(57)【要約】本発明は、ウイルス感染の処置を目的とした、ピコルナウイルス科、カリチウイルス科、トガウイルス科またはフラビノウイルス科のウイルス増殖の阻害において使用する、アンチセンス抗ウイルス化合物および方法を提供する。これらのアンチセンス抗ウイルス化合物は、実質的に無電荷のオリゴマーであり、ウイルスゲノムの第１のオープンリーディングフレームのＡＵＧ開始部位をまたぐウイルス標的配列に実質的に相補的な標的化塩基配列を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピコルナウイルス科、カリチウイルス科、トガウイルス科またはフラビノウイルス科由来のＲＮＡウイルスに対する抗ウイルス化合物であって、該ウイルスは、一本鎖の１２ｋｂ未満のポジティブセンスゲノム、および多機能タンパク質を含むポリタンパク質をコードする第１のオープンリーディングフレームを有し、該化合物は、以下；
（ａ）１２〜４０のモルホリノサブユニットの配列であって、該配列は、該第１オープンリーディングフレームの翻訳開始領域をまたぐウイルス標的配列に実質的に相補的な標的化塩基配列を支持する、配列；および
（ｂ）実質的に無電荷の骨格、を有するモルホリノオリゴマーを含む、化合物。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物であって、前記サブユニットが、無電荷のリンを含有するサブユニット間結合によって接続され、１つのサブユニットのモルホリノ窒素を隣接するサブユニットの５’環外炭素に結合する、化合物。
【請求項３】
前記サブユニット間結合が、ホスホロジアミデート結合である、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
請求項３に記載の化合物であって、前記モルホリノサブユニットが、以下の構造：
【化１】
2005507660.tif 000015
に従って、ホスホロジアミデート結合によって結合され、ここで
Ｙ１はＯであり、ＺはＯであり、Ｐｊは、塩基特異的水素結合によって、ポリヌクレオチドの塩基に結合するのに有効な、プリン塩基対形成部分またはピリミジン塩基対形成部分であり、そしてＸはアルキル、アルコキシ、チオアルコキシ、またはアルキルアミノである、化合物。
【請求項５】
請求項４に記載の化合物であって、ＸはＮＲ２であり、各Ｒは独立して水素またはメチルである、化合物。
【請求項６】
請求項１に記載の化合物であって、前記オリゴマーは、前記ウイルス標的配列への結合に対して約５０℃よりも高いＴｍを有し、そして該化合物が哺乳動物細胞によって能動的に取り込まれる、化合物。
【請求項７】
請求項１に記載の化合物であって、該化合物は、ピコルナウイルスに対し、かつ以下：
（ｉ）Ｍａｈｏｎｅｙ株およびＳａｂｉｎ株のポリオウイルスについては、配列番号１６、
（ｉｉ）Ａ型肝炎ウイルスについては、配列番号１７、
（ｉｉｉ）ライノウイルス１４については、配列番号１８、
（ｉｖ）ライノウイルス１６については、配列番号１９、
（ｖ）ライノウイルス１Ｂについては、配列番号２０、
（ｖｉ）アフトウイルスについては、配列番号２１および２２、ならびに
（ｖｉｉ）コクサッキーウイルスについては、配列番号２３、２４および２５、
からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％相同性を有する標的化配列を有する、化合物。
【請求項８】
ヒトライノウイルス１６に対し、かつ配列番号１８または１９によって示される標的化配列を有する、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
請求項１に記載の化合物であって、該化合物は、カリチウイルスに対し、かつ以下：
（ｉ）血清群Ｐａｎ−１ベシウイルス（ｖｅｓｉｖｉｒｕｓ）については、配列番号２７、２８、および２９、
（ｉｉ）ブタベシウイルスについては、配列番号３０、
（ｉｉｉ）ノーウォークウイルスについては、配列番号３１、ならびに
（ｉｖ）ネコベシウイルスについては、配列番号３２、
からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％相同性を有する標的化配列を有する、化合物。
【請求項１０】
血清型Ｐａｎ−１ベシウイルスに対する請求項９に記載の化合物であって、前記オリゴマーが、ホスホロジアミデート結合モルホリノオリゴマーであり、配列番号２７、２８、および２９からなる群より選択される標的化配列を有する、化合物。
【請求項１１】
ネコベシウイルスに対する請求項９に記載の化合物であって、前記オリゴマーが、ホスホロジアミデート結合モルホリノオリゴマーであり、配列番号３２の標的化配列を有する、化合物。
【請求項１２】
請求項１に記載の化合物であって、該化合物は、Ｅ型肝炎ウイルスに対し、かつ配列番号３３および３４からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％相同性を有する標的化配列を有する、化合物。
【請求項１３】
前記オリゴマーが、配列番号３３および３４からなる群より選択される配列を有するホスホロジアミデート結合モルホリノオリゴマーである、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
請求項１に記載の化合物であって、該化合物は、Ｃ型肝炎フラビウイルスに対し、かつ配列番号３５の配列に対して少なくとも９０％相同性を有する標的化配列を有する、化合物。
【請求項１５】
前記オリゴマーが、配列番号３５の標的化配列を有するホスホロジアミデート結合モルホリノオリゴマーである、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１６】
請求項１に記載の化合物であって、前記オリゴマーが、哺乳動物被験体に投与された数時間後に、該オリゴマーおよび前記ＲＮＡウイルスのウイルスゲノムの相補的部分からなるヘテロ二重鎖形態で、該被験体の血清または尿から回収され得る、化合物。
【請求項１７】
ピコルナウイルス科、カリチウイルス科、トガウイルス科またはフラビノウイルス科由来のＲＮＡウイルスの複製を阻害する方法であって、該ウイルスは、一本鎖の１２ｋｂ未満のポジティブセンスゲノム、および多機能タンパク質を含むポリタンパク質をコードする第１のオープンリーディングフレームを有し、該方法は、該ウイルスをモルホリノオリゴマーに曝露する工程を包含し、該モルホリノオリゴマーは、以下：
（ａ）１２〜４０のモルホリノサブユニットの配列であって、該配列は、該第１オープンリーディングフレームの翻訳開始領域にわたるウイルス標的配列に実質的に相補的な標的化塩基配列を支持する、配列；および
（ｂ）実質的な無電荷の骨格、
を有する、方法。
【請求項１８】
前記オリゴマーが、前記ウイルスに感染した哺乳動物被験体に投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１７に記載の方法であって、前記オリゴマーが、前記投与工程の数時間後に、該オリゴマーおよび前記ウイルスゲノムの相補的部分からなるヘテロ二重鎖形態で、前記被験体の血清または尿から回収され得る、方法。
【請求項２０】
請求項１７に記載の方法であって、前記オリゴマーが、無電荷のリンを含有するサブユニット間結合を有し、１つのサブユニットのモルホリノ窒素を隣接するサブユニットの５’環外炭素に結合する、方法。
【請求項２１】
前記サブユニット間結合が、ホスホロジアミデート結合である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、前記モルホリノサブユニットが、以下の構造：
【化２】
2005507660.tif 000016
に従って、ホスホロジアミデート結合によって結合され、ここで
Ｙ１はＯであり、ＺはＯであり、Ｐｊは、塩基特異的水素結合によって、ポリヌクレオチドの塩基に結合するのに有効な、プリン塩基対形成部分またはピリミジン塩基対形成部分であり、そしてＸはアルキル、アルコキシ、チオアルコキシ、またはアルキルアミノである、方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法であって、ＸはＮＲ２であり、各Ｒは独立して水素またはメチルである、化合物。
【請求項２４】
ピコルナウイルスの複製を阻害するための請求項１７に記載の方法であって、前記標的化配列が、以下：
（ｉ）Ｍａｈｏｎｅｙ株およびＳａｂｉｎ株のポリオウイルスについては、配列番号１６、
（ｉｉ）Ａ型肝炎ウイルスについては、配列番号１７、
（ｉｉｉ）ライノウイルス１４については、配列番号１８、
（ｉｖ）ライノウイルス１６については、配列番号１９、
（ｖ）ライノウイルス１Ｂについては、配列番号２０、
（ｖｉ）アフトウイルスについては、配列番号２１および２２、ならびに
（ｖｉｉ）コクサッキーウイルスについては、配列番号２３、２４および２５、
からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％相同性を有する、方法。
【請求項２５】
ヒトライノウイルス１６の複製を阻害するための請求項２４に記載の方法であって、前記標的化配列が配列番号１８または１９であり、そして前記オリゴマーがホスホロジアミデート結合モルホリノオリゴマーである、方法。
【請求項２６】
カリチウイルスの複製を阻害するための請求項１７に記載の方法であって、前記標的化配列が、以下：
（ｉ）血清群Ｐａｎ−１ベシウイルスについては、配列番号２７、２８、および２９、
（ｉｉ）ブタベシウイルスについては、配列番号３０、
（ｉｉｉ）ノーウォークウイルスについては、配列番号３１、ならびに
（ｉｖ）ネコベシウイルスについては、配列番号３２、
からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％相同性を有する、方法。
【請求項２７】
血清型Ｐａｎ−１ベシウイルスの複製を阻害するための請求項２６に記載の方法であって、前記標的化配列が配列番号２７、２８、および２９からなる群より選択され、そして前記オリゴマーが、ホスホロジアミデート結合モルホリノオリゴマーである、方法。
【請求項２８】
ネコベシウイルスの複製を阻害するための請求項２６に記載の方法であって、前記標的化配列が配列番号３２であり、そして前記オリゴマーがホスホロジアミデート結合モルホリノオリゴマーである、方法。
【請求項２９】
Ｅ型肝炎ウイルスの複製を阻害するための請求項１７に記載の方法であって、前記標的化配列は配列番号３３および３４からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％相同性を有し、そして前記オリゴマーがホスホロジアミデート結合モルホリノオリゴマーである、方法。
【請求項３０】
Ｃ型肝炎フラビウイルスの複製を阻害するための請求項１７に記載の方法であって、該標的化配列は配列番号３５の配列に対して少なくとも９０％相同性を有し、そして前記オリゴマーがホスホロジアミデート結合モルホリノオリゴマーである、方法。
【請求項３１】
請求項１７に記載の方法であって、前記オリゴマーが、前記ウイルス標的配列への結合に対して約５０℃よりも高いＴｍを有し、かつ哺乳動物細胞によって能動的に取り込まれ得る、方法。
【請求項３２】
ピコルナウイルス、カリチウイルス、トガウイルスまたはフラビノウイルスに感染した哺乳動物被験体と、感染ウイルスに対して標的化されたアンチセンスオリゴマーとの間の効果的な相互作用の存在を確認する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該被験体に該オリゴマーを投与する工程であって、該オリゴマーは、１２〜４０のモルホリノサブユニットの配列を有し、該感染ウイルスの第１オープンリーディングフレームの翻訳開始領域をまたぐウイルス標的配列に実質的に相補的な標的化塩基配列を支持する、工程；
（ｂ）該投与工程の後に選択された時間で、該被験体から体液のサンプルを入手する工程；ならびに
（ｃ）該アンチセンスオリゴマーおよび該ウイルス標的配列の相補的部分を含むヌクレアーゼ耐性ヘテロ二重鎖の存在について、該サンプルをアッセイする工程、
を包含する、方法。
【請求項３３】
前記オリゴマーが、無電荷のリンを含有するサブユニット間結合を有し、１つのサブユニットのモルホリノ窒素を、隣接するサブユニットの５’環外炭素に結合する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記結合が、ホスホロジアミデート結合である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記オリゴマーを投与することによって、ピコルナウイルス感染、カリチウイルス感染、トガウイルス感染またはフラビノウイルス感染の処置の有効性を決定するために使用される請求項３２に記載の方法であって、処置期間を通して、前記投与工程、入手工程、およびアッセイ工程が定期的な間隔で実施される、方法。
【請求項３６】
感染したピコルナウイルス、カリチウイルス、トガウイルスまたはフラビノウイルスの科または属を決定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）複数のアンチセンスオリゴマーを提供する工程であって、該オリゴマーの各々は、ピコルナウイルス、カリチウイルス、トガウイルスまたはフラビノウイルスから選択される複数の既知のウイルスのうちウイルス標的配列に実質的に相補的である塩基配列を有する、工程であって、ここで該ウイルス標的配列の各々が、（ｉ）ウイルスの科または属に共通であり、そして（ｉｉ）ヒトには見出されない、工程；
（ｂ）該被験体に複数のオリゴマーのうちの少なくとも１つのオリゴマーを投与する工程；
（ｃ）該投与工程の後に選択された時間で、該被験体から体液のサンプルを入手する工程；
（ｄ）該アンチセンスオリゴマーおよび該ウイルス標的配列の相補的部分を含むヌクレアーゼ耐性ヘテロ二重鎖の存在について、該サンプルをアッセイする工程、ならびに
（ｅ）投与されたアンチセンスオリゴマーおよび該ウイルス標的塩基配列に相補的な部分を含むヘテロ二重鎖の存在または非存在に基づいて、感染ウイルスの科または属を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項３７】
特異的に感染したピコルナウイルス、カリチウイルス、トガウイルスまたはフラビノウイルスを同定するのに使用するための請求項３６に記載の方法であって、該方法はさらに、以下：
第二の複数のアンチセンスオリゴマーを提供する工程であって、該オリゴマーの各々は、工程（ｅ）において同定される科または属由来の複数の既知のウイルスのうちの１つのウイルス標的配列に実質的に相補的である塩基配列を有する工程であって、ここで、該ウイルス標的配列の各々は、（ｉ）該既知のウイルスの１つに特異的であり、そして（ｉｉ）ヒトにおいて見出されない、工程；
（ｂ）該被験体に複数のオリゴマーのうちの少なくとも１つのオリゴマーを投与する工程；
（ｃ）該投与工程の後に選択された時間で、該被験体から体液のサンプルを入手する工程；
（ｄ）該アンチセンスオリゴマーおよび該ウイルス標的配列の相補的部分を含むヌクレアーゼ耐性ヘテロ二重鎖の存在について、該サンプルをアッセイする工程、ならびに
（ｅ）投与されたアンチセンスオリゴマーおよび該ウイルス標的塩基配列の相補的部分を含むヘテロ二重鎖の存在または非存在に基づいて、感染ウイルスの科または属を同定する工程、
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピコルナウイルス感染、カリチウイルス感染、トガウイルス感染またはフラビウイルス感染の処置における使用のためのアンチセンスオリゴマー、このオリゴマーを用いる抗ウイルス処置方法、およびウイルスゲノム標的部位へのアンチセンスオリゴマーの結合をモニタリングする方法に関する。
（参考文献）
【０００２】
【数１】
2005507660.tif 000002
【０００３】
【数２】
2005507660.tif 000003
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
ＲＮＡウイルスは、野生生物、家畜および人間における多くの疾病の原因になる。これらのウイルスは、遺伝学的および抗原性的に多様であり、広い組織向性および広範な病原性潜在能力を示す。大部分の病原性ウイルスのうちいくつか（例えば、カリチウイルス）は、潜伏期間が非常に短い。ウイルスの複製および毒性因子の発現は、初期防御メカニズムを圧倒し得（Ｘｕ、１９９１）、急性および重篤な症状を引き起こし得る。
【０００５】
多くのウイルス感染に対する特異的な処置レジメン（ｒｅｇｉｍｅ）はない。感染は血清型特異的であり得、自然免疫は、しばしば短期間または不在である（Ｍｕｒｒａｙら、１９９８）。血清型が多種多様であるので、これらの毒性ウイルスに対する免疫化は非現実的である。ＲＮＡウイルスの複製プロセスは、有効な遺伝子の修復メカニズムを欠き、ＲＮＡウイルスの複製エラー率の現在評価は、各ゲノム複製が１〜１０エラーを産生することを予期し得る程度であり、従って、多数の改変体を産生する（Ｈｏｌｌａｎ、１９９３）。しばしば、この血清型は干渉効果を示さず、その結果、任意の１つの血清型の感染は、他の感染を防御しない。例えば、カリチウイルスのベシウイルス（ｖｅｓｉｖｉｒｕｓ）属に対するワクチンは、４０を超える異なる中和血清型に対する防御を提供しなければならず（Ｓｍｉｔｈら、１９９８ａ）、カリチウイルス科の他の属に対するワクチンは、同じ制限を有することが予期される。
【０００６】
アンチセンス剤は、ウイルス感染の様々なタイプの処置について提案している。一般に、現在までの明確な提案は、標的とされたウイルスのタイプ、ウイルスゲノム標的、およびアンチセンス化合物に使用されるオリゴヌクレオチド骨格のタイプによって分類され得る。標的とされたウイルスには、水疱性口内炎ウイルス（ＲｏｂｂｉｎｓおよびＬｅｂｌｅｕ、１９９９）、インフルエンザウイルス（Ｍｉｚｕｔａら、１９９９）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＷｕおよびＷｕ、１９９２）、ヒトパピローマウイルス（Ａｌｖａｒｅｚ−Ｓａｌａｓら、１９９９）、単純ヘルペスウイルス（ＡｕｒｅｌｉａｎおよびＳｍｉｔｈ、２０００）、ＨＩＶ（Ｋｕｓｕｎｏｋｉら、Ｗｅｉら、２０００）ならびに口蹄疫ウイルス（Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚら、１９９３）がある。提案されたウイルスゲノム標的としては、サイトメガロウイルスのＩＥ−２遺伝子（Ｇｒｅｅｎら、２０００）、５’非コード領域のステムループ構造（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）、転写開始コドン、Ｃ型肝炎ウイルスの配列をコードするコアタンパク質、および口蹄疫ウイルスの第二の機能的イニシエーターＡＵＧ（Ｈａｎｅｃａｋら、１９９６；Ａｌｔら、１９９５；Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚら、１９９３）が、挙げられる。最終的に、アンチセンス骨格構造の広範な多様性が提案されており、負に荷電したホスホロチオネート（ＰＳＯ）骨格オリゴマー、特にホスホロチオネートオリゴデオキシヌクレオチド（Ｈａｎｅｃａｋら、１９９６；Ａｌｔら、１９９５；Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚら、１９９３）および均一に改変された２’−メトキシエトキシホスホジエステルオリゴヌクレオチド（Ｈａｎｅｃａｋら、１９９６）が挙げられる。
【０００７】
発見および開発は、一般に、細胞培養における抗ウイルス活性の実証を含む。細胞培養における抗ウイルス実験の編集物を以下の表１に提供する。
（表１．インビトロでの抗ウイルスアンチセンスの研究）
【０００８】
【表１】
2005507660.tif 000004
ＨＩＶ、ＨＰＶ、ＣＭＶおよびＨＣＶ（下記の表２）を標的とするアンチセンス治療法について、臨床試験が開始されており、これらの全ての臨床試験では、ホスホロチオネート連結オリゴヌクレオチドが使用されている。示されたように、現在までの臨床試験の実績は、数例の失敗を示しているが、ＣＭＶ感染（ＩＳＩＳ２９２２）に対するアンチセンスは、ＦＤＡによって承認されており、現在まででＦＤＡによって承認された唯一のアンチセンス剤である。
（表２．抗ウイルス治療のためのアンチセンスを用いた臨床試験）
【０００９】
【表２】
2005507660.tif 000005
有効な抗ウイルス治療法に対するアンチセンスのアプローチに関する、初期の楽観主義は鈍かった。細胞培養物モデルを使用した実際のアンチセンスストラテジー（例えば、表１のストラテジー）の多くは、臨床試験へとうまく進行しなかった。この進歩の遅れは、丈夫な（ｒｏｂｕｓｔ）細胞培養物モデルの欠如に一部起因する。例えば、培養細胞に感染したＨＩＶの単離物は、一般に、感染した集団に見られるＨＩＶの単離物を反映せず、そして細胞培養物モデルは、感染した複数の細胞型の役割を統合しない。この問題は、インビボでのウイルス遺伝子の発現および複製を最大限活用するための適切な前臨床動物モデルの欠如によって、悪化される。さらに、ＨＩＶの場合、ヒトウイルスは動物に感染しないか、または霊長類に感染する場合は、ヒトで見られる病状と類似の病状を発症しないかのいずれかである。丈夫な培養物モデルおよび適切な動物モデルを用いずにアンチセンス抗ウイルス剤を開発することにおけるリスクは、重大である。
【００１０】
従って、いくつかのウイルス科（ピコルナウイルス科、カリチウイルス科、トガウイルス科およびフラビウイルス科における、小さな、一本鎖の、ポジティブセンスＲＮＡウイルスを含む）に有効な抗ウイルス治療のための必要性が依然として残っている。この必要性に対応するため、アンチセンス剤は、ヌクレアーゼ分解に対して十分に安定であり、化合物投与後に、ウイルス感染した宿主細胞によって容易に取り込まれ得、かつ、ウイルスゲノムの有効な領域に対して標的化（すなわち、ウイルスの複製を中断可能である）されなければならない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
１つの局面において、本発明は、ピコルナウイルス科、カリチウイルス科、トガウイルス科またはフラビウイルス科由来のＲＮＡウイルスに対して指向される抗ウイルス性化合物を提供し、このＲＮＡウイルスは、一本鎖の、１２ｋｂより小さなポジティブセンスゲノム、およびポリタンパク質（多機能タンパク質を含む）をコードする第一のオープンリーディングフレームを有する。この抗ウイルス化合物は、以下を有する実質的に無電荷のオリゴマーが挙げられる；（ａ）１２〜４０のサブユニットの配列であり、前述の第一オープンリーディングフレームの翻訳開始領域に及ぶウイルス標的配列に対して実質的に相補的な標的化塩基配列を支持する、配列、および（ｂ）実質的に無電荷の骨格。
【００１２】
好ましい実施形態において、このオリゴマーは、モルホリノオリゴマーであり、配列またはモルホリノサブユニットを有する。このサブユニットは、一般に、無電荷の、リン含有サブユニット間連結（これは、１つのサブユニットのモルホリノ窒素を隣接したサブユニットの５’環外炭素に連結する）によって連結されている。１つの実施形態において、これらの連結は、ホスホロジアミデート連結である。例えば、モルホリノサブユニットおよびホスホロジアミデート連結の１つの実施形態は、以下の構造によって表され得る：
【００１３】
【化３】
2005507660.tif 000006
ここで、Ｙ１はＯであり、ＺはＯであり、Ｐｊは、ポリヌクレオチド中の塩基に対する塩基特異的な水素結合による結合に有効であるプリン塩基対またはピリミジン塩基対部分であり（ここで、異なるサブユニット上の塩基対部分は、同じかまたは異なり得る）、Ｘは、アルキル基、アルコキシ基、チオアルコキシ基、またはアルキルアミノ基である。１つの実施形態において、ＸはＮＲ２であり、ここで各Ｒは、独立して水素またはメチル基である。このような構造ユニットのオリゴマーにおいて、１つのリン原子は次のモルホリノ窒素に結合している。
【００１４】
実質的に無電荷のオリゴマーは、典型的には、約５０℃よりも大きなＴｍ（ウイルス標的配列への結合に関して）および、哺乳動物細胞によって能動的に取り込まれる能力を有する。さらに、この化合物は一般に、オリゴマーおよびＲＮＡウイルスのウイルスゲノムに相補的な部分からなるヘテロ二本鎖の形態で、哺乳動物被験体への投与の数時間後に、この被験体の血清または尿から回収され得る。
【００１５】
種々の実施形態において、抗ウイルス化合物は、特定のウイルスまたは科に対して指向される。例えば、選択された実施形態は、ピコルナウイルスに対して指向される抗ウイルス化合物を含む。例示的な化合物は、以下の（ｉ）〜（ｖｉｉ）からなる群から選択された配列に対して、少なくとも９０％の相同性を有する標的化配列を有する化合物を含む：
（ｉ）Ｍａｈｏｎｅｙ株およびＳａｂｉｎ株のポリオウイルスについて、配列番号１６、
（ｉｉ）Ａ型肝炎ウイルスについて、配列番号１７、
（ｉｉｉ）ライノウイルス１４型について、配列番号１８、
（ｉｖ）ライノウイルス１６型について、配列番号１９、
（ｖ）ライノウイルス１Ｂ型について、配列番号２０、
（ｖｉ）アフトウイルスについて、配列番号２１および２２、ならびに
（ｖｉｉ）コクサッキーウイルスについて、配列番号２３、２４および２５。
【００１６】
他の実施形態は、カリチウイルスに対して指向される抗ウイルス化合物を含む。例示的な化合物は、以下からなる群から選択された配列に対して、少なくとも９０％の相同性を有する標的化配列を有する化合物を含む：
（ｉ）血清型Ｐａｎ−１ベシウイルス（ｖｅｓｉｖｉｒｕｓ）について、配列番号２７、２８および２９、
（ｉｉ）ブタベシウイルスについて、配列番号３０、
（ｉｉｉ）ノーウォークウイルスについて、配列番号３１、ならびに
（ｉｖ）ネコベシウイルスについて、配列番号３２。
【００１７】
他の実施形態は、トガウイルスに対して指向される抗ウイルス化合物を含む。Ｅ型肝炎ウイルスの阻害に使用するため、この化合物は、配列番号３３および配列番号３４からなる群から選択された配列に対して、少なくとも９０％の相同性を有する標的化配列を有するオリゴマーを含む。さらに他の実施形態は、トガウイルスに対して指向される抗ウイルス化合物を含む。Ｃ型肝炎フラビウイルスの阻害に使用するため、この化合物は、配列番号３５に対して、少なくとも９０％の相同性を有する標的化配列を有するオリゴマーを含む。
【００１８】
より具体的な実施形態において、この化合物は、前掲の正確な標的化配列を有し、かつ／またはホスホロジアミデートで連結したモルホリノオリゴマーを含む。例えば、血清型Ｐａｎ−１ベシウイルスに対して指向される化合物は、配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９からなる群から選択された標的化配列を有するホスホロジアミデートで連結したモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）を含み得る。ネコベシウイルスに対して指向される化合物は、標的化配列の配列番号３１を有するＰＭＯを含み得る。
【００１９】
関連する局面において、本発明は、ピコルナウイルス科、カリチウイルス科、トガウイルス科またはフラビウイルス科由来のＲＮＡウイルスの複製を阻害する方法を提供し、ここで、このＲＮＡウイルスは、一本鎖の、１２ｋｂより小さなポジティブセンスゲノム、およびポリタンパク質（多機能タンパク質を含む）をコードする第一オープンリーディングフレームを有する。この方法は、ウイルスまたは代表的にはウイルスに感染している細胞を、実質的に無電荷のモルホリノオリゴマーに暴露する工程を包含し、ここで、このモルホリノオリゴマーは、以下；（ａ）１２〜４０のサブユニットの配列であって、標的化第一オープンリーディングフレームの翻訳開始領域に及ぶウイルスの標的配列と実質的に相補的である塩基配列を支持する配列、および（ｂ）実質的に無電荷の骨格、を有する。この方法の１つの実施形態において、このオリゴマーは、ウイルスに感染した哺乳動物被験体に投与される。このアンチセンス化合物の好ましい実施形態は、特性および構造に関して、前述のとおりである。
【００２０】
さらなる局面において、本発明は、哺乳動物被験体に感染しているピコルナウイルス、カリチウイルス、トガウイルスまたはフラビウイルスと、この感染しているウイルスに対して標的化された実質的に無電荷のアンチセンスオリゴマーとの間の、有効な相互作用の存在を確認する方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）このオリゴマーを被験体へ投与する工程；
（ｂ）前記投与の選択された時間後に、この被験体由来の体液サンプルを獲得する工程；および
（ｃ）このサンプルを、アンチセンスオリゴマーおよびウイルス標的配列に相補的な部分を含む、ヌクレアーゼ耐性ヘテロ二本鎖の存在について、アッセイする工程。
前述のように、このオリゴマーは１２〜４０のサブユニットの配列を有し、この配列は、感染しているウイルスの第一オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ１）の翻訳開始領域に及ぶウイルス標的配列と実質的に相補的な標的化塩基配列を支持している。好ましくは、このオリゴマーは、モルホリノオリゴマーであって、無電荷の、リン含有サブユニット間連結（これは、１つのサブユニットのモルホリノ窒素を隣接したサブユニットの５’環外炭素に結合する）を有する。１つの実施形態において、これらの連結はホスホロジアミデート連結である。
【００２１】
この方法は、前述の投与工程、サンプルを獲得する工程、および処置期間を通じて定期的な間隔でヘテロ二本鎖についてアッセイする工程を実施することによって、オリゴマー投与によるピコルナウイルス感染、カリチウイルス感染、トガウイルス感染またはフラビウイルス感染の処置の有効性を判定するのに用いられ得る。
【００２２】
さらに、この方法は、感染しているピコルナウイルス、カリチウイルス、トガウイルスまたはフラビウイルスの同一性を判定するのに用いられ得る。このようなウイルスの科または属は、以下によって判定され得る：
（ａ）複数のアンチセンスオリゴマーを提供する工程であって、各アンチセンスオリゴマーは、ピコルナウイルス、カリチウイルス、トガウイルスまたはフラビウイルスから選択された複数の既知のウイルスのウイルス標的配列と実質的に相補的な塩基配列を有し、ここで、前記のウイルス標的配列の各々は、（ｉ）ウイルスの科または属に共通であり、そして（ｉｉ）ヒトにおいて見出されない工程；
（ｂ）複数のオリゴマーの少なくとも１つを被験体に投与する工程；
（ｃ）前記投与の後、選択された時間で、被験者由来の体液のサンプルを獲得する工程；
（ｄ）アンチセンスオリゴマーおよびウイルス標的配列の相補的な部分を含む、ヌクレアーゼ耐性へテロ二本鎖の存在について、サンプルをアッセイする工程；ならびに
（ｅ）投与したアンチセンスオリゴマーおよび前記ウイルス標的塩基配列の相補的な部分を含むヘテロ二本鎖の存在または非存在に基づいて、感染しているウイルスの科または属を同定する工程。
【００２３】
特定の感染しているピコルナウイルス、カリチウイルス、トガウイルスまたはフラビウイルスの同定のために、さらに以下の工程が実施され得る：
（ａ）第二の複数のアンチセンスオリゴマーを提供する工程であって、アンチセンスオリゴマーの各々は、前記工程（ｅ）において同定された科または属由来の既知の複数のウイルスのうち１つのウイルス標的配列と実質的に相補的である塩基配列を有し、ここで、前記ウイルス標的配列の各々は、（ｉ）前記既知のウイルスの１つに特異的であり、そして（ｉｉ）ヒトにおいて見出されない、工程；
（ｂ）複数のオリゴマーの少なくとも１つを被験体に投与する工程；
（ｃ）前記投与の選択された時間後に、この被験体由来の体液サンプルを獲得する工程；
（ｄ）このサンプルを、アンチセンスオリゴマーおよびウイルス標的配列に相補的な部分を含む、ヌクレアーゼ耐性ヘテロ二本鎖の存在について、アッセイする工程；ならびに
（ｅ）投与したアンチセンスオリゴマーおよび前記ウイルス標的塩基配列と相補的な部分を含むヘテロ二本鎖の存在または不在に基づいて、感染しているウイルスを同定する工程。
【００２４】
本発明のこれらの目的および特徴ならびに他の目的および特徴は、以下の発明の詳細な説明が、添付の図面と組み合わせて読まれる場合、より十分に理解される。
【００２５】
（発明の詳細な説明）
Ｉ．定義
以下の用語は、本明細書で使用される場合、他に示されない限り、次の意味を有する：
用語「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」とは、単一の５’開始コドンを含み、１以上の個々のタンパク質をコードし、そして終止コドンで終結するヌクレオチド配列を言う。
【００２６】
用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「オリゴマー」は、交換可能に使用され、代表的なポリヌクレオチドに対して水素結合可能な塩基を支持する骨格を有する重合体分子を言い、このポリマー骨格は、この重合体分子と代表的なポリヌクレオチド（例えば、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡ）との間の配列特異的な様式において、このような水素結合を可能にする様式で塩基を提示する。「ポリヌクレオチド」は、プリン塩基またはピリミジン塩基のＮグリコシドまたはＣグリコシドであるヌクレオチドを有するポリマー、ならびに非標準的なヌクレオチド骨格（例えば、ホスホロジアミデートモノホリノ化学反応、ポリアミド連結（例えば、ペプチド核酸またはＰＮＡ）および他の合成の配列特異的な核酸分子を用いて形成された骨格）を含む。
【００２７】
生理学的条件下で、第一の配列を有するポリヌクレオチドが、第二の配列を有するポリヌクレオチドと特異的に結合するか、または特異的にハイブリダイズする場合、第一の配列は、第二の配列に対して「アンチセンス配列」である。
【００２８】
用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」、および「アンチセンスオリゴマー」とは、ウイルスの標的配列である、ポジティブセンスｓｓＲＮＡにハイブリダイズするのに有効な、サブユニット間骨格によって連結した、ヌクレオチド塩基対部分を有するサブユニットの配列を言う。このようなオリゴマーは、代表的には、８〜約４０ヌクレオチドサブユニット長であり、より代表的には、約１２〜４０ヌクレオチドサブユニット長であり、好ましくは、約１２〜３０、または１２〜２５ヌクレオチドサブユニット長である。このオリゴマーは、以下に定義されるように、この標的配列に対して正確な配列相補性または近い相補性を有し得る。このようなアンチセンスオリゴマーは、標的オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によってコードされたポリプロテインの翻訳をブロックまたは阻害し得る。
【００２９】
オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドアナログの「サブユニット」とは、オリゴマーの１ヌクレオチド（または、ヌクレオチドアナログ）単位を言う。この用語は、「荷電したサブユニット」を言う場合、たとえ、この荷電が典型的にサブユニット間連結（例えば、リン連結またはホスホロチオエート連結）内に存在しても、付属したサブユニット間連結を伴うまたは伴わないヌクレオチド単位を言い得る。
【００３０】
「モルホリノオリゴマー」は、図１Ａ〜Ｅに示した形態のモルホリノサブユニット構造からなるオリゴヌクレオチドアナログであり、ここで、（ｉ）この構造は、１〜３原子長のリン含有連鎖によって連結され、この１つのサブユニットのモルホリノ窒素を隣接したサブユニットの５’環外炭素に連結し、（ｉｉ）ＰｉおよびＰｊは、塩基特異的水素結合によって、ポリヌクレオチド中の塩基に結合するのに有効なプリン塩基対部分またはピリミジン塩基対部分である。プリン塩基対部分またはピリミジン塩基対部分は、代表的には、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシルまたはチミンである。モルホリノオリゴマーの合成、構造、および結合特性は、米国特許第５，６９８，６８５号、米国特許第５，２１７，８６６号、米国特許第５，１４２，０４７号、米国特許第５，０３４，５０６号、米国特許第５，１６６，３１５号、米国特許第５，５２１，０６３号、および５，５０６，３３７号に詳述され、これらの全ては、参考文献として本明細書中で援用される。
【００３１】
図１Ｂに示したサブユニットおよび連結は、図２Ｂに示したように（６個の原子が以下を含む場合：モルホリノ窒素、連結したリン原子、リン原子を５’環外炭素に連結する原子（たいてい酸素）、５’環外炭素、および次のモルホリノ環の２個の炭素原子）、６個の原子の繰り返し単位の骨格に使用される。これらの構造において、５’環外モルホリノ炭素をリン群に連結する原子Ｙ１は、硫黄、窒素、炭素、または好ましくは、酸素であり得る。このリン由来のＸ部分ペンダントは、塩基特異的な水素結合を妨害しない、任意の安定な群である。好ましいＸ群は、フルオロ、アルキル、アルコキシ、チオアルコキシ、およびアルキルアミノ（環状アミンを含む）を含み、これらの全ては、塩基特異的結合が破壊されない限りは、多様に置換され得る。アルキル、アルコキシおよびチオアルコキシは、好ましくは１〜６個の炭素原子を含む。アルキルアミノは、好ましくは、より低いアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）置換を言い、環状アミンは、好ましくは、酸素、窒素、および硫黄から選択される１〜２個のさらなるヘテロ原子を必要に応じて含む５〜７員窒素ヘテロ環である。Ｚは、硫黄または酸素であり、好ましくは酸素である。
【００３２】
好ましいモノホリノオリゴマーは、本明細書中でＰＭＯと言われる、ホスホロジアミデート連結モルホリノオリゴマーである。このようなオリゴマーは、図２Ｂに示されるようなモノホリノサブユニット構造から構成され、ここで、Ｘ＝ＮＨ２、ＮＨＲ、またはＮＲ２（ここで、Ｒは低級アルキルであり、好ましくはメチルである）、Ｙ＝Ｏ、およびＺ＝Ｏであり、そして、ＰｉおよびＰｊは、塩基特異的な水素結合によって、ポリヌクレオチド中の塩基に結合するのに有効なプリン塩基対部分もしくはピリミジン塩基対部分である。このような構造も好ましく、図４Ｈにも示される。また、代替のホスホロジアミデート連結を有する構造であり、ここで、図２Ｂにおいて、Ｘは低級アルコキシ（例えば、メトキシもしくはエトキシ）であり、ＹはＮＨもしくはＮＲ（ここで、Ｒは低級アルキル）であり、Ｚ＝Ｏである。
【００３３】
用語「置換した（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）」とは、特に、アルキル基、アルコキシ基、チオアルコキシ基、またはアルキルアミノ基に関して、炭素上の水素原子の、例えばハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、チオール、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、イミノ、オキソ（ケト）、ニトロ、シアノ、あるいは種々の酸またはエステル（例えば、カルボン酸、スルホン酸、またはホスホン酸）のようなヘテロ原子含有置換基との置き換えを言う。また、ヘテロ原子上の水素原子（例えば、アミン水素）と、アルキル、カルボキシルまたは他の炭素含有基との置き換えも言い得る。
【００３４】
２つの一本鎖ポリヌクレオチド間のアンチパラレルな配置においてハイブリダイゼーションが起こる場合、ポリヌクレオチドは、相互に「相補的」と表現される。もし第一ポリヌクレオチドの鎖の一本と第二ポリヌクレオチドの鎖の一本との間にハイブリダイゼーションが起こり得るならば、二本鎖ポリヌクレオチドは、もう１つのポリヌクレオチドと「相補的」であり得る。相補性（１つのポリヌクレオチドがもう１つのポリヌクレオチドと相補的である度合い）は、一般に受容された塩基対法則に従って、相互に水素結合を形成することが予期される対立する鎖中の塩基の割合（すなわち、パーセンテージ）の点から定量化できる。アンチセンスオリゴマーは、標的配列に対して「近い」または「実質的な」相補性を有し得、なお依然として、本発明の目的において機能的である。好ましくは、この使用されたアンチセンスオリゴマーは、本明細書中に指定されたような配列番号１６〜配列番号３５を有する例示的なオリゴマーと比較した場合、１０ヌクレオチドのうち標的配列に対して多くとも１つのミスマッチを有し、好ましくは、２０ヌクレオチドのうち標的配列に対して多くとも１つのミスマッチを有する。あるいは、この使用されたアンチセンスオリゴマーは、本明細書中に指定されたような配列番号１６〜配列番号３５を有する例示的なオリゴマーと、少なくとも９０％の配列相同性を有し、好ましくは、少なくとも９５％の配列相同性を有する。
【００３５】
もし、生理学的条件下（Ｔｍは実質的に３７℃より大きく、好ましくは少なくとも５０℃であり、典型的には６０℃〜８０℃またはそれより上）で、オリゴマーが標的にハイブリダイズするならば、このオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴマーは、この標的ポリヌクレオチドに「特異的にハイブリダイズする」。このようなハイブリダイゼーションは、好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に対応する。所定のイオン強度およびｐＨで、このＴｍは、５０％の標的配列が相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズする温度である。さらに、このようなハイブリダイゼーションは、アンチセンスオリゴマーの標的配列に対する、「近い」または「実質的な」相補性、および正確な相補性で起こり得る。
【００３６】
「ヌクレアーゼ耐性」オリゴマー分子（オリゴマー）とは、非ハイブリダイズ型またはハイブリダイズ型において、その骨格が、ヌクレアーゼ切断（体内の通常の細胞外ヌクレアーゼおよび細胞内ヌクレアーゼによる）に対して、実質的に耐性であることを言う。つまり、オリゴマーが暴露される体内の正常なヌクレアーゼ条件下において、このオリゴマーは、ヌクレアーゼ切断をほとんどまたは全く示さない。
【００３７】
「ヘテロ二重鎖」とは、アンチセンスオリゴマーと標的ＲＮＡの相補的部分との間の二重鎖を言う。「ヌクレアーゼ耐性ヘテロ二重鎖」とは、その相補的標的に対するアンチセンスオリゴマーの結合によって形成された二重鎖を言い、その結果、このヘテロ二重鎖は、細胞内ヌクレアーゼおよび細胞外ヌクレアーゼ（例えば、二本鎖ＲＮＡ／ＲＮＡ複合体または二本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡ複合体を切断可能である、ＲＮＡｓｅＨ）によるインビボの分解に対して、実質的に耐性である。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、用語「標的」とは、ウイルスゲノムＲＮＡまたはｍＲＮＡに関連し、１以上の型の哺乳動物細胞において、一本鎖で発現されるまたは存在するｍＲＮＡまたはウイルスゲノムＲＮＡを言う。
【００３９】
「標的ＲＮＡに関する塩基特異的な細胞内結合事象」とは、細胞内部の標的ＲＮＡ配列に対するオリゴマーの特異的な結合を言う。このような結合の塩基特異性は、配列特異的である。例えば、一本鎖ポリヌクレオチドは、配列中で相補的な一本鎖ポリヌクレオチドに特異的に結合し得る。
【００４０】
「アンチセンスオリゴマー組成物」とは、本発明のＲＮＡ検出法に用いるための１以上のアンチセンスオリゴマーを含む組成物を言う。いくつかの場合には、このような「アンチセンスオリゴマー組成物」は、複数のアンチセンスオリゴマーを含む。
【００４１】
感染しているｓｓＲＮＡウイルスに対して標的化された、アンチセンスオリゴマーの「有効量」は、感染しているウイルスの複製の速度、および／またはウイルスの負荷、および／またはウイルス感染に関連する症状を低減するのに有効な量である。
【００４２】
本明細書で使用される場合、用語「体液」とは、尿、唾液、血漿、血液、髄液、または生物学的起源の他のサンプル（例えば、皮膚細胞もしくは真皮性細片）を含む、被験体から得られた種々のサンプル型を含み、細胞もしくはその中に懸濁された細胞フラグメント、または液体培地およびその溶質を言い得る。
【００４３】
用語「相対量」とは、試験測定とコントロール測定の間に比較がなされる場合に用いられる。反応中に複合体を形成する試薬の相対量は、コントロール試料と反応する量と比較して、試験試料と反応する量である。コントロール試料は、同じアッセイにおいて別々に実施され得るか、または、同じサンプルの一部（例えば、組織切片中の悪性の領域を取り囲む正常組織）であり得る。
【００４４】
個体または細胞の「処置」は、個体または細胞の自然の経過を変えるための手段として提供された任意の型の処置（ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ）である。処置は、例えば、薬学的組成物の投与を含むが、これらに限定されず、予防的に、または病理学的な事象の開始後もしくは病因学的な薬剤との接触の開始後のいずれかに実施され得る。関連する用語「改善された治療の結果」とは、特定のウイルスに感染したと診断された患者に関し、ウイルスの増殖、またはウイルスの負荷、または特定のウイルスによる感染に関連する検出可能な症状の、緩徐化もしくは減少を言う。
【００４５】
薬剤が、受動拡散以外の機構によって細胞膜を通過して細胞に入り得る場合、その薬剤は「哺乳動物細胞に能動的に取り込まれた」と言う。薬剤は、例えば、「能動輸送」によって輸送され得、これは、例えばＡＴＰ依存性の輸送機構によって哺乳動物細胞膜を横断する薬剤の輸送を言い、または「促進輸送」によって輸送され得、この輸送は、輸送タンパク質への薬剤の結合を必要とし、その後、膜を横断する結合薬剤の通過を促進する輸送機構によって細胞膜を横断する、アンチセンス薬剤の輸送を言う。能動輸送と促進輸送の両方のために、アンチセンス薬剤は、以下に定義されるように、好ましくは実質的に無電荷の骨格を有する。あるいは、このアンチセンス化合物は、複合体形態（例えば、カチオン性脂質またはカチオン性リポソームと複合体化されたアニオン性骨格を有する薬剤のような）で処方され得、エンドサイトーシスの機構によって細胞内に取り込まれ得る。
【００４６】
（ＩＩ．標的化されたウイルス）
本発明は、特定の分類の小さな一本鎖のポジティブセンスＲＮＡウイルスの有効な阻害は、このウイルスに感染した細胞を、以下のアンチセンス化合物に暴露することによって達成され得るという発見に基づく（ｉ）ウイルスの第一オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ１）の開始領域に対して標的化されたアンチセンス化合物、ならびに（ｉｉ）物理的特徴および薬物動態学的特徴を有し、アンチセンス化合物と宿主細胞内のウイルスとの間の有効な相互作用を可能にするアンチセンス化合物。１つの局面において、これらのオリゴマーは、ウイルスに感染した哺乳動物被験体の処置に用いられ得る。
【００４７】
本発明は、以下：（ｉ）一本鎖の、（ｉｉ）正の極性の、（ｉｉｉ）１２ｋｂ未満の、および（ｉｖ）第一オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ１）でポリタンパク質をコードしている、ゲノムを有するＲＮＡウイルスを標的とする。特に、標的化されたウイルス科としては、ピコルナウイルス科、カリチウイルス科、トガウイルス科またはフラビウイルス科が挙げられる。これらの４つの科およびそれらのメンバーの各々の、種々の物理学的特性、形態学的特徴、および生物学的特徴は、例えば、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｒ．Ｂｅｌｓｈｅ編、第二版、Ｍｏｓｂｙ、１９９１に見出され得る。各科の主要な生物学的特徴のいくつかは、以下に要約される。
【００４８】
（Ａ．ピコルナウイルス）
ピコルナウイルスは、ヒトおよび動物の両方に感染し、重篤な麻痺（麻痺性ポリオ）、様相（ａｓｐｅｃｔｉｃ）髄膜炎、肝炎、胸膜痛、皮膚発疹、心筋炎、および感冒（不顕性の感染が一般的である）を引き起こし得る。医学的に重要ないくつかのメンバーには、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ライノウイルス、アフトウイルス（口蹄疫ウイルス）、およびコクサッキーウイルスが挙げられる。
【００４９】
ライノウイルスは、ヒトにおける一般的な感冒の原因として認識される。血清型は、１Ａから１００まで指定されている。伝染は、最初にエアロゾル経路により、そしてそのウイルスは鼻の中で複製する。
【００５０】
全てのポジティブセンスＲＮＡウイルスと同じように、ピコルナウイルスのゲノムＲＮＡは感染性である；すなわち、このゲノムＲＮＡは、宿主の転写事象なしに、直接的にウイルスタンパク質の合成を指向し得る。
【００５１】
（Ｂ．カリチウイルス）
カリチウイルスは、ヒトおよび動物の両方に感染する。この属のベシウイルスは、哺乳動物において上皮の水疱形成を含む疾患症状発現を生じ、動物流産急性発症およびヒト肝炎（非Ａ型〜Ｅ型肝炎）の原因であることが疑われる（Ｓｍｉｔｈら、１９９８ａおよび１９９８ｂ）。カリチウイルスの他の属には、ノーウォーク様ウイルスおよびサッポロ様ウイルス（これらは共にヒトカリチウイルスを構成する）ならびにラゴウイルス（ｌａｇｏｖｉｒｕｓ）（これらはウサギの出血性疾患を引き起こす、特に急激で致死的なウイルスである）が挙げられる。
【００５２】
ヒトカリチウイルスは、成人において世界的に発生するウイルス性下痢の最も一般的な原因であり、そして乳幼児の有意な病原体である（Ｏ’Ｒｙａｎら、１９９２）。少なくとも５つのヒトカリチウイルスの型が存在し、胃腸管中に存在する。ノーウォークウイルスは、広範に行き渡ったヒト因子であり、急性の流行性胃腸炎を引き起こし、ヒトにおける胃腸炎の全発生数の約１０％を引き起こす（Ｍｕｒｒａｙら、１９９８）。
【００５３】
ベシウイルスは、現在、やや不明瞭かつ宿主特異的であるとみなされるものから、公知のウイルス病原体のより汎用性のある群の１つとして認識されるものまでが、出現している。例えば、単一の血清型は、塩水魚（オパールアイ（ｏｐａｌ  ｅｙｅ））、シーライオン、ブタ、およびヒトを含む１６の異なる動物種の多様な群に感染することが示されている。
【００５４】
（Ｃ．トガウイルス）
この科のメンバーは、蚊起源のウイルスを含み、これらはヒトおよび動物の両方に感染する。この科としては、アルファウイルス属、ルビウイルス属（風疹）、ペスチウイルス属（粘膜疾患）、アリテリウイルス属（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｕｓ）（ウマ動脈炎）およびＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）が挙げられる。
【００５５】
ＨＥＶは、１９８７年に最初に記載され、１９９１年にＵ．Ｓ．で初めて報告された。このウイルスは、最初に、小さな、一本鎖ＲＮＡ特性に基づいて、カリチウイルスとして記載された。いくつかのＨＥＶは、依然としてカリチウイルスとして分類されているが、トガウイルス科のメンバーとしても分類されている。感染は、Ａ型肝炎ウイルス感染に酷似しているように見える。この疾患は、急性のウイルス性肝炎であり、初期感染から約２０日後に現れ、そしてこのウイルスは、約２０日間血清中に観察され得る。伝染は、汚染した水を介して起こり、そしてこのウイルスは、地理的に発展途上国に限定される。
（Ｄ．フラビウイルス）
この科のメンバーは、数種の系列のヒト病原体を含み、それらの中には、黄熱病、西ナイル熱、Ｃ型肝炎、日本脳炎、セントルイス脳炎、マリーバレー脳炎、およびデング熱などの蚊起源のウイルスがある。
【００５６】
フラビウイルスビリオンは、直径約４０〜５０ｎｍである。フラビウイルスのヌクレオキャプシドの対称性は、完全には規定されていない。フラビウイルスエンベロープには、１種の糖タンパク質しか含まれないことが知られている。今のところはまだ、フラビウイルスについて、サブゲノムメッセンジャーＲＮＡもポリタンパク質前駆体も検出されていない。
【００５７】
（ＩＩＩ．ウイルス標的領域）
好ましい標的配列は、ウイルスゲノムの第一オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ１）のＡＵＧ開始部位に及ぶ領域である。この第一ＯＲＦは、一般に、ポリメラーゼ、ヘリカーゼおよびプロテアーゼのような非構造タンパク質を含むポリタンパク質をコードする。「ＡＵＧ開始部位に及ぶ」とは、この標的配列が、ＡＵＧ開始部位の一方に少なくとも３塩基と、他方に少なくとも２塩基（合計、少なくとも８塩基）を含むことを意味する。好ましくは、この標的配列は、この開始部位の各々の側に少なくとも４塩基（合計、少なくとも１１塩基）を含む。
【００５８】
より一般的には、好ましい標的部位は、種々のウイルス単離体の間で保存されている標的を含む。他の嗜好される部位には、ＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）、トランス活性化タンパク質結合部位、および複製開始部位、が挙げられる。複数の冗長な遺伝子を提供し得る複雑かつ大きなウイルスゲノムは、ウイルスの侵入をコードしている宿主細胞の遺伝子およびウイルスの存在に対する宿主の応答を標的化することによって、効率的に標的化され得る。
【００５９】
多様なウイルスゲノム配列は、例えば、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋデータベースのような、周知の情報源から入手可能である。あるいは、当業者は、公開された文献中に、多数の目的のウイルスに関する配列を（例えば、指定されたウイルスに関する配列情報を公開している参考文献の検索によって）見出し得る。一旦完全なウイルス配列または部分的なウイルス配列が得られると、ウイルスのＯＲＦ１は同定される。代表的に、ＯＲＦ１は、遺伝子データベースまたは信頼される参考文献中で同定される。あるいは、これらの４つの科に関して下記のように、ウイルスの一般的なゲノム編成によって導かれ得る。ＯＲＦ１のＡＵＧ開始部位はまた、遺伝子データベースまたは信頼される参考文献中で同定され得、または、ＯＲＦ１開始部位であると予想される領域中のＡＵＧコドンについて配列をスキャンすることによって見出され得る。
【００６０】
これらの４つのウイルス科の各々の一般的なゲノム編成は以下に示され、続いて、選択された各々の科内のメンバー（属、種または株）に関して例示的な標的配列が得られる。
【００６１】
（Ａ．ピコルナウイルス）
図３Ａは、ピコルナウイルス（この場合は、ピコルナウイルス科のライノウイルス）のゲノム構造１０を示す。ピコルナウイルスを代表するライノウイルスゲノム１０は、約７．５ｋｂの一本鎖の、ポジティブセンスの、ポリアデニル化されたＲＮＡの単一分子である。図のように、このゲノムは、第一ポリタンパク質の上流に位置する長いＵＴＲ１２を含み、そしてその末端に共有結合的に付着したＶＰｇ（ウイルスゲノム連結）タンパク質を有する単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。このＯＲＦは、２つのセグメント（１４、１６）に細分され、これらの各々はポリタンパク質をコードする。第一のセグメント１４は、ウイルスタンパク質ＶＰ１〜ＶＰ４を形成するために引き続いて分割されるポリタンパク質をコードし、そして第二のセグメント１６は、Ｃｉｓ−ｐｒｏ、プロテアーゼ、およびポリメラーゼを含む、ウイルスタンパク質前駆体であるポリタンパク質をコードする。このＯＲＦは、ポリＡ終結配列１８で終結する。
【００６２】
この最初の標的ＡＵＧ開始部位は、塩基位置６１５〜６４０の間に位置する。この領域を標的化することは、ポリタンパク質セグメント１４、１６の両方の翻訳を阻害するのに有効である。
【００６３】
（Ｂ．カリチウイルス）
図３Ｂは、カリチウイルス（この場合は、カリチウイルス科のベシウイルス）のゲノム２０を示す。このゲノムは、約７．５ｋｂの感染性の、一本鎖の、ポジティブセンスＲＮＡの単一分子である。図のように、ゲノム２０は、修飾されていない第一オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ１）２４の上流のＵＴＲ２２を含む。ゲノム２０の３’末端２６は、ポリアデニル化されている。ゲノム２０は、３つのオープンリーディングフレームを含む。第一のオープンリーディングフレーム２４は、ヘリカーゼ、プロテアーゼ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、および、ウイルスゲノムＲＮＡの５’末端に結合するタンパク質である「ＶＰｇ」を含むウイルス性の非構造タンパク質を形成するために引き続いて分割される、ポリタンパク質をコードする（ＣｌａｒｋｅおよびＬａｍｂｄｅｎ、２０００）。第二のオープンリーディングフレーム２８は、単一のキャプシドタンパク質をコードし、第三のオープンリーディングフレーム２９は、本質的に塩基性であり、おそらくＲＮＡと結合し得る構造タンパク質であることが報告されているものをコードする（Ｇｒｅｅｎら、２０００）。
【００６４】
最初の標的ＡＵＧ開始部位は、塩基位置７〜３５の間に位置する。この領域を標的化することは、第一リーディングフレーム２４の翻訳を阻害するのに有効である。
【００６５】
（Ｃ．トガウイルス）
図３Ｃは、トガウイルス（この場合は、トガウイルス科のルベラウイルス）のゲノム３０の構造を示す。ゲノム３０は、約１１．７ｋｂの一本鎖の、ポジティブセンスＲＮＡの単一線状分子であり、感染性である。その５’末端３２は、７−メチルＧ分子でキャップされ、３’末端３４は、ポリアデニル化されている。全長のメッセンジャーＲＮＡおよびサブゲノムのメッセンジャーＲＮＡが明らかにされており、ポリタンパク質の翻訳後分割は、ＲＮＡ複製の間に起こる。ゲノム３０は、２つのオープンリーディングフレーム３６、３８を含む。第一のオープンリーディングフレーム３６は、引き続いて４つの機能的なタンパク質であるｎｓＰ１〜ｎｓＰ４に分割されるポリタンパク質をコードしている。第二のオープンリーディングフレーム３８は、ウイルスキャプシドタンパク質ならびに３つの他のウイルスタンパク質であるＰＥ２、６ＫおよびＥ１をコードしている。第一オープンリーディングフレーム３６のＡＵＧ開始部位は、塩基位置１０〜４０の間に位置する。この領域を標的化することは、第一オープンリーディングフレーム３６の翻訳を阻害するのに有効である。
【００６６】
（Ｄ．フラビウイルス）
図３Ｄは、フラビウイルス科のＣ型肝炎ウイルスのゲノム４０の構造を示す。Ｃ型肝炎ウイルスゲノムは、約１１ｋｂの一本鎖の、ポジティブセンスＲＮＡの単一線状分子である。その５’末端４２は、ｍ７ＧｐｐＡｍｐ分子でキャップされ、３’末端４４は、ポリアデニル化されていない。ゲノム４０は、１つのオープンリーディングフレーム４６のみを含み、これは、６つの構造的タンパク質および機能的タンパク質に分離し得る前駆体ポリタンパク質をコードする。最初のＡＵＧ開始部位は、塩基位置３１０に位置する。
【００６７】
対応するウイルスゲノムのＯＲＦ１開始部位を含む、例示的なウイルス核酸配列についてのＧｅｎＢａｎｋ照会は、以下の表３に列挙される。これらの配列は、文献リソースまたは特許リソースの利用可能な遺伝子配列データベースから入手可能であり得るので、４つのウイルス科のメンバーのＯＲＦ１開始部位領域中の他の配列の例示にすぎないことが認識される。以下の配列は、配列番号１〜１５として同定され、本発明明細書の終末の表１０に列挙される。
【００６８】
（表３．ＯＲＦ１のＡＵＧ部位に及ぶ例示的なウイルス核酸配列）
【００６９】
【表３】
2005507660.tif 000007
前述のように、この標的化配列、つまり、アンチセンスオリゴマーの塩基配列は、好ましくはウイルス標的配列のＡＵＧに及ぶ部分に対して指向される。特に、標的化配列は、前述のように、ウイルスゲノムの第一オープンリーディングフレームのＡＵＧ開始部位に及ぶ標的領域の部分に対して、相補的であるか、または実質的に相補的であり、そして、標的と標的化配列との間の相補性の程度は、安定な二本鎖を形成するのに十分である。最小の長さの８塩基では、この標的化配列は、ＡＵＧコドンに対して配向されるＣＡＴ配列を含み、そしてこの配列の片側に少なくとも３塩基を、他方側に２塩基を含む。標的ＲＮＡ配列と相補性のあるアンチセンスオリゴマーの領域は、８〜１１塩基程度に短くてもよいが、好ましくは１２〜１５塩基もしくはそれ以上（例えば１２〜２０塩基）、または１２〜２５塩基である。約１５塩基のアンチセンスオリゴマーは、一般に、ウイルスゲノムにおいて特有の相補的配列を有するのに十分長い。さらに、相補的塩基の最小限の長さは、以下に考察されるように、必須の結合Ｔｍに達するのに必要とされ得る。
【００７０】
４０塩基程度の長いオリゴマーが適切であり得、ここで、少なくとも最小数の塩基（例えば、８〜１１塩基、好ましくは１２〜１５塩基）は、この標的配列に相補的である。一般には、しかし、細胞における促進性の取り込みまたは能動的取り込みは、約３０塩基未満、好ましくは２５塩基未満、より好ましくは２０塩基またはより少数の塩基のオリゴマー長に最適化される。ＰＭＯオリゴマーに関して、さらに下記のように、結合安定性および取り込みの最適な平衡は、一般に、１３〜１８塩基長で生じる。
【００７１】
このオリゴマーは、このオリゴマーとウイルスの核酸標的配列との間に形成されたヘテロ二本鎖が、細胞性ヌクレアーゼもしくはインビボで起こり得る他の分解機序の作用に耐える程度に実質的に安定である限りは、ウイルス核酸標的配列に１００％相補的であり得るか、またはミスマッチ（例えば、変異体に適応する）を含み得る。ヌクレアーゼによる切断に感受性の低いオリゴマー骨格は、以下に考察される。ミスマッチは、もし存在するならば、ハイブリッド二本鎖の中央よりも末端領域に向かって、より不安定性が低い。許可されたミスマッチの数は、よく理解された二本鎖安定性の原理に従って、オリゴマーの数、二本鎖中のＧ：Ｃ塩基対のパーセンテージ、および二本鎖中のミスマッチの位置に依存する。このようなアンチセンスオリゴマーは、ウイルス核酸標的配列に１００％相補的である必要は無いが、核酸標的の生物学的活性（例えば、ウイルスタンパク質の発現）が調節されるように、標的配列に安定におよび特異的に結合するのに有効である。
【００７２】
オリゴマーと標的配列との間に形成された二本鎖の安定性は、結合Ｔｍおよび細胞性の酵素切断に対する二本鎖の感受性の関数である。相補的配列のＲＮＡに対するアンチセンス化合物のＴｍは、Ｈａｍｅｓら、  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８５、ｐｐ．１０７−１０８に記載されるような、従来の方法によって測定され得る。各々のアンチセンスオリゴマーは、相補的配列のＲＮＡに対して、体温より高い結合Ｔｍ、好ましくは５０℃より高い結合Ｔｍを有するべきである。６０℃〜８０℃の範囲またはそれより大きいＴｍは好ましい。周知の原理に従って、オリゴマー化合物のＴｍは、相補性に基づくＲＮＡハイブリッドに対して、二本鎖中のＣ：Ｇ塩基対の比率の増大、および／またはヘテロ二本鎖の（塩基対の）長さの増大によって、増大され得る。同時に、結合Ｔｍは、細胞性の取り込みを最適化する目的のために、オリゴマーのサイズを制限するのに有利であり得る。この理由のために、１５塩基またはそれより小さい塩基の長さで、高いＴｍ（５０℃またはそれより高い）を示す化合物は、一般に、高いＴｍ値のために必要な塩基をさらに２０塩基超えることが好ましい。
【００７３】
表４は、ピコルナウイルス科、カリチウイルス科、トガウイルス科、およびフラビウイルス科の選択されたウイルスの第一オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ１）の翻訳開始部位に及ぶ標的領域に対して指向される例示的な標的化配列を列挙する。これらの配列は、前述のとおり、前述の標的配列中のＡＵＧ部位に及ぶ１つまたはそれ以上の配列に対して相補的な配列の構築によって選択した。
この一般的ルールの例外は以下である：配列番号２６はウイルスゲノムの点に指向される；配列番号２３〜２５は、下線によって示されるように、ミスマッチおよび／または挿入を含む；ならびに、配列番号３３はＡＴＧ開始コドンを１つだけ含む。
【００７４】
（表４．ＯＲＦ１翻訳開始領域を標的化する例示的なアンチセンス配列）
【００７５】
【表４】
2005507660.tif 000008
（ＩＶ．アンチセンスオリゴマー）
（Ａ．特性）
先に詳述したように、オリゴマーは、好ましくはＯＲＦ１開始部位に及ぶ、ウイルスゲノムの標的化された部分に対して指向される塩基配列を有する。さらに、感染した宿主細胞（例えば、感染した哺乳動物被験体）に投与する場合、このオリゴマーは、効率的に感染ウイルスを標的にすることが可能である。
【００７６】
後者の必要条件は、オリゴマー化合物が、（ａ）哺乳動物細胞によって能動的に取り込まれる能力を有し、そして（ｂ）一旦取り込まれると、標的ｓｓＲＮＡ配列と約５０℃よりも大きいＴｍで二本鎖を形成する場合に、満たされる。
【００７７】
下記のように、細胞によって取り込まれる能力は、オリゴマーの骨格が実質的に無電荷であることが必要であり、そして好ましくは、オリゴマー構造物が細胞膜を横断する能動輸送または促進輸送の基質として認識されることが必要である。標的ＲＮＡと安定な二本鎖を形成するためのオリゴマーの能力はまた、オリゴマーの骨格、ならびに前記の要因（標的配列に対するアンチセンスの長さおよび相補性の度合い、Ａ：Ｔ塩基対に対するＧ：Ｃ塩基対の比率、ならびに任意のミスマッチな塩基の位置）に依存する。細胞性ヌクレアーゼに耐え得るアンチセンス薬剤の能力は、細胞質までのこの薬剤の残存および最終的な送達を促進する。
【００７８】
以下は、これらの必要条件を満たす能力について、任意の所定の実質的に無電荷の骨格を試験するために開示された方法である。
【００７９】
（Ａ１．細胞による能動的取り込みまたは促進的取り込み）
アンチセンス化合物は、もし遊離形態（非複合型の形態）で投与されるならば、宿主細胞膜を横断する促進的輸送もしくは能動的輸送によって宿主細胞に取り込まれ得、またはもし複合型の形態で投与されるならば、エンドサイトーシスの機構によって宿主細胞に取り込まれ得る。
【００８０】
薬剤が遊離形態で投与される場合、このアンチセンス化合物は、実質的に無電荷（サブユニット間連結の大多数が、生理学的ｐＨにおいて無電荷であることを意味する）であるべきである。本発明を支持して実施された実験は、正味電荷の少数（例えば、１５〜２０マーのオリゴマーに対して１〜２荷電）が、実質的に無電荷の骨格を持つ特定のオリゴマーの細胞性取り込みを実際に亢進し得ることを示す。この電荷は、オリゴマー自身に保有され得（例えば、骨格連結中に）、または末端荷電基付属物であり得る。好ましくは、荷電した連結の数は、４個の無電荷連結に対してわずか１個の荷電連結である。さらに好ましくは、この数は、１０個または２０個の無電荷連結に対してわずか１個の荷電連結である。１つの実施形態において、このオリゴマーは、完全に無電荷である。
【００８１】
オリゴマーはまた、反対の電荷がほぼ同数で存在する限り、負に荷電された骨格連結および正に荷電された骨格連結の両方を含み得る。好ましくは、このオリゴマーは、いずれの電荷でも３〜５より多い連続したサブユニットの連なりを含まない。例えば、オリゴマーは、所定数のアニオン性連結（例えば、ホスホロチオエート結合またはＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート結合）、および匹敵する数のカチオン性連結（例えば、Ｎ，Ｎ−ジエチレンジアミンホスホルアミデートを有し得る（Ｄａｇｌｅ，２０００）。正味電荷は、好ましくは、中性または１オリゴマー当たり多くとも１〜２の正味電荷である。
【００８２】
実質的に荷電されていないか、または全く荷電されていないことに加えて、このアンチセンス剤は、好ましくは、細胞膜を横断するオリゴマーの輸送を促進し得るか、細胞膜を横断するオリゴマーを能動的に輸送し得る膜輸送系（すなわち、膜タンパク質（単数または複数））の基質である。この特徴は、以下のように、オリゴマー相互作用または細胞取り込みについての多数の試験のいずれかによって決定され得る。
【００８３】
第１の試験は、細胞表面上でオリゴマー化合物が置換するか、または選択された荷電オリゴマー（例えば、ホスホロチオエートオリゴマー）によって置換される能力を調べることによって、細胞表面レセプターでの結合を評価する。これらの細胞は、約１０〜３００ｎＭの間の最終濃度で、所定の量の試験オリゴマー（これは、代表的には、蛍光標識される）とインキュベートされる。その直後（例えば、１０〜３０分後）（試験オリゴマーの有意な内部移行が生じ得る前）、置換する化合物が、徐々に増大する濃度で添加される。試験化合物が細胞表面レセプターに結合し得る場合、置換する化合物は、試験化合物を置換することが観察される。置換する化合物が、１０×（試験化合物濃度）以下の濃度で５０％置換を生じることが示された場合、試験化合物は、細胞輸送系について、置換する化合物と同じ認識部位で結合すると考えられる。
【００８４】
第二の試験は、試験化合物が標識レポーター（例えば、蛍光レポーター）を細胞に輸送する能力を調べることによって、細胞輸送を測定する。細胞は、約１０〜３００ｎＭの最終濃度で添加された、標識された試験化合物の存在下でインキュベートされる。３０〜１２０分間のインキュベーション後、細胞は、細胞内標識について、例えば、顕微鏡検査によって、調べられる。有意な細胞内標識の存在は、促進された輸送または能動的な輸送によって試験化合物が輸送されることの証拠である。
【００８５】
アンチセンス化合物はまた、複合体化された形態で投与され得、ここで複合体化剤は、代表的には、アンチセンス化合物における正味電荷とは反対の電荷を有するポリマー（例えば、カチオン性脂質、ポリペプチド、または非生物学的カチオン性ポリマー）である。アニオン性オリゴヌクレオチドとカチオン性脂質または他のポリマー成分との間の複合体（二層複合体を含む）を形成する方法は、周知である。例えば、リポソーム組成物Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）（Ｆｅｌｇｎｅｒら、１９８７）（カチオン性脂質ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド）および中性リン脂質ＤＯＰＥ（ジオレイルホスファチジルエタノールアミン）を含む）が広範に使用される。投与後、複合体は、エンドサイトーシス機構（代表的には、エンドソーム体における粒子カプセル化を包含する）を通じて細胞によって取り込まれる。
【００８６】
あるいは、そして本発明の別の局面に従って、所定の骨格を有するオリゴマーの必要特性が、簡便なインビボ試験によって確認され得る。この簡便なインビボ試験では、標識された化合物を動物に投与し、そしてオリゴマーの投与数時間後に動物から採取した体液サンプルを、標的ＲＮＡとのヘテロ二重鎖の存在についてアッセイする。この方法は、以下のＤ節に詳述する。
【００８７】
Ａ２．ＲＮａｓｅＨに対する実質的な抵抗性
アンチセンスオリゴヌクレオチドによる発現の阻害を説明するために、２つの一般的な機構が提唱されている。（例えば、Ａｇｒａｗａｌら、１９９０；Ｂｏｎｈａｍら、１９９５；およびＢｏｕｄｖｉｌｌａｉｎら、１９９７を参照のこと）。第一には、オリゴヌクレオチドとウイルスＲＮＡとの間で形成されたヘテロ二重鎖が、ＲＮａｓｅＨの基質として作用し、ウイルスＲＮＡの開裂に至る。このクラスに属する、または属すると提唱されているオリゴヌクレオチドとしては、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、およびホスホジエステル（未改変の「天然の」オリゴヌクレオチド）が挙げられる。しかし、このような化合物は、オリゴマー：ＲＮＡ二重鎖構造中のウイルスＲＮＡをＲＮａｓｅＨによるタンパク質分解、および従って二重鎖の損失に曝露するので、それらは、本発明における使用のために最適に及ばない。
【００８８】
オリゴヌクレオチドアナログの第二のクラス（「立体遮断剤（ｓｔｅｒｉｃ  ｂｌｏｃｋｅｒ）」と呼ばれ、または別に「ＲＮａｓｅＨ不活性」または「ＲＮａｓｅＨ抵抗性」と呼ばれる）は、ＲＮａｓｅＨの基質として作用することが観察されておらず、標的ＲＮＡ核原形質輸送、スプライシング、または翻訳を立体的に遮断することにより作用すると考えられている。このクラスとしては、メチルホスホネート（Ｔｏｕｌｍｅら、１９９６）、モルホリノオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、特定の２’−Ｏ−アリルまたは２’−Ｏ−アルキル改変オリゴヌクレオチド（Ｂｏｎｈａｍ，１９９５）、およびＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート（Ｇｅｅ，１９９８；Ｄｉｎｇ，１９９６）が挙げられる。
【００８９】
試験オリゴマーは、Ｓｔｅｉｎらに記載のように、試験化合物とＲＮＡ：オリゴマー二重鎖を形成し、次いで、標準的なアッセイ条件下で二重鎖をＲＮａｓｅＨとインキュベートすることによって、そのＲＮａｓｅＨ抵抗性についてアッセイされ得る。ＲＮａｓｅＨへの曝露後、インタクトな二重鎖の存在または不在は、ゲル電気泳動または質量分析によってモニターされ得る。
【００９０】
Ａ３．インビボ取り込み
本発明の別の局面に従って、所定のアンチセンスオリゴマー型が上記の必要とされる特徴（すなわち、高Ｔｍ、宿主細胞によって能動的に取り込まれる能力、およびＲＮａｓｅＨに対する実質的な抵抗性）を提供することを確認するための、簡便で迅速な試験が提供される。この方法は、適切に設計されたアンチセンス化合物が、哺乳動物被験体に投与された場合にウイルスＲＮＡ標的の相補部分と安定なヘテロ二重鎖を形成し、このヘテロ二重鎖は続いて尿（または他の体液）中に出現するという発見に基づく。この方法の詳細はまた、同出願人の所有の米国特許出願第０９／７３６，９２０号（発明の名称「標的ＲＮＡを検出するための非侵襲的方法」（非侵襲的方法）、この開示内容は、参照することによって本明細書中に援用されている）において示される。
【００９１】
簡潔には、既知のＲＮＡに対して標的化された塩基配列を有する、評価される骨格を含む試験オリゴマーが、哺乳動物被験体に注入される。このアンチセンスオリゴマーは、宿主ＲＮＡまたは感染ウイルスのＲＮＡを含む、任意の細胞内ＲＮＡに対して指向される。投与後数時間（代表的には、８〜７２）で、尿は、アンチセンス−ＲＮＡヘテロ二重鎖の存在についてアッセイされる。ヘテロ二重鎖が検出された場合、その骨格は、本発明のアンチセンスオリゴマーにおいて使用するために適切である。
【００９２】
試験オリゴマーは、例えば、蛍光タグまたは放射性タグによって、それが哺乳動物に適切である場合、続く分析を促進するために、標識され得る。このアッセイは、任意の適切な固相または液体フォーマットであり得る。一般に、固相アッセイは、まずヘテロ二重鎖被分析物を固相支持体（例えば、粒子またはポリマーまたは試験片基材）に結合し、そして結合した二重鎖の存在／量を検出することを包含する。液相アッセイでは、代表的には、被分析サンプルは、干渉するサンプル成分を除去するために前処理される。オリゴマーが標識される場合、ヘテロ二重鎖の存在は、標識タグを検出することによって確認される。非標識化合物については、ヘテロ二重鎖は、固相フォーマットの場合、免疫アッセイにより、または溶液もしくは懸濁液フォーマットの場合、質量分析もしくは他の公知の方法によって、検出され得る。
【００９３】
アンチセンスオリゴマーが、ウイルスゲノムのウイルス特異的領域（例えば、上述のようなＯＲＦ１の翻訳開始領域）に相補的である場合、本方法は、所定のｓｓＲＮＡウイルスの存在、または処理方法の間のウイルスの量の減少を検出するために使用され得る。
【００９４】
Ｂ．例示のオリゴマー骨格
オリゴヌクレオチドアナログにおいて使用され得る非イオン性連結の例を、図４Ａ〜４Ｈに示す。これらの図において、Ｂは、塩基特異的水素結合によって、ポリヌクレオチド中の塩基（好ましくは、アデニン、シトシン、グアニン、およびウラシルから選択される）に結合するのに有効なプリンまたはピリミジン塩基対合部分を表す。適切な骨格構造としては、炭酸結合（４Ａ，Ｒ＝Ｏ）およびカルバミン酸結合（４Ａ，Ｒ＝ＮＨ２）（Ｍｅｒｔｅｓ，１９６９；Ｇａｉｔ，１９７４）；ホスホン酸アルキル結合およびホスホトリエステルアルキル結合（４Ｂ，Ｒ＝アルキルまたは−Ｏ−アルキル）（Ｍｉｌｌｅｒ，１９９３；Ｌｅｓｎｉｋｏｗｓｋｉ，１９９０）；アミド結合（４Ｃ）（Ｂｌｏｏｍｅｒｓ，１９９４）；スルホン結合およびスルホンアミド結合（４Ｄ，Ｒ１，Ｒ２＝ＣＨ２）（Ｒｏｕｇｈｔｅｎ，１９９５；ＭｃＥｌｒｏｙ，１９９４）；ならびにチオホルムアセチル結合（４Ｅ）（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，１９９０；Ｃｒｏｓｓ，１９９７）が挙げられる。後者は、ホスホロチオエートアンチセンス化合物に関して二重鎖および三重鎖の増大した安定性を有することが報告されている（Ｃｒｏｓｓ，１９９７）。構造４Ｆの３’−メチレン−Ｎ−メチルヒドロキシアミノ化合物もまた報告されている（Ｍｏｈａｎ，１９９５）。
【００９５】
ペプチド核酸（ＰＮＡ）（図４Ｇ）は、その骨格がデオキシリボース骨格と構造的に同形（ｈｏｍｏｍｏｒｐｈｏｕｓ）であるＤＮＡのアナログであり、ピリミジンまたはプリン塩基が結合したＮ−（２−アミノエチル）グリシン単位からなる。天然ピリミジンおよびプリン塩基を含むＰＮＡは、ワトソン−クリック塩基対合規則に従う相補オリゴヌクレオチド、および塩基対合認識によって模倣ＤＮＡにハイブリダイズする（Ｅｇｈｏｌｍら、１９９３）。ＰＮＡの骨格は、ホスホジエステル結合よりむしろペプチド結合によって形成され、このことは、それらを、アンチセンス適用に十分に適するものとする。骨格は、荷電されておらず、通常より高い熱安定性を示すＰＮＡ／ＤＮＡまたはＰＮＡ／ＲＮＡ二重鎖を生じる。ＰＮＡは、ヌクレアーゼにもプロテアーゼにも認識されない。
【００９６】
好ましいオリゴマー構造は、上述のように、荷電していない連結によって接続された塩基対合部分を有するモルホリノベースのサブユニットを用いる。図４Ｈおよび図２Ｂ−Ｂにおいて説明されているような、実質的に荷電していないホスホロジアミデート結合モルホリノオリゴマーが、特に好ましい。モルホリノオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴマーを含む）は、例えば、同出願人の所有の米国特許第５，６９８，６８５号、第５，２１７，８６６号、第５，１４２，０４７号、第５，０３４，５０６号、第５，１６６，３１５号、第５，１８５，４４４号、第５，５２１，０６３号、および第５，５０６，３３７号（これらは全て、本明細書中に参照することによって明確に援用されている）に詳述されている。
【００９７】
図１Ａ〜Ｅに示すモルホリノベースのサブユニットの重要な特性としては、以下が挙げられる：安定な荷電されていない骨格連結によってオリゴマー形態に連結される能力；形成されるポリマーが、１０〜１４塩基程度の短さのオリゴマーとでさえも、高Ｔｍで、相補塩基標的核酸（標的ＲＮＡを含む）とハイブリダイズし得るように、ヌクレオチド塩基（例えば、アデニン、シトシン、グアニン、またはウラシル）を支持する能力；オリゴマーが哺乳動物細胞に能動的に輸送される能力；およびオリゴマー：ＲＮＡヘテロ二重鎖がＲＮＡｓｅ分解に抵抗し得る能力。
【００９８】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの例示の骨格構造としては、図１Ａ〜Ｅに示されるβ−モルホリノサブユニット型が挙げられ、各々は、荷電されていないリン含有サブユニット結合によって連結される。図１Ａは、図２Ａ（ここでは、モルホリノ環が１原子ホスホアミド結合によって連結されている）に示される５原子反復単位骨格を形成するリン含有結合を示す。図１Ｂは、図２Ｂに示されるような６原子反復単位骨格を生成する連結を示す。この構造において、５’モルホリノ炭素をリン基に連結する原子Ｙは、イオウ、窒素、炭素、または好ましくは、酸素であり得る。リンから張り出したＸ部分は、フッ素、アルキルもしくは置換アルキル、アルコキシもしくは置換アルコキシ、チオアルコキシもしくは置換チオアルコキシ、または環状構造を含む未置換、単置換、もしくは二置換窒素（例えば、モルホリノまたはピペリジン）であり得る。アルキル、アルコキシ、およびチオアルコキシは、好ましくは、１〜６の炭素原子を含む。Ｚ部分は、イオウまたは酸素であり、そして好ましくは、酸素である。図１Ｃ〜Ｅに示される連結は、図２Ｃ〜Ｅにおいて構造が示されるように、７原子単位長の骨格について設計される。構造２Ｃでは、Ｘ部分は、構造２Ｂと同様であり、部分Ｙは、メチレン、イオウ、または好ましくは、酸素であり得る。構造２Ｄでは、Ｘ部分およびＹ部分は、構造２Ｂと同様である。構造２Ｅでは、Ｘは構造２Ｂと同様であり、そしてＹはＯ、Ｓ、またはＮＲであって、ここでＲは水素または低級アルキルであり、好ましくは水素またはメチルである。図２Ａ〜Ｅに示される全てのサブユニットにおいて、ＺはＯまたはＳであり、そしてＰｉおよびＰｊの各々は塩基対合部分であり、好ましくは、アデニン、シトシン、グアニン、およびウラシルから選択される。
【００９９】
特に好ましいモルホリノオリゴヌクレオチドとしては、図２Ｂに示される形態のモルホリノサブユニット構造（ここで、Ｘ＝ＮＨ２またはＮ（ＣＨ３）２、Ｙ＝Ｏ、そしてＺ＝Ｏである）で構成されたモルホリノオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【０１００】
上述のように、実質的に荷電されていないオリゴマーは、有利に、限定された数の荷電連結（例えば、５つの非荷電連結につき約１まで、より好ましくは、１０の非荷電連結につき約１まで）を含み得る。従って、小数の荷電連結（例えば、荷電されたホスホルアミデートまたはホスホロチオエート）もまた、オリゴマーに組み込まれ得る。モルホリノオリゴマーの場合、このような荷電連結は、図２Ａ〜Ｅのいずれかによって表されるような連結（ここで、Ｘはオキシド（−Ｏ−）またはスルフィド（−Ｓ−）である）であり得る。
【０１０１】
アンチセンス化合物は、上記の参考文献において詳述された方法を用いて、逐次固相合成によって調製され得る。いくつかの場合では、例えば、薬物動態を増強するため、または化合物の捕獲もしくは検出を容易にするために、さらなる化学部分をアンチセンス化合物に付加することが望ましいとされ得る。このような部分は、標準的な合成方法に従って、代表的にはオリゴマーの末端に、共有結合され得る。例えば、ポリエチレングリコール部分または他の親水性ポリマー（例えば、１０〜１００モノマーサブユニットを有するポリマー）の付加は、可溶性を増強する際に有用であり得る。１つ以上の荷電基（例えば、アニオン性荷電基（例えば、有機酸））は、細胞取り込みを増強し得る。レポーター部分（例えば、フルオレセインまたは放射性標識基）は、検出の目的のために結合され得る。あるいは、オリゴマーに結合されたレポーター標識は、標識された抗体もしくはストレプトアビジンを結合し得るリガンド（例えば、抗原もしくはビオチン）であり得る。オリゴマーアンチセンスの結合または改変について部分を選択する際に、一般には、無論、生体適合性であり、かつ望ましくない副作用がなく被験体によって寛容化され得ると思われる基の化学的化合物を選択することが望ましい。
【０１０２】
Ｖ．ウイルス複製の阻害
上記で詳述したアンチセンス化合物は、ピコルナウイルス科、カリチウイルス科、トガウイルス科、およびフラビウイルス科のｓｓＲＮＡウイルスの複製を阻害する際に有用である。１つの実施形態では、このような阻害は、これらのウイルスによる宿主動物の感染を処置する際に有効である。従って、この方法は、１つの実施形態では、ウイルスに感染した細胞を、特定のウイルスのゲノムの第一のオープンリーディングフレームにコードされたポリタンパク質の翻訳を阻害するのに有効なアンチセンス剤と接触させる工程を包含する。さらなる実施形態では、アンチセンス剤は、適切な薬学的キャリア中で、所定のウイルスに感染した哺乳動物被験体（例えば、ヒトまたは家庭内動物）に投与される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、宿主においてＲＮＡウイルスの増殖を阻止すると考慮される。ＲＮＡウイルスは、宿主の正常な成長または発達に有害な影響をほとんどまたは全く与えることなく、数が減少し得るか、または除去され得る。
【０１０３】
Ａ．感染因子の同定
感染を引き起こす特定のウイルスは、当該分野で公知の方法（例えば、血清学的方法もしくは培養方法）または本発明のアンチセンスオリゴマーを用いる方法によって決定され得る。
【０１０４】
血清学的同定は、被験体の生物学的標本（例えば、糞便、尿、脳脊髄液、血液など）から単離されたウイルスサンプルまたは培養物を使用する。一般に、ウイルスの検出の免疫アッセイは、当業者によって慣用的に使用される方法（例えば、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロット）によって実施される。さらに、特定のウイルス株または種に特異的なモノクローナル抗体はしばしば市販されている。
【０１０５】
培養方法は、種々の培養条件下で特徴（例えば、増殖速度および形態）を比較することを含むがこれらに限定されない技術を用いることによって、特定のタイプのウイルスを単離および同定するために使用され得る。
【０１０６】
感染した被験体においてウイルス感染因子を同定するための別の方法は、ウイルスの広範な科および／または属（例えば、ピコルナウイルス科、カルシウイルス科、トガウイルス科およびフラビウイルス科）を標的化する１つ以上のアンチセンスオリゴマーを用いる。任意の特徴的なウイルスＲＮＡを標的化する配列が使用され得る。所望の標的配列は、好ましくは、（ｉ）広範な科／属に共通であり、そして（ｉｉ）ヒトに見出されない。多数の感染ウイルスに特徴的な核酸配列は、公のデータベースで利用可能であり、そして特定のオリゴマーの設計の基礎として供し得る。
【０１０７】
複数のオリゴマーの各々について、以下の工程が実施される：（ａ）オリゴマー（単数または複数）を被験体に投与する；（ｂ）その投与後の選択された時点で、体液サンプルを被験体から得る；および（ｃ）アンチセンスオリゴマーおよびウイルスゲノムの相補部分を含むヌクレアーゼ抵抗性ヘテロ二重鎖の存在についてサンプルをアッセイする。工程（ａ）〜（ｃ）は、少なくとも１つのこのようなオリゴマー、またはウイルスもしくはウイルスの科を同定するために必要とされる数のオリゴマーについて実施される。オリゴマーは、投与され、そして続いて、またはより便宜的には同時に、アッセイされ得る。ウイルスは、アンチセンスオリゴマーおよび所定の公知のウイルスまたはウイルス科のウイルスゲノムの相補部分を含むヘテロ二重鎖の存在（または不在）に基づいて同定される。
【０１０８】
好ましくは、広範な科を標的化するオリゴマーの第一の群をまず用いて、次いで、それにより同定される広範な科／属内で特定の属および／または種および／または株に相補的なオリゴマーを選択する。この第二の群のオリゴマーは、広範な科／属内の特定の属および／または種および／または株に対して指向される標的化配列を含む。一般に、いくつかの異なる第二のオリゴマー集団（すなわち、第一段階で試験される広範なウイルス科／属の各々につき１つ）が提供される。（ｉ）試験される個々の属／種／株に特異的であり、かつ（ｉｉ）ヒトにおいて見出されない配列が選択される。
【０１０９】
Ｂ．アンチセンスオリゴマーの投与
標的核酸へのアンチセンスオリゴマーの有効な送達は、処置の重要な局面である。本発明によれば、アンチセンスオリゴマー送達の経路としては、種々の全身経路（経口経路および非経口経路を含む（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、および筋内）、ならびに吸入、経皮送達および局部送達が挙げられるが、これらに限定されない。適切な経路は、処置されている被験体の状態に適切であるように、当業者によって決定され得る。例えば、皮膚のウイルス感染の処置におけるアンチセンスオリゴマーの適切な送達のための経路は、局部送達であるが、ウイルス呼吸器感染の処置のためのアンチセンスオリゴマーの送達は吸入による。オリゴマーはまた、直接にウイルス感染部位に、または血流に送達され得る。
【０１１０】
アンチセンスオリゴマーは、生理学的に受容可能な任意の好都合なビヒクル中で投与され得る。このような組成物は、当業者によって使用される種々の標準的な薬学的に受容可能なキャリアのいずれかを含み得る。例としては、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、水、水性エタノール、乳濁液（例えば、油／水乳濁液またはトリグリセリド乳濁液）、錠剤、およびカプセルが挙げられるが、これらに限定されない。生理学的に受容可能なキャリアの適切な選択は、選択した投与様式に依存して変動する。
【０１１１】
いくつかの場合、リポソームが、細胞へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの取り込みを容易にするために使用され得る。（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｓ．Ａ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １０（１２）：１９８０−１９８９，１９９６；Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎ  ら．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．２３：１１９，１９９４；Ｕｈｌｍａｎｎら，ＡＮＴＩＳＥＮＳＥ  ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ  ：Ａ  ＮＥＷ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＰＲＩＮＣＩＰＬＥ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  ９０，Ｎｏ．４，ｐａｇｅｓ  ５４４−５８４，１９９０；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｇ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １４，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｐｐ．２８７−３４１，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９７９を参照のこと）。ヒドロゲルもまた、例えば、ＷＯ９３／０１２８６に記載されるように、アンチセンスオリゴマー投与のためのビヒクルとして使用され得る。あるいは、オリゴヌクレオチドは、ミクロスフェアまたは微粒子中で投与され得る。（例えば、Ｗｕ，Ｇ．Ｙ．およびＷｕ，Ｃ．Ｈ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２，１９８７を参照のこと）。
【０１１２】
徐放性組成物もまた使用され得る。これらは、成形品の形態（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）で半透性ポリマーマトリクスを含み得る。
【０１１３】
本方法の１つの局面では、被験体は、ヒト被験体（例えば、局部的なウイルス感染または全身ウイルス感染を有するとして診断された患者）である。例えば、（１）免疫無防備状態である患者；（２）やけど患者；（３）留置カテーテルを有する患者；または（４）手術を受ける予定のある患者、もしくは最近手術を受けた患者の場合、患者の状態もまた、本発明のアンチセンスオリゴマーの予防的な投与を指示し得る。１つの好ましい実施形態では、オリゴマーは、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーであり、これは、薬学的に受容可能なキャリア中に含有され、経口送達される。別の好ましい実施形態では、オリゴマーは、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーであり、薬学的に受容可能なキャリア中に含有され、静脈内（ＩＶ）送達される。
【０１１４】
本方法の別の適用では、被験体は、家畜動物（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、ブタ、ウシまたはヤギなど）であり、処置は、予防的または治療的のいずれかである。本発明はまた、上記のタイプの抗ウイルス性アンチセンス化合物の治療量以下の量を補充した穀物を含む、家畜および家禽の食餌組成物を包含する。また、抗ウイルス性の治療量以下レベルを補充した穀物を家畜および家禽に給餌する方法において、穀物に、上記の抗ウイルス性オリゴヌクレオチド組成物の治療量以下の量が補充されるという改善点が考慮される。
【０１１５】
アンチセンス化合物は、一般に、少なくとも２００〜４００ｎＭアンチセンスオリゴマーのピーク血中濃度を生じるのに有効な量および様式で投与される。代表的には、アンチセンスオリゴマーの１つ以上の用量が、一般には、約１〜２週間の間、定期的な間隔で投与される。経口投与のための好ましい用量は、７０ｋｇ当たり約１〜２５ｍｇのオリゴマーからである。いくつかの場合では、患者当たり２５ｍｇより多いオリゴマーの用量が必要であり得る。静脈内投与について、好ましい用量は、７０ｋｇ当たり約０．５ｍｇ〜１０ｍｇのオリゴマーである。アンチセンスオリゴマーは、短時間の間に定期的な間隔（例えば、２週間以下の間に毎日）で投与され得る。しかし、いくつかの場合、オリゴマーは、より長い期間にわたって断続的に投与される。投与は、抗生物質または他の治療剤処置の投与が後に続き得るか、または同時であり得る。処置レジメは、処置を受けている被験体の免疫アッセイ、他の生化学的試験および生理学的試験の結果に基づいて、示されるように調整され得る（用量、頻度、経路など）。
【０１１６】
Ｃ．処置のモニタリング
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いる有効なインビボでの処置レジメは、投与の持続期間、用量、頻度、および経路、ならびに処置を受けている被験体の状態（すなわち、予防的投与対局所感染または全身感染に応じた投与）に従って変動し得る。従って、このようなインビボ治療は、最適な治療結果を達成するために、特定のタイプのウイルス感染に適切な試験によるモニタリング、および用量または処置レジメにおける対応する調整をしばしば必要とする。処置は、例えば、感染の一般的な指標（例えば、全血球算定（ＣＢＣ）、核酸検出方法、免疫診断試験、ウイルス培養、またはヘテロ二重鎖の検出）によってモニタリングされ得る。
【０１１７】
インビボ投与された本発明のアンチセンスオリゴマーが１つ以上の型のＲＮＡウイルスの増殖を阻害または除去する際の効力は、アンチセンスオリゴマーの投与前、投与の間に、および投与後に被験体から採取した生物学的サンプル（組織、血液、尿など）から決定され得る。このようなサンプルのアッセイは、（１）当業者に公知の手順（例えば、電気泳動ゲル移動度アッセイ）を用いて標的配列と非標的配列とのヘテロ二重鎖の形成の存在または不在のモニタリング；（２）標準的な技術（例えば、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロッティング）により決定されるようなウイルスタンパク質産生の量のモニタリング；または（３）例えば、Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒの方法によりウイルス価に対する効果の測定を含む。（例えば、Ｐａｒｉ，Ｇ．Ｓ．ら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ３９（５）：１１５７−１１６１，１９９５；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｋ．Ｐ．ｅｔａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ４０（９）：２００４−２０１１，１９９６，Ｃｏｔｔｒａｌ，Ｇ．Ｅ．（ｅｄ）ｉｎ：Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ．６０−９３，１９７８を参照のこと）。
【０１１８】
アンチセンス処理の有効性をモニターする好ましい方法は、アンチセンスＲＮＡヘテロ二重鎖の検出による。アンチセンス投与後の選択された時間で、体液は、サンプル中のヘテロ二重鎖種の存在を検出および／またはヘテロ二重鎖種のレベルを測定するために収集される。代表的に、体液サンプルは、投与後３〜２４時間（好ましくは、投与後約６〜２４時間）で収集される。上記のように、体液サンプルは、尿、唾液、血漿、血液、脊髄液、または生物学的供給源の他の液体サンプルであり得、そして細胞またはそれらに懸濁された細胞フラグメント、あるいは液体培地およびその溶液を含み得る。収集されたサンプルの量は、代表的に０．１〜１０ｍｌの範囲、好ましくは約１ｍｌ未満である。
【０１１９】
サンプルを処理して所望でない成分を除去し得、そして／またはサンプル中のヘテロ二重鎖種を処理して所望でないｓｓＲＮＡオーバーハング領域を（例えば、ＲＮａｓｅでの処理によって）除去し得る。もちろん、オーバーハングを除去することが特に重要であり、ヘテロ二重鎖検出はサイズ分離（例えば、質量分光法の電気泳動）に依存する。
【０１２０】
種々の方法は、サンプルから所望でない成分を除去するのに利用可能である。例えば、ヘテロ二重鎖は、正味の負電荷を有するので、電気泳動技術またはイオン交換技術を使用して、天然の物質または正電荷物質からヘテロ二重鎖を分離し得る。サンプルはまた、表面結合抗体またはヘテロ二重鎖を特異的に結合し得る他の試薬を有する固体支持体と接触され得る。結合していない物質を除去するために支持体を洗浄した後、ヘテロ二重鎖は、さらなる分析（例えば、電気泳動、質量分光法または免疫アッセイ）のための実質的に精製された形態で放出され得る。
【実施例】
【０１２１】
（実施例）
以下の実施例が示されるが、本発明を限定する任意の方法を意図していない。
【０１２２】
（材料および方法）
標準の組換えＤＮＡ技術を、Ａｕｓｕｂｅｌ，ＦＭら、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｄｉａ，ＰＡ，１９９２およびＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，Ｖｏｌ．２，１９８９）に記載されるように全ての構成に利用した。
【０１２３】
（実施例１：インビトロでのピコルナウイルス科（ヒトライノウイルス）のアンチセンス阻害）
ライノウイルス１４の翻訳開始ゾーンに標的化された配列を有するホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）のライノウイルス１６に対する阻害効果を、評価した。ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）を、ＳｕｍｍｅｒｔｏｎおよびＷｅｌｌｅｒ，  １９９７に記載されるように、ＡＶＩ  ＢｉｏＰｈａｒｍａ（Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ，ＯＲ）で合成した。全長のオリゴマーの純度は、逆相高圧液体クロマトグラフィーおよびＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ質量分光法によって決定されるように９０％以上であった。凍結乾燥したＰＭＯを、細胞培養物において使用する前に滅菌した０．９％  ＮａＣｌに溶解し、０．２μｍのＡｃｒｏｄｉｓｃフィルター（Ｇｅｌｍａｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）に通して濾過した。
【０１２４】
ＰＭＯは、ライノウイルス１４を標的化する核酸配列を含み、そしてライノウイルス１６の標的配列に関して３つのミスペアを含む。この標的配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＣ００１７５２  ６１８−６３７；配列番号５）および標的化配列（配列番号１８）を以下に示す：
【０１２５】
【表５】
2005507660.tif 000009
ここで、太字のコドンは開始コドンであり、ミスペアには下線を引く。
【０１２６】
ＨｅＬａ細胞の２４時間経時した培養物を、６つのウェルプレート中で２４時間増殖した。コンフルエントの単層を、５％のウシ胎仔血清、Ｌ−グルタミン、抗生物質および重炭酸ナトリウムを補充したＥａｒｌｅｓ最小必須培地（ＭＥＭ）中で増殖させた。細胞を、３７℃、５％  ＣＯ２中で、加湿した雰囲気下でインキュベートした。処理の前に、単層を、血清を含まないＭＥＭで２回リンスした。
【０１２７】
ＰＭＯを、「スクレイプ−ローディング（ｓｃｒａｐｅ−ｌｏａｄｉｎｇ）」法によって、培養した細胞に導入した。この方法は、培養物中の８０〜９０％の接着細胞にＰＭＯを送達することが公知である（Ｐａｒｔｒｉｄｇｅら、１９９６）。このオリゴマーを、血清を含まないＭＥＭ中で２０μＭの最終濃度まで希釈した。０．５ｍｌ体積のオリゴマー−ＭＥＭ培地を培養物に添加し、室温で１分後、細胞をラバーポリスマンで穏やかにはがした（ｓｃｒａｐ  ｏｆｆ）。細胞をＣＯ２インキュベーターに１０分間戻し、次いで、仔ウシ血清を含むＭＥＭ（８ｍｌ）中に希釈し、そして９６ウェルプレートの１ウェル（ライノウイルス１６の対数希釈物を含む）あたり０．１ｍｌに分散した（１希釈あたり８ウェル）。これらのプレートを、７２時間３７℃にて、ＣＯ２インキュベーター中でインキュベートし、その時間の後、これらを細胞変性効果の存在について、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＣＫ光学顕微鏡を用いて試験した。ウイルス力価（ＴＣＩＤ５０）を、Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒの方法によって決定した。異なる処理グループに対するウイルス力価を以下の表６に示し、図５にグラフ化する。
【０１２８】
（表６）
【０１２９】
【表６】
2005507660.tif 000010
結果は、ＨＲＶ−１４に対するＰＭＯアンチセンスで処理した場合、ＨＲＶ−１６のウイルス力価の７５％より多い阻害を示す。以前の研究において証明された、ライノウイルス１６感染に対して指向されたライノウイルス１６標的化配列の効果よりも効果は、低いが、３つのミスマッチ塩基対から予測されるように、この研究は、ＨＲＶ−１６遺伝子の翻訳開始ゾーンに対して実質的に相補的なＰＭＯの抗ウイルス効果を確証する。
【０１３０】
（実施例２：ブタの腎臓（ＰＫ−１５）およびアフリカミドリザルの腎臓（Ｖｅｒｏ）組織培養物中のＣａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ  Ｖｅｓｉｖｉｒｕｓ単離物ＰＣＶ  Ｐａｎ−１よびＳＭＳＶ−１３のアンチセンス阻害）
Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅのベシウイルス属のＰａｎ−１株およびＳＭＳＶ−１３株のＯＲＦ１翻訳開始ゾーンに対して標的化した３つのホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）の抗ウイルス効果を評価した。ＰＭＯを、上記のように、２つの宿主細胞株（ブタの肝臓細胞（ＰＫ−１５）（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ３３）およびアフリカミドリザルの腎臓細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ１８）（Ｖｅｒｏ）、これらは、Ｐａｎ−１株およびＳＭＳＶ−１３株のベシウイルスに実質的に曝露された）に対してスクレイプロードした。インキュベーションおよびウイルス負荷については、実施例に従った。
【０１３１】
３つのＰＭＯの各々は、ＯＲＦ１の開始コドンにわたってＰａｎ−１配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０９１７３６）に対して相補的である標的化配列を含む。ＰＭＯを血清を含まない倍地中で２０μｍの濃度で使用した。生理食塩水ブランクおよびスクランブルした配列コントロールＰＭＯを、研究に含めた。ＰＭＯ配列（ＯＲＦ１．１（配列番号２７）、ＯＲＦ１．２（配列番号２８）、およびＯＲＦ１．３（配列番号２９）として同定される）ならびに標的部位の位置を、以下の表７に列挙する。
【０１３２】
（表７：オリゴマー配列および標的位置）
【０１３３】
【表７】
2005507660.tif 000011
ＰＫ−１５およびＶｅｒｏ細胞の両方におけるＳＭＳＶ−１３およびＰａｎ−１のウイルス力価に対するＰＭＯの阻害効果を、表８に提供する。両方の細胞型を所定のウイルス株で試験した場合の簡単な阻害平均パーセントを示す。
【０１３４】
（表８：ＰＫ−１５およびＶｅｒｏ宿主細胞中のベシウイルス、ＰＣＶ  Ｐａｎ−１株およびＳＭＳＶ−１３株のウイルス力価に対するアンチセンスＰＭＯの効果）
【０１３５】
【表８】
2005507660.tif 000012
ウイルス力価の有意な阻害を、ＯＲＦ１標的化ＰＭＯを用いて、両方の細胞株中で、そして両方のウイルス血清型について観察し、「ＯＲＦ１．１」が最も効果的であった。スクランブルしたコントロールＰＭＯは、阻害効果を有さなかった。
【０１３６】
用量応答研究において、Ｖｅｒｏ細胞を、ＯＲＦ１．１を有するＰＭＯで、実施例１に記載のプロトコルに従って負荷した。ＯＲＦ１．１  ＰＭＯでの処理は、０．２μＭおよび１．０μＭで阻害を与えず、そして２．０μＭで中程度の阻害を与え、２０μＭで高い阻害を与えた。ＯＲＦ１．３  ＰＭＯは、０．２μＭでＳＭＳＶ−１３のウイルス力価の阻害を与えなかったが、阻害は、１．０μＭで高く；さらなる阻害は、２μＭ、１０μＭおよび２０μＭで観察されなかった。
【０１３７】
（実施例３：ネコのカリチウイルスのＰＭＯアンチセンスの効果）
ネコに対して出血性のウイルスとなるネコカリチウイルスを単離し、そして細胞培地中で増殖させた。この細胞培地を実施例１に記載のプロトコルに従って、以下の標的化配列を有するアンチセンスＰＭＯに曝露した：ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＴＴＧ  ＡＧＡ  ＣＡＴ  ＴＧＴ  ＣＴＣ（配列番号３２）。ウイルス力価の１対数減少を細胞培地中で観察した。
【０１３８】
（実施例４：ＨＣＶ−ＴｒｉｍｅｒａマウスのＨＣＶウイルス血症に標的化されるアンチセンスＰＭＯの効果）
この研究を、Ｈａｒｌａｎ  Ｉｎｃ．（Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒで育てられそして維持された）から入手した病原体を含まない雌性ＣＢ６Ｆ１およびＳＣＩＤ／ベージュマウスで行った。マウスを、研究の開始前に、特定の病原体を含まない環境に収容し；滅菌した食物および酸性の水を自由に与えた。
【０１３９】
ＣＢ６Ｆ１マウスを、７〜９週齢で胸腺摘出した。実験を、１２〜１８週齢（１９〜２５ｇ／マウス）のＣＢ６Ｆ１マウスを使用して行った。異種移植の前に、ＣＢ６Ｆ１マウスに、γビーム１５０−Ａ６０Ｃｏ源（ＣａｎａｄａのＡｔｏｍｉｃ  Ｅｎｅｒｇｙ）から０．７Ｇｙ／分の照射速度で、スプリット用量の全身照射（４Ｇｙ、次いで１日後に１１Ｇｙ）を与えた。第１の照射後、シプロフロキサシン（２０μｇ／ｍｌ；Ｂａｙｅｒ）を、７〜１０日間、飲み水に添加した。第２の照射線量の直後、マウスに、６〜１０週齢のＳＣＩＤ／ベージュマウスから得た４〜６×１０６の骨髄細胞（０．２ｍｌＰＢＳ中）を静脈内注射した。
【０１４０】
ＣＢ６Ｆ１マウスを、１０ｍｇ／マウスの２，２，２トリブロモエタノール（Ａｌｄｒｉｃｈ）で麻酔し、そして開腹切開をした。Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を用いてエキソビボで感染したヒト肝臓フラグメントを、耳介の裏側に移植した。切開を９ｍｍのオートクリップ（ａｕｔｏｃｌｉｐ）の創傷クリップで閉じた。
【０１４１】
マウスを、標的化配列ＧＴＧ  ＣＴＣ  ＡＴＧ  ＧＴＧ  ＣＡＧ  ＧＧＴ  Ｃ（配列番号３５）を有する第１のオープンリーディングフレームのＡＵＧ部位にわたるＨＣＶ核配列に対する、ＰＭＯアンチセンスで処理した。アンチセンス化合物または生理食塩水での処理を、４つのマウス群（各群、約１７動物を含む）に対して、移植の１０日〜１７日後に行った（合計７日）。０．０１ｍｇ／マウス／日、０．０３ｍｇ／マウス／日および０．１ｍｇ／マウス／日の用量のＰＭＯを使用した。採血を１６日目および２１日目（処置完了後が１日目）で行い、血清サンプルを評価した。
【０１４２】
結果は、表９に要約され、そして図６にグラフ化さして示す。ウイルス負荷は、平均ウイルス負荷±ＳＤ（ＨＣＶ−ＲＮＡコピー／ｍｌ血清）として与える。コントロールと処理した群のマウスとの間のＨＣＶポジティブ動物のパーセンテージにおける差異を、χ２分析を使用して比較する。コントロールと処理された群のマウス（群対）との間のウイルス負荷における差異を、非パラメトリックのマンホイットニーのＵ検定によって比較する。
【０１４３】
（表９：インビボでのアンチセンス用量応答効果の研究）
【０１４４】
【表９】
2005507660.tif 000013
前記から、本発明の特定の実施形態が例示の目的で本明細書中に記載されるが、種々の改変が本発明の精神および範囲から逸脱することなくされ得ることが明らかである。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲以外に限定されない。
【０１４５】
（表１０：配列表）
【０１４６】
【表１０】
2005507660.tif 000014
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】図１Ａ〜１Ｅは、ポリマーの形成に適した、５原子連結基（Ａ）、６原子連結基（Ｂ）および７原子連結基（Ｃ〜Ｅ）を有する、いくつかの好ましいモルホリノ型サブユニットを示す。
【図２】図２Ａ〜Ｅは、Ａ〜Ｅと示された、図１のサブユニットＡ〜Ｅをそれぞれ用いて構築された、例示的なモノホリノオリゴヌクレオチドの繰り返しサブユニットセグメントを示す。
【図３】図３Ａ〜３Ｄは、例示的なウイルスおよびウイルス標的部位のゲノムの模式図である。
【図４】図４Ａ〜４Ｈは、オリゴヌクレオチドアナログの無電荷の連結タイプの例を示す。
【図５】図５は、実施例１に記載したように、ウイルス配列と３塩基のミスマッチを有する本発明のアンチセンスオリゴマーの存在下での、インビトロにおけるヒトライノウイルスの阻害パーセントを示す。
【図６】図６は、実施例４に記載したように、マウスのＨＣＶ感染の処置における本発明のアンチセンスオリゴマーについての用量応答データを示す；用量は、ｍｇ／マウス／日で表す。
【図３】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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