(57)【要約】本発明は患者においてシヌクレイン症を診断する方法、また、シヌクレイン症を治療する目的で患者に投与した治療薬の有効性をモニタリングする方法を提供する。本方法は患者から採取した非脳体液サンプルをそのサンプル中のシヌクレインの存在および／または量について解析することを含んでなる。シヌクレインは凝集シヌクレインであってもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者においてシヌクレイン症を診断する方法であって、患者由来の非脳体液サンプルを、そのサンプル中のシヌクレインの存在および／または量について解析することを含んでなる方法。
【請求項２】
シヌクレイン症を治療する目的で投与した治療薬の有効性をモニタリングする方法であって、動物から採取した非脳体液サンプルをシヌクレインの存在および／または量について解析することを含んでなる方法。
【請求項３】
非脳体液サンプルが全血、血清、血漿、尿、リンパ液または唾液を含んでなる群から選択される非脳体液である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
解析されるシヌクレインが可溶型（天然型）もしくは凝集型のシヌクレイン、変異型、硝化型、リン酸化型もしくはグリコシル化型のシヌクレイン、シヌクレイン断片、その他の改変された誘導体、または他の分子との複合体の一部として見出されるシヌクレインを含んでなる群から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
シヌクレイン症がパーキンソン病、レビー小体を伴う痴呆、アルツハイマー病、多系統萎縮症および癌を含んでなる群から選択される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
シヌクレインの解析が、α−シヌクレイン、β−シヌクレインまたはγ−シヌクレインの解析である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
シヌクレインの解析が、α−シヌクレインの解析である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
シヌクレインの存在の解析が、ラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、サンドイッチイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、沈降反応、ゲル免疫拡散法、凝集法、プロテインＡイムノアッセイ、免疫電気泳動法、電気泳動およびウエスタンブロット法、または試験されるサンプル中のシヌクレインタンパク質および／またはそれらの関連誘導体の量を測定することができるその他の技術を含んでなる群から選択される方法によって行われる、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ｉ）前濃縮ステップを実施するための、シヌクレインと結合可能な、またはシヌクレインとの複合体の一部である分子と結合可能な、固相と結合しているシヌクレイン結合種を用いたサンプルの処理；
ii）サンプルからの固相の除去；および所望により
iii）解析に向けてシヌクレインを比較的少量の液体に放出させるための固相の処理
をさらに含んでなる、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記種が結合されている固相が、磁性ビーズまたはその他の適したマトリックスである、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は「シヌクレイン（ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｓ）」と呼ばれるタンパク質の異常（例えば、発現されるタンパク質のレベルおよび／または性質における異常）に関連した疾病の検出および／またはモニタリングに関する。
【背景技術】
【０００２】
シヌクレインは神経組織で高レベルで発現される小さなタンパク質（約１４  ｋＤａ）のファミリーである。このファミリーに属する３種類のシヌクレイン（α−、β−、およびγ−シヌクレイン）は、異なる染色体に存在する３つの遺伝子の産物である（１）。１種類以上のシヌクレインの異常に関連した疾患を本明細書において「シヌクレイン症（ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐｈａｔｈｉｅｓ）」と呼ぶ。
【０００３】
シヌクレイン症としては、いくつかの重大な神経変性状態、例えば、パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体を伴う痴呆（ＤＬＢ）、アルツハイマー病（ＡＤ）および多系統萎縮症（ＭＳＡ）が挙げられる。シヌクレインはまた、ヒト癌における種々の腫瘍（例えば、乳房、卵巣）においても異常に高いレベルで発現される（２）。
【０００４】
このファミリーのα−シヌクレインメンバーの、神経変性疾患の病気の発生における関与を最初に示したのは、アルツハイマー病（ＡＤ）に罹患した脳の精製アミロイドのタンパク質分解断片の１つの単離に基づいてであった（３）。このα−シヌクレイン断片は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）不溶性物質の約１０％に相当し、ＡＤアミロイドの非Ａβ−成分（ＮＡＣ）と名づけられた。アミノ酸配列決定では、配列決定に使用した酵素の特異性のために、Ｎ末端残基を確実に指定できなかったが、ＮＡＣが少なくとも３５アミノ酸を含んでなることが示された。これらの３５アミノ酸は後に、１４０アミノ酸前駆体（ＮＡＣＰ）の残基６１〜９５に相当することが分かった。ＮＡＣＰはα−シヌクレインと呼ばれるタンパク質と同一であることが判明した。ＰＤとの明らかな関連は、この疾患の稀な遺伝性のものにおいてα−シヌクレイン遺伝子中に２つの異なる突然変異が見られると分かったことで確立された。１つの突然変異、α−シヌクレイン（Ａ５３Ｔ）は、あるイタリア人およびギリシャ人家系で見出され、Ａｌａ５３のＴｈｒへの置換を引き起こしている（４）。もう１つの突然変異、α−シヌクレイン（Ａ３０Ｐ）は、ドイツ系家系で見出され、Ａｌａ３０のＰｒｏへの変化を引き起こしている（５）。
【０００５】
「レビー小体（Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｉｅｓ）」および「レビー神経突起（Ｌｅｗｙ  ｎｅｕｒｉｔｅｓ）」として知られている脳の病変が、ＰＤおよびＤＬＢ患者の脳における主要な病理学的特徴を成している。これらのレビー小体およびレビー神経突起は、異常な微小繊維形態のα−シヌクレインを含有している（６）。さらなる免疫組織化学的および免疫電子顕微鏡検査によって、α−シヌクレインがその他の神経変性疾患における病理学的病変とも関連しており、ＭＳＡにおいて見出されるグリア細胞質内封入体などの非神経細胞に関係していることもあることが分かった（７）。α−シヌクレインが関係するこれらおよびその他の神経変性疾患はまとめて「シヌクレイン症」として知られている。ＰＤおよびＤＬＢでは、α−およびβ−シヌクレインはシナプス前軸索末端で検出されており、γ−シヌクレインは異常な軸索球状物様病変で検出されている（７）。
【０００６】
シヌクレイン症の基礎的な疾病メカニズムの理解が達成されるという進歩があるにもかかわらず、これらの疾病の診断に有用な方法を早急に開発しなければならない必要性は依然残されている。このような診断方法の必要性は、生存中におけるＰＤの正確な診断が驚くほど難しく、約７５％の割合でしか正確な判断を下していないことを示す研究によって十分証明されている（８、９）。このことは臨床的観点からだけでなく、これが臨床試験と疫学的研究との整合性に影響を及ぼすことからも深刻な問題である。
【０００７】
上記の証拠に基づき、シヌクレインの検出は、これらの状態を診断するための優れたマーカーであるといえる。神経変性を患う患者では、シヌクレインタンパク質が脳内に維持されていると考えられている。結果として、神経変性障害の診断を行うために、シヌクレインの存在あるいは不在について脳脊髄液（ＣＳＦ）を解析する技術が提案されている。
【０００８】
このように、例えば、ＷＯ−Ａ−００／０２０５３（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｎ．Ｖ．）では、特に、神経変性状態の鑑別診断を目的としたＣＳＦ中のα−シヌクレインの検出を開示している。より一般的なレベルでは、ＷＯ−Ａ−００／０２０５３に、血液、リンパ液、尿およびＣＳＦなどの体液中の神経変性の広範な選択マーカー（単にα−シヌクレインだけでない）の検出が開示されている。ＷＯ−Ａ−００／０２０５３には、ＣＳＦ以外のいずれかでのα−シヌクレイン、またはさらに言えば、その他のシヌクレインの検出について特に開示しておらず、参照した最近の思想を支持している。
【０００９】
しかしながら、神経変性状態を検出することを目的としたシヌクレインの存在についてのＣＳＦの解析はいくつかの不都合な点を伴う。具体的には、ＣＳＦを収集する技術は、サンプルを採取するものにとっては技術的に難しいものであり、また、多くの場合、サンプルを提供するものに対して不快感を与える。
【００１０】
同様の不都合はまた、投与した薬剤の有効性をモニタリングすることが望まれる場合にも存在する。このようなモニタリングは、例えば、特定患者の治療、あるいはシヌクレイン症の治療用薬剤の適合性を評価するための試験モデルにおいて薬剤の有効性を評価するために行われ得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、先行技術に関連した不都合な点を克服することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の第１の態様によれば、患者由来の非脳体液サンプルを、そのサンプル中のシヌクレイン（またはその改変型の１種）の存在および／または量について解析することを含んでなる、患者においてシヌクレイン症を診断する方法が提供される。患者はヒトまたは非ヒト（例えば、非ヒト哺乳類）であり得る。
【００１３】
シヌクレイン症の診断は、解析の結果に基づいて実施できる。
【００１４】
本発明の第２の態様によれば、動物から採取した非脳体液サンプルをシヌクレイン（またはその改変型の１種）の存在および／または量について解析することを含んでなる、シヌクレイン症を治療する目的で投与した治療薬の有効性をモニタリングする方法が提供される。動物はヒトまたはその他の動物（例えば、非ヒト哺乳類）であり得る。
【００１５】
治療薬の有効性は、実施した解析の結果を用いてモニタリングできる。有効な治療薬は、採取したサンプル中に存在するシヌクレイン量を参照値と比べて減少させるものであり得る。参照値は、治療薬の投与前に同じ患者から採取したサンプル中のシヌクレイン量を表してもよいし、または処置を施していない患者由来のサンプル中に見出されるシヌクレインの標準的な量を代表するものであってもよく、または効果のない薬剤を投与された動物モデルから採取したサンプル中に見出されるシヌクレイン量を表してもよい。見出されるシヌクレインの「標準的な」量は、適した対照群から採取したサンプルの解析によって決定することができる。
【００１６】
本発明は最近の思想に反して、シヌクレインがシヌクレイン症患者由来の非脳体液サンプル（例えば、血液、血清、血漿、尿、リンパ液および唾液）に存在しているという驚くべき発見に基づいている。当然のことながら、本発明にしたがって解析を行うために非脳体液サンプルを収集することは、先行技術で提案されたようにＣＳＦサンプルの解析を必要とする方法よりもかなり好都合である。
【００１７】
最も好ましくは、サンプルは、非脳体液、例えば、全血、血清、血漿、尿、リンパ液または唾液である。
【００１８】
解析されるシヌクレインは、可溶型（天然型）もしくは凝集型のシヌクレインであってもよいし、または変異型、硝化型、リン酸化型もしくはグリコシル化型、あるいはその他の改変型であってもよい。シヌクレインは、シヌクレイン断片であってもよいし、または他の分子との複合体の一部として見出されるものであってもよい。
【００１９】
サンプル中の凝集シヌクレインの存在または量について解析することが特に好ましい。例えば、凝集シヌクレインの存在、または全ての患者に見られる「バックグラウンド」レベル（“ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ“  ｌｅｖｅｌ）よりも高いレベルの凝集シヌクレインの存在を、シヌクレイン症を患う患者由来のサンプルと、そうではない健康な患者由来のサンプルとを見分けるために使用できる。当然のことながら、診断またはモニタリングは、サンプル中のシヌクレインの凝集度の増加、および／またはサンプル中の凝集したシヌクレインの比率の増加に基づいて行うこともできる。
【００２０】
本発明は可溶型または前段で記載したその他の型いずれかの、α−、β−またはγ−シヌクレインの検出に適用できる。
【００２１】
本発明は特に、可溶型または前記のその他の型いずれかの、α−シヌクレインの検出に適用できる。
【００２２】
診断および／またはモニタリングされるシヌクレイン症は、例えば、ＰＤ、ＤＬＢ、ＭＳＡ、ＡＤまたは癌であり得る。
【００２３】
本発明の方法は、アッセイの対象であるサンプル中のシヌクレインの量を決定すること、およびその量を、健常な（すなわち、シヌクレイン症ではない）個体から採取したサンプルおよび既知の病期のシヌクレイン症罹患個体から採取したサンプルから予め決定しておいた参照値と比較することによって行うことができる。シヌクレイン症患者由来の非脳体液の硝化型、リン酸化型または凝集型のシヌクレインのレベルは、健常な個体由来の体液と比べて上昇すると推測できる。
【００２４】
本発明の第１の態様の方法は、いくつかの異なる目的で診断を行うために使用できる。例えば、本方法を、患者がシヌクレイン症に罹患しているか否かを判定するための患者の診断に適用することができる。あるいは、この方法を、シヌクレイン症の進行または程度を判定するための患者の診断に適用することができる。
【００２５】
同様に、本発明の第２の態様の方法もまた、いくつかの異なる目的で、例えば、シヌクレイン症に罹患している患者（ヒトまたは非ヒト）の治療のために投与される薬剤の有効性のモニタリングのために使用できる。本発明の第２の態様の方法の別の用途は、試験モデルまたはスクリーニング、例えば、試験動物モデルまたはヒト臨床試験においてシヌクレイン症の可能性ある治療法として投与される薬剤の有効性をモニタリングすることにある。
【００２６】
本発明の方法は、いくつかの検出方法のうちのいずれか１つによって達成できる。検出方法は、例えば、ラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、サンドイッチイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、沈降反応、ゲル免疫拡散法、凝集法、プロテインＡイムノアッセイ、免疫電気泳動法、電気泳動およびウエスタンブロット法、または試験されるサンプル中のシヌクレインタンパク質および／またはそれらの関連誘導体の量を測定することができるその他の技術であり得る。
【００２７】
本方法は、例えば、シヌクレインと結合可能な固相と結合しているシヌクレイン結合種を用いたサンプルの処理を含み得る。このような固相に結合されている種を用いて、比較的多量の原サンプルに存在するシヌクレインがその種と結合され得る前濃縮ステップを実施できる。次いで、固相をサンプルと分け、解析に向けてシヌクレインを比較的少量の液体に放出させるように処理することができる。
【００２８】
抗体が結合している固相は、例えば、磁性ビーズであり得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明の好ましい実施形態では、シヌクレイン結合種は、シヌクレインと特異的に結合可能な抗体であり得る。本発明による使用に適した抗体の例としては、以下の抗体が挙げられる：
抗体２１１：α−シヌクレインのアミノ酸残基１２１〜１２５を認識するもの；
抗体Ｎ−１９：α−シヌクレインのＮ末端領域を認識するもの；
抗体ＦＬ−１４０：全長α−シヌクレインに対して作製されたもの；
抗体Ｃ２０：α、βおよびγ−シヌクレインのＣ末端領域を認識する入手可能な型；
（全てＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製） 
および
抗体ＬＢ５０９：α−シヌクレインのアミノ酸残基１１５〜１２２を認識するもの
（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能）。
【００３０】
あるいは、シヌクレイン結合種は、例えば、シヌクレインと特異的に結合可能なタンパク質断片、またはシヌクレインとの複合体の一部である別の分子に対する抗体であってもよい。
【００３１】
（例えば、前濃縮ステップにおける生成物中の）シヌクレインの存在は、シヌクレインに対して反応性のある抗体を用いた免疫ブロット法を実施することにより検出できる。
【００３２】
本発明の別の実施形態では、原サンプル中または前濃縮ステップにおける生成物中いずれかのシヌクレインの存在を、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を実施することにより検出できる。可溶性シヌクレインの存在の検出に適したこのＥＬＩＳＡ実施形態の例では、一次（捕捉）抗体および二次（検出）抗体は、シヌクレイン内の異なるエピトープを認識する抗体であり得る。あるいは、凝集型のシヌクレインを検出する場合には、シヌクレイン内に１つだけ存在するエピトープを認識する単一抗体を、捕捉抗体および検出抗体の双方として使用できる。リン酸化型の可溶性シヌクレインの存在を検出するには、捕捉抗体はシヌクレインに対して反応性を有する抗体であり得、検出抗体はリン酸化されたアミノ酸を認識するものであり得る。当然のことながら、捕捉抗体および検出抗体の特異性は逆であってもよく、そのような場合でもアッセイの有効性は維持される。硝化型の可溶性シヌクレインの存在を検出するには、捕捉抗体はシヌクレインに対して反応性を有する抗体であり得、検出抗体は硝化されたアミノ酸を認識する抗体であり得る。当然のことながら、捕捉抗体および検出抗体の特異性は逆であってもよく、そのような場合でもアッセイの有効性は維持される。
【００３３】
グリコシル化種のシヌクレインの存在は、適した脱グリコシル化酵素の使用によって、または化学的な脱グリコシル化方法によって調べることができる。例えば、サンプルのＳＤＳ  ＰＡＧＥによって得られたバンドの相対重量を、シアリダーゼおよびエンド−Ｏ−グリコシダーゼとともにインキュベート（ｉｎｃｕｂａｔｅ）した同じ材料のサンプルのＳＤＳ  ＰＡＧＥによって得られたバンドの重量と比較することができる。バンドの分子量の変化によって、グリコシル化型の存在が示される。ヒト脳がシムラ（Ｓｈｉｍｕｒａ）らによって確認されたα−シヌクレインの２２ｋＤａ  O−結合型グリコシル化イソ型（αＳｐ２２）を含んでいることは知られている（１０）。
【００３４】
シヌクレインアッセイによって検出された物質は、例えば、ゲルまたはブロットから溶出したタンパク質のタンデム質量分析によって、あるいはＮ末端アミノ酸配列データの解析によってさらに調べることができる。
【００３５】
本発明を以下の実施例、プロトコール、ならびに実施例１および２の結果を示す添付図面の図１〜４を参照してさらに説明する。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例１】
【００３６】
免疫沈降、ゲル電気泳動およびウエスタンブロット法によるヒト血漿およびＣＳＦ中のα−、β−、およびγ−シヌクレインタンパク質の検出
ａ）ダイナビーズ(Ｄｙｎａｂｅａｄｓ)：
組換えプロテインＡ（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）でコーティングした磁気ポリスチレンビーズを、製造業者の使用説明書に従って、捕捉抗体を用いて誘導体化した。血漿またはＣＳＦ由来のシヌクレインの捕捉に用いた抗体は、通常、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製のα／β／γ−シヌクレイン（ＦＬ−１４０）であったが、α−、β−、またはγ−シヌクレインに対するその他の抗体を同目的に使用できる。ビーズを何度も使用する場合には、製造業者の使用説明書に従って、捕捉抗体をダイナビーズと共有結合によって架橋させた。使用前に、ビーズを１．５ｍｌプラスチック試験管内で０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ  ８．１）で十分に洗浄し、洗浄後は、試験管をＤｙｎａｌ社製の磁気性部分濃縮器 (Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｐａｒｔｉａｌ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ)（Ｄｙｎａｌ  ＭＰＣ）に入れてビーズを試験管壁に集めた。
【００３７】
ｂ）免疫沈降：
α−、β−、およびγ−シヌクレインタンパク質（１ｍｌ）を含むＣＳＦまたは血漿サンプルを、抗体コーティングビーズに直接添加し、４℃で一晩攪拌した。０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ  ８．１）で十分に洗浄した後、それらを４Ｘ  ＮＵＰＡＧＥ  ＬＤＳ  ポリアクリルアミドゲル電気泳動サンプルバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で煮沸することによって免疫沈降した物質をビーズから溶出させた。
【００３８】
ｃ）ゲル電気泳動：
ビーズからの溶出物を、中性ｐＨ  ＳＤＳ−ＮＵＰＡＧＥ  ４〜１２％ビス−トリスアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）での電気泳動により分画した。既知の分子量のタンパク質マーカーを用いてゲルに目盛りをつけた。
【００３９】
ｄ）ウエスタンブロット法：
ゲルを泳動した後、分離したタンパク質をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｘセル  ＩＩ  ブロットモジュール（Ｘｃｅｌｌ  ＩＩ  Ｂｌｏｔ  Ｍｏｄｕｌｅ）（２００Ｖ、１２５ｍＡにて、１時間）を用いてニトロセルロースメンブレンにトランスファーした。トランスファー後、メンブレンをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＰＢＳＴ）で十分に洗浄し、その後、ブロッキングバッファー（５％乾燥粉乳を含むＰＢＳ）で室温にて１時間ブロッキングした。種々の異なる抗体を用いて、ブロット上の、α−、β−、およびγ−シヌクレインタンパク質、またはそれらの改変型（例えば、硝化型またはリン酸化型）を検出した。適した抗体の例としては、α−シヌクレイン（Ｃ−２０）、β−シヌクレイン（Ｃ−２０）およびγ−シヌクレイン（Ｃ−２０）、α−、β−およびγ−シヌクレイン（ＦＬ−１４０）、全てＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、またはニトロチロシンまたはホスホセリンに対する抗体（Ｓｉｇｍａ）が挙げられる。メンブレンを一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした後、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ  ２０で十分に洗浄し、その後、一次抗体の免疫グロブリン種に向けられた西洋わさびペルオキシダー共役二次抗体（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ―ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）とともにインキュベートした（室温にて１時間）。メンブレンをＰＢＳＴで十分に洗浄し、ペルオキシダーゼ活性を化学発光法（ＥＣＬ）によって検出した。
【００４０】
ｅ）結果：
図１は、前濃縮をα−シヌクレイン（ＦＬ１４０）に対して反応性を有する抗体を用いて実施し、同じ抗体を用いて検出を行った、ヒト血漿サンプルのウエスタンブロット法による解析の結果を示す。レーン１は組換えα−シヌクレインタンパク質を含み、レーン２はヒト血漿を含んでいる。
【００４１】
図２は、前濃縮をα−シヌクレイン（ＦＬ１４０）に対して反応性の抗体を用いて実施し、同じ抗体を用いて検出を行った、ヒト血漿サンプルのウエスタンブロット法による解析の結果を示す。レーン１は組換えα−シヌクレインタンパク質を含み、レーン２はヒト血漿を含んでいる。
【００４２】
図２は、前濃縮をβ−シヌクレイン（Ｃ２０）に対して反応性を有する抗体を用いて実施し、同じ抗体を用いて検出を行った、ヒト血漿サンプルのウエスタンブロット法による解析の結果を示す。レーン１は組換えα−シヌクレインタンパク質を含み、レーン２は組換えβ−シヌクレインタンパク質を含み、レーン３は組換えγ−シヌクレインタンパク質を含み、レーン４はヒト血漿を含んでいる。
【００４３】
図３は、前濃縮をβ−シヌクレイン（Ｃ２０）に対して反応性を有する抗体を用いて実施し、γ−シヌクレインに対する抗体（Ｃ２０）を用いて検出を行った、ヒト血漿サンプルのウエスタンブロット法による解析の結果を示す。レーン１はヒト血漿を含み、レーン２は組換えγ−シヌクレインタンパク質を含み、レーン３は組換えβ−シヌクレインタンパク質を含み、レーン４は組換えα−シヌクレインタンパク質を含んでいる。
【実施例２】
【００４４】
シヌクレイン症患者由来の血漿中のα−シヌクレインの検出
次の試験により、シヌクレイン症を患うヒト患者の血漿をはじめとする血漿中のシヌクレインを検出する能力を例示し、その結果を図４（パネルＡ〜Ｅ）に示す。
【００４５】
実施例１に記載の方法に従って、シヌクレイン症（パーキンソン病およびレビー小体を伴う痴呆）を患う患者由来の血漿、および年齢をマッチングさせた対照患者由来の血漿を、前濃縮ステップを達成するためα−シヌクレインに対して反応性を有する抗体と架橋している磁性ビーズ（以下で列挙）とともにインキュベートした。
【００４６】
得られた免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、（上記の方法に従って）以下で説明する抗体を用いてウエスタンブロット法を実施した。洗浄剤であるＳＤＳは、この方法で調べられるサンプル中に存在する可能性のあるシヌクレイン凝集物を分解するため、以下に示す結果は、試験したサンプル中の凝集シヌクレインの存在または不在に関する情報は提供しないが、記載した方法の、非脳体液サンプル中に存在するシヌクレインを同定する能力を例示するよう働く。
【００４７】
ウエスタンブロットを行ったゲルには、外来組換えヒトα−シヌクレインおよび／または正常ヒト脳溶解物（脳組織内ではα−シヌクレインが高レベルで見出されるため）から選択したα−シヌクレイン陽性対照物質を含む少なくとも１つのレーンを含めた。
【００４８】
実施例２．１および２．２の場合には、ゲルに外来組換えヒトβ−シヌクレインおよびγ−シヌクレインを含むレーンをさらに含めた。これらのレーンのタンパク質に標識がないことから、ウエスタンブロット法に使用した抗体はα−シヌクレインと特異的に結合可能なものであって、他のシヌクレインイソ型とは結合しないということが示される。
【００４９】
２．１  抗体ＦＬ−１４０を用いた免疫沈降；抗体ＬＢ５０９を用いたウエスタンブロット法
一次抗体ＦＬ−１４０を用いて免疫沈降を行った。抗体ＬＢ５０９を用いてウエスタンブロット法を実施した。この結果を図４Ａのウエスタンブロットメンブレンの写真で示す。それについては以下のとおりである：
レーン１：            ６ｎｇ  組換えヒトβ−シヌクレイン
レーン２：            ６ｎｇ  組換えヒトγ−シヌクレイン
レーン３：            ６ｎｇ  組換えヒトα−シヌクレイン
レーン４：            ３μｇ  正常ヒト脳溶解物
レーン５、６、１３：  パーキンソン病患者由来の血漿
レーン７、８：        ＤＬＢ患者由来の血漿
レーン９〜１２，１４：年齢をマッチングさせた対照患者由来の血漿
【００５０】
レーン１３および１４は、組換えヒトα−シヌクレイン（１μｇ  α−シヌクレイン／ｍｌ  抗体）を用いて予め吸着させておいたＬＢ５０９を用いて調べられた。これら２つのレーンで結合が認められないことから、ＬＢ５０９抗体のα−シヌクレインに対する特異性が示される。
【００５１】
これらの結果から、シヌクレイン症患者および対照患者双方の血漿サンプル、ならびに陽性対照（外来α−シヌクレインおよび脳溶解物）中の内生シヌクレインを検出するアッセイの能力が示される。
【００５２】
２．２  抗体ＦＬ−１４０を用いた免疫沈降；抗体２１１を用いたウエスタンブロット法
一次抗体ＦＬ−１４０を用いて免疫沈降を行い、抗体２１１を用いてウエスタンブロット法を実施したことを除き、実施例２．１を繰り返した。この結果を図２Ｂに示す。
【００５３】
レーン１３および１４は、組換えヒトα−シヌクレイン（１μｇ  α−シヌクレイン／ｍｌ  抗体）を用いて予め吸着させておいた抗体２１１を用いて調べられた。これら２つのレーンで結合が認められないことから、２１１抗体のα−シヌクレインに対する特異性が示される。
【００５４】
これらの結果から、対照患者およびシヌクレイン症患者血漿サンプル、ならびに陽性対照中の内生シヌクレインを検出するアッセイの能力が示される。
【００５５】
２．３  抗体ＦＬ−１４０を用いた免疫沈降；抗体Ｎ−１９を用いたウエスタンブロット法
一次抗体ＦＬ−１４０を用いて免疫沈降を行った。抗体Ｎ−１９を用いてウエスタンブロット法を実施した。この結果を図４Ｃに示し、調べたサンプルを以下に記載する：
レーン１、２、７：    パーキンソン病患者由来の血漿
レーン３、４、８、９：年齢をマッチングさせた対照患者由来の血漿
レーン５：            ３μｇ  正常ヒト脳溶解物
レーン６、１０：      ６ｎｇ  組換えヒトα−シヌクレイン
【００５６】
レーン７〜１０は、組換えヒトα−シヌクレイン（１μｇ  α−シヌクレイン／ｍｌ  抗体）を用いて予め吸着させておいた抗体Ｎ−１９を用いて調べられた。これら２つのレーンで結合が認められないことから、Ｎ−１９抗体のα−シヌクレインに対する特異性が示される。
【００５７】
これらの結果から、血漿サンプル、ならびに陽性対照中の内生シヌクレインを検出するアッセイの能力が示される。
【００５８】
２．４  抗体２１１を用いた免疫沈降；抗体ＦＬ−１４０を用いたウエスタンブロット法
一次抗体ＦＬ−１４０を用いて免疫沈降を行った。抗体２１１を用いてウエスタンブロット法を実施した。この結果を図４Ｄに示し、調べたサンプルを以下に記載する：
レーン１、５、６：    パーキンソン病患者由来の血漿
レーン２、３、７、８：年齢をマッチングさせた対照患者由来の血漿
レーン４，９：        ６ｎｇ  組換えヒトα−シヌクレイン
レーン１０：          ３μｇ  正常ヒト脳溶解物
【００５９】
レーン１〜４は、組換えヒトα−シヌクレイン（１μｇ  α−シヌクレイン／ｍｌ  抗体）を用いて予め吸着させておいた抗体ＦＬ−１４０を用いて調べられた。これら２つのレーンで結合が認められないことから、ＦＬ−１４０抗体のα−シヌクレインに対する特異性が示される。
【００６０】
これらの結果から、患者の血漿サンプル中の内生シヌクレインを検出し、ならびに陽性対照中のシヌクレインを検出するアッセイの能力が示される。
【００６１】
２．５  抗体２１１を用いた免疫沈降；抗体Ｎ−１９を用いたウエスタンブロット法
一次抗体２１１を用いて免疫沈降を行った。抗体Ｎ−１９を用いてウエスタンブロット法を実施した。この結果を図４Ｅに示し、調べたサンプルを以下に記載する：
レーン１、１０：      ６ｎｇ  組換えヒトα−シヌクレイン
レーン２：            ３μｇ  正常ヒト脳溶解物
レーン３、４、７：    パーキンソン病患者由来の血漿
レーン５、６、８、９：年齢をマッチングさせた対照患者由来の血漿
【００６２】
レーン７〜１０は、組換えヒトα−シヌクレイン（１μｇ  α−シヌクレイン／ｍｌ  抗体）を用いて予め吸着させておいた抗体Ｎ−１９を用いて調べられた。これら２つのレーンで結合が認められないことから、Ｎ−１９抗体のα−シヌクレインに対する特異性が示される。
【００６３】
これらの結果から、患者の血漿サンプル中の内生シヌクレインを検出し、さらに陽性対照中のシヌクレインを検出するアッセイの能力が示される。
【実施例３】
【００６４】
ＥＬＩＳＡによるヒト血漿中の可溶性α−シヌクレインタンパク質の測定
Ａ．試薬
１．コーティングバッファー
２００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（Ｓｉｇｍａ）ｐＨ  ９．６。次いで、この溶液を０．２μｍフィルター（Ａｌｄｒｉｃｈ）を通して濾過する。
【００６５】
２．ブロッキング溶液
ブロッキング溶液は、２．５％ゼラチン（Ｓｉｇｍａ）および０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｓｉｇｍａ）を含む１００ｍｌのＰＢＳバッファー（ｐＨ  ７．４）からなる。この溶液は新しく作製し、その日のうちに使用すべきであるが、濾過する必要はない。
【００６６】
３．抗体のビオチン化
ビオチン製造業者「ＰＩＥＲＣＥ」が推奨するように抗体をビオチン化した。
【００６７】
Ｂ．方法
１．プレート（Ｎｕｎｃ，ｍａｘｉｓｏｒｐ）を、１００μｌ／ウェルの、２００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ  ９．６）中、１：１０００（２μｇ／ｍｌ）のα−シヌクレイン（Ｃ−２０）抗体、α−シヌクレインのＣ末端に対して作製されたアフィニティー精製ヤギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、カタログ番号ＳＣ−７０１１）でコーティングする。このプレートを次いで、プレートシーラー（Ｓｉｇｍａ）および食品包装用フィルムを用いてカバーし、４℃で一晩保存する。
２．吸い込み口の上に逆さまにすることによって、プレートからＮ−１９抗体を吸引する。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０（０．０５％）（ＰＢＳＴ）で４回洗浄する。
３．２００μｌ／ウェル  ブロッキングバッファーを用いてプレートをブロックする。プレートを３７℃で１時間インキュベートする。
４．プレートをＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳバッファー）で４回洗浄する。
５．１００μｌ／ウェルの血漿または血清を添加する。プレートをカバーし、３７℃で２時間インキュベートする。
６．プレートをＰＢＳＴで４回洗浄する。ビオチン化したＮ−１９抗体、α−シヌクレインのＮ末端に対して作製されたアフィニティー精製ヤギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、カタログ番号ｓｃ−７０１２）をブロッキングバッファーで希釈率１：１０００（０．２μｇ／ｍｌ）に希釈し、１００μｌ／ウェルを添加する。３７℃で２時間インキュベートする。
７．ＰＢＳＴで４回洗浄する。
８．１００μｌ／ウェルの、ブロッキングバッファーで３：５０００希釈したエクストラアビジン−アルカリホスファターゼ（ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ)（Ｓｉｇｍａ）を添加し、３７℃で１時間インキュベートする。
９．プレートをＰＢＳＴで４回洗浄する。１００μｌ／ウェルのアルカリホスファターゼイエロー（Ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｙｅｌｌｏｗ)「ｐＮＰＰ」を添加し、室温にて３０分間インキュベートする。４０５ｎｍの吸光度値を読み取る。
【００６８】
Ｃ．結果
上記の手順を用いて、シヌクレイン症を患っていない健常な個体から採取したヒト血漿に１μＭよりも高い濃度でα−シヌクレインが含まれていることが判明した。
【実施例４】
【００６９】
パーキンソン病患者および対照患者の血漿中の凝集シヌクレイン量の測定および比較
ｎ＝３４の臨床的に診断されたパーキンソン病患者、およびｎ＝２７の年齢をマッチングさせた対照患者由来の血漿サンプルを、下記、多量体（凝集）α−シヌクレインの測定のプロトコール２で以下に記載したように実施したＥＬＩＳＡにより解析した。選択したＥＬＩＳＡプロトコールは、サンドイッチＥＬＩＳＡであり、凝集（オリゴマー化）型のシヌクレインに特異的なものである。
【００７０】
４０５ｎｍの吸光度の上昇が、試験したサンプル中の凝集シヌクレインの存在の増加を示す。吸光度は光学濃度単位（ＯＤ）で測定した。
【００７１】
臨床的に診断されたパーキンソン病患者由来の血漿サンプルの平均吸光度は、１．７ＯＤ＋／−標準偏差（ＳＤ）０．７０５７であった。これに対し、年齢をマッチングさせた対照患者由来の血漿サンプルの平均吸光度は、０．２３６ＯＤ＋／−ＳＤ０．３９６であった。これらの値は著しく異なり、シヌクレイン症であるパーキンソン病を患う患者群での平均値がかなり高かった。
【００７２】
群間の吸光度、ひいては凝集シヌクレインレベルの差は、統計的解析上有意であることがわかった。
【００７３】
フィッシャーの正確確率検定を、吸光度値０．５ＯＤを「高」レベルのオリゴマー化シヌクレインを表すよう割り当てて実施したところ、パーキンソン病群および対照群で得られた値間で非常に有意な差が示された（Ｐ＝０．００２）。フィッシャーの正確確率検定に、吸光度０．２５ＯＤというカットオフ値を選択すると、さらに有意な差（Ｐ＝０．００１）が得られた。よって、上記の、これら２つの選択したカットオフ値のいずれかよりも高い吸光度値は、パーキンソン病の存在を十分に示す。
【００７４】
プロトコール
可溶性α−シヌクレインタンパク質の測定のプロトコール１
Ａ．試薬
１．コーティングバッファー
２００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（Ｓｉｇｍａ）ｐＨ  ９．６。次いで、この溶液を０．２μｍフィルター（Ａｌｄｒｉｃｈ）を通して濾過する。
【００７５】
２．ブロッキング溶液
ブロッキング溶液は２．５％ゼラチン（Ｓｉｇｍａ）および０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｓｉｇｍａ）を含む１００ｍｌのＰＢＳバッファー（ｐＨ  ７．４）からなる。この溶液は新しく作製し、その日のうちに使用すべきであるが、濾過する必要はない。
【００７６】
３．抗体のビオチン化
ビオチン製造業者「ＰＩＥＲＣＥ」が推奨するように抗体をビオチン化した。
【００７７】
Ｂ．方法
１．プレート（Ｎｕｎｃ，ｍａｘｉｓｏｒｐ）を、１００μｌ／ウェルの、２００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ  ９．６）中、希釈率１：１０００（０．２μｇ／ｍｌ）のＮ−１９抗体、α−シヌクレインのＮ末端に対して作製されたアフィニティー精製ヤギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．カタログ番号ｓｃ−７０１２）でコーティングする。このプレートを次いで、プレートシーラー（Ｓｉｇｍａ）および食品包装用フィルムを用いてカバーし、４℃で一晩保存する。
２．吸い込み口の上に逆さまにすることによって、プレートからＮ−１９抗体を吸引する。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０（０．０５％）（ＰＢＳＴ）で４回洗浄する。
３．２００μｌ／ウェル  ブロッキングバッファーを用いてプレートをブロッキングする。プレートを３７℃で１時間インキュベートする。
４．プレートをＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳバッファー）で４回洗浄する。
５．１００μｌ／ウェルの血漿または血清を添加する。プレートをカバーし、３７℃で２時間インキュベートする。
６．プレートをＰＢＳＴで４回洗浄する。ビオチン化したα−シヌクレイン（Ｃ−２０）抗体、α−シヌクレインのＣ末端に対して作製されたアフィニティー精製ヤギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．カタログ番号ＳＣ−７０１１）をブロッキングバッファーで１：１０００（２μｇ／ｍｌ）に希釈し、１００μｌ／ウェルを添加する。３７℃で２時間インキュベートする。
７．ＰＢＳＴで４回洗浄する。
８．１００μｌ／ウェルの、ブロッキングバッファーで３：５０００希釈したエクストラアビジン−アルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ）を添加し、３７℃で１時間インキュベートする。
９．プレートをＰＢＳＴで４回洗浄する。１００μｌ／ウェルのアルカリホスファターゼイエロー「ｐＮＰＰ」を添加し、室温にて３０分間インキュベートする。４０５ｎｍの吸光度値を読み取る。
【００７８】
可溶性α−シヌクレインタンパク質の測定のプロトコール２
Ａ．試薬
１．コーティングバッファー
２００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（Ｓｉｇｍａ）ｐＨ  ９．６。次いで、この溶液を０．２μｍフィルター（Ａｌｄｒｉｃｈ）を通して濾過する。
【００７９】
２．ブロッキング溶液
ブロッキング溶液は２．５％ゼラチン（Ｓｉｇｍａ）および０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｓｉｇｍａ）を含む１００ｍｌのＰＢＳバッファー（ｐＨ  ７．４）からなる。この溶液は新しく作製し、その日のうちに使用すべきであるが、濾過する必要はない。
【００８０】
３．抗体のビオチン化
ビオチン製造業者「ＰＩＥＲＣＥ」が推奨するように抗体をビオチン化した。
【００８１】
Ｂ．方法
１．プレート（Ｎｕｎｃ，ｍａｘｉｓｏｒｐ）を１００μｌ／ウェルの、２００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ  ９．６）中、希釈率１：１０００（０．２μｇ／ｍｌ）のＦＬ−１４０抗体、組換え全長ヒトα−シヌクレインタンパク質に対して作製されたアフィニティー精製ウサギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．カタログ番号ＳＣ−１０７１７）でコーティングする。このプレートを次いで、プレートシーラー（Ｓｉｇｍａ）および食品包装用フィルムを用いてカバーし、４℃で一晩保存する。
２．吸い込み口の上に逆さまにすることによって、プレートからＮ−１９抗体を吸引する。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０（０．０５％）（ＰＢＳＴ）で４回洗浄する。
３．２００μｌ／ウェル  ブロッキングバッファーを用いてプレートをブロッキングする。プレートを３７℃で１時間インキュベートする。
４．プレートをＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳバッファー）で４回洗浄する。
５．１００μｌ／ウェルの血漿または血清を添加する。プレートをカバーし、３７℃で２時間インキュベートする。
６．プレートをＰＢＳＴで４回洗浄する。ビオチン化したα−シヌクレイン（Ｃ−２０）抗体、α−シヌクレインのＣ末端に対して作製されたアフィニティー精製ヤギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．カタログ番号ＳＣ−７０１１）をブロッキングバッファーで１：１０００（２μｇ／ｍｌ）に、またはビオチン化したＮ−１９抗体、α−シヌクレインのＮ末端に対して作製されたアフィニティー精製ヤギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．カタログ番号ＳＣ−７０１２）を希釈率１：１０００（０．２μｇ／ｍｌ）に希釈し、１００μｌ／ウェルを添加する。３７℃で２時間インキュベートする。
７．ＰＢＳＴで４回洗浄する。
８．１００μｌ／ウェルの、ブロッキングバッファーで３：５０００希釈したエクストラアビジン−アルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ）を添加し、３７℃で１時間インキュベートする。
９．プレートをＰＢＳＴで４回洗浄する。１００μｌ／ウェルのアルカリホスファターゼイエロー「ｐＮＰＰ」を添加し、室温にて３０分間インキュベートする。４０５ｎｍの吸光度値を読み取る。
【００８２】
可溶性硝化−α−シヌクレインタンパク質の測定についてのプロトコール１
Ａ．試薬
１．コーティングバッファー
２００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（Ｓｉｇｍａ）ｐＨ  ９．６。この溶液を０．２μｍフィルター（Ａｌｄｒｉｃｈ）を通して濾過する。
【００８３】
２．ブロッキング溶液
ブロッキング溶液は２．５％ゼラチン（Ｓｉｇｍａ）および０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｓｉｇｍａ）を含む１００ｍｌのＰＢＳバッファー（ｐＨ  ７．４）からなる。この溶液は新しく作製し、その日のうちに使用すべきであるが、濾過する必要はない。
【００８４】
３．抗体のビオチン化
ビオチン製造業者「ＰＩＥＲＣＥ」が推奨するように抗体をビオチン化した。
【００８５】
Ｂ．方法
１．プレート（Ｎｕｎｃ，ｍａｘｉｓｏｒｐ）を１００μｌ／ウェルの、２００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ  ９．６）中、希釈率１：１０００（０．２μｇ／ｍｌ）のＮ−１９抗体、α−シヌクレインのＮ末端に対して作製されたアフィニティー精製ヤギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．カタログ番号ｓｃ−７０１２）でコーティングする。このプレートを次いで、プレートシーラー（Ｓｉｇｍａ）および食品包装用フィルムを用いてカバーし、４℃で一晩保存する。
２．吸い込み口の上に逆さまにすることによって、プレートからＮ−１９抗体を吸引する。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０（０．０５％）（ＰＢＳＴ）で４回洗浄する。
３．２００μｌ／ウェル  ブロッキングバッファーを用いてプレートをブロッキングする。プレートを３７℃で１時間インキュベートする。
４．プレートをＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳバッファー）で４回洗浄する。
５．１００μｌ／ウェルの血漿または血清を添加する。プレートをカバーし、３７℃で２時間インキュベートする。
６．プレートをＰＢＳＴで４回洗浄する。ビオチン化したニトロチロシン抗体（ニトロチロシンを認識するポリクローナルまたはモノクローナルＩｇＧ抗体）をブロッキングバッファーで、モノクローナル抗体の場合１：２００またはポリクローナル抗体の場合１−１０００に希釈し、１００μｌ／ウェルを添加する。３７℃で２時間インキュベートする。
７．ＰＢＳＴで４回洗浄する。
８．１００μｌ／ウェルの、ブロッキングバッファーで３：５０００希釈したエクストラアビジン−アルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ）を添加し、３７℃で１時間インキュベートする。
９．プレートをＰＢＳＴで４回洗浄する。１００μｌ／ウェルのアルカリホスファターゼイエロー「ｐＮＰＰ」を添加し、室温にて３０分間インキュベートする。４０５ｎｍの吸光度値を読み取る。
【００８６】
可溶性硝化−α−シヌクレインタンパク質の測定についてのプロトコール２
Ｂ．試薬
１．コーティングバッファー
２００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（Ｓｉｇｍａ）ｐＨ  ９．６。次いで、この溶液を０．２μｍフィルター（Ａｌｄｒｉｃｈ）を通して濾過する。
【００８７】
２．ブロッキング溶液
ブロッキング溶液は２．５％ゼラチン（Ｓｉｇｍａ）および０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｓｉｇｍａ）を含む１００ｍｌのＰＢＳバッファー（ｐＨ  ７．４）からなる。この溶液は新しく作製し、その日のうちに使用すべきであるが、濾過する必要はない。
【００８８】
３．抗体のビオチン化
ビオチン製造業者「ＰＩＥＲＣＥ」が推奨するように抗体をビオチン化した。
【００８９】
Ｂ．方法
１．プレート（Ｎｕｎｃ，ｍａｘｉｓｏｒｐ）を１００μｌ／ウェルの、２００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ  ９．６）中、希釈率１：１０００（０．２μｇ／ｍｌ）のＦＬ−１４０抗体、組換え全長ヒトα−シヌクレインタンパク質に対して作製されたアフィニティー精製ウサギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．カタログ番号ＳＣ−１０７１７）でコーティングする。このプレートを次いで、プレートシーラー（Ｓｉｇｍａ）および食品包装用フィルムを用いてカバーし、４℃で一晩保存する。
２．吸い込み口の上に逆さまにすることによってプレートからＮ−１９抗体を吸引する。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０（０．０５％）（ＰＢＳＴ）で４回洗浄する。
３．２００μｌ／ウェル  ブロッキングバッファーを用いてプレートをブロッキングする。プレートを３７℃で１時間インキュベートする。
４．プレートをＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳバッファー）で４回洗浄する。
５．１００μｌ／ウェルの血漿または血清を添加する。プレートをカバーし、３７℃で２時間インキュベートする。
６．プレートをＰＢＳＴで４回洗浄する。ビオチン化したニトロチロシン抗体（硝化チロシンを認識するポリクローナルまたはモノクローナルＩｇＧ抗体）をブロッキングバッファーで、モノクローナル抗体の場合１：２００またはポリクローナル抗体の場合１−１０００に希釈し、１００μｌ／ウェルを添加する。３７℃で２時間インキュベートする。
７．ＰＢＳＴで４回洗浄する。
８．１００μｌ／ウェルの、ブロッキングバッファーで３：５０００希釈したエクストラアビジン−アルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ）を添加し、３７℃で１時間インキュベートする。
９．プレートをＰＢＳＴで４回洗浄する。１００μｌ／ウェルのアルカリホスファターゼイエロー「ｐＮＰＰ」を添加し、室温にて３０分間インキュベートする。４０５ｎｍの吸光度値を読み取る。
【００９０】
可溶性リン酸化−α−シヌクレインタンパク質の測定のプロトコール１
Ａ．試薬
１．コーティングバッファー
２００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（Ｓｉｇｍａ）ｐＨ  ９．６。次いで、この溶液を０．２μｍフィルター（Ａｌｄｒｉｃｈ）を通して濾過する。
【００９１】
２．ブロッキング溶液
ブロッキング溶液は２．５％ゼラチン（Ｓｉｇｍａ）および０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｓｉｇｍａ）を含む１００ｍｌのＰＢＳバッファー（ｐＨ  ７．４）からなる。この溶液は新しく作製し、その日のうちに使用すべきであるが、濾過する必要はない。
【００９２】
３．抗体のビオチン化
ビオチン製造業者「ＰＩＥＲＣＥ」が推奨するように抗体をビオチン化した。
【００９３】
Ｂ．方法
１．プレート（Ｎｕｎｃ，ｍａｘｉｓｏｒｐ）を１００μｌ／ウェルの、２００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ  ９．６）中、希釈率１：１０００（０．２μｇ／ｍｌ）のＮ−１９抗体、α−シヌクレインのＮ末端に対して作製されたアフィニティー精製ヤギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．カタログ番号ｓｃ−７０１２）でコーティングする。このプレートを次いで、プレートシーラー（Ｓｉｇｍａ）および食品包装用フィルムを用いてカバーし、４℃で一晩保存する。
２．吸い込み口の上に逆さまにすることによって、プレートからＮ−１９抗体を吸引する。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０（０．０５％）（ＰＢＳＴ）で４回洗浄する。
３．２００μｌ／ウェル  ブロッキングバッファーを用いてプレートをブロッキングする。プレートを３７℃で１時間インキュベートする。
４．プレートをＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳバッファー）で４回洗浄する。
５．１００μｌ／ウェルの血漿または血清を添加する。プレートをカバーし、３７℃で２時間インキュベートする。
６．プレートをＰＢＳＴで４回洗浄する。ビオチン化したホスホセリン抗体（ホスホセリンを認識するポリクローナルまたはモノクローナルＩｇＧ抗体）をブロッキングバッファーで、モノクローナル抗体の場合１：２００またはポリクローナル抗体の場合１−１０００に希釈し、１００μｌ／ウェルを添加する。３７℃で２時間インキュベートする。
７．ＰＢＳＴで４回洗浄する。
８．１００μｌ／ウェルの、ブロッキングバッファーで３：５０００希釈したエクストラアビジン−アルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ）を添加し、３７℃で１時間インキュベートする。
９．プレートをＰＢＳＴで４回洗浄する。１００μｌ／ウェルのアルカリホスファターゼイエロー「ｐＮＰＰ」を添加し、室温にて３０分間インキュベートする。４０５ｎｍの吸光度の値を読み取る。
【００９４】
可溶性硝化−α−シヌクレインタンパク質の測定についてのプロトコール２
Ａ．試薬
１．コーティングバッファー
２００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（Ｓｉｇｍａ）ｐＨ  ９．６。この溶液を０．２μｍフィルター（Ａｌｄｒｉｃｈ）を通して濾過する。
【００９５】
２．ブロッキング溶液
ブロッキング溶液は２．５％ゼラチン（Ｓｉｇｍａ）および０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｓｉｇｍａ）を含む１００ｍｌのＰＢＳバッファー（ｐＨ  ７．４）からなる。この溶液は新しく作製し、その日のうちに使用すべきであるが、濾過する必要はない。
【００９６】
３．抗体のビオチン化
ビオチン製造業者「ＰＩＥＲＣＥ」が推奨するように抗体をビオチン化した。
【００９７】
Ｂ．方法
１．プレート（Ｎｕｎｃ，ｍａｘｉｓｏｒｐ）を１００μｌ／ウェルの、２００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ  ９．６）中、希釈率１：１０００（０．２μｇ／ｍｌ）のＦＬ−１４０抗体、組換え全長ヒトα−シヌクレインタンパク質に対して作製されたアフィニティー精製ウサギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．カタログ番号ＳＣ−１０７１７）でコーティングする。このプレートを次いで、プレートシーラー（Ｓｉｇｍａ）および食品包装用フィルムを用いてカバーし、４℃で一晩保存する。
２．吸い込み口の上に逆さまにすることによって、プレートからＮ−１９抗体を吸引する。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０（０．０５％）（ＰＢＳＴ）で４回洗浄する。
３．２００μｌ／ウェル  ブロッキングバッファーを用いてプレートをブロッキングする。プレートを３７℃で１時間インキュベートする。
４．プレートをＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳバッファー）で４回洗浄する。
５．１００μｌ／ウェルの血漿または血清を添加する。プレートをカバーし、３７℃で２時間インキュベートする。
６．プレートをＰＢＳＴで４回洗浄する。ビオチン化したホスホセリン抗体（ホスホセリンを認識するポリクローナルまたはモノクローナルＩｇＧ抗体）をブロッキングバッファーで、モノクローナル抗体の場合１：２００またはポリクローナル抗体の場合１−１０００に希釈し、１００μｌ／ウェルを添加する。３７℃で２時間インキュベートする。
７．ＰＢＳＴで４回洗浄する。
８．１００μｌ／ウェルの、ブロッキングバッファーで３：５０００希釈したエクストラアビジン−アルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ）を添加し、３７℃で１時間インキュベートする。
９．プレートをＰＢＳＴで４回洗浄する。１００μｌ／ウェルのアルカリホスファターゼイエロー「ｐＮＰＰ」を添加し、室温にて３０分間インキュベートする。４０５ｎｍの吸光度の値を読み取る。
【００９８】
多量体（凝集）α−シヌクレインタンパク質の測定についてのプロトコール１
Ａ．試薬
１．コーティングバッファー
２００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（Ｓｉｇｍａ）ｐＨ  ９．６。次いで、この溶液を０．２μｍフィルター（Ａｌｄｒｉｃｈ）を通して濾過する。
【００９９】
２．ブロッキング溶液
ブロッキング溶液は２．５％ゼラチン（Ｓｉｇｍａ）および０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｓｉｇｍａ）を含む１００ｍｌのＰＢＳバッファー（ｐＨ  ７．４）からなる。この溶液は新しく作製し、その日のうちに使用すべきであるが、濾過する必要はない。
【０１００】
３．抗体のビオチン化
ビオチン製造業者「ＰＩＥＲＣＥ」が推奨するように抗体をビオチン化した。
【０１０１】
Ｂ．方法
１．プレート（Ｎｕｎｃ，ｍａｘｉｓｏｒｐ）を１００μｌ／ウェルの、２００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ  ９．６）中、希釈率１：１０００（０．２μｇ／ｍｌ）のＮ−１９抗体、α−シヌクレインのＮ末端に対して作製されたアフィニティー精製ヤギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．カタログ番号ｓｃ−７０１２）でコーティングする。このプレートを次いで、プレートシーラー（Ｓｉｇｍａ）および食品包装用フィルムを用いてカバーし、４℃で一晩保存する。
２．吸い込み口の上に逆さまにすることによってプレートからＮ−１９抗体を吸引する。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０（０．０５％）（ＰＢＳＴ）で４回洗浄する。
３．２００μｌ／ウェル  ブロッキングバッファーを用いてプレートをブロッキングする。プレートを３７℃で１時間インキュベートする。
４．プレートをＰＢＳＴで４回洗浄する。
５．１００μｌ／ウェルの血漿または血清を添加する。プレートをカバーし、３７℃で２時間インキュベートする。
６．プレートをＰＢＳＴで４回洗浄する。ビオチン化したＮ−１９抗体をブロッキングバッファーで１：２０００（１μｇ／ｍｌ）に希釈し、１００μｌ／ウェルを添加する。３７℃で２時間インキュベートする。
７．ＰＢＳＴで４回洗浄する。
８．１００μｌ／ウェルの、ブロッキングバッファーで３：５０００希釈したエクストラアビジン−アルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ）を添加し、３７℃で１時間インキュベートする。
９．プレートをＰＢＳＴで４回洗浄する。１００μｌ／ウェルのアルカリホスファターゼイエロー「ｐＮＰＰ」を添加し、室温にて３０分間インキュベートする。４０５ｎｍの吸光度の値を読み取る。
【０１０２】
多量体（凝集）α−シヌクレインタンパク質の測定についてのプロトコール２
Ａ．試薬
１．コーティングバッファー
２００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（Ｓｉｇｍａ）ｐＨ  ９．６。次いで、この溶液を０．２μｍフィルター（Ａｌｄｒｉｃｈ）を通して濾過する。
【０１０３】
２．ブロッキング溶液
ブロッキング溶液は２．５％ゼラチン（Ｓｉｇｍａ）および０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｓｉｇｍａ）を含む１００ｍｌのＰＢＳバッファー（ｐＨ  ７．４）からなる。この溶液は新しく作製し、その日のうちに使用すべきであるが、濾過する必要はない。
【０１０４】
３．抗体のビオチン化
ビオチン製造業者「ＰＩＥＲＣＥ」が推奨するように抗体をビオチン化した。
【０１０５】
Ｂ．方法
１．プレート（Ｎｕｎｃ，ｍａｘｉｓｏｒｐ）を１００μｌ／ウェルの、２００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ  ９．６）中、１：１００（２μｇ／ｍｌ）のα−シヌクレイン（２１１）（α−シヌクレインのアミノ酸１２１〜１２５を認識するマウスモノクローナルＩｇＧ抗体）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．カタログ番号ＳＣ−１２７６７）でコーティングする。このプレートを次いで、プレートシーラー（Ｓｉｇｍａ）および食品包装用フィルムを用いてカバーし、４℃で一晩保存する。
２．吸い込み口の上に逆さまにすることによって、プレートから２１１抗体を吸引する。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０（０．０５％）（ＰＢＳＴ）で４回洗浄する。
３．２００μｌ／ウェル  ブロッキングバッファーを用いてプレートをブロッキングする。プレートを３７℃で１時間インキュベートする。
４．プレートをＰＢＳＴで４回洗浄する。
５．１００μｌ／ウェルの血漿または血清を添加する。プレートをカバーし、３７℃で２時間インキュベートする。
６．プレートをＰＢＳＴで４回洗浄する。ビオチン化したα−シヌクレイン（２１１）をブロッキングバッファーで１：２００（１μｇ／ｍｌ）に希釈し、１００μｌ／ウェルを添加する。３７℃で２時間インキュベートする。
７．ＰＢＳＴで４回洗浄する。
８．１００μｌ／ウェルの、ブロッキングバッファーで３：５０００希釈したエクストラアビジン−アルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ）を添加し、３７℃で１時間インキュベートする。
９．プレートをＰＢＳＴで４回洗浄する。１００μｌ／ウェルのアルカリホスファターゼイエロー「ｐＮＰＰ」を添加し、室温にて３０分間インキュベートする。４０５ｎｍの吸光度の値を読み取る。
【０１０６】
（参照文献）
１．クレイトン・ディー・エフ（Ｃｌａｙｏｎ，Ｄ．Ｆ．）およびジョージ・ジェイ・エム（Ｇｅｏｒｇｅ，Ｊ．Ｍ．）（１９９９）シヌクレインズ・イン・シナプティック・プラスティシティー・アンド・ニューロデジェネレイティブ・ディスオーダーズ（Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｓ  ｉｎ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス・リサーチ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８、１２０〜１２９頁。
２．ブリューニング・ダブリュー（Ｂｒｕｅｎｉｎｇ，Ｗ．）、ギアソン・ビー・アイ（Ｇｉａｓｓｏｎ，Ｂ．Ｉ．）、クレイン−スザント・エイ・ジェイ（Ｋｌｅｉｎ−Ｓｚａｎｔｏ，Ａ．Ｊ．）、リー・ブイ・エム（Ｌｅｅ，Ｖ．Ｍ．）、トロジャノウスキ・ジェイ・キュー（Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｑ．）およびゴッドウィン・エイ・ケイ（Ｇｏｄｗｉｎ，Ａ．Ｋ．）（２０００）シヌクレインズ・アー・エクスプレスド・イン・ザ・マジョリティー・オブ・ブレスト・アンド・オバリアン・カルシノーマズ・アンド・イン・プレネオプラスティック・リーション・オフ・ジ・オバリー（Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｓ  ａｒｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒｉｔｙ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ａｎｄ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  ｉｎｐｒｅｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｌｅｓｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｏｖａｒｙ）キャンサー（Ｃａｎｃｅｒ）８８、２１５４〜２１６３頁。
３．ウエダ・ケイ（Ｕｅｄａ，Ｋ．）、フクシマ・エイチ（Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ，Ｈ．）、マスリア・イー（Ｍａｓｌｉａｈ，Ｅ．）、シア・ワイ（Ｘｉａ，Ｙ．）、イワイ・エー（Ｉｗａｉ，Ａ．）、オテロ・ディー（Ｏｔｅｒｏ，Ｄ．）、コンドウ・ジェイ（Ｋｏｎｄｏ，Ｊ．）、イハラ・ワイ（Ｉｈａｒａ，Ｙ．）およびサイトウ・ティー（Ｓａｉｔｏｈ，Ｔ．）（１９９３）モレキュラー・クローニング・オフ・シーディーエヌエー・エンコーディング・アン・アンレコグナイズド・コンポーネント・オブ・アミロイド・イン・アルツハイマー・ディジーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａｎ  ｕｎｒｅｃｏｇｎｉｓｅｄ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｏｆ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスズ・オブ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ＵＳＡ）９０、１１２８２〜１１２８６頁。
４．ポリメロポウロス・エム・エイチ（Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏｓ，Ｍ．Ｈ．）、ラベダン・シー（Ｌａｖｅｄａｎ，Ｃ．）、レロイ・イー（Ｌｅｒｏｙ，Ｅ．）、イデ・エス・イー（Ｉｄｅ，Ｓ．Ｅ．）、デヘジア・エー（Ｄｅｈｅｊｉａ，Ａ．）、デュトラ・エー（Ｄｕｔｒａ，Ａ．）、パイク・ビー（Ｐｉｋｅ，Ｂ．）、ルート・エイチ（Ｒｏｏｔ，Ｈ．）、ルベンステイン・ジェイ（Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．）、ボイヤー・アール（Ｂｏｙｅｒ，Ｒ．）、ステンロス・イー・エス（Ｓｔｅｎｒｏｏｓ，Ｅ．Ｓ．）、チャンドラセクハラッパ・エス（Ｃｈａｎｄｒａｓｅｋｈａｒａｐｐａ，Ｓ．）、アサンアッシアドウ・エー（Ａｔｈａｎａｓｓｉａｄｏｕ，Ａ．）、パパペトロポウロス・ティー（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ，Ｔ．）、ジョンソン・ダブリュー・ジー（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｗ．Ｇ．）、ラザリニ・エー・エム（Ｌａｚｚａｒｉｎｉ，Ａ．Ｍ．）、デュボイシン・アール・シー（Ｄｕｖｏｉｓｉｎ，Ｒ．Ｃ．）、ジイオリオ・ジー（Ｄｉ  Ｉｏｒｉｏ，Ｇ．）、ゴルベ・エル・アイ（Ｇｏｌｂｅ，Ｌ．Ｉ．）およびヌスバウム・アール・エル（Ｎｕｓｓｂａｕｍ，Ｒ．Ｌ．）（１９９７）ミューテーション・イン・ジ・アルファ−シヌクレイン・ジーン・アイデンティファイド・イン・ファミリーズ・ウィズ・パーキンソンズ・ディジーズ（Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ  ｇｅｎｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｉｎ  ｆａｍｉｌｉｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２７６、２０４５〜２０４７頁。
５．クルガー・アール（Ｋｒｕｇｅｒ，Ｒ．）、クーン・ダブリュー（Ｋｕｈｎ，Ｗ．）、ミュラー・ティー（Ｍｕｌｌｅｒ，Ｔ．）、ウォイタラ・ディー（Ｗｏｉｔａｌｌａ，Ｄ．）、グラエバー・エム（Ｇｒａｅｂｅｒ，Ｍ．）、コセル・エス（Ｋｏｓｅｌ，Ｓ．）、リュンテック・エイチ（Ｐｒｚｕｎｔｅｋ，Ｈ．）、エップレン・ジェイ・ティー（Ｅｐｐｌｅｎ，Ｊ．Ｔ．）、スコールズ・エル（Ｓｃｈｏｌｓ，Ｌ．）およびリース・オー（Ｒｉｅｓｓ，Ｏ．）（１９９８）Ａｌａ３Ｐｒｏミューテーション・イン・ザ・ジーン・エンコーディング・アルファ−シヌクレイン・イン・パーキンソンズ・ディジーズ（Ａｌａ３０Ｐｒｏ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ  ｉｎ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．）ネイチャー・ジェネティクス（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）１８、１０６〜１０８頁。
６．スピランチニ・エム・ジー（Ｓｐｉｌｌａｎｔｉｎｉ，Ｍ．Ｇ．）、クロウザー・アール・エー（Ｃｒｏｗｔｈｅｒ，Ｒ．Ａ．）、ジェイクス・アール（Ｊａｋｅｓ，Ｒ．）、カイアンズ・エヌ・ジェイ（Ｃａｉｒｎｓ，Ｎ．Ｊ．）、ラントス・ピー・エル（Ｌａｎｔｏｓ，Ｐ．Ｌ．）およびゴーダート・エム（Ｇｏｅｄｅｒｔ，Ｍ．）（１９９８）フィラメントウス・アルファ−シヌクレイン・インクルージョンズ・リンク・マルティプル・システム・アトロフィー・ウィズ・パーキンソンズ・ディジーズ・アンド・ディメンチア・ウィズ・レビー・ボディーズ（Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ  ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｓ  ｌｉｎｋ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｔｒｏｐｈｙ  ｗｉｔｈ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｄｅｍｅｎｔｉａ  ｗｉｔｈ  Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｉｅｓ）ニューロサイエンス・レターズ（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）２５１、２０５〜２０８頁。
７．ガルビン・ジェイ・イー（Ｇａｌｖｉｎ，Ｊ．Ｅ．）、ウリュー・ケイ（Ｕｒｙｕ，Ｋ．）、リー・ブイ・エム（Ｌｅｅ，Ｖ．Ｍ．）およびトロジャノウスキ・ジェイ・キュー（Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｑ．）（１９９９）アキソン・パソロジー・イン・パーキンソンズ・ディジーズ・アンド・レビー・ボディーズ・ディメンチア・ヒポカンプス・コンテインズ・アルファ−、ベータ−、アンド・ガンマ−シヌクレイン（Ａｘｏｎ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｙ  ｄｅｍｅｎｔｉａ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ  ｃｏｎｔａｉｎｓ  ａｌｐｈａ−，  ｂｅｔａ−，  ａｎｄ  ｇａｍｍａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスズ・オブ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ＵＳＡ）９６、１３４５０〜１３４５５頁。
８．ヒューズ・エー・ジェイ（Ｈｕｇｈｅｓ，Ａ．Ｊ．）、ベン−シュロモ・ワイ（Ｂｅｎ−Ｓｈｌｏｍｏ，Ｙ．）、ダニエル・エス・イー（Ｄａｎｉｅｌ，Ｓ．Ｅ．）およびリーズ・エー・ジェイ（Ｌｅｅｓ，Ａ．Ｊ．）（１９９２）ホワット・フィーチャーズ・インプルーブ・ジ・アキュラシー・オブ・クリニカル・ダイアグノシス・イン・パーキンソンズ・ディジーズ（Ｗｈａｔ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｔｈｅ  ａｃｃｕｒａｃｙ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｉｎ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）ニューロロジー（Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ）４２、１１４２〜１１４６頁。
９．ラジュプット・エー・エイチ（Ｒａｊｐｕｔ，Ａ．Ｈ．）、ロズジルスキー・ビー（Ｒｏｚｄｉｌｓｋｙ，Ｂ．）およびラジュプット・エー（Ｒａｊｐｕｔ，Ａ．）（１９９１）アキュラシー・オブ・クリニカル・ダイアグノシス・イン・パーキンソンズ・ディジーズ−ア・プロスペクティブ・スタディー（Ａｃｃｕｒａｃｙ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｉｎ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ−ａ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｙ）カナディアン・ジャーナル・オブ・ザ・ニューロロジカル・サイエンシズ（Ｃａｎｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）１８、２７５〜２７８頁。
１０．シムラ・エイチ（Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．）、ショルスマッチャー・エム・ジー（Ｓｃｈｌｏｓｓｍａｃｈｅｒ，Ｍ．Ｇ．）、ハットリ・エヌ（Ｈａｔｔｏｒｉ，Ｎ．）、フロスク・エム・ピー（Ｆｒｏｓｃｈ，Ｍ．Ｐ．）、トロケンバッカー・エー（Ｔｒｏｃｋｅｎｂａｃｈｅｒ，Ａ．）、シュナイダー・アール（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｒ．）、ミズノ・ワイ（Ｍｉｚｕｎｏ，Ｙ．）、コシック・ケイ・エス（Ｋｏｓｉｋ，Ｋ．Ｓ．）、セルコエ・ディー・ジェイ（Ｓｅｌｋｏｅ，Ｄ．Ｊ．）（２００１）ユビキチネーション・オブ・ア・ニュー・フォーム・オブ・アルファ−シヌクレイン・バイ・パーキン・フロム・ヒューマン・ブレイン：インプリケーションズ・フォー・パーキンソンズ・ディジーズ（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ  ｂｙ  Ｐａｒｋｉｎ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ：  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２９３、２６３〜２６９頁。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】前濃縮をα−シヌクレイン（ＦＬ１４０）に対して反応性を有する抗体を用いて実施し、同じ抗体を用いて検出を行った、ヒト血漿サンプルのウエスタンブロット法による解析の結果を示す（レーン１：組換えα―シヌクレインタンパク質、レーン２：ヒト血漿）。
【図２】図２は、前濃縮をβ−シヌクレイン（Ｃ２０）に対して反応性の抗体を用いて実施し、同じ抗体を用いて検出を行った、ヒト血漿サンプルのウエスタンブロット法による解析の結果を示す（レーン１：組換えα―シヌクレインタンパク質、レーン２：組換えβ―シヌクレインタンパク質、レーン３：組換えγ―シヌクレインタンパク質、レーン４：ヒト血漿）。
【図３】図３は、前濃縮をβ−シヌクレイン（Ｃ２０）に対して反応性を有する抗体を用いて実施し、γ−シヌクレインに対する抗体（Ｃ２０）を用いて検出を行った、ヒト血漿サンプルのウエスタンブロット法による解析の結果を示す（レーン１：ヒト血漿、レーン２：組換えγ―シヌクレインタンパク質、レーン２：組換えβ―シヌクレインタンパク質、レーン３：組換えα―シヌクレインタンパク質）。
【図４】図４は、シヌクレイン症を患うヒト患者の血漿をはじめとする血漿中のシヌクレインを検出する能力を例示した試験の結果を示す。
【図１】
2005528588.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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