(57)【要約】本発明は、変形性関節症(ＯＡ)を処置、予防または改善するための新規治療薬の開発に適切な標的としてＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１およびＯＳＭを開示している。本発明は、ＯＡの処置、予防または改善方法およびＰＩ３Ｋおよび／またはＰＫＢ酵素活性および／または遺伝子発現およびＩＬ−１および／またはＯＳＭ活性または遺伝子発現に対する阻害効果を有する物質を含むそのための医薬組成物に関するものである。本発明はまた、ＯＡを処置するための治療有用性をもつ化合物の同定方法であって、ＰＩ３Ｋおよび／またはＰＫＢ活性および／または遺伝子発現および／またはＰＩ３Ｋおよび／またはＰＫＢ活性および／または遺伝子発現のＩＬ−１またはＯＳＭ活性化に影響を及ぼす結果、ＡＧＧ−１および／またはＣＯＬ−３のダウンレギュレーションをまねくことにより、インビボでＯＡを予防、処置または改善し得る化合物を同定することを含む方法に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アグリカナーゼ−１またはコラゲナーゼ−３のレベルの変化に伴うかまたはそれによって誘発される病気の予防、処置または改善方法であって、それを必要とする対象に、ホスホ‐イノシチド３キナーゼ、プロテインキナーゼＢ、ＩＬ−１またはＯＳＭを調節し得、その調節を通してアグリカナーゼ−１またはコラゲナーゼ−３の遺伝子および／またはタンパク質発現を改変させる化合物の有効量を投与することを含む方法。
【請求項２】
変形性関節症の予防、処置または改善方法であって、それを必要とする対象に、ホスホ‐イノシチド３キナーゼ、プロテインキナーゼＢ、ＩＬ−１またはＯＳＭを調節し得、その調節を通してアグリカナーゼ−１またはコラゲナーゼ−３の遺伝子および／またはタンパク質発現を改変させる化合物の有効量を投与することを含む方法。
【請求項３】
ホスホ‐イノシチド３キナーゼモジュレーター、プロテインキナーゼＢモジュレーター、ＩＬ−１モジュレーター、またはＯＳＭモジュレーターが、上記対象においてホスホ‐イノシチド３キナーゼおよびプロテインキナーゼＢから選択される１種またはそれ以上のタンパク質の酵素活性を阻害する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
ホスホ‐イノシチド３キナーゼモジュレーターまたはプロテインキナーゼＢモジュレーターが、上記対象においてホスホ‐イノシチド３キナーゼ、プロテインキナーゼＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、アグリカナーゼ−１およびコラゲナーゼ−３から選択される１種またはそれ以上のタンパク質の遺伝子またはタンパク質発現を阻害する、請求項２記載の方法。
【請求項５】
ホスホ‐イノシチド３キナーゼモジュレーターまたはプロテインキナーゼＢモジュレーターが、ＬＹ２４９００２ ２−(４−モルホリニル)−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン)の遊離または医薬上許容される塩形態である、請求項２記載の方法。
【請求項６】
ホスホ‐イノシチド３キナーゼモジュレーター、プロテインキナーゼＢモジュレーター、ＩＬ−１モジュレーター、またはＯＳＭモジュレーターが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマーおよび二本鎖ＲＮＡから選択されるいずれか１種またはそれ以上の物質を含み、上記物質が、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３タンパク質の遺伝子発現を阻害するように設計されている、請求項２記載の方法。
【請求項７】
ホスホ‐イノシチド３キナーゼモジュレーター、プロテインキナーゼＢモジュレーター、ＩＬ−１モジュレーター、またはＯＳＭモジュレーターが、ホスホ‐イノシチド３キナーゼ、プロテインキナーゼＢ、ＩＬ−１、またはＯＳＭに対する１種またはそれ以上の抗体またはそのフラグメントを含み、上記抗体またはそのフラグメントがホスホ‐イノシチド３キナーゼおよびプロテインキナーゼＢから選択されるタンパク質の酵素活性を阻害し得る、請求項２記載の方法。
【請求項８】
変形性関節症の予防、処置または改善方法であって、それを必要とする対象に、ホスホ‐イノシチド３キナーゼ、プロテインキナーゼＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭのモジュレーターの有効量を含み、その調節(モジュレーション)を通してアグリカナーゼ−１またはコラゲナーゼ−３の遺伝子および／またはタンパク質発現を改変させる医薬組成物を投与することを含む方法。
【請求項９】
ホスホ‐イノシチド３キナーゼモジュレーター、プロテインキナーゼＢモジュレーター、ＩＬ−１モジュレーター、またはＯＳＭモジュレーターが、対象においてホスホ‐イノシチド３キナーゼおよびプロテインキナーゼＢから選択される１種またはそれ以上のタンパク質の酵素活性を阻害する、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ホスホ‐イノシチド３キナーゼモジュレーターまたはプロテインキナーゼＢモジュレーターが、対象においてホスホ‐イノシチド３キナーゼ、プロテインキナーゼＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、アグリカナーゼ−１およびコラゲナーゼ−３から選択される１種またはそれ以上のタンパク質の遺伝子またはタンパク質発現を阻害する、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
ホスホ‐イノシチド３キナーゼモジュレーターまたはプロテインキナーゼＢモジュレーターが、ＬＹ２４９００２（２−(４−モルホリニル)−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン)の遊離または医薬上許容される塩形態である、請求項８記載の方法。
【請求項１２】
ホスホ‐イノシチド３キナーゼモジュレーター、プロテインキナーゼＢモジュレーター、ＩＬ−１モジュレーター、またはＯＳＭモジュレーターが、ホスホ‐イノシチド３キナーゼ、プロテインキナーゼＢ、ＩＬ−１モジュレーター、またはＯＳＭモジュレーターに対する１種またはそれ以上の抗体またはそのフラグメントを含み、抗体またはそのフラグメントがホスホ‐イノシチド３キナーゼおよびプロテインキナーゼＢから選択されるタンパク質の酵素活性を阻害し得る、請求項８記載の方法。
【請求項１３】
変形性関節症の予防、処置または改善に有用なモジュレーターの同定方法であって、候補モジュレーターが、ホスホ‐イノシチド３キナーゼ、プロテインキナーゼＢ、ＩＬ−１、またはＯＳＭを阻害し、その阻害によってアグリカナーゼ−１またはコラゲナーゼ−３の遺伝子および／またはタンパク質発現を改変させる能力について検定することを含む方法。
【請求項１４】
さらに、同定されたホスホ‐イノシチド３キナーゼ、プロテインキナーゼＢ、ＩＬ−１、またはＯＳＭ阻害性モジュレーターが変形性関節症の動物モデルで観察される病理学的影響を除去する能力について検定することを含む方法である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
モジュレーターが、ホスホ‐イノシチド３キナーゼおよびプロテインキナーゼＢから選択される１種またはそれ以上のタンパク質の酵素活性を阻害する、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
モジュレーターが、ホスホ‐イノシチド３キナーゼ、プロテインキナーゼＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、アグリカナーゼ−１およびコラゲナーゼ−３から選択される１種またはそれ以上のタンパク質の遺伝子またはタンパク質発現を阻害する、請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
さらに、同定された阻害性モジュレーターが変形性関節症対象による臨床試験で観察される病理学的影響を除去する能力について検定することを含む方法である、請求項１３記載の方法。
【請求項１８】
ホスホ‐イノシチド３キナーゼモジュレーター、プロテインキナーゼＢモジュレーター、ＩＬ−１モジュレーター、またはＯＳＭモジュレーターが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマーおよび二本鎖ＲＮＡから選択されるいずれか１種またはそれ以上の物質を含み、上記物質が、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３タンパク質の遺伝子発現を阻害するように設計されている、請求項１３記載の方法。
【請求項１９】
ホスホ‐イノシチド３キナーゼモジュレーター、プロテインキナーゼＢモジュレーター、ＩＬ−１モジュレーター、またはＯＳＭモジュレーターが、ホスホ‐イノシチド３キナーゼ、プロテインキナーゼＢ、ＩＬ−１、またはＯＳＭに対する１種またはそれ以上の抗体またはそのフラグメントを含み、抗体またはそのフラグメントがホスホ‐イノシチド３キナーゼおよびプロテインキナーゼＢから選択されるタンパク質の酵素活性を阻害し得る、請求項１３記載の方法。
【請求項２０】
変形性関節症の予防、処置または改善を必要とする対象においてそれに有効な量でホスホ‐イノシチド３キナーゼモジュレーター、プロテインキナーゼＢモジュレーター、ＩＬ−１モジュレーター、またはＯＳＭモジュレーターを含む医薬組成物。
【請求項２１】
モジュレーターが、ホスホ‐イノシチド３キナーゼおよびプロテインキナーゼＢから選択される１種またはそれ以上のタンパク質の酵素活性を阻害する、請求項２０記載の医薬組成物。
【請求項２２】
モジュレーターが、ホスホ‐イノシチド３キナーゼ、プロテインキナーゼＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、アグリカナーゼ−１およびコラゲナーゼ−３から選択される１種またはそれ以上のタンパク質の遺伝子またはタンパク質発現を阻害する、請求項２０記載の医薬組成物。
【請求項２３】
モジュレーターが、ＬＹ２４９００２（２−(４−モルホリニル)−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン)の遊離または医薬上許容される塩形態である、請求項２０記載の医薬組成物。
【請求項２４】
モジュレーターが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマーおよび二本鎖ＲＮＡから選択されるいずれか１種またはそれ以上の物質を含み、上記物質が、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３タンパク質の遺伝子発現を阻害するように設計されている、請求項２０記載の医薬組成物。
【請求項２５】
モジュレーターが、ホスホ‐イノシチド３キナーゼ、プロテインキナーゼＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭに対する１種またはそれ以上の抗体またはそのフラグメントを含み、抗体またはそのフラグメントがホスホ‐イノシチド３キナーゼおよびプロテインキナーゼＢから選択されるタンパク質の酵素活性を阻害し得る、請求項２０記載の医薬組成物。
【請求項２６】
ホスホ‐イノシチド３キナーゼ、プロテインキナーゼＢモジュレーター、ＩＬ−１モジュレーター、またはＯＳＭモジュレーターによる処置に適切な候補であり得る活動性または発生期変形性関節症に罹患した対象の診断方法であって、対象からの生物学的試料においてホスホ‐イノシチド３キナーゼのα、β、γおよびδイソ型、ＩＬ−１、ＯＳＭ、アグリカナーゼ−１およびコラゲナーゼ−３の１種またはそれ以上から選択された物質のｍＲＮＡレベルを検定することを含み、非変形性関節症対照レベルと比べてホスホ‐イノシチド３キナーゼ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、アグリカナーゼ−１またはコラゲナーゼ−３のレベルが変化した対象が、ホスホ‐イノシチド３キナーゼモジュレーター、プロテインキナーゼＢモジュレーター、ＩＬ−１モジュレーター、またはＯＳＭモジュレーター処置に適切な候補である方法。
【請求項２７】
変形性関節症の予防、処置または改善方法であって、
(ａ)対象においてホスホ‐イノシチド３キナーゼのα、β、γおよびδイソ型、ＩＬ−１、ＯＳＭ、アグリカナーゼ−１およびコラゲナーゼ−３の１種またはそれ以上から選択された物質のｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルについて検定し、そして
(ｂ)対照のｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルと比べて、ホスホ‐イノシチド３キナーゼのα、β、γおよびδイソ型、ＩＬ−１、ＯＳＭ、アグリカナーゼ−１およびコラゲナーゼ−３のレベルが変化した対象に、ホスホ‐イノシチド３キナーゼモジュレーター、プロテインキナーゼＢモジュレーター、ＩＬ−１モジュレーター、またはＯＳＭモジュレーターを、変形性関節症の病理学的影響を処置または改善するのに十分な量で投与することを含む方法。
【請求項２８】
ホスホ‐イノシチド３キナーゼモジュレーター、プロテインキナーゼＢモジュレーター、ＩＬ−１モジュレーター、またはＯＳＭモジュレーターによる処置に適切な候補であり得る活動性または発生期変形性関節症に罹患した対象の診断方法であって、対象からの生物学的試料においてホスホ‐イノシチド３キナーゼのα、β、γおよびδイソ型、ＩＬ−１、ＯＳＭ、アグリカナーゼ−１およびコラゲナーゼ−３の１種またはそれ以上から選択された物質のｍＲＮＡレベルを検定することを含み、非変形性関節症対照レベルと比べてホスホ‐イノシチド３キナーゼ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、アグリカナーゼ−１またはコラゲナーゼ−３のレベルが増加した対象が、ホスホ‐イノシチド３キナーゼモジュレーター、プロテインキナーゼＢモジュレーター、ＩＬ−１モジュレーター、またはＯＳＭモジュレーター処置に適切な候補である方法。
【請求項２９】
変形性関節症の予防、処置または改善方法であって、
(ａ)対象においてホスホ‐イノシチド３キナーゼのα、β、γおよびδイソ型、ＩＬ−１、ＯＳＭ、アグリカナーゼ−１およびコラゲナーゼ−３の１種またはそれ以上から選択された物質のｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルについて検定し、そして
(ｂ)対照のｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルと比べて、ホスホ‐イノシチド３キナーゼのα、β、γおよびδイソ型、ＩＬ−１、ＯＳＭ、アグリカナーゼ−１およびコラゲナーゼ−３のレベルが増加した対象に、ホスホ‐イノシチド３キナーゼモジュレーター、プロテインキナーゼＢモジュレーター、ＩＬ−１モジュレーター、またはＯＳＭモジュレーターを、変形性関節症の病理学的影響を処置または改善するのに十分な量で投与することを含む方法。
【請求項３０】
生物学的試料においてホスホ‐イノシチド３キナーゼのα、β、γおよびδイソ型、ＩＬ−１、ＯＳＭ、アグリカナーゼ−１およびコラゲナーゼ−３の１種またはそれ以上から選択された物質のｍＲＮＡレベルおよび／またはタンパク質レベルを検出するための診断用キットであって、
(ａ)ホスホ‐イノシチド３キナーゼのα、β、γおよびδイソ型、ＩＬ−１、ＯＳＭ、アグリカナーゼ−１およびコラゲナーゼ−３の１種またはそれ以上から選択された物質のポリヌクレオチドまたはそのフラグメント、
(ｂ)(ａ)の配列と相補的なヌクレオチド配列、
(ｃ)ホスホ‐イノシチド３キナーゼのα、β、γおよびδイソ型、ＩＬ−１、ＯＳＭ、アグリカナーゼ−１およびコラゲナーゼ−３の１種またはそれ以上から選択された物質のポリペプチドまたはそのフラグメント(上記ポリペプチドまたはそのフラグメント)、または
(ｄ)ホスホ‐イノシチド３キナーゼのα、β、γおよびδイソ型、ＩＬ−１、ＯＳＭ、アグリカナーゼ−１およびコラゲナーゼ−３の１種またはそれ以上から選択された物質のポリペプチドに対する抗体
を含み、成分(ａ)、(ｂ)、(ｃ)または(ｄ)が重要な成分を含み得るキット。
【請求項３１】
アグリカナーゼ−１またはコラゲナーゼ−３のレベルの変化に伴うかまたはそれによって誘発される病気を処置するための医薬の製造を目的とするホスホ‐イノシチド３キナーゼ、プロテインキナーゼＢ、ＩＬ−１、またはＯＳＭを調節し得る化合物の使用。
【請求項３２】
変形性関節症処置用医薬の製造を目的とするホスホ‐イノシチド３キナーゼ、プロテインキナーゼＢ、ＩＬ−１、またはＯＳＭを調節し得る化合物の使用。
【請求項３３】
アグリカナーゼ−１またはコラゲナーゼ−３のレベルの変化に伴うかまたはそれによって誘発される病気を処置するための医薬の製造を目的とする２−(４−モルホリニル)−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン)の使用。
【請求項３４】
変形性関節症処置用医薬の製造についての２−(４−モルホリニル)−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン)の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
関節炎は、身体の関節構造(関節)の一般的炎症として定義される。慢性関節リウマチは関節炎疾患のサブセットであり、自己免疫機構および／またはウイルス感染症により誘発され得る慢性全身疾患であり、滑膜および関節構造の炎症を伴う。通常それは事実上多関節性である。一般的関節炎および慢性関節リウマチとは対照的に、変形性関節症(ＯＡ)の病状は、事実上非炎症性であり、関節における関節軟骨の一般的加齢分解を特徴とする、複雑な多因性進行性疾患である。ＯＡはまた、細胞増殖およびアポトーシスに至る軟骨細胞活性化、プロテアーゼ発現および異常なマトリックス生産を特徴とし、軟骨を修復し得ないことから、細胞外マトリックスの喪失、マトリックスカルシウム沈着および骨増殖体形成を誘発する。軟骨および細胞外マトリックス構造の分解により、冒された関節の骨および神経間の摩擦が増加する。ＯＡは、この病気に冒された関節において様々なレベルの疼痛および進行性衰弱を誘発する。ＯＡについての現行療法は緩和的または外科的なものである。
【０００２】
ＯＡで見られる分解プロセスの開始に関与する特異的分子経路は解明されていないが、軟骨喪失に至る中心的機序は、関節軟骨細胞により製造されるコラーゲン分解性酵素アグリカナーゼ−１(ＡＧＧ−１)、アグリカナーゼ−II(ＡＧＧ−２)およびコラゲナーゼ−３(ＣＯＬ−３)によるII型コラーゲンおよびアグリカンの酵素分解であると仮定されている。ＣＯＬ−３は、II型コラーゲンおよびアグリカンについて最も有効なコラゲナーゼであると思われ、開裂は、主にＡＧＧ−１およびＡＧＧ−２開裂部位で行なわれ、ＯＡにおける特異的アグリカナーゼの役割およびこれらの酵素の誘導に至る機序はまだ決定されていない。
【０００３】
軟骨細胞におけるマトリックス分解性金属プロテイナーゼ、ＣＯＬ−３の発現および生成は、血小板由来増殖因子(ＰＤＧＦ)により促進され得る。プロテインキナーゼＢ(ＰＫＢ)は、増殖因子、サイトカイン類および細胞ストレス条件により活性化されるプロト‐オンコジーンである。ＰＤＧＦは、ＰＫＢおよび同じくＰＫＢの上流アクチベーターであるホスホ‐イノシチド３キナーゼ(ＰＩ３Ｋ)の強力なアクチベーターである。しかしながら、ＰＤＧＦがマトリックスメタロプロテイナーゼを活性化する機序およびＰＩ３Ｋ、ＰＫＢおよびＯＡ間の関係は解明されていない。
【０００４】
我々は、驚くべきことに、サイトカイン類、例えばインターロイキン−１(ＩＬ−１)およびオンコスタチンＭ(ＯＳＭ)に加えて、ＰＩ３ＫおよびＰＫＢが、ＯＡに伴う軟骨喪失においてある一定の役割を演じることを発見した。ＩＬ−１、ＯＳＭおよびＰＤＧＦは、ＰＩ３ＫおよびＰＫＢ経路を介してメタロプロテイナーゼ遺伝子発現を顕著にアップレギュレーションすることが示されている。すなわち、本発明は、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＰＩ３Ｋおよび／またはＰＫＢのモジュレーターおよび阻害剤を用いることにより、ＰＩ３Ｋ／ＰＫＢシグナリング経路の活性化を低減化し、次いでＡＧＧ−１およびＣＯＬ−３遺伝子発現の誘導を低減化することを意図するものである。ＯＡの病因におけるＡＧＧ−１およびＣＯＬ−３の破壊的役割を仮定すれば、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１およびＯＳＭおよびそれらのイソ型は、ＯＡまたはＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３のレベルの変化に伴う疾患についての新規薬剤標的として使用され得る。本発明はまた、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１およびＯＳＭ誘導ＡＧＧ−１およびＣＯＬ−３活性のモジュレーターおよび阻害剤の同定およびまたＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１およびＯＳＭ遺伝子発現のモジュレーターの同定方法および対象におけるＯＡの処置および／または予防についての上記モジュレーターの使用法を提供する。本発明はまた、モジュレーターの医薬組成物および上記医薬組成物についての使用法を提供する。
【０００５】
発明の要約
本発明は、インビトロおよびインビボでＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１およびＯＳＭがＡＧＧ−１およびＣＯＬ−３ ｍＲＮＡの誘導の増加をまねくという本発明者らの新規発見に基いている。本発明者らは、初めてＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１およびＯＳＭに起因するＡＧＧ−１およびＣＯＬ−３ ｍＲＮＡ誘導の増加についての証拠をもたらした。この発見は、ＰＩ３ＫおよびＰＫＢ阻害剤、ＬＹ２９４００２、およびＰＫＢの阻害性優位突然変異形態の使用により示されている。ＰＩ３ＫおよびＰＫＢアクチベーターＰＤＧＦによる、ヒト関節軟骨細胞におけるＡＧＧ−１およびＣＯＬ−３ ｍＲＮＡ活性化のレベルは、ＬＹ２９４００２およびＰＫＢの優位阻害性突然変異体の存在下で低減化された。さらに、ＩＬ−１およびＯＳＭは両方とも、ＰＤＧＦの場合よりも高いレベルのＡＧＧ−１およびＣＯＬ−３ ｍＲＮＡ誘導をもたらした。このＩＬ−１およびＯＳＭ「超誘導」により、非ＩＬ−１およびＯＳＭ誘導軟骨細胞の場合と比べＡＧＧ−１およびＣＯＬ−３ ｍＲＮＡのレベルが増加する結果となった。さらに、ＬＹ２９４００１および優位阻害性突然変異体の存在下でさえ、弱いレベルにではあるが、超誘導が維持される。すなわち、本発明者らは、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１およびＯＳＭのモジュレーターまたは阻害剤が、ＡＧＧ−１およびＣＯＬ−３発現および生成の低減化によるＯＡの処置に有用であり得ることを示している。ＯＡの病因におけるＡＧＧ−１およびＣＯＬ−３の破壊的役割を仮定すれば、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１およびＯＳＭおよびそれらのイソ型は、ＯＡに関する新規薬剤標的として使用され得る。すなわち、本発明では、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１およびＯＳＭおよびそれらのイソ型が、ＰＩ３ＫおよびＰＫＢ活性化およびＩＬ−１およびＯＳＭ誘導ＰＩ３ＫおよびＰＫＢ活性化によるＡＧＧ−１およびＣＯＬ−３の誘導を伴うことが以前には知られていなかった病的状態であるＯＡを処置、予防または改善するための治療薬の開発についての有用な薬剤標的であると考えられる。
【０００６】
すなわち、一態様において本発明は、変形性関節症の処置、予防または改善に有用なモジュレーターの同定方法であって、候補化合物が、ＰＩ３Ｋおよび／またはＰＫＢの酵素活性を改変または阻害するかまたはインビトロまたはインビボでＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１および／またはＯＳＭ遺伝子発現を改変または阻害し、それによって軟骨細胞におけるＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３製造の遺伝子発現をダウンレギュレーションし得るか否かを試験することを含む方法を提供するもので、ＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３タンパク質発現の改変は、化合物が潜在的治療価値を有し得ることを示している。
【０００７】
一実施態様において、本発明は、ＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３レベルの変化に伴うかまたはそれにより誘発される疾患の予防、処置または改善方法であって、それを必要とする対象にＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１またはＯＳＭを調節し、その調節を通じてＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３の発現を改変させ得る化合物の有効量を投与することを含む方法を提供する。
【０００８】
本発明の別の態様は、変形性関節症の予防、処置または改善方法であって、それを必要とする対象にＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１またはＯＳＭを調節し、その調節を通じてＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３の発現を改変させ得る化合物の有効量を投与することを含む方法に関するものである。
【０００９】
本発明のさらに別の態様は、変形性関節症の予防、処置または改善方法であって、それを必要とする対象にＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１またはＯＳＭを調節し、その調節を通じてＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３の発現を改変させ得る化合物の有効量を投与することを含む方法で、上記ＰＩ３Ｋモジュレーター、ＰＫＢモジュレーター、ＩＬ−１モジュレーターまたはＯＳＭモジュレーターが対象においてＰＩ３ＫおよびＰＫＢから選択される１種またはそれ以上のタンパク質の酵素活性を阻害する方法に関するものである。
【００１０】
別の実施態様において、本発明は、変形性関節症の予防、処置または改善方法であって、それを必要とする対象にＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１またはＯＳＭを調節し、その調節を通じてＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３の発現を改変させ得る化合物の有効量を投与することを含む方法で、上記ＰＩ３Ｋモジュレーター、ＰＫＢモジュレーター、ＩＬ−１モジュレーターまたはＯＳＭモジュレーターが対象においてＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１およびＣＯＬ−３から選択される１種またはそれ以上のタンパク質の遺伝子またはタンパク質発現を阻害する方法に関するものである。
【００１１】
既知ＰＩ３Ｋおよび／またはＰＫＢ阻害剤は、本明細書でＬＹ−２９００４２(２−(４−モルホリニル)−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オンとしても知られている)(Vlahos,CJ et al. J.Biol.Chem.(１９９４)２６９：７ ５２４１−５２４８)と称する、シグマ‐アルドリッチ(セントルイス、ミズーリ)から市販されている化合物を含む。ＡＧＧ−１およびＣＯＬ−３のレベルの低下として観察される驚くべき良好な結果に基づくと、この化合物を含む医薬組成物が、ＰＩ３Ｋおよび／またはＰＫＢを阻害し、この阻害を通じて軟骨細胞でＡＧＧ−１およびＣＯＬ−３ ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルを低下させるのに使用され得ることから、処置等を必要とする対象におけるＯＡの処置、予防または改善に有用であり得ると本発明では考えられる。
【００１２】
ＰＩ３Ｋおよび／またはＰＫＢ阻害剤、ＬＹ２４９００２ ２−(４−モルホリニル)−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オンが、ＡＧＧ−１またはコラゲナーゼ−３の発現を改変させるという発見は、新規であり、本発明の重要な態様を構成する。したがって、一実施態様において、本発明は、変形性関節症の予防、処置または改善方法であって、それを必要とする対象にＰＩ３ＫまたはＰＫＢを調節し、その調節を通じてＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３の発現を改変させ得る化合物の有効量を投与することを含み、上記ＰＩ３ＫモジュレーターまたはＰＫＢモジュレーターがＬＹ２４９００２ ２−(４−モルホリニル)−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン)の遊離または医薬上許容される塩形態である方法に関するものである。
【００１３】
本発明の別の態様は、ＰＩ３Ｋモジュレーター、ＰＫＢモジュレーター、ＩＬ−１モジュレーターまたはＯＳＭモジュレーターが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマーおよび二本鎖ＲＮＡから選択されるいずれか１種またはそれ以上の物質を含み、上記物質が、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３タンパク質の遺伝子発現を阻害するように設計されている、請求項２記載の方法に関するものである。
【００１４】
本発明のさらに別の態様は、アグリカナーゼ−１またはコラゲナーゼ−３のレベルの変化に伴うかまたはそれによって誘発される病気を処置するための医薬の製造を目的とするホスホ‐イノシチド３キナーゼまたはプロテインキナーゼＢを調節し得る化合物の使用に関するものである。好ましい実施態様では、化合物は、ホスホ‐イノシチド３キナーゼまたはプロテインキナーゼＢを阻害し得る。別の好ましい実施態様では、病気は変形性関節症である。特に好ましい実施態様では、ホスホ‐イノシチド３キナーゼまたはプロテインキナーゼＢを阻害し得る化合物は、２−(４−モルホリニル)−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン)である。
【００１５】
本発明の興味深い実施態様は、ヒトＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１および／またはＣＯＬ−３ポリペプチドまたはヒトＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１および／またはＣＯＬ−３ポリペプチドの一部分について高度選択的である抗体を含む医薬組成物に関するものである。これらのタンパク質に対する抗体は、対象においてこれらのタンパク質の凝集を誘発することから、酵素の活性を低減化させ得る。上記抗体はまた、例えば活性部位と直接相互作用することにより、または活性部位への基質の接近を遮断することにより酵素活性を減少させ得る。ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１および／またはＣＯＬ−３抗体はまた、これらのタンパク質の調節またはＰＩ３Ｋ／ＰＫＢ経路に関与し、酵素活性に必要であり得るタンパク質‐タンパク質相互作用を阻止することにより、これらのタンパク質の酵素活性を阻害するのに使用され得る。阻害活性を伴う抗体、例えば本明細書記載の抗体は、当業者によく知られた標準的検定法にしたがって製造および同定され得る。したがって、本発明の別の態様は、変形性関節症の予防、処置または改善方法であって、それを必要とする対象にＰＩ３ＫまたはＰＫＢを調節し、その調節を通じてＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３の発現を改変させ得る化合物の有効量を投与することを含む方法で、上記ＰＩ３ＫモジュレーターまたはＰＫＢモジュレーターが、ＰＩ３ＫまたはＰＫＢに対する１種またはそれ以上の抗体またはそのフラグメントを含むものであり、上記抗体またはそのフラグメントがＰＩ３ＫまたはＰＫＢから選択されるタンパク質の酵素活性を阻害し得る方法に関するものである。
【００１６】
本発明はまた、医薬組成物を用いてＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１またはＯＳＭを調節し、すなわち対象において発現されるＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３のレベルを修飾することにより対象において変形性関節症を予防または処置する方法を提供する。したがって、本発明の一態様は、変形性関節症の予防、処置または改善方法であって、それを必要とする対象にＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１またはＯＳＭを調節し、その調節を通じてＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３の発現を改変させ得る化合物の有効量を含む医薬組成物を投与することを含む方法に関するものである。
【００１７】
本発明の別の態様は、変形性関節症の予防、処置または改善方法であって、それを必要とする対象にＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１またはＯＳＭを調節し、その調節を通じてＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３の発現を改変させ得る化合物の有効量を含む医薬組成物を投与することを含む方法で、上記ＰＩ３Ｋモジュレーター、ＰＫＢモジュレーター、ＩＬ−１モジュレーターまたはＯＳＭモジュレーターが、対象においてＰＩ３ＫおよびＰＫＢから選択される１種またはそれ以上のタンパク質の酵素活性を阻害する方法に関するものである。
【００１８】
本発明のさらに別の態様は、変形性関節症の予防、処置または改善方法であって、それを必要とする対象にＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１またはＯＳＭを調節し、その調節を通じてＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３の発現を改変させ得る化合物の有効量を含む医薬組成物を投与することを含む方法で、上記ＰＩ３Ｋモジュレーター、ＰＫＢモジュレーター、ＩＬ−１モジュレーターまたはＯＳＭモジュレーターが、対象においてＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１およびＣＯＬ−３から選択される１種またはそれ以上のタンパク質の遺伝子またはタンパク質発現を阻害する方法に関するものである。
【００１９】
別の実施態様において、本発明は、変形性関節症の予防、処置または改善方法であって、それを必要とする対象にＰＩ３ＫまたはＰＫＢを調節し、その調節を通じてＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３の発現を改変させ得る化合物の有効量を含む医薬組成物を投与することを含む方法で、上記ＰＩ３ＫモジュレーターまたはＰＫＢモジュレーターが、ＬＹ２４９００２ ２−(４−モルホリニル)−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン)の遊離または医薬上許容される塩形態である方法に関するものである。
【００２０】
本発明の追加的実施態様は、変形性関節症の予防、処置または改善方法であって、それを必要とする対象にＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１またはＯＳＭを調節し、その調節を通じてＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３の発現を改変させ得る化合物の有効量を含む医薬組成物を投与することを含む方法で、上記ＰＩ３Ｋモジュレーター、ＰＫＢモジュレーター、ＩＬ−１モジュレーターまたはＯＳＭモジュレーターが、ＰＩ３ＫまたはＰＫＢに対する１種またはそれ以上の抗体またはそのフラグメントを含み、上記抗体またはそのフラグメントがＰＩ３ＫおよびＰＫＢから選択されるタンパク質の酵素活性を阻害し得る方法に関するものである。
【００２１】
本発明はまた、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１またはＯＳＭを阻害し、その阻害によってＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３の発現を改変するモジュレーターをスクリーニングまたは同定する方法を提供する。すなわち、上記モジュレーターは、変形性関節症の予防、処置または改善に有用である。したがって、本発明の別の態様は、変形性関節症の予防、処置または改善に有用なモジュレーターの同定方法であって、候補モジュレーターがＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１またはＯＳＭを阻害し、その阻害によってＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３の発現を改変するその能力について検定することを含む方法に関するものである。
【００２２】
慣用的スクリーニング検定法(インビトロおよびインビボの両方)は、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１またはＯＳＭタンパク質活性および／またはｍＲＮＡ発現を阻害する化合物の同定に使用され得る。タンパク質活性レベルは、慣用的酵素活性検定方法を用いて対象から採取した生物学的試料、例えば軟骨細胞ライゼートを用いて対象で検定され得る。遺伝子発現はまた、当業者によく知られた方法、例えば慣用的ノーザン分析または市販のガラスチップマイクロアレイを用いて測定され得る。タンパク質レベルは、本明細書記載の方法により、または公知方法、例えばイムノアッセイおよび電気泳動検定法により生物学的試料から測定され得る。
【００２３】
本明細書に開示された方法による分析用の候補化合物には、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１および／またはＯＳＭ阻害活性を有することが知られている化学的化合物並びにいかなるレベルにせよこれらのタンパク質に対する効果がまた特性確認されていない化合物が含まれる。本発明では、必ずしも特異的阻害活性をもつ化合物だけではなく、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１またはＯＳＭ阻害活性をもつ化合物であれば有用な治療薬であることが証明され得ると考えられる。
【００２４】
当業者であれば、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１またはＯＳＭに対する効果をもつ化合物の場所をつきとめるスクリーニング検定法が、当業者によく知られた技術を含み得ること、例えばインビトロ酵素活性検定法が慣用的方法を用いて使用され得ることを容易に理解できるはずである。さらに、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１および／またはＯＳＭの試験化合物の阻害効果およびそれによるＡＧＧ−１および／またはＣＯＬ−３レベルの改変は、ＡＧＧ−１および／またはＣＯＬ−３を検出するためのＥＬＩＳＡ抗体ベース検定法または蛍光標識反応検定法により検出され得る。これらの技術は、高スループットスクリーニングに容易に利用され得、当業者にも熟知されている。
【００２５】
スクリーニングまたは同定検定法で発見されるモジュレーターは、インビトロまたはインビボでの変形性関節症の動物モデルにおいてそれらの効果についてさらに確認され得、また同定されたモジュレーターがＯＡの動物モデルおよび／またはＯＡ罹患対象による臨床試験において観察される病理学的影響を除去するその能力についてもさらに検定され得る。したがって、本発明の一態様は、変形性関節症の予防、処置または改善に有用なモジュレーターの同定方法であって、候補モジュレーターがＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１またはＯＳＭを阻害し、その阻害によってＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３の発現を改変させるその能力について検定することを含む方法で、さらに同定されたＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１またはＯＳＭ阻害性モジュレーターが変形性関節症の動物モデルで観察される病理学的影響を除去するその能力について検定することを含む方法に関するものである。
【００２６】
本発明の別の態様は、変形性関節症の予防、処置または改善に有用なモジュレーターの同定方法であって、候補モジュレーターがＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１またはＯＳＭを阻害し、その阻害によってＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３の発現を改変させるその能力について検定することを含む方法で、上記モジュレーターがＰＩ３ＫおよびＰＫＢから選択される１種またはそれ以上のタンパク質の酵素活性を阻害する方法に関するものである。
【００２７】
本発明のさらに別の態様は、変形性関節症の予防、処置または改善に有用なモジュレーターの同定方法であって、候補モジュレーターが、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１またはＯＳＭを阻害し、その阻害によってＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３の発現を改変させるその能力について検定することを含む方法で、上記モジュレーターが、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１およびＣＯＬ−３から選択される１種またはそれ以上のタンパク質の遺伝子またはタンパク質発現を阻害する方法に関するものである。
【００２８】
また本発明によると、上記スクリーニングまたは同定検定法で発見されるモジュレーターは、活動性または発生期変形性関節症に罹患した対象の臨床試験でそれらの効果についてさらに確認され得るものとする。したがって、本発明のさらなる態様は、変形性関節症の予防、処置または改善に有用なモジュレーターの同定方法であって、候補モジュレーターがＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１またはＯＳＭを阻害し、その阻害によってＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３の発現を改変させるその能力について検定することを含む方法で、さらに同定された阻害性モジュレーターが変形性関節症に罹患した対象による臨床試験で観察される病理学的影響を除去する能力について検定することを含む方法に関するものである。
【００２９】
本発明の別の態様は、変形性関節症の予防、処置または改善に有用なモジュレーターの同定方法であって、候補モジュレーターがＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１またはＯＳＭを阻害し、その阻害によってＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３の発現を改変させるその能力について検定することを含む方法で、上記ＰＩ３Ｋモジュレーター、ＰＫＢモジュレーター、ＩＬ−１モジュレーターまたはＯＳＭモジュレーターが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマーおよび二本鎖ＲＮＡから選択されるいずれか１種またはそれ以上の物質を含み、上記物質が、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３タンパク質の遺伝子発現を阻害するように設計されている方法に関するものである。
【００３０】
別の実施態様において、本発明は、変形性関節症の予防、処置または改善に有用なモジュレーターの同定方法であって、候補モジュレーターがＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１またはＯＳＭを阻害し、その阻害によってＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３の発現を改変させるその能力について検定することを含む方法で、上記ＰＩ３Ｋモジュレーター、ＰＫＢモジュレーター、ＩＬ−１モジュレーターまたはＯＳＭモジュレーターが、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１またはＯＳＭに対する１種またはそれ以上の抗体またはそのフラグメントを含み、上記抗体またはそのフラグメントがＰＩ３ＫおよびＰＫＢから選択されるタンパク質の酵素活性を阻害し得る方法に関するものである。
【００３１】
本発明は、変形性関節症の予防、処置または改善を必要とする対象においてそれに有効な量でＰＩ３Ｋモジュレーター、ＰＫＢモジュレーター、ＩＬ−１モジュレーターまたはＯＳＭモジュレーターを含む医薬組成物を提供する。
【００３２】
本発明の別の態様は、変形性関節症の予防、処置または改善を必要とする対象においてそれに有効な量でＰＩ３Ｋモジュレーター、ＰＫＢモジュレーター、ＩＬ−１モジュレーターまたはＯＳＭモジュレーターを含む医薬組成物であって、上記モジュレーターがＰＩ３ＫおよびＰＫＢから選択される１種またはそれ以上のタンパク質の酵素活性を阻害する医薬組成物を提供する。
【００３３】
本発明のさらに別の態様は、変形性関節症の予防、処置または改善を必要とする対象においてそれに有効な量でＰＩ３Ｋモジュレーター、ＰＫＢモジュレーター、ＩＬ−１モジュレーターまたはＯＳＭモジュレーターを含む医薬組成物であって、上記モジュレーターが、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３から選択される１種またはそれ以上のタンパク質の遺伝子またはタンパク質発現を阻止する医薬組成物を提供する。
【００３４】
本発明の一実施態様は、変形性関節症の予防、処置または改善を必要とする対象においてそれに有効な量でＰＩ３ＫモジュレーターまたはＰＫＢモジュレーターを含む医薬組成物であって、上記モジュレーターが、ＬＹ２４９００２ ２−(４−モルホリニル)−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン)の遊離または医薬上許容される塩形態である医薬組成物に関するものである。
【００３５】
本発明の別の実施態様は、変形性関節症の予防、処置または改善を必要とする対象においてそれに有効な量でＰＩ３Ｋモジュレーター、ＰＫＢモジュレーター、ＩＬ−１モジュレーターまたはＯＳＭモジュレーターを含む医薬(組成物)であって、上記モジュレーターが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマーおよび二本鎖ＲＮＡから選択されるいずれか１種またはそれ以上の物質を含み、上記物質が、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３タンパク質の遺伝子発現を阻害するように設計されている医薬(組成物)に関するものである。
【００３６】
本発明のさらに別の実施態様は、変形性関節症の予防、処置または改善を必要とする対象においてそれに有効な量でＰＩ３Ｋモジュレーター、ＰＫＢモジュレーター、ＩＬ−１モジュレーターまたはＯＳＭモジュレーターを含む医薬組成物であって、上記モジュレーターが、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１またはＯＳＭに対する１種またはそれ以上の抗体またはそのフラグメントを含み、上記抗体またはそのフラグメントが、ＰＩ３ＫおよびＰＫＢから選択されるタンパク質の酵素活性を阻害し得る医薬組成物に関するものである。
【００３７】
本発明のポリヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリペプチドおよび抗体はまた、診断目的に使用され得る。例えば、慣用的方法にしたがって上記抗体を用いることにより、対象におけるＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３のレベルが定量され得る。レベルの増加はＯＡの重さの度合を示す。すなわち、様々なタンパク質レベルは、ＯＡの様々な臨床形態または重症度を示している。上記情報はまた、本発明モジュレーターによる処置に応答し得るかまたは応答し得ない関節炎を経験している患者のサブセットを同定するのに有用である。同様に、本発明では、対象におけるＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３のメッセージレベルの定量は、診断および適切なＯＡ治療の決定に有用であると考えられる。適切な対照個体と比べてＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３のｍＲＮＡレベルが高い対象は、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１および／またはＯＳＭ阻害剤による処置についての適切な候補であるとみなされる。
【００３８】
本発明によると、本発明のポリヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリペプチドおよび抗体を診断目的に使用することが可能となる。したがって、一実施態様において、本発明は、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１またはＯＳＭモジュレーターによる処置についての適切な候補であり得る活動性または発生期変形性関節症に罹患した対象の診断方法であって、上記対象からの生物学的試料においてＰＩ３Ｋ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１およびＣＯＬ−３のα、β、γおよびδイソ型の１種またはそれ以上から選択された物質のｍＲＮＡレベルを検定することを含む方法で、非変形性関節症対照レベルと比べてＰＩ３Ｋ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３のレベルが変化、例えば増加または減少した対象が、ＰＩ３Ｋモジュレーター、ＰＫＢモジュレーター、ＩＬ−１モジュレーター、またはＯＳＭモジュレーター処置に適切な候補である方法に関するものである。上記診断方法は、活動性または発生期変形性関節症対象を、上記ＰＩ３Ｋ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３のレベルが非変形性関節症対照生物学的試料で観察されるレベルと比べて変化した対象として同定するものと意図され得る。
【００３９】
本発明の別の態様は、発生期または活動性ＯＡについて診断される対象におけるＰＩ３Ｋのα、β、γおよびδイソ型の割合の検出を意図し、それを実現させるものである。例えば、ＰＩ３Ｋイソ型α、β、γおよびδに対する抗体は、対象におけるα、β、γおよびδイソ型の割合の検出に使用され得る。これらのイソ型の相互割合は、表６〜１０で示されている通り、正常な軟骨細胞におけるこれらのタンパク質の割合と比べて変形性関節症軟骨細胞では特有な形で変化している。関節軟骨細胞におけるこれらのタンパク質の割合と活動性または発生期ＯＡ罹患患者で見られるレベルの割合との比較は、臨床試験手順の一部としてＰＩ３ＫおよびＰＩ３Ｋイソ型、ＰＫＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１および／またはＣＯＬ−３レベルをモニターするために、例えば所定の治療プログラムの効力を測定するかまたは変形性関節症疾患の診断を補助するのに使用され得る。興味深いことに、軟骨細胞は、本明細書に記載されている変形関節症の関節から得られ、ＰＩ３Ｋ発現の誘導物質であるＰＤＧＦの存在下で培養され得る。次いで、ＰＩ３Ｋのα、β、γおよびδイソ型の検出は、例えばウエスタン・ブロッティング検出法を用いるかまたはイソ型に対する蛍光標識抗体を用いて遂行され得る。
【００４０】
別の態様において、本発明は、同定された阻害性物質が、一般的当業者によく知られている、ＯＡの動物モデルおよび／またはＯＡ罹患対象による臨床試験で観察される病理学的影響を除去する能力を評価し得る検定法を提供する。例えば、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１および／またはＯＳＭの阻害剤がＯＡにおける治療効力について試験され得る一動物モデルは、試験される動物が変形性関節症病変を自然発症することが知られている自然発症ＯＡモデルである。変形性関節症の自然発症動物モデルの一例は、ＳＴＲ／ｏｒｔマウスモデルに見出される。Mason,R.M.,et al.、“The STR/ort mouse and its Use as a Model of Osteoarthritis”(ＳＴＲ／ｏｒｔマウスおよび変形性関節症モデルとしてのその使用)、Osteoarthritis and Cartilage(２００１)９：８５−９１。変形性関節症の自然発症の追加的一例は、ダンキン・ハートレイモルモットに見出される。変形性関節症の自然発症動物モデルに関するダンキン・ハートレイモルモットの使用については、Jimenez,P.A. et al.、“Spontaneous Osteoarthritis in Dunkin Hartley guinea pigs:Histologic,Radiologic and Biochemical Changes”(ダンキン・ハートレイモルモットにおける自然発症変形性関節症：組織学的、放射線学的および生化学的変化)、Lab.Anim.Sci.(１９９７)２７：１３４−１４２に記載されている。
【００４１】
二重盲検プラセボまたは活性コンパレーター制御臨床試験はまた、本発明の阻害剤スクリーンにより発見された阻害剤の変形性関節症患者における効果を試験するように設計され得る。
【００４２】
発明の詳細な説明
略語
ＰＩ３Ｋ、ホスホイノシチド３−キナーゼ；
ＰＫＢ、プロテインキナーゼＢ；
ＩＬ−１、インターロイキン−１；
ＴＮＦ、腫瘍壊死因子；
ＯＡ、変形性関節症；
ＲＡ、慢性関節リウマチ；
ＡＧＧ−１、アグリカナーゼ−１；
ＣＯＬ−３、コラゲナーゼ−３；
ＰＤＧＦ、血小板由来増殖因子；
ＭＭＰ、マトリックスメタロプロテイナーゼ；
ＯＳＭ、オンコスタチンＭ；
ＧＡＰＤＨ、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ；
ＡＤＡＭＴＳ、トロンボスポンジンモチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ；
ＦＫＨＲ、横紋筋肉腫；
ＰＣＲ、ポリメラーゼ連鎖反応；
ＲＴ−ＰＣＲ、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応；
【００４３】
定義
本明細書に記載されている本発明では、記載された方法、プロトコールおよび試薬は、変わり得るため、特定のものに限定されないものとする。また、本明細書で使用されている用語は、実施態様を説明することのみを目的としており、いかなる意味にせよ本発明の範囲を限定するものではないことは明らかである。
【００４４】
特記しない場合、本明細書で使用されている技術および科学用語は全て、この発明が属する技術分野での当業者により一般的に理解されているのと同じ意味を有するものとする。本明細書に記載されているものと類似しているかまたはそれに匹敵する方法および材料でも本発明の実践または試験で使用され得るが、好ましい方法、装置および材料はここに記載されているものである。本明細書で挙げられている出版物は全て、本発明に関して使用され得る出版物に報告されている材料および方法を記載および開示する目的のために出典明示により援用する。
【００４５】
本発明を実践する際には、分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡにおける多くの慣用的技術が使用される。これらの技術は公知であり、例えば、Current Protocols in Molecular Biology、第１、２および３巻、１９９７(F.M.Ausubel編)、Sambrook et al.、１９８９、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク；DNA Cloning:A Practical Approach、第１および２巻、１９８５(D.N.Glover編)；Oligonucleotide Synthesis、１９８４(M.L.Gait編)；Nucleic Acid Hybridization、１９８５(HamesおよびHiggins)；Transription and Translation、１９８４(HamesおよびHiggins編)；Animal Cell Culture、１９８６(R.I.Freshney編)；Immobilized Cells and Enzymes、１９８６(ＩＲＬプレス)；Perbal、１９８４、A Practical Guide to Molecular Cloning;シリーズ、Methods in Enzymology(アカデミック・プレス、インコーポレイテッド)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells、１９８７(J.H.MillerおよびM.P.Calos編、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー)；およびMethods in Enzymology 第１５４巻および第１５５巻(それぞれWuおよびGrossman、およびWu編)に説明されている。
【００４６】
請求の範囲を含め、本明細書の英文テキストで使用されている単数形の冠詞「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上、他に明記されていない場合、複数形を包含する。すなわち、例えば「抗体(antibody)」といえば、１個またはそれ以上の抗体および当業者に公知のその均等内容物などを指すものとする。
【００４７】
「ベクター」分子は、異種核酸が挿入され得る核酸分子であり、その後それは適切な宿主細胞へ導入され得る。ベクターは、好ましくは１個またはそれ以上の複製起点、および組換え体ＤＮＡが挿入され得る１個またはそれ以上の部位を有する。ベクターは、ベクターを伴う細胞が伴わない細胞から選択され得る好都合な手段を有することが多く、例えばそれらは薬剤耐性遺伝子をコード化する。一般的なベクターには、プラスミド、ウイルスゲノムおよび(主に酵母および細菌で)「人工染色体」がある。
【００４８】
物質がＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３を「調節する」能力には、限定されるわけではないが、物質がこれらのタンパク質の酵素活性を阻害および／またはこれらのタンパク質の遺伝子発現を阻害する能力が含まれる。また、上記調節によると、他のタンパク質がこれらのタンパク質、例えば関連調節タンパク質またはＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３により修飾されるタンパク質と相互作用する能力がもたらされ得る。ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３の「モジュレーター」は、特にこれらのタンパク質または例えば関連調節タンパク質に対するこれらの効果を有し得る物質をいう。
【００４９】
同様に、本明細書で使用されている「アンタゴニスト」または「阻害剤」の語は、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１またはＯＳＭに結合したとき、これらのタンパク質の生物活性を遮断または調節することにより、軟骨または軟骨細胞においてＡＧＧ−１およびＣＯＬ−３をダウンレギュレーションする分子をいう。アンタゴニストおよび阻害剤は、タンパク質、核酸、炭水化物またはこれらのポリペプチドに結合する天然または合成的な他のあらゆる分子を含み得る。
【００５０】
本明細書で使用されている「核酸配列」は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、およびそのフラグメントまたは一部分、並びに一本または二本鎖であり、センスまたはアンチセンス鎖を表し得るゲノムまたは合成に基くＤＮＡまたはＲＮＡをいう。
【００５１】
本明細書で使用されている「アンチセンス」の語は、特異的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列と相補的であるヌクレオチド配列をいう。「アンチセンス鎖」の語は、「センス」鎖に相補的である核酸鎖に関して使用される。アンチセンス分子は、興味の対象である遺伝子(複数も可)を逆配向で相補鎖を合成させ得るウイルスプロモーターにライゲーションすることによる合成を含む任意の方法により生成され得る。一旦細胞へ導入されると、この転写された鎖は、細胞により生成された天然配列を合わせてデュプレックスを形成する。次いで、これらのデュプレックスは、さらなる転写または翻訳を遮断する。「負(の)」という表現はアンチセンス鎖に関して使用されることがあり、「正(の)」はセンス鎖に関して使用されることもある。
【００５２】
本明細書で意図されているところによると、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、ＲＮＡアプタマー、リボザイムおよび二本鎖ＲＮＡは、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３の核酸配列に指向されており、それによって選択されたこれらのタンパク質のヌクレオチド配列は、これらのタンパク質の遺伝子発現の遺伝子特異的阻害をもたらす。例えば、ＰＩ３Ｋヌクレオチド配列の知識は、ｍＲＮＡとの非常に強いハイブリダイゼーションをもたらすアンチセンス分子を設計するのに使用され得る。同様に、リボザイムは、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３の特異的ヌクレオチド配列を認識し、それらを開裂するように合成され得る(Cech.J.Amer.Med Assn.２６０：３０３０(１９８８))。遺伝子発現のターゲッティングされた阻害で使用される上記分子の設計技術は、当業者にはよく知られている。
【００５３】
「ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３」の語は、限定されるわけではないが、ヒトまたは他のいずれかの種に由来する、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３配列または上記のいずれかのフラグメントを含む変異型、部分形態、イソ型、前駆体形態、完全長ポリペプチド、融合タンパク質を含む、これらのポリペプチドのあらゆる形態全てをいう。ＰＩ３Ｋのイソ型には、ＰＩ３Ｋα、ＰＩ３Ｋβ、ＰＩ３ＫγおよびＰＩ３Ｋδがある。ヒトＰＩ３Ｋαの配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｚ２９０９０で見出され得る。ヒトＰＩ３Ｋβの配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｓ６７３３４で見出され得る。ヒトＰＩ３Ｋγの配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ８３３６８で見出され得る。ヒトＰＩ３Ｋδの配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｕ８６４５３で見出され得る。ネズミＰＫＢの配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ−００９６５２で見出される。ヒトインターロイキン−１ベータの配列は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ０００５６７で見出され得る。ヒトオンコスタチンＭの配列は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ０６５３９１で見出され得る。ヒトＡＧＧ−１の配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ａｆ１４８２１３で見出され得る。ヒトＣＯＬ−３の配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＭ−００６２７４で見出され得る。当業者にとっては明白なものである、これらのタンパク質のホモログ(相同体)およびヒトオルソログも、この定義に含まれるものとする。また、この語は、あらゆる種の天然に存する供給源、例えばゲノムＤＮＡライブラリーおよび発現系を含む遺伝子操作された宿主細胞から単離されるか、または例えば自動ペプチド合成装置を用いた化学合成、または上記方法の組合せにより製造されるこれらのタンパク質を包含するものと考えられる。上記ポリペプチドの単離および調製手段は、当業界では十分に理解されている。
【００５４】
本明細書で使用されている「試料」の語は、その最も広い意味で使用されている。対象からの生物学的試料は、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３酵素活性または遺伝子発現が検定され得る軟骨、血液、尿または他の生物学的材料を包含し得る。生物学的試料は、慣用的ガラスチップマイクロアレイ技術、例えばアフィメトリックスチップ、ＲＴ−ＰＣＲまたは他の慣用的方法を用いて遺伝子発現プロファイリング用に全ＲＮＡが精製され得る関節軟骨を含み得る。
【００５５】
本明細書で使用されている「抗体」の語は、エピトープ決定基と結合し得る無傷の分子並びにそのフラグメント、例えばＦａ、Ｆ(ａｂ')２、およびＦｖをいう。ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３ポリペプチドと結合する抗体は、免疫化抗原として興味の対象である小ペプチドを含む無傷のポリペプチドまたはフラグメントを用いて製造され得る。動物の免疫化に使用されるポリペプチドまたはペプチドは、ＲＮＡの翻訳から誘導されるかまたは化学的に合成され得、所望の場合担体タンパク質にコンジュゲートされ得る。ペプチドに化学的にカップリングされる常用担体には、ウシ血清アルブミンおよびチログロブリンがある。次いで、カップリングされたペプチドを用いて、動物(例、マウス、ラットまたはウサギ)を免疫化する。
【００５６】
本明細書で使用されている「ヒト化抗体」の語は、もとの結合能を保持しながらも、ヒト抗体により緊密に類似させるためにアミノ酸が非抗原結合領域で置換された抗体分子をいう。
【００５７】
「治療有効量」は、ＯＡの病理学的影響、例えば、限定はされないが、関節痛、関節の可動性および可動域の減少、非可動性または凍結関節、関節軟骨の進行性分解、および関節強度の減少を処置および／または改善するのに十分な薬剤の量である。
【００５８】
本明細書で使用されている「関連調節タンパク質」および「関連調節ポリペプチド」は、慣用的方法、例えば本明細書記載の方法を用いて当業者により同定され得るＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３の調節に関与するポリペプチドをいう。
【００５９】
ＯＡおよび「関連状態」は、限定はされないが、変形性関節症として医学的に定義可能または診断可能であるかまたは付随する合併症として医学的に同定可能な病状および状態または変形性関節症疾患の誘導形態であるかまたは随伴的続発症である状態を包含する。「発生期ＯＡ」は、変形性関節症の観察可能な軽い徴候、例えば関節痛および硬直故に診断可能であり得る変形性関節症の初期段階をいう。発生期ＯＡはまた、無症候性であるが、例えば変性関節間隙狭小化の証拠を示すｘ線などの手段、ＰＩ３Ｋおよび／またはそのイソ型のレベルの改変および／または増加についての関節軟骨細胞の生化学的検定法、およびＡＧＧ−１および／またはＣＯＬ−３レベルの改変および／または増加についての関節軟骨細胞の生化学的検定法により診断可能であることを特徴とし得る。「活動性ＯＡ」は、症候性であり、医学的に診断可能または医師により変形性関節症として明確に診断される関節炎疾患をいう。変形性関節症疾患は、発生期または活動性変形性関節症により誘発される状態または病状をいう。
【００６０】
「対象」および／または「患者」は、ヒトまたはヒト以外の生物体を全て包含する。
本明細書で使用されている「形質転換ベクター」は、転位因子技術を用いて生物体のゲノムにおける一片のＤＮＡの組込みを仲介するものをいい、当業者にはよく知られている。
【００６１】
本明細書で使用されている「候補化合物」および「化合物」の語は、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１またはＯＳＭに結合したときＰＩ３ＫまたはＰＫＢの生物活性を遮断または調節し、その結果ＡＧＧ−１および／またはＣＯＬ−３をダウンレギュレーションする分子をいう。候補化合物および化合物は、上記ポリペプチドに結合する天然または合成のタンパク質、核酸、炭水化物、または他の分子を含み得る。
【００６２】
発明の記載
マトリックス分解酵素ＡＧＧ−１およびＣＯＬ−３のレベルは、正常軟骨に対し変形性関節症軟骨では高くなっている。これらのＡＧＧ−１およびＣＯＬ−３プロテアーゼのレベルの変化は、変形性関節症の発病および進行の誘因であり得る。
【００６３】
本発明は、ＩＬ−１およびＯＳＭが、新しい独特な作用機序を通してＯＡを処置、予防または改善するための新規治療薬の開発に適切な標的であるという発見に関するものである。特に、本出願者らは、驚くべきことに、インビトロまたはインビボでＩＬ−１およびＯＳＭの酵素活性または遺伝子発現を改変、阻害または調節することにより、ＰＩ３Ｋおよび／またはＰＫＢ活性化ＡＧＧ−１および／またはＣＯＬ−３遺伝子および／またはタンパク質発現および／または分泌のダウンレギュレーションが誘導されるということを発見した。マトリックス分解酵素ＡＧＧ−１およびＣＯＬ−３のレベル増加は、ＯＡに関係している。したがって、ＩＬ−１およびＯＳＭの阻害剤は、ＡＧＧ−１およびＣＯＬ−３生産のＩＬ−１およびＯＳＭ介在ＰＩ３Ｋおよび／またはＰＫＢ活性化の新たに解明された介在機構によるＯＡの処置に有用な化合物として機能する。
【００６４】
本発明は、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１およびＯＳＭ活性化により、ＡＧＧ−１およびＣＯＬ−３の発現および／または生産が誘導されるという発見に基いている。ＯＡの病因におけるＡＧＧ−１およびＣＯＬ−３の破壊的役割を考慮すれば、ＰＩ３ＫおよびＰＫＢおよびそのイソ型は、ＯＡに関する新規薬剤標的として使用され得る。すなわち、本発明では、ＰＩ３ＫおよびＰＫＢは、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１およびＯＳＭ活性化によるＡＧＧ−１およびＣＯＬ−３の活性化を伴うことが以前には知られていなかった病的状態である、ＯＡを処置、予防または改善するための治療薬の開発に有用な薬剤標的であると考えられる。
【００６５】
一実施態様において、本発明は、ＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３のレベルの改変に伴うかまたはそれにより誘発される疾患の予防、処置または改善方法を提供する。この実施態様は、ＡＧＧ−１および／またはＣＯＬ−３のレベルの増加に伴う疾患に罹患した可能性がある対象または患者に、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１またはＯＳＭ遺伝子および／またはタンパク質を調節し、例えば限定されるわけではないがこれらの物質の関節レベルを増加または減少させ、その調節を通じてＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３の遺伝子および／またはタンパク質発現および／または分泌を改変させ得る化合物の有効量を投与することを含む。上記の投与されるＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１および／またはＯＳＭ調節性化合物については、ＡＧＧ−１および／またはＣＯＬ−３遺伝子および／またはタンパク質のレベルを低減化し、対象または患者における関連した病的状態の改善を導くことを意図している。意図された病状の改善は、例えば、限定されるわけではないが、罹患身体組織におけるＡＧＧ−１および／またはＣＯＬ−３遺伝子および／またはタンパク質レベルを測定する検定法による生化学的検出を含む方法または病気の徴候の主観的改善により立証され得る。
【００６６】
ＡＧＧ−１および／またはＣＯＬ−３のレベル増加は、ＯＡと相互に関連している。したがって、本発明の別の態様は、変形性関節症の予防、処置または改善方法であって、それを必要とする対象に、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１および／またはＯＳＭ遺伝子および／またはタンパク質を調節し、例えば限定されるわけではないが、これらの物質の関節レベルを増加または減少させ、そしてその調節を通じてＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３の遺伝子および／またはタンパク質発現および／または分泌を改変させ得る化合物の有効量を投与することによる方法に関するものである。この実施態様は、活動性または発生期ＯＡに罹患した可能性のある対象または患者に、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１またはＯＳＭを調節し、その調節を通じてＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３のレベルを改変させ得る化合物の有効量を投与することを含む。上記の投与されるＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１および／またはＯＳＭ調節性化合物については、ＡＧＧ−１および／またはＣＯＬ−３遺伝子および／またはタンパク質のレベルを低減化し、対象または患者におけるＯＡの改善を導くことを意図している。ＯＡの改善は、例えば、限定されるわけではないが、関節軟骨細胞におけるＡＧＧ−１および／またはＣＯＬ−３レベルを測定する検定法による生化学的検出を含む方法またはＯＡの徴候の主観的改善により立証され得る。
【００６７】
ＯＡの予防、処置または改善はまた、ＰＩ３Ｋおよび／またはＰＫＢの酵素活性を低減化または阻害することを特異的に意図されたＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１および／またはＯＳＭモジュレーターの投与を通じてＡＧＧ−１および／またはＣＯＬ−３レベルを低減化することにより達成され得るとも考えられる。したがって、本発明の別の態様は、変形性関節症の予防、処置または改善方法であって、発生期または活動性ＯＡに罹患した対象に、ＰＩ３ＫまたはＰＫＢ酵素活性を阻害し得る化合物の有効量を投与する方法に関するものである。さらにＰＩ３Ｋおよび／またはＰＫＢ酵素活性の阻害は、ＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３の遺伝子発現またはタンパク質レベルを低下させることにより、罹患個体においてＯＡの改善を導くことを目的とする。上記処置を施された対象における発生期または活動性ＯＡの改善は、関節軟骨細胞におけるＡＧＧ−１および／またはＣＯＬ−３レベルを測定する検定法またはＯＡの徴候における主観的改善によりモニターされ得る。
【００６８】
別の興味深い実施態様において、本発明は、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１および／またはＣＯＬ−３の遺伝子および／またはタンパク質発現を阻害することによる変形性関節症の予防、処置または改善方法に関するものである。この方法は、発生期または活動性変形性関節症に罹患した対象に、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１およびＣＯＬ−３の遺伝子またはタンパク質のいずれかの阻害を目的とするＰＩ３ＫモジュレーターまたはＰＫＢモジュレーターである化合物の有効量を投与することを含む。したがって、この実施態様におけるＰＩ３Ｋモジュレーター、ＰＫＢモジュレーター、ＩＬ−１モジュレーターおよび／またはＯＳＭモジュレーターの効果は、本発明で確認された罹患経路と相関関係を示す４タンパク質、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１およびＣＯＬ−３のいずれかまたは全ての遺伝子および／またはタンパク質発現を阻害し得ることであると考えられる。
【００６９】
ＰＩ３Ｋおよび／またはＰＫＢ阻害剤がＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３の発現を改変するという発見は新規であり、本発明の重要な態様を構成する。公知ＰＩ３Ｋおよび／またはＰＫＢ阻害剤は、本明細書でＬＹ２９００４２(２−(４−モルホリニル)−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オンとしても知られている)(Vlahos,CJ et al. J.Biol.Chem.(１９９４)２６９：７ ５２４１−５２４８)と称され、シグマ‐アルドリッチ(セントルイス、ミズーリ)から市販されている化合物を含む。ＡＧＧ−１およびＣＯＬ−３のレベルの低下として観察される、驚くべき良好な結果に基づくと、本発明では、この化合物の遊離または医薬上許容される塩類を含む医薬組成物を用いることにより、ＰＩ３Ｋおよび／またはＰＫＢを阻害し、この阻害を通じて軟骨および／または軟骨細胞におけるＡＧＧ−１およびＣＯＬ−３ ｍＲＮＡ遺伝子および／またはタンパク質レベルを低減化させ得ると考えられる。したがって、ＬＹ２９４００２塩基またはその塩類は、ＰＩ３Ｋおよび／またはＰＫＢの阻害およびそれに応じた罹患身体組織におけるＡＧＧ−１および／またはＣＯＬ−３レベルの低減化により対象においてＯＡを処置、予防または改善するのに有用である。
【００７０】
ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１および／またはＣＯＬ−３の遺伝子発現の調節は、対象においてこれらの物質のレベルに相応じて影響を及ぼす。したがって、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１および／またはＯＳＭの遺伝子発現の調節に指向されたある種の生物学的ツールはまた、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１および／またはＣＯＬ−３の遺伝子発現を阻害し得ると考えられる。遺伝子発現を阻害する上記生物学的ツールは、ＯＡの処置に有用である。したがって、本発明の別の興味深い態様は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマーおよび二本鎖ＲＮＡのいずれか１種またはそれ以上を含むＰＩ３Ｋモジュレーター、ＰＫＢモジュレーター、ＩＬ−１モジュレーター、ＯＳＭモジュレーターを使用し、その場合これらの物質は、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３タンパク質の遺伝子発現を阻害し、発生期または活動性ＯＡに罹患した対象に有益なものとなるように設計されている。
【００７１】
ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１および／またはＯＳＭまたは関連調節タンパク質に対する適切な抗体は、１種またはそれ以上の差次的発現遺伝子エピトープを特異的に認識し得る。上記抗体には、限定されるわけではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(ｍＡｂ)、ヒト化またはキメラ抗体、１本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ(ａｂ')２フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーにより生成されたフラグメント、抗イディオタイプ(抗Ｉｄ)抗体、および上記のいずれかのエピトープ結合性フラグメントが含まれ得る。
【００７２】
本明細書で検討されているポリペプチドに対する抗体を製造するため、様々な宿主動物がポリペプチドまたはその一部分の注射により免疫化され得る。上記宿主動物には、限定されるわけではないが、少し例を挙げれば、ウサギ、マウスおよびラットが含まれ得る。宿主の種によって、免疫応答を高めるために様々なアジュバントが使用され得、例えば、限定されるわけではないが、フロイントアジュバント(完全および不完全)、無機ゲル、例えば水酸化アルミニウム、表面活性物質、例えばリソレシチン、プルロニックポリオール類、ポリアニオン類、ペプチド類、油性エマルジョン類、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールおよび潜在的に有用なヒトアジュバント、例えばＢＣＧ(カルメッテ‐グエリン(Calmette‐Guerin)菌)およびコリネバクテリウム・パルブム(Corynebacterium parvum)が挙げられ得る。
【００７３】
ポリクローナル抗体は、抗原、例えば標的遺伝子産物またはその抗原性機能的誘導体により免疫化された動物の血清から誘導された抗体分子の異種集団である。ポリクローナル抗体を製造するため、宿主動物、例えば上記のものは、同じく上記のアジュバントを補ったポリペプチドまたはその一部の注射により免疫化され得る。
【００７４】
特定抗原に対する抗体の均一集団であるモノクローナル抗体は、培養中の連続セルラインにより抗体分子を製造させる技術により得られる。これらの例としては、限定されるわけではないが、KohlerおよびMilsteinのハイブリドーマ技術(１９７５、Nature ２５６：４９５−４９７；および米国特許第４３７６１１０号)、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kosbor et al.、１９８３、Immunology Today ４：７２；Cole et al.、１９８３、Proc.Natl.Acad.Sci.USA ８０：２０２６−２０３０)、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術(Cole et al.、１９８５、Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy、Alan R.Liss,Inc.、７７−９６頁)がある。上記抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびそれらのサブクラスを含むいずれかの免疫グロブリンクラスに属し得る。この発明のｍＡｂを生産するハイブリドーマは、インビトロまたはインビボで培養され得る。インビボで高力価のｍＡｂが生産されるため、これは現時点では好ましい製造方法である。
【００７５】
さらに、適切な生物活性を有するヒト抗体分子からの遺伝子と一緒に適切な抗原特異性のマウス抗体分子からの遺伝子をスプライシングすることによる「キメラ抗体」を製造するために開発された技術(Morrison et al.、１９８４、Proc.Natl.Acad.Sci.、８１：６８５１−６８５５；Neuberger et al.、１９８４、Nature、３１２：６０４−６０８；Takeda et al.、１９８５、Nature、３１４：４５２−４５４)が使用され得る。キメラ抗体は、種々の部分が異なる動物種から誘導された分子で、例えばネズミｍＡｂから誘導された可変または超可変域およびヒト免疫グロブリン定常域を有するものがある。
【００７６】
別法として、１本鎖抗体の製造について報告された技術(米国特許第４９４６７７８号；Bird、１９８８、Science ２４２：４２３−４２６；Huston et al.、１９８８、Proc.Natl.Acad.Sci.USA ８５：５８７９−５８８３；およびWard et al.、１９８９、Nature ３３４：５４４−５４６)は、差次的発現遺伝子−１本鎖抗体の製造に適合化され得る。１本鎖抗体は、アミノ酸架橋を介してＦｖ領域の重および軽鎖フラグメントを結合して１本鎖ポリペプチドを生成することにより形成される。
【００７７】
非常に好ましくは、「ヒト化抗体」の製造に有用な技術は、本明細書に開示されたポリペプチド、フラグメント、誘導体および機能的均等内容物に対する抗体の製造に適合化され得る。上記技術は、米国特許第５９３２４４８、５６９３７６２、５６９３７６１、５５８５０８９、５５３０１０１、５９１０７７１、５５６９８２５、５６２５１２６、５６３３４２５、５７８９６５０、５５４５５８０、５６６１０１６および５７７０４２９号に開示されており、これらは全て出典明示により援用する。
【００７８】
特異的エピトープを認識する抗体フラグメントは、公知技術により生成され得る。例えば、上記フラグメントには、限定されるわけではないが、抗体分子のペプシン消化により生成され得るＦ(ａｂ')２フラグメントおよびＦ(ａｂ')２フラグメントのジスルフィド架橋の還元により生成され得るＦａｂフラグメントがある。別法として、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築することにより(Huse et al.、１９８９、Science、２４６：１２７５−１２８１)、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントが迅速かつ容易に同定され得る。
【００７９】
本明細書記載の抗体の検出は、標準ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ分析、およびインビトロまたはインビボで使用される標準イメージング技術を用いて達成され得る。検出は、抗体を検出可能物質にカップリング(すなわち、物理的結合)することにより簡易化され得る。検出可能物質の例には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光性物質、ルミネセンス物質、生物発光物質および放射性物質がある。適切な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、(３−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼがある。適切な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンがある。適切な蛍光性物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリスリンがある。ルミネセンス物質の一例にはルミノールがある。生物発光物質の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンがあり、適切な放射性物質の例には、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈがある。
【００８０】
検出の容易さについて特に好ましいのは、サンドイッチ検定法であり、それには若干の変形が存在し、それらも全て本発明に包含されるものとする。例えば、典型的なフォワード検定法では、非標識抗体を固体基質に固定し、試験すべき試料を結合分子と接触させる。適切なインキュベーション期間後、十分な時間をおいて抗体−抗原二元複合体を形成させる。この時点で、検出可能なシグナルを誘導し得るリポーター分子で標識した二次抗体を加え、インキュベーションし、十分な時間をもうけることにより、抗体−抗原−標識抗体の三元複合体を形成させる。未反応物質があれば洗い流し、シグナルの観察により抗原の存在を測定するか、または既知量の抗原を含有する対照試料と比較することにより定量し得る。フォワード検定法に関する変形には、試料および抗体の両方を同時に結合抗体に加える同時検定法、または標識抗体および試験すべき試料を最初に合わせ、インキュベーションし、非標識表面結合抗体に加えるリバース検定法がある。これらの技術は当業者にはよく知られており、小さな変形の可能性についても容易に理解されるはずである。本明細書で使用されている「サンドイッチ検定法」は、基本的２部位技術に関する変形も全て包含するものとする。本発明のイムノアッセイの場合、唯一の制限因子は、標識抗体がＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１またはＯＳＭポリペプチドまたは関連調節タンパク質に特異的な抗体またはそのフラグメントであることである。
【００８１】
このタイプの検定法で最も一般的に使用されるリポーター分子は、酵素、発蛍光団または放射性核種含有分子である。酵素免疫検定法の場合、通常グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸手段により酵素を二次抗体にコンジュゲートする。しかしながら、容易に認められる通り、広く多様な種々のライゲーション技術が存在し、それらは当業者に熟知されている。常用酵素としては、特に西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ‐ガラクトシダーゼおよびアルカリ性ホスファターゼが挙げられる。特異的酵素と共に使用される基質は、一般的に対応する酵素による加水分解時に、検出可能な色の変化を生じるように選択される。例えば、ｐ−ニトロフェニルリン酸は、アルカリ性ホスファターゼコンジュゲートとの使用に適切である。ペルオキシダーゼコンジュゲートの場合、１,２−フェニレンジアミンまたはトルイジンが常用される。また、上記の色素原基質ではなく蛍光生成物を生じる蛍光性基質を使用することも可能である。次いで、適切な基質を含む溶液を三元複合体に加える。基質は、二次抗体に結合された酵素と反応することにより、定性的視覚的シグナルを生じ、これはさらに通常分光光度計により定量され、血清試料中に存在する興味の対象であるポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントの量の評価を与え得る。
【００８２】
別法として、蛍光性化合物、例えばフルオレセインおよびローダミンは、結合能を変えることなく抗体に化学的にカップリングされ得る。特定波長の光線で照明することにより活性化されると、蛍光色素標識抗体は光エネルギーを吸収し、分子において励起状態を誘導し、特徴的な長い波長の光線を放射する。この放射は、光学顕微鏡で視覚的に検出され得る特徴的な色として現れる。免疫蛍光およびＥＩＡ技術は、両方とも当業界では十分に確立されており、本発明方法には特に好ましい。しかしながら、他のリポーター分子、例えば放射性同位元素、化学発光または生物発光分子もまた使用され得る。当業者にとって、要求される使用法に合わせるためにいかに手順を変えるべきかは一目瞭然のはずである。
【００８３】
同様に、阻害は、「三重らせん」塩基対合方法を用いて達成され得る。三重らせん対合は、それがポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合にとって十分な程度に開裂する二重らせんの能力の阻害を誘発するために有用である。三重らせんＤＮＡを用いた最近の治療技術の進歩については文献に記載されている(Gee,J.E.et al.(１９９４)Huber,B.E.およびB.I.Carr、Molecular and Immunologic Approaches、フツーラ・パブリッシング・カンパニー、マウントキスコ、ニューヨーク)。また、これらの分子は、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによりｍＲＮＡの翻訳を遮断するように設計され得る。
【００８４】
リボザイム、すなわち酵素的ＲＮＡ分子はまた、ＲＮＡの特異的開裂を触媒することにより遺伝子発現を阻害するのに使用され得る。リボザイム作用機序は、相補的標的ＲＮＡとのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーション、それに続くエンドヌクレアーゼ加水分解的開裂を含む。使用され得る例には、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１、ＣＯＬ−３またはそのアップレギュレーションに関与する様々な調節タンパク質についてのポリペプチドの遺伝子をコード化する配列のエンドヌクレアーゼ加水分解的開裂を特異的かつ有効に触媒するように設計され得る「ハンマーヘッド」または「ヘアピン」モチーフリボザイム分子がある。
【００８５】
以下の配列：ＧＵＡ、ＧＵＵおよびＧＵＣを含むリボザイム開裂部位について標的分子を走査することにより、潜在的ＲＮＡ標的内にある特異的リボザイム開裂部位が最初に同定される。一旦同定されると、開裂部位を含む標的遺伝子の領域に対応する１５および２０間のリボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列が、オリゴヌクレオチドを作動不可能にし得る二次構造的特徴について評価され得る。また、候補標的の適合性は、リボヌクレアーゼ保護検定法を用いることにより相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションへの接近性を試験することにより評価され得る。
【００８６】
リボザイム方法は、リボザイムへの細胞の暴露または上記小ＲＮＡリボザイム分子の細胞における発現の誘導を含む(GrassiおよびMarini、１９９６、Annals of Medicine ２８：４９９−５１０；Gibson、１９９６、Cancer and Metastasis Reviews １５：２８７−２９９)。本明細書で検討されている遺伝子の少なくとも１つに対応するｍＲＮＡにターゲッティングされたハンマーヘッドおよびヘアピンリボザイムの細胞内発現を用いることにより、遺伝子によりコード化されたタンパク質が阻害され得る。
【００８７】
リボザイムは、リボザイム配列を組込んだＲＮＡオリゴヌクレオチドの形態で直接細胞へ送達されるか、または所望のリボザイムＲＮＡをコード化する発現ベクターとして細胞へ導入され得る。リボザイムは、ｍＲＮＡを開裂し、それによって細胞においてｍＲＮＡ存在量を修飾する上で触媒的に有効であるのに十分な量で常用手順によりインビボ発現され得る(Cotten et al.、１９８９、EMBO J. ８：３８６１−３８６６)。特に、慣用的公知規則に従って設計され、例えば標準ホスホルアミダイト化学作用により合成されるリボザイムコーディングＤＮＡ配列は、ｔＲＮＡをコード化する遺伝子のアンチコドンステムおよびループにおける制限酵素部位へライゲーションされ得、次いでそれは当業界における常法により興味の対象である細胞へ形質転換され、そこで発現され得る。また、好ましくは誘導性プロモーター(例、グルココルチコイドまたはテトラサイクリン応答エレメント)をこの構築物へ導入することにより、リボザイム発現は選択的に制御され得る。飽和的使用の場合、高度構成的活性プロモーターが使用され得る。ｔＤＮＡ遺伝子(すなわち、ｔＲＮＡをコード化する遺伝子)は、サイズが小さく、転写速度が速く、異なる種類の組織で遍在的に発現されるため、この適用において有用である。
【００８８】
したがって、リボザイムは、事実上いかなるｍＲＮＡ配列でも開裂するように常用手順で設計され得、細胞は、制御可能で触媒的有効量のリボザイムが発現されるように上記リボザイム配列をコードするＤＮＡにより常用手順で形質転換され得る。したがって、細胞における事実上あらゆるＲＮＡ種の存在量が修飾または摂動され得る。
【００８９】
リボザイム配列は、アンチセンスヌクレオチドについて記載した方法と本質的に同じ方法で修飾され得、例えばリボザイム配列は修飾塩基部分を含み得る。
【００９０】
ＲＮＡアプタマーはまた、細胞へ導入または細胞で発現されることにより、ＲＮＡ存在量または活性を修飾し得る。ＲＮＡアプタマーは、タンパク質、例えばＴａｑおよびＲｅｖ ＲＮＡ(Good et al.、１９９７、Gene Therapy ４：４５−５４)に特異的なＲＮＡリガンドであり、それらの翻訳を特異的に阻害し得る。
【００９１】
遺伝子発現の遺伝子特異的阻害はまた、慣用的二本鎖ＲＮＡ技術を用いて達成され得る。上記技術の記載は、国際公開第９９／３２６１９号において見出され、それについては出典明示で援用する。
【００９２】
本発明のアンチセンス分子、三重らせんＤＮＡ、ＲＮＡアプタマーおよびリボザイムは、核酸分子の合成に関する当業界で公知の方法により製造され得る。これらの例には、オリゴヌクレオチドの化学合成、例えば固相ホスホルアミダイト化学合成技術がある。別法として、ＲＮＡ分子は、本明細書で検討されているポリペプチドの遺伝子をコード化するＤＮＡ配列のインビトロおよびインビボ転写により生成され得る。上記ＤＮＡ配列は、適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーター、例えばＴ７またはＳＰ６と共に広く多様なベクターへ組込まれ得る。別法として、アンチセンスＲＮＡを構成的または誘導的に合成するｃＤＮＡ構築物は、セルライン、細胞または組織へ導入され得る。
【００９３】
ベクターは、多くの利用可能な手段により細胞または組織へ導入され得、インビボ、インビトロまたはエクスビボで使用され得る。エクスビボ治療の場合、ベクターは、患者から採取された幹細胞へ導入され、同じ患者へオートロガス移植として戻すためにクローン増殖され得る。トランスフェクションおよびリポソーム注入による送達は、当業界で公知の方法を用いて達成され得る。
【００９４】
本発明では、ＯＡの処置方法として、例えば、関連調節タンパク質またはＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１、ＣＯＬ−３により修飾されるタンパク質についての遺伝子の機能および／または発現が、慣用的方法に従って、例えば、これらのタンパク質に対する抗体を設計および／または上記タンパク質についての遺伝子に対してターゲッティングされた阻害性アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイムおよびＲＮＡアプタマーを設計することにより阻害され得ると考えられる。また、ＯＡ処置用の上記阻害性物質を含む医薬組成物も考えられる。
【００９５】
本発明の興味深い実施態様は、ヒトＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１および／またはＣＯＬ−３ポリペプチドまたはヒトＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１および／またはＣＯＬ−３ポリペプチドの一部分について高度選択的である抗体を含む医薬組成物に関するものである。これらのタンパク質に対する抗体は、対象においてこれらのタンパク質の凝集を誘発することにより、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＡＧＧ−１および／またはＣＯＬ−３酵素の活性を低下させ得る。上記抗体はまた、例えば、活性部位と直接相互作用することにより、または活性部位への基質の接近を遮断することにより酵素活性を減少させ得る。ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１および／またはＯＳＭ抗体はまた、これらのタンパク質の調節またはＰＩ３Ｋ／ＰＫＢ経路に関与し、酵素活性に必要であり得るタンパク質‐タンパク質相互作用を阻止することによりこれらのタンパク質の酵素活性を阻害するのに使用され得る。阻害活性をもつ抗体、例えば本明細書記載のものは、当業者によく知られた標準的検定法にしたがって製造および同定され得る。したがって、本発明の別の態様は、変形性関節症の予防、処置または改善方法であって、ＯＡ罹患対象に、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１、および／またはＯＳＭに対する抗体または活性抗体フラグメントの有効量を投与することによる方法に関するものである。かくして使用される抗体は、ＰＩ３ＫおよびＰＫＢの酵素活性を阻害し、それに応じてＡＧＧ−１および／またはＣＯＬ−３のレベルを低下させることを意図したものである。
【００９６】
本発明の医薬組成物は、核酸レベルでＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１および／またはＯＳＭの発現を阻害する物質を含み得る。上記分子には、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１、ＣＯＬ−３または核酸または興味の対象である関連調節ポリペプチドの適切なヌクレオチド配列に指向されたリボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、ＲＮＡアプタマーおよび／または二本鎖ＲＮＡが含まれる。これらは、過度の負担または実験を伴わずとも当業者により慣用的技術を用いて生成され得る。例えば、遺伝子発現の修飾(例、阻害)は、本明細書で検討されたポリペプチドをコード化する遺伝子の制御領域、すなわちプロモーター、エンハンサーおよびイントロンに対しアンチセンス分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを設計することにより得られる。例えば、転写開始部位、例えば開始部位から−１０位と＋１０位の間から誘導されるオリゴヌクレオチドが使用され得る。それにもかかわらず、遺伝子の全領域を用いてアンチセンス分子を設計することにより、ｍＲＮＡと非常に強いハイブリダイゼーションをもたらすものが生成され得、上記の適切なアンチセンスオリゴヌクレオチドが当業者によく知られた標準検定手順により製造および同定され得る。
【００９７】
本発明はまた、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１またはＯＳＭを阻害し、その阻害を通じてＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３の発現を改変するモジュレーターのスクリーニングまたは同定方法を提供する。すなわち上記モジュレーターは、変形性関節症の予防、処置または改善に有用である。したがって、本発明の別の態様は、変形性関節症の予防、処置または改善に有用なモジュレーターの同定方法であって、候補モジュレーターがＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１またはＯＳＭを阻害し、その阻害を通じてＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３の発現を改変する能力について検定することを含む方法に関するものである。
【００９８】
慣用的スクリーニング検定法(インビトロおよびインビボの両方)は、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１およびＯＳＭタンパク質活性および／またはｍＲＮＡ発現を阻害する化合物を同定するのに使用され得る。タンパク質活性レベルは、慣用的酵素活性検定方法を用い、対象からの生物学的試料、例えば軟骨細胞の細胞ライゼートを用いて対象において検定され得る。遺伝子発現はまた、当業者によく知られた方法、例えば慣用的ノーザン分析または市販のガラスチップマイクロアレイを用いて測定され得る。タンパク質レベルは、本明細書記載の方法または任意の公知方法、例えばイムノアッセイおよび電気泳動検定法により生物学的試料から測定され得る。
【００９９】
本明細書に開示された方法による分析用の候補化合物には、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１および／またはＯＳＭ阻害活性を有することが知られている化学的化合物およびいかなるレベルにせよこれらのタンパク質に対するその効果がまだ特性確認されていない化合物が含まれる。本発明では、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１および／またはＯＳＭ阻害活性有する化合物であれば、必ずしも特異的阻害活性を有するものに限るわけではなく、有用な治療薬であると証明され得ると考えられる。
【０１００】
ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１および／またはＯＳＭに対する効果を有する化合物の位置を確認するスクリーニング検定法が、当業者に常用される技術を含み得、例えば、インビトロ活性検定法が慣用的方法を用いて使用され得ることは、当業者には容易に理解できるはずである。さらに、試験化合物のＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１および／またはＯＳＭの阻害およびそれによるＡＧＧ−１および／またはＣＯＬ−３レベルの改変効果は、ＡＧＧ−１および／またはＣＯＬ−３の検出についてのＥＬＩＳＡ抗体ベース検定法または蛍光標識反応検定法で検出され得る。これらの技術は、高スループットスクリーニングについて容易に利用され得、当業者にはよく知られている。
【０１０１】
モジュレーターは、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１および／またはＯＳＭのレベルに対する明確な効果を有し得るが、上記モジュレーターが相応じてＡＧＧ−１および／またはＣＯＬ−３のレベルを低下させる場合でも、必ずしもＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１および／またはＯＳＭを阻害するわけではない。上記モジュレーターはＰＩ３Ｋイソ型の活性化状態および経路を改変し得るため、調節されたＰＩ３Ｋおよび／またはＰＫＢ酵素活性または調節されたＩＬ−１またはＯＳＭ活性がＡＧＧ−１および／またはＣＯＬ−３の刺激を誘導することはない。したがって、本発明の別の態様は、変形性関節症の予防、処置または改善に有用なＰＩ３Ｋおよび／またはＰＫＢモジュレーターの同定方法であって、候補モジュレーターがＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１またはＯＳＭを阻害し、その阻害を通じてＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３の発現を改変させる能力について検定することを含む方法に関するものである。
【０１０２】
スクリーニングまたは同定検定法で発見されるモジュレーターは、インビトロまたはインビボで変形性関節症の動物またはヒト臨床モデルにおけるそれらの効果についてさらに証明され得、また同定されたモジュレーターがＯＡの動物モデルおよび／またはＯＡ罹患対象による臨床試験で観察される病理学的影響を除去する能力についてもさらに検定され得る。したがって、本発明の一実施態様は、変形性関節症の予防、処置または改善に有用なスクリーニングまたは同定検定法で同定されるＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１および／またはＯＳＭのさらなる試験方法であって、同定されたＰＩ３Ｋモジュレーター、ＰＫＢモジュレーター、ＩＬ−１モジュレーターおよび／またはＯＳＭモジュレーターが相応じてＡＧＧ−１および／またはＣＯＬ−３遺伝子および／またはタンパク質発現に影響する能力について、動物モデルまたはＯＡ罹患対象による臨床試験で観察される病理学的影響を除去するそれらの能力について検定することを含む方法に関するものである。
【０１０３】
本発明のさらに別の態様は、変形性関節症の予防、処置または改善に有用なモジュレーターの同定方法であって、候補モジュレーターがＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１またはＯＳＭを阻害し、その阻害を通じてＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３の発現を改変する能力を検定することを含む方法に関するものであり、この場合、上記モジュレーターは、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１およびＣＯＬ−３から選択される１種またはそれ以上のタンパク質の遺伝子またはタンパク質発現を阻害する。
【０１０４】
本発明はまた、上記スクリーニングまたは同定検定法で発見されるモジュレーターが、活動性または発生期変形性関節症罹患対象の臨床試験におけるそれらの効果についてさらに証明され得ることを示す。したがって、本発明の追加的態様は、変形性関節症の予防、処置または改善に有用なモジュレーターの同定方法であって、候補モジュレーターがＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１またはＯＳＭを阻害し、その阻害を通じてＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３の発現を改変させるその能力について検定することを含む方法で、さらに同定された阻害性モジュレーターが変形性関節症対象による臨床試験で観察される病理学的影響を除去するその能力について検定することを含む方法に関するものである。
【０１０５】
本発明の別の態様は、変形性関節症の予防、処置または改善に有用なモジュレーターの同定方法であって、候補モジュレーターがＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１またはＯＳＭを阻害し、その阻害を通じてＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３の発現を改変させるその能力について検定することを含む方法で、上記ＰＩ３Ｋモジュレーター、ＰＫＢモジュレーター、ＩＬ−１モジュレーターまたはＯＳＭモジュレーターが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマーおよび二本鎖ＲＮＡから選択されるいずれか１種またはそれ以上の物質を含み、上記物質がＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３タンパク質の遺伝子発現を阻害するように設計されている方法に関するものである。
【０１０６】
別の態様において、本発明は、変形性関節症の予防、処置または改善に有用なモジュレーターの同定方法であって、候補モジュレーターがＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１またはＯＳＭを阻害し、その阻害を通じてＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３の発現を改変させるその能力について検定することを含む方法で、上記ＰＩ３Ｋモジュレーター、ＰＫＢモジュレーター、ＩＬ−１モジュレーターまたはＯＳＭモジュレーターが、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１またはＯＳＭに対する１種またはそれ以上の抗体またはそのフラグメントを含み、上記抗体またはそのフラグメントがＰＩ３ＫまたはＰＫＢの酵素活性を阻害し得る方法に関するものである。
【０１０７】
本発明は、変形性関節症の予防、処置または改善を必要とする対象においてそれに有効な量でＰＩ３Ｋモジュレーター、ＰＫＢモジュレーター、ＩＬ−１モジュレーターまたはＯＳＭモジュレーターを含む医薬組成物を提供する。
【０１０８】
本発明の別の態様は、変形性関節症の予防、処置または改善を必要とする対象においてそれに有効な量でＰＩ３Ｋモジュレーター、ＰＫＢモジュレーター、ＩＬ−１モジュレーターまたはＯＳＭモジュレーターを含み、上記モジュレーターがＰＩ３ＫおよびＰＫＢから選択される１種またはそれ以上のタンパク質の酵素活性を阻害する医薬組成物に関するものである。
【０１０９】
本発明のさらに別の態様は、変形性関節症の予防、処置または改善を必要とする対象においてそれに有効な量でＰＩ３ＫモジュレーターまたはＰＫＢモジュレーターを含み、上記モジュレーターが、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１およびＣＯＬ−３から選択される１種またはそれ以上のタンパク質の遺伝子またはタンパク質発現を阻害する医薬組成物に関するものである。
【０１１０】
本発明の一実施態様は、変形性関節症の予防、処置または改善を必要とする対象においてそれに有効な量でＰＩ３ＫモジュレーターまたはＰＫＢモジュレーターを含み、上記モジュレーターがＬＹ２４９００２ ２−(４−モルホリニル)−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン)の遊離または医薬上許容される塩形態である、医薬組成物に関するものである。
【０１１１】
本発明の別の実施態様は、変形性関節症の予防、処置または改善を必要とする対象においてそれに有効な量でＰＩ３Ｋモジュレーター、ＰＫＢモジュレーター、ＩＬ−１モジュレーターまたはＯＳＭモジュレーターを含み、上記モジュレーターが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマーおよび二本鎖ＲＮＡから選択されるいずれか１種またはそれ以上の物質を含み、上記物質がＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３タンパク質の遺伝子発現を阻害するように設計されている、医薬組成物に関するものである。
【０１１２】
本発明のさらに別の実施態様は、変形性関節症の予防、処置または改善を必要とする対象においてそれに有効な量でＰＩ３Ｋモジュレーター、ＰＫＢモジュレーター、ＩＬ−１モジュレーターまたはＯＳＭモジュレーターを含み、上記モジュレーターが、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１またはＯＳＭに対する１種またはそれ以上の抗体またはそのフラグメントを含み、上記抗体またはそのフラグメントがＰＩ３ＫまたはＰＫＢから選択されるタンパク質の酵素活性を阻害し得る、医薬組成物に関するものである。
【０１１３】
ＯＡに罹患した個体を、伝統的な慣用的方法、例えばｘ線および自覚症状により診断するのは困難であり得る。ＯＡは、病的状態の全体を通して交互の間隔で無症候であったり症候を発現し得る。さらに、発生期ＯＡの対象は、病状が大きく悪化した段階に進行するまではほとんどの期間無症候であり得る。ＯＡの早期発見および処置または予防は、病気の後期段階に付随する過度の身体的障害を阻止し得る。発生期または活動性ＯＡについての生化学的試験手段は、早期検出および病気の確認を助ける。
【０１１４】
本発明のポリヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリペプチドおよび抗体は、診断に使用され得る。例えば、慣用的方法に従って抗体を使用することにより、対象におけるＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３のレベルを定量し得る。レベルの増加は、ＯＡの重症度を示す。すなわち、異なるタンパク質レベルは、ＯＡの様々な臨床形態または重症度を示すものである。上記情報はまた、本発明モジュレーターによる処置に応答し得るかまたは応答し得ない関節炎を経験している患者のサブセットを同定するのに有用である。同様に、本発明では、対象におけるＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３のメッセージレベルを定量することは、診断および適切なＯＡ治療法の決定に有用であると考えられる。適切な対照個体と比べてＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３のｍＲＮＡレベルが高い対象は、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１および／またはＯＳＭ阻害剤による処置についての適切な候補とみなされる。
【０１１５】
本発明によると、診断に使用される本発明ポリヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリペプチドおよび抗体の能力が提供される。したがって、一実施態様において本発明は、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１、またはＯＳＭモジュレーターによる処置に適切な候補であり得る活動性または発生期変形性関節症に罹患した対象の診断方法であって、上記対象からの生物学的試料においてＰＩ３Ｋのα、β、γおよびδイソ型、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１およびＣＯＬ−３の１種またはそれ以上から選択される物質のｍＲＮＡレベルを検定することを含み、非変形性関節症対照レベルと比べてＰＩ３Ｋ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３のレベルが変化、例えば増加または減少した対象が、ＰＩ３ＫモジュレーターまたはＰＫＢモジュレーター処置に適切な候補である方法に関するものである。上記診断方法では、非変形性関節症対照生物試料で観察されるレベルと比べてＰＩ３Ｋ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３のレベルが改変した対象として活動性または発生期変形性関節症罹患対象を同定することを意図し得る。
【０１１６】
本発明の別の態様は、発生期または活動性ＯＡの診断を目的とする対象におけるＰＩ３Ｋのα、β、γおよびδイソ型の割合の検出に関するもので、これらを提供する。例えば、ＰＩ３Ｋイソ型α、β、γおよびδに対する抗体は、対象におけるＰＩ３Ｋのα、β、γおよびδイソ型の割合を検出するのに使用され得る。これらのイソ型の互いの割合は、正常軟骨細胞におけるこれらのタンパク質の割合と比べて変形性関節症軟骨細胞では特徴的に改変されている。活動性または発生期ＯＡ罹患患者で見られるレベルの割合と関節軟骨細胞におけるこれらのタンパク質の割合の比較結果は、臨床試験手順の一部としてＰＩ３ＫおよびＰＩ３Ｋイソ型、ＰＫＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１および／またはＣＯＬ−３レベルをモニターするのに、例えば所定の処置プログラムの効力を測定または変形性関節症疾患の診断を補助するのに使用され得る。興味深いことに、軟骨細胞は、本明細書記載の通り変形性関節症の関節から得られ、ＰＩ３Ｋ発現の誘導因子であるＰＤＧＦの存在下で培養され得る。次いで、ＰＩ３Ｋのα、β、γおよびδイソ型の検出は、例えばウエスタンブロッティング検出方法またはイソ型に対する蛍光標識抗体を用いて遂行され得る。
【０１１７】
すなわち、酵素活性の阻害に関するこれらの抗体の使用に加えて、またはＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１および／またはＣＯＬ−３のアップレギュレーションに関与し得るタンパク質−タンパク質相互作用を阻止するため、上記抗体は、例えばＰＩ３Ｋおよび差次的ＰＩ３Ｋイソ型レベル、ＰＫＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１および／またはＣＯＬ−３レベルをモニターする方法として診断に使用され得、すなわち変形性関節症対象の特性確認に使用され得る。
【０１１８】
従って、本発明の別の態様は、変形性関節症の予防、処置または改善方法であって、
(ａ)対象においてＰＩ３Ｋのα、β、γおよびδイソ型、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１およびＣＯＬ−３の１種またはそれ以上から選択された物質のｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルについて検定し、そして
(ｂ)対照のレベルと比べてＰＩ３Ｋのα、β、γおよびδイソ型、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１およびＣＯＬ−３のｍＲＮＡおよび／タンパク質レベルが増加した対象に、ＰＩ３ＫモジュレーターまたはＰＫＢモジュレーターを、変形性関節症の病理学的影響を処置または改善するのに十分な量で投与する
ことを含む方法に関するものである。
【０１１９】
ＯＡ罹患対象を検出するための診断ツールに関するもので、これを提供する別の実施態様は、生物学的試料においてＰＩ３Ｋのα、β、γおよびδイソ型、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１およびＣＯＬ−３の１種またはそれ以上から選択された物質のｍＲＮＡレベルおよび／またはタンパク質レベルを検出するための診断用キットであって、
(ａ)ＰＩ３Ｋのα、β、γおよびδイソ型、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１およびＣＯＬ−３の１種またはそれ以上から選択された物質のポリヌクレオチドまたはそのフラグメント、
(ｂ)(ａ)の配列と相補的なヌクレオチド配列、
(ｃ)ＰＩ３Ｋのα、β、γおよびδイソ型、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１およびＣＯＬ−３の１種またはそれ以上から選択された物質のポリペプチドまたはそのフラグメント(上記ポリペプチドまたはそのフラグメント)、または
(ｄ)ＰＩ３Ｋのα、β、γおよびδイソ型、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１およびＣＯＬ−３の１種またはそれ以上から選択された物質のポリペプチドに対する抗体
を含み、成分(ａ)、(ｂ)、(ｃ)または(ｄ)が重要な成分を含み得るキットに関するものである。
【０１２０】
ただし、上記キットにおいて、(ａ)、(ｂ)、(ｃ)または(ｄ)は、重要な成分を含み得るものとする。また、上記キットは、本明細書で検討されている通りイソ型を含むＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１またはＯＳＭ、関連調節タンパク質またはこれらのタンパク質により修飾されるタンパク質のレベルを検出するように設計された成分(ａ)−(ｄ)を含み得ることが考えられる。
【０１２１】
患者に対して治療法を最適化するために考慮される因子には、処置されている特定の状態、処置されている特定哺乳類、個々の患者の臨床状態、活性化合物の送達部位、活性化合物の特定タイプ、投与方法、投与スケジュール、および専門家に知られている他の因子がある。投与すべき活性化合物の治療有効量は、上記の考慮すべき事項により決定され、変形性関節症の処置に必要とされる最少量である。
【０１２２】
本明細書で開示されている医薬組成物は、ＯＡの処置、予防および／または改善に有用であり、上記疾患の症状を処置または改善するのに治療上有効な用量で患者に投与されるべきである。治療有効量とは、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１および／またはＯＳＭを阻害することによりＡＧＧ−１および／またはＣＯＬ−３のレベルを減少させるかまたはＯＡを予防、処置または改善するのに十分な化合物の量をいう。
【０１２３】
本発明の阻害性化合物は、医薬組成物として投与され得る。本発明に従って使用される上記医薬組成物は、１種またはそれ以上の生理学的に許容される担体または賦形剤を用いて慣用的方法により処方され得る。
【０１２４】
すなわち、化合物およびそれらの生理学的に許容される塩類および溶媒和物は、吸入または通気(口または鼻を通して)による投与用または局所、経口、頬側、非経口または直腸投与用に処方され得る。
【０１２５】
経口投与の場合、医薬組成物は、例えば、医薬上許容される賦形剤、例えば結合剤(例、糊化済トウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース)、充填剤(例、乳糖、微晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム)、滑沢剤(例、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ)、崩壊剤(例、じゃがいも澱粉または澱粉グリコール酸ナトリウム)、または湿潤剤(例、ラウリル硫酸ナトリウム)による慣用的手段により製造される錠剤またはカプセル剤の形態をとり得る。錠剤は、当業界で公知の方法によりコーティングされ得る。経口投与用液体調製物は、例えば、溶液、シロップまたは懸濁液の形態をとり得るか、またはそれらは使用前に水または他の適切な賦形剤により構成される乾燥製品としての形態をとり得る。上記液体調製物は、医薬上許容される添加剤、例えば懸濁剤(例、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または硬化食用脂)、乳化剤(例、レシチンまたはアラビアゴム)、非水性賦形剤(例、扁桃油、油性エステル、エチルアルコールまたは分画植物油)および保存剤(例、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸)による慣用的手段により調製され得る。調製物はまた、適切な場合緩衝塩類、調味、着色および甘味剤を含み得る。
【０１２６】
経口投与用調製物は、活性化合物を放出制御するように適切に処方され得る。
頬側投与の場合、組成物は、慣用的方法で処方される錠剤またはトローチ剤の形態をとり得る。
【０１２７】
吸入投与の場合、本発明に従って使用される化合物は、好都合には、適切な高圧ガス、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切な気体の使用を伴う、加圧パックまたはネブライザーからのエーロゾル噴霧適用形態で送達される。加圧エーロゾルの場合、用量単位は、バルブを設けて計量された量を送達することにより決定され得る。吸入器または注入器で使用される例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物および適切な粉末基剤、例えば乳糖または澱粉の粉末混合物を含むものとして処方され得る。
【０１２８】
化合物は、注射、例えばボーラス注射または連続注入による非経口投与用に処方され得る。非経口処方物の送達経路は、興味の対象である罹患組織または身体の他の部分への例えば、筋肉内、腹腔内、皮下、静脈内または直接的経路であり得る。好ましい実施態様において、非経口投与は、患部である関節への直接関節注射により行われ得る。注射用処方物は、保存剤を加えた単位用量形態、例えばアンプルまたは多用量型容器を呈し得る。組成物は、油性または水性賦形剤中の懸濁液、溶液またはエマルジョンとしての形態をとり得、処方剤、例えば懸濁、安定および／または分散剤を含み得る。別法として、有効成分は、使用前に適切な賦形剤、例えば滅菌発熱物質不含有水により形成させる粉末形態であり得る。
【０１２９】
化合物はまた、例えば慣用的坐剤基剤、例えばカカオバターまたは他のグリセリドを含む、直腸組成物、例えば坐剤または停留浣腸で処方され得る。
【０１３０】
前記処方物に加えて、化合物はまた、デポー型調製物として処方され得る。上記の長期作用処方物は、移植(例えば、皮下、筋肉内、腹腔内または関節)または筋肉内または関節注射により投与され得る。すなわち、例えば、化合物は、適切なポリマー性または疎水性材料(例えば許容される油中エマルジョンとして)またはイオン交換樹脂により、または難溶性誘導体、例えば難溶性塩として処方され得る。
【０１３１】
組成物は、所望ならば、有効成分を含有する１個またはそれ以上の単位用量形態を含み得るパックまたはディスペンサー装置で装填され得る。パックは、例えば金属またはプラスチックフォイル、例えばブリスターパックを含み得る。パックまたはディスペンサー装置には、投与用の使用説明書が添付され得る。
【０１３２】
本発明での使用に適切な医薬組成物には、有効成分が意図された目的を達成するための有効量で含まれる組成物が含まれる。有効量の決定は、当業者が行える範囲内に十分含まれる。
【０１３３】
いずれの化合物についても、治療有効量は、最初に例えば新生物細胞の細胞培養検定法または通常はマウス、ウサギ、イヌまたはブタの動物モデルで評価され得る。動物モデルはまた、適切な濃度範囲および投与経路を決定するのに使用され得る。用量は、ＩＣ５０(すなわち、徴候の半最大阻害を達成する試験化合物濃度)を含む循環血漿濃度範囲を達成するように動物モデルで処方され得る。次いで、上記情報は、ヒトでの投与に有用な用量および経路を決定するのに使用され得る。
【０１３４】
治療有効量は、ＯＡの病理学的影響を処置、予防および／または改善するのに有用である、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３遺伝子発現を阻害するように設計された有効成分、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマーおよび二本鎖ＲＮＡ、これらのタンパク質または関連調節タンパク質に対する抗体またはそのフラグメントの量をいう。治療効力は、本明細書に記載されたＰＩ３ＫまたはＰＫＢ酵素検定法またはＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３発現レベル検定法により、または細胞培養物または実験動物における医薬上の手順により測定され得る。例えば、効力は、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１、ＯＳＭの阻害またはそれによるＡＧＧ−１および／またはＣＯＬ−３の減少レベルとして現わされ得る。この効力はＩＣ５０(５０％阻害濃度)として現わされ得、そのＩＣ５０とは、インビトロまたはインビボＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＩＬ−１またはＯＳＭ阻害試験またはＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３発現試験において、同じ試験条件下で阻害されないときに得られるレベルと比べて上記酵素のレベルまたはメッセンジャーＲＮＡレベルの５０％縮小となるＰＩ３ＫまたはＰＫＢ酵素活性のレベルまたはＩＬ−１、ＯＳＭ、ＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３発現レベルを得るために加えられなければならない化合物の量である。効力の別の尺度は、ＥＤ５０(５０％有効量)であり、ＥＤ５０は集団の５０％において治療上有効な用量である。毒性は、ＬＤ５０(試験動物または細胞の集団の５０％に対する致死量)として表され得る。ＬＤ５０および治療効力間の用量比が治療指数であり、それはＬＤ５０／ＥＤ５０の割合として表され得る。大きな治療指数を呈する医薬組成物が好ましい。細胞培養検定法および動物試験から得られるデータは、ヒトに使用する場合の範囲の用量を処方するのに使用される。上記組成物に含まれる用量は、好ましくはＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内であり、毒性をほとんどまたは全く伴わない。用量は、使用される用量形態、患者の感受性、および投与経路によりこの範囲内で変化する。
【０１３５】
正確な用量は、処置を必要とする対象に関する因子を考慮しながら専門家により決定される。活性部分の十分なレベルを達成するように、または所望の効果を維持するように、用量および投与を調節する。考慮され得る因子には、病状の重症度、対象の全般的健康状態、対象の年齢、体重および性別、食餌療法、投与時間および頻度、薬剤の組合わせ(複数も可)、反応感受性、および治療に対する耐性／応答がある。長時間作用医薬組成物は、特定処方物の半減期およびクリアランス速度により３〜４日ごと、１週間ごと、または２週間ごとに１回投与され得る。
【０１３６】
通常の投薬量は、投与経路によって、総用量約１グラム以下、０.１〜１０００００マイクログラムの範囲で変化し得る。特定投薬および送達方法に関するガイダンスは、文献に示されており、一般的に当業界の専門家にとって利用可能なものである。当業者であれば、タンパク質またはそれらの阻害剤ではなくヌクレオチドについての種々の処方物を使用するはずである。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、状態、場所に特異的である。タンパク質の経口投与に適切な医薬処方物は、例えば米国特許第５００８１１４、５５０５９６２、５６４１５１５、５６８１８１１、５７００４８６、５７６６６３３、５７９２４５１、５８５３７４８、５９７２３８７、５９７６５６９および６０５１５６１号に記載されている。
【０１３７】
以下、実施例により本発明についてさらに説明するが、本発明を限定する意図はない。
【０１３８】
実施例
方法：
以下の技術および実験方法は、本明細書記載の実施例で使用される。実施例で以下の技術について示す場合、下記要領で遂行される実験方法の確認を意図したものである。
【０１３９】
単離された正常および変形性関節症軟骨：軟骨を大腿骨顆およびヒト膝の脛骨プラトーから摘出する。関節炎の病歴が無く、肉眼で見える軟骨病変を全く伴わない死体から正常軟骨を入手する。関節置換治療が行われている患者から変形性関節症軟骨を入手する。
【０１４０】
単離された正常および変形性関節症軟骨ＲＮＡ：正常および変形性関節症軟骨を、上記と同様大腿骨顆およびヒト膝の脛骨プラトーから摘出する。摘出した軟骨を液体窒素浴中で急速冷凍する。
【０１４１】
ＲＮＡ単離：ＲＮＡを、急速冷凍軟骨からフリーザー・ミル中でホモジネートし、１ｍｌ／１００ｍｇ(組織)トリゾール(ライフ・テクノロジーズ、ロックビル、メリーランド)中でホモジネートを抽出することにより単離する。ホモジネートした軟骨試料をクロロホルムで抽出し、１５０００倍重力加速度で２０分間遠心分離し、水相を集める。等量の７０％エタノールを水相に加え、混合し、次いでＲＮイージーカラム(キアゲン、バレンシア、カリフォルニア)に適用する。リボグリーン試薬(モレキュラー・プローブ、ユージーン、オレゴン)を用いてＲＮＡ濃度を測定する。
【０１４２】
単離された正常および変形性関節症軟骨からのｃＤＮＡ：１μｇ総単離量の正常または変形性関節症軟骨ＲＮＡを、デオキシリボヌクレアーゼ緩衝液(アンビオン、オースティン、テキサス、１０μｌ総反応量とするのに十分な量)中デオキシリボヌクレアーゼ(アンビオン、オースティン、テキサス)により処理し、３７℃で３０分間加熱する。デオキシリボヌクレアーゼ酵素を、ＥＤＴＡを加え、５分間７５℃で加熱することにより不活化する。次いで、スーパースクリプト・プレアンプリフィケーション・システム(ライフ・テクノロジーズ、ロックビル、メリーランド)でオリゴｄＴ１２−１８を用いて上記反応混合物からｃＤＮＡを合成する。次いで、最終反応量を３００μｌに調節する。シクロフィリンＲＴ−ＰＣＲを各試料について実施することにより、比較正規化ＰＩ３Ｋ、ＰＫＢ、ＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３遺伝子定量が可能となる。まず、シクロフィリンについての逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(ＲＴ−ＰＣＲ)を、エクスパンド・ロングＰＣＲシステム(ロシュ・バイオケミカルズ、インディアナポリス、インディアナ)の使用により３μｌのテンプレートを用いて遂行する。シクロフィリンＲＴ−ＰＣＲを各試料について２８サイクル実施することにより、ＰＣＲ産物の飽和を阻止するが、存在量の少ない遺伝子の検出には３５〜４０サイクルが必要である。ローディング染料を、５０μｌのＲＴ−ＰＣＲ反応混合物に加え、１０μｌの染色ＲＴ−ＰＣＲ反応混合物を、４〜２０％ＴＢＥ勾配ゲル(バイオラッド、ハークルズ、カリフォルニア)にローディングし、２００Ｖで４５分間分離する。ゲルを、１時間ＳＹＢＲグリーン(１：１００００)(モレキュラー・プローブス、ユージーン、オレゴン)を含む１×ＴＢＥ(シグマ、セントルイス、ミズーリ)溶液中で染色し、次いでストーム８６０−青色蛍光／化学蛍光スキャナー(モレキュラー・ダイナミクス、アマーシャム・ファルマシア事業部、ピスキャタウェイ、ニュージャージー)で走査する。ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア(モレキュラー・ダイナミクス、アマーシャム・ファルマシア事業部、ピスキャタウェイ、ニュージャージー)を用いて、個々のバンドを定量する。特定遺伝子を表す各ＰＣＲバンドについて測定された蛍光値を、同じドナー試料中におけるシクロフィリンバンドについての蛍光値に対して正規化する。
【０１４３】
軟骨細胞培養：単離した正常および変形性関節症軟骨試料を、燐酸緩衝食塩水(ＰＢＳ)中ですすぎ、切り刻み、ストレプトマイシス・グリセウス(Streptomyces griseus)由来のプロテアーゼ(シグマ、セントルイス)およびコラゲナーゼ−２(ワーシントン・バイオケミカルズ、レイクウッド、ニュージャージー)で消化する。上記消化段階により、単離した軟骨試料から個々の軟骨細胞が遊離される。１０％熱不活化ウシ血清(インビトロジェン・コーポレーション、カールスバッド、カリフォルニア)を含む高グルコースダルベッコ修飾イーグル培地(ＤＭＥＭ)(インビトロジェン・コーポレーション、カールスバッド、カリフォルニア)中の６ウェルプレートにおいて１×１０６細胞／ウェルの高密度で軟骨細胞を播種し、細胞が飽和密度の８０％に達するまで３７℃、５％ＣＯ２でのＣＯ２インキュベーター(ケンドロ・ラボラトリー・プロダクツ、ニュータウン、コネティカット)中において維持する。
【０１４４】
培養軟骨細胞におけるＰＩ３Ｋ／ＰＫＢの誘導または阻害：下記の全試験において、軟骨細胞を、１０％胎児ウシ血清(インビトロジェン・ライフ・テクノロジーズ、カールスバッド、カリフォルニア)含有または不含有のＤＭＥＭ培地中で培養した。培養された軟骨細胞を、血清不含有培地(ＤＭＥＭ)中で一晩インキュベーションし、次いで、以下の試料タイプの一つとして、すなわち、１)培養物を２４時間血清不含有培地(ＤＭＥＭ)中でインキュベーションすることにより、対照試料を、２)ＰＩ３Ｋ／ＰＫＢ誘導物質ＰＤＧＦ−ＢＢ(インビトロジェン・ライフ・テクノロジーズ、カールスバッド、カリフォルニア)を含む血清不含有培地中で２４時間培養物をインキュベーションすることにより、誘導試料を、または３)試料を１時間ＰＩ３Ｋ／ＰＫＢ阻害剤ＬＹ２９４００２(シグマ、セントルイス、ミズーリ)中でプレインキュベーションし、次いでＰＤＧＦ−ＢＢを含む血清不含有培地(ＤＭＥＭ)中で培養物を２４時間インキュベーションすることにより、ＰＩ３Ｋ／ＰＫＢ阻害試料を処理する。図３は、一次ヒト軟骨細胞中のＰＤＧＦによるＰＩ３Ｋ／ＰＫＢ発現の活性化を示す。図４は、一次ヒト軟骨細胞におけるＰＤＧＦ活性化ＰＩ３Ｋ／ＰＫＢ発現のＬＹ２４９００２(２−(４−モルホリニル)−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン)阻害を示す。
【０１４５】
ウエスタン・ブロッティング−細胞を血清不含有培地(ＤＭＥＭ)中で一晩インキュベーションし、次いでＰＤＧＦ−ＢＢ(５０ｎｇ／ｍｌ)＋／−ＬＹ２９４００２(２０μＭ)含有の新しい血清不含有培地中で１０分間インキュベーションする。細胞を氷冷ＰＢＳ中で洗浄し、こすり落し、そして５０ｍＭのトリスｐＨ７.４、１％ＮＰ−４０、０.２５％デオキシコール酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ、アプロチニン、ロイペプチンおよびペプスタチン(全て１μｇ／ｍｌ、１ｍＭのバナジウム酸ナトリウム、１ｍＭのＮａＦ、および１μＭのマイクロシスチン)(シグマ、セントルイス、ミズーリ)を含む氷冷溶解緩衝液中で音波処理する。ミクロビシンコニン酸検定法(ピアス、ロックフォード、イリノイ)を用いてライゼートのタンパク質濃度を測定し、１レーン当たり２０μｇのライゼートをホスホ−ＰＫＢおよびホスホ‐フォークヘッドおよび５μｇを抗Ｈｉｓ抗体[ウサギ抗ホスホＰＫＢ−Ｓｅｒ４７３ＮＥＢ、ウサギ抗ホスホ−ＦＫＨＲＬ１−Ｔｈｒ３２ ＮＥＢ、マウス抗ペンタ−Ｈｉｓ(キアゲン、バレンシア、カリフォルニア)]について実施する。ペルオキシダーゼ標識二次抗体をジャクソン・ラボラトリーズ(バー、ハーバー、メイン)から購入する。ブロットをＥＣＬ試薬(アマーシャム、ピスキャタウェイ、ニュージャージー)で視覚化する。ＰＤＧＦ(インビトロジェン・ライフ・テクノロジーズ、カールスバッド、カリフォルニア)および／またはＬＹ２９４００２(シグマ、セントルイス、ミズーリ)２４時間処理軟骨細胞からの培地を用いてウエスタンブロットを実施し、マウス抗ＣＯＬ−３(ＭＭＰ−１３、オンコジーン、ケンブリッジ、マサチューセッツ)によりプローブし、ＥＣＬ(＋)試薬(アマーシャム、ピスキャタウェイ、ニュージャージー)で視覚化する。
【０１４６】
レトロウイルス−ＰＫＢ構築物−ヒトＰＫＢ−１と９５％より大きい相同性を共有するＭｙｃ−Ｈｉｓ標識ネズミＰＫＢ−１(ジェンバンク受入番号ＮＭ−００９６５２)からレトロウイルス構築物を調製する。この構築物は、５'末端でのミリストイル化に必要とされるｃ−ｓｒｃ誘導残基を含む(アップステート・バイオテクノロジーズ、レークプラシッド、ニューヨーク)。この配列をＰＣＲ増幅し、配列証明し、ＭｏＭｕＬＶ(モロニーネズミ白血病ウイルス)に基くレトロウイルス発現ベクターへ挿入する。リン酸カルシウムを用いてウイルスｇａｇおよびｐｏｌタンパク質を安定発現するＧＰ２−２９３細胞(クロンテック、パロアルト、カリフォルニア)へプラスミドを一時的にトランスフェクションする。また、パッケージング細胞をＶＳＶ−Ｇコートタンパク質(ストラタジーン、ラジョラ、カリフォルニア)と共トランスフェクションすることにより、シュードタイプ化レトロウイルス粒子を生成させる。形質導入実験用にウイルス上清を４８時間後に集める。レトロウイルスベクターを単独で対照としてトランスフェクションする。ＰＫＢを過剰発現する細胞を、下記要領に従って２ラウンドで形質導入する。第２ラウンドの形質導入後、ＰＫＢおよびＦＫＨＲＬ１タンパク質測定に使用する細胞を、一晩血清不含有培地中で回復させる。
【０１４７】
レトロウイルス形質導入軟骨細胞：トランスフェクション効率を最大にするため、軟骨細胞を２ラウンドでレトロウイルス形質導入する。これを達成するため、上記と同様、正常および変形性関節症軟骨を単離し、ストレプトマイシス・グリセウス(Streptomyces griseus)由来のプロテアーゼおよびコラゲナーゼ−２(ワーシントン・バイオケミカルズ、レイクウッド、ニュージャージー)で消化する。しかしながら、今度は遊離した軟骨細胞を培養用に上記より低密度で播種することにより、細胞を複製させる。軟骨細胞を、８μｇ／ｍｌのポリブレン(シグマ、セントルイス、ミズーリ)中において形質導入２４時間前に、６ウェルプレートにおいて１ウェルにつき２×１０５細胞で播種する。他方、細胞を培養軟骨細胞に関する上記要領と同様にして播種する。翌日以下の要領で細胞を形質導入する。培地を除去し、１０μＭのＨＥＰＥＳおよび８μｇ／ｍｌのポリブレン(シグマ、セントルイス、ミズーリ)を含む上記要領で調製した３ｍｌの新鮮なウイルス上清を細胞に加える。細胞を３２℃、１０００×ｇで１.５時間スイング式バケットローター中で遠心分離する。遠心分離後、３ｍｌの新鮮なポリブレン含有培地を各ウェルに加える。さらに細胞を、１６〜２４時間上記と同条件でインキュベーションする。次いで、培地を新鮮なポリブレン不含有培地と交換し、細胞をさらに２４時間インキュベーションする。この最初の形質導入後、第２ラウンドの形質導入を実施し、さらに２４時間の回復期間をおく。細胞は低密度で播種されるが、それらは依然として、下記の通りＩＬ−１に応じて亜硝酸塩を生成するそれらの能力により評価される軟骨細胞的性質を保持していた。
【０１４８】
亜硝酸塩生成検定法：Green et al.により報告されたグリエス方法(L.C.Green、Analytical Biochemistry １２６、１３１−１３８(１９８２))(出典明示により援用)を用いて、軟骨細胞培養培地における亜硝酸塩蓄積を測定することにより、ＮＯの生成を評価した。簡単に述べると、レトロウイルス形質導入軟骨細胞を、２ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１β(ペプロテック、ロッキーヒル、ニュージャージー)で処理した。２４時間のＩＬ−１とのインキュベーション後、培養培地を集め、各培養ウェルからの上清５０μｌを、９６ウェルの平底プレート(コーニング、コーニング、ニューヨーク)において等量のグレイス試薬(１：１、ｖ／ｖ、の蒸留水中０.１％Ｎ−ナフチルエチレンジアミン二塩酸塩および５％リン酸中１％スルファニルアミド)に加えた。バースマックス(Versemax)マイクロプレートリーダー(モレキュラー・ディヴァイス、サニーベール、カリフォルニア)を用いて、吸光度を５５０ｎｍで測定した。デュプリケイトウェルからの平均測定値を最終分析で用いた。標準としてＮａＮＯ２を用いて各実験用に作製した標準曲線から亜硝酸塩濃度を計算した。
【０１４９】
ＣＯＬ−３についてのＥＬＩＳＡ−軟骨細胞培養細胞を、血清不含有培地(ＤＭＥＭ)中で一晩インキュベーションし、次いで１時間(５０ｎｇ／ｍｌ)ＰＤＧＦ−ＢＢ(インビトロジェン・ライフ・テクノロジーズ、カールスバッド、カリフォルニア)不含有または含有の新鮮な血清不含有培地中でインキュベーションし、各ウェルに加え、さらに２４時間インキュベーションする。細胞培養上清を集め、アマーシャム(ピスキャタウェイ、ニュージャージー)ヒトコラゲナーゼ−３ＥＬＩＳＡを用いて各処理用にＣＯＬ−３タンパク質のレベルを測定する。図５は、ＣＯＬ−３タンパク質分泌およびＬＹ２４９００２による阻害のＥＬＩＳＡを示す。
【０１５０】
ＰＣＲプライマー：下記表１は、本明細書記載の手順で使用したＰＣＲプライマーのリストである。
【０１５１】
表１：
【表１】
2005507915.tif 000002
【０１５２】
統計的分析−ＲＴ−ＰＣＲデータの統計的分析をスチューデントｔ検定により実施する。
【０１５３】
実施例１
ＡＧＧ−１およびＣＯＬ−３生成に影響するＰＩ３Ｋ阻害剤についての検定
マトリックス分解酵素ＡＧＧ−１およびＣＯＬ−３のレベルは、正常軟骨に対し変形性関節症軟骨では増加している。ＡＧＧ−１およびＣＯＬ−３プロテアーゼのこれらのレベル変化は、変形性関節症の発症および進行の一因であり得る。非ＯＡおよびＯＡ軟骨細胞ライゼートにおけるＡＧＧ−１およびＣＯＬ−３遺伝子発現レベルの比較を下記表２および３に示す。ＡＧＧ−１およびＣＯＬ−３遺伝子発現またはタンパク質生成の増殖阻害剤は、潜在的に有用なＯＡ治療剤である。したがって、この実施例は、ＰＩ３Ｋおよび／またはＰＫＢ調節を通じてＡＧＧ−１および／またはＣＯＬ−３遺伝子またはタンパク質を減少させる能力を有する化合物に関するスクリーニング方法について説明している。この検定で試験される阻害剤を、ＡＧＧ−１および／またはＣＯＬ−３遺伝子発現に対するそれらの効果について調べる。
【０１５４】
表２
【表２】
2005507915.tif 000003
値は、任意蛍光単位として表されている。逆転写酵素を伴わず、テンプレートを伴わない試料についての蛍光値は、検出レベル未満であった。
【０１５５】
表３
【表３】
2005507915.tif 000004
値は、任意蛍光単位として表されている。逆転写酵素を伴わず、テンプレートを伴わない試料についての蛍光値は、検出レベル未満であった。
【０１５６】
ＰＩ３Ｋおよび／またはＰＫＢ調節または阻害を介して、変形性関節症を処置および／または予防する能力について候補化合物を試験するのに有用であるスクリーニング検定法を作り出すため、我々は、対照阻害剤としてＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２を用いてスクリーンを作製した。ＰＩ３Ｋ阻害活性について化合物をスクリーニングするため、ヒト軟骨細胞を活動性変形性関節症と診断された個体から上記と同じ方法で得、次いで上記と同様にして培養し得る。細胞を血清不含有培地中で一晩インキュベーションし、次いでＰＤＧＦ−ＢＢ(インビトロジェン‐ライフ・テクノロジーズ、カールスバッド、カリフォルニア)を加える前に、５０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−ＢＢを含む新鮮な血清不含有培地(陰性対照)、ＰＤＧＦ−ＢＢ(５０ｎｇ／ｍｌ)＋２０μＭのＬＹ２９４００２(シグマ、セントルイス、ミズーリ)を含む新鮮な血清不含有培地(陽性対照)、または５０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−ＢＢ＋１０または２０μＭ試験化合物を含む新鮮な血清不含有培地(試験試料)中で１時間インキュベーションし得る。次いで、細胞を上記と同様に洗浄および溶解し、上記の逆転写ＰＣＲおよびウエスタンブロット検出法によりＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３ｍＲＮＡレベルについてライゼートをプローブし得る。ＡＧＧ−１またはＣＯＬ−３ｍＲＮＡの発現レベルを下げる候補化合物は、阻害活性を立証するため、ＯＡおよび／または関連状態を臨床的に処置、予防または改善するのに有用であり得る。
【０１５７】
結果：
ＰＤＧＦによるＡＧＧ−１およびＣＯＬ−３の誘導は、下記表４および５で示されている通りＰＩ３Ｋ／ＰＫＢ経路の活性化に伴うもので、それに左右される。集合的にこれらのデータは、ＰＩ３Ｋおよび／またはＰＫＢがＡＧＧ−１およびＣＯＬ−３遺伝子発現およびタンパク質分泌を活性化することを立証している。また、これらのデータは、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＬＹ２４９０００２がＰＫＢのＰＤＧＦ誘導活性化を減少させ(表３)、またＡＧＧ−１およびＣＯＬ−３についてのｍＲＮＡの下流生成を阻害することを示している(表４)。ＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２４９０００２はまた、表５で示されている通りＣＯＬ−３タンパク質の分泌を阻害する。集合的に、これらの発見は、ＰＩ３Ｋ酵素が軟骨マトリックス分解性酵素ＡＧＧ−１およびＣＯＬ−３の誘導に至る重要な経路の一部であることを示唆している。
【０１５８】
表４：
【表４】
2005507915.tif 000005
一次ヒト軟骨細胞(非ＯＡ関節)におけるＰＤＧＦによるＰＩ３Ｋ／ＰＫＢの活性化およびその結果としてＬＹ２９４００２による活性化の阻害を示す。軟骨細胞ライゼートのウエスタンブロットを、上方セットのデータでは抗ホスホ−ＰＫＢでプローブした。第２セットのデータでは、軟骨細胞ライゼート試料を、抗ホスホ−ＦＫＨＲＬ１(ＰＫＢの下流プロモーター)でプローブすることにより、ＰＫＢ経路が刺激されることを明確に確認した。
【０１５９】
表５：
【表５】
2005507915.tif 000006
ＡＧＧ-１およびＣＯＬ-３ｍＲＮＡのＰＤＧＦ刺激による誘導のＬＹ２９４００２阻害を示す。一次ヒト軟骨細胞ライゼート(非ＯＡ関節)からのＡＧＧ−１およびＣＯＬ−３のＰＣＲアンプリコンを、アガロースゲル電気泳動により分析した。ゲル画像を、ストラタジーンのイーグル・アイII静止ビデオシステム(ストラタジーン、ラジョラ、カリフォルニア)へそれらを走査することにより分析した。
【０１６０】
実施例２
ＣＯＬ−３に対して生じた効果についてのＰＩ３Ｋ阻害剤の迅速なスクリーニング方法
上記(実施例１)のＡＧＧ−１およびＣＯＬ−３生成に影響するＰＩ３Ｋ阻害剤についての検定法で発見される阻害剤は、下記のＥＬＩＳＡ検定法を用いることによりＣＯＬ−３タンパク質分泌に対する影響について二次的にスクリーニングされ得る。記載されている通り、この検定手段は市販されており、当業者であれば、ヒトＣＯＬ−３タンパク質に対する放射性標識モノクローナル抗体を用いる新規のＥＬＩＳＡに基く免疫検定手段を作り出す手法については熟知しているはずである。この商業ベースのスクリーニング方法は、アマーシャム(ピスキャタウェイ、ニュージャージー)から市販されている。
【０１６１】
ＣＯＬ−３についてのＥＬＩＳＡ：
上記要領で単離した軟骨細胞を、血清不含有培地中で一晩インキュベーションし、次いでＬＹ２９４００２含有または不含有の新鮮な血清不含有培地(ＤＭＥＭ)中で１時間インキュベーションする。次いで、５０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−ＢＢ(シグマ、セントルイス、ミズーリ)を、各ウェルに加え、さらに２４時間インキュベーションする。軟骨細胞培養上清を集め、市販されているアマーシャム(ピスキャタウェイ、ニュージャージー)ヒトコラゲナーゼ−３ＥＬＩＳＡベースの検定手段を用い、各処理についてＣＯＬ−３タンパク質のレベルを測定する。
【０１６２】
結果：
一次ヒト軟骨細胞におけるＣＯＬ−３タンパク質分泌レベルに対する対照標準ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＬＹ２９４００２の効果を下記表６に示す。上記と同様ＥＬＩＳＡ試験を用いてこれらのデータを作成した。
【０１６３】
表６：
【表６】
2005507915.tif 000007
一次ヒト軟骨細胞(非ＰＡ関節)を、２４時間ＰＤＧＦ(５０ｎｇ／ｍｌ)の存在下様々な濃度のＰＩ３Ｋ−キナーゼ阻害剤ＬＹ２９４００２で処理した。軟骨細胞上清におけるコラゲナーゼ−３タンパク質レベルを、ヒトコラゲナーゼ−３ＥＬＩＳＡシステム(シグマ、セントルイス、ミズーリ)を用いて測定した。
【０１６４】
実施例３：
診断用ツールとしてのＰＩ３Ｋイソ型のレベル改変の検出：
この方法は、ＰＩ３Ｋイソ型α、β、γおよびδの改変されたレベルを検出し得る診断用ツールを提供する。出願者等は、驚くべきことに非ＯＡ関節の場合と比べてＯＡ罹患関節軟骨細胞ではこれらのＰＩ３Ｋイソ型のレベルが改変されていることを発見した。すなわち、この方法は、ＯＡに罹患している疑いがある対象を診断する方法を提供する。
【０１６５】
軟骨細胞は、ＯＡに罹患している疑いのある対象の関節から単離され得る。細胞は血清不含有培地(ＤＭＥＭ)中に置かれ得る。次いで、上記「方法」記載の要領で細胞を洗浄および溶解し、ライゼートを、上記と同様逆転写ＰＣＲおよびウエスタンブロット検出を介してＰＩ３Ｋα、ＰＩ３Ｋβ、ＰＩ３Ｋγおよび／またはＰＩ３Ｋδ ｍＲＮＡレベルについてプローブし得る。下記表７で示されている通り、正常軟骨試料と比べて改変されたＰＩ３Ｋイソ型レベルまたは傾向を示す対象は、ＯＡと診断され得る。例えば、対象が、下記表７、８、９および１０に示された対照正常軟骨試料と比べて以下の傾向を示す場合、その対象は明らかにＯＡを有するものとして確認され得る：
ＰＩ３Ｋαレベルの減少；および／または
ＰＩ３Ｋβレベルの減少；および／または
ＰＩ３Ｋγレベルの増加；および／または
ＰＩ３Ｋδレベルの減少。
【０１６６】
ＰＩ３Ｋイソ型レベルにおける上記傾向の一つまたはそれ以上を示す対象は、ＯＡの存在について明白に診断され、すなわちＰＩ３Ｋ阻害剤での処置に潜在的に応答性であるものとして、ＡＧＧ−１および／またはＣＯＬ−３のレベルを低下させることが確認され得る。
【０１６７】
表７：
【表７】
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値は、任意蛍光単位として表されている。逆転写酵素を伴わず、テンプレートを伴わない試料についての蛍光値は、検出レベル未満であった。
【０１６８】
表８
【表８】
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値は、任意蛍光単位として表されている。逆転写酵素を伴わず、テンプレートを伴わない試料についての蛍光値は、検出レベル未満であった。
【０１６９】
表９：
【表９】
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値は、任意蛍光単位として表されている。逆転写酵素を伴わず、テンプレートを伴わない試料についての蛍光値は、検出レベル未満であった。
【０１７０】
表１０：
【表１０】
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値は、任意蛍光単位として表されている。逆転写酵素を伴わず、テンプレートを伴わない試料についての蛍光値は、検出レベル未満であった。
【０１７１】
実施例３
ＰＩ３Ｋ／ＰＫＢ経路を介したＩＬ−１およびＯＳＭによるＡＧＧ−１およびＣＯＬ−３の超誘導
我々は、ＩＬ−１およびＯＳＭが、相乗的にＡＧＧ−１およびＣＯＬ−３(ＭＭＰ−１３)の超誘導を誘発し、この効果はまた、ＬＹ２９４００２またはＰＫＢ(Ａｋｔ)の優位抑制型についてのレトロウイルスベクターでＰＩ３キナーゼ経路を阻害することにより遮断されることを示す。
【０１７２】
サイトカイン類、例えばＩＬ−１およびＯＳＭは、ＯＡに伴う軟骨喪失においてある一定の役割を有することが立証されている。それらは、マトリックスメタロプロテイナーゼ遺伝子発現を顕著にアップレギュレーションすることが示された。我々は、ＰＩ３キナーゼ阻害剤ＬＹ２９４００２およびＡｋｔ／ＰＫＢの優位突然変異体の過剰発現を用いることにより、ＰＩ３キナーゼ経路が、ヒト関節軟骨細胞におけるアグリカナーゼ−１およびコラゲナーゼ−３のサイトカイン仲介誘導で重大な役割を有することを初めて立証している。
【０１７３】
方法：
軟骨細胞を２名の正常者および２名のＯＡ患者から単離した。細胞単独またはＡｋｔの優位抑制型を過剰発現する(レトロウイルス仲介遺伝子導入)細胞を、ＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２の存在および不存在下でＩＬ−１ベータ、ＯＳＭまたはＩＬ−１ベータ＋ＯＳＭにより処理した。ＲＮＡを単離し、Ａｇｇ−１、Ｃｏｌ−３ｍＲＮＡのレベルをリアルタイムＰＣＲにより測定した。異なる４ドナーにおける処理は全てデュプリケイトで行った。典型的実験から得られた値を表に示す。
【０１７４】
ＲＮＡ単離およびリアルタイムＰＣＲ：
製造業者の使用説明書に従ってキアゲンＲＮイージー９６キット(キアゲン、バレンシア、カリフォルニア)を用いて、総ＲＮＡをプールしたデュプリケイト９６ウェルプレートから単離した。最適なオン‐カラムデオキシリボヌクレアーゼＩ消化を用いて、混入しているゲノムＤＮＡを排除した。１００μｌの反応量においてハイ‐キャパシティーｃＤＮＡアーカイブキット(ＰＥアプライド・バイオシステムズ、フォスターシティー、カリフォルニア)でランダムプライマーを用いて、第一鎖ｃＤＮＡを合成した。
【０１７５】
ＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターミックス(アプライド・バイオシステムズ、フォスターシティー、カリフォルニア)を用いて、リアルタイムＰＣＲを、ＡＢＩプリズム７９００ＨＴ配列検出システム(アプライド・バイオシステムズ、フォスターシティー、カリフォルニア)における３８４ウェルフォーマットで実施した。２０μｌの反応物は、５μｌのｃＤＮＡ、２００ｎＭのフォワードおよびリバースプライマー、およびＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターミックスを含んでいた。デフォルトサイクリングプログラム(１０'間９５℃および４０サイクルの９５℃、１５"、６０℃、１')の後、融解曲線を作成する低速ランピング段階が続くことにより、ＰＣＲ産物の特異性およびプライマー二量体の不存在が確認される。
【０１７６】
プライマー：
実施例４については、デフォルトパラメーターおよび反応条件下でプライマーエクスプレスソフトウェア(アプライド・バイオシステムズ、フォスターシティー、カリフォルニア)によりｃＤＮＡ標的についてのプライマーを以下の通り設計した：
アグリカナーゼ I フォワード 5’TTTCCCTGGCAAGGACTATGA3’
アグリカナーゼ I リバース 5’AATGGCGTGAGTCGGGC3’
MMP13 フォワード 5’TGATCTCTTTTGGAATTAAGGAGCAT3’
MMP13 リバース 5’ATGGGCATCTCCTCCATAATTTG3’
GAPDH フォワード 5’ATGGGGAAGGTGAAGGTCG3’
GAPDH リバース 5’TAAAAGCAGCCCTGGTGACC3’
【０１７７】
ＧＡＰＤＨの増幅を用いて、反応に加えられる試料ｃＤＮＡの量を標準化した。標準物質(キャリブレーター)サンプルを利用する比較Ｃｔ方法を用いて、遺伝子発現における変化を計算した。これは、他の全てが比較されるもので、従って、その値が１に設定されるサンプルである。従って、他の値は全てキャリブレーターに対して表される。ｃＤＮＡ挿入体不含有レトロウイルスベクターは、キャリブレーターサンプルを表す。キャリブレーターに対する標的の量は、ＡＢＩ User Bulletin ＃２(アプライド・バイオシステムズ、フォスターシティー、カリフォルニア)で概説されている通り、式２−□□ＣＴに従って計算される。
【０１７８】
結果：
表１１は、ＩＬ−１およびＯＳＭが相乗的にＡＧＧ−１およびＣＯＬ−３(ＭＭＰ−１３)の超誘導を誘発し、この効果はまた、ＬＹ２９４００２またはＰＫＢ(Ａｋｔ)の優位抑制型についてのレトロウイルスベクターでＰＩ３キナーゼ経路を阻害することにより遮断されることを示している。
【０１７９】
表１１
【表１１】
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【０１８０】
これは、一ＯＡ患者から単離された軟骨細胞からの典型的結果である。他の４患者からも本質的に類似した結果が得られた。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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