(57)【要約】  少なくとも1種の動物種から得られる成分を含むことが推測される試料において、その本来の動物種を識別し検出する方法が開示される。本発明は以下のステップによって特徴付けられる:a)前記試料から核酸画分を得ること;b)下記からなる群から選択される動物種に特異的な少なくとも1つの物質を用意すること、-配列番号1〜232および242〜261のリファレンス配列;-配列番号1〜232および242〜261の配列の各々に相補的な配列;-配列番号1〜232および242〜261の配列、配列番号1〜232および242〜261の配列の各々に相補的な配列の各々にそれぞれ相同な配列;c)核酸画分と前記物質を接触させること;およびd)前記物質と核酸画分の間の特異的反応に起因する任意のシグナルまたは情報項目を検出し、それによって前記試料が前記本来の動物種を含むことを確定することを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも本来の動物種から得られる成分を含むことが推測される試料において、前記動物種を判定する方法であって:
a)前記試料から得られる核酸画分を用意すること、
b)下記： 
-  配列番号1〜232および242〜261のリファレンス配列、
-  配列番号1〜232および242〜261の配列の各々に相補的な配列(ここで、相補性は、20と70℃の間の温度で、およそ0.5〜1Mの濃度の塩溶液中、配列番号1〜232および242〜261の配列のうちのいずれか1つとハイブリダイズすることができる任意の配列を意味する)、
-  配列番号1〜232および242〜261の配列、配列番号1〜232および242〜261の配列の各々に相補的な配列の各々にそれぞれ相同な配列(ここで、相同性は、前記配列の任意の1つに含まれる少なくとも5個の連続モノマーを含み、その任意の配列と少なくとも70%の同一性を示す任意の配列、例えば断片を意味する)
からなる群から選択される、動物種に特異的な少なくとも1つの物質を用意すること、
c)前記核酸画分と前記物質を接触させること、および
d)前記本来の動物種の前記試料中での存在を特徴づける、前記物質と核酸画分の間の特異的反応によって生じる任意のシグナルまたは情報項目を検出によって判定すること
を特徴とする方法。
【請求項２】
同一の本来の種および/またはそれぞれ異なる本来の動物種に対して特異的な前記物質を複数含むセットを用意すること;および、前記試料中に前記同一の本来の動物種および/またはそれぞれ異なるいくつかの本来の動物種の存在を特徴づける複数のシグナルまたは情報項目を判定することを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
a)配列番号1〜232および242〜261のリファレンス配列、
b)配列番号1〜232および242〜261の配列の各々に相補的な配列(ここで、相補性は、20と70℃の間の温度で、およそ0.5〜1Mの濃度の塩溶液中、配列番号1〜232および242〜261の配列のうちのいずれか1つとハイブリダイズすることができる任意の配列を意味する)、
c)配列番号1〜232および242〜261の配列、およびb)による配列の各々にそれぞれ相同な配列(ここで、相同性は、前記配列の任意の1つに含まれる少なくとも5個の連続ヌクレオチドを含み、その任意の配列と少なくとも70%の同一性を示す任意の配列、例えば断片を意味する)
からなる群から選択されることを特徴とする、ヌクレオチド配列。
【請求項４】
少なくとも本来の動物種から得られる成分を含むことが推測される試料において、少なくとも1種の前記動物種の判定のためになされる、請求項3に記載の配列の使用。
【請求項５】
請求項3に記載の少なくとも1つの識別ヌクレオチド配列を含む、少なくとも1種の本来の動物種を判定するためのプローブ。
【請求項６】
請求項3に記載の少なくとも1つの識別ヌクレオチド配列を含む、本来の動物種からの核酸を特異的に増幅するためのプライマー。
【請求項７】
請求項3に記載のヌクレオチド配列を結合した固体支持体(これは分割されていてもよいしそうでなくてもよい)を含む、少なくとも1種の本来の動物種を判定するための物質。
【請求項８】
請求項3に記載の複数のヌクレオチド配列を所定の配置に従って配置結合させた、加工された表面を含む固体支持体を含むバイオチップ。
【請求項９】
複数のシグナルまたは情報項目を請求項8に記載のバイオチップを用いて判定することを特徴とする、請求項2に記載の方法。
【請求項１０】
a)リファレンス配列である配列番号235〜239および262〜271、
b)配列番号235〜239および262〜271の各々に相補的な配列(ここで、相補性は、20と70℃の間の温度で、およそ0.5〜1Mの濃度の塩溶液中、配列番号235〜239および262〜271の配列のうちのいずれか1つとハイブリダイズすることができる任意の配列を意味する)、
c)配列番号235〜239および262〜271ならびにb)による配列の各々にそれぞれ相同な配列(ここで、相同性は、前記配列の任意の1つに含まれる少なくとも5個の連続ヌクレオチド及び考慮される群のすべての種について保存されてきた領域に属する2個または3個のヌクレオチドの群を含み、その任意の配列と少なくとも70%の同一性を示す任意の配列、例えば断片を意味する)
からなる群から選択されることを特徴とする、ヌクレオチド配列。
【請求項１１】
請求項10に記載の配列のうちの1つに含まれ、考慮される群のすべての種について保存された領域に対応する、1〜3個のヌクレオチドの群からなることを特徴とするヌクレオチド配列。
【請求項１２】
配列番号235の位置14689-14690-14691のCAA塩基、配列番号236の位置15076-15077のCT塩基、配列番号237の位置15101-15102のCT塩基、配列番号238の位置14886-14887のGC塩基、または配列番号239の位置14713-14726のATA塩基を含むことを特徴とする、請求項11に記載のヌクレオチド配列。
【請求項１３】
配列番号262の位置14641のT塩基、配列番号263の位置14778のA塩基、配列番号264の位置15043のC塩基、配列番号265の位置15076のC塩基、配列番号266の位置15101のC塩基、配列番号267の位置15109のA塩基、配列番号268の位置15115のC塩基、配列番号269の位置15239のC塩基、または配列番号270の位置14519のT塩基、または配列番号271の位置14717のT塩基を含むヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項11に記載のヌクレオチド配列。
【請求項１４】
請求項10に記載のヌクレオチド配列を結合した固体支持体(これは分割されていてもよいしそうでなくてもよい)を含む、少なくとも1種の本来の動物種を判定するための物質。
【請求項１５】
考慮される本来の動物種の群に属する少なくとも1種の動物種から得られる成分を含むことが推測される試料において、前記動物種の群を判定する方法であって:
a)前記試料から得られる核酸画分を用意すること、
b)請求項10に記載の配列を含む少なくとも1つの物質を用意すること、
c)前記核酸画分と前記物質を接触させること、および
d)前記本来の動物種の前記試料中での存在を特徴づける、請求項11から13のいずれか一項に記載の配列の1つの存在によって生じる任意のシグナルまたは情報項目を検出によって判定すること
を特徴とする方法。
【請求項１６】
考慮される本来の動物種の群に属する少なくとも1種の動物種から得られる成分を含むことが推測される試料において、前記動物種の群の判定のためになされる、請求項11から13のいずれか一項に規定される配列の使用。
【請求項１７】
考慮される本来の動物種の群に属する少なくとも1種の動物種から得られる成分を含むことが推測される試料において、前記動物種の群を判定する方法であって:
a)前記試料から得られる核酸画分を用意すること、
b)判定すべき動物種の群に特徴的なヌクレオチド配列を識別すること、
c)ステップb)で識別した配列を含む少なくとも1つの物質を用意すること、
c)核酸画分と前記物質を接触させること、および
d)前記本来の動物種の前記試料中での存在を特徴づける、請求項11から13のいずれか一項に記載の配列の1つの存在によって生じる任意のシグナルまたは情報項目を検出によって判定すること
を特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも動物種(以下、本来の動物種と呼ぶ)から得られる成分を含むことが推測される試料において、前記動物種を判定する技術分野に関する。本発明に従ってそうした判定がなされる製品は、例えば、ヒトまたは動物のための食料または食品、化粧用製品、および一般に動物起源の成分を含むことが推測される製品、または、反対にこれらの抽出物の使用が禁止されている製品である。
【背景技術】
【０００２】
例えば、多くの活動分野で、食品中に含まれる動物種の識別が必要とされることがある。第1の理由は、野兎を兎に置き換えるようなある動物種を価格がより低廉な種で代用した不正食品に対処するためである。第2の理由は、例えば特に牛海綿状脳症(すなわちBSE。伝染病であり、牛の飼料に牛起源の動物性肉粉を使用することによる疾病)が流行している間における公衆衛生である。第3の理由は、宗教的なもので、例えば、食品中に豚肉が含まれていないことを確認するためである。第4の理由は、法律的なもので、食品中に保護種が含まれていないことを確認するためである。
【０００３】
現時点で3つの主要な識別アプローチが、文献に記載されている。これらの方法は、組織分析すなわち顕微鏡による分析に基づくもの、タンパク質分析および/または遺伝分析に基づくものである。
【０００４】
組織分析は、動物飼料用に意図した飼料試料中に骨片が含まれるか否かを判定することからなる。この手法は、特にMichardによる論文Revue de 1'alimentation animale(Animal feed review)、vol.508、pp.43-48、1997に記載されており、感度は良いが、手間が掛かり、専門家の解釈に基づく。したがって、ある研究施設での結果を他の研究施設での結果と比較するのは困難である。さらに、性質上、臓物、血清、血液組織、ゼラチンなどのような軟繊維の添加は検出できない。
【０００５】
使用されるタンパク質分析においては、与えられた試料中に含まれる動物種を識別する3群の方法が、主として文献において区分されている。
【０００６】
第1群の方法は、タンパク質電気泳動技術を含み、特異的酵素染色により可溶性の標的タンパク質を検出するものである。診断は、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動後に得られる。しかし、この手法は、新鮮であるか冷凍された、未加工組織についてのみ行うことができる。というのも、ある時間食品を調理することは、タンパク質を変性することの多い処理の例だからである。したがって、この手法は、製造中に調理段階を経た、工場で製造された食品中の動物種の検出に適用することはできない。
【０００７】
第2群の方法は、可溶性の標的タンパク質に対して特異的な抗体を使用する免疫学的手法に基づく。「オクタロニー試験(ouchterlony)」すなわち二重免疫拡散法は、混合物中の抗原を区別するのに使用できる。しかし、この手法には、他の種のエピトープとの交差反応を含むという大きな問題点がある。ELISA(酵素免疫測定法)技術を使用すれば、良好な種間の区別が可能であり、耐熱性エピトープに特異的な抗体を使用する場合は、調理済みの肉に対してこれらの技術を適用することができる。しかし、ここでも特異性の問題が見られる。目安として言えば、鶏肉由来の耐熱性エピトープに対して特異的なポリクローナル抗体は、鶏肉または七面鳥肉が含まれているか否かを判定できるほど十分な特異性を有していない。
【０００８】
第3群の方法は、可溶性の筋肉タンパク質を同定するために使用されるクロマトグラフィー(HPLC)法を含む。しかし、こうした手法は技術的に手間が掛かる上、高価であり、また、新鮮であるか冷凍して間もない組織にしか適用することができない。
【０００９】
これらの3つの方法の問題点は、タンパク質の特徴に主として依存しているという点にある。すなわち、タンパク質は、熱感受性であり食品が一定時間調理されると変性してしまい、また、動物の死後にその生物活性を失い、その存在はしばしば調べる細胞タイプに依存する。
【００１０】
したがって、与えられた試料自体またはその中に含まれている本来の動物種を識別するためには、タンパク質ではなく、直接DNAを分析することが好ましい。DNAは、同じ動物のすべての細胞タイプにおいて同一であり、タンパク質に比較してより安定だからである。したがって、第3のアプローチは、試料中に存在するDNAを分析するものである。つい最近になって、特に制限酵素または遺伝子マーカーの使用に基づく方法が文献に見出されているが、これらの方法は、加工された(特に熱処理後の)製品に適用することができるという長所を有する。
【００１１】
核酸の決定は、制限酵素またはRFLP(制限断片長多型、特にMeyer et al.、Journal of AOAC International、vol.78、No.6、pp.1542-1551、1995参照)と呼ばれる手法を利用することができる。制限酵素は、分析しようとする試料から予め抽出したDNAを、高分子中の正確な部位で切断させる。次いで、得られた断片を識別しようとする種を表わす対照試料の断片と単純な電気泳動によって比較すれば十分である。しかし、この方法によって得られる結果の分析は、特に試料中に何種類もの動物種が含まれる場合には、非常に注意が必要である。
【００１２】
また、核酸の決定は、ミトコンドリアDNAチトクロムBなどの広範にわたって存在するマーカーを配列決定することでも可能である。各ミトコンドリアは、1〜10のミトコンドリアDNA分子を含み、各細胞は数十〜数千のミトコンドリアを含み、非常に少量の試料で作業を行うことができるため、ミトコンドリアDNAはこの種の分析について知られている標的である。そこで、Bartlett & Davidson(Biotechniques、vol.12、No.3、1992)は、FINS(Forensically Informative Nucleotide Sequencing(法医学的に有益なヌクレオチド配列決定))と呼ばれる方法について記載している。この方法は、i)生物試料中に含まれるDNAを分離し、ii)ミトコンドリアチトクロムB遺伝子に特異的なプライマー(このプライマーは、進化の過程で高度に保存されている遺伝子部分中から選択される)を使用したPCRによってこのDNAを増幅し、iii)増幅されたDNAセグメントを配列決定するものである。次いで、この配列をデータベースによる系統発生分析に使用し、これにより、試料中に初めから含まれている動物種の識別が可能となる。この方法は、迅速であり、かつ、任意のタイプの食品(新鮮なもの、冷凍されたもの、加工されたのものなど)に使用できるという利点を有する反面、同じ広範にわたって存在する多型マーカーに由来する増幅された配列の混合物から、種の混合物の分析ができないという大きな問題点を有し、このため、均質な出発物質にしか用いられない。
【００１３】
また、分析は、与えられた種に特異的なマーカーを増幅することでも可能である。そこで、Lahiff et al.(Molecular and Cellular Probes、vol.15、pp.27-35、2001)は、PCRによって、各種に特異的な特別のプライマーを使用した、試料中に含まれる羊、牛または鳥類の種の識別について記載している。S.Colganらによって開発された、PCRにより特異的なプライマーを使用して混合物の4つの種を検出する方法も、2001年(FOOD Research International、2001、vol.34、No.5、401-414)に記載されている。この方法は、ある種であるか否かを特異的かつ迅速に識別することを可能にするが、いくつかの種の検出に同時に適用することはできない。何種類もの種の検出が望まれる場合には、連続的PCRが必要である。このため、多重PCR(Matsunaga et al.1999 Meat Sciences、(1999)、145-148およびMatsunaga T.,et al.、Nippon Shokuhin KogakuKaishi、(1999)vol.46、No.3、187-194)を使用した、6種類の動物種の検出例が従来技術に見出される。しかし、この方法は依然、適用に注意が必要で困難であり、実際上は、探索すべき種について事前に知っている必要がある。しかし、この技術は、盲験で、すなわち、試料中に含まれるであろう種についての事前の知識なしでは適用できない。また、多重的増幅による困難およびミスマッチの可能性から、定量的結果を得ることができない。さらに、多数の種を試験しようとする場合、この手法では多数の特異的プライマーが必要であり、感度と特異性の問題のため、実際上それらを実現することは、比較的不可能である。最後に、種が実験に用いたプライマーセットでは検出されないがそれでも分析対象の試料中に含まれる場合、結果は歪んだものとなるであろう。
【００１４】
上記手法によれば、試料が1つの種しか含まない場合は、含まれるその種を事前の知識なしで決定することができ、組み合せられた種について事前の知識がある場合は数種類を検出することができる。しかし、何種類もの混合物が存在する場合、上記手法のいずれでも含まれている前記種について事前の知識がなければ、決定することはできない。さらに、いくつかの種が存在する場合、上記技術のほとんどは、様々な種の割合が試料中で大きく異なる場合には信頼できる判定が得られない。
【非特許文献１】Michard、Revue de 1'alimentation animale(Animal feed review)、vol.508、pp.43-48、1997
【非特許文献２】Meyer et al.、Journal of AOAC International、vol.78、No.6、pp.1542-1551、1995
【非特許文献３】Bartlett & Davidson(Biotechniques、vol.12、No.3、1992)
【非特許文献４】Lahiff et al.(Molecular and Cellular Probes、vol.15、pp.27-35、2001)
【非特許文献５】FOOD Research International、2001、vol.34、No.5、401-414
【非特許文献６】Matsunaga et al.1999 Meat Sciences、(1999)、145-148
【非特許文献７】Matsunaga T.,et al.、Nippon Shokuhin KogakuKaishi、(1999)vol.46、No.3、187-194
【特許文献１】WO-A-00/05338
【特許文献２】WO-A-99/53304
【特許文献３】WO-A-99/15321
【特許文献４】米国特許第5,234,809号
【特許文献５】米国特許第4,672,040号
【特許文献６】米国特許第5,750,338号
【特許文献７】WO-A-97/45202
【特許文献８】WO-A-99/35500
【非特許文献８】Boom R.et al.、J.Clin.Microbiol.、1990、No.28(3)、p.495-503
【非特許文献９】Levison PR et a1.、J.Chromatography、1998、p.337-344
【非特許文献１０】P.E.Nielsen et al.、Science、254、1497-1500(1991)
【非特許文献１１】Kricka et al.、Clinical Chemistry、1999、No.45(4)、p.453-458
【非特許文献１２】Keller G.H.et al.、DNA Probes、2nd Ed.、Stockton Press、1993、sections 5 and 6、p.173-249
【特許文献９】WO-A-91/19812
【特許文献１０】フランス国特許出願FR-A-2 780 059号
【非特許文献１３】Holland P.M.、PNAS(1991)p.7276-7280
【特許文献１１】WO-A-95/08000
【特許文献１２】米国特許第4,683,195号
【特許文献１３】米国特許第4,683,202号
【特許文献１４】米国特許第4,800,159号
【特許文献１５】欧州特許出願0 201 184
【特許文献１６】WO-A-90/01069
【特許文献１７】特許出願WO-A-90/06995
【特許文献１８】WO-A-91/02818
【特許文献１９】米国特許第5,399,491号
【特許文献２０】WO-A-94/12670
【非特許文献１４】G.Ramsay、Nature Biotechnology、1998、No.16、p.40-44
【非特許文献１５】F.Ginot、Human Mutation、1997、No.10、p.1-10
【非特許文献１６】J.Cheng et al.、Molecular diagnosis、1996、No.1(3)、p.183-200
【非特許文献１７】T.Livache et al.、Nucleic Acids Research、1994、No.22(15)、p.2915-2921
【非特許文献１８】J.Cheng et al.、Nature Biotechnology、1998、No.16、p.541-546
【特許文献２１】米国特許第4,981,783号
【特許文献２２】米国特許第5,700,637号
【特許文献２３】米国特許第5,445,934号
【特許文献２４】米国特許第5,744,305号
【特許文献２５】米国特許第5,807,522号
【非特許文献１９】Maniatis et al.、Molecular Cloning、Cold Spring Harbor、1982
【非特許文献２０】Southern E.M.、J.Mol.Biol.、1975、98、503
【非特許文献２１】Dunn A.R.et al.、Cell、1977、12、23
【非特許文献２２】Bartlett et al.(1992)、Biotechniques Vol.12 No.3 pp.408-412
【特許文献２６】米国特許第5,744,305号
【特許文献２７】WO 95/11995
【非特許文献２３】A.Troesch et al.(J.Clin.Microbiol.、37(1):49-55、1999)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
したがって、分析する同じ試料中に非常の多量にまたは非常に少量存在する場合でも、存在する種について事前の知識なしで、一般性を保ちつつ、1種または複数の種が検出できる技術に対して大きな需要がある。
【００１６】
実際、不正行為があるというためには、製品中、正常な種に対して望ましくない種が5%以上の量(または法令に従って1%)存在しなければならず、これは分子診断を行うのに必要なレベルを簡単なものにしているが、動物起源の製品の含有が禁止される製品の場合には事情はまったく異なる。例えば、2001年1月1日以降、動物飼料用にフランスで使用される飼料の場合、動物起源の製品の中身をトレースすることが求められており、しかも、材料の大半は植物起源であって添加される動物材料は0.1および5重量/重量%の間の範囲であるので、方法の感度という点での技術的な制約は大きい。
【００１７】
したがって、ブラインドで、すなわち、探索される種が何であるかについて事前の知識なしで動物種の定性的および/または定量的識別または検出を可能とし、特異的で信頼性があり、正確であるにも拘わらず簡単に使用することができ、さらに、いくつかの動物種から得られた成分を含む可能性のある媒体中で使用できる、判定するツールの存在が必要とされている。
【００１８】
解決されるべき問題は相当に複雑である。判定はできるだけブラインドで行われなければならない。すなわち、試料は、1種または複数の動物種から得られた成分を含んでも含まなくてもよく、これらの本来の種は不明である。試料が動物種から得られた成分を含む場合、本来の種が判定されなければならないし関連づけることができるが、この判定は、(例えば、種の群を予め決める先行ステップや、例えば交差反応を回避するために属または種によって物質を分類するといったことを可能にする多数回の試験を用いることなく)単一の物質および単一の増幅ステップで、単一の分析で行い得るものでなければならない。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
このために、出願人は、配列番号1〜232、242〜261、これらにそれぞれ相補的な配列、および前記配列のいずれか1つに含まれる少なくとも5個の連続モノマーを含みその任意の配列と少なくとも70%の同一性を示す任意の相同配列を含む群からなる一連の配列を発見した。それらを用いれば、「分子生物学」的分析的手法を使用して、少なくとも本来の動物種から得られる成分を含むことの多い試料において、前記少なくとも1種の本来の動物種を判定することが可能である。
【００２０】
発明を開示する前に、明細書および特許請求の範囲において使用する様々な用語を以下に定義する。
【００２１】
-  「判定」は、動物種の識別または定量的および/または定性的検出もしくは分析であると理解される。
【００２２】
-  「動物種」は、生物種の分類すなわち分類学において使用される最も単純なカテゴリーであると理解される。生物種は分類群(taxon)と呼ばれるカテゴリーに分類される。最も重要な分類群は界(植物または動物)、門、綱、目、科、属および種である。鳥、魚および哺乳動物は脊椎動物綱である。
【００２３】
-  「本来の動物種」という用語は、動物の組織(それらが何であれ)が、本発明による判定がなされる製品の試料の成分を調製するための出発原料として使用される、その動物の動物種を意味すると理解される。
【００２４】
-  「分子生物学的方法」は、in vitroでの標的核酸(DNAおよび/またはRNA)の酵素による増幅およびオリゴヌクレオチドプローブの使用に基づく方法である。
【００２５】
-  「試料」は、それ自体少なくとも1種の「本来の」動物種から得られる少なくとも1つの成分を含むことの多い出発製品、物質または材料から直接または間接的に得られる任意の部分である。この定義の結果として、本発明に従って判定される試料は動物起源の成分を含むことが推測されるもので、それに基づいて、出発製品、物質または材料を構成する動物種が識別または検出される。本発明の目的のためには、出発製品としては、生物材料、肉または魚に基づくような食品または食料、化粧品などがあり得る。
【００２６】
-  「溶解ステップ」という用語は、(後の反応を妨害する細胞砕片などの)微生物のタンパク質および/または脂質外被に含まれている核酸を放出させることができるステップを意味すると理解される。例として挙げれば、出願人の以下の特許出願:
磁気的作用と機械的作用を併用した溶解に関するWO-A-00/05338、
電気的な溶解に関するWO-A-99/53304
および機械的な溶解に関するWO-A-99/15321
に記載されるような溶解方法を利用することができる。
【００２７】
当業者は熱や浸透圧衝撃、またはグアニジウム塩類(米国特許第5,234,809号)などのカオトロピック剤による化学的溶解などの、他のよく知られた溶解方法を使用することもできる。
【００２８】
-  「精製」という用語は、溶解ステップで放出される核酸と他の細胞成分との間の分離を意味すると理解される。このステップは、一般に核酸の濃縮を可能にする。例として言えば、必要に応じて吸着または共有結合によってオリゴヌクレオチドで被覆した磁気粒子を使用し(この主題については、米国特許第4,672,040号および米国特許第5,750,338号を参照)、これらの磁気粒子に結合した核酸を、洗浄ステップによって精製することが可能である。引き続いて前記核酸の増幅が望まれる場合、この核酸精製ステップは特に有利である。これらの磁気粒子の特に有利な実施形態は、本出願人によって出願された以下の番号の特許出願に記載されている:WO-A-97/45202およびWO-A-99/35500。
【００２９】
これらの特許出願のうち、後者では、粒子は熱感受性な磁気粒子であり、各々中間層で被覆された磁気コアを有する。中間層は、それ自体、少なくとも1つの生物分子(例えば核酸)と相互作用することができるポリマー系の外層で被覆されており、この外層ポリマーは熱感受性で、所定のより低い臨界溶解温度(LCST)を、10と100℃の間、好ましくは20と60℃の間に有する。この外層は、核酸と結合する能力を有するポリマーを生成するカチオン性モノマーから合成される。この中間層は、これらの核酸の増幅方法を阻害する問題点を回避するためにコアの磁力を遮断する。
【００３０】
核酸を精製する方法の別の有利な例は、カラム(例えば、Qiagenキット)の形態または不活性な粒子[Boom R.et al.、J.Clin.Microbiol.、1990、No.28(3)、p.495-503]もしくは磁気粒子(Merck:MagPrep(登録商標)Silica、Promega:MagneSil(商標)の常磁性粒子)の形でのシリカの使用である。他の非常に広く使用される方法はカラム中のイオン交換樹脂に基づくもの(例えばQiagenキット)、または常磁性の微粒子フォーマット(Whatman:DEAE-Magarose)[Levison PR et a1.、J.Chromatography、1998、p.337-344]によるものである。非常に適しているが本発明に限定されない他の方法は、酸化金属支持体(Xtrana:Xtra-Bind(商標) matrix)への吸着による方法である。
【００３１】
-  「配列」、「ヌクレオチド断片」、またはオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドは、ホスホエステル結合によってともに組み立てられた一連のヌクレオチド単位であり、ヌクレオチド断片とハイブリダイズすることができる、天然の核酸の情報配列によって特徴付けられており、鎖は異なる構造を有するモノマーを含むことが可能で、天然の核酸分子から、および/または遺伝の組換えによって、および/または化学合成によって得ることができる。
【００３２】
-  「単位」は、核酸の天然ヌクレオチド(その構成要素は、糖、リン酸基および含窒素塩基である)であるモノマーに由来する。DNAでは、糖は2-デオキシリボースであり、RNAでは、糖はリボースである。それがDNAかRNAかにより、含窒素塩基は、アデニン、グアニン、ウラシル、シトシンおよびチミンから選択される。あるいは、モノマーはその3つの構成要素のうちの少なくとも1つが修飾されたヌクレオチドである。例として言えば、修飾はイノシン、5-メチルデオキシシチジン、デオキシウリジン、5-ジメチルアミノデオキシウリジン、2、6-ジアミノプリン、5-ブロモデオキシウリジンまたはハイブリダイゼーションが可能な他の修飾塩基など、修飾塩基を有する塩基によるものでもよいし、または糖、例えば、ポリアミドを有する少なくとも1つのデオキシリボース(P.E.Nielsen et al.、Science、254、1497-1500(1991)、あるいはリン酸基、例えば、特にジホスフェート類、アルキル-およびアリールホスホネート類およびホスホロチオエート類から選択されるエステルとの置換でもよい。
【００３３】
-  「情報配列」という用語は、ヌクレオチドタイプの単位の任意の順序の配列を意味すると理解され、その化学的性質および標準方向におけるその順序は、天然核酸のそれと同じ性質の情報アイテムを構成する。
【００３４】
-  「ハイブリダイゼーション」という用語は、適当な条件下で、十分に相補的な配列を有する2個のヌクレオチド断片が、安定した特異的な水素結合により2本鎖を形成することができるプロセスを意味すると理解される。ポリヌクレオチドと「ハイブリダイズすることができる」ヌクレオチド断片は、各場合において知られた仕方で決定することができるハイブリダイゼーション条件の下の前記ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる断片である。ハイブリダイゼーション条件は、ストリンジェンシー(つまり厳密な条件)によって決定される。ハイブリダイゼーションが行われるストリンジェンシーが高いほど、ハイブリダイゼーションはより特異的である。ストリンジェンシーは、特にプローブ/標的2本鎖の基本的構成、さらに2つの核酸間のミスマッチの度合いによって定義される。
【００３５】
「ストリンジェンシー」は、ハイブリダイゼーション溶液中に存在するイオン種の濃度および種類、変性剤の性質や濃度および/またはハイブリダイゼーション温度などの反応パラメーターにも依存し得る。ハイブリダイゼーション反応が行われる条件でのストリンジェンシーは、主として使用される標的プローブに依存するであろう。これらのデータはすべてよく知られており、当業者は適当な条件を決定することができる。
【００３６】
一般に、使用される標的プローブの長さによって、ハイブリダイゼーション反応の温度は、およそ0.5〜1Mの濃度の生理用食塩水中で、およそ20と70℃の間、特に35と65℃の間である。
【００３７】
-  「プローブ」は、5〜100個のモノマー、特に6〜35個のモノマーを含むヌクレオチド断片を含み、与えられた条件下、ヌクレオチド断片とハイブリダイゼーション複合体を形成するためのハイブリダイゼーション特異性を有するヌクレオチド断片を含み、本願の場合、例えば、リボゾームRNA、前記リボゾームRNAの逆転写によって得られるDNA、および転写製品が前記リボゾームRNAであるDNA(本願においてリボソームDNAまたはrDNAと呼ぶ)に含まれ、プローブは捕捉プローブでも検出プローブでもあり得る。
【００３８】
-  「捕捉プローブ」は、任意の適当な手段によって、つまり、例えば共有結合または吸着によって、直接または間接的に固体支持体上に固定化されているか固定化され得る。
【００３９】
-  「検出プローブ」は、放射性同位体、酵素(特に、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたは発色基質、蛍光基質または発光基質を加水分解することができる酵素)、化学発色化合物、発色化合物、蛍光化合物または発光化合物、ヌクレオチド塩基アナログ、およびビオチンなどのリガンドから選ばれるラベルによって標識することができる。
【００４０】
-  「プライマー」は、例えば、増幅技術、配列決定プロセス、逆転写法などにおいて、酵素重合反応の開始のための与えられた条件下で、ハイブリダイゼーション特異性を有する5〜100個のヌクレオチド単位を含むヌクレオチド断片を含む。
【００４１】
-  「相同」は、2個の比較されるヌクレオチド断片の同一性の程度を特徴づけるもので、本発明について選択されるそのための基準は下に定義するものである。
【００４２】
本発明に従うプローブおよびプライマーは以下のものから選択される:
(a)明細書に添付する配列表中に識別される配列;
(b)明細書に添付する配列表中に識別される配列の各々に相補的な配列(ここで、相補性とは、20と70℃の間、好ましくは35と65℃の間の温度で、およそ0.5〜1M、好ましくは0.8〜1Mの濃度の塩溶液中、明細書に添付する配列表中に識別される配列のうちのいずれか1つとハイブリダイズすることができる任意の配列を意味する);
(c)明細書に添付する配列表中に識別される配列、および明細書に添付する配列表中に識別される配列の各々に相補的な配列の各々にそれぞれ相同な配列(ここで、相同性は、前記配列の任意の1つに含まれる一連の少なくとも5個の連続ヌクレオチドを含み、その任意の配列と少なくとも70%の同一性を示す任意の配列、例えば断片であり、例として言えば、断片(c)は10個のヌクレオチドを含み、その中の5個の連続するヌクレオチドは、配列(a)に属し、残り5個のヌクレオチドのうちの少なくとも2個のヌクレオチドが、アラインメント後に、リファレンス配列中の2個の対応するヌクレオチドに、それぞれ同一である)。
【００４３】
-  「識別配列」という用語は、検出プローブおよび/または捕捉プローブとして働き得る、上に定義される任意の配列または任意の断片を表わす。
【００４４】
-  「検出」という用語は、物理的な方法による直接の検出または標識を使用した検出方法のいずれかを意味するものと理解される。
【００４５】
核酸の検出については、多くの検出方法が存在する(例えば、Kricka et al.、Clinical Chemistry、1999、No.45(4)、p.453-458またはKeller G.H.et al.、DNA Probes、2nd Ed.、Stockton Press、1993、sections 5 and 6、p.173-249参照)。
【００４６】
「標識」という用語は、シグナルを発生させることができるトレーサーを意味すると理解される。これらのトレーサーの非限定的なリストは、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼおよびグルコース-6-リン酸塩脱水素酵素などの比色定量、蛍光または発光によって検出できるシグナルを生じる酵素;蛍光または発光または色素化合物などの発色団;電子顕微鏡の使用によって、または導電性などの電気的特性によって、または電流測定もしくは電圧測定法によって、またはインピーダンス測定によって検出することができる高電子密度基;回析、表面プラスモン共鳴または接触角度変化のような光学の方法によって、または原子間力分光学、トンネル効果などの物理的な方法によって検出することができる基;32P、35Sまたは125Iなどの放射性分子を含む。
【００４７】
したがって、酵素増幅ステップにおいて、例えば、増幅反応のために標識されたヌクレオチド三リン酸を使用することにより、ポリヌクレオチドを標識することができる。標識されたヌクレオチドは、PCRなどのDNAを生成する増幅システムでのデオキシリボヌクレオチドまたはTMAもしくはNASBA法などのRNAを生成する増幅法でのリボヌクレオチドであろう。
【００４８】
例えば、文献WO-A-91/19812に記載されたサンドイッチハイブリダイゼーション法によって標識が付与されたプローブをハイブリダイズさせることにより、増幅ステップ後にポリヌクレオチドを標識することもできる。
【００４９】
核酸を標識する別の特に好ましい方法は、本出願人の出願であるフランス国特許出願FR-A-2 780 059号に記載されている。別の好ましい検出法は、Holland P.M.、PNAS(1991)p.7276-7280に記載されているようにしてポリメラーゼの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を使用する。
【００５０】
シグナル増幅システムは、文献WO-A-95/08000に記載されているようにして使用することができ、この場合、あらかじめ行う酵素的増幅反応を不用とすることができる。
【００５１】
-  「酵素増幅」という用語は、特異的プライマーを使用し少なくとも1種類の酵素の作用によって、特定のヌクレオチド断片を複数コピー生成するプロセスを意味すると理解される。したがって、核酸増幅のためには、とりわけ、下記の方法が存在する:
-  PCR(ポリメラーゼ連鎖反応。米国特許第4,683,195号、米国特許第4,683,202号および米国特許第4,800,159号などに記載されている)、
-  LCR(リガーゼ連鎖反応、欧州特許出願0 201 184などに開示されている)、
-  RCR(修復連鎖反応(Repair Chain Reaction)、特許出願WO-A-90/01069に記載されている)、
-  3SR(自立的配列増殖(Self Sustained Sequence Replication)、特許出願WO-A-90/06995)、
-  NASBA(核酸配列に基づく増幅(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification)、特許出願WO-A-91/02818)、
-  TMA(転写媒介増幅(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification)、米国特許第5,399,491号)。
【００５２】
この場合、酵素的増幅法によって生成されたポリヌクレオチドを表わすために「アンプリコン」という用語が使用される。
【００５３】
-  本願で使用する場合、「固体支持体」という用語は、核酸を固定化することができる材料をすべて含む。固体支持体としては、合成材料または天然材料(場合によって化学的に修飾されていてもよい)が使用でき、特に、セルロース系材料(例えば、紙)、酢酸セルロースおよびニトロセルロースまたはデキストランなどのセルロース誘導体などの多糖類、重合体、共重合体、特にスチレンタイプのモノマーに基づくもの、綿などの天然繊維、およびナイロンなどの合成繊維;シリカ、石英、ガラス、セラミックスのような無機材料;ラテックス類;磁気粒子;金属誘導体、ゲルなどである。固体支持体は、マイクロタイタープレート、出願WO-A-94/12670に記載されているような薄膜、または粒子もしくはバイオチップの形とすることができる。
【００５４】
-  「バイオチップ」という用語は、多数の捕捉プローブを所定の位置に付着させた小さなサイズの固体支持体を意味すると理解される。
【００５５】
例として挙げれば、これらのバイオチップの例は、G.Ramsay、Nature Biotechnology、1998、No.16、p.40-44;F.Ginot、Human Mutation、1997、No.10、p.1-10;J.Cheng et al.、Molecular diagnosis、1996、No.1(3)、p.183-200;T.Livache et al.、Nucleic Acids Research、1994、No.22(15)、p.2915-2921;J.Cheng et al.、Nature Biotechnology、1998、No.16、p.541-546といった刊行物、米国特許第4,981,783号、米国特許第5,700,637号、米国特許第5,445,934号、米国特許第5,744,305号および米国特許第5,807,522号といった特許に記載されている。
【００５６】
固体支持体の主要な特性は、捕捉プローブの核酸へのハイブリダイゼーション特性を維持しつつ、同時に検出方法において生成するバックグラウンドノイズを最小にするものでなければならない。バイオチップの利点は、これを用いれば多数の捕捉プローブの使用が単純化され、それにより、検出されるべき種の多重検出が可能になる点にある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５７】
以下に記載する発明は、上記方法によって引き起こされる問題を、感度、特異性、多重検出能力および識別性の点で等しく解決可能とし、同時に迅速かつ容易に実施できる。
【００５８】
本発明は、少なくとも本来の動物種から得られる成分を含むことが推測される試料において、前記動物種を判定する方法であって:
a)前記試料から得られる核酸画分を用意すること、
b)下記：
-  配列番号1〜232および242〜261のリファレンス配列、
-  配列番号1〜232および242〜261の配列の各々に相補的な配列(ここで、相補性は、20と70℃の間、好ましくは35と65℃の間の温度で、およそ0.5〜1M、好ましくは0.8〜1Mの濃度の塩溶液中、配列番号1〜232および242〜261の配列のうちのいずれか1つとハイブリダイズすることができる任意の配列を意味する)、
-  配列番号1〜232および242〜261の配列、配列番号1〜232および242〜261の配列の各々に相補的な配列の各々にそれぞれ相同な配列(ここで、相同性は、前記配列の任意の1つに含まれる少なくとも5個の連続ヌクレオチドの列を含み、その任意の配列と少なくとも70%の同一性を示す任意の配列、例えば断片を意味する)
からなる群から選択される、動物種に特異的な少なくとも1つの物質を用意すること、  
c)前記核酸画分と前記物質を接触させること、および
d)前記本来の動物種の前記試料中での存在を特徴づける、前記物質と核酸画分の間の特異的反応に起因する任意のシグナルまたは情報項目を検出によって判定すること、
を特徴とする方法に関する。
【００５９】
本発明はまた、上記方法であって、同一の本来の種および/またはそれぞれ異なる本来の動物種に対しての前記特異的な複数の物質のセットを用意すること;および前記試料中において前記同一の動物種またはそれぞれ異なるいくつかの本来の動物種の存在を特徴づける複数のシグナルまたは情報項目を判定することを含む方法に関する。
【００６０】
本発明はまた、下記:
a)配列番号1〜232および242〜261のリファレンス配列、
b)配列番号1〜232および242〜261の配列の各々に相補的な配列(ここで、相補性は、20と70℃の間、好ましくは35と65℃の間の温度で、およそ0.5〜1M、好ましくは0.8〜1Mの濃度の塩溶液中、配列番号1〜232および242〜261の配列のうちのいずれか1つとハイブリダイズすることができる任意の配列を意味する)、
c)配列番号1〜232および242〜261の配列、およびb)による配列の各々にそれぞれ相同な配列(ここで、相同性は、前記配列の任意の1つに含まれる少なくとも5個の連続するヌクレオチドを含み、その任意の配列と少なくとも70%の同一性を示す任意の配列、例えば断片を意味する)
からなる群から選択されることを特徴とする、任意のヌクレオチド配列に関する。
【００６１】
本発明はまた、少なくとも本来の動物種から得られる成分を含むことが推測される試料において、少なくとも1種の前記動物種の判定のためになされる上に定義した配列の使用に関する。
【００６２】
本発明は、少なくとも本来の動物種から得られる成分を含むことが推測される試料において、前記本来の動物種を判定する方法であって、別の動物種から得られる少なくとも1つの他の成分を含む試料において、あわせて用いられている種について事前の知識なしで前記判定を行うことを可能とすること、及び：
a)前記試料から得られる核酸画分を用意すること、
b)下記： 
-  配列番号1〜232および242〜261のリファレンス配列、
-  配列番号1〜232および242〜261の配列の各々に相補的な配列(ここで、相補性は、20と70℃の間、好ましくは35と65℃の間の温度で、およそ0.5〜1M、好ましくは0.8〜1Mの濃度の塩溶液で、配列番号1〜232および242〜261の配列のうちのいずれか1つとハイブリダイズすることができる任意の配列を意味する)、
-  配列番号1〜232および242〜261の配列、配列番号1〜232および242〜261の配列の各々に相補的な配列の各々にそれぞれ相同な配列(ここで、相同性は、前記配列の任意の1つに含まれる一連の少なくとも5個の連続ヌクレオチドを含み、その任意の配列と少なくとも70%の同一性を示す任意の配列、例えば断片を意味する)
からなる群から選択される動物種に特異的な少なくとも1つの物質を用意すること、
c)前記核酸画分と前記物質を接触させること、および
d)前記本来の動物種の前記試料中での存在を特徴づける、前記物質と核酸画分の間の特異的反応に起因する任意のシグナルまたは情報項目を検出によって判定すること
によって特徴づけられる方法に関する。
【００６３】
本発明はまた、上に定義された、少なくとも1つの識別ヌクレオチド配列を含む、少なくとも1種の本来の動物種を判定するためのプローブであり得る。
【００６４】
それはまた、上に定義された、少なくとも1つの識別ヌクレオチド配列を含む、本来の動物種からの核酸を特異的に増幅するためのプライマーに関する。
【００６５】
本発明の別の実施形態は、上に定義したヌクレオチド配列を結合した固体支持体(これは分割されていてもよいしそうでなくてもよい)を含む少なくとも1種の本来の動物種を判定するための物質である。
【００６６】
本発明によれば、ヌクレオチド配列またはその断片は固体支持体に結合され、これにより、多数のシグナルまたは情報項目の識別を可能にするバイオチップを構成することができる。
【００６７】
本発明による方法は、手動、半自動的または自動的に実行することができ、試料に含まれている動物性材料中の本来の動物種を判定するための手段の使用を可能にする。
【００６８】
この発明はまた、特に、バイオチップ技術を用いた検出方法に関する。この検出方法は、各種の識別配列と呼ばれる配列をプローブとして使用することにより、探索される種に対して特異的である。この検出方法の迅速性、感度および特異性は、どのような媒体に対しても等しく適用可能である。特に、この方法は、用いた製造及び／又は生産条件および方法(特に調理、脱水および/または保存技術)が何であれ、動物性材料を含む任意の食品試料、および、例えば、動物起源のゼラチンなどを含む化粧用および/または薬剤製品など、動物抽出物を含むことの多い製造品試料に適用される。
【００６９】
多数の特異的増幅産物のこの同時的かつ単一ステップの検出は、固体支持体の使用によって、特に、多数の捕捉プローブを所定の位置に結合した小型固体支持体の形状である固体支持体、すなわち、「バイオチップ」によって可能である。ここで、これらの捕捉プローブは、探索しようとする種に対する前記識別配列に特異的なヌクレオチド配列の断片のセットまたはその全部からなる。
【００７０】
これらのヌクレオチド配列は、フィルタ上にスポットを堆積させる「ドットブロット」法[Maniatis et al.、Molecular Cloning、Cold Spring Harbor、1982]、DNAを転写する「サザンブロット」法[Southern E.M.、J.Mol.Biol.、1975、98、503]、RNAを転写する「ノーザンブロット」法または「サンドイッチ」技術[Dunn A.R.et al.、Cell、1977、12、23]などの、すべての知られているハイブリダイゼーション法においても使用することができる。
【００７１】
本発明はまた、種の群または動物種のクラスまたは分類群の判定に関する。こうした種の群または動物種のクラスまたは分類群は、例えば、哺乳動物、鳥または魚の綱などのクラス、あるいはまた鳥の科など種についての下位群、または鳥または哺乳動物などの下位群が2つ組み合せられたものからなる。
【００７２】
この識別は、signature配列と呼ばれる、分類群のクラス、群または下位群を特徴づけ、群を構成するすべての個体について保存された領域に対応するヌクレオチド配列の識別を通して可能である。本発明による方法の中で使用される動物のクラスに特異的などのようなsignature配列も、それによれば、第1に、事実上同じ分類群のクラスのすべての動物種について保存された核酸領域を有し、第2に、通常の判定条件下で、前記同じ定義に対応する他の配列と識別することができ、添付する特許請求の範囲において概括的に定義された特徴を有する。
【００７３】
本発明はまた、考慮される本来の動物種の群に属する少なくとも1つの種から得られる成分を含むことの多い試料中の前記動物種の群を判定する方法であって、
a)前記試料から得られる核酸画分を用意すること、
b)判定すべき動物種の群に特徴的なヌクレオチド配列(複数可)を識別すること、
c)ステップb)において識別された配列を含む少なくとも1種の物質を用意すること、
c)核酸画分および前記物質を接触させること、および
d)上に定義した配列のうちの1つの存在に起因する、本来の動物種の群の前記試料中での存在を特徴づける任意のシグナルまたは情報手段を検出手段によって判定すること
を特徴とする方法に関する。
【００７４】
例えば、哺乳動物の存在の検出のために、以下のものが利用されるであろう:
1/signature配列M1、配列番号235のGACACAACAA CAGC(位置14685〜14698(genbank ウシ(Bos taurus)リファレンス配列;受託番号V00654))に対応するもの。位置14689-14690-14691(genbank ウシ(Bos taurus)リファレンス配列;受託番号V00654)のCAA塩基は、調査が望まれる群を構成する所定の種(この場合、哺乳動物)に対応するすべての核酸材料について保存されている。選ばれた哺乳動物群の核酸材料を構成するすべての配列では、たった5個の変異した部位しか、前記signatureの残りの部分で観察されない。前記の位置におけるこれらの3つの塩基の存在により、試料中の哺乳動物の存在を判定することが可能になる。
【００７５】
2/signature配列M2、配列番号262、位置14634〜14648(genbank ウシ(Bos taurus)リファレンス配列;受託番号V00654)に対応するもの。位置14641(genbank ウシ(Bos taurus)リファレンス配列;受託番号V00654)のT塩基は、調査が望まれる群を構成する所定の種(この場合、哺乳動物)に対応するすべての核酸材料について保存されている。選ばれた哺乳動物群の核酸材料を構成するすべての配列では、たった5個の変異した部位しか、前記signatureの残りの部分で観察されない。前記の位置におけるこの塩基の存在により、試料中の哺乳動物の存在を判定することが可能になる;
【００７６】
3/signature配列M3、配列番号263、位置14771〜14785(genbank ウシ(Bos taurus)リファレンス配列;受託番号V00654)に対応するもの。位置14778(genbank ウシ(Bos taurus)リファレンス配列;受託番号V00654)のA塩基は、調査が望まれる群を構成する所定の種(この場合、哺乳動物)に対応するすべての核酸材料について保存されている。選ばれた哺乳動物群の核酸材料を構成するすべての配列では、たった5個の変異した部位しか、前記signatureの残りの部分で観察されない。前記の位置におけるこの塩基の存在により、試料中の哺乳動物の存在を判定することが可能になる。
【００７７】
鳥の存在の識別は以下のsignatureによって判定される:
1/O1、配列番号236、TCCCTAGCCT TCTC(位置15073〜15086(ニワトリ(Gallus gallus)リファレンス配列;genbank受託番号X52392))に対応するもの。CT塩基(位置15076-15077)は、調査が望まれる群を構成する所定の種(この場合、鳥類)に対応するすべての核酸材料について保存されている。選ばれた鳥類の群の核酸材料を構成するすべての配列では、たった5個の変異した部位しか、前記signatureの残りの部分で観察されない。前記の位置におけるこれらの2つの塩基の存在により、試料中の鳥の存在を判定することが可能になる。
【００７８】
2/O2、配列番号237、ACACTTGCCG GAAC(位置15098〜15111(ニワトリ(Gallus gallus)リファレンス配列;genbank受託番号X52392))に対応するもの。CTまたはCA塩基(位置15101-15102)は、調査が望まれる群を構成する所定の種(この場合、鳥類)に対応するすべての核酸材料について保存されている。選ばれた鳥類の群の核酸材料を構成するすべての配列では、たった4個の変異した部位しか、前記signatureの残りの部分で観察されない。前記の位置におけるこれらの2つの塩基の存在により、試料中の鳥の存在を判定することが可能になる。
【００７９】
3/O3、配列番号264、位置15036〜15050(genbankニワトリ(Gallus gallus)リファレンス配列;受託番号X52392)に対応するもの。位置15043(genbankニワトリ(Gallus gallus)リファレンス配列;受託番号X52392)のC塩基は、調査が望まれる群を構成する所定の種(この場合、鳥類)に対応するすべての核酸材料について保存されている。選ばれた鳥類の群の核酸材料を構成するすべての配列では、たった5個の変異した部位しか、前記signatureの残りの部分で観察されない。前記の位置におけるこの塩基の存在により、試料中の鳥の存在を判定することが可能になる。
【００８０】
4/O4、配列番号265、位置15069〜15083(genbankニワトリ(Gallus gallus)リファレンス配列;受託番号X52392)に対応するもの。位置15076(genbankニワトリ(Gallus gallus)リファレンス配列;受託番号X52392)のC塩基は、調査が望まれる群を構成する所定の種(この場合、鳥類)に対応するすべての核酸材料について保存されている。選ばれた鳥類の群の核酸材料を構成するすべての配列では、たった5個の変異した部位しか、前記signatureの残りの部分で観察されない。前記の位置におけるこの塩基の存在により、試料中の鳥の存在を判定することが可能になる。
【００８１】
5/O5、配列番号266、位置15094〜15108(genbankニワトリ(Gallus gallus)リファレンス配列;受託番号X52392)に対応するもの。位置15101(genbankニワトリ(Gallus gallus)リファレンス配列;受託番号X52392)のC塩基は、調査が望まれる群を構成する所定の種(この場合、鳥類)に対応するすべての核酸材料について保存されている。選ばれた鳥類の群の核酸材料を構成するすべての配列では、たった5個の変異した部位しか、前記signatureの残りの部分で観察されない。前記の位置におけるこの塩基の存在により、試料中の鳥の存在を判定することが可能になる。
【００８２】
6/O6、配列番号267、位置15102〜15116(genbankニワトリ(Gallus gallus)リファレンス配列;受託番号X52392)に対応するもの。位置15109(genbankニワトリ(Gallus gallus)リファレンス配列;受託番号X52392)のA塩基は、調査が望まれる群を構成する所定の種(この場合、鳥類)に対応するすべての核酸材料について保存されている。選ばれた鳥類の群の核酸材料を構成するすべての配列では、たった5個の変異した部位しか、前記signatureの残りの部分で観察されない。前記の位置におけるこの塩基の存在により、試料中の鳥の存在を判定することが可能になる。
【００８３】
7/O7、配列番号268、位置15108〜15122(genbankニワトリ(Gallus gallus)リファレンス配列;受託番号X52392)に対応するもの。位置15115(genbankニワトリ(Gallus gallus)リファレンス配列;受託番号X52392)のC塩基は、調査が望まれる群を構成する所定の種(この場合、鳥類)に対応するすべての核酸材料について保存されている。選ばれた鳥類の群の核酸材料を構成するすべての配列では、たった5個の変異した部位しか、前記signatureの残りの部分で観察されない。前記の位置におけるこの塩基の存在により、試料中の鳥の存在を判定することが可能になる。
【００８４】
8/O8、配列番号269、位置15232〜15246(genbankニワトリ(Gallus gallus)リファレンス配列;受託番号X52392)に対応するもの。位置15239(genbankニワトリ(Gallus gallus)リファレンス配列;受託番号X52392)のC塩基は、調査が望まれる群を構成する所定の種(この場合、鳥類)に対応するすべての核酸材料について保存されている。選ばれた鳥類の群の核酸材料を構成するすべての配列では、たった5個の変異した部位しか、前記signatureの残りの部分で観察されない。前記の位置におけるこの塩基の存在により、試料中の鳥の存在を判定することが可能になる。
【００８５】
哺乳動物および鳥の存在の識別は、signature Vによって判定される。これは、配列番号238に対応する配列ATAGCCACAGCATT(位置14883〜14896(genbank ウシ(Bos taurus)リファレンス配列;受託番号V00654))である。GC塩基(位置14886および14887)は、調査が望まれる群を構成する所定の種(この場合、鳥類および哺乳動物)に対応するすべての核酸材料について保存されている。選ばれた鳥類の群および哺乳動物の群の核酸材料を構成するすべての配列では、たった４個の変異した部位しか、前記signatureの残りの部分で観察されない。前記の位置におけるこれら2個の塩基の存在により、試料中の鳥および哺乳動物の存在を判定することが可能になる。
【００８６】
魚の存在の識別は、以下によって判定される。
1/signature配列P1、配列番号239に対応する配列ATAATAACCTCTTT(位置14713〜14726(マダラ(Gadus morhua)リファレンス配列;genbank受託番号X99772))である。ATAまたはATG塩基(位置14716-14717-14718)は、調査が望まれる群を構成する所定の種(この場合、魚類)に対応するすべての核酸材料について保存されている。選ばれた魚類の群の核酸材料を構成するすべての配列では、たった4個の変異した部位しか、前記signatureの残りの部分で観察されない。前記の位置におけるこれら3個の塩基の存在により、試料中の魚の存在を判定することが可能になる。
【００８７】
2/signature配列P2、配列番号270、位置14512〜14526(genbank マダラ(Gadus morhua)リファレンス配列;受託番号X99772)番に対応するもの。位置14519(genbank マダラ(Gadus morhua)リファレンス配列;受託番号X99772)のT塩基は、調査が望まれる群を構成する所定の種(この場合、魚類)に対応するすべての核酸材料について保存されている。選ばれた魚類の群の核酸材料を構成するすべての配列では、たった5個の変異した部位しか、前記signatureの残りの部分で観察されない。前記の位置におけるこの塩基の存在により、試料中の魚の存在を判定することが可能になる。
【００８８】
3/signature配列P3、配列番号271、位置14710〜14724(genbank マダラ(Gadus morhua)リファレンス配列;受託番号X99772)番に対応するもの。位置14717(genbankマダラ(Gadus morhua)リファレンス配列;受託番号X99772)のT塩基は、調査が望まれる群を構成する所定の種(この場合、魚類)に対応するすべての核酸材料について保存されている。選ばれた魚類の群の核酸材料を構成するすべての配列では、たった4個の変異した部位しか、前記signatureの残りの部分で観察されない。前記の位置におけるこの塩基の存在により、試料中の魚の存在を判定することが可能になる。
【００８９】
したがって、本発明はまた、下記からなる群:
a)リファレンス配列である配列番号235〜239および262〜271、
b)配列番号235〜239および262〜271の各々に相補的な配列(ここで、相補性は、20と70℃の間の温度で、およそ0.5〜1Mの濃度の塩溶液中で、配列番号235〜239および262〜271の配列のうちのいずれか1つとハイブリダイズすることができる任意の配列を意味する)、
c)配列番号235〜239および262〜271ならびにb)による配列の各々にそれぞれ相同な配列(ここで、相同性は、前記配列の任意の1つに含まれる少なくとも5個の連続ヌクレオチドと考慮される群のすべての種について保存されてきた領域に属する2個または3個のヌクレオチドの群を含み、その任意の配列と少なくとも70%の同一性を示す任意の配列、例えば断片を意味する)
から選ばれることを特徴とする、ヌクレオチド配列に関する。
【００９０】
本発明は、より特定すれば、配列番号235〜239のうちの1つに含まれ、考慮される群のすべての種について保存された領域に対応する2〜3個のヌクレオチドの群を含むことを特徴とする、上に定義されるヌクレオチド配列に関する。
【００９１】
本発明はまた、上に定義される配列の使用、すなわち、配列番号235〜239のうちの1つに含まれ、考慮される群のすべての種について保存された領域に対応する2〜3個のヌクレオチドの群を含むことを特徴とする配列を、考慮される動物種の群に属する少なくとも1種類の動物種から得られる成分を含むことの多い試料中におけるその本来の動物種を判定するために使用することに関する。
【００９２】
signature配列と名付けられたこれらの配列は、配列番号235の位置14689-14690-14691のCAA塩基を含むヌクレオチド配列、配列番号236の位置15076-15077のCT塩基を含むヌクレオチド配列、配列番号237の位置15101-15102のCT塩基を含むヌクレオチド配列、配列番号238の位置14886-14887のGC塩基を含むヌクレオチド配列、および配列番号239の位置14713-14726のATA塩基を含むヌクレオチド配列を含む群から選択される。
【００９３】
本発明は、より特定すれば、配列番号262〜271のうちの1つに含まれ、考慮される群のすべての種について保存された領域に対応する1個のヌクレオチドを含むことを特徴とする、上に定義されるヌクレオチド配列に関する。
【００９４】
本発明はまた、上に定義される配列の使用、すなわち、配列番号262〜271のうちの1つに含まれ、考慮される群のすべての種について保存された領域に対応する1個のヌクレオチドを含むことを特徴とする配列を、考慮される動物種の群に属する少なくとも1種類の動物種から得られる成分を含むことの多い試料中におけるその本来の動物種を判定するために使用することに関する。
【００９５】
signature配列と名付けられたこれらの配列は、配列番号262の位置14641のT塩基を含むヌクレオチド配列、配列番号263の位置14778のA塩基を含むヌクレオチド配列、配列番号264の位置15043のC塩基を含むヌクレオチド配列、配列番号265の位置15076のC塩基を含むヌクレオチド配列、配列番号266の位置15101のC塩基を含むヌクレオチド配列、配列番号267の位置15109のA塩基を含むヌクレオチド配列、配列番号268の位置15115のC塩基を含むヌクレオチド配列、配列番号269の位置15239のC塩基を含むヌクレオチド配列、配列番号270の位置14519のT塩基を含むヌクレオチド配列、および配列番号271の位置14717のT塩基を含むヌクレオチド配列を含む群から選択される。
【００９６】
本発明はまた、配列番号235〜239および262〜271からなる群から選ばれるヌクレオチド配列が結合した、分割されていてもいなくてもよい固体支持体を含む、少なくとも1種の本来の動物種を判定するための物質に関する。
【００９７】
本発明はまた、考慮される本来の動物種の群に属する少なくとも1種類の種から得られる成分を含むことの多い試料中におけるその動物種の前記群を判定する方法であって、
a)前記試料から得られる核酸画分を用意すること、
b)上に定義された配列を含む少なくとも1つの物質を用意すること、
c)核酸画分と前記物質を接触させること、および
d)配列番号235の位置14689-14690-14691のCAA塩基を含むヌクレオチド配列、配列番号236の位置15076-15077のCT塩基を含むヌクレオチド配列、配列番号237の位置15101-15102のCT塩基を含むヌクレオチド配列、配列番号238の位置14886-14887のGCの塩基を含むヌクレオチド配列、および配列番号239の位置14713-14726のATAまたはATGを含むヌクレオチド配列、配列番号262の位置14641のT塩基を含むヌクレオチド配列、配列番号の位置263の位置14778のA塩基を含むヌクレオチド配列、配列番号264の位置15043のC塩基を含むヌクレオチド配列、配列番号265の位置15076のC塩基を含むヌクレオチド配列、配列番号266の位置15101のC塩基を含むヌクレオチド配列、配列番号267の位置15109のA塩基を含むヌクレオチド配列、配列番号268の位置15115のC塩基を含むヌクレオチド配列、配列番号269の位置15239のC塩基を含むヌクレオチド配列、配列番号270の位置14519のT塩基を含むヌクレオチド配列、および配列番号271の位置14717のT塩基を含むヌクレオチド配列からなる群から選ばれるsignature配列のうちの1つの存在によってもたらされる何らかのシグナルまたは情報項目であって、前記試料中における本来の動物種のクラスまたは本来の動物種の群の存在が検出によって判定されることを特徴とする方法に関する。
【００９８】
識別配列もPCR識別法において特異的プライマーとして使用することができる。これは、アッセイされる媒体中に存在することの多い他の種の存在下で、動物種に特異的なヌクレオチド配列から選ばれるいくつかのプライマーを混合することによるもので、前記プライマーの少なくとも1つは、配列番号1〜232および242〜261の配列、ならびに前記配列のうちの任意の1つに含まれる少なくとも5個の連続するモノマーを含み、前記配列と少なくとも70%の同一性を示す任意の配列からなる群から選ばれる。
【００９９】
本発明はまた、配列番号240から241および配列番号272〜276からなる群から選ばれるヌクレオチド配列、およびユニバーサル増幅プライマー(すなわち、混合物中で種を検出するのに用いることができ、様々な種に関して十分に感度があって、(より大きな割合で存在することの多い別の種について感度が大きすぎるため)非常に小さな割合で含まれるある種についてマスキングによる誤った結果が生じるのを回避することができるプライマー)としてのそれらの使用に関する。これらのプライマーは、好ましくは次のペア：配列番号240と配列番号241、配列番号272と配列番号273、および配列番号274と配列番号275から選ばれるペアとして使用される。
【０１００】
これらのプライマーは、特に、試料が、脊椎動物の群に属する種に由来する生物材料を含むまたは含むことが推測される場合に、上に記載された方法の増幅ステップを行うために使用される。
【０１０１】
以下の例は説明のためのものであり、本発明を限定する性質のものではない。これらにより、本発明をより完全に理解することが可能になるであろう。
【実施例１】
【０１０２】
試料(表1)中の動物種の検出
a)試料の調製
この例ではいくつかの動物種(哺乳動物、鳥類、魚類)に由来する試料を使用した。試料はいくつかのカテゴリーに分類することができた:
-  リファレンス試料(表1中「ref」として表示):
-  様々な動物種からのリファレンスDNA:哺乳類DNA(牛、山羊、羊、豚、兎、野兎、トナカイ)、鳥DNA(ダチョウ、鶏、七面鳥、ガチョウ)、魚DNA(タラ、キハダマグロ、鰹、メルルーサ、サワラ(Spanish mackerel)、タイセイヨウヤイト(little tunny)、ニジマス、マス、カワマス(brook trout));
-  実験室で従来のプロトコルにより得た組織試料:山羊、ネコからの口内試料;マウス;
-  食物試料、その原料の正確な構成および起源が知られているもの:仔牛のブランケット(blanquette of veal)、ブフ-ブルギニヨン(ブルゴーニュ風牛肉の煮込み)、仔牛舌のソース煮込み、仔羊の骨付き大切り肉、豚の骨付き大切り肉、鶏の腿肉;
-  大量販売品から得た市販品試料(表1中「comm」として表示)、牛肉に基づくもの(仔牛、肝臓、ビーフステーキ、仔牛肉チョップ、牛挽肉、仔牛の骨付き大切り肉、パルマンティエ(Parmentier)、ボロネーズ( Bolognaise))、豚肉に基づくもの(ハム、ソーセージ、ソーセージ類、チャイニーズポーク)、鳥肉に基づくもの(ダチョウステーキ、ローストチキン、ホロホロ鳥のロースト、七面鳥腿肉、ガチョウのロースト)または魚に基づくもの(ヨーロッパウナギ、塩漬けタラの切り身、ツナ缶、カツオの缶詰、大西洋サケの切り身、サバ、ニジマス、アルプスイワナ(arctic char))。
【０１０３】
すべての試料には番号(E1からE57)を付け、この番号は発明を例証する5つの実施例において同じものとした。
【０１０４】
各試料はbaglight(登録商標)バッグ(Intersciences)に入れ、次いで、BagMixer(登録商標)型ミキサー(Intersciences)で均質化するまで混合する。
【０１０５】
b)試料25mgの溶解および全DNAの精製
試料を溶解し、Dneasy(商標)組織キット(Qiagen、参照番号69504)を使用し、Qiagenによって推奨されたプロトコルを適用し、動物組織から核酸を取り出して核酸を精製する。
【０１０６】
c)PCR
PCRは、Applied Biosystems製Ampli Taq goldキットを使用し以下のプロトコルにより行う。合計2ul のDNA懸濁液に下記のもの:10×goldバッファー、3.5 mM MgCl2、100uM dNTPs(デオキシリボヌクレオシド三リン酸)、2U Taq goldポリメラーゼおよびBartlett et al.(1992)に記載されている(Biotechniques Vol.12 No.3 pp.408-412)euvertebrateプライマー0.4uM:
配列番号233:5'CCATCCAACA TCTCAGCATG ATGAAA3'(配列CDL)、
配列番号234:5'GAAATTAATA CGACTCACTA TAGGGAGACC ACACCCCTCA GAATGATATT TGTCCTCA、3'(配列CBHT7、下線:T7ポリメラーゼプロモーター)を加え、最終反応体積50ulを得る。
【０１０７】
PCRの最初のサイクル(10分)は95℃で行い、次いで各々以下の3ステップ:94℃45秒、50℃45秒、72℃2分間からなる35サイクルを続ける。次いで、5分間の最後の伸張反応を72℃で行う。
【０１０８】
d)増幅の確認
増幅を確認するために、増幅産物(またはアンプリコン)5ulを、EDTA-Trisホウ酸塩バッファー中の1.5%アガロースゲル上にロードする。100ボルト20分で移動させた後、増幅バンドをエチジウムブロマイドで染色し、紫外線照射することにより可視化する。予想されるサイズ(350塩基対)を有するバンドの存在によって示されるように、増幅は陽性である。
【０１０９】
e)DNAチップ(Affymetrix、Santa Clara)上のアンプリコンの識別
米国特許第5,744,305号(Affymetrix(Fodor et al.))に記載される方法により、ガラス製固体支持体上にバイオチップを合成する。なお、WO 95/11995(Affymax(Chee et al.))に記載された再シークエンス方法を使用し、A.Troesch et al.(J.Clin.Microbiol.、37(1):49-55、1999)によって記載された方法に従う。
【０１１０】
各識別配列は17塩基を含み、配列の3'端に対して10番目の位置にインテロゲーションポジション(interrogation position)を有する。
【０１１１】
分析は、GeneArray(登録商標)reader、GeneChip(登録商標)fluid stationおよびGeneChip(登録商標)analytical softwareを含むGeneChip(登録商標)complete system(参照番号900228、Affymetrix、Santa Clara、カリフォルニア州)で行う。
【０１１２】
e.1.転写およびアンプリコンへの標識付与
アンチセンスプライマーCBHT7により、増幅産物はすべて、T7 RNAポリメラーゼのためのプロモーターを有する。次いで、これらのアンプリコンは、蛍光性のリボヌクレオチドが組込まれる転写反応のためのマトリックスとして働く。
【０１１３】
陽性増幅産物50ulから一定分量2ulを得て、Megascript T7キット(Ambion、参照番号1334)およびfluorescein-12-UTP(Roche、参照番号1427857)成分を含む転写混合物に加える。最終反応混合物は20ulに調製され、転写反応は37℃で2時間行う。
【０１１４】
e.2.標識された転写物の断片化
ハイブリダイゼーション条件を改善するために、標識された転写物を、およそ20ヌクレオチドの断片に断片化する。このために、標識された転写物20ulに、65℃で30分間30mMイミダゾール(Sigma)および30mM塩化マンガン(Merck)を作用させる。
【０１１５】
e.3.DNAチップ上でのハイブリダイゼーション
標識され断片化された転写物20ulから一定量7ulを得て、ハイブリダイゼーションバッファー(6X SSPE(Eurobio))700ul、5mM DTAB(シグマ)、3Mベタイン(Acros)、0.01%脱泡剤(参照番号A80082、Sigma)およびニシン精液DNA(Gibco)250ug/mlに加える。この混合物を下記の条件下:40℃で30分、チップ上でハイブリダイズする。洗浄後、チップを走査し、次いで、得られたハイブリダイゼーションイメージをGeneChip(登録商標)ソフトウェア(Affymetrix、Santa Clara、カリフォルニア州)を使用して分析する。
【０１１６】
ハイブリダイゼーションスポットは、アンプリコン配列の再構成を可能にするので、次いで、これをチップのリファレンス配列と比較する。
【０１１７】
アンプリコンの配列と最良の相同性パーセンテージ(「ベースコール」とも呼び、%として表わす)を示す配列(したがってそれに相当する種)を、識別のために選択する。
【０１１８】
e.4.結果の解釈
350塩基の配列の一部のみを各々の種に対して分析する。それは、識別プローブのすべてまたはいくらかに相当する。解釈閾値(つまり識別レベル)は、signature配列上90%のベースコールに設定する。この閾値を下回る場合、標的(したがって、対応する種)は、識別されたとみなさない。
【０１１９】
f)結果
食物試料から抽出されたDNAは、増幅産物を、次いでチップ上の識別を生じさせる。表1に示すように、リファレンス試料は、この方法によって正確に分析され、さらに、それは市販試料における動物種(哺乳動物、鳥類、魚類)の検出を可能にする。
【０１２０】
【表１Ａ】
2005514037.tif 000002
【表１Ｂ】
2005514037.tif 000003
【実施例２】
【０１２１】
試料(表2)中の数種類の動物種の検出
試料の準備、試料の溶解および全DNAの精製、PCR、増幅の確認、およびDNAチップ(Affymetrix、Santa Clara)上でのアンプリコンの識別に関する実験条件は、実施例1に記載するのと同一である。
【０１２２】
この例においては、同じ試料から数種類の動物種を同時に分析する。分析は:
2種の異なる動物種由来のDNAの混合物であって2種各々の割合を変えたもの、
アンプリコンの混合物(実施例1のプロトコルによって得られた)であって2種各々の割合を変えたもの;   
からなるリファレンス試料(実施例1同様「ref」として表示): 
同じ試料に数種類の動物種を含む大量販売品に由来する市販品試料(実施例1同様「comm」として表示)；
に対して行う。
【０１２３】
表2に示すように、これらの結果は、試料が、DNAの混合物、アンプリコンの混合物またはいくつかの種を含む市販品試料から構成されるものであっても、同じ試料において種の混合物を同時に検出できることを示す。
【０１２４】
【表２】
2005514037.tif 000004
【０１２５】
【表３】
2005514037.tif 000005
【実施例３】
【０１２６】
動物飼料用飼料中での1種または複数の動物種の検出
a)試料の調製
試料の調製に関する実験条件は、実施例1に記載するのと同様である。試料は動物飼料用飼料に由来する。これらの試料(F1からF17まで番号を付した)は、Michard(Revue de 1'Alimentation animale [Review of animal feed]、vol.508、pp.43-48、1997;標準法)に記載される骨断片存在分析後に、4つのカテゴリーに予備的に区分した。
【０１２７】
この時点で、骨断片数が20未満である場合、「陰性」試料とし、20個を越える骨断片が存在するが試料中の骨の割合が0.01%未満である場合、「痕跡量」とし、試料中の骨の割合が0.01%と1%の間にある場合、「監視必要」とし、割合が1%より大きな場合、「陽性」試料として区別する。
【０１２８】
b)試料の溶解および全DNAの精製
試料を溶解し核酸を精製するため、実施例1に記載するように、飼料25mgとともに、Dneasy(商標)組織キット(Qiagen、参照番号69504)を使用する。この方法はPCR阻害物質を除去するために用いる。具体的には、これらの阻害物質(ポリフェノール、陽イオン(Ca2+、Fe 3+)、微量な重金属、タンニン、炭水化物、塩類(NaCl、亜硝酸塩)は、植物中に相当な量で含まれており、その結果、動物飼料用飼料に存在することとなる。この適用は以下のとおりである:
1-  ATLバッファーおよびプロテイナーゼKによる溶解後、DNA精製ステップでchelexを添加する(InstaGene(商標)Matrix(BIO-RAD、参照番号732-6030)200ul)。
2-  56℃で30分インキュベートした後、遠心分離(5分;14 000rpm)を行い、Qiagen Dneasy(商標)組織キットマニュアルに記載されるようにして、抽出を行う。
【０１２９】
c)PCR
PCRは、Applied Biosystems製Ampli Taq goldキットを使用して行う。飼料から抽出したトータルDNAの懸濁液10ulに下記のもの:10×goldバッファー、3.5 mM MgCl2、100uM dNTPs(デオキシリボヌクレオシド三リン酸)、2U Taq goldポリメラーゼおよび0.4uMの実施例1で規定したeuvertebrateプライマーCBL およびCBHT7を加え、最終反応体積50ulを得る。PCRの最初のサイクル(10分)は95℃で行い、次いで各々以下の3ステップ:94℃45秒、50℃45秒、72℃2分間からなる35サイクルを続ける。次いで、5分間の最後の伸張反応を72℃で行う。
【０１３０】
d)増幅の確認
実施例1に記載するように、増幅を確認する。
【０１３１】
e)DNAチップ(Affymetrix、Santa Clara)上でのアンプリコンの識別。
実施例1に記載するようにして、この識別ステップを行う。
【０１３２】
f)結果
得られた結果を、先行技術における従来のプロトコルによって得られた結果と比較して表3中に示す。2つの方法間では完全な一致が見られるが、本発明の場合、さらに種の識別がなされている。本発明は、動物飼料用飼料試料中の1種または複数の動物種の存在を検出可能にする。
【０１３３】
【表４】
2005514037.tif 000006
【実施例４】
【０１３４】
試料(表4)に含まれる種のクラスの検出
この例の目的は、食物試料中または動物飼料用飼料試料中に含まれる成分の本来の動物の脊椎動物のクラス(哺乳動物、鳥類、魚類など)の検出方法を得ることである。
a)試料の調製、b)試料の溶解および全DNAの精製、c)PCR、d)増幅の確認、およびe)DNAチップ(Affymetrix、Santa Clara)上でのアンプリコンの識別に関する実験条件は、実施例1および3に記載するのと同様である。
【０１３５】
哺乳動物および/または魚類および/または鳥類の存在の識別は、各クラスに特異的なsignatureの存在によって判定する。
【０１３６】
例えば、哺乳動物の存在の検出のためには、配列番号235であるGACACAACAA CAGC(位置14685-14698(genbank ウシ(Bos taurus)リファレンス配列;受託番号V00654))に対応するsignature配列M1を使用することになろう。位置14689-14690-14691(genbank ウシ(Bos taurus)リファレンス配列;受託番号V00654)のCAA塩基は、調査が望まれる群を構成する所定の種(この場合、哺乳動物)に対応するすべての核酸材料について保存されている。選ばれた哺乳動物群の核酸材料を構成するすべての配列では、たった5個の変異した部位しか、前記signatureの残りの部分で観察されない。前記の位置におけるこれらの3個の塩基の存在により、試料中の哺乳動物の存在を判定することが可能になる。
【０１３７】
鳥類の存在の識別は以下のsignatureによって判定される:
配列番号236であるTCCCTAGCCT TCTC(位置15073-15086(ニワトリ(Gallus gallus)リファレンス配列;genbank受託番号))X52392) に対応するO1。このCT塩基(位置15076-15077)は調査が望まれる群を構成する所定の種(この場合、鳥類)に対応するすべての核酸材料について保存されている。選ばれた鳥類の群の核酸材料を構成するすべての配列では、たった5個の変異した部位しか、前記signatureの残りの部分で観察されない。前記の位置におけるこれらの2個の塩基の存在により、試料中の鳥類の存在を判定することが可能になる。
【０１３８】
配列番号237であるACACTTGCCG GAAC(位置15098〜15111(ニワトリ(Gallus gallus)リファレンス配列;genbank受託番号X52392)) O2に対応する。このCTまたはCA塩基(位置15101-15102)は、調査が望まれる群を構成する所定の種(この場合、鳥類)に対応するすべての核酸材料について保存されている。選ばれた鳥類の群の核酸材料を構成するすべての配列では、たった4個の変異した部位しか、前記signatureの残りの部分で観察されない。前記の位置におけるこれらの2個の塩基の存在により、試料中の鳥類の存在を判定することが可能になる。
【０１３９】
哺乳動物および鳥類の存在の識別は署名V1によって判定される。これは、配列番号238に対応するATAGCCACAGCATT(位置14883-14896(genbank ウシ(Bos taurus)リファレンス配列;受託番号V00654))である。このGC塩基(位置14886および14887での)は、調査が望まれる群を構成する所定の種(この場合、鳥類および哺乳動物)に対応するすべての核酸材料について保存されている。4個以下の変異位置が、選ばれた鳥類および哺乳動物の群の核酸材料を構成するすべての配列に対し引用された署名の残りの部分について観察される。このようにして上に示された位置におけるこれらの2個の塩基の存在により、試料中の鳥類および哺乳動物の存在を判定することが可能になる。
【０１４０】
魚類の存在の識別は署名P1によって判定される。これは、配列番号239に対応する、ATAATAACCTCTTT(位置14713〜14726(マダラ(Gadus morhua)リファレンス配列;genbank受託番号X99772))である。このATAまたはATG塩基(位置14716-14717-14718)は、調査が望まれる群を構成する所定の種(この場合、魚類)に対応するすべての核酸材料について保存されている。選ばれた魚類の核酸材料を構成するすべての配列では、たった4個の変異した部位しか、前記signatureの残りの部分で観察されない。前記の位置におけるこれらの3個の塩基の存在により、試料中の魚類の存在を判定することが可能になる。
【０１４１】
表4に示すように、この方法は哺乳動物および/または鳥類および/または魚類の存在を(これらの種が単独で存在しようがまたは混合物として存在しようが)検出することを可能にする。
【０１４２】
【表５】
2005514037.tif 000007
【０１４３】
バリアントは、ヌクレオチドのトリプレットではなく与えられた種の綱を代表する1個のヌクレオチドを選ぶものである。
【０１４４】
例えば、哺乳動物の存在の検出のためには、以下のものが区別なく利用されるであろう:
1/signature配列M2、配列番号262、CTAATCCTACAAATC(位置14634-14648(genbank ウシ(Bos taurus)リファレンス配列;受託番号V00654))に対応するもの。位置14641(genbank ウシ(Bos taurus)リファレンス配列;受託番号V00654)のT塩基は、調査が望まれる群を構成する所定の種(この場合、哺乳動物)に対応するすべての核酸材料について保存されている。選ばれた哺乳動物群の核酸材料を構成するすべての配列では、たった5個の変異した部位しか、前記signatureの残りの部分で観察されない。前記の位置におけるこの塩基の存在により、試料中の哺乳動物の存在を判定することが可能になる。
【０１４５】
2/signature配列M3、配列番号263、AGCTTCAATGTTTTT(位置14771〜14785(genbank ウシ(Bos taurus)リファレンス配列;受託番号V00654))に対応するもの。位置14778(genbank ウシ(Bos taurus)リファレンス配列;受託番号V00654)のA塩基は、調査が望まれる群を構成する所定の種(この場合、哺乳動物)に対応するすべての核酸材料について保存されている。選ばれた哺乳動物群の核酸材料を構成するすべての配列では、たった5個の変異した部位しか、前記signatureの残りの部分で観察されない。前記の位置におけるこの塩基の存在により、試料中の哺乳動物の存在を判定することが可能になる。
【０１４６】
鳥類の存在の検出のためには、以下のものが区別なく利用されるであろう:
1/signature配列O3、配列番号264、CGGCCTACTACTAGC(位置15036〜15050(genbankニワトリ(Gallus gallus)リファレンス配列;受託番号X52392))に対応するもの。位置15043(genbankニワトリ(Gallus gallus)リファレンス配列;受託番号X52392)のC塩基は、調査が望まれる群を構成する所定の種(この場合、鳥類)に対応するすべての核酸材料について保存されている。選ばれた鳥類の群の核酸材料を構成するすべての配列では、たった5個の変異した部位しか、前記signatureの残りの部分で観察されない。前記の位置におけるこの塩基の存在により、試料中の鳥の存在を判定することが可能になる。
【０１４７】
2/signature配列O4、配列番号265、CACATCCCTAGCCTT(位置15069〜15083(genbankニワトリ(Gallus gallus)リファレンス配列;受託番号X52392))に対応するもの。位置15076(genbankニワトリ(Gallus gallus)リファレンス配列;受託番号X52392)のC塩基は、調査が望まれる群を構成する所定の種(この場合、鳥類)に対応するすべての核酸材料について保存されている。選ばれた鳥類の群の核酸材料を構成するすべての配列では、たった5個の変異した部位しか、前記signatureの残りの部分で観察されない。前記の位置におけるこの塩基の存在により、試料中の鳥の存在を判定することが可能になる。
【０１４８】
3/signature配列O5、配列番号266、GCCCACACTTGCCGG(位置15094〜15108(genbankニワトリ(Gallus gallus)リファレンス配列;受託番号X52392))に対応するもの。位置15101(genbankニワトリ(Gallus gallus)リファレンス配列;受託番号X52392)のC塩基は、調査が望まれる群を構成する所定の種(この場合、鳥類)に対応するすべての核酸材料について保存されている。選ばれた鳥類の群の核酸材料を構成するすべての配列では、たった5個の変異した部位しか、前記signatureの残りの部分で観察されない。前記の位置におけるこの塩基の存在により、試料中の鳥の存在を判定することが可能になる。
【０１４９】
4/signature配列O6、配列番号267、TTGCCGGAACGTACA(位置15102〜15116(genbankニワトリ(Gallus gallus)リファレンス配列;受託番号X52392))に対応するもの。位置15109(genbankニワトリ(Gallus gallus)リファレンス配列;受託番号X52392)のA塩基は、調査が望まれる群を構成する所定の種(この場合、鳥類)に対応するすべての核酸材料について保存されている。選ばれた鳥類の群の核酸材料を構成するすべての配列では、たった5個の変異した部位しか、前記signatureの残りの部分で観察されない。前記の位置におけるこの塩基の存在により、試料中の鳥の存在を判定することが可能になる。
【０１５０】
5/signature配列O7、配列番号268、GAACGTACAATACGG(位置15108〜15122(genbankニワトリ(Gallus gallus)リファレンス配列;受託番号X52392))に対応するもの。位置15115(genbankニワトリ(Gallus gallus)リファレンス配列;受託番号X52392)のC塩基は、調査が望まれる群を構成する所定の種(この場合、鳥類)に対応するすべての核酸材料について保存されている。選ばれた鳥類の群の核酸材料を構成するすべての配列では、たった5個の変異した部位しか、前記signatureの残りの部分で観察されない。前記の位置におけるこの塩基の存在により、試料中の鳥の存在を判定することが可能になる。
【０１５１】
6/signature配列O8、配列番号269、TGAAACACAGGAGTA(位置15232〜15246(genbankニワトリ(Gallus gallus)リファレンス配列;受託番号X52392))に対応するもの。位置15239(genbankニワトリ(Gallus gallus)リファレンス配列;受託番号X52392)のC塩基は、調査が望まれる群を構成する所定の種(この場合、鳥類)に対応するすべての核酸材料について保存されている。選ばれた鳥類の群の核酸材料を構成するすべての配列では、たった5個の変異した部位しか、前記signatureの残りの部分で観察されない。前記の位置におけるこの塩基の存在により、試料中の鳥の存在を判定することが可能になる。
【０１５２】
魚類の存在の検出のためには、以下のものが区別なく利用されるであろう:
1/signature配列P2、配列番号270、TCAGACATCGAGACA(位置14512〜14526(genbank マダラ(Gadus morhua)リファレンス配列;受託番号X99772))に対応するもの。位置14519(genbank マダラ(Gadus morhua)リファレンス配列;受託番号X99772)のT塩基は、調査が望まれる群を構成する所定の種(この場合、魚類)に対応するすべての核酸材料について保存されている。選ばれた魚類の群の核酸材料を構成するすべての配列では、たった5個の変異した部位しか、前記signatureの残りの部分で観察されない。前記の位置におけるこの塩基の存在により、試料中の魚の存在を判定することが可能になる。
【０１５３】
2/signature配列P3、配列番号271、GTAATAATAACCTCT(位置14710〜14724(genbank マダラ(Gadus morhua)リファレンス配列;受託番号X99772))に対応するもの。位置14717(genbank マダラ(Gadus morhua)リファレンス配列;受託番号X99772)のT塩基は、調査が望まれる群を構成する所定の種(この場合、魚類)に対応するすべての核酸材料について保存されている。選ばれた魚類の群の核酸材料を構成するすべての配列では、たった5個の変異した部位しか、前記signatureの残りの部分で観察されない。前記の位置におけるこの塩基の存在により、試料中の魚の存在を判定することが可能になる。
【０１５４】
表4bに示すように、この方法は、試料中、特に食物試料の哺乳動物および/または鳥類および/または魚類の存在を検出することを可能にする。
【０１５５】
【表６】
2005514037.tif 000008
【実施例５】
【０１５６】
脊椎動物用のユニバーサルプライマー増幅(表5aおよび5b)
この例において提示される実験の目的は、それらが前の実施例に記載したものよりさらに敏感でプライマーであり、混合物中の種の検出のためのユニバーサルプライマーを得ることである。実際、実施例1〜4で使用したプライマーは、牛の種に関して非常に感度が高く、他の種が非常に小さな割合で存在する場合には時にその存在をマスクしてしまうことがある。
【０１５７】
この例で使用する数ペアのプライマーは以下のものであった:
次の配列を含む第1ペアのプライマー:
配列番号240:5'GACCTCCCAG CCCCATCAAA3'(配列CBL 20)および
配列番号241:5'GAAATTAATA CGACTCACTA TAGGGAGACC ACACAGAATG ATATTTGTCC TCA3'
(配列CBHT7 20、下線はT7ポリメラーゼプロモーターの位置)を、ある種、特に七面鳥または羊の検出閾値を増すために最初に選んだ。これらは、市販品試料中に痕跡量しかない場合、牛の種の存在によってマスクされるおそれがあるからである。
【０１５８】
チップ上の識別を得るために使用した方法は実施例1a、1b、lc、(改変したプライマーによる)1d、1eに記載したようなものである。
【０１５９】
表5aに示すように、これらの新しいプライマーの使用は、七面鳥において、実施例1〜4(検出閾値は約10%であった)のプライマーと比較して、1%のオーダーの検出閾値を得ることを可能にする。また、これらの新しいプライマーの使用は、大量販売品由来の市販品試料において、痕跡量しか存在しない動物種、特に羊(これらは、前記実施例(表5b)で牛の種の存在によってマスクされた)の識別を可能にする。
【０１６０】
【表７】
2005514037.tif 000009
【０１６１】
【表８】
2005514037.tif 000010
【０１６２】
第2に、プライマーの別のセットを選び、実施例1cに記載したペアのプライマーとduplexで用いた。当初缶詰めにした食物中に存在する動物種を検出する場合、検出が望まれるその動物種のDNAの分解の問題が、特に缶詰めにした魚(例えば、ツナ缶)の場合にあるかもしれない。
【０１６３】
チップ上の識別を得るために用いる技術は、ステップ1cを例外とした、実施例1a、1b、1d、1eに記載するのと同様である。(ユニバーサルプライマーに加えて)2個の追加の内部プライマー(それらは2個の小さな部分における350bp領域の増幅を可能にする)を使用する。数ペアのプライマーを検討し、使用するプライマーによって、長さでそれぞれ114〜245bpの2つの領域内の350bpの増幅を可能する。次いで、2ペアのプライマーをそれらの普遍的な性質によって選んだ。
【０１６４】
次の配列を含む第1のペアのプライマー(duplex 1で使用):
配列番号272:5'AGAIGCICCGTTTGCGTG3'(T7ポリメラーゼプロモーターを側面に有する。I=イノシン)、
配列番号273:TTCTTCTTTATCTGTITCTA(I=イノシン)
を、ある魚類の検出の閾値を(特にこれらの魚類が食物缶中に存在する場合に)増加させるために最初に選んだ。
【０１６５】
次の配列を含む第2のペアのプライマー(duplex 2で使用)も選択した:
配列番号274:5'RTCICGRCARATGTG3'(T7ポリメラーゼプロモーターを側面に有する。R=AまたはG、I=イノシン)、
配列番号275:5'GTIAAYTWYGGITGACTIATCCG3'(M=AまたはC、R=AまたはG、Y=CまたはT、W=AまたはT、I=イノシン)。
【０１６６】
実施例1cに記載されるそれに匹敵するやり方で、Applied Biosystems製Ampli Taq goldキット(4311814)を使用してPCRを行う。全DNA懸濁液2ulに、:10×goldバッファー、3.5 mM MgCl2、100uM dNTPs(デオキシリボヌクレオシド三リン酸)、2U Taq goldポリメラーゼおよび実施例1cで提示した脊椎動物普遍プライマーCBL およびCBHT7を0.2uMならびに上に定義されたペアのプライマー(duplex 1およびduplex 2)から選ばれるプライマー0.2uMを加え、最終反応体積50ulを得る。  PCRの最初のサイクル(10分)は95℃で行い、次いで各々以下の3ステップ:94℃45秒、50℃45秒、72℃2分間からなる35サイクルを続ける。次いで、5分間の最後の伸張反応を72℃で行う。
【０１６７】
増幅は、EDTA-Trisホウ酸塩中の1.5%アガロースゲル上に増幅産物(アンプリコン)5ulをロードすることにより確認される。100Vで20分移動させた後、エチジウムブロマイドで染色し紫外線照射することにより2本の増幅バンドが可視化される。
【０１６８】
各二重鎖を使用して得られた結果を、実施例1cに記載されるユニバーサルプライマーのみを使用して「従来の」増幅によって得られる結果と比較して表5c中に示す。
【０１６９】
【表９】
2005514037.tif 000011
【０１７０】
魚、特に食物缶詰中での存在の検出が望まれる場合、2本鎖の1および2で使用するプライマーがよりよい結果およびより良い感度を与えることは明らかである。
【０１７１】
各プライマーは、T7プロモーターとともに、またはこのプロモーターなしで使用できることはまったく明白である。
【配列表】
2005514037000001.app
【国際調査報告】
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