(57)【要約】本発明は、安定化架橋ヒドロゲルマトリックスであって、第一高分子量成分と、第一高分子量成分に共有結合により架橋した第二高分子量成分と、少なくとも１つの安定化剤または増強剤とを含み、第一高分子量成分および第二高分子量成分が各々ポリグリカンおよびポリペプチドからなる群から選択されるものに向けられる。安定化ヒドロゲルマトリックスは、移植可能な医療用具のための生物活性ゲル、ペースト、スラリー、細胞付着スカフォールド、および医療用具を構築するために適切な成形材料、もしくは結合材料として調製できる。ヒドロゲルマトリックスはその内因性生物活性のために、移植された医療用具周囲での創傷治癒を促進する細胞付着スカフォールドとして、局所的血管形成、創傷治癒、組織修復術、および再生を誘導するためのゲルおよびペーストとして、創傷接着剤として、および組織の体積を増やすためを含む多数の用途におけるゲルまたはペーストとして有用である。
2005528933.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
架橋生物活性ヒドロゲルマトリックスであって、前記マトリックスが、第一高分子量成分と、第一高分子量成分に共有結合により架橋した第二高分子量成分と、極性アミノ酸、アミノ酸アナログ、アミノ酸誘導体、無傷コラーゲン、二価カチオンのキレート剤、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの増強剤とを含んでおり、第一および第二高分子量成分が各々ポリグリカンおよびポリペプチドからなる群から選択されるマトリックス。
【請求項２】
第一高分子量成分がポリグリカンであり、第二高分子量成分がポリペプチドである、請求項１のマトリックス。
【請求項３】
ポリグリカンが、多糖または硫酸化多糖である、請求項２のマトリックス。
【請求項４】
ポリグリカンが、グリコシド結合により相互に結合した約１０を超える単糖残基を含む多糖である、請求項３のマトリックス。
【請求項５】
多糖が、グリコサミノグリカンおよびグルコサミノグリカンからなる群から選択される、請求項３のマトリックス。
【請求項６】
多糖が、デキストラン、ヘパラン、ヘパリン、ヒアルロン酸、アルギン酸塩、アガロース、カラゲナン、アミロペクチン、アミロース、グリコーゲン、デンプン、セルロース、キチン、およびキトサンからなる群から選択される、請求項３のマトリックス。
【請求項７】
硫酸化多糖が、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、デルマタン硫酸、およびケラタン硫酸からなる群から選択される、請求項３のマトリックス。
【請求項８】
ポリグリカンが、約２，０００〜約８，０００，０００Ｄａの分子量を有する、請求項２のマトリックス。
【請求項９】
ポリグリカンが、約２０，０００〜約１，０００，０００Ｄａの分子量を有する、請求項２のマトリックス。
【請求項１０】
ポリペプチドが、組織由来または合成ポリペプチドである、請求項２のマトリックス。
【請求項１１】
ポリペプチドが、コラーゲン、ゼラチン、ケラチン、デコリン、アグレカン、および糖タンパク質からなる群から選択される、組織に由来する組織由来ポリペプチドである、請求項１０のマトリックス。
【請求項１２】
ポリペプチドが、粘膜下組織、動脈、声帯、胸膜、気管、気管支、肺胞隔膜、靱帯、耳介軟骨、腹筋膜、肝臓、腎臓、神経鞘、クモ膜、硬膜、および軟膜からなる群から選択される組織の抽出物に由来する組織由来ポリペプチドである、請求項１０のマトリックス。
【請求項１３】
ポリペプチドが、ラミニン、ニドゲン、フィブリン、およびフィブリリンからなる群から選択される、請求項１０のマトリックス。
【請求項１４】
ポリペプチドが、約３，０００〜約３，０００，０００Ｄａの分子量を有する、請求項２のマトリックス。
【請求項１５】
ポリペプチドが、約３０，０００〜約３００，０００Ｄａの分子量を有する、請求項２のマトリックス。
【請求項１６】
ポリグリカンがデキストランであり、ポリペプチドがゼラチンである、請求項２のマトリックス。
【請求項１７】
デキストランが、約０．０１〜約１０ｍＭの濃度で存在する、請求項１６のマトリックス。
【請求項１８】
ゼラチンが、約０．０１〜約４０ｍＭの濃度で存在する、請求項１６のマトリックス。
【請求項１９】
少なくとも１つの増強剤が、チロシン、システイン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リシン、ヒスチジン、およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つの極性アミノ酸を含む、請求項１のマトリックス。
【請求項２０】
極性アミノ酸が、約３〜約１５０ｍＭの濃度で存在する、請求項１９のマトリックス。
【請求項２１】
極性アミノ酸が、約１０〜約６５ｍＭの濃度で存在する、請求項１９のマトリックス。
【請求項２２】
極性アミノ酸が、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リシン、Ｌ−アルギニン、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１９のマトリックス。
【請求項２３】
マトリックスが、約２〜約６０ｍＭの濃度でＬ−グルタミン酸を含む、請求項１９のマトリックス。
【請求項２４】
マトリックスが、約０．５〜約３０ｍＭの濃度でＬ−リシンを含む、請求項１９のマトリックス。
【請求項２５】
マトリックスが、約１〜約４０ｍＭの濃度でＬ−アルギニンを含む、請求項１９のマトリックス。
【請求項２６】
マトリックスが、約５〜約５００μＭの濃度でＬ−システインを含む、請求項１９のマトリックス。
【請求項２７】
少なくとも１つの増強剤が、エチレンジアミン四酢酸またはその塩を含む、請求項１のマトリックス。
【請求項２８】
エチレンジアミン四酢酸またはその塩が、約０．０１〜約１０ｍＭの濃度で存在する、請求項２７のマトリックス。
【請求項２９】
架橋マトリックスが生理的ｐＨで安定性である、請求項１のマトリックス。
【請求項３０】
マトリックスが生理的温度で安定性である、請求項１のマトリックス。
【請求項３１】
第一高分子量成分がポリグリカンであり、第二高分子量成分がポリペプチドであり、少なくとも１つの増強剤が１つまたは複数の極性アミノ酸を含む、請求項１のマトリックス。
【請求項３２】
ポリグリカンがデキストランであり、ポリペプチドがゼラチンである、請求項３１のマトリックス。
【請求項３３】
極性アミノ酸が、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リシン、Ｌ−アルギニン、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項３１のマトリックス。
【請求項３４】
少なくとも１つの増強剤が、エチレンジアミン四酢酸またはその塩をさらに含む、請求項３１のマトリックス。
【請求項３５】
ヒドロゲルマトリックスが組織細胞をさらに含む、請求項１のマトリックス。
【請求項３６】
組織細胞が、幹細胞、骨細胞、腱細胞、脂肪細胞、心筋細胞、肝細胞、平滑筋細胞、および内皮細胞からなる群から選択される、請求項３５のマトリックス。
【請求項３７】
架橋生物活性ヒドロゲルマトリックスを調製する方法であって：
第一高分子量成分と、第二高分子量成分と、極性アミノ酸、アミノ酸アナログ、アミノ酸誘導体、無傷コラーゲン、二価カチオンのキレート剤、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの増強剤との混合物を提供するステップであって、第一および第二高分子量成分が各々ポリグリカンおよびポリペプチドからなる群から選択されるステップと、
第一高分子量成分を第二高分子量成分へ共有結合により架橋させるために十分な条件下で第一高分子量成分を第二高分子量成分と反応させるステップと、
を含む方法。
【請求項３８】
第一高分子量成分がポリグリカンであり、第二高分子量成分がポリペプチドである、請求項３７の方法。
【請求項３９】
ポリグリカンが、多糖または硫酸化多糖である、請求項３８の方法。
【請求項４０】
ポリグリカンが、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、デルマタン硫酸、およびケラタン硫酸からなる群から選択される硫酸化多糖である、請求項３９の方法。
【請求項４１】
ポリグリカンが、グリコシド結合により相互に結合した約１０を超える単糖残基を含む多糖である、請求項３８の方法。
【請求項４２】
多糖が、グリコサミノグリカンおよびグルコサミノグリカンからなる群から選択される、請求項３８の方法。
【請求項４３】
多糖が、デキストラン、ヘパラン、ヘパリン、ヒアルロン酸、アルギン酸塩、アガロース、カラゲナン、アミロペクチン、アミロース、グリコーゲン、デンプン、セルロース、およびキチンからなる群から選択される、請求項３８の方法。
【請求項４４】
ポリグリカンが、約２，０００〜約８，０００，０００Ｄａの分子量を有する、請求項３８の方法。
【請求項４５】
ポリグリカンが、約２０，０００〜約１，０００，０００Ｄａの分子量を有する、請求項３８の方法。
【請求項４６】
ポリペプチドが組織由来ポリペプチドである、請求項３８の方法。
【請求項４７】
組織由来ポリペプチドが、コラーゲン、ゼラチン、ケラチン、デコリン、アグレカン、および糖タンパク質からなる群から選択される、請求項４６の方法。
【請求項４８】
ポリペプチドが、粘膜下組織、動脈、声帯、胸膜、気管、気管支、肺胞隔膜、靱帯、耳介軟骨、腹筋膜、肝臓、腎臓、神経鞘、クモ膜、硬膜、および軟膜からなる群から選択される組織由来の組織抽出物由来である、請求項４６の方法。
【請求項４９】
ポリペプチドが、ラミニン、ニドゲン、フィブリン、およびフィブリリンからなる群から選択される、請求項４６の方法。
【請求項５０】
ポリペプチドが、約３，０００〜約３，０００，０００Ｄａの分子量を有する、請求項３８の方法。
【請求項５１】
ポリペプチドが、約３０，０００〜約３００，０００Ｄａの分子量を有する、請求項３８の方法。
【請求項５２】
ポリグリカンがデキストランであり、ポリペプチドがゼラチンである、請求項３８の方法。
【請求項５３】
少なくとも１つの増強剤が、チロシン、システイン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リシン、ヒスチジン、およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つの極性アミノ酸を含む、請求項３７の方法。
【請求項５４】
少なくとも１つの増強剤が、エチレンジアミン四酢酸またはその塩を含む、請求項３７の方法。
【請求項５５】
前記反応させるステップの前に、第一および第二高分子量成分のうちの少なくとも１つを化学的に修飾し、共有結合に参加できる反応性部位をその上に形成するステップをさらに含む、請求項３７の方法。
【請求項５６】
前記修飾するステップが、第一および第二高分子量成分のうちの少なくとも１つを酸化するステップを含む、請求項５５の方法。
【請求項５７】
前記修飾するステップが、過ヨウ素酸の塩を用いて第一および第二高分子量成分のうちの少なくとも１つを処理するステップを含む、請求項５６の方法。
【請求項５８】
前記第一高分子量成分がデキストランであり、前記修飾するステップが、デキストランを酸化し、その上に反応性部位を形成するステップを含む、請求項５５の方法。
【請求項５９】
反応性部位が、アルデヒド基またはケトン基である、請求項５８の方法。
【請求項６０】
前記反応させるステップが、少なくとも１つの二官能架橋剤の存在下で第一および第二高分子量成分を反応させるステップを含む、請求項３７の方法。
【請求項６１】
架橋剤が、グルタルアルデヒド、エポキシド、酸化デキストラン、ｐ−アジドベンゾイルヒドラジン、Ｎ−［α−マレイミドアセトキシ］スクシンイミドエステル、ｐ−アジドフェニルグリオキサル一水和物、ビス−［β−（４−アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）、ビス−［スルホスクシンイミジル］スベレート、ジチオビス［スクシンイミジル］プロピオネート、ジスクシンイミジルスベレート、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロリドからなる群から選択される、請求項６０の方法。
【請求項６２】
哺乳類において組織再生を促進する方法であって、
組織再生を必要とする特定部位を同定するステップと、
治療有効量の請求項１に記載の架橋生物活性ヒドロゲルマトリックスを同定された部位へ投与するステップと、
を含む方法。
【請求項６３】
前記投与するステップが、血管末端でヒドロゲルマトリックスを投与するステップであって、マトリックスが血管末端から外側へ伸長するようにヒドロゲルマトリックスがポジショニングされるステップを含む、請求項６２の方法。
【請求項６４】
ヒドロゲルマトリックスが投与前に架橋させられる、請求項６２の方法。
【請求項６５】
ヒドロゲルマトリックスがインサイチューで架橋させられる、請求項６２の方法。
【請求項６６】
組織の体積を増やす方法であって、
体積増加を必要とする特定組織を同定するステップと、
治療有効量の請求項１に記載の架橋生物活性ヒドロゲルマトリックスを同定された組織へ投与するステップと、
を含む方法。
【請求項６７】
ヒドロゲルマトリックスが投与前に架橋させられる、請求項６６の方法。
【請求項６８】
ヒドロゲルマトリックスがインサイチューで架橋させられる、請求項６６の方法。
【請求項６９】
骨インプラントを調製する方法であって、
所定量の骨伝導性または骨誘導性の材料を供するステップと；
請求項１に記載の架橋生物活性ヒドロゲルマトリックスを供するステップと；
骨伝導性または骨誘導性の材料と架橋生物活性ヒドロゲルマトリックスとを混合し、成形可能な複合ペーストを形成するステップと；
ペーストを成形型に流し込むステップと；
成形型内のペーストを硬化させるステップと；
成形型から成形ペーストを取り出すステップと、
を含む方法。
【請求項７０】
骨伝導性または骨誘導性の材料が、アルミン酸カルシウム、ヒドロキシアパタイト、アルミナ、ジルコニア、ケイ酸アルミニウム、リン酸カルシウム、生体活性ガラス、セラミック、コラーゲン、自家骨、同種骨、異種骨、コラリン、およびそれらの誘導体または組み合わせからなる群から選択される、請求項６９の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、局所的血管形成、創傷治癒、組織修復、および組織再生の誘導に基づく治療方法に使用するために適切な架橋生物活性ヒドロゲルマトリックス(cross-linked bioactive hydrogel matrix)に関する。
【背景技術】
【０００２】
損傷もしくは罹患した組織や器官の移植術による置換や修復は長年にわたり医学の目標であり続けてきたが、現在では途方もない進歩を遂げている。その目標に向かって研究が実施されており、生体適合性かつ生体内分解性材料が支持マトリックスとして、培養細胞を送達するための基質として、または三次元組織再建術のために使用される組織工学技術における関心が高まっている(Park S.,「Characterization of porous collagen/hyaluronic acid scaffold modified by 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide cross-linking」,Biomaterials 23:1205-1212(2002))。しかし移植材料の使用を制限する最も重大な問題の１つは移植された異種材料により引き起こされる創傷治癒反応である(Ratner B.D.,「Reducing capsular thickness and enhancing angiogenesis around implant drug release systems」,Journal of Controlled Release 78:211-218(2002))。
【０００３】
生体適合性は、意図した用途のために使用された異物に対する宿主の適切な反応であると定義されている。生体適合性はさらに、異物とその異物を用いて治療された患者の組織や生理的系との間の相互作用を意味する。材料の生体適合性の決定因子としては、タンパク質結合およびその後の変性ならびに細胞接着および活性化が提起されている。生体適合性はさらに、移植物が宿主の様々な保護系からの有害な作用を回避し、相当に長い期間にわたり機能性を維持することも意味する。材料の潜在的生体適合性を測定するためには、細胞毒性またはタンパク質結合を評価するために設計されたインビトロ試験が日常的に使用されている。言い換えると、材料の生体適合性は移植後に周囲組織と完全に一体化できる能力に左右される。
【０００４】
以前に実施された研究は、細胞とそれらを取り囲んでいる細胞外マトリックスとの特異的相互作用が細胞の修復および置換プロセスの促進および調節において重要な役割を果たすことを証明している(Hynes S.O.,「Integrins:a family of cell surface receptors」,Cell 48:549-554(1987))。そこで治療用途において有用な生体適合性ポリマーに関する研究においては高い関心が集まってきた。コンタクトレンズ材料、人工腱、組織工学のためのマトリックス、および薬物送達システムを含むそのような用途のために有用であることが証明されている１つの特定クラスのポリマーはヒドロゲルである(Schacht E.,「Hydrogels prepared by crosslinking of gelatin with dextran dialdehyde」,Reactive & Functional Polymers 33:109-116(1997))。ヒドロゲルは、一般にはポリマー鎖間の間隙を充填している水を含む親水性ポリマーの永続的三次元網目構造からなる材料であると容認されている。ヒドロゲルは、適切な親水性モノマーを共重合させ、鎖伸長させ、そして親水性プレポリマーまたはポリマーを架橋させることによって入手することができる。
【０００５】
以前に実施された研究は、生理的温度の近くでは液体である熱可逆性ヒドロゲルマトリックスが皮膚潰瘍において血管発生を誘導して創傷治癒を調整することを証明している(Usala A.L.et al.,「Induction of fetal-like wound repair mechanisms in vivo with a novel matrix scaffolding」,Diabetes 50(増刊号2):A488(2001);およびUsala A.L.et al.,「Rapid Induction of vasculogenesis and wound healing using a novel injectable connective tissue matrix)」,Diabetes 49(増刊号1):A395(2000)。この生物活性ヒドロゲル材料は、移植された異物に反応して治癒を改善させることも証明されている；取り囲んでいる線維性被膜厚の減少およびこの熱可逆性ヒドロゲルに曝露させられた移植された材料にすぐ隣接する血液供給量の永続性増加を示す(Ravin A.G.et al.,「Long- and short-term effects of biological hydrogels on capsule microvascular density around implants in rats)」,J. Biomed. Mater. Res. 58(3):313-8(2001)。しかし三次元的安定性および熱安定性を必要とする治療用途におけるそのような生物活性熱可逆性ヒドロゲルの使用は、ヒドロゲルが生理的温度で融解しているので、実際的ではない。したがって、体温で安定性である、つまり医療用具として、または医療用途において、特に哺乳類の体内で使用することを目的とするいずれかに適切な生物活性材料に対する必要がある。
【０００６】
医療用途において使用するための特定生体高分子は、酸化多糖類と架橋したゼラチンを含む生体高分子マトリックスを含有する医薬品に関する米国特許第6,132,759号に開示されている。第'759特許の生体高分子は、創傷治癒を刺激する薬物がその中に組み込まれた場合は皮膚創傷または皮膚障害を治療するために有用であると主張されている。同様に、米国特許第5,972,385号は修飾された多糖と、成長因子と組み合わせると引き続いて組織修復のために使用できるコラーゲンとを反応させることによって形成されるマトリックスについて記載している。様々な追加の出版物は、薬物送達、組織再生、創傷治癒、創傷ドレッシング、接着性バリア、および創傷接着剤等の医療用途に使用するためのポリマーおよびコポリマーについて記載している(例えば、Draye J.P.et al.,「In vitro release characteristics of bioactive molecules from dextran dialdehyde cross-linked gelatin hydrogel films」,Biomaterials 19:99-107(1998);Draye J.P.et al.,「In vitro and in vivo biocompatibility of dextran dialdehyde cross-linked gelatin hydrogel films」,Biomaterials 19:1677-1687(1998);Kawai K.et al.,「Accelerated tissue regeneration through incorporation of basic fibroblast growth factor impregnated gelatin microspheres into artificial dermis」,Biomaterials 21:489-499(2000);Edwards G.A.et al.,「In vivo evaluation of collagenous membranes as an absorbable adhesion barrier」,Biomed. Mater. Res. 34:291-297(1997);米国特許第4,618,490号;および米国特許第6,165,488号を参照されたい)。しかしそのような生体適合性ポリマーは、一般に成長因子、凝固因子、抗生物質、およびその他の薬剤等の他の治療薬と結合した場合にのみ治療上有効である。
【０００７】
以前から知られている数種の生体適合性ポリマーは、少なくとも一部にはコラーゲンまたはコラーゲン由来材料に基づいている。さらに、その他の知られている生体適合性ポリマーは多糖類、特にデキストランに基づいている。一部の例では、生体高分子はゼラチンとデキストランとを架橋させることによって形成されてきたが、身体内で長期使用するためのそのようなポリマーの有用性については証明されていない。ゼラチンとデキストランが水溶液中では不適合であるために体温で安定性であるコポリマーを生成するのは困難であることは明確に証明されている。
【０００８】
そこで、依然として、体内での安定性の長期使用が所望である医療用途のために有用である安定化された、生物活性ヒドロゲルに対する必要がある。
【発明の開示】
【０００９】
治療用ゲルまたはペーストとして有用な安定化架橋生物活性ヒドロゲルマトリックスが提供される。本発明の生物活性ヒドロゲルの粘度は、当業者によく知られているパラメーターを使用して加工処理条件を制御することによって、広範囲にわたり変化させることができる。これらの生物活性ヒドロゲルは、治療用医療用具として、または局所的創傷治癒および組織との一体化を必要とする他の治療形態にとってのアジュバントとしてのいずれかで使用できる。本発明のヒドロゲルマトリックスは第一高分子量成分と第一高分子量成分に共有結合により架橋した第二高分子量成分とを含み、第一高分子量成分および第二高分子量成分は各々ポリグリカンおよびポリペプチドからなる群から選択される。このマトリックスは、さらにまた極性アミノ酸、アミノ酸アナログ、アミノ酸誘導体、無傷コラーゲン、およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）もしくはその塩等の二価カチオンのキレート剤等の１つもしくは複数の増強剤を含む。１つの好ましい実施形態では、この組成物は、高分子量ポリペプチドへ共有結合した高分子量ポリグリカンを含む。これら２つの高分子量成分は、好ましくはデキストランおよびゼラチンである。好ましい増強剤には、システイン、アルギニン、リシン、およびグルタミン酸等の極性アミノ酸、ＥＤＴＡもしくはその塩、およびそれらの混合物または組み合わせが含まれる。
【００１０】
安定化架橋生物活性ヒドロゲルマトリックスを調製する方法もまた提供される。本方法は、第一高分子量成分、第二高分子量成分、および増強剤の混合物を供するステップと、第一高分子量成分を第二高分子量成分へ共有結合により架橋させるために十分な条件下で第一高分子量成分と第二高分子量成分とを反応させるステップとを含む。理解されるように、２つの高分子量成分は１つまたは複数の増強剤の添加中、または添加後に架橋させることができる。
【００１１】
また別の態様では、本発明は組織再生を増強するために安定化架橋生物活性ヒドロゲルマトリックスを使用する方法を提供する。本方法は、組織再生を必要とする特定部位を同定するステップと、治療有効量の上記安定化架橋生物活性ヒドロゲルマトリックスを同定された部位へ投与するステップとを含む。
【００１２】
また別の態様では、組織の体積を増やすために(for adding bulk to tissue)安定化架橋生物活性ヒドロゲルマトリックスを使用する方法が提供される。本方法は、組織の体積増加(added tissue bulk)を必要とする特定部位を同定するステップと、治療有効量の上記安定化架橋生物活性ヒドロゲルマトリックスを同定された部位へ投与するステップを含む。
【００１３】
また別の態様では、本発明は本発明の安定化架橋生物活性ヒドロゲルマトリックスを使用して骨インプラントを調製する方法を提供する。本方法は、アルミン酸カルシウム、ヒドロキシアパタイト、アルミナ、ジルコニア、ケイ酸アルミニウム、リン酸カルシウム、生体活性ガラス、セラミック、コラーゲン、自家骨、同種骨、異種骨、コラリン、またはそれらの誘導体もしくは組み合わせ等の所定量の骨伝導性(osteoconductive)または骨誘導性(osteoinductive)材料を供するステップと、上記安定化架橋生物活性ヒドロゲルマトリックスを供するステップと、骨伝導性または骨誘導性の材料とヒドロゲルマトリックスとを混合し、注入可能(pourable)かつ成形可能(castable)な複合ペーストを形成するステップと、ペーストを成形型内へ流し込む(cast)ステップと、成形型内のペーストを硬化させるステップと、成形型から成形ペーストを取り出すステップとを含む。
【００１４】
本発明のまた別の態様では、治療のために様々な組織細胞と組み合わせて安定化架橋生物活性ヒドロゲルマトリックスを使用するための方法が提供される。
【００１５】
本発明のまた別の態様では、例えば創傷被覆剤または組織シーラントとして、創傷を治療するために安定化架橋生物活性ヒドロゲルマトリックスを使用するための方法が提供される。
【００１６】
本発明を一般的に説明してきたが、以下では添付の図面を参照されたい。なお、これらは必ずしも縮尺通りには示されていない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明を今度は以下で、本発明の好ましい実施形態が示されている添付の図面を参照しながらより詳細に説明する。しかし本発明は、数多くの様々な形態で具現化することができるので、下記に規定した実施形態に限定されると見なすべきではない；正確には、これらの実施形態は、本開示が完全かつ完璧であり、そして本発明の範囲を当業者へ十分に伝えるように提供される。全体を通して同じ符号は、同等の要素を示す。
【００１８】
細胞生存能力を維持するための細胞培養培地および組成物を提供する熱可逆性ヒドロゲルマトリックスの調製物は、本明細書にその全体が参照して組み込まれた米国特許第6,231,881号によって教示されている。さらに、血管新生を促進することに有用であるヒドロゲルマトリックスは、本明細書にその全体が参照して組み込まれた米国特許第6,261,587号の中に提供されている。これらの参考文献によって教示された熱可逆性ヒドロゲルマトリックスは、貯蔵温度ではゲルであり、生理的温度では融解しており、そしてゼラチン等のコラーゲン由来成分、デキストラン等の長鎖ポリグリカン、および有効量の極性アミノ酸等の他の成分の組み合わせを含んでいる。これらの参考文献によって教示された熱可逆性ヒドロゲルマトリックスについて、図１〜３と結び付けて以下で考察する。
【００１９】
コラーゲンは、動物の細胞外マトリックスの主要タンパク質成分である。コラーゲンは複雑な原線維組織(fibrillar organization)に組み込まれる。原線維は線維を形成する束状構造(bundle)内に組み込まれる。原線維は、ねじれ状配列に置かれた５つの微小線維(microfibril)から作られている。各微小線維は、コラーゲンロッドの集まりである。各コラーゲンロッドは右回り三重らせんであり、各ストランド自体は左回りらせんである。コラーゲン原線維は、成熟動物の組織を冷水不溶性にする共有的分子内架橋および分子間架橋により強化される。適切な処理を使用すると、コラーゲンロッドは抽出かつ可溶化され、そこでそれらは三重らせんとしてのそれらの立体配座を維持する。これは変性コラーゲンでありコラーゲンの天然形とは相違するが、コラーゲン内で所見される分子内安定化共有結合を破壊するのに十分な熱処理または化学処理を経験していない。コラーゲン溶液が高度に加熱されると、または天然コラーゲンを含有する組織が化学処理および熱処理を受けると、コラーゲンらせんを安定化する水素結合および共有結合が破壊され、そして分子は無秩序な立体配座を採り入れる。これらの水素結合を破壊することによって、今度は極性アミン基およびカルボン酸基を利用して他の入手源またはそれら自体の極性基へ結合させることができる。この材料はゼラチンであり、４０〜４５℃で水溶性である。
【００２０】
上記の通りに、ゼラチンは変性コラーゲンの１つの形であり、動物の皮膚、白色結合組織または骨由来のコラーゲンの部分加水分解によって入手される。ゼラチンは酸処理前駆体またはアルカリ処理前駆体から得ることができる。酸処理前駆体由来のゼラチンはＡ型として知られており、アルカリ処理前駆体由来ゼラチンはＢ型として知られている。熱および酸触媒分解の場合は、個々のコラーゲン鎖内では加水分解が優勢である。アルカリ加水分解では、分子間および分子内架橋の分解が優勢である。
【００２１】
図１は、ゼラチン１５の個別の極性α鎖を生成しているトロポコラーゲン１０の加水分解を図示している。トロポコラーゲン１０を加熱すると、成熟コラーゲン内に三重鎖モノマーを密に含有する水素結合が分離する。
【００２２】
図２Ａ〜２Ｂは、デキストラン２０等の長鎖ポリグリカンを導入することによるマトリックスモノマースカフォールディングの安定化を図示している。図２Ａに示したように、デキストラン２０は、折り重なってその極性基間で水素結合するゼラチン１５の天然素質を妨害することによって、事前に加熱されているゼラチン１５を開いたまま維持するように機能する。図２Ｂに示したように、デキストラン２０の不在下では、ゼラチン１５が冷却し始めるとモノマーの直線状部分内のアミノ基とカルボン酸基との間で水素結合が形成されて折り重なり、したがって細胞付着のために利用できる部位が限定されるであろう。
【００２３】
熱可逆性マトリックスは、例えば約０．０１〜約１０ｍＭ、好ましくは約０．０１〜約１ｍＭ、最も好ましくは約０．０１〜約０．１ｍＭの範囲内の治療に有効な濃度でデキストラン等のポリグリカンを含有する。１つの実施形態では、デキストランは約０．０９ｍＭの濃度で存在する。
【００２４】
熱可逆性マトリックスはさらにまた、例えば約０．０１〜約４０ｍＭ、好ましくは約０．０５〜約３０ｍＭ、最も好ましくは約１〜約５ｍＭの範囲内の治療に有効な濃度でゼラチンを含有する。有益には、ゼラチンの濃度はおよそ１．６ｍＭである。
【００２５】
細胞結合を増加させる目的では、マトリックス内に含有される細胞に対して追加の構造を提供するために無傷コラーゲンを熱可逆性マトリックスへ少量で付加することができる。無傷コラーゲンの最終濃度は、約０〜約５ｍＭ、好ましくは約０〜約２ｍＭ、最も好ましくは約０．０５〜約０．５ｍＭである。１つの実施形態では、無傷コラーゲンの濃度は約０．１１ｍＭである。
【００２６】
熱可逆性マトリックスは追加して、一般にはチロシン、システイン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リシン、およびヒスチジンを含むと定義されている極性アミノ酸を有効量で含有することができる。本発明における用途のためには、アミノ酸は好ましくはシステイン、アルギニン、リシン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸およびそれらの混合物、またはそれらの誘導体もしくはアナログからなる群から選択される。アミノ酸とは、それらのＤおよびＬ両方の立体異性体形であるすべての天然型αアミノ酸、およびそれらのアナログおよび誘導体を意味することが意図されている。アナログは、アミノ酸内の原子もしくは官能基が、通常は同様の特性を有する別の原子もしくは官能基に置換されたものと定義されている。誘導体は、それに結合した別の分子もしくは原子を有するアミノ酸であると定義されている。誘導体には、例えばアミノ基のアセチル化、カルボキシル基のアミノ化、またはシスチンを形成するための２つのシステイン分子の硫黄残基の酸化が含まれるであろう。全極性アミノ酸の総濃度は、一般には約３〜約１５０ｍＭ、好ましくは約１０〜約６５ｍＭ、最も好ましくは約１５〜約４０ｍＭである。
【００２７】
有益には、付加された極性アミノ酸はＬ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リシン、およびＬ−アルギニンを含んでいる。Ｌ−グルタミン酸の最終濃度は、一般には約２〜約６０ｍＭ、好ましくは約５〜約４０ｍＭ、最も好ましくは約１０〜約２０ｍＭである。１つの実施形態では、Ｌ−グルタミン酸の濃度は約１５ｍＭである。Ｌ−リシンの最終濃度は、一般には約０．５〜約３０ｍＭ、好ましくは約１〜約１５ｍＭ、最も好ましくは約１〜約１０ｍＭである。１つの実施形態では、Ｌ−リシンの濃度は約５．０ｍＭである。Ｌ−アルギニンの最終濃度は、約１〜約４０ｍＭ、好ましくは約１〜約３０ｍＭ、最も好ましくは約５〜約１５ｍＭである。１つの実施形態では、アルギニンの最終濃度は約１０ｍＭである。ジスルフィド結合を提供するＬ−システインの最終濃度は、一般には約５〜約５００μＭ、好ましくは約１０〜約１００μＭ、最も好ましくは約１５〜約２５μＭである。１つの実施形態では、システインの最終濃度は約２０μＭである。
【００２８】
熱可逆性マトリックスは、好ましくは生理的に適合するバッファーに基づいており、１つの実施形態は、様々なタイプの哺乳類細胞のインビトロ培養のために使用される一般栄養溶液であるMedium 199（ミズーリ州セントルイス所在のSigma Chemical社から市販で入手可能）であって、上記に記載した補充量の極性アミノ酸等の添加物や追加量の一部の媒体成分がさらに補充されているものである。
【００２９】
有益には、この調製物にはアミノグアニジンを添加することができる；しかし、本発明ではＮ−モノメチル−Ｌ−アルギニン、Ｎ−ニトロ−Ｌ−アルギニン、またはＤ−アルギニン等の他のＬ−アルギニンアナログが使用されてもよい。アミノグアニジンの最終濃度は、一般には約５〜約５００μＭ、好ましくは約１０〜約１００μＭ、最も好ましくは約１５〜約２５μＭである。１つの実施形態では、最終濃度は約２０μＭである。
【００３０】
さらに、このマトリックスは、１つもしくは複数の二価カチオンのキレート剤であって、存在するいずれかの二価金属イオンとの配位化合物を形成することによってマトリックスの剛性を増加させるキレート剤を含んでいてよい。当該化合物の形成は、二価金属イオンの存在によって惹起された−ＮＨ2と−ＣＯＯＨとの間の水素結合の阻害を取り除くことによってマトリックスの剛性増加を導く。本発明において有用である二価カチオンのキレート剤の好ましい例は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）またはその塩である。ＥＤＴＡ等の二価カチオンのキレート剤の濃度範囲は、一般には約０．０１〜約１０ｍＭ、好ましくは約１〜約８ｍＭ、最も好ましくは約２〜約６ｍＭである。１つの実施形態では、ＥＤＴＡは約４ｍＭの濃度で存在する。
【００３１】
図３は、露出したモノマー極性部位を例えばアルギニンのアミン基またはグルタミン酸のカルボン酸基へ結合させることによって、ゼラチン１５およびデキストラン２０によって形成された単位２５を安定化させるために添加された極性アミノ酸およびＬ−システインの作用を示している。さらに、ジスルフィド結合はＬ−システイン分子間で形成することができ（それによってシスチンを形成する）、これらは順にゼラチン１５への水素結合を形成する。
【００３２】
上記に記載した熱可逆性ヒドロゲルの機械的および熱的特徴は大体において、主要成分の１つであるゼラチンの熱機械的特性によって決定される。ゼラチンをベースとするマトリックスは、典型的にはほぼ生理的温度で融解しているので、したがって一定の用途における医療用具として移植するために必要な場合に不可欠な耐久性および機械的特性を有するとは予想できない。このため、水素結合、静電結合もしくは極性アミノ酸媒介結合、疎水結合および共有結合を含む様々な分子間相互作用を通してこれらのゲルを安定化させることが是非とも必要である。理論によって結び付けることを望まなくても、長鎖ポリグリカンと関連する上記に記載した結合機序のタイプがゼラチン等のポリペプチドを安定化させると考えられている。例えば、下記でより詳細に考察するように、コラーゲン由来α鎖の正荷電極性基は、次に例えばデキストラン中で見いだされる繰り返しグルコース単位の負荷電ヒドロキシル基と結び付くことができる。ゼラチンおよびデキストランは、高分子プロテオグリカン型構造を含有する複合体生物活性ヒドロゲルを形成する。
【００３３】
上記で考察した先行技術熱可逆性マトリックスとは相違して、本発明は、例えば創傷治癒または血管形成を促進するために使用できる架橋生物活性ヒドロゲルマトリックスを含む安定化組成物を提供する。本発明は、さらにまた生理的温度で治療的に有用である架橋生物活性ヒドロゲルマトリックスを調製するための方法に向けられる。「生物活性」とは、身体へ導入された異物への宿主の細胞反応もしくは組織反応を促進または阻止する能力を意味することが意図されている。例には、血管形成の誘導、異物反応の生成の阻害、スカフォールド材料への細胞付着の促進、および組織再生の促進が含まれるが、それらに限定されない。用語「安定化（された）」または「安定（している）」とは、意図した反応を達成するために十分な時間にわたり宿主内に存在し続け、生理的温度（すなわち、約３７℃）および生理的液体（例えば、約７．４の生理的ｐＨを有する水性体液）中で水膨潤性かつ難溶性である固体もしくは半固体材料組成物を意味することが意図されている。
【００３４】
本発明の安定化架橋生物活性ヒドロゲルマトリックスは、少なくとも２つの高分子量成分から形成される。生物活性ヒドロゲルマトリックスの高分子量成分は、高分子量ポリグリカン、高分子量ポリペプチド、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。高分子量ポリグリカンとは、グリコシド結合により相互へ結合した約１０を超える単糖残基からなる多糖を意味する。ポリグリカンは、同一単糖残基、もしくは様々な単糖残基または単糖残基の誘導体からなってよい。好ましい多糖であるデキストランは、単独でグルコース残基を含んでいる。デキストランは、典型的にはしばしばα（１→２）もしくはα（１→３）分枝鎖を備える（１→６）結合Ｄ−グルコース残基の直鎖を含んでいる。多数のラクトバシラス(Lactobacilliaceae)ファミリーの多数の細菌種によって産生した天然デキストランは、成分の多分散混合物である。
【００３５】
ポリグリカン成分は、好ましくは約２，０００〜約８，０００，０００Ｄａ、より好ましくは約２０，０００〜約１，０００，０００Ｄａの分子量範囲を有する。他に特別に言及しない限り、本明細書では分子量を数平均分子量（Ｍn）、すなわちΣＮｉＭｉ／ΣＮｉ（式中、Ｎｉは分子量Ｍｉを有する高分子の数、またはそれらの分子のモル数である）と定義されたものとして表す。
【００３６】
本発明においては、適切な粘度、分子量およびその他の所望の特性を備えるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）またはグルコサミノグリカンを含む多糖を利用することができる。グリコサミノグリカンとは、そのうちの１つは常にアミノ糖である繰り返し二糖単位を備える非分枝状多糖鎖を含むグリカン（すなわち、多糖）を意味する。１クラスとしてのこれらの化合物は高負電荷を有しており、強度に親水性であり、そして一般にはムコ多糖と呼ばれる。この多糖群には、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、およびヒアルロン酸が含まれる。これらのＧＡＧは主として細胞表面上および細胞外マトリックス内で見いだされる。グルコサミノグリカンとは、アルコール性ヒドロキシル基がアミノ基または硫酸塩もしくはリン酸塩等のその他の官能基と置換されている、主として単糖を含有するグリカン（すなわち、多糖）を意味する。グルコサミノグリカンの１つの例は、一般にはキトサンと呼ばれるポリ−Ｎ−アセチルグルコサミノグリカンである。本発明において有用な可能性がある代表的な多糖には、デキストラン、ヘパラン、ヘパリン、ヒアルロン酸、アルギン酸塩(alginate)、アガロース、カラゲナン、アミロペクチン、アミロース、グリコーゲン、デンプン、セルロース、キチン、キトサンおよびヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、デルマタン硫酸、またはケラタン硫酸等の様々な硫酸化多糖類が含まれる。
【００３７】
高分子量ポリペプチドとは、コラーゲンもしくはコラーゲン由来ゼラチン等の組織由来もしくは合成ポリペプチドを意味する。コラーゲン由来ゼラチンは好ましい高分子量ポリペプチド成分であるが、他の分子と相互作用することができる極性基を有するアミノ酸の配列からなる主鎖を特徴とするその他のゼラチン様成分を使用することもできる。例えば、ケラチン、デコリン、アグレカン、糖タンパク質（プロテオグリカンを含む）等を使用すると、ポリペプチド成分を製造することができよう。１つの実施形態では、ポリペプチド成分は皮膚組織由来の部分加水分解コラーゲンからのブタゼラチンである。さらに他のタイプの組織由来のポリペプチドも使用できよう。例には、動脈、声帯、胸膜、気管、気管支、肺胞隔膜、靱帯、耳介軟骨もしくは腹筋膜；肝臓の網目状構造；腎臓の基底膜；または神経系の神経線維鞘，クモ膜、硬膜、もしくは軟膜からの組織抽出物が含まれるが、それらに限定されない。ラミニン、ニドゲン、フィブリン、およびフィブリリンまたは米国特許第6,264,992号および第4,829,000号に記載されたようなタンパク質混合物、米国特許第6,284,284号に記載されたような細胞培養ブロスからの抽出物、米国特許第6,264,992号に記載されたような粘膜下組織、または米国特許第6,303,765に記載されたような遺伝子産物を含むがそれらに限定されない精製ポリペプチドもまた使用できる。適切な高分子量ポリペプチドのまた別の例は、知られている反応性種をタンパク質上で遺伝子組み換えを実施することによって形成された融合タンパク質である。ポリペプチド成分は、好ましくは約３，０００〜約３，０００，０００Ｄａ、より好ましくは約３０，０００〜約３００，０００Ｄａの分子量範囲を有する。
【００３８】
好ましい実施形態では、ゼラチンおよびデキストランは本発明の生物活性マトリックスの成分である。本発明を容易に説明できるように、用語「ゼラチン」および「デキストラン」は、本明細書を通して当業者であれば容易に想到できる他のポリグリカンおよびポリペプチド成分等の上記のような様々な代替物が本発明に予想されているという理解のもとに使用される。
【００３９】
図４に示したような本発明の１つの実施形態では、デキストラン２０は連鎖(linkage)７０によってゼラチン１５へ共有結合により架橋させられ、それによって架橋網目構造５０を形成している。連鎖７０は、ゼラチン１５上の官能基とデキストラン２０上の官能基との反応、または二官能架橋剤分子とデキストラン２０およびゼラチン１５の両方との反応のいずれかの結果として発生する。下記でより詳細に説明するように、ゼラチンとデキストランを架橋させる１つの方法は、ゼラチン１５への共有結合のために適切な官能基を形成するために、酸化によるようなデキストラン分子２０を修飾する方法である。この安定化架橋生物活性網目構造５０は、生理的温度では生理的液体中に不溶性である治療的に有用なゲルおよびペーストを産生する。追加の基質または表面は必要とされない。このように形成されたゲルおよびペーストは、局所的血管形成、創傷治癒、組織修復、および組織再生の誘導に基づく治療方法を開発するために適切である。そのような生物活性ヒドロゲルのゲルおよびペーストは、例えば心臓もしくは末梢血管の虚血性領域を修復するため、骨修復を促進するため、または創傷治癒および組織修復のための局所的スカフォールディングを提供するために使用できる。
【００４０】
架橋ヒドロゲルマトリックスを作製する方法の１つの実施形態では、架橋のために適切な反応性基を形成するために高分子量成分の１つが修飾されなければならない。例えば、デキストランまたはその他のポリグリカン成分は、ゼラチン成分と架橋させるために、例えば酸化により、修飾することができる。多糖類を酸化するための知られている１つの反応は、過ヨウ素酸酸化である。過ヨウ素酸化学を利用する塩基性反応プロセスは、当業者にはよく知られており、かつ正しく認識されている。過ヨウ素酸酸化は概して、参照してその全体が組み込まれる「Affinity Chromatography. A Practical Approach」,Deanet al., IRL Press, 1985 ISBN 0-904147-71-1に記載されている。過ヨウ素酸に基づく化学を使用することによるデキストランの酸化は、それらの全体が参照して本明細書に組み込まれる米国特許第6,011,008号に記載されている。
【００４１】
過ヨウ素酸酸化では、多糖は近接ジオール基の酸化によって活性化することができる。ポリグリカンを用いた場合、これは概して糖ジオールを酸化して反応性アルデヒド基（例、ジアルデヒド残基）を生成する過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ4）等の過ヨウ素酸の塩の水溶液を用いた処理を通して遂行される。この方法は、臭化シアンを使用する方法等の他の知られている酸化法に代えて迅速に行える便宜的方法である。過ヨウ素酸酸化によって活性化された材料は、感知できる活性の消失を伴わずに数日間は４℃で貯蔵することができる。
【００４２】
この方法で活性化されたデキストラン等のポリグリカン材料は、ゼラチン等のアミノ基を含有する材料と容易に反応し、シッフ塩基結合の形成を通して架橋材料を産生する。シッフ塩基とは、第一級アミンとアルデヒドまたはケトンとの反応によって形成されるイミンを意味するために一般に使用される名称である。セルロース性表面上に形成されたアルデヒド基は、約４〜約６の間のｐＨ値を有するほとんどの第一級アミンと反応する。シッフ塩基結合は、タンパク質上のポリグリカンのジアルデヒド残基と遊離アミノ基との間で形成される。架橋生成物は引き続いて水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ4）または水素化シアノホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ3ＣＮ）等のホウ化水素を用いた還元（すなわち、安定性アミン結合の形成）によって安定化させることができる。残留アルデヒド基は、さらに架橋マトリックスを修飾するためにエタノールアミンまたはその他のアミン含有種を用いて消滅させることができる。マトリックスの１つまたは２つのどちらかの高分子量成分上に反応性基を提供するためには、当業者に知られているその他の方法を利用することができる。
【００４３】
本発明では、製造プロセス中に存在するゼラチンおよび増強剤と反応できる多官能ポリマーを形成するためにデキストランとともに過ヨウ素酸の化学的作用が使用される。過ヨウ素酸反応は、第一級アミンと反応性であるポリアルデヒドポリグリカンの形成を導く。例えば、高分子量ポリペプチドおよび高分子量ポリグリカンはコロイド状ゲルまたは共有結合による架橋ゲルである共有ヒドロゲル複合体を形成することができる。デキストランの反応性基とゼラチン成分の反応性基との間に共有結合が発生する。ゼラチン上の反応性部位には、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、およびリシンによって提供されるアミン基が含まれる。これらのアミン基は、デキストラン上でアルデヒド基またはケトン基と反応して共有結合を形成する。これらのヒドロゲルは、約３４〜約９０℃の温度で容易に調製できる。さらに、ヒドロゲルは約５〜約９、好ましくは約６〜約８、および最も好ましくは約７〜約７．６のｐＨ範囲で調製できる。
【００４４】
デキストラン活性化の程度および反応時間を調節することによって、様々な粘度および剛性の安定化バイオミメティックスカフォールディング材料を製造することができる。「バイオミメティック」とは、生物学的プロセスまたは生成物を模倣または刺激する組成物または方法を説明することが意図されている。一部のバイオミメティックプロセスは、ビタミン類や抗生物質の人工合成等において数年間にわたり使用されてきた。より最近では、疾患誘発性細菌を探索して破壊するナノロボット抗体、人工臓器、人工の腕、脚、手、および足、ならびに様々な電子装置を含むまた別のバイオミメティック用途が提案されている。本発明のバイオミメティックスカフォールディング材料は、約３７℃もしくは体温で安定性である治療上有用なゲルおよびペーストを産生できる。これらのゲルは膨張および／または収縮できるが、水溶液中には溶解しない。
【００４５】
架橋デキストラン／ゼラチン網目構造を形成するためのまた別の方法として、ゼラチンおよびデキストラン鎖を共有結合する反応性部分として多官能架橋剤を利用することができる。そのような二官能架橋剤には、グルタルアルデヒド、エポキシド（例、ビス−オキシラン）、酸化デキストラン、ｐ−アジドベンゾイルヒドラジン、Ｎ−［α−マレイミドアセトキシ］スクシンイミドエステル、ｐ−アジドフェニルグリオキサル一水和物、ビス−［β−（４−アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド、ビス［スルホスクシンイミジル］スベレート、ジチオビス［スクシンイミジルプロピオネート、ジスクシンイミジルスベレート、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロリド、および当業者に知られているその他の二官能架橋試薬を含むことができる。
【００４６】
架橋剤を利用するまた別の実施形態では、エトキシル化（２０）トリメチルプロパントリアクリレート等のポリアクリル化材料を非特異的光活性化架橋剤として使用することができる。代表的な反応混合物の成分には、３９℃で保持された熱可逆性ヒドロゲル、エトキシル化（２０）トリメチルプロパントリアクリレート等のポリアクリレートモノマー、エオシンＹ等の光架橋剤、１−ビニル−２−ピロリジノン等の触媒、およびトリエタノールアミンが含まれるであろう。長波長光線（＞４９８ｎｍ）へのこの反応混合物の持続的曝露は架橋ヒドロゲル網目構造を産生するであろう。
【００４７】
本発明の安定化架橋ヒドロゲルマトリックスはさらにまた、１つもしくは複数の増強剤を添加することにより安定化かつ増強することができる。「増強剤」または「安定剤」とは、高分子量成分に加えてヒドロゲルマトリックスに添加される、さらに安定性または機能的長所を提供することによってヒドロゲルマトリックスを増強する化合物を意味する。高分子量成分と混合されてヒドロゲルマトリックス内に分散させられる適切な増強剤には、上記で考察した熱可逆性マトリックスと結び付けて上記で記載した多数の添加物が含まれる。増強剤には、架橋ヒドロゲルマトリックス内に組み込まれるとさらに安定性または機能的長所を提供することによってヒドロゲルマトリックスを増強する化合物、特に極性化合物を含むことができる。
【００４８】
安定化架橋ヒドロゲルマトリックスと一緒に使用するための好ましい増強剤には、極性アミノ酸、アミノ酸アナログ、アミノ酸誘導体、無傷コラーゲン、およびエチレンジアミン四酢酸ＥＤＴＡもしくはその塩等の二価カチオンのキレート剤が含まれる。極性アミノ酸は、チロシン、システイン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リシン、およびヒスチジンを含むことが意図されている。好ましい極性アミノ酸はＬ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リシン、およびＬ−アルギニンである。特定の好ましい各増強剤の適切な濃度は、熱可逆性ヒドロゲルマトリックスに結び付けて上記に記載した濃度と同一である。極性アミノ酸、ＥＤＴＡ、およびそれらの混合物は、好ましい増強剤である。増強剤は、高分子量成分の架橋の前、間、または後にマトリックス組成物へ添加することができる。
【００４９】
増強剤は、それらがマトリックス内で促進する固有の特性を有するために、特に安定化架橋生物活性ヒドロゲルマトリックスにおいて重要である。ヒドロゲルマトリックスは、下記で記載する追加の実施形態を通してより明白になる内在性生物活性を示す。この内在性生物活性は増強性および強化性の極性アミノ酸ならびにその他の増強剤の存在下での架橋高分子の独特の立体化学の機能であると考えられている。
【００５０】
例えば、ヒト線維芽細胞を生物活性ヒドロゲルへ曝露させると凝集(aggregation)が観察されているが、線維芽細胞を生物活性ヒドロゲルの個々の成分に曝露させても凝集は観察されない。多数の（５０件を超える）比較対照実験の結果は、正常ヒト新生児皮膚線維芽細胞は３７℃で完全熱可逆性ヒドロゲル調製物に曝露されると多細胞凝集物を形成するが、その中で生物活性コポリマーが形成されていない調製物に曝露されてもそのような細胞凝集活性は示されないことを証明した。凝集した細胞は交互に組み合う細胞質突起を備える密に併置した細胞集合を形成するが、そのようなコポリマーを含まない調製物を用いて処理した細胞は円形のままで表面突起部を示さない。図５に示したように、デキストランおよびゼラチンを含む生物活性ヒドロゲルに曝露されたヒト線維芽細胞のサンプル中では、存在する細胞の少なくとも８０％は凝集状態にあり、存在する細胞の２０％未満は単細胞のままであった。ヒト線維芽細胞をコラーゲンモノマー単独、炭水化物単独へ曝露させた場合、または未処理のまま放置した場合には、サンプル中で反対の作用が観察された。コラーゲンモノマー単独に曝露されたサンプル中では、およそ７５％の細胞は単細胞形態のままで、凝集状態にあったのは細胞の約２５％に過ぎなかった。炭水化物単独へ曝露されたサンプル中でもほぼ同様の作用が観察された。未処理で放置されたサンプル中では、およそ６０％の細胞は単細胞形態のままで、凝集状態であったのは細胞の約４０％に過ぎなかった。
【００５１】
下記に略述する治療使用の各々では、治療有効量の本発明のマトリックスが使用される。特定ヒドロゲルマトリックスの治療有効量は、マトリックス毎に、患者毎に、使用毎にある程度は変動し、そして患者の状態、治療される状態の性質、および送達経路等の要素に依存するであろう。例えば、径１ｃｍおよび深さ０．５ｃｍの小さな皮膚欠損は、間隙を充填し、血管形成および組織再生を刺激し、そして治療有効性を有するためには、およそ０．４ｃｍ3の安定化架橋生物活性ヒドロゲルを必要とするであろう。これとは対照的に、直径２０ｃｍおよび深さ５ｃｍの褥瘡性潰瘍は、類似の有効性を得るためにはおよそ１，６００ｃｍ3の安定化架橋生物活性ヒドロゲルを必要とするであろう。一般的提案として、治療有効性のために必要とする架橋生物活性マトリックスの量は０．１〜２，０００ｃｍ3、好ましくは約０．５〜１００ｃｍ3であろう。
【００５２】
本発明の１つの態様では、血管形成を含む部位特異的組織再生のためには安定化架橋生物活性ヒドロゲルが使用される。当技術分野においては、組織成長を促進するために設計された方法において成長因子等を保持して送達するための担体として無傷コラーゲン、ゼラチン、またはデキストランを使用することは知られている。(例えば、Kawai K.et al.,「Accelerated tissue Regeneration Through Incorporation of Basic Fibroblast Growth Factor-Impregnated Gelatin Microspheres into Artificial Dermis」,Biomaterials 21:489-499(2000);およびWissink M.J.B.et al.,「Binding and Release of Basic Fibroblast Growth Factor from Heparinized Collagen Matrices」,Biomaterials 22:2291-2299(2001)を参照されたい)。これとは対照的に、本発明の安定化架橋生物活性ヒドロゲルの内在性活性は、外因性薬物または成長因子を添加しなくても、組織再生および血管形成を促進する等の特定の生物学的反応順序を十分に引き出すことができる。実際に、本発明の架橋マトリックスには、血管形成または組織再生のために使用する場合は外因性薬物または成長因子を実質的に含んでいなくてよい、または完全に含んでいなくてよい。その独特の構造の結果としてのこの内在性に生物活性であるヒドロゲルは、組織再生および血管形成等の引き続いての細胞活性を調整する細胞付着スカフォールドを提供する。
【００５３】
安定化架橋ヒドロゲルの内因性生物活性は、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）等の追加の成長因子を使用せずに脈管形成を促進する能力に関して明白である。架橋ヒドロゲルは、血管末端(vascular terminus)に置かれ、新規血管組織を当該末端から外向きに成長させる血管スカフォールドとして機能させることで、損傷した組織における血管形成を促進するためにインビボで使用できる。血管スカフォールドは、新規血管組織にとっての支持体を提供するだけではなく、前外側血管成長(pro-lateral vessel growth)を促進する機能を担い、他方ではさらに損傷領域のための安定化の起源を提供する。
【００５４】
安定化架橋生物活性ヒドロゲルは、組織再生の他の態様に使用した場合に同様に挙動する。ヒドロゲルは、組織損傷を備える領域において細胞保持および増殖を促進する安定化された構造的格子(stabilized structural lattice)を提供する。これは、一部には再生性プロセスを助長するヒドロゲルの内在性生物活性に起因する。
【００５５】
本発明のまた別の態様では、安定化架橋ヒドロゲルは、審美的目的であろうと機能的目的であろうと、体積の増加を必要とする特定組織に寸法の増加を提供するバルキング剤として使用される。そのような用途の例には、尿失禁および胃食道逆流疾患（ＧＥＲＤ）、一般に括約筋張力低下に関連する問題を有する個人の治療が含まれる。括約筋は、通路を収縮する、または天然開口部を閉鎖するように作用する筋線維の環状帯である。ＧＥＲＤを有する個人（個体）は一般に、通常は物質が食道から胃の中へ通過できるように開放して閉鎖する、食道の基部にある括約筋は低い緊張状態を有していて完全に閉鎖することができないので、胃から食道内まで通過させられる胃液から起こる多数の症状を示すＧＥＲＤを有する個人は、胃液の産生を低下させる、または胃から食道内への食物の移動を速める薬剤を用いて治療することができる；しかし、重篤な症例では、しばしば胃の上方部分が下方食道の周囲で被覆されて食道括約筋を人工的に締め付けるニッセン・フンドプリケーション（胃底皺襞形成術）等の矯正手術を必要とする。同様に、尿失禁は、しばしば尿道内につながる膀胱基部での括約筋における低緊張状態の結果であり、手術を含む多数の治療法を必要とすることがある。
【００５６】
本発明のヒドロゲルを使用すると、これらの問題、および低下した括約筋の緊張に関連する他の問題を治療することができる。ヒドロゲルは、局所的組織欠損を再充填し、それによって体積を増加させ、そして低下した緊張を補うために増加した体積を使用することにより括約筋を再び正常に機能させ、それにより括約筋を完全に閉鎖させるための空間充填材料または細胞担体のいずれかとして括約筋内に注入することができる。そのような治療は、体温でその構造を維持して生物学的に適合し、代替治療よりはるかに侵襲性ではない長期解決策を提供する架橋生物活性ヒドロゲルの増加した安定性のために可能になる。
【００５７】
本発明のまた別の態様では、架橋生物活性ヒドロゲルマトリックスを一定の治療使用のために様々な組織細胞と組み合わせることができる。ヒドロゲルマトリックスが使用される組織の同一タイプ由来の組織細胞を治療的に使用するのが好ましいが、必要とはされない。生存する組織細胞は、自家組織起源、同種組織起源、または異種組織起源に由来することができる。用語「自家(autologous)」とは、同一宿主に由来する組織に関することを意味する。用語「同種(allogenic)」とは、同一種（すなわち、ヒト）のものであるが、同一の遺伝子組成を有していない起源に由来する組織に関することを意味する。用語「異種(xenogenic)」とは、宿主とは相違する種に由来する組織に関することを意味する。ヒドロゲルマトリックスと組み合わせて使用できる細胞タイプの非限定的例には、幹細胞、骨細胞、腱細胞、脂肪細胞、心筋細胞、肝細胞、平滑筋細胞、内皮細胞等が含まれる。組織細胞は、架橋が発生する前、間、または後にヒドロゲルマトリックスへ添加することができる。
【００５８】
様々な組織細胞と組み合わせたヒドロゲルマトリックスのための１つの特定の用途は、上記に記載したバルキング剤用途における細胞の使用である。バルキング剤を必要とする同一タイプの組織由来の組織細胞は、バルキング剤を必要とする解剖学的部位へマトリックスを投与する前に架橋生物活性ヒドロゲルマトリックスへ添加することができる。
【００５９】
また別の例では、架橋の前に本発明のマトリックス内に懸濁させた肝細胞は患者の体内に注入され、そしてインサイチューで架橋させられる。マトリックスは、ａ）固定化された細胞のためのスカフォールド、およびｂ）移植部位での迅速な血管形成のための生物活性ヒドロゲルを提供する。
【００６０】
さらにまた別の例では、本発明のヒドロゲルマトリックスは径の小さな人工血管を開発するためのエクスビボ培養スカフォールドとして、または患者に移植する前のその他の複合組織工学構築物として使用できよう。この場合には、架橋ヒドロゲルはインビトロでの細胞増殖に向けられた組織化テンプレート(organizing template)として機能し、そして一連の培養ステップを通して複合器官もしくは組織構造を発達させるために使用できる。
【００６１】
本発明のさらにまた別の態様では、架橋ヒドロゲルは成形可能な構造を形成するために他の材料と混合される。例えば、架橋ヒドロゲルはアルミン酸カルシウム、ヒドロキシアパタイト、アルミナ、ジルコニア、ケイ酸アルミニウム、リン酸カルシウム、生体活性ガラス、セラミック、コラーゲン、自家骨、同種骨、異種骨、コラリン、およびそれらの誘導体または組み合わせ、またはその他の生物学的に製造されたカルシウムもしくはヒドロキシアパタイト構造要素を含有する複合材料等の骨伝導性または骨誘導性材料と混合することができる。用語「骨伝導性」とは、血液の血管流入および明確な受動的格子構造内への新規骨形成を促進する材料に関することが意図されている。用語「骨誘導性」は、骨前駆体細胞の形成をもたらす未分化血管周囲間葉細胞（新規骨を形成する能力を備えた細胞）の有糸分裂誘発を導く材料に関することが意図されている。「アルミナ」は、コランダム（鋼玉）等の様々な形態で例示できるアルミニウムの天然もしくは合成酸化物からなる材料の一般的に保持された定義を意味する。生体活性ガラスは、一般に網目形成成分として二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）を含有しており、生体組織にしっかりと結合できる能力を特徴とする。市販で入手できる生体活性ガラスおよびそれらの製造業者の例には、Bioglass(登録商標)（American Biomaterials社、米国、４５％シリカ、２４％酸化カルシウム（ＣａＯ）、２４．５％酸化二ナトリウム（Ｎａ2Ｏ）、および６％ピロリン酸塩（Ｐ2Ｏ5））、Consil(登録商標)（Xeipon社、英国）、NovaBone(登録商標)（American Biomaterials社）、Biogran(登録商標)（Orthovita社、米国）、PerioGlass(登録商標)（Block Drug社、米国）、およびCeravital(登録商標)（E. Pfeil & H. Bromer社、ドイツ）が含まれる。Corglaes(登録商標)（Giltech社、英国エア）は、網目形成成分として二酸化ケイ素ではなくピロリン酸塩を含有するまた別の生体活性ガラスファミリーの代表である。これらのガラスは４２〜４９モル％のＰ2Ｏ5を含有しており、残りの１０〜４０モル％はＣａＯおよびＮａ2Ｏである。
【００６２】
上記に記載したような本発明の安定化架橋ヒドロゲルマトリックスと混合したそのような材料の使用は、図６に略図で示したような骨の修復術および再建術に適切な成形可能な架橋構造を形成すると予想されるであろう。図示したように、本発明の架橋生物活性ヒドロゲルマトリックスのための成分は、ステップ１に示したような注入可能なペーストを形成するために、容器内で混合され、微細に粉砕されたセラミック粉末、またはその他の骨誘導性材料の存在下で反応（すなわち、架橋）させられる。ペーストは成形型内へ流し込まれ、反応かつ硬化させられる（ステップ２）。最終生成物が型から取り出され、この例では骨修復術用のドエルとして使用される（ステップ３）。この医療用具またはインプラントは、血管形成を、したがって骨誘導性インプラントのより優れた一体化を誘導すると予想される。おそらく、大きな骨（例、大腿骨）における血液供給の改善は骨髄産生を増加させ、骨の密度および健康における単純な改善を超える治療作用を有するであろう。このタイプの固形または半固形ゲルは、骨断片の創傷または非治癒性骨折を含む組織創傷のために利用できよう。
【００６３】
本発明のまた別の態様では、安定化架橋ヒドロゲルは、架橋ヒドロゲルを創傷に投与することによって、治癒中の開放創傷を保護し、さらに治癒を促進するための創傷治癒用具として使用される。コラーゲンおよびゼラチンが創傷被覆および創傷治癒の分野において有用な役割を果たす個々の能力については明確に実証されている。コラーゲンは、創傷治癒において次の機能を実施することが知られている：止血する；単細胞と結合することにより創傷清拭に役立つ；組織および血管成長のためのマトリックスを提供する；線維芽細胞を引きつけて細胞の有向性移動に役立つ；細胞結合を促進するフィブロネクチンと結合する；細胞増殖、細胞分化、および細胞移動を支援する；ならびに、組織の完全性(integrity)を上昇させる指向性かつ組織化された線維の沈着に役立つ。同様に、ゼラチンもまた創傷治癒を遂行し、そしてマクロファージの活性化を刺激して高度の止血作用を産生することが知られている。（例えば、Hovig T.et al.,「Platelet Adherence to Fibrin and Collagen」,Journal Lab and Clin. Med. 71(1):29-39(1968);Postlewaithe A.E.et al.,「Chemotactic Attraction of Human Fibroblasts to Type I, II, and III Collagens and collagen Derived Peptides」,Proc. Natl. Acad. Science 177:64-65(1978);Kleinman H.K.et al.,「Role of Collagenous Matrices in the Adhesion and Growth of Cells」,The Journal of Cell Biology 88:473-485(1981);Dunn G.A. and Ebendal T.,「Contact Guidance on Oriented Collagen Gels」,Exp. Cell Res. 111:475-479(1978);Kleinman H.K.et al.,「Interactions of Fibronectin with Collagen Fibrils」,Biochemistry 20:2325-2330(1981);Morykwas M.J.et al.,「In Vitro and In Vivo Testing of a Collagen Sheet to Support Keratinocyte Growth for Use as a Burn Wound Covering」,The Journal of Trauma 29(8):1163-1167(1976);Emerman J.T. and Pitelka D.R.,「浮動性コラーゲン膜上の解離乳房上皮における形態学的分化の維持および誘導(Maintenance and Induction of Morphological Differentiation in Dissociated Mammary Epithelium on Floating Collagen Membranes)」,In Vitro 13(5):316-337(1977);Doillon C.J.et al.,「インビトロおよびインビボでの新規合成コラーゲン線維の線維芽細胞−コラーゲンスポンジ相互作用および空間的配置(Fibroblast-Collagen Sponge Interactions and Spatial Disposition of Newly Synthesized Collagen Fibers in Vitro and in Vivo)」,Scanning Electron Microscopy 3:1313-1320(1984);and Hong S.R.et al.,「Study on Gelatin-Containing Artificial Skin IV:A Comparative Study on the Effect of Antibiotic and EGF on Cell Proliferation During Epidermal Healing」,Biomaterials 22:2777-2783(2001)を参照されたい）。
【００６４】
本発明の安定化架橋ヒドロゲルは、増強性かつ強化性極性アミノ酸の存在下において材料の内在性生物活性と高分子の独特の空間的配置とに基づく創傷治癒用具として有用である。数件の研究は、コラーゲンが創傷治癒特性を有する原因はその独特の構造にあると指摘している（例えば、Brass L.F. and Bensusan H.,「The Role of Quaternary Structure in the Platelet-Collagen Interaction」,The Journal of Clinical Investigation 54:1480-1487(1974);Jaffe R. and Dykin D.,「Evidence for a Structural Requirement for the Aggregation of Platelets by Collagen」,Journal of Clinical Investigation 53:875-883(1974);Postlewaithe A.E. and Kang A.H.,「Collagen and Collagen Peptide Induced Chemotaxis of Human Blood Monocytes」,The Journal of Experimental Medicine 143:1299-1307(1976);およびReddi A.H.,「Collagen and Cell Differentiation」,Biochemistry of Collagen, New York;Plenum Press, 449-477(1976)を参照されたい）。同様に、本発明のヒドロゲルは、細胞にとってのスカフォールドを提供して創傷治癒を促進するために必要な組織構築成分および要素を誘引するヒドロゲルマトリックスの独特の構造のために創傷治癒剤としての独特の活性を示す。架橋ヒドロゲルと創傷床との迅速な機械的一体化、材料の類似の機械的特性、およびそれが創傷床における好ましい細胞付着スカフォールド材料として機能する能力は、創傷治療用具としてのマトリックスの有用性に貢献する。
【００６５】
また別の態様では、安定化架橋ヒドロゲルは創傷修復術における接着剤（すなわち、組織シーラント）として使用できる。創傷修復術における接着剤の使用は当技術分野において知られている。そのような使用は米合衆国では近年ＦＤＡ承認を獲得したばかりであるが、カナダおよびヨーロッパでは創傷修復用接着剤は２０年以上にわたり広範囲に使用されてきた。創傷接着剤は、使用法が容易で、疼痛が減少し、適用時間が短縮され、そして除去するためのフォローアップを必要としないので、縫合糸、ステープル、および接着性ストリップ等の標準方法より優れた創傷閉鎖剤にとって人気の高い代替材を提供する。歴史的に最初に利用できるようになり、現在でも最も頻回に使用されている創傷接着剤は、シアノアクリレート、もしくは一般的家庭用スーパーグルーのタイプである。以前の創傷接着剤はＮ−ブチルシアノアクリレートから構成されたが、しかし現在好ましい形態は２−オクチルシアノアクリレートである。しかし、シアノアクリレート創傷接着剤の使用は、アレルギー反応、残留溶剤の存在、および身体の他の部分への化学物質の移動等の使用を制限する幾つかの欠点を有する。さらに、シアノアクリレート接着剤は、妊婦または末梢血管疾患、糖尿病もしくはコルチコステロイド剤の長期使用の病歴を有する患者、あるいは穿刺創傷または咬傷もしくは引っ掻き傷（原因が動物またはヒト）を有する患者においては使用すべきではない。シアノアクリレート創傷接着剤は、皮膚の表面上そして容易に一緒に押し戻される平らな表面を備える規則的な形状の創傷上でのみ使用できる。これは、重度の刺激を引き起こすことがあり、そして実際的に創傷内の上皮形成を損なうように機能する可能性があるので、シアノアクリレートが確実に生皮に接触しない、または創傷内に侵入しないようにすることが必要である。
【００６６】
シアノアクリレート創傷接着剤にはより新規の代替物がいくつかあるが、代替物の多くはそれらの広汎な使用を面倒にする追加の欠点を有している。例えば、ゼラチン、レゾルシノール、およびホルムアルデヒドから構成される接着剤は有効であることが証明されているが、ホルムアルデヒドの毒性および発癌作用はそれらの使用を制限する。船の船体へ付着するためにフジツボが使用する分泌物等の海洋生物からの分泌物が有用な創傷接着剤であることを指摘する研究が実施されてきたが、その材料を商業的に製造するために使用される精密な遺伝子工学技術には現在までのところコストがかかりすぎることが見いだされている。フィブリン糊等の生物学的糊、または止血剤は、びまん性出血を制御するために心臓手術または血管手術において頻回に使用される。そのような止血シーラントFloSeal(登録商標)（FloSealマトリックス止血シーラント；Fusion Medical Technologies社、カリフォルニア州フレモント）の１つの例は、架橋ゼラチンマトリックスと、重合してフィブリンクロットを形成するフィブリンモノマーへフィブリノーゲンを転換させるトロンビンとの組み合わせである。しかし、これらの代替物の中で一般的実践に使用できる、容易に使用可能な創傷接着剤としてのシアノアクリレートの実行可能な代替物を提供するものはない。
【００６７】
本発明の安定化架橋ヒドロゲルマトリックスは、シアノアクリレートと結び付いた多数の欠点および禁忌を回避しながら創傷接着剤として有用にさせる特性を示す。ヒドロゲルがインサイチューで重合する能力は、同時に血管新生を加速して創傷治癒を促進しながら、細胞間接着を増加させる作用を有する。ヒドロゲルの生体適合性は、開放創、縁がギザギザの創傷、および粘膜周囲の創傷等のシアノアクリレートを使用できない状態を含む極めて多数の創傷に使用することを可能にする。実際に、本発明のヒドロゲルは、純粋の局所的使用とは対照的に創傷部位内へ導入された場合に最も有効である。発生期のヒドロゲル混合物が創傷内に配置されると、ヒドロゲルのインサイチュー重合は創傷をシールして治癒プロセスを容易にする一連の生物学的相互作用を開始するように機能する。ゼラチンおよびデキストラン高分子上の活性結合部位は、添加された安定性かつ増強性アミノ酸の存在下で、相互に架橋するだけではなく、創傷内の天然細胞への結合を形成し、それによって創傷の中心軸に向けて創傷面を引張って創縁を一緒に保持するように機能する架橋ヒドロゲルマトリックスを形成する。創縁を一緒に保持するように機能することに加えて、ヒドロゲルはさらにまた創傷部位と外部要素との間に非水溶性バリアを形成するように機能し、その部位での組織再生を助長するための細胞スカフォールドとして機能する。
【００６８】
創傷接着剤として使用するためにヒドロゲルを包装かつ送達できる多数の実施形態がある。例えば、反応性高分子量成分は保管中には成分を分離させて維持し、架橋が発生できる場所ではこれらの成分を同時に創傷内へ発射することを可能にするデュアルチャンバー装置に包装することができよう。また別の予想される実施形態は、成分を分離している分解性膜を備えた装置内に成分を包装するステップを含んでいる。使用直前に、装置を圧搾すると膜が破壊されて成分が混合され、限定された時間にわたり創傷に適用されると、インサイチューで架橋が発生できる。創傷接着剤として使用するためにヒドロゲルを包装して送達するための様々な追加の実施形態は、当業者には容易に明白であろう。
【００６９】
本明細書に記載した実施形態の各々で利用される生物活性ヒドロゲルマトリックスは、相互に架橋した２つの高分子量成分だけから構成されてよい。好ましくは、本明細書に記載した実施形態の各々は、上記に記載した好ましい実施形態に利用された増強剤等の追加の成分を組み込んでいてよい。下記の表１には、本発明の安定化架橋ヒドロゲルマトリックス内に存在する好ましい成分を各成分についての適切な濃度ならびに好ましい濃度とともに列挙した。ゼラチンおよびデキストランについて表１に列挙した濃度は、また別のポリグリカンおよびポリペプチド成分に対しても適合することに留意されたい。
【００７０】
【表１】
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@0001
【００７１】
上記で述べたように、本発明は、局所部位で血管新生を誘導する、局所的創傷治癒反応を調整する、および細胞に基づく治療薬のための回収可能な細胞移植用具を開発する適切な手段を含む多数の利点を提供する。追加の利点には以下が含まれる：生体内侵食性縫合材料の分解に関連する瘢痕の減少；インスリン送達システムのために日常的に使用されるグルコースセンサー等の血管外センサーの性能および長期的機能における改善；人工関節および人工腱等の構造的移植物の周囲での治癒速度、耐久性および機械的特性における改善；特に腹部傷害または脊椎傷害中の術後癒着の結果として生じる疼痛および付随合併症の減少；ならびに天然組織と移植構造（すなわち、歯、多孔質ヒドロキシアパタイトまたは骨修復術用のセラミック材料）との一体化の改善。
【００７２】
本発明の架橋ヒドロゲルマトリックスは体外で架橋させて、その後で患者の体内へ移植することができる、またはヒドロゲルマトリックスをインサイチューで架橋させることができる。ヒドロゲルは体温で安定性であるが、ゼラチンおよびデキストランの実際の架橋もまた体温で発生させることができる。この特徴は、以前に言及した組織再生、血管形成のために、バルキング剤として、および当業者には容易に明白であろう他の用途において使用される架橋ヒドロゲルの能力に照らすと特に有用である。迅速な治癒を必要とする化学的創傷、熱傷、または外傷において一般的であるような不規則な組織欠損は、組織再生のための細胞付着スカフォールドを提供する生物活性ヒドロゲルをインサイチューで形成する能力からも利益を得るであろう。インサイチュー形成のために所望の部位へヒドロゲルの液状成分を送達するための代表的方法は、マルチチャンバーシリンジを使用する方法を含んでいる。マルチチャンバーシリンジは、マトリックスが必要とされる場所で身体内の部位内へ注入されるまで架橋ヒドロゲルを形成する高分子量成分が相互作用しないように、マルチルーメンカテーテルまたはニードルに取り付けることができる。また別の予想される方法には、成分が部位内へ注入されるまでは分離されたままであるが、高分子量成分が特定部位内への注入中にカテーテルまたはニードルのルーメン内で実際的に相互に接触する場所で静的混合要素を含有するシングルルーメンカテーテルまたはニードルを備えたマルチチャンバーシリンジの使用が含まれる。インサイチュー形成のためにヒドロゲル成分を送達する追加の方法は、当業者には容易に明白であろう。典型的には、上記に記載した実施形態では、酸化デキストラン等の１つの高分子量成分がシリンジの１つのチャンバー内に配置され、もう１つの高分子量成分および追加の増強剤は別個のチャンバー内に配置されるであろう。
【実施例】
【００７３】
下記の実施例によって、本発明をより十分に説明するが、これらの実施例は本発明を説明するためのもので、限定することは意図されていない。他に特別に指摘しない限り、すべてのパーセンテージは生物活性ヒドロゲルマトリックスの総重量に基づく重量パーセンテージを意味する。
【００７４】
［実施例１］
１８０ｇのリン酸緩衝食塩液を含有する風袋を計量したビーカー内に２０ｇのデキストラン（分子量５００，０００Ｄａ）を量って入れた。デキストランは、継続的に撹拌しながら溶解させ、溶解したデキストランに８ｇのメタ過ヨウ素酸ナトリウム（Sigma社製、製品番号S1147）を添加した。光触媒副反応を防止するためにこのビーカーをホイルで覆い、撹拌プレート上に置いて１２時間にわたり５±３℃の冷蔵庫に入れた。このビーカーを取出し、過剰な過ヨウ素酸塩を消失させるために５０ｍＬのエチレングリコールを添加し、室温で３０分間にわたりクエンチング反応を進行させた。０．１ＮのＮａＯＨを用いてこの反応混合液のｐＨを７．５±０．５へ調整した。タンジェンシャルフロー限外濾過法を使用して反応生成物を分離した(Filtron Mini-Ultrasette、Pall Filtration Products社、製品番号OS100C77)。この溶液の質量を半分に減少させ、４倍量のリン酸緩衝食塩液と置換した。精製生成物の最終容積を１００ｍＬへ減少させた。最終生成物を２０％デキストラン溶液としてフィルター濾過し、使用時まで冷凍保存した。ヒドロキシルアミン滴定により、このデキストランが２０％酸化されていることが証明された。
【００７５】
ゼラチンおよびデキストランを含む熱可逆性ヒドロゲルマトリックスのバイアルおよび無菌濾過した酸化デキストランのバイアルは、ヒドロゲルを融解させて酸化デキストランを加温するために３９℃で３０分間保持した。ヒドロゲルのアリコート１０ｍＬを５０ｍＬの遠心管に添加し、５ｍＬの酸化デキストランと迅速に混合した。この溶液を１００ｍｍ培養皿内に注入し、培養皿の全域で一様な膜を形成するために穏やかに回転させた。
【００７６】
反応性ゲルを室温で架橋するに任せた。ゲルは、フェノールレッドを含有するMedium 199を用いてゲルの表面に溢れさせることによって、３７℃でMedium 199を用いて洗浄した。中性ｐＨを維持するために、必要に応じてMedium 199オーバーレイを取り換えた。
【００７７】
組織生検用パンチを使用して架橋ゲルの８ｍｍ径ディスクを作製した。個別ディスクを１０ｍＬのMedium 199を含有する１５ｍＬ遠心管内に入れ、２週間にわたり３７℃でインキュベートした。架橋ゲルは３７℃では不溶性であり、それらの最初の形状を保持した。
【００７８】
［実施例２］
２０ｇのデキストラン（分子量５００，０００Ｄａ）（Sigma社製、ミズーリ州セントルイス）を、２００ｍＬのリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）を含有する風袋を計量したビーカーに添加し、一様な溶液を形成するために撹拌した。さらにデキストラン溶液へ８ｇのメタ過ヨウ素酸ナトリウムを添加し、これをホイルで覆い、５±３℃で一晩撹拌し続けた。５０ｍＬのエチレングリコールを用いてこの反応をクエンチし、０．１ＭのＮａＯＨを用いてこの溶液のｐＨを７．５±０．５へ調整した。タンジェンシャル濾過法を使用して生成物を精製し、２０％デキストラン溶液へ濃縮した。無菌濾過溶液は、使用時まで冷凍保存した。ヒドロキシルアミン滴定により、このデキストランが２０％酸化されていることが証明された。２０±５℃で８ヵ月間貯蔵した後に、冷凍サンプルは酸化レベルの消失を示さなかった。
【００７９】
一定のゼラチン濃度（１２％）および酸化デキストランの濃度を増加させながら、一連の熱可逆性ヒドロゲルおよび酸化デキストラン調製物を調製した。図７に示したように、成形ゲルの強度は酸化デキストランの濃度が上昇するにつれて増加した。一定のゼラチン濃度および様々な酸化デキストラン濃度の混合物を、２種の温度２０℃および２８℃での圧縮に対する抵抗性について試験した。ゲル強度は、酸化デキストランの含量の増加および温度の低下に伴って増加した。
【００８０】
［実施例３］
２００ｍＬのリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）を含有する風袋を計量したビーカーに２０ｇのデキストラン（分子量６８，０００Ｄａ）（Sigma社製、ミズーリ州セントルイス）を添加し、一様な溶液を形成するために撹拌した。さらにデキストラン溶液へ８ｇのメタ過ヨウ素酸ナトリウムを添加し、これをホイルで覆い、５±３℃で一晩撹拌し続けた。５０ｍＬのエチレングリコールを用いてこの反応をクエンチし、０．１ＭのＮａＯＨを用いてこの溶液のｐＨを７．５±０．５へ調整した。タンジェンシャル濾過法を使用して生成物を精製し、そして２０％デキストラン溶液へ濃縮した。無菌濾過溶液を使用時まで冷凍保存した。ヒドロキシルアミン滴定により、このデキストランが１４％酸化されていることが証明された。
【００８１】
ゼラチンおよびデキストランを含む熱可逆性ヒドロゲルを融解させ、天然および酸化デキストランの数セットの混合物へ添加し、混合して、Ｔ−２５培養フラスコ内へ流し込んだ。各サンプル内の酸化デキストランの濃度範囲は約３〜約２１％であった。
【００８２】
成形ゲルは一晩かけて５±３℃で硬化するに任せ、熱量分析法でｐＨにおけるそれ以上の変化が明白にならなくなるまで、フェノールレッドを含有するMedium 199（Sigma Chemical社製、ミズーリ州セントルイス）を用いて３７℃で広範に洗浄した。材料は残留酸性成分を中和するために培養培地を用いて４日間にわたり広範にすすぎ洗いした。
【００８３】
さらに細胞培養試験を実施するために１２％酸化デキストランを含有するフラスコを使用した。正常ヒト新生児皮膚線維芽細胞を６ｍＬの血清含有培養培地へ供し、さらに２週間にわたり３７℃で材料と相互作用するに任せた。２４時間後、細胞は健常状態を維持しているように見え、細胞質プロセスによって材料への付着を示し、さらに多細胞集団の形成を示した。５日後に観察したとき、１つのフラスコは培養内で形成されていた大きな細胞凝集体および大きな凝集体が架橋ヒドロゲル材料に付着していた培養の下層において星細胞を示した。次の１週間にわたり、これらの凝集体はサイズが成長し続け、健常細胞を含有するように見えた。この時点で培養を画像描出したところ、結果として生じた図は細長い突起を備える材料表面の上方に盛り上がっている細胞凝集体およびこの構造をヒドロゲル基質へ接続する個別細胞を示した。
【００８４】
架橋材料への約１ヵ月間の曝露後、細胞をヒドロゲル含有フラスコから良好に分離することができ、標準組織培養プラスチック面上で再プレーティングした。そこでそれらは迅速に増殖することが観察され、正常に培養された線維芽細胞の形態に類似する形態を示した。
【００８５】
［実施例４］
架橋ヒドロゲルは、上記の実施例１により調製したが、このときヒドロゲルは１２％ゼラチンおよび５％酸化デキストラン（分子量５００，０００Ｄａ）から構成された。製造後、５ｍＬの架橋ヒドロゲルをＴ−２５フラスコ内に分注し、それに５ｍＬの培養培地（１０％ＦＢＳを含有するＩＭＤＭ）を添加した。架橋ヒドロゲルはインキュベーター温度（３７℃）では固体であった。添加４時間後、添加した培地は赤から淡黄色へ変色したが、これは溶液ｐＨの酸性に向かう変化を示していた。最初の培養培地５ｍＬを取り除き、培地の緩衝能力を試験するために第二の５ｍＬ量を添加した。３日後、同一の変色が観察された。培養培地を再び取り除き、追加の５ｍＬの培養培地と取り換えた。１日後、ほんのわずかな変色が生じたが、これは材料からの酸性浸出物が中和したことを示していた。同日に、ヒト皮膚線維芽細胞（製品番号CCD-1112Sk、アメリカンタイプカルチャーコレクション）の集団を分離させ、フラスコ内に播種するために調製した。細胞を総量６ｍＬ中に１：６の希釈率で新鮮培地へ播種し、フラスコをインキュベーターへ戻した。１時間後、細胞は偽足を伸長させて架橋ヒドロゲルと結合したが、まだ良好には付着していなかった。約４時間の追加のインキュベーション後、追加の付着は観察されなかった。さらに１日後、およそ２０％の細胞は凝集体様構造を形成しているように見え、凝集体のサイズ範囲は約２〜約１０ｃｅｌｌｓにわたり、細胞から付着突起が伸長していた。既存の培地を新規のＴ−２５フラスコ内へ注ぎ出し、培養には３ｍＬの新鮮培地を添加した。
【００８６】
翌日、最初の細胞および再プレーティングした細胞を試験した。どちらの細胞集団も円形化して健常ではないように見え、移植された細胞は新規フラスコ表面には付着していなかった。
【００８７】
５日（実験開始から９日）後、ヒト皮膚線維芽細胞、架橋ヒドロゲル、および平穏にインキュベートされていた培養培地を含有する第３のフラスコを試験した。このサンプルは大きな凝集体を示した。再び翌日に検査すると、凝集した細胞集団はサイズが成長し、胚様構造に似ていた。６日後の試験により、一部の部位で明白にヒドロゲル内に増殖している一部の細胞を備える架橋ヒドロゲルの上部にある大きな多細胞構造が明らかになった。
【００８８】
［実施例５］
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解させた架橋剤である０．５ｍｇ／ｍＬのビス−［β−（４−アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）の溶液１．５ｍＬを上記に記載したようにゼラチンおよびデキストランを含有する１５ｍＬの液状熱可逆性ヒドロゲルを含有する、ホイルで覆った容器に添加した。熱可逆性ヒドロゲルの光活性化非特異的架橋は、５５０ワット電球（写真撮影に使用するフラッドライト）への継続的曝露によって提供されるように、反応混合物を長波長光線へ曝露させると発生した。曝露時間が長いほどより良好な架橋が得られることが証明された。
【００８９】
上記の説明および添付の図面に呈示した教示から利益が得られる、本発明が関連する分野の当業者には本発明の多数の変形およびその他の実施形態が思い浮かぶであろう。このため、本発明は本明細書に開示した特定実施形態には限定されない、そして変形およびその他の実施形態は本特許の請求の範囲内に含まれることが意図されている、と理解すべきである。本明細書では特定の用語が使用されているが、それらは限定する目的ではなく一般的かつ記述的意味でのみ使用されている。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】コラーゲンモノマー由来の非環状α鎖の形成を示した図である。
【図２Ａ】α鎖とデキストランとの結合の作用を示した図である。
【図２Ｂ】デキストランと結合しないα鎖の挙動を示した図である。
【図３】他のヒドロゲルマトリックス添加物の作用を示した図である。
【図４】本発明の共有結合により架橋したゼラチン／デキストランマトリックスの実施形態を示した図である。
【図５】細胞凝集の促進におけるヒドロゲルマトリックスの作用を示したグラフである。
【図６】骨修復術における本発明の生物活性マトリックスの架橋された実施形態の使用を示した図である。
【図７】架橋ヒドロゲルマトリックスの全強度とデキストラン酸化の量との関係を示したグラフである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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