(57)【要約】本発明は、カスパーゼ−８中の特定の領域に対する抗体、およびその使用に関する。
2005501905.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カスパーゼ−８のSub−1ユニットのＣ末端由来のペプチドで動物を免疫することによって得られる抗体およびその断片であって、該抗体およびその断片が、該カスパーゼ（活性カスパーゼ−８およびプロカスパーゼ−８の両方）をカスパーゼ結合タンパク質とともに共免疫沈降することができ、かつ溶出により免疫複合体から効率的にカスパーゼおよび結合タンパク質を放出することができる抗体およびその断片。
【請求項２】
ポリクローナル抗体である請求項１記載の抗体、またはその断片。
【請求項３】
モノクローナル抗体である請求項１記載の抗体、またはその断片。
【請求項４】
キメラ抗体である請求項１記載の抗体、またはその断片。
【請求項５】
充分にヒト化された抗体である請求項１記載の抗体、またはその断片。
【請求項６】
抗−抗−Id抗体である請求項１記載の抗体、またはその断片。
【請求項７】
免疫に使用される前記ペプチドが、配列ＣＱＧＤＮＹＱＫＧＩＰＶＥＴＤを含む請求項１、２、３、４、５または６記載の抗体。
【請求項８】
免疫に使用される前記ペプチドが、KLHに結合される請求項１、２、３、４、５、６または７記載の抗体。
【請求項９】
免疫グロブリンアイソタイプIgG1である請求項１、２、３、４、５、６、７または８記載の抗体。
【請求項１０】
前記抗体が、カスパーゼ−８のプロセシングを誘導するものである請求項９記載の抗体。
【請求項１１】
ELISAアッセイの開発のための請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０記載の抗体の使用。
【請求項１２】
カスパーゼ−８のSub−1のＣ末端のペプチドで動物を免疫化することを含む請求項１または２記載の抗体の調製方法。
【請求項１３】
前記抗体がモノクローナルである請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
免疫化に使用される前記ペプチドが、アミノ酸配列ＣＱＧＤＮＹＱＫＧＩＰＶＥＴＤを含む請求項１５または１６記載のポリペプチド。
【請求項１５】
免疫原が、担体に結合される請求項１２または１３記載の方法。
【請求項１６】
前記担体が、KLHである請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
カスパーゼおよびカスパーゼ結合タンパク質の精製方法であって、カスパーゼおよびカスパーゼ結合タンパク質を含むサンプルと請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０記載の抗体との接触、カスパーゼおよびカスパーゼ結合タンパク質の共免疫沈降、生成された免疫複合体の洗浄、ならびにカスパーゼ由来の競合ペプチドを用いることによる免疫複合体からのカスパーゼおよびカスパーゼ結合タンパク質の回収を含む方法。
【請求項１８】
前記サンプルが、体液、細胞抽出物およびＤＮＡ発現ライブラリーである請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記競合ペプチドが、アミノ酸配列ＣＱＧＤＮＹＱＫＧＩＰＶＥＴＤ（配列番号：４）を含む請求項１７または１８記載の方法。
【請求項２０】
前記サンプル中の細胞が、抽出前に刺激されたものである請求項１７、１８または１９記載の方法。
【請求項２１】
前記カスパーゼが、カスパーゼ−８である請求項１７、１８、１９または２０記載の方法。
【請求項２２】
Sub−1のＣ末端ドメインに対して展開された抗体と、Sub−1のＮ末端ドメインに対して展開された抗体とを組合わせて、カスパーゼ−８のＣ末端ドメインに結合するカスパーゼ−８調節タンパク質の精製方法であって、調節タンパク質８を溶出するために、まずＮ末端ドメインに対する抗体で、ついでＣ末端ドメインに対する抗体を適用してカスパーゼ−８と調節タンパク質を共免疫沈降することを含む方法。
【請求項２３】
前記Ｎ末端ドメインに対する抗体が、Mab182である請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｃ末端ドメインに対する抗体が、Mab179である請求項２２または２３記載の方法。
【請求項２５】
エピトープ179（配列番号：４）で動物を免疫することを含む、請求項１、２、３、４、５または６記載の抗体を得るための該エピトープの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カスパーゼ−８中の特定の領域に対する抗体、およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍壊死因子（TNF−アルファ）およびリンホトキシン（TNF−ベータ）は、主に単核白血球により形成される多機能性前炎症性サイトカインであり、細胞に多くの効果を示す（Wallach, D.（1986年）：「インターフェロン 7」（Ion Gresser編）83−122頁、アカデミック・プレス、ロンドン（Academic Press, London）で；およびBeutlerおよびCerami（1987年））。TNF−アルファおよびTNF−ベータはいずれも、特異的な細胞表面の受容体に結合することによって、それらの効果を開始させる。その効果のいくつかは、生物に有益である可能性がある：それらは、たとえば、腫瘍細胞またはウイルス感染細胞を破壊し、顆粒球の抗細菌活性を増大し得る。この方法で、TNFは、腫瘍および感染性因子に対する生物の防御に寄与し、かつ外傷からの回復に寄与する。したがって、TNFは、その使用で、腫瘍細胞の表面のその受容体に結合することによって腫瘍細胞の死に至る事象を開始させる、抗腫瘍剤として使用され得る。TNFは、抗感染薬剤としても使用され得る。
【０００３】
しかし、TNF−アルファは、有害効果を示す。TNF−アルファの過剰生成が、数種の疾患において主要な病原性の役割を果たす可能性があるという証拠がある。たとえば、第一に血管でのTNF−アルファの効果は、敗血症性ショックの兆候の主な原因であることが知られている（Traceyら、1994年）。ある種の疾患では、TNFは、含脂肪細胞の活性を抑制することにより、および食欲不振を引起こすことにより、過剰な体重の減少（悪液質）を引起こす可能性があるので、TNF−アルファは、カケクチンと呼ばれた。それは、リウマチ性疾患における組織に対する損傷のメディエーター（BeutlerおよびCerami、1987年）、および移植片対宿主反応で観察される損傷の主要なメディエーター（Grau GEら、1989年）とも評された。さらに、TNFは、炎症の過程に、および多くの他の疾患に関与することが知られている。
【０００４】
２つの固有で、独立に発現した受容体である、TNF−アルファとTNF−ベータのいずれとも特異的に結合するp55（CD120a）およびp75（CD120b）TNF−受容体は、TNFの前記生物学的効果を開始および／または仲介する。これらの２つの受容体は、構造的に類似しない細胞内ドメインを有することから、それらは異なってシグナルを出すことが示唆された（Hohmannら、1989年；Engelmannら、1990年；Brockhausら、1990年；Loetscherら、1990年；Schallら、1990年；Nopharら、1990年；Smithら、1990年を参照）。しかし、CD120aおよびCD120bの細胞内シグナル伝達に関与する、細胞の機構、たとえば、種々のタンパク質および可能性のある他の因子は、まだ解明されていない。それは、TNFに対する細胞の最終的に観察される反応となる反応のカスケードの開始の原因である受容体にリガンド、すなわちTNF（アルファまたはベータ）が結合したのちに通常に起こる細胞内のシグナル伝達である。
【０００５】
TNFの前記細胞破壊性効果を考慮すると、これまで研究されたほとんどの細胞で、この効果は、おもにCD120aによって誘発される。CD120aの細胞外ドメインに対する抗体（リガンド結合ドメイン）は、それら自身、抗体による受容体架橋の効率と相互に関連する細胞破壊効果（欧州特許第412486号を参照）を誘発し、細胞内のシグナル伝達過程の発生での第一段階であると思われる。さらに、突然変異の研究（Brakebuschら、1992年；Tartagliaら、1993年）は、CD120aの生物学的機能が、その細胞内ドメインの完全性に依存することを示し、したがって、TNFの細胞破壊効果に至る細胞内のシグナル伝達の開始が、CD120aの２つまたはそれ以上の細胞内ドメインの結合の結果として起こることを示唆した。さらに、TNF（アルファおよびベータ）は、ホモ三量体として生じ、そしてそれ自体、受容体分子に結合および架橋する、すなわち、受容体凝集を引起こす方法で、CD120aを介して細胞内シグナル伝達を誘導することが示唆された（Engelmann H.ら、1990年）。
【０００６】
受容体のTNF／NGFスーパーファミリーのほかのメンバーは、FAS／AP01受容体（CD95）である。CD95は、アポトーシスの形態で細胞死を仲介し（Itohら、1991年）、自己反応性Ｔ細胞の陰性セレクターとして役割を果たすように見え、すなわち、Ｔ細胞の突然変異の間、CD95は、自己抗原を認識するＴ細胞のアポトーシス死を仲介する。CD95遺伝子（lpr）における突然変異は、ヒト自己免疫疾患、全身性紅斑性狼瘡（SLB）に類似するマウスでのリンパ球増殖疾患を引起こすことも分かった（Watanabe−Fukunagaら、1992年）。CD95のリガンドは、中でも、キラーＴ細胞（または細胞傷害性Tリンパ球−CTL）により担持した細胞表面に結合した分子であるので、このようなCTLがCD95を担持する細胞と接触した際、それらは、CD95担持細胞のアポトーシス性の細胞死を誘導する能力がある。さらに、CD95に特異的であるモノクローナル抗体が調製され、これらのモノクローナル抗体は、ヒトCD95をコードするcDNAにより形質転換されたマウス細胞を含めCD95を担持する細胞におけるアポトーシス性の細胞死を誘導する能力があった（たとえば、Itohら、1991年）。
【０００７】
様々な受容体からなるTNF受容体およびFasシグナル伝達機構、それらの調節、および同定された下流のシグナル伝達分子は、Wallachら（1999年）により詳細に検討される。
【０００８】
特定の悪性細胞およびHIV感染細胞がそれらの表面にCD95を担持し、CD95に対する抗体またはCD95リガンドは、これらの細胞でのCD95仲介細胞傷害性効果を誘発するために使用できるので、このような悪性細胞またはHIV感染細胞と戦うための手段を提供し得ることが見出された（Itohら、1991年を参照）。したがって、CD95の細胞傷害性活性を増強するさらにほかの方法を見出すことも、治療上の潜在性を有し得る。
【０００９】
TNF（アルファまたはベータ）およびCD95リガンドに対する細胞反応を調整する方法を提供する必要性が長年感じられてきた。たとえば、TNFまたはCD95リガンドが過剰発現される前記病理学的状況では、TNF−またはCD95リガンド誘導細胞破壊効果を阻害することが望ましい一方で、他の状況（たとえば、外傷適用）では、TNF効果を増強することが望ましく、またはCD95の場合には、腫瘍細胞またはHIV感染細胞で、CD95仲介効果を増強することが望ましい。
【００１０】
多数のアプローチは、TNFの破壊的効果を調節するために、抗TNF抗体を使用して、TNFのその受容体への結合を阻害することによるか、または可溶性TNF受容体（該受容体の本質的に可溶性の細胞外ドメインである）を使用して、細胞表面結合TNF−受容体（TNF−R）へのTNFの結合を拮抗させることによって、出願人ら（たとえば、欧州特許明細書番号  欧州特許第186,833号、欧州特許第308,378号、欧州特許第398,327号および欧州特許第412,486号を参照）によってなされた。さらに、その受容体へのTNF結合がTNF誘導細胞効果に必要とされることに基づいて、出願人ら（たとえば、欧州特許第568,925号参照）によるアプローチは、TNF−Rの活性を調整することにより、TNF効果を調整するためになされた。
【００１１】
欧州特許第568,925号は、TNF−Rでのシグナルトランスダクションおよび／または切断を調整する方法に関し、それによると、ペプチドまたは他の分子は、受容体自身と、または受容体と相互作用するエフェクタータンパク質とのいずれかと相互作用する可能性があるので、TNF−Rの正常な機能を調整している。欧州特許第568,925号では、その細胞外、膜貫通および細胞内ドメインに変異を有する様々な突然変異形態のCD120aの構築および特徴付けが記載されている。この方法により、CD120aの前記ドメイン内の領域は、受容体の機能、すなわち、リガンド（TNF）の結合、およびそののちのシグナルトランスダクション、ならびに最終的に細胞上で観察されるTNF効果を生じる細胞内シグナル伝達に必須であると識別された。さらに、CD120aの前記ドメインにある種々の領域に結合できるタンパク質、ペプチドまたは他の因子を単離および同定する多数のアプローチの記載があり、該タンパク質、ペプチドおよび他の因子は、TNF−Rの活性の調節または調整に関与し得るものであることが記載されている。このようなタンパク質およびペプチドをコードするDNA配列を単離およびクローニングするため；これらのタンパク質およびペプチドの産生のための発現ベクターを構築するため；ならびにCD120aと、またはCD120aの種々の領域と結合する前記タンパク質およびペプチドと相互作用する抗体またはその断片の調製のための多数のアプローチも、EPO368,925号に規定されるとおりである。しかし、欧州特許第568,925号は、TNF−Rの細胞内ドメインに結合する実際のタンパク質およびペプチドを特定していない。同様に、欧州特許第568,925号では、CD95の細胞内ドメインを結合する能力のある特定のタンパク質またはペプチドを全く開示していない。
【００１２】
したがって、TNFの、またはCD95リガンドの効果を阻害することが望まれる場合、細胞表面でのTNF−RまたはCD95の量または活性を減少することが望ましい。一方、TNF−RまたはCD95の量または活性の増加は、増強TNFまたはCD95リガンド効果が求められるときに望まれる。この目的のために、CD120aおよびCD120bはいずれのプロモーターを配列決定、および解析し、多数の重要な配列モチーフについて、種々の転写調節因子に特異的であり、これらTNF−Rの発現がそのプロモーターレベルで制御される、すなわち、受容体の数の減少に対してプロモーターからの転写の阻害、および受容体の数の増大に対してプロモーターからの転写の増強を制御され得ることが見出された（欧州特許第606,869号および国際公開第9531206号パンフレット）。
【００１３】
腫瘍壊死因子（TNF）受容体、および構造的に関連の受容体CD95は、白血球が産生するリガンドによる刺激により、細胞で誘発することが知られている。一方、それら自身の消滅に至る破壊的活動、この誘発の機構は、まだあまり理解されていない。突然変異の研究は、CD95およびCD120aでは、細胞傷害性のシグナル伝達が、それらの細胞内ドメイン内の固有の領域に関与することを示す（Brakebuschら、1992年；Tartagliaら、1993年、ItohおよびNagata、1993年）。これらの領域（「デスドメイン」）は、配列類似性を示す。CD95およびCD120aのいずれの「デスドメイン」は、自己結合する傾向にある。それらの自己結合は、シグナル伝達の阻害に必須である受容体凝集を明らかに促進し（Bigdaら、1994年；Boldinら、1995年）、高レベルの受容体発現は、リガンド依存性シグナル伝達の誘発を生じ得る（Boldinら、1995年）。
【００１４】
リンパ球の細胞傷害性効果のいくつかは、標的細胞でのCD95とリンパ球産生リガンドとの相互作用により仲介される（NagataおよびGoldstein、1995年も参照）。単核食細胞による細胞死滅は、TNFおよびその受容体CD120aに関与する（Vandenabeeleら、1995年も参照）。他の受容体誘導効果のように、TNF受容体およびCD95による細胞死誘導は、一連のタンパク質−タンパク質相互作用を介して起こり、リガンド−受容体結合から酵素的エフェクター機能の最終的な活性化に至り、そしてそれは、細胞死のためのシグナル伝達を開始する非酵素的タンパク質−タンパク質相互作用：受容体への三量体TNFまたはCD95リガンド分子の結合、自己結合に対するデスドメインモチーフの傾向（Boldinら、1995年a）により増大されたそれらの細胞内ドメインの生じた相互作用（Brakebuschら、1992年；Taitagliaら、1993年；ItohおよびNagata、1993年）、および受容体の細胞内ドメインへの２つの細胞質タンパク質（互いに結合もし得る）、−CD95へのMORT−1（またはFADD）（Boldinら、1995年b；Chinnaiyanら、1995年；Kischkelら、1995年）、およびCD120aへのTRADD（Hsuら、1996年）−の誘導された結合を包含することが示された。CD95およびCD120aへのそれらの結合は別として、MORT−1およびTRADDも、CD95とCD120aの間の機能性「クロストーク」を供するRIP（Stangerら、1995年）のようなタンパク質を含む他のデスドメインと同様に、互いに結合する能力がある。これらの結合は、保存配列モチーフ、受容体およびその付随タンパク質（associated protein）に共通の「デスドメインモジュール」を通して起こる。さらに、酵母２−ハイブリッド試験で、MORT−1は、CD95に同時に結合することが示されたが、哺乳類細胞では、この結合は、受容体の刺激後のみに起こるので、MORT−1はCD95シグナル伝達の開始事象に加わっていることが示唆される。MORT−1は、酵素的活性のあらゆる配列モチーフ特徴を含まないので、細胞死を誘発するその能力は、MORT−1自身の固有の活性を含まず、むしろ、MORT−1に結合し、シグナル伝達カスケードでさらに下流に作用するある種の他のタンパク質の活性化を含むように見える。分子のN末端部分を欠くMORT−1変異体の細胞の発現により、CD95またはCD120aによる細胞傷害性誘導を遮断することが示されたことから（Hsuら、1996年；Chinnaiyanら、1996年）、このＮ末端領域は、タンパク質−タンパク質相互作用を通して両方の受容体の細胞死滅効果のためのシグナル伝達を伝達することが示された。
【００１５】
種々の生理学的細胞死プロセスの開始における、カエノルハブジチス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）プロテアーゼCED3に、そして哺乳類のインターロイキン−１ベータ−変換酵素（ICE）に構造的に関連する細胞質のチオールプロテアーゼの群に関係している（Kumar、1995年およびHenkart、1996年による論評）。このファミリーのプロテアーゼが、CD95およびTNF−Rにより誘導される細胞−細胞傷害性に役割を果たす証拠もある。プロテアーゼおよびそれらの機能を遮断する２つのウイルスにコードされたタンパク質の特異的なペプチド阻害剤である牛痘タンパク質crmAおよびバキュロウイルスp35タンパク質は、この細胞−細胞傷害性に対する細胞への保護を供することが分かった（Enariら、1995年；Tewariら、1995年；Xueら、1995年；Beidlerら、1995年）。CED3／ICE（カスパーゼ）ファミリーのプロテアーゼにより明らかに仲介される特定の特異的細胞性タンパク質の迅速な切断は、CD95またはTNF−Rの刺激の直後の細胞で証明されている。
【００１６】
１つのこのようなプロテアーゼおよびその種々のアイソフォーム（阻害性のものを含む）は、MORT−1結合タンパク質であるMACH（現在のカスパーゼ−８）として知られ、単離され、クローンニングされ、特徴付けられ、その潜在的な使用も、共に所有するPCT／US96／10521号、および本発明者らの出版物（Boldinら、1996年）における言及により、詳細に記載され、かつ完全にここに包含されるように、述べられている。Mch4（カスパーゼ−１０とも呼ばれる）で表わされるほかのこのようなプロテアーゼおよびその種々のアイソフォーム（阻害性のものを含む）も、本発明者（未公表）および他者（Fernandes−Alnemriら、1996年；Srinivasulaら、1996年）により単離および特徴付けられた。カスパーゼ−1０も、MORT−1結合タンパク質である。したがって、カスパーゼ−１０の全ての局面、特性、特徴および使用に関する詳細は、前記出版物で述べられ、そしてその全ては、言及により完全にここに包含される。
【００１７】
類似のプロドメインを有するカスパーゼ、カスパーゼ−８およびカスパーゼ−１０（Boldinら、1996年；Muzioら、1996年；Fernandes−Alnemriら、1996年；VincentおよびDixit、1997年を参照）が、MORT−1と、そのプロドメインを通して相互作用すること、そしてこの相互作用は、MORT−1のN末端部分に存在し、かつカスパーゼ−８およびカスパーゼ−１０に重複して存在する「デスエフェクタードメイン」（すなわちDED）を介していることも注意すべきである（Boldinら、1995年b；Chinnalyanら、1996年参照）。
【００１８】
カスパーゼ（システイン・アスパラギン酸特異的プロテイナーゼ）は、数種の共通特性を共有するシステインプロテアーゼの成長ファリミーである。カスパーゼのほとんどは、プログラムされた細胞死あるいはアポトーシスの開始および執行に関与することが見出され、一方では、前炎症性サイトカインの産生に関与するようにも思えることが分かった（Nicholson DWら、1997年、Salvesen GSら、1997年、Cohen GM、1997年）。それらは、触媒的にほとんど不活性な前駆体として合成され、ドメイン間リンカーに存在する特異的な内部アスパラギン酸残基のうしろを切断することにより一般に活性化される。カスパーゼの切断部位は、テトラペプチド配列（Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｄ）により定義され、該切断は、アスパラギン酸の下流で常に起こる。結果として、特定の成熟した活性カスパーゼは、他の不活性前駆体と同様に、それら自身を処理し、活性化し得る（Fernandes−Alnemri Tら、1996年、Srinivasula SMら、1996年）。
【００１９】
プログラムされた細胞死過程の活性化は一般に特異的であり、「イニシエーター」カスパーゼと称される上流カスパーゼによる「エクセキューショナー（executioner）」カスパーゼと称される下流カスパーゼの一連のプロセシングを含む。２つのクラスのカスパーゼの機能的特徴は、それらの構造によっても反映される。実際に、「イニシエーターカスパーゼ」は、「エクセキューショナー」カスパーゼに比較して、より長いプロドメイン領域を含む（Salvesen GSら、1997年、Cohen GM 1997年）。長いプロドメインは、イニシエーターまたは「アピカル（apical）」カスパーゼを、TNF受容体ファミリーの死滅受容体の誘発により活性化させる。死滅受容体のリガンド誘導三量体化（trimerization）により、イニシエーターカスパーゼは、それらの長いＮ末端プロドメインを通して強化され、特異的アダプター分子と相互作用して、死滅誘導シグナル伝達複合体を形成する（Cohen GM 1997年、Kischkel FCら、1995年）。たとえば、カスパーゼ−８／MACHおよびおそらくカスパーゼ−１０（２つのDEDを含む）は、アダプター分子FADD／MORT−1により強化され受容体複合体となるのに対して、カスパーゼ−２は、CRADD／RAIDDおよびRIPにより強化されると想定される（Nagata Sら、1997年、MacFarlane Mら、1997年、Ahmad Mら、1997年、Duan Hら、1997年）。活性化受容体複合体の三量体特性により、少なくとも２つのカスパーゼ分子は、互いにきわめて接近するようになるので、自己触媒プロセシングによりその活性化に至ると思われる（Yangら、1998年、Muzioら、1998年）。
【００２０】
カスパーゼは、３つの主要サブユニット、すなわちＮ末端プロドメインおよび２つのサブユニット（それらは、リンカーペプチドによりしばしば分離される）から構成されるプロ酵素として合成される。２つのサブユニットは、活性酵素部位の主要部分を含む「長鎖」またはサブユニット１（Sub−1）、および「短鎖」またはサブユニット２（Sub−2）と称されている。酵素の充分な活性化については、それをプロセシングして、プロドメインと２つのサブドメインを形成する。２つのサブユニットは、異種ニ量体を形成する。カスパーゼ−３の推定の三次元構造により、長鎖ドメインのＣ末端および短鎖サブドメインのＮ末端は自由である必要があり、そして短鎖サブユニットのＣ末端は、正しく折畳まれ、活性な酵素を生じるために、長鎖サブユニットのN末端ときわめて接近する必要があるように思われる（Rotondaら、1996年、Mittlら、1997年、Srinivasulaら、1998年）。
【００２１】
アポトーシスまたは壊死に至る経路は、完全に区別されるものと常に考えられてきたが、最近の発見により、アポトーシスの主要なメディエーターを表すカスパーゼは、負および正のいずれの手段でも、壊死にも関与できることが示唆されている。実際に、L929細胞でのカスパーゼ阻害剤CrmAの過剰発現は、1000の因子により、TNFの壊死活性についてのこれらの細胞の感受性を増大させることが示されたことから（Vercammenら、1998年）、TNF誘導壊死活性におけるカスパーゼの阻害役割が示された。さらに、これらのリガンドによるアポトーシス誘導に重要な役割を果たすTNFR1−およびFas関連デスドメイン（Wallachら、1999年による論評）は、壊死誘導に重要な役割を果たすことも最近示唆された（Booneら、2000年）。興味深いことに、FasL−誘導肝臓壊死は、カスパーゼ阻害剤により遮断されることが示された（Kunstleら、1997年）。
【００２２】
カスパーゼ仲介タンパク質分解は、アポトーシス過程の重要で中心的な要素であるので［Nicholson D. W.およびThornberry, N. A.（1997年）、Villaら（1997年）およびSalvesen, G. S.およびDixit, V. M.（1997年）］、これらのプロテアーゼの重要な下流の分子標的の同定は、アポトーシスシグナルトランスダクションを理解するために必要である。種々の構造およびシグナルタンパク質は、アポトーシス死の間にカスパーゼにより切断されることが示されており［Nicholson D. W.およびThornberry, N. A.（1997年）、Villa, P.ら（1997年）］、たとえば、そのようなタンパク質には、アポトーシスの執行にとってでなく、ヌクレオソーム間のDNA分解（internucleosomal DNA degradation）に必須であるICAD、すなわちカスパーゼ活性化Dnaseの阻害剤が含まれる（Enari, M.ら（1998年）およびSakahiraら（1998年））。細胞質アクチンゲルゾル形質転換（gelsol transformation）を調整するアクチン調節タンパク質であるゲルゾリン（Yin, H. L.およびStossel, T. P.（1979年））は、（i）インビボでのアポトーシス中のその切断［Kothakota, S.ら（1997年）］、（ii）その過剰発現によるアポトーシスの防止［Ohtsu, M.ら（1997年）］および（iii）切断産物の1つによるアポトーシスの誘導［Kothakota, S.ら（1997年）］をもとに、アポトーシスに関係する。ゲルゾリンは、Ca＋2活性化多活性を示し、アクチンフィラメントに作用し、フィラメントの成長の早い端をキャップし、アクチン重合を凝集させたりもする［Yin, H. L.およびStossel, T. P.（1980年）、Kurth, M.およびBryan, J.（1984年）、Janmey, P. A.およびStossel, T. P.（1987年）］。
【００２３】
出願、国際公開第00/39160号パンフレットには、カスパーゼ−８のSub−1および／またはSub−2と相互作用する能力のあるカスパーゼ−８相互作用タンパク質が開示されている。該カスパーゼ相互作用タンパク質は、カスパーゼ−８の単鎖構造を使用する２−ハイブリッドスクリーニングにより見出された。
【００２４】
典型的には、カスパーゼ−８とカスパーゼ−8結合タンパク質との同時精製は、カスパーゼ−８のタグエピトープ修飾（たとえば、カスパーゼ−８へのHA融合 Rothら）、および抗タグ特異的抗体の使用を包含する。しかし、タンパク質のエピトープのタグ付けは、タグ付きタンパク質の活性に影響を及ぼし得る。
【００２５】
カスパーゼ−8特異的抗体は、入手可能である：
抗−Mach カタログ番号（Cat．NO）218777は、プロカスパーゼ−8および活性化カスパーゼ−８のいずれも認識する、カルビオケム（Calbiochem）から入手したポリクローナル・ニワトリ抗体である。この抗体を得るために使用した免疫原は、全長ヒト組換えカスパーゼ−８タンパク質であった。
【００２６】
カスパーゼ−８（D384）6B6は、カスパーゼ−８  Sub−2のアミノ末端に描かれる残基に対応する合成ペプチドにKLHを結合したものでマウスを免疫化することによって作製された、Cell Signaling technologyから入手できるモノクローナル抗体である。この抗体は、ウエスタンブロッティングにより、カスパーゼ−８の切断された10kDaの小サブユニットの内因性レベルを特異的に検出する。このMabは、ウエスタンブロッティングに推奨され、全長カスパーゼ−８と交差反応しない。
【００２７】
B9−2抗体は、カスパーゼ−８に対応する55kDaバンドを認識するファルミンゲン（Pharmingen）（Becton Dickinson Company）から入手されるモノクローナル抗体である。カスパーゼ−８のアミノ酸335〜469に対応する組換えヒトカスパーゼ−８タンパク質断片を、免疫原として使用した（Weaverら、2000年）。このモノクローナル抗体は、ウエスタンブロット解析でのカスパーゼ−８のレベルの監視に推奨される。このMabを使用する活性カスパーゼ−８の同定は、抗体を発生するために使用される断片が、非活性カスパーゼ−８でのみインタクトであるために、機能しないかもしれない。
【００２８】
カスパーゼ−８  p10（S−19）：sc−6135は、ヒト起源のカスパーゼ−８  Sub−2のカルボキシ末端付近に描かれるペプチドに対して生じる、Santa Cruz biotechnologyから入手できるアフィニティー精製されたヤギのポリクローナル抗体である。このポリクローナル抗体は、ウエスタンブロッティング、免疫沈降および免疫組織化学により、ヒト起源のp10サブユニット（Sub−2）および前駆体カスパーゼ−８と反応する。それは、カスパーゼ−８  p20（Sub−1）との交差反応ではない。
【００２９】
カスパーゼ−８  1C12は、カスパーゼ−８  Sub−1のカルボキシ末端に描かれる残基に対応する合成ペプチドとKLHを結合したもので、マウスを免疫化することによって作製されたCell Signaling technologyから入手できるモノクローナル抗体である。この抗体は、ウエスタンブロッティングにより、プロカスパーゼ−8および活性カスパーゼ−８を特異的に検出する。
【００３０】
このMab作製用にマウスを免疫化するために使用されるペプチドの正確な配列は、知られていない。
【００３１】
カスパーゼ−８  p20（H-134）：sc-7890は、ヒト起源のカスパーゼ−８  Sub−1内に描かれるアミノ酸217〜350に対応する組換えタンパク質に対して作製された、Santa Cruz biotechnologyから入手できるウサギのポリクローナル抗体である。このポリクローナル抗体は、ウエスタンブロッティング、免疫沈降および免疫組織化学により、マウス、ラットおよびヒト起源の活性および前駆体カスパーゼ−8と反応する。
【００３２】
しかし、カスパーゼ−８が免疫沈降されることによる効率、および結合タンパク質が、共沈され得るかどうか、ならびにもしそうであれば、免疫複合体からカスパーゼ−８とカスパーゼ−８結合タンパク質の回収が可能かどうかは、技術的データシートの情報にはない。
【００３３】
したがって、最近、カスパーゼ−８に対するポリクローナルおよびモノクローナル抗体で、以下の特性：プロカスパーゼ−８と活性カスパーゼ−８の両方を有効に免疫沈降できる特性、およびカスパーゼ−８とカスパーゼ−８結合タンパク質の同時精製が可能な免疫沈降複合体中のカスパーゼ−８から分離できる特性全てを含むという報告はなされていない。
【００３４】
したがって、本発明の方法は、カスパーゼ−８とカスパーゼ−８結合タンパク質との共沈および精製の領域での長年の問題を解決するものである。
【発明の開示】
【００３５】
カスパーゼ−８のSub−1ユニットのＣ末端のペプチド（例えば、ＣＱＧＤＮＹＱＫＧＩＰＶＥＴＤ）、およびその断片で動物を免疫することによって得られる抗体（ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、充分にヒト化された抗−抗Id抗体、またはその断片）であって、該カスパーゼ（活性カスパーゼ−８およびプロカスパーゼ−８の両方）をカスパーゼ結合タンパク質とともに共免疫沈降することができ、かつ溶出により免疫複合体から効率的にカスパーゼおよび結合タンパク質を放出することができる抗体。よりとくに、免疫に使用されるペプチドは、KLHに結合され得ることが好ましい。
【００３６】
ある実施態様において、本発明の抗体は、免疫グロブリンアイソタイプIgG1である。
【００３７】
ほかの実施態様において、本発明の抗体は、カスパーゼ−８のプロセシングを誘導する。
【００３８】
ある局面において、本発明は、ELISAアッセイの開発に使用できる抗体を提供する。
【００３９】
ほかの局面において、本発明は、本発明の抗体の調製方法、およびカスパーゼ付随タンパク質（caspase associated prorein）の単離方法のための抗体の使用を提供し、カスパーゼ付随タンパク質（配列番号：３のアミノ酸配列、もしくはそのアイソフォーム、対立変異体、断片、機能的類似体、融合タンパク質、変異体またはそれらの誘導体を含む）が、細胞試料（たとえば細胞抽出物、発現cDNAライブラリー、およびゲノムまたはコンビナトリアルペプチドのライブラリー）中に存在することがより好ましい。よりとくに、本発明は、カスパーゼ付随タンパク質の単離のための該抗体の使用に関する（ここで、カスパーゼはカスパーゼ−８である）。
【００４０】
本発明のある実施態様において、免疫に使用される免疫原は、担体（好ましくは、KLH）に結合される。
【００４１】
本発明はまた、ヒトカスパーゼと前記モノクローナル抗体との接触を含むカスパーゼ（好ましくは、カスパーゼ−８、およびカスパーゼ付随タンパク質）の精製方法を提供する。よりとくに、カスパーゼ付随タンパク質は、免疫に使用されるペプチドで溶出されることが好ましい。
【００４２】
さらに、本発明は、Sub−1のＣ末端ドメインに対して展開された抗体（例えば、Mab179）とSub−1のＮ末端ドメインに対して展開された抗体（例えば、Mab182）とを組合わせて用いる、カスパーゼ−８のＣ末端ドメインに結合するカスパーゼ−８調節タンパク質の精製方法であって、調節タンパク質８を溶出するために、まずＮ末端ドメインに対する抗体で、ついでＣ末端ドメインに対する抗体を適用してカスパーゼ−８と調節タンパク質を共免疫沈降することからなる方法を提供する。
【００４３】
さらに、本発明は、エピトープ179（配列番号：４）で動物を免疫することを含む、本発明の抗体を得るための該エピトープの使用を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
本発明は、カスパーゼ−８のSub−1のＣ末端ドメインに対して指向された抗体に関する。このドメインに指向されるこれらの抗体は、カスパーゼが、非常に低い濃度で存在する場合でさえ、高い効率で、カスパーゼ−８（プロカスパーゼ−８および活性カスパーゼ）を免疫沈降する能力が際立っていることが分かった。これらの抗体は、カスパーゼー８に結合するタンパク質を有効に共沈および単離するためにも使用できる。
【００４５】
本発明による抗体は、ポリクローナルであるか、またはより好ましくはモノクローナルであり得る。好ましい実施態様では、カスパーゼ−８  Sub−1のＣ末端由来の、残基Cys360〜Asp374および配列ＣＱＧＤＮＹＱＫＧＩＰＶＥＴＤ（ペプチド179  配列番号：４）を含むペプチドを、抗体を作製するために免疫化に使用した。
【００４６】
免疫化に使用されるペプチドは、逆相HPLCにより精製され、KLHなｄの何らかの担体に結合して（好ましくは、その天然システインを通して、または合成で融合されたシステインを通して）、担体の表面にペプチドを露出することで合成でき、そして、たとえば、モノクローナル抗体の調製用にマウスを、およびポリクローナル抗体用にウサギを免疫化するために使用できる。
【００４７】
ある実施態様では、カスパーゼ−８とカスパーゼ−８結合タンパク質との共免疫沈降を、Sub−1のＣ末端ドメインに見出されるエピトープ179に特異的なカスパーゼ−８抗体を使用して行なう。
【００４８】
本発明による共免疫沈降は、休止もしくは刺激細胞、またはcDNA発現ライブラリー、ゲノムもしくはコンビナトリアルペプチドライブラリーからの細胞溶解物から選択されるサンプルで行なう。
【００４９】
細胞は、様々のアポトーシス誘導剤を使用して（リンホカイン、たとえば、Fasリガンド、TNFでの処理など）、または飢餓、熱ショックなどの環境因子により、溶解および免疫沈降前に刺激できる。
【００５０】
本発明による共免疫沈降で抗体を使用することにより、カスパーゼ−８およびカスパーゼ−8結合タンパク質を免疫沈降複合体から有効に溶出でき、カスパーゼ−８に由来するペプチドＣＱＧＤＮＹＱＫＧＩＰＶＥＴＤ（免疫化に使用されるのと同じペプチド）との競合により上清中に回収できる。
【００５１】
配列ＣＱＧＤＮＹＱＫＧＩＰＶＥＴＤおよび配列番号：４のカスパーゼ−８由来のペプチド179もしくはエピトープ179、またはそのムテイン、断片、融合タンパク質、あるいはそれらの誘導体を、本発明による抗体を免疫化および作製するために使用できる。前記の化合的合成により、または哺乳類細胞での組換えDNA技術により、または精製タンパク質の切断により、免疫化のためのペプチドを生成できる。タンパク質は、F. M. Ausubelによる「分子生物学における最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」ISBN：047150338X、1988年、第16章で詳述されるとおり、細菌または昆虫細胞でも産生され得る。本発明は、本発明の該エピトープ179（配列番号：４）のムテインにも関し、該ムテインは、ペプチドの天然に生じる配列のみを基本的に有するペプチドと本質的に同じ特性を保持する。このような「ムテイン」は、ペプチド中のアミノ酸残基が、欠失、付加または他のものに置換され得るものであり、ペプチド自身に関して、この種類の修飾がペプチドムテインの生物学的特性を実質的に変化しないものである。
【００５２】
これらのムテインは、公知合成および／または部位特異的突然変異誘発技術、またはそれに適切なその他の公知技術により作製される。
【００５３】
本発明によるムテインの好ましい変化は、「保存的」置換として知られるものである。保存的アミノ酸置換は、充分に類似の物理化学的特性（該群のメンバー間での置換は、その分子の生物学的機能を保存するであろう特性）を有する群の範囲内の同義アミノ酸を包含する（Grantham、Science、185巻、862−864頁（1974年））。アミノ酸の挿入および欠失が、その機能を変化しなければ、特に、該挿入または欠失のみが、数個のアミノ酸（たとえば、３以下、好ましくは２以下）に関与するものであり、機能的な構造に重要であるアミノ酸を除去または置換しない場合、前記定義された配列でも行なわれ得ることは明らかである。
【００５４】
好ましくは、同義アミノ酸の群は、表１に定義されるものである。より好ましくは、同義アミノ酸の群は、表２に定義されるものである。最も好ましくは、同義アミノ酸の群は、表３に定義されるものである。
【００５５】
【表１】
2005501905.tif 000003
【００５６】
【表２】
2005501905.tif 000004
【００５７】
【表３】
2005501905.tif 000005
【００５８】
本発明で使用されるタンパク質のムテインを得るために使用できるタンパク質中のアミノ酸置換の生成の例としては、Markらによる米国特許第RE33,653号、第4,959,314号、第4,588,585号および第4,737,462号；Kothsらによる第5,116,943号；Namenらによる第4,965,195号；Chongらによる第4,879,111号；およびLeeらによる第5,017,691号に表されるようなあらゆる周知の方法工程；および米国特許第4,904,584号明細書（Shaw et al）に表されるリジン置換タンパク質があげられる。
【００５９】
前記タンパク質またはペプチドは、ついで、合成混合物、またはそれらが産生される細胞から精製される。タンパク質の精製方法は、当業者に周知であり、たとえば、前記Current Protocols in Molecular Biology、第16章で、およびCurrent Protocols in Protein Science Wiley and Sons Inc．第５章および第６章に詳述されている。有利には、該ペプチドは、KLHまたはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼなど、またはヒスチジンタグ配列などの配列タグとの融合物として産生されうる。融合またはタグ付きタンパク質の使用は、前記Current Protocols in Molecular Biology、第16章、および前記キアゲン（Qiagen）his−タグタンパク質発現および精製キットの取扱説明書に詳述されるように、精製手段を簡略化するものである。
【００６０】
前記タンパク質またはペプチドが、融合タンパク質として発現された場合、その融合パートナーは、該融合パートナーに対する抗体の作製を避けるために、抗体作製用のタンパク質を使用する前に切断できる。融合パートナーの切断および所望のタンパク質の単離は、前記Current Protocols in Molecular Biology、第16章に記載される。マルトース結合タンパク質の融合組換えタンパク質を発現および精製するためのベクター、プロトコールおよび試薬も、商業的に入手可能である。
【００６１】
融合タンパク質はそのペプチドに対する抗体の産生を刺激し得るので、ペプチドを生成する場合は、融合パートナーは除去されないことが望ましい場合があり得る。
【００６２】
前記のとおり、ペプチドは、化学の技術分野に周知の化学的方法によっても合成され得る。
【００６３】
タンパク質に対するポリクローナル抗体の調製は、「免疫学における最新プロトコール」、ウイリー・アンド・サンズ・インク．の第２章に記載されている。ペプチドに対する抗体の調製は、タンパク質と比較した場合、一般的にペプチドの抗原性が低いため、プロトコールにおける、ある程度の変化を必要とし得る。ペプチドに対するポリクローナル抗体の調製は、前記「免疫学における最新プロトコール」、第９章に記載される。
【００６４】
モノクローナル抗体は、ハイブリッド細胞の成長を支持する条件下で、免疫化Ｂ細胞との融合により、免疫化動物（特にラットまたはマウス）の脾臓またはリンパ節から取出されたＢ細胞から調製され得る。マウスＢ細胞の融合については、細胞系Ａｇ−８が好ましい。
【００６５】
モノクローナル抗体を調製する技術は、「免疫学における最新プロトコール」、ウイリー・アンド・サンズ・インク．第２章などの、多くの記事および教科書に記載されている。その第９章には、ペプチド、または動物を用いた免疫化が記載されている。これらの動物の脾臓またはリンパ節細胞は、その第２章に記載されているように、モノクローナル抗体の調製のために、タンパク質免疫化動物の脾臓またはリンパ節細胞と同じ方法で使用され得る。
【００６６】
モノクローナル抗体を調製するのに使用される技術は、さらに、KohlerおよびMilstein（1975年）および米国特許第4,376,110号明細書に記載されている。
【００６７】
そこの超可変領域がほとんどの任意の配列に置換される、ヒト抗体のジーンバンクからの抗体の調製について、米国特許第5,840,479号明細書に記載されている。このような抗体は、所定のペプチドまたはタンパク質を用いて動物を免疫化することが困難である場合に好ましい。ある種の構造は、免疫原性に乏しく、アジュバントを添加しても、および融合構築物で他のポリペプチドに結合しても、そのままの状態に維持され得る。たとえば、ヒトでの低免疫原性を有する抗体が望まれる際、ヒト抗体に類似の構造を有する抗体を使用することが望ましい場合には、米国特許第5,840,479号明細書に記載される抗体がさらに好ましい。
【００６８】
いったん適切な抗体が同定されると、その特性を変化することが所望され得る。たとえば、キメラ抗体は、高い収率の産生を達成し得る。定常領域が、ヒト抗体の定常領域で置換されたキメラ抗体は、抗体が、ヒトにおいて低免疫原性であることが望まれる場合に、さらに望ましい。キメラ抗体の調製は、Cabillyら、1984年、Morrisonら、1984年、Boulianneら、1984年、欧州特許第125023号明細書、欧州特許第171496号明細書、欧州特許第173494号明細書、欧州特許第184187号明細書、国際公開第86/01533号パンフレット、国際公開第87/02671号パンフレット、およびHarlowおよびLane、「抗体：実験室マニュアル」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、1988年などの多数の出版物に記載されている。
【００６９】
「充分にヒト化された抗体」は、ヒト免疫グロブリンの可変および定常領域のいずれも含む分子である。充分にヒト化された抗体は、自己免疫疾患などの慢性および再発疾患のために、反復治療が要求される治療用途のために強力に使用され得る。充分なヒト抗体の製造のためのある方法は、マウスのヒト化免疫系の「ヒト化」、すなわち、内因性Ig遺伝子が不活性化されたマウスへのヒト免疫グロブリン（Ig）遺伝子座の導入による、ヒトIgを産生できるマウス株（異種マウス（Xenomice））の作製からなる。Ig遺伝子座は、それらの物理的構造、および最終的に広範な免疫応答を生じるのに必要とされる遺伝子再編成および発現プロセスの両方の点で、非常に複雑である。抗体多様性は、まず、Ig遺伝子座に存在する様々なＶ、ＤおよびＪ遺伝子間のコンビナトリアルな再編成により調製される。これらの遺伝子座は、抗体発現、対立遺伝子の排除、クラススイッチングおよび親和性の成熟を制御する、様々に散らばる（interspersed）調節要素をも含む。マウスへの再編成されていないヒトIg移入遺伝子の導入は、マウス組換え機構が、ヒト遺伝子に適合性があることを証明した。さらに、種々のアイソフォームの抗原特異的hu−mAbを分泌するハイブリドーマは、抗原による異種マウスの免疫化により得られ得る。
【００７０】
充分にヒト化された抗体およびその調製方法は、当技術分野に周知である（Mendezら、Nature Genetics 15巻：146−156頁（1997年）；Buggemannら、Eur. J. Immunol. 21巻：1323−1326頁（1991年）；Tomizukaら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97巻：722−727頁（2000年）、国際公開第98/24893号パンフレット）。
【００７１】
他の型の抗体は、抗イディオタイプの抗体である。抗イディオタイプ（抗−Id）抗体は、一般的に抗体の抗原結合部位と関連する独特の決定基を認識する抗体である。Id抗体は、抗−Idが調製されるMabの源と同じ種および遺伝子型の動物（たとえば、マウス株）を免疫化することによって調製され得る。免疫化動物は、これらのイディオタイプの決定基に対する抗体（抗−Id抗体）を産生させることによって、免疫化する抗体のイディオタイプの決定基を認識し、応答する。たとえば、米国特許第4,699,880号明細書を参照（なお、この言及により完全に本明細書に包含される）。
【００７２】
抗−Id抗体は、さらに他の動物での免疫応答を誘導する「免疫原」としても使用され、いわゆる抗−抗−Id抗体を産生し得る。抗−抗−Idは、抗−Idを誘導する元来のmAbとエピトープ的に一致し得る。したがって、mAbのイディオタイプの決定基に対する抗体を使用することによって、同一の特異性の抗体を発現する他のクローンを同定することが可能である。
【００７３】
したがって、本発明のカスパーゼ−８のＣ末端サブユニットに対して作製されるMab、類似体、断片、またはそれらの誘導体は、BALB／cマウスなどの適切な動物において抗−Id抗体を誘導するために使用され得る。このような免疫化マウスからの脾臓細胞を用いて、抗−Id  mAbを分泌する抗−Idハイブリドーマを産生する。さらに、抗−Id  mAbは、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）などの担体と結合でき、別のBALB／ｃマウスを免疫化するために使用できる。これらのマウスから得られる血清は、前記カスパーゼ−８のエピトープに特異的な本来のmAbの結合特性を有する抗−抗−Id抗体、またはその類似体、断片、およびそれらの誘導体を含むだろう。
【００７４】
したがって、抗−Id  mAbは、自身のイディオタイプのエピトープか、または評価されるエピトープと構造的に類似する「イディオトープ」を有する。
【００７５】
用語「抗体」には、インタクトな分子、ならびにたとえば、抗原と結合できるFabおよびF（ab’）2などのその断片のいずれも包含されることも意味される。FabおよびF（ab’）2断片は、インタクトな抗体のFc断片を欠き、その流通（circulation）からいっそう迅速に明瞭になり、インタクトな抗体に比べ非特異的な組織とあまり結合し得ない（Wahlら、1983年）。
【００７６】
FabおよびF（ab’）2および本発明に有用な抗体の他の断片は、インタクトな抗体分子について本明細書に開示された方法にしたがって、p72タンパク質の検出および定量のために使用され得ることが理解されるだろう。このような断片は、通常、（Fab断片を産生するための）パパインまたは（F（ab’）2断片を産生するための）ペプシンなどの酵素を使用して、タンパク質分解性切断により作製される。
【００７７】
抗体は、それが、分子と特異的に反応することにより分子を抗体に結合できる場合、その分子と「結合できる」とされる。用語「エピトープ」は、抗体により結合されることができるあらゆる分子の一部を言うことを意味し、それは、抗体によって認識もされ得る。エピトープまたは「抗原性決定基」は、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表層基から構成され、特異的三次元構造特性および特異的電荷特性を示す。
【００７８】
「抗原」は、抗体によって結合できる分子または分子の一部であり、さらには、動物にその抗原のエピトープに結合できる抗体を産生させることができるものである。抗原は、１つまたは１つ以上のエピトープを有する。前記の特異的反応とは、抗原は、その対応する抗体と非常に選択的手段で反応するが、他の抗原により起こされ得る多数の他の抗体とは反応しないことを示すことを意味する。
【００７９】
本発明のエピトープ179は、カスパーゼ−８およびカスパーゼ−８付随タンパク質の顕著な免疫沈降および溶出用に、特異的ポリクローナル、モノクローナル抗体を展開するために使用できる。抗体は、カスパーゼ−８の新規プロセシングを誘導するためにも使用できる。
【００８０】
Mab179などのSub−1のＣ末端ドメインに対して展開された抗体は、カスパーゼ−８調節タンパク質を特異的に単離するためのMab183などのSub−1のＮ末端ドメインに対して展開された抗体と組合わせて使用できる。Sub−1のＣ末端ドメインは、カスパーゼ−８の活性部位の一部として知られていることから、調節タンパク質は、それに結合し得る（Thornberryら、1997年）。まずMab183で結合され、ついでMab179を適用されて共沈されるカスパーゼ−８および調節タンパク質は、カスパーゼ−８から培地に調節タンパク質を放出し、アポトーシス調節に関与する重要なタンパク質の同定に至り得る。
【００８１】
ある実施態様において、プロカスパーゼ−８結合タンパク質であるCariを、Mab179による本発明の免疫沈降を使用して単離した。Cariは、活性カスパーゼ−８により切断され、カスパーゼ−８の活性化およびアポトーシスに関与することが分かった。
【００８２】
本発明に有用な抗体（またはその断片）は、カスパーゼ−８のインサイチュ検出に対して、免疫蛍光または免疫電子顕微鏡法でのように組織学的に使用され得る。インサイチュ検出は、組織学的試験片を患者から取出し、そのような試験片に本発明の標識抗体を供することによって達成され得る。抗体（または断片）は、生物学的サンプルに標識抗体（または断片）を適用することによるか、または塗布することによって供されるのが好ましい。当業者であれば、本発明を使用して、どんな広範な組織学的方法（染色手法など）をも、このようなインサイチュ検出を達成するために改変され得ることを容易に理解できるだろう。
【００８３】
生物学的サンプルは、ニトロセルロースなどの固相支持体もしくは担体で、または細胞、細胞粒子もしくは可溶性ポリペプチドを固定できるその他の固相支持体もしくは担体で処理され得る。支持体または担体は、そののち、前記したように、本発明にしたがって、適切な緩衝液で洗浄し、続いて検出可能に標識された抗体で処理され得る。ついで、固相支持体または担体を、二回緩衝液で洗浄して、未結合の抗体を除去し得る。該固相支持体または担体に結合した標識の量は、ついで、従来の手段により検出され得る。
【００８４】
「固相支持体」、「固相担体」、「固形支持体」、「固形担体」、「支持体」または「担体」により、抗原または抗体を結合できるあらゆる支持体または担体が意図される。周知の支持体または担体には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および改質セルロース、ポリアクリルアミド、斑レイ岩および磁鉄鉱が含まれる。担体の性質は、ある程度まで可溶性であるか、または本発明の目的のために不溶性であるかのいずれかであり得る。支持体材料は、結合分子が抗原または抗体に結合できる限り、仮想的には、あらゆる可能性のある構造形態を有し得る。したがって、支持体または担体の形態は、ビーズのような球状、試験管の内側表面またはロッド（rod）の外側表面のような円筒状であり得る。また、表面は、シート、試験細片などのような平面であり得る。好ましい支持体または担体としては、ポリスチレンビーズがあげられる。当業者であれば、抗体または抗原を結合するための他の適切な担体を知っているだろうし、日常的な実験を用いて該担体を確かめることもできるだろう。
【００８５】
前記のように本発明の所定の多くの抗体の結合活性は、周知の方法にしたがって測定され得る。当業者は、日常的な実験を適用して、各測定についての操作的および最適アッセイの条件を決定できるだろう。
【００８６】
洗浄、攪拌、振とう、濾過などのその他の工程が、特定の状況のために通例であるか、または必要である場合は、アッセイに加えられ得る。
【００８７】
本発明による抗体が、検出可能に標識され得る１つの方法は、酵素に該抗体を連結させ、酵素免疫アッセイ（EIA）で使用されるものである。この酵素は、順に、後に適切な基質にさらされる際、たとえば、分光光度計、蛍光測定によるか、または可視手段により検出できる化学的部分の生成についての手段で基質と反応するだろう。抗体を検出可能に標識するために使用できる酵素としては、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカスのヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼがあげられるが、それらに限定されるものではない。検出は、酵素について発色基質を使用する比色法によって達成され得る。また、検出は、同様に作製された照準と比較して、基質の酵素的反応の範囲の目視比較によって達成され得る。
【００８８】
検出は、多様な他のあらゆる免疫アッセイを使用して達成され得る。たとえば、抗体または抗体断片を放射性標識することにより、放射性免疫アッセイ（RIA）の使用を通してR−PTPaseを検出することが可能である。RIAについての優れた説明は、Work, T. S.らによる「分子生物学における実験室技術および生化学」、ノース・ホーランド・パブリシング・カンパニー、ニューヨーク（NY）（1978年）に、特にChard, T.による「放射性免疫アッセイおよび関連技術への導入」と題される章に見出すことができ、該言及により本明細書に包含される。放射活性アイソトープは、g計測器もしくはシンチレーション計測器の使用のような手段によって、またはオートラジオグラフィーによって検出できる。
【００８９】
本発明による抗体を、蛍光化合物を用いて標識することも可能である。蛍光標識抗体を、適切な波長の光にさらした場合、その存在は蛍光により検出できる。最も一般的に使用される蛍光標識化合物の中でも、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、ピコシアニン（pycocyanin）、アロピコシアニン（allophycocyanin）、ｏ−フタルアルデヒドおよびフルオレサミンである。
【００９０】
抗体は、152Eまたは他のランタニド系列などの蛍光放出金属を使用して検出可能に標識することもできる。これらの金属は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ETPA）のような金属キレート基を使用して、抗体に付着され得る。
【００９１】
抗体は、化学発光化合物に連結することによって検出可能に標識することもできる。ついで、化学発光タグ付抗体の存在は、化学反応の過程中に生じる発光団の存在を検出することによって決定される。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、セロマチックアクリジニウムエステル（theromatic acridinium ester）、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルである。
【００９２】
同様に、生物発光化合物も、本発明の抗体を標識するために使用され得る。生物発光は、触媒タンパク質が、化学発光反応の効力を増大する生物系に見られる一種の化学発光である。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することによって測定される。標識目的用の重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンである。
【００９３】
本発明の抗体分子は、「２つの部位」または「サンドイッチ」アッセイとしても知られる免疫測定アッセイでの利用に適合され得る。典型的な免疫測定アッセイでは、多量の未標識の抗体（または抗体の断片）は、固形支持体または担体に結合され、多量の検出可能に標識された可溶性抗体は、固相抗体、抗原および標識抗体との間に形成された三重複合体の検出および／または定量を可能にするために添加される。
【００９４】
典型的で、好ましい免疫測定アッセイとしては、固相に結合した抗体が、まず試験されるべきサンプルと接触され、二成分の固相の抗体−抗原複合体の形成により、サンプルから抗原を抽出される「順行」アッセイがあげられる。適切なインキュベーション期間ののち、必要であれば、固形支持体または担体を洗浄し、未反応抗原を含む流動体サンプルの残渣を除去し、ついで、未知量の標識抗体（「レポーター分子」として機能する）を含む溶液と接触させる。標識抗体に、未標識抗体を通して固形支持体または担体に結合した抗原と複合体化させる二次インキュベーション期間ののち、固形支持体または担体を二回洗浄して、未反応標識抗体を除去する。
【００９５】
本発明の抗原でも有用であり得る他の型の「サンドイッチ」アッセイでは、いわゆる「同時」および「逆行」アッセイが使用される。同時アッセイは、固形支持体または担体に結合した抗体、および標識抗体を、いずれも同時に試験されるサンプルに加えるような単一のインキュベーション工程を含む。インキュベーションを完了したのち、固形支持体または担体を洗浄し、流動体サンプルの残渣および未複合化標識抗体を除去する。固形支持体または担体と結合した標識抗体の存在は、従来の「順行」サンドイッチアッセイにあるとおりに測定される。
【００９６】
「逆行」アッセイでは、流動体サンプルへの標識抗体の溶液を添加したのち、適切なインキュベーション期間後の固形支持体または担体に結合した未標識抗体を添加する工程を利用する。二次インキュベーション後、固相を従来の形態で洗浄し、試験されるサンプルの残基および未反応標識抗体の溶液を遊離する。固形支持体または担体と結合した標識抗体の測定は、ついで、「同時」および「順行」アッセイと同様に測定される。
【００９７】
RIAまたはELISAなどの免疫アッセイの創作は、多くの記事、教科書、およびその他の出版物に記載されている。国際公開第97/03998号パンフレット、48頁４行から52頁27行までに言及される。本発明の免疫アッセイは、一般型の２つのうちにあり得る：第一に、固定カスパーゼ、または同等のペプチドを使用する免疫アッセイは、カスパーゼ−８の定量化で使用され得る。第二に、カスパーゼのエピトープに対して指向された固定抗体を使用する免疫アッセイは、カスパーゼタンパク質を定量するために使用され得る。
【００９８】
このようなアッセイは、アポトーシス経路に関与するカスパーゼ、および他のタンパク質のレベルが、このような経路の関与の可能性のある多数の疾患または兆候で評価される必要があり得る場合に、診断での利用が見出され得る。
【００９９】
ある実施態様では、Cariとして示されるプロカスパーゼ−８相互作用タンパク質が、本発明の抗体の活用により単離された。しかし、前記免疫沈降法を使用して、様々なカスパーゼに結合するタンパク質の免疫沈降を望む場合、カスパーゼ−８以外のカスパーゼのSub−1のＣ末端ドメインに特異的な抗体が使用できる。
【０１００】
本発明による抗体は、プロカスパーゼ−８とカスパーゼ−８のいずれかを沈降できるので、カスパーゼ結合タンパク質は、共免疫沈降により、活性カスパーゼまたはプロカスパーゼとともに共沈できる。
【０１０１】
本発明は、今や以下の限定するものではない実施例によって説明されるだろう。
【実施例】
【０１０２】
［実施例１］
カスパーゼ−８に特異的なモノクローナル抗体作製のためのマウスの免疫化
活性化ののち、カスパーゼ−８を切断し、２つのサブユニットにする（Sub−1およびSub−2）。
【０１０３】
カスパーゼ−８活性化ののち形成され、新規であり得るエピトープに特異的な抗体を作製するために、Sub−1のＣ末端、ならびにSub−1およびSub−2のＮ−末端に由来する合成ペプチドを使用してマウスを免疫した。
【０１０４】
以下のペプチドを使用して、モノクローナル抗体作製のためにマウスを免疫した。
【０１０５】
ペプチド179：カスパーゼ−８の大サブユニット（Sub−1）のＣ末端に対応するペプチドＣＱＧＤＮＹＱＫＧＩＰＶＥＴＤ（配列番号：４）（残基Cys360〜Asp374に対応するエピトープ、図１）を合成し、逆相HPLCによって精製し、その天然のシステインを通して担体KLHに結合して、担体の表面にペプチドを露出させた。
【０１０６】
ペプチド182：カスパーゼ−８の小サブユニットのN末端に対応するペプチドＬＳＳＰＱＴＲＹＩＰＤＥＡＤＣ（配列番号：５）（Sub−2、残基Lys385−Gly399）を合成し、逆相HPLCによって精製し、Sub−2の配列に由来しないＣを通して担体KLHに結合した。
【０１０７】
ペプチド183：Sub−1のＮ末端に対応するペプチドＳＥＳＱＴＬＤＫＶＹＱＭＫＳＫＰＲＣ（残基Ser217〜Gly234）を合成し、逆相HPLCによって精製し、そしてSub−1の配列に由来しないＣを通して担体KLHに結合した。
【０１０８】
同量の抗原（ペプチド−KLH）による４回の免疫および２回の追加免疫（boost）を、以下のようにマウスに投与した。
【０１０９】
50μgのペプチド−KLHによる最初の免疫化を50μl  PBSに溶解し、50μl完全フロイントアジュバントで均質化し、ついで５匹の７週齢Balb／Cの雌マウスの各々の足の裏に注射した。
【０１１０】
第１の免疫化の２週間後に行なった第２の免疫化のために、マウスを、不完全フロインドアジュバントの50％（v／v）溶液中同量のペプチドで筋肉内に追加免疫した。
【０１１１】
第２の免疫化の２週間後に行なった第３の免疫化のために、マウスを、50μl  PBS中50μgのペプチド−KLHで、腹膜内注射した。
【０１１２】
注射したマウスの血清を、第２および第３の免疫化の10日後に試験した。
【０１１３】
第４の免疫化（ペプチド182および183のみで行なわれた）を、第３の免疫化と同じ方法で、１ヶ月後に行なった。
【０１１４】
第４の免疫化（またはペプチド179で促されたマウスの第３の免疫化）の１ヶ月後に、（第３および第４の免疫化と同じ方法で）２日の間隔内で、２回の追加免疫を行なった。
【０１１５】
４日後、最も高い特異的免疫反応性を示す２匹のマウスの脾臓および鼠蹊リンパ節を、ミエローマ細胞との融合のために取出した（Eshhar Zm, 1985）。
【０１１６】
［実施例２］
カスパーゼ−８に特異的なポリクローナル抗体作製のためのウサギの免疫化
特異的ポリクローナル抗体作製のために、ウサギを、179−KLHおよび183−KLHで免疫化した。
【０１１７】
100μｇのペプチド−KLH（50μlのPBSに溶解し、50μl完全フロイントアジュバントで均質化された）で第１の免疫化を行ない、皮下に注射された。同量のペプチド−KLHで2週間後に、第２の免疫化を行ない、不完全フロイントアジュバントで２週間後に筋肉内に注射した。これらの２回の免疫化ののち、PBS中に溶解された同量のペプチド−KLHによる２回の追加免疫をし、２週間の間隔で皮下に投与した。
【０１１８】
［実施例３］
ハイブリドーマ作製、抗体産生クローンの選択、および腹水からの抗体の調製
Eshhar Z、1985年におけるプロトコールにしたがって、融合プロセスおよびハイブリドーマ細胞選択を行なった。手短に言うと、２匹の反応性マウスからの脾臓およびリンパ節細胞110×106の混合物を、PEGを用いた短いインキュベーションにより、32×106のNSO／1ミエローマ変異ミエローマ細胞と融合させた。PEGを、まずDMEMで徐々に希釈し、ついで、遠心分離により完全に除去した。細胞を、DMEM−HAT培地に再懸濁し、約2.5×104細胞／ウェルの濃度で96穴プレートに分配し、37℃で８％のCO2インキュベーターでインキュベーションした。全てのハイブリドーマウェル中の培地を、10％ウマ血清（HS）で補足されたDMEMに交換した。ハイブリドーマ培養上清サンプルを、ELISA（以下実施例12に記載）によって、融合から２週間後の特異的Mabの存在についてスクリーニングした。細胞上清中で特異的抗体の存在が検出されたウェルからの細胞を、24穴プレートに移した。陽性細胞を、２回サブクローニングした：この段階で、全サブクローンは、陽性であることが分かった。クローンを、24穴に、その後25cm2のＴフラスコに広げた。拡張培養物を、特異的Mabの分泌について監視した。陽性培養物からの細胞のアンプルを、凍結し、そして液体窒素で保存した。
【０１１９】
ペプチド179に対する特異的抗体を検出するためにスクリーニングされたおよそ700クローンの内、１つだけ陽性クローンを見出し（Mab179）、ペプチド182に対する特異的抗体を検出するためにスクリーニングされたおよそ700クローンの内、１つだけ陽性クローンを見出し（Mab182）、そしてペプチド183に対する特異的抗体を検出するためにスクリーニングされたおよそ1100クローンの内、２つだけ陽性クローンを見出した（Mab183.1および183.2）。陽性クローンを、96穴プレートでの限界希釈によりサブクローニングした。成長中のクローンから得た上清を、数回、ELISA（実施例１２に記載）により特異的抗体について試験した。
【０１２０】
陽性ハイブリドーマ・クローンを、15％ウマ血清を含むDMEM中の組織培養フラスコで生育させ、アンプルを培養物の一部から凍結させた。並行して、異なるハイブリドーマ・クローンの細胞を、２〜４匹のマウスに各々注射して、腹水液を得た。マウス免疫化のために使用される合成ペプチド（ペプチド179、182または183）に結合したBSA（Pierce Cat 77116）と架橋したアフィゲルビーズ（アフィゲル15、バイオラッド（Biorad））を使用するアフィニティー精製により、抗体を、腹水液から精製した。
【０１２１】
抗体精製については、50％硫酸アンモニウムにより沈殿された腹水を、０℃で16時間、PBSで透析した。透析ののち、分取を、０℃で、16時間、１mlアフィゲル−BSA−ペプチドビーズとインキュベーションし、そして予備インキュベーションしたビーズを使用して１mlカラムに充填した。最初に、カラムを、10ml  PBSで洗浄し、続いて、1M  NaClを含む10mM  トリスpH7.5で洗浄し、ついでPBSで洗浄した。抗体を、100mMグリシンHCl（pH2.7）および0.5M  NaClを含む溶液でカラムから溶出させた。１ml分画を、溶出剤の中和のために40μlのトリス基材を含む試験管に収集した。25ml腹水から、約５〜13.6mgの精製抗体を得た。
【０１２２】
［実施例４］
モノクローナル抗体アイソタイプ
市販のアイソタイピングキット（Southern Biotechnology Associates, INC cat 5300−05）を使用し、取扱説明書のアッセイ手段により、モノクローナル抗体のアイソタイプを決定した。Mab183および179は、IgG1と同定され、一方、Mab182は、IgMクラスのものであることが分かった。
【０１２３】
［実施例５］
Mab179、182および183を用いるカスパーゼ−8の免疫沈降
前記実施例３に記載される様々なモノクローナル抗−カスパーゼ−８抗体を、休止および活性化Bjab細胞の溶解物由来のカスパーゼ−８を免疫沈降する能力について試験した（以下、実施例１２参照）。Bjab系は、バーキットリンパ腫のアフリカ人の症例由来の継代リンパ腫細胞系である（Clements  GBら、1975）。
【０１２４】
Bjab細胞を、１時間、Fasリガンドで刺激した。細胞溶解物を、刺激の前後のBjab細胞から調製した。（実施例12に記載されるとおり）Mab179、182および183を用いる免疫沈降ののち、対応のペプチドで溶出された「消耗溶解物（depleted lysate）」およびカスパーゼ−８を、SDS−PAGEおよび銀染色、または１次抗体として抗Sub−1抗体を用いるウエスタンブロット解析（Cell Signaling Technology Caspase-8 ICI2 Cat 9746）により解析した。
【０１２５】
図２は、Mab179、183.1および183.2、ならびに182を用いる免疫沈降の後に得られた全細胞抽出物および「消耗溶解物」のウエスタンブロット解析（以下の実施例１１で記載されるとおりに行なわれる）を示す。
【０１２６】
未刺激細胞（レーン２、４、６、８および１０）において、プロカスパーゼ−８アイソフォームα１およびα２（プロカスパーゼ−８  53／55kDa）に対応するバンド二重線を、全細胞抽出物（レーン２）および抗183および抗182抗体で得られた消耗溶解物（レーン６、８および１０）で検出し、対照に、プロカスパーゼ−８は、Mab179で得られた消耗溶解物では検出されなかった（レーン４）。
【０１２７】
刺激細胞では、全細胞抽出物中のプロカスパーゼ−８のレベルは、より低かった（レーン1）。活性化カスパーゼ−８断片に対応する別のより小さいバンドが、活性化において出現した、すなわち、アイソフォームα１およびα２に対応する部分的にプロセシングを受けたカスパーゼ−８（部分的にプロセシングを受けたカスパーゼ−８  p41／43、Sub−3を欠く）の二重線、およびSub−1に対応するより小さいバンド（p20）。プロカスパーゼ−8の最小量の消耗、およびMabによる活性化カスパーゼ−8断片を、Fasリガンドで刺激された細胞の溶解物で試験した（図２  レーン３、５、７、９および１１）。
【０１２８】
活性化カスパーゼ−８は、Sub−2に結合したSub−1からなるため、Mab182での免疫沈降によるSub−2の除去は、結果的に、Sub−1の消耗至るはずであるので、Sub−2に特異的なMab182によるSub−1の消耗も試験した。
【０１２９】
刺激細胞溶解物からのカスパーゼ−8の免疫沈降によると、正常なマウス血清コントロール（図２  レーン１１）と同様Mab182、183.1および183.2は、少量の残存するプロカスパーゼ−８または活性カスパーゼ−8の断片（それぞれ、レーン９、７、５および11）を除去しないことが示される。これらの結果とは対照的に、Mab179での細胞溶解物の処理（レーン３）は、活性カスパーゼ−８断片だけでなく、全てのポリカスパーゼ−８を有効に除去した。
【０１３０】
図３ａ（ウエスタンブロット解析）および３ｂ（銀染色によるタンパク質検出）は、Mab179、182および183.1および183.2抗体により免疫沈降したプロカスパーゼ−８および活性カスパーゼ−８の断片は、それぞれのペプチド（種々の抗体を生じさせた）との競合により上清中に有効に回収できた（実施例１３）。
【０１３１】
未刺激細胞（図３ａ、レーン２、４、６、８および１０、および図３ｂ、レーン２、３、６、８、および１０）では、プロカスパーゼ−８は、Mab179での免疫沈降、およびペプチド179との競合（図３ａおよび３ｂ、レーン８）により、有効に回収された。刺激細胞では、活性化の後に残存する少量のプロカスパーゼ−８の代わりに、Mab179での免疫沈降により、タンパク質を有効に回収した（図３ａおよびｂ、レーン９）。プロカスパーゼ−８のある種の回収は、Mab183.2による非活性化細胞（図３ａ、レーン６）、およびMab183.1による活性化細胞（図３ａ、レーン５）で観察でき、ここでカスパーゼ−８の活性断片は、Mab182（図３ａ、レーン３）、183.1（図３ｂ、レーン５）および183.2（図３ａ、レーン７  p20のみ）による活性化細胞の溶解物で回収できた。
【０１３２】
得られた結果は、Sub−1のＣ末端に対応するペプチド（179エピトープ）に対して展開されたMab179が、活性化カスパーゼ−８についてと同様に、微量に存在する場合でさえ、プロカスパーゼ−８の免疫沈降および精製について非常に効率的であることを示した。
【０１３３】
同じ179エピトープに特異的なポリクローナル抗体（前記実施例１に記載されるとおりに調製）を作製し、179エピトープが、プロカスパーゼ−８および活性カスパーゼ−８の有効な免疫沈降および精製のために一般に使用できる抗体を誘導する特徴的能力を有するかどうか調べた。エピトープ179に特異的なポリクローナル抗体（レーン５および６、それぞれ、活性化および非活性化細胞について）、エピトープ182に特異的なモノクローナル抗体（レーン７および８、それぞれ、活性化および非活性化細胞について）による免疫沈降で得られた「消耗溶解物」を比較した。図４での結果は、明らかに、実際に刺激細胞溶解物由来のプロカスパーゼ−８およびカスパーゼ−８の断片が、モノクローナル抗182抗体よりも、ポリクローナル抗179抗体によって細胞溶解物から効率的に除去されることを示す。
【０１３４】
並行して、Mab183および183エピトープに特異的なポリクローナル抗体（実施例1に記載）を用いて行なった、休止細胞溶解物由来のプロカスパーゼ−８の免疫沈降および回収を、Mab179により得られたものと比較した。図５より、Mab183およびポリ183によるプロカスパーゼ−８の免疫沈降は、効果がないのに対して、Mab179によるプロカスパーゼ−８の免疫沈降は、極めて優れていることが示される。
【０１３５】
約5.6kDaの別のカスパーゼ−８誘導断片は、Mab179で行なわれた免疫沈降でのみ観察される（レーン３）。大型カスパーゼSub−1のＣ末端に対応するカスパーゼ−８の領域に対して展開された抗体は、カスパーゼに新規態様のプロセシングを課す独特の能力を有する。
【０１３６】
上で観察された結果は、他のエピトープとは異なり、カスパーゼ−８のエピトープ179が、プロカスパーゼ−８および活性化カスパーゼ−８の免疫沈降に非常に有効であり、プロカスパーゼ−８自動プロセシングを誘導できる特異的抗体を誘導する特別な能力を有することを示す。
【０１３７】
［実施例６］
カスパーゼ−８結合ポリペプチド（p72）の単離および同定
カスパーゼ−８を効率的に免疫沈降する能力により、Mab179を活用して、カスパーゼ−８とカスパーゼ−８結合タンパク質を共免疫沈降した。
【０１３８】
Bjab細胞（Steinitz M, Klein G. 1975年）を１時間、Fasリガンドで刺激し、ついで細胞溶解物を、刺激の前後の細胞から調製した。実施例１３に記載されるとおり、免疫沈降および溶出ののち、回収されたタンパク質を、SDS−PAGEにより分離し、銀染色により検出した。マウスIgG1での免疫沈降を、ネガティブコントロールとした。図６での結果は、一見約72.5kDaの分子量のポリペプチド（本明細書では、p72と言う）は、休止細胞からの溶解物中のプロカスパーゼ−８（p53／55）とともに共沈降されるが（レーン３）、刺激細胞からの溶解物中の活性カスパーゼ−８とでは沈降されない（レーン４）ことを示す。
【０１３９】
さらに、p72ポリペプチドは、未刺激HeLa、Raji、H9、K562、HL−60、CEMおよびHut78細胞（ATCC）から調製された溶解物においても、プロカスパーゼ−8とともに共免疫沈降されることが分かった。
【０１４０】
これらの結果は、ポリペプチド、p72が、一般に、プロカスパーゼ−８と結合されるが、活性カスパーゼ−８には結合されないことを示唆する。
【０１４１】
p72に対応するSDS−PAGE中のバンドを切取り、トリプシンで消化し、そして限定配列解析および質量分析解析に供した。トリプシン消化により得られた７つのペプチドを使用して、ヌクレオチド配列（またはEST）から推定されるタンパク質データベースを検索した。該タンパク質配列は、その機能が知られていない、遺伝子バンクに見られるヒトESTクローン（配列番号：１）の推定タンパク質配列の一部に適合した（受諾番号gi／2988397）／gbAAC08052.1／（AC004475）。
【０１４２】
［実施例８］
p72をコードする全長cDNAの作製
p72をコードする全長cDNAを、以下のとおりに作製した：
ESTフォーム（実施例７）を、TIGRヒト遺伝子指数をスクリーニングするために使用し、この配列に適合する全てのESTのコンセンサスを含むTHCレポート（THC510568  配列番号：１）を得た。
【０１４３】
推定ポリペプチドの一部をコードするDNAクローンを、インサイト・ゲノミックス（Incyte Genomics）（IMAGE＃2964545）から購入した。クローンは、最初のメチオニンとそれに続く６個のアミノ酸（すなわち、21個のヌクレオチド）をコードするヌクレオチド配列を欠いていた。マウスおよびヒトのこれらのタンパク質配列は、非常に類似することが分かり（約90％の同一性）、したがって、マウスESTで欠失されていないマウスのタンパク質の最初のメチオニンとそれに続く６個の連続アミノ酸をコードするヌクレオチド配列を、欠損ヒト配列を完成させるために、ヒトゲノムの作業中の仮の配列と比較した。ホモサピエンスの19番染色体、クローンLLNLR−232E12の配列に対応する該当物を得た。このクローンは、p72の欠失している7個のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を確かにした。p72の全長cDNAを２回のPCR（Takara ExTaq, Takara, cat # R001Aを使用）により得た。それは、図８に概略的に表す。
【０１４４】
第１回PCRでは、インサイト・ゲノミックスから得られたクローンを鋳型とし、p72の実存配列とともに、21個の欠失ヌクレオチドのうち15個（下線）を含むように合成されたフォワードプライマー（図８、プライマー２）：ＣＴＣＡＡＧＡＴＧＧＡＣＡＡＣＣＧＧＧＡＴＧＴＴＧＣＡＧＧＡＡＡＧＧおよび終止コドンを有する３’領域の末端を含むリバースプライマー（図８、プライマー３）：ＣＣＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＴＡＧＴＡＡＧＧＣＣＧＴＣＴＧＧＧＡＴＴとともに使用した。
【０１４５】
第２回PCRは、鋳型として第１回PCRのPCR産物、および全21個の欠失ヌクレオチドと５つの実存するヌクレオチドを含むフォワードプライマー（図７、プライマー１）：ＡＡＴＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＧＴＣＴＣＡＡＧＡＴＧＧＡＣＡＡＣＣＧＧＧＡ、および同じリバースプライマー（図７、プライマー３）からなる。p72をコードする全cDNAを回収、配列決定し（配列番号：２）、アミノ酸配列を、ヌクレオチド配列（配列番号：３）から推定した。
【０１４６】
図１３における、全ESTのコンセンサスを含むTHCレポートで得られた配列（THC510568  配列番号：１）と、作製された全長cDNA（配列番号：３）により推定されるポリペプチドとの比較により、ESTにおいて７個の最初のアミノ酸を欠失していること、ESTにおいて25個のアミノ酸配列を欠失していること、およびアミノ酸397の誤り（ロイシンの代わりにプロリン）が見出される。
【０１４７】
p72ポリペプチドは、３つの保存モチーフ（図７）を含むことが見出された：コイルドモチーフであるＣモチーフ、ポリペプチドのＮ末端付近の２つの縦列配置した「SURP」（「SWAP」モチーフとも呼ばれ、図７でＳとして示す）（Denhez FおよびLafyatis R、1994年）、および１つのＣ末端に配置している「Ｇ−パッチ」（図7は、Ｇとして示す）（Aracind LおよびKoonin EV 1999年）。SURPおよびG−パッチモチーフはいずれも、RNA結合に寄与すると考えられることから、p72の標的はRNA分子であり得ると示唆される。
【０１４８】
［実施例９］
カスパーゼ−８によるp72の切断
実施例８に示されるように、p72は、刺激から１時間後に試験されるとき、活性カスパーゼ−８にではなく、プロカスパーゼ−８にのみ結合される。ある種のプロカスパーゼ−８は、刺激から20分後も、まだ検出され得る。p72が、より短い刺激時間で、プロカスパーゼ−８と共沈できるかどうかを決定するために、20分間のみで活性化されたBjab細胞を溶解し、Mab179で免疫沈降した。免疫沈降と溶出ののち、カスパーゼ−８および結合ポリペプチドを、SDS−PAGEにより分離し、ポリペプチドを銀染色により検出させた。おそらくp72に対応する72.5kDaの１つのバンド（図９、レーン３）は、刺激前の細胞からの溶解物において免疫沈降されるが、刺激から20分後に、一見約68kDaの低分子量を示すポリペプチドが検出された（図９、レーン４）。Bjab細胞から免疫沈降される両ポリペプチド72.5および68kDaを、質量分析解析に供した。トリプシン処理後、両ポリペプチドは、１つの明らかな相違以外は同様のペプチドプロファイルを示し、配列FRPNPLNNPR（残基632〜641）の別のペプチドが、72.5kDaのＣ末端に存在するが、68kDaポリペプチドには存在しなかった。
【０１４９】
この結果は、細胞刺激により、約4.5kDaの断片が、おそらく活性化カスパーゼ−８により、p72のＣ末端から除去され、その結果、一見68kDaの分子量を有する小型ポリペプチド（残存しているプロカスパーゼ−８にまだ結合される）が生じることを示唆する。
【０１５０】
このような切断から生じる推定断片が、20分間の刺激ののちインビボで検出されたp72断片と類似の分子量を示すので、p72のＣ末端に配置する残基D600（図８）は、切断のための候補残基である可能性が考えられる。
【０１５１】
示唆されるとおり、p72がカスパーゼ−８の基質であり、D600が切断のための標的残基であるかどうかを試験するために、インビトロ転写−翻訳および放射性アイソトープ標識（Ｓ35）p72（TnTシステム）を、組換え活性カスパーゼ−８の作用に供した。p72 cDNAによるコードされるタンパク質を、TnT T7結合網状赤血球溶解物システムを用いて、35Ｓメチオニンの存在下で、網状赤血球溶解物中で、インビトロで発現させ、組換え活性カスパーゼ−８（混合された大腸菌（イー．コリ（E.coli）で別個に作製された各Sub−ユニット１および２、ならびにインビトロでともに折畳み直されたもの）による切断に供した。簡潔には、p72インビトロ合成35Ｓ標識タンパク質を、細菌で産生された活性カスパーゼ−８の存在または非存在下で、30分間、37℃で、プロテアーゼ緩衝液（25mMヘペス（pH7.5）、0.1％ CHAPS、５mM EDTAおよび２mM DTT）中でインキュベーションした。タンパク質およびそれらの断片をSDS−PAGEで分離し、その結果を、ホスホイメージングにより視覚化した。結果（図１０）は、カスパーゼ−８の非存在下では、全長Cariに対応する72.5バンドのみ（レーン１）が、検出されたことを示す。このバンドは、１時間の活性化カスパーゼ−８の添加のちに消え、68kDaに対応する新たな小断片が出現する（レーン４）。この結果は、基質として使用されるp72 cDNAによりコードされるタンパク質が、カスパーゼ−８により効率的に切断されることを示す。さらに、TnT転写翻訳系を、インビトロの２つの異なるp72変異体を産生するためにも使用した：インビボ実験から、カスパーゼ−８の標的残基であると思われる残基D600をＥに変異されたp72（D600E）、およびD600の下流で残基を欠っている欠失p72（すなわち、発現タンパク質は1〜600残基を示す）。
【０１５２】
前記２つのp72変異体の切断を、活性組換えカスパーゼ−８の存在下（図１０、それぞれ、レーン５および６）、または非存在下（それぞれ、レーン２および３）で試験した。図１０（それぞれ、レーン３および６）に示されるとおり、p72 D600E変異体の同じタンパク質プロファイルが、カスパーゼ−８の存在または非存在下で観察されたことから、カスパーゼ−８は、p72 D600E変異体を切断しないことが示される。p72 １〜600の突然変異体は、野生型p72の切断後に産生される68kDa断片と同時に移動し、カスパーゼ−８の添加によりさらには切断されない（レーン２および５）。これらの結果は、活性化により、カスパーゼ−８は、D600残基でp72を切断することを示す。
【０１５３】
インビトロで行なわれた研究は、p72の切断が、Fasリガンド刺激から５〜20分後（図１１）の範囲内で、細胞で急速に起こることと、切断されたタンパク質（またはむしろ、そのより長い断片）がプロカスパーゼ−８に結合したままであることを示唆する。
【０１５４】
［実施例１０］
カスパーゼ−８免疫反応性血清の検出のためのウエスタンブロット解析
組換え精製Sub−1およびSub−2の混合物を、合成ペプチドで展開された抗体のウエスタンブロット解析のために使用した。簡潔には、12％SDSポリアクリルアミドゲルに、還元条件（40mM DTT）下で100ng／レーンのSub−1およびSub−2の混合物をロードした。1つのレーンに、低分子量マーカー（LMW）をロードした。ゲルで分離されるタンパク質を、電気溶出により、PVDF高結合−P（アマシャム）膜に移した。膜を、16時間、５％低脂肪乳、0.05％ツイーン20を含むPBSでインキュベーションした。膜を、細片に切断し、各細片を、１時間室温でマウス血清（１／2000に希釈）でインキュベーションした。膜細片を、0.05％ツイーン20を含むPBSで洗浄し（３×15分）、1時間、二次抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼに接合したヤギ抗−マウス（１：100000に希釈、Jakson））で室温で１時間インキュベーションした。
【０１５５】
細片を、0.1％のツイーン20を含むPBSで洗浄した（３×15分）。陽性バンドを、高感度化学発光（ECL、アマシャム）により検出した。
【０１５６】
実施例５で行なわれたウエスタンブロットについては、Sub−1に特異的な抗体を使用した（Cell Signaling Technology Caspase-8 ICI2 Cat 9746）。
【０１５７】
［実施例１１］
ハイブリドーマクローンスクリーニングのためのELISA
特異的抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングするための直接的ELISAを、以下のとおり行なった：96穴プレートを、１時間37℃で、または16時間４℃で、結合溶液（0.1M  Na2HPO4、pH９）中の2.5μg／mlの濃度で、50μl／ウェルのBSA−ペプチド（またはコントロールプレートに関してはBSAのみ）で被覆した。続いて、プレートを、３回、PBS−T（0.05％のツイーン20を伴うPBS）で洗浄し、そして37℃で１時間、200μl／ウェルの遮断溶液（PBS中の１％のヘモグロビン）をロードし、そしてPBSで３回洗浄した。50μlのハイブリドーマ培養上清または（PBS−Tを用いた）希釈標準を、ウェル毎にロードし、37℃で１時間、または22℃で4時間インキュベーションした。このインキュベーション期間の後、ウェルを、６回PBS−Tで洗浄した。二次抗体、HRPに接合した抗マウス抗体（Jackson  115−025−100）を、PBS−T中で１：5000に希釈し、37℃で１時間インキュベーションし、PBS−Tで６回洗浄することによって洗い流した。HRPに関する基質を、新たに作製し（2.2mlの0.2M  Na2HPO4、pH9.2、1.4mlの0.2Mクエン酸、pH4.35、6.4ml H2O、10mg ABTSおよび１μl H2O2）、50μl／ウェルをロードし、22℃で彩色するまで（約５〜80分）インキュベーションした。50μl／ウェルに0.2Mクエン酸を添加することによって、発色反応を停止させた。プレートを、405nmで読み取った。
【０１５８】
ポジティブコントロール抗体として、１：1000に希釈した陽性マウス抗血清を使用し、そしてネガティブコントロールは培地とした。
【０１５９】
［実施例１２］
カスパーゼ−８の免疫沈降
各免疫沈降のために、108細胞を使用した。細胞を収集し、40分間０℃で、１％  NP−40溶解緩衝液および完全プロテアーゼインヒビター（Roche Molecular Biochemicalsから得られる完全プロテアーゼインヒビターカクテル錠剤）中でのインキュベーションにより溶解させた。細胞溶解物を、エッペンドルフチューブに等分し、10分間4℃で、1400rpmで遠心分離し、上清を新しいチューブに収集した。タンパク質Ｇ−セファロースに非特異的に結合するタンパク質を除去する意図で、細胞溶解物を予備洗浄工程に供した。予備洗浄のために、細胞溶解物を、PBSで予備洗浄したタンパク質Ｇ−セファロース（Pharmacia）と、マウスIgGとで４℃で２〜３時間予備インキュベーションした。このインキュベーションののち、溶解物を、30秒間1400rpmで、エッぺンドルフチューブ中で遠心分離し、タンパク質Ｇ−セファロースを捨て、予備洗浄した上清を収集した。精製モノクローナル抗体（またはネガティブコントロールについてはマウスIgG1カッパ）とPBS予備洗浄したタンパク質Ｇ−セファロースを混合し、４℃で４〜16時間、予備洗浄した上清とともにインキュベーションした。このインキュベーション期間ののち、「消耗溶解物」と称する未結合材料を、遠心分離（1400rpmで30秒）により収集し、結合材料を溶解緩衝液で６回セファロースビーズを洗浄することにより、および22℃で2時間、免疫化のために使用される0.2％ NP−40溶解緩衝液、プロテアーゼインヒビターおよび400μg／mlのペプチドを含む「溶出溶液」（300μlの溶出溶液／100μlセファロース）とのインキュベーションによって溶出した。チューブを、５分間5,000rpmで回転させ、「カスパーゼ−８溶出液」と称される上清を、新たなチューブに移した。
【０１６０】
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【図面の簡単な説明】
【０１６１】
【図１】プロ−カスパーゼ−８のアミノ酸配列を示す。Mabの調製に使用されるカスパーゼ−８のペプチド配列は、太字でかつ下線を付している。ペプチド−179：カスパーゼ−８の大サブユニット（Sub−1）のＣ末端に対応するペプチドＣＱＧＤＮＹＱＫＧＩＰＶＥＴＤ。ペプチド−182：カスパーゼ−８の小サブユニットのＮ末端に対応するペプチドＬＳＳＰＱＴＲＹＩＰＤＥＡＤ（Sub−2、残基Lys385〜Gly399）。ペプチド−183：Sub−1のＮ末端に対応するペプチドＳＥＳＱＴＬＤＫＶＹＱＭＫＳＫＰＲ（残基Ser217〜Gly234）。
【図２】エピトープ179に対するモノクローナル抗体を用いる、BJAB細胞の溶解物で見出された少量のカスパーゼ−８の有効な免疫沈降を示す。（Fas受容体刺激前（−）、後（＋）に調製された）ＢＪＡＢ細胞溶解物由来のカスパーゼ−８の、様々な抗体による免疫沈降による消耗（depletion）は、左から右へ示される。レーン３および４、Mab179：Sub−1のＣ末端に対応するペプチド（カスパーゼ−８の大サブユニット、Cys360〜Asp374）に対して調製されたモノクローナル抗体。レーン５および６、Mab183.1：およびレーン７および８、Mab183.2：Sub−1のＮ末端に対応するペプチド（Ser217〜Gly234）に対して調製された２つのモノクローナル抗体。レーン９および１０、Mab182：Sub−2（カスパーゼ−８の小サブユニット）のＮ末端に対応するペプチド（Lys385〜Asp399）に対して調製されたモノクローナル抗体。レーン１１、NMS：正常なマウス血清。この図は、指定の抗体による免疫沈降ののちの細胞溶解物中、および未沈降の全細胞溶解物中に残存するカスパーゼ−８の量のウエスタンブロッティング評価を示す（レーン1および２）。
【図３ａ】ペプチド（該ペプチドに対して様々な抗体が作製された）と競合することによって、図２のように免疫沈降されたカスパーゼ−８の溶出を示す。指定の抗体で生成された免疫沈降物からの溶出液中のカスパーゼ−８を、（図２のように）ウエスタンブロット解析で検出する。
【図３ｂ】ペプチド（該ペプチドに対して様々な抗体が作製された）と競合することによって、図２のように免疫沈降されたカスパーゼ−８の溶出を示す。指定の抗体で生成された免疫沈降物からの溶出液中のカスパーゼ−８を、銀染色で検出する。
【図４】Sub−1のＣ末端に対応するペプチド（カスパーゼ−８の大サブユニット、残基Cys360〜Asp374）で免疫することにより調製されたポリクローナル血清を用いる、BJAB細胞の溶解物中に見出された少量のカスパーゼ−８の効果的な免疫沈降を示す。（Fas受容体刺激前（−）、後（＋）に調製された）BJAB細胞溶解物由来のカスパーゼ−８の、様々な抗体による免疫沈降による消耗は、左から右に示される。該溶解物中に残存するカスパーゼ−８は、以下の抗体による免疫沈降法ののちウエスタンブロット解析により検出される。レーン３および４、NMS：正常なマウス血清。レーン５および６、抗179ポリクローナル抗体：Sub−1のＣ末端（カスパーゼ−８の大サブユニット、残基Cys360〜Asp374）に対して調製されたウサギポリクローナル抗体。レーン７および８、Mab182。TL：全細胞溶解物。
【図５】未刺激BJAB細胞の溶解物から、様々な抗体を用いて免疫沈降され、溶出されたカスパーゼ−８を示す。左から右に、以下の抗体を用いて行なった免疫沈降の溶出ののち、ウエスタンブロット解析によって検出されたカスパーゼ−８のレベルを示す。レーン１、Sub−1のＮ末端に対する抗183ポリクローナル血清（残基Ser217〜Gly234）。レーン２、Mab183.2：Sub−1のＮ末端（残基Ser217〜Gly234）に対するモノクローナル抗体。レーン３、Mab179：Sub−1のＣ末端（カスパーゼ−８の大サブユニット、残基Cys360〜Asp374）に対するモノクローナル抗体。Mab179による新規プロセシング様式によって産生された、カスパーゼ−８の小断片（5.6kDa）は、矢印で示される。
【図６】Fasリガンドによる１時間の刺激の前または後のBjab細胞の溶解物からMab179で免疫沈降され、ペプチド179により溶出されたカスパーゼ−８および付随タンパク質（P72/Cari）を示す。Mab179で免疫沈降されたカスパーゼ−８および付随タンパク質は、（図3bのように）溶出され、SDS-PAGEで分離され、ついで銀染色された。レーン１および２は、細胞溶解物がMIgG1（マウス免疫グロブリンIgG1）で免疫沈降されたコントロールを示す。
【図７】P72タンパク質モチーフの略図を示す。コイルドコイルモチーフ（Ｃ）および２つの縦列配置した「SURPモチーフ」（Ｓ）は、タンパク質のＮ末端付近に位置し、１つの「Ｇ−パッチ（G-patch）」モチーフは、タンパク質のＣ末端に位置している（Ｇモチーフ）。Ｇモチーフの内側に存在するアスパラギン酸残基D600も示す。D600：タンパク質中の残基D600がグルタミン酸残基で置換された変異体。
【図８】p72cDNAの全長作成に使用するアプローチの略図を示す。Incyte Genomicsから購入した、（最初の７個のアミノ酸をコードする）最初の21個のヌクレオチドの配列を欠くESTクローンIMAGE29964545は、一対のプライマーとともに最初のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）用の鋳型として使用した（フォワードプライマーP2は、5’ESTクローンとオーバーラップする核酸と、さらに21個欠失しているヌクレオチドのうち15個のヌクレオチドを含む；およびリバースプライマーP3は、3’ESTとオーバーラッピングする配列を含む）。得られたPCR産物は、一対のプライマーとともに第２のPCR用の鋳型として使用した（フォワードプライマーＰ１は、全21個欠失しているヌクレオチドと、ESTの５個の核酸を含む：リバースプライマーP3は、３’ESTとオーバーラッピングする配列を含む）。
【図９】Fasリガンドによる刺激から０時間および20分間後のBjab細胞の溶解物からの、Mab179によるカスパーゼ−８とｐ72の共免疫沈降を示す。Mab179による免疫沈降ののち溶出されたタンパク質は、SDS-PAGEゲルで分離され、銀染色により検出された。p72に対応する、一見約72.5kDaの分子量を有するバンドは、Fasリガンド刺激の前にプロカスパーゼ−８で共沈される（レーン３）。刺激から20分後、72.5kDaのバンドのレベルは減少し、一見約68kDaの低分子量のタンパク質に対応する新しいバンドが検出される（レーン４）。レーン１および２は、MIgG1（マウス免疫グロブリンIgG1）による細胞溶解物の免疫沈降からなるネガティブコントロールを示す。
【図１０】活性カスパーゼ−８によるp72の切断を示す。P72cDNAによってコードされるタンパク質は、TnT T7結合網状赤血球溶解物システムを用いる35Ｓメチオニンの存在下で、網状赤血球の溶解物においてインビトロで発現し、組換え活性カスパーゼ−８の存在または非存在下で１時間37℃でのインキュベーションののち試験した。さらに、p72の切断を、２つの異なるp72cDNA変異体でコードされるTnT産物を用いて研究した（一方は、p72において、カスパーゼ−８の標的残基であると思われる残基D600がＥに変異されたp72［p72（D600）］をコードしているもの：もう一方は、該遺伝子が欠失し、得られた切断ポリペプチドが下流の残基を欠くもの［D600 p72（1-600）］）。得られるタンパク質を、SDS-PAGEで分離し、その結果をホスホイメージング（phoshoimaging）により、視覚化した。
【図１１】Fasリガンドによる刺激の前（０’）、または５、１０、２０、４０および60分後のBjab細胞の溶解物からMab179で共免疫沈降されたカスパーゼ−８およびp72を示す。ペプチドは溶出され、SDS-PAGＥゲルにおいて分離され、銀染色により検出された。一見72.5kDaの分子量のペプチドは、刺激前（０’）に検出される。刺激から５および10分後、一見約68kDaの低分子量を有する新規タンパク質が出現した。刺激から40分後、72.5kDaのバンドが完全に消え、68kDaのみが検出される。60分に、前記タンパク質は、カスパーゼ−８で共沈した。
【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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