(57)【要約】本発明は、植物における異種ヌクレオチド配列の発現を調節するための組成物および方法を提供する。組成物は、プルナシンヒドロラーゼをコードする遺伝子の維管束組織優先的プロモーターについての新規のヌクレオチド配列およびそれから単離された配列を包含する。本明細書中に開示されるプロモーター配列を用いて植物において異種ヌクレオチド配列を発現するための方法が提供される。この方法は、本発明の維管束組織優先的プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を植物細胞のゲノム中に安定に組み込む工程、およびこのヌクレオチド配列を発現する安定に形質転換された植物を再生させる工程を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された核酸分子であって、以下：
ａ）配列番号１または配列番号２に示される配列を含む、ヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号１または配列番号２に示される配列のうちの少なくとも５０個連続したヌクレオチドを含む、ヌクレオチド配列；
ｃ）配列番号１もしくは配列番号２に示される配列またはそれらのフラグメントに対して少なくとも７０％の同一性を有する配列を含む、ヌクレオチド配列であって、ここで、該配列は、転写を調節する、ヌクレオチド配列；および、
ｄ）ストリンジェントな条件下で、ａ）、ｂ）、ｃ）の配列またはそれらの相補体にハイブリダイスするヌクレオチド配列
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する、単離された核酸配列。
【請求項２】
維管束組織優先的な様式で転写を駆動し得る単離されたプロモーターであって、ここで、該プロモーターは、Ｐｒｕｎｕｓ  ｓｅｒｏｔｉｎａプルナシンヒドロラーゼをコードするＤＮＡと天然で結合している、プロモーター。
【請求項３】
目的の異種ヌクレオチド配列に対して作動可能に連結した、請求項１に記載のヌクレオチド配列を含む、発現カセット。
【請求項４】
請求項３に記載の発現カセットを含む、発現ベクター。
【請求項５】
そのゲノム内に、請求項３に記載の発現カセットが安定に組み込まれている、宿主細胞。
【請求項６】
そのゲノム内に、請求項３に記載の発現カセットが安定に組み込まれている、植物細胞。
【請求項７】
前記植物細胞が、双子葉植物由来である、請求項５に記載の植物細胞。
【請求項８】
前記植物細胞が、単子葉植物由来である、請求項５に記載の植物細胞。
【請求項９】
植物であって、そのゲノム内に、以下：
ａ）配列番号１または配列番号２に示される配列を含む、ヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号１または配列番号２に示される配列のうちの少なくとも５０個連続したヌクレオチドを含む、ヌクレオチド配列；
ｃ）配列番号１もしくは配列番号２に示される配列またはそれらのフラグメントに対して少なくとも７０％の同一性を有する配列を含む、ヌクレオチド配列であって、ここで、該配列は、転写を調節する、ヌクレオチド配列；および、
ｄ）ストリンジェントな条件下で、ａ）、ｂ）、ｃ）の配列またはそれらの相補体にハイブリダイスするヌクレオチド配列
からなる群より選択されるヌクレオチド配列が安定に組み込まれている、植物。
【請求項１０】
前記植物が、双子葉植物由来である、請求項９に記載の植物。
【請求項１１】
前記植物が、単子葉植物由来である、請求項９に記載の植物。
【請求項１２】
請求項９に記載の植物の種子であって、ここで、該種子は、請求項１に記載のヌクレオチド配列を含む、種子。
【請求項１３】
植物において異種ヌクレオチド配列を発現するための方法であって、該方法は、プロモーターに作動可能に連結された目的の異種ヌクレオチド配列を植物細胞内に安定に組み込む工程を包含し、ここで、該プロモーターは、以下：
ａ）配列番号１または配列番号２に示される配列を含む、ヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号１または配列番号２に示される配列のうちの少なくとも１００個連続したヌクレオチドを含む、ヌクレオチド配列；
ｃ）配列番号１もしくは配列番号２またはそれらのフラグメントに示される配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する配列を含む、ヌクレオチド配列であって、ここで、該配列は、転写を調節する、ヌクレオチド配列；および、
ｄ）ストリンジェントな条件下で、ａ）、ｂ）、ｃ）の配列またはそれらの相補体の相補体にハイブリダイスするヌクレオチド配列
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、方法。
【請求項１４】
前記植物が、双子葉植物である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記植物が、単子葉植物である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記異種ヌクレオチド配列が、維管束組織において優先的に発現される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記維管束組織が、篩部組織である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記目的の異種ヌクレオチド配列が、抗病原活性を有するポリペプチドをコードする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記異種ヌクレオチド配列が、昆虫に対する抗病原活性を有するポリペプチドをコードする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記異種ヌクレオチド配列が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（Ｂ．ｔ．）毒性ポリペプチドまたはキメラＢ．ｔ．毒性ポリペプチドをコードする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記目的の異種ヌクレオチド配列が、レクチンおよびリポキシゲナーゼからなる群より選択されるポリペプチドをコードする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記目的の異種ヌクレオチド配列が、昆虫キチナーゼおよび殺虫ポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドをコードする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記目的の異種ヌクレオチド配列が、維管束組織負荷を調節し得るポリペプチドをコードする、請求項１３に記載の方法。
【請求項２４】
前記ポリペプチドが、スクロースシンターゼ、スクロース輸送体、ガラクチノールシンターゼ、Ｋ＋チャネル、アミノ酸輸送体、Ｈ＋  ＡＴＰａｓｅ、アミノ酸パーミアーゼ、硫酸輸送体、フルクトシルトランスフェラーゼ、および篩部炭水化物レギュレーターからなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本願は、２００１年７月１３日に出願された、米国仮出願番号６０／３０５，３６２の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、植物分子生物学の分野に関し、より具体的には、植物における遺伝子発現の調節に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
植物宿主における異種ＤＮＡ配列の発現は、その植物宿主において機能的である、作動可能に連結されたプロモーターの存在に依存する。プロモーター配列の選択は、その生物においていつ、どこで、異種ＤＮＡ配列が発現するかを決定する。従って、発現が、植物の好ましい組織において望まれる場合、組織優先的なプロモーターが利用される。対照的に、植物の細胞全体にわたる遺伝子発現が望ましい場合、構成的プロモーターが、選択される調節エレメントである。コアプロモーター配列から上流および／または下流の、さらなる調節配列は、形質転換ベクターの発現構築物に含まれて、トランスジェニック植物における異種ヌクレオチド配列の、種々のレベルの組織優先的発現または構成的発現をもたらし得る。
【０００４】
生物の組織において、ＤＮＡ配列の優先的な発現を有することが、頻繁に望ましい。例えば、昆虫の攻撃に対する植物の増加した抵抗性は、異種殺虫遺伝子に作動可能に連結した組織特異的プロモーターを含んで、昆虫抑止物質が感受性の植物組織において特異的に発現されるように、その植物の遺伝的操作によって達成され得る。適切な組織における異種ヌクレオチド配列の優先的な発現は、構成的プロモーターがその植物の細胞全体にわたる異種ヌクレオチド配列の転写を開始する場合におこる、その植物の資源の消耗を減少させる。
【０００５】
あるいは、所望の表現型を達成するために、植物の組織において、ネイティブなＤＮＡ配列の発現を阻害することが、望ましくあり得る。この場合には、このような阻害は、アンチセンスヌクレオチド配列に作動可能に連結した組織特異的プロモーターを含み、その結果、このアンチセンス配列の組織特異的発現が、その植物の細胞の部分集団におけるネイティブのＤＮＡ配列のｍＲＮＡの翻訳を阻害するＲＮＡ転写物を産生するような、その植物の形質転換によって、達成され得る。
【０００６】
篩部組織は、栄養分、ホルモン、および他の物質を、種々の植物組織全体にわたって移送する。篩部の柔組織細胞は、スクロースおよび他の栄養分含有量の、篩移送系へのロードおよびアンロードに関与する。篩部組織に位置する汁液の、高い栄養分含有量は、篩部に種々の昆虫種（とりわけ、アブラムシ（Ａｐｈｉｄｉｄａｅ科）、アワノメイガ（Ｐｙｒａｌｉｄａｅ科）、およびリーフホッパー（Ｃｉｃａｄｅｌｌｉｄａｅ）が挙げられる）を標的化させる。これらの昆虫による侵入から生じる植物の損傷は、複数の機構を介して起こり、この機構には、昆虫への、栄養分および水分の損失、侵入後の篩部組織へのウイルス粒子の導入、ならびに真菌攻撃に感受性の組織の作製が含まれる。病原体（例えば、昆虫、ウイルス、真菌、線虫など）に対する植物の保護を補助する、異種ヌクレオチド配列に作動可能に連結した、維管束組織優先的なプロモーターに対する必要性が存在する。
【０００７】
維管束組織のローディング特徴を改変し、これによって、植物の発達および成長、炭素の配給、ならびに作物の収穫量に影響を与える、異種ヌクレオチド配列に作動可能に連結される、維管束組織優先的なプロモーター配列に対する、さらなる必要性が存在する。篩ローディングに関与する物質のレベルを変化させることによって、維管束組織のローディング特徴、植物の発達および植物の成長が、影響を受け得る。維管束組織ローディングを調節する物質の発現を調節するために使用され得るプロモーター配列に対する必要性が、存在する。
【０００８】
茎の強度の改善における、維管束組織優先的なプロモーターの使用もまた、存在し得る。例えば、より多くのセルロースの沈着によってのように、細胞壁を厚くすることを介する。維管束組織優先的なプロモーターは、細胞壁の強度を増加させるために、セルロースの生合成に関与する遺伝子を発現するために使用することが望ましい。細胞壁の強度がトウモロコシの茎において増加する場合、より良好な直立性（ｓｔａｎｄａｂｉｌｉｔｙ）が期待される。このことは、トウモロコシにおける茎の倒状に対する抵抗性を改善することに、特に関連する。このような適用の例は、維管束組織特異的プロモーターを使用して、二次細胞壁形成に関与するセルロースシンターゼ遺伝子（例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来のｉｒｘ３遺伝子（Ｔａｙｌｏｒ  ＮＧ，Ｓｃｈｅｉｂｌｅ  ＷＲ，Ｃｕｔｌｅｒ  Ｓ，Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ  ＣＲ、Ｔｕｒｎｅｒ  ＳＲ．１９９９．Ｔｈｅ  ｉｒｒｅｇｕｌａｒ  ｘｙｌｅｍ３  ｌｏｃｕｓ  ｏｆ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｅｎｃｏｄｅｓ  ａ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｃｅｌｌ  ｗａｌｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １１：７６９−８０））を駆動することである。この場合には、通常は二次壁を有さない細胞は、潜在的に、さらなる細胞壁増殖を得、従って、より強い細胞構造を導く。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、目的の異種ヌクレオチド配列の組織優先的発現のための調節領域として働き得る、篩優先的なプロモーターの単離および特徴付けが、特定の表現型形質を示すための植物の遺伝的操作のために必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
植物における異種ヌクレオチド配列の発現を調節するための組成物および方法が、提供される。組成物は、転写を維管束組織優先的な様式で、特に、篩部組織優先的な様式で開始する、新規プロモーター配列を含有する。具体的には、プルナシン（ｐｒｕｎａｓｉｎ）ヒドロラーゼをコードするＰｒｕｎｕｓ  ｓｅｒｏｔｉｎａ遺伝子から単離された転写開始領域が、提供される。本発明のさらなる組成物は、配列番号１に記載されるヌクレオチド配列、および配列番号１に記載されるヌクレオチド配列のフラグメントを含有する。本発明の組成物は、配列番号１に記載される配列またはそのフラグメントに対して少なくとも７０％同一性を有するヌクレオチド配列、およびストリンジェントな条件下で、上記配列のいずれか１つにハイブリダイズするヌクレオチド配列をさらに含有する。配列番号２に記載される配列は、クローニングの目的でなされた、ヌクレオチド配列の改変を表す。プルナシンヒドロラーゼプロモーター領域を含む、プルナシンヒドロラーゼオペロンについての配列は、配列番号３に記載される。配列番号３のヌクレオチド９８９〜２６２６は、プルナシンヒドロラーゼポリペプチドをコードする。配列番号４は、プルナシンヒドロラーゼポリペプチドについてのアミノ酸配列である。配列番号５および６は、配列番号１として開示されるポリヌクレオチド配列の、関連するバリエーションである。
【００１１】
本発明の組成物はまた、目的のヌクレオチド配列に作動可能に結合された、本発明のプロモーター配列を含むＤＮＡ構築物を含有し、ここで、このプロモーターは、植物細胞におけるヌクレオチド配列の発現を駆動し得る。本発明の新規プロモーター配列を含む、形質転換された植物細胞、形質転換された植物、および形質転換された種子もまた、提供される。
【００１２】
植物において、目的のヌクレオチド配列を発現させるための方法が、提供される。この方法は、植物細胞のゲノムに、目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結された本発明のプロモーター配列を含む発現カセットを安定に組み込む工程を包含し、ここで、このプロモーターは、植物細胞におけるヌクレオチド配列の転写を開始し得る。この方法は、維管束組織、より具体的には、篩部組織において、ヌクレオチド配列を優先的に発現させるための手段を、さらに提供する。
【００１３】
（発明の詳細な説明）
本発明の組成物は、プルナシン（ｐｒｕｎａｓｉｎ）ヒドロラーゼをコードするＰｒｕｎｕｓ  ｓｅｒｏｔｉｎａ遺伝子の植物プロモーターについての新規のヌクレオチド配列を含む核酸分子である。このプロモーター配列は、作動可能に連結されたヌクレオチド配列の維管束組織優先的発現（より具体的には篩部優先的発現）を付与する。特に、本発明は、特許寄託第ＰＴＡ−３２３５号として細菌宿主中に寄託されたＤＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列、または配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子、ならびにそれらの改変体およびフラグメントを提供する。このプロモーター配列は、プルナシンヒドロラーゼをコードするＰ．ｓｅｒｏｔｉｎａ遺伝子の転写開始部位に隣接する５’非翻訳領域から単離された。
【００１４】
本発明のＰ．ｓｅｒｏｔｉｎａプロモーター配列を含むプラスミドは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａの特許寄託機関に、２００１年３月２７日に寄託され、そして特許寄託第ＰＴＡ−３２３５号が割り当てられた。配列番号１の最後の２つのヌクレオチド（ヌクレオチド９８７および９８８）は、ＡＴＣＣに寄託されたプラスミド中の配列において、ＣからＴへと変更された。この寄託物は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の約定の下で維持される。この寄託を、単に当業者への便宜のために行った。そしてこれは、寄託が米国特許法第１１２条に基づいて必要であることを認めるものではない。
【００１５】
本発明は、単離された核酸組成物および実質的に精製された核酸組成物を包含する。「単離された」または「精製された」、核酸分子またはその生物学的に活性な部分は、天然に存在する環境において見出されるような核酸分子と通常付随または相互作用している成分を実質的または本質的に含まない。従って、単離または精製された核酸分子、またはその生物学的に活性な部分は、他の細胞物質を実質的に含まず、組換え技術によって生成された場合、培養培地も実質的に含まず、化学合成された場合、化学的前駆体も他の化学物質も実質的に含まない。好ましくは、「単離された」核酸は、その核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡにおいてその核酸に天然で隣接する配列（好ましくはタンパク質コード配列）（すなわち、その核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）を含まない。例えば、種々の実施形態では、単離された核酸分子は、この核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡにおいてこの核酸分子と天然で隣接する、約５ｋｂ未満、約４ｋｂ未満、約３ｋｂ未満、約２ｋｂ未満、約１ｋｂ未満、約０．５ｋｂ未満、または約０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含み得る。
【００１６】
「プロモーター」または「転写開始領域」によって、ＲＮＡポリメラーゼＩＩに、特定のコード配列について適切な転写開始部位でＲＮＡ合成を開始させ得る、ＴＡＴＡボックスを通常含むＤＮＡ調節領域が意図される。プロモーターは、転写開始速度に影響を与える、ＴＡＴＡボックスの上流すなわち５’側に一般に配置される他の認識配列（上流プロモーターエレメントといわれる）をさらに含み得る。本明細書中に開示されたプロモーター領域についてのヌクレオチド配列が同定されたので、本明細書中で同定された特定のプロモーター領域の上流の５’非翻訳領域中のさらなる調節エレメントを単離および同定することは、技術水準の範囲内であることが認識される。従って、本明細書中に開示されたプロモーター領域は、さらに、この開示されたプロモーター配列に作動可能に連結された任意の異種ヌクレオチド配列の組織優先的発現、特に維管束組織優先的発現、より具体的には篩部組織優先的発現、なおより具体的には篩部柔組織優先的発現を付与する上流の調節エレメントを包含する。
【００１７】
本発明のプロモーターについてのヌクレオチド配列は、天然に存在する配列または実質的相同性を有する任意の配列であり得る。「実質的相同性」によって、ネイティブすなわち天然に存在する配列との実質的な機能的および構造的等価性を示す配列が意図される。実質的に相同な配列の間の任意の機能的または構造的相違は、その配列が本発明において開示されるプロモーターとして機能する能力に影響を与えない。従って、本発明の特定のプロモーターの配列との実質的配列相同性を有する任意の配列は、作動可能に連結された異種ヌクレオチド配列の発現を指向する。２つのプロモーターヌクレオチド配列は、これらが、少なくとも約５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％まで、一般に少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、少なくとも９０％、少なくとも９８％までの配列相同性を有する場合、実質的に相同であるとみなされる。
【００１８】
本発明の単離されたプロモーター配列は、目的のヌクレオチド配列の組織優先的発現を提供すると特徴付けられる。植物の維管束系は、木部および篩部を含む複数の組織を含む。篩部組織は、篩管構成要素または篩管部材、篩管細胞、伴細胞（被子植物において）、タンパク質分泌性細胞（裸子植物において）、篩部柔組織細胞、および篩部繊維を含む、多数の細胞型を含む。本明細書中に開示された組織優先性プロモーターは、植物の維管束系（特に、篩部組織、より具体的には篩部柔組織細胞）における１以上のＤＮＡ配列の転写を優先的に活性化し得る。本明細書中に開示される篩部優先的プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列は、作動可能に連結された配列の発現を、維管束組織（特に篩部組織）において、他の組織よりも高いレベルで、または形質転換されていない植物の維管束組織において見いだされるよりも高いレベルでもたらす。
【００１９】
本明細書中に開示されるプロモーターヌクレオチド配列のフラグメントおよび改変体もまた、本発明によって包含される。「フラグメント」によって、ヌクレオチド配列の一部分が意図される。ヌクレオチド配列のフラグメントは、生物学的活性を保持し得、それゆえ、異種ヌクレオチド配列の転写を開始し得る。あるいは、ハイブリダイゼーションプローブとして有用である、プロモーターヌクレオチド配列のフラグメントは一般に、生物学的活性を保持しない。従って、ヌクレオチド配列のフラグメントは、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチドから、本発明の全長ヌクレオチド配列までの範囲にわたり得る。
【００２０】
従って、プロモーターヌクレオチド配列のフラグメントは、そのプロモーターの生物学的に活性な部分をコードし得るか、または、このフラグメントは以下に開示される方法を用いる、ハイブリダイゼーションプローブもしくはＰＣＲプライマーとして使用され得るフラグメントであり得る。プロモーターの生物学的に活性な部分は、本発明のプロモーター配列のうちの１つの一部分を単離し、そしてそのプロモーターのその一部分の活性を評価することによって調製され得る。プロモーターヌクレオチド配列のフラグメントである核酸分子は、配列番号１の少なくとも３０ヌクレオチド、少なくとも３５ヌクレオチド、少なくとも４０ヌクレオチド、少なくとも４５ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも７５ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも３２５ヌクレオチド、少なくとも３５０ヌクレオチド、少なくとも３７５ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも４２５ヌクレオチド、少なくとも４５０ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも５５０ヌクレオチド、少なくとも６００ヌクレオチド、少なくとも６５０ヌクレオチド、少なくとも７００ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチド、少なくとも９００ヌクレオチド、または少なくとも９８８ヌクレオチドを含む。
【００２１】
このようなフラグメントのヌクレオチドは、特定のプロモーター配列または組織特異性を付与する調節エレメントのＴＡＴＡ認識配列を含む。このようなフラグメントは、本明細書中で開示される天然に存在するプロモーターヌクレオチド配列を切断する認識酵素の使用によって入手され得るか；このプロモーターＤＮＡ配列の天然に存在する配列からヌクレオチド配列を合成することによって入手され得るか；またはＰＣＲ技術の使用を通して入手され得る。特に、Ｍｕｌｌｉｓら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５５：３３５−３５０およびＥｒｌｉｃｈ編（１９８９）ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照のこと。これらのプロモーターフラグメントの改変体（例えば、部位特異的変異誘発から得られる改変体）は、本発明の組成物によって包含される。
【００２２】
「改変体」によって、実質的に類似の配列が意図される。ヌクレオチド配列に関して、天然に存在する改変体（例えば、これらの改変体）は、周知の分子生物学技術（例えば、以下に概説されるようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびハイブリダイゼーション技術）の使用によって同定され得る。改変体ヌクレオチド配列はまた、合成由来のヌクレオチド配列（例えば、部位特異的変異誘発を用いることによって生成されたヌクレオチド配列）を包含する。一般に、本発明の特定のヌクレオチド配列の改変体は、デフォールトパラメーターを用いた、本明細書中のどこかに記載される配列整列プログラムによって決定されるような特定のヌクレオチド配列に対して、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、一般に少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、そしてより好ましくは少なくとも約９８％、少なくとも約９９％以上の配列同一性を有する。本発明の改変体ヌクレオチド配列は、生物学的活性を保持する（すなわち、転写を調節する）。転写調節をアッセイするための方法は、当該分野で周知である。アッセイ方法としては、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、およびレポーター配列（例えば、ＧＵＳ）の使用が挙げられる。
【００２３】
改変体ヌクレオチド配列はまた、変異促進手順および組換え生成（ｒｅｃｏｍｂｉｎｏｇｅｎｉｃ）手順（例えば、ＤＮＡシャッフリング）に由来する配列を包含する。このような手順を用いて、１以上の異なる配列は、所望の特性を保有する新たなプロモーターを作製するように操作され得る。このようにして、組換えポリヌクレオチドのライブラリーは、実質的配列同一性を有しかつインビトロまたはインビボで相同的に組換えられ得る配列領域を含む、関連配列のポリヌクレオチドの集団から作製される。このようなＤＮＡシャッフリングについてのストラテジーは、当該分野で公知である。例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１０７４７−１０７５１；Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：３８９−３９１；Ｃｒａｍｅｒｉら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：４３６−４３８；Ｍｏｏｒｅら（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  ２７２：３３６−３４７；Ｚｈａｎｇら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：４５０４−４５０９；Ｃｒａｍｅｒｉら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：２８８−２９１；ならびに米国特許第５，６０５，７９３号および同第５，８３７，４５８号を参照のこと。
【００２４】
本発明のＰ．ｓｅｒｏｔｉｎａプロモーター配列は、他の生物（特に他の植物、より具体的には他の双子葉植物）から対応する配列を単離するために用いられ得る。このようにして、方法（例えば、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションなど）は、このような配列を、本明細書中に示される配列に対するそれらの配列相同性に基づいて同定するために用いられ得る。本明細書中に示されるプロモーター配列全体またはそれらのフラグメントに対するそれらの配列同一性に基づいて単離された配列は、本発明によって包含される。本発明の１つの実施形態は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と天然で結合していてその発現を駆動し得るヌクレオチド配列を含み、このポリペプチドは、Ｐ．ｓｅｒｏｔｉｎａプルナシンヒドロラーゼのコード配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｕ５０２０１）に対して、少なくとも７４％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。「天然で結合する」によって、このプロモーター配列が、人為的介入によって、このヌクレオチド配列に対して作動可能に連結されているのではないことを意図する。本発明の別の実施形態は、Ｐ．ｓｅｒｏｔｉｎａプルナシンヒドロラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｕ５０２０１）に対して少なくとも７４％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の５’ＵＡＳ領域において、維管束組織優先的プロモーターを同定するための方法を包含する。
【００２５】
ＰＣＲアプローチでは、オリゴヌクレオチドプライマーは、対応するＤＮＡ配列を、目的の任意の植物から抽出されたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから増幅するためにＰＣＲ反応において使用するために設計され得る。ＰＣＲプライマーおよびＰＣＲクローニングを設計するための方法は、当該分野で一般に公知であり、そしてＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に開示される。Ｉｎｎｉｓら編（１９９０）ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；ＩｎｎｉｓおよびＧｅｌｆａｎｄ編（１９９５）ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；ならびにＩｎｎｉｓおよびＧｅｌｆａｎｄ編（１９９９）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）もまた参照のこと。ＰＣＲの公知の方法としては、対プライマー、ネスティッドプライマー、シングル特異的プライマー（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ）、縮重プライマー、遺伝子特異的プロモーター、ベクター特異的プライマー、部分的に不一致のプライマーなどを用いる方法が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２６】
ハイブリダイゼーション技術において、公知のヌクレオチド配列の全部または一部が、選択した生物由来のクローン化したゲノムＤＮＡフラグメントまたはｃＤＮＡフラグメント（すなわち、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリー）の集団に存在する他の対応するヌクレオチド配列に選択的にハイブリダイズするプローブとして用いられる。このハイブリダイゼーションプローブは、ゲノムＤＮＡフラグメント、ｃＤＮＡフラグメント、ＲＮＡフラグメント、または他のオリゴヌクレオチドであり得、そして３２Ｐのような検出可能な基、または任意の他の検出可能なマーカーで標識され得る。従って、例えば、ハイブリダイゼーションのためのプローブは、本発明の配列に基づく合成オリゴヌクレオチドを標識することにより作製され得る。ｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムライブラリーのハイブリダイゼーションのためおよび構築のためのプローブの調製のための方法は、一般的に、当該分野で公知であり、そしてＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に開示される。
【００２７】
例えば、本明細書中で開示される全体のプロモーター配列、またはその１つ以上の部分は、対応するプロモーター配列に特異的にハイブリダイズし得るプローブとして用いられ得る。種々の条件下での特異的ハイブリダイゼーションを達成するために、このようなプローブは、プロモーター配列の間で固有であり、そして、好ましくは、少なくとも約１０ヌクレオチドの長さ、および最も好ましくは、少なくとも約２０ヌクレオチドの長さである、配列を含む。このようなプローブは、選択した植物由来の対応するプロモーター配列を、ＰＣＲにより増幅するために用いられ得る。この技術は、所望の植物由来のさらなるプロモーター配列を単離するため、または植物中のプロモーター配列の存在を決定するための診断アッセイとして、用いられ得る。ハイブリダイゼーション技術としては、プレートしたＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニング（プラークまたはコロニーのいずれか；例えば、Ｓｏｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照のこと）が挙げられる。
【００２８】
このような配列のハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で実行され得る。「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、プローブが、他の配列に対してよりも検出可能なより高い程度まで（例えば、バックグラウンドよりも少なくとも２倍）その標的配列にハイブリダイズする条件を意図する。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、そして異なる環境では異なる。ハイブリダイゼーション条件および／または洗浄条件のストリンジェンシーを制御することにより、プローブに１００％相補的である標的配列が同定され得る（相同的プロービング）。あるいは、ストリンジェンシー条件は、配列中のいくつかのミスマッチを許容するように調節され得、その結果、より低い程度の類似性が検出される（非相同的プロービング）。一般的に、プローブは、約１０００ヌクレオチドの長さ未満、好ましくは、５００ヌクレオチドの長さ未満である。
【００２９】
代表的には、ストリンジェントな条件は、以下である：塩濃度が、約１．５Ｍ  Ｎａイオン未満、代表的には、ｐＨ７．０〜８．３で、約０．０１〜１．０Ｍ  Ｎａイオン濃度（または、他の塩）であり、そして温度は、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）について、少なくとも約３０℃、および長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドより長い）について、少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような変性剤の添加で達成され得る。例示的な低いストリンジェンシー条件としては、３７℃にて、３０〜３５％のホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％  ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝液を用いるハイブリダイゼーション、ならびに５０〜５５℃にて、１×〜２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ  ＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）中での洗浄が挙げられる。例示的な中程度のストリンジェンシー条件としては、３７℃にて、４０〜４５％のホルムアミド、１．０Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、ならびに５５〜６０℃にて０．５×〜１×ＳＳＣ中での洗浄が挙げられる。例示的な高いストリンジェンシー条件としては、３７℃にて、５０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、ならびに６０〜６５℃にて０．１×ＳＳＣ中での洗浄が挙げられる。必要に応じて、洗浄緩衝液は、約０．１〜約１％のＳＤＳを含み得る。ハイブリダイゼーションの時間は、一般的に、約２４時間未満、通常は、約４〜約１２時間である。
【００３０】
特異性は、代表的に、ハイブリダイゼーション後の洗浄の関数であり、重要な因子は、最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドについて、Ｔｍは、ＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌ（１９８４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７−２８４の式から近似され得る：Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ  Ｍ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌ；ここで、Ｍは、一価のカチオンのモル数であり、％ＧＣは、ＤＮＡ中のグアノシンヌクレオチドおよびシトシンヌクレオチドのパーセントであり、％ｆｏｒｍは、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアルデヒドのパーセントであり、そしてＬは、塩基対中のハイブリッドの長さである。Ｔｍは、５０％の相補的な標的配列が、（規定されたイオン強度およびｐＨ下で）完全に一致したプローブにハイブリダイズする温度である。Ｔｍは、各１％のミスマッチについて約１℃まで低下され；従って、Ｔｍ条件、ハイブリダイゼーション条件、および／または洗浄条件は、所望の同一性の配列にハイブリダイズするように調整され得る。例えば、９０％以上の同一性を有する配列が求められる場合、Ｔｍは、１０℃低下され得る。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨでの特定の配列およびその相補体についての熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。しかし、厳しいストリンジェント条件は、熱融点（Ｔｍ）よりも、１℃、２℃、３℃、または４℃低い、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得；中程度にストリンジェントな条件は、熱融点（Ｔｍ）よりも、６℃、７℃、８℃、９℃、または１０℃低い、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得；低いストリンジェンシー条件は、熱融点（Ｔｍ）よりも、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、または２０℃低い、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得る。この式、ハイブリダイゼーション組成および洗浄組成、および所望のＴｍを用いて、当業者は、ハイブリダイゼーション溶液および／または洗浄溶液のストリンジェンシーにおけるバリエーションが、固有に記載されることを理解する。ミスマッチの所望の程度が４５℃（水溶液）または３２℃（ホルムアミド溶液）よりも低いＴｍを生じる場合、より高い温度が用いられ得るようにＳＳＣ濃度を増加させることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範なガイドは、以下に見出され得る：Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，第１部，第２章（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；およびＡｕｓｕｂｅｌら編（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２章（Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。Ｓａｎｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒ���ｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照のこと。
【００３１】
従って、プロモーター活性を有し、そして本明細書中に開示されるプロモーター配列、またはそのフラグメントにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする単離された配列が、本発明に包含される。このような配列は、開示される配列と、少なくとも約４０％〜５０％相同、約６０％、６５％、または７０％相同、およびさらに、少なくとも、約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上相同である。すなわち、配列の配列同一性は、少なくとも約４０％〜５０％、約６０％、６５％、または７０％、およびさらに、少なくとも、約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を共有する、範囲であり得る。
【００３２】
以下の用語は、２つ以上の核酸の間の配列の関係を記載するために用いられる：（ａ）「参照配列」、（ｂ）「比較ウィンドウ」、（ｃ）「配列同一性」、（ｄ）「配列同一性のパーセント」、および（ｅ）「実質的に同一」。
【００３３】
（ａ）  本明細書中で用いられる場合、「参照配列」は、配列比較の基礎として用いられる規定された配列である。参照配列は、特定の配列のサブセットまたは全体（例えば、全長ｃＤＮＡ配列もしくは遺伝子配列、すなわち、完全なｃＤＮＡ配列もしくは遺伝子配列のセグメント）であり得る。
【００３４】
（ｂ）  本明細書中で用いられる場合、「比較ウィンドウ」は、ポリヌクレオチド配列の連続するセグメントおよび特定のセグメントに対する参照をなし、ここで、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド配列は、２つの配列の最適な整列についての参照配列（これは、付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。一般的に、比較ウィンドウは、少なくとも２０個の連続するヌクレオチドの長さであり、そして必要に応じて、３０、４０、５０、１００以上の長さであり得る。当業者は、ポリヌクレオチド配列中のギャップの包含に起因して参照配列に対する高い類似性を回避し、ギャップペナルティーが、代表的に、導入され、そして一致の数から減算されることを理解する。
【００３５】
比較のための配列の整列方法は、当該分野で周知である。従って、任意の２つの配列の間のパーセント配列同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成され得る。このような数学的アルゴリズムの非制限的な例は、以下である：ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７のアルゴリズム；Ｓｍｉｔｈら（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所ホモロジーアルゴリズム；ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３の相同性整列アルゴリズム；ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４−２４４８の類似性についての検索方法；ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４のアルゴリズム；ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７のような改変。
【００３６】
これらの数学的アルゴリズムのコンピューター実行は、配列同一性を決定するための配列の比較のために利用され得る。このような実行として、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＰＣ／Ｇｅｎｅ  ｐｒｏｇｒａｍ中のＣＬＵＳＴＡＬ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能）；ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）およびＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ８中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡから入手可能）。これらのプログラムに用いるアルゴリズムは、デフォルトパラメーターを用いて実行され得る。ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、以下により十分に記載される：Ｈｉｇｇｉｎｓら（１９８８）Ｇｅｎｅ  ７３：２３７−２４４（１９８８）；Ｈｉｇｇｉｎｓら（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３；Ｃｏｒｐｅｔら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：１０８８１−９０；Ｈｕａｎｇら（１９９２）ＣＡＢＩＯＳ  ８：１５５−６５；およびＰｅａｒｓｏｎら（１９９４）Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３３１。ＡＬＩＧＮプログラムは、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（１９８８）前出のアルゴリズムに基づく。ＰＡＭ１２０ウェイト残基表（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ長ペナルティー、および４のギャップペナルティーが、アミノ酸配列を比較する場合、ＡＬＩＧＮプログラムと共に用いられ得る。Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３のＢＬＡＳＴプログラムは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）前出のアルゴリズムに基づく。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＢＬＡＳＴＮプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実行されて、本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列に相同なヌクレオチド配列を獲得し得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＢＬＡＳＴＸプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実行されて、本発明のタンパク質またはポリペプチドに相同なアミノ酸配列を獲得し得る。比較の目的のためのギャップ整列を得るために、ギャップＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ  ２．０）が、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９に記載されるように利用され得る。あるいは、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ  ２．０）を用いて、分子間の離れた関係を検出する反復検索を実行し得る。Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）前出を参照のこと。ＢＬＡＳＴ、ギャップＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ヌクレオチド配列についてＢＬＡＳＴＮ、タンパク質についてＢＬＡＳＴＸ）のデフォルトパラメーターが用いられ得る。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照のこと。整列はまた、検査により手動で行われ得る。
【００３７】
他で述べない限り、本明細書中で提供される配列同一性／類似性の値は、以下のパラメーターを用いるＧＡＰバージョン１０、または任意の等価なプログラムを使用して得られる値をいう：５０のＧＡＰウェイトおよび３のレングスウェイトを用いる％同一性；１２のＧＡＰウェイトおよび４のレングスウェイトを用いる％類似性。「等価なプログラム」とは、問題の任意の２つの配列について、好ましいプログラムにより作成された対応する整列と比較した場合、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の一致を有する整列、ならびに同一パーセント配列同一性を作成する、任意の配列比較プログラムを意図する。
【００３８】
ＧＡＰは、一致の数を最大にし、かつギャップの数を最小にする、２つの完全配列の整列を見つけるための、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３のアルゴリズムを使用する。ＧＡＰは、全ての可能な整列およびギャップ位置を考慮し、そして最も多い数の一致した塩基および最も少ないギャップを有する整列を作成する。これは、ギャップ作成ペナルティーおよび一致した塩基を単位にしたギャップ伸長ペナルティーの予想を可能にする。ギャップは、挿入する各ギャップについての一致のギャップ作成ペナルティー数の利益をもたらさなければならない。０よりも大きいギャップ伸長ペナルティーが選択される場合、ＧＡＰは、さらに、ギャップ時間の長さ（ギャップ伸長ペナルティー）の挿入された各ギャップについての利益をもたらさなければならない。タンパク質配列についてのＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＰａｃｋａｇｅのＶｅｒｓｉｏｎ  １０における、デフォルトギャップ作成ペナルティーの値およびギャップ伸長ペナルティー値は、それぞれ、８と２である。ヌクレオチド配列について、デフォルトギャップ作成ペナルティーは５０であり、一方で、デフォルトギャップ伸長ペナルティーは３である。ギャップ作成ペナルティーおよびギャップ伸長ペナルティーは、０〜２００からなる整数の群から選択される整数として表され得る。従って、例えば、ギャップ作成ペナルティーおよびギャップ伸長ペナルティーは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５以上であり得る。
【００３９】
ＧＡＰは、最良の整列のファミリーの１つのメンバーに存在する。このファミリーの多くのメンバーが存在し得るが、他のメンバーは、良好な質を有さない。ＧＡＰは、整列についての利点の４つの数字を表す：質、割合、同一性、および類似性。質は、配列を整列するために最大にした測定基準である。割合は、質をより短いセグメント中の塩基の数で割ったものである。パーセント同一性は、実際に一致する記号のパーセントである。パーセント類似性は、類似する記号のパーセントである。ギャップを隔てる記号は無視される。類似性は、記号の対についてのスコアリングマトリクス値が０．５０（類似性の閾値）以上である場合に、記録される。Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗｅａｒ  ＰａｃｋａｇｅのＶｅｒｓｉｏｎ  １０において用いられるスコアリングマトリクスは、ＢＬＯＳＵＭ６２（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５を参照のこと）である。
【００４０】
（ｃ）  本明細書中で用いられる場合、２つの核酸またはポリペプチド配列の状況における「配列同一性」または「同一性」は、特定の比較ウィンドウに渡って最大の一致について整列される場合、同じである２つの配列中の残基を参照する。配列同一性のパーセントが、タンパク質を参照して用いられる場合、同一ではない残基位置が、しばしば、保存的アミノ酸置換により異なることが認識される。ここで、アミノ酸残基は、類似した化学的特性（例えば、電荷、または疎水性）を有する他のアミノ酸残基と置換され、従って、分子の機能的特性を変化しない。配列が保存的置換で異なる場合、パーセント配列同一性は、置換の保存的性質について矯正するために、上向きに調整され得る。このような保存的置換により異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有するといわれる。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。代表的には、これは、全体のミスマッチよりむしろ、一部として保存的置換をスコアリングし、それにより、パーセント配列同一性を増大させることを包含する。従って、例えば、同一のアミノ酸に１のスコアを与え、そして非保存的置換に０のスコアを与える場合、保存的置換には、０と１との間のスコアが与えられる。保存的置換のスコアリングは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で実行されるように計算される。
【００４１】
（ｄ）  本明細書中で使用される場合、「配列同一性の％」とは、２つの最適に整列された配列を、比較ウィンドウを通して比較することにより決定される値を意味する。ここで比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適な整列のための参照配列（これは、付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。パーセンテージは、同一の核酸塩基が両方の配列で生じる位置の数を決定して、マッチした位置の数を得、マッチした位置の数を比較ウィンドウ中の位置の総数で除算し、その結果に１００をかけて、配列同一性のパーセンテージを得ることにより計算される。
【００４２】
（ｅ）  用語ポリヌクレオチド配列の「実質的同一性」とは、ポリヌクレオチドが、標準的なパラメーターを使用して記載された整列プログラムの１つを使用して参照配列と比較して、少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、およびもっとも好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。当業者は、これらの値が、コドン縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレーム位置などを考慮することによって、２つのヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質の対応する同一性を決定するために適切に調節され得ることを認識する。これらの目的でアミノ酸配列の実質的同一性は、通常、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、およびもっとも好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を意味する。
【００４３】
ヌクレオチド配列が、実質的に同一であるという別の指標は、２つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズする場合である。一般に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度およびｐＨで特定の配列についての熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低いように選択される。しかし、ストリンジェントな条件は、本明細書中で別段制限されなければ、所望のストリンジェンシーの程度に依存して、Ｔｍより約１℃〜約２０℃低い範囲の温度を包含する。ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一である場合になお実質的に同一である。これは、例えば、核酸のコピーが遺伝コードによって許容される最大のコドン縮重を使用して作製される場合に生じ得る。２つの核酸配列が実質的に同一であるという１つの指標は、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが第２のポリペプチドによってコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性である場合である。
【００４４】
本発明において開示されるプロモーター配列、ならびにその改変対およびフラグメントは、そのプロモーター配列が目的の異種ヌクレオチド配列と作動可能に連結されるように、ＤＮＡ構築物内にアセンブリされる場合に任意の植物の遺伝子操作において有用である。カセットは、異種ヌクレオチド配列に作動可能に連結される５’調節配列および３’調節配列を含む。「作動可能に連結される」によって、本発明のプロモーター配列と第２の配列との間の機能的連結が意図される。ここでこのプロモーター配列は、第２の配列に対応するＤＮＡ配列の転写を開始および媒介する。一般に、作動可能に連結されるとは、連結される核酸配列が連続しており、２つのタンパク質コード配列を連結することが必要な場合、連続して同じリーディングフレーム中にあることを意味する。このようにして、そのプロモーターヌクレオチド配列は、目的の植物における発現のための異種ヌクレオチド配列とともに発現カセット中に提供される。このような発現カセットは、本発明のプロモーター配列を含む調節領域の転写調節下にあるように、その異種ヌクレオチド配列の挿入のための複数の制限部位とともに提供される。そのカセットは、生物へ同時形質転換される少なくとも１つのさらなる遺伝子をさらに含み得る。あるいは、さらなる遺伝子は、複数の発現カセット上に提供され得る。
【００４５】
発現カセットは、選択マーカー遺伝子をさらに含み得る。一般に、発現カセットは、形質転換細胞の選択のための選択マーカー遺伝子を含む。選択マーカー遺伝子は、形質転換細胞または形質転換組織の選択のために利用される。マーカー遺伝子としては、抗生物質耐性をコードする遺伝子（例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）およびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）をコードする遺伝子）、ならびに除草剤化合物（例えば、グルホシネートアンモニウム、ブロモキシニル、イミダゾリノン（ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ）、および２，４−ジクロロフェノキシアセテート（２，４−Ｄ））に対する耐性を付与する遺伝子が挙げられる。一般に、Ｙａｒｒａｎｔｏｎ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３：５０６−５１１；Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｏｎら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６３１４−６３１８；Ｙａｏら（１９９２）Ｃｅｌｌ  ７１：６３−７２；Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：２４１９−２４２２；Ｂａｒｋｌｅｙら（１９８０）Ｔｈｅ  Ｏｐｅｒｏｎ，ｐｐ．１７７−２２０；Ｈｕら（１９８７）Ｃｅｌｌ  ４８：５５５−５６６；Ｂｒｏｗｎら（１９８７）Ｃｅｌｌ  ４９：６０３−６１２；Ｆｉｇｇｅら（１９８８）Ｃｅｌｌ  ５２：７１３−７２２；Ｄｅｕｓｃｈｌｅら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：５４００−５４０４；Ｆｕｅｒｓｔら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：２５４９−２５５３；Ｄｅｕｓｃｈｌｅら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８：４８０−４８３；Ｇｏｓｓｅｎ（１９９３）Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；Ｒｅｉｎｅｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１９１７−１９２１；Ｌａｂｏｗら（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３３４３−３３５６；Ｚａｍｂｒｅｔｔｉら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：３９５２−３９５６；Ｂａｉｍら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：５０７２−５０７６；Ｗｙｂｏｒｓｋｉら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：４６４７−４６５３；Ｈｉｌｌｅｎａｎｄ−Ｗｉｓｓｍａｎ（１９８９）Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏｌ．１０：１４３−１６２；Ｄｅｇｅｎｋｏｌｂら（１９９１）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３５：１５９１−１５９５；Ｋｌｅｉｎｓｃｈｎｉｄｔら（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７：１０９４−１１０４；Ｂｏｎｉｎ（１９９３）Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；Ｇｏｓｓｅｎら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５５４７−５５５１；Ｏｌｉｖａら（１９９２）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３６：９１３−９１９；Ｈｌａｖｋａら（１９８５）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．��８  （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）；Ｇｉｌｌら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：７２１−７２４を参照のこと。このような開示は、本明細書中に参考として援用される。選択マーカー遺伝子の上記の列挙は、限定することを意図しない。任意の選択マーカー遺伝子が、本発明において使用され得る。
【００４６】
発現カセットは、転写の５’から３’方向において、本発明のプロモーター配列、転写開始領域、異種ヌクレオチド配列、ならびに植物において機能する転写および翻訳終結領域を含む。この異種ヌクレオチド配列は、植物宿主に対してネイティブであってもよいし、類似であってもよいし、外来であってもよいし、異種であってもよい。さらに、その異種ヌクレオチド配列は、天然の配列であってもよいし、あるいは合成配列であってもよい。「外来」によって、転写開始領域が、転写開始領域が導入されるネイティブ植物中に見いだされないことを意味する。本明細書中で使用される場合、キメラ遺伝子は、プロモーター配列に対して異種であるコード配列に作動可能に連結されるプロモーター配列を含む。
【００４７】
終結領域は、本発明のプロモーター配列に対してネイティブであってもよいし、作動可能に連結される異種ヌクレオチド配列に対してネイティブであってもよいし、別の供給源に由来してもよい。便利な終結領域は、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉ−プラスミド（例えば、オクトピンシンターゼ終結領域およびノパリンシンターゼ終結領域）から利用可能である。Ｇｕｅｒｉｎｅａｕら（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ  ２６２：１４１−１４４；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９９１）Ｃｅｌｌ  ６４：６７１−６７４；Ｓａｎｆａｃｏｎら（１９９１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．５：１４１−１４９；Ｍｏｇｅｎら（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：１２６１−１２７２；Ｍｕｎｒｏｅら（１９９０）Ｇｅｎｅ  ９１：１５１−１５８；Ｂａｌｌａｓら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：７８９１−７９０３；およびＪｏｓｈｉら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１５：９６２７−９６３９もまた参照のこと。
【００４８】
発現カセットを調製する際に、種々のＤＮＡフラグメントは、適切な方向に、適切な場合には、適切なリーディングフレーム中にそのＤＮＡ配列を提供するように、操作され得る。この目的に関して、アダプターまたはリンカーが、そのＤＮＡフラグメントを連結するために使用され得るか、または他の操作が、便利な制限部位、余分なＤＮＡの除去、制限部位の除去などを提供するために含められ得る。この目的のために、インビトロ変異誘発、プライマー修復、制限消化、アニーリング、再置換（例えば、トランジションおよびトランスバージョン）が含められ得る。
【００４９】
適切な場合、その異種ヌクレオチド配列は、形質転換植物における発現の増大のために最適化され得る。すなわち、遺伝子は、改善された発現のために植物優先的コドンを使用して合成され得る。宿主優先的コドン使用頻度の議論については、例えば、ＣａｍｐｂｅｌｌおよびＧｏｗｒｉ（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ９２：１−１１を参照のこと。植物優先的遺伝子を合成するための方法が当該分野で利用可能である。例えば、本明細書中に参考として援用される米国特許第５，３８０，８３１号および同第５，４３６，３９１号、ならびにＭｕｒｒａｙら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：４７７−４９８を参照のこと。
【００５０】
さらなる配列改変は、細胞宿主における遺伝子発現を増強することが公知である。これらは、  偽のポリアデニル化シグナル、エキソン−イントロンスプライス部位シグナル、トランスポゾン様反復、および遺伝子発現に有害であり得る他のこのような十分に特徴づけられた配列をコードする配列の排除を包含する。その配列のＧ−Ｃ含有量は、宿主細胞において発現される既知の遺伝子を参照して計算されるように、所定の細胞宿主に対して平均的なレベルに調節され得る。可能な場合、その配列は、推定されるヘアピン構造の二次的ｍＲＮＡを避けるために改変される。
【００５１】
発現カセットは、発現カセット構築物または発現ベクター中の５’リーダー配列をさらに含み得る。このようなリーダー配列は、翻訳を増強するように作用し得る。翻訳リーダーは、当該分野で公知であり、以下が挙げられる：ピコルナウイルスリーダー（例えば、ＥＭＣＶリーダー（脳心筋炎５’非コード領域））（Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６１２６−６１３０）；ｐｏｔｙｖｉｒｕｓリーダー（例えば、ＴＥＶリーダー（Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｅｔｃｈ  Ｖｉｒｕｓ）（Ｇａｌｌｉｅら（１９９５）Ｇｅｎｅ  １６５（２）：２３３−２３８）、ＭＤＭＶリーダー（Ｍａｉｚｅ  Ｄｗａｒｆ  Ｍｏｓａｉｃ  Ｖｉｒｕｓ）（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １５４：９−２０））、およびヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）（Ｍａｃｅｊａｋら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５３：９０−９４）；アルファルファモザイクウイルスのコートタンパク質ｍＲＮＡに由来する非翻訳リーダー（ＡＭＶ  ＲＮＡ  ４）（Ｊｏｂｌｉｎｇら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２５：６２２−６２５）；タバコモザイクウイルスリーダー（ＴＭＶ）（Ｇａｌｌｉｅら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ＲＮＡ，Ｃｅｃｈ編（Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２３７−２５６）；およびｍａｉｚｅ  ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ  ｍｏｔｔｌｅ  ｖｉｒｕｓリーダー（ＭＣＭＶ）（Ｌｏｍｍｅｌら（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８１：３８２−３８５）。Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａら（１９８７）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．８４：９６５−９６８もまた参照のこと。翻訳を増強することが既知の他の方法もまた利用され得る（例えば、イントロンなど）。
【００５２】
本発明のプロモーター配列が、目的の遺伝子のヌクレオチド配列についてのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の少なくとも一部に相補的なアンチセンス構築物の転写を開始するために使用され得ることが認識される。アンチセンスヌクレオチドは、対応するｍＲＮＡとハイブリダイズするように構築される。アンチセンス配列の改変は、その配列がハイブリダイズし、対応するｍＲＮＡの発現を妨害しない限り行われ得る。このようにして、対応するアンチセンス配列に対して７０％、好ましくは８０％、より好ましくは８５％の配列類似性を有するアンチセンス構築物が使用され得る。さらに、アンチセンスヌクレオチドの一部は、標的遺伝子の発現を破壊するために使用され得る。一般に、少なくとも５０個のヌクレオチド、１００個のヌクレオチド、２００個のヌクレオチド、またはそれ以上のヌクレオチドの配列が使用され得る。
【００５３】
本発明のプロモーター配列はまた、センス方向にヌクレオチド配列の転写を開始して、植物における内因性遺伝子の発現を抑制するために使用され得る。センス方向にヌクレオチド配列を使用して植物における遺伝子発現を抑制するための方法は、当該分野で公知である。この方法は、一般に、内因性遺伝子の転写産物に対応するヌクレオチド配列の少なくとも一部に作動可能に連結された植物において、発現を駆動するプロモーターを含むＤＮＡ構築物で、植物を形質転換する工程を包含する。代表的には、このようなヌクレオチド配列は、内因性遺伝子の転写産物の配列に対して実質的な配列同一性、好ましくは、約６５％を超える配列同一性、より好ましくは、約８５％を超える配列同一性、もっとも好ましくは、約９５％を超える配列同一性を有する。米国特許第５，２８３，１８４号および同第５，０３４，３２３号；本明細書中に参考として援用される、を参照のこと。
【００５４】
本発明のプロモーター配列は、目的の異種ヌクレオチド配列の組織優先的発現において有用である。「異種ヌクレオチド配列」によって、プロモーター配列とともに天然に存在しない配列が意図される。このヌクレオチド配列は、プロモーター配列に対して異種であるが、植物宿主に対して同種であっても、ネイティブであっても、異種であっても、外来であってもよい。本明細書中で開示されるプロモーターのうちの１つに作動可能に連結されたこの異種ヌクレオチド配列は、目的のポリペプチドをコードし得る。このような異種遺伝子の例としては、非生物的ストレス（例えば、干魃、温度、塩分、オゾン、および毒素（例えば、殺虫剤および除草剤））に対する耐性を付与するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または生態活動のストレス（ｂｉｏｔｉｃ  ｓｔｒｅｓｓ）（例えば、昆虫、ウイルス、細菌、真菌および線虫を含む病原体による攻撃）、ならびにこれらの生物と関連する疾患の発症が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
本明細書中に開示されるプロモーターヌクレオチド配列および方法は、植物の表現型を変化させるために、宿主植物における任意の異種ヌクレオチド配列の発現を調節するにおいて有用である。表現型の種々の変化は、興味深く、植物において脂肪酸組成を改変すること、植物のアミノ酸含有量を改変すること、植物の病原体防御機構を改変すること、維管束組織への基質の出入りを改変することなどを包含する。これらの結果は、植物における異種産物の発現または内因生産物の増大した発現を提供することにより達成され得る。あるいは、その結果は、植物における１以上の内因性産物の発現、特に酵素または補因子の発現の減少を提供することにより達成され得る。これらの変化は、形質転換植物の表現型における変化を生じる。
【００５６】
本発明の１つの実施形態において、本明細書中に開示されるプロモーター配列は、維管束組織の負荷特徴を改変する異種ヌクレオチド配列に作動可能に連結され、それにより、植物の発生および成熟、炭素分配、および作物収量に影響が与えられる。篩部は、植物生物全体に物質を輸送する。篩部に輸送される物質としては、炭化水素、アミノ酸、ペプチド、無機リン酸、および侵入病原体が挙げられるが、これらに限定されない。篩部により輸送されるこれらの物質は、篩部へ負荷または移入されなければならず、多くの遺伝子が、篩部の負荷を調節する。「維管束組織負荷」により、ホルモン、ポリペプチド、または炭水化物のような栄養素を、植物維管束輸送系の細胞へ負荷または負荷をおろすことが意図される。篩部負荷に関与する物質のレベルを改変することにより、維管束組織の負荷特徴、植物発生および植物生長は、影響を及ぼされ得る。本発明のヌクレオチド配列は、維管束組織負荷を調節する物質のの発現を調整するために使用され得る。
【００５７】
維管束組織負荷を制御する物質としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＳＵＴ１（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ２８００５０，ＡＪ２７２３０９，ＡＦ１６７４１７，ＡＦ１９１０２５，ＡＦ１９１０２４，ＡＦ１０９９２２，Ｘ８２２７５，ＡＪ２２４９６１，Ｘ８３８５０，Ｘ６９１６５）、ＳＵＴ２（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｙ１６７６８，ＡＦ１６６４９８，ＡＪ２７２３０８）およびＳＵＴ４（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ１７６９５０，ＡＦ１７５３２２，ＡＦ２３７７８０）によってコードされるスクロース輸送体；ＡＳＵＳ１（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｘ７０９９０）、ＳＵＣ１（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｘ７５３６５）、ＳＵＣ２（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｘ７５７６４，Ｘ７９７０２）、ＳＵＳ１（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｌ２９４１８），Ｓｈｒｕｎｋｅｎ１（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｊ０１２４１）、ＳＳ１（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＪ００１１１７）およびＳＳ２（Ｍａｒａｎａら（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６３：２５３−２６０）によってコードされるスクロースシンターゼ；ＮａＡＡＰ１（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ０８０５４２）によってコードされるアミノ酸輸送体；ＮａＮＴＲ１（Ｓｃｈｕｌｔｚら（１９９９）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．６：６３７−６４６）によってコードされるペプチド輸送体、ガラクチノールシンターゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ２４９９１２，ＡＪ２３７６９３，ＡＪ２３７６９４）、無機ピロホスファターゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＪ２５２２１０）；ＡＫＴ３（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｕ４４７４５）によってコードされるＫ＋チャネルタンパク質、ＡＨＡ１（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＪ００２０２０）、ＡＨＡ２（Ｈａｒｐｅｒら（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１３６０１−１３６０８）、ＡＨＡ３（ＤｅＷｉｔｔら（１９９１）Ｐｌａｎｔ  Ｊ  １：１２１−１２８）、およびｐｍａ４（Ｇｉａｎｉｎａｚｚｉ−Ｐｅａｒｓｏｎら（２０００）Ｐｌａｎｔａ  ２１１：６０９−６１３およびＧｅｎｂａｎｋ登録番号Ｘ６６７３７）によってコードされるＨ＋ＡＴＰａｓｅ；アミノ酸透過酵素（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｘ７１７８７）；ｐｇｍ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ２１６５８０）およびｓｅｘ１（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ３１２０２７）によってコードされる篩部炭水化物レギュレーター、ならびにフルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＪ２５０６３４）。これらのＧｅｎｂａｎｋ登録番号によって同定される参照物を含むこれらの参照物は、参考として本明細書中に援用される。
【００５８】
本発明の別の実施形態において、本明細書中に開示されるプロモーター配列は、植物を病原体から保護することにおいて有用な異種ヌクレオチド配列と作動可能に連結され得、この病原体としては、昆虫、ウイルス、真菌、線虫などが挙げられる。多くの病原体は、維管束組織を通って移動し、植物中に病気を行き渡らせる。樹液を吸う昆虫は、ウイルス、真菌および線虫を、感染した植物から健康な植物に移動させる。本発明は、抗病原性活性を付与する遺伝子、維管束組織優先遺伝子（より具体的には、篩部組織優先遺伝子）の発現を可能にする。「抗病原性組成物」によって、本発明の組成物が、侵入する病原性生物を抑制、制御、および／または殺傷することが可能であることが意図される。本発明の抗病原性組成物は、病原体チャレンジから生じる疾患の症状を、少なくとも約５％〜約５０％、少なくとも約１０％〜約６０％、少なくとも約３０％〜約７０％、少なくとも約４０％〜約８０％、または少なくとも約５０％〜約９０％以上低減する。従って、本発明の方法は、疾患、特に植物病原体が引き起こす疾患から植物を防護するために使用され得る。
【００５９】
抗病原性活性を測定するアッセイは、当該分野で一般的に公知であり、病原体感染後の植物における疾患耐性を定量するための方法も同様である。例えば、米国特許第５，６１４，３９５号を参照のこと（参考として本明細書中に援用される）。このような技術としては、平均損傷直径、病原体バイオマス、および全腐敗植物組織のパーセントを経時測定することが挙げられる。例えば、抗病原体ポリペプチドを発現する植物またはその表面に適用された抗病原体組成物を有する植物のいずれかは、抗病原性組成物に曝露されなかったコントロール植物に比較した場合、病原体チャレンジ後の組織壊死（すなわち、損傷直径）の減少または植物の死の減少を示す。あるいは、抗病原性活性は、病原体バイオマスの減少によって測定され得る。例えば、抗原性ポリペプチドを発現する植物または抗病原性組成物に曝露された植物は、目的の病原体でチャレンジされる。経時的に、病原体播種組織からの組織サンプルが得られ、そしてＲＮＡが抽出される。植物特異的転写物のレベルと比べた、特定の病原体ＲＮＡ転写物のパーセントは、病原体バイオマスのレベルが決定されることを可能にする。例えば、Ｔｈｏｍｍａら（１９９８）Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９５：１５１０７−１５１１１（参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。
【００６０】
さらに、インビトロ抗病原性アッセイは、例えば、種々の濃度の抗病原性組成物を紙の円板に添加する工程およびこの円板を目的の病原体の懸濁物を含む寒天に配置する工程を包含する。インキュベーションの後、透明な阻害領域が、円板のまわりに広がり、この領域は、有効濃度の抗病原性ポリペプチドを含む（Ｌｉｕら（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９１：１８８８−１８９２（参考として本明細書中に援用される））。さらに、微小分光光度学的分析が、組成物のインビトロでの抗病原性特性を測定するために使用され得る（Ｈｕら（１９９７）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４：９４９−９５９およびＣａｍｍｕｅら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２２２８−２２３３（両者は、参考として本明細書中に援用される））。
【００６１】
疾患耐性特性をコードする遺伝子としては、例えば、フモノシンに対する解毒遺伝子（米国特許第５，７９２，９３１号）；弱毒性（ａｖｉｒｕｌｅｎｃｅ）（ａｖｒ）遺伝子および疾患耐性（Ｒ）遺伝子（Ｊｏｎｅｓら（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：７８９；Ｍａｒｔｉｎら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１４３２；およびＭｉｎｄｒｉｎｏｓら（１９９４）Ｃｅｌｌ  ７８：１０８９）；などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００６２】
「昆虫耐性」によって、植物が植物−昆虫相互作用の結果である症状および損傷を防止することが意図される。すなわち、昆虫は、植物損傷、穀物損傷、植物の外観損傷、および植物疾患を引き起こすことを予防され、あるいは昆虫によって引き起こされる植物損傷、穀物損傷、植物の外観損傷、および植物疾患が、最小化または低減される。目的の昆虫耐性遺伝子は、Ｂａｃｉｌｌｕｓからの毒素タンパク質を含む、その多くは、当該分野で公知である。
【００６３】
特に目的とされる異種ヌクレオチド配列は、種々の植物害虫（樹液を摂食する、注入口部または吸引口部を有する昆虫を含む）に対する増強された疾患耐性を付与する配列を含む。例えば、Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ目の昆虫（しばしば、Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ目の別個の亜目として見られる）は、植物ナンキンムシとして公知の昆虫を含む。これらの害虫としては、アブラムシ［Ａｐｈｉｄｉｄａｅ科］、コナジラミ［Ａｌｅｙｒｏｄｉｄａｅ］、ウンカ［Ｄｅｌｐｈａｃｉｄａｅ］、ヨコバイ［Ｃｉｃａｄｅｌｌｉｄａｅ］、キジラミ［Ｐｓｙｌｌｉｄａｅ］ワタアブラムシ［Ｐｅｍｐｈｉｇｉｄａｅ］、コナカイガラムシ［Ｐｓｅｕｄｏｃｏｃｃｉｄａｅ］、およびカイガラムシ［Ｃｏｃｃｉｄａｅ、Ｄｉａｓｐｉｄｉｄａｅ、Ａｓｔｅｒｏｌｅｃａｎｉｉｄａｅ、およびＭａｒｇａｒｏｄｉｄａｅ］が挙げられるがこれらに限定されない。多くの種は、農芸穀物および園芸穀物の深刻な害虫、ならびに鑑賞用植物の深刻な害虫である（例えば、エンドウヒゲナガアブラムシ、ブラックビーンアブラムシ；Ａｐｈｉｓ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ（ワタアブラムシ）；アオリンゴアブラムシ、ジャガイモヒゲナガナアブラムシ、コアブラムシ、バナナアブラムシ；Ｂｒｅｖｉｃｏｒｙｎｅ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ（キャベツアブラムシ）；カブラアブラムシ、ピーチポテトアブラムシ、トウモロコシアブラムシ、コムギアブラムシ、アブラナコナジラミ、タバココナジラミ、温室コナジラミ、ミカンノトゲコナジラミ、スモールトビイロウンカ、コメトビイロウンカ、クロフツノウンカ、ホワイトバックウンカ、グリーンコメヨコバイ、ビートヨコバイ、ワタヨコバイ、ジグザグウイングコメヨコバイ、アップルサッカー、ナシサッカー、リンゴワタアブラムシ、レタスネワタアブラムシ、ブドウネアブラムシ、ロングテイルカイガラムシ、パイナップルカイガラムシ、シマカイガラムシ、ピンクサトウキビカイガラムシ、ワタクッションカイガラムシ、オリーブカイガラムシ、ムラサキガイカイガラムシ、サンノゼカイガラムシ、カリフォルニアアカカイガラムシ、フロリダアカカイガラムシおよびココナツカイガラムシが挙げられる）。
【００６４】
甲虫目、鱗翅目および直翅目に属する昆虫の植物咀嚼段階に対する耐性をコードする昆虫耐性遺伝子はまた、目的の遺伝子であり、これらの昆虫としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：Ａｃａｎｔｈｏｓｃｅｌｉｄｅｓ  ｏｂｔｅｃｔｕｓ；Ｂｒｕｃｈｕｓ種；Ｃａｌｌｏｓｏｂｒｕｃｈｕｓ種［シャープマメゾウムシ］；Ａｇｒｉｏｔｅｓ種［コメツキムシ］特に、Ａｇｒｏｔｉｓ  ｉｐｓｉｌｏｎ（タマナヤガ）；Ａｍｐｈｉｍａｌｌｏｎ種［コガネ］；Ａｎｔｈｏｎｏｍｕｓ  ｇｒａｎｄｉｓ  ｇｒａｎｄｉｓ（ワタツミハナゾウムシ）；Ｃｅｕｔｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ａｓｓｉｍｉｌｉｓ（サルゾウムシ）；Ｃｙｌａｓ種［アリモドキゾウムシ］；Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ種［根きり虫］、特に、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ（ウリハムシ），Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｌｏｎｇｉｃｏｒｎｉｓ  ｂａｒｂｅｒｉ（ノーザンコーンルートワーム），Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ  ｈｏｗａｒｄｉ（サザンコーンルートワーム）；Ｅｐｉｃａｕｔａ種［クロツチハンミョウ］；Ｅｐｉｌａｃｈｎａ種［ウリハムシなど］、特に、Ｅｐｉｌａｃｈｎａ  ｖａｒｉｖｅｓｔｉｓ（マダラテントウムシ）；Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ  ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ（コロラドハムシ）；Ｍｅｌｉｇｉｓｔｈｅｓ種［ハナアブラムシ］；Ｍｅｌｏｌｏｎｔｈａ種［コフキコガネ］；Ｐｈｙｌｅｏｔｒｅｔａ種；Ｐｓｙｌｌｉｏｄｅｓ種［ハムシ］；Ｐｏｐｉｌｌｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ，Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｂｅｅｔｌｅ；Ｓｃｏｌｙｔｕｓ種［キクイムシ］；Ｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ種［コクゾウムシ］、特に、Ｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ，コクゾウムシ；Ｔｅｎｅｂｒｉｏ  ｍｏｌｉｔｏｒ［チャイロコメノゴミムシダマシ］；Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ種［コクヌストモドキ］；Ｔｒｏｇｏｄｅｒｍａ  ｇｒａｎａｒｉｕｍ，Ｋｈａｐｒａ  ｂｅｅｔｌｅ；Ａｃｌｅｒｉｓ種［フルーツチャハマキ］；Ａｃｒａｅａ  ａｃｅｒａｔａ，サツマイモチョウ；Ａｇｒｏｔｉｓ種［ヤガ］特に、Ａｇｒｏｔｉｓ  ｏｒｔｈｏｇｏｎｉａ，セイヨウヤガ；Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｇａｍｍａ，ギン−Ｙガ；Ｃｈｉｌｏ種［ショウブヨトウ］特に、Ｃｈｉｌｏ  ｐａｒｔｅｌｌｕｓ（ソルグハムヤガ）；Ｃｙｄｉａ  ｐｏｍｏｎｅｌｌａ（コドリンガ）；Ｄｉｐａｒｏｐｓｉｓ種［レッドボルウォーム］；Ｅｐｈｅｓｔｉａ種［コナマダラメイガ］；Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ種、特に、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ（ワタガ）；Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ種［ガ，ワタノミムシ］特に、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ（オオタバコガ）；Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ（ヨトウガ）；Ｍａｎｄｕｃａ種［マメシャクトリムシ］，Ｍａｒｕｃａ  ｔｅｓｔｕｌａｌｉｓ（マングガ）；Ｍｙｔｈｉｍｎａ種［シリアルアワヨトウ］；Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｎｕｂｉｌａｌｉｓ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｃｏｒｎ  ｂｏｒｅｒ；Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ  ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ（ワタアカミムシ）；Ｐｈｔｈｏｒｉｍａｅａ  ｏｐｅｒｃｕｌｅｌｌａ（ジャガイモガ）；Ｐｉｅｒｉｓ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ（キョダイモンシロチョウ）；Ｐｉｅｒｉｓ  ｒａｐａｅ（モンシロチョウ）；Ｐｌｏｄｉａ  ��ｎｔｅｒｐｕｎｃｔｅｌｌａ，Ｉｎｄｉａｎ  ｇｒａｉｎ  ｍｏｔｈ；Ｐｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ（コナガカイ）；Ｓｉｔａｔｒｏｇａ  ｃｅｒｅａｌｅｌｌａ，Ａｎｇｏｕｍｏｉｓ  ｇｒａｉｎ  ｍｏｔｈ；Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ種［ヨトウムシ］特に、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ヨトウガまたはオオタバコガ）およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｘｉｇｕａ（シロイチモジヨトウ）；Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ（カベージセミルーパー）；Ａｃｈｅｔａ種［タイワンエンマコオロギ］；Ｇｒｙｌｌｏｔａｌｐｈ種［ノミバッタ］；Ｌｏｃｕｓｔａ  ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ（トノサマバッタ）；ならびにＳｃｈｉｓｔｏｃｅｒｃａ  ｇｒｅｇａｒｉａ（サバクイナゴ）。
【００６５】
さらに、本発明のプロモーター配列は、以下の目から選択される昆虫の害虫に対する耐性をコードする昆虫耐性遺伝子の維管束組織優先の発現を可能にする：Ｄｉｐｔｅｒａ、Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ，Ｍａｌｌｏｐｈａｇａ，Ｔｈｙｓａｎｏｐｔｅｒａ，Ｄｅｒｍａｐｔｅｒａ，Ｉｓｏｐｔｅｒａ，Ａｎｏｐｌｕｒａ，Ｓｉｐｈｏｎａｐｔｅｒａ，Ｔｒｉｃｈｏｐｔｅｒａなど。主要な穀物に対する昆虫の害虫としては以下が挙げられる：トウモロコシ：Ｄｉａｔｒａｅａ  ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ（ナンセイブアワノメイガ）；Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ  ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ（レザーコーンスタークキクイムシ）；Ｄｉａｔｒａｅａ  ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ（サトウキビキクイムシ）；Ｍｅｌａｎｏｔｕｓ  ｓｐｐ．（コメツキムシ）；Ｃｙｃｌｏｃｅｐｈａｌａ  ｂｏｒｅａｌｉｓ，ノーザンマスクコガネムシ（シロジムシ）；Ｃｙｃｌｏｃｅｐｈａｌａ  ｉｍｍａｃｕｌａｔａ，サザンマスクコガネムシ（シロジムシ）；Ｃｈａｅｔｏｃｎｅｍａ  ｐｕｌｉｃａｒｉａ（トウモロコシノミアブラムシ）；Ｓｐｈｅｎｏｐｈｏｒｕｓ  ｍａｉｄｉｓ（トウモロコシゾウムシ）；Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ  ｍａｉｄｉｓ（トウモロコシハアブラムシ）；Ａｎｕｒａｐｈｉｓ  ｍａｉｄｉｒａｄｉｃｉｓ（トウモロコシネアブラムシ）；Ｂｌｉｓｓｕｓ  ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ  ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ（チンチバグ）；Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ  ｆｅｍｕｒｒｕｂｒｕｍ（アカアシグラスポッパー）；Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｉｐｅｓ（移動性グラスポッパー）；Ｈｙｌｅｍｙａ  ｐｌａｔｕｒａ（タネバエ）；Ａｇｒｏｍｙｚａ  ｐａｒｖｉｃｏｒｎｉｓ（コーンブロットハモグリムシ）；Ａｎａｐｈｏｔｈｒｉｐｓ  ｏｂｓｃｒｕｒｕｓ（クサキイロアザミウマ）；Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｍｉｌｅｓｔａ（シーフアント）；Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ  ｕｒｔｉｃａｅ（ナミハダニ）；Ｓｏｒｇｈｕｍ：Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ  ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ（レサーコーンストークアブラムシ）；Ｆｅｌｔｉａ  ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ（グラニュレートカットウォーム）；Ｐｈｙｌｌｏｐｈａｇａ  ｃｒｉｎｉｔａ（シロジムシ）；Ｅｌｅｏｄｅｓ，Ｃｏｎｏｄｅｒｕｓ，およびＡｅｏｌｕｓ  ｓｐｐ．（コメツキムシ）；Ｏｕｌｅｍａ  ｍｅｌａｎｏｐｕｓ（クビアカクビボソハムシ）；Ｃｈａｅｔｏｃｎｅｍａ  ｐｕｌｉｃａｒｉａ（トウモロコシトビハムシ）；Ｓｐｈｅｎｏｐｈｏｒｕｓ  ｍａｉｄｉｓ（トウモロコシゾウムシ）；Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ  ｍａｉｄｉｓ；トウモロコシハアブラムシ；Ｓｉｐｈａ  ｆｌａｖａ（キイロサトウキビアブラムシ）；Ｂｌｉｓｓｕｓ  ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ  ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ（チンチバグ）；Ｃｏｎｔａｒｉｎｉａ  ｓｏｒｇｈｉｃｏｌａ（ソルグハムミッジ）；Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ  ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ（ニセナミハダニ）；Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ  ｕｒｔｉｃａｅ（ナミハダニ）；コムギ：Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ  ｕｎｉｐｕｎｃｔａｔａ（アワヨトウ）；Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ  ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ（レサーコーンスタークアブラムシ）；Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ  ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ（レサーコーンスタークアブラムシ）；Ｏｕｌｅｍａ  ｍｅｌａｎｏｐｕｓ（クビアカクビボソハムシ）；Ｈｙｐｅｒａ  ｐｕｎｃｔａｔａ（クローバーハムシ）；Ｓｃｈｉｚａｐｈｉｓ  ｇｒａｍｉｎｕｍ（アブラムシ）；Ｍａｃｒｏｓｉｐｈｕｍ  ａｖｅｎａｅ，Ｅｎｇｌｉｓｈ  ｇｒａｉｎ  ａｐｈｉｄ；Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ  ｆｅｍｕｒｒｕｂｒｕｍ（アカアシグラスホッパー）；Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｉｓ（異種グラスホッパー）；Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｉｐｅｓ，（移動性グラスホッパー）；Ｍａｙｅｔｉｏｌａ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ（コムギタマバエ）；Ｓｉｔｏｄｉｐｌｏｓｉｓ  ｍｏｓｅｌｌａｎａ（コムギムシ）；Ｍｅｒｏｍｙｚａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ（ムギキモグリバエ）；Ｈｙｌｅｍｙａ  ｃｏａｒｃｔａｔａ（コムギキュウコンバエ）；Ｆｒａｎｋｌｉｎｉｅｌｌａ  ｆｕｓｃａ（タバコアザミウマ）；Ｃｅｐｈｕｓ  ｃｉｎｃｔｕｓ（コムギミキアカハバチ）；Ａｃｅｒｉａ  ｔｕｌｉｐｅ（コムギツルダニ）；ヒマワリ：Ｓｕｌｅｉｍａ  ｈｅｌｉａｎｔｈａｎａ（ヒマワリツボミガ）；Ｈｏｍｏｅｏｓｏｍａ  ｅｌｅｃｔｅｌｌｕｍ（ヒマワリガ）；ｚｙｇｏｇｒａｍｍａ  ｅｘｃｌａｍａｔｉｏｎｉｓ（ヒマワリアブラムシ）；Ｂｏｔｈｙｒｕｓ  ｇｉｂｂｏｕｓ（ニンジンアブラムシ）；Ｎｅｏｌａｓｉｏｐｔｅｒａ  ｍｕｒｔｆｅｌｄｔｉａｎａ（ヒマワリタネユスリカ）；ワタ：；Ｐｓｅｕｄａｔｏｍｏｓｃｅｌｉｓ  ｓｅｒｉａｔｕｓ（ワタフリーホッパー）；Ｔｒｉａｌｅｕｒｏｄｅｓ  ａｂｕｔｉｌｏｎｅａ（バンドウイングホワイトフライ）；Ｌｙｇｕｓ  ｌｉｎｅｏｌａｒｉｓ（マキバメク）；Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ  ｆｅｍｕｒｒｕｂｒｕｍ（アカアシグラスホッパー）；Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｉｓ（異種グラスホッパー）；Ｔｈｒｉｐｓ  ｔａｂａｃｉ（ネギアザミウマ）；Ｆｒａｎｋｌｉｎｋｉｅｌｌａ  ｆｕｓｃａ（タバコアザミウマ）；Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ  ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ（ニセナミハダニ）；Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ  ｕｒｔｉｃａｅ（ナミハダニ）；イネ：Ｄｉａｔｒａｅａ  ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ（サトウキビアブラムシ）；Ｃｏｌａｓｐｉｓ  ｂｒｕｎｎｅａ（グレープコラプシス）；Ｌｉｓｓｏｒｈｏｐｔｒｕｓ  ｏｒｙｚｏｐｈｉｌｕｓ（イネミズゾウムシ）；Ｎｅｐｈｏｔｅｔｔｉｘ  ｎｉｇｒｏｐｉｃｔｕｓ（コメヨコバイ）；Ｂｌｉｓｓｕｓ  ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ  ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ（チンチバグ）；Ａｃｒｏｓｔｅｒｎｕｍ  ｈｉｌａｒｅ（アオクサカメムシ）；ダイズ：Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ  ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ（ダイズシャクトリムシ）；Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ  ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ（べルベットビーンイモムシ）；Ｐｌａｔｈｙｐｅｎａ  ｓｃａｂｒａ（グリーンクローバーワーム）；Ｍｙｚｕｓ  ｐｅｒｓｉｃａｅ（モモアカアブラムシ）；Ｅｍｐｏａｓｃａ  ｆａｂａｅ（ジャガイモアブラムシ）；Ａｃｒｏｓｔｅｒｎｕｍ  ｈｉｌａｒｅ（アオクサカメムシ）；Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ  ｆｅｍｕｒｒｕｂｒｕｍ（アカアシグラスホッパー）；Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｉｓ（異種グラスホッパー）；Ｈｙｌｅｍｙａ  ｐｌａｔｕｒａ（タネトウモ���コシウジ）；Ｓｅｒｉｃｏｔｈｒｉｐｓ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ（ダイズアザミウマ）；Ｔｈｒｉｐｓ  ｔａｂａｃｉ（ネギアザミウマ）；Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ  ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉ（ストロベリースパイダーマイト）；Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ  ｕｒｔｉｃａｅ（ナミハダニ）；Ｂａｒｌｅｙ：Ｓｃｈｉｚａｐｈｉｓ  ｇｒａｍｉｎｕｍ（アブラムシ）；Ｂｌｉｓｓｕｓ  ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ  ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ（チンチバグ）；Ａｃｒｏｓｔｅｒｎｕｍ  ｈｉｌａｒｅ（アオクサカメムシ）；Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ  ｓｅｒｖｕｓ（チャイロカメムシ）；Ｄｅｌｉａ  ｐｌａｔｕｒａ（タネトウモロコシウジ）；Ｍａｙｅｔｉｏｌａ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ（コムギタマバエ）；Ｐｅｔｒｏｂｉａ  ｌａｔｅｎｓ（チャイロコムギダニ）；脂肪種子サイヨウアブラナ：Ｐｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ  ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ，Ｆｌｅａ  ｂｅｅｔｌｅ；Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔａ，Ｂｅｒｔｈａ  アワヨトウ；Ｄｅｌｉａ  ｓｓｐ．（根食い虫）
増強された昆虫耐性を付与するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、当該分野で公知である。例えば、このような配列としては、以下をコードする配列が挙げられるがこれらに限定されない：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒性タンパク質（米国特許第５，３６６，８９２号；同第５，７４７，４５０号；同第５，７３６，５１４号；同第５，７２３，７５６号；同第５，５９３，８８１号；同第６，１１０，４６４号；同第６，０３３，８７４号；同第６，０１５，８９１号；同第５，９４２，６６４号；同第５，９１４，３１８号；同第５，５６７，６００号；同第５，５６７，８６２号；同第５，７２３，４４０号；同第６，１５３，８１４号；同第６，０６３，７５６号；同第５，８５４，０５３号；同第５，８５４，０５３号；Ｇｅｉｓｅｒら（１９８６）Ｇｅｎｅ  ４８：１０９）；レクチン類（ここでレクチンは、以下を含む：マツユキソウレクチン、ナシレクチン、ナタマメレクチン、改変ナタマメレクチン、コムギレクチン、ジャガイモレクチン、ピーナツレクチンまたはコムギ凝集素、アプロチニン、およびＨｅｒｎａｎｄｉａ  ｍｏｅｒｅｎｈｏｕｔｉａｎａレクチン（Ｚｈｏｕら（１９９８）Ｃｈｉｎ  Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １４：９；Ｖａｎ  Ｄａｍｍｅら（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：８２５；米国特許第５，５４５，８２０号；ＷＯ９４１６５６５Ａ１号；およびＷＯ００／４４７８０号）；リポキシダーゼ（ここで、リポキシダーゼは、ナシリポキシダーゼ１またはダイズリポキシダーゼを含む）；昆虫キチナーゼ（米国特許第５，８６６，７８８号）；殺虫薬ポリペプチダーゼ（米国特許第５，８２４，８６４号）；など。これらの参考文献の全ては、参考として本明細書中に援用される。
【００６６】
樹液吸引昆虫は、感染した植物から健康な植物にウイルスを移す。このようなウイルスとしては以下が挙げられる：ライスツングロ杵状ウイルス（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａ−Ｐａｋｒａｓｉら（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．４：７１）、タバコモザイクウイルス（Ｃｈｅｎｇら（２０００）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．３：３４９）、サツマイモ退緑萎縮（ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ  ｓｔｕｎｔ）ウイスル、およびサツマイモ斑紋モザイクウイルス（Ｋａｒｙｅｉｊａら（２０００）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２６９：２６）。抗病原体活性を有する異種ヌクレオチド配列の篩部（ｐｈｌｏｅｍ）嗜好性発現は、ウイルス病原体の影響を低減または最小化する。
【００６７】
目的のさらなる病原体としては、ウイルスまたはウイロイドおよび真菌が挙げられるがこれらに限定されない。ウイルスは、任意の植物ウイルス（例えば、タバコモザイクウイルス、キュウリモザイクウイルス、または輪紋ウイスル、壊死ウイルス、トウモロコシ萎縮モザイクウイルス（ｄｗａｒｆ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）など）を含む。主要な穀物に対する特定の真菌病原体およびウイルス病原体としては以下が挙げられる：ダイズ：Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｍｅｇａｓｐｅｒｍａ  ｆｓｐ．ｇｌｙｃｉｎｅａ、Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ  ｐｈａｓｅｏｌｉｎａ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ  ｐｈａｓｅｏｌｏｒｕｍ  ｖａｒ．ｓｏｊａｅ（Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ  ｓｏｊａｅ）、Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ  ｐｈａｓｅｏｌｏｒｕｍ  ｖａｒ．ｃａｕｌｉｖｏｒａ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ  ｒｏｌｆｓｉｉ、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｋｉｋｕｃｈｉｉ、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｓｏｊｉｎａ、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｍａｎｓｈｕｒｉｃａ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｄｅｍａｔｉｕｍ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｉｃｈｕｍ  ｔｒｕｎｃａｔｕｍ）、Ｃｏｒｙｎｅｓｐｏｒａ  ｃａｓｓｉｉｃｏｌａ、Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ｇｌｙｃｉｎｅｓ、Ｐｈｙｌｌｏｓｔｉｃｔａ  ｓｏｊｉｃｏｌａ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐ．ｖ．ｇｌｙｃｉｎｅａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐ．ｖ．ｐｈａｓｅｏｌｉ、Ｍｉｃｒｏｓｐｈａｅｒａ  ｄｉｆｆｕｓａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｅｍｉｔｅｃｔｕｍ、Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ  ｇｒｅｇａｔａ、ダイズモザイクウイルス、Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｇｌｙｃｉｎｅｓ、タバコ輪点ウイルス、タバコ条斑ウイルス、Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ  ｐａｃｈｙｒｈｉｚｉ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｕｌｔｉｍｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｄｅｂａｒｙａｎｕｍ、トマト黄化壊疽（ｓｐｏｔｔｅｄ  ｗｉｌｔ）ウイルス、Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ  ｇｌｙｃｉｎｅｓ  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ；アブラナ：Ａｌｂｕｇｏ  ｃａｎｄｉｄａ、Ａｌｔｅｍａｒｉａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍａｃｕｌａｎｓ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ、Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ  ｂｒａｓｓｉｃｃｏｌａ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｕｌｔｉｍｕｍ、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｐａｒａｓｉｔｉｃａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔａ；アルファルファ：Ｃｌａｖｉｂａｔｅｒ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｓｅ  ｓｕｂｓｐ．ｉｎｓｉｄｉｏｓｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｕｌｔｉｍｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｓｐｌｅｎｄｅｎｓ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｄｅｂａｒｙａｎｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｍｅｇａｓｐｅｒｍａ、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｔｒｉｆｏｌｉｏｒｕｍ、Ｐｈｏｍａ  ｍｅｄｉｃａｇｉｎｉｓ  ｖａｒ．ｍｅｄｉｃａｇｉｎｉｓ、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｍｅｄｉｃａｇｉｎｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｐｅｚｉｚａ  ｍｅｄｉｃａｇｉｎｉｓ、Ｌｅｐｔｏｔｒｏｃｈｉｌａ  ｍｅｄｉｃａｇｉｎｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐ．ｖ．ａｌｆａｌｆａｅ、Ａｐｈａｎｏｍｙｃｅｓ  ｅｕｔｅｉｃｈｅｓ、Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ  ｈｅｒｂａｒｕｍ、Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ  ａｌｆａｌｆａｅ；コムギ：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐ．ｖ．ａｔｒｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｕｒｏｃｙｓｔｉｓ  ａｇｒｏｐｙｒｉ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐ．ｖ．ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐ．ｖ．ｓｙｒｉｎｇａｅ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔａ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｈｅｒｂａｒｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ａｖｅｎａｃｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ、Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｔｒｉｔｉｃｉ、Ａｓｃｏｃｈｙｔａ  ｔｒｉｔｉｃｉ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｃｏｌｌｏｔｅｔｒｉｃｈｕｍ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ、Ｅｒｙｓｉｐｈｅ  ｇｒａｍｉｎｉｓ  ｆ．ｓｐ．ｔｒｉｔｉｃｉ、Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ  ｆ．ｓｐ．ｔｒｉｔｉｃｉ、Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｒｅｃｏｎｄｉｔａ  ｆ．ｓｐ．ｔｒｉｔｉｃｉ、Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ、Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ  ｔｒｉｔｉｃｉｒｅｐｅｎｔｉｓ、Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ、Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ｔｒｉｔｉｃｉ、Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ａｖｅｎａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒｅｌｌａ  ｈｅｒｐｏｔｒｉｃｈｏｉｄｅｓ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｃｅｒｅａｌｓ、Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ  ｖａｒ．ｔｒｉｔｉｃｉ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｒｒｈｅｎｏｍａｎｅｓ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｕｌｔｉｍｕｍ、Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ、オオムギ黄色萎縮ウイルス（Ｙｅｌｌｏｗ  Ｄｗａｒｆ  Ｖｉｒｕｓ）、スズメノチャヒキ（Ｂｒｏｍｅ）モザイクウイルス、ムギ類モザイクウイルス、コムギ萎縮モザイクウイルス、コムギ紡錘状（Ｓｐｉｎｄｌｅ）萎縮ウイルス、アメリカコムギ線条（Ｓｔｒｉａｔｅ）ウイルス、Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ  ｐｕｒｐｕｒａ、Ｔｉｌｌｅｔｉａ  ｔｒｉｔｉｃｉ、Ｔｉｌｌｅｔｉａ  ｌａｅｖｉｓ、Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｔｒｉｔｉｃｉ、Ｔｉｌｌｅｔｉａ  ｉｎｄｉｃａ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｒｒｈｅｎｏｍａｎｎｅｓ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｇｒａｍｉｃｏｌａ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ、高原ウイルス（Ｈｉｇｈ  Ｐｌａｉｎｓ  Ｖｉｒｕｓ）、ヨーロッパコムギ線条ウイルス；ヒマワリ：Ｐｌａｓｍｏｐｈｏｒａ  ｈａｌｓｔｅｄｉｉ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ、Ａｓｔｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗｓ、Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ｈｅｌｉａｎｔｈｉ、Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ  ｈｅｌｉａｎｔｈｉ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｈｅｌｉａｎｔｈｉ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｚｉｎｎｉａｅ、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ、Ｐｈｏ��ａ  ｍａｃｄｏｎａｌｄｉｉ、Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ  ｐｈａｓｅｏｌｉｎａ、Ｅｒｙｓｉｐｈｅ  ｃｉｃｈｏｒａｃｅａｒｕｍ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ａｒｒｈｉｚｕｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒ、Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｈｅｌｉａｎｔｈｉ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａｅ、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ  ｐｖ．ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ  ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｃｒｙｐｔｏｇｅａ、Ａｌｂｕｇｏ  ｔｒａｇｏｐｏｇｏｎｉｓ；コーン：Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ  ｖａｒ．ｓｕｂｇｌｕｔｉｎａｎｓ、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｓｔｅｗａｒｔｉｉ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、Ｓｔｅｎｏｃａｒｐｅｌｌａ  ｍａｙｄｉ（Ｄｉｐｌｏｄｉａ  ｍａｙｄｉｓ）、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｄｅｂａｒｙａｎｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｓｐｌｅｎｄｅｎｓ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｕｌｔｉｍｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ、Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ  ｍａｙｄｉｓ  Ｏ、Ｔ（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ）、Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｃａｒｂｏｎｕｍ  Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｃａｒｂｏｎｕｍ）、Ｅｘｓｅｒｏｈｉｌｕｍ  ｔｕｒｃｉｃｕｍ  Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ、Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｐｅｄｉｃｅｌｌａｔｕｍ、Ｐｈｙｓｏｄｅｒｍａ  ｍａｙｄｉｓ、Ｐｈｙｌｌｏｓｔｉｃｔａ  ｍａｙｄｉｓ、Ｋａｂａｔｉｅｌｌａ  ｍａｙｄｉｓ、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｓｏｒｇｈｉ、Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ、Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｓｏｒｇｈｉ、Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｐｏｌｙｓｏｒａ、Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ  ｐｈａｓｅｏｌｉｎａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｏｘａｌｉｃｕｍ、Ｎｉｇｒｏｓｐｏｒａ  ｏｒｙｚａｅ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｈｅｒｂａｒｕｍ、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｌｕｎａｔａ、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｐａｌｌｅｓｃｅｎｓ、Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｅ  ｓｕｂｓｐ．ｎｅｂｒａｓｋｅｎｓｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ、トウモロコシ萎縮ウイルスＡおよびトウモロコシ萎縮ウイルスＢ、コムギ線条モザイクウイルス、トウモロコシ退緑萎縮ウイルス、Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ  ｓｏｒｇｈｉ、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｍａｓ  ａｖｅｎａｅ、Ｅｒｖｖｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ  ｐｖ．ｚｅａ、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ、Ｃｏｒｎ  ｓｔｕｎｔ  ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ  ｍａｃｒｏｓｐｏｒａ、Ｓｃｌｅｒｏｐｈｔｈｏｒａ  ｍａｃｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｒｏｎｏｓｃｌｅｒｏｓｐｏｒａ  ｓｏｒｇｈｉ、Ｐｅｒｏｎｏｓｃｌｅｒｏｓｐｏｒａ  ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｎｓｉｓ、Ｐｅｒｏｎｏｓｃｌｅｒｏｓｐｏｒａ  ｍａｙｄｉｓ、Ｐｅｒｏｎｏｓｃｌｅｒｏｓｐｏｒａ  ｓａｃｃｈａｒｉ、Ｓｐｈａｃｅｌｏｔｈｅｃａ  ｒｅｉｌｉａｎａ、Ｐｈｙｓｏｐｅｌｌａ  ｚｅａｅ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｍａｙｄｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ  ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、トウモロコシ退緑斑紋（Ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ  Ｍｏｔｔｌｅ）ウイルス、高原ウイルス、トウモロコシモザイクウイルス、トウモロコシラヤドフィノ（Ｒａｙａｄｏ  Ｆｉｎｏ）ウイルス、トウモロコシ線条（Ｓｔｒｉａｔｅ）ウイルス、トウモロコシ紡錘状（Ｓｐｉｎｄｌｅ）ウイルス、トウモロコシラフドワーフ（Ｒｏｕｇｈ  Ｄｗａｒｆ）ウイルス；サトウモロコシ：Ｅｘｓｅｒｏｈｉｌｕｍ  ｔｕｒｃｉｃｕｍ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｓｏｒｇｈｉ、Ｇｌｏｅｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｓｏｒｇｈｉ、Ａｓｃｏｃｈｙｔａ  ｓｏｒｇｈｉｎａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇｅ  ｐ．ｖ．ｓｙｒｉｎｇｅ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐ．ｖ．ｈｏｌｃｉｃｏｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎｉｓ、Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｐｕｒｐｕｒａ、Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ  ｐｈａｓｅｏｌｉｎａ、Ｐｅｒｃｏｎｉａ  ｃｉｒｃｉｎａｔａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔａ、Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ  ｓｏｒｇｈｉｃｏｌａ、Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｏｒｇｈｉｃｏｌａ、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｌｕｎａｔａ、Ｐｈｏｍａ  ｉｎｓｉｄｉｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｖｅｎａｅ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｌｂｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｎｓ）、Ｒａｍｕｌｉｓｐｏｒａ  ｓｏｒｇｈｉ、Ｒａｍｕｌｉｓｐｏｒａ  ｓｏｒｇｈｉｃｏｌａ、Ｐｈｙｌｌａｃｈａｒａ  ｓａｃｃｈａｒｉ、Ｓｐｏｒｉｓｏｒｉｕｍ  ｒｅｉｌｉａｎｕｍ（Ｓｐｈａｃｅｌｏｔｈｅｃａ  ｒｅｉｌｉａｎａ）、Ｓｐｈａｃｅｌｏｔｈｅｃａ  ｃｒｕｅｎｔａ、Ｓｐｏｒｉｓｏｒｉｕｍ  ｓｏｒｇｈｉ、サトウキビモザイクＨ、トウモロコシ萎縮モザイクウイルスＡおよびトウモロコシ萎縮モザイクウイルスＢ、Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ  ｓｏｒｇｈｉ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｓｔｒｉｃｔｕｍ、Ｓｃｌｅｒｏｐｈｔｈｏｎａ  ｍａｃｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｒｏｎｏｓｃｌｅｒｏｓｐｏｒａ  ｓｏｒｇｈｉ、Ｐｅｒｏｎｏｓｃｌｅｒｏｓｐｏｒａ  ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｎｓｉｓ、Ｓｃｌｅｒｏｓｐｏｒａ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｒｒｈｅｎｏｍａｎｅｓ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａなど。
【００６８】
線虫としては、寄生虫線虫（根節線虫（ｒｏｏｔ−ｋｎｏｔ  ｎｅｍａｔｏｄｅ）、シスト線虫（ｃｙｓｔ  ｎｅｍａｔｏｄｅ）、および病変線虫（ｌｅｓｉｏｎ  ｎｅｍａｔｏｄｅ）（ＨｅｔｅｒｏｄｅｒａおよびＧｌｏｂｏｄｅｒａ  ｓｐｐ；特に、Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ  ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓおよびＧｌｏｂｏｄｅｒａ  ｐａｉｌｉｄａ（ジャガイモシスト線虫）；Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ  ｇｌｙｃｉｎｅｓ（ダイズシスト線虫）；Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ  ｓｃｈａｃｈｔｉｉ（ビートシスト線虫）；ならびにＨｅｔｅｒｏｄｅｒａ  ａｖｅｎａｅ（穀物シスト線虫）を含む））が挙げられる。
【００６９】
本発明のさらなる実施形態は、除草剤耐性特性の発現を可能にする。除草剤耐性特性は、除草剤に対する耐性をコードする遺伝子によって、植物に導入され得、これらの遺伝子は、アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）（特に、スルホニル尿素型除草剤（例えば、このような耐性を導く変異（特に、Ｓ４変異および／またはＨｒａ変異）を含むアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）遺伝子））の作用を阻害するように作用する。グルタミンシンターゼ（例えば、ホスフィノトリシンまたはバスタ（例えば、ｂａｒ遺伝子）、あるいは当該分野で公知の他のこのような遺伝子）の作用を阻害するように作用する、除草剤に対する耐性をコードする遺伝子もまた、目的の遺伝子である。ｂａｒ遺伝子は、除草剤バスタに対する耐性をコードし、そしてＡＬＳ遺伝子変異型は、除草剤クロルスルフロンに対する耐性をコードする。
【００７０】
本発明において使用される目的のヌクレオチド配列は、穀物の成長に関係する市場およびその市場の目的を反映することが、さらに理解される。目的の穀物および市場は、変化し、発展途上国が世界市場を開放した場合、新規穀物および技術がまた明らかになる。さらに、作物学的特性および特徴（例えば、収量およびヘテローシス）に対する本発明者らの理解が増えるにつれて、形質転換に対する遺伝子の選択は、それに応じて変化する。
【００７１】
目的のヌクレオチド配列の一般的な範疇としては、例えば、情報に関与する遺伝子（例えば、ジンクフィンガー）、伝達に関与する遺伝子（例えば、キナーゼ）、ハウスキーピングに関与する遺伝子（例えば、熱ショックタンパク質）、および篩部負荷に関与する遺伝子（例えば、輸送体）が挙げられる。トランスジーンのより具体的な範疇としては、例えば、作物学的に重要な特性（昆虫耐性、疾患耐性、除草剤耐性、滲出物特性、および市販産物）をコードする遺伝子が挙げられる。目的のヌクレオチド配列は、一般に、油、デンプン、炭水化物、または栄養素代謝に関与するヌクレオチド配列、および顆粒の大きさ、スクロース負荷、栄養素輸送などに影響するヌクレオチド配列をさらに含む。
【００７２】
作物学的に重要な特性（油含量、デンプン含量、およびタンパク質含量）は、一般的に、本発明の方法を使用して改変され得る。改変としては、オレイン酸の含量、飽和油の含量または不飽和油の含量の増加、リジンレベルおよび硫黄レベルの増加、必須アミノ酸の提供、ならびにデンプンの改変が挙げられる。ホルドチオニンタンパク質の改変は、１９９７年４月１０日に出願された、米国特許出願０８／８３８，７６３号；１９９７年３月２６日に出願された、０８／８２４，３７９号；１９９７年３月２６日に出願された、０８／８２４，３８２号；および米国特許第５，７０３，０４９号に記載される（参考として本明細書中に援用される）。他の例は、ダイズ２Ｓアルブミンによってコードされる、リジンおよび／または硫黄リッチ種子タンパク質であり、これは、１９９６年３月２０日に出願された、米国特許出願０８／６１８，９１１号およびオオムギ由来のキモトリプシンインヒビター、Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎら（１９８７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６５：９９−１０６に開示され、その開示は、参考として本明細書中に援用される。
【００７３】
これらのコード配列の誘導体は、部位特異的変異導入によって作製され得、コードされたポリペプチド中の前もって選択されたアミノ酸のレベルを増加する。例えば、オオムギハイリジン（ｈｉｇｈ  ｌｙｓｉｎｅ）ポリペプチド（ＢＨＬ）をコードする遺伝子は、オオムギキモトリプシンインヒビターに由来する（１９９６年１１月１日に出願された、米国特許出願０８／７４０，６８２号および１９９７年１０月３１日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ９７／２０４４１号（各々の開示は、参考として本明細書中に援用される））。他のタンパク質としては、メチオニンリッチ植物タンパク質（例えば、ヒマワリの種子）（Ｌｉｌｌｅｙら（１９８９）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｎ  Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｆｏｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｎｉｍａｌ  Ｆｅｅｄｓｔｕｆｆｓ，Ａｐｐｌｅｗｈｉｔｅ編（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｃｈａｍｐａｉｇｎ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）、４９７頁−５０２頁；参考として、本明細書中に援用される））；トウモロコシ（Ｐｅｄｅｒｓｅｎら（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：６２７９；Ｋｉｒｉｈａｒａら（１９８８）Ｇｅｎｅ  ７１：３５９；この両方は、参考として本明細書中に援用される）；およびコメ（Ｍｕｓｕｍｕｒａら（１９８９）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：１２３，参考として本明細書中に援用される）が挙げられる。他の作物学的に重要な遺伝子は、ラテックス、Ｆｌｏｕｒｙ  ２、増殖因子、種子保存因子、および転写因子をコードする。
【００７４】
穀物の質は、油のレベルおよび油の型、飽和および不飽和、必須アミノ酸の質および量、ならびにセルロースのレベルのような性質に影響される。とうもろこしにおいて、改変されたホルドチオニンタンパク質は、１９９７年４月１０日に出願された、米国特許出願０８／８３８，７６３号；１９９７年３月２６日に出願された、０８／８２４，３７９号；１９９７年３月２６日に出願された０８／８２４，３８２；および１９９７年１２月３０日に発行された米国特許第５，７０３，０４９号に記載され、これらは、所望の目的についてタンパク質の改変の記載を提供する。
【００７５】
商業的特徴は、例えば、エタノール生成のためのデンプンを増加し得るか、またはタンパク質の発現を提供する遺伝子上にコードされ得る。形質転換した植物の別の重要な商業的使用は、１９９７年２月１１日に発行された米国特許第５，６０２，３２１号に記載されるようなポリマーおよび生体プラスチックの産生である。Ｂ−ケトチオラーゼ、ＰＨＢａｓｅ（ポリヒドロキシブリレート（ｂｕｒｙｒａｔｅ）シンターゼ）およびアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（Ｓｃｈｕｂｅｒｔら（１９８８）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：５８３７−５８４７を参照のこと）のような遺伝子は、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の発現を容易にする。本発明の特定の実施形態は、このポリマーおよび生体プラスチックの篩部優先的発現を包含し、浸出液または植物樹液からのこれらの生成物の収集および回収を容易にする。
【００７６】
外因性生成物は、植物酵素および生成物ならびに原核生物および他の真核生物を含む他の供給源からの酵素および生成物を含む。このような生成物としては、酵素、補因子、ホルモンなどが挙げられる。タンパク質（特に、植物の栄養素価値を改善するための改善されたアミノ酸分布を有する改変タンパク質）のレベルは、増加し得る。このことは、増加したアミノ酸含量を有するこのようなタンパク質の発現によって達成される。
【００７７】
目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結された、本発明のプロモーター配列を含む発現カセットは、任意の植物種（単子葉植物および双子葉植物を含むがこれらに限定されない）を形質転換するために使用され得る。目的の植物種の例としては、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ種（例えば、Ｂ．ｎａｐｕｓ、Ｂ．ｒａｐａ、Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）、特に、以下の種子油の供給源として有用なＢｒａｓｓｉｃａ種：アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）、コメ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）、サトウモロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ，Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、キビ（ｍｉｌｌｅｔ）（例えば、トウジンビエ（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｇｌａｕｃｕｍ）、キビ（ｐｒｏｓｏ  ｍｉｌｌｅｔ）（Ｐａｎｉｃｕｍ  ｍｉｌｉａｃｅｕｍ）、アワ（Ｓｅｔａｒｉａ  ｉｔａｌｉｃａ）、シコワビエ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ  ｃｏｒａｃａｎａ））、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ピーナツ（ｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ  ｂａｔａｔｕｓ）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ種）、ココナッツ（Ｃｏｃｏｓ  ｎｕｃｉｆｅｒａ、パイナップル（Ａｎａｎａｓ  ｃｏｍｏｓｕｓ）、ミカンノキ（Ｃｉｔｒｕｓ種）、ココア（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ）、茶（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、バナナ（Ｍｕｓａ種）、アボカド（Ｐｅｒｓｅａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）、イチジク（Ｆｉｃｕｓ  ｃａｓｉｃａ）、グアヴァ（Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａ）、マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ  ｉｎｄｉｃａ）、オリーブ（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ）、パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ  ｐａｐａｙａ）、カシュー（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ）、マカダミア（Ｍａｃａｄａｍｉａ  ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ）、アーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ  ａｍｙｇｄａｌｕｓ）、テンサイ（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ種）、エンバク、エンバク、ヤサイ、オーナメント、および針葉樹が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７８】
植物としては、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、レタス（例えば、Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ）、緑莢サヤインゲン（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ライマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｌｉｍｅｎｓｉｓ）、エンドウ（Ｌａｔｈｙｒｕｓ  ｓｐｐ．）、およびＣｕｃｕｍｉｓ属のメンバー（例えば、キュウリ（Ｃ．ｓａｔｉｖｕｓ）、カンタロープ（Ｃ．ｃａｎｔａｌｕｐｅｎｓｉｓ）およびマスクメロン（Ｃ．ｍｅｌｏ）が挙げられる。観賞植物としては、アザレア（Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ  ｓｐｐ．）、アジサイ（Ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ  ｈｙｄｒａｎｇｅａ）、ハイビスカス（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ  ｒｏｓａｓａｎｅｎｓｉｓ）、バラ（Ｒｏｓａ  ｓｐｐ．）、チューリップ（Ｔｕｌｉｐａ  ｓｐｐ．）、スイセン（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ  ｓｐｐ．）、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ）、カーネーション（Ｄｉａｎｔｈｕｓ  ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ）、ポインセチア（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ  ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）およびキクが挙げられる。
【００７９】
本発明を実施する際に使用され得る針葉樹としては、例えば、マツ（例えば、テーダマツ（ｌｏｂｌｏｌｌｙ  ｐｉｎｅ）（Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａ）、テーダマツ（ｓｌａｓｈ  ｐｉｎｅ）（Ｐｉｎｕｓ  ｅｌｌｉｏｔｉｉ）、ポンデローサマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｐｏｎｄｅｒｏｓａ）、ロッジポールマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｃｏｎｔｏｒｔａ）、およびモンテレーマツ（Ｍｏｎｔｅｒｅｙ  ｐｉｎｅ）（Ｐｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔａ））；ダグラスファー（Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ  ｍｅｎｚｉｅｓｉｉ）；アメリカツガ（Ｔｓｕｇａ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）；ベイトウヒ（Ｐｉｃｅａ  ｇｌａｕｃａ）；セコイア（Ｓｅｑｕｏｉａ  ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ）；モミ（ｔｒｕｅ  ｆｉｒｓ）（例えば、ヨーロッパモミ（ｓｉｌｖｅｒ  ｆｉｒ）（Ａｂｉｅｓ  ａｍａｂｉｌｌｉｓ）およびバルサムモミ（Ａｂｉｅｓ  ｂａｌｓａｍｅａ））；ならびにスギ（例えば、ベイスギ（Ｔｈｕｊａ  ｐｉｃａｔａ）およびアラスカヒノキ（Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ  ｎｏｏｔｋａｔｅｎｓｉｓ））が挙げられる。好ましくは、本発明の植物は、穀物（例えば、トウモロコシ、アルファルファ、ヒマワリ、アブラナ属、ダイズ、綿花、ベニバナ、落花生、モロコシ、コムギ、キビ、タバコなど）であり、より好ましくは、トウモロコシ植物およびダイズ植物であり、なおより好ましくは、トウモロコシ植物である。
【００８０】
形質転換プロトコルおよびヌクレオチド配列を植物中に導入するためのプロトコルは、形質転換のために標的化される植物の型または植物細胞の型（すなわち、単子葉または双子葉）に依存して、変化し得る。ヌクレオチド配列を植物細胞中に導入する適切な方法および植物ゲノム中へのその後の挿入の適切な方法としては、マイクロインジェクション（Ｃｒｏｓｓｗａｙら（１９８６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：３２０−３３４）、エレクトロポレーション（Ｒｉｇｇｓら（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：５６０２−５６０６）、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換（Ｔｏｗｎｓｅｎｄら，米国特許第５，５６３，０５５号、Ｚｈａｏら、米国特許第５，９８１，８４０号）、直接遺伝子移入（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉら（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：２７１７−２７２２）、および遺伝子銃粒子加速（例えば、Ｓａｎｆｏｒｄら，米国特許第４，９４５，０５０号；Ｔｏｍｅｓら，米国特許第５，８７９，９１８号；Ｔｏｍｅｓら，米国特許第５，８８６，２４４号；Ｂｉｄｎｅｙら，米国特許第５，９３２，７８２号；Ｔｏｍｅｓら（１９９５）「Ｄｉｒｅｃｔ  ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  Ｉｎｔａｃｔ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  Ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ」Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ，ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ＧａｍｂｏｒｇおよびＰｈｉｌｉｐｓ編（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）；ならびにＭｃＣａｂｅら（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：９２３−９２６）を参照のこと）が挙げられる。また、Ｗｅｉｓｓｉｎｇｅｒら（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２２：４２１−４７７；Ｓａｎｆｏｒｄら（１９８７）Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５：２７−３７（タマネギ）；Ｃｈｒｉｓｔｏｕら（１９８８）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．８７：６７１−６７４（ダイズ）；ＭｃＣａｂｅら（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：９２３−９２６（ダイズ）；Ｆｉｎｅｒ  ａｎｄ  ＭｃＭｕｌｌｅｎ  （１９９１）Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２７Ｐ：１７５−１８２  （ダイズ）；Ｓｉｎｇｈら（１９９８）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．９６：３１９−３２４（ダイズ）；Ｄａｔｔａら（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：７３６−７４０（イネ）；Ｋｌｅｉｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：４３０５−４３０９（トウモロコシ）；Ｋｌｅｉｎら（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：５５９−５６３（トウモロコシ）；Ｔｏｍｅｓ，米国特許第５，２４０，８５５号；Ｂｕｉｓｉｎｇら，米国特許第５，３２２，７８３号および同第５，３２４，６４６号；Ｔｏｍｅｓら（１９９５）「Ｄｉｒｅｃｔ  ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  Ｉｎｔａｃｔ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  Ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ」Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ，ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ��，Ｇａｍｂｏｒｇ編（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）（トウモロコシ）；Ｋｌｅｉｎら（１９８８）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１：４４０−４４４（トウモロコシ）；Ｆｒｏｍｍら（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：８３３−８３９（トウモロコシ）；Ｈｏｏｙｋａａｓ−Ｖａｎ  Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３１１：７６３−７６４；Ｂｏｗｅｎら，米国特許第５，７３６，３６９号（穀物）；Ｂｙｔｅｂｉｅｒら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：５３４５−５３４９  （Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）；Ｄｅ  Ｗｅｔら（１９８５）ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｖｕｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅｓ，Ｃｈａｐｍａｎら編（Ｌｏｎｇｍａｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），ｐｐ．１９７−２０９（花粉）；Ｋａｅｐｐｌｅｒら（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ９：４１５−４１８、ならびにＫａｅｐｐｌｅｒら（１９９２）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８４：５６０−５６６（ｗｈｉｓｋｅｒ媒介性形質転換）；Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎら（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ４：１４９５−１５０５（エレクトロポレーション）；Ｌｉら（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １２：２５０−２５５、ならびにＣｈｒｉｓｔｏｕおよびＦｏｒｄ  （１９９５）Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｂｏｔａｎｙ  ７５：４０７−４１３  （イネ）；Ｏｓｊｏｄａら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：７４５−７５０（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを介するトウモロコシ）（これら全ては、本明細書中に参考として援用される）もまた参照のこと。
【００８１】
形質転換された細胞は、従来の方法に従って植物へと成長され得る。例えば、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋら（１９８６）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ５：８１〜８４を参照のこと。その後、これらの植物は、成長され得、同じ形質転換株または異なる株のいずれかで受粉され得、そして所望の表現型特徴の発現を有する生じたハイブリッドが、同定され得る。所望の表現型特徴の発現が安定に維持されそして遺伝されるのを確実にするように、２世代以上が成長され得、その後、所望の表現型特徴の発現が達成されたことを確実にするように、種子が採集され得る。
【００８２】
以下の実施例は、例示のために提供され、限定のためには提供されない。
【実施例】
【００８３】
（実験）
（実施例１：プロモーター配列の単離）
プルナシンヒドロラーゼをコードするＰｒｕｎｕｓ  ｓｅｒｏｔｉｎａ遺伝子についてのプロモーター領域を、ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ  ＫｉｔＴＭ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を利用して、サクラの木から単離した。プルナシンヒドロラーゼプロモーターについての配列が、配列番号１に示される。プルナシンヒドロラーゼプロモーター領域を含むプルナシンヒドロラーゼオペロンについての配列が、配列番号３に示される。配列番号３のヌクレオチド９８９〜２６２６は、プルナシンヒドロラーゼポリペプチドをコードする。
【００８４】
ゲノムＤＮＡを、「ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ」（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号６９１０４）を使用して、黒実サクランボ（ｂｌａｃｋ  ｃｈｅｒｒｙ）（Ｐｒｕｎｕｓ  ｓｅｒｏｔｉｎａ）の葉から抽出した。プロトコルは、記載された（１９９９年１１月編）通りに従った。その後、５つのＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒＴＭライブラリーを、「Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒＴＭ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｋ１８０７−１）についてのマニュアルに従って、そのゲノムＤＮＡから作製した。これらのライブラリーを、平滑切断酵素を使用して作製した。
【００８５】
ライブラリー  酵素      
ＤＬ−１      ＥｃｏＲＶ
ＤＬ−２      ＳｃａＩ
ＤＬ−３      ＤｒａＩ
ＤＬ−４      ＰｖｕＩＩ
ＤＬ−５      ＳｔｕＩ。
【００８６】
遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ１／配列番号７およびＧＳＰ２／配列番号８）を、プルナシンヒドロラーゼについての公知の配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｕ５０２０１）を使用して設計した。
【００８７】
（プルナシンヒドロラーゼＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒＴＭプライマー）
2005501535.tif 000002
【００８８】
その後、「Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒＴＭ  Ｋｉｔ」についてのマニュアルに従って、ＧＳＰ１プライマーを一次ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒＴＭ  増幅のために使用し、ＧＳＰ２プライマーを二次増幅のために使用して、増幅を実行した。１．５ｋｂのバンドが、Ｄｌ−１ライブラリーにおいて生成された。このフラグメントを、ｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ａ１３６０）中にクローン化し、そして配列決定した。その配列からの結果は、２つの異なる生成物が、クローン化産物中に存在したことを示した。それらの産物を、ＤＬ１．４およびＤＬ１．１と呼んだ。ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒＴＭフラグメントからの配列に基づく順方向プライマーと、プルナシンヒドロラーゼ配列からの逆方向プライマーを使用して産物を増幅することによって、両方の産物がプルナシンヒドロラーゼにゲノム上で近接することを確認した。一旦確認した後、ＰＨ  ＤＬ１．１プロモーターおよびＰＨ  ＤＬ１．４プロモーターを、下記のプライマーを使用して黒実サクランボ（ｂｌａｃｋ  ｃｈｅｒｒｙ）ゲノムＤＮＡから増幅して、開始子ドンにＮｃｏＩ部位を付加した。生成したフラグメントを、ｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙ中にクローン化し、確認のために配列決定した。
【００８９】
（プルナシンヒドロラーゼプロモーターＰＣＲプライマー）
（ＤＬ１．１／配列番号５）
長さ１２６０の生成物（評点付け（ｒａｔｉｎｇ）：１６２。開始コドンにＮｃｏＩを配置する）
Ｔｍ：７４．５℃  ＴａＯｐｔ：５４．０Ｃ  ＧＣ：３６．８
配列番号９：ＡＣＣＧＴＧＣＧＡＡＡＧＧＴＣＴＴＣＴＴＧ
配列番号１０：ＡＴＧＣＣＡＴＧＧＣＴＧＡＧＡＧＧＡＧＧＧ。
【００９０】
（ＤＬ１．４／配列番号１）
長さ８７１の生成物（評点付け（ｒａｔｉｎｇ）：１６２）
（開始コドンにＮｃｏＩを配置する）
Ｔｍ：７３．７℃  ＴａＯｐｔ：５５．６Ｃ  ＧＣ：３５．６
配列番号１１：ＧＧＧＧＴＧＣＴＴＡＣＡＣＣＣＡＣＡＡＴＣＡＴＣＣ
配列番号１２：ＧＣＡＡＴＧＣＣＡＴＧＧＣＴＣＡＧＴＧＧＡＧ。
【００９１】
（実施例２：トランスジェニック植物の形質転換および再生）
温室ドナー植物からの未成熟トウモロコシ胚に、異種ヌクレオチド配列および選択マーカー遺伝子ＰＡＴ（Ｗｏｈｌｌｅｂｅｎら（１９８８）Ｇｅｎｅ  ７０：２５〜３７）（これは、除草剤Ｂｉａｌａｐｈｏｓに対する耐性を付与する）に作動可能に連結された、プルナシンヒドロラーゼプロモーターを含むプラスミドをボンバードメントする。あるいは、上記選択マーカー遺伝子は、別個のプラスミド上に提供する。形質転換は、以下のように実施する。培地の製法は、以下の通りである。
【００９２】
（標的組織の調製）
穂を剥ぎ、表面を、３０％ブリーチ剤＋０．５％界面活性剤中で２０分間滅菌し、滅菌水で２回リンスする。その未成熟胚を切り出し、５６０Ｙ培地上に胚軸側を下（胚盤側を上）にして４時間配置し（２５個の胚／プレート）、その後、ボンバードメントのための調製中に２．５ｃｍの標的領域内に並べる。
（ＤＮＡの調製）
異種ヌクレオチド配列に作動可能に連結したプルナシンヒドロラーゼプロモーターを含むプラスミドベクターを、作製する。このベクター＋（同じベクターまたは別個のベクターのいずれか中にある）ＰＡＴ選択マーカーを、以下の通りのＣａＣｌ２沈殿手順を使用して、１．１μｍ（平均直径）タングステン粒子上に沈殿させる：
水中に調製したタングステン粒子  １００μｌ
Ｔｒｉｓ  ＥＤＴＡ緩衝液中の（１μｇ）ＤＮＡ  １０μｌ（１μｇ総ＤＮＡ）
１００μｌ  ２．５Ｍ  ＣａＣｌ２
１０μｌ  ０．１Ｍスペルミジン。
【００９３】
各試薬を、タングステン粒子懸濁物に連続して添加しつつ、マルチチューブボルテックス上に維持する。最終混合物を、短く超音波処理し、一定のボルテックス処理下で１０分間インキュベートする。この沈殿時間の後、チューブを短く遠心分離し、液体を除去し、５００ｍｌの１００％エタノールで洗浄し、そして３０秒間遠心分離する。再度液体を除去し、そして１０５μｌの１００％エタノールを最終タングステン粒子ペレットに添加する。粒子銃ボンバードメントのために、このタングステン／ＤＮＡ粒子を短く超音波処理し、各マクロキャリアの中心上に１０μｌスポットし、ボンバードメント前に約２分間乾燥させた。
【００９４】
（粒子銃処理）
同じプレートを、粒子銃番号ＨＥ３４−１または粒子銃番号ＨＥ３４−２におけるレベル数４にてボンバードメントする。すべてのサンプルに、６５０  ＰＳＩにて単回ショットする。合計１０アリコートを、調製した粒子／ＤＮＡの各チューブから得る。
【００９５】
（その後の処理）
ボンバードメント後、胚を、５６０Ｙ培地上に２日間維持し、その後、３ｍｇ／リットルのＢｉａｌａｐｈｏｓを含む５６０Ｒ選択培地に写し、２週間ごとに継代する。約１０週間の選択の後、選択耐性カルスクローンを、２８８Ｊ培地に移して植物再生を開始する。体細胞胚成熟（２〜４週間）の後、十分に発達した体細胞胚を発芽用培地に移し、光照射した培養室に移す。約７〜１０日後、発達する外植片を、その外植片が十分に樹立するまで、７〜１０日間、チューブ中のホルモンを含まない２７２Ｖ培地に移す。その後、植物を、鉢植え用土壌を含む平箱中のインサート（２．５インチポットと等価）に移し、成長チャンバー中で１週間成長させ、その後、温室中でさらに１〜２週間成長させ、その後、古典的６００ポット（１．６ガロン）に移して成長させて成熟させる。植物をモニターし、異種ヌクレオチド配列の発現についてスコア付けする。
【００９６】
（ボンバードメントおよび培養培地）
ボンバードメント培地（５６０Ｙ）は、４．０ｇ／ｌ  Ｎ６基礎塩（ＳＩＧＭＡ  Ｃ−１４１６）、１．０ｍ／ｌ  Ｅｒｉｋｓｓｏｎ’ｓ  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｍｉｘ（１０００×  ＳＩＧＭＡ−１５１１）、０．５ｍｇ／ｌ塩酸チアミン、１２０．０ｇ／ｌスクロース、１．０ｍｇ／ｌ  ２，４−Ｄおよび２．８８ｇ／ｌ  Ｌ−プロリン（ＫＯＨを用いてｐＨ５．８に調整した後、Ｄ−ｌ  Ｈ２Ｏで体積を合わせる）；２．０ｇ／ｌ  Ｇｅｌｒｉｔｅ（Ｄ−ｌ  Ｈ２Ｏで体積を合わせた後添加する）；および８．５ｍｇ／ｌ硝酸銀（培地を滅菌し室温まで冷ました後に添加する）を含む。選択培地（５６０Ｒ）は、４．０ｇ／ｌ  Ｎ６基礎塩（ＳＩＧＭＡ  Ｃ−１４１６）、１．０ｍ／ｌ  Ｅｒｉｋｓｓｏｎ’  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｍｉｘ（１０００×  ＳＩＧＭＡ−１５１１）、０．５ｍｇ／ｌ塩酸チアミン、３０．０ｇ／ｌスクロース、および２．０ｍｇ／ｌ  ２，４−Ｄ（ＫＯＨを用いてｐＨ５．８に調整した後、Ｄ−ｌ  Ｈ２Ｏで体積を合わせる）；３．０ｇ／ｌ  Ｇｅｌｒｉｔｅ（Ｄ−ｌ  Ｈ２Ｏで体積を合わせた後添加する）；ならびに０．８５ｍｇ／ｌ硝酸銀および３．０ｍｇ／ｌのＢｉａｌａｐｈｏｓ（培地を滅菌し室温まで冷ました後に両方を添加する）を含む。
【００９７】
植物再生培地（２８８Ｊ）は、４．３ｇ／ｌのＭＳ塩（ＧＩＢＣＯ  １１１１７−０７４）、５．０ｍｌ／ｌ  ＭＳビタミンストック溶液（０．１００ｇニコチン酸、０．０２ｇ／ｌチアミンＨＣＬ、０．１０ｇ／ｌピリドキシンＨＣＬ、および０．４０ｇ／ｌグリシン（洗練したＤ−Ｉ  Ｈ２Ｏで容量にする）（ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ（１９６２）Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．１５：４７３）、１００ｍｇ／ｌミオイノシトール、０．５ｍｇ／ｌゼアチン、６０ｇ／ｌスクロース、および１．０ｍｌ／ｌの０．１ｍＭアブシジン酸（ｐＨ５．６に調整した後、洗練した  Ｄ−Ｉ  Ｈ２Ｏで容量にする）；３．０ｇ／ｌゲルライト（Ｇｅｌｒｉｔｅ）（Ｄ−Ｉ  Ｈ２Ｏで容量にした後添加）；および１．０ｍｇ／ｌインドール酢酸および３．０ｍｇ／ｌ  バイアラホス（ｂｉａｌａｐｈｏｓ）（培地を滅菌し、６０℃に冷却した後に添加）を含む。ホルモン非含有培地（２７２Ｖ）は、４．３ｇ／ｌのＭＳ塩（ＧＩＢＣＯ  １１１１７−０７４）、５．０ｍｌ／ｌ  ＭＳビタミンストック溶液（０．１００ｇ／ｌニコチン酸、０．０２ｇ／ｌチアミンＨＣＬ、０．１０ｇ／ｌピリドキシンＨＣＬ、および０．４０ｇ／ｌグリシン（洗練した  Ｄ−Ｉ  Ｈ２Ｏで容量にする）、０．１ｇ／ｌミオイノシトール、４０．０ｇ／ｌスクロース（ｐＨ５．６に調整した後、洗練した  Ｄ−Ｉ  Ｈ２Ｏで容量にする）；および６ｇ／ｌバクト−アガー（洗練した  Ｄ−Ｉ  Ｈ２Ｏで容量にした後添加）（培地を滅菌し、６０℃に冷却）を含む。
【００９８】
（実施例３：トウモロコシのアグロバクテリウム媒介形質転換）
本発明のプルナシン（ｐｒｕｎａｓｉｎ）ヒドロラーゼプロモーターでのトウモロコシのアクロバクテリウム媒介形質転換について、好ましくは、Ｚｈａｏの方法が用いられる（米国特許第５，９８１，８４０号およびＰＣＴ特許公開ＷＯ９８／３２３２６；これらの内容は本明細書によって参考として援用される）。簡潔には、トウモロコシから未熟胚を単離し、この胚をアグロバクテリウムの懸濁液と接触させ、ここでこの細菌は、少なくとも１つの未熟胚の少なくとも１つの細胞に、目的の異種ヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプルナシンヒドロラーゼプロモーターを移送し得る（工程１：感染工程）。この工程において、未熟胚を、好ましくは、接種の開始のためにアグロバクテリウム懸濁液中に浸漬する。これらの胚を、しばらくの間アグロバクテリウムと同時培養する（工程２：同時培養工程）。好ましくは、未熟胚を、感染工程後、固形培地上で培養する。この同時培養期間後、任意の「休止」工程が企図される。この休止工程後、胚を、植物形質転換体についての選択剤の添加なしでアグロバクテリウムの増殖を阻害することが公知の少なくとも１つの抗生物質の存在下でインキュベートする（工程３：休止工程）。好ましくは、アグロバクテリウムの除去のため、および感染細胞について休止期のために、未熟胚を、抗生物質を有するが、選択剤を有さない固形培地上で培養する。次に、接種された胚を、選択剤を含む培地上で培養し、そして増殖する形質転換カルスを回収する（工程４：選択工程）。好ましくは、これら未熟胚を、選択剤を有する固形培地上で培養し、形質転換細胞の選択的増殖を生じさせる。このカルスを、次いで、植物に再生させ（工程５：再生工程）、好ましくは、選択培地上で増殖したカルスを固形培地上で培養し、植物を再生させる。
【００９９】
（トウモロコシにおけるＧＵＳ融合構築物形質転換）
ＧＵＳに融合したプルナシンヒドロラーゼプロモーターを含有する構築物を用いて、上記のＺｈａｏの方法によってトウモロコシを形質転換した。１事象につき全部で３つの植物を再生させ、温室中に移植した。
【０１００】
（ＧＵＳ検出プロトコル）
トランスジェニック植物から採集した種々の組織試料を用手切片化し、そしてＧＵＳ発現パターンを３７℃で染色溶液中で一晩染色させることにより組織化学的にチェックした。この溶液は、０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．５、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および０．５ｍｇ／ｍＬ  ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド（Ｘ−ｇｌｕｃ）を含んだ。トランスジーンを発現する細胞において産生されたＧＵＳ酵素は、インサイチュでＸ−ｇｌｕｃを青い沈殿物に転換し得、従って、トランスジーンの局在を可能にする（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら、１９８７  ＥＭＢＯ  Ｊ  ６：３９０１）。緑色組織由来のクロロフィルを７５％エタノールでブリーチし、ＧＵＳ発現からの青染色の可視化を容易にした。次いで、組織切片を調べ、そして解剖顕微鏡下で写真撮影した。
【０１０１】
（トウモロコシにおけるＧＵＳ発現）
１６の事象からの葉中央脈（ｍｉｄｒｉｂ）試料を、ＧＵＳ発現について調査した。１６の事象のうち１５が、組織化学アッセイを用いて検出可能な染色を含んだ。１０の事象についての植物をさらなる調査のために無作為に選択し、これらの事象の５つからの試料を、穀粒の発達における発現を検出するために複数の時点から採取した。種々の組織および器官を調査し、そしてＧＵＳ発現が維管束において一貫して見出された。いくつかの組織切片において、維管束近辺の周囲細胞への拡散もまた観察された。これらの植物において採集された発現データは、プルナシンプロモーターがトウモロコシにおいて十分に活性であったこと、および管状組織に対するその特異性が保持されたことを示す。
【０１０２】
図３および図４は、ＧＵＳ／プルナシンプロモーター構築物でのトウモロコシ形質転換と関連した管状組織発現をさらに詳述する。
【０１０３】
（実施例４：ダイズ胚形質転換）
ダイズ胚を、以下のように、目的の異種ヌクレオチド配列に作動可能に連結したプルナシンヒドロラーゼプロモーターを含むプラスミド（図１）でボンバードした。体細胞胚を誘導するために、ダイズ栽培種Ａ２８７２の表面滅菌した未熟種子から長さ３〜５ｍｍに切断した子葉を、２６℃で明所または暗所で６〜１０週間適当な寒天培地上で培養する。次いで、二次胚を生成する体細胞胚を切り出し、適切な液体培地中に配置する。初期球状期胚として増殖した体細胞胚の塊について繰り返し選択した後、懸濁液を以下に記載のように維持する。
【０１０４】
ダイズ胚形成懸濁培養物は、１６時間：８時間の日／夜スケジュールでの蛍光下で、２６℃での１５０ｒｐｍのロータリーシェーカー上で、３５ｍｌ液体培地中で維持され得る。培養物を、３５ｍｌの液体培地に約３５ｍｇの組織を接種することにより、２週間ごとに継代培養する。
【０１０５】
ダイズ胚形成懸濁培養物は、次いで、粒子銃ボンバードメントの方法（Ｋｌｅｉｎら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３２７：７０−７３、米国特許第４，９４５，０５０号）によって形質転換され得る。ＤｕＰｏｎｔ  Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ＰＤＳ１０００／ＨＥ器具（ヘリウム改装）がこれらの形質転換のために使用され得る。
【０１０６】
ダイズ形質転換を容易にするために使用され得る選択マーカー遺伝子は、カリフラワーモザイクウイルス由来の３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：８１０−８１２）、プラスミドｐＪＲ２２５由来のハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｅ．ｃｏｌｉ由来；Ｇｒｉｔｚら（１９８３）Ｇｅｎｅ  ２５：１７９−１８８）、およびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ由来のノパリンシンターゼ遺伝子の３’領域で構成されるトランスジーンである。異種ヌクレオチド配列に作動可能に連結したプルナシンヒドロラーゼプロモーターを含む発現カセットを、制限フラグメントとして単離し得る。次いで、このフラグメントを、マーカー遺伝子を有するベクターの唯一の制限部位に挿入し得る。
【０１０７】
５０μｌの６０ｍｇ／ｍｌの１μｍ金粒子懸濁液に以下を添加する（順に）：５μｌ  ＤＮＡ（１μｇ／μｌ）、２０μｌスペルミジン（０．１Ｍ）、および５０μｌ  ＣａＣｌ２（２．５Ｍ）。次いで、この粒子調製物を３分間攪拌し、１０秒間微量遠心管中で旋回し、そして上清を取り除く。次いで、ＤＮＡコーティングした粒子を、４００μｌの７０％エタノール中で一度洗浄し、そして４０μｌの無水エタノール中に再懸濁する。ＤＮＡ／粒子懸濁液を３回、各１秒間、超音波処理し得る。次いで、５μｌのＤＮＡコーティングした金粒子を、各マクロキャリアーディスク上にローディングする。
【０１０８】
約３００〜４００ｍｇの２週齢懸濁培養物を、空の６０×１５ｍｍペトリ皿中に置き、残余液体を、ピペットを用いて組織から除去する。各形質転換実験について、通常、約５〜１０プレートの組織をボンバードする。膜破壊圧を１１００ｐｓｉに設定し、そしてチャンバーを２８インチ水銀の真空度に排気する。組織を保持スクリーンから約３．５インチ離れたところに置き、３回ボンバードする。ボンバード後、この組織を半分に分け得、液体中に戻し得、そして上記のように培養し得る。
【０１０９】
ボンバードメントの５〜７日後、液体培地を新鮮な培地に、そしてボンバードの１１〜１２日後、５０ｍｇ／ｍｌハイグロマイシンを含む新鮮な培地に交換し得る。この選択培地を、１週間ごとに更新し得る。ボンバードの７〜８週間後、緑色の形質転換組織が形質転換されていない壊死胚性クラスターから増殖するのを、観察し得る。分離された緑色組織を取り出し、個々のフラスコに接種し、新規なクローン性に増殖した形質転換した胚形成懸濁培養物を再生させる。各々の新規な株が、独立した形質転換事象として処理され得る。これらの懸濁物は、次いで、継代培養されて、そして未熟胚のクラスターとして維持され得るか、または個々の体細胞胚の成熟および発芽により植物体に再生され得る。
【０１１０】
（実施例５：ヒマワリ分裂組織形質転換）
ヒマワリ分裂組織を、以下のように、異種ヌクレオチド配列に作動可能に連結したプルナシンヒドロラーゼプロモーターを含む発現カセットで形質転換する（欧州特許番号ＥＰ０４８６２３３（本明細書により参考として援用される）およびＭａｌｏｎｅ−Ｓｃｈｏｎｅｂｅｒｇら（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １０３：１９９−２０７もまた参照のこと）。成熟したヒマワリ種子（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ  Ｌ．）を脱穀機（ｓｉｎｇｌｅ  ｗｈｅａｔ−ｈｅａｄ  ｔｈｒｅｓｈｅｒ）を用いて剥皮する。種子を、５０ｍｌ溶液につき２滴のＴｗｅｅｎ２０を添加した２０％Ｃｌｏｒｏｘブリーチ溶液中で３０分間、表面滅菌する。これら種子を、滅菌蒸留水で２回リンスする。
【０１１１】
分割した胚軸外植片を、Ｓｃｈｒａｍｍｅｉｊｅｒら（Ｓｃｈｒａｍｍｅｉｊｅｒら（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．９：５５−６０）により記載の手順の変法によって調製する。種子を、表面滅菌手順後、６０分間蒸留水中に浸漬する。次いで、各種子の子葉を折り取り、胚軸の面のきれいな断面を生じさせる。根端の切除後、外植片を初生の葉の間で縦に二等分する。この２つの半分部を、ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ最少要素（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅら（１９６２）Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．１５：４７３−４９７）、Ｓｈｅｐａｒｄのビタミン添加物（Ｓｈｅｐａｒｄ（１９８０）、Ｅｍｅｒｇｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｒｏｐｓ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓｔ．Ｐａｕｌ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）、４０ｍｇ／硫酸アデニン、３０ｇ／ｌスクロース、０．５ｍｇ／ｌ  ６−ベンジル−アミノプリン（ＢＡＰ），０．２５ｍｇ／ｌインドール−３−酢酸（ＩＡＡ）、０．１ｍｇ／ｌジベレリン酸（ＧＡ３）、ｐＨ５．６、および８ｇ／ｌＰｈｙｔａｇａｒからなるＧＢＡ培地上に、切断面を上にして配置する。
【０１１２】
この外植片をアグロバクテリウム処理前にマイクロプロジェクタイルボンバードメントに供する（Ｂｉｄｎｅｙら（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：３０１−３１３）。３０〜４０の外植片を、この処理のために６０×２０ｍｍプレートの中心部に円状に配置する。約４．７ｍｇの１．８ｍｍタングステンマイクロプロジェクタイルを２５ｍｌの滅菌ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中に再懸濁し、そして１．５ｍｌアリコートを１ボンバードあたり使用する。各プレートを、ＰＤＳ１０００（登録商標）粒子加速装置において試料の２ｃｍ上に配置した１５０ｍｍ  ｎｙｔｅｘスクリーンを通して２回ボンバードする。
【０１１３】
アームのないＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＥＨＡ１０５を全ての形質転換実験において使用する。異種ヌクレオチド配列に作動可能に連結したプルナシンヒドロラーゼプロモーターを含む発現カセットを含む二成分（ｂｉｎａｒｙ）プラスミドベクターを、Ｈｏｌｓｔｅｒｓら（１９７８）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６３：１８１−１８７により記載されるように凍結解凍を介して、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株ＥＨＡ１０５に導入する。このプラスミドは、カナマイシン選択マーカー遺伝子（すなわち、ｎｐｔＩＩ）をさらに含む。植物形質転換実験用細菌を、細菌株およびバイナリープラスミド維持のために必要とされる適当な抗生物質を有する液体ＹＥＰ培地（１０ｇ／イーストエキストラクト、１０ｇｍ／ｌ  Ｂａｃｔｏｐｅｐｔｏｎｅ、および５ｇｍ／ｌ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）中で一晩（２８℃、１００ＲＰＭ連続攪拌）、増殖させる。この懸濁物を、それが約０．４〜０．８のＯＤ６００に達するまで使用する。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞をペレット化し、１２．５ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ５．７、１ｇｍ／ｌ  ＮＨ４Ｃｌ、および０．３ｇｍ／ｌ  ＭｇＳＯ４で構成される接種培地において０．５の最終ＯＤ６００に再懸濁する。
【０１１４】
新鮮にボンバードされた外植片をＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁液中に配置し、混合し、そして３０分間静置する。次いで、外植片をＧＢＡ培地に移し、２６℃で１８時間、切断面を下にして同時培養する。同時培養の３日後、外植片を、２５０ｍｇ／ｌセフォタキシムおよび５０ｍｇ／ｌ硫酸カナマイシンを補充した３７４Ｂ（増殖調節因子を欠き、１％の低スクロースレベルであるＧＢＡ培地）に移す。外植片を選択に際し２〜５週間培養し、次いで、１〜２週間の継続した発達の間、カナマイシンを欠く新鮮な３７４Ｂ培地に移す。切り出しに適したシュートを生じない分化した抗生物質耐性成長領域を有する外植片を、２回目の３日植物ホルモン処理のために、２５０ｍｇ／ｌセフォタキシムを含有するＧＢＡ培地に移す。緑色カナマイシン耐性シュート由来の葉試料を、ＥＬＩＳＡによりＮＰＴＩＩの存在について、およびプルナシンヒドロラーゼプロモーター駆動性の異種ヌクレオチド配列の発現についてアッセイすることにより、トランスジーン発現の存在についてアッセイする。
【０１１５】
ＮＰＴＩＩ陽性シュートをＰｉｏｎｅｅｒ（登録商標）ｈｙｂｒｉｄ  ６４４０インビトロ成長ヒマワリ実生根茎に移植する。表面滅菌種子を４８−０培地（半強度ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ塩、０．５％スクロース、０．３％ゲルライト、ｐＨ５．６）中で発芽させ、そして外植片培養物について記載した条件下で成長させる。実生の上の部分を除去し、子葉において１ｃｍの軸方向のスライスを作製し、そして形質転換されたシュートを切断面に挿入する。領域全体をパラフィルムで包み、シュートを固定する。移植された植物は、１週間のインビトロ培養後に土壌に移され得る。土壌中の移植物を、高湿条件下に維持し、その後、温室環境にゆっくりと慣れさせる。温室中で成熟するＴ０植物（親世代）の形質転換区域を、ＮＰＴＩＩ  ＥＬＩＳＡにより、および／または葉抽出物の転写活性分析によって同定する。一方、ＮＰＴＩＩ陽性Ｔ０植物から採取したトランスジェニック種子を、小部分の乾燥種子子葉の転写活性分析によって同定する。
【０１１６】
代替のヒマワリ形質転換プロトコルは、化学的な選択圧の使用なしにトランスジェニックの子孫の回収を可能とする。種子から外皮をとり、そして１００ｍｌ溶液当たり２〜３滴のＴｗｅｅｎ  ２０を添加した２０％  Ｃｌｏｒｏｘブリーチ溶液中で２０分間、表面を滅菌し、次いで、蒸留水で３回洗浄する。この滅菌した種子を水で湿らせた濾紙上で、暗所で２０時間２６℃で吸水させる。子葉および根部分（ｒｏｏｔ  ｒａｄｉｃａｌ）を取り除き、そして増殖外植片を３７４Ｅ（ＭＳ塩、Ｓｈｅｐａｒｄのビタミン、４０ｍｇ／ｌ  アデニン硫酸塩、３％  スクロース、０．５ｍｇ／ｌ  ６−ＢＡＰ、０．２５ｍｇ／ｌ  ＩＡＡ、０．１ｍｇ／ｌ  ＧＡおよび０．８％  ＰｈｙｔａｇａｒからなるＧＢＡ培地（ｐＨ  ５．６））上で、暗所下で２４時間培養する。第１葉を取り除いて頂端分裂組織に曝し、約４０の外植片を３７４Ｍ（１．２％のＰｈｙｔａｇａｒを有するＧＢＡ培地）の中央の２ｃｍの円内に上向きに頂端のドームを置き、次いでその培地で暗所下で２４時間培養する。
【０１１７】
約１８．８ｍｇの１．８μｍ  タングステン粒子を１５０μｌの無水エタノール中に再懸濁する。ソニケーション後、そのうちの８μｌをマクロキャリアの表面中央に滴下する。核プレートを、２６ｍｍのＨｇヘリウムガン真空度で第１の棚に６５０ｐｓｉの大気放出板（ｒｕｐｔｕｒｅ  ｄｉｓｃ）を用いて２回ボンバードする（ｂｏｍｂａｒｄ）。
【０１１８】
目的のプラスミドを、以前に記載された凍結融解を介してＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＥＨＡ１０５に導入する。５０μｇ／ｌのカナマイシン存在下での液体ＹＥＰ培地（１０ｇ／ｌ  イーストエキストラクト、１０ｇ／ｌ  Ｂａｃｔｏｐｅｐｔｏｎｅおよび５ｇ／ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．０））中で２８℃にて一晩増殖した細菌のペレットを、播種培地（１２．５ｍＭ  ２ｍＭ  ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、１ｇ／ｌ  ＮＨ４Ｃｌおよび０．３ｇ／ｌ  ＭｇＳＯ４（ｐＨ５．７））中に、ＯＤ６００での終濃度４．０に達するように再懸濁する。粒子をボンバードした外植片をＧＢＡ培地（３７４Ｅ）に移し、そして１滴の細菌懸濁物を、増殖頂点上に直接置く。この外植片を培地上で４日間同時培養し、その後、この外植片を３７４Ｃ培地（１％  スクロースを有しＢＡＰ、ＩＡＡ、ＧＡ３を有さず、そして２５０μｇ／ｍｌ  セフォタキシムで補充したＧＢＡ）に移す。この外植片を、この培地上で、日中１６時間および２６℃の培養条件の下で約２週間培養する。
【０１１９】
３７４Ｃ培地での２週間培養した外植片（約２ｃｍ長）を、ノーザンブロットのような、当該分野で公知のアッセイを使用して、発現についてスクリーニングする。ポジティブ（すなわち、プルナシン（ｐｒｕｎａｓｉｎ）ヒドロラーゼプロモーター駆動性発現についてポジティブ）な外植片を同定した後、プルナシンヒドロラーゼプロモーター駆動性発現を示すことが出来ない苗条を廃棄し、そして全てのポジティブな外植片を、結節性外植片に細分する。１つの結節性外植片は、少なくとも１つの見込まれる節を含む。この結節性セグメントをＧＢＡ培地上で３〜４日間培養して各節からの副芽の形成を促進する。次いで、これらを３７４Ｃ培地に移し、そしてさらに４週間成長させる。成長中の出芽を分離し、そして３７４Ｃ培地上でさらに４週間培養する。各々の新たに回収した苗条由来のプールした葉のサンプルを、適切なタンパク質活性アッセイによって再度スクリーニングする。この時点で、１つの節から回収したポジティブな苗条は、一般的に、節の培養前の開始時のアッセイにおいて検出したトランスジェニック領域で富化されている。
【０１２０】
プルナシンヒドロラーゼプロモーター調節性発現についてポジティブである、回収した苗条を、Ｐｉｏｎｅｅｒハイブリッド６４４０のインビトロ増殖したヒマワリ苗木の台木に移植する。この台木を以下の様式で調製する。種子から外皮をとり、そして１００ｍｌ溶液当たり２〜３滴のＴｗｅｅｎ  ２０を添加した２０％  Ｃｌｏｒｏｘブリーチ溶液中で２０分間、表面を滅菌し、そして蒸留水で３回洗浄する。この滅菌した種子を水で湿らせた濾紙上で、３日間発芽させ、次いで、４８培地（半分の強度のＭＳ塩、０．５％  スクロース、０．３％ゲルライト（ｇｅｌｒｉｔｅ）（ｐＨ  ５．０））中に移し、そして２６℃の暗所下で３日間成長させ、次いで、１６時間の日中の培養条件でインキュベートする。選択した苗木の上側部分を取り除き、各胚軸において垂直な切片を作製し、そして形質転換した苗条をＶ−カットに挿入する。この切断領域をパラフィルムで覆う。その培地上での１週間の培養後、移植した植物を土壌に移す。最初の２週間中、これら植物を高湿度条件下で維持し、温室環境に順応させる。
【０１２１】
（実施例６：ＧＵＳ融合構築物のシロイヌナズナへの形質転換）
ＧＵＳと融合したプルナシンヒドロラーゼプロモーターを含有する構築物を使用して、ＢｅｃｈｔｏｌｄおよびＰｅｌｌｅｔｉｅｒの方法（ＡＲＡＢＩＤＯＰＳＩＳ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳのＮ．ＢｅｃｈｔｏｌｄおよびＧ．Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  Ｐｌａｎｔａ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ｐｌａｎｔｓ  ｂｙ  ｖａｃｕｕｍ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ  ８２巻、２５９−２６６頁（Ｊ．Ｍ．Ｍａｒｔｉｎｅｚ−ＺａｐａｔｅｒおよびＪ．Ｓａｌｉｎａｓ共編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）によってシロイヌナズナを形質転換した。
【０１２２】
（シロイヌナズナの形質転換）
４〜６週齢のシロイヌナズナ植物を土壌から注意深く取り出して、根系をインタクトのままにした。次いで、これらの根を水で洗浄して根に付着した全ての土壌粒子を取り除いた。２５〜５０本の植物をアルミニウムのトレイに置いた。同じサイズの第２の孔空きトレイを第１トレイの上側に配置して、その植物の動きを妨げた。次いで、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの懸濁物をこのトレイに注いだ。次いで、このトレイを１０−Ｌバキュームチャンバー中に置いた。１０４Ｐａ（０．１  ａｔｍ）の吸引圧を２０分間適用した。吸引プロセスの間に、堆肥、肥料（ｔｒｅａｔ）および水で充填したトレイを調製した。吸引を丁寧に破り、そしてトレイをチャンバーから取り出した。浸潤させた植物を直ちに再移植し、そして穴の開いたプラスチックのラップで覆うかまたは低部に水を備える種子トレイインキュベーターに置いた。この覆いを３〜４週間後に植物から取り除いた。この植物を、所望の成長度に達するまで、適度に灌水で成長し続けさせた。
【０１２３】
（ＧＵＳ検出プロトコル）
トランスジェニック植物から収集した種々の組織サンプルを手動で切片作製し、そしてＧＵＳ発現パターンを３７℃の染色溶液中で一晩染色することによって組織化学的に確認した。この溶液は、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ  ７．５）、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および０．５ｍｇ／ｍＬ  ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド（Ｘ−ｇｌｕｃ）を含んだ。トランスジーンを発現する細胞において生成されたＧＵＳ酵素は、インサイチュでＸ−ｇｌｕｃを青色沈殿物に転換し、これによりトランスジーンの位置測定を可能とする（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら、１９８７  ＥＭＢＯ  Ｊ  ６：３９０１）。緑色組織由来のクロロフィルを、７５％エタノールでブリーチしてＧＵＳ発現由来の青色染色の視認を容易にした。次いで、組織切片を試験して、解剖顕微鏡の下で写真撮影した。
【０１２４】
図５はさらに、ＧＵＳ／プルナシンプロモーター構築物を利用したシロイヌナズナ形質転換に関連した、維管束組織発現を詳述する。
【０１２５】
本明細書中に述べた全ての刊行物および特許出願は、本発明が関係する技術の当業者のレベルに指示的である。全ての刊行物および特許出願は、個々の刊行物および特許出願の各々が参考として援用されることを特定かつ個別に示された場合と同程度まで、本明細書中で参考として援用される。
【０１２６】
前記の発明は、理解の明快化の目的のために、例示および実施例の方法によりいくらか詳細に記載されているが、特定の変更および改変は添付の実施形態の範囲内で実行され得ることは、明白である。
【０１２７】
【表１】
2005501535.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】図１は、Ｐｒｕｎｕｓ  ｓｅｒｏｔｉｎａプルナシンヒドロラーゼのプロモーター領域のヌクレオチド配列を示す。
【図２−１】図２は、２つのゲノムフラグメント（配列番号１（ＰＨ  ＤＬ１．４ＰＲＯ）および配列番号５（ＰＨ  ＤＬ１．１ＰＲＯ））の整列およびコンセンサスであり、関連するプロモーター配列パターンおよびモチーフを強調する：７９３位〜７９６位のＴＡＴＡボックス、６５９位〜６６２位のＣＡＡＴシグナル、２５９位〜２６７位のＲＧＡＴＡＯＳモチーフ（Ｒ−ＧＡＴＡ、ＧＡＴＡモチーフ結合因子、Ｒｉｃｅ  Ｔｕｎｇｒｏ  Ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍ  Ｖｉｒｕｓ）の篩特異的遺伝子発現のために必要とされる）結合部位。
【図２−２】図２は、２つのゲノムフラグメント（配列番号１（ＰＨ  ＤＬ１．４ＰＲＯ）および配列番号５（ＰＨ  ＤＬ１．１ＰＲＯ））の整列およびコンセンサスであり、関連するプロモーター配列パターンおよびモチーフを強調する：７９３位〜７９６位のＴＡＴＡボックス、６５９位〜６６２位のＣＡＡＴシグナル、２５９位〜２６７位のＲＧＡＴＡＯＳモチーフ（Ｒ−ＧＡＴＡ、ＧＡＴＡモチーフ結合因子、Ｒｉｃｅ  Ｔｕｎｇｒｏ  Ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍ  Ｖｉｒｕｓ）の篩特異的遺伝子発現のために必要とされる）結合部位。
【図３】図３は、トランスジェニックトウモロコシ植物における、種々の組織におけるＧＵＳ発現を示す表である。
【図４】図４は、ＰＨＰ１７６８８を保有するＭａｉｚｅ  Ｔ０植物におけるＧＵＳ発現である。Ａ．１０５４１６４０中央脈６０日間；Ｂ．１０５４１６５７節間８５日間、縦断面（矢印は、維管束に沿ったＧＵＳ発現を示す）；Ｃ．１０５４１６６５節間８５日間、横断面；Ｄ．１０５４１６２８さらなる６０日間；Ｅ．１０５４１６６５穀粒４ＤＡＰ；Ｆ．１０５４１６４７穀粒８ＤＡＰ。
【図５】図５は、植物内（ｉｎ  ｐｌａｎｔａ）アグロバクテリウム媒介形質転換後の、シロイヌナズナ植物におけるＧＵＳ発現を示す。
【図２−１】
2005501535.tif 000004
【図２−２】
2005501535.tif 000005
【図３】
2005501535.tif 000006
【国際公開パンフレット】
2005501535.tif 000007
2005501535.tif 000008
2005501535.tif 000009
2005501535.tif 000010
2005501535.tif 000011
2005501535.tif 000012
2005501535.tif 000013
2005501535.tif 000014
2005501535.tif 000015
2005501535.tif 000016
2005501535.tif 000017
2005501535.tif 000018
2005501535.tif 000019
2005501535.tif 000020
2005501535.tif 000021
2005501535.tif 000022
2005501535.tif 000023
2005501535.tif 000024
2005501535.tif 000025
2005501535.tif 000026
2005501535.tif 000027
2005501535.tif 000028
2005501535.tif 000029
2005501535.tif 000030
2005501535.tif 000031
2005501535.tif 000032
2005501535.tif 000033
2005501535.tif 000034
2005501535.tif 000035
2005501535.tif 000036
2005501535.tif 000037
2005501535.tif 000038
2005501535.tif 000039
2005501535.tif 000040
2005501535.tif 000041
2005501535.tif 000042
2005501535.tif 000043
2005501535.tif 000044
2005501535.tif 000045
2005501535.tif 000046
2005501535.tif 000047
2005501535.tif 000048
2005501535.tif 000049
2005501535.tif 000050
2005501535.tif 000051
2005501535.tif 000052
2005501535.tif 000053
2005501535.tif 000054
2005501535.tif 000055
2005501535.tif 000056
2005501535.tif 000057
2005501535.tif 000058
2005501535.tif 000059
2005501535.tif 000060
2005501535.tif 000061
2005501535.tif 000062
2005501535.tif 000063
2005501535.tif 000064
2005501535.tif 000065
2005501535.tif 000066
2005501535.tif 000067
2005501535.tif 000068
2005501535.tif 000069
2005501535.tif 000070
2005501535.tif 000071
2005501535.tif 000072
2005501535.tif 000073
2005501535.tif 000074
2005501535.tif 000075
2005501535.tif 000076
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005501535.tif 000077
【国際調査報告】
2005501535.tif 000078
2005501535.tif 000079