(57)【要約】  本発明は、細胞間伝達および細胞間輸送の調査のための方法に関し、細胞個別化の後に、個別化された細胞が、Ｆアクチンおよびミオシンを含み、５０から４００ｎｍの直径を有し、概して５０μｍｍの長さまでであるいは場合によってさらに長く、細胞間を橋絡している膜チューブに関して調査される。本発明はさらに、細胞間における細胞小器官輸送が調査される方法に関する。
2005509446.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞間の伝達および細胞間の輸送を調査する方法であって、
細胞の個別化の後に、個別化された細胞が、Ｆアクチンおよびミオシンを含み、５０から４００ｎｍの直径を有し、概して５０μｍの長さまでで、あるいは場合によってさらに長く、細胞間を橋絡している膜チューブ（membrane tubes) に関して調査される  
細胞間の伝達および細胞間の輸送を調査する方法。
【請求項２】
前記細胞間における細胞小器官輸送が調査される
請求項２に記載の方法。
【請求項３】
（ｉ）第１の数の細胞への１つあるいはそれ以上の物質を添加する工程であって、前記物質は第１の期間内に前記第１の数の細胞によって取り込まれる（endocyted)ように選択される工程、
（ｉｉ）洗浄後の前記第１の数の細胞と第２の数の細胞とを混合する工程であって、その混合の結果、第２の期間内に細胞間の膜チューブが、前記第１および第２の数の細胞の間に形成される工程、
（ｉｉｉ）１つあるいはそれ以上の取り込まれた（endocyted)前記物質を含む前記第２の数の細胞の細胞数を決定する工程
を含む請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｉ）において、前記第１の数の細胞は第１の取り込み可能な（endocytable)物質をもつ細胞であり、前記第２の数の細胞は第２の取り込み可能な（endocytable)物質をもつ細胞であり、前記第１および第２の物質は異なる
請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記取り込み可能な物質は、蛍光色素（fluorescence dyes)、Ｄｉｌ、ＤｉＯ、リソトラッカー（Lysotracker:商標名) 、放射性マーカー物質(radioactive marker substances) 、発光色素(luminescence dyes) 、蛍光を発するあるいは発光するタンパク質およびペプチド(fluorescing or luminescing protein and peptide)、マーカー物質と結合されたタンパク質あるいはペプチド（proteins or peptides which are coupled with a marker substance) のうち、１つあるいはそれ以上の色素から選択される
請求項３あるいは４に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｉ）において、前記物質の取り込み（endocytosis)は、前記細胞小器官における前記物質の本質的あるいは一時的な発現によって、前記細胞小器官において取り替えられる
請求項２から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｉｉｉ）は、ＦＡＣＳによって行われる
請求項２から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｉｉｉ）は、試験媒体の存在あるいは影響下において行われる
請求項２から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記試験媒体は、化学的化合物あるいは擬似薬学的に効果的な物質である
請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記試験媒体は、薬品あるいは治療用物質である
請求項８記載の方法。
【請求項１１】
前記試験媒体は、物理的な機器である
請求項８記載の方法。
【請求項１２】
前記試験媒体は、物理的な治療機器である
請求項８記載の方法。
【請求項１３】
前記調査は、ｚ軸において異なる顕微鏡平面の観察を許容する顕微鏡システムを用いてもたらされる
請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記顕微鏡システムは、顕微鏡、ｚステッパおよび関連する制御装置を含む
請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれかに記載の前記方法および前記装置の使用であって、
擬似医薬品および活性媒体の連続的な調査に適用される
使用。
【請求項１６】
腫瘍（tumours)、高血圧症(high blood pressure) 、ウイルス性(viral) 、細菌性(bacterial) あるいは寄生性(parasitic) の感染症(infection diseases)、新陳代謝の不調(disorders of the metabolism) 、神経系の不調(disorders of the nervous system) 、心理あるいは精神(the psyche or the mind)、およびコレステロールレベル(cholesterol level) の治療のための、擬似活性物質(suspected active substances) および活性媒体(active mediums)の連続的な調査(serial investigation)のための
請求項１５に記載の方法の使用。
【請求項１７】
遺伝子治療において、細胞ターゲッティングのため、および薬理学において、効果的な物質の調査のための
請求項１５に記載の方法の使用。
【請求項１８】
請求項１５から１７のいずれかに従って決定された新規活性物質を含む
医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞相互作用、細胞間輸送および細胞間伝達に影響を与えるための、薬学的および物理的な手段、並びにその調査のための方法および手段に関する。
【背景技術】
【０００２】
多細胞有機体および組立効果（assemblies effect)における細胞は、予め決定された経路を介してのみ交換される。短い経路にわたる伝達は、知られている限りでは、ギャップ結合、原形質連絡あるいはシナプス結合（化学シナプス）を介してもたらされる。
【０００３】
ギャップ結合は、約１．５ｎｍの小孔寸法をもつ連結タンパク質のタンパク質小孔を有する。ギャップ結合は、細胞間における膜連続体を提供せず、隣り合う細胞を２から４ｎｍの距離にわたって接続するが、これは、電気的なシグナルの通過および、１０００ドォールトン（Dalton）まで、例外的な場合では５０００ドォールトンまでの重さの小さい分子の受動交換を介して行われる。シグナルの流れは、カルシウム濃度および／または適用されるポテンシャルによって調節され、そのため、ギャップ結合は”電気シナプス”としても特徴付けられる。膜小胞の輸送は、記述されない。ギャップ結合は、動物および菌の細胞において見出される。植物では、これまでに連結状のタンパク質のみ確認されている。
【０００４】
原形質連絡は、膜により囲まれた細胞質のチャンネルである。それらは、約６０ｎｍの直径をもつ細胞壁における小孔を介して、隣り合う植物細胞を連結する。これは、連結された細胞間における膜連続体になる。連結された細胞の小胞体（endoplasmic reticuli）
は、原形質連絡に渡って伸び得る。原形質連絡は、小さな分子、栄養素、リボ核酸プロテイン融合体、イオンおよび蛍光色素を通す。原形質連絡の寸法拒絶限度は、約１〜４キロドォールトン（kilodalton) であるが、もう少し大きいウイルスは、感染のための経路として原形質連絡を使用する。しかしながら、原形質連絡を介した小胞輸送は、これまでのところ知られていない。
【０００５】
シナプス結合は、細胞連続（軸索）であり、それらの端部と他の細胞表面がシナプスを介して連結される。シナプスおよびターゲット細胞は、約２０ｎｍ幅のシナプス間隙によって分離される。軸索の直径は、約０．３〜１．３μｍである。軸索は、微小管を含み、シナプスまでの双方向性の小胞輸送を可能にする。情報交換は、シナプスにおけるシグナル物質の排出を介してもたらされる。これらの物質は、シナプス間隙を越えて、ターゲット細胞へと拡散し、そこでは特定の受容体への結合を介して、それらはシグナル伝達を導く。シナプス結合は、中枢神経系および末梢神経系に対して特徴的なものである。
【０００６】
伝達すなわち長い経路を渡る情報の交換は、知るかぎりでは、サイトネメス（cytonemes)およびアーゴサムズ（argosomes)および内分泌系を介した伝達物質の排出を介してもたらされる。
【０００７】
サイトネメスは、微細な細胞伸張であり、約２００ｎｍの厚さで、たいてい細胞外空間において自由に終結するが、時々他の細胞と接触して立設もする。その伸張は、アクチンを含むが、微小管は含まない。これまでのところ、サイトネメスが細胞間伝達にどのように寄与するかについては知られていない。サイトネメスは、昆虫（ショウジョウバエ、成虫原基細胞）、カルポデス（Calpodes) 、ロードニウス（Rodnius)および北紫ウニ胚（sea urchin embryos) において検出されている。哺乳動物細胞における存在は、これまでのところ記述されていない。
【０００８】
アーゴサムズは、細胞内および細胞外で発生する膜小胞であり、細胞から細胞へとシグナル物質を輸送し得る。アーゴサムズの細胞間輸送の機構は、未だ決定されていない。アーゴサムズはエンドサイトーシス機構およびエキソサイトーシス機構を介して輸送されると仮定される。アーゴサムズは、これまでのところ、ショウジョウバエ胚において検出されているのみである。
【０００９】
細胞間における内分泌伝達は、例えばホルモンのようなシグナル伝達物質の血流への排出を介し、続くターゲット細胞への受容体仲介による効果により、目ざましい効果を発揮する。内分泌伝達は、有機体における一般的な原理である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、細胞間における相互作用、輸送および伝達のさらなる形態を明らかにすることにある。特に、本発明の目的は、細胞間における伝達および細胞間輸送に影響を与えることができる薬学的および物理的な手段を利用し得るようにすることにある。さらに、本発明の目的は、細胞伝達および細胞間輸送の新規な形態の調査のための手段および方法を利用し得るようにすることにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記の目的は、細胞間の伝達および細胞間の輸送の調査の方法によってなし遂げられ、そこでは細胞は、個別化の後に、Ｆアクチンおよびミオシンを含み、５０から４００ｎｍの直径を有し、概して５０μｍの長さまでで、あるいは個々の場合にはさらに長く、細胞間を橋絡している膜チューブに関して調査される。
【００１２】
第２の観点の発明は、そのような膜チューブを介した細胞間における細胞小器官輸送の調査に関し、例えば、（ｉ）第１の数の細胞への１つあるいはそれ以上の物質を添加する工程であって、前記物質は第１の期間内に前記第１の数の細胞によって取り込まれる（endocyted)ように選択される工程、（ｉｉ）洗浄後の前記第１の数の細胞と第２の数の細胞とを混合する工程であって、その混合の結果、前記第１および第２の数の細胞の間に、細胞間の膜チューブが第２の期間内に形成される工程、（ｉｉｉ）１つあるいはそれ以上の取り込まれた（endocyted)前記物質を含む前記第２の数の細胞の細胞数を決定する工程を含む。他の実施態様では、ステップ（ｉ）において、前記第１の数の細胞は第１の取り込み可能な（endocytable)物質を用いて処理され、前記第２の数の細胞は第２の取り込み可能な（endocytable)物質を用いて処理され、前記第１および第２の物質は異なる。前記取り込み可能な物質は、蛍光色素、Ｄｉｌ、ＤｉＯ、リソトラッカー（Lysotracker:商標名) 、放射性マーカー物質、発光色素、蛍光を発するあるいは発光するタンパク質およびペプチド、マーカー物質と結合された（coupled)タンパク質あるいはペプチドのうち、１つあるいはそれ以上の色素から選択される。これらの調査は、代替的に、ステップ（ｉ）において、前記取り込み可能な物質は追跡されず、まず前記細胞小器官における検出物質の本質的あるいは一時的な発現をなし遂げるように、もたらされる。ステップ（ｉｉｉ）は、ＦＡＣＳによってもたらされてもよい。
【００１３】
本発明の第３の観点では、前記細胞小器官輸送の前記調査が、試験媒体の存在あるいは影響下においてもたらされる。前記試験媒体は、化合物あるいは擬似薬学的に効果的な物質で良く、好ましくは、薬品あるいは治療剤である。前記試験媒体は、物理機器でもよく、好ましくは、物理治療機器である。
【００１４】
本発明のさらなる観点では、前記調査は、ｚ軸において様々な顕微鏡平面の観察を許容する顕微鏡システムを用いてもたらされる。前記顕微鏡システムは、好ましくは、顕微鏡、ｚステッパおよび関連する制御装置を含む。
【００１５】
前記発明のさらなる観点は、擬似医薬品および効果的な物質の連続的な調査のための、上述した方法および装置の装置の採用に関し、特に、腫瘍、高血圧症、ウイルス性、細菌性あるいは寄生性の感染症、新陳代謝の病気、神経系、心理および精神の病気、コレステロールレベルの治療のための、擬似効果的物質および効果的媒体の連続的な調査のためのものである。本発明に従った前記方法のさらなる採用は、細胞ターゲッティングのためおよび薬理学における、遺伝子治療において、効果的な物質の調査にある。前記発明は、また、細胞間伝達および細胞間小器官輸送への影響のための効果的な手段に基づいて、そのように決定された効果的な物質を含む薬品組成および治療過程に関する。
【００１６】
前記本発明のさらなる利点、目的および特徴は、例および添付の図面において提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明とその実施の詳細な記述
神経内分泌細胞株中のタンパク質分泌物の調査において、細胞培養の３次元ビデオ顕微鏡調査により、細胞直径の多数について部分的に非常に大きい距離にわたって隣接する細胞を橋絡するチューブ状の輸送チャンネルが観察された（図１）。そのチューブの鎖は、蛍光ビデオ顕微鏡の焦点面に置かれている期間に、小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）でマークされた蛍光を有する形質膜の染色の後に、偶然に観察された（図１ａ−ｃ）。そのチューブは、あたかもそれらが張力印加の下で立っているかのように、実質的に真っ直ぐであり、自由に細胞間に橋をかけ渡し（spanned)、基質（substrate ) とはほとんど接触していない（図１ｄ）。チューブの構造は、従来知られている細胞の伸張状態とは異なる。それらのチューブは、概して、５０μｍの長さまでで、約２００ｎｍの平均直径をもつが、場合によっては４００ｎｍまでかそれ以上までであることもある。従って、下記において、それらのチューブを輸送ナノチューブあるいは簡潔にＴＮＴと称する。染色法による修飾の後に、１ｍｍ以上の長さをもち、形態論的に非常に似た構造が観察された（図１９）。ＴＮＴは、光のような電磁波、機械的な作用（音波）、化学的な固定に関して非常に敏感である（図９）。しかしながら、ＴＮＴはトリプシン（trypsin)／ＥＤＴＡ処理について感度がないことが見出されたが（図１０）、その処理はタンパク質で仲介された細胞−細胞間の接着をなくす。免疫組織化学分析法は、ＴＮＴがＦアクチン（filamentory
actin)を含むが、微小管を全く含まないことを示しており（図１ｅ，図６ｄ１−ｄ３）、ショウジョウバエの成虫原基のサイトネメス(cytonemes) に似ている（Ramirez-Weber F.Aet al.,cytonemes;cellular processes thatproject to the principal signaling centerin Drosophila imaginal discs. Cell 97, 599-607頁(1999)) 。アクチンを除くことにより、サイトネメスのためにシグナル気質、例えば形態形成物質の指向した拡散が仮定されているのに反して（図３ｊ−ｍ２）、我々はＴＮＴの中で例えば組み換え型タンパク質（例えばＥＹＦＰ，図７）あるいは小さな色素分子（例えばカルセイン（calcein ，図１３ｄ−ｆ２）で表される細胞質が運搬されたことを決定できなかった。ＴＮＴの小さな内部直径が、恐らく可溶性分子の受動交換を妨げている。このことは、細胞質のイオンに対しても多分適用される。対照的に、ＴＮＴを介して細胞形質膜の構成要素は細胞間で交換され得る。それ故、我々は、固定され生きている細胞上で、非常に特定的な形質膜指標であるＥＧＦＰ−Ｆ（farnesylatedＥＧＦＰ）（図８）がＴＮＴを介して連結された細胞間で選択的に交換されることを示すことができた（図３ｎ−ｑ２，４ａ−ｃ）。このことから、細胞に相当する形質膜は、連続体であることがわかる。
【００１８】
さらに、我々は、ＴＮＴにおいて一つの細胞から他の細胞への膜小胞の重要な輸送が行われていることを見出した。新たな方法によって、我々は光学式顕微鏡の下で、細胞間をかけ渡るＴＮＴにおいて、小胞が単一方向に２５．９±７．９ｎｍ／ｓｅｃ（ｎ＝６）の速さで輸送されることを観察することができた（図２ｇ，ｈ）。ＴＮＴは、腎臓上皮細胞（ベロ細胞）や人間の胎児性腎臓細胞（ＨＥＫ，図１６ａ）の培養の場合にも観察され、また、髄質（図１６ｂ）および海馬組織（図１６）の初代培養に検出することができたことから、これらは細胞間での一般的な輸送伝達および相互作用原理である。ナノチューブを介した細胞個々の間の膜構造の細胞間相互輸送は、これまでのところ知られていなかった。さらに、細胞小器官輸送に基づく細胞間の伝達は、多細胞生物の開発および維持のために疑う余地のない重要性を有する新規な生物学的な機能的な原理を表す。このことから、例えば医学的な診断および治療のための経済的に採用できる方法が提供される。
【００１９】
非常に敏感なＴＮＴは、分離された細胞培養の中で検出され、また、生理学的条件の下で組織の集合の中にも多分存在する。それらは、その構造的および機能的特性において非常に似ているだろうが、局所的な条件に起因して異なる構造をもち得る。ＴＮＴの代替した構造（伸びてなく細胞の輪郭を辿っている）は、既に培養された細胞の集密的集合の中で現れている（図１７参照）。現在までのところ、ＴＮＴは、そのように見分けられあるいは観測されておらず、それは第１にそれらは非常に敏感であり、細胞培養の中で概して標準的な顕微鏡使用の手順、例えば洗浄工程の機械的エネルギーや、化学的固定方法、あるいは単なる照射光のエネルギーを通しても破壊されてしまうからである（図９参照）。第２に、光を用いない細胞培養条件かつ不適当な細胞密度のために、細胞間を自由に伸びるＴＮＴの数がゼロになる傾向があることである。第３に、細胞間で伸びたＴＮＴは、細胞の平面内で横たわるからであり、これは多くの他の顕微鏡による観察では不適当であり、またこのことは無視されている。第４に、ＴＮＴは、しばしば水平ではなく、細胞培養容器へと傾いて発達し、その結果、それらは一つの平面的な顕微鏡検査では初めから終わりまで見えず、すなわち、それらは３次元分析を介してのみ検出されるからである。
【００２０】
多くの病原体は、それらの増殖および繁殖のサイクルにおいて、細胞間での細胞間転移に依存する。非常に多くの場合において、この転移の正確な仕組みは、未だに説明されていない。例えば、ウィルスＨＳＶ１テグメントタンパク質ＶＰ２２は、細胞間で非常に効率的に交換される（Wybranietz, W. A. et al. Enhanced suicide gene effect by adenoviral transduction of a VP22-cytosine deaminase(CD) fusion gene.Gene Therapy 8,
1654-1664(2001))。ＶＰ２２に付着したタンパク質もまた、この交換の対象となり、当該交換は、ＶＰ２２を遺伝子治療のための重要な手段にさせる（Wybranietz, W. A. et al. Enhanced suicide gene effect by adenoviral transduction of a VP22-cytosine deaminase(CD) fusion gene.Gene Therapy 8, 1654-1664(2001))。しかしながら、現在までのところ、どのようにＶＰ２２あるいはＶＰ２２融合タンパク質が、１つの細胞から他の細胞へと移動するかは説明されていない。我々は、ここでいうＴＮＴは病原体により感染のための経路として使用されると考える。我々の想定は、ウイルス実験によって支持され、当該実験の中で我々はウイルスタンパク質ＶＰ２２（図１７ａ−ｃ）およびＶＳＶＧ（図１７Ｇ）がＴＮＴの中に集まっていることを示すことができており、そこでは小胞的な輸送および転移が連結された細胞間で行われる。また、ＶＰ２２がアクチンと相互作用を起こすことができ、このタンパク質の細胞間交換がサイトカラシンＤによるフィラメント状アクチンの破壊によって妨げることができるという他の観察も証拠となる（ELLIOT, G. & O'Hare, P. Intercellular trafficking and protein delivery by a herpesvirus structural protein. Cell 88, 223-233(1997)) 。要約すると、ＴＮＴおよびそれに影響を与えるものは、このように例えば新奇な遺伝子治療方法の改善および創造、並びに伝染病の影響および抑制のための作用の重要な点である。
【００２１】
新規に見出された細胞間連結は、それらの糸状の性質および不安定性に起因して、様々な形態において、（１）音、振動、熱あるいは流体力学的エネルギー形態、および（２）光および他の電磁波（図９参照）によって影響を受け得る。さらに、高血圧のような病的な状態の複雑な身体機能は、ＴＮＴの概念（図５）を介して、電磁波の放射やノイズ等のようなわずかな環境の影響、客観的な細胞生物学的な輸送および相互作用過程に関係付けられ得る。さらに、（３）例えばメチル−β−シクロデキストリン（methyl- β- cyclodextrin) のような薬理学的に活性な物質であって、細胞膜からコレステロールを引き抜く物質によって、脂質組成およびこのような膜の性質が合目的的に交替され得る。この影響は、ＴＮＴの安定性に永続的に影響を与える。それ故、細胞のコレストロールの含有量の２０％の減少は、ＴＮＴの数の４０％に至る（図１８）。それ故、本発明は、ＴＮＴで仲介された細胞伝達を精密に調節するためのモデルを利用し得るようにし、病理学的に決定された変化を修正することに適用し得る。（４）さらに、例えば新陳代謝の病気、あるいは薬品等の病気を経た、それらの構造、組成、誤った調節の変更のような従来からの生化学的な影響は、特に細胞学的な病気および細胞学的な薬品の分野において、重要な診断の意見を許容するが、ここで予想通り、伝達処理が重要な役割を演ずるからである。それ故、本発明は、新規な製薬物質の調査、監視、発見のための入手し得るモデルを作製する。これに加えて、見出されたＴＮＴは、試験管内で生成されたリン脂質２重膜のナノチューブを備えた驚くべき形態論的な類似性を示す（Karlsson, A. et al., Networks
of nanotubes and containers ,Nature 409,  頁 150-152(2001)）。また、試験管内で生成されたこれらのナノチューブとともに、膜連続体がリポソームの間で生成され、脂質容器の輸送はナノチューブを介してもたらされ得る。それは、試験管内で生成されたナノチューブあるいはリポソームのためおよび薬品ターゲッティングのために、見出された輸送原理を利用することをもたらす。
【００２２】
見出されたＴＮＴは、弾性力のある糸状のチャンネルであり、膜によって取り囲まれており、最短経路を介して細胞間で自由に張られており、そのチャンネルは、概して、例えば細胞培養プレートの基質とは接触していない（図１）。それらの直径は、２００ｎｍ未満程度であるが、ときには４００ｎｍまで達し得る。ＴＮＴは、基質上に横たわっておらず、概してそれらの長さに起因して顕微鏡のいくつかの焦点面を横切るため、それらは、従来の顕微鏡検査方法においては細胞間チューブとして直ちに見分けがつかないが、出所や目標なしの不特定な伸張あるいは細胞チューブとしてのみ見られる。新規な細胞間の連結（ＴＮＴ）の長さは、たいてい５０μｍまでで（図１）、時折１ｍｍ以上までにもなる（図１９）。個々の場合に、分岐されたＴＮＴが観察され得る（図１ｃ、矢印参照）。
【００２３】
ＴＮＴはＦアクチンを含むが、微小管を全く含まない（図１ｅ、図６ｄ１−ｄ３）。おそらく、ＴＮＴにおける十分に高い比率をもって、Ｆアクチンはこの細胞連結の形態において構造的および機能的に含まれる（図２ａ−ｄ参照）。Ｆアクチンを単量体に分解するラトランクリンＢ（Latrunculin B)の存在下で、ＴＮＴがもはや形成せず、存在するＴＮＴが破壊されるという観察（図１１ｂ）により、この推測は支持される。たとえチューブリンの点シグナルがＴＮＴにおいて時折観測され得るとしても、これらは、微小管に特有の糸状構造をもたない（図１ｅ）。さらに、ＴＮＴにおいて、”微小なシナプスのような微小水疱”（ＳＬＭＶ， Hannah M.J. et al., Synaptic vesicle biogenesis, Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 15, 733-798 頁(1999)) のためのメンブレンマーカーである、シナプトフィシンは、免疫細胞化学的に複数の点で検出されている（図３ｃ）。ＳＬＭＶは、アセチルコリン（Bauernfeind R. et al., Selective storage of acetylcholin, but not catecholamines, in neuroendocrine synaptic-like microvesicles
of early endosomal origin, Neuron 11, 105-121 頁(1993)）のようなシグナル分子を含み、それでＴＮＴは細胞間のシグナルの通路と関係させられる。さらに、ミオシンＶａ（図３ｄ，ｅ）、アクチン依存性モータータンパク質およびＲａｂ３ａ（図３ｄ，ｅ）、タンパク質を結合する単量体のＧＴＰがＴＮＴにおいて見出された。ＴＮＴにおいて、ミオシンＶａの部分的な共通局在化およびシナプトフィシン−陽性（synaptophysin-positive) 小器官もまた決定され得る（図３ｅ、開矢印）。目に見える細胞小器官輸送およびＦアクチンの同時の存在、ミオシンＶａおよびタンパク質を結合するＧＴＰは、細胞小器官輸送で仲介されたアクチンあるいはミオシンを指し示す（Mermall V. et al., Unconventional myosins in cell movement, membrane traffic, and signal transduction, Science 279,527-533頁(1998)) 。さらに、分泌顆粒、ホルモン蓄積細胞小器官は、より高い頻度で試験管内および生体内においてＴＮＴの根底に存在することが見出された（図２０、矢印）。このことは、ＴＮＴおよび内分泌系との間の機能的な関係の推論を認める。
【００２４】
複数のＴＮＴは、非常に敏感な構造である。わずかな機械的圧力、化学的固定、あるいは例えば５６５ｎｍの波長をもつ数秒の光照射のような波状のエネルギー形態は、多くの場合それらを引き裂く（図９）。対照的に、糸状偽足（filo podia）あるいは軸索とは異なり、ＴＮＴは、トリプシン処理に関しては敏感でない（図１０）。ＴＮＴは、細胞間で速やかに新規な（de novo)形態となり、ＰＣ１２細胞の平板培養の３０分後に観察され得るにすぎない（図２ｅ，ｆ，図１１ａ）。それらの数は、続く１．５時間以内に激しく増加した（８倍）（図１１ａ）。この期間における細胞分裂の遮断はそれらの形態に影響を与えないので（図１２）、ＴＮＴは不完全に発達された細胞質分裂の生産物ではない。
【００２５】
原形質連絡あるいは”ギャップ結合”のような従来の伝達に関する細胞連絡とは対照的に、例えばカルセイン（図１３）あるいはボディピィ（bodipy） のような微小注入された色素分子のため、ＴＮＴは、ほとんど計測できない受動伝達性を示す。同様に、細胞質的に発現されたＥＹＦＰあるいはＥＣＦＰの有意でない輸送が観察された（図７）。対照的に、ＴＮＴの構造上の構成要素であるアクチンは、ＴＮＴで連結された細胞間において、ＧＦＰ融合プロテイン（ＥＧＦＰアクチン）の形態で選択的に輸送された（図３ｊ−ｍ２）。同様に、形質膜のための特定的なマーカーである、ＥＧＦＰ−Ｆ（farnesylated  ＥＧＦＰ）のＴＮ仲介による細胞間交換が検出された（図８）（図３ｎ−ｑ２）。ＴＮＴの独特の特徴として、それらの構造を通して膜小胞の単一方向の輸送が見出された。これらの小胞は、シナプトフィシンＥＧＦＰ（図３ｃ，ｆ−ｉ２）、Lysotracker(商標名)（図３ａ，ｂ）、あるいは取り込まれた（endocyted）色素ＤｉｌあるいはＤｉＯ（Hong et al., Dil and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labellingand pathway tracing. Trends Neurosci.,12, 331-340頁; Kuffler D.P., Long-Term survival and sprouting in culture by motoneurons isolated from the spinal cord ofadultfrogs. J. Comp. Neurol., 302, 729-738 頁(1990)）（図４ｄ−ｈ）に対して陽性であった。。一つの細胞から他の細胞へのＤｉｌあるいはＤｉＯがマークされた細胞小器官のＴＮＴ仲介単一方向輸送は、蛍光ビデオ顕微鏡を介して直ちに観察され得る（図４ｄ，ｅ，図１４）。加えて、ＤｉｌおよびＤｉＯ着色細胞の混合培養の準備の丁度２時間後に、異なる細胞がＴＮＴを介して単一方向に互いに緑および赤の蛍光を発する細胞小器官を交換することが観察され得る（図４ｇ１）。この交換は、従来のエンドサイトーシス機構およびエキソサイトーシス機構を含む機構を介して明らかに引き起こされなかった。この仮定は、効率的な既知のエンドサイトーシスおよびエキソサイトーシス機構を遮断する温度、０℃における輸送実験によって支持された。この条件下において、３７℃における実験と比較して減少した小器官輸送であるが、まだかなりの輸送が生じた（図１５）。この発見は、ＴＮＴ連結を介して形成された細胞（図５）間での膜連続性のモデルを支持する。
【００２６】
ＴＮＴの中で、明視野ビデオ顕微鏡を介して、小胞輸送と類似した輸送過程がさらに検出され得る。明視野あるいは蛍光顕微鏡検査法は、８〜１００ｎｍ／秒の速さでの細胞から細胞への、これらの構造の単一方向輸送を示した（図２ｇｈ，図３ａｂ）。これらの結果は、シナプトフィシン陽性構造（図３ｃ）あるいはリソトレイカー（Lysotraker: 商標名） 陽性構造（図３ａ，ｂ）の検出とともに、細胞から細胞へ輸送された構造体が少なくとも部分的にＳＬＭＶおよび／または、エンドソーム組織（endosomal system） に属するあるいはそこから生じる膜構造であることを明らかにする。ミオシンＶａ（図３ｅ）を備える構造体の共同局在化は、おそらくミオシンＶａがこれらの構造体の輸送に部分的に関わり、Ｒａｂ３ａがその輸送の規制に関わり得ることを示す。分泌顆粒およびミトコンドリアは、対照的に、ＴＮＴにおいて観察されず、あるいは細胞間で著しく交換されなかった（図２１）。これらの細胞小器官は、このように寸法選択あるいは他のこれまでに知られていない機構を通してＴＮＴ仲介輸送からおそらく除外される。
【００２７】
ＴＮＴはネズミの副腎髄質からＰＣ１２細胞株のために見出されただけでなく、ベルモットモンキーの腎臓上皮細胞株（ベロ細胞株）、人間のＨＥＫ細胞（図１６ａ）、および髄質（図１６ｂ）および海馬（図１６ｃ）から得られたネズミの初代培養において検出されることができた。それ故、ＴＮＴは非常に異なる組織タイプから生じる細胞において現れる。これを越えて、その結果は、ＴＮＴが健全な組織だけでなく癌組織においても生じたことを実証する。特定的な特性をもつ組織タイプの特定的なＴＮＴが存在することが、それ故に見出される。ＴＮＴは、特に細胞の胎児性発達の期間においても生成され、たとえばパターン構築において重要な役割をもつことが期待される。ＴＮＴは、第１に、例えば組織形成および維持のために細胞−細胞伝達の特定の形成を担い、第２に、癌あるいはフィルス感染のような様々な病気に偶然関連して存在し、例えばＶＰ２２のようなウイルスタンパク質あるいはＶＳＧ  Ｇ−タンパク質が組織においてＴＮＴを介して拡がる（図１７ａ−ｄ）、第３に、外部のエネルギー形態に関する高い感度に起因して、直ちに影響を受け、および／または、壊れやすく（たとえ光により、（図９））、このようにして複雑な身体機能に影響を与える、第４に、例えばＴＮＴを通しておよび／またはそれらの感度を通して橋絡された細胞間連絡網に基づいた多くの病気のために、目的にかなう治療上の出発点を示す。この点に関して、細胞膜からのコレステロールの除去は、ＴＮＴを破壊するあるいはそれらの新規な形成（図１８）を妨げ、加えて膜のコレステロール含有量の設定を介したそれらの形成の正確な規制が可能となる（図１８）。病気として、我々はここでは例えば癌および高血圧について述べる。それ故、病気の処置のために、以下の手段および治療上の適用が提供される。
【００２８】
例
例１
腫瘍の治療のための手段
１．外部の波状のエネルギー形態によるＴＮＴの影響
褐色細胞種組織からの例えばＰＣ１２細胞株のような癌細胞において、例１５（図１ａ−ｄ）に従って、細胞接種の約２４時間後に撮像する高解像度、３次元ビデオ顕微鏡検査により、ＷＧＡによる染色の後に、ＴＮＴは検出された。これらの細胞上で、例えば５６５ｎｍの波長をもつ顕微鏡システム（例１５−２に従う）の可視光のような外部エネルギー形態の影響が検査された。約７０秒の観察期間にわたって、ＴＮＴ連結（図９ａ）が５６５ｎｍの入射光により初めは振動していたが（図９ｂ）、引き裂かれて（９ｃ）、数秒以内に引き裂かれたゴムバンドのような自由端になることが示された（図９ｄ）。ＴＮＴへの類似の影響は、他の波状のエネルギー形態においても予想される。外部のエネルギー形態に関するＴＮＴの感度に起因して、特に褐色細胞種腫瘍を、超低周波、超音波、光、あるいは磁場治療で処理することが提案される。これらの処理のため、例えばパルス磁場のための、商業的に入手可能な発生器、あるいはこの適用のために特に開発された発生器が考慮され得る。腫瘍細胞の間のＴＮＴは、それ故に合目的的に損傷を受け得る。健全な組織はまた細胞間糸連結を生成し得るので、腫瘍組織の選択的な損傷を達成するために、これらのエネルギー形態の適用が合目的的にかつ局所的に果たされる。そのような処理の副作用は、おそらく、相当する放射線照射あるいは化学的治療手段の適用よりもかなり低い。さらに、ＰＣ１２細胞培養およびクロム親和１次培養は、例１６に従って、これらの治療に採用されるエネルギー形態の最も効果的および選択的な周波数および強度を決定するための適当なモデル系を代表する。
【００２９】
２）細胞薬理学的あるいは他の構成要素の合目的的な”ターゲッティング”
ａ）細胞小器官のＴＮＴ仲介輸送を介したターゲッティング
例えば褐色細胞種組織の細胞株ＰＣ１２のような癌細胞において、（例１５に従って）細胞接種の約２４時間後の高解像度、３次元の光透過顕微鏡検査により、ＴＮＴに基づく細胞間連絡網が新規に形成される（図２ａ−ｆ）。さらに、直接明視野顕微鏡を（例１５に従って）用いて、単一方向のＴＮＴで仲介された細胞間の細胞小器官輸送が、観察されることができた（図２ｇ，ｈ）。リソトラッカー（Lysotracker:商標名） で染色（例１５の５に従う）した後のこれらの細胞の蛍光ビデオ顕微鏡像（例１５の２に従う）は、蛍光を発する細胞小器官はＴＮＴにおいて単一方向に輸送され（図３ａ，ｂ）、エンドソーム源となることを示す。シナプトフィシン、ミオシンＶａおよびＲａｂ３ａ（例１５の４に従う）およびＴＲＩＴＣ−ファロイジン−アクチン着色（例１５の４に従う）の抗体染色の後に、ＰＣ１２細胞の蛍光ビデオ顕微鏡像（例１５の２に従う）は、シナプトフィシンおよびミオシンＶａシグナルが、ＴＮＴにおいて同じ位置で見出されたことを示す（図４ｂ，ｅ，図１４）。点状の染色ではいずれの場合にも、細胞小器官輸送の直接観察と関連して（図４ｂ，ｅ，図１４）、これらは、ＴＮＴにおいてシナプトフィシン陽性細胞小器官（例えばＳＬＭＶ）が例えばミオシンＶａのようなモータータンパク質によって動かされること、例えばＲａｂ３ａのような調節タンパク質がこの輸送において係わっていることを示す。
【００３０】
ここで示されるＴＮＴで連結された細胞間におけるエンドソームのあるいはエンドソーム関連の細胞小器官の選択的な交換は、細胞医薬あるいは他の構成要素が合目的的に、および例えば腫瘍のような組織アセンブリにおいて制御された方法で分配され得る効率的な輸送システムを表す。実証の目的で、一例としてＥＧＦＰが遺伝子組み替えによりシナプトフィシンと連結され、シナプトフィシンは選択的にエンドソームおよび（シナプトフィシン−ＥＧＦＰ）関連付けられる細胞小器官に関連付けられる。癌細胞間におけるこの融合タンパク質の輸送は、以下の検証処理によって立証された。ＰＣ１２細胞の集団（集団２）は、セルトラッカー（CellTracker:商標名） （分子プローブ”青”Ｃ−２１１０）で染色され（例１５の７に従う）、シナプトフィシンＥＧＦＰでトランスフェクションされたＰＣ１２細胞の集団（集団１）とさらに混合して平板培養された。混合細胞培養は、２４〜４８時間後に固定され、免疫細胞化学的にポリクローナル抗ＧＦＰ抗体（分子プローブＡ−６４５５）およびファロイジン−ＦＩＴＣで染色された（例１５の４に従う）。細胞は、その後３次元蛍光顕微鏡検査および例１５の２に従って取得された画像データの逆重畳によって分析された。シナプトフィシンＥＧＦＰは、集団２（図３ｆ−ｉ２）のＴＮＴ連結細胞において、選択的に点シグナルの形式で検出され、例えば、選択的にこれらの細胞間で転送された。例１４に従ってＤｉｌ／ＤｉＯで染色された細胞小器官を用いた分析を介して、ＴＮＴは、アクチン依存であるが、従来のエンドサイトーシスおよびエキソサイトーシス機構を除く機構に従って、Ｄｉｌ／ＤｉＯで染色された細胞小器官の細胞間輸送をもたらす。このため、異なって染色された２つのＰＣ１２細胞集団は、３７℃で１時間の間、ラブテック（Labtec: 商標名） 培養容器上で混合培養として培養され、その後さらに、５μＭのラトランクリンＢ（Latrunculin B）の欠如下あるいは存在化において様々な温度で培養された。ラトランクリンＢなしでの細胞培養は、平板培養の１時間後にＷＧＡを用いて染色され０．７℃あるいは３７℃でさらに４時間培養され、固定された後に、ビデオ顕微鏡分析の対象となり、双方とも明確なＴＮＴ依存の細胞小器官輸送を示したが（図１５ａ，ｅ）、０．７℃、従来のエンドサイトーシス機構を遮断する温度（図１５，ｃおよびｄ参照）では、減少した（図１５ｅ）。腫瘍組織において存在し、ＴＮＴに基づく細胞連絡網はそれ故に、有毒、アポトーシスあるいは免疫原性の物質（遺伝子組み替えによって生産され、上記した例に従ってＴＮＴを介した輸送のための必要なシグナルのために装備された物質あるいはタンパク質）の合目的的な導入を通して、例えば、例１の１に従って、合目的的に破壊するため、あるいは調整された方法によりＴＮＴを介して連結された細胞へ影響を与えるための可能性を開く。
【００３１】
ｂ）膜構成要素のＴＮＴ仲介輸送を介したターゲッティング
癌細胞が、特定の膜構成要素が交換され得る合胞体（図２ｅ，ｆ）をＴＮＴを介して生成することが示された。この実証は以下のようにして遂行される。褐色細胞種ＰＣ１２細胞の集団（集団２）は、セルトラッカー（CellTracker:商標名） （分子プローブ”青”Ｃ−２１１０）で染色され（例１５の７に従う）、ＥＧＦＰ−Ｆ（Clontech  ６０７４−１）でトランスフェクションされたＰＣ１２細胞の集団（集団１）とさらに混合して平板培養された。混合細胞培養は、２４〜４８時間後に固定され、ポリクローナル抗ＧＦＰ抗体（分子プローブＡ−６４５５）およびファロイジン−ＦＩＴＣで免疫細胞化学的に染色された（例１５の４に従う）。細胞は、その後３次元蛍光顕微鏡検査および取得された画像データの逆重畳によって分析された（例１５の２に従う）。ＥＧＦＰ−Ｆは、ＴＮＴで連結された集団２の細胞の形質膜において選択的に検出され（図３ｎ−ｑ２）、すなわち、形質膜輸送の形式をとってＴＮＴで連結された細胞間において選択的に交換された。腫瘍組織において存在し、ＴＮＴに基づく細胞連絡網はそれ故に、有毒、アポトーシスあるいは免疫原性の物質（遺伝子組み替えによって生産され、上記した例に従って、例えばファルネシルアンカーのようなＴＮＴを介した膜輸送のための必要なシグナルを備えた物質あるいはタンパク質）の合目的的な導入を通して、（例えば、例１の１に従って）ＴＮＴを介して連結された細胞を合目的的に破壊するため、あるいは調整的に影響を与えるための可能性を開く。
【００３２】
例２
新陳代謝の病気の治療のための手段
例えば膜のコレステロール含有量のような脂質組成に影響を与える新陳代謝の病気もまた、見出されたＴＮＴの安定性へ効果を発揮する（図１８、例１６の１に従う）。それらの引き裂きは、伝達物質、いわゆる分泌顆粒のための蓄積細胞小器官がたくさん存在している（図２０）、特に例えば神経内分泌細胞の形質膜の領域における微小損傷（図９）を引き起し、血流循環あるいは細胞外領域へのホルモン、神経ペプチドあるいは成長物質のような伝達物質のエキソサイトーシスのような細胞反応のための効率的なシグナルとなる。このシグナルは、代替されたエキソサイトーシス速度をももたらす。このことは、例えば病的に増加したホルモンレベルのような病理学効果をもち得るが、また治療的に有用である。それ故、例１６に従ってＴＮＴに基づいた細胞伝達の影響はシグナル効果をもつことができ、シグナル効果は代替された細胞反応につながり、結果として例えばアポトーシスあるいは壊死のような実用的な機構を有する。最後に述べられた機構の明確な制御もまた、例えば脂質組成の変化を介したＴＮＴの安定性の合目的な設定（例１６の１に従う）、あるいは外部のエネルギー形態を介したそれらの影響（例１６の２に従う）によって考えられる。
【００３３】
例３
高血圧
高血圧は、特に例えば副腎のシグナル物質のようなホルモン系統によって制御される。緑蛍光発光の人間のクロモグラニンＢ−ＥＧＦＰ（Kaether, C, Salm, T., Glombik, M., Almers, W. & Gerdes, H.-H.: Targeting of green fluorescent protein to neuroendocrine secretory granules: a new tool for real time studies of regulated protein
secretion, in Eur. J. Cell Biol. 1997, 74:133-142 頁) 、分泌顆粒のための特有のマーカータンパク質をコード化するｃＤＮＡを用いたトランスフェクション（例１５に従う）の２４時間後に、ＷＧＡで染色された副腎のＰＣ１２細胞を録画する多色ビデオ顕微鏡検査は、ＴＮＴで連結された細胞の接触区域における分泌顆粒の蓄積を示す（図２０，矢印）。このことは、ＴＮＴは調整されたホルモンおよび神経ペプチド分泌に関わることを明確にする。副腎細胞の刺激あるいは微細損傷（例えば、この組織におけるＴＮＴの振動あるいは引き裂きを用い（例１の１あるいは例１６の２に従う））、あるいは代替された脂質組成（例１６の１に従う）は、結果として、副腎細胞から血液循環への伝達物質のエキソサイトーシスを有する。これを介して、病的に増加したアドレナリンレベルが生じ、次には増加した血液循環を導く。治療のための選択肢は、適切な選別用物質（例えば、携帯電話のための放射線防護、あるいは”ＥＳを保護する”特別のホイルあるいは壁塗料のような、商業的に既に入手し得る”ウェーブシールド”を用いる）によって、外部のエネルギー状態の選別あるいは除去を介して、および／または細胞膜の脂質組成のような内性要因の影響を介して、提供される。後者は、代替された栄養素あるいは特別な薬品の適用を介して達成されることができ、このような状況により、コレステロールレベルはそれに関連付けられた特別な重要性をもつ（図１８，例１６の１に従う）。
【００３４】
例４
自己免疫疾患
例えば１型糖尿病のような自己免疫疾患の場合には、免疫系が身体自身のタンパク質を認識する。この誤った応答は、しばしばウイルスタンパク質（分子模倣）あるいは不正確に折り重ねられたタンパク質によって開始される。ＴＮＴを介して、膜構成要素が交換され得る合胞体（図２ｅ，ｆ）を細胞が生成することが示されてきた。この実証は、以下のように遂行される。副腎ＰＣ１２細胞の集団（集団２）は、セルトラッカー（CellTracker:商標名） （分子プローブ”青”Ｃ−２１１０）で染色され、ＥＧＦＰ−Ｆ（Clontech  ６０７４−１）でトランスフェクションされたＰＣ１２細胞の集団（集団１）とさらに混合して平板培養された。混合細胞培養は、２４〜４８時間後に固定され、ポリクローナル抗体ＧＦＰ抗体（分子プローブＡ−６４５５）およびファロイジンＦＩＴＣで免疫細胞化学的に染色された（例１５に従う）。細胞は、その後３次元蛍光顕微鏡検査および取得された画像データのその後の逆重畳によって分析された（例１５の２に従う）。形質膜のための特定のマーカー（図８）である、ＥＧＦＰ−Ｆは、ＴＮＴで連結された集団２の細胞の形質膜において選択的に検出され（図３ｎ−ｑ２）、すなわち、形質膜輸送の形式をとってＴＮＴで連結された細胞間において選択的に交換された。この結果は、細胞表面タンパク質が、組織においておよびＴＮＴに基づいて存在する細胞の連絡網を介して分配され得ることを実証する。
【００３５】
この点について、ＴＮＴが、組織における”主要な組織適合性”（ＭＨＣ）複合体の構成要素である、表面タンパク質を提示する抗原の分配に関わっていることも示された。この目定のため、褐色細胞種ＰＣ１２細胞の集団（集団２）は、セルトラッカー（CellTracker:商標名） （分子プローブ”青”Ｃ−２１１０）で染色され（例１５の７に従う）、ＨＬＡ−Ａ２−ＥＧＦＰ（H. J. Geuze, Department of Cell Biology, Institute of Biomembranes, UMC, Utrecht, Holland）でトランスフェクションされたＰＣ１２細胞の集団（集団１）とさらに混合して平板培養された。混合細胞培養は、２４〜４８時間後に固定され、ポリクローナル抗ＧＦＰ抗体（分子プローブＡ−６４５５）で免疫細胞化学的に染色された（例１５の４に従う）。細胞は、その後３次元蛍光顕微鏡検査によって分析された（例１５の２に従う）。ＨＬＡ−Ａ２−ＥＧＦＰは、点シグナルの形式により、ＴＮＴで連結された集団２の細胞において検出された（図１７ｅ，ｆ）。特に、ＭＨＣ複合体が膜輸送体によって遂行されることができ、エンドソーム組織（endosomal system） に部分的に関係しているという事実は、組織内でのこれらの複合体の分配におけるＴＮＴの潜在的な関与を明確にする。このため、影響を受けた全体の組織の破壊は防止されることができ、これは、上述した外部のエネルギー形態（例１６の２に従う）あるいは脂質組成の代替（例１６の１に従う）を介して、ＴＮＴに基づく網が局所的に破壊されあるいは調整的に影響を受けるからである。組織構造における免疫反応性構成要素のＴＮＴ仲介輸送は、組織におけるそのような構成要素を合目的的に分配すること、すなわち、免疫系上の身体により最終的な結果として排除へ導く免疫反応を刺激することによる。
【００３６】
例５
プリオン病
プリオン病は、ＧＰＩ（glycosalphosphatidylinositol） アンカーおよび感染性の方法におけるこの作用を介して細胞表面に関連する誤って折り重ねられたタンパク質（プリオンタンパク質）によって開始され、それは対応する無傷の細胞のタンパク質の誤った折り重ねを引き起こすからである。細胞から細胞へのプリオンの通過の仕方は、大部分は分からない。副腎細胞あるいは海馬神経細胞（図１６ｃ）が、ＴＮＴを介して、脂質アンカー膜構成要素が例１の２ｂに従って交換され得る合胞体を生成することが示されてきた（図４ａ−ｃ，図３ｎ−ｑ２）。比較し得る脂質アンカーを介して形質膜と関連する感染性のプリオンタンパク質は、それ故にＴＮＴを介して隣の細胞へ輸送され得る。治療選択肢は、例１６の２に従った外部のエネルギー状態源によって（図９）、あるいは例１６の１に従った膜組成の代替を介して（図１８）、ＴＮＴに基づく網の破壊によって与えられる。
【００３７】
例６
一般的なホルモンおよび代謝崩壊
例１の２ａ，ｂに従った副腎髄質細胞の３次元ビデオ顕微鏡検査分析を介して、合胞体が生成され（図２ｅ，ｆ，図３ｎ−ｑ２，図４ａ−ｃ）かつ細胞小器官（図４ｄ−ｈ，図１４）が輸送される細胞間の網に基づく組織化されたＴＮＴが検出された。さらに、細胞質構成要素がＴＮＴを介して細胞間で交換される。これは、神経内分泌細胞ＰＣ１２細胞の集団（集団２）が、セルトラッカー（CellTracker:商標名） （分子プローブ”青”Ｃ−２１１０）で染色され（例１５の７に従う）、ＥＧＦＰアクチン（Fischer, M., Kaech, S., Knutti, D. & Matus, A. Rapid Actin-Based Plasticity in Dendritic Spines. Neuron(1998) 20: 847-854 頁） でトランスフェクションされたＰＣ１２細胞の集団（集団１）とさらに混合して平板培養されたことにより実証された。混合細胞培養は、２４〜４８時間後に固定され、ポリクローナル抗体ＧＦＰ抗体（分子プローブＡ−６４５５）およびファロイジンＦＩＴＣで免疫細胞化学的に染色された（例１５に従う）。細胞は、３次元蛍光顕微鏡検査および取得された画像データのその後の逆重畳によって分析された（例１５の２に従う）。ＥＧＦＰアクチンは、ＴＮＴを介して連結された集団２の細胞において選択的に検出され（図３ｇ−ｍ２）、すなわち、ＴＮＴで連結された細胞間において選択的に輸送された。それ故、ＴＮＴは、電気的あるいは化学的な細胞カップリングを可能にし、それによってメッセンジャー物質の同調されたエキソサイトーシスを引き起こすことができた。これまでに、ＰＣ１２細胞における非電気的あるいは他の連結が見出されているが、それはこれらの細胞間における特定の接触タンパク質、連結の欠如と一致している。しかしながら、内蔵神経を興奮させることは、副腎髄質の同調細胞応答を生じる副腎髄質細胞とのシナプス接触を部分的に形成するだけである。このＴＮＴを介した細胞カップリングの原理は、他の身体あるいは腺組織のために理にかなってもある。例えば光（図９）によるＴＮＴの引き裂きの後における副腎細胞の同調を欠如することは、結果として、生理的な要求に適応されず、それ故多くのホルモン病および代謝病のための原因となり得るシグナル物質の分泌をともなう。これらの代謝崩壊は、例３において指示された方法に従って処理されることができ、例３は、例えば外部のエネルギー状態からの保護および／または例えば特定の医薬の適用を介した細胞膜組成の代替のような内性要因の影響（例１６の１に従う）のようなものである。例えばＶＳＶ  Ｇ−ＥＣＦＰのようなウイルスタンパク質の発現を介した、ＴＮＴ形成の合目的的な刺激による治療が考えられる（図１７ｄ）。
【００３８】
例７
新規な遺伝子治療方法の改善あるいは提供のための手段
遺伝子治療のための重要な点は、組織構造における反応性構成要素の合目的的な分配である。これは、従来知られていない機構に従って細胞から細胞へ効率的に輸送される、ウイルスＶＰ２２タンパク質へのそのような構成要素の結合を用いて追跡される。この目的のため、輸送機構はＴＮＴの関与に関して調査される。ＰＣ１２細胞へのＶＰ２２−ＧＦＰのトランスフェクションの２４時間後に、その細胞がビデオ蛍光顕微鏡検査により解析された（例１５に従う）。激しく蛍光を発する細胞間のＴＮＴ連結が見出された。これらの連結の内部において、蛍光を発する小胞構造が目に見え、観測の最中にそれらの位置を変える。この発見は、細胞間でのウイルスタンパク質のＴＮＴ依存輸送を立証する。例えばＶＰ２２のような特定の治療的に重要な分子の輸送を可能にするこれらの特性に起因して、ＴＮＴおよびそれについての影響は、遺伝子治療方法を改善するため、あるいは新規な方法を創造するための重要な選択肢を表す。例えばＶＳＶＧプロテインのようなウイルスタンパク質の発現を介した例えばＴＮＴ形成の刺激（図１７ｄ，例８に従う）あるいはＴＮＴの影響（例１６に従う）を介して、治療剤の細胞間輸送上に及ぼす影響となり得る。そのため局所的に適用するエネルギー需要（例えば、音、電磁羽、光）あるいは薬品の可能性は、しばしば治療剤の局所的な制御の見込みを提供する。ＴＮＴを介した輸送のための必要なシグナルが備えられた治療上の物質の合目的的な導入を介して、組織における合目的的および効率的な分配が、例１の２に従って達成され得る。
【００３９】
例８
病原体の感染の治療のための手段
例７に従ったウイルスタンパク質の輸送に加えて、トランスフェクション（例１５に従う）の４８時間後における神経内分泌細胞ＰＣ１２細胞の蛍光顕微鏡検査分析により、さあらにウイルス融合タンパク質、ＶＳＶＧ−ＥＣＦＰ（Rustom, A., Bajohrs, M., Kaether, C., Keller, P., Toomre, D., Corbeil, D., Gerdes, H.-H.: Selective delivery of secretory cargo in Golgi-derived carriers of non-epithelial Cells, in Traffic
2002, 3: 279-288頁）の細胞間輸送が検出された（図１７ｄ）。これを越えて、ＶＳＶＧ発現細胞において、ＴＮＴ形成への刺激効果が観察された。ここで調査されたモデルウイルス以外の他の病原タンパク質あるいは病原体もまた、ＴＮＴを介して組織において広がったことが推定される。それ故、理想的なＴＮＴは、組織における病原体の分配を妨げる治療のための理想的な攻撃点を表す。必要なエネルギー形態、あるいは例１および例１６に従った薬品の局所的な適用によるＴＮＴの合目的的な破壊は、それ故に病原体の分配を減少させるあるいは防止することができる。例えば例１６の１に従って薬品によって膜組成に影響を与えることによって、例えば膜のコレステロール含有量を変えそれとともにＴＮＴの安定性を変える（図１８）、あるいは、栄養素の合目的的な変更によって、ウイルスあるいはバクテリアの感染を妨げるための予防策が見出され得る。
【００４０】
例９
わずかな生理的および心理的な効果
非常に敏感なＴＮＴは、それらの過度の感度に起因して、例えば超低周波、超音波、光あるいは磁場のような外部のエネルギー形態あるいはまた内部の刺激の知覚を担う。この仮定は、例えば顕微鏡分析の期間において波長５６５ｎｍの光による比較的低エネルギーの刺激を介して、ＴＮＴは刺激を受けて、微視的に分析し得る振動をし、さらに多くの場合引き裂かれた（図９）ことが観察されることにより支持された。ＴＮＴのそのような振動あるいは引き裂きは、異なる細胞の反応を引き起し得る。副腎細胞の刺激の場合には、神経内分泌の増加に至り、さらに結果として例えば高血圧症に至り得る。これは、神経ペプチドおよびホルモンを蓄積する分泌顆粒が、ＴＮＴにより連結された細胞の接触区域において局所的に集中されている（図２０）ことの観察により支持される。例えば副腎から血液循環に解放された物質は、他の器官の生理的過程および組織型に作用し、さらに、中枢神経系における神経回路網のシナプス可塑性をも代替させる。これがわずかな生理的および心理的効果の結果を招くと考えられる。そのような効果の例は、気分が優れないといった一般的な病気、興奮、睡眠障害および精神分裂症の行動型に至る緊張感、また、水路、携帯電話からの放射線、高圧電力線、産業設備への無意識の反応、および超心理的な効果まで含む。治療のための機会は、ＴＮＴ連結あるいはそれらの形成への影響を介して提供され、例２、３、６、８に従う（外部エネルギー形態の選別あるいは排除、細胞膜の脂質構成の影響、ＴＮＴの形成の誘発）。
【００４１】
例１０
組織工学
例１の２ａ，ｂに従った副腎髄質細胞の３次元ビデオ顕微鏡検査分析を介して、細胞間の網に基づいて組織化されたＴＮＴの形成が検出され、そこでは、合胞体が生じ（図２ｅ，ｆ，図３ｎ−ｑ２，図４ａ−ｃ）、細胞小器官が単一方向に輸送され得る（図４ｄ−ｈ，図１４）。ＴＮＴは、例１６に従って、これまでに調査された、ＰＣ１２細胞、ＨＥＫ細胞（図１６ａ）のような細胞構造系、並びに髄質（図１６ａ）および海馬（図１６ｃ）の１次培養の全てにおいて見出された。特定の染色方法により、さらに、非常に長いＴＮＴが見出されている。この目的のため、細胞培地へのＤｉｌ（分子プローブ、Oregon）の慎重な添加（局所的な添加）によって、ＰＣ１２細胞がラブテック（LabTec:
商標名) 細胞培養容器において染色された。染色および同時に起こる顕微鏡分析（例１５に従う）の期間に、破壊的なエネルギー形態（その培地の揺動、移動、非常に強い光の照射等）は、できる限り避けられた。その分析は、１ｍｍ以上の距離にわたって個々の細胞を連結するＴＮＴを示す（図１９）。ＴＮＴの形成は、それ故に、生体の発達あるいは成熟した生体における組織形成のための重要な構成要素を表す。ＴＮＴは、不完全な細胞質分裂を介した細胞分裂から生じず、新規に形成されることが示されている（図２ａ−ｄ）。この目的のため、ＰＣ１２細胞は、細胞周期のＧ１／Ｓ期における細胞を遮断しかつ分裂を防止する細胞培地において、２．５ｍＭのチミジンを用いた１４時間の処理の後に、ＴＮＴの形成のために分析され、あるいは、制御された条件下において、すなわち、チミジンの存在なしで、ＷＧＡを用いた染色、４％パラホルムアルデヒド／４％スクロースにおける２０分固定、０．２％トリトン（Triton: 商標名）Ｘ−１００を用いた３分処理、およびＤａｐｉを用いた核染色（図１２）の後、１時間後に移されて分析された（例１５に従う）。これらの結果は、試験管内における組織工学は、ＴＮＴの形成および／または維持に強く依存することを暗示する。それは、細胞を激しく増殖させるためだけでなく、ゆっくりと成長させるかあるいは分裂後の細胞培養にも適用する。これは、今度は、試験管内の組織培養の制御はＴＮＴ連結の調節を介して達成され得ることを明確にする。この調節は、その特徴的な性質に基づき、そこでは、例えば光のような外部のエネルギー形態（図９）、あるいは例えばコレステロールの回収のような脂質組成の代替（図１８）を介して、例１６に従って合目的的に影響がもたらされ得る。
【００４２】
例１１
神経回路網を支持したコンピュータ
例１０に従って、細胞間の網に基づいて組織化されたＴＮＴの形成が検出され、ＴＮＴを介して合胞体が生じ（図２ｅ，ｆ，図３ｎ−ｑ２，図４ａ−ｃ）、個々の細胞間において情報が単一方向に交換される（図４ｄ−ｈ，図１４）。例１６に従って、神経の１次培養においてもＴＮＴが見出された（図１６ｃ）。それ故、ＴＮＴは神経系を処理する情報の決定的な構成要素を表すことが想定される。神経回路網を支持したコンピュータは、そのような中枢神経系の神経回路網のシミュレーションに基づく。将来の技術のためのそのような回路網シミュレーションの潜在性は、非常に高いと見積もられるが、これまでに理解されたその系は、中枢神経系に比べてそれらの機能において未だ非常に激しく限定される。見出された細胞を連結したＴＮＴの連結パターンを介して、情報の単一方向輸送と組合わさって、ＴＮＴに基づく連結およびそれらの特徴的な性質を考慮することにより現在の回路網を支持したコンピュータの著しい改善、あるいは新規な系の開発のための可能性を生じる。
【００４３】
例１２
染色方法およびＴＮＴの特徴描写
我々の調査は、ＷＧＡを備える生体内（図１ａ−ｄ）において、また、水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質（ウイルス膜貫通型タンパク質）（図１７）と連結したＧＦＰ、ＥＧＦＰアクチン（図３ｊ−ｍ２）、あるいは非常に特有の形質膜マーカー（図８）であるＥＧＦＰ−Ｆ（図３ｎ−ｑ２，図４ａ−ｃ）に相当する暗号のプラスミドを用いたトランスフェクションによって、ＴＮＴが目で見られ得ることを実証した。さらに、ＴＮＴは、ファロイジンを備えるアクチンの染色の間における注意深い固定の後に、試験管内において目に見え得る（図１ｅ）。糸状偽足あるいは軸索とは対照的に、ＴＮＴはもっぱらアクチンを含むが微小管は含まないことが見出された（図１ｅ，図６）。この実証のため、ＰＣ１２細胞が平板培養の２４時間後にグルタルアルデヒドを用いて固定され（図１ｆに従う）、アルファ（α）−チューブリンの抗体（図６ａ，ｂ，ｃ１，ｄ２）およびファロイジンＦＩＴＣ（図６ｃ２，ｄ２）を用いて免疫細胞化学的に染色され、蛍光顕微鏡を用いて分析された（例１５に従う）。微小管糸状体は、細胞における糸状偽足において（図６ａ，ｂ）かつ、細胞の”中央体”領域における結合形態において見られ、その細胞は細胞質分裂の間に固定され、それ故に細胞間において収縮性アクチン環をもつ（図６ｄ２）。細胞を連結したＴＮＴを用いて、ＴＮＴにおいて、微小管（図６ｄ１）は全く検出されることができないが、対照的に糸状アクチン（図６ｄ２）が検出され得ることが明確になる。アクチンを除外すると（図３ｊ−ｍ２）、可溶性の非重合体細胞質物質のＴＮＴ仲介による細胞間輸送はこれまでのところ示されていない。ボディピィ（Bodipy: 商標名)
あるいはカルセインＡＭのような低分子量色素のために、ＴＮＴはおそらく透明でない（図１３参照）。この観察は、これらのあるいは類似の色素の微量注入調査の期間にＴＮＴが見えなかった理由、あるいはこれらの色素のいずれの輸送も観察できなかった理由をも説明することができた。カルセインのような小さな分子、例えばＥＹＦＰ（図７）のような細胞質表現タンパク質およびおそらくイオンの、強く制限されたＴＮＴ仲介輸送は、これまで実証できなかった、ＴＮＴで連結された細胞の電気的なカップリングに一致する（”パッチ・クランプ”法）。対照的に、小さな細胞小器官／小胞、アクチンおよび例えばＥＧＦＰ−Ｆのような形質膜構成要素の細胞から細胞へのＴＮＴ仲介が観察された（図３，４）。糸状偽足および軸索とは対照的に、ＴＮＴはトリプシン処理に関して敏感でない（図１０）。これは、ＰＣ１２細胞間におけるＴＮＴの時間的に推移した蛍光明視野ビデオ顕微鏡検査画像を通して示され、それは細胞媒体において１．２５％（図１０ａ１，ａ２）あるいは２．５％（図１０ｂ１，ｂ２）のトリプシン／ＥＤＴＡを用いた処理を受け。トリプシン／ＥＤＴＡ処理を続けることは、丸くなる細胞の増加を介して目に見える基質からの細胞の解放、最終的にはそれらの解放を導く（図１０）。ＴＮＴは、観察期間にわたって元のままである（図１０）。
【００４４】
例１３
顕微鏡分析
ＰＣ１２細胞（Heumam R. et.al., Relationship between NFG-mediated volume increase and "priming effect" in fast and slow reacting clones of PC12 pheochromacytoma Cells, Exp. Cell Res. 145, 179-190 頁(1983)）は、ラブテック（Labtec: 商標名)
細胞培養容器において最適な密度で培養された（see Rudolf R. et al., Dynamics of immature secretory granulel: role of cytoskeletal elements during transport, cortical restriction and F-actin-depending tethering. Mol Biol. Cell, 12, 1353-1365頁（2000))。その細胞培地はＤＭＥＭと、１０％ウマ血清（Gibco)と、５％ウシ胎仔血清（Gibco)と、４ｍｍｏｌのグルタミンを含んだ。１つの培養容器は、例えば薬物あるいは他の影響（例えば外部エネルギー形態）を用いて処理された。制御容器は、標準化された条件の下に置かれた。実験の後、制御および試験細胞は、ＷＧＡ（以下の例を参照）を用いて染色され、ＴＮＴのために分析された。この目的のため、生きている細胞の自動３次元ビデオ顕微鏡検査が遂行された。この目的のため、細胞培養容器の自由に定義できる領域において、細胞の３次元画像シーケンスが取得された。顕微鏡システムは、この目的のため、プログラマブル顕微鏡テーブル、オートフォーカス装置、Ｚ−ステッパ（自動こま送り機構）および適切な制御ソフトウェアを含んだ。２次元分析と対照的に、この画像の３次元シーケンスを用いて、ＴＮＴの数や外観が正確に決定されることができた。ＧＦＰ融合タンパク質、あるいはＴＮＴを介して交換された特定の膜構造の選択的なマーキングのための他のウイルス蛍光色素の適用を介して、生きた細胞の前記自動３次元顕微鏡によって、この交換の定量的な分析が遂行されることができた。この方法は、単色あるいは多色分析を用いて遂行された。細胞培養におけるＴＮＴの分析は、注意深い固定およびその後のファロイジンを用いた染色の後でも可能だったが、我々の意見では信頼性が低くい、これは厳しい固定方法は部分的にＴＮＴの破壊に至り、試験および制御細胞の間に存在する代替された違いに至るからである。
【００４５】
例１４
ＦＡＣＳ分析
２つのＰＣ１２細胞培養はＤｉｌあるいはＤｉＯ（商標名）を用いて別々に染色された。バイブラント（Vibrant:商標名）ＤｉｌあるいはＤｉＯ（分子プローブ、Eugene, Oregon） は、製品説明書に従って、懸濁において細胞のマーキングのために直接使用するために置かれた。この目的のため、ＰＣ１２細胞は、１×ＰＢＳを用いて２回、１５ｃｍの細胞培養容器において洗浄され、３７℃において１ｍｌのトリプシンを用いて２〜５分間保温された。５ｍｌのＰＣ１２細胞培地がピペットにより加えられ、その細胞が４００ｒｐｍ／４℃で５分間遠心分離機にかけられた。その上澄みが排出され、１ｍｌの１×ＰＢＳにおいて細胞ペレットが再び懸濁された。５ｍｌのバイブラント（Vibrant:商標名）ＤｉｌあるいはＤｉＯ”細胞ラベル溶液”（分子プローブ、Ｖ−２２８８９）において混合され、そのサンプルは、時折振動させて、３７℃および１０％ＣＯ2の条件下でインキューベータにおいて２０分間保温された。その後、その細胞は、再び（４００ｒｐｍ／４℃で５分間）遠心分離機にかけられた。その残余物は処分され、細胞ペレットは３ｍｌの培地において再び懸濁され、３７℃に加熱された。最後に、ＤｉｌあるいはＤｉＯで染色された細胞ペレットは、いずれも１ｍｌの細胞培地に取り上げられ、混合され、細胞培地を用いて４０ｍｌに希釈され、細胞培養容器上で平板培養された。蛍光顕微鏡下での分析は、ＤｉｌおよびＤｉｏの双方ともまた、おそらく取り込まれた（endocyted)膜構造において実質的に完全に現れ、細胞膜ではほとんど検出できないことを示す（図４ｄ−ｈ）。混合培養から平板培養した後の早い時間では、もっぱら緑あるいは赤の蛍光シグナルをもつ細胞が存在した（図４ｆ）。２時間後にはすぐに、緑および赤の蛍光シグナルの双方を含む細胞間を連結したＴＮＴが見出された（図４ｄ１）。やがて、細胞の数が、交換された蛍光構造の数と同じくらいに増加した（図４ｈ）。２４時間から４８時間後に細胞において、ほとんどが黄色で、わずかに緑あるいは赤の蛍光構造が観察され（図４ｈ）、これは交換された緑および赤の膜構造の融合を指し示す。ＴＮＴを介してもたらされた膜小胞の単一方向の交換は、それ故に、”蛍光活性化細胞区分け（Fluorescence Activated CellSorting(FACS)) ”により簡単に定量化されることができ、それは驚くほど単純で、非常に効率的および定量的な方法であり、それ故にＴＮＴの影響およびそれによって理解された細胞伝達の調査のための薬理学的な連続試験にも適している。
【００４６】
例１５
顕微鏡検査方法
１．ＰＣ１２細胞の細胞接種
１５ｃｍ細胞培養容器（Nulge Nunc International） 上で培養された細胞は、１×ＰＢＳを用いて２回洗浄され、その後、１ｍｌのトリプシンが加えられ（トリプシン／ＥＤＴＡ溶解液、Gobco-BRL ）、その細胞が３７℃で，約５分間保温された（１０％ＣＯ2 ）。その細胞は、５ｍｌ細胞培地（材料参照）に取り上げられ、４００ｒｐｍ（４℃）で５分間遠心分離機にかけられた。その細胞ペレットは、２ｍｌの細胞培地において再び懸濁され取り上げられる、このとき細胞個別化のため、狭小なグラスピペットを用いて８０〜１００回取り上げられ、所望の容積の細胞培地へ希釈された。その細胞は、その後、ＰＬＬ（Poly-L-Lysin) ラブテック（Labtec: 商標名) 細胞培養容器（Chambered Coverglas 4 well, Nalge Nunc International）上にコティーティングされ、所望の密度で平板培養された。
【００４７】
２．顕微鏡におけるＴＮＴの視覚化
顕微鏡システムは、オリパスＩＸ７０顕微鏡、ＰＩピエゾ−ｚ−ステッパ（E-662, Physik Instrumente GmbH & Co.) 、ヒーターボックス（Life Imaging Services, Olten, Switzerland)、ポリクロームＩＩモノクロメータ（T.I.L.L. Photonics GmbH, Martinsried, Germany)、Ｄａｐｉ／ＦＩＴＣ／ＴＲＩＴＣ  Ｆ６１−０２０蛍光フィルタ（AHF Analysentechnik AG, Tubingen, Germany ）および制御ソフトウェア−ティルビジョン（TillVison(商標名) ）von T.I.L.L. Photonics GmbH, Martinsried, Munichから構成された。その単色あるいは多色蛍光ビデオ顕微鏡検査は、記述されたシステムを用いて標準的な方法に従って遂行された。同じことが３次元蛍光あるいは明視野顕微鏡検査のためにも当てはまる。ＴＮＴを見ることができるようにするため、まず、細胞培養容器の底の下に、正確な顕微鏡平面が見出されなければならない。しばしば、ＴＮＴは、細胞培養容器へ水平でなく伸び、それに対してある傾斜角度をもったが、一つの顕微鏡平面では、それを通してＴＮＴは完全に分析されることができなかった。そのＴＮＴは、焦点変更あるいは３次元調査を介してのみ完全に像が形成されることができた。この目的のため、ｚステッパにより細胞を介して、細胞基台から始まる、連続的なｚ断面の４０像が概して製造された。この連続像は部分的に、TillvisIONソフトウェアの逆重畳伸張を用いて処理され、３次元再構成され、３次元分析のための適切なソフトウェアを用いて分析された（Scanalytics Inc., Fairfax, Virginia のVoxblast (商標名）、TILLvisIONあるいはIPLab ソフトウェアv.3.2.2 を用いる）。共焦点顕微鏡検査は、１００×ＨＣＸ  ＰＬ  ＡＰＯ
１００×／１．４０  ＮＡ  ｏｉｌ  ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ(Leica Microsysteme Vertrieb GmbH, Bensheim, Germany) を備えたLeica SP2 共焦点顕微鏡を用いて遂行された。採用された２つの撮像システムは、３７℃の温度調整装置を備える（Live Imaging Services, Olten, Switzerland)。
【００４８】
３．ＴＮＴの小麦胚芽凝集素染色
ラブテック（LabTek: 商標名）細胞培養容器上で成長された細胞は、分子プローブ（Eugen, Or, W-11262) の約１ｍｌの”ＷＧＡ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（商標名）”（１ｍｇ／ｍｌ溶解液）を直接的に用いて、４５０ｍｌの媒体において、前もって３７℃に加熱された顕微鏡上で処理された。約２〜５分後に、細胞の形質膜は染色され、減少された媒体における背景であった。
【００４９】
４．免疫細胞化学方法
ＰＣ１２細胞は、細胞接種の２４時間後に、１×ＰＢＳにおいて２回注意深く洗浄され、４％ＰＦＡ／４％スクロースにおいて２０分間注意深く固定された。その後、その細胞は、５０ｍｍｏｌのＮＨ4 Ｃｌにおいて１０分間注意深く保温された。その抗体染色は、標準的な方法に従って遂行されたが、それについて、サンプルの慎重な取り扱いに注意が支払われた。4,6-diamino-2-phenylindol-di-hydrochloride（Ｄａｐｉ）（分子プローブ、１：５００の希釈）を用いた核の染色およびファロイジンを用いたアクチン染色において、その色素はそれらが抗体であったかのように使用された。Ｆアクチンは、ファロイジン  ＴＲＩＴＣ／ＦＩＴＣ共役（sigma Chemical Co., 250 nanomolar end concentration)を用いて蛍光マークがされた、参照：Rudolf R. et al., Dynamics of immature secretory granulel: role of cytoskeletal elements during transport, cortical restriction and F-actin-depending tethering. Mol Biol. Cell, 12, 1353-1365頁（2001) 。間接免疫蛍光法マーキングは、以下の記述のようにしてもたらされた、Rudolf R. et al.Further Primary antibodies put to use were: polyclonal anti-GFP antibody(Molecular Probes A-6455) ;monoclonal anti-synaptophysin antibodySy-38(chemicon, Temecula, CA, Dilution 1:100); polyclonal anti-myosin-Va-antiserum-Dil2(dilution 1:300),of Wu X. et al., Myosin V Associates with melanosomes in mouse melanocytes: evidence that myosin V is an organelle motor., J. Cell Sci. 110,847-859頁 (1997) ；monoclonal anti-alpha-tubullin antibody (Klon DM1A, Sigma Chemical Co., dilution
1:500)。２次抗体として、以下のものが使用される：goat-anti-mouse-lissamin(dilution 1:500), goat-anti-rabbit-TRITC(dilution 1:200) and goat-anti-rabbit-Cy5 (dilution 1:500), all from Jackson Immuno Research Labs, Inc. (West Grove, Pennsylvania)。
【００５０】
５．リソトラッカー（Lysotracker:商標名) 染色
顕微鏡へのＰＣ１２細胞の輸送の前に、細胞培地は、６０ｎｍｏｌのリソトラッカー（Lysotracker:商標名) 緑（green)ＤＮＤ−２６（分子プローブ,Eugen, あるいは,L-7526)を備える細胞培地に注意して交換された。その染色された細胞は、蛍光顕微鏡検査により直接的に分析されることができた。
【００５１】
６．ＰＣ１２細胞のトランスフェクション
ｃＤＮＡのＰＣ１２細胞へのトランスフェクションは、我々の文献に記載されたようにして遂行された（Kaether C. et al., Targetting of green fluorescent protein to neuroendocrine secretory granules: a new tool for real time studies of regulated protein secretion. Eur. J. Cell Biol., 74, 133-142 頁(1997)) 。
【００５２】
７．セルトラッカー（CellTracker:商標名) 染色
染色は、製品説明書に従って付着細胞を用いて遂行された、すなわち、媒体における細胞の１５分の保温、それに続く色素のない媒体における３０分間の保温に従った。
【００５３】
例１６
ＴＮＴの影響の試験のための方法
細胞接種（図１６ａ）、ネズミの髄質１次培養（図１６ｂ，個別化された細胞の分離のため、Ｐ１０ネズミの副腎髄質はコラゲナーゼ（０．１％）を用いた処理および度重なるトリプシン処理（０．１２５％）を受け、その個別化された細胞はその後ポリオルニチン／ラミニンでコーティングされたラブテック（Labtec: 商標名) 細胞培養容器上で平板培養され、４日間培養された）および海馬１次培養（図１６ｃ，標準的な方法（Branker, G. Goslin, K. in Culturing Nerve Cells, eds. Banker G & Goslin K, MIT Press, Cambridge MA,1991)に従って準備された）の２日後に、ＷＧＡを用いた染色の後に、高分解能３次元ビデオ顕微鏡撮像により（例１５に従う）、ＰＣ１２細胞を越えて、ＴＮＴは、非神経内分泌のＨＥＫ−２９３−細胞（ATCC CRL 1573 - human embryonic kidney) において検出された。これらの培養において形成されたＴＮＴの形態および数は、例１３に従った３次元顕微鏡分析によって決定されることができた。それ故、これらあるいは類似の細胞培養は、例１３における分析方法と組合わさって、例えば細胞医薬あるいは外部エネルギー形態によってＴＮＴの影響を試験するためのスクリーニングシステムを提供する。
【００５４】
１．ＴＮＴの影響のための細胞医薬のスクリーニング
ＴＮＴの安定性への例えばコレステロールの影響を調査するために、ＰＣ１２細胞の細胞培地が、接種の２時間後に、５，８あるいは１０ｍｍｏｌのスクロース（制御）をもつＤＭＥＭ、または５，８あるいは１０ｍＭのメチル−β−シクロデキストリンをもつＤＭＥＭと交換され、その細胞が３７℃および１０％ＣＯ2 下で３０分間保温された。ＷＧＡの添加の後に、無作為に選択された１０の顕微鏡検査領域（オリンパスＩＸ７０、１００倍対物レンズ、TillvisION System 、ピエゾｚストッパ、それぞれ４０断面）の３次元分析が遂行され、ＴＮＴの数が決定された。図１８ａ１および図１８ｂ１は、５ｍｍｏｌメチル−β−シクロデキストリンについての３次元解析の代表的な画像面を示し、そこではＴＮＴが矢印先端を用いてマークされている。その定量化は、メチル−β−シクロデキストリンの増加とももに、ＴＮＴ数の著しい減少を示した、すなわち、５ｍｍｏｌのメチル−β−シクロデキストリンでは４０％減少、８ｍｍｏｌのメチル−β−シクロデキストリンでは９３％減少、１０ｍｍｏｌのメチル−β−シクロデキストリンでは１００％であった（図１８ｃｌ）。細胞のコレステロール含有量の減少におけるメチル−β−シクロデキストリンの効果を検出するために、細胞のフィリピン（filipin)染色（Sigma,F-9765) が遂行された。この目的のため、分析された細胞のＤＭＥＭを含む、メチル−β−シクロデキストリンあるいはスクルースが、２０ｍｇ／ｍｌのフィリピンを備えたＤＭＥＭによって交換され、１５分後に、蛍光着色強度がＦＩＴＣ／ＴＲＩＴＣ／ＤＡＰＩフィルターセットを用いて生体内で分析された（Chroma, Brattleboro)。その詳細については、４００ｎｍを用いて励起した後に、４つの無作為に選択された顕微鏡検査領域が撮像され、平均諧調値が決定された。その評価は、５ｍｍｏｌのメチル−β−シクロデキストリンを用いた処理の後のその評価は、細胞のコレステロール含有量の２０％の減少をもたした（図１８ｃ２）。この例に従って、他の細胞薬理学的物質も、ＴＮＴの影響およびそれに依存した細胞の伝達に関して試験され得る。
【００５５】
２．外部の波状エネルギー形態のスクリーニング
ＰＣ１２細胞株において、ＴＮＴは、細胞接種から約２４時間後に、ＷＧＡを用いて染色した後に、高分解能３次元ビデオ顕微鏡撮影により検出された（図１ａ−ｄ）。例１５の２に従った顕微鏡システムの、例えば５６５ｎｍの波長をもつ可視光のような外部エネルギー形態の影響が、これらの細胞上で試験された。約７０秒の観察時間にわたって、連結（図９ａ）は、当初５６５ｎｍの波長の入射光により振動され（９ｂ）、引き裂かれ（図９ｃ）、数秒以内に、固定されていない端部が引き割かれたゴムバンドのようになった（図９ｄ）。このモデル系をもちいて、ＴＮＴ上での他の波状エネルギー形態の影響もまた分析されることができ、採用されるエネルギー形態の最も効果的および選択的な周波数および強度が、例えば治療用途のために決定された。
【００５６】
例１７
動物細胞間の膜連続性の原理
ＴＮＴは、連結された細胞間における膜連続体を生成する。さらに、ＴＮＴは、おそらく新規かつ全体的な細胞の原理を表す。この推測は、ＴＮＴで連結された細胞間において、形質膜構成要素（図３ｎ−ｑ２，図４ａ−ｃ）およびアクチン（図３ｊ−ｍ２）の輸送、並びにＤｉｌ細胞小器官の直接的な輸送（図４ｄ，ｅ，図１４）を実証する実験によって支持される。比較できる膜連続体が、植物体における細胞間の原形質連絡によって理解できる。動物体に関しては、細胞間の膜連続性の新規な形態が、述べられていなかった。現在の説は、概して動物細胞は個体を表すことである。ここで提案されるモデル、動物細胞間におけるＴＮＴ仲介による膜連続体は、それとともに見出された輸送過程とともに（図５）、原則として、連結された細胞間における多くの多様な内因性あるいは外因性野構成要素の交換を許容する。そのような交換のために問題となる重要な構成要素は、本質的な重要性をもつ例えばモルフォゲン（形態形成物質）あるいは転写因子である。ＴＮＴの影響の例１６において説明された可能性を介して、合目的的および精密に調整された影響および様々な生物学的機構への幅広く広がる可能性が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１ａは、細胞接種およびＷＧＡを用いた染色の約２４時間後における生きているＰＣ１２細胞の、高分解能、３次元ビデオ顕微鏡による録画およびＴＮＴ（画像中心）を示す図であり、ＴＮＴは非常に長い距離をわたって２つのＰＣ１２細胞を橋絡することを示している（バー：１５μｍ）。  図１ｂは、図１ａに従った画像を示す図であり、複数のＴＮＴを示し、一つの細胞から始まって様々な細胞へ伸びることを示している（バー：１５μｍ）。  図１ｃは、分岐されたＴＮＴ（矢印参照）の図１ａに従った画像を示す図である。  図１ｄは、コンピュータが発生したＴＮＴの個別の断面（ｘ−ｚ）を示す図であり、ＴＮＴは、基質との接触なしで２つのＰ１２細胞の間において伸びることを示している。  図１ｅは、固定されたＰＣ１２に対するビデオ顕微鏡の多色蛍光画像の３次元再構成からの個別の断面（ｘ−ｙ）を示す図であり、ＰＣ１２細胞はＴＮＴを介して連結され、抗チューブリン抗体（緑）を用いた免疫染色、ＦＩＴＣファロイジンアクチン染色（赤）およびＤＡＰＩ核染色（青、分子プローブＤ−１３０６）の後のもの−チューブリンの存在は細胞体までに制限され、一方、アクチンの存在はＴＮＴを越えて伸びる（矢印）ことを示している、挿入物は矢印マークが付されたＴＮＴを通る対応する個別の断面（ｘ−ｚ）を示す（バー：１５μｍ）。  図１ｆは、ＴＮＴのラスター電子顕微鏡画像を示す図である。ＰＣ１２細胞は、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）において２．５％グルタルアルデヒドを用いて３０分間固定され、１％スクロースが補充され、通常の方法により顕微鏡検査のための用意がされた。ｆ１）、ｆ２）およびｆ３）は、（ｆ）における囲われた領域の拡大詳細図であり、根元部および約５０ｎｍの直径をもつＴＮＴの中央領域を示す−根元部は連結された細胞の形質膜を用いて膜連続体をはっきりと構築することを示している（バー：拡大画像では１５μｍ、縮小画像では２００ｎｍ）。  図１ｇは、２つの固定されたＰＣ１２細胞を連結する、５０ｎｍの直径をもつＴＮＴの透過型電子顕微鏡画像を示す図であり、ボックスは、ＴＮＴ根元の拡大を示す図である。星印は分泌顆粒を示す（バー：拡大像では１０μｍ、縮小像では２００ｎｍ）。
【図２】図２ａ〜ｄは、ＰＣ１２細胞の平板培養の２時間後における様々な段階においての、明視野ビデオ顕微鏡による新規形成ＴＮＴの時間推移画像を示す図であり、ａ）は１つの細胞上の活動的な突出部を示す図であり、ｂ）は矢印先端によりマークされたその突出部が隣の細胞に接触することを示す図であり、ｃ）はＴＮＴ（矢印）を形成することを示す図である。時間を分で示している（バー：２０μｍ）。  図２ｅ，ｆは、明視野ビデオ顕微鏡によるＰＣ１２細胞におけるＴＮＴ連絡網形成画像を示す図である。一方のＴＮＴ（黒矢印）は、おそらく既に存在するが、互いに離れる細胞の間において目に見えることができ、そして新規なＴＮＴ（白矢印）が形成される、その結果、複雑な連絡網が生じ（画像は３つの個別の断面（ｘ−ｙ）の重ね合わせであり、全ての検出し得るＴＮＴを示している。同じ細胞には同様の番号が付される。時間を分で示している（バー：２０μｍ）。  図２ｇ，ｈは、細胞接種の後、単一方向から３６０秒の期間にわたって、２つのＰＣ１２細胞間に伸びたＴＮＴにおける、細胞間の細胞小器官輸送（矢印先端）を直接明視野ビデオ顕微鏡で連続検査した場合の最初と最後の個別の画像を示す図であり、その輸送速さは８および１００ｎｍの間であった。矢印は、位置の移動の開始点を示す（バー：２０μｍ）。
【図３】図３ａ，ｂは、リソトラッカー（Lysotracker:商標名) を用いた染色後のＰＣ１２細胞の蛍光ビデオ顕微鏡画像を示す図であり、蛍光を発する細胞小器官（矢印先端）は、ＴＮＴにおいて単一方向に移動され、そこでは矢印は対象の開始点を示している（バー：１０μｍ）。  図３ｃ〜ｅ２は、シナプトフィシン（ｃ，ｅ中の緑）、ミオシンＶａ（ｄ中の緑およびｅ中の赤）およびラブ（Ｒａｂ）３ａ（ｅ２中の緑）の抗体染色およびＴＲＩＴＣファロイジンアクチン染色（ｃ，ｄ，ｅ２中の赤およびｅ中の青）の後における、蛍光ビデオ顕微鏡によるＰＣ１２細胞の画像を示す図であり、開矢印先端は点シグナルおよび細胞端部の破線部を示している。シナプトフィシンおよびミオシンＶａシグナルは同じ位置（ｅ中の開矢印）で見出されており、その点状の特色は、ＴＮＴにおいて、シナプトフィシン陽性細胞小器官（例えばＳＬＭＶ）が例えばミオシンＶａのようなモータータンパク質によって移動され、例えばラブ（Ｒａｂ）３ａのような調節タンパク質がこの輸送に貢献することを明確にしている（バー：１０μｍ）。  図３ｆ〜ｉ２は、シナプトフィシンＥＧＦＰのＴＮＴ仲介輸送を示す図である。ＰＣ１２細胞の集団は、セルトラッカー（CellTracker:商標名) （分子プローブ”青”Ｃ−２１１０）で染色され（集団２）、シナプトフィシンＥＧＦＰ（ｓｙｎ−ＥＧＦＰ）でトランスフェクションされたＰＣ１２細胞の集団（集団１）とさらに混合して平板培養された。混合細胞培養は、２４〜４８時間後に固定され、ポリクローナル抗ＧＦＰ抗体（分子プローブＡ−６４５５）およびファロイジン−ＦＩＴＣで免疫細胞化学的に染色された。その細胞は、３次元蛍光顕微鏡検査およびその画像データの逆重畳によって分析された。個々のチャンネル画像において、ＴＮＴ（矢印）で結合された双方の集団の細胞を介して、対応する個別の（ｘ−ｙ）断面が表される（上側画像列では、数値は対応する細胞集団を示す）。点シグナルの形態において、シナプトフィシンＥＧＦＰは、集団２（矢印先端）の細胞を連結したＴＮＴにおいて選択的に検出される、すなわち、細胞間において選択的に輸送された。個々のチャンネルの重なりにおいて、ファロイジンシグナルは緑、シナプトフィジンシグナルは赤およびセルトラッカーシグナルは青である。囲まれた領域に関しては、対応する拡大図（ｉ１）が表され、追加した個別（ｘ−ｙ）の断面図（ｉ２）が表される（バー：１０μｍ）。  図３ｊ〜ｍ２は、ＥＧＦＰアクチンのＴＮＴ仲介輸送を示す図であり、図解３ｆ〜ｉ２に従った図解であるが、集団１の細胞は、ＥＧＦＰアクチン（EGFP-actin, Fischer, M., Kaech, S., Knutti, D & Matus, A. Rapid Actin-Based Plasticity in Dendritic Spines. Neuron (1998) 20: 847-854 頁) とともに輸送されている。なお、ＴＮＴを介して連結された集団２（矢印先端）の細胞において、ＥＧＦＰアクチンは選択的に検出された、すなわち、ＴＮＴで連結された細胞間において選択的に輸送されている。  図３ｎ〜ｑ２は、ｆ−ＥＧＦＰ（farnesylated  ＥＧＦＰ）のＴＮＴ仲介輸送を示す図である。像３ｆ〜ｉ２に従った像であるが、集団１の細胞は、ｆ−ＥＧＦＰ（pEGFP-f, Clontech 6074-1) とともに輸送されている。なお、ＴＮＴにより連結された細胞集団２の形質膜において、ｆ���ＥＧＦＰは選択的に検出されている（矢印）、すなわち、形質膜輸送の形式で、ＴＮＴで連結された細胞間において選択的に交換されている。
【図４】図４ａ〜ｃは、生きている細胞において観察された、ｆ−ＥＧＦＰ（farnesylated  ＥＧＦＰ）のＴＮＴ仲介輸送を示す図である。ＰＣ１２細胞の集団は、セルトラッカー（CellTracker:商標名) （分子プローブ”青”）で染色され（集団２）、ｆ−ＥＧＦＰ（ Clontech ）でトランスフェクションされたＰＣ１２細胞の集団（集団１）とさらに混合して平板培養された。混合細胞培養は、４８時間後に３次元蛍光顕微鏡検査によって分析された。個々のチャンネル画像（ｂ，ｃ）において、ＴＮＴで結合された２つの集団の細胞を介して、対応する個別の（ｘ−ｙ）断面が表される（数字は対応する細胞集団を示す）。個々のチャンネルの重なりにおいて、ｆ−ＥＧＦＰシグナルは緑で表され、セルトラッカーシグナルは青である。重ねて挿入されたボックスは、マークされたＴＮＴ（矢印）を通った、対応する（ｘ−ｚ）個別の断面を示す。なお、ｆ−ＥＧＦＰは、集団２の細胞（矢印先端）において、形質膜シグナルとして検出される、すなわち、形質膜輸送の形式で、ＴＮＴで連結された細胞間において選択的に輸送されている（バー：２０μｍ）。  図４ｄ〜ｅは、ＴＮＴで連結された細胞間におけるＤｉｌ陽性細胞小器官の直接輸送を示す図である。ＰＣ１２細胞はＤｉｌを用いて染色され、ラブテック（LabTek: 商標名）培養容器上で平板培養された（例１４参照）。その後、その細胞は、蛍光ビデオ顕微鏡によって分析された。３つの映像連続体の個別の画像が示され、その画像は、ＴＮＴ（矢印）を介して連結された２つの細胞間において、複数のＤｉｌ陽性細胞小器官の単一方向輸送を示す。表された４つの細胞小器官に関して、それらの部分的に重なる軌跡が図解される（矢印１−４）。破線は、細胞輪郭の部分を示す（詳細には、図１４参照）（バー：２０μｍ）。  図４ｆ〜ｈ−共焦点、３次元蛍光顕微鏡による、２つの混合されたＰＣ１２細胞集団の間における輸送画像を示す図であり、それぞれの細胞集団はＤｉｌ（赤）およびＤｉＯ（緑）を用いて各々染色され、個別化された細胞の平板培養の後における異なる時点のものを示す。ｆ）では１時間たった細胞は、相応するように、ＤｉｌのみあるいはＤｉＯのみのいずれかの陽性細胞小器官を含んでおり、ｇ１）では２時間後のいくつかの細胞は、Ｄｉ１およびＤｉＯの両方の陽性構造を含んでおり（矢印）、ｇ２は、ｇ１からの細胞の（ｘ−ｙ）あるいは（ｘ−ｚ）に関連した個別の断面（ｇ３）の３次元分析を示す図であり、Ｄｉｌ陽性細胞小器官がＤｉＯでマークされた１つの細胞内に位置することを示す、ｈ）では８時間後のいくつかの細胞は、主として、両方の染色（黄色）に大して陽性である小胞を（矢印頭）を主として含んでいる（バー：２０μｍ）。
【図５】図５は、個々の結果を指摘するＴＮＴ概念の概略を示す図である。一つの細胞は、アクチンに基づいて、目標となる細胞の方向における延長部分（ａ）を形成する。目標となる細胞の膜との延長部分の融合、および両方の細胞の間における膜連続体の形成（ｂ）、すなわちＴＮＴの形成の後、細胞小器官が細胞間において単一方向に輸送され得る。赤はアクチン、緑は細胞小器官を示す。
【図６】図６は、ＴＮＴが、糸状アクチンを含むが、微小管は含まないことを示す図である。ＰＣ１２細胞は、平板培養の２４時間後にグルタルアルデヒドを用いて固定され（詳細は図１ｆを見よ）、アルファ（α）−チューブリンの抗体（ａ，ｂ，ｃ１，ｄ２）およびファロイジンＦＩＴＣ（ｃ２，ｄ２）を用いて免疫細胞化学的に染色され、その後、蛍光顕微鏡を用いて分析された。なお、微細な微小管糸状体は、細胞の糸状偽足において取り残される（ａ）。一つのそのような領域（ａ中のボックス）は、（ｂ）において拡大されて示され、矢印先端は微小管糸状体を示す。細胞質分裂の間に固定された細胞において、結合された微小管は”中央体”領域（ｃ１）において観察され、細胞間における収縮性アクチン環である（ｃ２）。（ｃ３）は、（ｃ１）および（ｃ２）からの画像の重ね合わせを示す。ＴＮＴで連結された細胞に関して（ｄ１−ｄ３）、ＴＮＴ（矢印先端）において、微小管（ｄ１）は全く検出されることができないが、対照的に糸状アクチン（ｄ２）が検出され得ることが明確になる（図１ｅをも比較せよ）。（ｄ３）は、（ｄ１）および（ｄ２）からの画像の重ね合わせを示す（バー：１０μｍ）。
【図７】図７は、細胞質ＥＹＦＰがＴＮＴで連結された細胞間において輸送されないことを示す図である。画像３ｆ−ｉ２のオーバーレイに従った画像だが、集団１の細胞はＥＹＦＰ（Clontech) が導入(transfected) され、逆重畳されていない顕微鏡画像データである。糸状アクチンを染色したファロイジンからのシグナルは、緑で表され、ＥＹＦＰシグナルは赤、セルトラッカー（Cell Tracker: 商標名) シグナルは青である。ａ中のボックスに関して、拡大図が（ａ１）に示される。なお、ＥＦＦＰは、ＴＮＴで連結された集団２（青色細胞）の細胞において検出できないが、半分だけは橋絡するＴＮＴを貫く、すなわち、ＴＮＴにより効率的に輸送されていない（バー：１０μｍ）。
【図８】図８は、ｆ−ＥＧＦＰ（farnesylated  ＥＧＦＰ）が、非常に明確な形質膜マーカーであることを示す図である。ＰＣ１２細胞は、図３ｎ−ｐ２に従った顕微鏡分析のために準備された。細胞を表現する３ｆ−ＥＧＦＰは、その後、３次元共焦点顕微鏡により分析された。（ｘ−ｙ）個別の断面および対応する（ｘ−ｚ）および（ｙ−ｚ）個別の断面（各断面は（ｘ−ｙ）個別の断面における線として図解される）が、細胞の中央部を介して示される。なお、ｆ−ＥＧＦＰは、もっぱら細胞形質膜に局在化されている（バー：１０μｍ）。
【図９】図９ａ〜ｄは、約７０秒の観察期間にわたる、ＴＮＴの図１ａに従った４つのビデオ顕微鏡画像を示す図であり、そこでは連結（ａ）が波長５６５ｎｍの入射光により初めは振動し（ｂ）、引き裂かれ（ｃ）、数秒以内に、最終的に自由となり引き裂かれたゴムバンドのようになっている（ｄ）。画像の時点は秒で示す（バー：５０μｍ）。
【図１０】図１０は、細胞媒体において１．２５％（ａ１，ａ２）あるいは２．５％（ｂ１，ｂ２）のトリプシン／ＥＤＴＡを用いた処理を受けたＰＣ１２細胞間におけるＴＮＴの、時間的推移蛍光明視野ビデオ顕微鏡検査画像を示す図である。トリプシン／ＥＤＴＡ処理を続けることは、基質からの細胞の分離に至り（丸くなる細胞の増加を通して目に見える（矢印先端）および最終的にはそれらの分離に至る（図１０）。観察期間にわたって、ＴＮＴは元のままである（矢印）。画像の時点は、秒で示す（バー：２０μｍ）。
【図１１】図１１ａは、ラトランクリンＢ（Latrunculin B)のないＰＣ１２細胞の場合において、ＴＮＴの一時的な出現のグラフ例である。横軸は細胞接種の後の計測された時点を時間で示し、縦軸は新規形成ＴＮＴの数を示し、無作為に選択された細胞培養容器の領域において、ＷＧＡを用いた細胞の形質膜染色および３次元蛍光顕微鏡分析により決定した。  図１１ｂは、５μｍｏｌのラトランクリンＢ（Latrunculin B)の存在下のＰＣ１２細胞の場合において、ＴＮＴの一時的な出現のグラフ例である。横軸は、細胞接種の後におけるラトランクリンＢの存在下（＋）および欠如下（−）において、細胞接種の後の計測された時点を時間で示し、縦軸は無作為に選択された細胞培養容器の１０の領域における新規形成ＴＮＴの数を示し、ＷＧＡを用いた細胞の形質膜染色および３次元蛍光顕微鏡分析により決定した。
【図１２】図１２ａは、細胞接種、ＷＧＡを用いた染色、４％パラホルムアルデヒド／４％スクロースにおける２０分固定、０．２％トリトン（Triton: 商標名）Ｘ−１００を用いた３分処理、およびＤａｐｉを用いた核染色の後の約１時間後における、ＰＣ１２細胞の蛍光顕微鏡画像を示す図である。（ａ）の左の画像は、細胞周期のＧ１／Ｓ期における細胞を遮断しかつ細胞分裂を防止した細胞培地において、２．５ｍＭのチミジンを用いた１４時間の処理をしたものを示し、（ａ）の右の画像は、ＰＣ１２細胞の処理なしで（制御）、核染色有糸分裂期（矢印）において、観察されたものである。有糸分裂期の欠如にもかかわらず、チミジン処理されたＰＣ１２細胞はＴＮＴを形成している（矢印先端）、（バー：２０μｍ）。  図１２ｂは、図１２ａの結果に関する、グラフ例および定量化分析を示す図であり、−制御の時と比べて、有糸分裂期の数はチミジン処理によって２０％まで減少したが、ＴＮＴ形成は８６．５％に維持されている（わずかな減少はおそらく細胞分裂遮蔽に起因する減少した細胞数の結果である）、ＴＮＴはそれ故、細胞分裂の現象あるいは不完全に発達した細胞質分裂の結果ではない。
【図１３】図１３は、カルセインは効率的に糸状偽足へ浸透するが、ＴＮＴへは浸透しないことを示す図である。平板培養の２４時間後、ＰＣ１２細胞はＷＧＡ（左欄、赤）、およびカルセンＡＭ（中央欄、緑、分子プローブＣ−３０９９，１．３０００）を用いて染色され、その後、共焦点蛍光顕微鏡を用いて分析された（右欄はその重なりを示す）。細胞の底（ａ１−ｃ２）における光学的な（ｘ−ｙ）個別断面においての糸状偽足の分析は、そこではこれらの構造が多く存在するが、カルセインもまた効率的に糸状偽足を染色することを示す。ａ１，ｂ１，ｃ２におけるボックス領域のため、それぞれの場合の拡大図（ａ２，ｂ２，ｃ２）が示され、そこでは、矢印先端がカルセインで染色された糸状偽足を示す。ＴＮＴ（ｄ１−ｆ２）の分析における、細胞中央部を介した光学的（ｘ−ｙ）個別断面は、そこでは構造が典型的に局所化されているが、カルセンがこれらへ浸透しないことを示す。ｄ１，ｅ１，ｆ１におけるボックス領域のため、拡大図が各図（ｄ２，ｅ２，ｆ２）に示され、そこでは、矢印先端が細胞間を橋絡したＴＮＴを示す（バー：１５μｍ）。
【図１４】図１４は、ＴＮＴで連結された細胞間におけるＤｉｌ陽性細胞小器官の直接輸送を示す図である。画像４ｄ−ｅに従った画像である。概観画像（ａ）では、ＴＮＴ（矢印先端）を介して連結された２つの細胞（星印）が示され、Ｄｉｌ陽性細胞小器官の単一方向輸送を示す（矢印方向において）。破線は、細胞輪郭の部分を示す。（ｂ）では、色符号として表された４つの細胞小器官の部分的に重なる軌跡が図解され、および破線に数字が付されている（１−４）。着色された矢印は、輸送のそれぞれの方向を示す。（ｂ）に示された各軌跡のため、基本的なビデオ連続体（シリーズ１−４）の４つの選択的な個別画像が図示されており、それは対応する細胞小器官（矢印先端）の輸送を示す。画像の時点は秒で示す（バー：２０μｍ）。
【図１５】図１５は、温度遮蔽を採用し、ＴＮＴが、通常のエンドサイトーシスおよびエキソサイトーシス機構を除く機構に従って、Ｄｉｌ／ＤｉＯで染色した細胞小器官の細胞間輸送を引き起こすことの蛍光顕微鏡実証を示す図である。（ｅ）では異なって染色された２つのＰＣ１２細胞集団は、３７℃で１時間の間、ラブテック（Labtec: 商標名) 培養容器上で混合培養として培養され、その後さらに、５μＭのラトランクリンＢ（Latrunculin B)（ｌａｔ−Ｂ）の欠如下あるいは存在下において様々な温度で培養された。（ａ）では異なって染色された２つのＰＣ１２細胞集団は、３７℃で１時間の間およびその後０．７℃で４時間の間、ラブテック培養容器上で混合培養として培養された。１つの個別化された２重に染色された細胞が見出すことができ、その細胞は、ＴＮＴ（矢印）を用いて隣の細胞（星印）へ連結されている。（Ｂ）は（ａ）中の囲まれた細胞領域の拡大図である。（ｃ，ｄ）は、ＰＣ１２細胞は、平板培養の１時間後にＷＧＡを用いて染色され、０．７℃あるいは３７℃（ｄ）でさらに４時間培養された後に、ビデオ顕微鏡分析された図である。（ｃ）中の細胞は、もっぱら形質膜染色を示し、一方、（ｄ）中の細胞は、それに加えて、核周囲染色（星印）および染色されたエンドサイトティック（endocytotic)構造を示す（矢印頭）（バー：１０μｍ）。
【図１６】図１６は、３次元蛍光ビデオ顕微鏡画像の（ｘ−ｙ）個別断面を示す図である。ＷＧＡを用いた染色の後における、非神経内分泌のＨＥＫ−２９３細胞（ａ，ATCC CRL 1573 -人間の胚芽腎臓細胞) 、ネズミの髄質１次培養（ｂ，個別化された細胞の分離のため、Ｐ１０ネズミの副腎髄質はコラゲナーゼ（０．１％）を用いた処理および度重なるトリプシン処理（０．１２５％）を受けた、その個別化された細胞はその後ポリオルニチン／ラミニンでコーティングされたラブテック（Labtec: 商標名) 細胞培養容器上で平板培養され、４日間培養された）および海馬１次培養（図ｃ，標準的な方法（Branker, G. Goslin,K. in Culturing Nerve Cells, eds. Banker G & Goslin K, MIT Press, Cambridge MA,1991) に従って準備された）が示される。培養において見出されたＴＮＴ（矢印）は、基質に接触せず、各細胞間を最短経路で橋絡している（バー：２０μｍ）。
【図１７】図１７ａは、ＶＰ２２−ＧＦＰをトランスフェクションした約２４時間後に分析されたＰＣ１２細胞の蛍光顕微鏡画像を示す図である。強くはっきりしたおよび弱く目立たない細胞の間において、強く蛍光を発するＴＮＴ連結（矢印）がはっきりと見える。この連結内において、強く蛍光を発する小胞構造（矢印先端）が現れ、その構造は、観察の過程においてそれらの位置を変える。  図１７ｂは、図１７ａに相当する透過顕微鏡画像を示す図である。星印は図１７ａと同じ細胞を示す。  図１７ｃは、図１７ａ（赤）および図１７ｂ（青）の重ね合わせを示す図である。  図１７ｄは、ＶＳＶＧ−ＥＣＦＰ（Rustom, A., Bajohrs, M., Kaether, C., Keller,P., Toomre, D., Corbeil, D., Gerdes, H.-H.: Selective delivery of secretory cargo in Golgi-derived carriers of non-epithelial Cells, in Traffic 2002, 3: 279-288頁）を用いたトランスフェクションおよびラブテック（LabTek: 商標名）細胞培養容器上で平板培養の４８時間後におけるＰＣ１２細胞の蛍光顕微鏡分析結果を示す図である。ＶＳＶＧ−ＥＣＦＰ表現細胞（矢印）とは別に、ＴＮＴを介して連結されたさらに２つの細胞（星印）は、形質膜染色を示す。なお、細胞間のＴＮＴもまた、ＶＳＶＧ−ＥＣＦＰ（矢印）により強く染色される。このことから、ウイルスＶＳＶＧ−ＥＣＦＰは、ＴＮＴ連結を介して細胞間において輸送されるということになる、（バー：２０μｍ）。  図１７ｅ，ｆは、ＭＨＣ  Ｉ−複合体の構成要素である、ＨＬＡ−Ａ２−ＥＧＦＰの輸送を示す図である。図３ｆ−ｉ２に従った画像だが、集団１の細胞がＨＬＡ−Ａ２−ＥＧＦＰを用いてトランスフェクションされた。なお、ＨＬＡ−Ａ２−ＥＧＦＰは、ＴＮＴ（矢印）を介して連結された集団２の細胞において選択的に検出でき、すなわち、ＴＮＴで連結された細胞間において輸送された。
【図１８】図１８は、ＴＮＴの安定性へのコレステロールの効果を示す図である。ＰＣ細胞の接種の２時間後に、その細胞培地が、５，８あるいは１０ｍｍｏｌのスクロース（制御）をもつＤＭＥＭ、または５，８あるいは１０ｍＭのメチル−β−シクロデキストリンをもつＤＭＥＭと交換され、その細胞が３７℃および１０％ＣＯ2 下で３０分間保温された。ＷＧＡの添加の後に、無作為に選択された１０の顕微鏡検査領域の３次元分析が遂行され（オリンパスＩＸ７０、１００倍対物レンズ、TillvisION System 、ピエゾｚストッパ、それぞれ４０断面）、ＴＮＴの数が決定された（ａ１，ｂ１）。（ａ１，ｂ１）は、５ｍｍｏｌメチル−β−シクロデキストリン条件についての３次元解析の代表的な画像面を示し、そこではＴＮＴが矢印先端を用いてマークされている。その定量化は、メチル−β−シクロデキストリン濃度の増加とももに、ＴＮＴ数の著しい減少を示した、すなわち、５ｍｍｏｌのメチル−β−シクロデキストリンでは４０％減少、８ｍｍｏｌのメチル−β−シクロデキストリンでは９３％減少、１０ｍｍｏｌのメチル−β−シクロデキストリンでは１００％であった（ｃｌ）。細胞のコレステロール含有量の減少におけるメチル−β−シクロデキストリンの効果を検出するために、フィリピン（filipin)染色（Sigma, F-765) が遂行された。この目的のため、分析された細胞のＤＭＥＭを含む、メチル−β−シクロデキストリンあるいはスクルースが、２０ｍｇ／ｍｌのフィリピンを備えたＤＭＥＭによって交換され、１５分後に、蛍光着色強度がＦＩＴＣ／ＴＲＩＴＣ／ＤＡＰＩフィルターセットを用いて生体内で分析された（Chroma, Brattleboro)。その詳細については、４００ｎｍで励起した後に、４つの無作為に選択された顕微鏡検査領域が撮像され、平均諧調値が決定された。５ｍｍｏｌのメチル−β−シクロデキストリンを用いた処理の評価は、細胞のコレステロール含有量の２０％の減少をもたした（ｃ２）。
【図１９】図１９は、ＰＣ１２細胞間における、非常に長くおよび非常に敏感なＴＮＴ状構造の蛍光顕微鏡画像を示す図である。ＰＣ１２細胞は、細胞培地へのＤｉｌ（分子プローブ、Oregon）の慎重な添加（局所的な添加）によって、ＰＣ１２細胞がラブテック（LabTec: 商標名) 容器において染色された。染色の期間および同時に起こる顕微鏡分析において、破壊的なエネルギー形態（その培地の揺動、移動、非常に強い光の照射等）は、できる限り避けられた。約３００μｍの長さで、約２００ｎｍの明白な直径をもち、基質に接触することなく、細胞間で橋絡された、微細な膜糸が観察された（バー：２０μｍ）。
【図２０】図２０は、緑蛍光発光の人間のクロモグラニンＢ−ＥＧＦＰ（Kaether, C, Salm, T.,Glombik, M., Almers, W. & Gerdes, H.-H.: Targeting of gree fluorescent protein to neuroendocrine secretory granules: a new tool for real time studies of regulated protein secretion, in Eur. J. Cell Biol. 1997, 74:133-142頁) をコード化したｃＤＮＡを用いたトランスフェクションの２４時間後に、ＷＧＡで染色された副腎のＰＣ１２細胞の多色ビデオ顕微鏡画像を示す図である。画像において分泌顆粒（矢印を見よ、黒および白画像における薄い灰色）が緑の蛍光を発するような特性の分泌顆粒のためのマーカータンパク質、赤に着色された（中間の灰色）細胞の形質膜および新規に見出された細胞チューブがある。ＴＮＴで連結された細胞の接触区域における分泌顆粒の発生は、ＴＮＴが、調節されたホルモンおよび神経ペプチド分泌に関わることを強く提示する（バー２０μｍ）。
【図２１】図２１は、分泌顆粒およびミトコンドリアのいずれも、ＴＮＴで連結された細胞間において交換されないことを示す図である。画像３ｆ−ｉ２に従うが、集団１の細胞は、クロモグラニンＢ−ＥＧＦＰ（ａ）あるいはＥＹＦＰ−ｍｉｔｏ（ｂ，ｐＥＹＦＰ−ｍｉｔｏ，Clontech 6115-1 ）を用いてトランスフェクションされる。なお、ＴＮＴ（矢印）を介して連結された集団２の細胞において、採用されたマーカータンパク質のシグナルは、全く見出されなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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