(57)【要約】細胞にポリヌクレオチドを伝達するためのプロセスが記載される。プロセスは、ポリヌクレオチドとカチオンの界面活性剤との間の塩に安定な複合体の形成を含む。３倍の複合体はさらに、２倍の複合体に両親媒性の化合物を関連づけることによって成される。結果となる複合体は、生体内及び試験管内で細胞へのポリヌクレオチドの伝達に適している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体内で細胞にポリヌクレオチドを伝達するためのプロセスであって、２倍の複合体を形成するためにカチオンの界面活性剤と該ポリヌクレオチドを関連づけること、該複合体を安定化すること、該複合体を動物の細胞に伝達すること、とからなることを特徴とするプロセス。
【請求項２】
前記カチオンの界面活性剤は洗剤から構成されることを特徴とする請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記複合体を安定化することは、高温で前記複合体をインキュベートすることと、前記複合体を乾燥することとからなるリストから選択されることを特徴とする請求項１に記載のプロセス。
【請求項４】
前記複合体を哺乳類の細胞に伝達することは、溶液内の前記複合体を哺乳類の組織に注入することからなることを特徴とする請求項１に記載のプロセス。
【請求項５】
前記複合体を哺乳類の細胞に伝達することは、溶液内の前記複合体を哺乳類の脈管に送入することからなることを特徴とする請求項１に記載のプロセス。
【請求項６】
前記脈管は、門脈、肝臓の静脈、下大静脈、尾部静脈、肝臓の動脈及び胆管から構成されるリストから選択されることを特徴とする請求項６に記載のプロセス。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドはＤＮＡから構成されることを特徴とする請求項１に記載のプロセス。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドは、１８乃至３０のヌクレオチドのモノマーのサブユニットを含むポリヌクレオチドから構成されることを特徴とする請求項１に記載のプロセス。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ干渉を引き起こすポリヌクレオチドから構成されることを特徴とする請求項１３に記載のプロセス。
【請求項１０】
細胞にポリヌクレオチドを伝達するためのプロセスであって、２倍の複合体を形成するためにカチオンの界面活性剤と該ポリヌクレオチドを関連づけること、該２倍の複合体を安定化すること、３倍の複合体を形成するために両親媒性の化合物と前記２倍の複合体を関連づけること、該複合体を前記細胞に伝達すること、とからなることを特徴とするプロセス。
【請求項１１】
前記カチオンの界面活性剤は洗剤と脂質から構成されるリストから選択されることを特徴とする請求項１５に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記複合体を安定化することは、高温で前記複合体をインキュベートすることと、前記複合体を乾燥することとからなるリストから選択されることを特徴とする請求項１に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記両親媒性の化合物は、一つ以上の疎水性部位を含むポリマー、一つ以上の疎水性部位を含むペプチド、一つ以上の疎水性部位を含むターゲットとする基、一つ以上の疎水性部位を含む立体の安定剤、界面活性剤及び脂質から構成されるリストから選択されることを特徴とする請求項１５に記載のプロセス。
【請求項１４】
前記複合体を哺乳類の細胞に伝達することは、溶液内の前記複合体を哺乳類の組織に注入することからなることを特徴とする請求項１５に記載のプロセス。
【請求項１５】
前記複合体を哺乳類の細胞に伝達することは、溶液内の前記複合体を哺乳類の脈管に送入することからなることを特徴とする請求項１５に記載のプロセス。
【請求項１６】
前記脈管は、門脈、肝臓の静脈、下大静脈、尾部静脈、肝臓の動脈及び胆管から構成されるリストから選択されることを特徴とする請求項２２に記載のプロセス。
【請求項１７】
前記細胞は肝臓細胞を含むことを特徴とする請求項１５に記載のプロセス。
【請求項１８】
前記ポリヌクレオチドはＤＮＡから構成されることを特徴とする請求項１５に記載のプロセス。
【請求項１９】
前記ＤＮＡは発現カセットからなることを特徴とする請求項２６に記載のプロセス。
【請求項２０】
前記ポリヌクレオチドは、１８乃至３０のヌクレオチドのモノマーのサブユニットを含むポリヌクレオチドから構成されることを特徴とする請求項１５に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願のクロス・リファレンス
本願は、２００２年６月１４日に出願された、先の仮特許出願番号米国第６０／３８８，６８５に関する。
【０００２】
技術分野
本発明の技術分野は、ポリヌクレオチド、両親媒性の化合物及びポリマーからなる化合物であり、さらに動物細胞にポリペプチドを伝達するためのそのような組成の使用である。
【０００３】
背景技術
遺伝子及び核酸に基づく伝達
細胞に遺伝子又はポリヌクレオチドを転移することは、潜在的な治療の適用と同様に生物学的かつ医学的な研究において重要な技術である。ポリヌクレオチドは、細胞膜を越えて細胞内に転移されることを必要とする。発現できる遺伝子をコード化したポリヌクレオチドにおいて、ポリヌクレオチドは、遺伝子が転写できる細胞核に伝達されるべきである。現在探索されている遺伝子転移方法は、ウィルスベクター及び非ウィルスの方法を含んでいる。
【０００４】
哺乳類の細胞へウィルスの遺伝子を転移するために、ウィルスは何百万もの年月にわたって発展してきた。ウィルスは所望の遺伝子を運ぶために修正でき、遺伝子を運ぶための“ベクター”となる。組換え技術を利用して、有害で余分のウィルスの遺伝子を取り除くことができ、所望の遺伝子と置き換えできる。この技術は、マウス・レトロウィルスで最初に達成された。レトロウィルスベクターの発展は、遺伝子治療の適用のために追求されている。しかしながら、それらのベクターは、特に生体内ですべてのタイプの細胞に対して効率的に感染しない。したがって、ヘルペスウィルス、アデノウィルス、アデノ関連のウィルスなどを含む数多のウィルスベクターが、脳や肺を含む異なる種類の細胞に対して、より効率よく遺伝子転移をできるように発展している。
【０００５】
さらに、非ウィルスベクターは、哺乳類の細胞にポリヌクレオチドを転移するように発展している。それらの非ウィルスベクターにおいて、典型的には、発現可能な遺伝子は、通常は大腸菌である細菌において複製可能なプラスミドにクローニングされる。所望の遺伝子は、遺伝子が哺乳類の細胞で発現されることを可能にする、哺乳類のプロモータ、エンハンサー、又は他の配列を伴ってバクテリアのプラスミドに対して組換え技術で挿入される。ミリグラム単位のプラスミドＤＮＡは、細菌の培養液から精製されて調製できる。代替として、細胞に伝達するためのポリヌクレオチドは、ＰＣＲなどによって酵素的に成されるか、又は化学的に合成できる。ポリヌクレオチドは、ターゲットの哺乳類の細胞にポリヌクレオチドを転移する、脂質小胞（リポフェクチンなどのカチオンの脂質を含むリポソーム）内に組み込むことができる。ポリヌクレオチドはまた、ポリリジン、ポリエチレンイミン及びタンパク質などのポリマーと複合体となることができる。細胞に対してポリヌクレオチドを伝達する他の方法は、エレクトロポレーション及び“ジーンラン（ｇｅｎｅ  ｒｕｎ）”技術を含む。
【０００６】
遺伝子を運ぶアプローチは、直接的及び間接的な方法に分類できる。組織スペースに直接注入された場合、それらの遺伝子の転移方法の幾つかは最も効果的である。上述した遺伝子の転移技術の多くを使用する直接的な方法は、腫瘍、筋肉、肝臓、肺及び脳をターゲットとするために使用されている。他の方法は、身体から取り除かれた細胞又は組織及び遺伝子工学的に改変された細胞に適用し、次いで身体に移植して戻される場合に最も効果的である。レトロウィルスベクターと組み合わせた間接的なアプローチは、骨髄細胞、リンパ細胞、肝細胞、筋芽細胞及び皮膚細胞に対して遺伝子を転移するために発展している。
【０００７】
遺伝子治療及び核酸に基づく治療
遺伝子治療は疾病の処置において革命的な進展をもたらすと約束されている。遺伝子治療で、疾病状態は、矯正的なポリヌクレオチドを細胞に挿入することによって直接的に処置できる。対照的に、従来の薬剤に基づくアプローチは、遺伝子の下流産物（タンパク質、酵素、酵素の基質及び酵素産物）に作用する。遺伝子治療の初期の動機づけが遺伝子疾患の治療であったが、遺伝子治療は癌、感染症、心臓病、関節炎及び精神障害（パーキンソン病及びアルツハイマーなど）のような広範囲の後天性疾病の治療に役立つであろうことがますます明白になっている。
【０００８】
外来遺伝子の提供に加えて、遺伝子治療はまた外来遺伝子を阻害する潜在性を有する。特に、外来遺伝子の発現を阻害する数多の機能が存在する。それらは、アンチセンスの核酸、リボザイム、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を仲介するスモールインヒビトリー（ｓｍａｌｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ）ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む。アンチセンスの阻害は、ターゲットのｍＲＮＡに対して相補的な一本鎖のポリヌクレオチドを含む。リボザイムは、ターゲットのｍＲＮＡを特異的に切断することができる触媒的なＲＮＡである。ＳｉＲＮＡは、細胞性タンパク質と共にターゲットＲＮＡの分解を引き起こす、発現されるターゲット遺伝子のセグメント配列に同一な短い二本鎖ＲＮＡである。外来性遺伝子発現の特異的な阻害は、主要な遺伝子障害、ウィルス感染及び癌の治療で多大な可能性を有する。
【０００９】
遺伝子の転移はまた、感染症及び癌に対する予防接種として使用できる。外部の遺伝子が細胞に転移されて発現した場合、合成されたタンパク質は免疫システムに対して現される。この現われは、身体に対して単にタンパク質を注入して生じる抗原の現われとは異なり、細胞を介した免疫反応を引き起こす。細胞内のウィルス遺伝子の発現は、実際のウィルスの感染の危険性がないウィルス感染を刺激し、より効果的な免疫反応を誘発する。このアプローチは、ヒト免疫不全ウィルス、ヘルペス及びサイトメガロウィルスなどの潜在しているウィルス感染と戦うためにより効果的である。
【００１０】
核酸を運ぶためのポリマー
ポリマーは、細胞にポリヌクレオチドを運ぶための研究で使用されている。細胞にポリヌクレオチドを伝達する数多の方法の一つは、ポリヌクレオチド／ポリカチオンの複合体の使用である。ヒストン及びプロタミンなどのカチオン性タンパク質並びにポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ＤＥＡＥデキストラン、ポリブレン及びポリエチレンイミンなどの合成ポリマーは、効果的な細胞間のポリヌクレオチド伝達剤であることが示されている。下記は、ポリカチオンがポリヌクレオチドの取り込みを促進する機能を含む数多の重要な原理である。
【００１１】
ポリカチオンは核酸の凝縮を容易にする。一つのポリヌクレオチド分子がポリカチオンを有する複合体で占有する容積は、自由なポリヌクレオチド分子の容積よりも相当に少ない。ポリヌクレオチド／ポリマーの複合体のサイズは、試験管内で可能であるのと同様に生体内の遺伝子伝達において、おそらく重要である。血管内伝達において、ポリヌクレオチドは関心のある柔組織的な細胞に到着するために内皮の障壁と交差する必要がある。最大の内皮の穿孔（内皮障壁の孔）は肝臓に生じ、１００ｎｍの平均直径を有する。他の組織のトランス−上皮孔は、より小さい。例えば、筋肉内皮は、半径４ｎｍの多数の小さな孔と、半径２０乃至３０ｎｍの非常にわずかな大きな孔を有する構造として記載することができる。ポリヌクレオチド複合体のサイズはまた、細胞の取り込み処理のために重要である。細胞に結合した後、ポリヌクレオチド／ポリカチオンの複合体は、エンドサイトーシスによっておそらく取り込まれる。エンドサイトーシス小胞が約１００ｎｍの典型的な内部直径を有するので、１００ｎｍ未満のポリヌクレオチドの複合体が好まれる。
【００１２】
ポリカチオンは細胞表面に対するポリヌクレオチドの付加を提供する。ポリマーは、ポリアニオンのポリヌクレオチドと細胞のポリアニオンの表面との間でクロスブリッジを形成する。結果として、細胞内の空間へのポリヌクレオチド転置の機能は、非特異性の吸着性のエンドサイトーシスであってよい。このプロセスは、流体位相のエンドサイトーシス又はレセプターを介するエンドサイトーシスのいずれかよりも、さらに効果的であってよい。さらに、ポリカチオンは複合体に特異的なリガンドを付加するための便利なリンカーを提供する。次いで、ポリヌクレオチド／ポリカチオンの複合体は、特定の細胞のタイプに対してターゲットとされる。
【００１３】
ポリカチオンの複合体のポリヌクレオチドは、ヌクレアーゼの分解に対して保護される。ヌクレアーゼが血清及びエンドソーム／リゾソームに存在するので、この保護はポリヌクレオチドの細胞外及び細胞内保護の両保護において重要である。エンドソーム／リゾソームでの分解からの保護は、細胞小器官の酸性化を回避することによって増大される。酸性化を回避する一つの方法は、ＮＨ４Ｃｌ又はクロロキンの使用である。ポリエチレンイミンなどの他のポリマーは、追加的な処理なしでエンドソーム／リゾソームの機能をおそらく分裂させる。エンドソーム／リゾソームの機能の分裂は、融合ペプチド又はアデノウィルスのような、エンドソーム又は膜の破壊性の作因をポリカチオン又は複合体にリンクすることにより達成される。
【００１４】
核酸の凝縮
幅広く異なる分子構造の相当数の多価の陽イオンは核酸の凝縮を引き起こすことが示されている。３以上の電荷を有する多価の陽イオンはＤＮＡを凝縮するために示される。それらは、スペルミジン、スペルミン、Ｃｏ（ＮＨ３）６３＋、Ｆｅ３＋、並びにヒストンＨ１、プロタミン、ポリリジン、及びポリエチレンイミンなどの天然又は合成ポリマーを含む。分析は、糖とリン酸の骨組みに沿った９０％以上の電荷が中性の場合にＤＮＡ凝縮が好ましいことを示す。天然でアニオンのポリマーは、ＤＮＡとその周辺との間の反発作用を増大でき、したがって、ＤＮＡを圧縮する。最も重要なこととして、自発的なＤＮＡの自己アセンブリ及び集合プロセスは、除外された容積効力による大量のＤＮＡの制限に起因すると示されている。
【００１５】
ポリヌクレオチドの凝縮の機能は明らかでない。平静な螺旋間の静電気力は、第一に多価の陽イオンを要求する反イオン変動機能から発生し、ポリヌクレオチド凝縮に主な役割をする。核酸の螺旋がわずかな水の直径より接近してアプローチする場合、水和力は静電気力を抑える。ＤＮＡ／ポリマー状のポリカチオンの相互作用の場合、ＤＮＡの凝縮は、低分子量のポリカチオンの場合よりも複雑なプロセスである。異なるポリカチオンのタンパク質は、２乃至５の正対負の電荷の比率で異なるサイズのＤＮＡで環状及び棒状の形成物を生成することができる。ポリアルギニン又はヒストンを有するＤＮＡ複合体は、２種類の構造を形成でき、約３５０ｎｍの長さの長軸を有する拡張された構造（自由なＤＮＡなど）と凝縮した球状の粒子である。両形態は、同一の溶液中に同時に存在する。２形態の共に存在する理由は、ＤＮＡ分子内のポリカチオン鎖の不均一な分配として説明できる。不均一な分配は、２つの熱力学的に好ましい構成を生成する。
【００１６】
ポリペプチド／ポリカチオンの複合体の電気泳動の移動度は、超過のポリカチオンで負から正に変化できる。大型のポリカチオンはポリヌクレオチドに沿って完全に整列しないが、他のポリヌクレオチド分子と相互作用するポリマーループを形成する可能性がある。異なる核酸分子間の迅速な集合と強力な分子間力は、堅く詰め込まれた順序正しい粒子を形成するために必要とされる螺旋間の遅い調節を防ぐ。
【００１７】
表面の電荷
前述したように、ポリカチオンは細胞表面に対するポリヌクレオチドの複合体の付着を支援できる。しかしながら、負の表面の電荷は、多くの実際上の適用、つまり生体内の伝達において、より望ましい。表面の電荷の現象は、コロイド化学において周知であり、疎液性／親液性システム（つまり、ハロゲン化銀ヒドロゾル）において詳細に記載される。反対に電荷された表面を有するラテックス粒子の懸濁液へのポリイオンの追加は、表面上に対するポリイオンの永久的な吸収に結びつく。適切な化学量論に達する際、表面は反対の電荷に課される。
【００１８】
ｐＨに対する感受性を有する脂質、両親媒性の合成物、及び核酸を運ぶためのリポソームの使用
カチオニック・リポソームは、プラズマ膜を越えて直接的にＤＮＡを伝達するか、又はエンドソームのコンパートメントを介してＤＮＡを伝達する。その正確なエントリーポイントに関係なく、カチオニック・リポソーム内の多くのＤＮＡは、エンドソームのコンパートメントで蓄積する。数多のアプローチは、加水分解から外来ＤＮＡを保護するか、又は細胞質へ外来ＤＮＡの回避を可能にすることによって、エンドソームのコンパートメントでの外来ＤＮＡの損失を防ぐために調査されている。それらのアプローチは、エンドソームの酸性化を阻害することによって推測上ＤＮＡ分解を防止するクロロキンなどのアシッドトロピック（ａｃｉｄｏｔｒｏｐｉｃ）（リソモトロフィック（ｌｙｓｏｍｏｔｒｏｐｈｉｃ））の弱アミンの使用を含む（Ｌｅｇｅｎｄｒｅ  ｅｔ  ａｌ．  １９９２）。代替として、ウィルス及びウィルスの融合ペプチドは、エンドソームを分裂させるか、又はエンドソームを有するリポソームの融合を促進し、細胞質へＤＮＡの放出を促進するように含まれている（Ｋａｍａｔａ  ｅｔ  ａｌ．  １９９４；  Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  １９９４）。
【００１９】
脂質相及び膜融合の知識は、潜在的にエンドソームの膜を有する融合を促進するためにエンドソームの酸性化を展開する、より用途の広いリポソームを設計するために使用されている。そのようなアプローチは、酸性のｐＨにおいてエンドソームの膜で不安定にするか又は融合することを目指した、陰イオンで、ｐＨに感受性であるリポソームによって最も例証される（Ｄｕｚｇｕｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  １９９１）。陰イオンで、ｐＨに感受性のあるリポソームはすべて、カルボン酸基を含んでいる脂質の追加によって非酸性ｐＨで安定させられるホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）二層を利用した。単にＰＥを含んでいるリポソームは逆の六角形の相（ＨＩＩ）になりやすい。ｐＨに感受性な陰イオンのリポソームでは、カルボン酸の負の電荷が、カルボン酸のｐＫａより大きなｐＨで脂質の頭部の基のサイズを増加させて、それによってホスファチジルエタノールアミン二層を安定させる。エンドソーム内で見られる酸性ｐＨ条件では、荷電していない電荷種又は縮小された電荷種がホスファチジルエタノールアミンに富んだ二層を安定させることができない。陰イオンで、ｐＨに感受性のリポソームは、ＤＮＡを含む様々な膜を通さない化合物を伝達する。しかしながら、これらのｐＨに感受性なリポソームの負の電荷は、それらが効率的にＤＮＡを取り込み、かつ細胞と作用するのを防ぎ、したがってトランスフェクションのための細胞の効用を減少させる。我々は、培養中の様々な細胞へＤＮＡの効率的な転移を仲介させるためにカチオンで、ｐＨに感受性なリポソームの使用について記述した（例えば、特許文献１及び２を参照）。
【００２０】
核酸を伝達するためのｐＨに感受性なポリマーの使用
ｐＨに感受性なポリマーは、薬剤の制御された放出の目的で様々な生理学的かつ細胞内のｐＨ勾配を展開するポリマーの性能のためにドラッグデリバリーの分野で広い応用を見出した。ｐＨ感度は、ポリマーのｐＨ範囲にわたる物理化学的な特性の如何なる変化として広く定義することができる。より狭い定義は、生理学上許容されたｐＨ範囲（典型的には、ｐＨ５．５乃至８）における生体に影響する物質を保持するか又は放出するポリマーの性能の著しい変更を要求する。すべてのポリイオンは、水溶液での陽子を与えるか又は受け取るポリイオンの性能に基づいて３つのカテゴリーに分類することができ、ポリ酸、ポリ塩基及びポリ両性電解質である。ドラッグデリバリーの応用でのｐＨに感受性なポリ酸の使用は、通常、ａ）ｐＨ上昇（酸／塩転換）で可溶になるか、ｂ）ｐＨの変化に関して他のポリマーで複合体を形成するか、又はｃ）疎水性／親水性のバランスの重要な変化を受ける、ポリ酸の性能に依存する。さらに、前述の３つすべての要素の組み合わせは可能である。
【特許文献１】ＵＳ０８／５３０，５９８
【特許文献２】ＵＳ０９／０２０，５６６  発明の概要  好ましい実施態様において、我々は、複合体を形成するために水溶液でカチオンの界面活性剤にポリヌクレオチドを関連させること、複合体を安定させること、及び細胞と複合体を接触させることからなる、細胞にポリヌクレオチドを伝達するための生体内プロセスを記載する。複合体を安定化させることは、高温度で水性溶液において複合体をインキュベートすることを含む。インキュベーションは、温度に依存して、数分から数時間であってよい。代替として、複合体を安定化させることは、複合体を乾燥させること、適切な有機溶媒で複合体を溶解すること、及び適切な水性溶液で希釈することを含む。安定した粒子は、複合体が生理的濃度で塩にさらされる場合、複合体のサイズが急速に増加せず、また、ポリヌクレオチドも急速に非凝縮しない、凝縮したポリヌクレオチドを含む。細胞と複合体を接触させることは、組織に直接的に水溶液中の複合体を注入するか、又は脈管が体液を供給するか、若しくは排水する、組織中の細胞への伝達のための哺乳動物における脈管へ水溶液の複合体を送入することを含んでよい。
【００２１】
好ましい実施態様において、我々は、水溶液でカチオンの界面活性剤にポリヌクレオチドを関連させて、かつ、高温度で溶液をインキュベーションすることを含む安定したポリヌクレオチド／カチオンの界面活性剤の複合体の形成過程について記述する。インキュベーションは、温度に依存して数分から数時間であってよい。高温度は、３０℃乃至１００℃又はそれ以上であってよい。より好ましくは、高温度は３５℃乃至５０℃である。安定した粒子は、複合体が生理的濃度で塩にさらされる場合、複合体のサイズが急速に増加せず、また、ポリヌクレオチドも急速に非凝縮しない、凝縮したポリヌクレオチドを含む。
【００２２】
好ましい実施態様において、我々は、２倍の複合体を形成するためにカチオンの界面活性剤にポリヌクレオチドを関連させること、３倍の複合体を形成するために両親媒性の化合物に複合体を関連させること、及び細胞に複合体を関連させることからなる、ポリヌクレオチドを細胞に伝達するためのプロセスについて記述する。両親媒性の化合物は、疎水性部分を含むポリマー、疎水性部分を含むペプチド、疎水性部分を含むターゲットとする基、疎水性部分を含む立体の安定剤、界面活性剤及び脂質からなるリストから選択されてよい。両親媒性の化合物は、カチオンか、陰イオンか、中立か、あるいは両性イオンであってよい。結果として生じる３倍の複合体は、正、負又は中性である正味の表面電荷を有することができる。両親媒性の化合物はまた、トランスフェクション効率を高める一つ以上の官能基を含むように修飾されてよい。両親媒性の化合物は、３倍の複合体の形成後の３倍の複合体の形成に先立って修飾されてよい。２倍の複合体は、３倍の複合体の形成に先立って安定化されてよい。２倍の複合体を安定化することは、高温度において水性溶液中の複合体をインキュベーションすることを含む。インキュベーションは、温度に依存して数分から数時間であってよい。代替として、複合体を安定化させることは、複合体を乾燥させること、適切な有機溶媒で複合体を溶解すること、及び適切な水性溶液で希釈することを含む。安定した粒子は、複合体が生理的濃度で塩にさらされる場合、複合体のサイズが急速に増加せず、また、ポリヌクレオチドも急速に非凝縮しない、凝縮したポリヌクレオチドを含む。３倍の複合体は、生体内又は試験管内で細胞に伝達されてよい。生体内で細胞に３倍の複合体を伝達することは、組織に直接的に水溶液中の複合体を注入するか、又は脈管が体液を供給するか、若しくは排水する、組織中の細胞への伝達のための哺乳動物における脈管へ水溶液の複合体を送入することを含んでよい。
【００２３】
好ましい実施態様において、我々は、２倍の複合体を形成するためにカチオンの界面活性剤にポリヌクレオチドを関連させること、２倍の複合体を安定化させること、及び３倍の複合体を形成するために両親媒性の化合物に２倍の複合体を関連させることからなる、小型で直径が５０ｎｍ未満のポリヌクレオチドを含んでいる複合体について記述する。２倍の複合体を安定化させることは、高温度で水溶液中の複合体をインキュベーションすることを含む。インキュベーションは、温度に依存して数分から数時間であってよい。代替として、複合体を安定化させることは、複合体を乾燥させること、適切な有機溶媒で複合体を溶解すること、及び適切な水性溶液で希釈することを含む。安定した粒子は、複合体が生理的濃度で塩にさらされる場合、複合体のサイズが急速に増加せず、また、ポリヌクレオチドも急速に非凝縮しない、凝縮したポリヌクレオチドを含む。両親媒性の化合物は、疎水性部分を含むポリマー、疎水性部分を含むペプチド、疎水性部分を含む目的とする基、疎水性部分を含む立体の安定剤、界面活性剤及び脂質からなるリストから選択されてよい。両親媒性の化合物は、カチオンか、陰イオンか、中立か、あるいは両性イオンであってよい。結果として生じる３倍の複合体は、正、負又は中性である正味の表面電荷を有することができる。両親媒性の化合物はまた、トランスフェクション効率を高める一つ以上の官能基を含むように修飾されてよい。両親媒性の化合物は、３倍の複合体の形成後の３倍の複合体の形成に先立って修飾されてよい。
【００２４】
本発明のさらなる目的、特徴、及び利点は、添付図と共に下記の詳細な記載から明らかとなるであろう。
【００２５】
発明を実施するための最良の形態
数多の報告が、ＤＮＡとカチオンの界面活性剤との複合体の形成を記載する文献に表わされている（Ｍｅｌｎｉｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．  １９９５ａ；  Ｓｅｒｇｅｙｅｖ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９ａ；  Ｓｅｒｇｅｙｅｖ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９ｂ；  Ｓｕｋｈｏｒｕｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．  ２０００；  Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．  １９９６；  Ｉｊｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．  １９９２；  Ｍｅｌｎｉｋｏｚ  ｅｔ  ａｌ．  １９９５ｂ）。例えば、Ｍｅｌｎｉｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．は、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）の追加におけるＤＮＡのための任意のコイルと小型の小球状態との間の相転移を示した。この複合体の形成物は、競合するポリアニオン（ポリアクリル酸）の追加で可逆的なことをさらに示した。複合体は、複合体を沈殿させるような方法で調製することができる。完全に乾燥する際、複合体は、エタノール、クロロホルム、ＴＨＦ及びシクロヘキサンのような有機溶剤で可溶性になることができる。幾つかの報告で提案されたが、遺伝子転移は、ＤＮＡ／カチオンの界面活性剤の複合体で実証されていない。実際に、ＤＮＡ／ＣＴＡＢの複合体は、プラズマ膜の外面上にトラップされ、それによって、効率的なトランスフェクションにおける主要な制限を構成することをＣｌａｍｍｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｌａｍｍｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２０００）は実証した。
【００２６】
使用した濃度に依存して、沈殿は形成しても、又はしなくてもよい。文献は、固体の沈殿を分離し、有機溶液でサンプルを溶解することを記述している。沈殿した複合体（ＤＮＡ／カチオンの界面活性剤）及び沈殿しない複合体は、本質的に異なる複合体を形成することを我々は見出した。両複合体は、凝縮したＤＮＡ（Ｔｒｕｂｅｔｓｋｏｙ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９）及び同様の粒子サイズを表す。しかしながら、複合体は、生理的な塩濃度の存在において粒子のサイズ化と蛍光の非凝縮アッセイに基づいて、幅広く異なる安定性を示す。乾燥されて、有機溶液で得られる複合体は、粒子サイズの増加のない１５０ｍＭの塩化ナトリウムに安定性を示す。しかしながら、沈殿しない複合体は、粒子サイズの増加及び非凝縮を示し、１５０ｍＭの塩化ナトリウムに対して安定ではない。本発明は、安定した複合体が、ＤＮＡ及びカチオンの界面活性剤の沈殿しない濃度から形成できる（塩安定性アッセイ、ＤＮＡ凝縮及び粒子サイズの安定性によって示される）ことによるプロセスを提供する。ＤＮＡ／カチオンの界面活性剤の複合体は水溶液で形成でき、数分から数時間で様々な温度において加熱でき、結果として塩に安定な複合体の形成を生じる。ＤＮＡ／カチオンの界面活性剤の複合体は、水溶液で形成でき、凍結乾燥でき、適切な有機溶媒で溶解でき、適切な水溶液で希釈できて、塩に安定な複合体を結果として生じる。
【００２７】
本発明は、生体内及び試験管内で細胞へのポリヌクレオチドの転移を提供する。生体内でＤＮＡ／カチオンの界面活性剤の複合体の調製及び伝達のためのプロセスが記載される。加えて、本発明は、生体内及び試験管内でＤＮＡ／カチオンの界面活性剤／第三の化合物の複合体の調製及び伝達が提供される。
【００２８】
ＤＮＡ／カチオンの界面活性剤の複合体は試験管内で細胞にトランスフェクションしないことが文献に示されているが、我々は複合体が生体内でＤＮＡを伝達できることを見出した。血管注入法は、有機溶媒で複合体を溶解、かつ注入に先立って適切な水性の緩衝液でサンプルを希釈することによって達成できる。複合体が溶液中で粒子を維持し、粒子は細胞にトランスフェクションできることを研究は示している。マウスの尾の静脈注入は、水性の緩衝液でＤＮＡ／カチオンの界面活性剤の複合体を形成すること、サンプルを充分な時間において加熱すること、及び注入に先立って適切な水性の緩衝液でサンプルを希釈することによって達成できる。複合体が溶液中で粒子を維持し、粒子は細胞にトランスフェクションできることを研究は示している。
【００２９】
加えて、ＤＮＡ／カチオンの界面活性剤の複合体は、新しい複合体を形成するために疎水性部位を含むポリマーと混合できる。新しい３倍の複合体は、ＤＮＡ／カチオンの界面活性剤の複合体と相関して、生体内のトランスフェクションを高め、さらに試験管内で細胞に対するＤＮＡのトランスフェクションにおいて機能的である。疎水的に修飾されたポリマーを有する複合体の形成物は、ポリマーの臨界のミセル濃度（ｃｍｃ）の下で生じることができる。ポリマーはポリカチオン又はポリアニオンのいずれかであり、かつターゲットとする基を含むことができる。下記に限定されないが、例えば、（電荷修正型ポリマーをも含む）追加的なポリマー、ペプチド、疎水的に修正されたペプチド、電荷修正型ペプチド、両親媒性の化合物、アニオンの界面活性剤、膜活性化合物及び塩類などの追加的な化合物は、３倍の複合体に加えることができる。
【００３０】
加えて、ＤＮＡ／カチオンの界面活性剤の複合体は、新しい複合体を形成するために疎水性部位を含むペプチドと混合できる。新しい３倍の複合体は、生体内及び試験管内での細胞のトランスフェクションのために使用できる。疎水的に修飾されたペプチドを有する複合体の形成物は、疎水的に修飾されたペプチドの臨界のミセル濃度（ｃｍｃ）の下で生じることができる。ペプチドは、正味のカチオン、正味のアニオン、あるいは正味の中性の電荷となる。下記に限定されないが、例えば、（電荷修正型ポリマーをも含む）ポリマー、ペプチド、疎水的に修飾されたペプチド、電荷修正型ペプチド、両親媒性の化合物、アニオンの界面活性剤、膜活性化合物及び塩類などの追加的な化合物は、３倍の複合体に加えることができる。
【００３１】
加えて、ＤＮＡ／カチオンの界面活性剤の複合体は、新しい複合体を形成するために疎水性部位を含むターゲットとする基と混合できる。新しい３倍の複合体は、生体内及び試験管内での細胞のトランスフェクションのために使用できる。疎水的に修正された目的とする基を有する複合体の形成物は、疎水的に修飾されたターゲットとする基の臨界のミセル濃度（ｃｍｃ）の下で生じることができる。疎水的に修飾されたターゲットとする基は、正味のカチオン、正味のアニオン、あるいは正味の中性の電荷となる。下記に限定されないが、例えば、（電荷修正型ポリマーをも含む）ポリマー、ペプチド、疎水的に修正されたペプチド、電荷修正型ペプチド、両親媒性の化合物、アニオンの界面活性剤、膜活性化合物及び塩類などの追加的な化合物は、３倍の複合体に加えることができる。
【００３２】
加えて、ＤＮＡ／カチオンの界面活性剤の複合体は、新しい複合体を形成するために疎水性部位を含む立体安定剤と混合できる。新しい３倍の複合体は、生体内及び試験管内での細胞のトランスフェクションのために使用できる。疎水的に修飾された立体安定剤を有する複合体の形成物は、疎水的に修飾された立体安定剤の臨界のミセル濃度（ｃｍｃ）の下で生じることができる。疎水的に修飾されたターゲットとする基は、正味のカチオン、正味のアニオン、あるいは正味の中性の電荷となる。下記に限定されないが、例えば、（電荷修正型ポリマーをも含む）ポリマー、ペプチド、疎水的に修飾されたペプチド、電荷修正型ペプチド、両親媒性の化合物、アニオンの界面活性剤、膜活性化合物及び塩類などの追加的な化合物は、３倍の複合体に加えることができる。
【００３３】
加えて、ＤＮＡ／カチオンの界面活性剤の複合体は、新しい複合体を形成するためにアニオンの界面活性剤と混合できる。新しい３倍の複合体は、生体内及び試験管内での細胞のトランスフェクションのために使用できる。アニオンの界面活性剤を有する複合体の形成物は、アニオンの界面活性剤の臨界のミセル濃度（ｃｍｃ）の下で生じることができる。下記に限定されないが、例えば、（電荷修正型ポリマーをも含む）ポリマー、ペプチド、疎水的に修飾されたペプチド、電荷修正型ペプチド、両親媒性の化合物、アニオンの界面活性剤、膜活性化合物及び塩類などの追加的な化合物は、３倍の複合体に加えることができる。
【００３４】
別の好ましい実施態様において、ＤＮＡ／カチオンの界面活性剤の複合体が両親媒性の化合物と組合せでき、フィルムに蒸発でき、リポソームを含んでいる複合体から水和できるプロセスが記述される。複合体は、下記に限定されないが、例えば、（電荷修正型ポリマー、疎水的に修飾されたポリマーをも含む）ポリマー、ペプチド、疎水的に修飾されたペプチド、電荷修正型ペプチド、両親媒性の化合物、アニオンの界面活性剤、膜活性化合物及び塩類などの追加的な化合物を含むことができる。
【００３５】
定義
複合体
２つの分子が、静電の相互作用、水素結合の相互作用、あるいは疎水性の相互作用などの共有結合でない相互作用により互いに接触しない場合、コンプレキシエイション（ｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎ）又は複合体形成と呼ばれるプロセスを通じて複合体を形成するために組み合わせられる。
【００３６】
２倍の複合体
２倍の複合体は、ポリヌクレオチドとカチオンの界面活性剤との間に形成された複合体を含むことを意味する。カチオンの界面活性剤は、単一の界面活性剤、正の正味の全体の電荷を有する界面活性剤（正、負及び中性）の混合物、塩などの一つ以上の他の化合物を有する一つ以上の界面活性剤となる。
【００３７】
３倍の複合体
３倍の複合体は、一つ以上の化合物が２倍の複合体に加えられた場合に形成される複合体である。
【００３８】
高温度
用語としての高温度は、２５℃よりも高く１００℃よりも低い温度を意味する。高温度はまた、２倍の複合体に塩の安定性を与える、温度と時間の組合せを意味する。
【００３９】
ポリヌクレオチド
用語としてのポリヌクレオチド、又は核酸あるいはポリ核酸は、少なくとも２つのヌクレオチドを含んでいるポリマーを意味する技術用語である。ヌクレオチドは、ポリヌクレオチドポリマーのモノマーの単位である。１２０のモノマーの単位より少ないポリヌクレオチドは、頻繁にオリゴヌクレオチドと呼ばれる。天然の核酸は、デオキシリボース又はリボースとリン酸のバックボーンを有する。人工的又は合成のポリヌクレオチドは、試験管内で重合されたか、又は細胞がないシステムで同一若しくは同様の塩基を含むが天然のリボースとリン酸のバックボーン以外の別のタイプのバックボーンを含んでよい、任意のポリヌクレオチドである。それらのバックボーンは、ＰＮＡｓ（ペプチド核酸）、フォスフォロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｓ）、フォスフォロジアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉａｍｉｄａｔｅｓ）、モルフォリノ（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｓ）、及び天然の核酸のリン酸のバックボーンの別の変形を含む。塩基は、天然化合物のアデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシン及び天然のアナログをさらに含む、プリン及びピリミジンを含む。プリン及びピリミジンの合成の変形物は、下記に限定しないが、新しい反応基を位置する修飾物を含み、それらは、下記に限定されないが、アミン、アルコール、チオール、カルボン酸塩及びアルキルハライドである。用語としての塩基は、下記に限定されないが、４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジニジニルシトシン、シュードイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチル−アミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルシュード−ウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチル−グアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチル−シトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシ−アミノ−メチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マノシルキノシン、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、シュードウラシル、キノシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、シュードウラシル、キノシン、２−チオシトシン、及び２，６−ジアミノプリンを含むＤＮＡ及びＲＮＡの任意の既知の塩基のアナログを包含する。用語としてのポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ＤＮＡとＲＮＡの組合せ、並びに他の天然及び合成のヌクレオチドを含む。
【００４０】
ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、試験管内で重合されたＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、プラスミドＤＮＡの一部、ウィルス由来の遺伝子物質、線形のＤＮＡ、ベクター（Ｐ１、ＰＡＣ、ＢＡＣ、ＹＡＣ、人工染色体）、発現カセット、キメラの配列、組換えＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、アンチセンスＤＮＡ、又は前述して列記した群の変形であってよい。ＲＮＡは、オリゴヌクレオチドＲＮＡ、ｔＲＮＡ（トランスファーＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、試験管内で重合したＲＮＡ、組換えＲＮＡ、キメラの配列、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ（小型の干渉ＲＮＡ）、リボザイム、又は前述して列記した群の変形であってよい。アンチセンスのポリヌクレオチドは、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡの機能を干渉するポリヌクレオチドである。アンチセンスのポリヌクレオチドは、下記に限定されないが、モルホリノ、２’−Ｏ−メチルポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡなどを含む。ＳｉＲＮＡは、典型的には１５乃至５０塩基対で、好ましくは２１乃至２５塩基対を含み、細胞内で発現される目的とする遺伝子又はＲＮＡと同一であるか若しくはほぼ同一であるヌクレオチド配列を有する二本鎖構造を含む。干渉は、発現の抑制となる。ポリヌクレオチドは、細胞中の存在又は発現が、細胞の遺伝子又はＲＮＡの発現若しくは機能を変化させる配列となる。加えて、ＤＮＡ及びＲＮＡは、一本、二本、三本又は四本鎖であってよい。二本、三本及び四本鎖のポリヌクレオチドは、ＤＮＡとＲＮＡの両者、又は天然及び／若しくは合成の核酸の他の組合せを含んでよい。
【００４１】
変形したポリヌクレオチドは、内因性の遺伝物質とは別に細胞質又は核内にとどまることができる。あるいは、ＤＮＡは内因性の遺伝物質と組換え（一部分になる）できる。組換えは、相同性又は非相同性の組換えのいずれかによって、染色体ＤＮＡにＤＮＡを挿入させることができる。
【００４２】
ポリヌクレオチドは、外来のヌクレオチド配列を発現するため、内因性のヌクレオチド配列の発現を阻害、除去、増大あるいは変化するため、又は細胞と当然関連しない特定の生理的な特性に影響するために細胞に伝達できる。ポリヌクレオチドは、タンパク質又はＲＮＡの全体若しくは一部を発現するためにコードされた発現カセットを含んでよい。発現カセットは、遺伝子を発現できる、天然又は組換えで生成されたポリヌクレオチドを意味する。ここで使用される用語としての組換えは、分子生物学的な技術によって共に結合されたポリヌクレオチドのセグメントから構成される、ポリヌクレオチド分子を意味する。カセットは、遺伝子の発現に影響する任意の他の配列に沿う関心のある遺伝子のコード領域を含む。ＤＮＡ発現カセットは、プロモーター（転写の開始を可能にする）及び一つ以上のタンパク質をコード化する配列を典型的に含む。発現カセットは、下記に限定しないが、任意的に、転写のエンハンサー、非コード配列、スプライシング信号、転写停止信号及びポリアデニレーション信号を含んでよい。ＲＮＡ発現カセットは、翻訳開始コドン（翻訳を開始する）、及び一つ以上のタンパク質をコード化する配列を典型的に含む。発現カセットは、下記に限定しないが、任意的に、翻訳停止信号、ポリアデノシン配列、内部のリボソームのエントリー部位（ＩＲＥＳ）、及び非コード配列を含んでよい。
【００４３】
ポリペプチドは、ターゲットの細胞で特定の機能に役立たないが、ポリヌクレオチドの生成に使用される配列を含んでよい。そのような配列は、下記に限定しないが、宿主生物におけるポリヌクレオチドの複製又は選択に必要とされる配列を含む。
【００４４】
ポリヌクレオチドは、ゲノムの又は余分な染色体ＤＮＡ配列を修飾するために使用できる。これは、発現されるポリヌクレオチドを伝達することによって達成できる。代わりに、ポリヌクレオチドは、ターゲットとなる細胞のＤＮＡ又はＲＮＡ配列の変化をもたらすことができる。これは、ハイブリダイゼーション、多重鎖のポリヌクレオチドの形成、相同性の組換え、遺伝子転換又はさらに記載される他の機能によって達成できる。
【００４５】
用語としての遺伝子は、治療のポリヌクレオチド（例えば、リボザイム）又はポリペプチドあるいはプレカーサーの生成に必要なコード配列を含むポリヌクレオチド配列を意味する。ポリヌクレオチドは、完全長のポリペプチドか断片の所望の活性若しくは機能的な特性（例えば、酵素活性、リガンドの結合、信号の形質導入）が保持される限り、完全長のコード配列又はコード配列の任意の部分によってポリペプチドをコード化することができる。その用語はまた、遺伝子のコード領域を包含し、遺伝子が、完全長のｍＲＮＡの長さと対応するように、いずれかの末端で約１ｋｂ以上の距離における５´及び３´の両末端でコード領域に隣接した位置の配列を含んでいる。ｍＲＮＡに存在し、コード領域の５´に位置する配列は、５´の非翻訳配列として呼ばれる。ｍＲＮＡに存在し、コード領域の３´又は下流に位置する配列は、３´の非翻訳配列として呼ばれる。用語としての遺伝子は、遺伝子のｃＤＮＡ及びゲノム形態の両者を包含する。遺伝子のゲノム形態又はクローンは、介在領域又は介在配列である、イントロンと定義される非コード配列で妨害されるコード領域を含む。イントロンは、核ＲＮＡに転写される、遺伝子のセグメントである。イントロンは、エンハンサーなどの調節要素を含んでよい。イントロンは、核又は主要な転写から除去又はスプライシングされ、したがって、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の転写ではイントロンは存在しない。初期のポリペプチドでアミノ酸の配列又は順番を特定するために、ｍＲＮＡは翻訳段階で機能する。用語としての非コード配列はまた、遺伝子のゲノム形態の他の領域を意味し、下記に限定されないが、プロモーター、エンハンサー、転写因子結合部位、ポリアデニレーション信号、内部のリボソームが入る部位、サイレンサー、乖離配列、マトリックス付加領域を含む。それらの配列は、遺伝子のコード領域に近接して存在するか（１０，０００ヌクレオチド内）、又は離れた部位で存在（１０，０００ヌクレオチド以上）してよい。それらの非コード配列は、遺伝子の転写及び翻訳のレベル又は速度に影響する。遺伝子の共有結合の修正は、転写率（例えば、ゲノミックＤＮＡのメチル化）、ｍＲＮＡの安定性（例えば、３´ポリアデニレーション尾部の長さ、）翻訳率（例えば、５´のキャッピング）、核酸の修復、及び免疫性に影響する。核酸の共有結合の修正の一つの例は、ＬａｂｅｌＩＴ試薬（Ｍｉｒｕｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）の作用を含む。
【００４６】
ここで使用されるように、用語としての遺伝子発現は、遺伝子にコード化された遺伝情報をデオキシリボ核酸の遺伝子の転写を介して（例えば、ＲＮＡポリメラーゼの酵素作用を介して）ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、又はｓｎＲＮＡ）に変換し、タンパク質をコード化する遺伝子においてｍＲＮＡの翻訳を介してタンパク質に変換する過程を意味する。遺伝子発現は、この過程の多くの段階において制御できる。上方調節又は活性化は、遺伝子発現産物（つまり、ＲＮＡ又はタンパク質）の産物を増大する調節を意味し、一方で、下方調節又は抑制は産物を減じる調節を意味する。上方調節又は下方調節に含まれる分子（例えば、転写因子）は、それぞれ、アクチベーター及びリプレッサーとそれぞれ呼ばれる。
【００４７】
ＲＮＡ機能の阻害剤は、細胞の存在又は発現が、配列に特異的な手法で、通常はｍＲＮＡである、特定の細胞のＲＮＡを分解させるか、又は特定の細胞のＲＮＡの機能若しくは翻訳を抑制する、如何なるポリヌクレオチド又は核酸アナログを含む。したがって、ＲＮＡの抑制は、ＲＮＡが転写される遺伝子の発現を効果的に抑制する。ＲＮＡの機能の抑制剤は、ｓｉＲＮＡ、干渉ＲＮＡ又はＲＮＡｉ、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ若しくはアンチセンス遺伝子をエンコードするＤＮＡを転写するＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ、リボザイム及びＲＮＡ、ＤＮＡあるいは人工的な核酸であってよいアンチセンス核酸からなる群から選択される。ＳｉＲＮＡは、典型的には、１５乃至５０塩基対、好ましくは２１−２５塩基対を含み、細胞内の発現される目的とする遺伝子又はＲＮＡに対して同一であるか、若しくはほとんど同一であるヌクレオチド配列を有する二本鎖構造を含む。アンチセンスのポリヌクレオチドは、下記に限定しないが、モルホリノ、２´−Ｏ−メチルポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡなどを含む。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩは、Ｕ６プロモーターなどのプロモーターを含むＤＮＡを転写する。それらのＤＮＡは、アンチセンスＲＮＡとして機能できるｓｉＲＮＡ又は線形ＲＮＡとして機能できる、細胞中で小型のヘアピンＲＮＡを生成するように転写できる。ＲＮＡ機能の阻害剤は、試験管内で組換えＲＮＡを重合され、キメラの配列又はそれら群の派生物をふくんでよい。ＲＮＡの機能の阻害剤は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、合成ヌクレオチド、又はターゲットとなるＲＮＡ及び／若しくは遺伝子が阻害されるような任意の適切な組合せを含んでよい。加えて、核酸のそれらの形態は、一本、二本、三本又は四本鎖であってよい。
【００４８】
トランスフェクション
ポリヌクレオチドを細胞に伝達するためのプロセスは、一般に、トランスフェクション又はトランスフェクションのプロセスとして定義され、さらに、形質転換と定義される。ここで使用されるような用語としてのトランスフェクションは、細胞内へのポリヌクレオチド又は他の生物学的に活性な化合物の導入を意味する。ポリヌクレオチドは、研究の目的のために使用されてよく、又は治療が可能な細胞に変化を生成するように使用されてもよい。治療目的のためのポリヌクレオチドの伝達は、一般的に、遺伝子治療と呼ばれる。ポリヌクレオチドの伝達は、目的となる細胞に存在する遺伝子物質の修正を導くことができる。用語としての安定可能なトランスフェクション又は安定してトランスフェクションされたことは、一般的に、トランスフェクションされた細胞のゲノムに外来性のポリヌクレオチドを導入し、且つ、統合することを意味する。用語としての安定したトランスフェクタントは、ゲノムＤＮＡにポリヌクレオチドを安定して統合した細胞を意味する。安定したトランスフェクションは、真核細胞の分割段階において複製されるエピソームベクター（例えば、乳頭腫ウィルスの複製起点、人工染色体を含むプラスミドＤＮＡベクター）を使用することによって得ることができる。用語としての一時的なトランスフェクション又は一時的にトランスフェクションされたことは、ポリヌクレオチドがトランスフェクションされた細胞のゲノムに統合されない、細胞へのポリヌクレオチドの導入を意味する。ポリヌクレオチドが発現できる遺伝子を含む場合、発現カセットは、染色体の内因性の遺伝子の発現を支配する、調節的な制御を受ける。用語としての一時的なトランスフェクタントは、ポリヌクレオチドがもたらされたが、ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに統合されていない細胞を意味する。
【００４９】
脈管内及び脈管
用語としての脈管内は、直接的な注入よりも、より均一に分配して細胞にポリマー、オリゴヌクレオチド、あるいはポリヌクレオチドの伝達を可能にする、投与の脈管内ルートを意味する。ここでの脈管内は、哺乳類を含む動物の身体内の組織又は器官に結合される脈管と呼ばれる内部の管状構造内を意味する。脈管は、身体内で組織又は器官に結合される内部の中空の管状構造を含む。体液は、管状構造の孔内の身体部分の内外へ流れる。体液の例は、血液、リンパ液、あるいは胆汁を含む。脈管の例は、動脈、小動脈、毛細管、小静脈、シヌソイド、静脈、リンパ管及び胆管を含む。器官の導入性の血管は、器官又は組織に向かって導かれ、正常な生理的な条件下で器官又は組織に向かって血液が流れる脈管として定義される。反対に、器官の輸出性の血管は、器官又は組織から遠ざかって導かれ、正常な生理的な条件下で器官又は組織から遠ざかって血液が流れる脈管として定義される。肝臓において、下大静脈へ肝臓から通常血液を運び去るので、肝臓の静脈は輸出性の血管である。さらに、肝臓では、門脈及び肝臓の動脈は、通常肝臓への血液を保持するので、門脈及び肝臓の動脈は肝臓に関して導入性の血管である。直接の柔組織的な注入と比較して、脈管の中への抑制剤又は抑制剤の複合体の挿入は、抑制剤を柔組織的な細胞に対して、より効率的により均衡のとれた分配で伝達することができる。
【００５０】
修飾
修飾と呼ばれるプロセスを介して修飾が形成されるように、２つの分子が共有結合によって結合される場合、分子は第二の分子によって修飾される。すなわち、２つの分子は、新しい単一の分子の形成物に帰着する１つの分子からの原子と、第２の分子からの原子との間で共有結合を形成する。化学的な共有結合は、電子密度を共有している２つの原子間の相互作用又は結合である。修飾はまた、非共有結合を介する２つの分子間の相互作用を意味する。例えば、クラウンエーテルは、あるアミノ基で非共有結合を形成できる。
【００５１】
塩
塩は、イオン結合、つまり、一個以上の電子がある原子から別の原子まで完全に移動される、を含む如何なる化合物である。塩は、溶液で溶解された場合、陽イオンと陰イオンに分離して、したがって、溶液のイオン強度を強める、イオン化合物である。
【００５２】
薬学的に受容可能な塩
薬学的に受容可能な塩は、酸と塩基の両者の追加的な塩を意味する。
【００５３】
薬学的に受容可能な酸性の追加塩
薬学的に受容可能な酸性の追加塩は、生物学的な有効性及び遊離塩基の特性を保持し、生物学的でないか、あるいはそうでなければ不適当でない、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸及びその他同種のもの、さらに酢酸、プロピオン酸、ピルビン酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸のような有機酸、トリフルオロ酢酸及び同種のものなどの無機酸で形成される塩である。
【００５４】
薬学的に受容可能な塩基の追加塩
薬学的に受容可能な塩基の追加塩は、生物学的な有効性及び遊離酸の特性を保持し、生物学的でなくあるいはそうでなければ不適当でない、無機有機の塩基から遊離酸まで調製される塩である。無機塩基から派生する塩は、下記に限定されないが、ナトリウム、カリウム、カルシウム、リチウム、アンモニア、マグネシウム、亜鉛、及びアルミニウム塩類並びにその他同種のものである。有機塩基から派生する塩は、下記に限定されないが、メチルアミン、トリエチルアミン及びその他同種のものなどの一次、二次及び三次のアミンの塩類である。
【００５５】
乾燥
乾燥は、サンプルから溶媒を除去すること、例えば、減圧下の複合体から溶媒を除去することを意味する。乾燥はまた、サンプルの脱水又はサンプルの凍結乾燥を意味する。
【００５６】
塩が安定した複合体
塩が安定した複合体は、１５０ｍＭの塩化ナトリウム溶液にさらされた場合に安定性を示す複合体である。この場合における安定性は、１５０ｍＭの塩化ナトリウム溶液の複合体において安定した粒子サイズを読む（６０分間にわたって２０％未満の変化）ことによって示される。この場合の安定性はまた、１５０ｍＭの塩化ナトリウム溶液の複合体において複合体内でＤＮＡの非凝縮がない（６０分間にわたって２０％未満の変化）ことによって示される。
【００５７】
高分子電解質間の複合体
高分子電解質間の複合体は、相反する電荷の高分子電解質間の非共有の相互作用である。
【００５８】
電荷、極性及びサイン
合成物の電荷、極性若しくはサインは、合成物が一個以上の電子（正の電荷、極性あるいはサイン）を失ったか又は一個以上の電子（負の電荷、極性あるいはサイン）を獲得したかどうかを意味する。
【００５９】
官能基
官能基は、細胞をターゲットとするシグナル、核の局所化シグナル、エンドソーム若しくは他の細胞内小胞（シグナルを放出する）からの内容物の放出を増強する化合物、及び化合物又は複合体が付加される、化合物又は複合体の挙動若しくは相互作用を変更する他の化合物を含む。
【００６０】
細胞をターゲットとするシグナル
細胞をターゲットとするシグナルは、細胞と生物学的に活性な化合物との関連を増大する、任意のシグナルである。それらのシグナルは、培養又は生物体のいずれかにおいて、細胞位置（組織など）若しくは細胞内の位置（核など）に直接的に導くことができる、薬剤や核酸などの生物学的に活性な化合物を修飾できる。シグナルは、細胞表面及び／又は細胞内部分と細胞表面との関連に対する化合物の結合を高める。外来遺伝子の細胞又は組織の位置を修飾することによって、生物学的な活性物質の機能は増大することができる。細胞をターゲットとするシグナルは、下記に限定しないが、タンパク質，ペプチド、脂質、ステロイド、糖、炭水化物、（発現しない）ポリ核酸又は合成化合物である。リガンドなどの細胞をターゲットとするシグナルは、レセプターへの細胞の結合を増強する。様々なリガンドは、細胞及び特定の細胞のレセプターに対する薬剤や遺伝子をターゲットとするために使用されている。リガンドは、細胞膜上又は細胞に近い細胞膜内のターゲットを探索する。レセプターに対するリガンドの結合は、典型的には、エンドサイトーシスを開始する。リガンドは、アシオログライコプロテイン（ａｓｉｏｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）又はガラクトース残基の使用により、アシアログライコプロテイン（ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）レセプターに対してターゲットとする薬剤を含む。インスリン、ＥＧＦ、又はトランスフェリンなどの他のタンパク質は、ターゲットのために使用できる。ＲＧＤ配列を含むペプチドは、多数の細胞をターゲットとするように使用できる。細胞のチオール、メルカプト基又は二硫化物の基で反応する、化学基も、多種の細胞をターゲットとするために使用することができる。フォラシンと他のビタミンもターゲットとするために使用することができる。他のターゲットとする群は、脂質、脂肪酸、コレステロール、ダンシル化合物及びアンホテリシン派生物のような薄膜と相互作用する分子を含む。さらに、細胞を結合するためにウィルスのタンパク質を使用することができ得る。
【００６１】
細胞と化合物又は複合体との相互作用の後、他のターゲットとする群は、生物学的に有効な化合物の伝達を細胞のある部分に増加させるために使用することができる。
【００６２】
核局所化シグナル
核局所化シグナルは、核に近接する製薬剤及び／又は細胞周期の分裂期中での核への製薬剤のエントリーをターゲットとすることを増強する。そのような核輸送シグナルは、シミアンウイルス４０の大型Ｔ抗原ＮＬＳ又はヌクレオプラスミン（ｎｕｃｌｅｏｐｌａｓｍｉｎ）ＮＬＳのようなタンパク質若しくはペプチドである。それら核局所化シグナルは、カルヨフェリン（ｋａｒｙｏｐｈｅｒｉｎ）ベータと相互作用するＮＬＳレセプター（カルヨフェリンアルファ）のような様々な核輸送因子と相互作用する。核輸送タンパク質自体が核孔及び核に対してターゲットとされるので、核輸送タンパク質自体はさらに、ＮＬＳの機能として機能することができる。例えば、カルヨフェリンベータ自体は、核孔の複合体に対するＤＮＡをターゲットとし得る。幾つかのペプチドは、シミアンウイルス４０のＴ抗原から派生される。他のＮＬＳペプチドは、ｈｎＲＮＰ  Ａ１  タンパク質、ヌクレオプラスミン、ｃ−ｍｙｃなどから派生する。それらは、短いＮＬＳ（Ｈ−ＣＧＹＧＰＫＫＫＲＫＶＧＧ−ＯＨ、ＳＥＱ  ＩＤ  １）又は長いＮＬＳ（Ｈ−ＣＫＫＫＳＳＳＤＤＥＡＴＡＤＳＱＨＳＴ−ＰＰＫＫＫＲＫＶＥＤＰＫＤＦＰＳＥＬＬＳ−ＯＨ、  ＳＥＱ  ＩＤ  ２及びＨ−ＣＫＫＫＷＤＤＥＡＴＡＤＳＱＨＳＴＰＰＫＫＫ−ＲＫＶＥＤＰＫＤＦＰＳＥＬＬＳ−ＯＨ、  ＳＥＱ  ＩＤ  ３）を含む。他のＮＬＳペプチドは、Ｍ９タンパク質（ＣＹＮＤＦＧＮＹＮＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＱＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹ、  ＳＥＱ  
ＩＤ  ４）、Ｅ１Ａ（Ｈ−ＣＫＲＧＰＫＲＰＲＰ−ＯＨ、  ＳＥＱ  ＩＤ  ５）、ヌクレオプラスミン（Ｈ−ＣＫＫＡＶＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫＬ−ＯＨ、  ＳＥＱ  ＩＤ  ６）、及びｃ−ｍｙｃ（Ｈ−ＣＫＫＫＧＰＡＡＫＲＶＫＬＤ−ＯＨ、  ＳＥＱ  ＩＤ  ７）から派生する。
【００６３】
膜の活性な化合物
多数の生物学的に活性な化合物、特に、大型及び／又は電荷された化合物は、生物学的な膜と交差することができない。細胞にそれらの化合物を入れるために、細胞はエンドサイトーシスによって、つまりエンドソームに取られなければならないか、又は化合物が交差することを可能にする細胞の膜の混乱があるに違いない、いずれかである。エンドソームの入り込む場合、エンドソームの膜は、エンドソームからの、及び細胞質内へ移動させるように分裂しなければならない。細胞へのいずれかのエントリー経路は、細胞の膜の混乱か又は変更を要求する。膜を分裂させるか、又は膜融合を促進する化合物は、膜の活性な化合物と呼ばれる。それらの膜を活性する化合物又はシグナルの放出は、エンドソーム（初期及び終期）のような細胞内のコンパートメント、リゾソーム、ファゴソーム、小胞、小胞体、ゴルジ体、トランスゴルジネットワーク（ＴＧＮ）及び筋小胞体からエンドサイトーシスされた物質の放出を増強する。放出は、細胞内のコンパートメントから細胞質への、又は核などの細胞小器官への移動を含む。放出するシグナルは、クロロキン、バフィロマイシン（ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ）又はＢｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ１、及びＥＲを保持するシグナル（ＫＤＥＬシーケンス）のような化学薬品、インフルエンザウイルスの赤血球凝集素サブユニットＨＡ−２ペプチドのようなウィルスの構成部分並びに他のタイプの両親媒性のペプチドを含む。膜の活性な化合物が活性な時と場所の制御は、効果的な輸送にとって重要である。膜の活性剤がある時間と場所において作用する場合、生物学的な膜を越える生物学的に活性な化合物の輸送は容易になる。膜の活性な化合物があまりにも活発であるか、又は間違った時間において活発である場合、輸送は生じないか、若しくは輸送は細胞の破壊と細胞死に関連する。自然は、膜の膜融合及び使用を含む生物学上活性な化合物の膜輸送を許容する様々な戦略を発展させ、膜の活性な化合物の使用の活動は、毒性を有せずに輸送を支援するように調整される。多数の脂質に基づく形態は、膜癒合に依存し、幾つかの膜の活性なペプチドの活動は、ｐＨによって調整される。特に、ウィルスの外殻タンパク質は、ｐＨに感受性であり、中性又は塩基のｐＨで不活性で、エンドソームに見られる酸性条件下では活性である。
【００６４】
細胞を通過する化合物
カチオンの輸入ペプチド（また、ペプチド転置領域、細胞膜転置ペプチド、アルギニンに富んだモチーフ、細胞を通過するペプチド及びぺプトイド（ｐｅｐｔｏｉｄ）の分子のトランスポーター）を含む細胞を通過する化合物は、一般的にアルギニン及びリジン残基に富んでおり、生物学的な膜と交差できる。加えて、膜を越えて付着される分子を輸送できる。例は、ＴＡＴ（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、  ＳＥＱ  ＩＤ  ９）、ＶＰ２２ペプチド、及びＡＮＴｐペプチド（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ、  ＳＥＱ  ＩＤ  １０）を含む。細胞を通過する化合物は、厳密にはペプチドではない。さらに、アミン又はグアニジニウム（ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ）基に富んだ、短い、非ペプチドポリマーは、生物学的な膜と交差する分子を保持することができる。膜の活性なペプチドと同様に、カチオンの輸入ペプチドは、厳密なアミノ酸配列の要求よりも、むしろそれらの活性によって定義される。
【００６５】
相互作用の修飾因子
相互作用の修飾因子は、分子がそれ自体と相互作用するか、又は相互作用の修飾因子を含まない分子に関する他の分子と相互作用する方法を変更する。この修飾の結果は、自己の相互作用又は他の分子との相互作用は、増大又は減少のいずれかである。例えば、細胞をターゲットする信号は、分子と細胞又は細胞の部分との間の相互作用を変化する相互作用の修飾因子である。ポリエチレングリコールは、他の分子を備えて分子とそれら分子自体との間の相互作用を減少する相互作用の修飾因子である。
【００６６】
リンケージ
２つの他の基（化学的な部分）間に共有結合又はスペーサーを提供する付加。リンケージは、電気的に中性であって、又は正又は負の電荷を保持する。化学的な部分は、親水性又は疎水性である。好ましいスペーサーの基は、下記に限定しないが、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ１−Ｃ１２アルケニル、Ｃ１−Ｃ１２アルキニル、Ｃ６−Ｃ１８アラルケル（ａｒａｌｋｙｌ）、Ｃ６−Ｃ１８アラルケニル（ａｒａｌｋｅｎｙｌ）、Ｃ６−Ｃ１８アラルケルニル（ａｒａｌｋｙｎｙｌ）、エステル、エーテル、ケトン、アルコール、多価アルコール、アミド、アミン、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、ポリアミン、チオール、チオールエーテル、チオエステル、リン含有、及び複素環を含む。リンケージは、一つ以上の不安定な結合を含んでもよく、含まなくてもよい。
【００６７】
二官能
クロスリンカーとして一般的に呼ばれる二官能分子は、２つの分子が共に結合される、つまり、２つの分子間にリンケージが形成するように使用される。二官能分子は、ホモ又はヘテロの二官能性を含むことができる。
【００６８】
不安定な結合
不安定な結合は、選択的に破壊されることができる共有結合である。すなわち、不安定な結合は、他の共有結合の破壊を伴わずに、他の共有結合の存在下で破壊されてよい。例えば、二硫化物の結合は、さらに分子に存在する、炭素と炭素、炭素と酸素、炭素と硫黄、炭素と窒素の結合などの他の分子との切断を伴わずに、チオールの存在下で破壊可能である。不安定は切断をも意味する。
【００６９】
不安定なリンケージ
不安定なリンケージは、不安定な結合を含み、２つの他の基の間にリンク又はスペーサーを提供する、化学的な化合物である。リンクされる基は、生物学的に活性な化合物、膜の活性な化合物、膜の活性を阻害する化合物、官能活性基、モノマー及び細胞をターゲットとする信号などの化合物から選択されてよい。スペーサー基は、アルカン、アルケン、エステル、エーテル、グリセリン、アミド、蔗糖エステル、多糖、及び酸素、硫黄又は窒素のようなヘテロ原子を含む基から選択される化学的な部分を含んでよい。スペーサーは電気的に中性であってよく、正又は負の電荷を保持してよく、中性、正若しくは負の全体の電荷を備える正又は負の両電荷を保持してよい。
【００７０】
ｐＨの不安定なリンケージ及び結合
ｐＨの不安定は、酸性条件（ｐＨ＜７）下の共有結合の選択的な破壊を意味する。すなわち、ｐＨの不安定な結合は、破壊されない他の共有結合の存在下の酸性条件で破壊される。
【００７１】
両親媒性化合物
両親媒性化合物は、親水性（水に可溶性）及び疎水性（水に不溶性）部分の両部分を有する。
【００７２】
ポリマー
ポリマーは、モノマーと呼ばれる小さなユニットを共に繰り返して結合することによって構成される分子である。この適用において、用語としてのポリマーは、２乃至約８０モノマーを有するオリゴマーと８０以上のモノマーを有するポリマーの両者を含む。ポリマーは、線形、枝分かれしたネットワーク、星型、くし型、又はポリマーのラダータイプである。ポリマーは、単一のモノマーが使用されるホモポリマーであるか、又は２つ以上のモノマーが使用されるコポリマーである。コポリマーの種類は、交替、ランダム、ブロック及びグラフトを含む。
【００７３】
ポリマーの主鎖は、結合がポリマーの長さの拡張のために必要とされる原子から構成される。ポリマーの側鎖は、結合がポリマーの長さの拡張のために必要とされない原子から構成される。
【００７４】
ポリマー重合の当業者にとって、記載されたプロセスで活用されることができる幾つかの分類のポリマー重合がある。ポリマー重合は、連鎖又は段階である。この分類の記載は、追加及び凝縮ポリマーの以前の用語がかなり頻繁に使用される。“Ｍｏｓｔ  ｓｔｅｐ−ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎｓ  ａｒｅ  ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ａｎｄ  ｍｏｓｔ  ｃｈａｉｎ−ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎｓ  ａｒｅ  ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ”  （Ｍ．  Ｐ．  Ｓｔｅｖｅｎｓ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：  Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９０）．テンプレートのポリマー重合は、娘ポリマーからポリマーを形成するために使用することができる。
【００７５】
ポリマー重合の段階
ポリマー重合の段階において、ポリマー重合は段階ごとに生じる。ポリマー成長は、モノマー、オリゴマー、及びポリマーとの間の反応によって生じる。全体を通して同一の反応であり、終端の基が反応性であるように、終了段階がないので、イニシエータは必要としない。ポリマー重合速度は、官能基が消費されるにつれて減少する。
【００７６】
典型的には、ポリマー重合の段階は、２つの異なる手法のいずれかでなされる。一つの手法は、モノマーが、Ａ−Ｂが−〔Ａ−Ｂ〕−を生じるように、同一分子で（Ａ及びＢの）反応性の両官能基を有する。
【００７７】
または、他のアプローチは、２つの二官能モノマーを有することである。
【００７８】
Ａ−Ａ＋Ｂ−Ｂが−〔Ａ−Ａ−Ｂ−Ｂ〕−を生じる。
【００７９】
さらに別のアプローチは、Ａ−Ａに別の薬剤を添加して−〔Ａ−Ａ〕−を生じるように、一つの二官能基を有することである。
【００８０】
ポリマー重合の連鎖
連鎖反応において、ポリマーのポリマー重合の成長は、成長する鎖の限定された数に対してモノマーユニットの連続的な追加によって生じる。開始及び伸長メカニズムは異なり、通常は、連鎖停止段階がある。ポリマー重合率は、モノマーが無くなるまで一定を維持する。
【００８１】
モノマー及びポリマーの他の化合物
ポリマーは、ポリマーの活用性を高める他の基を有する。それらの基は、ポリマー形成に先立ってモノマーに組み入れられることができるか、又はポリマー形成後にポリマーに付加される。それらの基は、ターゲットとなる基を含み、かかる基は、特定の細胞又は組織に対してポリマーと核酸の複合体をターゲットとするために使用される。それらのターゲットとなる物質の例は、アシアログライコプロテイン又はガラクトース残基の使用によって、アシアログライコプロテインレセプターにターゲットとなる薬剤を含む。インスリン、ＥＧＦ、あるいはトランスフェリンなどの他のタンパク質は、ターゲットとするために使用できる。タンパク質は、ポリペプチドとして互いに接続される２つ以上のアミノ酸残基からなる分子を意味する。アミノ酸は、天然に生じるか、又は合成であってよい。ＲＧＤ配列を含むペプチドは、多数の細胞をターゲットとするように使用できる。細胞上でチオール、メルカプト基あるいは二硫化物基と反応する化学基も、多数の種類の細胞をターゲットとするために使用することができる。フォラシンと他のビタミンもターゲットとするために使用することができる。他のターゲットとする基は、脂肪酸、コレステロール、ダンシル化合物及びアンホテリシン派生物のような膜と相互作用する分子を含む。
【００８２】
細胞と超分子の複合体との相互作用の後に、他のターゲットとする基は薬剤又は核酸の伝達を細胞のある部分に増加させるために使用することができる。例えば、作用薬は、エンドソームを分裂させるために使用することができ、核をターゲットとするために核の局所化する信号（ＮＬＳ）を使用することができる。
【００８３】
様々なリガンドは細胞への、及び特定の細胞のレセプターへの薬剤や遺伝子をターゲットとするために使用された。リガンドは、細胞膜内の、細胞膜上の、あるいは細胞の近くのターゲットを求めてよい。リガンドのレセプターへの結合は、一般的には、エンドサイトーシスを開始する。エンドサイトーシスされないレセプターに結合するＤＮＡ伝達のためにリガンドを使用することができ得る。例えば、インテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎ）レセプターを結合するＲＧＤペプチド配列を含むペプチドが使用されうる。加えて、ウィルスタンパク質は、細胞に複合体を結合するように使用され得る。脂質及びステロイドは、細胞の膜に複合体を直接的に挿入するように使用され得る。
【００８４】
ポリマーはまた、ポリマー内の切断可能な群を含むことができる。ターゲットとする基に付加された場合、切断は、ターゲットとなる基において複合体とレセプターとの間の相互作用を減少するように導く。切断可能な群は、下記に限定されないが、ジスルフィド結合、ジオール、ジアゾ基を含んだ結合、エステル結合、スルホン結合、アセタール、ケタル（ｋｅｔａｌｓ）、エノール・エーテル、エノール・エステル、エナミン及びイミンを含む。
【００８５】
高分子電解質
高分子電解質、又はポリイオンは、一つ以上の電荷を有するポリマーであり、つまり、ポリマーは、一つ以上の電子を得るか失ういずれかの基を含む。ポリカチオンは、正味の正の電荷を有する高分子電解質であり、例えば、臭化水素ポリ−Ｌ−リジンである。ポリカチオンは、正、中性、あるいは負に電荷するモノマーユニットを含むことができるが、しかしながら、ポリマーの正味電荷は正であるべきである。ポリカチオンはまた、２つ以上の正電荷を含む、非ポリマー分子を意味することもできる。ポリアニオンは負、中性、あるいは正に電荷するモノマーユニットを含むことができるが、しかしながら、ポリマーの正味電荷は負であるべきである。ポリアニオンはまた、２つ以上の負電荷を含む、非ポリマー分子を意味することもできる。用語としての高分子電解質は、ポリカチオン、ポリアニオン、両性イオンのポリマー、及び中性ポリマーを含む。用語としての両性イオンは、同一分子の部分である酸性基と塩基との間の反応の産物を意味する。
【００８６】
立体安定剤
立体安定剤は、粒子から粒子への又はポリマーからポリマーへの静電気の相互作用を立体的に妨害することによって凝集を防ぐ長鎖の親水性の基である。例は、アルキル基、ＰＥＧ鎖、多糖類、アルキルアミンを含む。静電気の相互作用は、正電荷と負電荷との間の引き合う力により２つ以上の物質の非共有関係である。
【００８７】
緩衝液
緩衝液は弱酸又は弱塩基及びそれらの塩からなる。緩衝溶液は、追加的な酸又は塩基が溶液に添加された場合、ｐＨの変化に耐える。
【００８８】
生物学的、化学的又は生化学的な反応
生物学的、化学的又は生化学的な反応は、イオン及び／若しくは共有結合の形成又は切断を含む。
【００８９】
反応的
化合物は、他の化合物とイオン又は共有結合のいずれかが形成可能である場合に反応的である。共有結合を形成できる反応的な化合物の部分は、反応的な官能基又は反応的な基として意味する。
【００９０】
ステロイド
ステロイドの派生物はステロール、ヒドロキシ部位が修飾された（例えば、アシル化された）ステロール、ステロイドホルモン、又はそれらのアナログを意味する。修飾は、スペーサー基、リンカー、又は反応基を含むことができる。
【００９１】
立体化学
立体障害、又は立体化学は、同一分子の隣接する基による化学反応の防止又は妨害である。
【００９２】
脂質
水に不溶であるが、クロロホルム及びベンゼンのような有機溶媒に可溶の有機化合物の如何なる種々の群である。脂質は、親水性及び疎水性部分の両部分を含む。用語としての脂質は、複合の脂質、単一の脂質、及び合成の脂質を含むことを意味する。
【００９３】
複合体の脂質
複合体の脂質は、脂肪酸のエステルで、グリセリド（油脂）、糖脂質、リン脂質及びろうを含む。
【００９４】
単一の脂質
単一の脂質は、ステロイド及びテルペンを含む。
【００９５】
合成の脂質
合成の脂質は、カルボン酸がアミドに変換された脂肪酸から調製されたアミド、１つ以上の酸素原子が別のヘテロ原子窒素または硫黄など）によって置換された複合の脂質の合成の変形、及び追加の親水基が化学的に付加された単一の脂質の派生物を含む。合成の脂質は、一つ以上の不安定な基を含んでよい。
【００９６】
脂肪
脂肪は、長鎖のカルボン酸のグリセリン・エステルである。脂肪の加水分解は、グリセリン及びカルボン酸−脂肪酸を生成する。脂肪酸は、飽和又は不飽和（一つ以上の二重結合を含む）であってよい。
【００９７】
油
油は、カルボン酸のエステル、又は脂肪酸のグリセリドである。
【００９８】
糖脂質
糖脂質は脂質を含んでいる砂糖である。砂糖は典型的にガラクトース、グルコースあるいはイノシトールである。
【００９９】
リン脂質
リン脂質は燐酸基及び１つ以上の脂肪酸（脂肪酸のエステルとして）の両方がある脂質である。燐酸基は、１つ以上の追加の有機の基に結合されてよい。
【０１００】
ろう
ろうは、一般に脂肪酸のエステルである、様々な固体か半固体の物質のいずれかである。
【０１０１】
脂肪酸
脂肪酸は、脂質（脂肪、ろう、及びホスホグリセリド）の加水分解産物と考えられる。
【０１０２】
界面活性剤
界面活性剤は、洗剤又は脂質（それはその表面張力の減少によりその拡張特性あるいは湿る特性を増加させるために液体に加えられる）のような界面活性剤である。界面活性剤は、同一分子の極性の基（親水性）及び非極性の（疎水性）基を含む合成物を意味する。切断された界面活性剤は、極性基が２つの基の間に位置した化学結合の破損か切断によって、非極性基から分離されてもよい界面活性剤か、あるいは極性基若しくは非極性基又は両方の基が、界面活性剤の洗剤特性が破壊されるように化学的に修飾されてよい界面活性剤である。
【０１０３】
洗剤
洗剤は、水に可溶で、非極性物質を水の溶液に入らせる化合物である。洗剤は、疎水基と親水基を有する。
【０１０４】
ミセル
ミセルは両親媒性の分子を含んでいるが、膜によって完全に包含される水の容積を含んでいない、微視的な小胞である。ミセルでは、両親媒性化合物の親水性の部分が、外部（小胞の表面上の）上にある。逆のミセルでは、両親媒性化合物の疎水性の部分が外部上にある。したがって、逆のミセルは、逆のミセル内の水及び巨大分子の両方を可溶化できる、極の芯を含む。
【０１０５】
リポソーム
リポソームは、両親媒性分子を含んでおり、膜によって完全に包含される水の容積を含んでいる、微視的な小胞である。
【０１０６】
ミクロの乳剤
ミクロの乳剤は、単一の界面活性剤又は界面活性剤の混合により、単一の位相へ２つの混ざらない液体（水と油）の実質的な量がもたらされる、等方性で、熱力学的に安定した溶液である。自然に形成されたコロイド粒子は、界面活性剤分子の単分子層によって囲まれた、主要でない溶剤の球状の小滴である。自発的な屈曲、油／水の界面で１分子層の界面活性剤のＨ０は、小胞の位相の振る舞い及び微構造を指令する。親水性の界面活性剤は、水の中の油（Ｏ／Ｗ）のミクロの乳剤（Ｈ０＞０）を生成し、一方で、脂肪親和性の強い界面活性剤は、油の中の水（Ｗ／Ｏ）のミクロの乳剤を生成する。
【０１０７】
疎水基
疎水基は、化学的な部位が水を避けることを意味する、性質の用語を示す。典型的には、そのような化学基は可溶性でなく、水素結合を形成しない傾向がある。
【０１０８】
親水基
親水基は、化学的な部位が水を好むことを意味する、性質の用語を示す。典型的には、そのような化学基は可溶性であり、水との水素結合のドナー又はアクセプターである。
【０１０９】
実施例
実施例１．ドデシルアミン塩酸塩の調製
ドデシルアミン（１１３ｍｇ、０．６１０ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）は、メタノール（５００μＬ）に溶解し、塩化水素（７ｍＬ、１Ｍのジエチルエーテル、アルドリッチ）を加えることによりその塩酸塩の塩に変換された。生じた沈殿は、ジエチルエーテルで洗浄され、白い固体としてドデシルアミン塩酸塩（１１５ｍｇ、収率８５％）を与えるために真空乾燥された。
【０１１０】
実施例２．ｐＤＮＡとドデシルアミン塩酸塩との複合体の調製
水（５０μＬ）に、ｐＤＮＡ（０．３０μｍｏｌのリン酸塩１００μｇ、２ｍｇ／ｍＬの５０μＬの水溶液）の溶液が混合して加えられた。ドデシルアミン塩酸塩の水溶液（１３．４μＬ、１３４μｇ、０．６０μｍｏｌ）が、混合して加えられた。１０分後に、沈殿は遠心分離でスピンダウンされた。また、ペレットは水（２ｘ１００μＬ）で洗浄された。生じたペレットは、Ｐ２Ｏ５で３日間凍結乾燥装置にて乾燥された。
【０１１１】
実施例３．ｐＤＮＡと臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）との複合体の調製
水（５０μＬ）に、ｐＤＮＡ（０．３０μｍｏｌのリン酸塩１００μｇ、２ｍｇ／ｍＬの５０μＬの水溶液）の溶液が混合して加えられた。ドデシルアミン塩酸塩の水溶液（１３．４μＬ、１３４μｇ、０．６０μｍｏｌ）が、混合して加えられた。１０分後に、沈殿は遠心分離でスピンダウンされた。また、ペレットは水（２ｘ１００μＬ）で洗浄された。生じたペレットは、Ｐ２Ｏ５で３日間凍結乾燥装置にて乾燥された。
【０１１２】
実施例４．Ｃｙ３−ＤＮＡ−ＮＣ１２の調製
Ｈ２Ｏ（１５μＬ）にＣｙ３（０．３０μｍｏｌのリン酸塩、１．１７μｇ／μＬの８５μＬのＨ２Ｏ、１００μｇ）が添加されて、穏やかに混合された。ＮＣ１２（０．６１μｍｏｌ、１０μｇ／μＬの１３．４μＬのＨ２Ｏ、１３４μｇ）が添加されて、穏やかに混合された。ピンク色の沈殿が形成された。室温で１０分間反応されて、ペレットを形成するために遠心分離によってスピンダウンされた。上澄みが捨てられ、ペレットは水で２回洗浄された。ペレットは、Ｐ２Ｏ５で数日間凍結乾燥された。
【０１１３】
実施例５．キトサンが修飾されたオレイン酸の調製
オレイン酸（４．１５μＬ、１３．２ｍｍｏｌ、アルドリッチ）がＤＭＦ（３４２μＬ）に溶解された。生じた溶液に、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１３．２μｍｏｌ、１００ｍｇ／ｍＬの２９μＬの水溶液、ピアスケミカルカンパニー）と、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（１３．２μｍｏｌ、２０ｍｇ／ｍＬの１２５μＬの水溶液、アルドリッチ）が添加され、生じた溶液は室温で攪拌された。１時間後に溶液はＤＭＦ（３．５ｍＬ）のキトサン（終濃度を１０ｍｇ／ｍＬとなるように試薬は１％塩酸水に溶解された。５００μＬの濃縮が５００μＬの水に溶解されて、１Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ６．５に調節された。５．０ｍｇのポリマー（８５％デアシル化）、３１μｍｏｌのアミン、フルカケミカルカンパニー）に添加された。生じた溶液は、８０％ＤＭＦ／水の１ｍｇ／ｍｌ溶液としてキトサンが修飾されたオレイン酸を与えるために、１６時間室温で攪拌された。
【０１１４】
実施例６．オレイン酸とキトサンが修飾されたラクトバイオン酸（Ｌａｃｔｏｂｉｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ）の調製
ＤＭＦのラクトバイオン酸のストック溶液は、１００ｍｇ／ｍｌの終濃度に調製された。９．４５μＬのラクトバイオン酸のストック溶液（９４５μｇ、２．６４μｍｏｌ、アルドリッチ）にＤＭＦ（４３７μＬ）、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（５７３μｇ、２．６４μｍｏｌ、２０ｍｇ／ｍＬの２８．７μＬの水溶液、ピアスケミカルカンパニー）と、１−（３−ジメチル−アミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（５０５μｇ、２．６４μｍｏｌ、２０ｍｇ／ｍＬの２５．３μＬのＤＭＦ溶液、アルドリッチ）が添加された。生じた溶液は周辺温度で１時間攪拌されて、キトサンが修飾されたオレイン酸（８０％ＤＭＦ／水の１ｍｇ／ｍｌ溶液の１ｍＬ）が添加された。生じた溶液は、０．６６７ｍｇ／ｍｌ溶液としてオレイン酸及びラクトバイオン酸を与えるために、１６時間周辺温度で攪拌された。
【０１１５】
実施例７．キトサンが修飾されたデオキシコール酸の調製
デオキシコール酸（カルビオケム）は、１００ｍｇ／ｍＬの終濃度まで水に溶解された。デオキシコール酸の水溶液（１１μＬ、２．７μｍｏｌ）に、ＤＭＦ（４０７μＬ）が加えられ、続けて、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（２．７μｍｏｌ、１０ｍｇ／ｍＬの５７μＬの水溶液、ピアスケミカルカンパニー）と、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（２０ｍｇ／ｍＬの２５μＬのＤＭＦ溶液、アルドリッチ）が添加され、生じた溶液は室温で攪拌された。１時間後にキトサン（終濃度を１０ｍｇ／ｍＬとなるように試薬は１％塩酸水に溶解された。１ｍＬの濃縮が５ｍＬの水に溶解されて、３Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ６．５に調節された。１０ｍｇのポリマー（８５％デアシル化）、５３μｍｏｌのアミン、フルカケミカルカンパニー）が添加され、生じた溶液は、キトサンが修飾されたデオキシコール酸を与えるために、１６時間室温で攪拌された。
【０１１６】
実施例８．キトサンが修飾されたコール酸の調製
コール酸（カルビオケム）は、１００ｍｇ／ｍＬの終濃度まで水に溶解された。コール酸の水溶液（１１μＬ、２．７μｍｏｌ）に、ＤＭＦ（４０７μＬ）が加えられ、続けて、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（２．７μｍｏｌ、１０ｍｇ／ｍＬの５７μＬの水溶液、ピアスケミカルカンパニー）と、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（２０ｍｇ／ｍＬの２５μＬのＤＭＦ溶液、アルドリッチ）が添加され、生じた溶液は室温で攪拌された。１時間後にキトサン（終濃度を１０ｍｇ／ｍＬとなるように試薬は１％塩酸水に溶解された。１ｍＬの濃縮が５ｍＬの水に溶解されて、３Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ６．５に調節された。１０ｍｇのポリマー（８５％デアシル化）、５３μｍｏｌのアミン、フルカケミカルカンパニー）が添加され、生じた溶液は、キトサンが修飾されたコール酸を与えるために、１６時間室温で攪拌された。
【０１１７】
実施例９．２−プロピオン−３−メチルマレイン無水物（カルボキシジメチルマレイン無水物又はＣＤＭ）
５０ｍＬの無水のテトラヒドロフランの水素化ナトリウム（０．５８ｇ、２５ｍｍｏｌ）の懸濁液に、トリエチル−２−ホスホノプロピオン酸エステル（７．１ｇ、３０ｍｍｏｌ）が添加された。水素の泡が停止した後、１０ｍＬの無水のテトラヒドロフランのジメチル−２−オキソグルタル酸（３．５ｇ、２０ｍｍｏｌ）が添加されて３０分間攪拌された。次いで、１０ｍＬの水が添加されて、回転式の蒸発によってテトラヒドロフランが除去された。生じた固体と水の混合は、５０ｍＬのエチルエーテルで３回抽出された。エーテルの抽出物はいっしょにされて、硫酸マグネシウムで乾燥されて、明るい黄色のオイルに濃縮された。４ｇｍ（８２％収率）の純粋なトリエステルを生じるように２：１のエーテル：へキサンのシリカゲルの溶離クロマトグラフィーでオイルが精製された。次いで、２−プロピオン−３−メチルマレインの無水物は、このトリエステルを、４．５ｇ（５等価物）の水酸化カリウムを含有する水とエタノールの５０ｍＬの５０／５０の混合液に溶解することによって形成される。この溶液は１時間逆流に熱せられた。次いで、エタノールは回転式蒸発によって除去され、溶液は塩酸でｐＨ２まで酸性化された。次いで、この水溶液は２００ｍＬの酢酸エチルで抽出され、分離されて、硫酸マグネシウムで乾燥されて、白色の固体に濃縮された。次いで、２ｇ（８０％の収率）の２−プロピオン−３−メチルマレインの無水物を生じるために、この固体はジクロロメタンとヘキサンから再結晶された。
【０１１８】
実施例１０．２−（ドデシルプロピオンアミド）−３−メチルマレインの無水物（ＣＤＭＮＣ１２）の調製
２−（ドデシルプロピオンアミド）−３−メチルマレインの無水物（１００ｍｇ、０．５４３ｍｍｏｌ）はジクロロメタン（３ｍＬ）で溶解された。生じた溶液はアイスバスで０℃まで冷却され、塩化オキサリル（４９．７μＬ、０．５７ｍｍｏｌ、アルドリッチ）はシリンジで滴下して添加された。生じた溶液は室温まで温められて、ドデシルアミン（２０６ｍｇ、１．１１ｍｍｏｌ、アルドリッチ）が添加され、続いて、ジイソプロピルエチルアミン（９４．６μＬ、０．５４３ｍｍｏｌ、アルドリッチ）が添加された。１６時間後、溶液は減圧下（アスピレータ）で濃縮され、酢酸エチルと水に分割された。１７９ｍｇ（９４％）の２−（ドデシルプロピオンアミド）−３−メチルマレインの無水物（ＣＤＭＮＣ１２）を与えるために、有機層は１Ｎ塩酸（３Ｘ）、塩水で洗浄され、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）され、濾過されて、濃縮された。
【０１１９】
実施例１１．キトサン−ＣＤＭＮＣ１２（Ｃｈｉｔ−ＣＤＭＮＣ１２）の調製
キトサン（２００μｇ、１０μｇ／μＬの１％塩酸の２０μＬ、１．０６μｍｏｌのアミン、フルカケミカルカンパニー）にエタノール（２０μＬ）と数ｍｇのジイソプロピルアミノメチル−ポリスチレンの固体の支持塩基（フルカケミカルカンパニー）が添加された。ＣＤＭＮＣ１２（１８５μｇ、１．８５μＬの１００μｇ／μＬのＤＭＦ、０．５３μｍｏｌ）が添加され、反応は室温で３０分間攪拌されて、固体の支持塩基が遠心分離によって除去された。
【０１２０】
実施例１２．キトサン−ＣＤＭＣ１２−ＣＤＭ（Ｃｈｉｔ−ＣＤＭＣ１２−ＣＤＭ）の調製
Ｃｈｉｔ−ＣＤＭＣ１２（２００μｇ、１００μＬの２μｇ／μＬのエタノール、０．５３μｍｏｌのアミン）に数ｍｇのジイソプロピルアミノメチル−ポリスチレンの固体の支持塩基（フルカケミカルカンパニー）が添加された。２−プロピオン−３−メチルマレインの無水物（ＣＤＭ）（９７μｇ、１０μＬの１０μｇ／μＬのＤＭＦ、０．５３μｍｏｌ）が添加され、反応は室温で３０分間攪拌されて、固体の支持塩基が遠心分離によって除去された。
【０１２１】
実施例１３．キトサン−オレイン−ＣＤＭ（Ｃｈｉｔ−Ｏｌ−ＣＤＭ）の調製
Ｃｈｉｔ−Ｏｌ（５００μｇ、１００μＬの５μｇ／μＬの８０％ＤＭＦ、１．３μｍｏｌ）に数ｍｇのジイソプロピルアミノメチル−ポリスチレンの固体の支持塩基（フルカケミカルカンパニー）が添加されて十分に混合された。ＣＤＭ（２４４μｇ、２．４μＬの１００μｇ／μＬのＤＭＦ、１．３μｍｏｌ）が添加され、反応は室温で３０分間攪拌されて、固体の支持塩基が遠心分離によって除去された。
【０１２２】
実施例１４．キトサン−オレイン−無水コハク酸（Ｃｈｉｔ−Ｏｌ−ＳＡ）の調製
Ｃｈｉｔ−Ｏｌ（５００μｇ、１００μＬの５μｇ／μＬの８０％ＤＭＦ、１．３μｍｏｌ）に数ｍｇのジイソプロピルアミノメチル−ポリスチレンの固体の支持塩基（フルカケミカルカンパニー）が添加されて十分に混合された。無水コハク酸（１３２μｇ、１．３μＬの１００μｇ／μＬのＤＭＦ、１．３μｍｏｌ）が添加され、反応は室温で３０分間攪拌されて、固体の支持塩基が遠心分離によって除去された。
【０１２３】
実施例１５．ＭＣ７９１−ＣＤＭの調製
ＭＣ７９１は、ビニルエーテルの重合から調製されるポリマーである。ＭＣ７９１における重合供給率（モル比）は、４７％エチルビニルエーテル、３％オクタデシルビニルエーテル、及び５０％１−アミノエチルビニルエーテル（フタルイミドの派生物として重合反応中に保護された）である。ＭＣ７９１（２００μｇ、２０μＬの１０μｇ／μＬのＨ２Ｏ、３．２μｍｏｌのアミン）に、エタノール（８０μＬ）及び数ｍｇのジイソプロピルアミノメチル−ポリスチレンの固体の支持塩基（フルカケミカルカンパニー）が添加された。溶液が十分に混合された。ＣＤＭ（２００μｇ、２．０μＬの１００μｇ／μＬのＤＭＦ、１．１μｍｏｌ）が添加され、反応は室温で３０分間攪拌された。固体の支持塩基が遠心分離によって除去された。
【０１２４】
実施例１６．ＭＣ７９１−ＣＤＭＣ１２−ＣＤＭの調製
ＭＣ７９１は、ビニルエーテルの重合から調製されるポリマーである。ＭＣ７９１における重合供給率（モル比）は、４７％エチルビニルエーテル、３％オクタデシルビニルエーテル、及び５０％１−アミノエチルビニルエーテル（フタルイミドの派生物として重合反応中に保護された）である。ＭＣ７９１（２００μｇ、２０μＬの１０μｇ／μＬのＨ２Ｏ、３．２μｍｏｌのアミン）に、エタノール（８０μＬ）及び数ｍｇのジイソプロピルアミノメチル−ポリスチレンの固体の支持塩基（フルカケミカルカンパニー）が添加された。溶液が十分に混合された。ＣＤＭＣ１２（２００μｇ、２．０μＬの１００μｇ／μＬのＤＭＦ、０．５７μｍｏｌ）が添加され、反応は室温で３０分間攪拌された。ＣＤＭ（２００μｇ、２．０μＬの１００μｇ／μＬのＤＭＦ、１．１μｍｏｌ）が添加され、反応は室温でさらに３０分間攪拌された。固体の支持塩基が遠心分離によって除去された。
【０１２５】
実施例１７．ＭＣ７８７−ＣＤＭの調製
ＭＣ７８７は、ビニルエーテルの重合から調製されるポリマーである。ＭＣ７８７における重合供給率（モル比）は、４７％ｎ−プロピルビニルエーテル、３％オクタデシルビニルエーテル、及び５０％１−アミノエチルビニルエーテル（フタルイミドの派生物として重合反応中に保護された）である。ＭＣ７８７（２００μｇ、２０μＬの１０μｇ／μＬのＨ２Ｏ、３．２μｍｏｌのアミン）に、エタノール（８０μＬ）及び数ｍｇのジイソプロピルアミノメチル−ポリスチレンの固体の支持塩基（フルカケミカルカンパニー）が添加された。溶液が十分に混合された。ＣＤＭ（２００μｇ、２．０μＬの１００μｇ／μＬのＤＭＦ、１．１μｍｏｌ）が添加され、反応は室温で３０分間攪拌された。固体の支持塩基が遠心分離によって除去された。
【０１２６】
実施例１８．ＭＣ７８７−ＣＤＭＣ１２−ＣＤＭの調製
ＭＣ７８７は、ビニルエーテルの重合から調製されるポリマーである。ＭＣ７８７における重合供給率（モル比）は、４７％ｎ−プロピルビニルエーテル、３％オクタデシルビニルエーテル、及び５０％１−アミノエチルビニルエーテル（フタルイミドの派生物として重合反応中に保護された）である。ＭＣ７８７（２００μｇ、２０μＬの１０μｇ／μＬのＨ２Ｏ、３．２μｍｏｌのアミン）に、エタノール（８０μＬ）及び数ｍｇのジイソプロピルアミノメチル−ポリスチレンの固体の支持塩基（フルカケミカルカンパニー）が添加された。溶液が十分に混合された。ＣＤＭＣ１２（２００μｇ、２．０μＬの１００μｇ／μＬのＤＭＦ、０．５７μｍｏｌ）が添加され、反応は室温で３０分間攪拌された。ＣＤＭ（２００μｇ、２．０μＬの１００μｇ／μＬのＤＭＦ、１．１μｍｏｌ）が添加され、反応は室温でさらに３０分間攪拌された。固体の支持塩基が遠心分離によって除去された。
【０１２７】
実施例１９．カチオンの界面活性剤でｐＤＮＡの凝縮
部分Ａ。臭化セチルトリメチル−アンモニウム（ＣＴＡＢ）でローダミン標識ＤＮＡの凝縮の決定
ＰＣＩＬｕｃ  ＤＮＡ（ｐＤＮＡ［Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７］は、ＭｉｒｕｓのＬａｂｅｌ  ＩＴ（Ｒ）  Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ｋｉｔ  （Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ，  Ｍｉｒｕｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して１００塩基ごとに１つのローダミンを標識するように修飾された。修飾されたｐＤＮＡ（１０μｇ）は、水で標識（９０μｇ）されておらず、水で１μｇ／μＬの終濃度に希釈されたｐＤＮＡと混合された。修飾されたｐＤＮＡ／ｐＤＮＡの混合物（５μｇ）は、５００μＬの終量まで水で希釈された。ＣＴＡＢの異なる量が溶液に添加されて、溶液の蛍光強度がＣａｒｙ  Ｅｃｌｉｐｓｅ蛍光分光光度計（励起＝５５５、放射＝５８５、Ｖａｒｉａｎ，  Ｉｎｃ．）を使用して測定された。Ｔｒｕｂｅｔｓｋｏｙ  ｅｔ  ａｌは、ｐＤＮＡが凝縮されるようにローダミン標識したｐＤＮＡが、蛍光のクエンチングを受けることを照明した［Ｔｒｕｂｅｔｓｋｏｙ，  １９９９］。
【０１２８】
【表１】
2005529959.tif 000002
結果は、ＣＴＡＢが、ＣＴＡＢの文献のｃｍｃ（１ｍＭ）［Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，  ２０００  −  ２００１］よりも低い０．３３ｍＭのＣＴＡＢ濃度でｐＤＮＡを凝縮することを示す。
【０１２９】
部分Ｂ．ドデシルアミン塩酸塩でローダミン標識ＤＮＡの凝縮の決定
ＰＣＩＬｕｃ  ＤＮＡ（ｐＤＮＡ）［Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７］は、ＭｉｒｕｓのＬａｂｅｌ  ＩＴ（Ｒ）  Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ｋｉｔ  （ＤＮＡ標識試薬を含有するローダミン、  Ｍｉｒｕｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して１００塩基ごとに１つのローダミンを標識するように修飾された。修飾されたｐＤＮＡ（１０μｇ）は、水で標識（９０μｇ）されておらず、水で１μｇ／μＬの終濃度に希釈されたｐＤＮＡと混合された。修飾されたｐＤＮＡ／ｐＤＮＡの混合物（５μｇ）は、５００μＬの終量まで水で希釈された。ドデシルアミン塩酸塩の異なる量が溶液に添加されて、溶液の蛍光強度がＣａｒｙ  Ｅｃｌｉｐｓｅ蛍光分光光度計（励起＝５５５、放射＝５８５、Ｖａｒｉａｎ，  Ｉｎｃ．）を使用して測定された。Ｔｒｕｂｅｔｓｋｏｙ  ｅｔ  ａｌは、ｐＤＮＡが凝縮されるようにローダミン標識したｐＤＮＡが、蛍光のクエンチングを受けることを照明した［Ｔｒｕｂｅｔｓｋｏｙ，  １９９９］。
【０１３０】
【表２】
2005529959.tif 000003
結果は、ｐＤＮＡが０．０３６乃至０，０５４ｍＭのドデシルアミン塩酸塩の濃度に凝縮されることを示した。
【０１３１】
実施例２０．修飾されたキトサンポリマーを有するｐＤＮＡ−ＮＣ１２（ｐＣＩＬｕｃ）のマウスの尾部の静脈注入
１５の複合体が下記のように調製された。
【０１３２】
複合体Ｉ：Ｈ２Ｏ（２ｍＬ）中のｐＤＮＡ（ｐＣＩＬｕｃ、４０μｇ）。リンゲル液（１０ｍＬ）は、注入に先立って添加される。
【０１３３】
複合体ＩＩ：ｐＤＮＡ−ＮＣ１２（ｐＣＩＬｕｃ、４０μｇ、４０μＬの１μｇ／μＬのエタノール）がＨ２Ｏ（２ｍＬ）に添加されて、ボルテックスされた。リンゲル液（１０ｍＬ）は、注入に先立って添加されて十分に混合された。
【０１３４】
複合体ＩＩＩ：ｐＤＮＡ−ＮＣ１２（ｐＣＩＬｕｃ、４０μｇ、４０μＬの１μｇ／μＬのエタノール）がＨ２Ｏ（２ｍＬ）のＣｈｉｔ−Ｏｌ（８４μｇ、０．２２μｍｏｌ）溶液に添加されて、ボルテックスされた。リンゲル液（１０ｍＬ）は、注入に先立って添加されて十分に混合された。
【０１３５】
複合体ＩＶ：ｐＤＮＡ−ＮＣ１２（ｐＣＩＬｕｃ、４０μｇ、４０μＬの１μｇ／μＬのエタノール）がＨ２Ｏ（２ｍＬ）のＣｈｉｔ−Ｏｌ−ＬＢＡ（８４μｇ、０．２２μｍｏｌ）溶液に添加されて、ボルテックスされた。リンゲル液（１０ｍＬ）は、注入に先立って添加されて十分に混合された。
【０１３６】
複合体Ｖ：ｐＤＮＡ−ＮＣ１２（ｐＣＩＬｕｃ、４０μｇ、４０μＬの１μｇ／μＬのエタノール）がＨ２Ｏ（２ｍＬ）のＣｈｉｔ−ＣＤＭＣ１２（８４μｇ、０．２２μｍｏｌ）溶液に添加されて、ボルテックスされた。リンゲル液（１０ｍＬ）は、注入に先立って添加されて十分に混合された。
【０１３７】
複合体ＶＩ：ｐＤＮＡ−ＮＣ１２（ｐＣＩＬｕｃ、４０μｇ、４０μＬの１μｇ／μＬのエタノール）がＨ２Ｏ（２ｍＬ）のＣｈｉｔ−Ｏｌ−ＳＡ（８４μｇ、０．２２μｍｏｌ）溶液に添加されて、ボルテックスされた。リンゲル液（１０ｍＬ）は、注入に先立って添加されて十分に混合された。
【０１３８】
複合体ＶＩＩ：ｐＤＮＡ−ＮＣ１２（ｐＣＩＬｕｃ、４０μｇ、４０μＬの１μｇ／μＬのエタノール）がＨ２Ｏ（２ｍＬ）のＣｈｉｔ−Ｏｌ−ＣＤＭ（８４μｇ、０．２２μｍｏｌ）溶液に添加されて、ボルテックスされた。リンゲル液（１０ｍＬ）は、注入に先立って添加されて十分に混合された。
【０１３９】
複合体ＶＩＩＩ：ｐＤＮＡ−ＮＣ１２（ｐＣＩＬｕｃ、４０μｇ、４０μＬの１μｇ／μＬのエタノール）がＨ２Ｏ（２ｍＬ）のＣｈｉｔ−ＣＤＭ（８４μｇ、０．２２μｍｏｌ）溶液に添加されて、ボルテックスされた。リンゲル液（１０ｍＬ）は、注入に先立って添加されて十分に混合された。
【０１４０】
複合体ＩＸ：ｐＤＮＡ−ＮＣ１２（ｐＣＩＬｕｃ、４０μｇ、４０μＬの１μｇ／μＬのエタノール）がＨ２Ｏ（２ｍＬ）のＣｈｉｔ−ＣＤＭＣ１２−ＣＤＭ（８４μｇ、０．２２μｍｏｌ）溶液に添加されて、ボルテックスされた。リンゲル液（１０ｍＬ）は、注入に先立って添加されて十分に混合された。
【０１４１】
複合体Ｘ：ｐＤＮＡ−ＮＣ１２（ｐＣＩＬｕｃ、４０μｇ、４０μＬの１μｇ／μＬのエタノール）がＨ２Ｏ（２ｍＬ）のＣｈｉｔ−ＬＢＡ−ＣＤＭＣ１２（８４μｇ、０．２２μｍｏｌ）溶液に添加されて、ボルテックスされた。リンゲル液（１０ｍＬ）は、注入に先立って添加されて十分に混合された。
【０１４２】
複合体ＸＩ：ｐＤＮＡ−ＮＣ１２（ｐＣＩＬｕｃ、４０μｇ、４０μＬの１μｇ／μＬのエタノール）がＨ２Ｏ（２ｍＬ）のＣｈｉｔ−Ｃｈｏｌ（８４μｇ、０．２２μｍｏｌ）溶液に添加されて、ボルテックスされた。リンゲル液（１０ｍＬ）は、注入に先立って添加されて十分に混合された。
【０１４３】
複合体ＸＩＩ：ｐＤＮＡ−ＮＣ１２（ｐＣＩＬｕｃ、４０μｇ、４０μＬの１μｇ／μＬのエタノール）がＨ２Ｏ（２ｍＬ）のＣｈｉｔ−Ｃｈｏｌ−ＣＤＭＣ１２（８４μｇ、０．２２μｍｏｌ）溶液に添加されて、ボルテックスされた。リンゲル液（１０ｍＬ）は、注入に先立って添加されて十分に混合された。
【０１４４】
複合体ＸＩＩＩ：ｐＤＮＡ−ＮＣ１２（ｐＣＩＬｕｃ、４０μｇ、４０μＬの１μｇ／μＬのエタノール）がＨ２Ｏ（２ｍＬ）のＣｈｉｔ−Ｃｈｏｌ−ＣＤＭＣ１２−ＣＤＭ（８４μｇ、０．２２μｍｏｌ）溶液に添加されて、ボルテックスされた。リンゲル液（１０ｍＬ）は、注入に先立って添加されて十分に混合された。
【０１４５】
複合体ＸＩＶ：ｐＤＮＡ−ＮＣ１２（ｐＣＩＬｕｃ、４０μｇ、４０μＬの１μｇ／μＬのエタノール）がＨ２Ｏ（２ｍＬ）のＣｈｉｔ（８４μｇ、０．２２μｍｏｌ）溶液に添加されて、ボルテックスされた。リンゲル液（１０ｍＬ）は、注入に先立って添加されて十分に混合された。
【０１４６】
複合体ＸＶ：ｐＤＮＡ（ｐＣＩＬｕｃ、４０μｇ）がＨ２Ｏ（２ｍＬ）のＣｈｉｔ（８４μｇ、０．２２μｍｏｌ）溶液に添加されて、ボルテックスされた。リンゲル液（１０ｍＬ）は、注入に先立って添加されて十分に混合された。
【０１４７】
体重１０ｇにつき１．０ｍＬの尾部の静脈注入（〜２．５ｍＬ）は、３０ゲージの０．５インチ注射針を使用してＩＣＲマウス（ｎ＝２）で行われた。注入は、４乃至５秒の注入時間で手動式に成された［Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９；  Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９］。注入の一日後、肝臓を取り出し、分解バッファー（０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ  １００、０．１Ｍリン酸カリウム、１ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ７．８）で均一化した。不溶解物質は遠心分離で取り除かれ、１０μｌの細胞の抽出物又は１０倍に希釈された抽出物は、すでに報告したようにルシフェラーゼ活性において分析された［Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ  １９９０］。
【０１４８】
結果：２．５ｍＬの注入
【０１４９】
【表３】
2005529959.tif 000004
結果は、ｐＤＮＡ−ＮＣ１２でのｐＣＩ  Ｌｕｃ  ＤＮＡ発現の増大したレベル／ｐＣＩ  Ｌｕｃ  ＤＮＡにわたる修飾されたキトサン複合体／キトサン複合体を示す。さらに、結果は、ｐＤＮＡがｐＤＮＡ−ＮＣ１２／修飾されたキトサン複合体から放出され、転写のためにアクセス可能であることを示す。
【０１５０】
実施例２１．修飾されたキトサンポリマーを有するｐＤＮＡ−ＮＣ１２（ｐＣＩＬｕｃ）のマウスの尾部の静脈注入。
【０１５１】
７つの複合体が下記のように調製された。
【０１５２】
複合体Ｉ：Ｈ２Ｏ（７５０μＬ）内のｐＤＮＡ（ｐＣＩＬｕｃ、３０μｇ）
複合体ＩＩ：ｐＤＮＡ−ＮＣ１２（ｐＣＩＬｕｃ、３０μｇ、３０μＬの１μｇ／μＬエタノール）がＨ２Ｏ（７５０μＬ）に添加されて、ボルテックスされた。
【０１５３】
複合体ＩＩＩ：ｐＤＮＡ−ＮＣ１２（ｐＣＩＬｕｃ、３０μｇ、３０μＬの１μｇ／μＬエタノール）がＨ２Ｏ（７５０μＬ）内のＣｈｉｔ−Ｏｌ（６３μｇ、０．１７μｍｏｌ）溶液に添加されて、ボルテックスされた。
【０１５４】
複合体ＩＶ：ｐＤＮＡ−ＮＣ１２（ｐＣＩＬｕｃ、３０μｇ、３０μＬの１μｇ／μＬエタノール）がＨ２Ｏ（７５０μＬ）内のＣｈｉｔ−ＣＤＭ１２（６３μｇ、０．１７μｍｏｌ）溶液に添加されて、ボルテックスされた。
【０１５５】
複合体Ｖ：ｐＤＮＡ−ＮＣ１２（ｐＣＩＬｕｃ、３０μｇ、３０μＬの１μｇ／μＬエタノール）がＨ２Ｏ（７５０μＬ）内のＣｈｉｔ−Ｏｌ−ＬＢＡ（６３μｇ、０．１７μｍｏｌ）溶液に添加されて、ボルテックスされた。
【０１５６】
複合体ＶＩ：ｐＤＮＡ−ＮＣ１２（ｐＣＩＬｕｃ、３０μｇ、３０μＬの１μｇ／μＬエタノール）がＨ２Ｏ（７５０μＬ）内のＣｈｉｔ（６３μｇ、０．１７μｍｏｌ）溶液に添加されて、ボルテックスされた。
【０１５７】
複合体ＶＩＩ：ｐＤＮＡ（ｐＣＩＬｕｃ、３０μｇ）がＨ２Ｏ（７５０μＬ）内のＣｈｉｔ（６３μｇ、０．１７μｍｏｌ）溶液に添加されて、ボルテックスされた。
【０１５８】
２５０μＬの複合体の２５０μＬの尾部静脈注入が、１０秒以内の手による総溶液で３０ゲージの０．５インチ針を使用してＩＣＲハツカネズミ（ｎ＝２）で実行された。注入の１日後に、動物は犠牲にされて、ルシフェラーゼ分析は肝臓、脾臓、肺、心臓及び腎臓上で導かれた。ルシフェラーゼの発現は、既に報告したように決定された（Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．  １９９０．）。Ａ  Ｌｕｍａｔ  ＬＢ  ９５０７  （ＥＧ＆Ｇ  Ｂｅｒｔｈｏｌｄ，  Ｂａｄ−Ｗｉｌｄｂａｄ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）ルミノメーターが使用された。
【０１５９】
結果：２５０μＬ注入
【０１６０】
【表４】
2005529959.tif 000005
結果は、ｐＣＩＬｕｃＤＮＡ／キトサン複合体にわたってｐＤＮＡ−ＮＣ１２／修飾されたキトサン複合体でのｐＣＩＬｕｃＤＮＡ発現の増大したレベルを示す。それらの結果はまた、ｐＤＮＡがｐＤＮＡ−ＮＣ１２／修飾されたキトサン複合体から放出され、転写のためにアクセス可能である。
【０１６１】
実施例２２．修飾されたキトサンポリマーを有するＣｙ３−ｐＤＮＡ−ＮＣ１２（ｐＣＩＬｕｃ）のマウスの尾部の静脈注入。
【０１６２】
３つの複合体が下記のように調製された。
【０１６３】
複合体Ｉ：Ｃｙ３−ｐＤＮＡ−ＮＣ１２（ｐＣＩＬｕｃ、４０μｇ、４０μＬの１μｇ／μＬエタノール）がＨ２Ｏ（５００μＬ）に添加されて、ボルテックスされた。
【０１６４】
複合体ＩＩ：Ｃｙ３−ｐＤＮＡ−ＮＣ１２（ｐＣＩＬｕｃ、４０μｇ、４０μＬの１μｇ／μＬエタノール）がＨ２Ｏ（５００μＬ）内のＣｈｉｔ−Ｏｌ（８４μｇ、０．２２μｍｏｌ）溶液に添加されて、ボルテックスされた。
【０１６５】
複合体ＩＩＩ：Ｃｙ３−ｐＤＮＡ−ＮＣ１２（ｐＣＩＬｕｃ、４０μｇ、４０μＬの１μｇ／μＬエタノール）がＨ２Ｏ（５００μＬ）内のＣｈｉｔ−Ｏｌ−ＬＢＡ（８４μｇ、０．２２μｍｏｌ）溶液に添加されて、ボルテックスされた。
【０１６６】
２５０μＬの複合体の２５０μＬの尾部静脈注入が、１０秒以内の手による総溶液で３０ゲージの０．５インチ針を使用してＩＣＲハツカネズミ（ｎ＝２）で実行された。注入の１日後に、動物は犠牲にされて、ルシフェラーゼ分析は肝臓、脾臓、肺、心臓及び腎臓上で導かれた。ルシフェラーゼの発現は、既に報告したように決定された（Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．  １９９０．）。Ａ  Ｌｕｍａｔ  ＬＢ  ９５０７  （ＥＧ＆Ｇ  Ｂｅｒｔｈｏｌｄ，  Ｂａｄ−Ｗｉｌｄｂａｄ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）ルミノメーターが使用された。
【０１６７】
実施例２３．ｐＣＩＬｕｃＤＮＡ−ＮＣ１２を有しない複合体の粒子サイズ
Ｈ２Ｏ（５００μＬ）の溶液に、修飾されたポリマー（容量は下記に示す）が添加されて攪拌された。複合体のサイズは、Ｚｅｔａ  Ｐｌｕｓ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｅｒ  （Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で測定された。
【０１６８】
【表５】
2005529959.tif 000006
粒子サイズのデータは、粒子が、重合体のミセルとして、この濃度の数多のポリマーの式で存在することを示す。
【０１６９】
実施例２４．ｐＣＩＬｕｃＤＮＡ−ＮＣ１２を有する複合体の粒子サイズ
Ｈ２Ｏ（５００μＬ）の溶液に、修飾されたポリマー（容量は下記に示す）が添加されて攪拌された。ＤＮＡ−ＮＣ１２（５μｇ、５μＬの１μｇ／μＬエタノール、０．０１５μｍｏｌリン酸塩）が溶液に添加されて攪拌され、複合体のサイズは、Ｚｅｔａ  Ｐｌｕｓ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｅｒ  （Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で測定された。
【０１７０】
【表６】
2005529959.tif 000007
粒子サイズのデータは、粒子が、ポリマーと修飾ＤＮＡの両者が存在する場合に存在することを示す。
【０１７１】
実施例２５：３−ジメチルアミノプロピル−１−ジメチルオクタデシルシリルエーテルの合成
２ｍＬクロロホルムの３−ジメチルアミノ−１−プロパノール（９０．０ｍｇ、０．８７３ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）溶液に、ジメチルオクタデシルクロロシラン（３７８ｍｇ、１．０９ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）及びイミダゾール（７４．２ｍｇ、１．０９ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）が添加された。周辺温度で１６時間後、溶液は、１０％の重炭酸ナトリウムでＥｔＯＡｃ／Ｈ２Ｏに分割された。有機層は水と塩水で洗浄された。クリーム色の固体として３２８ｍｇ（９１％）の３−ジメチルアミノプロピル−１−ジメチルオクタデシルシリルエーテルを与えるために溶液が除去（アスピレータ）された。
【０１７２】
実施例２６：３−（ジメチルアミノプロピル）−１，２−ジメチルオクタデシルシリルエーテルの合成
２ｍＬクロロホルムの３−（ジメチルアミノ）−１，２−プロペンジオール（５０．０ｍｇ、０．４１９ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）溶液に、ジメチルオクタデシルクロロシラン（３２８ｍｇ、０．９４４ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）及びイミダゾール（６８．１ｍｇ、０．９４４ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）が添加された。周辺温度で１６時間後、溶液は、１０％の重炭酸ナトリウムでＥｔＯＡｃ／Ｈ２Ｏに分割された。有機層は水と塩水で洗浄された。白色固体として２６６ｍｇ（８６％）の３−（ジメチルアミノプロピル）−１，２−ジメチルオクタデシルシリルエーテルを与えるために溶液が除去（アスピレータ）された。
【０１７３】
実施例２７：１−（３−ラウロイルアミノプロピル）、４−（３−オレオイルアミノプロピル）ピペラジン（ＭＣ７６３）、１，４−ビス（３−ラウロイルアミノプロピル）ピペラジン（ＭＣ７６２）、及び１，４−ビス（３−オレオイルアミノプロピル）ピペラジン（ＭＣ７９８）の合成
２５ｍＬのフレームドライのフラスコに、塩化オレオイル（新鮮な蒸留、１．０ｍｌ、３．０ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）と窒素下の１５ｍＬのジクロロメタン内の塩化ラウロイル（０．７０ｍｌ、３．０ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）が添加された。生じた溶液は、アイスバスで０℃まで冷却された。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．１ｍｌ、６．１ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）が、１，４−ビス（３−アミノプロピル）ピペラジン（０．５０ｍｌ、２．４ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）に続いて添加された。アイスバスが除去され、溶液は周辺温度で１５時間攪拌された。溶液は、１Ｎの水酸化ナトリウム（１０ｍｌ）で２回洗浄されて、水（１０ｍｌ）で２回洗浄されて、減圧下で濃縮された。
【０１７４】
生じた残存物のほぼ３０％は、アセトニトリル／Ｈ２Ｏ／トリフルオロ酢酸の溶離液でＢｅｔａ  Ｂａｓｉｃ  Ｃｙａｎｏカラム（１５０Å、２５０ｘ２１ｍｍ、Ｋｅｙｓｔｏｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｉｎｃ．）の半調製型ＨＰＬＣによって精製された。３つの化合物は、カラムから分離されて、質量分光法（Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  １５０ＥＸ）によって照明された。
【０１７５】
ＭＣ７６３  １−（３−ラウロイルアミノプロピル）、４−（３−オレオイルアミノプロピル）ピペラジン（ＭＷ＝６４７）
ＭＣ７６２  １，４−ビス（３−ラウロイルアミノプロピル）ピペラジン（ＭＷ＝５６４）
ＭＣ７９８  １，４−ビス（３−オレオイルアミノプロピル）ピペラジン（ＭＷ＝７２９．２５）
実施例２８：１−（３−ミリストイル（ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ）アミノプロピル）、４−（３−オレオイルアミノプロピル）ピペラジン（ＭＣ７６５）、１，４−ビス（３−ミリストイルアミノプロピル）ピペラジン（ＭＣ７６４）、及び１，４−ビス（３−オレオイルアミノプロピル）ピペラジン（ＭＣ７９８）
２５ｍＬのフレームドライのフラスコに、塩化オレオイル（新鮮な蒸留、１．０ｍｌ、３．０ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）と窒素下の１５ｍＬのジクロロメタン内の塩化ミリストイル（０．８３ｍｌ、３．０ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）が添加された。生じた溶液はアイスバスで０℃まで冷却された。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．１ｍｌ、６．１ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）が、１，４−ビス（３−アミノプロピル）ピペラジン（０．５０ｍｌ、２．４ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）に続いて添加された。アイスバスが除去され、溶液は周辺温度で１５時間攪拌された。溶液は、１Ｎの水酸化ナトリウム（１０ｍｌ）で２回洗浄されて、水（１０ｍｌ）で２回洗浄されて、減圧下で濃縮された。
【０１７６】
生じた残存物のほぼ３０％は、アセトニトリル／Ｈ２Ｏ／トリフルオロ酢酸の溶離液でＢｅｔａ  Ｂａｓｉｃ  Ｃｙａｎｏカラムの半調製型ＨＰＬＣによって精製された。３つの化合物は、カラムから分離されて、質量分光法によって照明された。
【０１７７】
ＭＣ７６５  １−（３−ミリストイルアミノプロピル）、４−（３−オレオイルアミノプロピル）ピペラジン（ＭＷ＝６４７）
ＭＣ７６４  １，４−ビス（３−ミリストイルアミノプロピル）ピペラジン（ＭＷ＝６２０）
ＭＣ７９８  １，４−ビス（３−オレオイルアミノプロピル）ピペラジン（ＭＷ＝７２９．２５）
実施例２９：１，４−ビス（３−デカノイルアミノプロピル）ピペラジンＭＣ７７４の合成
０℃まで冷却されたジクロロメタン（１ｍｌ）の１，４−ビス（３−アミノプロピル）ピペラジン（１０μｌ、０．０４９ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）溶液に塩化デカノイル（２５μｌ、０．１２ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）とＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２１μｌ、０．１２ｍｍｏｌ）が添加された。３０分後、溶液は周辺温度まで暖められた。１２時間後、溶液は水（２ｘ２ｍｌ）で洗浄され、ＴＬＣによって十分な精製度の１，４−ビス（３−デカノイルアミノプロピル）ピペラジン（ＭＣ７７４）（２１．６ｍｇ、８７％）を与えるために減圧下で濃縮された。
【０１７８】
実施例３０：１，４−ビス（３−パルミトイルアミノプロピル）ピペラジン（ＭＣ７７５）の合成
ジクロロメタン（１ｍｌ）の１，４−ビス（３−アミノプロピル）ピペラジン（１０μｌ、０．０４９ｍｍｏｌ）の溶液にパルミトレイン酸（３０．８ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）と、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２１μｌ、０．１２ｍｍｏｌ）と、ジシクロヘキシルカルボジイミド（２５ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）が添加された。１２時間後、溶液は濾過され、水で洗浄（２ｘ２ｍｌ）されて、ＴＬＣによって十分な精製度の１，４−ビス（３−パルミトイルアミノプロピル）ピペラジン（ＭＣ７７５）（２６．５ｍｇ、８１％）を与えるために減圧下で濃縮された。
【０１７９】
実施例３１：１，４−ビス（３−チオシトイル（ｔｈｉｏｃｔｏｙｌ）アミノプロピル）ピペラジン（ＭＣ７７７）、１−（３−リノレノイルアミノプロピル）、４−（３−チオシトイルアミノプロピル）ピペラジン（ＭＣ７７８）、１，４−ビス（３−リノレノイルアミノプロピル）ピペラジン（ＭＣ７７９）の合成
ジクロロメタン（８ｍｌ）のベンゾトリアゾール−１−イル−オキソ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフロロリン酸塩（ＰｙＢＯＰ、１．３００ｇ、２．５００ｍｍｏｌ、ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ）に、チオクト酸（０．２４８ｇ、１．２０ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）及びリノール酸（３６５μｌ、１．２０ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）を添加した。生じた溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチレンアミン（６１０μｌ、３．５ｍｍｏｌ）に続いて、１，４−ビス（３−アミノプロピル）−ピペラジン（２０６μｌ、１．００ｍｍｏｌ）が添加された。周辺温度で１６時間後、溶液は水（２ｘ２０ｍｌ）で洗浄され、１．８００ｇの粗物質を与えるために減圧下で濃縮された。８５ｍｇの粗物質は、２ｍｌのアセトニトリル（０．１％トリフロロ酢酸）／１ｍｌの水（０．１％トリフロロ酢酸）で溶解され、３１．８ｍｇのＭＣ７７７、１．３ｍｇのＭＣ７７８、及び１．５ｍｇのＭＣ７７９を与えるためにＢｅｔａ  Ｂａｓｉｃ  Ｃｙａｎｏカラムの逆相ＨＰＬＣ（４０分間にわたる１０−９０％Ｂ）によって精製された。
【０１８０】
実施例３２：１，４−ビス（３−（トランス）−レチノイル（ｒｅｔｉｎｏｙｌ）アミノプロピル）ピペラジン（ＭＣ７８０）、１−（３−（シス−１１）−エイコセノイル（ｅｉｃｏｓｅｎｏｙｌ）アミノプロピル）、４−（３−（トランス）−レチノイルアミノプロピル）ピペラジン（ＭＣ７８１）、１，４−ビス（３−（シス−１１）−エイコセノイルアミノプロピル）ピペラジン（ＭＣ７８２）の合成
化合物ＭＣ７８０、ＭＣ７８１、及びＭＣ７８２は、化合物ＭＣ７７７、ＭＣ７７８、及びＭＣ７７９と同様の合成を使用して成された。合成からの粗物質は、２ｍｌのアセトニトリル（０．１％トリフロロ酢酸）／１ｍｌの水（０．１％トリフロロ酢酸）で溶解され、７．１ｍｇのＭＣ７８０、１３．０ｍｇのＭＣ７８１、及び１８．０ｍｇのＭＣ７８２を与えるためにＢｅｔａ  Ｂａｓｉｃ  Ｃｙａｎｏカラムの逆相ＨＰＬＣ（４０分間にわたる１０−９０％Ｂ）によって精製された。
【０１８１】
実施例３３：ビス（２−アミノエチル）−（２−オレオイルアミノエチル）アミン（ＭＣ７５３）、２−アミノエチル−ビス−（２−オレオイルアミノエチル）アミン（ＭＣ７５４）、及びトリス−（２−オレオイルアミノエチル）アミン（ＭＣ７５５）の合成
ジクロロメタン（３ｍＬ、０．５Ｍ）でトリス（２−アミノエチル）アミン（０．２ｍＬ、１．４ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）が溶解され、ドライアイス／アセトン槽で冷却された。生じた溶液に、窒素のブランケットの下で、塩化オレオイル（０．１８ｍＬ、０．４５ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）が滴下で添加された。反応は、攪拌して室温になるまで温められた。反応は室温で１時間攪拌されて、反応が完全に停止したことを照明するために、ＴＬＣ及び質量分析法（Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  １５０ＥＸ）によって分析された。ベージュのフィルム（３３０ｍｇ）を与えるために、反応は減圧下で濃縮された。物質の一部は、２０分間にわたる４０−９０％Ｂのジフェニルカラム（Ｖｙｄａｃ）の逆相ＨＰＬＣによって精製された（Ａ＝０．１％ＴＦＡ／水、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル）。４回のＨＰＬＣが行われた。分画は、２１０ｎｍで収集され、質量分析法（Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  １５０ＥＸ）によって分析された。ＭＣ７５３（５，６，１５−１７，２５−３１，４２−４４）、ＭＣ７５４（７，１８，１９，３２，３３，４５，４６）及びＭＣ７５５（８−１０，２０−３，３４−７，４７−５０）における分画は共にプールされ、減圧下で濃縮されて、凍結されて、さらに凍結乾燥された。ＭＣ７５３（２６ｍｇ）、ＭＣ７５４（８．６ｍｇ）及びＭＣ７５５（１５０ｍｇ）を産出した。
【０１８２】
実施例３４：Ｓ−オレオイル−Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン−３−（ジメチルアミノプロピルアミン）−アミド（ＭＣ９０９）の合成
ジ−（ジメチルアミノ）プロピルアミノ−シスチンの調製。フレーム乾燥させた丸底フラスコ（２５ｍＬ）にＮ，Ｎ−ジ−Ｂｏｃ−Ｌ−シスチン（５００ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）が添加され、攪拌してＴＨＦ（６ｍＬ、０．２Ｍ）で溶解された。生じた溶液に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（２６０ｍｇ、２．３ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）及びジシクロヘキシルカルボジイミド（５２０ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）が添加された。２分後、３−（ジメチルアミノ）プロピルアミン（０．２８ｍＬ、２３０ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）が反応混合液に添加された。反応は３０分間室温で攪拌されて、反応が完全に停止したことを照明するために、ＴＬＣ及び質量分析法（Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  １５０ＥＸ）によって分析された。反応はＤＣＵを除去するために濾過されて、減圧下で濃縮された。生じた残存物は、冷エーテル（１０ｍＬ）で沈殿させて、エーテル（２ｘ１０ｍＬ）で洗浄された。沈殿は窒素下で乾燥されて、次いで、白い粉末としてジ−（ジメチルアミノ）プロピルアミノ−ジ−Ｂｏｃ−シスチン（６７０ｍｇ、９７％）を与えるために高い真空に位置した。
【０１８３】
ジ−（ジメチルアミノ）プロピルアミノ−ジ−Ｂｏｃ−Ｌ−シスチン（６７０ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）は窒素で覆われたＴＩＰＳ／水／ＴＦＡ（０．５／４．５／９５％容量、５ｍＬ、０．２Ｍ）で得られ、室温で１時間攪拌された。物質のデプロテクションは、ＴＬＣ及び質量分析法（Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  １５０ＥＸ）によって証明された。白い粉末（６７０ｍｇ、１００％）としてジ−（ジメチルアミノ）プロピルアミノ−シスチンを与えるために、物質は、冷エーテル（１０ｍＬ）で沈殿させて、エーテル（２ｘ１０ｍＬ）で洗浄されて、窒素下で乾燥されて、真空下に置かれた。
【０１８４】
１−メチル−２−ピロリジノン（８ｍＬ、０．２Ｍ、ＶＷＲ）のジ−（ジメチルアミノ）プロピルアミノ−シスチン（６７０ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）の溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（０．５８ｍＬ、４３０ｍｇ、３．３ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）を攪拌して添加された。反応はアイスバス（０℃）で冷却されて、無水酢酸（１．５ｍＬ、１．７ｇ、１６ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）はゆっくりと添加された。反応混合物は、周辺温度にまるまで自然に温められ、１時間攪拌を続けた。アミンのキャッピングは、ＴＬＣ及び質量分析法（Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  １５０ＥＸ）によって証明された。反応溶液は冷エーテル（２５ｍＬ）に滴下して添加され、白い沈殿を形成した。沈殿はエーテル（２ｘ２５ｍＬ）で洗浄され、窒素下で乾燥され、次いで、真空下に置かれた。暗い黄色の油（２００ｍｇ、２５％）を産出した。
【０１８５】
黄色の油（８３ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）は、攪拌しながらＴＨＦ（２ｍＬ、０．２Ｍ）で溶解された。ジチオールトレイトール（３５ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ、０．１Ｍ、シグマケミカルカンパニー）が攪拌されて添加された。反応は室温で１６時間攪拌された。ジスルフィド切断が完全に行われたことを証明するために、物質はＴＬＣ及び質量分析法（Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  １５０ＥＸ）によって分析された。物質の一部（５４ｍｇ）は、Ａｑｕａｓｉｌ  Ｃ１８カラム（Ｋｅｙｓｔｏｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）、１０−４０％Ｂ、０−１０分間、４−６０％Ｂ  １０−２０分間、６０−９０％Ｂ、２０−３０分間（Ａ＝水中の０．１％  ＴＦＡ、Ｂ＝アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡ）の逆相ＨＰＬＣによって精製された。分画は２１０ｎｍで収集されて、質量分析法（Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  １５０ＥＸ）によって分析された。２回のＨＰＬＣからの所望の産物を含有する分画（３、４、３０、３１）は、共にプールされ、減圧下で濃縮され、凍結され、凍結乾燥された。透明な油として３２ｍｇ（６０％）が与えられた。オイル（３２ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）が攪拌してＴＨＦ（１ｍＬ、０．１３Ｍ）で溶解された。生じた溶液にジイソプロピルエチルアミン（０．０２ｍＬ、１７ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）が添加された。反応溶液はアイスバス（０℃）で冷却され、塩化オレオイル（３９ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）はシリンジによって攪拌しながら滴下して添加された。反応は、自然と周辺温度になるまで温められた。反応は、反応が完全に停止したことを証明するためにＴＬＣ及び質量分析法（Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  １５０ＥＸ）によって分析された。反応溶液は冷エーテル（５ｍＬ）で沈殿され、エーテル（２ｘ５ｍＬ）で洗浄され、窒素下で乾燥され、高い真空に置かれた。ＴＬＣ及び質量分析法（Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  １５０ＥＸ）は十分な精製度を示した。黄色の油（４５．３ｍｇ、６８％）としてＳ−オレオイル−Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン−３−（ジメチルアミノプロピルアミン）−アミド（ＭＣ９０９）が産出された。
【０１８６】
実施例３５：Ｓ−オレオイル、Ｎ−アセチル、３−（ジメチルアミノプロピルアミン）−Ｌ−システインアミド（ＭＣ９０９）塩酸塩の調製
ＭＣ９０９（９ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）がエタノール（０．０９ｍＬ）で溶解され、冷塩酸／エーテル（１Ｎの１ｍｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）に滴下して添加された。沈殿は、遠心分離によってスピンダウンされ、エーテル（２ｘ１ｍｌ）で洗浄され、窒素下で乾燥され、高い真空に配置された。白い結晶物質（６ｍｇ、６２％）が産出された。
【０１８７】
実施例３６：β−Ｄ−グルコピラノシルデカンジスルフィド及びＯ−グリシン−β−Ｄ−グルコピラノシルデカンジスルフィド（ＭＣ７４９）の合成
クロロホルム（１１ｍＬ）のデカンチオール（０．５９ｍＬ、２．９ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）の溶液に、塩化スルフリル（０．４６ｍＬ、５．７ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）が添加され、生じた混合物は室温で１８時間攪拌された。溶媒を除去し（アスピレータ）、塩化デカンスルフェニルが与えられた。
【０１８８】
４ｍＬのアセトニトリルの塩化デカンスルフェニル（１９０ｍｇ、０．９２ｍｍｏｌ）の溶液に、１−チオ−β−Ｄ−グルコースナトリウム塩の水和物（２００ｍｇ、０．９２ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）及び１５−クラウン−５（０．１８ｍＬ、０．８９９ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）が添加された。生じた混合物は、周辺温度で１６時間攪拌され、濾過され、さらにエタノールで沈殿された。残存物は、エタノールでトリチュレートされ（ｔｒｉｔｕｒａｔｅｄ）、逆相ＨＰＬＣ（Ａｑｕａｓｉｌ  Ｃ１８カラム（Ｋｅｙｓｔｏｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）、１０−９０％Ｂ、２０分間（Ａ＝水中の０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡ）で精製された。凍結乾燥し、細かい白い固体として、１０ｍｇ（３％）のβ−Ｄ−グルコピラノシルデカンジスルフィドが与えられた。
【０１８９】
８０μＬＴＨＦのβ−Ｄ−グルコピラノシルデカンジスルフィド（８ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ−Ｂｏｃグリシン（１５ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ、シグマケミカルカンパニー）、ＤＣＣ（１８ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）、ジメチルアミノピリジン（アルドリッチケミカルカンパニー）の触媒量が添加された。生じた溶液は、周辺温度で１２時間攪拌されて、固体を除去するように遠心分離された。生じた溶液は、減圧下で濃縮され、ジクロロメタンで再懸濁され、シリカゲルのプラグを介して濾過され、濃縮された（アスピレータ）。Ｂｏｃ保護基は、２００μＬの２．５％ＴＩＰＳ／５０％ＴＦＡ／ジクロロメタンで残存物を１２時間処理することによって除去された。溶媒の除去（アスピレータ）に続いて、逆相ＨＰＬＣ（Ａｑｕａｓｉｌ  Ｃ１８カラム（Ｋｅｙｓｔｏｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）、１０−９０％Ｂ、２０分間（Ａ＝水中の０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡ））によって精製して、凍結乾燥後に細かい白い固体として０．７ｍｇ（５％）のＯ−グリシン−β−Ｄ−グルコピラノシルデカンジスルフィド（ＭＣ７４９）が与えられた。
【０１９０】
実施例３７：β−Ｄ−グルコピラノシルコレステロールジスルフィドの合成
実施例３６に記載したような同様の方法論によって、β−Ｄ−グルコピラノシルコレステロールジスルフィドが分離された（収率１２％）。
【０１９１】
実施例３８：２つのテーリングされたβ−Ｄ−グルコピラノシルジスルフィド派生物の合成。β−Ｄ−グルコピラノシルＮ−ドデカノイル−システイン−ドデカノアートジスルフィド及びＯ−グリシン−β−Ｄ−グルコピラノシルＮ−ドデカノイル−システイン−ドデカノアートジスルフィド
ジクロロメタン（４ｍＬ）のＮ−ＦＭＯＣ−Ｓ−Ｔｒｔ−システイン（５８５ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ、ノババイオケム）の溶液に、１−ドデカノール（２４０ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）、ＤＣＣ（２６０ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）、及びジメチルアミノピリジン（アルドリッチケミカルカンパニー）の触媒量が添加された。生じた溶液は、周辺温度で３０分間攪拌され、濾過され、シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（１０−２０％の酢酸エタノール／へキサンの溶離剤）によって精製された。溶媒を除去（アスピレータ）し、５７２ｍｇ（７６％）の保護されたシステイン−ドデカノアートが与えられた。
【０１９２】
保護されたシステイン−ドデカノアート（５７２ｍｇ、０．７６ｍｍｏｌ）の溶液に、３ｍＬのＤＭＦ中の２０％ピペリジンが添加された。生じた溶液は周辺温度で１時間攪拌されて、酢酸エタノール／水に分割された。水層は２回の酢酸エタノールで抽出された。有機層の組み合わせは、２回の１Ｎ塩酸、乾燥した（硫酸ナトリウム）で洗浄され、Ｓ−Ｔｒｔ−システイン−ドデカノアートが与えられるように濃縮された。残存物はジクロロメタン（２ｍＬ）で懸濁され、−２０℃まで冷却された。ジイソプロピルエチルアミン（０．１６ｍＬ、０．９２ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）は、塩化ドデカノール（０．２６ｍＬ、１．１ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）に続いて添加され、溶液は周辺温度までゆっくりと温められた。１時間後、溶媒は除去され（アスピレータ）、残存物は酢酸エタノール／水に分割される。有機層は、２回の１Ｎ塩酸、１回の塩水、乾燥した（硫酸ナトリウム）で洗浄されて、溶媒は除去される（アスピレータ）。生じた残存物は、トリチル保護基を除去するために２％ＴＩＰＳ／５０％ＴＦＡ／ジクロロメタンで懸濁される。４時間後、溶液は濃縮され、生じた残存物は、１８０ｍｇ（４２％）のＮ−ドデカノイル−システイン−ドデカノアート（Ｍ＋１＝４７２．２）が与えられるようにシリカゲル（１０−２０％酢酸エタノール／へキサンの溶離剤）のフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製された。
【０１９３】
０．５ｍＬクロロホルムのＮ−ドデカノイル−システイン−ドデカノアート（１８０ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ）の溶液に塩化スルフリル（６２μＬ、０．７６ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）が添加された。生じた溶液は、周辺温度で２時間攪拌され、溶媒が除去された（アスピレータ）。生じた残存物は１ｍＬのアセトニトリルで懸濁され、１−チオ−β−Ｄ−グルコースナトリウム塩の水和物（８５ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）及び１５−クラウン−５（７６μｇ、０．３８ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）が添加された。１時間後、周辺温度で溶媒が除去され（アスピレータ）、残存物が酢酸エタノール／水に分割された。有機層は濃縮され、生じた残存物は、１９ｍｇ（８％）のβ−Ｄ−グルコピラノシルＮ−ドデカノイル−システイン−ドデカノアートジスルフィドが与えられるようにシリカゲル（１０−２０％メタノール／０．１％ＴＦＡ／ジクロロメタンの溶離剤）のフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製された。
【０１９４】
１００μＬのジクロロメタンのβ−Ｄ−グルコピラノシルＮ−ドデカノイル−システイン−ドデカノアートジスルフィド（３．９ｍｇ、０．００４５ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ−Ｂｏｃグリシン（３．２ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ、シグマケミカルカンパニー）、ＤＣＣ（３．８ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）、及びジメチルアミノピリジンの触媒量（アルドリッチケミカルカンパニー）が添加される。生じた溶液は、周辺温度で４時間攪拌されて、濾過された。Ｂｏｃ保護基は、２ｍＬの１％ＴＩＰＳ／５０％ＴＦＡ／ジクロロメタンで残存物を２時間処理することによって除去された。溶媒を除去し（アスピレータ）、続いて逆相ＨＰＬＣ（ジフェニルカラム（Ｖｙｄａｑ）、２０−９０％Ｂ、２０−９０％Ｂ、２０分間（Ａ＝水中の０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡ））による精製によって、凍結乾燥に続いて細かい白い固体としての３．６ｍｇ（９０％）のＯ−グリシン−β−Ｄ−グルコピラノシルデカンジスルフィドが与えられた。
【０１９５】
実施例３９．ペプチドの一般的な調製
ペプチドは、ＦａｓｔＭｏｃ化学を採用するＡＢＩ４３３Ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ）を使用して、標準の固相ペプチド合成によって調製された。ペプチドは、０．１又は１．０ｍｍｏｌスケールで合成された。樹脂の脱保護及び切断は、標準的な脱保護技術を活用して達成された。ペプチドは、少なくとも９０％の純度レベルまで逆相ＨＰＬＣによって精製されて、質量分析法（Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  １５０ＥＸ）によって証明された。
【０１９６】
実施例４０．Ｈ２Ｎ−ＣＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＯＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  １１）及びＮ−ドデカノイル−システイン−ドデカノアート（ＭＣ７５６）の混合されたジスルフィドの合成
ペプチドＨ２Ｎ−ＣＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＯＨ（ＬＨ１６８−１００）（５．０ｍｇ、０．００３３ｍｍｏｌ）は、イソプロピルアルコール（０．５ｍＬ）及びトリフルオロ酢酸（０．５ｍＬ）と溶解された。生じた溶液に、アルドリチオール（０．７９ｍｇ、０．００３６ｍｍｏｌの１０ｍｇ／ｍＬイソプロピルアルコール、アルドリッチケミカルカンパニー）が添加された。反応は室温で２時間攪拌され、形成された産物は、質量分析法（Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  １５０ＥＸ）によって証明された。物質は冷エーテル（２ｍｌ）で沈殿され、エーテル（２ｘ２ｍｌ）で洗浄され、窒素下で乾燥された。乾燥された沈殿は、イソプロピルアルコール（０．２５ｍＬ）及びトリフルオロ酢酸（０．２５ｍＬ）と溶解された。生じた溶液に、Ｎ−ドデカノイル−システイン−ドデカノアート（０．１５ｍＬ、１．５ｍｇの１０ｍｇ／ｍＬのエーテル、０．００３３ｍｍｏｌ）が添加された。反応は室温で２時間攪拌されて、形成された産物は、質量分析法（Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  １５０ＥＸ）によって証明された。物質は冷ジエチルエーテル（４ｍｌ）で沈殿され、ジエチルエーテル（２ｘ４ｍｌ）で洗浄された。沈殿は、２０分間にわたって、逆相ＨＰＬＣ（Ａｑｕａｓｉｌ  Ｃ１８カラム（Ｋｅｙｓｔｏｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ）、５−９０％Ｂ（Ａ＝０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル））によって精製された。分画は２１０ｎｍで収集され、質量分析法（Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  １５０ＥＸ）によって分析された。分画（９及び１８）は、２つのＨＰＬＣのランから共にプールされ、濃縮、凍結され、白いふかふかした結晶物質としてＭＣ７５６（０．５ｍｇ）を与えるために、凍結乾燥された。
【０１９７】
実施例４１：１−デカンチオクロリドの調製
１−デカンチオール（０．５９ｍＬ、５００ｍｇ、２．９ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）は、フレーム乾燥の丸底フラスコに移され、クロロホルム（１１ｍＬ、０．２５Ｍ）と溶解された。生じた溶液に、塩化スルフリル（０．４６ｍＬ、７７０ｍｇ、アルドリッチケミカルカンパニー）を５分間にわたって攪拌しながら滴下して添加された。反応は、窒素下で１６時間にわたって室温で攪拌された。反応混合物は、反応が停止したことを証明するためにＴＬＣによって分析された。反応は、窒素下で濃縮されて、真空速度で置かれた。物質は使用されるまで−２０℃に保存された。
【０１９８】
実施例４２：３−メルカプトプロピオン酸のトリチル保護
３−メルカプトプロピオン酸（０．４１ｍＬ、５００ｍｇ、４．７ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）は、フレーム乾燥の丸底フラスコに移され、ジクロロメタン（１８ｍＬ、０．２６Ｍ）と共にされた。生じた溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（０．８２ｍＬ、６１０ｍｇ、４．７ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）が添加され、追加の塩化トリチル（１．４ｇ、４．９ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）が添加された。溶液は、窒素下で１６時間にわたって室温で攪拌された。反応混合物は、反応が停止したことを証明するためにＴＬＣ及び質量分析法（Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  １５０ＥＸ）によって分析された。反応混合物は減圧下で濃縮され、白い結晶物質を産出した。白い結晶物質は、酢酸エタノール（５０ｍＬ）でスラリー状にされ、水に（５０ｍＬ）に分割された。反応は０．１ＭのＮａＨＣＯ３で中性にされた。有機層は、水（２ｘ５０ｍＬ）及び塩水（５０ｍＬ）で洗浄された。有機層は移されて、減圧下で濃縮された。結晶は、白い結晶の物質としてトリチルメルカプトプロピオン酸（１．７ｇ）を与えるために高い真空で乾燥された。産物は、質量分析法（Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  １５０ＥＸ）によって証明された。
【０１９９】
実施例４３：トリチルメルカプトプロピオン酸で３−（ジメチルアミノ）プロピルアミンのアシル化。３−チオール−プロピオン酸（３−（ジメチルアミノ）プロピルアミン）アミドの合成
トリチルメルカプトプロピオン酸（３００ｍｇ、０．８６ｍｍｏｌ）は、ジクロロメタン（３．５ｍＬ、０．２５Ｍ）と溶解された。生じた溶液に、ＰｙＢＯＰ（４５０ｍｇ、０．８６ｍｍｏｌ、ノババイオケム）が添加され、室温で５分間攪拌された。３−（ジメチルアミノ）プロピルアミン（０．１１ｍＬ、０．８６ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）が攪拌されて添加された。反応混合物は、窒素下の室温で１６時間攪拌された。反応混合物は、反応が停止したことを証明するためにＴＬＣ及び質量分析法（Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  １５０ＥＸ）によって分析された。反応混合物は、減圧下で濃縮され、酢酸エタノール（４ｍＬ）と溶解され、水（４ｍＬ）で分割され、水（２ｘ４ｍＬ）及び塩水（４ｍＬ）で洗浄された。物質はＮａ２ＳＯ４で乾燥され、濾過され、減圧下で濃縮された。濃縮された物質は、ＴＩＰＳ／ＴＦＡ／ＣＨ２Ｃｌ２（２．５／４７．５／５０％容量、３ｍＬ）に溶解され、室温で１時間攪拌された。反応はＴＬＣによってモニターされ、１時間後、脱保護は終了しなかった。ＴＦＡ（１．５ｍＬ）が溶液に加えられ、１０分後、溶液は黄色から透明に変わった。脱保護された産物は、ＴＬＣによって証明された。反応は減圧下で濃縮され、結晶のスラリーとして３−チオール−プロピオン酸（３−（ジメチルアミノ）プロピルアミン）アミドを産出した。
【０２００】
実施例４４：３−チオールプロピオン酸（３−（ジメチルアミノ）プロピルアミン）アミドとデカンチオール（ＭＣ７４４）の混合されたジスルフィドの合成
３−チオール−プロピオン酸（３−（ジメチルアミノ）プロピルアミン）アミド（８２ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）はジクロロメタン（１．８ｍＬ、０．２５Ｍ）に溶解された。生じた溶液に、攪拌しながら１−デカンチオクロリド（９０ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）が添加された。反応は、窒素下の室温で攪拌され、即座にオレンジ色に変化した。２０分後、反応混合物は、反応が停止したことを証明するためにＴＬＣ及び質量分析法（Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  １５０ＥＸ）によって分析された。物質は、−２０℃で１６時間保存された。形成された結晶（ＰｙＢｏｐ尿素）は、濾過され、ジクロロメタンで洗浄された。生じた溶液は、減圧下で濃縮され、ジクロロメタン（１ｍＬ）に溶解され、フラッシュクロマトグラフィー（１０％メタノール／ＣＨ２Ｃｌ２溶離剤）によって精製され、分画が収集された。分画は、ＴＬＣ及び質量分析法（Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  １５０ＥＸ）によって分析された。所望の産物が最終の分画にあり、ＭＣ７４４（１７ｍｇ）が産出した。
【０２０１】
実施例４５：１−ドデカンチオクロリドの調製
１−ドデカンチオール（０．５９ｍＬ、５００ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）がフレーム乾燥した丸底フラスコに移され、クロロホルム（１０ｍＬ、０．２５Ｍ）で溶解された。生じた溶液に、塩化スルフリル（０．４０ｍＬ、６７０ｍｇ、４．９ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）を攪拌しながら５分間にわたって滴下して添加した。反応は窒素下の室温で３時間攪拌された。反応混合物は、反応が停止したことを証明するためにＴＬＣによって分析された。反応は窒素下の真空速度で濃縮された。物質は使用するまで−２０℃で保存された。
【０２０２】
実施例４６：トリチル−メルカプトプロピオン酸で３−（ジメチルアミノ）プロピルアミンのアシル化。３−チオール−プロピオン酸（３−（ジメチルアミノ）プロピルアミン）アミドの合成
トリチルメルカプトプロピオン酸（５００ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）は、ジクロロメタン（６ｍＬ、０．２５Ｍ）に溶解された。生じた溶液に、ＰｙＢＯＰ（７５０ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ、ノババイオケム）が添加されて、室温で５分間攪拌された。３−（ジメチルアミノ）プロピルアミン（０．１８ｍＬ、１．４ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）は攪拌しながら添加された。反応混合物は、窒素下の室温で１６時間攪拌された。反応混合物は、反応が停止したことを証明するためにＴＬＣ及び質量分析法（Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  １５０ＥＸ）によって分析された。反応混合物は減圧下で濃縮され、酢酸エタノール（２０ｍＬ）に溶解され、水（２０ｍＬ）に分割され、水（２ｘ２０ｍｌ）及び塩水（２０ｍＬ）で洗浄された。物質はＮａ２ＳＯ４で乾燥され、濾過され、減圧下で濃縮された。濃縮された物質は、ジクロロメタン（１０ｍＬ）で溶解され、白い沈殿を形成した。物質は遠心分離によってスピンダウンされ、沈殿はジクロロメタン（１０ｍＬ）で洗浄された。沈殿された物質は、ＴＩＰＳ／ＴＦＡ／ＣＨ２Ｃｌ２（２．５／５０／４７％容量、６ｍＬ）に溶解され、室温で１．５時間攪拌された。直ちに、混合物は、透明から明るい黄色（トリチル陽イオンの放出）に変化し、透明に戻った。物質の脱保護は、ＴＬＣ及び質量分析法（Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  １５０ＥＸ）によって証明された。反応混合物は、減圧下で濃縮され、白い結晶の固体（２４５ｍｇ、収率９１％）として、３−チオール−プロピオン酸（３−（ジメチルアミノ）プロピルアミン）アミドを産出した。
【０２０３】
実施例４７：３−チオール−プロピオン酸（３−（ジメチルアミノ）プロピルアミン）アミド及びドデカンチオール（ＭＣ７４５）の混合したジスルフィドの合成
３−チオール−プロピオン酸（３−（ジメチルアミノ）プロピルアミン）アミド（１００ｍｇ、０．５２ｍｍｏｌ）がジクロロメタン（２ｍＬ、０．２５Ｍ）に溶解された。生じた溶液に、攪拌しながら１−ドデカンチオクロリド（１２０ｍｇ、０．５２ｍｍｏｌ）が添加された。反応は、窒素下の室温で攪拌されて、瞬時にオレンジ色に変化した。１時間後、反応混合物は、反応が停止したことを証明するためにＴＬＣ及び質量分析法（Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  １５０ＥＸ）によって分析された。生じた溶液は減圧下で濃縮されて、黄色いオイル（３００ｍｇ）を産出した。オイル（１６０ｍｇ）は、ジクロロメタン（０．５ｍＬ）で溶解され、フラッシュクロマトグラフィー（１０％メタノール／ＣＨ２Ｃｌ２、０．１％ＴＦＡ）によって精製されて、分画が収集された。メタノールの百分率はゆっくりと２０％まで上昇し、分画が収集された。分画は、ＴＬＣ及び質量分析法（Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  １５０ＥＸ）によって分析された。所望の産物は最終分画にある。最終分画は減圧下で濃縮されて、黄色いオイルとしてＭＣ７４５（２２．４ｍｇ、収率２２％）を産出した。
【０２０４】
実施例４８：ＢＯＣで１，１２−ジアミノドデカンの単保護
１，１２−ジアミノドデカン（１．０ｇ、１０ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）は、ジクロロメタン（２５ｍＬ）及び水（２５ｍＬ）で溶解された。水酸化ナトリウム（２ペレット、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が添加され、反応は活発に攪拌された。ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボナート（５００ｍｇ、２．３ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）は、ジクロロメタン（１０ｍＬ）で溶解され、５分間にわたって攪拌している反応液に滴下して添加された。１時間後、反応は、反応が停止したことを証明するためにＴＬＣ及び質量分析法（Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  １５０ＥＸ）によって分析された。反応液は、分液漏斗に移されて、層は分離された。有機層は減圧下で濃縮された。濃縮された物質の半分は、熱いアセトニトリル（１００ｍＬ）にもたらされ、結晶化された。物質は、遠心分離によってスピンダウンされ、アセトニトリル（２ｘ２５ｍＬ）で洗浄された。物質は高い真空で乾燥されて、結晶物質（７４５ｍｇ、収率９９％）を産出した。産物、Ｂｏｃ−アミンドデカンアミンは、ＴＬＣ及び質量分析法（Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  １５０ＥＸ）によって証明された。
【０２０５】
実施例４９：トリメチルアミノドデカンアミンの調製
Ｂｏｃ−アミンドデカンアミン（７４５ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）は、アセトニトリル（１２ｍＬ、０．２Ｍ）に溶解された。生じた溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（０．４３ｍＬ、３７０ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）及びヨウ化メチル（０．７７ｍＬ、１．８ｇ、１２．４ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）が添加された。反応は、窒素下の室温で１６時間攪拌された。反応は、反応が停止したことを証明するためにＴＬＣ及び質量分析法（Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  １５０ＥＸ）によって分析された。反応混合物は、ヒートガンで加熱され、周辺温度まで自然に冷却させた。結晶が形成され、ＴＬＣ及び質量分析法（Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  １５０ＥＸ）によって分析された。結晶は、１，１２−ドデカンアミンであると決定された。結晶は濾過によって除去され、上澄みは減圧下で濃縮された。濃縮された物質は、ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＰＳ（９５／４．５／１．５％容量、１０ｍＬ）で溶解され、窒素下の室温で攪拌された。完全な脱保護は、ＴＬＣによって証明された。反応溶液は、冷エーテル（２５ｍＬ）で沈殿され、遠心分離によってスピンされ、エーテル（２ｘ２５ｍＬ）で洗浄された。次いで、沈殿は高い真空の窒素下で乾燥された。白色の結晶物質（３７０ｍｇ）が産出された。産物は、ＴＬＣ及び質量分析法（Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  １５０ＥＸ）によって証明された。
【０２０６】
実施例５０：イミダゾール酢酸のＢｏｃ保護
４−イミダゾール酢酸塩酸塩（２５０ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）は、アセトニトリル（５ｍＬ、０．３Ｍ）に溶解された。生じた溶液に、トリエチルアミン（０．２２ｍＬ、１６０ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）が添加された。ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボナート（４００ｍｇ、１．８ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）が添加され、続いて、４−ジメチルアミノピリジン（コダックケミカルカンパニー）の触媒量が添加された。３０分後、反応は、反応が停止したことを証明するためにＴＬＣ及び質量分析法（Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  １５０ＥＸ）によって分析された。反応混合物は減圧下で濃縮され、水（５０ｍＬ）で溶解され、ｐＨは、ＮａＯＨ（１Ｎ）でｐＨ５まで調節された。溶液は、酢酸エタノール（５０ｍＬ）で分割され、塩水（２ｘ５０ｍＬ）で洗浄された。物質はＮａ２ＳＯ４で乾燥され、濾過され、減圧下で濃縮されて、オイル（８２ｍｇ、収率２３％）を産出した。
【０２０７】
実施例５１：イミダゾール酢酸（トリメチルアミノドデカンアミン）アミド（ＭＣ９３３）の合成
トリメチルアミノドデカンアミン（５３ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）がＤＭＦ（０．７ｍＬ、０．２Ｍ）で溶解された。生じた溶液に、Ｂｏｃ−イミダゾール酢酸（３２ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）が添加され、続いてジシクロヘキシルカルボジイミド（３０ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）が添加された。反応は窒素下で３６時間攪拌された。反応混合物は、−２０℃まで冷却され、尿素はペレットの形態で遠心分離を介して除去された。上澄みは、産物を含むことを証明するために、ＴＬＣ及び質量分析法（Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  １５０ＥＸ）によって分析された。上澄みは真空速度で濃縮され、ＴＩＰＳ／Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ（０．１／９７．４／２．５％容量、１．５ｍＬ）で溶解された。反応は窒素下の室温で１時間攪拌された。反応は、脱保護が停止したことを証明するためにＴＬＣ及び質量分析法（Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  １５０ＥＸ）によって分析された。反応混合物は、冷エーテル（１０ｍＬ）に滴下して添加され、白い沈殿を形成した。沈殿はエーテル（２ｘ１０ｍＬ）で洗浄され、窒素下で乾燥され、高い真空に置かれた。結晶物質（３９．２ｍｇ）を産出した。物質は、加熱してアセトニトリル（２ｍＬ）に溶解された。不純物が結晶化し、濾過された。マザーリカーはＴＬＣ及び質量分析法（Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  １５０ＥＸ）によって分析され、産物があることを証明された。マザーリカーは減圧下で濃縮されて、オイル（２０ｍｇ、収率３３％）としてＭＣ９３３を与えた。
【０２０８】
実施例５２：Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアミノプロピルアミンの調製
Ｎ−Ｂｏｃ−１，３−ジアミノプロパン（０．２５ｍＬ、２５０ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ、Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）は、無水のアセトニトリル（７ｍＬ、０．２Ｍ）で溶解される。生じた溶液に、ジイソプロピルアミン（０．２５ｍＬ、１９０ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）が添加され、続いて、ヨウ化メチル（０．３１ｍＬ、７２０ｍｇ、５．０ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）が添加されて、溶液は窒素下で１６時間加熱（７０℃）して攪拌された。反応混合物は、反応が停止したことを証明するためにＴＬＣ及び質量分析法（Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  １５０ＥＸ）によって分析された。反応混合物は、冷エーテル（２０ｍＬ）で沈殿され、エーテル（２ｘ２０ｍＬ）で洗浄されて、窒素下で乾燥された。沈殿物は、ジイソプロピルエチルアミンの塩（１７４ｍｇ）であった。エーテル層は、減圧下で濃縮されて、ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＰＳ（９７．５／４２／０．５％容量、１０ｍＬ）で溶解された。反応混合物は、窒素下の室温で１６時間攪拌された。反応混合物は、冷エーテル（２０ｍＬ）に滴下して加えられ、白色沈殿を産出する。沈殿はエーテル（２ｘ２０ｍＬ）で洗浄され、窒素下で乾燥され、高い真空に置かれた。明るいオレンジ色のハイドロスコープの固体（３７０ｍｇ、収率７５％）が産出した。産物Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアミノプロピルアミンは、ＴＬＣ及び質量分析法（Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  １５０ＥＸ）によって分析された。
【０２０９】
実施例５３：Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアミノプロピルアミン−ＣＤＭＮＣ１２（ＭＣ９２８）の合成
Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアミノプロピルアミン（０．５０ｍｇ、２５μＬの２０μｇ／μＬの７５％ＴＨＦ／ＤＭＦ、４．３μｍｏｌ）がジイソプロピルエチルアミン（０．５５ｍｇ、５．５μＬの１００μｇ／μＬのＴＨＦ、アルドリッチケミカルカンパニー）に添加され、掻き混ぜられた。生じた溶液に、ＣＤＭＮＣ１２（１．５ｍｇ、１５μＬの１００μｇ／μＬのＴＨＦ）が添加され、掻き混ぜられた。反応は室温で３０分間攪拌されて、さらなる精製をせずにＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアミノプロピルアミン−ＣＤＭＮＣ１２（ＭＣ９２８）を与えるために真空速度で濃縮された。生じた残存物は、ＤＭＦ（１００μＬ、２０μｇ／μＬ）で溶解された。
【０２１０】
実施例５４：Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアミノプロピル−ジメチルオクタデシルシラザン（ＭＣ９２７）の合成
Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアミノプロピルアミン（０．８１ｍｇ、４１μＬの２０μｇ／μＬの７５％ＴＨＦ／ＤＭＦ、７．０μｍｏｌ）にジイソプロピルジエチルアミン（０．９０ｍｇ、９．０μＬの１００μｇ／μＬのＴＨＦ、アルドリッチケミカルカンパニー）が添加された。生じた溶液に、クロロジメチルオクタデシルシラン（１．４ｍｇ、１４μＬの１００μｇ／μＬのＴＨＦ、アルドリッチケミカルカンパニー）が添加された。反応は室温で３０分間攪拌されて、さらなる精製をせずにＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアミノプロピル−ジメチルオクタデシルシラザン（ＭＣ９２７）を与える真空速度で濃縮された。生じた残存物はＤＭＦ（１００μＬ、２０μｇ／μＬ）で溶解された。
【０２１１】
実施例５５：チオプロピオン−３−ジメチルアミノプロパノアートとデカンチオール（ＭＣ７４６）の混合したジスルフィドの調製
ジクロロメタン（４．０ｍＬ）のＳ−トリチル−チオプロピオン酸（０．３６ｇ、１．０ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）の溶液に、ＰｙＢＯＰ（０．５４ｇ、１．０ｍｍｏｌ、ノババイオケム）が添加された。ジメチルアミノプロパノール（０．１２ｍＬ、１．０ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）の添加前に、混合物は周辺温度で５分間攪拌された。反応は室温で１８時間連続して攪拌され、減圧下で濃縮された。残存物は酢酸エタノールでもたらされ、水で分割された。有機層は、２回の水、１回の塩水で洗浄され、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）されて、溶媒が除去（アスピレータ）された。生じた残存物は、トリチル保護基を除去するために２％ＴＩＰＳ／５０％ＴＦＡ／ＣＨ２Ｃｌ２（３ｍＬ）で懸濁された。２時間後、チオプロピオン−３−ジメチルアミノプロパノアートを与えるために溶液が濃縮された。
【０２１２】
ジクロロメタン（２ｍＬ）のチオプロピオン−３−ジメチルアミノプロパノアート（０．１０ｇ、０．５２ｍｍｏｌ）の溶液に、デカンチオクロリド（０．１１ｇ、０．５２ｍｍｏｌ）が添加された。生じた溶液は、周辺温度で２０分間攪拌された。溶媒が除去され、生じた残存物の一部（２５ｍｇ）は、デカンチオールとチオプロピオン−３−ジメチルアミノプロパノアート（Ｍ＋１＝３６４．４）との２０．９ｍｇ（８４％）の混合したジスルフィドを与えるために、シリカゲル（１０％メタノール／ＣＨ２Ｃｌ２溶離剤）のプラグフィルタレーションによって精製された。
【０２１３】
実施例５６：チオプロピオン−３−ジメチルアミノプロパノアートとドデカンチオール（ＭＣ７４７）の混合されたジスルフィドの調製
ジクロロメタン（２ｍＬ）のチオプロピオン−３−ジメチルアミノプロパノアート（０．１０ｇ、０．５２ｍｍｏｌ）の溶液に、ドデカンチオクロリド（０．１１ｇ、０．５２ｍｍｏｌ）が添加された。生じた溶液は、周辺温度で２０分間攪拌された。溶媒が除去され、生じた残存物の一部（１５０ｍｇ）は、デカンチオールとチオプロピオン−３−ジメチルアミノプロパノアート（Ｍ＋１＝３９２．４）との３８ｍｇ（２５％）の混合したジスルフィドを与えるために、シリカゲル（１％ＴＦＡ／１０％メタノール／ＣＨ２Ｃｌ２溶離剤）のフラッシュフィルタレーションによって精製された。
【０２１４】
実施例５７：ラウリルアミンでＬ−リジンのアミド化
ジ−Ｎ−Ｂｏｃ−Ｌ−リジンのジシクロヘキシルアンモニウム塩（１．０ｇ、１．９ｍｍｏｌ、シグマケミカルカンパニー）は、酢酸エタノール（５０ｍＬ）と溶解され、水（５０ｍＬ）で分割され、１Ｎの塩酸（３ｘ５０ｍＬ）及び塩水（１ｘ５０ｍＬ）で洗浄された。有機層はＭｇＳＯ４で乾燥され、減圧下で濾過され濃縮された。物質は、質量分析法（Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  １５０ＥＸ）（Ｍ＋１＝３４７．７）によって証明された。濃縮された物質は、ジクロロメタン（１０ｍＬ）で溶解された。生じた溶液に、ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．７８ｇ、３．８ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）及びラウリルアミン（０．４ｇ、２．２ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）が添加された。反応は窒素のブランケットでカバーされ、室温で１時間攪拌された。反応は、反応が停止したことを証明するためにＴＬＣによって分析された。反応混合物はＤＣＵを除去するために濾過され、減圧下で濃縮された。濃縮された物質は、５％メタノール／ＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ）で溶解され、５％メタノール／ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）でシリカゲルカラムに流した。分画は減圧下で濃縮されて、オイル（４１０ｍｇ）が産出した。オイルは、ＴＦＡ／ＣＨ２Ｃｌ２／ＴＩＰＳ（５ｍＬ／２ｍＬ／０．０５ｍＬ）で溶解され、窒素下の室温で１時間攪拌された。反応は、反応が停止したことを証明するためにＴＬＣによって分析された。物質は減圧下で濃縮され、アセトニトリル（１ｍＬ）で溶解され、水に沈殿された。白色結晶（７７ｍｇ）のＬ−リジンのラウリルアミンアミドを与えるために、沈殿は真空下で乾燥された。
【０２１５】
実施例５８：ピレンドデカノン−３−トリメチルアミノプロピルアミンカルボキシアミドヨウ素の調製
ピレンドデカノン酸（１０ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ、モレキュラープローブ）は、ＴＨＦ（０．１３ｍＬ、０．２Ｍ）で溶解された。生じた溶液に、３−ジメチルアミノプロピルアミン（０．００４ｍＬ、３．２ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）が添加されて、続いてジシクロヘキシルカルボジイミド（６．４ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）が追加された。反応は、窒素下の室温で１６時間光から遮断されて攪拌された。反応混合物は、反応が停止したことを証明するためにＴＬＣ及び質量分析法（Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  １５０ＥＸ）によって分析された。反応混合物は、減圧下で濃縮されて、酢酸エタノール（０．５ｍＬ）に溶解され、水（０．５ｍＬ）で分割され、１Ｎの塩酸（２ｘ０．５ｍＬ）及び塩水（０．５ｍＬ）で洗浄された。ピレンドデカノン−３−ジメチルアミノプロピルアミンカルボキシアミドを与えるために、有機層は減圧下で濃縮された。
【０２１６】
ピレンドデカノン−３−ジメチルアミノプロピルアミンカルボキシアミドはアセトニトリル（０．１ｍＬ、０．２５Ｍ）に溶解された。生じた溶液に、Ｋ２ＣＯ３の触媒量が添加され、続いてメチルヨウ素（０．０３ｍＬ、７．１ｍｇ、０．０５０ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）が添加された。反応混合物は窒素でカバーされ、１６時間攪拌されて加熱（５５℃）された。反応混合物は、反応が停止したことを証明するためにＴＬＣ及び質量分析法（Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  １５０ＥＸ）によって分析された。反応混合物は、減圧下で濃縮された。濃縮された物質は、ジクロロメタン（１ｍＬ）で溶解され、シリカ（６ｃｍ、１０％メタノール／ＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）溶離剤）のプラグにより濾過された。オイル（８．７ｍｇ、収率５６％）のピレンドデカノン−３−トリメチルアミノプロピルアミンカルボキシアミドヨウ素を与えるために溶液は減圧下で濃縮された。
【０２１７】
実施例５９：ＦＩＴＣ−Ｃｈｉｔ−Ｏｌの調製
Ｃｈｉｔ−Ｏｌ（１０ｍｇ、１ｍｇ／ｍＬの８０％ＤＭＦ溶液の１０ｍＬ、０．０２６ｍｍｏｌアミン）にｐＨ９までになるようにＮａ２ＣＯ３（０．１Ｍ、１０ｍＬ）が添加された。フルオレセインイソチオシアン酸塩（２ｍｇ、０．２ｍＬの１０ｍｇ／ｍＬのＤＭＦ溶液、０．００５３ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）が溶液に添加された。溶液は、１６時間光から保護されて、室温で攪拌された。反応は、反応が停止したことを証明するためにＴＬＣによって分析された。反応は減圧下で濃縮されて、冷エーテル（１０ｍＬ）で沈殿されてエーテル（２ｘ１０ｍＬ）で洗浄された。物質は高い真空で乾燥されて、水（２ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ）で再構成された。物質（５ｍｇ、１ｍＬ）がＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ５０カラムにロードされ、水で溶出されて分画（１ｍＬ）が収集された。分画は、蛍光（Ｖａｒｉａｎ  Ｃａｒｙ  Ｅｃｌｉｐｓｅスペクトロフルオロメーター、励起４９５ｎｍ、放射５３０ｎｍ）によって分析された。分画２４〜３７は共にプールされて、凍結されて凍結乾燥された。ふわふわした黄色／オレンジ物質（５．０ｍｇ）が産出され、水（０．５ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ）に溶解された。
【０２１８】
実施例６０：Ｒｈ−ＤＮＡ−ＮＣ１２−ＰｙｒＤｅｔの調製
Ｒｈ−ＤＮＡ（１００μｇ、５０μＬの２μｇ／μＬの水溶液、０．３０μｍｏｌリン酸塩）が水（５０μＬ、１μｇ／μＬのｐＤＮＡ）に溶解され、穏やかに混合された。個別の試験管において、ドデシルアミン塩酸塩（１３μｇ、１３μＬの１０μｇ／μＬ水溶液、０．６１μｍｏｌ）及びＰｙｒＤｅｔ（９．５μｇ、９．５μＬの１μｇ／μＬのＴＨＦ、０．０１５μｍｏｌ）が共に混合された。洗剤がＲｈ−ＤＮＡ溶液に添加されて穏やかに混合された。物質が沈殿して、遠心分離によってスピンダウンされた。上澄みが除去され、ペレットが水（２ｘ１００μＬ）で洗浄された。ペレットがＰ２Ｏ５で７２時間凍結乾燥されて、ＴＨＦ（１００μＬ、１μｇ／μＬ）で再構成された。
【０２１９】
実施例６１：疎水性のｐＤＮＡ複合体の超遠心分離
【０２２０】
【表７】
2005529959.tif 000008
水（１０００μＬ）にポリマー又は洗剤が添加され、ボルテックスされた。生じた溶液にＲｈＤＮＡ又はＰｈ−ＤＮＡ−ＮＣ１２−ＰｙｒＤｅｔ（５０μｇ）が添加されてボルテックスされた。サンプルは、ショ糖勾配（１８〜５４％、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ、９．５ｍＬ）及び塩基（クッション）としてのトリザミド（ｔｒｉｚａｍｉｄｅ）で調製された試験管にロードされた。サンプルは、真空下の４℃で２０時間、３５ｋｒｐｍで遠心分離された。各サンプルは、試験管の底部から上部に分画する、７５０μＬの分画に分離された。各分画に塩化ナトリウム（終濃度が５Ｍ、１Ｍの１５０μＬ）及びトリトン（終濃度２０％、１％の３７．５μＬ）がボルテックスされて添加された。分画は、スペクトロフルオロメーター（Ｖａｒｉａｎ  Ｃａｒｙ  Ｅｃｌｉｐｓｅ）のローダミン（励起５５５ｎｍ、放射５８５ｎｍ）、ＦＩＴＣ（励起４９５ｎｍ、放射５３０ｎｍ）、及びピレン（励起３４０ｎｍ、放射３７７ｎｍ）チャンネルで分析された。
【０２２１】
ローダミンの蛍光の結果（図１）は、Ｐｈ−ＤＮＡ−ＮＣ１２−ＰｙｒＤｅｔとＲｈ−ＤＮＡ／ＦＩＴＣ−Ｃｈｉｔ−Ｏｌの両者が最も濃い分画（分画１２〜１４）の観察された蛍光に基づく粒子／凝集を形成する。ＦＩＴＣの蛍光の結果は、ほとんどのＦＩＴＣ−Ｃｈｉｔ−Ｏｌが最も薄い分画（上部の分画）に維持することを示す。少量のＦＩＴＣの蛍光は、複合体（Ｐｈ−ＤＮＡ−ＮＣ１２−ＰｙｒＤｅｔ／ＦＩＴＣ−Ｃｈｉｔ−Ｏｌ）における分画７で観察され、ローダミンの蛍光の複合体と重なり合い、したがって、ＦＩＴＣ−Ｃｈｉｔ−ＯｌとＰｈ−ＤＮＡ−ＮＣ１２−ＰｙｒＤｅｔとの間の相互作用を示す。ピレンの蛍光の結果は、すべてのピレン洗剤が上部の分画に維持することを示す。Ｐｈ−ＤＮＡ−ＮＣ１２−ＰｙｒＤｅｔとＲｈ−ＤＮＡ−ＮＣ１２−ＰｙｒＤｅｔ／ＦＩＴＣ−Ｃｈｉｔ−Ｏｌの強度は、Ｐｈ−ＤＮＡ−ＮＣ１２−ＰｙｒＤｅｔの形成中にＰｙｒＤｅｔの添加の結果として、より低い傾向にある。ＰｙｒＤｅｔがＰｈ−ＤＮＡ−ＮＣ１２粒子に組み込まれない場合、形成中の水が洗浄する間に洗い流される。これは、観察されたより低い蛍光強度を説明し得る。
【０２２２】
実施例６２：ゲラニルアミン塩酸塩の調製
ゲラニルアミン（０．６ｍＬ、５００ｍｇ、３．３ｍｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）はメタノール（０．４ｍＬ）に溶解され、ボルテックスしながら穏やかに混合された。溶液は、冷塩酸／エーテル（１Ｍの５．５ｍＬ、アルドリッチケミカルカンパニー）に滴下して添加され、白色沈殿が形成された。沈殿は遠心分離でスピンダウンされ、エーテル（２ｘ６ｍＬ）で洗浄された。物質は窒素下で乾燥されて、ついで高い真空にされた。白色の結晶物質（５５０ｍｇ、８９％）が産出された。
【０２２３】
実施例６３：ｐＤＮＡ−ＣＰＢの調製
ｐＤＮＡ（ｐＣＩ  Ｌｕｃ、５０μＬ、１００μｇの２μｇ／μＬの水、０．３０μｍｏｌリン酸塩）が臭化セチルピリジニウム（２４．４μＬ、２４４μｇの１０μｇ／μＬの水、０．６１μｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）に添加されて穏やかに混合された。沈殿は遠心分離によってスピンダウンされ、Ｐ２Ｏ５で凍結乾燥された。
【０２２４】
実施例６４：ｐＤＮＡ−ＮＣ３（１：１）の調製
３倍にして、ｐＤＮＡ（ｐＣＩ  Ｌｕｃ、５０μｇ、１００μＬの２μｇ／μＬの水、０．１５μｍｏｌのリン酸塩、ｐＭＩＲ４８）は水（２５μＬ）に溶解されてボルテックスされた。生じた溶液にＮＣ３塩酸（１．４μＬ、１４μｇの１０μｇ／μＬの水溶液、０．１５μｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）が添加されて穏やかに混合された。溶液は凍結され、真空速度で１６時間乾燥された。
【０２２５】
実施例６５：ｐＤＮＡ−ＭＣ９２７（１：１）の調製
乾燥された物質、ｐＤＮＡ−ＮＣ３（５０μｇ、０．１５μｍｏｌのリン酸塩）は、ＭＣ９２７（４μＬ、４０μｇの１０μｇ／μＬのＤＭＦ溶液、０．１５μｍｏｌ）で溶解され、ボルテックスされた。生じた溶液にＤＭＦ（２１μＬ、２μｇ／μＬのｐＤＮＡ）が添加された。
【０２２６】
実施例６６：ｐＤＮＡ−ＭＣ９２７（１：２）の調製
乾燥された物質、ｐＤＮＡ−ＮＣ３（５０μｇ、０．１５μｍｏｌのリン酸塩）は、ＭＣ９２７（９μＬ、９０μｇの１０μｇ／μＬのＤＭＦ溶液、０．３０μｍｏｌ）で溶解され、ボルテックスされた。生じた溶液にＤＭＦ（１６μＬ、２μｇ／μＬのｐＤＮＡ）が添加された。
【０２２７】
実施例６７：ｐＤＮＡ−ＭＣ９２７（１：３）の調製
乾燥された物質、ｐＤＮＡ−ＮＣ３（５０μｇ、０．１５μｍｏｌのリン酸塩）は、ＭＣ９２７（１３μＬ、１３０μｇの１０μｇ／μＬのＤＭＦ溶液、０．４５μｍｏｌ）で溶解され、ボルテックスされた。生じた溶液にＤＭＦ（１２μＬ、２μｇ／μＬのｐＤＮＡ）が添加された。
【０２２８】
実施例６８：ｐＤＮＡ−ＭＣ９３３（１：１）の調製
ｐＤＮＡ（ｐＣＩ  Ｌｕｃ、５０μｇ、２５μＬの２μｇ／μＬの溶液、０．１５μｍｏｌのリン酸塩）は水（２５μＬ）に溶解されてボルテックスされた。生じた溶液にＭＣ９３３（７μＬ、７０μｇの１０μｇ／μＬの水溶液、ｐＨ８、０．１５μｍｏｌ）が添加されて穏やかに混合された。溶液は凍結され、真空速度で１６時間乾燥された。
【０２２９】
実施例６９：ｐＤＮＡ−ＭＣ９３３（１：２）の調製
ｐＤＮＡ（ｐＣＩ  Ｌｕｃ、５０μｇ、２５μＬの２μｇ／μＬの水、０．１５μｍｏｌのリン酸塩）は水（２５μＬ）に溶解されてボルテックスされた。生じた溶液にＭＣ９３３（１５μＬ、１５０μｇの１０μｇ／μＬの水溶液、ｐＨ８、０．３０μｍｏｌ）が添加されて穏やかに混合された。溶液は凍結され、真空速度で１６時間乾燥された。
【０２３０】
ＭＣ９３３（１：２）において記載されるような同様の手順によって、下記の調製が形成された：ｐＤＮＡ−ＮＣ６、ｐＤＮＡ−ＮＣ１０、ｐＤＮＡ−ＣＨＡＰＳ、ｐＤＮＡ−Ｌｙｓ−ＮＣ１２、ｐＤＮＡ−ＭＣ７５３、ｐＤＮＡ−ＭＣ７５４、ｐＤＮＡ−ＭＣ７４４、ｐＤＮＡ−ＭＣ７４５、ｐＤＮＡ−ＭＣ７４６、ｐＤＮＡ−ＭＣ７４７、ｐＤＮＡ−ＭＣ９０９。
【０２３１】
実施例７０：ｐＤＮＡ−ＭＣ９３３（１：３）の調製
ｐＤＮＡ（ｐＣＩ  Ｌｕｃ、５０μｇ、２５μＬの２μｇ／μＬの水、０．１５μｍｏｌのリン酸塩）は水（２５μＬ）に溶解されてボルテックスされた。生じた溶液にＭＣ９３３（２２０μＬ、２２μｇの１０μｇ／μＬの水溶液、ｐＨ８、０．４５μｍｏｌ）が添加されて穏やかに混合された。溶液は凍結され、真空速度で１６時間乾燥された。
【０２３２】
実施例７１：Ｏｌ−Ｍｅｌ−ＣＤＭの調製
Ｏｌ−Ｍｅｌ（４０μＬ、４００μｇの１０μｇ／μＬのＤＭＦ溶液、０．５２μｍｏｌのアミン）は、ジイソプロピルエチルアミン（１．８μＬ、１８μｇの１０μｇ／μＬのＤＭＦ溶液、０．１４μｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）に添加されてボルテックスされた。ＣＤＭ（２．６μＬ、２６μｇの１０μｇ／μＬのＤＭＦ溶液、０．１４μｍｏｌ）が添加されてボルテックスされた。反応混合物は、室温で３０分間ボルテックスされた。終濃度は、１０μｇ／μＬのＯｌ−Ｍｅｌであった。
【０２３３】
実施例７２：Ｏｌ−Ｍｅｌ−ＣＤＭ（２．５）の調製
Ｏｌ−Ｍｅｌ（２５μＬ、２５０μｇの１０μｇ／μＬのＤＭＦ溶液、０．３２μｍｏｌのアミン）は、ジイソプロピルエチルアミン（１．１μＬ、１１μｇの１０μｇ／μＬのＤＭＦ溶液、０．０８５μｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）に添加されてボルテックスされた。ＣＤＭ（３．７μＬ、３７μｇの１０μｇ／μＬのＤＭＦ溶液、０．２０μｍｏｌ）が添加されてボルテックスされた。反応混合物は、室温で３０分間ボルテックスされた。終濃度は、８．４μｇ／μＬのＯｌ−Ｍｅｌであった。
【０２３４】
実施例７３：肝細胞のトランスフェクション
１０％ＦＢＳ及び２４時間のハーベスト（開始のコンフルエンシー５５％）。１７のサンプルが下記のように形成された。
【０２３５】
１）Ｏｐｔｉ（３００μＬ）にｐＤＮＡ（ｐＣＩ  Ｌｕｃ、１．５μＬ、３μｇの２μｇ／μＬの水）が添加されボルテックスされた。Ｌｔ−ｌ（９μＬ、Ｍｉｒｕｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が添加されボルテックスされた。
【０２３６】
２−７）水（３００μＬ）にｐＤＮＡ−ＭＣ９２７の形成物（ｐＣＩ  Ｌｕｃ、１．５μＬ、３μｇの２μｇ／μＬのＤＭＦ溶液）が添加されボルテックスされた。
【０２３７】
８）水（３００μＬ）にｐＤＮＡ（ｐＣＩ  Ｌｕｃ、１．５μＬ、３μｇの２μｇ／μＬの水）が添加されボルテックスされた。Ｏｌ−Ｍｅｌ−ＣＤＭ（１．５μＬ、１５μｇの１０μｇ／μＬのＤＭＦ溶液）が添加されボルテックスされた。
【０２３８】
９）水（３００μＬ）にｐＤＮＡ（ｐＣＩ  Ｌｕｃ、１．５μＬ、３μｇの２μｇ／μＬの水）が添加されボルテックスされた。Ｏｌ−Ｍｅｌ−ＣＤＭ（３μＬ、３０μｇの１０μｇ／μＬのＤＭＦ溶液）が添加されボルテックスされた。
【０２３９】
１０−１１）水（３００μＬ）にｐＤＮＡ−ＭＣ９２７（ｐＣＩ  Ｌｕｃ、１．５μＬ、３μｇの２μｇ／μＬのＤＭＦ溶液）が添加されボルテックスされた。Ｏｌ−Ｍｅｌ−ＣＤＭ（１．５μＬ、１５μｇの１０μｇ／μＬのＤＭＦ溶液）が添加されボルテックスされた。
【０２４０】
１２−１３）水（３００μＬ）にｐＤＮＡ−ＭＣ９２７（ｐＣＩ  Ｌｕｃ、１．５μＬ、３μｇの２μｇ／μＬのＤＭＦ溶液）が添加されボルテックスされた。Ｏｌ−Ｍｅｌ−ＣＤＭ（３μＬ、３０μｇの１０μｇ／μＬのＤＭＦ溶液）が添加されボルテックスされた。
【０２４１】
１４−１５）水（３００μＬ）にｐＤＮＡ−ＭＣ９３３（ｐＣＩ  Ｌｕｃ、１．５μＬ、３μｇの２μｇ／μＬのＤＭＦ溶液）が添加されボルテックスされた。Ｏｌ−Ｍｅｌ−ＣＤＭ（１．５μＬ、１５μｇの１０μｇ／μＬのＤＭＦ溶液）が添加されボルテックスされた。
【０２４２】
１６−１７）水（３００μＬ）にｐＤＮＡ−ＭＣ９３３（ｐＣＩ  Ｌｕｃ、１．５μＬ、３μｇの２μｇ／μＬのＤＭＦ溶液）が添加されボルテックスされた。Ｏｌ−Ｍｅｌ−ＣＤＭ（３μＬ、３０μｇの１０μｇ／μＬのＤＭＦ溶液）が添加されボルテックスされた。
【０２４３】
肝細胞はＤＭＥＭに保持された。トランスフェクションのおよそ２４時間前に、細胞は４８ウェルのプレート適切な濃度で置かれ、オーバーナイトでインキュベートされた。培地は３７℃で５％の二酸化炭素を含有する湿潤な環境で保持された。細胞は、１ｍＬの培地の細胞と１００μＬのサンプル（ウェル当たり１μｇのｐＤＮＡ）を組み合わせることによって、７３％の開始のコンフルエンシーでトランスフェクションされた。細胞は２４時間後にハーベストされて、Ｌｕｍａｔ  ＬＢ  ９５０７  （ＥＧ＆Ｇ  Ｂｅｒｔｈｏｌｄ，  Ｂａｄ−Ｗｉｌｄｂａｄ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）ルミノメーターを使用するルシフェラーゼ活性において分析された。ルシフェラーゼの発現量は、相対的な光ユニットに記録された。数は、２つの別個のウェルの平均である。
【０２４４】
【表８】
2005529959.tif 000009
結果は、ｐＤＮＡ／カチオンの界面活性剤の複合体が、ｏｌ−ｍｅｌの派生物と相互作用した場合、生体外で発現可能であることを示す。
【０２４５】
実施例７４：肝細胞のトランスフェクション
１０％ＦＢＳ、２４時間のハーベスト。２３のサンプルが細胞のトランスフェクションにおいて形成された。
【０２４６】
１）Ｏｐｔｉ（２００μＬ）にｐＤＮＡ（ｐＣＩ  Ｌｕｃ、１μＬ、２μｇの２μｇ／μＬの水）が添加されボルテックスされた。Ｌｔ−ｌ（６μＬ、Ｍｉｒｕｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が添加され、再度ボルテックスされた。
【０２４７】
２−２５）水（２００μＬ）にｐＤＮＡ又はｐＤＮＡ／カチオンの界面活性剤の複合体（ｐＣＩ  Ｌｕｃ、１μＬ、２μｇの２μｇ／μＬのＤＭＦ）が添加され、溶液がボルテックスされた。Ｏｌ−Ｍｅｌ又はＯｌ−Ｍｅｌ−ＣＤＭが添加され、溶液が再度ボルテックスされた。
【０２４８】
肝細胞はＤＭＥＭで保持された。トランスフェクションに先立つおよそ２４時間前に、細胞は４８穴ウェルのプレートに適切な密度でプレートされ、オーバーナイトでインキュベートされた。培地は３７℃で５％の二酸化炭素を含有する湿潤な環境で保持された。細胞は、１ｍＬの培地の細胞と１００μＬのサンプル（ウェル当たり１μｇのｐＤＮＡ）を組み合わせることによって、７３％の開始のコンフルエンシーでトランスフェクションされた。細胞は２４時間後にハーベストされて、Ｌｕｍａｔ  ＬＢ  ９５０７  （ＥＧ＆Ｇ  Ｂｅｒｔｈｏｌｄ，  Ｂａｄ−Ｗｉｌｄｂａｄ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）ルミノメーターを使用するルシフェラーゼ活性において分析された。ルシフェラーゼの発現量は、相対的な光ユニットに記録された。数は、２つの別個のウェルの平均である。
【０２４９】
【表９】
2005529959.tif 000010
結果は、ｐＤＮＡ／カチオンの界面活性剤の複合体が、修飾されたペプチドの派生物と相互作用した場合、生体外で発現可能であることを示す。
【０２５０】
実施例７５：ＧＬ３−１５３−ＮＣ１２の調製
水（４６．２μＬ）にＧＬ３−１５３（３．８μＬ、５０μｇの１３．３μｇ／μＬの１０ｍＭの塩化ナトリウム、０．１６μｍｏｌのリン酸塩、２´ＯＨ−ＣＵＵＡＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡｄＴｄＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  １２）及びその補体２´ＯＨ−ＵＣＧＡＡＧＵＡＣＵＣＡＧＣＧＵＡＡＧｄＴｄＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  １３）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）が添加されてボルテックスされた。生じた溶液にドデシルアミン塩酸（７μＬ、７０μｇの１０μｇ／μＬの水、０．３１μｍｏｌ）が添加されて穏やかに混合された。反応混合物は室温で３０分間インキュベートされて、凍結されて、Ｐ２Ｏ５で１６時間凍結乾燥された。乾燥された物質は、ＤＭＦ（２５μＬ、２μｇ／μＬのＧＬ３−１５３）で再構成された。
【０２５１】
実施例７６：ＥＧＦＰ−６４−ＮＣ１２の調製
水（４６．３μＬ）にＥＧＦＰ−６４（３．７μＬ、５０μｇの１３．４μｇ／μＬの１０ｍＭの塩化ナトリウム、０．１６μｍｏｌのリン酸塩、２´ＯＨ−ＧＡＣＧＵＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＵＧＣＡｄＴｄＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  １４）及びその補体２´ＯＨ−ＣＧＣＵＧＣＡＵＵＵＧＣＣＧＧＵＧＵＵＣＡＧｄＴｄＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  １５）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）が添加されてボルテックスされた。生じた溶液にドデシルアミン塩酸（７μＬ、７０μｇの１０μｇ／μＬの水、０．３１μｍｏｌ）が添加されて穏やかに混合された。反応混合物は室温で３０分間インキュベートされて、凍結されて、Ｐ２Ｏ５で１６時間凍結乾燥された。乾燥された物質は、ＤＭＦ（２５μＬ、２μｇ／μＬのＥＧＦＰ−６４）で再構成された。
【０２５２】
実施例７７：マウス尾部の静脈注射
ＨＰ尾部デュアルルシフェラーゼ：ｓｉＲＮＡ伝達。５つの複合体が下記のように調製された。
【０２５３】
複合体Ｉ−Ｖ：リンゲル液（１倍の１０ｍＬ）にｐＭＩＲ１１６（ｐＣＩ  Ｌｕｃ、４０μｇ、２０μＬの２μｇ／μＬの水）が添加されボルテックスされた。ｐＭＩＲ１２２（ｐＣＩ  Ｒｅｎ、４μｇ、２μＬの２μｇ／μＬの水）が溶液に添加されてボルテックスされた。
【０２５４】
複合体ＩＩ：プラスミド溶液にＧＬ３−１５３（２０μｇ、１．５μＬの１３．３μｇ／μＬの１０ｍＭの塩化ナトリウム、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）が添加されてボルテックスされた。
【０２５５】
複合体ＩＩＩ：プラスミド溶液にＥＧＦＰ−６４（２０μｇ、１．５μＬの１３．４μｇ／μＬの１０ｍＭの塩化ナトリウム、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）が添加されてボルテックスされた。
【０２５６】
複合体ＩＶ：プラスミド溶液にＧＬ３−１５３−ＮＣ１２（２０μｇ、１０μＬの２μｇ／μＬのＤＭＦ）が添加されてボルテックスされた。
【０２５７】
複合体Ｖ：プラスミド溶液にＥＧＦＰ−１５３−ＮＣ１２（２０μｇ、１０μＬの２μｇ／μＬのＤＭＦ）が添加されてボルテックスされた。
【０２５８】
体重（〜２．５ｍｌ）１０ｇあたり１．０ｍＬの尾部静脈注射が、３０ゲージの０．５インチ針を使用してＩＣＲハツカネズミ（ｎ＝２）で実行された。注射は、４乃至５秒の注射時間で手動になされた［Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９；  Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９］。注射の一日後、肝臓がハーベストされて溶解バッファー（０．１％のトリトンＸ−１００、０．１ＭのＫ−リン酸塩、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７．８）で均質化された。不溶解性物質は遠心分離によって除去され、１０μｌの細胞の抽出物又は１０倍希釈の抽出物は、すでに報告されたようなルシフェラーゼ活性において分析された［Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ  １９９０］。
【０２５９】
結果：
【０２６０】
【表１０】
2005529959.tif 000011
結果は、疎水性のｓｉＲＮＡ（ＧＬ３−１５３）がルシフェラーゼ発現を阻害することを示す。
【０２６１】
実施例７８：ＣＤＭ−Ｍｅｌ−Ｓｉ（Ｍｅ）２Ｃ１８の調製
メリチン（１５μＬ、３００μｇの２０μｇ／μＬのＤＭＦ、０．１１μｍｏｌ）がＤＭＦ（２．５μＬ）に溶解されてボルテックスされた。生じた溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（１．５μＬ、１５μｇの１０μｇ／μＬのＤＭＦ、０．１１μｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）が添加されて、ボルテックスされた。クロロジメチルオクタデシルシラン（４μＬ、４０μｇの１０μｇ／μＬのＴＨＦ、０．１１μｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）が溶液に添加されて、ボルテックスされた。反応は５分間加熱（７０℃）されて、ジイソプロピルエチルアミン（２μＬ、２０μｇの１０μｇ／μＬのＤＭＦ、０．１６μｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）が添加されてボルテックスされた。ＣＤＭ（５μＬ、５０μｇの１０μｇ／μＬのＤＭＦ、０．２７μｍｏｌ）が添加されてボルテックスされた。反応混合物は、室温で３０分間浸透して混合された。生じた混合物は、精製なしに使用された。
【０２６２】
実施例７９：ＣＤＭ−Ｍｅｌの調製
メリチン（１５μＬ、３００μｇの２０μｇ／μＬのＤＭＦ、０．１１μｍｏｌ）がＤＭＦ（６．５μＬ）に溶解されてボルテックスされた。生じた溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（３．５μＬ、３５μｇの１０μｇ／μＬのＤＭＦ、０．２７μｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）が添加されて、ボルテックスされた。ＣＤＭ（５μＬ、５０μｇの１０μｇ／μＬのＤＭＦ、０．２７μｍｏｌ）が添加されてボルテックスされた。反応混合物は、室温で３０分間浸透して混合された。生じた混合物は、精製なしに使用された。
【０２６３】
実施例８０：ＣＤＭ−Ｍｅｌ−ＣＤＭＮＣ１２の調製
メリチン（１５μＬ、３００μｇの２０μｇ／μＬのＤＭＦ、０．１１μｍｏｌ）がＤＭＦ（３．５μＬ）に溶解されてボルテックスされた。生じた溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（１．５μＬ、１５μｇの１０μｇ／μＬのＤＭＦ、０．１１μｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）が添加されて、ボルテックスされた。ＣＤＭＮＣ１２（４μＬ、４０μｇの１０μｇ／μＬのＤＭＦ、０．１１μｍｏｌ）が添加されてボルテックスされた。反応混合物は、室温で３０分間浸透して混合された。反応混合物にジイソプロピルエチルアミン（２μＬ、２０μｇの１０μｇ／μＬのＤＭＦ、０．１６μｍｏｌ、アルドリッチケミカルカンパニー）が添加されて、ボルテックスされた。ＣＤＭ（５μＬ、５０μｇの１０μｇ／μＬのＤＭＦ、０．２７μｍｏｌ）が添加されてボルテックスされた。反応は、室温で３０分間浸透して混合された。生じた混合物は、精製なしに使用された。
【０２６４】
実施例８１：マウス尾部の静脈注射ＨＰ
６つの複合体が下記のようになされた。
【０２６５】
複合体Ｉ：水（９．７ｍＬ）にｐＤＮＡ−ＮＣ１２（ｐＣＩ  Ｌｕｃ、２０μＬ、４０μｇの２μｇ／μＬのＤＭＦ）が添加されてボルテックスされた。ＣＤＭ−Ｍｅｌ−ＳｉＭｅ２Ｃ１８（１５μＬ、１５０μｇの１０μｇ／μＬのＤＭＦ）が注射の直前に添加された。
【０２６６】
複合体ＩＩ：水（９．７ｍＬ）にｐＤＮＡ−ＮＣ１２（ｐＣＩ  Ｌｕｃ、２０μＬ、４０μｇの２μｇ／μＬのＤＭＦ）が添加されてボルテックスされた。Ｏｌ−Ｍｅｌ−ＣＤＭ（１５μＬ、１５０μｇの１０μｇ／μＬのＤＭＦ）が添加されてボルテックスされた。
【０２６７】
複合体ＩＩＩ：水（９．７ｍＬ）にｐＤＮＡ−ＮＣ１２（ｐＣＩ  Ｌｕｃ、２０μＬ、４０μｇの２μｇ／μＬのＤＭＦ）が添加されてボルテックスされた。ＣＤＭ−Ｍｅｌ−ＣＤＭＮＣ１２（１５μＬ、１５０μｇの１０μｇ／μＬのＤＭＦ）が添加されてボルテックスされた。
【０２６８】
複合体ＩＶ：水（９．７ｍＬ）にｐＤＮＡ−ＮＣ１２（ｐＣＩ  Ｌｕｃ、２０μＬ、４０μｇの２μｇ／μＬのＤＭＦ）が添加されてボルテックスされた。ＣＤＭ−Ｍｅｌ（１５μＬ、１５０μｇの１０μｇ／μＬのＤＭＦ）が添加されてボルテックスされた。
【０２６９】
複合体Ｖ：水（９．７ｍＬ）にｐＤＮＡ−ＮＣ１２（ｐＣＩ  Ｌｕｃ、２０μＬ、４０μｇの２μｇ／μＬのＤＭＦ）が添加されてボルテックスされた。
【０２７０】
複合体ＶＩ：水（９．７ｍＬ）にｐＤＮＡ（ｐＣＩ  Ｌｕｃ、２０μＬ、４０μｇの２μｇ／μＬの水）が添加されてボルテックスされた。
【０２７１】
注射前に塩化ナトリウム（５Ｍ、終濃度１５０ｍＭの３００μＬ）が各複合体に添加された。体重（〜２．５ｍｌ）１０ｇあたり１．０ｍＬの尾部静脈注射が、３０ゲージの０．５インチ針を使用してＩＣＲハツカネズミ（ｎ＝２）で実行された。注射は、４乃至５秒の注射時間で手動になされた［Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９；  Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９］。注射の一日後、肝臓がハーベストされて溶解バッファー（０．１％のトリトンＸ−１００、０．１ＭのＫ−リン酸塩、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７．８）で均質化された。不溶解性物質は遠心分離によって除去され、１０μｌの細胞の抽出物又は１０倍希釈の抽出物は、すでに報告されたようなルシフェラーゼ活性において分析された［Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ  １９９０］。
【０２７２】
結果：平均ＲＬＵ（ｎ＝３）
【０２７３】
【表１１】
2005529959.tif 000012
実施例８２：低圧の尾部マウス
４つの複合体が下記のようになされた。
【０２７４】
複合体Ｉ：水（６００μＬ）にｐＤＮＡ−ＮＣ１２（ｐＣＩ  Ｌｕｃ、１５μＬ、３０μｇの２μｇ／μＬのＤＭＦ）が添加されてボルテックスされた。注射の直前に、ＣＤＭ−Ｍｅｌ−ＳｉＭｅ２Ｃ１８（１１．２μＬ、１１２μｇの１０μｇ／μＬのＤＭＦ）が添加されてボルテックスされた。
【０２７５】
複合体ＩＩ：水（６００μＬ）にｐＤＮＡ−ＮＣ１２（ｐＣＩ  Ｌｕｃ、１５μＬ、３０μｇの２μｇ／μＬのＤＭＦ）が添加されてボルテックスされた。Ｏｌ−Ｍｅｌ−ＣＤＭ（１１．２μＬ、１１２μｇの１０μｇ／μＬのＤＭＦ）が添加されてボルテックスされた。
【０２７６】
複合体ＩＩＩ：水（６００μＬ）にｐＤＮＡ−ＮＣ１２（ｐＣＩ  Ｌｕｃ、１５μＬ、３０μｇの２μｇ／μＬのＤＭＦ）が添加されてボルテックスされた。ＣＤＭ−Ｍｅｌ−ＣＤＭＮＣ１２（１１．２μＬ、１１２μｇの１０μｇ／μＬのＤＭＦ）が添加されてボルテックスされた。
【０２７７】
複合体ＩＶ：水（６００μＬ）にｐＤＮＡ−ＮＣ１２（ｐＣＩ  Ｌｕｃ、１５μＬ、３０μｇの２μｇ／μＬのＤＭＦ）が添加されてボルテックスされた。ＣＤＭ−Ｍｅｌ（１１．２μＬ、１１２μｇの１０μｇ／μＬのＤＭＦ）が添加されてボルテックスされた。
【０２７８】
２００μＬの複合体の２００μＬの尾部静脈注射は、１０秒以内の手によって注射された総溶液で３０ゲージの０．５インチ針を使用してＩＣＲハツカネズミ（ｎ＝２）で実行された。注射した一日後、動物は犠牲にされ、ルシフェラーゼアッセイが肝臓、脾臓、肺、心臓及び腎臓で行われた。ルシフェラーゼ発現は、すでに報告されたように決定された（Ｗｏｌｆｆ，  Ｊ．Ａ．，  Ｍａｌｏｎｅ，  Ｒ．Ｗ．，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｐ．，  Ｃｈｏｎｇ，  Ｗ．，  Ａｃｓａｄｉ，  Ｇ．，  Ｊａｎｉ，  Ａ．  ａｎｄ  Ｆｅｌｇｎｅｒ，  Ｐ．Ｌ．「Ｄｉｒｅｃｔ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  ｍｏｕｓｅ  ｍｕｓｃｌｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．」Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ｌ４６５−ｌ４６８，  ｌ９９０．）。Ｌｕｍａｔ  ＬＢ  ９５０７（ＥＧ＆Ｇ  Ｂｅｒｔｈｏｌｄ，  Ｂａｄ−Ｗｉｌｄｂａｄ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）ルミノメーターが使用された。
【０２７９】
結果：平均ＲＬＵ（ｎ＝２）
【０２８０】
【表１２】
2005529959.tif 000013
結果は、ｐＤＮＡが転写されることができる場合、疎水性の修飾されたペプチドの３倍の複合体は肝臓にｐＤＮＡを優勢的に伝達することを示す。
【０２８１】
実施例８３：胆管注入
２つの複合体が下記のようになされた。
【０２８２】
複合体Ｉ：等張のマンニトール（８００μＬ）にｐＤＮＡ−ＭＣ９３３（１：２）（ｐＣＩ  Ｌｕｃ、２０μＬ、４０μｇの２μｇ／μＬのＤＭＦ）が添加されてボルテックスされた。
【０２８３】
複合体ＩＩ：等張のマンニトール（８００μＬ）にｐＤＮＡ−ＭＣ９３３（１：２）（ｐＣＩ  Ｌｕｃ、２０μＬ、４０μｇの２μｇ／μＬのＤＭＦ）が添加されてボルテックスされた。Ｏｌ−Ｍｅｌ−ＣＤＭ（１５μＬ、１５０μｇの１０μｇ／μＬのＤＭＦ）が添加されてボルテックスされた。
【０２８４】
３０ゲージの１／２インチ針及び１ｍｌシリンジを備えるＨａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ＰＨ  ２０００のプログラム可能なポンプを使用して胆管注入がＩＣＲハツカネズミで実行された。ポンプは４秒間にわたって２００μＬを送入するためにプログラムされた。５ｘ１ｍｍのＫｌｅｉｎｅｒｔ  Ｋｕｔｚミクロ管クリップが、肝臓から離れて十二指腸への流れを防ぐために注入のポイントから下流の胆管を塞ぐために使用された。胆嚢の入り口は塞がれなかった。これらの注入では、肝臓の静脈の結合及び尾部の大静脈がクランプされなかった。加えて、門脈及び肝臓の動脈は注入のためにクランプされなかった。
【０２８５】
結果：平均ＲＬＵ
【０２８６】
【表１３】
2005529959.tif 000014
結果は、記載された２倍及び３倍の複合体が胆管を介して肝臓にｐＤＮＡを伝達できることを示す。
【０２８７】
実施例８４：胆管注入
４つの複合体が下記のようになされた。
【０２８８】
複合体Ｉ：等張のマンニトール（８００μＬ）にｐＤＮＡ−ＮＣ１２（ｐＣＩ  Ｌｕｃ、２０μＬ、４０μｇの２μｇ／μＬのＤＭＦ）が添加されてボルテックスされた。Ｏｌ−Ｍｅｌ−ＣＤＭ（１５μＬ、１５０μｇの１０μｇ／μＬのＤＭＦ）が添加されてボルテックスされた。
【０２８９】
複合体ＩＩ：等張のマンニトール（８００μＬ）にｐＤＮＡ−ＮＣ１２（ｐＣＩ  Ｌｕｃ、２０μＬ、４０μｇの２μｇ／μＬのＤＭＦ）が添加されてボルテックスされた。Ｏｌ−Ｍｅｌ−ＣＤＭＣ１２（１５μＬ、１５０μｇの１０μｇ／μＬのＤＭＦ）が添加されてボルテックスされた。
【０２９０】
複合体ＩＩＩ：等張のマンニトール（８００μＬ）にｐＤＮＡ−ＮＣ１２（ｐＣＩ  Ｌｕｃ、２０μＬ、４０μｇの２μｇ／μＬのＤＭＦ）が添加されてボルテックスされた。ＣＤＭ−Ｍｅｌ（１５μＬ、１５０μｇの１０μｇ／μＬのＤＭＦ）が添加されてボルテックスされた。
【０２９１】
複合体ＩＶ：等張のマンニトール（８００μＬ）にｐＤＮＡ−ＮＣ１２（ｐＣＩ  Ｌｕｃ、２０μＬ、４０μｇの２μｇ／μＬのＤＭＦ）が添加されてボルテックスされた。Ｏｌ−Ｍｅｌ−ＣＤＭ（１５μＬ、１５０μｇの１０μｇ／μＬのＤＭＦ）が添加されてボルテックスされた。ＭＣ８９４（３．５μＬ、７０μｇの２０μｇ／μＬのＤＭＦ）が添加されてボルテックスされた。
【０２９２】
３０ゲージの１／２インチ針及び１ｍｌシリンジを備えるＨａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ＰＨ  ２０００のプログラム可能なポンプを使用して胆管注入がＩＣＲハツカネズミで実行された。ポンプは４秒間にわたって２００μＬを送入するためにプログラムされた。５ｘ１ｍｍのＫｌｅｉｎｅｒｔ  Ｋｕｔｚミクロ管クリップが、肝臓から離れて十二指腸への流れを防ぐために注入のポイントから下流の胆管を塞ぐために使用された。胆嚢の入り口は塞がれなかった。これらの注入では、肝臓の静脈の結合及び尾部の大静脈がクランプされなかった。加えて、門脈及び肝臓の動脈は注入のためにクランプされなかった。
【０２９３】
結果：平均ＲＬＵ（ｎ＝３）
【０２９４】
【表１４】
2005529959.tif 000015
結果は、記載された２倍及び３倍の複合体が胆管を介して肝臓にｐＤＮＡを伝達できることを示す。
【０２９５】
実施例８５：ゲル電気泳動によるＤＮＡｓｅＩでのｐＤＮＡ−ＮＣ１２の分解
サンプルは下記に記載（総容量１０μＬ）のように形成（２〜１３）され、３７℃で３０分間インキュベーションされた。ローディングバッファーがすべてのサンプルに添加され混合された。サンプルはエチジウムブロミドを含有する０．８％アガロースゲルにローディングされた。ゲルは９５Ｖで４５分間にわたってランされ、紫外線光によって分析された。
【０２９６】
【表１５】
2005529959.tif 000016
結果（図２）は、ｐＤＮＡ−ＮＣ１２複合体のｐＤＮＡがＤＮＡｓｅＩにアクセス可能であることを示す。
【０２９７】
実施例８６：ＮＣ１２でのＲｈＤＮＡの凝縮、濃度及び温度依存
５つの複合体が、下記のように４倍になされた。
【０２９８】
複合体Ｉ：水（５００μＬ）にＲｈＤＮＡ（２．５μＬ、５μｇの２μｇ／μＬの水、０．０１５μｍｏｌ）が添加されてボルテックスされた。ドデシルアミン塩酸塩（６．７μＬ、６．７μｇの１μｇ／μＬの水、０．０３０μｍｏｌ）が溶液に添加されてボルテックスされた。ＲｈＤＮＡの終濃度は、０．１μｇ／μＬであった。
【０２９９】
複合体ＩＩ：水（４６８μＬ）にＲｈＤＮＡ（２５μＬ、５０μｇの２μｇ／μＬの水、０．１５μｍｏｌ）が添加されてボルテックスされた。ドデシルアミン塩酸塩（６．７μＬ、６７μｇの１μｇ／μＬの水、０．０３０μｍｏｌ）が溶液に添加されてボルテックスされた。ＲｈＤＮＡの終濃度は、０．１μｇ／μＬであった。
【０３００】
複合体ＩＩＩ：水（２１８μＬ）にＲｈＤＮＡ（２５μＬ、５０μｇの２μｇ／μＬの水、０．１５μｍｏｌ）が添加されてボルテックスされた。ドデシルアミン塩酸塩（６．７μＬ、６７μｇの１μｇ／μＬの水、０．０３０μｍｏｌ）が溶液に添加されてボルテックスされた。ＲｈＤＮＡの終濃度は、０．２μｇ／μＬであった。
【０３０１】
複合体ＩＶ：ＲｈＤＮＡ−ＮＣ１２（２μｇ／μＬのＤＭＦ）
複合体Ｖ：ＲｈＤＮＡ−ＮＣ１２（２μｇ／μＬのベンジルアルコール）
複合体Ｉ−ＩＩＩは異なる温度（室温、３７℃、５０℃及び７０℃）でインキュベートされた。それらの蛍光（Ｖａｒｉａｎ  Ｃａｒｙ  Ｅｃｌｉｐｓｅスペクトロフルオロメーター）は、異なる時間のポイント（ｔ＝０、１、２、４及び２０時間）でモニターされて、複合体ＩＶ及びＶと比較された。
【０３０２】
結果：結果は、サンプルが室温のサンプルと比較して加熱された場合に、２倍の複合体のｐＤＮＡがより凝縮されることを示す。より希釈したサンプルは、時間に関する最大の凝縮量と、真空下で乾燥された制御する全面的な凝縮に近いことを示す。
【０３０３】
実施例８７：ＲｈＤＮＡ＋ＮＣ１２複合体の塩化ナトリウムの安定
２０時間のインキュベーション後、サンプルは塩化ナトリウムで滴定され、蛍光（Ｖａｒｉａｎ  Ｃａｒｙ  Ｅｃｌｉｐｓｅスペクトロフルオロメーター）によって分析された。図４参照。５つの複合体が下記のように４倍になされた。
【０３０４】
複合体Ｉ：水（５００μＬ）にＲｈＤＮＡ（２．５μＬ、５μｇの２μｇ／μＬの水、０．０１５μｍｏｌ）が添加されてボルテックスされた。ドデシルアミン塩酸塩（６．７μＬ、６．７μｇの１μｇ／μＬの水、０．０３０μｍｏｌ）が溶液に添加されてボルテックスされた。ＲｈＤＮＡの終濃度は、０．１μｇ／μＬであった。
【０３０５】
複合体ＩＩ：水（４６８μＬ）にＲｈＤＮＡ（２５μＬ、５０μｇの２μｇ／μＬの水、０．１５μｍｏｌ）が添加されてボルテックスされた。ドデシルアミン塩酸塩（６．７μＬ、６７μｇの１０μｇ／μＬの水、０．０３０μｍｏｌ）が溶液に添加されてボルテックスされた。ＲｈＤＮＡの終濃度は、０．１μｇ／μＬであった。
【０３０６】
複合体ＩＩＩ：水（２１８μＬ）にＲｈＤＮＡ（２５μＬ、５０μｇの２μｇ／μＬの水、０．１５μｍｏｌ）が添加されてボルテックスされた。ドデシルアミン塩酸塩（６．７μＬ、６７μｇの１μｇ／μＬの水、０．０３０μｍｏｌ）が溶液に添加されてボルテックスされた。ＲｈＤＮＡの終濃度は、０．２μｇ／μＬであった。
【０３０７】
複合体ＩＶ：ＲｈＤＮＡ−ＮＣ１２（２μｇ／μＬのＤＭＦ）
複合体ＩＶ：ＲｈＤＮＡ−ＮＣ１２（２μｇ／μＬのベンジルアルコール）
複合体Ｉ−ＩＩＩは異なる温度（室温、３７℃、５０℃及び７０℃）でインキュベートされた。
【０３０８】
２０時間のインキュベーション後、サンプルは塩化ナトリウムで滴定され、蛍光（Ｖａｒｉａｎ  Ｃａｒｙ  Ｅｃｌｉｐｓｅスペクトロフルオロメーター）によって分析された。図４参照。
【０３０９】
結果。結果は、７０℃まで加熱されたサンプルが塩化ナトリウムの存在下で凝縮しないことを示す。５０℃のサンプルは塩に安定であり、３７℃のサンプルは凝縮しない少量を示し、一方で、室温のサンプルは、さらなる非凝縮を示す。３７℃及び室温のサンプルにおいて、サンプルをさらに希釈すると安定性が高まり、２倍の複合体が時間、温度及び濃度に基づいて安定できることを示している。
【０３１０】
実施例８８：１５０ｍＭ塩化ナトリウムで３７℃におけるＲｈＤＮＡ−ＮＣ１２の安定性
４つの複合体が下記のように２倍になされた。
【０３１１】
複合体Ｉ：水（５００μＬ）にＲｈＤＮＡ−ＮＣ１２（２．５μＬ、５μｇの２μｇ／μＬのＤＭＦ、０．０１５μｍｏｌ）が添加されてボルテックスされた。
【０３１２】
複合体ＩＩ：水（５００μＬ）にＲｈＤＮＡ（２．５μＬ、５μｇの２μｇ／μＬの水、０．０１５μｍｏｌ）が添加されてボルテックスされた。ドデシルアミン塩酸塩（６．７μＬ、６．７μｇの１μｇ／μＬの水、０．０３０μｍｏｌ）が溶液に添加されてボルテックスされた。
【０３１３】
複合体ＩＩＩ：水（５００μＬ）にＲｈＤＮＡ（２．５μＬ、５μｇの２μｇ／μＬの水、０．０１５μｍｏｌ）が添加されてボルテックスされた。ｐ−Ｌ−リジン臭化水素（９．５μＬ、９．５μｇの１μｇ／μＬの水、０．０３０μｍｏｌ、シグマケミカルカンパニー）が溶液に添加されてボルテックスされた。
【０３１４】
複合体ＩＶ：水（５００μＬ）にＲｈＤＮＡ（２．５μＬ、５μｇの２μｇ／μＬの水、０．０１５μｍｏｌ）が添加されてボルテックスされた。
【０３１５】
複合体の１セットに対して、塩化ナトリウム（５Ｍ、１５０ｍＭｎ１５μＬ）が各複合体に添加されて溶液がボルテックスされた。複合体の第二セットに対して、塩化ナトリウムは添加されなかった。すべての複合体は３７℃でインキュベートされた。各サンプルの蛍光は、幾つかの時間（ｔ＝０、４、２４時間）で分析された（Ｖａｒｉａｎ  Ｃａｒｙ  Ｅｃｌｉｐｓｅスペクトロフルオロメーター）。図５参照。
【０３１６】
結果：結果は、塩の存在下で加熱されたサンプルは、塩が存在しないで加熱されたサンプルよりもｐＤＮＡの凝縮がわずかであることを示した。
【０３１７】
実施例８９：血清でのＲｈＤＮＡ−ＮＣ１２の安定性
３つの複合体が下記のようになされた。
【０３１８】
複合体Ｉ：水（５００μＬ）にＲｈＤＮＡ−ＮＣ１２（２．５μＬ、５μｇの２μｇ／μＬのＤＭＦ、０．０１５μｍｏｌ）が添加されてボルテックスされた。
【０３１９】
複合体ＩＩ：水（５００μＬ）にＲｈＤＮＡ（２．５μＬ、５μｇの２μｇ／μＬの水、０．０１５μｍｏｌ）が添加されてボルテックスされた。ドデシルアミン塩酸塩（６．７μＬ、６．７μｇの１μｇ／μＬの水、０．０３０μｍｏｌ）が溶液に添加されてボルテックスされた。
【０３２０】
複合体ＩＩＩ：水（５００μＬ）にＲｈＤＮＡ（２．５μＬ、５μｇの２μｇ／μＬの水、０．０１５μｍｏｌ）が添加されてボルテックスされた。ｐ−Ｌ−リジン臭化水素（９．５μＬ、９．５μｇの１μｇ／μＬの水、０．０３０μｍｏｌ、シグマケミカルカンパニー）が溶液に添加されてボルテックスされた。
【０３２１】
サンプルは、蛍光（Ｖａｒｉａｎ  Ｃａｒｙ  Ｅｃｌｉｐｓｅスペクトロフルオロメーター）によって分析された。血清（５μＬ、１０％）は、ボルテックスをしながら各複合体に添加された。各サンプルの蛍光は、幾つかの時間（ｔ＝０、０．２、０．３、４、２４時間）にわたって分析された（Ｖａｒｉａｎ  Ｃａｒｙ  Ｅｃｌｉｐｓｅスペクトロフルオロメーター）。図６参照。
【０３２２】
結果：この結果は、ｐＤＮＡが時間とともに血清の存在で放出されることを示す、血清が時間とともに凝縮レベルの減少を引き起こすことを示す。
【０３２３】
実施例９０：疎水性ＤＮＡの円偏光二色性
ｐＤＮＡ＋ＮＣ１２＋３７Ｃ（０．２μｇ／μＬ）の調製：ｐＤＮＡ（ｐＣＩ  Ｌｕｃ、１００μＬ、２００μｇの２μｇ／μＬ、０．６１μｍｏｌ）が水に溶解され、ボルテックスされた。生じた溶液にドデシルアミン塩酸塩（２７μＬ、２７０μｇの１０μｇ／μＬの水、１．２μｍｏｌ）が添加された。溶液は３７℃で１６時間インキュベートされた。４つの複合体が下記のようになされた。
【０３２４】
複合体Ｉ：水（１９５５μＬ）にｐＤＮＡ（ｐＣＩ  Ｌｕｃ、３０μＬ、６０μｇの２μｇ／μＬの水）が添加されてボルテックスされた。メタノール（１５μＬ）が溶液に添加されてボルテックスされた。
【０３２５】
複合体ＩＩ：水（１９４７μＬ）にｐＤＮＡ（ｐＣＩ  Ｌｕｃ、３０μＬ、６０μｇの２μｇ／μＬの水）が添加されてボルテックスされた。溶液にドデシルアミン塩酸塩（８μＬ、８０μｇの１０μｇ／μＬの水）が添加されてボルテックスされた。メタノール（１５μＬ）が溶液に添加されてボルテックスされた。
【０３２６】
複合体ＩＩＩ：水（１６８５μＬ）にｐＤＮＡ＋ＮＣ１２＋３７Ｃ（３００μＬ、６０μｇの２μｇ／μＬの水）が添加されてボルテックスされた。溶液にドデシルアミン塩酸塩（８μＬ、８０μｇの１０μｇ／μＬの水）が添加されてボルテックスされた。メタノール（１５μＬ）が溶液に添加されてボルテックスされた。
【０３２７】
複合体ＩＶ：水（１９８５μＬ）にｐＤＮＡ−ＮＣ１２（１５μＬ、６０μｇの４μｇ／μＬのメタノール）が添加されてボルテックスされた。
【０３２８】
結果：この結果は、カチオンの洗剤の存在下でＣＤスペクトルのシフトが存在することを示す。この結果はまた、乾燥された複合体において低いシグナル強度を示す。
【０３２９】
実施例９１：２倍の複合体のリポソームの組み込み
ローダミン標識のｐＤＮＡ／ラウリルアミン塩酸塩の２倍の複合体（ＲｈＤＮＡ−ＮＣ１２）が既に記載のように調製されて、乾燥した固体は２ｍｇ／ｍｌ溶液としてのＤＭＦに溶解された。ホスファチジルコリン（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，  Ｉｎｓ．）／へミコハク酸コレステロール（シグマケミカルカンパニー）（２ｍｇ、クロロホルムで１：１質量）に、２０μｇのＲｈＤＮＡ−ＮＣ１２（ＤＮＡの質量に基づく）が添加された。溶液は減圧下で乾燥されて、次いで高い真空にされた。生じた残存物は、２ｍＬの水で水和され、リポソームを形成するために超音波で処理された。溶液は、サイズ排除カラム（ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂ−２００、１５０ｍＭの塩化ナトリウムの溶離剤、１ｍＬの分画）を通して通過された。
【０３３０】
結果：この結果は、ＲｈＤＮＡがリポソームの分画で溶出し、ＲｈＤＮＡのブランクから分離することを示す。
【０３３１】
実施例９２：ハツカネズミへの生体内の尾部静脈注入
複合体は下記のようになされた。
【０３３２】
複合体Ｉ：水（１６００μＬ）にｐＤＮＡ−ＮＣ１２（ｐＣＩ  Ｌｕｃ、３２μＬ、８０μｇの２．５μｇ／μＬのベンジルアルコール）が添加されてボルテックスされた。
【０３３３】
複合体ＩＩ：水（１６００μＬ）にＣｈｉｔ−Ｏｌ−ＬＢＡ（１６８μｇ、２５２μＬの０．６７μｇ／μＬのＤＭＦ／Ｈ２）が添加されてボルテックスされた。ｐＤＮＡ−ＮＣ１２（ｐＣＩ  Ｌｕｃ、３２μＬ、８０μｇの２．５μｇ／μＬのベンジルアルコール）が添加されてボルテックスされた。
【０３３４】
複合体ＩＩＩ：水（１６００μＬ）にＣｈｉｔ−Ｏｌ−ＬＢＡ（１６８μｇ、２５２μＬの０．６７μｇ／μＬのＤＭＦ／Ｈ２）が添加されてボルテックスされた。ｐＤＮＡ−ＮＣ６（ｐＣＩ  Ｌｕｃ、３２μＬ、８０μｇの２．５μｇ／μＬのベンジルアルコール）が添加されてボルテックスされた。
【０３３５】
２００μＬの複合体の２００μＬの尾部静脈注射は、１０秒以内の手によって注射された総溶液で３０ゲージの０．５インチ針を使用してＩＣＲハツカネズミ（ｎ＝４）で実行された。注射した三日後、グループＡからの動物は犠牲にされ、ルシフェラーゼアッセイが肝臓、脾臓、肺、心臓及び腎臓で行われた。注射した七日後、グループＢからの動物は犠牲にされ、ルシフェラーゼアッセイが肝臓、脾臓、肺、心臓及び腎臓で行われた。ルシフェラーゼ発現は、すでに報告されたように決定された（Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．  ｌ９９０．）。Ｌｕｍａｔ  ＬＢ  ９５０７（ＥＧ＆Ｇ  Ｂｅｒｔｈｏｌｄ，  Ｂａｄ−Ｗｉｌｄｂａｄ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）ルミノメーターが使用された。
【０３３６】
結果：平均ＲＬＵ（ｎ＝２）ハーベスト日数３、グループＡ
【０３３７】
【表１６】
2005529959.tif 000017
結果：平均ＲＬＵ（ｎ＝２）ハーベスト日数７、グループＢ
【０３３８】
【表１７】
2005529959.tif 000018
結果は、ｐＤＮＡ−ＮＣ１２複合体のｐＤＮＡが転写においてアクセス可能であることを示す。
【０３３９】
本発明の原理の例証としてのみ、先の記載が考慮される。さらに、当業者にとって多数の修正及び変更が容易であるので、本発明は、示されて記載された正確な構成及び操作に制限することは望むところではない。したがって、適切な修正及び等価なものはすべて本発明の範囲以内となる。
【図面の簡単な説明】
【０３４０】
【図１】超遠心分離後のＤＮＡ／カチオンの界面活性剤の複合体の蛍光を示す図である。
【図２】ＤＮＡｓｅＩでのＤＮＡ／カチオンの界面活性剤の複合体の分解を示す図である。
【図３】ドデシルアミン塩酸塩でのＲｈＤＮＡ凝縮を示す図である。
【図４】塩化ナトリウムでのＲｈＤＮＡ／カチオンの界面活性剤の複合体の安定性を示す図である。
【図５】３７℃又は１５０ｍＭの塩化ナトリウムにおけるＲｈＤＮＡ−ＮＣ１２の安定性を示す図である。
【図６】１０％の血清でのＲｈＤＮＡ−ＮＣ１２の安定性を示す図である。
【図７】ＤＮＡ／カチオンの界面活性剤の複合体の円偏光二色性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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