(57)【要約】  本発明は、細胞培養中でのレスベラトロールの産生方法に関する。本発明の方法は、１１〜１３の範囲の置換度を備える無作為メチル化β−シクロデキストリン（ＲＭＢＣＤ）の存在下で、レスベラトロールの合成および培地中への分泌、そして所望であれば培地からのレスベラトロールの単離を許容する条件下で、懸濁液中での、天然にレスベラトロールを産生する細胞の培養をインキュベートするステップからなる。レスベラトロールは、医薬品または栄養補助製品の製造に用いることができる。
2005514945.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
懸濁液中での、天然にレスベラトロールを産生する細胞の培養中でレスベラトロールを産生する方法であって、１１〜１３の範囲の置換度を備える無作為メチル化β−シクロデキストリン（ＲＭＢＣＤ）の存在下で、レスベラトロールの合成および培地中への分泌、そして所望であれば培地からのレスベラトロールの単離を許容する条件下で当該細胞をインキュベートするステップからなる方法。
【請求項２】
天然にレスベラトロールを産生する当該細胞にＰｉｎｕｓ  ｓｉｂｉｒｉｃａ、Ｐｉｎｕｓ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｇｎｅｔｕｍ  ｐａｒｖｉｆｌｏｒｕｍ、Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ、Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ  ｃｕｓｐｉｄａｔｕｍ、Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ、Ｅｕｃａｌｉｐｔｕｓ  ｓｐ．、Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ  ｌａｋｏｏｃｈａ、Ｎｏｔｈｏｆａｇｕｓ  ｆｕｓｃａ、Ｐｈｏｅｎｉｘ  ｄａｃｔｉｌｉｆｅｒａ、Ｆｅｓｔｕｃａ  ｖｅｒｓｕｔａ、Ｃａｒｅｘ  ｆｅｄｉａ、またはＶｅｒａｔｒｕｍ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ由来の細胞が含まれる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
１１〜１３の範囲の置換度を備える当該ＲＭＢＣＤがα（１→４）型グルコシド結合によって結合された７Ｄ−グルコース単位からなる環状マルトオリゴ糖であり、Ｄ−グルコース単位の２位、３位、および６位におけるそのヒドロキシル基は空いていてもメチル化によって誘導体化されていてもよく、シクロデキストリン環１つ当たり１１〜１３個のメトキシ基を有する状態で、メトキシ化学基を有する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
１１〜１３の範囲の置換度を備える当該ＲＭＢＣＤがＲＡＭＥＢであると同定されたシクロデキストリンまたはＣＡＶＡＳＯＬ（登録商標）Ｗ７Ｍであると同定されたシクロデキストリンである、請求項３記載の方法。
【請求項５】
レスベラトロールを産生する当該細胞が、中間オーキシン／サイトキニンホルモン比を用いて、１１〜１３の範囲の置換度を備える当該ＲＭＢＣＤの存在下で、軌道振とうを用いて、２０〜２８℃の範囲の温度で、０〜１６時間の明期および８〜２４時間の暗期からなる光周期下で、液体培地中で培養されるＶｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ由来の細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
産生するレスベラトロールがトランス−レスベラトロール異性体である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
懸濁液中での、天然にレスベラトロールを産生する細胞の培養中でレスベラトロール合成を誘導する方法であって、１１〜１３の範囲の置換度を備えるＲＭＢＣＤの存在下で、当該細胞によるレスベラトロール合成を許容する条件下で当該細胞をインキュベートするステップからなる方法。
【請求項８】
天然にレスベラトロールを産生する当該細胞にＰｉｎｕｓ  ｓｉｂｉｒｉｃａ、Ｐｉｎｕｓ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｇｎｅｔｕｍ  ｐａｒｖｉｆｌｏｒｕｍ、Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ、Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ  ｃｕｓｐｉｄａｔｕｍ、Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ、Ｅｕｃａｌｉｐｔｕｓ  ｓｐ．、Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ  ｌａｋｏｏｃｈａ、Ｎｏｔｈｏｆａｇｕｓ  ｆｕｓｃａ、Ｐｈｏｅｎｉｘ  ｄａｃｔｉｌｉｆｅｒａ、Ｆｅｓｔｕｃａ  ｖｅｒｓｕｔａ、Ｃａｒｅｘ  ｆｅｄｉａ、またはＶｅｒａｔｒｕｍ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ由来の細胞が含まれる、請求項７記載の方法。
【請求項９】
１１〜１３の範囲の置換度を備える当該ＲＭＢＣＤがα（１→４）型グルコシド結合によって結合された７Ｄ−グルコース単位からなる環状マルトオリゴ糖であり、Ｄ−グルコース単位の２位、３位、および６位におけるそのヒドロキシル基は空いていてもメチル化によって誘導体化されていてもよく、シクロデキストリン環１つ当たり１１〜１３個のメトキシ基を有する状態で、メトキシ化学基を有する、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
１１〜１３の範囲の置換度を備える当該ＲＭＢＣＤがＲＡＭＥＢであると同定されたシクロデキストリンまたはＣＡＶＡＳＯＬ（登録商標）Ｗ７Ｍであると同定されたシクロデキストリンである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
レスベラトロールを産生する当該細胞が、中間オーキシン／サイトキニンホルモン比を用いて、１１〜１３の範囲の置換度を備える当該ＲＭＢＣＤの存在下で、軌道振とうを用いて、２０〜２８℃の範囲の温度で、０〜１６時間の明期および８〜２４時間の暗期からなる光周期下で、液体培地中で培養されるＶｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ由来の細胞である、請求項７記載の方法。
【請求項１２】
産生するレスベラトロールがトランス−レスベラトロール異性体である、請求項７記載の方法。
【請求項１３】
懸濁液中でレスベラトロールを産生する細胞の培地中で、シクロデキストリンを全く含有しない当該培地中の溶解限度より高い濃度で当該細胞により分泌されたレスベラトロールを蓄積させる方法であって、１１〜１３の範囲の置換度を備えるＲＭＢＣＤを当該培地へ添加するステップからなる方法。
【請求項１４】
レスベラトロールを産生する当該細胞がレスベラトロールを天然に産生する細胞である、または天然にはレスベラトロールを産生しないがレスベラトロールを産生する能力を獲得している細胞である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
レスベラトロールを産生する当該細胞にＰｉｎｕｓ  ｓｉｂｉｒｉｃａ、Ｐｉｎｕｓ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｇｎｅｔｕｍ  ｐａｒｖｉｆｌｏｒｕｍ、Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ、Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ  ｃｕｓｐｉｄａｔｕｍ、Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ、Ｅｕｃａｌｉｐｔｕｓ  ｓｐ．、Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ  ｌａｋｏｏｃｈａ、Ｎｏｔｈｏｆａｇｕｓ  ｆｕｓｃａ、Ｐｈｏｅｎｉｘ  ｄａｃｔｉｌｉｆｅｒａ、Ｆｅｓｔｕｃａ  ｖｅｒｓｕｔａ、Ｃａｒｅｘ  ｆｅｄｉａ、Ｖｅｒａｔｒｕｍ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ由来の細胞が含まれる、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
レスベラトロールを産生する当該細胞が天然にはレスベラトロールを産生しない植物、すなわちトランスジェニック植物由来の細胞を含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
１１〜１３の範囲の置換度を備える当該ＲＭＢＣＤがα（１→４）型グルコシド結合によって結合された７Ｄ−グルコース単位からなる環状マルトオリゴ糖であり、Ｄ−グルコース単位の２位、３位、および６位におけるそのヒドロキシル基は空いていてもメチル化によって誘導体化されていてもよく、シクロデキストリン環１つ当たり１１〜１３個のメトキシ基を有する状態で、メトキシ化学基を有する、請求項１３記載の方法。
【請求項１８】
１１〜１３の範囲の置換度を備える当該ＲＭＢＣＤがＲＡＭＥＢであると同定されたシクロデキストリンまたはＣＡＶＡＳＯＬ（登録商標）Ｗ７Ｍであると同定されたシクロデキストリンである、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
レスベラトロールを産生する当該細胞が、中間オーキシン／サイトキニンホルモン比を用いて、１１〜１３の範囲の置換度を備える当該ＲＭＢＣＤの存在下で、軌道振とうを用いて、２０〜２８℃の範囲の温度で、０〜１６時間の明期および８〜２４時間の暗期からなる光周期下で、液体培地中で培養されるＶｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ由来の細胞である、請求項１３記載の方法。
【請求項２０】
蓄積したレスベラトロールがトランス−レスベラトロール異性体である、請求項１３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レスベラトロールを産生するように誘導され、そしてその溶解限度より高い濃度でレスベラトロールを蓄積する培地を含む、懸濁液中の細胞培養に関する。詳細には、本発明は、懸濁液中で細胞を産生する際のレスベラトロール合成のエリシターとしての、およびレスベラトロールを産生かつ分泌する細胞の培地中でのレスベラトロールのアキュムレーターとしての無作為メチル化シクロデキストリンの使用に関する。本発明はさらに、細胞培養中でのレスベラトロールの産生方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
スチルベノイドは、広域抗菌活性および薬理学的活性を示す生物学的に活性なフェノール化合物である。
【０００３】
グレープバイン（ｇｒａｐｅｖｉｎｅ）等の一定の植物が紫外線照射または細菌感染症等のストレスに反応する適応メカニズムとしてスチルベノイドを合成できることは知られている（非特許文献１）。これらの化合物の主要成分の１つはトランス−レスベラトロールもしくはｔ−レスベラトロール（トランス−３，５，４’−トリヒドロキシスチルベン）である（非特許文献２）。
【０００４】
シス−レスベラトロール異性体は、通常はｔ−レスベラトロールおよび誘導体生成物を産生する植物由来抽出物中に存在する。それが存在するのは、紫外線照射によるトランス異性体の緩徐な光異性化に起因する（非特許文献３）。
【０００５】
ヒト、動物、培養中の動物細胞、および酵素アッセイを含む疫学的および実験的試験に基づいて、スチルベノイド、および特別にはレスベラトロールが健康にとって好都合な作用を有することが証明されている（非特許文献４）。このため、ヒトおよび動物の食事にレスベラトロールを含有する摂取できる生成物を含めることが望ましい。
【０００６】
レスベラトロールはワインの中に存在しており、健康によい適度なワイン消費の作用に関係している可能性がある。そこでレスベラトロールの消費を増加させることがヒトにおける癌や心血管疾患の発生率を減少させる方法として提案されている（非特許文献５）。レスベラトロールおよびレスベラトロールを含有する植物抽出物は、動脈硬化症の予防および治療のために（非特許文献６）、抗炎症薬として（非特許文献７）、および抗超酸化剤として（非特許文献８）有効であることが証明されている。レスベラトロールは発癌物質（アゾキシメタン）により処置されたラットモデルにおける異常な結腸における陰窩形成の有意な阻害を示しており、ヒトにおける腫瘍発生阻害剤としての価値を示唆している（非特許文献９）。レスベラトロールはさらにまた、血管拡張薬かつ抗血小板凝集薬であるニトロキシドの生成を促進すると報告されている（非特許文献１０）。
【０００７】
レスベラトロールがヒトおよび動物の健康に及ぼす有益な役割を考えると、需要を満たす適正な量のレスベラトロールが入手可能になるように、適正な生物学的起源を利用できるようにすることが重要である。このために様々な試験が実施されてきた。
【０００８】
ある試験では、ブドウ、ブドウ果汁、およびワイン等の植物およびその誘導体生成物中のレスベラトロール含有量を増加させるために、グレープバイン植物全体がレスベラトロール合成を誘導する物質として機能する塩化アルミニウムを用いて処理された（特許文献１）。
【０００９】
また別の試験では、植物が構成的に該遺伝子を発現してその組織中で誘導レスベラトロールグルコシドを蓄積するように、レスベラトロールシンターゼ遺伝子、またはその一部分が天然にはレスベラトロールを産生しない植物へ導入された（特許文献２）。
【００１０】
また別の試験では、レスベラトロールを産生する植物由来細胞の懸濁液が、レスベラトロールの合成ならびに培地中および細胞中のその蓄積を誘導するために真菌細胞壁の部分を用いて誘導された（非特許文献１１）。
【００１１】
さらにまた別の試験は、シクロデキストリン、特別にはヘプタキス−（２，６−ジ−Ｏ−メチル−β−シクロデキストリン）（ＤＩＭＥＢ）がグレープバイン細胞懸濁液（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ  ｖａｒ．  Ｇａｍａｙ）中で培地中へ分泌されたｔ−レスベラトロール合成を誘導する能力について報告した（非特許文献１２）。シクロデキストリンは既に、包接複合体を形成することによって難水溶性化合物の水溶性を増加させる特性を共有することが知られている。包接複合体は、宿主分子がシクロデキストリン分子の中心空洞内に受け入れられると形成され、その組立体は遊離シクロデキストリンと類似の溶解性を有する（非特許文献１３）。これらの特性に基づくと、細胞によって分泌されたｔ−レスベラトロールはシクロデキストリンとの包接複合体を形成することができ、そして沈降することなくその溶解限度より高い濃度で培地中に蓄積することができる。
【００１２】
しかし、本発明者らが実施した様々な試験は、予想には反して、すべてのシクロデキストリンが細胞培地中でのレスベラトロール合成のエリシターとして機能する能力を有する訳ではないことを証明しており、そしてこの分野における詳細な研究が今なお必要とされている。
【特許文献１】Ｊｅａｎｄｅｔら，「Ｕｔｉｌｉｓａｔｉｏｎ  ｄｕ  ｃｈｌｏｒｕｒｅ  ｄ’ａｌｕｍｉｎｉｕｍ  ｃｏｍｍｅ  ａｇｅｎｔ  ｅｌｉｃｉｔｅｕｒ  ｄｅ  ｌａ  ｓｙｎｔｈｅｓｅ  ｄｕ  ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ」国際特許出願第ＷＯ９７／１８７１５号明細書
【特許文献２】Ｈｉｐｓｋｉｎｄ  Ｊ．Ｄ．，「レスベラトロールグルコシドを含有するように修飾されたトランスジェニック植物およびその使用（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｐｌａｎｔｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｔｏ  ｃｏｎｔａｉｎ  ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ  ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ  ａｎｄ  ｕｓｅｓ  ｔｈｅｒｅｏｆ）」国際特許出願第ＷＯ００／４４９２１号明細書
【非特許文献１】Ｄｅｒｋｓら，１９９５，「ブドウにおけるスチルベンフィトアレキシンおよび病害抵抗性（Ｓｔｉｌｂｅｎｅ  ｐｈｙｔｏａｌｅｘｉｎｓ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｖｉｔｉｓ）」，Ｍ．  Ｄａｎｉｅｌ  ａｎｄ  Ｒ．Ｐ．  Ｐｕｒｋａｙａｓｔｈａ編集，「フィトアレキシンの代謝および作用に関するハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈｙｔｏａｌｅｘｉｎ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｏｎ）」，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．  ＵＳＡ，２８７〜３１５頁
【非特許文献２】Ｌａｎｇｃａｋｅ  Ｐ．  ａｎｄ  Ｐｒｙｃｅ  Ｒ．Ｊ．  １９７６，「感染または傷害に対する反応としてのヴィティス・ヴィニフェラ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）およびその他のブドウ科（Ｖｉｔａｃｅａｅ）のメンバーによるレスベラトロールの産生（Ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ  ｂｙ  Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｖｉｔａｃｅａｅ  ａｓ  ａ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｒ  ｉｎｊｕｒｙ）」，Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｌａｎｔ．  Ｐａｔｈｏｌ．  ９：７７−８６。
【非特許文献３】Ｍａｔｔｉｖｉ  Ｆ．ら，１９９５，「赤ワイン醸造におけるレスベラトロールモノマーの単離、特徴付けおよび進化（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｅｄ  ｗｉｎｅ  ｖｉｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ  ｍｏｎｏｍｅｒｓ）」，Ｊ．  Ａｇｒｉｃ．  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．  ４３：１８２０−１８２３
【非特許文献４】Ｊａｎｇら，１９９７，「ブドウ由来の天然産物であるレスベラトロールの癌に対する化学的予防活性（Ｃａｎｃｅｒ  ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ，  ａ  ｎａｔｕｒａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｇｒａｐｅｓ）」，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：２１８−２２０
【非特許文献５】Ｓｏｌｅａｓら，１９９７，「生物学的液体としてのワイン：歴史、製造、および疾患予防における役割（Ｗｉｎｅ  ａｓ  ａ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｌｕｉｄ：  ｈｉｓｔｏｒｙ，  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｌａｂ．  Ａｎａｌ．  １１：２８７−３１３
【非特許文献６】Ａｒｉｃｈｉら，１９８２，「脂質代謝にイタドリの根のスチルベン成分が及ぼす作用（Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｓｔｉｌｂｅｎｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｏｏｔｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ  ｃｕｓｐｉｄａｔｕｍ  Ｓｉｅｂ．  ｅｔ  Ｚｕｃｃ．  ｏｎ  ｌｉｐｉｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）」，  Ｃｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｕｌｌ．  ３０：１７６６−１７７０
【非特許文献７】Ｋｉｍｕｒａら，１９８５，「白血球中のアラキドン酸塩代謝にスチルベンが及ぼす作用（Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓｔｉｌｂｅｎｅｓ  ｏｎ  ａｒａｃｈｉｄｏｎａｔｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ）」，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ８３４：２７５−２７８
【非特許文献８】Ｋｉｍｕｒａら，１９８３，「過酸化油を与えられたラットにおける肝障害にＰｏｌｙｇｏｎｕｍ  ｓｓｐ．（タデ亜種）の根のスチルベン成分が及ぼす作用（Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓｔｉｌｂｅｎｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｏｆ  ｒｏｏｔｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ  ｓｓｐ．  ｏｎ  ｌｉｖｅｒ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｐｅｒｏｄｉｚｅｄ  ｏｉｌ−ｆｅｄ  ｒａｔｓ）」，  Ｐｌａｎｔａ  Ｍｅｄｉｃａ．  ４９：  ５１−５４
【非特許文献９】Ｓｔｅｅｌｅら，１９９８，「レスベラトロールについての癌化学療法予防薬の開発戦略（Ｃａｎｃｅｒ  ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｄｒｕｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）」，  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｉｏ．  ３６：６２−６８  ｓｕｐｐｌ．
【非特許文献１０】Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋら，１９９３，「ワインおよびその他のブドウ製品の内皮依存性血管緊張低下活性（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｖａｓｏｒｅｌａｘｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｗｉｎｅ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｇｒａｐｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）」，Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２６５：Ｈ７７４−Ｈ７７８
【非特許文献１１】Ｌｉｓｗｉｄｏｗａｔｉら，１９９１，「培養グレープバイン細胞中のボトリチス灰白質によるスチルベンシンターゼの誘導（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔｉｌｂｅｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｂｙ  Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｇｒａｐｅｖｉｎｅ  ｃｅｌｌｓ）」，Ｐｌａｎｔａ  １８３：３０７−３１４
【非特許文献１２】Ｍｏｒａｌｅｓら，１９９８，「Ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ  ａｍｐｅｌｉｎｕｓを用いた接種前後のＧａｍｅｙグレープバイン細胞培養中でのレスベラトロール代謝にジメチル−β−シクロデキストリンが及ぼす作用（Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｄｉｍｅｔｈｙｌ−β−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎｓ  ｏｎ  ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  Ｇａｍａｙ  ｇｒａｐｅｖｉｎｅ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｂｅｆｏｒｅ  ａｎｄ  ａｆｔｅｒ  ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ  ａｍｐｅｌｉｎｕｓ）」，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓ．  Ｏｒｇ．  Ｃｕｌｔ．  ５３：１７９−１８７
【非特許文献１３】Ｓａｅｎｇｅｒ  Ｗ．  １９８０，「研究および産業におけるシクロデキストリン含有化合物（Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ  ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｉｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｓｔｒｙ）」，Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．  １９：３４４−３６２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、細胞培地懸濁液中でレスベラトロールを産生する方法を提供するという問題を取り扱う。
【００１４】
本発明が提供する解決策は、本発明者らによる、懸濁液中で細胞を産生する際にレスベラトロール、特別にはｔ−レスベラトロールの合成を誘導する、そして培地中へ分泌されたレスベラトロールを蓄積させる高度の能力を有するシクロデキストリン、詳細には無作為メチル化されたβ−シクロデキストリン（ＲＭＢＣＤ）の同定に基づいている。本発明に記載した方法のような懸濁液中で細胞を産生する際にレスベラトロールを産生する方法は、高度の量のレスベラトロール、特別にはｔ−レスベラトロールを入手することを可能にする。
【００１５】
このため、本発明の１つの目的は、懸濁液中でレスベラトロールを産生する細胞中のレスベラトロール合成のエリシターとしての、および懸濁液中の当該細胞から培地中へ分泌されたレスベラトロールのアキュムレーターとしてのＲＭＢＣＤの使用である。
【００１６】
本発明のさらなる目的は、ＲＭＢＣＤを使用することにより懸濁液中で細胞を産生する際のレスベラトロール合成を誘導する方法である。
【００１７】
本発明のまた別の目的は、培地へＲＭＢＣＤを添加することによって、懸濁液中の細胞によって産生かつ分泌されたレスベラトロールをその溶解限度より高い濃度で培地中に蓄積させる方法である。
【００１８】
本発明のもう１つの目的は、ＲＭＢＣＤの存在下でのレスベラトロールを産生する細胞のインキュベーションからなる、レスベラトロール、および特別にはｔ−レスベラトロールの産生方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明は一般に、懸濁液中での、天然にレスベラトロールを産生する細胞中でのレスベラトロール合成のエリシターとしての、そして、天然に、またはそれらが人工的に獲得した当該能力のためのどちらかでレスベラトロールを産生し、そして懸濁液中にレスベラトロールを分泌する細胞の培地中でのレスベラトロールのアキュムレーターとしての、１１〜１３の範囲の置換度を備える、すなわちシクロデキストリン環１つ当たり１１〜１３個のメトキシ基を有する、無作為にメチル化された、７グルコース単位を有するシクロデキストリン（シクロヘプタ−アミロース）の使用に関する。
【００２０】
本明細書で使用する用語「１１〜１３の範囲の置換度を備える無作為メチル化β−シクロデキストリン（ＲＭＢＣＤ）」は、Ｄ−グルコース単位の２位、３位、および６位におけるそのヒドロキシル基は空いていてもメチル化によって誘導体化されていてもよく、当該位置がシクロデキストリン環１つ当たり１１〜１３個のメトキシ基を有する状態でメトキシ（ＣＨ3−Ｏ−）化学基を有する、α（１→４）型グルコシド結合によって結合された７Ｄ−グルコース単位からなる環状マルトオリゴ糖を意味する。特定の実現では、当該無作為メチル化シクロデキストリンは、シクロデキストリン環１つ当たり１２〜１３個のメトキシ基を含有する、例えば、グルコース単位の３位以外の２及び６位のすべての位置でメチル化された７Ｄ−グルコース単位からなることにより１４の置換度を備えるβシクロデキストリンであるＤＩＭＥＢの分子量約１，３３１よりわずかに小さいおよそ１，３１７の分子量を有する、ＲＡＭＥＢであると同定された１２〜１３の範囲の置換度を備える無作為メチル化シクロデキストリンである［Ｓｚｅｊｔｌｉ  Ｊ．，  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  Ｖｏｌ．  １４，  ３；３５３−３８６（１９９４）、詳細にはＤＩＭＥＢとＲＡＭＥＢを区別する数種の特徴が言及されている第３５６および３５７頁を参照されたい］。また別の特定の実現では、当該ＲＭＢＣＤは、例えば、およそ１，３１０の分子量を有するＣＡＶＡＳＯＬ（登録商標）Ｗ７Ｍ（ワッカー（Ｗａｃｋｅｒ）社、ドイツ）であると同定された１１〜１３の範囲の置換度を備えるＲＭＢＣＤのように、シクロデキストリン環１つ当たり１１〜１３個のメトキシ基を含有する。
【００２１】
同様に、本明細書で使用する表現「天然にレスベラトロールを産生する細胞」とは、Ｐｉｎｕｓ  ｓｉｂｉｒｉｃａ、Ｐｉｎｕｓ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｇｎｅｔｕｍ  ｐａｒｖｉｆｌｏｒｕｍ、Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ、Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ  ｃｕｓｐｉｄａｔｕｍ、Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ、Ｅｕｃａｌｉｐｔｕｓ  ｓｐ．、Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ  ｌａｋｏｏｃｈａ、Ｎｏｔｈｏｆａｇｕｓ  ｆｕｓｃａ、Ｐｈｏｅｎｉｘ  ｄａｃｔｉｌｉｆｅｒａ、Ｆｅｓｔｕｃａ  ｖｅｒｓｕｔａ、Ｃａｒｅｘ  ｆｅｄｉａ、Ｖｅｒａｔｒｕｍ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ等の天然にレスベラトロールを合成する能力を有する植物由来の細胞を意味する。
【００２２】
さらに、本明細書で使用する表現「人工的にレスベラトロールを産生する細胞」とは、天然にはレスベラトロールを合成する能力を有していないが遺伝子導入を含む遺伝子操作プロセスによって当該能力を獲得した、アルファルファ、大豆、またはその他の一般には天然にはレスベラトロールを産生しない植物等の有機体由来細胞を意味する。
さらに、本発明では、他に特別に明記していない限り、用語「植物」もしくは「有機体」には植物もしくは有機体からの部分、組織、細胞、またはプロトプラスト、最終的には植物もしくは有機体に由来する細胞培養、組織培養、カルス、胚、および種子が含まれる。
【００２３】
このため、本発明は１つの態様では天然にレスベラトロールを産生する細胞の懸濁液培養中でレスベラトロール合成を誘導する方法に関するが、当該方法は、１１〜１３の範囲の置換度を備えるＲＭＢＣＤの存在下で、当該細胞によるレスベラトロール合成を許容する条件下で当該細胞をインキュベートすることからなる。一般に、天然にレスベラトロールを産生するあらゆる植物は、細胞懸濁液培養中でのレスベラトロール合成において誘導できる適正な細胞系の起源として機能することができる。インキュベーション条件（温度、光周期、振とう、オーキシン／サイトキニンホルモン比等）は、他の要素の中でも特にインキュベートされる細胞系に依存するであろう。例示するためだけに述べるが、当該レスベラトロール産生細胞がＧａｍｅｙ亜種もしくはＭｏｎａｓｔｒｅｌｌ亜種のグレープバイン（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）に由来する場合、それらの細胞はレスベラトロール、特別にはｔ−レスベラトロールを産生させるために、１Ｌ当たり例えば０．１ｍｇのα−ナフタレン酢酸／０．２ｍｇのキネチン等の中間オーキシン／サイトキニンホルモン比を備える液体培地中において、例えばＲＡＭＥＢであると同定されたシクロデキストリン等の１１〜１３の範囲の置換度を備えるＲＭＢＣＤの存在下で、９０〜１５０ｒｍｐで１〜２ｃｍの軌道振とうさせながら、２０〜２８℃で、０〜１６時間の明期（８００〜５，０００ルクス）および８〜２４時間の暗期からなる光周期下で培養することができる。
【００２４】
本発明では、天然にレスベラトロールを産生する細胞の培養は、当該化合物を合成するための所定条件下で誘導される。天然誘導工程では、侵襲性真菌の細胞由来オリゴ糖は、レスベラトロールを天然に産生する植物から細胞を誘導し、特にフィトアレキシン合成を含む防衛メカニズムを開始する。一部の植物種では、産生するフィトアレキシンは本質的にはスチルベノイドであり、そして詳細にはｔ−レスベラトロールである。細胞培養中では、一部のシクロデキストリン（実施例１を参照）は、侵襲性真菌のオリゴ糖と同一方法でエリシターとして機能することができ、ｔ−レスベラトロール合成を導く植物細胞の防衛メカニズムを開始する。
【００２５】
知られているように、シクロデキストリンはより小さな分子を収容し包接体を形成することを許容するようなサイズの空洞を有する円錐台形を備える化合物である。シクロデキストリンの空洞は実質的に水性媒体より極性が小さいので、その結果として宿主分子は不良な極性の性質、したがって水性媒体における低溶解度を有する。シクロデキストリンは、多数の低極性化合物の水性媒体中で溶解度を重大に上昇させることができる。この特性について認められたメカニズムは包接複合体の形成であり、その結果として該複合体は水性媒体中で遊離シクロデキストリンの溶解度に極めて類似する溶解度を有する。そこで、シクロデキストリンは低極性を備える化合物の水溶液を高濃度で調製するために使用できる。同様に、培地に添加されるシクロデキストリンは、培地中で増殖する細胞が産生することができる分子を含む培地中に存在する低極性分子の溶解度を上昇させることができる。
【００２６】
包接複合体は、遊離シクロデキストリンおよび遊離宿主分子と均衡が取れている。そこで、宿主分子によって誘発されうる増殖中の細胞への作用または宿主分子が培養または培養の外側の化学的、物理的、または生物学的因子の作用を通して経験しうる変化はその遊離形に依存する。
【００２７】
細胞培養によって合成され、シクロデキストリンを含有する培地へ分泌されたレスベラトロールは、シクロデキストリンとの包接複合体を形成することができ、最終的にはこの方法で培地中に存在するシクロデキストリンの濃度に類似する濃度で蓄積することができる。
【００２８】
シクロデキストリンとの包接複合体としてのレスベラトロールの蓄積は、次の（１）培地中でより高い濃度を達成できること；（２）該複合体は遊離レスベラトロールよりも物理化学的変換からよりいっそう保護されること；および（３）遊離レスベラトロールの濃度が低いので、細胞によるレスベラトロール合成の逆阻害の潜在的作用が少ないこと、を含むその遊離蓄積に優る多数の長所を有する。
【００２９】
そこで、レスベラトロールを産生して培地へ分泌する能力を有するあらゆる細胞培養は、培地中でのレスベラトロールアキュムレーターとしてシクロデキストリンを含めることの長所から利益を得ることができる。培地中にレスベラトロールを蓄積させる方法は、構成的に、または誘導を通してのどちらかで、レスベラトロールを産生してそれを培地へ分泌するあらゆる細胞懸濁液へ適用することができる。
【００３０】
このため、また別の態様では、本発明は天然に、または人工的に、懸濁液中でレスベラトロールを産生する細胞の培地中で、当該細胞によって分泌されたレスベラトロールを当該シクロデキストリン無含有培地中における溶解限度より高濃度で蓄積する方法に関する。本方法は、当該培地へ１１〜１３の範囲の置換度を備えるＲＭＢＣＤを添加するステップから構成される。
【００３１】
本発明はさらにまた、懸濁液中で天然にレスベラトロールを産生する細胞の培養中でレスベラトロール、特別にはｔ−レスベラトロールを産生する方法であって、１１〜１３の範囲の置換度を備えるＲＭＢＣＤの存在下で、レスベラトロールの合成および培地中への分泌、そして所望であれば培地からのレスベラトロールの単離を許容する条件下で当該細胞をインキュベートするステップからなる方法を提供する。
【００３２】
天然にレスベラトロールを産生するあらゆる植物は、懸濁液培地中でレスベラトロールを産生するための細胞系起源として使用できる。インキュベーション条件（温度、光周期、振とう、オーキシン／サイトキニンホルモン比等）は、他の因子の中でも特にインキュベートされる細胞系に依存するであろう。例示するためだけに述べるが、当該レスベラトロール産生細胞がＧａｍｅｙ亜種もしくはＭｏｎａｓｔｒｅｌｌ亜種のグレープバイン（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）に由来する場合、それらの細胞はレスベラトロール、特別にはｔ−レスベラトロールを産生させるために、１Ｌ当たり例えば０．１ｍｇのａ−ナフタレン酢酸／０．２ｍｇのキネチン等の中間オーキシン／サイトキニンホルモン比を備える液体培地中において、例えばＲＡＭＥＢであると同定されたシクロデキストリン等の１１〜１３の範囲の置換度を備えるＲＭＢＣＤの存在下で、９０〜１５０ｒｍｐで１〜２ｃｍの軌道振とうさせながら、２０〜２８℃で、０〜１６時間の明期（８００〜５，０００ルクス）および８〜２４時間の暗期からなる光周期下で培養することができる。
【００３３】
レスベラトロールは、例えば有機抽出法の後に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）を単独で使用して、またはその後に質量分析法（ＧＣＭＳ）もしくはキャピラリー電気泳動法（ＣＥ）を実施するような従来型化学的方法を使用して、生物学的材料または培地等の細胞培養の一部分を化学的に分析することによって同定できる。
【００３４】
レスベラトロールは、例えばジエチルエーテルまたはメタノール等の有機溶媒を用いた抽出による従来型の方法を使用して細胞培養の一部分から単離することができる。あるいはまた、レスベラトロールを産生する細胞培養の一部分を新鮮形、冷凍形、または脱水形で使用することもできる。
【００３５】
天然にレスベラトロールを産生する細胞の培養を使用するレスベラトロールの産生は、天然に、もしくは遺伝子組換えによってレスベラトロールを産生する植物または植物の部分からの抽出に基づく方法、またはその化学合成に基づく方法等の他の知られている産生方法に優る長所を提供する。そのような長所には、（１）細胞培養はｔ−レスベラトロール異性体を特異的に産生し、この異性体は光異性化を受けうるが、その他のフェノール性の化合物は全く所見されないこと；（２）培養による産生は栽培植物に関連する季節的または気候的制限を受けないこと；（３）レスベラトロールは細胞によって天然に産生するので、消費者の満足を高め、化学合成によって産生するレスベラトロールより環境にとってはるかに優しいこと；および（４）遺伝子操作された有機体によるレスベラトロールの産生とは対照的に、産生する培養は天然系統となる可能性があり、これは消費者から通例はより良好に受け入れられること、が含まれる。
【００３６】
レスベラトロールは、培養から単離して粗抽出物または精製化合物として使用することができる。細胞培養により産生したレスベラトロールのヒトまたは動物への投与は、酸化防止剤、血小板凝集阻害剤、アラキドン酸塩代謝阻害剤、プロテインキナーゼ阻害剤、腫瘍細胞中のアポトーシスによる細胞死の誘発因子、エストロゲン受容体アンタゴニスト、リボヌクレオチド還元酵素阻害剤、腫瘍発生阻害剤、発癌促進阻害剤、腫瘍進行および分化の阻害剤、シクロオキシゲナーゼ−２およびその誘導の阻害剤、リポタンパク質合成および遊離の調節因子、ならびにその他の有益な作用を備える化合物によって提供される利点が含まれるがそれらに限定されない治療的および栄養補給的作用を有する。細胞培養によって産生するレスベラトロールは、紫外線照射保護剤、紫外線照射誘発性損傷に対する生物学的制御剤の安定剤、および光化学エネルギーを貯蔵する際の物質としても有用である。真菌病原体に対する耐性を植物に付与するレスベラトロールの役割に基づいて、細胞培養によって産生したレスベラトロールはヒトにおける抗真菌剤および抗菌剤としての用途も有するであろう。
【００３７】
誘導細胞により産生して培地中に蓄積したレスベラトロールは、ヒトおよび動物の栄養状態を向上させるために有用である。レスベラトロールが富裕な培養の部分は、ヒトおよび動物のための食品として使用できる。レスベラトロールが富裕な食用組成物は、培養の部分または培養から単離したレスベラトロールを組み入れることによっても入手できる。食品、栄養補給剤、動物用栄養補給剤、栄養補助食品、医薬品、または化粧品として適用するために適した組成物もまた、培養の部分または培養から単離したレスベラトロールを組み入れることによって入手できる。培養またはその部分から単離したレスベラトロールは、栄養補給作用を達成するための栄養補助製剤を調製するため、または治療作用を達成するための医薬品を調製するために使用できる。
【実施例】
【００３８】
以下の実施例は、本発明を具体的に示すために使用するが、本発明の範囲を限定すると見なしてはならない。
実施例１
シクロデキストリンの存在下で、懸濁液中のグレープバイン細胞中でのレスベラトロールの産生
植物材料および培養条件
Ｇａｍａｙ  ｒｏｕｇｅ亜種、Ｍｏｎａｓｔｒｅｌｌ  ａｌｂｉｎｏ亜種、およびＭｏｎａｓｔｒｅｌｌ  ｇｒｅｅｎ亜種由来のグレープバイン細胞（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）を使用した。使用した植物材料の特徴および培養条件を以下に述べる：
Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ  ｖａｒ．  Ｇａｍａｙ  ｒｏｕｇｅ：Ｇａｍａｙ  Ｆｒｅａｕｘ品種のグレープバインの未熟果物から１９７８年にＪ．Ｃ．  Ｐｅｃｈによって樹立されたグレープバイン細胞系（ＥＮＳＡＴ、フランス国ツールーズ）を使用した。カルスは、Ｍｏｒｅｌビタミン（Ｍｏｒｅｌ  Ｇ．，  １９７０，「Ｌｅ  ｐｒｏｂｌｅｍｅ  ｄｅ  ｌａ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｔｕｍｏｒａｌｅ  ｃｈｅｚ  ｌｅｓ  ｖｅｇｅｔａｕｘ」，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｅ  Ｖｅｇｅｔａｌｅ，  ８：１８９−２０４。）、カゼイン加水分解物（０．２５ｇ／Ｌ）、炭酸起源としてのサッカロース（２０ｇ／Ｌ）、およびホルモンとしてのａ−ナフタレン酢酸（０．１ｍｇ／Ｌ）およびキネチン（０．２ｍｇ／Ｌ）を補給した８０ｍＬのＧａｍｂｏｒｇ  Ｂ5基礎培地（Ｇａｍｂｏｒｇら，１９６８，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５０：１５１−１５８）（以下では、培地）を含有する２５０ｍＬのフラスコ内に維持した。この培地をｐＨ６へ調整し、１２１．２ｋＰａ（１．２ａｔｍ）の圧力で湿り比熱を２０分間適用（オートクレーブ）することによって滅菌し、培地が冷却したら精製寒天（８ｇ／Ｌ）を添加することによって固体一貫性を獲得した。細胞懸濁液は、８０ｍＬの寒天無含有培地を含有する２５０ｍＬフラスコ内で、上記に記載した培地中で入手した脆いカルスから開始した。液体培地中の細胞は、１４時間の明期（６Ｗ／ｍ2）および１０時間の暗期からなる光周期下で、１００ｒｐｍおよび２５℃に設定したオービタルシェーカー内に維持した。
【００３９】
Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ  ｖａｒ．  Ｍｏｎａｓｔｒｅｌｌ：１つ（ａｌｂｉｎｏ系）は暗期に樹立され、もう１つ（ｇｒｅｅｎ系）は白色光の存在下で確立された未熟果物由来のＭｏｎａｓｔｒｅｌｌ品種の２つのグレープバイン細胞系を使用した。ｇｒｅｅｎ系についてのすべての操作およびインキュベーションは照明条件下で実施したが、ａｌｂｉｎｏ系についてはカルスを発生、発達、および増殖させるためのインキュベーション、ならびに細胞懸濁液のインキュベーションは暗所で実施した。このために、直径およそ５ｍｍの未熟ブドウを１５分間にわたり７％の次亜塩素酸カルシウム溶液への浸漬によって外面を滅菌した。この後に、そして常に無菌条件下で、無菌二重蒸留水を用いてブドウを３回洗浄し、それらの種子を取り除き、４つの部分に分割した。これらの部分（外植片）は、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  Ｔ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ  Ｆ．  １９６２，「タバコ組織培養を用いた迅速な増殖およびバイオアッセイのための改良培地（Ａ  ｒｅｖｉｓｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｂｉｏａｓｓａｙｓ  ｗｉｔｈ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ）」，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ  Ｐｌａｎｔａｒｕｍ  １５：４７３−４９７）によって報告された培地を基礎とする、Ｍｏｒｅｌビタミン、カゼイン加水分解物（０．２５ｇ／Ｌ）、炭酸起源としてのサッカロース（３０ｇ／Ｌ）、およびホルモンとしてのａ−ナフタレン酢酸（０．１ｍｇ／Ｌ）およびキネチン（０．２ｍｇ／Ｌ）、８ｇ／Ｌの精製寒天を補給してｐＨ６へ調整した固体培地を含有するシャーレ内にミクロカルスが出現するまで置いた。最後に、これらのミクロカルスは、カルス発達用の同一固体培地８０ｍＬを含有する２５０ｍＬフラスコ内に移した。細胞懸濁液は、寒天の不在下でＭｏｒｅｌビタミン、カゼイン加水分解物（０．２５ｇ／Ｌ）、炭酸起源としてのサッカロース（２０ｇ／Ｌ）、ならびにホルモンとしてのａ−ナフタレン酢酸（０．２ｍｇ／Ｌ）およびキネチン（０．２ｍｇ／Ｌ）を補給した８０ｍＬのＧａｍｂｏｒｇ  Ｂ5基礎培地を含有する２５０ｍＬフラスコ内で脆いカルスから開始した。液体培地中の細胞は、１００ｒｐｍおよび２５℃に設定したオービタルシェーカー内に維持した；ｇｒｅｅｎ系には１４時間の明期（６Ｗ／ｍ2）および１０時間の暗期からなる光周期を受けさせたが、ａｌｂｉｎｏ系は常に暗期で維持した。
【００４０】
細胞の誘導
各誘導実験のために、事前に新鮮培地で洗浄して濾過した生体重４ｇの細胞を無菌条件下で採取した。これらの細胞を５０ｍＬのフラスコに移し、各場合に以下に記載するシクロデキストリンを補給した無菌新鮮培地１０ｍＬを添加して置換した：
【００４１】
2005514945.tif 000003
【００４２】
フラスコは上記に記載した条件と同一条件下で２４〜９６時間にわたりインキュベートした。
【００４３】
細胞外培地中のトランス−レスベラトロールの分析
インキュベーション期間が完了したら、ウォーターポンプを用いて軽度の真空をかけることによる濾過によって細胞を培地から分離し、細胞および濾液を個別に収集した。
トランス−レスベラトロールは、ＨＰＬＣ検査（ＬａＣｈｒｏｍ、Ｍｅｒｃｋ−Ｈｉｔａｃｈｉ社）、ダイオードアレイ検出器（Ｌ−７４５０）による化学種のスペクトルの光線記録、および同一条件下で構築されたフェノール化合物のライブラリーとの比較によって検出したときに、濾液中で３０６ｎｍでの光線を吸収する唯一の種であることが証明されている。このため、この濾液のアリコートを新鮮培地中で希釈し、０．２μｍのＡｎｏｐｏｒｅフィルターに通して濾過し、そして２０μＬの濾液をＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ  １００  ＲＰ−１８カラム（２５０(４ｍｍ、粒径５μｍ）中へ注入した。移動相として２つのタイプの溶媒を使用した：溶媒Ａ、水に溶解させた０．０５％トリフルオロ酢酸、および溶媒Ｂ、メタノール：アセトニトリル（６０：４０  体積／体積）中に溶解させた０．０５％トリフルオロ酢酸。サンプルは、１ｍＬ／分の流速で次の溶媒混合液：０分間、１０％のＢ；５分間、１５％のＢ；４０分間、３５％のＢ；４５分間、６５％のＢ；５０分間、６５％のＢ；５５分間、１０％のＢ；および３５℃のカラム温度（Ｄａｌｌｕｇｅら，１９９８．  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ａ  ７９３：２６５−２７４）を使用して溶離した。図１は、ＲＡＭＥＢを含有する培地中でのインキュベーション開始時およびインキュベーション９６時間後に対応するＶｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ  ｖａｒ．  Ｇａｍａｙの細胞培養の上清を用いて実施した分析の結果を示している。
【００４４】
ｔ−レスベラトロールのルーチン分析のため、新鮮培地を用いて濾液のアリコートを希釈し、参照として新鮮培地を採取してＫｏｎｔｒｏｎ  Ｕｖｉｋｏｎ  ９４０分光計を使用してその紫外線吸収スペクトルを記録した。上清中のｔ−レスベラトロールの濃度は、３０６ｎｍでの２６，８００Ｍ-1ｃｍ-1のモル吸光係数を使用して推定した（Ｓｉｅｍａｎｎ  Ｅ．Ｈ．  ａｎｄ  Ｃｒｅａｓｙ  Ｌ．Ｌ．  １９９２，「ワイン中のフィトアレキシンレスベラトロールの濃度（Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｈｙｔｏａｌｅｘｉｎ  ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ  ｉｎ  ｗｉｎｅ）」，Ａｍ．  Ｊ．  Ｅｎｏｌ  Ｖｉｔｉｃ．  ４３：４９−５２）。図２は、ＲＡＭＥＢを含有する培地中でのインキュベーション開始時およびインキュベーション９６時間後に対応する、信頼できるｔ−レスベラトロール溶液（Ｓｉｇｍａ社製）およびＶｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ  ｖａｒ．  Ｇａｍａｙの細胞培養の上清のＵＶスペクトルを示している。
【００４５】
図３は、ＲＡＭＥＢを含有する培地中でのインキュベーション開始時およびインキュベーション４８時間後に対応する、信頼できる純粋なｔ−レスベラトロール（Ｓｉｇｍａ社製）およびＶｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ  ｖａｒ．  Ｍｏｎａｓｔｒｅｌｌの細胞培養の上清のＵＶ−ｖｉｓスペクトルを示している。そのような図３は、純粋トランス−レスベラトロールのスペクトルとの有意差を示している。この結果は、トランス−レスベラトロールに加えて他の化合物が蓄積する可能性があることを示唆している。このため、フェノール化合物の定性分析および定量分析は、このような化合物のＨＰＬＣによる分離、同定、および定量によって実施した。図４は、ＲＡＭＥＢを含有する培地中でのインキュベーション開始時およびインキュベーション４８時間後に対応する、Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ  ｖａｒ．  Ｍｏｎａｓｔｒｅｌｌの細胞培養からの上清についてのこの分析の結果を示している。
【００４６】
シクロデキストリンの存在下での、懸濁液中のグレープバイン細胞（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）によるレスベラトロールの産生および蓄積
５０ｍｍｏｌ／Ｌ（培地）（難溶解性のために濃度が１５ｍｍｏｌ／Ｌに対応するＢＥＴＡを除く）の濃度の様々なシクロデキストリンを用いて細胞を誘導した濾液１Ｌ当たりのｔ−レスベラトロール（ｍｇ）として表示した、９６時間のインキュベーション後に入手した結果は、表１に示した。
【００４７】
【表１】
2005514945.tif 000004
【００４８】
入手した結果は、ＲＭＢＣＤ、詳細にはＲＡＭＥＢおよびＣＡＶＡＳＯＬ（登録商標）Ｗ７Ｍが試験した他のいずれのシクロデキストリンよりも懸濁液中のグレープバイン細胞中でのｔ−レスベラトロール合成を誘導する大きな能力を有することを証明している。それらの一部はｔ−レスベラトロール合成の誘導作用さえ引き起こさず、ＳＵＬＦＯＢ等の他のタイプは毒性でさえあり、細胞を殺した。さらにまた、作用の強度は亜種および細胞系に依存することも認められた（Ｍｏｎａｓｔｒｅｌｌ  ｇｒｅｅｎ亜種よりＭｏｎａｓｔｒｅｌｌ  ａｌｂｉｎｏ亜種における方が高度の産生が所見された）。
【００４９】
水性媒体中のｔ−レスベラトロールの溶解度
エタノールに溶解させた５ｍＬのｔ−レスベラトロール（１１，４１０ｍｇ／Ｌ）（供給業者（Ｓｉｇｍａ社、マドリッド）によると純度９９％）を球状ボトルへ入れ、Ｎ2ガス流を用いて乾燥するまで蒸発させた。残留エタノールは、ボトルを一晩低圧下で維持することによって除去した。５ｍＬの水性媒体を固体残留物に添加し、ボトルの栓をきっちりと閉鎖し、暗所で２５℃で５日間にわたり攪拌しながら保持した。結果として生じた懸濁液は０．２μｍのＡｎｏｐｏｒｅフィルターに通して濾過し、濾液中のｔ−レスベラトロールの濃度はＵＶ分光法により分析した。
濾液１Ｌ当たりのｔ−レスベラトロールの重量（ｍｇ）として表示した濾液中のｔ−レスベラトロールの濃度は、表２に示した。
【００５０】
【表２】
2005514945.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】ＲＭＢＣＤ、詳細にはＲＡＭＥＢを含有する培地中でのインキュベーション開始時およびインキュベーション９６時間後に対応する、Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ  ｖａｒ．  Ｇａｍａｙの細胞培養の上清のクロマトグラムである。ピーク時のＵＶ−ｖｉｓスペクトルを同時に記録し、信頼できる標準のライブラリーと比較した。
【図２】ＲＭＢＣＤ、詳細にはＲＡＭＥＢを含有する培地中でのインキュベーション開始時およびインキュベーション９６時間後に対応する、信頼できるｔ−レスベラトロールおよびＶｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ  ｖａｒ．  Ｇａｍａｙの細胞培養の上清のＵＶ−ｖｉｓスペクトルを示した図である。
【図３】ＲＭＢＣＤ、詳細にはＲＡＭＥＢを含有する培地中でのインキュベーション開始時およびインキュベーション４８時間後に対応する、信頼できるｔ−レスベラトロールおよびＶｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ  ｖａｒ．  Ｍｏｎａｓｔｒｅｌｌの細胞培養の上清のＵＶ−ｖｉｓスペクトルを示した図である。
【図４】ＲＭＢＣＤ、詳細にはＲＡＭＥＢを含有する培地中でのインキュベーション開始時およびインキュベーション４８時間後に対応する、Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ  ｖａｒ．  Ｍｏｎａｓｔｒｅｌｌの細胞培養の上清のクロマトグラムである。ピーク時のＵＶ−ｖｉｓスペクトルを同時に記録し、信頼できる標準のライブラリーと比較した。
【図１】
2005514945.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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