(57)【要約】腫瘍反応性T細胞のエキソビボ生成の改良方法を提供し、これは例えば、自己腫瘍細胞を有する癌患者からのPBMCとCD28、CD40、またはCD28＋CD40と組み合わせたCD3を介してTリンパ球を活性化しうる電磁ビーズとを培養することを含む。本発明はまた、抗-CD3または抗-41BB scFvをコードする遺伝子およびその表面にこれら遺伝子を発現させるための腫瘍または正常起源の細胞の形質移入方法を提供する。該遺伝子および形質移入された腫瘍細胞は腫瘍破壊性免疫応答の誘導に有用な組成物である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌患者からのT細胞、抗原提示細胞、自己または異質遺伝子型腫瘍細胞、およびポリクローナル活性化を誘導するT細胞受容体に対する固定化抗体を含む、腫瘍反応性Tリンパ球を生成するための培養系。
【請求項２】
該抗原提示細胞が、該T細胞に応答して分化する自己単球である、請求項1の培養系。
【請求項３】
該自己または異質遺伝子型腫瘍細胞が、直接的または間接的T細胞応答を刺激する分子をコードする少なくとも１つの遺伝子を発現するように形質移入されている、請求項1の培養系。
【請求項４】
該固定化抗体がCD3およびCD28受容体に結合する、請求項1の培養系。
【請求項５】
細胞表面発現が可能な抗-CD3 scFvをコードするポリヌクレオチドを含む組成物。
【請求項６】
該ポリヌクレオチドがG19-4 scFvをコードする請求項5の組成物。
【請求項７】
細胞表面発現が可能な抗-ヒト 4-1BB scFvをコードするポリヌクレオチドを含む組成物。
【請求項８】
該ポリヌクレオチドが5B9 scFvをコードする請求項7の組成物。
【請求項９】
細胞表面発現が可能な抗-CD3 scFvをコードする遺伝子を形質移入された自己または異質遺伝子型腫瘍細胞を含む組成物。
【請求項１０】
該自己または異質遺伝子型腫瘍細胞が、G19-4 scFvで形質移入されており、該G19-4 scFvが細胞表面発現が可能なものである、請求項9の組成物。
【請求項１１】
細胞表面発現が可能な抗-4-1BB scFvをコードする遺伝子で形質移入された自己または異質遺伝子型腫瘍細胞を含む組成物。
【請求項１２】
該自己または異質遺伝子型腫瘍細胞が、5B9 scFvで形質移入されており、該5B9 scFvが細胞表面発現が可能なものである、請求項11の組成物。
【請求項１３】
細胞表面に抗-CD3 scFvを発現するように形質移入された腫瘍細胞を患者に投与することを含む、癌患者の治療方法。
【請求項１４】
該腫瘍細胞がG19-4を発現する請求項13の方法。
【請求項１５】
細胞表面に抗-4-1BB scFvを発現するように形質移入された腫瘍細胞を患者に投与することを含む、癌患者の治療方法。
【請求項１６】
該腫瘍細胞が5B9を発現する請求項15の方法。
【請求項１７】
細胞表面発現が可能な抗-CD3 scFvをコードする配列を含むプラスミドを患者に投与することを含む、癌患者の治療方法。
【請求項１８】
該プラスミドが19-4 scFvをコードする請求項17の方法。
【請求項１９】
細胞表面発現が可能な抗-4-1BBをコードする配列を含むプラスミドを患者に投与することを含む、癌患者の治療方法。
【請求項２０】
該プラスミドが5B7 scFvをコードする請求項19の方法。
【請求項２１】
細胞表面発現が可能な抗-CD3 scFvをコードする配列を含む単離ポリヌクレオチド。
【請求項２２】
細胞表面発現が可能なG19-4 scFvをコードする配列を含む単離ポリヌクレオチド。
【請求項２３】
細胞表面発現が可能な抗-4-1BBをコードする配列を含む単離ポリヌクレオチド。
【請求項２４】
細胞表面発現が可能な5B9 scFvをコードする配列を含む単離ポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本特許出願は2002年3月26日出願の米国特許出願第10/107991号からの優先権を主張する。
【０００２】
連邦政府委託研究に関する宣言
本発明の一部は合衆国国立衛生研究所からの助成金によって達成され、合衆国政府は本発明に関する一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、腫瘍反応性T細胞の生成方法、腫瘍ワクチンおよび関連する組成物、かかるワクチンおよび組成物の製造方法、かかるワクチンおよび組成物の、例えば、インビボでの治療用途での使用方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
以下の記載は本発明の理解に有用であろう情報を含む。本明細書において提供するあらゆる情報が本出願において記載され、請求の範囲に記載される本発明の従来技術、または関連技術であることを認めるものではなく、明示的または黙示的に引用される刊行物または文書が従来技術であることを認めるものでもない。
【０００５】
ヒト腫瘍は多数の腫瘍抗原を発現し、それらのほとんどはいくらかの正常組織にもレベルは低いが存在している(Hellstrom and Hellstrom、Adv Cancer Res、12,167-223、1969; Cheever et al. 、Immunol Rev、145,33-59、1995; Finn et al. 、Immunol Rev、145,61-89、1995; Boon et al. 、Immunol Today、18,267-8、1997; Hellstrom and Hellstrom、Handbook of Experimental Pharmacology、Vaccines (Chapter 17)、463-478,1999)。多くのかかる抗原は腫瘍担持宿主において免疫原性である。例えば、様々な腫瘍関連抗原に対するIgG抗体はSEREX技術によって検出することが出来(Old and Chen、J. Exp. Med. 、187、1163-1167,1998)、そして腫瘍抗原を認識するT細胞は四量体の使用により(Cassian et al. 、J. Immunol.、162,1999)、また、腫瘍選択的T細胞クローンをインビトロで形成する能力により示される(Boon、Coulie et al.、Immunol Today、18,267-8、1997)。これにより様々な形態の免疫療法の可能性が提供される。免疫療法には例えば、インビトロで増殖させた免疫性Tリンパ球の投与(Rosenberg、Biologic Therapy of Cancer (Chapter 19)、487,1995)および治療的腫瘍ワクチン接種(Nestle et al. 、Nat Med、4,328-32、1998; Rosenberg et al. 、Nat Med、4,321-7、1998; Greenberg、Adv Immunol、49,281-355、1991; Melief and Kast、Immunol Rev、145,167-77、1995; Pardoll、Curr Opin Immunol、8,619-21、1996; Hellstrom and Hellstrom、Handbook of Experimental Pharmacology、Vaccines (Chapter 17)、463-478,1999)が挙げられる。
【０００６】
マウス腫瘍は、より有効な免疫療法の開発に向けての有用なモデルを提供する。これらは腫瘍破壊性免疫応答に対する標的を発現するが、自然発生の腫瘍のほとんどに対する有効な免疫応答を得るためには一定の実験操作が必要である(Greenberg、Adv Immunol、49,281-355、1991; Kerr and Mule'、J. Leuko. Biol. 、56,210-214、1994; Cheever、Disis et al. 、Immunol Rev、145,33-59、1995; Finn、Jerome et AL.、Immunol Rev、145,61-89、1995; Melief and Kast、Immunol Rev、145,167-77、1995; Pardoll、Curr Opin Immunol、8,619-21、1996; Boon、Coulie et,a1.、Immunol Today、18,267-8、1997; Hellstrom and Hellstrom、Handbook of Experimental Pharmacology、Vaccines (Chapter 17)、463-478,1999)。
【０００７】
Tリンパ球(CD8+およびCD4+)は腫瘍破壊性応答の生成において(および一般に遂行においても)重要な役割を果たすが、NK細胞および抗体、マクロファージも同様に寄与している(Hellstrom and Hellstrom、Adv Cancer Res、12,167-223、1969; Greenberg、Adv Immunol、49,281-355、1991; Melief and Kast、Immunol Rev、145,167-77、1995; Hellstrom and Hellstrom、Handbook of Experimental Pharmacology、Vaccines (Chapter 17)、463-478,1999)。
【０００８】
抗原提示は通常骨髄および血液中の単球における幹細胞から分化した樹状細胞(DC)によるが(Huang et al. 、Science、264、961-5、1994)、特定の条件下では腫瘍細胞自体によっても行われることがある(Chen et al.、Cell、71,1093-102、1992; Schoenberger et al. 、Cancer Res、58,3094-100、1998)。DCによる腫瘍抗原の提示を容易にする手段は有効な腫瘍免疫を得るために必須であり、かかる手段によって、特定のヒトの癌治療をより有効とすることが出来ることを示すデータが最近報告されている(例えば、(Kugler et al.、Nature Medicine、6,332-、2000)を参照されたい)。CD8+ Tリンパ球とインビトロ細胞障害性Tリンパ球(CTL)活性の組み合わせおよびリンホカイン産生性Tヘルパー細胞がほとんどの腫瘍の拒絶に必要とされる(Hellstrom and Hellstrom、Handbook of Experimental Pharmacology、Vaccines (Chapter 17)、463-478,1999)。
【０００９】
ThlおよびTh2応答の両方が好ましいが(Rodolfo et al. 、T Immunol、163,1923-8、1999)、Thl応答が腫瘍の免疫破壊に主要な役割を果たしている(Hu et al.、J Immunol、161,3033-41、1998)。
【００１０】
免疫応答を誘導するために、同時刺激、特に抗原提示細胞 (APC)上のCD80 および/または CD86とTリンパ球上のCD28の相互作用によるものが必要である(Schwartz、Cell、57,1073-81、1989; June et al. 、Immunol Today、11,211-6、1990; Linsley and Ledbetter、Annu Rev Immunol、11,191-212、1993)。それによって免疫応答の拡張に必要とされるIL2、IFN-γ、およびその他のリンホカインの持続的産生が導かれ(Thompson et al. 、Proc Natl Acad Sci U S A、86、1333-7、1989)、リンホカインをコードする遺伝子を形質移入した腫瘍細胞を用いるのと同様の目的が果たされる(Pardoll、Curr Opin Immunol、8,619-21、1996)。
【００１１】
CD28を介する二次シグナル無しではT細胞受容体(TCR)を抗原に曝しても免疫応答は誘発されず、アネルギーを引き起こしてしまうことがある。ほとんどの腫瘍はCD80やCD86を発現せず(Chen、Ashe et al. 、Cell、71,1093-102、1992 ; Yang et al. 、J Immunol、154,2794-800、1995)、有効な免疫は抗原が腫瘍流入領域リンパ節に至ってCD80およびCD86を発現するDCに取り込まれ、プロセシングされ、提示されるまでは誘導されない(Huang、Golumbek et al.、Science、264,961-5、1994; Yang et al. 、J Immunol、158,851-8、1997)。
【００１２】
これによってなぜ腫瘤が確立するまで腫瘍がしばしば免疫系を「すりぬける」のかが説明される。CD80およびCD86はCD28に結合するだけでなく、より高い結合活性にて活性化T細胞上のCTLA4に結合する。後者の結合は免疫応答を終了させることが出来る負のシグナルを誘導し(Thompson、Lindsten et al.、Proc Natl Acad Sci U S A、86,1333-7、1989; Walunas et al.、Immunity、1,405-13、1994; Krummel and Allison、J Exp Med、183,2533-40、1996; Leach et al.、Science、271,1734-6、1996; Walunas et al. 、J Exp Med、183,2541-50、1996; Allison et al. 、Novartis Found SYMP、215,92-8、1998)、CTLA4ではなくCD28が関与する手法が治療上の利点を有することを示す。
【００１３】
抗-腫瘍免疫の誘導の能力にもかかわらず、免疫系は確立された腫瘍の破壊においてはあまり有効でない。従来からの腫瘍ワクチンまたはインビトロ抗腫瘍活性を有する免疫性T細胞の移入によって誘導されるような免疫応答では、数百万を超える腫瘍細胞を破壊することがほとんど不可能である。この原因であると思われるいくつかの逃避機構が同定されている。というのはそれらは免疫学的攻撃から腫瘍を保護している可能性があるからである(Hellstrom and Hellstrom、Handbook of Experimental Pharmacology、Vaccines (Chapter 17)、463-478,1999 ; Kiessling et al. 、Cancer Immunol. Immunother.、48,353-362、1999)。それらには腫瘍エピトープの欠失(Maeurer et al. 、J Clin Invest、98,1633-41、1996)、および/またはかかるエピトープをCTLに提示しうるMHCクラスI分子の欠失(Restifo、1993; Maeurer、1996; Hellstrom、1997; Garrido、1997; Johnsen、1998)、およびアポトーシスによる腫瘍反応性リンパ球の消滅(Hahne et al. 、Science、274,1363-1366、1996; Shiraki et al. 、Proc Natl Acad Sci U S A、94、6420-5、1997; Bennett et al. 、J Immunol、160、5669-75,1998 ; Kume et al. 、Int J Cancer、84,339-43、1999) (Chappell and Restifo、Cancer Immunol Immunother、47,65-71、1998)が含まれる。しかしながら、免疫原性腫瘍抗原を提示することが出来、反応性リンパ球のアポトーシスを誘導しない腫瘍も通常免疫制御から逃避する。これは様々な「阻害因子」によるものであり、かかる因子は腫瘍、宿主の一方または両方により産生され、T細胞に直接作用するかエピトープ選択性を有するかあるいは有さないAPCを介して間接的に作用する。これらには、可溶性腫瘍抗原および免疫複合体、そしてTGF-ベータ、プロスタグランジン、NOなどが含まれる(Hellstrom and Hellstrom、Adv Immunol、18、209-77、1974 ; Kehrl et al. 、J Exp Med、163,1037-50、1986; Sulitzeanu、Adv Cancer Res、60,247-267、1993; Kiessling et al.、Springer Semin. Immunopathol. 、18,227-242、1996; Kiessling、Wasserman et al.、Cancer Immunol. Immunother.、48,353-362、1999)。
【００１４】
腫瘍細胞によって、単独でまたは抗体と組み合わされて免疫複合体として放出される抗原の下方制御は、腫瘍破壊性Thl応答から (Hu、Urba et al. 、J Immunol、161,3033-41、1998) Th2応答へとそれることにより起こり得(Fiorentino et al. 、J Exp Med、170,2081-95、1989)、TGFβの産生を伴うことがある。TGFβの産生はTh2リンホカイン、例えばIL- 10の産生に対して二次的なものである(Wilbanks et al. 、Eur J Immunol、22,165-73、1992; D'Orazio and Niederkorn、J Immunol、160,2089-98、1998)。下方制御はまた、活性化Tリンパ球上のCTLA4とAPC上のCD80/CD86の相互作用または活性化T細胞による可能性もあり(Leach、Krummel et al.、Science、271,1734-6、1996; Allison、Chambers et al. 、Novartis Found Symp、215,92-8、1998)、これもまたTGF-βに媒介される(Chen et al. 、J Exp Med、188,1849-57、1998)。NOおよびプロスタグランジンを産生するマクロファージの下方制御における役割もまた同定されている (Kiessling、Wasserman et al.、Cancer Immunol. Immunother.、48、353-362、1999)。
【００１５】
T細胞反応性の阻害は、T細胞シグナル伝達機構はしばしば腫瘍-浸潤性Tリンパ球において欠損しているという報告に反映されており(Mizoguchi et al.、Science、258,1795-8、1992; Nakagomi et al.、Cancer Res、53,5610-5612、1993; Kiessling、Wasserman et al. 、Cancer Immunol. Immunother.、48,353-362、1999)、リンパ球が体外へ取り出されると回復しうる。
【００１６】
例えば、T細胞活性化分子4-1BBのマウス腫瘍治療への使用に関する報告によると (Melero et al.、Nat Med、3,682-5、1997; Melero et al. 、Eur J Immunol、28,1116-21、1998)大きな腫瘍でさえ免疫系に拒絶されるといういくつかの状況がある。しかし、もっとも驚くべき例は、おそらく腎臓移植の早期において、屍体移植片に汚染されている癌細胞から生じた大きな転移を有する患者のなかに、免疫抑制を解除した後に完全に回復したものがいたという観察であろう(Wilson et al. 、N Engl J Med、278,479-83、1968; Matter et al.、Transplantation、9,71-4、1970)。
【００１７】
細胞表面分子 4-1BBは活性化T細胞上に発現するが未処置の(naive)T細胞には発現しない(DeBenedette et al. 、J Exp Med、181,985-92、1995; Shuford et al. 、J Exp Med、186,47-55、1997)。4-1BBの関与により既に誘導された免疫応答が増幅されている可能性がある。
【００１８】
抗-4-1BB MAb に曝すことにより、CTL活性を有する抗原活性化CD8+Tリンパ球の増殖、IFN-γおよびその他のThl型のサイトカイン(IL-2、TNF-α)の産生/放出、そしてT細胞のアポトーシスに対する保護が刺激されることが報告されている(Hurtado et al. 、J Immunol、158,2600-9、1997; Kim et al. 、Eur J Immunol、28,881-90、1998; Natoli et al.、Biochem Pharmacol、56、915-20、1998; Takahashi et al. 、J Immunol、162,5037-40、1999; Tsushima et al. 、Exp Hematol、27,433-40、1999)。さらに、4-1BBはNK1. 1 細胞が関与する免疫調節性作用を有するといわれている(Melero et al. 、Cell Immunol、190,167-72、1998)。
【００１９】
4-1BBに対するMAbはまた、マウスにおける免疫原性が低い腫瘍を含む確立した (直径およそ10 mm)腫瘍に対して活性を有し、細胞溶解活性が上昇したCD8+ CTLが抗-4-1BB MAb で処理したマウスのリンパ球から生じたことが報告されている(Melero、Shuford et al. 、Nat Med、3,682-5、1997)。4-1BBに結合する4-1BB リガンド(4-1BBL)が組み込まれるよう形質移入された腫瘍細胞にリンパ球を曝すと、有意にCD8+T細胞応答が上昇し、4-1BBL-形質移入腫瘍細胞はマウスモデルにおいてワクチンとして用いた際に治療活性を有する。しかし、抗-4-1BB MAb の投与は4-1BBLを発現する腫瘍細胞のワクチン接種よりも有効であるという証拠がある。抗体治療は非-免疫原性肉腫 Ag104に有効であるが(Melero、Shuford et al. 、Nat Med、3,682-5、1997)、4-1BBLを発現するよう形質移入されたAg104 細胞は、この腫瘍に対する治療効果を得るためにはCD80を発現する細胞と組み合わせる必要がある(Melero、1998)。
【００２０】
腫瘍免疫を増強させる別のアプローチは、腫瘍反応性リンパ球クローンの活性化を含む、ポリクローナルT細胞活性化をもたらす抗- CD3 MAb を一定用量投与することであり、このアプローチによるいくつかの治療上の成功がマウスモデルを用いた研究において報告されている(Ellenhom et al.、Science、242,569-71、1988)。
【００２１】
腫瘍反応性T細胞は、それぞれの腫瘍から移植された細胞が増殖するのを防ぐためのリンパ球による腫瘍免疫の付与により示されるように、インビボでの使用のためにインビトロで作成できる(Klein et al.、Cancer Res、20,1561-1572、1960)。免疫性リンパ球の養子移入後の少量の確立した腫瘍の拒絶が以前に報告された(Hellstrom et al. 、Transplant Proc、1,90-4、1969)。養子移入されたリンパ球はそれらが免疫された腫瘍に優先的に局在化し(Mule' et al、J. Immunol. 、123,600-606、1979)、これはインビトロで増殖させた、腫瘍-浸潤性リンパ球(TIL)の治療のための利用を促進する知見である(Rosenberg、Biologic Therapy of Cancer (Chapter 19)、487,1995)。劇的な臨床応答は少数の患者にみられたが、直径数 mm 以上の腫瘍を担持するマウスにおいても(Greenberg、Adv Immunol、49、281-355、1991; Chen、Ashe et al.、Cell、71,1093-102、1992; Melief and Kast、Immunol Rev、145,167-77、1995; Hellstrom and Hellstrom、Handbook of Experimental Pharmacology、Vaccines (Chapter 17)、463-478,1999)ヒトにおいても治療の成功の程度はしばしば中程度であった。かかる失敗は1以上の上述の「逃避」機構および/または注入したリンパ球の腫瘤における不完全な局在に起因すると考えられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
それゆえ、より強い免疫応答を誘導する腫瘍ワクチンの構築および癌患者の治療用のTリンパ球の作成の改良方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
発明の概略
本発明は、インビトロでの腫瘍反応性T細胞作成の改良方法および治療用にインビボで用いられる腫瘍ワクチンならびに関連する組成物に関する。
【００２４】
１つの方法において末梢血または腫瘍からの単核リンパ球が例えば、癌患者から収集され、CD3およびCD28に特異的な固定化抗体の存在下で自己腫瘍細胞とともに培養される。かかる培養は、例えば、4-5日間行うとよい。固定化抗体を担持するビーズを除いた後、細胞を治療上有用なレベルまで、例えば、10 μl/ml IL-2中にて増殖させる。かかる方法は癌治療のための腫瘍反応性リンパ球の作成の改良に有用である。
【００２５】
特定の理論または機構に束縛されるわけではないが、本発明は以下の要素によって行われると考えられる: CD3の発現が元々低いTリンパ球がポリクローナルに活性化され、激しく増殖し、Th1型のリンホカインを形成し、迅速に腫瘍細胞を破壊し、腫瘍抗原を放出する。ポリクローナルT細胞活性化は培養中で単球の樹状細胞への成熟を引き起こし、これが死んだ腫瘍細胞を取り込んでプロセシングして腫瘍抗原を提示し、CTLを含む腫瘍-特異的T細胞の持続的増殖を誘導すると考えられる。
【００２６】
本発明はまた、例えば腫瘍細胞表面に発現する、抗-CD3または抗-4-1BB 一本鎖 Fv (scFv) 分子をコードする遺伝子およびインビボ癌治療用のかかる遺伝子を形質移入された細胞を提供する。特定の理論または機構に拘束されないが、腫瘍細胞表面の抗-CD3 scFv 発現はポリクローナルT細胞活性化および腫瘍細胞破壊を誘導し、それによって腫瘍抗原が放出され、抗原特異的腫瘍免疫への変化を促進すると考えられており、これは同じ腫瘍からの「野生型」(非形質移入)細胞の拒絶として検出される。腫瘍細胞表面上の抗-4-1BB scFvの発現はまた、腫瘍反応性T細胞の活性化/増殖を誘導すると考えられている。これは、その増殖の上昇および/またはそれらのアポトーシスからの保護により、腫瘍反応性リンホカイン、例えば、IFN-γの産生を引き起こす。細胞表面に抗-4-1BB scFvを発現するように形質移入された腫瘍細胞の免疫化の後、これもまた特定の理論または機構に拘束されないが、同じ腫瘍からの野生型細胞がNK細胞およびCD4+ T細胞の活性化をともなう機構によって拒絶されると考えられている。細胞表面に抗-4-1BB scFvを発現する腫瘍細胞は、確立した野生型腫瘍の治療において活性である。
【００２７】
本発明により、例えば、２つの新規な癌治療方法が可能となる。まず本発明により、例えば、抗- CD3/抗-CD28/抗-CD40 (または抗-CD3/CD28)が固定化されたビーズによる「抑制された」リンパ球の活性化が提供され、それらは増殖してThlリンホカインを作り、TGF-βによる阻害に対する感受性が低くなる。特定の理論または機構に拘束されないが、活性化リンパ球は腫瘍細胞を破壊し、そうして腫瘍抗原が提供され、またAPC の成熟も誘導されると考えられている。この方法は癌患者への養子移入に好適な腫瘍反応性 CD8+およびCD4+ T細胞およびNK細胞の増殖を導くと考えられている。第２に、本発明は例えば、同じ腫瘍からの野生型細胞に対する腫瘍破壊性免疫応答を有効に誘導しうる腫瘍細胞表面の抗-CD3または抗-4-1BB scFvをコードする遺伝子またはポリヌクレオチドを提供する。
【００２８】
本発明のその他の側面を添付の請求の範囲に示し、引用によりその内容を本明細書に含める。
【００２９】
本発明の範囲は広く、記載または引用する実施例に限定されるものではないが、本発明の側面は添付の図面を参照することによりさらによく理解されよう。
【００３０】
発明の詳細な説明
本発明の実施において特に断りのない限り当業者に実施可能な、分子生物学（組換え技術を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学、核酸化学、および免疫学の様々な技術を用いる。
【００３１】
様々な有用な技術が以下の文献に説明されている： MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL、second edition (Sambrook et al. 、1989) および MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL、third edition (Sambrook and Russel、2001)、(「Sambrook」と称する); OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (M. J. Gait、ed. 、1984); ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney、ed. 、1987); HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY (D. M. Weir & C. C. Blackwell、eds. ) ; GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS (J. M. Miller & M. P. Calos、eds. 、1987); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel et al.、eds. 、1987、2001年までの追補を含む）; PCR: THE POLYMERASE CHAIN REACTION、(Mullis et al.、eds. 、1994); CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (J. E. Coligan et al.、eds. 、1991); THE IMMUNOASSAY HANDBOOK (D. Wild、ed. 、Stockton Press NY、1994); BIOCONJUGATE TECHNIQUES (Greg T. Hermanson、ED.、Academic Press、1996); METHODS OF IMMUNOLOGICAL ANALYSIS (R. Masseyeff、W. H. Albert、and N. A. Staines、eds. 、Weinheim: VCH Verlags gesellschaft mbH、1993)、Harlow and Lane (1988) ANTIBODIES、A LABORATORY MANUAL、Cold Spring Harbor Publications、New York、およびHarlow and Lane (1999) USING ANTIBODIES : A LABORATORY MANUAL Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY (「Harlow and Lane」と称する)、Beaucage et al. eds. 、CURRENT PROTOCOLS IN NUCLEIC ACID CHEMISTRY John Wiley & Sons、Inc.、New York、2000);および Agrawal、ed. 、PROTOCOLS FOR OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGS、SYNTHESIS AND PROPERTIES Humana Press Inc. 、New Jersey、1993)。 
【００３２】
本発明は、抗-腫瘍薬または抗-癌薬によって利益を被りうる疾患、障害および症状の治療、予防および/または改善およびそれに使用する医薬に関する。
【００３３】
本発明は例えば、抗-腫瘍免疫の生成に有用な様々な方法および組成物を提供する。
【００３４】
１つの態様において、本発明は、進行した癌患者を含む(かかる患者は一般に免疫抑制されている)癌患者からのPBMCおよび腫瘍細胞のPBMCとの共培養物をCD3とCD28またはCD3とCD28＋CD40との組み合わせに対する固定化抗体によって刺激することによりインビボでの治療用の腫瘍反応性Tリンパ球集団をインビトロで得る新規方法を提供する。別の態様において、例えば、本発明は細胞表面に発現する抗-CD3 scFvまたは抗-4-1BB scFvをコードする遺伝子またはその他のポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。別の態様において、本発明は、抗-腫瘍免疫の誘導のためのかかる遺伝子を発現する形質移入細胞を提供する。
【００３５】
電磁ビーズに固定化されたCD3およびCD28に対する抗体によるT細胞の刺激および活性化の結果、ポリクローナルT細胞増殖および複数のサイトカインの産生が起こる(Levine et al. 、J Immunol、159,5921-30、1997; Garlie et al. 、J Immunother、22,336-45、1999)。しかしCD3およびCD28に対する抗体による刺激後の、ポリクローナル増殖から抗原-特異的T細胞の生成および/または増殖への変化はいままで報告されていなかった。
【００３６】
本明細書において記載するように、これは、例えば、自己腫瘍細胞の培養物、好ましくは初期培養物への添加によって達成される。腫瘍細胞は活性化T細胞によって48-72時間以内に破壊されることが示され、また、培養中の単球は同時期においてCD83+ 樹状細胞へと成熟することが示された。これはIFNγおよびTNFαを含む、活性化T細胞によって分泌されるリンホカインに曝される結果であると考えられる。樹状細胞は死んだ腫瘍細胞を取り込み、活性化T細胞に対して腫瘍抗原を提示し、腫瘍特異的T細胞の持続的増殖を促進する。
【００３７】
別の態様において、本発明は、CD3に特異的である抗-CD3一本鎖抗体フラグメント(scFv)をコードする遺伝子またはその他のポリヌクレオチドを提供する。かかる遺伝子またはポリヌクレオチドを形質移入することにより、例えばヒトまたはマウス腫瘍系からの細胞表面での発現が可能となる。両方の場合において、かかる形質移入細胞は、増殖し、リンホカインを形成し、腫瘍細胞を殺傷するTリンパ球を活性化することが示された。
【００３８】
インビボで行ったさらなる実験により、表面に抗-マウスCD3を発現するマウス腫瘍細胞が免疫適格マウスにより拒絶され、同腫瘍からの野生型細胞を拒絶することが出来る全身免疫を誘導することが示された。したがって、抗-マウスまたは抗-ヒト CD3遺伝子によってコードされるscFvは腫瘍細胞表面で発現した場合、ポリクローナルT細胞活性化を誘導するが、本発明では、腫瘍細胞が存在する場合の抗-CD3のポリクローナル活性化特性はインビボで癌ワクチンとして用いられた場合、抗原特異的免疫への変化を誘導するものあることが示された。
【００３９】
本発明のさらに別の態様において、例えば、4-1BBに特異的な抗-4-1BB一本鎖抗体フラグメント(scFv)がコードされるように遺伝子またはその他のポリヌクレオチドが構築され、例えばヒトおよびマウスからの腫瘍細胞に発現させるために形質移入される。かかる形質移入腫瘍細胞はそれぞれの種からのTリンパ球を活性化することが出来る。抗-マウス4-1BB scFv遺伝子によって形質移入されたマウス腫瘍細胞は免疫適格マウスによって拒絶され、同腫瘍からの野生型細胞に対する腫瘍特異的免疫を誘導するためのワクチンとして利用することが出来る。記憶を有し、抗原特異的であることが示された免疫応答は、皮下または肺転移として増殖した被験腫瘍細胞(K1735 メラノーマ)に対して治療的に有効である。K1735は非常に免疫原性が低く、MHCクラスI分子の発現が非常に低レベルでありMHCクラスIIを欠き、多くのヒト腫瘍に類似するため、これらの結果は生物学的に重要である。
【００４０】
本発明者らはマウスおよびヒトCD3および4-1BBと反応性を有するscFv分子をコードする遺伝子を作成した。各遺伝子はヒトCD80の膜貫通ドメインおよび細胞質尾部を含む。さらに各遺伝子は、scFv 結合部位と膜貫通ドメインとの間に位置するヒトIgG1のヒンジ、CH2およびCH3ドメインをコードする。これら遺伝子およびこれら遺伝子を形質移入された細胞は癌の治療に有用である。
【００４１】
例えば、以下の実験例で示すように、細胞表面に発現する抗-CD3または抗-4-1BB scFv 分子をコードするcDNAは、DNA プラスミドとして癌患者に送達してもよいし、ベクター、例えばウイルスまたは細菌ベクター中にて送達してもよい。細胞表面に発現する抗-CD3 scFvまたは抗-4-1BBをコードするcDNAは、癌細胞にインビトロで導入することが出来、そして遺伝子導入された癌細胞は治療に使用することができる。自己または異質遺伝子型のいずれの腫瘍細胞も利用できる。細胞表面に発現する分子をコードするscFv 遺伝子の組み合わせも本発明に含まれ、組み合わせは活性化または同時刺激シグナルを提供するT細胞上の受容体に結合するscFv 分子をコードするscFv 遺伝子から選択される。別のインビボでT細胞にポリクローナル活性化シグナルを伝達する方法も本発明に含まれ、例えば、T細胞によって発現される表面受容体に対する抗体またはリガンドを含む徐放性ポリマーの患者への注入が挙げられる。
【００４２】
本発明はまた、例えば、癌患者への養子移入に用いられるインビトロでの腫瘍選択的Tリンパ球の、自己腫瘍細胞およびCD3を介するシグナルおよび同時刺激分子の存在下でそれらを活性化することによる、生成/増殖の新規方法も提供する。本発明により、既存の腫瘍反応性T細胞集団を増殖させ、以前には認識されなかった抗原に対する免疫応答生成を容易にするために、腫瘍細胞から放出される抗原を提示する樹状細胞のインビトロでの形成が促進される。本発明で記載するようにインビトロで生成したT細胞は、TGF-ベータによる阻害に対する感受性が低く、寿命が長い。本発明はまた、２つの新規なタイプのヒト腫瘍ワクチンを記載し、これはCD3または 4-1BBのいずれかを認識する抗体-由来分子をコードするscFv 遺伝子の形質移入に基づくものであり、これらのワクチンは、非常に免疫原性が低く、MHCクラスIの発現レベルが非常に低く、MHCクラスIIが発現しないマウスメラノーマに対して試験した場合に腫瘍破壊性免疫応答を引き起こすことが出来ることを示す。本発明に記載するアプローチは、細胞に基づくワクチンとして使用するための抗-ヒト CD3または抗-ヒト 4-1BB scFvを発現させるためのヒト腫瘍細胞の形質移入にも適用できる。さらにそれは、遺伝子に基づく腫瘍ワクチンの構築にも容易に適用でき、ここで腫瘍エピトープをコードする遺伝子は抗-CD3 scFvまたは抗-4-1BB scFvをコードする遺伝子の一方または両方と組み合わされる。
【００４３】
本発明は、さらなるまたは別の免疫刺激受容体を認識するscFvおよび/または抗- 腫瘍免疫応答を上方制御するリンホカインをコードする遺伝子を組み合わせることにより拡張させることが出来る。
【００４４】
本発明を特定の実施例に言及してさらに説明するが、実施例は単に例示のためのものであり本発明を限定するためのものではないと理解されたい。
【実施例１】
【００４５】
進行したヒト癌患者からの腫瘍反応性リンパ球のCD3-媒介活性化
末梢血単核細胞(PBMC) または腫瘍浸潤性リンパ球(TIL)を、CD3に対するMAbをCD28に対するMAbまたはCD28に対するMAbとCD40に対するMAbの両方と組み合わせて結合させた電磁ビーズの存在下で自己腫瘍細胞と共培養した。培養中に起こったいくつかの事象、例えば、培養腫瘍細胞の破壊、リンパ球の増殖およびリンホカイン産生、CD83+ APCの生成および腫瘍反応性CTLの活性化/増殖、ならびにTGF-ベータによる阻害に対するリンパ球の感受性の低下などを特徴づけた。
【００４６】
患者材料
腫瘍は、ステージIVの癌患者の手術または悪性滲出液(ほとんどは腹水)から得た。腫瘍および末梢血サンプルはインフォームドコンセントを得た上で提供された。ほとんどの研究は8名の患者について行い、そのうち5名(1OV、30V、80V、440V、480V)は卵巣癌、2名(1C、22C)は大腸癌、および1名(1HN)は頭頚部癌を有していた。卵巣癌系、4007からの細胞も用いた。
【００４７】
腫瘍および血液サンプルの調製
固形腫瘍を培地に懸濁し、滲出液から液体を除いた後、細胞を再懸濁した。赤血球をFicoll-Hypaque (Pharmacia Biotech、Upsala、Sweden)によって除き、Percollグラジエント(Sigma、St Louis、MO)を用いて腫瘍細胞をTILから分離した。リンパ球サンプルを直接用いるか、あるいは後で使用するために液体窒素中で保存した。腫瘍サンプルを標準方法を用いてインビトロで増殖させ、細胞培養物を樹立した。Tリンパ球、単球およびB細胞を含むPBMCをFicoll-Hypaqueを用いて精製した。いくつかの最初の実験において、CD8+ Tリンパ球(純度、>90%)を用い、これは以前にVarioMac 電磁ビーズ (Miltenyi Biotech Inc. 、Auburn、CA)を用いてTILからポジティブに選択されたものであった。
【００４８】
リンパ球、抗体結合ビーズおよび腫瘍細胞を組み合わせた培養の調製
最初の実験において、1腫瘍細胞あたり5リンパ球を添加し、その後混合物を37℃で、Costar (3513) 12-ウェルプレート(Corning Inc. 、Corning、NY)中でRPMI培地(Gibco、Rockville、MD)および10% 胎児ウシ血清 (Atlanta Biological、Norcross、GA)とともにインキュベートした。これらに続く実験において、PBMCまたはTILを、公表された技術(Levine、Bernstein et al. 、J Immunol、159,5921-30、1997; Garlie、LeFever et al. 、J Immunother、22,336-45、1999)を用いてCD3、CD28に対するMAbおよび/または CD40に対するMAbを結合した電磁ビーズ (Dynal Inc.、Lake Success、NY)の存在下で、自己腫瘍細胞の存在下または不在下で培養した; MAbと結合していないビーズ(または無関係のMAbと結合しているビーズ)をコントロールとして用いた。MAbは、64.1 (Martin et al. 、J Immunol、136,3282-7、1986) (Martin、Ledbetter et al. 、J Immunol、136,3282-7、1986)、9.3 (Martin、Ledbetter et al. 、J Immunol、136,3282-7、1986)およびG28-5 (Ledbetter et al. 、J Immunol、138,788-94、1987)であり、それぞれリンパ球をポリクローナルに刺激するもの(抗-CD3)、それらを共刺激するもの(抗-CD28)、またはAPCを活性化するもの(抗- CD40)であった。自己腫瘍細胞を用いた場合、細胞(40,000-75,000/ウェル)をまず一晩のインキュベーションにより、Costar 24-ウェルプレート（2 mlの10% 胎児ウシ血清を含むIMDM培地含有）に付着させた。MAb-結合ビーズ (3x106/ml)を添加し、 次いで10% 胎児ウシ血清を含むRPMI中のリンパ球(106/ml) を添加した。プレートを37℃で空気雰囲気中6% C02中にて4-5日間ンキュベートした。ビーズを磁石を用いて取り出し、リンパ球をlOU/mlのIL2 (Roche Molecular Biochemicals、Indianapolis、IN)を含有する培地中にて新たなウェルに移し、その濃度が2 x106細胞/mlに達したらフラスコに移した。培養物を腫瘍細胞破壊の証拠について観察した。リンパ球増殖は細胞計数によって測定した。培地をサンプリングしてWEHI 細胞を用いるバイオアッセイにてTNF 産生を測定し(Espevik and Nissen-Meyer、J Immunol Methods、95,99- 105,1986)、IFN-γはELISA (EH-IFNG、Endogen、Woburn、MA)によって測定した。TGFβ1はSigma (St Louis、MO)から購入した。TGFβ1を用いるすべての実験において、MAb-結合ビーズを除いた後にも分子は培養物に残っていた。
【００４９】
CTLアッセイ
常套の4時間51Cr放出アッセイを行った。効果細胞を特徴づけるため、MHCクラスIフレームワーク決定基を認識するMAb w6/32 (10μg/ml)の添加による細胞障害性の阻害の実験を行った(Research Diagnostics Inc.、Flanders、NJ)。NK マーカーであるCD 16およびCD56に対するMAb(Beckman Coulter、Brea、CA)、抗-CD8 MAb HIT8a (BD Pharmingen、Lexington、KY)、および抗-インテグリン-ベータ 2 (CD 18) MAb 60.3 (Beatty et al. 、J Immunol、131,2913-8、1983)も用いた。
【００５０】
リンパ球のFACS分析
CD 発現の密度を、PE-標識MAbを用い所定の最低の明度を有する場合細胞を陽性と計数して、FACS(Epics XL、Coulter、Miami、FL)によって評価した。リンパ球のインビトロ活性化後のCD3 発現の密度の上昇が元々CD3 発現が高い細胞の選択的増殖によるのかどうかを調べるために、癌患者から収集したPBLを色素CFDA (den Haan et al. 、J. Exp. Med. 、192,1685-1695、2000) (Molecular Probes、Eugene、OR)で標識した。次いでそれらを抗-CD3/CD28/CD40 ビーズの存在下で5日間培養し、その後ビーズを取り出し、リンパ球を10 U IL-2/mlを含有する培地で増殖させた。ビーズの除去後２時点で(4時間後および3日後) FACS分析を行い、ここで細胞をCFDA明度およびCD3発現について分析した。コントロールビーズとともに培養した標識リンパ球を比較のために調べた。
【００５１】
抗体-結合ビーズを介する刺激の不在下でT細胞反応性が低レベルであることの実証
最初の実験を６回行い、ここで、TILから精製したCD8+ Tリンパ球を腫瘍細胞とともに培養し、その後上清をTNFまたはIFN-γについてアッセイした。代表的な実験において、大腸癌患者、1CからのCD8+ TILをまず1 C 腫瘍細胞と15日間培養し、取り出して新しいセットの1C 細胞または肺癌患者3Lからの腫瘍細胞に添加した。1C リンパ球を1Cと組み合わせた場合に少量のTNF (1.2 pg/ml)が検出されたが3L 腫瘍と組み合わせた場合は検出されず、TNF およびIFN-γ (1.5 pg/ml)は3LからのTILを3L 腫瘍細胞と組み合わせた場合に産生されたが単独で培養した場合は産生されなかった。リンパ球増殖の証拠はみられなかった。次の実験において、CD8+ リンパ球に加えて単球、CD4+ T細胞およびB 細胞を含むTIL 集団を自己腫瘍細胞と組み合わせて10-15日間培養した。13名の患者にうち8名の患者からの培養物からの上清においておよそ10倍高レベルのTNF (4.5-48 pg/ml)およびIFN-γ (150 pg/mlまで)が検出された。しかしリンパ球増殖はみられなかった。
【００５２】
自己腫瘍細胞および抗-CD3-結合ビーズの存在下でのT細胞増殖および腫瘍細胞破壊の実証
最初の実験の後に、MAb-結合電磁ビーズを用いて様々なリンパ球受容体を介してシグナルが誘導される系での実験を行った(Levine、Bernstein et al. 、J Immunol、159,5921-30、1997; Garlie、LeFever et al. 、J Immunother、22,336-45、1999)。PBMCまたはTILを、CD3に対するMAb、そしてCD28に対するMAbまたはCD28に対するMAbとCD40に対するMAbと結合したビーズの存在下で自己腫瘍細胞と混合した。同様の群ではリンパ球を含めたが腫瘍細胞は含めなかった。コントロールとして、腫瘍細胞の存在下または不在下でのリンパ球を、コントロールの非結合ビーズとともに培養した。3-5日後、ビーズを除き、リンパ球と腫瘍細胞を別々に2-21日間10 U/mlのIL2とともにインキュベートした。
【００５３】
図1は、患者 OV44からのTILが4日間抗-CD3/CD28/CD40結合ビーズに曝した際、激しく増殖した実験結果を示す。CD3 シグナルの不在下で培養したリンパ球は増殖せず、抗-CD28 および/または CD40 ビーズとともに培養したリンパ球も増殖しなかった(データ示さず)。増殖は、自己腫瘍細胞とともにCD3を介するシグナルを誘導するビーズが存在していた方が大きかった(パネルB)。抗-CD3/CD28結合ビーズは抗- CD3/CD28/CD40結合ビーズと同様に増殖を誘導した(データ示さず)。
【００５４】
図2は、患者 1C からのPBLと様々なMAb-結合ビーズを5日間、自己腫瘍細胞または異質遺伝子型(4007) 細胞のいずれかとともに培養した実験からの結果を示す。培養あたりのリンパ球数はCD3/CD28 (パネル C)または抗-CD3/CD28/CD40 (図2D)活性化リンパ球を1C 腫瘍と組み合わせて培養した場合の方が4007 細胞と組み合わせて培養した場合よりもかなり高く、この知見は図1からの知見と同様である。FACS分析によると90%を超える活性化リンパ球がCD3を発現し、そのおよそ70% がCD8+であり、5%未満がCD16またはCD56を発現することが示された。一方、ビーズがCD3を介するシグナルを提供しない場合 (図2AおよびB)、増殖は異質遺伝子型細胞が添加された場合の方が高く、おそらく4007 細胞に発現する同種抗原に対する免疫応答を表すものであった。
【００５５】
ほとんどの腫瘍細胞が抗-CD3/CD28または抗-CD3/CD28/CD40結合ビーズの存在下で自己リンパ球に曝された後24-48時間以内に破壊され、しばしば培養が全くリンパ球形態を示す細胞のみとなった。この腫瘍破壊が免疫特異性を有するか否かを調べるために４つの実験を行った。これらの実験では癌患者からのPBLの段階希釈(106-105/サンプル)を自己腫瘍細胞または異質遺伝子型のドナーからの腫瘍細胞または線維芽細胞と混合した。２つの実験の両方において、自己腫瘍の存在下での培養上清においておよそ１０倍以上のTNFが存在したが、自己または異質遺伝子型腫瘍からの細胞または異質遺伝子型線維芽細胞の殺傷においては差はなかった。リンパ球活性化の24-72時間後にみられる腫瘍細胞破壊は抗原特異的ではなく、それはおそらく大量の活性化Tリンパ球およびリンホカインが特異的成分を不明瞭にするからであると結論づけられる。
【００５６】
腫瘍選択的CTLの生成
MHCクラス I-拘束CTLを腫瘍細胞＋抗-CD3/CD28または抗-CD3/CD28/CD40ビーズにより活性化したリンパ球から生成した。図3は、図2に示す実験において活性化された患者 1CからのPBLを用いた実験を示す。腫瘍細胞とMAb-結合ビーズによる活性化の後、ビーズを除き、リンパ球を10 U IL-2/ml培地で3週間さらなる腫瘍細胞やビーズなしで増殖させた。1 Cおよび抗-CD3/CD28 ビーズによるPBL活性化は1C 細胞に対して強く細胞溶解性であり、溶解はCD8に対するMAbおよび抗-MHCクラス I フレームワーク MAb w6/32により阻害された(図3A)。異質遺伝子型4007 細胞はE/T比50:1において20%のみ殺傷されたのに対し、1C 細胞は98% 溶解された(図3A)。図3Bは抗-CD3/CD28/CD40ビーズにより刺激されたPBLについての同様のデータを提供する。4007 細胞の溶解はMAb w6/32の存在下では1 Cと同程度に低レベルであった。一方、抗- CD3/CD28/CD40 ビーズで刺激されたPBLはCD8 に対するMAbまたはMAb w6/32の存在下でもともに1Cおよび4007 細胞を殺傷した(データ示さず)。図3Bに示す実験に用いた細胞集団から濃縮されたCD8+ 細胞は25%の1C 細胞をE/T比 20/1にて溶解したのに対し、4007系からの細胞の溶解は0%、異質遺伝子型B 細胞系からの細胞の溶解は0%であった。この実験において、1C 細胞の溶解はMAb w6/32の存在下で5%であり、抗-CD18 MAb 60.3の存在下でも5%であり、CD16およびCD56に対するMAbの組み合わせによっては25から18%に減少したのみであった。4007 細胞といずれかのビーズとの共培養により活性化されたリンパ球は1 Cまたは4007 細胞を選択的に溶解するものではなかった。CTL アッセイを２回繰り返したが同様の結果であった。
【００５７】
Th1タイプリンホカインの産生
大量のIFN-γがCD3を介して活性化されたリンパ球の培養上清において検出された。これを図4に示し、この図はまたIFN-γの産生が培養の最初の4-5日間に自己腫瘍細胞が存在した方が高いことを示す。
【００５８】
表1は６つのさらなる増殖およびPBLまたはTILによるリンホカイン産生を示す代表的実験を示す。これらは患者からの収集時または１ラウンドのビーズによるインビトロ活性化の後に試験した。抗-CD3、抗-CD3/CD28、抗-CD3/CD40および抗-CD3/CD28/CD40ビーズはそれらの間で有意差無く、リンパ球増殖を強く上昇させた。一方、抗-CD28、抗-CD40および抗-CD28/CD40ビーズはコントロールビーズと比べてリンパ球増殖もリンホカイン産生も上昇させなかった。これはCD3を介するシグナルが重要であることを示す。TNFおよびIFN-γの産生は互いに相関していた。それはリンパ球を腫瘍細胞とビーズの不在下で3-5日以上培養した場合、バックグラウンドレベルにまで低下した。図1および4に示すように、CD3シグナル伝達はリンパ球増殖とリンホカイン産生の激しい誘導に必要であった。 
【００５９】
MAb-結合ビーズを介して活性化されたリンパ球上のCD3およびその他のマーカーの上方制御
リンパ球集団上のCD抗原発現の密度を腫瘍細胞と抗-CD3/CD28/CD40 ビーズとの3-5日間の培養の前後にFACSで測定し、次いでビーズ無しでさらに3-7日間増殖させた。CD受容体発現密度の変化を反映させるために、各集団において選択された設定における密度に匹敵する明度またはより明度が高い細胞のパーセンテージを報告する(表2); 6名の健康ドナー(30から65歳)からの非刺激PBLを比較のために分析した。癌患者からの非刺激PBLのCD3、CD4およびCD28のレベルは低かった。5名の患者のうち4名はCD8密度も低く、CD86密度は健康なドナーからの非刺激PBLにおけるものより高かった。PBLとコントロールビーズとの培養により部分的にCD3発現が上昇したが、CD28発現は有意に上昇しなかった。一方、抗-CD3/CD28/CD40ビーズとの培養では、一貫してCD3およびCD28の発現が正常レベルに回復し、CD8 発現密度が高い細胞数が倍増した。CD3 発現密度を5名の患者からのTILを用いて試験した。それはそれぞれ2.9%、40.2%、96%、42.8%および40. 1%であり、即ち、変動が大きく、PBMCについてよりも一般に高かった。TIL によるCD8 発現はPBMCによるよりも高く、61.4%から87.3%に上昇した。TILでのCD28 発現に対応する値は39.3%および52.8%であった。
【００６０】
リンパ球のインビトロ活性化の後のCD3 発現密度の上昇が、元々CD3 発現が高い細胞の選択的増殖によるのか否かを調べるために、癌患者から収集したPBLを色素CFDA (Molecular Probes、Eugene、OR)で標識した。実験はTILを用いて行い、その40.2%が元々CD3を発現するものであり、色素CFDAで標識した(den Haan、Lehar et al. 、J. Exp. Med. 、192,1685-1695、2000)。抗-CD3/CD28/CD40 ビーズを介する活性化の後、CD3 発現は95%まで上昇した。CFDAおよびPE-標識抗-CD3をプローブとして用いるFACS分析により、元々CD3 発現が高いPBLの亜集団の選択的増殖は無いことが示された。
【００６１】
抗-CD3/CD28 ビーズによる刺激後の培養におけるCD83発現
抗-CD3/CD28/CD40 ビーズによるPBMC (その10-20%が単球マーカーCD14を発現することが見いだされている)の刺激が樹状細胞の成熟を上昇させるか否かを調べるために、刺激後様々な時点でのCD83の発現を測定した。CD83は成熟後の樹状細胞に発現するが、未熟な樹状細胞または血液単球には発現しない。典型的な実験を示す図5は、PBMCの抗-CD3/CD28ビーズによる刺激の24時間後に、すでにCD83発現が35%の細胞で検出されたことを示す。CD83発現は0日目のPBMC(刺激前)では検出されなかった。
【００６２】
どの細胞がPBMC 刺激後にCD83を発現するのか調べるために、抗-CD3/CD28ビーズまたは抗-CD3/CD28/CD40ビーズでの刺激の2日後にフルオレセイン標識抗-CD3とPE-標識抗-CD83による二色染色を行った。図6は、CD83はビーズ活性化の不在下における細胞では発現しなかったが、抗-CD3/CD28結合ビーズはCD3陰性細胞の明確な集団においてCD83 発現を誘導し(13.9%)、CD3陽性細胞の有意な部分においても誘導したことを示す。一方、抗-CD3/CD28/CD40結合ビーズによる活性化はCD83発現を誘導したが、CD3陰性およびCD3陽性細胞の両方について抗-CD3/CD28 ビーズによるものより低レベルであった。これらの結果は、樹状細胞マーカー CD83を発現する細胞は、抗-CD3および抗-CD28 MAbに結合したビーズによる刺激の後に迅速にPBMCから誘導されることを示す。抗-CD3、抗-CD28、および抗-CD40 MAbに結合したビーズによる刺激は抗-CD3および抗-CD28 MAbにのみ結合したビーズに比べてCD83 発現の刺激において同様に有効ではなかった。
【００６３】
MAb-結合ビーズを介する活性化シグナルの存在下でのTGFβ1による阻害に対する耐性の上昇
表3は、TGFβ1のリンホカイン産生およびリンパ球増殖に対する阻害効果がCD3を介するシグナルを誘導するビーズとの共培養によって変化されるか否かを調べるために行った５つの代表的な実験を示す。コントロールビーズでは、TNFおよびIFN-γレベルは低く、これらのレベルはTGFβ1によってさらに抑制された。一方、抗-CD3/CD28/CD40ビーズによるとこれらのレベルはTGFβ1の不在下でのレベルに近いレベルにまで上昇した。同様に、抗-CD3/CD28/CD40 ビーズを用いた場合、リンパ球増殖に対するTGFβ1の阻害効果はかなり低く、患者1HNについては阻害は全くみられなかった。T細胞増殖およびリンホカイン産生の相対的耐性はTGF-ベータ1の用量を20 ng/mlに上昇させた場合も観察され、リンパ球濃度は105/サンプルまで低下した(データ示さず)。CD28、CD40の単独または両方を介するビーズ刺激はTGFβ1に対して保護しなかった(データ示さず)。
【００６４】
したがって、腫瘍細胞の存在下での腫瘍細胞殺傷を伴うリンパ球活性化は、抗原放出を引き起こす。培養中の単球は腫瘍抗原を取り込み、CD83陽性APCへと分化し、腫瘍反応性T細胞の選択的増殖のためのエピトープを提示する。治療用ワクチンは同じ原理に基づいて腫瘍担持個体における抑制されたリンパ球を活性化および増殖させることが出来、また、優性ではない（subdominant）エピトープに対する免疫応答の生成を促進しうる。一般に、腫瘍反応性T細胞生成のための培養系は以下の４つの成分を含む：1) 癌患者からのT細胞、2) 患者からの抗原提示細胞、3) 抗-CD3および抗-CD28抗体に結合したビーズまたは抗-CD3、抗- CD28および抗-CD40 抗体に結合したビーズ、そして 4) 患者からの腫瘍細胞。
【００６５】
想定または期待されるこれらの成分の様々な改変が存在する。それらにはこれら４つの成分の添加時期における改変も含まれ、これら成分の起源における改変も含まれる。例えば、患者のT細胞は末梢血から単離してもよいし、腫瘍浸潤性リンパ球から単離してもよい。実施例において示す抗原提示細胞は末梢血単核細胞画分に存在するものであったが、その他の起源、例えば骨髄由来のものであってもよい。実施例においては培養において自己腫瘍細胞を用いたが、異質遺伝子型腫瘍細胞または腫瘍抗原を自己腫瘍細胞に加えてあるいはその代わりに用いてもよい。というのは腫瘍抗原は自己APCによって提示されるからである。抗-CD3および抗-CD28抗体に結合した電磁ビーズはその他の手段によって固定化された抗体と置換してもよく、ポリクローナルT細胞活性化および腫瘍反応性T細胞増殖を促進するさらなる細胞表面受容体に特異的な固定化抗体またはリガンドを含むかあるいは固定化したものであってもよい。
【００６６】
実施例において用いた手法はまた、CD3陽性リンパ球の生成を可能にするものであり、かかるリンパ球はインビトロ培養で10週間を超えて増殖し続け、養子移入免疫療法に有用である。これはおそらくCD28を介する同時刺激が、リンパ球がアポトーシスを経る可能性を減少させ(Boise et al.、Immunity、3,87-98、1995; Daniel et al. 、J Immunol、159,3808-15、1997)、インビトロでの長い寿命を付与するからであろう(Levine、Bernstein et al. 、J Immunol、159,5921-30、1997)。同時刺激されたリンパ球は自己患者に戻された後も、高用量のIL2の存在下で増殖させたリンパ球と比べて長期間生存した(Ranga et al. 、Proc. Natl. Acad. Sci.、95,1201-1206、1998)。CD28またはCD28＋CD40と組み合わせたCD3を介するT細胞刺激は、培養中でTGFβ１が飽和レベルである20 ng/ml用いられた場合であっても、リンパ球増殖およびTNFおよびIFN-γ産生に対するTGFβ1-に媒介される阻害効果からおよそ50%保護することが出来ることは注目に値する。
【実施例２】
【００６７】
ヒトまたはマウス起源の抗-ヒトおよび抗-マウス CD3 scFvをコードするベクターの構築、形質移入、および抗-CD3 scFvを表面に発現する細胞が、T細胞の増殖、Thlタイプリンホカインの産生、細胞溶解性になるように、またインビボで抗-腫瘍活性を有するようにポリクローナル刺激を誘導することの実証
上記の実施例は、電磁ビーズに結合した抗-CD3 mAbによって提供されるシグナルが自己腫瘍細胞＋PBMCまたはTILを含む培養において腫瘍反応性リンパ球を活性化および増殖させることを示すものである。腫瘍療法用遺伝子が、活性な抗-CD3 mAb 一本鎖 Fv (scFv)誘導体の腫瘍細胞表面での発現を可能にするような遺伝子を構築した。マウス CD3に対して反応性の抗-CD3 scFvをハイブリドーマ 500A2から構築し、ヒト CD3に反応性の抗-CD3をハイブリドーマ G19-4から構築した(Ledbetter et al. 、J. Immunol. 、136,3945-3952、1986)。
【００６８】
scFvの構築
一本鎖 Fv (scFv)の細胞表面形態をハイブリドーマ RNAから抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインをクローニングすることによって構築した (Hayden et al. 、Ther Immunol、1、3-15、1994; Gilliland et al. 、Tissue Antigens、47,1-20、1996)。ハイブリドーマをRPMI [10% 胎児ウシ血清、4 mM グルタミン、1 mM ピルビン酸ナトリウム、および 50 u/ml ペニシリン-ストレプトマイシン、(すべて Life Technologies、Gaithersburg MDから購入)含有]中で培養し、数日間対数増殖期に維持した後細胞を収集した。細胞は懸濁培養からの遠心分離によって収集しRNAをTrizolによってまたはQIAGEN RNAカラム(Life Technologies、Gaithersburg MD、およびQIAGEN、Valencia、CA)を用いて製造業者の指示に従って、あるいはNP-40 溶解技術 (Gilliland、Norris et al. 、Tissue Antigens、47,1-20、1996)の改変方法によって2x107 細胞から単離した。１μgのトータルRNAを用いて、Superscript II 逆転写酵素(Life Technologies)およびランダムヘキサマー(Takara Shuzo、Otsu Shiga、Japan)を用いたcDNAのランダムプライムド一本鎖合成を行った。逆転写の後、cDNA断片にdGTPおよび末端転移酵素を用いてポリG-尾部を付加した。末端転移酵素はDNA鎖の末端3'-OH基にデオキシヌクレオチド三リン酸からのデオキシリボヌクレオチドの添加を触媒する酵素である。cDNAに未知のリーダーペプチドを一端に有するmRNAのクローニング効率を上昇させるためにアンカー尾部を付加した。5'プライマーは改変ANCTAIL プライマーであり、T細胞受容体鎖配列のPCRについて記載されたポリC尾部を含むものであり(Loh et al. 、Science、243,217-20、1989)、クローニングのためにSacI、XbaI、および EcoRI部位を備えるものであった。配列は以下の通り: 5’-cgtcgatgagctctagaattcgcatgtgcaagtccgatgagtccccccccccccc-3’
【００６９】
cDNAの3'末端用プライマーは重鎖または軽鎖の定常領域由来のものであり、J-C 接合部を超えておよそ50塩基に結合するものであった。各3'プライマーはクローニングのためにHindIII、BamHI、およびSalI部位を含むものであった。最初の断片のサブクローニングのための制限部位はしたがって、これらの元のPCR増幅プライマーの一部として含まれ、増幅されたPCR断片を消化し、pUC19、pSL1180またはTOPOベクター(Invitrogen、San Diego、CA)に配列決定のためにサブクローニングした。DNA配列決定はミニプレップDNA (QIAGEN、Valencia、CA)にてpUC、T7、またはM13 ユニバーサルおよびリバースプライマーそしてBigDye Terminator サイクルシーケンシングキット試薬(PE Biosystems、Foster City、CA)を用いてABI Prism 310 (PE Biosystems)配列決定機によって行った。
【００７０】
個々の可変ドメインが単離され、少なくとも３つの同一のクローンからコンセンサス配列が得られると、scFv をオーバーラップするオリゴヌクレオチドを用いてPCR増幅によって構築し、その結果、軽鎖および重鎖可変領域をコードするcDNAの融合体が得られた。軽鎖および重鎖可変ドメインは、ソーイングPCRの際にオーバーラップするオリゴヌクレオチドの部分として(gly4ser) 3リンカーを付加することによって連結した(Gilliland、Norris et al.、Tissue Antigens、47,1-20、1996)。アセンブリーしたscFv分子を、ヒト CD80 膜貫通および細胞質尾部にインフレームにて融合したヒトIgG1ヒンジ、CH2、およびCH3 ドメインの上流にサブクローニングした(Winberg et al.、Immunol Rev、153,1996)。完成した発現カセットは、軽鎖V領域のネイティブなリーダーペプチドまたはscFvの軽鎖可変領域にSalI部位にて融合したL6 VK 軽鎖からの分泌シグナルペプチドのいずれかをコードするものであった。scFvはHindIII-BclI、またはSalI-BclIカセットとしてコードされ、ここで第一の制限部位はオープンリーディングフレームについてインフレームにてコードされ、第二の制限部位は融合タンパク質のリーディングフレームについてインフレームではなかった。このカセットを次ぎにBglII-BamHI断片上にコードされるヒトIgG1  野生型 Fc ドメインに融合させた。CD80膜貫通および細胞質尾部はヒト扁桃腺RNAからPCRにより増幅し、Clal部位の上流に近接する停止コドンを含むBstBI-ClaI断片にコードされるものであった。各サブ断片を、ベクターpcDNA3の改変版に挿入されている合成ポリリンカー/マルチクローニング部位にサブクローニングした。細胞表面 scFvをコードする完全な融合タンパク質コンストラクトをアセンブリーさせた後、完全な発現カセットをレトロウイルス発現ベクターpLNCX (Miller and Rosman、Biotechniques、7,980-2、984-6,989-90、1989)にHindIII-ClaI断片として導入した(図9)。
【００７１】
形質移入
プラスミドDNAをこれらの組換えレトロウイルスベクターから調製し、CaP04 沈降技術 (Winberg、et al.、(1996) Immunol Rev. 153: 209-223. )を用いたPT67 ドュアル・トロピック (Clontech、Palo Alto、CA)パッケージング細胞への形質移入に用いた。簡単に説明すると、細胞をDMEM（10% 胎児ウシ血清、4mM グルタミン、2xDMEM 非必須アミノ酸、およびペニシリン-ストレプトマイシン含有(この処方を以下DMEM-Cと称し、すべての試薬はLife Technologiesから購入した）)におよそ25%の集密度にて播き、一晩培養してから形質移入を行った。プラスミド DNAを0.5 ml 0.25 M CaCl2に添加し、これを0.5 ml 2x HEBSバッファー(pH 7.1)に滴下した。5分間37℃で沈殿を形成させ、溶液をついで新鮮なDMEM-C (8 ml)を含む100 mm培養皿中の細胞に滴下した。形質移入細胞を一晩インキュベートし、PBSで２回洗浄し、新鮮な培地を与えた。ウイルス上清を形質移入細胞から収集し、24時間後に形質導入に用いた。あるいは、形質移入された、細胞表面にscFvを発現する接着PT67細胞を、懸濁培養したB細胞系と共培養した。数回の継代後、パッケージング細胞を培養から希釈し、B細胞系を培養フラスコに固定化されたヤギ抗-ヒト IgG1を用いて細胞表面 scFvの発現について選抜した。高レベルの細胞表面 scFvを発現する細胞はフラスコにより強固に結合し、陰性細胞および低発現細胞をフラスコから洗い流した。高レベルに発現する細胞を次ぎにフラスコ表面からはぎ取ることにより単離し、数日間再培養した後、生物アッセイに用いた。
【００７２】
マウスおよび腫瘍細胞系
６から８週齡の雌性C3H/HeN マウスを購入した(Taconic、Germantown、New York)。K1735はC3H/HeN起源のメラノーマであり、この起源から転移性クローンM2が選抜されたものである(Fidler and Hart、Cancer Res、41、3266-3267、1981)。以前の知見と一致して、そのMHCクラスI発現は非常に低いことが見いだされた(データ示さず)。動物設備はALAC認可されたものであり、プロトコールはInstitutional Animal Committeeに認められたものであった。
【００７３】
抗体
R-フィコエリトリン(PE) -結合MAbである、 GK1. 5 (抗-マウス CD4)、53-6.7 (抗-マウス CD8a) および精製AF3-12. 1 (抗 H-2KK)はPharmingen (San Diego、California)から得、R-PE結合ヤギF (ab') 2 抗-ヒトIgGは、Biosource International (Camarillo、California)から得た。 MAb 169-4 (抗-CD8)はDr R. Mittler (Emory University、Atlanta、Georgia)から譲り受けた。GK1. 5 (抗-CD4)はATCCから得たハイブリドーマによって産生した。
【００７４】
ベクターおよびK1735 細胞の形質移入
可変領域クローニング方法、scFv構築方法、およびscFv発現を生じさせる方法は、以前に記載されている(Gilliland、Norris et al. 、Tissue Antigens、47,1-20、1996; Hayden et al. 、Tissue Antigens、48,242-54、1996; Winberg、Grosmaire et al. 、Immunol Rev、153,1996)。本研究は、抗-CD3 ハイブリドーマ 500A2または 抗-4-1BB ハイブリドーマ 1D8からの可変領域遺伝子を用いて細胞-結合500A2 scFvまたは1D8 scFvの表面発現を得るために行った(Hayden、Grosmaire et al. 、Tissue Antigens、48,242-54、1996; Winberg、Grosmaire et al.、Immunol Rev、153,1996)。scFvの発現のために、CD80からの膜貫通ドメインおよび細胞質尾部を用いた。というのはそれは細胞-細胞接触時の細胞骨格付着および架橋を媒介するからである(Doty and Clark、J Immunol、157,3270-9、1996; Doty and Clark、J Immunol、161,2700-7、1998)。pLNCX中のscFv 遺伝子融合コンストラクトをRetroPack（商標）PT67 パッケージング細胞(Clontech Laboratories、Inc、Palo Alto、California)にCaP04沈降により形質移入した。K1735-WT細胞はこれらの細胞からの培地を用いて形質移入した。G418耐性クローンをscFv表面発現についてPE標識ヤギ 抗-ヒトによって染色した。
【００７５】
動物実験
5または10/群のマウスの背中の一方に、2x106 K1735-WT または K1735-500A2 細胞あるいはγ-照射された (12,000 rad) K1735-WT細胞を皮下移植した。免疫したマウスをK1735-WT (2 x106細胞/マウス)またはAg104 (3x10５細胞/マウス)によって攻撃した。腫瘍サイズをノギスを用いて２つの最も大きい垂直直径を測定することにより評価し、平均腫瘍面積 (mm2)±SDとして報告した。マウスに皮下移植した部位を腫瘍測定を容易にするために剪毛した。
【００７６】
CD4+ および/または CD8+ Tリンパ球およびNK細胞のインビボ枯渇(depletion)
T細胞を以前に記載されているようにして枯渇させた(Chen、Ashe et al.、Cell、71,1093-102、1992)。マウス腹腔内に3回CD4に対するMAb (GK1.5、ラットIgG2b)またはCD8に対するMAb(169-4、rat IgG 2a)、あるいはそれら２種の混合物を0.5mg/マウスにて3日間連続して注入した。この後、0.5 mgの各MAbを3日おきに注入して枯渇を維持した。NK細胞は抗-アシアロGM1 抗体を30μl/マウスにて４日おきに腹腔内注入することによって枯渇させた。12日目に、各群からの脾細胞をFACSによって分析し、枯渇が有効であるかを確認した。その後マウスの皮下に腫瘍細胞を移植した。
【００７７】
増殖アッセイ
脾細胞を、96-ウェル平底プレート(1 x 105 細胞/ウェル)に、5 x 105 同系、照射(3,000 rad)脾細胞(APCとして)および腫瘍細胞とともに播いた。72時間のインキュベーション後、三連の培養に16-18時間、1μCiの3[H] チミジン(Amersham Pharmacia、Biotech Piscataway、New Jersey)でパルスし、その取り込みを測定した。
【００７８】
どのT細胞がインビトロで増殖したかを調べるために、脾細胞を2μM CFDA SE (5- (および-6)-カルボキシフルオレセインジアセテートスクシニミジルエステル) (den Haan、Lehar et al.、J. Exp. Med.、192、1685-1695、2000)により、製造業者(Molecular Probes、Eugene、Orgeon)のプロトコールに従ったインキュベーションによって標識し、K1735-WT細胞の存在下または不在下で3日間インキュベートし、FACSで分析した。
【００７９】
CTL活性のアッセイ
マウスをK1735-1D8の移植の2-4週間後に屠殺し、脾細胞懸濁液を調製した。特記する場合、NK細胞を抗- アシアロ GM1 抗体＋ウサギ補体(Cedarane、Ontario、Canada)を用いて除いた。5 x 106 脾細胞を5日間、1x105□-照射された(12,000 rad) K1735-WT細胞とともに24-ウェルプレート(Costar Corp. 、Cambridge、Massachusetts)で培養した。細胞溶解活性を4時間Cr51放出アッセイで様々なE/T比にて調べた。
【００８０】
ELISPOTアッセイ
マウスIFNγELISPOTキット(R&D Systems、Minneapolis、Minnesota)を製造業者のプロトコールにしたがって用い、プレートをプレート- スキャン装置(Cellular Technology Ltd. 、CLeveland、Ohio)によって計数した。
【００８１】
ポリクローナルに活性化したヒトT細胞は、増殖し、Th1タイプリンホカインを産生し、細胞溶解性となる
細網内皮細胞系Reh、およびB細胞リンパ芽球腫系T51の細胞表面の抗-ヒト CD3 scFv の発現を図10に示す。形質移入細胞は抗-CD3 scFv 遺伝子産物の高レベルの発現を示した。
【００８２】
形質移入と野生型のRehおよびT51細胞のT細胞増殖誘導能力を、正常ドナーからのPBMCとの細胞系の培養により試験した。野生型と形質移入の細胞系をマイトマイシンCで処理し、培養中のその増殖を阻止した。抗-CD3 scFvを発現する形質移入RehおよびT51 細胞は用量依存的に増殖を誘導したが、野生型 RehおよびT51 細胞は増殖を誘導しなかった(図11)。
【００８３】
腫瘍細胞表面の抗-ヒト CD3 scFvの発現が、PBMCからのT細胞を形質移入細胞を迅速に殺傷するように刺激するか否かを調べる実験を行った。野生型または形質移入Reh およびT51 細胞を51Crで標識し、8時間51Cr放出アッセイを正常なドナーからのPBMCを用いて行った。図12は、形質移入細胞が迅速に静止T細胞によって殺傷されたが、野生型細胞は殺傷されなかったことを示す。細胞の殺傷の結果、用量依存的に有意な51Crの放出がみられた。
【００８４】
K1735-500A2 細胞は免疫適格同系マウスによって拒絶される。
図7に示すように、抗-マウス CD3 scFv を発現するように形質移入されたK1735-500A2 細胞は、一時的にマウス内で増殖したがその後拒絶された。CD80を発現する細胞は、非形質移入細胞よりは遅かったが連続的に増殖し、これは以前に報告された知見と一致する(Chen et al. 、J Exp Med、179,523-532、1994)。
【００８５】
マウスに３回、７日間隔で2x106 の抗-CD3 (500A2 scFv)形質移入細胞を移植した(腫瘍は起こっていない)。コントロール群の9匹のマウスにはPBSのみを注入した。その後、両群を106 K1735-WT細胞で攻撃した。
【００８６】
K1735-WT細胞はすべてのコントロールマウスで腫瘍を形成したが、免疫された10匹のマウスのうち6匹には腫瘍は形成されなかった。腫瘍を形成した免疫されたマウスのうち4匹は腫瘍増殖が非免疫(コントロール)群より遅かった。抗-CD3 scFv-形質移入腫瘍細胞を繰り返し与えられたマウスを含むいずれのマウスにおいても毒性または免疫抑制の証拠はみられなかった。
【００８７】
K1735-500A2 細胞がK1735-WT細胞に混合された際のバイスタンダー効果の証拠
例えば、インビボ形質移入の結果、抗-CD3 scFvをインビボで発現する腫瘍細胞が、野生型腫瘍細胞に対しても有効な免疫応答を誘導するか否かを調べるために、K1735-WT細胞とK1735-500A2 細胞とを混合する２つの実験を行った。第一の実験は、同じ数の２つの細胞タイプを混合した場合、腫瘍は短期間のインビボ増殖の後に退行することを示した。第二の実験において、2x106 K1735-WT細胞を2x105 K1735-500A2 細胞と混合した。図13に示すように、WT細胞の増殖はそれらが単独で移植された場合と比較して阻害された。
【００８８】
K1735-500A2 細胞による免疫化が腫瘍選択的T細胞の増殖を導く
移植されたK1735-500A2 細胞を拒絶したマウスから脾細胞を収集した。図14はかかる脾細胞の増殖が、インビトロで照射された K1735-WT細胞と混合された場合、抗原的に異なる同系肉腫Ag104からの照射された細胞と混合された脾細胞と比べて増殖の程度が大きいことを示す。照射された K1735-500A2 細胞で免疫されたマウスからの脾細胞は未処置のマウスからの脾細胞(コントロール)より増殖程度が大きくなかった。
【００８９】
したがって、腫瘍細胞表面での抗-CD3 scFvの発現は腫瘍細胞の迅速な殺傷を誘導し、T細胞増殖を引き起こす。これらの特性は腫瘍特異的免疫を促進する。というのは腫瘍細胞の破壊およびT細胞のポリクローナル活性化は、T細胞によって産生されるサイトカインの影響下で成熟する樹状細胞によって取り込まれる腫瘍抗原を作るからである。T細胞はまずポリクローナル抗-CD3 活性化によって感作され、次いで腫瘍特異的T細胞が増殖し続けてAPCによって提示される腫瘍抗原を認識する。活性化T細胞によって形成されるタイプ1リンホカイン、ならびにT細胞自体がバイスタンダー腫瘍細胞を破壊することが出来、これは、抗-CD3 scFvをインビボで発現させる腫瘍細胞の形質移入が治療的に有効であることを示す。
【実施例３】
【００９０】
癌の遺伝子療法のための抗4-1BB scFv
免疫系を刺激するワクチンを構築するために、確立した技術(Hayden、Grosmaire et al. 、Tissue Antigens、48,242-54、1996; Winberg、Grosmaire et al.、Immunol Rev、153、1996)を用いてハイブリドーマ 1D8(抗-4-1BB モノクローナル抗体) (Melero、Shuford et al. 、Nat Med、3,682-5、1997)から細胞-結合型一本鎖Fv フラグメントをコードするベクターを構築した。ベクターは免疫原性が低くMHCクラスI発現が非常に低いK1735 メラノーマからの細胞に形質移入した(Ward et al. 、J. Exp. Med. 、170,1989)。形質移入細胞は強いThl応答を引き起こし、このためにはCD8+ではなくCD4+Tリンパ球が必要であり、NK細胞も関与する。ワクチン接種したマウスは皮下結節として、または肺の内部で増殖する野生型 K1735 腫瘍を拒絶する。本発明のアプローチは例えばMHCクラスI発現が低い腫瘍を含む、ヒト患者における微小転移に対して有効である。
【００９１】
マウスおよび腫瘍細胞系
６から８週齡の雌性C3H/HeN マウスを購入した(Taconic、Germantown、New York)。K1735はC3H/HeN起源のメラノーマであり、かかる起源から転移性クローン、M2が選抜された (Fidler and Hart、Cancer Res、41,3266-3267、1981)。そのMHCクラスI発現は非常に低いことが見いだされた(データ示さず)。Ag104 (Ward、Koeppen et al. 、J. Exp. Med. 、170,1989)はC3H/HeNの自然発生の線維肉腫である。YAC-1はAmerican Type Culture Collection (Rockville、Maryland)から得た。動物設備はALACに認可されたものであり、プロトコールはInstitutional Animal Committeeに許容されたものであった。
【００９２】
抗体
R-フィコエリトリン (PE) -結合MAbである、GK1. 5 (抗-マウス CD4)、53-6.7 (抗-マウス CD8a)および精製AF3-12. 1 (抗 H-2KK)はPharmingen (San Diego、California)から得、R-PE結合ヤギF (ab') 2 抗-ヒト IgGはBiosource International (Camarillo、California)から得た。MAb 169-4 (抗-CD8)はATCCから得、GK1. 5 (抗-CD4)はATCCから得たハイブリドーマによって産生した。ウサギ抗-アシアロ GM1 抗体はWako Pure Chemical Industries、(Richmond、Virginia)から得、精製ウサギIgGはSigma and Rockland (Gilbertsville、Pennsylvania)から得た。
【００９３】
ベクターおよびK1735 細胞の形質移入
可変領域クローニング方法、scFv構築方法、およびscFvを発現させる方法は以前に記載されている (Gilliland、Norris et al.、Tissue Antigens、47,1-20、1996; Hayden、Grosmaire et al.、Tissue Antigens、48,242-54、1996; Winberg、Grosmaire et al. 、Immunol Rev、153,1996)。本研究では抗-4-1BB ハイブリドーマ 1D8からの可変領域遺伝子(Melero、Shuford et al. 、Nat Med、3、682-5,1997)を用いて細胞-結合型1D8 scFvの表面発現を達成した (Hayden、Grosmaire et al.、Tissue Antigens、48,242-54、1996; Winberg、Grosmaire et al.、Immunol Rev、153,1996)。scFvの発現のために、細胞骨格付着および細胞-細胞接触間の架橋を媒介するCD80からの膜貫通ドメインおよび細胞質尾部を用いた(Doty and Clark、J Immunol、157,3270-9、1996; Doty and Clark、J Immunol、161,2700-7、1998)。pLNCX中のscFv 遺伝子融合コンストラクトをRetroPack（商標）PT67 パッケージング細胞(Clontech Laboratories、Inc、Palo Alto、California)にCaP04沈降を用いて形質移入した。K1735-WT細胞はかかる細胞からの培地を用いて形質移入した。G418耐性クローンをPE標識ヤギ抗-ヒト IgGでscFv表面発現について染色した。
【００９４】
動物実験 
5 または10/群のマウスの背中の一方に2 x 106 K1735-WTまたはK1735-1D8 細胞または照射された (12,000 rad) K1735-WT細胞を皮下移植した。免疫したマウスをK1735-WT (2 x 106細胞/マウス)またはAg104 (3 x 105細胞/マウス)で攻撃した。確立した K1735-WT 腫瘍を有するマウスの皮下にK1735-1D8 (2 x 106細胞/マウス)を移植した;免疫化細胞をWT細胞の反対側の背中の一方に与えた。腫瘍サイズはノギスを用いて２つの最も大きい垂直直径を測定することにより評価し、平均腫瘍面積 (mm2)±SDとして報告した。マウスの皮下移植された部位を腫瘍測定を容易にするために剪毛した。
【００９５】
１つの実験においてマウスの側尾静脈に3x105 K1735-WT細胞を静脈内注入し、肺転移を確立させた(Kahn et al. 、J Immunol、146,3235-3241、1991)。３日後、それらの背中の一方にK1735-1D8 細胞を皮下移植し、これを週に１回、全部で４回繰り返した。WT細胞の移植の３７日後、マウスを屠殺した。墨汁(リン酸緩衝食塩水中15%)を気管内に注入し、肺を取り出し、染色されていない転移が黒い正常組織に対してみられた (Estin et al. 、Proc Natl Acad Sci U S A、85,1052-6、1988)。
【００９６】
CD4+および/または CD8+Tリンパ球およびNK細胞のインビボ枯渇
T細胞を既に記載されているように、マウス腹腔内に3回、CD4に対するMAb (GK1. 5、ラットIgG2b)またはCD8に対するMAb(169-4、ラットIgG 2a)、またはそれら２種の組み合わせを、0. 5mg/マウスにて3日間注入することにより枯渇させた(Chen、Ashe et al.、Cell、71,1093-102、1992)。この後、各MAb を0.5 mgずつ3日ごとに注入して枯渇を維持させた。NK細胞は抗-アシアロ GM1 抗体を30μl/マウスにて腹腔内に４日ごとに注入することによって枯渇させた。12日目に、各群からの脾細胞をFACSにより分析し、枯渇の有効性を確かめた。その後、マウスの皮下に腫瘍細胞を移植した。
【００９７】
増殖アッセイ
脾細胞を96-ウェル平底プレート(1 x 105 細胞/ウェル)に、5 x105の同系の照射された(3,000 rad) 脾細胞(APCとして)および腫瘍細胞とともに播いた。72時間のインキュベーション後、 三連の培養を1 μCiの3 [H] チミジン (Amersham Pharmacia、Biotech Piscataway、New Jersey)によって16-18時間パルスし、その取り込みを測定した。
【００９８】
どのT細胞がインビトロで増殖したかを調べるために、脾細胞を2μMのCFDA SE (5- (および-6)-カルボキシフルオレセインジアセテートスクシニミジルエステル) (den Haan、Lehar et al. 、J. Exp. Med. 、192,1685-1695、2000)とともに製造業者 (Molecular Probes、Eugene、Oregon)のプロトコールにしたがってインキュベーションすることにより標識し、K1735-WT細胞の存在下または不在下で3日間インキュベートし、FACSで分析した。
【００９９】
CTL 活性のアッセイ
マウスをK1735-1D8の移植の2-4週間後に屠殺し、脾細胞懸濁液を調製した。特記する場合、NK細胞を抗- アシアロ GM1 抗体＋ウサギ補体(Cedarane、Ontario、Canada)を用いて除去した。5 x 106 脾細胞を5日間、 1x105□-照射された(12,000 rad) K1735-WT細胞とともに24-ウェルプレート(Costar Corp. 、Cambridge、Massachusetts)で培養した。細胞溶解活性を4時間Cr51放出アッセイで様々なE/T比にて測定した。
【０１００】
ELISPOTアッセイ
マウスIFNγELISPOTキット(R&D Systems、Minneapolis、Minnesota)を製造業者のプロトコールにしたがって用い、プレートをプレート- スキャン装置(Cellular Technology Ltd. 、Cleveland、Ohio)によって計数した。
【０１０１】
免疫組織化学
組織を腫瘍注入の10-30日後に取り出し、10% ホルマリンで固定し、ブロッキングし、4-6 μmの切片とし、ベクター ABCキット(Vector laboratories、Burlingame、California)を用いて製造業者のプロトコールにしたがって染色してCD4+および CD8+T細胞を検出した。切片をH-Eでも染色した。
【０１０２】
K1735-1D8 細胞は、CD4+T細胞およびNK細胞を必要とする機構を介して拒絶される
細胞結合型抗-4-1BB scFvをレトロウイルスベクターpLNCX (図15a)にクローニングした。コンストラクトをK1735-WTと称するK1735の転移性M2 クローン(Fidler and Hart、Cancer Res、41,3266-3267、1981)からの細胞に形質移入した。形質移入系、K1735-1D8は高レベルの抗-4-1BB scFvをその表面に発現する(図15b)。
【０１０３】
K1735-WT細胞は未処置の同系(C3H)マウスの皮下に(s.c.)に移植した場合連続的に増殖した。同じ用量のK1735-1D8 細胞は最初におよそ30 mm2 の表面積の腫瘍を形成したが、これらは退行し、20日目には消失した(図15c)。抗- ヒト CD28 scFvをコードする同様に構築されたコントロールベクターを形質移入したK1735-WT細胞はK1735-WT細胞と同様の速度でC3Hマウス中で増殖した。
【０１０４】
K1735-1D8の退行におけるCD4+およびCD8+Tリンパ球ならびにNK細胞の役割を調べるために、未処置マウスの腹腔内に(i.p.) MAbを注入して、CD8+、CD4+ またはCD4+およびCD8+両方のT細胞を除去するか、または抗-アシアロ GM1ウサギ抗体を注入してNK細胞を除去した。コントロールマウスにはラットIgGを注入した。１２日後、類似のマウスからの脾細胞のFACS分析により、標的細胞集団が枯渇したことが示された際に、K1735- 1D8 細胞を各群の皮下に移植した。K1735-1D8は抗-CD8 MAbまたはコントロールラットIgGを注入されたマウスにおいて類似の増殖動力学を示したが、CD4+T細胞のみ、あるいはCD4+T細胞とCD8+ T細胞を除いた場合、K1735-1D8はK1735-WTと同程度によく増殖した。CD4-枯渇群と比較して遅かったが、すべてのNK-枯渇マウスにおいてK1735-1D8が増殖した(図15d)。
【０１０５】
K1735-1D8による免疫化は記憶および特異性を有するK1735-WTに対する免疫を誘導する
群あたり10匹のC3Hマウスに２回、１０日間隔でK1735-1D8または照射された K1735-WT細胞を皮下移植した;コントロールには皮下にPBSを注入した。１０日後、マウスをWT細胞で攻撃した。K1735-1D8-免疫化マウスはWT細胞を拒絶したが、照射された K1735-WTで免疫したマウスは拒絶しなかった(図16a)。K1735-1D8 細胞による１回の免疫化は、移植されたK1735-WT細胞に対して保護するのに十分であった。
【０１０６】
WT細胞の拒絶の２ヶ月後、K1735-1D8に対して免疫したマウスに再びWT細胞を移植したところ、拒絶された(図16a)。一方、抗原的に無関係の肉腫Ag104からの細胞は未処置のコントロールにおけるのと同様に「拒絶性」マウスにおいても増殖した(図16b)。
【０１０７】
K1735-1D8に対して２回免疫され、その後移植したWT細胞を拒絶したマウスのおよそ20%が皮膚の色素脱失をおこし、これは４ヶ月を超える追跡期間中持続した(図16c)。自己免疫の他の徴候は無かった。
【０１０８】
K1735-1D8細胞は治療用ワクチンとして有効である
確立したK1735-WT腫瘍を有するマウスにK1735-1D8細胞を移植する３つの実験を行った。第一の実験は皮下に表面積およそ30 mm2の腫瘍を有するマウスを用いて行った。１群にはWT 腫瘍と反対側の背中の側にK1735-1D8 細胞の毎週の注入を４回行った。別の群には照射された K1735-WT細胞を移植し、第３の群にはPBSを皮下に与えた。WT 腫瘍はすべてのコントロールマウスおよびすべての照射された K1735-WT細胞で免疫されたマウスにおいて増殖した。一方、K1735-1D8に対して免疫した5匹のマウスのうち4匹では腫瘍は退行し(図17a)、３ヶ月後に実験を終了した際にも腫瘍無しのまま維持され、毒性の徴候はみられなかった。5匹目のマウスにおける腫瘍結節はマウスにK1735-1D8 細胞を与えている限り大きさが小さくなった。
【０１０９】
第二の実験において、マウスの皮下に１週間間隔でK1735-1D8を注入し、この実験はK1735-WT細胞の移植の１日前または４または８日後に開始した。比較のため、MAb 1D8をその他のマウス群と同じ時期に腹腔内(i.p.)注入した。コントロールにはPBSを腹腔内に与えた。表4に示すように、すべてのコントロールマウスはWT細胞を与えられた後49日以内に100 mm2以上の腫瘍のために死んだ。一方、WT細胞の移植の１日前から開始して、K1735-1D8 細胞をワクチン接種されたすべてのマウスまたはMAb 1D8を与えられたすべてのマウスは、WT細胞の移植の70日後に実験を終了した際に腫瘍を有さなかった。WT細胞の移植の4または8日後から開始して、K1735-1D8に対して免疫されたマウスは観察の最初の28日間は検出可能な腫瘍を有さなかったが、10匹のマウスうち4匹ではワクチン接種を止めた後腫瘍ができた。WT細胞の８日後にMAbを最初に注入されたマウスでは、対応するK1735-1D8群におけるマウスと比べて早く腫瘍が起こったが、これら２群の間で生存度の差はなかった。WT細胞の移植の20日後に収集した腫瘍を切片とし、H&Eで染色し、免疫組織化学によって評価した。PBSコントロールマウスからの腫瘍結節は多くの腫瘍性細胞および少数のCD4+およびCD8+T細胞を含んでおり、8日目からMAbを与えられたマウスも同様であった。一方、8日目にK1735-1D8によって初めて免疫されたマウスからの結節は、多数のCD4+およびCD8+Tリンパ球そしてわずかな腫瘍性細胞を含んでいた(図17b)。
【０１１０】
5マウス/群を用いる第三の実験では、マウスの静脈内に(i.v.) 3x105 K1735-WT細胞を注入して肺転移を起こさせた。３日後、K1735-1D8細胞を皮下に移植し、この手順を週に１回、１ヶ月繰り返した;コントロールマウスにはPBSを注入した。この実験はWT細胞を与えられてから３７日後にコントロール群の１匹のマウスが死んだときに終了した。その時点で、コントロールマウスの肺は500を超える転移性病巣を有していたが、免疫したマウスからの肺においてはかかる病巣は10未満であった(図17c)。
【０１１１】
K1735-1D8細胞による免疫化はThlタイプ免疫応答を誘導する
K1735-1D8に対して免疫したマウスからの脾細胞の、トリチウム標識チミジンの取り込みによって測定した増殖は、未処置マウスまたは照射された K1735-WTで免疫されたマウスからの脾細胞の増殖のおよそ２倍であった(図18a)。K1735-1D8で免疫したマウスからの脾細胞を照射された K1735-WT細胞とともに培養した場合、それはおよそ４倍に上昇したが、Ag104 細胞と共に培養しても上昇しなかった。未処置マウスおよびK1735-1D8に対して免疫したマウスからの脾細胞をCFDA SEで標識し(den Haan、Lehar et al. 、J. Exp. Med. 、192,1685-1695、2000)、その後、照射された K1735-WT細胞の存在下または不在下でインキュベーションする増殖アッセイも行った。K1735-1D8免疫マウスからのCD4+およびCD8+脾細胞は激しく増殖し(図18b)、もっとも強い増殖はK1735-WT細胞の存在下でみられた。未処置マウスからの脾細胞は増殖しなかった。
【０１１２】
K1735-1D8に対して免疫されたマウスからの脾細胞では、未処置マウスまたはK1735-WT 腫瘍担持マウスからの脾細胞と比べてより大部分がELISPOTアッセイにおいてIFNγを産生した(図19a)。表4における実験からの脾細胞を用いたELISPOTアッセイは、K1735-WT の移植の１日前または４日後にK1735-1D8で免疫したマウスにおける反応性を示し、反応性は脾細胞を最初にK1735- WT細胞と3日間共培養した場合により高かった(図19b)。WT細胞の１日前に免疫した群における最も高い反応性は、腫瘍負荷がより小さいことによる可能性がある。抗-4-1BB MAbを注入されたマウスからの脾細胞または未処置の脾細胞では反応性はみられなかった。
【０１１３】
K1735-1D8に対して免疫したマウスからの脾細胞を照射された K1735-WT細胞とともに５日間インキュベートし、その後4時間Cr51放出アッセイにて試験した。NK細胞を前もって除去しなかった場合、K1735、Agl04およびYAC細胞はほぼ同程度に溶解された(図19c)。しかし、脾細胞をまずウサギ抗-アシアロ GM1 抗体 ＋補体とともにインキュベートしてNK細胞を除いた場合、低くはあるがAg104またはYACと比べて有意な、K1735-WTに対するCTL 活性がみられ、これは抗-MHCクラス I MAbによって阻害される(図19d)。
【０１１４】
K1735-1D8 細胞とK1735-WT細胞を混合した場合のバイスタンダー効果の証拠
例えばインビボ形質移入の結果として、インビボで抗-4-1BB scFvを発現する腫瘍細胞が野生型腫瘍細胞に対しても有効な免疫応答を誘導するのか否かを調べるために、K1735-WT細胞とK1735-1D8 細胞とを混合する２つの実験を行った。第一の実験は同じ数の２つの細胞タイプを混合した場合、腫瘍は短期間のインビボ増殖の後退行することを示した。第二の実験において、2x106 K1735-WT細胞を2x105 K1735-1D8 細胞と混合した。図20に示すように、WT細胞の増殖はそれらが単独で移植された場合と比べて阻害された。
【０１１５】
したがって抗-4-1BB ハイブリドーマ 1D8からの細胞-結合型scFvを発現するK1735-1D8 細胞は、同系マウスによって拒絶され、CD4+T細胞およびNK細胞が拒絶に必須であるが、CD8+T細胞は必須ではない。さらに、K1735-1D8に対する免疫化は、記憶と特異性の両方を有するK1735-WTに対する全身免疫応答を誘導する。一方、照射された K1735-WT細胞によるマウスの反復する免疫化はWT細胞による攻撃に対して保護しなかった。これは K1735がCD80を発現するよう形質移入された後にも低い免疫原性しか有さないということを示すデータと一致する。インビトロアッセイにより、マウスからの脾細胞がK1735-1D8 細胞に免疫性を与えることが示された。腫瘍担持マウスへのワクチン接種は、腫瘍が皮下で増殖する場合も肺で増殖する場合も治療上有効であった。
【０１１６】
免疫原性が低くMHCクラスI発現が非常に低い腫瘍であるK1735-WTに対して観察された治療効果は、腫瘍細胞が抗- (ヒト) 4-1BB scFvを発現するするように形質移入され、自己または異質遺伝子型ワクチンとして、癌患者が従来の治療を受けた後にも残っている微小転移を破壊するために用いられる臨床試験を支持する。
【０１１７】
ヒト 4-1BBに特異的なscFvを、G19-4、500A2 および1D8 scFvについて記載した手順に従ってハイブリドーマ 5B9から作成した。図21は、ヒトIgG1ヒンジ、CH2およびCH3ドメインならびにヒトCD80からの膜貫通ドメインおよび細胞質尾部に融合させた5B9 scFvの配列を示す。
【０１１８】
以下の参考文献も参照されたい： 
Allison, J. P., C. Chambers, et al. (1998). "A role for CTLA-4-mediated inhibitory signals in peripheral T cell tolerance ?" Novartis Found Symp 215: 92-8. 
Beatty, P. G. , J. A. Ledbetter, et al. (1983). "Definition of a common leukocyte cell- surface antigen (Lp95-150) associated with diverse cell-mediated immune functions. "J Immunol 131 (6): 2913-8. 
Bennett, M. W. , J. O'Connell, et al. (1998)."The Fas counterattack in vivo: apoptotic depletion of tumor-infiltrating lymphocytes associated with Fas ligand expression by human esophageal carcinoma."J Immunol 160 (11): 5669-75. 
Boise, L. H. , A. J. Minn, et al. (1995). "CD28 costimulation can promote T cell survival by enhancing the expression of Bcl-XL."Immunity 3 (1) : 87-98. 
Boon, T. , P. G. Coulie, et al. (1997). "Tumor antigens recognized by T Cells."Immunol Today 18 (6): 267-8. 
Cassian, Y. , P. A. Savage, et al. (1999). "Isolation of high avidity melanoma-reactive CTL from heterogeneous populations using peptide-MHC tetramers. "J. Immunol. 162 (2227- 2234). 
Chappell, D. B. and N. P. Restifo (1998). "T cell-tumor cell: a fatal interaction ?" Cancer Immunol Immunother 47 (2) : 65-71. 
Cheever, M. A. , M. L. Disis, et al. (1995). "Immunity to oncogenic proteins."Immunbl Rev 145: 33-59. 
Chen, L. , S. Ashe, et al. (1992)."Costimulation of antitumor immunity by the B7 counterreceptor for the T lymphocyte molecules CD28 and CTLA-4." Cell 71 (7): 1093-102. 
Chen, L. , P. McGowan, et al. (1994)."Tumor immunogenicity determines the effect of B7 costimulation on T cell-mediated tumor immunity."J Exp Med 179: 523-532. 
Chen, W. , W. Jin, et al. (1998). "Engagement of cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 (CTLA-4) induces transforming growth factor beta (TGF-beta) production by murine CD4 (+) T cells."J Exp Med 188 (10): 1849-57. 
Daniel, P. T. , A. Kroidl, et al. (1997). "Costimulatory signals through B7.1/CD28 prevent T cell apoptosis during target cell lysis."J Immunol 159 (8): 3808-15. 
DeBenedette, M. A. , N. R. Chu, et al. (1995)."Role of 4-1BB ligand in costimulation of T lymphocyte growth and its upregulation on M12 B lymphomas by cAMP."J Exp Med 181 (3): 985-92. 
den Haan, J. M. M. , S. M. Lehar, et al. (2000). "CD8+ but not CD8-dendritic cells cross- prime cytotoxic T cells in vivo. "J. Exp. Med. 192: 1685-1695. 
D'Orazio, T. J. and J. Y. Niederkorn (1998). "A novel role for TGF-beta and IL-10 in the induction of immune privilege. "J Immunol 160 (5): 2089-98. 
Doty, R. T. and E. A. Clark (1996). "Subcellular localization of CD80 receptors is dependent on an intact cytoplasmic tail and is required for CD28-dependent T cell costimulation. "J Immunol 157 (8): 3270-9. 
Doty, R. T. and E. A. Clark (1998). "Two regions in the CD80 cytoplasmic tail regulate CD80 redistribution and T cell costimulation. "J Immunol 161 (6): 2700-7. 
Ellenhorn, J. D. , R. Hirsch, et al. (1988). "In vivo administration of anti-CD3 prevents malignant progressor tumor growth. "Science 242 (4878): 569-71. 
Espevik, T. and J. Nissen-Meyer (1986). "A highly sensitive cell line, WEHI 164 clone 13, for measuring cytotoxic factor/tumor necrosis factor from human monocytes."J Immunol Methods 95 (1) : 99-105. 
Estin, C. D. , U. S. Stevenson, et al. (1988). "Recombinant vaccinia virus vaccine against the human melanoma antigen p97 for use in immunotherapy."Proc Natl Acad Sci U S A 85 (4): 1052-6. 
Fidler, I. J. and I. R. Hart (1981). "Biological and experimental consequences of the zonal composition of solid tumors. "Cancer Res 41: 3266-3267. 
Finn, O. J. , K. R. Jerome, et al. (1995)."MUC-1 epithelial tumor mucin-based immunity and cancer vaccines."Immunol Rev 145: 61-89. 
Fiorentino, D. F. , M. W. Bond, et al. (1989). "Two types of mouse T helper cell. IV. Th2 clones secrete a factor that inhibits cytokine production by Thl clones. "J Exp Med 170 (6): 2081-95. 
Garlie, N. K. , A. V. LeFever, et al. (1999). "T cells coactivated with immobilized anti- CD3 and anti-CD28 as potential immunotherapy for cancer. "J Immunother 22 (4): 336-45. 
Gilliland, L. K. , N. A. Norris, et al. (1996). "Rapid and reliable cloning of antibody variable regions and generation of recombinant single chain antibody fragments."Tissue Antigens 47 (1) : 1-20. 
Greenberg, P. D. (1991). "Adoptive T cell therapy of tumors : mechanisms operative in the recognition and elimination of tumor cells."Adv Immunol 49: 281-355. 
Hahne, M. , D. Rimoldi, et al. (1996). "Melanoma cell expression of Fas (Apo-1/CD95) ligand: implications for tumor immune escape. "Science 274: 1363-1366. 
Hayden, M. S. , L. S. Grosmaire, et al. (1996). "Costimulation by CD28 sFv expressed on the tumor cell surface or as a soluble bispecific molecule targeted to the L6 carcinoma antigen." Tissue Antigens 48 (4 Pt 1) : 242-54. 
Hayden, M. S. , P. S. Linsley, et al. (1994). "Single-chain mono-and bispecific antibody derivatives with novel biological properties and antitumour activity from a COS cell transient expression system. "Ther Immunol 1 (1) : 3-15. 
Hellstrom, I., K. E. Hellstrom, et al. (1969). "Studies on immunity to autochthonous mouse tumors. "Transplant Proc 1 (1) : 90-4. 
Hellstrom, K. E. and I. Hellstrom (1969). "Cellular immunity against tumor specific antigens."Adv Cancer Res 12: 167-223. 
Hellstrom, K. E. and I. Hellstrom (1974). "Lymphocyte-mediated cytotoxicity and blocking serum activity to tumor antigens."Adv Immunol 18: 209-77. 
Hellstrom, K. E. and I. Hellstrom (1999). Cancer Vaccines. Handbook of Experimental Pharmacology. P. Perlmann and H. Wigzell. Heidelberg, Springer. Vaccines (Chapter IT) : 463- 478. 
Hu, H. M. , W. J. Urba, et al. (1998). "Gene-modified tumor vaccine with therapeutic potential shifts tumor-specific T cell response from a type 2 to a type 1 cytokine profile."J Immunol 161 (6): 3033-41. 
Huang, A. Y., P. Golumbek, et al. (1994). "Role of bone marrow-derived cells in presenting MHC class I-restricted tumor antigens. "Science 264 (5161): 961-5. 
Hurtado, J. C. , Y. J. Kim, et al. (1997). "Signals through 4-1BB are costimulatory to previously activated splenic T cells and inhibit activation-induced cell death. "J Immunol 158 (6): 2600-9. 
June, C. H. , J. A. Ledbetter, et al. (1990). "Role of the CD28 receptor in T-cell Activation."Immunol Today 11 (6): 211-6. 
Kahn, M. , H. Sugawara, et al. (1991). "CD4+ T cell clones specific for the human p97 melanoma-associated antigen can eradicate pulmonary metastases from a murine tumor expressing the p97 antigen."J Immunol 146 (9): 3235-3241. 
Kehrl, J. H. , L. M. Wakefield, et al. (1986). "Production of transforming growth factor beta by human T lymphocytes and its potential role in the regulation of T cell growth."J Exp Med 163 (5): 1037-50. 
Kerr, W. G. and J. J. Mule' (1994). "Gene therapy: current status and future prospects."J. Leuko. Biol. 56: 210-214. 
Kiessling, R. , K. Kono, et al. (1996). "Immunosuppression inhuman tumor-host interaction: role of cytokines and alterations in signal-transducing molecules."Springer Semin. Immunopathol. 18: 227-242. 
Kiessling, R. , K. Wasserman, et al. (1999). "Tumor-induced immune dysfunction." Cancer Immunol. Immunother. 48: 353-362. 
Kim, Y. J. , S. H. Kim, et al. (1998)."Human 4-1BB regulates CD28 co-stimulation to promote Thl cell responses. "Eur J Immunol 28 (3): 881-90. 
Klein, G. , H. O. Sjogren, et al. (1960). "Demonstration of resistance against methylcholanthrene-induced sarcomas in the primary autochthonous host. "Cancer Res 20: 1561- 1572. 
Krummel, M. F. and J. P. Allison (1996). "CTLA-4 engagement inhibits IL-2 accumulation and cell cycle progression upon activation of resting T cells. "J Exp Med 183 (6): 2533-40. 
Kugler, A. , G. Stuhler, et al. (2000)."Regression of human metastatic renal cell carcinoma after vaccination with tumor cell-dendritic cell hybrids. "Nature Medicine 6: 332-. 
Kume, T. , K. Oshima, et al. (1999). "Relationship between Fas-ligand expression on carcinoma cell and cytotoxic T-lymphocyte response in lymphoepithelioma-like cancer of the stomach."Int J Cancer 84 (4): 339-43. 
Leach, D. R. , M. F. Krummel, et al. (1996)."Enhancement of antitumor immunity by CTLA-4 blockade. "Science 271 (5256): 1734-6. 
Ledbetter, J A., C. H. June, et al. (1986)."Valency of CD3 binding and internalization of the CD3 cell-surface complex control T cell responses to second signals: Distinction between effects on protein kinase C, cyplasmic free calcium, and proliferation. "J. Immunol. 136: 3945- 3952. 
Ledbetter, J. A. , G. Shu, et al. (1987). "Augmentation of normal and malignant B cell proliferation by monoclonal antibody to the B cell-specific antigen BP50 (CDW40). "J Immunol 138 (3): 788-94. 
Levine, B. L. , W. B. Bernstein, et al. (1997)."Effects of CD28 costimulation on long- term proliferation of CD4+ T cells in the absence of exogenous feeder cells."J Immunol 159 (12): 5921-30. 
Linsley, P. S. and J. A. Ledbetter (1993). "The role of the CD28 receptor during T cell responses to antigen. "Annu Rev Immunol 11: 191-212. 
Loh, E. Y. , J. F. Elliott, et al. (1989)."Polymerase chain reaction with single-sided specificity: analysis of T cell receptor delta chain. "Science 243 (4888): 217-20. 
Maeurer, M. J. , S. M. Gollin, et al. (1996). "Tumor escape from immune recognition: lethal recurrent melanoma in a patient associated with downregulation of the peptide transporter protein TAP-1 and loss of expression of the immunodominant MART-1/Melan-A antigen. "J Clin Invest 98 (7): 1633-41. 
Martin, P. J. , J. A. Ledbetter, et al. (1986). "A 44 kilodalton cell surface homodimer regulates interleukin 2 production by activated human T lymphocytes."J Immunol 136 (9): 3282- 7. 
Matter, B. , C. F. Zukoski, et al. (1970). "Transplanted carcinoma in an immunosuppressed patient. "Transplantation 9 (1) : 71-4. 
Melero, I., N. Bach, et al. (1998). "Amplification of tumor immunity by gene transfer of the co-stimulatory 4-1BB ligand: synergy with the CD28 co-stimulatory pathway."Eur J Immunol 28 (3): 1116-21. 
Melero, I., J. V. Johnston, et al. (1998)."NK1.1 cells express 4-1BB (CDWL37) costimulatory molecule and are required for tumor immunity elicited by anti-4-1BB monoclonal antibodies. "Cell Immunol 190 (2): 167-72. 
Melero, I., W. W. Shuford, et al. (1997). "Monoclonal antibodies against the 4-1BB T- cell activation molecule eradicate established tumors. "Nat Med 3 (6): 682-5. 
Melief, C. J. and W. M. Kast (1995). "T-cell immunotherapy of tumors by adoptive transfer of cytotoxic T lymphocytes and by vaccination with minimal essential epitopes." Immunol Rev 145: 167-77. 
Miller, A. D. and G. J. Rosman (1989)."Improved retroviral vectors for gene transfer and expression. "Biotechniques 7 (9): 980-2,984-6, 989-90. 
Mizoguchi, H. , J. J. O'Shea, et al. (1992). "Alterations in signal transduction molecules in T lymphocytes from tumor-bearing mice [see comments]. "Science 258 (5089): 1795-8. 
Mule', J. , F. R. Jones, et al. (1979). "Selective localization of radiolabelled immune lymphocytes into syngeneic tumors."J. Immunol. 123: 600-606. 
Nakagomi, H. , M. Petersson, et al. (1993). "Decreased expression of the signal- transducing z chains in tumor-infiltrating T cells and NK cells of patients with colorectal carcinoma. "Cancer Res 53: 5610-5612. 
Natoli, G. , A. Costanzo, et al. (1998). "Apoptotic, non-apoptotic, and anti-apoptotic pathways of tumor necrosis factor signalling."Biochem Pharmacol 56 (8): 915-20. 
Nestle, F. O., S. Alijagic, et al. (1998). "Vaccination of melanoma patients with peptide- or tumor lysate-pulsed dendritic cells [see comments]."Nat Med 4 (3): 328-32. 
Old, L. J. and Y. -T. Chen (1998). "New paths in human cancer serology. "J. Exp. Med. 187: 1163-1167. 
Pardoll, D. M. (1996). "Cancer vaccines: a road map for the next decade."Curr Opin Immunol 8 (5) : 619-21. 
Ranga, U. , C. Woffendin, et al. (1998). "Enhanced T cell engraftment after retroviral delivery of an antiviral gene in HIV-infected individuals. "Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 1201-1206. 
Rodolfo, M. , C. Zilocchi, et al. (1999). "IL-4-transduced tumor cell vaccine induces immunoregulatory type 2 CD8 T lymphocytes that cure lung metastases upon adoptive transfer." J Immunol 163 (4): 1923-8. 
Rosenberg, S. A. (1995). Cell transfer therapy: clinical applications. Biologic Therapy of Cancer (Chapter 19). V. T. DeVita, S. Hellman and S. A. Rosenberg. Philadelphia, PA, J. P. Lippincott: 487. 
Rosenberg, S. A. , J. C. Yang, et al. (1998). "Immunologic and therapeutic evaluation of a synthetic peptide vaccine for the treatment of patients with metastatic melanoma [see comments]."Nat Med 4 (3): 321-7. 
Schoenberger, S. P. , L. E. Jonges, et al. (1998). "Efficient direct priming of tumor- specific cytotoxic T lymphocyte in vivo by an engineered APC. "Cancer Res 58 (14): 3094-100. 
Schwartz, R. H. (1989)."Acquisition of immunologic self-tolerance."Cell 57 (7): 1073- 81. 
Shiraki, K. , N. Tsuji, et al. (1997)."Expression of Fas ligand in liver metastases of human colonic adenocarcinomas."Proc Natl Acad Sci U S A 94 (12): 6420-5. 
Shuford, W. W. , K. Klussman, et al. (1997)."4-1 BB costimulatory signals preferentially induce CD8+ T cell proliferation and lead to the amplification in vivo of cytotoxic T cell responses."J Exp Med 186 (1) : 47-55. 
Sulitzeanu, D. (1993). "Immunosuppressive factors in human cancer. "Adv Cancer Res 60: 247-267. 
Takahashi, C. , R. S. Mittler, et al. (1999). "Cutting edge: 4-1BB is a bona fide CD8 T cell survival signal."J Immunol 162 (9): 5037-40. 
Thompson, C. B. , T. Lindsten, et al. (1989). "CD28 activation pathway regulates the production of multiple T-cell-derived lymphokines/cytokines."Proc Natl Acad Sci U S A 86 (4): 1333-7. 
Tsushima, H. , Y. Imaizumi, et al. (1999). "Fas antigen (CD95) in pure erythroid cell line AS-E2 is induced by interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha and potentiates apoptotic death. "Exp Hematol 27 (3): 433-40. 
Walunas, T. L. , C. Y. Bakker, et al. (1996). "CTLA-4 ligation blocks CD28-dependent T cell activation. "J Exp Med 183 (6): 2541-50. 
Walunas, T. L. , D. J. Lenschow, et al. (1994). "CTLA-4 can function as a negative regulator of T cell activation. "Immunity 1 (5): 405-13. 
Ward, P. I., H. Koeppen, et al. (1989). "Tumor antigens defined by cloned immunological probes are highly polymorphic and are not detected on autologous normal cells." J. Exp. Med. 170 (217-232). 
Wilbanks, G. A. , M. Mammolenti, et al. (1992). "Studies on the induction of anterior chamber-associated immune deviation (ACAID). III. Induction of ACAID depends upon intraocular transforming growth factor-beta. "Eur J Immunol 22 (1) : 165-73. 
Wilson, R. E. , E. B. Hager, et al. (1968)."Immunologic rejection of human cancer transplanted with a renal allograft."N Engl J Med 278 (9): 479-83. 
Winberg, G. , L. S. Grosmaire, et al. (1996). "Surface expression of CD28 single chain Fv for costimulation by tumor cells."Immunol Rev 153 (209). 
Yang, G. , K. E. Hellstrom, et al. (1995). "Antitumor immunity elicited by tumor cells transfected with B7-2, a second ligand for CD28/CTLA-4 costimulatory molecules. "J Immunol 154 (6): 2794-800. 
Yang, G. , M. T. Mizuno, et al. (1997). "B7-negative versus B7-positive P815 tumor: differential requirements for priming of an antitumor immune response in lymph nodes. "J Immunol 158 (2): 851-8. 
【０１１９】
本明細書において参照または言及したすべての特許、刊行物、技術文献、ウェブサイトおよびその他の文献および材料は本発明が属する技術分野の当業者のレベルを示すものであり、かかるそれぞれの参照された文献および材料を、それらが完全かつ個々にその全体が本明細書に開示されているかのように引用により本出願に含める。本出願人はかかるあらゆる特許、刊行物、技術文献、ウェブサイト、電子情報、およびその他の参考材料または文献からのすべての材料および情報を本明細書に物理的に組み込む権利を有する。
【０１２０】
本明細書に記載した特定の方法および組成は好適な態様を代表するものであり、例示的な物であって本発明の範囲を限定する意図のものではない。その他の目的、側面および態様は当業者が本明細書を考慮することによって想到できるものであり、請求の範囲に記載する本発明の精神の範囲に含まれる。当業者には様々な代替および改変が本発明の範囲および精神を逸脱することなく、本明細書に開示された本発明に対して行うことが出来ることが明らかであろう。本明細書において例示的に記載する本発明は、本明細書において必須であると具体的に開示された１または複数の要素あるいは限定が存在しなくても好適に
実施することが出来る。したがって、例えば、本発明の態様または実施例においてあらゆる場合、「含む」、「実質的に〜からなる」および「からなる」の用語は、本明細書において互換的に用いることが出来る。また「からなる」、「含む」、「含有する」などの用語も、拡張的に限定無しに読むことが出来る。本明細書に例示的に記載する方法および手段は異なる工程の順序にて好適に実施することが出来、本明細書または請求の範囲に示された工程の順序に拘束される必要はない。本明細書および添付の請求の範囲において用いる場合、特に断りのない限り単数形は複数形も含む。したがって例えば「宿主細胞」の語は、複数の宿主細胞（例えば、培養物または集団)も含む。本特許は、いかなる状況においても本明細書に具体的に開示した特定の実施例または態様または方法に限定されるように解釈してはならない。特許庁の審査官などのいかなる言葉によっても、かかる言葉が本出願人に責任ある記載において、具体的に限定または制限無く明白にされない限り、本特許は、いかなる状況においても限定されるように解釈してはならない。
【０１２１】
用語および表現は記載のためであって制限のためでなく用いられたものであり、かかる用語および表現の使用により本明細書に示され、記載された特徴またはその部分のいかなる均等物を排除する意図ではなく、請求の範囲に記載した本発明の範囲内で様々な改変を行うことが出来ることを理解されたい。したがって本発明は好適な態様および任意の特徴によって具体的に開示したが、本明細書に開示した概念の改変および変更が当業者に可能であり、かかる改変および変更は添付の請求の範囲に記載した本発明の枠内であると考えられることを理解されたい。
【０１２２】
本発明を本明細書において広範囲に一般的に記載した。この一般的な開示に含まれるより狭い下位概念も、本発明の一部を形成する。特記した材料が本明細書に具体的に開示されているかにかかわらず、これには本発明の一般的な記載も含まれるし、部類から特定のものを除くような条件または限定も含まれる。
【０１２３】
その他の態様も添付の請求の範囲の枠内である。さらに、本発明の特徴または側面がマーカッシュグループにおいて記載されている場合、当業者であればマーカッシュグループの個々のメンバーまたは複数のメンバーのサブグループに関しても本発明が記載されていることを理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】図１は、進行した卵巣癌患者(OV44)から単離したインビトロで増殖させた腫瘍浸潤性リンパ球(TIL)の増殖を示す。パネルAはコントロールビーズ＋自己腫瘍細胞で刺激したリンパ球増殖を示す。パネルBは、抗-CD3/CD28/CD40結合ビーズ＋自己腫瘍細胞で刺激した後のリンパ球増殖を示す。パネルCは腫瘍細胞を添加せずに抗- CD3/CD28/CD40 ビーズで刺激した後のリンパ球増殖を示す。
【図２】図２は、自己であって異質遺伝子型ではない腫瘍細胞と、CD28と組み合わせてCD3を介して大腸癌患者からのPBMCの増殖を刺激するビーズの組み合わせである。この図は自己(1C)または異質遺伝子型の(4007)卵巣癌細胞の存在下でのインビトロ刺激の5日後の癌患者1Cからの末梢血リンパ球の増殖を示す。刺激は以下の通りであった;A=コントロールビーズ;B=抗-CD28/CD40結合ビーズ; C=抗-CD3/CD28結合ビーズ; D=抗-CD3/CD28/CD40結合ビーズ; E=抗-CD3/CD40結合ビーズ。
【図３】図３は、CD28またはCD28＋CD40と組み合わせてCD3を介して刺激するビーズの存在下での大腸癌患者からのPBMCが、4時間Cr51放出アッセイにて自己腫瘍細胞を溶解することを示す図である。この図は、自己腫瘍細胞＋抗-CD3/CD28 ビーズ(A)または自己腫瘍細胞＋抗-CD3/CD28/CD40ビーズ (B)によるPBL活性化の後の、示された標的細胞に対して試験した患者1CからのPBLの細胞-媒介細胞障害性を示す。
【図４】図４は、自己腫瘍細胞とCD28と組み合わせてCD3を刺激するビーズとの培養後に、頭頚部癌患者からのPBMCがIFNγを産生することを示す。この図は進行した頭頚部癌の患者 1HN からのPBLによって産生されるIFNγを示す。培養上清中のIFNγレベルを抗-CD3/CD28のみ(A)、抗-CD3/CD28 ビーズ＋自己腫瘍細胞(B)、またはコントロールビーズ＋自己腫瘍細胞(C)による刺激後の様々な時点で測定した。
【図５】図５は、CD28と組み合わせてCD3を刺激するビーズによる刺激後の大腸癌患者からのPBMCに発現するCD83を示す。この図は、進行した癌患者(38C)からのPBMC上のCD83の発現を示す。細胞を抗-CD3/CD28 ビーズによる刺激前（0日目）または刺激の1日後にフィコエリトリン(PE)を直接結合した抗-CD83で染色した。
【図６】図６は、CD3＋CD28を介する刺激の2日後の方が、CD28＋CD40とCD3の組み合わせを介する刺激後よりも高いレベルのCD83が大腸癌患者からのPBMCに発現することを示す。この図は、進行した癌患者(38C)からのPBMCが抗- CD3/CD28/CD40 ビーズにより活性化されなかったか2日間活性化されたか、または抗-CD3/CD28 ビーズにより2日間活性化されたかを示す。細胞を同時にフルオレセイン-結合抗-CD3およびPE-結合抗-CD83で染色した。
【図７】図７は、マウス CD80を発現するK1735細胞および野生型K1735細胞と比較して細胞表面に抗-CD3 scFvを発現するように形質移入されたK1735メラノーマ 細胞(500A2)の退行を示す。
【図８】図８は、K1735-50OA2 細胞に対して繰り返し免疫された同系マウスに移植されたK1735-WT細胞の退行を示す。C3H/HeNマウスを３回、K1735M2/500A2細胞(2ｘ106/マウス)で7日間隔で免疫し、1ｘ106/マウス皮下注射にてK1735M2野生型細胞(青色線)で攻撃した(challenged)。C3H/HeN マウスをPBSで免疫し、同じ用量でK1735M2 野生型で攻撃した(赤色線)。
【図９】図９は、抗-ヒト CD3 scFv遺伝子の配列、即ち、形質移入に使用するための細胞表面に発現する産物をコードする抗-ヒト CD3 scFv-hIgG1-CD80TM合成ポリヌクレオチドの配列を示す。
【図１０】図１０は、レトロウイルス遺伝子形質導入の後の２つのヒト細胞系の表面における抗-ヒト CD3 scFvの発現を示す。抗-ヒト CD3 scFv (G19-4)はレトロウイルス遺伝子形質導入によりRehおよびT51細胞系の表面に発現した。G19-4 scFv 遺伝子産物の表面発現を、遺伝子産物に含まれるIgG1CH2およびCH3ドメイン検出用のフルオレセイン-結合抗-ヒトIgGを用いて検出した。各パネルにおいて野生型細胞との反応を破線によって示し、形質移入細胞との反応を実線で示す。
【図１１】図１１は、表面に抗-CD3 scFvを発現するヒト細胞系と共培養したヒトT細胞の増殖を示す。この図は、細胞表面に抗-CD3 scFvを発現するRehまたはT51 細胞との培養により誘導されたT細胞の増殖を示す。増殖は野生型 RehまたはT51 細胞によっては誘導されない。増殖は３日間の培養の最後の８時間の3H-チミジンの取り込みによって測定した。
【図１２】図１２は、静止ヒトPBMCが表面に抗- CD3 scFvを発現する２つのヒト細胞系からの細胞を溶解することを示す。この図は、静止PBMCが迅速に腫瘍細胞表面に抗-CD3 scFv を発現するReh およびT51 細胞を殺傷するが、野生型 RehやT51 細胞は殺傷しないことを示す。51Cr-標識化細胞系を８時間図示する細胞比にて三連の培養にてPBMCとインキュベートし、放出された51Crを測定した。パーセント特異的殺傷は古典的な式によって測定した(実験放出−自発放出を、最大放出−自発放出で割った)。
【図１３】図１３は、表面に抗-CD3 scFvを発現するK1735-500A2 細胞が、K1735-500A2 対 WT細胞比1: 10にて混合されたK1735-WT細胞からの腫瘍形成を阻害し、「バイスタンダー効果」を示すことを示す。この図は、K1735- 500A2 細胞と K1735-WT細胞の混合物(比1: 10)が免疫適格同系 (C3H) マウスにおける増殖を阻害されることを示す。K1735-WT細胞は単独で免疫されたか、あるいはK1735-WT細胞はK1735-500A2 形質移入細胞と10: 1（非形質移入：形質移入腫瘍細胞）の比にて混合された。2x106のK1735-WT細胞が2 x105のK1735-500A2 細胞と混合され、混合細胞を用いてC3H マウスを皮下注射により免疫した。腫瘍増殖は５日間隔でモニターした。
【図１４】図１４は、K1735-500A2 細胞で免疫されたマウスからの脾細胞は照射された K1735-WT細胞と組み合わせた場合に増殖するが、Ag104 細胞と組み合わせた場合は増殖しないことを示す。
【図１５】図１５は、同系マウスに移植されたK1735-1D8 細胞が、CD4+ T細胞と NK細胞の両方に依存する機構によって拒絶されることを示す。この図は、C3H マウスに移植されたK1735-1D8 細胞がCD4+ T細胞およびNK細胞依存的機構によって拒絶されることを示す。a)抗-マウス 4-1BB ハイブリドーマ1D8からのscFv DNAを含むレトロウイルスベクターの構造; b) K1735-1D8 細胞表面の1D8 scFvの発現（K1735- 1D8 細胞に発現する免疫グロブリン尾部を認識するが(斜線部分)、K1735-WT細胞上のそれは認識しない(実線部分)PEに結合したヤギ-抗-ヒトIgからの F(ab') 2により検出）; c) 未処置マウスにおけるK1735- 1D8 (○)およびK1735-WT (■)の細胞の増殖動力学; d)精製ラットIgG を注入された、CD4+(■)、CD8+ (□)、CD4++CD8+ (○) T細胞またはNK (△) 細胞を失ったマウスおよびコントロール (●) マウスにおけるK1735-1D8 細胞の増殖動力学。
【図１６】図１６は、照射されたK1735-WT細胞による免疫化ではなく、K1735-1D8 細胞による免疫化が、移植されたK1735-WT細胞の増殖に対して保護することを示し、これは記憶および特異性を有する機構によると考えられる。a) マウス (10/群)を１０日間隔で２回、K1735-1D8 (○)または照射されたK1735-WT (□) 細胞の皮下移植によって免疫した。あるいはPBS(■)を注入した。最後の免疫化の１０日後に、それらをK1735-WT細胞で攻撃し、K1735-1 D8で免疫したマウスは第二の２ヶ月後のWT細胞の攻撃を拒絶した(黒三角);b) Ag104 細胞を3x105/マウスにて、K1735-1D8 (■)に対して免疫され、２回K1735-WT細胞を拒絶したマウスおよびPBSを注入したコントロール(○)マウスに移植した; c)K1735-1D8に対して免疫されK1735-WT細胞を拒絶したマウスの背中の皮膚の色素脱失。
【図１７】図１７は、皮下または肺の中で増殖した確立したK1735-WT腫瘍の、皮下移植したK1735-1D8 細胞をワクチンとして用いる治療を示す。この図は免疫原としてK1735-1D8を用いる確立したK1735-WT腫瘍の治療を示す。a)６日前に30 mm2 の表面積のK1735-WT 腫瘍を移植されたマウスにK1735-1D8 (○)または照射されたK1735-WT (□) 細胞を反対側における皮下注入によりワクチン接種した; PBS (■)を皮下注入されたマウスをコントロールとした。同じ処置を示された時点にて(↓)繰り返した; b)未処置のマウス(左パネル)、またはWT細胞を受容した８日後にK1735-1D8でワクチン接種したマウス(中央パネル)、またはWT細胞を受容した８日後にMAb 1D8を注入したマウス(右パネル)に、K1735-WT細胞を移植した２０日後に回収した腫瘍の免疫組織化学。各写真の上側および下側はそれぞれ同じ腫瘍結節のCD4+T細胞およびCD8+T細胞を表す; c) K1735-WT細胞を静脈注射されたマウスにおける肺転移。上側パネルはコントロールマウスの肺および下側パネルはK1735-1D8 細胞を繰り返し移植することによってワクチン接種されたマウスの肺を示す。
【図１８】図１８は、K1735-1D8で免疫したマウスからの脾細胞がK1735-WT細胞と組み合わせた場合に増殖するが、抗原的に異なる肉腫 Ag104からの細胞と組み合わせた場合増殖しないことを示す。この図はK1735-1D8により免疫されたマウスからの脾細胞の増殖を示す。a) K1735-1D8 または照射された K1735-WT細胞のいずれかで２回免疫されたマウスからの脾細胞を照射された K1735-WT (「K1735」) またはAg104 (「Ag104」) 細胞とともに３日間培養した;未処置マウスからの脾細胞をコントロールとした。トリチウム標識した脾細胞の増殖を測定した; b) CFDA SEで標識したCD4+ および CD8+ 脾細胞の増殖のフローサイトメトリー分析。
【図１９】図１９は、K1735-1D8に対して免疫されたマウスからの脾細胞のIFNγ分泌およびCTL活性を示す。この図はINFγ分泌および細胞障害性活性を示す。a)１０日間隔でK1735-1D8 細胞で２回免疫した未処置マウスからの脾細胞の直接INFγELISPOTアッセイ。最後の免疫化の１０日後に収集した脾細胞をIFN-γELISPOTプレートに添加し、これを24時間インキュベートした;未処置マウスおよびK1735-WT 腫瘍担持マウスからの脾細胞を比較のために試験した; b)表１に要約する実験からのインビトロ刺激(■)および非刺激(□)脾細胞をINFγ分泌につき、K1735-WTでの攻撃の３０日後に行ったELISPOTアッセイで試験した。以下を与えられたマウスにつき群あたりの平均スポット数(3連)を示す(上から下へ）: WT細胞の１日前または４または８日後のK1735- 1D8 細胞; WT細胞の１日前または４または８日後のMAb 1D8。下の２行はコントロール群からの脾細胞および未処置マウスからの脾細胞についてのELISPOTデータを示す; c) K1735-1D8 免疫化マウスからの脾細胞を照射されたK1735-WT細胞とともに５日間培養し、4時間Cr51放出アッセイにてK1735-WT(■)、Ag1O4 (□)およびYAC-1 (○) 細胞の溶解について試験した。d) 図5cと同様の実験を行ったが、ただし、脾細胞を抗-アシアロGM1抗体およびウサギ補体とともにインキュベートしてNK細胞を除いた後、照射された K1735- WT細胞とともに培養して試験した。それらのK1735-WT (■) 細胞に対する細胞溶解活性は抗- MHCクラス I Mab (黒三角)によって阻害された。低い細胞溶解活性がAg104 (□)に対して検出されたが、YAC-1 (○) 細胞は溶解されなかった
【図２０】図２０は、表面に抗-4-1BB scFvを発現するK1735-1D8 細胞が、1D8 と WT細胞の比を1: 10とした場合に混合 K1735-WT細胞からの腫瘍形成を阻害し、「バイスタンダー効果」を有することを示す。この図はK1735-1D8 細胞と K1735-WT細胞の混合物 (比1: 10)が免疫適格同系 (C3H) マウスにおいて増殖を阻害されたことを示す。K1735-WT細胞は単独で免疫されたかあるいはK1735-WT細胞と K1735-1D8 形質移入細胞が、非形質移入：形質移入腫瘍細胞比10: 1にて混合された。2x106 K1735-WT細胞が2x105 K1735-1D8 細胞と混合され、混合細胞を用いてC3H マウスを皮下注入により免疫した。腫瘍増殖は５日間隔でモニターした。
【図２１】図２１は、5B9 抗-ヒト 4-1BB scFvの配列を示す。この図は、細胞表面に発現した5B9Igの推定ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。
【図２２】図２２は表１である。
【図２３】図２３は表２である。
【図２４】図２４は表３である。
【図２５】図２５は表４である。
【配列表】
2005528892.tif 000002
2005528892.tif 000003
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
2005528892.tif 000036
【図２１−１】
2005528892.tif 000037
【図２１−２】
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【図２１−３】
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【図２２】
2005528892.tif 000040
【図２３】
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【図２４】
2005528892.tif 000042
【図２５】
2005528892.tif 000043
【手続補正書】
【提出日】平成17年5月18日(2005.5.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005528892000001.app
【国際調査報告】
2005528892.tif 000044
2005528892.tif 000045
2005528892.tif 000046