(57)【要約】  他のアイソフォームがない哺乳類細胞における、アイソフォーム特異的遺伝子発現のための方法が提供される。該方法は、特異的発現を達成するためにＲＮＡｉを用いる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子産物の不所望なアイソフォームがない細胞において、遺伝子産物の所望のアイソフォームを発現させる方法であって、
（ａ）少なくとも１つの核酸に哺乳類細胞を曝露すること（該核酸は、少なくとも一部分は２本鎖のリボ核酸であり、そして該２本鎖部分は、該遺伝子産物の２以上のアイソフォームにより共有される共通核酸配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有している）；および
（ｂ）該哺乳類細胞に、該遺伝子産物の所望のアイソフォームをコード化する発現ベクターを導入すること（該所望のアイソフォームは、該細胞において該所望のアイソフォームの発現をもたらすことが可能なプロモーターに作動可能に結合した、該核酸の該２本鎖部分に対する１以上のミスマッチを含む配列を有している）、
を含む方法。
【請求項２】
該共通核酸配列が少なくとも１９の連続ヌクレオチド長である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該共通核酸配列が、該細胞中の該遺伝子産物の全内在性アイソフォームで共通する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
該核酸の２本鎖部分が、該共通核酸配列に対して１００％同一である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
該核酸が１９から２５ヌクレオチド長である、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
該少なくとも一部分は２本鎖のリボ核酸が、少なくとも１９ヌクレオチドの２本鎖部分、および少なくとも１つの２ヌクレオチド１本鎖３’オーバーハングを含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
該所望のアイソフォームが、該核酸の該２本鎖部分に対する２以上のミスマッチを含む、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
該発現ベクターが、該所望のアイソフォームをコードする内在性配列とは異なる少なくとも１つのコドンを用いて、該所望のアイソフォームをコード化する、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
該発現ベクターが、該所望のアイソフォームをコードする対応する内在性配列とは異なる２つのコドンを用いて、該所望のアイソフォームをコード化する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
該所望のアイソフォームが、対応する内在性アイソフォームに対して同一のタンパク質配列を有する、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
該所望のアイソフォームが、細胞中の変異型アイソフォームと取って代わる、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
該変異型アイソフォームが、発癌性、アポトーシス性、腫瘍抑制性、炎症誘導または抑制性、または血管新生性である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
該所望のアイソフォームの機能を決定することをさらに含む、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
該細胞が癌細胞である、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
該細胞が、Ｈｅｌａ（子宮頸癌）、ＰＣ３（前立腺癌）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳癌）、およびＭＣＦ−７からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
該所望のアイソフォームが、内在性プロモーターの制御下で転写される、請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
該発現ベクターが、該所望のアイソフォームに作動可能に結合した構造プロモーターを含む、請求項１から１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
該発現ベクターが、該所望のアイソフォームに作動可能に結合した誘導可能なプロモーターを含む、請求項１から１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
該発現ベクターが、該所望のアイソフォームに作動可能に結合した組織特異的プロモーターを含む、請求項１から１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
遺伝子産物の不所望のアイソフォームがない細胞において、遺伝子産物の所望のアイソフォームを発現させる試薬を含むキットであって、少なくとも一部分は２本鎖のリボ核酸、そして該２本鎖部分が、該遺伝子産物の２以上のアイソフォームにより共有される共通核酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、核酸；および該遺伝子産物の所望のアイソフォームをコード化する発現ベクター（該所望のアイソフォームは、該細胞において該所望のアイソフォームの発現をもたらすことが可能なプロモーターに作動可能に結合した、該核酸の該２本鎖部分に対する１以上のミスマッチを含む配列を有する）を含むキット。
【請求項２１】
請求項１〜１９に記載の方法のいずれかにより達成される、アイソフォーム特異的発現を示す哺乳類細胞。
【請求項２２】
疾病を処置する方法であって、処置の必要な対象に、有効量の、少なくとも一部分は２本鎖のリボ核酸であり、そして該２本鎖部分が、該遺伝子産物の２以上のアイソフォームにより共有される共通核酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、核酸；および該遺伝子産物の所望のアイソフォームをコード化する発現ベクター（該所望のアイソフォームは、該細胞において該所望のアイソフォームの発現をもたらすことが可能なプロモーターに作動可能に結合した、該核酸の該２本鎖部分に対する１以上のミスマッチを含む配列を有する）を投与することを含む、方法。
【請求項２３】
ａ）少なくとも１つの核酸（該核酸は、少なくとも一部分は２本鎖のリボ核酸であり、そして該２本鎖部分は、該遺伝子産物の２以上のアイソフォームにより共有される共通核酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する）に、哺乳類細胞を曝露すること；
ｂ）該遺伝子産物の所望のアイソフォームをコード化する発現ベクター（該所望のアイソフォームが、該細胞において該所望のアイソフォームの発現をもたらすことが可能なプロモーターに作動可能に結合した、該核酸の該２本鎖部分に対する１以上のミスマッチを含む配列を有する）に、該哺乳類細胞を曝露すること；
ｃ）該所望のアイソフォームが存在しない場合と比較して、該哺乳類細胞の表現型を同定すること、および
ｄ）該所望のアイソフォームに該表現型または機能を決定すること、
を含む、所望のアイソフォームに機能を決定する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、遺伝子発現の分野、特に、２本酸ＲＮＡを用いて哺乳類細胞において遺伝子の特異的アイソフォームの発現を阻害すること、および阻害背景がない状態（clean background）において特異的アイソーフォームを発現させることに関する。本発明の技術に基づく２本鎖ＲＮＡは、例えば、特定の遺伝子アイソフォームの機能を決定するため、あるいは疾病を処置する治療方法を開発するための広範な応用性を有する。
【０００２】
発明の背景
多くの真核生物の遺伝子は、転写および翻訳開始部位の異なる利用を介して、または異なった組み替えを介して、多種アイソフォームとして発現され、それゆえ、関係配列のタンパク質だが、生化学的ならびに生物学的に異なる特徴を有するタンパク質を生じる（Andreadis et al., 1987, Annu. Rev. Cell Biol. 3, 207-242）。多くの場合、多種アイソフォームが同一細胞で同時に発現されるが、該発現レベル、およびそれぞれのアイソフォームのパターンは、細胞のタイプおよび発生ステージで変動し、このことがそれぞれのアイソフォームの研究を混乱させ、かつ困難とする。
【０００３】
個々のアイソフォームの機能を調べる従来の方法は、１つのアイソフォームのみが発現するか、あるいは阻害背景のない状態（すなわち、他のアイソフォームの影響がない）を提供するために排除される条件を必要とする。従って典型的には、所望のアイソフォームは、標的遺伝子が欠損された細胞または生物全体で発現されてきた。これは時間のかかる方法である。興味ある遺伝子の組織特異的発現または排除のいくつかのプロトコールが開発されてきた（Johnson et al., 1989, Mol. Cell Biol.  9, 3393-3399; Tan, 1991, Dev. Biol.  146, 24-37; Gorman and Bullock, 2000, Curr. Opin. Biotechnol.  11, 455-460）が、アイソフォーム特異的遺伝子不活性化（Migliaccio et al., 1999, Nature 402, 309-313）または阻害背景のない状態での発現の報告は限られている。かかるプロトコールは通常長く、所望の条件を確立するためにたいてい数ヶ月を必要とする。この間に、細胞または生物は新しい条件に順応し（Muller, U., 1999, Mech. Dev.  82, 3-21）、結果を解釈する際に注意が必要となる。
【０００４】
ここ数年、核酸化学および遺伝子伝達における進歩が、遺伝子発現の特異的阻害を操作するための新規方法をもたらした。アンチセンス技術が、遺伝子特異的阻害を達成するためのプロトコールにおいて、最も一般的に記載される方法であったが、最近、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）またはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と言われる応答を誘導する、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）に基づく標的遺伝子サイレンシングが提案された。ＰＴＧＳは元々植物で報告された現象であり（van der Krol et al., 1990, Plant Cell  2, 291-299; Napoli, et al., 1990, Plant Cell  2, 931-943）、導入遺伝子の導入により、内在性相同遺伝子ならびにそれ自体のサイレンシングが引き起こされる。ＰＴＧＳの機序には、引き金として２本鎖（ｄｓ）ＲＮＡによる、ｍＲＮＡ分解の増進を含む（Cogoni and Macino, 2000, Curr. Opin. Genet. Dev.  10, 638-643; Carthew, 2001, Curr. Opin. Cell Biol.  13, 244-248）。同様の現象（クエリング（quelling））はアカパンカビでも観察されている（Cogoni et al., 1994, Antonie Van Leeuwenhoek  65, 205-209）。ＲＮＡｉの背景機序が部分的に解明され、２１から２３ヌクレオチド長のｄｓＲＮＡが、ｍＲＮＡ分解の中間体／メディエーターであると分かった（Zamore et al., 2000, Cell  101, 25-33; Bernstein et al., 2001, Nature 409, 363-366）。
【０００５】
動物界においては、ｄｓＲＮＡ仲介性遺伝子サイレンシングは、線虫であるC. elegansにおいて最初に明らかにされ（Fire et al., 1998, Nature 391, 806-811）、これはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と名付けられた。続いて、ＲＮＡｉは、ハエ、トリパノソーマ、ヒドラ、ゼブラフィッシュ、およびマウス卵母細胞を含む、広範な生物で観察された（Cogoni and Macino, 2000; Bosher and Labouesse, 2000, Nat. Cell Biol.  2, E31-36）。ＲＮＡｉは非哺乳類系では広範に用いられてきたが、ｄｓＲＮＡ阻害が哺乳類系で上手く利用されるようになったのは、ごく最近である。例えば、哺乳類細胞において低分子の干渉２本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を利用する、有効な転写後遺伝子サイレンシング法が報告されている（Elbashir et al., 2001, Nature 411, 494-498）。この著者は、培養哺乳類細胞において、２１ヌクレオチドのｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）のトランスフェクションが、同時トランスフェクションされた遺伝子および内在性遺伝子両方のＰＴＧＳを誘発すると記載している。
【０００６】
ｄｓＲＮＡ仲介性ｍＲＮＡ分解の無細胞システムを用いて、ｄｓＲＮＡと同一の領域を含むショウジョウバエの胚細胞抽出物において、ｍＲＮＡが切断されることが示された（Zamore et al., 2000）。しかしながら、虫およびハエでのＲＮＡｉの効果は、ｄｓＲＮＡが触媒様に作用し、かつ／または増幅されることを示す（Zamore, 2001, Nature Structural Biology 8, 746-750）。C. elegansにおいて、ｓｉＲＮＡは内在性ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼで複製されないと説示されたが、現在では、C.elegansおよびショウジョウバエの両方で、ｓｉＲＮＡが実際に細胞ポリメラーゼのプライマーとして働き、ｄｓＲＮＡから伸長されるという、モデルを支持するデータが存在する（Lipardi et al., 2001, Cell 107, 297-307; Sijen et al., 2001, Cell 107, 465-476; Nishikura, 2001, Cell 107, 415-418）。この方法におけるｍＲＮＡの他の領域へのＲＮＡｉの伝搬は、関係配列への遺伝子サイレンシングの広がりを生じ、これにより、アイソフォーム特異的ｄｓＲＮＡの阻害が不可能となる。
【０００７】
当該技術分野において、遺伝子機能を評価するため、特に哺乳類細胞でのアイソフォーム機能を評価するためのシステム、ならびに哺乳類細胞での密接に関係するｍＲＮＡのｄｓＲＮＡ阻害に依存した治療法が要求され、本発明が該要求を満たす。
【０００８】
適切な文献
１．Andreadis, A., Gallego, M. E. and Nadal-Ginard, B. (1987) Generation of protein isoform diversity by alternative splicing: mechanistic and biological implications. Annu. Rev. Cell Biol.  3, 207-242
２．Johnson, J. E., Wold, B. J. and Hauschka, S. D. (1989) Muscle creatine kinase sequence elements regulating skeletal and cardiac muscle expression in transgenic mice. Mol. Cell Biol.  9, 3393-3399
３．Tan, S. S. (1991) Liver-specific and position-effect expression of a retinol-binding protein-lacZ fusion gene (RBP-lacZ) in transgenic mice. Dev. Biol.  146, 24-37
４．Gorman, C. and Bullock, C. (2000) Site-specific gene targeting for gene expression in eukaryotes. Curr. Opin. Biotechnol.  11, 455-460
５．Migliaccio, E., Giorgio, M., Mele, S., Pelicci, G., Reboldi, P., Pandolfi, P. P., Lanfrancone, L. and Pelicci, P. G. (1999) The p66shc adaptor protein controls oxidative stress response and life span in mammals. Nature (London)  402, 309-313
６．Muller, U. (1999) Ten years of gene targeting: targeted mouse mutants, from vector design to phenotype analysis. Mech. Dev.  82, 3-21
７．Luzi, L., Confalonieri, S., Di Fiore, P. P. and Pelicci, P. G. (2000) Evolution of Shc functions from nematode to human. Curr. Opin. Genet. Dev.  10, 668-674
８．Nakamura, T., Muraoka, S., Sanokawa, R. and Mori, N. (1998) N-Shc and Sck, two neuronally expressed Shc adapter homologs. Their differential regional expression in the brain and roles in neurotrophin and Src signaling. J. Biol. Chem.  273, 6960-6967
９．Bonfini, L., Migliaccio, E., Pelicci, G., Lanfrancone, L. and Pelicci, P. G. (1996) Not all Shc's roads lead to Ras. Trends Biochem. Sci.  21, 257-261
１０．Migliaccio, E., Mele, S., Salcini, A. E., Pelicci, G., Lai, K. M., Superti-Furga, G., Pawson, T., Di Fiore, P. P., Lanfrancone, L. and Pelicci, P. G. (1997) Opposite effects of the p52shc/p46shc and p66shc splicing isoforms on the EGF receptor-MAP kinase-fos signalling pathway. EMBO J.  16, 706-716
１１．van der Krol, A. R., Mur, L. A., Beld, M., Mol, J. N. and Stuitje, A. R. (1990) Flavonoid genes in petunia: addition of a limited number of gene copies may lead to a suppression of gene expression. Plant Cell  2, 291-299
１２．Napoli, C., Lemieux, C. and Jorgensen, R. A. (1990) Introduction of a chimeric chalcone synthase gene in petunia results in reversible cosuppression of homologous genes in trans. Plant Cell  2, 931-943
１３．Cogoni, C. and Macino, G. (2000) Post-transcriptional gene silencing across kingdoms. Curr. Opin. Genet. Dev.  10, 638-643
１４．Carthew, R. W. (2001) Gene silencing by double-stranded RNA. Curr. Opin. Cell Biol.  13, 244-248
１５．Cogoni, C., Romano, N. and Macino, G. (1994) Suppression of gene expression by homologous transgenes. Antonie Van Leeuwenhoek  65, 205-209
１６．Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E. and Mello, C. C. (1998) Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature  (London) 391, 806-811
１７．Bosher, J. M. and Labouesse, M. (2000) RNA interference: genetic wand and genetic watchdog. Nat. Cell Biol.  2, E31-36
１８．Zamore, P. D., Tuschl, T., Sharp, P. A. and Bartel, D. P. (2000) RNAi: double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals. Cell  101, 25-33
１９．Bernstein, E., Caudy, A. A., Hammond, S. M. and Hannon, G. J. (2001) Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature (London)  409, 363-366
２０．El shir, S. M., Harborth, J., Lendeckel, W., Yalcin, A., Weber, K. and Tuschl, T. (2001) Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature (London) 411, 494-498ba
２１．Lipardi, C., Wei, Q. and Paterson, B. M. (2001) RNAi as random degradative PCR: siRNA primers convert mRNA into dsRNAs that are degraded to generate new siRNAs. Cell  107, 297-307
２２．Sijen, T., Fleenor, J., Simmer, F., Thijssen, K. L., Parrish, S., Timmons, L., Plasterk, R. H. and Fire, A. (2001) On the Role of RNA Amplification in dsRNA-Triggered Gene Silencing. Cell  107, 465-476
２３．Cohen, S. S. (1968) Virus-induced Enzymes, Columbia University Press, New York
２４．Fagard, M. and Vaucheret, H. (2000) Systemic silencing signal(s). Plant Mol. Biol.  43, 285-293
２５．Tuschl, T., Zamore, P. D., Lehmann, R., Bartel, D. P. and Sharp, P. A. (1999) Targeted mRNA degradation by double-stranded RNA in vitro. Genes. Dev.  13, 3191-3197
【０００９】
発明の要約
本発明は、遺伝子産物の不所望なアイソフォームがない細胞において、遺伝子産物の所望のアイソフォームを発現させる方法を提供し、これは、
（ａ）少なくとも一部分２本鎖のリボ核酸（該２本鎖部分は、遺伝子産物の２以上のアイソフォームにより共有される共通核酸配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性、好ましくは１００％の配列同一性を有している）を含む少なくとも１つの核酸に、哺乳類細胞を曝露すること；および
（ｂ）該哺乳類細胞に、遺伝子産物の所望のアイソフォームをコード化する発現ベクターを導入すること（核酸は、細胞において所望のアイソフォームの発現をもたらすことが可能なプロモーターに結合した、核酸の２本鎖部分に対して１以上のミスマッチを含む配列を有する所望のアイソフォームをコード化している）の段階を含む。好ましくは、共通核酸配列は、少なくとも１９の連続ヌクレオチド長であり、かつ課題とする細胞中の遺伝子産物の全内在性アイソフォームに共通する。
【００１０】
該核酸は、好ましくは１９〜２５ヌクレオチド長であり、該核酸の２本鎖部分は、好ましくは、共通核酸配列に対して１００％同一である。特に、少なくとも一部分は２本鎖のリボ核酸は、好ましくは、少なくとも１９ヌクレオチド、より好ましくは１９ヌクレオチドの２本鎖部分、および少なくとも１つの、２ヌクレオチドの１本鎖３’オーバーハング、好ましくは、上方鎖および下方鎖が共に有する２ヌクレオチドの１本鎖３’オーバーハングを含有する。
【００１１】
少なくとも一部分は２本鎖のＲＮＡ特性の核酸が所望のアイソフォームの発現に影響しないことを確実にするために、所望のアイソフォームは、核酸の２本鎖部分に対して少なくとも１つのミスマッチを含む配列によりコード化される。それゆえ、変更されたコード配列が所望の産物をコード化している限り、所望のアイソフォームは、核酸の２本鎖部分に対して１、２またはそれ以上のミスマッチを有する配列によりコード化される。従って、所望のアイソフォームをコード化する少なくとも１つのコドン（例えば、２以上）は、同じ位置で内在的に用いられたコドンとは異なる。多くのアミノ酸が１以上のトリプレットコドンで表されることは、当該技術分野においてよく知られている。アイソフォーム配列に対するアミノ酸置換、欠損、または付加、特に保存的置換が許容されるが、好ましくは、所望のアイソフォームは、対応する内在性アイソフォームと同一のタンパク質配列を有する（内在性変異型アイソフォームを矯正するために、内在性野生型配列が用いられない場合は、野生型配列が用いられる）。
【００１２】
１つの実施態様において、所望のアイソフォームが、細胞により発現された変異型アイソフォームに取って代わり、これにより遺伝子機能の矯正が可能となる。該変異型アイソフォームは、発癌性、アポトーシス性、腫瘍抑制性、炎症誘導または抑制性、または血管新生性等であり得る。
【００１３】
さらなる実施態様において、本発明の方法を用いて、所望のアイソフォームの機能（すなわち、アイソフォームの未知機能）を決定する。
【００１４】
該方法は、ＨｅＬａ（子宮頸癌）、ＰＣ３（前立腺癌）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳癌）、およびＭＣＦ−７（乳癌）の様な癌細胞、または生体内細胞を含む、全種類の哺乳類細胞で有用である。
【００１５】
所望のアイソフォームは、内在性プロモーター、構造プロモーター、誘導可能なプロモーター、または組織特異的プロモーターの様ないずれかのプロモーターの制御下で転写され得る。
【００１６】
本発明は、所望の機能未知（または認識されていない）のアイソフォームの機能を決定する方法も提供する。本発明を実施するキットおよび材料、ならびに遺伝子的阻害背景のない状態でアイソフォーム特異的発現を示す細胞も提供される。本発明は、本発明の方法に基づく治療上の使用および組成物も包含する。
【００１７】
発明の詳細な説明
該広範な観点において、本発明は、少なくとも１つの核酸に哺乳類細胞を曝露すること（該核酸は、少なくとも一部分は２本鎖の核酸であり、そして該２本鎖部分は、遺伝子産物の２以上のアイソフォームにより共有される共通核酸配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有している）；および哺乳類細胞に、遺伝子産物の所望のアイソフォームをコード化する発現ベクターを導入すること（該所望のアイソフォームは、該細胞において所望のアイソフォームの発現をもたらすことが可能なプロモーターに作動可能に結合した、核酸の２本鎖部分に対する１以上のミスマッチを含む配列を有している）により、遺伝子産物の不所望のアイソフォームがない細胞において、遺伝子産物の所望のアイソフォームを発現させる方法を提供する。
【００１８】
核酸は、典型的には、遺伝子産物の２以上のアイソフォームにより共有される共通核酸配列に対して、少なくとも９５％、好ましくは９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する２本鎖形のリボ核酸（ＲＮＡ）である。阻害に好ましいＲＮＡ分子は、少なくとも１９〜２５連続塩基、好ましくは、少なくとも１９連続塩基の遺伝子産物の２以上のアイソフォームで共有される共通核酸配列と同一の配列を含む。好ましくは、該共通核酸配列は、課題とする細胞により発現される全内在性アイソフォームで共通する。ＲＮＡ配列は、好ましくは、エクソン配列と同一性を有するように選択される。ＲＮＡの２本鎖領域に対応するヌクレオチド配列が阻害の標的とされる配列特異的方法で、遺伝子発現は阻害される。
【００１９】
配列比較、および当該技術分野で既知のアラインメントアルゴリズム（Gribskov and Devereux, Sequence Analysis Primer, Stockton Press, 1991を参照。該参考文献は本明細書に引用される）および例えば、デフォルトパラメーターを用いたＢＥＳＴＦＩＴソフトウエアプログラム（例えば、University of Wisconsin Genetic Computing Group）で実行されるスミス−ウォーターマンアルゴリズムによりヌクレオチド配列間相違の百分率を計算することにより、配列同一性（そしてそれ故、特異性）が最適化され、そして共通核酸配列が決定される。配列特異性は、核酸が他の非関連遺伝子配列の発現と交差反応、および影響しないことを確実にするために重要である。
【００２０】
細胞への核酸の十分な送達を可能とするため、および細胞の任意のタンパク質キナーゼＲ（ＰＫＲ）応答を回避するため、核酸は典型的に比較的短い。または、ｄｓＲＮＡに対する非特異的細胞応答を回避する別の方法、またはより有効な送達方法が用いられ得る。従って、該核酸は少なくとも一部分は２本鎖のＲＮＡ特性であり、そして典型的には１８から２５ヌクレオチド長である。該２本鎖ＲＮＡ特性は、２以上のアイソフォームの所望の遺伝子により共有される共通核酸配列に対して、好ましくは１００％同一である、少なくとも１８ヌクレオチド長、好ましくは１９ヌクレオチド長の配列により与えられる。好ましい実施態様において、該核酸は、少なくとも１つの、２ヌクレオチドの１本鎖３’オーバーハング、好ましくは、上方鎖および下方鎖が共に有する２ヌクレオチドの１本鎖３’オーバーハングを含む。
【００２１】
少なくとも一部分は２本鎖のＲＮＡは、自己相補的ＲＮＡ鎖（例えば、相対する繰り返しを有する転写物）により、または２以上の相補的ＲＮＡ鎖により形成され得る。該ＲＮＡ２本鎖形成は、細胞内または外のいずれかで開始される。該ＲＮＡは、細胞当たり少なくとも１コピー、好ましくは、細胞当たり少なくとも５、１０、１００、５００、または１０００コピーの送達を可能とする量で導入される。該導入量は所望の効果に依存し、そして経験上容易に決定され得る。
【００２２】
該核酸は、例えば、特にＲＮＡが細胞に送達され、該細胞によって産生されないとき、分解からｄｓＲＮＡを安定させるために、リボ核酸中に天然に存在するもの以外のヌクレオチドまたは結合を含んでもよい。従って、１以上の修飾（すなわち、合成、または非天然物の）ヌクレオチドを含むオリゴリボヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを利用し得る。普通、該核酸中のヌクレオチドモノマーは、リン酸ジエステル結合またはその類似のものにより結合される。該ホスホジエステル結合の類似のものは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート（phosphoroselenoate）、ホスホロジセレノエート（phosphorodiselenoate）、ホスホロアニロチオエート（phosphoroanilothioate）、ホスホルアニリデート（phosphoranilidate）、ホスホロアミデート（phosphoramidate）、ペプチド、等の結合を含む。当該技術分野の技術者は、利用される試薬は市販されているか、あるいはオリゴヌクレオチドの場合は、市販の機器を用いて製造され得ることを理解するであろう。好ましくは、２本鎖ＲＮＡは、細胞による適切なプロセッシング、および細胞により発現されるアイソフォームの有効な阻害を可能とする、リボヌクレオチド単位または他のヌクレオチド単位を含む。核酸（典型的には、ＲＮＡ）は、生体内または試験管内のいずれか、特に短い配列が利用されるときは試験管内で合成される。細胞の内在性ＲＮＡポリメラーゼが生体内の転写を仲介するか、あるいはクローン化ＲＮＡポリメラーゼが、本質的には以下の生体内または試験管内転写に用いられ得る。
【００２３】
従って、本発明の方法の１つの段階において、課題とする細胞において発現される特異的アイソフォームの発現を阻害するため、好ましくは全ての関係するアイソフォームを阻害するために、哺乳類細胞は上記核酸に曝露される。用語「アイソフォーム」は、当該技術分野でよく知られており、異なる遺伝子スプライシング、ならびに異なる転写および翻訳開始部位の使用の結果として産生される遺伝子産物を包含することを意味する。さらに、本発明の目的上、用語アイソフォームは、いずれかの密接に関係する配列を含み、従って、有害な点変異等の様な細胞中の変異型遺伝子を含む。変異型アイソフォームは、発癌性、アポトーシス性、腫瘍抑制性、炎症誘導または抑制性、または血管新生性等であり、そして該有害な機能が本発明の方法により矯正される。以下の実施例は、ＳｈｃＡを用いて本発明を説明するが、多数の形で産生された遺伝子産物のいずれもが、本発明の方法を用いる標的とされ得る。例えば、該タンパク質は、酵素、例えば、キナーゼ（ＰＫＢ）、ｒａｓ、インテグリン、Ｅ２Ｆ、Ｒｂ、ＦＧＦ、他のシグナル伝達分子、および転写因子の様な、治療上重要なタンパク質である。
【００２４】
遺伝子発現に対するｄｓＲＮＡの影響は、典型的には、該段階で処理されていない細胞と比較した場合、少なくとも１０％、３３％、５０％、９０％、９５％、または９９％またはそれ以上で阻害される標的アイソフォームの発現を生じる。
【００２５】
哺乳類細胞は、課題とするいずれかの細胞であり得る。従って、該細胞は、内部細胞塊、胚体外外胚葉細胞または胚性幹細胞、全能性細胞または多能性細胞、分裂細胞または非分裂細胞、実質細胞または上皮細胞、不死化細胞または形質転換細胞等であってもよい。該細胞は、幹細胞または分化細胞であってもよい。分化する細胞の種類は、脂肪細胞、線維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、樹状細胞、神経細胞、グリア細胞、肥満細胞、血液細胞および白血球（例えば、赤血球、巨核球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、およびナチュラルキラー細胞の様なリンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、血小板、顆粒球）、上皮細胞、ケラチノサイト、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞、および内分泌または外分泌腺細胞、ならびに感覚細胞（これらに限られない）を含む。好ましくは、特定のアイソフォームの生物学的機能の研究のため、またはタンパク質とタンパク質の相互作用を研究するため、容易に培養される細胞が好ましい。これらは、例えば、Ｈｅｌａ（子宮頸癌）、ＰＣ３（前立腺癌）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳癌）、およびＭＣＦ−７（乳癌）細胞を含む、癌細胞を含む。本明細書の教示が、１以上の所望のアイソフォームで変異型「アイソフォーム」を置き換えるために、癌細胞の様な他の状況に適用され得ることは、当該技術分野の技術者には明らかであろう。
【００２６】
さらなる段階において、遺伝子産物の所望のアイソフォームをコード化する発現ベクターが、哺乳類細胞に導入される（該所望のアイソフォームは、該細胞において所望のアイソフォームの発現をもたらすことが可能なプロモーターに作動可能に結合した、核酸の２本鎖部分に対する１以上のミスマッチを含む配列を有する）。所望のアイソフォームをコード化する核酸は、好ましくは、核酸（ＲＮＡｉ）が所望のアイソフォームの発現を阻害しないことを確実にするために、内在性アイソフォームの発現を阻害するために用いられる核酸の２本鎖部分に対して、１以上、好ましくは２以上のミスマッチを含む配列を含む。好ましくは、発現ベクターは、対応するアイソフォームをコードする内在性配列とは異なる、少なくとも１つのコドン、より好ましくは、少なくとも２つのコドンを用いて、所望のアイソフォームをコード化する。内在性アイソフォームと所望のアイソフォームとのタンパク質配列の変化、特に、遺伝子機能に影響しない置換、欠損、または付加、好ましくは保存的置換も、本発明に包含される。最も好ましくは、所望のアイソフォームは、対応する内在性アイソフォームに対して、同一のタンパク質配列を有する（コドン使用により、コード配列は異なる）。
【００２７】
生体内での導入遺伝子の転写（所望のアイソフォーム、または必要に応じてヘアピン構造形のｓｉ／ｄｓＲＮＡのいずれか）のため、所望のＲＮＡ転写物をコードするＤＮＡに作動可能に結合した、少なくとも１つの制御領域（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、スプライスドナーおよびアクセプター、およびポリアデニル化シグナル）を含む発現構造物が、ＲＮＡ鎖（または、ＲＮＡ２本鎖）を転写するために用いられる。該プロモーターは、たいていの起源のものであり得る。ＳＶ４０、β−アクチン、メタロチオネイン、Ｔ７、ポリヘドリン、およびサイトメガロウイルスプロモーターの様な、選択された宿主細胞で活性なプロモーターが好ましい。該プロモーターは、例えば、器官または細胞種類が標的とされるべき阻害；または周囲の状態（例えば、感染、ストレス、温度、化学誘導物質）の刺激で誘導されるべき転写を可能とし；かつ／または、発生ステージまたは年齢での転写を操作する、構造プロモーター、誘導可能なプロモーター、または組織特異的プロモーターであり得る。または、ノックイン構造物を用いて、当該技術分野で既知の内在性プロモーターの制御下で、課題とする核酸を転写できる。変更または非変更ＲＮＡはまた、上記の手動または自動化反応により、化学的にまたは酵素的に合成され得る。該ＲＮＡは、細胞ＲＮＡポリメラーゼ、またはバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３、Ｔ７、ＳＰ６）により合成されてもよい。
【００２８】
発現ベクターは、宿主生物内で自立複製を可能とする配列、ベクター含有細胞が選択されることを可能とする遺伝子形質コード化配列、およびＲＮＡが転写されるにつれて有効性を増す配列を含んでいてもよい。長期間安定なベクターは、ウイルスの制御エレメントを用いることで、自由に複製する実体として維持される。ゲノムＤＮＡにベクターを込み込まれた細胞株も生成され、該方法で、転写物が連続塩基上で産生される。
【００２９】
従って、該発現ベクターは、所望なら、レポーター遺伝子（例えば、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質）、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、ＣＡＴ、マーカー遺伝子の表現型発現により、形質転換体の選択を促進する選択遺伝子マーカー（例えば、抗生物質抵抗性を示すもの、または、栄養要求性宿主変異体の場合、宿主障害（lesion）を補う遺伝子）、または他の有用な配列）の様な、プロモーターに作動可能に結合した、追加配列をさらに含み得る。
【００３０】
物理的方法、例えば、核酸含有溶液の注入による単純拡散、核酸で被覆された粒子によるボンバードメント、核酸溶液に細胞または生物を浸すこと、または核酸の存在下での細胞膜へのエレクトロポレーションを含む、遺伝子操作における様々な標準的方法により、核酸（発現ベクターまたは２本鎖ＲＮＡのいずれか）が細胞に導入され得る。核酸を送達するのに特に好ましい方法は、エレクトロポレーションの使用である。または、ウイルス構造物が、細胞への発現構造物の効率的導入、および発現構造物によりコード化されるＲＮＡの転写の両方を成し遂げる。脂質仲介性送達システム、リン酸カルシウムトランスフェクションの様な化学物質仲介性輸送、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション等の様な、細胞へ核酸を導入する当該技術分野において既知の他の方法も用いられる。このことは当該技術分野の技術者には明らかである。トランスフェクションされた宿主細胞は、細胞培養の標準的方法で培養され得る。
【００３１】
本発明の方法は、特定のアイソフォームの機能を決定するのに特に有用である。本発明の該態様において、該方法は、所望のアイソフォームが存在しない場合と比較して、哺乳類細胞の表現型を同定すること、および所望のアイソフォームに表現型または機能を決定することをさらに含む。
【００３２】
本発明は、本発明の方法で有用な試薬を含むキットも提供し、これは、少なくとも一部分は２本鎖のリボ核酸であり、そして該２本鎖部分が、遺伝子産物の２以上のアイソフォームにより共有される共通核酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、核酸；および遺伝子産物の所望のアイソフォームをコード化する発現ベクター（該所望のアイソフォームは、該細胞において所望のアイソフォームの発現をもたらすことが可能なプロモーターに作動可能に結合した、核酸の２本鎖部分に対する１以上のミスマッチを含む配列を有する）を含む。該方法で用いられる構成要素の好ましい特色は、上記のものである。
本発明のいずれかの方法で達成される、アイソフォーム特異的発現を示す哺乳類細胞も、提供される。
【００３３】
アイソフォームを用いて、異常アイソフォームを矯正するのと同様に、疾病を処置する方法も提供され、これは、処置が必要な対象に、有効量の、少なくとも一部分は２本鎖のリボ核酸であり、そして該２本鎖部分が、遺伝子産物の２以上のアイソフォーム（特に異常アイソフォーム）により共有される共通核酸配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有する、核酸；および遺伝子産物の所望のアイソフォームをコード化する発現ベクター（該所望のアイソフォームは、該細胞において所望のアイソフォームの発現をもたらすことが可能なプロモーターに作動可能に結合した、核酸の２本鎖部分に対する１以上のミスマッチを含む配列を有する）を投与することを含む。従って、本発明は、異常アイソフォーム発現の処置、および医薬品の製造のための、上記核酸の使用を提供する。
【００３４】
本発明の医薬組成物の投与は、経口または非経腸で行われる。非経腸送達方法は、局所性、動脈内（例えば、腫瘍に直接的に）、筋肉内、皮下、髄内、髄腔内、脳室内、静脈内、腹腔内、または鼻腔内投与を含む。有効成分に加えて、該医薬組成物は、活性化合物の製剤への処理を促進する添加剤および他の成分を含む、適当な医薬的に許容される担体（医薬上用いられ得る）を含有する。製剤および投与技術についてのより詳細な記載は、Remington's Pharmaceutical Sciencesの最終版（Maack Publishing Co, Easton PA）で見られる。
【００３５】
経口投与用医薬組成物は、当該技術分野でよく知られた医薬的に許容される担体を用いて、経口投与に最適な用量で、製剤され得る。該担体により、医薬組成物が患者が摂取するのに適した錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤等として製剤されることが可能となる。
【００３６】
経口使用用医薬製剤は、活性化合物を固体添加剤と組み合わせること、必要に応じて、生じた混合物を粉砕すること、および所望なら錠剤または糖衣錠コアを得るために適当な追加成分を添加した後、顆粒混合物を処理することで、得られ得る。適当な添加剤は、炭水化物またはタンパク質充填剤であり、ラクトース、スクロース、マニトール、またはソルビトールを含む糖；トウモロコシ、小麦、米、ポテト、または他の植物由来のスターチ；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはナトリウムカルボキシメチルセルロースの様なセルロース；およびアラビアガムおよびトラガカントガムを含むガム；ならびにゼラチンおよびコラーゲンの様なタンパク質（これらに限らない）を含む。所望なら、架橋結合ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはアルギン酸ナトリウムの様な塩の様な、崩壊剤または可溶化剤が添加される。
【００３７】
糖衣錠コアは、アラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールジェル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適当な有機溶媒または溶媒混合物も含有する、濃縮糖溶液の様な適当なコーティング剤を提供される。製品同定のために、または活性化合物の量（すなわち、用量）を特徴付けるために、染料または色素が、錠剤または糖衣錠コーティング剤に添加されてもよい。
【００３８】
経口で用いられ得る医薬製剤は、ゼラチン製のはめ込み型カプセル剤、ならびにゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールの様なコーティング剤で作られた軟密封カプセル剤を含む。はめ込み型カプセル剤は、ラクトースまたはスターチの様な充填剤または結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムの様な滑沢剤、および必要に応じて安定剤と混合された有効成分を含有し得る。軟カプセル剤において、活性化合物は、安定剤ありまたはなしで、脂肪油、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコールの様な適当な液体中に、溶解または懸濁され得る。
【００３９】
非経腸投与用の医薬製剤は、活性化合物の水溶液を含む。注射用の本発明の医薬組成物は、水溶液、好ましくは、ハンクス液、リンゲル液、または、生理食塩水の様な生理的に両立性のバッファー中で製剤される。水性注射用懸濁剤は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、またはデキストランの様な、懸濁剤の粘性を増す物質を含有し得る。さらに、活性化合物の懸濁剤は、適切な油性注射用懸濁剤として製造され得る。適当な親油性溶媒または賦形剤は、ゴマ油の様な脂肪油、またはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドの様な脂肪酸エステルを含む。必要に応じて、該懸濁剤は、高濃縮溶液の製造を可能とするために、安定剤、または化合物の溶解性を増す薬品も含有し得る。
【００４０】
局所または鼻腔内投与用には、浸透されるための、特定のバリアに対して適当な浸透剤が製剤中に用いられる。該浸透剤は一般に当該技術分野において既知である。
【００４１】
本発明は、例示の目的のためだけに、以下の実施例においてさらに記載される。言及されるが、本明細書において明白に記載されていない分子遺伝学、タンパク質およびペプチド生化学、および免疫学は、科学文献で報告されており、当該技術分野の技術者によく知られている。
【００４２】
実施例
実施例１．ＨｅＬａ細胞におけるＳｈｃＡの阻害（ノックダウン）
シグナル伝達アダプター／足場タンパク質ＳｈｃＡは、３つの遺伝子、ＳｈｃＡ、ＳｈｃＢ／Ｓｌｉ／Ｓｃｋ、およびＳｈｃＣ／Ｎ−Ｓｈｃ／ＲａｉからなるＳｈｃファミリーのメンバーである（Luzi et al., 2000, Curr. Opin. Genet. Dev.  10, 668-674）。該ＳｈｃＡは偏在性に発現し、一方ＳｈｃＢおよびＳｈｃＣは脳で特異的に発現する（Nakamura et al., 1998, J. Biol. Chem.  273, 6960-6967）。転写開始部位（ｐ６６対ｐ５２／ｐ４６）、および翻訳開始部位（ｐ５２対ｐ４６）の異なる使用を介して、１つの遺伝子からもたらされたＳｈｃＡの３つのアイソフォームである、ｐ６６ＳｈｃＡ、ｐ５２ＳｈｃＡ、およびｐ４６ＳｈｃＡが存在し、これはアミノ末端領域のみが異なっている（Luzi et al., 2000）。我々は、それぞれのアイソフォームが示す異なる細胞機能として、本発明を例示するためにＳｈｃＡを選択しており、それ故これは、ＳｈｃＡのアイソフォーム特異的発現を得るための科学的課題である。しかしながら、本発明が決して、該特定の遺伝子ファミリーに限られないことは、当該技術分野の技術者には明らかであろう。
【００４３】
ｐ５２／ｐ４６  ｍＲＮＡの１次転写物は、ｐ６６  ｍＲＮＡの全配列を含有する；しかしながら、ｐ６６  ｍＲＮＡの特に５’領域は、ｐ５２／ｐ４６  ｍＲＮＡの第１イントロンには存在するが、スプライスアウトした後のｍＲＮＡには存在しない。ｐ４６およびｐ５２アイソフォームは、異なる翻訳開始部位を用いた同一のｍＲＮＡに由来する。ｐ６６  ｓｉＲＮＡ部位は、ｐ６６ＳｈｃＡ  ｍＲＮＡにのみ存在する５’領域中にあり、一方ｈ／ｍ−ｓｈｃ  ｓｉＲＮＡ部位は、両ｍＲＮＡに存在する第２のエクソン中にある。ｐ６６−ｓｈｃ  ｓｉＲＮＡの配列は、ヒトｐ６６ＳｈｃＡ  ｍＲＮＡの５’領域由来であり、そしてｐ５２／４６ＳｈｃＡ  ｍＲＮＡ中に存在しないことに注意されたい。
【００４４】
細胞を、ｓｉＲＮＡなしで、またはｈ／ｍ−ｓｈｃ  ｓｉＲＮＡおよびｌｕｃ  ｓｉＲＮＡで、オリゴフェクタミン試薬を用いてトランスフェクションした。簡単に言うと、ＨｅＬａ細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（AMIMED）、０．２ｍｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン、および５０単位／ｍｌ  ペニシリンを添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Gibco-BRL）において、３７℃、加湿ＣＯ２（５％）インキュベーター中で培養した。ｓｉＲＮＡでのトランスフェクションの１日前に、細胞を６ウェルプレートに、抗生物質を含まない培地中に１．４×１０５細胞／ウェルでまいた。
【００４５】
次の２１ｍｅｒのオリゴリボヌクレオチド対を、ｓｉＲＮＡとして用いた：ｎｔ６７７〜６９７（ＰＴＢドメイン中）由来のｈ／ｍ−ｓｈｃ  ｓｉＲＮＡ、５’−ＣＵＡ  ＣＵＵ  ＧＧＵ  ＵＣＧ  ＧＵＡ  ＣＡＵ  ＧＧＧ−３’（配列番号：１）および５’−ＣＡＵ  ＧＵＡ  ＣＣＧ  ＡＡＣ  ＣＡＡ  ＧＵＡ  ＧＧＡ−３’（配列番号：２）。該配列は、ヒトｐ６６ＳｈｃＡ  ｍＲＮＡの配列（受託番号：ＨＳＵ７３７７）由来であり、そしてその相補体およびそれぞれの対は、各部位で２ｎｔの３’オーバーハングを有する。設計したＲＮＡオリゴヌクレオチドを、データベース（ＧＥＭＢＬ）で検索し、遺伝子特異性を確かめた。該ＲＮＡオリゴヌクレオチドはＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈ（Balgach, Switzerland）から入手した。Elbashir et al.（2001, Nature 411, 494-498）に従い、アニーリングを行った。アニーリングバッファー（１００ｍＭ  酢酸カリウム、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．４、２ｍＭ  酢酸マグネシウム）２００μｌ中の相補的な２つの鎖（各２００μＭ）を、９０℃で１分間温め、続いて３７℃で１時間インキュベートした。ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡ（ｌｕｃ  ｓｉＲＮＡ）のヌクレオチド７５３〜７７３に対応するｓｉＲＮＡを、負の対照として用いた。
【００４６】
製造元の指示に従い、オリゴフェクタミン試薬（Life Technologies）を用いて、ウェル当たり２０μＭ  ｓｉＲＮＡ１０μｌ、およびトランスフェクション試薬３μｌで、ｓｉＲＮＡをＨｅＬａ細胞に導入した。トランスフェクションの後、異なる時間で、全細胞抽出物を調製し、ウエスタンブロットで分析した。１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、および１％  ＮＰ４０プラスコンプリート（Roche）タンパク質阻害錠剤含有バッファー中で、細胞を可溶化した。全細胞抽出物（２０ｍｇ）を、ポリクローナルウサギ抗Ｓｈｃ抗体（１：２５０；Transduction Laboratories）、マウスモノクローナル抗Ｇｒｂ２（１：１０００；Transduction Laboratories）、またはマウスモノクローナル抗βチュブリン抗体（１：１０００；Sigma）を用いて、ＳｈｃＡ、βチュブリン、およびＧｒｂ２についてウエスタンブロットで分析した。我々は、２次抗体として、Amershamの抗ウサギまたは抗マウスＨＲＰ結合抗体を用いた。増強化学発光検出法（ＥＣＬ；Amersham）を利用し、膜をコダックスのＸｏｍａｔ  ＬＳフィルムに露光した。ＳｈｃＡタンパク質の定量を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ５．０を用いて行った。
【００４７】
ＨｅＬａ細胞をｈ／ｍ−ｓｈｃ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクションした場合、３つ全てのＳｈｃＡアイソフォームのレベルが、トランスフェクションの２４時間後に大変下がり、４８時間後には対照の２０％未満に、そして６０時間後には４％未満に至った。対照タンパク質であるβチュブリンのレベルは、用いた条件下では影響されず、このことは、成長因子シグナル伝達の活性化に際してＳｈｃＡと特異的に相互作用するタンパク質である、Ｇｒｂ２についても同様であった（Luzi et al., 2000）。ｌｕｃ  ｓｉＲＮＡは影響されなかった。時間経過分析により、全ＳｈｃＡアイソフォームのレベルは、トランスフェクションの後５日目まで低いままであるが、その後上がり始めることが示された。３つのアイソフォームでの低下は一様であり、このことは、ｓｉＲＮＡがｐ５２／ｐ４６およびｐ６６  ＳｈｃＡ  ｍＲＮＡ全てを、同等に標的としたことを示している。本発明により繰り返し行うトランスフェクションが、ＳｈｃＡアイソフォームの低レベルを維持、または再確立する。
【００４８】
実施例２．アイソフォーム特異的ノックダウン
ｐ６６特異的ｓｉＲＮＡを用いたＳｈｃＡ  ｐ６６アイソフォームの選択的阻害を本実施例で示す。細胞を、無処理のまま（対照）か、またはｓｉＲＮＡなし（対照）、またはｈ／ｍ−ｓｈｃ  ｓｉＲＮＡ、ｐ６６−ｓｈｃ  ｓｉＲＮＡ（ＣＨ２ドメイン中のｎｔ２３６〜２５６由来、５’−ＧＡＡ  ＵＧＡ  ＧＵＣ  ＵＣＵ  ＧＵＣ  ＡＵＣ  ＧＵＣ−３’、配列番号：３；および５’−ＣＧＡ  ＵＧＡ  ＣＡＧ  ＡＧＡ  ＣＵＣ  ＡＵＵ  ＣＣＧ−３’、配列番号：４）、および実施例１で本質的に記載の対照ｌｕｃ  ｓｉＲＮＡで、トランスフェクションした。全細胞抽出物を４８時間後に調製し、実施例１の様にＳｈｃＡおよびβチュブリンレベルについて分析した。細胞をｐ６６−ｓｈｃ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクションした場合、ｐ６６ＳｈｃＡアイソフォームのみが、ｈ／ｍ−ｓｈｃ  ｓｉＲＮＡで得たものと同様のカイネティクスで低下した；他の２つのアイソフォームは影響されなかった。同様に、βチュブリンレベルも影響されなかった。最初のトランスフェクションの６日後（ｐ６６ＳｈｃＡのレベルは非常に低いが、まさに上がり始めるとき）、および最初のトランスフェクションの１０日後（ｐ６６ＳｈｃＡのレベルが実質的に回復したとき）に、細胞中のｐ６６ＳｈｃＡレベルに対してｐ６６−ｓｈｃ  ｓｉＲＮＡによる２回目の処置を行い、該レベルは６日後トランスフェクションでは低レベルを保ち、そして１０日後のトランスフェクションでは顕著に低下した。
【００４９】
本実施例は、ｐ６６ＳｈｃＡアイソフォームに限定したｐ６６−ｓｃｈ  ｓｉＲＮＡの効果により、ｓｉＲＮＡの特異性を例示する。ｐ６６およびｐ５２／ｐ４６  ｍＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ部位の３’領域のほとんどで配列同一性を有するが、ｐ５２／ｐ４６  ＳｈｃＡの発現は影響を受けなかった。このことは、サイレンシングシグナルが、哺乳類細胞においてｓｉＲＮＡに対するｍＲＮＡ３’領域に伝搬しないことを示す。
【００５０】
さらに、ｐ６６−ｓｈｃ  ｓｉＲＮＡの配列は、ｐ５２／ｐ４６  ＳｈｃＡ  ｍＲＮＡの１次転写物には存在するが、成熟型ｍＲＮＡからスプライスアウトされる。理論に縛られることを望むわけではないが、ｐ６６  ＳｈｃＡアイソフォームのみがｐ６６−ｓｈｃ  ｓｉＲＮＡによって強力にダウンレギュレートされるという事実は、ｓｉＲＮＡの作用部位が細胞質およびスプライスされたｍＲＮＡに限られることを示す。仮に、ｓｉＲＮＡが核で作用し、対応配列を含有する転写物の分解を誘発するなら、ｐ５２ＳｈｃＡおよびｐ４６ＳｈｃＡタンパク質は、同じｐ６６−ｓｈｃ  ｓｉＲＮＡで同様にダウンレギュレートされるべきであるが、この場合そうならなかった。
【００５１】
実施例３．ＳｈｃＡのアイソフォーム特異的発現
本実施例は、アイソフォーム特異的遺伝子発現について、迅速な代わりの方法を例示する。先の実施例は、ヒト細胞株でのアイソフォーム特異的方法において、アダプタータンパク質ＳｈｃＡがどのように抑制され得るかを示すものである。２つのＳｈｃ転写物により共有される配列を有するｓｉＲＮＡは、ｐ６６、ｐ５２、およびｐ４６を抑制する（実施例１参照）。しかしながら、ｐ６６  ｍＲＮＡにのみ存在する配列のｓｉＲＮＡは、ｐ６６アイソフォームのみを抑制し（実施例２参照）、これは、ｓｉＲＮＡシグナルが標的ｍＲＮＡの３’領域に伝搬しないことを示している。本実施例において、共通（ｈ／ｍ  ｓｈｃ）ｓｉＲＮＡ（実施例１に記載）により、全アイソフォームをまずダウンレギュレートし、続いて、ｈ／ｍ−ｓｈｃ  ｓｉＲＮＡに対応する部位でサイレントな変異体を宿す所望のアイソフォームの発現ベクターで、トランスフェクションすることにより、個々のアイソフォームの発現を達成する。このことが、個々のＳｈｃＡアイソフォーム、特に複数のタンパク質をコード化するいずれかの遺伝子の機能解析を可能とする。
【００５２】
それぞれ、センスプライマー５’−ＣＧＧ  ＡＡＴ  ＴＣＡ  ＴＧＧ  ＧＡＣ  ＣＴＧ  ＧＧＧ  ＴＴＴ  ＣＣＴ  ＡＣＴ−３’（配列番号：５）、５’−ＣＧＧ  ＡＡＴ  ＴＣＡ  ＴＧＡ  ＡＣＡ  ＡＧＣ  ＴＧＡ  ＧＴＧ  ＧＡＧ  ＧＣＧ−３’（配列番号：６）、および５’−ＣＧＧ  ＡＡＴ  ＴＣＡ  ＴＧＧ  ＡＴＣ  ＴＴＣ  ＴＡＣ  ＣＣＣ  ＣＣＡ  ＡＧＣ  ＣＧＡ  ＡＧＴ  Ａ−３’（配列番号：７）、および共通アンチセンスプライマー５’−ＣＧＧ  ＡＡＴ  ＴＣＡ  ＣＡＣ  ＴＴＴ  ＣＣＧ  ＡＴＣ  ＣＡＣ  ＧＧＧ  ＴＴＧ  Ｃ−３’（配列番号：８）用いた逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法により、ＮＩＨ３Ｔ３細胞から、全長マウスｐ４６、ｐ５２、およびｐ６６ＳｈｃＡ  ｃＤＮＡを単離した。全長ＳｈｃＡ  ｃＤＮＡを、pBluescriptII  ＫＳ＋にまずクローン化し、ジデオキシリボヌクレオチド連鎖反応終結法により、ヌクレオチド配列を確認した。
【００５３】
オーバーラップするオリゴヌクレオチド対５’−ＣＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＣＴ  ＴＡＣ  ＣＣＡ  ＴＡＣ  ＧＡＴ  ＧＴＴ  ＣＣＡ  ＧＡＴ  ＴＡＣ  ＧＣＴ  Ｇ−３’（配列番号：９）および５’−ＡＡＴ  ＴＣＡ  ＧＣＧ  ＡＡＴ  ＴＣＴ  ＧＧＡ  ＡＣＡ  ＴＣＧ  ＴＡＴ  ＧＧＧ  ＴＡＡ  ＧＣＣ  ＡＴＧ  ＧＴＧ  ＧＧＧ  ＴＡＣ−３’（配列番号：１０）を、ｐｃＤＮＡ３（Invitrogen）のＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩ部位に挿入することで、ＨＡ標識発現ベクターｐｃＤＮＡ３ＨＡを構築した。ＨＡ標識ＳｈｃＡ、ｐ４６ＨＡ、ｐ５２ＨＡ、およびｐ６６ＨＡの発現ベクターを構築するために、ｐ４６、ｐ５２、およびｐ６６の全長ｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ３ＨＡのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＶ部位に挿入した。可能性のある内部開始メチオニンコドンがロイシンコドンに変換され、従ってｐ６６ＳｈｃＡまたは５２ＳｈｃＡ形のみを発現するＳｈｃＡ変異体を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位指示変異誘発キット（Stratagene）を用いて、生成した。オーバーハングオリゴヌクレオチド対５’−ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＣＡＧ  ＧＡＣ  ＣＴＧ  ＡＡＣ  ＡＡＧ  ＣＴＧ  ＡＧＴ  Ｇ−３’（配列番号：１１）および５’−ＣＡＣ  ＴＣＡ  ＧＣＴ  ＴＧＴ  ＴＣＡ  ＧＧＴ  ＣＣＴ  ＧＧＡ  ＧＧＡ  Ｇ−３’（配列番号：１２）を用いて、メチオニン６５（ｐ５２の開始部位）をｐ６６ＨＡのロイシンに変異させ、ｐ６６ＨＡ−ｍ１を得た。別のオーバーハングオリゴヌクレオチド対、５’−ＣＣＡ  ＡＣＧ  ＡＣＡ  ＡＡＧ  ＴＣＣ  ＴＧＧ  ＧＡＣ  ＣＣＧ  ＧＧＧ−３’（配列番号：１３）および５’−ＣＣＣ  ＣＧＧ  ＧＴＣ  ＣＣＡ  ＧＧＡ  ＣＴＴ  ＴＧＴ  ＣＧＴ  ＴＧＧ−３’（配列番号：１４）を用いて、ｐ６６ＨＡ−ｍ１およびｐ５２ＨＡ両方のｐ４６開始部位を変異させ、ｐ６６ＨＡ−ＭＬおよびｐ５２ＨＡ−ＭＬを得た。オーバーハングオリゴヌクレオチド対５’−ＧＧＧ  ＧＴＴ  ＴＣＣ  ＴＡＣ  ＴＴＧ  ＧＴＣ  ＣＧＣ  ＴＡＣ  ＡＴＧ  ＧＧＴ  ＴＧＴ  Ｃ−３’（配列番号：１５）および５’−ＣＡＣ  ＡＡＣ  ＣＣＡ  ＴＧＴ  ＡＧＣ  ＧＧＡ  ＣＣＡ  ＡＧＴ  ＡＧＧ  ＡＡＡ  ＣＣＣ  Ｃ−３’（配列番号：１６）を用いて、上記のｈ／ｍ−ｓｈｃ  ｓｉＲＮＡに対応する部位で該ベクターにサイレントな変異体を挿入し、ｐ４６ＨＡ−ｓｍ、ｐ５２ＨＡ−ＭＬ−ｓｍ、およびｐ６６ＨＡ−ＭＬ−ｓｍを得た。該ベクターから発現するタンパク質は、親タンパク質と同一であることに注意されたい。
【００５４】
アイソフォーム特異的発現のため、ＨｅＬａ細胞を、ｓｉＲＮＡ（偽）なしで、またはｈ／ｍ−ｓｈｃ  ｓｉＲＮＡでまずトランスフェクションし、上記の本質的な３つの内在性ＳｈｃＡタンパク質全て（アイソフォーム）をダウンレギュレートした。２日後、製造元の指示に従い、リポフェクタミン２０００（Life Technologies）を用いて、空の発現ベクター、ｐｃＤＮＡ３、または所望のアイソフォームである野生型マウスＳｈｃＡまたはサイレントな変異体ＳｈｃＡの発現ベクターで、細胞をトランスフェクションした。１日後、全細胞抽出物を調製し、ＳｈｃＡ発現レベルについて、ウエスタンブロットで分析した。ポリクローナル抗ＳｈｃＡおよび抗βチュブリン抗体で、膜をブロテッィングした。
【００５５】
実施例１で既に示した様に、ｈ／ｍ−ｓｈｃ  ｓｉＲＮＡは、内在性ＳｈｃＡの３つのアイソフォーム全てをほぼ完全にノックダウンした。個々のアイソフォームの変異体発現ベクターで３つの細胞をトランスフェクシンし、対応するアイソフォームのみ発現させた。野生型発現ベクターでトランスフェクションされた細胞において、タンパク質はほとんど検出されなかった。このことは、ｓｉＲＮＡがベクターにより発現した内在性ＳｈｃＡで作用することを示している。ｈ／ｍ−ｓｈｃ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクションしていない細胞は、発現ベクター中の変異の存在または非存在には関係しないＳｈｃＡアイソフォームを、上昇したレベルで発現する。対照的に、ｓｉＲＮＡは変異配列では作用せず、これにより任意のＳｈｃＡアイソフォームのアイソフォーム特異的発現が可能となる。ｐ６６ＨＡ−ＭＬ−ｓｍでトランスフェクションした細胞は、ｐ６６のみの特異的発現を明確に示し、一方ｐ４６ＨＡ−ｓｍおよびｐ５２  ＨＡ−ＭＬ−ｓｍでは、それぞれｐ４６およびｐ５２のみの発現を生じた。
【００５６】
本発明者は、哺乳類細胞において、ｓｉＲＮＡが、内在性タンパク質のレベルを効率的、特異的、および迅速にダウンレギュレート可能なことを示した。ｓｉＲＮＡの効果は、用いたｓｉＲＮＡと本質的に同一の配列を含有するｍＲＮＡに限られた。ほとんどが内ヌクレオチド結合分解性攻撃であり、標的ｍＲＮＡの他の領域には伝搬しない、ｍＲＮＡへのｓｉＲＮＡの第１の作用を、次の知見から推測した；（１）ｐ６６−ｓｈｃ  ｓｉＲＮＡの効果がｐ６６ＳｈｃＡに限られること（実施例２）、および（２）ｈ／ｍ−ＳｈｃＡ  ｓｉＲＮＡは、野生型ＳｈｃＡ  ｍＲＮＡを標的とするが、変異型ｍＲＮＡを標的としないこと（実施例３）。第２の知見は、異所性に発現したＳｈｃＡ  ｍＲＮＡでのものである。
【００５７】
本実施例において、各アイソフォームの野生型ＳｈｃＡ  ｍＲＮＡおよび変異型ＳｈｃＡ  ｍＲＮＡの配列は、ｍＲＮＡの中央に位置するｓｉＲＮＡ認識部位の２つのヌクレオチド以外、同一である。該２つのヌクレオチド変化は、所望のアイソフォームの発現に対するｓｉＲＮＡの影響を回避するのに十分であった。サイレンシングシグナルがｓｉＲＮＡの５’または３’のいずれかに広がると、該並列の少なくともいくつかが同一であるため、野生型および変異型ｍＲＮＡ由来のＳｈｃＡ発現が抑制される。野生型ｍＲＮＡ由来だが、変異型ｍＲＮＡ由来ではない発現が抑制された。このことは、ｓｉＲＮＡ仲介性ｍＲＮＡ分解のストリンジェントな特異性、および哺乳類細胞においてＲＮＡｉの伝搬がないことを強く示す。これは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより合成された高分子量ｄｓＲＮＡ分子が、ＲＮＡｉの中間体であり、ｓｉＲＮＡの効果を増幅し、そして維持すること（これはｓｉＲＮＡからのサイレンシングシグナルの５’方向への広がりを示している）を示した昆虫無細胞システム（Lipardi et al., 2001, Cell  107, 297-307）、およびC. elegans（Sijen et al., 2001, Cell  107, 465-476）の結果と全く対照的である。増幅が哺乳類細胞におけるサイレンシングでも含まれるなら、アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドのみが、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプライマーとして働き、従って、遺伝子ダウンレギュレーションが十分となるはずである。我々は、アンチセンスＲＮＡがサイレンシングに含まれないことを見出した。
【００５８】
我々の結果の重要な意味は、ｓｉＲＮＡを用いるＰＴＧＳと、サイレントな変異を有する相同遺伝子のアイソフォーム特異的発現との組合せが、細胞に１つのアイソフォームのみを発現させる一方、他のアイソフォームのレベルは非常に低く保つことである。該ノックダウンおよびノックイン法を用いて、細胞活性に対する個々のアイソフォームの様々な変異の影響を調べることが可能である。発現ベクター中のアイソフォーム配列は、細胞遺伝子の発現に影響するｓｉＲＮＡで認識されないように、設計されるべきである。変異型発現ベクター中の２つのミスマッチは、それらがｓｉＲＮＡ仲介性抑制を受けないようにするのに十分であった。マウスとヒトＳｈｃＡとの配列同一性（ｐ６６アイソフォームの９０％ｍＲＮＡ、および９３％アミノ酸配列）は高いので、我々は本研究において、マウスＳｈｃＡの発現ベクターを用いた。従って、発現ベクターへの変異の導入の代わりに、内在性ヒトＳｈｃＡ遺伝子と完全に一致するが、トランスフェクションされたマウス遺伝子とは一致しない配列を有する異なるｓｉＲＮＡを設計し、同様の結果を達成することが可能であった。しかしながら、我々の方法の利点は、同じプローブセットを用いて、ヒトおとびマウス細胞両方でアイソフォーム特異的ＳｈｃＡ発現を得ることである。
【００５９】
要するに、我々は、哺乳類細胞において、ｓｉＲＮＡ仲介性ｍＲＮＡ分解の作用部位が細胞質に限られ、かつ標的ｍＲＮＡが、用いたｓｉＲＮＡと本質的に同一の配列を含有するｍＲＮＡに限られることを示した。アイソフォーム特異的方法におけるＳｈｃＡ遺伝子の発現の条件を確立するために、特異的発現ベクターと組み合わせて、ｓｉＲＮＡ仲介性遺伝子ノックダウンの該特異的特徴を、短期間利用できる。該ノックダウンおよびノックイン方法は、複数のアイソフォームとして発現される任意の遺伝子の研究に適用され、かつ有用である。
【００６０】
本明細書で言及のそれぞれの刊行物、ならびに２００２年１月２３日に出願の優先権主張出願ＧＢ  ０２０１４７７．７の記載は、個々に言及する様に、本明細書において引用により取り込まれる。
【配列表】
2005514946.tif 000002
2005514946.tif 000003
2005514946.tif 000004
【手続補正書】
【提出日】平成16年9月16日(2004.9.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005514946000001.app
【国際調査報告】
2005514946.tif 000005
2005514946.tif 000006