(57)【要約】本発明は、アルツハイマー病患者の治療方法に関し、アミロイドβペプチド又はその断片をターゲットとする抗体分子を投与するステップを含んでいる。他の実施形態では、本発明は、アミロイドβ沈着を特徴とする病気又は障害の治療方法に関する。他の実施形態では、本発明は、アミロイドβペプチド又はその断片のＮ末端又はＣ末端に対する、遊離端に対して特異的な抗体分子、及びその抗体分子を含んでいる医薬組成物に関する。他の実施形態では、本発明は、Ｎ末端及び／又はＣ末端が切断されたアミロイドβペプチド断片の遊離Ｃ末端又はＮ末端をターゲットとする抗体分子に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルツハイマー病患者を治療する薬剤を製造するための、アミロイドβペプチド又はその断片をターゲットとする抗体の使用。
【請求項２】
アミロイドβ沈着を特徴とする病気又は障害を有する患者を治療する薬剤を製造するための、アミロイドβペプチド又はその断片をターゲットとする抗体の使用。
【請求項３】
アミロイドβペプチド又はその断片が脳内に蓄積するのを遅らせる又は抑制する又は阻止する薬剤を製造するための、アミロイドβペプチド又はその断片をターゲットとする抗体の使用。
【請求項４】
脳内にアミロイドβペプチド又はその断片による神経毒性を遅らせる又は抑制する又は阻止する薬剤を製造するための、アミロイドβペプチド又はその断片をターゲットとする抗体の使用。
【請求項５】
前記抗体は、前記アミロイドβペプチド又はその断片と直接的に反応することを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項６】
前記抗体は、Ｎ末端が切断されたアミロイドβペプチド断片と直接的に反応することを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項７】
前記抗体は、Ｃ末端が切断されたアミロイドβペプチド断片と直接的に反応することを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項８】
前記抗体は、アミロイド前駆体タンパク質又はその断片と直接的に反応することを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項９】
前記抗体は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、人工抗体、ｓｃＦｖ抗体、Ｆ（ａｂ）、又はそれらの断片であることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項１０】
前記アミロイドβ沈着を特徴とする病気又は障害は、軽度認識障害（ＭＣＩ）、脳アミロイド・アンギオパチー又はコンジオフィリック・アンギオパチー（congiophylic angiopathy）、ダウン症と関連するアルツハイマー病、又は封入体筋炎であることを特徴とする請求項２に記載の抗体の使用。
【請求項１１】
遊離端に対して特異的であり、アミロイドβペプチドの遊離Ｎ末端をターゲットとする抗体。
【請求項１２】
遊離端に対して特異的であり、第１アミノ酸がアスパラギン酸塩であるアミロイドβペプチドの遊離Ｎ末端をターゲットとする抗体。
【請求項１３】
遊離端に対して特異的であり、Ｎ末端及び／又はＣ末端が切断されたアミロイドβペプチド断片の遊離Ｎ末端をターゲットとする抗体。
【請求項１４】
遊離端に対して特異的であり、アミロイドβペプチド：Ａβ１−３９、Ａβ１−４０、Ａβ１−４１、又はＡβ１−４３の遊離Ｃ末端をターゲットとする抗体。
【請求項１５】
遊離端に対して特異的であり、Ｎ末端及び／又はＣ末端が切断されたアミロイドβペプチド断片の遊離Ｃ末端をターゲットとする抗体。
【請求項１６】
遊離端に対して特異的であり、アミロイドβペプチド：Ａβ１−４２の遊離Ｃ末端をターゲットとする一本鎖又は人工抗体。
【請求項１７】
前記抗体は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、人工抗体、ｓｃＦｖ抗体、Ｆ（ａｂ）、又はそれらの断片であることを特徴とする請求項１１から請求項１５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１８】
請求項１１から請求項１６のいずれか一項に記載の抗体と、薬学的に許容されるキャリヤを含んでいることを特徴とする医薬組成物。
【請求項１９】
前記組成物は、皮下に、静脈内に、皮内に、筋肉内に、腹腔内に、脳内に、鼻腔内に、経口で、経皮で、頬側に、動脈内に、頭蓋内に、又は頭部に投与されることを特徴とする請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
アルツハイマー病患者を治療する薬剤を製造するための、請求項１１から請求項１６のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項２１】
アミロイドβ沈着を特徴とする病気又は障害を有する患者を治療する薬剤を製造するための、請求項１１から請求項１６のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項２２】
脳内にアミロイドβペプチド又はその断片が蓄積するのを遅らせる又は抑制する又は阻止する薬剤を製造するための、請求項１１から請求項１６のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項２３】
アミロイドβペプチド又はその断片による神経毒性を遅らせる又は抑制する又は阻止する薬剤を製造するための、請求項１１から請求項１６のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病患者の治療方法に関し、アミロイドβペプチド又はその断片をターゲットとする抗体分子を投与するステップを含んでいる。他の実施形態では、本発明は、アミロイドβ沈着を特徴とする病気又は障害の治療方法に関する。他の実施形態では、本発明は、アミロイドβペプチド又はその断片のＮ末端又はＣ末端に対する、遊離端に対して特異的な抗体分子、及びその抗体分子を含んでいる医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（Alzheimer's Disease: AD）の主な組織病理学的な特徴は、扁桃体、海馬及び新皮質の柔組織における、老人斑（neuritic plaques）及びびまん性老人斑（diffuse plaque）内のアミロイド沈着の存在である（GlermerとWong, 1984; Mastersら, 1985; SisodiaとPrice, 1995）。アミロイドは、一般的なβプリーツ構造（β-pleated structure）を有する線維性会合体の総称である。これらの会合体は、コンゴレッド（Congo red）及び偏光の存在下で複屈折の性質を示す（GlemerとWong, 1984）。びまん性老人斑は、反応及び変性過程と強く関係していると思われる老人斑と比べると、比較的良性であると考えられている（Dicksonら, 1988； Tagliaviniら, 1988； Yamaguchiら, 1989； Yamaguchiら, 1992）。老人斑の主要成分の１つは、とても大きいβアミロイド前駆体タンパク（β-amyloid precursor protein： β-APP（又はAPP）、Kangら, 1987）から生じる、４２アミノ酸残基アミロイドβ（Ａβ）ペプチドである（Millerら, 1993； Roherら, 1993）。Ａβ１−１２が作製される量は、Ａβペプチド１−４０よりもはるかに少ない（Haassら, 1992; Seubertら, 1992）。しかし、ＣＯＯＨ−の延びた形状は、Ａβ１−４０よりもはるかに不溶性であり、会合して逆平行のβプリーツ・シートを形成する傾向がはるかに強いので、Ａβ１−１２は選択的に沈着する（Joachimら, 1989; Halversonら, 1990; Barrowら, 1992; Burdickら, 1992; Fabianら, 1994）。Ａβ１−１２は、Ａβ１−４０の会合をシード（seed）をすることができる（JarrettとLansbury, 1993）。
【０００３】
ＡＰＰ遺伝子の配列は決定されており、第２１染色体にコード化されていると考えられている（Kangら, 1987）。ＡＰＰ遺伝子の発現は、アミノ酸６９５，７５１，及び７７０のいくつかのＡβを含んでいるイソフォームを生成する。その後、Kunitz型セリン・プロテアーゼ・インヒビターと構造上及び機能的相同性を共有する領域を含んでいる２つのＡＰＰ遺伝子を生成する（Kangら, 1987; Kitaguchiら, 1988; Ponteら, 1988; Tanziら, 1988; Konigら, 1992）。神経系でのＡＰＰの機能は、依然として明らかにされていないが、ＡＰＰがニューロンの接着及び成長を仲介する役割を果たしているということが一層明らかになっている（Schubertら, 1989; Saitohら, 1994; Rochら, 1995）。おそらくは、Ｇタンパク質と結合したシグナル変換経路において、その役割を果たしている（Nishimotoら, 1993）。培養細胞では、ＡＰＰは構成的分泌経路を経て十分に成長する（Weidernannら, 1989; Haassら, 1992; Sisodia 1992）。そして、いくつかの細胞表面結合ＡＰＰ（cell-surface-bound APP）は、酵素、指定されたα−セクレターゼ（Eschら, 1990）、及びＡβアミロイド生成を防止する現象により、Ａβ領域内で切断される。いくつかの研究は、２つのさらなるＡＰＰ処理経路（両方ともＡβアミロイド生成性である）について詳細に説明している。第１に、エンドソーマル／リゾソーマルの経路は、ＡＰＰと関連している膜結合型断片の複合体セット（それらのいくつかは、完全なＡβ配列を含んでいる）を生成する（Haassら, 1992; Goldeら, 1992）。第２に、完全には判明していないメカニズムにより、Ａβ１−４０はならし培地に分泌され、インビボで脳脊髄液内に存在する（Haassら, 1992; Seubertら, 1992; Shojiら, 1992; Buscigliaら, 1993）。リゾソーマルの分解がＡβの作製に大きく貢献しているとは、もはや考えられてはいない（SisodiaとPrice, 1995）。ＡβのＮＨ２末端及びＣＯＯＨ末端での切断に関与するタンパク質分解酵素は、それぞれ、β（ＢＡＣＥ）及びγセクレターゼと呼ばれている。最近まで、Ａβは前駆物質の異常な代謝作用により生成されると、一般に考えられていた。しかし最近では、培養液中及びヒト脳脊髄液中の幅広い種類の細胞のならし培地内のＡβにより、Ａβは細胞の正常機能により生成されるということがわかっている。
【０００４】
研究者の主な関心事、及びＡＤ用の薬剤開発に関しての最も重要な目的は、中枢神経系（ＣＮＳ）でのＡβ沈着の量を減らすことである。これらの活性は、Ａβの生成、Ａβの除去、及び不溶性Ａβ微小繊維の形成の防止に影響を与える要因という、いくつかの一般的な領域に分類される。他の治療上の目的は、Ａβ神経毒性によって生じる炎症反応を減らすことである。
【０００５】
もし、神経毒性がＡβのβプリーツ会合体（β−pleated aggregate）と関係していると考えると、治療的なアプローチの１つは、Ａβの会合を抑制又は阻止することである。このアプローチの利点は、Ａβの過剰生成を引き起こす細胞内機構、又はＡβにより細胞内に生じる影響について、詳しく理解する必要がないということである。Ａβに結合する様々な物質は、インビトロでＡβ神経毒性を抑制することができる。例えば、Ａβに結合する染料であるコンゴレッドは、培養ニューロン内でＡβが引き起こす毒性を完全に抑制する（Yanknerら, 1995）。同様に、抗生物質リファンパシン（rifampacin）は、Ａβの会合とその後の神経毒性を防止する（Tomiyamaetら, 1994）。Ａβと直接結合させるプロセス（例えば、キサデシル−Ｎ−ピペリジン塩（ＨＭＰ）ブロマイド；Woodら, 1996）、又はＡβ沈着の生成の一因となるＡβの他の分子との相互作用を防止するプロセスの抑制剤としての他の組成物は開発中である。そのような分子の例としては、ヘパラン硫酸、又はヘパラン硫酸プロテオグリカン,パールカンがある（全てのアミロイド内に確認することができ、アミロイドに引き起こされる炎症の初期段階に関与している）。
【０００６】
ヘパラン硫酸は、Ａβペプチドと相互作用し、特有の第２及び第３のアミロイドの構造的特徴を付与する。最近では、小分子陰イオン界面が、アミロイド生成を防止又は阻止するための反応を妨げることが証明されている（Kisilevsky, 199S）。しかし、これらの組成物がＣＮＳに進入するかどうかは明らかではない。ペプチドは、Ａβとパールカンとの間の相互作用を抑制すると思われるパールカン結合領域の配列に基づいている。そして、Ａβ由来ペプチドの自己重合を抑制する能力は、ＡＤ治療上の処置の開発を導く可能性があるとして、調査されている。インビトロでのこれらの組成物の有効性は、いくつかの理由により控えめになると思われるが、最も顕著なのは、血液脳関門への慢性的な浸透の必要性である。
【０００７】
他のペプチドに基づくアプローチは、Ａβ神経毒性の細胞メカニズムを解明し、それらの細胞ターゲット向けの治療法を開発することである。焦点は、神経細胞の損傷を媒介する遊離基のカルシウム機能障害の制御にある。細胞表面でＡβがＲＡＧＥ（receptor for advanced glycation end-products：後期糖化反応生成物用の受容体）と結合するのを前提としており、それにより細胞傷害性の酸化刺激物を生成することができる反応を引き起こす（Yanら, 1996）。Ａβが細胞表面の結合部位に近づくのを阻止することにより、ＡＤでの細胞損傷の進行を抑制することができるかもしれない。今日まで、Ａβが引き起こす神経毒性を阻止するための特定の薬剤はなかった。
【発明の開示】
【発明の効果】
【０００８】
（発明の概要）
本発明は、アルツハイマー病、又はアミロイドβ沈着を特徴とする他の病気又は障害を有する患者の治療方法に関し、アミロイドβペプチド又はその断片をターゲットとする抗体分子を投与するステップを含んでいる。他の実施形態では、本発明は、アミロイドβペプチドのＮ末端又はＣ末端に対する遊離端に対して特異的な抗体分子、及びその抗体分子を含んでいる医薬組成物に関する。他の実施形態では、本発明は、Ｎ末端及び／又はＣ末端が切断されたアミロイドβペプチド断片の遊離Ｃ末端又はＮ末端をターゲットとする抗体分子、及びその抗体分子を含んでいる医薬組成物に関する。
【０００９】
ある実施形態では、本発明は、アルツハイマー病患者の治療薬を製造するための、アミロイドβペプチド又はその断片をターゲットとする抗体の使用に関する。
【００１０】
ある実施形態では、本発明は、アミロイドβ沈着を特徴とする病気又は障害を有する患者の治療薬を製造するための、アミロイドβペプチド又はその断片をターゲットとする抗体の使用に関する。そのような障害の例としては、軽度認識障害（mild cognitive impairment：MCI）、脳アミロイド・アンギオパチー又はコンジオフィリック・アンギオパチー（congiophylic angiopathy）、ダウン症と関連するアルツハイマー病、及び封入体筋炎がある。
【００１１】
他の実施形態では、本発明は、脳内にアミロイドβペプチド又はその断片が蓄積するのを遅らせる又は抑制する又は阻止する薬剤を製造するための、アミロイドβペプチド又はその断片をターゲットとする抗体の使用に関する。
【００１２】
他の実施形態では、本発明は、アミロイドβペプチド又はその断片による神経毒性を遅らせる又は抑制する又は阻止する薬剤を製造するための、アミロイドβペプチド又はその断片をターゲットとする抗体の使用に関する。
【００１３】
他の実施形態では、本発明は、遊離端に対して特異的であり、アミロイドβペプチドの遊離Ｎ末端をターゲットとする抗体に関する。
【００１４】
他の実施形態では、本発明は、遊離端に対して特異的であり、遊離Ｎ末端の第１アミノ酸がアスパラギン酸塩であるアミロイドβペプチドの遊離Ｎ末端をターゲットとする抗体に関する。
【００１５】
他の実施形態では、本発明は、遊離端に対して特異的であり、Ｎ末端及び／又はＣ末端が切断されたアミロイドβペプチド断片の遊離Ｎ末端をターゲットとする抗体に関する。
【００１６】
他の実施形態では、本発明は、遊離端に対して特異的であり、アミロイドβペプチド：Ａβ１−３９、Ａβ１−４０、Ａβ１−４１、又はＡβ１−４３の遊離Ｃ末端をターゲットとする抗体に関する。
【００１７】
他の実施形態では、本発明は、遊離端に対して特異的であり、Ｎ末端及び／又はＣ末端が切断されたアミロイドβペプチド断片の遊離Ｃ末端をターゲットとする抗体に関する。
【００１８】
他の実施形態では、本発明は、遊離端に対して特異的であり、アミロイドβペプチド：Ａβ１−４２の遊離Ｃ末端をターゲットとする一本鎖抗体に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
ある実施形態では、本発明は、アルツハイマー病患者の治療方法に関し、アミロイドβペプチド又はその断片をターゲットとする抗体を投与するステップを含んでおり、それによってアルツハイマー病患者を治療する。
【００２０】
他の実施形態では、本発明は、アミロイドβ沈着を特徴とする病気又は障害を有する患者の治療方法に関し、アミロイドβペプチド又はその断片をターゲットとする抗体を投与するステップを含んでおり、それによってアミロイドβ沈着を特徴とする病気又は障害を有する患者を治療する。
【００２１】
アミロイドβ沈着を特徴とする他の病気又は障害としては、例えば、軽度認識障害（mild cognitive impairment：MCI）、脳アミロイド・アンギオパチー又はコンジオフィリック・アンギオパチー（congiophylic angiopathy）、ダウン症と関連するアルツハイマー病、及び封入体筋炎がある（ただし、これらに限定されるものではない）。
【００２２】
「アミロイドβ（ベータ）」と「Ａβ」は、ここでは同義である。このようなタンパク質は、一般的に４ｋＤａである。ペプチドアミロイドβの性質に基づいて、アルツハイマー病細胞及び培養細胞から、いくつかの異なるアミノ末端及び異質のカルボキシル末端配列が観察されている（GlemerとWong, 1984, Biochem Biophys Res Commun120: 885-890; loaclimら, 1988, Brain Res 474: 100-111; Prelliら, 1988, J Neurochem 51: 648-651; Moriら, 1992, J Biol Chem 267: 17082-17806; Seubertら, 1992, Nature 359: 325-327; Naslundら, 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91: 8378-8382; Roherら, 1993, Proc Natl Acad Sci USA 90: 10836-10840; Busciglioら, 1993, Proc Natl Acad Sci USA 90: 2092-2096; Haassら, 1992, Nature 359: 322-325）。特に、カルボキシル末端に関しては、アミロイドβペプチドが位置３９、４０、４１、４２、４３、又は４４において見られる。ただし、GlemerとWong, 1984, Biochem Biophys Res Commun120: 885-890にて定義されているように、位置１はアミロイドβ配列のアスパラギン酸塩である。
【００２３】
完全長Ａβペプチドの主要な役割を認識しつつも、本発明は、それらのことだけに限定されるものではない。したがって、主要な治療ターゲットとしての完全長Ａβペプチドの重要性にもかかわらず、本発明は、神経毒性を有する及び/又は線維性沈着を形成する他のアミロイドβペプチドから生成された断片に対する、遊離端に対して特異的な抗体の使用についても想定している。重要なことだが、Ｎ末端及び／又はＣ末端が切断されたアミロイドβペプチドを認識する遊離端に対して特異的な抗体は、前記アミロイドβペプチドに由来するアミロイド前駆体タンパク質と反応しないということである。
【００２４】
「アミロイドβ断片」、「異質のアミロイドβ」、「切断されたアミロイドβ」は、上に定義した完全長のアミロイドβペプチドから生成された断片と同義である。位置１でのＬ−アスパラギン酸に加えて、Ａβペプチドはraceminzed又は異性化されたアスパラギン酸から始めることもできるということが生化学試験で実証されている。突出したＮ末端が切断されたＡβのイソフォームは、位置３での環化されたグルタミン酸塩（ピログルタミン酸塩）残基、位置１１でのピログルタミン酸塩、及び位置１７でのロイシンから始まる（Geddesら, 1999）。これらのイソフォームがアルツハイマー病の病因となるという事実は、次の（１）と（２）の研究により実証されている。（１）Ｎ末端が切断されたフォームは、インビトロで、Ａβ１−４０又はＡβ１−４２よりも、より容易にそして毒性がより強く会合する（Pikeら, 1995）。（２）Ｎ末端が切断されたフォームは、初期のイソフォームの中で、斑から検出される。また、斑形成のための病巣を形成する（Theoら, 1995）。例えば、Ａβ１７−４２（ｐ３ペプチド）は、ＡＤ脳でよく見られるが、老人のＡＤではない脳では見られないかわずかである（Higginsら, 1996）。高分解能の逆相液体クロマトグラフィー及び質量分析法によるＡＤアミロイドの研究により、Ａβｎ−４２（ｎ＝１−１１）及びＡβ３−４０を含んでいる、さらなるＮ末端が切断されたフォームが、常に存在していることが確認されている（Larner 1999）。様々な培養細胞、及び異なるＡＰＰ組織によりトランスフェクトされた細胞系の培地に分泌されたＡβの研究により、位置２、３、４、５、６、９、１１、１６、１７、１８、１９、２０、２４でのＡβが確認されている（Busciglioら, 1993； Haasら, 1992； Haasら, 1994）。“非アミロイド生成性”ｐ３断片（アミロイドβ１７−４２）は、ダウン症小脳プレアミロイドの主要な構成物質である（Lalowski Mら, J Biol Chem 1996 Dec27; 271(52): 33623-3）。この主要フォームの除去、又はその神経毒性を制限することにより、ダウン症と関連するアルツハイマー病の進行を遅らせること、及び影響を受けやすい個人の発症を遅らせることが期待できる。したがって、本発明に係る抗体は、ある実施形態では、アミロイドβペプチドのＮ末端又はＣ末端と直接的に反応し、ある実施形態では、アミロイドβペプチド由来の断片のＮ末端又はＣ末端と直接的に反応する。
【００２５】
「抗体」は、抗原と結合することができる免疫グロブリン・タンパク質を意味する。ここで使用される抗体は、エピトープ抗原又は抗原断片と結合することができる抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ）と同様な、完全抗体を含んでいる。ある実施形態では、本発明に係る抗体は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ｓｃＦｖ抗体、Ｆ（ａｂ）、又はそれらの断片である。
【００２６】
「モノクローナル抗体」は、一本鎖形態と同様の、免疫学的に効果的な断片である。
【００２７】
「ヒト化抗体」は、マウス又は他のヒト以外の抗体の相補性決定領域（complementary-determining regions：CDR）が、ヒト抗体のフレームワークに移植された抗体である。なお、ヒト抗体のフレームワークは、ＣＤＲを除外した完全ヒト抗体である。
【００２８】
「キメラ抗体」は、マウス又はラット抗体の可変領域全体が、ヒトの定常領域と共に発現した抗体である。
【００２９】
「人工抗体」は、米国特許第5,630,978号に記載されている分子捺印技術を使用して作製された抗体である。簡単に説明すると、人工抗体は次のようにしてを作製される。
（ｉ）生物学的活性モノマーの周りで、機能性モノマーを重合する。これは、アミロイドβペプチド又はその断片に対する抗体（テンプレート）となる。（ｉｉ）テンプレート分子を除去する。そして、（ｉｉｉ）テンプレートを除去した空間で、モノマーのセカンドクラスの重合を行い、前記テンプレートと似ている１つ以上の望ましい性質を示す新しい有機分子を作製する。したがって、ある実施形態では、本発明は、アミロイドβペプチド及びその断片を選択的に認識し、抗体として働き、アルツハイマー病及び他のアミロイドβ沈着を特徴とする病気又は障害の治療に使用される分子認識ポリマー（molecularly imprinted polymers：MIP）である人工抗体に関する。
【００３０】
「治療」は、アルツハイマー病又は他のアミロイドβ沈着を特徴とする病気又は障害の、発症を遅らせる又は防止する、進行を遅らせる、又は症状を改善することである。
【００３１】
他の実施形態では、本発明は、アミロイドβペプチド又はその断片が脳内に蓄積するのを遅らせる又は抑制する又は阻止するための方法に関し、アミロイドβペプチド又はその断片をターゲットとする抗体を投与するステップを含んでおり、それによって脳内にアミロイドβペプチド又はその断片が蓄積するのを遅らせる又は抑制する又は阻止する。
【００３２】
他の実施形態では、本発明は、アミロイドβペプチド又はその断片による神経毒性を遅らせる又は抑制する又は阻止するための方法に関し、アミロイドβペプチド又はその断片をターゲットとする抗体を投与するステップを含んでおり、それによってアミロイドβペプチド又はその断片による神経毒性を遅らせる又は抑制する又は阻止する。
【００３３】
したがって、本発明は、選択的な蓄積の抑制、及び／又はアミロイドβ種と関連する細胞毒性を中和する方法としての、アミロイドβペプチドに対する抗体の使用に関する。アルツハイマー病を治療するための端部特異性抗体（end-specific antibodie）の最も効果的なターゲットは、環化されているアミロイドβペプチド（ヒトＣＦＳ，血漿、尿）の大部分を形成するＡβ１−４０、又は毒性がより強いが量がより少ないアミロイド沈着をシードすることができるＡβ１−４２及びＡβ１−４３である。神経炎の斑及び血管のアミロイド沈着は、それらの大量のフォームと、ヒト組織及び遺伝子導入マウスモデルから遺伝子学的及び生化学分析に得た、アミロイドβペプチドの完全長フォームはアルツハイマー病の病因の主役であるというコンセンサスとを含んでいる。
【００３４】
抗体又はその抗体を含む医薬組成物は、その周囲又はそれらの抗体を発現させる抗原を含んでいる医薬組成物に投与される。他の実施形態では、本発明に係る抗体は、頭蓋内（注射）により脳に直接加えられる。
【００３５】
ある実施形態では、本発明に係る抗体は、血液脳関門を通過し、脳内でアミロイドβタンパク質又はその断片と共に複合体を形成する。
【００３６】
ある実施形態では、本発明は、中枢神経系（ＣＮＳ）の治療方法に関し、抗体の周辺投与により状態を調節する。てんかんに対するＩＶ Ｉｇ治療の効用は、Engelen BGら（J. Neurol Neurosurg Psychiatry 1994 Nov 57 Supp 21-5）により評価されている。てんかん患者のＩＶ Ｉｇ治療前後の脳脊髄液ＩｇＧ濃度に関する研究よるこれらの著者の結論では、ＩＶ Ｉｇ調合液の主要成分は血液脳脊髄液（ＣＳＦ）関門を通過し、ＣＳＦ−ＩｇＧの濃度を著しく増加させる。そして、脳に至り、主として作用する。
【００３７】
中枢神経系中でのＩｇＧの存在は、免疫細胞化学により実証されており、タンパク質の分布と血液脳関門との間に、密接な解剖学的関係が示されている。ＩｇＧ及びそのサブクラスに対して単クローン性及び多クローン性の抗体を使用することにより、ＩｇＧは通常のラット脳内で免疫局在性である。
【００３８】
静脈内における免疫グロブリンの通過、及びＣＮＳとの相互作用については、Wursterらによる批評（J. Neurol Neurosurg Psychiatry 1994 Nov 57 Supp21-5）において要約されている。
【００３９】
ある実施形態では、本発明に係る抗体は、何らかの方法又はキャリアを使用して、血液脳関門（blood brain barrier: BBB）を通って脳細胞に進入する。詳細については後述する。
【００４０】
抗体の溶解度を高めるために組成物に付け加えられる好ましい化合物は、シクロデキストリン派生物であり、より好ましくヒドロキシプロピル・ガンマ・シクロデキストリンである。ペプチドを中枢神経系へ送達するためのシクロデキストリン派生物を含んでいる薬物送達賦形剤については、Bodor, N.ら（1992, Science 257: 1698-1700）により説明されている。
【００４１】
したがって、本発明に係る抗体とシクロデキストリン派生物との併用は、モジュレータを単体で使用するのよりも、神経毒性を大いに抑制することができる。シクロデキストリンの化学修飾は、当業者に周知である（Hanessian, S.ら, 1995, J. Org. Chem. 60: 4786-4797）。本発明に係るモジュレータを含んでいる医薬組成物への添加物として使用するのに加えて、シクロデキストリン派生物は修飾基として有用であり、本発明に係るモジュレータ化合物を形成すべく、遊離端に対して特異的なβアミロイド抗体と共有結合する。
【００４２】
Lowらによる米国特許第5,108,921号では、受容体を介した飲食作用による、分子（例えば、タンパク質や核酸）の膜貫通型送達（transmembrane delivery）の有効な方法について述べている。これらの受容体システムとしては、それらを認識する、ガラクトース、マンノース、マンノース−６−リン酸、トランスフェリン、アシアログリコプロテイン、トランスコバラミン、ビタミンＢ１２、α−２マクログロブリン、インスリン、及び他のペプチド増殖因子（例えば、上皮細胞増殖因子。epidermal growth factor： EGF）がある。また、Lowらは、栄養因子受容体（例えば、ビオチン及び葉酸に対する受容体）は、ほとんどの細胞における膜表面でのビオチン及び葉酸の位置及び非常に多数の存在、及び関連する受容体を介した膜透過輸送プロセスにより、細胞膜を通過する輸送を増進するのに有用であると述べている。したがって、細胞質に導入される化合物及びリガンド（例えば、ビオチン及び葉酸）間に形成された複合体は、受容体を介した膜透過輸送機構を開始し、望ましい化合物を細胞内に進入させるべく、ビオチン又は葉酸受容体の方向の細胞膜と接触する。
【００４３】
ビオチン・リガンドは、例えば、末端デオキシヌクレオチド転移酵素を使用して、市販のビオチン化デオキシヌクレオチド３リン酸（例えば、Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA.製のビオチン−１４−ＭＴＰ又はビオチン−１４−ｄＣＴＰ）と組み合わせることより、ＤＭ細胞に付着することができる（Karger, B. D. , 1989）。ビオチン−１４−ｄＭＴＰは、１４−原子リンカーにより、プリン塩基の６位置にビオチンを付着させたＭＴＰ類似物である。また、ビオチン−１４−ｄＣＴＰは、１４−原子リンカーにより、ピリミジン塩基のＮ４位置にビオチンを付着させたｄＣＴＰ類似物である。
【００４４】
ある実施形態では、本発明に係る抗体は、科学文献及び特許文献によく載っているリポソームにより送達することができる。
【００４５】
ＢＢＢ、ペプチド性、又はペプチド模倣性のモジュレータを通過する輸送を増進するための他のアプローチは、第２ペプチド又はタンパク質と共役させてキメラタンパク質を形成することである。第２ペプチド又はタンパク質は、吸収を介して又は受容体を介して、ＢＢＢを通って経細胞輸送される。したがって、モジュレータをこの第２ペプチド又はタンパク質と結合させることにより、キメラタンパク質はＢＢＢを通過して輸送される。第２ペプチド又はタンパク質は、脳毛細血管内皮細胞受容体のリガンドと成り得る。例えば、好ましいリガンドは、脳毛細血管内皮細胞上で、トランスフェリン受容体と特異的に結合するモノクローナル抗体である（Fridenらによる、米国特許第5,182,107号、米国特許第5,154,924号、ＰＣＴ公報WO 93/10819、ＰＣＴ公報WO 95/02421を参照されたい）。ＢＢＢを通過する輸送を仲介する他の適したペプチド又はタンパク質としては、ヒストンがある（PardridgeとSchimmelによる、米国特許第4,902,505号を参照のこと）。また、ビオチン、葉酸、ナイアシン、パントテン酸、リボフラビン、チアミン、プリリドオキサル（pryridoxal）、及びアスコルビン酸などのリガンドがある（Heinsteinによる、米国特許第5,416,016号、及び米国特許第5,108,991号を参照のこと）。また、ＢＢＢを通過してグリコペプチド（［Ｍｅｔ５］エンケファリンのＬ−セリニル−β−Ｄ−グルコシド）を輸送するブドウ糖輸送担体ＧＬＵＴ−１が知られている（Polt, R.ら, 1994, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:7114-1778を参照のこと）。また、モジュレータがＧＬＵＴ−１ブドウ糖輸送担体をターゲットにするために、モジュレータ化合物はそのようなグリコペプチドと化合することができる。例えば、そのアミノ末端が修飾基Ａｉｃ（３−（Ｏ−アミノエチル−イソ）−コリル、遊離アミノ基を有するコール酸の派生物）により修飾されたモジュレータ化合物は、標準的な手法によりアミノ基を介してグリコペプチドと結合することができる。キメラタンパクは、遺伝子組み換え手法（例えば、融合タンパク質をコード化しているキメラ遺伝子の形成により）、又はモジュレータの第２ペプチド又はタンパク質への化学的架橋により形成することができる。数多くの化学的架橋作用物が知られている（例えば、Pierce. Rockford III.から市販されている）。架橋作用物は、モジュレータの第２ペプチド又はタンパク質への結合を大量にもたらし、その後、生物活性モジュレータを放出すべくリンカーの分裂をもたらすものが選ばれる。例えば、ビオチン−アビジンに基づいたリンカーシステムを使用することができる。
【００４６】
さらに、ＢＢＢを通過する輸送を強める他の実施形態では、モジュレータは、ＢＢＢを通過する輸送を仲介するキャリア・ベクター内でカプセル化されている。例えば、モジュレータは、正電気を帯びた単層リポソームのようなリポソーム内でカプセル化されている（Fadenによる、ＰＣＴ公報WO 88/07851及びＰＣＴ公報WO 88/07852を参照されたい）。又は、高分子ミクロスフィア内でカプセル化されている（Khanらによる米国特許第5,413,797号、Mathiowitzらによる米国特許第5,271,961号、及びGombotzらによる米国特許第5,019, 400号を参照されたい）。さらに、キャリア・ベクターは、ＢＢＢを通過する輸送を目的として、修飾することができる。例えば、キャリア・ベクター（例えば、リポソーム）は、積極的にＢＢＢを通過して輸送する細胞と、共有結合的に修飾されることができる。又は、トランスフェリン受容体と特異的に結合するモノクローナル抗体のような脳内皮細胞受容体のリガンドと、共有結合的に修飾されることができる（CollinsらによるＰＣＴ公報WO 91/04014、及びGreigらによるＰＣＴ公報WO 94/02178を参照されたい）。
【００４７】
本発明に係る抗体は、抗体が唯一の活性化合物である医薬組成物、又はさらなる活性化合物を含むことのできる医薬組成物内に作製することもできる。例えば、２つ以上の抗体化合物を組み合わせて使用することができる。さらに、本発明に係る抗体は、１つ以上の他の抗アミロイド生成性を有する物質と併用することもできる。例えば、抗体は、非特異性のコリンエステラーゼ抑制タクリン（COGNEX.RTM., Parke-Davis）と併用することができる。
【００４８】
また、時折開発される他の方法も用いることができる。
【００４９】
特異性抗体分子は、一旦脳に導入されると、細胞外空間、間質液、及び脳脊髄液に移送される。この特異性抗体分子は、その後、Ａβペプチドと可溶性複合体を形成する。ある実施形態では、こられの可溶性特異性Ａβペプチド抗体複合体は、アミロイド斑へのＡβペプチドの沈着を減少させる。そして、細胞外空間、間質液、及び脳脊髄液から一般の血液循環に排出して、中枢神経系からＡβペプチドを除去することにより（プロテアーゼ消化により除去される）、Ａβペプチドが引き起こす神経毒性を減衰させる。したがって、アミロイド沈着及びＡβペプチドが引き起こす神経毒性の原因である新しく分泌された可溶性Ａβペプチドの蓄積を抑制することができ、Ａβペプチド引き起こす。
【００５０】
さらに、本発明による可溶性アミロイドβペプチドの除去は、例えば、アミロイドβが引き起こす補体活性化及びサイトカイン放出の抑制、及びＡβの細胞表面受容体（例えば、ＲＡＧＥ受容体）との相互作用を阻止により、アルツハイマー病に見られる炎症過程を減少させることが期待される。
【００５１】
他の実施形態では、本発明に係る抗体を、一旦アミロイドβペプチドと結合させると、細胞性免疫反応を引き出すことができる（例えば、Ｆｃ受容体の活性化により）。Ｆｃ受容体は、抗体（抗原と結合する）と遊離抗体を区別することができる。その結果、Ｆｃ受容体は、通常は、アミロイドβペプチドを標的として取り込むために、標的抗原を識別することができない補助細胞となることができる。この場合は、抗体と抗原間の関係に対する化学量論的な要求は除かれる。結果として、沈着したアミロイドβペプチドを除去するために、遊離端に対する特異性が弱い抗体は、ＢＢＢへ進入することが要求される。
【００５２】
他の実施形態では、本発明に係る抗体を加えることにより、ＡβとＡＰＯＥ４遺伝子産物との相互作用を減少させることができる。
【００５３】
ある実施形態では、抗体及びその抗体を含んでいる医薬組成物は、周辺のＡβペプチドがＣＮＳに進入するのを阻止する。その結果、脳内でのアミロイド斑の蓄積を減少させることができる。
【００５４】
他の実施形態では、本発明に係る医薬組成物及び抗体は、末梢効果を有することにより、アルツハイマー病の発症を遅らせ、進行を抑制する。周辺からのアミロイドβの除去は、血中での（結果として脳内での）アミロイドβの平衡を変化させる。最近の研究では、アミロイドβは、脳脊髄液から血漿へ運ばれることが分かっている。脳からの排出半減期は、約半時間である。したがって、抗体は、血漿内のアミロイドβレベルに影響を与え、血漿内に主要なアミロイドβの蓄積を引き起こし、結果として脳内のアミロイドβ沈着を減少させる。
【００５５】
ある実施形態では、本発明は、アミロイドβペプチド及び／又はその断片のＮ末端又はＣ末端の遊離端に対して特異的であり、アミロイドβペプチドとアミロイド前駆体タンパク質とを区別することができる抗体分子を提供する。「遊離端に対して特異的」というのは、細胞が、細胞外空間、間質液、及び脳脊髄液におけるアミロイドβペプチドの蓄積を遅らせる又は防止する、及びアミロイドβペプチドと他の細胞（Ａβの神経毒性の原因となる細胞）との相互作用を妨げるべく、アミロイドβペプチド又はその断片の遊離端と特異的に結合することを意味する。
【００５６】
アミロイドβペプチド及び／又はその断片のＮ末端又はＣ末端に対する遊離端に対して特異的な抗体分子を検出する方法、即ち、「スパンニング・ペプチドＥＬＩＳＡ検出方法」は次のようにして行われる（ただし、これに限定されるものではない）。アミロイドβペプチドのＮ末端領域の配列（例えば、ペプチドA又はAsp-Ala-Glu-Phe-Argの残基１−５、図４参照）と結合する、及びアミロイド前駆体タンパク質の配列と対応しているスパンニング・ペプチドＣのアミノ酸の同一配列と結合する抗体は、スクリーンから除去される。この検出方法では、(NH2)Asp-Ala-Glu-Phe-Argと遊離Ｎ末端を結合し（例えば、７量体ペプチド又は完全長Ａβ１−４０）、スパンニング・ペプチドとは結合しない抗体だけが選択される。これらの選択された抗体は、「遊離Ｎ末端特異性」と称される。それは、そのエピトープ結合は、特定のアミロイドβペプチドのＮ末端アミノ酸残基の認識要素に加えて、遊離アミノ基に対する高親和性認識要素を組み込んでいるからである。Ｃ末端特異性抗体を選択するための似たような検出方法としては、ＡＰＰの切断部位のＣ末端両側のアミノ酸の連続的配列と対応するスペアリング・ペプチド（sparing peptide）を使用した方法がある。この極めて敏感な末端特異性抗体は、膜貫通型の受容体同様のＡＰＰ分子（いくつかの重要な生理的な役割と関わりのある）の通常の生物学的機能に対して影響を与えないことが必須である（例えば、付着、成長促進効果、神経防護作用、シナプス小胞の再生利用、セリン・プロテアーゼのアポトーシス抑制の調整、受容体及び情報伝達機能、カルシウム代謝、及び核酸転写などにおける仲介）。したがって、ある実施形態では、本発明は、遊離端特異性抗体を、アミロイドβペプチドの蓄積の抑制、アミロイド沈着の影響による神経毒性の改善又は防止、アルツハイマー病又は他のアミロイドβ沈着を特徴とする病気の進行を遅らせる、又はそれらの発病を遅らせるのに利用する。
【００５７】
他の実施形態では、本発明は、遊離端に対して特異的であり、アミロイドβペプチドの遊離Ｎ末端をターゲットとする抗体に関する。他の実施形態では、本発明は、遊離端に対して特異的であり、遊離Ｎ末端の第１アミノ酸がアスパラギン酸塩であるアミロイドβペプチドの遊離Ｎ末端をターゲットとする抗体に関する。
【００５８】
他の実施形態では、本発明は、遊離端に対して特異的であり、Ｎ末端及び／又はＣ末端が切断されたアミロイドβペプチド断片の遊離Ｎ末端をターゲットとする抗体に関する。
【００５９】
ある実施形態では、遊離端に対して特異的な抗体は、アミノ（ＮＨ２）基に加えて、Ｎ末端が切断されたアミロイドβペプチドのアミノ酸１−３に対して特異的である。ある実施形態では、遊離端に対して特異的な抗体は、アミノ（ＮＨ２）基に加えて、Ｎ末端が切断されたアミロイドβペプチドのアミノ酸１−４に対して特異的である。ある実施形態では、遊離端に対して特異的な抗体は、アミノ（ＮＨ２）基に加えて、Ｎ末端が切断されたアミロイドβペプチドのアミノ酸１−５に対して特異的である。ある実施形態では、遊離端に対して特異的な抗体は、アミノ（ＮＨ２）基に加えて、Ｎ末端が切断されたアミロイドβペプチドのアミノ酸１−６に対して特異的である。ある実施形態では、遊離端に対して特異的な抗体は、アミノ（ＮＨ２）基に加えて、Ｎ末端が切断されたアミロイドβペプチドのアミノ酸１−７に対して特異的である。ある実施形態では、遊離端に対して特異的な抗体は、アミノ（ＮＨ２）基に加えて、Ｎ末端が切断されたアミロイドβペプチドのアミノ酸１−８に対して特異的である。
【００６０】
後述する実施例で示すように、スパンニング・ペプチドＥＬＩＳＡ検出方法は、アルツハイマー病の病因として有力であることが分かっているＮ末端が切断されたアミロイドβペプチド種の内のいずれか１つの遊離Ｎ末端に適用される（Masters CLら, 1985、Haassら, 1993、Miller DLら, 1993、Vigo-PelfreyCら, 1993、Naslundら, 1994、Theo TCら, 1995）。ある実施形態では、例えば、遊離端特異性抗体を製作するための免疫原の例として、位置１（Ａｓｐ）から始まるアミロイドβペプチドのＮ末端のアミノ酸配列と対応する、SEQ ID NO: 2(Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-Cys)及びSEQ ID NO: 3(Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Cys)のような短いペプチドの使用に関する。これらの免疫原を使用する場合は、ある実施形態では、スパンニング・ペプチドＥＬＩＳＡ検出方法では、スパンニング・ペプチド（SEQ ID NO: 7 Glu-Ile-Ser-Glu-Vai-Lys-Met-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His）の反応性の欠如をテストする。同様に、Ｎ末端末端が切断されたアミロイドβペプチド種（例えば、Ａβ１１−４０／４２）に対応する配列の免疫付与又は選択は（続いて適切なスパンニング・ペプチドのスクリーニングが行われる）、本発明で採用される。それらの配列の例としては、完全長Ａβペプチドの残基１１−１５と対応するSEQ ID NO: 9 Glu-Val-His-His-Gin-Cys（結合目的の付加的なシステイン残基と共に、免疫ペプチドの例である）や、SEQ ID NO: 10 Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gin（遊離端特異性抗体を単離するためのスパンニング・ペプチドＥＬＩＳＡ検出方法に使用されるスパンニング・ペプチドの例である）がある。
【００６１】
他の実施形態では、本発明は、遊離端に対して特異的であり、アミロイドβペプチド：Ａβ１−３９、Ａβ１−４０、Ａβ１−４１、又はＡβ１−４３のＣ末端をターゲットとする抗体に関する。
【００６２】
他の実施形態では、本発明は、遊離端に対して特異的であり、アミロイドβペプチドＡβ１−４２の遊離Ｃ末端をターゲットとする単鎖抗体に関する。他の実施形態では、アミロイドβペプチドＡβ１−４０の遊離Ｃ末端に対して特異的であり、アミロイドβペプチドがタンパク分解性に生成されたアミロイドβ前駆体タンパク質と反応しない抗体が提供される。
【００６３】
他の実施形態では、アミロイドβペプチドＡβ１−１３の遊離Ｃ末端に対する、遊離端に対して特異的であり、アミロイドβペプチドがタンパク分解性に生成されたアミロイドβ前駆体タンパク質と反応しない抗体が提供される。
【００６４】
他の実施形態では、本発明は、遊離端に対して特異的であり、Ｎ末端及び／又はＣ末端が切断されたアミロイドβペプチド断片の遊離Ｃ末端をターゲットとする抗体に関する。したがって、本発明は、Ａβｘ−４２／３と呼ばれる全長型が微小繊維として会合する傾向が強く、たくさんのＡβ１−４０の会合をもたらすことができるＣ末端の異質性に対応する。例えば、本発明は、Ａβｘ−３９、Ａβｘ−４０、Ａβｘ−４１、Ａβｘ−４２、及びＡβｘ−４３フォームの各Ｃ末端に対する遊離端特異性抗体を治療的に使用することを想定している（ただし、これに限定されるものではない）。例えば、ある実施形態では、Ａβ４２は、次の配列を有している。
【００６５】
H2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-LeuVal-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-ValGly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-OH。
【００６６】
Ａβ４１、Ａβ４０、及びＡβ３９は、それぞれＣ端末側終端からAla、Ala-Ile、及びAla-Ile-Valが欠落しているという点でＡβ４２と異なる。Ａβ４３は、Ｃ端末にトレオニンが存在しているという点でＡβ４２と異なる。
【００６７】
例えば、ある実施形態では、アミロイドβペプチドのＣ末端の短い領域に対応する抗原性配列としては、SEQ ID No: 4 Cys-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val（Ａβｘ−４０）と、SEQ ID No: 11 Cys-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-Thl（Ａβｘ−４３）がある。スパンニング・ペプチドＥＬＩＳＡ検出方法において、Ｃ末端に対する遊離端特異性抗体を検出するのに使用されるスパンニング・ペプチドは、Ａβ４０とＡβ４３に対して、それぞれSEQ ID NO: 12 (Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val)と、SEQ ID NO: 13 (Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-Thr)である。Ａβ４２種をターゲットとするために、類似ペプチドを設計することもできる。したがって、これに限定されるものではないが、例えば、アミロイドβ１−４０を使用する代表的なものでは、ある実施形態では、遊離端特異性抗体は、遊離カルボキシル基（ＣＯＯＨ）に加えて、Ｃ末端が切断されたアミロイドβペプチドのアミノ酸３３−４０をターゲットとする。また、ある実施形態では、遊離端特異性抗体は、遊離カルボキシル基（ＣＯＯＨ）に加えて、Ｃ末端が切断されたアミロイドβペプチドのアミノ酸３４−４０をターゲットとする。また、ある実施形態では、遊離端特異性抗体は、遊離カルボキシル基（ＣＯＯＨ）に加えて、Ｃ末端が切断されたアミロイドβペプチドのアミノ酸３６−４０に対応する。また、ある実施形態では、遊離端特異性抗体は、遊離カルボキシル基（ＣＯＯＨ）に加えて、Ｃ末端が切断されたアミロイドβペプチドのアミノ酸３７−４０に対応する。アミロイドβペプチド１−４０は、代表例であるということに注意されたい。それと同じ断片をアミロイドβペプチド１−３９、１−４１、及び１−４３から生成することができる。
【００６８】
図１に示すように（Schehr, 1994を参照されたい）、また背景技術の欄で説明したように、アミロイド前駆体タンパク質（amyloid protein precursor： APP）は、タンパク質分解生成物の前駆体、溶解性アミロイド前駆体タンパク質（soluble-amyloid protein precursor： APP）として作用すると考えられており、発育促進機能及び神経防護作用機能を有していると考えられている。遊離端特異性分子の導入／投与が、Ａβペプチドの形成に使用されないＡＰＰ又はｓＡＰＰの正常な生物学的機能を妨げるものではないということは、当業者にとって容易に理解できることである。
【００６９】
また、本発明によれば、遊離端特異性分子としての単鎖抗体を作製することができる。このような単鎖抗体としては、遊離端特異性Ａβペプチド結合能力を有し、免疫グロブリン軽鎖又は重鎖（ＶＨ−ＶＬ、又は単鎖Ｆｖに連結する）の可変領域と相同又は類似の一組のアミノ酸配列から成る単鎖合成ポリペプチドがある。ＶＨとＶＬの両方は、天然抗体配列を複写する。又は、一方又は両方の鎖は米国特許第5,091,513号に記載されている種類のＣＤＲ構造を含んでいる。軽鎖又は重鎖の可変領域に対する分離ポリペプチド類似体は、ペプチド・リンカーによりつなぎ合わせられている。そのような単鎖抗体（例えば、単鎖Ｆｖ。single chain Fv： scFv）、特に、ＶＨとＶＬ鎖のポリペプチド構造をコード化しているＤＮＡを特徴とする又は配列分析によりすぐに確認することができる単鎖抗体の製作方法としては、次のようなものがある。例えば、米国特許第4,946,778号、米国特許第5,091,513号，米国特許第5,096,815号、Bioccaら，1993、Duanら，1994、Mhashilkarら,1995、Marascoら,1993、及びRichardsonら,1995に記載されているもの。図３Ａ〜３Ｄ（Bioccaら,1995より）は、無傷の抗体（図３Ａ）、Ｆａｂ断片（図３Ｂ）、非共有結合可変領域複合体Ｖ,−Ｖから成るＦｖ断片（図３Ｃ）、及び単鎖Ｆｖ抗体（図３Ｄ）を図式的に示している。
【００７０】
動物の免疫付与に使用される免疫原性ペプチドの設計、ハイブリドーマを作製する抗体の生成は、インビトロで使用されるＡβ種の遊離端を認識する多クローン性の抗体を生成するのにいくつかの研究室で以前に使用された類似したペプチドに基づいて行われる（Harringtonら,1993、Iwatsuboら,1994、Konigら,1996、Murphyら,1994、Gravinaら,1995）。ある症例では、全長の長いペプチドは、Ａβ端部特異性抗体を生成するのに、うまく使用される。Theoとその同僚は（1993;1994）、全ての既知のペプチドに対する５つのアミノ酸の長さが、Ｎ末端で特異的な遊離アミノ基が新しい抗体により認識されるエピトープの主要部分を構成することを確実にするということを立証した。したがって、免疫原性ペプチドに対して生成された抗体は、Ａβペプチドの遊離Ｎ末端又はＣ末端の認識についての抗体の選択性が評価される。βＡＰＰの細胞外範囲のＡβの異なる領域及びβ−セクレターゼ切断部位の直接先行領域に対応するペプチドへの、酵素結合免疫吸着検定法（Enzyme-Linked immunoadsorbent Assay： ELISA）又は免疫沈降を使用した競合的抑制検定は、抗体の選択性を測定することができる。
【００７１】
キャリアタンパク質との結合を容易にするために、上記した免疫原性ペプチドの端部（アミロイドβペプチドの遊離Ｎ末端又は遊離Ｃ末端に対応する端部の反対側）に、システイン残基を追加することができるということは、当業者に周知である。キーホール・リンペット・ヘモシニアン（ＫＬＨ）、オボアルブミン、及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）は、免疫原のキャリアとして使用することのできるタンパク質の一例である（ただし、これらに限定されるものではない）。合成免疫原ペプチドにおけるＮ末端又はＣ末端のシステイン残基の存在は、マレイミド活性化タンパク質と共有結合するための遊離スルフヒドリル基を提供する。ヘテロ二価性試薬（例えば、Ｎ-マレイミド-６-アミノカプロイル・エスエル、又はｍ−ベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミド・エスエル（ＭＢＳ））は、免疫原性ペプチドをキャリアタンパク質と共有結合させるために使用される（例えば、Hartlow, Eら, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. 1988を参照されたい）。また、ペプチド抗原をマレイミド活性化キャリアタンパク質に共有結合させるのに使用される市販キットは、すぐに入手することができる。
【００７２】
本発明は、アミロイドβペプチド又はその断片のＮ末端又はＣ末端に対して遊離端特異性であり、アミロイドβペプチドとタンパク分解的に生成されたアミロイド前駆体タンパク質とを区別するモノクローナル抗体又は単鎖抗体を産出するハイブリドーマ細胞をさらに提供する。本発明に係るモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマは、KohlerとMilstein, Nature, 256, p.495 (1975)に記載されている一般的な方法に従って作製される。その方法では、ハイブリドーマは、体細胞交雑方法を用いて、抗体産生細胞（通常は、予め抗原源としてアミロイドβにより免疫されたマウスの脾臓細胞）を、不死化癌細胞株由来細胞へ融合させることにより作製される。
【００７３】
抗体を生成するためには、様々なホスト（ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト化マウス、ヒトなど）が、免疫原性を有する関連するエピトープ又はその断片又はオリゴペプチドと共に、注射により免疫される。ホストの種類に応じて、免疫反応を高めるために、様々な補助物質が使用される。そのような補助物質としては、フロイント（Freund's）、ゲル状鉱物（例えば、水酸化アルミニウム）、及び界面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニック・ポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、ＫＬＨ、及びジニトロフェノール）がある（ただし、それらに限定されるものではない）。
【００７４】
融合プロセスによる作製されたハイブリドーマは、成長することができる。その後、結果として生じた上清は、上清に存在する特定の抗原と結合することができる抗体を検出するために、免疫学的検定方法を用いてスクリーニングされる。
【００７５】
他の実施形態では、モノクローナル抗体の作製に、コンビナトリアル抗体ライブラリー技術（例えば、Ｍ１３線状ファージの表面に発現した抗体ライブラリーからの抗原に基づいた選択）を使用することができる。前記ライブラリー技術はハイブリドーマの方法と比べて多くの利点を有している（Huseら,1989、Barbasら,1991、Clacksonら,1991、Burton とBarbas,1994）。また、本発明に係る抗体は、ファージ抗体ライブラリー技術により作製することもできる。ファージ提示法技術を使用した、大きな組み合わせライブラリーの作製に関係がある一般的な方法は、米国特許第5,223,409号（1993/1/29に取得）に記載されている。
【００７６】
モノクローナル抗体が生成されるとすぐに、選択性と結合親和力（Ｋｄ）はＥＬＩＳＡで評価することができる。そして、Ａβが引き起こす細胞毒性の阻止についてのＡβ遊離端特異性抗体の効果をテストするために、抗体に対してインビトロでのバイオアッセイを行うことができる。インビトロでのバイオアッセイは、アミロイド前駆体タンパク質ＡＰＰの機能の障害の欠如をテストするためにも行うことができる。他の実施形態では、抗原（アミロイドβペプチド又はその断片）を投与することにより、抗体はインビボで作製することができる。
【００７７】
抗体のタイター（titer）は、当業者に周知の技術により測定される。また、必要に応じて、さらなる抗原が投与される。
【００７８】
他の実施形態では、上述した抗体を含んでいる医薬組成物と、神経細胞の細胞外液内でのアミロイドβペプチドの蓄積の抑制するための前記医薬組成物の使用方法を提供する。アミロイドβペプチドの蓄積を減少させることにより、アルツハイマー病又は他のアミロイドβ沈着を特徴とする病気の進行をさらに遅らせることができる。
【００７９】
ある実施形態では、前記医薬組成物は、治療的又は予防的に効果的な量で、天然のβアミロイドペプチドの神経毒性を抑制するのに十分である抗体、及び薬学的に許容されるキャリアを含んでいる。「治療的に効果的な量」とは、望ましい治療結果を得るための、効果的な用量、及び必要な間に効果的な量である。なお、望ましい治療結果とは、例えば、アルツハイマー病の進行の抑制、発病の遅延、アミロイドβ沈着の減少又は反転（reversal）、及び／又はＡβの神経毒性の減少又は反転である。本発明に係る抗体の治療的に効果的な量は、例えば、各自の病状、年齢、性別、及び体重、望ましい反応を引き出すためのモジュレータの能力などの要因によって変わる。用量は、最適な治療反応を提供するために、調整する必要がある。また、治療的に効果的な量は、治療的に有益な効果がモジュレータの有毒な又は有害な影響を上回るような量である。
【００８０】
「予防的に効果的な量」とは、望ましい予防結果を得るための、効果的な用量、及び必要な間に効果的な量である。なお、望ましい予防結果とは、例えば、アミロイドβ沈着する傾向のある患者における、アミロイドβ沈着及び／又はアミロイドβの神経毒性の割合の防止又は抑制である。予防線量は、治療的に効果的な量において前述したようにして決定される。一般に、予防的投与は、患者に病気より前に又は初期の段階で使用されるが、予防的に効果的な用量は、治療的に効果的な量よりも少なくする。
【００８１】
アミロイドβに対する抗体の治療的に効果的な量又は予防的に効果的な量を決定するために重要な要因は、患者の生物学的な区画（例えば、患者の脳脊髄液（cerebrospinal fluid： CSF）、又は血漿）内の天然アミロイドβの濃度である。用量は、軽減すべき状態の重症度によって変わることを注意すべきである。当然のことながら、どの患者に対しても、個人の要求、又は前記組成物を投与又は投与を監視する専門家の判断によって、特定の用量の投薬計画は時間と共に調整すべきである。例えば、治療状況の要件が示すように、１つのボーラスを投与する、時間と共に薬を何回かに分割して投与する、又は投薬を均等に減少又は増加させる。
【００８２】
前記医薬組成物は、皮下に、静脈内に、皮内に、筋肉内に、腹腔内に、脳内に、鼻腔内に、経口で、経皮で、頬側に、動脈内に、頭蓋内に、又は頭部に投与することができる。非経口の組成物を形成すると、投与を容易にし、均一な投与を行うことができる。ここで使用される投薬形式は、治療すべき哺乳類対象の投与に適しておる物理的に別個のユニットである。各ユニットは、要求される薬剤キャリアと共に望ましい治療効果を提供するのに適した所定量の活性化合物を含んでいる。本発明に係る投与形式の明細については、（ａ）活性化合物及び特定の達成すべき治療効果の特性、及び（ｂ）治療のための活性化合物を化合する技術固有の、個々の感受性の制限により決定される（直接的に依存している）。
【００８３】
「薬学的に許容されるキャリア」としては、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌性及び抗真菌剤、等張性吸収遅延剤、及び生理的に適合するものがある。ある実施形態では、前記キャリアは非経口的投与に適している。好ましくは、前記キャリアは、静脈内、腹腔内、及び筋肉内投与に適している。また、前記キャリアは、中枢神経系への投与に適している（例えば、脊髄内又は大脳内に）。他の実施形態では、前記キャリアは経口投与に適している。殺菌した注入可能な水溶液又は分散液を即席で作製するための、薬学的に許容されるキャリアとしては、殺菌した水溶液又は分散液、及び殺菌した粉剤がある。薬学的に活性な物質のための、それらの媒質及び物質の使用は、当業者に周知である。従来の媒体又は物質が活性化合物と不適合である場合以外に、それらは本発明に係る医薬組成物内で使用される。また、前記組成物内に、補助的な活性化合物を組み込むこともできる。
【００８４】
治療組成物は、一般に、製造及び保存の条件の下に殺菌され安定されている。前記組成物は、高い薬物濃度に適した、液剤、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は他の注文された構造として製剤される。前記キャリアは、水溶液又は分散液の媒体であり、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレン・グリコール、及び液体ポリエチレン・グリコール）、及びその適した混合物である。適切な流動性は、レシチンのようなコーティングの使用、分散液の場合は必要とされる粒径の管理、及び界面活性剤の使用により維持することができる。多くの場合では、組成物内に、例えば、糖、多価アルコール（例えば、マンニトール）、ソルビトール、又は塩化ナトリウムなどのなどの等張性物質を含むことが好ましい。注入可能な組成物の長期に渡る吸収作用は、組成物内に吸収を遅らせる物質（例えば、モノステアレート塩及びゼラチン）を含ませることによってなされる。さらに、抗体は持続放出製剤（例えば、持続放出ポリマーを含んでいる組成物）で投与される。活性組成物は、組成物を急速な放出から守る、放出制御製剤（埋め込み及びマイクロカプセル化された配達システムを含んでいる）などのキャリアと調合することができる。生体分解性、生体適合性ポリマーとしては、エチレン酢酸ビニール、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸及び乳酸、ポリグリコール・コポリマー（ＰＬＧ）などを使用することができる。それらの製剤を調合するためのたくさんの方法は、特許化されている、又は一般に当業者に周知である。
【００８５】
殺菌された注射可能な溶液は、活性組成物（例えば、必要な量のアミロイドβに対する抗体）を、上に列挙した材料又はそれの組み合わせと共に、適切な溶媒に組み込むことにより調合することができる。また、必要に応じて、その後、フィルター処理により殺菌する。一般に、分散液は、活性組成物を殺菌された賦形剤（基礎的な分散媒と必要な他の上に列挙した材料を含んでいる）に組み込むことにより調合される。殺菌された注射可能な溶液を調合するための殺菌された粉剤の場合は、好ましい調合方法は、活性成分の粉剤とその殺菌フィルター処理された液体からの望ましい成分とを産出する真空乾燥又は凍結乾燥法である。
【００８６】
局所適用は、経皮的な又は皮内への適用により実現される。局所投与は、物質とコレラ毒素又はその解毒する派生物又はサブユニットの同時投与により容易になる。また、経皮的な送達は、皮膚用パッチ剤の使用、又はtransferosomesの使用により実現することができる。
【００８７】
他の送達システムとしては、持続放出、遅延放出、又は持続した放出送達システムがある。そのようなシステムによれば、本発明に係る活性組成物の反復投与を避けることができる。つまり、患者と医師の便性さが高まる。たくさんの種類の放出送達システムを利用することができる。また、それらは、当業者に周知である。そのようなシステムとしては、高分子システム（例えば、ポリ乳酸及びポリグリコール酸、ポリ酸無水物、及びポリカプロラクトン）、ステロール（例えば、コレステロール、コレステロール・エステル、及び脂肪酸又は中性脂肪（例えば、モノグリセリド、ジグリセリド、及びトリグリセリド））を含んでいる脂質である非高分子システム、ヒドロゲル放出システム、シラスティック（Ｒ）・システム、ペプチド・システム、従来の結合剤と賦形剤を使用したワックス・コーティングされた圧縮錠、部分的に融合した埋没物などがある。さらに、ポンプをベースにしたハードウエアの送達システム（それらのいくつかは移植に適応している）を使用することもできる。
【００８８】
長時間に渡って持続放出する埋没物を使用することもできる。「長時間に渡る放出」とは、埋没物は、治療レベルにある活性成分を少なくとも３０日間、好ましくは６０日間送達するように構成され、配置されているという意味である。長時間に渡って持続放出する埋没物は、当業者に周知であり、前述した放出システムのいくつかを含んでいる。ある埋没物は、アミロイドβペプチドの会合体を特徴とする状態の治療に特に有用である。その際は、埋没物を前記会合体の影響を受ける脳に近い部分に配置することにより、本発明に係る組成物を局地的かつ高用量で投与することができる。
【００８９】
以上、本発明について詳細に説明したが、本発明は前記した実施形態のみに限定されるものではなく、本発明の技術的思想に基づく限りにおいて、種々の変形が可能である。
【００９０】
また、ここに引用した全ての文献である、学術論文又はブストラクト、公開又は非公開の米国又は他の国の特許出願、米国又は他の国の取得特許、又はその他文献は、言及することをもって全て本発明に含まれるものとする。なお、引用文献の全てのデータ、表、図、及び文章を含む。さらに、ここに引用した全ての文献の全ての内容もまた、言及することをもって全て本発明に含まれるものとする。また、本発明の特徴、説明、実施形態は、関連する従来技術には、開示、教示又は示唆されていない。
【実施例】
【００９１】
本発明についての理解をさらに深めるために、以下の実施例を示す。ただし、これらの実施例は、本発明を限定するものではない。
【００９２】
（実施例１）
アミロイドβペプチドの遊離端に対して特異的な抗体を検出する“スパンニング・ペプチド”ＥＬＩＳＡ検出方法の実証
ペプチドH2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-アミノヘキサン酸-Cys-アミドは、ＳＭＣＣリンカーを介して、ＢＳＡと共役する。スイスウェブスターマウスは、完全フロインドアジュバント内の１００μｇの共役により免疫される。そして、その後、さらなる不完全フロインドアジュバント内の１００μｇの共役により、２回追加免疫する。抗血清は、“スパンニング・ペプチドＥＬＩＳＡ検出方法”を使用してスクリーンされる。簡単に説明すると、Ａβ１−４０は、９６ウエルプレート上にコーティングされる。９６ウエルプレートは、その後、競合するペプチドＡ（免疫原）、Ｃ（節約ペプチド）、又はＡβ１−４０自身の存在下で培養される。共通の結果を図５に示す。予想どおりに、これらの動物から作られた抗体は、免疫付与に使用されたペプチドであるＡβ（ペプチドＡ）の残基１−５、及び完全長Ａβ１−４０ペプチドと結合する。また、無傷のアミロイド前駆体タンパク質ＡＰＰの場合と同様に、そのＮ末端（ペプチドＣ）において両側をさらなる配列に挟まれた場合は、これらの抗体はＡβ１−５エピトープとも反応する。そのような抗体は、エピトープに対して特異的であると言われる（ＡβのＮ末端の配列１−５に対して）。
【００９３】
サンプルの検査で見られるさらにまれな結果を図６に示す。これらの抗体は、免疫ペプチド（Ａβ１−５）とＡβ１−４０配列を結合する。しかし、完全長ＡＰＰ（ペプチドＣ）で同じ５アミノ酸配列を架橋する領域から生じるペプチドは認識しない。これらの抗体の優れた選択性は、分子の遊離Ｎ末端に位置した場合にのみ１−５配列を結合する能力によるものである。このような抗体は、遊離端に対して特異的であると言われる。
【００９４】
（実施例２）
アミロイドβペプチドの遊離端に対して特異的なハイブリドーマを選択する“スパンニング・ペプチド”ＥＬＩＳＡ検出方法の実証
ペプチドH2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-アミノヘキサン酸-Cys-アミドは、ＭＢＳリンカーを介して、ＫＬＨと共役する。BaLb/c×C57BL/6 F1マウスは、完全フロインドアジュバント内の５０μｇの共役により免疫される。そして、その後、さらなる不完全フロインドアジュバント内の５０μｇの共役により、４回追加免疫する。標準方法を使用して、抗血清は検査され、融合が行われる。本明細書にて前述したように、ハイブリドーマは、“スパンニング・ペプチドＥＬＩＳＡ検出方法”を使用してスクリーンされる。簡単に説明すると、陽性ペプチド（ＢＳＡと共役したH2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His）、又は陰性対照である“スパンニング”・ペプチド（アセチル-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His）は、９６ウエルプレート上にコーティングされる。９６ウエルプレートは、その後、ハイブリドーマの上清と共に培養される。図７及び図８に示すように、いくつかのハイブリドーマは両方のペプチドを同じように認識する（例えば、クローン５Ｅ２、２Ａ８、及び２Ｆ８）、又は微々たる差異を認識する（例えば、クローン４Ｈ９、１Ｃ１２、及び３Ｈ３）。また、いくつかのクローンは、陰性対照スパンニング・ペプチド（免疫付与に使用されたのと同じ配列を含んでいる）よりも、免疫付与に使用された陽性ペプチドをより強く認識することにより、遊離端特異性を実証する。この例は、クローン４Ｄ１２及び２Ａ１０に見られる。
【００９５】
（実施例３）
仮説実験（Prophetic Experiments）
Ａβ端部特異性抗体が、Ａβ微小繊維形成、及びＡβが引き起こす細胞毒性を阻止する効果を検査するためのインビトロ生物検定法
《Ａβ端部が引き起こす神経毒性》
後期糖化反応生成物用の受容体（receptor for advanced glycation end-products：RAGE）は、神経細胞及び小膠細胞（microglia）におけるＡβの神経毒性作用を仲介する（Yanら, 1996）。
【００９６】
端部特異性抗体は、競合的抑制による受容体仲介の神経毒性を抑制する能力が検査される。抗体は、精製したＲＡＧＥ受容体調合液、及びＡβにより引き起こされる細胞酸化ストレスの測定の両方により検査される。ウシの肺の抽出物から精製したＲＡＧＥ受容体は、トリス緩衝化塩類含有オクチル−ｐ−グルコシド（１％）及びフェニルメチルスルホニルフッ化物（２ｎｍ）に溶解され、ヘパリン・ハイパーＤカラム（Biosepra）に適用される。カラムは、ＮａＣｌの勾配、及び125Ｉ標識Ａβが識別された最大結合による分画（fraction）により溶離する。分画は、ヒドロキシアパタイト・ウルトラジェル（Biosepra）上にプール及びロードされ、リン酸塩の濃度の増加により溶離される。
【００９７】
125Ｉ標識Ａβの最大結合による分画は、非減少ポリアクリルアミドＳＤＳゲル（１０％）の調整に適用される。
【００９８】
ＲＡＧＥ受容体タンパク質Mr 50,000は、Coommassie Blue 染色により識別され、隣接するレーン（lane）の領域は切断され、溶離される。125Ｉ標識Ａβ（１−４０/１−４２）と結合する端部特異性抗体による、ＲＡＧＥ受容体に対する競合的抑制は、次の（１）〜（３）のような様々な方法により測定される。（１）異なる量（０−１５０μｇ）の精製されたタンパク質をマイクロタイター細胞上に固定化し、１００ｎＭの125Ｉ標識Ａβ（１−４０／１−４２）と共に培養する。（２）異なる量（０−２５０ｎＭ）の125Ｉ標識Ａβ（１−４０／１−４２）を、５μｇの精製されたＲＡＧＥ受容体により予めコーティングされたマイクロタイター細胞上で培養する。（３）異なる量（０−５００μｇ／ｍｌ）のＡβ（１−４０／１−４２）をマイクロタイター細胞上に固定化し、５０ｎＭの125Ｉ標識ＲＡＧＥ受容体と共に培養する。どの検定法でも、異なる量の抗体の存在下で細胞と結合するリガンドの量は、ガンマ・シンチレーション・カウンタで細胞内の放射活性量を計測することにより測定される。
【００９９】
Ａβにより引き起こされる細胞酸化ストレスの抑制剤としての異なる端部特異性Ａβ抗体の効果を評価するために、培養されたマウス脳微小血管内皮細胞（Breitner ら, 1994）は、異なる量の抗体の存在下で０．２５μＭのＡβと共に培養される。そして、細胞酸化ストレスは、チオバルビツール酸反応性物質の用量依存的な生成を、前述したTBARS評価法（Demeryら, 1990; Yanら, 1996）を使用して測定することにより評価される。同様の評価方法（Khouryらにより開発された, 1996）で、前記抗体の抑制作用は、Ｎ９マウス小グリア細胞内のＡβにより生成される酸素反応種上で検査される。Ｎ９細胞（５０μＬのＰＤ−ＢＳＡ（二価陽イオンが不足しており、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを有するリン酸緩衝生理食塩水）内で、異なる量の抗体の存在下で５×１０４が摂氏３７度にて培養されている）は、１μＭのＨ２ＤＣＦ（２’，７’−ジクロロフルオレセイン二酢酸）と、Ａβペプチドによりコーティングされたマルチスポットスライド上の酸化に対して蛍光を発する染料を含んでいる。様々な時点で、培地のアリコートが採取され、蛍光プレートリーダー（Cytofluor II）により蛍光性が測定される。
【０１００】
《プロテオグリカンとの相互作用への影響》
血管細胞由来のヘパラン硫酸プロテオグリカン、ペルレカン（perlecan）は、全てのアミノ沈着物内で識別される。また、Ａβとの高親和性結合による炎症性アミロイドの初期段階に関与している（Snowら, 1989; 1995）。ペルレカンのＡβへの結合は、相互作用を妨げる分子がアミロイド生成を防止する又は阻止するという、第２及び第３アミロイド構造の特徴を授ける。
【０１０１】
ペプチドに対して作製された遊離端特異性ＡＤ抗体（ペプチドのＮ末端と対応する）は、ペルレカンのＡβのＮ末端領域における結合部位との結合を阻止する能力について評価される（Snow ら, 1995）。それらの評価は、培養された内皮細胞（ウシの胸大動脈から作製された）から単離されたペルレカンを使用した固相結合測定法に基づいている（詳細については、Snow ら, 1995を参照されたい）。ポリビニル・マイクロタイター細胞は、１００μｌのニトロセルロース溶液によりコーティングされており、乾燥させておく。その後、細胞は、０．２８μｇの結合したペルレカンを生成するために、標識されていないペルレカンと共に室温にて一晩コーティングされる。そして、２００μｌの５％の無脂肪粉乳と共に室温にて一晩ブロックされる。
【０１０２】
１００μｌのＴＢＳ／０．０５％のTween 20（ＴＢＳＴ）内に希釈された様々な量の125ＩＡβ（７０００ｃｐｍ／ｐＭ）は、細胞に３倍に加えられる。そして、室温にて、回転式攪拌器で２．５時間培養される。培養期間の終わりには、遊離125ＩＡβは、ＴＢＳＴの６回の洗浄により除去される。結合した125Ｉは、１００μｌ，１Ｎの水酸化ナトリウム内に抽出される。そして、遊離端に対する結合の放射活性は、液体シンチレーション計測による計測される。スキャッチャード分析は、量が増加した抗体の存在下での125ＩＡβの培養後に行われる。
【０１０３】
《Ａβ微小繊維形成への影響》
動力学的に溶性のペプチド（例えばＡβ１−４０）によるアミロイド微小繊維形成は、例えばＡβ１−４２のようなペプチド（境界Ｃ末端残基４１（Ｉｌｅ）及び４２（Ａｌａ）を含む）により核となる、又はシード（seed）される。Ｃ末端又はＮ末端特異性Ａβ抗体の、Ａβ１−４２によるシーディングを阻止、又はアミロイドペプチドの会合を防止する能力は、標準的な会合分析法を使用して検査される（Woodら, 1996）。Ａβ１−４０ペプチドは、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール内に５ｍｇ／ｍｌ可溶化される。前記ペプチドは、蒸発濃縮され、最終的な濃度が２３０μｍとなるまで、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）内に再可溶化される。Ａβ１−４０（２０μｍ）の溶液は、３日間攪拌される。そして、Ａβ微小繊維を生成すべく、３０分間超音波切断される。２ｎＭ濃度の会合前Ａβ１−４２は、Ａβ１−４０の会合をシードするために、ｐＨ７．４の過飽和状態の培養に添加される。各Ａβ端部特異性抗体の存在下又は非存在下での会合形成は、４０５ｎｍでマイクロタイター・プレートリーダを使用して、マイクロタイター細胞上に作製された資料の濁度をモニターすることにより測定される。また、反応は、Woodら（1996）により説明された、チオフラビンＴ蛍光によりモニターされる。遊離端特異性抗体のアミロイドペプチド微小繊維の解離を促進する能力は、ＶＩ標識アミロイド会合ペプチドのコラーゲン・マトリクス（９６ウエル・マイクロタイター・プラスチック・コーティング・プレート上にコーティングされた非会合ペプチドを含んでいる）からの変位を調べることにより検査される。さらに、遊離端特異性抗体のＡβにより引き起こされるダメージから神経細胞を保護する能力は、トリパンブルー法、細胞内カルシウム測定、走査型及び透過電子顕微鏡法、及び共焦点顕微鏡法により評価される。
【０１０４】
《Ａβ抗体の治療上の潜在能力を立証するための動物モデル》
動物モデルは、脳のＡＤのような病状の進行を遅らせる又は防止するために投与される抗体の潜在能力を実証するために必要である。また、ＡＤはヒト固有の病気なので、ヒトＡＰＰとＰＳ１を過剰に発現する遺伝子導入マウスが数多く作成された。遺伝子導入マウスにおけるアルツハイマー病を連想する、相関関係にある行動、生化学、及び病理学の異常性は、Ａβにより引き起こされる病態生理を遅らせる又は防止するための物質の有用性を調査する機会を与えた。
【０１０５】
ＡＰＰ／ＰＳ１の両方が遺伝子導入されたモデル（Holcombら, Nat Med 1998, 4: 97-100）は、著しい頑強さ、第１アミロイド沈着を急速に発生する複写可能な表現型、及び１２週齢で検出される行動の機能的障害を有している。これらの要素により、アルツハイマー病に適した薬物の素早いスクリーニング及び評価のモデルを得ることができる。重要なのは、ＡＰＰ／ＰＳ１の表現型は、ヒトのアルツハイマー病の主要な特性と一致するということである。前記特性としては、例えば、酸化ストレス、反応性神経膠症、炎症、神経変性、神経細胞の成長の異常、コリン作用性の末端の認識、及びもつれ形成の媒介物である高リン酸化タウの存在の標識が挙げられる。認識機能障害の他の多くの型とは違って、ＰＳ１／ＡＰＰは、運動障害（motor deficit）を伴わない、選択的な「作業記憶（working memory）」損失を有する。
【０１０６】
アルツハイマー病のためのＡＰＰ／ＰＳ１の両方が遺伝子導入されたマウスモデル内の抗体の一般的な評価方法は、次のようにして行う。まず、５−６週齢で治療を始める。遺伝子導入マウスは、各グループが１０−１２匹づつとなるように、３つの主要グループ（対照、２つの投与量）にランダムに選ばれる。各グループは、８週（斑の沈着以前）、１２週（斑が現れてくる）、及び１８−１９週齢（アミロイドの負担がとても顕著になる）まで治療される。
【０１０７】
どの時点でも、マウスは安楽死させられ、生理食塩水又はサッカロースによりかん流させられる。脳は採取され、両脳半球は分離される。一方の脳半球はパラホルムアルデヒドに浸され、区切られ、班検出のためのCampbell-Switzerアルツハイマー銀染色法、又は他の染色方法により染色する。他の脳半球は素早く冷凍され、その後、溶解性及び非溶解性の、１−４０及び１−４２、βアミロイドを定量化すべく、ＥＬＩＳＡ検査のために処理される。
【０１０８】
犠牲にする前に、Ｙ迷路、“place set”モリス水迷路、及び痕跡条件付けのような行動の検査が行われる。
【０１０９】
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【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）及びα、β及びγセクレターゼ切断による生成物の略図である。様々な領域の概略位置が、セクレターゼの切断部位（α、β、γ）と共に表示されている。
【図２】アミロイドβペプチド（Ａβ）が生成されるβＡＰＰ内の領域のアミノ酸配列（SEQ ID No: 1）である。矢印は、α、β又はγセクレターゼ切断部位を示す。免疫原として使用される合成ペプチドに対応するアミノ酸残基は、線分により配列の下に示す。
【図３Ａ】無傷の抗体の模式図である。重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域と、軽鎖（ＣＬ）及び重鎖（ＣＨ１，ＣＨ２，ＣＨ３）の定常領域から成る。
【図３Ｂ】Ｆａｂ断片の模式図である。Ｆａｂ断片は、重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域と、ジスルフィド架橋により結合している第１の定常領域（ＣＨ１，ＣＬ）から成る。
【図３Ｃ】非共有結合可変領域複合体Ｖ,−Ｖ,から成るＦｖ断片の模式図である。Ｆｖ断片は、非共有結合している可変領域複合体（ＶＨ〜ＶＬ）により形成された抗体の一部と結合している抗原を表している。
【図３Ｄ】単鎖Ｆｖ抗体の模式図である。単鎖Ｆｖでは、可変領域の重鎖（ＶＨ）は、軽鎖（ＶＬ）とペプチド・リンカーを介して結合している。
【図４】上の配列はアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）及びその機能的領域を示し、真中の配列はＡβペプチド及びそのＮ末端配列の拡張を示し（ペプチドＡ及びＣが生成される位置を表している）、下の配列は、ＡＰＰ及び実験用ペプチドＡ，Ｃの配列をコードするアミノ酸を示している。
【図５】エピトープ特異性抗体の生成を表している。標準的なＥＬＩＳＡ検定法における、サンプル１の免疫原（ペプチドＡ）への特異的結合は、同一のペプチドにより抑制される。つまり、Ａβ１−４０ペプチド及びペプチドＣ（前駆体分子ＡＰＰのＡβ切断部位の橋渡しをする）により抑制される。
【図６】遊離端エピトープ特異性抗体の生成を表している。標準的なＥＬＩＳＡ検定法における、サンプル２の免疫原（ペプチドＡ）への特異的結合は、同一のペプチドにより抑制される。ただし、Ａβ１−４０ペプチドによっては抑制されるが、ペプチドＣ（前駆体分子ＡＰＰのＡβ切断部位の橋渡しをする）によっては抑制されない。
【図７】遊離端エピトープ特異性抗体の生成を表している。クローン４Ｄ１２は、陰性対照であるスパンニング・ペプチドよりも、陽性対照である免疫ペプチドを遥かに強く認識するハイブリドーマの例である。
【図８】遊離端エピトープ特異性抗体の生成を表している。クローン２Ａ１０は、陰性対照であるスパンニング・ペプチドよりも、陽性対照である免疫ペプチドを遥かに強く認識するハイブリドーマの例である。
【図１】
2005531509.tif 000002
【図２】
2005531509.tif 000003
【図３Ａ】
2005531509.tif 000004
【図３Ｂ】
2005531509.tif 000005
【図３Ｃ】
2005531509.tif 000006
【図３Ｄ】
2005531509.tif 000007
【図４】
2005531509.tif 000008
【図５】
2005531509.tif 000009
【図６】
2005531509.tif 000010
【図７】
2005531509.tif 000011
【図８】
2005531509.tif 000012
【配列表】
2005531509000001.app
【国際調査報告】
2005531509.tif 000013
2005531509.tif 000014