(57)【要約】本発明は、共通の支持体表面上の、それぞれが組に特有の放射線種を有する少なくとも二組の点放射体の局所分布を測定するための方法に関する。
2005528623.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
共通の支持体表面上の、それぞれの組に特有の放射線種を有する、少なくとも二組の点放射体の局所分布を測定する、下記の段階を有する方法；
ａ）支持体表面の放射線強度の第一の局所分布を求める、
ｂ）少なくとも一つの組に特有の放射線種の強度を、対応する修正係数で修正する、
ｃ）支持体表面の放射線強度の少なくとも第二の局所分布を求める、および
ｄ）少なくとも二組の点放射体のそれぞれの局所分布を、求められた第一のおよび少なくとも第二の局所分布から、個別に計算する。
【請求項２】
修正段階ｂ）、および支持体表面の放射線強度の少なくとも第二の局所分布を求める段階ｃ）が、少なくとも一回、好ましくは異なる修正係数を用いて繰り返されることを特徴とする、請求項１で請求される方法。
【請求項３】
求められた放射線強度の局所分布が、対応するピクセル行列によって表され、行列のピクセル値は支持体表面上の対応する位置の放射線強度を表すことを特徴とする、請求項１または２で請求される方法。
【請求項４】
少なくとも二組の点放射体のそれぞれの局所分布が、ピクセル行列に基づいて個別に決定されることを特徴とする、請求項３で請求される方法。
【請求項５】
少なくとも二組の点放射体のそれぞれの局所分布が、定義された、特に近傍の、ピクセル行列の成分のピクセル値を合計することによって得られる強度に基づいて個別に決定されることを特徴とする、請求項３または４で請求される方法。
【請求項６】
各組の点放射体が、少なくとも一種類の放射性の、特に放射能を放射する種類の同位体から成ることを特徴とする、前記の請求項のうち一つで請求される方法。
【請求項７】
各組の点放射体が、光を放射する、特に蛍光性、燐光性および／または発光性の物質から成ることを特徴とする、前記の請求項のうち一つで請求される方法。
【請求項８】
少なくとも一組の異なる点放射体について、支持体表面上の少なくとも一つの位置に、既知の放射線を有する少なくとも一の較正点が存在することを特徴とする、前記の請求項のうち一つで請求される方法。
【請求項９】
組に特有の放射線種の修正係数の比が、５％ないし９０％、好ましくは１０％ないし７０％、特に１５％ないし５０％であることを特徴とする、前記の請求項のうち一つで請求される方法。
【請求項１０】
修正係数が少なくとも一つの吸収材を用いることによって得られることを特徴とする、前記の請求項のうち一つで請求される方法。
【請求項１１】
修正係数が少なくとも二つの組の点放射体の放射性崩壊によって得られ、その少なくとも二つの組のそれぞれの点放射体は好ましくは異なる半減期を有することを特徴とする、前記の請求項のうち一つで請求される方法。
【請求項１２】
修正係数が、少なくとも二組の点放射体のそれぞれの組に特有の放射線種について、支持体表面の放射線強度の局所分布を求めるために用いられる、検出器の異なる感度によって得られることを特徴とする、前記の請求項のうち一つで請求される方法。
【請求項１３】
局所分布が、アルファ、ベータ、ガンマおよび／またはＸ線についての位置分解検出器を用いることによって求められることを特徴とする、前記の請求項のうち一つで請求される方法。
【請求項１４】
局所分布が、いわゆる蛍光体画像処理検出器を用いることによって求められることを特徴とする、前記の請求項のうち一つで請求される方法。
【請求項１５】
それぞれの組に特有の放射線種について、支持体表面の放射線強度の局所分布を求めるために用いられる、蛍光体画像処理検出器の異なる感度が、大きい原子番号Ｚを持つ原子、特に鉛、および／または小さい原子番号Ｚを持つ原子を付加的に含む蛍光体画像処理検出器の蛍光体によって達成されることを特徴とする、請求項１４で請求される方法。
【請求項１６】
支持体表面の放射線強度の第一の局所分布が、第一の蛍光体画像処理検出器を用いることによって求められ、かつ支持体表面の放射線強度の少なくとも第二の局所分布は、少なくとも第二の蛍光体画像処理検出器を用いることによって同時に求められ、第一の蛍光体画像処理検出器の感度および少なくとも第二の蛍光体画像処理検出器の感度はそれぞれの組に特有の放射線種について異なることを特徴とする、請求項１５で請求される方法。
【請求項１７】
第一のおよび少なくとも第二の蛍光体画像処理装置検出器が、支持体表面の向かい合う側に用いられることを特徴とする、請求項１６で請求される方法。
【請求項１８】
局所分布が、いわゆるフラットパネル検出器を用いることによって求められることを特徴とする、前記の請求項のうち一つで請求される方法。
【請求項１９】
放射線強度の第一のおよび少なくとも第二の局所分布が、同一の種類の検出器を用いることによって求められることを特徴とする、前記の請求項のうち一つで請求される方法。
【請求項２０】
分析すべき少なくとも二つの物質が、一組の点放射体でそれぞれ標識化され、このような方法で標識化された物質を混合し、かつこの混合物をその後、特に平坦な分析媒体の形である支持体表面に適用することを特徴とする、前記の請求項のうち一つで請求される方法。
【請求項２１】
分析すべき物質が好ましくはペプチド、タンパク質、および／またはオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項２０で請求される方法。
【請求項２２】
分析媒体がタンパク質ゲル、核酸アレイ、タンパク質アレイ、ＥＬＩＳＡアレイおよび／またはブロットであることを特徴とする、請求項２０または２１で請求される方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、共通の支持体表面上の、それぞれの組に特有の放射線種を有する、少なくとも二組の点放射体の局所分布を測定する方法に関する。
【０００２】
プロテオーム研究の一つの重要な用途は、実験上の目的の二つ以上の系の間における特定のタンパク質またはタンパク質アイソフォームの頻度の差、たとえば対応する薬理学的に処理された細胞、組織、または生物に由来する対応する頻度と比較した、対照の細胞、組織、または生物に由来するタンパク質の頻度の測定である。
【０００３】
本研究の異なる実験系に由来する異なるゲルのタンパク質スポットについてのタンパク質強度は、典型的には、これらのタンパク質スポット中のタンパク質の量が実験系間で異なるかどうかを判定するために比較される。これが示差表示の原理であり、マルチカラー分析ともいう。さまざまな２次元ゲル上のタンパク質スポット座標の配置および対応するタンパク質スポットの同定はマッチング手順と呼ばれ、二次元ＰＡＧＥによって作られた異なるゲルの、再現性の無い挙動のために、不確かである可能性がある。マッチング手順はしたがって、時間のかかる段階であり、現在のところわずかな程度しか自動化できない。
【０００４】
たとえば、大まかなマルチカラー分析は、異なる実験系でさまざまな試料を測定することによって実施することができる。この場合、たとえば、異なる試料に由来するタンパク質はそれぞれ別個の二次元ＰＡＧＥ実験で処理し、その後、さまざまな二次元ＰＡＧＥゲル中のタンパク質に対応するスポットの検出、および、各ゲルまたは複製分析ゲルの各群の各試料について得られたスポットパターンの比較を行う。スポットパターンは典型的には、グラフィックゲル画像ファイル、たとえばＴＩＦＦファイルに保存される。従来のソフトウェアプログラムアルゴリズムが、これらのゲル画像ファイルを互いと並べ、すべての画像中のピクセルを他の画像からのピクセルと比較できるようにする。複製二次元ＰＡＧＥゲル画像の「複合ゲル画像」は、典型的には一つの試料について作製され、特定の試料についてすべての複製ゲルのスポット強度の平均を含む。異なる試料の複合ゲルは典型的には、試料間のタンパク質頻度の差を明らかにするために、互いに比較される。この手法の二つの主な制限は、対応するスポットの正確な割り当てを可能にするスポットマッチング、および、異なる２次元ゲルのスポット中のタンパク質の量の比較を可能にするスポットの定量的評価である。
【０００５】
より洗練された示差表示を生み出すため、異なる試料の分析対象分子は典型的には、試料を混合し一緒に分析することができるように、試薬を用いて標識化されるかまたは修飾されている。複雑でエラーを起こしやすいマッチング手順はこのように回避することができる。標識化が理由で、各試料のタンパク質はその後、別の試料に由来するタンパク質の存在とは無関係に検出することができる。
【０００６】
Ｃｙ色素を基礎とするＤＩＧＥ蛍光試薬は、アマシャム・バイオサイエンス社（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（ドイツ、フライブルク（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ））から入手可能であって、一つの例である。２つの試料に由来するタンパク質を、異なる蛍光試薬を用いて別々に標識し、その後混合して一緒に二次元ＰＡＧＥ電気泳動に供する。各試料中のさまざまな蛍光基は、異なる波長によって励起され、異なる波長の光を放射する。適当な光フィルターを用いることによって、各試料のタンパク質の画像を、他方の試料に由来するタンパク質の分布とは無関係に得ることができる。これらの画像はその後、適当なソフトウェアパッケージによって分析することができる。
【０００７】
より洗練された示差表示のための別の手法は、異なる試料に由来する分析対象分子の、放射性同位体を用いた標識化を含む。分析対象分子の放射性標識化および適当な検出器によるそれらの検出は、他の方法、たとえばＣｙ色素を用いる前述の方法よりも、数桁高感度である。
【０００８】
分析対象分子が放射性同位体を用いて標識化されている分析方法は下記に記載されている。
【０００９】
Ｍｏｎｒｉｂｏｔ−Ｅｓｐａｇｎｅ Ｃ， Ｂｏｕｃｈｅｒｉｅ Ｈ，『示差ゲル曝露−タンパク質試料の二次元比較のための新しい方法論』（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｇｅｌ ｅｘｐｏｓｕｒｅ， ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓａｍｐｌｅｓ．） プロテオミクス（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）， ２００２， ２；２２９−２４０。
【００１０】
分析対象分子が放射性同位体で標識される場合、その同位体の放射線または放射能を測定する必要がある。放射性同位体の原子核は不安定である。それは粒子または光子を放出することによって自然に崩壊する傾向がある。いくつかの異なる種類の粒子が放射性物質によって放出される。電子、陽電子、アルファ粒子、および中性子が一般に重要なものである。これらの粒子の放出はしばしば、必ずではないにせよ、ガンマ線の放射を伴う。別の種類の放射性崩壊は、Ｋ殻電子の原子核による自然捕捉であり、これはＫ電子捕捉として知られている。放射線検出器は、これらのさまざまな種類の放射線を検出するために開発されている装置である。
【００１１】
ＤＮＡアレイまたは二次元ＰＡＧＥタンパク質ゲルといった、アレイ中または表面上に存在する放射性分子の定量的分析には、下記の空間的に分解する検出器が用いられ、またそれらはこの目的のための写真フィルムの代わりとなる。引用した４つの例のうち、２、３、および４の型の検出器は上記の原理に基づく。
【００１２】
１．富士写真フイルム株式会社（東京）、パッカード・バイオサイエンス株式会社（Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＧｍｂＨ）（ドイツ、ドライアイヒ（Ｄｒｅｉｅｉｃｈ））、アグフア・ゲバルト社（ＡＧＦＡ−Ｇｅｖａｅｒｔ Ｎ．Ｖ．）（ベルギー、モルツェル（Ｍｏｒｔｓｅｌ））またはアマシャム・バイオサイエンス社（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（ドイツ、フライブルク（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ））から現在入手可能な装置のような、画像プレートを使用する装置の原理に従って動作する、蛍光体画像処理装置を用いるオートラジオグラフィー。Ａｍｅｍｉｙａ Ｙ， Ｍｉｙａｈａｒａ Ｊ． 『画像処理プレートは多数の分野を照らす。』（Ｉｍａｇｉｎｇ ｐｌａｔｅ ｉｌｌｕｍｉｎａｔｅｓ ｍａｎｙ ｆｉｅｌｄｓ．） ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）， １９９８， ３３６；８９−９０．
Ｍｉｙａｈａｒａ Ｊ． 『画像処理プレート；新しい放射線画像センサー。』（Ｔｈｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｐｌａｔｅ； ａ ｎｅｗ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｉｍａｇｅ ｓｅｎｓｏｒ．） ケミストリートディ（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｏｄａｙ）， １９８９， ２２３；２９−３６。
【００１３】
２．ベータ粒子を検出するためにマイクロチャンネルプレートアナライザーと連結したＰＰＡＣ（平行電極電子なだれチャンバー）イオン化ガスチャンバー、たとえばバイオスペース・メジャーズ社（ＢｉｏＳｐａｃｅ Ｍｅａｓｕｒｅｓ）（パリ）によって市販されるベータ画像処理装置、およびパッカード・バイオサイエンス社（Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）（ドイツ、ドライアイヒ（Ｄｒｅｉｅｉｃｈ））によって市販される同様の装置。
【００１４】
これらの画像処理装置では、ＰＰＡＣからの光はレンズによって多芯画像増倍管へ集中され、そこからのシグナルはＣＣＤカメラによって記録される。
【００１５】
Ｌａｎｉｅｃｅ Ｐ， Ｃｈａｒｏｎ Ｙ， Ｄｕｍａｓ Ｓ， Ｍａｓｔｒｉｐｐｏｌｉｔｏ Ｒ， Ｐｉｎｏｔ Ｌ， Ｔｒｉｃｏｉｒｅ Ｈ， Ｖａｌｅｎｔｉｎ Ｌ． ＨＲＲＩ；『ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション実験における迅速直接定量のための高分解能放射性画像処理装置。』（ａ ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｒａｄｉｏｉｍａｇｅｒ ｆｏｒ ｆａｓｔ， ｄｉｒｅｃｔ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．）バイオテクニクス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）， １９９４， １７；３３８−３４５．
【００１６】
Ｃｒｕｍｅｙｒｏｌｌｅ−Ａｒｉａｓ Ｍ， Ｌａｔｏｕｃｈｅ Ｊ， Ｌａｎｉｅｃｅ Ｐ， Ｃｈａｒｏｎ Ｙ， Ｔｒｉｃｏｉｒｅ Ｈ， Ｖａｌｅｎｔｉｎ Ｌ， Ｒｏｕｘ Ｐ， Ｍｉｒａｍｂｅａｕ Ｇ， Ｌｅｂｌａｎｃ Ｐ， Ｆｉｌｌｉｏｎ Ｇ ｅｔ ａｌ．『ＧｎＲＨ受容体の"ｉｎ ｓｉｔｕ"特徴づけ；二つの放射性画像処理装置の使用および定量的オートラジオグラフィーとの比較。』（"Ｉｎ ｓｉｔｕ」ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＧｎＲＨ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ； ｕｓｅ ｏｆ ｔｗｏ ｒａｄｉｏｉｍａｇｅｒｓ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｙ．） Ｊ． Ｒｅｃｅｐｔ Ｒｅｓ， １９９４， １４；２５１−２６５．
【００１７】
Ｊｅａｖｏｎｓ ＡＧ．『定量的オートラジオグラフィー分析のための方法および装置。』（Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｙ ａｎａｌｙｓｉｓ）１９９２年８月１１日。米国特許第５１３８１６８号。所有者；オックスフォード・ポジション・システムズ社（Ｏｘｆｏｒｄ Ｐｏｓｉｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ）。
【００１８】
Ｄｅｃｒｉｓｔｏｆｏｒｏ Ｃ， Ｚａｋｎｕｎ Ｊ， Ｋｏｈｌｅｒ Ｂ， Ｏｂｅｒｌａｄｓｔａｅｔｔｅｒ Ｍ， Ｒｉｃｃａｂｏｎａ Ｇ．『電子オートラジオグラフィーの放射性医薬における使用。』（Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｙ ｉｎ ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｙ．） Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ．， １９９７， ２４；３６１−３６５．
【００１９】
３．ベータ、ガンマ、およびアルファ粒子の検出のためのシンチレーション表面がマイクロチャンネルプレートアナライザーと連結されている、ミクロ画像処理装置（バイオスペース・メジャーズ社（ＢｉｏＳｐａｃｅ Ｍｅａｓｕｒｅｓ）（パリ））のような装置。これらの画像処理装置では、シンチレーション表面からの光は多芯画像増倍管へ入り、そこからのシグナルはＣＣＤカメラによって取り込まれる。
【００２０】
Ｌａｎｉｅｃｅ Ｐ， Ｃｈａｒｏｎ Ｙ， Ｄｕｍａｓ Ｓ， Ｍａｓｔｒｉｐｐｏｌｉｔｏ Ｒ， Ｐｉｎｏｔ Ｌ， Ｔｒｉｃｏｉｒｅ Ｈ， Ｖａｌｅｔｉｎ Ｌ． ＨＲＲＩ；『ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション実験における迅速直接定量のための高分解能放射性画像処理装置。』（ａ ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｒａｄｉｏｉｍａｇｅｒ ｆｏｒ ｆａｓｔ， ｄｉｒｅｃｔ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｅｘｐｅｒｉｅｍｅｎｔｓ．） バイオテクニクス（Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）， １９９４， １７； ３３８−３４５．
【００２１】
Ｃｒｕｍｅｙｒｏｌｌｅ−Ａｒｉａｓ Ｍ， Ｌａｔｏｕｃｈｅ Ｊ， Ｌａｎｉｅｃｅ Ｐ， Ｃｈａｒｏｎ Ｙ， Ｔｒｉｃｏｉｒｅ Ｈ， Ｖａｌｅｎｔｉｎ Ｌ， Ｒｏｕｘ Ｐ， Ｍｉｒａｍｂｅａｕ Ｇ， Ｌｅｂｌａｎｃ Ｐ， Ｆｉｌｌｉｏｎ Ｇ ｅｔ ａｌ．『ＧｎＲＨ受容体の"ｉｎ ｓｉｔｕ"特徴づけ；二つの放射性画像処理装置の使用および定量的オートラジオグラフィーとの比較。』（"Ｉｎ ｓｉｔｕ」ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＧｎＲＨ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ； ｕｓｅ ｏｆ ｔｗｏ ｒａｄｉｏｉｍａｇｅｒｓ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｙ．） Ｊ． Ｒｅｃｅｐｔ Ｒｅｓ， １９９４， １４；２５１−２６５．
【００２２】
Ｊｅａｖｏｎｓ ＡＧ．『定量的オートラジオグラフィー分析のための方法および装置。』（Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｙ ａｎａｌｙｓｉｓ）１９９２年８月１１日。米国特許第５１３８１６８号。オックスフォード・ポジション・システムズ社（Ｏｘｆｏｒｄ Ｐｏｓｉｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ）。
【００２３】
Ｄｅｃｒｉｓｔｏｆｏｒｏ Ｃ， Ｚａｋｎｕｎ Ｊ， Ｋｏｈｌｅｒ Ｂ， Ｏｂｅｒｌａｄｓｔａｅｔｔｅｒ Ｍ， Ｒｉｃｃａｂｏｎａ Ｇ．『電子オートラジオグラフィーの放射性医薬における使用。』（Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｙ ｉｎ ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｙ．） Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ．， １９９７， ２４；３６１−３６５．
【００２４】
４．バイオトレース社（ＢｉｏＴｒａｃｅｓ Ｉｎｃ．）（米国バージニア州ハーンダン（Ｈｅｒｎｄｏｎ））およびプロトシス社（ＰｒｏｔｏＳｙｓ ＡＧ）（ドイツ、マインツ（Ｍａｉｎｚ））によって市販されているＭＰＤ（多光子検出）画像処理装置のような、空間的分解光電子増倍器を使用するシンチレーション結晶アレイ画像処理装置。
【００２５】
Ｄｒｕｋｉｅｒ ＡＪ， Ｓａｇｄｅｊｅｖ ＩＲ，『超低バックグラウンド多光子検出器。』（Ｕｌｔｒａｌｏｗ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐｈｏｔｏｎ ｄｅｔｅｃｔｏｒ）１９９９年２月２日。米国特許第５，８６６，９０７号。所有者；バイオトレース社（ＢｉｏＴｒａｃｅｓ Ｉｎｃ．）（バージニア州ハーンダン（Ｈｅｒｎｄｏｎ））
【００２６】
上記の２、３、および４の型の検出器とは対照的に、蛍光体画像処理装置画像処理プレート（蛍光体画像処理装置ＩＰ）は、フィルム状の放射線画像センサーであって、放射線エネルギーを吸収し蓄え、そのため後で再び放出し適当な蛍光体画像処理読み出し装置で測定することができる、特に設計された蛍光体を含む。蛍光体画像処理装置は、蛍光体画像処理読み出し装置と蛍光体画像処理装置画像処理プレートから成る複合系であって、以下では蛍光体画像処理装置と称する。蛍光体とは、特定の性質を有する光子または化学反応によって作用された後に光を放射する粉末または結晶性物質である。蛍光体による光の放射（発光）は、即時的（蛍光）、遅延性（燐光）、または輝尽性発光（ＰＳＬ）でありうる。蛍光体画像処理装置ＩＰの蛍光体はＰＳＬ現象を利用し、これは蛍光でも燐光でもない。ＰＳＬは、蛍光体の原子の電子オービタルで、放射性崩壊する原子によって放射された光子のエネルギーといった、最初の刺激のエネルギーを貯蔵する。このエネルギーは、蛍光体が第一の刺激の波長よりも長い波長を持つ光によって刺激された時に放射される。このような方法で、蛍光体はそれが曝露された放射線の量に関する情報を貯蔵し、この情報を光として出力し、それは市販の蛍光体画像処理装置といった適当な装置で定量的に分析できる。
【００２７】
蛍光体画像処理装置における試料の照射は、写真フィルムにおける露光と似た同じ方法で実施される。照射された蛍光体画像処理装置ＩＰは移動中に集束レーザービーム（たとえばＨｅ−Ｎｅレーザー）を用いてスキャンされる。蛍光体結晶がレーザー光で照射される際に放出されるＰＳＬは集光コンダクターによって光電子増倍管（ＰＭＴ）に集められ、電気シグナルに変換される。
【００２８】
上記で考察した放射能測定装置の型（蛍光体画像処理装置、ＰＰＡＣイオン化ガスチャンバー検出器、空間的分解光子増倍器付きシンチレーション結晶アレイ画像処理装置、ＣＣＤカメラで撮影したシンチレーション表面）の中で、シンチレーション結晶アレイ画像処理装置は、エネルギーおよび粒子の種類（ベータ／ガンマ）を用い、および異なる放出粒子の検出された波形を分析することによって、さまざまな同位体を識別することができる。ＰＰＡＣイオン化ガスチャンバー検出器（たとえばベータ画像処理装置）およびＣＣＤカメラで撮影したシンチレーション表面（たとえばミクロ画像処理装置）は、異なる放射性同位体を識別するために、取扱説明書に示される通り、他の同位体に加えてＨ−３の極めて弱いベータ粒子の検出を必要とする。これらの検出器は、Ｈ−３標識化タンパク質を二次元ＰＡＧＥゲルから直接検出することはできず、それはポリアクリルアミドマトリクスが弱いＨ−３ベータ粒子を吸収するためである。分析対象分子は、ＰＰＡＣイオン化ガスチャンバー検出器によって検出することができるように、ポリアクリルアミドゲルからたとえば膜上へのブロッティングによって取り出さなければならない。これは時間がかかり、たとえば分子量が異なるタンパク質について、変わりやすい効率でしか働かない。Ｓ−３５といった、より強くベータ放出性である同位体を用いて標識化された分析対象分子は、それらがまだポリアクリルアミドゲルマトリクス中にある場合でさえイオン化ガスチャンバーによって効率的に可視化することができ、ブロットする必要が無い。しかし、空間的分解光子増倍器およびイオン化ガスチャンバーを用いるシンチレーション結晶アレイ画像処理装置は、放射線照射の全体を通じて装置を占領する。高処理量を必要とする分析は、たとえばタンパク質またはゲノム研究では、したがって非常に費用がかかる。
【００２９】
他の従来の示差検出方法を下記に説明するが、これらは支持体表面上の分析対象分子の示差検出には用いることができない。
【００３０】
一つの検出器での二測定を用いることによる材料試料中に存在する二種類の異なる元素の濃度の定量的測定は；Ｓａｓｔｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．， １９８１， ５３；７６５−７７０に記載されている。
【００３１】
しかし、材料試料中の元素の、たとえば試料表面上の局所分布でなく、濃度だけがこの方法で計算される。ここで記載される方法はしたがって、異なる同位体を用いて標識化された分析対象分子の示差分析には適しない。
【００３２】
パーデュ大学（Ｐｕｒｄｕｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）（パーデュ研究基金（Ｐｕｒｄｕｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）、インディアナ州ウエスト・ラファィエット（Ｗｅｓｔ Ｌａｆａｙｅｔｔｅ））からのハイパースペクトル処理ソフトウェアであるマルチスペック（ＭｕｌｔｉＳｐｅｃ）（登録商標）は、衛星画像のさまざまな特性を抽出または検出するために画像のスペクトル測定を用いる。マルチスペックの構想は、一つの画像のピクセルのスペクトル占有率を、一連の画像に分解することを含み、その一連の画像のすべては、一次データがすべて同時に記録された一つの親画像に由来する。この方法では、一つの親画像から開始して、この元の画像に由来するさまざまな画像が数学的方法によってこのように作製される。
【００３３】
Ｃ．Ｈ． Ｃｈｅｎ編『リモートセンシングのための情報処理』（Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｆｏｒ Ｒｅｍｏｔｅ Ｓｅｎｓｉｎｇ）、第一章Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｄｇｒｅｂｅ、『多スペクトルおよびハイパースペクトル画像データのための情報抽出原理と方法』（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｔｒａｌ ａｎｄ Ｈｙｐｅｒｓｐｅｃｔｒａｌ Ｉｍａｇｅ Ｄａｔａ）、発行ワールドサイエンティフィックパブリッシング社（Ｗｏｒｌｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｉｎｃ）， １０６０ メインストリート、リバーエッジ（Ｍａｉｎ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｒｉｖｅｒ Ｅｄｇｅ）， ＮＪ ０７６６１， ＵＳＡ， ２０００。
【００３４】
分析対象分子の放射性標識化はしばしば、多くの研究、たとえば生物学研究で、必要な分析性能を達成するための最適な方法であるため、また、１回の分析での２つ以上の試料に由来する分析対象分子の示差検出が望ましいため、放射性標識化された分析対象またはその他の分子を用いたそのような示差検出を実施する大きな必要性がある。
【００３５】
目的および解決方法
したがって、たとえばタンパク質またはゲノム研究において、高い分析性能および高処理量を有するとともにコストが比較的低く、先行技術の上述の欠点を克服するのに役立つ、示差分析を可能にする方法を提供することが本発明の目的である。
【００３６】
この目的は、請求項１の性質を有する方法によって達成される。本発明の好ましい改良は、独立請求項２から１９に明示されている。すべての請求項の文言は、参照によって本明細書本文の内容に含まれる。
【００３７】
本発明に記載の方法では、共通の支持体表面上の、それぞれの組に特有の放射線種を有する、少なくとも二組の点放射体の局所分布は下記の段階によって測定される；ａ）支持体表面の放射線強度の第一の局所分布を求める、ｂ）少なくとも一つの組に特有の放射線種の放射線強度を、対応する修正係数で修正する、ｃ）支持体表面の放射線強度の少なくとも第二の局所分布を求める、およびｄ）少なくとも二組の点放射体のそれぞれの局所分布を、求められた第一のおよび少なくとも第二の局所分布から、個別に計算する。
【００３８】
点放射体の局所分布は、たとえば、試験する位置または支持体表面上の、放射線強度および／または単位面積当たりの各点放射体数を意味する。それぞれの組に特有の放射線種を有する、少なくとも二組の点放射体の局所分布が調べられる。点放射体は、それに特有の放射線を均一にまたは少なくとも理論上は均一に全面へ、すなわち固体角を越えて放射する、たとえば一つの原子またはその同位体および／または、原子または同位体の群を含む分子といった物体である。組に特有の放射線種は、たとえば、アルファ、ベータ、ガンマおよび／またはＸ線および／または特定波長を有する光でありうる。その少なくとも二組はそれぞれ、組に特有の同一の放射線種を有する点放射体から成り、基質表面上に共に存在する。基質表面は実質的に平坦な構造、たとえば二次元ＰＡＧＥゲルである。
【００３９】
支持体表面の放射線強度、すなわち単位面積当たりの放射線の強さの、第一の局所分布は、本発明に記載の方法の第一の段階ａ）で求められる。
【００４０】
少なくとも一つの組に特有の放射線種の放射線強度は、対応する修正係数を用いて修正され、第二の段階ｂ）で修正係数は既知であるかまたは測定されるかまたは計算することができる。修正は、組に特有の放射線種の強度の低下または上昇でありうる。修正係数は％で与えられ、０％は放射線強度の完全な抑制を意味し、放射線強度の１００％不変性および１００％より大きい値は放射線強度の上昇を意味する。
【００４１】
組に特有の放射線種のすべての強度、放射線種の一部だけの強度、または放射線種の一つだけの強度を、対応する修正係数によって修正することが可能である。組に特有の放射線種の修正係数の一または複数の比は、好ましくは１に等しくない一個または複数の値を有する、すなわち、組に特有の放射線種の修正係数は好ましくは互いに異なる。
【００４２】
少なくとも、支持体表面の放射線強度の第二の局所分布は、放射線強度の修正後のさらに後の段階ｃ）で求められる。
【００４３】
少なくとも二組の点放射体のそれぞれの局所分布は、求められた第一のおよび少なくとも第二の局所分布から、第四の段階ｄ）で個別に計算される。
【００４４】
求められた少なくとも二つの局所分布に基づいて、支持体表面上の点放射体の各組の局所分布は、支持体表面上の他方の組の点放射体の分布とは無関係に、計算によって別々に決定される。組に特有の局所分布への分離は、検出器によって直接に実行されるのでなく、個々の放射線源の検出されたシグナルの重ね合わせを表す、求められた局所分布に基づく計算によってのみ実行される。
【００４５】
本発明の有利な一改良では、修正段階ｂ）および、少なくとも第二の支持体表面の放射線強度の局所分布を求める段階ｃ）は、異なる修正係数を用いて少なくとも一回繰り返される。これは二組より多い点放射体を分析する場合に必要であり、なぜならある組の個別の局所分布を決定するためには、組に特有の放射線種の強度の対応する修正を伴う少なくとも一の局所分布を求める必要があるからである。
【００４６】
二組の点放射体だけが分析されるならば、本方法の精度はそのような反復によって改善することができる。これは、特にたとえば吸収材を用いることでおよび／またはその後に放射性崩壊によって、異なる機構を用いた修正係数を得ることによって達成される。
【００４７】
本発明の別の有利な一改良では、求められた放射線強度の局所分布は、対応するピクセル行列によって表され、行列のピクセル値は支持体表面上の対応する位置の放射線強度を表す。
【００４８】
支持体表面上の放射線強度の局所分布を、たとえば適当な位置分解検出器を用いて求める際は、支持体表面の放射線強度の局所分布はピクセル値の行列配列に変換され、その場合ピクセル値は検出器によって求められる放射線強度と比例しうる。各ピクセルは、表面の定義された領域に配置されている。
【００４９】
本発明の別の有利な一改良では、少なくとも二組の点放射体のそれぞれの局所分布は、ピクセル行列に基づいて個別に決定される。
【００５０】
純粋に説明のための一例では、計算は、点放射体のＡおよびＢの二組を、組Ａの放射線種について修正係数０％、すなわち完全な抑制、および組Ｂの放射線種について修正係数１００％、すなわち不変を用いて分析する際、下記のように行うことができる。
【００５１】
求められた第二の局所分布での放射線種Ａの完全抑制のために、放射線種Ｂについての重ね合わせが無い局所分布が直接得られる。両方のシグナル成分が存在する求められた第一の局所分布から、組Ｂの放射線種のシグナル成分だけが存在する求められた第二の局所分布を除算することによって、放射線種Ｂのシグナル成分を含まない組Ａの放射線種の局所分布が得られる。
【００５２】
前記方法は、同一の検出器または同様の検出器を用いることによってマルチカラー測定を可能にし、すなわち、前記方法は個々の点放射線源の局所分布の、重なりの無い別々の表示を可能にする。従来の方法は、マルチカラー表示のためには各試料の分析対象分子の元の単色画像を必要とする。各同位体の単色画像は、それ自体は本発明では測定されず、求められた少なくとも二つの局所分布または画像から計算される。
【００５３】
実際には、異なる放射線種に起因するシグナル成分は好ましくは、１００％または９５％未満の係数によって修正または低下される。二組の点放射体の重なりが無い局所分布を計算する一つの可能な方法を、下記に説明する。
【００５４】
下記は、求められた第一の局所分布のピクセル行列の典型的なピクセル値に適用される；
Ａ＋Ｂ＝Ｘ                  （１）
【００５５】
下記は、求められた第二の局所分布のピクセル値に適用される；
ＭＡ＋ＮＢ＝Ｙ              （２）；
ここで
Ａ＝  求められた第一の局所分布における放射線種Ａのシグナル寄与
Ｂ＝  求められた第一の局所分布における放射線種Ｂのシグナル寄与
Ｘ＝  求められた第一の局所分布における放射線強度に対応するピクセル値
Ｙ＝  求められた第二の局所分布における放射線強度に対応するピクセル値
Ｍ＝  組に特有の放射線種Ａについての修正係数
Ｎ＝  組に特有の放射線種Ｂについての修正係数。
ＡおよびＢは未知であって求める。
ＸおよびＹは測定された強度である。
【００５６】
ＭおよびＮは較正または計算によって決定することができる。二つの放射線種の修正係数の比は、より小さい修正係数を持つ放射線種の修正係数と、より大きい修正係数を持つ放射線種の修正係数との比と定義される（Ｎ≧ＭであってＭ／Ｎ）。修正係数の比は、二つ以上の放射線種が存在する場合は、対応する方法で定義される。
【００５７】
ＡおよびＢの値は、式（１）および（２）から成る連立式を解くことによって計算することができる。この計算は、同様の方法で、ピクセル行列のすべてのピクセルについて実施することができる。
【００５８】
ある位置での放射線強度または放射線種シグナル寄与が既知である場合、したがって、その位置での単位面積当たりの点放射体数を計算することもまた可能であり、なぜなら放射線強度と単位面積当たりの点放射体数は互いに比例するからである。
【００５９】
Ｐ個の組の点放射体を含むより一般化された例では、そのためにはＰ個の局所分布を計算する必要があるが、問題は行列表示を用いることによって公式化することができる；
Ｆ*Ｘ＝Ｉ
ここで；
Ｘ＝  求められた第一の局所分布におけるＰ個の組の点放射体の放射線種のシグナル寄与から成る、Ｐ個の成分を有するベクトル
Ｉ＝  求められたＰ個の組のピクセル値から成る、Ｐ個の成分を有するベクトル
Ｆ＝  Ｐ個の異なる組の点放射体について求められたＰ個の局所分布について計算または決定されたＰ*Ｐ個の修正係数から成る、Ｐ*Ｐ個の成分を有する行列。
【００６０】
ベクトルＸの放射線種の個々のシグナル寄与は、下記の式に従って行列Ｆを逆転することによって計算することができる；
Ｘ＝Ｆ-1*Ｉ
【００６１】
本発明の一改良では、少なくとも二組の点放射体のそれぞれの局所分布は、定義された、特に近傍の、ピクセル行列の成分のピクセル値を合計することによって得られる強度に基づいて個別に決定される。ピクセル毎の分析について上述したアルゴリズムを用いる代わりに、求められた第一のおよび第二の局所分布について計算することができる特定領域の合計ピクセル強度を用いることもまた可能である。これは、非常にノイズが多いシグナルまたは、検出器上のシグナルの空間的分布が点放射体の異なる組について変化する場合に特に推奨される。
【００６２】
好ましくは、最小限として必要になるよりも多くの局所分布の測定が、改変された条件下で実施される。この場合、点放射体の個々の局所分布を決定するために、最適化処理が用いられる。本方法の精度はこのような方法で改善することができる。
【００６３】
本発明の一改良では、一組の点放射体は、少なくとも一種類の放射性の、特に放射能を放射する種類の同位体から成る。たとえば、Ｉ−１２５および／またはＩ−１３１は同位体として使用することができる。
【００６４】
本発明の一改良では、一組の点放射体は、光を放射する、特に蛍光性、燐光性および／または発光性の物質から成る。
【００６５】
本発明の一改良では、少なくとも一組の異なる点放射体について、支持体表面上の少なくとも一つの位置に、既知の放射線を有する少なくとも一の較正点が存在する。目的の個々の局所分布を計算するために必要な、それぞれの修正係数を決定または計算するために、較正が用いられる。
【００６６】
較正点は個々のシグナル源、たとえば個々の放射性同位体であることができる。較正は、試験する放射線源または同位体に起因する、シグナル強度の修正または低減の絶対または相対割合を計算する目的で用いられる。
【００６７】
較正は、放射性開始物質を、測定で試験する一つ以上の同位体について組み込むことによって実施することができる。この較正物質の測定されたシグナルは、好ましくは較正物質以外のすべての他の放射線源の成分を全くまたは無視できる程度しか含むべきでない。測定前の較正物質の比放射能は好ましくは既知である。較正物質は好ましくは、試験するすべての同位体について入手可能である。較正はまた、空間的に共存し、測定するすべての同位体の既知量を含む、一つ以上の放射性物質を用いることによっても可能である。この場合、較正物質中の各同位体の非放射能または放射線強度は既知でなければならない。適当なアルゴリズムを用いて、求められた複数の局所分布に基づき、局所分布においてシグナル中の同位体の一つ以上の放射線強度が修正された、局所分布のそれぞれのピクセル値への各同位体の寄与を計算することが可能である。後者の場合には、たとえば放射性崩壊の程度の差、などといったその他の因子も、もちろん既知でなければならない。
【００６８】
吸収材が用いられる場合、修正係数は、吸収材材料、その厚み、および吸収される放射性粒子の種類に関するその質量吸収係数に依存する。示差画像が、両方の同位体が崩壊するという事実によって生成される場合、修正係数は二つの同位体について較正物質の相対強度を測定することによって決定することができる。または、修正係数は、照射の正確な時間および持続時間と核放射性同位体についての崩壊速度定数に関する情報を用いることによって計算することができる。
【００６９】
本発明の一改良では、組に特有の放射線種の修正係数の比は、５％ないし９０％、好ましくは１０％ないし７０％、特に１５％ないし５０％である。一つの放射線種を完全に抑制しない修正係数を使用する可能性は、使用することができる放射線源または検出器の数を有意に増加させる。特に修正係数が、異なる放射性の同位体の放射性崩壊によって得られる場合、その同位体の別々の局所分布を、一つの同位体種の完全な崩壊無しでも計算することが可能である。
【００７０】
本発明の一改良では、修正係数は少なくとも一つの吸収材を用いることによって得られる。吸収材は、その材料を通過する放射線（粒子または光子）の強度を低下させる。吸収材は、金属、金属合金、プラスチック、ポリメタクリル酸メチル、ポリテトラフルオロエチレンおよび／または別の適当な材料から成ることができる。本発明の機能のためには、たとえばＩ−１２５同位体からの光子およびＩ−１３１同位体からのベータ粒子といった、検出器上にシグナルを生じる放射された放射線種は、異なる修正係数または低下係数で吸収材によって吸収または減衰されることが必須である。たとえばアルミ箔または薄いポリメタクリル酸メチルといった、小さい原子番号を持つ元素でできた吸収材はこの目的のためにより効果的であって、それはこれらの吸収材が光子よりもベータ粒子を強く吸収するためである。大きい原子番号を持つ元素の非常に薄い層でできた吸収材もまた用いることができ、それはこれらの吸収材がベータ粒子よりも光子を強く吸収するためである。吸収材の厚みは吸収効率に重要な役割を果たす。
【００７１】
本発明の一改良では、修正係数は少なくとも二つの組のそれぞれの点放射体の放射性崩壊によって得られ、その少なくとも二つの組のそれぞれの点放射体は好ましくは異なる半減期を有する。放射線強度の修正または低減はこの場合は吸収材によらず、点放射体の崩壊速度の差による。同位体Ｉ−１２５およびＩ−１３５は、たとえば、それらの半減期がほぼ７．５倍異なるためこの目的によく適している。にもかかわらず，その他の同位体もまた本発明に用いることができる。
【００７２】
本発明の一改良では、修正係数は、それぞれの組に特有の放射線種について、支持体表面の放射線強度の局所分布を求めるために用いられる、検出器の異なる感度によって得られる。組に特有の放射線種の放射線強度の修正係数はこの場合、その少なくとも二組の点放射体によって放射される放射線に対して用いられている検出器の異なる感度によって得られる。その異なる感度は好ましくは、修正係数の比が好ましくは５％より大になるように選択される。
【００７３】
本発明の一改良では、放射線強度の局所分布は、アルファ、ベータ、ガンマおよび／またはＸ線についての位置分解検出器を用いることによって求められる。
【００７４】
本発明の一改良では、放射線強度の局所分布は、いわゆる蛍光体画像処理検出器を用いることによって求められる。そのような蛍光体画像処理検出器はまた、蛍光体画像処理装置画像プレートすなわち蛍光体画像処理装置ＩＰともいう。蛍光体画像処理検出器は、好ましくは輝尽性発光に基づいて動作する。それぞれの組に特有の放射線種について、支持体表面の放射線強度の局所分布を求めるために用いられる、蛍光体画像処理検出器の異なる感度は、好ましくは、大きい原子番号Ｚを持つ原子、特にたとえば鉛化合物に含まれる鉛、および／または小さい原子番号Ｚを持つ原子を付加的に含む蛍光体画像処理検出器の蛍光体によって達成される。大きいかまたは小さい原子番号Ｚを持つ原子が蛍光体画像処理検出器に、蛍光体画像処理検出器の製造中に組み込まれた場合、その検出感度はガンマ放射線についてそれぞれ上昇または低下する。これは、異なる放射線種についての感度の比は変化することを意味する。この場合、蛍光体画像処理検出器における光の貯蔵に必要でないが、蛍光体画像処理検出器の吸収効率を変化させる別の原子が組み込まれる。このような方法で、アルファ線、ベータ線、ガンマ線、および中性子線および異なるエネルギーを有する放射線を識別することが可能である。特に、ベータ線、とりわけ検出器の蛍光体被覆を通過することができる２０ｋｅＶより高いエネルギーを有するベータ線についての感度に対するガンマ線についての感度の比は；
１）大きい原子番号Ｚを持つ元素を組み込むこと、
２）小さい原子番号Ｚを持つ元素を組み込むこと
によって修正することができる。
【００７５】
一改良では、支持体表面の放射線強度の第一の局所分布は、第一の蛍光体画像処理検出器を用いることによって求められ、および支持体表面の放射線強度の少なくとも第二の局所分布は、少なくとも第二の蛍光体画像処理検出器を用いることによって同時に求められ、第一の蛍光体画像処理検出器の感度および少なくとも第二の蛍光体画像処理検出器の感度は、それぞれの組に特有の放射線種について異なる。これは、異なる点放射体の放射線に対する感度の異なる比を有する、少なくとも二つの蛍光体画像処理検出器または蛍光体画像処理装置ＩＰが測定中に用いられることを意味する。これは、それぞれの放射線強度を速やかに連続してまたは同時に測定または求めることを可能にする。異なるＩＰ材料の異なる感度は、使用している同位体の崩壊による十分な差が無い場合でも、それぞれの点放射体の局所分布を計算することを可能にする。この手順はもちろん、同位体の崩壊もまた利用することができるように、測定の間の待機時間と組み合わせることができる。
【００７６】
本発明の一改良では、第一のおよび少なくとも第二の蛍光体画像処理装置検出器は、支持体表面の向かい合う側に用いられる。このような方法で、二測定を同調してまたは同時に、測定する試料または支持体表面の前面または後面上で、異なる感度の蛍光体画像処理装置ＩＰを用いることによって実施することができる。異なるＩＰ材料の異なる感度は、点放射体の局所分布をこれから計算することを可能にする。
【００７７】
本発明の一改良では、放射線強度の局所分布は、いわゆるフラットパネル検出器を用いることによって求められる。そのようなフラットパネル検出器は、リアルタイムデジタルＸ線画像処理装置を作り上げることを可能にする。それらは、検出効率と評価速度が上昇するように、Ｘ線をデジタルコード化されたピクセルの行列に直接に変換する。
【００７８】
修正係数が、たとえばそれぞれの組に特有の放射線種について、支持体表面の放射線強度の局所分布を求めるのに用いられる検出器の異なる感度によって得られる場合、蛍光体画像処理検出器とフラットパネル検出器を、たとえば、支持体表面の放射線強度の局所分布のそれぞれの測定を実施するために用いることができる。点放射体の局所分布は、異なる検出器を用いて測定された局所分布から個別に計算することができる。
【００７９】
本発明の一改良では、放射線強度の第一のおよび少なくとも第二の局所分布は、同一の種類の検出器を用いることによって求められる。原理的に、一つの検出器は、たとえば二つの異なる同位体から来るベータ粒子または光子、または異なる半減期を持つ同位体から来る放射線といった、異なる放射線種の間の明瞭な識別ができない。マルチカラー測定、すなわち個々の種類の点放射線源の局所分布の、重なりの無い別々の測定は、同一の検出器または同様の検出器を用いることによる前記方法によって可能である。ここでは、同様の検出器とは、たとえば、異ならないかまたは、実質的に特定の放射線種に対する感度に関してのみ異なる、同一の種類のまたは同一の設計の検出器である。このことは分析装置の構造を簡略化し、したがってコストを軽減する。
【００８０】
本発明の一改良では、分析すべき少なくとも二つの物質が、一組の点放射体でそれぞれ標識化され、このような方法で標識化された物質を混合して混合物をその後、特に平坦な分析媒体の形である支持体表面に加える。分析すべき物質は好ましくはペプチド、タンパク質、および／またはオリゴヌクレオチドであって、たとえば、それぞれ異なる同位体で標識化されている非常に多数の異なるタンパク質からそれぞれ構成されうる第一のおよび第二のタンパク質試料を含む。標識化後、二つの試料のタンパク質を混合し、分析媒体、特にタンパク質ゲル、核酸アレイ、タンパク質アレイ、ＥＬＩＳＡアレイおよび／またはブロットに一緒に適用する。異なる試料中の分析する物質またはタンパク質の共通の分離を、分析媒体上で、たとえば、分析媒体によって決定される特定の性質を用いてその後に実施する。分離後に、点放射体の局所分布は、点放射体の各組について、本発明に記載の方法によって個別に計算する。特定の点放射体局所分布を用いて、その後、それぞれの試料中の調べるタンパク質の局所分布を、互いに別々に推論することが可能である。
【００８１】
図面の簡単な説明
以下に記載する本発明の有利な実施例は、他の図面に表される。
【００８２】
図１Ａは、蛍光体画像処理装置を用いて求められた、二次元ゲルを用いて分離した二種類のタンパク質試料の放射線強度の局所分布を示し、一つの試料は、Ｉ−１２５種の同位体を用いて標識化されており他方の試料はＩ−１３１種の同位体を用いて標識化されている。
【００８３】
図１Ｂは、蛍光体画像処理装置を用いて求められた、８２日間の待ち時間後の図１Ａの二次元ゲルの放射線強度の局所分布を示す。
【００８４】
図１Ｃは、本発明に記載の方法を用いて計算した、Ｉ−１２５種の同位体を用いて標識化したタンパク質試料の放射線強度の局所分布を示す。
【００８５】
図１Ｄは、本発明に記載の方法を用いて計算した、Ｉ−１３１種の同位体を用いて標識化したタンパク質試料の放射線強度の局所分布を示す。
【００８６】
図１Ｅは図１Ｃと図１Ｄにおける局所分布の差を示し、Ｉ−１２５種の同位体を用いて標識化したタンパク質試料は青で表し、Ｉ−１３１種の同位体を用いて標識化したタンパク質試料は橙で表す。
【００８７】
図１Ｆは、蛍光体画像処理装置を用いて求められた、２３日間の待ち時間後の図１Ａの二次元ゲルの放射線強度の局所分布を示す。
【００８８】
図１Ｇは、本発明に記載の方法を用いて計算した、Ｉ−１２５種の同位体を用いて標識化したタンパク質試料の放射線強度の局所分布を示し、図１Ｆにおける局所分布が、求められた第二の局所分布として計算に用いられている。
【００８９】
図１Ｈは、本発明に記載の方法を用いて計算した、Ｉ−１３１種の同位体を用いて標識化したタンパク質試料の放射線強度の局所分布を示し、図１Ｆにおける局所分布が、求められた第二の局所分布として計算に用いられている。
【００９０】
図１Ｉは図１Ｇと図１Ｈにおける局所分布の差を示し、Ｉ−１２５種の同位体を用いて標識化したタンパク質試料は青で表し、Ｉ−１３１種の同位体を用いて標識化したタンパク質試料は橙で表す。
【００９１】
図２Ａは、蛍光体画像処理装置を用いて求められた、Ｉ−１２５種の同位体およびＩ−１３１種の同位体を用いて標識化された、異なる希釈段階と混合比の、吸収材を用いない、ウシ血清アルブミンのタンパク質試料の放射線強度の局所分布を示す。
【００９２】
図２Ｂは、蛍光体画像処理装置を用いて求められた、吸収材を用いた図２Ａの放射線強度の局所分布を示す。
【００９３】
図２Ｃは、本発明に記載の方法を用いて計算した、Ｉ−１２５種の同位体の放射線強度の局所分布を示す。
【００９４】
図２Ｄは、本発明に記載の方法を用いて計算した、Ｉ−１３１種の同位体の放射線強度の局所分布を示す。
【００９５】
図２Ｅは図２Ｃと図２Ｄにおける局所分布の差を示し、Ｉ−１２５種の同位体は青で表しＩ−１３１種の同位体は橙で表す。
【００９６】
第一の実施形態
タンパク質試料は、元素ヨウ素のそれぞれ異なる同位体を用いて標識化される。第一の試料はＩ−１２５を用いて標識化され、第二の試料はＩ−１３１を用いて標識化される。質量スケールを較正するため、特別の質量参照タンパク質がＩ−１２５を用いて標識化される。Ｉ−１２５は半減期６０．１４日であって、電子捕捉によって崩壊し、その結果として２７ｋｅＶないし３５ｋｅＶの範囲のＸ線およびガンマ線の発生が起こる。Ｉ−１３１は半減期８．０６日であって、ベータ放出のさまざまな機構によって崩壊する。
【００９７】
試料はその後に混合し、二次元ゲルを用いて分離する。修正係数を決定するため、二つの同位体種のための較正点がゲルの左側に付加される。較正点は、個々の局所分布を計算するために必要である修正係数を計算するために用いられる。
【００９８】
二次元分離後、蛍光体画像処理装置ＩＰを規定の時間、試料または試料からの放射線に曝露する。蛍光体画像処理装置ＩＰは、低エネルギーＸ線、ガンマ線、およびベータ粒子の両方に感受性である。Ｉ−１３１崩壊に由来する相対的にエネルギーの高い光子は吸収されるかまたは蛍光体画像処理装置ＩＰによって低い効率でだけ検出される。蛍光体画像処理装置ＩＰは二つの放射線源の放射線強度を合成する。蛍光体画像処理装置ＩＰの貯蔵された放射線エネルギーの局所分布を続いて読み取り装置で読み取ってピクセル行列または画像を形成し、それを図１Ａに示す。このような方法で求められた局所分布またはピクセル行列は、Ｉ−１２５とＩ−１３１の両方に由来する成分を含む。８２日間の待機時間後、試料の局所分布を上述の通りに再度測定する。この局所分布を図１Ｂに示す。二つの同位体の異なる半減期のため、Ｉ−１２５の放射線強度または放射能は２倍低下している。これと対照的に、ゲル上に残っているＩ−１３１の放射線強度は元の放射線強度の１％未満である。図１Ｂはしたがって、ほぼＩ−１２５由来のシグナル成分だけを含む。
【００９９】
本実施形態における放射線強度の異なる修正は、吸収材でなく、二つの同位体の異なる放射性崩壊の固有の性質だけによる。
【０１００】
続いて、個々の同位体の局所分布が本発明に記載の方法を用いて別々に計算される。４Ｘ４の近傍ピクセルに及ぶ領域の強度を計算に用い、すなわち使用するガウスフィルタを用いて合計した。求められた局所分布の相互配置は、局所分布の同一の位置にそれぞれ与えられる、対応する参照点を用いて実施する。図１Ｃは、Ｉ−１２５種の同位体を用いて標識化されたタンパク質試料の放射線強度または同位体量の計算された局所分布を示し、図１Ｄは、Ｉ−１３１種の同位体を用いて標識化されたタンパク質試料の放射線強度の計算された局所分布を示す。図１Ｅは図１Ｃと図１Ｄにおける局所分布の差を示し、Ｉ−１２５種の同位体を用いて標識化したタンパク質試料は青で表し、Ｉ−１３１種の同位体を用いて標識化したタンパク質試料は橙で表す。黒は、二つの同位体の同数が存在することを意味する。
【０１０１】
もちろん、放射線強度の局所分布はまた、位置分解検出器を用いずに測定することができる。この目的のために、試験する支持体表面を、適当な分離、たとえば切断によってより細かい断片に分割し、これらの断片の放射線強度を従来の「単一線源」検出器を用いて測定する。たとえば、放射線種および放射線強度は、ガンマおよび／またはベータスペクトル方を用いることによって測定することができる。
第二の実施形態
【０１０２】
本発明の第二の実施形態では、第一の実施形態と同一の手順を用い、第一のおよび第二の局所分布を求める間の待機時間が８２日間から２３日間に短縮されている。図１Ｆは、蛍光体画像処理装置を用いて求められた、２３日間の待ち時間後の図１Ａの二次元ゲルの放射線強度の局所分布を示す。Ｉ−１３１の崩壊がまだ完全でないため、両方の同位体が現在、求められた局所分布に寄与する。増幅係数はしたがって、両方の同位体について実質的に０％より大である。同様に、修正係数の比は実質的に０％より大である。
【０１０３】
図１Ｇは、本発明に記載の方法を用いて計算した、Ｉ−１２５種の同位体を用いて標識化したタンパク質試料の放射線強度の局所分布を示し、図１Ｈは、同様に計算された、Ｉ−１３１種の同位体を用いて標識化したタンパク質試料の放射線強度の局所分布を示し、図１Ｆにおける局所分布が、求められた第二の局所分布として両方の場合で計算に用いられている。
【０１０４】
図１Ｉは図１Ｇと図１Ｈにおける局所分布の差を示し、Ｉ−１２５種の同位体を用いて標識化したタンパク質試料は青で表し、Ｉ−１３１種の同位体を用いて標識化したタンパク質試料は橙で表す。黒は、二つの同位体の同数が存在することを意味する。
【０１０５】
本実施形態の結果は、Ｉ−１３１のほぼ完全な抑制のために参照結果として用いることができる実施形態１の結果と一致する。本発明に記載の方法はしたがって、第二の局所分布を求める際に一つの放射線種が完全に抑制されていなくても、信頼できる測定結果を提供する。
【０１０６】
第三の実施形態
本発明の本実施形態において対応する修正係数を得るために、すなわち二つの同位体Ｉ−１２５とＩ−１３１を含む試料の示差測定を実施するために、吸収材が用いられる。本発明の第一の実施形態と同様に、二つの同位体Ｉ−１２５とＩ−１３１を用いて標識化されたタンパク質を含む二次元ゲルが調製される。蛍光体画像処理装置ＩＰは、二次元ゲルの放射線強度の局所分布に規定の時間曝露される。蛍光体画像処理装置ＩＰはその後蛍光体画像処理読み出し装置を用いて読み取られる。二次元ゲルの表面上の放射線強度は行列として画像処理され、行列の個々の成分の値すなわちピクセルが、蛍光体画像処理装置ＩＰ上に配置された領域の放射線強度を表す。これはシグナル成分がＩ−１２５とＩ−１３１との両方の結果である行列または画像を提供する。
【０１０７】
第二の画像または第二の局所分布を見出すためには、シグナル成分を分離するために、一つの放射線種の強度を適当な手段によって修正または低減することが必要である。
【０１０８】
既知の厚みの吸収材を試料と蛍光体画像処理装置ＩＰの間に導入することによって、放射線強度は照射中に異なる修正係数を用いて各放射線種について選択的に低減することができる。そのような吸収材は、金属、金属合金、プラスチック、ポリメタクリル酸メチル、ポリテトラフルオロエチレンおよび／または別の適当な材料から成ることができる。本発明に記載の機能を実現するために、吸収材は、それぞれ異なる修正係数で、検出器上にシグナルを生じる、放射線源によって放射される放射線種（本実施形態では、Ｉ−１２５由来の光子およびＩ−１３１由来のベータ粒子）を吸収しなければならない。
【０１０９】
本実施形態では、Ｉ−１３１由来のシグナルの強度は、吸収材を用いて、Ｉ−１２５由来のシグナルと相対的に顕著に低下させることができる。小さい原子番号を持つ元素でできた吸収材は、この目的のためにより効果的である（例；アルミ箔、薄いポリメタクリル酸メチルなど）。吸収材の厚みは吸収効率に重要な役割を果たす。
【０１１０】
放射線強度の第一のおよび少なくとも第二の局所分布は、蛍光体画像処理装置ＩＰ、ゲル、吸収材、および蛍光体画像処理装置ＩＰを含む「サンドイッチ」配置を用いて同時に求めることができる。代替法として画像は、吸収材を用いてまたは用いないで、連続して得ることができ、これは本発明の場合に好ましい。もちろん、その他の放射性同位体もまた、ここに開示される本発明に用いることができる。
【０１１１】
第四の実施形態
本発明の第四の実施形態では、第三の実施形態の場合のように、さまざまな 放射線種の放射線強度をそれぞれに修正するために、吸収材が用いられる。
【０１１２】
ウシ血清アルブミンの二つの試料が、一方はＩ−１２５を用いて、他方はＩ−１３１を用いて、本実施形態で標識化される。試料のそれぞれを四回、１０倍希釈する。これは各試料の非希釈から１／１００００倍希釈までの５段階の希釈を与える。放射線強度は結果的に１０，０００倍差がある。第一の試料の各希釈段階を第二の試料の各希釈段階と混合する。これは異なる混合比の２５試料を与え、それらの各１μｌ量を、辺の長さが３ｍｍの正方形フィルタープレートに加える。濾紙は平坦な支持体上に行列配置で配置されている。Ｉ−１２５の濃度は下から上へ低下する。Ｉ−１３１の濃度は左から右へ低下する。
【０１１３】
蛍光体画像処理装置ＩＰを、その平坦な支持体からの放射線に２４時間曝露する。蛍光体画像処理装置ＩＰは試料の二つの放射線源からの放射線強度を合成する。蛍光体画像処理装置ＩＰの貯蔵された放射線エネルギーの局所分布を、続いて読み取り装置で読み取ってピクセル行列または画像を形成し、それを図２Ａに示す。このような方法で求められた局所分布またはピクセル行列は、Ｉ−１２５とＩ−１３１の両方に由来する成分を含む。この第一の局所分布を求めた直後、吸収材を平坦な支持体と蛍光体画像処理装置ＩＰとの間に配置して、第二の局所分布を求める。この第二の局所分布を図２Ｂに示す。吸収材は厚さ９００μmのプラスチックシートから成る。求められた両方の局所分布について同一の領域を用いて、平坦な支持体上に配置された試料の放射線強度を合成し、または合計する。これらの合成された放射線強度に基づいて、個々の同位体の局所分布を、求められた二つの局所分布から、本発明に記載の方法の方法を用いて別々に計算する。図２ＣはＩ−１２５種の同位体を用いて標識化されたタンパク質試料の放射線強度または同位体量の計算された局所分布を示し、図２ＤはＩ−１３１種の同位体を用いて標識化されたタンパク質試料の放射線強度の計算された局所分布を示す。図２Ｅは図２Ｃと図２Ｄにおける局所分布の差を示し、Ｉ−１２５種の同位体を用いて標識化したタンパク質試料は青で表し、Ｉ−１３１種の同位体を用いて標識化したタンパク質試料は橙で表す。黒は、二つの同位体の同数が存在することを意味する。
【０１１４】
右下のＩ−１２５を用いて標識化された非希釈試料および左上のＩ−１３１を用いて標識化された非希釈試料を、局所分布を計算するために必要な崩壊定数を計算するために用いた。
【０１１５】
計算結果は理論上予想される結果と狭い誤差限界内で合致する。これは、０％より顕著に大きい修正係数を用いてさえ、本発明に記載の方法が成功することを示す。
【０１１６】
実施形態の可能な変形
本発明の上記の実施形態では、分析対象分子（タンパク質）は化学的に同一の放射性同位体（放射性ヨウ素）を用いて標識化される。二つの試料間の放射線の強度分布の差は試料自体の間の差が原因であるため、この方法は示差分析を実施するために極めて有用である。これはまた、たとえば、Ｐ−３３およびＰ−３２を用いて標識化したタンパク質にも当てはまる。
【０１１７】
Ｃ−１４、Ｓ−３５、またはＰ−３３の組み合わせを用いて標識化されたタンパク質は、炭素、硫黄、およびリン酸はそれぞれ異なる化学によってタンパク質中に存在するため、異なる 二次元ＰＡＧＥ 画像を生じる。たとえば、一部のタンパク質はシステインまたはメチオニンを全く含まず、したがって硫黄を全く含まないが、それらはキナーゼによってリン酸化することができ、そのためそれらは効率的にリン酸を持つことができる。その他のタンパク質は、硫黄を含むアミノ酸を多数有しうるが、リン酸化しない可能性がある。にもかかわらず、本発明はまた、本発明に従ってこれらの同位体の組み合わせが用いられる場合、両方の同位体の分布に対応する合成画像を抽出するためにも適当である。本発明は実際、異なる表面構造を持つものでさえ、蛍光体画像処理装置分析に適当である場合は、表面または同様の範囲に分布した、任意の放射性同位体の示差測定に適用することができる。
【０１１８】
本発明に適当である放射性同位体は、崩壊速度、放射される粒子のエネルギー、放出される粒子の種類、またはこれらの組み合わせに有意な差を示す。同位体の高純度は望ましいが必要ではない。
【０１１９】
放射性同位体の化学的高純度は望ましいが必要ではない。本発明を、同位体の異なる混合物を用いて標識化された試料に適用する、たとえば一方の試料を９５％Ｉ−１３１、５％Ｉ−１２５を用いて標識化し、他方の試料を５％Ｉ−１３１、９５％Ｉ−１２５を用いて標識化することが可能である。標識化混合物は、本発明の概念または範囲を離れることなく、もちろん非常に複雑になる可能性があり、たとえば、痕跡量の多数の同位体を含みその一部はＫ−４０のように分析対象分子に共有結合で組み込まれていない可能性がある。
【０１２０】
本発明は、放射性同位体が分析対象分子に組み込まれる方法とは独立している。たとえば、タンパク質は、代謝取り込みによって、回収後の放射性ヨウ素化によって、放射性試薬（任意の化学の）を用いるアルキル化によって、またはその他の方法によって標識化することができる。
【０１２１】
蛍光体画像処理装置の別の用途は、ＤＮＡおよび核酸アレイの測定である。そのような用途、たとえばｍＲＮＡの頻度分析では、Ｐ−３３、Ｐ−３２、Ｓ−３５、Ｃ−１４、Ｈ−３および任意の従来の種類の同位体が、ハイブリダイゼーション分子に組み込まれることが可能である。蛍光体画像処理装置を、これらの系の二色分析を実施するために、本発明の原理に従って用いることができる。ＤＮＡ様高分子の単純な化学のために、これらの放射性同位体を含むハイブリダイゼーション分子の放射線強度は、同一の試料が独立して標識され各同位体について測定される場合、全く同一でありうる。上記の原理はまた、もちろん、タンパク質アレイ、または任意の他のアレイ、または分析対象分子の蛍光体画像処理装置分析に適当である半平面分布にも当てはまる。
【０１２２】
本発明の応用は、二つ以上のシグナル源からの合成画像を抽出するために、二つ以上の示差画像が作成される、医用画像処理の分野で実施されうることは明らかである。一つの例は、本発明に記載の適当な吸収材を用いることによる、身体のＸ線撮影と組み合わせた、ある種の放射性痕跡元素の検出に関する可能性があり、医療の分野で非常に有用である可能性がある。
【０１２３】
明らかに、本発明は蛍光体画像処理装置ＩＰおよび放射能測定に限られない。本発明はまた、放射能でなく可視光が繰り返し測定される場合にも適用でき、二つのシグナル成分はアルゴリズム的に抽出される。たとえば、酵素反応は、蛍光団分子または発光分子によって放射されるものと同様の波長の光を生じうる。酵素反応は減少した量の光を生じるため、化学反応および蛍光団によって一緒に放射される光の強度分布、および蛍光団によって放射される光の強度分布を求めることにより、蛍光によってまたは酵素によって生じた光の、元の画像における寄与を測定することが可能である。この実施では、両方の光の強度における低下が既知であるかまたは正確に較正可能であることが重要である。
【０１２４】
本開示に引用されたすべての出版物および特許出願は、引用によって本発明の開示の一部として含まれる。
【０１２５】
用語、材料および方法
使用した用語を下記に説明し、また、従来の材料および方法の要約を示す。
【０１２６】
画像は行列によって表され、行列セル値はたとえば画像処理された表面上の対応する位置で検出器によって記録されたシグナルの強度に対応する。画像は、画像のための従来のファイル形式で保存することができる。
【０１２７】
マルチカラー分析は、複数の試料がそれぞれ別々に標識化され、混合されて一緒に分離されることを意味することを意図する。評価はその後、各試料について個別に実施され、残りのそれぞれの試料の存在に影響されない。マルチカラー式を作るためのさまざまな方法が存在する。
【０１２８】
ゲノミクスは、核酸または核酸と類似の高分子の定量的研究を意味する。
【０１２９】
プロテオミクスは、試験される細胞のゲノム中の発現されているすべてのタンパク質の研究と定義されている。頭字語であるプロテオームは、ゲノムによって発現されるタンパク質を意味する。
【０１３０】
Ｗａｓｉｎｇｅｒ ＶＣ， Ｃｏｒｄｗｅｌｌ ＳＪ， Ｃｅｒｐａ−Ｐｏｌｊａｋ Ａ， Ｙａｎ ＪＸ， Ｇｏｏｌｅｙ ＡＡ， Ｗｉｌｋｉｎｓ ＭＲ， Ｄｕｎｃａｎ ＷＭ， Ｈａｒｒｉｓ Ｒ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＫＬ， Ｈｕｍｐｈｒｅｙ−Ｓｍｉｔｈ Ｉ． （１９９５）『モリキューテス綱の遺伝子産物マッピングの進歩：マイコプラズマ・ゲニタリウム』（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｗｉｔｈ ｇｅｎｅ−ｐｒｏｄｕｃｔ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ； Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ．） エレクトロフォレシス（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）， １６， １０９０−４．
【０１３１】
ここでは、プロテオミクスは特に、当業者に既知である通り、少なくとも一部がリボソームへ翻訳されている分子（タンパク質）、またはそのようなタンパク質の一群の研究を意味する。プロテオミクスはまた、翻訳後タンパク質修飾、タンパク質合成および分解速度、タンパク質分解産物、およびこれらの組み合わせの研究も対象とする。
【０１３２】
ここでは、細胞，一群の細胞，組織、または生物といった生物学的系の分子プロファイル、またはプロファイルは、調べる２つ以上の生物学的系の間の、遺伝子発現またはタンパク質発現または脂質組成または小分子の代謝産物産生または温度または小分子の代謝産物分泌における変化、糖の頻度または種類における変化、または翻訳後タンパク質修飾における変化、またはタンパク質分解における変化，または一つ以上の細胞内区画によるイオン分泌における変化、または一つ以上の細胞内区画によるイオン取り込みにおける変化のパターンをいう。より一般的に言うと、生物学的系の分子プロファイルは、この系を形成する原子、および特にそれらの化学的、空間的、および時間的相互関係の指標である。
【０１３３】
アレイとは、規則正しい配置または配列を意味する。この語はここでは、オリゴヌクレオチド（ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、およびゲノムＤＮＡを含む）の、または分析対象分子に対するリガンドの、たとえばタンパク質、脂質、および糖、またはそのような官能基を含む分子（たとえば、糖タンパク質は少なくとも一つの糖基を含み、または、たとえば、リポタンパク質は少なくとも一つの脂質基を含む）に対する親和性試薬の規則正しい配置を示すために用いられる。規則正しい分子は、表面、たとえばチップ上に配置され、相補的オリゴヌクレオチド（ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、およびゲノムＤＮＡを含む）、またはリガンドに対する基質を捕捉するために用いられる。配列中の任意の位置のオリゴヌクレオチドまたはリガンドは既知であるため、その（核酸の）配列または（タンパク質の）物理的性質は、核酸または基質がアレイと結合する位置によって判定することができる。
【０１３４】
タンパク質分離方法
調製目的での電気泳動の適用は確立された手法であり、調製および分析目的のためのさまざまな種類の電気泳動装置が存在する。これらの装置およびその対応する原理は三つの分類に分けることができる。
【０１３５】
Ａｎｄｒｅｗｓ ＡＴ． （１９８６）『電気泳動；理論，手法，ならびに生化学的および臨床的応用。』（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ； Ｔｈｅｏｒｙ， Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．）オックスフォード大学出版（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ．）
【０１３６】
Ｗｅｓｔｅｒｍｅｉｅｒ Ｒ． （１９９７）『電気泳動の実践；ＤＮＡおよびタンパク質分離の方法と応用への手引き。』（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｉｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅ； Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＤＮＡ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ．）ジョン・ウイリー・アンド・サン、ワインハイム（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｗｅｉｎｈｅｉｍ．）
ａ）ゾーン電気泳動
ｂ）等速電気泳動
ｃ）等電点電気泳動
【０１３７】
等速電気泳動は親水性マトリクスを用い、典型的には高分解能を示すが負荷能力は低い。自由電気泳動との組み合わせで、本方法は微量調製目的に用いることができる。
【０１３８】
Ｗｅｂｅｒ Ｇ， Ｂｏｃｅｋ Ｐ． （１９９８）『連続流式電気泳動の安定性。』（Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｆｌｏｗ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．） エレクトロフォレシス（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）， １９， ３０９４−３０９５．
【０１３９】
等電点電気泳動（ＩＥＦ）は、液体密度勾配で、ゲル勾配で、またはＩＥＦイモビリン（ｉｍｍｏｂｉｌｉｎ）（商標）を基礎とする分離ゲル媒体を用いたマルチチャンバー装置のいずれかで実施される。
【０１４０】
『生化学と分子生物学の実験手法第２０巻』（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ． Ｖｏｌ． ２０）（ＲＨ Ｂｕｒｄｏｎ， ＰＨ Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ編）中のＲｉｇｈｅｔｔｉ ＰＧ． （１９９０）『固定化ｐＨ勾配；理論および方法論。』（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｐＨ ｇｒａｄｉｅｎｔｓ； ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ．）、３９７ページ。 Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ．
【０１４１】
Ｒｉｇｈｅｔｔｉ ＰＧ， Ｂｏｓｓｉ Ａ， Ｗｅｎｉｓｃｈ Ｅ， Ｏｒｓｉｎｉ Ｇ． （１９９７）『等電点膜を用いた多成分電気分解槽におけるタンパク質精製。』（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｕｌｔｉｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｚｅｒｓ ｗｉｔｈ ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．）Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ｂ Ｂｉｏｍｅｄ． Ｓｃｉ． Ａｐｐｌ．， ６９９， １０５−１５．
【０１４２】
ゾーン電気泳動は、グリシン、ビシンおよびトリシンを用いて緩衝したＳＤＳ ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）タンパク質ゲル系を含み、タンパク質分析に従来用いられ上記の引用文献に考察される。
【０１４３】
現在のプロテオーム手法は従来、二次元ＰＡＧＥ（二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動）の使用を含み、そのためタンパク質は最初にｐＩの差によってＩＥＦを用いて第一の次元で分離される。これらのタンパク質はその後、続いて第二の方向に分子量によってＳＤＳ ＰＡＧＥゲルで分離される。
【０１４４】
二次元ＰＡＧＥは、現在、生化学精製について最高の分離性能を与える方法であるが、真核細胞、組織、および生物中に存在するタンパク質およびそれらの修飾されたアイソフォームの数は、最高の二次元ＰＡＧＥ系の分離性能を越える。さまざまなタンパク質およびタンパク質アイソフォームの、複雑な真核細胞、組織、および生物における頻度はまた、非常に大きい程度に変化する。真核細胞中で最も高頻度のタンパク質は細胞当たり１０8コピー存在しうる。高頻度のタンパク質の例は、特定の細胞骨格タンパク質、または肝臓および血清中のアルブミンを含む。一部のタンパク質は、非常に少量存在する場合、時には細胞当たり一対の分子で、顕著な生物学的効果を発揮することができる。タンパク質が生物学的活性を発揮することができる最小量はほとんどわかっていないが、この分類は、前がん細胞からがん細胞への進行におけるテロメラーゼおよびＤＮＡポリメラーゼといった例を含みうる。タンパク質混合物中で頻度が低い分子が生物学的に意義があるその他の例は、リットル当たり二個のサイトカイン分子が重要である場合がある血液で、または何兆もの他の細胞の中のただ１個の転移がんが患者にとって致命的な生物学的結果を有しうる骨髄で生じる。真核細胞で予想されるタンパク質およびタンパク質アイソフォームの数の考察、およびプロテオミクスにおける二次元ＰＡＧＥに関するいくつかの示唆については、Ｖｕｏｎｇ ｅｔ ａｌ．を参照。
【０１４５】
Ｖｕｏｎｇ ＧＬ， Ｗｅｉｓｓ ＳＭ， Ｋａｍｍｅｒ Ｗ， Ｐｒｉｅｍｅｒ Ｍ， Ｖｉｎｇｒｏｎ Ｍ， Ｎｏｒｄｈｅｉｍ Ａ， Ｃａｈｉｌｌ ＭＡ．『タンパク質の回収後アルキル化および放射性標識化によって向上した感度プロテオミクス。』（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｂｙ ｐｏｓｔ ｈａｒｖｅｓｔ ａｌｋｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．）２０００，エレクトロフォレシス（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ） ２１；２５９４−２６０５．
【０１４６】
二次元ＰＡＧＥの再現性はまた周知の通り低く、そのため、ソフトウェアパッケージを用いて、試験する系の典型的な二次元ＰＡＧＥパターンの構成の平均的近似を集計するためには、各ゲルのいくつかの複製が典型的には必要である。一部のソフトウェアパッケージは市販されている。プロテオーム研究の一つの重要な用途は、たとえば医薬で処理した細胞、組織または生物からの対応する頻度と比較した、対照細胞、組織または生物に由来するタンパク質の頻度のように、実験的な目的の二つ以上の系の間での、特定のタンパク質またはタンパク質アイソフォームの頻度における差を測定することを含む。
【０１４７】
さまざまなその他の方法がタンパク質分離のために利用可能であり、それは制限を含意することなく、高速液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、ＦＰＬＣ、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動およびチップ状に支持された微量流体といった微量液体系、マイクロアフィニティアレイを用いるアフィニティ試薬、および電気泳動を含む。下記の参照文献は、プロテオーム研究に用いられる分離方法の先行技術を記載する。
【０１４８】
Ｄａｎｉｅｌ Ｃ． Ｌｉｅｂｌｅｒ．『プロテオミクス入門；新しい生物学のための方法』（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ； Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｙ．）３００ページ、第一版（２００１年１１月）ハマナ出版（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）； ＩＳＢＮ； ０８９６０３９９２７．
【０１４９】
Ｔｉｍｏｔｈｙ Ｐａｌｚｋｉｌｌ．『プロテオミクス』（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．）第一版（２００１年１１月１５日） クルワーアカデミック出版（Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）； ＩＳＢＮ ０７９２３７５６５３．
【０１５０】
ＭＪ Ｄｕｎｎ （編者）『プロテオミクス総説２００１』（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２００１．）（２００１年４月） ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇｓ−ｇｅｓ． ｍｂＨ； ＩＳＢＮ ３５２７３０３１４６．
【０１５１】
Ａｎｄｒｅ Ｓｃｈｒａｔｔｅｎｈｏｌｚ （編者）。『プロテオミクス研究の方法。タンパク質発現の分子分析』［ドイツ語］（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）２００１年。スペクトラムアカデミッシェフェアラグ、ハイデルベルグ（Ｓｐｅｋｔｒｕｍ Ａｃａｄｅｍｉｓｃｈｅ Ｖｅｒｌａｇ， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．） ＩＳＢＮ； ３８２７４１１５３Ｘ．
【０１５２】
Ｉｓｓａｑ ＨＪ． 『プロテオミクス研究における分離化学の役割。』（Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｓｃｉｅｎｃｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ．）エレクトロフォレシス（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ） ２００１， ２２；３６２９−３６３８．
【０１５３】
Ｆｉｇｅｙｓ Ｄ， Ｐｉｎｔｏ Ｄ．『チップ上のプロテオミクス；有望な進展』。（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｏｎ ａ ｃｈｉｐ； ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ．）エレクトロフォレシス（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ） ２００１， ２２；２０８−１６．
【０１５４】
Ｂｌａｇｏｅｖ Ｂ， Ｐａｎｄｅｙ Ａ． 『マイクロアレイが動き始める−プロテオミクスの新しい展望。』（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ ｇｏ ｌｉｖｅ − ｎｅｗ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． ２００１， ２６；６３９−６４１．
【０１５５】
Ｃａｈｉｌｌ ＤＪ． 『タンパク質と抗体アレイおよびそれらの医学的用途。』（Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｒｒａｙｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００１， ２５０；８１−９１．
【０１５６】
Ｐａｗｅｌｅｔｚ ＣＰ， Ｃｈａｒｂｏｎｅａｕ Ｌ， Ｂｉｃｈｓｅｌ ＶＥ， Ｓｉｍｏｎｅ ＮＬ， Ｃｈｅｎ Ｔ， Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ ＪＷ， Ｅｍｍｅｒｔ−Ｂｕｃｋ ＭＲ， Ｒｏｔｈ ＭＪ， Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎ ＩＩＩ ＥＦ， Ｌｉｏｔｔａ ＬＡ． 『疾患進行を捉える逆相タンパク質マイクロアレイは、がん浸潤前線での生存促進経路の活性化を示す。』（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｈａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ ｗｈｉｃｈ ｃａｐｔｕｒｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｓｈｏｗ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏ−ｓｕｒｖｉｖａｌ ｐａｔｈｗａｙｓ ａｔ ｔｈｅ ｃａｎｃｅｒ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｆｒｏｎｔ．）オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ） ２００１， ２０；１９８１−１９８９．
【０１５７】
Ｆｉｇｅｙｓ Ｄ， Ｐｉｎｔｏ Ｄ． 『チップ上のプロテオミクス； 有望な進展』（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｏｎ ａ ｃｈｉｐ； ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ．）エレクトロフォレシス（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ） ２００１， ２２；２０８−１６．
【０１５８】
Ｍｉｋｌｏｓ ＧＬ， Ｍａｌｅｓｚｋａ Ｒ． 『タンパク質機能と生物学的背景』（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｔｅｘｔｓ．）プロテオミクス（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ） ２０００， １；１６９−１７８．
【０１５９】
Ｌｏｄｉｓｈ Ｈ， Ｂｅｒｋ Ａ， Ｚｉｐｕｒｓｋｙ ＬＳ， Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ Ｐ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ Ｄ， Ｄａｒｎｅｌｌ Ｊ． 『分子細胞生物学第４版』（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ４th ｅｄｉｔｉｏｎ）、Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＩＳＢＮ； ０−７１６７−３１３６−３１９８６．
【０１６０】
Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ ＳＤ． 『プロテオミクス；タンパク質化学の工業化』（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ； ｔｈｅ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０００ １１；４１３−４１８．
【０１６１】
プロテオミクスにおけるタンパク質検出
タンパク質は、上記の文献に記載された非常に多数の方法によって検出することができ、その方法は何ら制限を意味することなく下記を含む；
１）  アミドブラック、スルホローダミンＢ、アガルマブラックといった色素または着色料の結合、またはさまざまな銀染色方法（上記の文献引用）。
２）  芳香族アミノ酸またはペプチド結合の分光学的検出。
３）  蛍光試薬の非共有結合による会合。
４）  モノブロミウムビマンチオライト、ナフタレン−２，７−ジスルホン酸、蛍光、Ｃｙ色素誘導体、または当業者に既知であるさまざまなその他の試薬といった蛍光試薬の共有結合。蛍光基は、たとえば、リジンまたはアミノ末端基といったアミノ基のアルキル化によって、システイン基のアルキル化によって、またはその他の方法によって、タンパク質分子に組み込むことができる。
５）  Ｈ−３， Ｃ−１４， Ｓ−３５， Ｐ−３２、およびＰ−３３を含む放射性同位体の代謝的組み込みと、その後の放射能検出。
６）  回収後の放射性標識化、たとえばタンパク質のヨウ素化 （Ｖｕｏｎｇ ｅｔ ａｌ．、上記に示す引用を参照）と、その後の放射能検出。
７）  Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， 『抗体−実験の手引き』（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ） （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ， ＮＹ， １９８８）によって開示されたかまたは、Ｈｕｄｓｏｎ ａｎｄ Ｓｏｕｒｉａｕ， Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｌ． Ｔｈｅｒ． １；８４５−８５５ （２００１）およびＭａｎｏｕｔｃｈａｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２；２１７−２３３ （２００１）で言及された通りのさまざまな標準手順に記載の、抗体または組み換えによって作製した親和性分子が目的のタンパク質分子と特異的に相互作用する免疫検出。抗体は放射性分子を用いて放射性標識する、すなわちそれと共有結合することができ、そのことによって放射能検出器でＭａｎｏｕｔｃｈａｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．に上述の通り検出することができる。
８）  タグ化は、タンパク質発現における変化を検出し測定するための別の方法である。  たとえば、タグを認識することによってそのタンパク質を特異的に検出することができるように、検出可能なタグを含むハイブリッドタンパク質を作製するために、そのタンパク質をコードする遺伝子の組み換えを行うことができる。たとえばタンパク質を分離したゲル中で、放射性タグ化の直接画像処理および定量的分析を行える系が入手可能である。発現の差は、被験試料および対照試料中に存在するタグの量の差を認識することによって測定することができる。
【０１６２】
試料材料が極めて限られている場合、たとえば臨床で患者から組織を得るためのある種の生検または解剖方法、または研究が最低頻度の分析対象分子の検出を含む場合、最も高感度な検出方法が極めて望ましい。前述の方法のなかでも、適当な検出器による放射性同位体標識化タンパク質の検出は他のどの方法よりも数桁高感度であり、したがって最適な方法である。
【０１６３】
画像 分析 ソフトウェア
タンパク質ゲル分析または核酸アレイ分析といった生物学研究から得られたグラフィックまたはデジタルデータの処理のための、いくつかの複雑なソフトウェアパッケージがある。プロテオーム分析の例は、ノンリニア・ダイナミクス社（ＮｏｎＬｉｎｅａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）（英国ニューカッスル・アポン・タイン（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｕｐｏｎ Ｔｙｎｅ））からのフォアティクス（Ｐｈｏｒｅｔｉｘ）２Ｃ、Ｄｅｌｔａ ２Ｄ ｆｒｏｍデコドン社（Ｄｅｃｏｄｏｎ ＧｍｂＨ）（ドイツ、グライフスバルト（Ｇｒｅｉｆｓｗａｌｄ））からのデルタ（Ｄｅｌｔａ）２Ｄ、コンピュジェン（Ｃｏｍｐｕｇｅｎ）（イスラエル、テルアビブ）からの３Ｚ，，スカナリティクス（Ｓｃａｎａｌｙｔｉｃｓ）（バージニア州ファイファクス（Ｆａｉｆａｘ））からのゲルラブ（Ｇｅｌｌａｂ）ＩＩ＋、ゲノミック・ソリューションズ（Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）（ミシガン州アンアーバー（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ））からのバイオイメージ（Ｂｉｏｌｍａｇｅ）、ジーンバイオ（ＧｅｎｅＢｉｏ）（ジュネーブ）からのメラニー（Ｍｅｌａｎｉｅ）３、ラージ・スケール・バイオロジー社（Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（カリフォルニア州ヴァカヴィル（Ｖａｃａｖｉｌｌｅ））からのケップラー（Ｋｅｐｐｌｅｒ）プログラム、ＣＡＲＯＬ プログラムのＪａｖａ使用可能ブラウザ（ベルリン自由大学（Ｆｒｅｉｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔaｔ）、フリッカー（Ｆｌｉｃｋｅｒ）二次元ゲル画像比較装置（Ｌｅｍｋｉｎ ＰＦ． 『二次元電気泳動ゲル 画像をインターネットを介して比較する。』電気泳動， １８；４６１−４７０ （１９９７）およびアマシャム？バイオサイエンス社（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（ドイツ、フライブルク（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ））によって市販されている画像 分析産物という製品を含む。
【０１６４】
プロテオミクスにおけるタンパク質同定
質量分析は、二次元ＰＡＧＥによって分離されているタンパク質の同定のためだけでなく、二次元ＰＡＧＥとは独立したタンパク質の直接検出および相対定量のためにも、プロテオミクスにおいて重要性を増してきている。タンパク質同定のためのその他の方法は、エドマン分解、アミノ酸分析および、当業者に既知であるその他の方法を含む。これらの方法の多くは、調べるタンパク質に由来するデータの取得および、これらのパラメーターの、核酸およびタンパク質データベースの理論分析によって予測されたパラメーターの一覧との比較を含む。
【０１６５】
Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＮＬ， Ｍａｔｈｅｓｏｎ ＡＤ， Ｓｔｅｉｎｅｒ Ｓ．『プロテオミクス；基礎および応用生物学における応用。』（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ； ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｂａｓｉｃ ａｎｄ ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｌｏｇｙ．）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０００， １１；４０８−４１２．
【０１６６】
Ｇｙｇｉ ＳＰ， Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ Ｒ．『質量分析とプロテオミクス。』（Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ２０００， ４；４８９−４９４．
【０１６７】
Ｌｅｅ ＫＨ．『プロテオミクス；技術に主導され技術に制限される発見科学。』（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ； ａ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−ｄｒｉｖｅｎ ａｎｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−ｌｉｍｉｔｅｄ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｓｃｉｅｎｃｅ．）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００１ Ｊｕｎｅ； １９（６）；２１７−２２２．
【０１６８】
Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ ＳＤ．『プロテオミクス；タンパク質化学の工業化。』（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ； ｔｈｅ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０００ １１；４１３−４１８．
【０１６９】
Ｇｏｄｏｖａｃ−Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ Ｊ， Ｂｒｏｗｎ ＬＲ．『質量分析と機能プロテオミクスの展望。』（Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｆｏｒ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．）Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ． Ｒｅｖ． ２００１， ２００１， ２０；１−５７．
【０１７０】
Ｐ． Ｊａｍｅｓ （編者）『タンパク質研究；質量分析（原理と実践）』（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ； Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ （Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ））２３５ページ（２０００年１２月） Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ； ＩＳＢＮ； ３５４０６７２５６７。
ゲノミクス
【０１７１】
細胞、生物、またはウイルスまたは転写活性を有するその他の系における遺伝子発現の程度を検出および比較するためのさまざまな方法が従来技術で知られている。
【０１７２】
そのような比較のための一つの標準的方法がノーザンブロットである。この手法では、ＲＮＡは試料から抽出され、ＲＮＡ分析に適当であるさまざまなゲルに用いられ、その後ゲルはＲＮＡをサイズに従って分離するために実行される。
【０１７３】
Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ． ｅｔ ａｌ．， １９８９．『分子クローニング−実験の手引き』（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．）コールドスプリングハーバー研究所出版社、コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ）， ＮＹ第二版。
【０１７４】
ゲルはその後ブロットされ（Ｓａｍｂｒｏｏｋに上述の通り）、目的のＲＮＡについて試料とハイブリダイズされる。試料は放射性または非放射性であることができる。たとえば、試料とのハイブリダイゼーションは、ジーニアス（Ｇｅｎｉｕｓ）システム（べーリンガー・マンハイム社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ドイツ、マンハイム）を用いてメーカーのデータに従って、結合した試料の化学発光検出によって観察し分析することができる。トラックへのＲＮＡの等しい負荷は、たとえば、リボソームＲＮＡバンドをエチジウムブロマイドを用いて染色することによって評価することができる。代替法として、試料は放射性標識化し、遺伝子についての試料および写真フィルムまたは蛍光体画像処理装置を用いて、または、本発明に従い一より多い遺伝子についての試料を用いて、オートラジオグラフィーによって検出することができる。
【０１７５】
ＲＮＡはさまざまな方法によって増幅しその後検出することができる。たとえば、Ｍａｒｓｈａｌｌ、米国特許第５，６８６，２７２号はリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を用いたＲＮＡ配列の増幅を開示する。ＬＣＲはＬａｎｄｅｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４１；１０７７−１０８０ （１９９８）； Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， ４；５６０−５６９ （１９８９）； Ｂａｒａｎｙ， ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ， １；５−１６ （１９９１）で；およびＢａｒａｎｙ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８８；１８９−１９３ （１９９１）によって記載されている。ＲＮＡはまた、逆転写によって相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）へ変換することができ、その後ＬＣＲ，ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、またはその他の方法によって増幅することができる。ＲＮＡの逆転写を実施するための方法の一例は、米国特許第５，７０５，３６５号に開示されている。適当なプライマーの選集およびＰＣＲ手順は、たとえば、Ｉｎｎｉｓ Ｍ． ｅｔ ａｌ．編、『ＰＣＲ手順１９９０年版』（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ １９９０）（アカデミック出版、サンディエゴ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）ＣＡ）に開示されている。メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の発現の差はまた、ｍＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写によって比較することができ、ｃＤＮＡは次いで制限酵素によって切断しそして電気泳動によって分離し、Ｂｅｌａｖｓｋｙ、米国特許第５，８１４，４４５号に開示される通りそのためｃＤＮＡ断片を比較することが可能になる。
【０１７６】
典型的には、５'末端のプライマーは、ビオチンまたは多数の蛍光 色素のうち一つで標識化されている。試料は、従来はホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）およびアルカリホスファターゼといった酵素を用いて標識化されるが、Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．中のＬｅｖｅｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｎｇ、 『非同位体標識化プローブおよびプライマー』（Ｎｏｎｉｓｏｔｒｏｐｉｃａｌｌｙ Ｌａｂｅｌｅｄ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｐｒｉｍｅｒｓ）を参照、試料はまた、たとえばソラレン−ビオチンで標識化することもできる。標識化 プライマーのための、および 酵素標識化試料を合成するための詳細な手順は、 Ｌｅｖｅｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｎｇに規定されている。試料はまた、放射性同位体を用いて標識化することもできる。放射性標識化されたＤＮＡおよびＲＮＡ試料を合成するための典型的な手順がＳａｍｂｒｏｏｋに規定されている。さまざまな放射性核種のＤＮＡ試料への組み込みのために、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、および、たとえば放射性ヨウ素を含む天然に存在する核酸には存在しないその他の元素を有する酵素前駆体基質を含む、いくつかの試薬が入手可能である。当業者に既知である通り、プライマーと共有結合した幅広いその他の放射性元素を含むプライマーを作製することもまた可能である。ＰＣＲ産物の検出のためのさまざまな方法が既知である。それらは一般に、試料のおよびＰＣＲ産物のハイブリダイゼーションを可能にする段階を含み、その後、検出を促進するために一つ以上の現像段階を行う。
【０１７７】
放射性標識化された試料を使用する場合は、試料とハイブリダイズしているＰＣＲ産物はオートラジオグラフィーによって検出することができる。たとえば、ビオチニル化ｄＵＴＰ （Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， ＭＤ）を増幅に用いることができる。標識化ＰＣＲ産物は次いでアガロースで分離し、サザン転写によってナイロンフィルター上に載せ、そして、たとえば、ストレプトアビジン／アルカリホスファターゼを用いる検出器系によって検出することができる。組み込まれたビオチニル化 ｄＵＴＰの検出のための手順は、たとえば、Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ中の、Ｌｏ ｅｔ ａｌ．『ビオチニル化ｄＵＴＰの組み込み』（Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ｄＵＴＰ）に記載されている。最後に、ＰＣＲ産物をアガロースゲルに載せることができ、そして核酸は特異的に核酸を認識するエチジウムブロマイドといった色素によって検出することができる。
【０１７８】
Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ、米国特許第５，８０７，６８０号は、発現に差のあるｍＲＮＡの同時の同定および相対濃度の測定のための方法を開示する。その手法は、アンカープライマーを有するｃＤＮＡの形成およびその後のＰＣＲを含むが、組織中で発現されている事実上すべてのｍＲＮＡを、ゲル上の明瞭なバンドとして可視化することを可能にし、バンドの強度はほぼｍＲＮＡ濃度に相当する。
【０１７９】
別の一群の手法は、相対的転写発現値の分析を用いる。高処理量での包括的分析を可能にするために、近年、四つのそのような手法が開発されている。第一に、ｃＤＮＡは逆転写によって試料中のＲＮＡから得ることができ（上記の引用に記載の通り）、被験試料および対象試料で発現されている、遺伝子についての発現配列タグ（ＥＳＴｓ）を定義するために５'および３'末端の簡単な配列解析に供することができる。異なる試料のタグの相対的発現を計測することで試料中の遺伝子転写物の相対的発現の推定値が与えられる。
【０１８０】
次に、ＳＡＧＥ（遺伝子発現の連続分析）として知られるＥＳＴの改変が開示されており、これは多数の転写物の定量的な同時分析を可能にする。この手法は、標的機能の遺伝子発現特性のパターンを示すために短い診断配列タグの単離および配列決定を用い、そして、たとえば、正常細胞および腫瘍細胞における何千の遺伝子の発現値を比較するために用いられている。Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ ａｔ ａｌ．， サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２７０；３６８−３６９ （１９９５）， Ｚｈａｎｇ ａｔ ａｌ．， サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２７６；１２６８−１２７２ （１９９７）を参照。
【０１８１】
三つめに、ディファレンシャル・ディスプレイに基づく手法が開発されている。これらの手法では、特定の制限配列によって定義される断片を、それが発現遺伝子において断片長の情報と組み合わされた場合、遺伝子についての個々の識別子として用いることができる。細胞における発現遺伝子の相対的発現は、その後、その遺伝子に割り当てられた断片の相対的発現によって推定することができる。いくつかの手法の例は、ジーン・ロジック社（Ｇｅｎｅ Ｌｏｇｉｃ Ｉｎｃ．）によって用いられる、発現に差のある配列の制限酵素分析（ＲＥＡＤＳ）、およびデジタル・ジーン・テクノロジー社（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）からの総遺伝子発現分析である。クローンテック社（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ， Ｉｎｃ．）（カリフォルニア州パロアルト（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ））は、発現に差のある遺伝子をＰＣＲによって特定するための、デルタ（登録商標）ディファレンシャル・ディスプレイキットを販売している。もう一つの方法は、コネチカット州ニューヘイブン（Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ）のキュラジェン社（ＣｕｒａＧｅｎ Ｃｏｒｐ．）からのジーンコーリング（ＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇ）システムであり、これは遺伝子同定を、遺伝子単離手順を最適化するために遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを用いることによる比較ＰＣＲによって確認される制限エンドヌクレアーゼフィンガープリントのデータベース照会と組み合わせる。
【０１８２】
四つめに、好ましい実施形態では、検出はハイブリダイゼーション分析のためのさまざまな手法によって実施される。これらの手法では、目的の試料に由来するＲＮＡは、標識化ｃＤＮＡを得るために逆転写に供される。ｃＤＮＡはその後、既知の配列でチップまたはその他の領域に配置された、典型的には既知の配列を有するオリゴヌクレオチドまたはｃＤＮＡとハイブリダイズされる。標識化ｃＤＮＡとハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの位置は、そのｃＤＮＡに関する配列情報を与える一方、標識化ＲＮＡまたはｃＤＮＡの量は、元の試料中のＲＮＡまたはｃＤＮＡの相対的な量の推定値を与える。本手法はさらに、たとえば、本発明の請求項１に記載の、二つ以上の放射性または蛍光標識といった、二つ以上の異なる検出可能な標識との同時ハイブリダイゼーションを可能にする。ハイブリダイゼーション結果は、試料の相対的発現の直接比較を与える。先行技術は、Ｋｉｎｇ ａｎｄ Ｓｉｎｈａ， ＪＡＭＡ ２８６；２２８０−２２０８ （２００１）およびＪａｉｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２９４；６２１−６２３ （２００１）およびこれらの中の引用文献によって概説されている。
【０１８３】
ハイブリダイゼーション分析のためのさまざまなキットが市販されている。これらのキットは、特定のＲＮＡまたはｃＤＮＡ分子を、フィルター、顕微鏡スライド、マイクロチップ、および質量分析技術を含む高密度形式で同定することを可能にする。たとえば、アフィメトリクス社（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｉｎｃ．）（カリフォルニア州サンタクララ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ））は、既知の配列、長さ、およびアレイ中での位置を有する数千の異なるオリゴヌクレオチド試料を含む、遺伝子の高精度配列決定のためのジーンチップ（ＧｅｎｅＣｈｉｐ）（登録商標）試料アレイを市販している。ＰＣＲ方法と組み合わせた合成オリゴヌクレオチドアレイは複合生物試料において細胞当たり１コピーを用いて転写条件を検出することができ、そしてインクジェットオリゴヌクレオチドアレイ手法は正確な用途のために用いることができる。Ｈｕｇｈｅｓ， Ｔ．Ｒ． ｅｔ ａｌ．， ネーチャーバイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）， １９；３４２−３４７ （２００１）を参照。クローンテック社のアトラス（Ａｔｌａｓ）（登録商標）ｃＤＮＡ発現アレイは、５８８種の選ばれた遺伝子の発現 パターンを測定することを可能にする。ハイセック社（Ｈｙｓｅｑ Ｉｎｃ．）（カリフォルニア州サニーベール（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ））からの遺伝子発見モジュール（ＧｅｎｅＤｉｓｃｏｖｅｒｙＭｏｄｕｌｅ）は、高処理量ＲＮＡスクリーニングを、先行する配列情報無しに、細胞当たりｍＲＮＡ１コピーの感度で可能にする。インサイト・ファーマシューティカルズ社（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）（カリフォルニア州パロアルト（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ））は、たとえば、ヒトがんの特注オリゴヌクレオチドおよびシグナル伝達遺伝子を含むマイクロアレイを提供する。その他の企業によって用いられる技術は、たとえば、Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｒ．； Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２；３９６−３９９ （１９９８）およびＣｌａｒｋｅ Ｐ．Ａ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， ６２；１３１１−１１３６およびこれらの中の引用で考察されている。
【０１８４】
放射線の測定
放射線検出のために開発された最初の電気装置はイオン化検出器であった。これらの機器は、放射線によってガス中に生じる電子およびイオンの直接捕捉に基づく。検出器の二つの基本形が存在し、それらは、イオン化チャンバーおよび比例計数管と呼ばれる。
【０１８５】
もう一つの検出装置はシンチレーション検出器である。それは核粒子または放射線がシンチレーション検出器に衝突する時、ある種の材料は一つ以上の光子、すなわちシンチレーションを放射するという事実に基づく。光電子増倍器のような増幅装置と組み合わせることによって、これらのシンチレーションは電気パルスに変換することができ、その後、入射放射線についての情報を提供するために分析し電子的にカウントすることができる。
【０１８６】
半導体検出器もまた、結晶性半導体材料、主にケイ素およびゲルマニウムを基礎とする幅広く用いられている検出装置である。これらの検出器は、固体検出器と呼ばれる。半導体の機能的原理は、ガスイオン化装置の機能的原理と同様である。ガスの代わりに、媒体は固体半導体材料である。イオン化チャンバーと比較しての半導体検出器の長所は、その高エネルギー解像度である。
【０１８７】
下記の教科書は放射能検出方法の原理を記載する；
【０１８８】
Ｋｎｏｌｌ， Ｇ．Ｆ．；『放射線検出および測定』（Ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ）８０２ページ、第三版、１９９９年１２月、ジョン・ウイリー・アンド・サン（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ）， ＩＳＢＮ ０４７１０７３３８５．
【図面の簡単な説明】
【０１８９】
【図１】図１Ａは、蛍光体画像処理装置を用いて求められた、二次元ゲルを用いて分離した二種類のタンパク質試料の放射線強度の局所分布を示し、一つの試料は、Ｉ−１２５種の同位体を用いて標識化されており他方の試料はＩ−１３１種の同位体を用いて標識化されている。図１Ｂは、蛍光体画像処理装置を用いて求められた、８２日間の待ち時間後の図１Ａの二次元ゲルの放射線強度の局所分布を示す。図１Ｃは、本発明に記載の方法を用いて計算した、Ｉ−１２５種の同位体を用いて標識化したタンパク質試料の放射線強度の局所分布を示す。図１Ｄは、本発明に記載の方法を用いて計算した、Ｉ−１３１種の同位体を用いて標識化したタンパク質試料の放射線強度の局所分布を示す。図１Ｅは図１Ｃと図１Ｄにおける局所分布の差を示し、Ｉ−１２５種の同位体を用いて標識化したタンパク質試料は青で表し、Ｉ−１３１種の同位体を用いて標識化したタンパク質試料は橙で表す。図１Ｆは、蛍光体画像処理装置を用いて求められた、２３日間の待ち時間後の図１Ａの二次元ゲルの放射線強度の局所分布を示す。図１Ｇは、本発明に記載の方法を用いて計算した、Ｉ−１２５種の同位体を用いて標識化したタンパク質試料の放射線強度の局所分布を示し、図１Ｆにおける局所分布が、求められた第二の局所分布として計算に用いられている。図１Ｈは、本発明に記載の方法を用いて計算した、Ｉ−１３１種の同位体を用いて標識化したタンパク質試料の放射線強度の局所分布を示し、図１Ｆにおける局所分布が、求められた第二の局所分布として計算に用いられている。図１Ｉは図１Ｇと図１Ｈにおける局所分布の差を示し、Ｉ−１２５種の同位体を用いて標識化したタンパク質試料は青で表し、Ｉ−１３１種の同位体を用いて標識化したタンパク質試料は橙で表す。
【図２】図２Ａは、蛍光体画像処理装置を用いて求められた、Ｉ−１２５種の同位体およびＩ−１３１種の同位体を用いて標識化された、異なる希釈段階と混合比の、吸収材を用いない、ウシ血清アルブミンのタンパク質試料の放射線強度の局所分布を示す。図２Ｂは、蛍光体画像処理装置を用いて求められた、吸収材を用いた図２Ａの放射線強度の局所分布を示す。図２Ｃは、本発明に記載の方法を用いて計算した、Ｉ−１２５種の同位体の放射線強度の局所分布を示す。図２Ｄは、本発明に記載の方法を用いて計算した、Ｉ−１３１種の同位体の放射線強度の局所分布を示す。図２Ｅは図２Ｃと図２Ｄにおける局所分布の差を示し、Ｉ−１２５種の同位体は青で表しＩ−１３１種の同位体は橙で表す。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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