(57)【要約】金属錯体形成により骨格が環化したソマトスタチン同族体であり、そして改良されたソマトスタチン受容体サブタイプ親和性及び選択性を有する新規診断用及び治療用ペプチドが開示されている。開示された骨格環化ペプチド同族体は他の同族体よりも独特にして優れた性質、例えば化学的及び代謝に対する安定性、選択性、増加した生物学的利用率及び改良された薬物動態を有する。骨格環化ソマトスタチン同族体及び放射能標識同族体からなる医薬組成物、それを合成する試薬、及び診断及び治療目的のために該組成物を使用する方法も開示されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨格環化構造が少なくとも一つの構築単位及び第二構築単位、配列のアミノ酸残基の側鎖又は末端アミノ酸からなる群から選択された第二基からなるキレート形成基に対する金属錯体形成により形成されるアミノ酸のＮα−ω−官能化誘導体からなる少なくとも一つの構築単位を組み込んだ３から２４アミノ酸のソマトスタチン同族体。
【請求項２】
キレート形成基が４個のドナー原子からなる請求項１に記載のソマトスタチン同族体。
【請求項３】
キレート形成基がＮ２Ｓ２タイプである請求項２に記載のソマトスタチン同族体。
【請求項４】
一般式Ｎｏ．３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）：
【化１】
2005538966.tif 000024
式中ｎ＝１から６；
Ｑは存在しないか又はガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ），Ｇｌｙ，及びβＡｌａからなる群から選択されている；
Ｘは末端のカルボン酸、アミド又はアルコール基を示す；
Ｃｙｓ１及びＣｙｓ２はそれぞれ独立してＬ又はＤ異性体；そして
Ｍは金属、
を有する同族体からなる請求項１に記載のソマトスタチン同族体。
【請求項５】
式中：
ｎ＝２，３，又は６；
Ｑは存在しないか又はβＡｌａ；
Ｃｙｓ２はＬＣｙｓ；
Ｘはアミド；そして
Ｍは［ｎａｔＲｅ］オキソレニウム（Ｖ）、［１８６Ｒｅ］オキソレニウム（Ｖ）、［１８８Ｒｅ］オキソレニウム（Ｖ）又は［９９ｍＴｃ］オキソテクネチウム（Ｖ）からなる群から選択された放射性金属、
である請求項４に記載のソマトスタチン同族体。
【請求項６】
下記からなる群：
2005538966.tif 000025
その中のアスタリスクは金属錯体形成により環化するために使用されるキレート形成基を示す、
から選択された請求項４に記載のソマトスタチン同族体。
【請求項７】
キレート形成基が放射性アイソトープと錯体を構成する請求項１に記載のソマトスタチン同族体。
【請求項８】
放射性アイソトープが９９ｍＴｃ，１８６Ｒｅ及び１８８Ｒｅから選択されている請求項７に記載のソマトスタチン同族体。
【請求項９】
骨格環化構造が少なくとも一つの構築単位及び第二構築単位、配列のアミノ酸残基の側鎖又は末端アミノ酸からなる群から選択された第二基からなるキレート形成基に対する放射性金属の錯体形成により形成される、少なくとも一つの構築単位、その構築単位はアミノ酸のＮα−ω−官能化誘導体からなる、を組み込んだ３から２４アミノ酸のソマトスタチン同族体からなる放射性標識ペプチド同族体。
【請求項１０】
哺乳動物体内の造影部位に使用するための請求項９に記載の放射性標識ペプチド同族体。
【請求項１１】
インビトロ又はエクスビボにおける診断に使用するための請求項９に記載の放射性標識ペプチド同族体。
【請求項１２】
骨格環化構造が少なくとも一つの構築単位及び第二構築単位、配列のアミノ酸残基の側鎖又は末端アミノ酸残基からなる群から選択された第二基からなるキレート形成部に対する金属錯体形成により形成される、アミノ酸のＮα−ω−官能化誘導体からなる少なくとも一つの構築単位を組み込んだ３から２４アミノ酸のソマトスタチン同族体からなり；さらに医薬として受容しうる担体からなる医薬組成物。
【請求項１３】
キレート形成基が４個のドナー原子からなる請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
キレート形成基がＮ２Ｓ２タイプである請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
ソマトスタチン同族体が一般式Ｎｏ．３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１）である：
【化２】
2005538966.tif 000026
式中ｎ＝１から６；
Ｑは存在しないか又はガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ），Ｇｌｙ，及びβＡｌａからなる群から選択されている；
Ｘは末端のカルボン酸、アミド又はアルコール基を示す；
Ｃｙｓ１及びＣｙｓ２はそれぞれ独立してＬ又はＤ異性体；そして
Ｍは金属、
である請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
式中：
ｎ＝２，３，又は６；
Ｑは存在しないか又はβＡｌａ；
Ｃｙｓ２はＬＣｙｓ；
Ｘはアミド；そして
Ｍは［ｎａｔＲｅ］オキソレニウム（Ｖ）、［１８６Ｒｅ］オキソレニウム（Ｖ）、［１８８Ｒｅ］オキソレニウム（Ｖ）又は［９９ｍＴｃ］オキソテクネチウム（Ｖ）からなる群から選択された放射性金属である、
請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
下記からなる群：
2005538966.tif 000027
その中のアスタリスクは金属錯体形成により環化するために使用されるキレート形成基を示す、
から選択された請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
ソマトスタチン同族体が一つのソマトスタチン受容体サブタイプに対して選択的である請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
ソマトスタチン同族体が二つ以上のソマトスタチン受容体サブタイプに対して選択的である請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
骨格環化構造が少なくとも一つの構築単位及び第二構築単位、配列のアミノ酸残基の側鎖又は末端アミノ酸残基からなる群から選択された第二基からなるキレート形成部に対する金属錯体形成により形成される、アミノ酸のＮα−ω−官能化誘導体からなる少なくとも一つの構築単位を組み込んだ３から２４アミノ酸のソマトスタチン同族体；及び医薬として受容しうる担体を投与することからなる癌及び同種移植片拒絶の診断又は治療のための方法。
【請求項２１】
ソマトスタチン同族体が転移の存在を造影するために使用される請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ソマトスタチン同族体が検出可能なトレーサーで標識される請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
ソマトスタチン同族体が一つのソマトスタチン受容体サブタイプに選択的である請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
ソマトスタチン同族体が二つ以上のソマトスタチン受容体サブタイプに選択的である請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１−１６のいずれか一つに記載の金属錯体形成により骨格が環化したソマトスタチン同族体の治療有効量を含む医薬組成物をそれを必要とする哺乳動物に投与することからなる癌、自己免疫疾患、内分泌障害、糖尿病合併症、胃腸管障害、炎症性疾患、膵炎、アテローム性動脈硬化症、再閉塞、同種移植片拒絶、及び手術後の痛み、からなる群から選択した障害を診断、治療又は防ぐ方法。
【請求項２６】
ソマトスタチン同族体が一つのソマトスタチン受容体サブタイプに選択的である請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ソマトスタチン同族体が二つ以上のソマトスタチン受容体サブタイプに選択的である請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
該キットが金属錯体形成により骨格が環化したソマトスタチン同族体を含む、哺乳動物体内の造影部位のためのシンチグラフ造影剤を調製するためのキット。
【請求項２９】
骨格環化放射能標識ペプチドを形成するために、請求項１に記載のソマトスタチン同族体を放射性金属及び金属を還元するための適当な添加物と反応させることからなる哺乳動物体内のシンチグラフ造影部位のための試薬を調製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は金属との錯体形成により環化したＮα骨格環化標識ソマトスタチンペプチド同族体、それを含む医薬組成物、それを合成するための試薬、及び該化合物の診断及び治療のための使用法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ソマトスタチン（ＳＳＴ）は中枢神経系及び末梢組織のいずれにも見出される環状テトラデカペプチドである。最初に哺乳類下垂体から単離されそして下垂体前葉の成長ホルモン分泌の重要な阻害因子として同定された。その多様な生物活性としては膵臓からのグルカゴン及びインスリンの分泌阻害、大部分の消化管ホルモンの調節及び中枢神経系に広く分布する運動活動及び認識過程に関係する他の神経伝達物質の放出の調節がある（総説として、Ｌａｍｂｅｒｔｓ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖ．，９：４２７，１９８８参照）。
【０００３】
ＳＳＴの多様な生理的効果は、７回膜貫通受容体スーパーファミリーのメンバーである受容体に選択的にそして高親和性の結合をすることにより誘発される（Ｒｅｉｓｉｎｅ  Ｔ．，Ｂｅｌｌ  Ｇ．Ｉ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｖ．，１６：４２７−４４２，１９９５に総説）。これまでに、ＳＳＴ−Ｒ１からＳＳＴ−Ｒ５と命名された５個のＳＳＴ受容体が単離されそしてクローニングされている。これ等の受容体は高度な配列相同性を特徴とするが、多数の異なる細胞効果器系に連結している。この受容体サブタイプは天然に存在するリガンド及び合成リガンドのいずれも異なる親和性をもって認識する。
【０００４】
その天然の形では、低い生物学的利用率及び短い作用持続という二つの好ましくない性質を示すために、ＳＳＴは治療薬としての使用は制限されている。このような理由のために、効力、生体内安定性、作用持続または選択性に優れたＳＳＴ同族体を発見するために多大の努力が払われてきた。
【０００５】
癌におけるソマトスタチン
ＳＳＴ受容体は多くの内分泌腺腫瘍及び非内分泌腺腫瘍において高い密度で存在するので、放射能標識ＳＳＴ同族体を癌患者に使用する診断及び治療が試みられた。ＳＳＴ−Ｒ２サブタイプが最も多く発現しているが、殆どの腫瘍は複数のＳＳＴ受容体サブタイブを発現する。受容体特異的放射能標識化合物は原発部位を検出することができ、潜伏性転移傷害を確認することができ、外科的介入を導くことができ、腫瘍の段階を分類することができ、ある種の治療薬の効果を予測でき、或いは適当な放射性核種で標識すると治療薬として有用でありうる。種々の腫瘍（例えば、殆どの内分泌腺腫瘍）において高親和性ＳＳＴ受容体が豊富に存在することはこれ等の腫瘍のインビボにおける確認、可視化及び局在のために放射能標識ＳＳＴ同族体の使用を可能にする（Ｌａｍｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３３４：２４６，１９９６）。放射能標識ＳＳＴ又はその同族体を使用した結合試験及びオートラジオグラフィーにより、胃腸管の神経内分泌性腫瘍の８０〜９０％は多数のＳＳＴ受容体を有することが示された。カルチノイド腫瘍は複数のＳＳＴ受容体サブタイプを有しており、そして受容体タイプ２及び５に優先的に結合するオクトレオチドのようなＳＳＴ同族体はこれ等の腫瘍の診断及び医療処置に使用しうることが示された（Ｎｉｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，７７：６３２，１９９８）。クローニング受容体の結合試験に基づいて、ＳＳＴ−Ｒ２はオクトレオチドの主要標的でありそして腫瘍の造影の必要条件であることが示された。
【０００６】
診断／治療薬としての放射標識ソマトスタチン同族体
標識ＳＳＴ同族体トレーサーを使用するシンチグラフィーは腫瘍の位置を示しそして手術のできないＳＳＴ受容体陽性腫瘍の患者の長期治療の可能性を評価するのに役立つ。
【０００７】
標識ＳＳＴ同族体を使用するための一つの方法はチロシン含有同族体をヨードで標識することである。国際特許出願ＷＯ  ９６／３９１６１は、放射ヨード化及びその後の診断及び治療のために、ペプチドのＮ−末端をチロシン残基で延長したマルチ−チロシン化ＳＳＴ同族体を開示している。
【０００８】
放射標識ＳＳＴ同族体の一つの応用は放射能誘導手術である。外科的介入は手術前に投与した（１２５Ｉ−Ｔｙｒ３）−オクトレオチドが結合した組織の手術領域内での確認により最適化することができる。この技術は甲状腺髄質癌、カルチノイド及び島細胞腫瘍の手術に使用され成功してきた。高度な比活性は追加されたチロシンにより提供される多数のヨード化部位の結果としてマルチ−チロシン化ＳＳＴ同族体によって達成された。もう一つの標識方法はジスルフィドブリッジの還元であり、これにより９９ｍＴｃとキレート形成する二つのスルフヒドリル基を生じる（Ｋｏｌａｎ  ａｎｄ  Ｔｈａｋｕｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ．，９：１４４，１９９６）。一部のペプチドは機能的特異性を失わずに直接標識することができるが、そのほかのものは２座キレート試薬を使用して標識する必要があり、それは一方で同族体に共有結合しそして他方で放射性金属と錯体を形成する。ペプチドを９９ｍＴｃで標識する方法は米国特許Ｎｏ．５，７１６，５９６及び米国特許Ｎｏ．５，６２０，６７５に記述されている。放射能標識ＳＳＴ同族体に関する一連の特許は１０〜１６残基及びＳＳＴ受容体に対する高い親和性を有する環状（ＵＳ  ５，９３２，１８９，ＷＯ  ９５／００５５３及びＷＯ  ９６／０４３０８）及び直鎖（ＵＳ  ５，６２０，６７５，ＷＯ  ９５／０３３３０）ペプチドを記述している。開示されている環状ペプチドはジスルフィド結合を含まない。キレート形成のために二個の窒素原子及び２個の硫黄原子を含むＮ２Ｓ２型キレート形成リガンド及び環状及び直鎖ヘキサペプチドＳＳＴ同族体への使用は国際特許出願ＷＯ  ９６／１１９５４及びＷＯ  ９６／１１９１８に記述されている。特異的キレート形成基を持つジスルフィド架橋ＳＳＴ同族体はヨーロッパ出願ｎｏ．７１４９１１に請求されている。ジスルフィドを形成するか又はジスルフィドが還元されてスルフヒドリル型になっている少なくとも２個のシステイン残基を含む同族体は米国特許Ｎｏ．５，２２５，１８０に開示されている。この化合物は通常のＳＳＴ同族体よりも改良された腫瘍／腎臓分布比を有し、従って腎臓の放射線暴露が少ないと述べられている。国際出願ＷＯ  ９４／００４８９及び米国特許Ｎｏ．５，８７１，７１１はシンチグラフ造影試薬用のＳＳＴ由来ペプチド試薬を開示している。ＳＳＴ同族体は錯体形成により９９ｍＴｃ，１８６Ｒｅ及び１８８Ｒｅで標識される。米国特許Ｎｏ．５，３８２，６５４はアミノチオールリガンド（Ｎ２Ｓ２及びＮ３Ｓ）を記述しており、これ等はＳＳＴ同族体ペプチドに結合しておりそして放射性金属でありうる金属イオンを収容することができる。診断目的には９９ｍＴｃ及び６２Ｃｕが錯体形成のために提案されており、一方１８６Ｒｅ，６７Ｃｕ，１８８Ｒｅ及び６０Ｃｏイオンは放射線治療に使用することができる。
【０００９】
９９ｍＴｃ  ＳＳＴ同族体に対する標識方法及びペプチド配列の影響はＤｅｃｒｉｓｔｏｆｏｒｏ  Ｃ．及びＭａｔｈｅｒ  Ｓ．Ｊ．（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，２６：８６９，１９９９）によって総説されている。好ましい活性と生体分布を達成するために、標識方法の選択並びにペプチド構造の正しい選択が９９ｍＴｃでペプチドを標識するには重要であると結論されている。著者はさらに異なる受容体特異性による利点はこれからの研究の課題であるとも述べている。
【００１０】
多数の９９ｍＴｃ−標識生物活性ペプチドは有用な診断造影剤であることが立証されている。Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３９：１３６１，１９９６）は９９ｍＴｃ標識ＳＳＴ同族体の化学及び生物学を記述している。
【００１１】
放射標識ＳＳＴ同族体、１１１Ｉｎ−ＤＴＰＡ−（Ｄ）Ｐｈｅ−オクトレオチド（ＯｃｔｒｅｏＳｃａｎ，Ｍａｌｌｉｎｋｒｏｄｔ）は神経内分泌腫瘍及びリンパ腫に対して高い診断能力を有するが、一方で黒色腫のような他の腫瘍に対する適応性は低い。標識オクトレオチド同族体はＳＳＴ−Ｒ２及びＳＳＴ−Ｒ５に結合する。１１１Ｉｎで標識されたオクトレオチドは高い特異性及び感度をもって種々の神経内分泌腫瘍を検出することが示されており、診断において価値ある道具となりつつあるが、少なくとも一つの大きな欠点がある：コストである。バプレオチド（ＲＣ−１６０）は９９ｍＴｃで直接にそして２座キレート剤を使用して標識されており、実験的ヒト前立腺癌を有するヌードマウスにおいてよい評価が得られた。化合物９９ｍＴｃ−デプレオチドはＩＩ／ＩＩＩ相臨床試験において孤立肺結節の検査に使用して好成績を得た（Ｂｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｓｔ  １１７：１２３２，２０００）。心臓同種移植拒絶の検出のために（１１１Ｉｎ−ペンテトレオチドを使用して）ＳＳＴ受容体造影を行い、好成績を得た（Ａｐａｒｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｕｃ．Ｍｅｄ．２７：１７５４，２０００）。心臓拒絶過程は通常、拒絶の重症度及び処置の必要性を示すリンパ球の浸潤を示す。活性化リンパ球はＳＳＴ受容体を発現するので、ＳＳＴ受容体造影はそれを対象に使用することができる。ソマトスタチン受容体造影により心筋内膜バイオプシーが陽性になる少なくとも１週間前に切迫した拒絶を予告することができるので、早期に拒絶に介入することができる。
【００１２】
６７Ｇａ，６８Ｇａ，９９ｍＴｃ，１１１Ｉｎ，又は１２３Ｉを含めて種々の放射性核種が放射線造影に有用であることが知られている。放射活性ペプチドの特異的結合により関心の細胞、例えば腫瘍細胞上に放射能信号が濃縮されるので、放射能標識ペプチドを使用する造影法の感度はこの技術分野で知られている他の技術よりも非常に高い。これは特に、通常小さく、成長が遅くそして通常の方法では検出が困難な内分泌活性のある胃腸管腫瘍にとって重要である。テクネチウム−９９ｍ（９９ｍＴｃ，ｔ１／２＝６時間，Ｅγ＝１４０ｋｅＶ）はコスト−有効性、利用率及び好ましい核の性質のために選択された放射核種である。それは９９Ｍｏの壊変産物である。その短い半減期の故に、検査を行った後に長期に患者に不必要な放射線負荷を与えず、そしてそのガンマ線は外部の造影には非常に有効である。９９ｍＴｃは診断用核医学製品の９０％以上に使用されている。他の核種は非常に長い有効半減期（例えば、１１１Ｉｎは６０〜７０時間の半減期を有す）であり、毒性があり（例えばＩｎは鋭い電子放射がある）或いは高価である（１１１Ｉｎは電子によって作られた核種である）。
【００１３】
米国特許Ｎｏ．４，９８０，１４７は放射線造影薬品として特に腎機能造影法を実施するために使用する９９ｍＴｃ化合物を開示している。請求されている望ましい化合物は９９ｍＴｃ−メルカプトアセチル−グリシルグリシルグリシン（９９ｍＴｃ−ＭＡＧ３）。この化合物及び関連化合物はＳＳＴ又は他のペプチド同族体と結合せずに使用されている。米国特許Ｎｏ．４，８８３，８６２は腎臓に使用する薬物として化合物メルカプトスクシニル−グリシルグリシルグリシン及びそれと９９ｍＴｃとの錯体を開示している。メルカプトスクシニル−グリシルグリシルグリシンはグリシルグリシルグリシンとＳ−アセチル−メルカプトコハク酸無水物の縮合により作られる。
【００１４】
ＷＯ  ０１／０２０２２はインビボにおいてその標的に到達することができる安定した錯体を提供するオキソレニウム（Ｖ）及びオキソテクネチウム（Ｖ）により環化した直鎖アルファメラノサイト刺激ホルモン同族体を開示した。これ等の新規な化合物はメラノトロピン受容体発現黒色腫の診断造影及び標的放射ペプチド治療のための候補である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
改良されたペプチド同族体
有機化学及び分子生物学の大きな進歩の結果として、今では多数の生物活性ペプチドが薬理学的および臨床的使用に十分な量で調製することができる。このためこの数年の間にペプチドが関与する病気の治療及び診断のための新しい方法が確立されてきた。しかし、治療薬及び診断薬としてペプチドを使用するには以下の要因による制約がある：ａ）組織浸透性；ｂ）胃腸管及び血清中におけるタンパク分解に対する低い代謝安定性；ｃ）特に比較的高分子量そして特異的輸送システムの欠如又はその両者のために、経口摂取後の低い吸収；ｄ）肝臓及び腎臓からの早い排泄；及びｅ）ペプチド受容体は生体内に広範囲に分布しているので、標的でない臓器系における意図しない副作用。
【００１６】
臨床上の選択性を増強するためにより大きな特異性を持つペプチド同族体を完成させることが望まれる。天然のペプチド分子の欠点を解消し、それにより改善された治療特性を示すコンフォーメーション固定ペプチド同族体を作ることが最も有利であろう。
【００１７】
ペプチドのコンフォーメーション固定に関する新しい概念の方法はＧｉｌｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，（Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ３１：７４５，１９９１）により導入され、彼はペプチド骨格から骨格への環化を提案した。この方法の理論的利点は所与ペプチドの特異的受容体との相互作用に重要な側鎖を妨害することなくペプチド骨格の炭素又は窒素を介して環化が可能なことである。さらにＧｉｌｏｎ及び共同研究者による開示（ＷＯ  ９５／３３７６５，ＷＯ  ９７／０９３４４，ＵＳ  ５，７２３，５７５，ＵＳ  ５，８１１，３９２，ＵＳ  ５，８８３，２９３及びＵＳ  ６，２６５，３７５）は骨格環化ペプチド同族体の合成に必要な構築単位を製造する方法を提供した。ブラジキニン同族体の骨格環化ペプチド同族体（ＵＳ  ５，８７４，５２９）の製造にこの方法が使用されて成功し、ソマトスタチン活性を有する骨格環化ペプチド同族体も開示された（ＷＯ  ９８／０４５８３，ＷＯ  ９９／６５５０８，ＵＳ  ５，７７０，６８７，ＵＳ  ６，０５１，５５４及びＵＳ  ６，３５５，６１３）。本発明者の一人のＷＯ  ０２／０６２８１９は診断及び治療的使用のための放射能標識骨格環化ソマトスタチン同族体を開示している。これ等の方法及び同族体は全て参照文献によりその全体をここに取り入れている。
【００１８】
インビボにおける腫瘍の造影に使用するためのＴｃ−９９ｍ又は他の検出可能アイソトープで標識したシンチグラフ試薬として、そしてレニウム−１８８のような細胞傷害性放射性アイソトープで放射能標識した放射線療法薬として治療に使用するために、インビボ安定性が増加した合成ＳＳＴ同族体に対する要求がまだある。それによってその後の治療及び／又は手術を計画するために個々の患者の特異的ＳＳＴ受容体プロフィールを明らかにするための診断的選択性を強化するために受容体サブタイプに対して大きな親和性及び特異性を持つペプチド同族体に到達することが望ましい。特にこれ等の要求を満たす骨格環化ＳＳＴ同族体が本発明により提供される。
【００１９】
改良された診断的及び治療的活性及び選択性を有することがここに開示された金属との錯体を介して骨格が環化したソマトスタチン同族体は背景技術のいずれも教えていないし、また示してもいない。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
発明の要約
本発明は、放射線治療及び放射線診断への適用を含めた治療及び診断へ適用するための骨格環化ペプチド同族体である新規なソマトスタチン同族体を提供する。特に本発明はシンチグラフ造影に有用な金属錯体により骨格が環化したＳＳＴ同族体を提供する。数種のタイプの癌に関連するＳＳＴ受容体サブタイプに高い親和性を有する本発明の新規同族体は、受容体特異的試薬の適用による腫瘍の診断及び治療に使用することができる。
【００２１】
特別な態様は、少なくとも一つの構築単位を含むキレート形成基および第二の構築単位、配列のアミノ酸残基又は末端アミノ酸残基の側鎖からなる基から選択された第二の基に対する金属錯体形成によりそこに骨格環状構造が形成される、アミノ酸のＮα−ω−官能化−誘導体からなる少なくとも一つの構築単位を組み込んだ３から２４アミノ酸のソマトスタチン同族体からなる。
【００２２】
この技術分野において既知の天然ＳＳＴ及びＳＳＴ同族体と異なり、本発明の環状ペプチドは化学的及び代謝的安定性、選択性、増加した生物的利用率及び改良された薬物動態のような独特の優れた性質を有する金属錯体により骨格が環化したＳＳＴ同族体である。これ等の同族体はペプチドを環化するために使用されるアイソトープ望ましくは放射性アイソトープにより標識されている。
【００２３】
本発明により、アルファアミノ酸のアルファ窒素に結合した架橋基を持つ新規構築単位を組み込んでいることが特徴である新規標識ペプチド同族体が開示される。特に、これ等の化合物は３から２４アミノ酸のペプチド配列からなる骨格環化ソマトスタチン同族体であり、各同族体は少なくとも一つの構築単位を組み込んでおり、該構築単位はキレート配位子−金属錯体、望ましくはＮ２Ｓ２オキソレニウム（Ｖ）又はオキソテクネチウム（Ｖ）からなる架橋基に結合するペプチド骨格の一つの窒素原子を含み、そしてその少なくとも一つの構築単位は環状構造を形成するための該架橋基を介して第二の構築単位、配列のアミノ酸残基の側鎖又は末端アミノ酸残基からなる群から選択された基と結合する。望ましくは、ペプチド配列は３から２４残基を、より望ましくは４から１２アミノ酸を、最も望ましいのは５〜９アミノ酸を組み込んでいる。
【００２４】
本発明は部位特異的金属錯体形成により環化したソマトスタチン同族体を初めて提供する。少なくとも一つのＮα置換アミノ酸に結合したキレート形成基への結合によりペプチドに金属をキレート形成させることにより環状構造の形成を可能にする。望ましい態様において、金属はＮ２Ｓ２型キレート配位子を介してペプチドに結合する。最も望ましい態様において、キレート配位子はシステイン残基の２個のチオール基及び２個の窒素原子から構築される。
【００２５】
放射性核種により環化したペプチドを含む診断用放射性薬品はこの技術分野で既知である金属錯体形成以前に既に環化している化合物に対していくつかの利点を有している。両者の場合に、放射能のないキット標識操作によりキットペプチドの１０％未満しか金属と錯体形成しなかった。環状の金属非含有／非放射活性ペプチドの場合に、このペプチドは代謝に対して比較的安定である；これは比較的長時間循環する薬理活性化合物を投与したことになる。本発明によると、非標識直鎖ペプチドは代謝に対して不安定であることが予想されるので、９０％の非標識物質は体から速やかに排泄されるはずであり、非標識環状化合物である同族体に比較してわずかしか又は全く薬理活性を示さないことが期待される。
【００２６】
本発明により望ましい標識ソマトスタチン同族体は特定のソマトスタチンサブタイプに改良された親和性及び選択性を有する同族体であることが今開示される。望ましい同族体はＳＳＴ−Ｒサブタイプ２又は５或いはＳＳＴ−Ｒサブタイプ２及び５に受容体選択性を示すソマトスタチンの新規骨格環化同族体である。その他の望ましい同族体は二つ以上のＳＳＴ受容体に結合する。
【００２７】
本発明によるその他の望ましいソマトスタチン同族体は少なくとも一つの金属錯体形成により環化した少なくとも一つの骨格構造を含む２環性構造を含んでおり、そしてその中で少なくとも一つの構築単位が環状構造に、そして側鎖から側鎖へ、骨格から骨格へ及び骨格から末端へからなる群から選択された第二の環状構造に含まれている。
【００２８】
さらに本発明は骨格が環化した診断及び治療薬を形成するために標識することができるペプチド試薬を提供する。これ等の試薬は少なくとも一つのアミノ酸のＮα−ω−官能化−誘導体を使用して形成される結合基に共有結合したソマトスタチン同族体からなる。金属は結合基に結合して骨格環状構造を形成する。本発明の望ましい態様においてキレート形成基は４個のドナー原子からなりそして金属は放射性アイソトープである。本発明の望ましい態様に従うとキレート配位子は２個のフリーチオール及びフリー窒素から構築され、それらは金属と錯体を形成することにより骨格環状構造を形成する。最も望ましい同族体においてキレート配位子は２個のシステイン残基から作られる。本発明の望ましい態様においてシステイン残基の少なくとも一つはアミノ酸のＮα−ω−官能化−誘導体の架橋基に共有結合している。
【００２９】
本発明の望ましいキレート形成基は、その中の４個のドナー原子は２個が窒素そして２個が硫黄（Ｎ２Ｓ２）であり、そして金属錯体形成によりペプチド同族体は環化し、そして一般式Ｎｏ．１に示す安定な５−から６−員環が形成される：
【化１】
2005538966.tif 000002
式中ＤはＮ２Ｓ２の４個のドナー原子を表す；
半円はドナー原子間の２個又は３個の炭素架橋を表す；
Ｒ基は環状ペプチド、直鎖ペプチド、オキソ、ヒドロキシ、炭化水素、水素、ペプチド同族体とキレート形成基を結合する連結又はスペース基からなる群から独立して選択され、そしてドナー原子及び炭素架橋から選択された位置に存在し、そしてＲ基の少なくとも二つはキレート形成基と共に環状ペプチド構造を形成し；そしてＭは望ましくは＋５酸化状態にあるＲｅ及びＴｃから選択された金属原子である。
【００３０】
Ｎ２Ｓ２タイプのキレート配位子は、例えば２個のＮＳヘミ−キレート配位子：２個のシステイン残基；１個のＣｙｓ及び１個のアミドメルカプトアセチル（ＡＭＡ）残基、１個のＣｙｓ及び１個のアミドメルカプトエチル（ＡＭＥ）残基；２個のＡＭＡ残基；１個のＡＭＡ及び１個のＡＭＥ残基；又は２個のＡＭＥ残基である。Ｃｙｓ残基はＤ及びＬ立体異性体から選択されそしてペプチド上の似ていない残基の交換により第二の、異性同族体を提供する。
【００３１】
望ましい同族体においてペプチドはリンカーを介して１個のヘミ−キレート配位子にそしてペプチド骨格を介して第二のヘミ−キレート配位子に結合して、一般式Ｎｏ．２の構造を形成する：
【化２】
2005538966.tif 000003
式中Ｚは２個のドナー原子、一つはＮそして一つはＳ、を含む第一ヘミ−キレート形成基、これは金属錯体形成により５−から６−員環を形成する；
Ｑは存在しないかまたはペプチドのフリー官能基に結合できるリンカー基；
ＰＴＲはアミノ酸の少なくとも一つのＮα−ω−官能化−誘導体を含むソマトスタチン同族体；そして
Ｘは２個のドナー原子、一つはＮそして一つはＳ、を含む第二ヘミ−キレート形成基、これは金属錯体形成により５−から６−員環を形成し、その中のキレート形成基は１〜６個の炭素原子からなる低級アルキル鎖を介してＰＴＲ骨格のアルファ窒素又はペプチドのフリー官能基に結合している。
【００３２】
望ましくは、リンカーＱはペプチドのＮ−末端に結合し、そしてＸはペプチド骨格又はペプチドの側鎖に結合している。さらに望ましいのは、リンカーＱは無いか又はガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、Ｇｌｙ，及びβＡｌａからなる群から選択されており、そしてＸはＮ−構築単位のα−窒素に結合している。最も望ましいのは、Ｚ及びＸがそれぞれ独立にＬ及びＤシステインからなる群から選択されている。
【００３３】
本発明による望ましい同族体の一部は２個以上の異性体を含むことがある。本発明は該異性体を一緒に又は個々に単離して含んでいる。
【００３４】
本発明は、シンチグラフ造影剤、放射線診断剤及び放射線治療剤である放射標識骨格環化ペプチドを提供する。
【００３５】
本発明のシンチグラフ造影剤は、診断のための造影（シングルフォトンエミッションコンピュータートモグラフィー、ガンマカメラ、手術中に使用するためのプラナーディテクタープローブまたはデバイス、ポジトロンエミッショントモグラフィー）に使用するための放射性核種、望ましくは９９ｍＴｃと金属錯体形成することにより骨格が環化したペプチド試薬からなる。
【００３６】
本発明の放射線治療剤は（α又はβ放射能を有する）細胞傷害性放射性アイソトープで放射能標識された骨格環化ペプチド試薬からなる。本発明による最も望ましい細胞傷害性放射性アイソトープはレニウム−１８６及びレニウム−１８８である。本発明のその他の望ましい放射性核種はインジウム、イットリウム、ルテニウム、ガリウム及びガドリニウムの放射性アイソトープである。特定の錯体がシンチグラフ造影及び標的放射線治療の両者に有用であるような組み合わせた態様も本発明により提供される。該骨格環化ペプチド、骨格環化試薬の製造及び使用方法及び放射標識したその態様も提供される。
【００３７】
本発明に従い金属錯体形成により骨格が環化したＳＳＴ同族体のうち現在最も望ましいものを今開示する：
一つの態様は一般式Ｎｏ．３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を有する化合物である：
【化３】
2005538966.tif 000004
式中  ｎは１から６；
Ｑは存在しないかまたはＧＡＢＡ，Ｇｌｙ，及びβＡｌａからなる群から選択される；
Ｘは末端カルボン酸、アミド又はアルコール基を示す；
Ｃｙｓ１及びＣｙｓ２はそれぞれ独立してＬ又はＤ異性体；そして
Ｍは金属。
【００３８】
望ましくは：
ｎは２，３，又は６；
Ｑは存在しないかβＡｌａ；
Ｃｙｓ２はＬＣｙｓであり；
Ｘはアミド；そして
Ｍは［ｎａｔＲｅ］オキソレニウム（Ｖ）、［１８６Ｒｅ］オキソレニウム（Ｖ）、［１８８Ｒｅ］オキソレニウム（Ｖ）又は［９９ｍＴｃ］オキソテクネチウム（Ｖ）からなる群から選択された放射性金属。
【００３９】
式３による最も望ましい同族体は下記の群から選択される：
2005538966.tif 000005
配列中のアスタリスクは金属錯体形成により環化するために使用されるキレート形成基を示す。
【００４０】
これらの骨格環化ＳＳＴペプチド同族体は少なくとも一つのアミノ酸のＮα−ω−官能化誘導体をペプチド配列の中に組み込むことにより調製される。二個のヘミ−キレート形成ＮＳドナー原子を含む基が付加される、一つはＮα−ω−官能化アミノ酸の窒素へ（例えばＣｙｓの付加により）、そしてもう一つは末端窒素又はＮ−末端の直鎖ＡＡスペーサーへ（例えば末端ＮへＣｙｓの付加により）。選択的環形成は１個の金属又は放射性金属（望ましくはオキソレニウム（Ｖ）又はオキソテクネチウム（Ｖ）として）の両方の２座へミ−配位子への結合により行われ、４座Ｎ２Ｓ２オキソ金属（Ｖ）環状ペプチド（又はペプチド類似）錯体を形成する。ヘミ−キレート形成基は２個のＮα−ω−官能化体、ペプチド配列中の１以上のアミノ酸の側鎖、又はＮα−ω−官能化体、アミノ酸側鎖、Ｃ−又はＮ−末端又はリンカー又は上記のいずれかに結合したスペーサー基のいずれかの組合せのいずれかに共有結合することができる。
【００４１】
骨格環化結合がエキソペプチダーゼによる分解からこのペプチドを保護するように作用することは、本発明により提供されるＳＳＴ同族体のもう一つの利点である。
【００４２】
本発明の金属錯体により骨格が環化したソマトスタチン同族体は癌の診断法、腫瘍又はその転移の存在の造影、及び限定はしないが心臓同種移植を含む同種移植片拒絶の検出において診断用組成物として使用することができる。癌及び同種移植片拒絶の診断法はヒト患者を含む哺乳動物に放射性アイソトープ及び非放射性トレーサーからなる群から選択された検出可能なトレーサーで標識された骨格環化同族体を投与することからなる。該組成物を使用して癌及び同種移植片拒絶を診断又は造影する方法は本発明のもう一つの態様を表している。
【００４３】
薬理学的に活性な標識骨格環化ＳＳＴ同族体アゴニスト又はアンタゴニスト及び医薬として受容しうる担体又は希釈剤からなる医薬組成物は、該組成物を使用して標的放射線療法における癌の治療方法と同様に、本発明のもう一つの態様を示す。本発明の医薬組成物は、一つ以上のＳＳＴ受容体サブタイプに特異的な錯体形成により骨格が環化したＳＳＴペプチド同族体の少なくとも一つを含むことが利点である。これ等の医薬組成物は経口、局所又は全身を含む適当な投与経路のいずれかにより投与することができる。望ましい投与方法は静脈内及び筋肉内注射のような非経口経路、並びに鼻腔内投与又は経口摂取であるがこれに限定されない。
【００４４】
さらに本発明は、本発明の骨格環化ＳＳＴ同族体の治療有効量を投与することからなる動物、望ましくはヒトのソマトスタチン関連疾患の治療又は診断の方法を提供する。一部の望ましい態様において、試薬は１８６Ｒｅ又は１８８Ｒｅで放射能標識されている。
【００４５】
本発明のその他の態様は治療用及び望ましくはシンチグラフ造影剤を含む診断用薬物の調製方法を提供する。それぞれの該試薬は金属錯体形成により骨格を環化することができるＳＳＴ同族体からなる。さらに本発明は該組成物を作りそして標識するためのキットを提供する。
【００４６】
発明の詳細な説明
本発明により、新規の非ペプチド結合を可能にするアミノ酸のアルファ窒素に結合した架橋基を介して金属錯体形成によりペプチド同族体は環化される。一般的に、その構築単位から該ペプチド同族体を構築するために使用される方法はペプチド合成の既知原理に依拠している；最も簡便には、その方法は固相ペプチド合成の既知原理に従って実施することができる。
【００４７】
本発明の骨格環化同族体の設計及び合成の方法は、米国特許番号：５，８１１，３９２；５，８７４，５２９；５，８８３，２９３；６，０５１，５５４；６，１１７，９７４；６，２６５，３７５，及び国際特許出願ＷＯ  ９５／３３７６５；ＷＯ  ９７／０９３４４；ＷＯ  ９８／０４５８３；ＷＯ９９／３１１２１；ＷＯ  ９９／６５５０８；ＷＯ  ００／０２８９８；ＷＯ  ００／６５４６７及びＷＯ  ０２／０６２８１９に開示されている。これ等の方法は全て引用によりその全体をここに取り入れた。
【発明の効果】
【００４８】
骨格環化の最も衝撃的な利点は：
１）ペプチド配列の環化はペプチドの側鎖のいずれも損傷することなく行われるので生物学的認識（例えば、特定の受容体への結合）及び機能にとって必須な機能基を犠牲にする機会を減らす。
２）ペプチドコンフォーメーションの最適化は、架橋の長さ、及び結合の型（例えば、アミド、ジスルフィド、チオエーテル、チオエステル、尿素、カルバメート、又はスルホンアミド、など）、結合の方向、及び環内の結合の位置の順列を可能にすることにより行われる。
３）既知活性の直鎖ペプチドの環化を適用する場合は、架橋はペプチドの活性領域及びその同族受容体の間の相互作用を少なくするように設計することができる。これにより環化する腕が認識及び機能を妨害する機会を減少させ、そしてまた放射性トレーサー、細胞傷害性薬物、造影活性物質又はその他の必要な標識のようなタグの結合に適する部位を創りだす。
【００４９】
天然のＳＳＴ及び背景技術において既知のＳＳＴ同族体と異なり、本発明のペプチドは、金属錯体形成により骨格が環化したＳＳＴ同族体であり、化学的及び代謝的な安定性、選択性、増加した生物学的利用率及び改良された薬物動態のような独特にして優れた性質を有する。これ等の同族体は、金属アイソトープ、望ましくは放射性アイソトープで標識されている。
【００５０】
放射性核種により環化したペプチドからなる診断用の放射性医薬品は、金属錯体形成の前に既に環化している当技術分野で既知の化合物とは異なる利点をいくつか有している。両者のいずれにおいてもコールドキット標識操作により金属との錯体を形成するキットペプチドは１０％未満である。環状の金属非含有／非放射性ペプチドの場合には、ペプチドは代謝に対して比較的安定である；このため比較的長時間循環する薬理活性化合物を投与したことになる。本発明によると、非標識直鎖ペプチドは代謝に対して不安定であることが予測され、したがって９０％の非標識物質は体内から速やかに排泄されるはずであり、そして非標識環状種である同族体に比較してわずかしかあるいは全く薬理活性を示さないことが期待される。
【００５１】
用語及び定義
用語「ソマトスタチンのアゴニスト」は、望ましくは分子がソマトスタチンの活性の少なくとも一つを模倣することができることを意味する。
【００５２】
本発明の文脈における用語「ソマトスタチンのアンタゴニスト」は、望ましくはこれ等の分子がソマトスタチンの活性の少なくとも一つを減少させるか又は阻害することができることを意味する。
【００５３】
用語リンカーは、その目的がキレート形成基およびペプチド、ペプチド同族体又はペプチド類似体を共有結合で結合することである化学基を示す。このリンカーはまたその目的がキレート形成基（したがって金属）及びペプチド、ペプチド同族体又はペプチド類似体の間に距離をとることを可能にすることが目的であるスペサーとしても使用することができる。
【００５４】
ここに使用されている用語「キレート形成試薬」は、その目的がキレート形成試薬（又は配位子）−金属錯体を安定的に形成することである化学基を示す。錯体はキレート形成試薬上のある電子に富む原子から電子に乏しい金属への電子供与により形成される。キレート形成試薬は典型的に４個のドナー原子を有する。オキソレニュウム（Ｖ）及びオキソテクネチウム（Ｖ）に対して望ましいドナー原子は窒素であり、そして最も望ましいドナー原子は硫黄である。
【００５５】
「ヘミ−配位子」は、その目的が上記のような２個のドナー原子により金属錯体の半分を形成することである化学基を示す。同じ化合物上の第二のヘミ−配位子は同じ金属と錯体の第二の半分を形成する。
【００５６】
ここに使用した「シンチグラフ造影剤」は放射能検出手段（限定はしないが、プラナーカメラ、ガンマカメラ、シングルホトンエミッション（コンピューター）トモグラフィー（ＳＰＥＣＴ又はＳＰＥＴ）又は手持ち検出器（例えば、ガイガー−ミュラーカウンター又はシンチレーション検出器を含む）又は手術中などに腫瘍の検出に使用される装置により検出することができる放射能標識薬物を包含することを意味する。
【００５７】
ここに使用する「ペプチド」はペプチド結合により連結したアミノ酸の配列を示す。本発明のペプチドは３から２４個のアミノ酸残基、望ましくは４から１２個の残基、より望ましくは５から９個のアミノ酸からなる。本発明のペプチド同族体は、尿素結合、カルバメート結合、スルホンアミド結合、ヒドラジン結合、又はその他の共有結合のいずれかのようなアミド代替結合である結合を少なくとも一つ含むことができる。
【００５８】
さらに用語「同族体」は、１以上のアミノ酸が変化している以外は本発明のアミノ酸配列を有する分子を示す。適切な「同族体」の設計はコンピューター支援により行うことができる。
【００５９】
「本発明のペプチド」又は「本発明の同族体」が本明細書及び請求項に記述された場合には、ＳＳＴに関するペプチドの生物活性が維持されている限り、その塩及び官能基誘導体も包含される。本発明に包含される本発明のペプチドの塩は生理的に受容される有機又は無機の塩である。本発明のペプチドの官能基誘導体は当技術分野において既知の手段により残基上の側鎖又はＮ−又はＣ−末端基として存在する官能基から調製され、そして医薬として受容される、すなわち、ペプチドの活性を損ねずそしてそれを含有する組成物に毒性を付与しない限り本発明に含まれる。これ等の誘導体は、例えば、カルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニア又は１級又は２級アミンとの反応によって作られるカルボキシル基のアミド、アシル基（例えば、アルカノイル又はアロイルカルボキシル基）との反応によって形成されるアミノ酸の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体又はアシル基との反応により形成される遊離ヒドロキシル基（例えばセリン又はトレオニン残基のヒドロキシル基）のＯ−アシル誘導体を含むことができる。
【００６０】
ここに使用した用語「骨格環化ペプチド」又は「骨格環化同族体」は、アミノ酸のＮα−ω−官能化誘導体からなる少なくとも一つの構築単位を組み込んだ望ましくは３から２４個のアミノ酸のペプチド配列からなる直鎖ペプチドの同族体を示し、そして
ｉ．該構築単位はアミド、チオエーテル、チオエステル、ジスルフィド、尿素、カルバメート、又はスルホンアミドからなる架橋基に結合したペプチド骨格の一つの窒素原子を含み、そして少なくとも一つの構築単位は該架橋基を介して第二構築単位、配列のアミノ酸残基の側鎖又は末端アミノ酸残基からなる群から選択された基と結合して環状構造を形成する；又は
ｉｉ．骨格環化構造は、少なくとも一つの構築単位及び第二構築単位、配列のアミノ酸残基の側鎖又は末端アミノ酸残基からなる群から選択された第二の基に結合したキレート形成基に対する金属錯体形成により形成される。
さらに望ましくは、ペプチド配列は３−２４アミノ酸を組み込み、より望ましくは４〜１２アミノ酸を組み込み、そして最も望ましいのは５〜９アミノ酸を組み込んでいる。
【００６１】
「構築単位」は一般式Ｎｏ．４のアミノ酸のＮα誘導体を示す：
【化４】
2005538966.tif 000006
式中Ｘはアルキレン、置換アルキレン、アリレン、シクロアルキレン及び置換シクロアルキレンからなる群から選択されたスペーサー基；Ｒ’はアミノ酸側鎖、任意に特異的保護基と結合している；そしてＧはアミン、チオール、アルコール、カルボン酸、スルホナート及びエステル、及びハロゲン化アルキルからなる群から選択された官能基である；それはペプチド配列の中に組み込まれた後に、Ｎ２Ｓ２ドナー化学により金属と錯体形成することにより、選択的に官能基Ｇを介して該ペプチド配列のアミノ酸の側鎖の一つ又は他のω−官能化アミノ酸誘導体とともに環化される。
【００６２】
構築単位を製造する方法はＷＯ  ９５／３３７６５及びＷＯ  ９８／０４５８３として公開されている国際特許出願及び米国特許Ｎｏ．５，７７０，６８７及び５，８８３，２９３に記述されており、これ等の全てを記述されている全体を引用してここに明確に取り入れた。
【００６３】
構築単位は対応する修飾アミノ酸の３文字略号、次いで反応基のタイプ（アミンに対してはＮ，カルボキシルに対してはＣ）、そして介在するメチレン基の数の表示により略称する。例えば、ＧｌｙＣ２はカルボキシル反応基及び炭素２個のメチレンスペーサーを伴う修飾Ｇｌｙ残基を記述しており、そしてＰｈｅＮ３はアミノ反応基及び３炭素メチレンスペーサーを伴う修飾フェニルアラニン基を示している。一般式中において構築単位は配列中の位置に相当する上付き数字を伴うＲとして略記され、その位置の骨格窒素が該式中において特定された架橋基の結合位置であることを示すように文字Ｎが先行する。
【００６４】
ここに開示した化合物は不斉中心を有することがある。キラル、ジアステレオマー、及びラセミの型は全て本発明に包含される。多数の二重結合の幾何異性体などもここに開示した化合物の中に存在しうるので、そのような安定な異性体は全て本発明中で考慮されている。
ここでは「安定な化合物」又は「安定な構造」によって、反応混合物から使用しうる純度で単離でき、そして有効な診断及び治療剤に製剤化できる化合物を意味する。
【００６５】
ここ及び請求項に使用した用語「置換」は、指定した原子の正常な原子価を超えず、そして置換の結果安定な化合物を生じることを前提にして、指定した原子上の１以上の水素のいずれかを示した基から選択して置き換えることを意味する。
【００６６】
いずれかの可変基（例えばＲ，Ｘ，Ｚなど）がいずれかの成分又はこの中のいずれかの式中に一度を超えて存在する場合には、存在する度の定義はそれぞれ存在する時の定義にしたがう。また、置換基及び／又は可変基の組み合わせはその組み合わせが安定な化合物を生じる場合のみ認められる。
【００６７】
ここ及び請求項に使用されている「治療有効量」とは、限定はしないが、癌、内分泌障害、炎症性疾患、及び胃腸管障害のようなここに開示された適応症に対して目的とする結果を達成するために宿主に投与する新規骨格環化ペプチド同族体及びそれを含む組成物の量を意味する。
【００６８】
本発明及びそれを作りそして使用する方法を記述するために一定の略称がここでは使用される。例えば、Ａｌｌｏｃはアリルオキシカルボニル、Ｂｏｃはｔ−ブチルオキシカルボニル、ＤＣＭはジクロロメタン、ＤＩＥＡはジイソプロピル−エチルアミン、ＤＭＦはジメチルスルホミド、ＤＴＰＡはジエチレントリアミンペンタ酢酸、Ｆｍｏｃはフルオレニルメトキシカルボニル、ＨＰＬＣは高圧液体クロマトグラフィー、ＧＡＢＡはガンマアミノ酪酸、ｍＣｉはミリキュリー、ＭＳは質量分析、ＮＭＰは１−メチル−２−ピロリドン、ＰＥＴはポジトロンエミッショントモグラフィー、ＰｙＢｒＯＰはブロモ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウム  ヘキサフルオロホスファート、ＳＰＥＣＴはシングルホトンエミッションコンピュータートモグラフィー、ＳＰＥＴはシングルホトンエミッショントモグラフィー、ＳＲＩＦはソマトロピン放出抑制因子、ＳＳＴはソマトスタチン、ＳＳＴ−Ｒはソマトスタチン受容体、ＴＦＡはトリフルオロ酢酸である。
【００６９】
本発明に使用されるアミノ酸は市販品を使用するか又は定型的な合成法により入手することができるものである。一部の残基はペプチドに組み込むために特別な方法が必要であり、そしてペプチド配列に対して分散的及び集中的合成法が本発明において有用である。天然の略号アミノ酸及びその誘導体はＩＵＰＡＣ慣用に従って３文字略号により示す。表示がない場合にはＬ異性体を使用した。Ｄ異性体は残基略号の前に「（Ｄ）」又は「Ｄ」により表示する。略号のないアミノ酸のリスト：Ａｂｕは２−アミノ酪酸、Ｄａｂはジアミノ酪酸、Ｄｐｒ及びＤａｐはいずれもジアミノプロピオン酸、ＧＡＢＡはガンマアミノ酪酸、１Ｎａｌは１−ナフチルアラニン、２Ｎａｌは２−ナフチルアラニン、及びＮｌｅはノルロイシンである。
【００７０】
当業者に既知のアミノ酸の保存的置換は本発明の範囲内である。保存的アミノ酸置換は一つのアミノ酸を同じタイプの官能基又は側鎖、例えば、脂肪族、芳香族、陽性電荷、陰性電荷を有する他のアミノ酸での置換を含む。これらの置換は生物学的利用率、中枢神経系への浸透性、特定の細胞集団への指向性などを増強することがある。記述された配列における一つのアミノ酸又は少ないパーセンテージのアミノ酸の変更、追加又は削除するペプチド、ポリペプチド、又はプロテイン配列に対する個別の置換、削除又は追加は、その変更が化学的に類似するアミノ酸によるアミノ酸の置換を生じる「保存的修飾変異体」であることを、当業者は認識しているであろう。機能的に類似するアミノ酸を示す保存的置換表は当業者によく知られている。
【００７１】
以下の６群はそれぞれ互いに保存置換であるアミノ酸を含んでいる：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；及び
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【００７２】
薬理
他の考慮を別として、本発明の新規な活性成分がペプチド又はペプチド同族体であるという事実から、このようなタイプの化合物の投与には製剤が適切でなければならないということが要求される。明らかに、胃酸又は腸の酵素による消化を受けやすいために経口投与には余り適していない。ペプチドの投与のために望ましい経路は関節内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、又は髄膜内である。より望ましい経路は障害又は病気の部位に又はその近くに直接注射することによるものである。
【００７３】
本発明の医薬組成物は当業者によく知られている操作、例えば、通常の混合、溶解、顆粒化、粉砕、粉末化、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル作成、エントラッピング又は凍結乾燥操作により製造することができる。
【００７４】
したがって、本発明に従って使用する医薬組成物は、活性化合物を製剤に加工し易くするために医薬として使用することができる賦形剤及び補助剤からなる１以上の生理的に受容しうる担体を使用して通常の様式で製剤化することができる。適当な製剤は選択された投与経路による。
【００７５】
注射用には、本発明の化合物は水溶液に、望ましくはＨａｎｋの溶液、Ｒｉｎｇｅｒの溶液、又は生理食塩液緩衝液のような生理的に適合する緩衝液中に製剤化することができる。経粘膜投与用には、透過すべきバリアーに適する浸透剤が製剤中に使用される。該浸透剤、例えばポリエチレングリコールは当業者に一般的に知られている。
【００７６】
糖衣錠コアは適当なコーティングを施される。この目的のために、任意にアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液及び適当な有機溶媒又は溶媒混合物を含むことができる濃縮糖溶液を使用することができる。活性化合物の異なる用量を同定又は特徴付けるために染料又は色素を錠剤又は糖衣錠コーティングに添加することができる。
【００７７】
経口的に使用される医薬組成物はゼラチンから作られた硬カプセル並びにゼラチン及びグリセロール又はソルビトールのような可塑剤から作られた軟、シールドカプセルを含む。硬カプセルはラクトースのような充填剤、澱粉のような結合剤、タルク又はステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤、及び任意に安定化剤と混合して活性化合物を含有することができる。軟カプセル中には、活性化合物は脂肪油、液体パラフィン、又は液状ポリエチレングリコールのような適当な液体に溶解又は懸濁することができる。さらに安定化剤を加えることができる。経口投与用の製剤は全て選択した投与経路に適した用量でなければならない。口腔内投与のためには、組成物は通常の方法で製剤化された錠剤又はトローチの形態をとることができる。
【００７８】
吸入による投与のために、本発明による使用のための変形は、加圧容器又は適当なプロペラント、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン又は二酸化炭素を使用するネブライザーからエアロゾルを噴射する形態で供給するのが便利である。加圧式エアロゾルの場合に、用量単位は定量を供給するバルブを装着することにより決めることができる。ペプチドの粉末混合物及び乳糖又は澱粉のような適当な粉末基剤を含む、例えば、インヘラー又はインサフレーター内に使用するためのゼラチンのカプセル及びカートリッジを製剤化することができる。
【００７９】
非経口投与用の医薬組成物は水可溶型の活性成分の水溶液を含む。さらに、活性化合物の懸濁剤を適当な油状注射懸濁剤として調製することができる。適当な天然又は合成の担体は当業者によく知られている（Ｐｉｌｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５：４４７，２００１）。任意に、懸濁剤は適当な安定化剤又は化合物の溶解性を増加させ、高濃度の溶液を作ることが出来る試薬を含むこともできる。その他には、活性成分を、使用前に適当な基剤、例えば、滅菌、発熱物質除去水で再構成するための粉末の形態にすることもできる。
【００８０】
本発明の化合物を、例えば、ココアバター又はその他のグリセリドのような通常の坐剤基剤を使用して坐剤又は留置浣腸剤のような直腸用組成物に製剤化することもできる。
【００８１】
本発明の文脈において使用するために適する医薬組成物は、意図する目的を達成するために有効な量の活性成分を含有する組成物である。特に、治療有効量は治療を受ける患者の病気の症状を予防し、緩和し又は改善するために有効な化合物の量を意味する。治療有効量を決定することは当業者の能力の範囲内で行うことができる。
【００８２】
ここに記述したペプチドの毒性及び治療有効性は細胞培養又は実験動物における標準的薬物学的方法、例えば、被験化合物のＩＣ５０（５０％阻害を生じる濃度）及びＬＤ５０（試験動物の５０％に死亡を生じる致死量）を測定することにより決定することができる。これ等の細胞培養及び動物試験から得られたデータはヒトに使用するための投与量範囲で製剤化する際に使用される。投与量は使用する投与形態及び利用する投与経路により変わる。実際の製剤、投与経路及び投与量は患者の状態を診てそれぞれの医師が選択することができる（例えば、Ｆｉｎｇｌ，ｅｔ  ａｌ．，１９７５，ｉｎ“Ｔｈｅ  Ｐａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”，Ｃｈ．１  ｐ．１）。
【００８３】
治療すべき病気の重症度及び応答性によって、投与方法は、数日から数週間又は治癒するまで継続する治療コースの間に又は治癒されるか又は病状の改善が生じるまで徐放性製剤の１回投与のこともありうる。投与される組成物の量は、勿論、治療を受ける患者、苦痛の程度、投与方法、処方医師の判断、その他の関連因子の全てによるであろう。
【００８４】
望ましい態様
本発明により、アルファアミノ酸のアルファ窒素に結合した架橋基を有する新規構築単位を組み込んでいることが特徴である新規標識ペプチド同族体が開示される。特に、これ等の化合物は３から２４個のアミノ酸のペプチド配列からなる骨格環化ソマトスタチン同族体であり、各同族体は少なくとも一つの構築単位を組み込んでおり、該構築単位はＮ２Ｓ２オキソレニウム（Ｖ）又はオキソテクネチウム（Ｖ）金属錯体からなる架橋基に結合したペプチド骨格の一つの窒素原子を含んでおり、そしてその中の一つの構築単位は該架橋基を介して第二構築単位、配列のアミノ酸残基の側鎖又は末端アミノ酸残基からなる群から選択された基と結合して環状構造を形成する。望ましくは、ペプチド配列は３から２４個の残基、より望ましくは４から１２個のアミノ酸、最も望ましいのは５〜９個のアミノ酸を組み込んでいる。
【００８５】
本発明の骨格環化同族体はヒトＳＳＴ受容体の限定されたサブセットに高い親和性をもって結合する。この受容体選択性はインビボにおける生理的選択性の可能性を示す。さらに、本発明は初めて特異的ＳＳＴ受容体選択性又は受容体選択性の組合せを有する一団の骨格環化標識同族体を提供する。これによりそれぞれの患者及びそれぞれの病気に対するニーズに基づいて種々のタイプの癌における診断と治療への使用を可能にする。
【００８６】
本発明により、望ましいＳＳＴ同族体は特別なＳＳＴサブタイプに親和性及び選択性を有する金属錯体形成により骨格が環化したノナペプチド同族体である。望ましい同族体は、ＳＳＴ−Ｒサブタイプ２またはＳＳＴ−Ｒサブタイプ２及び５に対して受容体選択性を示すことができるＳＳＴの新規骨格環化同族体を含む。
【００８７】
本発明によるその他のソマトスタチン同族体は、利点として少なくとも一つの骨格の環状構造を含む２環性構造を含むことができる、そしてその中で少なくとも一つの構築単位が環状構造及び側鎖から側鎖；骨格から骨格及び骨格から末端からなる群から選択された第二の環状構造の中に含まれている。
【００８８】
本発明はさらに骨格が環化した診断及び治療薬を形成するために標識することができるペプチド試薬を提供する。これ等の試薬はアミノ酸の少なくとも一つのＮα−ω−官能化誘導体を使用して形成される金属−結合基に共有結合したソマトスタチン同族体からなる。金属は金属−結合基に結合して骨格環化構造を形成する。本発明による望ましい態様においてキレート形成基は４個のドナー原子からなり、そして金属は放射性アイソトープである。本発明によると配位子は２個の遊離チオール及び２個の遊離窒素から作られ、それらは金属との錯体形成により骨格環化構造を形成する。最も望ましい同族体において配位子は２個のシステイン残基から作られる。本発明による望ましい態様において少なくとも一つのシステイン残基はアミノ酸のＮα−ω−官能化誘導体の架橋基に共有結合している。
【００８９】
本発明による望ましいキレート形成基は４個のドナー原子が２個の窒素及び２個の硫黄（Ｎ２Ｓ２）であり、そして金属錯体形成によりペプチド同族体は環化し、そして一般式Ｎｏ．１に示す安定な５−から６−員環が形成されるものである：
【化５】
2005538966.tif 000007
式中ＤはＮ２Ｓ２のドナー原子を示す；
半円はドナー原子間の２−又は３−炭素架橋を示す；
Ｒ基は環状ペプチド、直鎖ペプチド、オキソ、ヒドロキシ、炭化水素、水素、ぺプチド同族体及びキレート形成基に結合した連結基又はスペーサー基からなる群から独立して選択され、そしてドナー原子及び炭素架橋から選択された位置に存在し、そしてその中の少なくとも２個のＲ基はキレート形成基と共に環化ペプチド構造を形成する；そしてＭは望ましくは＋５酸化状態にあるＲｅ及びＴｃから選択された金属原子である。
【００９０】
その他の望ましい態様は下記表に記述するような−１、中性、＋１、又は＋２電荷を有するオキソレニウム（Ｖ）又はオキソテクネチウム（Ｖ）錯体を形成するキレート形成基を含む：
【表１】
2005538966.tif 000008
【００９１】
本発明はシンチグラフ造影剤、放射性診断薬及び放射線治療薬である放射標識骨格環化ペプチドを提供する。
【００９２】
本発明のシンチグラフ造影剤は、診断的造影（シングルホトンエミッションコンピュータートモグラフィー、ガンマカメラ、プラナー、手術中に使用するための検出プローブ又はデバイス）に使用するために、ガンマ線放射アイソトープ、望ましくは９９ｍＴｃで放射標識した骨格環化ペプチドからなる。放射性核種造影（ポジトロンエミッショントモグラフィー、ＰＥＴを含む）において有用な減衰特性を有し、本発明の骨格環化同族体と錯体形成することができるその他のテクネチウム又はレニウムの放射性アイソトープも本発明に包含される。
【００９３】
本発明の放射線治療薬は細胞傷害性放射性アイソトープ（α又はβ放射）で放射能標識した骨格環化ペプチド試薬からなる。本発明による最も望ましい細胞傷害性放射性アイソトープはレニウム−１８６及びレニウム−１８８である。該錯体がシンチグラフ造影及び標的放射線治療の両者に有用である組み合わせた態様も本発明により提供される。放射線療法に有用な減衰特性を有し、本発明の骨格環化同族体と錯体形成することができるその他のテクネチウム又はレニウムの放射性アイソトープも本発明に包含される。
【００９４】
本発明により金属錯体形成による骨格環化ソマトスタチン同族体は癌の磁気共鳴造影（ＭＲＩ）のコントラスト試薬としても使用することができる。プロトンＭＲＩ診断において、内臓及び組織のコントラストの増加は、周囲の水プロトンの緩和性を増加させる常磁性金属種を含む組成物の投与により得られる。さらに、本発明の化合物は、腫瘍のコントラストの増加が本質的に放射線不透過のコントラスト試薬を投与することにより得られるコンピュータートモグラフィー（ＣＴ）診断に使用することができる。
【００９５】
ソマトスタチンは、組織依存性に発現する５個の受容体のファミリーによって仲介される多数の調節機能を有するテトラデカペプチドホルモンである。受容体に特異的なＳＳＴの同族体は種々の病気の治療及び診断における価値ある診断薬及び治療薬であると考えられている。この選択性を有する小さなペプチド同族体を設計する試みは完全には成功していない。金属錯体形成により骨格が環化した本発明のＳＳＴ同族体はＳＳＴ受容体サブタイプに高度に選択性があり、従って特定のＳＳＴ受容体が特定の組織に発現する病気の診断及び治療に有用であることが予期せず今発見された。該病気はなるべく、結腸癌、成長ホルモン分泌下垂体アデノーマ、甲状腺癌、胃カルチノイド、小型細胞肺カルチノーマ、メラノーマ、骨髄性非ホジキンリンパ腫、及び乳癌及びその他のタイプの癌のような種々のタイプの癌である。さらに、本発明の骨格環化ＳＳＴ同族体を、限定はしないが心臓同種移植片拒絶を含む同種移植片拒絶の検出に使用することができる。
【００９６】
本発明の骨格環化同族体は癌の診断及び腫瘍又はその転移の存在を造影する方法及び限定はしないが心臓同種移植片拒絶を含む同種移植片拒絶の検出における診断用の組成物として使用することができる。癌及び同種移植拒絶の診断方法はヒト患者を含む哺乳動物に骨格環化同族体又は放射性アイソトープ及び非放射性トレーサーからなる群から選択された検出可能なトレーサーで標識した同族体を投与することからなる。該組成物を使用する癌及び同種移植片拒絶の診断又は造影方法は本発明のもう一つの態様を表している。
【００９７】
本発明によって供給される造影剤は腫瘍の造影に、特に該新生物細胞がＳＳＴ受容体を発現している原発及び転移新生物部位を造影するために、そして特に通常の方法を使用して検出及び分析することが臨床的に困難である該原発及び特に転移腫瘍細胞において有用性がある。本発明による造影剤は臓器、及び腫瘍を可視化するために使用することができ、特に胃腸管腫瘍、骨髄腫、小細胞肺癌及びその他のＡＰＵＤ腫、髄性甲状腺癌及び下垂体腫瘍のような内分泌腺腫瘍、髄膜腫及び星状細胞腫のような脳腫瘍、及び前立腺、乳腺、結腸、及び卵巣の腫瘍も造影することができる。
【００９８】
９９ｍＴｃ標識診断試薬は望ましくは１単位注射用量で静脈内に投与される。これ等の試薬は食塩水溶液のような静脈注射用の通常の溶剤に入れて投与することができる。一般的に、投与される単位用量は約１から３０ｍＣｉの放射能である。単位用量で注射される溶液は約０．１から約１０ｍｌである。静脈注射の後、インビボにおける造影は注射直後から物理的減衰半減期の４倍までの間のいつでも実施することができる。ガンマシンチグラフィーのようなシンチグラフ造影のいずれかの方法を本発明に従って利用することができる。
【００９９】
ｍＬ当り約１ｍＣｉから１００ｍＣｉの濃度で溶液中に放射能を有する本発明による放射能標識シンチグラフ造影剤が提供される。
【０１００】
薬理的に活性な骨格環化ＳＳＴアゴニスト又はアンタゴニスト及び医薬として受容しうる担体又は希釈剤からなる医薬組成物は、該組成物を使用する標的療法による癌の治療方法と同様に、本発明のもう一つの態様を表す。本発明による医薬組成物は１又は２種のＳＳＴ受容体サブタイプに対して選択的である少なくとも一つの骨格環化ペプチド同族体からなることが利点である。これ等の医薬組成物は経口的、局所的又は全身的を含むいずれかの適当な投与経路により投与することができる。望ましい投与方法は、限定はしないが静脈内及び筋肉内注射のような非経口投与、並びに鼻腔内投与又は経口摂取である。該医薬組成物の投与のための望ましい用量は約０．１μｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲である。
【０１０１】
医薬組成物は望ましくは特にＳＳＴ受容体を発現するあるタイプの腫瘍の縮小を促進するために使用することができる。さらに、医薬組成物はしばしばＡＰＵＤ腫のようなある種の癌に伴うホルモン過剰分泌を減少させるためにも使用することができる。本発明の化合物による治療が有用であるその他の病気は内分泌障害、胃腸管障害、糖尿病合併症、膵炎、自己免疫疾患、及び炎症性疾患、同種移植片拒絶、アテローム性動脈硬化症及び再閉塞である。
【０１０２】
本発明はさらに、本発明の骨格環化ＳＳＴ同族体の治療有効量を動物に投与することからなる動物、望ましくはヒトにおけるソマトスタチン関連疾患を緩和する方法を提供する。一部の望ましい態様において骨格環化同族体は非標識である。
【０１０３】
一部の望ましい態様において、試薬が１８６Ｒｅ又は１８８Ｒｅのような細胞傷害性放射性アイソトープで標識されている場合には、レニウム−１８６又はレニウム−１８８をある種の腫瘍の放射線療法に使用することができる。望ましい態様において、投与されるＳＳＴ同族体の量は約０．１μｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇ体重／日である。この目的のために、約１０ｍＣｉから約２００ｍＣｉの放射性アイソトープの量を臨床的に適するいずれかの経路、望ましくは静脈注射により投与することができる。
【０１０４】
本発明のその他の態様は治療用及び診断用の医薬品、望ましくはシンチグラフ造影剤、及びそれを作るのに必要な試薬の調製方法を提供する。該試薬のそれぞれは放射性金属錯体分子と共有結合したＳＳＴ同族体からなる。例えば、本発明により提供されるシンチグラフ造影剤は本発明の試薬を、［９９ｍＴｃ］過テクネチウム酸イオン（一般的に核医学診療所又は核薬局に見られる９９Ｍｏ／９９ｍＴｃ発生器から溶出する＋７金属酸化状態）をオキソ［９９ｍＴｃ］テクネチウム種（＋５金属酸化状態）に還元することができる試薬の存在下に、９９ｍＴｃと反応させることにより形成した９９ｍＴｃ標識錯体からなる。望ましい還元剤は限定はしないが亜ジチオン酸、錫又は鉄イオンである。本発明の該９９ｍＴｃ錯体は予め還元した９９ｍＴｃ錯体のリガンド交換により本発明のペプチド同族体を９９ｍＴｃで標識することによっても形成することができる。この場合に、ｉｎ  ｓｉｔｕ還元混合物中に弱い配位子が存在するが、本発明の試薬は最初は存在しない。本発明の試薬を＋５酸化状態オキソ［９９ｍＴｃ］テクネチウム「弱い配位子」錯体を含む溶液に加え、より安定な本発明の試薬とのオキソ［９９ｍＴｃ］テクネチウム錯体を形成する。
【０１０５】
本発明はさらに金属錯体形成により骨格が環化したＳＳＴ同族体を標識するためのキットを提供する。本発明の望ましい態様において、［９９ｍＴｃ］テクネチウム−標識ペプチド同族体を調製するためのキットが提供される。骨格環化同族体の適当量を、同族体を９９ｍＴｃで標識するのに十分な量で塩化錫のような還元剤を含むバイアル中に導入する。適当量の転移リガンド（例えば、酒石酸、クエン酸、グルコンサン、２，５−ヂヒドロキシ安息香酸、グルコヘプタン酸又はマンニトールのような弱いオキソ［９９ｍＴｃ］テクネチウム配位子）も含むことができる。キットはまた浸透圧を調節するための塩、ｐＨを調節するための緩衝液、又はコールドキット又は最終的診断放射性医薬品の長期保存を可能にする保存剤のような添加物も含むことができる。キットの組成物は液体、凍結又は乾燥状態とすることができる。望ましい態様において、キット構成物は凍結乾燥の形態で提供される。
【０１０６】
本発明によるテクネチウム−９９ｍ標識造影剤は適当量の９９ｍＴｃ又は９９ｍＴｃ−錯体を本発明の試薬を含むバイアルに加え、そして適当な条件で反応させることにより調製することができる。望ましい放射性アイソトープがレニウム−１８６及びレニウム−１８８である放射性治療薬を調製するキットも提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１０７】
最も望ましい態様
本発明の最も望ましい骨格環化ＳＳＴ同族体を今記述する。
【０１０８】
最も望ましい同族体においてペプチドはリンカーを介して一つのヘミ−配位子及びペプチド骨格を介して第二ヘミ−配位子に結合して、一般式Ｎｏ．２の構造を形成する：
【化６】
2005538966.tif 000009
式中Ｚは金属錯体形成により５−ないし６−員環を形成する２個のドナー原子、ひとつはＮそしてひとつはＳ，を含む第一へミ−配位子基：
Ｑは存在しないかまたはペプチドのフリー官能基と結合することができるリンカー基；
ＰＴＲは少なくとも一つのアミノ酸のＮα−ω−官能化誘導体を含むソマトスタチン同族体を示す；そして
Ｘは金属錯体形成により５−ないし６−員環を形成する２個のドナー原子、ひとつはＮそしてひとつはＳ，を含む第二ヘミ−配位子基、その中のキレート形成基は１−６炭素原子からなる低級アルキル鎖を介してＰＴＲ骨格のα窒素又はペプチドのフリー官能基に結合している。
【０１０９】
望ましくは、リンカーＱはペプチドのＮ−末端に結合しており、そしてＸはペプチド骨格又はペプチド側鎖に結合している。さらに望ましくはリンカーＱは無いか又はガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、Ｇｌｙ，及びβＡｌａからなる群から選択されており、そしてＸはＮ−構築単位のα−窒素に結合している。最も望ましいのは、Ｚ及びＸがＬ及びＤシステインからなる群から選択されている。
【０１１０】
一態様は一般式Ｎｏ．３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を有する化合物である：
【化７】
2005538966.tif 000010
式中ｎは１から６；
Ｑは存在しないか又はＧＡＢＡ、Ｇｌｙ，及びβＡｌａからなる群から選択される；
Ｘは末端カルボン酸、アミド又はアルコール基を示す；
Ｃｙｓ１及びＣｙｓ２はそれぞれ独立してＬ又はＤ異性体；及び
Ｍは金属。
【０１１１】
望ましくは：
ｎは２，３，又は６；
Ｑは存在しないか又はβＡｌａ；
Ｃｙｓ２はＬＣｙｓ；
Ｘはアミド；そして
Ｍは［ｎａｔＲｅ］オキソレニウム（Ｖ）、［１８６Ｒｅ］オキソレニウム（Ｖ）、［１８８Ｒｅ］オキソレニウム（Ｖ）、又は［９９ｍＴｃ］オキソテクネチウム（Ｖ）からなる群から選択された放射性金属。
【０１１２】
式３による最も望ましい同族体は以下の群から選択される：
2005538966.tif 000011
式中アスタリスクは金属錯体形成により環化するために使用されるキレート形成基を示す。
【０１１３】
これ等の骨格環化ＳＳＴペプチド同族体はべプチド配列中に少なくとも一つのアミノ酸のＮα−ω−官能化誘導体を組み込むことにより調製される。２個のヘミ−キレート形成ＮＳドナー原子含有基が付加され、ひとつはＮα−ω−官能化アミノ酸の窒素に（例えばＣｙｓを付加することにより）そしてもう一つは末端Ｎ又はＮ−末端の直鎖ＡＡスペーサーに（例えば末端ＮへのＣｙｓの付加により）付加される。選択的環化は一つの金属（望ましくはオキソレニウム（Ｖ）又はオキソテクネチウム（Ｖ）として）の両方の２座ヘミ−配位子へ結合して４座Ｎ２Ｓ２オキソ金属（Ｖ）環状ペプチド（又はペプチド類似体）錯体を形成することにより達成される。ヘミ−キレート形成基は２個のＮα−ω−官能化誘導体、ペプチド配列中の１以上のアミノ酸側鎖、又はＮα−ω−官能化誘導体、アミノ酸側鎖、Ｃ−又はＮ−末端又は上記いずれかに結合したリンカー又はスペーサー基のいずれかの組合せのいずれかに共有結合することができる。
【０１１４】
本発明によるＰＴＲ  ３１７３の標識誘導体は、その親化合物と同様に、ＳＳＴ−Ｒ２及びＳＳＴ−Ｒ５の両者に結合することが期待され、従って両受容体タイプを発現する悪性腫瘍を検出しそして治療するために使用することができる。
【０１１５】
本発明の望ましい同族体のタイプ２  ＳＳＴ受容体に対する親和性は、これ等の同族体を潜在的に有効な診断用及び治療用組成物にするナノモル以下からナノモルの範囲にある。
【０１１６】
金属錯体形成により骨格が環化したＳＳＴ同族体の合成、精製及び分析の一般的方法
同族体はＨｏｕｇｈｔｅｎ  Ｒ．，（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２，５１３１−５１３５，１９８５）から改変した「ティーバッグ」方式を使用して下記のように合成した：
樹脂：０．５５ｍｍｏｌ／ｇを負荷したＲｉｎｋ  ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡ樹脂９．６ｇを、４８個の４ｃｍ  Ｘ５ｃｍの大きさのポリエチレンバッグ（「ティーバッグ」）のそれぞれに０．２ｇずつに分けていれた。このバッグを１２バッグずつ４個の容器に入れた。
【０１１７】
Ｆｍｏｃ−脱保護：５０ｍＬのＮＭＰ中２０％ピペリジンを使用（３０分間ずつ２回）、次いでそれぞれ２分間振とうして５０ｍＬのＮＭＰで５回洗いそして５０ｍＬのＤＣＭで３回洗う。
【０１１８】
カップリング：
ｉ．通常のカップリング：５０ｍＬのＮＭＰ中３当量のアミノ酸、３当量のＰｙＢｒｏＰ及び７当量のＤＩＥＡを使用。振とうして２時間。カップリングはニンヒドリン試験により監視し、ニンヒドリンが黄色にとどまるまで反復する。
ｉｉ．Ｇｌｙ構築単位へのカップリング：５０ｍＬのＮＭＰ中５当量のアミノ酸、５当量のＰｙＢｒｏＰ及び１２当量のＤＩＥＡを使用。振とうして２時間を２回。
【０１１９】
構築単位のＡｌｌｏｃ保護基の除去：５％酢酸及び２．５％メチルモルホリンを含む３０  ｍＬのＤＣＭ中Ａｌｌｏｃ当り０．６当量のＰｄ（ＰＰｈ３）４を使用。暗所において１〜４時間振とう。
【０１２０】
Ｂｏｃ−（Ｌ又はＤ）Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨのカップリング：上記の通常のカップリングプロトコールに従う。
【０１２１】
Ｆｍｏｃ脱保護：上記の通常の脱保護プロトコールに従う。
【０１２２】
Ｂｏｃ−（Ｌ又はＤ）Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨのカップリング：上記の通常のカップリングプロトコールに従う。
【０１２３】
切断：スカベンジャー：２．５％  Ｈ２Ｏ及び２．５％トリイソプロピルシランを添加した９５％ＴＦＡを使用。
【０１２４】
環化：ペプチドを樹脂から切断した後に行い、そして１当量のトリクロロオキソビス（トリフェニル−ホスフィン）レニウム（ｖ）のＤＭＦ溶液（１ｍｇペプチド当り１ｍＬ、総量）を含む２ｍＬの水に溶解する。１〜３時間振とう。環化は分析ＨＰＬＣにより監視する。
【０１２５】
精製：他の成分から環化ペプチドの単離を最適化するために、骨格環化ペプチドのそれぞれに対する個別の精製方法が分析ＨＰＬＣ上で開発される。分析方法は通常固定相としてＣ−１８Ｖｙｄａｃカラム２５０Ｘ４．６ｍｍ及び０．１％ＴＦＡを含む水／アセトニトリル混合グラジエントを使用して行われる。調製方法は分析的分離方法を調製Ｃ−１８Ｖｙｄａｃカラムに適用して設計される。採取したフラクションを分析ＨＰＬＣに注入して純度をチェックする。純粋なフラクションを集めて凍結乾燥する。
【０１２６】
分析：集めた純粋凍結乾燥物質は、ＨＰＬＣ、ＭＳ及びキャピラリー電気泳動により純度を、アミノ酸分析によりペプチド含量及びアミノ酸比を分析する。
【０１２７】
テクネチウムによる放射能標識の一般的方法
本発明の試薬による放射性テクネチウムの錯体形成において、望ましくはナトリウム［９９ｍＴｃ］過テクネチウム酸（＋７酸化状態）を含む９９Ｍｏ／９９ｍＴｃ発生器からの溶出液を還元剤の存在下に試薬と反応させる。望ましい還元剤は確実にＴｃＶＩＩをＴｃＶに還元する塩化錫である。該錯体を調製するための手段は、予め定めた量の標識すべき本発明の試薬及びＴｃ−９９ｍで試薬を標識するための十分な量の還元剤を含む密閉バイアルからなるキットの形態で供給するのが便利である。でなければ、錯体は本発明の試薬を予め作製したテクネチウム及び転移リガンドとして知られる他の化合物の不安定な錯体と反応させることにより形成することができる。この操作はリガンド交換として知られており、当業者にはよく知られているものである。不安定錯体は、例えば酒石酸、クエン酸、グルコン酸、２，５−ジヒドロキシ安息香酸、グルコヘプタン酸又はマンニトールのような転移リガンドを使用して形成することができる。
【０１２８】
粗製配位子−環化ペプチド結合体で金属錯体を形成する一般的方法：
粗製配位子−環化ペプチド結合体はオキソレニウム（Ｖ）と錯体を形成することができる。切断後の組成物を測り、全体が１００％求める結合体であると仮定してモル当量を計算する。或いは、結合体のモル当量を負荷した固相樹脂に基づいて計算する。適当な金属試薬を当量加える。この方法は粗製ペプチドが比較的純粋である場合にレニウムで成功する。クロマトグラフィーによる精製段階を省略することにより時間と資源を節約する。
【０１２９】
ソマトスタチン同族体のインビトロスクリーニングの一般的方法
インビトロにおいてＳＳＴ受容体に結合する本発明のＳＳＴ同族体の能力はＳＳＴ受容体含有細胞膜に対する放射性標識ＳＳＴ同族体の結合を阻害する該同族体の能力を検定することにより示した。
【０１３０】
ＳＳＴ同族体について（Ｒａｙｎｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ４３：８３８，１９９３により記述されている方法に基づいて）膜貫通ＳＳＴ受容体（ＳＳＴ−Ｒ１，２，３，４又は５）を発現する膜標本に対する１２５Ｉ−Ｔｙｒ１１−ＳＲＩＦの結合を阻害する効力を試験した。この試験に使用した受容体標本はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に選択的にそして安定して発現するクローン化ヒト受容体又はＳＳＴ−Ｒ類を自然に発現する細胞系からのものである。典型的に、細胞膜をプロテアーゼ阻害剤の存在下にＴｒｉｓ緩衝液中でホモゲナイズし、そして１２５Ｉ−Ｔｙｒ１１−ＳＲＩＦ及び種々の濃度の試験検体と共に３０〜４０分間インキュベートした。結合反応を濾過し、濾取物を洗い、そして結合した放射能をシンチレーション溶液を加えた後βカウンターで計測した。非選択的結合は１μＭの非標識ＳＲＩＦ−１４の存在下に結合して残る放射能と定義した。
【０１３１】
ソマトスタチン同族体の活性を評価するためのインビボモデル
本発明の放射線標識化合物について下記のような細胞系に由来する異種移植片における腫瘍取り込みを試験する：
ｉ．    ヌードラットにおけるラット下垂体アデノーマ細胞（ＧＨ３）。
ｉｉ．  ヌードマウス又はヌードラットにおけるヒト結腸腺癌細胞（ＨＴ−２９）。
ｉｉｉ．正常ラットにおけるラット膵臓胞状腺癌細胞（ＣＡ２０９４８）。
ｉｖ．  ヌードマウスにおけるラット膵臓癌細胞（ＡＲ４２Ｊ）。
ｖ．    ヌードマウスにおけるヒト小細胞肺カルチノーマ細胞（ＮＣＩ−Ｈ６９）。
ｖｉ．  ヌードマウス又はヌードラットにおけるヒト膵臓カルチノイド細胞（ＢＯＮ−１）。
ｖｉｉ．ヌードマウス又はヌードラットにおけるＬＣＣ−１８細胞。
【０１３２】
簡単に記述すると、この細胞を懸濁として０．０５から０．１ｍＬ／動物で筋肉内に移植する、この腫瘍を約０．５から２ｇに増殖させ、回収して、新しい動物群への二回目の移植に使用する。このように継代を繰り返して腫瘍保有動物の継続世代を作る。３代目から５代目の腫瘍保有動物に標識化合物を静脈内注射する。選択した時期に動物を殺処理して、採取した組織検体を秤量し、そして注射投与の分割液と共に、ガンマウエルカウンター中でカウントする。そのほかには、放射標識化合物を正常又は免疫不全−無腫瘍動物において試験する。例えば、該インビボ試験において、膵臓及び副腎においてＳＳＴ−Ｒ標的取り込みを観察し、そして非標的臓器についてもそれぞれの化合物の排泄プロフィールを確認するために観察する。
【０１３３】
一般的インビボ造影方法
動物腫瘍細胞によって示されるＳＳＴ受容体のインビボ造影は本質的にＢａｋｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ４９：１５９３−１６０１）により記述されているように行われる。その他のインビボスクリーニング方法は実施例６に詳細に記述される。
【０１３４】
部分的に多数の既知生物活性ペプチドの配列又はこれまでに未知の新規配列に基づいて構築された立体的に固定したＳＳＴ同族体は下記実施例中に示される。以下の実施例は本発明の化合物及び方法をいかに作りそして使用するかを説明することを意図しており、決して限定と解釈してはならない。本発明をこれからその特定の態様を以って記述するが、当業者にとって多くの修飾又は変種が考えられることは明白である。従って、付記した請求項の精神及び幅広い範囲内にある該修飾及び変種は全て包含されるものである。
【０１３５】
実施例
本発明をこれから以下の実施例により非限定的様式において説明する：
【０１３６】
実施例１．ライブラリー合成の詳細な手順
上記一般的方法に従って合成された４８ペプチドのセットの合成スキームを図１に記述する。化合物は粗製ペプチドとしてＲｅＯと部位特異的錯体形成することにより骨格が環化し（実施例２）、次いで精製される。
【０１３７】
それによる放射能の性質及びその半減期の特徴のために医学的適用に最も適している放射性アイソトープ１８６Ｒｅ，１８８Ｒｅ，及び９９Ｔｃの優れたモデル金属としてレニウムが選択された。
【０１３８】
配位によって金属原子を選択したことにより結合部位の設計が導かれた。故にＲｅ及びＴｃはドナー原子に対する同じ優先順位Ｓ＞Ｎ＞＞Ｏを示す。またＲｅ及びＴｃは＋５酸化状態にある場合に、同じ配位構造を優先的にとる。すなわち（錐体の中心に位置する金属を伴う）正方錐構造をとり、その正方形の隅に４個のドナー原子が位置しそしてモノ−オキソ基が正方形の面の上又は下に位置する。４個のドナー原子を必要としそして硫黄及び窒素が最良のドナーであるので、Ｒｅ結合部位は２個のシステイン、一つはＣ−末端Ｇｌｙ構築単位窒素に、そして一つはＮ−末端の最後の残基に、それぞれＣｙｓカルボキシ基を介して結合し、Ｒｅ原子に配位するための遊離チオール及び遊離アミンをペプチドの両側に構築する。
【０１３９】
実施例２：オキソレニウム（Ｖ）錯体を得るための粗製の金属を含まないペプチドとレニウムの反応
粗製ペプチドを水に溶解しそしてＤＭＦ中においてトリクロロオキソビス（トリフェニルホスフィン）−レニウム（Ｖ）を加え、混合物を室温にて約２時間振とうする。減圧下にＤＭＦを除去し、（４０℃の検体を）１０時間遠心分離し、そして生成物をＨＰＬＣにより精製してペプチドのオキソレニウム（Ｖ）錯体を得る。
【０１４０】
実施例３：金属錯体形成により骨格が環化したＳＳＴペプチド同族体４８個の設計及び合成。
ＰＴＲ  ３１７３と命名された化合物はＳＳＴ−Ｒ２及びＳＳＴ−Ｒ５に対して選択的な骨格環化ソマトスタチン同族体である。その合成及び活性はＷＯ  ９９／６５５０８に記述されている。
この化合物は次の構造を有す：配列（３）（式中アスタリスクは環化する位置を示す、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）。
2005538966.tif 000012
【０１４１】
ＰＴＲ  ３１７３のペプチド同族体４８個のセットは次の式によって合成された：
2005538966.tif 000013
式中の４個のパラメーターを系統的に変化させた：
１）（Ｃｙｓ２）に結合したＧｌｙ構築単位上のメチレン鎖の長さ（Ｘ＝２，３，６）；
２）Ｃ−末端のＧｌｙ構築単位のω−アミンに結合したシステイン残基（Ｃｙｓ２）のコンフィグレーション（Ｌ又はＤ異性体）；
３）Ｎ−末端のシステイン（Ｃｙｓ１）をペプチドに結合しているスペーサー（ＧＡＢＡ，βアラニン，Ｇｌｙ，又はなし）；そして
４）Ｎ−末端のシステイン残基（Ｃｙｓ１）のコンフィグレーション（Ｌ又はＤ異性体）。
【０１４２】
次のスキームに生成した同族体の直鎖及び環化構造を記す：
直鎖構造：
【化８】
2005538966.tif 000014
金属錯体形成により骨格が環化した構造：
【化９】
2005538966.tif 000015
【０１４３】
これ等の変換により種々の環の大きさ（２９個から３８個の原子）を持つ４８個のペプチドライブラリーが導かれたが、このライブラリーのメンバーは全てＰＴＲ−３１７３のファルマコフォアを保存している。コンフォメーションの変化はＲｅ結合部位におけるＣｙｓコンフィグレーションの相違及び異なる構成（Ｎ−末端のＣｙｓの前の構築単位及び残基の長さ）により同じ環の大きさを持つ群の中において期待された。
この化合物は表２に記述される：
【表２−１】
2005538966.tif 000016
【表２−２】
2005538966.tif 000017
【０１４４】
実施例４：ソマトスタチン受容体に対する同族体の結合。
本発明のＳＳＴ同族体のインビトロにおけるＳＳＴ受容体への結合能力は、上記のＳＳＴ受容体含有細胞膜への放射能標識ＳＳＴ同族体の結合を阻害する該同族体の能力を検定することにより示された。これ等の試験に使用された受容体膜標本はＣＨＯ細胞に選択的にそして安定的に発現したクローン化ヒト受容体由来であり、そして使用された放射能標識同族体は（３−［１２５Ｉ］ｔｙｒｏｓｙｌ１１）ＳＲＩＦ−１４であった。
【０１４５】
表３は４８個のＲｅＯ−ＧＦ同族体のヒトクローン化ＳＳＴ−Ｒ２に対する結合試験の結果を示し、一方図２はＲｅＯ−ＧＦ−２１及びＲｅＯ−ＧＦ−３１の競合結合曲線を示す。
【表３−１】
2005538966.tif 000018
【表３−２】
2005538966.tif 000019
【０１４６】
金属錯体形成による環化を行うために粗製直鎖ペプチドのオキソレニウム（Ｖ）との錯体形成を行った後に、半調製ＨＰＬＣ生成を行った。目的の産物が溶出した複数のＨＰＬＣフラクションを採取し、（ＭＳにより）正しい分子量を含む１以上のフラクションを生じた。この４８個のペプチド錯体のそれぞれには４種までの立体異性体（シス−エンド、シス−エキソ、トランス−エンド、トランス−エキソ）が予想されるので、錯体形成反応の組成物の分析的クロマトグラム及び半調製クロマトグラムに複数のＨＰＬＣピークが予想されそして観察された。しばしば１以上のピークが観察されたので、ＨＰＬＣフラクションは多分異性体の混合物を含んでいた。スクリーニングは、ＰＴＲ  ３１７３標準品に対するペプチド濃度測定により、それ以上の精製を行わないフラクションで実施した。従ってそれぞれのペプチドについて、１以上のフラクションが分析されたが、各フラクションは多分異なる比率の立体異性体を含んでいた。
【０１４７】
上記表に示されたデータは、本発明のペプチドがヒトＳＳＴ−Ｒ２に対して高い親和性を有することを示している。最も活性があると確認され選択された同族体を以下の表にまとめた：
【表４】
2005538966.tif 000020
標柱アスタリスクは金属錯体形成により環化するために使用されるキレート形成基を示す。
【０１４８】
ＩＣ５０＜５ｎＭを有する上記表中の６化合物の性質を表５に示す：
【表５】
2005538966.tif 000021
【０１４９】
実施例５：ラットにおけるＳＳＴ−Ｒ発現腫瘍の局在及びインビボ造影。
ラット腫瘍細胞により発現されるＳＳＴ受容体のインビボ造影は本質的にＢａｋｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ４２：１５９３−１６０１）による記述に従って実施する。腫瘍細胞を０．０５から０．１ｍＬ／動物の懸濁として、６週齢のラット右後肢大腿の筋肉内に移植する。腫瘍を約０．５から２ｇに増殖させ、回収し、そして粥状の腫瘍を使用して二回目の移植を新しい１群のＬｅｗｉｓラットに行う。このようにして継代を繰り返し、５継代以内の腫瘍を持つ動物を作製する。インビボ試験に使用した腫瘍を持つ動物は通常３から５代目でありそして０．２から２ｇの腫瘍を持っている。腫瘍中の放射性トレーサー局在の特異性の試験のために、選択された動物には放射性トレーサーの注射３０分前にオクトレオチドのＳＳＴ−Ｒ阻害用量（４ｍｇ／ｋｇ）を皮下投与する。（Ｂａｋｋｅｒ等によりこのプロトコールは１１１Ｉｎ−ＤＴＰＡ−オクトレオチドの腫瘍取り込みの４０％低下を生じることが示されている）。３から５代目の腫瘍を持つラットに背部尾静脈から０．２から０．４ｍＬ中３から８μｇペプチドに相当する０．１５〜０．２０ｍＣｉ９９ｍＴｃ−標識化合物を静脈内注射する。選んだ時間に、動物を頚椎脱臼により殺処理しそして採取した組織検体を秤量しそして注射液の分割液と共にガンマウエルカウンター中でカウントする。
【０１５０】
本発明を一定の望ましい態様及び実施例により記述したが、本発明のペプチド及び同族体の活性を最適化するために多くの変更及び修飾を行いうることは当業者に認識されることであろう。この実施例は非限定的なものでありそして本発明により開示される原理を説明するためにのみ役立つものであると解釈されるべきものであり、その範囲は以下の請求項によって特定される。
【図面の簡単な説明】
【０１５１】
【図１Ａ】図１Ａは合成された金属錯体形成により骨格が環化したソマトスタチン同族体の４８個のセットの合成スキームを示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは合成された金属錯体形成により骨格が環化したソマトスタチン同族体の４８個のセットの合成スキームを示す。
【図２】図２は対照化合物１２５Ｉ−Ｔｙｒ１１−ＳＲＩＦ−１４の阻害により測定したヒトＳＳＴ−Ｒ２に対する選択化合物、ＲｅＯ−ＧＦ−２１及びＲｅＯ−ＧＦ−３１の親和性を示す。
【配列表】
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2005538966.tif 000023
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【国際調査報告】
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