(57)【要約】本発明は、インタクトな細胞において受容体の細胞内ドメインへのタンパク質の補充を観察するための免疫学的方法およびキットに関する。
2005507493.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞において受容体の細胞内ドメインへのタンパク質の結合を観察する方法であって、
ａ）細胞でのシグナロソーム形成の誘導、
ｂ）細胞の溶解、
ｃ）シグナロソーム内に受容体を捕捉できる１次抗体で被覆された固相での細胞溶解物のインキュベーション、
ｄ）細胞溶解物からの固相の分離、および
ｅ）タンパク質を検出できる２次抗体を使用する固相に結合したタンパク質の量の検出および測定
を含む方法。
【請求項２】
シグナロソーム形成が、受容体の過剰発現によって誘導される請求項１記載の方法。
【請求項３】
シグナロソーム形成が、受容体の活性化によって誘導される請求項１記載の方法。
【請求項４】
受容体の活性化が、受容体に対するリガンドで細胞を処置することによって誘導される請求項３記載の方法。
【請求項５】
受容体の活性化が、受容体のクロスリンクによって誘導される請求項４記載の方法。
【請求項６】
クロスリンクが、受容体特異的抗体によって誘導される請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記受容体が、ＣＤ４０、ＢＣＭＡ、ＬＴβＲ受容体、ＴＡＣＩ、ｐ７５ＴＮＦＲおよびＣＤ２７から選択される請求項１、２、３、４、５または６記載の方法。
【請求項８】
固相に結合した前記タンパク質が、ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ４、ＴＲＡＦ５およびＴＲＡＦ６から選択されるアダプタータンパク質である請求項１、２、３、４、５、６または７記載の方法。
【請求項９】
固相に結合した前記タンパク質が、酵素である請求項１、２、３、４、５、６または７記載の方法。
【請求項１０】
前記酵素が、キナーゼである請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記キナーゼが、ＮＩＫである請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
固相に結合した前記タンパク質が、ＩＫＫである請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０記載の方法。
【請求項１３】
前記受容体が、その細胞外ドメインでポリペプチドまたはペプチドに融合され、１次抗体が、そのような融合ポリペプチドまたはペプチドに特異的である請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２記載の方法。
【請求項１４】
前記融合ペプチドが、特異的タグであり、１次抗体がそのようなタグに特異的である請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリペプチドが、受容体の細胞外ドメインであり、１次抗体がそのような細胞外ドメインに特異的である請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
前記融合ポリペプチドが、ＣＤ４０の細胞外ドメインである請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
固相に結合した前記タンパク質が、タグに融合され、２次抗体がそのようなタグに特異的である請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６記載の方法。
【請求項１８】
前記タグが、ヒスチジン、ＦＬＡＧ、ＶＳＶ−Ｇ、プロテイン−Ｃおよびｃ−ｍｙｃタグから選択される請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
細胞において受容体の細胞内ドメインへのアダプタータンパク質および／またはシグナルタンパク質の結合を阻害する分子のスクリーニング方法であって、
細胞への個々の分子の接触、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８記載の方法による、受容体の細胞内ドメインへのタンパク質の結合の観察、および受容体へのアダプターおよび／またはシグナルタンパク質の結合を阻害できる分子の選択を含む方法。
【請求項２０】
スクリーニングされる分子が、合成有機化合物である請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
請求項１９および２０の方法によって選択される分子。
【請求項２２】
細胞においてシグナロソームの組立てを阻害する分子のスクリーニング方法であって、
ａ）細胞でのシグナロソーム形成の誘導、
ｂ）細胞への個々の生成分子の接触、
ｃ）細胞の溶解、
ｄ）シグナロソーム内に受容体を捕捉できる１次抗体で被覆された固相での細胞溶解物のインキュベーション、
ｅ）細胞溶解物からの固相の分離、
ｆ）受容体以外のシグナロソーム構成要素のいずれかを検出できる２次抗体を使用する、形成されたシグナロソームの量の検出および測定、および
ｇ）シグナロソーム形成を阻害できる分子の選択
を含む方法。
【請求項２３】
シグナロソーム形成が、いくつかまたは全てのシグナロソーム構成要素の過剰発現によって誘導される請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
シグナロソーム形成が、受容体の活性化によって誘導される請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
受容体の活性化が、受容体に対するリガンドで細胞を処置することによって誘導される請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
受容体の活性化が、受容体のクロスリンクによって誘導される請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
クロスリンクが、受容体特異的抗体によって誘導される請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
シグナロソーム内の受容体が、ＣＤ４０、ＢＣＭＡ、ＬＴβＲ受容体、ＴＡＣＩ、ｐ７５ＴＮＦＲおよびＣＤ２７から選択される請求項２２、２３、２４、２５、２６または２７記載の方法。
【請求項２９】
測定される受容体とは異なるシグナロソーム構成要素が、ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ４、ＴＲＡＦ５、ＴＲＡＦ６から選択されるアダプタータンパク質である請求項２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８記載の方法。
【請求項３０】
受容体とは異なるシグナロソームで観察される構成要素が、酵素である請求項２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９ま記載の方法。
【請求項３１】
前記酵素が、キナーゼである請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記キナーゼが、ＮＩＫである請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
測定される受容体とは異なるシグナロソーム構成要素が、ＩＫＫである請求項２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０または３１記載の方法。
【請求項３４】
シグナロソーム内の受容体が、その細胞外ドメインでペプチドまたはポリペプチドに融合され、１次抗体が、そのような融合ペプチドまたはポリペプチドに特異的である請求項２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２または３３記載の方法。
【請求項３５】
前記ポリペプチドが、特異的タグである請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
前記融合ポリペプチドが、受容体の細胞外ドメインである請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
前記融合ポリペプチドが、ＣＤ４０の細胞外ドメインである請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
測定される受容体とは異なるシグナロソーム構成要素が、タグに融合され、２次抗体が、そのようなタグに特異的である請求項２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６または３７記載の方法。
【請求項３９】
前記タグが、ヒスチジン、ＦＬＡＧ、ＶＳＶ−Ｇ、プロテイン−Ｃおよびｃ−ｍｙｃタグから選択される請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
スクリーニングされる分子が、合成有機化合物である請求項２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８または３９記載の方法。
【請求項４１】
請求項２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０記載の方法によって選択される分子。
【請求項４２】
細胞において特異的な膜タンパク質へのアダプターおよび／またはシグナルタンパク質の結合を測定および定量するためのキットであって、
ａ）２つの発現プラスミド（一方は、第１のタグまたはポリペプチドに融合された膜タンパク質を過剰発現するための発現プラスミド、他方のプラスミドは、第２のタグに融合されたアダプター／シグナルタンパク質を発現するための発現プラスミド）、
ｂ）膜タンパク質に融合された第１のタグまたはポリペプチドに結合できる１次抗体で被覆されたＥＬＩＳＡマイクロタイタープレート、
ｃ）アダプター／シグナルタンパク質に融合された第２のタグに結合できる２次抗体、
ｄ）トランスフェクション試薬、
ｅ）溶解緩衝液、
ｆ）トランスフェクション反応におけるベクターの濃度、ならびにＥＬＩＳＡおよび定量手段における抗体の濃度を記載するプロトコール
を含むキット。
【請求項４３】
前記タグが、ヒスチジン、ＦＬＡＧ、ＶＳＶ−Ｇ、プロテイン−Ｃおよびｃ−ｍｙｃタグから選択される請求項４２記載のキット。
【請求項４４】
前記融合ポリペプチドが、ＣＤ４０受容体の細胞外ドメインである請求項４２記載のキット。
【請求項４５】
細胞において受容体の細胞内ドメインへのアダプタータンパク質および／またはシグナルタンパク質の結合を阻害する分子のスクリーニング方法であって、
個々の分子が接触されたトランスフェクション細胞での、請求項４２または４３記載のキットを使用する、受容体の細胞内ドメインへのタンパク質の結合の観察、および受容体へのアダプターおよび／またはシグナルタンパク質の結合を阻害できる分子の選択を含む方法。
【請求項４６】
スクリーニングされる分子が、合成有機化合物である請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
請求項４５または４６記載の方法によって選択される分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インタクトな細胞において受容体の細胞内ドメインへのタンパク質の補充を観察するための免疫学的方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
サイトカインは、その標的細胞上の特異的受容体に結合することによってその効果を仲介する。この相互作用は、最終的に細胞内のシグナルカスケードを誘導する受容体の細胞質部分で構造的変化／修飾を生じさせる。これらのシグナルカスケードは、通常、所定のサイトカインに対する生物学的反応に基づく生物学的および遺伝的変化を仲介するキナーゼ、リパーゼ、またはプロテアーゼなどの酵素を含む。
【０００３】
ＴＮＦ受容体ファミリーなどの多くのサイトカイン受容体について立証されているように、受容体へのリガンドの結合ののちの最初の事象うちの１つは、活性化した受容体のシグナルドメインへの種々のアダプタータンパク質の補充である（Wallach et al. 1999およびInoue et al. 2000に概説される）。第２段階では、これらのアダプタータンパク質は、種々のシグナルカスケードを構成する重要な酵素の特異的結合および活性化を仲介する。その結果得られる、受容体、および１つまたは種々のシグナルタンパク質からなるマルチ・タンパク質複合体は、「シグナロソーム」と呼ばれる。シグナロソームの組成は、基本的に、シグナル経路のどの組合せが標的細胞で活性化されるかを決定する。したがって、シグナロソームは、サイトカインに対する最終的な生物学的反応を決定する主要な細胞スイッチボードとみなされ得る。
【０００４】
サイトカイン受容体のシグナル伝達のこの分子機構を考慮すると、所定の受容体についてのシグナロソーム組成を理解することは非常に重要になっている。結合アダプタータンパク質の同一性、それらが結合する環境、およびそれらの結合動力学を知ることで、目的の受容体によって開始されるシグナルを推定できる。そのような知識は、生物学的応答に対するシグナルカスケードまたはその組合せにさえも関連させることもできる。
【０００５】
ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）の１つであるＣＤ４０は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）とＴリンパ球とのあいだの相互作用の開始のための主要な切換え点（switch point）として認識される。細胞増殖、活性化およびアポトーシスなどの基本的機能に影響を及ぼすことによって、この受容体は、Ｔ細胞のプライミング（priming）、抗体産生Ｂ細胞の選択プロセス、および細胞内病原体を排除するためのマクロファージのエフェクター機構の活性化を調整する（Grewal et al. 1998, Schonbeck et al. 2001で概説される）。多様な免疫エフェクター機構の成熟化および活性化にとってのＣＤ４０の重要さは、この受容体またはそのリガンドが機能しなくなったときに最も明白になる。哺乳類では、これにより、高ＩｇＭ症候郡として知られる症状に至る。この重篤な免疫欠乏は、高レベルの血漿ＩｇＭ、ならびに低レベルのＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＥ、胚中心の欠如、ならびに胸腺依存性免疫応答の組込みに対する能力不全により特徴付けられる（Grewal et al. 1998, Ramesh et al. 1994で概説される）。さらに、インビボ研究により、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ受容体−リガンド対が、Ｂ細胞増殖の調節、免疫グロブリンの産生、Ｉｇクラスのスイッチング、アポトーシスからのＢ細胞の救出、胚中心の形成、記憶Ｂ細胞の産出および炎症の調節において重要な役割を果たすことを示された（Grewal et al. 1998, Schonbeck et al. 2001, Clark et al. 1996およびFoy et al. 1996で概説される）。免疫応答に関するＣＤ４０の優れた役割は、望まない免疫応答が、人工的に抑制され得るという種々の治療的構想の開発を導いた（Grewal et al. 1998およびLiu et al. 1996で概説される）。ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用の遮断は、自己免疫の症状、移植拒絶、移植片対宿主反応および動脈硬化症の治療に有用であろうことが分かった（Grewal et al. 1998およびSchonbeck et al. 2001）。ＣＤ４０は、「デスドメイン」を有しないＴＮＦ受容体の群に属する。それらは、ＴＮＦ受容体関連因子（ＴＲＡＦ）との直接的な相互作用を通してそのシグナルを発生する（Arch et al. 1998およびInoue et al. 2000に概説される）。
【０００６】
ＴＲＡＦは、キナーゼＮＩＫ（Malinin et al. 1997）などの別のシグナル分子を補充することにより、ＡＰ−１およびＮＦ−κＢなどの重要な下流エフェクターを活性化するアダプターとして作用する遺伝的に保存されたタンパク質のファリミーである。これらの転写因子は、順に、細胞および免疫の機能の種々の局面に関与する膨大な遺伝子を調節することが明らかにされている（Baeurle et al. 1994, Ghosh et al. 1998およびKarin et al. 1997で概説される）。現在６つのＴＲＡＦタンパク質が知られている。最初の２つのＴＲＡＦ１およびＴＲＡＦ２は、ｐ７５ＴＮＦ受容体結合タンパク質として単離された（Rothe et al. 1994）。全てのＴＲＡＦタンパク質は、共通の構造組織に割り当てられる。ＴＲＡＦドメインと呼ばれるＣ末端の相互作用ドメインは、ＴＮＦＲファミリーの種々の受容体への補充を仲介する（Rothe et al. 1995）。このドメインは、ホモおよびヘテロ−オリゴマー化、ならびにデスドメインタンパク質ＴＲＡＤＤなどの他のシグナル分子へのに結合をも仲介する（Arch et al. 1998およびInoue et al. 2000に概説される）。ＴＲＡＦドメインは、様々なＴＲＡＦファミリーのメンバー間で最も相同性の高い領域でもある。ＴＲＡＦ１以外の全てのＴＲＡＦは、ＮＩＫまたはＪＮＫなどのシグナル経路での下流構成要素の活性化に必須であるＮ末端部分に６個までの反復Ｚｎフィンガーモチーフおよび1つのリングフィンガーモチーフ（riＮＧＦinger motif）を有する（Malinin et al. 1997, Takeuchi et al. 1996, Liu et al. 1996およびSong et al. 1997）。さらに、ＴＲＡＦ３およびＴＲＡＦ５は、これらの２つのＴＲＡＦのあいだでホモ−およびヘテロ化を可能にするコイルドコイル構造を含む（Pullen et al. 1998およびLeo et al. 1999）。最近の結晶化研究により、ＴＲＡＦは、三量体としてのその受容体と相互作用することが示された（McWhirter et al 1999, Park et al 1999, Ye et al 1999およびNi et al 2000）。補充は、リガンド誘導受容体三量体化によって最も達成されるようであり、その結果、相互作用部位に接近でき、三量体ＴＲＡＦに対して最適な結合部位を形成する（Baud et al 1999, Pullen et al 1999）。ＴＲＡＦタンパク質を通してそれらのシグナルを発生する多数の受容体を考慮すると、インビボでのＴＲＡＦ遺伝子の破壊により劇的な結果となることは驚くべきことではない。マウスでは、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３およびＴＲＡＦ６の欠失は致命的である（Yeh et al 1997、Nguyen et al 1999, Xu et al 1996, Lomaga et al 1999およびNaito et al 1999）。ＴＲＡＦ５の欠失により、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０およびＬＴＪ３受容体を含め複数の受容体にシグナル欠陥が生じる（Nakano et al 1999）。ＴＲＡＦ４欠失マウスは、気管奇形を伴うが、他の明白な欠陥はなく生まれる（Shiels et al2000）。ＴＲＡＦ１遺伝子標的マウスについての記載はない。
【０００７】
６２個のアミノ酸のそれの比較的短いシグナルドメインにもかかわらず、ＣＤ４０は、ＴＲＡＦ４以外の全てのＴＲＡＦと相互作用することが示された（Pullen et al. 1998, Hu et al. 1994, Rothe et al. 1995, Mosialos et al. 1995, Cheng et al. 1995, Ishida et al. b 1996, Ishida et al. a 1996およびKrajewska et al. 1998）。ＴＲＡＦ結合受容体間の配列比較に基づいて、２つのアミノ酸配列モチーフが、最小のＴＲＡＦ結合部位が明確にされた：ＴＲＡＦ１、２および３についてはＰｘＱｘＴ（Pullen et al. 1998, Cheng et al. 1996, Gedrich et al. 1996, Devergne et al. 1996, Boucher et al. 1997, Eliopoulos et al. 1997, Sandberg et al. 1997, Brodeur et al. 1997およびPullen et al. 1999）およびＴＲＡＦ６については塩基性−ＱｘＰｘＥｘ−酸性（Pullen et al. 1999, Tsukamoto et al. 1999およびDarnay et al. 1999）。ＴＲＡＦ５は、ＴＲＡＦ３を介して間接的に結合するように思われる（Pullen et al. 1999, Leo et al. 1999）。最小のコンセンサス配列Ｐ／Ｓ／Ｔ／ＡｘＱ／ＥＥに対するＴＲＡＦ２結合モチーフのさらなる解析は、結晶化研究によって達成された（Ye et al. 1999）。どちらのＴＲＡＦ結合モチーフもＣＤ４０に存在し、この受容体へのＴＲＡＦ補充を仲介することが明らかにされた。ＣＤ４０−ＴＲＡＦ相互作用において大規模な構造的な研究がなされているのにもかかわらず、ＣＤ４０−ＴＲＡＦシグナロソームの組立てに関するいくつかの基本的な疑問は、未解決のままである。全長ＣＤ４０細胞質ドメインの配列状況（sequence context）が、２つの既知のＴＲＡＦ結合モチーフの機能に影響を及ぼすかどうか、そしてそれはどのように及ぼすかは、なお不明である。シグナロソーム中の種々の構成要素が、たとえば、他のシグナロソームタンパク質に別の結合部位を提供することによって、受容体に対する結合に相互に影響を及ぼすかどうかも知られていない。これらの疑問の解決は、ＴＲＡＦ結合受容体のシグナル伝達機構を理解するために重要であるだけでなく、ＴＲＡＦ仲介シグナル伝達を特異的に妨げる薬剤の合理的な設計にとっても重要である。
【０００８】
腫瘍壊死因子受容体関連（ＴＲＡＦ）タンパク質に結合できるそのアイソフォーム、類似体、フラグメントまたは誘導体を含めＮＩＫと称されるタンパク質が知られている（Malinin et al. 1997）。したがって、ＴＲＡＦタンパク質が、あるＴＮＦ／ＮＧＦ受容体およびそのほかのものによって開始される転写因子ＮＦ−κＢの活性化の仲介の調節に関与する場合、ＴＲＡＦタンパク質に結合することによって、ＮＩＫおよびそのアイソフォームなどは、たとえば、ＴＲＡＦタンパク質と直接または間接的な相互作用を介するＮＦ−κＢの活性化のその調節／仲介などのその受容体への種々のリガンド（たとえば、ＴＮＦおよびその他のもの）結合により開始される細胞内シグナル伝達プロセスに影響を及ぼす（調節するか、または仲介する）ことができる。
【０００９】
そのシグナルアダプタータンパク質とのサイトカイン受容体の相互作用は、ＴＮＦ受容体遺伝子ファミリーについて充分に研究された。ほとんどのアッセイ系は、目的の受容体のシグナルドメインのペプチドフラグメントを使用し、インビトロ条件下で既知のアダプター分子とこのペプチドとの相互作用を試験する（Rothe et al. 1994, Hu et al. 1994, Boldin et al. 1995, Stanger et al. 1995, Chinnaiyan，A. M. et al. 1995, Cheng, G. et al. 1995, Mosialos et al. 1995, Ishida, T. et al., a, 1996, Ishida, T., b, 1996およびFields, S. 1989）。使用された系は、酵母−２−ハイブリッド−システム（Fields et al. 1989）、たとえば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−タグ付受容体フラグメントを用いる免疫沈降法（Rothe et al. 1994, Boldin et al. 1995, Chinnaiyan et al. 1995およびMosialos et al. 1995）、またはフィルター上にスポットされたペプチド受容体フラグメントへの標的アダプタータンパク質の結合（Boucher et al. 1997, Pullen et al. 1998およびPullen et al. 1999）を含む。これら全ての方法に共通した問題は、シグナロソームの組立てが、その天然の「膜近傍の」細胞環境では起こらないことである。
【００１０】
したがって、シグナロソームの組立てが、従来のインビトロ条件とは対照的にその天然の細胞環境で起こる簡易な定量アッセイが必要とされている。
【００１１】
抗原を定量する免疫学的方法は、優れた感受性および特異性を提供し、研究および臨床適用のどちらにおいても標準技術となった。タンパク質定量の全ての現代の免疫化学的方法は、プラスチックなどの固形表面に結合する指標分子（抗原または抗体）の量を、結合していない該指標を洗い流したのちに測定する簡易かつ正確な方法に基づく。
【００１２】
指標分子が、放射性アイソトープで標識される場合は、そのアッセイは、ラジオイムノアッセイと呼ばれる。その指標分子は、シンチレーション・カウンタで放射性崩壊事象を計数することにより定量される。指標分子が、レポーター基質を切断できる酵素に共有結合される場合は、そのアッセイは、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）と呼ばれ、そしてそれは、比色、化学発光、蛍光、またはホスホメトリック（phosphometric）であり得る。指標分子は、酵素が、中立の基質を、着色または発光産物に変換する初速度を分光光度計で測定することによって定量され得る。
【００１３】
ＥＬＩＳＡは、４つの表題：直接、間接、サンドイッチおよび競合の下に分類され得る（Croｗｔher, J.R.（1995）、Methods in Molecular Biology 42巻、35-50頁）。直接標識抗原ＥＬＩＳＡでは、抗体を固相に吸着し、抗原を標識する。直接標識抗体ＥＬＩＳＡでは、固相に結合された抗原は酵素標識された抗体（たとえば、酵素との共役）と直接反応される。間接ＥＬＩＳＡでは、抗体は標識されず、酵素に共役した二次抗種特異的抗体が使用される。
【００１４】
直接サンドイッチＥＬＩＳＡでは、一次抗体は固相に結合され、試験抗原が添加され、結合された抗体に捕捉される。酵素に共役した別の二次抗体は、捕らえられた抗原を検出するために使用される。間接サンドイッチＥＬＩＳＡでは、二次抗体は標識されず、一次抗体と異なる動物種において産生され、三次抗種特異的標識抗体によって検出される。
【００１５】
競合ＥＬＩＳＡは三次抗体と競合する２つの反応体からなる。以下が競合ＥＬＩＳＡの例である。
【００１６】
直接標識抗体競合ＥＬＩＳＡでは、抗原を固相に吸着し、前滴定された共役抗体を添加するので、該抗原は飽和され、さらなる抗体との結合に利用できる遊離の認識部位はない。標識抗体が、固相に結合された抗原と反応できるほかの抗体（競合抗体）と混合されている場合、抗原と共役抗体との相互作用は混乱する。このような分析は、同一のタンパク質に対するモノクローナル抗体を比較するために使用できる。
【００１７】
直接抗原競合ＥＬＩＳＡでは、抗原を固相に吸着し、前滴定された共役抗体を添加するので、該抗原は飽和され、さらなる抗体との結合に利用できる遊離の抗原部位はない。この場合、標識抗体がほかの抗原（競合物）と混合されていれば、抗原と共役抗体との相互作用は混乱する。したがって、競合抗原が交差反応的である場合、標識抗体は固相に結合した抗原との反応に利用することができず、色の減少が観察される。このような分析は、抗原を定量するため、または同一抗体に対する２つの抗原の結合の相対的な親和性を比較するために使用される。
【００１８】
間接抗原／抗体競合ＥＬＩＳＡでは、抗体は標識されず、三次抗種特異的標識抗体によって検出される。
【００１９】
現在のところ、インタクトな細胞において、種々のアダプタータンパク質の、活性化受容体のシグナルドメインへの補充を定量できる、一般的で、感受性で、特異的で、行うのが容易で、有効な方法は存在しない。したがって、本発明に記載される免疫学的方法は、シグナル伝達の領域で長期にわたる問題を解決するものである。
【発明の開示】
【００２０】
本発明は、細胞において、ＣＤ４０、ＢＣＭＡ、ＬＴβＲ受容体、ＴＡＣＩ、ｐ７５ＴＮＦＲ、およびＣＤ２７などの受容体の細胞内ドメインへの、ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ４、ＴＲＡＦ５、ＴＲＡＦ６、ＮＩＫおよびＩＫＫなどのタンパク質の結合を観察する方法であって、
ａ）細胞でのシグナロソーム形成の誘導、
ｂ）細胞の溶解、
ｃ）シグナロソーム内に受容体を捕捉できる１次抗体で被覆された固相での細胞溶解物のインキュベーション、
ｄ）細胞溶解物からの固相の分離、および
ｅ）タンパク質を検出できる２次抗体を使用する固相に結合したタンパク質の量の検出および測定
を含む方法に関する。
【００２１】
より詳細には、本発明の方法によるシグナロソーム形成は、たとえば、受容体の過剰発現により、受容体特異的リガンドでの処置により、またはたとえば特異的抗体による受容体のクロスリンクにより誘導され得る。受容体は、その細胞外ドメインで、ポリペプチド、たとえば、ＣＤ４０の細胞外ドメイン、またはタグ（たとえば、ヒスチジン、ＦＬＡＧ、ＶＳＶ−Ｇ、プロテイン−Ｃおよびｃ−ｍｙｃタグ）などのペプチドに融合され得るので、１次抗体は、そのような融合ポリペプチドまたはペプチドに特異的である。また、測定された結合タンパク質またはシグナロソーム構成要素は、ポリペプチドタグに融合され得るので、２次抗体は、そのようなタグに特異的である。
【００２２】
１つの実施態様において、本発明は、細胞において受容体の細胞内ドメインへのアダプタータンパク質および／もしくはシグナルタンパク質の結合を阻害する、またはシグナロソームの組立てを阻害する分子、たとえば合成有機化合物のスクリーニング方法であって、
細胞への個々の分子の接触、受容体の細胞内ドメインへのタンパク質の結合またはシグナロソームの組立ての観察、ついで受容体へのアダプターおよび／もしくはシグナルタンパク質の結合、またはシグナロソームの組立てを阻害できる分子の選択を含む方法に関する。
【００２３】
本発明は、また、本発明のスクリーニング方法によって選択される分子をも提供する。
【００２４】
本発明は、さらに、細胞において特異的な膜タンパク質へのアダプターおよび／またはシグナルタンパク質の結合を測定および定量するためのキットであって、
ａ）第１のタグまたはポリペプチドに融合された膜タンパク質を過剰発現するための、および第２のタグに融合されたアダプター／シグナルタンパク質を発現するための発現プラスミド、
ｂ）膜タンパク質に融合された第１のタグまたはポリペプチドに結合できる１次抗体で被覆されたＥＬＩＳＡマイクロタイタープレート、
ｃ）アダプター／シグナルタンパク質に融合された第２のタグに結合できる２次抗体、
ｄ）ＨＥＫ２９３細胞、
ｅ）トランスフェクション試薬、
ｆ）溶解緩衝液、
ｇ）トランスフェクション反応におけるベクターの濃度、ならびにＥＬＩＳＡおよび定量手段における抗体の濃度を記載するプロトコール
を含むキットに関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明は、インタクトな細胞における目的の受容体の細胞内ドメインへのタンパク質の補充を観察できる感受性アッセイに関する。用語インタクトな細胞とは、溶解されていない細胞のことを言い、したがって、補充は、従来のアッセイとは対照的に、その本来の細胞環境で行なわれる。
【００２６】
用語、受容体の細胞内ドメインへのタンパク質の補充、および細胞内受容体に対するタンパク質の結合は、相互に交換可能である。
【００２７】
用語、シグナロソームへのタンパク質の補充、およびシグナロソームに対するタンパク質の結合も、相互に交換可能である。
【００２８】
用語、因子ポリペプチドおよびタンパク質は、相互に交換可能である。
【００２９】
ＴＮＦ受容体ファミリーなどの多くのサイトカイン受容体について示されるように、受容体に対するリガンド結合ののちの最初の事象の1つは、活性化受容体のシグナルドメインへの種々のアダプタータンパク質の補充である（Wallach et al. 1999およびInoue et al. 2000により概説される）。第２段階では、これらのアダプタータンパク質は、種々のシグナルカスケードを構成する重要な酵素またはシグナルタンパク質への特異的結合および活性化を仲介する。その結果得られる、受容体、および1つまたはそれ以上のアダプター、ならびに1つまたはそれ以上のシグナルタンパク質を含むマルチ・タンパク質複合体は、「シグナロソーム」と呼ばれる。シグナロソームの組成は、基本的に、シグナル経路のどの組合せが、標的細胞中で活性化されるかを決定する。したがって、シグナロソームは、サイトカインに対する最終的な生物学的反応を決定する主要な細胞スイッチボードとみなされ得る。
【００３０】
サイトカイン受容体のシグナル伝達のこの分子機構を考慮すると、所定の受容体についてのシグナロソーム組成を理解することは非常に重要になっている。結合アダプタータンパク質の同一性、それらが結合する環境、およびそれらの結合動力学を知ることで、目的の受容体によって開始されるシグナルを推定できる。そのような知識は、生物学的応答に対するシグナルカスケードまたはその組合せにさえも関連させることもできる。
【００３１】
この方法は、シグナロソームへの所定のタンパク質の組込みを特異的に妨げる化合物（分子）をスクリーニングするのに適する。この方法は、種々のシグナルカスケードを構成する重要な酵素、たとえば、キナーゼ、リパーゼまたはプロテアーゼの、シグナロソームへの組込みを特異的に妨げる化合物のスクリーニングに特に適する。そのような化合物は、同じインタクトな受容体の他の有益な機能をそのままにして、望まない効果を示すただ1つのシグナル経路から目的の受容体を分離する薬剤として非常に有用であり得る。
【００３２】
補充タンパク質は、種々のシグナルカスケードを構築する重要な酵素、たとえば、ＮＩＫ、ＩＫＫなどのアダプタータンパク質またはシグナルタンパク質であり得る。受容体は、タンパク質が補充されるあらゆる受容体であることができ、たとえば、ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーの受容体である。
【００３３】
本発明は、全タンパク質に加え、さらに、そのフラグメント、たとえば、全膜貫通タンパク質の代わりに、たとえば、膜貫通および細胞内ドメインを使用し、全アダプター／シグナルタンパク質の代わりに、シグナロソーム結合ドメインのみを使用することも含む。
【００３４】
中でも、このアッセイは、シグナロソームの組成、タンパク質相互作用に関する重要な部位、薬剤ハイスループットスクリーニングなどの分析のために使用され得る。
【００３５】
一般に、本発明によるアッセイは、細胞の内側で生じる受容体の細胞内ドメインへのアダプターまたはシグナルタンパク質の会合または補充を観察するために使用することができ、たとえば、このアッセイは、ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ４、ＴＲＡＦ５およびＴＲＡＦ６またはそのフラグメントなどのあらゆるＴＮＦ／ＮＧＦ受容体関連タンパク質の補充を観察するために使用できる。補充は、多量の受容体および補充タンパク質を発現する細胞において測定できる。
【００３６】
シグナロソーム形成は、ＣＤ４０などの受容体および／もしくはＴＲＡＦなどのアダプターおよび／もしくはＮＩＫ、ＩＫＫなどのシグナルタンパク質、その等価物もしくはそのフラグメントの過剰発現によるか；またはリガンド誘導もしくは受容体クロスリンクによる受容体の活性化のいずれかにより誘導できる。受容体活性化は、特異的抗体と受容体をクロスリンクすることによって達成され得る（Engelmann et al. 1990を参照）。以下の限定されない実施例では、シグナロソーム形成または補充は、ＣＤ４０、ＴＲＡＦ、ＮＩＫおよび等価物の過剰発現により誘導される。
【００３７】
受容体および補充可能なタンパク質は、前記タンパク質をコードする発現ベクターを用いたトランスフェクションにより過剰発現できる。受容体および補充タンパク質は、様々のプラスミドにコードされ得るか、または１つのプラスミドに連結され得る。受容体および補充タンパク質の増大した発現は、当技術分野で知られる適切な発現系および耐性マーカーを使用することにより一時的または構成的であり得る。
【００３８】
受容体および補充タンパク質の内因性の産生を誘導および／または増強するためのベクターの使用による過剰発現も、本発明に意図される。ベクターは、受容体および／または補充タンパク質を発現することが望まれる細胞において機能的な調節配列を含み、たとえば、そのような調節配列は、プロモーターまたはエンハンサーであり得る。そののち、調節配列は、相同組換えにより、ゲノムの正しい遺伝子座に導入されるので、調節配列を遺伝子と操作可能に連結し、必要な発現が誘導または増強される。その技術は、通常、「内因性遺伝子活性化」（ＥＧＡ）と呼ばれ、たとえば、国際公開第９１／０９９５５号パンフレットで記載される。
【００３９】
プラスミドのトランスフェクションは、たとえば、リン酸カルシウム法によって当技術分野で知られる任意の方法により行なわれることができる（Kingston et al. 1993）。
【００４０】
所定の受容体へのタンパク質の補充の測定は、任意の細胞、たとえば、シグナル伝達の結果が評価され得るＨＥＫ２９３、２９３Ｔ細胞およびＢ細胞での「インタクトな細胞における補充アッセイ」により試験できる。
【００４１】
アッセイについては、たとえば、２×１０5細胞を、３．５ｃｍ皿に接種し、３７℃で、約１６時間増殖させ、受容体、たとえば、ＣＤ４０をコードする発現プラスミド、および１つまたはそれ以上の補充可能なタンパク質／ペプチド、たとえば、ＴＲＡＦ、ＮＩＫをコードする発現プラスミドでトランスフェクションできる。約２７時間のトランスフェクションののち、細胞を、分離し、洗浄し、ついで、たとえば、プロテアーゼインヒビターカクテル（０．１６ｍＭ  Ｐｅｆａｂｌｏｃ、１０５ＩＵアプロチニン）、１％トリトンＸ１００および０．１％アジ化Ｎａを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む溶解緩衝液を用いて、界面活性剤で抽出する。
【００４２】
溶解物を、微小遠心装置での遠心分離により不要なものを除去し、好ましくは３倍までの一連の希釈まで希釈し、ついで、各希釈サンプルを、受容体の細胞外ドメイン（たとえば、ＣＤ４０に関してはのＲｏ１）に特異的なｍＡｂで被覆された固相、好ましくはＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートのウエル中で約２時間（または一晩）インキュベーションする（Schwabe et al. 1997）。アッセイの感受性を増大させるために、抗受容体抗体を、抗種特異的抗体を通して固相に被覆できる。目的の対照として、野生型受容体をコードするプラスミドの代わりに、シグナルドメイン全体または一部を欠く受容体変異体をコードするプラスミドは、トランスフェクションのために使用できる。インキュベーションののち、好ましくは、洗浄が、結合していないタンパク質を除去するために行われ得る。補充タンパク質を検出するために、前記補充タンパク質に対する特異的抗体、たとえば、目的の抗ＴＲＡＦ、抗ＮＩＫを、プレートに加え、室温で約３時間インキュベーションしたのち、洗浄して、結合していない抗体を除去する。この抗体は、酵素結合抗体または酵素に結合した第２の抗種ＩｇＧ抗体またはプロテインＡ／Ｇを使用して検出し、着色、蛍光または化学発光に特異的な基質によって可視化できる。また、抗体またはプロテインＡ／Ｇは、放射線で標識し得る。さらに、ビオチンは、リシン残基を通して抗体またはプロテインＡ／Ｇに化学的に結合され得る。標識ストレプトアビジンは、ビオチンの存在を検出するために使用され得る。
【００４３】
補充タンパク質は、インタクトな細胞で行なわれる補充アッセイを使用して定量的に測定できる。その目的のために、アッセイ条件は、補充タンパク質が、受容体タンパク質よりも明らかに過剰であるように調節される。したがって、細胞において受容体濃度よりも過剰な好ましい補充タンパク質の濃度は、等量または約２倍であるべきである。この比は、受容体をコードするプラスミドの量を越えて補充タンパク質をコードするプラスミドの量を増大してトランスフェクションを行うことにより、および／またはそれぞれのタンパク質の転写を制御するより強力なプロモーターを使用することによって達成され得る。
【００４４】
補充タンパク質の濃度は、各アッセイでの基準として、たとえば、１０００Ｕ／ｍｌの受容体／補充タンパク質複合体を含む照準細胞抽出物を使用して測定できる。この基純抽出物は、好ましくは、目的の補充タンパク質および目的の受容体をコードするプラスミドで同時トランスフェクションされた細胞からの細胞抽出物の大量のプールからなる。抽出物を、少量に等量に分けて凍結し、さらに使用するまで−８０℃で維持する。これらの抽出物と未知のサンプルのレベルを比較することにより、任意のユニットで受容体を補充したタンパク質複合体の濃度を相対的に測定することができる。以下の式は、サンプル対サンプルの偏差を定量および必須の正規化のために使用できる。
【００４５】
受容体発現では：
【００４６】
【数１】
2005507493.tif 000003
【００４７】
受容体濃度は、モノクローナルおよびポリクローナル抗受容体抗体（どちらも該受容体の細胞外ドメインに特異的である）を使用するＥＬＩＳＡで測定できる。精製された可溶な細胞外ドメインを、基準として使用できる。
【００４８】
限定されない例では、アッセイは、たとえば、アダプタータンパク質（たとえば、ＴＲＡＦ２）を介してサイトカイン受容体（たとえば、ＣＤ４０）へのシグナルタンパク質（たとえば、ＮＩＫ（ＮＦ−κＢ経路での下流メディエーター、Malinin et al. 1997））の補充を測定するのに適することが示された。ＣＤ４０へのＮＩＫの補充は、ＴＲＡＦ２依存性であり、ＩＫＫが同時に発現されたとき改善した。
【００４９】
受容体は、受容体の細胞外部分が、ポリペプチドタグ、たとえば、ヒスチジンタグに融合された融合タンパク質として発現できる。この融合タンパク質の使用により、受容体特異的抗体を必要とせずに、固相に受容体を固定するためのタグ特異的抗体、たとえば、抗ヒスチジンタグを使用することによって、任意の受容体への補充を観察することができる。タグ融合タンパク質の産生のために設計された発現ベクターは、商業的に入手可能である。これらのベクターは、クローニング部位の上流または下流に特異的タグをコードする。また、ＰＣＲにより、たとえば、目的のＤＮＡの増幅のために使用されるプライマーにタグ配列を含ませることによって、タグを、目的の遺伝子に融合し得る。ＰＣＲ増幅ＤＮＡ融合産物は、転写および翻訳のための適切な調節シグナルを含む発現ベクターにクローニングされ得る。
【００５０】
エピトープタグの例は、ヒスチジンタグ（一筋の６個の連続ヒスチジン、Janknecht et al. 1991）、ＦＬＡＧ（８個のアミノ酸エピトープ、ＲＯＣＨＥ）、ＶＳＶ−Ｇ（水泡性口内炎ウイルス由来の１１個のアミノ酸エピトープ、ＲＯＣＨＥ）、プロテイン−Ｃ（ヒトプロテイン−Ｃの重鎖由来の１２個のアミノ酸エピトープ、ＲＯＣＨＥ）、およびｃ−ｍｙｃ（ヒトｃ−ｍｙｃ遺伝子タンパク質由来の１０個のアミノ酸エピトープ、ＲＯＣＨＥ）である。エピトープタグ付きタンパク質では、その付加される配列は、通常、それ自身機能しない約３〜１２アミノ酸の短いペプチドである。エピトープタグの重要な性質は、単独のタグ特異的抗体により認識および結合される能力である。エピトープタグは、たとえば、アミノ末端（Ｎ末端）に配置できる。
【００５１】
広範なエピトープは、タグタンパク質に使用されており、その多くのタグ特異的抗体は、商業的に入手可能である。特定の実験系のための最高のエピトープタグは、タグ付きタンパク質の機能または細胞プロセシングを妨げないものであり、さらに免疫蛍光顕微鏡法または定量アッセイでのウエスタンブロットで強力な検出シグナルを発生するものである。
【００５２】
また、ＣＤ４０などの所定の受容体の細胞外ドメイン、および様々の受容体の細胞内シグナルドメインを含むハイブリッド構築物を、細胞の内側で行なわれる補充アッセイに使用できる。ハイブリッド受容体を、同じ捕捉抗体、たとえば、ＣＤ４０特異的抗体を使用して、多様な細胞内受容体への補充を比較のに使用できる。限定するものではない記載の実施例では、ＢＣＭＡ、ＬＴβＲ受容体、ＴＡＣＩ、ｐ７５ＴＮＦＲまたはＣＤ２７のシグナルドメインへのＴＲＡＦ補充の測定は、ＴＲＡＦをコードするプラスミドとともにハイブリッド受容体をコードするプラスミドで２９３Ｔ細胞を同時にトランスフェクションし、ＴＲＡＦ／受容体複合体の測定を同一のＥＬＩＳＡサンドイッチを使用して行なった。ここに記載されるアッセイは、まず、所定の郡のシグナル分子、たとえば、ＴＲＡＦの結合特徴について数種の受容体の直接的な比較を可能にする。これは、所定のＴＲＡＦ受容体の組合せの生物学的機能を結論づけることができるだろう。得られた結果は、あらゆる受容体へのＴＲＡＦ補充を観察する補充アッセイの実現可能性を再度証明するものである。
【００５３】
ＥＫなどのポリペプチドタグに融合した補充タンパク質を発現し、抗Ｘｐｒｅｓｓ抗体などの商業的に入手可能なタグ特異的抗体を用いて補充タンパク質を検出することからなる同じアプローチは、補充タンパク質を検出するために採用できる。
【００５４】
以下の制限するものではない実施例では、ＥＫに特異的な抗体（抗発現抗体）を使用して、補充ＴＲＡＦ６を観察されたことにより、ＣＤ４０へのタグ付dＴＲＡＦ６の補充が証明された。
【００５５】
したがって、得られた結果は、このアッセイを使用して、任意の受容体への任意のＴＲＡＦの補充が、特異的に観察され得ることを示唆する。
【００５６】
以下の制限するものではない実施例では、細胞内環境における受容体へのタンパク質補充に基づく補充アッセイは、従来の補充アッセイよりいっそう感受性のあることが証明された（図２）。さらに、補充が、受容体自身、またはシグナロソーム中の未だ同定されていない分子のいずれかによって提供される複数の相互作用部位に依存することが示された。たとえば、アッセイは、ＣＤ４０に対するＴＲＡＦ結合、たとえば、インタクトなＣＤ４０  Ｃ末端の必要性を決定する構造的な必要性をより正確に測定することができる。さらに、どのように様々なＴＲＡＦが、互いに結合に影響を及ぼすのかを示すことができた。本発明による補充アッセイは、任意の受容体への種々の異なるアダプターおよび／またはシグナルタンパク質の補充を観察するのに定量的な感受性で、かつ適切である。これらの成果を考慮すると、記載されたアッセイ法は、サイトカイン受容体と細胞内のシグナル分子とのあいだの相互作用の理解におおいに貢献するだろう。この知識は、シグナロソームの組立てのレベルで作用する薬剤の合理的な開発に必要不可欠であろう。
【００５７】
したがって、本発明による補充アッセイは、受容体の細胞内ドメインへのアダプターおよび／またはシグナルタンパク質の補充を阻害するか、またはシグナロソーム形成を阻害する治療的におおいに価値のある分子をスクリーニングするために使用できる。細胞を、コンビナトリアルケミストリーによって作製された多様な個々の合成有機化合物に接触し、対照細胞に対する処置細胞での補充を、本発明による補充アッセイにより観察し、定量できる。試験される化合物は、コンビナトリアルケミストリーを通したものだけでなく、他のハイスループット合成法からも得られ得る。自動化技術は、スクリーニングできる、別個の化合物の大きな集合である分子のライブラリーの迅速な合成を可能にする。大量の、そしていっそう多様な化合物ライブラリーを作製することは、ライブラリーに有用な薬剤を発見する見込みを増大させる。ハイスループットスクリーニングについては、ロボットが、数千の化合物によるシグナロソーム形成の補充または破壊の阻害を試験するために使用できる。
【００５８】
本発明は、以下の構成要素を含む、特異的な受容体へのタンパク質の補充を測定および定量するためのキットであって、
ａ）２つの発現プラスミド（一方は、第１のタグまたはＣＤ４０受容体の細胞外ドメインに融合された膜タンパク質を過剰発現するための発現プラスミド、他方は、第２のタグに融合されたアダプター／シグナルタンパク質を発現するための発現プラスミド）、
ｂ）膜タンパク質に融合された第１のタグまたはＣＤ４０の細胞外ドメインに結合できる１次抗体で被覆されたＥＬＩＳＡマイクロタイタープレート、
ｃ）アダプター／シグナルタンパク質に融合された第２のタグに結合できる２次抗体、
ｄ）トランスフェクション試薬、
ｅ）溶解緩衝液、
ｆ）トランスフェクション反応におけるベクターの濃度、ならびにＥＬＩＳＡおよび定量手段における抗体の濃度を記載するプロトコール
を含むキットにも関する。
【００５９】
そのようなキットは、補充もしくは受容体の細胞内ドメインに対する細胞内タンパク質の結合を阻害できる分子、またはシグナロソーム形成を阻害できる分子を選択するために使用できる。たとえば、当技術分野に周知の組換え技術を使用して、受容体をコードするｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを、1つのベクターに導入でき、アダプター／シグナルタンパク質をコードするｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを、キットによって提供される他のベクターに導入できる。キットで提供されるベクターは、一方は、第１のタグまたはＣＤ４０の細胞外ドメインに融合したｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡによりコードされる膜タンパク質を含む融合タンパク質を発現でき、他方のプラスミドは、第２のタグに融合したアダプターまたはシグナルドメインを発現できるようなものである。細胞、たとえば、ＨＥＫ２９３を、提供されたトランスフェクション試薬を使用して、適切な比率（前記参照）の両ベクターの混合物でトランスフェクションし、トランスフェクション細胞を、個々の分子、たとえば、合成有機分子とインキュベーションする。２７時間後、細胞を、界面活性剤で溶解し、溶解物を、遠心分離により不要なものを除去し、一連の３倍希釈により希釈し、第１のタグまたは抗ＣＤ４０吸着マイクロタイタープレートに指向された抗体とインキュベーションする。結合していないタンパク質を除去する集中的な洗浄ののち、結合タンパク質を、第２のタグに対する抗体、および西洋ワサビペルオキシダーゼが共役した第２の抗種抗−ＩｇＧ抗体で検出できる。補充タンパク質のレベルは、前記のとおり測定でき、この補充についての各単独分子の効果を、対照サンプルの増殖培地または緩衝液のみでインキュベーションした細胞と比較できる。
【００６０】
本発明は、ここで、以下の制限するものでない実施例で例示する。
【実施例１】
【００６１】
インタクトな細胞においてＣＤ４０へのＴＲＡＦ補充の観察
インタクトな細胞において、ＣＤ４０受容体へのＴＮＦ受容体関連因子1（ＴＲＡＦ１）の補充を観察するために、ＣＤ４０およびＴＲＡＦ１をコードするプラスミド（実施例７に記載されるとおり作製）を、ヒト胚性腎臓２９３Ｔ細胞（ＨＥＫ２９３、すなわちＴ抗原を過剰発現するＡＴＴＣ  ＣＲＬ−１５７３）を同時にトランスフェクションするために使用した（DuBridge et al. 1987）。２×１０5細胞を、３．５ｃｍ皿に播種し、３７℃で、約１６時間で増殖させ、ついでリン酸カルシウム法（Kingston et al. 1993）により、１μｇのＣＤ４０発現プラスミド、およびＴＲＡＦをコードする２μｇの発現プラスミドでトランスフェクションした。２つの発現プラスミド、ＴＲＡＦ１プラスミドとＣＤ４０プラスミドを、産生された全てのＣＤ４０分子を飽和するために、それぞれ２：１より大きな比率でトランスフェクションするために使用した。約２７時間のトランスフェクションののち、細胞を、分離し、氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄し、そして１８０μl溶解緩衝液［プロテアーゼインヒビターカクテル（０．１６ｍＭ  Ｐｅｆａｂｌｏｃ、１０５ＩＵアプロチニン）、１％トリトンＸ１００および０．１％アジ化Ｎａを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）］を用いて界面活性剤抽出した。高レベルで発現される場合、ＣＤ４０は、リガンドに独立してシグナル伝達する傾向があるので、溶解の前に、ＣＤ４０リガンドまたは擬態抗ＣＤ４０抗体で受容体を活性化する必要はない。この特徴は、ＴＲＡＦ遺伝子ファミリーの種々のメンバーに共通している（Boldin et al. 1995、Siegel et al. 2000およびChan et al. 2000）。
【００６２】
溶解物を、微小遠心装置において、４℃、１５０００Ｇで遠心分離により不要なものを除去し、（１％ウシ血清アルブミン含有溶解緩衝液で）一連して３倍に連続希釈し、そののち、各希釈サンプルを、ＣＤ４０細胞外ドメインに特異的なｍＡｂ（Ｒｏ１）で被覆したＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートのウエル中で、室温で約２時間（または一晩）インキュベーションした（Schwabe et al. 1997）。目的の対照として、野生型ＣＤ４０プラスミドの代わりに、全てのシグナルドメインを欠くＣＤ４０変異体をコードするプラスミドを、トランスフェクションおよび一過性発現のために使用した（ＣＤ４０  １−２２２、図１Ｂ）。インキュベーションののち、徹底的な洗浄を、マイクロタイタープレートで行なって、あらゆる結合していないタンパク質を除去した［０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ）での約１０回の洗浄工程］。結合したＴＲＡＦ１を検出するために、抗ＴＲＡＦ１特異的抗体を、プレートに加え、室温で約３時間インキュベーションし、集中的に洗浄して、結合していない抗体を除去し、ＨＲＰ共役２次抗体で結合した抗体を検出した。（固相抗体として使用する場合以外の）全ての抗体を、１％ＢＳＡをＢＳＡ含有ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎに希釈した。
【００６３】
図１Ａに概要的に表された前記アッセイを使用して得られた結果は、インタクトな細胞で生じるＣＤ４０受容体へのＴＲＡＦ１の補充を検出でき（図１Ｂの黒丸）、かつ非常に低いタンパク質濃度、すなわち、当初の抽出物の２４３倍希釈で検出できることを示す。非常に低いタンパク質濃度下でさえ、ＣＤ４０細胞内ドメインへのＴＲＡＦ１補充が検出されることから、この補充アッセイは非常に感受性であることを示す。このアッセイの高い特異性は、ＴＲＡＦ１の補充が検出不可能であるシグナルドメイン欠損ＣＤ４０変異体（ＣＤ４０  １−２２２）を用いた実験対照群で示された（図１Ｂの白丸）。
【００６４】
ＣＤ４０へのＴＲＡＦ２、３、５および６の補充は、以下の実施例４および５に、ＴＲＡＦ１の代わりに、それぞれＴＲＡＦ２、３、５および６のいずれかをコードする様々の発現ベクター（実施例７に記載）を使用して記載される。様々のＴＲＡＦの検出のために使用される抗体を、表１に記載する。
【００６５】
補充アッセイで試験された別の代替的抗体を、表２に示す。
【００６６】
【表１】
2005507493.tif 000004
【００６７】
【表２】
2005507493.tif 000005
【実施例２】
【００６８】
インタクトな細胞および細胞溶解物でのＣＤ４０へのＴＲＡＦ補充の比較
ＣＤ４０へのＴＲＡＦ補充を測定するために、多くの研究は、合成ペプチドまたはＣＤ４０シグナルドメインの可溶性フラグメントに対するＴＲＡＦ結合を探査する実験系に依存していた（Rothe et al. 1994, Hu et al. 1994, Cheng et al. 1995, Mosialos et al. 1995, Ishida et al. 1996, Ishida et al. b 1996, Boucher et al. 1997, Pullen et al. 1998およびPullen et al. 1999）。これらの方法の潜在的な問題は、シグナロソームの組立てが、「膜近傍の」環境で起こらないことである。そこで、細胞溶解物に対するＣＤ４０インタクトな細胞によるＴＲＡＦ１およびＴＲＡＦ２の補充を比較した。実験では、ＣＤ４０とＴＲＡＦ１またはＴＲＡＦ２を、２９３Ｔ細胞中で同時に発現、または個別に発現させた（以下の実施例７に記載される構築物）。プラスミド濃度および比率は、実施例１に記載される実験と同一であった。２７時間後、細胞を、実施例１でと同様に界面活性剤で溶解させた。目的のＣＤ４０またはＴＲＡＦのみを発現する２９３Ｔ細胞からの抽出物を、１：１の比で混合し、４℃で一晩インキュベーションした。目的のＣＤ４０とＴＲＡＦの両方を発現する抽出物も、同一条件下で維持した。そののち、サンプルを、実施例１に記載されるとおりＣＤ４０の細胞外ドメインに対するｍＡｂで被覆したマイクロタイタープレートでインキュベーションした。洗浄工程ののち、ＣＤ４０結合ＴＲＡＦを、抗ＴＲＡＦ抗体で検出した（実施例１）。ＣＤ４０へ補充されたＴＲＡＦの定量を、以下の実施例３に記載されるとおり行なった。図２Ｂに見られるとおり、ＣＤ４０細胞溶解物に対するＴＲＡＦ１またはＴＲＡＦ２結合が、かろうじて検出できたのに対して、インタクトな細胞中でシグナロソームの組立てが起こった、ＣＤ４０とＴＲＡＦ１またはＴＲＡＦ２のあいだの相互作用は、明らかに改善された感受性で測定できた（図２Ａ）。
【００６９】
この結果により、有効なＴＲＡＦ補充は細胞内環境を必要とすることが示唆される。
【実施例３】
【００７０】
ＣＤ４０へのＴＲＡＦ補充の定量
ＣＤ４０へのＴＲＡＦの補充は、実施例１に記載されるアッセイを使用して定量的に測定できる。その目的のために、アッセイ条件を、ＴＲＡＦ発現がＣＤ４０の発現より明らかに過剰であるような方法に調節した。これは、ＴＲＡＦ発現プラスミドが、ＣＤ４０発現プラスミドよりも２〜３倍過剰に使用した場合である。ＣＤ４０結合ＴＲＡＦ濃度を、実施例１で記載されるとおり測定した。ＣＤ４０／ＴＲＡＦ複合体を含む照準抽出物は、各アッセイで基準としての役割を果たした。この基準抽出物は、ＣＤ４０／ＴＲＡＦ１、ＣＤ４０／ＴＲＡＦ２、ＣＤ４０／ＴＲＡＦ３、ＣＤ４０／ＴＲＡＦ５およびＣＤ４０／ＴＲＡＦ６をコードするプラスミドで同時にトランスフェクションされた細胞からの大量プールの抽出物からなる。抽出物を、ＣＤ４０／ＴＲＡＦ複合体の存在について試験し、各抽出物中の複合体濃度を、１０００Ｕ／ｍｌと任意に定義した。抽出物を、少量に等量に分けて凍結し、さらに使用するまで−８０℃で維持した。未知のサンプルをこれらの抽出物と比較することによって、任意のユニットでＣＤ４０−ＴＲＡＦ複合体の濃度を相対的に決定することができた。ＣＤ４０発現でのサンプル−対−サンプル偏差に必須の正規化を、以下の式で計算した：
【００７１】
【数２】
2005507493.tif 000006
【００７２】
ＣＤ４０濃度を、ともに受容体の細胞外ドメインに特異的であるモノクローナル抗体（固相）およびポリクローナル抗ＣＤ４０抗体（検出用）を使用するＥＬＩＳＡで測定した。精製された可溶性ＣＤ４０細胞外ドメインを基準として使用した（Schwabe et al. 1999）。
【実施例４】
【００７３】
インタクトな細胞での補充を観察するアッセイによるＣＤ４０変異体へのＴＲＡＦ補充の再評価
配列比較、突然変異分析および結晶化研究は、コンセンサス配列ＰｘＱＥＴ２５４およびＱｘＰｘＥ２３５ｘ−酸性を示すＣＤ４０中の２つのＴＲＡＦ相互作用部位をマッピングした。ＣＤ４０中の両方のＴＲＡＦ結合モチーフは、インビトロでのＴＲＡＦ１、２、３、５および６の補充を仲介することが示された。アラニンの変異が、対応のＴＲＡＦ結合を完全に消失させたので、いくつかの結合研究により、ＴＲＡＦ６結合は、２３５位のグルタミン酸（Ｅ２３５）に基本的に依存し（Pullen et al. 1999, Tsukamoto et al. 1999）、ＴＲＡＦ１、２、３および５は、２５４位のトレオニン（Ｔ２５４）に依存する（Hu et al. 1994, Cheng et al. 1996, Boucher et al. 1997, Pullen et al. 1999, Hanissian et al. 1997）ことが示された。本明細書に記載されるとおり、ＣＤ４０へのＴＲＡＦ補充を測定するために、ほとんどの研究は、合成ペプチドまたはＣＤ４０シグナルドメインの可溶性フラグメントに対するＴＲＡＦ結合を探査する実験系に依存していた。
【００７４】
実施例３に記載されるとおりＴＲＡＦ補充アッセイの定量版は、そのＴＲＡＦ補充挙動に関して、ＣＤ４０および種々のＣＤ４０変異体を比較するために使用された。ＴＲＡＦ１、２、３、５および６を試験した。強力なＴＲＡＦ結合部位で欠失または点突然変異を示すＣＤ４０変異体を使用した（図３Ａは、強力なＴＲＡＦ結合部位を示す、配列番号：１）。図３Ｂから分かるように、本明細書に記載されるアッセイにより、試験されたＣＤ４０変異体に依存するＴＲＡＦ補充に特異的差異を検出した。２３５位のグルタミン酸（Ｅ２３５Ａ）の変異は、ＴＲＡＦ６補充の消失させた。アミノ酸２５０〜２５４位のＴＲＡＦ１／２／３／５結合モチーフＰＸＱＸＴ２５４の別の欠失は、バックグランドレベルに対して５つ全てのＴＲＡＦ試験の結合を減少させた（図３Ｂの1−２５４ＥＡ）。このアッセイにより、ＣＤ４０のＣ末端（ａａ２５６〜ａａ２７７）が、ＣＤ４０により補充された５つ全てのＴＲＡＦの結合にとって重要であるも示された（図３Ｂの１−２５５）。さらに、２つのＴＲＡＦは、互いの補充に影響を及ぼし得ることが示された。たとえば、ＴＲＡＦ２の結合を低下させる変異がＣＤ４０に挿入されたときはいつでも、ＴＲＡＦ６の結合は減少した（たとえば、図３ＢのＴ２５４Ａ、ＱＥ２６３ＡＡまたはＱＥ２７４ＡＡ）。Ｅ２３５Ａ変異によるＴＲＡＦ６補充の障害も、ＴＲＡＦ３およびＴＲＡＦ５の補充を減少させた（図３Ｂ）。ＣＤ４０変異体１−２４５ＥＡ（図３Ｂ）が、ＴＲＡＦ結合について試験されたとき、興味深い部位態様が生じた。１−２５４ＥＡでのＴＲＡＦ２のためのコンセンサス結合モチーフＰＸＱＥ231が存在するにもかかわらず［結晶学により測定されるとおり（Ye et al. 1999）］、このＣＤ４０変異体は、ＴＲＡＦ２を結合しなかった。これは、ＴＲＡＦ結合モチーフが配置される配列状況も、所定のＴＲＡＦが補充されるかどうかを決定することを示す。
【００７５】
本明細書に記載されるアッセイは、ＣＤ４０へのＴＲＡＦの補充を検出する従来使用されていた方法より明らかに優れている。本来の膜の環境でのインタクトな受容体の使用により、このアッセイの感受性は、従来記載されていた方法よりも明らかによい（Rothe et al. 1994, Hu et al. 1994, Boldin et al. 1995, Stanger et al. 1995, Chinnaiyan et al. 1995, Cheng et al. 1995, Mosialos et al. 1995, Ishida et al. a 1996, Ishida et al. b. 1996, Boucher et al. 1997, Pullen et al. 1998およびPullen et al. 1999）。したがって、Ｔ２５４Ａ変異体に対するＴＲＡＦ２の結合（Hu et al. 1994, Boucher et al. 1997, Pullen et al. 1999, Cheng et al. 1996, Hanissian et al. 1997）または結晶化研究で決定されるＴＲＡＦ結合のためのコンセンサス配列の配列環境の効果（Ye et al. 1999, NcWhirter et al. 1999およびPark et al. 1999）などの、以前に観察できなかったＣＤ４０−ＴＲＡＦ相互作用を検出することが可能である。アッセイは、たとえば、インタクトなＣＤ４０  Ｃ末端の必要性などのＣＤ４０に対するＴＲＡＦ結合を測定する構造的な必要性をより正確な測定することができる。さらに、どのように異なるＴＲＡＦが、互いに結合に影響を及ぼすかを示すことができた。これらの結果を考慮すると、記載されたアッセイ法は、サイトカイン受容体と細胞内シグナル分子のあいだの相互作用の理解に大いに貢献することが予測されるだろう。この知識は、シグナロソームの組立てのレベルで作用する薬剤の合理的な開発に必須であろう。
【実施例５】
【００７６】
様々の受容体への種々のＴＲＡＦの補充
ＣＤ４０の細胞外ドメイン、および以下の受容体：ＢＣＭＡ（Madry et al. 1998およびHatzoglou et al. 2000）、ＬＴβＲ受容体（Mosialos et al. 1995, Crowe et al. 1994, Nakano et al. 1996）、ＴＡＣＩ（von Bulow et al. 1997, Xia et al. 2000）、ｐ７５ＴＮＦＲ（Rothe et al. 1994）およびＣＤ２７（Gravestein et al. 1998, Akiba et al. 1998）（構築物の詳細は、実施例７を参照のこと）の内のいずれかの膜貫通および細胞内ドメインを含むハイブリッド受容体をコードする発現プラスミドで細胞を形質転換させることにより、ＣＤ４０および異なる受容体への種々のＴＲＡＦの補充を、実施例１に記載される補充アッセイによって試験した。実施例１に記載されるＥＬＩＳＡサンドイッチ、および実施例３に記載される定量を使用して、ＴＲＡＦをコードするプラスミドとともに前記ハイブリッド受容体のいずれか1つをコードするプラスミドで２９３Ｔ細胞を同時にトランスフェクションし、ＴＲＡＦ／受容体複合体を測定することにより、ＢＣＭＡ、ＬＴβＲ−受容体、ＴＡＣＩ、ｐ７５ＴＲＡＦまたはＣＤ２７のシグナルドメインに対するＴＲＡＦ補充の測定を行なった。ハイブリッド受容体を用いたアッセイは、図４Ａに概要的に表される。図４Ｂに示される結果は、インタクトな細胞での補充を観察するアッセイを使用して、ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーの任意のＴＲＡＦ補充受容体を、実施例１に記載されるのと同じ抗体サンドイッチアッセイで試験でき、ＴＲＡＦ−受容体／ＣＤ４０ハイブリッド複合体の量を、実施例３に記載されるとおり観察できる。結果は、ＬＴβＲおよびｐ７５ＴＮＦＲへのＴＲＡＦ１の補充が、ＣＤ４０へのその補充より２５倍高いこと、そしてＬＴβＲおよびｐ７５ＴＮＦＲへのＴＲＡＦ２の補充が、ＣＤ４０へのその補充より約６０倍高いことを示す。試験された受容体の全てへのＴＲＡＦ３の補充は、類似している。ＴＲＡＦ５は、ＬＴβＲへ例外的に高く補充され、この受容体への補充は、ＣＤ受容体への補充より約１５２倍高い。ＴＲＡＦ６は、ＣＤ４０受容体への補充よりも約１０倍高くＢＣＭＡ、ＴＡＣＩおよびｐ７５ＴＮＦＲに補充される。
【００７７】
この実施例より分かるように、本明細書に記載されるアッセイは、まず、所定の郡のシグナル分子の結合特徴に関して、いくつかの受容体を直接的に比較できる。これにより、所定のＴＲＡＦ受容体の組合せの生物学的機能を結論づけることができるだろう。得られた結果は、あらゆる受容体へのＴＲＡＦ補充を観察する補充アッセイの実現可能性を再度証明するものである。
【実施例６】
【００７８】
ＣＤ４０へのＮＩＫの補充
実施例１に記載されるアッセイは、アダプタータンパク質（たとえば、ＴＲＡＦ２）を介したサイトカイン受容体（たとえば、ＣＤ４０）へのシグナルタンパク質（たとえば、ＮＩＫ（ＮＦ−κＢ経路での下流メディエーター、Malinin et al. 1997））の補充を測定するために使用できる。ＣＤ４０、ＴＲＡＦ２、ＮＩＫ（ｐｃＤＮＡ３．１中）およびｍｙｃタグ付ＩＫＫαをコードする発現プラスミドを、２９３Ｔに（それぞれ、１：１．７５：１．７５：１．７５の比率で）同時にトランスフェクションした。空のベクターを、トランスフェクションされたＤＮＡと等量使用した。トランスフェクションを、実施例１に記載されるとおり行なった。２７時間後、細胞を、実施例１に記載されるとおり抽出した。溶解物を、抗ＣＤ４０ｍＡｂで被覆したＥＬＩＳＡプレートでインキュベーションした（R01、Schwabe et al. 1997）。２時間後、プレートを、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、そして商業的に入手可能なウサギ抗ＮＩＫ抗体（サンタクルーズ、１：１００希釈、ＳＣ−６３６３）およびＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇ抗体（ファルミンゲン）で展開した。ＮＩＫについての補充アッセイは、図５Ａに概要的に表される。図５ＢおよびＣに示されるとおり、ＣＤ４０へのＮＩＫの補充は、ＴＲＡＦ２依存性であり、ＩＫＫが同時に発現されるとき明らかに改善された。
【００７９】
この結果により、アダプタータンパク質に加えて、ＣＤ４０ドメインの細胞内ドメインへの、ＮＩＫなどの他のシグナロソーム構成要素の補充が測定できることが示された。
【実施例７】
【００８０】
ｃＤＮＡクローニング、ＣＤ４０変異体の作製および発現構築物
ヒトＣＤ４０ｃＤＮＡを、Hessら（1995）により記載されるとおりクローンニングした。ＣＤ４０ｃＤＮＡを、ｐＥＦ−ＢＯＳ（プラスミドサイズ616４Ｂp）に挿入した。
【００８１】
ヒトＴＲＡＦ２ｃＤＮＡを、Mullinaxら（1996）により記載されるとおりクローンニングした。他の全てのヒトＴＲＡＦｃＤＮＡを、公表された配列情報を用いてＲＴ−ＰＣＲによりクローンニングした。
【００８２】
ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２およびＴＲＡＦ３の発現のために、個々のｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ３（ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２およびＴＲＡＦ３をコードするプラスミドのサイズは、それぞれ、６８８１、７０１４、７７００ｂｐである）に挿入した（図６）。ＴＲＡＦ５およびＴＲＡＦ６を、ｐｃＤＮＡ３．１Ｈｉｓ（インビトロゲン、Karlsruhe，Germany）で発現させ、得られたｄＴＲＡＦ５およびｄＴＲＡＦ６をコードするプラスミドのサイズは、それぞれ、６７７６および６１９９ｂｐであった。ｐｃＤＮＡ３．１Ｈｉｓベクターは、抗Ｈｉｓタグまたは抗Ｘｐｒｅｓｓ抗体で検出できるペプチドタグをコードしている（図７）。
【００８３】
ＴＲＡＦ５（ｄＴＲＡＦ５）およびＴＲＡＦ６（ｄＴＲＡＦ６）の欠失変異体をコードするｃＤＮＡフラグメントを、酵素的なＤＮＡ制限により作製した。そこで、ＴＲＡＦ５のアミノ酸１４５〜５５７をコードするＮｃｏＩ〜ＸｈｏＩフラグメント、およびＴＲＡＦ６のアミノ酸３００〜５２４をコードするＸｍｎＩ〜ＸｈｏＩフラグメントを使用した（図８）。
【００８４】
ＣＤ４０変異体を、製造業者の指示にしたがってＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ Ｓｉｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、オランダ国）を用いて作製した。発現については、全てのＣＤ４０構築物を、ｐＥＦ−ＢＯＳのＸｂａ−１部位に挿入し（Mizushima et al. 1990）、配列決定により確認した（図８)。
【００８５】
ＣＤ４０受容体ハイブリッドを作製するために、ｐＥＦ−ＢＯＳの変異体であるｐＥＧＦＰ−ＢＯＳ  ＡＳ  ＭＣＳを使用した（図９）。ｐＥＦ−ＢＯＳ中の２つのＸｂａＩ部位のあいだにアンチセンス方向で、商業的に入手可能なｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミド（Clontech）から得られるＮｈｅＩ−ＸｂａＩフラグメントを挿入することにより、このプラスミドを作製した。フラグメントは、緑色蛍光タンパク質のコーディング配列、指定の制限部位ＳａｌＩおよびＫｐｎＩを含む。ＰＣＲ指向突然変異誘導を使用して、ＣＤ４０ｃＤＮＡの細胞質ドメイン境界に、細胞外に特徴的なＭｌｕＩ部位を作製した。このことから、１１９０位のアスパラギン酸(Ｄ)をグルタミン酸へ指向された変異も生じた。続いて、ＬＴβＲ、ＴＡＣＩ、ｐ７５ＴＮＦ受容体、ＣＤ２７（全てＳａｌＩ／ＭｌｕＩを介する）、およびＢＣＭＡ（ＫｐｎＩ／ＭｌｕＩを介する）の膜貫通および細胞質ドメインをコードするｃＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲにより作製し、ｐＥＧＦＰ−ＢＯＳ  ＡＳ  ＭＣＳにＣＤ４０細胞外ドメイン（ＥＣＤ）をコードするＸｂａＩ／ＭｌｕＩフラグメントとともに、挿入した。指定の受容体ドメインをコードするｃＤＮＡフラグメント中に指定の制限部位を、ＰＣＲ指向突然変異誘導により作製し、コードアミノ酸配列を厳密に考慮したところ、対応の野生型受容体と一致した。全ての構築物を、使用前に配列決定により確認した。
【実施例８】
【００８６】
シグナロソーム形成を阻害する非ペプチド小型分子の調製およびスクリーニング
コンビナトリアルケミストリーにより、小型非ペプチド分子のライブラリーを調製した。コンビナトリアルケミストリー技術の設計は、当技術分野に周知であり、たとえば、Hermkensら（1996）に記載されている。ＣＤ４０およびＴＲＡＦ２を過剰発現する細胞を、個々の合成有機化合物に接触させ、実施例１に記載されるとおり補充を試験し、実施例３のように定量した。
【００８７】
補充またはシグナロソーム形成を阻害できる化合物は、今後試験されるために選択される。
【００８８】
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【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１Ａ】ＣＤ４０に関するシグナロソームの組立てを測定する本発明によるアッセイの概要図である。ＣＤ４０の細胞外ドメインに対する抗体を、固相に吸着した。そののち、ＣＤ４０およびＴＲＡＦアダプター（詳細は、実施例１を参照）を過剰発現する細胞の抽出物から得られるＣＤ４０および結合ＴＲＡＦアダプターからなるマルチ・タンパク質複合体は、抗ＣＤ４０吸着固相に捕捉される。結合ＴＲＡＦは、ＴＲＡＦアダプターに対する特異的西洋ワサビペルオキシダーゼ共役（ＰＯＸ）抗体で検出される。
【図１Ｂ】図１Ａで概要的に表わされ、説明されるアッセイによるＣＤ４０受容体へのＴＲＡＦ１の補充を示す。ＣＤ４０ｗｔ（黒丸）またはＣＤ４０  １−２２２（白丸）を、実施例１に記載される通り、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＴＲＡＦ１とともに同時発現させた。２７時間後、細胞を、界面活性剤で溶解し、溶解物を、遠心分離で不要なものを除去し、一連の３倍希釈により希釈し、ついで抗ＣＤ４０吸着マイクロタイタープレートでインキュベーションした。ＣＤ４０結合ＴＲＡＦ１を、ＴＲＡＦ１に対する商業的に入手可能な抗体、および西洋ワサビペルオキシドに共役した第２の抗種抗ＩｇＧ抗体（ＰＯＸ）を用いて、指示された希釈で検出した。（使用された抗体の詳細は、表１を参照）。
【図２】細胞抽出物に対するインタクトな細胞でのＣＤ４０受容体へのＴＲＡＦ１およびＴＲＡＦ２の補充の比較を示す。ＣＤ４０ｗｔ（黒丸）またはシグナルドメイン欠損変異体ＣＤ４０  １−２２２（白丸）を、２９３Ｔ細胞において、別々に（Ａ）に発現させるか、またはＴＲＡＦ１もしくはＴＲＡＦ２とともに同時に発現させた（Ｂ）。２７時間後、細胞を、実施例１に記載されるとおり界面活性剤で溶解した。ＣＤ４０ｗｔまたはＣＤ４０  １−２２２のみを発現する２９３Ｔ細胞からの抽出物と、ＴＲＡＦ１またはＴＲＡＦ２を発現する２９３Ｔ細胞からの抽出物を１：１の比で混合し、ついで４℃で、一晩インキュベーションした。他の抽出物も全て、同一の条件下で維持した。ＣＤ４０結合ＴＲＡＦを、実施例１に記載されるとおりＥＬＩＳＡによって細胞抽出物の指示された希釈で測定した。アッセイを、表１に列挙される抗体で行なった。ＴＲＡＦ２の測定のために、モノクローナルラット抗ＴＲＡＦ２（クローン８．Ｆ１；Dr, E．Kremmerの好意により提供、GSF, Institut fuer Molekulare Immunologie；Marchioninistr．25,81337 Munchen）を、検出抗体（１：１０で希釈されたハイブリドーマ上清）として使用した。
【図３Ａ】ＴＲＡＦ補充について試験したＣＤ４０変異体の概要図である。強力なＴＲＡＦ結合部位を含むＣＤ４０野生型配列を、下線を付した２つの主要なＴＲＡＦ結合部位とともに中央（ｈｓＣＤ４０  配列番号：１）に示す。結晶化研究（Ye et al. 1999）により決定されるとおり、ＴＲＡＦ２結合のコンセンサス配列と一致する第三の配列モチーフ（ＳＶＱＥ）も下線を付す。矢印で印を付けたアミノ酸は、アラニン（Ａ）に置換された。
【図３Ｂ】図３Ａに概要的に表されるＣＤ４０変異体へのＴＲＡＦ補充を示す。（同じ実験で測定されたとおり）野生型ＣＤ４０に対する変異ＣＤ４０への相対的なＴＲＡＦ結合を示す。測定は全て、二重に３つの独立した実験で行なった（平均値周辺の平均および偏差を示す）。定量および正規化の詳細は、実施例３を参照のこと。アッセイを、表１に列挙される抗体で行なった。ＴＲＡＦ２の測定については、モノクローナルラット抗ＴＲＡＦ２（クローン８．Ｆ１；Dr, E．Kremmerの好意により提供、GSF, Institut fuer Molekulare Immunologie；Marchioninistr．25,81337 Munchen）を、検出抗体（１：１０で希釈されたハイブリドーマ上清）として使用した。
【図４Ａ】ＴＮＦ受容体ファミリーの様々のメンバーに対するＴＲＡＦ結合を観察するための本発明のアッセイの概要図である。試験される受容体のＣＤ４０細胞外ドメインならびに膜貫通および細胞内ドメインを含む受容体ハイブリッドをコードする発現プラスミドを構築した。ＴＲＡＦを補充することが知られているＣＤ２７、ＬＴβ受容体、ｐ７５ＴＮＦＲ、ＴＡＣＩおよびＢＣＭＡのシグナルドメインへのＴＲＡＦ補充を、実施例１と同様のアッセイを使用して行なった。
【図４Ｂ】図４Ａに概要的に表され、記載されるアッセイを用いて得られた結果を示す。ＴＲＡＦ補充を、実施例１に記載されるとおり測定した（定量および正規化の詳細は、実施例３を参照のこと）。ＣＤ４０へのＴＲＡＦの補充を、複数の照準ＣＤ４０として示される他の試験受容体へのＴＲＡＦ補充と比較するための相対的な基準として使用した。アッセイのバックグランドは、完全なシグナルドメインを欠くＣＤ４０変異体を用いて測定した（ＣＤ４０  １−２２２、図３も参照）。アッセイは、表１に列挙される抗体を用いて行なった。ＴＲＡＦ２の測定については、モノクローナルラット抗ＴＲＡＦ２（クローン８．Ｆ１；Dr, E．Kremmerの好意により提供、GSF, Institut fuer Molekulare Immunologie；Marchioninistr．25,81337 Munchen）を、検出抗体（１：１０で希釈されたハイブリドーマ上清）として使用した。
【図５Ａ】アダプタータンパク質を介して仲介されるシグナルタンパク質の補充を観察するための、本発明によるインタクトな細胞における補充アッセイの概要図である。これは、ＴＲＡＦを介してＣＤ４０に補充されるキナーゼＮＩＫで示される。２９３ＴへのＣＤ４０、ＴＲＡＦ２（Ｔ２）およびＮＩＫをコードする３つの発現プラスミドの同時トランスフェクションののち、細胞を溶解し、ついでＣＤ４０結合ＮＩＫを、実施例７に記載されるとおり測定した。
【図５Ｂ】図５Ａで概要的に表され、記載されるアッセイを用いて得られた結果を示す。指示された発現プラスミドの組合せは、実施例７に記載されるとおり、２９３Ｔ細胞で過剰発現された。細胞を抽出し、ＣＤ４０結合ＮＩＫを、実施例７に記載されるとおり測定した。アッセイのバックグランドは、完全なシグナルドメイン（１−２２２）を欠くＣＤ４０変異体の同時トランスフェクションにより測定した。この図は、ＮＩＫ補充におけるＩＫＫα過剰発現の影響をも示す。
【図５Ｃ】ＣＤ４０へのＮＩＫ補充は、ＴＲＡＦ２依存性であることを示す。指示されたプラスミドの組合せは、実施例７に記載されるとおりトランスフェクションされた。ＣＤ４０結合ＮＩＫを、実施例７に記載されるとおりＥＬＩＳＡによって測定した。
【図６】ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２およびＴＲＡＦ３（ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２およびＴＲＡＦ３をコードするプラスミドのサイズは、それぞれ、６８８１、７０１４、７７００ｂｐである）をコードする発現ベクターを示す。
【図７】ｄＴＲＡＦ５およびｄＴＲＡＦ６（ｄＴＲＡＦ５およびｄＴＲＡＦ６をコードするプラスミドのサイズは、それぞれ、６７７６および６１９９ｂｐである）をコードする発現ベクターを示す。この発現ベクターは、抗−Ｈｉｓ−タグまたは抗Ｘｐｒｅｓｓ抗体で検出できるペプチドタグをコードする。ＴＲＡＦ５（ｄＴＲＡＦ５）およびＴＲＡＦ６（ｄＴＲＡＦ６）の欠失変異体をコードするｃＤＮＡフラグメントを、酵素的ＤＮＡ制限により作製した。したがって、ＴＲＡＦ５のアミノ酸１４５〜５５７をコードするＮｃｏＩ〜ＸｈｏＩフラグメント、およびＴＲＡＦ６のアミノ酸３００〜５２４をコードするＸｍｎＩ〜ＸｈｏＩフラグメントを使用した。
【図８】製造業者の指示にしたがってＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＴＭ Ｓｉｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、オランダ国）で作製したＣＤ４０変異体をコードする発現ベクターを示す。ＣＤ４０構築物を、ｐＥＦ−ＢＯＳのＸｂａ−１部位に挿入し（Mizushima et al. 1990）、配列決定によって確認した。
【図９】ＣＤ４０の細胞外ドメイン、ならびにＣＤ２７、ＬＴβ受容体、ｐ７５ＴＮＦＲ、ＴＡＣＩおよびＢＣＭなどの別の受容体の細胞内および膜貫通ドメインを含むハイブリッド受容体をｐＵＣ１１９にコードするＤＮＡ構築物を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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