(57)【要約】本発明は、哺乳動物の血小板機能を監視する方法であって、哺乳動物の身体から採取した血液を通路（１４０）を介して通過させて、通路（１４０）中の障害物または凹凸（１２０）に接触させて通路（１４０）中に血小板塊を生じさせ、そして通路（１４０）中の血液の流れまたは組成を監視して血小板塊を検出することによる方法を提供する。この流れおよび組成は、通路（１４０）中の血小板塊の形成に応答して変化する。本方法を実施するための装置、製品およびキットも開示する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
血小板機能を監視する方法であって、
哺乳動物から採取した血液を、障害物または凹凸を含む通路を介して通過させて、障害物にまたは凹凸のところで通路の壁に接触させて、通路中に血小板塊を生じさせ；そして
通路中の血液の流れまたは組成を監視して、血小板塊の形成を検出すること
を含み；
ここにおいて、通路は、血小板を活性化する追加の生体物質を含まない、前記方法。
【請求項２】
血液が障害物または凹凸を通過する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
血液が、血小板を活性化する追加の生体物質を含まない、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
通路および血液が、血小板を活性化する追加の化学物質を含まない、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
採取した血液に生体物質も化学物質も加えない、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
哺乳動物の血小板機能を監視する方法であって、
哺乳動物から採取した血液を、障害物または凹凸を含む通路を介して通過させて、障害物にまたは凹凸のところで通路の壁に接触させて、通路中に血小板塊を生じさせ；そして
通路中の血液の流れまたは組成を監視して、血小板塊の形成を検出すること
を含み；
ここにおいて、血小板塊は、天然クロットと比較して、実質的にフィブリンが激減している、前記方法。
【請求項７】
血液が障害物または凹凸を通過する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
通路中の血液の流れを監視する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
通路中の血圧を監視することによってその流れを監視する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
血圧を圧力変換器で監視する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
流れを光学的に監視する、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
流れを発光ダイオードおよび光検出器で監視する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
通路中の血液の組成を監視する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
血小板塊のサイズを直接的に監視する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
血液の化学組成を監視する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
ｐＨ、Ｏ２濃度、ＣＯ２濃度、Ｍｇ＋＋濃度またはＫ＋濃度を監視する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
通路が障害物を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
障害物がプラグである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
プラグが通路を部分的に塞いでいる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
プラグが通路を完全に塞いでいる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
プラグがワイヤである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
血小板塊が、あらゆる寸法に少なくとも約２０μの厚みを有する、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
血小板を、機械力によって少なくとも部分的に活性化させる、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
血小板を、機械力によって単独に活性化させる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
血小板塊が、天然クロットと比較して、実質的に赤血球および白血球が激減している、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
通路が、血小板を活性化する追加の生体物質を含まない、請求項６〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
血液が、血小板を活性化する追加の生体物質を含まない、請求項６〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
通路および血液が、血小板を活性化する追加の化学物質を含まない、請求項６〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
採取した血液に生体物質も化学物質も加えない、請求項６〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
通路が、血小板が天然に接着する生体成分を含まない、請求項６〜２５、２７および２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
通路が、コラーゲン、ＡＤＰ、エピネフリンまたはそれらの誘導体を含まない、請求項６〜２５および２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
通路および血液が、追加の抗凝血剤を含まない、請求項６〜２８および３０〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
血小板活性化因子を血液に加えることを更に含む、請求項１〜２、６〜２５および３０〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
通路が血小板活性化因子を含む、請求項６〜２５、２７および３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
血小板活性化因子がトロンボキサンＡ２である、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
０．４ｍｌ未満の血液を哺乳動物の身体から採取する、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
血液が、通路を介して２方向に通過する、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
通路の少なくとも一部分がループであり、血液がループを介して１方向に通過する、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
血液が全血である、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
血液が分画血である、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
哺乳動物を抗血小板薬で処置する、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
抗血小板薬が、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、ＡＤＰ阻害剤、ＧＰＩＩｂＩＩＩａ阻害剤またはそれらの組合せを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
血小板機能を監視する装置であって、
通路を形成する流体密封材料；
通路を介して血液をポンプ輸送するために通路に機能的に連結されたポンプ；
通路内の障害物であって、通路を介して血液をポンプ輸送して障害物に接触させる場合に、フィブリンを実質的に含まない血小板塊が障害物の上または付近で形成されるように配置された障害物；および
通路を介する血液の流れを検出して、血小板塊の形成を検出する手段
を含む、前記装置。
【請求項４４】
血小板機能を監視する装置であって、
通路を形成する流体密封材料；
通路を介して血液をポンプ輸送するために通路に機能的に連結されたポンプ；
通路内の障害物であって、通路を介して血液をポンプ輸送して障害物に接触させる場合に、フィブリンを実質的に含まない血小板塊が障害物の上または付近で形成されるように配置された障害物；および
通路中の血液の組成を検出して、血小板塊の形成を検出する手段
を含む、前記装置。
【請求項４５】
障害物が、通路を介して血液をポンプ輸送する場合に、血液が障害物を通過するように配置されている、請求項４３または４４に記載の装置。
【請求項４６】
血小板機能を監視する装置であって、
通路を形成する流体密封材料；
通路を介して血液をポンプ輸送するために通路に機能的に連結されたポンプ；ここにおいて、該通路は、通路を介して血液をポンプ輸送して、凹凸のところで通路の壁に接触させる場合に、フィブリンを実質的に含まない血小板塊が、凹凸のところまたはその付近の通路の壁上で形成されるように配置された凹凸を含む；および
通路を介する血液の流れを検出して、血小板塊の形成を検出する手段
を含む、前記装置。
【請求項４７】
血小板機能を監視する装置であって、
通路を形成する流体密封材料；
通路を介して血液をポンプ輸送するために通路に機能的に連結されたポンプ；ここにおいて、該通路は、通路を介して血液をポンプ輸送して、凹凸のところで通路の壁に接触させる場合に、フィブリンを実質的に含まない血小板塊が、凹凸のところまたはその付近の通路の壁上で形成されるように配置された凹凸を含む；および
通路中の血液の組成を検出して、血小板塊の形成を検出する手段
を含む、前記装置。
【請求項４８】
凹凸が、通路を介して血液をポンプ輸送する場合に、血液が凹凸を通過するように配置されている、請求項４６または４７に記載の装置。
【請求項４９】
装置が、血小板を活性化する生体物質を含むことなく作動する、請求項４３〜４８のいずれか１項に記載の装置。
【請求項５０】
装置が、血小板を活性化する化学物質を含むことなく作動する、請求項４３〜４９のいずれか１項に記載の装置。
【請求項５１】
血小板機能を監視する装置で用いるための製品であって、
通路を形成する流体密封材料；および
通路内の障害物であって、通路を介して血液をポンプ輸送して障害物に接触させる場合に、フィブリンを実質的に含まない血小板塊が障害物の上または付近で形成されるように配置された障害物
を含む、前記製品。
【請求項５２】
障害物が、通路を介して血液をポンプ輸送する場合に、血液が障害物を通過するように配置されている、請求項５１に記載の製品。
【請求項５３】
障害物が、通路を介して血液をポンプ輸送して障害物に接触させる場合に、フィブリンを実質的に含まず且つあらゆる寸法が少なくとも約２０μの厚みである血小板塊が、障害物の上または付近で形成されるように配置されている、請求項５１または５２に記載の製品。
【請求項５４】
障害物がプラグである、請求項５１〜５３のいずれか１項に記載の製品。
【請求項５５】
プラグがワイヤである、請求項５４に記載の製品。
【請求項５６】
血小板機能を監視する装置で用いるための製品であって、
通路を形成する流体密封材料を含み；
ここにおいて、該通路は、通路を介して血液をポンプ輸送して、凹凸のところで通路の壁に接触させる場合に、フィブリンを実質的に含まない血小板塊が、凹凸のところまたはその付近の通路の壁上で形成されるように配置された凹凸を含む、前記製品。
【請求項５７】
凹凸が、通路を介して血液をポンプ輸送する場合に、血液が凹凸を通過するように配置されている、請求項５６に記載の製品。
【請求項５８】
凹凸が、通路を介して血液をポンプ輸送して、凹凸のところで通路の壁に接触させる場合に、フィブリンを実質的に含まず且つあらゆる寸法が少なくとも約２０μの厚みである血小板塊が、凹凸のところまたはその付近の通路の壁上で形成されるように配置されている、請求項５６または５７に記載の製品。
【請求項５９】
血小板を活性化する生体物質を含まない、請求項５１〜５８のいずれか１項に記載の製品。
【請求項６０】
血小板を活性化する化学物質を含まない、請求項５１〜５９のいずれか１項に記載の製品。
【請求項６１】
血小板機能を監視する場合に用いるためのキットであって、
（ａ）通路を形成する流体密封材料；および通路を介して血液をポンプ輸送して障害物に接触させる場合に、フィブリンを実質的に含まない血小板塊が障害物の上または付近で形成されるように配置された通路内の障害物、を含む製品；並びに
（ｂ）血小板機能を監視する装置で該製品が用いられることを示す取扱説明手段
を含有する包装材料を含む、前記キット。
【請求項６２】
血小板機能を監視する場合に用いるためのキットであって、
（ａ）通路を形成する流体密封材料を含む製品；ここにおいて、該通路は、凹凸を通り越して通路を介して血液をポンプ輸送する場合に、フィブリンを実質的に含まない血小板塊が、凹凸のところまたはその付近の通路の壁上で形成されるように配置された凹凸を含む；および
（ｂ）血小板機能を監視する装置で該製品が用いられることを示す取扱説明手段
を含有する包装材料を含む、前記キット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
血小板は、出血を止めることに関与する主要な細胞である無核細胞である。血小板は、約３μのサイズであり、組織傷害かまたは異物への暴露による活性化で、傷害または異物の部位において凝集体形成をもたらす生理学的変化を行う円板形細胞として血流中を循環している。血小板は、全血１μｌにつき約２５０，０００〜３５０，０００個で循環している。活性化で、血小板は、円板から球へと形状を変化させ、偽足伸長を形成する。
【０００２】
出血の停止を開始する正常な血小板応答は、形状変化を行うこと、表面に付着すること、およびより多くの血小板を自己触媒的に補充するように作用する血小板内成分を放出することである。追加の血小板の補充で、血小板プラグまたは凝集塊が形成される。この凝集塊は、僅か３μのサイズの単一血小板からｍｍ程度のサイズの塊へと進化する。凝集塊は、更に補充され、血漿凝固タンパク質と関与する。それら血漿凝固タンパク質は、１３種類の酵素および補因子を伴うイベントのカスケードを行い、これが、血漿フィブリンの活性化をもたらして、フィブリンクロットを形成する。
【０００３】
ここで、止血（出血の停止）の生化学イベントを簡単に要約することは有用である。正常な無傷の内皮は、（若干の血管疾患では、血小板は無傷の内皮に接着することがありうるが）血小板接着を開始することも支持することもない。しかしながら、血管傷害は、内皮の表面および基底にあるコラーゲンを露出する。血管傷害後、血小板は、血小板表面上の特異的糖タンパク質によって、コラーゲンなどの接着性タンパク質に付着する。この接着は、血小板活性化へと続くかまたは伴うが、この場合、血小板は、円板形から球形へと伸長した偽足を含んで形状変化する。この時点で、血小板放出反応も起こる。それら血小板は、血小板活性化を刺激するかまたはクロット形成反応に関与している細胞質体中に貯蔵された生物学的活性化合物を放出する。これらには、ＡＤＰ、セロトニン、トロンボキサンＡ２およびフォンビルブラント因子が含まれる。トロンボキサンＡ２は、血小板の分泌および凝集の強力な誘導物質である。それは、数ある薬物の中でもアスピリンによって阻害される酵素シクロオキシゲナーゼによって形成される。
【０００４】
活性化後、血小板表面上の糖タンパク質ＩＩｂおよびＩＩＩａ（ＧＰＩＩｂＩＩＩａ）受容体は、比較的不活性なコンホメーションから活性化型へとコンホメーション変化する。ＧＰＩＩｂＩＩＩａ受容体は、循環性血漿タンパク質フィブリノーゲンに接着することによって、より多くの血小板の接着を媒介し、それが、血小板間の架橋リガンドとして役立つ。血小板の接着および凝集は、１次止血を構成している。
【０００５】
２次止血は、フィブリンクロットを形成することによって血小板塊を安定化させる。フィブリンクロットは、血漿タンパク質が関与する一連の反応の最終産物である。その過程は血液凝固として知られている。関与する血漿タンパク質の中には、クロット形成因子ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩおよびＸＩＩの活性化型がある（それら活性化型は、ローマ数字の後に「ａ」を有する、例えば、ＩＩａ因子）。これらタンパク質の活性化型は、セリンプロテアーゼである。
【０００６】
フィブリンは、大型の循環性血漿タンパク質であるフィブリノーゲンから、特異的タンパク質分解によって形成される。その過程において、タンパク質トロンビン（ＩＩａ因子）が消費される。次に、フィブリンモノマーは、自発的に会合してポリマーを形成し、そして血小板プラグのゆるやかな補強を形成する。次に、フィブリンポリマーは、若干の酵素によって架橋される。そのフィブリンポリマーは、更に、赤血球および白血球を捕捉して、完成したクロットを形成する。
【０００７】
正常な止血条件下において、出血している個体は、形状を変化させ、接着し、拡大し、化学的メッセンジャーおよび活性化因子を放出し、凝集し、そしてフィブリンと一緒に集合する血小板の能力から利益を得る。この一連のイベントは、傷害部位において出血を止め、創傷治癒の過程を開始する。
【０００８】
しかしながら、血小板活性化およびクロット形成は、ヒトを病理学的心臓血管イベントの危険にさらすこともありうる。例えば、深静脈血栓症として知られる状態である下肢の静脈血クロット形成は、血液クロットが（破裂して）塞栓形成し、肺または脳にクロットを閉じ込めて、肺塞栓症および発作関連状態を引き起こすことがありうる危険を生じる。若干のヒトの場合、他の場所での血小板活性化およびフィブリン形成は、塞栓形成および発作をもたらすこともありうる動脈循環中の凝集および小クロットを生じる。
【０００９】
年齢、および遺伝的および生活様式の危険因子に加えて、血流中の埋め込まれた医学的装置も、ヒトをクロット形成および塞栓形成の一層大きい危険にさらす。米国では、毎年約５００，０００個の心臓弁が埋め込まれている。生体材料の進歩は、血栓症（クロット形成）の危険をある程度減少させたが、機械的心臓弁を有する患者は全て、クロット形成、塞栓形成および発作の危険が大きい。
【００１０】
動脈ステントは、循環系に入れられた別のタイプの装置であり、患者を血小板活性化による危険にさらしている。動脈ステントは、詰まった冠状動脈および頸動脈に入れられて、心臓組織に酸素を与える。それらは、典型的には、直径約５ｍｍであり、ステンレス鋼または他の材料から製造される。血流中への異物の導入のために、血小板は活性化した状態になり、ステントが入った血管壁に付着することがありうる。これは、ステントが入った血管の再閉塞（再狭窄）をもたらし、それが、動脈ステントを有する患者におけるきわめて有意の危険である。最初の２８日目の再狭窄は、ステントを受けた患者の０．５〜８％で報告されている。
【００１１】
塞栓形成および再狭窄の危険を減少させようと努力して、心臓弁または動脈ステントを与えられている患者は、一般的には、それら処置前、処置中および処置後に、抗凝血剤または血小板阻害薬物治療を受ける。
【００１２】
現在用いられている血小板阻害薬は、（１）アスピリン関連薬であって、血小板シクロオキシゲナーゼ酵素を阻害し、したがって、血小板活性化因子であるトロンボキサンＡ２の生産を減少させるもの；（２）ＡＤＰ受容体阻害薬であって、血小板上の活性化過程に関与する表面膜受容体をブロックするもの；（３）モノクローナル抗体であって、血小板表面上のＧＰＩＩｂＩＩＩａ受容体をブロックするもの、の三群に分類される。ＧＰＩＩｂＩＩＩａ受容体は、血漿凝固因子フィブリノーゲンを結合し、凝集にもフィブリンクロットの形成にも関与している。
【００１３】
血小板活性化を減少させる場合、３種類全てのアプローチが有効であるが、介入が全ての患者に成功することはない。アスピリンは最も費用がかからない。しかしながら、適切な用量は、ヒトによって予測不能に異なり、長期アスピリン療法中の個体の３０％までが、血小板接着の阻害を達成していない。ＡＤＰ阻害薬は、アスピリンより高価であるが人気を得ている。しかしながら、アスピリンの場合と同様、必要な用量および治療期間が異なり、それら薬物について患者の血小板接着特性に大きな差がある。ＧＰＩＩｂＩＩＩａ阻害薬は、最大の血小板阻害を与えると論じられているが、それらはきわめて高価であり、しかも投薬量および有効性の患者間変動になお欠点がある。他の薬物治療が考えられる可能性はあるが、いずれも、おそらくは、他のアプローチで認められる患者間変動をなお有するであろう。
【００１４】
血小板を阻害するのに適した用量および薬物治療を決定できないことは、多大な経費を要することがありうるし、不必要な病的状態および致死を引き起こすことがありうる。例えば、抗ＧＰＩＩｂＩＩＩａ薬で処置された患者は、ステントを入れた後の最初の２８日で、５．８〜１１．２％の発生率の有害反応を有すると報告されている。それら有害反応は、致死、心筋梗塞、または血管形成法での再介入への緊急要求として定義された。患者がそれら薬物で処置されなかった場合、その危険はなお一層高かった。（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊ．Ｍｅｄ．３３０：９５６−９６１、１９９４；Ｎｅｗ．Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊ．Ｍｅｄ．３３６：１６８９−９６Ａ、１９９７；Ｌａｎｃｅｔ  ３４９：１４２９−３５、１９９７）
したがって、抗血小板薬は患者間変動が大きく、しかも多数の患者は、若干の抗血小板薬に無反応性である。血小板機能を監視して、特定の患者に適した抗血小板薬の用量を決定することができるようにし、そして特定の患者が１つの抗血小板薬に無反応性であるが、別のものに反応性であるかどうかを医師が確かめることができるようにする方法が要求される。
【００１５】
現在のところ、血小板の接着および凝集が阻害されたかどうか具体的に確かめるための信頼できるポイント・オブ・ケア法（point-of-care method）は存在しない。したがって、血小板機能を測定する、好ましくは、血小板の接着および凝集を血小板機能の測定の一部分として測定する方法および装置が要求されている。血小板機能を測定する要求は、動脈ステントまたは他の心臓血管装置を与えられている患者、および有害な心臓血管イベントの危険がある他のヒトに、特に深刻である。このような方法は、担当医師が、危険のある患者において血小板機能が実際に阻害されたことを確かめること、および心臓血管装置を埋め込む前に薬理学的パラメータを調整することを可能にすると考えられ、それが、クロット形成の血小板開始に関連した有害イベントの危険を減少させるであろう。
【００１６】
血小板機能を測定する他の要求は、血小板輸血の場合に生じる。血小板は、出血の危険がある患者を支持するために採取され且つ血小板輸血に用いられる。しかしながら、血小板貯蔵は、全血または他の成分の貯蔵で見出されなかった問題をもたらす。全血、赤血球および白血球は、４℃で何週間も貯蔵することができる。しかしながら、血小板は、冷蔵においておよび沈降させた場合に凝集するであろう。したがって、血小板を貯蔵する標準的な手段は、室温で静かに撹拌しながらである。これら条件下でさえも、血小板は、ほぼ５日で機能を失う。したがって、貯蔵された血小板が、患者に輸血するのに適した活性を有するかどうか確かめるために血小板機能を監視する方法および装置も要求される。
【００１７】
医学的または歯科的処置を受けている患者をその処置中の過剰の出血の危険について調べるために血小板機能を監視する別の要求も存在する。
したがって、血小板機能を測定する方法への要求が存在する。その方法は、血小板の接着および凝集を監視することが好ましい。その方法は、血小板機能を、具体的には、血液凝固のようなクロット形成の他の側面とは別個に監視することが好ましい。その方法は安価であることが好ましい。その方法は、いずれか特定の化学的血小板活性化因子または化学的血小板活性化因子群による血小板活性化に依存しないことが好ましい。その方法は、未処理の全血について使用でき、迅速に結果を生じうる（例えば、病床で、往診中に、または医学的処置中に用いられて、ほとんど即時に結果を与えうる）ことが好ましい。血小板機能を監視する装置も要求される。
【発明の開示】
【００１８】
発明の概要
本発明は、血小板接着、好ましくは、血小板凝集によって示されるような血小板機能を評価するための方法および装置を提供する。それら方法では、血液を、カテーテルのような通路を介して、カテーテル中に置かれたワイヤのような通路中の障害物若しくは凹凸を通過させてまたはそれに対して吸引する。血小板は、障害物上にまたは障害物若しくは凹凸の付近の通路の壁上に接着し且つ凝集し、血小板塊を形成する。通路中の障害物若しくは凹凸を通過することまたはそれに接触することに関連した剪断力は、血小板を活性化し、そしてそれらを障害物または通路の壁の異物に接着させ且つ凝集させると考えられる。プラグが形成される場合、それは通路の内腔を閉塞し、流れが止まるかまたは遅くなる。内腔の部分閉塞または完全閉塞時間は、血小板プラグ形成時間として記録することができる。
【００１９】
プラグは血小板活性の最終産物であるため、プラグの形成は、血小板接着、およびプラグが約１５μより厚い場合は血小板凝集を含めた、全ての血小板活性の機能化に依存する。（プラグが約１５μより厚い場合、それは、表面への血小板接着のために形成される２層以上の血小板層を含むが、むしろ、血小板−血小板凝集によって形成される塊を含む。）これは、特定の生化学物質の放出のような唯一の具体的な血小板活性だけを測定するか、または血小板接着のみに依存して凝集には依存しない若干の現行の血小板試験とは対照的である。本発明の方法における血小板塊は、フィブリンも、赤血球も白血球も、ほとんどまたは全く含まないということが判明した。したがって、少なくとも若干の態様において、本発明の方法は、血小板機能を、具体的には、血液凝固反応とは無関係に測定する。
【００２０】
本発明の方法について、化学的または生物学的血小板活性化因子を、若干の態様においては加えることもありうるが、血液または通路に加える必要はない。したがって、それら方法は、特定の生化学的活性化因子または特定の活性化因子群に応答する血小板に依存することはない。それら方法は迅速であり、未処理の全血を用いることができる。したがって、それらは、患者の病床で、往診中にまたは介入処置中に採取される少量の血液試料で、迅速に且つ安価に結果を生じることができる。
【００２１】
したがって、本発明は、血小板機能を監視する方法であって、哺乳動物から採取した血液を、障害物または凹凸を含む通路を介して通過させて、障害物にまたは凹凸のところで通路の壁に接触させて、通路中に血小板塊を生じさせ；そして通路中の血液の流れまたは組成を監視して、血小板塊の形成を検出することを含み；通路は、血小板を活性化する追加の生体物質を含まない方法を提供する。
【００２２】
本発明は、更に、哺乳動物の血小板機能を監視する方法であって、哺乳動物から採取した血液を、障害物または凹凸を含む通路を介して通過させて、障害物にまたは凹凸のところで通路の壁に接触させて、通路中に血小板塊を生じさせ；そして通路中の血液の流れまたは組成を監視して、血小板塊の形成を検出することを含み；血小板塊は、天然クロットと比較して、実質的にフィブリンが激減している方法を提供する。
【００２３】
本発明は、更に、血小板機能を監視する装置であって、（ａ）通路を形成する流体密封材料；（ｂ）通路を介して血液をポンプ輸送するために通路に機能的に連結されたポンプ；（ｃ）通路内の障害物であって、通路を介して血液をポンプ輸送して障害物に接触させる場合に、フィブリンを実質的に含まない血小板塊が障害物の上または付近で形成されるように配置された障害物；および（ｄ）通路を介する血液の流れを検出して、血小板塊の形成を検出する手段を含む装置を提供する。
【００２４】
本発明は、更に、血小板機能を監視する装置であって、（ａ）通路を形成する流体密封材料；（ｂ）通路を介して血液をポンプ輸送するために通路に機能的に連結されたポンプ；（ｃ）通路内の障害物であって、通路を介して血液をポンプ輸送して障害物に接触させる場合に、フィブリンを実質的に含まない血小板塊が障害物の上または付近で形成されるように配置された障害物；および（ｄ）通路中の血液の組成を検出して、血小板塊の形成を検出する手段を含む装置を提供する。
【００２５】
本発明は、更に、血小板機能を監視する装置であって、（ａ）通路を形成する流体密封材料；（ｂ）通路を介して血液をポンプ輸送するために通路に機能的に連結されたポンプ；ここにおいて、通路は、通路を介して血液をポンプ輸送して、凹凸のところで通路の壁に接触させる場合に、フィブリンを実質的に含まない血小板塊が、凹凸のところまたはその付近の通路の壁上で形成されるように配置された凹凸を含む；および（ｃ）通路を介する血液の流れを検出して、血小板塊の形成を検出する手段を含む装置を提供する。
【００２６】
本発明は、更に、血小板機能を監視する装置であって、（ａ）通路を形成する流体密封材料；（ｂ）通路を介して血液をポンプ輸送するために通路に機能的に連結されたポンプ；ここにおいて、通路は、通路を介して血液をポンプ輸送して、凹凸のところで通路の壁に接触させる場合に、フィブリンを実質的に含まない血小板塊が、凹凸のところまたはその付近の通路の壁上で形成されるように配置された凹凸を含む；および（ｃ）通路中の血液の組成を検出して、血小板塊の形成を検出する手段を含む装置を提供する。
【００２７】
本発明は、更に、血小板機能を監視する装置であって、（ａ）通路を形成する流体密封材料；（ｂ）通路を介して血液をポンプ輸送するために通路に機能的に連結されたポンプ；（ｃ）通路内の障害物であって、通路を介して血液をポンプ輸送して障害物に接触させる場合に、フィブリンを実質的に含まない血小板塊が障害物の上または付近で形成されるように配置された障害物；および（ｄ）血小板塊の形成を検出する血流検出器を含む装置を提供する。
【００２８】
本発明は、更に、血小板機能を監視する装置であって、（ａ）通路を形成する流体密封材料；（ｂ）通路を介して血液をポンプ輸送するために通路に機能的に連結されたポンプ；（ｃ）通路内の障害物であって、通路を介して血液をポンプ輸送して障害物に接触させる場合に、フィブリンを実質的に含まない血小板塊が障害物の上または付近で形成されるように配置された障害物；および（ｄ）血小板塊の形成を検出する血液組成検出器を含む装置を提供する。
【００２９】
本発明は、更に、血小板機能を監視する装置であって、（ａ）通路を形成する流体密封材料；（ｂ）通路を介して血液をポンプ輸送するために通路に機能的に連結されたポンプ；ここにおいて、通路は、通路を介して血液をポンプ輸送して、凹凸のところで通路の壁に接触させる場合に、フィブリンを実質的に含まない血小板塊が、凹凸のところまたはその付近の通路の壁上で形成されるように配置された凹凸を含む；および（ｃ）血小板塊の形成を検出する血流検出器を含む装置を提供する。
【００３０】
本発明は、更に、血小板機能を監視する装置であって、（ａ）通路を形成する流体密封材料；（ｂ）通路を介して血液をポンプ輸送するために通路に機能的に連結されたポンプ；ここにおいて、通路は、通路を介して血液をポンプ輸送して、凹凸のところで通路の壁に接触させる場合に、フィブリンを実質的に含まない血小板塊が、凹凸のところまたはその付近の通路の壁上で形成されるように配置された凹凸を含む；および（ｃ）血小板塊の形成を検出する血液組成検出器を含む装置を提供する。
【００３１】
本発明は、更に、血小板機能を監視する装置で用いるための製品であって、通路を形成する流体密封材料；および通路内の障害物であって、通路を介して血液をポンプ輸送して障害物に接触させる場合に、フィブリンを実質的に含まない血小板塊が障害物の上または付近で形成されるように配置された障害物を含む製品を提供する。
【００３２】
本発明は、更に、血小板機能を監視する装置で用いるための製品であって、通路を形成する流体密封材料を含み；ここにおいて、通路は、通路を介して血液をポンプ輸送して、凹凸のところで通路の壁に接触させる場合に、フィブリンを実質的に含まない血小板塊が、凹凸のところまたはその付近の通路の壁上で形成されるように配置された凹凸を含む製品を提供する。
【００３３】
本発明は、更に、血小板機能を監視する場合に用いるためのキットであって、（ａ）（ｉ）通路を形成する流体密封材料；および（ｉｉ）通路を介して血液をポンプ輸送して障害物に接触させる場合に、フィブリンを実質的に含まない血小板塊が障害物の上または付近で形成されるように配置された通路内の障害物を含む製品；並びに（ｂ）血小板機能を監視する装置で製品が用いられることを示す取扱説明手段を含有する包装材料を含むキットを提供する。
【００３４】
本発明は、更に、血小板機能を監視する場合に用いるためのキットであって、（ａ）通路を形成する流体密封材料を含む製品；ここにおいて、通路は、凹凸を通り越して通路を介して血液をポンプ輸送する場合に、フィブリンを実質的に含まない血小板塊が、凹凸のところまたはその付近の通路の壁上で形成されるように配置された凹凸を含む；および（ｂ）血小板機能を監視する装置で製品が用いられることを示す取扱説明手段を含有する包装材料を含むキットを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
詳細な説明
定義：
「血小板機能」とは、血小板が支持体に接着すること、形状を変化させること、血小板の細胞質中に貯蔵された化学的メッセンジャー若しくはクロット形成因子を放出すること、および／または他の血小板と凝集することを意味する。「血小板を活性化する生体物質または化学物質」とは、血小板との接触で、血小板に（血小板が剪断またはいずれか他の機械的活性化因子に暴露されることを必要とすることなく）それら血小板機能のいずれかを行わせる物質を意味する。
【００３６】
「血小板を活性化する生体物質」という用語は、コラーゲン、ＡＤＰ、トロンビン、トロンボキサンＡ２、セロトニンおよびエピネフリンのような、血小板を活性化する生物学的役割を有する哺乳動物体中に天然に見出される物質を意味する。
【００３７】
「血小板を活性化する化学物質」とは、哺乳動物生体物質以外の、血小板を活性化する化合物を意味する。それには、例えば、非生体合成化合物、血小板を活性化する生体物質の誘導体、または血小板を活性化する植物または微生物中で見出される生体物質が含まれる。
【００３８】
「追加の生体物質または化学物質」とは、生体から採取した後の血液に加えられる化合物または物質を意味する。「通路中の追加の物質」とは、通路に血液を添加する前に通路中に置かれたまたは取り込まれた物質を意味する。その物質は、例えば、通路の壁にまたは通路中の障害物に接着しうる。
【００３９】
「障害物」とは、通路を部分的にまたは完全に塞いでいる物体を意味する。好ましくは、障害物は、通路を部分的に塞いでいる。障害物の例には、（ａ）ワイヤのようなプラグであって、（好ましくは、プラグと通路の壁との間に間隔をおいて）通路の一部分を占有するもの、（ｂ）フィルターまたはメッシュ、または（ｃ）繊維が含まれる。
【００４０】
本明細書中で用いられる、「プラグ」である通路中の障害物は、通路を部分的にまたは完全に塞いでいる固体非孔質物体である。そのプラグは、いずれかの形状の横断面、例えば、円形、正方形または長方形でありうるし、いずれかの非孔質材料、例えば、プラスチックまたは金属から構成されうる。
【００４１】
本明細書中で用いられる「血液」とは、全血、または血小板を含有する血液画分を意味する。好ましくは、血液は、哺乳動物から採取した後、本発明の方法において、いずれの処理もすることなく且ついずれの物質（例えば、抗凝血剤または血小板活性化因子）も加えることなく、通路を介して通過させる。しかしながら、その方法は、精製された血小板でも、または血小板に富んだ若しくは血小板を含有するいずれの血液画分でも行われるであろう。したがって、「血液」という用語には、血小板含有血漿、精製血小板、または血小板を含有するいずれかの血液画分が含まれる。
【００４２】
「全血」という用語は、分画されていない血液を意味する。
本明細書中で用いられる「血小板塊」とは、主として血小板であるいずれかの塊を意味する。その塊は、フィブリンおよび他の細胞も含有しうる。好ましくは、それは、天然クロットと比較して、フィブリンが激減しており、他の細胞も激減している。血小板塊は、１つ以上の寸法が約１５μ未満の厚みであり得、すなわち、血小板の厚みが約５以下の血小板層から成り、血小板−血小板凝集をほとんどまたは全く含まない血小板接着によって形成される。しかしながら、血小板塊は、あらゆる寸法が約１５μより厚いことが好ましい。「血小板プラグ」という用語は、「血小板塊」と同じ意味に用いられる。
【００４３】
説明
本発明は、哺乳動物の血小板機能を監視する方法であって、哺乳動物の身体から採取した血液を通路を介して通過させ、通路中の障害物または凹凸に接触させて通路中に血小板塊を生じさせ、そして通路中の血液の流れまたは組成を監視することを含む方法を提供する。血小板塊の形成は、通路中の血液の流れまたは組成の変化を引き起こし、その流れまたは組成の変化が検出される。
【００４４】
本発明の装置において、血液は、異物（すなわち、天然の血管内皮以外のいずれかの材料）の流体密封壁１１０によって形成される通路１００を介して通過する（図１Ａ）。好ましくは、その異物は非生体材料である。それは、例えば、いずれかのタイプのプラスチック、ガラス、ゴム、テフロンまたは金属でありうる。通路内には、障害物または凹凸がある。障害物１２０を有する通路が図１Ａに示されている。その障害物も、異物から作られることが好ましい。それは、多孔質でも非孔質でもよい。それは、通路の壁と同じ材料でも異なった材料でもよい。
【００４５】
血液は、通路を介してポンプ輸送されて、障害物にまたは凹凸のところで通路の壁に接触する。その障害物または凹凸は、通路を介して通過する流体への高剪断部位および低剪断部位を生じる。高剪断は血小板を活性化するが、低剪断部位は血小板を接着させて血小板塊を形成すると考えられる。好ましくは、血液は、障害物または凹凸を通り越して、血液通過を妨げるかまたは阻止する血小板塊が形成されるまでポンプ輸送される。しかしながら、障害物は、通路を完全に閉塞することができるし、凹凸は、通路の密閉端でありうるので、この場合、血液は障害物または凹凸を通過することができない。その場合、血液は、検出される血小板塊が形成するまで、閉塞している障害物または凹凸に対して行ったり来たりして通過することができる。
【００４６】
障害物の一例は、図１Ａに示されるようなワイヤ１２０である。その障害物は、好ましくは、通路を部分的に塞いでいるだけである。好ましくは、障害物は、障害物と通路壁との間に少なくとも約２０μの間隙を残している。したがって、その場合、通路を完全に閉塞するためには、血小板塊は、少なくとも約２０μの厚みであるべきである。塊をそのサイズに形成するために、血小板は、表面に単に接着すべきであるだけでなく、互いに凝集すべきである。したがって、この態様において、その方法は、接着活性および凝集活性をともに示す血小板の能力を調べる。
【００４７】
血液が障害物１２０を通り越してポンプ輸送されると、血小板塊がその障害物の上または付近で形成される。典型的には、血小板塊は、ワイヤ障害物の先端上のような低剪断の場所で形成される。血小板機能は、通路の部分的または完全な閉塞までの時間を測定することによって監視することができる。通路の閉塞は、いずれか適当な手段によって検出することができる。例えば、発光ダイオードおよび連動した検出器は、通路の一点を越えて置かれて、その地点を通り越した赤血球の通過を検出することができる。圧力変換器は、血液をポンプ輸送するのに必要な圧力を監視するのに用いることができる。通路は、分光光度計の光路を越えて置くことができるので、分光光度計は、（ａ）光路を通り越した赤血球の通過、（ｂ）血小板プラグが形成されると予想される地点を介して通過するように光路が配置されている場合、血小板プラグの成長に伴う血小板プラグの地点における色の散乱の増加および／または変化、または（ｃ）血小板プラグの形成に関連した血小板プラグ外部の血液の色の変化、を検出する。Ａ地点からＢ地点へと血液が通過するのに要する時間を測定することができる。化学センサーを用いて、血小板塊が形成されるにつれて、血液中で全体として、または血小板塊のところ若しくはその付近の微環境中で変化する特定の生化学物質の濃度を測定することもできる。例えば、ｐＨ、Ｍｇ＋＋濃度、Ｋ＋濃度、Ｎａ＋濃度、Ｏ２濃度またはＣＯ２濃度を、当該技術分野において公知のセンサーおよび方法によって監視することができる。
【００４８】
通路および障害物または凹凸の寸法は、いずれか適当な寸法、すなわち、血小板塊が形成されるまで通路を介して血液を自由に通過させるのに充分に幅が広く、しかも血小板塊の形成で、通路の閉塞を検出することができるほど充分に幅が狭いものでありうる。例えば、通路は、直径１ｍｍ以下または直径１ｃｍを超えるものでありうる。通路のワイヤ障害物は、例えば、通路壁とのあいだに約５０μの間隙を残すことができる。他のより大きなおよびより小さな間隙サイズおよび寸法も可能である。
【００４９】
血液は、通路を介して２方向にまたは１方向にポンプ輸送することができる。血液を２方向に、すなわち、障害物または凹凸を通り越して行ったり来たりしてポンプ輸送することは、より少量の血液を用いることを可能にするという利点を有する。更に、２方向の流れでは、いずれの血小板塊形成時間も、限られた量の血液で測定することができる。両端で開口している直線通路を介する１方向の血流では、より長い血小板塊形成時間は、より多くの血液の使用を必要とするであろう。
【００５０】
密閉ループを介して１方向に血液をポンプ輸送することは、その場合、血液がそのループを必要なだけ多数回循環することができるので、２方向の流れと同じ利点を有する。すなわち、より少量の血液の使用を可能にするし、長時間のプラグ形成時間の測定を可能にする。
【００５１】
したがって、本発明の装置および方法の若干の態様は、少量の血液を使用して血小板活性を監視することを可能にする。具体的には、若干の態様において、約２ｍｌ未満、約１ｍｌ未満、約０．４ｍｌ未満、約０．２ｍｌ未満、約０．１ｍｌ未満または５０μｌ未満を用いる。若干の態様において、指穿刺によって形成されるような１滴を用いることができる。
【００５２】
障害物または凹凸のいくつかの態様は図１Ａ〜Ｆに示されている。図１Ａは障害物としてのワイヤ１２０を示している。ワイヤ１２０は、通路の中心にあっても中心から外れていてもよい。通路１００およびワイヤ１２０のどちらかまたは双方は、非円形断面を有することができる。この態様におけるワイヤ１２０は、いずれかの非孔質材料のプラグで置き換えることができる。ワイヤはいずれの長さでもよく、幅より短くてもよい。
【００５３】
障害物は、図１Ｂに示されるように、多数のワイヤまたはプラグ１２１でありうる。
通路は、障害物よりもむしろ、またはそれに加えて、凹凸を含むことができる。その凹凸は、血小板塊の形成を可能にするのに適した、通路中のいずれの角度、幅の狭さ、広がりまたは曲線でもありうる。例えば、凹凸は、図１Ｃに示されるように、通路の壁にある段１３０でありうる。通路の短径部分は、長径部分と同じ中心上にあっても中心を外れていてもよい。
【００５４】
凹凸は、図１Ｄに示されるように、通路の幅の狭い部分１３１でありうる。凹凸は、通路１００中の広がり１３２でもありうる（図１Ｅ）。
適当な障害物の他の例は、挿入された流れレストリクター１２２である（図１Ｆ）。流れレストリクターは、例えば、膜フィルター；単一フィルターまたは複数の繊維、ワイヤ若しくはリボン；または１枚の織布または編地でありうる。
【００５５】
複数の障害物または凹凸、または障害物と凹凸との組合せを用いることができる。
本発明の通路は、円形、正方形、またはいずれか他の形状の断面でありうる。通路は、曲線でも直線でもよい。
【００５６】
血小板塊を適当な時間内に生じるいかなる流れパターンも用いることができる。例えば、定常１方向の流れまたは振動性２方向の流れを用いることができる。振動性２方向の流れでは、その振動パターンは、正弦波、のこぎり波、方形波、非対称のこぎり波、台形、非対称台形または他のパターンでありうる。１方向の流れの場合、脈動成分を定常流の上に置くことができるが、その脈動成分は、上のパターンのいずれかを有することができる。その流れパターンは、時間によりまたは測定される抵抗により変化して、いったん形成し始めた血小板塊を追い出す危険を減少させることができる。停止時間（無流）は、剪断によって活性化される血小板の凝集を可能にするように導入することができる。
【００５７】
記載された流れパターンを達成するために、好ましくは、ポンプを用いて、所定量の血液を所定の流速（流速は、上記のように時間で変化することがありうるが）および所定の剪断速度で、通路中におよび通路を介して吸引する。
【００５８】
本発明の血小板機能を監視する装置の一例は、図２に示されている。３個のルアロック１８０、１８１および１８２をその開口部に有する三方Ｙ型流れ分割器１５０を、管１４０にルアロック１８１において連結させて、通路１００を形成する。その通路１００は、ワイヤ１２０を含有するが、それは、通路の開口端の適所に保持されている。血液は、ルアロック１８０にシリンジを連結することによって装置中に入れることができる。ルアロック１８２は、流れ分割器１５０を２方向ポンプ１６０に連結している。２方向ポンプ１６０は、通路中の圧力を監視する圧力変換器１７０に連結している。血液を通路中に入れた後、ルアロック１８０における開口を閉じることができる。次に、血液を、圧力変換器によって検出されるように、流れを遅くしたり停止させて血小板塊が形成されるまで通路を介して行ったり来たりさせてポンプ輸送する。その時間は、血小板塊形成時間として記録される。
【００５９】
血小板機能を監視する装置で用いるための製品の１つの態様は、その中に成形された通路を有する硬質精密成形プラスチック品で構成される。その製品は、通路に連結された、血液を受け入れるためのアパーチャー（apperture）を有することができる。通路の両端は、圧力発生を伴うことなく血液を自由に流れさせるように外気へと開いていることができる。１つの態様における通路は、ほぼ直径１ｍｍおよび長さ数ｃｍであり、通路の１つの壁に固定された長さ数ｍｍのステンレス鋼製ワイヤプラグを有する。そのワイヤプラグと通路のもう一方の壁との間の間隙は、例えば、約５０μでありうる。製品は、流れ検出装置中に置くことができるが、その場合、その装置は、通路に連結された２方向ポンプを含み、ＬＥＤおよび連動した検出器は、通路の一端を越えて置かれる。その検出器は、血小板塊が形成され、血液の通過を妨げるまで血液が行ったり来たりしてポンプ輸送されると、血液の通過、次に空気の通過を検出する。製品は、安価なプラスチックから製造することができるので、使い捨て可能である。
【００６０】
本発明の利点の１つは、血小板を活性化する生体物質も化学物質も、血液に、または血液がポンプ輸送される通路に加える必要がないということである。したがって、本発明の若干の態様において、（血液を加える前の）通路は、血小板を活性化する追加の生体物質を含有していない。血液も、血小板を活性化する追加の生体物質を含有していなくてよい。若干の態様において、通路および血液は双方とも、血小板を活性化する追加の生体物質を有していない。
【００６１】
若干の態様において、通路および血液のどちらかまたは双方は、血小板を活性化する追加の化学物質を含まない。
若干の態様において、通路は、天然に血小板が接着する生体成分を含まない。
【００６２】
具体的な態様において、通路は、コラーゲン、ＡＤＰ、エピネフリンまたはそれらの誘導体を含まない。
若干の態様において、生体物質も化学物質も、採取した血液に加えない。例えば、若干の態様において、抗凝血剤を採取した血液に加えない。若干の態様において、通路および血液は、追加の抗凝血剤を含まない。
【００６３】
しかしながら、それら方法は、場合により、血小板を活性化する追加の物質の使用を伴うこともありうる。その物質は、哺乳動物の身体から採取した後の血液に加えることができるし、またはそれを装置の通路に加え、それによって、通路を介して血液が通過する時に血液に加えることができる。例えば、通路の壁または障害物の壁を、その物質で被覆することができる。障害物がフィルターである場合、フィルターをその物質中に浸漬しうる。使用できる物質の中にはトロンボキサンＡ２がある。アスピリンは、主に、トロンボキサンＡ２の生産を阻害することによって血小板機能を阻害すると考えられるので、アスピリン療法の有効性を調べる若干の態様において、トロンボキサンＡ２を血液または通路に加えることは有用でありうる。特に、血液または通路に加えられたトロンボキサンＡ２を含む場合と含まない場合の血小板塊形成時間を比較することは、有用でありうる。
【００６４】
若干の態様において、採取した血液または通路に加えることができる他の物質には、いずれかの血小板活性化因子が含まれる。これらの中には、ＡＤＰ、コラーゲン、トロンビン、エピネフリンおよびセロトニンがある。血小板活性化因子ではないが、プラグ形成に有益である他の化合物も加えうる。これらには、フィブリノーゲン、フィブリンおよびフォンビルブラント因子が含まれる。
【００６５】
本発明は、ＡＤＰ阻害剤で処置された患者の血小板機能を監視するのに用いることができる。これら薬物の中には、クロピドグレル（ＰＬＡＶＩＸ）およびチクロピジンがある。ＡＤＰ阻害剤で処置された患者の場合、採取した血液または通路に血小板活性化物質を加えるならば、ＡＤＰは、追加の物質として有用でありうる。特に、血液または通路に加えられたＡＤＰを含む場合と含まない場合の血小板塊形成時間を比較することは、有用でありうる。
【００６６】
本発明は、更に、ＧＰＩＩｂＩＩＩａ阻害剤で処置された患者の血小板機能を監視するのに用いることができる。ＧＰＩＩｂＩＩＩａ阻害剤の中には、チロフィバン、エプチフィバチドおよびアブシキシマブがある。ＧＰＩＩｂＩＩＩａ阻害剤で処置された患者の場合、採取した血液または通路に血小板活性化物質を加えるならば、フィブリノーゲンは、ＧＰＩＩｂＩＩＩａ受容体に結合するので、好ましい物質でありうる。
【００６７】
したがって、本発明は、更に、血小板機能を監視する方法であって、（ａ）哺乳動物から採取した血液を、障害物または凹凸を含む通路を介して通過させて、障害物にまたは凹凸のところで通路の壁に接触させて、通路中に血小板塊を生じさせること；および通路中の血液の流れまたは組成を監視して、血小板塊形成時間を決定すること、ここにおいて、血液および通路は、血小板を活性化する追加の生体物質または化学物質を含まない；並びに（ｂ）哺乳動物から採取した血液を、障害物または凹凸を含む通路を介して通過させて、障害物にまたは凹凸のところで通路の壁に接触させて、通路中に血小板塊を生じさせること；および通路中の血液の流れまたは組成を監視して、血小板塊形成時間を決定すること、ここにおいて、血液および通路は、血小板を活性化する追加の生体物質または化学物質を含む；並びに（ｃ）それら血小板塊形成時間を比較することを含む方法を提供する。
【００６８】
血小板を活性化する生体物質または化学物質は、例えば、トロンボキサンＡ２、ＡＤＰまたはフィブリノーゲンでありうる。
本発明の若干の態様において形成される血小板塊は、フィブリンを、および赤血球および白血球を実質的に含まないということが判明した。したがって、若干の態様において、血小板塊は、天然クロットと比較して、実質的にフィブリンが激減している。例えば、血小板塊は、末梢血系の天然クロット中で見出される塊１単位につき約５０％未満、約３０％未満、約１０％未満または約５％未満のフィブリンを含有することができる。他の態様において、血小板塊は、検出可能なフィブリンを有していない。いくつかの態様において、血小板塊は、赤血球および／または白血球が実質的に激減している（例えば、末梢血系の天然クロット中で見出される赤血球または白血球の約５０％未満、約３０％未満、約１０％未満または約５％未満を含有するか、または検出可能な赤血球または白血球を有していない）。
【００６９】
本発明の若干の態様において、血液は、通路中の障害物または凹凸を通過する（例えば通り越してポンプ輸送される）。
血小板塊形成は、通路中の血液の流れまたは組成を監視することによって検出することができる。若干の態様において、その流れを監視する。流れは、例えば、通路中の血圧を監視することによってまたは光学的に監視することができる。その血圧は圧力変換器で監視することができる。光学的監視は、例えば、ＬＥＤおよび連動した光検出器でありうる。光学的監視または他の方法は、通路中のある一定距離を血液が移動する時間を測定するのに用いることができる。流れは、流量計によってまたは排出量によって、更には、当業者に公知の他の手段によって監視することもできる。
【００７０】
若干の態様において、通路中の血液の組成を監視する。例えば、血小板塊の形成またはサイズは、例えば、ＬＥＤまたは分光光度計のような光学的手段により、直接的に監視することができる。血液の化学組成を監視することもできる。例えば、ｐＨ、またはＯ２、ＣＯ２、Ｍｇ＋＋またはＫ＋の濃度は、血小板塊形成と相関するので、これらを監視することができる。
【００７１】
若干の態様において、通路は障害物を含む。その障害物は、例えばプラグでありうる。そのプラグは、金属ワイヤ、プラスチック、セラミック、ガラスまたはいずれかの非孔質物質でありうる。プラグは、通路を完全にまたは部分的に塞ぐことができる。
【００７２】
若干の態様において、血小板塊は、あらゆる寸法に厚みを生じる。すなわち、本方法のこれら態様は、血小板接着に加えて血小板凝集を必要とする。したがって、若干の態様において、血小板塊は、あらゆる寸法に少なくとも約２０μ、少なくとも約３０μ、少なくとも約４０μ、少なくとも約５０μ、少なくとも約７０μまたは少なくとも約１００μの厚みを有する。
【００７３】
本発明の若干の態様において、通路は、天然に血小板が接着する生体成分を含まない。
若干の態様において、通路は、コラーゲン、ＡＤＰ、エピネフリンまたはそれらの誘導体を含まない。
【００７４】
若干の態様において、通路および血液は、追加の抗凝血剤を含まない。
本方法の若干の態様において、その方法は、更に、血小板活性化因子を血液に加えることを含む。若干の態様において、通路は、血小板活性化因子を含む。その血小板活性化因子は、例えば、トロンボキサンＡ２でありうる。
【００７５】
本発明の方法および装置の若干の態様において、血小板を、少なくとも部分的に機械力によって活性化させる。若干の態様において、血小板を、単独に機械力によって活性化させる。本発明の方法における血小板は、高剪断によって活性化し、低剪断の地点で接着するということが考えられる。しかしながら、通路の寸法、血液ポンプ輸送によって生じる流速、および通路の壁およびいずれかの障害物の材料（例えば材料の接着力）を変更することにより、広範囲の剪断を用いることができる。最大の剪断は、いろいろな装置で評価されるが、この場合、血小板塊形成は、少なくとも５０〜５，０００／秒の範囲にわたって検出された。
【００７６】
若干の態様において、２ｍｌ未満、１ｍｌ未満、０．４ｍｌ未満、０．２ｍｌ未満、０．１ｍｌ未満または５０μｌ未満の血液を、哺乳動物の身体から採取する。若干の態様において、これらより少量を通路に入れる。
【００７７】
本発明の若干の態様において、血液は、通路を介して２方向に通過する。他の態様において、通路の少なくとも一部分はループ（すなわち、円形であれ、卵形、正方形または別の形状であれ、閉回路）であり、血液はそのループを介して１方向に通過する。
【００７８】
本発明の若干の態様において、血液は全血である。若干の態様において、採取した血液は、分画後に本発明の方法および装置で用いられる。
本発明の装置および製品の若干の態様において、装置または製品は、更に、通路に連結されたアパーチャーを形成する流体密封材料を含む。
【００７９】
本発明の装置の若干の態様において、装置は、血小板を活性化する生体物質を含むことなく作動する。若干の態様において、装置は、血小板を活性化する化学物質を含むことなく作動する。
【００８０】
本発明の装置および製品の若干の態様において、通路中の障害物は、通路を介して血液をポンプ輸送して障害物に接触させる場合に、フィブリンを実質的に含まず且つあらゆる寸法が少なくとも約２０μの厚みである血小板塊が、障害物の上または付近で形成されるように配置されている。
【００８１】
本発明の装置および製品の若干の態様において、通路中の凹凸は、通路を介して血液をポンプ輸送して、凹凸のところで通路の壁に接触させる場合に、フィブリンを実質的に含まず且つあらゆる寸法が少なくとも約２０μの厚みである血小板塊が、凹凸のところまたはその付近の通路の壁上で形成されるように配置されている。
【００８２】
若干の態様において、血液は障害物または凹凸を通り越して流れ、障害物または凹凸は、障害物または凹凸のところで少なくとも直径または幅が２０μの通路を残している。例えば、プラグと通路の壁との間の間隙は、これら態様において少なくとも２０μである。他の例について、通路を狭くする凹凸のところの通路の最も幅の狭い地点における通路の直径または幅は、これら態様において少なくとも２０μである。この地点で通路に充満する血小板プラグが形成されると通路は閉塞され、そしてこれは、通路中の血流の変化として検出される。したがって、本方法は、少なくとも２０μの厚みの血小板プラグの形成を検出する。他の態様において、障害物または凹凸は、障害物または凹凸のところで、少なくとも５０μ、少なくとも１００μ、２０〜１００μまたは２０〜２００μの直径または幅の通路を残している。
【００８３】
本発明の若干の態様において、血小板機能を監視されている哺乳動物を、抗血小板薬で処置する。具体的な態様において、その抗血小板薬は、シクロオキシゲナーゼ阻害剤（例えば、アスピリンまたは他のサリチラート）、ＡＤＰ阻害剤、ＧＰＩＩｂＩＩＩａ阻害剤またはそれらの組合せを含む。
【００８４】
本発明の方法および装置のいくつかの使用が存在する。それら方法および装置は、抗血小板薬で処置された患者における抗血小板薬の有効性を監視するのに用いることができる。このような患者には、介入的心臓カテーテル法によって処置された患者が含まれる。これには、血管造影図、血管形成術およびステント配置が含まれる。更に、それら方法は、人工心臓弁を与えられた患者における抗血小板薬の有効性を監視するのに用いることができる。
【００８５】
それら方法および装置は、冠状動脈血栓症（心臓発作）、肺塞栓症、発作、または過度の血小板活性による深静脈血栓症のような心臓血管イベントを予防するためにアスピリンまたは他の抗血小板薬を摂取している患者におけるそれら薬剤の有効性を監視するのに用いることができる。
【００８６】
それら方法および装置は、過度の出血の危険について患者を調べるのに用いることができる。この試験は、例えば、外科的または歯科的処置の前に要求されることがありうる。例えば、それら方法は、抜歯するかまたは智歯を抜く前の患者について、過度の出血の危険を確かめるために用いることができる。その患者に過度の出血の危険があるということが確かめられるならば、輸血または血小板輸血が利用可能である設定で処置を行うなどの、適当な予防措置を講じることができる。
【００８７】
それら方法は、肝機能を監視するのに用いることもできる。肝機能が低下すると、脾臓を介する血流が増加する。脾臓は、通常は、老化した非機能性血小板を分解するが、その後、良好な血小板も分解し始めるので、血小板数は減少する。血小板機能の低下は、低血小板数のためでありうるので、低血小板機能を検出することにより、本発明の方法は、可能性のある低血小板数を迅速に検出する方法を提供する。したがって、それらは、Ａ型、Ｂ型およびＣ型の肝炎、肝硬変、およびアルコール中毒による肝障害を含めた肝疾患についてスクリーニングするのに用いることができる。
【００８８】
ここで、本発明を、以下の非限定的実施例によって詳しく説明する。
【実施例１】
【００８９】
管内のワイヤへの血小板塊接着の特性決定。
方法：
血小板塊形成。ヒト血液を、その内腔に２４ゲージステンレス鋼製ワイヤを有するテフロンチューブの内腔を介してポンプ輸送した。ワイヤはチューブの端の適所に保持されている。２０μｌの血液を、２０／３５＝１．７５μｌ／秒の流速で、３５秒のサイクルでポンプ輸送した。その流れは、１６００／秒のピーク剪断速度に相当する。ワイヤの端上で血小板塊が形成後、そのワイヤおよび付着した血小板塊を、０．９％ＰＢＳで５分間すすぎ洗浄し、１％グルタルアルデヒドで３時間固定した。
【００９０】
抗体染色。フルオレセイン結合モノクローナル抗体ＣＤ４５（ベクトン／ディッキンソン）は、血小板上に見出されるが他の血液細胞上には見出されない表面受容体ＧＰＩｂに特異的である。１０μｌの蛍光抗体を、ワイヤの先端上の塊に加え、暗所において室温で３０分間インキュベートした。非特異的に結合したモノクローナル抗体を、０．９％ＰＢＳで５分間５回の洗浄で試料から除去した。次に、蛍光顕微鏡検査を行った。
【００９１】
電子顕微鏡検査。他の実験において、ワイヤの端に付着し、グルタルアルデヒドで固定された塊を、透過型電子顕微鏡検査によって特性決定した。ワイヤおよび塊を、包埋用溶液でマウントし、塊の横断面を、標準的な切片作成手順を用いて切断した。それら横断面を、透過型電子顕微鏡検査によって評価した。
【００９２】
結果：
蛍光顕微鏡検査は、ワイヤの端上の塊が血小板特異的抗体で均一に染色されたことを示し、塊がより深い地点では、より深い色であった（データは示されていない）。これは、その塊が主として血小板から成り、血小板がその塊中に一様に分布していたことを示している。
【００９３】
電子顕微鏡検査は、その塊が、小さい無核細胞（すなわち血小板）のみから成ることを示した。核含有細胞（すなわち白血球細胞）は認められなかった。更に、より大きな無核細胞（赤血球細胞）は識別されなかった。更に、透過型電子顕微鏡検査で調べた試料中には、フィブリン鎖は目視できなかった。したがって、この装置によってワイヤの端上に生じた塊は、フィブリンを含まず且つ他の血液細胞も含まないと考えられる血小板塊であった。
【実施例２】
【００９４】
アスピリン投与ブタの血小板活性の監視。
方法：
ブタを、いろいろな血小板阻害剤で処置後、それらブタの血小板機能を監視した。２５頭のブタに、３００ｍｇのアスピリンを毎日、７日間投与した。１０頭のブタに、３００ｍｇのチクロピジン（ＡＤＰ阻害剤）を毎日投与した。１０頭のブタに、３００ｍｇのアスピリンと３００ｍｇのチクロピジンとの組合せを毎日投与した。
【００９５】
動脈血を吸引し、図２に示された装置に類似した装置中に入れた。２０μｌの血液を、チューブの内腔に１．０μｌ／秒の速度で吸引した。ワイヤは、直径０．０１６インチであり、チューブの内径は直径０．０３４インチであった。血液（２０μｌ）を、三方流れ分割器（Touhy-Borstコネクター）によって長さ２インチのテフロンチューブに供給した。テフロンチューブは、チューブを介して挿入されてチューブ長の約４分の３に伸長した直径０．１６インチのステンレス鋼製ワイヤを有する。ワイヤは、チューブの端の適所に保持した。そのチューブを、ハミルトンシリンジポンプ、及びチューブ内の圧力を測定するＨＰ血圧変換器に連結させた。血小板プラグ形成時間は、血圧シグナルの減衰として測定した。
【００９６】
結果：
結果を以下の表１〜３に示す。
【００９７】
【表１】
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【００９８】
【表２】
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【００９９】
【表３】
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【０１００】
結果は、用いた方法が、アスピリン（シクロオキシゲナーゼ阻害剤）およびチクロピジン（ＡＤＰ阻害剤）に応答してブタの血小板機能変化を検出することを可能にしたことを示している。したがって、本方法は、抗血小板薬への応答を首尾良く監視し、特定のタイプの抗血小板薬に特異的ではない。
【０１０１】
引用された特許、特許文書および参考文献は全て援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】図１Ａ〜Ｆは、血液が通過するための通路であって、通路内にいろいろなタイプの障害物および凹凸を有する通路を示す。
【図２】図２は、本発明の装置の概略図である。
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【図２】
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【国際調査報告】
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