノ末端のみ）の、ＭＣＧ−７細胞遊走に対する影響をボイデンチェンバー法で試験した。６．６ｘｌ０-11   Ｍ  （中白棒グラフ）、  ３．３ｘｌ０-10   Ｍ（中黒棒グラフ）、または  ８ｘ１０-10   Ｍ（斜線棒グラフ）のタンパク質を用いて、１０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１に応答する細胞遊走速度を測定した。結果は、１０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１のみが存在する場合のＭＣＦ−７細胞の遊走速度のパーセントとして示す。Ｂ．  ＡＴＥ＋３１によるＭＣＦ−７細胞の増殖。細胞を１８ｋＤａ  ＦＧＦ−２、２４ｋＤａ  ＦＧＦ−２、または４  ｘ  １０-10   Ｍ のＡＴＥ＋３１で処理して、チミジン取り込み率に対する影響を測定した。ＡＴＥ＋３１による影響は見られなかったが、１８ｋＤａ  ＦＧＦ−２と２４ｋＤａ  ＦＧＦ−２のどちらもチミジン取り込みを８〜１０倍促進した。結果は、成長因子が存在しない場合のチミジン取り込み率に対する割合として示す。
【図３】図３は、ＡＴＥ＋３１のアミノ末端領域内でのアルギニン→アラニン置換の遊走抑制に対する影響を示す。ＡＴＥ＋３１のアミノ末端にある５５アミノ酸は、４つの小領域に分割され、各領域のアルギニンが部位特異的突然変異によってアラニンに転換された（上パネル）。各突然変異タンパク質は、ＭＣＦ−７細胞と１０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１を用いて抑制活性について試験され、その結果は、ＩＧＦ−１のみが存在する場合の遊走速度のパーセントとして表示した。ｘ軸上の数値は、置換が生じたアミノ末端ペプチドの領域を示す。この結果は、抑制活性が領域１と２に局在している可能性を示す。
【図４】図４は、ＡＴＥ＋３１が、ＦＧＦＲ１結合について２４ｋＤａ  ＦＧＦ−２と競合しないことを示す。３Ｔ３細胞は、２ｎｇの125 Ｉ−２４ｋＤａ  ＦＧＦ−２と漸増濃度の非標識２４ｋＤａ  ＦＧＦ−２またはＡＴＥ＋３１を加えて４℃で２時間インキュベートした。表示値は、３組の試料±Ｓ．Ｄ．の平均値であり、３回または４回の実験を代表するものである。この結果は、競合相手が不在の場合の２４ｋＤａ  ＦＧＦ−２結合の最大値のパーセントとして表示される。
【図５】図５は、ＡＴＥ＋３１がＥＲＫリン酸化促進作用を有さないことを示す。ＭＣＦ−７及び内皮細胞を１ｎｇ／ｍｌの２４ｋＤａ  ＦＧＦ−２または０．３７ｎｇ／ｍｌのＡＴＥ＋３１で１０分間処理し、細胞を抽出して、タンパク質溶解産物をリン酸化ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）または総ＥＲＫに対する抗体で免疫ブロットした。
【図６Ａ】血管新生に対するＡＴＥ＋３１の影響のインビボ評価を示す図。６Ａ．メス胸腺欠損Ｎｃｒヌードマウスに、表示のようにヘパリン（２５  ．Ｉｌｇ）、ＦＧＦ−２（２０ｎＭ）及びＡＴＥ＋３１を混合したマトリゲル（５００〜Ｌ）で腹部正中線付近の３箇所に皮下注射した。注射部位は、各動物が陽性対照プラグ（ＦＧＦ−２及びヘパリン）、陰性対照プラグ（ヘパリン＋緩衝液）、並びに試験する処理を含むプラグ（FGF-2 、ヘパリン、ATE ＋３１）を受容するように選択された。全ての処置は３組で試験した。
【図６Ｂ】血管新生に対するＡＴＥ＋３１の影響のインビボ評価を示す図。６Ｂ．インビボにおけるマトリゲルプラグでの新生血管発生の定量分析。マトリゲルプラグを動物から切除して、水中に分散して３７℃で一晩インキュベートした。ヘモグロビン量は、Ｄｒａｂｋｉｎ試薬（Ｓｉｇｍａ）を製造元の指示に従って用いて測定した。この結果は、５４０ｎｍで分光測定によって定量し、添加成長因子を含まないプラグ中に存在するヘモグロビン量の関数として表示されている（左パネル）。１８ｋＤａ  ＦＧＦ−２が存在しない場合に生じる血管新生の基礎レベルを処理プラグのヘモグロビン量から減算して、その結果を１８ｋＤａ  ＦＧＦ−２のみが存在する場合に生じる血管新生のパーセントとして表示する（１００％、右パネル）。
【図７】図７は、ＡＴＥ＋３１の腫瘍成長に対する影響のインビボ評価を示す。２ｘ１０6 個のＭａｔＬｙＬｕ前立腺癌細胞を４００ｎＭ  ＡＴＥ＋３１が存在する場合または存在しない場合に０．５ｍｌのマトリゲル中に移植して、このゲルを４〜８週齢のメス胸腺欠損Ｎｃｒヌードマウスの腹部正中線付近部位の皮下に置いた。７日後、このゲルを除去して、写真撮影し（パネルＡ）、そして重量を計測した（Ｂ）。各動物に細胞もタンパク質も含まない、細胞のみ、そして細胞とタンパク質、を含むマトリゲルを注射して、それぞれの相対重量を同一個体で比較した。
【図８Ａ】全長２４ｋＤａ線維芽細胞成長因子のアミノ酸配列を示す図。
【図８Ｂ】ＡＴＥ＋３１切断型線維芽細胞成長因子のアミノ酸配列を示す図。
【図８Ｃ】ＡＴＥ＋３３切断型線維芽細胞成長因子のアミノ酸配列を示す図。
【図９Ａ】全長２４ｋＤａ線維芽細胞成長因子の核酸配列を示す図。
【図９Ｂ】ＡＴＥ＋３１切断型線維芽細胞成長因子の核酸配列を示す図。
【図９Ｃ】ＡＴＥ＋３３切断型線維芽細胞成長因子の核酸配列を示す図。
【図１０】図１０は、ＡＴＥ＋３１の転移に対する影響のインビボ評価を示す。ＡＴＥ＋３１の投与は、マウス肺における転移病巣の形成を抑制する。ＭＤＡ  ＭＢ２３１細胞（２ｘ１０5 ）をＳＣＩＤマウスの尾静脈中に注射し、ＡＴＥ＋３１を静脈注射によって週２回、６週間投与した。データは、マウス肺当たりの病巣数を表示する。
【図１１】図１１は、ＭＣＦ−７腫瘍に対するＡＴＥ＋３１の影響を示す。ＭＣＦ−７細胞を含むスフェロイドを、背側皮下脂肪チェンバー内に配置し、２０ｎｇのＡＴＥ＋３１で２日ごとに局所処理（潅流）した。左パネル、５日：処理スフェロイドは、明らかに血管供給が少なく、断片化している。右パネル、１５日、上：未処理及び最少処理群では血管神経叢が密集している。下：１５日間のＡＴＥ＋３１処理後のＭＣＲ−７腫瘍の組織学的評価。腫瘍を含む組織を除去、固定、切片標本を作成してから、ヘマトキシリンとエオシンで染色した。
【図１２】図１２は、ルイス肺癌細胞（ＬＬＣ）に対するＡＴＥ＋３１の影響を示す。図Ａ、Ｂ及びＣは、移植４８時間後の蛍光標識ＬＬＣ腫瘍の比較を示す。浸潤血管が腫瘍を浸潤する前に、蛍光標識細胞の分布を記録してその領域を定量した。Ａ．移植時、Ｂ．  未処理対照、並びにＣ．  ＡＴＥ＋３１処理（１００ｎｇ／ｍｌ）。グラフは、腫瘍の相対領域を示す（ｎ＝３）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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