(57)【要約】本開示は、リコンビナーゼを用いた宿主細胞のゲノム内へのＤＮＡ分子のターゲティングされた組込みを得るための方法を提供する。本書に開示された方法は、例えば双子葉植物及び単子葉植物の植物細胞を含めたさまざまな宿主細胞について使用できる。本開示は、植物細胞内にＤＮＡの部位特異的組換えをもたらすための方法において、第１のＩｎｔ認識部位を含む標的ヌクレオチド配列を植物細胞内に導入する段階；第２のＩｎｔ認識部位を含むドナーヌクレオチド配列を該植物細胞内に導入する段階；及びインテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体を該植物細胞内に導入する段階、を含んで成る方法を提供している。
2005521400.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物細胞内のＤＮＡの部位特異的組換えを得るための方法において、
−  第１のＩｎｔ認識部位を含む標的配列を植物細胞内に導入する段階；
−  第２のＩｎｔ認識部位を含むドナー配列を前記植物細胞内に導入する段階；及び
−  インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体を前記植物細胞内に導入する段階、
を含んで成る方法。
【請求項２】
前記植物細胞が単子葉植物の植物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記植物細胞が双子葉植物の植物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記植物細胞が小麦細胞、トウモロコシ細胞、イネ細胞、大麦細胞、大豆細胞、綿の木細胞、トマト細胞及びタバコ細胞のうちの１つである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記標的配列が、Agrobacterium媒介型形質転換、マイクロプロジェクタイルボンバード、電気穿孔、ＰＥＧ媒介型形質転換及びマイクロインジェクションのうちの１つにより前記植物細胞内に導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記標的配列が前記植物細胞のゲノム内に安定した形で組込まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記植物細胞が前記標的配列の単一コピーを含む標的系列細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記第１のＩｎｔ認識部位が修飾されたラムダインテグラーゼ認識部位である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第１のＩｎｔ認識部位がａｔｔＢ（配列番号：１７２）、ａｔｔＢ１（配列番号１７６）、ａｔｔＢ２（配列番号１７８）、ａｔｔＰ（配列番号１７３）、ａｔｔＰ１（配列番号１７７）、ａｔｔＰ２（配列番号１７９）、ａｔｔＬ（配列番号１７４）、ａｔｔＬ１（配列番号１８０）、ａｔｔＬ２（配列番号１８２）、ａｔｔＲ（配列番号１７５）、ａｔｔＲ１（配列番号１８１）、ａｔｔＲ２（配列番号１８３）、ａｔｔＢ３、ａｔｔＬ３、及びａｔｔＲ３のうちの１つを含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記標的配列が問題の配列、分子マーカー、選択マーカー、可視マーカー、負の選択マーカー、プロモータ、発現カセット、イントロン及びこれらのいずれかの一部分のうちの少なくとも１つを含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的配列が、ＰＰＯ遺伝子、ＬＵＣ遺伝子、ＮＰＴＩＩ遺伝子、ＧＵＳ遺伝子、ＰＭＩ遺伝子、ＨＰＴ遺伝子、及びこれらのいずれかの一部分のうちの少なくとも１つを含んで成る、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記標的配列がさらに第３のＩｎｔ認識部位を含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１のＩｎｔ認識部位及び前記第３のＩｎｔ認識部位が同一である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１のＩｎｔ認識部位及び前記第３のＩｎｔ認識部位が同一でない、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１のＩｎｔ認識部位及び前記第３のＩｎｔ認識部位は互いに組換えする能力をもたない、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１のＩｎｔ認識部位及び前記第３のＩｎｔ認識部位のうちの少なくとも１つが修飾されたランダムインテグラーゼ認識部位である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１のＩｎｔ認識部位及び前記第３のＩｎｔ認識部位が互いとの関係において直接配位にある、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１のＩｎｔ認識部位及び前記第３のＩｎｔ認識部位が互いとの関係において反転配位にある、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１の認識部位及び前記第３の認識部位は、それらが互いに隣接するような形で前記標的配列内に位置づけされている、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１の認識部位及び前記第３の認識部位は、第１のヌクレオチド配列が前記第１の認識部位と前記第３の認識部位の間にくるような形で前記標的配列内に位置づけされている、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１のヌクレオチド配列が問題の配列、分子マーカー、選択マーカー、可視マーカー、負の選択マーカー、プロモータ、発現カセット、イントロン及びこれらのいずれかの一部分のうちの少なくとも１つを含んで成る、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１のヌクレオチド配列が、ＰＰＯ遺伝子、ＬＵＣ遺伝子、ＮＰＴＩＩ遺伝子、ＧＵＳ遺伝子、ＰＭＩ遺伝子、ＨＰＴ遺伝子、及びこれらのいずれかの一部分のうちの少なくとも１つを含んで成る、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１のＩｎｔ認識部位及び前記第３のＩｎｔ認識部位の各々が独立して選択され、ａｔｔＢ（配列番号：１７２）、ａｔｔＢ１（配列番号１７６）、ａｔｔＢ２（配列番号１７８）、ａｔｔＰ（配列番号１７３）、ａｔｔＰ１（配列番号１７７）、ａｔｔＰ２（配列番号１７９）、ａｔｔＬ（配列番号１７４）、ａｔｔＬ１（配列番号１８０）、ａｔｔＬ２（配列番号１８２）、ａｔｔＲ（配列番号１７５）、ａｔｔＲ１（配列番号１８１）、ａｔｔＲ２（配列番号１８３）、ａｔｔＢ３、ａｔｔＬ３、及びａｔｔＲ３のうちの１つを含んで成る、請求項１２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ドナー配列が、Agrobacterium媒介型形質転換、マイクロプロジェクタイルボンバード、電気穿孔、ＰＥＧ媒介型形質転換及びマイクロインジェクションのうちの１つにより前記植物細胞内に導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記ドナー配列がウイルスレプリコン上で前記植物細胞内に導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記ウイルスレプリコンが前記植物細胞内で自律複製する能力を有している、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ウイルスレプリコンがジェミニウイルスから誘導される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記ジェミニウイルスが、トウモロコシストリークウイルス、小麦萎縮病ウイルス、タバコゴールデンモザイクウイルス及びビートカーリートップウイルスのうちの１つである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ウイルスレプリコンが、Agrobacterium媒介型形質転換、マイクロプロジェクタイルボンバード、電気穿孔、ＰＥＧ媒介型形質転換及びマイクロインジェクションのうちの１つにより前記植物細胞内に導入される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記第２のＩｎｔ認識部位が改質されたラムダインテグラーゼ認識部位である、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記第２のＩｎｔ認識部位がａｔｔＢ（配列番号：１７２）、ａｔｔＢ１（配列番号１７６）、ａｔｔＢ２（配列番号１７８）、ａｔｔＰ（配列番号１７３）、ａｔｔＰ１（配列番号１７７）、ａｔｔＰ２（配列番号１７９）、ａｔｔＬ（配列番号１７４）、ａｔｔＬ１（配列番号１８０）、ａｔｔＬ２（配列番号１８２）、ａｔｔＲ（配列番号１７５）、ａｔｔＲ１（配列番号１８１）、ａｔｔＲ２（配列番号１８３）、ａｔｔＢ３、ａｔｔＬ３、及びａｔｔＲ３のうちの１つを含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記ドナー配列が問題の配列、分子マーカー、選択マーカー、可視マーカー、負の選択マーカー、プロモータ、発現カセット、イントロン及びこれらのいずれかの一部分のうちの少なくとも１つを含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ドナー配列が、ＰＰＯ遺伝子、ＬＵＣ遺伝子、ＮＰＴＩＩ遺伝子、ＧＵＳ遺伝子、ＰＭＩ遺伝子、ＨＰＴ遺伝子、及びこれらのいずれかの一部分のうちの少なくとも１つを含んで成る、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ドナー配列がさらに第４のＩｎｔ認識部位を含んで成る、請求項１２に記載の方法。
【請求項３５】
前記第２のＩｎｔ認識部位及び前記第４のＩｎｔ認識部位が同一である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記第２のＩｎｔ認識部位及び前記第４のＩｎｔ認識部位が互いとの関係において反転配位にある、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記第２のＩｎｔ認識部位及び前記第４のＩｎｔ認識部位が同一でない、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記第２のＩｎｔ認識部位及び前記第４のＩｎｔ認識部位が互いとの関係において直接配位にある、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記第２のＩｎｔ認識部位及び前記第４のＩｎｔ認識部位が互いとの関係において反転配位にある、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記第２のＩｎｔ認識部位及び前記第４のＩｎｔ認識部位は互いに組換えする能力をもたない、請求項３４に記載の方法。
【請求項４１】
前記第２のＩｎｔ認識部位及び前記第４のＩｎｔ認識部位のうちの少なくとも１つが修飾されたランダムインテグラーゼ認識部位である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４２】
前記第２の認識部位及び前記第４の認識部位は、それらが互いに隣接するような形で前記ドナー配列内に位置づけされている、請求項３４に記載の方法。
【請求項４３】
前記第２の認識部位及び前記第４の認識部位は、予め選択されたヌクレオチド配列が前記第２の認識部位と前記第４の認識部位の間にくるような形で前記ドナー配列内に位置づけされている、請求項３４に記載の方法。
【請求項４４】
前記予め選択されたヌクレオチド配列が問題の配列、分子マーカー、選択マーカー、可視マーカー、負の選択マーカー、プロモータ、発現カセット、イントロン及びこれらのいずれかの一部分のうちの少なくとも１つを含んで成る、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記予め選択されたヌクレオチド配列が、ＰＰＯ遺伝子、ＬＵＣ遺伝子、ＮＰＴＩＩ遺伝子、ＧＵＳ遺伝子、ＰＭＩ遺伝子、ＨＰＴ遺伝子、及びこれらのいずれかの一部分のうちの少なくとも１つを含んで成る、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記第２のＩｎｔ認識部位が、前記第１のＩｎｔ認識部位と組換えする能力を有し、前記第４のＩｎｔ認識部位が前記第３のＩｎｔ認識部位と組換えする能力を有する、請求項３４に記載の方法。
【請求項４７】
前記第２のＩｎｔ認識部位及び前記第４のＩｎｔ認識部位の各々が独立して選択され、ａｔｔＢ（配列番号：１７２）、ａｔｔＢ１（配列番号１７６）、ａｔｔＢ２（配列番号１７８）、ａｔｔＰ（配列番号１７３）、ａｔｔＰ１（配列番号１７７）、ａｔｔＰ２（配列番号１７９）、ａｔｔＬ（配列番号１７４）、ａｔｔＬ１（配列番号１８０）、ａｔｔＬ２（配列番号１８２）、ａｔｔＲ（配列番号１７５）、ａｔｔＲ１（配列番号１８１）、ａｔｔＲ２（配列番号１８３）、ａｔｔＢ３、ａｔｔＬ３、及びａｔｔＲ３のうちの１つを含んで成る、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記第１のＩｎｔ認識部位及び前記第３のＩｎｔ認識部位の各々が独立して選択され、ａｔｔＢ（配列番号：１７２）、ａｔｔＢ１（配列番号１７６）、ａｔｔＢ２（配列番号１７８）、ａｔｔＰ（配列番号１７３）、ａｔｔＰ１（配列番号１７７）、ａｔｔＰ２（配列番号１７９）、ａｔｔＬ（配列番号１７４）、ａｔｔＬ１（配列番号１８０）、ａｔｔＬ２（配列番号１８２）、ａｔｔＲ（配列番号１７５）、ａｔｔＲ１（配列番号１８１）、ａｔｔＲ２（配列番号１８３）、ａｔｔＢ３、ａｔｔＬ３、及びａｔｔＲ３のうちの１つを含んで成る、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体が野生型ランダムインテグラーゼ及び修飾されたランダムインテグラーゼのうちの１つを含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項５０】
前記修飾されたランダムインテグラーゼがＩｎｔ−ｈ及びＩｎｔ−ｈ／２１８のうちの１つを含んで成る、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体がさらに組込み宿主因子を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体がさらにエキシジオナーゼを含んで成る、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体が、それらを構成する各々のタンパク質のためのコーディング領域を含む単数又は複数のヌクレオチド配列として前記植物細胞内に導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項５４】
前記単数又は複数のヌクレオチド配列が配列番号２１、配列番号２９、配列番号３７、及び配列番号４３のうちの少なくとも１つを含んで成る、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
配列番号２１は、塩基対５２０が「Ｇ」から「Ａ」へと変化するような形で修飾されている、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
配列番号２１は、塩基対６５２が「Ｇ」から「Ａ」へと変化するような形でさらに修飾されている、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
各々の成分タンパク質のための前記コーディング領域が植物発現可能プロモータに操作可能な形でリンクされている、請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
前記植物発現プロモータが、構成性プロモータ、誘導性プロモータ、組織特異的プロモータ、組織選好プロモータ、発達調節型プロモータ、細胞特異的プロモータ及びオルガネラ特異的プロモータのうちの１つである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体が前記植物細胞のゲノム内に安定した形で組込まれている、請求項５３に記載の方法。
【請求項６０】
前記インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体が前記植物細胞内で過渡的に発現されている、請求項５３に記載の方法。
【請求項６１】
前記インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体がウイルスレプリコン上で前記植物細胞内に導入される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記ウイルスレプリコンが前記植物細胞内で自律複製する能力を有している、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記ウイルスレプリコンがジェミニウイルスから誘導される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記ジェミニウイルスが、トウモロコシストリークウイルス、小麦萎縮病ウイルス、タバコゴールデンモザイクウイルス及びビートカーリートップウイルスのうちの１つである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記ウイルスレプリコンが、Agrobacterium媒介型形質転換、マイクロプロジェクタイルボンバード、電気穿孔、ＰＥＧ媒介型形質転換及びマイクロインジェクションのうちの１つにより前記植物細胞内に導入される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６６】
前記インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体が単数又は複数のＲＮＡ分子として前記植物細胞内に導入されている、請求項６０に記載の方法。
【請求項６７】
各々の成分タンパク質のための前記コーディング領域が前記植物細胞内での発現のために最適化されている、請求項５３に記載の方法。
【請求項６８】
前記インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体が単数又は複数のタンパク質として前記植物細胞内に導入されている、請求項１に記載の方法。
【請求項６９】
前記単数又は複数のタンパク質が電気穿孔法又はマイクロインジェクションのうちの１つにより前記植物細胞内に導入されている請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記単数又は複数のタンパク質がＶｉｒＥ又はＶｉｒＦ融合タンパク質を含むAgrobacteriumを通して前記植物細胞内に導入される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
前記ドナー配列を導入する段階及び前記インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体を導入する段階が同時に実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項７２】
前記標的配列が第１の方法により前記植物細胞内に導入され、前記ドナー配列が第２の方法により導入され、前記インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体が第３の方法によって導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項７３】
前記第１の方法、前記第２の方法及び前記第３の方法が、Agrobacterium媒介型形質転換、マイクロプロジェクタイルボンバード、電気穿孔、ＰＥＧ媒介型形質転換マイクロインジェクション及び有性生殖から成るグループの中から独立して選択されており、前記第１の方法、第２の方法及び第３の方法のうちの少なくとも１つが有性生殖以外の方法である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記ドナー配列及び前記インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体が前記植物細胞内に同時に導入される、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記標的配列が前記ドナー配列及び前記インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体の導入以前に前記植物細胞内に導入される、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
前記インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体が前記標的配列及び前記ドナー配列が前記植物細胞内に導入された後に前記植物細胞内に導入される、請求項７３に記載の方法。
【請求項７７】
前記ドナー配列が、前記植物細胞内に導入される前に第２の植物細胞のゲノム内に安定した形で組込まれる、請求項７３に記載の方法。
【請求項７８】
前記標的配列が不完全ヌクレオチド配列を含み、前記ドナー配列が完全配列を含み、かくして前記標的配列と前記ドナー配列の間の組換えが完全ヌクレオチド配列を生成するようになっている、請求項３４に記載の方法。
【請求項７９】
前記不完全ヌクレオチド配列が、問題の配列、遺伝子、イントロン、プロモータ、発現カセット、選択マーカー、可視マーカー及び負の選択マーカーのうちの少なくとも１つのものを含んで成る、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記ドナー配列が、前記標的配列の前記第１のＩｎｔ認識部位と組換えせずかつ前記植物細胞内のＤＮＡのその後の組換えにおいて使用され得る第３のＩｎｔ認識部位を含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項８１】
前記第１のＩｎｔ認識部位、前記第２のＩｎｔ認識部位及び前記第３のＩｎｔ認識部位の各々が独立して選択され、ａｔｔＢ（配列番号１７２）、ａｔｔＢ１（配列番号１７６）、ａｔｔＢ２（配列番号１７８）、ａｔｔＰ（配列番号１７３）、ａｔｔＰ１（配列番号１７７）、ａｔｔＰ２（配列番号１７９）、ａｔｔＬ（配列番号１７４）、ａｔｔＬ１（配列番号１８０）、ａｔｔＬ２（配列番号１８２）、ａｔｔＲ（配列番号１７５）、ａｔｔＲ１（配列番号１８１）、ａｔｔＲ２（配列番号１８３）、ａｔｔＢ３、ａｔｔＬ３、及びａｔｔＲ３のうちの１つを含んで成る、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記ドナー配列が、前記標的配列の前記第１のＩｎｔ認識部位又は前記第３のＩｎｔ認識部位のいずれとも組換えせずかつ前記植物細胞内のＤＮＡのその後の組換えにおいて使用され得る第５のＩｎｔ認識部位を含んで成る、請求項３４に記載の方法。
【請求項８３】
前記第１のＩｎｔ認識部位、前記第２のＩｎｔ認識部位、前記第３のＩｎｔ認識部位、前記第４のＩｎｔ認識部位及び前記第５のＩｎｔ認識部位の各々が独立して選択され、ａｔｔＢ（配列番号１７２）、ａｔｔＢ１（配列番号１７６）、ａｔｔＢ２（配列番号１７８）、ａｔｔＰ（配列番号１７３）、ａｔｔＰ１（配列番号１７７）、ａｔｔＰ２（配列番号１７９）、ａｔｔＬ（配列番号１７４）、ａｔｔＬ１（配列番号１８０）、ａｔｔＬ２（配列番号１８２）、ａｔｔＲ（配列番号１７５）、ａｔｔＲ１（配列番号１８１）、ａｔｔＲ２（配列番号１８３）、ａｔｔＢ３、ａｔｔＬ３、及びａｔｔＲ３のうちの１つを含んで成る、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記標的配列と前記ドナー配列の間の配列交換を通して得られる組換え産物を同定する段階をさらに含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項８５】
前記組換え産物が少なくとも１つの新たに作り出されたＩｎｔ認識部位を含み、前記新たに作り出されたＩｎｔ認識部位には、前記標的配列から得た配列が第１の側で隣接し、前記ドナー配列から得た配列により第２の側で隣接している、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記標的配列と前記ドナー配列の間の配列交換を通して得られる組換え産物を同定する段階をさらに含んで成る、請求項３４に記載の方法。
【請求項８７】
前記組換え産物が少なくとも１つの新たに作り出されたＩｎｔ認識部位を含み、前記新たに作り出されたＩｎｔ認識部位には、前記標的配列から得た配列が第１の側で隣接し、前記ドナー配列から得た配列が第２の側で隣接している、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
植物細胞内の標的配列を操作するための方法において、
−  （ａ）互いに組換えする能力をもつ第１のＩｎｔ認識部位と第２のＩｎｔ認識部位及び（ｂ）前記第１のＩｎｔ認識部位と前記第２のＩｎｔ認識部位の間にある第１のヌクレオチド配列、を含んで成る標的配列を植物細胞内に導入する段階；
−  インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体を前記植物細胞内に導入する段階；及び、
−  改変した標的配列を含む組換え産物を同定する段階、
を含んで成る方法。
【請求項８９】
前記第１のＩｎｔ認識部位と前記第２のＩｎｔ認識部位が直接配位にあり、前記改変した標的配列が前記第１のヌクレオチド配列を含まない、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記第１のＩｎｔ認識部位及び前記第２のＩｎｔ認識部位が反転配位にあり、前記改変した標的配列が前記第１のヌクレオチド配列の当初の配位との関係において反転した配位にある前記第１のヌクレオチド配列を含んで成る請求項８８に記載の方法。
【請求項９１】
前記第１のＩｎｔ認識部位及び前記第２のＩｎｔ認識部位の各々が独立して選択されており、ａｔｔＢ（配列番号：１７２）、ａｔｔＢ１（配列番号１７６）、ａｔｔＢ２（配列番号１７８）、ａｔｔＰ（配列番号１７３）、ａｔｔＰ１（配列番号１７７）、ａｔｔＰ２（配列番号１７９）、ａｔｔＬ（配列番号１７４）、ａｔｔＬ１（配列番号１８０）、ａｔｔＬ２（配列番号１８２）、ａｔｔＲ（配列番号１７５）、ａｔｔＲ１（配列番号１８１）、ａｔｔＲ２（配列番号１８３）、ａｔｔＢ３、ａｔｔＬ３、及びａｔｔＲ３のうちの１つを含んで成る、請求項８８に記載の方法。
【請求項９２】
前記第１のヌクレオチド配列が問題の配列、分子マーカー、選択マーカー、可視マーカー、負の選択マーカー、プロモータ、発現カセット、イントロン及びこれらのいずれかの一部分のうちの少なくとも１つを含んで成る、請求項８８に記載の方法。
【請求項９３】
前記標的配列がさらに、前記第１のＩｎｔ認識部位と前記第２のＩｎｔ認識部位の間に位置づけされていない第２のヌクレオチド配列を含んで成る、請求項８８に記載の方法。
【請求項９４】
前記第２のヌクレオチド配列が、問題の配列、分子マーカー、選択マーカー、可視マーカー、負の選択マーカー、プロモータ、発現カセット、イントロン及びこれらのいずれかの一部分のうちの少なくとも１つを含んで成る、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記改変した標的配列が、前記第１のヌクレオチド配列の当初の配位との関係において反転した配位にある前記第１のヌクレオチド配列及び当初の配位にある前記第２のヌクレオチド配列を含んで成る、請求項９３に記載の方法。
【請求項９６】
前記インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体が野生型ランダムインテグラーゼ及び修飾されたランダムインテグラーゼのうちの１つを含んで成る、請求項８８に記載の方法。
【請求項９７】
前記修飾されたランダムインテグラーゼがＩｎｔ−ｈ及びＩｎｔ−ｈ／２１８のうちの１つを含んで成る、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体がさらに組込み宿主因子を含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体がさらにエキシジオナーゼを含んで成る、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
植物細胞内にＤＮＡの部位特異的組換えを得るための方法において、
−  ａｔｔＬ（配列番号１７４）、ａｔｔＬ１（配列番号１８０）、ａｔｔＬ２（配列番号１８２）、ａｔｔＲ（配列番号１７５）、ａｔｔＲ１（配列番号１８１）、ａｔｔＲ２（配列番号１８３）、ａｔｔＬ３、及びａｔｔＲ３のうちの１つを含む第１のＩｎｔ認識部位を含む標的配列を、植物細胞のゲノム内に導入する段階；
−  ａｔｔＬ（配列番号１７４）、ａｔｔＬ１（配列番号１８０）、ａｔｔＬ２（配列番号１８２）、ａｔｔＲ（配列番号１７５）、ａｔｔＲ１（配列番号１８１）、ａｔｔＲ２（配列番号１８３）、ａｔｔＬ３、及びａｔｔＲ３のうちの１つを含む第２のＩｎｔ認識部位を含むドナー配列を、前記植物細胞内に導入する段階、
−  インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体を前記植物細胞内に導入する段階；及び
−  前記標的配列と前記ドナー配列の間の配列交換を通して得られた前記植物細胞の前記ゲノム内で組換え産物を同定する段階、
を含んで成る方法。
【請求項１０１】
前記インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体が野生型ランダムインテグラーゼ及び修飾されたランダムインテグラーゼのうちの１つを含んで成る、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記修飾されたランダムインテグラーゼがＩｎｔ−ｈ及びＩｎｔ−ｈ／２１８のうちの１つを含んで成る、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体がさらに組込み宿主因子を含む、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体がさらにエキシジオナーゼを含んで成る、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
植物細胞内でＤＮＡの部位特異的組換えを得るための方法において、
−  第１のＩｎｔ認識部位及び第３のＩｎｔ認識部位を含む標的配列を植物細胞のゲノム内に導入する段階であって、前記第１のＩｎｔ認識部位と前記第３のＩｎｔ認識部位が独立して選択され、ａｔｔＬ（配列番号１７４）、ａｔｔＬ１（配列番号１８０）、ａｔｔＬ２（配列番号１８２）、ａｔｔＲ（配列番号１７５）、ａｔｔＲ１（配列番号１８１）、ａｔｔＲ２（配列番号１８３）、ａｔｔＬ３、及びａｔｔＲ３のうちの１つを含んで成る段階；
−  第２のＩｎｔ認識部位及び第４のＩｎｔ認識部位を含むドナー配列を前記植物細胞内に導入する段階であって、前記第２のＩｎｔ認識部位及び前記第４のＩｎｔ認識部位の各々が独立して選択され、ａｔｔＬ（配列番号１７４）、ａｔｔＬ１（配列番号１８０）、ａｔｔＬ２（配列番号１８２）、ａｔｔＲ（配列番号１７５）、ａｔｔＲ１（配列番号１８１）、ａｔｔＲ２（配列番号１８３）、ａｔｔＬ３、及びａｔｔＲ３のうちの１つを含んで成る段階；
−  インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体を前記植物細胞内に導入する段階；及び
−  前記標的配列と前記ドナー配列の間の配列交換を通して得られた前記植物細胞の前記ゲノム内で組換え産物を同定する段階、
を含んで成る方法。
【請求項１０６】
前記インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体が野生型ランダムインテグラーゼ及び修飾されたランダムインテグラーゼのうちの１つを含んで成る、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記修飾ランダムインテグラーゼがＩｎｔ−ｈ及びＩｎｔ−ｈ／２１８のうちの１つを含んで成る、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体がさらに組込み宿主因子を含む、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体がさらにエキシジオナーゼを含んで成る、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記標的配列と前記ドナー配列の間の配列交換を通して得られた前記遺伝子導入植物細胞のゲノム内で組換え産物を含む遺伝子導入植物細胞を同定する段階をさらに含んで成る請求項１に記載の方法。
【請求項１１１】
少なくとも１つのＩｎｔ認識部位を含んで成る、請求項１１０に記載の方法によって得られた遺伝子導入植物細胞。
【請求項１１２】
前記Ｉｎｔ認識部位がａｔｔＢ（配列番号１７２）、ａｔｔＢ１（配列番号１７６）、ａｔｔＢ２（配列番号１７８）、ａｔｔＰ（配列番号１７３）、ａｔｔＰ１（配列番号１７７）、ａｔｔＰ２（配列番号１７９）、ａｔｔＬ（配列番号１７４）、ａｔｔＬ１（配列番号１８０）、ａｔｔＬ２（配列番号１８２）、ａｔｔＲ（配列番号１７５）、ａｔｔＲ１（配列番号１８１）、ａｔｔＲ２（配列番号１８３）、ａｔｔＢ３、ａｔｔＬ３、及びａｔｔＲ３のうちの少なくとも１つを含んで成る、請求項１１１に記載の遺伝子導入植物細胞。
【請求項１１３】
請求項１１１に記載の遺伝子導入植物細胞を含んで成る遺伝子導入植物。
【請求項１１４】
請求項１１２に記載の遺伝子導入植物細胞を含んで成る遺伝子導入植物。
【請求項１１５】
前記標的配列と前記ドナー配列の間の配列交換を通して得られた前記遺伝子導入植物細胞のゲノム内で組換え産物を含む遺伝子導入植物細胞を同定する段階をさらに含んで成る請求項３４に記載の方法。
【請求項１１６】
少なくとも１つのＩｎｔ認識部位を含んで成る、請求項１１５に記載の方法によって得られた遺伝子導入植物細胞。
【請求項１１７】
前記Ｉｎｔ認識部位がａｔｔＢ（配列番号１７２）、ａｔｔＢ１（配列番号１７６）、ａｔｔＢ２（配列番号１７８）、ａｔｔＰ（配列番号１７３）、ａｔｔＰ１（配列番号１７７）、ａｔｔＰ２（配列番号１７９）、ａｔｔＬ（配列番号１７４）、ａｔｔＬ１（配列番号１８０）、ａｔｔＬ２（配列番号１８２）、ａｔｔＲ（配列番号１７５）、ａｔｔＲ１（配列番号１８１）、ａｔｔＲ２（配列番号１８３）、ａｔｔＢ３、ａｔｔＬ３、及びａｔｔＲ３のうちの少なくとも１つを含んで成る、請求項１１６に記載の遺伝子導入植物細胞。
【請求項１１８】
請求項１１６に記載の遺伝子導入植物細胞を含んで成る遺伝子導入植物。
【請求項１１９】
請求項１１７に記載の遺伝子導入植物細胞を含んで成る遺伝子導入植物。
【請求項１２０】
配列番号２１を含む単離されたヌクレオチド配列。
【請求項１２１】
塩基対５２０が「Ｇ」から「Ａ」へと変化している、請求項１２０に記載の単離されたヌクレオチド配列。
【請求項１２２】
塩基対６５２が「Ｇ」から「Ａ」へと変化している、請求項１２１に記載の単離されたヌクレオチド配列。
【請求項１２３】
配列番号２９及び配列番号３７をさらに含んで成る、請求項１２０に記載の単離されたヌクレオチド配列。
【請求項１２４】
配列番号４３をさらに含んで成る、請求項１２０に記載の単離されたヌクレオチド配列。
【請求項１２５】
配列番号２９、配列番号３７及び配列番号４３をさらに含んで成る、請求項１２０に記載の単離されたヌクレオチド配列。
【請求項１２６】
配列番号２９及び配列番号３７をさらに含んで成る、請求項１２１に記載の単離されたヌクレオチド配列。
【請求項１２７】
配列番号４３をさらに含んで成る、請求項１２１に記載の単離されたヌクレオチド配列。
【請求項１２８】
配列番号２９、配列番号３７、及び配列番号４３をさらに含んで成る、請求項１２１に記載の単離されたヌクレオチド配列。
【請求項１２９】
配列番号２９及び配列番号３７をさらに含んで成る、請求項１２２に記載の単離されたヌクレオチド配列。
【請求項１３０】
配列番号４３をさらに含んで成る、請求項１２２に記載の単離されたヌクレオチド配列。
【請求項１３１】
配列番号２９、配列番号３７及び配列番号４３を含んで成る、請求項１２２に記載の単離されたヌクレオチド配列。
【請求項１３２】
配列番号２９及び配列番号３７を含んで成る単離されたヌクレオチド配列。
【請求項１３３】
配列番号４３を含んで成る単離されたヌクレオチド配列。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
関連出願に対するクロスリファレンス
本出願は、共に本書に全体が参考として内含されている２００２年３月２９日付の米国仮出願第６０／３６９，０４１号及び２００２年１１月１２日付米国仮出願第６０／４２５，５１２号の利益を享受するものである。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般にインテグラーゼを用いた植物形質転換方法、より特定的には食物のゲノム内の予め選択された部位において外来性ＤＮＡを組込むための方法に関する。本発明は同様に、インテグラーゼを用いた植物細胞内でのＤＮＡ配列の切除又は反転にも関する。本発明は同様に、かかる方法により得られた遺伝子導入植物にも関する。
【０００３】
背景技術
近年、遺伝子工学技術の発達が作物改良分野と劇的に関わりをもつようになってきた。これらの技術を使用して、ほぼ全ての作物に有益な特徴を導入することが可能であり、改良作物を急速に得ることが可能である。遺伝子工学を使用することによって、従来の品種改良方法を通して所望の特長を導入する長期にわたるプロセスは不要になる。
【０００４】
当該植物形質転換方法は一般に、宿主ゲノム内への導入遺伝子のランダム組込みを導く。このランダム組込みは例えば、いわゆる「位置効果」と呼ばれる異なる組込み遺伝子座の結果としての潜在的に可変的な導入遺伝子発現及び、導入遺伝子の組込み中に宿主ゲノムを突然変異させる危険性といったものを含むさまざまな理由から、問題を呈するものである。これらの潜在的問題の結果、植物のゲノム内の重要な遺伝子座における不慮の配列中断の結果として付随する異常なく、所望のレベルの導入遺伝子発現を示す遺伝子導入植物を得るために、多数の形質転換事象をスクリーニングし試験しなければならなくなっている。その上、遺伝子導入植物を単数又は複数の導入遺伝子のその後の添加によって修飾しなければならない場合、付加的な導入遺伝子（単複）のランダム組込みは、特に選良植物系列について、これらの多数の導入遺伝子を含有する植物のための品質改良プログラムの実施を厄介かつ困難なものにする。
【０００５】
ターゲティングされた導入遺伝子組込みに対する１つのアプローチでは、部位特異的リコンビナーゼが用いられる。部位特異的組換え系が、複数の原核及び下級真核生物の中で同定されてきた。かかる系は標準的に、特異的ヌクレオチド配列の２つのコピーを認識し、これらのヌクレオチド配列を分割及び連結しかくして遺伝子情報の精確で部位特異的な交換を提供する単数又は複数のタンパク質を含む。当該技術分野では、いくつかの部位特異的リコンビナーゼが知られている。それには、例えばバクテリオファージＰ１  Ｃｒｅ／ｌｏｘ系（Austin et al. (１９８１) Cell ２５：７２９−７３６）、酵母Zygosaccharomyces rouxiiのｐＳＲ１プラスミド由来のＲ／ＲＳリコンビナーゼ系（Araki et al. (１９８５) J. Mol. Biol.１８２：１９１−２０３）、ファージＭｕのＧｉｎ／ｇｉｘ系（Maeser及びKahlmann (１９９１) Mol. Gen. Genet. ２３０：１７０−１７６）、酵母Saccharomyces cerevisiaeの２μｍのプラスミド由来のＦＬＰ／ＦＲＴリコンビナーゼ（Broach et al. (１９８２) Cell ２９：２２７−２３４）、及びバクテリオファージＬａｍｂｄａ由来のＩｎｔリコンビナーゼ（Landy (１９８９) Annu. Rev. Biochem. ５８：９１２−９４９; Landy (１９９３) Curr. Opin. Genet. Dev. ３：６９９−７０７; Lorbach et al. (２０００) J. Mol. Biol. ２９６：１１７５−１１８１; 及びＷＯ０１／１６３４５）が含まれるが、これらに制限されるわけではない。
【０００６】
要約
本開示は、リコンビナーゼを用いた宿主細胞のゲノム内へのＤＮＡ分子のターゲティングされた組込みを達成するための方法を提供する。本書に開示された方法は、例えば双子葉植物及び単子葉植物の植物細胞を含めたさまざまな宿主細胞について使用できる。本開示は、植物細胞内にＤＮＡの部位特異的組換えを達成するための方法において、第１のＩｎｔ認識部位を含む標的ヌクレオチド配列を植物細胞内に導入する段階；第２のＩｎｔ認識部位を含むドナーヌクレオチド配列を該植物細胞内に導入する段階；及びインテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体を該植物細胞内に導入する段階、を含んで成る方法を提供している。
詳細な説明
定義
「ａｔｔＢ／ａｔｔＰ反応」又は「Ｂ／Ｐ反応」というのは、Ｉｎｔによって媒介されたａｔｔＢ認識部位とａｔｔＰ認識部位の間の組換え反応である。
【０００７】
「ａｔｔＬ／ａｔｔＲ反応」又は「Ｌ／Ｐ反応」というのは、Ｉｎｔにより媒介されるａｔｔＬ認識部位とａｔｔＲ認識部位の間の組換え反応である。
【０００８】
「ａｔｔ部位」というのは、インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体のためのＤＮＡ分子上の付着部位である。本書で使用されているように「ａｔｔ部位」というのは一般に、以下にさらに詳述されている「認識部位」と互換的に使用される。一般に、「ａｔｔ部位」は、例えばａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ又はａｔｔＲ部位といったような特定のタイプの認識部位を意味するために使用される。
【０００９】
「染色体組込みされた」又は「組込まれた」という語は、宿主ＤＮＡで形成された共有結合による宿主ゲノム内への外来性遺伝子又はヌクレオチド配列の組込みを意味する。
【００１０】
「欠失反応」及び「切除反応」は、互換的に用いられ、同じＤＮＡ分子上にあり互いとの関係において直接的配位にある２つの認識部位の間の組換え反応を意味する。この反応は、２つの認識部位間に位置づけされている１つのヌクレオチド配列の除去を結果としてもたらす。
【００１１】
「直接配位」というのは、認識部位の１５塩基対コア領域が同じ５’か３’への方向に配位されるような形での２つ以上の認識部位の配位を意味する。本書で使用されているような「直接反復」という語は、互いに直接配位にある２つ以上の認識部位を意味している。
【００１２】
「ドナー」、「ドナー分子」、「ドナー配列」及び「ドナーＤＮＡ」という語は、部位特異的組換えを用いた標的ＤＮＡ配列との組換えを受けるように選択されたヌクレオチド配列を意味するべく、互換的に用いられる。ドナーヌクレオチド配列は、例えば、遺伝子、発現カセット、プロモータ、分子マーカー、選択マーカー、可視マーカー、これらのいずれの一部分などといった、あらゆるヌクレオチド配列であり得る。ドナーＤＮＡ配列は少なくとも１つのリコンビナーゼ認識部位を含む。
【００１３】
本書で使用されている「内因性」というのは、「同じ由来の」すなわち１つの宿主細胞から誘導されたものであることを意味する。
【００１４】
本書で使用される「発現カセット」という語には、適切な宿主細胞内でもう１つのヌクレオチド配列の発現を導くつまり駆動する能力をもつヌクレオチド配列が含まれている。発現カセットは標準的には、例えば終結シグナルに対して操作可能な形でリンクされている問題のヌクレオチド配列といったようなヌクレオチド配列に操作可能な形でリンクプロモータを含んで成る。発現カセットは同様に、標準的には、ヌクレオチド配列の適切な翻訳のために必要とされる配列をも含んで成る。問題のヌクレオチド配列は通常問題のタンパク質についてコードするが、例えばアンチセンスＲＮＡなどの問題の機能的ＲＮＡ又は、センス又はアンチセンス方向で例えばアンチセンスＲＮＡといった特定の遺伝子の発現を阻害する未翻訳ＲＮＡについてもコードすることができる。ヌクレオチド配列を含む発現カセットはキメリックでもあり得、これはすなわち、その構成要素のうちの少なくとも１つが、その他の構成要素のうちの少なくとも１つとの関係において非相同であることを意味している。該発現カセットには、組換え体形態で得た、非相同発現のために有用である内因性ＤＮＡが内含され得る。しかしながら標準的には、発現カセットは宿主との関係において非相同である。すなわち、発現カセットの特定のＤＮＡ配列は宿主細胞内で天然に発生せず、宿主細胞内又は宿主細胞の祖先の中に形質転換事象を通して導入されなくてはならない。発現カセット内のヌクレオチド配列の発現は、例えば宿主細胞が幾分かの特定の外部刺激に露呈された場合にのみ転写を開始させる誘導性プロモータか又は構成性プロモータのいずれかといったような任意の適切なプロモータの制御下にあり得る。植物といったような多細胞生体の場合、プロモータは同様に特定の組織又は器官又は開発段階に特異的であり得る。
【００１５】
「外来性」遺伝子又はＤＮＡは、通常宿主生体内に見られないものの遺伝子移入により導入することのできる遺伝子又はヌクレオチド配列を意味する。宿主細胞のゲノム内に組込まれていない外来性遺伝子及びＤＮＡは、「染色体外」のものとして言及される。
【００１６】
「遺伝子」という語は、生物学的機能に関連するヌクレオチド配列の任意のセグメントを内含するべく、広義に使用される。かくして、遺伝子には、その発現に必要な調節配列を伴うか又は伴わないコーディング配列が内含される可能性がある。さらに、遺伝子は、エキソン及びイントロン配列の両方を含む可能性もあれば、エキソン配列のみを内含する可能性もある。遺伝子は同様に、例えば、その他のタンパク質のための認識部位を形成する発現されていないＤＮＡセグメントをも内含することができる。本書で使用されるような「遺伝子の一部分」又は「不完全遺伝子」というのは、機能性に必要な配列の全てを含有しないことから非機能的である遺伝子の一部分を意味する。この部分は１つの遺伝子の５’部分である可能性もあれば（すなわち遺伝子の３’未満にある配列は存在しない）、又１つの遺伝子の３’部分である可能性もある（すなわち、遺伝子の５’末端の配列は存在しない）。５’及び３’部分は、それ自体非機能的であるが、５’及び３’部分が操作可能な形でリンクされている場合、遺伝子は「機能的である」か又は「完全である」。
【００１７】
「問題の遺伝子」、「問題の配列」及び「問題のＤＮＡ」は互換的に使用され、かつ、植物に移入された時点で植物に対し、ウイルス耐性、昆虫耐性、非生物ストレス耐性、耐病性、その他の有害小動物に対する耐性、除草剤寛容性、栄養価の改善、工業プロセスにおける性能の改善又は生殖能力の改変といったような所望の特性を付与するあらゆるヌクレオチド配列を内含する。問題の配列は同様に、植物の中での商業的に価値ある酵素又は代謝産物の産生のために植物に移入されるものでもあり得る。
【００１８】
「ゲノム」は、１つの生体の完全な遺伝子材料を意味する。
【００１９】
本書で使用される「異種の」という語は、「異なる天然由来の」すなわち非天然状態を表わす、ということを意味している。例えば、１つの宿主細胞がもう１つの生体、特にもう１つの種に由来する遺伝子で形質転換される場合、その遺伝子は、その遺伝子を担持する宿主細胞及びその子孫の両方に対し異種である。同様にして、「異種の」という語は、天然の又は起源の細胞型から誘導され、同じ天然の又は起源の細胞型の中に挿入されているものの、異なる調節要素の制御下で例えば異なるコピー数でなどといったような非天然状態で存在するヌクレオチド配列に関する。
【００２０】
組換え産物を「同定する」というのは、組換え産物が検出され標的及びドナー配列の両方から区別されることを意味している。組換え産物を同定するための手段は、数多く存在している。例えば、選択可能なマーカー遺伝子を使用して、部位特異的組込みの結果として、選択マーカー遺伝子が組換え体産物内でのみプロモータと操作可能な形でリンクした状態となるようにすることができる。代替的には、可視マーカー遺伝子を使用し、マーカー遺伝子発現の増大又は損失が組換え産物を同定するようにすることもできる。代替的には、負の選択マーカー遺伝子を使用し、マーカー遺伝子の発現の損失又は欠如によって組換え産物が同定されるようにすることもできる。さらに、標的配列及び／又はドナー配列の特徴である分子マーカーを使用して、分子マーカーパターンが組換え産物に独特のものとなるようにすることもできる。
【００２１】
本書で使用されている「インテグラーゼ」は、野生型インテグラーゼ及びさまざまな突然変異体又は修飾されたインテグラーゼのうちのいずれかを含めたバクテリオファージλ−由来インテグラーゼを意味する。本書で使用されている「インテグラーゼ複合体」というのは、インテグラーゼ及び組込み宿主因子（ＩＨＦ）を含む複合体を意味する。本書で使用されている「インテグラーゼ複合体」は、同様に、インテグラーゼ、組込み宿主因子及びバクテリオファージλ−由来のエキシジオナーゼ（Ｘｉｓ）を含む複合体を意味することもある。さらに、本書で使用されているように、「Ｉｎｔ」は、「インテグラーゼ」及び「インテグラーゼ複合体」の両方を意味する。
【００２２】
「インテグラーゼ媒介型組換え産物」というのは、インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体の存在下で標的配列及びドナー配列の間に形成された組換え産物である。インテグラーゼ媒介型組換えの結果、標的上の少なくとも１つのリコンビナーゼ認識部位とドナー上の少なくとも１つのリコンビナーゼ認識部位の間のストランド交換がもたらされ、かくして組換え産物が形成される。以上に定義した用法と一貫して、「Ｉｎｔ媒介型組換え」又は「Ｉｎｔ媒介型組換え産物」は、インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体のいずれかにより媒介された組換え又は組換え産物を意味する。
【００２３】
「分子内組換え」というのは、単一核酸分子上の認識部位間の組換えを意味する。異なる分子上の認識部位間の組換えは、「分子間組換え」と呼ばれる。
【００２４】
「染色体内組換え」というのは、単一の染色体上の認識部位間の組換えに関する。異なる染色体上の認識部位間の組換えは、「染色体間組換え」と呼ばれる。
【００２５】
「反転反応」というのは、互いとの関係において反転配位にある２つのａｔｔ部位間の分子内組換え反応を意味する。例えば、反転配位にあるａｔｔＢ部位とａｔｔＰ部位又は反転配位にあるａｔｔＬ部位とａｔｔＲ部位のいずれかの間の分子内反応によって、反転反応をもたらすことができる。
【００２６】
「反転配位」というのは、認識部位の１５塩基対のコア領域が相対する５’から３’への方向に配位されるような形での２つの認識部位の配位を意味する。
【００２７】
「操作可能な形でリンクされた」又は「操作的にリンクされた」という語は、物理的に又は機能的に相互作用する２つ以上のヌクレオチド配列の間の関係を意味する。例えば、プロモータ又は調節ヌクレオチド配列は、該調節ヌクレオチド配列がコーディング又は構造ヌクレオチド配列の発現レベルに影響を与えるような形で２つの配列が位置づけされている場合に、ＲＮＡ又はタンパク質についてコードするヌクレオチド配列に操作可能な形でリンクされていると言われる。１つの遺伝子の５’部分は、２つの部分が１つの機能的遺伝子を形成するように位置づけされている場合に１つの遺伝子の３’部分と操作的に又は操作可能な形でリンクされている。
【００２８】
本書で使用されている「植物」という語は、制限的な意味なく、植物全体、植物器官（例えば葉、茎、根、果実など）、種子、植物細胞及び植物細胞の後代、植物組織、植物細胞又は組織の培養、プロトプラスト、カルス及び構造的かつ／又は機能的単位の形で組織された植物細胞のあらゆるグループを意味する。植物細胞から「再生された」植物というのは、該植物の全ての細胞がその植物細胞に由来することを意味する。開示された方法で使用できる植物のクラスは、一般に、単子葉植物及び双子葉植物の両方の植物を含めた、形質転換技術の影響を受けやすい高等植物クラスと同じ位広いものである。好ましい植物としては、制限的な意味なく、アカシア、アルファルファ、アネット、リンゴ、アンズ、アーティチョーク、Arabidopsis（シロイヌナズナ）、ルッコラ、アスパラガス、アボガド、バナナ、オオムギ、豆、ビート、ブラックベリー、ブルーベリー、ブロッコリ、芽キャベツ、キャベツ、カノーラ、カンタロープメロン、ニンジン、キャッサバ、カリフラワー、セロリ、サクランボ、チコリ、クローバ、香菜、シトラス、クレメンタイン、コーヒー、コーン、綿花、キュウリ、ナス、エンダイブ、キクジシャ、ユーカリ、ウイキョウ、イチジン、ニンニク、ヘチマ、ブドウ、グレープフルーツ、大麻、甘露タバコ、クズイモ、キウイ、レタス、西洋ニラネギ、レモン、ライム、マンゴ、トウモロコシ、メロン、マッシュルーム、ネクタリン、ナッツ、オート麦、オクラ、タマネギ、オレンジ、観賞植物、パパイヤ、パセリ、エンドウマメ、モモ、ピーナツ、ナシ、コショウ、柿、パイナップル、オオバコ、プラム、ザクロ、ジャガイモ、カボチャ、マルメロ、赤チコリ、ダイコン、ラズベリー、イネ、ライ麦、サフラワー、サトウモロコシ、大豆、ホウレンソウ、スカッシュ、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、サツマイモ、モミジバフウ、ミカン、茶、タバコ、トマト、ライ小麦、芝、カブ、ツリ植物、スイカ、小麦、ヤム、ズッキーニ及び針葉樹及び落葉樹といった木本植物が含まれる。問題の配列がひとたび特定の植物種へと形質転換された時点で、その種の中で問題の配列を繁殖させることもできるし、又は従来の品種改良技術を用いて実用品種を含めた同じ種のその他の品種へと移行させることもできる。
【００２９】
「植物細胞」というのは、プロトプラスト及び細胞壁を含む１本の植物の構造的及び生理学的単位を意味し、制限的意味なく、種子懸濁培養、胚芽、分裂組織領域、カルス組織、葉、根、苗条、配偶体、胞子体、花粉、及び小胞子を含む。植物細胞は、単離された単一の細胞、培養された細胞又は、例えば植物組織、植物器官又は全植物といったような高等組織化単位の一部の形をしている可能性がある。
【００３０】
「植物細胞培養」は、例えばプロトプラスト、細胞培養細胞、植物組織内の細胞、花粉、花粉管、卵細胞、胚のう、接合体及びさまざまな発達段階にある胚芽といったような植物単位の培養を意味する。
【００３１】
「植物材料」は、葉、茎、根、花又は花の一部分、果実、花粉、卵細胞、接合体、種子、挿し木、細胞又は組織培養又は植物のその他のあらゆる部分又は産物を意味する。
【００３２】
「植物器官」は、根、茎、葉、つぼみ又は胚芽といったような植物の全く異なる、目に見えて構造化され分化された部分である。
【００３３】
本書で使用されている「植物組織」は、構造的及び機能的単位の形に組織されたインプランタの又は培養状態のいずれかにある植物のあらゆる組織を含めた、植物細胞の一群を意味する。この用語は、植物全体、植物器官、植物種子、組織培養及び構造的及び／又は機能的単位へと組織されたあらゆる植物細胞群を内含するが、これらに制限されるわけではない。以上で列挙した又はその他の形でこの定義に包含される通りのあらゆる特異的タイプの植物組織と合せてか又はそれらが無い状態でのこの用語の使用に際してはいずれかのその他のタイプの植物組織を除外することが意図されているわけではない。
【００３４】
「認識部位」又は「組換え部位」は、ＰＣＢタンパク質により認識され得るヌクレオチド配列を意味している。認識部位は、リコンビナーゼ及び関連するあらゆる補助タンパク質によって結合、分割及びストランド交換が実施されるヌクレオチド配列である。インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体は、ａｔｔＢ、ａｔｔＬ、ａｔｔＲ、ａｔｔＰを含む認識部位及び／又はかかる部位の適切な突然変異を認識する。ａｔｔＢ部位は、約２５〜３０ｂｐｓであり得、２つの９ｂｐコア配列及び７ｂｐのオーバラップ（又はスペーサ）領域を内含し、一方ａｔｔＰ部位は、約２４０ｂｐｓであり得、インテグラーゼ及び単数又は複数の補助タンパク質のための結合部位を含む。ａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位を、Ｉｎｔによって合わせて組換えることもでき又代替的にはａｔｔＬ及びａｔｔＲ部位をＩｎｔにより合わせて組換えることもできる。
【００３５】
「リコンビナーゼ」というのは、ＤＮＡの部位特異的組換えを実施する能力をもつ酵素を意味する。リコンビナーゼ酵素は、エンドヌクレアーゼ及びリガーゼ活性を有している。リコンビナーゼは、単一のタンパク質としてか又はタンパク質複合体の一部としてのいずれかで機能しうる。本書中で使用されるように、インテグラーゼ及びインテグラーゼ複合体がリコンビナーゼである。
【００３６】
一般に、同じ分子上にある２つのリコンビナーゼ認識部位の間でリコンビナーゼ媒介型組換えが起こる場合、その組換え反応の結果として２つの認識部位によりフランキングされた配列の欠失又は反転のいずれかがもたらされる。異なる分子上にある２つのリコンビナーゼ認識部位の間（例えば標的配列上のリコンビナーゼ認識部位とドナー配列上のリコンビナーゼ認識部位の間）でリコンビナーゼ媒介型組換えが起こる場合、リコンビナーゼ反応は結果として、１つの分子からの配列のその他の分子内への挿入（例えば、標的分子内へのドナー配列の挿入）が結果としてもたらされる。組換え能力をもつ特定の認識部位が標的とドナーの両方の上に存在する場合（例えば、標的上にａｔｔＢ部位そしてドナー上にａｔｔＰ部位、又は標的上にａｔｔＬ部位そしてドナー上にａｔｔＲ部位）、組換え産物は、２つの部位間のヌクレオチド配列の交換を表わし、２つの新しい部位を結果としてもたらす。これらの新しい部位の各々は、ドナー及び標的分子の両方からのもとの認識部位の一部分を含有する。例えば、標的上のａｔｔＢ部位とドナー上のａｔｔＰ部位の間で組換えが起こる場合、ａｔｔＬ及びａｔｔＲ部位が、組換え産物内で作り出される。さらに、新たに形成されたａｔｔＬ、及びａｔｔＲ部位は、一方の側でドナー分子から得られた配列によって、又もう一方の側では、標的分子から得られた配列によってフランキングされている。
【００３７】
組換え産物は、ドナー分子上の１つの認識部位及び標的分子上の１つの認識部位を用いて得ることができ、かくして「単一交叉」組換え産物が生成される（図１）。代替的には、標的分子上の２つの認識部位及びドナー分子上の２つの認識部位を使用することができる。ドナー上の２つの部位と標的上の２つの部位の間の組換えが「２重交叉」組換え産物を生成する。ドナー分子上の組換え部位が標的分子と交換されるべき問題の配列に隣接している場合、標的分子との２重交叉組換えの結果として、標的分子内の認識部位間にもともとあったヌクレオチド配列を問題の配列が置換している組換え産物がもたらされることになる。組換えを通した標的分子とドナー分子の間のヌクレオチド配列の交換は「配列交換」、「配列置換」又は「カセット交換」と呼ばれる（図２）。
【００３８】
「調節要素」は、例えば問題の配列といったようなもう１つのヌクレオチド配列の発現を宿主細胞上で付与することに関与しているヌクレオチド配列を内含している。調節要素は、問題のヌクレオチド配列及び終結シグナルに操作可能な形でリンクされているプロモータを含むことができる。調節要素は標準的に、問題のヌクレオチド配列の適切な翻訳にとって有用な配列をも包含する。
【００３９】
「選択マーカー」又は「選択マーカー遺伝子」というのは、１つの植物細胞内でのその発現が特定の条件下での選択的利点を細胞に与えるヌクレオチド配列を意味する。選択マーカー遺伝子で形質転換された細胞が有する選択上の利点は、例えば形質転換されていない細胞の能力に比べて抗生物質又は除草剤といったような負の選択作用物質の存在下で成長する能力が改善されているということにあると考えられる。代替的には、形質転換された細胞が有する選択上の利点は、形質転換を受けていない細胞に比べて、栄養素、成長因子又はエネルギー源として特殊な化合物を利用する能力が増強されているという点にもあり得る。代替的には、形質転換された細胞が有する選択上の利点は、「負の選択」と呼ばれるものをもたらす以前に有していた特色又は特性の喪失にあり得る。この最後の場合、宿主細胞は、標準的には遺伝子導入親細胞である親細胞の中に存在していた（例えば負の選択マーカー遺伝子などといった）特異的特色又は特徴を発現する能力を失っていない細胞に対してのみ毒性を示す化合物に対し露呈されるか又はかかる化合物と接触している。
【００４０】
本書で使用されている「部位特異的組換え」は、各々少なくとも１つの認識部位を含む２つのヌクレオチド配列の間の組換えを意味している。
【００４１】
「部位特異的」という語は、宿主細胞のゲノム内の特定の場所にありうる特定のヌクレオチド配列にあることを意味する。ヌクレオチド配列は、宿主ゲノム内のその天然の場所においてか又はゲノム内のいくつかのその他の場所において宿主細胞に対し内因性である可能性もあり、又は、さまざまな既知の方法のいずれかにより宿主細胞のゲノム内に予め挿入された異種のヌクレオチド配列である可能性もある。
【００４２】
「安定した形で形質転換された」というのは、宿主細胞のゲノム内に安定した形で組込まれた問題のヌクレオチド配列を含有する宿主細胞を意味する。
【００４３】
「標的」、「標的分子」、「標的配列」及び「標的ＤＮＡ」は、少なくとも１つのリコンビナーゼ認識部位を含有するヌクレオチド配列を意味するために互換的に用いられる。標的ヌクレオチド配列は、遺伝子、発現カセット、プロモータ、分子マーカー、これらのいずれかのものの一部分などであり得る。標的配列は、植物ゲノム内の染色体の場所に組込まれた標的配列を含む「標的系列」を作り出すべく植物細胞内に安定した形で形質転換され得る。
【００４４】
「ターゲティングされた組込み事象」又は「標的事象」というのは、インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体の存在下で標的配列とドナー配列の間で形成された組換え産物を意味する。特にそれは、標的配列が植物細胞内に安定した形で形質転換された時点でのＩｎｔ媒介型組換えの結果としての標的配列内のドナー配列の組込みを意味する。
【００４５】
遺伝子又はヌクレオチド配列の「過渡的発現」又は「過渡的に発現された」というのは、宿主染色体内に組込まれてはいないものの独立して（例えば自律複製プラスミドの一部であるか又は発現カセットのいずれかであることによって）か又は例えばウイルスといったもう１つの生物学系の一部として機能しうる遺伝子又はヌクレオチド配列の発現を意味する。
【００４６】
宿主細胞の「過渡的に形質転換された」又は「過渡的形質転換」というのは、宿主細胞染色体内への外来性ＤＮＡ又はヌクレオチド配列の組込み無しで（例えばAgrobacterium媒介型形質転換又はバイオリスティックボンバードといった方法により）宿主細胞内に外来性ＤＮＡ又は問題のヌクレオチド配列を導入しかくして宿主細胞の後代の中の外来性ＤＮＡ又はヌクレオチド配列の安定した維持を妨げることを意味する。
【００４７】
「ウイルスレプリコン」又は「ウイルスベクター」というのは、植物細胞内で複製を受けることのできるＤＮＡ又はＲＮＡウイルスベクター又はその一部分を意味する。レプリコン又はベクターは、例えば複製に必要である複製起点といったようなシス作用性ウイルス配列を含む。レプリコン又はベクターは、例えばウイルス複製遺伝子といったような（例えばそれぞれＡＣＭＶ及びＴＧＭＶジェミニウイルス内のＡＣ１及びＡＬ１遺伝子）トランス作用性ウイルス配列を含んでいてもいなくてもよい。レプリコン又はベクターは、宿主植物細胞内での発現のための標的配列を含んでいてもいなくてもよい。
【００４８】
ウイルスレプリコン上のドナーＤＮＡの導入は、植物細胞内のドナーＤＮＡのコピー数を増大させることによりターゲティングの頻度を増大させることができる。
【００４９】
「可視マーカー遺伝子」というのは、形質転換された細胞内でのその発現がその細胞に対し利点を付与しない可能性があるものの検出されるか又は可視状態とされる可能性のある遺伝子又はヌクレオチド配列を意味する。可視マーカーの例としては、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）、及び蛍光タンパク質（例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又はシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ））が含まれるが、これらに制限されるわけではない。
【００５０】
１つの態様において、本開示は、植物内での発現の増強のために修飾された新規のヌクレオチド配列を提供している。該ヌクレオチド配列は、植物内での機能的インテグラーゼ活性を提供するＩｎｔをコードする。
【００５１】
もう１つの態様においては、フランキング認識部位を伴う標的配列を含む植物細胞内のインテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体の発現は、標的配列の効率の良い切除及び／又は反転を導く。従って、植物ゲノムから望ましくない配列を除去するためかつ／又は植物ゲノム内での望まれる標的配列の反転のための方法が提供されている。例えば、問題の配列のためのオンオフスイッチとして反転を使用することができる。
【００５２】
もう１つの態様においては、該開示は、植物における部位特異的組換えをもたらすための方法を提供している。
【００５３】
本書で開示されている方法は、組換えを実施するために付加的な付帯的因子（単複）を伴ってか又は伴わずに、インテグラーゼを利用する。組換えは、例えば、最高２５〜３０ｂｐの認識部位を含むａｔｔＢ認識部位（配列番号１７２）及びそれよりも実質的に大きく（最高２４０〜２５０ｂｐ）インテグラーゼのための結合部位のみならず付帯的因子のための結合部位をも含むａｔｔＰ認識部位といったような２つのインテグラーゼ認識部位の対合及び相互作用の結果として得ることができる（Lanay (1989) Annu. Rev. Biochem. 58: 913-949）。ａｔｔＢ（配列番号１７２）とａｔｔＰ（配列番号１７３）部位の間の反応は、交叉において配列を交換して、組換え産物内の２つの新しい部位ａｔｔＬ（配列番号１７４）及びａｔｔＲ（配列番号１７５）を作り出す。組換えは同様に、ａｔｔＬ及びａｔｔＲ認識部位の対合及び相互作用の結果として得ることもできる。Ｌ／Ｒ反応の組換え産物はａｔｔＢ（配列番号１７２）及びａｔｔＰ（配列番号１７３）認識部位を再度作り出すことから、Ｌ／Ｒ反応を用いてＢ／Ｐ反応を逆転させることが可能である。
【００５４】
１つの実施形態においては、宿主細胞には、インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体のための単一の認識部位（「第１のＩｎｔ認識部位」）を含む標的配列が含まれる。該認識部位は、例えばａｔｔＢ（配列番号１７２）、ａｔｔＰ（配列番号１７３）、ａｔｔＬ（配列番号１７４）、ａｔｔＲ（配列番号１７５）を含めたＩｎｔのための任意の認識部位、又は、本書で記述されているか又はその他の形で当該技術分野において既知である、Ｉｎｔ媒介型Ｂ／Ｐ又はＬ／Ｒ反応において機能的である任意の突然変異体認識部位であり得る。
【００５５】
対応するドナー配列が標的の第１の認識部位と組換えする能力をもつ第２の認識部位を伴って構築される。例えば、標的配列のための第１の認識部位としてａｔｔＢ（配列番号１７２）が選択される場合、ドナー配列のための第２の認識部位として、ａｔｔＰ（配列番号１７３）が選択される。類似の形で、標的配列のための第１の認識部位としてａｔｔＲ（配列番号１７５）が選択される場合、ドナー配列のための第２の認識部位としてａｔｔＬ（配列番号１７４）が選択される。
【００５６】
突然変異体又は修飾されたＩｎｔ認識部位を用いることによって、本書に開示された組換え方法に対して、さらなる特異性及び融通性を付与することができる。例えば組込み宿主因子又はＩＸＺといったような単数又は複数の補助タンパク質に対する該部位の結合親和力を改変するために、認識部位を突然変異させるか又は修飾することができる。さらに、突然変異又は修飾は、組換え産物を形成する効率を増大させることができるか；組換え反応の特異性を増大させることができるか；又は例えばＢ／Ｐ反応ではなくむしろＬ／Ｒ反応に有利に作用することなどによって組換え反応の方向性を増大させることができる。米国特許第５，８８８，７３２号には、多数のこれらの認識部位が記述されている。以上の記述と類似の要領で、標的配列内の突然変異体ａｔｔＬ部位がドナー配列内の突然変異体ａｔｔＲ部位と対合されるか、標的配列内の突然変異体ａｔｔＢ部位がドナー配列内の突然変異体ａｔｔＰ部位と対合されるか、標的配列内の突然変異体ａｔｔＲ部位がドナー配列内の突然変異体ａｔｔＬ部位と対合されるか又は、標的配列内の突然変異体ａｔｔＰ部位がドナー配列内の突然変異体ａｔｔＢ部位と対合されるような形で、対応する認識部位が対合される。例えば、標的配列及びドナー配列の中で認識部位の以下の対を使用することが可能である：ａｔｔＢ１（配列番号１７６）とａｔｔＰ１（配列番号１７７）、ａｔｔＢ２（配列番号１７８）とａｔｔＰ２、Ｐ３（本書でａｔｔＰ２と呼ばれる）（配列番号１７９）、ａｔｔＬ１（配列番号１８０）とａｔｔＲ１（配列番号１８２）、ａｔｔＬ２（配列番号１８１）とａｔｔＲ２（配列番号１８３）、ａｔｔＢ３とａｔｔＰ２、Ｐ３（配列番号１７９）、及びａｔｔＬ３  ａｎｄ  ａｔｔＲ３．（米国特許第５，８８８，７３２を参照のこと）。
【００５７】
もう１つの実施形態においては、標的配列は、以下第３の認識部位と呼ぶ付加的なＩｎｔ認識部位を含んでいる。第１及び第３の認識部位は、同一である又は同一でない可能性がある。１つの実施形態においては、第１の及び第２の認識部位は同一であり、２つの部位は、互いに反転配位にある。もう１つの実施形態においては、第１及び第３の認識部位は、非同一であり、２つの部位は、互いに反転又は直接配位のいずれかにある可能性がある。１つの実施形態では、第１及び第３の認識部位は、それらが互いに組換えできないような形で選択される。例えば、標的は、２つのａｔｔＢ部位、２つのａｔｔＬ部位、２つのａｔｔＢ部位又は２つのａｔｔＲ部位を含むことができる。１つの実施形態においては、標的の認識部位は、互いに隣接して位置づけ可能である。もう１つの実施形態においては、標的の認識部位は、互いに近接して位置づけ可能である。もう１つの実施形態においては、（本書で「第１のヌクレオチド配列」とも呼ばれている）予め選択されたヌクレオチド配列が第１と第３の認識部位の間に位置設定されるような形で、標的配列内に第１及び第３の認識部位を位置づけすることができる。予め選択されたヌクレオチド配列は、分子マーカー、問題の配列、選択マーカー、可視マーカー、プロモータ、発現カセット、これらのいずれかの一部分などを含むことができる。
【００５８】
予め選択されたヌクレオチド配列は、単数又は複数の発現カセットを含むことができる。１実施形態においては、予め選択されたヌクレオチド配列は、本書で記述されているか又はその他の形で当該技術分野において既知の選択マーカーのいずれかといったような選択マーカー遺伝子を含む発現カセットを含んで成る。選択マーカーは、宿主細胞のゲノム内に組込まれた標的配列を含む宿主細胞の選択を含めた、標的配列を含む宿主細胞の選択を可能にする。一実施例では、選択マーカー遺伝子は、プロトックス阻害性除草剤に対する耐性を付与するプロトポルフィリノーゲンオキシゲナーゼ（ＰＰＯ）遺伝子である（米国特許第６，０８４，１５５号）。もう１つの実施形態においては、選択マーカー遺伝子は、栄養炭素源としてマンノースを利用する能力を植物に付与するホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子（ＰＭＩ）である。
【００５９】
もう１つの実施形態においては、予め選択されたヌクレオチド配列は、問題の配列、そして任意には可視マーカー遺伝子例えばＧＵＳ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子（例えばＧＦＰ）又は本書に記述されているか又はその他の形で当該技術分野において既知であるその他の任意の選択マーカー遺伝子を含む発現カセットを含んで成る。
【００６０】
さらなる実施形態においては、予め選択されたヌクレオチド配列は、例えばシトシンデアミナーゼ遺伝子（Perera et al. (１９９３) PMB  ２３：７９３−７９９）、単純ヘルペスウイルススチミジンキナーゼ遺伝子（Czako及びMarton (１９９４) Plant Physiol. １０４：１０６７−１０７１）、Ｔ−ＤＮＡ遺伝子２（Depicker et al. (１９８８) Plant Cell Reports ７：６３−６６）又は本書で記述されているか又はその他の形で当該技術分野におい既知である任意のその他の負の選択マーカー遺伝子といったような負の選択マーカー遺伝子を含む発現カセットを含んで成る。
【００６１】
もう１つの実施形態においては、ドナー配列は同様に、２つのＩｎｔ認識部位つまり上述のとおりの第２の認識部位及び以下第４の認識部位と呼ばれる付加的部位をも含んで成る。第２及び第４の認識部位は同一である又は同一でない可能性がある。１つの実施形態においては、第２及び第４の認識部位は、同一であり、２つの部位は、互いに反転配位にある。もう１つの実施形態においては、第２及び第４の認識部位は同一でなく、２つの部位は、互いに反転又は直接配位にある。
【００６２】
１実施形態においては、第４の認識部位の配列は、第４の認識部位が第２の認識部位と組換えできないような形で選択される。さらに、ドナーの２つの認識部位（第２及び第４の認識部位）は、標的の２つの認識部位（それぞれ第１及び第３の認識部位）と組換えできるような形で選択される。例えば標的配列が２つのａｔｔＢ部位（又は代替的には２つのａｔｔＬ部位）を含む場合、ドナー配列は、２つのａｔｔＰ部位（又は代替的には２つのａｔｔＲ部位）を含むように構築される。
【００６３】
もう１つの実施形態においては、ドナー配列は、単数又は複数の予め選択されたヌクレオチド配列を第２及び第４の認識部位の間に含む。予め選択されたヌクレオチド配列は、プロモータ、問題のヌクレオチド配列、分子マーカー、選択マーカー、可視マーカー、発現カセット、これらのうちの任意のものの一部分などのいずれかを内含することができる。
【００６４】
もう１つの実施形態においては、ドナー配列は少なくとも１つの問題のヌクレオチド配列を含んで成る。問題のヌクレオチド配列は、１つの発現カセット内に含まれている可能性があり、問題の配列の発現は、本書に記述されているプロモータのうちのいずれか１つ又は当該技術分野におい既知のその他のあらゆる植物発現可能プロモータによって制限され得る。本書で使用される通り、「植物発現可能」というのは、プロモータが１つの植物細胞内で操作可能であり従って、該プロモータが１つの植物細胞内で操作可能な形でリンクされている１つのヌクレオチド配列の発現を駆動する能力をもつことを意味している。問題のヌクレオチド配列の発現を制御又は駆動するプロモータは、問題のヌクレオチド配列を含む発現カセットにより内含されている可能性があり、そうでなければ、問題のヌクレオチド配列にその他の形で操作可能な形でリンクされ得る。問題のヌクレオチド配列の例としては、ろう質でんぷん；除草剤寛容性；細菌、真菌又はウイルス性疾患に対する耐性；昆虫耐性；非生物ストレス耐性；栄養的品質の増強；工業プロセスにおける性能の改善；雄性不稔又は雄の妊性といった生殖能力の改変；収量安定性；収量増強；及び植物における商品価値の高い酵素又は代謝産物の産生といった所望の特徴のいずれかに関係する特色をコードする配列が含まれるが、これらに制限されるわけではない。
【００６５】
もう１つの実施形態においては、ドナー配列は選択マーカー遺伝子又は可視マーカー遺伝子を含む。このような選択マーカー又は可視マーカー遺伝子は、本書で記述された又はその他の形で当該技術分野におい既知の任意の選択マーカー又は可視マーカー遺伝子であり得るが、標準的には、標的系列又は標的ＤＮＡが含む選択マーカー又は可視マーカー遺伝子である。１つの実施形態では、終結シグナルは、選択マーカー又は可視マーカー遺伝子のコーディング領域の３’末端に融合されている。
【００６６】
該開示の方法に従うと、標的及びドナーヌクレオチド配列は１つの植物細胞内に導入される。１つの実施形態においては、標的ＤＮＡは安定した形で植物ゲノム内に組込まれている。標的配列で形質転換された植物又は植物細胞が、標的系列を形成するための本書で記述されている通りの形質転換方法又はその他の形で当該技術分野におい既知の方法によって得られる。かかる標的系列は、そのゲノム内に組込まれた標的ＤＮＡの単一のコピーを含むことができる。かかる標的系列は、ひとたび得られ同定された時点で、さらに特徴づけされる。例えば、導入遺伝子挿入の場所は、当該技術分野において周知の遺伝子方法によってか又は、制限フラグメント長多形現象（ＲＦＬＰ）、増幅フラグメント長多形現象（ＡＦＬＰ）、単一配列反復（ＳＳＲ）などといった分子マーカーを使用することによって正確に決定される。さらに、挿入部位をフランキングする宿主動物ＤＮＡは、導入遺伝子の挿入によっていかなる必須遺伝子も突然変異を受けたりその他の形で分断されていないことを保証するように配列決定される。充分に特徴づけされた標的系列がひとたび得られた場合、これを単数又は複数のその後導入されたヌクレオチド配列又は導入遺伝子の受容体として使用することができる。かかる付加的な配列又は導入遺伝子は、ドナー配列内に含まれている可能性があり、制限的な意味なく本書に記述されているか又はその他の形で当該技術分野におい既知のAgrobacterium媒介型形質転換、バイオリスティックボンバード、電気穿孔、ＰＥＧ媒介形質転換、ウィスカ又はガラスビーズでの摩擦を含む任意の適切な形質転換方法によって、標的系列内に導入され得る。
【００６７】
もう１つの実施形態では、ドナー配列は植物ゲノム内に安定した形で組込まれる。ドナーＤＮＡで形質転換された植物又は植物細胞が、ドナー系列を形成するための本書で記述されている通りの形質転換方法又はその他の形で当該技術分野におい既知の方法によって得られる。かかるドナー系列は、そのゲノム内に組込まれた標的ＤＮＡの単一のコピーを含むことができる。かかるドナー系列は、ひとたび得られ同定された時点で、先行する段落で記述されている通りに、さらに特徴づけされる。
【００６８】
１つの実施形態においては、標的系列は、例えば、標的系列をドナー系列の花粉で受粉し標的配列及びドナー配列の両方を含む種子を得ることなどといった、当該技術分野におい既知の有性生殖方法により、ドナー系列と交配される。標的系列とドナー系列を交配して産生された植物に由来する植物細胞の中に本書で記述されているようなインテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体を導入した時点で、Ｉｎｔ媒介型組換え産物を形成することができる。Ｉｎｔ媒介型組換え産物は、標的配列遺伝子座とドナー配列遺伝子座の間のヌクレオチド配列の交換の結果として得られる。標的配列とドナー配列の各々の内部に単一の認識部位が存在する場合、標的とドナーの間の組換えが、植物細胞ゲノム内で染色体再配列を生成する。標的配列及びドナー配列の各々の内部に２つの認識部位が存在する場合、標的及びドナーの間の組換えは、植物細胞ゲノム内での染色体再配列を生成しない。
【００６９】
もう１つの実施形態においては、ウイルスレプリコンを通して植物細胞内にドナー配列を導入することができる。ウイルスレプリコン上のドナー配列の導入は、植物細胞内部でのウイルスレプリコンの複製によりドナー配列を増幅させることができるようにする。１つの実施形態においては、ドナー配列は、植物細胞内部での自律複製能力をもつウイルスレプリコン上で宿主植物細胞内に導入される。ウイルスレプリコンの例としては、制限的な意味なく、植物ウイルス（例えばトウモロコシ条斑病ウイルス（Shen and Hohn （１９９５) J Gen Virol ７６：９６５−９６９）；小麦萎縮病ウイルス米国特許第６，０５１，４０９号及びMatzeit et al. (１９９１) Plant Cell ３：２４７−２５８）；例えばタバコゴールデンモザイクウイルス又はタバコ黄色萎縮病ウイルスといったようなタバコジェミニウイルス；ビートカーリートップウイルス；アフリカ産キャッサバモザイクウイルス；トマトゴールデンモザイクウイルス；イチビモザイクウイルス；豆萎縮病モザイクウイルス；豆ゴールデンモザイクウイルス；クロリス線条モザイクウイルス；ディジタリア条斑病ウイルス；ミスカンタス条斑ウイルス；キビ条斑病ウイルス；ジャガイモ黄色モザイクウイルス；スカッシュ縮葉病ウイルス；サトウキビ条斑病ウイルス；トマト縮葉病ウイルス；トマト斑葉病ウイルス；トマト黄色縮葉病：又はその他の既知のウイルスといったようなウイルス（Timmermans et al. (１９９４) Annu Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. ４５：７９−１１２））から誘導されたレプリコンが含まれる。ドナー配列を含むウイルスレプリコンを、既知のさまざまな形質転換方法のうちのいずれかによって宿主植物細胞内に導入することが可能である。形質転換方法の例としては、本書に記述されているか又はその他の形で当該技術分野において既知のとおりのAgrobacterium媒介型形質転換（Grimsley et al. (１９８９) Mol Gen Genet ２１７：３０９−３１６）、マイクロプロジェクタイルボンバード（すなわち「バイオリスティック」又は「粒子ボンバード」）、ＰＥＧ媒介型形質転換、電気穿孔、マイクロインジェクションなどが含まれる。
【００７０】
本書に提供されているように、標的配列及びドナー配列の組換えは、インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体によって媒介される。例えば、Ｉｎｔは、本書に記述されているような例えばａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、ａｔｔＲ及び突然変異体認識部位といったようなインテグラーゼ認識部位を認識し、これらの認識部位間の組換えを媒介する。１実施形態においては、この反応は、組込み宿主因子（ＩＨＦ）と呼ばれる補助タンパク質が随伴し得るインテグラーゼによって媒介される。ＩＨＦは２つの細菌タンパク質サブユニットα及びβを含む。ＩＨＦは、ＤＮＡのベンディングにおいて１つの役割を果たし、かくしてインテグラーゼにより実施される組換え反応を容易にすることができる。１つの実施形態においては、標的配列とドナー配列の間の組換えを媒介するためにインテグラーゼとＩＨＦが使用される。もう１つの実施形態においては、組換え反応はインテグラーゼ、ＩＨＦ及びエキシジオナーゼ（Ｘｉｓ）により媒介される。Ｘｉｓタンパク質は、バクテリオファージラムダから誘導され得る。インテグラーゼ、インテグラーゼとＩＨＦの組合せ又はインテグラーゼ、ＩＨＦ、及びＸｉｓの組合せを使用して標的及びドナー配列の間の組換えを媒介することができる。さらに、組換え反応を媒介するために選択される特定のインテグラーゼの性質により、選択されたＩｎｔの構成要素（すなわち、Ｉｎｔがインテグラーゼ、ＩＨＦを伴うインテグラーゼ又はＩＨＦ及びＸｉｓを伴うインテグラーゼのいずれを含むか）が決定される。野生型ランダムインテグラーゼが使用される場合には、それにＩＨＦが随伴し、Ｌ／Ｒ反応の場合にはＸｉｓが随伴する。突然変異体インテグラーゼが用いられる場合（例えばＩｎｔ−ｈ又はＩｎｔ−ｈ／２１８）、ＩＨＦ及び／又はＸｉｓによる随伴は任意であり得る。
【００７１】
もう１つの実施形態では、Ｉｎｔは突然変異体インテグラーゼを含む。特定のアミノ酸変化をもたらしかつＩＨＦといったような補助タンパク質の不在下でインテグラーゼが組換えを容易にすることができるようにするファージランダムインテグラーゼコーディング配列内の突然変異が知られている（Lorbach et al. (２０００) J. Mol. Biol. ２９６：１１７５−１１８１）。本書で提供されている方法と共に、任意の適切な突然変異を受けたインテグラーゼを使用することができ、例えばＩｎｔ−ｈ及びＩｎｔ−ｈ／２１８を内含する。インテグラーゼ突然変異体Ｉｎｔ−ｈは、インテグラーゼポリペプチド内のアミノ酸１７４に、グルタミン酸からリジンへの変化を含む。Ｉｎｔ−ｈは、ＩＨＦ及び／又はＸｉｓの不在下で哺乳動物細胞の組換えを媒介する能力をもつ。インテグラーゼ突然変異体Ｉｎｔ−ｈ／２１８は、アミノ酸１７４におけるグルタミン酸からリジンへの変化と、アミノ酸２１８におけるグルタミン酸からリジンへの変化を含む。Ｉｎｔ−ｈ／２１８は、ＩＨＦの不在下で哺乳動物における組換えを媒介する能力を有する（Lorbach et al. (２０００) J. Mol. Biol. ２９６：１１７５−１１８１）。
【００７２】
もう１つの実施形態では、Ｉｎｔは、その各々の成分タンパク質のためのコーディング配列を含む単数又は複数の核酸分子（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）として宿主細胞内に導入される。Ｉｎｔは、その各々のタンパク質のためのコーディング領域を含む単数又は複数の発現カセットとして導入され得、ここで各々のコーディング領域は、植物細胞内での発現の能力をもつプロモータに操作的にリンクされている。Ｉｎｔの発現が任意の所望の要領で空間的又は時間的に調節されうるような形で、各々との発現カセットのためのプロモータを選択することができる。例えば、Ｉｎｔの発現が構成性、発達調節方、組織特異的、特定の細胞区画に特異的（すなわちオルガネラ特異的）などのものとなるような形で、プロモータを選択することができる。さらに、Ｉｎｔの発現が植物内で化学的に誘発され得、結果として植物細胞又は組織の化学的リガンドでの処理にのみ応答するＩｎｔの発現をもたらすような形で、プロモータを選択することができる。特異的発現を付与するプロモータ要素と化学的に誘発された発現を付与するものを組合わせることによって、化学物質の適用に応えて植物の特異的細胞又は組織内部でＩｎｔを発現又は活性化させることができる。さまざまな植物発現可能プロモータのうちの任意のものを用いてＩｎｔの発現を駆動することができる。かかるプロモータのうちのいくつかが本書に記述されており、その他のかかるプロモータが当該技術分野におい既知である。
【００７３】
もう１つの実施形態においては、インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体は、植物細胞のゲノム内に安定した形で形質転換されることによって植物細胞内に導入される。例えば、Ｉｎｔは、Ｉｎｔのコーディング配列を含む単数又は複数の発現カセットの中に含まれることができ、かくしてＩｎｔの各タンパク質構成要素のためのコーディング配列は、植物組織及び細胞内の発現能力をもつプロモータに操作的にリンクされることになる。安定した形で植物細胞を形質転換するための適切な方法が当該技術分野におい既知であり、本書で記述されている。１つの実施形態においては、Ｉｎｔで安定した形で形質転換されている植物細胞が同様に、ドナー配列でも安定した形で形質転換される。
【００７４】
当業者であればわかるように、選択されたヌクレオチド配列を用いて安定した形で形質転換された植物細胞又は植物細胞群から、全植物を再生させることができる。この再生された全植物はこのとき、選択されたヌクレオチド配列で形質転換されたものとしても言及される。かくして、本書で開示した方法に従うと、第１の植物は、Ｉｎｔ及びドナー配列を含む単数又は複数の発現カセットで安定した形で形質転換され得、この第１の植物は次に、標的配列で安定した形で形質転換されている第２の植物と交配され得る。従って、Ｆ１植物又は種子内のＩｎｔの発現は、Ｉｎｔ媒介された組換え産物がＦ１植物又は種子内で形成されるような形で、標的配列とドナー配列の間の組換えを媒介することができる。Ｉｎｔをコードするヌクレオチド配列（単複）及びドナー配列の未組換え部分（単複）は次に、品種改良を通して組換え産物配列（単複）を含むヌクレオチド配列から分離され得る。
【００７５】
もう１つの実施形態においては、植物細胞が過渡的にＩｎｔを発現するような形で植物細胞内にＩｎｔを導入することができる。例えば、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、及びＸｉｓを含む単数又は複数のヌクレオチド配列を、例えばAgrobacterium又はマイクロプロジェクタイルボンバードを通して植物細胞内に導入することができる。導入されたヌクレオチド配列の多くは、ゲノム内に組込まれないが、ｍＲＮＡ内に転写され得る。もう１つの実施例では、Ｉｎｔを植物細胞内に導入し、ウイルス発現系を用いて発現させることができる。ウイルス発現系は、植物に感染する能力をもつＲＮＡ又はＤＮＡウイルスから構築され得る。１つの実施形態では、Ｉｎｔのタンパク質（単複）のコーディング配列は、植物細胞内の自律複製能力をもつウイルスレプリコンの中に含まれている。
【００７６】
もう１つの実施形態では、Ｉｎｔのコーディング配列は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形で宿主細胞に供給される。この要領で、Ｉｎｔは、過渡的にのみ宿主細胞に提供される。Ｉｎｔのタンパク質の各々についてのコーディング配列は、Lebel et al. (１９９５) Theor. Appl. Genet. ９１：８９９−９０６及び米国特許第６，０５１，４０９に記述されている方法を用いて該ＲＮＡのｉｎ−ｖｉｔｒｏ転写のためのベクター内に挿入可能である。次に該ＲＮＡを、例えばドナー系列又は標的系列からの細胞といったような宿主細胞内へ形質転換することができる。１つの実施形態においては、ＲＮＡはドナー配列と共に宿主細胞内に同時形質転換される。１実施例において、該ＲＮＡは、米国特許第６，０５１，４０９号に記述されているように、マイクロプロジェクタイルボンバードを用いて宿主細胞に移入される。もう１つの実施形態では、該ＲＮＡは、Lebel et al. (１９９５) Theor. Appl. Genet. ９１：８９９−９０６に記述されているようにＰＥＧ媒介型形質転換によってか又は電気穿孔によって、宿主細胞のプロトプラスト内に導入される。もう１つの実施形態では、ＲＮＡのマイクロインジェクションといったようなその他の形質転換技術が、宿主細胞へのＲＮＡの導入に用いられる。
【００７７】
さらなる実施形態においては、例えば単数又は複数の精製タンパク質といったような単数又は複数のタンパク質として宿主細胞内に活性Ｉｎｔが導入される。例えばマイクロインジェクション又は電気穿孔といったような当該技術分野におい既知の任意の適切な方法により、Ｉｎｔ  タンパク質を細胞内に導入することができる。もう１つの実施形態においては、Ｉｎｔは、ドナーＤＮＡ配列と合わせたマイクロインジェクションによって宿主細胞内に導入される（例えば、Neuhaus et al. (１９９３) Cell ７３：９３７−９５２を参照のこと）。もう１つの実施形態においては、Ｉｎｔタンパク質は、ＶｉｒＥ２又はＶｉｒＦ融合タンパク質を含むAgrobacteriumでの感染を通して宿主細胞内に導入される（例えばVergunst et al. (２０００) Science ２９０：９７９−８２参照）
１実施形態においては、Ｉｎｔタンパク質（単複）のコーディング配列は、特定の植物宿主内での発現のために最適化される。宿主植物のコドン選好性に従ってタンパク質のコーディング配列を最適化することによって、植物中の異種タンパク質の発現を増強できるということは当該技術分野におい既知のことである。植物中の選好コドン使用法は、或る種の微生物内での選好コドン使用法と異なっている。クローニングされた微生物ＯＲＦ（読取り枠）内でのコドン使用法と植物遺伝子（そして特に選択された宿主植物からの遺伝子）内でのコドン使用法を比較することで、宿主植物内での発現のためにコーディング配列を最適しようとして変更可能なＯＲＦ内でのコドンの同定が可能となる。
【００７８】
当業者であれば、本書で開示されている方法によって生成されるＩｎｔ媒介型組換え産物が選択された標的配列及びドナー配列及びリコンビナーゼ認識部位との関係におけるこれらの配列の位置づけに従って変動し得るということを認識することであろう。
【００７９】
１つの実施形態においては、標的は、例えば不完全な問題の配列、不完全な遺伝子、不完全な選択マーカー、不完全な可視マーカー、不完全な負の選択マーカー、不完全なプロモータ配列、不完全な発現カセットなどといった不完全なヌクレオチド配列を含有し、ドナーは、完全な配列を含有するように構築されており、かくして、標的とドナーの間の組換えが完全なヌクレオチド配列を生成するようになっている。この要領で、組換え産物を含む宿主細胞のみが適切な発現産物（すなわち完全なヌクレオチド配列から誘導されるようなもの）を含む。例えば、１実施形態においては、標的は、２つの認識部位、例えば選択マーカー又は可視マーカー遺伝子といったような１つの問題の配列及び問題の配列の３’末端で融合された終結シグナルを含んで成る。問題の配列は、それが２つの認識部位の間にないような形で標的配列内に位置づけされるが、問題の配列の５’末端は認識部位のうちの１つに隣接している。ドナー配列は、１つのプロモータと２つの認識部位を含んで成る。該プロモータは、それが認識部位のうちの１つに隣接しかつ２つの認識部位の間にもあるような形でドナー配列内に位置づけされている。さらに、プロモータの方向性は、プロモータが隣接する認識部位を横断してかつ２つの認識部位の間に存在する残りの配列から離れて転写を駆動する能力をもつことになるようなものである。標的配列及びドナー配列が宿主植物細胞内に導入され宿主細胞内のＩｎｔに露呈されるか又は接触させられた時点で、結果として得られた組換え産物は、問題の配列に操作的にリンクされたドナーのプロモータ及び標的の３’終結シグナルを含む。かくして、問題の配列はこのとき、宿主細胞内で発現される能力をもつ。
【００８０】
もう１つの実施形態においては、標的配列は、遺伝子の３’部分といったような遺伝子の一部分に対し５’のところに挿入された少なくとも１つの認識部位を含むことができる。ドナー配列はこのとき、好ましくは標的配列内に存在しない遺伝子のコーディング領域の部分を含有するその遺伝子の対応する５’部分を含むように構築される。この実施形態においては、ドナー配列は、その内部に含有された遺伝子の部分に対して３’のところに挿入された少なくとも１つの認識部位を含む。標的配列及びドナー配列のＩｎｔ媒介型組換えの時点で、組換え産物は、互いに操作可能な形でリンクされた遺伝子の５’及び３’部分を含み、かくして完全な遺伝子を形成する。この実施形態においては、遺伝子の５’部分と操作可能な形でリンクされた遺伝子のためのプロモータは、ドナー配列内に含まれ得る。かくして標的配列及びドナー配列の組換えの時点でＩｎｔ媒介型組換え産物は、遺伝子の５’及び３’部分の操作可能なリンケージから形成される完全遺伝子に対し操作可能な形でリンクされたプロモータを含む。
【００８１】
さらなる実施形態においては、標的配列は、遺伝子の５’部分といったような遺伝子の一部分に対し３’のところで挿入された少なくとも１つの認識部位を含むことができる。このときドナー配列は、好ましくは標的配列内に存在しない遺伝子のコーディング領域の部分を含有しているその遺伝子の対応する３’部分を含んでいる状態で構築される。この実施形態では、ドナー配列は、その内部に含有された遺伝子の部分に対し５’のところに挿入された少なくとも１つの認識部位を含む。標的配列及びドナー配列のＩｎｔ媒介型組換えの時点で、組換え産物は、互いに操作可能な形でリンク遺伝子の５’及び３’部分を含み、かくして完全な遺伝子を形成する。この実施形態においては、該遺伝子のためのプロモータは、標的配列内に含有され得、かくして該遺伝子の５’部分と操作可能な形でリンクされるようになっている。かくして標的配列及びドナー配列の組換えの時点でＩｎｔ媒介型組換え産物は、遺伝子の５’及び３’部分の操作可能なリンケージから形成される完全遺伝子に対し操作可能な形でリンクプロモータを含む。
【００８２】
１つの実施形態においては、イントロン又はその一部分が、標的配列内に含有された問題の配列（例えば遺伝子、選択マーカー遺伝子又は可視マーカー遺伝子など）又はその一部分の３’末端に対し操作可能な形でリンクされ得る。この実施形態においては、認識部位がイントロン配列の５’末端に隣接してか又はその内部のいずれかに位置づけされている。このとき、ドナー配列は、プロモータが問題の配列の５’末端に操作可能な形でリンクされているような形で構築される。もう１つの実施形態では、イントロン又はその一部分は、ドナーが含有している問題の配列の一部分の３’末端に対して操作可能な形でリンクされ得る。さらに、ドナーは、プロモータがイントロン及び問題の配列の５’部分に対して操作可能な形でリンクされるような形で構築され得、イントロン配列の３’末端に隣接して又はその内部に認識部位を配置することができる。標的配列及びドナー配列のＩｎｔ媒介型組換えの時点で、組換え産物はこのとき、完全イントロン並びに標的構築体の問題の配列に操作可能な形でリンクされたドナー構築体からのプロモータを含有する。組換え産物は同様に、（ドナーからの）問題の配列の５’部分と（標的からの）問題の配列の３’部分の操作可能なリンケージから形成された、機能的な問題の配列をも含有することになる（図３）。
【００８３】
もう１つの実施形態においては、ゲノム内の１つの遺伝子座における問題の多数のヌクレオチド配列の組込みを容易にするために、付加的な認識部位が使用される。（本書で記述されているような）一定数の突然変異体ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、及びａｔｔＲ認識部位が利用可能であるということは、各々の認識部位がその対応する認識部位とのみ組換えできることから、使用可能な認識部位の数を増加させる。ドナー配列は、初期標的配列との組換えのために使用されず第１の組換え産物と第２の異なるドナー配列を組換えするためのその後の組換えラウンドで使用される付加的な認識部位を組換え産物に寄与することができる。１つの実施形態においては、ドナー配列は、第２の及び第４の認識部位と異なる単数又は複数の付加的な認識部位を含んで成る。付加的な認識部位ののうちの１つは、例えば選択マーカー遺伝子といったような問題の配列の５’末端に隣接することができる。問題の配列が選択マーカー遺伝子である場合、本書で記述されているか又はその他の形で当該技術分野におい既知の任意の選択マーカー遺伝子を使用することができるが、かかる選択マーカーは好ましくは、標的系列又は標的配列内に含まれ得るいずれの選択マーカー遺伝子とも異なっている。もう１つの実施形態では、終結シグナルが問題の配列の３’末端に融合されている。付加的な認識部位及び問題の配列はドナーの２つの認識部位の間（すなわち上述の第２及び第４の認識部位の間）にある。１実施形態においては、付加的な認識部位は２つの発現カセットによってフランキングされている。Ｉｎｔ媒介型組換えの第１ラウンドの後、第３の認識部位は、Ｉｎｔ媒介組換えのその後のラウンドを可能にし、その結果付加的な認識部位及び第１の２つの認識部位のうちのいずれか１つを用いて付加的な導入遺伝子又は問題の配列が組込まれることになる。
【００８４】
もう１つの実施形態では、標的配列内に特異的欠失を作り出すためにＩｎｔが利用される。標的配列は第１の認識部位と第２の認識部位を互いに対し直接的配位で含んでいる。付加的には、標的配列は第１及び第２の認識部位の間に第１のヌクレオチド配列を含む。第１のヌクレオチド配列は、本書で記述されているように、又はその他の形で当該技術分野において既知であるように、選択マーカー、負の選択マーカー、可視マーカー、問題の配列などを含むことができる。第１及び第２の認識部位は、それらが互いと組換えできるような形で選択される。例えば、第１の認識部位がａｔｔＢ又はａｔｔＬである場合、第２の認識部位はそれぞれａｔｔＰ又はａｔｔＲである。インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体が、標的配列を含有する宿主細胞内に導入され、該インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体は、第１及び第２の認識部位間の組換えを媒介する。直接配位での第１及び第２の認識部位の組換えは、標的ＤＮＡから第１のヌクレオチド配列を欠失させ、かくして、改変された標的配列を形成する。
【００８５】
さらなる実施形態では、標的ＤＮＡは植物のゲノム内に組込まれる。標的配列で形質転換された植物又は植物細胞が、標的系列を形成するための本書で記述されているか又はその他の形で当該技術分野におい既知であるような適切なあらゆる形質転換方法によって得られる。１つの実施形態においては、このような標的系列は、そのゲノム内に組込まれた標的ＤＮＡの単一のコピーを含有している。かかる系列は、ひとたび同定された時点で、前述のようにさらに特徴づけされる。インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体はこのとき、本書に記述されているか又はその他の形で当該技術分野におい既知である方法により、核酸分子又はタンパク質のいずれかとして標的系列内に導入される。Ｉｎｔ媒介型組換え産物は、可視マーカー、選択マーカー又は問題の配列の発現又はその不在；欠失のＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）同定；負の選択マーカーの不在を含めた（ただしこれらに制限されるわけではない）、当該技術分野におい既知の方法によって同定可能である。
【００８６】
もう１つの実施形態においては、インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体は、ヌクレオチド配列内部での２つの認識部位間にあるヌクレオチド配列の反転を媒介し、改変されたヌクレオチド配列を形成する。反転は、本書で記述されている通り又はその他の形で当該技術分野におい既知であるように例えば問題の配列、可変又は選択マーカー遺伝子などといったような選択されたヌクレオチド配列のためのオンオフスイッチとして使用可能である。１実施形態においては、標的配列は、互いに反転配位にある第１の認識部位と第２の認識部位を含む。付加的には、標的配列は、第１及び第２の認識部位の間にある第１のヌクレオチド配列を含む。第１のヌクレオチド配列は、例えば、選択マーカー、負の選択マーカー、可視マーカー、問題の配列、これらのうちのいずれかの１部分などといったような任意の選択されたヌクレオチド配列を含有し得る。第１及び第２の認識部位は、互いに対し反転配位にある。さらに、第１及び第２の認識部位は、互いとの組換え能力をもつような形で選択される。例えば第１の認識部位がａｔｔＢ又はａｔｔＬである場合、第２の認識部位はそれぞれａｔｔＰ又はａｔｔＲである。インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体が、標的配列を含有する宿主細胞内に導入され、該インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体は、第１及び第２の認識部位間の組換えを媒介する。反転配位での第１及び第２の認識部位が組換えすると、第１のヌクレオチド配列は第１及び第２の認識部位間のその当初の配位に対し反転し、かくして、改変された標的配列を形成する。
【００８７】
１つの実施形態では、標的配列は植物のゲノム内に組込まれる。標的系列は、以上で記述されている通りに得られ、特徴づけされる。インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体は、本書に記述されているか又はその他の形で当該技術分野におい既知である方法により、核酸又はタンパク質のいずれかとして導入される。Ｉｎｔ媒介型組換え産物は、以上で記述されている通り、第１のヌクレオチド配列内に含まれている可視マーカー、問題の配列、選択マーカー、負の選択マーカーなどの発現又はその不在などといった既知の方法により特徴づけされる。
【００８８】
もう１つの実施形態においては、標的配列は、第２及び第３の認識部位の間に位置づけされていない第２のヌクレオチド配列を含む。第１及び第２の認識部位の組換え時点で、標的の第１のヌクレオチド配列が反転させられ、標的の第２のヌクレオチド配列がその当初の配位にとどまるような形で、Ｉｎｔ媒介型組換え産物が生成される。第２のヌクレオチド配列は、例えば、本書で記述されるか又はその他の形で当該技術分野におい既知であるように、例えばプロモータ、発現カセット、問題の配列、選択マーカー、可視マーカー、負の選択マーカー、これらのいずれかの一部分などといった任意の適切なヌクレオチド配列であり得る。１つの実施形態においては、第２のヌクレオチド配列は、例えばホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＭＩ）をコードするヌクレオチド配列、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする配列、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＰＯ）をコードするヌクレオチド配列、ルシフェラーゼ酵素（ＬＵＣ）をコードするヌクレオチド配列などといったような選択マーカー遺伝子を含む。
【００８９】
もう１つの実施形態においては、第２のヌクレオチド配列は、例えば不完全な遺伝子、不完全な問題の配列、不完全なプロモータ、不完全な発現カセットなどといったような不完全なヌクレオチド配列を含み、標的配列は、その第１及び第２の認識部位の間の組換えが完全なヌクレオチド配列を生成するような形で構築されている。かかる構成体の中では、不完全なヌクレオチド配列は、配列が完成されないかぎりかつ完成するまで、標的配列内で機能的ではない。例えば、問題のヌクレオチド配列の転写は、標的内に問題の配列の発現を導く完全なプロモータが不在であるか又は標的内に完全な問題の配列が存在しないことを理由として、不可能である。
【００９０】
さらなる実施形態においては、例えば、マーカー遺伝子の３’末端に融合された終結シグナルを有する選択可能又は可視マーカー遺伝子といったような問題の配列が、標的の第２のヌクレオチド配列内に配置され得る。標的配列は、認識部位のうちの１つに隣接しかつ２つの認識部位の間にあるような形で標的配列内に位置づけされているプロモータを含む。さらに、該プロモータの方向性は、プロモータが隣接する認識部位を横断してかつ２つの認識部位の間に存在する残りの配列から離れて転写を駆動する能力をもつことになるようなものである。標的配列内部で、第１のヌクレオチド配列は、該プロモータが第２のヌクレオチド配列に操作的にリンクされないような形で配位されている。第１及び第２の認識部位の組換え及び第１のヌクレオチド配列の反転の時点で、組換え産物はこのとき、第２のヌクレオチド配列の３’終結シグナル及び問題の配列に操作的にリンクされた第１のヌクレオチド配列のプロモータを含んでいる。
【００９１】
一般的構成要素及び方法
Ｉ．発現カセット
遺伝子導入植物内での発現が意図されたコーディング配列がまず最初に、植物内で発現可能な適切なプロモータに対し３’のところで、発現カセット内で組立てられる。発現カセットは同様に、導入遺伝子の発現のために必要とされるか又は選択された任意のさらなる配列を含むこともできる。かかる配列としては、転写ターミネータ、イントロンといったような発現を増強させるための外来性配列、ウイルス配列及び特定のオルガネラ及び細胞区画に遺伝子産物をターゲティングするように意図された配列が含まれるが、これらに制限されるわけではない。これらの発現カセットを、このとき、本書に記述されている植物形質転換ベクターに移入することができる。
【００９２】
以下では、標準的な発現カセットのさまざまな構成要素について記述する。
Ａ．プロモータ
発現カセット内で使用すべきプロモータの選択が、遺伝子導入植物内の導入遺伝子の空間的及び時間的発現パターンを決定することになる。選択されたプロモータは、特定の細胞型（例えば葉の上皮細胞、葉肉細胞、根の皮膚細胞）又は特定の組織又は器官（例えば根、葉又は花）の中で導入遺伝子を発現することになり、選択は、遺伝子産物の所望の蓄積場所を反映すべきである。代替的には、選択されたプロモータは、さまざまな誘発条件下で遺伝子の発現を駆動することができる。プロモータはその強度すなわち転写を促進する能力が変動する。利用される宿主細胞系に応じて、遺伝子の未変性プロモータを含め一定数の適切なプロモータのうちのいずれか１つを使用することができる。以下は、本発明において利用された発現カセット内で使用可能な制限的意味のないプロモータの例である。
１．   構成性プロモータ
ａ．ユビキチンプロモータ
ユビキチンは、数多くの細胞型の中で蓄積するものとして知られている遺伝子産物であり、そのプロモータは、遺伝子導入植物において使用するため複数の種からクローニングされている（例えばヒマワリBinet et al. Plant Science ７９：８７−９４（１９９１）; トウモロコシ−Christensen et al. Plant Molec. Biol. １２：６１９−６３２（１９８９）; 及びArabidopsis - Norris et al., Plant Mol. Biol. ２１：８９５−９０６（１９９３)）。トウモロコシユビキチンプロモータは、遺伝子導入単子葉植物系内で開発されてきており、単子葉植物の形質転換のために構築されたその配列及びベクターは、本書に参考として内含されている特許公報ＥＰ０３４２．９２６（Lubrizolに対する）の中で開示されている。Taylor et al. (Plant Cell Rep. １２：４９１−４９５（１９９３）) は、トウモロコシユビキチンプロモータ及び第１のイントロンを含むベクター（ｐＡＨＣ２５）、及びマイクロプロジェクタイルボンバードを介して導入された時点での数多くの単子葉植物の細胞懸濁液中でのその高い活性について記述している。Arabidopsis ユビキチンプロモータは、本発明のヌクレオチド配列と共に使用するために理想的なものである。ユビキチンプロモータは、単子葉植物及び双子葉植物の両方の遺伝子導入植物内での遺伝子発現に適している。適切なベクターとしては、ｐＡＨＣ２５の誘導体又は本出願に記述されている形質転換ベクターのいずれかが内含される。ベクターは、適切なユビキチンプロモータ及び／又はイントロン配列の導入によって修飾可能である。
【００９３】
ｂ．ＣａＭＶ３５Ｓプロモータ
プラスミドｐＣＧＮ１７６１の構築は、本書に参考として内含されている公示された特許出願ＥＰ０３９２２２５号（‘９１年９月２５日公示；Ciba Geigy; 例２３）の中で記述されている。該プラスミドは、プロモータとターミネータの間にユニークＥｃｏＲＩ部位を伴うｔｍｌ転写ターミネータ及び「２重」ＣａＭＶ３５Ｓプロモータを含有し、ｐＵＣ型バックボーンを有する。既存のＥｃｏＲＩ部位に加えて、ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩを内含する修飾されたポリリンカーを有するｐＣＧＮ１７６１の誘導体が構築される。ｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸと呼ばれるこの誘導体は、遺伝子導入植物内の３５Ｓプロモータの制御下でのその発現を目的として、そのポリリンカー内部での（微生物ＯＲＦ配列を含む）ｃＤＮＡ配列又はコーディング配列のクローニングに有用である。かかる構築の３５Ｓのプロモータコーディング配列−ｔｍｌターミネータカセット全体は、以下で記述するもののような形質転換ベクターに移入するため、プロモータに対し５’のところのＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｈＩ、ＳａｌＩ及びＸｂａＩ部位及びターミネータに対し３’のところのＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩ部位により切除され得る。さらに、２重３５Ｓプロモータフラグメントは、もう１つのプロモータとの置換のため、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｈＩ、Ｓａは、ＸｂａＩ又はＰｓｔＩでの５’切除及びポリリンカー制限部位（ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩ又はＸｈｏＩ）のいずれかでの３’切除によって除去することができる。望ましい場合、クローニング部位のまわりの修飾は、翻訳を増強しうる配列の導入により行なうことができる。これは、特に過剰発現が望まれる場合に有用である。例えば、ｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸは、本書に参考として内含されている米国特許第５，６３９，９４９号（Ciba Geigy）に対し‘９７年６月１７日付けで発行されたもの）の例３７に記述されているように、翻訳開始部位の最適化により修飾され得る。
【００９４】
ｃ．アクチンプロモータ
アクチンの複数のイソ型が、大部分の細胞型の中で発現されるものとして知られており、従ってアクチンプロモータは、構成性プロモータのための優れた選択肢である。特にイネＡｃｔＩ遺伝子由来のプロモータがクローニングされ特徴づけされてきた（McElroy et al. Plant Cell ２：１６３−１７１（１９９０））。プロモータの１．３ｋｂのフラグメントが、イネのプロトプラスト内での発現に必要とされる全ての調節要素を含有することが発見された。さらに、ＡｃｔＩプロモータに基づく数多くの発現ベクターが、単子葉植物内での使用のために特異的に構築されてきた（McElroy et al. Mol. Gen. Genet. ２３１：１５０−１６０（１９９１））。これらは、ＡｃｔＩ−イントロンＩ、ＡｄｈＩ５’フランキング配列及びＡｄｈＩ−イントロンＩ（トウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来のもの）及びＣａＭＶ３５Ｓプロモータからの配列を取込んでいる。最高の発現を示すベクターは、３５Ｓ及びＡｃｔＩイントロンの融合又はＡｃｔＩ５’フランキング配列とＡｃｔＩイントロンの融合であった。（ＧＵＳリポータ遺伝子の）開始ＡＴＧのまわりの配列の最適化も、発現を増強した。McElroy et al. (Mol. Gen. Genet. ２３１：１５０−１６０（１９９１）) によって記述されたプロモータ発現カセットは、遺伝子発現のために容易に修飾可能であり、単子葉植物宿主の中での使用に特に適している。例えば、McElroyの構築からプロモータ含有フラグメントを除去し、そのとき特異的遺伝子配列の挿入に利用可能であるｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸ内の２重３５Ｓプロモータを置換するために使用することができる。かくして構築された融合遺伝子はこのとき、適切な形質転換ベクターに移入可能である。別の報告書では、第１のイントロンを伴うイネＡｃｔＩプロモータも又、培養された大麦細胞内での高い発現を導くことが発見された（Chibbar et al. Plant Cell Rep. １２：５０６−５０９（１９９３））。
２．   誘発可能な発現
ａ．ＰＲ−１プロモータ
ｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸ内の２重３５Ｓプロモータは、適切な高い発現レベルを結果としてもたらすことになるその他のあらゆる選択されたプロモータで置換可能である。一例を挙げると、タバコＰＲ−１ａプロモータといったような米国特許第５，６１４，３９５号（Ciba Geigyに対し９７年３月２５日付で発行されたもの）の中で記述された化学的に調節可能なプロモータの１つが、２重３５Ｓプロモータに置換することができる。代替的には、Lebel et al., Plant J. １６：２２３−２３３（１９９８）内で記述されたArabidopsis ＰＲ−１プロモータを使用することができる。選択されたプロモータは、制限酵素によってその供給源から切除可能である。代替的には、それは、適切な末端制限部位を担持するプライマを用いてＰＣＲ増幅され得る。ＰＣＲ増幅が受けた場合には、標的ベクター内での増幅済みプロモータのクローニングの後、増幅の誇りについて検査するためにプロモータを再度配列決定することができる。化学的に又は病原体で調節可能なタバコＰＲ−１ａプロモータは、プラスミドｐＣＩＢ１００４から分割され（構築については、例えば本書に参考として内含されているＥＰ０３３２１０４（９１年３月２０日に公示；Ciba Geigy）を参照のこと）、プラスミドｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸに移入される（Uknes et al. Plant Cell ４：６４５−６５６（１９９２））。プラスミドｐＣＩＢ１００４は、ＮｃｏＩで分割され、結果として得た線形化されたフラグメントの３’オーバーハングはＴ４ＤＮＡポリメラーゼでの処理により平滑末端にされる。次にフラグメントはＨｉｎｇＩＩＩで分割され、結果として得たＰＲ−１ａプロモータ含有フラグメントはゲル精製され、２重３５Ｓプロモータが取り出されたｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸへとクローニングされる。これは、ＸｈｏＩでの分割とＴ４ポリメラーゼでの平滑末端化そしてそれに続くＨｉｎｄＩＩＩでの分割及びｐＣＩＢ１００４プロモータフラグメントが中にクローニングされるより大きなベクターターミネータ含有フラグメントの単離によって行なわれる。こうして、ユニークＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ部位を伴う介入ポリリンカーと共にＰＲ−１ａプロモータ及びｔｍｌターミネータを伴うｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸ誘導体が生成される。選択されたコーディング配列はこのベクター内に挿入され得、その後融合産物（すなわちプロモータ−遺伝子−ターミネータ）は、以下で記述するものを含めた任意の選択された形質転換ベクターに移入され得る。米国特許第５，５２３，３１１号及び５，６１４，３９５号の中で開示されているベンゾチアジアゾール、イソニコチン酸及びサリチル酸化合物を含め、本発明に従って形質転換された植物中での選択されたコーディング配列の発現を誘発するために、さまざまな化学的調節因子を利用することができる。
【００９５】
ｂ．エタノール誘発可能なプロモータ
エタノールといったような或る種のアルコール又はケトンによって誘発可能なプロモータを用いて、本発明のコーディング配列の誘発可能な発現を付与することもできる。かかるプロモータは、例えば、Aspergillus nidulansからのａｌｃＡ遺伝子プロモータである（Caddick et al. (１９９８) Nat. Biotechnol １６：１７７−１８０）。A. nidulans内では、ａｌｃＡ遺伝子はアルコールデヒドロゲナーゼＩをコードし、その発現は、化学的誘発因子の存在下でＡｌｃＲ転写因子によって調節される。本発明においては、最小限の３５Ｓプロモータに対し融合されたａｌｃＡ遺伝子プロモータ配列を含むプラスミドｐａｌｃＡ：ＣＡＴ内のＣＡＴコーディング配列（Caddick et al. (１９９８) Nat. Biotechnol １６：１７７−１８０）は、本発明のコーディング配列により置換されて、ａｌｃＡ遺伝子プロモータの制御下でコーディング配列を有する発現カセットを形成する。これは、当該技術分野において周知の方法を用いて実施される。
【００９６】
ｃ．グルココルチコイド誘発可能なプロモータ
ステロイドホルモンに基づく系を用いた本発明の核酸配列の発現の誘発も考慮されている。例えば、グルココルチコイド媒介型誘発系が使用され（Aoyama及びChua (１９９７) The Plant Journal １１：６０５−６１２）合成グルココルチコイド（例えばデキサメタゾン）といったようなグルココルチコイドの適用によって遺伝子発現が誘発される。１実施形態においては、グルココルチコイドは、約０．１ｍＭ〜約１ｍＭの範囲内の濃度で存在する。もう１つの実施形態では、グルココルチコイドは、約１０ｍＭ〜１００ｍＭの範囲内の濃度で存在する。当該開示では、ルシフェラーゼ遺伝子配列を問題の配列で置換して、３５Ｓの最小プロモータに融合されたＧＡＬ４上流側活性化配列の６つのコピーの制御下で問題の配列をもつ発現カセットを形成することができる。これは、当該技術分野において周知の方法を用いて実施される。トランス作用性因子は、ラットグルココルチコイド受容体（Picard et al. (１９８８) Cell ５４：１０７３−１０８０）のホルモン結合ドメインに融合されたヘルペスウイルスタンパク質ＶＰ１６（Triezenberg et al. (１９９８) Genes Devel ２：７１８−７２９）のトランス作用性ドメインに融合されたＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン（Keegan et al. (１９８６) Science ２３１：６９９−７０４）を含んで成る。融合タンパク質の発現は、当該技術分野におい既知であるか又は本書に記述されているように、植物中での発現に適した任意のプロモータによって制御され得る。この発現カセットは同様に、６×ＧＡＬ４／最小プロモータに融合された問題の配列を含むこともできる。かくして、融合タンパク質の組織又は器官特異性を達成することができ、発現カセットの誘発可能な組織又は器官特異性が導かれる。
【００９７】
ｄ．傷害誘発可能プロモータ
傷害誘導性プロモータも、遺伝子発現に適している可能性がある。かかるプロモータは数多く記述されており（例えばXu et al. Plant Molec. Biol. ２２：５７３−５８８  （１９９３）, Logemann et al. Plant Cell １：１５１−１５８（１９８９）, Rohrmeier & Lehle, Plant Molec. Biol. ２２：７８３−７９２（１９９３）, Firek et al. Plant Molec. Biol. ２２：１２９−１４２（１９９３）, Warner et al. Plant J. ３： １９１−２０１（１９９３））、全てが本発明で使用するのに適している。Logemann et al.は、双子葉植物ジャガイモｗ＜？＞遺伝子の５’上流側配列について記述している。Xu et al.は、双子葉植物ジャガイモ（ｐｉｎ２）由来の傷害誘導性プロモータが単子葉植物イネにおいて活性であることを示している。さらに、Rohrmeier & Lehleは、傷害誘発され、標準技術を用いて同族プロモータを単離するために使用可能であるトウモロコシＷｉｎＩ  ｃＤＮＡのクローニングについて記述する。類似のFirek et al.及びWarner et al.は、局所的傷害及び病原体侵入部位で発現される単子葉植物のAsparagus officinalis由来の傷害誘発された遺伝子について記述した。当該技術分野において周知のクローニング技術を用いて、これらのプロモータを適切なベクターに移入し、本発明に関連する遺伝子に対し融合させ、植物傷害部位においてこれらの遺伝子を発現させるために使用することができる。
３．   組織特異的又は組織選好型発現
ａ．根選好型発現
遺伝子発現のもう１つのパターンは、根発現である。本発明の構成体及び方法のための適切な根のプロモータが、Framond (ＦＥＢＳ２９０：１０３〜１０６（１９９１）)によって、又、本書に参考として内含された米国特許第５，４６６，７８５号（Ciba Geigyに対し‘９５年１１月１４日に発行された）の中でも記述されているトウモロコシメタロチオネイン様（ＭＴＬ）遺伝子のプロモータである。この「ＭＴＬ」プロモータは、選択された遺伝子の挿入及び問題の形質転換ベクターへのプロモータ−遺伝子−ターミネータカセット全体のその後の移入のため、ｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸといったような適切なベクターに移入される。
【００９８】
ｂ．樹心選好型発現
本書に参考として内含されている特許出願ＷＯ９３／０７２７８号（‘９３年４月１５日付公示；Ciba Geigy）は、樹心内で優先的に発現されるトウモロコシｔｒｐＡ遺伝子の単離について記述している。転写出発点から最高１７２６ｂｐまで延びる遺伝子配列及びプロモータが紹介されている。標準的な分子生物学技術を用いて、このプロモータ又はその一部分は、ｐＣＧＮ１７６１といったベクターに移入され得、ここで、３５Ｓのプロモータと置換して樹心選好的に外来性遺伝子の発現を駆動するために使用され得る。実際には、樹心選好型プロモータ又はその一部を含有するフラグメントを任意のベクターに移入して遺伝子導入植物内での有用性について修飾することができる。
【００９９】
ｃ．葉特異的発現
ホスホフェノールカルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ）をコードするトウモロコシ遺伝子が、Hudspeth & Grula (Plant Molec Biol １２：５７９−５８９（１９８９）によって記述されてきた。標準的な分子生物学的技術を用いて、この遺伝子のためのプロモータを使用して、遺伝子導入植物内で葉特異的に任意の遺伝子の発現を駆動することができる。
【０１００】
ｄ．花粉特異的発現
ＷＯ９３／０７２７８（‘９３年４月１５日付け公示；Ciba Geigy）は、花粉細胞内で発現されるトウモロコシカルシウム依存性タンパク質キナーゼ（ＣＤＰＫ）の単離について記述している。遺伝子配列及びプロモータは、転写出発点から最高１４００ｂｐまで延びている。標準的な分子生物学技術を用いて、このプロモータ又はその一部分は、ｐＣＧＮ１７６１といったベクターに移入され得、ここで、３５Ｓのプロモータと置換して花粉特異的に問題の配列の発現を駆動するために使用され得る。
【０１０１】
Ｂ．転写ターミネータ
本発明の発現カセット内で使用するためにさまざまな転写ターミネータが利用可能である。これらは、導入遺伝子を超えて転写の終結を担当し、ｍＲＮＡポリアデニル化を修正する。適切な転写ターミネータは、植物内で機能することがわかっているものであり、ＣａＭＶ３５Ｓターミネータ、ｔｍｌターミネータ、ノパリンシンターゼターミネータ及びエンドウマメｒｂｃＳＥ９ターミネータが含まれるが、これらに制限されるわけではない。これらは、単子葉植物及び双子葉植物の両方で使用可能である。さらに、遺伝子の未変性転写ターミネータを使用することができる。
【０１０２】
Ｃ．発現の増強又は調節用配列
数多くの配列が、転写単位ないからの遺伝子発現を増強させることがわかっており、これらの配列をさまざまな遺伝子と合わせて使用して遺伝子導入植物におけるその発現を増大させることができる。
【０１０３】
さまざまなイントロン配列が、特に単子葉植物細胞内での発現を増強させることが示されてきた。例えば、トウモロコシＡｄｈＩ遺伝子のイントロンは、トウモロコシ細胞内に導入された時点でその同族プロモータの下での野生型遺伝子の発現を著しく増強させることがわかっている。イントロンＩは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子との融合構成体の中で特に有効であることが発見され、その中での発現を増強した（Callis et al., Genes Develop. １：１１８３−１２００（１９８７））。同じ実験系において、トウモロコシbronzel 遺伝子からのイントロンは、発現を増強する上で類似の効果を有していた。標準的には未翻訳リーダー内部で、植物形質転換ベクター内に日常的にイントロン配列が取込まれてきた。
【０１０４】
ウイルスから誘導された数多くの未翻訳リーダー配列も同様に発現を増強することが知られており、これらは、双子葉植物細胞において特に有効である。特定的に言うと、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ、「Ｗ−配列」）、トウモロコシ退緑斑病ウイルス（ＭＣＭＶ及びアルファルファモザイクウイルス（ＡＭＶ）からのリーダー配列が発現を増強する上で有効であることが示されてきた（例えばGallie et al. Nucl. Acids Res. １５：８６９３−８７１１（１９８７）; Skuzeski et al. Plant Molec. Biol. １５：６５−７９（１９９０））。当該技術分野において既知のその他のリーダー配列としては、ピコルナウイルスリーダー、例えばＥＭＣＶリーダー（エンセファロミオカルジティス５’非コーディング領域）（Elroy-Stein, O., Fuerst, T. R., 及びMoss, B. PNAS USA ８６：６１２６−６１３０（１９８９））；ポチウイルスリーダー、例えば、ＴＥＶリーダー（タバコエイチウイルス）（Allison et al., １９８６）；ＭＤＭＶリーダー（トウモロコシ萎縮病モザイクウイルス）；Virology １５４：９−２０）；ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）リーダー、（Macejak, D. G., 及びSarnow, P., Nature ３５３：９０−９４（１９９１）；アルファルファモザイクウイルスの外被タンパク質ｍＲＮＡからの未翻訳リーダー（ＡＭＶ  ＲＮＡ４）、（Jobling, S. A., 及びGehrke, L., Nature ３２５：６２２−６２５（１９８７）；タバコモザイクウイルスリーダー（ＴＭＶ）、（Gallie, D. R. et al., ＲＮＡの分子生物学ｐ２３７−２５６（１９８９）；及びトウモロコシ退緑斑病ウイルス（ＭＣＭＶ）（Lommel, S. A. et al., Virology ８１：３８２−３８５（１９９１）があるが、これらに制限されるわけではない。同様にDella-Cioppa et al., Plant Physiology ８４：９６５−９６８（１９８７）も参照のこと。
【０１０５】
Ｄ．合成遺伝子
本発明の好ましい実施形態においては、インテグラーゼ複合体のタンパク質のコーディング配列は、特定の植物宿主内での発現のために最適化されている。当該技術分野においては、植物内のタンパク質発現の最適化が、宿主のコドン選好に対して遺伝子のコーディング領域を最適化することによって増強され得る、ということがわかっている。従って、植物内での選好コドン使用法は、或る種の微生物における選好コドン使用法とは異なっている。クローニングされた微生物ＯＲＦ内部でのコドン使用法と植物遺伝子（特に標的植物からの遺伝子）内での使用法を比較することによって、変更可能なＯＲＦ内部のコドンの同定が可能となる。標準的には、植物の進化は単子葉植物の第３の塩基位置におけるヌクレオチドＣ及びＧの強い選好性に向かう傾向があったが、一方双子葉植物は往々にしてこの位置でヌクレオチドＡ又はＴを用いている。特定の標的遺伝子導入種のための選好コドン使用法を取込むように遺伝子を修飾することによって、ＧＣ／ＡＴ含有率及び非正統的なスプライシングについての以下に記述する問題点の多くが克服されることになる。
【０１０６】
植物遺伝子は標準的に３５％を上回るＧＣ含有率を有する。Ａ及びＴヌクレオチドが豊富なＯＲＦ配列は、植物内でいくつかの問題をひき起こす可能性がある。まず第１に、ＡＴＴＴＡというモチーフは、メッセージの不安定化をひき起こすと考えられ、数多くの短命なｍＲＮＡの３’末端に発見される。第２に、メッセージ内部の不適切な位置におけるＡＡＴＡＡＡといったようなポリアデニル化シグナルの出現は、転写の早期切形をひき起こすと考えられている。さらに、単子葉植物は、イントロンとしてＡＴ富有配列を認識することができ、フランキングスプライス部位を同定することができる（以下参照）。
【０１０７】
植物は、定義されたリボソーム結合部位をそのメッセージが有していないという点で微生物と異なっている。むしろ、リボソームは、メッセージの５’末端に付着し、翻訳を開始すべき第１の利用可能なＡＴＧについて走査する。それでも、ＡＴＧに隣接する或る種のヌクレオチドについての選好性が存在し、ＡＴＧにおける真核性コンセンサス翻訳イニシエータの内含により、微生物遺伝子の発現を達成することができる、と考えられている。Clontech (本書に参考として内含されている１９９３／１９９４版カタログ、ｐ２１０)は、植物内のE. coli ｕｉｄＡ遺伝子の発現のためのコンセンサス翻訳イニシエータとして１つの配列を提案している。さらにJoshi (本書に参考として内含されたNAR １５：６６４３−６６５３（１９８７）) は、ＡＴＧに隣接する数多くのＰＬＳを比較し、もう１つのコンセンサス配列を示唆している。植物内の微生物ＯＲＦの発現に問題がある状況においては、開始ＡＴＧにおいてこれらの配列の１つを内含させることにより翻訳が改善する可能性がある。このような場合、コンセンサスの最後の３つのヌクレオチドは、それらの第２のアミノ酸残基の修飾に起因して修飾済み配列に内含するのに適していない可能性がある。開始メチオニンに隣接する好ましい配列は、異なる植物種の間で異なっている可能性がある。Gen Bankデータベース内にある１４のトウモロコシ遺伝子を調査すると、以下のような結果が得られた：
１４のトウモロコシ遺伝子内の開始ＡＴＧの前の位置
【０１０８】
【表１】
2005521400.tif 000003
【０１０９】
この分析は、ヌクレオチド配列が取込まれつつある所望の植物種及び好ましいヌクレオチドを取込むように修飾されたＡＴＧに隣接する配列について行なうことができる。
【０１１０】
非植物供給源からクローニングされ植物内での発現のために最適化されていない遺伝子は同様に、５’又は３’スプライス部位として植物内で認識され得るモチーフをも含有し、分割させられて切形又は欠失メッセージを生成する可能性がある。これらの部位を、当該技術分野において周知の技術を用いて除去することができる。
【０１１１】
コーディング配列及び隣接する配列の修飾のための技術は、当該技術分野において周知である。微生物ＯＲＦの初期発現が低く上述の通りに配列に対し改変を行なうことが適切であるとみなされている場合には、当該技術分野において周知の方法に従って、合成遺伝子の構築を達成することが可能である。例えば、これらは、公示済み特許の開示ＥＰ０３８５９６２号（Monsantoに対し９０年９月５日付けで公示）、ＥＰ０３５９４７２号（Lub-rizolに対し９５年１２月２７日付けで発行）及びＷＯ９３／０７２７８号（Ciba-Geigyに対して９３年４月１５日付けで公示）の中で記述されており、これらの開示は全て本書に参考として内含された。大部分のケースにおいて、遺伝子導入植物へのに移入に先立ち過渡的検定プロトコル（これは当該技術分野において周知である）を用いて遺伝子構築の発現を検定することが望ましい。
ＩＩ．植物形質転換ベクター及び選択マーカー
植物形質転換技術における当業者には植物形質転換のために利用可能な数多くの形質転換ベクターが知られており、本発明に関連する遺伝子を、任意のこのようなベクターと合わせて使用することが可能である。ベクターの選択は、好ましい形質転換技術及び形質転換のための標的種に左右されることになる。或る種の標的種については、異なる抗生物質又は除草剤選択マーカーが好ましいかもしれない。形質転換において日常的に用いられる選択マーカーとしては、カナマイシン及び関連する抗生物質に対する耐性を付与するｎｐｔＩＩ遺伝子（Messing & Vierra. Gene １９：２５９−２６８（１９８２）; Bevan et al., Nature ３０４：１８４−１８７（１９８３））、除草剤ホスファノトリシンに対する耐性を付与するｂａｒ遺伝子（White et al., Nucl. Acids Res 18: 1062 (1990), Spencer et al. Theor. Appl. Genet ７９：６２５−６３１（１９９０））、抗生物質ハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｐｔ遺伝子（Blochinger & Diggelmann, Mol Cell Biol ４：２９２９−２９３１）、及びメタトレキセンに対する耐性を付与するｄｈｆｒ遺伝子（Bourouis et al., EMBO J. ２（７）：１０９９−１１０４（１９８３））、グリホセートに対する耐性を付与するＥＰＳＰＳ遺伝子（共にMonsantoに対しそれぞれ９０年７月１０日及び９３年２月２３日付けで発行された米国特許第４，９４０，８３５号及び５，１８８，６４２号）及びマンノースを代謝する能力を提供する（本書ではホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子とも呼ばれている）マンノース−６−ホスフェートイソメラーゼ遺伝子（共にNorartisに対してそれぞれ９８年６月１６日及び９９年１１月３０日付で発行された米国特許第５，７６７，３７８号及び５，９９４，６２９号）。
【０１１２】
Ａ．Agrobacterium形質転換に適したベクター
Agrobacterium tumefaciensを用いた形質転換のために数多くのベクターが利用可能である。これらは、標準的に少なくとも１つのＴ−ＤＮＡボーダー配列を担持し、ｐＢＩＮ１９といったようなベクターを内含する（Bevan, Nucl. Acids Res. （１９８４））。以下では、Agrobacterium  形質転換に適した２つの標準的なベクターの構築について記述する。
【０１１３】
１．ｐＣＩＢ２００及びｐＣＩＢ２００１
バイナリベクターｐｃＩＢ２００及びｐＣＩＢ２００１は、Agrobacteriumと共に使用するための組換え体ベクターの構築のために使用され、以下の要領で構築される。ｐＴＪＳ７５ｋａｎは、テトラサイクリン耐性遺伝子の切除を可能にするｐＴＪＳ７５のＮａｒＩ消化（Schmidhauser & Helinski, J. Bacteriol. １６４：４４６−４４５（１９８５））とそれに続くＮＰＴＩＩを担持するｐＵＣ４ＫからのＡｃｃＩフラグメントの挿入（Messing & Vierra, Gene １９：２５９−２６８（１９８２）: Bevan et al., Nature ３０４：１８４−１８７（１９８３）: McBride et al., Plant Molecular Biology 14: 266-276 (1990)）により作り出される。ＸｈｏＩリンカーは、左右のＴ−ＤＮＡボーダー、植物選択可能ｎｏｓ／ｎｐｔＩＩキメラ遺伝子及びｐＵＣポリリリンカーを含有するＰＣＩＢ７のＥｃｏＲＶフラグメントに連結されており（Rothstein et al., Gene 53: 153-161 (1987)）、ＸｈｏＩ消化されたフラグメントはＳａｌＩ消化されたｐＴＪＳ７５ｋａｎ内にクローニングされてｐＣＩＢ２００を作り出す（同様にＥＰ０３３２１０４、例１９；９１年３月２０日公示；Ciba Geigy）。ｐＣＩＢ２００は、以下のユニークポリリンカー制限部位を含有する：ＥｃｏＲＩ、ＳｓｔＩ、ＫｐｎＩ、ＢｇｌＩＩ、ＸｂａＩ及びＳａｌＩ。ｐＣＩＢ２００１は、付加的な制限部位のポリリンカー内への挿入によって作り出されたｐＣＩＢ２００の誘導体である。ｐＣＩＢ２００１のポリリンカー内のユニークな制限部位は、ＥｃｏＲＩ、ＳｓｔＩ、ＫｐｎＩ、ＢｇｌＩＩ、ＸｂａＩ、ＳａｌＩ、ＭｌｕＩ、ＢｃｌＩ、ＡｖｒＩＩ、ＡｐａＩ、ＨｐａＩ、及びＳｔｕＩである。ｐＣＩＢ２００１は、これらのユニーク制限部位を含有することに加えて、Agrobacterium媒介型形質転換のための植物及び細菌カナマイシン選択左右Ｔ−ＤＮＡボーダー、E. coliとその他の宿主の間の動員のためのＲＫ２−由来のｔｒｆＡ官能基、及び同じくＲＫ２からのＯｒｉＴ及びＯｒｉＶ官能基をも有している。ｐＣＩＢ２００１ポリリンカーは、独自の調節シグナルを含有する植物発現カセットのクローニングに適している。
【０１１４】
２．ｐＣＩＢ１０及びそのハイグロマイシン選択誘導体
バイナリベクタｐＣＩＢ１０は、植物中での選択のためカナマイシン耐性をコードする遺伝子及びＴ−ＤＮＡ左右ボーダー配列を含有する。ｐＣＩＢ１０は、E. coli及びAgrobacteriumの両方で複製できるようにする野生ホストレンジプラスミドｐＲＫ２５２からの配列を取込んでいる。その構築についてはRothstein et al. (Gene ５３：１５３−１６１（１９８７）) によって記述されている。Gritz et al. (Gene ２５：１７９−１８８（１９８３）) によって記述されているハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼのための遺伝子を包含するｐＣＩＢ１０のさまざまな誘導体が構築されている。これらの誘導体は、ハイグロマイシンのみ（ｐＣＩＢ７４３）又はハイグロマイシンとカナマイシン（ｐＣＩＢ７１５、ｐＣＩＢ７１７）に基づく遺伝子導入植物細胞の選択を可能にする。
【０１１５】
Ｂ．非Agrobacterium  形質転換に適したベクター
Agrobacterium tumefaciensを使用しない形質転換は、選択された形質転換ベクター内でのＴ−ＤＮＡ配列に対する必要性をなくし、その結果、これらの配列が欠如したベクターを、Ｔ−ＤＮＡ配列を含有する上述のもののようなベクターに加えて利用することが可能である。Agrobacteriumに依存しない形質転換技術には、粒子ボンバード、プロトプラスト摂取（例えばＰＥＧ及び電気穿孔）及びマイクロインジェクションが含まれる。ベクターの選択は、形質転換対象の種についての好ましい選択により大きく左右される。以下では、非Agrobacterium形質転換に適した標準的ベクターの構築について記述する。
【０１１６】
１．ｐＣＩＢ３０６４
ｐＣＩＢ３０６４は、除草剤バスタ（又はホスフィノトリシン）による選択と組合せた直接的遺伝子移入技術に適したｐＵＣ由来のベクターである。プラスミドｐＣＩＢ２４６は、E. coli ＧＵＳ遺伝子に対する操作的融合状態にあるＣａＭＶ３５Ｓプロモータ及びＣａＭＶ３５Ｓ転写ターミネータを含んで成り、ＰＣＴ公示出願ＷＯ９３／０７２７８号（９３年４月１５日付公示；Ciba Geigy）の中で記述されている。このベクターの３５Ｓプロモータは、出発部位から５’のところに２つのＡＴＧ  配列を含有する。これらの部位は、ＡＴＧを除去し制限部位ＳｓｐＩ及びＰｖｕＩＩを生成するような形で標準的ＰＣＲ技術を用いて突然変異させられる。新しい制限部位は、ユニークＳａｌＩ部位から９６及び３７ｂｐのところそして実質の出発部位から４２ｂｐ離れたところにある。ｐＣＩＢ２４６の結果として得られた誘導体はｐＣＩＢ３０２５と呼称される。ＧＵＳ  遺伝子は次に、ＳａｌＩ及びＳａｃＩでの消化によりｒＣＩＢ３０２５から切除され、末端は平滑にされ、再度連結されてプラスミドｐＣＩＢ３０６０を生成する。プラスミドｐＪＩＴ８２は、John Innes Centre, Norwichから得ることができる。Streptomyces viridochromogenesからのｂａｒ遺伝子を含有する４００ｂｐのＳｍａＩフラグメントは切除され、ｐＣＩＢ３０６０のＨｐａＩ部位内に挿入される（Thompson et al. EMBO J ６：２５１９−２５２３（１９８７））。こうして、除草剤選択のためのＣａＭＶ３５Ｓプロモータ及びターミネータの制御下にあるｂａｒ遺伝子、（E. coli中での選択のための）アンピシリン耐性用遺伝子及びユニーク部位ＳｐｈＩ、ＰｓｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍ  ＨＩを伴うポリリンカーを含むｐＣＩＢ３６４が生成された。このベクターは、独自の調節シグナルを含有する植物発現カセットのクローニングに適している。
【０１１７】
２．ｐＳＯＧ１９及びｐＳＯＧ３５
プラスミドｐＳＯＧ３５は、メトトレキセートに対する耐性を付与する選択マーカーとしてE. coli 遺伝子ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＦＲ）を利用する形質転換ベクターである。トウモロコシＡｄｈ１遺伝子からのイントロン６（−５５０ｂｐ）、３５Ｓプロモータ（−８００ｂｐ）及びｐＳＯＧ１０からの１８ｂｐのＧＵＳ未翻訳リーダー配列を増幅するためには、ＰＣＲが用いられる。E. coliジヒドロ葉酸還元酵素ＩＩ型遺伝子をコードする２５０ｂｐのフラグメントも同様にＰＣＲによって増幅され、これら２つのＰＣＲフラグメントは、ｐＵＣ１９ベクターバックボーン及びノパリンシンターゼターミネータを含むｐＢ１２２１からのＳａｃＩ−ＰｓｔＩフラグメント（Clontech）と組立てられる。これらのフラグメントを組立てることにより、イントロン６配列と融合した３５Ｓのプロモータ、ＧＵＳリーダー、ＤＨＦＲ遺伝子及びノパリンシンターゼターミネータを含有するｐＳＯＧ１９が生成される。ｐＳＯＧ１９内のＧＵＳリーダーとトウモロコシ退緑斑病ウイルス（ＭＣＭＶ）からのリーダー配列の置換によりｐＳＯＧ３５が生成される。ｐＳＯＧ１９及びｐＳＯＧ３５は、アンピシリン耐性のためのｐＵＣ遺伝子を担持し、外来性物質のクローニングのために利用可能なＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｈＩ、ＰｓｔＩ、及びＥｃｏＲＩ部位を有する。
【０１１８】
Ｃ．葉緑体形質転換に適したベクター
植物プラスチド内での本発明のヌクレオチド配列の発現のためには、プラスチド形質転換ベクターｐＰＨ１４３（ＷＯ９７／３２０１１、例３６、９７年９月４日公示；Novartis）が使用される。ヌクレオチド配列はｐＰＨ１４３内に挿入され、かくしてＰＲＯＴＯＸコーディング配列が置換される。このベクターは次に、プラスチド形質転換及びスペクチノマイシン耐性についての形質転換体の選択のために用いられる。代替的には、ａａａＨ  遺伝子に置換するようにｐＰＨ１４３内にヌクレオチド配列が挿入される。この場合、ＰＲＯＴＯＸ阻害物質に対する耐性について、形質転換体が選択される。
ＩＩＩ．形質転換方法
本発明の標的及びドナーＤＮＡ配列カセットは、当該技術分野が認知した数多くのやり方で、ＰＬＳ内に導入できる。植物を再生するための方法は、当該技術分野において周知である。例えば、外来性ＤＮＡの送達ならびに、直接的ＤＮＡ摂取、リポゾーム、電気穿孔、マイクロインジェクション及びマイクロプロジェクタイルのためにＴｉプラスミド由来のベクターが利用されてきた。さらに、Agrobacterium属からの細菌を利用して、植物細胞を形質転換することができる。
【０１１９】
本発明に従って形質転換される植物は、単子葉植物でも双子葉植物でもよく、これには、トウモロコシ、小麦、大麦、ライ麦、サツマイモ、豆、エンドウ豆、チコリ、レタス、キャベツ、カリフラワ、ブロッコリ、カブ、大根、ホウレンソウ、アスパラガス、タマネギ、ニンニク、コショウ、セロリ、スカッシュ、カボチャ、大麻、ズッキーニ、リンゴ、ナシ、マルメロ、メロン、プラム、サクランボ、桃、ネクタリン、アンズ、イチゴ、ブドウ、ラズベリー、ブラックベリー、パイナップル、アボカド、パパイヤ、マンゴ、バナナ、大豆、トマト、サトウモロコシ、サトウキビ、テンサイ、ヒマワリ、ナタネ、クローバ、タバコ、ニンジン、綿花、アルファルファ、イネ、ジャガイモ、ナス、キュウリ、Arabidopsis thaliana、及び針葉樹及び落葉樹といったような木本植物特にトウモロコシ、小麦又はテンサイが含まれるが、これらに制限されるわけではない。
【０１２０】
所望のＤＮＡ配列がひとたび特定の植物種へと形質転換されたならば、それはその種内で繁殖されてもよいし又は、従来の品種改良技術を用いて、特に実用品種を含め、同じ種のその他の品種内へと移動させられてもよい。
【０１２１】
以下に記されているのは、双子葉植物及び単子葉植物の両方の植物を形質転換するための代表的技術ならびに代表的プラスチド形質転換技術である。
【０１２２】
Ａ．双子葉植物の形質転換
双子葉植物のための形質転換技術は、当該技術分野において周知であり、Agrobacteriumベースの技術及びAgrobacteriumを必要としない技術を内含している。非Agrobacterium技術には、プロトプラスト又は細胞による直接的な外因性遺伝子材料の摂取が関与する。これは、ＰＥＧ又は電気穿孔媒介型摂取、粒子ボンバード媒介型送達又はマイクロインジェクションによって達成可能である。これらの技術の例は、Paszkowski et al., EMBO J ３：２７１７−２７２２（１９８４), Potrykus et al., Mol. Gen. Genet. １９９：１６９−１７７（１９８５）、Reich et al., Biotechnology ４: １００１−１００４ （１９８６）、及びKlein et al., Nature ３２７：７０−７３（１９８７） によって記述されている。各ケースにおいて、形質転換された細胞は、当該技術分野におい既知の標準的技術を用いて全植物まで再生される。
【０１２３】
その高い形質転換効率及び多くの異なる種でのその広い有用性を理由として、Agrobacterium媒介型形質転換が双子葉植物の形質転換のために好まれる技術である。Agrobacterium形質転換には標準的には、同時に常駐するＴｉプラスミド上でか又は染色体により宿主Agrobacterium菌株（例えばｐＣＩＢ２００及びｐＣＩＢ２００１についてはＣＩＢ５４２菌株（Uknes et al. Plant Cell ５：１５９−１６９（１９９３））により担持されたｖｉｒ遺伝子の補体に依存するものでありうる適切なAgrobacterium菌株まで問題の外来性ＤＮＡを担持するバイナリベクター（例えばｐＣＩＢ２００又はｐＣＩＢ２００１）を移入することが関与している。Agrobacteriumへの組換え型バイナリベクターの移入は、ｐＲＫ２０１３といったようなプラスミドを担持し組換え体バイナリベクターを標的Agrobacterium菌株に可動化することのできるヘルパーE. coli菌株である組換え体バイナリベクターを担持するE. coliを用いる、三親交配手順によって達成される。代替的には、組換え体バイナリベクターは、ＤＮＡ  形質転換によりAgrobacteriumに移入され得る（Hoefgen & Willmitzer, Nucl. Acids Res. １６：９８７７（１９８８））。
【０１２４】
組換え体Agrobacteriumによる標的植物種の形質転換には、通常植物からの外植体とAgrobacteriumの同時育成が関与し、これは当該技術分野において周知のプロトコルに従っている。形質転換された組織は、バイナリプラスミドＴ−ＤＮＡボーダー間に存在する抗生物質又は除草剤耐性マーカーを担持する選択可能培地上で再生される。
【０１２５】
遺伝子で植物細胞を形質転換するためのもう１つのアプローチには、植物組織及び細胞において不活性又は生物活性をもつ粒子を推進することが関与している。この技術は、全てSanford et al.に対するものである（それぞれ９０年７月３１日、９１年７月３０日、９２年３月３１日付で発行された）米国特許第４，９４５，０５０号、５，０３６，００６号及び５，１００，７９２号の中で開示されている。一般に、この手順には、細胞の外部表面に進入しその内部への取込みを提供するのに有効な条件の下で細胞において不活性の又は生物活性をもつ粒子を推進することが関与している。不活性粒子が利用される場合、ベクターは、所望の遺伝子を含有するベクターで粒子をコーディングすることにより、細胞内に導入され得る。代替的には、粒子の覚醒により細胞内にベクターが運び入れられるようにベクターにより標的細胞をとり囲むこともできる。生物活性をもつ粒子（例えば、導入されることが求められているＤＮＡを各々含有する乾燥酵母細胞、乾燥細菌又はバクテリオファージ）も同様に、植物細胞組織内に推進され得る。
【０１２６】
Ｂ．単子葉植物の形質転換
大部分の単子葉植物種の形質転換は今や日常的なこととなってきた。好ましい技術としては、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）又は電気穿孔技術を用いたプロトプラスト内への直接的遺伝子移入、及びカルス組織内への粒子ボンバード及びAgrobacteriumにより媒介された形質転換が含まれる。形質転換は、単一のＤＮＡ種又は多数のＤＮＡ種（すなわち同時形質転換）で実施でき、これらの技術は共に本発明で使用するのに適している。同時形質転換は、完全なベクター構築を回避し問題の遺伝子のためのリンクされていない遺伝子座及び選択マーカーを伴う遺伝子導入植物を生成し、望ましいと考えられた場合にその後の世代における選択マーカーの除去を可能にするという利点を有するかもしれない。しかしながら、同時形質転換の使用がもつ欠点は、別々のＤＮＡ種がゲノム内に組込まれる頻度が１００％未満であるという点にある（Schocher et al. Biotechnology ４：１０９３−１０９６（１９８６））。
【０１２７】
特許出願ＥＰ０２９２４３５（Ciba Geigyに対し９５年７月２６日付けで発行）、ＥＰ０３９２２２５号（Ciba Geigyに対して９１年９月２５日付けで公示）及びＷＯ９３／０７２７８（９３年４月１５日公示；Ciba Geigy）は、トウモロコシの優良近交系からのカルス及びプロトプラストの調製、ＰＥＧ又は電気穿孔を用いたプロトプラストの形質転換、及び形質転換されたプロトプラストからのトウモロコシ植物の再生のための技術について記述している。Gordon-Kamm et al. (Plant Cell ２：６０３−６１８（１９９０）)及びFromm et al. (Biotechnology ８：８３３−８３９（１９９０）)は、粒子ボンバードを用いたＡ１８８由来のトウモロコシ系列の形質転換のための技術を公表した。さらにＷＯ９３／０７２７８（９３年４月１５日公示；Ciba Geigy）及びKoziel et al (Biotechnology １１：１９４−２００（１９９３）)は、粒子ボンバードによるトウモロコシの優良近交系の形質転換のための技術について記述している。この技術は、受粉から１４〜１５日目にトウモロコシの穂から切除された長さ１．５〜２．５ｍｍの未成熟トウモロコシ胚芽、及びボンバード用のＰＤＳ−１０００Ｈｅバイオリスティックス装置を利用している。
【０１２８】
イネの形質転換は、同様に、プロトプラストを用いた直接的遺伝子移入技術又は粒子ボンバードによっても実施できる。プロトプラスト媒介型形質転換は、Japonica型及びIndica型について記述されてきた（Zhang et al. Plant Cell Rep ７：３７９−３８４（１９８８）; Shimamoto et al. Nature ３３８：２７４−２７７（１９８９）; Datta et al. Biotechnology ８：７３６−７４０（１９９０））。両方の型共、粒子ボンバードを用いて同様に日常的に形質転換可能である（Christou et al. Biotechnology ９：９５７−９６２（１９９１））。さらに、ＷＯ９３／２１３３号（９３年１１月２８日公示；Plant Genetic Systems）は、電気穿孔を介したイネの形質転換のための技術について記述している。特許出願ＥＰ０３３２５８１号（Ciba Geigyに対し９６年１２月１１日付けで発行）は、Pooideaeプロトプラストの生成、形質転換及び再生のための技術を記述している。これらの技術は、Dactylis及び小麦の形質転換を可能にする。
【０１２９】
さらに、小麦の形質転換は、Ｃ型長期再生可能カルスの細胞内への粒子ボンバードを用いてVasil et al. (Biotechnology １０：６６７−６７４（１９９２）) によっても、又未成熟胚芽及び未成熟胚芽由来のカルスの粒子ボンバードを用いてVasil et al. (Biotechnology １１：１５５３−１５５８（１９９３）)及びWeeks et al. (Plant Physiol. １０２：１０７７−１０８４（１９９３）)によっても記述されてきた。
【０１３０】
しかしながら、小麦の形質転換のための好ましい技術には、未成熟胚芽の粒子ボンバードによる小麦の形質転換が関与し、遺伝子送達に先立つ高スクロース又は高マルトース段階が含まれる。ボンバードに先立って、暗所にて進めることのできる不定胚の誘発のための３％のスクロース（Murashiga & Skoog, Physiologia Plantarum １５：４７３−４９７（１９６２））及び３ｍｇ／ｌの２．４−Ｄを伴うＭＳ培地上に、任意の適切な数の胚芽（長さ０．７５〜１ｍｍ）が平板培養される。選択されたボンバード日に、胚芽は誘発培地から除去され、osmoticum（すなわち、標準的には１５％といった所望の濃度でスクロース又はマルトースが添加された誘発培地）上に平板培養される。胚芽は２〜３時間原形質分離され、その後ボンバードを受ける。標的平板１枚につき２０の胚芽が標準的であるが、これは重要なことではない。標準的な手順を用いて、マイクロメートルサイズの全粒子上に適切な遺伝子担持プラスミド（例えばｐＣＩＢ３０６４又はｐＳＧ３５）が沈殿させられる。標準的な８０メッシュのスクリーンを用いて最高１０００ｐｓｉの破壊圧力でDuPont Biolistics（登録商標）ヘリウム装置で、各々の胚芽平板にショットする。ボンバードの後、胚芽は、約２４時間（なおもosmoticum上で）回復のため暗所に戻される。２４時間後、胚芽をosmoticumから取出し、誘発培地上に戻し、そこに、再生に先立ち約１ヵ月間とどまらせる。およそ１ヵ月後に、発達中の胚形成カルスをもつ胚芽外植体を、さらに適切な選択作用物質（ｐＣＩＢ３０６４の場合は１０ｍｇ／ｌのバスタそしてｐＳＯＧ３５の場合には２ｍｇ／ｌのメトトレキセート）を含有する再生培地（ＭＳ＋１ｍｇ／リットルのＮＡＡ、５ｍｇ／リットルのＧＡ）へと移す。およそ１ヵ月後に、発達した菌条を、半強度ＭＳ、２％のスクロース及び同じ濃度の選択作用物質を含有する「ＧＡ７」として知られるさらに大きい無菌コンテナに移す。
【０１３１】
Agrobacteriumを用いた単子葉植物の形質転換も記述されてきた。例えば、共に本書に参考として内含されたＷＯ９４／００９７７（９４年１月２０日付け公示；Japan Tabacco）及び米国特許第５，５９１，６１６号（Japan Tobaccoに対し９７年１月７日付けで発行）。
【０１３２】
Ｃ．プラスチドの形質転換
Ｔ寒天培地上で１インチの円形アレイの形で平板１枚あたり７個の割合で、Nicotiana tabacum c.v.「Xanthi nc」の種子を発芽させ、播種から１２〜１４日後に、基本的に記述された通りに（Svab, Z.及びMaliga, P. (993) PNAS90, 913-917）、プラスミドｐＰＨ１４３からのＤＮＡでコーティングされた１μｍのタングステン粒子（M10, Biorad, Hercules, CA）でボンバードする。２日間Ｔ培地上でボンバードを受けた苗をインキュベートし、その後葉を切除し、５００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンジヒドロクロリド（Sigma, St. Louis, MO）を含有するＰＭＯＰ培地の平板（Svab, Z., Hajdukiewicz, P.及びMaliga, P. （１９９０） PNAS87, ８５２６−８５３０）上で、明光（３５０〜５５０μｍｏｌの光子／ｍ2／秒）の中で、背軸面を上にして置く。ボンバードから３〜８週間後に白くなった葉の下に現われる耐性苗条を同じ選択培地上にサブクローニングさせ、カルスを形成させ、二次苗条を単離させサブクローニングさせる。標準的なサザンブロット技術（Sambrook et al. (１９８９)、分子クローニング：実験室マニュアルCold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor）により、独立したサブクローン内の形質転換されたプラスチドゲノムコピーの完全な分離（同種原形質性）を評価する。ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで消化された全細胞ＤＮＡ（Mettler, I. J. (1987) Plant Mol Biol Reporter ５、３４６−３４９）を１％のトリス−ホウ酸塩（ＴＢＥ）アガロースゲル上で分離させ、ナイロン膜（Amersham）に移し、ｒｐｓ７／１２プラスチド標的配列の一部分を含有するｐＣ８からの０．７ｋｂのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ  ＤＮＡフラグメントに対応する32Ｐで標識づけされたランダムプライミングされたＤＮＡ配列でプローグ探査する。スペクチノマイシン含有ＭＳ／ＩＢＡ培地上で無菌で同種原形質性苗条を根付かせ、（McBride, K. E. et al. (1994) PNAS ９１，７３０１−７３０５）、温室に移す。
【０１３３】
以上では本発明のさまざまな実施形態を記述しているが、これは、添付のクレーム内で定義されているような本発明の範囲を制限することを意図したものではない。以上の例は、単に選択された実施形態の実践を実証するためだけに内含されており、制限としてではなく例示としてみなされるべきものである。
【０１３４】
実施例
１．トウモロコシ細胞内でのラムダＩｎｔ活性の実証
Ａ．トウモロコシ細胞内での組換え検定用の一般的方法
Ｉ．分子間及び分子内組換え試験基板
本書で記述されているプラスミドは、Ｉｎｔの機能的発現を実証するように設計されている。分子間試験基板を、ルシフェラーゼ発現カセットの一部分が基板の１つの上にあり、カセットの残りの部分がもう一方の基板上にあるように構築する。プラスミド間の単一の部位組換え事象が、完全な機能的ルシフェラーゼ発現カセットを再構築する。ルシフェラーゼ発現カセットの両方の部分が単一プラスミド上にあるもののこのカセットの３’部分はカセットの５’部分との関係において反転配位にあるような形で、分子内試験基板が構築される。反転した３’部分は、同じく反転配位にある相容性あるａｔｔ部位によってフランキングされる。ａｔｔ部位間の分子内組換え事象は、機能的ルシフェラーゼ発現カセットを産生する３’部分の反転を導く。Ｉｎｔの分子間及び分子内組換え活性を実証するためにルシフェラーゼ検定が実施される。
【０１３５】
２．細胞培養
ｐＨ５．８で４．３ｇ／ｌのＭＳ塩（Murashige及びSkoog, Plant Physiol. １５：４７３−４３９，（１９６２））、１０ｍｇ／ｌのチアミン−ＨＣｌ、１００ｍｇ／ｌのミオ−イノシトール、３ｍｇ／ｌの２．４−ジクロロフェノキシ酢酸（２．４−Ｄ）を内含する液体懸濁培地の中で、ＢＭＳ（トウモロコシ遺伝子型Black Mexican Sweet）細胞を成長させる。培地をｐＨ５．８にした後、オートクレーブ処理の前に１ｇ／ｌの割合でカゼイン加水分解産物を添加する。暗所にておよそ１００ｒｐｍで回転プラットフォーム振盪機上でＢＭＳ液体培地内で細胞を２８℃でインキュベートする。１０ｍｌの懸濁細胞を４０ｍｌの新鮮なＢＭＳ培地内に移すことにより、維持のため７日毎に細胞を継代培養する。
【０１３６】
３．ＤＮＡ粒子ボンバード
ボンバードの２日前に新鮮なＢＭＳ培地内に細胞を再懸濁させ、上述のとおりにインキュベートする。ボンバードの日に、滅菌した磁気フィルタ−漏斗器具（VWR cat # 28143-550）のプラットホーム上で膜フィルタ（Millipore cat.# GVWP０４７００）上に、２ｍｌの細胞をピペットで取り、液体培地を真空を用いて細胞から穏やかにひき離す。細胞を伴う膜をosmoticumつまり１２％のスクロースと０．８％のフィタガーを伴うＢＭＳ半固体培地上に置く。細胞を３〜５時間、暗所で２８℃でインキュベートし、次にボンバードの標的としてこれを使用する。
【０１３７】
粒子ボンバードのためには、標準ＣａＣｌ2−スペリミジン化学（Klein et al. Nature 327: 70-73 (1987)）を用いて、１μｍ未満の全粒子上にプラスミドＤＮＡを沈殿させる（Crescent Chem. Co., Inc., NY）。DuPontヘリウムガン及び１１００ｐｓｉ破壊板（Biorad）を用いて、各標的を一度ボンバードする。
４．   ルシフェラーゼ検定
ボンバードの後、全ての平板を２〜５日間２８℃の暗所でインキュベートし、次に粗製抽出物を調製し、ルシフェラーゼ活性について検定する。細胞を収獲し、機械式分断によって分解する。細胞の破片を、１０分間４℃で最高２０，０００ｇの遠心分離により除去する。Promegaルシフェラーゼキット（Promega カタログ番号Ｅ１５００）を用いTurner Designs ＴＤMonolight ２０１０照度計を用いて、ルシフェラーゼ発現レベルについて、細胞リゼイトを検定する。ルシフェラーゼ発現は、Ｉｎｔ媒介型組換え活性の尺度である。
Ｂ．  トウモロコシにおける組換え検定のための構成体：
例1：  トウモロコシ選好コドンを用いた合成ラムダインテグラーゼ遺伝子（ＳｙｎIｎｔ)の構築
バクテリオファージラムダインテグラーゼタンパク質アミノ酸配列：（Hoess et al、(１９８０年)PNAS USA７７（５）、２４８２−２４８６）は、トウモロコシ選好コドン（米国特許第６，１２１，０１４号）を用いてＳｙｎＩｎｔのためのヌクレオチド配列へと逆翻訳される。該遺伝子を形成させるため、共に連結された２５０−３００ｂｐの４つのセグメントでのその構築を可能にするユニークな制限エンドヌクレアーゼ切断部位、すなわち２４０のＡｖａＩＩ、５６０のＢｇｌＩＩ、及び８７０のＢｓｓＨＩＩは、このＤＮＡ配列の中で同定される。４つのサブフラグメントの各々は、二重らせんの交番するストランドを表し、かつ後続及び／又は先行するオリゴヌクレオチドと２０ｂｐだけオーバーラップする６５〜８３塩基の範囲のオリゴヌクレオチドから構築される。ＳｙｎＩｎｔのセグメント１は、最高ＡｖａＩＩ部位まで最初の２４０ｂｐから成り、オリゴヌクレオチド１Ａ（ＢａｍＨＩ部位＋Ｋｏｚａｋ配列＋上部ストランド塩基１−７３）（配列番号：１）；１Ｂ（下部ストランド塩基５３−１２８）（配列番号：２）；１Ｃ（上部ストランド塩基１０８−１８３）（配列番号：３）；及び１Ｄ（下部ストランド塩基１６３−２４４＋５’ＧＧ）（配列番号：４）から構築される。
【０１３８】
セグメント１は、二量体を形成させるためのクレノウ充填反応とそれに続く四量体を形成させるための二量体のＰＣＲ接合の２段階で構築される。
【０１３９】
１×ＤＮＡポリメラーゼ塩及び、１Ａ及び１Ｂ又は１Ｃ及び１Ｄの２０μＭ溶液各１μｌずつを含む５０μＬの２つの溶液を５分間、６７℃で加熱し、その後２２℃までゆっくり冷却させる。各反応に対して、１μｌの４つのデオキシヌクレオチド三リン酸塩（各１０ｍＭ）の混合物に、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメント（New England Biolabs）２μｌ（１０単位）のを加えたものを添加する。反応を１５分間２２℃でインキュベートし、Ｓｙｎｉｎｔセグメント１のＡＢ及びＣＤ前駆物質を生成する。
【０１４０】
セグメントＡＢを５〜２０サイクルのＰＣＲにより、オーバーラップしたＣＤに接合させる。１３μｌの水、各々５μｌのＡＢ及びＣＤクレノウ反応及びプライマ―としてのオリゴ１Ａ及び１Ｄの２０μＭ溶液各１μｌずつを含むＰＣＲ混合物を、Ready-to-Go ＰＣＲビーズ（Amersham Pharmacia Biotech Inc.）に添加する。ＰＣＲ反応は：５分間９５℃；（１分間９５℃、３０秒間５６°Ｃ、１分間７２°Ｃ）５〜２０サイクル；１０分間７２°Ｃである。四量体サイズのＰＣＲ産物を、アガロースミニゲル(２%のSeaplaqueアガロース)から切除し、ＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット(QIAgen)により精製する。ＴＯＰＯ−ＴＡクローニングキット(InVitrogen)を用いてＤＮＡフラグメントをクローニングし、増幅の忠実度を確保するために配列決定し、さらなる組立てのためにＨＩＮＤＩＩＩとＡｖａＩＩを用いてＴＯＰＯベクターから切除すす。
【０１４１】
セグメント２を、二量体ＥＦ、ＧＨ及びＩＪを形成させるためのクレノウ充填反応；四量体ＥＦＧＨを形成させるための二量体ＥＦ及びＧＨのＰＣＲ接合；そして、六量体ＥＦＧＨＩＪを形成させるためのＩＪ及びＥＦＧＨの第２のＰＣＲ接合、の３段階で構築する。セグメント２の二量体、四量体、及び六量体は、セグメント１について上述したステップに従って、オリゴヌクレオチド２Ｅ（配列番号５）、２Ｆ（配列番号６）、２Ｇ（配列番号７）、２Ｈ（配列番号８）、２１（配列番号９）及び２Ｊ（配列番号１０）で構築される。
【０１４２】
ＤＮＡフラグメントＥＦＧＨＩＪを、ＴＯＰＯ−ＴＡクローニングキット(InVitrogen)を用いてクローニングし、増幅の忠実性を確保するために配列決定し、さらなる組立てのためにＡｖａＩＩとＢｇＩＩＩを用いてＴＯＰＯベクターから切除する。
【０１４３】
セグメント３及び４は、それぞれ、３Ｋ（配列番号１１）、３Ｌ（配列番号１２）、３Ｍ（配列番号１３）、３Ｎ（配列番号１４）、３Ｏ（配列番号１５）、３Ｐ（配列番号１６）、４Ｑ（配列番号１７）、４Ｒ（配列番号１８）、４Ｓ（配列番号１９）及び４Ｔ（配列番号２０）のオリゴヌクレオチドを用いて、六量体ＫＬＭＮＯＰ及び四量体ＱＲＳＴから類似の要領で構築される。
【０１４４】
ＫＬＭＮＯＰ及びＱＲＳＴを、それぞれＳｐｅＩ／ＢｓｓＨＩＩとＢｓｓＨＩＩ／ＡｐａＩフラグメントとしてそれらのＴＯＰＯベクターから切除し、ＳｐｅＩ／ＡｐａＩとの共にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋（Stratagene）カットへの３方連結によって結合させてｐＢＳ−ＫＬＭＮＯＰＱＲＳＴを形成させる。第２の３方連結によって、フラグメントＨｉｎｄＩＩＩ−ＡＢＣＤ−ＡｖａＩＩ及びＡｖａＩＩ−ＥＦＧＨＩＪ−ＢｇｌＩＩは、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｇｌＩＩ消化されたｐＢＳ−ＫＬＭＮＯＰＱＲＳＴと接合されて、全ＳｙｎＩｎｔ遺伝子を形成させる。ＳｙｎＩｎｔのための完全なトウモロコシ最適化されたＤＮＡ配列は配列番号２１に記されている。対応するアミノ酸配列は配列番号２２に記されている。
例２：ＳｙｎＩｎｔコーディング領域を伴う単子葉植物発現カセットの構築
トウモロコシユビキチンプロモータ（Christensen et al. (1992年) Mol.Biol 18 : 675-689）及びノパリンシンターゼターミネーター（Bevan et. al (1982) J.Mol. Applied Genetics 1:561-573)を含む発現ベクター、ｐＢＨ１６を、プロモータとターミネーターの間のポリリンカー部位でＢａｍＨＩ／ＳａｃＩで消化させる。例1で記述されるとおりに構築されたＳｙｎＩｎｔ遺伝子を、ＢａｍＨＩ／ＳａｃＩフラグメントとしてｐＢＳＳｙｎＩｎｔから切除し、ＭＵＳｙｎＩｎｔを形成させるために発現ベクター内でこれらの部位内に連結させる。
例３：トウモロコシ優先コドンを用いた合成Ｅ．ｃｏｌｉ組込み宿主因子、アルファサブユニット(ＳｙｎＨＦα)遺伝子の構築
Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＩＨＦのアミノ酸配列、アルファサブユニット（Blattner et al(１９９７) Science２７７（５３３１）：１４５３−１４７４； GenBank 受入番号ＡＥ０００２６６）を、ＳｙｎＨＦαのためにトウモロコシ優先コドンを使用してヌクレオチド配列中に逆翻訳する。ＳｙｎＨＦαを構築するために使用されるオリゴヌクレオチドは、例1でＳｙｎＩｎｔについて記述したとおり設計し、Ａ’（配列番号２３）、Ｂ’（配列番号２４）、Ｃ’（配列番号２５）、Ｄ’（配列番号２６）、Ｅ’（配列番号２７）及びＦ’（配列番号２８）を含む。
【０１４５】
コーディング領域は、５’末端上で２つのＧ残基（クローニングを容易にするため)及び１つのＢａｍＨＩ部位により、そして３’末端上でＢＧＬＩＩ部位及び２つのＧ残基によりフランキングされている。
【０１４６】
六量体Ａ’Ｂ’Ｃ’Ｄ’Ｅ’Ｆ’ の構築は、ＳｙｎＩｎｔの六量体ＥＦＧＨＵについて例1で記述した通りに進行する。ＳｙｎＨＦαのための完全なトウモロコシ最適化ＤＮＡ配列は配列番号２９に記されている。対応するアミノ酸配列は、配列番号３０に記されている。
例４：ＳｙｎＨＦαコーディング領域を用いた単子葉植物発現カセットの構築
ＳｙｎＨＦα遺伝子配列（例３）を、ＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩフラグメントとしてそのＴＯＰＯベクターから切除し、例２に記述されているトウモロコシユビキチンプロモータ及びノパリンシンターゼターミネーターを含む発現ベクターｐＢＨ１６の部位であるＢａｍＨＩ中に挿入し、、プラスミドＭＵＳｙｎＨＦαを形成させる。
例５：トウモロコシ優先コドンを用いた合成Ｅ．ｃｏｌｉ組込み宿主因子、ベータサブユニット(ＳｙｎＨＦβ)遺伝子の構築
Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＩＨＦのアミノ酸配列、ベータサブユニット（Blattner et al(１９９７) Science２７７（５３３１）：１４５３−１４７４; GenBank 受入番号＃ＡＥ０００１９３）を、ＳｙｎＨＦβのためにトウモロコシ優先コドンを使用してヌクレオチド配列中に逆翻訳する。ＳｙｎＨＦβを構築するために使用されるオリゴヌクレオチドは、ＳｙｎＩｎｔについて例1で記述した通りに設計され、α（配列番号３１）、β（配列番号３２）、γ（配列番号３３）、δ（配列番号３４）、ε（配列番号３５）及びζ（配列番号３６）を含む。
【０１４７】
コーディング領域は、５’末端上で２つのＧ残基（クローニングを容易にするため)、及び１つのＢａｍＨＩ部位により、そして3’末端上で１つのＢｇｌＩＩ部位及び２つのＧ残基によりフランキングされている。
【０１４８】
六量体αβγδεζの構築は、ＳｙｎＩｎｔの六量体ＥＦＧＨＵ用について例1に記述した通り進行する。ＳｙｎＨＦβのための完全なトウモロコシ最適化ＤＮＡ配列は配列番号３７に記されている。対応するアミノ酸配列は、配列番号３８に記されている。
例６：ＳｙｎＨＦβコーディング領域を用いた単子葉植物発現カセットの構築
ＳｙｎＨＦβ遺伝子配列（例５から）を、ＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩフラグメントとしてそのＴＯＰＯベクターから切除し、例２に記述されているトウモロコシユビキチンプロモータ及びノパリンシンターゼターミネーターを含む発現ベクターｐＢＨ１６の部位であるＢａｍＨＩ中に挿入し、プラスミドＭＵＳｙｎＨＦβを形成させる。
例７：トウモロコシ選好コドンを用いた合成ラムダエキシジオナーゼ遺伝子（ＳｙｎＸｉｓ)の構築
バクテリオファージラムダエキシジオナーゼタンパク質のアミノ酸配列：（Hoess et al、PNAS USA７７（５）、２４８２−２４８６（１９８０））は、トウモロコシ選好コドンを用いてＳｙｎＸｉｓのためのヌクレオチド配列へと逆翻訳される。ＳｙｎＸｉｓの構築に使用される、ＳｙｎＩｎｔ用として例1に記述したとおりに設計され、Ｉ（配列番号３９）、ＩＩ（配列番号４０）、ＩＩＩ（配列番号４１）及びＩＶ（配列番号４２）を含む。
【０１４９】
コーディング領域は、クローニングを容易にするために、５’末端上で、ＢａｍＨＩ部位及びＫｏｚａｋ配列により、そして３’末端上で１つのＳａｃＩ部位及び付加的なＣ残基によりフランキングされる。
【０１５０】
四量体Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶの構築は、ＳｙｎＩｎｔの四量体ＡＢＣＤのために例1で上述した通りに進められる。ＳｙｎＸｉｓのための完全なトウモロコシ優先DNA配列は配列番号４３に記されている。対応するアミノ酸配列は、配列番号４４に記されている。
例８：ＳｙｎＸｉｓコーディング領域を用いた単子葉植物発現カセットの構築
ＳｙｎＸｉｓ遺伝子配列（例７から）を、ＢａｍＨＩ／ＳａｃＩフラグメントとしてそのＴＯＰＯベクターから切除し、発現ベクターＣＭＳｙｎＨＦβのＢａｍＨＩ／ＳａｃＩ内に挿入し、は２９９４ＳｙｎＸｉｓを形成させる。ＣＭＰＳプロモータを含むＣＭＳｙｎＨＦβの４０４ｂｐフラグメントを、２９９４ＳｙｎＸｉｓのＢａｍＨＩ部位に挿入し、ｐＡｄＦ６１を形成させる。ｐＡｄＦ６１の９４５ｂｐのＥｃｏＲＩフラグメントを、ＥｃｏＲＩで消化されたＶＳＩｎｔ−ｈ／２１８の５７６３ｂｐのバイナリベクター部分に連結し、ｐＡｄＦ６２を形成させる。この非指向クローニングの中でこの構成体の両方の配位が得られた。ｐＡｄＦ６２Ａにおいて、ＣＭＰＳ−SｙｎＸｉｓ遺伝子の５’末端は、バイナリベクターの右ボーダーの次に位置設定され、ｐＡｄＦ６２Ｂにおいて、それはバイナリベクターの左ボーダーの次に位置設定される。
例９：合成ラムダインテグラーゼ遺伝子突然変異体(ＳｙｎＩｎｔ−ｈ)を用いた（単子葉植物発現カセットの構築
単一塩基対突然変異（Lange-Gustafson et al, J.Biol.Chem.２５９（２０）：１２７２４−１２７３２（１９８４））を、ｐＢＳＳｙｎＩｎｔのＳｙｎＩｎｔ遺伝子コーディング領域に導入し、「Ｇ」から「Ａ」の塩基対５２０を突然変異させる。この突然変異は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅの部位特異的突然変異誘発キット（Stratagene）と以下のオリゴヌクレオチドを用いて導入される：５’−ＣＣＣ  ＧＣＧ  ＣＣＧ  ＣＣＡ  ＡＧＡ  ＧＣＡ  ＡＧＧ  ＴＧＣ  ＧＣＣ  ＧＣＡ  ＧＣＣ  ＧＣ−３’（配列番号４５）、及び５’−ＧＣＧ  ＧＣＴ  ＧＣＧ  ＧＣＧ  ＣＡＣ  ＣＴＴ  ＧＣＴ  ＣＴＴ  ＧＧＣ  ＧＧＣ  ＧＣＧ  ＧＧ−３’（配列番号４６）。「Ａ」から「Ｇ」の突然変異は、ｐＢＳＳｙｎＩｎｔのアミノ酸１７４を、ＧｌｕからＬｙｓに変更し、ｐＢＳＳｙｎＩｎｔＥ１７４Ｋを形成させる。
【０１５１】
Ｅ１７４Ｋの突然変異体インテグラーゼ遺伝子を発現カセット中にクローニングするために、ＭＵＳｙｎＩｎｔのＢａｍＨＩ部位を、最初に、部位変更オリゴヌクレオチド５’−ＧＡＴ  ＣＡＣ  ＴＡＧ  Ｔ−３’（配列番号４７）を用いてＳｐｅＩ部位に変換する。次に、Ｅ１７４Ｋ突然変異を含むｐＢＳＳｙｎＩｎｔＥ１７４ＫのＳｐｅＩ／ＢｇｌＩＩフラグメントを、ＭＵＳｙｎＩｎｔベクターのＳｐｅＩ／ＳａｃＩ部位中へＭＵＳｙｎＩｎｔのＢｇｌＩＩ／ＳａｃＩフラグメントとの３方連結の一部としてクローニングし、ＭＵＳｙｎＩｎｔ−ｈを形成させる。
例１０：合成ラムダインテグラーゼ遺伝子二重突然変異体(ＳｙｎＩｎｔ−ｈ／２１８)用いた単子葉植物発現カセットの構築
二重塩基対突然変異（Ｃｈｒｉｓｔ，  Ｎ．及びＤｒｏｇｅ，Ｐ．Ｊ．Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２８８：８２５−８３６  （１９９８））を、ｐＢＳＳｙｎＩｎｔのＳｙｎｌｎｔ遺伝子コーディング領域に導入して、塩基対５２０を「Ｇ」から「Ａ」へ、及び塩基対６５２を「Ｇ」から「Ａ」へ突然変異させる。塩基対突然変異５２０は上述されている。塩基対突然変異６５２は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）及び以下のオリゴヌクレオチドを用いて導入される：５’−ＧＣＧ  ＴＧＧ  ＧＣＧ  ＡＣＣ  ＴＧＴ  ＧＣＡ  ＴＧＡ  ＡＧＴ  ＧＧＡ  ＧＣＧ  ＡＣ−３’（配列番号４８）及び５’−ＧＴＣ  ＧＣＴ  ＣＣＡ  ＣＴＴ  ＣＡＴ  ＣＴＴ  ＧＣＡ  ＣＡＧ  ＧＴＣ  ＧＣＣ  ＣＡＣ  ＧＣ−３’（配列番号４９）。「Ｇ」から「Ａ」の突然変異は、ｐＢＳＳｙｎＩｎｔのアミノ酸２１８をＧｌｕからＬｙｓに変更し、ｐＢＳＳｙｎＩｎｔＥ２１８Ｋを形成させる。
【０１５２】
Ｅ１７４Ｋ突然変異とＥ２１８Ｋ突然変異を発現カセット中にクローニングするために、最初に、ＭＵＳｙｎＩｎｔのＢａｍＨＩ部位を、部位変更オリゴヌクレオチド５’−ＧＡＴＣＡＣＴＡＧＴ−３’（配列番号４７）を用いてＳｐｅＩ部位に変換する。次に、Ｅ１７４Ｋ突然変異を含むｐＢＳＳｙｎＩｎｔＥ１７４ＫのＳｐｅＩ／ＢｇｌＩＩフラグメントを、Ｅ２１８Ｋ突然変異を含むｐＢＳＳｙｎＩｎｔＥ２１８ＫのＢｇｌＩＩ／ＳａｃＩフラグメントとの３方連結の一部としてＭＵＳｙｎＩｎｔベクターのＳｐｅＩ／ＳａｃＩ部位へとクローニングし、ベクターＭＵＳｙｎＩｎｔ−ｈ２１８中の二重突然変異体遺伝子を形成させる。
例１１：単子葉植物分子間組換え基質対、ｐＡｔｔＢとｐＡｔｔＰの構築
プラスミド間の単一部位分子間組換え事象が、発現カセットの２つの不完全な部分から完全なルシフェラーゼ発現カセットを再構築するような形で、２つのプラスミドが構築される。分子間のａｔｔＢテスト基質は、ルシフェラーゼ発現カセットの５’部分（５’Ｌｕｃ−５’イントロン−ａｔｔＢ）を含み、ａｔｔＰテスト基質は、カセットの３’部分（ａｔｔＰ−３’イントロン−３’Ｌｕｃ）を含んでいる。Ｉｎｔ複合体によって媒介されるように、ａｔｔＢとａｔｔＰ部位の間の分子間組換えは、、ルシフェラーゼ酵素活性の産生する能力をもつ無傷のルシフェラーゼ発現カセットの再構築という結果をもたらす。組換え産物はＭｚＵｂｉ−５‘Ｌｕｃ５’イントロン−ａｔｔＬ−３’イントロン３’Ｌｕｃ−Ｎｏｓを含有する。
例１１A；ａｔｔＢ部位、ｐＡｔｔＢを含むルシフェラーゼ発現カセットの５’部分
ＳｐｈＩからＸｂａＩ部位までのルシフェラーゼ３’末端を、イントロン挿入のためにそのＨｉｎｃＩＩ部位か単離するために、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）からｐＵＣ１８へとサブクローニングする。オリゴヌクレオチドプライマ対５’−ＧＧＧ  ＴＡＣ  ＧＴＡ  ＡＧＴ  ＴＴＣ  ＴＧＣ  ＴＴＣ  ＴＡＣ  ＣＴＴ  ＴＧ−３’（配列番号５０）及び５’−ＣＣＣ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＣＡＣ  ＡＴＣ  ＡＡＣ  ＡＡＡ  ＴＴＴ  ＴＧＧ  ＴＣ３’（配列番号５１）を用いて、ｐＢＩＳＮ１（Navasimhulu, S.B.et al Plant Cell ８：８７３−８８６（１９９６））からイントロンをＰＣＲ増幅し、いずれかの末端にＳｎａＢ１及びＰｖｕＩＩ部位を形成させる。ＰＣＲ産物を、ＴＯＰＯ−ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてクローニングし、配列決定を通して完全なコピーを同定する。イントロンを、ＳｎａＢＩ／ＰｖｕＩＩフラグメントとして切除し、３’Ｌｕｃクローン中のＨｉｎｃＩＩ部位内に連結し、３’Ｌｕｃ−イントロンを形成させる。非対称のＡｐｏＩ部位をマッピングによってイントロンの正しいオリエンテーションを決定し、配列決定によってこれを確認する。イントロンの中心近くのユニークＭｕｎＩ部位を分割し、ＭｕｎＩをＸｈｏＩ部位で置換させたオリゴヌクレオチドを挿入して、３’Ｌｕｃ−Ｉｎｔ−Ｘを形成させる。
【０１５３】
Ｐ−Ｕ５’  ＬｕｃイントロンＡｔｔＢ（ｐＡｔｔＢ）を、ｎｏｓターミネーターを除去するためにＳａｃＩとＡＳＰ７１８で消化された発現ベクターｐＢＨ１６の、Ｌｕｃコーディング領域の５’末端の２つの部分（ＢａｍＨＩからＳｐｈＩ［Ｉｎｓｅｒｔ  Ａ］及びＡｔｔＢを含めたＳｐｈＩからＡＳＰ７１８［Ｉｎｓｅｒｔ  Ｂ］との３方連結（例２に記述されている）により構築し、Ｐ−Ｐ−ＵＬｕｃＩイントロンＡｔｔＢを形成させる。Ｉｎｓｅｒｔ  Ａは、ＰＵＣ１８中にサブクローニングされたＳａｃＩ部位と５塩基Ｋｏｚａｋ配列を付加する以下のオリゴヌクレオチド対をＮｃｏＩ部位内に挿入することによって開始コドンの上流で修飾されｐＧＬ３ｂａｓｉｃ(Promega)のルシフェラーゼ遺伝子から誘導される：５’−ＣＡＴ  ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＧＣ  ＣＡＣ−３’（配列番号５２）及び５’−ＣＡＴ  ＧＧＴ  ＧＧＣ  ＧＡＧ  ＣＴ−３’（配列番号５３）。
【０１５４】
結果として生じるプラスミド、ｐＡＴ１３４Ｓから、Ｌｕｃコーディング領域の５′末端を、ＳａｃＩからＳｐｈＩまでのフラグメントとして切除し、Ｉｎｓｅｒｔ  Ａを形成させる。Ｉｎｓｅｒｔ  Ｂは、ＸｈｏＩとＡＳＰ７１８での消化及び適切な５’拡張を伴うａｔｔＢ部位を有する以下のオリゴヌクレオチド対の挿入によって修飾された３’ＬｕｃイントロンＸから誘導される：５’−ＴＣＧ  ＡＴＧ  ＡＡＧ  ＣＣＴ  ＧＣＴ  ＴＴＴ  ＴＴＡ  ＴＡＣ  ＴＡＡ  ＣＴＴ  ＧＡＧ  ＣＧ−３’（配列番号５４）及び５’−ＧＴＡ  ＣＣＧ  ＣＴＣ  ＡＡＧ  ＴＴＡ  ＧＴＡ  ＴＡＡ  ＡＡＡ  ＡＧＣ  ＡＧＧ  ＣＴＴ  ＣＡ−３’（配列番号５５）。
例１１Ｂ；ＡｔｔＰ部位を有するルシフェラーゼ発現カセットの３’部分、ｐＡｔｔＰ
Ｐ−ＡｔｔＰイントロンＬｕｃ（ｐＡｔｔＰ）は、プロモータを除去するためにＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで消化された発現ベクターＰＢＨ１６を、ａｔｔＰフラグメント［Ｉｎｓｅｒｔ  Ｃ］に及びＸｈｏＩからＡｓｐ７１８のＬｕｃイントロン遺伝子の３’末端［Ｉｎｓｅｒｔ  Ｄ］対して３方連結させることによって形成させる。
【０１５５】
Ｉｎｓｅｒｔ  Ｃを生成するために、ａｔｔＰ配列を以下のプライマ対を用いてバクテリオファージラムダＤＮＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）からＰＣＲ増幅される：ＨａｔｔＰ  （５’−ＧＧＡ  ＡＧＣ  ＴＴＣ  ＴＧＴ  ＴＡＣ  ＡＧＧ  ＴＣＡ  ＣＴＡ  ＡＴＡ  Ｃ−３’）  （配列番号５６）及びＸａｔｔＰ（５’−ＣＣＴ  ＣＧＡ  ＧＡＡ  ＡＴＣ  ＡＡＡ  ＴＡＡ  ＴＧＡ  ＴＴＴ  ＴＡＴ−３’）（配列番号５７）。
【０１５６】
Ｓｅａｐｌａｑｕｅアガロースゲル電気泳動によって産物を精製し、アガロースからＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（ＱＩＡｇｅｎ）によって抽出させ、ＴＯＰＯ−Ａクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてクローニングさせ、ＴＯＰＯＡｔｔＰを形成させる。完全配列のクローンを同定し、ＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩでの消化によってＩｎｓｅｒｔ  Ｃを切除する。ＸｈｏＩとＢａｍＨＩでの消化によって３’ＬｕｃイントロンＸからＩｎｓｅｒｔ  Ｄを切除する。ＰＢＨ１６ベクターを、Ｉｎｓｅｒｔ  Ｃ及びＤに連結させて、プラスミドｐＡｔｔＰイントロンＬｕｃを形成させる。
【０１５７】
この分子間組換えテスト基質対は、以下でウイルスレプリコンについての以下記述される類似の構成体（接頭辞「v」)と区別するために接頭辞「p」によって呼呼ばれる。
例１２：単子葉植物組換え産物プラスミド、ｐＡｔｔＬの構築
分子間組換えテスト基質間のインテグラーゼ組換えの予測された産物が、機能的なルシフェラーゼ遺伝子を産生するか否かをテストするためにｐ−ＵＬｕｃイントロンＡｔｔＬ（ｐＡｔｔＬ）を構成する。上述の切除されたａｔｔＰ  ＤＮＡフラグメントを、以下のプライマ対を用いた８回のＰＣＲ増幅サイクルによってａｔｔＬフラグメントへと変換させる：Ｘ５ＡｔｔＬ  （５’−ＣＣＴ  ＣＧＡ  ＧＴＧ  ＡＡＧ  ＣＣＴ  ＧＣＴ  ＴＴＴ  ＴＴＡ  ＴＡＣ  ＴＡＡ  ＧＴＴ  ＧＧＣ  ＡＴＴ  Ａ−３’）  （配列番号５８）及びＸａｔｔＰ（５’−ＣＣＴ  ＣＧＡ  ＧＡＡ  ＡＴＣ  ＡＡＡ  ＴＡＡ  ＴＧＡ  ＴＴＴ  ＴＡＴ−３’（配列番号５７）。ＰＣＲ産物をゲル精製し、Ｔｏｐｏ−ＴＡクローニングし、完全ａｔｔＬクローン、ＴＯＰＯＡｔｔＬを、配列決定を通して同定する。ａｔｔＬフラグメントを、ＸｈｏＩを用いて切除し、３’ＬｕｃイントロンＸのＸｈｏＩ部位へと連結させて、フォーム３’ＬｕｃイントロンＡｔｔＬを形成させる。この中間体から、ＳｐｈＩとＢａｍＨＩを用いてインサートを切除する。プラスミドｐ−Ｕ５’ＬｕｃイントロンＡｔｔＢから、トウモロコシユビキチンプロモータの一部を持つＬｕｃの５’末端を、ＳａｌＩ／ＳｐｈＩによって切除させる。ベクターｐＢＨ１６を、（トウモロコシユビキチンプロモータの不要な部分を廃棄して）ＳａＩＩ／ａｍＨＩで消化させて、これらのフラグメントの３方連結によりプラスミドＰ−ＵＬｕｃイントロンＡｔｔＬが産生される。
例１３：ＷＤＶレプリコン上での単子葉植物分子内組換えテスト基質、ｖＡｔｔＢ／Ｐの構築
分子内ａｔｔＢ／ａｔｔＰテスト基質は、ルシフェラーゼ発現カセットの５’部分（５’Ｌｕｃ−５’イントロン−ａｔｔＢ）及びルシフェラーゼ発現カセットの３’部分（ａｔｔＰ−３’イントロン−３’Ｌｕｃ）を含み、ここで３’部分は５’部分と関係において反転されており、ａｔｔＢとａｔｔＰ部位は反転した配位にある。Ｉｎｔによって媒介されるように、ａｔｔＢとａｔｔＰの部位間の分子内組換えは、ルシフェラーゼ発現カセットの３’部分の反転に導き、無傷のカセット及びルシフェラーゼ酵素活性を生成する。
【０１５８】
Ｅ．Ｃｏｌｉ及び単子葉植物細胞内での複製能力をもつシャトルプラスミドは、このため及びさらなる基質のために利用される。小麦萎縮ウイルス（ＷＤＶレプリコン）  及びプラスミドｐｌ５Ａ由来の複製起点を持つプラスミドｐＷＩ−１１（Ugaki et al., Nucl.Acides Res.19:371(1991)）を、（ＡＳＰ７１８、ＢＧＬＩＩ、ＳｐｅＩ、ＮｏｔＩ、及びＮＨＥＩ部位を作り上げる）ＳａｌＩとＢａｍＨＩの部位間に導入された以下のオリゴヌクレオチド対を伴うユニークなクローニング部位の付加によって修飾させる：５’−ＴＣＧ  ＡＣＧ  ＧＴＡ  ＣＣＡ  ＧＡＴ  ＣＴＡ  ＣＴＡ  ＧＴＴ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＧ  ＣＴＡ  ＧＣＧ−３’（配列番号５９）及び５’−ＧＡＴ  ＣＣＧ  ＣＴＡ  ＧＣＧ  ＣＧＧ  ＣＣＧ  ＣＡＡ  ＣＴＡ  ＧＴＡ  ＧＡＴ  ＣＴＧ  ＧＴＡ  ＣＣＧ−３’（配列番号６０）。
【０１５９】
結果として得たベクター、ｐＷＩ−１１Ｍを、ＮｏｔＩ及びＢＧＬＩＩで消化させ、ｖＡｔｔＢ／Ｐのバックボーンを形成させる。オリゴヌクレオチド５’−ＡＧＣ  ＴＧＣ  ＧＧＣ  ＣＧＣ−３’（配列番号６１）を用いて、そのＨｉｎｄＩＩＩ部位をＮｏｔＩ部位に変更させた後に、インサートＥを、ｐＡｔｔＢから誘導する。ＵｂｉＬｕｃイントロンＡｔｔＢを含むインサートを、ＮｏｔＩとＡＳＰ７１８を用いて切除する。オリゴヌクレオチド５’−ＡＧＣ  ＴＡＧ  ＡＴＣ  Ｔ−３’（配列番号６２）を用いて、そのＨｉｎｄＩＩＩ部位をＢｇｌＩＩ部位に変更させた後に、インサートＦをｐＡｔｔＰから誘導する。ＡｔｔＰイントロン３’ＬｕｃＮｏｓを含有するインサートを、ＢｇｌＩＩとＡｓｐ７１８を用いて切除する。インサートＥ及びＦとのｐＷＩ−１１Ｍの３方連結によって、遺伝子の３’末端が５’末端との関係において逆転され、ｖＡｔｔＢ／Ｐと呼ばれる反対に配位されたａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位によってフランキングされているプラスミドが生成される。
例１４：ＷＤＶレプリコン上の単子葉植物分子内組換えテスト基質、ｖＡｔｔＢ及びｖＡｔｔＰの構築
例１３で調製された、ＵｂｉＬｕｃイントロンＡｔｔＢを有するＮｏｔＩ／Ａｓｐ７１８フラグメントを、ＮｏｔＩ及びＡＳＰ７１８で消化させたｐＷＩ−１１Ｍ内へと連結させて、ｖＡｔｔＢを形成させる。同じく例１３で先に調製されたＡｔｔＰＩｎｔ３’ＬｕｃＮｏｓを有するＢｅｌＩＩ／Ａｓｐ７１８フラグメントを、ＢｇｌＩＩ及びＡｓｐ７１８で消化させたｐＷＩ−１１Ｍ内へと連結させて、プラスミドｖＡｔｔＰを形成させる。
例１５：ＭＵＳｙｎＩｎｔを担持するＷＤＶレプリコン、ｖＭＵＳｙｎＩｎｔの構築
ＭＵＳｙｎＩｎｔの５’末端にあるＨｉｎｄＩＩＩ部位を、オリゴヌクレオチド５’−ＡＧＣ  ＴＡＣ  ＴＡＧ  Ｔ−３’（配列番号６３）を用いてＳｐｅＩ部位に変換する。発現カセットを、ＳｐｅＩとＡＳＰ７１８で切除し、ＳｐｅＩ／Ａｓｐ７１８消化したｐＷＩ−１１Ｍ内に連結させて、プラスミドｖＭＵＳｙｎＩｎｔを形成させる。
C.トウモロコシ細胞中での組換え検定
例１６：トウモロコシ細胞中でのＳｙｎＩｎｔ及びＳｙｎＩＨＦα／βによって媒介された分子内及び分子間の組換え
分子間組換え基質であるｖＡｔｔＢとｖＡｔｔＰ及び、分子内組換え基質ｖＡｔｔＢ／Ｐを、ＳｙｎＩｎｔ、ＳｙｎＩＨＦα及びＳｙｎＩＨＦβ発現の不在下でルシフェラーゼの過渡的発現の背景レベルを決定するために２５μｇ／プラスミド／ショットの濃度でＢＭＳ細胞内に個別にボンバードする。同じ基質は、次に、ｖＭＵＳｙｎＩｎｔ（０．２５μｇ／ショット）又はＭＵＳｙｎＩｎｔ（０．２５μｇ／ショット）のいずれか、及びＭＵＳｙｎＩＨＦα（０．５μｇ／ショット）及びＭＵＳｙｎＩＨＦβ（０．５μｇ／ショット）で同時ボンバードする。ボンバードを受けたＢＭＳ細胞を、最長２日又は最長５日間２８℃で暗所にてインキュベートする。インキュベーション後、細胞をルシフェラーゼ発現レベルについて検定する。ルシフェラーゼ発現はＩｎｔ媒介型組換え活性の１つの尺度である。結果は下表１中で提示されている。
【０１６０】
表１内で実証されているように、プラスミド（ｐＳｙｎＩｎｔ）又は小麦ジェミニウイルスレプリコン（ｖＳｙｎＩｎｔ）のいずれかの上でのＭＵＳｙｎＩｎｔの発現は、ＢＭＳ細胞内での分子内及び分子間組換えを媒介する。ｐＳｙｎＨＦα、βは、ＭＵＳｙｎＩＨＦαとＭＵＳｙｎＩＨＦβという２つのプラスミドの同時ボンバードを表している。
【０１６１】
【表２】
2005521400.tif 000004
【０１６２】
例１７：  トウモロコシ細胞中におけるプラスミドとウイルスレプリコン基質上のａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位間の分子間の組換え
分子間組換えプラスミドとウイルスレプリコンの対、ｐＡｔｔＢ＋ｐＡｔｔＰ、ｐＡｔｔＢ＋ｖＡｔｔＰ、ｖＡｔｔＢ＋ｐＡｔｔＰ及びｖＡｔｔＢ＋ｖＡｔｔＰを、ルシフェラーゼの過渡的発現の背景レベルを決定するために、０．２５μｇ／プラスミド／ショットの濃度でＢＭＳ細胞中に別々に同時ボンバードする。同じ細胞間組換え基質を、次に、ＭＵＳｙｎＩｎｔ（０．２５μｇ／ショット）、ＭＵＳｙｎＩＨＦα（０．５μｇ／ショット）及びＭＵＳｙｎＩＨＦβｓ（０．５μｇ／ショット）で同時ボンバードする。ボンバードを受けたＢＭＳ細胞を、最長４８時間２８℃で暗所にてインキュベートする。インキュベーション後、細胞をルシフェラーゼ発現レベルについて検定する。結果は下の表２中に提示しされている。
【０１６３】
【表３】
2005521400.tif 000005
【０１６４】
ＢＭＳ細胞中のＭＵＳｙｎＩｎｔ、ＭＵＳｙｎＨＦα及びＭＵｓｙｎＨＦβの同時発現は、小麦ジェミニウイルスレプリコン基質上でａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位間の分子間組換えを媒介する。
例１８：トウモロコシ細胞中でのＭＵＳｙｎＨＦα及びＭＵＳｙｎＨＦβの同時発現を伴う及び伴わない突然変異体ＳｙｎＩｎｔ−ｈ及びＳｙｎＩｎｔ−ｈ／２１８媒介型分子間組換え
ルシフェラーゼ過渡的発現の背景レベルを決定するために、分子間組換えプラスミドの対、ｐＡｔｔＢ＋ｐＡｔｔＰ、ｐＡｔｔＢ＋ｖＡｔｔＰ、ｖＡｔｔＢ＋ｐＡｔｔＰ及びｖＡｔｔＢ＋ｖＡｔｔＰを、ＢＭＳ細胞中に別々同時ボンバードする。同じ分子間組換えプラスミド対を、次に、発現ベクターの以下の組合わせで同時に同時ボンバードする：
Ａ）ＭＵＳｙｎＩｎｔ−ｈ（０．２５μｇ／ショット）
Ｂ）ＭＵＳｙｎＩｎｔ−ｈ（０．２５μｇ／ショット）、ＭＵＳｙｎＨＦα（０．５μｇ／ショット）及びＭＵＳｙｎＨＦβ（０．５μｇ／ショット）
Ｃ）ＭＵＳｙｎＩｎｔ−ｈ／２１８（０．２５μｇ／ショット）
Ｄ）ＭＵＳｙｎＩｎｔ−ｈ／２１８（０．２５μｇ／ショット）、ＭＵＳｙｎＨＦα（０．５μｇ／ショット）及びＭＵＳｙｎＨＦβ（０．５μｇ／ショット）
ボンバードを受けたＢＭＳ細胞を、約４８時間２８℃で暗所にてインキュベートする。インキュベーション後、細胞をルシフェラーゼ発現レベルについて検定する。結果は以下の表３中に提示されている。
【０１６５】
【表４】
2005521400.tif 000006
【０１６６】
ＢＭＳ細胞中における突然変異体λインテグラーゼ、ＭＵＳｙｎＩｎｔ−ｈ（ｐＳｙｎＩｎｔ−ｈ）の発現は、Ｅ．ＣｏｌｉＩＨＦ（すなわちＭＵＳｙｎＨＦα及びＭＵＳｙｎＨＦβ）の発現無しで、プラスミド及びウイルスレプリコンの対、ｐＡｔｔＢ＋ｐＡｔｔＰ及びｖＡｔｔＢ＋ｐＡｔｔＰの間の組換えを媒介する。ＭＵＳｙｎＨＦα及びＭＵＳｙｎＨＦβとＭＵＳｙｎＩｎｔ−ｈとの同時発現は、ＢＭＳ細胞中におけるプラスミド及びウイルスレプリコン対、ｐＡｔｔＢ＋ｐＡｔｔＰ、ｖＡｔｔＢ＋ｐＡｔｔＰ及びｐＡｔｔＢ＋ｖＡｔｔＰの間の組換えを媒介する。ＢＭＳ細胞中の突然変異体λインテグラーゼＭＵＳｙｎＩｎｔ−ｈ／２１８（ｐＳｙｎＩｎｔ−ｈ／２１８）の発現は、ＭＵＳｙｎＨＦα及びＭＵＳｙｎＨＦβの同時発現を伴って及び伴わずにプラスミド及びウイルスレプリコンの対、ｐＡｔｔＢ＋ｐＡｔｔＰ、ｖＡｔｔＢ＋ｐＡｔｔＰ、及びｐＡｔｔＢ＋ｖＡｔｔＰの間の組換えを媒介する。
例１９：トウモロコシ細胞中のＳｙｎＩＨＦＰの同時発現を伴う及び伴わないＳｙｎＩｎｔ、ＳｙｎＩｎｔ−ｈ及びＳｙｎＩｎｔ−ｈ／２１８媒介型分子間組換え
ルシフェラーゼ過渡的発現の背景レベルを決定するために、0.２５μg/ショットの濃度で分子間組換えプラスミドｖＡｔｔＢ／Ｐを、ＢＭＳ細胞内に同時ボンバードする。同じ分子間組換えプラスミドを、次に、以下の発現ベクター組合せで同時に同時ボンバードする：
Ａ）ＭＵＳｙｎＩｎｔ（０．２５μｇ／ショット）
Ｂ）ＭＵＳｙｎＩｎｔ（０．２５μｇ／ショット）、ＭＵＳｙｎＨＦα（０．５μｇ／ショット）及びＭＵＳｙｎＨＦβ（０．５μｇ／ショット）
Ｃ）ＭＵＳｙｎＩｎｔ−ｈ（０．２５μｇ／ショット）
Ｄ）ＭＵＳｙｎＩｎｔ−ｈ（０．２５μｇ／ショット）、ＭＵＳｙｎＨＦα（０．５μｇ／ショット）及びＭＵＳｙｎＨＦβ（０．５μｇ／ショット）
Ｅ）ＭＵＳｙｎＩｎｔ−ｈ／２１８（０．２５μｇ／ショット）
Ｆ）ＭＵＳｙｎＩｎｔ−ｈ／２１８（０．２５μｇ／ショット）、ＭＵＳｙｎＨＦα（０．５μｇ／ショット）及びＭＵＳｙｎＨＦβ（０．５μｇ／ショット）
ボンバードを受けたＢＭＳ細胞を、４８時間２８℃で暗所にてインキュベートする。インキュベーション後、細胞をルシフェラーゼ発現レベルについて検定する。結果は下表４中に提示されている。
【０１６７】
【表５】
2005521400.tif 000007
【０１６８】
野生型（ｐＳｙｎＩｎｔ）、単一突然変異体（ｐＳｙｎＩｎｔ−ｈ）及び二重突然変異体（ｐＳｙｎＩｎｔ−ｈ／２１８）λインテグラーゼは全て、トウモロコシ細胞中のａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位間の分子内組換えを媒介する。野生型λインテグラーゼは一般に、分子内組換えを媒介するためにＥ．Ｃｏｌｉ組込み宿主因子タンパク質の同時発現を必要とするが、単一及び二重突然変異体λインテグラーゼは、Ｅ．Ｃｏｌｉ組込み宿主因子タンパク質の同時発現の有無にかかわらず分子内組換えを媒介する。
ＩＩ．Ｂ／Ｐ反応を用いたトウモロコシ内でのターゲティングされた組込み。
Ａ．標的配列の構築
一般に、対応するドナー配列のＩｎｔ触媒作用を受ける部位特異的挿入のための遺伝子座としての役立つように標的配列構成体が、植物ゲノム中に導入される。ターゲティングされた挿入が発生した場合に、２つの部分が完全な機能的カセット中に再構築されるように、標的配列（「ＬＰ」構成体）とドナー（「ｄｏｎ」構成体）間で分かれた部分的発現カセットとして選択及びスクリーニング可能なマーカーが取込まれる。スクリーニング可能なマーカーを検定することによって、ターゲティングされた挿入事象を含んでいる細胞を同定することが可能になる。選択的圧力を適用することは、ターゲティングされた挿入事象を含んでいる細胞の数を増やす手段を提供する。
【０１６９】
本書中に記述されている構成体例において、標的配列をトウモロコシに挿入するために用いられるプラスミドは、標的配列を含有し植物クローンの同定を助けるために、突然変異体プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＰＯ）遺伝子コーディング領域用の発現カセット（米国特許第．６，２８８，３０６号）を含んでいる。さらに、標的配列プラスミドは、１つのイントロン内で切り取られかつ単一ａｔｔ部位又は１対の同一ａｔｔ部位（これらは全て野生型或いは突然変異体のいずれであってもよい）のいずれかによって中断されている部分発現カセット、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）（５’ＧＵＳ−５’イントロン）及びホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＭＩ）（３’イントロン−３’ＰＰＭＩ）を有する。かくして、単一ａｔｔ部位標的配列は、５’ＧＵＳ−５’イントロン−Ａｔｔ部位−３’イントロン−３’ＰＭＩという形のスプリットマーカー遺伝子を含有する。二重ａｔｔ部位標的配列は、５’ＧＵＳ−５’イントロン−Ａｔｔ部位−ＰＰＯ−Ａｔｔ部位−３’イントロン−３’ＰＭＩという形をしている。標的配列中の５’及び３’イントロン部分は異なるイントロンに対応している。
【０１７０】
単一ａｔｔ部位は、標的配列の遺伝子コーディング領域との関係において５’−３’又は３’−５’のいずれの配位であってよい。ａｔｔ部位の対は、発散配位されている（反転配位）か又は収束配位されている（同じく反転配位）可能性がある。ａｔｔ部位の対の３’末端が、互いに離れるように方向づけされている場合、該部位は発散配位されていると呼ばれる。ａｔｔ部位の対が互いに向かって方向づけされている場合、該部位は収束配位されていると呼ばれる。いずれの配位が選択された場合であっても、対応する標的及びドナー配列中のａｔｔ部位又は位対ａｔｔ部位は、整合した配位を有している。さらに、標的及びドナーの中のａｔｔ部位は組換えについて相容性がある。すなわち、ａｔｔＢ標的は、本書中に記述されている通りａｔｔＰドナーなどと整合させられる。
例２０：反転ａｔｔＢ部位を伴う単子葉植物標的配列
構成体ｐＮＯＶ２７９０は、配列番号６４に記されるとおり、コーディング領域への４つのイントロンの導入によって５つのエクソンに分けられたｐＮＯＶ１１（Negrotto et al. (２０００) Plant Cell Reports １９：７９８−８０３）のホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＭＩ）遺伝子を含有する。Arabidopsis thaliana (Oppenheimer et al.（１９８８）Gene６３：８７−１０２）由来のベータ−１チュブリンイントロン「Ａ」は、一連のオーバーラップするプライマ対を用いて、遺伝子コーディング領域のエクソン３と４の間に導入される。該イントロンは導入されて、ＰＭＩイントロン３と命名される。ｐＮＯＶ２７９０のこの部分は、さらなるクローニングに用いられる。
【０１７１】
ＭｆｅＩ付着末端と５’Ａｓｐ７１８Ｉ部位によって、かつＥｃｏＲＩ付着末端と３’ＡｖｒＩＩ部位によってフランキングされたａｔｔＢ部位を担持する、オリゴヌクレオチド対が構築される（５’−ＡＡＴ  ＴＧＧ  ＴＡＣ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  ＣＣＴ  ＧＣＴ  ＴＴＴ  ＴＴＡ  ＴＡＣ  ＴＡＡ  ＣＴＴ  ＧＡＧ  ＣＧＣ  ＣＴＡ  ＧＧ−３’（配列番号  ６５）及び５’−ＡＡＴ  ＴＣＣ  ＴＡＧ  ＧＣＧ  ＣＴＣ  ＡＡＧ  ＴＴＡ  ＧＴＡ  ＴＡＡ  ＡＡＡ  ＡＧＣ  ＡＧＧ  ＣＴＴ  ＣＡＧ  ＧＴＡ  ＣＣ−３’（配列番号：６６の））。このオリゴヌクレオチド対を、アニーリングし、ｐＮＯＶ２７９０のＰＭＩイントロン３のＭｆｅＩ部位内に連結して、ベクターpＮＯＶ２７９０ＡｔｔＢを形成させる。
【０１７２】
ｐＮＯＶ２１１７は、ｐＶＳＬ及びＣｏｌＥｌの両方の複製起点を持つバイナリベクターである。このベクターはｐＡＤ１２８９由来の構成体ＶｉｒＧ構成遺伝子（Hansen et al.（１９９４）PNAS US ９１：７６０３−７６０７）及びＴｎ７由来のスペクチノマイシン耐性遺伝子を含有する。左右のボーダーの間ポリリンカー内にクローニングされるのは、トウモロコシユビキチンプロモータ、ＰＭＩコーディング領域及びＰＮＯＶ１１７のノパリンシンターゼターミネーター（Negrotto et al.（２０００）Plant Cell Report１９：７９８−８０３）である。
【０１７３】
ａｔｔＢ部位を含有するＰＭＩイントロン３を伴うＰＭＩコーディング領域の一部を、ＢｓｔＢＩ／ＰｓｈＡＩフラグメントとしてｐＮＯＶ２７９０ＡｔｔＢから切除し、バイナリベクターｐＮＯＶ２１１７内に連結させ、そこから、ＢＳＴＢＩ／ＰＳＨＡＩでの消化によって対応する領域を除去する。これは、イントロン中にＡｔｔＢ部位を含有する、ＭＵＰＭＩＡｔｔＢと呼ばれる完全なＰＭＩ発現カセットを形成させる。
【０１７４】
ｐＮＯＶ５０１３は、イントロンから除去されたＢａｍＨＩ部位を伴うイネアクチン１プロモータ（McElroy et al.（１９９１）Mol. Gen.Genet.２３１（１）：１５０−６０）、突然変異体プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＰＯ）遺伝子コーディング領域（米国特許出願第０９／０１５，６８３号）及びＣａＭＶ  ３５ターミネーターを含むBluescriptベクターである。ｐＮＯＶ５０１３のＰＰＯ発現カセットは、Ａｓｐ７１８Ｉフラグメントとして切除され、ＭＵ  ＰＭＩＡｔｔＢのＡｓｐ７１８Ｉ部位内に連結させｔＰＰＯＰＭＩＡｔｔＢを形成している。
【０１７５】
ｐＮＯＶ５００３は、一連のオーバーラップするプライマ対を用いてｐＢＩ１２１（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）からβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子コーディング配列に導入された、ＡＴ  ＢＡＦ６０と呼ばれるArabidopsisイントロン（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＢ００７６５０）を含有している。
【０１７６】
ＡｔＢＡＦ６０遺伝子由来のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓイントロンを用いてＧＵＳ遺伝子を構築するためには、ＡｔＢＡＦ６０イントロン（４２０ｂｐｓ）を、２つのプライマ、ＧＵＳＢＡＦＦＷ１（５’−ＴＴＧ  ＡＣＴ  ＧＧＣ  ＡＧＧ  ＴＡＣ  ＣＡＡ  ＧＣＴ  ＧＣＧ  ＡＡＴ  ＣＴＴ  ＣＧ−３’）（配列番号６７）及びＧＵＳＢＡＦＲＶ１（５’−ＡＴＴ  ＧＧＣ  ＣＡＣ  ＣＡＣ  ＣＴＧ  ＡＡＡ  ＡＡＴ  ＴＣＡ  ＧＡＡ  ＡＣＡ  ＡＡ−３’）（配列番号６８）を用いてArabidopsisゲノムから増幅する。ＡｔＢＡＦ６０（ＣＨＣ１）は、哺乳動物ヌクレオソームリモデリング因子ＢＡＦ６０(http://www.chromdb.org/)と相同性を共有する遺伝子である。２つのプライマ、ＧＵＳＢＡＭＨＩ（５’−ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＡＡＣ  ＣＡＴ  ＧＴＴ  ＡＣＧ  ＴＣＣ  ＴＧＴ  ＡＧＡ  ＡＡ−３’）（配列番号を６９）及びＢＡＦＧＵＳＲＶ１（５’−ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＧＧＴ  ＡＣＣ  ＴＧＣ  ＣＡＧ  ＴＣＡ  ＡＣＡ  ＧＡＣ  ＧＣＧ  ＡＣ−３’）（配列番号７０）を用いてｐＢＩ１２１(Clonetech)からＧＵＳエクソン（６４５ｂｐｓ）を増幅させる。２つのプライマ、ＢＡＦＧＵＳＦＷ１（５’；−ＴＴＧ  ＡＣＴ  ＧＧＣ  ＡＧＧ  ＴＡＣ  ＣＡＡ  ＧＣＴ  ＧＣＧ  ＡＡＴ  ＣＴＴ  ＣＧ−３’）（配列番号７１）及びＧＵＳＳＡＬＩ（５’−ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＴＴＧ  ＴＴＴ  ＧＣＣ  ＴＣＣ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＣＧＧ−３’）（配列番号７２）を用いてｐＢＩ１２１からＧＵＳエクソン２（１２００ｂｐｓ）を増幅させる。鋳型としてゲル精製ＧＵＳエクソン１（６４５ｂｐ）及びＡｔＢＡＦ６０イントロン（４２０ｂｐ）フラグメント及び２つのプライマ、ＧＵＳＢＡＭＨＩ（５’−ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＡＡＣ  ＣＡＴ  ＧＴＴ  ＡＣＧ  ＴＣＣ  ＴＧＴ  ＡＧＡ  ＡＡ−３’）（配列番号６９）及びＧＵＳＢＡＦＲＶ１（５’−ＡＴＴ  ＧＧＣ  ＣＡＣ  ＣＡＣ  ＣＴＧ  ＡＡＡ  ＡＡＴ  ＴＣＡ  ＧＡＡ  ＡＣＡ  ＡＡ−３’）（配列番号６８）を用いて、ＰＣＲによってＧＵＳエクソンｌ−ＡｔＢＡＦ６０イントロンフラグメント（１０４９ｂｐ）を形成させる。ＧＵＳエクソン１−ＡｔＢＡＦ６０イントロンフラグメント（１０４９ｂｐ）を、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター内にクローニングして、ｐＮＯＶ５００１を形成させる。鋳型及びプライマとしてＡｔＢＡＦ６０イントロン（４２０ｂｐ）とＧＵＳエクソン２（１２００ｂｐ）フラグメントを鋳型として、かつＧＵＳＢＡＦＦＷ１（５’−３’）及びＧＵＳＳＡＬＩ（５’−３’）を用いて、ＰＣＲによってＡｔＢＡＦ６０イントロンＧＵＳエクソン２フラグメント（１６２０ｂｐ）を形成させる。ＡｔＢＡＦ６０イントロンＧＵＳエクソン２フラグメント（１６２０ｂｐ）は、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ中にクローニングされｐＮＯＶ５００２を形成させる。  ２つの挿入フラグメント、ｐＮＯＶ５００１  ＢａｍＨＩ／ＨＩＮＤＩＩＩフラグメント（９６１ｂｐ）及びｐＮＯＶ５００２  ＸｈｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（１３１２ｂｐｓ）とのＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ−消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ（＋）の3部連結の中でｐＮＯＶ５００３を形成させる。
【０１７７】
オリゴヌクレオチド対、５’−ＧＡＴ  ＣＴＣ  ＧＣＴ  ＣＡＡ  ＧＴＴ  ＡＧＴ  ＡＴＡ  ＡＡＡ  ＡＡＧ  ＣＡＧ  ＧＣＴ  ＴＣＡ  ＧＣＴ  ＡＧＣ−３’（配列番号７３）及び５’−ＧＡＴ  ＣＧＣ  ＴＡＧ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  ＣＣＴ  ＧＣＴ  ＴＴＴ  ＴＴＡ  ＴＡＣ  ＴＡＡ  ＣＴＴ  ＧＡＧ  ＣＧＡ−３’（配列番号７４）の合成ＡｔｔＢ部位を、ｐＮＯＶ２７９０ＡｔｔＢのＡｔｔＢ部位に対して反対配位で、ｐＮＯＶ５００３のＡＴ  ＢＡＦ６０イントロンのＢｇｌＩＩ部位内に連結させて、ベクターＧＵＳＩｎｔＡｔｔＢｒｅｖを形成させる。
【０１７８】
ｐＮＯＶ４２１１は、ＢａｍＨＩ部位でＰＣＲ産物をフランキングさせるプライマによってケストルムモザイクウイルスからＰＣＲ増幅されたプロモータを含有する。配列番号７５に記された増幅されたＣＭＰＳプロモータは、ＬａｃＺ遺伝子の配位とは反対配位でＢａｍＨＩフラグメントとしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋中にクローニングされる。該プロモータについては、本書に参照として内含されているＷＯ０１７３０８７Ａ１に記述されている。
【０１７９】
ケストルムモザイクウイルスプロモーターを、ＢａｍＨＩフラグメントとしてｐＮＯＶ４２１１から切除し、ＧＵＳＩｎｔＡｔｔＢｒｅｖのＢａｍＨＩ部位内に連結させてベクターＣＭＰＳＧＵＳＡｔｔＢｒｅｖを形成させる。
【０１８０】
ＰＰＯ．ＰＭＩＡｔｔＢのＡｐａＩ部位を、最初に部位変更オリゴ５’−ＡＣＴ  ＡＧＴ  ＧＧＣ  Ｃ−３’（配列番号７６の）を用いてＳｐｅＩ部位に変換してＰＰＯ．ＰＭＩＡｔｔＢＳｐｅを形成させ、次に、ＡｔｔＢ部位を含む、ＣＭＰＳＧＵＳＡｔｔＢｒｅｖの５’Ｉ／ＮｈｅＩフラグメントを、ＰＰＯＰＭＩＡｔｔＢ．ＳｐｅのＳｐｅＩ部位内に連結させて、２つの反転ＡｔｔＢ部位を内含する標的配列（ＬＰｄｂＡｔｔＢと呼ばれる）を形成させる。
例２１：反転ＡｔｔＰ部位を伴う単子葉植物標的配列
ＡｔｔＰ部位を、ＴＯＰＯ  ＴＡをクローニングキット（Invitogen）を用いて、オリゴヌクレオチドプライマ対５’−ＧＧＡ  ＡＧＣ  ＴＴＣ  ＴＧＴ  ＴＡＣ  ＡＧＧ  ＴＣＡ  ＣＴＡ  ＡＴＡ  Ｃ−３’（配列番号７７）及び５’ＣＣＴ  ＣＧＡ  ＧＡＡ  ＡＴＣ  ＡＡＡ  ＴＡＡ  ＴＧＡ  ＴＴＴ  ＴＡＴ−３’（配列番号７８）でバクテリオファージラムダゲノミックＤＮＡ（New England Biolanbs）からＰＣＲクローニングさせる。ａｔｔＰ部位の５’末端上のＨｉｎｄＩＩＩ部位を、部位変更オリゴヌクレオチド５’−ＡＧＣ  ＴＧＧ  ＴＡＣ  ＣＣＡ  ＡＴＴ  ＧＧＧ  ＴＡＣ  Ｃ−３’（配列番号７９）を用いて、３つの新しい部位、Ａｓｐ７１８Ｉ／ＭｆｅＩ／Ａｓｐ７１８Ｉに転換する。ＡｔｔＰ部位の３’末端上のＸｈｏＩ部位は、部位変更オリゴヌクレオチド５’−ＴＣＧ  ＡＣＣ  ＴＡＧ  ＧＣＡ  ＡＴＴ  ＧＣＣ  ＴＡＧ  Ｇ−３’（配列番号８０）を用いて、３つの新しい部位、ＡｖｒＩＩ／ＭｆｅＩ／ＡｖｒＩＩに転換する。ａｔｔＰフラグメントを、次にＭｆｅＩフラグメントとしてＴＯＰＯベクターから切除し、ｐＮＯＶ２７９０のＰＭＩイントロン３のＭｆｅＩ部位の内に連結させ、ベクターｐＮＯＶ２７９０ＡｔｔＰを形成させる。  
ａｔｔＰ部位を含有するＰＭＩイントロン３を、ＢｓｔＢＩ、ＰｓｈＡＩフラグメントとしてｐＮＯＶ２７９０ＡｔｔＰから切除し、ＢｓｔＢＩ、ＰｓｈＡＩと共に切断されたバイナリベクターｐＮＯＶ２１１７内に連結させ、ＭＵＰＭＩＡＴＴＰと呼ばれるＡｔｔＰ部位と共にＰＭＩイントロン３を含有するＰＭＩ発現カセットを形成させる。
【０１８１】
ｐＮＯＶ５０１３のＰＰＯ発現カセットを、Ａｓｐ７１８Ｉフラグメントとして切除し、ＭＵＰＭＩＡｔｔＰのＡｓｐ７１８Ｉ部位内に連結させてＰＰＯ．ＰＭＩＡｔｔＰを形成させる。
【０１８２】
上述のＴＯＰＯクローン中のＡｔｔＰ部位の５’末端上のＨｉｎｄＩＩＩ部位を、部位変更オリゴヌクレオチド５’−ＡＧＣ  ＴＧＣ  ＴＡＧ  ＣＧＧ  ＡＴＣ  ＣＧＣ  ＴＡＧ  Ｃ−３’（配列番号８１）用いて、３つの新しい部位、ＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩ／ＮｈｅＬに変換させる。このクローンのＡｔｔＰ部位の３’末端上のＸｈｏＩ部位を、次に部位変更オリゴヌクレオチド５’−ＴＣＧ  ＡＡＧ  ＡＴＣ  ＴＣＧ  ＧＣＣ  ＧＡＧ  ＡＴＣ  Ｔ−３’（配列番号８２）を用いて、３つの新しい部位ＢｇｌＩＩ／ＥａｇＩ／ＢｇｌＩＩに変換される。ＡｔｔＰ部位を、次にＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩフラグメントとして切除され、ｐＮＯＶ２７９０ＡｔｔＰのＡｔｔＰ部位に対して反対配位でｐＮＯＶ５００３のＡＴ  ＢＡＦ６０イントロンのＢｇｌＩＩ部位内に連結させてベクターＧＵＳＩｎｔＡｔｔＰｒｅｖを形成させる。
【０１８３】
ケストルムモザイクウイルスプロモーターを、ＢａｍＨＩフラグメントとしてｐＮＯＶ４２１１から切除され、ＧＵＳＩｎｔＡｔｔＰｒｅｖのＢａｍＨＩ部位内に連結させ、ベクターＣＭＰＳＧＵＳＡｔｔＰｒｅｖを形成させる。
【０１８４】
ＰＰＯ．ＰＭＩＡｔｔＰのＡｐａＩ部位を最初に、部位変更オリゴ５’ＡＣＴ  ＡＧＴ  ＧＧＣ  Ｃ−３’（配列番号８３）を用いて、ＳｐｅＩ部位に変換させてＰＰＯ．ＰＭＩＡｔｔＰ．Ｓｐｅを形成させ、次に、ＡｔｔＰ部位を含む、ＣＭＰＳＧＵＳＡｔｔＰｒｅｖの５’ＳｐｅＩ、ＮｈｅＩフラグメントを、ＰＰＯ．ＰＭＩＡｔｔＰ：ＳｐｅのＳｐｅＩ部位内に連結させて、２つの反転ＡｔｔＰ部位を含有する標的配列（ＬＰｄｂＡｔｔＰと呼ばれる）を形成させる。
例２２：反転ＡｔｔＰｌ及びＡｔｔＰ２部位を伴う単子葉植物標的配列
ｐＤＯＮ２０１（ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の「ＡｔｔＰｌ」及び「ＡｔｔＰ２」部位間の介在ＳａｌＬフラグメントを、ＳａｌＩ消化とその後の連結により除去して、ＡｔｔＰｌＳａｌＩＡｔｔＰ２を形成させる。
【０１８５】
ａｔｔＰ２部位を、ＴＯＰＯ  ＴＡをクローニングキットを用いて、オリゴヌクレオチドプライマ対５’−ＧＧＧ  ＣＡＡ  ＴＴＧ  ＧＧＴ  ＡＣＣ  ＴＡＣ  ＡＧＧ  ＴＣＡ  ＣＴＡ  ＡＴＡ  ＣＣＡ  ＴＣＴ−３’（配列番号８４）及び５’−ＧＧＧ  ＣＡＡ  ＴＴＧ  ＣＣＴ  ＡＧＧ  ＣＡＡ  ＡＴＡ  ＡＴＧ  ＡＴＴ  ＴＴＡ  ＴＴＴ  ＴＧＡ−３’（配列番号８５）でＡｔｔＰｌＳａｌＩＡｔｔＰ２のＡｐａＩ；ＳａｌＬフラグメントからＰＣＲクローニングする。ａｔｔＰ２ａ部位を、ＭｆｅＩフラグメントとしてＴＯＰＯベクターから切除し、ｐＮＯＶ２７９０のＰＭＩイントロン３のＭｆｅＩ部位内に連結させて、ベクターｐＮＯＶ２７９０ＡｔｔＰ２を形成させる。
【０１８６】
ＡｔｔＰ２部位を含有するＰＭＩイントロン３を、ＢｓｔＢＩ、ＰｓｈＡＩフラグメントとしてＰＮＯＶ２７９０ＡＴＴＰ２から切除し、ＢｓｔＢＩ、ＰｓｈＡＩと共に切断されたバイナリベクターｐＮＯＶ２１１７内に連結させ、ＭＵＰＭＩＡｔｔＰ２と呼ばれるＡｔｔＰ２部位を伴うＰＭＩイントロン３を含有させ、ＰＭＩ発現カセットを形成させる。
【０１８７】
ｐＮＯＶ５０１３のＰＰＯ発現カセットを、Ａｓｐ７１８Ｉフラグメントとして切除し、ＭＵＰＭＩＡｔｔＰ２のＡｓｐ７１８Ｉ部位内に連結させて、ＰＰＯ．ＰＭＩＡｔｔＰ２を形成させる。
【０１８８】
ＡｔｔＰｌ部位を、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキットを用いて、オリゴヌクレオチドプライマ対５’−ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＴＡＣ  ＡＧＧ  ＴＣＡ  ＣＴＡ  ＡＴＡ  ＣＣＡ  ＴＣＴ−３’（配列番号８６）及び５’−ＧＧＧ  ＡＧＡ  ＴＣＴ  ＣＡＡ  ＡＴＡ  ＡＴＧ  ＡＴＴ  ＴＴＡ  ＴＴＴ  ＴＧＡ−３’（配列番号８７）でＡｔｔＰｌＳａｌＩＡｔｔＰ２のＰｓｔＩ、ＳａｌＬフラグメントからＰＣＲクローニングさせる。
【０１８９】
ＡｔｔＰＬ部位を、ＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩフラグメントとしてＴＯＰＯベクターから切除し、ｐＮＯＶ２７９０ＡｔｔＰ２のＡｔｔＰ２部位に対して反対配位でｐＮＯＶ５００３のＡＴ  ＢＡＦ６０イントロンのＢＧＬＩＩ部位内に連結させて、ベクターＧＵＳイントロンＡｔｔＰｌｒｅｖを形成させる。
【０１９０】
ケストルムモザイクウイルスプロモーターを、ＢａｍＨＩフラグメントとしてｐＮＯＶ４２１１から切除し、ＧＵＳイントロンＡｔｔＰｌｒｅｖのＢａｍＨＩ部位内に連結させて、ベクターＣＭＰＳＧＵＳＡｔｔＰｌｒｅｖを形成させる。
【０１９１】
ＰＰＯ．ＰＭＩＡｔｔＰ２のＡｐａＩ部位を、最初に、部位変更５’−ＡＣＴ  ＡＧＴ  ＧＧＣ  Ｃ−３’（配列番号８３の）を用いて、ＳｐｅＩ部位へと転換させ、ＰＰＯ．ＰＭＩＡｔｔＰ２を形成させ、次にＡｔｔＰｌ部位を含むＣＭＰＳＧＵＳＡｔｔＰｌｒｅｖのＮｈｅＩフラグメントである５’ＳＰｅＩを、ＰＰＯ．ＰＭＩＡｔｔＰ２のＳｐｅＩ部位内に連結して、反転配位でＡｔｔＰ１とＡｔｔＰ２部位（ＬＰＡｔｔＰ１．２Ｐと呼ばれる）を含有する標的配列を形成させる。
例２３：ＡｔｔＢ部位を伴う単子葉植物標的配列
ｐＮＯＶ２１１４は、pＶＳｌとＣｏｌＥｌの両方の複製起点を有するバイナリベクターである。このベクターはｐＡＤ１２８９由来の構成性ＶｉｒＧ遺伝子（Hansen et. al.（１９９４） PNAS USA：９１７６０３−７６０７）、Ｔｎ７由来のスペクチノマイシン耐性遺伝子、及び左右ボーダー間のポリリンカーを含有する。
【０１９２】
ＡｔｔＢ部位から３’のところにあるＭＵＰＭＩＡｔｔＢのＰＭＩ発現カセットを、ｐＮＯＶ５０１３のＨｉｎｄＩＩＩ発現カセットフラグメントである、Ｐｓｔ１共に３方連結の形で、ＳｂｆｌフラグメントであるＡＳＰ７１８Ｉとして、ｐＮＯＶ２１１４のＨｉｎｄＩＩＩポリリンカー部位であるＡＳＰ７１８Ｉ中に導入し、バイナリベクターＡｔｔＢＰＭＩ．ＰＰＯを形成させる。
【０１９３】
ＡｔｔＢＰＭＩ．ＰＰＯのＡｓｃＩ部位を、最初に、部位変更オリゴ５’−ＣＧＣ  ＧＡＣ  ＴＡＧ  Ｔ−３’（配列番号８８）を用いてＳｐｅＩ部位に転換し、ＡｔｔＢＰＭＩＰＰＯ．Ｓｐｅを形成させる。次に、ＡｔｔＢ部位を除く、ＣＭＰＳＧＵＳＡｔｔＢｒｅｖのＳｐｅＩフラグメントである５’ＢｇｌＩＩ（クレノウ充填）を、ＡｔｔＢＰＭＩ．ＰＰＯ．ＳｐｅのＳｐｅＩ部位であるＡｓｐ７１８Ｉ（クレノウ充填）内に連結させ、単一ＡｔｔＢ部位を伴う標的配列（ＬＰｓｇＡｔｔＢと呼ばれる）を形成させる。
例２４：ＡｔｔＰ部位を伴う単子葉植物標的配列
ａｔｔＰ部位を含むＭＵＰＭＩＡｔｔＰのＰＭＩ発現カセットの３’半分を、ｐＮＯＶ２１１４に導入し、完全なＰＰＯ発現カセットを含有するｐＮＯＶ５０１３のＨｉｎｄＩＩＩフラグメント、ＰｓｔＩと共に３方連結の形で、ＳｂｆｌフラグメントであるＡｓｐ７１８Ｉ、としてＡｓｐ７１８Ｉ、ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、バイナリベクターＡｔｔＰＰＭＩ．ＰＰＯを形成させる。
【０１９４】
ＡｔｔＰＰＭＩ．ＰＰＯのＡｓｃＩ部位を、最初に、部位変更オリゴ（配列番号８８）５’−ＣＧＣ  ＧＡＣ  ＴＡＧ  Ｔ−３’を用いてＳｐｅＩ部位に転換させ、ＡｔｔＰＰＭＩ．ＰＲＯ．Ｓｐｅを形成させる。次に、ＡｔｔＢ部位を除く、ＣＭＰＳＧＵＳＡｔｔＢｒｅｖのＳｐｅＩフラグメントである５’ＢｇｌＩＩ（クレノウ充填）を、ＡｔｔＰＰＭＩ．ＰＰＯ．ＳｐｅのＳｐｅＩ部位であるＡｓｐ７１８Ｉ（クレノウ充填）内に連結させ、単一ＡｔｔＢ部位を含有する標的配列（ＬＰｓｇＡｔｔＢと呼ばれる）（図4）を形成させる。
Ｂ．トウモロコシ標的細胞系列の産生
例２５：標的配列構成体を導入するためのトウモロコシのAgrobacterium媒介型形質転換
未成熟なトウモロコシ胚芽の形質転換を、基本的にNegrotto et al,(２０００) Plant Cell Report １９：７９８−８０３中に記述されているように実施する。
例２５Ａ．形質転換プラスミド及び選択マーカー
標的配列、ＬＰｄｂＡｔｔＢ、ＬＰｄｂＡｔｔＰ、ＬＰＡｔｔＰ１．Ｐ２、ＬＰｓｇＡｔｔＢ、及びＬＰｓｇＡｔｔＰ（図４）は、トウモロコシの形質転換に適したバイナリベクター中にあり、ブタフェナシルが補足された培地を用いたトウモロコシ遺伝子導入細胞の選択を可能にする、突然変異体プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＰＯ）遺伝子（米国特許第６，２８８，３０６号）を内含しする。
例２５Ｂ．Agrobacterium  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの調製
標的配列バイナリベクターを含有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株ＬＢＡ４４０４（ｐＳＢｌ）（Ishida et. al.（１９９６）Nature Biotechnology１４：７４５−７５０）を、２８℃で２−４日間、ＹＰ固体培地（酵母エキス（５ｇ／Ｌ）、ペプトン（１０ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（５ｇ／Ｌ）、寒天１５ｇ／ｌ、ｐＨ６．８）上で成長させる。およそ０．８×１０9のＡｇｕｒｏｂａｃｔｅｒｉａを、１００μＭのＡＳ（Negrotto et al. Plant Cell Rep １９：７９８−８０３)を補足したＬＳ−ｉｎｆ培地中に懸濁させる。バクテリアを３０−６０分間この培地中で予備誘発させる。
例２５Ｃ．培地の調製
１．ＪＭＳ株
主要塩類１０×。  １Ｌ調製用：ＮＨ4ＮＯ3、１６．９ｇ；ＫＮ０3、１８．２ｇ；ＣａＣｌ2２Ｈ2０、２．１ｇ；ＭＧＳＯ4−７Ｈ2Ｏ、４．０ｇ；ＫＨ2ＰＯ４，３．５ｇ。
【０１９５】
副塩類１００×。  １Ｌ調製用：ＫＩ、０．１ｇ；Ｈ3ＢＯ3、０．５ｇ；ＭｎＳＯ4・４Ｈ2Ｏ、１．０ｇ；ＺｎＳ０4・７Ｈ2Ｏ，０．１ｇ；ＮａＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ、０．０１０ｇ；ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ，０．０２０ｇ・ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ，０．０１０ｇ
Ｇ５添加物１００×。  １Ｌ調製用：カゼイン加水分解物、ｌ０ｇ；チアミンＨＣｌ、０．５ｇ；ピリドキシンＨＣｌ、０．０５ｇ；ニコチン酸、０．５ｇ；ミオイノシトール、ｌ０ｇ；プロリン、ｌ０ｇ；フィルター殺菌する
ジカンバ。  ０．１ＭのＨＣｌ中、１ｍｇ／ｍｌ
チカルシリン。  １００ｍｇ／ｍｌの蒸留水；フィルター殺菌する。
【０１９６】
硝酸銀。  ＡｇＮＯ3１０ｍｇ／ｍｌ；フィルター殺菌する。
マンノース．1g/mlの蒸留水；溶解のために加熱し、フィルター殺菌する。
【０１９７】
２．ＪＭＳ処方
２ＪＭＳＴｉ２００Ａｇ。  １Ｌ調製用：ＪＭＳ主要塩類、１００ｍｌ；ＳＨ副塩類、１０ｍｌ；ＦｅＳＯ4−７Ｈ2Ｏ、２７．８ｍｇ；ジカンバ、５ｍｌ；スクロース、２０ｇ。ｐＨは５．８に調整：２．４ｇ／ＬのＧｅｌｒｉｔｅを添加する。オートクレーブ処理する。オートクレーブ処理後の添加：Ｇ５添加物、１０ｍｌ；チカルシリン、２ｍｌ；ＡｇＮＯ3、０．５ｍｌ。
【０１９８】
２ＪＭＳＴｉ２００。  １Ｌ調製用：ＪＭＳ主要塩類、１００ｍｌ；ＳＨ副塩類、１０ｍｌ；ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、２７．８ｍｇ；ジカンバ、５ｍｌ；スクロース、２０ｇ。ｐＨは５．８に調整：２．４ｇ／ＬのＧｅｌｒｉｔｅを添加する。オートクレーブ処理。オートクレーブ処理の後の添加：Ｇ５添加物、１０ｍｌ；チカルシリン、２ｍｌ。
【０１９９】
２ＪＭＳＡｇ。  １Ｌ調製用：ＪＭＳ主要塩類、１００ｍｌ；ＳＨ副塩類、１０ｍｌ；ＦｅＳＯ4．７Ｈ2Ｏ、２７．８ｍｇ；ジカンバ、５ｍｌ；スクロース、２０ｇ。ｐＨは５．８に調整：２．４ｇ／ｌのＧｅｌｒｉｔｅを添加する。オートクレーブ処理。オートクレーブの処理後の添加：Ｇ５添加物、１０ｍｌ；ＡｇＮＯ3、０．５ｍｌ。
【０２００】
１２ＪＭＳ。  １Ｌ調製用：ＪＭＳ主要塩類、１００ｍｌ；ＳＨ副塩類、１０ｍｌ；ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、２７．８ｍｇ；ジカンバ、５ｍｌ；スクロース、１２０ｇ。ｐＨは５．８に調整：２．４ｇ／ｌのＧｅｌｒｉｔｅを添加する。オートクレーブ処理。オートクレーブ処理の後の添加：Ｇ５添加物、１０ｍｌ。
【０２０１】
ＪＭＳ  １Ｍ／０．５Ｓ。  １Ｌ調製用：ＪＭＳ主要塩類、１００ｍｌ；ＳＨ副塩類１０ｍｌ；ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、２７．８ｍｇ；ジカンバ、５ｍｌ；スクロース、５ｇ。ｐＨは５．８に調整：２．４ｇ／ｌのＧｅｌｒｉｔｅを添加する。オートクレーブ処理。オートクレーブ処理の後の添加：  Ｇ５添加物、１０ｍｌ、チカルシリン、２ｍｌ；マンノース、１０ｍｌ。
【０２０２】
３．ＭＳ処方
ＭＳＡＫ３ＳＰＯ4２００Ｔｉ。  １Ｌ調製用：ＭＳ塩、４．３ｇ；ＭＳビタミン（１００×）、１０ｍｌ；アンシミドール、０．２５ｍｇ；キニチン、０．５ｍｇ；ＫＨ2ＰＯ4、０．１７ｇ；スクロース、３０ｇ。ｐＨは５．８に調整：２．４ｇ／ＬのＧｅｌｒｉｔｅを添加する。オートクレーブ処理。オートクレーブ処理の後の添加：チカルシリン、２ｍｌ。
【０２０３】
ＭＳＡＫＰＯ4２００Ｔｉ２Ｓ／０．５Ｍ。  １Ｌ調製用：ＭＳ塩、４．３ｇ；ＭＳビタミン（１００×）、１０ｍｌ；アンシミドール、０．２５ｍｇ；キニチン、０．５ｍｇ；ＫＨ2ＰＯ4、０．１７ｇ；スクロース、２０ｇ。ｐＨは５．８に調整：２．４ｇ／ＬのＧｅｌｒｉｔｅを添加する。オートクレーブ処理。オートクレーブ処理の後の添加：チカルシリン、２ｍｌ；マンノース、１０ｍｌ。
【０２０４】
ＭＳ２００Ｔｉ２Ｓ／０．５Ｍ。  １Ｌ調製用：ＭＳ塩、４．３ｇ；ＭＳビタミン（１００×）、１０ｍｌ；スクロース、２０ｇ。ｐＨは５．８に調整：２．４ｇ／ＬのＧｅｌｒｉｔｅを添加する。オートクレーブ処理。オートクレーブ処理の後の添加：チカルシリン、２ｍｌ；マンノース、１０ｍｌ。
【０２０５】
０．７５ＭＳ３１０ＰＰＭ。  １Ｌ調製用：ＭＳ塩、４．３ｇ；ＭＳビタミン（１００×）、１０ｍｌ；スクロース、３０ｇ。ｐＨは５．８に調整：２．４ｇ／ＬｌのＧｅｌｒｉｔｅを添加する。オートクレーブ処理。オートクレーブ処理の後の添加分：植物防腐剤混合（Plant Cell Technology）、１０ＭＬ／Ｌ．
例２５Ｄ．接種
Ａ１８８ＸＨＩＩＩ又は他の適切な遺伝子型由来の未成熟な胚芽を、８−１２日経過した穂から液体ＬＳ−ｉｎｆ＋１００μＭ  Ａｓ（アセトシリンゴン）内に切除する。胚芽を新鮮な感染培地を用いて１回洗浄し、４５℃で熱衝撃処理を施す。次にAgrobacterium溶液を添加し、胚芽を３０秒間渦流に付し、５分間細菌と共に沈殿させる。次に胚芽を、胚盤側を上にして５００μＭのＡｓを含有するＬＳＡｓ培地（Negrotto et al. (２０００) Plan Cell Rep１９：７９８−８０３）に移し、２日〜３日間暗所で培養する。その後、ペトリ皿１枚あたり２０〜２５個の胚芽を、５ｎＭのブタフェナシルを補足した２ＪＭＳＴｉ２００ＡＧ培地に移し９−１４日間２８℃で暗所で培養する。
例２５Ｅ．形質転換を受けたトウモロコシの選択
胚形成カルスを産生する未成熟な胚芽を、７５０ｎＭのブタフェナシルを補足した２ＪＭＳＴｉ２００培地に移す。この培養を、暗所で２−３週間この培地上で選択し、次に、７５０ｎＭｎｏブタフェナシルを補足した２ＪＭＳＴｉ２００培地上で継代培養し、さらに２−３週間暗所で継代培養した。
例２５Ｆ．形質転換を受けたトウモロコシ植物の再生
選択を生き延びたカルスを、ＭＳＡＫ３ＳＰＯ4２００Ｔｉ培地に移して、１０−１４日間暗所に置く。生き残ったカルスをＭＳＡＫ３ＳＰＯ4２００Ｔｉ培地に移して、７−１０日間光の下に置く。再生苗条を、０．７５ＭＳ３Ｓ１０ＰＰM培地を含有するＭａｇｅｎｔａ  ＧＡ−７ボックス(Magenta Corp, Chicago Ill.)に移し、根の成長が土壌へ移植に十分なものとなるまで光の下で成長させる。
例２５Ｇ．形質転換を受けたトウモロコシ植物の分析
ＧＡ７ボックス内で２−３週間経過した後に、ＰＰＯ遺伝子及びその他の問題の遺伝子の存在についてＰＣＲにより植物を試験する。ＰＣＲ検定の結果陽性の植物を、ＴａｑＭａｎ（Applied Biosystems）を用いて定量的実時間ＰＣＲ検定により試験し、単一の又は少ないコピー数の挿入候補を温室に送る。形質転換を受けたトウモロコシ植物内に標的配列の無傷の挿入が存在することをさらに確認するために、候補植物に対してサザン分析を実施する。
Ｃ．植物内の発現のためのＩｎｔ構成体
例２：単子葉植物と双子葉植物内での組換えを媒介するためのトウモロコシ最適化されたラムダインテグラーゼ、Ｉｎｔ−ｈ、Ｉｎｔ−ｈ／２１８、エキシジオナーゼ、及びＥ．Ｃｏｌｉ組込み宿主因子発現ベクターの構築
例２６Ａ．双子葉植物及び単子葉植物発現ベクターＣＭＳｙｎＩｎｔの構築
細菌宿主中でのインテグラーゼの発現に対っし防御するべくイントロンをインテグラーゼコーディング領域中に導入する目的で、Ｐｍｌｌを用いてＭＵＳｙｎＩｎｔを消化させる。ＰｖｕＩＩ／ＳｎａＢＩ切除されたイントロンフラグメント（ｐＢＩＳＮｌからのそのクローニングについては例１１Ａに記述されている）を、ＭＵＳｙｎＩｎｔのコーディング領域内でユニークＰｍｌＩ部位内に連結させて、ＭＵＳｙｎＩｎｔ’を形成させる。
【０２０６】
Ａｓｐ７１８Ｉで消化させ、以下のオリゴヌクレオチド、つまり５’−ＧＴＡ  ＣＧＧ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＣＣ−３’（配列番号８９）中で連結させることによって、ＸｈｏＩ部位を、ＭＵＳｙｎＩｎｔの発現カセットの３’末端に作り上げる。結果として生じたプラスミドＭＵＳｙｎＩｎｔＸを、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩで消化させ、トウモロコシユビキチンプロモータを切除する。
【０２０７】
ＳｐｅＩを用いてＣＭＰＳプロモータを内含するｐＮＯＶ４２１２を部位を消化させ、該部位を、オリゴヌクレオチド５’−ＣＴＡ  ＧＧＡ  ＧＡＴ  ＣＴＣ−３’（配列番号９０）を用いた連結によりＢｇｌＩＩ部位に転換させて、４２１２Ｂｇを形成させる。ＣＭＰＳプロモーターフラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｇｌＩＩでの消化により４２１２Ｂｇから切除し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ消化されたＭＵＳｙｎＩｎｔ’Ｘプラスミドに連結させ、ＣＭＳｙｎＩｎｔを形成させる。
例２６Ｂ．両方とも双子葉及び単子葉植物発現ベクターである、ＣＭＳｙｎＩｎｔ−ｈ及びＣＭＳｙｎＩｎｔ−ｈ／２１８の構築
例２６Ａに記述されたように、ＭＵＳｙｎＩｎｔ−ｈ’及びＭＵＳｙｎＩｎｔ−ｈ／２１８’を、それぞれＭＵＳｙｎＩｎｔ−ｈ及びＭＵＳｙｎＩｎｔ−ｈ／２１８から形成させる。例２６Ａで記述されたように、ＭＳｙｎＩｎｔと全く同じ方法で、それぞれＣＭＳｙｎＩｎｔ−ｈ及びＣＭＳｕｎＩｎｔ−ｈ／２１８は、ＭＵＳｙｎＩｎｔ−ｈ’及びＭＵＳｙｎＩｎｔ−ｈ／２１８’を用いて作る。
例２６Ｃ．双子葉植物及び単子葉植物発現ベクターＣＭＳｙｎＨＦαの構築
ＨｉｎＤＩＩＩを用いてＭＵＳｙｎＨＦαを消化させ、オリゴヌクレオチド５’−ＡＧＣ  ＴＡＣ  ＴＡＧ  Ｔ−３’（配列番号９１）に対する連結によって部位をＳｐｅＩ部位へ転換させる。結果として得られたプラスミドＭＵＳｙｎＨＦαＳｐを、ＳｐｅＩ／ＢａｍＨＩで消化させて、ユビキチンプロモーターを切除する。ＣＭＰＳプロモータを含有するｐＮＯＶ４２１１を、ＰｓｔＩで消化させ、オリゴヌクレオチド５’−ＣＣＡＧＡＴＣＴＧＧＴＧＣＡ−３’（配列番号９２）中で連結させることによって、該部位をＢＧＬＩＩ部位へ部位変更させ、４２１ＬＢＧを形成させる。ＣＭＰＳプロモータを、ＳｐｅＩとＢｇｌＩＩを用いて４２１ＬＢＧから切除し、ＳｐｅＩ／ＢａｍＨＩ消化されたＭＵＳｙｎＨＦαＳｐに連結させてＣＭＳｙｎＨＦαを形成させる。、
例２６Ｄ．双子葉植物及び単子葉植物発現ベクター、ＣＭＳｙｎＩＨＦβの構築
Ａｓｐ７１８ＩでＭＵＳｙｎＨＦβを消化させ、オリゴヌクレオチド５’−ＧＴＡ  ＣＧＧ  ＡＣＴ  ＡＧＴ  ＣＣ−３’（配列番号９３）  に対する連結によって部位をＳｐｅＩ部位に転換させる。結果として得られるプラスミドＭＵＳｙｎＨＦβＳｐを、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩで消化させて、ユビキチンプロモーターを切除する。４２１２Ｂｇを、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩで消化させ、結果として得られるＣＭＰＳプロモーターフラグメントをＭＵＳｙｎＨＦβＳｐ内に連結させてＣＭＳｙｎＨＦβを形成させる。
例２６Ｅ．ＣＭＳｙｎＩｎｔ、ＣＭＳｙｎＨＦα及びＣＭＳｙｎＨＦβの、単一プラスミドの形での組合せ。
１．ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中でのｐＢＳＩｎｔＨＦの構築
ＨｉｎＤＩＩＩ及びＸｈｏＩでＣＭＳｙｎＩｎｔを消化させ、分取ゲル電気泳動によりインサートを分離する。ＳｐｅＩ及びＡｓｐ７１８ＩでＣＭＳｙｎＨＦａを消化させ、そのインサートも同じ要領で精製する。ＨｉｎｄＩＩＩを用いてＣＭＳｙｎＨＦβを消化させ、オリゴヌクレオチド５’−ＡＧＣ  ＴＣＴ  ＣＧＡ  Ｇ−３’（配列番号９４）を用いて部位をＸｈｏＩ部位に転換させる。結果として得られたプラスミドＣＭＳｙｎＨＦβＨを、ＸｈｏＩ及びＳｐｅＩで消化させ、そのインサートを同じ要領で精製する。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩ／Ａｓｐ７１８Ｉで消化させ、アルカリホスファターゼによって処理する。ゲル精製の後に、このベクターを、４方連結の形で３つのインサートフラグメントと接合させて、ｐＢＳＩｎｔＨＦを形成させる。
２．ＲＫＩｎｔＨＦバイナリベクターの構築
ＨｉｎｄＩＩＩ／Ａｓｐ７１８Ｉを用いてバイナリベクターｐＮＯＶ２１２２を消化させ、アルカリホスファターゼで処理する。ゲル精製の後に、このベクターと上述３つのインサートフラグメントを、４方連結によって接合させて、ＲＫＩｎｔＨＦを形成させる。
３．  ＶＳＩｎｔＨＦバイナリベクターの構築
ＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｓｐ７１８ＩでＲＫＩｎｔＨＦを消化させ、４０９９ｂｐのフラグメントを精製する。アルカリホスファターゼの存在下で、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｓｐ７１８Ｉを用いてｐＮＯＶ２１１４を消化させ、ベクターを精製する。インサートとベクターの連結によりＶＳＩｎｔＨＦが産生される。
【０２０８】
例２６Ｆ．ＣＭＳｙｎＩｎｔ−ｈ、ＣＭＳｙｎＨＦα及びＣＭＳｙｎＨＦβの、単一プラスミドの形での組合せ
１．ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中でのｐＢＳＩｎｔ−ｈＨＦの構築
ｐＢＳＩｎｔＨＦを形成させるための上述した４方連結を、ＣＭＳｙｎＩｎｔ由来のＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ消化されたインサートの代わりにＣＭＳｙｎＩｎｔ−ｈ由来のＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ消化されたインサートを使って実施し、ｐＢＳＩｎｔ−ｈＨＦを形成させる。
２．ＲＫＩｎｔ−ｈＨＦバイナリベクターの構築
ＲＫＩｎｔＨＦを形成させるための上述した４方連結を、ＣＭＳｙｎＩｎｔ由来のＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ消化されたインサートの代わりにＣＭＳｙｎＩｎｔ−ｈ由来のＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ消化されたインサートを使って同じ要領で実施し、ＲＫＩｎｔ−ｈＨＦを形成させる。
３．  ＶＳＩｎｔ−ｈＨＦバイナリベクターの構築
ＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｓｐ７１８ＩでＲＫＩｎｔ−ｈＨＦを消化させ、４０９９ｂｐのフラグメントを精製する。アルカリホスファターゼの存在下で、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｓｐ７１８Ｉを用いてｐＮＯＶ２１１４を消化させ、ベクターを精製する。インサートとベクターの連結によりＶＳＩｎｔ−ｈＨＦが産生される。
例２６Ｇ．ＣＭＳｙｎＩｎｔ−ｈ／２１８、ＣＭＳｙｎＨＦα及びＣＭＳｙｎＨＦβの、単一プラスミドの形での組合せ
１．ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中でのｐＢＳＩｎｔ−ｈ／２１８ＨＦの構築
ｐＢＳＩｎｔＨＦを形成させるための上述した４方連結を、ＣＭＳｙｎＩｎｔ由来のＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ消化されたインサートの代わりにＣＭＳｙｎＩｎｔ−ｈ／２１８由来のＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ消化されたインサートを使って実施し、ｐＢＳＩｎｔ−ｈ／２１８ＨＦを形成させる。
２．ＲＫＩｎｔ−ｈ／２１８ＨＦバイナリベクターの構築
ＲＫＩｎｔＨＦを形成させるための上述した４方連結を、ＣＭＳｙｎＩｎｔ由来のＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ消化されたインサートの代わりにＣＭＳｙｎＩｎｔ−ｈ／２１８由来のＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ消化されたインサートを使って同じ要領で実施し、ＲＫＩｎｔ−ｈ／２１８ＨＦを形成させる。
３．  ＶＳＩｎｔ−ｈ／２１８ＨＦバイナリベクターの構築
ＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｓｐ７１８ＩでＲＫＩｎｔ−ｈ／２１８ＨＦを消化させ、４０９９ｂｐのフラグメントを精製する。アルカリホスファターゼの存在下で、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｓｐ７１８Ｉを用いてｐＮＯＶ２１１４を消化させ、ベクターを精製する。インサートとベクターの連結によりＶＳＩｎｔ−ｈ／２１８ＨＦが産生される。
例２６Ｈ．ＲＫＩｎｔバイナリベクターの構築
ＣＭＳｙｎＩｎｔの発現カセットを、ＥｃｏＲＩフラグメントとして切除し、ＥｃｏＲＩで消化させアルカリホスファターゼで処理した、ＲＫ２ベースのバイナリベクターｐＮＯＶ２１２２内に連結させて、プラスミドＲＫＩｎｔを形成させる。
例２６Ｉ．ＲＫＩｎｔ−ｈバイナリベクターの構築
ＣＭＳｙｎＩｎｔ−ｈの発現カセットを、ＥｃｏＲＩフラグメントとして切除し、ＥｃｏＲＩで消化させアルカリホスファターゼで処理した、ＲＫ２ベースのバイナリベクターｐＮＯＶ２１２２内に連結させて、プラスミドＲＫＩｎｔ−ｈを形成させる。
例２６Ｊ．ＲＫＩｎｔ−ｈ／２１８バイナリベクターの構築
ＣＭＳｙｎＩｎｔ−ｈ／２１８の発現カセットを、ＥｃｏＲＩフラグメントとして切除し、ＥｃｏＲＩで消化させアルカリホスファターゼで処理したＲＫ２ベースのバイナリベクターｐＮＯＶ２１２２内に連結させて、プラスミドＲＫＩｎｔ−ｈ／２１８を形成させる。
例２６Ｋ．ＶＳＩｎｔ−ｈ／２１８バイナリベクターの構築
ＣＭＳｙｎＩｎｔ−ｈ／２１８をＥｃｏＲＩで消化させ、２０１２ｂｐのインサートフラグメントを精製する。ｐＮＯＶ２１１４を、アルカリホスファターゼの存在下で、ＥｃｏＲＩで消化させ精製する。このベクターを、ＣＭＳｙｎＩｎｔ−ｈ／２１８を含有するＥｃｏＲＩフラグメントに連結させ、形成された２つの産物をＶＳＩｎｔ−ｈ／２１８Ａ及びＶＳＩｎｔ−ｈ／２１８Ｂと命名する。
例２６Ｌ．エキシジオナーゼ発現カセットを含有するバイナリベクターの構築
ＳｙｎＸｉｓ遺伝子配列（例７から）を、そのＴＯＰＯベクターからＢａｍＨＩ／ＳａｃＩフラグメントとして切除し、発現ベクターＣＭＳｙｎＨＦβのＢａｍＨＩ／ＳａｃＩ部位に挿入して、２９９４ＳｙｎＸｉｓを形成させる。ＣＭＰＳプロモータを含有するＣＭＳｙｎＨＦβの４０４ｂｐフラグメントを、２９９４ＳｙｎＸｉｓのＢａｍＨＩ部位中に挿入して、ＣＭＳｙｎＸｉｓを形成させる。ＣＭＳｙｎＸｉｓの９４５ｂｐＥｃｏＲＩフラグメントを、ＥｃｏＲＩで消化させたＶＳＩｎｔ−ｈ／２１８Ａのバイナリベクター部分の内に連結させて、ＶＳＸｉｓを形成させる。
例２６Ｍ．ＣＭＳｙｎＩｎｔ、ＣＭＳｙｎＩＨＦα及びＣＭＳｙｎＨＦβを伴う小麦ジェミニウイルスレプリコン、ｖＩｎｔＨＦの構築
ｐＢＳＩｎｔＨＦを、ＳｐｅＩとＸｈｏＩで消化させ、ＣＭＰＳＩｎｔ遺伝子を含有する２０４７ｂｐのフラグメントを精製する。ＸｈｏＩとＡｓｐ７１８Ｉを用いた同一プラスミドの消化が、ＩＨＦ遺伝子を含有する２０８８ｂｐのフラグメントを提供する。３方連結によって、これら２つの挿入フラグメントを、ＳｐｅＩ及びＡｓｐ７１８Ｉよって消化された精製ウイルスベクターｐＷＩ−１１Ｍに接合させる。産物をｖＩｎｔＨＦと命名する。
例２６Ｎ．ＣＭＳｙｎＩｎｔ−ｈ／２１８、ＣＭＳｙｎＨＦα及びＣＭＳｙｎＨＦβを伴う小麦ジェミニウイルスレプリコン、ｖＩｎｔ−ｈ／２１８ＨＦの構築
ｐＢＳＩｎｔ−ｈ／２１８ＨＦを、ＳｐｅＩ及びＸｈｏＩで消化させ、ＣＭＰＳＩｎｔ−ｈ／２１８遺伝子を含有する２０４７ｂｐのフラグメントを精製する。以上からの２０８８ｂｐのＩＨＦ遺伝子フラグメントをここでも再度使用する。３方連結によって、これら２つのインサートフラグメントを、ＳｐｅＩ及びＡｓｐ７１８Ｉ消化されたウイルスベクターｐＷＩ−１１Ｍに接合させる。産物をｖＩｎｔ−ｈ／２１８ＨＦと命名する。
例２６Ｏ．ＣＭＳｙｎＩｎｔ−ｈ／２１８を伴う小麦ジェミニウイルスレプリコン、ｖＩｎｔ−ｈ／２１８の構築
上述のｐＢＳＩｎｔ−ｈ／２１８ＨＦの２０４７ｂｐのＳｐｅＩ／ＸｈｏＩフラグメントを、ＳｐｅＩ及びＳａｌＩよって消化されたｐＷＩ−１１Ｍに結合させる。結果として得られたプラスミドをｖＩｎｔ−ｈ／２１８と命名する。
例２６Ｐ．Agrobacterium  ＬＢＡ４４０４（ｐＳＢＩ）中の小麦萎縮病ジェミニウイルスＤＮＡレプリコンによってフランキングされたバイナリベクターｐＮＯＶ２１１４中へのＣＭＰＳＩｎｔＨＦ、ＣＭＰＳＩｎｔ−ｈ／２１８ＨＦ、及びＣＭＰＳＩｎｔ−ｈ／２１８の導入
ウイルスレプリコンの反復コピーを伴うＴ−ＤＮＡベクターは、反復の間に挿入されたＤＮＡと共に、ウイルスゲノムの切除を可能にする。かかる切除事象は植物ゲノム内へのＴ−ＤＮＡの挿入に先行するか又は後続するかのいずれであってもよい。このアプローチにより、挿入されたＤＮＡを、適切な宿主植物細胞中で多くのコピー数まで複製することが可能になる。構成体は２段階で作成される。最初に、Ｔ−ＤＮＡボーダーの間にウイルスゲノム（ＮＰＴＩＩ遺伝子及び非相容性Ｅ．Ｃｏｌｉ  ｏｒｉを除く）の一部分を伴うバイナリベクターを構築し、ＬＢＡ４４０４などのAgrobacteriumヘルパー菌株へと形質転換させる。
【０２０９】
次に、このAgrobacterium菌株を、ＫｍＲについて選択し、Ｔ−ＤＮＡに挿入すべきウイルスプラスミドを用いて再形質転換させる。ウイルスベクターはAgrobacterium中では複製できないことから、ＫｍＲについての選択により、Ｔ−ＤＮＡ中にウイルスが同時組込されたクローンが同定される。プラスミドｖＣＭＬｕｃＢ／Ｐ（下の例６７Ａ）を、ＳｐｈＩで消化し、結果として得られたベクターの中にオリゴヌクレオチド（５’−ＣＣＧ  ＧＡＴ  ＣＣＧ  ＧＣＡ  ＴＧ−３’（配列番号９５））を連結させて、ＳｐｈＩ部位をＢａｍＨＩに転換する。
【０２１０】
結果として得られたプラスミド、ｖＣＭＬｕｃＢ／Ｐ−ＢａｍＨＩから、ＢａｍＨＩでの消化により、ウイルスベクター（ＰＷＩ−１１Ｍ）を含有する３１４９ｂｐのフラグメントから、６３７ｂｐのｐｌ５Ｑ  ｏｒｉ領域を差し引いたものが提供される。バイナリベクターｐＮＯＶ２１１４を、アルカリホスファターゼの存在下でＢｇｌＩＩで消化させ、精製されたベクターフラグメントをｐＷＩ−１１Ｍの３１４９ｂｐのフラグメントを用いて連結させる。ＮＰＴＩＩ遺伝子がＴ−ＤＮＡのＲＢの近くにあるような形で配位されたインサートを有するプラスミドを同定し、それを２１１４ＷＩ−ＩＩＢと名付ける。ＸｂａＩでそれを消化させ、大半のＮＰＴＩＩ遺伝子を除去するために再連結させ、産物を２１１４ＷＩ−ＡＸＢと命名する。このプラスミドを、ｐＮＯＶ２１１４のスペクチノマイシン耐性について選択するAgrobacterium菌株ＬＢＡ４４０４（ＰＳＢ１）へと形質転換させる。結果として得られたAgrobacterium菌株は、ＬＢＡ４４０４（ｐＳＢｌ）（２１１４ＷＩ−ΔＸＢ）である。この菌株から、ウイルス構成体の導入のために、電気コンピテント細胞を調製する。
例２６Ｑ．Agrobacterium内でのＶｅｘＣＭＩｎＦの構築
プラスミドｖＩｎｔＨＦを、ＬＢＡ４４０４（ＰＳＢＬ）（２１１４ＷＩ−ΔＸＢ）へと形質転換し、形質転換体を、Ｋｍ５０、Ｓｐｅｃ１００及びＴｃ５を伴うＹＰ寒天上で選択する。ウイルスフランキングされたＣＭＩｎｔＨＦ構成体を伴うＤＮＡの構造を、Agrobacteriumから単離されたミニプレップＤＮＡの分析によって確認する。
例２６Ｒ．Agrobacterium内でのＶｅｘＣＭＩｎｔ−ｈ／２１８ＨＦの構築
プラスミドＶＩｎｔ−ｈ／２１８ＨＦをＬＢＡ４４０４（ＰＳＢＬ）（２１１４ＷＩ−ΔＸＢ）へと電気形質転換し、形質転換体を、Ｋｍ５０、Ｓｐｅｃ１００及びＴｃ５を伴うＹＰ寒天上で選択する。ウイルスフランキングされたＣＭＩｎｔ−ｈ／２１８ＨＦ構成体を伴うＴ−ＤＮＡの構造を、Agrobacteriumから単離されたミニプレップＤＮＡの分析によって確認する。
例２６Ｓ．Agrobacterium内でのＶＶｅｘＣＭｉｎｔ−ｈ／２１８の構築
プラスミドｖＩｎｔ−ｈ／２１８をＬＢＡ４４０４（ｐＳＢＬ）（２１１４ＷＩ−ΔＸＢ）へと電気形質転換し、形質転換体を、Ｋｍ５０、Ｓｐｅｃ１００及びＴｃ５を伴うＹＰ寒天上で選択する。ウイルスフランキングされたＣＭＩｎｔ−ｈ／２１８構成体を伴うＴ−ＤＮＡの構造を、Agrobacteriumから単離されたミニプレップＤＮＡの分析によって確認する。
Ｄ．  トウモロコシ中の標的配列を用いた組換えのためのドナー配列の構築
一般に、本書中で構築されている典型的なドナー配列例はＰＭＩ発現カセットの５’−部分とＧＵＳ発現カセットの３’−部分、すなわち、該標的配列から欠如している各々の一部分を含有している。各遺伝子内部のイントロンの分割点はａｔｔ部位によって中断されている。
【０２１１】
ドナー構成体は、５’ＰＭＩ−５’イントロン−Ａｔｔ部位−３’イントロン−３’ＧＵＳの形態をとる単一ａｔｔ部位を含有する可能性がある。代替的には、ドナー構成体は、Ａｔｔ部位−３’イントロン−３’ＧＵＳ−５’ＰＭＩ−５’イントロン−Ａｔｔ部位という形態をとる、２つのａｔｔ部位を含有する可能性がある。ドナー中のイントロンの３’部分は、相容性のある標的配列の中の同じイントロンの５’部分に対応している。ドナー中のイントロンの５’部分は、相容性のある標的配列の中の同じイントロンの３’部分に対応している。ドナー中のatt部位(単複)は、対応する標的配列の中のａｔｔ部位(単複)と組換え能力を有する。さらに、切詰められた遺伝子との関係煮におけるａｔｔ部位の配位はドナー及び標的配列において同じである。
例２７：反転したａｔｔＢ部位を伴う単子葉植物ドナー
Arabidopsis Ａｃｔ２  ３’ＵＴＲ（AN, Y. Q. et. al.（１９９６）Plant. J.１０：１０７−１２１）を、プライマＰＡｃｔ２ＢＨ（５’−ＣＴＡ  ＡＧＧ  ＡＴＣ  ＣＡＡ  ＧＡＴ  ＣＡＡ  ＡＧＧ  ＣＴＴ  ＡＡＡ  ＡＡＧ  Ｃ−３’）（配列番号９６）及びＰＡｃｔ２ＸｂａＩ（５’−ＧＧＡ  ＡＴＣ  ＴＡＧ  ＡＴＧ  ＴＡＴ  ＡＡＡ  ＣＣＡ  ＡＡＴ  ＧＡＧ  ＣＡＧ−３’）（配列番号９７）を用いて、Arabidopsis thalianaコロンビア生態型から増幅させる。
【０２１２】
ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩとＸｂａＩで消化させ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（＋）内に連結させて、ｐＮＯＶ２７１３を形成させる。Arabidopsis thalianaアクチン−２  ３’の未翻訳領域を、ｐＮＯＶＶ２７１３からＮｏｔＩターミネーターフラグメント、ＢａｍＨＩ（クレノウ）として切除し、ＣＭＰＳＧＵＳＡｔｔＢｒｅｖのＧＵＳエクソン２の３’末端にあるＰｓｐＯＭＩ部位、ＡｖａＩ（クレノウ）内に連結させて、ＣＭＧＵＳＡｔｔＢｒＴａｃｔと命名される完全なＧＵＳ発現カセットを形成させる。
【０２１３】
反転ａｔｔＢ部位を伴うドナーを、（１）ＣＭＧＵＳＡｔｔＢｒＴａｃｔからＸｂａＩ（クレノウ）／ＢｇｌＩＩフラグメントとして切除された、ａｔｔＢ部位を含むＧＵＳ発現カセットの３’部分；（２）ＭＵＰＭＩＡｔｔＢからＳｐｈＩ（クレノウ）／ＡｖｒＩＩフラグメントとして切除された、ａｔｔＢ部位を含むＰＭＩ発現カセットの５’部分；及び（３）ＢａｍＨＩ／ＸｂａＩで消化されたｐＮＯＶ２１１４、の間の３方連結によって形成させる。該３方連結は、ＤＯＮｄｂＡｔｔＢと命名されるドナーを形成させる。
【０２１４】
ｐＮＯＶ５０１３のＰＰＯ発現カセットを、ＰｓｔＩフラグメントとしてＤＯＮｄｂＡｔｔＢのユニークＳｂｆＩ部位内に連結させて、ＤＯＮｄｂＡｔｔＢ．ＰＰＯを形成させることが可能であり、これは、例４８に記述されているように利用することができる。
例２８：反転ａｔｔＰ部位を伴う単子葉植物ドナー
Arabidopsis thalianaアクチン−２  ３’の未翻訳領域を、ｐＮＯＶ２７１３からＮｏｔＩターミネーターフラグメント、ＢａｍＨＩ（クレノウ）として切除し、ＣＭＰＳＧＵＳＡｔｔＰｒｅｖのＧＵＳエクソン２の３’末端にあるＰｓｐＯＭＩ部位、ＡｖａＩ（クレノウ）内に連結させて、ＣＭＧＵＳＡｔｔＰｒＴａｃｔと命名される完全なＧＵＳ発現カセットを形成させる。
【０２１５】
反転ａｔｔＰ部位を伴うドナーを、（１）ＣＭＧＵＳＡｔｔＰｒＴａｃｔからＸｂａＩ（クレノウ）／ＢｇｌＩＩフラグメントとして切除された、ａｔｔＰ部位を含むＧＵＳ発現カセットの３’部分；（２）ＭＵＰＭＩＡｔｔＰからＳｐｈＩ（クレノウ）／ＡｖｒＩＩフラグメントとして切除された、ａｔｔＰ部位を含むＰＭＩ発現カセットの５’部分；及び（３）ＢａｍＨＩ／ＸｂａＩで消化されたｐＮＯＶ２１１４、の間の３方連結によって形成させる。該３方連結は、ＤＯＮｄｂＡｔｔＰと命名されるドナーを形成させる。
【０２１６】
ｐＮＯＶ５０１３のＰＰＯ発現カセットを、ＰｓｔＩフラグメントとしてＤＯＮｄｂＡｔｔＰのユニークなＳｂｆＩ部位内に連結させてＤＯＮｄｂＡｔｔＰ．ＰＰＯを形成させることが可能であり、これは例４８に記述されているように利用することができる。
例２９．反転ａｔｔＢｌ及びａｔｔＢ２部位を伴う単子葉植物ドナー
ａｔｔＢｌ部位を、オリゴヌクレオチド対５’−ＧＡＴ  ＣＴＧ  ＧＧＧ  ＡＣＡ  ＡＧＴ  ＴＴＧ  ＴＡＣ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＧＣＡ  ＧＧＣ  ＴＴＣ  ＡＧＣ  ＴＡＧ  Ｃ−３’（配列番号９８）及び５’ＧＡＴ  ＣＧＣ  ＴＡＧ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  ＣＣＴ  ＧＣＴ  ＴＴＴ  ＴＴＧ  ＴＡＣ  ＡＡＡ  ＣＴＴ  ＧＴＣ  ＣＣＣ  Ａ−３’（配列番号９９）を用いてｐＮＯＶ５００３のＧＵＳ遺伝子中のＡＴ  ＢＡＦ６０イントロンのＢｇｌＩＩ部位内に導入する。これらのオリゴヌクレオチドを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化させ、次にＢｇｌＩＩで消化されかつアルカリホスファターゼによって処理されたｐＮＯＶ５００３と連結反応中で組合わせる。ａｔｔＢ１部位がＧＵＳコーディング領域の配位との関係において３’から５’への方向にあることを確認するために結果として得られたプラスミドＧＵＳＡｔｔＢｌｒｅｖを配列決定する。
【０２１７】
Arabidopsis thalianaアクチン−２  ３’未翻訳領域を、切除し、ｐＮＯＶ２７１３の（Ｔａｃｔ）をＧＵＳＡｔｔＢｌｒｅｖの３’末端において３方連結により付加する。ＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩで消化させたベクターｐＵＣ１８を、ＭｆｅＩ／ＸｈｏＩで消化されたＧＵＳＡｔｔＢｌｒｅｖ及びＸｈｏＩ、ＸｂａＩで消化させたｐＮＯＶ２７１３と共に連結させて、ＧＵＳＡｔｔＢｌｒｅｖＴａｃｔを産生させる。
【０２１８】
ａｔｔＢ２部位を、オリゴヌクレオチド対５’−ＡＡＴ  ＴＧＧ  ＴＡＣ  ＣＴＧ  ＡＡＣ  ＣＣＡ  ＧＣＴ  ＴＴＣ  ＴＴＧ  ＴＡＣ  ＡＡＡ  ＧＴＧ  ＧＴＣ  ＣＣＣ  ＴＡＧ  Ｇ−３’（配列番号１００）及び５’ＡＡＴ  ＴＣＣ  ＴＡＧ  ＧＧＧ  ＡＣＣ  ＡＣＴ  ＴＴＧ  ＴＡＣ  ＡＡＧ  ＡＡＡ  ＧＣＴ  ＧＧＧ  ＴＴＣ  ＡＧＧ  ＴＡＣ  Ｃ−３’（配列番号１０１）を用いて、ｐＮＯＶ２７９０のＰＭＩイントロン３のＭｆｅＩ部位に導入する。これらのオリゴヌクレオチドを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化させ、次にＭｆｅＩで消化させかつアルカリホスファターゼで処理したｐＮＯＶ２７９０と連結反応において組合わせる。ａｔｔＢ２部位がＰＭＩイントロン３の配位との関係において５’から３’への方向にあることを確認するために、結果として得られたプラスミドｐＮＯＶ２７９０ＡｔｔＢ２を配列決定する。
【０２１９】
ａｔｔＢ２部位を含有するＰＭＩイントロン３を、ＢｓｔＢＩ、ＰｓｈＡＩフラグメントとしてｐＮＯＶ２７９０ＡｔｔＢ２から切除し、ＢｓｔＢＩ、ＰｓｈＡＩで切断されたバイナリベクターｐＮＯＶ２１１７内に連結させ、ａｔｔＢ２部位を伴うＰＭＩイントロン３を含有するＭＵＰＭＩＡｔｔＢ２と呼ばれるＰＭＩ発現カセットを形成させる。
【０２２０】
反転ａｔｔＢ１及びａｔｔＢ２部位を伴うドナーを、（１）ＧＵＳＡｔｔＢ１ｒＴａｃｔからＢｇｌＩＩ、ＳｐｈＩフラグメントとして切除した、ａｔｔＢ１部位を含むＧＵＳ発現カセットの３’部分；（２）ＭＵＰＭＩＡｔｔＢ２からＡｖｒＩＩフラグメント／ＳｐｈＩ（クレノウ）として切除されたａｔｔＢ２部位を含むＰＭＩ発現カセットの５’部分；及び（３）ＢａｍＨＩ／ＸｂａＩで消化されたｐＮＯＶ２１１４、の間の３方連結によって形成させる。該３方連結は、ＤＯＮｄｂＡｔｔＢ１．Ｂ２と命名されたドナーを形成させる。
【０２２１】
ｐＮＯＶ５０１３のＰＰＯ発現カセットを、ＰｓｔＩフラグメントとしてＤＯＮｄｂＡｔｔＢ１．Ｂ２のユニークなＳｂｆＩ部位内に連結させてＤＯＮｄｂＡｔｔＢ１．Ｂ２．ＰＰＯを形成させることが可能であり、これは、例４８に記述されているように利用することができる。
例３０：単一ａｔｔＢ部位を伴う単子葉植物ドナー
ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔクローニングベクターｐＢＳ−ＳＫｍｉｎｕｓを、オリゴヌクレオチド５’−ＴＣＧ  ＡＡＧ  ＣＡＴ  ＧＣＴ−３’（配列番号１０２）の挿入によるポリリンカー内のＸｈｏＩ部位のＳｐｈＩ部位への転換によって修飾し、ｐＢＳ．ＸＳｐｈ．を形成させる。ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｐｈＩで消化されたｐＢＳ．ＸＳｐＨ；（５’ＵｂｉＰＭＩ／ＡｔｔＢを切除する）ＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｖｒＩＩで消化されたＭＵＰＭＩＡｔｔＢ；及び（３’Ｇｕｓ．Ａｃｔ２ｕｔｒは切除するがＡｔｔＢｒｅｖは切除しない）ＮｈｅＩ及びＳｐｈＩで消化されたＣＭＧｕｓＡｔｔＢｒｅｖＴａｃｔ、といったフラグメントを用いて３方連結を実施し、ｐＢＳＤＯＮｓｇＡｔｔＢを形成させる。
例３１：単一ａｔｔＰ部位を伴う単子葉植物ドナー
ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｐｈＩで消化させたｐＢＳ．ＸＳｐＨ；（５’ＵｂｉＰＭＩ／ＡｔｔＰを切除する）ＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｖｒＩＩで消化させたＭＵＰＭＩＡｔｔＰ；及び（３’Ｇｕｓ．Ａｃｔ２ｕｔｒは切除するがＡｔｔＢｒｅｖは切除しない）ＮｈｅＩ及びＳｐｈＩで消化させたＣＭＧｕｓＡｔｔＢｒｅｖＴａｃｔ、といったフラグメントを用いて３方連結を実施し、ｐＢＳＤＯＮｓｇＡｔｔＢを形成させる。
例３２：単一ａｔｔＢ部位を伴うＴ−ＤＮＡ単子葉植物ドナー
ｐＢＳＤＯＮｓｇＡｔｔＢを、ＡｓｃＩ及びＳｂｆＩで消化させ、約６ｋｂのインサートフラグメントを、ＡｓｃＩ及びＳｂｆＩで消化されたバイナリベクターｐＮＯＶ２１１４内に連結させ、ＤＯＮｓｇＡｔｔＢを形成させる。
例３３：単一ａｔｔＰ部位を伴うＴ−ＤＮＡ単子葉植物ドナー
ｐＢＳＤＯＮｓｇＡｔｔＰを、ＡｓｃＩ及びＳｂｆＩで消化させ、約６ｋｂのインサートフラグメントを、ＡｓｃＩ及びＳｂｆＩで消化されたバイナリベクターｐＮＯＶ２１１４内に連結させ、ＤＯＮｓｇＡｔｔＰを形成させる。
例３４：単一ａｔｔＢ部位を伴う単子葉植物ウイルスレプリコンドナー
ｐＷＩ−１１ＭのＢａｍＨＩ部位を、オリゴヌクレオチド５’−ＧＡＴ  ＣＡＣ  ＧＣＧ  Ｔ−３’（配列番号１０３）を用いて、ＭＬＵＩ部位へと転換させ、ｐＷＩ−１１Ｍ．Ｍｌｕを形成させる。３’−５’エキソヌクレアーゼによる平滑末端にされたＳｂｆＩ及びＡｓｃＩで、ｐＢＳＤＯＮｓｇＡｔｔＢを消化させ、約６ｋｂのフラグメントを形成させる。このフラグメントを、クレノウにより平滑末端にされたＡｓｐ７１８Ｉ及びＭｌｕＩで消化されたｐＷＩ−１１Ｍｌｕ内に連結させ、ｖＤＯＮｓｇＡｔｔＢを形成させる（図５）。
例３５：単一ａｔｔＰ部位を伴う単子葉植物ウイルスレプリコンドナー
３’−５’エキソヌクレアーゼにより平滑末端にされたＳｂｆＩ及びＡｓｃＩでｐＢＳＤＯＮｓｇＡｔｔｐを消化させ、約６ｋｂのフラグメントを形成させる。このフラグメントを、クレノウによって平滑末端にされたＡｓｐ７１８Ｉ及びＭｌｕＩで消化されたｐＷＩ−１１Ｍｌｕ内に連結させ、ｖＤＯＮｓｇＡｔｔＰを形成させる。
例３６：反転ａｔｔＢ部位を伴う単子葉植物ウイルスレプリコンドナー
クレノウによって平滑末端にされたＡｇｅＩ及びＡｓｃＩでＤＯＮｄｂＡｔｔＢを消化させ、約６ｋｂのフラグメントを形成させる。このフラグメントを、クレノウにより平滑末端にされたＡｓｐ７１８Ｉ及びＭｌｕＩで消化されたｐＷＩ−１１Ｍ．Ｍｌｕ内に連結させ、ｖＤＯＮｄｂＡｔｔＢを形成させる。
例３７：反転ａｔｔＰ部位を伴う単子葉植物ウイルスレプリコンドナー
クレノウによって平滑末端にされたＡｇｅＩ及びＡｓｃＩでＤＯＮｄｂＡｔｔＰを消化させ、約６ｋｂのフラグメントを形成させる。このフラグメントを、クレノウにより平滑末端にされたＡｓｐ７１８Ｉ及びＭｌｕＩで消化されたｐＷＩ−１１Ｍ．Ｍｌｕ内に連結させ、ｖＤＯＮｄｂＡｔｔｐを形成させる。
例３８：反転ａｔｔＢ１及びａｔｔＢ２部位を伴う単子葉植物ウイルスレプリコンドナー
クレノウによって平滑末端にされたＡｇｅＩ及びＡｓｃＩでＤＯＮｄｂＡｔｔＢ１．Ｂ２を消化させ、約６ｋｂのフラグメントを形成させる。このフラグメントを、クレノウにより平滑末端にされたＡＳＰ７１８Ｉ及びＭｌｕＩで消化されたｐＷＩ−１１Ｍ．Ｍｌｕ内に連結させ、ｖＤＯＮｄｂＡｔｔＢ１．Ｂ２を形成させる。
例３９：ＶｅｘＤＯＮｓＡｔｔＢの構築：Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中で単子葉植物ウイルスレプリコンによりフランキングされたＤＯＮｓｇＡｔｔＢ
本例及び以下の例の幾つかにおいて、問題の遺伝子（単複）をフランキングする小麦萎縮病ウイルスレプリコンのほぼ完全なコピーをそのＴ−ＤＮＡが有している一連のバイナリウイルス切除（Ｖｅｘ）ベクターを構築する。これらのウイルス切除ベクターによって、問題の遺伝子(単複）を担持し問題の遺伝子(単複）を高いコピー数まで増大させること能力を持つ円形ウイルスレプリコンを、植物細胞への送達の後に、Ｔ−ＤＮＡから切除することが可能となる。Ｔ−ＤＮＡがｐＷＩ−１１Ｍからの１つのほぼ完全なウイルスのコピーを含有するもののそのＫｍＲ遺伝子が欠如している受容体バイナリベクター２１１４  ＰＷＩ−ＡＸを構築するというのが一般的なアプローチである。２１１４−ｐＷＩ−ΔＸを、AgrobacteriumＬＢＡ４４０４（ｐＳＢ１）へと電気形質転換させて、ＬＢＡ４４０４（ｐＳＢＩ）（２１１４−ｐＷＩ−ΔＸ）を生成する。その後、いずれかのドナー又はその他の問題の構成体を、Agrobacterium中で複製不能なプラスミド、ＰＷＩ−１１Ｍ（その無傷のＫｍＲ遺伝子を伴う）内にクローニングする。後者のプラスミドをＬＢＡ４４０４（２１１４−ｐＷＩ−ΔＸ）へとに電気形質転換し、ドナーＤＮＡがウイルスＤＮＡ相同性を通してバイナリである受容体とその中で同時組込みしたクローンについて選択するために、細菌をカナマイシン含有寒天上で平板培養し、問題の遺伝子（単複）をフランキングするウイルスコピーを伴うＴ−ＤＮＡを生成させる。
【０２２２】
２１１４−ｐＷＩ−ΔＸの構築のためには、ＳａｃＩＩでプラスミドｖＣＭＬｕｃＢ／Ｐ（以下の例６７Ａ）を消化させ、部位を部位変更オリゴヌクレオチド５’−ＣＣＧ  ＧＡＴ  ＣＣＧ  ＧＧＣ−３’（配列番号１０４）を用いてＢａｍＨＩ（ボールド）に転換して、ＣＭＰＳＶＬｕｃＢ／Ｐ．  ＢａｍＨＩを生成する。この産物をＢａｍＨＩで消化させ、全ウイルスレプリコンを含有するもののＰ１５Ｑ  ｏｒｉのほとんどが欠如している３１４５ｂｐのフラグメントをゲル精製する。バイナリベクターｐＮＯＶ２１１４をＢＧｌＩＩ及びアルカリホスファターゼで消化させて、ゲル精製する。この２つを合わせて連結させて、２１１４ＷＩ−１１Ａ及び２１１４ＷＩ−１１Ｂを形成させる。後者は右のボーダーにより近いところにＮＰＴＩＩマーカーを有し、次の段階で使用される。ＸｂａＩでの消化及び再連結によって、これを２１１４ＷＩ−ΔＸＢに転換し、そこから大半のＮＰＴＩＩ遺伝子を欠失させる。このプラスミドを、スペクチノマイシン耐性についての選択によってＬＢＡ４４０４（ｐＳＢＩ）へと形質転換し、この例及び例４０−４３において使用される受容菌株ＬＢＡ４４０４（ｐＳＢＩ）（２１１４ＷＩ−ΔＸＢ）を作り上げる。
【０２２３】
プラスミドｖＤＯＮｓｇＡｔｔＢ（図  ５）を、ＬＢＡ４４０４（ｐＳＢ１）（２１１４ＷＩ−ΔＸＢ）へと形質転換し、形質転換体をＫｍ５０、Ｓｐｅｃ１００、及びＴｃ５を伴うＹＰ寒天上で選択する。ウイルスフランキングされたＤＯＮｓｇＡｔｔＢ構成体を伴うＴ−ＤＮＡの構造を、Agrobacteriumから単離されたミニプレップＤＮＡの分析によって確認する。
例４０：ＶｅｘＤＯＮｓｇＡｔｔＰ、すなわちＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中の単子葉植物ウイルスレプリコンによってフランキングされたＤＯＮｓｇＡｔｔＰの構築
プラスミドｖＤＯＮｓｇＡｔｔＰを、ＬＢＡ４４０４（ｐＳＢ１）（２１１４ＷＩ−ΔＸＢ）へと形質転換し、形質転換体をＫｍ５０、Ｓｐｅｃ１００、及びＴｃ５を伴うＹＰ寒天上で選択する。ウイルスフランキングされたＤＯＮｓｇＡｔｔＰ構成体を伴うＴ−ＤＮＡの構造を、Agrobacteriumから単離されたミニプレップＤＮＡの分析によって確認する。
例４１：ＶｅｘＤＯＮｄｂＡｔｔＢ、すなわちＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中の単子葉植物ウイルスレプリコンによってフランキングされたＤＯＮｄｂＡｔｔＢの構築
プラスミドｖＤＯＮｄｂＡｔｔＢを、ＬＢＡ４４０４（ｐＳＢ１）（２１１４ＷＩ−ΔＸＢ）へと形質転換し、形質転換体をＫｍ５０、Ｓｐｅｃ１００、及びＴｃ５を伴うＹＰ寒天上で選択する。ウイルスフランキングされたＤＯＮｄｂＡｔｔＢ構成体を伴うＴ−ＤＮＡの構造を、Agrobacteriumから単離されたミニプレップＤＮＡの分析によって確認する。
例４２：ＶｅｘＤＯＮｄｂＡｔｔＰ、すなわちＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中の単子葉植物ウイルスレプリコンによってフランキングされたＤＯＮｄｂＡｔｔＰの構築
プラスミドｖＤＯＮｄｂＡｔｔＰを、ＬＢＡ４４０４（ｐＳＢ１）（２１１４ＷＩ−ΔＸＢ）へと形質転換し、形質転換体をＫｍ５０、Ｓｐｅｃ１００、及びＴｃ５を伴うＹＰ寒天上で選択する。ウイルスフランキングされたＤＯＮｄｂＡｔｔＰ構成体を伴うＴ−ＤＮＡの構造を、Agrobacteriumから単離されたミニプレップＤＮＡの分析によって確認する。
例４３：ＶｅｘＤＯＮＡｔｔＢの１．Ｂ２、すなわちＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中の単子葉植物ウイルスレプリコンによってフランキングされたＤＯＮＡｔｔＢ１．Ｂ２の構築
プラスミドｖＤＯＮＡｔｔＢ１．Ｂ２を、ＬＢＡ４４０４（ｐＳＢ１）（２１１４ＷＩ−ΔＸＢ）へと形質転換し、形質転換体をＫｍ５０、Ｓｐｅｃ１００、及びＴｃ５を伴うＹＰ寒天上で選択する。ウイルスフランキングされたＤＯＮＡｔｔＢ１．Ｂ２構成体を伴うＴ−ＤＮＡの構造を、Agrobacteriumから単離されたミニプレップＤＮＡの分析によって確認する。
Ｅ．トウモロコシ標的系列中へのドナー配列のターゲティングされた組込み
例４４：ボンバードを介した形質転換を受けたトウモロコシ胚形成カルス中へのドナー構成体のターゲティングされた組込み
例４４Ａ．ターゲティングされた組込みの実験用のトウモロコシカルスの産生
標的配列Ｔ−ＤＮＡの単一コピーインサートを含有する形質転換を受けたトウモロコシ植物を、温室内で自家受粉又は戻し交配し、種子を産生させる。未成熟の胚を、基本的にNegrotto et al. (２０００) Plant Cell Reports １９：７９８−８０３中で記述されているように、穂から切除する。形質転換を受けた胚形成カルスは、ブタフェナシルを全く含有しない又は陽性の分離体の選択用にブタフェナシルを１００ｎＭ含有する２ＪＭＳＡｇ上に未成熟な胚芽を置くことによって開始される。形質転換を受けた胚形成カルスは、カルス開始後9-12日で接合体胚芽から直接、或いは繁殖した培養からのいずれかでターゲティングされた組込みのために使用する。
例４４Ｂ．ボンバードのための金ビーズ上へのプラスミドＤＮＡの共沈
各処理のために用いられるプラスミドの組合わせには、標的配列Ｔ−ＤＮＡとの組換えのために相容性をもつ適切なドナーＤＮＡ、及びＥ．Ｃｏｌｉ組込み宿主因子タンパク質の同時発現を伴う又は伴わないインテグラーゼ発現カセットが含まれる。これらのプラスミドを、1μm未満の金粒子（Crescent Chem. Co., Inc., NY）３ｍｇを伴う５０μｌの体積の無菌の５０％グリセロール中に、プラスミド１個あたり１−１０μｇとして等分する。標準ＣａＣｌ2−スペリミジン化学（Klein et al. (１９８７) Nature ３２７：７０−７３）を用いて、プラスミドＤＮＡを金粒子上に沈殿させる。
例４４Ｃ．ターゲティングされた組込みのためのトウモロコシカルスのボンバード
遺伝子導入トウモロコシカルスを、１２％のスクローを含有する１２ＪＭＳ培地上に置かれた直径２ｃｍのリングの形に配置し、これがボンバードに先立ち少なくとも３時間カルスに対する浸透圧処理を提供する。６５０ｐｓｉの破裂板（Ｂｉｏｒａｄ）を伴うデュポンヘリウムガンを用いて各標的平板を１−２時間ボンバードに付し、その後これを暗所に置く。
例４４Ｄ．ＧＵＳ陽性のターゲティングされた事象の評定
標的配列Ｔ−ＤＮＡ部位内へのボンバードを受けたドナーＤＮＡの、ラムダインテグラーゼ媒介型インサートが、無傷のβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）発現カセットを作り上げる。ボンバードを受けたトウモロコシカルスを２−１０日間暗所でインキュベートする。ターゲティングされたカルスのサブセットを、ＧＵＳ組織化学的検定（Jefferson et al. (１９８７) EMBO J. ６：３９０１−３９０７）を用いたターゲティングされた組込みについて検定する。陽性で、青色に着色された細胞（ＧＵＳスポット)を、安定したターゲティングされたインサート事象として評定する。
例４４Ｅ．トウモロコシのターゲティングされた事象の選択
標的配列Ｔ−ＤＮＡ部位内へのボンバードを受けたドナー配列のインテグラーゼ媒介型インサートは、無傷のホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＭＩ）発現カセット（Negrotto et al. (２０００) Plant Cell Reports１９：７９８−８０３）をも同様に作り上げ、ターゲティングされた事象の選択を可能にする。ＧＵＳ検定のために犠牲にされなかったカルスを、ボンバードの１−２週間後に選択培地ＪＭＳ  １Ｍ／０．５Ｓ上に置く。マンノース上でのミクロカルスの成長が明白になるまで、トウモロコシカルスを選択培地の上で暗所においてインキュベートする。マンノースの上で成長したカルスを新鮮な選択培地上で継代培養し、再生のために増大させる。
例４４Ｆ．トウモロコシのターゲティングされた事象のＰＣＲ分析
選ばれた組織をＭＳＡＫＰＯ4２００Ｔｉ２Ｓ／０．５Ｍ培地上において暗所で１０−１４日間再生させる（Negrotto et al. (２０００) Plant Cell Reports１９：７９８−８０３）。
次に組織を、新鮮なＭＳＡＫＰＯ4２００Ｔｉ２Ｓ／０．５Ｍ培地に移し、明所にて培養させる（明所１６時間／暗所８時間の方式）。1週間後に、緑色組織をＭＳＡＫＰＯ4２００Ｔｉ２Ｓ／０．５Ｍ培地に移し、明所で成長させる。小植物を、０．７ＭＳ３Ｓ１０ＰＰＭＯ4２００Ｔｉ２Ｓ／０．５Ｍ培地を含むＭａｇｅｎｔａＧＡ−７ボックスに移し、根の成長が土壌への移植に十分なものとなるまで明所で成長させる。再生されたトウモロコシ植物を、ＰＣＲ検定を用いて分析する。対のうちの1つのプライマは標的配列ＤＮＡに対して相同で、もう一つはドナーＤＮＡに対して相同であり、かくしてドナーＤＮＡが、標的配列ＤＮＡの付着部位（単複）との、ラムダインテグラーゼ媒介型組換えを受けた場合にのみ、予測可能なサイズのPCR産物が形成されるようになっている。ターゲティングされた組込み事象を含有することがＰＣＲによって確認されたこれらの植物を温室に送る。ＰＣＲが陽性の候補に対して、ターゲティングされた組込み事象の分子構造をさらに確認する目的でサザン分析を実施する。
例４４Ｇ．ＧＵＳが陽性であるターゲティングされた事象
トウモロコシゲノム中の異なる位置に挿入された標的配列Ｔ−ＤＮＡは、下表５で系列１、２などと呼称されている。
【０２２４】
【表６】
2005521400.tif 000008
【０２２５】
これらの結果は、Ｅ．Ｃｏｌｉ組込み宿主因子タンパク質の発現によって増強されたラムダインテグラーゼ遺伝子の発現が、トウモロコシ標的配列系列の認識部位(単複) とドナー認識部位(単複)の間の分子間組換えを媒介することを示している。
例４５： Agrobacterium媒介型形質転換を介した、ドナー構成体のトウモロコシ標的配列胚芽内へのターゲティングされた組込み
例４５Ａ：形質転換のためのバイナリベクター
ドナーバイナリベクター、ＤｏｎｓｇＡｔｔＢ、ＤｏｎｓｇＡｔｔＰ、ＤｏｎｄｂＡｔｔＢ、ＤｏｎｄｂＡｔｔＰ、ＤｏｎＡｔｔＰ１．Ｐ２、ＶｅｘＤｏｎｓｇＡｔｔＢ、ＶｅｘＤｏｎｓｇＡｔｔＰ、ＶｅｘＤｏｎｄｂＡｔｔＢ、ＶｅｘＤｏｎｄｂＡｔｔＰ及びＶｅｘＤｏｎＡｔｔＢ１．B２、及びラムダインテグラーゼバイナリベクター、ＶＳＩｎｔＨＦ、ＶＳＩｎｔ−ｈ／２１８、ＶＳＩｎｔ−ｈ／２１８ＨＦ、ＶｅｘＩｎｔＨＦαβ、ＶｅｘＩｎｔ−ｈ／２１８、及びＶｅｘＩｎｔ−ｈ／２１８ＨＦαβはトウモロコシ形質転換用として適切である。
例４５Ｂ．Ａgrobacterilum tumefaciensの調製
ドナーバイナリベクターの1つを含有するAgrobacterium菌株ＬＢＡ４４０４(ｐＳＢＬ)及びラムダインテグラーゼバイナリベクターの1つを含有する第２のAgrobacterium菌株ＬＢＡ４４０４（ｐＳＢＬ）を、例２５に記述される通り形質転換実験のため、成長させ予備誘発させる。代替的には、ドナーバイナリベクターのうちの１つのを含有するAgrobacterium菌株ＬＢＡ４４０４及び相容性のあるラムダインテグラーゼバイナリベクターを、形質転換実験のため、例２５に記述されてい通りに成長させ予備誘発させる。
例４５Ｃ．接種と同時育成
ドナーバイナリベクターを含有するAgrobacterium菌株とラムダインテグラーゼバイナリベクターを含有する第２のAgrobacterium菌株を、接種用に１：１の比率で混合する。代替的には、ドナー及びラムダインテグラーゼの両方のバイナリベクターを含有するAgrobacterium菌株を接種のために利用する。ドナーバイナリベクターは、接種に用いられるトウモロコシの未成熟な胚芽中での標的配列Ｔ−ＤＮＡインサートを伴う組換えと相容性がある。接種と同時育成を、例２５に記述された要領で実施する。
例４５Ｄ．トウモロコシのターゲティングされた事象の予備選択及び選択
同時育成の後、カルスを、暗所中で１０−１４日間予備選択培地２ＪＭＳＴｉ２００Ａｇに移す。胚芽形成カルスをＪＭＳ１Ｍ０．５Ｓ培地に移し、この培地上で、２−３週間隔の継代培養段階を伴って６−１０週間にわたり選択させる。生き延びたカルスをＭＳＡＫＰＯ4２００Ｔｉ２Ｓ／０．５Ｍ培地に移し、１０−１４日間暗所に保つ。組織をＭＳＡＫＰＯ4２００Ｔｉ２Ｓ／０．５Ｍ培地に移し、明所に置く（明所１６時間／暗所８時間方式）。1週間後に、緑色の組織をＭＳ２００Ｔｉ２Ｓ／０．５Ｍ培地に移し、１−２週間インキュベートする。小植物を、０．７５ＭＳ３Ｓ１０ＰＰＭ培地を含むＭａｇｅｎｔａＧＡ−７ボックス（Magenta Corp., Chicago, Ill）に移し、明所で成長させる。２−３週間の後に、植物をターゲティングされたインサート事象（下記参照）について試験し、陽性が判明している植物を温室内の土壌に移す。
例４５Ｅ．トウモロコシのターゲッティングされた事象についてのＧＵＳ及びＰＣＲ検定
標的配列Ｔ−ＤＮＡ部位内へのドナーＤＮＡの、ラムダインテグラーゼ媒介型インサートにより、無傷のβ−グルコニダーゼ（ＧＵＳ）発現カセットが作り出される。トウモロコシの組織を、約２４−７２時間３７℃でＧＵＳ組織化学的ミックス（Jefferson et al. (１９８７) EMBO J. ６：３９０１−３９０７）中に沈める。青色に着色された領域の出現を、ラムダインテグラーゼターゲティングされた事象として評定する。トウモロコシ組織を、新たに形成されたａｔｔＬ、ａｔｔＲ、ａｔｔＬｌ及びａｔｔＬ２組換え部位を横断するＤＮＡフラグメントの増幅に導くプライマ対を用いて、ＰＣＲによって検定する。対のうちの一方のプライマは標的配列ＤＮＡに対して相同で、かつもう一方はドナーＤＮＡに対して相同であり、かくしてドナーＤＮＡが、標的配列Ｔ−ＤＮＡの付着部位との間にラムダインテグラーゼ媒介型組換えを受けた場合にのみ、予測可能なサイズのＰＣＲ産物を形成するようになっている。予測可能なサイズのＰＣＲ産物の増幅が、ラムダインテグラーゼターゲティングされた事象として評定される。
例４６：標的配列についての遺伝子導入型であるトウモロコシ植物とドナー配列について遺伝子導入型であるトウモロコシ植物の間の交配を介したターゲティングされた組込み
例４６Ａ．標的配列構成体導入するためのトウモロコシのAgrobacterium媒介型形質転換
標的配列バイナリベクターのうちの1つを含有するAgrobacterium菌株ＬＢＡ４４０４（ｐＳＢＬ）を用いた、未成熟トウモロコシ胚芽の形質転換を、例２５に記述された通りに実施する。
例４６Ｂ．標的配列Ｔ−ＤＮＡを用いて形質転換を受けたトウモロコシ植物の選択と再生
例２５に記述されたように、ブタフェナシル耐性トウモロコシカルスを選択させかつ再生させる。ブタフェナシル耐性トウモロコシ植物を、例２５に記述される通りにＰＣＲ及びサザン分析を用いて標的配列の単一又は少コピー数インサートについてスクリーニングする。
例４６Ｃ．標的配列Ｔ−ＤＮＡを用いて形質転換を受けたトウモロコシ植物の産生
単一又は少コピー数の標的配列を含有する形質転換トウモロコシ植物を、温室内で自家受粉させて種子を産生する。Hill et al.（１９９５）Euphytica ８５：１１９−１２３中に記述されている通り種子からに胚芽を奪回し、２％スクロース及び５０ｎＭブタフェナシルを含むＢ５培地の上に置いて、標的配列Ｔ−ＤＮＡを含有すう形質転換体について選択する。発芽した苗をＧＡ７マジェンタボックスに移して、発根培地上に根付かせる。標的配列Ｔ−ＤＮＡについて同型接合である形質転換体と異型接合のものを区別するためにこれえらの植物上でＴａｑｍａｎＰＣＲを行う。根が同型接合の形質転換体の上で発達した場合、これを温室内の土壌に移す。該植物を、交配における一方の親として利用する。
例４６Ｄ．ドナーを導入するためのトウモロコシのAgrobacterium媒介型形質転換：ＰＰＯ及びラムダインテグラーゼ発現カセット
ドナー：ＰＰＯバイナリベクター１つ及び「ＲＫ」ラムダインテグラーゼ発現カセットバイナリベクターの1つを含有するAgrobacterium菌株ＬＢＡ４４０４を用いた未成熟なトウモロコシ胚芽の形質転換を、トウモロコシについて上述の通りに実施する。
例４６Ｅ．ドナー：ＰＰＯ及びインテグラーゼ発現カセットを用いて形質転換を受けたトウモロコシ植物の選択と再生
以上で記述されたように、ブタフェナシル耐性トウモロコシカルスを選択しかつ再生させる。ブタフェナシル耐性トウモロコシ植物を、上述の通りにＰＣＲ及びサザン分析を用いてドナー：ＰＰＯ及びラムダインテグラーゼ発現カセットＴ−ＤＮＡの単一又は少コピー数インサートについてスクリーニングする。
例４６Ｆ．ドナー：ＰＰＯ及びラムダインテグラーゼ発現カセットＴ−ＤＮＡを用いて形質転換を受けたトウモロコシ植物の産生
ドナーＰＰＯ及びラムダインテグラーゼＴ−ＤＮＡの単一又は少コピー数挿入を含有する形質転換を受けたトウモロコシ植物を、温室内で自家受粉させて種子を産生させる。Hill et al.（１９９５）Euphytica ８５：１１９−１２３中に記述されている通りに種子から胚芽を奪回し、２％スクロース及び５０ｎＭブタフェナシルを含むＢ５培地の上で発芽させ、陽性の分離体について選択する。発芽した苗をＧＡ７マジェンタボックスに移して、発根培地上に根付かせる。挿入されたＴ−ＤＮＡについて同型接合又は異型接合のいずれかである形質転換体を区別するためにこれらの植物についてＴａｑｍａｎＰＣＲを行う。該植物を、ノーザン分析及び／又はＥＬＩＳＡによっても同様に検定し、インテグラーゼの発現レベルを決定する。最も高いインテグラーゼ発現レベルを有する同型接合の形質転換体を、交配におけるもう一方の親として使用する。
例４６Ｇ．標的配列親とドナー：ＰＰＯ／ラムダインテグラーゼ発現親の間の交配を介したターゲティングされた組込み
標的配列について同型接合であるトウモロコシ植物を、相容性のあるドナー：ＰＰＯについて同型接合でありかつ発現ラムダインテグラーゼを発現するウモロコシ植物と交配する。Hill et al.， Euphytica ８５：１１９−１２３，１９９５中に記述されている通りに種子から胚芽を奪回し、マンノースを含むＢ５培地の上で発芽させ、無傷のＰＭＩ遺伝子発現カセット、ひいてはターゲティングされたインサート事象を含有する形質転換体について選択する。
例４６Ｈ．トウモロコシターゲティングされた事象についての検定
マンノース上で成長するトウモロコシカルスを、トウモロコシについて上述したプロトコルに従って植物内に再生させる。ＧＵＳ及びＰＣＲ分析によりトウモロコシ植物を検定し、それがターゲティングされた組込み事象を含んでいることを確認する。ターゲティングされた組込み事象を含有する植物を温室に送る。ＰＣＲ陽性の候補についてサザン分析を施し、ターゲティングされた組込み事象の分子構造をさらに確認する。
例４６Ｉ．ドナー及びラムダインテグラーゼＴ−ＤＮＡ由来のターゲティングされた組込み体の分離
ターゲティングされたインサートを含有するトウモロコシ植物を、温室内で戻し交配して、種子を産生させる。上述のように、穂から胚芽を奪回して、マンノースを含有する５Ｂ培地の上に発芽させる。発芽した苗を、ブタフェナシル耐性の不在についてスクリーニングする。ブタフェナシル感受性植物を、ターゲティングされたインサート構造の存在並びにドナー：ＰＰＯ及びラムダインテグラーゼＴ−ＤＮＡの両者の不在についてＰＣＲにより検定する。、ターゲティングされたインサートを単独で含有する分離体についてのスクリーニングにこのＰＣＲ検定を使用する。
ＩＩＩ．トウモロコシ中のヌクレオチド配列の染色体内切除
例４７：ヌクレオチド配列の染色体内切除のためのａｔｔＢとａｔｔＰ組換え部位を含有する単子葉植物ベクターの構築
ＣＭＰＳ：ＧＵＳイントロン：Ｔａｃｔ２及びＺｍＵｂｉ：ＰＭＩイントロン：Ｔｎｏｓカセットを含有するバイナリベクターｐＱＤ２０３Ａｌｌを、以下に記述される通りに構築する。ｐＱＤ２０３Ａｌｌ内において、ａｔｔＢ部位をＰＭＩイントロン遺伝子（すなわち、ＰＭＩコーディング配列内に挿入された４つのイントロンを含むＰＭＩ遺伝子）の第１のイントロン中に挿入し、かつａｔｔＰ部位をＺｍＵｂｉプロモータの上流側に挿入する（図６参照）。ＡｔｔＢ及びａｔｔＰ配列は同じ配位にある。このベクターにより、介入するＤＮＡ配列を切除するためにファージラムダインテグラーゼを使用し、かくして、全トウモロコシＵｂｉプロモーター（ＺｍＵｂｉ）とａｔｔＢ配列の上流側のＰＭＩイントロンの一部分を除去することによって選択マーカーを不活性化することが可能になる。これを行うために、相補的オリゴヌクレオチドＡＴＴＢ１（５’−ＧＡＴ  ＣＣＧ  ＣＴＣ  ＡＡＧ  ＴＴＡ  ＧＴＡ  ＴＡＡ  ＡＡＡ  ＡＧＣ  ＡＧＧ  ＣＴＴ  ＣＡＴ  ＧＡ−３’）（配列番号１０５）及びＡＴＴＢ２（５’−ＧＡＴ  ＣＴＣ  ＡＴＧ  ＡＡＧ  ＣＣＴ  ＧＣＴ  ＴＴＴ  ＴＴＡ  ＴＡＣ  ＴＡＡ  ＣＴＴ  ＧＡＧ  ＣＧ−３’）（配列番号１０６）をアニーリングし、ＢｇｌＩＩ消化されたｐＮＯＶ２７９０内に挿入して、ｐＱＤ１８７Ａ８を形成させる。第１のイントロン中にａｔｔＢ配列を伴う正の対照ＰＭＩイントロン遺伝子を含有するバイナリベクター（ｐＮＯＶ５０９９）を、ＢａｍＨＩ−消化されたｐＮＯＶ０４１中にｐＱＤ１８７Ａ８の３５５１ｂｐのＢａｍＨＩフラグメントを挿入することによって構築する。ｐＮＯＶ０４１は、そのＴ−ＤＮＡ領域中にＺｍＵｂｉ：ＰＭＩイントロン：Ｔｎｏｓ発現カセットを含有するバイナリベクターである。
【０２２６】
ａｔｔＰ配列を、２つのプライマ、ＡＴＴＰＳＰＯＭＩ（５’−ＧＧＧ  ＣＣＣ  ＴＣＴ  ＧＴＴ  ＡＣＡ  ＧＧＴ  ＣＡＣ  ＴＡＡ  ＴＡＣ  ＣＡＴ  ＣＴＡ  ＡＧ−３’）（配列番号１０７）及びＡＴＴＰＳＰＥＩ（５’−ＡＣＴ  ＡＧＴ  ＧＡＡ  ＡＴＣ  ＡＡＡ  ＴＡＡ  ＴＧＡ  ＴＴＴ  ＴＡＴ  ＴＴＴ  Ｇ−３’）（配列番号１０８）を伴うファージＤＮＡからＰＣＲによって増幅させ、ＰＣＲ産物を、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターの中にクローニングしてｐＮＯＶ５０８８を形成させる。ｐＱＤ１８９Ａｌ２を、ＸｂａＩで消化させ、クレノウで充填し、次にＮｏｔＩで切断する。ｐＱＤ１８９Ａｌ２は、ＣＭＰＳ：ＧＵＳ：Ｔａｃｔ２発現カセットを含有するｐＢｌｕｅｓｃｒｐｔＫＳ（＋）クローニングベクターである。ｐＱＤ１８９Ａｌ２の上記のＸｂａＩ／ＮｏｔＩフラグメントを、次にｐＮＯＶ５０８８のＡｐａＩ／ＮｏｔＩフラグメントと連結させ、ｐＱＤ１９４Ａ１を形成させる。ｐＱＤ１１０Ａ５はＲＳ配列を含有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ（＋）ベクターである。ＲＳ配列を、ＮｏｔＩとＳａｃＩでの消化によってｐＱＤ１１０Ａ５から切除し、ＳａｃＩ／ＮｏｔＩで消化されたｐＱＤ１９４Ａｌ（６３７０ｂｐｓ）に挿入してｐＱＤ１９８Ａｌを形成させる。ｐＱＤ１９８ＡｌのＮｃｏＩ（平滑末端）／ＰｓｐＯＭＩフラグメント（３．６ｋｂ）を、ｐＮＯＶ５０９９の（Ｐａｃｌ）平滑末端／ＰｓｐＯＭＩフラグメント（１１５３５ｂｐｓ）に挿入して、バイナリベクターｐＱＤ２０３Ａｌ１を形成させるが、これは同じ配位でａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位の両方を含有している（図６）。
例４８：ヌクレオチド配列の染色体内切除のためのａｔｔＬ及びａｔｔＲ組換え部位を含有する単子葉植物ベクターの構築
ＣＭＰＳ−ＧＵＳイントロン：Ｔａｃｔ２及びＺｍＵｂｉ：ＰＭＩイントロン：Ｔｎｏｓカセットを含有するバイナリベクターｐＱＤ３４６Ａを、以下に記述される通りに構築する。ｐＱＤ３６４Ａ内において、ａｔｔR部位をＰＭＩイントロンの第１のイントロン中に挿入し、ａｔｔL部位をＣＭＰＳプロモータの上流側に挿入する（図７参照）。ＡｔｔＬ及びａｔｔＲ配列は同じ配位にある。このベクターにより、ａｔｔＬ及びａｔｔＲ部位によってフランキングされたＤＮＡ配列を切除するためにファージラムダインテグラーゼを使用することが可能になり、全ＧＵＳ発現カセット、トウモロコシＵｂｉプロモーター（ＺｍＵｂｉ）及びａｔｔＲ配列の上流のＰＭＩイントロンの一部分を除去する。ファージラムダａｔｔＬ配列を、２つのプライマ、ａｔｔＬＡｐａＩ（５’−  ＡＧＧ  ＧＣＣ  ＣＡＧ  ＣＣＴ  ＧＣＴ  ＴＴＴ  ＴＴＡ  ＴＡＣ  ＴＡＡ  ＧＴＴ  ＧＧＣ  ＡＴＴ  Ａ−３’）（配列番号１０９）及びａｔｔＬＳｐｅＩ（５’−ＴＡＣ  ＴＡＧ  ＴＣＡ  ＡＡＴ  ＡＡＴ  ＧＡＴ  ＴＴＴ  ＡＴＴ  ＴＴＧ  ＡＣＴ  ＧＡＴ  ＡＧ−３’）（配列番号１１０）を用いて、ファージＤＮＡから増幅させる。ａｔｔＬ  ＰＣＲ産物を、ＡｐａＩとＳｐｅＩで消化させ、ＡｐａＩ／ＳｐｅＩで消化されたｐＱＤ１８９Ａ１２に挿入してｐＱＤ３４０Ｂ５を形成させる。２つのオリゴヌクレオチドＲＳＫｐｎＩ（５’−ＣＴＴ  ＧＡＴ  ＧＡＡ  ＡＧＡ  ＡＴＡ  ＡＣＧ  ＴＡＴ  ＴＣＴ  ＴＴＣ  ＡＴＣ  ＡＡＧ  ＧＧＣ  Ｃ−３’）（配列番号１１１）及びＲＳＡｐａＩ（５’−ＣＴＴ  ＧＡＴ  ＧＡＡ  ＡＧＡ  ＡＴＡ  ＣＧＴ  ＴＡＴ  ＴＣＴ  ＴＴＣ  ＡＴＣ  ＡＡＧ  ＧＴＡ  Ｃ−３’）（配列番号１１２）をアニーリングすることから誘導されたＲＳ配列を、ｐＱＤ３４０Ｂ５のａｔｔＬ部位の上流側に挿入してｐＱＤ３４２Ｂを形成させる。ファージラムダａｔｔＲ配列を、２つのプライマ、ＡＴＴＲＢＧＬＩＩ（５’−ＴＡＧ  ＡＴＣ  ＴＧＴ  ＴＡＣ  ＡＧＧ  ＴＣＡ  ＣＴＡ  ＡＴＡ  ＣＣＡ  ＴＣＴ  ＡＡＧ  Ｔ−３’）（配列番号１１３）及びＡＴＴＲＭＳＣＩ（５’−ＡＴＧ  ＧＣＣ  ＡＣＧ  ＣＴＣ  ＡＡＧ  ＴＴＡ  ＧＴＡ  ＴＡＡ  ＡＡＡ  ＡＧＣ  ＴＧＡ  ＡＣ−３’）（配列番号１１４）を用いてファージＤＮＡから増幅させる。ａｔｔＲ  ＰＣＲ産物を、ＢｇｌＩＩとＭｓｃＩで消化させ、ＢｇｌＩＩ／ＭｓｃＩで消化されたｐＮＯＶ２７９０内に挿入してｐＱＤ３４１Ｃ７を形成させる。次に、全ＰＭＩ遺伝子をＢａｍＨＩ消化によってｐＱＤ３４１Ｃ７から切除し、ＢａｍＨＩで消化されたｐＮＯＶ０４１に挿入してそのＰＭＩ遺伝子を置換し、ｐＱＤ３４４Ａ１を形成させる。ｐＮＯＶ０４１はＺｍＵｂｉ−ＰＭＩイントロン−Ｔｎｏｓ発現カセットを含有するバイナリベクターである。ｐＱＤ３４２Ｂを、ＫｐｎＩとＮｏｔＩで消化させ、ＲＳ−ＡｔｔＬ−ＣＭＰＳプロモータ−ＧＵＳイントロン−Ａｃｔ２ターミネーターカセットを含有するフラグメントを放出させる。ＰＱＤ３４４Ａを、ＮｏｔＩとＡｓｃＩで消化させ、ＺｍＵｂｉ−ＰＭＩイントロン−ＮＯＳターミネーターカセットを含有するフラグメントを切除する。上記の２つのフラグメントを、ＫｐｎＩ／ＡｓｃＩで消化された塩基バイナリベクターｐＮ���Ｖ２１１４で連結させ、同一配位でａｔｔＬとａｔｔＲ部位の両方を含有するｐＱＤ３４６Ａを形成させる（図７）。
例４９：ａｔｔＢ及びａｔｔＰ或いはａｔｔＬ及びａｔｔＲ組換え部位を含有するバイナリベクターからの遺伝子導入トウモロコシ系列の生成
バイナリベクターｐＱＤ２０３Ａ１１及びｐＱＤ３４６Ａを、Agrobacterium菌株ＬＡＢ４４０４（ｐＳＢ１）中に個別に電気穿孔する。次に、Agrobacterium菌株の個々の培養を、（Negrotto et al. (２０００) Plan Cell Rep１９：７９８−８０３中に記述されているように）マンノース選択を用いた未成熟なトウモロコシ胚芽との同時育成のために使用する。遺伝子導入トウモロコシ植物をインテグラーゼ発現系列に直接交配するか、或いは自家授粉させて種子を産生させ、他の植物との交配のための追加植物材料を精製するためにそれを使用する。
例５０：インテグラーゼ、インテグラーゼ突然変異体、及び組込み宿主因子の発現のためのバイナリベクターの構築
ＩｎｔとＩＨＦ発現カセットを含有するＨｉｎｄＩＩＩ）平滑末端／ＡｓｃＩのフラグメント（４１２２ｂｐ）を、ＨｉｎｄＩＩＩ消化によりＶＳＩｎｔＨＦ（例２６Ｅ．３で記述した）から切除し、クレノウ処理で充填し、ＨｉｎｄＩＩＩを用いて再切断し、ｐＷＣ０５７の（ＢａｍＨＩ）平滑末端／ＡｓｃＩフラグメント（９５４１ｂｐｓ）と連結させ、ｐＱＤ２０８Ｂ１２を形成させる。ｐＷＣ０５７は、ＺｍＵｂｉプロモータ−ＡｔＰＰＯ（ｄｍ）−Ｔ３５Ｓ発現カセットを含有するバイナリベクターである（「改変されたプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有する除草剤寛容性植物又は植物種子を用いた望ましくない植生の生育を制御する方法」という題の米国特許第６，２８２，８３７、を参照）。ｐＱＤ２０８Ｂ１２は、ＣＭＰＳプロモータ−Ｉｎｔ−Ｔｎｏｓ、ＣＭＰＳプロモータ−ＩＨＦα−Ｔｎｏｓ及びＣＭＰＳプロモータ−ＩＨＦβ−ＴＮＯＳ発現カセット、並びにＺｍＵｂｉプロモータ−ＡｔＰＰＯｄｍ−Ｔ３５Ｓ選択マーカーカセットを含有するバイナリ形質転換ベクターである。Ｉｎｔ−ｈ／２１８及びＩＨＦ発現カセットを含有する（ＨｉｎｄＩＩＩ）平滑末端／ＡｓｃＩフラグメント（４１２２ｂｐ）を、ＨｉｎｄＩＩＩ消化、クレノウ処理で充填し、ＨｉｎｄＩＩＩで再切断にし、ＶＳＩｎｔ−ｈ／２１８ＨＦ（例２６Ｇ．３に記述）から切除し、ｐＷＣ０５７の（ＢａｍＨＩ）平滑末端／ＡｓｃＩフラグメント（９５４１ｂｐｓ）と連結させて、ｐＱＤ２０９Ｂ１６を形成させる。ｐＱＤ２０９Ｂ１６は、ＣＭＰＳ−プロモータ−ＩｎｔＨ２１８−Ｔｎｏｓ、ＣＭＰＳ  プロモータ−ＩＨＦα−Ｔｎｏｓ及びＣＭＰＳ  プロモータ−ＩＨＦβ−Ｔｎｏｓ発現カセット、並びにＺｍＵｂｉプロモータ−ＡｔＰＰＯｄｍ−Ｔ３５Ｓ選択マーカーカセットを含有するバイナリ形質転換ベクターである。
例５１：インテグラーゼ、インテグラーゼ突然変異体、組込み宿主因子（ＩＨＦ）、及びエキシジオナーゼ（Ｘｉｓ）の発現のためのバイナリベクターの構築
プラスミドベクターｐＡｄＦ６２Ａ（例８で記述）を、ＳｐｅＩで切断し、クレノウで充填し、次にＡｓｃＩで再切断して、ＣＭＰＳ−Ｘｉｓ−Ｔｎｏｓ発現カセットを含有するＳｐｅＩ（平滑末端）／ＡｓｃＩフラグメントを単離する。
このフラグメントを、ＡＳＣＩ／ＳＷＡＩ消化されたＰＱＤ２０８Ｂ１２内に挿入してｐＱＤ３５０Ａを形成させるか又はＰＱＤ２０９Ｂ１６に挿入してＰＱＤ３５１Ａを形成させる。
例５２：ＩｎｔＩＨＦｓ及びＩｎｔＨ／２１８ＩＨＦｓを発現する遺伝子導入のトウモロコシ系列生成
バイナリベクターｐＱＤ２０８Ｂ１２、ｐＱＤ２０９Ｂ１６、ｐＱＤ３４９Ａ及びｐＱＤ３５０Ａの各々を、Agrobacterium菌株ＬＡＢ４４０４（ＰＳＢＬ）内に個別に形質転換させる。次に、Agrobacterium菌株の個々の培養を未成熟なトウモロコシ胚芽との同時育成に使用する。同時育成された胚芽を、ブタフェナシル（ＣＧＡ  ８５４，２７６）を含有する選択培地上に置き、遺伝子導入植物を生成させる。遺伝子導入の植物を、標的植物に対して直接交配させるか、又は自家受粉させて種子を産生させ、他の植物と交配させるための追加植物材料を生成するためにこれを利用する。ＰＱＤ２０８Ｂ１２又はＰＱＤ２０９Ｂ１６のいずれか由来のＴ−ＤＮＡ領域を含有する遺伝子導入系列は、形態学的に正常であり良質な結実を示す。
例５３：ａｔｔＢ及びａｔｔＰ或いはａｔｔＬ及びａｔｔＲよってフランキングされたヌクレオチド配列の染色体内切除
ａｔｔＢとａｔｔＰ或いはａｔｔＬとａｔｔＲ部位の間の組換えを、これらの部位によってフランキングされた配列を切除するために使用することができる（図６と７）。組込み宿主因子及び切除因子（Ｘｉｓ）と共に合成ラムダインテグラーゼ又はその突然変異体Ｉｎｔ−ｈ／２１８を発現する遺伝子導入のトウモロコシ系列を、Agrobacterium媒介型形質転換より得る。インテグラーゼ発現系列を、所望の基質系列と交配させて、ａｔｔＢ／ａｔｔＰ又はａｔｔＬ／ａｔｔＲ部位のいずれかによってフランキングされた配列を欠失させる。欠失について、後代をＰＣＲによりスクリーニングする。欠失を有する系列を、遺伝子導入でない親系列と戻し交配して種子を生成させる。次にこれらの種子を発芽させ、苗をＰＣＲによってスクリーニングし、所望の欠失を伴うがインテグラーゼ遺伝子座を伴わない系列を回収する。
ＩＶ．Ｌ／Ｒ反応を用いたイネにおけるターゲティングされた組込み
Ａ．標的配列の構築
例５４：単一ａｔｔＬ部位及び１つのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ発現カセットを伴う単子葉植物標的配列
単一ａｔｔＬ部位を含有する単子葉植物標的配列を、ＬＰｓｇＡｔｔＰのａｔｔＰ部位（図４）をａｔｔＬ部位に転換することによって構築する。ＬＰｓｇＡｔｔＰを、Ａｓｐ７１８Ｉ及びＡｖｒＩＩで消化させ、これによりａｔｔＰ部位とＡＴ  ＢＡＦ６０イントロンの１断片を除去して、ベクターを形成させる。鋳型としてＣＭＰＳＧＵＳＡｔｔＰｒｅｖを伴うオリゴヌクレオチド対、５’−ＧＧＡ  ＧＡＴ  ＣＴＴ  ＧＡＡ  ＧＣＣ  ＴＧＣ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＡＴＡ  ＣＴ−３’（配列番号１１５）及び５’−ＣＣＣ  ＣＴＡ  ＧＧＡ  ＡＡＴ  ＣＡＡ  ＡＴＡ  ＡＴＧ  ＡＴＴ  ＴＴＡ  ＴＴＴ  ＴＧ−３’（配列番号１１６）を用い、かつＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキットを利用して、ａｔｔＬ部位をＰＣＲによりクローニングする。結果として得られたＴＯＰＯクローンは、ＴＯＰＯＢＡｔｔＬＡｖと命名され、ａｔｔＬ部位を含有し、ＢｇｌＩＩ及びＡｖｒＩＩで消化され、３方連結のためのフラグメントの１つを形成する。ベクターから除去されたＡＴ  ＢＡＦ６０イントロンの断片を、オリゴヌクレオチド対５’−ＧＧＴ  ＡＣＣ  ＡＡＧ  ＣＴＧ  ＣＧＡ  ＡＴＣ  ＴＴＣ  ＧＴＴ  ＴＴＴ−３’（配列番号１１７）及び５’−ＧＧＣ  ＣＡＴ  ＡＧＡ  ＡＡＧ  ＡＴＣ  ＴＧＧ  ＡＡＴ  ＴＴＡ  ＣＡＡ−３’（配列番号１１８）並びに鋳型としてのＣＭＰＳＧＵＳＡｔｔＰｒｅｖを使用して、ＰＣＲによりクローニングする。結果として得られたＴＯＰＯクローンを、Ａｓｐ７１８Ｉ及びＢｇｌＩＩで消化させ、もう一つのフラグメントを形成させる。両方のフラグメントとベクターを一緒に連結させて、単一ａｔｔＬ部位（ＬＰｓｇＡｔｔＬ）を伴う標的配列を形成させる。
例５５：単一ａｔｔＲ部位及び１つのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ発現カセットを伴う単子葉植物標的配列
単一ａｔｔＲ部位を含有する単子葉植物標的配列を、ＬＰｓｇＡｔｔＰのａｔｔＰ部位をａｔｔＲ部位に転換することによって構築する。ＬＰｓｇＡｔｔＰ（図４）を、Ａｓｐ７１８Ｉ及びＡｖｒＩＩで消化させ、これによりａｔｔＰ部位とＡＴ  ＢＡＦ６０イントロンの１断片を除去して、ベクターを形成させる。鋳型としてのＣＭＰＳＧＵＳＡｔｔＰｒｅｖを伴うオリゴヌクレオチド対５’−ＡＧＡ  ＴＣＴ  ＧＴＴ  ＡＣＡ  ＧＧＴ  ＣＡＣ  ＴＡＡ  ＴＡＣ−３’（配列番号１１９）及び５’−ＣＣＴ  ＡＧＧ  ＣＧＣ  ＴＣＡ  ＡＧＴ  ＴＡＧ  ＴＡＴ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＧＣＴ  ＧＡＡ  ＣＧ−３’（配列番号１２０）を用い、かつＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキットを利用して、ａｔｔＲ部位をＰＣＲによりクローニングする。結果として得られたＴＯＰＯクローンは、ＴＯＰＯＢＡｔｔＲＡｖと命名され、ａｔｔＲ部位を含有し、ＢｇｌＩＩ及びＡｖｒＩＩで消化され、３方連結用としてフラグメントの１つを形成する。ＡＴ  ＢＡＦ６０イントロンの断片を、例５４に記述される通りにＰＣＲによりクローニングし、結果として得られたＴＯＰＯクローンを、Ａｓｐ７１８Ｉ及びＢｇｌＩＩで消化させ、もう一方のフラグメントを形成させる。両方のフラグメントとベクターを一緒に連結させて、標的配列の単一ａｔｔＲ部位（ＬＰｓｇＡｔｔＲ）を形成させる。
例５６：反転ａｔｔＬ部位及び１つのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ発現カセットを伴う単子葉植物標的配列
反転ａｔｔＬ部位を含有する単子葉植物標的配列を、ＬＰｓｇＡｔｔＰのａｔｔＰ部位をａｔｔＬ部位に転換することによって構築する。ＣＭＰＳＧＵＳＡｔｔＰｒｅｖのＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｐｅＩフラグメントを、最初にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋中にサブクローニングし、ＮｈｅＩ及びＢｇｌＩＩでの消化によりａｔｔＰ部位を除去する。鋳型としてＣＭＰＳＧＵＳＡｔｔＰｒｅｖを伴うオリゴヌクレオチド対５’−ＣＣＧ  ＣＴＡ  ＧＣＴ  ＧＡＡ  ＧＣＣ  ＴＧＣ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＡＴＡ  Ｃ−３’（配列番号１２１）及び５’−ＧＧＡ  ＧＡＴ  ＣＴＧ  ＡＡＡ  ＴＣＡ  ＡＡＴ  ＡＡＴ  ＧＡＴ  ＴＴＴ  ＡＴＴ−３’（配列番号１２２）を用い、ａｔｔＬ部位をＰＣＲによりクローニングする。結果として得られたＴＯＰＯクローンは、ＴＯＰＯＢＡｔｔＲＢｇと称され、ａｔｔＬ部位を含有し、ＮｈｅＩ／ＢｇｌＩＩフラグメントとして連結され、サブクローンのａｔｔＰ部位を置換し、５’ＧＵＳＡｔｔＬｒｅｖを形成する。ＰＰＯ．ＰＭＩＡＡｔｔＰ．ＳｐｅのａｔｔＰ部位を、ＸｂａＩ及びＡｖｒＩＩを用いて消化により除去する。ａｔｔＬ部位を、オリゴヌクレオチド対５’−ＧＧＴ  ＣＴＡ  ＧＡＴ  ＧＡＡ  ＧＣＣ  ＴＧＣ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＡＴＡ  ＣＴ−３’（配列番号１２３）及び配列番号１１６を利用して、ＣＭＰＳＧＵＳＡｔｔＰｒｅｖからＰＣＲによりクローニングする。結果として得られたＴＯＰＯクローンは、ＴＯＰＯＸＡｔｔＬＡｖと命名され、ａｔｔＬ部位を含有し、ＸｂａＩ／ＡｖｒＩＩフラグメントとして連結され、ＰＰＯ．ＰＭＩＡｔｔＰ．Ｓｐｅを置換し、ＰＰＯＰＭＩＡｔｔＬｆ．Ｓｐｅを形成する。５’ＧＵＳＡｔｔＬｒｅｖを、ＮｈｅＩ／ＳｐｅＩで消化させ、結果として得られたフラグメントをＰＰＯＰＭＩＡｔｔＬｆ．ＳｐｅのＳｐｅＩ部位内に連結させ、標的配列の２重ａｔｔＬ（ＬＰｄｂＡｔｔＬ）を形成させる。
例５７：反転ａｔｔＲ部位及び１つのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ発現カセットを伴う単子葉植物標的配列
反転ａｔｔＲ部位を含有する単子葉植物標的配列を、ＬＰｓｇＡｔｔＰのａｔｔＰ部位をａｔｔＲ部位に転換することによって構築する。ＣＭＰＳＧＵＳＡｔｔＰｒｅｖのＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｐｅＩフラグメントを、最初にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋中にサブクローニングし、ＮｈｅＩ及びＢｇｌＩＩでの消化によりａｔｔＰ部位を除去する。鋳型としてのＣＭＰＳＧＵＳＡｔｔＰｒｅｖを伴うオリゴヌクレオチド対５’−ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＴＣＴ  ＧＴＴ  ＡＣＡ  ＧＧＴ  ＣＡＣ  ＴＡＡ  ＴＡＣ−３’（配列番号１２４）及び５’−ＡＧＡ  ＴＣＴ  ＣＧＣ  ＴＣＡ  ＡＧＴ  ＴＡＧ  ＴＡＴ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＧＣＴ  ＧＡＡ  ＣＧ  −３’（配列番号１２５）を用いたＰＣＲによりａｔｔＲ部位をクローニングする。結果として得られたＴＯＰＯクローンは、ＴＯＰＯＢＡｔｔＲＢｇと称され、ａｔｔＲ部位を含有し、ＮｈｅＩ／ＢｇｌＩＩフラグメントとして連結され、サブクローンのａｔｔＰ部位を置換し、５’ＧＵＳＡｔｔＲｒｅｖを形成する。ＰＰＯ．ＰＭＩＡＡｔｔＰ．ＳｐｅのａｔｔＰ部位を、ＸｂａＩ及びＡｖｒＩＩでの消化により除去する。ａｔｔＲ部位を、オリゴヌクレオチド対５’−ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＴＣＴ  ＧＴＴ  ＡＣＡ  ＧＧＴ  ＣＡＣ  ＴＡＡ  ＴＡＣ−３’（配列番号１２６）及び配列番号１２０を用いて、ＣＭＰＳＧＵＳＡｔｔＰｒｅｖからＰＣＲによりクローニングする。結果として得られたＴＯＰＯクローンは、ＴＯＰＯＸＡｔｔＲＡｖと命名され、ａｔｔＲ部位を含有し、ＸｂａＩ／ＡｖｒＩＩフラグメントとして連結され、ＰＰＯ．ＰＭＩＡｔｔＰ．ＳｐｅのａｔｔＰ部位を置換し、ＰＰＯＰＭＩＡｔｔＲｆｗｄを形成する。５’ＧＵＳＡｔｔＲｒｅｖを、ＮｈｅＩ／ＳｐｅＩで消化させ、結果として得られたフラグメントをＰＰＯＰＭＩＡｔｔＲｆｗｄのＳｐｅＩ部位内に連結させ、２つのａｔｔＲ（ＬＰｄｂＡｔｔＲ）をもつ標的配列を形成させる。
例５８：単一ａｔｔＬ部位及びハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ発現カセットを伴う単子葉植物標的配列
単一ａｔｔＬ部位及びハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ発現カセットを含有する単子葉植物標的配列を、ＬＰｓｇＡｔｔＬのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＰＯ）遺伝子及び３５Ｓターミネーターをハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＨＰＴ）及び３５Ｓターミネーターで置換することによって構築する。ＬＰｓｇＡｔｔＬをＮｃｏＩで消化させ、続いてグリーンピースエンドヌクレアーゼで処理し、その後さらにＨｉｎｄＩＩＩで消化させ、ベクターを形成させる。  ｐＡｄＦ５５はイネアクチン１プロモータ（例２０に記述した通り）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、及び３５ターミネーター（例２０に記述した通り）を含有する。ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子及び３５Ｓターミネーターを、オリゴヌクレオチド対５’−ＣＧＡ  ＧＣＴ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＡＴＧ  ＡＡＡ  ＡＡＧ  ＣＣＴ  ＧＡＡ  ＣＴＣ−３’（配列番号１２７）及び５’−ＴＧＣ  ＡＧＣ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＣＡＣ  ＴＧＧ  ＡＴＴ  ＴＴＧ  ＧＴＴ  ＴＴＡ−３’（配列番号１２８）を用いて、ｐＡｄＦ５５からＰＣＲフラグメントとしてクローニングする。ＰＣＲフラグメントを、ＰｖｕＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化させ、ベクターの内に連結させてＬＰｓｇＡｔｔＬ．ＨＹＧを形成させる。
例５９：単一ａｔｔＲ部位及びハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ発現カセット伴う単子葉植物標的配列
単一ａｔｔＲ部位及びハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ発現カセットを含有する単子葉植物標的配列を、ＬＰｓｇＡｔｔＲの３５Ｓターミネーター及びプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＰＯ）遺伝子を３５Ｓターミネーター及びハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＨＰＴ）置換することによって構築する。ＬＰｓｇＡｔｔＲをＮｃｏＩで消化させ、続いてグリーンピースエンドヌクレアーゼで処理し、その後ＨｉｎｄＩＩＩでさらに消化させ、ベクターを形成させる。ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子及び３５ターミネーターを例５８に記述した通りにＰＣＲクローニングする。ＰＣＲフラグメントを、ＰｖｕＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化させ、ベクターの内に連結させてＬＰｓｇＡｔｔＲ．ＨＹＧを形成させる。
例６０：反転ａｔｔＲ部位及びハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ発現カセット伴う単子葉植物標的配列
反転ａｔｔＲ部位及びハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ発現カセットを含有する単子葉植物標的配列を、ＬＰｄｂＡｔｔＲの３５Ｓターミネーター及びプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＰＯ）遺伝子を３５Ｓターミネーター及びハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＨＰＴ）で置換することによって構築する。ＬＰｄｂＡｔｔＲをＮｃｏＩで消化させ、続いてグリーンピースエンドヌクレアーゼで処理し、その後アルカリホスファターゼを用いてさらに処理して、ベクターを形成させる。ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子及び３５ターミネーターを、オリゴヌクレオチド対、配列番号１２７）及び５’−ＴＧＣ  ＡＧＣ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＣＡＣ  ＴＧＧ  ＡＴＴ  ＴＴＧ  ＧＴＴ  ＴＴＡ−３’（配列番号１２９）を用いて、ｐＡｄＦ５５からＰＣＲフラグメンととしてクローニングする。ＰＣＲフラグメントを、ＰｖｕＩＩ／ＸｂａＩで消化させ、次にクレノウ充填反応に付し、最後にベクターの内に連結させてＬＰｄｂＡｔｔＲ．ＨＹＧを形成させる。
例６１：反転ａｔｔＬ部位及びハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ発現カセット伴う単子葉植物標的配列、ＬＰｄｂＡｔｔＬ．ＨＹＧの構築
ＬＰｄｂＡｔｔＲ．ＨＹＧの２９４０ｂｐのＸｂａＩ−ＢｂｓＩフラグメントを、構成体ＬＰｄｂＡｔｔＬの８２８５ｂｐのＸｂａＩ−ＢｂｓＩベクターフラグメント中へ連結することによって、ＬＰｄｂＡｔｔＬ．ＨＹＧ（図８）を構築する。
B. イネ標的細胞系列の産生
例６２：標的配列構成体を導入するためのイネのAgrobacterium媒介型形質転換
バイナリベクターＬＰｓｇＡｔｔＬ、ＬＰｓｇＡｔｔＲ、ＬＰｄｂＡｔｔＬ、ＬＰｄｂＡｔｔＲ、ＬＰｓｇＡｔｔＬ．ＨＹＧ、ＬＰｓｇＡｔｔＲ．ＨＹＧ、ＬＰｄｂＡｔｔＬ．ＨＹＧ（図８）及びＬＰｄｂＡｔｔＲ．ＨＹＧの各々をAgrobacterium菌株ＬＢＡ４４０４中へと個別に形質転換させる。次に、Agrobacterium菌株の個々の培養を、以下に記述される通りに同時育成のために使用し、それぞれの標的系列を生成させる。標的系列列を生成するために、イネ(Oryza sativa var.javonica)品種「Ｋａｙｂｏｎｎｅｔ」を使用する。その他のイネ栽培品種を利用することも同様に可能である（Hiei et al（１９９４）Plant Journal ６：２７１−２８２；Don et al（１９９６）Molecular Breeding  ２：２６７−２７６；Hiei et al.（１９９７）Plant Moleculr Biology  ３５：２０５−２１８）。また、以下に記述される様々な培地成分を置き換えることも可能である。
【０２２７】
ＭＳＢ培地（ＭＳ塩基性塩、４．３ｇ／リットル；ビタミンＢ５（２００×）、５ｍｌ／リットル；スクロース，３０  ｇ／リットル；プロリン、５００ｍｇ／リットル；グルタミン、５００ｍｇ／リットル；カゼイン加水分解物、３００ｍｇ／リットル；２，４−Ｄ（１ｍｇ／ｍｌ）、２ｍｌ／リットル；１ＮのＫＯＨによってｐＨを５．８に調整；Ｐｈｙｔａｇｅｌ、３ｇ／リットル）．上で培養することにより胚形成培養を、成熟した胚芽から確立する。確立した培養系列を、所望の標的配列構成体を含有するAgrobacteriumＬＢＡ４４０４を接種し、同時育成させる。Agrobacteriumを、２８℃で３日間固体ＹＰ培地（１００ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシン）内で培養する。Agrobacteriumを液体ＭＳＢ培地中で再懸濁させる。Agrobacterium培養を、０．２−０．３のＯＤ600まで希釈し、２００μＭの最終濃度までアセトシリンゴンを添加する。溶液をイネの培養と混合する前に少なくとも３０分間アセトシリンゴンによってAgrobacteriumを誘発させる。
【０２２８】
接種にあたっては、培養を３０分間細菌懸濁液中に浸漬する。液体懸濁物を真空吸引器で除去し、接種された培養を同時育成培地ＭＳＢ−Ａｓ（２００μＭのアセトシリンゴンを伴うＭＳＢ）上のワットマン濾紙の上に置き、２日間２２℃でインキュベートする。次に培養を、チメンジン（４００ｍｇ／リットル）を伴うＭＳＢ培地に移し、Agrobacteriumの成長を阻害する。
ＬＰｓｇＡｔｔＬ、ＬＰｓｇＡｔｔＬ、ＬＰｄｂＡｔｔＬ又はＬＰｄｂＡｔｔＲを含有する形質転換細胞を、プロトックス阻害型除草剤（例えばブタフェナシル）（米国特許第６，２８２，８３７号）を用いて選択させる。培養を１４日後にブタフェナシル（すなわち、１０００  ｎＭのブタフェナシル、２００ｍｇ／リットルのチメンチンを含むＭＳ誘発培地）を含有する選択培地に移し、暗所にて  ２８日間培養する。次に耐性コロニーを、再生誘発培地（２，４−Ｄを含まず、０．５ｍｇ／リットルのLＡＡ、１ｍｇ／リットルのゼアチン、２００ｍｇ／リットルのチメンチン及び３％のソルビトールを含むＭＳ）に移し、明光成長室に移動させる。再生した苗条を、３週間ブタフェナシル（ホルモンを含まず２％のソルビトールを含むＭＳ）含有する発根培地の移し、次に土壌中への移植のために温室に送る。
【０２２９】
形質転換プロセス全体にわたり選択作用物質としてハイグロマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を用いたこと、及び培養を同時育成に続いて直ちに選択培地に移したことを除いて、ＬＰｓｇＡｔｔＬＨＹＧ、ＬＰｓｇＡｔｔＲ．ＨＹＧ、ＬＰｄｂＡｔｔＬ．ＨＹＧ（図８）又はＬＰｄｂＡｔｔＲ．ＨＹＧを含有する形質転換細胞を、類似の選択プロセスに付す。
【０２３０】
標的配列の単一のコピー挿入を担持する組換え事象を、Ｔaqmanにより同定し、土壌中に移植して、成熟するまで温室で成長させる。
Ｃ．ドナー配列の構築：
例６３：単一ａｔｔＬ部位又は単一ａｔｔＲ部位を伴う単子葉植物ドナー
Arabidopsis thalianaアクチン−２  ３’の未翻訳領域を、ＣＭＰＳＧＵＳＡｔｔＰｒｅｖのＧＵＳ遺伝子の３’部分に対して、３方連結によりターミネーターとして追加する。ベクターを、ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩを用いたＰＵＣ１８の消化によって形成させる。
ＭｆｅＩ及びＸｈｏＩを用いてＣＭＰＳＧＵＳＡｔｔＰｒｅｖを消化させて、部分的ＧＵＳを含有するフラグメントを産生させ、ＸｂａＩ及びＸｈｏＩでｐＮＯＶ２７１３を消化させ、Arabidopsis thalianaアクチン−２  ３’未翻訳領域を含有するフラグメントを産生させる。これらの構成要素間の３方連結が３’ＧＵＳＡｔｔＰｒＴａｃｔを形成させる。ＭＵＰＭＩＡｔｔＰ２のａｔｔＰ２部位を、２つのクローニング段階によってａｔｔＬ又はａｔｔＲ部位で置換させる。
【０２３１】
第１段階では、ＭＵＰＭＩＡｔｔＰ２を、Ｓｂｆｌ及びＰｓｈＡＩで消化させ、今後の利用のために保存しておくベクターを生成させる。この消化によって産生されたフラグメントはａｔｔＰ２部位を含有し、Ｓｂｆｌ及びＰｓｈＡＩを用いた３’ＧＵＳＡｔｔＰｒＴａｃｔの消化によって形成されたベクター中にサブクローニングされ、ＰＭＩＡｔｔＰ２ｉを作り出す。
【０２３２】
ＰＭＩＡｔｔＰ２ｉのａｔｔＰ２部位を置換するために用いられたａｔｔＬ又はａｔｔＲ部位を、鋳型としてＬＰｓｇＡｔｔＬを用いてａｔｔＬを作り上げるために５’−ＣＧＴ  ＡＧＣ  ＣＣＴ  ＡＧＧ  ＧＡＡ  ＡＴＣ  ＡＡＡ  ＴＡＡ  ＴＧＡ  ＴＴＴ−３’（配列番号１３１）を伴うオリゴヌクレオチド対５’−ＧＧＣ  ＴＧＡ  ＧＧＴ  ＡＣＣ  ＴＧＡ  ＡＧＣ  ＣＴＧ  ＣＴＴ  ＴＴＴ  ＴＡＴ−３’（配列番号１３０）を用いて、又、鋳型としてＬＰｓｇＡｔｔＲを使ってａｔｔＲを作り上げるために５’−ＣＧＴ  ＡＧＣ  ＣＣＴ  ＡＧＧ  ＣＧＣ  ＴＣＡ  ＡＧＴ  ＴＡＧ  ＴＡＴ  ＡＡＡ−３’（配列番号１３３）を伴うオリゴヌクレオチド対５’−ＧＧＣ  ＴＧＡ  ＧＧＴ  ＡＣＣ  ＴＣＴ  ＧＴＴ  ＡＣＡ  ＧＧＴ  ＣＡＣ  ＴＡＡ−３’（配列番号１３２）を用いて、ＰＣＲフラグメントとして形成させる。
【０２３３】
第２の段階では、ＰＭＩＡｔｔＰ２ｉをＡｖｒＩＩ及びＫｐｎで消化させる。切除されたａｔｔＰ２部位を、ａｔｔＬ又はａｔｔＲ  ＰＣＲフラグメントのいずれかで置換させ、ＡｖｒＩＩとＫｐｎＩで消化させ、それぞれＰＭＩＡｔｔＬｉ及びＰＭＩＡｔｔＲｉを形成させる。これらの２つの構成体を、ＳｂｆＩ及びＰｓｈＡＩで消化させる。ａｔｔＬ又はａｔｔＲのいずれか含有する結果として得られたフラグメントを、以上で記述した保存しておいた予備のベクターの中で別々に連結させ、それぞれＭＵＰＭＩＡｔｔＬとＭＵＰＭＩＡｔｔＲを形成させる。バイナリのベクター、ｐＮＯＶ２１１４をＳｐｈＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化させ、次に３’ＧＵＳＡｔｔＰｒＴａｃｔのＮｈｅＩ／ＳｐｈＩ消化及びＭＵＰＭＩＡｔｔＬ又はＭＵＰＭＩＡｔｔＲのＡｖｒＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化によって形成されたフラグメントととの３方連結ににおいて使用し、それぞれＤＯＮｓｇＡｔｔＬ又はＤＯＮｓｇＡｔｔＲを形成させる。
例６４：反転ａｔｔＬ部位又は反転ａｔｔＲ部位を伴う単子葉植物ドナー
単子葉植物ドナー配列、ＤＯＮｄｂＡｔｔＰを、ａｔｔＰ部位を除去するためにＫｐｎＩ及びＳａｃＩで消化させる。鋳型としてＬＰｓｇＡｔｔＬを用いてａｔｔＬを作り上げるために５’−ＣＧＴ  ＡＧＣ  ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＧＡＡ  ＡＴＣ  ＡＡＡ  ＴＡＡ  ＴＧＡ  ＴＴＴ−３’（配列番号１３５）を伴うオリゴヌクレオチド対５’−ＧＧＣ  ＴＧＡ  ＧＧＴ  ＡＣＣ  ＴＧＡ  ＡＧＣ  ＣＴＧ  ＣＴＴ  ＴＴＴ  ＴＡＴ−３’（配列番号１３４）を用いて、又、鋳型としてＬＰｓｇＡｔｔＲを使って、ａｔｔＲを作り上げるための５’−ＣＧＴ  ＡＧＣ  ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＣＧＣ  ＴＣＡ  ＡＧＴ  ＴＡＧ  ＴＡＴ  ＡＡＡ−３’（配列番号１３７）を伴うオリゴヌクレオチド対５’−ＧＧＣ  ＴＧＡ  ＧＧＴ  ＡＣＣ  ＴＣＴ  ＧＴＴ  ＡＣＡ  ＧＧＴ  ＣＡＣ  ＴＡＡ−３’（配列番号１３６）を用いて、ａｔｔＰ部位を置換するために用いられたａｔｔＬ又はａｔｔＲ部位を、ＰＣＲフラグメントとして形成させる。ＤＯＮｄｂＡｔｔＰの切除されたａｔｔＰ部位を、ＫｐｎＩ及びＳａｃＩで消化させたａｔｔＬ又はａｔｔＲ  ＰＣＲフラグメントで置換し、それぞれＤＯＮＡｔｔＬｉとＤＯＮＡｔｔＲｉを形成させる。
【０２３４】
ＤＯＮｄｂＡｔｔＰのａｔｔＰ部位を含有する部分的ＧＵＳ遺伝子を、ＢｇｌＩＩ及びＳｐｈＩ消化を用いて切除する。このＧＵＳＡｔｔＰフラグメントを、ｐＮＯＶ２７９０ＡｔｔＢ中にサブクローニングし、ＢｇｌＩＩ及びＳｐｈＩで消化させてそのａｔｔＰ部位を除去し、ＧＵＳＡｔｔＰｉを形成させる。ＧＵＳＡｔｔＰｉのａｔｔＰ部位を、ＮｈｅＩ及びＢｇｌＩＩでの消化により除去し、共にＮｈｅＩ及びＢｇｌＩＩで消化されたＴＯＰＯＮＡｔｔＬＢｇのａｔｔＬ部位又はＴＯＰＯＮＡｔｔＲＢｇのａｔｔＲ部位で置換し、それぞれＧＵＳＡｔｔＬｉ及びＧＵＳＡｔｔＲｉを形成させる。バイナリベクターＤＯＮｄｂＡｔｔＰを、ＢｇｌＩＩ／ＳａｃＩで消化させ、ＧＵＳＡｔｔＬｉのＢｇｌＩＶＳｐｈＩ消化及びＤＯＮＡｔｔＬｉのＳａｃＩ／ＳｐｈＩ消化によって形成されたフラグメントを用いた３方連結において使用し、ＤＯＮｄｂＡｔｔＬを形成させる。
【０２３５】
同様にして、バイナリベクターＤＯＮｄｂＡｔｔＰを、ＢｇｌＩＩ及びＳａｃＩで消化させ、ＧＵＳＡｔｔｒｉのＢｇｌＩＩ／ＳｐｈＩ消化及びＤＯＮＡｔｔＲｉのＳａｃＩ／ＳｐｈＩ消化によって形成されたフラグメントを用いた３方連結において使用し、ＤＯＮｄｂＡｔｔＲを形成させる（図９）。
Ｄ．イネ標的配列細胞系列中へのドナー配列のターゲティングされた組込み
例６５：バイオリスティクスを用いたイネ標的配列系列中へのドナー配列のターゲティングされた組込み
一次標的配列を、自家授粉させ、種子を得る。これらの系列の自家受粉した後代に由来する種子を用いて、ターゲティング実験のための胚形成培養と懸濁培養を確立する。若い種子由来の未成熟な胚芽又は乾燥種子由来の成熟した胚芽を用いて、胚形成培養を確立する（Hiei et al （１９９４）Plant Journal６：２７１−２８２；Don et al（１９９６） Molecular Breeding２：２６７−２７６；Hiei et al.(１９９７)Plant Molecular Biology３５：２０５−２１８）。Cheng et al. (１９９８) Plant Cell Reports１８：２５−３１に記述されている通り、選択作用物質として２％マンノースを用い、これらの培養又は懸濁細胞培養を、バイオリスティクス送達を用いたターゲティング実験のために使用する。
【０２３６】
各処理のために用いられるプラスミドの組合せは、標的配列内の認識部位(単複)と相容性を有する適切なドナーＤＮＡ、組込み宿主因子との同時発現を伴う又は伴わないラムダインテグラーゼ発現カセット、及びエキシジオナーゼを含む。
【０２３７】
標的配列を伴うボンバードを受けたドナー配列のラムダのインテグラーゼ媒介型組換えをは、無傷のβ−グルクロニダーゼ(GUS)発現カセットを作り上げる。ターゲティングされたカルスのサブセットを、例４４Dで記述されたＧＵＳ組織化学的検定を用いて、ターゲティングされた組込みについて試験する。
【０２３８】
標的配列を伴うボンバードを受けたドナー配列のインテグラーゼ媒介型組換は同様に、無傷のホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＭＩ）発現カセットも作り出し、これはターゲティングされた事象の選択と回収を可能にする。ＧＵＳ検定に用いられないカルスを、マンノース選択培地の上に置き、マンノース上で成長しているカルスを新鮮な培地の上に継代培養させ、再生のために増大させる。
【０２３９】
次に、これらのカルスを、ＰＣＲ検定を使って分析する。プライマ対のうちの一方のプライマは標的配列に対して相同であり、もう一方のプライマはドナー配列に相同であり、かくして予測可能サイズのＰＣＲ産物は、ドナーが標的配列を用いたラムダインテグラーゼ媒介型組換えを受けた場合にのみ形成されるようになっている。組換え部位（単複）で予想されるａｔｔ部位の存在を示すためにＰＣＲ産物の配列決定を実施する。ターゲティングされた組込み事象を含むことがＰＣＲによって確認された植物を温室に送る。ゲノムサザン分析をＰＣＲ陽性の候補について実施して、ターゲティングされた組込み事象の分子構造をさらに確認する。
例６６：Agrobacterium媒介型形質転換を用いたイネ標的配列系列中へのドナー配列のターゲティングされた組込み
一次標的配列を、自家授粉させて種子を得る。ターゲティング実験のための胚形成培養と懸濁培養を確立させために、これらの系列の自家受粉後代由来の種子を使用する
若い種子由来の未成熟な胚芽又は乾燥種子由来の成熟した胚芽を用いて胚形成培養を確立する（Hiei et al （１９９４）Plant Journal６：２７１−２８２；Don et al（１９９６） Molecular Breeding２：２６７−２７６；Hiei et al.(１９９７)Plant Molecular Bioloogy３５：２０５−２１８）。次に、これらの培養又は懸濁細胞クラスタを、Agrobacterium媒介型形質転換のために利用する。
【０２４０】
ドナー構成体又はラムダインテグラーゼ（野生型又はIｎｔ−ｈ又はInt−ｈ／２１８)発現カセット（組込み宿主因子を伴う又は伴わない)のいずれかを担持するバイナリベクター及びエキシジオナーゼを、個別に、Agrobacterium菌株LBA4404中へと形質転換させる。
【０２４１】
ターゲティングのために、１つは相容性を有するドナー配列を含有し、1つはインテグラーゼ（ＩＨＦを伴う又は伴わない)を含有し、さらにもう1つはエキシジオナーゼを含有している、3つのLBA4404Agrobacterium菌株と各イネ標的配列細胞系列を同時育成する。代替的には、インテグラーゼ（ＩＨＦを伴う又は伴わない)を含有する発現カセットと同様にエキシジオナーゼを含有する発現カセットを用いて1つのAgrobacterium菌株を、形質転換させることも可能である。単一Agrobacterium菌株を利用する場合、２つの発現カセットを、２つの異なるＴ−ＤＮＡ上又は単一のＴ−ＤＮＡ上のいずれかに位置設定することができる。例６２に記述した通りに同時育成を実施し、２％マンノースを選択作用物質として用いてターゲティングされた事象を選択する。
【０２４２】
マンノース耐性事象の分子分析(PCR及びゲノムサザン)を、先行する例に記述した通りに実施する。
Ｖ．タバコ細胞中でのラムダインテグラーゼ活性の実証。
Ａ．タバコ細胞中での組換え検定のための構成体
例６７：タバコ細胞中におけるＴ−ＤＮＡ試験基質上のラムダインテグラーゼ、Ｉｎｔ−ｈ、及びＩｎｔ−ｈ／２１８によって媒介されたａｔｔＢ及びａｔｔＰ間の分子内組換え
例６７Ａ．バイナリベクター分子内組換え試験基質CMｌｕｃB/Pの構築
ｖＡｔｔＢ／Ｐを、ＢａｍＨＩで消化させ、Ｌｕｃ遺伝子の５’部分を伴う１７８３ｂｐのフラグメントを精製する。ＣＭＰＳプロモータを含有するｐＮＯＶ４２１１を、Ｓｐｅｌで消化させ、オリゴヌクレオチド５’−ＣＴＡ  ＧＧＡ  ＧＡＴ  ＣＴＣ−３’（配列番号１３８）を用いた連結により部位をＢｇｌＩＩ部位へと転換させ、４２１１Ｂｇを形成させる。プラスミド４２１１Ｂｇを、アルカリホスファターゼの存在下でＢｇｌＩＩで消化させ、このベクターを、上述の１７８３ｂｐのＢａｍＨＩフラグメントを用いて精製し、連結させてＣＭ５’；ＬｕｃＩｎｔＡｔｔＢを形成させる。このプラスミドを、Ａｓｐ７１８Ｉ及びＮｏｔＩで消化させ、１９２３ｂｐのフラグメントを精製する。ｖＡｔｔＢ／ＰをＢｇｌＩＩ／Ａｓｐ７１８Ｉで消化させ、ＡｔｔＰＩｎｔ３’ＬｕｃＮｏｓを含有する１０２５ｂｐフラグメントを精製する。ウイルスベクターｐＷＩ−１１Ｍを、ＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩで消化させ、先行する２つのフラグメントに連結させて、ｖＣＭＬｕｃＢ／Ｐ．を生成させる。
ＣＭＬｕｃＢ／Ｐを、ＮｈｅＩ及びＢｇｌＩＩでｖＣＭＬｕｃＢ／Ｐを消化させることによってＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによる送達のためにバイナリベクター中に導入する。２９５５ｂｐのフラグメントを単離し、ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで消化させたバイナリベクターｐＮＯＶ２１２２に連結させ、ＲＫＬｕｃＢ／Ｐを形成させる。このプラスミドを、電気穿孔法によりコンピテントAgrobacterium菌株LBA4404中へと形質転換させ、カナマイシン耐性について選択する。ＲＫＬｕｃＢ／Ｐプラスミドの存在を、形質転換体からのミニプレップＤＮＡの分析によって確認する。
例６７Ｂ．分子内Ｂ／Ｐ組換え試験基質のための正の対照ＲＫＬｕｃＡｔｔＬの構築
ｐＡｔｔＬ正の対照プラスミドを、ＳｐｈＩ及びＡｓｐ７１８Ｉで消化させ、ＬｕｃＩｎｔＡｔｔＬ遺伝子の３’末端を１６４１ｂｐのフラグメントとして精製する。これを、Ａｓｐ７１８Ｉ及びＳｐｈＩで消化させたｐＮＯＶ２１２２ベクター中で連結させる。結果として得られたプラスミドを、次に、アルカリホスファターゼの存在下においてＳｐｈＩで消化させ、このベクター中に、ＣＭＰＳプロモータ及びルシフェラーゼ遺伝子の５’末端を含有するＲＫ２ＬｕｃＢ／Ｐの１２９８ｂｐのＳｐｈＩ消化フラグメントに連結させる。結果として得られたプラスミドをＲＫＬｕｃＡｔｔＬと呼称する。
このプラスミドを、電気穿孔法によりコンピテントAgrobacterium菌株ＬＢＡ４４０４中へと形質転換させ、カナマイシン耐性について選択する。ＲＫＬｕｃＡｔｔＬプラスミドの存在を、形質転換体からのミニプレップＤＮＡの分析によって確認する。
例６８：分子内L／R組換え試験基質ｐＢＳ．ＣＭＰＳＬｕｃＬ／Ｒの構築
プラスミドｐＢＳ．ＣＭＰＳＬｕｃＬ／Ｒを、以下に記述するように３方連結によって構築する。第１に、２９５２ｂｐのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（−）ベクターを、ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで消化させる。第２に、構成体ＣＭＰＳＶＬｕｃＩｎＡｔｔＬを、ＸｈｏＩで消化させ、クレノウで充填し、次にＳｐｅＩで切断して、イントロンに挿入された（ルシフェラーゼの読み取り枠との関係において）順方向の配位にあるａｔｔＬ部位が後続するルシフェラーゼ遺伝子の５’末端にスプライスされたＣＭＰＳプロモータを担持する１９８７ｂｐを放出させる。第３に、構成体ＡｔｔＲ３’ＬｕｃＮｏｓ−Ａを、ＡＳＰ７１８で消化させ、クレノウで充填し、次にＢｇｌＩＩで切断させて、ルシフェラーゼ読み取り枠との関係において順方向の配位にあるイントロン中に位置設定されたａｔｔＲ部位が先行し、３’ｎｏｓターミネーターが後続するルシフェラーゼ遺伝子の３’末端を担持する９６２ｂｐのフラグメントを放出させる。上述の３つのＤＮＡフラグメントは、共にに連結されて分子内Ｌ／Ｒ組換え試験基質ｐＢＳ．ＣＭＰＳＬｕｃＬ／Ｒを形成し、ここでＣＭＰＳプロモータは、ルシフェラーゼ遺伝子の３’末端が反転配位で後続し、ａｔｔＲ部位（５’側）及びａｔｔＬ部位（３’側）によってフランキングされた、ルシフェラーゼ遺伝子の５’末端にスプライスされる。ａｔｔＲ及びａｔｔＬ部位は反転した配位にある。ラムダインテグラーゼによって媒介されたＬ／Ｒ組換えの時点で、ルシフェラーゼの３’末端は反転され、その結果全長ルシフェラーゼ読み取り枠は再構成される。検出されたルシフェラーゼの量は、ラムダインテグラーゼによって媒介されたＬ／Ｒ組換え量の尺度である。
Ｂ． Agrobacteriumを用いたタバコ細胞内での組換え検定
１．分子内組換え試験基質
本研究中で用いられたバイナリベクター試験基質は、Ｉｎｔの機能的発現を提示するように設計されている。分子内ａｔｔＢ／ａｔｔＰ試験基質は、ルシフェラーゼ発現カセットの５’部分（５’Ｌｕｃ−５’イントロン−ａｔｔＢ）及びルシフェラーゼ発現カセットの３’部分（ａｔｔＰ−３’イントロン−３’Ｌｕｃ）を含有し、ここで３’部分は５’部分に対して反転されており、ａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位は反転配位にある。Ｉｎｔ複合体により媒介されるａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位間の分子内組換えは、ルシフェラーゼ発現カセットの３’部分の反転を導き、無傷のカセット及びルシフェラーゼ酵素活性を産生する。
２．Agrobacterium を用いた同時育成
新鮮なＢＹ２培地（Narasimhulu et al.,The Plant Cell.第８巻：８７３−８８６（１９９６））へ移してから２−３日後にＢＹ２タバコ懸濁細胞を使用する。実験に用いるAgrobacterium菌株を、適切な抗生物質と共にＹＰ培地中（例２５）で２５℃で一晩成長させる。細菌を遠心分離に付し、ＢＹ２培地中に再懸濁させ、その濃度をＯＤ660＝０．５に調整した。各同時育成のために、２５Ｘ９０ｍｍの無菌ペトリ皿中の３ｍｌの新鮮なＢＹ２培地に、様々な容量（通常１５〜６０マイクロリットル）の指示されたAgrobacterium菌株を接種し、徹底的に混合する。細菌懸濁液に３ｍｌのＢＹ２懸濁駅を添加し、細菌と植物細胞を混合させるために混合物を勢い良く旋回させる。同時育成を、暗所２５℃で２日間インキュベートし、その後、懸濁液をペトリ皿から、８００ｍｇ／リットルのチカルシリンを含有する３ｍｌのＢＹ２培地の入った１２５ｍｌ入りの無菌エーレンマイヤー培養フラスコ中に洗い落す。懸濁液を、回転式振盪機上で約1週間暗所２５℃で培養する。
３．ルシフェラーゼ検定
ルシフェラーゼ検定のためには、植物細胞（１ｍｌ）を約２日の間隔で除去し、遠心分離により収集し、手持ち電池駆動式ホモジナイザーを利用してカーボランダムで磨砕し、遠心分離（１０分、１０，０００Ｇ）に付し、透明の上清液を、PromegaのLuciferase Assay System（ルシフェラーゼ検定システム）によりルシフェラーゼ活性について検定する。BioRad のProtein Assay Reagent（タンパク質検定試薬）によりタンパク質濃度を決定し、結果をを用いて以下の表６、７及び８に記録されているようなルシフェラーゼの比活性を計算する。
４．分子内組換え研究
以下の研究において、分子内試験基質ＲＫＬｕｃＢ／Ｐ（以下の表６，７及び８中ではＢ／Ｐと省略されている）を含有するAgrobacterium宿主菌株LBA4404を、単独であるか又はインテグラーゼバイナリベクターＲＫＩｎｔ、ＲＫＩｎｔ−ｈ、ＲＫＩｎｔ−ｈ／２１８、ＲＫＩｎｔＨＦ，ＲＫＩｎｔ−ｈＨＦ又はＲＫＩｎｔ−ｈ／２１８ＨＦ（例２６に記述される通り）（それぞれ表６、７及び８中で、Ｉｎｔ、Ｉｎｔ−ｈ、Ｉｎｔ−ｈ／２１８、ＩｎｔＨＦ、Ｉｎｔ−ｈＨＦ及びＩｎｔ−ｈ／２１８ＨＦと略されている）の１つを含有するAgrobacterium LBA4404宿主菌株と組み合わせた形のＢＹ２タバコ細胞を同時育成させる。ラムダインテグラーゼ、Ｉｎｔ−ｈ又はＩｎｔ−ｈ／２１８二より媒介された分子内組換えは、ルシフェラーゼ発現という結果をもたらす。バイナリベクター、ＲＫＬｕｃＡｔｔＬ（表６、７及び８中ではＬｕｃＡｔｔＬと省略されている）を含有するAgrobacterium LBA4404菌株を、正の対照としてＢＹ２細胞と同時育成させる。菌株の略号に続く「＃１」又は「＃２」は、２つのAgrobacterium形質転換体コロニーのどちらが、実験のその部分に使用されたるを示している。抗生物質を適用してから２日目、４日目等々にルシフェラーゼ活性検定を実施する。ルシフェラーゼ発現は、Ｉｎｔ媒介型組換え活性の尺度である。
【０２４３】
【表７】
2005521400.tif 000009
【０２４４】
【表８】
2005521400.tif 000010
【０２４５】
【表９】
2005521400.tif 000011
【０２４６】
以上の表６、７及び8に提示されている結果は、ＩＨＦ遺伝子によって増強されたインテグラーゼ遺伝子及びその突然変異体のAgrobacterium送達が、Agrobacteriumによって細胞中に送達されているＬｕｃＢ／Ｐ基質上のａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位間の組換えを良好に媒介する活性インテグラーゼを産生することを示している。
Ｃ．マイクロプロジェクタイルボンバードを用いたタバコ細胞中の組換え検定
例６９：バイオリスティクスを用いたタバコ細胞中での分子内Ｌ／Ｒ組換えの試験
IＨＦ及びＸｉｓと組合せた形で、トウモロコシで最適化された３つのインテグラーゼ（野生型インテグラーゼ、Ｉｎｔ−ｈ及びＩｎｔ−ｈ／２１８突然変異体）の機能的発現を実証するためにｐＢＳ．ＣＭＰＳＬｕｃＬ／Ｒ試験基質を利用する。ＰＢＳ．ＣＭＰＳＬｕｃＬ／Ｒは、ルシフェラーゼ発現カセットの５’部分（５’Ｌｕｃ−５’イントロン−ａｔｔＬ）及びルシフェラーゼ発現カセットの３’部分（ａｔｔＲ−３’イントロン−３’Ｌｕｃ）を含有し、ここで３’部分は５’部分に対して反転しており、ａｔｔＬとａｔｔＲ部位は反転配位にある。Ｉｎｔ複合体によって媒介されたａｔｔＬ及びａｔｔＲ部位間の分子内組換えは、ルシフェラーゼ発現カセットの３’部分の反転を導き、無傷のカセットとルシフェラーゼ酵素活性を産生する。
【０２４７】
野生型ＢＹ２懸濁細胞を、ＢＹ２液体培地［１リットルあたり、４．３１ｇのＭＳ塩，３７０ｍｇのＫＨ2ＰＯ4、１ｍｇのチアミン、０．２ｍｇの２，４−Ｄ、３０ｇのスクロース、ｐＨ５．７］中で１００−１５０ｒｐｍの回転式振盪機上で暗所において２８℃で成長させる。これらを、新鮮なＢＹ２培地中の１：５０の希釈を用いて、毎週継代培養させる。過渡的発現検定のためには、1週間経過した培養の1：5−１：１０希釈を2日間成長させる。ボンバードの日に、２〜５ｍｌの細胞を、殺菌された磁気フィルター漏斗装置（ＶＷＲ  CAT#２８１４３−５５０）のプラットフォーム上で膜フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Cat#ＧＶＷＰ０４７００）の上にピペットで取り出し、真空を用いて細胞から液体培地を穏やかに引き離す。細胞を伴う膜を、１２％のスクロースと０．８％のphytagarを伴うosmoticumBY2培地の上に置く。細胞を、ボンバードに先に立ち３−５時間暗所でインキュベートする。
【０２４８】
粒子ボンバードのためには、プラスミドＤＮＡを、標準ＣａＣｌ2−スペルミジン化学を用いて１μｍ未満の金粒子（CrescentChem. Co., Inc., NY）上で共沈させる。デュポンヘリウムガン及び1100psiの破裂板(Biorad)を用いて、各標的に２回ボンバードする。
【０２４９】
分子内のプラスミド組換えの試験基質、ｐＢＳ．ＣＭＰＳＬｕｃＬ／Ｒを、インテグラーゼ、ＩＨＦ又はエキシジオナーゼの不在下におけるルシフェラーゼ過渡的発現の背景レベルを確立べく、最初に、０．６６６μｇ／ショットの濃度でＢＹ２細胞の中に別々にボンバードする。次に基質を、各インテグラーゼ及びＩＨＦ構成体（０．１６６μｇ／ショット）並びにエキシジオナーゼ構成体ｐＡｄＦ６１（０．１６６μｇ／ショット）で同時ボンバードする。各ＤＮＡ混合物について重複標的平板をボンバードする。ボンバードの後、平板を２日間２８℃で暗所にてインキュベートし、次に粗抽出物を調製してＩ．Ａ．４で上述したように、ルシフェラーゼ活性について検定する。重複平板についての平均相対光単位（ＲＬＵ）を下表９に示す。
【０２５０】
【表１０】
2005521400.tif 000012
【０２５１】
表９中のデータは、３つのインテグラーゼのそれぞれが、ＩＨＦとＸｉｓと組合わせた場合にタバコＢＹ２細胞中で分子内Ｌ／Ｒ組換えを媒介することを示している。
Ｄ．タバコ細胞中での染色体内組換え
例７０：タバコ染色体ＤＮＡ中に組み込まれたａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位間のＩｎｔ媒介型分子内組換え
例７０Ａ  双子葉植物選択マーカーＶＳＵｂｑ３ＩｎｔＨｙｇの構築
トウモロコシユビキチンプロモータに付着したハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含有するｐＣＩＢ７６１３をＢａｍＨＩで消化させるＨｙｇＲ遺伝子を、１０３２ｂｐのフラグメントとして切除し、精製する。Arabidopsisユビキチン−３プロモータ／イントロン及びｎｏｓターミネーターを含有する発現ベクターｐＰＥＨ３０を、ＢａｍＨＩで消化させ、アルカリホスファターゼで処理する。このベクターをＨｙｇＲ遺伝子と合わせて連結させ、インサートが正しい配位にあるクローンをＳＡＣＩＩとＸｂａＩでの消化により同定する。産物プラスミド、Ｕｂｑ３ＩｎｔＨｙｇは、双子葉植物発現可能形態のハイグロマイシン耐性として役立つ。
【０２５２】
ＸｂａＩでｐＮＯＶ２１１４を消化させ、アルカリホスファターゼ用いてそれを処理することによって、Ｕｂｑ３ＩｎｔＨｙｇをバイナリベクターに挿入させる。オリゴヌクレオチド５’−ＧＴＡ  ＣＧＡ  ＡＴＴ  Ｃ−３’（配列番号１３９）用いてＡｓｐ７１８Ｉ部位がＥｃｏＲＩ部位に転換されたプラスミドＵｂｑ３ＩｎｔＨｙｇを、ＸｂａＩで消化させ、３０８９ｂｐのＵｂｑ３ＩｎｔＨｙｇ発現カセットを分離し、精製する。Ｕｂｑ３ＩｎｔＨｙｇとｐＮＯＶ２１１４との連結は、インサートの２つの配位を伴う産物を生み出す。Ｔ−ＤＮＡ右のボーダーの近くに遺伝子の５′末端を伴う１つのものを、植物の形質転換実験用として選択し、ＶＳＵｂｑ３ＩｎｔＨｙｇと命名する。
例７０Ｂ．分子間Ｂ／Ｐ組換え試験基質及び双子葉植物の選択マーカーのAgrobacteriumＬＢＡ４４０４内への同時形質転換
ＶＳＵｂｑ３ＩｎｔＨｙｇとＲＫＬｕｃＢ／Ｐ１：１の混合物（各々約５０ｎｇ）を、電気穿孔法によって５０マイクロリットルのコンピテントAgrobacteriumＬＢＡ４４０４へと形質転換させ、３時間の回復期の後に、細菌を、５０ｍｇ／ｌのカナマイシンと１００ｍｇ／ｌのスペクチノマイシンを補足したＹＰ寒天上で平板培養し、両方のバイナリベクター獲得について選択する。形質転換体は２−３日後に出現し、その一方を取り上げて選択寒天上での単一コロニー単離により精製する。この菌株をＬＢＡ４４０４（ＶＳＵｂｑ３ＩｎｔＨｙｇ）（ＲＫＬｕｃＢ／Ｐ）と命名する。
例７０Ｃ．タバコ染色体ＤＮＡ内への試験基質の安定した組込み
１．同時育成及び選択
新鮮な培地内への１０倍希釈の２日後の、系列ＢＹ２のタバコの懸濁細胞に対して、上述のＶ．Ｂ．２の節で記したものと基本的に同じプロトコル用いてAgrobacteriumＬＢＡ４４０４（ＶＳＵｂｑ３ＩｎｔＨｙｇ）（ＲＫＬｕｃＢ／Ｐ）を接種する。各同時育成について、３ｍｌの新鮮なＢＹ２植物細胞培地を深いペトリ皿にピペットで移し、６０マイクロリットルの再懸濁された細菌を添加して、十分に混合する。ＢＹ２懸濁細胞（６ｍｌ）を添加し、皿を旋回させて、植物細胞と細菌を徹底的に混合させる。未接種ＢＹ２細胞という対照を同様の形で調製する。暗所において２５℃で３日間インキュベーションした後、植物細胞を、孔径８ミクロンのフィルター（白いＳＣＷＰ，４７  ｍｍ）を取付けた無菌の濾過装置中へ洗い流し、チカルシリン（２００ｍｇ／リットル）を含有する１５ｍｌのＢＹ２培地で３回洗浄する。最後に、植物細胞を、チカルシリン（２００ｍｇ／リットル）を加えた５ｍｌのＢＹ２培地中に再懸濁させ、懸濁液を、ハイグロマイシン（２５ｍｇ／リットル）とチカルシリン（４００ｍｇ／リットル）を補足したＢＹ２培地の２−３枚の平板上に広げる。平板を３．５週間暗所で２８°でインキュベートし、その時点で、死んだ未形質転換（ハイグロマイシン感受性）細胞の背景に、急速に成長するハイグロマイシン耐性細胞の小さいクローンが見える。
２．  ＲＫＬｕｃＢ／Ｐ  Ｔ−ＤＮＡを用いて安定した形で形質転換を受けた細胞系列の同定
ハイグロマイシン耐性クローンを、平板培養の約３．５週後に選択平板から取り上げる。各クローンに番号付けし、２つの部分に分割し、その一方を５ｍｌの液体選択培地中に接種し、他方を選択寒天上に再度平板培養する。両方の培地とも、チカルシリン（４００ｍｇ／リットル）及びハイグロマイシン（寒天のための２５ｍｇ／ｌ、液体培地のための５０ｍｇ／ｌ）を含有している。暗所にて２８°で回転式振盪機（１２３ｒｐｍ）上での１週間インキュベーションした後に、各懸濁培養の３ｍｌのアリコートを新鮮な選択培地中で１０倍に希釈し、細胞の標本を遠心分離し、そこからIsoQuick Nucleic Acid Isolationキット(Orca Research Inc.)のプロトコルによってＤＮＡを単離する。各クローンのＤＮＡを、ｖｉｒＧ位伝子、(Agrobacterium汚染について試験するため)、ＨｙｇＲ遺伝子（正の対照）及び反転ルシフェラーゼ遺伝子特異的なプライマを用いてＰＣＲにより分析する。Agrobacteriumを含まず、反転シフェラーゼ遺伝子についてＰＣＲ陽性である細胞系列の１つをＢ／Ｐ−６と命名し、以下で記述される通りに使用する。
例７０Ｄ．タバコクロマチン内でのａｔｔＢとａｔｔＰ間の組換え賭けについて試験するための検定
１．Agrobacteriumとの同時育成
移転後２日目に、Ｂ／Ｐ−６系列の懸濁細胞を、６ミクロンのフィルターを取付けたフィルター装置上に洗い出し、選択作用物質を含まない無菌のＢＹ２培地の５０ｍｌアリコート連続して６回洗浄する。洗浄したＢ／Ｐ−６細胞を、５０ｍｌの新鮮なＢＹ２培地が入った無菌のフラスコの中にフィルターから洗い流し、Agrobacteriumでの接種前に６時間暗所にて回転式振盪機上で２８°でインキュベーションさせる。
２．ａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位間の染色体内組換えの研究
組込み宿主因子を伴う又は伴わない野生型又は突然変異Ｉｎｔ遺伝子を送達するためのバイナリベクターを含有するAgrobacterium菌株については、以上の例４５で記述されている。ラムダインテグラーゼ、Ｉｎｔ−ｈ又はＩｎｔ−ｈ／２１８によって媒介された染色体ａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位間の分子内組換えは、ルシフェラーゼの発現という結果をもたらす。すべての菌株を、ＹＰＫａｎ５０肉汁中で培養し、遠心分離に付して、ＯＤ660＝０．５でＢＹ２培地内で再懸濁させる。上述の通り、６０μｌの細菌懸濁液を、深いペトリ皿に入った３ｍｌのＢＹ２培地に接種し、この懸濁液に対して、上述の洗浄されたＢ／Ｐ−６タバコ懸濁細胞の６ｍｌアリコートを強く混合しながら添加する。
【０２５３】
同時育成を、３日間暗所にて２５°でインキュベートし、その時点で植物細胞をフラスコに移し、４００ｍｇ／１の最終濃度となるように十分なチカルシリンと共に３ｍｌの新鮮なＢＹ２培地を添加する。培養を２日間回転式振盪機上でインキュベートし、その時点で、以上の例３４に記述される通りのルシフェラーゼ酵素検定とタンパク質決定のために各々の１．５ｍｌのアリコートを取り出す。かかる検定の結果を表１２中に提示する。
【０２５４】
【表１１】
2005521400.tif 000013
【０２５５】
表１２中に提示された結果は、宿主因子タンパク質によって増強されたＩｎｔ−ｈ及びＩｎｔ−ｈ／２１８遺伝子のAgrobacterium送達が、タバコ染色体ＤＮＡ中に安定した形で組込まれたａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位間の組換えをうまく媒介する活性インテグラーゼを産生することを示している。ＩＨＦタンパク質によって強化されていないＩｎｔ−  ｈ／２１８遺伝子のAgrobacterium送達も同様に、タバコ染色体ＤＮＡ中に挿入されたａｔｔＢ及び  ａｔｔＰ部位間の組換え場介することができる。
例７１：タバコ染色体ＤＮＡ中に組込まれたａｔｔＬ及びａｔｔＲ部位間のラムダインテグラーゼ媒介型分子内組換え
例７１Ａ．分子内Ｌ／Ｒ試験基質のタバコゲノムへの形質転換のためのバイナリベクターの構築
ゲノムバイナリベクターＶＳＵｂｑ３ＩｎＨｙｇを、ＨｉｎｄＩＩＩで消化させ、クレノウで充填し、次にＡｐａＩで切断し、ｐＢＳ．ＣＭＰＳＬＵｃｕＲから３０３１ｂｐのＭｓｌＩ−ＡｐａＩフラグメントに連結させ、構成体ｐＡｄＦ６６を形成させる。構成体ｐＡｄＦ６６を、次にAgrobacterium菌株LBA4404中に電気穿孔し、スペクチノマイシン耐性について選択する。
例７１B．タバコ染色体ＤＮＡへの試験基質の安定した組込み
例４５中に記述される通りに、ＬＢＡ４４０４（ｐＡｄＦ６６）とＢＹ２懸濁細胞を同時育成する。暗所にて２５℃で３日間インキュベーションした後、植物細胞を、テーブルトップ式ＩＥＣ遠心分離機中で１分間１０００ｒｐｍで沈降させ、新鮮なＢＹ２培地で洗い流す。次にこれを、新鮮なＢＹ２培地中に再懸濁させ、ハイグロマイシン（１５ｍｇ／リットル又は２５ｍｇ／リットル）及びチカルシリン（４００ｍｇ／リットル）を補足したＢＹ２寒天上で平板培養する。平板を１０日間暗所でインキュベートし、その時点でハイグロマイシン耐性カルスを選別し、新鮮な選択平板上に移す。各々の形質転換カルス中のＴ−ＤＮＡインサートの数をＴａｑｍａｎ分析を利用して推定し、Ｔ−ＤＮＡインサート数の少ない系列を選択する。次に、ハイグロマイシン（１５ｍｇ／１）及びチカルシリン（４００  ｍｇ／１）を補足した液体ＢＹ２培地中の形質転換を受けたカルスの小さい塊を成長させることによって懸濁細胞培養を開始させる。
例７１Ｃ．タバコクロマチン内のａｔｔＬ及びａｔｔＲ間の組換えについて試験するための検定
この実験では、分子内Ｌ／Ｒ基質を担持する３つの独立した遺伝子導入ｐＡｄＦ６６  ＢＹ２懸濁細胞系列を利用し例６９に記述される通りに細胞をボンバードのために準備する。ＩＨＦ（０．８３３μｇ／ショット）を伴う又は伴なわず、エキシジオナーゼ（０．１６６μｇ／ショット）を伴うインテグラーゼを、ｐＡｄＦ６６細胞中に同時ボンバードし、過渡的ルシフェラーゼ発現を、ボンバードの２日後に細胞抽出物上で測定する。１１００ｐｓｉで１回ずつ各平板をショットする状態で、各ＤＮＡ混合物を用いて重複平板をボンバードする。個々の細胞系統が過渡的発現表示能力を示すために、１つの平板は、対照プラスミド２１２２−ＣＭＰＳＬＵＣＩＮＡＴＴＬでも同様に１回ショットを受ける。
下表を見ると分かるように、さまざまな細胞系列が正の対照プラスミドを用いた過渡的ルシフェラーゼ発現の可変的な度合いを示す。重複平板についての平均相対光単位（ＲＬＵ）を下表１０に示す。表１０中の「プラスミドなし」とラベリングされた列の示される通り、分子内基質を担持する細胞系列からは、標準背景を超えるいかなるルシフェラーゼ活性も検出されない。
【０２５６】
【表１２】
2005521400.tif 000014
【０２５７】
表１０中のデータは、３つのインテグラーゼの各々が、ＩＨＦ及びエキシジオナーゼと共に送達された場合に、植物クロマチン内で分子内Ｌ／Ｒ組換えを媒介することを示している。
ＶＩ．タバコにおけるターゲット組込み
Ａ．Agrobacterium媒介型形質転換を用いて送達されたドナー配列及びＩｎｔ
１．正の対照バイナリベクターの構築
例７２：ａｔｔＬ部位を伴うイントロンを含有する正の対照ルシフェラーゼ構成体ＣＭＰＳＶＬｕｃＩｎｔｒｏｎＡｔｔＬを形成するためのインテグラーゼを用いたプラスミドＣＭＰＳＶＬｕｃＢ／Ｐのインビトロ処理
Gateway クローニングキット(Invitrogen)からの酵素及び緩衝液を用いて、約３００ｎｇのプラスミドｖＣＭＬｕｃＢ／Ｐ（２μｌ）を、１０μｌの水、４μｌＢＰ緩衝液、及び４μｌのＢＰクロナーゼ酵素と混合させ、１．５時間  ２５℃でインキュベートさせる。Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５αを、反応混合物の半分を用いて形質転換させる。分子内反応産物ＣＭＰＳＶＬｕｃＩｎｔｒｏｎＡｔｔＬを、Ａｓｐ７１８Ｉ及びＢｇｌＩＩでのミニプレップの消化により同定する。
２．  標的配列の構築
ここに記述される構成体例においては、標的配列をタバコ中に挿入するために用いられるプラスミドは、標的配列を含有する植物クローンの同定を補助するべくＨＰＴ(ハイグロマイシン耐性遺伝子)のための発現カセットを含有している。さらに、標的配列プラスミドは、イントロン内で切詰められ、単一のａｔｔ部位又は１対の同一ａｔｔ部位（そのいずれでも野生型又は突然変異体であり得る）のいずれかによって中断された、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴＩＩ）（３’Ｉｎｔｒｏｎ−３’ＮＰＴＩＩ）発現カセット及び部分的ルシフェラーゼ（５’Ｌｕｃ−５’Ｉｎｔｒｏｎ−）を含んでいる。従って、単一ａｔｔ部位標的配列は、５’Ｌｕｃ−５’Ｉｎｔｒｏｎ−ＡｔｔＳｉｔｅ−３’Ｉｎｔｒｏｎ−３’ＮＰＴＩＩという形のスプリットマーカー遺伝子を含有している。２重ａｔｔ部位標的配列は、５’；Ｌｕｃ−５’Ｉｎｔｒｏｎ−ＡｔｔＳｉｔｅ−スペーサー−ＡｔｔＳｉｔｅ−３’Ｉｎｔｒｏｎ−３’ＮＰＴＩＩという形を有している。５’及び3’イントロン部分は異なるイントロンに対応している。ａｔｔ部位の間に含まれたスペーサーＤＮＡは、発現カセット、遺伝子又は遺伝子フラグメントであってよい。スペーサーＤＮＡは、ドナーと標的配列間のＩｎｔ媒介型２重組換えの時点でドナー配列によって除去及び置換される。
【０２５８】
単一ａｔｔ部位は、標的配列の遺伝子コーディング領域との関係において５’−３’又は３’−５’のいずれの配位にあってもよい。ａｔｔ部位の対は、発散性配位（反転配位）又は収束性配位（同じく反転配位）のいずれであってもよい。ａｔｔ部位の対の３’末端が、互いから離れる方向に向いている場合、該部位は、発散性配位であるといわれる。ａｔｔ部位の対の３’末端が互いに向い合う方向に向いている、部位は、週早世配位であるといわれる。いずれの配位が選択されても、対応する標的及びドナー配列中のａｔｔ部位又は対合したａｔｔ部位は一致した配位を有している。さらに、標的配列とドナーの中のａｔｔ部位は組換え用として相容性を有する。すなわち、本書中で記述される通りに、ａｔｔＢ標的配列はａｔｔＰドナーなどと一致する。
例７３：単一ａｔｔＲ部位を伴う標的配列の構築
プラスミドＶＬｕｃＩｎｔｒｏｎＡｔｔＬ（例７２）を、完全にＢｇｌＩＩで消化させ、次にＳｐｈＩで部分的に消化させ、４８６０ｂｐの部分的消化フラグメントを単離して、Ｖｅｃｔｏｒ１を形成させる。例１１Ａにおける中間体、プラスミド３’ＬｕｃＩｎｔｒｏｎを、ＭｆｅＩで消化させ、部位変更オリゴヌクレオチド５’−ＡＡＴ  ＴＧＴ  ＣＴＡ  ＧＡＣ−３’（配列番号１４０）と連結させて、３’ＬｕｃＩｎｔｒｏｎＸｂａを形成させる。プラスミド３’ＬｕｃＩｎｔｒｏｎＸｂａＩを、ＳｐｈＩ及びＸｂａＩで消化させ、イントロンの５’部分を伴うＬｕｃの中央部を含有する７６２ｂｐのフラグメントである、Ｉｎｓｅｒｔ１を単離する。Ｉｎｓｅｒｔ２を、ＴＯＰＯＢＡｔｔＲＡｖ（例５５と５６中のＬＰｓｇＡｔｔＲ及びＬＰｄｂＡｔｔＲ構築における中間体）から、ＢＧＬＩＩ及びＡｖｒＩＩでの消化及びａｔｔＲフラグメント（１６９ｂｐ）のゲル精製によって切除する。Ｖｅｃｔｏｒ１、Ｉｎｓｅｒｔ１及びＩｎｓｅｒｔ２の３方連結により、プラスミドＶ５’ＬｕｃＩｎｔｒｏｎＡｔｔＲｒｅｖを形成させる。
【０２５９】
標的配列プラスミドを、次の通り調製されるフラグメントの４方連結によって構築する：フラグメント１については、バイナリベクターｐＮＯＶ２１１４を、アルカリホスファターゼと共にＰａｃＩ及びＸｂａＩで消化させ、ゲル精製する。フラグメント２については、プラスミドＶ５’ＬｕｃＩｎｔｒｏｎＡｔｔＲｒｅｖを、ＢｇｌＩＩ（クレノウ）／ＳＰＥＩで消化させ、２０４７ｂｐのフラグメントをゲル精製する。フラグメント３については、ｐＮＯＶ２７２０をＭｆｅＩで消化させ、部位をクレノウポリメラーゼで充填し、プラスミドをＳａｃＩで再消化させ、３’−ＮＰＴＩＩを含有する１２９１ｂｐのフラグメントをゲル精製する。フラグメント４を、ＳａｃＩ及びＰａｃＩでの消化及び３１５７ｂｐのフラグメントとしてのＨｙｇＲカセットのゲル精製により２１１４Ｕｂｑ３ＨｙｇＢから切除する。フラグメント１、２、３、及び４の４方連結によりＬＰＡｔｔＲｒｅｖ．ＢＹ２を産生させる。
例７４：ＬＰＡｔｔＰ１Ｐ２．ＢＹ２の構築
ルシフェラーゼ発現カセットの５’部分とネオマイシンホスホトランスフェラーゼ発現カセットの３’部分を分離する、反転ａｔｔＰｌとａｔｔＰ２部位によってフランキングされた「ｓｔｕｆｆｅｒ」ＤＮＡ配列を含有するように双子葉植物ランディングパッドを構築する。
ＮｃｏＩ（クレノウ）、ＸｈｏＩを用いてｐＡｔｔＬを消化させ、このフラグメントをＥｃｏＲＩ（クレノウ）、ＸｈｏＩで消化されたベクターＰＮＯＶ４２１１内に連結させることによって、ＣＭＰＳプロモータを、ルシフェラーゼ遺伝子の５’部分及びｐＡｔｔＬのイントロンにリンクさせ、Ｃｍ５’ＬｕｃＩｎｔを形成させる。ＢａｍＨＩ（クレノウ）、ＸｈｏＩでＴＯＰＯＡｔｔＰ１を消化させ、フラグメントをＰｓｐＯＭＩ（クレノウ）、ＸｈｏＩで消化させたＣＭ５’ＬｕｃＩｎｔベクターに連結させることによって、ａｔｔＰｌ部位をＣＭ５’ＬｕｃＩｎｔのイントロン中に導入し、ＣＭ５’ＬｕｃＰ１を形成させる。オリゴヌクレオチド対５’−ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＣＴＣ  ＣＧＴ  ＣＣＧ  ＡＣＧ  ＡＣＴ  ＣＡＡ  ＴＣ−３’（配列番号１４１）  及び、５’ＧＧＴ  ＡＣＣ  ＧＧＣ  ＧＣＧ  ＣＣＧ  ＣＡＡ  ＣＡＴ  ＧＡＧ  ＡＴＧ  ＧＣＡ  ＣＣＧ  Ｔ５’（配列番号１４２）及びTOPO TA Cloning Kitを用いてＤＮＡ「ｓｔｕｆｆｅｒ」フラグメントを、鋳型ｐＮＯＶ５０１３からＰＣＲクローニングさせ、ＴＯＰＯ．ｆＰＰＯを形成させる。ＴＯＰＯ．ＦＰＰＯのＮｈｅＩ、Ａｓｐ７１８Ｉフラグメントを、ＮｈｅＩ、Ａｓｐ７１８Ｉで消化させたＣＭ５’ＬｕｃＰｌベクター内へ連結させることによって、「ｓｔｕｕｆｅｒ」ＤＮＡをａｔｔＰｌ部位の３’に追加し、ＣＭＬｕｃＰｌｆＰＰＯを形成させる。ＣＭＬｕｃＰ１ｆＰＰＯのユニークＳｐｅＩ部位を、オリゴヌクレオチド５’−ＣＴＡ  ＧＧＣ  ＧＣＧ  Ｃ−３’（配列番号１４３）を用いてＡｓｃＩ部位に転換させ、ＣＭＬｕｃＰｌｆＰＰＯ．Ａｓｃを形成させる。
【０２６０】
ａｔｔＰ２部位を、以下の３方連結を用いて、ｐＮＯＶ２７２０のチュブリン−１−βイントロンの３’領域中に挿入する。ｐＮＯＶ２７２０のＮＰＴＩＩ発現カセットの３’領域を、ＭｆｅＩ、ＳａｃＩを用いて切除し、ａｔｔＰ２部位を、ＫｐｎＩ、ＭｆｅＩを用いてＴＯＰＯＡｔｔＰ２から切除し、２つのフラグメントを、ＫｐｎＩ、ＳａｃＩで消化されたＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋内に連結させ、ｐＢＳＡｔｔＰ２Ｋａｎを形成させる。ｐＢＳＡｔｔＰ２ＫａｎのユニーなＡｓｐ７１８Ｉ部位を、オリゴヌクレオチド５’−ＧＴＡ  ＣＧＧ  ＣＧＣ  ＧＣＣ−３’（配列番号１４４）を用いてＡｓｃＩ部位に転換させ、ｐＢＳＡｔｔＰ２Ｋａｎ．Ａｓｃを形成させる。ａｔｔＰ２部位を含有するＮＰＴＩＩ発現カセットの３’領域を、ＡｓｃＩ、ＳａｃＩフラグメントとしてｐＢＳＡｔｔＰ２Ｋａｎ．Ａｓｃから切除し、ＡｓｃＩ、ＳａｃＩで消化されたバイナリベクターＶＳＵｂｑ３ＩｎｔＨｙｇに連結させ、ＶＳＰ２ＫａｎＨＹＧを形成させる。
【０２６１】
ａｔｔＰ１部位を伴うルシフェラーゼ発現カセットの５’領域及びＤＮＡ「ｓｔｕｆｆｅｒ」領域をＡｓｃＩフラグメントとしＣＭＬｕｃＰｌｆＰＰＯ．Ａｓｃから切除し、ＶＳＰ２ＫａｎＨＹＧのユニークＡｓｃＩ部位に挿入させ、反転ａｔｔＰｌ及びａｔｔＰ２部位を伴う、ＬＰＡｔｔＰｌＰ２．ＢＹ２と命名された標的配列を形成させる。
例７５：反転ａｔｔR部位を伴う標的配列の構築
第１に、ｐＡｄＦ５６のａｔｔＰｌ部位を、以下の通りにａｔｔＲ部位により置換する：その５’末端においてＮｈｅＩ部位により、かつ３’末端においてＸｈｏＩ部位によりフランキングされたａｔｔＲ部位を担持するＰＣＲフラグメントを、ＰＣＲプライマＮｈｅＡｔｔＲＦＯＲ（５’−ＧＧＧ  ＣＴＡ  ＧＣＴ  ＣＴＧ  ＴＴＡ  ＣＡＧ  ＧＴＣ  ＡＣＴ  ＡＡＴ  Ａ−３’（配列番号１４５）及びＸｈｏＡｔｔＲＲＥＶ（５’−ＣＣＣ  ＴＣＧ  ＡＧＣ  ＧＣＴ  ＣＡＡ  ＧＴＴ  ＡＧＴ  ＡＴＡ  ＡＡＡ  ＡＡＧ−３’（配列番号１４６）を用いて構成体ＴＯＰＯＢＡｔｔＲＡｖから増幅させる。ａｔｔＲ  ＰＣＲフラグメントを、ＮｈｅＩ及びＸｈｏＩを用いて再切断し、ＮｈｅＩ及びＸｈｏＩで消化されたベクター構成体ｐＡｄＦ５６中にクローニングして、ｐＡｄＦ５８Ａを形成させる。
【０２６２】
第２に、ｐＡｄＦ５８ＡのａｔｔＰ２部位を、ａｔｔＲ部位により、次の通りに置換する：その５’末端においてＡｓｃＩ部位により、かつその３’末端においてＡｖｒＩＩ部位によりフランキングされたａｔｔＲ部位を、ＰＣＲプライマＡｓｃＡｔｔＲＦＯＲ（５’−ＧＧＧ  ＧＣＧ  ＣＧＣ  ＣＴＣ  ＴＧＴ  ＴＡＣ  ＡＧＧ  ＴＣＡ  ＣＴＡ  ＡＴＡ−３’）（配列番号１４７）及びＡｖｒＡｔｔｒＲＥＶ（５’−ＣＣＣ  ＣＴＡ  ＧＧＣ  ＧＣＴ  ＣＡＡ  ＧＴＴ  ＡＧＴ  ＡＴＡ  ＡＡＡ  ＡＡＧ−３’）（配列番号１４８）を用いて、ＴＯＰＯＢＡｔｔＲＡｖから増幅させる。ａｔｔＲ  ＰＣＲ産物を、ＡｓｃＩとＡｖｒＩＩを用いて再切断し、ＡｓｃＩ及びＡｖｒＩＩで消化されたベクター構成体ｐＡｄＦ５８Ａ中にクローニングさせて、ｐＡｄＦ５８を形成させる。
【０２６３】
最後に、ｐＡｄＦ５８の４０４９ｂｐのＳｆｏＩ−Ａｃｃ６５Ｉフラグメントを、構成体ＬＰＡｔｔＰｌＰ２．ＢＹ２の９３２６ｂｐのＳｆｏｌ−Ａｃｃ６５Ｉベクター部分に連結させ、バイナリベクターｐＡｄＦ６０（すなわちＬＰｄｂｌＡｔｔＲ．ＢＹ２）を形成させる（図１２）。
３．ドナー配列の構築
一般に、本書中で構築されたドナー配列例は、ＮＰＴＩＩ発現カセットの５’部分及びＬｕｃ発現カセットの３’部分、すなわち、標的配列から欠如している各々の一部分を含有する。各遺伝子の中のイントロンの分割点はａｔｔ部位によって中断されている。
ドナー構成体は、５’ＮＰＴＩＩ−５’Ｉｎｔｒｏｎ−ＡｔｔＳｉｔｅ−３’イントロン−３’Ｌｕｃの形を取る単一ａｔｔ部位を含有し得る。代替的には、ドナー構成体は、ＡｔｔＳｉｔｅ−３’Ｉｎｔｒｏｎ−３’Ｌｕｃ−５’ＮＰＴＩＩ−５’Ｉｎｔｒｏｎ−ＡｔｔＳｉｔｅの形を取る、２つのａｔｔ部位を含有し得る。ドナーの中のイントロンの３’部分は、相容性のある標的配列の中の同じイントロンの５’部分に対応する。ドナーの中のイントロンの５’部分は、相容性のある標的配列中の同じイントロンの３’部分に対応する。ドナーの中のａｔｔ部位（単複）は対応する標的配列の中のａｔｔ部位（単複）と組換えについての相容性を有する。さらに、切詰られた形遺伝子との関係におけるａｔｔ部位の配位は、ドナー及び標的配列中において同一である。
【０２６４】
以下の構成体が有用であるAgrobacteriumＴ−ＤＮＡ送達によって、ドナー配列を導入することができる。代替的には、バイオリスティックボンバード（以下の第ＶＩ節に記述されている通り）又はその他の物理的送達システムを使用することもでき、これらのためには、例えばｐＵＣ１８又はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなどといった高コピープラスミド上のドナー構成体のその他のバージョンが本書中に記述されているバイナリプラスミドから容易に誘導される。
【０２６５】
ドナー配列及び相容性ある標的配列間の単一部位又は二重部位組換えをのいずれかを介したターゲティングされたインサート事象の生成は、機能性的シフェラーゼ及びＮＰＴＩＩ発現カセットの再構成という結果をもたらす。
例７６：ａｔｔＬ部位を含有するドナー配列の構築
このドナーは、３方向連結により構築される。フラグメント１は、ＰｓｐＯＭＩ及びＳａｃＩでの消化及び６０６３ｂｐのフラグメントの精製によりＶＳＩｈｔ−ｈ／２１８から切除されたＮｏｓターミネーターを、ｐＮＯＶ２１１４ベクターに加えたものである。フラグメント２はＰｓｐＯＭＩとＭＦＥＩで切除された、Ｓｍａｓプロモータ及び５’ＮＰＴＩＩ遺伝子を含有するｐＮＯＶ２７２０の３２０３ｂｐのフラグメントである。
【０２６６】
フラグメント３は以下の通りに生成される。すなわち、例７２に記述されたプラスミドＶＬｕｃＩｎｔｒｏｎＡｔｔＬを、ＳａｃＩ及びＸｈｏＩで消化させ、３’ＩｎｔｒｏｎＬｕｃ（ターミネーターなし）を含有する４９１ｂｐのフラグメントをゲル精製する。ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターｐＢＳＫＳ-を、ＸｈｏＩ及びＳａｃＩで消化させ、アルカリホスファターゼで処理し、ベクターをゲル精製する。これから２つのフラグメントを一緒に連結させ、Ｅ．Ｃｏｌｉへと形質転換させる。クローンをＳａｃＩ／ＸｈｏＩでのミニプレップＤＮＡの消化によって分析し、所望の４９１ｂｐのインサートを示すものを、ｐＢＳ３’ＬｕｃＩｎｔｒｏｎと命名する。ａｔｔＬの挿入に備えて、ｐＢＳ３’ＬｕｃＩｎｔｒｏｎをＸｈｏＩで消化させ、アルカリホスファターゼで処理し、ゲル精製する。ＴＯＰＯＡｔｔＬ（例１２）をＸＨＯＩで消化させ、１１３ｂｐのａｔｔＬフラグメントを２％のアガロースの中でゲル精製する。ａｔｔＬ部位を、ｐＢＳ３’ＬｕｃＩｎｔｒｏｎを用いて連結しｐＢＳ３’ＬｕｃＩｎｔｒｏｎＡｔｔＬを形成させる。逆転配位でａｔｔＬを伴うクローンをＰｓｉＩでの消化によって同定し、ＤＮＡ配列により確認する。ＰＢＳ３’ＬｕｃＩｎｔｒｏｎＡｔｔＬｒｅｖをＡｓｐ７１８Ｉで消化させ、部位変更オリゴヌクレオチド５’−ＧＴＡ  ＣＧＧ  ＣＡＡ  ＴＴＧ  ＣＣ−３’（配列番号１４９）と連結させて、ＭｆｅＩ部位を生成しｐＢＳ３’ＬｕｃＩｎＡｔｔＬＭｆｅを形成させる。このプラスミドをＭｆｅＩとＳａｃＩで消化させ、６１８ｂｐのインサートフラグメントをゲル精製して、フラグメント３を生成させる。フラグメント１、２及び３を一緒に連結させて、ＤｏｎＡｔｔＬ．ＢＹ２（図１１）を形成させる。
例７７：ＤｏｎＡｔｔＢＩ．ＢＹ２の構築
このドナー配列を、４方連結を通して構築する。フラグメント１を、Ａｓｐ７１８Ｉ及びＰｓｐＯＭＩでの消化、アルカリホスファターゼを用いた処理、及び結果として得られた５６６７ｂｐのフラグメントのゲル精製によってバイナリベクターｐＮＯＶ２１１４から誘導する。フラグメント２を、Ａｓｐ７１８Ｉ／ＸＨＯＩでの消化及びＩｎｔｒｏｎ３’ＬｕｃＮｏｓを含有する７７３ｂｐのフラグメントのゲル精製によりｖａｔｔＰＩｎｔｒｏｎ３’ＬｕｃＮｏｓ（ｖＡｔｔＰ）（例１４）から切除する。ＸｈｏＩ及びＭｆｅＩの付着末端によりフランキングされたａｔｔＢｌ部位を表す、オリゴヌクレオチド対５’−ＴＣＧ  ＡＧＡ  ＧＣＣ  ＴＧＣ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＧＴＡ  ＣＡＡ  ＡＣＴ  ＴＧＴ  ＣＣＣ  Ｃ−３’（配列番号１５０）及び５’−ＡＡＴ  ＴＧＧ  ＧＧＡ  ＣＡＡ  ＧＴＴ  ＴＧＴ  ＡＣＡ  ＡＡＡ  ＡＡＧ  ＣＡＧ  ＧＣＴ  Ｃ−３’（配列番号１５１）をアニーリングすることによってフラグメント３を形成させる。フラグメント４は、ＰｓｐＯＭＩ及びＭｆｅＩでのｐＮＯＶ２７２０の消化と３２０３ｂｐのフラグメントのゲル精製によって得られたＳｍａｓプロモータ／５’ＮＰＴＩＩフラグメントである。４方連結及び形質転換は、ＸｈｏＩ／ＸｂａＩでのミニプレップの消化によって分析されるコロニーを提供する。選択されたクローンは、正しいフラグメントパターン（４０５８、１７４４、１１７６、１１４２、５９８、４４５、３１２及び９３ｂｐ）を産生する。これらのクローンは、ＤＮＡ配列決定を通して分析され、すべての接合点において、かつＡｔｔＢＬ部位を横断して予測された構造を示す。
例７８：ＤｏｎＡｔｔＢｌＡｔｔＢ２．ＢＹ２の構築。
【０２６７】
このドナーは段階で構築される。第１段階として、ＤｏｎＡｔｔＢ１．ＢＹ２（例７７）をＭｆｅＩ及びＡｓｐ７１８Ｉで消化させ、ＡｔｔＢｌＬｕｃＮｏｓを含有する８０７ｂｐフラグメントをゲル精製させ、インサート＃１を形成させる。ｐＮＯＶ２１１４をＥｃｏＲＩ及びＡｓｐ７１８１で消化させ、５７５１ｂｐのベクターをゲル精製させ、インサート＃１に連結させて、２１１４ＡｔＢ１．３’ＬｕｃＮｏｓを生成させる。ＸｈｏＩ／ＸｂａＩでの８つの候補クローンからのミニプレップＤＮＡの消化は、すべてが予測されたフラグメントパターン：３８３８、１７４４、４４５，２９７、９５、及び９３ｂｐ、を有していることを示した。この産物から、３方連結によってＤｏｎＡｔｔＢｌＡｔｔＢ２．ＢＹ２を産生させる。ＰｓｐＯＭＩ及びＳｂｆＩで２１１４ＡｔｔＢ１．３’ＬｕｃＮｏｓを消化させて、第２段階用のベクターを生成させる。インサートＡについては、ＭｆｅＩ及びＰｓｐＯＭＩでｐＮＯＶ２７２０を消化させ、Ｓｍａｓプロモータ／５’ＮＰＴＩＩを含有する３２０３ｂｐのフラグメントをゲル精製させる。インサートＢは、ＭｆｅＩとＳｂｆｌ付着末端によりフランキングされたａｔｔＢ２部位を表すアニーリングされたオリゴヌクレオチド対（５’−ＡＡＴ  ＴＧＡ  ＣＣＣ  ＡＧＣ  ＴＴＴ  ＣＴＴ  ＧＴＡ  ＣＡＡ  ＡＧＴ  ＧＧＴ  ＣＣＣ  ＣＴＧ  ＣＡ−３’（配列番号１５２）及び５’−ＧＧＧ  ＧＡＣ  ＣＡＣ  ＴＴＴ  ＧＴＡ  ＣＡＡ  ＧＡＡ  ＡＧＣ  ＴＧＧ  ＧＴＣ−３’（配列番号１５３））である。連結混合物の形質転換は１１０のコロニーを与える。１０個のクローンからのミニプレップのＸＨＯＩ／ＸＢＡＩ消化により、正しいフラグメントパターン：３８３８、２９０１、１１４２，５９８、４４５，３１２、２９７、９３、及び９０ｂｐをもつの２つが同定された。ＤＮＡ配列分析により、すべての接合点における、かつＡｔｔＢ１及びＡｔｔＢ２部位を横断する予測された構造が確認された。
例７９：反転ａｔｔＬ部位を伴うｐＵＣベースの双子葉植物ドナープラスミドの構築
第１のクローニング段階には、以下のフラグメントとの４方連結が関与している。すなわち、ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで消化されたベクターｐＮＥＢ１９３、構成体ＤｏｎＡｔｔＢｌＡｔｔＢ２．ＢＹ２由来の３１９４ｂｐのＸｈｏＩ−ＭｆｅＩフラグメント、ＬＰｄｂＡｔｔＬ由来の１２ｂｐのＸｈｏＩ−ＢｇｌＩＩａｔｔＬフラグメント（例５６）、及びＰＭＩＡｔｔＬｉ由来の１２０ｂｐのＭｆｅＩ−ＡｖｒＩＩ  ａｔｔＬフラグメント（例６３）。結果として得られたプラスミドをｐＡｄＦ７４と呼ぶ。第２段階では、３’ｎｏｓターミネーターにリンクされたルシフェラーゼ遺伝子の３’末端を担持するＤｏｎＡｔｔＢｌＡｔｔＢ２．ＢＹ２（例７８）の８７８ｂｐのＸｈｏＩフラグメントを、ｐＡｄＦ７４のユニークなＸｈｏＩ部位内に連結する。ベクター中の８７８ｂｐのＸｈｏＩインサートの所望の配位を、標準制限消化物を用いて決定し、構成体ｐＡｄＦ７５を産出させる。このｐＵＣベースのドナー構成体は２つの反転ａｔｔＬ部位を含有し、ｐＡｄＦ６０を含有するＢＹ２標的配列系列中への２つのＬ／Ｒ組換え事象に続いて機能的ルシフェラーゼ及びＮＰＴＩＩ遺伝子を再構築するのに必要な遺伝子フラグメントを含有している（図１２）。
例８０：ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＴ−ＤＮＡとしての送達のためのバイナリベクター  ｐＮＯＶ２１１４中へのドナー構築物ＤｏｎｄｂＡｔｔＬ．ＢＹ２のクローニング
ＤｏｎｄｂＡｔｔＬ．ＢＹ２を含有するｐＡｄＦ７５を、ＡｓｃＩ及びＳｂｆｌで消化させ、インサート４３５２ｂｐフラグメントをゲル精製する。バイナリベクターｐＮＯＶ２１１４をアルカリホスファターゼの存在下でＡｓｃＩ及びＳｂｆｌで消化させ、５６１１ｂｐのベクターフラグメントをゲル精製する。バイナリベクターとドナーフラグメントの連結は数百の形質転換体を提供する。ＭｆｅＩ／ＳｂｆＩでのミニプレップの消化による５つの分析は、（２１１４）ＤｏｎｄｂｌＡｔｔＬ．ＢＹ２（図１３）の５つの全てが、５６０４、４２１４、及び１４５ｂｐのフラグメント（ａｔｔＬフラグメント）を伴って適正であることを明らかにしている。
３．タバコ標的配列細胞系列の産生
例８１：標的配列のタバコ懸濁細胞中への形質転換
ＬＰＡｔｔＲ．ＢＹ２（図１０）を担持するAgrobacteriumＬＢＡ４４０４菌株を、スペクチノマイシン（１００ｍｇ／１）を伴うＹＰ肉汁中に接種して、後期対数期（一般に２４時間）まで２５℃で成長させる。細菌を遠心分離に付し、ＢＹ２液体培地の中でＯＤ660＝０．５で再懸濁させる。ペトリ皿１枚あたり標準的に１２０μｌのAgrobacteriumを使用し、同時育成を通常約３日間行う点を除き、基本的に例４５に記述される通りにタバコＢＹ２細胞の形質転換を実施する。この時間の終了時点で、植物細胞を懸濁させ、ピペットを用いてペトリ皿から１５ｍｌ入りの遠心分離管に移し、無菌のＢＹ２培地でペトリ皿を１回すすぎ、すすぎ液を管に追加する。植物細胞を２分間２０００ｒｐｍで遠心分離に付し、上清液を傾瀉させる。ＢＹ２細胞を、３−５ｍｌ中で懸濁させ、１５ｍｇ／ｌのハイグロマイシン、２００ｍｇ／リットルのチカルシリン（ＢＹ２ＨｙｇＬ５ＴＩＣ２００）  を伴うＢＹ２寒天上に展延させた（平板１枚あたり充填細胞約０．５−１ｍｌ）。平板を２８℃で暗所にてインキュベートし、およそ２−３週後に、標的配列クローンとしてカルスを選択する。ＬＰＡｔｔＲ．ＢＹ２（図１０）を含有する選択されたクローンを、周囲光の下で２２℃で培養し、２−３週の間隔でＢＹ２Ｈｙｇ１５Ｔｉｃ２００の新鮮な平板上に移す。
４．タバコ標的細胞系列中へのドナー配列のターゲティングされた組込み
例８２：ａｔｔＲ部位を含有するタバコ標的細胞系列とａｔｔＬ部位を伴うドナー構成体を含有するAgrobacteriumとの同時育成
ＬＰＡｔｔＲ．ＢＹ２（図１０）を含有する標的配列植物細胞系列を、懸濁培養として成長させ、抗生物質を除去するべくに洗浄し、同時育成に先立って直ちに選択することなくＢＹ２培地の中で一晩成長させる。標的配列系列を以下の通りの3つの処理に付す：（１）１００μｌのＬＢＡ４４０４（ＤｏｎＡｔｔＬ．ＢＹ２）＋６０μｌのＬＢＡ４４０４（ＲＫＩｎｔ−ｈＨＦ）＋２０μｌのＬＢＡ４４０４（ｐＡｄＦ６２Ａ）；（２）１８０μｌのＬＢＡ４４０４（ｐＮＯＶ２７３１）（正の対照）；及び（３）Agrobacterium無し（未処理対照）。ＬＢＡ４４０４培養をＯＤ660＝０．５に調整し、指示量のAgrobacterium菌株を深いペトリ皿中で１．８ｍｌの液体ＢＹ２培地に添加する。ｐＡｄＦ６２Ａは、例８に記述される通り、Ｘｉｓ発現カセットを伴うバイナリベクターである。ｐＮＯＶ２７３１は、正の対照カナマイシン耐性発現カセットである。
【０２６８】
３枚の深いペトリ皿（各処理用に１枚ずつ）を準備し、約１．５ｍｌの充填細胞を含有する７ｍｌの植物細胞懸濁液及び指示量のAgrobacterium培養（単複）を含有する２ｍｌのＢＹ２培地を各皿に加える。細菌と植物細胞を勢い良く混合し、約３日間暗所で周囲温度（約２２℃）で保存する。細胞を遠心分離に付し、再懸濁させ、選択寒天上にピペットで移す。各同時育成を、１００ｍｇ／ｌのカナマイシンに２００ｍｇ／ｌのチカルシリンを加えたものを伴う新鮮なＢＹ２培地の２つの選択平板間で分割する。余剰の水分を、層流フード中で蒸発させて、平板を２８℃で暗所にてインキュベートする。
【０２６９】
約２−３週後に、処理１及び２平板上にコロニーが見られるが、一方処理３平板は成長を全く示していない。処理１平板からクローコロニーがンを選択し、新鮮な選択ＢＹ２培地に移す。Qiagen Dneasyキットを用いて、急速成長クローンからＤＮＡを抽出する。標的配列（ＤＮＡ調製の品質を試験するため）並びに新しい組み換え遺伝子、ＮＰＴＩＩ及びルシフェラーゼ（ａｔｔ部位で結合部にまたがるもの）の各々について特定的なプライマ対用いてＰＣＲによってＤＮＡを分析する。標的配列のためのプライマは、ＩｎＴｕＡｆｗ（５’−ＧＴＡ  ＡＴＴ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＴＴＣ  ＣＡＣ  ＣＴＣ  ＴＣＴ  ＴＧＴ  Ｔ−３’（配列番号１５４））及びＩｎＴｕＡｒｖ（５’−ＧＡＴ  ＣＣＴ  ＧＣＡ  ＧＣＡ  ＡＧ  ＧＡＡ  ＡＡＡ  ＴＡＴ  ＴＴＣ  ＡＡＴ  ＡＣ−３’（配列番号１５５））である。ＮＰＴＩＩ接合部のためのプライマはＮｅｏ３１３２ｆ（５’−ＧＧＣ  ＧＧＴ  ＡＧＴ  ＧＴＡ  ＴＴＡ  ＧＴＧ  ＴＣ−３’（配列番号１５６））及びＮｅｏ３６３７ｒ（５’；−ＧＡＴ  ＧＣＴ  ＣＴＴ  ＣＧＴ  ＣＣＡ  ＧＡＴ  ＣＡ−３’（配列番号１５７））である。ルシフェラーゼ接合のためのプライマはＬｕｃ１８７６Ｆの（５’−ＧＧＡ  ＡＧＣ  ＧＡＣ  ＣＡＡ  ＣＧＣ  ＣＴＴ  ＧＡ−３’（配列番号１５８））及びＬｕｃ２３８７ｒ（５’−ＴＧＣ  ＧＡＣ  ＡＣＣ  ＴＧＣ  ＧＴＣ  ＧＡＡ  ＧＡ−３’（配列番号１５９））である。
【０２７０】
選択されたＬＰＡｔｔｒＲ．ＢＹ２形質転換体は、ターゲット事象のために適正なサイズ（ＮＰＴＩＩプライマでは５８１ｂｐ及びＬｕｃプライマでは４２０ｂｐであるＬｕｃ及びＮＰＴＩＩ両方のプライマ対を伴うＰＣＲ産物を提供する。構造を決定するためにＤＮＡフラグメントを配列決定に付す。配列は、このクローンがドナーＤＮＡ中のａｔｔＬ部位と標的配列の中のａｔｔＲ部位の間でのＩｎｔ触媒反応の結果であることを確認する。ＤｏｎＡｔｔＬ．ＢＹ２といった単一部位ドナーＴ−ＤＮＡは線形構造であることから、植物ゲノム中に挿入されたＬＰＡｔｔＲ  ＢＹ２とのその組換えは、ドナーＴ−ＤＮＡの左右の自由ボーダー末端に対応する染色体の破断を生成する。植物細胞は、左のボーダー及び右のボーダーの非相同末端結合部（Gorbunova 及びLevy（１９９９）、Trends in Plant Science、４：２６３−２６９）によってこの破断を修復することができる。これらのＴ−ＤＮＡボーダーは、、Ｔ−ＤＮＡの末端及びそれらの間の任意の配列を増幅させるため、各々のボーダー近くに位置付けられかつ「外向き」、すなわちボーダー配列を通して指向されたＰＣＲプライマを用いて増幅される。プライマＬｕｃＬ８７６ｆ（配列番号１５８）及びＮｅｏ３６３７ｒ（配列番号１５７）は約５５０ｂｐのフラグメントを増幅させ、その配列は、ドナーＤＮＡが、Ｌｕｃ遺伝子の末端を越えて右のボーダーのニック部位より８ｂｐ前の位置まで、かつＳｍａｓプロモータの上では精確にＴ−ＤＮＡの左ボーダー内のニック部位まで延びていることを明らかにしている。９８ｂｐのフィラーＤＮＡが２つの間に位置付けられている。フィラーは、ドナー配列のＳｍａｓプロモータ部分から誘導された５１ｂｐから成り、未知の配列の１６−及び３１−ｂｐブロックによってフランキングされている。選択された形質転換体はＸｉｓ及びＩＨＦを伴うＩｎｔ−ｈによって触媒されるような完全な単一部位のターゲティングされた事象を含有する、ということが結論付けられる。
例８３：反転ａｔｔＲ部位を含有するタバコ標的細胞系列と反転ａｔｔＬ部位を伴うドナー構成体を含有するAgrobacteriumの同時育成
ｐＡｄＦ６０を含有する標的細胞系列（すなわちＬＰｄｂｌＡｔｔＲ．ＢＹ２）（図  １２）を、選択培地中での懸濁液として培養する。同時育成前に、細胞を、ＢＹ２培地を用いて遠心分離及び再懸濁により反復的に洗浄し、抗生物質のあらゆる痕跡を除去する。ドナー構成体及びＩｎｔ、ＩＨＦ、及びＸｉｓの発現カセット並びにＬＢＡ４４０４（ｐＮＯＶ２７３１）正の対照菌株を含有するAgrobacterium菌株を、適切な抗生物質を伴うＹＰ肉汁中で成長させる。標的配列系列を次の3つの処理に付す：（１）１００μｌのＤｏｎｄｂｌＡｔｔＬ．ＢＹ２、１００μｌのＲＫＩｎｔ−ｈ／２１８ＨＦ（Ｉｎｔ−ｈ／２１８＋ＩＨＦ）、及び６０μｌのＸｉｓ；（２）１２０μｌのｐＮＯＶ２７３１（正の対照）；及び（３）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ無し（未処置対照）。ＬＢＡ４４０４培養をＯＤ660＝０．５に調整し、指示量のAgrobacterium菌株を深いペトリ皿中の１．８ｍｌの液体ＢＹ２培地に添加する。
【０２７１】
３枚の深いペトリ皿（各処理用に１枚ずつ）を用意し、約１．５ｍｌの充填細胞を含有する７ｍｌの植物細胞懸濁液及び指示量のAgrobacterium培養（単複）を含有する２ｍｌのＢＹ２培地を各皿に加える。細菌と植物細胞を勢いよく混合し、約３日間暗所で約２２℃の培養器中で保存する。細胞を遠心分離に付し、再懸濁させ、選択寒天の上にピペットで移す。各同時育成を、１００ｍｇ／ｌのカナマイシンに２００ｍｇ／ｌチカルシリンを加えたものを伴う新鮮なＢＹ２培地の２つの選択平板間で分割する。余剰の水分を、層流フード中で蒸発させて、平板を２８℃で暗所にてインキュベートする。
【０２７２】
ＢＹ２Ｋａｎ１００Ｔｉｃ２００上で４週間平板培養した後に、小さい白い球形のクローンが出現し、それを新鮮な選択培地に移す。クローンを選択し、分析する。ＰＣＲ分析は、選択されたクローンが、両側でターゲティングされた形質転換体のための正しいサイズであるＬｕｃ及びＮＰＴＩＩの両方の増幅産物を提示することを示している。
ＰＣＲ産物のＤＮＡ配列分析は、この形質転換体が２つのＩｎｔ触媒作用を受けた部位特異的組換えの産物であることを実証している。
Ｂ．マイクロプロジェクタイルボンバードを用いて送達されたドナー配列及びＩｎｔ
例８４：反転ａｔｔＬ部位を伴う標的配列を含有するバイナリ双子葉植物ベクターの構築
第１段階に「は、プラスミドｐＡｄＦ５６を形成させるべく、ＳｆｏＩ及びＡｃｃ６５１で消化されたベクターＰｕｃ１８内への構成体ＬＰＡｔｔＰ１Ｐ２、ＢＹ２の４１９６ｂｐのＳｆｏＩ−Ａｃｃ６５Ｉフラグメントのサブクローニングが関与している。標的配列構成体ＬＰＡｔｔＰ１Ｐ２．ＢＹ２のこの４１９６ｂｐフラグメントは、反転配位でａｔｔＰ１部位とａｔｔＰ２部位を含有している。ここで、ａｔｔＰｌ部位は、イントロン内でかつルシフェラーゼコーディング領域と同じ配位（即ち順方向）で、ＣＭＰＳプロモータ、すなわちルシフェラーゼ５’末端遺伝子フラグメントの下流側にあり；ａｔｔＰ２部位は、イントロン内部でかつＮＰＴＩＩコーディング領域に対して反対配位で、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴＩＩ）遺伝子フラグメントの３’末端の上流側にある。
【０２７３】
第２段階では、ｐＡｄＦ５６のＡｔｔＰ１部位を次のようにａｔｔＬ部位で置換する。すなわち、その５’末端上でＮｈｅＩ部位によりかつ３’末端上でＸｈｏＩ部位によってフランキングされたａｔｔＬ部位を担持するＰＣＲフラグメントを、ＰＣＲプライマＮｈｅＡｔｔＬＦＯＲ（５’−ＧＧＧ  ＣＴＡ  ＧＣＴ  ＧＡＡ  ＧＣＣ  ＴＧＣ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＡＴＡ  ＣＴＡ−３’）（配列番号１６０）及びＸｈｏＡｔｔＬＲＥＶ（５’−ＣＣＣ  ＴＣＧ  ＡＧＡ  ＡＡＴ  ＣＡＡ  ＡＴＡ  ＡＴＧ  ＡＴＴ  ＴＴＡ  ＴＴＴ  ＴＧ−３’）（配列番号１６１）を用いて構成体ＤｏｎＡｔｔＬ．ＢＹ２（例７６）から増幅させる。ａｔｔＬ  ＰＣＲフラグメントを、ＮｈｅＩ及びＸｈｏＩで切断し、ベクターｐＡｄＦ５６中にクローニングし、次にＮｈｅＩ及びＸｈｏＩで消化させて、ＡｄＦ５７Ａを形成させる。
【０２７４】
第３段階では、ｐＡｄＦ５７ＡのａｔｔＰ２部位を次の通りａｔｔＬ部位によって置換する。すなわち、５’末端上でＡｓｃＩ部位によりかつ３’末端上でＡｖｒＩＩ部位によりフランキングされたａｔｔＬ部位を、ＰＣＲプライマＡｓｃＡｔｔＬＦＯＲ（５’−ＧＧＧ  ＧＣＧ  ＣＧＣ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  ＣＣＴ  ＧＣＴ  ＴＴＴ  ＴＴＡ  ＴＡＣ  ＴＡ−３’）（配列番号１６２）及びＡｖｒＡｔｔＬＲＥＶ（５’−ＣＣＣ  ＣＴＡ  ＧＧＡ  ＡＡＴ  ＣＡＡ  ＡＴＡ  ＡＴＧ  ＡＴＴ  ＴＴＡ  ＴＴＴ  ＴＧ−３’）（配列番号１６３）を用いてＤｏｎＡｔｔＬ．ＢＹ２（例７６）から増幅させる。ａｔｔＬ  ＰＣＲ産物をＡｓｃＩ及びＡｖｒＩＩを用いて再切断し、ＡｓｃＩ及びＡｖｒＩＩで消化させたベクター構成体ｐＡｄＦ５７Ａ中にクローニングして、ｐＡｄＦ５７を形成させる。
【０２７５】
最後のクローニング段階において、ｐＡｄＦ５７の３９５３ｂｐのＳｆｏＩ−Ａｃｃ６５Ｉフラグメントを、構成体ＬＰＡｔｔＰ１Ｐ２．ＢＹの２９３２６ｂｐのＳｆｏＩ−Ａｃｃ６５Ｉベクター部分に連結させて、バイナリベクターｐＡｄＦ５９（図１４）を形成させる。
２．タバコ標的配列細胞系列の産生
例８５：遺伝子導入タバコＢＹ２標的系列の生成
バイナリベクターｐＡｄＦ５９（図  １４）を、Agrobacterium菌株ＬＢＡ４４０４中に電気穿孔する。結果として得られた菌株ＬＢＡ４４０４（ｐＡｄＦ５９）を、例７１Ｂで上述したように、タバコＢＹ２懸濁培養細胞と同時育成する。最も少ない数のＴ−ＤＮＡ挿入を担持する独立した形質転換細胞系列を、Ｔａｑｍａｎ技術を利用して同定する。ハイグロマイシン（１５ｍｇ／ｌ）及びチカルシリン（４００ｍｇ／ｌ）を補足した液体ＢＹ２培地中にカルスを再懸濁させることによって、後者からの懸濁細胞培養を開始させる。
３．ドナー配列の構築
例８６：反転ａｔｔＲ部位を伴う、ｐＵＣベースの双子葉植物ドナープラスミドの構築
第１のクローニング段階には、以下のフラグメントとの４方連結が関与する：（１）ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで消化させたベクターｐＮＥＢ１９３、（２）構成体ＤｏｎＡｔｔＢｌＡｔｔＢ２．ＢＹ２由来の３１９４ｂｐのＸｈｏＩ−ＭｆｅＩフラグメント、（３）ＬＰｄｂＡｔｔＲ（例５６）由来の１８６ｂｐのＸｈｏＩ−ＢｇｌＩＩａｔｔＲフラグメント、及び（４）ｐＢＳ．ＤｏｎＡｔｔＲ由来の１８８ｂｐのＭｆｅＩ−ＡｖｒＩＩａｔｔＲフラグメント。（ｐＢＳ．ＤｏｎＡｔｔＲは、４１８２ｂｐのＸｈｏＩフラグメントがベクターｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＫＳ（−）のＸｈｏＩ部位中にサブクローニングされているＤｏｎＡｔｔＲ、ＢＹ２の誘導体であり；ベクターアンピシリン耐性遺伝子に対して反対の配位でＮＰＴＩＩとルシフェラーゼの遺伝子をむこの非指向性連結の産物はｐＢＳ．ＤｏｎＡｔｔＲと呼ばれる）。結果として得られたプラスミドをｐＡＤＦ７１と称する。
【０２７６】
第２段階では、３’ｎｏｓターミネーターにリンクされたルシフェラーゼ遺伝子の３’末端を担持する、ＤｏｎＡｔｔＢｌＡｔｔＢ２．ＢＹ２の８７８ｂｐのＸｈｏＩフラグメントを、ｐＡｄＦ７１のユニークなＸｈｏＩ部位内に連結させる。ベクター内の８７８ｂｐの  ＸｈｏＩインサートの所望の配位を、標準制限消化物を用いて決定し、構成体ｐＡｄＦ７２（図１５）を生成する。このｐＵＣベースのドナー構成体は２つの反転ａｔｔＲ部位を含有し、同様に、ｐＡｄＦ５９を含有するＢＹ２標的配列系列中への、２つのＬ／Ｒ組換え事象に続いて機能的ルシフェラーゼ及びＮＰＴＩＩ遺伝子を再構築するために必要な遺伝子フラグメントも含有している。
４．たばこ標的細胞系列中へのドナー配列のターゲティングされた組込み
例８７：バイオリスティクスを用いたタバコクロマチン内へのドナー配列のターゲティングされた組込み
ｐＡｄＦ５９（反転ａｔｔＬ部位を担持する）を含有する標的系列の懸濁細胞培養を成長させ、例６９に記述される通りに、ボンバードのために細胞を調製する。ドナーＤＮＡ、ｐＡｄＦ７２（図１５）を、Ｉｎｔ−ｈ／２１８及び組込み宿主因子（ｐＢＳＩｎｔ−ｈ／２１８ＨＦ）（０．８３３μｌ／ショット）及びエキシジオナーゼ（ｐＡｄＦ６１）（０．１６６μｌ／ショット）と共に金粒子（０．８３３ＩＴＧ／ショット）の上に共沈させる。各標的平板を、１１００ｐｓｉで１回ショットする。次に、平板を高浸透性培地（１２％のスクロースを伴うＢＹ２）上で７２時間暗所にて２８℃でインキュベートする。その後、細胞を上に乗せたフィルターを、カナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）とチカルシリン（４００ｍｇ／ｌ）を補足したＢＹ２培地を含有する選択平板に移す。２４時間後、細胞をフィルターから穏やかに掻き取り、カナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）を補足した２ｍｌの液体ＢＹ２を使用して選択寒天上に展延させる。２−３週間後、選択平板上で成長している小さいカルスを新鮮な平板に移し、ルシフェラーゼ検定及びＰＣＲ分析のための十分な組織が利用可能になるまでそこで成長させる。
例８８：標的細胞系列中へのドナーＤＮＡのボンバードの後のターゲティングされた事象の同定
下の表11に例示するように、上のＩ．Ａ．３節で記述されたとおり、最高２０ｍgのカルスがルシフェラーゼ検定中で用いられう場合、4つの独立したなカナマイシン耐性カルスが、機能的ルシフェラーゼ遺伝子を含むことが分かる。
【０２７７】
【表１３】
2005521400.tif 000015
【０２７８】
Qiagen DNeasy Plant Mini Kitを使用して上述の４つのカナマイシン耐性カルスからゲノミックＤＮＡを抽出し、下に記述される通りにＰＣＲプライマを用いてＰＣＲ分析を実施する。１つはＮＰＴＩＩ遺伝子内に、もう１つはルシフェラーゼ遺伝子内に位置設定されている状態で、各Ｌ／Ｒ組換え部位で標的配列内にａｔｔＰ部位が形成されることが予測されている。カナマイシン接合部位を網羅するＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅を、Qiagen HotStartTaq  ＤＮＡポリメラーゼ及びＰＣＲプライマＩｎＴｕＢＦｗ（５’−ＣＡＧ  ＧＴＡ  ＴＡＴ  ＡＴＡ  ＴＧＡ  ＡＴＣ  ＧＡＴ  ＴＴＣ  ＴＣＣ  ＣＴＴ−３’（配列番号１８４）及びＩｎＴｕＢＲｖ５’−ＴＣＧ  ＴＣＣ  ＡＧＡ  ＴＣＡ  ＴＣＣ  ＴＧＴ  ＡＡＴ  ＡＣＡ  ＧＡＡ  ＡＴＧ  ＴＴ−３’（配列番号１８５）を用いて行う。予測されたサイズ（最高１０７８ｂｐ）のＰＣＲ産物を、事象５９／５−１及び５９／２４−１から抽出されたＤＮＡを用いて獲得する。これらのＰＣＲ産物は、配列決定され、Ｌ／Ｒ組換えを通した標的配列の中へのドナーＤＮＡのターゲティングされた組込みの結果得られる予測されたＤＮＡ配列と一致している。
【０２７９】
ＰＣＲ増幅の第２のセットを、Roche Expand Long Template PCR System及びＰＣＲプライマ３’Ｌｕｃ４４８ｆ（５’−ＧＡＡ  ＧＣＧ  ＡＡＧ  ＧＴＴ  ＧＴＧ  ＧＡＴ  ＣＴ−３’（配列番号１６４）及びＩｎＴｕＢＲｖ（配列番号１８５）を用いて行う。予測されたサイズ（最高５０３８ｂｐ）のＰＣＲ産物を、事象５９／５−１及び５９／２４−６から抽出されたＤＮＡを用いて獲得する。２つのＬ／Ｒ組換え部位（すなわちａｔｔＰ部位）を網羅する、事象５９／５−１由来のＰＣＲ産物の末端の配列は、予測された配列と一致している。
例８９：ターゲティング効率を改善するためのドナーＤＮＡのウイルス増幅
本書中に記述されているいずれかのドナー／標的組合せを用いたターゲティングされたインサート事象の頻度は、植物細胞中のドナーDNAの濃度を上昇させることによって増大させることができる。例えば双子葉植物についてのビートカーリートップウイルス（ＢＣＴＶ）などのジェミニウイルスの複製系はこの目的にとって有用である。（一般に、Stanley et al.（１９８６） EMBO J. ５  （８）：１７６１−１７６７を参照のこと）。ここでは、バイオリス系送達システムについて記述しているが、このアプローチはAgrobacterium送達系（Stenger et al. (１９９１) Proc.Natl.Acad. Sci.USA,８８：８０２９−８０３３）にも同様に応用可能である。AgrobacteriumＴ−ＤＮＡ中の問題のＤＮＡ配列（例えばドナー配列など）が、ウイルスｏｒｉ（下記参照）のコピーによってフランキングされる場合、ローリングサークル複製が問題のＤＮＡを担持する複製形態の形成を導く。これは植物ゲノム中へのＴ−ＤＮＡ組込みの前又は後のいずれかに起こり得る。
【０２８０】
バイオリスティック送達については、該アプローチには、ウイルスゲノムであるウイルスoriの複製及び転写のための認識配列であるヌクレオチド配列のコピーをドナーDNAプラスミド中に取込むことが関与する。この認識配列は、ジェミニウイルスに共通である中心に位置づけされたヌクレオチド配列を含有する回文配列である。ＢＣＴＶについては、該認識配列は：５’−ＧＧＧ  ＧＣＣ  ＡＴＣ  ＣＧＧ  ＴＡＡ  ＴＡＴ  ＴＡＡ  ＴＧＣ ＧＧＡ  ＴＧＧ  ＣＣＣ  Ｃ−３’（配列番号：１６５）である（回文配列には下線付記）。ＢＣＴＶ上で、この配列はウイルスプラス鎖の読取り枠（ＯＲＦｓ）とマイナス鎖のＯＲＦｓ間の遺伝子間領域にある（Timmermans et al.（１９９４） Annu.Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. ４５：７９−１１２）。
【０２８１】
さらなる構築ステップに備えて、内部で外皮タンパク質ＯＲＦが欠失し、ＸｈｏＩとＥｃｏＲＶ認識部位によって置換されているＢＣＴウイルスＤＮＡのサブクローンを構築する。American Type Culture Collection（10801 University Blvd. Manassas,VA 20110-2209）は、ＥｃｏＲＩ部位で線形化されｐＵＣ８ベクターのＥｃｏＲＩ部位中に挿入されたビートカーリートップウイルス二本鎖ＤＮＡのＣＦＨ菌株を含む、プラスミドｐＣＦＨ（ＡＴＣＣカタログ番号第ＰＶＭＣ６号、ビートカーリートップウイルス菌株ＣＦＨ）の供給源である。プライマ対：ＢＣＴＶ−ＣＰ−Ｖ−Ｘｈｏ−ＲＶ（５’−ＧＧＣ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＧＡＴ  ＡＴＣ  ＴＴＧ  ＧＣＡ  ＡＴＴ  ＧＴＡ  ＧＡＴ  ＧＣＴ  ＡＴＴ  Ｔ−３’）（配列番号１６６）及びＢＣＴＶ−ＣＰ−Ｃ−Ｘｈｏ−ＲＶ（５’−  ＧＧＣ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＡＴＡ  ＴＣＡ  ＣＡＡ  ＣＧＡ  ＡＣＡ  ＣＴＴ  ＣＣＴ  ＡＴＧ  Ａ−３’）（配列番号１６７）を用いて、Expand High Fidelity PCR System（Ｒｏｃｈe）を用いたＰＣＲ増幅（１０サイクル）によってウイルスＤＮＡから外皮タンパク質遺伝子を欠失させる。最高４．８ｋｂのＰＣＲフラグメントを、ＸｈｏＩで消化させ、自己連結させる。完全なクローンを、ＤＮＡ配列決定により同定し、こｒをＣＦＨ−ΔＣＰと呼ぶ。このプラスミドを、ＥｃｏＲＩ及びＥｃｏＲＶで消化させ、１７９９ｂｐと３９８ｂｐの２つのインサートフラグメントをゲル精製させる。ＨｉｎｄＩＩＩで消化され、クレノウポリメラーゼにより平滑末端にし、アルカリホスファターゼで処理したｐＵＣ１８ベクターを伴うこれら２つのインサートの３方連結は、ウイルスレプリコンの２つの考えられる配位を持つクローンｐＵＣ１８ＤＶＲ１及びｐＵＣ１８ＤＶＲ２を産生する。ＯＲＦＶ１及びＯＲＦＶ２が残存するｐＵＣ１８ポリリンカー部位の近くにあるクローンをｐＵＣ１８ＤＶＲ２と指定する。ｐＵＣ１８ＤＶＲ２は、ＳｐｈＩ消化によって同定され、４１３１ｂｐ及び８２５ｂｐのフラグメントを生成する。
【０２８２】
ｐＵＣ１８ＤＶＲ２から、次のクローニングステップに必要なＡｓｃＩ（下線）及びＭｌｕｌ（下線）クローニング）部位のフランキングを伴うＰＣＲによって、ＢＣＴＶ遺伝子間の領域を増幅させる。この目的のためのプライマ対は：５’−ＧＧＣ  ＧＣＧ  ＣＣＴ  ＣＡＣ  ＡＴＣ  ＡＡＣ  ＡＴＣ  ＴＴＴ  ＡＧＣ  Ｔ−３’（配列番号１６８）及び５’−ＧＧＡ  ＣＧＣ  ＧＴＡ  ＴＴＧ  ＡＡＴ  ＣＧＧ  ＧＣＴ  ＣＴＣ  ＴＴＣ  Ａ−３’（配列番号１６９）である。ＰＣＲ産物をＴＯＰＯベクター中でＴＡクローニングし、１６６ｂｐのインサートをＡｓｃＩ及びＭｌｕＩを用いて切除させる。ＡｓｃＩを用いてベクターを消化した後に、ＢＣＴＶの遺伝子間領域を含有するこのフラグメントを、２重ａｔｔＲドナー（ｐＡｄＦ７２）（図  １５）のバイオリスティック送達形態内に連結させる。ウイルスｏｒｉインサートの配位（順方向又は逆方向）を、ＡＳＣＩ／ＸＨＯＩで産物を消化させることによって決定する。各ｏｒｉ配位を持つクローンを、ターゲティングされた組込みにおける効率について試験する。結果として得られたドナープラスミドをＶｆＤｏｎＤｂＡｔＲ．ＢＹ２及びＶｒＤｏｎＤｂＡｔｔＲ．ＢＹ２と命名する。
植物細胞内部でウイルスによりドナー配列を増幅させるために、複製のために必要とされる遺伝情報を含有するウイルス遺伝子と共に植物細胞中にドナーを同時送達する。我々は、Ｖ２の一部が欠失しているＤＶＲ２の誘導体であるＤＶＲ２*でさえ、ボンバードによってＮＰＴＩＩ発現カセットであるｐＮＯＶ２７２０と共に、ＢＹ２細胞に同時送達された時点で形質転換体の回収と干渉することを発見したことから、この「ヘルパー」ウイルスＤＮＡが、ＤＶＲ２でないことが望ましい。従って、ウイルス複製遺伝子（すなわちＣ１−Ｃ４）の全セットは、非複製形態、つまり上述の回文領域（複製起点）が欠失されたている形態で供給される。このｏｒｉをフランキングするＤＮＡも、無傷のウイルス中でプラス及びマイナス両方の鎖の転写のための「二重プロモータ」として役立ことから、ウイルスの全遺伝子間領域は、マイナス鎖複製遺伝子を転写するように配位されたArabidopsisユビキチン遺伝子プロモータ/イントロン構成体で置換される。遺伝子間領域を削除すること以外に「ヘルパー」構成体は、ＢＣＴＶの＋又はＶ鎖に対応する３つの遺伝子、すなわち外皮タンパク質遺伝子、Ｖ２；その除去が２本鎖ＤＮＡ対１本鎖（ビリオン）ＤＮＡの量を増大させるＶ３（Hormuzdi, S. G.&Bisaro, D. M.、Virology 193：900-909 (1993) ) ;及び、植物を通ってのウイルスの移動を可能にするＶ１、の全てを削除する。
【０２８３】
ヘルパープラスミドは以下の通りの３方連結によって構成される。すなわち、ＰＵＣ１８ＤＶＲ２をアルカリホスファターゼと共にＳｐｈＩ及びＡｓｃＩで消化させ、部分的インサートを伴う４０６８ｂｐのベクターをゲル精製させる。インサートを形成させるためには、ＰＵＣ１８ＤＶＲ２をＨｉｎｆＩで消化させ、５９６ｂｐのフラグメントをゲル精製させる。末端はクレノウで充填して、フラグメントを精製させて、ＳｐｈＩで再消化させる。１７３  ｂｐの産物をゲル精製させ、３方向連結用のインサート１として利用する。インサート２、Arabidopsisユビキチンプロモーターは、ハイグロマイシン耐性のための発現カセットUｂｑ3Hｙｇから誘導される。ｕｂｑ３プロモータは、そのリーダー及びイントロンと共に、ＳｎａＢＩ（ボールド）リンカを下流末端（ＢａｍＨＩ部位を部位変更オリゴ５’−ＧＡＴ  ＣＧＧ  ＴＡＣ  ＧＴＡ  ＣＣ−３’（配列番号１７０）で置換する）に、かつＡｓｃＩ（ボールド）リンカを上流末端（ＥｃｏＲＩ部位を部位変更オリゴ５’−ＡＡＴ  ＴＧＧ  ＣＧＣ  ＧＣＣ−３’（配列番号１７１）で置換する）に付着させることによって、ヘルパー構成体への挿入に適合するよう調整される。ｕｂｑ３プロモーターフラグメントをＡｓｃＩ／ＳｎａＢＩでの消化によって切除させ、インサート２として利用する。新しい複製遺伝子ヘルパープラスミド、Ｕｂｑ３Ｒｅｐを、インサートｌ及びインサート２とベクターフラグメントの３方連結によって組立てる。Ｕｂｑ３Ｒｅｐの構造を消化とＤＮＡ配列決定により確認する。
【０２８４】
ＶｄｏｎＤｂｌＡｔｔＲ．ＢＹ２及びＵｂｑ３Ｒｅｐを、例８７に記述される通りに実施されるターゲティングされた組込みにおいてドナーＤＮＡシステム（ｐＡｄＦ７２を置換する）として利用する。
【０２８５】
本明細書中において引用したすべての刊行物、公開特許文献及び特許出願は、本発明が関係する技術分野の水準を示すものである。本書中で引用したすべての刊行物、公開特許文献及び特許出願は、各々の個々の刊行物、公開特許文書及び特許出願が、参考として内含されるものとして特定的かつ個別に指示されている場合と同じレベルで、参考として内含される。
【０２８６】
以上の記述は、様々な実施形態及び例を参照しながら発明を記述するものである。いかなる特定の実施形態、例又は特定の実施形態又は例の要素も、いずれかの又は全てのクレームの、決定的な、必須の又は根本的な要素又は特長とみなされるべきものでない。
本書中で用いられている、「含む」、「含んでいる」、「内含する」、「内含している」、「含有する」、「含有している」なる用語及びそれらの変形は、プロセス、方法、プロダクトバイプロセス或いは、１要素又は要素の一覧を含む、内含する又は含有する物質の組成が、これらの要素のみを内含するのではなく、必ずしも明示的に一覧されていない又はかかるプロセス、方法、プロダクトバイプロセス或いは物質の組成に固有のその他の要素も含み得るような形での、非排他的な包含を網羅するように意図されている。さらに、本書で記述されているいかなる要素も、「必須」又は「決定的な」ものとして明示的に記述されているものでないかぎり、本発明の実施のために必要とされない。
【０２８７】
以下のクレーム中に示されている本発明の範囲から逸脱することなく開示された実施形態に対してさまざまな変更又は置換を行うことができるということは、十分にわかるであろう。図面及び例を含めて本明細書は、制限的なものというよりむしろ例示的な形でみなされるべきであり、かかる変更及び置換は全て本発明の範囲内に含まれるように意図されている。従って、本発明の範囲は、上記に示された例によってではなくむしろ、付属するクレーム及びそれらの合法的等価物によって決定されるべきである。例えば、方法又はプロセスクレームのいずれかの中で列挙されている段階は、実行可能なあらゆる順序で実施でき、いずれかのクレーム中に提示されている１つの順序に制限されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【０２８８】
【図１】単一交叉組換え事象を表わしている。第１のＩｎｔ認識部位が、標的分子上に存在し、第２のＩｎｔ認識部位がドナー分子上に存在する。標的及びドナー分子の認識部位をフランキングするヌクレオチド配列が、それぞれ細線と太線で表わされている。ドナー分子は円形ＤＮＡ分子及び線形ＤＮＡ分子であり得る。インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体が標的及びドナー分子に導入され、Ｉｎｔ媒介型組換え産物が形成されている。組換えプロセスは、標的及びドナー分子の各々の上の１つのＩｎｔ認識部位がインテグラーゼ媒介型組換えに参与することから「単一交叉」と呼ばれている。
【図２】２重交叉組換え事象を表わす。第１及び第３のＩｎｔ認識部位が標識分子上に存在し、第２及び第４のＩｎｔ認識部位がドナー分子上に存在する。インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体が標的及びドナー分子に導入され、Ｉｎｔ媒介型組換え産物が形成される。組換えプロセスは、標的及びドナー分子の各々の上の２つのＩｎｔ認識部位がインテグラーゼ媒介型組換えに参与することから「２重交叉」と呼ばれている。
【図３】標的及びドナー分子の各々の上のＩｎｔ認識部位の１つが、コーディング配列の一部分の中に埋込まれたイントロンの一部分の内部に存在する２重交叉組換え事象を表わしている。インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体が標的及びドナー分子に導入され、Ｉｎｔ媒介型組換え産物が形成される。組換え産物は、標的分子内のイントロンの５’部分とドナー分子のイントロンの３’部分の両方の中に存在するＩｎｔ認識部位の間の交叉により形成される完全イントロンを含有する。完全イントロンは、同様に標的及びドナー分子の両方の中に存在するＩｎｔ認識部位の間の交叉によって形成される完全ヌクレオチド配列の内部にある。
【図４】単一のａｔｔＰ部位をもつ単子葉植物標的配列を含有するプラスミドの一例であるＬＰｓｇＡｔｔＰの構造を表わしている。
【図５】単一のａｔｔＢ部位を伴う単子葉植物ドナー配列を含有するプラスミドの一例であるｖＤＯＮｓｇＡｔｔＢの構造を表わしている。
【図６】標的分子上のａｔｔＰ認識部位とａｔｔＢ認識部位の間にあるヌクレオチド配列がＩｎｔ及びＩＨＦを用いて切除される１つの組換え事象を表わしている。
【図７】標的分子上のａｔｔＬ認識部位とａｔｔＲ認識部位の間にあるヌクレオチド配列がＩｎｔ、ＩＨＦ及びＸｉｓを用いて切除される１つの組換え事象を表わしている。
【図８】反転配位で２つのａｔｔＬ部位をもつ単子葉植物標的配列を含有するプラスミドの一例であるＬＰｄｂＡｔｔＬ．ＨＹＧの構造を表わしている。
【図９】２つのａｔｔＲ部位を伴う単子葉植物ドナー配列を含有するプラスミドの一例であるＤＯＮｄｂＡｔｔＲの構造を表わしている。
【図１０】単一のａｔｔＲ部位を伴う双子葉植物標的配列を含有するAgrobacterium内に包含されたプラスミドの一例であるＬＰＡｔｔＲ．ＢＹ２の構造を表わしている。
【図１１】単一のａｔｔＬ部位を伴う双子葉植物ドナー配列を含有するAgrobacterium内に包含されたプラスミドの一例であるＤｏｎＡｔｔＬ．ＢＹ２の構造を表わす。
【図１２】反転配位にある２つのａｔｔＲ部位を伴う双子葉植物標的配列を含有するAgrobacterium内に包含されたプラスミド例であるＬＰｄｂ１ＡｔｔＲ．ＢＹ２の構造を表わす。
【図１３】反転配位にある２つのａｔｔＬ部位を伴う双子葉植物ドナー配列を含有するAgrobacterium内に包含されたプラスミドの一例であるＤｏｎｄｂ１ＡｔｔＬ．ＢＹ２の構造を表わす。
【図１４】反転配位にある２つのａｔｔＬ部位を伴う双子葉植物標的配列を含有するAgrobacterium内に包含されたプラスミドの一例であるｐＡｄＦ５９の構造を表わす。
【図１５】反転配位にある２つのａｔｔＲ部位を伴う双子葉植物ドナー配列を含有するバイオリスティック送達のためのプラスミド例であるｐＡｄＦ７２の構造を表わす。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年12月14日(2004.12.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１６】
前記第１のＩｎｔ認識部位及び前記第３のＩｎｔ認識部位のうちの少なくとも１つが修飾されたラムダインテグラーゼ認識部位である、請求項１２に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項４１】
前記第２のＩｎｔ認識部位及び前記第４のＩｎｔ認識部位のうちの少なくとも１つが修飾されたラムダインテグラーゼ認識部位である、請求項３４に記載の方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項４９】
前記インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体が野生型ラムダインテグラーゼ及び修飾されたラムダインテグラーゼのうちの１つを含んで成る、請求項１に記載の方法。
【手続補正４】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項５０】
前記修飾されたラムダインテグラーゼがＩｎｔ−ｈ及びＩｎｔ−ｈ／２１８のうちの１つを含んで成る、請求項４９に記載の方法。
【手続補正５】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項９６】
前記インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体が野生型ラムダインテグラーゼ及び修飾されたラムダインテグラーゼのうちの１つを含んで成る、請求項８８に記載の方法。
【手続補正６】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項９７】
前記修飾されたラムダインテグラーゼがＩｎｔ−ｈ及びＩｎｔ−ｈ／２１８のうちの１つを含んで成る、請求項９６に記載の方法。
【手続補正７】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１０１】
前記インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体が野生型ラムダインテグラーゼ及び修飾されたラムダインテグラーゼのうちの１つを含んで成る、請求項１００に記載の方法。
【手続補正８】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１０２】
前記修飾されたラムダインテグラーゼがＩｎｔ−ｈ及びＩｎｔ−ｈ／２１８のうちの１つを含んで成る、請求項１０１に記載の方法。
【手続補正９】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１０６】
前記インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体が野生型ラムダインテグラーゼ及び修飾されたラムダインテグラーゼのうちの１つを含んで成る、請求項１０５に記載の方法。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１０７】
前記修飾ラムダインテグラーゼがＩｎｔ−ｈ及びＩｎｔ−ｈ／２１８のうちの１つを含んで成る、請求項１０６に記載の方法。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
本書に提供されているように、標的配列及びドナー配列の組換えは、インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体によって媒介される。例えば、Ｉｎｔは、本書に記述されているような例えばａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、ａｔｔＲ及び突然変異体認識部位といったようなインテグラーゼ認識部位を認識し、これらの認識部位間の組換えを媒介する。１実施形態においては、この反応は、組込み宿主因子（ＩＨＦ）と呼ばれる補助タンパク質が随伴し得るインテグラーゼによって媒介される。ＩＨＦは２つの細菌タンパク質サブユニットα及びβを含む。ＩＨＦは、ＤＮＡのベンディングにおいて１つの役割を果たし、かくしてインテグラーゼにより実施される組換え反応を容易にすることができる。１つの実施形態においては、標的配列とドナー配列の間の組換えを媒介するためにインテグラーゼとＩＨＦが使用される。もう１つの実施形態においては、組換え反応はインテグラーゼ、ＩＨＦ及びエキシジオナーゼ（Ｘｉｓ）により媒介される。Ｘｉｓタンパク質は、バクテリオファージラムダから誘導され得る。インテグラーゼ、インテグラーゼとＩＨＦの組合せ又はインテグラーゼ、ＩＨＦ、及びＸｉｓの組合せを使用して標的及びドナー配列の間の組換えを媒介することができる。さらに、組換え反応を媒介するために選択される特定のインテグラーゼの性質により、選択されたＩｎｔの構成要素（すなわち、Ｉｎｔがインテグラーゼ、ＩＨＦを伴うインテグラーゼ又はＩＨＦ及びＸｉｓを伴うインテグラーゼのいずれを含むか）が決定される。野生型ラムダインテグラーゼが使用される場合には、それにＩＨＦが随伴し、Ｌ／Ｒ反応の場合にはＸｉｓが随伴する。突然変異体インテグラーゼが用いられる場合（例えばＩｎｔ−ｈ又はＩｎｔ−ｈ／２１８）、ＩＨＦ及び／又はＸｉｓによる随伴は任意であり得る。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
もう１つの実施形態では、Ｉｎｔは突然変異体インテグラーゼを含む。特定のアミノ酸変化をもたらしかつＩＨＦといったような補助タンパク質の不在下でインテグラーゼが組換えを容易にすることができるようにするファージラムダインテグラーゼコーディング配列内の突然変異が知られている（Lorbach et al. (２０００) J. Mol. Biol. ２９６：１１７５−１１８１）。本書で提供されている方法と共に、任意の適切な突然変異を受けたインテグラーゼを使用することができ、例えばＩｎｔ−ｈ及びＩｎｔ−ｈ／２１８を内含する。インテグラーゼ突然変異体Ｉｎｔ−ｈは、インテグラーゼポリペプチド内のアミノ酸１７４に、グルタミン酸からリジンへの変化を含む。Ｉｎｔ−ｈは、ＩＨＦ及び／又はＸｉｓの不在下で哺乳動物細胞の組換えを媒介する能力をもつ。インテグラーゼ突然変異体Ｉｎｔ−ｈ／２１８は、アミノ酸１７４におけるグルタミン酸からリジンへの変化と、アミノ酸２１８におけるグルタミン酸からリジンへの変化を含む。Ｉｎｔ−ｈ／２１８は、ＩＨＦの不在下で哺乳動物における組換えを媒介する能力を有する（Lorbach et al. (２０００) J. Mol. Biol. ２９６：１１７５−１１８１）。