(57)【要約】本発明は、抗レトロウイルス活性を示す、Ｔ−２０および／またはＴ−１２４９ペプチドのようなＨＩＶ融合阻害ペプチド（その断片および変種を含むが、それらに限定されない）をアルブミン（アルブミンの断片または変種を含むが、それらに限定されない）へ融合させた、タンパク質に関する。これらの融合タンパク質は、ここでは“本発明のアルブミン融合タンパク質”として包括的に称される。これらの融合タンパク質は、長期貯蔵期間および／または長期または治療活性を示す。本発明は、治療用アルブミン融合タンパク質、組成物、医薬組成物、処方物およびキットを包含する。本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする核酸分子、並びにこれらの核酸を含有したベクター、これらの核酸およびベクターで形質転換された宿主細胞、およびこれらの核酸、ベクターおよび／または宿主細胞を用いて本発明のアルブミン融合タンパク質を作製する方法も包含する。本発明はまたＨＩＶ誘導細胞融合を阻止するための組成物および方法にも関する。さらに本発明は、未感染細胞へのＨＩＶ伝染を阻止するための組成物および方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶ融合阻害ペプチドまたはその断片もしくは変種と、アルブミンまたはその断片もしくは変種とを含んでなる、アルブミン融合タンパク質であって、
アルブミンまたはその断片もしくは変種がアルブミン活性を有している、アルブミン融合タンパク質。
【請求項２】
ＨＩＶ ｅｎｖまたはその断片もしくは変種と、アルブミンまたはその断片もしくは変種とを含んでなる、請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項３】
ＨＩＶ融合阻害ペプチドが、ＨＩＶ ｅｎｖと結合するペプチドである、請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項４】
ＨＩＶ融合阻害ペプチドが、ＨＩＶ ｇｐ４１またはその断片もしくは変種である、請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項５】
ＨＩＶ融合阻害ペプチドが、ＨＩＶ ｇｐ４１と結合するペプチドである、請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項６】
ＨＩＶ融合阻害ペプチドが、Ｔ−２０またはＴ−１２４９、あるいはＴ−２０またはＴ−１２４９の断片もしくは変種である、請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項７】
アルブミン融合タンパク質が、少なくとも２つのＨＩＶ融合阻害ペプチドまたはその断片もしくは変種を含んでなる、請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項８】
第一のＨＩＶ融合阻害ペプチドまたはその断片もしくは変種、および第二のＨＩＶ融合阻害ペプチドまたはその断片もしくは変種を含んでなり、ここで、第一のＨＩＶ融合阻害ペプチドまたはその断片もしくは変種が、第二のＨＩＶ融合阻害ペプチドまたはその断片もしくは変種と異なっている、請求項７に記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項９】
アルブミン活性が、非融合状態にあるＨＩＶ融合阻害ペプチドまたはその断片もしくは変種のインビボ半減期と比較して、ＨＩＶ融合阻害ペプチドまたはその断片もしくは変種のインビボ半減期を伸ばす能力を有している、請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項１０】
１以上の追加のＨＩＶ融合阻害ペプチドまたはその断片もしくは変種、または、１以上の追加のアルブミンまたはその断片もしくは変種を更に含んでなる、請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項１１】
融合タンパク質が化学的部分を更に含んでなる、請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項１２】
ＨＩＶ融合阻害ペプチドまたはその断片もしくは変種が、アルブミンのＮ末端、またはアルブミンの断片もしくは変種のＮ末端へ融合されている、請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項１３】
ＨＩＶ融合阻害ペプチドまたはその断片もしくは変種が、アルブミンのＣ末端、またはアルブミンの断片もしくは変種のＣ末端へ融合されている、請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項１４】
ＨＩＶ融合阻害ペプチドまたはその断片もしくは変種が、アルブミンの内部領域、またはアルブミンの断片もしくは変種の内部領域へ融合されている、請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項１５】
ＨＩＶ融合阻害ペプチドまたはその断片もしくは変種が、リンカーにより、アルブミンまたはアルブミンの断片もしくは変種から離されている、請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項１６】
アルブミン融合タンパク質が下記式を含んでなる、請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質：
Ｒ２−Ｒ１；Ｒ１−Ｒ２；Ｒ２−Ｒ１−Ｒ２；Ｒ２−Ｌ−Ｒ１−Ｌ−Ｒ２；Ｒ１−Ｌ−Ｒ２；Ｒ２−Ｌ−Ｒ１；またはＲ１−Ｌ−Ｒ２−Ｌ−Ｒ１
［式中、Ｒ１は、少なくとも１つの治療用タンパク質、ペプチドまたはポリペプチド配列（その断片または変種を含む）であり、必ずしも同一の治療用タンパク質ではなく、Ｌはリンカーであり、かつ、Ｒ２は血清アルブミン配列（その断片または変種を含む）である］。
【請求項１７】
アルブミン融合タンパク質のインビボ半減期が、非融合状態にあるＨＩＶ融合阻害ペプチドのインビボ半減期よりも長い、請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項１８】
アルブミンまたはその断片もしくは変種へ融合されたＨＩＶ融合阻害ペプチドまたはその断片もしくは変種のインビトロ生物活性が、非融合状態にあるＨＩＶ融合阻害ペプチドまたはその断片もしくは変種のインビトロ生物活性よりも大きい、請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項１９】
アルブミンまたはその断片もしくは変種へ融合されたＨＩＶ融合阻害ペプチドまたはその断片もしくは変種のインビボ生物活性が、非融合状態にあるＨＩＶ融合阻害ペプチドまたはその断片もしくは変種のインビボ生物活性よりも大きい、請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項２０】
酵母で発現される、請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項２１】
酵母がグリコシル化欠陥である、請求項２０に記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項２２】
酵母がグリコシル化およびプロテアーゼ欠陥である、請求項２０に記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項２３】
哺乳動物細胞により発現される、請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項２４】
アルブミン融合タンパク質が、培養で哺乳動物細胞により発現される、請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれか一項に記載のアルブミン融合タンパク質と、担体とを含んでなる、組成物。
【請求項２６】
請求項１〜２４のいずれか一項に記載のアルブミン融合タンパク質の有効量と、製薬上許容される担体または賦形剤とを含んでなる、医薬組成物。
【請求項２７】
請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質の有効量を投与する工程を含んでなる、患者で疾患または障害を治療する方法。
【請求項２８】
請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質の有効量を投与する工程を含んでなる、ＨＩＶ融合阻害ペプチドにより治療可能なＨＩＶ感染の患者を治療する方法。
【請求項２９】
非融合状態にあるＨＩＶ融合阻害ペプチドまたはその断片もしくは変種のインビボ半減期と比較して、ＨＩＶ融合阻害ペプチドまたはその断片もしくは変種のインビボ半減期を延長させるのに十分な、アルブミンまたはアルブミンの断片もしくは変種へ、ＨＩＶ融合阻害ペプチドまたはその断片もしくは変種を融合させる工程を含んでなる、ＨＩＶ融合阻害ペプチドまたはその断片もしくは変種のインビボ半減期を延長する方法。
【請求項３０】
ＨＩＶ融合阻害ペプチドをアルブミンへ連結させて、アルブミン融合ＨＩＶ融合阻害ペプチドを形成させ、該アルブミン融合ＨＩＶ融合阻害ペプチドを哺乳動物へ投与し、これによって該アルブミン融合ＨＩＶ融合阻害ペプチドの半減期を連結アルブミンを欠くＨＩＶ融合阻害ペプチドの半減期より少なくとも２倍に延長することを含んでなる、哺乳動物でＨＩＶ融合阻害ペプチドの半減期を延長させるための方法。
【請求項３１】
請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる、核酸分子。
【請求項３２】
請求項３１に記載の核酸分子を含んでなる、ベクター。
【請求項３３】
請求項３１に記載の核酸分子を含有した、宿主細胞。
【請求項３４】
ウイルスによる細胞の感染が起きないような有効期間にわたって、有効濃度の請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質とまたは有効濃度の請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質を発現しうる核酸構築物と、細胞を接触させることを含んでなる、細胞へのＨＩＶの伝染を阻止する方法。
【請求項３５】
宿主がウイルスを中和するために十分な免疫応答を起こして、宿主における未感染細胞のウイルス感染が阻止されるように、有効濃度の請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質または有効濃度の請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質を発現しうる核酸構築物を宿主へ投与することを含んでなる、宿主でＨＩＶを中和する方法。
【請求項３６】
宿主における未感染細胞のウイルス感染が阻止されるように、請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質に対する抗体の有効濃度を宿主へ投与することを含んでなる、宿主でＨＩＶを中和する方法。
【請求項３７】
アルブミン融合ＨＩＶ融合阻害ペプチドまたは該ＨＩＶ融合阻害タンパク質を発現しうる核酸構築物を哺乳動物へ投与することを含んでなる、ＨＩＶ融合阻害ペプチドで哺乳動物の治療に伴う副作用を最少に抑えるための方法。
【請求項３８】
請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質の製造方法であって、
(ａ)  細胞または生物で発現しうるアルブミン融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸を用意し、
(ｂ)  細胞または生物で核酸を発現させてアルブミン融合タンパク質を形成させ、かつ
(ｃ)  アルブミン融合タンパク質を精製する
ことを含んでなる、方法。
【請求項３９】
アルブミン融合タンパク質がグリコシル化欠陥酵母株で発現される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ペプチドアルブミン融合体がグリコシル化コンピテント酵母株で発現される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
製薬上許容される担体と、治療有効量の請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質または有効濃度の請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質を発現しうる核酸構築物とを含んでなる、ＨＩＶ感染に対する免疫を哺乳動物で誘導するためのワクチン組成物。
【請求項４２】
哺乳動物がヒトである、請求項４１に記載のワクチン組成物。
【請求項４３】
請求項４１に記載のワクチン組成物の治療有効量を哺乳動物へ投与することを含んでなる、哺乳動物でＨＩＶ感染に対する免疫を誘導する方法。
【請求項４４】
哺乳動物がヒトである、請求項４３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ＨＩＶ融合インヒビターおよびアルブミン融合タンパク質の分野に関する。
【０００２】
背景技術
２００１年の終わりで、米国およびカナダにおけるＨＩＶ／エイズの成人および子供は９４０，０００人と推定されていた。この地域における成人罹患率は０．６％であり、女性はＨＩＶ陽性成人の２０％に相当した。２００１年には、その地域で４５，０００人の成人および子供が新たにＨＩＶに感染した（UNAIDS AIDS Epidemic Update December 2001）。
【０００３】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）と戦う抗レトロウイルス療法の開発に著しい進展がここ数年でみられ、主に逆転写プロセスおよびウイルスの成熟を妨げることでウイルス複製を標的にしている。しかしながら、薬物許容性および毒性作用、潜伏ウイルスリザーバー、および薬物耐性の問題を克服する上で、新たな種類の薬物が必要とされている。抗レトロウイルス療法で良いコンプライアンスを促すために、投薬法が改善されたより安全な治療の必要性がある。これらの治療法は、許容しうるリスク／利益プロフィールを有して、他の抗レトロウイルス療法と併用しうるものでなければならない。薬物開発で有望なアプローチは、ＨＩＶ侵入の阻止である。
【０００４】
ＨＩＶ−１のエンベロープ糖タンパク質は、ビリオンコアを取囲む二層膜に包埋されたｇｐ１６０前駆体として産生される。その糖タンパク質１６０ｋＤａ重量のほぼ５０％はＮ連結炭水化物から構成されている。ｅｎｖは、合成に際して、共有結合されていない外部ｇｐ１２０サブユニットおよび貫膜ｇｐ４１サブユニットへタンパク質分解される。ｇｐ１２０サブユニットは細胞レセプターへの付着に関与し、そのレセプターへの結合に際してコンホメーション変化をうける。ｇｐ１２０のコンホメーション変化は、膜融合を直接媒介するアミノ酸の疎水性パッチ、ｇｐ４１の融合ペプチドの露出につながる。トリガーに際して、２本のα−ヘリックスが融合ペプチドの挿入に役立つ超らせんを形成して、融合孔を形成する、という大規模なコンホメーション変化をｇｐ４１はうける。これらヘリックスのペプチドミミックを用いることによるこれらコンホメーション変化の、または十字形ヘリックス構造と結合する小分子での妨害は、ウイルスがその標的細胞へ侵入することを阻止する有効な方法であることを証明している（レビューとして、Chan DC and Kim PS(1998)Cell 93:681-684；Doranz BJ(2000)Emerging Therapeutic Targets 4:423-437；LaBranche CC(2001)Antiviral Research 50:95-115参照）。ｅｎｖはｇｐ１２０／ｇｐ４１サブユニットのトリマーとして細胞の表面へ到達し、ウイルス膜と細胞膜との間に孔を形成することで融合を促している。
【０００５】
ＤＰ−１７８としても知られるＴ−２０は、ｇｐ４１のＣ−ペプチドからの保存３６アミノ酸ペプチドである。それはプレヘアピン中間体と結合し、ｇｐ４１で更なるコンホメーション変化を妨げることで、標的細胞中へのウイルス侵入を阻止する（Wild CT et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91:9770-9774）。それはＨＩＶ−１の数クレードに対して活性であることが示されたが、しかしながら、それはＨＩＶ−２またはＳＩＶを阻害しない。それは細胞−細胞融合アッセイにおいて低ナノモル範囲（０．２〜２ｎＭ）で抗ウイルス活性を示す。Ｔ−２０はＨＩＶ−１ ｇｐ４１タンパク質のアミノ酸（ａａ）６３８−６７３（３６ａａ）に相当する。
【０００６】
Ｔ−１２４９はデザインがＴ−２０と類似したもう１つの融合インヒビターであるが、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２およびＳＩＶに対して活性であり、エンハンサー配列を含んでいる（ＵＳ６，２５８，７８２）。エンハンサー配列はｇｐ４１から誘導されるもので、付着すると、あらゆるペプチドの薬力学性を改善すると言われている。Ｔ−１２４９は鎖長が３９アミノ酸で、部分的にＴ−２０と相同的であるが、アミノ酸の変化および追加のｇｐ４１アミノ酸配列およびＴ−２０耐性ウイルスを処理しうる可能性がある。加えて、Ｔ−１２４９は霊長類でＴ−２０よりも長い半減期を有しており（ＡＵＣ２倍増）、そのため１日１回の投与で済むかもしれない。
【０００７】
ＨＩＶ−１のｇｐ４１のアミノ酸５５８−６７８位から誘導される５−ヘリックスは、短いペプチドリンカーで繋がれた、ｇｐ４１トリマー・オブ・ヘアピン(trimer-of-hairpin)構造のコアを形成する６ヘリックスのうち５つ（３つのＮ−および２つのＣ−ヘリックス）を含有している。第三Ｃ−ペプチドの空隙は、ｇｐ４１のカルボキシ末端領域用の結合部位を形成すると予想されている。この領域がトリマー・オブ・ヘアピンの形成前に（少なくとも一時的に）接近しうるならば、５−ヘリックスの結合は、融合現象に伴うコンホメーション変化を妨げることで、細胞の感染を防げると予想される（Root MJ(2001)Science 291:884-888）。
【０００８】
細菌発現により得られる、インビトロの生理的条件下で安定な５−ヘリックスは、ウイルス感染力および細胞−細胞融合アッセイで調べてみると、ナノモル範囲でＨＩＶ−１膜融合を効果的に阻害することが示された。このことから、Ｃ−ペプチドの結合が５−ヘリックスの抗ウイルス活性における主な決定要因である、と結論づけられた。５−ヘリックスはクレードＡ、ＢおよびＤからの単離物のＨＩＶ−１感染を抑えることが示され、ｇｐ４１トリマー・オブ・ヘアピン内におけるＮおよびＣ末端領域間で保存域を証明した。
【０００９】
シアノビリン−Ｎは、ｇｐ１２０の糖構造と結合する、Nostoc ellipsosporumから単離された小さなタンパク質である（Boyd et al.(1997)Antimicrob.Agents Chemother.41:1521-1530；Gustafson et al.(1997)Biochem.Biophys.Res.Comm.238:223-228）。
【００１０】
臨床試験がＴ−２０およびＴ−１２４９について行われた。Ｔ−２０の場合、１日２回５０ｍｇの典型的用量が用いられた。血漿半減期は約１．８時間であることがわかった。Ｔ−１２４９は霊長類でＴ−２０よりやや長い半減期を有している（ＡＵＣ２倍増）。
【００１１】
長期および短期双方におけるＨＡＡＲＴ使用継続の期待、および薬物耐性による治療失敗の可能性増大は、侵入インヒビターを含めたマルチ革新的抗レトロウイルス療法に真の役割があることを示唆している。Ｔ−２０およびＴ−１２４９のようなＨＩＶ融合インヒビターは、古典的プロテアーゼおよび逆転写酵素インヒビターに加えて、新たな治療原理を提供する。アルブミン融合技術は、血漿半減期およびバイオアベイラビリティを有意に伸ばせるならば、１週１回の投薬を可能にして、第一線の治療で非経口ＨＩＶ薬の許容性を有意に増すであろう。Ｔ−２０およびＴ−１２４９アルブミン融合体のような製品は、副作用プロフィール改善のおかげで、一部患者で治療法許容性を改善するかもしれない。Ｔ−２０およびＴ−１２４９のようなペプチドは疎水性であるため、アルブミンへのそれらの融合はそれらの溶解性を改善し、そのことがバイオアベイラビリティの向上をもたらして、高濃度処方を可能にするはずである。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、ＨＩＶ融合阻害ペプチド（ＨＩＶ ｅｎｖタンパク質またはＨＩＶ ｅｎｖタンパク質から誘導されるペプチドと結合するペプチドを含むが、それらに限定されない）をアルブミンまたはその断片もしくは変種へ融合させたタンパク質に関する。これらの融合タンパク質は、ここでは「本発明のアルブミン融合タンパク質」として包括的に称される。本発明のこれら融合タンパク質は、長期インビボ半減期および／または長期または治療活性を示す。
【００１３】
本発明は、治療用アルブミン融合タンパク質、組成物、医薬組成物、処方物およびキットを包含する。本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする核酸分子、並びにこれらの核酸を含有したベクター、これらの核酸およびベクターで形質転換された宿主細胞、およびこれらの核酸、ベクターおよび／または宿主細胞を用いて本発明のアルブミン融合タンパク質を作製する方法も包含する。
【００１４】
本発明はＨＩＶ誘導細胞融合を阻害するための組成物および方法にも関する。本発明は、未感染細胞へのＨＩＶ伝染を阻害するための、およびＨＩＶ関連疾患を予防および／または治療するための組成物および方法にも更に関する。
【発明の具体的説明】
【００１５】
本発明は、アルブミンをＨＩＶ融合阻害ペプチドにカップリングさせた融合タンパク質に関する。このようなペプチドには、ＨＩＶ ｇｐ４１またはＨＩＶ ｇｐ４１から誘導されるペプチドと結合するペプチドを含めて、ＨＩＶ ｅｎｖタンパク質またはＨＩＶ ｅｎｖタンパク質から誘導されるペプチドと結合するペプチドがあるが、それらに限定されない。これらのペプチドには、ＨＩＶ融合阻害性を有するＴ−２０、Ｔ−１２４９、５−ヘリックスまたはシアノビリン−Ｎ、またはそれらの断片もしくは変種がある。
【００１６】
ここで用いられている「タンパク質」および「ペプチド」という用語は限定されず、タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドを含む。
【００１７】
本発明は、２つ（またはそれ以上）のＨＩＶ融合阻害ペプチド、必要に応じて異なるＨＩＶ融合阻害ペプチドにアルブミンがカップリングされた、二官能性（または多官能性）融合タンパク質にも関する。異なるＨＩＶ融合阻害ペプチドを有するこのような二官能性（または多官能性）融合タンパク質は、薬物耐性変異ＨＩＶ株の成長が有意に遅れるという点で、１タイプのみのＨＩＶ融合阻害ペプチドを含んでなるアルブミン融合タンパク質と比較して、改善された薬物耐性プロフィールを有すると期待される。このような二官能性（または多官能性）融合タンパク質は、１タイプのみのＨＩＶ融合阻害ペプチドを含んでなるアルブミン融合タンパク質と比較して、相乗的抗ＨＩＶ効果も示す（但し、５−ヘリックスおよびＣ−ペプチドは拮抗性であると示されたことが注目される(Root et al.2001)）。
【００１８】
本発明は、１つ（またはそれ以上）のＨＩＶ融合阻害ペプチド、必要に応じて異なるＨＩＶ融合阻害ペプチドまたはそれらの断片もしくは変種が、同一でもまたは異なってもよい２つのアルブミン分子またはその断片もしくは変種にカップリングされた、融合タンパク質にも関する。
【００１９】
更に、化学的存在物も、生物活性を高めるため、または生物活性を調節するために、本発明の融合タンパク質へ共有結合させるか、または組み合わせて用いてよい。
【００２０】
本発明のアルブミン融合タンパク質は、インビボでＨＩＶ融合阻害ペプチドの半減期を長期化させると予想される。上記アルブミン融合ペプチドのインビトロまたはインビボ半減期は、連結アルブミンを欠くペプチドの半減期よりも２倍、５倍またはそれ以上伸びている。更に、少なくとも一部はペプチドの半減期延長のおかげで、本発明のアルブミン融合タンパク質は治療用ペプチドの投薬スケジュールの頻度を減少させられると期待される。投薬スケジュール頻度は、連結アルブミンを欠く治療用ペプチドの投薬スケジュールの頻度と比較して、少なくとも１／４、少なくとも１／２またはそれ以上に減少する。
【００２１】
本発明のアルブミン融合タンパク質は、インビトロおよび／またはインビボにおいて、溶解状態（または医薬組成物中）のとき、ペプチドの貯蔵期間を長期化させる、および／またはペプチドおよび／またはその活性を安定化させる。治療剤でもあるこれらのアルブミン融合タンパク質は、非特異的結合のようなファクターによるタンパク質の喪失を防ぐために、大過剰のキャリアタンパク質（例えばアルブミン、未融合）でタンパク質溶液を処方する必要性を減らせると予想される。
【００２２】
本発明は、アルブミン融合タンパク質をコードする核酸分子、これらの核酸を含有するベクター、これらの核酸ベクターで形質転換された宿主細胞、およびこれらの核酸、ベクターおよび／または宿主細胞を用いて本発明のアルブミン融合タンパク質を作製する方法も包含する。本発明は、核酸分子によりコードされたアルブミン融合タンパク質を発現するように必要に応じて修飾された、本発明の核酸分子を含有するように修飾されたトランスジェニック生物を更に含んでいる。
【００２３】
本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質および製薬上許容される希釈物または担体を含んでなる医薬処方物も包含する。このような処方物はキットまたは容器中へ入れてもよい。このようなキットまたは容器へ、タンパク質の貯蔵期間延長に関する説明書も入れてよい。このような処方物は、医薬処方物を患者へ投与する工程を含んでなる、哺乳動物またはヒトのような患者でＨＩＶ感染またはＨＩＶ関連疾患、病状または関連障害を予防、治療、改善または診断する方法で用いてよい。
【００２４】
本発明は、本発明のアルブミン融合ＨＩＶ融合阻害ペプチドを哺乳動物へ投与することを含んでなる、適度に高い濃度でのＨＩＶ融合阻害ペプチドによる哺乳動物の治療に伴う副作用（例えば、注射部位反応、頭痛、悪心、発熱、エネルギーレベル増加、発疹無力症、下痢、めまい、アレルギー反応、異常低好中球レベル）をできるだけ最少に抑えるための方法も包含する。
【００２５】
本発明は、哺乳動物へ投与することを含んでなる、ＨＩＶ感染および／またはＨＩＶ感染により引き起こされる疾患または障害を予防、治療または改善する方法を包含しており、このような予防、治療または改善では、疾患または障害を治療、予防または改善するために有効な量でＨＩＶ融合阻害ペプチド（またはその断片もしくは変種）を含んでなる本発明のアルブミン融合タンパク質が望まれる。本発明では、Ｔ−２０および／またはＴ−１２４９のようなＨＩＶ融合阻害ペプチドは「治療用タンパク質」とも称されている。
【００２６】
本発明は、Ｔ−２０および／またはＴ−１２４９ペプチドまたはＴ−２０および／またはＴ−１２４９のモノマーのマルチコピー（その断片および変種を含む）をアルブミンまたはアルブミンのマルチコピー（その断片および変種を含む）へ融合させたアルブミン融合タンパク質を包含する。
【００２７】
本発明は、哺乳動物でＨＩＶ Ｔ−２０および／またはＴ−１２４９ペプチドの半減期を伸ばすための方法も包含する。その方法では、ＨＩＶ Ｔ−２０および／またはＴ−１２４９ペプチドをアルブミンへ連結させてアルブミン融合ＨＩＶ Ｔ−２０および／またはＴ−１２４９ペプチドを形成し、そのアルブミン融合ＨＩＶ Ｔ−２０および／またはＴ−１２４９ペプチドを哺乳動物へ投与することを要する。典型的には、アルブミン融合ＨＩＶ Ｔ−２０および／またはＴ−１２４９ペプチドの半減期は、連結アルブミンを欠くＨＩＶ Ｔ−２０および／またはＴ−１２４９ペプチドの半減期より少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍または少なくとも５０倍伸びている。
【００２８】
抗ウイルス活性を示す、アルブミンをＴ−２０および／またはＴ−１２４９へ融合させた融合タンパク質が、ここでは例示されている。このような抗ウイルス活性には未感染ＣＤ−４＋細胞へのＨＩＶ伝染の阻害があるが、それに限定されない。更に、本発明は、未感染細胞へのヒトおよび非ヒトレトロウイルス、特にＨＩＶ伝染のインヒビターとして、アルブミンをＴ−２０および／またはＴ−１２４９へ融合させたこのような融合タンパク質の使用に関する。
【００２９】
本発明は、当業界で利用しうるものと比較して改善された治療用部分の製造方法も含んでいる。例えば、本発明は、当業界で現在利用されている複雑な化学合成法と比較して向上した、活性部分Ｔ−２０またはＴ−１２４９をもつタンパク質の製造手段を提供する（例えばSCRIP Magazine,September 2002,pp.7-10およびＷＯ９９／４８５１３「ペプチド合成のための方法および組成物」参照）。
【００３０】
本発明の様々な態様が、以下で更に詳細に記載されている。
【００３１】
Ｔ−２０
Ｔ−２０（ＤＰ−１７８としても知られる）は、ＨＩＶ−１ＬＡＩ単離物からの貫膜タンパク質ｇｐ４１のアミノ酸残基６３８−６７３に相当するアミノ酸配列ＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬＥＬＤＫＷＡＳＬＷＮＷＦ（配列番号１）のペプチドである。本発明で有用なＴ−２０ペプチドには、その断片または変種、例えば天然ＨＩＶ Ｔ−２０ペプチドのアナローグ、ホモローグ、断片または誘導体であるあらゆる分子、例えば参考のためここに特に組み込まれる、米国特許６，１３３，４１８およびＷＯ９４／２８９２０と、本表１で掲載された他の特許およびレファレンスで記載されたものがある。本発明で有用なＨＩＶ Ｔ−２０ペプチドは、配列番号１のＨＩＶ Ｔ−２０ペプチドの単一生物活性を有してさえいればよい。
【００３２】
本発明で有用なＴ−２０ペプチドは抗ウイルス活性を示すが、追加の有利な特徴、例えばバイオアベイラビリティおよび／または安定性の向上、または宿主免疫認識の減少を更に呈してもよい。
【００３３】
Ｔ−２０（またはその断片もしくは変種）がＯ−グリコシル化しうる酵母で発現されるとき、Ｔ−２０（またはその断片もしくは変種）のＯ−グリコシル化または生物活性の影響を最少に抑えるために、いかなるセリンまたはトレオニンも修飾または数的に減少させてよい。一方、または加えて、過少にグリコシル化する（即ち、Ｏ−グリコシル化に欠陥のある）酵母株も用いてよい。
【００３４】
Ｔ−１２４９
Ｔ−１２４９のアミノ酸配列はＷＱＥＷＥＱＫＩＴＡＬＬＥＱＡＱＩＱＱＥＫＮＥＹＥＬＱＫＬＤＫＷＡＳＬＷＥＷＦ（配列番号２）である。例えば、ＵＳ６，２５８，７８２およびＷＯ９９／５９６１５参照。本発明のアルブミン融合タンパク質で有用なその活性断片および変種は、参考のためここに組み込まれる、表１で掲載された特許およびレファレンスで記載されたものを含めて、当業界で知られている方法を用いて特定しうる。
【００３５】
５−ヘリックス
５−ヘリックスは、３つのＮ−ペプチドセグメント（Ｎ４０）および２つのＣ−ペプチドセグメント（Ｃ３８）が短Ｇｌｙ／Ｓｅｒペプチド配列を用いて交互に連結された（Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｃ−Ｎ）、デザインされたタンパク質である。一文字アミノ酸コードによる各セグメントの配列は：Ｎ４０、ＱＬＬＳＧＩＶＱＱＱＮＮＬＬＲＡＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬＡ（配列番号３）；Ｃ３８、ＨＴＴＷＭＥＷＤＲＥＩＮＮＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱ−ＮＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬＥ（配列番号４）；Ｎ->Ｃリンカー、ＧＧＳＧＧ（配列番号５）；およびＣ->Ｎリンカー、ＧＳＳＧＧ（配列番号６）である(Root et al)。本発明のアルブミン融合タンパク質で有用なその活性断片および変種は、参考のためここに組み込まれる、表１で掲載された特許およびレファレンスで記載された手法で特定しうる。
【００３６】
シアノビリン−Ｎ
シアノビリン−Ｎのアミノ酸配列は下記のとおりである：
【化１】
2005516607.tif 000002
（配列番号７）(Gustafson et al)。本発明のアルブミン融合タンパク質で有用なその活性断片および変種は、参考のためここに組み込まれる、表１で掲載された特許およびレファレンスで記載された手法で特定しうる。
【００３７】
アルブミン
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびヒトアルブミン（ＨＡ）という用語は、ここでは互換的に用いられる。「アルブミン」および「血清アルブミン」という用語は広く、ヒト血清アルブミン（とその断片および変種）および他種からのアルブミン（とその断片および変種）を包含する。
【００３８】
ここで用いられている「アルブミン」とは、アルブミンの１以上の機能活性（例えば、生物活性）を有した、アルブミンタンパク質またはアミノ酸配列、またはアルブミン断片もしくは変種に包括的に関する。特に、「アルブミン」とは、ヒトアルブミンまたはその断片（ＥＰ２０１２３９、ＥＰ３２２０９４、ＷＯ９７／２４４４５、ＷＯ９５／２３８５７参照）、特にここでの図１４、配列番号１８と、米国仮出願第６０／３５５，５４７およびＷＯ０１／７９４８０の図１５および配列番号１８で示されているようなヒトアルブミンの成熟型、あるいは他の脊椎動物からのアルブミンまたはその断片、あるいはこれら分子またはその断片のアナローグまたは変種に関する。
【００３９】
本発明のアルブミン融合タンパク質で用いられているヒト血清アルブミンタンパク質は、配列番号１８において下記組の点変異のうち一方または双方を含んでいる：Ｌｅｕ−４０７->Ａｌａ、Ｌｅｕ−４０８->Ｖａｌ、Ｖａｌ−４０９->ＡｌａおよびＡｒｇ−４１０->Ａｌａ；またはＡｒｇ−４１０->Ａｌａ、Ｌｙｓ−４１３->ＧｌｎおよびＬｙｓ−４１４->Ｇｌｎ（例えば、参考のためそれ全体でここに組み込まれる国際公開第ＷＯ９５／２３８５７参照）。他の態様では、上記組の点変異のうち一方または双方を含んだ本発明のアルブミン融合タンパク質は、酵母Ｙａｐ３ｐタンパク質分解に対して改善された安定性／耐性を有し、酵母宿主細胞で発現される組換えアルブミン融合タンパク質の産生を増す。
【００４０】
ここで用いられている、治療用タンパク質のインビボ半減期、治療活性または貯蔵期間を長期化または延長する上で十分なアルブミンの部分とは、非融合状態にある治療用タンパク質のインビボ半減期、治療活性または貯蔵期間と比較して、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分のインビボ半減期、治療活性または貯蔵期間を安定化、長期化または延長するために、鎖長または構造上十分なアルブミンの部分に関する。アルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は上記のようなＨＡ配列の全鎖長を含んでもよく、または治療活性を安定化または長期化しうる１以上の断片を含んでもよい。このような断片は鎖長が１０以上のアミノ酸でも、またはＨＡ配列からの約１５、２０、２５、３０、５０またはそれ以上の隣接アミノ酸を含んでも、またはＨＡの特定ドメインの一部または全部を含んでもよい。
【００４１】
本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、正常ＨＡの変種でもよい。本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分も、ここで記載されているような治療用タンパク質の変種でよい。「変種」という用語には、保存的または非保存的な挿入、欠失および置換を含み、このような改変が、治療用タンパク質の治療活性を発揮させるアルブミンまたはその活性部位または活性ドメインの腫脹性、有用なリガンド結合性および非免疫原性のうち１以上を実質的に変化させることはない。
【００４２】
特に、本発明のアルブミン融合タンパク質は、ヒトアルブミンの天然多形性変種およびヒトアルブミンの断片、例えばＥＰ３２２０９４で開示された断片（即ちＨＡ（Ｐｎ）、ここでｎは３６９〜４１９である）を含んでもよい。アルブミンは、いかなる脊椎動物、特にいかなる哺乳動物、例えばヒト、ウシ、ヒツジまたはブタに由来するものでもよい。非哺乳動物アルブミンにはメンドリおよびサケのものがあるが、それらに限定されない。アルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、治療用タンパク質部分とは異なる動物に由来してもよい。
【００４３】
一般的に言うと、ＨＡ断片または変種は少なくとも１００のアミノ酸鎖長、必要に応じて少なくとも１５０のアミノ酸鎖長である。ＨＡ変種はＨＡの少なくとも１つの全ドメイン、例えばドメイン１（配列番号１８のアミノ酸１−１９４）、２（配列番号１８のアミノ酸１９５−３８７）、３（配列番号１８のアミノ酸３８８−５８５）、１＋２（配列番号１８の１−３８７）、２＋３（配列番号１８の１９５−５８５）または１＋３（配列番号１８のアミノ酸１−１９４＋配列番号１８のアミノ酸３８８−５８５）からなるか、またはそれを含んでなる。各ドメインは、２つの相同的サブドメイン、即ち１−１０５、１２０−１９４、１９５−２９１、３１６−３８７、３８８−４９１および５１２−５８５と、残基Ｌｙｓ１０６−Ｇｌｕ１１９、Ｇｌｕ２９２−Ｖａｌ３１５およびＧｌｕ４９２−Ａｌａ５１１を含んでなるフレキシブルなサブドメイン間リンカー領域から、それ自体が構成されている。
【００４４】
本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、ＨＡの少なくとも１つのサブドメインまたはドメイン、またはその保存的修飾物を含んでもよい。融合体がサブドメインをベースにしているならば、隣接リンカーの一部または全部が、治療用タンパク質部分へ連結するために、必要に応じて用いられる。
【００４５】
アルブミン融合タンパク質
本発明は、一般的に、アルブミン融合タンパク質と、疾患または障害を治療、予防または改善する方法に関する。ここで用いられている「アルブミン融合タンパク質」とは、治療用タンパク質（またはその断片もしくは変種）の少なくとも１つの分子へアルブミン（またはその断片もしくは変種）の少なくとも１つの分子の融合により形成されるタンパク質に関する。本発明のアルブミン融合タンパク質は、例えば互いの遺伝子融合により（即ち、治療用タンパク質の全部または一部をコードするポリヌクレオチドがアルブミンの全部または一部をコードするポリヌクレオチドと枠内で結合された核酸の翻訳により、アルブミン融合タンパク質が形成される）、互いに結合された、治療用タンパク質の少なくとも１つの断片または変種とヒト血清アルブミンの少なくとも１つの断片または変種とを含んでなる。アルブミン融合タンパク質の個別部分、治療用タンパク質およびアルブミンタンパク質は、アルブミン融合タンパク質の「一部分」、「領域」または「部分」と称されることもある。
【００４６】
一つの態様において、本発明は、治療用タンパク質および血清アルブミンタンパク質を含んでなる、またはそれらからなる、アルブミン融合タンパク質を提供する。他の態様において、本発明は、治療用タンパク質および血清アルブミンタンパク質の生物活性および／または治療活性断片を含んでなる、またはそれらからなる、アルブミン融合タンパク質を提供する。他の態様において、本発明は、治療用タンパク質および血清アルブミンタンパク質の生物活性および／または治療活性変種を含んでなる、またはそれらからなる、アルブミン融合タンパク質を提供する。別の態様において、アルブミン融合タンパク質の血清アルブミンタンパク質成分は、血清アルブミンの成熟部分である。
【００４７】
別の態様において、本発明は、治療用タンパク質と、血清アルブミンの生物活性および／または治療活性断片を含んでなる、またはそれらからなる、アルブミン融合タンパク質を提供する。別の態様において、本発明は、治療用タンパク質と、血清アルブミンの生物活性および／または治療活性変種を含んでなる、またはそれらからなる、アルブミン融合タンパク質を提供する。一部の態様において、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分は、治療用タンパク質の成熟部分である。
【００４８】
別の態様において、本発明は、治療用タンパク質の生物活性および／または治療活性断片または変種と、血清アルブミンの生物活性および／または治療活性断片または変種とを含んでなる、またはそれらからなる、アルブミン融合タンパク質を提供する。一部の態様において、本発明は、治療用タンパク質の成熟部分および血清アルブミンの成熟部分を含んでなる、またはそれらからなる、アルブミン融合タンパク質を提供する。
【００４９】
一つの態様において、アルブミン融合タンパク質は、Ｎ末端部分としてＨＡおよびＣ末端部分として治療用タンパク質を含んでなる。一方、Ｃ末端部分としてＨＡおよびＮ末端部分として治療用タンパク質を含んでなるアルブミン融合タンパク質も用いてよい。
【００５０】
他の態様において、アルブミン融合タンパク質はアルブミンのＮ末端およびＣ末端の双方へ治療用タンパク質を融合させている。一つの態様において、ＮおよびＣ末端で融合された治療用タンパク質は同一の治療用タンパク質である。別の態様において、ＮおよびＣ末端で融合された治療用タンパク質は異なる治療用タンパク質である。もう１つの態様において、ＮおよびＣ末端で融合された治療用タンパク質は、同様の疾患、障害または症状を治療または予防するために用いられる、異なる治療用タンパク質である。もう１つの態様において、ＮおよびＣ末端で融合された治療用タンパク質は、通常患者で同時に生じることが当業界で知られた疾患または障害を治療または予防するために用いられる、異なる治療用タンパク質である。
【００５１】
アルブミン部分が治療用タンパク質部分のＮ末端および／またはＣ末端で融合されたアルブミン融合タンパク質に加えて、本発明のアルブミン融合タンパク質はＨＡの内部領域中へ対象の治療用タンパク質またはペプチドを挿入することにより作製してもよい。例えば、ＨＡ分子のタンパク質配列内には、ジスルフィド結合により安定化されるいくつかのループまたはターンが、α−ヘリックスの最後と最初との間に存在している。ＨＡの結晶構造（ＰＤＢアイデンティファイアー１ＡＯ６、１ＢＪ５、１ＢＫＥ、１ＢＭ０、１Ｅ７Ｅ〜１Ｅ７Ｉおよび１ＵＯＲ）から調べたところ、そのループは大部分が分子の本体から離れて伸びている。これらのループは、特別な生物活性を有するアルブミン分子を本質的に作製する上で、治療活性ペプチド、特に機能化に二次構造を要するもの、または治療用タンパク質の挿入または内部融合に有用である。
【００５２】
本発明のアルブミン融合タンパク質を作製するためにペプチドまたはポリペプチドが挿入されるヒトアルブミン構造中のループには、Ｖａｌ５４−Ａｓｎ６１、Ｔｈｒ７６−Ａｓｐ８９、Ａｌａ９２−Ｇｌｕ１００、Ｇｌｎ１７０−Ａｌａ１７６、Ｈｉｓ２４７−Ｇｌｕ２５２、Ｇｌｕ２６６−Ｇｌｕ２７７、Ｇｌｕ２８０−Ｈｉｓ２８８、Ａｌａ３６２−Ｇｌｕ３６８、Ｌｙｓ４３９−Ｐｒｏ４４７、Ｖａｌ４６２−Ｌｙｓ４７５、Ｔｈｒ４７８−Ｐｒｏ４８６およびＬｙｓ５６０−Ｔｈｒ５６６がある。他の態様では、ペプチドまたはポリペプチドが成熟ヒトアルブミン（配列番号１８）のＶａｌ５４−Ａｓｎ６１、Ｇｌｎ１７０−Ａｌａ１７６および／またはＬｙｓ５６０−Ｔｈｒ５６６ループ中に挿入される。
【００５３】
挿入されるペプチドは、特定の生物活性についてスクリーニングされたファージディスプレーまたは合成ペプチドライブラリーから、または望ましい機能を有した分子の活性部分から誘導される。加えて、ランダムペプチドライブラリーは特定ループ内で、またはＨＡ分子の特定ループ中へのランダム化ペプチドの挿入により作製してもよく、そこではアミノ酸のすべての可能な組合せが表わされている。
【００５４】
このようなライブラリーは、下記方法の１つにより、ＨＡまたはＨＡのドメイン断片上で作製しうる：
（ａ）ＨＡまたはＨＡドメイン断片の１以上のペプチドループ内におけるアミノ酸のランダム化変異。ループ内における１つ、それ以上または全部の残基はこうして変異させうる；
（ｂ）鎖長Ｘｎ（Ｘはアミノ酸であり、ｎは残基の数である）のランダム化ペプチドのＨＡまたはＨＡドメイン断片の１以上のループの置換またはその中への挿入（即ち、内部融合）；
（ｃ）（ａ）および／または（ｂ）に加えて、Ｎ、ＣまたはＮおよびＣ末端ペプチド／タンパク質融合。
【００５５】
ＨＡまたはＨＡドメイン断片は、異なる標的に対する異なるループの異なるスクリーンから誘導されたペプチドを同一ＨＡまたはＨＡドメイン断片へグラフトすることにより、多機能化してもよい。
【００５６】
ヒト血清アルブミンのループ中へ挿入されるペプチドは、治療用タンパク質ペプチドまたはそのペプチド断片もしくはペプチド変種である。例えば、ヒト血清アルブミンのループ中へ挿入されるペプチドには、Ｔ−２０および／またはＴ−１２４９ペプチドまたはそのペプチド断片もしくはペプチド変種がある。更に詳しくは、本発明は、鎖長が少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５または少なくとも４０のアミノ酸のペプチド断片またはペプチド変種をヒト血清アルブミンのループ中へ挿入したアルブミン融合タンパク質を包含する。本発明は、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５または少なくとも４０のアミノ酸のペプチド断片またはペプチド変種をヒト血清アルブミンのＮ末端へ融合させたアルブミン融合タンパク質も包含する。本発明は、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５または少なくとも４０のアミノ酸のペプチド断片またはペプチド変種をヒト血清アルブミンのＣ末端へ融合させたアルブミン融合タンパク質も包含する。
【００５７】
通常、本発明のアルブミン融合タンパク質は１つのＨＡ由来領域および１つの治療用タンパク質由来領域を有する。しかしながら、各タンパク質の複数領域も、本発明のアルブミン融合タンパク質を作製する上で用いてよい。同様に、２以上の治療用タンパク質も、本発明のアルブミン融合タンパク質を作製する上で用いてよい。例えば、治療用タンパク質はＨＡのＮおよびＣ末端の双方へ融合される。各構造において、治療用タンパク質部分は同一でもまたは異なる治療用タンパク質分子でもよい。二官能性アルブミン融合タンパク質の構造は、Ｘ−ＨＡ−Ｙ、Ｙ−ＨＡ−Ｘ、Ｘ−Ｙ−ＨＡ、ＨＡ−Ｘ−Ｙ、ＨＡ−Ｙ−Ｘ−ＨＡ、ＨＡ−Ｘ−Ｘ−ＨＡ、ＨＡ−Ｙ−Ｙ−ＨＡ、ＨＡ−Ｘ−ＨＡ−Ｙ、Ｘ−ＨＡ−Ｙ−ＨＡまたは複数の組合せおよび／またはＨＡ配列内のいずれかの位置における挿入Ｘおよび／またはＹとして表わせる。
【００５８】
二または多官能性アルブミン融合タンパク質は、機能、半減期などに応じて、様々な比率で作製しうる。
【００５９】
二または多官能性アルブミン融合タンパク質は、ＨＡの反対端にあるタンパク質またはペプチドを介して標的臓器または細胞タイプへ融合体の治療用タンパク質部分を向かわせうるように作製してもよい。
【００６０】
公知の治療用分子の融合体に代わるものとして、典型的には６、８、１２、２０、２５またはＸｎ（Ｘはアミノ酸であり、ｎは残基の数である）ランダム化アミノ酸のＨＡまたはＨＡのドメイン断片のＮ、ＣまたはＮおよびＣ末端への融合体として構築されたライブラリーのスクリーニングにより、ペプチドは得ることができ、そこではアミノ酸のすべての可能な組合せが表わされた。このアプローチの特別な利点は、ペプチドがＨＡ分子付きのままで選択され、したがって、ペプチドの性質が、可能性として変化することなく、いずれか他の方法により誘導されて後からＨＡへ付着されるペプチドの場合のように選択しうることである。
【００６１】
加えて、本発明のアルブミン融合タンパク質は、各部分間で物理的距離を大きくして、例えば同族レセプターと結合する際の、治療用タンパク質部分の接近性を最大化するために、融合部分間にリンカーペプチドを含有してもよい。リンカーペプチドは、それがフレキシブルまたはより硬くなるように、アミノ酸から構成される。
【００６２】
したがって、上記のように、本発明のアルブミン融合タンパク質は下記式：Ｒ２−Ｒ１；Ｒ１−Ｒ２；Ｒ２−Ｒ１−Ｒ２；Ｒ２−Ｌ−Ｒ１−Ｌ−Ｒ２；Ｒ１−Ｌ−Ｒ２；Ｒ２−Ｌ−Ｒ１；またはＲ１−Ｌ−Ｒ２−Ｌ−Ｒ１を有している：ここでＲ１は少なくとも１つの治療用タンパク質、ペプチドまたはポリペプチド配列（その断片または変種を含む）であり、必ずしも同一の治療用タンパク質ではなく、Ｌはリンカーであり、かつ、Ｒ２は血清アルブミン配列（その断片または変種を含む）である。リンカーの例としては、（ＧＧＧＧＳ）Ｎ（配列番号８）、（ＧＧＧＳ）Ｎ（配列番号９）または（ＧＧＳ）Ｎがあり、ここでＮは１以上の整数であり、Ｇはグリシンを表わし、Ｓはセリンを表わす。Ｒ１が２以上の治療用タンパク質、ペプチドまたはポリペプチド配列であるとき、これらの配列は必要に応じてリンカーで連結される。
【００６３】
他の態様において、治療用タンパク質を含んでなる本発明のアルブミン融合タンパク質は、アルブミンへ融合されていない同治療用タンパク質の貯蔵期間、インビボ半減期または治療活性と比較して、長い貯蔵期間、インビボ半減期または治療活性を有している。貯蔵期間とは、典型的には、溶解状態またはある他の貯蔵処方時における治療用タンパク質の治療活性が治療活性の過度な喪失なしに安定である期間に関する。治療用タンパク質の多くは、それらの非融合状態時で高度に不安定である。下記のように、これら治療用タンパク質の典型的貯蔵期間は、本発明のアルブミン融合タンパク質中への組込みで著しく長期化している。
【００６４】
貯蔵期間が「長期化」または「延長」された本発明のアルブミン融合タンパク質は、同一の貯蔵および取扱い条件に付された標準と比較して、大きな治療活性を示す。標準は非融合全鎖長治療用タンパク質である。アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分がアナローグ、変種であるか、またはそれ以外に改変されているか、またはそのタンパク質の完全配列を含まないとき、治療活性の長期化はアナローグ、変種、改変ペプチドまたは不完全配列の非融合相当物と比較される。例として、本発明のアルブミン融合タンパク質は、標準と同一の貯蔵および取扱い条件に付されて、所定の時点で比較されたとき、標準の治療活性の約１００％以上、または治療活性の約１０５％、１１０％、１２０％、１３０％、１５０％または２００％以上を留めている。しかしながら、治療活性は治療用タンパク質の安定性に依存しており、１００％以下のこともある。
【００６５】
貯蔵期間は、貯蔵が始まったときの治療活性を基準とした、貯蔵後に残留する治療活性として評価してもよい。治療活性の長期化または延長で示されるような、貯蔵期間が長期化または延長された本発明のアルブミン融合タンパク質は、同一条件に付されたとき、相当する非融合治療用タンパク質の治療活性の約５０％以上、治療活性の約６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上を留めている。
【００６６】
治療用タンパク質
上記のように、本発明のアルブミン融合タンパク質は、遺伝子融合で互いに結合された、治療用タンパク質の少なくとも１つの断片または変種と、ヒト血清アルブミンの少なくとも１つの断片または変種とを含んでなる。
【００６７】
ここで用いられている「治療用タンパク質」とは、１以上の治療および／または生物活性を有するＨＩＶ融合阻害ペプチド（例えば、Ｔ−２０、Ｔ−１２４９、５−ヘリックスまたはシアノビリン−Ｎ）またはその断片もしくは変種に関する。そのため、本発明のアルブミン融合タンパク質は治療用タンパク質の少なくとも１つの断片または変種を含有してもよい。加えて、「治療用タンパク質」という用語は、治療用タンパク質の内在または天然相関物に関することもある。変種には変異体、アナローグ、ミメティックおよびホモローグを含み、治療用タンパク質の内在または天然相関物を含める。
【００６８】
「治療活性」を示すポリペプチドまたは「治療活性」であるタンパク質とは、ここで記載されたまたは当業界で知られている１種以上の治療用タンパク質のような、治療用タンパク質に付随する１種以上の公知生物および／または治療活性を有したポリペプチドを意味する。非制限例として、「治療用タンパク質」は、疾患、症状または障害を治療、予防または改善する上で有用なタンパク質である。
【００６９】
ここで用いられている「治療活性」または「活性」とは、その効果がヒトで望まれる治療成果、あるいは非ヒト哺乳動物または他の種もしくは生物で望まれる効果と符合する、活性に関する。治療活性はインビボまたはインビトロで測定される。例えば、望ましい効果は細胞培養物でアッセイされる。このようなインビトロまたは細胞培養物アッセイは、当業界で記載されているように、多くの治療用タンパク質について通常利用しうる。
【００７０】
有用アッセイの例には、参考のためここで特に組み込まれる、表１のレファレンスおよび文献（例えば米国特許６，１３３，４１８、第１２欄、２０〜５８行目）で記載されたもの、および本例８および１１で記載されたものがあるが、それらに限定されない。本発明の融合タンパク質により示される抗ウイルス活性は、例えば、シンシチウム形成を阻害する融合タンパク質の能力、または無細胞ウイルスによる感染を阻止するそれらの能力について試験しうる、ここで記載されているような簡単に行えるインビトロアッセイにより測定される。これらのアッセイを用いて、所定のウイルス株に対して示す融合タンパク質の相対的な抗ウイルス活性および／または融合タンパク質の株特異的阻害活性のようなパラメーターが調べられる。細胞−細胞融合アッセイは、インビトロでＨＩＶ誘導性シンシチウム形成を阻害する融合タンパク質の能力を試験するために利用しうる。このようなアッセイでは、長期ＨＩＶ感染細胞およびアッセイされるペプチドの存在下で（例えば、ＭｏｌｔまたはＣＥＭ細胞のような）未感染ＣＤ−４＋細胞を培養する。各ペプチドについて、ある範囲のペプチド濃度で試験される。この範囲には、ペプチドが加えられなかったコントロール培養物を含めるべきである。当業者に周知の培養標準条件が用いられる。適切な時間にわたるインキュベート（例えば、３７℃で２４〜７２時間）後、培養物は細胞融合およびシンシチウム形成の指標である多核巨細胞の存在について顕微鏡観察される。
【００７１】
別な例として、逆転写酵素（ＲＴ）アッセイが無細胞ＨＩＶによるＣＤ−４＋細胞の感染を阻止する融合タンパク質の能力を試験するために利用しうる。このようなアッセイでは、試験される融合タンパク質の存在下で、適切な濃度（即ち、ＴＣＩＤ５０）のウイルスおよびＣＤ−４＋細胞を培養する。当業者に周知の培養条件が用いられる。上記のように、ペプチドが加えられなかったコントロール培養物に加えて、ある範囲の融合タンパク質濃度が用いられる。適切な培養時間（約７日間）のインキュベート後に、標準操作を用いて無細胞上澄が調製され、感染成功の尺度としてＲＴ活性の存在について試験される。ＲＴ活性は、例えばGoff et al.（Goff,S.et al.,1981,J.Virol.38:239-248）および／またはWilley et al.（Willey,R.et al.,1988,J.Virol.62:139-147）により記載されたような標準技術を用いて試験される。これらのレファレンスは参考のためそれら全体でここに組み込まれる。
【００７２】
本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に相当する治療用タンパク質は、１以上のオリゴ糖基の結合で修飾してもよい。グリコシル化と称される修飾は、タンパク質の物理的性質に劇的な影響を与え、タンパク質の安定性、分泌および局在化に重要なこともある。このような修飾は、参考のためここに組み込まれる、米国仮出願第６０／３５５，５４７およびＷＯ０１／７９４８０で詳細に記載されている。
【００７３】
本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に相当する治療用タンパク質、並びにそのアナローグおよび変種は、それらが発現される宿主細胞により、または他の発現条件により、１以上の部位におけるグリコシル化がそれら核酸配列の操作結果として改変されるように修飾してよい。例えば、グリコシル化異性体は、グリコシル化部位を除くまたは導入することにより、例えばアスパラギンからグルタミンへの置換のような、アミノ酸残基の置換または欠失により産生してもよく、あるいは非グリコシル化組換えタンパク質は、それらをグリコシル化しない宿主細胞、例えばE.coliまたはグリコシル化欠陥酵母で、タンパク質を発現させることにより産生してもよい。これらアプローチの例は、参考のため組み込まれる、当業界で知られた米国仮出願第６０／３５５，５４７およびＷＯ０１／７９４８０で更に詳細に記載されている。
【００７４】
表１は、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に相当する治療用タンパク質の非網羅リストを掲載している。「治療用タンパク質Ｘ」欄では、治療用タンパク質分子を開示しており、その後の括弧書では、その治療用タンパク質分子またはその断片もしくは変種を含んでなる、またはそれらからなる、科学およびブランド名を記載している。ここで用いられている「治療用タンパク質Ｘ」とは、（ＣＡＳおよびGenebank受入番号から得られるアミノ酸配列により特定されるような）個別の治療用タンパク質分子、またはこの欄で開示された所定の治療用タンパク質分子に関連した治療用タンパク質の全体グループに関する。これら項目の各々に関連した情報は、特にそこで記載されたアミノ酸配列に関して、それら全体で参考のため各々組み込まれる。「ＰＣＴ／特許レファレンス」欄では、治療用タンパク質分子について記載する特許および／または公開特許出願に対応した米国特許番号、またはＰＣＴ国際公開番号を掲載している。「ＰＣＴ／特許レファレンス」欄で引用された特許および／または公開特許出願の各々は、参考のためそれら全体でここに組み込まれる。特に、各引用「ＰＣＴ／特許レファレンス」の配列リストで掲載された特定ポリペプチドのアミノ酸配列、例えば各引用「ＰＣＴ／特許レファレンス」の詳細な説明で掲載されたこれらアミノ酸配列の変種（変異体、断片など）、例えば各引用「ＰＣＴ／特許レファレンス」の詳細な説明で掲載された治療適応症、および各引用「ＰＣＴ／特許レファレンス」の詳細な説明、更に詳しくは実施例で掲載された特定ポリペプチドについての活性アッセイが、参考のためここに組み込まれる。「生物活性」欄は、治療用タンパク質分子に伴う生物活性を記載している。「関連情報」欄で引用されたレファレンスの各々は、特に対応生物活性のアッセイについてレファレンス（例えば、方法セクション参照）で記載された各活性アッセイの記載に関して、参考のためそれら全体でここに組み込まれる。「好ましい適応症Ｙ」欄では、治療用タンパク質Ｘ、または治療用タンパク質Ｘ部分を含んでなる本発明のアルブミン融合タンパク質により治療、予防、診断または改善される、疾患、障害および／または症状について記載している。
【００７５】
【表１】
2005516607.tif 000003
【００７６】
様々な態様において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、表１の対応列で掲載されたアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に相当する治療用タンパク質の治療活性および／または生物活性に相当する治療活性および／または生物活性を発揮しうる（例えば、表１の「生物活性」および「治療用タンパク質Ｘ」欄参照）。別の態様において、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療活性タンパク質部分はレファレンス配列の断片または変種であり、表１の「生物活性」欄で開示された対応治療用タンパク質の治療活性および／または生物活性を発揮しうる。
【００７７】
ポリペプチドおよびポリヌクレオチド断片および変種
断片
本発明は、表１で記載された治療用タンパク質、アルブミンタンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質の断片に更に関する。
【００７８】
タンパク質のＮ末端から１以上のアミノ酸の欠失が、治療用タンパク質、アルブミンタンパク質および／またはアルブミン融合タンパク質の１以上の生物学的機能の変化または喪失をもたらすとしても、他の治療活性および／または機能活性（例えば、生物活性、マルチマー化する能力、リガンドと結合する能力）はなお留まることがある。例えば、ポリペプチドの完全または成熟型を認識する抗体を誘導しうるおよび／またはそれと結合しうる、Ｎ末端欠失ポリペプチドの能力は、完全ポリペプチドの残基が過半数に満たないでＮ末端から除去されたとき、通常留められる。完全ポリペプチドのＮ末端残基を欠く具体的なポリペプチドがこのような免疫活性を留めているかどうかは、ここで記載された当業界で知られる常法により、簡単に調べられる。多数の欠失Ｎ末端アミノ酸残基を有する変異タンパク質がある生物または免疫活性を留めていることは、ないわけではない。事実、わずか６アミノ酸残基から構成されるペプチドでも、しばしば免疫応答を励起する。
【００７９】
したがって、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に相当する治療用タンパク質の断片には、全鎖長タンパク質、並びにレファレンスポリペプチド（例えば、表１で開示されているような治療用タンパク質）のアミノ酸配列のアミノ末端から１以上の残基を欠失させたポリペプチドを含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも、本発明に包含される。
【００８０】
加えて、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分に相当する血清アルブミンポリペプチドの断片には、全鎖長タンパク質、並びにレファレンスポリペプチド（例えば、血清アルブミン）のアミノ酸配列のアミノ末端から１以上の残基を欠失させたポリペプチドを含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも、本発明に包含される。
【００８１】
更に、本発明のアルブミン融合タンパク質の断片には、全鎖長アルブミン融合タンパク質、並びにアルブミン融合タンパク質のアミノ末端から１以上の残基を欠失させたポリペプチドを含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも、本発明に包含される。
【００８２】
本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に相当する治療用タンパク質（例えば、表１で掲載された治療用タンパク質）のアミノ酸配列のカルボキシ末端から１以上の残基を欠失させたポリペプチドを更に提供する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも、本発明に包含される。
【００８３】
加えて、本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分に相当するアルブミンタンパク質（例えば、血清アルブミン）のアミノ酸配列のカルボキシ末端から１以上の残基を欠失させたポリペプチドを提供する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも、本発明に包含される。
【００８４】
更に、本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質のカルボキシ末端から１以上の残基を欠失させたポリペプチドを提供する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも、本発明に包含される。
【００８５】
加えて、上記いずれのＮまたはＣ末端欠失も、ＮおよびＣ末端欠失レファレンスポリペプチド（例えば、表１で掲載された治療用タンパク質、または血清アルブミン（例えば、配列番号１８）、または本発明のアルブミン融合タンパク質）を作製するために組み合わせうる。本発明は、アミノおよびカルボキシル末端の双方から１以上のアミノ酸を欠失させたポリペプチドも提供する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも、本発明に包含される。
【００８６】
本出願は、ここで掲載されたレファレンスポリペプチド配列（例えば、治療用タンパク質、血清アルブミンタンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質）と少なくとも６０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のポリペプチドを含有したタンパク質、またはその断片にも関する。一部の態様において、本出願は、上記のようなＮおよびＣ末端欠失のアミノ酸配列を有するレファレンスポリペプチドと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のポリペプチドを含んでなるタンパク質に関する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも、本発明に包含される。
【００８７】
本発明の他のポリペプチド断片は、アミノ酸配列が断片である、治療用タンパク質または血清アルブミンタンパク質のポリペプチド配列の治療活性および／または機能活性（例えば、生物活性）を示すアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる断片である。
【００８８】
他のポリペプチド断片は生物活性断片である。生物活性断片とは、本発明のポリペプチドの活性と、必ずしも同一ではなく、類似した活性を示すものである。断片の生物活性には、望ましい活性の改善、または望ましくない活性の減少も含む。
【００８９】
変種
「変種」(variant)とは、レファレンス核酸またはポリペプチドとは異なるが、その本質的性質を留めた、ポリヌクレオチドまたは核酸に関する。通常、変種はレファレンス核酸またはポリペプチドと全体的に近似し、多くの領域では同一である。
【００９０】
ここで用いられている「変種」とは、治療用タンパク質（例えば、表１の「治療」欄参照）、アルブミンタンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質とは配列が異なるが、ここで他に記載されまたは当業界で他に知られているような、少なくとも１つのその機能性および／または治療性（例えば、表１の「生物活性」欄で開示されているような治療活性および／または生物活性）を留めた、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分、またはアルブミン融合タンパク質に関する。通常、変種は、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に相当する治療用タンパク質、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分に相当するアルブミンタンパク質、および／または本発明のアルブミン融合タンパク質のアミノ酸配列と全体的に非常に類似しており、多くの領域では同一である。これらの変種をコードする核酸も本発明に包含される。
【００９１】
本発明は、例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に相当する治療用タンパク質のアミノ酸配列（例えば、表１のレファレンスで開示されたアミノ酸配列またはその断片もしくは変種）、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分に相当するアルブミンタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号１８またはその断片もしくは変種）、および／または本発明のアルブミン融合タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも６０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含んでなる、またはからなるタンパク質にも関する。これらポリペプチドの断片も提供される（例えば、ここで記載されている断片）。本発明に包含される別なポリペプチドは、ストリンジェントハイブリッド形成条件下（例えば、約４５℃で６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）で結合ＤＮＡを濾過するハイブリッド形成、次いで約５０〜６５℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで１回以上の洗浄）、高ストリンジェント条件下（例えば、約４５℃で６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）で結合ＤＮＡを濾過するハイブリッド形成、次いで約６８℃で０．１×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳで１回以上の洗浄）または当業者に知られた他のストリンジェントハイブリッド形成条件下（例えば、Ausubel,F.M.et al.,eds.,1989,Current protocol in Molecular Biology,Green publishing associates,Inc.,and John Wiley & Sons Inc.,New York,page 6.3.1-6.3.6 and 2.10.3参照）で、本発明のアミノ酸配列をコードする核酸分子の相補体とハイブリッド形成するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドである。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明に包含される。
【００９２】
本発明の対象アミノ酸配列と少なくとも、例えば、９５％「同一」のアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、本ポリペプチドのアミノ酸配列が対象配列と同一であるが、本ポリペプチド配列が対象アミノ酸配列の１００アミノ酸毎に５以内のアミノ酸改変を有しうることを意味する。換言すると、対象アミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、本配列で５％以内のアミノ酸残基が挿入、欠失または他のアミノ酸と置換しうる。レファレンス配列のこれら改変は、レファレンスアミノ酸配列のアミノまたはカルボキシ末端で、あるいはこれら末端間のいずれで生じても、レファレンス配列の各残基内でまたはレファレンス配列内の１以上の隣接基で個別に散在してもよい。
【００９３】
実際問題として、いずれか具体的なポリペプチドが、例えば本発明のアルブミン融合タンパク質またはその断片（例えば、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分またはアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分）のアミノ酸配列と少なくとも６０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるかどうかは、従来どおりに公知のコンピュータープログラムを用いて調べることができる。このようなプログラムおよびそれらを用いる方法は、参考のためここに組み込まれる、例えば米国仮出願第６０／３５５，５４７およびＷＯ０１／７９４８０（ｐ．４１−４３）で記載されており、当業界で周知である。
【００９４】
本発明のポリヌクレオチド変種は、コード領域、非コード領域または双方で改変を含んでよい。ポリヌクレオチド変種には、サイレント置換、付加または欠失を生じるが、コードされたポリペプチドの性質または活性は変えない改変をもつものも含む。このようなヌクレオチド変種は、遺伝コードの縮重に基づくサイレント置換により作製してもよい。ポリペプチド変種には、５０以下、４０以下、３０以下、２０以下、１０以下または５〜５０、５〜２５、５〜１０、１〜５または１〜２のアミノ酸がいずれかの組合せで置換、欠失または付加されたものを含む。ポリヌクレオチド変種は、様々な理由から、例えば具体的宿主でのコドン発現を最適化するために作製しうる（微生物宿主、例えば酵母またはE.coliに好まれるものへヒトｍＲＮＡのコドンを改変する）。
【００９５】
別の態様では、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分をコードするポリヌクレオチドが、酵母または哺乳動物細胞での発現用に最適化されている。他の態様では、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分をコードするポリヌクレオチドが、酵母または哺乳動物細胞での発現用に最適化されている。更に別の態様では、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、酵母または哺乳動物細胞での発現用に最適化されている。
【００９６】
別の態様において、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドは、ここで記載されているようなストリンジェントハイブリッド形成条件下で、治療用タンパク質をコードする野生型ポリヌクレオチドとハイブリッド形成しない。別の態様において、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドは、ここで記載されているようなストリンジェントハイブリッド形成条件下で、アルブミンタンパク質をコードする野生型ポリヌクレオチドとハイブリッド形成しない。もう１つの態様において、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドは、ここで記載されているようなストリンジェントハイブリッド形成条件下で、治療用タンパク質部分またはアルブミンタンパク質部分をコードする野生型ポリヌクレオチドとハイブリッド形成しない。
【００９７】
追加の態様において、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分をコードするポリヌクレオチドは、その治療用タンパク質の天然配列を含んでいるわけではなく、またはそれからなるわけでもない。別の態様において、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分をコードするポリヌクレオチドは、アルブミンタンパク質の天然配列を含んでいるわけではなく、またはそれからなるわけでもない。別の態様において、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、治療用タンパク質部分またはアルブミンタンパク質部分の天然配列を含んでいるわけではなく、またはそれからなるわけでもない。
【００９８】
追加の態様において、治療用タンパク質は、天然野生型ポリヌクレオチドが存在しないように、バイオパンニング(biopanning)によりランダムペプチドライブラリーから選択される。
【００９９】
天然変種は「対立遺伝子変種」と称され、生物の染色体で所定の座を占める遺伝子の数種代替型のうち１つに関する（Genes II,Lewin,B.,ed.,John Wiley & Sons,New York(1985)）。これらの対立遺伝子変種はポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドレベルが様々であり、本発明に含まれる。一方、非天然変種は変異誘発技術または直接合成により作製しうる。
【０１００】
タンパク質エンジニアリングおよび組換えＤＮＡテクノロジーの公知方法を用いて、本発明のポリペプチドの特徴を改善または改変するために変種が作製される。例えば、１以上のアミノ酸が、生物学的機能の実質的喪失なしに、本発明のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端から欠失される。例えば、Ron et al.,J,Biol.Chem.268:2984-2988(1993)（ＫＧＦ変種）およびDobeli et al.,J.Biotechnology,7:199-216(1988)（インターフェロンγ変種）参照。
【０１０１】
更に、変種が天然タンパク質の場合と類似した生物活性を多くの場合に留めていることを、十分な証拠が証明している（例えば、Gayle et al.,J.Biol.Chem.268:22105-22111(1993)(ＩＬ−１ａ変種)）。更に、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端から１以上のアミノ酸を欠失させて、１以上の生物学的機能の改変または喪失をもたらすとしても、他の生物活性はなお留められることがある。例えば、分泌型を認識する抗体を誘導しうる、および／またはそれと結合しうる欠失変種の能力は、分泌型の残基が過半数に満たないでＮ末端またはＣ末端から除去されたとき、おそらく留められるであろう。タンパク質のＮまたはＣ末端残基を欠く具体的ポリペプチドがこのような免疫活性を留めているかどうかは、ここで記載され当業界で他に知られた常法により、簡単に調べられる。
【０１０２】
そのため、本発明は機能活性（例えば、生物活性および／または治療活性）を有したポリペプチド変種を更に含んでいる。別の態様において、本発明は、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に相当する治療用タンパク質の１以上の生物および／または治療活性に相当する機能活性（例えば、生物活性および／または治療活性、例えば表１の「生物活性」欄で開示されたもの）を有した、アルブミン融合タンパク質の変種を提供する。このような変種には、活性に影響をほとんど有しないような、当業界で知られた一般的規則に従い選択される欠失、挿入、逆転、反復および置換を含む。
【０１０３】
他の態様において、本発明の変種は保存的置換を有している。「保存的置換」とは、脂肪族または疎水性アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの置換；酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの置換；アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの置換；塩基性残基Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓの置換；芳香族残基Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐの置換；小サイズアミノ酸Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＭｅｔおよびＧｌｙの置換のような、グループ内の交換を意味する。
【０１０４】
表現型がサイレントのアミノ酸置換をどのように行うかに関するガイダンスは、例えばBowie et al.,”Deciphering the Message in Protein Sequences:Tolerance to Amino Acid Substitutions”,Science,247:1306-1310(1990)で示されており、そこでは改変しうるアミノ酸配列の許容性を研究するための主戦略が２つあることを著者は示している。
【０１０５】
著者が述べているように、タンパク質はアミノ酸置換に対して驚くほど許容性である。その著者は、どのアミノ酸変更がタンパク質のあるアミノ酸位置で許容されそうかを更に示している。例えば、（タンパク質の三次構造内に）ほとんど埋没されたアミノ酸残基は非極性側鎖を必要とし、表面側鎖の特徴は通常ほとんど保存されていない。更に、許容される保存的アミノ酸置換には、脂肪族または疎水性アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの置換；酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの置換；アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの置換；塩基性残基Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓの置換；芳香族残基Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐの置換；小サイズアミノ酸Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＭｅｔおよびＧｌｙの置換がある。
【０１０６】
保存的アミノ酸置換の他にも、本発明の変種には、（ｉ）置換アミノ酸残基が遺伝コードでコードされたまたはそうでない、非保存アミノ酸残基の１以上の置換を含んだポリペプチド、(ii)置換基を有するアミノ酸残基の１以上の置換を含んだポリペプチド、(iii)他の化合物、例えばポリペプチドの安定性および／または溶解性を増す化合物（例えば、ポリエチレングリコール）と融合された、または化学的に接合されたポリペプチド、または(iv)例えばＩｇＧ  Ｆｃ融合領域ペプチドのような追加アミノ酸を含んだポリペプチドがある。このような変種ポリペプチドは、ここでの開示から当業者の範囲内に属すると思われる。
【０１０７】
例えば、他の荷電または中性アミノ酸による荷電アミノ酸のアミノ酸置換を含んだポリペプチド変種は、低凝集性のような、改善された特徴を有するタンパク質をもたらすことがある。医薬処方物の凝集は、凝集物の免疫活性のせいで、活性を減少させ、クリアランスを増加させる。Pinckard et al.,Clin.Exp.Immunol.2:331-340(1967)；Robbins et al.,Diabetes 36:838-845(1987)；Cleland et al.,Crit.Rev.Therapeutic Drug Carrier Systems 10:307-377(1993)参照。
【０１０８】
特定の態様において、本発明のポリペプチドは、ここで記載された治療用タンパク質および／またはヒト血清アルブミンおよび／または本発明のアルブミン融合タンパク質のアミノ酸配列の断片または変種を含んでなるか、またはそれからなり、その断片または変種は、レファレンスアミノ酸配列と比較して、１〜５、５〜１０、５〜２５、５〜５０、１０〜５０または５０〜１５０アミノ酸残基の付加、置換および／または欠失を有している。ある態様において、アミノ酸置換は保存的である。これらのポリペプチドをコードする核酸も本発明に包含される。
【０１０９】
本発明のポリペプチドは、ペプチド結合または修正ペプチド結合、即ちペプチドアイソスターで互いに結合されたアミノ酸から構成され、２０遺伝子コードアミノ酸以外のアミノ酸を含有してもよい。ポリペプチドは、翻訳後プロセッシングのような自然プロセスまたは当業界で周知の化学的修飾技術により修飾してもよい。このような修飾は、基本テキスト、更に詳細な専門研究論文、および多数の研究文献で詳しく記載されている。修飾は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端を含めて、ポリペプチドのどの箇所で生じてもよい。同一タイプの修飾が所定ポリペプチドの数部位に同一または異なる程度で存在しうることは明らかであろう。しかも、所定ポリペプチドは多くのタイプの修飾を含んでよい。ポリペプチドは、例えばユビキチン化の結果として分岐させてもよく、それらは分岐があるまたはない環状でもよい。環状、分岐および分岐環状ポリペプチドは翻訳後自然プロセスから得ても、または合成法により作製してもよい。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリスチル化、酸化、ペギル化、タンパク質分解プロセッシング、ホスホリル化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のようなタンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ媒介付加、およびユビキチン化がある。
【０１１０】
更に、化学的存在物も、例えばBiotechnology,10:324(1999)のCurrent Opinionsで開示された方法により、特定の機能または生物活性を高めるまたは調節するために、アルブミン融合タンパク質へ共有結合させてよい。
【０１１１】
本発明に包含される追加の翻訳後修飾には、例えば、Ｎ連結またはＯ連結炭水化物鎖、Ｎ末端またはＣ末端のプロセッシング、アミノ酸主鎖への化学的部分の付着、Ｎ連結またはＯ連結炭水化物鎖の化学修飾、および原核宿主細胞発現の結果としてＮ末端メチオニン残基の付加または欠失がある。アルブミン融合タンパク質は、例えば、薬物のような化学療法剤で、および／またはタンパク質の検出および単離を行えるように、酵素、蛍光、アイソトープおよび／または親和性ラベルのような検出可能ラベルで修飾してもよいが、それらに限定されない。このような修飾の例は、例えば、参考のためここに組み込まれる、当業界で周知の米国仮出願第６０／３５５，５４７およびＷＯ０１／７９４８０（ｐ．１０５−１０６）で示されている。
【０１１２】
機能活性
「機能活性を有するポリペプチド」とは、全鎖長プロタンパク質および／または治療用タンパク質の成熟型に伴う１以上の既知機能活性を示せるポリペプチドに関する。このような機能活性には、生物活性、抗原性〔抗ポリペプチド抗体と結合しうる（または結合に際してポリペプチドと競合しうる）能力〕、免疫原性（本発明の特定ポリペプチドと結合する抗体を産生しうる能力）、本発明のポリペプチドとマルチマーを形成しうる能力、およびポリペプチドのレセプターまたはリガンドと結合しうる能力があるが、それらに限定されない。
【０１１３】
「生物活性を有するポリペプチド」とは、用量依存的にまたはそれなしで、特定の生物学的アッセイで測定されるような、成熟型を含めた、本発明の治療用タンパク質の活性と類似した、但し必ずしもそれと同一ではない、活性を示す、ポリペプチドに関する。用量依存性が存在する場合に、それはポリペプチドの場合と同一でなく、本発明のポリペプチドと比較して、むしろ所定活性で用量依存性と実質的に類似していることを要する。
【０１１４】
他の態様において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、アルブミンと融合していないときの治療用タンパク質（またはその断片もしくは変種）に伴う生物および／または治療活性を少なくとも１つ有している。
【０１１５】
本発明のアルブミン融合タンパク質は、当業界で公知のルーチンな修飾アッセイ、およびここで記載されたアッセイを用いて、機能活性（例えば、生物活性）についてアッセイしうる。特に、アルブミン融合タンパク質は、表１の「関連文献」欄で掲載されたアッセイを用いて、機能活性（例えば、生物活性または治療活性）についてアッセイしうる。加えて、当業者は、表１の対応列に掲載されたアッセイを用いて、活性について、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に相当する治療用タンパク質の断片をルーチンでアッセイしうる。更に、当業者は、当業界で知られた、および／または米国仮出願第６０／３５５，５４７およびＷＯ０１／７９４８０の実施例セクションで記載されたようなアッセイを用いて、活性について、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分に相当するアルブミンタンパク質の断片をルーチンでアッセイしてもよい。
【０１１６】
加えて、ここで記載された（例および表１参照）、そうでなければ当業界で知られたアッセイは、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分および／またはアルブミン部分に関連した生物活性および／または治療活性（インビトロまたはインビボ）を発揮しうる、本発明のアルブミン融合タンパク質とその断片、変種および誘導体の能力を測定するために、ルーチンで適用される。他の方法も当業者に公知であり、本発明の範囲内に属する。
【０１１７】
融合タンパク質の発現
本発明のアルブミン融合タンパク質は、酵母、微生物、例えば細菌、またはヒトもしくは動物細胞系からの分泌により、組換え分子として産生してもよい。必要に応じて、ポリペプチドは宿主細胞から分泌される。
【０１１８】
ここで例示されたアルブミン融合タンパク質の発現向けに、ＷＯ９５／３３８３３で例示されたようなＨＳＰ１５０遺伝子の酵母株分断物(disrupted)、ＷＯ００／４４７７２で例示されたようなＰＭＴ１遺伝子の酵母株分断物〔ｒＨＡプロセス〕（アルブミン融合体のＯ連結グリコシル化を減少／消失させるように働く）またはＷＯ９５／２３８５７で例示されたようなＹＡＰ３遺伝子の酵母株分断物が、酵母ＰＲＢ１プロモーター、ＷＯ９０／０１０６３で例示されたＨＳＡ／ＭＦα−１融合リーダー配列、酵母ＡＤＨ１ターミネーター、ＬＥＵ２選択マーカーおよびＵＳ５，６３７，５０４で例示された崩壊ベクターｐＳＡＣ３５と組み合わせて、好結果に用いられた。
【０１１９】
本発明で有用と期待される他の酵母株、プロモーター、リーダー配列、ターミネーター、マーカーおよびベクターは、参考のためここに組み込まれる、当業界で周知の米国仮出願第６０／３５５，５４７およびＷＯ０１／７４９８０（ｐ．９４−９９）で記載されている。
【０１２０】
本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質を発現するように形質転換された細胞、必要に応じて酵母細胞も含む。形質転換宿主細胞自体に加えて、本発明では、栄養培地中における、それら細胞の培養物、必要に応じてモノクローナル（クローン的に均一な）培養物、またはモノクローナル培養物から誘導された培養物も考えている。そのポリペプチドが分泌されるならば、培地は細胞と一緒に、あるいはそれらが濾過または遠心で除去されるならば細胞なしで、そのポリペプチドを含有する。細菌（例えば、E.coliおよびBacillus subtilis）、酵母（例えば、Saccharomyces cerevisiae、Kluyveromyces lactisおよびPichia pastoris）、糸状菌（例えば、Aspergillus）、植物細胞、動物細胞および昆虫細胞を含めて、多くの発現系が公知であり、用いうる。
【０１２１】
望ましいタンパク質は、例えば宿主染色体または遊離プラスミドに挿入されたコード配列から、従来の手法で産生される。酵母は、いずれかの常法、例えばエレクトロポレーションにより、望ましいタンパク質のコード配列で形質転換される。エレクトロポレーションによる酵母の形質転換のための方法は、Becker & Guarente(1990)Methods Enzymol.194,182で開示されている。
【０１２２】
好結果に形質転換された細胞、即ち本発明のＤＮＡ構築物を含有した細胞は、周知の技術により同定しうる。例えば、発現構築物の導入から得られた細胞は、望ましいポリペプチドを産生するために増殖させうる。細胞は回収および溶離され、それらのＤＮＡ分がSouthern(1975)J.Mol.Biol.98,503またはBerent et al.(1985)Biotech.3,208により記載されたような方法を用いてＤＮＡの存在について試験される。一方、上澄中におけるタンパク質の存在は抗体を用いて検出しうる。
【０１２３】
有用な酵母プラスミドベクターにはｐＲＳ４０３−４０６およびｐＲＳ４１３−４１６があり、これらはStratagene Cloning Systems,La Jolla,CA 92037,USAから通常入手しうる。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５およびｐＲＳ４０６は酵母組込みプラスミド（ＹＩｐ）であり、酵母選択マーカーＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２およびＵＲＡ３を組み込んでいる。プラスミドｐＲＳ４１３−４１６は酵母動原体プラスミド（ＹＣｐ）である。
【０１２４】
酵母で発現用のアルブミン融合タンパク質を作製するためのベクターにはｐＰＰＣ０００５、ｐＳｃＣＨＳＡ、ｐＳｃＮＨＳＡおよびｐＣ４：ＨＳＡがあるが、それらはAmerican Type Culture Collection,10801 University Boulevard,Manassas,Virginia 20110-2209に２００１年４月１１日付で寄託され、参考のためここに組み込まれる仮出願第６０／３５５，５４７およびＷＯ０１／７９４８０で記載されている。
【０１２５】
酵母でアルブミン融合タンパク質を発現させるために有用であると期待されるもう１つのベクターは、参考のためそれ全体でここに組み込まれる、Sleep et al.,BioTechnology 8:42(1990)で記載されたｐＳＡＣ３５ベクターである。プラスミドｐＳＡＣ３５は、ＵＳ５，６３７，５０４で記載された崩壊クラスのベクターに属する。
【０１２６】
相補的付着末端を介してＤＮＡをベクターへ作働可能に連結させるために、様々な方法が開発された。例えば、相補的ホモポリマー領域がベクターＤＮＡへ挿入されるＤＮＡセグメントへ加えられる。次いで、ベクターおよびＤＮＡセグメントが、組換えＤＮＡ分子を形成するために、相補的ホモポリマーの尾部間で水素結合により結合される。
【０１２７】
１以上の制限部位を含んだ合成リンカーは、ＤＮＡセグメントをベクターへ結合させる代替法を提供する。エンドヌクレアーゼ制限切断で得られたＤＮＡセグメントは、３′，５′−エキソヌクレアーゼ分解活性で突出γ一本鎖末端を除去して、窪み３′末端を重合活性でふさぐ酵素、バクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼまたはE.coli ＤＮＡポリメラーゼＩで処理される。したがって、これら活性の組合せで平滑末端ＤＮＡセグメントを得る。次いで、平滑末端セグメントは、バクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼのような平滑末端ＤＮＡ分子の連結を触媒しうる酵素の存在下で、モル大過剰のリンカー分子とインキュベートされる。そのため、反応の産物は末端にポリマーリンカー配列を有するＤＮＡセグメントである。次いで、これらのＤＮＡセグメントは適切な制限酵素で開裂され、そのＤＮＡセグメントのものと適合しうる末端を生じる酵素で開裂された発現ベクターへ連結される。
【０１２８】
様々な制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する合成リンカーが、いくつかの市販元から商業的に入手しうる。
【０１２９】
本発明に従いＤＮＡを修飾する望ましい手法は、例えばＨＡ変種が作製されるのであれば、Saiki et al.(1988)Science 239,487-491で開示されたようなポリメラーゼ連鎖反応を用いることである。この方法において、酵素的に増幅されるＤＮＡは、増幅ＤＮＡ中へ自ら入り込む２種の特異的オリゴヌクレオチドプライマーにより隣接される。特異的プライマーは、当業界で公知の方法を用いて、発現ベクター中へのクローニングに用いうる制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含有してもよい。
【０１３０】
アルブミン融合タンパク質を発現させるための宿主として本発明の実施に際して有用と考えられる酵母の例示属は、Pichia（以前はHansenulaとして分類されていた）、Saccharomyces、Kluyveromyces、Aspergillus、Candida、Torulopsis、Torulaspora、Schizosaccharomyces、Citeromyces、Pachysolen、Zygosaccharomyces、Debaromyces、Trichoderma、Cephalosporium、Humicola、Mucor、Neurospora、Yarrowia、Metschunikowia、Rhodosporidium、Leucosporidium、Botryoascus、Sporidiobolus、Endomycopsisなどである。属には、Saccharomyces、Schizosaccharomyces、Kluyveromyces、PichiaおよびTorulasporaからなる群より選択されるものを含む。Saccharomyces spp.の例はS.cerevisiae、S.italicusおよびS.rouxiiである。他の種類の例およびそれらの形質転換方法は、参考のためここに組み込まれる、米国仮出願第６０／３５５，５４７およびＷＯ０１／７９４８０（ｐ．９７−９８）で記載されている。
【０１３１】
S.cerevisiaeの形質転換方法はＥＰ２５１７４４、ＥＰ２５８０６７およびＷＯ９０／０１０６３で一般的に記載されており、それらすべてが参考のためここに組み込まれる。
【０１３２】
S.cerevisiae用の適切なプロモーターには、ＰＧＫ１遺伝子、ＧＡＬ１またはＧＡＬ１０遺伝子、ＣＹＣ１、ＰＨＯ５、ＴＲＰ１、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、グルコキナーゼ、α−接合因子フェロモン（接合因子フェロモン）の遺伝子に伴うもの、ＰＲＢ１プロモーター、ＧＵＴ２プロモーター、ＧＰＤ１プロモーター、および他のプロモーターの５′調節領域の一部または上流活性化部位との５′調節領域の一部のハイブリッドを要するハイブリッドプロモーター（例えば、ＥＰ−Ａ−２５８０６７のプロモーター）がある。
【０１３３】
Schizosaccharomyces pombeで使用上便利な調節プロモーターは、Maundrell(1990)J.Biol.Chem.265,10857-10864で記載されたようなｎｍｔ遺伝子からのチアミン抑制性プロモーター、およびHoffman & Winston(1990)Genetics 124,807-816で記載されたようなグルコース抑制性ｊｂｐｌ遺伝子プロモーターである。
【０１３４】
外来遺伝子の発現用にPichiaを形質転換する方法は、例えば、Cregg et al.(1993)および様々なPhillips特許（例えば、参考のためここに組み込まれるＵＳ４，８５７，４６７）で開示され、Pichia発現キットはInvitrogen BV,Leek,NetherlandsおよびInvitrogen Corp.,San Diego,Californiaから市販されている。適切なプロモーターにはＡＯＸ１およびＡＯＸ２がある。Gleeson et al.(1986)J.Gen.Microbiol.132,3459-3465はHansenulaベクターおよび形質転換の情報を含み、適切なプロモーターはＭＯＸ１およびＦＭＤ１である；ＥＰ３６１９９１、Fleer et al.(1991)およびRhone-Poulenc Rorerによる他の文献では、Kluyveromyces spp.で外来タンパク質を発現する方法を開示している。
【０１３５】
転写終結シグナルは、転写終結およびポリアデニル化用の適正なシグナルを含む真核生物遺伝子の３′隣接配列でもよい。適切な３′隣接配列は、例えば、用いられた発現コントロール配列へ自然に連結された遺伝子のものでもよく、即ちプロモーターに相当してもよい。一方、それらは異なってもよく、その際にはS.cerevisiae ＡＤＨ１遺伝子の終結シグナルが必要に応じて用いられる。
【０１３６】
望ましいアルブミン融合タンパク質は分泌リーダー配列と一緒に初めは発現されることがあり、その配列は選択された酵母で有効ないかなるリーダーでもよい。S.cerevisiaeで有用なリーダーには、接合因子αポリペプチド（ＭＦα−１）からのもの、およびＥＰ−Ａ−３８７３１９のハイブリッドリーダーがある。このようなリーダー（またはシグナル）は、成熟アルブミンが周辺培地中へ放出される前に、酵母により開裂される。別のこのようなリーダーには、ＪＰ６２−０９６０８６（９１１０３６５１６として許可）で開示されたS.cerevisiaeインベルターゼ（ＳＵＣ２）、酸ホスファターゼ（ＰＨＯ５）、ＭＦα−１，０グルカナーゼのプレ配列（ＢＧＬ２）およびキラー毒素；S.diastaticusグルコアミラーゼII；S.carlsbergensis α−ガラクトシダーゼ（ＭＥＬ１）；K.lactisキラー毒素；およびCandidaグルコアミラーゼのものがある。
【０１３７】
アルブミン融合タンパク質の組換えおよび合成産生の別法
本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、これらのポリヌクレオチドを含有するベクター、宿主細胞および生物を含む。本発明は、合成および組換え技術により、本発明のアルブミン融合タンパク質を産生する方法も含む。ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞および生物は、当業界で公知の方法により単離および精製される。
【０１３８】
本発明で有用なベクターは、例えば、ファージ、プラスミド、コスミド、ミニ染色体、ウイルスまたはレトロウイルスベクターである。
【０１３９】
本発明のポリヌクレオチドをクローニングおよび／または発現するために利用しうるベクターは、そのポリヌクレオチドの複製および／または発現が望まれる宿主細胞でポリヌクレオチドを複製および／または発現しうるベクターである。一般的に、ポリヌクレオチドおよび／またはベクターは、哺乳動物細胞（例えばヒト（例えばＨｅＬａ）、サル（例えばＣｏｓ）、ウサギ（例えばウサギ網状赤血球）、ラット、ハムスター（例えば、ＣＨＯ、ＮＳＯおよびベビーハムスター腎臓細胞）またはマウス細胞（例えばＬ細胞））、植物細胞、酵母細胞、昆虫細胞または細菌細胞（例えばE.coli）を含めて、真核または原核いずれの細胞でも利用しうる。例えば、様々なタイプの宿主細胞向けに適したベクターの例に関して、F.Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience(1992) and Sambrook et al.(1989)参照。しかしながら、複製欠失のあるレトロウイルスベクターが用いられた場合、ウイルス増殖は相補的宿主細胞のみで通常生じることに留意しなければならない。
【０１４０】
これらのポリヌクレオチドを含有した宿主細胞は、例えば医薬、診断試薬、ワクチンおよび治療剤に有用なタンパク質を大量に発現させるために用いうる。タンパク質は、当業界で知られたまたはここで記載された方法により、単離および精製される。
【０１４１】
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、宿主で増殖用の選択マーカーを含有したベクターへ結合させてもよい。通常、プラスミドベクターは、沈降物、例えばリン酸カルシウム沈降物、または荷電脂質との複合物中に導入される。ベクターがウイルスであるならば、それは適切なパッケージング細胞系を用いてインビトロでパッケージングされ、次いで宿主細胞中へ導入される。
【０１４２】
ポリヌクレオチドインサートは、ポリヌクレオチドが発現される宿主細胞と適合しうる適切なプロモーターへ作働可能に連結すべきである。そのプロモーターは強プロモーターおよび／または誘導プロモーターである。プロモーターの例として、いくつか挙げると、ファージラムダＰＬプロモーター、E.coli ｌａｃ、ｔｒｐ、ｐｈｏＡおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、およびレトロウイルスＬＴＲのプロモーターがある。他の適切なプロモーターも当業者にはわかるであろう。発現構築物は、転写開始、終結のための部位、および転写領域には、翻訳のためのリボソーム結合部位を更に含有する。その構築物により発現される転写物のコード部分は、翻訳されるポリペプチドの始めに翻訳開始コドン、およびその終わりに終止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を適切な部位で含有しうる。
【０１４３】
示されたように、発現ベクターは少なくとも１つの選択マーカーを含有しうる。このようなマーカーには、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、Ｇ４１８、グルタミンシンターゼ、または真核細胞培養用のネオマイシン耐性、およびE.coliおよび他の細菌で培養向けのテトラサイクリン、カナマイシンまたはアンピシリン耐性遺伝子がある。適切な宿主の代表例には、細菌細胞、例えばE.coli、StreptomycesおよびSalmonella typhimurium細胞；真菌細胞、例えば酵母細胞（例えば、Saccharomyces cerevisiaeまたはPichia pastoris（ＡＴＣＣ受入Ｎｏ．２０１１７８））；昆虫細胞、例えばDrosophila S2およびSpodoptera Sf9細胞；動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＮＳＯ、２９３およびBowesメラノーマ細胞；および植物細胞があるが、それらに限定されない。上記宿主細胞用に適した培地および条件は、当業界で公知である。
【０１４４】
一つの態様において、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、原核または真核細胞の特定分画へ本発明のタンパク質を局在化させる、および／または原核または真核細胞から本発明のタンパク質を分泌させる、シグナル配列へ融合させてもよい。例えば、E.coliの場合では、タンパク質の発現を周辺腔へ向けたいと思うことがある。細菌の周辺腔へポリペプチドの発現を向けるために、本発明のアルブミン融合タンパク質が融合されるシグナル配列またはタンパク質（またはその断片）の例には、ｐｅｌＢシグナル配列、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）シグナル配列、ＭＢＰ、ｏｍｐＡシグナル配列、ペリプラズムE.coli熱不安定エンテロトキシンＢサブユニットのシグナル配列、およびアルカリホスファターゼのシグナル配列があるが、それらに限定されない。いくつかのベクターが、New England Biolabs市販のｐＭＡＬシリーズのベクター（特に、ｐＭＡＬ−ｐシリーズ）のように、タンパク質の局在化を指示する融合タンパク質の構築向けに市販されている。特定の態様において、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、グラム陰性菌でこのようなポリペプチドの発現および精製の効力を高めるために、ｐｅｌＢペクチン酸リアーゼシグナル配列へ融合される。米国特許第５，５７６，１９５および５，８４６，８１８参照；その内容は参考のためそれら全体でここに組み込まれる。
【０１４５】
哺乳動物細胞で分泌を指示するために本発明のアルブミン融合タンパク質へ融合されるシグナルペプチドの例には、ＭＰＩＦ−１シグナル配列（例えば、GenBank受入Ｎｏ．ＡＡＢ５１１３４のアミノ酸１−２１）、スタンニオカルシンシグナル配列（ＭＬＱＮＳＡＶＬＬＬＬＶＩＳＡＳＡ、配列番号１０）およびコンセンサスシグナル配列（ＭＰＴＷＡＷＷＬＦＬＶＬＬＬＡＬＷＡＰＡＲＧ、配列番号１１）があるが、それらに限定されない。バキュロウイルス発現系と共に用いうる適切なシグナル配列は、ｇｐ６７シグナル配列（例えば、GenBank受入Ｎｏ．ＡＡＡ７２７５９のアミノ酸１−１９）である。
【０１４６】
選択マーカーとしてグルタミンシンターゼ（ＧＳ）またはＤＨＦＲを用いたベクターは、各々薬物メチオニンスルホキシミンまたはメソトレキセートの存在下で増幅させうる。グルタミンシンターゼベースベクターの利点は、グルタミンシンターゼ陰性の細胞系（例えば、ネズミミエローマ細胞系ＮＳＯ）の利用可能性である。グルタミンシンターゼ発現系は、追加インヒビターを入れて内在遺伝子の機能を妨げることにより、グルタミンシンターゼ発現細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）でも機能しうる。グルタミンシンターゼ発現系およびその成分はＰＣＴ文献：ＷＯ８７／０４４６２、ＷＯ８６／０５８０７、ＷＯ８９／０１０３６、ＷＯ８９／１０４０４およびＷＯ９１／０６６５７で詳述されており、これらは参考のためそれら全体でここに組み込まれる。加えて、グルタミンシンターゼ発現ベクターはLonza Biologics,Inc.(Portsmouth,NH)から得られる。ネズミミエローマ細胞でＧＳ発現系を用いたモノクローナル抗体の発現および産生は、参考のためここに組み込まれるBebbington et al.,Bio/technology 10:169(1992)およびBiblia and Robinson Biotechnol.Prog.11:1(1995)で記載されている。
【０１４７】
本発明は、ベクター構築物を含有した宿主細胞、例えばここで記載されているものにも関し、当業界で公知の技術を用いて１以上の異種コントロール領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）と作働可能に結合された本発明のヌクレオチド配列を含有する宿主細胞を更に包含する。宿主細胞は哺乳動物細胞（例えば、ヒト由来細胞）のような高等真核細胞でもまたは酵母細胞のような下等真核細胞でもよく、あるいは宿主細胞は細菌細胞のような原核細胞でもよい。挿入遺伝子配列の発現を調節するか、または望ましい特別な方式で遺伝子産物を修飾およびプロセッシングする宿主株が選択される。あるプロモーターからの発現はあるインデューサーの存在下で高められる；こうして遺伝子工学ポリペプチドの発現が制御しうる。更に、異なる宿主細胞はタンパク質の翻訳および翻訳後プロセッシングおよび修飾（例えば、リン酸化、開裂）について特徴および特別なメカニズムを有している。発現される外来タンパク質の望ましい修飾およびプロセッシングを保証するために、適切な細胞系が選択される。
【０１４８】
本発明の核酸および核酸構築物の宿主細胞中への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、トランスダクション、感染または他の方法により行える。このような方法は多くの標準実験マニュアル、例えばDavis et al.,Basic Methods In Molecular Biology(1986)で記載されている。本発明のポリペプチドは組換えベクターを欠く宿主細胞により実際に発現させうる、と特に考えられている。
【０１４９】
ここで記載されたベクター構築物を含有した宿主細胞を包含することに加えて、本発明は、内在遺伝物質を欠失または置き換える（例えば、治療用タンパク質に相当するコード配列は、治療用タンパク質に相当するアルブミン融合タンパク質で置き換えてもよい）および／または遺伝物質を含有する（例えば、例えば治療用タンパク質に相当する本発明のアルブミン融合タンパク質のような異種ポリヌクレオチド配列が含有させうる）ように工学処理された脊椎動物源、特に哺乳動物源の一次、二次および不死化宿主細胞も包含する。内在ポリヌクレオチドと作働可能に結合された遺伝物質は、内在ポリヌクレオチドを活性化、変化および／または増幅させうる。
【０１５０】
加えて、当業界で公知の技術は、相同的組換え（例えば、１９９７年６月２４日付で発行された米国特許第５，６４１，６７０；国際公開第ＷＯ９６／２９４１１；国際公開第ＷＯ９４／１２６５０；Koller et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:8932-8935(1989)；Zijlstra et al.,Nature 342:435-438(1989)参照；それら各々の開示は参考のためそれら全体でここに組み込まれる）により、治療用タンパク質をコードする内在ポリヌクレオチド配列と、異種ポリヌクレオチド（例えば、アルブミンタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはその断片もしくは変種）および／または異種コントロール領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）を作働可能に結合させるために用いてもよい。
【０１５１】
有利には、本発明のアルブミン融合タンパク質は、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈降、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、疎水性電荷相互作用クロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた周知の方法により、組換え細胞培養物から回収および精製しうる。一部の態様では、高性能液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製に用いうる。
【０１５２】
一部の好ましい態様において、本発明のアルブミン融合タンパク質は上記の１以上のクロマトグラフィー法を用いて精製される。他の態様では、本発明のアルブミン融合タンパク質は次のクロマトグラフィーカラム、ＱセファロースＦＦカラム、ＳＰセファロースＦＦカラム、Ｑセファロース高性能カラム、ブルーセファロースＦＦカラム、ブルーカラム、フェニルセファロースＦＦカラム、ＤＥＡＥセファロースＦＦまたはメチルカラムのうち１以上を用いて精製される。
【０１５３】
加えて、本発明のアルブミン融合タンパク質は、参考のためそれ全体でここに組み込まれる国際公開第ＷＯ００／４４７７２で記載されたプロセスを用いて精製してもよい。当業者であれば、本発明のアルブミン融合タンパク質の精製で使用のために、ここで記載されたプロセスを容易に改変しうるであろう。
【０１５４】
本発明のアルブミン融合タンパク質は、例えば細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞を含めた原核または真核宿主から組換え技術により産生された産物より回収しうる。組換え産生操作で用いられた宿主に応じて、本発明のポリペプチドはグリコシル化されても、またはグリコシル化されなくてもよい。加えて、本発明のアルブミン融合タンパク質は、一部の場合には宿主媒介プロセスの結果として、開始修飾メチオニン残基も含有してよい。こうすると、翻訳開始コドンによりコードされたＮ末端メチオニンが、すべての真核細胞で翻訳後にタンパク質から高効力で通常除去されることは、当業界で周知である。ほとんどのタンパク質のＮ末端メチオニンはほとんどの原核細胞で効率的に除去されるが、一部のタンパク質の場合には、Ｎ末端メチオニンが共有結合されたアミノ酸の性質に応じて、この原核除去プロセスは非効率的である。
【０１５５】
本発明のアルブミン融合タンパク質、および治療用タンパク質またはその断片もしくは変種と結合する抗体は、マーカー配列、例えば精製を促すためのペプチドへ融合させてもよい。一つの態様において、マーカーアミノ酸配列はヘキサヒスチジンペプチド、例えばｐＱＥベクターでもたらされるタグ（QIAGEN,Inc.,9259 Eton Avenue,Chatsworth,CA,91311）であり、特にその多くが市販されている。例えばGentz et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:821-824(1989)で記載されているように、ヘキサヒスチジンは融合タンパク質の精製に便宜をもたらす。精製に有用な他のペプチドタグには、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から誘導されるエピトープに相当する「ＨＡ」タグ（Wilson et al.,Cell 37:767(1984)）および「ＦＬＡＧ」タグがあるが、それらに限定されない。
【０１５６】
更に、本発明のアルブミン融合タンパク質は、治療部分、例えば、細胞毒素、例えば細胞静止または細胞致死剤、治療剤または放射性金属イオン、例えば２１３Ｂｉのようなα放出体へ接合してもよい。このような剤の例は、参考のためここに組み込まれる、米国仮出願第６０／３５５，５４７およびＷＯ０１／７９４８０（ｐ．１０７）で記載されている。
【０１５７】
アルブミン融合タンパク質は、本発明のアルブミン融合タンパク質により結合されている、それと結合または会合するポリペプチドのイムノアッセイまたは精製に特に有用な固形担体へ付着させてもよい。このような固形担体には、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリビニルクロリドまたはポリプロピレンがあるが、それらに限定されない。
【０１５８】
ポリペプチドの溶解性、安定性および循環時間の向上、または免疫原性の低下のような追加の利点を発揮しうる、本発明のアルブミン融合タンパク質の化学的修飾誘導体も、本発明により提供される（米国特許第４，１７９，３３７参照）。ポリエチレングリコールの使用を伴う例は、参考のためここに組み込まれる、ＷＯ０１／７９４８０（ｐ．１０９−１１１）で記載されている。
【０１５９】
本発明のアルブミン融合タンパク質の存在および量は、当業界で知られている周知のイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡを用いて調べてもよい。
【０１６０】
ポリペプチドの使用
ここで特定されたポリペプチドの各々は様々な手法で用いうる。以下の記載は例示とみなすべきであり、公知の技術を利用している。
本発明のアルブミン融合タンパク質は、哺乳動物、好ましくはヒトで様々な障害の治療、予防および／または予後に有用である。このような障害には表１の「生物活性」欄で記載されたものがあるが、それらに限定されない。
【０１６１】
本発明のアルブミン融合タンパク質は、未感染細胞へのヒトおよび非ヒトレトロウイルス、特にＨＩＶ、伝染のインヒビターとして用いうる。伝染が本発明のペプチドにより阻止されるヒトレトロウイルスには、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２およびＴリンパ球ウイルス（ＨＴＬＶ−Ｉ、II、III）の全株があるが、それらに限定されない。伝染が本発明のペプチドにより阻止される非ヒトレトロウイルスには、ウシ白血症ウイルス、ネコ肉腫および白血病ウイルス、サル肉腫および白血病ウイルス、およびヒツジ進行性肺炎ウイルスがあるが、それらに限定されない。
【０１６２】
更に、本発明のアルブミン融合タンパク質は疾患または症状を治療または予防するために用いうる。ＨＩＶに関して、本発明のアルブミン融合タンパク質はエイズまたは他のＨＩＶ関連疾患または障害の予防または治療で予防剤または治療剤として用いてよい。
【０１６３】
加えて、本発明のアルブミン融合タンパク質は、ＨＩＶウイルスへの急性的な曝露後に、これまで未感染の個体で予防手段として用いうる。ペプチドのこのような予防使用の例には、母から子へのウイルス伝染の防止、およびＨＩＶ伝染の可能性が存在する他の環境、例えば作業者がＨＩＶ含有血液製剤へ曝されるヘルスケア環境下のアクシデントがあるが、それらに限定されない。本発明のアルブミン融合タンパク質はこのような場合に予防ワクチンの役割を果たし、宿主が本発明のアルブミン融合タンパク質に対する抗体を産生してから、例えば新たなＨＩＶ感染を阻止することで、ＨＩＶウイルスを中和するように働く。
【０１６４】
アルブミン融合タンパク質は、生物学的サンプルでポリペプチドのレベルをアッセイするために用いうる。例えば、本発明の放射線標識アルブミン融合タンパク質は体のウイルス結節の画像診断に用いられる。アッセイの例は、例えば、参考のためここに組み込まれ、当業界で周知の米国仮出願第６０／３５５，５４７およびＷＯ０１７９４８０（ｐ．１１２−１２２）で記載されている。
【０１６５】
本発明のアルブミン融合タンパク質は、宿主細胞の形質転換を評価する手法として、または生物学的サンプルにおいて、組換え細胞からの治療用タンパク質、アルブミンタンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質のタンパク質発現を測定するために用いられる抗体を産生するために用いることもできる。更に、本発明のアルブミン融合タンパク質は、ここで記載された生物活性を試験するために用いうる。
【０１６６】
トランスジェニック生物
本発明のアルブミン融合タンパク質を発現するトランスジェニック生物も本発明に含まれる。トランスジェニック生物は、組換え、外来またはクローン化遺伝物質が移入された遺伝子修飾生物である。このような遺伝物質はトランスジーンと称されることが多い。トランスジーンの核酸配列は、コードされたタンパク質の最良発現および分泌に必要かもしれない、１以上の転写調節配列および他の核酸配列、例えばイントロンを含有しうる。トランスジーンは、生物からの、または生物により産生された産物からの、例えば生物の乳、血液、尿、卵、毛または種子からの回収を促すやり方で、コードタンパク質の発現を指示するようにデザインしてもよい。トランスジーンは、標的動物の種と同様の種またはそれとは異なる種のゲノムから誘導される核酸配列からなる。トランスジーンは、特定の核酸配列が通常みられないゲノムの座に、またはトランスジーンの正常な座に組み込まれる。
【０１６７】
「生殖細胞系トランスジェニック生物」という用語は、遺伝子改変または遺伝情報が生殖系細胞中へ導入されることで、遺伝情報を子孫へ伝えうるトランスジェニック生物の能力を付与した、トランスジェニック生物に関する。このような子孫がその改変または遺伝情報の一部または全部を実際に有しているならば、それらもトランスジェニック生物である。その改変または遺伝情報は、レシピエントが属する生物の種に外来でも、具体的な個別のレシピエントのみに外来であっても、またはレシピエントにより既に保有された遺伝情報でもよい。最後の場合に、改変または導入された遺伝子は、在来遺伝子とは別に発現されることもある。
【０１６８】
トランスジェニック生物は、トランスジェニックのヒト、動物または植物である。トランスジェニックは、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、胚幹細胞での遺伝子標的化と組換えウイルスおよびレトロウイルス感染を含めた様々な異なる方法により作製しうる（例えば、米国特許第４，７３６，８６６；米国特許第５，６０２，３０７；Mullins et al.(1993)Hypertension 22(4):630-633；Brenin et al.(1997)Surg.Oncol.6(2)99-111；Tuan(ed.),Recombinant Gene Expression Protocols,Methods in Molecular Biology No.62,Humana Press(1997)参照）。組換えコンピテント哺乳動物細胞中への核酸断片の導入方法は、マルチ核酸分子の同時形質転換を行わせる、どのような方法によるものでもよい。トランスジェニック動物を作製するための詳細な操作は、米国特許第５，４８９，７４３および米国特許第５，６０２，３０７の開示を含めて、当業者に容易に利用しうる。追加の情報は、参考のためここに組み込まれる、米国仮出願第６０／３５５，５４７およびＷＯ０１／７９４８０（ｐ．１５１−１６２）で記載されている。
【０１６９】
遺伝子療法
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする構築物は、治療有効量のアルブミン融合タンパク質を送達する遺伝子療法プロトコールの一部として用いうる。細胞中への核酸のインビボ導入のための１つのアプローチは、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする核酸を含有したウイルスベクターの使用による。ウイルスベクターによる細胞の感染は、標的細胞の大部分がその核酸を受け取れる、という利点を有している。加えて、ウイルスベクター内でコードされた分子は、例えばウイルスベクターに含有されたｃＤＮＡにより、ウイルスベクター核酸を取り込んだ細胞で効率的に発現される。望ましいアルブミン融合タンパク質の血漿半減期延長は、潜在的な低発現レベルすら補えるかもしれない。
【０１７０】
レトロウイルスベクターおよびアデノ関連ウイルスベクターは、インビボでアルブミン融合タンパク質をコードする外来核酸分子の移入用の組換え遺伝子送達系として用いうる。これらのベクターは細胞中への核酸の効率的送達を行い、移入された核酸は宿主の染色体ＤＮＡ中へ安定的に組み込まれる。このようなベクターの例、それらを用いる方法、それらの利点および非ウイルス送達法は、参考のためここに組み込まれる、米国仮出願第６０／３５５，５４７およびＷＯ０１／７９４８０（ｐ．１５１−１５３）で詳細に記載されている。
【０１７１】
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする遺伝子用の遺伝子送達系は、いくつかの方法で患者へ導入される。例えば、遺伝子送達系の医薬製剤は、例えば静脈注射により全身導入でき、標的細胞へのタンパク質の特異的導入は、遺伝子送達ビヒクルにより得られるトランスフェクションの特異性、レセプター遺伝子の転写調節配列制御発現による細胞タイプまたは組織タイプ発現、またはそれらの組合せから優先的に生じる。他の態様において、組換え遺伝子の初期送達は更に制限されており、動物への導入は全く局在化されている。例えば、遺伝子送達ビヒクルはカテーテル（米国特許５，３２８，４７０）または定位注射（例えば、Chen et al.(1994)PNAS 91:3054-3057）により導入しうる。遺伝子療法構築物の医薬製剤は許容される希釈物中の遺伝子送達系から本質的になるか、または遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれた徐放性マトリックスを含むことができる。アルブミン融合タンパク質が組換え細胞、例えばレトロウイルスベクターから完全なままで産生されうる場合は、医薬製剤はアルブミン融合タンパク質を産生する１以上の細胞を含むことができる。別な遺伝子療法は、参考のためここに組み込まれる、米国仮出願第６０／３５５，５４７およびＷＯ０１／７９４８０（ｐ．１５３−１６２）で記載されている。
【０１７２】
医薬または治療組成物
本発明のアルブミン融合タンパク質またはその処方物は、非経口（例えば、皮下または筋肉内）注射または静脈内注入を含めた、いずれかの常法により投与される。治療は所定の期間にわたり１回の投薬または複数回の投薬からなる。更に、１回分の用量または複数回分の用量が、アルブミンへ融合されていない治療用タンパク質の場合よりも少ない回数で投与される。
【０１７３】
本発明のアルブミン融合タンパク質は単独で投与することが可能であるが、１種以上の許容される担体と一緒に医薬処方物としてそれを提供することが望ましい。担体は、アルブミン融合タンパク質と適合できて、そのレシピエントに有害でないという意味で、「許容しうる」ものでなければならない。典型的には、担体は無菌で無発熱物質の水または塩水である。本発明のアルブミン融合タンパク質は、溶液中での貯蔵期間延長のおかげで、無菌無発熱物質水、塩水または他の等張液のような水性担体中での処方に特によく合う。例えば、本発明の医薬組成物は、例えば分配される数週間、数ヶ月間前またはそれ以上前に、予め水性形で適宜に処方される。
【０１７４】
アルブミン融合タンパク質を含有した処方物は、水性処方物中でのアルブミン融合タンパク質の貯蔵期間延長を考慮にいれて製造される。上記のように、これら治療用タンパク質の多くの貯蔵期間はＨＡへの融合後に著しく増加または長期化する。
【０１７５】
エアゾール投与が適する場合に、本発明のアルブミン融合タンパク質は標準操作を用いてエアゾールとして処方しうる。「エアゾール」という用語は、細気管支または鼻腔中へ吸入されうる、本発明のアルブミン融合タンパク質のガス入り懸濁相を含有している。特に、エアゾールは、計量吸入器もしくはネブライザー、またはミストスプレー器で生じさせるように、本発明のアルブミン融合タンパク質の液滴のガス入り懸濁物を含有している。エアゾールは、例えば吸入器から吸入により送達される、空気または他のキャリアガス中に懸濁された本発明の化合物の乾燥粉末組成物も含有している。
【０１７６】
処方物は便宜上単位剤形で供与し、製剤業界で周知の方法により製造してもよい。このような方法は、１種以上の補助成分からなる担体とアルブミン融合タンパク質とを混合する工程を含んでいる。一般的に、処方物は、液体担体、微細固形担体または双方と活性成分を均一かつ完全に混合し、必要であれば、製品に成形することにより製造される。
【０１７７】
非経口投与に適した処方物には、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤および処方物を所定のレシピエントに適合させる溶質を含有した水性および非水性無菌注射液；懸濁剤および増粘剤を含有した水性および非水性無菌懸濁液がある。処方物は単位用量またはマルチ用量容器、例えば密封アンプル、バイアルまたはシリンジで供与され、フリーズドライ（凍結乾燥）条件下で貯蔵されて、使用直前に無菌液体担体、例えば注射用水の添加のみを要する。即時注射溶液および懸濁液は無菌粉末から調製される。投薬処方物は、血清半減期の延長が本発明のアルブミン融合タンパク質の多くにより示されるとすれば、治療用タンパク質の非融合標準処方物と比較して低いモル濃度または低い用量で、治療用タンパク質部分を含有しうる。
【０１７８】
例として、本発明のアルブミン融合タンパク質が１以上の治療用タンパク質領域を含んでなるとき、投薬剤形は、治療用タンパク質そのものの場合と比べたアルブミン融合タンパク質の血清半減期および貯蔵期間の長期化を考慮しながら、治療用タンパク質の効力と比較したアルブミン融合タンパク質の効力に基づき計算できる。例えば、全鎖長治療用タンパク質に融合された全鎖長ＨＡからなるアルブミン融合タンパク質において、相当用量が単位の関係で剤の重量増加に繋がるが、投与回数は減少しうる。
【０１７９】
本発明の処方物または組成物は、アルブミン融合タンパク質成分の貯蔵期間延長に関する説明書またはパッケージインサートと一緒にパッケージングされるか、またはそれと共にキットへ入れられる。例えば、このような説明書またはパッケージインサートは、本発明のアルブミン融合タンパク質の貯蔵期間延長または長期化を考慮にいれた、時間、温度および光のような推奨貯蔵条件を扱う。このような説明書またはパッケージインサートは、管理された病院、診療所またはオフィス条件の外部、野外で使用を要することもある処方物での貯蔵の容易性のような、本発明のアルブミン融合タンパク質の特別な利点についても扱える。上記のように、本発明の処方物は水性形でもよく、治療活性の過大な喪失なしに、理想とはいかない環境下でも貯蔵しうる。
【０１８０】
本発明は、製薬上許容される担体中で本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（「アルブミン融合ポリヌクレオチド」）の有効量の対象者への投与による、疾患または障害（例えば、ここで開示された疾患または障害のうち１以上）の治療および／または予防の方法も提供する。
【０１８１】
投与される本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドの有効量は、当業者に周知の方法を用いた、表１のレファレンスで記載されたようなルーチンのインビトロおよびインビボ研究からのデータを用いることを含めて、生物学的半減期、バイオアベイラビリティおよび毒性のようなパラメーターを扱う当業者に周知の操作から決定しうる。
【０１８２】
アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、個別患者の臨床条件（特に、アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチド単独での治療の副作用）、送達の部位、投与の方法、投与のスケジュール、および従事者に公知の他のファクターを考慮にいれて、良好な医療実務に従い処方および投与される。こうして、ここでの目的に合わせた「有効量」がこのような考慮により定められる。
【０１８３】
例えば、送達される物質の有効量の決定は、例えば、物質の化学構造および生物活性、患者の年齢および体重、治療を要する正確な症状およびその重篤度、および投与の経路を含めたいくつかのファクターに依存しうる。治療の頻度は、１回当たりで投与されるアルブミン融合タンパク質またはポリヌクレオチド構築物の量、対象者の健康および病歴のようないくつかのファクターに依存する。正確な量、投与の回数および投与のタイミングは、担当医または獣医師により決定される。
【０１８４】
本発明のアルブミン融合タンパク質およびポリヌクレオチドは、あらゆる動物、好ましくは哺乳動物および鳥へ投与しうる。好ましい哺乳動物には、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ウマおよびブタがあるが、ヒトが特に好ましい。
【０１８５】
一般論として、本発明のアルブミン融合タンパク質は、非融合治療用タンパク質よりも（非融合治療用タンパク質のモルベースで）少ない用量で、または少ない頻度で投与される。治療有効量とは、患者でインビボＨＩＶ力価の低下、症状の改善、病状の安定化または生存期間の延長、または生活の質の改善をもたらすために十分な化合物の量に関する。
【０１８６】
本発明のアルブミン融合タンパク質は、それらが「古典薬」(classic drugs)の連続注入をシミュレートしうる、即ち同一の阻害活性に少ないタンパク質相当量で済むという点で、有利である。
【０１８７】
本発明のアルブミン融合タンパク質は次の追加利点を有する：(ｉ)ＨＩＶの具体的な成長、ウイルス量または耐性特徴（例えば、早いおよび遅い成長）に合わせた、ＨＩＶ感染の表現型に基づく用量最適化デザイン；および(ii)治療期間中効果的濃度での薬物濃度の制御／維持。更に、（Ｔ−２０およびＴ−１２４９のような）ペプチドが性質上疎水性であるとき、アルブミンへのそれらの融合はそれらの溶解性を改善するため、バイオアベイラビリティの向上ももたらし、高濃度処方を可能にするはずである。
【０１８８】
例えば、未融合Ｔ−２０の臨床試験では１日２回５０ｍｇの典型的用量が用いられ（Zhang 2002,Kilby 2002,Kilby 1998）、未融合Ｔ−１２４９の臨床試験では１２．５〜２００ｍｇ／日の用量が用いられ、ＨＩＶの用量関連抑制を発揮した（Gulick,2002）。本発明のアルブミン融合タンパク質でＴ−２０またはＴ−１２４９の用量および／または投与回数（即ち、活性部分のモル当量）は、未融合Ｔ−２０またはＴ−１２４９の場合よりも少なくなると予想される。
【０１８９】
アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、経口、経直腸、非経口、槽内、膣内、腹腔内、局所（粉末、軟膏、ゲル、滴剤または経皮パッチとして）、経口腔で、または経口もしくは経鼻スプレーとして投与しうる。「製薬上許容される担体」とは、無毒性固形、半固形または液体フィラー、希釈物、封入物質または処方補助物のあらゆるものに関する。ここで用いられている「非経口」という用語は、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節腔内注射および注入を含めた投与様式に関する。
【０１９０】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、参考のためここに組み込まれる米国仮出願第６０／３５５，５４７およびＷＯ０１／７９４８０（ｐ．１２９−１３０）で記載されたような持続的放出系でも、適切に投与される。
【０１９１】
非経口投与の場合、一つの態様において、アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、製薬上許容される担体、即ち用いられる用量および濃度でレシピエントに無毒性であって処方物の他成分と適合しうるものと、単位注射剤形（溶液、懸濁液または乳濁液）で、望ましい純度でそれを混合することにより、通常処方される。例えば、処方物は、治療剤に有害であることが知られた酸化剤および他の化合物を必要に応じて含有しない。
【０１９２】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、単独で、または他の治療剤と組み合わせて投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与しうるアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチド剤には、プロテアーゼ、逆転写酵素、インテグラーゼおよびアセンブリーインヒビターのような抗レトロウイルス剤、化学療法剤、抗生物質、ステロイドおよび非ステロイド抗炎症剤、慣用的免疫療法剤、および／または、例えば、参考のためここに組み込まれる米国仮出願第６０／３５５，５４７およびＷＯ０１／７９４８０（ｐ．１３２−１５１）で記載されたような治療剤があるが、それらに限定されない。組合せ剤は、協同して、例えば混合物として、別々に但し同時または併合して；または連続的に投与される。これには、組合せ剤が治療用混合物として一緒に投与される方式、更には、組合せ剤が別々に但し同時に、例えば同一個体へ別々な静脈系を介して投与される処置も含む。「組合せ」投与には、初回、次いで２回目に行われる化合物または剤の１種の別々な投与を更に含む。
【０１９３】
本発明で使用に適した医薬組成物には、活性成分がその所定目的を果たせる有効量で含有された組成物を含む。
【０１９４】
ある態様において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、抗レトロウイルス剤、ヌクレオシド／ヌクレオチド逆転写酵素インヒビター（ＮＲＴＩ）、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター（ＮＮＲＴＩ）および／またはプロテアーゼインヒビター（ＰＩ）と組み合わせて投与される。
【０１９５】
本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質を含んでなる医薬組成物の１種以上の諸成分で１以上の容器を満たした、製薬パックまたはキットも提供する。必要に応じて、医薬または生物学的製剤の製造、使用または販売を規制する政府機関により規定された告知書がこのような容器に付されており、その告知書はヒト投与用の製造、使用または販売について機関による承認を表示している。
【０１９６】
本発明について一般的に記載してきたが、説明のためであって制限するためではない下記例を参考にすると、本発明はより簡単に理解されるであろう。
【０１９７】
更に記載せずとも、当業者であれば、これまでの記載および以下の実施例を用いて、本発明で認められた改変を行いおよび利用して、請求項記載の方法を実施しうる、と考えられる。したがって、下記研究例は本発明のある態様を特に示しており、開示の残りを制限するとは決して解釈すべきでない。
【実施例】
【０１９８】
例１
Ｎ末端およびＣ末端アルブミン−（ＧＧＳ）４ＧＧリンカークローニングベクターの構築
組換えアルブミン発現ベクターｐＤＢ２２４３およびｐＤＢ２２４４は、特許出願ＷＯ００／４４７７２で以前に記載されている。組換えアルブミン発現ベクターｐＡＹＥ６４５およびｐＡＹＥ６４６は、ＵＫ特許出願０２１７０３３．０で以前に記載されている。アルブミンポリペプチドのＣ末端で１４アミノ酸ポリペプチドリンカーＮ−ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧ−Ｃ（（ＧＧＳ）４ＧＧ：「Ｎ」および「Ｃ」はポリペプチド配列の向きを表わす）をコードするＤＮＡ配列を導入し、次いで（ＧＧＳ）４ＧＧリンカーのＣ末端にもう１つのポリペプチド鎖を挿入して、全体構造、アルブミン−（ＧＧＳ）４ＧＧ−ポリペプチドのＣ末端アルブミン融合体を作製するように、プラスミドｐＤＢ２２４３を修飾した。同様に、アルブミンポリペプチドのＮ末端で（ＧＧＳ）４ＧＧポリペプチドリンカーをコードするＤＮＡ配列を導入し、次いで（ＧＧＳ）４ＧＧリンカーのＮ末端にもう１つのポリペプチド鎖を挿入して、ポリペプチド−（ＧＧＳ）４ＧＧ−アルブミンの全体構造でＮ末端アルブミン融合体を作製するように、プラスミドｐＡＹＥ６４５を修飾した。
【０１９９】
適切な転写プロモーターおよび転写ターミネーター配列を供与する酵母ＰＲＢ１プロモーターおよび酵母ＡＤＨ１ターミネーターを含有したプラスミドｐＤＢ２２４３が、Sleep,D.et al.(1991)Bio/Technology 9,183-187および特許出願ＷＯ００／４４７７２で記載されている。プラスミドｐＤＢ２２４３をＢａｍＨＩで完全に切断し、窪み末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰで平滑末端化し、最後に再連結して、プラスミドｐＤＢ２５６６を作製した。
【０２００】
２本鎖合成オリゴヌクレオチドリンカーＢｓｕ３６Ｉ／ＨｉｎｄIIIリンカーを、合成オリゴヌクレオチドＪＨ０３３ＡおよびＪＨ０３３Ｂをアニールすることにより合成した。
【化２】
2005516607.tif 000004
【０２０１】
アニールされたＢｓｕ３６Ｉ／ＨｉｎｄIIIリンカーをＨｉｎｄIII／Ｂｓｕ３６Ｉ切断ｐＤＢ２５６６へ連結して、Ｃ末端に（ＧＧＳ）４ＧＧペプチドリンカーをもつアルブミンコード領域を含んでなるプラスミドｐＤＢ２５７５Ｘを作製した。
【０２０２】
適切な転写プロモーターおよび転写ターミネーター配列を供与する酵母ＰＲＢ１プロモーターおよび酵母ＡＤＨ１ターミネーターを含有したプラスミドｐＡＹＥ６４５が、ＵＫ特許出願０２１７０３３．０で記載されている。プラスミドｐＡＹＥ６４５を制限酵素ＡｆｌIIで完全に切断し、制限酵素ＨｉｎｄIIIで部分的に切断し、３′側の酵母ＰＲＢ１プロモーターおよびｒＨＡコード配列を含んでなるＤＮＡ断片を単離した。特許出願ＷＯ００／４４７７２で記載されたプラスミドｐＤＢ２２４１をＡｆｌII／ＨｉｎｄIIIで切断し、５′側の酵母ＰＲＢ１プロモーターおよび酵母ＡＤＨ１ターミネーターを含んでなるＤＮＡ断片を単離した。次いで、ｐＡＹＥ６４５からのＡｆｌII／ＨｉｎｄIII  ＤＮＡ断片をＡｆｌII／ＨｉｎｄIII  ｐＤＢ２２４１ベクターＤＮＡ断片へクローニングして、プラスミドｐＤＢ２３０２を作製した。プラスミドｐＤＢ２３０２をＰａｃＩ／ＸｈｏＩで完全に切断し、６．１９ｋｂ断片を単離し、窪み末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰで平滑末端化し、再連結して、プラスミドｐＤＢ２４６５を作製した。プラスミドｐＤＢ２４６５をＣｌａＩで直線化し、窪み末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰで平滑末端化し、再連結して、プラスミドｐＤＢ２５３３を作製した。プラスミドｐＤＢ２５３３をＢｌｎＩで直線化し、窪み末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰで平滑末端化し、再連結して、プラスミドｐＤＢ２５３４を作製した。プラスミドｐＤＢ２５３４をＢｍｇＢＩ／ＢｇｌIIで完全に切断し、６．９６ｋｂ  ＤＮＡ断片を単離し、２種の２本鎖オリゴヌクレオチドリンカーのうち一方、即ちＶＣ０５３／ＶＣ０５４およびＶＣ０５７／ＶＣ０５８へ連結してプラスミドｐＤＢ２５４０を作製し、またはＶＣ０５５／ＶＣ０５６およびＶＣ０５７／ＶＣ０５８へ連結してプラスミドｐＤＢ２５４１を作製した。
【０２０３】
【化３】
2005516607.tif 000005
【０２０４】
２本鎖合成オリゴヌクレオチドリンカーＢｇｌII／ＡｇｅＩリンカーを、合成オリゴヌクレオチドＪＨ０３５ＡおよびＪＨ０３５Ｂをアニールすることにより合成した。
【化４】
2005516607.tif 000006
【０２０５】
アニールされたＢｇｌII／ＡｇｅＩリンカーをＢｇｌII／ＡｇｅＩ切断ｐＤＢ２５４０へ連結して、Ｎ末端に（ＧＧＳ）４ＧＧペプチドリンカーをもつアルブミンコード領域を含んでなるプラスミドｐＤＢ２５７３Ｘを作製した。
【０２０６】
例２
Ｎ末端およびＣ末端アルブミン−Ｔ−１２４９融合体の構築
Ｎ末端Ｔ−１２４９−（ＧＧＳ）４ＧＧ−アルブミン発現プラスミドの構築
Ｔ−１２４９のアミノ酸配列を含んでなるＤＮＡクローンを、２つのオーバーラップ合成オリゴヌクレオチドから各々作製された２つの合成ＤＮＡ断片を結合させることにより作製した。ＤＮＡ断片１は、オリゴヌクレオチド５′−ＧＴＧＡＧＡＴＣＴＴＴＧＧＡＴＡＡＧＡＧＡＴＧＧＣＡＡＧＡＡＴＧＧＧＡＡＣＡＡＡＡＧＡＴＴＡＣ−３′（配列番号２４）および５′−ＣＡＣＧＡＧＣＴＴＧＴＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＡＧＴＡＡＴＣＴＴＴＴＧＴＴＣＣＣＡＴＴＣ−３′（配列番号２５）をアニールしてから、２本鎖ＤＮＡ断片を得るためにＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼでプライマー伸長反応を行うことにより作製した。オリゴヌクレオチド５′−ＧＴＧＡＧＣＴＣＡＡＡＴＴＣＡＡＣＡＡＧＡＡＡＡＧＡＡＣＧＡＡＴＡＣＧＡＡＴＴＧＣＡＡＡＡＧＴＴＧＧＡＣＡＡＧＴＧＧＧ−３′（配列番号２６）および５′−ＣＡＣＧＧＡＴＣＣＡＣＣＧＡＡＣＣＡＴＴＣＣＣＡＣＡＡＡＧＡＡＧＣＣＣＡＣＴＴＧＴＣＣＡＡＣＴＴＴＴＧＣＡＡＴＴＣＧＴＡＴＴＣ−３′（配列番号２７）を用いて同様の操作を行い、ＤＮＡ断片２を作製した。次いでＤＮＡ断片１を制限エンドヌクレアーゼＢｇｌII／ＡｌｕＩで切断し、ＤＮＡ断片２を制限エンドヌクレアーゼＡｌｕＩ／ＭａｍＨＩで切断した。次いで両断片をベクターＬＩＴＭＵＳ２９（New England Biolabs）へ連結し、ＢｇｌIIおよびＢａｍＨＩで切断して、ｐＬＩＴ−Ｔ−１２４９−Ｎを作製した。
【０２０７】
プラスミドｐＬＩＴ−Ｔ−１２４９−ＮをＢａｍＨＩおよびＢｇｌIIで完全に切断した。０．１４ｋｂ  ＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ、ＢｇｌII切断ｐＤＢ２５７３へ連結させて、プラスミドｐＤＢ２６６７を作製した。適切な酵母ベクター配列を、ＥＰ−Ａ−２８６４２４で一般的に開示され、Sleep,D.et al.(1991)Bio/Technology 9,183-187で記載された「崩壊」プラスミドｐＳＡＣ３５により得た。プラスミドｐＤＢ２６６７をＮｏｔＩで完全に切断し、３．１５ｋｂ  Ｎ末端Ｔ−１２４９−（ＧＧＳ）４ＧＧ−ｒＨＡ発現カセットを単離し、次いでＮｏｔＩ仔ウシ腸ホスファターゼ処理ｐＳＡＣ３５へ連結させて、ＬＥＵ２選択マーカーと同じ発現方向でＮｏｔＩ発現カセットを含有するプラスミドｐＤＢ２６８１を作製した。
【０２０８】
Ｃ末端アルブミン−（ＧＧＳ）４ＧＧ−Ｔ−１２４９発現プラスミドの構築
フォワードプライマー５′−ＧＴＧＧＧＡＴＣＣＧＧＴＧＧＴＴＧＧＣＡＡＧＡＡＴＧＧＧＡＡＣＡＡＡＡＧＡＴＴＡＣ−３′（配列番号２８）およびリバースプライマー５′−ＣＡＣＡＡＧＣＴＴＡＴＴＡＧＡＡＣＣＡＴＴＣＣＣＡＣＡＡＡＧＡＡＧＣ−３′（配列番号２９）を用いて、ＰＣＲ断片をｐＬＩＴ−Ｔ−１２４９−Ｎから増幅させた。その断片をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIIIで完全に切断し、同様にＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIIIで切断されたベクターｐＬＩＴＭＵＳ２９へ連結して、ｐＬＩＴ−Ｔ−１２４９−Ｃを作製した。プラスミドｐＤＢ２５７５をＨｉｎｄIIIで部分的に切断し、次いでＢａｍＨＩで完全に切断した。望ましい６．５５ｋｂ  ＤＮＡ断片を単離し、ｐＬＩＴ−Ｔ−１２４９−Ｃからの０．１３ｋｂ  ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIII断片と連結させて、プラスミドｐＤＢ２６６８を作製した。
【０２０９】
適切な酵母ベクター配列を、ＥＰ−Ａ−２８６４２４で一般的に開示され、Sleep,D.et al.(1991)Bio/Technology 9,183-187で記載された「崩壊」プラスミドｐＳＡＣ３５により得た。プラスミドｐＤＢ２６６８をＮｏｔＩで完全に切断し、３．１５ｋｂ  Ｃ末端ｒＨＡ−（ＧＧＳ）４ＧＧ−Ｔ−１２４９発現カセットを単離し、次いでＮｏｔＩ仔ウシ腸ホスファターゼ処理ｐＳＡＣ３５へ連結させて、プラスミドｐＤＢ２６８２を作製した。
【０２１０】
例３
Ｎ末端およびＣ末端アルブミン−Ｔ−２０融合体の構築
基本クローンの作製
フォワードプライマー５′−ＧＴＧＣＣＴＴＧＧＡＡＴＧＣＴＡＧＴＴＧ−３′（配列番号３０）およびリバースプライマー５′−ＣＴＴＡＡＡＣＣＴＡＣＣＡＡＧＣＣＴＣＣ−３′（配列番号３１）を用いて、ＨＩＶ−１含有細胞培養上澄から単離されたＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによるＰＣＲ断片の増幅により、Ｔ−２０の配列のクローニングを行い、次いでベクターｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（Invitrogen）へクローニングして、ｐＣＲ４−ＨＩＶ−Ｔ−２０を作製した。
【０２１１】
Ｎ末端Ｔ−２０−（ＧＧＳ）４ＧＧ−アルブミン発現プラスミドの構築
フォワードプライマーＤＳ２２３  ５′−ＣＴＣＴＡＧＡＴＣＴＴＴＧＧＡＴＡＡＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＡＧＣＴＴＡＡＴＡＣＡＣＴＣＣＴＴＡＡＴＴＧＡＡＧ−３′（配列番号３２）およびリバースプライマーＤＳ２２４  ５′−ＣＣＡＣＣＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＡＡＣＣＡＡＴＴＣＣＡＣＡＡＡＣＴＴＧＣＣＣＡＴＴＴＡＴＣ−３′（配列番号３３）を用いて、ＰＣＲ断片をｐＣＲ４−ＨＩＶ−Ｔ−２０から増幅させた。ＤＮＡ断片をＢｇｌIIおよびＢａｍＨＩで完全に切断し、０．１３ｋｂ  ＤＮＡ断片をＢｇｌIIおよびＢａｍＨＩで同様に切断されたｐＤＢ２５７３へ連結して、ｐＤＢ２５９３を作製した。適切な酵母ベクター配列を、ＥＰ−Ａ−２８６４２４で一般的に開示され、Sleep,D.et al.(1991)Bio/Technology 9,183-187で記載された「崩壊」プラスミドｐＳＡＣ３５により得た。ＮｏｔＩ  Ｎ末端Ｔ−２０−（ＧＧＳ）４ＧＧ−ｒＨＡ発現カセットをｐＤＢ２５９３から単離し、精製し、仔ウシ腸ホスファターゼで処理されたＮｏｔＩ切断ｐＳＡＣ３５へ連結させて、２種のプラスミドを作製した；第一のｐＤＢ２５９５はＬＥＵ２と同じ発現方向でＮｏｔＩ発現カセットを含有し、第二のｐＤＢ２５９６はＬＥＵ２と反対の方向でＮｏｔＩ発現カセットを含有していた。
【０２１２】
Ｃ末端アルブミン−（ＧＧＳ）４ＧＧ−Ｔ−２０発現プラスミドの構築
フォワードプライマーＤＳ２２５  ５′−ＴＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＧＴＧＧＴＴＡＣＡＣＣＡＧＣＴＴＡＡＴＡＣＡＣＴＣＣＴＴＡＡＴＴＧＡＡＧＡＡＴＣＧＣ−３′（配列番号３４）およびリバースプライマーＤＳ２２６  ５′−ＡＡＴＴＡＡＧＣＴＴＡＴＴＡＡＡＡＣＣＡＡＴＴＣＣＡＣＡＡＡＣＴＴＧＣＣＣＡＴＴＴＡＴＣＴＡＡＴＴＣＣ−３′（配列番号３５）を用いて、ＰＣＲ断片をｐＣＲ４−ＨＩＶ−Ｔ−２０から増幅させた。ＤＮＡ断片をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIIIで完全に切断し、０．１３ｋｂ  ＤＮＡ断片をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIIIで同様に切断されたｐＤＢ２５７５へ連結して、ｐＤＢ２５９４を作製した。適切な酵母ベクター配列を、ＥＰ−Ａ−２８６４２４で一般的に開示され、Sleep,D.et al.(1991)Bio/Technology 9,183-187で記載された「崩壊」プラスミドｐＳＡＣ３５により得た。ＮｏｔＩ  Ｃ末端ｒＨＡ−（ＧＧＳ）４ＧＧ−Ｔ−２０発現カセットをｐＤＢ２５９４から単離し、精製し、仔ウシ腸ホスファターゼで処理されたＮｏｔＩ切断ｐＳＡＣ３５へ連結させて、２種のプラスミドを作製した；第一のｐＤＢ２５９７はＬＥＵ２と同じ発現方向でＮｏｔＩ発現カセットを含有し、第二のｐＤＢ２５９８はＬＥＵ２と反対の方向でＮｏｔＩ発現カセットを含有していた。
【０２１３】
例４
酵母形質転換および培養条件
ＷＯ９５／２３８５７、ＷＯ９５／３３８３３およびＷＯ９４／０４６８７で開示された酵母株を、Sleep,D.et al.(2001)Yeast 18,403-421で記載されているように、ロイシン原栄養体性に形質転換させた。形質転換株を緩衝化最少培地（ＢＭＭ、Kerry-Williams,S.M.et al.(1998)Yeast 14,161-169で記載）上に点在させ、更なる分析用に十分増殖するまで３０℃でインキュベートした。
【０２１４】
例５
アルブミンＴ−２０融合タンパク質の発現および精製
ｒＨＡ融合体をシェークフラスコ培養で発現させ、アルブミン標準を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより発現レベルを測定した。（ＷＯ００／４４７７２で記載されたような）発酵培養上澄中の発現レベルは、ｒＨＡ−ＧＳ−Ｔ−２０およびＴ−２０−ＧＳ−ｒＨＡの双方について＞２ｇ．Ｌ−１であった。
Ｃ末端Ｔ−２０精製
Ｃ末端Ｔ−２０をＷＯ００／４４７７２で記載されているような標準ｒＨＡ  ＳＰ−ＦＦ条件および溶離用緩衝液を用いて精製した。次いで、溶出液を標準ｒＨＡ  ＤＥ−ＦＦ条件を用いて精製したが、但し追加２００ｍＭ  ＮａＣｌを溶離用緩衝液に用いた（この塩濃度は最適ではなかったため、変えてもよい）。次いで、精製物質を濃縮し、ＰＢＳに対してダイアフィルトレーションした。
【０２１５】
Ｎ末端Ｔ−２０精製
Ｎ末端Ｔ−２０を標準ｒＨＡ  ＳＰ−ＦＦ条件および溶離用緩衝液を用いて精製した。次いで、溶出液を標準ｒＨＡ  ＤＥ−ＦＦ条件を用いて精製した。標準溶離用緩衝液および２００ｍＭ  ＮａＣｌ含有の標準溶離用緩衝液を双方とも用いて、ＤＥ−ＦＦを溶出させた。２種の溶出液がＳＤＳ−ＰＡＧＥによると別々に現れ、ＤＥ−ＦＦ溶出液＃１およびＤＥ−ＦＦ溶出液＃２として別々にプロセッシングした。次いで、２種の精製物質を＞５ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、１０ｋＤａ分子量カットオフ膜を用いて７連続容量分のＰＢＳに対してダイアフィルトレーションした。
【０２１６】
例６
４〜１２％勾配ＳＤＳ非還元ゲルにサンプルをのせて、抗ＨＳＡ抗体でウェスタンブロットを行うことにより、精製Ｔ−２０アルブミン融合タンパク質を特徴付けた。結果は図９で示されている。脚注：（Ａ）ブルーゲルとしてのコロイド；（Ｂ）抗ＨＳＡウェスタンブロット。サンプルを次のようにのせた：
【表２】
2005516607.tif 000007
【０２１７】
「ＳＰＴ９９０１」は、アルブミンまたはアルブミン融合体を含有していない酵母発酵培養上澄である。ウェスタンブロットで検出された免疫交差反応が、抗体と酵母（宿主）由来成分との非特異的交差反応というよりもむしろ、アルブミン融合体発現酵母株により産生された一部特異種のせいであることを示すために、それは用いられている。
【０２１８】
例７
アルブミンＴ−２０融合タンパク質の薬物動態
動物モデル
一群が雄性３匹および雌性３匹のウサギへ、０日目に、１回のｉ．ｖ．またはｓ．ｃ．注射によりアルブミン融合Ｔ−２０（３５０μｇ／ｍｌ）を投与した。血液サンプルを、基準時と試験物質のｉ．ｖ．投与後５min、１０min、２０min、３０min、４５min、１ｈ、２ｈ、４ｈ、８ｈ、２４ｈ（１ｄ）、４８ｈ（２ｄ）、７２ｈ（３ｄ）、５ｄ、７ｄ、９ｄ、１１ｄおよび１４ｄ目に、および基準時とｓ．ｃ．注射後、３０min、１ｈ、２ｈ、４ｈ、８ｈ、２４ｈ（１ｄ）、４８ｈ（２ｄ）、７２ｈ（３ｄ）、５ｄ、７ｄ、９ｄ、１１ｄおよび１４ｄ目に、抗原レベルの測定のために採取した。
【０２１９】
計量値
薬物動態（ＰＫ）計量値：
血漿濃度時間曲線下の面積（ＡＵＣ）、最大濃度（Ｃｍａｘ）、最大濃度の時間（ｔｍａｘ）、平均滞留時間、吸収および分布の半減期（適用時）、クリアランス、分布の容積
【０２２０】
分析法
アルブミン融合Ｔ−２０血漿濃度を抗ヒトアルブミンＥＬＩＳＡで調べた。アルブミン融合Ｔ−２０は標準曲線の作成にも用いた。ＥＬＩＳＡの検出限界は５ｎｇ／ｍｌであった。
【０２２１】
統計法
個別血漿レベルの分析
アルブミン融合Ｔ−２０の血漿濃度−時間プロフィールを非直線回帰により動物毎に分析した。＜５ｎｇ／ｍｌとして報告された値は５ｎｇ／ｍｌとして処理した。基準時に測定された値を以後の濃度から差し引いた。得られた負の値はゼロに定めた。指数モデルを最小二乗法によりデータへあてはめた。ｉ．ｖ．投与後のプロフィールについては、オープン２分画モデルを用いた。ｓ．ｃ．投与後のプロフィールについては、一次インプットおよびラグタイムのオープン１分画モデルを用いた。
【０２２２】
ｓ．ｃ．処置群では、薬物動態分析を最初７日間の血漿レベルに限定したが、これはおそらくその後の抗体形成が血漿レベルの測定を信頼しえないものにしているからである。
【０２２３】
ｉ．ｖ．処置群では、最終測定値（ＡＵＣ０−１４ｄ）まで線性梯形法則を用いてＡＵＣを計算した。
【０２２４】
ｓ．ｃ．群で最初７日間への限定のせいで、７日目までのＡＵＣ（ＡＵＣ０−７ｄ）を両群について更に、ｓ．ｃ．群ではＡＵＣ０−７ｄの代わりに計算した。
【０２２５】
要約および比較分析
個別ＰＫ結果を適用経路毎に記述でまとめた（最少、中央値、最大、平均、標準偏差）。
【０２２６】
分散の二元分析を一次計量値について行った：消失半減期、ＡＵＣおよびＣｍａｘ（すべてｌｏｇ変換）。固定ファクターは投与経路であった。処置群間の適切な相違を評価した。不等分散の可能性も考慮に入れた。
【０２２７】
この分析の目的のために、Ｉｎ（半減期）、Ｉｎ（ＡＵＣ）およびＩｎ（Ｃｍａｘ）は各々正規分布していると仮定した。
【０２２８】
両側９０％信頼区間を用いて、０．１のアルファレベルで投与経路間のバイオアベイラビリティ（絶対バイオアベイラビリティ）を比較した。
【０２２９】
結果
毎時におけるＴ−２０−ＡＦＰ濃度の平均および標準偏差が、図１３で示されている。
【０２３０】
静脈内処置された動物で、Ｔ−２０−ＡＦＰレベルは約１０時間の分布期、次いでゆっくりした消失期を示した。そのレベルは１４日間にわたり１００ｎｇ／ｍｌを超えたままであった。
【０２３１】
皮下処置された動物で、そのレベルは２．３時間の平均ラグタイム後に血漿で現れた。それらは注射後２４〜４８時間でピークに達した。７日間は、下降曲線がｉ．ｖ．群の場合と事実上同一であった。それ以後、レベルは急激に降下したが、これはおそらく抗体の干渉を示している。したがって、７日目より後に測定された値は薬物動態分析に含めなかった。
【０２３２】
結論
ｉ．ｖ．適用後８１時間およびｓ．ｃ．適用後７６時間の平均最終半減期で、Ｔ−２０−ＡＦＰは血漿から消失した。２群の半減期は非常によく一致し、差異は統計学的に有意でなかった。
【０２３３】
ｉ．ｖ．適用後、４．１時間の平均半減期で約１０時間続く分布期が消失期に先立っていた。ｓ．ｃ．投与後、２．３時間の平均ラグタイムに続き、Ｔ−２０−ＡＦＰレベルは上昇し、７．９時間の平均吸収半減期であった。
【０２３４】
０〜７日目のＡＵＣに関するｓ．ｃ．適用後のバイオアベイラビリティは７２％であり、Ｃｍａｘの場合それは２８％であった。
【０２３５】
これらのデータは、Ｔ−２０ペプチドの血漿半減期を有意に伸ばせるアルブミンの能力を証明している。ヒトにおけるＴ−２０ペプチドの最終半減期は、４５および１８０ｍｇ皮下用量のとき各々３．４６および４．３５時間であることが報告された（Zhang X et al.,2002）。ウサギで得られた上記データと一緒にすると、アルブミンへ融合されたＴ−２０ペプチドの血漿半減期の延長がヒトの場合で少なくとも１０倍に達成しうる、と見積もられる。
【０２３６】
例８
アルブミンＴ−２０融合タンパク質のインビトロ効力
ＨＩＶペプチドアルブミン融合体の抗ウイルス活性を細胞−細胞融合アッセイにおいてインビトロで試験した。基本的に、Jurkat細胞懸濁液（２×１０６／ｍｌ）をＨＩＶインヒビターまたはコントロールタンパク質溶液およびＨＩＶ−１（１．５×１０５／ｍｌ）と混合し、（各サンプルは８回反復してアッセイする）３７℃で４日間インキュベートした。各サンプルを細胞−細胞融合体の量および質について評価したが、その際に抗ウイルス活性はコントロールと比較した融合現象の低下から測定した。精製タンパク質および酵母細胞培養上澄は双方ともアッセイに適していた。
【０２３７】
ＰＭＴ１株で産生されるＴ−２０
標準酵母株で産生されたｒＨＡ−ＧＳ−Ｔ−２０およびＴ−２０−ＧＳ−ｒＨＡを精製し、抗ウイルス活性について上記試験でスクリーニングした。コントロールは培地コントロール（ＲＰＭＩ）、１および３μＭ組換えアルブミンを含有していた。ｒＨＡ−ＧＳ−Ｔ−２０を３μＭ濃度で用いたが、それはいかなるＨＩＶ阻害効果も示さず、融合現象の平均数は組換えコントロールに匹敵した。これらの結果は図１０で示されている。同様の結果が精製Ｔ−２０−ＧＳ−ｒＨＡで得られたが（２溶出液、例６参照）、ここでは少なくとも１μＭ濃度でわずかな抗ウイルス効果を示した。Ｏ連結マンノシル化の差異が、ｒＨＡ−ＧＳ−Ｔ−２０およびＴ−２０−ＧＳ−ｒＨＡの各々無または低抗ＨＩＶ活性についての妥当な説明であろう。この仮定は下記実験により支持されている。
【０２３８】
ｐｍｔ１株で産生されるＴ−２０
Ｏ連結グリコシル化を減少させるために、ホスホマンノシルトランスフェラーゼ１遺伝子欠失（ｐｍｔ１）酵母株をｒＨＡ−ＧＳ−Ｔ−２０の発現に用いたところ、有意の抗ウイルス活性が観察できた。５０％阻害濃度は４〜１３ｎＭであり（図１０）、Ｔ−２０ペプチドと類似した範囲で抗ウイルス活性を示した（Wild CT et al.1994.PNAS 91:9770-9774）。
【０２３９】
例９
Ｃ末端Ｔ−１２４９アルブミン融合タンパク質の発現および精製
ｒＨＡ融合体をシェークフラスコ培養物中で発現させ、アルブミン標準を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより発現レベルを測定した。（ｐＨ５．５で、ＷＯ００／４４７７２で記載されたように行われた）発酵培養物中の発現レベルは、ｒＨＡ−ＧＳ−Ｔ−１２４９について＞２ｇ．Ｌ−１であった。
【０２４０】
ＷＯ００／４４７７２で記載された標準ｒＨＡ  ＳＰ−ＦＦ条件および溶離用緩衝液を用いて、Ｃ末端Ｔ−１２４９を精製した。次いで、ＷＯ００／４４７７２で記載された標準ｒＨＡ  ＤＥ−ＦＦ条件を用いて溶出液を精製したが、但し標準ｒＨＡ溶出液は捨てるフラクションについて洗液として用い、それ以後の溶離は標準ｒＨＡ溶離用緩衝液に追加２００ｍＭ  ＮａＣｌを含有させて行った。次いで精製物質を＞５ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、１０ｋＤａ分子量カットオフ膜を用いて７連続容量分のＰＢＳに対してダイアフィルトレーションした。
【０２４１】
例１０
精製後におけるＣ末端Ｔ−１２４９アルブミン融合タンパク質の特徴
４〜１２％勾配ＳＤＳ非還元ゲルにサンプルをのせて、抗ＨＳＡ抗体でウェスタンブロットを行うことにより、精製Ｃ末端Ｔ−１２４９アルブミン融合タンパク質を特徴付けた。結果は図１１で示されている。脚注：（Ａ）ブルーゲルとしてのコロイド；（Ｂ）抗ＨＳＡウェスタンブロット。サンプルを次のようにのせた：
【表３】
2005516607.tif 000008
【０２４２】
例１１
精製後におけるアルブミンＴ−１２４９融合体のインビトロ効力
標準（ＰＭＴ１）酵母株で産生されたＴ−１２４９−ＧＳ−ｒＨＡを精製し（例９）、抗ウイルス活性について上記アッセイで試験した。図１２は結果を示しており、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）が１０〜１００ｎＭで得られることを示している。
【０２４３】
参考文献
【表４】
2005516607.tif 000009
2005516607.tif 000010
2005516607.tif 000011
2005516607.tif 000012
【０２４４】
本発明は本発明の個別面の単一説明として記載された具体的態様により範囲が制限されることはなく、機能的に相当する方法および成分も本発明の範囲内である。実際に、本発明の様々な修正が、ここで示されおよび記載されたものに加えて、先の記載および添付図面から当業者に明らかとなるであろう。このような修正も添付された請求の範囲内に属するとみなされる。
【０２４５】
上記すべてのレファレンスは、参考のためそれ全体で組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０２４６】
【図１】Ｎ末端Ｔ−１２４９−（ＧＧＳ）４ＧＧ−アルブミン融合体読み取り枠のＤＮＡ配列（このＤＮＡ配列は一次翻訳産物をコードし、したがって最初の７２ヌクレオチドは、本例では酵母からの分泌に際して除去される２４アミノ酸リーダー配列をコードしている）。
【図２】Ｎ末端Ｔ−１２４９−（ＧＧＳ）４ＧＧ−アルブミン融合タンパク質のアミノ酸配列（このアミノ酸配列は図１で示されたＤＮＡ配列の一次翻訳産物を表わし、したがって酵母で分泌に際して除去される２４アミノ酸リーダー配列を含んでいる。そのため、そのタンパク質配列は本ウイルス阻害例で用いられるタンパク質の配列を表わしていない）。
【図３】Ｃ末端アルブミン−（ＧＧＳ）４ＧＧ−Ｔ−１２４９融合体読み取り枠のＤＮＡ配列（このＤＮＡ配列は一次翻訳産物をコードし、したがって最初の７２ヌクレオチドは、本例では酵母からの分泌に際して除去される２４アミノ酸リーダー配列をコードしている）。
【図４】Ｃ末端アルブミン−（ＧＧＳ）４ＧＧ−Ｔ−１２４９融合タンパク質のアミノ酸配列（このアミノ酸配列は図３で示されたＤＮＡ配列の一次翻訳産物を表わし、したがって酵母で分泌に際して除去される２４アミノ酸リーダー配列を含んでいる。そのため、そのタンパク質配列は本ウイルス阻害例で用いられるタンパク質の配列を表わしていない）。
【図５】Ｎ末端Ｔ−２０−（ＧＧＳ）４ＧＧ−アルブミン融合体読み取り枠のＤＮＡ配列（このＤＮＡ配列は一次翻訳産物をコードし、したがって最初の７２ヌクレオチドは、本例では酵母からの分泌に際して除去される２４アミノ酸リーダー配列をコードしている）。
【図６】Ｎ末端Ｔ−２０−（ＧＧＳ）４ＧＧ−アルブミン融合タンパク質のアミノ酸配列（このアミノ酸配列は図５で示されたＤＮＡ配列の一次翻訳産物を表わし、したがって酵母で分泌に際して除去される２４アミノ酸リーダー配列を含んでいる。そのため、そのタンパク質配列は本ウイルス阻害例で用いられるタンパク質の配列を表わしていない）。
【図７】Ｃ末端アルブミン−（ＧＧＳ）４ＧＧ−Ｔ−２０融合体読み取り枠のＤＮＡ配列（このＤＮＡ配列は一次翻訳産物をコードし、したがって最初の７２ヌクレオチドは、本例では酵母からの分泌に際して除去される２４アミノ酸リーダー配列をコードしている）。
【図８】Ｃ末端アルブミン−（ＧＧＳ）４ＧＧ−Ｔ−２０融合タンパク質のアミノ酸配列（このアミノ酸配列は図７で示されたＤＮＡ配列の一次翻訳産物を表わし、したがって酵母で分泌に際して除去される２４アミノ酸リーダー配列を含んでいる。そのため、そのタンパク質配列は本ウイルス阻害例で用いられるタンパク質の配列を表わしていない）。
【図９】Ｔ−２０アルブミン融合体の４〜１２％勾配ＳＤＳ非還元ゲル：（Ａ）コロイド性ブルーゲル；（Ｂ）抗ＨＳＡウェスタンブロット。
【図１０】ｐｍｔ１遺伝子欠失酵母株での発現の依存性に関する細胞−細胞融合アッセイにおけるＴ−２０アルブミン融合体の抗ウイルス活性。ＰＭＴ１、野生型；ｐｍｔ１、欠失株。
【図１１】Ｃ末端Ｔ−１２４９アルブミン融合体の４〜１２％勾配ＳＤＳ非還元ゲル：（Ａ）コロイド性ブルーゲル；（Ｂ）抗ＨＳＡウェスタンブロット。
【図１２】Ｃ末端Ｔ−１２４９アルブミン融合タンパク質の抗ウイルス活性。
【図１３】Ｃ末端Ｔ−２０アルブミン融合タンパク質の薬物動態研究結果。
【図１４】（Ａ〜Ｄ）ヒトアルブミンの成熟型のアミノ酸配列（配列番号１８）およびそれをコードするポリヌクレオチド（配列番号１７）。
【図１】
2005516607.tif 000013
【図２】
2005516607.tif 000014
【図３】
2005516607.tif 000015
【図４】
2005516607.tif 000016
【図５】
2005516607.tif 000017
【図６】
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【図７】
2005516607.tif 000019
【図８】
2005516607.tif 000020
【図９】
2005516607.tif 000021
【図１０】
2005516607.tif 000022
【図１１】
2005516607.tif 000023
【図１２】
2005516607.tif 000024
【図１３】
2005516607.tif 000025
【図１４Ａ】
2005516607.tif 000026
【図１４Ｂ】
2005516607.tif 000027
【図１４Ｃ】
2005516607.tif 000028
【図１４Ｄ】
2005516607.tif 000029
【配列表】
2005516607000001.app
【国際調査報告】
2005516607.tif 000030
2005516607.tif 000031
2005516607.tif 000032
2005516607.tif 000033
2005516607.tif 000034
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