(57)【要約】本発明は、霊長類及びヒトの炎症及び／または感染症の場合に形成される、炎症及び敗血症の診断及び治療のための新規なペプチド及び部分的ペプチド配列、並びに診断及び治療におけるそれらの使用、またはこれらのペプチドに対して形成された抗体の使用に関する。
2005503343.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
霊長類及びヒトの炎症及び／または感染症の場合に見出されたペプチドの以下の部分的配列（配列番号１）：
【化１】
2005503343.tif 000003
を有することを特徴とする、炎症及び敗血症の診断及び治療のためのペプチド。
【請求項２】
以下のペプチド（配列番号５）：
【化２】
2005503343.tif 000004
である、または一つ以上のその部分的配列を含むことを特徴とする、霊長類及びヒトの炎症及び／または感染症の場合に形成されるペプチド。
【請求項３】
以下のペプチド（配列番号４）：
【化３】
2005503343.tif 000005
である、または一つ以上のその部分的配列を含むことを特徴とする、霊長類及びヒトの炎症及び／または感染症の場合に形成されるペプチド。
【請求項４】
合成的または遺伝学的に操作された組換えペプチドであることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項５】
ペプチドまたはその部分的配列が、遺伝学的に操作された融合産物の一部であることを特徴とする、請求項３に記載のペプチド。
【請求項６】
配列番号１、配列番号４、または配列番号５を有するペプチドと少なくとも６０％のホモロジーを有する哺乳動物ペプチドであることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項７】
炎症及び感染症の過程の診断またはモニタリングのためのマーカーペプチドとしての、及び／または炎症及び／または感染症の過程に治療上影響する標的としての、請求項１から６のいずれか一項に記載のペプチドの使用。
【請求項８】
炎症及び感染症の過程の診断及びモニタリングのための、関連するｍＲＮＡの間接的（ＰＣＲ）または直接的検出による、請求項１から３のいずれか一項に記載のペプチドの請求項７に記載の使用。
【請求項９】
患者の生物学的液体または組織サンプルにおける、前記ペプチドまたはその断片またはこのペプチドのためのｍＲＮＡの測定による敗血症またはひどい感染症、特に敗血症様の全身的な感染症の早期鑑別診断及び診断における、そのひどさの評価における、及びその過程の治療に随伴する評価における、請求項１から６のいずれか一項に記載のペプチドの使用。
【請求項１０】
免疫化のための、及び／または前記ペプチドまたはその断片に対する特異的な抗体の調製のための、免疫原的なアジュバントと任意に組み合わせた、請求項１から６のいずれか一項記載のペプチド、またはその免疫原性の断片の使用。
【請求項１１】
特異的モノクローナル抗体の調製のための、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
ヒトにおける治療目的のための薬剤物質、及び獣医学的医薬としての、請求項１から６のいずれか一項に記載のペプチドの使用。
【請求項１３】
予防または治療の目的を有する、炎症性疾患及び感染症の過程に作用するための薬剤としての、請求項１から６のいずれか一項に記載のペプチド、または請求項１０または１１に記載の特異的抗体の使用。
【請求項１４】
所望のペプチドをコードするＤＮＡが、適切にトランスフェクトされた細胞性宿主生物において発現され、発現されたペプチドが回収されることを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載のペプチドの調製方法。
【請求項１５】
請求項１から３のいずれか一項に記載のペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項１６】
ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、または合成抗体であることを特徴とする、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１７】
請求項１から６のいずれか一項に記載のペプチド、及び製薬学的に許容可能なキャリアーを含むことを特徴とする、全身性の炎症を含む炎症の治療のための製薬組成物。
【請求項１８】
請求項１５または１６に記載の抗体、及び生理学的に許容可能なキャリアーを含むことを特徴とする、全身性の炎症を含む炎症の治療のための製薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、健常人に関しても、いずれかの病理的過程に関しても、今日まで科学文献に記載されていない生理学的発生、検出、及び生理学的機能を有する新規なペプチド、並びに医学的診断及び治療におけるそのようなペプチド、及びその断片、または部分的ペプチド、及び機能的産物の使用に関する。用語「ペプチド」は、形成された鎖の長さとは独立的なアミノ酸の縮合物を含むと企図される、遺伝学的用語の文脈において本願で使用され、即ち特に、その鎖の長さを考慮して、オリゴペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質と称され得る産物を意味する。
【０００２】
本発明は、炎症及び感染症、特に感染性の病因の炎症及び敗血症の診断及び治療のさらなる改良に関する、本出願人の集中的な研究作業に由来する。
【背景技術】
【０００３】
炎症は、各種のタイプの外的な影響、例えば傷害、火傷、アレルゲン、細菌及び真菌及びウイルスのような微生物による感染症に対する、あるいは拒絶反応を引き起こす外的組織に対する、あるいは例えば自己免疫疾患及び癌といった、身体の特定の炎症性内因的拒絶反応に対する、生物の特定の生理学的反応によって非常に一般的に定義される。炎症は、無害のものとして、身体の局所的な反応を生じ得るが、個々の組織、器官、器官の一部、及び組織の一部の数多くの重大な慢性及び急性の疾患という典型的な特徴をも有する。
【０００４】
局所的な炎症は一般的に、有害な効果に対する身体の健全な免疫反応の一部であり、それ故身体の生命保存的防御機構の一部である。しかしながら、もし炎症が、例えば自己免疫疾患のような特定の内因性過程に対する身体の誤って向けられた反応の一部である、及び／または慢性の性質を有するのであれば、またはもし炎症が、全身性炎症性反応症候群（ＳＩＲＳ）の場合、または感染によって引き起こされる重度の敗血症の場合のような、全身に亘って生じるのであれば、炎症反応に典型的である生理学的な過程はコントロールできなくなり、急性の、しばしば生命を脅かす病理学的過程となる。
【０００５】
炎症過程の起源及び進行は、主にタンパク質またはペプチドの性質を有する非常に多くの数の物質によって制御され、または多かれ少なかれ制限された時間に特定の生体分子の出現を伴う。炎症反応に関与する内因性物質は、特にサイトカイン、メディエーター、血管作用性物質、及び急性期のタンパク質、及び／またはホルモン性レギュレーターの中に数えられて良いものを含む。炎症反応は、複雑な生理学的反応であり、そこでは炎症工程を活性化する内因性物質（例えばＴＮＦ−α）と、不活性化物質（例えばインターロイキン−１０）が関与している。
【０００６】
敗血症または敗血性ショックの場合のような全身性の炎症では、炎症特異的反応カスケードは、全身に亘り非制御的な態様で広がり、過度の炎症応答に関して生命を脅かすものとなる。内因性の炎症特異的物質の個々の群の出現及び考え得る役割についての現在の知見に関して、例えば、A. Beishuizen等, "Endogenous Mediators in Sepsis and Septic Shock", Advances in Clinical Chemistry, vol. 33, 1999, 55-131（非特許文献１）;及びC. Gabey等, "Acute Phase Proteins and Other Systemic Responses to Inflammation", The New England Jounal of Medicine, Vol. 340, No. 6, 1999, 448-454（非特許文献２）が挙げられる。敗血症及び関連する全身性の炎症性疾患の理解、及び認識されている定義は数年で変化するため、K. Reinhart等, "Sepsis und septischer Schock" [Sepsis and septic shock], Intensivmedizin, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, New York, 201, 756-760（非特許文献３）が参考にされ、ここでは敗血症の最近の定義が示されている。本出願の内容では、使用される用語「敗血症」及び「炎症性疾患」は、挙げられた三つの参考文献に示された定義に基づく。
【０００７】
少なくとも欧州では、陽性の血液培養の長さによって検出可能な全身性の細菌感染が用語「敗血症」を特徴付けていた一方で、敗血症は特に、感染によって引き起こされるが、病理学的過程として、他の原因によって誘発される全身性の炎症と非常に類似点を有する全身性の炎症として現在理解されている。敗血症の理解の前記の変遷は、診断アプローチの変化を引き起こしている。かくして、細菌病原体の直接的検出は、生理学的パラメーターの複雑なモニタリングによって、及びより最近では、特に敗血症過程または炎症過程に関与する特定の内因性物質、即ち特異的「バイオマーカー」の検出によって置換されたり補われた。
【０００８】
炎症過程に関与することが既知である数多くのメディエーター及び急性期のタンパク質の中で、診断目的に適しているものは、特に炎症性疾患、または炎症性疾患の特定期に非常に特異的な出現を有するものであり、その濃度は、劇的且つ診断的に有意な態様で変化し、さらに通常の測定に必要な安定性を有し、高濃度の値に到達する。診断目的のため、病理学的過程（炎症、敗血症）と、それぞれのバイオマーカーとの信頼できる相関関係が特に重要であり、炎症過程に関与する内因性物質の複雑なカスケードにおけるその役割を知る必要性は存在しない。
【０００９】
敗血症のバイオマーカーとして特に適切であるそのような内因性物質は、プロカルシトニンである。プロカルシトニンは、感染性の原因の全身性の炎症の疾患（敗血症）の下で非常に高い値に到達する一方、健康な患者では実質的に検出できない血清濃度を有するプロホルモンである。プロカルシトニンの測定が、敗血症の早期の診断のため、及び他の原因を有するひどい炎症から感染症によって引き起こされる敗血症の早期の区別のため適切であるように、プロカルシトニンの高い値はまた、敗血症の比較的早期で到達する。敗血症マーカーとしてのプロカルシトニンの測定は、M. Assicot等, "High serum procalcitonin concentrations in patients with sepsis and infection", The Lancet, Vol. 341, No. 8848, 1993, 515-518（非特許文献４）による文献;並びに特許DE 42 27 454 C2（特許文献１）及びEP 0 656 121 B1（特許文献２）及びUS 5,639,617（特許文献３）の主題である。上記特許及び上記文献に記載された早期の文献のレファレンスに対しては、本明細書を補うためにここで参照される。近年、プロカルシトニンの主題についての数多くの文献が顕著に増大している。それ故、W. Karzai等, "Procalcitonin - A New Indicator of the Systemic Response to Severe Infection", Infection, Vol. 25, 1997, 329-334（非特許文献５）;及びM. Oczenski等, "Procalcitonin: a new parameter for the diagnosis of bacterial infection in the peri-operative period", European Journal of Anaesthesiology 1998, 15, 202-209（非特許文献６）;及びさらに、H. Redl等, "Procalcitonin release patterns in a baboon model of trauma and sepsis: Relationship to cytokines and neopterin", Crit Care Med 2000, Vol. 28, No. 11, 3659-3663（非特許文献７）;及びH. Redl等, "Non-Human Primate Models of Sepsis", Sepsis 1998; 2: 243-253（非特許文献８）;及び最近印刷されたレビューの典型であるこれらに引用されるさらなる文献のレファレンスが参照される。
【００１０】
敗血症マーカープロカルシトニンの利用可能性は、敗血症の研究に対してかなりの刺激を与え、プロカルシトニンの測定を補うことができる、及び／または細かい診断または異なる診断の目的のための付加的な情報を提供できるさらなるバイオマーカーを見出すのに多大な努力が払われている。しかしながら、潜在的な新たな敗血症バイオマーカーについての研究は、炎症または敗血症の過程に関与する特定の内因性物質の正確な機能、またはその出現についての正確な理由についてしばしばほとんどまたは全く知られていないことによって複雑になっている。
【００１１】
さらなる潜在的な敗血症マーカーの測定につての実効的な純粋に仮説的なアプローチの実験的試験の結果は、DE 198 47 690 A1及びWO 00/22439に見出すことができる。敗血症の場合、プロホルモンプロカルシトニンの濃度が増大するだけでなく、ペプチドプロホルモンの中に含まれて良い他の物質に対して、有意に増大した濃度が観察されることが示されている。記載された現象は十分に現実味がある一方で、敗血症におけるプロホルモンの濃度の増大の原因は、まだ実質的に説明されていない。
【００１２】
【非特許文献１】
A. Beishuizen等, "Endogenous Mediators in Sepsis and Septic Shock", Advances in Clinical Chemistry, vol. 33, 1999, 55-131
【非特許文献２】
C. Gabey等, "Acute Phase Proteins and Other Systemic Responses to Inflammation", The New England Jounal of Medicine, Vol. 340, No. 6, 1999, 448-454
【非特許文献３】
K. Reinhart等, "Sepsis und septischer Schock" [Sepsis and septic shock], Intensivmedizin, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, New York, 201, 756-760
【非特許文献４】
M. Assicot等, "High serum procalcitonin concentrations in patients with sepsis and infection", The Lancet, Vol. 341, No. 8848, 1993, 515-518
【特許文献１】
DE 42 27 454 C2
【特許文献２】
EP 0 656 121 B1
【特許文献３】
US 5,639,617
【非特許文献５】
W. Karzai等, "Procalcitonin - A New Indicator of the Systemic Response to Severe Infection", Infection, Vol. 25, 1997, 329-334
【非特許文献６】
M. Oczenski等, "Procalcitonin: a new parameter for the diagnosis of bacterial infection in the peri-operative period", European Journal of Anaesthesiology 1998, 15, 202-209
【非特許文献７】
H. Redl等, "Procalcitonin release patterns in a baboon model of trauma and sepsis: Relationship to cytokines and neopterin", Crit Care Med 2000, Vol. 28, No. 11, 3659-3663
【非特許文献８】
H. Redl等, "Non-Human Primate Models of Sepsis", Sepsis 1998; 2: 243-253
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本願では、さらなる炎症または敗血症特異的生体分子についての研究における別の純粋に実験的なアプローチの最初の結果が報告される。これらの実験調査もまた、感染性の原因の全身性の炎症反応に関連するプロカルシトニンの測定に由来する。かくして、プロカルシトニンが、ホルモンカルシトニンについての前駆体である場合とは、敗血症において同様な態様では明らかに形成されないことを非常に初期の段階で観察している。かくして、高いプロカルシトニンレベルは、甲状腺が除去されている患者でも観察された。それ故甲状腺は、敗血症の間でプロカルシトニンを形成または分泌する器官ではあり得ない。. Redl等, "Procalcitonin release patterns in a baboon model of trauma and sepsis: Relationship to cytokines and neopterin", Crit Cre Med 2000, Vol. 28, No. 11, 3659-3663;及びH. Redl等, "Non-Human Primate Models of Sepsis", Sepsis 1998; 2: 243-253による文献では、敗血症におけるプロカルシトニンの形成を説明することを企図するようである実験調査の結果が報告されている。この実験では、人工的な敗血症を、霊長類（ヒヒ）にエンドトキシン投与により生産し、血液中で最も高いプロカルシトニン濃度に到達する実験的に生産された状態を測定している。本願の文脈では、前記の実験に記載された実験動物モデルのさらなる開発が、ペプチド性またはタンパク質の性質の新規な内因性敗血症特異的バイオマーカーを測定するために機能し、そのバイオマーカーの出現は、敗血症または特定の形態の敗血症に特徴的であり、それ故敗血症の特異的診断を可能にする。霊長類とヒトが生理学的に非常に類似しており、多くの治療上及び診断上のヒトの試薬と高度に交差反応するため、前記霊長類モデルが選択された。
【００１４】
炎症の間で形成される内因性物質は、身体の複雑な反応カスケードの一部であり、前記物質は診断上の興味を有するだけでなく、例えば敗血症の間で広がりが観察される、炎症の全身性の広がりを同じくらい早期に停止するために、このタイプの個々の物質の形成及び／または濃度に影響を与えることによって、炎症過程に治療上の介入を与えるための試みが、かなりの努力を持って現在なされている。この文脈では、炎症過程に関与することが示されている内因性物質は、潜在的な治療上の標的であると考慮される。炎症過程の特定のメディエーターに基づき、前記過程に陽性の治療上の影響を有すると企図される試みは、例えばE.A. Panacek, "Anti-TNF strategies", Jounal fur Anasthesie und Intensivbehandlung"; No. 2, 2001, 4-5; T. Calandra等, "Protection from septic shock by neutralization of macrophage migration inhibitory factor", Nature Medicine, Vol. 6, No. 2, 2000, 164-170;またはK. Garber, "Protein C may be sepsis solution", Nature Biotechnology, Vol. 18, 2000, 917-918に記載されている。これらの治療上のアプローチは、炎症促進物質の濃度を低減するために、または前記物質の形成を阻害するために、及び特に特異的な抗体を使用してそれを実施するために（ＴＮＦ−αまたはＭＩＦに対して；E.A. Panacek, "Anti-TNF strategies", Journal fur Anasthesis und Intensivbehandlung; No. 2, 2001, 4-5; T. Calandra等, "Protection from septic shock by neutralization of macrophage migration inhibitory factor", Nature Medicine, Vol. 6, No. 2, 2000, 164-170参照）、または炎症カスケードにおいて阻害効果を有する内因性物質の濃度を増大するために（プロテインＣ；K. Garber, "Protein C may be sepsis solution", Nature Biotechnology, Vol. 18, 2000, 917-918）企図されている。最後に挙げられた文献は、選択された内因性標的分子による炎症過程に対する治療上の影響を有するためのそのような試みの外観を与えるが、前記試みは、残念ながら一般的に今日までほとんど成功を収めていない。今日までむしろ失望を与える治療アプローチに鑑みて、できるだけ炎症または敗血症に特異的であり、治療上の標的として、炎症に立ち向かう際の成功のための新たな期待を導くさらなる内因性生体分子の同定に大きな興味が存する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、感染症によって引き起こされる炎症の間に霊長類及びヒトで形成され、炎症の診断／敗血症の診断で、新規な治療上の標的として適切である新規なペプチドを提供する。
【００１６】
本発明は、霊長類へのエンドトキシン投与による敗血症の人工的な誘引の後のその特異的な出現に基づき、敗血症特異的または炎症特異的であるヒトペプチドの配列が明らかとなったペプチド配列及びその断片を開示する。
【００１７】
請求項１、２及び３は、これらの精製されまたは単離されたペプチド配列、及び特徴的な部分的配列または断片、及びそれらの融合産物に関する。請求項４から６は、前記ペプチドの特定の形態に関する。
【００１８】
検出された敗血症特異性から生ずる使用は、請求項７から１３に記載されている。請求項１５から１８は、本発明に係るペプチドに対する抗体、及びそのような抗体を含む製薬組成物に関する。
【００１９】
実験の部分で以下に詳細に記載されている通り、本発明は、エンドトキシン投与（Salmonella Typhimuriumから得たＬＰＳ）によってヒヒにおいて人工的に敗血症を誘導し、２Ｄゲル電気泳動による処理された動物の肝組織の分析の実験の後に、処理された動物でのみ同定可能なペプチドまたはタンパク質産物を見出すことが可能であったという事実に基づく。この特異的産物は、電気泳動ゲルから単離され、本質的に既知の態様でマススペクトロメトリーによって調べられた、。１２アミノ酸の部分的配列（配列番号１）が明白に同定でき、タンパク質配列を含む大きなヒトデータベースの比較により、前記配列がデータベースに貯蔵された全てのペプチド配列の二つのみの一部として同定できた。両者は明らかに、同じ仮説的タンパク質に属し（Ｒ３３７２９＿１）、これについての関連するゲノムＤＮＡは、利用可能なデータベース情報により第１９染色体に局在する。今日まで、そのようなタンパク質またはペプチドの実際の出現、及びその考え得る機能について何も印刷されていない。敗血症タンパク質としての今までのところ仮説的であるこのタンパク質の明白な同定は、かなりの科学的、診断的、及び治療的興味が有される。本出願人は、このタンパク質について「プレインフラミン」という名称を与え、前記タンパク質の将来のネーミングのための称号としてこの名称を提案する。従って、実際のマーカーペプチドとして推定的に考慮される、以下に記載のゲル電気泳動の分析の過程で直接見出され、より小さい分子量を有するより短いペプチドは、「インフラミン」と名付けられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、一方で請求項１に従って、配列番号１のアミノ酸の部分的配列の存在によって明白に定義され、全ての他の既知のペプチドとは区別されるペプチド、及び付加的なアミノ酸配列の長さ及び性質に関していずれの制限も企図されることはないタンパク質に関し、他方で請求項２に従って、配列番号５の完全なペプチドプレインフラミンに関し、請求項３に従って、配列番号４のより短いマーカーペプチドインフラミン、及び診断目的及び／または治療目的に適したその断片（部分的配列）に関し、その断片は、部分的配列が配列番号１の部分的配列を必ずしも含まずに、完全なペプチドまたはその部分的配列のそれぞれを含んで良い融合産物をも含む。本出願人におけるこの用語での使用の文脈での部分的配列はまた、一つ以上のアミノ酸または短いペプチドの配列の、例えば配列番号５の全ペプチド配列から、若しくは配列番号４のペプチドから５９から６３位に対応するペンタペプチドの、欠失の後に得られる配列として考慮される。さらに、診断目的及び／または治療目的に適した部分的配列（断片）は特に、配列番号４のペプチドの、または配列番号５の３２から１７８位の間のアミノ酸配列の部分に対応する、少なくとも３のアミノ酸、好ましくは少なくとも６のアミノ酸の配列を含むものである。この明細書におけるこの用語の使用の文脈での部分配列はまた、配列番号１、配列番号４、及び配列番号５に係る個々のアミノ酸またはペプチド断片またはペプチドの置換及び／または欠失によって形成され、前記ペプチドの一つと少なくとも６０％のホモロジー、特に少なくとも８０％のホモロジーを有するるペプチドの部分として存在できる。本発明に係るペプチドは、配列番号１、配列番号４、または配列番号５を有するペプチドの一つと少なくとも６０％のホモロジーを有し、例えば診断目的で、または獣医学的医薬で使用される哺乳動物ペプチドであっても良い。
【００２１】
現在既知である配列、及び前記ペプチドの生理学的役割のため、これらは、現在従来技術の一部である方法による診断目的及び／または治療目的のための組換え産物としての遺伝学的操作によって、または合成的に調製できる。
【００２２】
さらに、前記ペプチドまたはその適切な部分的配列は、本発明に係るペプチドの診断的測定のための補助として、または潜在的な治療薬としても適切である特異的ポリクローナル抗体、特にモノクローナル抗体の生産のための近年の従来技術の既知の方法によって使用できる。既知のペプチド部分配列に対する適切なモノクローナル抗体の生産は、現在一般的従来技術の一部である。
【００２３】
インフラミンの、または選択されたその部分的ペプチドの測定において、例えばP.P. Ghillani等, "Monoclonal antipeptide antibodies as tools to dissect closely related gene products", The Journal of Immunology, Vol. 141, No. 9, 1988, 3156-3163;及びP.P. Ghillani等, "Identification and Measurement of Calcitonin Precursors in Serum of Patients with Malignant Diseases", Cancer Research, Vol. 49, No. 23, 1989, 6845-6851における選択的プロカルシトニン測定のために記載されたように本質的に進行することが可能であり、さらにインフラミンの部分的配列に対するモノクローナル抗体に対する一つの可能性を構成する、ここに記載された免疫化法についても明白に且つさらに参照される。記載された方法の変形、及び／またはさらなる免疫化法は、関連する標準的実験から応用可能であり、当業者により文脈で適用可能である。
【００２４】
さらに、ＤＮＡでの直接的遺伝学的免疫化のための方法を使用する抗体生産もまた挙げられるべきである。得ることが可能な抗体の標本が、そのような免疫化法によって拡張できることが過去に見出されているため、例えば免疫化のための所望されるインフラミンペプチドのｃＤＮＡを使用することは、本発明の範囲内に属する。請求項４に記載のインフラミン、またはその部分的ペプチド、例えば配列番号１の部分的配列を含むもの、及び／または他の部分的配列は、入手可能な結果に基づいて、炎症及び感染症（特に敗血症タイプの全身性の感染症）の過程の診断及びモニタリングのための特異的マーカーペプチド（バイオマーカー）として機能できる。プロカルシトニンの測定と同様に、インフラミンの測定は、早期鑑別診断のための方法、診断方法、及びひどさの評価の方法、敗血症及び感染症の過程の治療に随伴する評価のため方法の使用に対して影響を有することができ、そのような方法では、インフラミンの、またはその部分的ペプチドの含量は、生物学的液体、または患者の、若しくは組織の及び炎症の存在のサンプル、ひどい感染症のサンプル、または特異的ペプチドの確立された存在及び／または量から結論付けられる敗血症のサンプル中で測定され、得られた結果は、敗血症のひどさ、及び治療についての可能性、及び／または治療の予測の確立と相関する。
【００２５】
ペプチドプレインフラミンまたはインフラミンまたはその断片またはそのいずれかの翻訳後修飾形態の測定の代わりに、関連するｍＲＮＡの測定もまた、診断目的のために可能である。
【００２６】
インフラミン、またはその断片若しくは融合産物、またはそれをコードするＤＮＡはまた、予防的な医薬または治療において使用できる。かくして例えば、適切なインフラミン断片は、本質的に既知の方法による活性の免疫化によって、インフラミン結合抗体のin vivo生産において使用できる。翻訳後修飾形態、例えばグルコシル化もしくはリン酸化形態、または製薬学的賦形剤、例えばポリエチレングリコール残基で置換された形態での、完全なインフラミンまたはその適切な部分的配列を含む分子はまた、インフラミンとして考慮されるべきである。さらにインフラミンは、存在する二つのシステイン残基から形成されたジスルフィド架橋を有する酸化形態、または還元形態で存在しても良い。インフラミン、またはその適切な部分的配列はまた、インフラミンまたはその部分的ペプチドに対する適切な特異的バインダーによって、インフラミンが体内で不活性化される、または任意に、適切な免疫吸着剤の使用で「全身性の洗浄」または血漿瀉血の意味で体外で除去される意味で、治療上の介入のための標的として機能しても良い。特に特異的抗体、特にヒト化モノクローナル抗体は、インフラミンのin vivo不活性化のために適切である。しかしながら炎症カスケードは、インフラミン自体の使用、またはインフラミンアゴニスト若しくはアンタゴニストの使用で治療上影響され得る。そのような治療上の介入は、インフラミンの生理学的機能のさらなる発見が確認された場合に特に可能である。それ故、インフラミンまたはその部分的ペプチドが、おそらくメディエーターとして、またはホルモンレギュレーターとして、炎症過程における重要な役割を果たすことは、現在では除外できない。
【００２７】
インフラミンの発見及び同定は、添付された配列表及びその部分を参考にして、以下により詳細に記載されている。図面は以下に記載されたことを示す。
【実施例】
【００２８】
１．動物モデル（ヒヒ）におけるエンドトキシン投与による感染症の刺激
エンドトキシン注射によるプロカルシトニン分泌の刺激のためにヒヒで実施された実験に基づいて（H. Redl等, "Procalcitonin release patterns in a baboon model of trauma and sepsis: Relationship to cytokines and neopterin", Crit Care Med 2000, Vol. 28, No. 11, 3659-3663; H. Redl等, "Non-Human Primate Models of Sepsis", Sepsis 1998; 2: 243-253参照）、ヒヒ（オス、約２年齢、体重２７から２９ｋｇ）を、１００μｇのＬＰＳ（Salmonella Typhimuriumから得たリポポリサッカリド、供給源：Sigma）でそれぞれ静脈内で投与した。注射から５から５．５時間後、１０ｍｌのドレタールの静脈内投与により動物を殺傷した。その死亡から６０分以内で、全ての器官／組織を切除し、液体窒素における凍結によって安定化した。
【００２９】
さらなるプロセッシングの間、１．５ｍｌのバッファーＡ（５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．１、１００ｍＭ ＫＣｌ、２０％グリセロール）を、窒素で冷却しながら個々の凍結組織のサンプル（１ｇ）に加え、サンプルをポーセレンモルタルで微粉化し、パウダーを得た（J. Klose, "Fractionated Extraction of Total Tissue Proteins from Mouse and Human for 2-D Electrophoresis", Methods in Molecular Biology, Vol. 112: 2-D Proteome Analysis Protocols, Humana Press Inc., Totowa, NJ参照）。その後４℃で１時間１００，０００ｇで遠心分離後、得られた上清を回収し、さらなるプロセッシングの必要まで−８０℃で貯蔵した。
【００３０】
この態様で得られた組織抽出物を使用して、最も多い量の既知の敗血症バイオマーカーであるプロカルシトニンが、調査された組織のどこでエンドトキシン投与によって生産されるかを測定する調査を最初に実施した。さらに、プロカルシトニンの最大レベルを有する測定された組織において、エンドトキシン投与の後のみに出現する、以前に未同定のタンパク質産物を、ディフェレンシャルプロテオーム分析によって求めた。この目的のため、未処理のヒヒの組織サンプルをコントロール組織サンプルとして使用し、サンプルの犠牲と取得法は、処理動物の場合と同様の条件下で実施した。
【００３１】
２．エンドトキシン注射の後の最大レベルのプロカルシトニン形成を有するヒヒ組織の測定
一方で、ポリスチレンチューブに固定化されたヒヒカルシトニンに対する抗体、及びアクリジウムエステルで標識され、ヒヒプロカルシトニンのＮ末端に対して向けられたモノクローナル抗体を使用して操作される免疫発光定量試験の補助で、個々の組織のサンプルを調査した（ヒトプロカルシトニンの測定のために開発された本出願人のLU-MItest(登録商標)PCTと同様に）。この試験の補助で、個々のサンプルにおけるヒヒカルシトニンの含量が、組換えヒトカルシトニンを使用する試験の較正の後に測定された。
【００３２】
実験により、肝組織が最大量のプロカルシトニンを与えることが示された。それ故、前述の態様で得られたヒヒ肝臓から得られたタンパク質抽出物が、新規な敗血症特異的バイオマーカーについてのサーチのために使用された。
【００３３】
３．ヒヒの細胞質肝細胞タンパク質を使用するプロテオーム分析
一方で、健康なヒヒ（コントロール）の、他方で、ＬＰＳで注射されているヒヒの、細胞質肝細胞タンパク質抽出物を、プロテオーム分析において使用した。最初の分析的２Ｄゲル電気泳動では、１００μｇのタンパク質を含む肝臓抽出物を、９Ｍウレア、７０ｍＭ ＤＴＴ、２％アンフォライト、ｐＨ２−４に安定化し、次いで、J. Klose等, "Two-dimensional electrophoresis of proteins: An updated protocol and implications for a functional analysis of the genome", Electrophoresis 1995, 16, 1034-1059に記載されたような分析的２Ｄゲル電気泳動によって分離した。２Ｄ電気泳動ゲルにおけるタンパク質の視覚化を、銀染色によって実施した(J. Heukeshoven等, "Improved silver staining procedure for fast staining in Phast-System Development Unit. I. Staining of sodium dodecyl gels", Electrophoresis 1988, 9, 28-32参照)。
【００３４】
評価のため、非処理動物のサンプルのタンパク質スポットパターンを、処理動物の肝組織サンプルから得られたタンパク質スポットパターンと比較した。コントロールサンプルでは出現しないが、全ての処理動物で付加的に出現する物質を、さらなる分析的調査のために選択した。図１は、コントロールサンプル（Ａ）と処理動物のサンプル（Ｂ）についての２Ｄ電気泳動ゲルの比較を示し、インフラミンに対応する（Ｂ）における付加的なタンパク質スポットの位置が、矢印と円によって強調されている。
【００３５】
次いで、分析的２Ｄゲル電気泳動のタンパク質スポットパターンで同定された新規な特異的タンパク質を、３５０μｇのタンパク質を使用して予備的２Ｄゲル電気泳動によって調製した（もう一度（１０）参照）。予備的２Ｄゲル電気泳動では、染色をクマシーブリリアントブルーＧ２５０によって実施した(V. Neuhoff等, "Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250", Electrophoresis 1988, 9, 255-262参照)。
【００３６】
さらなる分析のために事前選択されたタンパク質スポットを、A. Otto等, "Identification of human myocardial proteins separated by two-dimensional electrophoresis using an effective sample preparation for mass spectrometry", Electrophoresis 1996, 17, 1643-1650に記載された方法を使用してゲルから切り出し、トリプシン切断し、次いで特に例えば、G. Neubauer等, "Mass spectrometry and EST-database searching allows characterization of the multi-protein splicesome complex", Nature genetics vol. 20, 1998, 46-50; J. Lingner等, "Reverse Transcriptase Motifs in the Catalytic Subunit of Telomerase", Science, vol. 276, 1997, 561-567; M. Mann等, "Use of mass spectrometry-derived data to annotate nucleotide and protein sequence databases", TRENDS in Biochemical Sciences, Vol. 26, 1, 2001, 54-61に記載され議論されたようなマススペクトル測定調査の使用により、マススペクトロメトリーにより分析した。ＥＳＩ（ElectroSprayIonization：電気スプレーイオン化）の後、トリプシン切断サンプルをタンデムマススペクトロメトリーにかけた。Micromass, UK社製のナノフロー−Ｚ−スプレーイオンソースと称されるＱ−ＴＯＦマススペクトロメーターを使用した。方法は、装置の製造者の作業説明書に従った。
【００３７】
４．インフラミンの同定
図１（Ａ）と１（Ｂ）に示されているように、ＬＰＳ注射が投与されているヒヒの肝細胞抽出物は、本質的に新規なタンパク質を含み、その分子量は、既知の分子量のマーカー物質との比較によるゲル電気泳動データに基づいて、約１５，０００±７００ドルトンと見積もられる一方、その等電点は、第一次元から得たタンパク質の相対的位置から約６．５から７と見積もられた。
【００３８】
このタンパク質を前述のようにマススペクトロメトリーにより分析し、図２は全トリプシン切断タンパク質のマススペクトルを示す一方、図３は、タンデムマススペクトロメトリーによって選択され、６６０．８のマス／Ｚを有する断片のスペクトルを示す。この断片について得られたマススペクトルは、本質的に既知の態様でコンピューター的に、配列番号１の部分的配列を有すると評価できた。次いでこの部分的配列を、配列データベースで入手可能であるタンパク質配列と比較した（ＯＷＬデータベースhttp://www.matrixscience.com；またはhttp://www.ch.embnet.org）。大きなデータベースno. 2.13.2001では、配列番号１に係る断片の１００％が存在する二つの配列が測定された。二つの配列部分は、ヒトゲノムプロジェクト由来の仮説的タンパク質Ｒ３３７２９＿１であると評価でき、一つの配列（配列番号２）は、「部分的ＣＤＳ」と称される１５２アミノ酸(AAC33800; DBSOURCEローカスAC005594; Accession AC005594.1)を有する部分的配列である一方、第二の部分的配列（配列番号３）は、「仮説的タンパク質」と称される１７０アミノ酸（ローカスCAB96947; DBSOURCE emblローカスIR1875335; accession AL365373.1）を有する配列である。両者の配列は仮説的ヒトタンパク質の一部であり、そのコード配列は第１９染色体に存在する。第一の配列（「部分的ＣＤＳ」）は配列表に記載された配列番号２の配列であり、第二の部分的配列は、配列表の配列番号３に係る配列である。配列番号２の部分的配列は、全仮説的タンパク質の開始コドン（１−３位）を含む一方、配列番号３の第二の部分的配列は、停止コドン（１４５−１７０位）の前にさらなるアミノ酸を含み、リボソームにより生産される配列番号５の全タンパク質を、二つの配列を組み合わせることによって表すことができる。配列番号２と配列番号３の二つの配列内の唯一の偏向は、配列番号２の配列の５９−６３位におけるペンタペプチドであり、それは第二の部分的配列にカウンターパートを有さない。配列番号２は、ゲノムＤＮＡの理論的エキソン／イントロン予測に基づく一方、配列番号３はｃＤＮＡから由来する。４の同様なマウスｃＤＮＡ(BAB25579、BAB25931、BAB23155、BAB31038)は、ヒトｃＤＮＡの場合のように、対応するペンタペプチド配列を含まない。かくして、見出されたヒトポリペプチドは、このペンタペプチド配列を含まないであろう。しかしながら、もし前記ペンタペプチドが不存在であったとしても、配列番号５の理論的分子量（約１９ｋＤａ）は、新規なタンパク質スポットについて実際に見出された値（１５±０．７ｋＤａ）より大きい。ポリペプチドの細胞外局在に関与するであろうＮ末端シグナル配列についての予測プログラム（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）における配列番号５のチェックは、高い可能性で、配列番号５の最初の３１アミノ酸が、小胞体の膜を通過する発生期のポリペプチドのトランスロケーションの際にシグナルペプチダーゼから切断されることを示した。そのような短縮化は、ゲル電気泳動で実際に観察された分子量と良好に一致するであろう。前述の同様のマウス配列での同一の分析は、類似する予測を与える。短縮化の実験的な証拠は、配列番号１のペプチドの検出である。これは、トリプシンでの電気泳動から得た新規なタンパク質スポットの処��の後に、マススペクトロメトリーにより同定された。配列番号１では、トリプシン切断で典型的であろう、配列番号５のＮ末端側の位置での塩基性アミノ酸が存在しないという事実は、重要である。他方で、見出された切断は、シグナルペプチダーゼの作用の下で予測されるであろう切断と正確に対応する。それ故、配列番号５のタンパク質（ペプチド）はプレインフラミンと称されるべきである一方、配列番号４が推定の成熟インフラミンとして提案される。配列番号４は、１−３１位及び５９−６３位が欠失している点で、配列番号５とは異なる。
【００３９】
今日まで記載されているような前記タンパク質、及び今日までそのようなタンパク質に割り当てられる既知のペプチドまたはペプチドホルモン断片は存在しない。かくしてそれは、投与されたエンドトキシンとの霊長類動物の接触の後に最初に観察される発現を有する新規タンパク質（またはペプチド）として名付けられるべきである。今日まで、前記タンパク質についての天然の役割について予測のみが可能である。それは、生物学的に活性な未知の物質の前駆体であろう（例えばアミノ末端メチオニンを有する及び／または有さない標的配列を有するプロホルモンの前駆体）。初めてで、記載された高い特異性についての同定は、このタンパク質を、約束されている診断上の標的、及び治療上の介入のための新規な興味ある標的とするであろう。
【００４０】
既知の完全な配列は、診断上及び／または治療上の目的のため、特にペプチドの調製のための既知の合成または遺伝学的操作法を使用して、全ペプチドまたはそのいずれかの部分的配列（断片）の特異的な調製を可能にする。次いでそのようなペプチドは、例えばP.P. Ghillani等, "Monoclonal antipeptide antibodies as tools to dissect closely related gene products", The Jounal of Immunology, Nol. 141, No. 9, 1988, 3156-3163;及びP.P. Ghillani等, "Identification and Measurement of Calcitonin Precursors in Serum of Patients with Malignant Diseases", Cancer Research, Vol. 49, No. 23, 1989, 6845-6851に記載された方法に類似して、適切な抗体、特にモノクローナル抗体の提供のために機能しても良く、それは次いで、インフラミンまたは選択されたその部分的ペプチドの免疫診断的測定のためのアッセイを提供可能である。
【００４１】
記載された既知の態様で入手可能なモノクローナル抗体は、特に本質的に既知のヒト化の後、新規な治療薬の開発のために機能できる(K. Garber, "Protein C May be sepsis solution", Nature Biotechnology, Vol. 18, 2000, 917-918に要約された治療的アプローチ参照)。さらに、インフラミンのin vivo中和化はまた、インフラミン遺伝子の発現をブロックすることによって可能である。
【００４２】
さらに、製薬学的な活性物質としてのインフラミン自体またはその部分的ペプチドの使用も、本発明の範囲内にある。従って本発明はさらに、実際の活性物質として、本発明に係るペプチドまたはこれらのペプチドに対して生産された抗体の一つを含み、適切な製薬学的キャリアーと共に患者に投与するように作用する、製薬組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、健康なヒヒの細胞質肝細胞タンパク質のスポットパターン（Ａ）を、ＬＰＳ投与によって敗血症を誘導した５時間後のヒヒの肝細胞スポットパターン（Ｂ）と比較した２Ｄ電気泳動ゲルの様子を示す。矢印は、本発明にかかる敗血症特異的産物、インフラミンの位置を示し、それは円によって図（Ｂ）で区別されている。
【図２】図２は、２Ｄゲル電気泳動によって同定された、トリプシン切断された完全な産物インフラミンのマススペクトルを示す。
【図３】図３は、６６０．８０のチャージ／マス比でのトリプシン切断の選択されたペプチド断片のタンデム電気泳動の結果を示す。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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