(57)【要約】本発明は、短い二本鎖ＲＮＡの合成の分野に関する。バクテリオファージポリメラーゼおよび鋳型としての標的配列特異的一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写方法が開示される。本発明は、植物における転写後遺伝子阻害の間の配列特異的ＲＮＡ分解ならびに無脊椎動物および脊椎動物系におけるＲＮＡ干渉の誘発における重要な中間体として機能することが示されている低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の合成において、とりわけ有利な使用を見出す。
2005508177.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）鋳型で伸長されたセンスオリゴリボヌクレオチド産物が形成されるような反応混合物中で、標的特異的センスオリゴヌクレオチド鋳型および鎖伸長酵素を組み合わせること；
ｂ）鋳型で伸長されたアンチセンスオリゴリボヌクレオチド産物が形成されるような反応混合物中で、標的特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド鋳型および鎖伸長酵素を組み合わせること；ならびに
ｃ）段階ａ）で得られるセンスオリゴリボヌクレオチド産物を段階ｂ）で得られる相補的アンチセンスオリゴリボヌクレオチド産物とハイブリダイズさせること
の段階を含んで成る、標的特異的な短い二本鎖ＲＮＡの合成方法。
【請求項２】
鎖伸長酵素がＲＮＡポリメラーゼである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼもしくはＳＰ６ポリメラーゼよりなる群から選択される、請求項２記載の方法。
【請求項４】
段階ａ）およびｂ）のオリゴヌクレオチド鋳型がｄｓＤＮＡよりなるＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含んで成る、請求項１記載の方法。
【請求項５】
ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列が、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼもしくはＳＰ６  ポリメラーゼよりなる群から選択されるＲＮＡポリメラーゼにより認識される、請求項４記載の方法。
【請求項６】
ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列がＴ７  ＲＮＡポリメラーゼにより認識される、請求項４ないし５のいずれか１つ記載の方法。
【請求項７】
段階ａ）およびｂ）のオリゴヌクレオチド鋳型が、標的特異的鋳型配列を伴い鋳型鎖の５’端で伸長された二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含んで成る部分的に二本鎖のＤＮＡオリゴ鋳型であることをさらに特徴とする、請求項４ないし６のいずれか１つ記載の方法。
【請求項８】
ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列が図１に示されるところの短縮されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列よりなる、請求項４ないし７のいずれか１つ記載の方法。
【請求項９】
標的特異的な短い二本鎖ＲＮＡが３０ヌクレオチド長未満である、請求項１ないし８のいずれか１つ記載の方法。
【請求項１０】
標的特異的な短い二本鎖ＲＮＡが、プロモーター配列から転写された５’端ヌクレオチドおよびプロモーター配列から転写されたヌクレオチドに相補的な３’端ヌクレオチドを含んで成ることを特徴とする、請求項１ないし８のいずれか１つ記載の方法。
【請求項１１】
ａ）鋳型で伸長されたセンスオリゴリボヌクレオチド産物が形成されるような反応混合物中で、センスｓｉＲＮＡ鋳型を鎖伸長酵素と組み合わせること；ｂ）鋳型で伸長されたアンチセンスオリゴリボヌクレオチド産物が形成されるような反応混合物中で、アンチセンスｓｉＲＮＡ鋳型を鎖伸長酵素と組み合わせること；ならびに
ｃ）段階ａ）で得られるセンスオリゴリボヌクレオチド産物を段階ｂ）で得られるアンチセンスオリゴリボヌクレオチド産物とハイブリダイズさせること；
それにより、段階ａ）およびｂ）のｓｉＲＮＡ鋳型が、標的特異的鋳型配列および２もしくは３個の付加的ヌクレオチドを伴い鋳型鎖の５’端で伸長された二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含んで成る、
の段階を含んで成る、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の合成方法。
【請求項１２】
鎖伸長酵素がＲＮＡポリメラーゼである、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼもしくはＳＰ６ポリメラーゼよりなる群から選択される、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
ＲＮＡポリメラーゼがＴ７  ＲＮＡポリメラーゼよりなる、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列が、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼもしくはＳＰ６ポリメラーゼよりなる群から選択されるＲＮＡポリメラーゼにより認識される、請求項１１記載の方法。
【請求項１６】
ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列がＴ７  ＲＮＡポリメラーゼにより認識される、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列が、図１で示されるところの短縮されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列よりなる、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
標的特異的鋳型配列が、５’端に２個のグアノシン（ｇ）ヌクレオチドおよび３’端に２個のシトシン（ｃ）ヌクレオチドを含んで成ることをさらに特徴とする、請求項１１記載の方法。
【請求項１９】
５’端にＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列から転写されたヌクレオチド、および３’端に前記ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列から転写されたヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを含んで成ることを特徴とする５０未満のヌクレオチドの標的特異的な短い二本鎖ＲＮＡを含んで成るＲＮＡの、細胞中への導入を含んで成る、細胞中での標的遺伝子の発現の阻害方法。
【請求項２０】
プロモーター配列から転写されたヌクレオチドの数およびプロモーター配列から転写されたヌクレオチドに相補的なヌクレオチドの数が、２、３もしくは４ヌクレオチドよりなる、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
標的特異的な短い二本鎖ＲＮＡが２もしくは３個の付加的ヌクレオチドを伴い３’端で伸長された、請求項１９もしくは２０記載の方法。
【請求項２２】
ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列が、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼもしくはＳＰ６ポリメラーゼよりなる群から選択されるＲＮＡポリメラーゼにより認識されている、請求項１９ないし２１のいずれか１つ記載の方法。
【請求項２３】
ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列が、図１に示されるところの短縮されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列よりなる、請求項１９ないし２２のいずれか１つ記載の方法。
【請求項２４】
標的遺伝子が、細胞遺伝子、内在性遺伝子、トランスジーンもしくは病原体からの遺伝子である、請求項１９ないし２３のいずれか１つ記載の方法。
【請求項２５】
請求項１ないし１８記載の方法のいずれか１つにより得ることができる単離されたＲＮＡ。
【請求項２６】
５’端にＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列から転写されたヌクレオチド、および３’端に前記ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列から転写されたヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを含んで成ることを特徴とする５０未満のヌクレオチドの標的特異的な短い二本鎖ＲＮＡよりなる、請求項２５記載の単離されたＲＮＡ。
【請求項２７】
プロモーター配列から転写されたヌクレオチドの数およびプロモーター配列から転写されたヌクレオチドに相補的なヌクレオチドの数が、２、３もしくは４ヌクレオチドよりなる、請求項２５もしくは２６記載の単離されたＲＮＡ。
【請求項２８】
前記ＲＮＡ分子のセンス配列が、５’−ｘｘ（ｎ１２−３０）ｙｙ−３’［式中ｘはプロモーター配列から転写されたヌクレオチドを指し、ｙはプロモーター配列から転写されたヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを指し、そしてｎは１２ないし３０ヌクレオチドのいずれかのオリゴヌクレオチドを指す］により表されることができる、請求項２５ないし２７のいずれか１つ記載の単離されたＲＮＡ。
【請求項２９】
前記ＲＮＡ分子のセンス配列が、５’−ｇｇ（ｎ１５−３０）ｃｃ−３’［式中ｇは短縮されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列（図１に示されるところの）から転写されたヌクレオチドグアノシンを指し、ｃは短縮されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列（図１に示されるところの）から転写されたヌクレオチドに相補的なヌクレオチドシトシンを指し、そしてｎ１５−３０は１５ないし３０ヌクレオチドのいずれかのオリゴヌクレオチドを指す］により表されることができる、請求項２５ないし２８のいずれか１つ記載の単離されたＲＮＡ。
【請求項３０】
標的特異的な短い二本鎖ＲＮＡが３’端で２もしくは３個の付加的なヌクレオチドを伴い伸長された、請求項２５ないし２９のいずれか１つ記載の単離されたＲＮＡ。
【請求項３１】
請求項１ないし１８のいずれか１つ記載の方法での使用のための標的特異的センスオリゴヌクレオチド鋳型。
【請求項３２】
請求項１ないし１８のいずれか１つ記載の方法での使用のための標的特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド鋳型。
【請求項３３】
前記オリゴヌクレオチド鋳型が、鋳型鎖の５’端で標的特異的鋳型配列を伴い伸長されたｄｓＲＮＡよりなるＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含んで成る、請求項３１および３２記載の標的特異的オリゴヌクレオチド鋳型。
【請求項３４】
ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列が、図１に示されるところの短縮されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列よりなる、請求項３１ないし３３記載の標的特異的オリゴヌクレオチド鋳型。
【請求項３５】
標的特異的な短い二本鎖ＲＮＡが３０ヌクレオチド長未満である、請求項３１ないし３４記載の標的特異的オリゴヌクレオチド鋳型。
【請求項３６】
標的特異的な短い二本鎖ＲＮＡが、５’端にプロモーター配列から転写されたヌクレオチドおよび３’端にプロモーター配列から転写されたヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを含んで成ることを特徴とする、請求項３１ないし３５記載の標的特異的オリゴヌクレオチド鋳型。
【請求項３７】
以下の成分；ａ）標的特異的センスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド鋳型を設計するための説明書；ｂ）鎖伸長酵素；ｃ）転写緩衝液；ｄ）４種の必要とされるリボヌクレオチド塩基のヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）；ｅ）センスおよびアンチセンスオリゴリボヌクレオチド産物を得るための精製手段の最低１種を含んで成る、短い二本鎖標的特異的ＲＮＡの合成のためのキット。
【請求項３８】
標的特異的センスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド鋳型を設計するための説明書が、以下の段階；
１）標的遺伝子のコーディング配列内に配置されかつ以下の配列５’−ｘｘ（ｎ１２−３０）ｙｙ−３’［式中ｘはプロモーターから転写されたヌクレオチドを指し、ｙはプロモーター配列から転写されたヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを指し、そしてｎ１２−３０は１２ないし３０ヌクレオチドのいずれかのオリゴヌクレオチドを指す］を有する標的特異的配列を探す
２）場合によっては２個の付加的なヌクレオチドを伴い伸長された、段階１）で配置された標的特異的配列の相補物オリゴヌクレオチド配列を伴い鋳型鎖の５’端で伸長された、本発明の二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含んで成るセンスオリゴヌクレオチド鋳型を設計する
３）場合によっては２個の付加的なヌクレオチドを伴い伸長された、段階１）で配置された標的特異的配列の逆オリゴヌクレオチド配列を伴い鋳型鎖の５’端で伸長された、本発明の二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含んで成るアンチセンスオリゴヌクレオチド鋳型を設計する
を含んで成る方法よりなる、請求項３７記載のキット。
【請求項３９】
鎖伸長酵素が、ＲＮＡポリメラーゼ、好ましくはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼおよびＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼよりなる群から選択されるＲＮＡポリメラーゼよりなる、請求項３７記載のキット。
【請求項４０】
精製手段がサイズ排除クロマトグラフィーカラムよりなる、請求項３７ないし３９のいずれか１つの請求項記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は短い二本鎖標的特異的ＲＮＡの合成の分野に関する。ＲＮＡポリメラーゼおよび鋳型としての標的配列特異的ＤＮＡオリゴヌクレオチドを使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写方法が開示される。本発明は、とりわけ、植物における転写後遺伝子サイレンシング（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）の間の配列特異的ＲＮＡ分解ならびに無脊椎動物および脊椎動物系におけるＲＮＡ干渉の誘発における重要な中間体として機能することが示されている低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の合成における有利な使用を見出す。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ阻害は、ＲＮＡの配列特異的ターゲッティングおよび分解に基づく注目すべき型の遺伝子調節である。ＲＮＡ阻害はトランスジェニック植物で最初に発見され、そこでそれは共抑制（ｃｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）もしくは転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）と命名された。最近にのみ、ＰＴＧＳに関する配列特異的ＲＮＡ分解過程すなわちＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）が繊毛虫、真菌、ならびにＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）からマウスおよびヒト細胞までの多様な動物で見出された。それらは詳細が異なるかもしれないとは言え、ＲＮＡｉおよびＰＴＧＳは同一の高度に保存された機構から生じ、古来の起源を示す。基礎過程は相同ｍＲＮＡの認識および標的を定められた切断を導く低分子二本鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に切断される二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を必要とする。これらの低分子ｄｓＲＮＡはＲＮアーゼＩＩＩ様の消化の分解産物に似ている。とりわけｓｉＲＮＡはｓｉＲＮＡの各鎖が５’一リン酸、３’ヒドロキシル末端および２〜３ヌクレオチドの３’オーバーハングを運搬する標的特異的な短い二本鎖ＲＮＡである（非特許文献１）。
【０００３】
ＲＮＡｉは、それが特定の遺伝子の活性をノックアウトする手段であり遺伝子解析に対し修正可能（ａｍｅｎｄａｂｌｅ）でないと以前は考えられていた種においてとりわけ有用であるためにかなりの注目を引いている。最近の研究は、合成ｓｉＲＮＡがＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）ならびにヒトおよびマウスからの細胞系での発現の遺伝子特異的阻害を誘導する可能性があることを示した（非特許文献１；非特許文献２）。前記刊行物において、哺乳動物細胞中で、ｓｉＲＮＡが翻訳因子ｅＩＦ２αを不活性化するより長いｄｓＲＮＡの使用に比較して配列特異的な答えを提供し、タンパク質合成の一般化された抑制につながることがさらに示された。また、アンチセンス技術を使用する遺伝子発現の阻害に比較して、ｓｉＲＮＡは非常に安定であると思われ、そして従って一本鎖ＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドがｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を高めるために必要とする広範囲の化学修飾を必要としないかもしれない。
【０００４】
従って、ｓｉＲＮＡを使用するＲＮＡサイレンシングが、遺伝子発現の制御の工作ならびに機能的ゲノム学および分子農業からおそらくなお動物における遺伝子治療までの範囲にわたる多様な生物工学の応用における重要なツールとなるであろうことが期待されるはずである。異なるｓｉＲＮＡはそれらの標的に対し異なる有効性で作用するかもしれないため、特定の標的についての１種以上のｓｉＲＮＡの試験が望ましいことができる。加えて、ゲノムスケール逆遺伝学プログラム（ｇｅｎｏｍｅ−ｓｃａｌｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｐｒｏｇｒａｍ）は多数のｓｉＲＮＡを必要とすることができる。
【０００５】
しかしながら、伝統的な化学合成による二本鎖標的特異的ＲＮＡオリゴの製造は、ＤＮＡオリゴ合成に比較した場合に比較的遅くかつ高価なままである。加えて、ＲＮＡオリゴの化学合成は特殊な合成機および複雑な精製プロトコルを必要とする。本発明は、バクテリオファージもしくは他のウイルスポリメラーゼおよび標的配列特異的オリゴヌクレオチド鋳型を使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写に基づく短い二本鎖標的特異的ＲＮＡを製造するための代替の一アプローチを提供する。ＲＮＡオリゴの化学合成に比較して、本発明は実施するのが比較的迅速かつ容易である。
【０００６】
しかしながら、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたｓｉＲＮＡは化学的に合成されたＲＮＡオリゴと２つの点で異なる。第一に、天然に存在するｓｉＲＮＡと同一に、化学的に合成されたＲＮＡオリゴは５’一リン酸基を有する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたｓｉＲＮＡは５’三リン酸基を保持する。この三リン酸基の存在がｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写されたｓｉＲＮＡがＲＮＡ干渉を誘導することを無能にするかどうかは未知であった。
【０００７】
第二に、化学的に合成されたＲＮＡオリゴはとりわけイオン交換および逆相ＨＰＬＣを使用して高度に精製され、ここで、合成された化合物の純度および質がとりわけＮＭＲおよび質量分析を使用してさらに評価される。本発明においては、サイズ排除クロマトグラフィー、フェノール：クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を含んで成る単純な粗精製プロトコルを使用する。徹底的な精製プロトコルの省略がＲＮＡ媒介性阻害における「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」転写されたＲＮＡの有用性に影響を及ぼすことができるかどうかもまた、不確実であった。
【０００８】
驚くべきことに本発明は５’三リン酸基および粗精製が「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」転写されたＲＮＡのＲＮＡサイレンシング活性に影響を及ぼさずかつ平均的な分子生物学実験室における研究ツールとしてそれを利用可能にするｓｉＲＮＡ合成への代替の一アプローチを提供することを立証する。
【０００９】
規定された長さおよび配列の低分子一本鎖ＲＮＡの現存のｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成方法（非特許文献３）は低分子干渉ＲＮＡの合成に直接応用可能でなかった。問題は、ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列からの数個のヌクレオチドを転写物に転写する傾向があるという事実に存する。結果として、前述の方法を使用して生成される相補的一本鎖ＲＮＡ分子をアニーリングすることにより生じさせることができる標的特異的ｄｓＲＮＡは、５’端にプロモーター配列から転写されたヌクレオチドおよび３’端に該プロモーター配列から転写されたヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを含まなければならない。標的配列のｍＲＮＡにおいて、おそらく、５’端がプロモーター配列から転写されたヌクレオチドおよび３’端が該プロモーター配列から転写されたヌクレオチドに相補的なヌクレオチドよりなる規定された配列長の伸長が存在しないであろう。本発明は、プロモーター配列の鋳型鎖の５’端の１個もしくはそれ以上のヌクレオチドが標的特異的配列の一部であるヌクレオチドにより置き換えられる短縮されたＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を提供することによりこの問題を解消する。これらの置換はｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写の収量に影響を及ぼさないが、しかし、５’端がプロモーター配列から転写されたヌクレオチドおよび３’端が該プロモーター配列から転写されたヌクレオチドに相補的なヌクレオチドよりなる標的タンパク質のｍＲＮＡ中に、規定された配列長の最低１種の標的特異的配列が存在する可能性を増大させる。
【００１０】
これおよび本発明の他の局面を本明細書で下述することができる。
【非特許文献１】
Ｃａｐｌｅｎ，Ｎ．ら、２００１、ＰＮＡＳ（９８）９７４２−９７４７
【非特許文献２】
Ｅｌｂａｓｈｉｒ  Ｓ．ら、２００１、Ｎａｔｕｒｅ（４１１）４９４−４９８
【非特許文献３】
Ｍｉｌｌｉｇａｎ  Ｆ．ら、１９８７、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．（１５）８７８３−８７９８
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の要約
本発明は、ａ）鋳型で伸長されたセンスオリゴリボヌクレオチド産物が形成されるような反応混合物中でセンスの標的特異的オリゴヌクレオチド鋳型および鎖伸長酵素を組み合わせること；ｂ）鋳型で伸長されたアンチセンスオリゴリボヌクレオチド産物が形成されるような反応混合物中でアンチセンスの標的特異的オリゴヌクレオチド鋳型および鎖伸長酵素を組み合わせること；ならびにｃ）段階ａ）で得られるセンスオリゴリボヌクレオチド産物を段階ｂ）で得られる相補的アンチセンスオリゴリボヌクレオチド産物とハイブリダイズさせること、の段階を含んで成る短い二本鎖の標的特異的なＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成方法を提供する。
【００１２】
本発明のさらなる一態様において、鎖伸長酵素はＲＮＡポリメラーゼであり、また、段階ａ）およびｂ）のオリゴヌクレオチド鋳型は好ましくはｄｓＤＮＡよりなるＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含んで成る。より好ましい一態様において、ＲＮＡポリメラーゼはＴ７ポリメラーゼであり、また、段階ａ）およびｂ）のオリゴヌクレオチド鋳型は、場合によっては２もしくは３個の付加的なヌクレオチドを伴い伸長された標的特異的鋳型配列を伴い鋳型鎖の５’端で伸長されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含んで成る。
【００１３】
本発明は低分子干渉ＲＮＡの合成における特定の使用を見出す。従って標的特異的な短い二本鎖ＲＮＡの合成方法を提供することが本発明のさらなる一目的であり、ここで前記標的特異的な短い二本鎖ＲＮＡは、５’端にプロモーター配列から転写されたヌクレオチドおよび３’端にプロモーター配列から転写されたヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを含んで成ることをさらに特徴とする５０ヌクレオチド未満、好ましくは３０ヌクレオチド長未満、なおより好ましくは３０〜１２ヌクレオチド長である。
【００１４】
従って、本発明は、ａ）鋳型で伸長されたセンスオリゴリボヌクレオチド産物が形成されるような反応混合物中でセンスｓｉＲＮＡ鋳型を鎖伸長酵素と組み合わせること；ｂ）鋳型で伸長されたアンチセンスオリゴリボヌクレオチド産物が形成されるような反応混合物中でアンチセンスｓｉＲＮＡ鋳型を鎖伸長酵素と組み合わせること；ならびにｃ）段階ａ）で得られるセンスオリゴリボヌクレオチド産物を段階ｂ）で得られるアンチセンスオリゴリボヌクレオチド産物とハイブリダイズさせること；ここで、段階ａ）およびｂ）のｓｉＲＮＡ鋳型が標的特異的鋳型配列および２もしくは３個の付加的ヌクレオチドを伴い鋳型鎖の５’端で伸長された二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含んで成る、の段階を含んで成る低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の合成方法を提供する。好ましい一態様において鎖伸長酵素はＴ７  ＲＮＡポリメラーゼであり、また、ｓｉＲＮＡ鋳型は二本鎖Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列、好ましくは図１に示される短縮されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含んで成る。
【００１５】
本発明の方法を実施するためのキットならびに開示される方法のいずれかでの使用のための化合物を提供することが、本発明のさらなる一目的である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
詳細な記述
本発明は短い二本鎖標的特異的ＲＮＡの合成の分野に関し、そして鎖伸長酵素を使用するオリゴヌクレオチド鋳型のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写に基づく。
【００１７】
本明細書で使用されるところの標的特異的な短い二本鎖ＲＮＡは、特定の一タンパク質すなわち標的タンパク質をコードする配列の一部に一致する二本鎖ＲＮＡを指す。これらの配列は好ましくは５０ヌクレオチド未満、より好ましくは３０ヌクレオチド長未満、なおより好ましくは１５〜２５ヌクレオチド長である。特定の一態様において、標的特異的な短い二本鎖ＲＮＡは低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として無脊椎動物および脊椎動物系におけるＲＮＡ干渉で有用である。本明細書で使用されるところのｓｉＲＮＡは、３’端でオーバーハングする２もしくは３ヌクレオチドを伴う１２〜３０ヌクレオチドの短いｄｓＲＮＡ分子である。好ましい一態様において、ｓｉＲＮＡは３’端でオーバーハングする２ヌクレオチドを伴う１５〜２５ヌクレオチド長である。なおより好ましくは、ｓｉＲＮＡは３’端でオーバーハングする２ヌクレオチドを伴う１７〜２２ヌクレオチド長である。
【００１８】
ｄｓＲＮＡを得るためにセンスおよびアンチセンス双方のオリゴヌクレオチド鋳型が必要とされる。本明細書で使用されるところの「オリゴヌクレオチド鋳型」という用語は、いくつかの直接物理的過程において通常はある意味でそれに相補的な二次構造を作る（ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ）もととなる可能性のある構造を指す。現在の生物学ではワトソン−クリックの塩基対形成の規則（Ｔｈｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３版、アカデミック  プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、ロンドン、１９９９（ＩＳＢＮ  ０−１２−４３２５６５−３））によりそれに相補的な配列の合成を指図するヌクレオチド配列を指すことのみに使用される。これらの鋳型配列は好ましくは５０ヌクレオチド長未満であり、そして二本鎖、一本鎖もしくは部分的に一本鎖のいずれかのＤＮＡオリゴ鋳型であってよい。
【００１９】
オリゴヌクレオチド鋳型は、合成ＤＮＡ鋳型、または例えば原核生物クローニングベクター（ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１９）もしくはインヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＴＯＰＯクローニング系のようなＰＣＲクローニング系のようなベクターの一制限部位にクローン化された標的特異的配列から直鎖状にされたプラスミドＤＮＡとして生成される鋳型のいずれかであることができる。合成ＤＮＡ鋳型は当該技術分野で公知の技術により製造してよい。本発明の好ましい態様において、オリゴヌクレオチド鋳型はｄｓＤＮＡよりなるＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含んで成る部分的に一本鎖のＤＮＡオリゴ鋳型よりなる。本態様において、標的特異的な短い二本鎖ＲＮＡは、５’端にＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列から転写されたヌクレオチドおよび３’端に該プロモーター配列から転写されたヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを含んで成ることをさらに特徴とする。
【００２０】
本明細書で定義されるところの「鎖伸長酵素」はリボヌクレオシド５’三リン酸からＲＮＡポリマーを形成することが可能な酵素を指し；形成されるＲＮＡはＤＮＡ鋳型に相補的である。該酵素はＲＮＡ鎖の３’−ヒドロキシル端にモノヌクレオチド単位を付加し、そして従って鋳型として使用したＤＮＡ鎖に反平行の５’→３’の向きにＲＮＡを形成する。こうした鎖伸長酵素は、例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩのようなＤＮＡ依存性ポリメラーゼ；ＲＳＶおよびＡＭＶポリメラーゼのようなＲＮＡに指図されるＤＮＡポリメラーゼ；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮＡポリメラーゼのようなＤＮＡに指図されるＲＮＡポリメラーゼ；ＲＮＡ複製酵素としてもまた知られるバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼのようなＲＮＡに指図されるＲＮＡポリメラーゼ；もしくは細菌のポリヌクレオチドリン酸化酵素であることができる。
【００２１】
好ましい一態様において、鎖伸長酵素はＲＮＡポリメラーゼである。前記ＲＮＡポリメラーゼはＤＮＡ鋳型内の特異的開始部位の存在を必要とする。下で「ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列」と称される本開始部位はＲＮＡポリメラーゼがＤＮＡ鋳型に結合する部位である。それはまた開始シグナルとしてＲＮＡポリメラーゼにより認識されてＲＮＡを形成するための転写を開始する場所を示す部位でもある。
【００２２】
従って、本発明はポリメラーゼプロモーター配列がＲＮＡポリメラーゼにより認識されるｄｓＤＮＡよりなるＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含んで成るオリゴヌクレオチド鋳型を提供する。本明細書で使用されるところの「認識される」という用語は、開始部位へのＲＮＡポリメラーゼの結合に対する影響を全くもしくはほとんど伴わずかつ転写反応に対する影響を全くもしくはほとんど伴わずにプロモーター配列の一方もしくはいずれかの側で１個もしくはそれ以上のヌクレオチドだけ短くされた（ｓｈｏｒｔｅｎｅｄ）全部の短縮された（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を包含することを意図している。例えば、Ｍｉｌｌｉｇａｎら（Ｍｉｌｌｉｇａｎ  Ｆ．ら、１９８７、Ｎａｔｕｒｅ（１５）８７８３−８７９８）は、そのプロモーターが領域−１７ないし−１４および−３ないし＋６中の非鋳型鎖中のＤＮＡを必要とすると思われないことをＴ７  ＲＮＡポリメラーゼについて立証した。これらのヌクレオチドを除去することは転写反応にほとんど影響を有しないからである。また、位置＋２を越えたすなわち位置＋３ないし＋６の鋳型鎖の短縮は反応の収量にほとんど影響を有しない（Ｍｉｌｌｉｇａｎ  Ｆ．ら、１９８７、Ｎａｔｕｒｅ（１５）８７８３−８７９８）。かように得られる短縮されたＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列は「前記ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列」として包含されることを意味している。従って本発明の特定の一態様において、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列は１個もしくはそれ以上のヌクレオチドが該プロモーター配列の鋳型鎖の一方もしくはいずれかの側で欠失された短縮されたＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列よりなる。好ましくは、短縮されたＲＮＡポリメラーゼプロモーターは図１に示されるところの鋳型鎖の５’端の位置＋３ないし＋６で短縮されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列よりなる。
【００２３】
従って、短い二本鎖標的特異的ＲＮＡの合成方法を提供することが本発明の第一の目的である。該方法はａ）鋳型で伸長されたセンスオリゴリボヌクレオチド産物が形成されるような反応混合物中で標的特異的センスオリゴヌクレオチド鋳型および鎖伸長酵素を組み合わせること；ｂ）鋳型で伸長されたアンチセンスオリゴリボヌクレオチド産物が形成されるような反応混合物中で標的特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド鋳型および鎖伸長酵素を組み合わせること；ｃ）段階ａ）で得られるセンスオリゴリボヌクレオチド産物を段階ｂ）で得られるアンチセンスオリゴリボヌクレオチド産物とハイブリダイズさせること、の段階を含んで成る。
【００２４】
本発明の方法の鎖伸長酵素は、好ましくはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼおよびＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼよるなる群から選択されるＲＮＡポリメラーゼである。好ましい一態様においてＲＮＡポリメラーゼはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼよりなる。
【００２５】
従って、本発明の方法で使用されるオリゴヌクレオチド鋳型はｄｓＤＮＡよりなるＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含んで成り、ここでＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列はＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼおよびＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼよりなる群から選択されるＲＮＡポリメラーゼにより認識される。好ましい一態様においてＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列はＴ７  ＲＮＡポリメラーゼにより認識される。より好ましい一態様において、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列は図１に示されるところの短縮されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列よりなる。
【００２６】
さらなる一態様において、本発明の方法で使用されるオリゴヌクレオチド鋳型は、場合によっては２もしくは３個の付加的なヌクレオチドを伴い伸長された標的特異的鋳型配列を伴い鋳型鎖の５’端で伸長された二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含んで成る部分的に二本鎖のＤＮＡオリゴ鋳型であることを特徴とする。より好ましい一態様において、標的特異的鋳型配列は５’端にプロモーター配列から転写されたヌクレオチドおよび３’端にプロモーター配列からのヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを含んで成る。オリゴヌクレオチド鋳型が図１に示される短縮されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含んで成る特定の態様において、標的特異的鋳型配列は５’端に２個のグアノシン（ｇ）ヌクレオチドおよび３’端に２個のシトシンヌクレオチドを含んで成る。
【００２７】
従って、ａ）鋳型で伸長されたセンスオリゴリボヌクレオチド産物が形成されるような反応混合物中でセンスｓｉＲＮＡ鋳型を鎖伸長酵素と組み合わせること；ｂ）鋳型で伸長されたアンチセンスオリゴリボヌクレオチド産物が形成されるような反応混合物中でアンチセンスｓｉＲＮＡ鋳型を鎖伸長酵素と組み合わせること；ならびにｃ）段階ａ）で得られるセンスオリゴリボヌクレオチド産物を段階ｂ）で得られるアンチセンスオリゴリボヌクレオチド産物とハイブリダイズさせ；それにより段階ａ）およびｂ）のｓｉＲＮＡ鋳型は該鋳型の５’端に標的特異的鋳型配列および２もしくは３個の付加的なヌクレオチドを伴い伸長された二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含んで成る、の段階を含んで成る低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の合成方法を提供することが本発明の第二の態様である。好ましい一態様において、ｓｉＲＮＡの合成で使用される鎖伸長酵素は好ましくはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼもしくはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼから選択されるＲＮＡポリメラーゼよりなる。従って、本発明の方法で使用されるｓｉＲＮＡ鋳型はＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼおよびＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼよりなる群から選択されるＲＮＡポリメラーゼにより認識されるＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含んで成る。より好ましい一態様において鎖伸長酵素はＴ７  ＲＮＡポリメラーゼである。従って、好ましい一態様においてｓｉＲＮＡ鋳型のＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列はＴ７  ＲＮＡポリメラーゼにより認識される。さらなる一態様において、ｓｉＲＮＡ鋳型は図１に示されるところの二本鎖の短縮されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含んで成り、ここで前記短縮されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列は本発明の方法の鋳型鎖の５’端で伸長され、またここで標的特異的鋳型配列は５’端に該プロモーター配列から転写されたヌクレオチドおよび３’端に該プロモーター配列から転写されたヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを含んで成る。特定の一態様において、本発明の方法で使用されるｓｉＲＮＡ鋳型は図１に示されるところの二本鎖の短縮されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含んで成り、ここで前記短縮されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列は本発明の方法の鋳型鎖の５’端で伸長され、またここで標的特異的鋳型配列は５’端に２個のグアノシン（ｇ）ヌクレオチドおよび３’端に２個のシトシン（ｃ）ヌクレオチドを含んで成る。
【００２８】
鋳型で伸長されたオリゴリボヌクレオチド産物を得るための前述の方法のいずれかにおける反応条件は当該技術分野で公知である。本質的に、ＲＮＡを生じさせるための酵素的転写の出発原料は、ＲＮＡポリメラーゼ酵素活性に至適の反応緩衝液中のＤＮＡ鋳型、ＲＮＡポリメラーゼ酵素ならびに４種の必要とされるリボヌクレオチド塩基すなわちアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルのヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）である。例えばＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のための反応混合物は、典型的にはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（０．０５ｍｇ／ｍｌ）、オリゴヌクレオチド鋳型（１μＭ）、各ＮＴＰ（４ｍＭ）およびＭｇ２＋（ポリメラーゼのコファクター）を供給するＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）を含有する。本混合物を３７℃およびｐＨ８．１（例えば１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液中）で数時間インキュベートする（Ｍｉｌｌｉｇａｎ  Ｊ．とＵｈｌｅｎｂｅｃｋ  Ｏ．、１９８９、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ（１８０）５１−６２）。ＭＥＧＡ  ｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔＴＭ  Ｔ７キット（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ））のような前述の成分を含んで成るキットが商業的に入手可能である。
【００２９】
上で挙げられた方法のいずれかからオリゴリボヌクレオチド産物を得るための精製プロトコルは当該技術分野で公知であり、そしてとりわけゲル電気泳動、サイズ排除クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動およびＨＰＬＣを含んで成る。ゲル電気泳動は典型的に反応混合物から完全長の転写物を精製するのに使用されるが、しかし本技術はより大スケールでの生産に対し改善可能でない。本発明の好ましい一態様において、オリゴリボヌクレオチド産物を得るための精製手段は、場合によってはフェノール：クロロホルム：イソアミル抽出およびエタノール沈殿と組合せられたセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５樹脂のようなサイズ排除クロマトグラフィーよりなる。
【００３０】
本発明の方法を実施するためのキットを提供することが本発明の第三の目的である。一態様において、該キットは以下の成分ａ）標的特異的センスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド鋳型を設計するための説明書；ｂ）鎖伸長酵素；ｃ）転写緩衝液；ｄ）４種の必要とされるリボヌクレオチド塩基のヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）；ｅ）センスおよびアンチセンスオリゴリボヌクレオチド産物を得るための精製手段の１種もしくはそれ以上を含んで成る。本発明の好ましい一態様において、キット中で提供される鎖伸長酵素はＲＮＡポリメラーゼ、好ましくはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼおよびＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼよりなる群から選択されるＲＮＡポリメラーゼよりなる。なおより好ましくは、本発明のキット中で提供される鎖伸長酵素はＴ７  ＲＮＡポリメラーゼよりなる。
【００３１】
本発明のキット中で提供される分離手段は一般に反応混合物からオリゴリボヌクレオチド産物を得ることが当該技術分野で既知の精製プロトコルを指し、かつ、とりわけゲル電気泳動、サイズ排除クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動およびＨＰＬＣを含んで成る。本発明の好ましい一態様において、本発明のキット中で提供される精製手段はサイズ排除クロマトグラフィーカラムもしくはセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５樹脂のような樹脂よりなる。
【００３２】
標的特異的センスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド鋳型を設計するための説明書は本発明の図１に例示される方法を企図する。本質的に、該方法は、以下の段階；
１）標的遺伝子のコーディング配列内に配置されかつ以下の配列５’−ｘｘ（ｎ１２−３０）ｙｙ−３’［式中ｘはプロモーターから転写されたヌクレオチドを指し、ｙはプロモーター配列から転写されたヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを指し、そしてｎ１２−３０は１２ないし３０ヌクレオチドのいずれかのオリゴヌクレオチドを指す］を有する標的特異的配列を探す
２）場合によっては２個の付加的なヌクレオチドを伴い伸長された段階１）で配置された標的特異的配列の相補物オリゴヌクレオチド配列を伴い鋳型鎖の５’端で伸長された本発明の二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含んで成るセンスオリゴヌクレオチド鋳型を設計する。
３）場合によっては２個の付加的なヌクレオチドを伴い伸長された段階１）で配置された標的特異的配列の逆オリゴヌクレオチド配列を伴い鋳型鎖の５’端で伸長された本発明の二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含んで成るアンチセンスオリゴヌクレオチド鋳型を設計する
を含んで成る。
【００３３】
好ましい一態様において本発明の方法は鎖伸長酵素としてＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用する。前記態様において、標的特異的センスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド鋳型の設計方法は、以下の段階；
１）標的遺伝子のコーディング配列内に配置されかつ以下の配列５’−ｇｇ（ｎ１２−３０）ｃｃ−３’を有する標的特異的配列を探す；
２）場合によっては２個の付加的なヌクレオチドを伴い伸長された以下の配列
５’ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ
３’ＡＴＴＡＴＧＣＴＧＡＧＴＧＡＴＡＴｃｃ（ｎ相補物）１２−３０ｇｇ［式中（ｎ相補物）１２−３０は段階１）で配置された標的特異的配列の相補物オリゴヌクレオチド配列を指す］を有するセンスオリゴヌクレオチド鋳型を設計する；ならびに
３）場合によっては２個の付加的なヌクレオチドを伴い伸長された以下の配列
５’ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ
３’ＡＴＴＡＴＧＣＴＧＡＧＴＧＡＴＡＴｃｃ（ｎ逆）１２−３０ｇｇ［式中（ｎ逆）１２−３０は段階１）で配置された標的特異的配列の逆オリゴヌクレオチド配列を指す］を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド鋳型を設計する
を含むことができる。
【００３４】
特定の一態様において本発明の方法は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の合成に使用される。前記態様において標的特異的センスおよびアンチセンスｓｉＲＮＡ鋳型の設計方法は、以下の段階；
１）標的遺伝子のコーディング配列内に配置されかつ以下の配列５’−ｘｘ（ｎ１５−３０）ｙｙ−３’［式中ｘはプロモーターから転写されたヌクレオチドを指し、ｙはプロモーター配列から転写されたヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを指し、そしてｎ１５−３０は１５ないし３０ヌクレオチドのいずれかのオリゴヌクレオチドを指す］を有する標的特異的配列を探す；
２）２個の付加的なヌクレオチド、好ましくは２個のアデニン残基を伴い伸長される段階１）で配置された標的特異的配列の相補物オリゴヌクレオチド配列を伴い鋳型鎖の５’端で伸長された本発明の二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含んで成るセンスオリゴヌクレオチドｓｉＲＮＡ鋳型を設計する；
３）２個の付加的なヌクレオチド、好ましくは２個のアデニン残基を伴い伸長された段階１）で配置された標的特異的配列の逆オリゴヌクレオチド配列を伴い鋳型鎖の５’端で伸長された本発明の二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含んで成るアンチセンスオリゴヌクレオチドｓｉＲＮＡ鋳型を設計する
を含むことができる。
【００３５】
ｓｉＲＮＡの合成方法が鎖伸長酵素としてＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを利用する特定の態様において、標的特異的センスおよびアンチセンスｓｉＲＮＡ鋳型の設計方法は、以下の段階；
１）標的遺伝子のコーディング配列内に配置されかつ以下の配列５’−ｇｇ（ｎ１５−３０）ｃｃ−３’を有する標的特異的配列を探す；
２）以下の配列
５’ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ
３’ＡＴＴＡＴＧＣＴＧＡＧＴＧＡＴＡＴｃｃ（ｎ相補物）１５−３０ｇｇａａ［式中（ｎ相補物）１５−３０は段階１）で配置された標的特異的配列の相補物オリゴヌクレオチド配列を指す］を有するセンスオリゴヌクレオチドｓｉＲＮＡ鋳型を設計する；ならびに
３）以下の配列
５’ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ
３’ＡＴＴＡＴＧＣＴＧＡＧＴＧＡＴＡＴｃｃ（ｎ逆）１５−３０ｇｇａａ［式中（ｎ逆）１５−３０は段階１）で配置された標的特異的配列の逆オリゴヌクレオチド配列を指す］を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドｓｉＲＮＡ鋳型を設計する
を含むことができる。
【００３６】
従って、本発明は短い二本鎖標的特異的ＲＮＡの合成のためのキットを提供し、該キットは以下の成分；ａ）標的特異的センスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド鋳型を設計するための説明書；ｂ）鎖伸長酵素；ｃ）転写緩衝液；ｄ）４種の必要とされるリボヌクレオチド塩基のヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）；ｅ）センスおよびアンチセンスオリゴリボヌクレオチド産物を得るための精製手段の最低１種を含んで成る。
【００３７】
従って、さらなる一態様において本発明は低分子干渉ＲＮＡの合成のためのキットを提供し、該キットは以下の成分；ａ）標的特異的センスおよびアンチセンスｓｉＲＮＡ鋳型を設計するための説明書；ｂ）鎖伸長酵素；ｃ）転写緩衝液；ｄ）４種の必要とされるリボヌクレオチド塩基のヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）；ｅ）センスおよびアンチセンスオリゴリボヌクレオチド産物を得るための精製手段の最低１種を含んで成る。
【００３８】
短い二本鎖ＲＮＡの開示されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成方法のいずれかのための手段を提供することもまた本発明の一目的である。従って、本発明は；
ｉ）標的特異的センスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド鋳型の設計方法
ｉｉ）短い二本鎖ＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成方法での使用のための本発明の鎖伸長酵素
ｉｉｉ）センスおよびアンチセンスオリゴリボヌクレオチド産物を得るための精製手段。
ｉｖ）センスおよびアンチセンスオリゴリボヌクレオチド産物が本発明の鎖伸長酵素を使用して標的特異的センスおよびアンチセンス鋳型から形成されるような反応混合物のための試薬
を提供する。
【００３９】
細胞中での標的遺伝子の発現の阻害方法において本発明の方法により得ることができるｓｉＲＮＡを使用することが本発明のさらなる一目的である。該方法は本発明の方法により得ることができるｓｉＲＮＡの細胞中への導入を含んで成る。
【００４０】
標的遺伝子は、細胞（すなわち細胞遺伝子）、内在性遺伝子（すなわちゲノム中に存在する細胞遺伝子）、トランスジーン（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）（すなわち細胞のゲノム中の異所性部位に挿入された遺伝子構築物）もしくは該細胞が由来する生物体を感染させることが可能である病原体からの遺伝子由来の遺伝子であってよい。特定の標的遺伝子および送達される二本鎖ＲＮＡ物質の用量に依存して、本方法は標的遺伝子の機能の部分的もしくは完全な喪失を提供するかもしれない。
【００４１】
標的遺伝子をもつ細胞はいかなる生物体由来であってももしくはそれに含有されていてもよい。該生物体は植物、動物、原生動物、細菌、ウイルスもしくは真菌であってよい。植物は単子葉、双子葉もしくは裸子植物であってよく；動物は脊椎動物もしくは無脊椎動物であってよい。標的遺伝子を有する細胞は、生殖系列もしくは体細胞性、全能性もしくは多能性、分割もしくは非分割、実質もしくは上皮、不死化もしくは形質転換されたなどからであってよい。細胞は幹細胞もしくは分化細胞からであってよい。分化した細胞型は脂肪細胞、線維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、ニューロン、グリア、血球、巨核球、リンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、白血球、顆粒球、ケラチノサイト、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞および内分泌もしくは外分泌腺の細胞を包含する。
【００４２】
本発明の方法により得ることができる単離されたＲＮＡは標的特異的な短い二本鎖ＲＮＡよりなり、ここで前記標的特異的な短い二本鎖ＲＮＡは５’端にプロモーター配列から転写されたヌクレオチドおよび３’端にプロモーター配列から転写されたヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを含んで成ることを特徴とする５０ヌクレオチド未満、好ましくは３０ヌクレオチド長未満、なおより好ましくは３０〜１２ヌクレオチドであり、好ましくは、プロモーター配列から転写されるヌクレオチドの数およびプロモーター配列から転写されるヌクレオチドに相補的なヌクレオチドの数は２、３もしくは４ヌクレオチド、より好ましくは２ヌクレオチドよりなる。
【００４３】
本発明の方法により得ることができる短い二本鎖ＲＮＡは、場合によっては２もしくは３個の付加的なヌクレオチドを伴い３’端で伸長され、そして、本発明のさらなる一態様において以下のセンス配列５’−ｘｘ（ｎ１２−３０）ｙｙ−３’［式中ｘはプロモーター配列から転写されたヌクレオチドを指し、ｙはプロモーター配列から転写されたヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを指し、またｎ１２−３０は１２ないし３０ヌクレオチドのいずれかのオリゴヌクレオチドを指す］を有するとして表すことができる。特定の一態様において、該短い二本鎖ＲＮＡはセンス配列として５’−ｇｇ（ｎ１５−３０）ｃｃ−３’［式中ｇは（図１に示されるところの）短縮されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列から転写されたヌクレオチドグアノシンを指し、ｃは（図１に示されるところの）短縮されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列から転写されたヌクレオチドに相補的なヌクレオチドシトシンを指し、またｎ１５−３０は１５ないし３０ヌクレオチドのいずれかのオリゴヌクレオチドを指す］を有する。
【００４４】
ＲＮＡは細胞中に直接導入してよい（すなわち細胞内に）か；もしくは腔、間質腔に細胞外で、生物体の循環中に導入されてよいか、経口で導入されてよいか、またはＲＮＡを含有する溶液中に生物体を浸すことにより導入してもよい。経口導入方法は、生物体の食物とのＲＮＡの直接混合、ならびに食物として使用される種をＲＮＡを発現するように工作しその後影響を及ぼされるべき生物体に供給する工作されたアプローチを包含する。例えば、ＲＮＡを植物に噴霧してよいか、または、植物を感染させることが既知の病原体のいくつかもしくは全部を殺すのに十分な量のＲＮＡを発現するように植物を遺伝子的に工作してもよい。
【００４５】
核酸の物理的導入方法、例えば細胞中への直接の注入もしくは生物体中への細胞外注入もまた使用してもよい。われわれは、本明細書で、ＨｅＬａ細胞において細胞の外側に導入された二本鎖ＲＮＡが遺伝子発現を阻害することを開示する。
【００４６】
血管もしくは血管外循環、血液もしくはリンパ系、篩部、根および脳脊髄液はＲＮＡを導入してよい部位である。組換え構築物からＲＮＡを発現するトランスジェニック生物体は、適切な生物体由来の接合子、胚幹細胞もしくは別の多能性細胞に該構築物を導入することにより生じられるかもしれない。
【００４７】
核酸の物理的導入方法は、ＲＮＡを含有する溶液の注入、ＲＮＡにより被覆された粒子による砲撃、細胞もしくは生物体をＲＮＡの溶液に浸すことまたはＲＮＡの存在下での細胞膜の電気穿孔を包含する。ウイルス粒子中にパッケージされたウイルス構築物が細胞中への発現構築物の効率的導入および該発現構築物によりコードされるＲＮＡの転写の双方を達成するとみられる。脂質媒介性担体輸送、リン酸カルシウムのような化学物質媒介性輸送などのような細胞への核酸の当該技術分野で既知の他の導入方法を使用してもよい。従って、ＲＮＡは以下の活動すなわち細胞によるＲＮＡ取込みを高める、二重鎖のアニーリングを促進する、アニーリングされた鎖を安定化するもしくは標的遺伝子の阻害を別の方法で増大させるの１種もしくはそれ以上を実施する成分とともに導入してよい。
【００４８】
本発明は疾患の処置もしくは予防のために細胞中にＲＮＡを導入するのに使用してよい。例えばｄｓＲＮＡを癌細胞もしくは腫瘍に導入しそしてそれにより発癌性／腫瘍原性表現系の維持に必要とされる遺伝子の遺伝子発現を阻害してよい。疾患もしくは他の病理学を予防するために、該疾患／病状の開始もしくは維持に必要とされる標的遺伝子を選択してよい。従って、さらなる一態様において、本発明は標的遺伝子の遺伝子発現を阻害するための本発明の方法により得ることができる短い二本鎖ＲＮＡおよび適切な担体を含んで成る製薬学的組成物を提供する。該組成物はいずれかの適する方法で、例えば注入により、経口、眼内、局所、直腸適用などにより投与してよい。担体はいかなる適する製薬学的担体であってよく、好ましくは、標的細胞に進入するようにＲＮＡ分子の効力を増大させることが可能である担体、例えばリポソーム、天然のウイルスキャプシド、または化学的にもしくは酵素的に製造される人工的キャプシドもしくはそれ由来の構造によりを使用する。
【００４９】
本発明の別の有用性は、以前に未知の機能の標的遺伝子の活性を阻害するための二本鎖ＲＮＡの使用を含んで成る生物体における遺伝子機能の同定方法であることができる。伝統的遺伝子スクリーニングによる突然変異体の時間のかかるかつ労力を要する単離の代わりに、ゲノム機能解析は標的遺伝子活性の量を低下させかつ／もしくはそのタイミングを変えるために本発明を使用することにより特徴づけられていない遺伝子の機能の決定を予見することができる。本発明は、製薬の潜在的標的の決定、発達に関連する正常および病理学的事象の理解、出生後の発達／加齢の原因となるシグナル伝達経路の決定などに使用することができる。ヒト、マウス、酵母、キイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）およびＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）ゲノムの全配列を包含するゲノムおよび発現された遺伝子供給源からのヌクレオチド配列情報獲得の増大する速度を本発明と結び付けて生物体（例えば線虫）における遺伝子機能を決定することができる。異なる生物体が特定のコドンを使用することの選好、関連遺伝子産物の配列データベースの検索、ヌクレオチド配列が由来する物理的地図との遺伝形質の連関地図の相関および人工知能の方法を使用して、こうした配列決定プロジェクトで獲得したヌクレオチド配列から推定の読取り枠が定義されるかもしれない。
【００５０】
単純なアッセイが発現配列タグ（ＥＳＴ）から入手可能な部分配列に従った遺伝子発現を阻害するはずであることができる。成長、発達、代謝、疾患耐性もしくは他の生物学的過程における機能的変化がＥＳＴ遺伝子産物の正常の役割を示すことができる。
【００５１】
従って、細胞中へのＲＮＡの導入を含んで成る細胞中での標的遺伝子の発現の阻害方法を提供することが本発明の一目的であり、ここで前記ＲＮＡは標的特異的な短い二本鎖ＲＮＡを含んで成り、ここで前記標的特異的な短い二本鎖ＲＮＡは５’端に該プロモーター配列から転写されたヌクレオチドおよび３’端にプロモーター配列から転写されたヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを含んで成ることを特徴とする５０ヌクレオチド未満、好ましくは３０ヌクレオチド長未満、なおより好ましくは３０〜１２ヌクレオチド長であり、ここで前記プロモーター配列はＲＮＡポリメラーゼにより認識されている。さらなる一態様において、該プロモーター配列はＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼもしくはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼよりなる群から選択されるＲＮＡポリメラーゼにより認識されている。
【００５２】
本発明は、後に続く実験の詳細への参照によりより良好に理解されるであろうが、しかし当業者はこれらがその後に続く請求の範囲でより完全に既述されるところの本発明の具体的説明のみであることを容易に認識するであろう。加えて、本明細を通じて多様な刊行物が引用される。これらの刊行物の開示はこれにより本発明が属する従来技術をより完全に既述するために本明細に引用することにより組み込まれる。
【実施例１】
【００５３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたＥＧＦＰおよびＧＬ３特異的な短いｄｓＲＮＡはヒト細胞中でＲＮＡ干渉を誘導する
材料および方法
プラスミド構築物
ルシフェラーゼ＋はプラスミドｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））から発現させた。ＥＧＦＰは哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））のＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩ部位に指向性に（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌｌｙ）連結されたｐＥＧＦＰ（クロンテック（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ））からのＥＧＦＰ遺伝子を含有するＥＧＦＰ／ｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴから発現させた。
ｓｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写およびハイブリダイゼーション
オリゴ鋳型鎖は２分間沸騰させかつ２〜３時間にわたって室温にゆっくり冷却することにより１０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ９．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中でセンスＴ７  プロモーター配列（５’ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ）にハイブリダイズさせた。転写は製造元の説明書に従ってＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔＴＭＴ７キット（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ））を使用して実施した。ｓｉＲＮＡ鎖はＧ−２５スピンカラムで精製し、重相ロックゲル（Ｈｅａｖｙ  Ｐｈａｓｅ−Ｌｏｃｋ  Ｇｅｌ）（エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ））を使用してフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）抽出し、そして−８０℃で一夜エタノール沈殿した。相補的ｓｉＲＮＡ鎖を、２分間煮沸しかつ２〜３時間にわたって室温にゆっくり冷却することにより１ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０中でハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは非変性２０％ポリアクリルアミドＴＢＥゲル上でｄｓ−およびｓｓ−ｓｉＲＮＡを泳動することにより評価した。
細胞系およびトランスフェクション
ＨｅＬａ細胞は１．８ｍＭ  ｌ−グルタミン、９％ＦＢＳおよび４５Ｕ／ｌペニシリン／ストレプトマイシンで補充した高ブドウ糖およびｌ−グルタミンを含むＤＭＥＭ（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中で成長させた。細胞をＥｌｂａｓｈｉｒら（２００１）に記述されたものに類似の様式でトランスフェクトした。トランスフェクション２４時間前に細胞をトリプシン処理しそして抗生物質を欠く成長培地で３×１０５細胞／ｍｌに希釈した。０．５ｍｌの細胞を２４ウェルプレートの各ウェルに接種した。細胞は別の方法で示される場合を除き製造元の説明書に従ってリポフェクタミン［Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ］ＴＭ２０００（ＬＦ２０００；インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を使用して１μｇのＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌもしくはＥＧＦＰ／ｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴレポーター構築物および５０ｐｍｏｌの一本鎖もしくは２５ｐｍｏｌの二本鎖ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。具体的には、われわれは抗生物質を欠く血清を含まない培地４８μｌ中でウェルあたり２μｌのＬＦ２０００を使用した。希釈されたＬＦ２０００を５０μｌの総容量に同一培地で希釈されたレポーターおよび／もしくはｓｉＲＮＡと混合する前に１分間室温で前インキュベートした。その後、複合体を細胞に添加する前に２０分間室温でインキュベートした。ＥＧＦＰおよびＧＬ３レポーター遺伝子アッセイを２４時間後に実施した。ＪＮＫ２α１  ｓｉＲＮＡ実験およびＧＬ３  ｓｉＲＮＡ用量応答実験に６ウェルプレートを使用した。細胞数を４倍および試薬量を５倍増大させた。ＪＮＫ２α１  ｓｉＲＮＡ実験には細胞をＲＮＡ単離のため収集し、また、タンパク質抽出はトランスフェクションおよそ４８時間後であった。
レポーター遺伝子アッセイ
ＥＧＦＰでトランスフェクトした細胞のＦＡＣＳアッセイはＦＡＣＳｃａｎ（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））を使用して実施した。細胞をトリプシン処理しそしてＦＡＣＳ固定溶液（ＰＢＳ＋１％ホルムアルデヒド）中への再懸濁前にＰＢＳで洗浄した。トランスフェクション効率を、水でトランスフェクトしたサンプルをＥＧＦＰ／ｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴでトランスフェクトしたものと比較することにより推定し、そして典型的には７５〜９０％であった。転写されたもしくは合成のｓｉＲＮＡにより誘導されるＲＮＡｉの程度は、コトランスフェクトしたｓｉＲＮＡを伴うもしくは伴わないサンプル中の平均ＧＦＰ蛍光の変化から推定した。
【００５４】
ルシフェラーゼアッセイのために細胞をトリプシン処理し、そして１００μｌのアリコートを白色９６ウェル組織培養プレート中の三重のウェルに移した。アッセイは、製造元の説明書に従ってルック−スクリーン［Ｌｕｃ−Ｓｃｒｅｅｎ］ＴＭシステム（アプライド  バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））ならびにトップカウント−ＮＸＴ［ＴｏｐＣｏｕｎｔ−ＮＸＴ］ＴＭマイクロプレートシンチレーションおよびルミネセンスカウンター（パッカード（Ｐａｃｋａｒｄ））を使用して実施した。
ノーザンおよびウェスタンブロッティング
全ＲＮＡは製造元の説明書に従ってＲＮイージーミニキット（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ）（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を使用しておよそ１０６ＨｅＬａ細胞のサンプルから調製した。サンプルを製造元の説明書に従ってプレキャストＭＯＰＳラチチュード（Ｌａｔｉｔｕｄｅ）ＲＮＡアガロースゲル（バイオウイタッカー  モレキュラー  アプリケーションズ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ））上で泳動しそしてハイボンド（Ｈｙｂｏｎｄ）−ＸＬナイロンメンブレン（ＡＰ  バイオテック（ＡＰ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））に転写した。ＤＮＡプローブは製造元の説明書に従ってレディプライム（Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ）ＩＩシステム（ＡＰ  バイオテック（ＡＰ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））を使用して作成した。ハイブリダイゼーションは製造元の説明書に従ってラピッド−ハイブ（Ｒａｐｉｄ−Ｈｙｂ）溶液（ＡＰ  バイオテック（ＡＰ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））中で実施した。
【００５５】
核および細胞質のタンパク質抽出物は、ロイペプチン、アプロチニンおよびペプスタチンの代わりにコンプリート  プロテアーゼ  インヒビターカクテル（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ）（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））を用い、Ｇｏｒｄｏｎ（１９９１）に既述される方法により作成した。
【００５６】
抽出物をレインボウ（Ｒａｉｎｂｏｗ）タンパク質マーカー（ＡＰ  バイオテック（ＡＰ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））とともに４〜２０％ＳＤＳポリアクリルアミドミニゲル（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））上で泳動し、そして０．２μｍトランスブロット（Ｔｒａｎｓｂｌｏｔ）ニトロセルロースメンブレン（バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ））上に電気ブロッティングした。ブロットをＰＢＳ＋０．０５％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０中ですすぎ、そして５％粉乳を含むＰＢＳ／トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０中１５０倍希釈されたＪＮＫ２  Ｄ２マウスモノクローナル抗体（サンタ  クルズ  バイオテック（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））とともに４℃で一夜インキュベートした。ブロットはその後、３０００倍のＨＲＰ結合ヤギ抗マウス抗体（バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ））との４５分のインキュベーション前にＰＢＳ／トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０中で３回洗浄した。もう３回の洗浄およびＰＢＳ／トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０中の３０分のインキュベーションをＥＣＬシステム（ＡＰ  バイオテック（ＡＰ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））による検出前に実施した。
結果
ＲＮＡｉは２個の３’でオーバーハングするヌクレオチドを除き二本鎖であるｓｉＲＮＡを使用して以前に立証されている（Ｅｌｂａｓｈｉｒら  ２００１；Ｃａｐｌｅｎら  ２００１）。複数の細胞標的に対する多様なｓｉＲＮＡを比較的迅速かつ安価に創製するために、われわれはｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写技術を使用して分子を生成するためのスキームを設計した。
【００５７】
Ｍｉｌｌｉｇａｎら（１９８７）はＴ７  ＤＮＡポリメラーゼによる転写のための部分的に一本鎖のＤＮＡオリゴ鋳型の使用を既述している。標準的Ｔ７最小プロモーターは３’端に３個のグアノシンヌクレオチドを包含し、これらは転写物の最初の３塩基として組み込まれる。しかしながら第三のグアノシンは通常ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写収量の大きな低減を伴わずに他のヌクレオチドで置き換えられることができる（Ｍｉｌｌｉｇａｎら  １９８７）。従って、この方法により製造されるｓｉＲＮＡは２個の５’グアノシンヌクレオチドを包含するはずである。２個の相補的シトシンヌクレオチドが、他方の鎖上の５’グアノシンと塩基対形成するために各ｓｉＲＮＡ鎖の３’端近くに必要とされる。この様式で生じらされる所定長さのｓｉＲＮＡはｍＲＮＡ中で平均２５０ヌクレオチドごとにおよそ１回出現する配列を標的とすることが可能であるはずである。
【００５８】
われわれは上の束縛を念頭におきつつＤＮＡオリゴ鋳型を設計した（図１）。各鋳型を使用してｓｉＲＮＡの一方の鎖を転写する。鎖はセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５サイズ排除カラムの通過、フェノール：クロロホルム抽出およびエタノール沈殿により粗精製する。その後、鎖をアニーリング緩衝液に再懸濁しそして煮沸および緩徐な冷却によりハイブリダイズさせる。
【００５９】
われわれのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写されたｓｉＲＮＡは以前に使用された化学的に合成された別種と２つの点で異なる。第一に、全部の他の報告されたｓｉＲＮＡは高度に精製されている。第二に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡは５’三リン酸基を保持する。天然のＲＮＡｉ機構の一部としてｉｎ  ｖｉｖｏで産生されたｓｉＲＮＡ種と同様、ｓｉＲＮＡを作成するのに使用された化学的に合成されたＲＮＡオリゴヌクレオチドは５’一リン酸を運搬していた。これらの差異がわれわれのｓｉＲＮＡがＲＮＡｉを誘導することを無能にするかどうかを決定するために、われわれは最初に２種のレポーター遺伝子ＥＧＦＰおよびＧＬ３を標的とするよう設計された二本鎖ｓｉＲＮＡを試験した（図２および３）。最低３回の独立した実験からの結果の平均および標準誤差を示す（図２Ｂ、図３Ｂ）。
【００６０】
転写されたＧＬ３  ｄｓ  ｓｉＲＮＡ  １はコトランスフェクトしたｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌレポータープラスミドからのルシフェラーゼ活性をおよそ５倍だけ低下させた一方、２倍分子濃度のアンチセンス鎖単独は影響を有しなかった。類似の結果が化学的に合成されたＧＬ３  ｄｓ  ｓｉＲＮＡ（ｄｓ１  ＲＮＡオリゴ）で観察された。第二の転写されたｓｉＲＮＡはより控えめな影響を有した。第三の転写されたｓｉＲＮＡは強い影響を有した一方、有意の活性はアンチセンス鎖単独からもまた見られた。二本鎖種からの影響の強さは用量依存性であり（図２Ｃ）かつ定常状態のＲＮＡレベルを改変する。ＥＧＦＰ  ｄｓ  ｓｉＲＮＡ  ２もまたルシフェラーゼ活性に対し控えめな影響を有した（図２Ｂ）。しかしながらこの影響は非特異的であるようであり、また、増大する用量で制限された応答を示す。
【００６１】
同一の転写されたＥＧＦＰ  ｄｓ  ｓｉＲＮＡ  ２はＥＧＦＰ／ｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴレポーターでコトランスフェクトした細胞中のＧＦＰ蛍光を強く低下させた（図３Ｂ）。はるかにより控えめな影響が、センスもしくはアンチセンス鎖単独または化学的に合成されたｓｉＲＮＡ（ＥＧＦＰ  ｄｓ１  ＲＮＡオリゴ）もしくはその構成要素部分から明らかであった。ＧＦＰ蛍光は非特異的ＧＬ３  ｄｓ  ｓｉＲＮＡ  ３により影響を及ぼされなかった。
【００６２】
上で挙げられたｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写された（ＩＶＴ）ルシフェラーゼｄｓ  ｓｉＲＮＡは異なる程度までルシフェラーゼ活性の阻害を生じた。ＲＮＡｉ活性の陽性対照としてわれわれは化学的に合成されたルシフェラーゼｄｓ  ｓｉＲＮＡを使用した。われわれの方法で、コトランスフェクトしたｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌレポータープラスミドからのルシフェラーゼ活性は合成ｄｓ  ｓｉＲＮＡによりおよそ５倍低下された。全部の実験のトランスフェクション効率は９１と９５％との間で変動した。１種のＩＶＴ−ルシフェラーゼｄｓ  ｓｉＲＮＡ（ＧＬ３  ｄｓ  ｓｉＲＮＡ  １）はルシフェラーゼ活性を７８％低下させた一方、ｄｓ  ｓｉＲＮＡの２倍のモル濃度のアンチセンスＲＮＡ鎖単独は影響を有しなかった。われわれが試験した第二のＩＶＴ−ｓｉＲＮＡ（ＧＬ３  ｄｓ  ｓｉＲＮＡ  ２）はより控えめな影響を有した（３６％阻害）。第三のＩＶＴ−ｓｉＲＮＡは強い影響（８２％阻害）を有した一方、有意の活性がアンチセンスＲＮＡ鎖単独（５５％阻害）からもまたみられ、結果を混乱させた。それぞれそれらについて個別に使用されたモル濃度の１／３の３種のＩＶＴ−ｓｉＲＮＡの混合物は相乗的なものよりもむしろ中間の影響を有し（７０％阻害）、同一遺伝子を標的とするのに複数のｓｉＲＮＡを使用することに対する利点が存在しないかもしれないことを示唆した。われわれはｄｓ種からの阻害効果が用量依存性であることを示すことができた。非特異的ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ（ＧＦＰ  ｄｓ  ｓｉＲＮＡ  ２）もまたルシフェラーゼ活性に対し控えめな影響を有した（４６％阻害）一方、これは非特異的であるようであり、また、増大する用量で制限された応答を示す（データは示されない）。
【００６３】
同一のＩＶＴ−ＧＦＰ  ｄｓ  ｓｉＲＮＡ（ＧＦＰ  ｄｓ  ｓｉＲＮＡ  ２）は、ＧＦＰ／ｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴレポーターでコトランスフェクトした細胞中のＧＦＰ蛍光を強く低下させた（８７％阻害）。はるかにより控えめな影響がセンス（４１％）もしくはアンチセンス（１９％）鎖単独または化学的に合成されたｓｉＲＮＡ（ＧＦＰ  ｄｓ１  ＲＮＡオリゴ）もしくはその構成要素部分から明らかであった。ＧＦＰ蛍光は、期待されたとおり非特異的ルシフェラーゼｄｓ  ｓｉＲＮＡ  ３により影響を及ぼされなかった。
【００６４】
内在性遺伝子発現もまた転写されたｓｉＲＮＡにより影響を及ぼされる可能性があることを立証するために、われわれはＪＮＫ２α１（図４Ａ）およびＣＤＳ−１（図４Ｂ）遺伝子の産物を標的とした。ウェスタンおよびノーザンブロット分析は、水（偽）、トランスフェクション対照としてのＥＧＦＰ／ｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴプラスミド（ＥＧＦＰ  ＤＮＡのみ）、一本鎖のｓｉＲＮＡもしくは非特異的ｓｉＲＮＡ（ＥＧＦＰ  ｄｓ  ｓｉＲＮＡ  ２）でトランスフェクトした細胞に比較した場合に、転写されたｓｉＲＮＡ（ＪＮＫ２α１  ｄｓ  ｓｉＲＮＡ  １−推定８７％低下）もしくは化学的に合成されたｓｉＲＮＡ（ＪＮＫ２α１  ｄｓ１  ＲＮＡオリゴ−推定７６％低下）のいずれかでトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞の核抽出物のサンプル中のＪＮＫ２α１タンパク質およびＲＮＡレベルの特異的低下を示した。
【００６５】
ウェスタンブロット分析は、偽トランスフェクトした細胞に比較した場合に、ＣＤＳ−１特異的ＩＶＴ−ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞の細胞質抽出物中のＣＤＳ１タンパク質レベルの控えめな（６７％まで）低下を示した（図４）が、しかし非特異的ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞では示さなかった。
【実施例２】
【００６６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたマウスＩｎｓｒ特異的な短いｄｓＲＮＡはＢａｌｂ／Ｃマウスの肝中のＩｎｓｒをノックダウンする
雄性Ｂａｌｂ／Ｃマウス（およそ２５ｇ）（標準的住居、食餌／水への自由到達）は生理的食塩水２．３ｍｌ、もしくは８００ＵのＲＮアーゼ阻害剤と一緒の短縮されたＴ７プロモーターのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写方法により調製されたマウスインスリン受容体に対し向けられたｓｉＲＮＡ（ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０１０５６８；塩基２５３６−２５５６）４０マイクログラムを含有する生理的食塩水のいずれかの尾静脈注入を受領した。
【００６７】
注入は可能な限り迅速に投与した（８〜１０秒）。２匹の対照および２匹のｓｉＲＮＡ処置されたマウスを２４、４８および７２時間に殺し；肝を迅速に取り出し、重量測定しそしてドライアイス／イソプロパノール中で凍結させた。全ＲＮＡは粉砕された凍結組織およびＲＮイージー  マキシ（ＲＮＥａｓｙ  Ｍａｘｉ）キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を使用して抽出した。
【００６８】
第一鎖のｃＤＮＡ合成後、インスリン受容体のｍＲＮＡをスマート  サイクラー（Ｓｍａｒｔ  Ｃｙｃｌｅｒ）を使用するＱ−ＰＣＲ（プライマー：Ｆ  ３５２６−３５４８、Ｒ  ３７４４−３７６８）によりアッセイし、そして結果をまたＱ−ＰＣＲ（ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０１７１０１の塩基１５７−１８２および塩基４９６−５２１）によるシクロフィリンＡ発現に対し正規化（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）した。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】オリゴヌクレオチド製造スキーム。一例をＪＮＫ２α１  ｍＲＮＡのコーディング配列内の１９ヌクレオチドの標的配列に対するｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド鋳型の設計について示す。
【図２Ａ】ルシフェラーゼレポーターアッセイで使用されるＧＬ３標的特異的二本鎖ｓｉＲＮＡ。ＧＬ３  ｓｉＲＮＡ  １、ＧＬ３  ｓｉＲＮＡ  ２およびＧＬ３  ｓｉＲＮＡ  ３は本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法を使用して作成した。ＧＬ３  ｓｉＲＮＡオリゴは化学的に合成した（Ｖａｒｇｅｅｓｅ，Ｃ．ら、１９８８、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．（２６）、１０４６−１０５０）。
【図２Ｂ】ＨｅＬａ細胞におけるルシフェラーゼ発現に対するＧＬ３標的特異的ｓｉＲＮＡおよびＧＬ３アンチセンス一本鎖ｓｉＲＮＡの影響。ＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌルシフェラーゼ＋レポーター構築物でトランスフェクトした細胞を１００％として解釈した。
【図２Ｃ】ｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌでトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞におけるルシフェラーゼ発現に対するＧＬ３−ｓｉＲＮＡ  １の阻害効果の用量応答曲線。
【図３Ａ】ＥＧＦＰでトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞のＦＡＣＳ分析で使用されたＥＧＦＰ標的特異的二本鎖ｓｉＲＮＡ。ＥＧＦＰ  ｄｓ  ｓｉＲＮＡ  ２は本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法を使用して作成した。ＥＧＦＰ  ｄｓ  ｓｉＲＮＡオリゴは化学的に合成した（Ｖａｒｇｅｅｓｅ，Ｃ．ら、１９８８、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．（２６）、１０４６−１０５０）。
【図３Ｂ】ＦＡＣＳｃａｎ分析（ベクトン−ディッキンソン（Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））を使用するＥＧＦＰでトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞中のＧＦＰ蛍光に対するＥＧＦＰ標的特異的ｓｉＲＮＡおよびＥＧＦＰアンチセンス一本鎖ｓｉＲＮＡの影響。ＥＧＦＰ  ＤＮＡのみでトランスフェクトした細胞を１００％として解釈した。
【図４Ａ】ＪＮＫ２α１でトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞で使用されたＪＮＫ２α１標的特異的二本鎖ｓｉＲＮＡ。
【図４Ｂ】ＣＤＳ−１でトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞で使用されたＣＤＳ−１標的特異的二本鎖ｓｉＲＮＡ。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
2005508177.tif 000009
【図４Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年2月4日(2004.2.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）鋳型で伸長されたセンスオリゴリボヌクレオチド産物が形成されるような反応混合物中で、標的特異的センスオリゴヌクレオチド鋳型およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを組み合わせること；
ｂ）鋳型で伸長されたアンチセンスオリゴリボヌクレオチド産物が形成されるような反応混合物中で、標的特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド鋳型およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを組み合わせること；ならびに
ｃ）段階ａ）で得られるセンスオリゴリボヌクレオチド産物を段階ｂ）で得られる相補的アンチセンスオリゴリボヌクレオチド産物とハイブリダイズさせることであって、
段階ａ）およびｂ）のオリゴヌクレオチド鋳型が、鋳型鎖の５’端で標的特異的鋳型配列を伴い伸長された図１に示されるところの短縮されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列よりなるＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含んで成り、ここで前記標的特異的鋳型配列が５’端に２個のグアノシン（ｇ）ヌクレオチドおよび３’端に２個のシトシン（ｃ）ヌクレオチドを含んで成る、
ことを特徴とする、
の段階を含んで成る、３０ヌクレオチド長未満の標的特異的な短い二本鎖ＲＮＡの合成方法。
【請求項２】
段階ａ）およびｂ）のオリゴヌクレオチド鋳型が、図１に示されるところの二本鎖の短縮されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ配列を含んで成る部分的に二本鎖のＤＮＡオリゴ鋳型であることをさらに特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ａ）鋳型で伸長されたセンスオリゴリボヌクレオチド産物が形成されるような反応混合物中で、センスｓｉＲＮＡ鋳型をＴ７  ＲＮＡポリメラーゼと組み合わせること；ｂ）鋳型で伸長されたアンチセンスオリゴリボヌクレオチド産物が形成されるような反応混合物中で、アンチセンスｓｉＲＮＡ鋳型をＴ７  ＲＮＡポリメラーゼと組み合わせること；ならびに
ｃ）段階ａ）で得られるセンスオリゴリボヌクレオチド産物を段階ｂ）で得られるアンチセンスオリゴリボヌクレオチド産物とハイブリダイズさせること；
それにより、段階ａ）およびｂ）のｓｉＲＮＡ鋳型が、鋳型鎖の５’端で請求項１で定義されるところの標的特異的鋳型配列および２もしくは３個の付加的ヌクレオチドを伴い伸長された図１に示されるところの短縮されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ配列よりなる二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含んで成る、
の段階を含んで成る、１２〜３０ヌクレオチドの低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の合成方法。
【請求項４】
短い二本鎖ＲＮＡがセンス配列５’−ｇｇ（ｎ１５−３０）ｃｃ−３’［ここでｇは（図１に示されるところの）短縮されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターから転写されたヌクレオチドグアノシンを指し、ｃは（図１に示されるところの）短縮されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列から転写されたヌクレオチドに相補的なヌクレオチドシトシンを指し、そしてｎ１５−３０は１５ないし３０ヌクレオチドのいずれかのオリゴヌクレオチドを指す］を有することを特徴とする標的特異的な短い二本鎖ＲＮＡを含んで成るＲＮＡの、細胞中への導入を含んで成る、細胞中での標的遺伝子の発現の阻害方法。
【請求項５】
標的特異的な短い二本鎖ＲＮＡが２もしくは３個の付加的ヌクレオチドを伴い３’端で伸長される、請求項１５記載の方法。
【請求項６】
標的遺伝子が、細胞遺伝子、内在性遺伝子、トランスジーンもしくは病原体からの遺伝子である、請求項４ないし５のいずれか１つ記載の方法。
【請求項７】
鋳型が、前記鋳型鎖の５’端で標的特異的鋳型配列を伴い伸長された図１に示されるところの短縮されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列よりなるＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含んで成り、ここで前記標的特異的鋳型配列は５’端に２個のグアノシン（ｇ）ヌクレオチドおよび３’端に２個のシトシン（ｃ）ヌクレオチドを含んで成る
ことを特徴とする、請求項１ないし６のいずれか１つ記載の方法での使用のための標的特異的センスオリゴヌクレオチド鋳型。
【請求項８】
鋳型が、前記鋳型鎖の５’端で標的特異的鋳型配列を伴い伸長された図１に示されるところの短縮されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列よりなるＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含んで成り、ここで前記標的特異的鋳型配列は５’端に２個のグアノシン（ｇ）ヌクレオチドおよび３’端に２個のシトシン（ｃ）ヌクレオチドを含んで成る
ことを特徴とする、請求項１ないし６のいずれか１つ記載の方法での使用のための標的特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド鋳型。
【請求項９】
請求項７−８で定義されるところの標的特異的センスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド鋳型を設計するための説明書を含んで成る、短い二本鎖標的特異的ＲＮＡの合成のためのキット。
【請求項１０】
標的特異的センスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド鋳型を設計するための説明書が、以下の段階；
１）標的遺伝子のコーディング配列内に配置されかつ以下の配列５’−ｘｘ（ｎ１２−３０）ｙｙ−３’［式中ｘはプロモーターから転写されたヌクレオチドを指し、ｙはプロモーター配列から転写されたヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを指し、そしてｎ１２−３０は１２ないし３０ヌクレオチドのいずれかのオリゴヌクレオチドを指す］を有する標的特異的配列を探す
２）場合によっては２個の付加的なヌクレオチドを伴い伸長された、段階１）で配置された標的特異的配列の相補物オリゴヌクレオチド配列を伴い鋳型鎖の５’端で伸長された、本発明の二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含んで成るセンスオリゴヌクレオチド鋳型を設計する。
３）場合によっては２個の付加的なヌクレオチドを伴い伸長された、段階１）で配置された標的特異的配列の逆オリゴヌクレオチド配列を伴い鋳型鎖の５’端で伸長された、本発明の二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含んで成るアンチセンスオリゴヌクレオチド鋳型を設計する
を含んで成る方法よりなる、請求項９記載のキット。
【国際調査報告】
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