(57)【要約】  血清を使用したｃＤＮＡ呈示ライブラリーの選択による特異的腫瘍抗原の同定方法であって、選択をファージディスプレイ技術により行い、特に選択をＳＥＲＥＸ技術(組換えｃＤＮＡの発現による自己腫瘍抗原の血清学的分析)により実施することを特徴とする方法が記載されている。本発明方法は、ＳＥＲＥＸ方法を上記ファージ・ディスプレイ技術の有効性と有利に組合わせると同時に、ＳＥＲＥＸ技術特有の欠点を回避するものである。
2005508616.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
選択をファージディスプレイ技術で遂行することを特徴とする、血清でのｃＤＮＡライブラリーの選択による特異的腫瘍抗原の同定方法。
【請求項２】
選択をＳＥＲＥＸ技術(組換えｃＤＮＡの発現による自己腫瘍抗原の血清学的分析)により遂行する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
選択をアフィニティー選択技術により遂行する、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
ライブラリーを腫瘍生検から入手する、請求項１記載の方法。
【請求項５】
ライブラリーを培養された腫瘍セルラインから入手する、請求項１記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５記載の方法で得られる腫瘍抗原。
【請求項７】
- MGTSRPANREAKQLHHQPHSIELIQSSGR;
- MGTSRPANSEVYKPTLLYSSGR; 
- MGTSGRPTVGFTLDFTVDPPSGR; 
- MGTSRAGQLYRTTLTYTSGR; 
- MGTSRAGQLHAFPLHSTTLYYTTPSGR;
- MRYYTATKTYELMLDATTQTSGR;
- MRVIDRAQAFVDEIFGGGDDAHNLNQHNSSGR
から成る群から選択される、請求項６記載の抗原。
【請求項８】
-VLVAGQRYQSRSGHDQKNHRKHHGKKRMKSKRSTSLSSPRNGTSGR;
-MGTSRAGQQREQEKKRSPQDVEVLKTTTELFHSNEESGFFNELEALRAESVATKAELASYKEKAEKLQEELLVKETNMTSLQKDLSQVRDHQGRG; 
-AGTSRAGQHAFEQIPSRQKKILEEAHELSEDHYKKYLAKLRSINPPCVPFFGIYLTNLLKTEEGNPEVLKRHGKELINFSKRRKVAEITGEIQQYQNQYCLRVESDIKRFFENLNPMGNSMEKEFTDYLFNKSLEIEPRKPSGR;
-MGTSRAGQQERSLALCEPGVNPEEQLIIIQSRLDQSLEENQDLKKELLKCKQEARNLQGIKDALQQRLTQQDTSVLQLKQELLRANMDKDELHNQNVDLQRKLDERTQRP;
-MGTSRAGQPMSGHGSFQEVPRLHTSAQLRSASLHSEGLSCCQEGQVGQCQSPETDQQQPKMHQPSGR;
-TSRAGQLARIPSVTASEQGRT;
-TSGPANAAPPSADDNIKTPAERLRGPLPPSADDNLKTPSERQLTPLPPAAAK;
-TSRAGQRELGRTGLYPSYKVREKIETVKYPTYPEAEK;
-TSVLEPTKVTFSVSPIEATEKCKKVEKGNRGLKNIPDSKEAPVNLCKPSLGKSTIKTNTPIGCKVRKTEIISYPSTSGR;
-MDLTAVYRTFHPTITEYTFYLTVHGTFSKIDHMIGHKTSLNKSKKTEIISSTLSDHSGIKLESNSKRNPQIHASGR;
-MPIDVVYTWVNGTDLELLKELQQVREQMEEEQKAMREILGKNTTEPTKKRSYFVNFLAVSSGR;
-TSGRPTYKVNISKAKTAVTELPSARTDTTPVITSVMSLAKIPATLSTGNTNSVLKGAVTKEAAKIIQDESTQEDAMKFPSSQSSQPSRLLKNKGISCKPVTHPSGR;
-TSRAGQLRFSDHAVLKSLSPVDPVEPISNSEPSMNSDMGKVSKNDTEEESNKSATTDNEISRTEYLCENSLEGKNKDNSSNEVFPQYASGR;
-TSRAGQRKQSFPNSDPLHQSDTSKAPGFRPPLQRPAPSPSGIVNMDSPYGSVTPSSTHLGNFASNISGGQMYGPGAPLGGAPTSGR;
-MGTSRAGQPTSENYLAVTTKTKHKHSLQPSNASISLLGIYPTPSGR;
-TSRAGQRDTQTHAHVSVCVHTPHHTYKYPTSGR
から成る群から選択される配列または該配列をコードする遺伝子の産物の全体または一部の腫瘍抗原としての使用。
【請求項９】
乳癌腫瘍抗原としての
-TSRAGQRYEKSDSSDSEYISDDEQKSKNEPEDTEDKEGCQMDKEPSAVKKKPKPTNPVEIKEELKSTPPA;
-MGTSRAGQLVEELDKVESQEREDVLAGMSGKSSFQRSEGDFLLRSLTSGR
から成る群から選択される抗原または該配列をコードする遺伝子の産物の全体または一部の使用。
【請求項１０】
腫瘍病変の画像診断用造影剤の製造に有用な活性剤としての、請求項６〜９記載の抗原の使用。
【請求項１１】
胸部腫瘍病変の画像診断用造影剤の製造に有用な活性剤としての、請求項９記載の抗原の使用。
【請求項１２】
請求項６〜９のいずれか１項記載の抗原についての特異的リガンド。
【請求項１３】
請求項６〜９のいずれか１項記載の抗抗原抗体。
【請求項１４】
標的特異的造影剤の製造についての請求項１２記載のリガンドまたは請求項１３記載の抗体の使用。
【請求項１５】
腫瘍診断についての請求項１４記載の使用。
【請求項１６】
請求項６〜９記載の少なくとも一抗原および／または請求項１２記載の少なくとも一特異的リガンドおよび／または請求項１３記載の抗体を含む標的特異的造影剤。
【請求項１７】
請求項９記載の少なくとも一抗原および／または請求項１２記載のその少なくとも一特異的リガンドおよび／または請求項１３記載のその特異的抗体を含む乳癌特異的造影剤。
【請求項１８】
ｃＤＮＡライブラリーについての発現／ディスプレイ・ベクター(λＫＭ４)。
【請求項１９】
請求項１〜５のいずれか１項記載の方法における請求項１８記載のベクターの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、腫瘍に罹患した対象から誘導されたｃＤＮＡライブラリーの血清での選択による特異的腫瘍抗原の同定および特に腫瘍診断方法に関するものである。
【０００２】
本発明は、また、動物または人体に直接使用されない診断補助器具の製造の技術分野に関するものである。
【０００３】
本発明は、医薬分野における工業的適用に適した化合物、それらの製造方法、それらの使用方法、およびそれらを含む組成物を提供する。
【０００４】
本発明は、診断医学、例えば臓器および組織の病的異常の検出および診断についての画像技術に有用な物質に適した化合物、組成物および方法を提供する。
【０００５】
特に、限定するわけではないが、本発明は腫瘍診断セクターに関するものである。
【０００６】
（発明の背景）
早期診断は、患者の生活の質をかなり改善させ、同時に国民の健康保険システムおよび患者自身にとっても経費節約となり得るため、全医学分野における重要な優先事項であり、非常に所望されている目標である。
【０００７】
利用可能な様々な診断技術の中で、現時点ではいわゆる非侵襲性技術を好む傾向があり、これらの中でも、患者を複雑で時には苦痛や危険を伴うこともある診断的検査、例えば試料および生検採取を伴う検査にかけることなく、可能性のある病的異常の存在を確かめる方法を代表する様々な画像化技術がある。
【０００８】
最も一般的に使用されているイメージング技術としては、コンピューター連動断層撮影(ＴＣ)、磁気共鳴(ＭＲ)、超音波検査法(ＵＳ)およびシンチグラフィー(ＳＣ)を挙げることができる。
【０００９】
これらの画像化技術は、有効性の高い造影剤の使用を必要とする。しかしながら、それらの開発は、高感度画像によりもたらされる解剖学的特性確認の改良に向けられているに過ぎず、現在までのところ組織特性確認に関するシグナルの特異性の開発には成功していない。現在極めて小さいサイズでも解剖学的病変を視覚化するのは可能であるが、観察される病変の性質の特定には依然として侵襲型検査が必要とされる。
【００１０】
この問題に対する一つの解決法は、健康な組織と病変部との画像コントラスト度を選択的および特異的に高め得る造影剤の開発である。
【００１１】
既知技術により提供される一例は、造影剤のビークルとしてのモノクローナル抗体の使用であり、この意味ではＳＣおよびＭＲ分野で既に試みられている。依然としてさらなる改良を必要とするにせよ、ＳＣ技術では肯定的な成果を得ているが、ＭＲでの結果はまだ満足すべきものではない。同じく結果を改善する必要性は、超音波検査分野でも認められている。
【００１２】
腫瘍抗原の同定により、標的特異的造影剤(ＴＳＣＭ)構築用の新規で改良された試薬が提供され得る。多少なりとも特異的腫瘍抗原は公知であり、それらは実験動物において抗体を刺激する抗原−免疫原として腫瘍細胞を用いて得られる。また、患者自身において抗体産生を刺激する若干の腫瘍抗原も知られている(例えば、ｐ５３、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ)。これらのタイプの抗原は、原則として、健康な組織と腫瘍組織とを区別するマーカーとして優れた候補である。しかしながら、それらの同定は慣用的方法を用いた場合困難である。
【００１３】
ＳＥＲＥＸ(組換えｃＤＮＡの発現を通した自己腫瘍抗原の血清学的分析、P.N.A.S. ９２、１１８１０、１９９５参照)として知られる、様々なタイプの腫瘍に罹患した患者の血清によるｃＤＮＡライブラリーの分析(スクリーニング)方法の最近の開発により、多数の腫瘍抗原が同定された。
【００１４】
ＳＥＲＥＸ技術は、新規腫瘍抗原の同定に明らかに有用であるが、非常に面倒な性質のライブラリースクリーニング操作、高度のバックグラウンドノイズおよび大量の必要材料に存する多くの欠点を呈する。
【００１５】
最初の腫瘍抗原(カルボニックアンヒドラーゼ)が特性確認された年である１９９３年以来、腫瘍において特異的に発現され、それに対して免疫応答が発せられる、６００を越える種々のタンパク質が同定されており[M.Pfreundschuch et al. Cancer Vaccine Week,International Symposium、１９９８年１０月５〜９日、Ｓ０３]、この数はさらに増えると予測される[現在ＳＥＲＥＸデータベースは、１６９５の公開配列を含む(www.licr.org/SEREX.html)]。ただし、興味深いことに、単離された配列の２０〜３０％がまだ未知の遺伝子産物である。
【００１６】
しかしながら、腫瘍の診断および処置を目的とする特異的腫瘍抗原の同定技術を改良するには、さらなる研究が必要である。
【００１７】
（発明の要約）
ＳＥＲＥＸ技術とファージディスプレイの組合わせ、すなわち小タンパク質ドメインが対応遺伝情報を内包しているバクテリオファージの表面で提示されるライブラリーの選択に基いた戦略が、血清でのｃＤＮＡディスプレイライブラリーの選択による特異的腫瘍抗原の同定方法を提供し得ることを見出した。この方法を用いると、非常に大きなライブラリー(すなわち、多数の異なる配列を発現する)から抗原を同定することが可能であると判明した。かくして同定された抗原は、造影剤の製造で使用し得るかまたは特異的リガンドを得ることを可能にし、次いで該リガンドは造影剤の製造で使用し得る。
【００１８】
したがって、本発明の一対象は、血清によるｃＤＮＡディスプレイライブラリーの選択による特異的腫瘍抗原の同定方法であって、ファージディスプレイ技術を用いて選択を遂行することを特徴とする方法である。
【００１９】
本発明の対象は、腫瘍病変の画像診断用造影剤の製造に有用な腫瘍抗原の同定方法およびその方法で得られる造影剤を提供することである。
【００２０】
造影剤は、この分野で公知の通常手順にしたがって製造され得るもので、これ以上の説明は必要ではない。
【００２１】
（発明の詳細な記載）
本発明は、生検(好ましくは鮮度がよいもの)および培養腫瘍ラインの両方から得られる、腫瘍細胞からのｃＤＮＡライブラリーの構築、自己および異種の患者血清での該ライブラリーの選択(スクリーニング)による、新しいものを含む腫瘍抗原の同定、該抗原の特性確認、上記腫瘍抗原に特異的なリガンドの生成(例えば、抗体、例えば組換えヒト抗体またはヒト化組換えネズミ抗体)、および生成されたリガンドを組込む標的選択的造影剤の構築を含む。
【００２２】
本発明による方法は、有利にはＳＥＲＥＸ方法を上記ファージ‐ディスプレイ技術の有効性と組合わせると同時に、上記で概説したＳＥＲＥＸ技術に特有な欠点を回避する。
【００２３】
「ファージディスプレイ」とは、通常レベルの当業者が認識するように、小タンパク質ドメインが対応遺伝情報を内包するバクテリオファージの表面で呈示されているライブラリーの選択に基いた戦略である。
【００２４】
本発明に従って実行される方法は、初めて以下の新規で有利な解析可能性を提供する：
−スクリーニング前に、複雑度を低減化させる方法で、腫瘍(罹患)患者血清でライブラリーを選択し、特異抗原を発現するクローンでライブラリーを濃厚化することによる、少量の血清の使用による腫瘍抗原の同定；
−技術的問題により、当技術分野の現状レベルで実現されるｃＤＮＡライブラリーの直接スクリーニングでは、多数のクローン（約１００万を越えるクローン）の解析は行えないため、組換えＤＮＡ技術の可能性を全て活用するのに適切ではない。本発明方法によると、事実、伝統的にＳＥＲＥＸで使用されているものより１０〜１００倍大きいライブラリーの構築および解析が可能であるため、限られた程度でしか存在しない抗原であっても、同定できる見込みが高くなる；
−最後に、異なる患者の血清または血清混合物を用いて後続選択サイクルを実施し得ることにより、本発明の主目的の一つを構成する交差反応性腫瘍抗原の同定が容易になる。
【００２５】
非指向的方法でクローン化されたｃＤＮＡのライブラリーでは、生成されるタンパク質の約６分の１(１６.７％)が正確であると予測される。このタイプのライブラリーを真の翻訳生成物で濃厚化することが、発現／ディスプレイライブラリーの実際の課業である。本発明はまた、ｃＤＮＡの発現、および「枠外」タンパク質の発現が限られたバクテリオファージラムダタンパク質Ｄ(ｐＤ)のアミノ末端部分との融合体としてのタンパク質の呈示についての新規ベクターを提供する。ベクター設計によると、ファージは、そのＯＲＦ(「読み枠」)がｐＤの場合と一致する場合のみ、表面にタンパク質フラグメントを呈示させる。我々のライブラリーにおけるクローン化ＤＮＡのフラグメントの平均サイズは１００〜６００ｂｐ(塩基対)であり、統計的理由によると、「枠外」配列のほとんどは、ｐＤを翻訳させ得ず、ファージ表面で呈示されない停止コドンを含む。この場合、野生型ｇｐＤのラムダゲノムのコピーは、キャプシドの構築を支える。ｃＤＮＡライブラリーについての新規発現／ディスプレイベクター(λＫＭ４)は、ｃＤＮＡフラグメントによりコードされた組換えタンパク質がバクテリオファージ自体のタンパク質との融合体として発現され、キャプシドで呈示される点で、ＳＥＲＥＸ実験で使用されるもの(λｇｔ１１)とは異なる。
【００２６】
各ライブラリーについて、十分な数の細胞、例えば１０７細胞のメッセンジャーＲＮＡを、一般的に市販されている手段を用いて精製し、対応するｃＤＮＡを生成させる。次いで、後者を発現／ディスプレイ・ベクターλＫＭ４でクローン化する。ライブラリーの増幅は、当業者に公知の通常技術により、例えば平板培養、増殖、溶離、精製および濃縮により行う。
【００２７】
次に、ライブラリーを用いて、同定された配列の選択、「スクリーニング」および特性確認に要求される条件を明らかにする。
【００２８】
ヒト細胞由来のｃＤＮＡを用いて構築された、ファージ‐ディスプレイタイプのライブラリーで、アフィニティーによる選択が可能となる。これは、キャプシドにおいてヒトタンパク質部分(一般的に腫瘍で発現される)を発現し、対応遺伝情報を内包するバクテリオファージの集合体と、特異血清のインキュベーションに基く。血清中に存在する抗体と特異結合するバクテリオファージは、固体支持体に(抗体自体により)結合したままであり、他方、非特異的結合したものは洗い流されるので、容易に採取し得る。
【００２９】
「スクリーニング」、すなわち所定の血清の抗体に対する単一ファージクローンの結合能の直接分析は、後の段階でのみ、選択の結果として、ライブラリーの複雑度(すなわち異なる配列数)が実質的に低減化されたときに行なう。
【００３０】
選択戦略の使用により、特定の、例えば腫瘍患者の血清中に存在する抗体と特異的に相互作用する特性に応答するものの同定を目的とする多数の異なるタンパク質配列の迅速な解析が可能となる。
【００３１】
アフィニティーによる選択は、キャプシドにおいてヒトタンパク質部分(一般的に腫瘍で発現される)を発現させ、対応する遺伝情報を内包するバクテリオファージの集合体と特異血清のインキュベーションに基いている。血清中に存在する抗体と特異結合するバクテリオファージは、固体支持体に(抗体自体により)結合したままであり、他方、非特異的結合したものは洗い流される点ので、容易に採取し得る。
【００３２】
「スクリーニング」、すなわち所定の血清の抗体に対する単一ファージクローンの結合能の直接分析は、後の段階でのみ、選択の結果として、ライブラリーの複雑度(すなわち異なる配列数)が実質的に低減されたときに行う。
【００３３】
この結果、負担となる労力が低減され、特に各分析に使用される血清の量も低減され得る。
【００３４】
標準的なｃＤＮＡライブラリーの直接「スクリーニング」は、事実、必ずしも調達しやすいものではない大量の血清の使用を必要とする。約１０６の独立クローンのライブラリーを解析するためには、予め選択された(自己)血清と、細菌感染させた様々なペトリ皿から移された全部で少なくとも１０６ファージプラークを含む多数のフィルターをインキュベーションしなければならない。別の血清による同じライブラリーの解析は、増幅ライブラリーを用いる場合のみ可能であり、これは１０６クローンの分析、もとのライブラリーの複雑度の喪失、またはスクリーニングの１０〜１００倍伸長および１０７〜１０８クローンの試験実施を意味する。
【００３５】
さらにこの戦略では、ライブラリーにおいて微量でしか存在しないかまたは低濃度で存在する抗体により認識される抗原を同定し得ず、異なる血清で多重解析を実施することもできない。
【００３６】
他方、ファージ・ディスプレイタイプのライブラリーの使用により、増幅ライブラリーの合計１０１０〜１０１１ファージ粒子および限られた量、例えば１０μｌの血清から出発して、直接スクリーニング前に少量(０.１〜１ｍｌ)でのアフィニティーによる選択が行い得る。すなわち、標準的ライブラリーより１０〜１００倍大きい複雑度をもつライブラリーを好都合に扱うことができるため、困難とされていた抗原を同定できる確率が高くなる。例えば、８２ｍｍフィルターで２回選択サイクルおよび１回スクリーニングを行う場合、血清の全消費量は僅か４０μｌですむ。
【００３７】
さらに、ファージ・ディスプレイタイプのライブラリーの解析は、潜在的に多数の異なる血清で遂行し得ることに注目することが重要である。すなわち、同じタイプの腫瘍に罹患した異なる患者の血清中に存在する抗体と相互作用し得る抗原(交差反応性抗原)の同定に有利な選択戦略を使用することが可能である。
【００３８】
様々なプロトコールを異なる固体支持体の使用に基いて採用し得る。これらのプロトコールは当業者に公知である。
【００３９】
様々なプロトコールは、種々の固体支持体、例えば以下のものの使用に基いて用い得る：
−セファロース：血清抗体と結合したファージを、免疫グロブリンを特異的に認識するプロテインＡで被覆したセファロース樹脂に結合させる。この樹脂を短時間の遠心分離操作で洗浄することにより、非特異的(aspecific)成分を除去し得る。
−磁気ビーズ：血清抗体と結合したファージを、ヒト抗ＩｇＣポリクローナル抗体で被覆した磁気ビーズを用いて回収する。これらのビーズを洗浄し、磁石で試験管壁に結合させる。
−ペトリ皿：血清抗体と結合したファージを、予めプロテインＡで被覆しておいたペトリ皿に結合させる。単に洗浄液を吸引することにより皿を洗浄する。
【００４０】
以下、実施例および図面により本発明をさらに詳しく説明する。図１は、ベクターλＫＭ４のマップを表す。
【実施例】
【００４１】
ファージおよびプラスミド：
プラスミドｐＧＥＸ−３Ｘ(Smith D.B.およびJohnson K.S.、Gene、６７(１９８８)３１−４０)のＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ部位において、合成オリゴヌクレオチドＫ108 5'-GATCCTTACTAGTTTTAGTAGCGGCCGCGGG-3'とＫ109 5'-AA-TTCCCGCGGCCGCTACTAAAACTAGTAAG-3のハイブリダイゼーションから誘導されたＤＮＡフラグメントをクローン化することにより、プラスミドｐＧＥＸ−ＳＮを構築した。
【００４２】
プラスミドｐＫＭ４のＲｓｒIIおよびＥｃｏＲＩ部位において、合成オリゴヌクレオチドＫ106 5'-GACCGCGTTTGCCGGAACGGCAATCAGCATCGTTCACCACCAC-CACCACCACTAATAGG-3'とＫ107 5'-AATTCCTATTAGTGGTGGT-GGTGGTGGTGAACGATGCTGATTGCCGTTCCGGCAAACGCG-3'のハイブリダイゼーションから誘導されたＤＮＡフラグメントをクローン化することにより、プラスミドｐＫＭ４−６Ｈを構築した。
【００４３】
アフィニティーによる選択
ファルコンプレート(６ｃｍ、ファルコン１００７)を、４℃で一晩、５０ｍＭのＮａＨＣＯ３(ｐＨ９.６)中の１μｇ／ｍｌのプロテインＡ(ピアス、＃２１１８４)３ｍｌで被覆した。被覆溶液を廃棄後、プレートを１０ｍｌの遮断溶液(ＰＢＳ×１、０.０５％トウィーン２０中、５％脱脂粉乳)と３７℃で２時間インキュベーションした。１０μｌのヒト血清を、静かに攪拌しながら３７℃で３０分間１０μｌのＢＢ４細菌抽出物、および１ｍｌの遮断溶液中の１０μｌの１ＭのＭｇＳＯ４、とプレインキュベーションした。ライブラリーの約１０１０ファージ粒子を血清溶液に加え、静かに攪拌しながら３７℃でさらに１時間インキュベーションした。インキュベーション混合物を、プロテインＡで被覆したプレートにおいて平板培養し、室温で３０分間放置した。プレートを１０ｍｌの洗浄溶液(１×ＰＢＳ、１％トリトン、１０ｍＭのＭｇＳＯ４)で数回すすいだ。プレートへ直接加えられた(１プレートにつき６００μｌ)ＢＢ４細胞の感染により、結合したファージを回収した。１０ｍｌの溶解ＮＺＹ−トップ・アガー(４８〜５０℃)を感染細胞に加え、ＮＺＹプレート(１５ｃｍ)へ直ちに注いだ。翌日、４℃で４時間プレートを１５ｍｌのＳＭ緩衝液と攪拌しながらインキュベーションすることにより、ファージを集めた。ファージをＰＥＧおよびＮａＣｌ沈澱により精製し、４℃で０.０５％アジ化ナトリウムを含む初回量の１０分の１のＳＭ中で貯蔵した。
【００４４】
免疫スクリーニング
細菌性培地のファージプラークを、４℃で１時間乾燥ニトロセルロースフィルター(シュライヒェル・アンド・シュエル)に移した。フィルターを室温で１時間遮断緩衝液(ＰＢＳ×１、０.０５％トウィーン２０中、５％脱脂粉乳)中で遮断した。２０μｌのヒト血清を、２０μｌのＢＢ４細菌抽出物、４ｍｌの遮断緩衝液中の１０９／ｍｌの野生型ラムダファージとプレインキュベーションした。遮断溶液を廃棄後、フィルターを室温で２時間攪拌しながら血清溶液とインキュベーションした。フィルターをＰＢＳ×１、０.０５％トウィーン２０で数回洗浄し、１：５０００に希釈したアルカリ性ホスファターゼ(シグマＡ２０６４)とコンジュゲートしたヒト抗ＩｇＧ二次抗体とインキュベーションした。次いで、フィルターを上記と同様洗浄し、基質緩衝液(１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９.６、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２)で簡単にすすいだ。各フィルターを、３３０ｍｇ／ｍｌのニトロブルーテトラゾリウム、１６５ｍｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートを含む基質緩衝液１０ｍｌとインキュベーションした。水で洗浄することにより、反応を停止させた。
【００４５】
ラムダファージの大規模製造(溶原細胞から)
ＢＢ４細胞を、攪拌しながら０.２％マルトース含有ＬＢ中でＯＤ600＝１.０まで増殖させ、遠心分離により回収し、ＯＤ600＝２.０までＳＭ緩衝液に再懸濁した。１００μｌの細胞を低多重度の感染でラムダにより感染させ、室温で２０分間インキュベーションし、アンピシリンを含むＬＢ寒天で平板培養し、３２℃で１８〜２０時間インキュベーションした。翌日、単一コロニーを、アンピシリンを含む１０ｍｌのＬＢ中、３２℃で一晩攪拌しながらインキュベーションした。アンピシリンおよびＭｇＳＯ４(１０ｍＭ)を含む５００ｍｌの新鮮なＬＢに、大きなフラスコ中で５ｍｌの一晩培養物を接種し、激しく攪拌しながらＯＤ600＝０.６まで３２℃で増殖させた。フラスコを４５℃の水浴中で１５分間インキュベーションし、次いでさらに３時間振とう器中３７℃でインキュベーションした。１０ｍｌのクロロホルムを培養物に加えて、細胞溶解を完了させ、混合物を振とう器中３７℃でさらに１５分間インキュベーションした。標準的手順(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.およびManiatis,T.(１９８９)Molecular Cloning、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、コールドスプリングハーバー)にしたがってファージを溶解物の培養物から精製した。
【００４６】
ＥＬＩＳＡ用のファージ溶解物を同様の手順により溶原細胞から製造したが、ただし、クロロホルムは加えなかった。ＮａＣｌおよびＰＥＧによる沈澱後、バクテリオファージペレットを、アジ化ナトリウム(０.０５％)を含む出発量の１０分の１のＳＭ緩衝液に再懸濁し、４℃で貯蔵した。
【００４７】
ラムダＥＬＩＳＡ
マルチウェルプレート(イムノプレート・マキシソーブ、ヌンク)を、ＮａＨＣＯ３(５０ｍＭ、ｐＨ９.６)中０.７μｇ／ｍｌ濃度で１００μｌ／ウェルの抗ラムダポリクローナル抗体により４℃で一晩被覆した。被覆溶液を廃棄後、プレートを２５０μｌの遮断溶液(ＰＢＳ×１、０.０５％トウィーン中、５％脱脂粉乳)とインキュベーションした。プレートを２回洗浄緩衝液(ＰＢＳ×１、トウィーン２０)で洗浄した。１００μｌの遮断緩衝液およびファージ溶解物の混合物(１：１)を、各ウェルに加え、３７℃で１時間インキュベーションした。１ｍｌのヒト血清を室温で３０分間１００μｌの遮断緩衝液中１０９プラーク形成単位(ｐｆｕ)のファージλＫＭ４、１μｌのウサギ血清、１μｌのＢＢ４抽出物、１μｌのＦＢＳとインキュベーションした。ファージ溶解物とインキュベーション後、プレートを洗浄し、３７℃で６０分間血清溶液とインキュベーションした。次いで、プレートを洗浄し、ヤギ抗ヒトＨＲＰコンジュゲート抗体を、遮断緩衝液／二次抗体混合物(遮断溶液中１：４０ウサギ血清)中、１：２００００の希釈率で加えた(ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ)。３０分インキュベーション後、プレートを洗浄し、１００μｌのＴＭＢ液体基質系(シグマ)によりペルオキシダーゼ活性を測定した。１５分展開後、２５μｌのＨ２ＳＯ４(２Ｍ)により反応を停止させた。自動式ＥＬＩＳＡプレート読取り装置でプレートを読み取り、結果をＡ＝Ａ450nm−Ａ620nmとして表した。ＥＬＩＳＡデータを、２独立検定の平均値として測定した。
【００４８】
λＫＭ４の構築
プラスミドｐＮＳ３７８５(Hoess、１９９５)を、後続のラムダファージでのクローニング用にオリゴヌクレオチド配列、部位ＸｂａＩおよびＡｖｒII(下線部)を含むＫT1 5'-TTTATCTAGACCCAGCCCTAG-GAAGCTTCTCCTGAGTAGGACAAATCC-3'およびＸｂａＩを含むＫT2 5'-GGGTCTAGATAAAACGAAAGGCCCA-GTCTTTC-3'による逆ＰＣＲにより増幅した。逆ＰＣＲにおいて、ＴａｑポリメラーゼおよびＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼの混合物を用いて、ＤＮＡ合成の忠実度を高めた。２５増幅サイクルを遂行した(９５℃・３０秒、５５℃・３０秒、７２℃・２０分)。予めＸｂａＩエンドヌクレアーゼで消化しておいたＰＣＲ産物の自己ライゲーションにより、プラスミドｐＫＭ３を得た。ラムダｐＤ遺伝子を、制限部位ＮｃｏＩ、ＳｐｅＩ、ＮｏｔＩ(下線部)を含むＫ51 5'-CCGCCTTCCATGGGTACTAGTTTTAAATGCGG-CCGCACGAGCAAAGAAACCTTTAC-3'およびＫ86 5'-CTCTCATCCGCCA-AAACAGCC-3'のプライマーを用いたプラスミドｐＮＳ３７８５からのＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物を精製し、ＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、ｐＫＭ３のＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩ部位で再クローン化することにより、ｇｐＤの５'末端に制限部位ＳｐｅＩおよびＮｏｔＩのみをもつプラスミドｐＫＭ４を得た。このプラスミドをＸｂａＩ酵素で消化し、ラムダファージλＤａｍ１５ｉｍｍ２１ｎｉｎ５(Hoess、１９９５)のＸｂａＩ部位でクローン化した (図１)。
【００４９】
ｃＤＮＡライブラリーの構築
クイックプレップ(QuickPrep)マイクロｍＲＮＡ精製キット(アマーシャム・ファーマシア・バイオテック)を用い、製造業者の使用説明書にしたがって、１０７ＭＣＦ−７細胞(Ｔ１ライブラリー)または０.１ｇの固体腫瘍試料(Ｔ４ライブラリー)からｍＲＮＡを単離した。タイムセーバー(TimeSaver)ｃＤＮＡ合成キット(アマーシャム・ファーマシア・バイオテック)を用いて、二本鎖ｃＤＮＡを５μｇのポリ(Ａ)＋ＲＮＡから合成した。以前に報告された方法(Santini、１９８６)でランダム標識プライミングを遂行した。５００ｎｇの二本鎖ｃＤＮＡから、ランダム標識プライマー5'-GCGGCCGCTGG(N)9-3'を用いることによりｃＤＮＡコピーの第一鎖を合成し、プライマー5'-GGCGGCCAAC-(N)9-3'を用いることにより第二鎖ｃＤＮＡコピーを合成した。３つの異なる読み枠を伴うＳｐｅＩおよびＮｏｔＩ部位を含むオリゴヌクレオチドを用いて最終ｃＤＮＡ産物を増幅することにより、λＫＭ４ラムダベクターにおけるクローニングを容易にした(5'-GCACTAGTGGCCG-GCCAAC-3', 5'-GCACTAGTCGGCCGGCCAAC-3', 5'-GCACTAGTCG-GGCCGGCCAAC-3'および5'-GGAGGCTCGAGCGGCCGCTGG-3')。ＰＣＲ産物をキアクイック(Quiaquick)カラム(キアゲン)で精製し、ミクロコン１００(アミコン)で濾過することにより小ＤＮＡフラグメントを除去し、ＳｐｅＩ、ＮｏｔＩ制限酵素で消化し、フェノールで抽出後、ミクロコン１００で再濾過した。
【００５０】
ベクターλＫＭ４をＳｐｅＩ／ＮｏｔＩで消化し、脱リン酸化し、８ライゲーション混合物を各ライブラリーについて、各々０.５ｍｇのベクターおよび約３ｎｇの挿入体を含むように調製した。一晩４℃でインキュベーション後、ラムダパッケージングキット(Ready−To-GoＴＭラムダ・パッケージング・キット、アマーシャム・ファーマシア・バイオテック)によりライゲーション混合物をインビトロでパッケージし、１００(１５ｃｍ)ＮＺＹプレート中トップアガーにおいて平板培養した。一晩インキュベーション後、ファージをＳＭ緩衝液でプレートから溶離し、精製し、濃縮し、７％ＤＭＳＯ ＳＭ緩衝液中において−８０℃で貯蔵した。
【００５１】
挿入体を伴う総独立クローンとして算出されたライブラリーの複雑度は、Ｔ１ライブラリーについては１０８およびＴ４ライブラリーについては３.６×１０７であった。
【００５２】
アフィニティーによる選択
特異的腫瘍抗原の同定については、２つの異なるアフィニティー選択手順を使用した。第一の手順では、陽性血清(すなわち腫瘍病変を呈する患者から採取)による２サイクルのふるいわけ、次いで同血清により実施する免疫学的スクリーニング手順、または別法として選択されたファージの混合物から無作為に採取したクローンの分析を行った。第二の手順では、交差反応性抗原の選択効率を高める目的で、選択用、ふるいわけおよびスクリーニングの両方について異なる患者からの血清混合物を使用した。
【００５３】
Ｔ１ライブラリーを１０陽性血清(Ｂ９、Ｂ１１、Ｂ１３、Ｂ１４、Ｂ１５、Ｂ１６、Ｂ１７、Ｂ１８、Ｂ１９およびＢ２０)により選択し、単一選択ラウンド後、対応するプールｐ９I、ｐ１１I、ｐ１３I、ｐ１４I、p１５I、ｐ１６I、ｐ１７I、ｐ１８I、ｐ１９I、およびｐ２０Iを生成せしめた。次いで、上述の第一戦略にしたがって、各プールを同血清での第二のアフィニティー選択ラウンドにかけることにより、第二の一連のプール(ｐ９IＩ、ｐ１１IＩ、ｐ１３IＩ、ｐ１４IＩ、p１５IＩ、ｐ１６IＩ、ｐ１７IＩ、ｐ１８IＩ、ｐ１９IＩ、およびｐ２０IＩと称す)を生成せしめた。ＥＬＩＳＡで試験されたプールの中には、対応する血清と高い反応性を示すものもあったことから、ライブラリーおよびアフィニティー選択手順の効力を確認した。高い反応性を示すプール(ｐ９IＩ、ｐ１３IＩ、p１５IＩ、ｐ１９IＩ、ｐ２０IＩ)からの個々のクローンを、選択用に使用した血清での免疫スクリーニングにより単離した。
【００５４】
上述の第二手順をｐ１３IＩプールに適用し、それをＢ１３以外の血清混合物(Ｂ１１、Ｂ１４、Ｂ１５、Ｂ１６、Ｂ１７、Ｂ１８、Ｂ１９およびＢ２０)での第三選択ラウンドにかけることにより、交差反応性クローンを選択した。生成したプール(ｐ１３IＩＩ)をふるいわけで使用したのと同じ血清混合物でのＥＬＩＳＡにより検定した。プールからの個々のクローンを、混合ΔＢ１３(Ｂ１１、Ｂ１４、Ｂ１５、Ｂ１６、Ｂ１７、Ｂ１８、Ｂ１９およびＢ２０)による免疫スクリーニングにより単離し、それによってさらなる陽性クローンの単離が可能となった。
【００５５】
また、本明細書記載の方法にしたがって、アフィニティー選択実験をＴ４ライブラリーにより(同じく異なる血清を用いてＴ１ライブラリーにより)実施した。
【００５６】
多重免疫学的スクリーニング(ピック‐ブロット分析)
免疫学的スクリーニングで陽性であった個々のファージクローンを単離し、溶離したファージを整列させた順序で採取することにより１５ｃｍのプレートにおける細菌叢で増殖させた。プラークをニトロセルロース膜へ移し、異なる陽性および陰性血清での分析にかけた。この方法をさらにエラーに強くし、その再現性を高めるため、ジェネシス・テカン(Genesys Tekan)ロボットステーションを用いてプレート上のファージを選抜することにより、１１×７.５ｃｍの膜における最大３９６までの個々のクローンの分析が可能となり、または血清とのインキュベーション前に膜を小片に切断することにより低い数のクローンを同じプレートにおいて反復選抜した。
【００５７】
陽性クローンの特性確認
多重反応性、または健康なドナーの血清と比べ腫瘍患者の血清について大きな特異性を呈するクローンを、順次配列決定し、現時点で入手できる配列の種々のデータベースと比較した(Non−Redundant(重複が無い)Ｇｅｎｂａｎｋ ＣＤＳ、Genbank Est DivisionのNon-Redundant Database、Non-Redundant Genbank＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ Sequences)。
【００５８】
得られた配列は、６つのグループに分類し得る：
−既知乳癌抗原のエピトープをコードする配列、
−乳癌抗原以外の腫瘍抗原のエピトープをコードする既知配列、
−自己抗原をコードする配列、
−既知ではあるが、腫瘍または自己免疫疾患に関与することは知られていないタンパク質をコードする配列、
−未知蛋白質(例、ＥＳＴ)をコードする配列、
−データベースにまだ示されていない新規配列。
【００５９】
８１の異なる配列をＴ１ライブラリーから同定し(Ｔ１−１〜Ｔ１−１１５と称す)、その１３％は未知タンパク質であり、そのうち１６％はデータベースに存在しなかった。２１配列をＴ４ライブラリーから同定し(Ｔ４−１〜Ｔ４−３８と称す)、その４０％はデータベースからは見出されなかった。以下の表は、選択されたクローンの幾つかの配列を例として示している：
【００６０】
【表１】
2005508616.tif 000003
【表２】
2005508616.tif 000004
【表３】
2005508616.tif 000005
【表４】
2005508616.tif 000006
【表５】
2005508616.tif 000007
【表６】
2005508616.tif 000008
【表７】
2005508616.tif 000009
【００６１】
クローンＴ１−５２は、結合タンパク質ｐ５３のフラグメントとして知られているが(Haluska P.et al.、NAR、１９９９、２７巻、１２号、２５３８−２５４４)、腫瘍抗原として同定されたことはない。該クローンは、配列VLVAGQRYQSRSGHDQKNHRKHHGKKRMKSKRSTSLSSPRNGTSGRを有し、腫瘍抗原としてのその使用は本発明の一部である。
【００６２】
クローンＴ１−１７は、悪性中皮腫腫瘍抗原として同定されたＤＮＡトポイソメラーゼIIベータのフラグメントとして知られている(Robinson C.,et al.Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.２０００、２２：５５０−５６)。本発明は、それを乳癌腫瘍抗原として同定した。上記クローンは、配列MGTSRAGQLVEELDKVESQEREDVLAGMSGKSSFQRSEGDFLLRSLTSGRを有し、乳癌腫瘍抗原としてのその使用は本発明の一部である。
【００６３】
これまでは未知のものであったクローンＴ１−３２は、以下の配列MGTSRAGQLHAFPLHSTTLYYTTPSGRを有する；それは腫瘍抗原であり、それ自体本発明の一部である。
【００６４】
これまでは未知のものであったクローンＴ１−７４は、以下の配列MGTSRPANREAKQLHHQPHSIELIQSSGRを有する；それは腫瘍抗原であり、それ自体本発明の一部である。
【００６５】
これまでは未知のものであったクローンＴ４−２は、以下の配列MGTSRPANSEVYKPTLLYSSGRを有する；それは腫瘍抗原であり、それ自体本発明の一部である。
【００６６】
これまでは未知のものであったクローンＴ４−１１は、以下の配列MGTSGRPTVGFTLDFTVDPPSGRを有する；それは腫瘍抗原であり、それ自体本発明の一部である。
【００６７】
これまでは未知のものであったクローンＴ４−１９は、以下の配列MGTSRAGQLYRTTLTYTSGRを有する；それは腫瘍抗原であり、それ自体本発明の一部である。
【００６８】
これまでは未知のものであったクローンＴ１−１２は、以下の配列MRYYTATKTYELMLDATTQTSGRを有する；それは腫瘍抗原であり、それ自体本発明の一部である。
【００６９】
これまでは未知のものであったクローンＴ１−３９は、以下の配列MRVIDRAQAFVDEIFGGGDDAHNLNQHNSSGRを有する；それは腫瘍抗原であり、それ自体本発明の一部である。
【００７０】
クローンＴ５−８は、ＡＫＡＰタンパク質のフラグメントとして知られているが、腫瘍抗原として同定されたことはない。上記クローンは、配列MGTSRAGQQREQEKKRSPQDVEVLKTTTELFHSNEESGFFNELEALRAESVATKAELASYKEKAEKLQEELLVKETNMTSLQKDLSQVRDHQGRGを有し、腫瘍抗原としてのその使用は本発明の一部である。
【００７１】
クローンＴ５−１３は、ＳＯＳ１タンパク質のフラグメントとして知られているが、腫瘍抗原として同定されたことはない。該クローンは、配列AGTSRAGQHAFEQIPSRQKKILEEAHELSEDHYKKYLAKLRSINPPCVPFFGIYLTNLLKTEEGNPEVLKRHGKELINFSKRRKVAEITGEIQQYQNQYCLRVESDIKRFFENLNPMGNSMEKEFTDYLFNKSLEIEPRKPSGRを有し、腫瘍抗原としてのその使用は本発明の一部である。
【００７２】
クローンＴ５−１５は、ＥＳＴタンパク質ＫＩＡＡ１７３５のフラグメントとして知られているが、腫瘍抗原として同定されたことはない。該クローンは、配列MGTSRAGQQERSLALCEPGVNPEEQLIIIQSRLDQSLEENQDLKKELLKCKQEARNLQGIKDALQQRLTQQDTSVLQLKQELLRANMDKDELHNQNVDLQRKLDERTQRPを有し、腫瘍抗原としてのその使用は本発明の一部である。
【００７３】
クローンＴ５−１８は、ｍｉｃ オンコジーン(oncogen)、オルターナティブフレームのフラグメントとして知られているが、腫瘍抗原として同定されたことはない。該クローンは、配列MGTSRAGQPMSGHGSFQEVPRLHTSAQLRSASLHSEGLSCCQEGQVGQCQSPETDQQQPKMHQPSGRを有し、腫瘍抗原としてのその使用は本発明の一部である。
【００７４】
クローンＴ６−１は、皮膚Ｔ細胞リンパ腫腫瘍抗原として同定されたプロテインキナーゼＣ結合タンパク質のフラグメントとして知られている(Eichmuller S.,et al.PNAS、２００１；９８；６２９−３４)。本発明は、それを乳癌腫瘍抗原として同定した。該クローンは、配列TSRAGQRYEKSDSSDSEYISDDEQKSKNEPEDTEDKEGCQMDKEPSAVKKKPKPTNPVEIKEELKSTPPAを有し、乳癌腫瘍抗原としてのその使用は本発明の一部である。
【００７５】
これまでは未知のものであったクローンＴ６−２は、以下の配列TSRAGQLARIPSVTASEQGRTを有する；それは腫瘍抗原であり、それ自体本発明の一部である。
【００７６】
クローンＴ６−６は、ＰＩ−３−キナーゼ関連キナーゼＳＭＧ−１との相同体のフラグメントとして知られているが、腫瘍抗原として同定されたことはない。該クローンは、配列TSGPANAAPPSADDNIKTPAERLRGPLPPSADDNLKTPSERQLTPLPPAAAKを有する。それは腫瘍抗原であり、それ自体が本発明の一部である。
【００７７】
クローンＴ６−７は、フコシルトランスフェラーゼのフラグメントとして知られているが、腫瘍抗原として同定されたことはない。該クローンは、配列TSRAGQRELGRTGLYPSYKVREKIETVKYPTYPEAEKを有する。それは腫瘍抗原であり、それ自体が本発明の一部である。
【００７８】
クローンＴ７−１は、ＥＳＴタンパク質ＫＩＡＡ１２８８のフラグメントとして知られているが、腫瘍抗原として同定されたことはない。該クローンは、配列TSVLEPTKVTFSVSPIEATEKCKKVEKGNRGLKNIPDSKEAPVNLCKPSLGKSTIKTNTPIGCKVRKTEIISYPSTSGRを有する。それは腫瘍抗原であり、それ自体が本発明の一部である。
【００７９】
クローンＴ９−２２は、逆転写酵素相同タンパク質に類似(５０％の同一性)したもののフラグメントとして知られているが、腫瘍抗原として同定されたことはない。該クローンは、配列MDLTAVYRTFHPTIT-EYTFYLTVHGTFSKIDHMIGHKTSLNKSKKTEIISSTLSDHSGIKLESNSKRNPQIHASGRを有する。それは腫瘍抗原であり、それ自体が本発明の一部である。
【００８０】
クローンＴ１１−５は、無名の膜貫通理論的タンパク質のフラグメントとして知られているが、腫瘍抗原として同定されたことはない。該クローンは、配列MPIDVVYTWVNGTDLELLKELQQVREQMEEEQKAMREILGKNTTEPTKKRSYFVNFLAVSSGRを有する。それは腫瘍抗原であり、それ自体が本発明の一部である。
【００８１】
クローンＴ１１−６は、亜鉛フィンガータンパク質２５８のフラグメントとして知られているが、腫瘍抗原として同定されたことはない。該クローンは、配列TSGRPTYKVNISKAKTAVTELPSARTDTTPVITSVMSLAKIPATLSTGNTNSVLKGAVTKEAAKIIQDESTQEDAMKFPSSQSSQPSRLLKNKGISCKPVTHPSGRを有する。それは腫瘍抗原であり、それ自体が本発明の一部である。
【００８２】
クローンＴ１１−９は、仮定的ヒトタンパク質のフラグメントとして知られているが、腫瘍抗原として同定されたことはない。該クローンは、配列TSRAGQLRFSDHAVLKSLSPVDPVEPISNSEPSMNSDMGKVSKNDTEEESNKSATTDNEISRTEYLCENSLEGKNKDNSSNEVFPQYASGRを有する。それは腫瘍抗原であり、それ自体が本発明の一部である。
【００８３】
クローンＴ１１−３は、ＥＳＴタンパク質ＫＩＡＡ０６９７のフラグメントとして知られているが、腫瘍抗原として同定されたことはない。該クローンは、配列TSRAGQRKQSFPNSDPLHQSDTSKAPGFRPPLQRPAPSPSGIVNMDSPYGSVTPSSTHLGNFASNISGGQMYGPGAPLGGAPTSGRを有する。それは腫瘍抗原であり、それ自体が本発明の一部である。
【００８４】
クローンＴ５−２は、ヒトゲノムＤＮＡのフラグメントとして知られているが、腫瘍抗原として同定されたことはない。該クローンは、配列MGTSRAGQPTSENYLAVTTKTKHKHSLQPSNASISLLGIYPTPSGRを有する。それは腫瘍抗原であり、それ自体が本発明の一部である。
【００８５】
クローンＴ５−１９は、ＥＳＴタンパク質のフラグメントとして知られているが、腫瘍抗原として同定されたことはない。該クローンは、配列TSRAGQRDTQTHAHVSVCVHTPHHTYKYPTSGRを有する。それは腫瘍抗原であり、それ自体が本発明の一部である。
【００８６】
本発明によると、既知タンパク質の一部ではあるが、腫瘍抗原としては知られていなかった配列も、腫瘍抗原としてのそれらの使用に関する限りでは本発明の対象であることがわかる。同様に、本発明の対象は、配列、または該配列をコードする遺伝子の産物の全体または一部の腫瘍抗原としての使用である。
【００８７】
ピック‐ブロット分析手段により特性確認され、乳癌患者からの血清により比活性が立証されたファージクローンを、増幅し、次いで陽性および陰性血清の大型パネルにより分析した。このＥＬＩＳＡ試験後、特異的腫瘍抗原に対応するとみられるｃＤＮＡクローンを、それらの特異性および選択性をさらに正確に測定する目的で、種々の細菌発現系でクローン化した(タンパク質Ｄおよび／またはＧＳＴ)。融合タンパク質を製造するため、以下のオリゴヌクレオチド：K84 5'-CGATTAAATAAGGAGGAATAAACC-3' および K86 5'-CTCTCATCCGCCAAAACAGCC-3'を用いたＰＣＲにより、各クローンを単一プラークから増幅した。次いで、生成したフラグメントを、キアゲン精製キットを用いて精製し、制限酵素ＳｐｅＩおよびＮｏｔＩにより消化し、プラスミドｐＫＭ４−６Ｈでクローン化することにより、６−ヒスチジン尾部を有するＤとの融合タンパク質、またはベクターｐＧＥＸ−ＳＮでクローン化することによりＧＳＴとの融合タンパク質を製造した。次いで、標準プロトコール(Sambrook,J.、Fritsch,E.F.およびManiatis,T.(１９８９)Molecular Cloning、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、コールドスプリングハーバー)により対応する組換えタンパク質を製造および精製した。
【００８８】
以下の表は、例として、ファージまたは融合タンパク質調製物形態で検定された、若干の選択されたクローンの陰性および陽性血清との反応性を示す。
【表１】
2005508616.tif 000010
【００８９】
腫瘍細胞認識について選択された腫瘍抗原の効力を立証するため、すなわち病的異常を検出および診断する目的で、マウスを免疫化して、選択されたいくつかのクローンに対する抗体応答を誘導した。
【００９０】
タンパク質ＤとクローンＴ１−５２、Ｔ４−１１およびＴ４−１９の配列の融合体に対応する融合タンパク質Ｄ１−５２、Ｄ４−１１およびＤ４−１９を免疫原として用いて、２ヶ月間にわたって抗原を７回投与することにより、マウスを免疫化した。毎回、１マウスに対し３タンパク質の各々について、ＣＦＡ中２０μｇ、ＩＦＡ中２０μｇ、ＰＢＳ中１０μｇおよび４回ＰＢＳ中５μｇのタンパク質を注射(腹腔内または皮下)した。腫瘍抗原の配列に対する免疫の効力をチェックするため、異なる状況でクローン化された同じペプチド配列に対して免疫動物の血清を検定することにより、タンパク質Ｄとの反応性を排除した。
【００９１】
Ｄ１−５２の場合、免疫マウスの血清をＧＳＴとの融合体(ＧＳＴ１−５２)により検定し、Ｄ４−１１およびＤ４−１９の場合、対応するペプチド配列をベクターｐＣ８９(Felici et al.１９９１、J.Mol.Biol.２２２：３０１−３１０)でクローン化し、次いでｐＶIII(線維状バクテリオファージの主コートタンパク質)との融合体として試験した。免疫化動物の血清によるＥＬＩＳＡの結果は、Ｄ１−５２およびＤ４−１１の場合には有効な免疫が達成されたことを示し、対応する血清を腫瘍細胞認識能力について検定した。このために、セルラインＭＣＦ７を使用し、ＦＡＣＳによる分析によると、両血清(抗Ｄ１−５２および抗Ｄ４−１１)に存在する抗体が、例えば卵巣腫瘍細胞ではなく、胸部腫瘍ＭＣＦ７細胞特異的に認識することができ、この認識能力は同マウスからの免疫前血清に存在しない。
【配列表】
2005508616.tif 000011
2005508616.tif 000012
2005508616.tif 000013
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2005508616.tif 000028
2005508616.tif 000029
2005508616.tif 000030
2005508616.tif 000031
2005508616.tif 000032
2005508616.tif 000033
2005508616.tif 000034
2005508616.tif 000035
【図１】
2005508616.tif 000036
【手続補正書】
【提出日】平成15年7月29日(2003.7.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
選択をファージディスプレイ技術で遂行することを特徴とする、血清でのｃＤＮＡライブラリーの選択による特異的腫瘍抗原の同定方法であって、該技術で用いられるファージが繊維状ファージでないという条件での方法。
【請求項２】
選択をＳＥＲＥＸ技術(組換えｃＤＮＡの発現による自己腫瘍抗原の血清学的分析)により遂行する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
選択をアフィニティー選択技術により遂行する、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
ライブラリーを腫瘍生検から入手する、請求項１記載の方法。
【請求項５】
ライブラリーを培養された腫瘍セルラインから入手する、請求項１記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５記載の方法で得られる新規腫瘍抗原フラグメント。
【請求項７】
- ＭＧＴＳＲＰＡＮＲＥＡＫＱＬＨＨＱＰＨＳＩＥＬＩＱＳＳＧＲ;
- ＭＧＴＳＲＰＡＮＳＥＶＹＫＰＴＬＬＹＳＳＧＲ; 
- ＭＧＴＳＧＲＰＴＶＧＦＴＬＤＦＴＶＤＰＰＳＧＲ; 
- ＭＧＴＳＲＡＧＱＬＹＲＴＴＬＴＹＴＳＧＲ; 
- ＭＧＴＳＲＡＧＱＬＨＡＦＰＬＨＳＴＴＬＹＹＴＴＰＳＧＲ;
- ＭＲＹＹＴＡＴＫＴＹＥＬＭＬＤＡＴＴＱＴＳＧＲ;
- ＭＲＶＩＤＲＡＱＡＦＶＤＥＩＦＧＧＧＤＤＡＨＮＬＮＱＨＮＳＳＧＲ
から成る群から選択される、請求項６記載の抗原。
【請求項８】
-ＶＬＶＡＧＱＲＹＱＳＲＳＧＨＤＱＫＮＨＲＫＨＨＧＫＫＲＭＫＳＫＲＳＴＳＬＳＳＰＲＮＧＴＳＧＲ;
-ＭＧＴＳＲＡＧＱＱＲＥＱＥＫＫＲＳＰＱＤＶＥＶＬＫＴＴＴＥＬＦＨＳＮＥＥＳＧＦＦＮＥＬＥＡＬＲＡＥＳＶＡＴＫＡＥＬＡＳＹＫＥＫＡＥＫＬＱＥＥＬＬＶＫＥＴＮＭＴＳＬＱＫＤＬＳＱＶＲＤＨＱＧＲＧ; 
-ＡＧＴＳＲＡＧＱＨＡＦＥＱＩＰＳＲＱＫＫＩＬＥＥＡＨＥＬＳＥＤＨＹＫＫＹＬＡＫＬＲＳＩＮＰＰＣＶＰＦＦＧＩＹＬＴＮＬＬＫＴＥＥＧＮＰＥＶＬＫＲＨＧＫＥＬＩＮＦＳＫＲＲＫＶＡＥＩＴＧＥＩＱＱＹＱＮＱＹＣＬＲＶＥＳＤＩＫＲＦＦＥＮＬＮＰＭＧＮＳＭＥＫＥＦＴＤＹＬＦＮＫＳＬＥＩＥＰＲＫＰＳＧＲ;
-ＭＧＴＳＲＡＧＱＱＥＲＳＬＡＬＣＥＰＧＶＮＰＥＥＱＬＩＩＩＱＳＲＬＤＱＳＬＥＥＮＱＤＬＫＫＥＬＬＫＣＫＱＥＡＲＮＬＱＧＩＫＤＡＬＱＱＲＬＴＱＱＤＴＳＶＬＱＬＫＱＥＬＬＲＡＮＭＤＫＤＥＬＨＮＱＮＶＤＬＱＲＫＬＤＥＲＴＱＲＰ;
-ＭＧＴＳＲＡＧＱＰＭＳＧＨＧＳＦＱＥＶＰＲＬＨＴＳＡＱＬＲＳＡＳＬＨＳＥＧＬＳＣＣＱＥＧＱＶＧＱＣＱＳＰＥＴＤＱＱＱＰＫＭＨＱＰＳＧＲ;
-ＴＳＲＡＧＱＬＡＲＩＰＳＶＴＡＳＥＱＧＲＴ;
-ＴＳＧＰＡＮＡＡＰＰＳＡＤＤＮＩＫＴＰＡＥＲＬＲＧＰＬＰＰＳＡＤＤＮＬＫＴＰＳＥＲＱＬＴＰＬＰＰＡＡＡＫ;
-ＴＳＲＡＧＱＲＥＬＧＲＴＧＬＹＰＳＹＫＶＲＥＫＩＥＴＶＫＹＰＴＹＰＥＡＥＫ;
-ＴＳＶＬＥＰＴＫＶＴＦＳＶＳＰＩＥＡＴＥＫＣＫＫＶＥＫＧＮＲＧＬＫＮＩＰＤＳＫＥＡＰＶＮＬＣＫＰＳＬＧＫＳＴＩＫＴＮＴＰＩＧＣＫＶＲＫＴＥＩＩＳＹＰＳＴＳＧＲ;
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から成る群から選択される配列または該配列をコードする遺伝子の産物の全体または一部の腫瘍抗原としての使用。
【請求項９】
乳癌腫瘍抗原としての
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から成る群から選択される抗原フラグメントまたは該配列をコードする遺伝子の産物の全体または一部の使用。
【請求項１０】
腫瘍病変の画像診断用造影剤の製造に有用な活性剤としての、請求項６〜９記載の抗原の使用。
【請求項１１】
胸部腫瘍病変の画像診断用造影剤の製造に有用な活性剤としての、請求項９記載の抗原の使用。
【請求項１２】
請求項６〜９のいずれか１項記載の抗原についての特異的リガンド。
【請求項１３】
請求項６〜９のいずれか１項記載の抗抗原抗体。
【請求項１４】
標的特異的造影剤の製造についての請求項１２記載のリガンドまたは請求項１３記載の抗体の使用。
【請求項１５】
腫瘍診断についての請求項１４記載の使用。
【請求項１６】
請求項６〜９のいずれか１項記載の少なくとも一抗原および／または請求項１２記載の少なくとも一特異的リガンドおよび／または請求項１３記載の抗体を含む標的特異的造影剤。
【請求項１７】
請求項９記載の少なくとも一抗原および／または請求項１２記載のその少なくとも一特異的リガンドおよび／または請求項１３記載のその特異的抗体を含む乳癌特異的造影剤。
【請求項１８】
マップが図１で提供されるｃＤＮＡライブラリーについての発現／ディスプレイ・ベクター(λＫＭ４)。
【請求項１９】
請求項１〜５のいずれか１項記載の方法における請求項１８記載のベクターの使用。
【手続補正書】
【提出日】平成16年4月21日(2004.4.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005508616000001.app
【国際調査報告】
2005508616.tif 000037
2005508616.tif 000038
2005508616.tif 000039
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2005508616.tif 000047