(57)【要約】本発明は、担体上に配置された生体機能化ナノ粒子を含むミクロ構造体を具備する機能要素、並びにこの機能要素の作製方法及びその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面を有する担体及び担体表面上に配置された少なくとも１つのミクロ構造体を含む機能要素であって、ミクロ構造体がミクロ構造体のアドレス指定を可能にする分子特異的認識部位を有するナノ粒子の形の個別成分からなる、上記機能要素。
【請求項２】
ミクロ構造体が担体表面の部分を覆い、担体表面の覆われた部分の領域・長さパラメータの少なくとも１つが９９９μｍ未満であり、少なくとも１０ｎｍである、請求項１に記載の機能要素。
【請求項３】
担体及び／又は担体表面が金属、金属酸化物、ポリマー、半導体材料、ガラス及び／又はセラミックからなる、請求項１又は２に記載の機能要素。
【請求項４】
担体の表面が平面である、請求項１〜３のいずれか１つに記載の機能要素。
【請求項５】
担体の表面があらかじめ構造化されている、請求項１〜３のいずれか１つに記載の機能要素。
【請求項６】
担体の表面が、担体表面への生体分子の非特異的付着を阻止する化合物の層を有する、請求項１〜５のいずれか１つに記載の機能要素。
【請求項７】
担体表面とミクロ構造体の間に結合剤の層が配置されている、請求項１〜６のいずれか１つに記載の機能要素。
【請求項８】
結合剤が荷電又は非荷電化学反応基を有するポリマーである、請求項７に記載の機能要素。
【請求項９】
ポリマーがヒドロゲルである、請求項８に記載の機能要素。
【請求項１０】
結合剤が荷電又は非荷電化学反応基を有するプラズマ層である、請求項７に記載の機能要素。
【請求項１１】
結合剤がシラン又はチオールをベースとした自己集合単分子層である、請求項７に記載の機能要素。
【請求項１２】
ｐＨ値、イオン濃度又は温度を変えることによって結合剤を操作することができる、請求項７〜１１のいずれか１つに記載の機能要素。
【請求項１３】
ナノ粒子がコアと分子特異的認識部位を有する表面とからなる、請求項１〜１２のいずれか１つに記載の機能要素。
【請求項１４】
１以上の生物学的活性分子が分子特異的認識部位に結合されている、請求項１３に記載の機能要素。
【請求項１５】
生物学的活性分子が共有結合及び／又は非共有結合されている、請求項１４に記載の機能要素。
【請求項１６】
生物学的活性分子がそれらの生物学的活性を維持して結合されている、請求項１４又は１５に記載の機能要素。
【請求項１７】
結合された分子がタンパク質、核酸、ＰＮＡ分子又はそのフラグメントである、請求項１４〜１６のいずれか１つに記載の機能要素。
【請求項１８】
タンパク質が抗体、抗原、酵素、サイトカイン又はレセプターである、請求項１６に記載の機能要素。
【請求項１９】
分子特異的認識部位が１個以上の第１の官能基を含み、結合された分子が第１の官能基と結合する相補的な第２の官能基を含む、請求項１３〜１８のいずれか１つに記載の機能要素。
【請求項２０】
第１の官能基及び第１の官能基と結合する相補的な第２の官能基が、活性エステル、アルキルケトン基、アルデヒド基、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、マレインイミド基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、チオール基、チオエステル基、オリゴヒスチジン基、ストレプ・タグ［Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ］Ｉ、ストレプ・タグＩＩ、デスチオビオチン、ビオチン、キチン、キチン誘導体、キチン結合ドメイン、金属キレート錯体、ストレプトアビジン、ストレプトアクチン、アビジン及びニュートラビジンからなる群から選ばれる、請求項１９に記載の機能要素。
【請求項２１】
第１及び第２の官能基が分子インプリンティング法によって生成される、請求項１９又は２０に記載の機能要素。
【請求項２２】
第１の官能基がスペーサーの構成部分であるか、又はスペーサーを介してナノ粒子の表面に結合されている、請求項１９〜２１のいずれか１つに記載の機能要素。
【請求項２３】
相補的な第２の官能基がスペーサーの構成部分であるか、又はスペーサーを介してナノ粒子の表面に結合されている、請求項１９〜２１のいずれか１つに記載の機能要素。
【請求項２４】
ナノ粒子のコアが有機材料からなるか、又は有機材料を含む、請求項１３〜２３のいずれか１つに記載の機能要素。
【請求項２５】
有機材料が有機ポリマーである、請求項２４に記載の機能要素。
【請求項２６】
有機ポリマーがポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアクリレート又はその混合物である、請求項２４又は２５に記載の機能要素。
【請求項２７】
コアが無機材料からなるか、又は無機材料を含む、請求項１３〜２３のいずれか１つに記載の機能要素。
【請求項２８】
無機材料がＡｕ、Ａｇ又はＮｉのような金属、ケイ素、ＳｉＯ2、ＳｉＯ、ケイ酸塩、Ａｌ2Ｏ3、ＳｉＯ2・Ａｌ2Ｏ3、Ｆｅ2Ｏ3、Ａｇ2Ｏ、ＴｉＯ2、ＺｒＯ2、Ｚｒ2Ｏ3、Ｔａ2Ｏ5、ゼオライト、ガラス、インジウム−スズ酸化物、ヒドロキシルアパタイト、Ｑ−Ｄｏｔ又はその混合物である、請求項２７に記載の機能要素。
【請求項２９】
コアが５ｎｍ〜５００ｎｍの大きさを有する、請求項２４〜２８のいずれか１つに記載の機能要素。
【請求項３０】
コアが少なくとも１つの補助機能を有する、請求項２４〜２９のいずれか１つに記載の機能要素。
【請求項３１】
補助機能がコアに定着されており、蛍光標識、紫外／可視標識、超常磁性機能、強磁性機能及び／又は放射性標識である、請求項３０に記載の機能要素。
【請求項３２】
コアの表面が第１の官能基を含む有機又は無機層で修飾され、この層が蛍光標識、紫外／可視標識、超常磁性機能、強磁性機能及び／又は放射性標識を有する、請求項３０に記載の機能要素。
【請求項３３】
コアの表面が、立体安定化及び／又は固定化分子の配座の変化の阻止及び／又は別の生物学的活性化合物のコアへの付着の阻止に役立つ化合物を有する、請求項３０〜３２のいずれか１つに記載の機能要素。
【請求項３４】
上記の化合物がポリエチレングリコール、オリゴエチレングリコール、デキストラン又はその混合物である、請求項３３に記載の機能要素。
【請求項３５】
結合された分子が標識を有する、請求項１〜３４のいずれか１つに記載の機能要素。
【請求項３６】
結合された分子に別の分子が結合されている、請求項１〜３５のいずれか１つに記載の機能要素。
【請求項３７】
ミクロ構造体が１つのナノ粒子層からなる、請求項１〜３６のいずれか１つに記載の機能要素。
【請求項３８】
ミクロ構造体が複数のナノ粒子層からなる、請求項１〜３６のいずれか１つに記載の機能要素。
【請求項３９】
異なる分子特異的認識部位を有するナノ粒子からなる複数のミクロ構造体が担体表面に配置されている、上記請求項のいずれか１つに記載の機能要素。
【請求項４０】
ミクロ構造体に様々な分子が結合されている、請求項３９に記載の機能要素。
【請求項４１】
リング／ピン・プリンターを使用して担体表面に１個以上のミクロ構造体を形成させることによって得られる、請求項１〜４０のいずれか１つに記載の機能要素。
【請求項４２】
リソグラフィー法を使用して担体表面に１個以上のミクロ構造体を形成させることによって得られる、請求項１〜４０のいずれか１つに記載の機能要素。
【請求項４３】
リソグラフィー法がフォトリソグラフィーである、請求項４２に記載の機能要素。
【請求項４４】
リソグラフィー法がマイクロペンリソグラフィーである、請求項４２に記載の機能要素。
【請求項４５】
インクジェット法を使用して担体表面に１個以上のミクロ構造体を形成させることによって得られる、請求項１〜４０のいずれか１つに記載の機能要素。
【請求項４６】
マイクロコンタクト印刷法を使用して担体表面に１個以上のミクロ構造体を形成させることによって得られる、請求項１〜４０のいずれか１つに記載の機能要素。
【請求項４７】
担体の表面に少なくとも１つの結合剤層を被着させ、次に分子特異的認識部位を有するナノ粒子からなる少なくとも１つのミクロ構造体を被着させることを特徴とする、上記請求項のいずれか１つに記載の機能要素の作製方法。
【請求項４８】
結合剤層を被着させる前に担体の表面を清浄化及び／又は活性化する、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
担体表面を化学的に活性化する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
担体表面に電荷を持たせる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
プライマーを被着することによって担体表面を活性化する、請求項４９又は５０に記載の方法。
【請求項５２】
自己集合層を担体表面に被着する、請求項４９又は５０に記載の方法。
【請求項５３】
担体表面をプラズマによって活性化する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５４】
形状と面が確定された結合剤層を担体表面に被着させ、次に担体をナノ粒子懸濁液に浸漬して、被着された結合剤層にナノ粒子を付着させることによって、形状と面が確定されたミクロ構造体を作る、請求項４７〜５３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５５】
形状と面が確定された結合剤層をリング／ピン・プリンター、リソグラフィー法、インクジェット法又はマイクロコンタクト印刷法により被着させる、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
担体を結合剤の懸濁液又は溶液に浸漬して全担体表面を覆う結合剤層を形成させ、次にナノ粒子を被着させて形状と面が確定されたミクロ構造体を作る、請求項４７〜５５に記載の方法。
【請求項５７】
形状と面が確定されたミクロ構造体をリング／ピン・プリンター、リソグラフィー法、インクジェット法又はマイクロコンタクト印刷法によって形成させる、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
結合剤及びナノ粒子を担体表面に数回被着させる、請求項４７〜５７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５９】
ナノ粒子を被着する前に生物学的活性分子をナノ粒子の分子特異的認識部位に結合させる、請求項４７〜５８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６０】
ナノ粒子を被着した後に生物学的活性分子をナノ粒子の分子特異的認識部位に結合させる、請求項４７〜５８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６１】
ナノ粒子の被着の前後に生物学的活性分子をナノ粒子の分子特異的認識部位に結合させる、請求項４７〜５８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６２】
第１の官能基を有するナノ粒子の分子特異的認識部位を、第１の官能基と結合する相補的な第２の官能基を有する生物学的活性分子と接触させて、分子特異的認識部位及び該分子の官能基間に共有結合及び／又は非共有結合を生じさせることによって、ナノ粒子の分子特異的認識部位への生物学的活性分子の結合を行う、請求項５９〜６１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６３】
第１の官能基及び第１の官能基と結合する相補的な第２の官能基が活性エステル、アルキルケトン基、アルデヒド基、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、マレインイミド基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、チオール基、チオエステル基、オリゴヒスチジン基、ストレプ・タグＩ、ストレプ・タグＩＩ、デスチオビオチン、ビオチン、キチン、キチン誘導体、キチン結合ドメイン、金属キレート錯体、ストレプトアビジン、ストレプトアクチン、アビジン及びニュートラビジンからなる群から選ばれる、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
生物学的活性分子をそれらの生物学的活性を維持して結合させる、請求項５９〜６３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６５】
生物学的活性分子がタンパク質、抗原、核酸、ＰＮＡ分子又はそのフラグメントである、請求項５９〜６４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６６】
請求項１〜４６のいずれか１つに記載の機能要素又は請求項４７〜６５のいずれか１つに記載の方法により作製された機能要素の、検出法の実施のための使用。
【請求項６７】
検出方法がＭＡＬＤＩ［マトリックス支援レーザ脱離イオン化］質量分析、蛍光又は紫外−可視分光法、蛍光又は光学顕微鏡法、導波路分光法、インピーダンス分光法又はその他の電気的方法である、請求項６６に記載の使用。
【請求項６８】
請求項１〜４６のいずれか１つに記載の機能要素又は請求項４７〜６５のいずれか１つに記載の方法により作製された機能要素の、細胞接着又は細胞増殖の制御のための使用。
【請求項６９】
請求項１〜４６のいずれか１つに記載の機能要素又は請求項４７〜６５のいずれか１つに記載の方法により作製された機能要素の、薬剤の開発のための使用。
【請求項７０】
請求項１〜４６のいずれか１つに記載の機能要素又は請求項４７〜６５のいずれか１つに記載の方法により作製された機能要素の、薬剤の作用及び／又は副作用の分析のための使用。
【請求項７１】
請求項１〜４６のいずれか１つに記載の機能要素又は請求項４７〜６５のいずれか１つに記載の方法により作製された機能要素の、疾病の診断のための使用。
【請求項７２】
機能要素を病原体の同定のために使用する、請求項７１に記載の使用。
【請求項７３】
機能要素をヒト又は動物の突然変異遺伝子の同定のために使用する、請求項７１に記載の使用。
【請求項７４】
請求項１〜４６のいずれか１つに記載の機能要素又は請求項４７〜６５のいずれか１つに記載の方法により作製された機能要素の、試料の微生物汚染の分析のための使用。
【請求項７５】
試料が水又は土壌試料である、請求項７４に記載の使用。
【請求項７６】
試料が食品又は動物飼料に由来する、請求項７４に記載の使用。
【請求項７７】
請求項１〜４６のいずれか１つに記載の機能要素又は請求項４７〜６５のいずれか１つに記載の方法により作製された機能要素の、バイオコンピュータの電子部品としての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、担体上に配置され、生体機能化可能な又は生体機能化されたナノ粒子からなるミクロ構造体を含む機能要素、この機能要素の作製方法及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体分子、例えばＤＮＡ又はタンパク質の研究は、多種多様な領域、例えば微生物の検出のための環境分析、病原体の同定のための臨床診断で、又は薬剤耐性の決定のためにますます重要な役割を果たしている。特定の用途に関係なく、この分析方法は常に同じ要求を満たさなければならない。特に、それらは迅速かつ安価に実施することができ、同時に極めて感度が高く、確実に再現性のある結果をもたらさなければならない。
【０００３】
生物学的活性分子の分析で画期的なものは、いわゆるバイオチップである。ＤＮＡアレイとも呼ばれる遺伝子チップによって、例えば被検試料中の核酸測定が大幅に簡素化され、加速され、並行化され、自動化され、精密化される。この遺伝子チップは、その表面に既知の配列の核酸を整然とした格子状に固定化した又は合成した小型の担体である。遺伝子チップはとりわけ感染症、癌疾患及び遺伝病の臨床診断に用いられる。試料の分析でのこのような遺伝子チップの効率は、特に極めて少量の試料しか必要でなく、高感度測定法により評価を行なうことができることに基づいている。したがって、このチップを使用して、多数の試料を並行して検査することが可能となる（ハイスループット・スクリーニング）。
【０００４】
遺伝子チップと同様に、タンパク質又はペプチドを例えばプラスチック膜上に整然とした既知の格子状に配置したタンパク質アレイも知られている。このようなタンパク質アレイはとりわけタンパク質の相互結合、例えばレセプター・リガンド相互作用の研究、細胞内タンパク質複合体の同定、ＤＮＡ・タンパク質及びＲＮＡ・タンパク質相互作用の研究又はタンパク質・抗体相互作用の分析のために使用される。タンパク質チップ技術によってすでに癌疾患又はアルツハイマー痴呆症のような病患のための多数のタンパク質マーカーを同定することができた。
【０００５】
バイオコンピュータの開発においても、担体に結合された生体分子が重要な役割を果たす。「バイオコンピュータ」によって特に在来の電子部品、例えばトランジスタ、ダイオード、スイッチ等が、少なくとも部分的に有機材料からなる又は有機材料を含む部品に置き換えられる。生体分子の電子部品としての使用は、とりわけ情報を処理する生物学的系の能力、例えばモデル及び物体認識、生殖並びに自己組織化を利用するという目標を追求するものである。シリコンベースの従来の部品はこうした能力を持たない。しかも生体分子の使用によって、シリコン部品ではほとんど実現されない電子部品の小型化を達成することができる。部品の小型化はチップのすべての重要なパラメータ、例えば集積密度、損失電力、スイッチ速度及び規模対コスト比の大幅な改善と結びついている。シリコンベースの部品では小型化の限界にまだ達してはいないが、小型化度の増加、特に実装密度の増加とともに熱排出や望ましくない電気的効果の問題が起こるので、すでに先が見えている。
【０００６】
今日、バイオエレクトロニクスの研究の大部分は分子部品の基本構造としてのタンパク質の使用に集中している。タンパク質は機能の高度な可変性と構造の高い安定性を有する。タンパク質の使用に際して次の戦略が追求される。即ち論理操作のためのタンパク質の機能機構の研究と改良、別の種類の分子ユニットの担体分子として応用するための構造特性の利用、分子スイッチ回路の技術的製造のためのタンパク質の構造的機能的性質の利用である。現在は特に光を直接に信号に変換できる光受容体タンパク質が研究されている。このプロセスは電気双極子の形成を含み、タンパク質の変色が付随する。このオプトエレクトリック的性質に基づき、このようなタンパク質は「スマートマテリアル」（ｓｍａｒｔ  ｍａｔｅｒｉａｌ）として使用される。これまで最もよく研究された例はバクテリオロドプシンである。光学的情報処理で光学的メモリーとしてこれを使用することが試みられている。
【０００７】
このようなバイオエレクトロニクス部品は従来の電子部品とともに「混合コンピュータシステム」で使用することができる。しかしバイオエレクトロニクス部品は他の技術分野例えば医療技術でも使用することができる。医学的測定及びモニタリング技術並びに人工臓器移植片及び補てつ物のための生物学的材料の使用は、多くの決定的な利点をもたらす。例えば失明した人のための有効な視力補助具を開発することに努めている。現在、人の眼における移植片として使用される、いわゆる網膜チップが開発されつつある。
【０００８】
様々な分析領域でセンサー及びスクリーニングシステムを作製する場合、担体材料上の層の構造化が非常に重要である。金属、ポリマー、ガラス、半導体又はセラミックからなる担体を自己集合単分子層、その他の単分子コーティング、塗料、金属フィルム又はポリマー膜で被覆するために幾つかの方法が記述されている。例えば平坦な表面の構造化のために光学用の非官能基化粒子を沈着させることが知られている（Ｃｈｅｎ，Ｊｉａｎｇ，Ｋｉｍｅｒｌｉｎｇ ａｎｄ Ｈａｍｍｏｎｄ，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，１６(２０００)，７８２５−７８３４）。
【０００９】
Ｆａｎら（Ｎａｔｕｒｅ，４０５（２０００），５６−６０）は階層的に組織化された機能性構造体の作製を記述する。その場合シリカ・界面活性剤系の自己整列と、構造化自己集合単分子層（ＳＡＭ）の急速印刷法、特にピン（ペン）リソグラフィー、インクジェット印刷及び浸漬被覆とが組合わされる。上記の方法はセンサーアレイ及び流体又は光子系の作製のために使用される。上記の方法にとって重要なのは、安定した均質なインク混合物を使用することである。このインク混合物は蒸発の後に自己集合過程で所望の有機修飾シリカ・界面活性剤中間相を形成することができる。そのために、シロキサン縮合率を最低限に抑え、こうして構造化過程でシリカ・界面活性剤系の表面自己整列を可能にするヒドロニウムイオン濃度で、エタノール水溶液中にオリゴマー・シリカゾルが調製される。インク液によって表面にパターンが作られ、その際エタノールの優先的蒸発が水、界面活性剤及びケイ酸塩の濃縮をもたらすため、複雑な三次元濃度勾配が生じる。臨界ミセル濃度（ｃ．ｍ．ｃ．）を超えるとミセルが生成され、特に水の蒸発が進行するにつれて、液体-蒸気界面にミセルの連続的自己組織化が誘導され、シリカ・界面活性剤結晶をもたらす。エタノールの蒸発の後に、生じる中間層の網状構造体にアルコール可溶の疎水性分子が区画される。マイクロペンリソグラフィー法（ＭＰＬ）を使用して、官能基を含む整然としたナノ構造体を作製することができる。官能基化可能なナノ粒子を使用してマイクロペンリソグラフィー法によりこのような構造体を作製することは記載されなかった。
【００１０】
ところが、生体分子による担体の被覆、特に構造化した被覆ははるかに複雑である。担体への生体分子の固定化は一般に吸着又は共有結合によって行われる。その場合一方では、個別分子を高い充填密度で所定の間隔で配置しなければならない。他方では、生物学的活性が変化したり失われないように、分子を安定化して担体に結合しなければならない。タンパク質の固定化の際に、生物学的活性のために必要な三次元構造、例えば酵素の活性中心の三次元構造が改変されてはならない。米国特許第５，６０９，９０７号は自己整列性コロイド金属粒子を使用した巨視的金属表面の作製を記載する。その場合、ストレプトアビジンで標識した銀コロイドがビオチン化ＳＡＭ（自己集合単分子層）の表面に非構造化状態で被着される。コロイド粒子の負電荷のために、粒子の相互反発が起こる。こうして複数の粒子の凝集が阻止され、粒子は単独の粒子として均等な相互間隔で配置される。従って、この方法を使用して複数の粒子を含む連続的構造体を作ることはできない。
【００１１】
接着性鋳型の作製、特にビオチン機能化粒子のＳＡＭ（自己集合単分子層）表面への構造化配置は、Ｈａｒｎｅｔｔら（Ｈａｒｎｅｔｔ，Ｓａｔｙａｌａｋｓｈｍｉ  ａｎｄ  Ｃｒａｉｇｈｅａｄ，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，１７（２００１），１７８−１８２）により記載される。その場合、ＳＡＭ表面が電子ビームリソグラフィーで構造化され、続いてビオチン化ポリスチレン粒子（２０ｎｍ〜２０μｍ）が被着される。上記の方法では不活性単分子層が電子ビームリソグラフィーによって処理され、構造体が作製される。続いて処理され清浄化された構造体を反応性単分子層で後充填し、この単分子層に末端ビオチン単位を有するリンカー分子又はポリスチレン粒子が選択的に結合される。使用する粒子は蛍光を発し、例えばタンパク質で機能化することができ、特に細胞接着の用途に適している。構造体の後充填（ｂａｃｋｆｉｌｌｉｎｇ）のために使用される反応性単分子層はその後再び除去することができる。即ち後充填処理を逆にすることができる。なお上記の方法は特に個々の線又は個々の点を印刷する時の電子ビームリソグラフィーの迅速性を利用する。
【００１２】
カーボン・ナノチューブ上のアミン基を有する単分子層を電子ビームリソグラフィーで処理し、続いて反応性単分子層で後充填することによって接着性鋳型を作ることも知られている（Ｈａｒｎｅｔｔ，Ｓａｔｙａｌａｋｓｈｍｉ  ａｎｄ  Ｃｒａｉｇｈｅａｄ，Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．，７６（２０００），２４６６−２４６８）。非電子ビームリソグラフィーについての研究には、「走査型プローブ」リソグラフィーによる単分子層の処理（Ｓｕｇｉｍｕｒａ  ａｎｄ  Ｎａｋａｇｉｒｉ，Ｊ．Ｖａｃ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１５（Ｂ１９９７），１３９４−１３９７；Ｗａｄｕ−Ｍｅｓｔｈｒｉｇｅら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ，１５（１９９９），８５８０−８５８３）、ＤＮＡアレイの作製のためのフォトリソグラフィーで処理したアミン含有疎水性単分子層の後充填（Ｂｒｏｃｋｍａｎ，Ｆｒｕｔｏｓ  ａｎｄ  Ｃｏｒｎ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１（１９９９），８０４４−８０５１）、及びマイクロコンタクト印刷法での未印刷面の機能化のための常法による後充填が含まれる。
【００１３】
ＤＮＡのような核酸は担体に比較的問題なく固定化されるが、タンパク質の場合は事情が非常に複雑である。特にタンパク質の定方向固定化を、特にその機能を維持して、行うことができる方法は目下のところほとんどない。多くの公知の方法では、タンパク質が主として非特異的相互作用によって表面に結合される。即ち定方向共有結合は行われない。
【００１４】
種々の機能性、例えばタンパク質機能を有するヒドロゲルで表面を被覆することは公知である。ヒドロゲルによる被覆は平面と比較して表面積の拡大をもたらすが、しかし同時に機能性の非特異的固定が強められる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の根底にあるのは、先行技術で周知の欠点が取り除かれ、生体分子が特にその生物学的活性を維持して高い充填密度で担体に固定化され又は固定化することができ、種々のスクリーニング及び分析システム、例えば医学的測定及びモニタリングやバイオコンピュータでの使用に適合する、生体分子を固定化した小型担体系、例えば遺伝子チップ及びタンパク質チップを作るための手段及び方法を開発するという技術的課題である。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、表面を有する担体及び担体表面に配置された少なくとも１つのミクロ構造体を含む機能要素であって、ミクロ構造体がナノ粒子の形の個別成分からなり、ナノ粒子がミクロ構造体のアドレス指定を可能にする分子特異的認識部位を有する、上記の機能要素を提供することによって、本発明の基礎をなす上記の技術的課題を解決するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
従って、本発明は、表面に１個以上のミクロ構造体が配置され、各ミクロ構造体が同一又は不同の分子特異的認識部位を有する複数のナノ粒子からなる機能要素を提供する。機能要素のミクロ構造体は生体機能を有するか、又は生体機能を持たせることができる。即ちミクロ構造体を構成するナノ粒子の分子特異的認識部位は、対応する分子、特に生物学的機能又は活性を有する有機分子を認識し、これと結合することができる。この分子は例えば核酸又はタンパク質である。その後、ナノ粒子の分子特異的認識部位に結合された分子に、別の分子、例えば試料中の被検分子を結合させることができる。先行技術で公知のシステム、例えば従来の遺伝子又はタンパク質アレイとは異なり、本発明は、生体分子を平坦な平面に直接結合させるのではなく、ナノ粒子の表面に生体分子を固定化するのであり、このナノ粒子は固定化の前又は後にミクロ構造体の形成のために使用される。
【００１８】
分子特異的認識部位を有するナノ粒子系を具備する本発明の機能要素は、従来の系（例えば生体分子が担体に直接固定化された系）と比較して、幾つかの決定的な利点をもたらす。
【００１９】
本発明に基づき使用されるナノ粒子は極めてフレキシブルな不活性の系である。例えば、それらは多種多様なコア、例えば有機ポリマー又は無機材料からなることができる。その場合、シリカ粒子のような無機ナノ粒子は、例外なく化学的に不活性であり、機械的に安定であるという利点をもたらす。サーフマー（Ｓｕｒｆｍｅｒ）及び分子インプリンティングされたポリマーは軟質のコアを有するが、シリカ又は鉄のコアを有するナノ粒子は溶剤中で膨潤性を示さない。非膨潤性粒子は、長時間にわたって繰返し溶媒に懸濁しても、その形態を変えない。それゆえ、非膨潤性粒子を含む本発明の機能要素は、溶媒の使用を必要とする分析法又はミクロ構造体形成方法に問題なく使用することができ、ナノ粒子又は固定化した生体分子の状態に不利な影響を及ぼさない。そこでこのようなナノ粒子を含む機能要素は、固定化すべき生体分子を、望ましくない物質（例えば洗剤又は塩）を含む複雑な物質混合物から精製することにも使用される。固定化される分子は、所望の持続時間の洗浄処理を経てこのような物質混合物から最適な方法で分離することができる。他方、酸化鉄コアを有する超常磁性又は強磁性ナノ粒子は磁界で磁力線に沿って配置される。酸化鉄ナノ粒子のこの性質はミクロ構造体、特にナノ級の条導体を直接形成するために利用される。
【００２０】
本発明に基づく機能要素は多種多様な生体分子の固定化のために使用され、その際生体分子の生物学的活性が維持される。ミクロ構造体の形成のために使用されるナノ粒子は、生物学的活性のために必要な分子領域が自然の分子状態に相当する状態にあるように固定化分子と結合することができる分子特異的認識部位、特に官能基を有する。ナノ粒子の表面にある官能基に応じて、生体分子を、必要に応じて共有的及び／又は非共有的にナノ粒子に結合させることができる。ナノ粒子は様々な官能基を持つことができるから、様々な生体分子又は様々な官能基を持つ生体分子が好適な配向で固定化される。生体分子はナノ粒子に非配向及び配向のいずれでも固定化することができ、その場合生体分子のほとんどすべての望ましい配向が可能である。生体分子をナノ粒子に固定化することによって、生体分子の安定化も得られる。
【００２１】
ミクロ構造体の形成のために使用されるナノ粒子は比較的大きな表面／体積比を有し、従って単位質量当り多量の生体分子を結合することができる。生体分子が平坦な担体に直接結合された系と比較して、機能要素は単位面積当りではるかに多量の生体分子を結合することができる。担体表面にミクロ構造体を作製するために複数の粒子層を重ねて積層することにより、単位面積当り結合される分子の量（即ち充填密度）を一層高めることができる。ナノ粒子をまずヒドロゲルで、次に生体分子で被覆することにより、単位面積当り結合される生体分子の量をさらに増加することができる。
【００２２】
本発明に基づき使用されるナノ粒子は５ｎｍ〜５００ｎｍの直径を有する。従ってこのようなナノ粒子を使用して、ナノメートルからマイクロメートルまでの範囲の任意の形状をした極めて小さなミクロ構造体を有する機能要素を作製することが可能である。ミクロ構造体を作るためにナノ粒子を使用すれば、機能要素のこれまで得られなかった小型化が可能であり、それが機能要素の重要なパラメータの顕著な改善を伴う。
【００２３】
本発明に基づき使用されるナノ粒子は、担体又は担体表面を作るために使用される材料に対して極めて良好な付着を示す。このため粒子を多数の担体系に、かつ多種多様な応用分野を有する多数の各種機能要素に、問題なく使用することができる。このナノ粒子を使用して形成されたミクロ構造体はすこぶる均質であり、このことはスペースに左右されないシグナル強度をもたらす。
【００２４】
本発明に基づく機能要素は、異なる分子特異的認識部位を持つ種々のナノ粒子からなる様々なミクロ構造体を担体表面に備えることができる。従ってこの様々なミクロ構造体に異なる生体機能を配することもできる。こうして機能要素は様々な生体分子を含むか又はこれを備えることができるミクロ構造体を並列的に含むことができる。従って機能要素は幾つかの異なるタンパク質又は幾つかの異なる核酸又は同時にタンパク質と核酸を含むことができる。
【００２５】
本発明に基づく機能要素は公知の方法を使用して簡単に作製される。例えば適当な懸濁化剤を使用してナノ粒子から安定な懸濁液を簡単に調製することができる。ナノ粒子懸濁液は溶液のようにふるまうため、ミクロ構造体化の技法と両立する。従ってナノ粒子の固着のために結合剤で予備処理した適当な担体の上にナノ粒子懸濁液を、例えばリング／ピン・プリンター、リソグラフィー法、インクジェット法及び／又はマイクロコンタクト法のような従来の方法を使用して、直接に被着させて構造化することができる。結合剤を適切に選択することによって、形成されるミクロ構造体を、その後の時点で例えばｐＨ値や温度を変えることによって機能要素の担体表面から部分的又は完全に溶解したり、場合によっては別の機能要素の担体表面に転移させたりすることができる。
【００２６】
本発明に基づく機能要素は多種多様な形で作ることができ、従って極めて多様な分野で使用される。例えば本発明に基づく機能要素はバイオチップ、例えば医学的分析又は診断で使用される遺伝子又はタンパク質アレイである。また本発明に基づく機能要素は電子部品、例えば分子スイッチ回路として、医学的測定及びモニタリングで、又はバイオコンピュータで使用される。
【００２７】
本発明に関連して「機能要素」とは、単独で又は複合的な装置の構成部分として、即ち別の類似の又は異なる機能要素との組み合わせで、少なくとも１つの所定の機能を遂行する要素を意味する。機能要素は同じ又は異なる材料からなる複数の構成部分を包含する。１つの機能要素の個々の構成部分は機能要素の内部で異なる機能を遂行し、この要素の全体的な機能に異なる程度に又は異なる方法で寄与することができる。本発明においては、機能要素は担体表面を有する担体を含み、その上に１以上の所定のナノ粒子層がミクロ構造体として配置されており、ナノ粒子は生物学的機能（例えば核酸、タンパク質及び／又はＰＮＡ分子のような生体分子）を備えており、且つ／又は備えることができる。
【００２８】
「担体」とは、主として機能要素の体積と外形を決定する機能要素の構成部分のことである。「担体」という用語は特に固体マトリックスを意味する。担体は任意の大きさと任意の形状、例えば球、円筒、棒、線条、板又はフィルムの形状を有することができる。担体は中空体でも中実体でもよい。中実体とは、おおむね空洞がなく、完全に１つの材料又は材料の組合せからなる物体をいう。また中実体は同じ又は異なる材料の層列からなることもできる。
【００２９】
本発明によれば、機能要素の担体特に担体表面は、金属、金属酸化物、ポリマー、ガラス、半導体材料又はセラミックからなる。本発明に関連して、このことは担体が完全に上記の材料の１つからなるか又はこれをおおむね含み、もしくは完全にこれらの材料の組合せからなるか又はこれをおおむね含むこと、又は担体の表面が完全に上記の材料の１つからなるか又はおおむねこれを含み、もしくは完全にこれらの材料の組合せからなるか又はこれをおおむね含むことを意味する。その場合担体又はその表面は少なくとも約６０％、とりわけ約７０％、好ましくは約８０％、最も好ましくは約１００％が上記の材料又はこの材料の組合せからなる。
【００３０】
好ましい実施形態では、機能要素の担体は透明ガラス、二酸化ケイ素、金属、金属酸化物、デキストラン又はアミドの重合体又は共重合体（例えばアクリルアミド誘導体）、セルロース、ナイロン、又は高分子材料（例えばポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポリスチレン又はポリメタクリル酸メチル又はビスフェノールＡのポリカーボネート）のような材料から構成される。
【００３１】
本発明によれば、機能要素担体の表面は平坦であるか又はあらかじめ構造化され、例えばリードインとリードアウトを備えている。また本発明に基づきミクロ構造体で覆われていない担体表面の領域は、この領域への生体分子の非特異的付着を阻止する機能性物質又は化合物を含むものとする。特に、これはエチレンオキシド層でありうる。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態では、担体表面とミクロ構造体の間に少なくとも１つの結合剤の層を配置する。結合剤はナノ粒子を機能要素の担体表面に固着するために使用される。結合剤の選択は担体材料の表面及び結合されるナノ粒子に従う。結合剤は好ましくは荷電又は非荷電ポリマーである。ポリマーはヒドロゲルであってもよい。結合剤が荷電基を有するプラズマ層（例えば高分子電解質）、又は化学反応性基を有するプラズマ層であることも可能である。結合剤がシランベース又はチオールベースの自己集合単分子層であることも可能である。本発明によれば、結合剤層は１つの結合剤の少なくとも１つの層からなるものとする。しかし結合剤層が異なる結合剤の複数の層からなることも可能であり、例えばアニオン・プラズマ層とカチオン・ポリマー層又は交互にアニオンとカチオンの複数のポリマー層からなることもできる。
【００３３】
本発明の別の好ましい実施形態は、外部刺激によってその性質、例えば付着性を変えることができ、従って外部から調節可能な結合剤に関する。例えばｐＨ値、イオン濃度及び／又は温度を変更することによって結合剤の付着性を低下させ、結果的に、結合剤を使用して機能要素の担体表面に結合させたミクロ構造体が剥離され、場合によっては別の機能要素の担体表面に転移されるようにすることができる。
【００３４】
本発明の別の好ましい実施形態では、被着される結合剤層及びミクロ構造体の担体又はその表面への結合を改善するために、結合剤層及びミクロ構造体の被着の前に、担体特に担体表面を表面活性化剤で予備処理する。担体の表面は例えば化学的方法により、例えばプライマー又は酸もしくは塩基を使用して、活性化することができる。プラズマを使用して表面活性化を行うこともできる。表面活性化は自己集合単分子層の被着を含むこともできる。
【００３５】
「ミクロ構造体」とは、マイクロメートル又はナノメートル範囲の構造体を意味する。特に本発明に関連して「ミクロ構造体」とは、分子特異的認識部位を有するナノ粒子の形の少なくとも２個の個別成分からなり、担体の表面に配置された構造体を意味する。その場合、所定の形状及び所定の面積を有する担体表面の特定の部分（担体表面より小さい）が被覆される。本発明によれば、特にミクロ構造体によって覆われた部分を決定する領域・長さパラメータの少なくとも１つがマイクロメートル範囲にあるものとする。ミクロ構造体が例えば円形を有するならば、円の直径はマイクロメートル範囲にある。ミクロ構造体が長方形として形成されている場合は、例えばこの長方形の幅がマイクロメートル範囲にある。本発明によれば、特にミクロ構造体によって覆われる部分を決定する領域・長さパラメータの少なくとも１つは１ｍｍ未満とする。本発明によるミクロ構造体は少なくとも２個のナノ粒子からなるから、この領域・長さパラメータの下限は１０ｎｍである。
【００３６】
本発明に基づくミクロ構造体によって覆われた領域は任意の幾何学的形状、例えば円、楕円、正方形、長方形又は１本の線の形状を有する。またミクロ構造体は複数の規則的及び／又は不規則的な幾何学的形状で構成することもできる。本発明に基づく機能要素が例えば遺伝子チップ又はタンパク質チップであるならば、ミクロ構造体は円形又は楕円形の形状を有することが好ましい。本発明に基づく機能要素がバイオコンピュータで使用するための電子部品であるならば、ミクロ構造体はスイッチ回路に似た形状を有することもできる。また本発明によれば、機能要素の担体表面に同じ又は異なる形状の複数のミクロ構造体が互いに間隔を置いて配置される。
【００３７】
本発明によるミクロ構造体は例えばリング／ピン・プリンターを使用してリング／ピンにより、リソグラフィー法、例えばフォトリソグラフィー又はマイクロペン・リソグラフィー、インクジェット法又はマイクロコンタクト印刷法により、機能要素担体の表面に被着される。１個以上のミクロ構造体を機能要素の表面に被着する方法の選択は、担体材料、ミクロ構造体を構成するナノ粒子の表面及び機能要素のその後の用途に従う。
【００３８】
本発明に関連して「ナノ粒子」とは、第１の官能基を含む分子特異的認識部位を有する特定の結合マトリックスを意味する。本発明に基づき使用されるナノ粒子はコアと表面からなり、表面に第１の官能基が配置されている。第１の官能基は生体分子の相補的な第２の官能基と共有結合又は非共有結合で結合することができる。第１及び第２の官能基の間の相互作用によって生体分子はナノ粒子に、またそれとともに機能要素のミクロ構造体に固定化されており、且つ／又はこれに固定化することができる。本発明に基づきミクロ構造体の形成のために使用されるナノ粒子は５００ｎｍ以下、とりわけ１５０ｎｍ以下の大きさを有する。
【００３９】
本発明に関連して「アドレス可能」とは、ナノ粒子を担体表面に被着した後にミクロ構造体が再び検索可能及び／又は検出可能であることを意味する。例えばマスク又はスタンプを使用してミクロ構造体を担体表面に被着する場合は、ミクロ構造体のアドレスは、一方ではマスク又はスタンプによってあらかじめ決定された担体表面の領域（その上にミクロ構造体が被着される）のｘ及びｙ座標から得られる。他方ではミクロ構造体のアドレスはミクロ構造体の再検索又は検出を可能にするナノ粒子表面の分子特異的認識部位から得られる。ミクロ構造体が生体機能化可能であるならば、即ち生体分子が結合されていない分子特異的認識部位を有するナノ粒子を含むならば、ミクロ構造体を構成するナノ粒子の分子特異的認識部位に１個以上の生体分子が特異的に結合するが、ミクロ構造体によって覆われない担体表面の部分には結合しないことによって、ミクロ構造体を再び見つけ出し且つ／又は検出することができる。固定化された分子が例えば発蛍光団、スピンラベル、金粒子、放射性マーカーのような検出マーカーで標識されているならば、適当な検出法を使用してミクロ構造体の検出を行うことができる。ミクロ構造体が生体機能化されているならば、即ち分子特異的認識部位にすでに１個以上の生体分子が結合されているならば、「アドレス可能」とは、この生体分子が別の分子の相補的構造により又は計測学的方法により検索及び／又は検出可能であることを意味する。その場合ナノ粒子からなるミクロ構造体だけが当該シグナルを示すが、ミクロ構造体で覆われていない担体表面の部分はかかるシグナルを示さない。検出方法として、例えば多種多様な物質（特にタンパク質）の分析のための重要な方法へと発展したマトリックス支援レーザ脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）を使用することができる。その他の検出方法は導波路分光法、蛍光、インピーダンス分光法、放射測定的及び電気的方法である。
【００４０】
本発明によれば、生体分子はその生物学的活性を維持して、ミクロ構造体を構成するナノ粒子の表面に結合又は固定化されているか、もしくは結合又は固定化することができる。その場合分子はとりわけ配向されて結合又は固定化されているか、もしくは結合又は固定化される。分子の生物学的活性とは、この分子が生体の自然の細胞環境で遂行するすべての機能を意味する。分子がタンパク質であれば、特異的触媒又は酵素機能、免疫防御機能、輸送及び貯蔵機能、調節機能、転写及び翻訳機能等が問題になる。分子が核酸であれば、生物学的機能は例えば遺伝子産物のコード化であり、もしくは別の核酸分子の合成のための鋳型としての又は調節タンパク質の結合モチーフとしての核酸の使用にある。「生物学的活性の維持」とは、生体分子がナノ粒子の表面に固定化された後に、適当なｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件で非固定化状態の同分子又は自然の細胞環境での同分子と同じ又はほぼ同じ生物学的機能を少なくとも同程度に遂行し得ることを意味する。
【００４１】
本発明に関連して「配向して固定化された」又は「配向固定化」という用語は、例えば生物学的活性のために必要な１以上のドメインの三次元構造が非固定化状態と比較して変化しておらず、このドメイン例えば細胞反応体の結合ポケットが他の天然の細胞反応体と接触したときにこれに自由にアクセス可能であるように、分子が分子内の所定の位置で分子特異的認識部位に結合されること又は結合されていることを意味する。
【００４２】
また「配向して固定化された」とは、ある分子種の固定化の際にすべて又はほぼすべての個別分子（但し全分子のすくなくとも８０％以上、とりわけ８５％以上）が、ミクロ構造体を構成するナノ粒子の表面上に再現可能に同一又はほぼ同一の配向をとることを意味する。
【００４３】
本発明によれば、本発明の機能要素のミクロ構造体に固定化された又は固定化可能な生体分子は特に核酸、タンパク質、ＰＮＡ分子、そのフラグメント又は混合物である。
【００４４】
本発明に関連して核酸とは、ホスホジエステル結合によって結合された少なくとも２個のヌクレオチドからなる分子を意味する。核酸はデオキシリボ核酸及びリボ核酸でありうる。核酸は一本鎖でも二本鎖でもよい。本発明においては、核酸がオリゴヌクレオチドであってもよい。本発明の機能要素のミクロ構造体に結合された核酸は、少なくとも１０塩基の長さを有することが好ましい。核酸は天然又は合成起源でありうる。核酸は遺伝子工学的手法により野生型核酸に対して修飾されていてもよく、且つ／又は非天然の及び／又は普通でない核酸構成単位を含むことができる。核酸は他の種類の分子、例えばタンパク質と結合させることができる。
【００４５】
本発明に関連して「タンパク質」とは、アミド結合によって互いに結合された少なくとも２個のアミノ酸を含む分子を意味する。本発明の趣旨に基づき、タンパク質はペプチド例えばオリゴペプチド、ポリペプチド、又は例えばタンパク質ドメインであることも可能である。このようなタンパク質は天然又は合成起源である。タンパク質は遺伝子工学的手法によって野生型タンパク質に対して修飾されていてもよく、且つ／又は非天然の及び／又は普通でないアミノ酸を含むことができる。タンパク質は野生型形態に対して誘導体化することができ、例えばグリコシル化することができ、短く切断することができ、他のタンパク質と融合することができ、他の種類の分子（例えば炭水化物）と結合させることができる。本発明によれば、タンパク質は特に酵素、レセプター、サイトカイン、抗原又は抗体である。
【００４６】
「抗体」とは、被検体（抗原）と特異的に結合し且つ認識する１以上の免疫グロブリン遺伝子によりおおむねコードされるポリペプチド又はそのフラグメントを意味する。抗体は例えば無傷の免疫グロブリン又は種々のぺプチダーゼで切断することによって生じるそのフラグメントである。また「抗体」は修飾抗体（例えばオリゴマー、還元型、酸化型及び標識抗体）をも意味する。「抗体」は完全な抗体の修飾により、又はＤＮＡ組換え技術を使用してｄｅ−ｎｏｖｏ合成により生成された抗体フラグメントも含む。「抗体」の用語は、エピトープ決定基と結合することができる無傷の分子も、そのフラグメント（例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ）も包含する。
【００４７】
ＰＮＡ（ペプチド核酸又はポリアミド核酸）分子は、負電荷を持たず、ＤＮＡと同様に作用する分子である（Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４，１４９７−１５００；Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９７、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６，５０７２−５０７７；Ｗｅｉｌｅｒら、１９９７，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５，２７９２−２７９９）。ＰＮＡ配列はＮ−（２−アミノエチル）−グリシン単位からなるポリアミド基本骨格を含み、グルコース単位及びリン酸基を持たない。
【００４８】
本発明に関連して「分子特異的認識部位」とは、ナノ粒子と標的分子としての生体分子との間の特異的相互作用を可能にするナノ粒子の領域を意味する。相互作用は、ナノ粒子の第１の官能基と、標的分子即ち生体分子の第１の官能基と結合する相補的な第２の官能基と、の１以上の対の間の特定の吸引相互作用に基づく。ナノ粒子と生体分子の間の相互作用する個々の官能基対はそれぞれナノ粒子及び生体分子に空間的に固定されて配置されている。この固定は硬直的な配置である必要はなく、むしろ極めて柔軟でありうる。ナノ粒子と生体分子の官能基の間の吸引相互作用は非共有結合、例えばファンデルワールス結合、水素結合、π−π結合、静電相互作用又は疎水相互作用の形でありうる。可逆的共有結合、並びに形状又は形態の相補性に基づく機構も考えられる。このようにして本発明に基づき設けられるナノ粒子の分子特異的認識部位と標的分子との間の相互作用は、官能基対の間の特異的相互作用及びナノ粒子及び標的分子上の対の形成にかかわるこれらの基の相互の空間的配置に基づく。この相互作用は２つの結合パートナー間に共有結合型又は非共有結合型の親和性結合をもたらし、ミクロ構造体を形成するナノ粒子の表面に生体分子を固定化させる。
【００４９】
本発明の好ましい実施形態では、ナノ粒子の表面の分子特異的認識部位の構成部分であり又はこれを構成する第１の官能基は活性エステル、アルキルケトン基、アルデヒド基、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、マレインイミド基、ヒドラジン基、ヒドラジド゛基、チオール基、チオエステル基、オリゴヒスチジン基、ストレプ・タグＩ、ストレプ・タグＩＩ、デスチオビオチン、ビオチン、キチン、キチン誘導体、キチン結合ドメイン、金属キレート錯体、ストレプトアビジン、ストレプトアクチン、アビジン及びニュートラビジンからなる群より選ばれたものである。
【００５０】
また本発明によれば、分子特異的認識部位は第１の官能基を含む比較的大きな分子、例えばタンパク質、抗体等である。また分子特異的認識部位が複数のタンパク質及び／又は抗体及び／又は核酸からなる分子複合体であることも可能である。その場合これらの分子の少なくとも１つが第１の官能基を含む。タンパク質は分子特異的認識配列として例えば抗体及びこれと結合されたタンパク質を含むこともできる。その場合抗体はストレプトアビジン又はビオチン基を含んでいてもよい。抗体と結合されたタンパク質はレセプター、例えばＭＨＣタンパク質、サイトカイン、Ｔ細胞レセプター、例えばＣＤ−８タンパク質及びリガンドと結合することができるその他のレセプターであることも可能である。分子複合体は複数のタンパク質及び／又はペプチドを含み、例えば複合体中で別のタンパク質と結合し、さらにペプチドと結合するビオチン化タンパク質を含むこともできる。
【００５１】
第２の官能基、即ち固定化される生体分子の官能基は、本発明に基づき活性エステル、アルキルケトン基、アルデヒド基、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、マレインイミド基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、チオール基、チオエステル基、オリゴヒスチジン基、ストレプ・タグＩ、ストレプ・タグＩＩ、デスチオビオチン、ビオチン、キチン、キチン誘導体、キチン結合ドメイン、金属キレート錯体、ストレプトアビジン、ストレプトアクチン、アビジン及びニュートラビジンからなる群より選ばれたものである。
【００５２】
第１及び第２の官能基は例えば分子インプリンティング法によって生成することができる。第１及び第２の官能基は活性エステル、例えばいわゆるサーフマー（Ｓｕｒｆｍｅｒ）であることも可能である。
【００５３】
従って本発明に基づき使用されるナノ粒子はその表面に第１の官能基を有し、第１の官能基は固定化される生体分子の第２の官能基と共有又は非共有結合される。その場合第１の官能基は第２の官能基と異なる基である。互いに結合される２つの基は互いに相補的でなければならない。即ち互いに共有又は非共有結合することができなければならない。
【００５４】
本発明によれば、第１の官能基として例えばアルキルケトン基、特にメチルケトン又はアルデヒド基を使用する場合は、第２の官能基はヒドラジン又はヒドラジド基である。逆にヒドラジン又はヒドラジド基が第１の官能基として使用されるときは、本発明に基づき第２の官能基はアルキルケトン、特にメチルケトン又はアルデヒド基である。本発明に基づきチオール基を第１の官能基として使用するならば、第２の相補的官能基はチオエステル基である。第１の官能基としてチオエステル基を使用するならば、本発明に基づき第２の官能基はチオール基である。
【００５５】
本発明に基づき第１の官能基として金属イオンキレート錯体を使用するならば、第２の相補的官能基はオリゴヒスチジン基である。第１の官能基としてオリゴヒスチジン基を使用するならば、第２の相補的官能基は金属イオンキレート錯体である。
【００５６】
第１の官能基としてストレプ・タグＩ、ストレプ・タグＩＩ、ビオチン又はデスチオビオチンを使用するならば、第２の相補的官能基としてストレプトアビジン、ストレプトアクチン、アビジン又はニュートラビジンが使用される。第１の官能基としてストレプトアビジン、ストレプトアクチン、アビジン又はニュートラビジンが使用されるならば、第２の相補的官能基としてストレプ・タグＩ、ストレプ・タグＩＩ、ビオチン又はデスチオビオチンが使用される。
【００５７】
別の実施形態でキチン又はキチン誘導体が第１の官能基として使用されるならば、第２の相補的官能基としてキチン結合ドメインが使用される。第１の官能基としてキチン結合ドメインが使用されるならば、第２の相補的官能基としてキチン又はキチン誘導体が使用される。
【００５８】
上記の第１及び／又は第２の官能基は、本発明によれば、固定化される生体分子又はナノ粒子のコアにスペーサーによって結合させることができ、あるいはナノ粒子のコア又は生体分子にスペーサーによって導入することができる。このようにしてスペーサーは一方では官能基とコア又は生体分子間の距離を維持する役目を果たし、他方では官能基のための担体として役立つ。このようなスペーサーは本発明によればアルキレン基又は２個〜５０個の炭素原子を持つエチレンオキシドオリゴマーからなる。好ましい実施形態ではこれらはヘテロ原子で置換されてヘテロ原子を有する。
【００５９】
本発明の好ましい実施形態では、第２の官能基は生体分子特にタンパク質の天然の構成成分である。
【００６０】
中程度の大きさ、即ち約５００個のアミノ酸を持つ約５０ｋＤａの大きさのタンパク質では、原則として固定化のための官能基として考慮される反応性アミノ基が約２０〜３０個存在する。これは特にタンパク質のＮ末端のアミノ基に当てはまる。その他のすべての遊離アミノ基、特にリシン残基の遊離アミノ基も固定化のために考慮される。アルギニンのグアニジウム基も官能基として取り上げられる。
【００６１】
本発明の別の好ましい実施形態では、第２の官能基を遺伝子工学的手法、生化学的、酵素的及び／又は化学的誘導体化又は化学的合成法により生体分子に導入することが考えられる。誘導体化は、固定化の後も生物学的活性が維持されるように行わねばならない。
【００６２】
生体分子がタンパク質であるならば、例えば非天然アミノ酸を遺伝子工学的手法により又は化学的タンパク質合成の際に、例えばスペーサー又はリンカーとともに、タンパク質分子に導入することができる。このような非天然アミノ酸は、アミノ酸機能と残基Ｒを有し、天然の遺伝子コードによって規定されない化合物であって、このアミノ酸はチオール基を有することが特に好ましい。本発明によれば、天然のアミノ酸（例えばリシン）を、例えばその側鎖（特にその一級アミノ基）をレブリン酸のカルボン酸機能により誘導体化することによって修飾することもできる。
【００６３】
本発明の別の好ましい実施形態では、タンパク質をタグ即ちマーカーで修飾することによって官能基をタンパク質に挿入することができる。その場合、タグ即ちマーカーはタンパク質のＣ末端又はＮ末端に付加されることが好ましい。しかし、このタグを分子内に配置することもできる。特に少なくとも１個のストレプ・タグ、例えばストレプ・タグＩ又はストレプ・タグＩＩ又はビオチンを付加することによってタンパク質を修飾する。本発明によれば、ストレプ・タグとは、機能的及び／又は構造的等価体をも意味する。但しそれがストレプトアビジン基及び／又はその等価体と結合しうるという条件付きである。従って本発明の意味で「ストレプトアビジン」という用語は、その機能的及び／又は構造的等価体も包含する。また本発明によれば、タンパク質を、少なくとも３個のヒスチジン残基を含むヒス・タグ（Ｈｉｓ−Ｔａｇ）に、とりわけオリゴヒスチジン基を介して、付加することによって修飾することが考えられる。タンパク質に挿入されたヒス・タグは、次に金属キレート錯体を含む分子特異的認識部位に結合することができる。
【００６４】
そこで本発明の好ましい実施形態では、例えば非天然アミノ酸、人工的に誘導体化された天然アミノ酸又は特異的ストレプ・タグで修飾されたタンパク質又は抗体結合タンパク質を、これと相補的な反応性ナノ粒子表面に結合させて、該タンパク質の表面への適当な特異的（特に非共有的）結合、それゆえに該タンパク質の特異的固定化が起こるようにする。タグ結合部位を介する生体活性分子の整列後、これらの分子をさらに例えばグルタルジアルデヒドのような架橋剤を用いて共有結合させることもできる。その結果タンパク質表面がより安定になる。
【００６５】
機能要素の担体表面にミクロ構造体を形成するために付着されたナノ粒子は、分子特異的認識部位を有する表面のほかにコアを有する。本発明に関連してナノ粒子の「コア」とは、固定化される分子のための担体の役割をする化学的に不活性な物質を意味する。本発明によればコアは５ｎｍ〜５００ｎｍの大きさの密な又は中空の粒子である。
【００６６】
本発明の好ましい実施形態では、本発明に基づき使用されるナノ粒子のコアは無機材料、例えば金、銀又はＮｉのような金属、ケイ素、ＳｉＯ２、ＳｉＯ、ケイ酸塩、Ａｌ２Ｏ３、ＳｉＯ２・Ａｌ２Ｏ３、Ｆｅ２Ｏ３、ＡｇＯ２、ＴｉＯ２、ＺｒＯ２、Ｚｒ２Ｏ３、Ｔａ２Ｏ５、ゼオライト、ガラス、インジウム・スズ酸化物、ヒドロキシルアパタイト、Ｑ−Ｄｏｔ又はその混合物からなるか、もしくはこれを含有する。
【００６７】
本発明の別の好ましい実施形態では、コアが有機材料からなるか、又はこれを含む。とりわけ有機ポリマーはポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアクリル酸、乳酸のポリエステル又はその混合物である。
【００６８】
本発明に基づき使用されるナノ粒子のコアの作製は、当業者に周知の慣用の方法、例えばゾルゲル合成法、乳化重合、懸濁重合等を使用して行うことができる。コアを作った後に、例えばグラフト重合、シラン化、化学的誘導体化等のような慣用の方法を使用して、化学的修飾反応によってコアの表面に特異的な第１の官能基を設けることができる。表面修飾したナノ粒子を１段階で作る方法は、乳化重合でサーフマーを使用することである。別の方法は分子インプリンティング法である。
【００６９】
分子インプリンティング法とは、重合時にモノマーと比較的安定な複合体を形成することができる鋳型の存在下でのモノマーの重合と理解される。鋳型を洗い流した後に、こうして作られた材料は、鋳型分子、鋳型分子と構造的に近縁な分子種、又は鋳型分子もしくはその一部と構造的に近縁な又は同一の基を有する分子と再び特異的に結合することができる。従って鋳型とは、重合時にモノマー混合物中に存在し、形成されたポリマーが親和性を示す物質である。
【００７０】
本発明に基づきサーフマーを使用して乳化重合により表面修飾ナノ粒子を作製することが特に好ましい。サーフマー（Ｓｕｒｆｍｅｒ）とは、ラテックス粒子の表面上で重合させることができ、これを安定化する両親媒性モノマー（Ｓｕｒｆｍｅｒ＝Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ＋ｍｏｎｏｍｅｒ）である。反応性サーフマーはさらに官能化可能な末端基を有する。この末端基は温和な条件で求核性物質、例えば一級アミン（アミノ酸、ペプチド、タンパク質）、チオール又はアルコールと反応することができる。こうして多数の生物学的に活性なポリマーナノ粒子が得られる。サーフマーの応用の先行技術並びにその可能性及び限界を示す刊行物は、米国特許第５，１７７，１６５号、米国特許第５，５２５，６９１号、米国特許第５，１６２，４７５号、米国特許第５，８２７，９２７号及び日本国特許第４０１８９２９号である。反応性末端基を持つサーフマーの合成に関する研究は、とりわけＮａｇａｉら（Ｐｏｌｙｍｅｒ  １９９６，３７（１），１２５７−１２６６；Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｌｌｏｉｄ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９５，１７２，６３−７０）、Ａｓｕａら（Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．１９９７，６６，１８０３−１８２０）及びＧｕｙｏｔら（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｏｌｌｏｉｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉ．１９９６，１（５），５８０−５８６）によって発表されている。
【００７１】
第１の官能基の密度とこの基の相互の間隔は、本発明に従って固定化される分子ごとに最適化することができる。表面上の第１の官能基の周囲も、生体分子の固定化を可能な限り特異的なものとするために、適切に調製される。
【００７２】
本発明の好ましい実施形態では、適当な検出法を使用してナノ粒子それゆえにミクロ構造体の簡便な検出を可能にする補助機能がコアに定着されている。この機能は例えば蛍光標識、紫外／可視標識、超常磁性機能、強磁性機能及び／又は放射性標識である。ナノ粒子の適当な検出法は例えば蛍光又は紫外／可視分光法、蛍光又は光学顕微鏡法、ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザ脱離イオン化）質量分析法、導波路分光法、インピーダンス分光法、電気的及び放射測定的方法を包含する。別の実施形態では、補助機能例えば蛍光標識、紫外／可視標識、超常磁性機能、強磁性機能及び／又は放射性標識を被着することによってコア表面を修飾することができる。さらに本発明の別の実施形態では、第１の官能基及び上記の補助機能を有する有機又は無機層によってナノ粒子のコアを表面修飾する。
【００７３】
本発明の別の実施形態では、コア表面は、固定化された分子の立体的安定化及び／又は該分子のコンホメーション変化の阻止のため及び／又は別の生物学的活性化合物のコア表面への付着の阻止のために利用される化合物を有する。この化合物はとりわけポリエチレングリコール、オリゴエチレングリコール、デキストラン又はその混合物である。
【００７４】
本発明によれば、ナノ粒子のコアの表面に別個に又は補足的にイオン交換機能を定着させることも可能である。イオン交換機能を有するナノ粒子はそれによって有害なイオンを結合することができるから、特にＭＡＬＤＩ分析の最適化のために適している。
【００７５】
本発明の別の実施形態では、機能要素のミクロ構造体に固定化された生体分子は、適当な検出法を使用してミクロ構造体に固定化された生体分子を簡単に検出することを可能にする標識を有する。この標識は例えば蛍光標識、紫外／可視標識、超常磁性機能、強磁性機能及び／又は放射性標識である。前述のように、これらの標識の検出法として例えば蛍光又は紫外／可視分光法、ＭＡＬＤＩ質量分析法、導波路分光法、インピーダンス分光法、電気的及び放射測定的方法が考えられる。
【００７６】
本発明の別の実施形態は、ミクロ構造体に固定化された少なくとも１つの生体分子を有し、この固定化分子に少なくとも１つの別の生体分子が共有又は非共有結合されている機能要素に関する。ミクロ構造体に固定化された分子がタンパク質であれば、これに例えば第２のタンパク質又は抗体を、例えばタンパク質−タンパク質相互作用により又は抗体−抗原結合により結合させることができる。ミクロ構造体に固定化された分子が核酸であれば、これに例えばタンパク質を結合させることができる。
【００７７】
本発明の別の好ましい実施形態は、１以上のミクロ構造体が単一のナノ粒子層からなる機能要素に関する。本発明の別の好ましい実施形態は、１以上のミクロ構造体が同じナノ粒子の複数の重なり合った層からなる機能要素に関する。各層は適当なポリマーからなる前述の結合層によってその下の層に強固に結合される。
【００７８】
さらに本発明の別の好ましい実施形態は、担体表面に複数の異なるミクロ構造体が並置され、これらのミクロ構造体が異なる分子特異的認識部位を有するナノ粒子からなる機能要素に関する。従ってこのような機能要素は、異なる生体分子が固定化された又は固定化され得るミクロ構造体を並列的に含む。従ってこのような機能要素の担体表面は、例えばタンパク質が固定化された又は固定化され得るミクロ構造体と、核酸が固定化された又は固定化され得るミクロ構造体を同時に含むことができる。また機能要素は異なるタンパク質又は異なる核酸が同時に固定化された又は固定化され得るミクロ構造体を有することもできる。
【００７９】
本発明の別の実施形態は、ミクロ構造体で覆われていない担体表面の部分が補助機能又は化合物を被着することによって修飾されている機能要素に関する。これらは特に、担体表面のミクロ構造体で覆われていない領域への生体分子の非特異的結合を阻止する機能又は化合物である。とりわけこの化合物はポリエチレングリコール、オリゴエチレングリコール、デキストラン又はその混合物である。特に機能要素の担体表面がエチレンオキシド層を含むことが好ましい。
【００８０】
また本発明は、適当な担体の表面に、結合剤の少なくとも１層、次いで分子特異的認識配列を有するナノ粒子からなる少なくとも１つのミクロ構造体を被着する、本発明に基づく機能試験の作製方法に関する。
【００８１】
本発明によれば、結合剤の層を被着させる前に機能要素の表面をあらかじめ構造化する。担体表面の予備構造化の後に、担体表面への生体分子の非特異的結合を阻止する化合物の層を被着することができる。その場合とりわけエチレンオキシド層が好ましい。
【００８２】
本発明の好ましい実施形態では、本発明に基づく機能要素の担体表面を、予備構造化の後で結合剤層の被着の前に活性化する。本発明によれば、活性化は清浄化を含むこともできる。機能要素の担体表面の活性化は、本発明に基づき化学的方法を使用して、特にプライマー又は酸もしくは塩基を使用して行うことができる。また本発明に基づきプラズマを使用して担体表面を活性化することも可能である。活性化は自己集合単分子層の被着を含むこともできる。
【００８３】
本発明に従う機能要素の担体表面にミクロ構造体を作製するために、基本的に次の２つの実施形態が使用される。
【００８４】
本発明の機能要素の本発明に基づく作製方法の第１の実施形態では、まず結合剤を担体表面に構造化された様式で被着する。本発明の趣旨に基づき「構造化された」とは、一定の形状と面の結合剤層が担体表面に塗布され、こうして塗布された結合剤層がその後ミクロ構造体によって覆われる担体表面の部分を確定することを意味する。次に機能要素の担体をナノ粒子懸濁液に浸漬することによってミクロ構造体を被着させるが、その際ナノ粒子は構造化された被着結合剤層にだけ付着し、結合剤層がない担体表面の部分には付着しない。こうして形状と面が確定されたミクロ構造体が作られる。
【００８５】
本発明による構造化された結合剤層は、例えばリング／ピン・プリンター、インクジェット法（例えば圧電的もしくは熱的方法）、又はマイクロコンタクト印刷法によって塗布される。リソグラフィー法、特にフォトリソグラフィー又はマイクロペンリソグラフィー法を使用する場合は、担体表面を結合剤で覆い、次にこうして作られた結合剤層をリソグラフィー法によって構造化する。結合剤を適当に選択することによって、ミクロ構造体又はその一部が外部から操作され、例えばその後の時点でｐＨ値、イオン濃度又は温度を変えることにより再び剥離される（ｄｅｂｏｎｄ  ｏｎ  ｃｏｍｍａｎｄ［要求に応じた剥離］）ようにミクロ構造体を設計することができる。このようにして、例えばミクロ構造体はある機能要素から他の機能要素に転移させることができる。
【００８６】
安定したナノ粒子懸濁液を簡単に調製するには、必要に応じて補助成分、例えばｐＨ調整剤、懸濁助剤などを使用して、ナノ粒子を液体（特に水性媒質）に懸濁させる。
【００８７】
本発明に基づく機能要素の作製方法の第２の実施形態では、まず担体に全担体表面を覆う結合剤層を付着させる。これは例えば、担体を結合剤の懸濁液又は溶液に浸漬することによって行うことができる。続いてミクロ構造体を作製するために、例えばリング／ピン・プリンター、インクジェット法（例えば圧電的もしくは熱的方法）又はマイクロコンタクト印刷法を使用して、ナノ粒子懸濁液を構造化された状態で被着させ、こうして形状と面が確定されたミクロ構造体が作られる。リソグラフィー法、特にフォトリソグラフィー又はマイクロペンリソグラフィー法を使用する場合は、担体表面をナノ粒子懸濁液で覆い、次にこうして生じたナノ粒子層をリソグラフィー法によって構造化させる。
【００８８】
ミクロ構造体を作るために本発明の機能要素の担体表面に被着されるナノ粒子は、生体機能化可能なナノ粒子であり、即ちまだ生体分子が結合していない分子特異的認識部位だけを有するナノ粒子である。しかし本発明によれば、担体表面の構造化のために、生体機能化されたナノ粒子、即ち生体分子がその生物学的活性を維持しつつ分子特異的認識部位にすでに固定化されているナノ粒子、を使用することも可能である。本発明によれば、固定化される生体分子は特にタンパク質、ＰＮＡ分子又は核酸である。
【００８９】
本発明の別の好ましい実施形態では、強固に付着している多層ミクロ構造体を作るために、同じ結合剤及び／又は同じナノ粒子を数回塗布する。本発明によれば、上記の方法の一つを１０回まで反復することが可能である。また異なる機能を有する異なるミクロ構造体を備えた機能要素を作製するために、異なる結合剤及び／又は異なるナノ粒子を使用して上記の方法を反復することもできる。
【００９０】
本発明の別の好ましい実施形態では、磁界を使用して超常磁性又は強磁性酸化鉄ナノ粒子を担体表面に構造化された状態で配置し、こうしてミクロ構造体、特にナノ級の条導体を直接形成することができる。
【００９１】
機能要素の担体表面にナノ粒子を被着した後に、本発明によれば、粒子をさらに変換させることが可能である。粒子が例えば反応性エステルを含むならば、これをタンパク質の直接結合のために使用することができる。またナノ粒子に補助機能を持たせるために、ナノ粒子を変換させることもできる。本発明によれば、粒子を例えば互いと及び／又は結合剤と共有結合で架橋することによって、ナノ粒子からなるミクロ構造体をさらに固定することも可能である。
【００９２】
また本発明は、試料中の被検体の検査のために及び／又は試料からのその単離及び／又は精製のために本発明の機能要素を使用することに関する。その場合、本発明による機能要素は、例えば遺伝子アレイもしくは遺伝子チップとして、又はタンパク質アレイとして設計される。本発明に関連して「被検体」とは、その個別成分の正体と量が決定され且つ／又は混合物から分離される物質を意味する。特に被検体はタンパク質、核酸、炭水化物等を含む。本発明の好ましい実施形態では、被検体はタンパク質、ペプチド、活性物質、有害物質、毒素、殺虫剤、抗原又は核酸である。「試料」とは、上記で定義した被検体を単離又は精製した形で、もしくは種々の物質の複合混合物の一成分として含む水性又は有機の溶液、エマルジョン、分散液又は懸濁液を意味する。試料は例えば体液（例えば血液、リンパ液、組織液等）、即ち生存している又は死滅している生物、器官又は組織から採取された液体であり得る。また試料は生物（例えば微生物）又はヒト、動物もしくは植物の細胞が培養されていた培地、例えば発酵培養液であってもよい。さらにまた、本発明の意味で試料とは、単離及び精製された被検体の水溶液、エマルジョン、分散液又は懸濁液であることも可能である。試料はすでに精製段階を経たものでもよいし、未精製のものであってもよい。
【００９３】
そこで本発明は、分析及び／又は検出方法の実施のために本発明の機能要素を使用することにも関する。その場合、これらの方法はＭＡＬＤＩ質量分析法、蛍光又は紫外／可視分光法、蛍光又は光学顕微鏡法、導波路分光法又は電気的方法（例えばインピーダンス分光法）である。
【００９４】
また本発明は、細胞接着又は細胞増殖の調節のために本発明の機能要素を使用することに関する。
【００９５】
また本発明は、生体分子の検出及び／又は単離のために本発明の機能要素を使用することに関する。例えば、ミクロ構造体に一本鎖核酸が固定化された本発明の機能要素は、試料中の相補的核酸の検出のため及び／又はこの相補的核酸の単離のために使用することができる。ミクロ構造体にタンパク質が固定化された本発明の機能要素は、例えば固定化されたタンパク質と相互作用するタンパク質を試料から検出及び／又は単離するために使用することができる。
【００９６】
また本発明は、薬剤の開発のために本発明の機能要素を使用することに関する。また本発明は、薬剤の効果及び／又は副作用の検査のために本発明の機能要素を使用することに関する。本発明に基づく機能要素は疾患の診断に使用することができ、例えば病源体の同定や発病を招く突然変異遺伝子の同定に使用される。本発明の機能要素の別の用途は、地表水、地下水及び土壌の微生物汚染の検査である。同様に、本発明の機能要素は食品又は動物飼料の微生物汚染の検査にも使用される。
【００９７】
本発明の機能要素の別の好ましい使用は、電子部品例えば分子スイッチ回路等として、メディカルエンジニアリングにおいて、又はバイオコンピュータにおいて本発明の機能要素を使用することである。特に本発明の機能要素を光学的情報処理における光学的記憶装置として使用することが好ましい。その場合、本発明の機能要素は特にミクロ構造体に固定化された光受容体タンパク質を含み、このタンパク質は光を直接シグナルに変換することができる。
【００９８】
本発明のその他の有利な実施形態は、従属請求項に従うものである。
【００９９】
本発明を図面及び実施例に基づいてさらに詳しく説明することにする。
【実施例１】
【０１００】
シリカ粒子の合成
２００ｍｌのエタノールに１２ｍｍｏｌのテトラエトキシシラン及び９０ｍｍｏｌのＮＨ３を加える。次にこれを室温で２４時間撹拌する。続いて反復遠心分離により粒子を清浄化する。
【０１０１】
平均粒度１２５ｎｍのシリカ粒子６５０ｍｇが得られる。
【実施例２】
【０１０２】
磁性酸化鉄粒子の合成
２ＭのＨＣｌ中に溶解した２ＭのＦｅＳＯ４溶液５ｍｌと１ＭのＦｅＣｌ３溶液２０ｍｌを、激しく撹拌しながら０．７ＭのＮＨ３溶液２５０ｍｌに加える。次に３０分間再び撹拌し、黒色の固形物を２００ｍｌの水で洗浄する。続いて沈殿物を１００ｍｌの２Ｍ  ＨＮＯ３とともに３０分撹拌し、１００ｍｌの水で３回洗浄する。超常磁性酸化鉄ナノ粒子を５０ｍｌの０．１Ｍ水酸化テトラメチルアンモニウム溶液に再懸濁する。
【０１０３】
平均粒度１０ｎｍの酸化鉄粒子２ｇが得られる。
【実施例３】
【０１０４】
磁性複合粒子の合成
上記で得られた磁性酸化鉄ナノ粒子５０ｍｇを５ｍｌのエタノールで２回洗浄し、次に２００ｍｌのエタノールに入れる。次に１２ｍｍｏｌのテトラエトキシシラン及び９０ｍｍｏｌのＮＨ３を加える。室温で２４時間撹拌した後、反復遠心分離により粒子を清浄化する。
【０１０５】
平均粒度１５０ｎｍの磁性複合粒子６００ｍｇが得られる。
【実施例４】
【０１０６】
蛍光粒子の合成
１９０μｍｏｌのフルオレセインアミンと１７０μｍｏｌのイソシアナトプロピルトリエトキシシランを５０ｍｌのエタノール中で還流しつつ３時間加熱する。５０ｍｌのエタノールに３ｍｍｏｌのテトラエトキシシランと８８０μｌのシラン染料溶液を加える。２２．５ｍｍｏｌのＮＨ３を加えた後、室温で２４時間撹拌する。続いて反復遠心分離により粒子を清浄化する。
【０１０７】
平均粒度１１０ｎｍのシリカ粒子１６０ｍｇが得られる。
【実施例５】
【０１０８】
有機ポリマーナノ粒子の合成
５０ｍｇの乳化剤ｐ−（１１−アクリルアミド）−ウンデセノイルオキシフェニル−ジメチルスルホニウム−メチルスルフェートを３０ｍｌの水に撹拌しつつ溶解する。この溶液にアルゴンを１時間通す。次いで１．８ｍｌのメタクリル酸メチルを撹拌しつつ加える。生じた乳濁液を６０℃に熱する。１０ｍｇの２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩を加えることによって重合を開始する。５時間後に粒子懸濁液を冷却し、遠心分離により粒子を清浄化する。
【０１０９】
平均粒度１４５ｎｍの粒子１．６ｇが得られる。粒子は表面に共有結合されたスルホニウム基を有し（リン酸緩衝液ｐＨ７．０中のゼータ電位：＋２２ｍＶ）、求核基と結合する能力がある。
【実施例６】
【０１１０】
粒子の表面修飾（アミノ官能基化表面）
実施例１〜４の１つで得られた粒子の１重量％水性懸濁液に１０容積％の２５％アンモニアを加える。次に粒子に対し２０重量％のアミノプロピルトリエトキシシランを加え、室温で１時間撹拌する。反復遠心分離により粒子を清浄化する。この粒子は表面にアミノ官能基を有する（０．１Ｍ酢酸緩衝液中のゼータ電位：＋３５ｍV）。
【実施例７】
【０１１１】
粒子の表面修飾（アミノ官能基化有機ポリマー粒子）
実施例５で得られた粒子１０ｍｇを５０μｌの１０ｍｍｏｌリン酸緩衝液（ｐH７．８）に入れ、１０ｍｍｏｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）中の１Ｍエチレンジアミン溶液９５０μｌと混合する。次にこれを室温で２時間振とうする。続いて遠心分離により清浄化する。この粒子は表面に共有結合されたアミノ基を有する。
【実施例８】
【０１１２】
粒子の表面修飾（カルボキシル官能基化表面）
アミノ官能基化ナノ粒子の２重量％懸濁液１０ｍｌをテトラヒドロフランに入れる。これに２６０ｍｇの無水コハク酸を加える。超音波で５分間処理した後に室温で１時間撹拌する。次に反復遠心分離により粒子を清浄化する。得られるシリカ粒子は表面にカルボキシル官能基を有し（０．１Ｍ酢酸緩衝液中のゼータ電位−３５ｍＶ）、１７０ｎｍの平均粒度を有する。
【実施例９】
【０１１３】
粒子の表面修飾（カルボキシ−デキストラン修飾粒子）
０．１Ｍのモルホリノ−エタンスルホン酸緩衝液（ＭＥＳ、ｐＨ：５．０）１ｍｌに１０ｍｇのアミノ官能基化ナノ粒子と１ｍｇのカルボキシデキストラン（Ｓｉｇｍａ、＞５５ｃｐｓ）を入れる。これに濃度５００μｍｏｌ／ｍｌのＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）溶液３０μｌを加える。次に室温で３０分振とうする。粒子を交互にＭＥＳ及びＴＢＥ緩衝液（８９ｍＭトリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン、８９ｍＭホウ酸、２ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸、ｐＨ：８．３）で洗浄して、１ｍｌのＭＥＳ緩衝液に入れる。得られるシリカ粒子は表面にカルボキシル官能基（０．１Ｍ酢酸緩衝液中のゼータ電位−２５ｍＶ）を有し、１６０ｎｍの平均粒度を有する。
【０１１４】
このデキストラン表面は、その三次構造が粒子表面への吸着過程によって乱されるタンパク質の固定化に特に適している。
【実施例１０】
【０１１５】
粒子の表面修飾（カルボキシ−（デキストラン）粒子のアミノ官能基化）
０．１ＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０）中に溶解した１Ｍのエチレンジアミン溶液を調製する。これにカルボキシ（デキストラン）修飾粒子５００μｇ及び５００μｍｏｌ／ｍｌのＥＤＣ溶液３０μｌを加える。次に室温（ＲＴ）で３時間振とうする。続いてＭＥＳ緩衝液で数回洗浄する。平均粒度１６０ｎｍ、０．１Ｍ酢酸緩衝液中のゼータ電位＋２５ｍＶの粒子が得られる。
【０１１６】
官能基の密度及びスペーサーの長さを変えるために、別のアミン例えば４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミン（又はより高級の同族体）又はトリス−（２−アミノエチル）−アミンを同様に使用することもできる。
【実施例１１】
【０１１７】
粒子の表面修飾（ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）表面）
１０ｍｇのカルボキシル修飾粒子を１ｍｌのアセトニトリル（ＭｅＣＮ）で２回洗浄して、１ｍｌのＭｅＣＮに入れる。これに１０μｍｏｌのジシクロヘキシルカルボジイミド及び１０μｍｏｌのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを加える。次に室温で２時間振とうする。続いて１ｍｌのシクロヘキサンで１回、１ｍｌのＭｅＣＮで１回洗浄する。反応混合物を１ｍｌのＭｅＣＮに入れる。これに４μｍｏｌのＮ，Ｎ−ビスカルボキシメチル−Ｌ−リシンを加える。室温で３時間振とうした後、１ｍｌのアセトニトリルで１回、１ｍｌの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で２回洗浄する。
【０１１８】
この反応によって、一方ではカルボキシル官能基の密度が高められ、他方では錯化によりこの表面にＮｉ２＋イオンを結合させることができる。そこで表面はヒス・タグ修飾タンパク質と結合する能力を有する。
【実施例１２】
【０１１９】
粒子の表面修飾（チオール表面）
１０ｍｇのカルボキシル修飾粒子を１ｍｌのアセトニトリル（ＭｅＣＮ）で２回洗浄して、１ｍｌのＭｅＣＮに入れる。これに１０μｍｏｌのジシクロヘキシルカルボジイミド及び１０μｍｏｌのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを加え、室温で２時間振とうする。１ｍｌのシクロヘキサンで１回、１ｍｌのＭｅＣＮで１回洗浄し、１ｍｌのＭｅＣＮに入れる。これに５００μｇのシステインを加え、室温で３時間振とうする。１ｍｌのアセトニトリルで１回、１ｍｌの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で２回洗浄する。
【０１２０】
この表面はジスルフィド橋によるタンパク質の固定化に適している。
【実施例１３】
【０１２１】
タンパク質固定化のための官能基化（マレイミド活性化表面）
５００μｇのアミノ官能基化粒子を１ｍｌの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に再懸濁する。これに１．２５μＭｏｌのスルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレートを加える。室温で１時間振とうした後、常温の１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で１回洗浄し、混合物を１ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に入れる。
【実施例１４】
【０１２２】
タンパク質固定化のための官能基化（ヨードアセチル活性化表面）
５００μｇのアミノ官能基化粒子を１ｍｌの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に再懸濁する。これに１．２５μｍｏｌのアミノ安息香酸スクシンイミジル−（４−ヨードアセチル）を加え、室温で１時間振とうし、冷却した０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で１回洗浄し、１ｍｌの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐｈ７．０）に入れる。
【０１２３】
この表面は遊離チオール基を有するタンパク質をカップリングさせるのに適している。
【実施例１５】
【０１２４】
タンパク質固定化のための官能基化（ビオチン化表面）
５００μｇのアミノ官能基化粒子を１ｍｌの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に再懸濁する。これに１．２５μｍｏｌのスクシンイミドビオチンを加えて、室温で１時間振とうし、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で１回洗浄し、１ｍｌの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に入れる。
【０１２５】
官能基による被覆は実施例１３〜１５に記述されており、これは定量的に行われる。またこの被覆は通常、反応条件の選択によって（たいてい修飾剤の濃度によって）、部分的にしか起こらないように制御することができる。修飾剤の適当な選択によって、様々な官能基を粒子表面に並存させることも可能である。この例は次のとおりである。
【０１２６】
−ＮＨ２と−ＣＯＯＨ：
実施例８で無水コハク酸の濃度を低下させる。ＮＨ２／ＣＯＯＨ比を適当に選択することによって、粒子系の等電点を広い範囲（８〜３）で変えることができる。これは、タンパク質との反応において反応性を制御するための決定的なパラメータである（同じ電荷をもつ系は反発し合う）。
【０１２７】
−ＳＨとＮＴＡ：
実施例１１又は１２で説明したように反応を行う。但し２つの修飾剤の混合物を使用する。こうしてヒス・タグを有するタンパク質を第１段階で非共有的に配向させ、続いてこの状態を共有結合ジスルフィド橋の形成によって永久的に固定させることができる。
【実施例１６】
【０１２８】
タンパク質の固定化（ストレプトアビジン修飾粒子）
１０ｍｌの０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０）に２．６８ｎｍｏｌのストレプトアビジンを入れる。これに実施例８で得られた粒子５ｍｇを加える。さらに２μｍｏｌのＥＤＣを加える。室温で３時間振とうした後、粒子を１０ｍｌのＭＥＳ緩衝液で１回、１０ｍｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で１回洗浄する。その後粒子を１０ｍｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に入れる。
【実施例１７】
【０１２９】
タンパク質の固定化（プロテインＧ修飾粒子）
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１０ｍｌに３００μｇのプロテインＧを入れる。これに実施例５の粒子５ｍｇを加え、室温で３時間振とうする。続いて粒子を１０ｍｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で２回洗浄してから、１０ｍｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に入れる。
【０１３０】
実施例１６及び１７は２つの異なる方法による２つのタンパク質の固定化を例示する。この２つの方法で多くの様々なタンパク質を固定化することができる。上記の粒子によってその他の多くの戦略が考えられ、例えばカルボキシル修飾粒子のスクシンイミドによる活性化、遊離システインのチオール／マレインイミド表面へのカップリングである。また多官能性粒子への異なるタンパク質の並行カップリングも可能である。
【０１３１】
実施例１〜１７で説明したすべての粒子はミクロ構造体の形成のために直接使用することができる。
【実施例１８】
【０１３２】
シリカコアを有するナノ粒子を用いて調製したシリコン表面上での、リング／ピン・プロッターを使用する遺伝子又はタンパク質アレイの作製
リング／ピン・マイクロアレイヤーを使用して、実施例１のナノ粒子懸濁液をシリコン担体に塗布した。裁断したシリコン担体を２容積％のＨＥＬＬＭＡＮＥＸ（登録商標）水溶液中に４０℃で９０分間静置する。室温で５分間超音波浴にて処理し、脱イオン水で洗浄する。窒素で乾燥した後、楕円偏光計で層の厚さを測定する。
【０１３３】
続いて試料を７０℃の３：１（ｖ／ｖ）ＮＨ３／Ｈ２Ｏ２溶液で３０分間ヒドロキシル化する（ＮＨ３：ｐｕｒｉｓｓ．ｐ．ａ．、約２５％水溶液；Ｈ２Ｏ２：分析用、ＩＳＯ試薬、安定化、脱イオン水１８ｍΩ）。試料を脱イオン水でよく洗浄してから、水中に静置（最大３時間）する。基体を室温で高分子電解質溶液（脱イオン水中の０．０２Ｍポリジアリルジメチルアンモニウムクロリド（ＰＤＡＤＭＡＣ）、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、分子量＝１００〜２００ｋＤａ）に移す。２０分後に脱イオン水でよく洗浄する。試料を室温で超音波浴にて５分間処理し、洗浄し、窒素で乾燥する。こうして調製したシリコン担体をスライドガラス（約７６×２６ｍｍ）に接着する。１重量％ナノ粒子水性懸濁液の１ｍｌ部分をそれぞれ１５秒間振とうして、室温で超音波浴にて分散させる。
【０１３４】
プレートのウェル（３００μｌの９６ウェル、Ｕ字形）に１００μｌの分散液を充填する。プレート中の溶液を放出させ、１５分後にリング／ピン・マイクロアレイヤー（ＧＭＳ４１７，Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，ＵＳＡ）により実験室条件でシリコン担体に移す。リング／ピン・マイクロアレイヤーを適当にプログラミングすることによって、規則的に配置され、互いに明確に分離された直径約１５０μｍ〜２００μｍのマイクロスポットが得られ、個々のミクロ構造体の間隔は数ミクロンである。光学顕微鏡又は走査型電子顕微鏡によるマイクロスポットの分析は、驚いたことに、ナノ粒子懸濁液を正確に同じ位置に１０回被着した場合（ドット当り１０のヒット）、ナノ粒子がマイクロスポットの周縁に特に集積していることを明らかにした。ドット当り１〜２回のヒットで被着した場合には、マイクロスポット内にナノ粒子の均一な分布が得られる。
【０１３５】
図１は、直径１５０μｍ〜１５５μｍで水平軸沿いに５μｍ〜２０μｍの可変間隔、垂直軸沿いに１4０μｍの間隔を有する、シリコン担体上の上記ナノ粒子によるミクロ構造体化マイクロスポットの光学顕微鏡写真を示す。
【０１３６】
図２は、正確に同じ位置に１０回被着したナノ粒子懸濁液のマイクロスポット周縁部の、走査型電子顕微鏡により得られた三次元写真を示す。ナノ粒子がマイクロスポットの周縁部に集まっていることがはっきり分かる。
【実施例１９】
【０１３７】
シリカコアを有するナノ粒子を用いて調製したガラス表面上での、リング／ピン・プロッターを使用する遺伝子又はタンパク質アレイの作製
リング／ピン・マイクロアレイヤーを使用して実施例１のナノ粒子懸濁液をガラス担体に被着した。ガラス担体は実施例１８のように予備処理し、１重量％の水性ナノ粒子懸濁液を実施例１８と同様にガラス表面に被着する。
【０１３８】
図３は、直径１４０μｍ〜１４５μｍで水平軸沿いに５μｍ〜２０μｍの可変間隔、垂直軸沿いに１4０μｍの間隔を有するガラス担体上の上記ナノ粒子によるミクロ構造体化マイクロスポットの光学顕微鏡写真を示す。
【実施例２０】
【０１３９】
ＰＭＭＡコアを有するナノ粒子を用いて調製したガラス表面上での、リング／ピン・プリンターを使用する遺伝子又はタンパク質アレイの作製
リング／ピン・マイクロアレイヤーを使用して実施例５のナノ粒子懸濁液をガラス担体に被着した。ガラス担体を４０℃の２容積％ＨＥＬＬＭＡＮＥＸ（登録商標）水溶液中に９０分間静置する。次に室温で５分間の超音波浴処理を行い、脱イオン水で洗浄する。窒素で乾燥した後、楕円偏光計で層の厚さを測定する。続いて試料を７０℃の３：１（ｖ／ｖ）ＮＨ３／Ｈ２Ｏ２溶液で３０分間ヒドロキシル化する（ＮＨ３：ｐｕｒｉｓｓ．ｐ．ａ．、約２５％水溶液；Ｈ２Ｏ２：分析用、ＩＳＯ試薬、安定化、脱イオン水１８ｍΩ）。試料を脱イオン水でよく洗浄してから水中に静置（最大３時間）する。基体を室温で高分子電解質溶液１（脱イオン水中の０．０２Ｍポリジアリルジメチルアンモニウムクロリド（ＰＤＡＤＭＡＣ）、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、分子量＝１００〜２００ｋＤａ）に移す。２０分後に脱イオン水でよく洗浄する。次にガラス担体を室温で２０分間高分子電解質溶液２（脱イオン水中０．０１Ｍポリスチレンスルホン酸ナトリウム塩（ＳＰＳ）、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、分子量＝７０ｋＤａ）に移す。高分子電解質溶液２の中に静置した後、室温の脱イオン水中で５分間超音波浴処理し、窒素で乾燥する。続いて１重量％の水性ナノ粒子懸濁液を実施例１及び２と同様にガラス表面に被着する。
【０１４０】
図４は、直径１６０μｍ〜１６６μｍで水平軸沿いに５μｍ〜２０μｍの可変間隔、垂直軸沿いに１4０μｍの間隔を有する、ガラス担体上の上記ナノ粒子によるミクロ構造体化マイクロスポットの光学顕微鏡写真を示す。
【０１４１】
図５は、実施例５で得られた固定化ナノ粒子の維持された機能を示すグラフ（導波路分光計）である。基線はそれぞれ０．１Ｍリン酸緩衝液である。Ａ）０．１Ｍ  ＮａＣｌ中の０．０２ＭのＰＤＡＤＭＡＣの添加。Ｂ）０．１Ｍ  ＮａＣｌ中の０．０１ＭのＳＰＳの添加。Ｃ）対照試験として０．５μｍ（１）及び１μｍ（２）のストレプトアビジンの添加。非特異的結合は認められない。Ｄ）０．５％（ｗ／ｖ）のナノ粒子の添加。Ｅ）ストレプトアビジン０．５〜３μｍの結合。Ｆ）差（ｓｅｃ−１）。これは粒子に特異的に結合することができた量である。
【実施例２１】
【０１４２】
リソグラフィー法を使用する遺伝子又はタンパク質アレイの作製
実施例１８で説明したように被覆したシリコン担体を水銀ＵＶランプ（Ｐｅｎ−Ｒａｙ，ＵＰＶ，ＵＳＡ）の下へ２ｃｍの距離に置く。ランプのステムを垂直に対して４５°傾けた。銅格子（Ｐｌａｎｏ、ドイツ、ｄ＝３．０５ｍｍ）を載せた後、ＰＤＡＤＭＡＣで被覆した担体を４５分間照射する。実施例６で得られた１重量％の水性ナノ粒子懸濁液の１ｍｌをそれぞれ１５秒間振とうし、室温で超音波浴にて分散させる。銅格子を担体から叩いて取り除き、構造化された領域にそれぞれ４０μｌの懸濁液を被着する。実験室条件で１０分後に試料を脱イオン水に移す。次に窒素流で１分間乾燥する。
【０１４３】
図６は、こうして得られたミクロ構造体の光学顕微鏡微分干渉コントラスト写真を示す。黒ずんだ領域（島）にナノ粒子が局在する。島の幅は１０μｍ〜１３μｍである。
【０１４４】
図７は、得られたミクロ構造体の走査型電子顕微鏡写真（５×５μｍ２）を示す。ナノ粒子がある島と未被覆の基体との鮮明な境界がはっきり分かる。
【実施例２２】
【０１４５】
タンパク質被覆ナノ粒子の単層を有する試料担体を使用したＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ［マトリックス支援レーザ脱離イオン化飛行時間型］質量分析
本実施例は、タンパク質被覆ナノ粒子の単層を有する試料担体をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析に直接使用できることを示す。分析は結合層にもナノ粒子にも妨げられない。
【０１４６】
試料の準備
ＭＡＬＤＩ試料担体の金表面をまずアセトンで、次にイソプロパノール（ＨＰＬＣ級）と０．０２Ｎ  ＨＣｌの１：１混合物で、続いてイソプルパノール（ＨＰＬＣ級）で予備処理した（それぞれ超音波浴で１０分）。続いて圧縮空気で乾燥する。清浄化した試料担体を次にＳＰＳ溶液（０．０１Ｍ  ＳＰＳ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ）に２０分浸漬し、脱イオン水で洗浄し、乾燥した。次に試料担体を実施例１６で得られたストレプトアビジン修飾粒子の懸濁液（０．５ｍｇ／ｍｌ）に４０分浸漬した。このｐＨ値で粒子の電荷は−２０ｍＶである。担体を脱イオン水で洗浄し、乾燥した。これに０．５μｌの飽和マトリックス［０．１％トリフルオル酢酸（ＴＦＡ，Ｆｌｕｋａ，ｐ．ａ．）及びアセトニトリル（Ｂａｋｅｒ、ＨＰＬＣ級）の６：４（ｖ／ｖ）混合物に溶解した３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシケイ皮酸］を被着し、空気乾燥し、その上でＬＤ−ＴＯＦ−ＭＳ［ＨＰ  Ｇ  ２０２５Ａ  ＬＤ−ＴＯＦ、タイムラグ焦点調整（ＴＬＦ）ユニット（Ｆｕｔｕｒｅ、ＧＳＧ社）改良型；Ｌｅ  Ｃｒｏｙ−５００  ＭＨｚオシロスコープでデータ収集；外部キャリブレーション；誤差０．１％］で測定した。
【０１４７】
結果
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を図８に示す。ストレプトアビジンの２つのピークが見られる。１３０７０．５Ｄａ及び６５４２Ｄａのピークは一電荷及び二電荷ストレプトアビジンモノマーに由来するものである。従って、５２２８０Ｄａの分子量が認められるのは四量体ストレプトアビジンのためである。高分子電解質ＰＤＡＤＭＡＣ及びＳＰＳはタンパク質の検出を妨げない。
【実施例２３】
【０１４８】
点突然変異及びＳＮＰを検出するためのハイブリダイゼーション及び固相酵素反応に用いる、並びに転写研究に用いるＤＮＡチップの作製
実施例６で得られた粒子を、実施例１８で説明したようにＬａｙｅｒ−ｂｙ−Ｌａｙｅｒ法を使用して平坦なチップ表面に被着した。こうして調製したナノ粒子担体にマイクロアレイヤー、即ちマイクロアレイを作るための装置（ピン・リング型又は毛管ピン型）を使用してＤＮＡプローブを塗布した。塗布のためにそれぞれ５０μＭのＤＮＡを含む１０ｍＭトリス／Ｃｌ、ｐＨ８．０及び４０％ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）中のＤＮＡ溶液を使用した。Ｄｉｅｈｌ，Ｇｒａｈｌｍａｎｎ，Ｂｅｉｅｒ  ａｎｄ  Ｈｏｈｅｉｓｅｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２９（２００１），７，ｅ３８に記載されているように、固定及び再処理を行った。こうして作製されたＤＮＡチップを続いて、蛍光標識された逆相補的ＤＮＡフラグメントとのハイブリダイゼーションのため、及びＡＰＥＸ方式（ａｒｒａｙｅｄ  ｐｒｉｍｅｒ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ；Ｐａｓｔｉｎｅｎら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，１０（２０００），１０３１−１０４２を参照）によるチップ上の酵素反応のために使用した。対照として、同じＤＮＡプローブを標準プロトコルに従ってポリ−Ｌ−リシン被覆スライドガラスに被着した。こうして作製した対照チップを同じく蛍光標識された逆相補的ＤＮＡフラグメントとのハイブリダイゼーション及び酵素反応のために使用した。
【０１４９】
図９は、対照ＤＮＡチップを使用したハイブリダイゼーションと本願に基づくナノ粒子ＤＮＡチップを使用したハイブリダイゼーションとの比較を示す。図から分かるように、本発明に基づく特殊な表面によってハイブリダイゼーションの際のシグナル強度が著しく高められる。
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】シリコン担体上のナノ粒子からなる直径１５０μｍ〜１５５μｍのミクロ構造体化マイクロスポットの光学顕微鏡写真を示す。
【図２】１０回塗布したナノ粒子懸濁液のマイクロスポットの周縁部の走査型電子顕微鏡三次元写真を示す。
【図３】ガラス担体上のナノ粒子からなる直径１４０μｍ〜１４５μｍのミクロ構造体化マイクロスポットの光学顕微鏡写真を示す。
【図４】ガラス担体上のナノ粒子からなる直径１６０μｍ〜１６６μｍのミクロ構造体化マイクロスポットの光学顕微鏡写真を示す。
【図５】固定化ナノ粒子の維持された機能を示すグラフ（導波路分光計）を示す。基線はそれぞれ０．１Ｍリン酸緩衝液である。Ａ）０．１Ｍ  ＮａＣｌ中の０．０２ＭのＰＤＡＤＭＡＣの添加。Ｂ）０．１Ｍ  ＮａＣｌ中の０．０１ＭのＳＰＳの添加。Ｃ）対照試験として０．５μｍ（１）及び１μｍ（２）のストレプトアビジンの添加。非特異的結合は認められない。Ｄ）０．５％（ｗ／ｖ）のナノ粒子の添加。Ｅ）ストレプトアビジン０．５〜３μｍの結合。Ｆ）差（ｓｅｃ−１）。これは粒子に特異的に結合された量である。
【図６】ミクロ構造体の光学顕微鏡微分干渉コントラスト写真を示す。黒ずんだ領域（島）にナノ粒子が局在する。島の幅は１０μｍ〜１３μｍである。
【図７】ミクロ構造体の走査型電子顕微鏡写真（５×５μｍ２）を示す。
【図８】タンパク質被覆ナノ粒子（ＳＰＳ−ＰＤＡＤＭＡＣ−ストレプトアビジン修飾粒子）の単層を有する試料担体を使用したＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析の結果を示す。
【図９】（Ａ）市販のチップに結合したオリゴヌクレオチドのそれぞれ相補的蛍光標識ＤＮＡによるハイブリダイゼーション、（Ｂ）本発明に基づくナノ粒子チップ表面に結合した同じオリゴヌクレオチドのそれぞれ相補的蛍光標識ＤＮＡによるハイブリダイゼーションを示す。２つのチップ表面を比較すれば、ナノ粒子による本発明の表面修飾はシグナル強度の顕著な増加をもたらすことが明らかである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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