(57)【要約】本発明は、オリゴヌクレオチドプライマーセット、プローブ、及び前記したプライマーセットとプローブの組合せを提供する。前記試薬は試験サンプル中のＨＩＶ−１標的配列を増幅・検出するために有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プライマーセット１（配列番号１及び配列番号２）、プライマーセット２（配列番号３及び配列番号２）、プライマーセット３（配列番号４及び配列番号２）、プライマーセット４（配列番号５及び配列番号２）、プライマーセット５（配列番号６及び配列番号２）、プライマーセット６（配列番号７及び配列番号２）、プライマーセット７（配列番号８及び配列番号２）、プライマーセット８（配列番号９及び配列番号１０）、プライマーセット９（配列番号９及び配列番号１１）、プライマーセット１０（配列番号１及び配列番号１２）、プライマーセット１１（配列番号１３及び配列番号１４）、プライマーセット１２（配列番号１３及び配列番号１５）、プライマーセット１３（配列番号１３及び配列番号２）、プライマーセット１４（配列番号９及び配列番号１２）、プライマーセット１５（配列番号１及び配列番号１１）、プライマーセット１６（配列番号１６及び配列番号１２）、プライマーセット１７（配列番号１６及び配列番号１７）、プライマーセット１８（配列番号３及び配列番号１２）、プライマーセット１９（配列番号３及び配列番号１８）、プライマーセット２０（配列番号１９及び配列番号１８）、プライマーセット２１（配列番号１３及び配列番号１７）、プライマーセット２２（配列番号１３及び配列番号２０）、プライマーセット２３（配列番号２１及び配列番号１８）、プライマーセット２４（配列番号２１及び配列番号１４）、プライマーセット２５（配列番号２１及び配列番号２０）、プライマーセット２６（配列番号４及び配列番号２０）、プライマーセット２７（配列番号５及び配列番号１５）、プライマーセット２８（配列番号２１及び配列番号２２）、プライマーセット２９（配列番号２１及び配列番号２３）、プライマーセット３０（配列番号５及び配列番号２３）、プライマーセット３１（配列番号２８及び配列番号２９）、プライマーセット３２（配列番号２８及び配列番号３０）、プライマーセット３３（配列番号２８及び配列番号３１）、プライマーセット３８（配列番号３７及び配列番号３２）、プライマーセット３９（配列番号３７及び配列番号３３）、プライマーセット４０（配列番号３８及び配列番号２９）、プライマーセット４１（配列番号３８及び配列番号３０）、プライマーセット４２（配列番号４及び配列番号２２）、プライマーセット４３（配列番号４及び配列番号４０）、プライマーセット４４（配列番号３４及び配列番号２２）、プライマーセット４５（配列番号３４及び配列番号４０）、プライマーセット４６（配列番号２４及び配列番号２５）及びプライマーセット４７（配列番号２６及び配列番号２７）からなる群から選択されることを特徴とするプライマーセット。
【請求項２】
オリゴヌクレオチドセットがオリゴセット１（配列番号２８、配列番号２９及び配列番号４１）、オリゴセット２（配列番号２８、配列番号２９及び配列番号４２）、オリゴセット３（配列番号２８、配列番号２９及び配列番号４３）、オリゴセット４（配列番号２８、配列番号２９及び配列番号４４）、オリゴセット５（配列番号２８、配列番号２９及び配列番号４５）、オリゴセット７（配列番号２８、配列番号２９及び配列番号４７）、オリゴセット８（配列番号２８、配列番号２９及び配列番号４８）、オリゴセット９（配列番号２８、配列番号２９及び配列番号４９）、オリゴセット１０（配列番号２８、配列番号２９及び配列番号５０）、オリゴセット１１（配列番号２８、配列番号２９及び配列番号５１）、オリゴセット１２（配列番号２８、配列番号２９及び配列番号５２）、オリゴセット１３（配列番号２８、配列番号２９及び配列番号５３）、オリゴセット１４（配列番号２８、配列番号３０及び配列番号４１）、オリゴセット１５（配列番号２８、配列番号３０及び配列番号４２）、オリゴセット１６（配列番号２８、配列番号３０及び配列番号４３）、オリゴセット１７（配列番号２８、配列番号３０及び配列番号４４）、オリゴセット１８（配列番号２８、配列番号３０及び配列番号４５）、オリゴセット２０（配列番号２８、配列番号３０及び配列番号４７）、オリゴセット２１（配列番号２８、配列番号３０及び配列番号４８）、オリゴセット２２（配列番号２８、配列番号３０及び配列番号４９）、オリゴセット２３（配列番号２８、配列番号３０及び配列番号５０）、オリゴセット２４（配列番号２８、配列番号３０及び配列番号５１）、オリゴセット２５（配列番号２８、配列番号３０及び配列番号５２）、オリゴセット２６（配列番号２８、配列番号３０及び配列番号５３）、オリゴセット２７（配列番号２８、配列番号３１及び配列番号４１）、オリゴセット２８（配列番号２８、配列番号３１及び配列番号４２）、オリゴセット２９（配列番号２８、配列番号３１及び配列番号４３）、オリゴセット３０（配列番号２８、配列番号３１及び配列番号４４）、オリゴセット３１（配列番号２８、配列番号３１及び配列番号４５）、オリゴセット３３（配列番号２８、配列番号３１及び配列番号４７）、オリゴセット３４（配列番号２８、配列番号３１及び配列番号４８）、オリゴセット３５（配列番号３７、配列番号３２及び配列番号５５）、オリゴセット３６（配列番号３７、配列番号３３及び配列番号５５）、オリゴセット３８（配列番号３７、配列番号３３及び配列番号５７）、オリゴセット３９（配列番号３８、配列番号２９及び配列番号５０）、オリゴセット４０（配列番号３８、配列番号２９及び配列番号５１）、オリゴセット４１（配列番号３８、配列番号２９及び配列番号５２）、オリゴセット４２（配列番号３８、配列番号２９及び配列番号５３）、オリゴセット４３（配列番号３８、配列番号３０及び配列番号５０）、オリゴセット４４（配列番号３８、配列番号３０及び配列番号５１）、オリゴセット４５（配列番号３８、配列番号３０及び配列番号５２）、オリゴセット４６（配列番号３８、配列番号３０及び配列番号５３）、オリゴセット４７（配列番号２８、配列番号３０及び配列番号５８）、オリゴセット４８（配列番号２８、配列番号３０及び配列番号５９）、オリゴセット４９（配列番号２８、配列番号３０及び配列番号６０）、オリゴセット５０（配列番号２８、配列番号３０及び配列番号６１）、オリゴセット５１（配列番号２８、配列番号３０及び配列番号６２）、オリゴセット５２（配列番号２８、配列番号３０及び配列番号６３）、オリゴセット５３（配列番号２８、配列番号３０及び配列番号６４）及びオリゴセット５４（配列番号２８、配列番号３０及び配列番号６５）からなる群から選択されることを特徴とするプライマーセット及び検出プローブを含むオリゴヌクレオチドセット。
【請求項３】
配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４及び配列番号６５からなる群から選択されることを特徴とするプローブ。
【請求項４】
ａ）試験サンプルを増幅試薬及び請求の範囲第１項に記載のプライマーセットと接触させて反応混合物を形成するステップ、及び
ｂ）前記反応混合物を増幅条件下に置いてＨＩＶ−１標的配列を増幅させるステップ
を含むことを特徴とするＨＩＶ−１標的配列の増幅方法。
【請求項５】
更に、増幅したＨＩＶ−１標的配列を検出するステップを含むことを特徴とする請求の範囲第４項に記載の方法。
【請求項６】
ａ）試験サンプルを増幅試薬及び請求の範囲第２項に記載のオリゴヌクレオチドセットと接触させて反応混合物を形成するステップ、
ｂ）前記反応混合物を増幅条件下に置いて増幅産物を形成するステップ、
ｃ）増幅産物／プローブハイブリッドを形成するステップ、及び
ｄ）前記ハイブリッドを試験サンプル中のＨＩＶ−１の存在の指標として検出するステップ
を含むことを特徴とする試験サンプル中のＨＩＶ−１の存在の検出方法。
【請求項７】
反応混合物が増幅条件下に置かれている間に増幅産物／プローブハイブリッドが形成されることを特徴とする請求の範囲第６項に記載の方法。
【請求項８】
（ａ）請求の範囲第１項に記載のプライマーセット及び（ｂ）増幅試薬を含むことを特徴とするＨＩＶ−１増幅用キット。
【請求項９】
（ａ）請求の範囲第２項に記載のオリゴヌクレオチドセット及び（ｂ）増幅試薬を含むことを特徴とするＨＩＶ−１検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）に関する。特に、本発明はＨＩＶ−１核酸配列の増幅・検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界中から集めたＨＩＶ株の分子キャラクタリゼーションにより広範囲の遺伝的多様性が明らかとなった。ウイルスゲノム配列の系統分析に基づいて、ＨＩＶはＭ、Ｎ及びＯの３つの別個の群に分類されている。群ＭウイルスがＨＩＶの大部分を占め、配列ダイバージェンスに基づいて更にサブタイプＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ及びＫと称される９つの区別できるクレードに細分されている（Ｄ．Ｌ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら，「ヒトレトロウイルス及びＡＩＤＳ  １９９９−核酸及びアミノ酸配列の収集及び分析(Human Restroviruses and AIDS 1999- A Compilation and Analysis of Nucleic Acid and Amino Acid Sequences)」，Ｃ．Ｋｕｉｋｅｎら編，ｐ．４９２−５０５（１９９９））。群Ｍ単離物の系統パターンは、共通の祖先から分岐している、互いにおおよそ等距離離れているサブタイプを有する星形系統である。ウイルスエンベロープ（ｅｎｖ）遺伝子アミノ酸配列のサブタイプ内ダイバージェンス度は最高２０％であり、サブタイプ間ダイバージェンス度は２５〜３０％である（Ｐ．Ｍ．Ｓｈａｒｐら，ＡＩＤＳ，８：Ｓ２７−Ｓ４２（１９９４））。
【０００３】
１９９０年に、異常ＨＩＶ−１株（ＡＮＴ７０）がカメルーン人患者から単離されたと報告された（Ｒ．ＤｅＬｅｙｓら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６４：１２０７−１２１６（１９９０））。入手し得る配列情報に基づいて、このウイルス株は他のＨＩＶ−１配列とは全く異なるようであった。類似のウイルス（ＭＶＰ−５１８０）が別のカメルーン人患者から単離された（Ｌ．Ｇｕｒｔｌｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６８：１５８１−１５８５（１９９４））。完全ゲノム配列分析から、これらのウイルスは群Ｍ株と同一の全ゲノム構造を共有しているが、これらの配列は群Ｍ単離物と比較してｅｎｖ遺伝子内のヌクレオチドホモロジーが〜５０％しかなく高度に分岐していた（Ｌ．Ｇｕｒｔｌｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６８：１５８１−１５８５（１９９４））。群Ｍ株との遺伝子ダイバージェンス度により、これらの単離物は群Ｏ（域外値）ウイルスと称された。最近、群Ｍ及び群Ｏ株から系統的に等距離にあるＨＩＶ−１ウイルスがカメルーンで同定された。前記ウイルスはＮ群と称されている（Ｆ．Ｓｉｍｏｎら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，４：１０３２−１０３７（１９９８））。
【０００４】
先天的にエラー頻発型の逆転写酵素、高いウイルス負荷及びインビボ選択圧すべてがＨＩＶ−１の遺伝的多様性の一因である。多様性の別の原因として、５’末端に結合している２つのゲノムＲＮＡ転写物がビリオンに包膜されているＨＩＶ複製サイクルの副産物が挙げられる。細胞に２つ以上のＨＩＶ−１株を同時に感染させると、ヘテロ接合型ビリオンが生じ得る。ビリオンに感染後、逆転写酵素は２つのＲＮＡ転写物間で前後に切り替えられ、組換えウイルスが生じ得る（Ｗ．Ｓ．Ｈｕ及びＨ．Ｍ．Ｔｅｍｉｎ，Ｓｃｉｎｅｃｅ，２５０：１２２７−１２３３（１９９０））。この組換え能力により、遺伝子変化が迅速かつ劇的に生ずる機会が生ずる。天然に存在するサブタイプ間組換えウイルスは最初Ｓａｂｉｎｏらにより同定され、彼らは２人の疫学的に関連する患者で見つけたＢ／Ｆモザイクをキャラクタライズした（Ｅ．Ｃ．Ｓａｂｉｎｏら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６８：６３４０−６３４６（１９９４））。複数のサブタイプが同時循環している地域では、サブタイプ間組換え体がＨＩＶ−１感染者の２０％以上を占める恐れがある（Ｍ．Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：８２０９−８２１２（１９９６））。現在までに公表されたウイルス組換え体の大部分は群Ｍサブタイプ間モザイクであるが、群Ｍ及び群Ｏ遺伝子セグメントからなる群間組換えウイルスも同定されている（Ｍ．Ｐｅｅｔｅｒｓら，Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌ．，７３：７３６８−７３７５（１９９９））。
【０００５】
完全長ゲノムのキャラクタリゼーションにより、群Ｍの２つの既に確認されているサブタイプのリファレンス株は実際にはサブタイプ間組換えウイルスであったことが明らかとなった。現在までに配列決定された“サブタイプＥ”株の代表例はすべてサブタイプＡ由来のｇａｇ及びＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌ）遺伝子から構成され、そのｅｎｖ遺伝子はサブタイプＥから誘導されている（Ｆ．Ｇａｏら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：７０１３−７０２９（１９９６））。以前サブタイプＩ株として確認されていたＨＩＶ−１株はサブタイプＡ、Ｇ及びＩ由来のサブゲノムセグメントからなるトリプルモザイクであることが分かった（Ｇ．Ｎａｓｉｏｕｌａｓら，ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，１５：７４５−７５８（１９９９））。流行が確認されている前記組換え株は循環組換え体形態(Circulating Recombinant Forms)（ＣＲＦ；Ｄ．Ｌ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら，「ヒトレトロウイルス及びＡＩＤＳ  １９９９−核酸及びアミノ酸配列の収集及び分析(Human Restroviruses and AIDS 1999- A Compilation and Analysis of Nucleic Acid and Amino Acid Sequences)」，Ｃ．Ｋｕｉｋｅｎら編，ｐ．４９２−５０５（１９９９））として分類されてきた。
【０００６】
ＣＲＦ株の出現の可能性は既に文献に記載されている。ＣＲＦ０１＿ＡＥと称されるサブタイプＥ株はタイにおけるＨＩＶ−１の主形態である。カリーニングラードでは、注射薬使用者でＡ／Ｂ組換えウイルス（ＣＲＦ０３＿ＡＢ）が大発生することが最近文献に記載されている（Ｋ．Ｌｉｉｔｓｏｌａ，ＡＩＤＳ，１２：１９０７−１９１９（１９９９））。独自で複雑なモザイクパターンを有するＡ／Ｇサブタイプ間組換え体（ＣＲＦ０２＿ＡＧ）がナイジェリア、ジブチ及び西中央アフリカ領域で同定された（Ｊ．Ｋ．Ｃａｒｒら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２４７：２２−３１（１９９８））。
【０００７】
ＨＩＶ−１群、サブタイプ及びＣＲＦの全分布は地理的地域毎にかなり異なり、常に変化している。サブタイプＢは北アメリカ及び西ヨーロッパにおいて優勢であるが（Ｆ．Ｅ．ＭｃＣｕｔｃｈａｎ，ＡＩＤＳ，１４（補遺３）：Ｓ３１−Ｓ４４（２０００））、非サブタイプＢ感染者の数がヨーロッパでも米国でも増えつつある。フランスでは、１９８５〜１９９５年の１０年間で非Ｂウイルスの罹患率は約４％から２０％以上に上昇した（Ｆ．Ｂａｒｉｎら，ＡＩＤＳ，１１：１５０３−１５０８（１９９７））。非Ｂ反応性検体が調べたすべての地域で発見された。驚くことに、ほぼ全ての群Ｍサブタイプ及び群Ｏ感染がパリの１つの病院で報告された（Ｆ．Ｓｉｍｏｎら，ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，１５：１４２７−１４３３（１９９６））。最近感染した２４人のドイツ人患者の分析から、該患者の３３％が非Ｂウイルスに感染していたことが判明した。この中にはサブタイプＡ、Ｅ及びＣが含まれていた（Ｕ．Ｄｉｅｔｒｉｃｈら，ＡＩＤＳ，１１：１５３２−１５３３（１９９７））。ベルギーでは、サブタイプＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ及びＨ感染が検出され、これらは全ＨＩＶ−１感染者の３０％以上を占めていた（Ｌ．Ｈｅｙｎｄｒｉｃｈｘら，ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，１４：１２９１−１２９６（１９９８））。サブタイプＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及び群Ｏを含めた非サブタイプＢ感染者の数が米国でも上昇しつつある（Ｐ．Ｊ．Ｗｅｉｄｌｅら，Ｊ．Ｉｎｆｅｒｃｔ．Ｄｉｓ．，１８１：４７０−４７５（２０００））。よって、サブタイプＢが伝統的に最も優勢の地域ではウイルス異質性も増えつつある。
【０００８】
血漿中のビリオン随伴ＲＮＡを定量することがＨＩＶ−１感染患者の臨床的管理及び追跡のための十分確立された方法となってきた。逆転写酵素結合ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）及び分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）を含めた各種の核酸ベース方法がＨＩＶ−１ウイルスＲＮＡの検出及び定量のために開発された（Ｊ．Ｍｕｌｄｅｒら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３２：２９２−３００（１９９４）；Ｔ．Ｋｉｅｖｉｔｓら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，３５：２７３−２８６（１９９１）；Ｄ．Ｋｅｒｎら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３４：３１９６−３２０２（１９９６）；Ｐ．Ｓｗａｎｓｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，８９：９７−１０８（２０００））。これらの方法はすべてオリゴヌクレオチドの標的配列へのハイブリダイゼーションを利用している。プライマー／プローブと標的配列がミスマッチであると、標的配列の増幅及び／または検出の効率がゼロになったり低減する恐れがある。よって、プライマー及び／またはプローブ配列の選択は前記アッセイの性能において重要な役割を果たす。
【０００９】
第１代の核酸ベース試験は、主に米国及び西ヨーロッパに共通するＨＩＶ−１サブタイプＢから誘導される配列情報に基づいて開発された。第１代Ａｍｐｌｉｃｏｒ  ＨＩＶ−１モニター（バージョン１．０）アッセイにより増幅効率に対するＨＩＶ−１遺伝的多様性の影響がすぐに明らかとなり始めた。なぜならば、群ＭサブタイプＡ、Ｅ、Ｆ、Ｇ及び群Ｏ臨床検体及びウイルス単離物を全く検出できなかったり、過少にしか定量できなかったからである（Ｊ．Ｌｏｕｓｓｅｒｔ−Ａｊａｋａら，Ｌａｎｃｅｔ，３４６：９１２−９１３（１９９５）；Ｊ．Ｃｏｓｔｅら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．，５０：２９３−３０２（１９９６）；Ｐ．Ｓｗａｎｓｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，８９：９７−１０８（２０００））。ＨＩＶ−１遺伝的多様性に起因するミスマッチがＮＡＳＢＡ  ＨＩＶ−１  ＲＮＡ  ＱＴ試験による群ＭサブタイプＡ、Ｇ、Ｈ、Ｊ及び群Ｏ検体の定量に悪影響を及ぼすことも判明した（Ｊ．Ｃｏｓｔｅら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．，５０：２９３−３０２（１９９６）；Ａ−Ｍ．Ｖａｎｄａｍｍｅら，Ｊ．Ａｃｑｕｉｒｅｄ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｆｉｃ．Ｓｙｎｄｒ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌ．，１３：１２７−１３９（１９９６）；Ｚ．Ｄｅｂｙｓｅｒら，ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，１４：４５３−４５９（１９９８））。Ａｍｐｌｉｃｏｒ  ＨＩＶ−１  Ｍｏｎｉｔｏｒ及びＮＡＳＢＡ  ＨＩＶ  ＲＮＡ  ＱＴ試験はいずれも遺伝的に分岐なサブタイプＢ検体を過少にしか定量しないように、サブタイプ間多様性も上記アッセイに影響を及ぼす（Ａ．Ａｌａｅｕｓら，ＡＩＤＳ，１１：８５９−８６５（１９９７）；Ｅ．Ｇｏｂｂｅｒｓら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６６：２９３−３０１（１９９７））。アッセイ性能に対するＨＩＶ−１遺伝的多様性の影響はＲＴ−ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ及びｂＤＮＡアッセイの第２代バージョンでも認められた（Ｍ．Ｓｅｇｏｎｄｙら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３６：３３７２−３３７４（１９９７）；Ａ．Ｈｏｌｇｕｉｎら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１８：２５６−２５９（１９９９））。現在のＡｍｐｌｉｃｏｒ  Ｍｏｎｉｔｏｒ  １．５試験は群Ｍサブタイプに対して著しい改善を示しているが、群Ｏ検体を検出できないかまたは信頼できる程度に定量できない（Ｐ．Ｓｗａｎｓｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，８９：９７−１０８（２０００））。ｇａｇベースのＮＡＳＢＡ及びｂＤＮＡアッセイも群Ｏ検体を検出できないかまたは過少にしか定量できない（Ｅ．Ｇｏｂｂｅｒｓら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６６：２９３−３０１（１９９７）；Ｐ．Ｓｗａｎｓｏｎら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．，３９：８６２−８７０（２００１））。
【００１０】
ＨＩＶ−１群及びサブタイプの地理的分布は常に変化しており、ＨＩＶ−１の組換え体形態の数が増えているために、血漿中のＨＩＶ−１  ＲＮＡレベルをモニターするために使用されるアッセイがＨＩＶ−１変異体すべてを検出できることが重要となってきた。理想的には、ＨＩＶ−１ウイルスＲＮＡを定量するために使用されるアッセイはすべての感染を高信頼性で確実に定量できるように群及びサブタイプと無関係に機能しなければならない。
【００１１】
最初に高変異性ＨＩＶ−１ゲノムの各種群及びサブタイプとハイブリダイスし得るプライマーセットを見つけることが更に困難になるのは、各種ゲノムと比較することにより選択したプライマーが必ずしも所期標的を増幅するために有効でないためである。Ｑ．Ｈｅら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１７（１）：８２−８６（１９９４）に記載されているように、当業者は特定標的配列にハイブリダイズするプライマーセットから十分な増幅産物を得るのに説明できない困難さを経験している。このことが、所与標的配列のためのプライマーセットを設計する際に直面する問題であり、既に困難なＨＩＶ−１標的のためのプライマヘの選択を複雑にしている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って、ＨＩＶ−１群Ｍ、Ｎ及びＯ、並びに前記群内ないし前記群に由来する各種サブタイプを含めたＨＩＶ−１変異体を特異的且つ高感度で増幅・検出するためのプライマーセット及び試薬が要望されている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、ＣＲＦ及び群間組換え体を含めたＨＩＶ−１群Ｍ、Ｎ及びＯ株をすべて増幅・検出するために有用な試薬を提供する。特に、前記試薬は上記したＨＩＶ−１変異体を特異的且つ高感度で検出するために核酸増幅方法に従って使用され得るプライマーセットの形態を有する。本発明で提供するプライマーセットは、ＨＩＶ−１標的配列を増幅させるために１対のプライマーを使用する公知の核酸増幅方法に従って使用され得る。プローブ配列も提供する。前記プローブ配列を各種プライマーセットと組合せて、ＨＩＶ−１標的配列を増幅・検出するために使用され得るオリゴヌクレオチド、すなわち“オリゴ”セットを形成し得る。
【００１４】
ＨＩＶ−１を検出するために使用され得る本発明のプライマーセットは、本明細書中、プライマーセット１（配列番号１及び配列番号２）、プライマーセット２（配列番号３及び配列番号２）、プライマーセット３（配列番号４及び配列番号２）、プライマーセット４（配列番号５及び配列番号２）、プライマーセット５（配列番号６及び配列番号２）、プライマーセット６（配列番号７及び配列番号２）、プライマーセット７（配列番号８及び配列番号２）、プライマーセット８（配列番号９及び配列番号１０）、プライマーセット９（配列番号９及び配列番号１１）、プライマーセット１０（配列番号１及び配列番号１２）、プライマーセット１１（配列番号１３及び配列番号１４）、プライマーセット１２（配列番号１３及び配列番号１５）、プライマーセット１３（配列番号１３及び配列番号２）、プライマーセット１４（配列番号９及び配列番号１２）、プライマーセット１５（配列番号１及び配列番号１１）、プライマーセット１６（配列番号１６及び配列番号１２）、プライマーセット１７（配列番号１６及び配列番号１７）、プライマーセット１８（配列番号３及び配列番号１２）、プライマーセット１９（配列番号３及び配列番号１８）、プライマーセット２０（配列番号１９及び配列番号１８）、プライマーセット２１（配列番号１３及び配列番号１７）、プライマーセット２２（配列番号１３及び配列番号２０）、プライマーセット２３（配列番号２１及び配列番号１８）、プライマーセット２４（配列番号２１及び配列番号１４）、プライマーセット２５（配列番号２１及び配列番号２０）、プライマーセット２６（配列番号４及び配列番号２０）、プライマーセット２７（配列番号５及び配列番号１５）、プライマーセット２８（配列番号２１及び配列番号２２）、プライマーセット２９（配列番号２１及び配列番号２３）、プライマーセット３０（配列番号５及び配列番号２３）、プライマーセット３１（配列番号２８及び配列番号２９）、プライマーセット３２（配列番号２８及び配列番号３０）、プライマーセット３３（配列番号２８及び配列番号３１）、プライマーセット３８（配列番号３７及び配列番号３２）、プライマーセット３９（配列番号３７及び配列番号３３）、プライマーセット４０（配列番号３８及び配列番号２９）、プライマーセット４１（配列番号３８及び配列番号３０）、プライマーセット４２（配列番号４及び配列番号２２）、プライマーセット４３（配列番号４及び配列番号４０）、プライマーセット４４（配列番号３４及び配列番号２２）、プライマーセット４５（配列番号３４及び配列番号４０）、プライマーセット４６（配列番号２４及び配列番号２５）及びプライマーセット４７（配列番号２６及び配列番号２７）と称される。
【００１５】
本発明で提供される（増幅されていてもされていなくてもよい）ＨＩＶ−１標的配列を検出するために使用され得るプローブ配列は、本明細書中、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４及び配列番号６５と称される。
【００１６】
ＨＩＶ−１標的配列を増幅・検出するために使用され得るオリゴセットは、本明細書中、オリゴセット１（配列番号２８、配列番号２９及び配列番号４１）、オリゴセット２（配列番号２８、配列番号２９及び配列番号４２）、オリゴセット３（配列番号２８、配列番号２９及び配列番号４３）、オリゴセット４（配列番号２８、配列番号２９及び配列番号４４）、オリゴセット５（配列番号２８、配列番号２９及び配列番号４５）、オリゴセット７（配列番号２８、配列番号２９及び配列番号４７）、オリゴセット８（配列番号２８、配列番号２９及び配列番号４８）、オリゴセット９（配列番号２８、配列番号２９及び配列番号４９）、オリゴセット１０（配列番号２８、配列番号２９及び配列番号５０）、オリゴセット１１（配列番号２８、配列番号２９及び配列番号５１）、オリゴセット１２（配列番号２８、配列番号２９及び配列番号５２）、オリゴセット１３（配列番号２８、配列番号２９及び配列番号５３）、オリゴセット１４（配列番号２８、配列番号３０及び配列番号４１）、オリゴセット１５（配列番号２８、配列番号３０及び配列番号４２）、オリゴセット１６（配列番号２８、配列番号３０及び配列番号４３）、オリゴセット１７（配列番号２８、配列番号３０及び配列番号４４）、オリゴセット１８（配列番号２８、配列番号３０及び配列番号４５）、オリゴセット２０（配列番号２８、配列番号３０及び配列番号４７）、オリゴセット２１（配列番号２８、配列番号３０及び配列番号４８）、オリゴセット２２（配列番号２８、配列番号３０及び配列番号４９）、オリゴセット２３（配列番号２８、配列番号３０及び配列番号５０）、オリゴセット２４（配列番号２８、配列番号３０及び配列番号５１）、オリゴセット２５（配列番号２８、配列番号３０及び配列番号５２）、オリゴセット２６（配列番号２８、配列番号３０及び配列番号５３）、オリゴセット２７（配列番号２８、配列番号３１及び配列番号４１）、オリゴセット２８（配列番号２８、配列番号３１及び配列番号４２）、オリゴセット２９（配列番号２８、配列番号３１及び配列番号４３）、オリゴセット３０（配列番号２８、配列番号３１及び配列番号４４）、オリゴセット３１（配列番号２８、配列番号３１及び配列番号４５）、オリゴセット３３（配列番号２８、配列番号３１及び配列番号４７）、オリゴセット３４（配列番号２８、配列番号３１及び配列番号４８）、オリゴセット３５（配列番号３７、配列番号３２及び配列番号５５）、オリゴセット３６（配列番号３７、配列番号３３及び配列番号５５）、オリゴセット３８（配列番号３７、配列番号３３及び配列番号５７）、オリゴセット３９（配列番号３８、配列番号２９及び配列番号５０）、オリゴセット４０（配列番号３８、配列番号２９及び配列番号５１）、オリゴセット４１（配列番号３８、配列番号２９及び配列番号５２）、オリゴセット４２（配列番号３８、配列番号２９及び配列番号５３）、オリゴセット４３（配列番号３８、配列番号３０及び配列番号５０）、オリゴセット４４（配列番号３８、配列番号３０及び配列番号５１）、オリゴセット４５（配列番号３８、配列番号３０及び配列番号５２）、オリゴセット４６（配列番号３８、配列番号３０及び配列番号５３）、オリゴセット４７（配列番号２８、配列番号３０及び配列番号５８）、オリゴセット４８（配列番号２８、配列番号３０及び配列番号５９）、オリゴセット４９（配列番号２８、配列番号３０及び配列番号６０）、オリゴセット５０（配列番号２８、配列番号３０及び配列番号６１）、オリゴセット５１（配列番号２８、配列番号３０及び配列番号６２）、オリゴセット５２（配列番号２８、配列番号３０及び配列番号６３）、オリゴセット５３（配列番号２８、配列番号３０及び配列番号６４）及びオリゴセット５４（配列番号２８、配列番号３０及び配列番号６５）と称される。
【００１７】
試験サンプル中のＨＩＶ−１を増幅・検出する方法も提供する。通常、前記方法は試験サンプルを増幅試薬及び上記プライマーセットと接触させて反応混合物を形成することを含む。次いで、前記反応混合物を増幅条件下に置いて増幅産物を形成し、よってＨＩＶ−１標的配列を増幅させる。増幅産物は各種検出方法を用いて検出され得る。しかしながら、増幅産物／プローブハイブリッドを形成し、試験サンプル中のＨＩＶ−１の存在の指標として検出することが好ましい。
【００１８】
（発明の詳細説明）
本発明により提供されるプライマーセットは、試験サンプル中のＨＩＶ−１標的配列を増幅させるために使用され得る２つのオリゴヌクレオチドプライマーから構成される。本明細書中、「試験サンプル」はＨＩＶ−１標的配列を含んでいるかまたは含んでいると疑われるサンプルを指す。試験サンプルは生物学的ソース（例えば、血液、精液、眼房液、脳脊髄液、乳、腹水液、滑液、腹膜液、羊水、セット織、発酵ブロス、細胞培養物等）であるかまたは前記ソースから誘導され得る。試験サンプルは（ｉ）前記ソースから入手したまま直接、または（ｉｉ）サンプルの特性を修飾するための予備処理後使用され得る。よって、使用する前に、試験サンプルを例えば血液から血漿を作成したり、細胞またはウイルス粒子を破壊したり、固体材料から液体を作成したり、粘性流体を希釈したり、液体を濾過したり、液体を蒸留したり、液体を濃縮したり、干渉成分を不活化したり、試薬を添加したり、核酸を精製したりして予備処理され得る。
【００１９】
本明細書中、「標的配列」は本発明のプライマーセットを用いて増幅及び／または検出される核酸配列を意味する。更に、標的配列はときどき一本鎖と称されるが、標的配列が実際には二本鎖であり得ることを当業者は認識している。よって、標的が二本鎖の場合には、本発明のプライマー配列は標的配列の両鎖を増幅する。
【００２０】
好ましくは、ＨＩＶ−１標的配列を増幅させるために使用され得るプライマーセットはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）からなる。前記プライマーセットは、標的配列を増幅させるために２つのオリゴヌクレオチドを用いる核酸増幅方法に従って使用され得る。例えば、プライマーセットは公知の核酸増幅反応、例えば、参照により本明細書に含まれるとする米国特許第５，３９９，４９１号明細書に記載されているＴＭＡのようなＮＡＳＢＡまたは類似の反応、いずれも参照により本明細書に含まれるとする米国特許第４，６８３，１９５号明細書及び同第４，６８３，２０２号明細書に記載されているＰＣＲに従って使用され得る。更に、ＨＩＶゲノムのＲＮＡ特性にてらして、プライマーセットはいずれも参照により本明細書に含まれるとする米国特許第５，３２２，７７０号明細書及び同第５，３１０，６５２号明細書に記載されている“ＲＴ−ＰＣＲ”フォーマットに従って使用され得る。簡単に説明すると、ＲＴ−ＰＣＲフォーマットによりＲＮＡ標的配列からＤＮＡ鎖を転写する方法が提供される。ＲＮＡ標的から転写したコピーＤＮＡ鎖は通常“ｃＤＮＡ”と称され、このｃＤＮＡはその後上記方法により増幅するための鋳型として使用され得る。ｃＤＮＡの作成方法はＰＣＲのような他の増幅方法を取り巻く多くのハイブリダイゼーション及び伸長原則を共有しているが、使用する酵素は逆転写活性を有していなければならない。逆転写活性を有する酵素及びＲＴ−ＰＣＲ法は公知であり、よって詳細な検討は省く。更に、ｃＤＮＡの合成方法も公知であり、例えば参照により本明細書に含まれるとする１９９５年２月２２日に出願された本出願人の米国特許出願第０８／３５６，２８７号明細書に記載されている。一般的に、試験サンプル中のＨＩＶ−１標的配列の増幅方法は通常試験サンプルをプライマーセット及び増幅試薬と接触させて反応混合物を形成するステップ及び前記反応混合物を増幅条件下に置いて前記標的配列を増幅させるステップを含む。
【００２１】
本明細書中、「増幅反応試薬」は、核酸増幅反応に使用することが公知の試薬を意味し、この中には１つまたは複数の試薬；逆転写酵素及び／またはポリメラーゼ活性またはエキソヌクレアーゼ活性を有する１つまたは複数の酵素；酵素コファクター、例えばマグネシウムまたはマンガン；塩；ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）；デオキシヌクレオシドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）、例えばデオキシアデノシントリホスフェート、デオキシグアノシントリホスフェート、デオキシシトジントリホスフェート及びチミジントリホスフェートが含まれるが、これらに限定されない。使用する正確な増幅試薬は、使用する特定の増幅反応に基づく当業者の設計事項である。
【００２２】
「増幅条件」は、通常プライマー配列のアニーリング及び伸長を促進する条件として定義され、当業者に公知であり、選択した増幅反応に基づく当業者の設計事項である。例えば、ＰＣＲの場合、増幅条件は熱サイクリングと称される２つ以上の温度間で様々に反応混合物をサイクリングさせることを含み得る。典型的には、ＰＣＲ反応は所望通り増幅させるために２０〜５０回サイクリングさせる。所謂“等温度”増幅反応を使用する場合には、異なる温度間をサイクリングさせることなく増幅が生じ、反応混合物が形成される結果として増幅産物が生成されるが、反応を開始するために初期温度を高く設定しなければならないこともある。
【００２３】
ＨＩＶ−１標的配列を増幅させるために使用され得るプライマーセットが以下の表１、表３及び表７にリストされている。表中、正プライマーを対の上段、逆プライマーを対の下段に示す。これらのプライマーセットの多くは、該プライマーを用いて生成される増幅産物がゲルまたは以下に詳記する他の手段を用いて検出され得るような感度のよい方法でＨＩＶ−１標的配列を増幅させることが判明した。表１、表３及び表７にリストしたプライマーセットは、好ましくはサンプル１ｍｌあたり１００，０００コピーのＨＩＶ−１核酸、より好ましくはサンプル１ｍｌあたり１０，０００コピーのＨＩＶ−１核酸、最も好ましくはサンプル１ｍｌあたり１，５００コピーのＨＩＶ−１核酸から検出し得る増幅産物を産生するほど高感度である。
【００２４】
【表１】
2005507655.tif 000002
2005507655.tif 000003
【００２５】
本発明のプライマーセットを用いて産生した増幅産物は当業界で公知の各種検出方法を用いて検出され得る。例えば、増幅産物はアガロースゲル電気泳動にかけ、臭化エチジウム染色により可視化し、紫外（ＵＶ）光に露出させるか、またＨＩＶ−同一性を確認するために増幅産物の配列を分析することにより検出され得る。
【００２６】
或いは、増幅産物はプローブとのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションによっても検出され得る。プローブ配列は通常１０〜５０ヌクレオチド長、より典型的には１５〜４０ヌクレオチド長であり、プライマー配列と同様にプローブ配列も核酸である。よって、プローブはＤＮＡ、ＲＮＡまたは核酸アナログ（例えば、非荷電核酸アナログ）から構成され得、この中には国際特許出願公開第９２／２０７０２号パンフレットに開示されているペプチド核酸（ＰＮＡ）、または米国特許第５，１８５，１４４号明細書、同第５，０３４，５０６号明細書及び同第５，１４２，０４７号明細書に記載されているモルホリノアナログが含まれるが、これらに限定されない。なお、上記特許文献はいずれも参照により本明細書に含まれるとする。前記配列は通常現在利用可能な各種方法を用いて合成され得る。例えば、ＤＮＡ配列は慣用のヌクレオチドホスホルアミデート化学及びカリフォルニア州フォスターシティーに所在のＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、デラウェア州ウィルミントンに所在のＤｕＰｏｎｔ、またはマサチューセッツ州ベッドフォードに所在のＭｉｌｌｉｇｅｎから入手し得る装置を用いて合成され得る。また、所望ならば、プローブをいずれも参照により本明細書に含まれるとする米国特許第５，４６４，７４６号明細書、同第５，４２４，４１４号明細書及び同第４，９４８，８８２号明細書に記載されているような当業界で公知の方法を用いて標識してもよい。また、プローブは通常プライマー配列間の標的配列とハイブリダイズする。換言すると、プローブ配列は通常いずれのプライマーとも共伸長性でない。
【００２７】
本明細書中、「標識」は検出し得る性質ないし特徴を有する分子または部分を意味する。標識は、例えば放射性同位体、発蛍光団、化学発光団、酵素、コロイド粒子、蛍光微粒子等のように直接検出され得る。或いは、標識は例えば特異的結合メンバーのように間接的に検出され得る。直接検出可能な標識では、該標識を検出し得るように基質、トリガー試薬、光等のような追加成分が必要な場合がある。間接的に検出可能な標識を使用するときには、該標識は通常“コンジュゲート”と組合せて使用される。通常、コンジュゲートは間接的に検出可能な標識に結合またはカップリングさせた特異的結合メンバーである。コンジュゲートを合成するためのカップリング化学は当業界で公知であり、この例には特異的結合メンバーの特異的結合性または標識の検出可能性を損なわない任意の化学的手段及び／または物理的手段が含まれ得る。本明細書中、「特異的結合メンバー」は、１つの分子がもう一方の分子に例えば化学的または物理的手段により特異的に結合する２種の分子という結合対のメンバーを意味する。抗原／抗体特異的結合対に加えて、他の特異的結合対にはアビジンとビオチン；ハプテンとこのハプテンに対して特異的な抗体；相補性ヌクレオチド配列；酵素コファクターまたは基質と酵素；等が含まれるが、これらに限定されない。
【００２８】
プローブ配列は、増幅産物を検出するために各種の均一または不均一方法を用いて使用され得る。通常、前記方法はプローブが増幅産物の鎖にハイブリダイズして増幅産物／プローブハイブリッドを形成するステップを含む。次いで、前記ハイブリッドはプライマー及び／またはプローブ上の標識を用いて検出され得る。増幅産物を検出するための均一検出プラットフォームの例には、標的配列の存在下でシグナルを発するプローブに結合したＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギートランスファー）標識の使用が含まれる。核酸配列を均一に検出するために使用され得る方法の例として、参照により本明細書に含まれるとする米国特許第５，２１０，０１５号明細書に記載されている所謂ＴａｑＭａｎアッセイ及び参照により本明細書に含まれるとする米国特許第５，９２５，５１７号明細書に記載されているＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎアッセイが挙げられる。均一検出方法によれば、増幅反応の産物が該産物が形成されたときかまたは所謂リアルタイムに検出され得る。その結果、反応混合物が増幅条件下にあるときに増幅産物／プローブが形成、検出される。
【００２９】
不均一検出フォーマットでは、反応に使用した他の材料から増幅配列を分離するために通常捕捉試薬を使用する。典型的な捕捉試薬は、同一または異なる結合メンバーに対して特異的な１つ以上の特異的結合メンバーを被覆した固体支持材料である。本明細書中、「固体支持材料」は、不溶性であるかまたはその後の反応により不溶性となる任意の材料を指す。よって、固体支持材料はラテックス、プラスチック、誘導体化プラスチック、磁気または非磁気金属、ガラスもしくはシリコーン表面、試験管表面、微量滴定ウェル、シート、ビーズ、微量粒子、チップ、及び当業者に公知の他の構成であり得る。増幅産物／プローブハイブリッドを不均一的に検出するのを助けるために、微量粒子のような固体材料に結合させた結合パートナーに対して特異的な第１結合メンバーでプローブを標識してもよい。また、上記コンジュゲートに対して特異的な第２結合メンバーでプライマーを標識してもよい。次いで、プローブに結合した増幅産物は、反応混合物を上記固体支持体と接触させた後その固体支持体を反応混合物から除去することにより残りの反応混合物から分離され得る。次いで、固体支持体に結合した増幅産物／プローブハイブリッドをコンジュゲートと接触させて、固体支持体上のハイブリッドの存在を検出することができる。
【００３０】
均一または不均一的に検出するかに関係なく、試験サンプル中の標的配列の検出方法は通常試験サンプルを本発明のプライマーセット及び増幅試薬と接触させて反応混合物を形成するステップを含む。次いで、前記反応混合物を上記したように増幅条件下に置いて増幅産物を形成する。次いで、増幅産物を試験サンプル中の標的配列の存在の指標として検出する。上記したように、反応産物はゲル電気泳動、均一反応または不均一方法を用いて検出され得る。従って、反応産物は、増幅条件下に置かれている間にＴａｑＭａｎ  ＰｒｏｂｅｓまたはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓを用いるような均一方法を用いて反応混合物中で検出され得る。或いは、標的配列の増幅が完了後増幅産物を不均一方法またはゲルを用いて検出され得る。
【００３１】
また、本発明は試験サンプル中のＨＩＶ−１標的配列を増幅・検出するために有用なオリゴヌクレオチドセットを提供する。前記オリゴヌクレオチドセット、すなわち“オリゴセット”は上記したように使用され得るプライマーセット及び分子ビーコンプローブからなる。更に、前記オリゴセットは適当な容器に収容されていてもよく、試験サンプル中のＨＩＶ−１を検出するためのキットを提供すべく（同様に適当な容器に収容されている）増幅試薬のような追加試薬と組合わせてもよい。
【００３２】
分子ビーコンを用いて検出する場合、プローブ配列を修飾し、蛍光検出標識及び蛍光消光基で標識する。前記配列のプローブ部分を用いてプライマー配列より生じた配列とハイブリダイズさせ、通常はプライマー配列を含まない配列とハイブリダイズさせる。このフォーマットでは、それぞれが異なる発蛍光団で標識されている複数のビーコンを用いてプローブすることも可能である。コピー配列／分子ビーコンハイブリッドを形成する際、異なる分子ビーコンからの別の標識を使用して増幅産物中で予想され得る僅かな配列の変化を分離、検出することができる。増幅配列の変化が予想される状況の例には、増幅反応（例えば、ＨＩＶ−１特異的及びＨＩＶ−２特異的）での複数のプライマーセットの使用、内部コントロール配列の初期標的配列への付加及び共増幅、または複数のＨＩＶサブタイプを増幅するために１つのプライマーセットの可能性が含まれる。なぜならば、前記プライマーセットはそうするように設計されており、その後サブタイプ特異的分子ビーコン配列により区別され得るからである。検出は、当業者に公知のように蛍光検出のために利用し得る装置を用いて実施される。
【００３３】
以下、本発明を更に説明するために実施例を提示するが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００３４】
下記実施例は、ＨＩＶ−１の各種サブタイプの本発明のプライマーセットを用いる増幅・検出を説明する。プライマーセットからなるＤＮＡ配列を、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３８及び配列番号４０として同定する。
【００３５】
実施例で使用するプローブ配列を、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４及び配列番号６５として同定する。
【００３６】
（実施例１）
オリゴヌクレオチドプライマーの作成
公知のＨＩＶ−１群Ｍ株、ＨＩＶ−１群Ｏ株、またはＨＩＶ−１群Ｍ及び群Ｏ株すべてをＲＴ−ＰＣＲにより増幅させるためにオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。これらのプライマーは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３８及び配列番号４０であった。プライマー配列を標準オリゴヌクレオチド合成法により合成した。
【００３７】
（実施例２）
単離物のキャラクタリゼーション
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーセット（表１）がＨＩＶ−１変異株を検出・増幅できたかを調べるために、群Ｍ（最も優勢なサブタイプを含む）、ＣＲＦ及び群Ｏウイルス単離物のパネルを使用して性能を試験した。ＨＩＶ−１単離物は幾つかのソースから入手した。１２個の群Ｍ単離物はメリーランド州ベセズダに所在のＷａｌｔｅｒ  Ｒｅｅｄ  Ａｒｍｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＷＲＡＩＲ）から入手した。群Ｏ単離物の１個は提携研究開発契約(Collaborative Research and Development Agreement)に基づいてジョージア州アトランタに所在のＣｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎから入手した。もう一方の群Ｏ単離物はジョージア州アトランタに所在のＳｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から受領した。単離物からの無細胞ウイルスストックはメリーランド州ロックビルに所在のＳＲＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより作成した。ウイルス単離物を配列分析及び系統分析によりキャラクタライズして、ＨＩＶ−１群／サブタイプ分類を指定した。
【００３８】
ＨＩＶ−１ゲノムの３つの領域、すなわちｇａｐ  ｐ２４（３９９ヌクリオチド）、ｐｏｌインテグラーゼ（８６４ヌクリオチド）及びｅｎｖ  ｇｐ４１免疫優性領域（ＩＤＲ；３６９ヌクリオチド）を配列分析のための標的とした。ウイルスストックをＨＩＶ−１血清陰性ヒト血漿で希釈した。２００〜４００μｌの血漿から全核酸をＱＩＡａｍｐ  Ｂｌｏｏｄキット（カリフォルニア州バレンシアに所在のＱｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．）を用いて抽出した。上記した３つの領域をＲＴ−ＰＣＲ増幅するためのプライマー及び条件は公知である（Ｂｒｅｎｎａｎら，ＡＩＤＳ，１１：１８２３−１８３２（１９９７）；Ｂｒｅｎｎａｎら，ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，１３：９０１−９０４（１９９７）；Ｈａｃｋｅｔｔら，ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，１３：１１５５−１１５８（１９９７）；Ｓｗａｎｓｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，８９：９７−１０８（２０００））。増幅産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．）を用いて精製した。精製ＰＣＲ産物の両鎖をＡＢＩモデル３７７自動シーケンサー（カリフォルニア州フォスターシティーに所在のＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキット（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて直接配列決定した。ヌクレオチド配列を、すべての群サブタイプ及び群Ｏを表す樹立リファレンス株からのヌクレオチド配列とアラインさせ、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ  ９９（ウィスコンシン州マディソンに所在のＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．）を用いて分析した。Ｐｈｙｌｉｐソフトウェアパッケージ（バージョン３．５ｃ；ワシントン州シアトルに所在のワシントン大学のＪ．Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ）を系統分析のために使用した。進化距離をＤＮＡＤＩＳＴ（キムラ２パラメーター法）を用いて推定し、系統学的再構成は近隣−結合法(neighbot-joining method)（ＮＥＩＧＨＢＯＲ）を用いて推定した。分岐パターンの再現性はＳＥＱＢＯＯＴを用いてブーツストラップ分析（１００サンプリング）により調べた。３つすべての領域は１４個すべてのウイルス単離物からうまくＲＴ−ＰＣＲ増幅され、配列決定された。系統分析の結果を図１〜３に示し、表２に要約する。
【００３９】
【表２】
2005507655.tif 000004
【００４０】
試験のために選択した単離物パネルは地理的な広範囲にわたり、２つのＣＲＦ株を含め群Ｍの最も広く分布しているサブタイプ及び群Ｏが含まれている。これらの単離物はｐｏｌインテグラーゼ遺伝子の系統分析の結果に基づいて選択した。なぜならば、本発明のプライマーはＨＩＶ−１のｐｏｌインテグラーゼ遺伝子を標的するように設計されているからである。１４個の単離物のうち、ｐｏｌインテグラーゼ領域の分析（図２、表２）が示すように群Ｍサブタイプあたり２つの単離物及び２つの群Ｏ単離物が均一に分布している。上記したように、ＣＲＦ０１＿ＡＥはｐｏｌインテグラーゼ領域においてサブタイプＡであり、よってサブタイプＣＲＦ０１＿ＡＥ単離物の検出はサブタイプＡ及びＣＲＦ０１＿ＡＥを検出するプライマーセットの能力を立証している。このパネルの試験から、本発明のプライマーはＨＩＶ−１の遺伝学的に多様の株を検出するために有効である。
【００４１】
（実施例３）
ＨＩＶサブタイプ検出
表１のプライマーセットがＨＩＶ−１群Ｍサブタイプ及びＣＲＦ株及び群Ｏ単離物をそれぞれ検出するかを確かめるために、実施例２でキャラクタライズしたウイルス単離物を用いて表１のプライマーセットを試験した。
【００４２】
ＰＣＲ増幅産物の分析を容易とするために、精製ＨＩＶ−１  ＲＮＡ希釈物を逆転写し、完全ｐｏｌインテグラーゼ遺伝子を表３にリストした群Ｍ（ｐｏｌＩ８及びｐｏｌＩ５）または群Ｏ（Ｏ−ｐｏｌＩ８及びＯ−ｐｏｌＩ５）特異的プライマーを用いてＰＣＲ増幅した。次いで、別の反応で本発明のＨＩＶ−１プライマーセット（表１）を用いて第２回増幅を実施した。
【００４３】
【表３】
2005507655.tif 000005
【００４４】
ＲＴ−ＰＣＲをＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲキットの成分を製造業者の指示に従って用いて実施した。ＰＣＲ緩衝液ＩＩ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、２．５Ｕ／反応物の濃度のＭｕＬＶ逆転写酵素、それぞれ１．０ｍＭの濃度のｄＮＴＰ類（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＣＴＰ）、１Ｕ／反応物の濃度のＲＮａｓｅインヒビター及び１μＭのプライマーを含む反応物（総容量２０μｌ）中で３μｌのサンプルを用いて核酸を逆転写することにより相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成した。反応混合物を逆転写し、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ９６００サーマルサイクラーにおいて増幅した。ＲＴ反応混合物をまず４２℃で４０分間インキュベートした後９９℃で５分間インキュベートした。
【００４５】
第１回ＰＣＲ増幅を、１００μｌの総反応容量につき２０μｌのｃＤＮＡ反応物に対して追加試薬を添加して実施した。反応物は最終濃度で５ｍＭのＭｇＣｌ２、２．５Ｕ／反応物のＡｍｐｌｉｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、０．５μＭの正プライマー及び０．５μＭの逆プライマーを含んでいた。次いで、反応を次のようにサイクリングした：９５℃×１分間の初期変成、９４℃×３０秒間，４５℃×３０秒間及び７２℃×９０秒間を１サイクルとして４０サイクル、その後７２℃×１０分間の最終インキュベーション。
【００４６】
次いで、完全長ｐｏｌインテグラーゼ増幅産物を鋳型として用いて、本発明のＨＩＶ−１プライマーセット（表１）の性能を試験した。各プライマーセットを、５μｌの初期ＰＣＲ反応物、ＰＣＲ緩衝液、それぞれ０．２ｍＭの濃度のｄＮＴＰ類（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＣＴＰ）、２．５Ｕ／反応物のＡｍｐｌｉｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ及び０．５μＭの各プライマーを含む反応物１００μｌ中で個別に試験した。反応混合物をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ９６００または９７００サーマルサイクラーにおいて増幅させた。反応混合物を次のようにサイクリングした：９５℃×１分間の初期変成、９４℃×３０秒間，５０℃または５５℃×３０秒間及び７２℃×９０秒間を１サイクルとして４０サイクル、その後７２℃×１０分間の最終インキュベーション。アガロースゲル電気泳動までサンプルを４℃に保持した。
【００４７】
反応産物をアガロースゲル電気泳動により検出した。各１００μｌの反応物から、５μｌを分子量マーカーと一緒にアガロースゲル上に流して、断片の長さを測定した。図４は、各プライマーセットに関してインテグラーゼ遺伝子に対して予想される断片サイズ及び位置を概略的に示す。臭化エチジウムで染色後ＵＶ光に曝すことにより断片を可視化した。前記データの代表的サンプリングを図５〜７に示す。図５は、各単離物のプライマーセット＃１、＃２、＃１２及び＃１３を用いる増幅を示す。図６及び７は、群ＭサブタイプＣＲＦ０２＿ＡＧ単離物ＤＪ２６３及び群Ｏ単離物３０１２の２つの特定単離物について残りのプライマーセットを用いる増幅を示す。本実験で実施した試験データを表４に要約し、ＨＩＶ−１プライマーセット＃１〜３０によるＨＩＶ−１群ＭサブタイプＡ〜Ｇ及び群Ｏの検出を示す。
【００４８】
幾つかの断片に関して、反応物の残りの部分を精製し、配列決定して、所期産物の増幅を確認した。精製は、ＱＩＡａｍｐ  ＰＣＲ精製キットまたはＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．）を製造業者の指示に従って用いて実施した。精製ＰＣＲ断片を本発明の対応プライマー、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅターミネーターサイクルシーケンシクング反応キット（カリフォルニア州フォスターシティーに所在のＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ及びＡＢＩモデル３７７自動シーケンサー（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて直接配列決定した。表５は配列決定結果を要約し、予想断片が増幅されたことを示している。
【００４９】
【表４】
2005507655.tif 000006
【００５０】
【表５】
2005507655.tif 000007
【００５１】
ＨＩＶ−１プライマーセット＃１〜３０は、遺伝的に分岐した群Ｏ単離物を含めて試験したすべてのＨＩＶ−１サブタイプ（表４）をうまく検出した。各プライマーセットに関して、予想される長さを有する断片がアガロースゲル分析に基づいて検出された。配列決定した断片に関して、各増幅断片が標的単離物のインテグラーゼ配列との比較に基づいて予想される断片であったことが配列分析から確認された。
【００５２】
（実施例４）
ＨＩＶ−１感受性
実施例２及び３に記載されている２つのウイルス単離物を使用して、表１のプライマーセットの感受性を評価した。前記単離物を脱繊維素ＨＩＶ−１血清陰性ヒト血漿で希釈した後Ａｂｂｏｔｔ  ＬＣｘ  ＨＩＶ定量ＲＮＡアッセイ（イリノイ州アボットパークに所在のＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて試験してウイルス負荷を測定した。次いで、希釈したサンプルを実施例３に記載されているプライマーセット１〜３０を用いて試験した。試験のために選択した２つの単離物のうち１つは、１５８５コピー／ｍｌの群Ｍ単離物のＵＧ２７４（サブタイプＤ）、１つは１４７９コピー／ｍｌの群Ｏ単離物の３０１２であった。
【００５３】
感受性試験の結果を表６に示す。すべてのプライマーセットが両方の単離物をうまく検出した。１つのプライマーセット＃１では、群Ｏ単離物を検出するためにＰＣＲ条件を僅かに修正しなければならなかった。群Ｏ単離物をプライマーセット＃１を用いて最初に試験したところ、混合結果を示した。第１の試験は、アガロースゲルで予想される断片長さの非常に弱いバンドを示した。しかしながら、試験を繰り返してもバンドは示さなかった。サイクリング中のアニーリング温度を５０℃から４５℃に下げることによりＰＣＲ条件を僅かに修正すると、結果が改善され、アガロースゲル電気泳動により明瞭なバンドが検出された。実施例３に記載されている条件はすべての単離物に対してプライマーセットを通常スクリーニングするために設計した。プライマーセット＃１の結果は、最適感受性のために増幅条件が各プライマーセットに対して特異的に最適化し得ることを示している。
【００５４】
上記結果は、本発明のプライマーセットがＨＩＶ群Ｍ及び群Ｏを試験した最低濃度の１５００コピー／ｍｌという感受性で検出することを示している。
【００５５】
【表６】
2005507655.tif 000008
【００５６】
（実施例５）
ＨＩＶ−１  Ｍ及びＯ増幅産物の分子ビーコンプローブを用いる検出
分子ビーコンプローブを用いて検出した増幅産物を作成するために使用したプライマーは、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号４、配列番号３７、配列番号３８、配列番号２２及び配列番号４０であった。プライマー配列は標準オリゴヌクレオチド合成法を用いて合成した。ＨＩＶを検出するために、プライマー配列を下表７に示すようにプライマーセットで一緒に使用した。表中、正プライマーを対の上段、逆プライマーを対の下段に示す。
【００５７】
【表７】
2005507655.tif 000009
【００５８】
（実施例６）
ＨＩＶ分子ビーコンプローブの作成
増幅したＨＩＶインテグラーゼ標的配列とオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションによりハイブリダイズするために分子ビーコンプローブを設計した。これらのプローブは、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４及び配列番号６５であった。プローブ配列は標準オリゴヌクレオチド合成法を用いて合成し、援用により本明細書に含まれるとする米国特許第５，４６４，７４６号明細書に記載されている標準シアノエチルホスホルアミデートカップリング化学を用いて５’末端を蛍光６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、３’末端をＣ６−ＮＨ−ＤＡＢＣＹＬで標識した。使用したＨＩＶ分子ビーコンプローブ配列を下表８に示す。
【００５９】
【表８】
2005507655.tif 000010
2005507655.tif 000011
上表８において、大文字はＨＩＶに特異的な配列を表し、小文字は分子ビーコンプローブのステムを作成するために使用したランダム配列を表し、囲んだ領域はこのステムを形成する配列である。
【００６０】
プローブＡ（配列番号４１）、プローブＢ（配列番号４２）、プローブＣ（配列番号４３）、プローブＤ（配列番号４４）、プローブＥ（配列番号４５）、プローブＦ（配列番号４６）、プローブＧ（配列番号４７）及びプローブＨ（配列番号４８）はプライマーセット３１、３２、３３、３４及び３５と一緒に使用され得る。プローブＩ（配列番号４９）はプライマーセット３１、３２、３４及び３５と一緒に使用され得る。プローブＪ（配列番号５０）、プローブＫ（配列番号５１）、プローブＬ（配列番号５２）及びプローブＭ（配列番号５３）はプライマーセット３１、３２、３４、３５、４０及び４１と一緒に使用され得る。プローブＯ（配列番号５４）はプライマーセット３４、３５、３６及び３７と一緒に使用され得る。プローブＰ（配列番号５５）はプライマーセット３４、３５、３６、３７、３８及び３９と一緒に使用され得る。プローブＱ（配列番号５６）及びプローブＲ（配列番号５７）はプライマーセット３５、３７及び３９と一緒に使用され得る。
【００６１】
（実施例７）
分子ビーコンプローブを用いるプライマーセットの感受性
実施例５で作成した表７に示すプライマーセットの性能を、ＨＩＶ  ＲＮＡサンプルの希釈物（Ｋ．Ａｂｒａｖａｙａら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３８：７１６−７２３（２０００））を実施例６で作成した表８に示す特定の分子ビーコンプローブで試験して評価した。精製ＨＩＶ  ＲＮＡを１００，０００コピー／ｍｌ、１０，０００コピー／ｍｌ、１，０００コピー／ｍｌ、１００コピー／ｍｌ及び２５コピー／ｍｌに希釈した後、いろいろなプライマーセット／プローブの組合せを用いる別々の反応で逆転写し、ＰＣＲ増幅し、検出した。ＨＩＶ  ＲＮＡを含まないネガティブコントロールもそれぞれのプライマーセット／プローブの組合せに含めた。ＲＴ−ＰＣＲを、１３０ｎＭの適切な正プライマー、４７８ｎＭの適切な逆プライマー、８１ｎＭの適切なＨＩＶ分子ビーコンプローブ、４．３８ｍＭのＭｎＣｌ２、０．３７５ｍＭの各ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴｐ及びｄＣＴＰ）、１３単位の組換えサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ポリメラーゼ、Ｂｉｃｉｎｅ緩衝液及びＨＩＶ  ＲＮＡ希釈物またはネガティブコントロールを含む反応混合物１００μｌ中で実施した。
【００６２】
反応混合物を逆転写し、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ９７００サーマルサイクラーにおいて増幅させた。まず、反応混合物を５９℃で３０分間インキュベートしてＲＮＡを逆転写した後、９５℃×３０秒間、５４℃×３０秒間及び７２℃×３０秒間を４サイクル実施した。次いで、９０℃×３０秒間、５９℃×３０秒間及び７２℃×３０秒間を３６〜４０サイクル実施して増幅させた。反応混合物を熱サイクルにかけた後、混合物を９４℃に５秒間上昇させ、温度を４５℃に１５秒間下げ、更に２５℃に１０秒間下げることによりプローブオリゴハイブリダイゼーションを実施した。反応産物が検出されるまでサンプルを２５℃で維持した。反応産物をＣｙｔｏｆｌｕｏｒ（マサチューセッツ州フレーミングハムに所在のＰｅｒｃｅｐｔｉｖｅ）またはＢｉｏＴｅｋ  ６００（カリフォルニア州フォスターシティーに所在のＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のような蛍光リーダーを用いて検出した。蛍光単位で表示した結果を下表９に示す。
【００６３】
【表９】
2005507655.tif 000012
【００６４】
プライマーセット３１、３２及び３８は最良の性能を与え、ネガティブコントロール（０コピー／ｍｌ）と簡単に判別される２５コピー／ｍｌのＨＩＶを検出した。プライマーセット３３、３９、４０及び４１は１０００〜１０，０００コピー／ｍｌのＨＩＶを検出した。プライマーセット３４、３５、３６及び３７はうまく働かなかったが、これは使用したプローブのせいではなかった。なぜならは、プローブＡまたはＰは他のプライマーセットと併用したときには良好な結果を示したからである。
【００６５】
プライマーセット４２、４３、４４及び４５をプローブアニーリングステップを省いた以外は上記したように試験した。ゲルをＲＴ−ＰＣＲ産物と一緒に流すことにより結果を分析した。１０，０００コピー／ｍｌのＨＩＶを用いて予想されるバンドが観察された。
【００６６】
（実施例８）
分子ビーコンプローブの感受性
実施例６で作成した表８に示す分子ビーコンプローブＡ〜Ｍの性能を、実施例７のＨＩＶ  ＲＮＡ希釈物を実施例５で作成したプライマーセット３２を用いて試験することにより評価した。また、プローブＯをプライマーセット３５と併用し、プローブＰ、Ｑ及びＲをプライマーセット３９と併用した。結果を下表１０に示す。
【００６７】
【表１０】
2005507655.tif 000013
2005507655.tif 000014
【００６８】
プローブＡ、Ｂ、Ｅ、Ｈ及びＩは２５コピー／ｍｌのＨＩＶを検出し、この量はネガティブコントロール（０コピー／ｍｌ）と判別できた。プローブＪ、Ｋ、Ｍ、Ｐ及びＲは１００〜１０００コピー／ｍｌのＨＩＶを検出した。プローブＦ、Ｏ及びＱはあまり有効でなく、プローブＣ、Ｄ、Ｇ及びＬはネガティブコントロールでより高いバックグランウンド値を示した。プローブＣ、Ｄ、Ｅ及びＦで観察された性能の違いは驚くものであった。なぜならば、これらのプローブは同じＨＩＶ結合配列を有していたからである。しかしながら、これらのプローブはステム配列の組成にしか違いがなかった。プローブＪ、Ｋ及びＬも、ＨＩＶ結合配列中の塩基の違いは１つしかなく、ステム配列セット成は同一またはほぼ同一である点で驚くことであった。プローブＪ及びＫは約１０００コピー／ｍｌのＨＩＶを検出したのに対して、プローブＬはＪまたはＫよりも高いバックグラウンド値を与えた。
【００６９】
（実施例９）
インドールまたはイノシン置換基を有する分子ビーコンプローブの感受性
プローブＡ、Ｂ、Ｅ、Ｈ及びＩを３２５個の公知ＨＩＶ−１配列に対して分析した。最も一般的なミスマッチを有する部位を同定し、プローブをそのミスマッチ位置にユニバーサル塩基を含むように修飾した。プローブ内のミスマッチ位置を表１１に示すようにニトロインドールまたはイノシンで置換した。これらの修飾プロープは実施例６のように合成した。前記修飾プローブの配列を下表１１に示す。
【００７０】
【表１１】
2005507655.tif 000015
2005507655.tif 000016
【００７１】
インドールまたはイノシン分子ビーコンプローブの性能を、上記実施例７のようにＨＩＶ  ＲＮＡの希釈物を実施例５で作成したプライマーセット３２を用いて試験することにより評価した。結果を下表１２に示す。インドールまたはイノシン置換基を含むプローブはすべて２５コピー／ｍｌのＨＩＶを検出し、この量はネガティブコントロール（０コピー／ｍｌ）と判別できた。
【００７２】
【表１２】
2005507655.tif 000017
【００７３】
（実施例１０）
各種ＨＩＶサブタイプの分子ビーコンプローブを用いる検出
各種ＨＩＶサブタイプを入手し、ＲＮＡをＫ．Ａｂｒａｖａｙａら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３８：７１６−７２３（２０００）及びＪ．Ｊｏｈｎｓｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，９５：８１−９２（２００１）に記載されているように単離した。各種サブタイプから単離したＨＩＶ  ＲＮＡを約１０００コピー／ｍｌに希釈し、プライマーセット３２＋プローブＡ、プライマーセット３２＋プローブＨまたはプライマーセット３８＋プローブＰを用いてＲＴ−ＰＣＲ及びプローブオリゴハイブリダイゼーションを実施して実施例７に記載されているように試験した。プライマーセットは実施例７に記載されており、蛍光単位で表示した。下表１３から分かるように、すべてのＨＩＶサブタイプが試験した３つのプライマー／プローブセットで検出された。
【００７４】
【表１３】
2005507655.tif 000018
【００７５】
ＲＮＡ転写物を、Ｋ．Ａｂｒａｖａｙａら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３８：７１６−７２３（２０００）及びＪ．Ｊｏｈｎｓｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，９５：８１−９２（２００１）に記載されているようにＨＩＶサブタイプＡ、Ｃ、Ｄ、ＣＲＦ０１＿ＡＥ及びＦのクローンから作成した。転写物を約１０，０００コピー／ｍｌに希釈し、プライマーセット３２＋プロープＡまたはプローブＨを用いて実施例８に記載されているように増幅し、検出した。表１４の結果は、試験したすべてのＨＩＶサブタイプが使用した２つのプライマー／プローブセットで検出されたことを示している。
【００７６】
【表１４】
2005507655.tif 000019
【００７７】
（実施例１１）
各種ＨＩＶサブタイプの分子ビーコンプローブを用いる定量
実施例１０に記載されている各種ＨＩＶサブタイプから単離したＲＮＡを約１０００（すなわち、３ｌｏｇ）コピー／ｍｌに希釈し、プライマーセット３２＋プローブＡまたはプライマーセット３２＋プローブＨを用いて実施例７に記載されているように試験した。定量結果を得るために、ＲＴ−ＰＣＲ反応混合物には０．１μＭのＩｎｔｅｒｎａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ転写物配列に対して特異的な分子ビーコンプローブ
【００７８】
【化１】
2005507655.tif 000020
及び５００コピー／反応物のＩｎｔｅｒｎａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ転写物（配列番号６７）を含めた。ＩＣ転写物はＨＩＶと同一のプライマー結合部位及び特異的なＩＣブローブ結合領域を有している。ＩＣプローブは実施例６と同様に合成したが、合成後５’末端をスルホニルクロリド誘導体化スルホローダミン１０１（Ｔｅｘａｓ  Ｒｏｄ）とコンジュゲートしたＣ６−ＮＨ−誘導体化プローブを用いて５’末端を異なる蛍光発色団のスルホローダミン１０１を用いて標識した。この競合フォーマットでは、標的ＨＩＶの濃度が高くなるとＨＩＶプローブからのシグナルは上昇し、ＩＣプローブからのシグナルは低下する。ＨＩＶプローブシグナルのｌｏｇをＩＣプローブシグナルのｌｏｇで割ることにより検量曲線を作成し、その後この検量曲線を用いてＨＩＶサンプルを定量した。
【００７９】
各種ＨＩＶサブタイプからのＲＮＡ単離物のこの方法による定量結果を表１５に示す。結果はｌｏｇコピー／ｍｌで表示する。サブタイプＡ単離物３２７を除いて、試験したすべての単離物が約３ｌｏｇコピー／ｍｌで定量された。この単離物をプライマーセット３１を用いても試験した。このプライマーセット３１は逆プライマーが３塩基長いこと（表７参照；５’末端に２つの追加ヌクレオチド、３’末端に１つの追加ヌクレオチド）を除いてプライマー３２と同一であった。シグナルは２倍高かった（データ示さず）。
【００８０】
【表１５】
2005507655.tif 000021
【００８１】
また、実施例１０に記載されているようにサブタイプＡ、Ｃ、Ｄ、ＣＲＦ０１＿ＡＥ及びＦを代表とするＨＩＶ−１単離物のクローンから作成したＲＮＡ転写物を約１０，０００コピー／ｍｌに希釈し、プライマーセット３２＋プローブＡまたはプローブＨを用いて実施例１１に上記したように定量した。表１６の結果は、ほとんどすべてのＨＩＶ転写物（Ｋ．Ａｂｒａｖａｙａら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３８：７１６−７２３（２０００）参照）が４ｌｏｇコピー／ｍｌで定量されたことを示している。
【００８２】
【表１６】
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【００８３】
本発明を特定実施例を参照して詳細に説明してきたが、本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく前記実施例に各種の変更び改変を加えることができることは当業者に自明である。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】ｇａｐ  ｐ２４遺伝子（３９９ヌクレオチド）の分析に基づいてＨＩＶ−１群Ｍ及び群Ｏリファレンス株に対してプライマーセットを試験するために使用したウイルス単離物の系統的類縁関係を示す。ウイルス単離物を太字で示す。リファレンス株の場合、株アイデンティファイアーの前にサブタイプ／群を記す。サブタイプ分類を弧及びサブタイプラベルで示す。ＣＲＦ０１＿ＡＥ及びＣＲＦ０２＿ＡＧでは、弧を点線で示した。主要分岐節では７０％以上のブーツストラップ値を示している。
【図２】ｐｏｌインテグラーゼ遺伝子（８６４ヌクレオチド）の分析に基づいてＨＩＶ−１群Ｍ及び群Ｏリファレンス株に対してプライマーセットを試験するために使用したウイルス単離物の系統的類縁関係を示す。ウイルス単離物を太字で示す。リファレンス株の場合、株アイデンティファイアーの前にサブタイプ／群を記す。サブタイプ分類を弧及びサブタイプラベルで示す。ＣＲＦ０１＿ＡＥ及びＣＲＦ０２＿ＡＧでは、弧を点線で示した。主要分岐節では７０％以上のブーツストラップ値を示している。
【図３】ｅｎｖ  ｇｐ４１免疫優性領域（３６９ヌクレオチド）の分析に基づいてＨＩＶ−１群Ｍ及び群Ｏリファレンス株に対してプライマーセットを試験するために使用したウイルス単離物の系統的類縁関係を示す。ウイルス単離物を太字で示す。リファレンス株の場合、株アイデンティファイアーの前にサブタイプ／群を記す。サブタイプ分類を弧及びサブタイプラベルで示す。ＣＲＦ０１＿ＡＥ及びＣＲＦ０２＿ＡＧでは、弧を点線で示した。主要分岐節では７０％以上のブーツストラップ値を示している。
【図４】完全長ｐｏｌインテグラーゼ遺伝子とアラインさせた各プライマーセットからの予想ＰＣＲ増幅断片の構成図を示す。各断片にプライマーセット番号を付し、予想される断片長を塩基対（ｂｐ）で示す。群Ｍ及び群Ｏ単離物について完全長ｐｏｌインテグラーゼ遺伝子の第１回増幅のために使用した表３のプライマーの相対位置及び方向も示されている。
【図５Ａ】すべての試験単離物についてＲＴ−ＰＣＲ増幅ｐｏｌ／インテグラーゼ断片のアガロースゲル電気泳動及び臭化エチジウム染色による検出を示す。図５Ａはプライマーセット＃１を用いる増幅を示す。６００、５００及び１０００ｂｐマーカーに相当する分子量バンドは矢印で強調されている。
【図５Ｂ】すべての試験単離物についてＲＴ−ＰＣＲ増幅ｐｏｌ／インテグラーゼ断片のアガロースゲル電気泳動及び臭化エチジウム染色による検出を示す。図５Ｂはプライマーセット＃２を用いる増幅を示す。６００及び１０００ｂｐマーカーに相当する分子量バンドは矢印で強調表示されている。
【図５Ｃ】すべての試験単離物についてＲＴ−ＰＣＲ増幅ｐｏｌ／インテグラーゼ断片のアガロースゲル電気泳動及び臭化エチジウム染色による検出を示す。図５Ｃはプライマーセット＃１２を用いる増幅を示す。６００及び１０００ｂｐマーカーに相当する分子量バンドは矢印で強調表示されている。
【図５Ｄ】すべての試験単離物についてＲＴ−ＰＣＲ増幅ｐｏｌ／インテグラーゼ断片のアガロースゲル電気泳動及び臭化エチジウム染色による検出を示す。図５Ｄはプライマーセット＃１３を用いる増幅を示す。５００ｂｐマーカーに相当する分子量バンドは矢印で強調表示されている。
【図６】図５〜８に示していないすべてのプライマーセットを用いるＲＴ  ＰＣＲ増幅群ＭサブタイプＣＲＦ０２＿ＡＧ単離物ＤＪ２６３  ｐｏｌ／インテグラーゼ断片のアガロースゲル電気泳動及び臭化エチジウム染色による検出を示す。６００、５００及び１０００ｂｐマーカーに相当する分子量バンドは矢印で強調表示されている。
【図７Ａ】図５に示していないすべてのプライマーセットを用いるＲＴ−ＰＣＲ増幅した群Ｏ単離物３０１２  ｐｏｌインテグラーゼのアガロースゲル電気泳動及び臭化エチジウム染色による検出を示す。６００、５００及び１０００ｂｐマーカーに相当する分子量バンドは矢印で強調表示されている。
【図７Ｂ】図５に示していないすべてのプライマーセットを用いるＲＴ−ＰＣＲ増幅した群Ｏ単離物３０１２  ｐｏｌインテグラーゼのアガロースゲル電気泳動及び臭化エチジウム染色による検出を示す。６００、５００及び１０００ｂｐマーカーに相当する分子量バンドは矢印で強調表示されている。
【図１】
2005507655.tif 000023
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
2005507655.tif 000029
【図５Ｄ】
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【図６】
2005507655.tif 000031
【図７Ａ】
2005507655.tif 000032
【図７Ｂ】
2005507655.tif 000033
【国際公開パンフレット】
2005507655.tif 000034
2005507655.tif 000035
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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