(57)【要約】本発明は、概日リズムを調節する化合物をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、（ａ）プロキネチシンプロキネチシン２（ＰＫ２）レセプターアンタゴニストまたはアゴニストである化合物を与える工程と、（ｂ）概日リズム機能の１つ以上の特徴を調節する上記化合物の能力を測定する工程とを包含し、概日リズムの１つ以上の特徴を調節する化合物を、概日リズムを調節する化合物として同定する。また、本発明は、マウスＰＫ２レセプター核酸、ポリペプチド、および関連組成物を提供する。さらに、動物の概日リズムを調節する方法を提供するもので、該方法は、動物に対して、有効量のＰＫ２レセプターアンタゴニストまたはＰＫ２レセプターアゴニストを投与することを含む。また、異種ヌクレオチド配列に作動可能に結合したＰＫ２遺伝子プロモーターを含む単離核酸も提供する。
2005538695.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(ａ）プロキネチシンプロキネチシン２（ＰＫ２）レセプターアンタゴニストまたはアゴニストである化合物を与える工程と、（ｂ）概日リズム機能の１つ以上の特徴を調節する該化合物の能力を測定する工程とを包含し、概日リズムの１つ以上の特徴を調節する化合物を、概日リズムを調節する化合物として同定する、概日リズムを調節する化合物をスクリーニングする方法。
【請求項２】
前記ＰＫ２レセプターアンタゴニストまたはＰＫ２レセプターアゴニストを、観察可能な概日リズム機能を持つ動物に投与する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＰＫ２レセプターおよびＰＫ１レセプターから選択されるレセプターに、ＰＫ２が所定のシグナルを高める条件下で、１種類以上の候補化合物を接触させ、前記所定のシグナルを減少させる化合物を同定することで、前記与えられたＰＫ２レセプターアンタゴニストを同定する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＰＫ２レセプターおよびＰＫ１レセプターから選択されるレセプターに、ＰＫ２が所定のシグナルを高める条件下で、１種類以上の候補化合物を接触させ、前記所定のシグナルを促進する化合物を同定することで、前記与えられたＰＫ２レセプターアンタゴニストを同定する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記所定のシグナルがカルシウム・イオンの移動である、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記レセプターが約１００を上回る候補化合物に接触する、請求項３または４に記載の方法。
【請求項７】
前記レセプターが約１０５を上回る化合物と接触させる、請求項３または４に記載の方法。
【請求項８】
前記レセプターがマウスＰＫ２レセプターである、請求項３または４に記載の方法。
【請求項９】
前記マウスＰＫ２レセプターが配列番号２のアミノ酸配列を有するか、もしくは前記マウスＰＫ１レセプターが配列番号４のアミノ酸配列を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記レセプターがヒト細胞調製物に含まれる、請求項３または４に記載の方法。
【請求項１１】
ＰＫ２レセプターおよびＰＫ１レセプターから選択されるレセプターに、レセプターアゴニストの存在下、前記アゴニストが前記選択されたレセプターに結合する条件下で、１種類以上の候補化合物に接触させ、該結合を減少させる化合物を同定することで、前記与えられたＰＫ２レセプターアンタゴニストを同定する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記レセプターアゴニストがＰＫ２である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＰＫ２がヒトＰＫ２である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＰＫ２レセプターおよびＰＫ１レセプターから選択されるレセプターに、ＰＫ２が前記選択されたレセプターに結合する条件下で、１種類以上の候補化合物に接触させ、前記選択されたレセプターに結合し、かつ該レセプターを活性化させる化合物を同定することで、前記与えられたＰＫ２レセプターアンタゴニストを同定する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記レセプターが約１００を上回る候補化合物に接触する、請求項１０または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記レセプターが約１０５を上回る化合物と接触させる、請求項１０または１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記レセプターがＰＫ２レセプターである、請求項１０または１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＰＫ２レセプターがマウスＰＫ２レセプターである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記レセプターがヒト細胞調製物を含む、請求項１０または１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記動物が哺乳類である、請求項２に記載の方法。
【請求項２１】
前記動物がヒト、非ヒト霊長類、ラット、およびマウスから選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記概日リズム機能の１つ以上の特徴は、体温、睡眠・覚醒周期、メラトニン分泌、ＡＣＴＨ−コルチゾール分泌、胸腺刺激ホルモン分泌、成長ホルモン分泌、神経ペプチドγ分泌、セロトニン分泌、インスリン様増殖因子Ｉ型分泌、副腎皮質刺激ホルモン分泌、プロラクチン分泌、Ｙ−アミノブチル酸分泌、カテコールアミン分泌、自発運動リズム、および賢さから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記概日自発運動リズムがホイール・ランニング・リズムである、請求項２に記載の方法。
【請求項２４】
動物に対して有効量のＰＫ２レセプターアンタゴニストまたはＰＫ２レセプターアゴニストを投与することが含まれる、前記動物の概日リズムを調整する方法。
【請求項２５】
前記動物に対してＰＫ２を投与する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
動物の概日リズムを変えることで、非２４時間型睡眠・覚醒症候群、時間帯急変症候群、交代制勤務性症候群、睡眠相後退症候群、睡眠相前進症候群、不規則型睡眠・覚醒パターン症候群、振幅の減少に関連した症候群、および季節性感情障害から選択される状態を改善する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
ＰＫ２レセプターアンタゴニストが投与される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記アンタゴニストが前記動物の睡眠を促進する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＰＫ２レセプターが投与される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記アンタゴニストが前記動物の覚醒を促進する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記動物が哺乳類である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記哺乳類が、ヒト、非ヒト霊長類、ラット、およびマウスから選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
検出可能に標識されたＰＫ２と単離マウスＰＫ２レセプターとを含む組成物。
【請求項３４】
前記マウスＰＫ２レセプターが配列番号４として参照されるアミノ酸配列を含む、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記検出可能に標識されたＰＫ２が放射標識ＰＫ２である、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３６】
異種ヌクレオチド配列に作動可能に結合したＰＫ２遺伝子プロモーターを含む、単離核酸。
【請求項３７】
前記ＰＫ２遺伝子プロモーターが配列番号１４、１５、１６、１７、または１８から選択される核酸配列を含む、請求項３６に記載の単離核酸。
【請求項３８】
請求項３６に記載の単離された核酸であって、前記異種ヌクレオチド配列が、レポーター核酸である、核酸。
【請求項３９】
請求項３６に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項４０】
請求項３６に記載の核酸を含む、組み換え細胞。
【請求項４１】
配列番号１４として参照される核酸配列に対して特異的にハイブリダイズすることが可能な少なくとも１７ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド。
【請求項４２】
(ａ）ＰＫ２遺伝子プロモーター活性化に応答してレポーター核酸が所定のシグナルを生成する条件下で、前記レポーター核酸に作動可能に結合したＰＫ２遺伝子プロモーターを含む単離核酸を、一種類以上の候補化合物を接触させる工程と、（ｂ）前記シグナルの生成を変える化合物を同定する工程と、（ｃ）前記化合物を与える工程と、（ｄ）概日リズム機能の１つ以上の特徴を調節する該化合物の能力を測定する工程とを包含し、概日リズムの１つ以上の特徴を調節する化合物を、概日リズムを調節する化合物として同定する、概日リズムを調節する化合物を同定する方法。
【請求項４３】
前記ＰＫ２遺伝子プロモーターが配列番号１４、１５、１６、１７、１８、および１９から選択された核酸配列を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記工程（ａ）が、前記ヒトＰＫ２遺伝子プロモーターをＣＬＯＣＫとＢＭＡＬ１とのヘテロ複合体に接触させることで前記ヒトＰＫ２遺伝子プロモーターを活性化させることをさらに有する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
異種ヌクレオチド配列に作動可能に結合したＰＫ２遺伝子プロモーターを含む単離核酸を動物に導入する工程を包含する、該動物の核酸分子を光制御発現する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国国立衛生研究所からの研究助成番号ＮＩＭＨ５７８８９による政府の支援によりなされた。米国政府は、この発明に対して一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
(発明の背景）
生命の日周リズムは、細菌からヒトに至る生物では概日時計（体内時計）によって維持される。概日時計によって時間が保たれることで、日周的環境変動に対して生物が生理学的に反応し、該変動に対する生物の行動が影響を受ける。ヒトでは、概日リズムは私たちの外界との相互作用と同様に私たちの体内機能（例えば、睡眠）のタイミングを調整する手助けをする。実質的に、既知の生理学的パラメータおよび細胞内活性の全てが身体の概日リズムの影響を受けている。
【０００３】
ごく最近になって、医学界や一般の人々がヒトの健康、安全性、能力、および生産性にとって概日リズムが重要であることに気がつきはじめた。現在、肉体的および精神的欠陥が、先進工業国労働人口の２０％を上回る夜の仕事と関係していることが分かっている。深夜シフトで働く人々は、眠り込んだり、眠ったままでいたり、あるいは起きたままであるという問題をしばしば抱えている。２，５００万を上回る米国人が非伝統的な作業スケジュールを持っており、これらの人々の６０乃至７０パーセントが慢性不眠症を抱えていると推定される。また、多くの産業において２４時間体制で働く労働者の採用が増加している（例えば、輸送、公共事業、公衆安全、重工業、および多くのサービス産業）。
【０００４】
正常な睡眠は、適切に機能している概日リズムに依存する。ヒトでは、睡眠時間が必要とされる時間よりも少ない場合、特にそれが数夜にわたる場合、新規情報の保持力が減少し、生産性が損なわれ、気分が変わり、感染に対する抵抗性が減少し、さらに事故が起こりやすくなる。睡眠関連の交通事故は毎年何千もの生命を奪い、さらに操縦者の疲労もまた飛行機墜落および他の破局的な事故の一因となることが示されている。
【０００５】
製薬産業は、現在薬物送達のタイミングに関する概日リズムの重要性について研究されており、農業用植物および動物と同様に、ヒトの概日リズムに影響を及ぼす薬物の開発に関心がもたれている。最近、数多くの健康上の問題（ある種のうつ病形態、多様な睡眠障害、神経障害、心血管障害、および内分泌障害等）が概日リズム障害に関連していることが知られている。
【０００６】
また、世界中の他の国々と同様に、米国の人口に占める年配者の割合がますます高まるにつれて、種々の睡眠、精神、および身体的な障害を患う老人で日周期異常のよりいっそうの増加が観察されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
（要旨）
したがって、概日リズムに関連した分子を同定すること、および概日リズムの調節に使用することができる新規治療薬を同定するための方法が求められている。本発明は、これらの要求を満たすとともに、関連した利点を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、概日リズムを調節するための化合物をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、（ａ）プロキネチシン２（ＰＫ２）レセプターアンタゴニストまたはアゴニストである化合物を与え、（ｂ）概日リズム機能の１つ以上の特徴（ｉｎｄｉｃｉａ）を調節する化合物の能力を測定することで、概日リズム機能の１つ以上の特徴を調節する化合物を概日リズムを調節する化合物として同定する。
【０００９】
一実施形態では、上記与えられたＰＫ２レセプターアンタゴニストの同定は、ＰＫ２が所定のシグナルを高める条件下でＰＫ２レセプターおよびＰＫ１レセプターから選択されるレセプターと１種類以上の候補化合物とを接触させ、さらに上記所定のシグナルを減少させる化合物を同定することで、おこなうことができる。
【００１０】
別の実施形態では、上記与えられたＰＫ２レセプターアゴニストの同定は、ＰＫ２レセプターおよびＰＫ１レセプターから選択されるレセプターと１種類以上の候補化合物とを接触させ、さらに上記所定のシグナル（例えばカルシウム・イオン動員（カルシウム・イオンの移動））を高める化合物を同定することで、おこなうことができる。
【００１１】
さらなる実施形態では、上記与えられたＰＫ２レセプターアンタゴニストの同定は、レセプターアゴニストの存在下で、ＰＫ２レセプターおよびＰＫ１レセプターから選択されるレセプターと１種類以上の候補化合物とを、上記アゴニストが上記選択されたレセプターと結合する条件下で接触させ、さらに上記結合を減少させる化合物を同定することで、おこなうことができる。
【００１２】
さらに別の実施形態では、上記与えられたＰＫ２レセプターアゴニストの胴体は、ＰＫ２レセプターおよびＰＫ１レセプターから選択されるレセプターと１種類以上の候補化合物とを、ＰＫ２が選択されたレセプターと結合する条件下で接触させ、さらに上記選択されたレセプターに結合して活性化させる化合物を同定することで、おこなうことができる。
【００１３】
本発明は、動物の概日リズムを調整する方法も提供する。この方法は、有効量のＰＫ２レセプターアンタゴニストまたはＰＫ２レセプターアゴニスト、例えばＰＫ２、ＰＫ１、または化合物を動物に投与することを含む。そのような処置は、概日リズム障害（例えば、睡眠／覚醒リズムおよび季節障害）の改善に使用することができる。ＰＫ２レセプターアゴニストまたはＰＫ２レセプターアンタゴニストによる治療を有益におこなうことができる典型的な条件として、非２４時間型睡眠・覚醒症候群、時間帯急変症候群（Ｒａｐｉｄ  ｔｉｍｅ  ｚｏｎｅ  ｃｈａｎｇｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、交代制勤務性症候群（Ｗｏｒｋ  ｓｈｉｆｔ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、睡眠相後退症候群、進行睡眠期症候群、不規則睡眠・覚醒パターン症候群、減少した振幅に伴う症候群を含む。加えて、季節性感情障害等の季節性障害の治療は、ＰＫ２レセプターアゴニストまたはＰＫ２レセプターアンタゴニストで有益におこなうことができる。
【００１４】
本発明は、概日リズムを修正するための化合物を同定するための別のものを提供する。この方法は、（ａ）レポーター核酸に作動可能に結合したＰＫ２遺伝子プロモーターを含む単離核酸に、上記レポーター核酸がＰＫ２遺伝子プロモーター活性化に応答して所定のシグナルを生成する条件下で、１種類以上の候補化合物を接触させ、（ｂ）上記シグナルの生成を変える化合物を同定し、（ｃ）上記化合物を提供し、さらに（ｄ）上記化合物が概日リズム機能の１つ以上の特徴を調節する上記化合物の能力を決定することを含み、概日リズム機能の１つ以上の特徴を調節する化合物が、概日リズムを調節する化合物として同定される。
【００１５】
本発明は、検出可能に標識されたＰＫ２と単離マウスＰＫ２レセプターとを含む組成物も提供する。
【００１６】
本発明によってさらに提供されるものは、レポーター配列等の異種ヌクレオチド配列に作動可能に結合したＰＫ２遺伝子プロモーターを含む単離核酸である。一実施形態では、本発明は動物が有する核酸分子の光誘導発現のためのＰＫ２遺伝子プロモーターを用いる方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
(発明の詳細な説明）
本発明は、視交叉上核（ＳＣＮ）内でのプロキネチシン２（ＰＫ２）遺伝子発現が概日様式で発振することの判断とＰＫ２レセプター活性がラットの概日リズムを調節するという観察とに関する。
【００１８】
概日リズムは、生理的、内分泌的、および行動的プロセスが適当なタイミングで協調することによって、生物学的効率を最適化する。概日リズムは、すくなくとも３つの要素、すなわち（ａ）概日ペースメーカー（時計）に環境情報を中継する入力経路、（ｂ）発振を起こす概日ペースメーカー、および（ｃ）ペースメーカーが種々の出力リズムを制御する出力経路を含むと考えられる。哺乳類では、マスター概日ペースメーカーが視床下部前部の視神経交叉上核（ＳＣＮ）に存在する（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ:Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ.Ｐｒｅｓｓ.ｐｐ.４６７(１９９１））。環境明暗周期は、網膜視床下部投影を介してＳＣＮ時計を１日２４時間に同調または同期させる入力シグナルである（Ｍｏｏｒｅ，Ａｎｎ.Ｒｅｖ.Ｍｅｄ.４８：２５３−６６(１９９７））。ＳＣＮ内での細胞自律性概日時計の同期は、生理および行動の概日制御を媒介する協調された出力（シグナル伝達経路）に至る。
【００１９】
本明細書に開示されるように、プロキネチン２（ＰＫ２）は概日リズムを伝達するＳＣＮ出力分子である。ＰＫ２に対するこの役割は、ＰＫ２がＳＣＮ内で発振的な様式で発現されること（実施例Ｉを参照せよ）、ＰＫ２の生産および／または放出がコア時計遺伝子（実施例ＩＩおよびＩＩＩを参照せよ）によって調節されること、ＰＫ２の生産または放出が光り同調に応答すること（実施例ＩＶを参照せよ）、ＰＫ２レセプターがプライマリＳＣＮ出力標的エリアにてＰＫ２レセプターで発現されること（実施例Ｖを参照せよ）、ＰＫ２の投与が概日行動で変化すること（実施例ＶＩを参照せよ）、さらにＳＣＮでのＰＫ２リズム出力が光りによって制御されることを観察する（実施例ＶＩＩＩを参照せよ）。
【００２０】
特に、本発明者らは、正常明暗周期のみならず恒暗下、ＳＣＮでのＰＫ２遺伝子発現が概日様式で発振することを明らかにした。ＳＣＮ内でのＰＫ２ｍＲＮＡの発振振幅は非常に高く、ピーク値（日中）を有し、また少なくとも５０倍まで異なる谷値（夜間）を有する。ＳＣＮのＰＫ２発振の大きさは他の既知時計または時計制御遺伝子よりも高く、該遺伝子として、ｍＰｅｒｓ、ｍＣｒｙｓ、  および  Ｂｍａｌ(Ｃｅｒｍａｋｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ.２０：３９６７−７４(２００１）;Ａｌｂｒｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ９１：１０５５−６４(１９９７）;Ｔｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８９：５１２−１６(１９９７）;Ｍｉｙａｍｏｔｏ  ａｎｄ  Ｓａｎｃａｒ，Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ  ９５：６０９７−１０２(１９９８）；および  Ｚｙｌｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  ２０：１１０３−１０(１９９８））挙げられる。ＰＫ２自体の転写上でのＰＫ２の観察された正のフィードバックがＰＫ２ｍＲＮＡの振幅を高くすることがわかった（実施例ＩＩを参照せよ）。クリプトクロームおよびクロックＩが欠損した突然変異体マウスのインビトロ転写アッセイおよび分析の両方（それぞれ実施例ＩＩおよびＩＩＩを参照せよ）が、ＰＫ２が時計制御遺伝子であることを示す。
【００２１】
ＰＫ２転写は、５’−フランキング領域内でＥボックス・エンハンサーを介してＣＬＯＣＫおよびＢＭＡＬ１ヘテロダイマーによって、活性化され、さらにこの転写促進もまたｍＰＥＲ１、ｍＰＥＲ２、ｍＰＥＲ３、ｍＣＲＹ１、および  ｍＣＲＹ２を含む中枢時計仕掛け（ｃｅｎｔｒａｌ  ｃｌｏｃｋｗｏｒｋ）の負の四肢の構成要素（ｔｈｅ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｌｉｍｂ）によっても阻害される。５’−フランキング領域でのＥボックス・エンハンサーの構成およびＳＣＮでのＰＫ２発振プロフィルは、ｍｐｅｒ１のものと最も類似している（Ａｌｂｒｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ９１：１０５５−６４(１９９７）;ａｎｄ  Ｔｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８９：５１２−１６(１９９７））。光パルス実験によって、ＳＣＮのＰＫ２リズムが光同調（実施例ＩＶを参照せよ）に反応し、明暗周期の急変および明期の変化がＰＫ２発現を変えることが示される（実施例ＶＩＩＩおよびＩＸを参照せよ）。ｍＰｅｒ１およびｍＰｅｒ２（Ａｌｂｒｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ９１：１０５５−６４(１９９７）;Ｔｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８９：５１２−１６(１９９７）;ａｎｄ  Ｚｙｌｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  ２０：１１０３−１０(１９９８））と同様に、ＰＫ２は、主観的夜の間だけ光誘導に反応する。夜早くまたは夜遅く伝達された光パルスによって、ＳＣＮのＰＫ２リズムの遅延または促進が生ずる。これらの光誘導によるＰＫ２リズムの変化は、行動リズムの変位に一致する（Ｄａａｎ  ａｎｄ  Ｐｉｔｔｅｎｄｒｉｇｈ，Ｊ.Ｃｏｍｐ.Ｐｈｙｓｉｏｌ.１０６：２５３−２６６(１９７６）;ａｎｄ  Ｒｏｅｎｎｅｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｆｏｓｔｅｒ，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ.Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ.６６：５４９−５６１(１９９７））。
【００２２】
実施例ＶＩに示すように、ラットにＰＫ２を投与することで、ＰＫ２がＳＣＮの自発運動リズムを伝達する出力分子であることの直接的証拠が得られる。特に、実施例ＶＩは、主観的夜の間にＰＫ２をＩＣＶ投与することで、極端な夜行性ホイール・ランニング行動が抑制されたことを示す。これらの行動研究は、ＳＣＮ出力経路の主要一次標的領域内でのＰＫＲ２ｍＲＮＡ分布と整合性がある(Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ:Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ.Ｐｒｅｓｓ.４６７  ｐｐ.（１９９１）;Ｍｏｏｒｅ，Ａｎｎ.Ｒｅｖ.Ｍｅｄ.４８：２５３−６６(１９９７）;Ｓｏｆｒｏｎｉｅｗ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｄｌ，Ａｍｅｒ.Ｊ.Ａｎａｔ.１５３：３９１−４２９(１９７８）;Ｗａｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ.Ｃｏｍｐ.Ｎｅｕｒｏｌ.２５８：２０４−２９(１９８７）;Ｗａｔｔｓ  ａｎｄ  Ｓｗａｎｓｏｎ，Ｊ.Ｃｏｍｐ.Ｎｅｕｒｏｌ.２５８：２３０−５２(１９８７）;Ｌｅａｋ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ，Ｊ.Ｃｏｍｐ.Ｎｅｕｒｏｌ.４３３：３１２−３４(２００１）;およびＢｕｉｊｓ，Ｐｒｏｇ.Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ.１１１：２２９−４０，（１９９６））。
【００２３】
ＰＫ２は、Ｇタンパク質結合レセプター（ＰＫＲ２）に対するポリペプチド・リガンドである。このレセプターにＰＫ２が結合することで該レセプターが活性化し、細胞機能の変更をもたらす分子事像のカスケードが誘発される。そのような細胞機能の変化によって、細胞応答、生理応答、内分泌応答、行動応答等、ＰＫ２処理した動物で観察される応答が生ずる。したがって、ＰＫ２レセプターアゴニストまたはアンタゴニストを動物に与えて、ＰＫ２誘導反応を変え、有利に概日リズムを調節することができる。
【００２４】
このような、概日リズムを制御する上でＰＫ２およびＰＫ２レセプターの重要な薬理学的役割の決定にもとづいて、本発明は、概日リズムを変調する化合物を同定（例えば、ＰＫ２発現またはＰＫ２レセプター活性を調節することで）するための方法を提供する。典型的なＰＫ２レセプター活性を調節する化合物がＰＫ２レセプターアゴニストおよびアンタゴニストである。本発明の方法を用いて同定された化合物を、概日リズム障害の治療のために概日リズムの調節に用いることができる。
【００２５】
本発明は、概日リズムを変調する化合物を同定する方法を提供する。この方法は、（ａ）プロキネチシン２（ＰＫ２）レセプターアンタゴニストまたはアゴニストである化合物を与える工程と、（ｂ）概日リズム機能の１つ以上の特徴を調節する上記化合物の能力を測定する工程とを包含し、概日リズムの１つ以上の特徴を調節する化合物を、概日リズムを調節する化合物として同定する。
【００２６】
本発明の方法は、２４時間周期以外の周期を持つ生物学的周期性を調節するのに有用な化合物を同定することにも用いられる。例えば、ＰＫ２レセプターの活性化は、２４時間よりも短い周期性（超概日性リズム）または２４時間よりも長い周期性（インフラディア・リズム（ｉｎｆａｒｄｉａｎ  ｒｈｙｔｈｍ））を持つ生物学的リズムを調節することができる。典型的な超概日性リズムは、夢想、導尿、および空腹である。典型的なインフラディア・リズムとして、交尾のための動物の雄に対する雌の受容性発現頻度（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆ  ｒｅｃｅｐｔｉｖｉｔｙ）が挙げられる。
【００２７】
本明細書で用いられるように、「概日リズム（ｃｉｒｃａｄｉａｎ  ｒｈｙｔｈｍ）」という用語は、約２４時間にわたって起こる生理的および行動的パラメータの規則的変動を意味する。
【００２８】
本明細書で用いられるように、概日リズムに関連して用いられる場合の「調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ）」という用語は、動物の概日タイミング・システムによって調整される生理的機能、内分泌機能、または行動を変えること、もしくは概日リズム性を発現する細胞機能を変えることを意味する。動物の日周期タイミング・システムによって調整される典型的な生理学的な機能として、体温、自律神経の調節、新陳代謝、および睡眠・覚醒周期が挙げられる。動物の日周期タイミング・システムによって調整される典型的な内分泌機能として、松果体、メラトニン分泌、ＡＣＴＨ−コルチゾール分泌、胸腺刺激ホルモン分泌、成長ホルモン分泌、神経ペプチドＹ分泌、セロトニン分泌、インスリン様増殖因子Ｉ型分泌、副腎皮質刺激ホルモン分泌、プロラクチン分泌、γ−アミノブチル酸分泌、およびカテコールアミン分泌が挙げられる。動物の日周期タイミング・システムによって調整される典型的な行動は、運動（自発運動リズム）、賢さ、記憶、感覚運動統合、および情緒が挙げられる。概日周期性を示す典型的な細胞機能として、ニューロン発射と遺伝子発現の転写制御とがある。
【００２９】
該日リズムを調節する化合物をスクリーニングするための本発明の方法は、ＰＫ２レセプターアンタゴニストまたはＰＫ２レセプターアゴニストを与えることを含む。ＰＫ２レセプターアンタゴニストまたはＰＫ２レセプターアゴニストを、概日リズム機能について観察可能な指標（ｉｎｄｅｘ）を少なくとも１つ持つ細胞調製物、組織、器官、生物、または動物に対して、与えることができる。概日リズムを調整するＰＫ２レセプターアンタゴニストまたはＰＫ２レセプターアゴニストの能力は、概日リズム機能の特徴を示す種々の動物種とともに、そのような動物から得られた器官、組織、および細胞、さらにそれらに由来するサンプルで試験することができる。与えられたＰＫ２レセプターアンタゴニストまたはＰＫ２レセプターアゴニストは、既知のＰＫ２レセプターアンタゴニストまたはＰＫ２レセプターアゴニスト、例えばＰＫ２、ＰＫ１、またはＰＫ２／ＰＫ１キメラであるか、もしくは本明細書に記載のインビトロスクリーニング法を用いてＰＫ２レセプターアンタゴニストまたはＰＫ２レセプターアゴニストとして同定された化合物である。
【００３０】
種々のインビトロスクリーニング方法は、概日リズムを調整する化合物を同定するための本発明の方法で与えられるＰＫ２レセプターアンタゴニストまたはＰＫ２レセプターアゴニストの同定に有用である。ＰＫ２レセプターを調節する化合物の能力は、例えば、該化合物がＰＫ２レセプターに結合して活性化させる能力、ＰＫ２レセプターにアゴニストが結合するのをブロックする能力、ＰＫ２レセプターにより生じた所定のシグナルを促進させる能力、あるいはＰＫ２レセプターにより生じた所定のシグナルを減少させる能力を、示すことができる。したがって、シグナル伝達および結合アッセイを用いて、概日リズムを調節する化合物を同定するための本発明の方法で与えられるＰＫ２レセプターアンタゴニストまたはＰＫ２レセプターアゴニストの同定に用いることができる。
【００３１】
ＰＫ２レセプターアンタゴニストまたはＰＫ２レセプターアゴニストを同定するために用いられるシグナル伝達または結合アッセイは、ＰＫ２レセプターまたはＰＫ１レセプターを含むことができる。アミノ酸配列が約８５％同一であるＰＫ２レセプターとＰＫ１レセプターとの相同性から、ＰＫ２レセプターまたはＰＫ１レセプターは、ＰＫ２アゴニストを同定するスクリーニング・アッセイで使用することができる。特に、ＰＫ１レセプターとＰＫ２レセプターとの相同性により、ＰＫ１レセプターアゴニストまたはアンタゴニストは、ＰＫ２レセプターアゴニストまたはアンタゴニストとして機能しうる。同様に、ＰＫ１またはＰＫ２のいずれかが、拮抗的アゴニストを用いるシグナル伝達および結合アッセイ形態でのアゴニストとして機能することができる。
【００３２】
シグナル伝達アッセイを用いてＰＫ２レセプターアンタゴニストまたはＰＫ２レセプターアゴニストを同定する場合、本発明の方法は、ＰＫ１レセプターまたはＰＫ２レセプターを、ＰＫ２が所定のシグナルを高める条件下で、１種類以上の候補化合物と接触させ、上記所定のシグナルを減少または増加させる化合物を同定することを含むことができる。結合アッセイを用いてＰＫ２レセプターアンタゴニストまたはＰＫ２レセプターアゴニストを同定する場合、本発明の方法は、ＰＫ１レセプターまたはＰＫ２レセプターを、ＰＫ２がＰＫ２レセプターに結合する条件下で、１種類以上の候補化合物と接触させ、ＰＫ１レセプターまたはＰＫ２レセプターに対するＰＫ２レセプターアゴニストの結合を減少させるか、もしくはＰＫ１レセプターまたはＰＫ２レセプターに結合して活性化させる化合物を同定することを含むことができる。
【００３３】
本発明のスクリーニング方法で使用されるＰＫ２レセプターを、例えば、細胞調製物に存在する天然のレセプターまたは組み換え技術により生成されたレセプターを含むマウスまたはヒトＰＫ２レセプターとすることができる。本明細書で使用されるように、「マウスＰＫ２レセプター」という用語は、本明細書で用いられるように、「マウスＰＫ２レセプター」という用語は、ＰＫ２に応答したＧタンパク質共役シグナル伝達経路を介してＰＫ２およびシグナルに結合するマウスＰＫ２レセプターのアミノ酸配列もしくは天然または人工的な軽い修飾を加えたアミノ酸配列を含むヘプタヘリカル膜貫通Ｇタンパク質共役レセプターを意味する。ＰＫ２レセプターもまた、ＰＫ１に結合してＰＫ２レセプターシグナル伝達を誘導することができる。本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を有し、かつ配列番号１のヌクレオチド配列によってコードされるマウスＰＫ２レセプターを提供する。また、本発明はＰＫ１またはＰＫ２の存在下でマウスＰＫ２レセプターを含むスクリーニング組成物も提供する。
【００３４】
同様に、本発明のスクリーニング方法で用いられるＰＫ１レセプターは、例えば、マウスまたはヒトＰＫ１レセプターであり、細胞調製物に存在する天然のレセプターまたは組み換えにより生じたレセプターが挙げられる。本明細書で用いられるように、「マウスＰＫ１レセプター」という用語は、ＰＫ１またはＰＫ２に応答したＧタンパク質共役シグナル伝達経路を介してＰＫ１またはＰＫ２およびシグナルに結合するマウスＰＫ１レセプターのアミノ酸配列もしくは天然または人工的な軽い修飾を加えたアミノ酸配列を含むヘプタヘリカル膜貫通Ｇタンパク質共役レセプターを意味する。典型的なマウスＰＫ１レセプターは、配列番号４のアミノ酸配列を有し、かつ配列番号３のヌクレオチド配列によってコードされる。
【００３５】
配列番号２または４の配列に軽い修飾を加えたものは、天然ポリペプチド配列に対して天然または非天然アミノ酸の１つ以上の付加、欠失、または置換を持つことができる。そのような修飾は、例えば、置換アミノ酸が類似の構造的または化学的特性を有する保守的変化、例えば別の無極性アミノ酸による無極性アミノ酸の置換（例えば、イソロイシンによるロイシンの置換）である。そのような修飾もまた、非保守的変化であり、所望の生物学的活性、例えば無極性Ｒ基を持つアミノ酸(例えば、トリプトファンによるグリシンの置換）による非帯電極性Ｒ基を持つアミノ酸の置換に対して悪影響が与えられるように、置換アミノ酸は、十分な類似性がある異なる構造的または化学的特性を有する。さらに、配列番号２または４のマウスＰＫ２レセプターアミノ酸配列の軽い修飾は、非天然アミノ酸である対応のＤ型アミノ酸によるＬ型アミノ酸の置換である。
【００３６】
さらに、配列番号２または３の軽い修飾は、ポリペプチドに対する化学的または酵素的修飾であり、例えばアルキル、アシル、またはアミノ基による水素の置換、適当なアルキルまたはアリールによるカルボキシル基のエステル化、ヒドロキシル基のアルキル化によるエーテル誘導体の形成、セリンのリン酸化または脱リン酸化、スレオニンまたはチロシン残基、もしくはＮまたはＯ結合グリコシル化である。
【００３７】
当業者は、ネイティブ・マウスＰＫ２レセプター配列またはＰＫ１レセプター配列に対する軽い修飾が有利かどうか決定することができる。例えば、そのような修飾は、マウスＰＫ２レセプターまたはＰＫ１レセプターの安定性、生物学的利用能、または生物活性を高めるために、おこなうことができる。修飾マウスＰＫ２レセプターまたはＰＫ１レセプターポリペプチドを、例えば、組み換え方法によって、合成方法によって、合成後の化学または酵素方法によって、もしくはこれらの方法の組み合わせによって調製し、ＰＫ２またはＰＫ１に対する結合能力もしくはＧタンパク質共役シグナル伝達経路を介したシグナルを試験することができる。
【００３８】
当業者は、Ｇタンパク質共役シグナル伝達経路を介したシグナル伝達またはＰＫ２結合を消滅することなしに修飾することができるマウスＰＫ２レセプターまたはＰＫ１レセプターアミノ酸配列の領域を決定することができる。構造および配列に関する情報を用いて、ＰＫ２レセプターまたはＰＫ１レセプター活性にとって重要なアミノ酸残基の決定をおこなうことができる。例えば、ＰＫ２レセプターまたはＰＫ１レセプター配列のアミノ酸配列を異なる種のものと比較することで、活性を損なうことなく変化させることができるアミノ酸残基を決定する際のガイダンスを提供することができる。
【００３９】
さらに、多数の公開されたＧＰＣＲ構造−機能研究によって、リガンド相互作用、Ｇタンパク質カップリングおよび膜貫通領域、さらに修飾に対して寛容な表示領域に関与するＧＰＣＲの領域が示されている（例えば、Ｂｕｒｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ．，２７３（３８）：２４３２２−７(１９９８)および  Ｂｕｒｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７（１２)４０５２−８(１９９８）を参照せよ）。さらに、当業者に公知のコンピュータ・プログラムを用いて、活性を損なうことなく上記のように修飾されうるマウスＰＫ２レセプター等のＧＰＣＲアミノ酸残基がどれかを決定する際に用いることができる（例えば、Ｅｒｏｓｈｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ.Ａｐｐｌ.Ｂｉｏｓｃｉ.９：４９１−４９７(１９９３）を参照せよ）。
【００４０】
本明細書で使用されるように、「ＰＫ２レセプターアゴニスト」という用語は、ＰＫ２レセプターを介して正常なシグナル伝達を選択的に促進または高める化合物を意味する。ＰＫ２レセプターは、任意のアゴニスト的機能によって、例えば正常ＰＫ２結合部位でＰＫ２レセプターに結合することによって作用することができ、それによってＰＫ２レセプターシグナル伝達が促進される。ＰＫ２レセプターアゴニストも、例えば、ＰＫ２の結合活性またはＰＫ２レセプターのシグナル伝達活性を増強することで、作用することができる。ＰＫ２レセプターアゴニストもまたＰＫ１レセプターアゴニストである。それによって、ＰＫ１レセプターは、本明細書に記載したスクリーニング方法を用いて、ＰＫ２レセプターアゴニストとして機能する能力が調べられる。
【００４１】
ＰＫ２レセプターアゴニストの具体例として、配列番号５および６のヒトＰＫ２アミノ酸配列、配列番号７および８のマウスＰＫ２アミノ酸配列、配列番号９のヒトＰＫ１アミノ酸配列、配列番号１０のマウスＰＫ１アミノ酸配列、配列番号１２のヒキガエルＢｖ８アミノ酸配列、配列番号１１のカエルＢｖ８アミノ酸配列、およびヘビＭＩＴ１（配列番号１３）が挙げられる。主要ヒトＰＫ２アミノ酸配列が配列番号５として示されるものであり、一方配列番号６として示されるＰＫ２アミノ酸配列が少なくとも精巣で発現される組織特異的なＰＫ２アミノ酸配列である。同様に、主要マウスＰＫ２アミノ酸配列が配列番号７として示されるものである場合、配列番号８として示されるＰＫ２アミノ酸配列が、少ない頻度で発現されたＰＫ２アミノ酸配列である。
【００４２】
ＰＫ２レセプターアゴニストは、ＰＫ２レセプターに結合して活性化させることが可能なＰＫ２またはＰＫ１の修飾を含むことができる。そのような修飾は、例えば、列挙したアミノ酸配列と比較した１つ以上の付加、欠失、または置換；ポリペプチドに対する１つ以上の化学的または酵素的修飾；または対応のＤ型アミノ酸による１つ以上のＬ型アミノ酸の置換である。
【００４３】
ＰＫ２レセプターアゴニストは、ＰＫ１およびＰＫ２遺伝子によってコードされるアミノ酸配列キメラ・ポリペプチドを含むことができる。典型的なＰＫ２レセプターアゴニストとして、ＰＫ１のエクソン１および２とＰＫ２のエクソン３とによってコードされるキメラ・ポリペプチド（配列番号２０）と、ＰＫ２のエクソン１および２とＰＫ１のエクソン３とによってコードされるキメラ・ポリペプチド（配列番号２１）とが挙げられる。また、ＰＫ２レセプターアゴニストとして、ナノモル濃度でＰＫ２レセプターを介してシグナル伝達を活性化する他の天然または合成環状ペプチドが挙げられる。
【００４４】
ＰＫ２またはＰＫ１のアミノ酸残基を修飾する一方で活性を保持するガイダンスは、哺乳類または非哺乳類脊椎動物種由来の対応ＰＫ２またはＰＫ１配列との比較によって、与えることができる。図１０は、マウスおよびヒト由来のＰＫ１、マウスおよびヒト由来のＰＫ２、ならびにカエル、ヒキガエル（Ｂｖ８）、およびヘビ（ＭＩＴ１）由来のＰＫ１およびＰＫ２遺伝子を示すオーソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）のアミノ酸配列の比較を提供する。進化的に保存されたアミノ酸残基およびドメインが、あまり保存されていない残基およびドメインよりも生物学的活性を維持する上で、重要である可能性が高いことが当業者によく知られている。したがって、哺乳類プロキネチシンおよび脊椎動物オーソログのあいだで高度に保存された残基、例えばＮ末端配列、または１０個の保存されたシステインのいずれかが置換されると予想され、保存が劣る残基、例えばＣ末端残基の置換は許容しうる。
【００４５】
本明細書で使用されるように、「ＰＫ２レセプターアンタゴニスト」とう用語は、ＰＫ２レセプターを介して正常なシグナル伝達を選択的に阻害または減少させる化合物を意味する。ＰＫ２レセプターアンタゴニストは、任意のアンタゴニスト的機構によって、例えばＰＫ２レセプターまたはＰＫ２の結合によって作用し、それによってＰＫ２とＰＫ２レセプターとの結合を阻害する。そのような特異的または非特異的ＰＫ２レセプターアゴニストは、例えば、ＰＫ２レセプターを介してシグナル伝達を促進させることで望ましくない副作用が生ずる薬物である。ＰＫ２レセプターアンタゴニストもまた、例えば、ＰＫ２の結合活性またはＰＫ２レセプターのシグナル伝達活性を阻害することによって、作用する。例えば、ＰＫ２レセプターアンタゴニストもまた、ＰＫ２レセプターのリン酸化またはグリコシル化の状態を変えることで、作用する。ＰＫ２レセプターアンタゴニストもまた、構成的ＰＫ２レセプターシグナル伝達活性の基線量からのＰＫ２レセプターシグナル伝達を減少させる逆のアゴニストである。
【００４６】
本明細書で用いられるように、「所定のシグナル」という用語は、ＰＫ２レセプターを介してＧタンパク質依存シグナル伝達の定性的または定量的表示である任意の分析手段によって検出可能な読み出しを意味する。ＰＫ２レセプターを介したＧタンパク質依存シグナル伝達の定性的または定量的活性化を決定するために使用されるアッセイは、「シグナル伝達アッセイ」として以下を参照する。Ｇタンパク質またはヘテロトリメリックＧＴＰ結合タンパク質は、７つの膜貫通型細胞表面レセプターに結合したＧα、Ｇβ、およびＧγと指定されたサブユニットを持つシグナル伝達ポリペプチドである。Ｇタンパク質は、種々の細胞外刺激、例えば光、神経伝達物質、ホルモン、および着臭剤を、種々の細胞内エフェクター・タンパク質へ伝達する。Ｇタンパク質は、哺乳類、他の脊椎動物、または他の脊椎動物、すなわちハエおよび酵母を真核生物および原核生物の両方に存在する。
【００４７】
候補化合物がＰＫ２レセプターアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを決定するために、シグナル伝達アッセイをおこなうことができる。そのようなアッセイで、ＰＫ２レセプターは、ＰＫ２レセプターがＰＫ２アゴニストに応答して所定のシグナルを生成する条件下で１種類以上の候補化合物、例えばＰＫ２と接触する。ＰＫ２レセプター活性に応答して、所定のシグナルは、未刺激ＰＫ２レセプター基線から増加または減少することができる。所定のシグナルは増加シグナルであり、例えば、検出された第２メッセンジャーの量がＰＫ２レセプター活性化に応答して増加する。所定のシグナルは、減少シグナルであり、例えば、検出可能な第２のメッセンジャーが、例えばＰＫ２レセプター活性化に応答して、加水分解によって、検出された第２のメッセンジャー分子が破壊される。したがって、ＰＫ２レセプター活性に応答する所定のシグナルは、増加したＰＫ２レセプター活性と相関する所定のシグナルの増加または増加したＰＫ２レセプター活性と相関する所定のシグナルの減少である。したがって、ＰＫ２レセプターシグナル伝達は、所定のシグナルの生成を促進するＰＫ２レセプターアゴニストを同定するために使用することができる。ＰＫ２レセプター活性と正の相関がある所定のシグナルを増加させ、あるいはＰＫ２レセプター活性と負の相関がある所定のシグナルを減少させる。同様に、シグナル伝達アッセイは、候補化合物がＰＫ２レセプターアゴニストであうかどうかを決定することができる。そのようなシグナル伝達アッセイでは、ＰＫ２レセプターが、ＰＫ２レセプターアゴニスト（例えばＰＫ２）に応答して所定のシグナルを生成するＰＫ２レセプターである条件下で、１種類以上の候補化合物と接触し、上記所定のシグナルの生成を減少させる化合物が同定される。
【００４８】
Ｇタンパク質を介したシグナル伝達は、アラキドン酸、アセチルコリン、ジアシルグリセロール、ｃＧＭＰ、ｃＡＭＰ、イノシトールリン酸（例えばイノシトール−１，４，５−三リン酸エステル）、Ｃａ＋＋イオンを含むイオン;変えられた細胞膜電位;ＧＴＰ加水分解;アミノ酸の流入または流出;細胞内タンパク質リン酸エステル化の増減;または転写の活性化等、第２のメッセンジャーの増加または減少生産もしくは遊離をもたらすことができる。
【００４９】
Ｇタンパク質共役シグナル伝達経路の変化を同定する種々のアッセイ（例えば、高スループット自動化スクリーニング・アッセイ）が当該技術分野において周知である。Ｃａ＋＋、ｃＡＭＰ、電圧変化、および遺伝子発現を測定する種々のスクリーニング・アッセイが概説されている（例えば、Ｇｏｎｚａｌｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ.Ｏｐｉｎ.ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ.９：６２４−６３１(１９９８）;Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ.Ｏｐｉｎ.Ｂｉｏｔｅｃｈ.８：６２９−６３４(１９９７）;およびＣｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.２７０：２４２４−２４８(１９９９））。Ｇタンパク質共役レセプターの薬物標的を高スループット・スクリーニングするための酵母細胞をベースとしたバイオアッセイが、例えばＰａｕｓｃｈ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ.１５：４８７−４９４(１９９７）に記載されている。種々の細胞に基づく発現系として、Ｇタンパク質共役レセプターアゴニストおよびアンタゴニストに有用な細菌、酵母、バキュロウィルス／昆虫系、および哺乳類細胞が概説されている（例えば、Ｔａｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ.１４：４２６−４３０(１９９６））。  
【００５０】
Ｇタンパク質共役シグナル伝達を検出および測定するためのアッセイは、最初に、単離細胞、膜、もしくはリポソームまたはミセル等の人工膜等、ＰＫ１レセプターまたはＰＫ２レセプターを含むサンプルを、検出可能な指示薬と接触させる。検出可能な指示薬は、色の変化等、測定される物質の存在下で物理的または化学的特性の検出可能な違いを示す任意の分子とすることができる。カルシウム指示薬、ｐＨ指示薬、および金属イオン指示薬と、選択されたシグナル伝達経路を検出および測定するためにそれらの指示薬を用いるアッセイとが、例えば、Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓｅｔｓ  ２０−２３  ａｎｄ  ２５(１９９２−９４）に記載されている。例えば、カルシウム指示薬およびその使用について当該技術分野で周知であり、例えばＦｌｕｏ−３  ＡＭ、Ｆｕｒａ−２、Ｉｎｄｏ−１、ＦＵＲＡ  ＲＥＤ、ＣＡＬＣＩＵＭ  ＧＲＥＥＮ、ＣＡＬＣＩＵＭ  ＯＲＡＮＧＥ、ＣＡＬＣＩＵＭ  ＣＲＩＭＳＯＮ、ＢＴＣ、およびＯＲＥＧＯＮ  ＧＲＥＥＮ  ＢＡＰＴＡが挙げられ、それらはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ  Ｏｒｅｇ．から入手可能であり、また、例えば米国特許第５，４５３，５１７号、第５，５０１，９８０号、および第４，８４９，３６２号に記載されている。
【００５１】
ＰＫ２レセプターおよびＰＫ１レセプターを介したシグナル伝達は、細胞内カルシウム・イオンの移動を促進することから、それらのレセプターが通常、Ｇαｑ含有Ｇタンパク質に結合することが示唆される。したがって、ＰＫ２レセプターまたはＰＫ１レセプターを介したシグナル伝達は、細胞内カルシウム・イオンの移動を検出する当該技術分野で周知の任意のアッセイ（例えば実施例ＶＩＩに記載のもの）によって検出することができる。
【００５２】
カルシウム・イオン移動アッセイは、ＰＫ１またはＰＫ２の存在下または非存在下で実施される。図１２は、所定のシグナルがカルシウム・イオンの移動である典型的なＰＫ２レセプター活性アッセイの結果を示す。図１２は、マウスＰＫ２レセプターのヒトＰＫ２による活性化のＫｄ値が２．９ｎＭであることを示している。
【００５３】
必要に応じて、Ｃa２＋流入以外の所定のシグナルをＰＫ２レセプター活性の読み出しとして用いることができる。細胞表面レセプターに対するＧタンパク質の特異性は、ＧαサブユニットのＣ末端にある５つのアミノ酸によって測定される。種々の真核および原核生物のＧαサブユニットの異なるクラスおよびサブクラスのヌクレオチド配列およびシグナル伝達経路は、当該技術分野において周知である。したがって、任意の簡便なＧタンパク質媒介シグナル伝達経路を、アッセイを望むシグナル伝達経路に結合するＧαに対応するタンパク質の残部により、Ｇαｑ等のＰＫ２レセプターまたはＰＫ１レセプターに結合したＧαのＣ末端残基を含むキメラＧαを調製することで、アッセイすることができる。キメラＧαタンパク質を組み換え技術的に発現させる方法は当該技術分野において周知であり、例えばＣｏｎｋｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：２７４−２７６(１９９３），Ｋｏｍａｔｓｕｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４０６：１６５−１７０(１９９５）、およびＳａｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４００：２６５−２６９(１９９９）に記載されている。また、キメラＧαタンパク質は、合成的方法によって調製することができる。
【００５４】
シグナル伝達アッセイの別のタイプは、ＰＫ２レセプターまたはＰＫ１レセプターアゴニストもしくはアンタゴニストに応答して遺伝し発現での変化を検出する。種々のシグナル伝達経路は、各々の遺伝子のプロモーター領域にある応答要素（ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）と呼ばれる遺伝子配列によって転写因子の相互関係を刺激することによって、動物細胞での転写を制御することに貢献する。遺伝子発現を刺激するプロモーター領域と転写因子との相互作用を決定するためのアッセイは、当業者に周知であり、かつ市販されている。本明細書に記載したように、ＰＫ２プロモーターがＰＫ２レセプター活性（実施例ＩＩ）に応答して活性化される。したがって、ＰＫ２プロモーターを含む種々のプロモーターを遺伝子発現アッセイに用いてＰＫ２レセプターまたはＰＫ１レセプターが検出される。典型的な遺伝子発現アッセイは、βラクタマーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、またはβガラクトシダーゼ等の容易に検出可能なタンパク質が、ＰＫ２レセプターまたはＰＫ１レセプターとアゴニスト（例えば、ＰＫ２、ＰＫ１、またはＰＫ２／ＰＫ１キメラ）との接触に応じて発現されるように、プロモーター・レポーター核酸構成体による細胞の形質導入を含む。そのような遺伝発現アッセイで同定された化合物は、細胞表面のレベルで、ＰＫ２レセプターの活性、ＰＫ２レセプターシグナル・カスケード化合物の活性、またはＰＫ２制御遺伝子の転写産物を調節する因子の活性を調節することで、作用することができる。
【００５５】
ＰＫ２レセプターアゴニストまたはアンタゴニストとして機能する化合物を同定するためのアッセイは、該レセプターと既知のＰＫ２レセプターアゴニストとを接触させることで所定のシグナルを生成する条件下で実施される。必要に応じて、このアッセイは、既知のＰＫ２レセプターアゴニスト、例えば配列番号５、６、７、および８のものが含まれるＰＫ２、または配列番号９および１０のものが含まれるＰＫ１、もしくは配列番号２０および２１のものが含まれるＰＫ２／ＰＫ１キメラの存在下で実施することができる。アゴニスト濃度は、ＥＣ５０の１０倍内とすることができる。したがって、ＰＫ２レセプターを介したシグナル伝達に関してＰＫ２、ＰＫ１、またはＰＫ２／ＰＫ１キメラと競合するアゴニスト、またはＰＫ２レセプターのシグナル伝達活性を間接的に可能にするアゴニストが、容易に同定される。同様に、ＰＫ１レセプターを介したシグナル伝達についてＰＫ２、ＰＫ１、またはＰＫ２／ＰＫ１キメラと競合するアゴニストを容易に同定することができる。
【００５６】
同様に、ＰＫ２、ＰＫ１またはＰＫ２／ＰＫ１キメラがＰＫ２レセプターに結合するのを妨げる、もしくはＰＫ２レセプターのシグナル伝達活性を間接的に減少させるアンタゴニストも同定することができる。同様に、ＰＫ２、ＰＫ１またはＰＫ２／ＰＫ１キメラがＰＫ１レセプターに結合するのを妨げる、もしくはＰＫ１レセプターのシグナル伝達活性を間接的に減少させるアンタゴニストも同定することができる。候補化合物は、最大半減シグナル伝達が生ずる濃度を確立する濃度範囲で試験することができ、そのような濃度は一般にＰＫ２レセプター結合の解離定数（Ｋｄ）が類似している。
【００５７】
結合アッセイは、ＰＫ２レセプターアゴニストまたはアンタゴニストである化合物を同定するために実施することができる。そのようなアッセイでは、選択されたレセプターと、選択されたレセプターに結合する化合物または選択されたレセプターに対するアゴニストの結合を減少させる化合物とにＰＫ２が結合する条件下で、ＰＫ２レセプターまたはＰＫ１レセプターを１つ以上の候補化合物と接触することができる。意図した結合アッセイは、候補化合物を検出可能に標識し、未標識候補化合物を検出可能に標識されたＰＫ２アゴニスト（例えば、ＰＫ２、ＰＫ１、またはＰＫ２／ＰＫ１キメラ）と競合させることを含む。検出可能な標識は、例えば、放射性同位元素、蛍光色素、強磁性物質、または発光物質である。標識化合物に有用な典型的な放射性標識として、１２５Ｉ、１４Ｃ、および３Ｈが挙げられる。標識アミノ酸を合成の際に化合物に取り込むことで、合成後に化合物を誘導体化することで、有機分子を検出可能なかたちで標識する方法は、当該技術分野において周知である。
【００５８】
候補化合物が検出可能に標識されたＰＫ２とＰＫ２レセプターとの結合を減少されるかどうかを判断するために、検出可能に標識された所定量のＰＫ２が結合する量を候補化合物非存在下で測定する。一般に、検出可能に標識されたＰＫ２の量は、そのＫｄ値よりも低く、例えばそのＫｄの１／１０である。同一条件下で、候補化合物の存在下、検出可能に標識されたＰＫ２、ＰＫ１、またはＰＫ２／ＰＫ１キメラの結合量が測定される。ＰＫ２レセプターリガンドとして特徴づけられた候補化合物による結合の減少が、候補化合物の非存在下に比べて、候補化合物の存在下でのＰＫ２レセプターに対する検出可能に標識されたＰＫ１またはＰＫ２／ＰＫ１キメラの結合が、少なくとも２倍少ないこと、例えば少なくとも１０倍から少なくとも１００倍少ない、例えば少なくとも１，０００倍少ないによって明らかである。
【００５９】
ＰＫ２レセプターまたはＰＫ１レセプターへの検出可能に標識されたＰＫ２、ＰＫ１、またはＰＫ２／ＰＫ１キメラの結合を測定するための典型的なアッセイは、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ.Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ５９：６９２−６９８(２００１））に記載される放射性リガンド・フィルター結合アッセイである。図１１は、典型的なＰＫ２レセプター結合アッセイの結果を示す。図１１は、マウスＰＫ２レセプターへの１２５ＩヒトＰＫ２の結合に対するＫｄが約１ｎＭであることを示す。レセプターおよびリガンド間の選択的結合相互作用を検出するために適した様々な他のロースルプットおよびハイスループット・アッセイが当技術で既知である。そのようなアッセイとしては、例えば、Ｍａｊｏｒ，Ｊ.Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｒｅｓ.１５：５９５−６０７(１９９５）；およびＳｔｅｒｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ.Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｒｅｓ.１７：５１１−５２０(１９９７））に概説されている蛍光相関分光方（ＦＣＳ）およびシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）が挙げられる。任意の好適なアッセイ形式で結合アッセイを実行することができ、該アッセイ形式には、例えば、溶液中でまたは固相に結合させた状態で、ＰＫ２レセプターまたはＰＫ１レセプターを含有する完全な細胞または膜等の細胞調製物、あるいは実質的に精製されたＰＫ２レセプターポリペプチドまたはＰＫ１レセプターが含まれる。
【００６０】
検出可能に標識されたＰＫ２、ＰＫ１、およびＰＫ２／ＰＫ１キメラは、上述した多数のインビトロアッセイで有用である。ＰＫ２、ＰＫ１、およびＰＫ２／ＰＫ１キメラを、任意の分析手段によって検出可能な部とともに誘導体化、または該検出可能な部に連結することができる。本明細書に開示されるアッセイで有用なそのような検出可能に標識された分子は概ね、ナノモル以下の濃度でＰＫ２レセプターまたはＰＫ１レセプターに結合する能力を保有する。例えば、検出可能な部は、ラジオアイソトープ、蛍光色素、強磁性物質、または発光物質であり得る。一実施形態では、検出可能に標識されたＰＫ２、ＰＫ１、またはＰＫ２／ＰＫ１キメラは、放射性標識されている。ペプチドを標識するために有用な典型的な放射性標識としては、１２５Ｉ、１４Ｃ、および３Ｈが挙げられる。合成中に標識アミノ酸をペプチドに組み込むことによって、または合成後にペプチドを誘導体化することによってペプチドを検出可能に標識する方法が当技術で既知である。Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ.ｓｕｐｒａ(２００１）に記載されるように、典型的な検出可能に標識されたＰＫ２、ＰＫ１、またはＰＫ２／ＰＫ１キメラは、コアＴｙｒで１２５Ｉを用いて放射性ヨード標識されたヒトＰＫ２であり、これはＰＫ１レセプターでトランスフェクションされた細胞膜に識別可能な７０ｐＭのＫｄで結合する。
【００６１】
ＰＫ２レセプターを介してシグナル伝達に選択的に結合または該シグナル伝達を調節する化合物を同定するためのアッセイ方法は、一般に、対照との比較を伴う。「対照」の一種類は、試験調製物に対して識別可能に処置された調製物であり、但し該対照が候補化合物にさらされないことは除外する。「対照」の別の種類は、試験調製物と類似する調節物であり、但し該対照調製物がレセプターを発現しないか、あるいはＰＫ２またはＰＫ１に選択的に応答しないように改変されていることは除外する。この状況では、候補化合物への試験化合物の応答を、実質的に同一な反応条件下での同化合物への対照化合物の応答（または応答がないこと）と比較する。
【００６２】
本明細書で下記に記載するように、概日リズム機能の１つ以上の特徴を調節する能力に対して、ＰＫ２レセプターアゴニストまたはアンタゴニストであると同定される化合物を試験することができる。
【００６３】
本発明は、概日リズムを調節するために有用な化合物を同定するための更なる方法を提供する。該方法は、（ａ）レポーター核酸がＰＫ２遺伝子プロモーター活性化に応答して所定のシグナルを生成する条件下で、レポーター核酸に作用自在に結合するＰＫ２遺伝子プロモーターを含有する単離核酸を１種類以上の候補化合物に接触させることと、（ｂ）該シグナルの生産を変化させる化合物を同定することと、（ｃ）該化合物を与えることと、（ｄ）概日リズム機能の１つ以上の特徴を調節する上記化合物の能力を測定することとを含み、この際、概日リズム機能１つ以上の特徴を調節する化合物が概日リズムを調節するために有用な化合物として同定される。
【００６４】
ヒトＰＫ２遺伝子プロモーター等のＰＫ２遺伝子プロモーターのモジュレーターであると同定される化合物は、概日リズムを調節するための潜在的に治療上有用な化合物である。実施例ＩＩによって、マウスＰＫ２の転写は、ＰＫ２プロモーター中の複数のＥボックス・エンハンサーに結合する転写因子によって調節され得ることが実証される。特に、マウスＰＫ２プロモーターの２．８ｋｂ領域に結合するＣＬＯＣＫ：ＢＭＡＬ１ヘテロダイマーは、ＰＫ２転写を１７２倍増加させることが実証された。したがって、ＰＫ２遺伝子プロモーターからのＰＫ２遺伝子発現を活性化または阻害することによって、細胞内のＰＫ２の程度を調節することができる。例えば、ＰＫ２プロモーターに結合して、ＰＫ２遺伝子発現を誘導する化合物を加えることによって、ＰＫ２プロモーターの活性を直接増加させることができる。さらに、該プロモーターに結合するＣＬＯＣＫ：ＢＭＡＬ１ヘテロダイマーまたはそれらのヒトオーソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）等の転写因子を活性化する量を増加させること、活性化する転写因子がＰＫ２プロモーターに結合したままでいる時間の長さを増加させること、ｍＰＥＲ１、ｍＰＥＲ２、ｍＰＥＲ３、ｍＣＲＹ１、およびｍＣＲＹ１またはそれらのヒトオーソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）等の転写因子を阻害する量を減少させること、あるいは阻害転写因子がＰＫ２プロモーターに結合したままでいる時間の長さを減少させることによって、ＰＫ２プロモーターの活性を間接的に増加させることができる。同様に、ＰＫ２プロモーターに結合して、ＰＫ２遺伝子発現を阻害する化合物を加えることによって、ＰＫ２プロモーターの活性を直接減少させることができる。例えば、転写因子を活性化する量を減少させること、活性化する転写因子がＰＫ２プロモーターに結合したままでいる時間の長さを減少させること、転写因子を阻害する量を増加させること、または阻害転写因子がＰＫ２プロモーターに結合したままでいる時間の長さを増加させることによって、ＰＫ２プロモーター活性を間接的に減少させることができる。
【００６５】
例えば、ＰＫ２発現を高める転写因子の発現または安定性を増加させること、外来促進転写因子またはその模倣体を加えること、ＰＫ２発現を阻害する転写因子の発現または安定性を減少させること、および外来阻害転写因子またはその模倣体を加えることによって、転写因子あるいはホモ多量体またはヘテロ多量体転写因子複合体の量を増加または減少させることを実行することができる。例えば、レポーター核酸に結合するＰＫ２プロモーターを含有するサンプルに候補化合物を添加して、レポーター核酸の発現を測定することによって、ＰＫ２プロモーターの活性を調節することができる化合物を同定することができる。このようなアッセイを用いて、ＰＫ２遺伝子発現を調節する化合物を同定することができ、かつ概日リズム機能の１つ以上の特徴を調節する化合物を、例えばヒトを含む動物での概日リズムを調節するために用いることができる。この種類のＰＫ２転写活性アッセイは、上記に記載されるように、ＰＫ２レセプターアンタゴニストまたはＰＫ２レセプターアゴニストに応答するＰＫ２レセプターの活性を測定するためにも有用である。
【００６６】
本明細書に開示されるように、ヒトＰＫ２遺伝子のプロモーター領域は、複数のＥボックス・エンハンサーおよび環状ＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）を含有すると同定されている（例えば、Ｅボックス（Ｅ）およびＣＲＥの境界ならびにプロモーター領域の配列をそれぞれ示す図１３を参照せよ）。スクリーニング法は、配列番号１４（ヒトＰＫ２プロモーター）、配列番号１５（ヒト２．８ｋｂ  ＰＫ２プロモーター）、配列番号１６（マウスＰＫ２プロモーター）、配列番号１７（マウス２．８ｋｂプロモーター）、または配列番号１８（マウス１８８ｂｐ  ＰＫ２プロモーター）として参照される核酸配列を有する典型的なＰＫ２遺伝子プロモーターを用いることができる。これらのＰＫ２遺伝子プロモーターのそれぞれを調節して、本発明の方法でＰＫ２遺伝子の発現を誘導または減少させることができる。
【００６７】
実施例ＶＩＩＩに示されるように、ＳＣＮでのＰＫ２の発現は、明期で調節される。したがって、動物中の核酸分子の明期調節発現のための方法で、ヒトＰＫ２遺伝子プロモーターを用いることができる。一実施形態では、本発明は、動物中の核酸分子の明期調節発現のための方法を提供し、該方法は、異種ヌクレオチド配列に作動可能に結合したＰＫ２遺伝子プロモーターを有する単離核酸分子を動物に導入することを伴う。核酸分子を細胞に導入するための様々な方法が当技術で既知である。そのような方法としては、マイクロインジェクション、電気穿孔法、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、ポリブレンまたはポリリシン媒介トランスフェクション、および抗体、グラミシジンＳ、人工ウイルス・エンベロープ、または他の細胞内担体（ＴＡＴ等）への結合が挙げられる。例えば、Ｃｉｂｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ.Ｂｉｏｔｅｃｈ.１６：６４２−６４６(１９９８）またはＬａｍｂ  ａｎｄ  Ｇｅａｒｈａｒｔ，Ｃｕｒ.Ｏｐｉｎ.Ｇｅｎ.Ｄｅｖ.５：３４２−３４８(１９９５）に記載されるようにマイクロインジェクションによって、Ｃｈｏｉ（米国特許番号第６，０６９，０１０号）またはＬａｍｂ  ａｎｄ  Ｇｅａｒｈａｒｔ，Ｃｕｒ.Ｏｐｉｎ.Ｇｅｎ.Ｄｅｖ.５：３４２−３４８(１９９５）に記載されるようにリポフェクションによって、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，ｐｐ  ９．１６．４−９．１６．１１(２０００）またはＣｉｂｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ.Ｂｉｏｔｅｃｈ.１６：６４２−６４６(１９９８）に記載されるように電気穿孔法によって、Ｌａｍｂ  ａｎｄ  Ｇｅａｒｈａｒｔ，Ｃｕｒ.Ｏｐｉｎ.Ｇｅｎ.Ｄｅｖ.５：３４２−３４８(１９９５）に記載されるように酵母スフェロプラストとの融合によって、細胞を形質転換することができる。
【００６８】
当技術で周知の好適なベクターを用いて、インビボまたはインビトロで、異種ヌクレオチド配列に作動可能に結合したＰＫ２遺伝子プロモーターを含有する核酸分子を細胞に送達することができる。哺乳類細胞に核酸を送達するための好適なベクターとしては、レトロウイルス・ベクター、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス等のウイルスベクターと、プラスミド・ベクター等の非ウイルス・ベクターとが挙げられる。
【００６９】
ウイルスに基づく系によって、種々の細胞に比較的高程度の異種核酸分子を導入することができる利点が与えられる。ＰＫ２遺伝子プロモーターを含有する核酸を哺乳類細胞に導入するための好適なウイルスベクターは、当技術で周知である。これらのウイルスベクターとしては、例えば、単純ヘルペス・ウイルス・ベクター（Ｇｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：１６６７−１６６９(１９８８））、ワクシニア・ウイルス・ベクター（Ｐｉｃｃｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ.Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３：５４５−５６３(１９８７））、サイトメガロウイルス・ベクター（Ｍｏｃａｒｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｙ.Ｇｌｕｚｍａｎ  ａｎｄ  Ｓ.Ｈ.Ｈｕｇｈｅｓ，Ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐｐ.７８−８４））、モロニー・マウス白血病ウイルスベクター（Ｄａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ，８５：６４６０−６４６４(１９８８）;Ｂｌａｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７０：４７５−４７９(１９９５）;Ｏｎｏｄｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ.Ｖｉｒｏｌ．，７２：１７６９−１７７４(１９９８））、アデノウイルス・ベクター（Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６：６１６−６２６(１９８８）;Ｃｏｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ，８９：６０９４−６０９８(１９９２）;Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ.Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ．，７：１０９−１２７(１９９１）;Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，４：４０３−４０９(１９９３）;Ｚａｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，６：７５−８３(１９９４））、アデノ関連ウイルスベクター（Ｇｏｌｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１０：２２６１−２２６８(１９９７）;Ｇｒｅｅｌｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，５：４３９−４４３(１９９９）;Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ，９６：３９０６−３９１０(１９９９）;Ｓｎｙｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，５：６４−７０(１９９９）;Ｈｅｒｚｏｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，５：５６−６３(１９９９））、レトロウイルス・ベクター（Ｄｏｎａｈｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，４：１８１−１８６(１９９８）;Ｓｈａｃｋｌｅｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ，８５：９６５５−９６５９(１９８８）;米国特許第４，４０５，７１２号、第４，６５０，７６４号、および第５，２５２，４７９号、ならびにＷＩＰＯ公表ＷＯ  ９２／０７５７３、ＷＯ  ９０／０６９９７、ＷＯ  ８９／０５３４５、ＷＯ  ９２／０５２６６、およびＷＯ  ９２／１４８２９）、およびレンチウイルス・ベクター（Ｋａｆｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１７：３１４−３１７(１９９７））が挙げられる。持続的および一時的発現両方が本発明の方法で有用であることが理解される。
【００７０】
ヒト・プロモーターは、概日リズムを調節する化合物を同定するための方法で有用である。この理由は、そのように同定される化合物は、ヒト細胞で活性な化合物として機能すると考えられるためである。しかし、概日リズムを調節する化合物を同定するための方法でマウスＰＫ２プロモーターを用いることもできる。マウスＰＫ２プロモーターを調節すると同定された化合物は、マウスおよびヒトＰＫ２プロモーター両方を調節することができる。この理由は、これらのＰＫ２プロモーターは、構造的および機能的に類似しているか、マウスＰＫ２プロモーターを調節できるか、または別の種のＰＫ２プロモーターを調節できるためである。
【００７１】
本明細書に開示されるように、実施例Ｉでは、ＣＬＯＣＫとＢＭＡＬ１とのヘテロ複合体は、マウスＰＫ２遺伝子発現の正の調節因子として機能する。マウスおよびヒトＰＫ２プロモーター領域間の類似性のために、ＣＬＯＣＫ：ＢＭＡＬ１ヘテロ複合体を用いて、ヒトＰＫ２プロモーターに結合させることによって、ヒトＰＫ２遺伝子発現を正に調節することができる。したがって、本発明の方法は、ＣＬＯＣＫとＢＭＡＬ１とのヘテロ複合体に該プロモーターを接触させることによって、ヒトＰＫ２遺伝子プロモーターを活性化させることを含むことができる。  
【００７２】
本発明の方法を用いて、ＰＫ２遺伝子発現を負に調節する化合物を同定するとき、候補化合物を活性化ＰＫ２プロモーターに与える。用いられるアッセイ形式にしたがって、例えばＣＬＯＣＫ：ＢＭＡＬ１ヘテロ複合体またはＰＫ２遺伝子転写を正に調節する他の転写因子を添加すること、あるいはＰＫ２またはＰＫ２レセプターアゴニストを添加することによって、ＰＫ２プロモーターを活性化することができる。特に、ＰＫ２プロモーターに作用自在に結合するレポーター核酸のみを含む最小構成要素系から、ＰＫ２に応答して活性化され得るＰＫ２レセプターを含有するインタクトな細胞を含む系に至るまで、様々なアッセイ形式でＣＬＯＣＫ：ＢＭＡＬヘテロ複合体または他の転写因子を用いることができる。ＰＫ２に応答して活性化され、シグナルを細胞核に伝達して、ＰＫ２プロモーター活性化を調節することができるＰＫ２レセプターを含む細胞に基づくアッセイ形式でＰＫ２または別のＰＫ２レセプターアゴニストを用いることができる。
【００７３】
上記の方法を用いて、ＰＫ２遺伝子発現を正に調節する化合物を同定するとき、結合転写因子を持たないか、または結合阻害転写因子を有する非活性ＰＫ２プロモーターに候補化合物を与えることができる。該方法を用いて、ＰＫ２プロモーターに直接結合して、プロモーター活性を増加させる化合物、阻害転写因子に結合して、ＰＫ２プロモーターへのその結合を調節する化合物、または任意の他のメカニズムによる機能によって、ＰＫ２遺伝子発現を増加させる化合物を同定することができる。
【００７４】
種々の核酸分子は、ＰＫ２遺伝子プロモーターに作用自在に結合することができる。本明細書で使用されるように、用語「作用自在に結合する」とは、テンプレートとしての核酸分子を用いて、プロモーターがＲＮＡの転写を導くように、マウスまたはヒトＰＫ２プロモーター等のプロモーターに対して核酸分子が位置することを意味することが意図される。
【００７５】
異種プロモーターに核酸を作用自在に結合させるための方法は、当技術で周知であり、例えば所望のプロモーターを含有するベクター中に核酸をクローニングすること、またはＰＣ４を用いて核酸配列にプロモーターを付加することを含む。ＲＮＡ転写のプロモーターに作用自在に結合する核酸分子を用いて、所望の宿主細胞またはインビトロ転写・翻訳系で、レポーター核酸転写物およびポリペプチドを発現させることができる。典型的なレポーター核酸としては、ルシフェラーゼ、β−ラクタマーゼ、β−グルクロニダーゼ、緑色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、およびβガラクトシダーゼが挙げられる。
【００７６】
上記に記載されるように、ＰＫ２レセプターアゴニストまたはアンタゴニストを与えて、ＰＫ２レセプター活性を調節することによって、動物での概日リズムを変化させることができる。ＰＫ２レセプターアゴニストまたはアンタゴニストは、ＰＫ２レセプター活性およびＰＫ２遺伝子発現両方を調節することによって、ＰＫ２媒介生物学的応答を変更させる上で二面的な効果を持つことができる。この理由は、実施例ＩＩに示すように、ＰＫ２レセプター活性化によって、ＣＬＯＣＫ：ＢＭＡＬ１媒介ＰＫ２遺伝子発現の増加が生じるためである。特にＰＫ２遺伝子転写のＣＬＯＣＫ：ＢＭＡＬ１媒介活性化は、ＰＫ２レセプター活性化がＰＫ２遺伝子の転写を増加させるようなＰＫ２レセプター活性によって調節される。
【００７７】
ＳＣＮの細胞内で発現するＰＫ２の程度（レベル）は、正および負のエレメント両方を有する自己調節転写および翻訳フィードバック・ループの制御下にある。正の転写エレメントとしては、２つのベーシック・ヘリックス・ループ・ヘリックス、ＰＡＳドメイン含有転写因子、ＣＬＯＣＫ、およびＢＭＡＬ１が挙げられ、これらは、３つのピリオド遺伝子（ｍＰｅｒ１、ｍＰｅｒ２、およびｍＰｅｒ３）および２つのクリプトクローム遺伝子（ｍＣｒｙ１およびｍＣｒｙ２）を、それら各々のＣＡＣＧＴＧ  Ｅボックス・エンハンサーに結合することによってヘテロニ量体化および駆動する（Ｇｅｋａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０：１５６４−６９(１９９８）;Ｈｏｇｅｎｅｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ  ９５：５４７４−７９(１９９８））。ｍＰＥＲおよびｍＣＲＹタンパク質は、フィードバック・ループの負の構成要素として作用し、ｍＣＲＹタンパク質が主要な阻害的役割を果たす（Ｋｕｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ９８：１９３−２０５(１９９９））。これら自己調節転写および翻訳フィードバック・ループの分子成分の量または活性を変化させて、動物での概日リズムを調節することができる。
【００７８】
ＰＫ２レセプターアンタゴニストまたはＰＫ２レセプターアゴニストおよびＰＫ２プロモーター活性を調節する化合物が含まれる、概日リズムを調節する化合物をスクリーニングするための方法であって、ＰＫ２レセプターまたはＰＫ２プロモーターを１つ以上の候補化合物に接触させる工程を含めることが可能な化合物のスクリーニング方法。ペプチド、核酸、炭水化物、脂質、またはそれらの組み合わせなど天然高分子が候補化合物であってよい。部分的または完全に合成誘導体、それら高分子のアナログまたはミメティク、あるいはコンビナトリアル・ケミストリーの手法を用いて部分的または完全に調整された低分子の有機または無機分子も候補化合物であってよい。さらに、抗体が候補化合物であってよく、抗体にはモノクローナルで、ヒト化キメラ抗体ならびにキメラであり、機能を２つ有し、単鎖ヒト化抗体（ｓｃＦｖ）、可変領域フラグメント（ＦｖまたはＦｄ）、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２などの抗体の機能フラグメントが含まれる。抗体は天然物または人工物であってよい。
【００７９】
核酸の候補化合物として、アンチセンス、塩基配列、ＲＮＡ分子、またはアプタマー配列が挙げられる。アンチセンス塩基配列は、細胞内の塩基配列に結合して、ＰＫ２遺伝子またはＰＫ２レセプター遺伝子の発現レベルあるいはＰＫ２またはＰＫ２レセプターの発現をコントロールするもう一方の遺伝子の発現を調節することができる。同様に、触媒のはたらきを有するリボザイムなどのＲＮＡ分子は、ＰＫ２遺伝子、ＰＫ２レセプター遺伝子、あるいはＰＫ２またはＰＫ２レセプターの発現をコントロールするその他の遺伝子に結合し、発現を変えることができる。アプタマーは塩基配列であり、その塩基配列はＰＫ２またはＰＫ２レセプターなどの分子ターゲットに結合することが可能な立体構造を有する。（Ｊａｙａｓｅｎａ，Ｓ．Ｄ.Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ.４５：９，１６２８−１６５０(１９９９））。それ故、アプタマーはＰＫ２レセプターのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用することができる。
【００８０】
ＲＮＡ干渉の手法で用いる２本鎖ＲＮＡ分子も核酸の候補化合物であってよい。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、サイレンシングされる遺伝子配列と相同性の高い配列を有する、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって引き起こされる転写後のＲＮＡ分解を用いて配列特異的に遺伝子サイレンシングを実行するプロセスである。ＲＮＡｉに適した２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）には、それぞれの３’末端で２つのヌクレオチドが突き出たまま１９ｂｐのＲＮＡを形成する対象遺伝子に相当する、およそ２１の連続したヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖が含まれる。（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４９４−４９８(２００１）;Ｂａｓｓ，Ｎａｔｕｒｅ  ４１１；４２８−４２９(２００１）;Ｚａｍｏｒｅ，Ｎａｔ.Ｓｔｒｕｃｔ.Ｂｉｏｌ.８：７４６−７５０(２００１））。およそ２５〜３０のヌクレオチドをもつｄｓＲＮＡｓも、ＲＮＡｉに成功裡に用いられている。（Ｋａｒａｂｉｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ．Ｓｃｉ.９８：７８６３−７８６８(２００１）。ｄｓＲＮＡはインビトロで合成し、当業者に知られている方法により細胞内に導入することができる。
【００８１】
配列番号５〜１４などのＰＫ２ポリペプチドのアミノ酸配列のペプチド・ミメティクも候補化合物であってよい。神経ペプチド（ニューロ・ペプチド）を含むペプチドのペプチド・ミメティクを合理的に設計する方法は当業者に知られている。例えば、硫酸化した８ｍｅｒのペプチドＣＣＫ２６−３３に基づいて３つのペプチド・ミメティクを、１１ｍｅｒのペプチド、サブスタンスＰに基づいて２つのペプチド・ミメティクを合理的に設計すること、ならびに関連するペプチド・ミメティクス設計方式について、Ｈｏｒｗｅｌｌ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.１３２−１３４(１９９５）に述べられている。特定のアッセイ・フォーマットが望ましければ、候補化合物は検出可能なようにラベルを付けるか、または固体支持体に付着させることができる。
【００８２】
概日リズム機能を調節する化合物をスクリーニングするためのこの発明の方法には、候補化合物を試験する工程を含めることができる。特定のアッセイでスクリーニングするための異なる候補化合物数は当業者が決めることが可能であり、５、１０、１５、２０、５０、あるいは１００以上など、２以上の異なる化合物数であってよい。ランダム化合物ライブラリからスクリーニングする場合、および手順を自動化するなど、ある特定の場合においては、１０７以上の化合物を含む１０５以上など、１０３以上の化合物をスクリーニングすることが望ましい。
【００８３】
ハイスループットなインビトロスクリーニング・フォーマットが用いられる場合などは、巨大な化合物ライブラリにスクリーニングのための化合物が含まれていてよい。単一または複合の有機分子、金属含有化合物、炭水化物、ペプチド，タンパク質、ペプチド・ミメティク、糖タンパク質、リポタンパク質、核酸、抗体、その他を含む巨大な化合物ライブラリを生成する方法は、当業者によく知られており、例えばＨｕｓｅ，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ.５，２６４，５６３;Ｆｒａｎｃｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ.Ｏｐｉｎ.Ｃｈｅｍ.Ｂｉｏｌ.２：４２２−４２８(１９９８）;Ｔｉｅｔｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ.Ｂｉｏｌ．，２：３６３−３７１(１９９８）;Ｓｏｆｉａ，Ｍｏｌ.Ｄｉｖｅｒｓ.３：７５−９４(１９９８）;Ｅｉｃｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｄ.Ｒｅｓ.Ｒｅｖ.１５：４８１−４９６(１９９５）;などで述べられている。天然および合成化合物を数多く含むライブラリは市販もされている。
【００８４】
個別または数個、数十あるいは何百の候補から化合物をスクリーニングすることができる。それゆえ、各サンプルが１つの化合物を受容するマルチサンプル・フォーマットで、あるいは各サンプルが１つ以上の化合物を受容するマルチプレックス・フォーマットで、化合物ライブラリから順次スクリーニングすることができる。
【００８５】
インビトロスクリーニングの手法では、ＰＫ２レセプターまたはＰＫ２プロモーターを細胞調製物に含めてよい。ここで用いたように、「細胞調製物」という用語は器官、組織、または培養細胞に含まれていてよい、天然のＰＫ２レセプターを含む単離された細胞を有するサンプルを意味する。細胞調製物は、ＰＫ２レセプターはＰＫ２に結合することが可能であり、ＰＫ２の結合に応答して活性化されるように、緩衝液、塩、および界面活性剤などの広範な要素の存在下で、完全な細胞、欠損した細胞、可溶化した細胞、ホモジナイズド細胞、または断片化した細胞を含むことができる。細胞調製物はＰＫ２レセプター発現細胞株であってよい。ＰＫ２レセプター発現細胞株は、結合競合アッセイ法（コンピティティブ・バインディングアッセイ）などの当業者に知られている方法により同定できる。ＰＫ２レセプター発現細胞株の例として、メラノーマ細胞株  Ｍ２Ａ７(Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎからＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２５００として入手可能）が挙げられる。他のＰＫ２レセプター発現細胞株の例としては、Ｍ２メラノーマ細胞（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａ１．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５；３２５−３２７(１９９２））およびＲｃ−４Ｂ／Ｃ  ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ(ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１９０３）が挙げられる。細胞調製物には組換え技術によりＰＫ２レセプターが発現している細胞も含めてよい。細胞調製物は、ヒト、ヒト以外の霊長類、ラットおよびマウスなどの種々の動物から入手できる。例えばヒト細胞調製物は、器官、組織、または培養細胞に含まれていてよく、天然のヒトＰＫ２レセプターを含む単離されたヒト細胞を有するサンプルである。
【００８６】
細胞調製物は概日リズム性を有することを特徴とする。しかしながら、化合物がＰＫ２レセプターアンタゴニストあるいはアゴニストであるかを検定するために細胞調製物がスクリーニング方法で用いられている場合、この特徴は必要条件ではない。Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ.  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｑｙ  ５９：６９２−６９８(２００１）に述べられているように、ヒトＰＫ２レセプターは、脳、心臓、骨格筋、胃および胎盤など種々のヒト組織で発現する。それゆえ、ＰＫ２レセプターを発現するこれらおよびその他の器官は全て、この発明のスクリーニング方法で用いる細胞調製物を用意するためのソースとすることが可能である。
【００８７】
概日リズムに従う特徴を有する細胞調製物は、候補化合物あるいはＰＫ２レセプターゴニストまたはアンタゴニストが概日リズム機能を調節するかどうかを検定するためのインビトロアッセイで用いる場合に有用である。概日リズムに従う特徴を有する細胞の例として、培養液に分散した場合にリズミック・ファイアリングパターンを保存するＳＣＮニューロンが挙げられる（Ｅａｒｎｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ.Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３：６９３−６９５(１９９９））。
【００８８】
細胞調製物には組換え技術によりＰＫ２レセプターが発現した細胞も含めることができる。ＰＫ２レセプター濃度を上げたい場合、または本来は発現しない哺乳類、酵母および微生物の細胞を含む宿主細胞でＰＫ２レセプターを発現する場合に、ＰＫ２レセプターを組換え技術により発現することができる。例えば、組換え技術によりヒトＰＫ２レセプターが発現したマウスをこの発明の方法で用いることができる。
【００８９】
組換え技術による発現は、内在していることがわかっているポリペプチドを高レベルで発現させ、細胞またはポリペプチドが普通はみつからない抽出物でも発現することができる点で有用である。通常、組換え技術による核酸発現コンストラクトは、宿主細胞または目的とするポリペプチドをコードしている塩基配列に効果的にリンクする転写−翻訳システムに適切な、ＲＮＡへの転写を担うか誘導するプロモーターを有する。前記の発現コンストラクトはＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、条件に応じてプラスミドまたはウイルスベクターなどのベクターを含めることができる。ＰＫ２レセプターをコードしている塩基配列の知見に基づき、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａ１．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ;Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ(１９９２）およびＡｎｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ(１９９８）などの標準的な分子生物学の技術マニュアルに述べられている所定の実験方法を用いて、当業者は組換え技術により、生物学的に活性のあるＰＫ２レセプター・ポリペプチドを目的とするレベルで発現させることができる。
【００９０】
組み換え型ＰＫ２レセプターを発現させるために使われる典型的な宿主細胞として、哺乳類単離始原細胞、哺乳類確立細胞系統（ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ  ２９３−Ｔ、およびＰＣ１２）、両生類細胞（例えば、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）胚および卵母細胞）、および他の脊椎動物細胞が挙げられる。また、典型的な宿主細胞として、組み換え技術によりＰＫ２レセプターが発現するように設計された昆虫細胞（例えば、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、酵母細胞（例えば、Ｓ.ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ.ｐｏｍｂｅ、またはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ)、および原核細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が挙げられる。また、組み換え体ＰＫ２レセプターは、転写および翻訳を支持する抽出物（例えば、網状赤血球溶菌液および小麦麦芽エキス）中で発現することができる。
【００９１】
単離細胞によるＰＫ２レセプターの発現を確立する適当なアッセイは、当業者によって決定することができる。そのようなアッセイは、例えば、当業者に周知の方法によるＰＫ２レセプター核酸の発現またはＰＫ２レセプターポリペプチドの発現を伴う。ＰＫ２レセプターｍＲＮＡの発現を決定するアッセイは、例えば、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲまたは原位置（インサイチュ）ハイブリダイゼーション分析が挙げられる。そのような方法は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ.（１９９８）（上掲）およびＡｎｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ.（１９９８）（上掲）に記載されている。ＰＫ２レセプタータンパク質の発現を決定するためのアッセイとして、ＰＫ２レセプターに特異的な抗原を用いるイムノブロット分析、免疫沈降法、免疫蛍光法、または免疫組織化学法が挙げられる。
【００９２】
本発明のポリペプチド、または本発明の方法で使用するために調製されたポリペプチドは、沈降法、ゲルろ過法、イオン交換法、逆相および親和性クロマトグラフィー、その他の当業者に周知の種々の方法を用いて、通常は結合している細胞成分から単離することができる。他の周知の方法は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ:Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ  １８２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ(１９９０）に記載されている。ポリペプチドの生化学的精製の方法および条件は、当業者によるものから選択することができ、適当な免疫学的アッセイ、機能的アッセイ、または他の生化学的アッセイを用いて、調製をモニターする。
【００９３】
本発明のマウスＰＫ２レセプターは、本発明の方法で使用されるＰＫ２や他のＰＫ２レセプターおよび候補化合物と同様に、当該技術分野で周知の種々の宿主細胞内で、一時的にまたは安定して組み換え技術的に発現することができる（例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，上掲(２００１）を参照せよ）。同様に、キメラＧαタンパク質を組み換え技術的に発現させる方法、およびＧタンパク質シグナル伝達アッセイでのその使用は、当該技術分野において周知であり、かつ記載されている（例えば、Ｓａｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４００：２６５−２６９(１９９９），およびＣｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.２７０：２４２４−２４８(１９９９））。そのような方法は、ペプチドまたはポリペプチドであるＰＫ２レセプターアゴニストまたはアンタゴニストを組み換え技術的に生成することにも適用可能である）。
【００９４】
多数のシステイン残基を含むポリペプチドの組み換え発現は、しばしば分子内および分子間ジスルフィド結合が誤って形成される。このことは、このことは、不活性かつ凝集した細菌タンパク質の生成をもたらす。Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ.上掲(２００１）に記載されるように、これらの問題は、これらの問題は、発現されたポリペプチドの再折りたたみの間、タンパク質凝集を最小化する条件を用いることで克服することができる。タンパク質凝集を最小化させる典型的な条件を実施例に記載し、以下の再折りたたみ条件の１つ以上を含むことで、組み換えタンパク質を調製するための従来の条件とは異なる。すなわち、（１）タンパク質濃度を低下させる（例えば、約１００μｇ／ｍｌ）こと、（２）希釈するよりはむしろペプチドを透析し、変性剤を取り除くこと、（３）緩衝液から酸化剤を取り除くこと、（４）全ての緩衝液の尿素を高濃度に保つこと、（５）緩衝液中のグリセロールを高濃度に保つこと（例えば、少なくとも約１０％）、および（６）ペプチドおよび緩衝液を低温（例えば、約４℃）に保つことである。これらの条件により、低タンパク質濃度（例えば、約２５０μｇ／ｍｌ未満、例えば２００μｇ／ｍｌ未満、１５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、または５０μｇ／ｍｌ）および高尿素濃度（例えば、少なくとも約１．５Ｍ、例えば約２Ｍ、４Ｍ、６Ｍ、８Ｍ以上）が、活性プロキネチシンの再折り畳みを成功させる最も重要な因子であることが考えられる。
【００９５】
本明細書で記載されるそれと同一または類似の条件を、生物学的活性ポリペプチドが単離されるように、多数のシステインを含む他のポリペプチド（例えば、ＰＫ２レセプターに結合して活性化させる他の分子）の組み換え技術的発現および再折り畳み（リフォールディング）に用いることが可能である。
【００９６】
修飾が加えられたフラグメントおよびポリペプチドを含む本発明のポリペプチドおよびペプチドまたは本発明の方法で用いるために調製されたものも、化学合成によって生成することができる。種々の化学反応および機器（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．のＭｏｄｅｌ  ４３０Ａまたは４３１Ａ等の自動化されシステム）は、ペプチドおよびポリペプチドの調製に好適である。
【００９７】
ＰＫ２レセプターアゴニストまたはアンタゴニストもしくは候補化合物である抗体または抗体フラグメントは、種々の方法を用いて調製することができる。そのような方法として、マウス、ラット、ヒツジ、およびウサギでポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を生成する周知の方法が含まれる（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ:Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ(１９８８）を参照せよ）。キメラ、ヒト化、ＣＤＲグラフト化、および最構築抗体もまた当業者に周知である（Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ.Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１(１９８９）;Ｗｉｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ.Ｔｏｄａｙ  １４：２４３−２４６(１９９３）;Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ.Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６(１９８９）;Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，上掲(１９８８）;Ｈｉｌｙａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ:Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ(ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９９２）;Ｂｏｒｒａｂｅｃｋ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２ｄ  ｅｄ.（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ(１９９５））。完全にヒト抗体もまたファージ・ライブラリーを用いて生成することができ、トランスジェニック・マウスから得ることができる。
【００９８】
例えば、本明細書に記載したスクリーニング方法を用いて、ＰＫ２レセプターアゴニストまたはアンタゴニストである化合物を同定する場合、そのような化合物を試験してその概日リズムに対する効果を決定する。細胞調製物、阻止委、または器官で保たれる概日リズムでのレセプターアンタゴニストまたはアゴニストの効果（例えばニューロン・ファイアリングおよび遺伝子転写）は、動物の概日リズム機能に対するアンタゴニストまたはアゴニストの効果を予測する。したがって、概日リズム機能の１つ以上の指標を保つ細胞調製物、組織、または器官を用いるアッセイは、動物の概日リズム機能に対するＰＲ２アンタゴニストまたはアゴニストの効果を評価する上で有用である。
【００９９】
このようなインビトロ機能的スクリーニングは、潜在的候補治療分子を選択するために用いることができる動物スクリーニングに対して比較的安価な代替法を提供する。概日リズムの指標を示し、かつＰＫ２レセプターを発現する種々の細胞型を用いて、概日リズムを調節するＰＫ２レセプターアゴニストまたはアンタゴニストの能力に対するインビトロ機能的スクリーニングを実行することができる。複数の細胞型は、それらが単離される生物の体外で概日リズム機能を維持する。例えば、哺乳類視床下部内では、視交叉上核（ＳＣＮ）は、多様なニューロン、内分泌、および行動リズムのタイミングに対する概日時計を含有する。固定微小電極アレイ上でラットＳＣＮ由来の細胞を培養することによって、個々のＳＣＮニューロンが数週間の概日リズムに整合する自発運動潜在能力を維持することが判明した（Ｗｅｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ.Ｎｅｕｒｏｎ  １４：６９７−７０６(１９９５）。本明細書で示すように、実施例Ｖでは、ＰＫ２レセプターがマウスＳＣＮで高度に発現する。したがって、ＳＣＮ由来の細胞は、ＰＫ２レセプターを発現し、かつ概日リズム機能の観察可能な指標を有する典型的な細胞でありえ、本発明のスクリーニング法に用いられ得る。Ｗｅｌｓｈ（上掲）(１９９５）に記載される方法等の様々な周知の方法を用いて、ＳＣＮ由来のもの等の単離ニューロンの活性を測定することができる。概日リズムと整合するニューロン発火（ｆｉｒｉｎｇ）での周期的変化は、本発明の方法で評価することができる概日リズムの指標の例である。
【０１００】
細胞が単離される生物の体外で概日リズム機能を維持する細胞の別の例としては、肝臓細胞があり、その中で代謝酵素の活性の概日リズムが維持される。下記に記載されるように、ＰＫ２レセプターは肝臓で発現する。したがって、肝臓由来の細胞は、ＰＫ２レセプターを発現する概日リズム機能の観察可能な指標を有する典型的な細胞でありえ、本発明のスクリーニング法で用いられ得る。周知の方法を用いて、酵素活性の値、例えば代謝酵素およびシグナル伝達酵素の値を測定することができる。例えば、様々な分析方法を用いて、酵素基質の生産または破壊を測定することができる。当業者は、特定の酵素の活性を測定するための適当な方法を選択できる。概日リズムに整合する細胞内酵素の活性での周期的変化は、本発明の方法で評価することができる概日リズムの指標の例である。  
【０１０１】
概日リズムは、末梢器官から外植された培養細胞（Ｙａｍａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ.Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８８：６８２−６８５(２０００））および固定化抹消細胞（Ｂａｌｓａｌｏｂｒｅ  ｅｔ  ａｌ.Ｃｅｌｌ  ９３：９２９−９３７(１９９８）およびＡｋａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ.Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ.１４：６４５−６４９(２０００））でも観測されている。Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ，ｓｕｐｒａ，２００１で示されるように、心臓、精巣、腎臓、虫垂、卵巣、肝臓、およびその他の器官を含む複数の末梢器官でＰＫ２レセプターは発現する。当業者は、ＰＫ２レセプターを発現する種々の細胞調製物、組織、または器官を入手して、ニューロン発火（ｆｉｒｉｎｇ）等の細胞機能の概日リズムが、選択された細胞調製物、組織、または器官で維持されるかどうかを決定することができる。当業者は、ニューロン発火（ｆｉｒｉｎｇ）に加えて種々の細胞機能が、動物から分離された細胞調製物、組織、または器官で維持され得ることを認識する。
【０１０２】
概日リズムに調節される遺伝子転写は、本発明の方法で評価することができる概日リズムの指標の別の例である。種々の遺伝子の転写は、概日リズムによって調節される。概日リズムに調節される典型的遺伝子としては、遺伝子産物が概日時計（時計遺伝子）を調節する遺伝子および遺伝子産物が動物の応答（生物学的、内分泌、細胞内、および行動機能等）を媒介する遺伝子の両方が挙げられる。概日リズムに調節される遺伝子は、異なる動物種間で変わるが、複数の時計遺伝子は、種の間で高度に保存される。概日リズムに調節される遺伝子の例としては、ピリオド−１、ピリオド−２、ピリオド−３、タイムレス、クロック、サイクル、ダブルタイム、クリプトクローム−１、クリプトクローム−２、ＰＫ２、およびｃ−ｆｏｓが挙げられる。例えば、ｃ−ｆｏｓ遺伝子は、活動的日中期間を促進するために夜間で光源にさらされた後にラットの神経細胞で調節されることが判明している（Ｋｏｒｎｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ.Ｂｅｈａｖ  Ｇｅｎｅｔ.Ｍａｙ；２６（３）：２２１−４０(１９９６）。光源への一定の暴露によって、ラットＳＣＮでのｃ−ｆｏｓｍＲＮＡ量の劇的かつ急激な増加を生じる。当業者は、動物での概日リズムに調節される遺伝子を同定することができ、かつこのような調節が細胞調製物、組織、または器官で維持されるかどうかを決定することができる。当業者は、様々な周知の方法を用いて、ＰＫ２レセプターアゴニストまたはアンタゴニスト等の化合物の存在または非存在下で、概日周期中の遺伝子の発現値をモニターすることができる。
【０１０３】
一般的に、研究下の細胞型に特異的な細胞活性を測定することによって、概日リズム機能の細胞指標を決定することができる。例えば、概日リズムで発現される遺伝子に対応するｍＲＮＡおよびポリペプチドを検出する周知の生化学的方法によって、遺伝子発現を測定することができる。典型的な技術としては、ハイブリダイゼーションおよびＰＣＲに基づくｍＲＮＡ検出法、ならびにウエスタン・ブロッティングおよび免疫細胞化学的方法等のポリペプチドの免疫検出法が挙げられる。
【０１０４】
ＰＫ２レセプターアンタゴニストまたはＰＫ２レセプターアゴニスト、あるいはＰＫ２プロモーター調節化合物を動物に投与して、該化合物が概日リズムを調節するかどうかを決定することもできる。本明細書で使用されるように、用語「観察可能な概日リズム機能を有する動物」とは、ヒト、家畜動物、実験動物を意味することを意図しており、該実験動物としては、カタツムリ（例えばブラ・ゴルジアナ（Ｂｕｌｌａ  ｇｏｕｌｄｉａｎａ））等の無脊椎動物、ウリミバエおよびショウジョウバエ等のハエ、イグアナ等の爬虫類、ゼブラフィッシュ等の魚、ならびにげっ歯類（例えばラット、マウス、ハムスター、およびデグー）、ウサギ、ネコ、および非ヒト霊長類等の哺乳類が挙げられ、これらは、概日リズム機能の１つ以上の特徴を示すか、または示すように誘導され得る。本明細書に記載されるように、昼行性動物に対して、ＰＫ２アンタゴニストは、睡眠を有益に高めることができる一方で、ＰＫ２アゴニストは、覚醒等の日中関連行動を有益に高めることができる。逆に、夜行性動物に対しては、ＰＫ２アンタゴニストは、覚醒等の日中関連行動を有益に高めることができる一方で、ＰＫ２アゴニストは睡眠を有益に高めることができる。  
【０１０５】
本明細書に記載されるように、用語「概日リズム機能の指標」または、複数形で、用語「概日リズム機能の特徴」とは、約２４時間の過程にわたって周期的である生物学的機能、内分泌機能、行動、または細胞機能の観察可能な徴候または表れを意味することが意図される。概日リズム機能の典型的な特徴としては、生物学的機能での周期的変化（体温、自律的調節、代謝、および睡眠・覚醒周期等）、内分泌機能での周期的変化（松果体メラトニン分泌、ＡＣＴＨ−コルチゾール分泌、胸腺刺激ホルモン分泌、および神経ペプチドＹ、セロトニン分泌、およびカテコールアミン分泌を含むホルモン分泌等）、および行動での周期的変化（動作（自発運動リズム）、賢さ、記憶、知覚運動統合、および感情等）、または細胞機能での周期的変化（ニューロン発火（ｆｉｒｉｎｇ）または遺伝子発現の転写制御等）が挙げられる。
【０１０６】
概日リズム機能障害は、生物学的、内分泌、および細胞機能、ならびに行動での変化によって特徴付けられる。異常性概日リズム機能の特徴としては、例えば、過度の日中睡眠、夜間覚醒、および早期の覚醒が挙げられる。ヒトでは、臨床的に認識される概日リズム機能障害としては、時間帯急変（時差ぼけ）症候群、交代性勤務性睡眠障害、不規則睡眠・覚醒パターン、睡眠相後退症候群、睡眠相前進症候群、非２４時間型睡眠・覚醒障害等が挙げられる。
【０１０７】
実施例Ｖに記載されるように、主観的夜中のＰＫ２の投与は、ラットで、夜行性行動を抑制して、日中関連行動を生じさせる。したがって、夜行性動物に対しては、ＰＫ２レセプターアゴニスト、またはＰＫ２遺伝子発現での増加を用いて、主観的日中に関連する生物学的、行動、または内分泌機能を生産することによって概日リズムを変化させることができる。逆に、ＰＫ２レセプターアンタゴニスト、またはＰＫ２遺伝子発現での減少を用いて、主観的夜間に関連する生物学的、行動、または内分泌機能を生産することによって概日リズムを変化させることができる。昼行性動物に対しては、ＰＫ２レセプターアゴニストを提供することによって、またはＰＫ２遺伝子発現を増加させることによって、昼行性動物を有益に処置して、例えば増加または過度の睡眠（ナルコレプシー等）、覚醒度の減少状態等に関連する状態に対して、主観的日中に関連する生物学的、行動、または内分泌機能を生産することによって概日リズムを変化させるとういように反対の処置戦略を用いることができる。逆に、ＰＫ２レセプターアンタゴニストを提供またはＰＫ２遺伝子発現を減少させることによってＰＫ２レセプター活性レベルを減少させて、昼行性動物を有益に処置して、例えば時差ぼけ、交代性勤務症候群等の減少された睡眠に関連する状態を治療するために、主観的夜間に関連する生物学的、行動、または内分泌機能を生産することによって概日リズムを変化させることができる。
【０１０８】
概日リズム機能の生物学的および内分泌指標と同様に、様々な行動に対して動物を評価することができる。動物を評価するために用いられる方法は、特定の動物、例えば、該動物が昼行性であるか夜行性であるかによって、および評価される指標によって異なる。概日リズムの行動特徴としては、様々な活動が挙げられ、これは、正常には日中に生じる活動または正常には夜間に生じる活動であり得る。このような活動は、動物種間で大きく変わる。例えば、昼行性動物は、通常、夜間に睡眠状態を示し、日中に自発運動を示す一方で、夜行性動物は、日中に睡眠状態を示し、夜間に自発運動を示す。ヒトおよび他の動物の様々な日中および夜間活動は周知であり、例えば視覚によって、イメージング装置、カメラ、ビデオカメラ、追跡装置等によって活動または行動を観察すること、あるいは１度以上の特定の時間で活動または行動を自己申告することによって評価され得る。例えば、本明細書に記載しているものとしては、ラットの概日リズム機能の行動指標としてホイール・ランニングの使用がある。探査行動等の自然発生的な定型的自発運動の他の種類を評価することができる。測定することができる典型的パラメータとしては、自発運動に関与する時間、休息または睡眠に関与する時間、移動距離、歩行数、および直立回数（立ち上がること）がある。
【０１０９】
例えば、概日リズム機能の特徴を評価するための方法は、正常時と比較して増加または減少された眠気または覚醒の存在を測定することを含むことができる。眠気または覚醒の「正常」量とは、いずれの概日リズム障害ではない動物で観測される、または観測されると予期される睡眠の量または質を意味することが意図される。正常概日リズムを有する動物は、動物種および個体特性（年齢、身体的条件、過去の外傷または疾患、薬物療法等）に依存する例えば２４時間の期間に対する予期数の睡眠時間、予期量のレム睡眠、予期数の覚醒事象、予期数の昼寝等を持つことができる。
【０１１０】
一般に、個体の身体的検査によって、例えば日中の特定の時間に体温計を用いて体温を測定するというように機器または測定装置を用いて、概日リズム機能の生物学的特徴を測定することができる。他の例としては、日中の特定の時間で睡眠を評価するために脳波を測定する電極を用いること、および日中の特定の時間で動物の身体活動を評価するために動作または心拍数モニターを用いることが挙げられる。測定用に選択される日中の時間は、特定の動物種に依存することができる。例えば、昼行性および夜行性動物は、それらの正常覚醒および睡眠周期と一致する概日リズム機能の生物学的特徴での周期的変化を有する。
【０１１１】
一般的に、日中の特定の時間に個体の体液に含まれる分子（ホルモン等）の量の測定等の生化学的試験を用いて、概日リズム機能の内分泌特徴を測定することができる。例えば、副腎は、概日リズムでコルチゾール等の分子を産生する。通常、コルチゾール出力は、朝に最も高く、日中を通してほぼ中間値であり、その後夜間では無視できる程度にまで落ちる。種々の他の分子は、特定の分子に依存する２４時間性日内の特定の時間に生じるピークおよび値で、概日リズムで産生されることが既知である。概日リズム機能の特徴として、概日リズムで体内で産生される分子の値を測定し、日中の特定の時間に体液に存在すると予期される分子の既知の標準値と比較することができる。さらに、分子の値が概日リズムで調節されるかどうかを評価するのに十分な時間期間にわたって、間隔をあけて、または連続してこのような分子の値を測定することができる。特定の分子の値に対して採取および試験することができる典型的な体液としては、血液、尿、および唾液が挙げられる。
【０１１２】
生物学的、行動、または内分泌機能を測定するために設計された様々な装着可能または移植可能装置の出力を観察することによって、概日リズム機能の指標を観測することもできる。典型的な移植可能装置には、実験動物で神経活動を測定するために有用な電極がある（例えばＳＣＮの光応答を測定するために）。典型的な装着可能装置には、個々の筋肉または筋肉群の電気的活性を測定するために有用な表面筋電図検査機器がある（例えば個体の睡眠または覚醒状態を測定するために）。このような装置から得たシグナルを増幅して、コンピューターによって分析することができる。概日リズムの特徴を定質的または定量的に測定することができ、一般に、ＰＫ２レセプターアゴニストまたはアンタゴニスト、あるいはＰＫ２プロモーター活性を調節する化合物、あるいは担体で処置する前および後で動物を試験することができる。
【０１１３】
ＰＫ２レセプターアンタゴニストまたはＰＫ２レセプターアゴニスト、あるいはＰＫ２プロモーター活性モジュレーターが概日リズムを調節するかどうかを評価するとき、化合物での処置前および後の概日リズム機能指標の値の相違を測定することができる。概日リズムを調節するために有効なＰＫ２レセプターアンタゴニストまたはＰＫ２レセプターアゴニスト、あるいはＰＫ２プロモーター活性モジュレーターの量は、少なくとも１０％で概日リズム機能の測定指標を調節するのに有効な量である。例えば、少なくとも複数の処置動物で、概日リズム機能の測定指標を少なくとも２０％、少なくとも５０％、例えば少なくとも８０％増加または減少させることができる。  
【０１１４】
動物で概日リズム評価するための方法は、個体がＰＫ２レセプターアンタゴニストまたはＰＫ２レセプターアゴニストでの処置用の候補であるかどうかを決定することと、ＰＫ２レセプターアンタゴニストまたはＰＫ２レセプターアゴニスト、あるいはＰＫ２プロモーター調節化合物の投与への個体の応答を評価することとのために様々な概日リズム障害を診断する上で有用である。
【０１１５】
概日リズム障害を診断するための方法は、当業者に周知である。概日リズム障害については、例えばＴｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１７ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｅｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｅｒｋｏｗ(Ｅｄｓ．），Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ.（１９９９）に記載されている。ＰＫ２レセプターアンタゴニストまたはＰＫ２レセプターアゴニスト、あるいはＰＫ２プロモーター調節化合物によって治療可能な概日リズム障害としては、１次的（原発性）または２次的（症候性、既知の障害に関連する）、あるいは遺伝性または散発性であり得る薬物誘導概日リズム障害が挙げられる。具体的には、概日リズム睡眠障害は、２４時間性日内での睡眠のタイミングに関連する障害である。これらの障害のうちいくつかは、個体の制御（例えば交代制勤務または時間帯急変）下にある睡眠期間のタイミングに影響される。他のものには、神経メカニズムの障害がある（例えば不規則睡眠・覚醒パターンおよび睡眠相前進症候群）。当業者は、ＰＫ２レセプターアンタゴニストまたはＰＫ２レセプターアゴニストでの処置が有益となる概日リズム機能障害を有する個体を同定することができ、該個体としては、覚醒を高めるＰＫ２レセプターアンタゴニストまたは睡眠を高めるＰＫ２レセプターアゴニストでの処置が有益となり得る概日リズム睡眠障害を有するものが挙げられる。
【０１１６】
上記に記載されるように、様々な概日リズム機能障害は、個体での睡眠の質または量の減少に至る可能性がある。非２４時間型睡眠・覚醒症候群、時間帯急変症候群、交代制勤務性症候群、睡眠相後退症候群、睡眠相前進症候群、不規則型睡眠・覚醒パターン症候群、および振幅の減少に関連する症候群等のヒトの概日リズム睡眠障害は、異常睡眠および覚醒パターンによって特徴づけられ、覚醒の増加または睡眠の増加が必要になる可能性がある。さらに、慢性的苦痛およびうつ病状態等の医学的および精神医学的状態は、概日リズムに影響を及ぼし、睡眠の質または量の減少を引き起こす。さらに、ＳＣＮでのＰＫ２の発現は、実施例ＸＩに示すように、日長情報をコード化することができるので、ＰＫ２レセプター活性の調節は、季節性感情障害等の障害を治療する季節リズム調節を変化させるために有用である。さらに、様々な状態を治療するために用いられる薬物療法は、概日リズムに影響を及ぼして、睡眠の質または量の減少を引き起こすことができる。本発明の方法で概日リズムを調節する化合物として同定されるＰＫ２レセプターアンタゴニストまたはＰＫ２レセプターアゴニスト、あるいはＰＫ２プロモーター調節化合物を用いて、動物、特定のヒトでのそのような障害を治療することができる。
【０１１７】
ＰＫ２遺伝子発現を増加させるＰＫ２レセプターアゴニストまたはＰＫ２プロモーター調節化合物を用いて、動物が覚醒の増加または睡眠の減少を経験するように動物の概日リズムを調節することができる。ＰＫ２を含むＰＫ２レセプターアゴニストで治療される動物または個体は、覚醒の増加が身体的または心理的に有益となるものであり得る。例えば、覚醒の増加は、眠気を有するか、眠り込む傾向があるか、または過度に深く眠りこむと感じる個体で必要とされ得る。不規則な勤務時間または交代性勤務によって引き起こされる症状等の生活様式誘導概日リズム障害を有する個体では、覚醒の必要性が生じ得る。個体は、覚醒を増加させて、長距離運転、交代性勤務、学習等で精神的または身体的活動での能力を高めることを所望するであろう。覚醒の必要性は、不都合な薬物反応と同様に過度の日中の眠気を引き起こす生物学的に基づいた概日リズム障害が原因であり得る。したがって、本発明の方法を用いて同定される組成物を用いて、このような障害および状態の症状を改善することができる。  
【０１１８】
ＰＫ２遺伝子発現を減少させるＰＫ２レセプターアンタゴニストまたはＰＫ２プロモーター調節化合物を用いて、動物が睡眠の増加または覚醒の減少を経験するように動物の概日リズムを調節することができる。したがって、ＰＫ２レセプターアンタゴニストで治療される動物または個体は、睡眠の質または量の増加が身体的または心理的に有益となり得るものである。例えば、能力が減少されて、眠り込むか、寝たままでいるか、朝に望むより早く覚醒する傾向にあるか、光を感知するか、または睡眠によって体力が回復されないような減少したまたは不十分な睡眠の質または量を有する動物または個体は、睡眠の質または量の増加が身体的または心理的に有益となり得る。したがって、本発明の方法を用いて同定される組成物を用いて、そのような障害または状態の症状を改善することができる。  
【０１１９】
当業者は、概日リズムを調節する本発明の方法によって同定されるＰＲ２レセプターアンタゴニストまたはアンタゴニストを投与することが適当である他の状態を測定することができ、かつ治療の安全性および効果をモニターすることができる。
【０１２０】
ＰＫ２レセプターアンタゴニストおよびアゴニスト、ならびにＰＫ２プロモーター調節化合物等の化合物を、概日リズムを調節するそれらの能力に関して、動物に投与することによって評価することができる。そのような化合物は、異常性概日リズムに関連する状態を有するもの等の個体に投与することができる潜在的な治療用化合物であり得る。したがって、本発明の方法は、ＰＲ２レセプターアゴニストまたはアンタゴニスト、あるいは他の化合物を含有する医薬組成物を動物に投与することを含むことができ、該動物としては、家畜動物、実験動物、またはヒトが挙げられる。化合物が概日リズムの指標を調節するかどうかを測定するために、概日リズム機能の検出可能な指標を有する種々の動物を用いて本発明の方法を実施することができる。典型的な動物および概日リズムの指標は、上記に記載されている。発症前研究に対して、ヒト疾患の確かなモデルとして機能する動物を用いて本発明の方法を実施することができ、該動物としては、非ヒト霊長類、ブタ、イヌ、ネコ、ハムスター、およびげっ歯類（例えば、ラット、マウス、およびテンジクネズミ）がある。当業者には、動物が対象ヒト疾患に対する適当なモデルとして機能することが理解される。
【０１２１】
治療条件に適当な方法および量で同定化合物を配合および投与することができる。該治療条件は、体重、性別、年齢、および個体の健康状態と、生化学的性質、生物活性、生物学的利用効率、および特定の化合物の副作用と、並行する治療用生活規則に適合する方法とである。本明細書に記載されるインビトロ結合およびシグナル伝達アッセイでの化合物の活性に基づいて、または特定の障害の識別動物モデルから、ヒトでの特定の治療適用に対する適当な量および配合を推定することができる。
【０１２２】
単一投与量としてまたは比較的短期間の時間にわたる注入によって、治療用化合物を含む化合物の全量を投与することができ、あるいはより長期の時間にわたって投与される複数回の投与量で投与することができる。さらに、標的組織部位にまたは近くに全身送達用に移植され得る徐放性マトリックスで該化合物を投与することができる。治療薬を含む化合物の制御放出に有用と考察されるマトリックスは当技術で周知であり、デポフォーム（ＤｅｐｏＦｏａｍＴＭ）、生体高分子、マイクロポンプ等の物質を含む。
【０１２３】
当技術で既知の経路によって治療用化合物を含む化合物を哺乳類に投与することができ、
該経路としては、例えば静脈内、筋肉内、皮下、眼窩内、皮膜内、腹腔内、嚢内、関節内、脳内、経口、腟内、直腸的、指向性、鼻腔内、または経皮が挙げられる。ヒト投与に好適な経路は、経口および静脈内投与であり、経口経路が特に好ましい。
【０１２４】
一般に、治療用化合物を含む化合物を、該化合物および製薬的に許容される担体を有する医薬組成物として動物に投与する。製薬的に許容される担体の選択は、化合物の投与経路と、その特定の物理学的および化学的特性とに依存する。製薬的に許容される担体は、当技術で周知であり、生物学的緩衝生理食塩水等の無菌水溶性溶媒と、グリコール、グリセロール、オリーブ油等の油、および注入可能有機エステル等の他の溶媒または運搬体（ｖｅｈｉｃｌｅ）とを含む。製薬的に許容される担体は、化合物を安定化するか、その溶解性を増加させるか、またはその吸収性を増加させる生物学的に許容される化合物をさらに含有することができる。そのような生物学的に許容される化合物としては、グルコース、ショ糖、またはデトラインズ（ｄｅｔｒａｉｎｓ）等の糖質と、アスコルビン酸またはグルタチオン等の酸化防止剤と、キレート剤と、低分子量タンパク質とが挙げられる。
【０１２５】
血液脳関門を横断するためまたは細胞膜を横断するための化合物および組成物を必要とする適用のために、化合物の親油性を増加させる配合が特に望ましい。例えば、本発明の化合物をリポソーム中に組み込むことができる（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ.Ｉ  ｔｏ  ＩＩＩ，２ｎｄ  ｅｄ.（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ  ＦＬ(１９９３））。リン脂質または他の脂質からなるリポソームは、非毒性の、生物学的に許容される、かつ代謝可能な担体であり、作製および投与が比較的容易である。
【０１２６】
概日リズム機能障害治療を施すために、最大症状制御用に１つ以上の治療アプローチまたは化合物を個体に与えることができる。したがって、概日リズム機能を調節する際に用いるために、ＰＫ２レセプターアンタゴニストまたはＰＫ２レセプターアゴニスト、あるいはＰＫ２プロモーター・モジュレーターを、別の治療形態と同時にまたは連続して、有利に投与することができ、あるいは同一または関連症状を制御する第２の化合物とともに配合することができる。例えば、概日リズム睡眠障害を治療するとき、ＰＫ２レセプターアンタゴニストまたはＰＫ２レセプターアゴニストを投与することができる一方で、個体は光療法、薬物療法等を受ける。概日リズムを調節する方法として考えられるものは、ＰＫ２レセプターアンタゴニストまたはＰＫ２レセプターアゴニストを単独で、そのような他の化合物と組み合わせて、または連続して投与することを含む。当業者は、ＰＫ２レセプターアンタゴニストまたはＰＫ２レセプターアゴニストとともに用いるために適当な同時または連続療法を決定することができる。
【０１２７】
本発明のスクリーニング法を用いて同定されるＰＫ２レセプターアンタゴニストおよびアゴニストは、概日リズム機能を調製することとは別にまたは加えて、有益な活性を有することが予期される。実施例Ｖに記載されるように、高度のＰＫ２レセプター発現が脳の異なる位置で観測されている。具体的には、ＰＫ２レセプターは、ＳＣＮ、視床下部核（ＰＶＮ）、背内側視床下部核（ＤＭＨ）、脳質周囲視床および終末傍核（ＰＶＴ／ＰＴ）、中心傍核（ＰＣ），、外側手綱核（ＬＨｂ）、ならびに外側中隔核（ＬＳ）で高度に発現する（図５および６参照）。
【０１２８】
本発明は、マウスＰＫ２レセプターポリペプチドをコードする単離核酸分子も提供する。上記に記載されるように、配列番号１として参照されるヌクレオチドにコードされる配列番号２として参照されるアミノ酸配列を有するもの等のマウスＰＫ２レセプターは、Ｇタンパク質共役シグナル伝達経路を介してＰＫ２およびシグナルと結合すること、およびマウスでの概日リズムを調節することができる。  
【０１２９】
本発明は、異種ヌクレオチド配列に作用自在に結合することができるＰＫ２遺伝子プロモーターを含有する単離核酸分子をさらに提供する。典型的なヒトおよびマウスＰＫ２遺伝子プロモーターとしては、ヒトＰＫ２プロモーター（配列番号１４）、ヒトＰＫ２  ２．８ｋｂプロモーター（配列番号１５）、マウスＰＫ２プロモーター（配列番号１６）、マウス２．８ｋｂ  ＰＫ２プロモーター（配列番号１７）、マウス１８８ｂｐ  ＰＫ２プロモーター（配列番号１８）、および互いに結合するヒトＰＫ２プロモーターの４つのヒトＥボックス・エンハンサー・エレメントを含有する７２ｂｐプロモーター（配列番号１９）が挙げられる。
【０１３０】
本明細書で示されるように、ＰＫ２遺伝子発現は、概日様式で調節される（実施例Ｉ、ＩＩ、およびＩＶを参照せよ）。このように、ＰＫ２プロモーターは、概日様式で種々の遺伝子を周期的に調節するために有用である。例えば、ＰＫ２プロモーターを用いて、治療用遺伝子の発現を調節することができる。例えば個体が活動的である日中等の日中の特定の時間中で遺伝子産物の存在が最も有益であるとき、治療用遺伝子の周期的発現は有利である。
【０１３１】
ＰＫ２プロモーターを種々の異種ヌクレオチド配列に作用自在に結合させることができ、該異種ヌクレオチド配列は、例えばレポーター核酸、アンチセンス核酸、治療用ポリペプチドをコードする核酸、または概日様式で調節される他の配列であり得る。典型的レポーター核酸は、スクリーニング法でのＰＫ２プロモーターの使用に関連して上記に記載されている。  
【０１３２】
本発明の核酸分子は、種々のスクリーニング適用にも適している。例えば、本発明の核酸分子を本明細書に記載されるスクリーニング・アッセイで用いることができる。例えば、ＰＫ２遺伝子プロモーターを含有する本発明の核酸分子を用いて、ＰＫ２遺伝子プロモーター活性を調節する化合物を同定することができる。さらに、マウスＰＫ２レセプターをコードする本発明の核酸分子をスクリーニング・アッセイで用いられる細胞で発現させることができ、またはコードされるＰＫ２ポリペプチドをスクリーニング・アッセイで用いるために単離することができる。マウスＰＫ２レセプターをコードする本発明の核酸分子をプローブまたはプライマーとして用いて、他の種から、ＰＫ２をコードする核酸分子を同定および単離すること、または関連分子を構造的に同定することもできる。
【０１３３】
本明細書で使用されるように、用語「単離核酸分子」とは、該核酸分子を、人の手操作によって、核酸分子がその天然環境で見出される様式から変化させることを意味することが意図される。例えば、単離核酸分子は、外来核酸配列に作用自在に結合する分子であり得る。単離核酸分子は、その正常フランキング核酸配列のいくつかまたは全てから除去される分子でもあり得る。
【０１３４】
単離分子は、代替的にまたは付加的に「実質的に純粋な」分子でありえ、その際、該分子は、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％で、分子が天然に関連する細胞成分を含まない。単離核酸分子は、固相に連結される（例えば、ＤＮＡアレイの成分として）緩衝溶液、懸濁液、凍結乾燥粉末中、または細胞中等の任意の形態で存在し得る。
【０１３５】
本明細書で使用されるように、用語「核酸分子」とは、天然または合成起原の、オリゴヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを指し、これは、一本鎖または二重鎖でありえ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡに対応することができ、かつセンスまたはアンチセンス鎖あるいは両方を表すことができる。
【０１３６】
用語「核酸分子」とは、塩基、糖、またはリン酸部分に対する修飾を有するか、あるいは１つ以上の非天然結合（ホスホロチオエート結合等）を有するヌクレオチド等の１つ以上の非天然ヌクレオチドを含有する核酸分子を含むことが意図される。そのような修飾は、核酸分子の安定性を増加させるとき、特にハイブリダイゼーション適用で用いられるとき有利であり得る。
【０１３７】
さらに、用語「核酸分子」とは、放射性標識、蛍光色素、強磁性物質、発光タグ、または検出可能結合因子（ビオチン等）等の検出可能部を含有するように修飾された核酸分子を含むことが意図される。そのような部を含有する核酸分子は、ＰＫ２レセプター核酸分子の存在または発現を検出するためのプローブとして有用である。
【０１３８】
配列番号１の核酸分子は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＭ＿０６６１０４およびＡＬ１２１７５５によって示される配列を含む公に利用可能なデータベースに存在するＥＳＴの正確な配列からは構成されていない。同様に、配列番号１４の核酸分子は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＣ０９６９７０．２、ＡＦ１８２０６７．１、およびＡＣ０１０２０７．１８によって示される配列を含む公に利用可能なデータベースに存在するＥＳＴの正確な配列からは構成されていない。
【０１３９】
本発明は、配列番号１および１４由来の少なくとも１７の隣接ヌクレオチドまたはその相補物を含有する単離オリゴヌクレオチドをさらに提供する。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、核酸分子を検出または単離するためのシーケンシング・プライマー、ＰＣＲプライマー、およびハイブリダイゼーション・プローブとして有用である十分な長さのものである。例えば、配列番号１のオリゴヌクレオチドを用いて、ＰＫ２レセプターポリペプチドをコードする核酸分子を検出または単離することができ、該オリゴヌクレオチドは、ＰＫ２レセプター発現を阻害するための治療用アンチセンス試薬としても有用である。このようなオリゴヌクレオチドは、必須ではないが、動物での概日リズム機能を調節することができるＰＫ２レセプターポリペプチドをコードすることができる。配列番号１４のオリゴヌクレオチドを用いて、ＰＫ２プロモーターを含有する核酸分子を検出または単離することができ、該オリゴヌクレオチドは、概日リズムを調節する化合物を同定するための本発明のスクリーニング法でも有用である。当業者は、特定の適用のために、本発明のオリゴヌクレオチドの適当な長さおよび配列を決定することができる。
【０１４０】
本明細書で使用されるように、用語「オリゴヌクレオチド」とは、参照配列由来の少なくとも１７の隣接ヌクレオチドを含有する核酸分子を指し、これは、必須ではないが、機能的ポリペプチドをコードすることができる。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号１または１４、あるいはそれらの相補物由来の３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、または３００を少なくともまたは上回る隣接ヌクレオチド等の少なくとも１７、２０、２２、または２５の隣接ヌクレオチドを含有することができる。配列番号１のオリゴヌクレオチドは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＭ＿０６６１０４およびＡＬ１２１７５５によって示される配列を含む公に利用可能なデータベースに存在するＥＳＴの正確な配列からは構成されていない。同様に、配列番号１４のオリゴヌクレオチドは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＣ０９６９７０．２、ＡＦ１８２０６７．１、およびＡＣ０１０２０７．１８によって示される配列を含む公に利用可能なデータベースに存在するＥＳＴの正確な配列からは構成されていない。
【０１４１】
特定の適用のためには、標的核酸分子に特異的にハイブリダイズする本発明の単離オリゴヌクレオチド分子を用いることが望ましい。例えば、サンプルでのＰＫ２レセプター発現を検出するためには、ＰＫ２レセプターをコードする核酸分子に特異的にハイブリダイズする本発明の単離オリゴヌクレオチド分子を用いることが望ましい。同様に、ＰＫ２プロモーター等の非発現核酸をサンプルで検出するためには、ＰＫ２プロモーターを含有する核酸分子に特異的にハイブリダイズする本発明の単離オリゴヌクレオチド分子を用いることが望ましい。
【０１４２】
本明細書で使用されるように、用語「特異的にハイブリダイズする」とは、上記に記載されるような中ストリンジェント条件下で、ＰＫ２レセプターまたはＰＫ２プロモーター核酸分子ではない核酸分子（アクチンｃＤＮＡ等）への同一条件下でのそれぞれへのハイブリダイゼーションなしに、参照ＰＫ２レセプター核酸分子（配列番号１）またはＰＫ２プロモーター核酸分子（配列番号１４）にハイブリダイズする核酸分子の能力を指す。
【０１４３】
本明細書で使用されるように、用語「ストリンジェント条件」とは、５０％ホルムアミド、５ｘデンハート溶液（Ｄｅｎｈａｒｔ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、５ｘＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを含有する溶液内での４２℃での核酸へのフィルター結合核酸分子のハイブリダイゼーション後に、６５℃で３０分間０．１ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳでフィルターを洗浄することと等価の条件を指す。上述のストリンジェント条件と等価の条件は、当技術で周知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ:Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ(１９９２）に記載されている。
【０１４４】
本発明の核酸分子、あるいはＰＫ２レセプターアゴニストまたはアンタゴニストである核酸分子を調製するための方法としては、自動化方法等の周知の化学的合成方法と、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ:Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ(２００１）;Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ.（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ(Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ４７），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ(１９９９））に記載されるもの等の組み換え方法とが挙げられる。単離マウスＰＫ２レセプター核酸、ヒトＰＫプロモーター領域核酸、または他の核酸分子を調製するための典型的方法には、特異的プライマーおよびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いた核酸分子の増幅が伴われる。ＰＣＲを用いて、少数のＤＮＡまたはＲＮＡ分子（単一細胞由来等の）のみから始まって、任意の所望の境界を有する核酸分子を指数関数的に増幅することができる。縮重プライマーを用いた他の種での所定の核酸分子のホモログを単離する方法を含むＰＣＲ法は、当技術で周知である。
【０１４５】
また、検出可能な核酸分子または抗体を用いて、ゲノム・ライブラリ、ｃＤＮＡライブラリ、または発現ライブラリ等のライブラリをスクリーニングすることによって単離核酸分子を調製することができる。ヒト・ライブラリおよび多様な哺乳類種に由来するライブラリは市販されており、あるいは対象種または細胞から生産することができる。特定の核酸分子を含有するとして同定されたライブラリ・クローンを通常の方法によって単離、サブクローニング、またはシーケンシングすることができる。
【０１４６】
さらに、本発明の単離核酸分子または本発明の方法で用いられる核酸分子を直接合成方法によって調製することができる。例えば、当技術で機知の自動合成方法によって、１つの断片または複数の断片で一本鎖核酸分子を化学的に合成することができる。同様に、１つ以上の断片で相補鎖を合成することができ、該相補鎖をアニーリングすることによって二重鎖分子を作製することができる。直接合成は、プローブまたはプライマー等の比較的短い分子を生産するために特に有利であり、修飾ヌクレオチドまたは結合を含有する核酸分子を生産するためにも有利である。
【０１４７】
本発明は、マウスＰＫ２レセプターポリペプチドをコードする単離核酸分子（配列番号１）を含有するベクターを提供する。本発明は、ヒトＰＫ２遺伝子プロモーター領域を含有する単離核酸分子（配列番号１４）を含有するベクターも提供する。典型的ベクターとしては、ウイルスに由来するベクター（バクテリオファージ、バキュロウィルス、またはレトロウイルス等）、ならびに細菌に由来するまたは細菌配列および他の生物からの配列を組み合わせに由来するベクター（コスミドまたはプラスミド等）が挙げられる。本発明のベクターは概ね、対象宿主細胞に適合する複製起点、転写停止およびＲＮＡプロセッシング・シグナル、対象宿主細胞に適合する１つ以上の選択可能マーカー、ならびに１つ以上の複数クローニング部位等のエレメントを含有する。任意で、該ベクターは、ＧＳＴタグ等のタグ配列をコードする配列および／またはＦａｃｔｏｒ  Ｘａ部位等のプロテアーゼ切断部位をさらに含有し、これらによってコードされるポリペプチドの発現および精製が容易になる。
【０１４８】
ベクターに含むべき特定のエレメントの選択は、対象宿主細胞、挿入サイズ、挿入配列の発現を所望するかどうか、ベクターの所望のコピー数、所望の選択系等の因子に依存する。異なる適用のための宿主細胞およびベクター間の適合性を確認する際伴われる因子は、当技術で周知である。
【０１４９】
コードされるポリペプチドの組み換え型発現用にベクターを用いる適用では、単離核酸分子は概ね、ベクターまたは挿入核酸分子中に存在し得る遺伝子発現プロモーターに作用自在に結合する。本発明の核酸分子に作用自在に結合するプロモーターの選択は、対象適用に依存し、かつ当業者によって決定され得る。例えば、特定の遺伝子産物が特定の宿主細胞に有害である場合、遺伝子の発現を開始または停止させることができるように調節プロモーターに本発明の核酸分子を結合させることが望ましい。また、微弱または強力な構成性プロモーターによって駆動される発現を持つことが好ましい。哺乳類細胞系に適した典型的なプロモーターとしては、例えばＳＶ４０初期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）ステロイド誘導性プロモーター、およびモロニー・マウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）プロモーターが挙げられる。細菌細胞系に適した典型的なプロモーターとしては、例えばＴ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃプロモーター、およびｔｒｐプロモーターが挙げられる。
【０１５０】
マウスＰＫ２レセプターポリペプチドをコードする単離核酸分子を含有する細胞も提供する。単離核酸分子は、一般に、ベクター内に含まれる。単離核酸分子をエピソーム的に維持すること、または宿主細胞ゲノムに組み込むことができる。
【０１５１】
本発明の細胞を、例えば、単離核酸分子の伸長、サブクローニング、または修飾等の分子生物学での適用のために用いることができる。このような適用に対しては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の実験用種等の細菌細胞が有用であり、コードされるポリペプチドの発現は必要ない。
【０１５２】
本発明の細胞を有利に用いて、コードされるポリペプチドを組み換え的に発現させ、単離することもできる。そのような適用のためには、細菌細胞（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、昆虫細胞（例えばショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）およびチョウ目（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｕｇｉｐｅｒｄａ））、酵母細胞（例えばＳ．セレビシエ（Ｓ.ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓ．ポンベ（Ｓ.ｐｏｍｂｅ）、またはピッチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ））、および脊椎動物細胞（例えば、哺乳類プライマリ細胞および樹立細胞系（ＣＨＯ、２９３、およびＣＯＳ細胞等）、ならびに両生類細胞（アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）胚および卵母細胞等））がある。
【０１５３】
本発明は、配列番号１として参照されるヌクレオチド配列にコードされる単離マウスＰＫ２レセプターポリペプチドおよびその縮重変異体を提供する。単離マウスＰＫ２レセプターポリペプチドをアッセイで用いて、ＰＫ２レセプターアンタゴニストまたはＰＫ２レセプターアゴニストを同定することができる。
【０１５４】
本発明は、ＰＫ２レセプターアゴニストおよびアンタゴニストを同定するアッセイで用いるために適した組成物も提供する。好適な組成物は、マウスＰＫ２またはＰＫ１レセプターおよびＰＫ２またはＰＫ１ポリペプチドを含有する単離組織、単離細胞、または細胞調製物を含有する。スクリーニングに適した組成物は、ＰＫ２またはＰＫ１ポリペプチドと組み合わせて、ＰＫ２またはＰＫ１レセプターを含有することができる。例えば、好適な組み合わせとしては、ＰＫ１またはＰＫ２およびＰＫ２レセプターの組み合わせと、ＰＫ１またはＰＫ２およびＰＫ１レセプターの組み合わせとが挙げられる。これらの組み合わせの任意のものを用いて、ＰＫ２レセプターアンタゴニストまたはＰＫ２レセプターアゴニストである化合物を同定することができる。この理由は、ＰＫ１レセプターおよびＰＫ２レセプターは、構造的に類似しており、双方ともＰＫ１およびＰＫに結合し、かつ配列番号２０および２１等のＰＫ１／ＰＫ２キメラに結合するためである。本発明の組成物に含まれるＰＫ２レセプターは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＭ＿０６６１０４およびＡＬ１２１７５５によって示されるアミノ酸配列を含む公に利用可能なデータベースに存在するＥＳＴの正確な配列を含まない。同様に、本発明の組成物に含まれるＰＫ１レセプターは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０２１３８１、ＡＦ２３６０８２、およびＸＭ＿０６６１０４によって示されるアミノ酸配列を含む公に利用可能なデータベースに存在するＥＳＴの正確な配列を含まない。
【０１５５】
上記の組成物に含まれるＰＫ２またはＰＫ１レセプターは、例えば、マウスまたはヒトレセプター等の哺乳類ＰＫ２レセプターまたはＰＫ１レセプターであり得る。典型的なマウスＰＫ２およびＰＫ１レセプターポリペプチド配列としてはそれぞれ、配列番号２および４として参照されるものが挙げられる。該組成物に含まれるＰＫ２またはＰＫ１ポリペプチドは、ＰＫ２レセプター、ＰＫ１レセプター、または両方に結合する。典型的なＰＫ２ポリペプチドとしては、配列番号５および６として参照されるヒトＰＫ２、ならびに配列番号７および８として参照されるマウスＰＫ２が挙げられる。典型的なＰＫ１ポリペプチドとしては、配列番号９として参照されるヒトＰＫ１、および配列番号１０として参照されるマウスＰＫ１が挙げられる。ＰＫ２レセプターまたはＰＫ１レセプターに結合するＢｖ８（配列番号１１および１２）およびＭＩＴ１（配列番号１３）等のＰＫ１およびＰＫ２のオーソログも本発明の組成物に含むことができる。任意で、本発明の組成物中のＰＫ１またはＰＫ２を検出可能に標識することができる。
【０１５６】
本発明の組成物は、ＰＫ２レセプターまたはＰＫ１レセプターを含有する細胞の未精製または部分的精製ライセートまたは抽出物と、ＰＫ２レセプターまたはＰＫ１レセプターを含有する再構成シグナル伝達系とを含むことができる。人工シグナル伝達系としては、例えばリポソームまたはミセル等の天然または人工脂質二重層が挙げられ、これは、ＰＫ２レセプターの活性コンフォメーションを高める。該組成物は、所望する所定のシグナルを生産および検出するために必要な細胞断片または単離成分をさらに含有することができる。
【０１５７】
本発明の組成物は、ＰＫ１レセプターおよびＰＫ２レセプター両方、ならびにＰＫ１およびＰＫ２両方あるいは別のＰＫ１レセプターまたはＰＫ２レセプターアゴニスト（ＰＫ２／ＰＫ１キメラ等）をさらに含有することができる。
【０１５８】
本発明の様々な実施形態の作用に実質的に影響を及ぼさない変更も本明細書に提供される本発明の定義内に含まれることが理解される。したがって、以下の実施例は、本発明を説明することを意図しており、限定することを意図しない。
【実施例】
【０１５９】
実施例Ｉ
視交叉上核（ＳＣＮ）でのプロキネチシン２（ＰＫ２）のリズム性発現
この実施例によって、ＰＫ２ｍＲＮＡがマウスのＳＣＮ内でリズム的に発現することを示す。
【０１６０】
インサイチュハイブリダイゼーションを用いて、マウス脳でマウスＰＫ２ｍＲＮＡ転写物を検出した。マウスＰＫ２のコーディング領域またはマウスＰＫＲ２の３’ＵＴＲ（非翻訳領域）を含有するアンチセンスおよびセンス・リボプローブを生成した。ＰＫＲ１およびＰＫＲ２の３’ＵＴＲを用いた。これは、それらのコーディング領域中の核酸配列値で、それらのレセプターは８０パーセントを超えて同一であるためである。（Ｗｉｎｚｅｒ−Ｓｅｒｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ.Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ３：２２９−４１(１９９９））に記載されているようにインサイチュハイブリダイゼーションを処置した。オートラジオグラムおよびエマルジョン浸漬切片でｍＲＮＡ分布を分析した。ビデオ・ベース・コンピューター画像解析装置（ＭＣＩＤ，Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔ.Ｃａｔｈａｒｉｎｅ’ｓ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）を用いて、特異的ハイブリダイゼーション・シグナルを定量的に分析した。１４Ｃ−標準物質を用いて、光学濃度対放射能の検量線（ｄｐｍ／ｍｇ組織湿重量）を構築した。ハイブリダイゼーション・シグナルを持たない隣接脳領域から得たバックグラウンド値を引いて、ＳＣＮでの特異的ハイブリダイゼーション・シグナルを得た。ＳＣＮの等しい領域中のシグナル強度間の相違に関してデータを正規化した。
【０１６１】
これらのインサイチュハイブリダイゼーション研究から得られた結果によって、ＰＫ２ｍＲＮＡがＳＣＮと、カエハ島、視床下部の内側視索前野、および側座核シェルを含む他の別な脳領域とに存在することが示された。図１ａは、マウス脳の冠状縫合切断（２０μｍ）でのＰＫ２ｍＲＮＡ発現を示す。側座核（ＮＡｃ）、カエハ島（ＩＣｊ）、内側視索前野（ＭＰＡ）、および視交叉上核（ＳＣＮ）を図１ａに示す（スケール・バー＝２  ｍｍ）。
【０１６２】
ＳＣＮ内のＰＫ２ｍＲＮＡの存在の時間依存性を決定するために、１２時間明期：１２時間暗期（ＬＤ）サイクル下で雄成体Ｃ５７Ｂ１６マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を同調させた。様々な時間点でのＳＣＮ内のＰＫ２ｍＲＮＡの定量化によって、ＬＤでの概日発振プロフィルの存在が示された。ＬＤあるいは２日間（２ＤＤ）または８日間（８ＤＤ）の恒暗下で動物を調査した。図１ｂは、ＳＣＮでのＰＫ２ｍＲＮＡの一時的プロフィルを示す。各値は、３〜６匹の動物の平均±標準誤差であり、ＺＴ／ＣＴ１〜７でのデータは、二重にプロットされている。陰影および囲まれた横棒はそれぞれ、明期および暗期期間を示す。図１ｂに示されるように、ＰＫ２ｍＲＮＡは、明期位相（ＺＴ１〜ＺＴ７）（ＺＴ＝ツァイトゲーバー時間、ＺＴ０＝明期開始、ＺＴ１２＝明期停止）中で最も高く、かつ暗期位相（ＺＴ１３−ＺＴ１２）中で最も低いことが認められた。ＰＫ２ｍＲＮＡの振幅は、最低値より少なくとも５０倍高いピーク値で高いことが認められた。図１ｃは、図１ｂに記載したＰＫ２ｍＲＮＡ発現の代表的な形を示す（スケール・バー＝１ｍｍ）。図１ｃは、暗期位相中ではＰＫ２ｍＲＮＡ値がＳＣＮ内で基本的に検出不可能であったことを示す。ＰＫ２発現の発振は、内側視索前野またはカエハ島等の他のＰＫ２ｍＲＮＡ陽性領域では検出されなかった（図１ｃ）。密接関連ＰＫ１ｍＲＮＡは、ＳＣＮを含む実験脳領域内で、検出可能な値では発現しなかった。
【０１６３】
ＰＫ２ｍＲＮＡの発振は、恒暗（ＤＤ）下で維持された（図１ｂ、ｃ）。ＤＤでの２日後、ＰＫ２ｍＲＮＡ値は、ＣＴ１〜ＣＴ７（ＣＴ＝概日時間、ＣＴ０＝主観的明期開始、ＣＴ１２＝主観的明期停止）で高く、ＣＴ１３〜ＣＴ２２で低いままであった。しかし、ＤＤでの８日後、低ＰＫ２発現の期間は、ＬＤでの約９時間から１２時間に拡大し、ピーク値でのわずかな減少があった。ＳＣＮでのＰＫ２ｍＲＮＡの強力な概日プロフィルは、ＰＫ２がＳＣＮ概日ペースメーカーおよび／またはその出力を調節していることを示す。
【０１６４】
要約すると、この実施例によって、マウスのＳＣＮ内のＰＫ２ｍＲＮＡの存在は、概日発振プロフィルに一致することが示される。
【０１６５】
実施例ＩＩ
時計遺伝子によるＰＫ２転写の調節
この実施例によって、ＰＫ２遺伝子転写が時計遺伝子によって調節されていることを示す。
【０１６６】
ヒトＰＫ２遺伝子のプロモーター配列を実験して（Ｊｉｌｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ２５６：１８９−９５(２０００））、ＣＬＯＣＫ−ＢＭＡＬ１媒介転写活性化でのＥボックス・エンハンサーの役割を決定した（Ｇｅｋａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０：１５６４−６９(１９９８）；およびＨｏｇｅｎｅｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ  ９５；５４７４−７９(１９９８））。図２ａは、マウスＰＫ２遺伝子の５’−フランキング領域の２．４ｋｂ内で同定された４つのＥボックス（Ｅ）およびｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）の位置を示す。番号軸は、０として示される推定転写開始部位からのキロ塩基対（ｋｂ）での距離を表す。４つのＥボックス全ては、マウスＰＫ２遺伝子の５’−フランキング領域中に保存されている。ＧｅｎＢａｎｋ調査によって、これら４つのＥボックス・エレメントは、４つのＥボックスそれぞれのおおよその位置を含むマウスＰＫ２遺伝子の５’−フランキング配列中に保存されていることが示された。密接関連ＰＫ１遺伝子の５ｋｂ  ５’−フランキング領域では、Ｅボックス配列は同定されなかった。
【０１６７】
Ｅボックス・エンハンサーを介してＰＫ２転写を駆動するＣＬＯＣＫ：ＢＭＡＬ１ヘテロダイマーの能力を実験するために、マウスＰＫ２の５’−フランキング領域の２．８ｋｂフラグメントを、プロモーター非含有ルシフェラーゼ・レボーター・ベクター（ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ）中にクローニングした。
【０１６８】
マウスＰＫ２プロモーターの転写活性を高める転写因子の能力を実験した。マウスＰＫ２遺伝子の５’−フランキング領域の２．８ｋｂ（ＰＫ２．８−Ｌｕｃ）および２００ｂｐ（ＰＫ０．２−Ｌｕｃ）に結合するルシフェラーゼ・レポーターの転写活性化を調査した。さらに、ルシフェラーゼ・レポーターを突然変異Ｅボックス（ＧＧＡＴＣＴ）（ＰＫ０．２Ｍ−Ｌｕｃ）に結合させた。
【０１６９】
１０％仔ウシ血清を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中でＨＥＫ２９３およびＮＩＨ３Ｔ３細胞を増殖させた。細胞をプレートして、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて６ウエル・プレート中でトランスフェクションした。蛍ルシフェラーゼ・レポーター・プラスミドを１０ｎｇと、ｍＢｍａｌ１およびｍＣｌｏｃｋを２５０ｎｇと、ｍＰｅｒ１、ｍＰｅｒ２、ｍＰｅｒ３、ｍＣｒｙ１、およびｍＣｒｙ２を５００ｎｇとを用いた。ＤＮＡ全量（ウエル毎に１ｍｇ）を担体としてのｐｃＤＮＡ３．１ベクターを用いて調整した。トランスフェクション後４８時間で、細胞を洗浄して、レポーター溶解緩衝液２００μｌを用いて溶解した。細胞抽出物の部分（２０μｌ）をルシフェラーゼ・アッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）と混和して、モノライト２０１０ルミノメーター（Ｍｏｎｏｌｉｇｈｔ  ２０１０  ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）中で１０秒間反応をモニターした。チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびＰＫＲ２を安定的に発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ＰＫＲ２）に対して、α−ＭＥＭ中で細胞を増殖させ、ＨＥＫ２９３およびＮＩＨ３Ｔ３細胞と同様の方法でトランスフェクションした。トランスフェクション後４２時間で、増加性濃度の精製組み換えマウスＰＫ２（０〜５０ｎＭ）で６時間細胞を処置して、その後溶解した。ルシフェラーゼ活性をタンパク質濃度に正規化した。  
【０１７０】
図２ｂでは、文字ＣおよびＢはそれぞれ、ＣＬＯＣＫおよびＢＭＡＬ１を示す。ＣおよびＢの非存在下でのＰＫ２．８−Ｌｕｃのルシフェラーゼ活性を１単位として指定した。図２ｂに示される結果によって、ＣＬＯＣＫおよびＢＭＡＬ１は共に、転写活性で強い増加（１７２倍）を生成したが、単独では生成しなかったことが示される。推定ＰＫ２転写開始部位の１３０ｂｐ上流内に存在する１つの近接Ｅボックスも、ＣＬＯＣＫ：ＢＭＡＬ１ヘテロダイマーによって転写活性化された。このＣＬＯＣＫ：ＢＭＡＬ１依存活性化は、Ｅボックス配列ＣＡＣＧＴＧを突然変異させたときは破壊された。  
【０１７１】
４つのＥボックスおよびそれらの隣接フランキング配列を互いに結合させた７２ｂｐコンストラクト（ＰＫ４Ｅ−Ｌｕｃ）の転写活性を試験した。アニールしたオリゴヌクレオチドＰＫ４Ｅ５およびＰＫ４Ｅ３を、ＳＶ４０プロモーター（ｐＧＬ３−プロモーター）を含有するルシフェラーゼ・レポーター・ベクター中にサブクローニングすることによってコンストラクトを生成した。４つの突然変異Ｅボックス全てを有する同等のコンストラクト（ＰＫ４ＥＭ−Ｌｕｃ）を、オリゴヌクレオチドＰＫ４Ｅ５ＭおよびＰＫ４Ｅ３Ｍを用いて同様に構築した。４つのＥボックス全てをＰＫ４ＥＭ−Ｌｕｃ中で突然変異させた。ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃのルシフェラーゼ活性を１単位として指定した。図２Ｃに示されるように、ＣＬＯＣＫおよびＢＭＡＬ１は共に（単独では不可）、これらの４つのＥボックスを介して転写活性での実質的な増加を引き起こした（１６２倍）。このＣＬＯＣＫ：ＢＭＡＬ１依存活性化は、４つのＥボックス全てを突然変異させたとき、活性化のバックグラウンド値まで減少した。これらの結果によって、ＣＬＯＣＫ：ＢＭＡｌ１ヘテロダイマーによる転写活性下には、少なくとも１つのＥボックスが必要であることが示される。
【０１７２】
２．８ｋｂ  ＰＫ２プロモーターを用いて、ＳＣＮ時計作用の負のエレメントの効果を実験した。ｍＰｅｒよびｍＣｒｙによるＰＫ２．８−ＬｕｃからのＣＬＯＣＫ：ＢＭＡＬ１媒介転写の阻害を実験した。ＣおよびＢの存在下でのＰＫ２．８−Ｌｕｃのルシフェラーゼ活性を１００％として指定した。図２ｄに示されるように、ｍＰＥＲは、ＣＬＯＣＫ：ＢＭＡＬ誘導転写の４０％〜６０％の阻害を引き起こす一方で、ｍＣＲＹ１およびｍＣＲＹ２媒介の阻害は、完全に近かったことが認められた。これらのことをまとめて考えると、これらのインビトロ研究によって、時計遺伝子産物は、ＰＫ２転写を調節することが示される。
【０１７３】
チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞でＰＫＲ２を安定的に発現させ（ＣＨＯ−ＰＫＲ２）、ルシフェラーゼ・レポーター核酸に融合した２．８ｋｂ  ＰＫ２プロモーターでＣＨＯ−ＰＫＲ２細胞をトランスフェクションすることによって、ＰＫ２遺伝子発現に対するＰＫＲ２活性化の役割を実験した。ＰＫ２プロモーター含有コンストラクトを調製するために、マウスＰＫ２遺伝子の２．８  ｋｂ  ５’−フランキング領域をｐＧＬ３−ＢＡＳＩＣベクター中にサブクローニングして、ＰＫ２．８−Ｌｕｃを生成した。単一Ｅボックスを含有するマウスＰＫ２遺伝子の１７０ｂｐ  ５’−フランキング領域を４つの長オリゴヌクレオチドを用いて合成し、ｐＧＬ３−ＢＡＳＩＣベクター中にサブクローニングして、ＰＫ０．２−Ｌｕｃを生成した。ＥボックスＣＡＣＧＴＧを有する突然変異５’−フランキング配列を突然変異オリゴヌクレオチドで同様に生成した（ＰＫ０．２Ｍ−Ｌｕｃ）。ＰＫ２処置の非存在下でのＣＨＯ細胞中のＰＫ２．８−Ｌｕｃのルシフェラーゼ活性を１単位として指定した。  
【０１７４】
図２ｅに示されるように、ＰＫ２によるＰＫＲ２の活性化は、２．８ｋｂ  ＰＫ２プロモーターのＣＬＯＣＫ：ＢＭＡＬ１媒介転写を投与量依存的に促進する（４．０±０．４倍、平均±標準誤差、ｎ＝３）。ＰＫ２のＥＣ５０値は、７．８±２．９ｎＭ（ｎ＝３）であり、ＰＫ２によるＰＫＲ２活性化のカルシウム移動から得られたＥＣ５０値（７．３±１．５ｎＭ、ｎ＝４）に類似していた。ＣＬＯＣＫおよびＢＭＡＬ１の非存在下では、ＰＫ２処置（５０ｎＭ、６時間）のみでのＰＫＲ２の活性化は、２．８ｋｂ  ＰＫ２プロモーターの転写を活性化しなかった（ルシフェラーゼ活性：ＣＨＯおよびＣＨＯ−ＰＫＲ２それぞれに対して１．０±０．１１および１．１４±０．０９）。ＣＬＯＣＫおよびＢＭＡＬ１の存在下では、２．８ｋｂ  ＰＫ２プロモーターの転写に対するＰＫＲ２活性化の促進的効果は、ｍＣＲＹ１およびｍＣＲＹ２によって破壊された。したがって、ＰＫ２は、時計遺伝子依存的様式でのＰＫＲ２活性化を介して、ＳＣＮ内でそれ自体の転写を活性化することができる。
【０１７５】
図２ｂ〜２ｅでは、図示される値は、１度のアッセイから得られた３つの複製物の平均±標準誤差である。示される結果は、少なくとも３つの非依存的実験の代表的なものである。
【０１７６】
要約すると、この実施例によって、マウスＰＫ２プロモーターは、ＣＬＯＣＫ：ＢＭＡＬ１ヘテロダイマー、ｍＰＥＲ、ｍＣＲＹ１、およびｍＣＲＹ２によって調節され得ることが示される。
【０１７７】
実施例ＩＩＩ  
Ｃｌｏｃｋ突然変異マウスでの変化ＰＫ２リズム
この実施例によって、ＰＫ２ｍＲＮＡのリズム性発現は、Ｃｌｏｃｋ欠損（Ｃｌｋ／Ｃｌｋ）およびクリプトクローム欠損（Ｃｒｙ／Ｃｒｙ）マウス内で乱されることを示す。      
【０１７８】
突然変異動物を用いた遺伝的研究によって、哺乳類分子時計のメカニズムに対する洞察が与えられた。ｍＣｒｙ１、ｍＣｒｙ２、およびｍＰｅｒ３を欠損するマウスは、概日周期の長さでわずかな変化を示すが、無リズム性を引き起こすことはない（Ｖｉｔａｔｅｒｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ  ９６：１２１１４−１９(１９９９）;Ｔｈｒｅｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１４９０−９４(１９９８）;Ｓｈｅａｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ.Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ.２０：６２６９−７５(２０００）；およびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈｏｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３９８：６２７−３０(１９９９））。Ｃｌｏｃｋ、ｍＰｅｒ１、またはｍＰｅｒ２遺伝子での突然変異によって、より重度の概日表現型を生じ、これには、恒暗（ＤＤ）での長期収容後の無リズム性が含まれる（Ｃｅｒｍａｋｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ.２０：３９６７−７４(２００１）;Ｖｉｔａｔｅｒｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：７１９−２５(１９９４）;Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ８９：６４１−５３(１９９７）;Ｂａｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  ３０：５２５−３６(２００１）；およびＺｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １０５：６８３−９４(２００１））。破壊されたＢｍａｌ１遺伝子を有するマウス、またはｍＰｅｒ１およびｍＰｅｒ２両方を欠損したマウスは、最も重度の表現型を示す。すなわち、それらは、ＤＤでの収容後すぐに無リズム性になる（Ｂａｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  ３０：５２５−３６(２００１）;Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １０５：６８３−９４(２００１）；およびＢｕｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １０３：１００９−１７(２０００））。同様の無リズム性は、ｍＣｒｙ１およびｍＣｒｙ２遺伝子両方を欠損したマウスでも起こる（Ｖｉｔａｔｅｒｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：７１９−２５(１９９４）；およびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈｏｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３９８：６２７−３０(１９９９））。カゼイン・キナーゼをコードし、かつその突然変異がハムスターの一種で概日周期の短縮を引き起こすＴａｕ遺伝子のクローニングによって、ＳＣＮ時計作用のための転写後メカニズムの重要性が明らかになった（Ｌｏｗｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８８，４８３−９１(２０００））。
【０１７９】
ＳＣＮペースメーカー時計作用とは対照的に、概日ペースメーカー系がタイミング情報を伝達し、生理機能および行動を制御するメカニズムについてはあまり知られていない（Ｒｅｐｐｅｒｔ  ａｎｄ  Ｗｅａｖｅｒ，Ａｎｎ.Ｒｅｖ.Ｐｈｙｓｉｏｌ.６３：６４７−７６(２００１）;Ａｌｌａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ.Ｒｅｖ.Ｎｅｕｒｏｓｃｉ.２４：１０９１−１１９(２００１）；およびＨａｒｄｉｎ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  １，ＲＥＶＩＥＷＳ１０２３(２０００））。ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）では、色素拡散因子、神経ペプチド、および分泌タンパク質をコードすると考えられている時計制御遺伝子であるテイクアウト（ｔａｋｅｏｕｔ）が概日運動リズムを伝達する媒介物質として証明されている（Ｒｅｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ９９：７９１−８０２(１９９９）；およびＳａｒｏｖ−Ｂｌａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １０１：６４７−５６(２０００））。哺乳類では、移植研究によって、ＳＣＮのリズム出力を媒介するシグナルも、分泌分子であるらしいことが示された（Ｒａｌｐｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：９７５−８(１９９０）;Ｓｉｌｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８２：８１０−１３(１９９６）；およびＥａｒｎｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３：６９３−５(１９９６））が、その生化学的アイデンティティは未知である。
【０１８０】
Ｃｌｏｃｋを欠損する（Ｃｌｋ／Ｃｌｋ）（Ｖｉｔａｔｅｒｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：７１９−２５(１９９４））またはクリプトクロームを欠損する（（ｍＣｒｙ１−／−、ｍＣｒｙ２−／−）、ｍＣｒｙ欠損）（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈｏｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３９８：６２７−３０(１９９９））突然変異マウスのＳＣＮで、ＰＫ２ｍＲＮＡ値を実験した。Ｃｌｋ／Ｃｌｋマウス（ＢＡＬＢ／ｃ遺伝的バックグラウンドでの）およびｍＣＲＹ欠損マウス（ｍＣｒｙ１−／−、ｍＣｒｙ２−／−、Ｃ５７ＢＬ／６−１２９ハイブリッド・バックグラウンドでの）のＳＣＮによる切片ならびにそれらそれぞれの同腹仔対照を調製するための方法は、先行して記載されているように得られる（Ｓｈｅａｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８８：９１７−２４(２０００）．；およびＪｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ９６：５７−６８(１９９９））。図３Ａに示されるように、ＳＣＮでのＰＫ２ｍＲＮＡの概日リズムは、ＬＤ下のＣｌｋ／Ｃｌｋ突然変異体で重度に鈍くなることが認められた。図３Ａの左グラフは、Ｃｌｋ／ＣｌｋマウスのＳＣＮ内のＰＫ２ｍＲＮＡの一時的プロフィルを示す。ＳＣＮおよびＭＰＡでの野生型（ＷＴ）およびＣｌｋ／ＣｌｋマウスのＺＴ２でのＰＫ２ｍＲＮＡの代表的な冠状縫合切断（１５ｍｍ）を右側に示す。ＺＴ２〜８に関するデータを二重にプロットする。  
【０１８１】
Ｃｌｋ／Ｃｌｋマウスでは、ＰＫ２ｍＲＮＡは、ＺＴ５〜ＺＴ８のみで検出可能であった。Ｃｌｋ／ＣｌｋマウスでのＰＫ２ｍＲＮＡのピーク値の減少は、約ＺＴ４からＺＴ８まで変位されることも認められた。内側視索前野でのＰＫ２ｍＲＮＡ値は、Ｃｌｋ／Ｃｌｋマウス中で変化しないことにも留意すべきである。これらの結果によって、Ｃｌｋ／ＣｌｋマウスでのＰＫ２遺伝子発現の減少は、ＳＣＮ概日時計に特異的であることが示される。Ｃｌｋ／ＣｌｋマウスでのＰＫ２概日リズムの重度の鈍化は、ＣＬＯＣＫがＰＫ２遺伝子発現に対して正の調節的効果を及ぼしていることを示す。  
【０１８２】
ｍＣＲＹ欠損マウスのＳＣＮでのＰＫ２ｍＲＮＡ値も実験した。図３ｂの左グラフは、ＣＴ６およびＣＴ１８でのＣｒｙ／ＣｒｙマウスのＳＣＮ内のＰＫ２ｍＲＮＡの発現を示す。ＳＣＮおよびＭＰＡ内のＷＴおよびＣｒｙ／ＣｒｙマウスのＣＴ６でのＰＫ２ｍＲＮＡの代表的な冠状縫合切断を右側に示す（スケール・バー＝１ｍｍ）。各値は、５〜６匹の動物の平均±標準誤差である。
【０１８３】
野生型マウスのＳＣＮで見られる発振パターンとは対照的に、ＰＫ２ｍＲＮＡ値は、ｍＣｒｙ欠損マウスでは、ＣＴ６およびＣＴ１８両方で低かった（図３ｂ）。内側視索前野でのＰＫ２ｍＲＮＡ値は、両概日時間で、野生型マウスとは観察可能には異なっていなかった。ｍＣＲＹは、ＣＬＯＣＫ：ＢＭＡＬ１媒介転写の主要阻害剤であり（Ｋｕｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ９８：１９３−２０５(１９９９））、かつ強壮な中程度に高めのｍＰｅｒ１およびｍＰｅｒ２値がｍＣｒｙ欠損マウスで観測されていた（Ｖｉｔａｔｅｒｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ  ９６：１２１１４−１９(１９９９）；およびＯｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６：２５３１−３４(１９９９））ので、ｍＣｒｙ欠損マウス内の両概日時間でのＰＫ２の明らかな低値は、予想外であると考えられる。ＤＤでのｍＣｒｙ欠損マウスの即時の無リズム性は、機能的概日時計の破壊を示す（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈｏｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ）。
【０１８４】
フィードバック・ループの機能的正および負の四肢の非存在下では、ＰＫ２ｍＲＮＡの絶対値は、基底プロモーター活性およびＲＮＡ安定性に依存するようである。暗期位相中のＳＣＮでのＰＫ２ｍＲＮＡの基本的に検出不可能な値（図１ｂおよびｃ）によって、低基底ＰＫ２プロモーター活性が示唆される。ヒトおよびマウスＰＫ２ｍＲＮＡ両方の３’非翻訳領域内で、ｍＲＮＡ不安定シグナル（ＡＵＵＵＡ）の複数のコピーが存在することにも留意すべきである。これらの組み合わされた効果は、ｍＣｒｙ欠損マウスでのＳＣＮ内のＰＫ２ｍＲＮＡの低値に寄与することが可能である。これらのことをまとめて考えると、突然変異マウスを用いたこれらの研究によって、ＰＫ２が時計制御遺伝子であることが裏付けられる。
【０１８５】
要約すると、この実施例によって、Ｃｌｏｃｋを欠損する（Ｃｌｋ／Ｃｌｋ）またはクリプトクロームを欠損する（ｍＣｒｙ１−／−、ｍＣｒｙ２−／−）突然変異マウスは、野生型マウスと比較して、ＳＣＮでのＰＫ２ｍＲＮＡ値を変化させたことが示される。
【０１８６】
実施例ＩＶ
光同調へのＰＫ２リズムの応答
この実施例によって、ＰＫ２発現がマウスの光同調によって変化されることを示す。
【０１８７】
光パルスに応答したＳＣＮ内のＰＫ２ｍＲＮＡ値を実験した。ＤＤでの第１日目に、ＣＴ１４（図４ａ）またはＣＴ２３（図４ｂ）で、動物を１５分間光パルスにさらした。光パルスは、それぞれ、１５分間の４００ルクス（図４ａ、ｂ）および１時間の４００ルクス（図４ｃ）である。図４では、白抜き記号および破線は、光暴露動物を表し、囲み記号は、ＤＤで維持される時間対応対照を表す。各値は、４〜６匹の動物の平均±標準誤差である。ｔ検定を用いて統計学的分析を実行した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【０１８８】
図４ａおよび４ｂに示されるように、ＰＫ２ｍＲＮＡ値は、ＣＴ１４およびＣＴ２３両方で、光暴露後３０分で急激かつ一時的に増加した。ＣＴ１４では、ＰＫ２ｍＲＮＡは光パルスなしでは検出不可能なままであった。光暴露に続いて、ＰＫ２ｍＲＮＡ値は、３０分までに増加して、１〜２時間でピークになり、暴露後４時間で対照値に戻った。ＣＴ２３では、ＰＫ２ｍＲＮＡ値は、光パルスがあってもなくても上昇した。しかし光パルスの存在下では、ＰＫ２ｍＲＮＡ値は、より急激にかつ強力に増加した。ＰＫ２ｍＲＮＡは、暴露後４時間で対照値に戻った。しかし、ＣＴ３では、光パルスは、ＰＫ２ｍＲＮＡ値に対する効果を高めることはなかった。ＰＫ２の光誘導性は、ＰＫ２プロモーターでのＣＲＥ活性化に起因する可能性がある（図２ａ）。
【０１８９】
ＰＫ２リズムの位相に対する、ＳＣＮ制御行動リズムの位相を変位させる光パルスの効果も実験した。ＤＤでの第１日目に、ＣＴ１４〜１５またはＣＴ１９〜２０で動物を１時間光パルスにさらした。対照動物は、光パルスを受けなかった。図４ｃでは、陰影および囲み横棒はそれぞれ、ＤＤ下での明期および暗期期間を示す。図４ｄは、図４ｃに示した位相変位（分、ｎ＝３）の定量化を示す。ＰＫ２ｍＲＮＡの半ピーク値で位相を測定した。従来、遅滞は負であり、促進は正である。３つの実験うち１つを示す。
【０１９０】
図４ｃおよび４ｄに示されるように、早期主観的夜（ＣＴ１４）中に施された光パルスは、ＰＫ２発現の位相で約７０分の遅滞を引き起こす。同様に、後期主観的夜（ＣＴ１９）中に施された光パルスは、ＰＫ２発現の位相で、約７５分の促進を引き起こす。これらの結果によって、ＳＣＮ制御行動リズムの位相を変位させる光パルスは、ＰＫ２発現の位相を変化させることが示される。ＰＫ２リズムのこれらの光誘導変位は、自発運動リズムの変位と非常に相関する。
【０１９１】
図７は、明暗周期の急変に応答したＳＣＮ内でのＰＫ２ｍＲＮＡ発現を示す。１２時間明期／１２時間暗期に動物を同調させた。正常明暗周期（ＬＤ）は、６時間までに遅滞する（６ｈｒＤ）か、または６時間までに促進する（６ｈｒＡ）。マウス脳サンプルの期間を挿入語句で示す。白抜きおよび囲み棒はそれぞれ、明期および暗期期間を表す。図７ｂは、正常ＬＤ、６ｈｒＤ、および６  ｈｒＤ＋２ＬＤ（６時間遅滞後の追加２日での適応）でのＰＫ２ｍＲＮＡ発現を示す。図７ｃは、正常ＬＤ、６ｈｒＡ、および６ｈｒＡ＋２ＬＤ（５時間促進後の２回追加明暗周期での適応）でのＰＫ２ｍＲＮＡ発現を示す。各値は、２匹の動物の平均を表す。  
【０１９２】
図８は、毎暗周期急変に応答したＳＣＨ内でのＰＫ２ｍＲＮＡの一時的プロフィルを示す。動物を１２時間明期／１２時間昼に同調させ、正常明暗周期（ＬＤ）、６時間遅滞（６ｈｒＤ）、６時間遅滞後の２回追加明暗周期での適応（６ｈｒＤ＋２ＬＤ）、６時間促進（６ｈｒＡ）、または６時間促進後の２回追加明暗周期での適応（６ｈｒＤ＋２ＬＤ）のいずれかにかける。ＳＣＮ値での冠状縫合切断（２０μｍ）の代表的な形を示す。スケール・バー＝１ｍｍ。
【０１９３】
要約すると、この実施例によって、ＳＣＮ内のＰＫ２リズムが光同調に応答することが示される。
【０１９４】
実施例Ｖ
ＳＣＮ出力標的でのＰＫ２レセプターの発現
この実施例によって、マウス脳でのＰＫ２レセプター発現を示す。
【０１９５】
インサイチュハイブリダイゼーションによって、雄成体Ｃ５７Ｂ１６マウス脳内でのＰＫ２レセプターｍＲＮＡの発現を実験した。図５上側パネル（ａ〜ｅ）は、外側中隔（ＬＳ）、脳室周囲視床核（ＰＶＴ）、および視床下部核（ＰＶＮ）、視交叉上核（ＳＣＮ）、終末傍核（ＰＴ）、中心傍核（ＰＣ）、外側手綱（ＬＨｂ）、背内側視床下部核（ＤＭＨ）、および弓状核（Ａｒｃ）のＰＫＲ２ｍＲＮＡのオートラジオグラフィー像を表す。図５中間パネル（ｆ〜ｊ）は、上側パネル（ａ〜ｅ）の線で囲んだ領域から得たＰＫＲ２ｍＲＮＡの暗視野顕微鏡像を示す。図５下側パネルは、ＳＣＮ内のＰＫ２（ｋ、ｌ）およびＰＫＲ２ｍＲＮＡ（ｍ、ｎ）の顕微鏡像を高倍率で示す。両暗視野（ｋ、ｍ）およびクレシル・バイオレット染色切片（ｌ、ｎ）を示す。上側パネルでは、スケール・バー＝２ｍｍであり、中間および下側パネルでは、スケール・バー＝０．５ｍｍである。全ての像は、ＺＴ１で採取したマウス脳から得た。  
【０１９６】
ＳＣＮ，視床下部核（ＰＶＮ）、背内側視床下部核（ＤＭＨ）、脳室周囲視床核および終末傍核（ＰＶＴ／ＰＴ）、中心傍核（ＰＣ）、外側手綱（ＬＨｂ）、ならびに外側中隔（ＬＳ）で、ＰＫＲ２ｍＲＮＡが豊富に発現することが判明した。図６に示されるように、ＰＫＲ２ｍＲＮＡは、背側淡蒼球（ＬＧＰ）、扁桃体、および他の領域でも中程度に発現する。
【０１９７】
ＰＫＲ２の最も高い発現は、ＰＶＴで見出された。興味深いことに、ＰＫＲ２ｍＲＮＡ陽性核の大部分は、ＳＣＮ出力経路のプライマリ標的エリアである（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ:Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ.Ｐｒｅｓｓ.４６７  ｐｐ.（１９９１）;Ｍｏｏｒｅ，Ａｎｎ.Ｒｅｖ.Ｍｅｄ.４８：２５３−６６(１９９７）;Ｓｏｆｒｏｎｉｅｗ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｄｌ，Ａｍｅｒ.Ｊ.Ａｎａｔ.１５３：３９１−４２９(１９７８）;Ｗａｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ.Ｃｏｍｐ.Ｎｅｕｒｏｌ.２５８：２０４−２９(１９８７）;Ｗａｔｔｓ  ａｎｄ  Ｓｗａｎｓｏｎ，Ｊ.Ｃｏｍｐ.Ｎｅｕｒｏｌ.２５８：２３０−５２(１９８７）;Ｌｅａｋ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ，Ｊ.Ｃｏｍｐ.Ｎｅｕｒｏｌ.４３３：３１２−３４(２００１）；およびＢｕｉｊｓ，Ｐｒｏｇ.Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ.１１１：２２９−４０(１９９６））。ＳＣＮ出力のこれらのプライマリ標的エリア内でのＰＫＥＲ２の高発現は、ＰＫ２がＳＣＮ出力を媒介するシグナル伝達分子として作用可能であることを示す。ＰＫＲ２ｍＲＮＡは、ＳＣＮでも広範に発現する（図５ｃ、ｈ、ｍ）。ＰＫ２ｍＲＮＡの強力なリズムとは対照的に、ＳＣＮおよび他のＰＫＲ２陽性核でのＰＫＲ２  ｍＲＮＡは、非発振性である。高倍率顕微鏡像によって、ＳＣＮ内の大部分のニューロンは、ＰＫ２およびＰＫＲ２ｍＲＮＡ両方を発現させることが示される（図５ｋ〜ｎ）。ＳＣＮでのＰＫ２およびＰＫＲ２ｍＲＮＡのこの発現パターンによって、ＰＫ２／ＰＫＲ２系は、ＳＣＮ出力を同期する上で役割を果たすことが可能であることが示される。
【０１９８】
実施例ＶＩ
ＰＫ２投与は概日自発運動を変化させる
この実施例によって、ラットへのＰＫ２投与がその概日自発運動を変化させることを示す。
【０１９９】
ＰＫ２が概日行動出力を媒介するかどうかを直接評価するために、ホイール・ランニング行動に対する、組み換えＰＫ２の脳室内（ｉｃｖ）注射の効果を実験した。（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ.Ｐｈａｒｍ.５９；６９２−８(２００１））に先行して記載されるように、組み換え型ヒトＰＫ２を生産および精製した。雄ＳＤ（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラット（３００〜３５０ｇ）を用いて、自発運動リズムへのＰＫ２の薬理学的効果を評価した。２３ゲージ・ガイド・カニューレを側脳室に移植した（０．４ｍｍを吻側からブレグマへ、３．０ｍｍを腹側から硬膜へ、２．４ｍｍを外側から正中線へ、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。３０ゲージ・スタイレットをガイド・カニューレに置き、開存性を維持した。ＬＤで２週間、ランニング・ホイール・ケージ内にラットを収容し、２〜５日間ＤＤに置き、その後ＣＴ１４で、組み換えＰＫ２のｉｃｖ注射にかけた。ｉｃｖ注射中、スタイレットを除去して、プラスチック管によってハミルトン・シリンジへ装着した３０ゲージ注射器を挿入した。各動物は、２分間にわたってＰＫ２または食塩水を５μｌ（１ｍｇ／ｍｌ）（暗赤色光＜１ルクス下で）受けた。動物を即座にそれらのケージに戻して、ＰＣシステム（Ｃｏｌｂｏｕｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ，ＰＡ）を用いて、恒暗でホイール・ランニング運動をモニターした。ランニング・ホイール・データを５分間隔で分析した。夜行性ホイール・ランニングの阻害をＣＴ１５〜ＣＴ２４中の運動回数として測定して、処置前２日の同時間間隔から得た平均回数のパーセント値として表した。ＰＫ２処置ラットの主観的昼でのホイール・ランニングの活性化をＣＴ０〜ＣＴ１２中の運動回数として測定して、処置前２夜（ＣＴ１３〜ＣＴ２４）から得た平均回数のパーセント値として表した。
【０２００】
図９ａおよび９ｂは、ＣＴ１４でＰＫ２または食塩水を注射されたラットの代表的アクトグラムを示す。陰影および囲み横棒はそれぞれ、ＤＤ下での主観的明期および暗期期間を示す。強調領域は、処置後の夜間自発運動を示す。線で囲まれた領域は、処置後の主観的昼中の自発運動を表す。図９ｃは、ＰＫ２（ｎ＝７）または食塩水（ｎ＝６）送達後の夜間および日中自発運動の定量化を示す。夜間位相（ＣＴ１５〜ＣＴ２４）および日中位相（ＣＴ０〜ＣＴ１２）中のホイール・ランニング運動へのＰＫ２の効果を夜間運動のパーセント値として表した。ｔ検定を用いて統計学的分析を実行した（＊＊ｐ＜０．０１）。
【０２０１】
図９に示される結果は、ＰＫ２送達が暗期位相に関連する高ホイール・ランニング行動を抑制した一方で、食塩水の投与のみでは、ホイール・ランニング行動をわずかに阻害したことを示す。正常に休止される日中運動とは対照的に、ＰＫ２処置ラットのうち、夜間と同程度に日中活動的であったのはおよそ半分であった。ＰＫ２注入によって、主観的昼でのホイール・ランニング・リズムのわずかな遅滞が引き起こされたが、この遅滞は、対照とは著しく異なっていた。これらの結果によって、主観的昼中に正常に高いＰＫ２は、ホイール・ランニング運動を阻害することが示される。主観的夜中で、内在ＰＫ２値が低いとき、ホイール・ランニング運動は阻害されない。ＰＫ２処置ラットで次の主観的昼で認められたホイール・ランニング運動の増加は、ＰＫ２投与が原因であるＰＫＲ２レセプター脱感作の結果であり得る。したがって、ＰＫ２は、ＳＣＮ時計の概日自発運動リズムを伝達する出力分子である。
【０２０２】
要約すると、この実施例によって、ラットへのＰＫ２投与は、それらの概日リズムを変化させることが示される。
【０２０３】
実施例ＶＩＩ
サイトゾル遊離カルシウムの測定
この実施例によって、サイトゾル遊離カルシウムの測定に対するアッセイが説明される。
【０２０４】
細胞をＨＥＰＥＳ培地中に懸濁して、３１℃で２０分間フラ−３ＡＭ  ２μＭでインキュベートした。その後、該細胞を遠心および洗浄し、フラ−３非含有培地で再懸濁して、９６ウエル中に、ウエル毎に４ｘ１０４細胞で播種した。３７℃１時間、０．１％仔牛血清を含有する標準緩衝溶液（１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、５ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭグルコース、０．４５ｍＭ  ＫＨ２  ＰＯ４、０．４ｍＭ  Ｎａ２  ＨＰＯ４、８ｍＭ  ＭｇＳＯ４、４．２ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、および１０μＭプロベネシド）中で、フルオ−３（Ｆｌｕｏ−３）ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）に細胞を添加して、その後、標準緩衝溶液で洗浄した。ＦＬＩＰＲ装置（蛍光イメージング・プレート・リーダー（Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ）;Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、２１０秒間４８８ｎｍで、プロキネチシンによって誘発された［Ｃａ２＋］ｉでの一時的変化をモニターした。
【０２０５】
実施例ＶＩＩＩ
明暗周期に応答したＳＣＮでのＰＫ２ｍＲＮＡの一時的プロフィル
この実施例によって、明暗周期の急変によりＳＣＮ内でのＰＫ２分子リズムの変化が生じることを示す。
【０２０６】
成体Ｃ５７Ｂｌ６マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を用いて明暗変位実験を実行した。該マウスは、１２時間明期：１２時間暗期（１２Ｌ：１２Ｄ、７：００ａｍ明期開始、７：００ｐｍ停止）周期下で、食餌および水分は制限なしに与えて、２週間同調させた。明期位相は、６時間（７：００ａｍ明期開始、１：００ａｍ停止）までに遅滞するか、または６時間（７：００ａｍ明期開始、１：００ｐｍ停止）までに促進し、２４時間の期間（ツァイトゲーバー時間＝ＺＴ、ＺＴ１〜２２）で、３時間毎にサンプルを採取した。これらの変位マイスの適応を試験するために、動物を追加の２回正常明暗周期に置き、サンプルを次の２４時間の期間で採取した。
【０２０７】
図１４は、ＳＣＮでのＰＫ２ｍＲＮＡリズムを２４時間周期で測定した実験の結果を示す。図１４Ａは、動物がさらされた明期および暗期期間の図を示す。図示されるように、動物は、初めに正常１２時間明期：１２時間暗期（ＬＤ）周期下で同調され、その後明期位相の６時間遅滞（６ｈｒＤ）または６時間促進（６ｈｒＡ）に同調される。図１４ＢおよびＣはそれぞれ、６時間遅滞または６時間促進の条件下でのＰＫ２ｍＲＮＡ値を示す。６時間遅滞および６時間促進両方は、図１４ＢおよびＣに示されるように、正常ＬＤ周期と比較したときＰＫ２ｍＲＮＡ発振リズムでの明らかな変化を引き起こした。しかし、これらの生活規則間に著しい相違があった。６時間遅滞では、ＰＫ２ｍＲＮＡ発現パターンは、正常ＬＤ下で観測されたものと類似しており、ＰＫ２ピーク値はわずかに減少し、そのリズムは約３時間までに促進した（図１４Ｂ）。正常ＬＤと同様に、ＰＫ２ｍＲＮＡは、明期の期間中で発現し、暗期位相で低いままであった。しかし、ＺＴ２２で、ＰＫ２ｍＲＮＡの早期の始まりが認められた。対照的に、６時間促進は、ＰＫ２ｍＲＮＡリズムでのより大きな変化を引き起こした。ＰＫ２ｍＲＮＡのピークは、約６時間までに減少および遅滞された（図１４Ｃ）。正常ＬＤとは異なり、ＰＫ２ｍＲＮＡのピークは、約ＺＴ１０まで遅滞し、ＰＫ２の値は、暗期期間の最初の半期中は高いままであった。これらの変位マウスの適応を２回追加のＬＤ周期でさらに試験した。ＳＣＮでのＰＫ２ｍＲＮＡ発現リズムによって判断されるように、６時間遅滞生活規則下でのマウスは、２回追加のＬＤ周期に置かれたあと即座に適応した（図１４Ｂ）。６時間促進マウスでも明らかな適応があったが、ＰＫ２ｍＲＮＡリズムは依然として対照群とは著しく異なっていた（図１４Ｃ）。
【０２０８】
これらのことをまとめて考えると、これらの結果によって、６時間促進は、ＳＣＮ内のＰＫ２の分子リズムでのより大きな変化を顕著に引き起こし、かつマウスは、６時間促進生活規則よりも６時間遅滞により素早く適応することが示される。
【０２０９】
図１４ＢおよびＣでは、白抜きおよび塗りつぶし横棒はそれぞれ、明期および暗期期間を示す。略語は以下のとおりである。すなわち正常明暗サイクル（ＬＤ）、６時間遅滞（６ｈｒＤ）、６時間遅滞後の２回追加ＬＤでの適応（６ｈｒＤ＋２ＬＤ）、６時間促進（６ｈｒＡ）、および６時間促進後の２回追加ＬＤでの適応（６ｈｒＡ＋２ＬＤ）である。図１４Ｄでは、異なる明暗条件下でのＳＣＮ内ＰＫ２ｍＲＮＡ発現を示す代表的オートラジオグラムが示され、スケール・バー＝１ｍｍ、各値は３匹の動物の平均±標準誤差である。＊はｐ＜０．０５であり、＊＊はｐ＜０．０１であり（スチューデント（Ｓｔｕｄｅｎｔ）のｔ検定）、これは、６ｈｒＤおよび６ｈｒＡに対するＬＤ下での対照値との著しい相違を表す。＄ｐ＜０．０５および＄＄ｐ＜０．０１は、６ｈｒＤ＋２ＬＤおよび６ｈｒＡ＋２ＬＤに対するＬＤ下での対照値との著しい相違を表す。
【０２１０】
要約すると、この実施例によって、明暗周期の急変にさらされたマウスでは、ＰＫ２ｍＲＮＡ発現が変化することが示される。
【０２１１】
実施例ＩＸ
ｍＣｒｙ１，２−／−マウスでのＰＫ２の分子リズム
この実施例によって、正常明暗条件下で、ＰＫ２リズムを含む複数の分子リズムが時計作用突然変異マウスで保存されることを示す。
【０２１２】
機能的概日時計を持たないクリプトクローム欠損（ｍＣｒｙ１，２−／−）マウスのＳＣＮ内の明記調節ｍＰｅｒ２分子リズムが保存されることが観測されている。ＳＣＮ内の明期調節ＰＫ２分子リズムがｍＣｒｙ１、２−／−マウスで保存されるかどうかを決定するために、明暗（ＬＤ）および恒暗（ＤＤ）両方の条件下で、ｍＣｒｙ１，２−／−マウス内でＰＫ２ｍＲＮＡの値を観測した。
【０２１３】
これらの実験では、野生型およびｍＣｒｙ１，２−／−マウスを正常１２Ｌ：１２Ｄに同調させ、２４時間の期間（ツァイトゲーバー時間＝ＺＴ、ＺＴ１〜２２）の３時間毎にサンプルを採取した。ｍＣｒｙ１，２−／−マウスの第２の群を２日の恒暗（２ＤＤ）（概日時間＝ＣＴ、ＣＴ１〜２２）に置いた。光パルス実験のために、ｍＣｒｙ１，２−／−マウスは、ＺＴ１４で１５分の光パルス（４００ルクス）を受け、光パルス後１時間または２時間でサンプルを採取した。暗期対照ｍＣｒｙ１，２−／−マウスは、光パルスを受けなかった。
【０２１４】
ｍＣｒｙ１，２−／−マウスのＳＣＮでのＰＫ２分子リズムを決定するためにＰＫ２ｍＲＮＡ値を測定した。ｍＣｒｙ１，２−／−マウス内でのＰＫ２ｍＲＮＡ発現を図１５Ａに示す一方で、１２Ｌ：１２Ｄ（ＬＤ）下での野生型マウス内のＰＫ２ｍＲＮＡ発現を図１５Ｂに示す。図１５Ｃは、ｍＣｒｙ１，２−／−マウス内のＰＫ２ｍＲＮＡの代表的オートラジオグラムを示し、正常ＬＤ下での野生型マウスが示される（それぞれ、上および下側列）。ＬＤ下でのｍＣｒｙ１，２−／−マウス内のＰＫ２ｍＲＮＡの代表的暗視野像を中間列に示す。明視野像は、ＳＣＮの細胞構造を示すクレシル・バイオレット染色切片を示す。図１５Ｃでは、スケール・バー＝１ｍｍである。各値は、３〜６匹の動物の平均±標準誤差を表す。図ａ６Ｄに関しては、光パルスおよび暗期対照条件下での野生型およびｍＣｒｙ１，２−／−マウスでのＰＫ２ｍＲＮＡ値が示される。この図では、＊ｐ＜０．０５、スチューデント（Ｓｔｕｄｅｎｔ）のｔ検定である。図１５Ｄに示される結果によって、ＰＫ２ｍＲＮＡ値は、ＺＴ１４での短時間の光パルス送達後に、ｍＣｒｙ１，２−／−マウス内で１時間および２時間で増加したことが示される。
【０２１５】
図２ＡおよびＣに示されるように、ｍＣｒｙ１，２−／−マウスのＳＣＮでのＰＫ２分子リズムは、明期位相でのＰＫ２ｍＲＮＡの低値の存在および暗期位相でのＰＫ２ｍＲＮＡの非存在とともに、正常ＬＤ下で顕著であった。野生型マウスと同様に、この残留ＰＫ２リズムのピーク値は、ＺＴ４付近であったが、その大きさは小さめであった（野生型マウスで観測されたものの約５％のみ）。この残留ＰＫ２分子リズムは、ｍＣｒｙ１，２−／−マウスを恒暗化に置いたときは存在しなかった（図１５Ａ）。これらの結果によって、正常ＬＤ下のｍＣｒｙ１，２−／−マウスで観測された残留ＰＫ２リズムは、光によって直接駆動されることが示される。  
【０２１６】
正常ＬＤ下でのｍＣｒｙ１，２−／−マウス内のｍＰｅｒ１およびｍＰｅｒ２リズムの一時的プロフィルも決定した（図１５ＥおよびＦ）。ｍＰｅｒ２の分子リズムは、インタクトなままであることが認められ、野生型動物で観測されたように暗期位相よりも明期位相中で値が約４倍高かった（図１５Ｅ）。ｍＰｅｒ２のこの分子リズムは、恒暗下では観測されなかった（図１５Ｅ）。日周リズムは、正常ＬＤ下のｍＣｒｙ１，２−／−マウス内のｍＰｅｒ１に対しても観測されたが、ＤＤでは観測されなかった（図１５Ｆ）。したがって、ｍＰｅｒ１およびｍＰｅｒ２は、非発振性であり、恒暗下でのｍＣｒｙ１，２−／−マウスの暗期位相中でわずかに増加した（図２ＥおよびＦ）。これらの結果によって、正常明暗条件下では、残留ＰＫ２リズムを含む複数の分子リズムが時計作用突然変位マウスで保存されることが示される。この残留ＰＫ２リズムは、正常ＬＤ下でのｍＣｒｙ１，２−／−マウスで認められた行動リズムの維持に寄与することが可能である。
【０２１７】
図１５で示される結果を得るために、マウスＰＫ２（登録番号ＡＦ４８７２８０  １−５２８  ｎｔ）、Ｐｅｒ１（登録番号ＡＦ０２２９９２  ３４０−７６１ｎｔ）、またはＰｅｒ２（登録番号ＡＦ０３５８３０  ９−４８９  ｎｔ）のコーディング領域を含有するアンチセンスおよびセンス・リボプローブを生成した。（Ｗｉｎｚｅｒ−Ｓｅｒｈａｎ  ｅｔ  ａｌｌ，１９９９，Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）に記載されるように、インサイチュハイブリダイゼーションを処置した。要約すれば、脳を素早く除去し、イソペンタン中で凍結して、使用するまで−７０℃で保存した。全ての実験に対して、２０ｍｍ切片を採取して、スーパーフロスト・プラス（ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ−ｐｌｕｓ）スライド上に乗せた。組織切片を４％パラホルムアルデヒドに１時間固定し、その後、０．１Ｍ  ＰＢで３回洗浄した。プロテイナーゼＫ（１ｍｇ／ｍｌ）を用いて切片を調製し、アセチル化、脱水、および風乾した。切片をリボプローブ（ＰＫ２、Ｐｅｒ１、またはＰｅｒ２に対するアンチセンスまたはセンス、１ｘ１０７ｃｐｍ／ｍｌ）にハイブリダイズして、１８時間６０℃でインキュベートして、その後ＲＮアーゼ（２０ｍｇ／ｍｌ）消化、減少性塩分洗浄、および３０分間の高ストリンジェンシー（６８℃）洗浄を行った。脱水および風乾後に、組織切片をコダック・バイオマックス（Ｋｏｄａｋ  Ｂｉｏｍａｘ）フィルムにさらし、３〜４日後にオートラジオグラムを現像した。生じた組織切片のいくつかを液状ＮＴＢ−２エマルジョンに浸して、５週の暴露期間後現像した。エマルジョン浸漬切片をクレシル・バイオレットで対比染色して、透過照明付顕微鏡による分析用にカバーガラスで覆った。ビデオ・ベース・コンピューター画像解析装置（ＭＣＩＤ，Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔ.Ｃａｔｈａｒｉｎｅ’ｓ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）を用いて、ＰＫ２、Ｐｅｒ１、およびＰｅｒ２の特異的ハイブリダイゼーション・シグナルを定量的に分析した。１４Ｃ標準物質を用いて、光学濃度対放射能の検量線（ｄｐｍ／ｍｇ組織湿重量）を構築した。ハイブリダイゼーション・シグナルを持たない隣接脳領域から得たバックグラウンド値を引いて、ＳＣＮでの特異的ハイブリダイゼーション・シグナルを決定した。ＳＣＮの同領域でのシグナル強度間の相違に関してデータを正規化した。ＳＣＮの画像をオートラジオグラムから得て、アドーブ・フォトショップ（Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ）で調製した。スポット・カメラ・ソフトウエア・バージョン２．２．２（Ｓｐｏｔ  ｃａｍｅｒａ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．２．２）（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＭＩ）を用いて、透過照明付顕微鏡（ＢＸ５０，Ｏｌｙｍｐｕｓ）下で、エマルジョン浸漬切片を採取した。図作製用に、取り込まれた画像をアドーブ・フォトショップ６．０（Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ６．０）に転送した。
【０２１８】
実施例Ｘ
メラノプシン欠損マウスでのＰＫ２の光誘導性
この実施例によって、メラノプシンは、ＰＫ２の光誘導性に対する入力メカニズムであることを示す。
【０２１９】
メラノプシンは、概日光同調に対する主要な光受容器である。ＰＫ２の光誘導性がメラノプシン欠損マウス（Ｏｐｎ４−／−）で鈍くなるかどうかを決定するために、Ｏｐｎ４−／−マウスのＳＣＮでのＰＫ２ｍＲＮＡ発現を観測した。
【０２２０】
野生型およびメラノプシン欠損（Ｏｐｎ４−／−）マウス（Ｃ５７Ｂｌ６／１２９ハイブリッド・バックグラウンドでの）を正常１２Ｌ：１２Ｄに同調させ、２４時間の期間（ツァイトゲーバー時間＝ＺＴ、ＺＴ１〜２２）で、３時間毎にサンプルを採取した。光パルス研究のために、野生型およびＯｐｎ４−／−マウスは、ＺＴ１４で１５分の光パルス（４００ルクス）を受け、光パルス後１時間または２時間でサンプルを採取された。ＺＴ１４での１５分の光パルス送達後１時間または２時間でＰＫ２ｍＲＮＡ発現を測定した。
【０２２１】
これらの実験の結果を図１６Ａに示す。陰影および塗りつぶり棒はそれぞれ、野生型（ＷＴ）およびＯｐｎ４−／−マウス内の光パルス誘導ＰＫ２ｍＲＮＡを表す。図示されるように、Ｏｐｎ４−／−マウス内の光パルス誘導ＰＫ２ｍＲＮＡは、光パルス後１時間および２時間で、それぞれ約３０％および５０％減少した。
【０２２２】
図１６Ｂに示されるように、正常ＬＤ周期下での野生型（塗りつぶし正方形）およびＯｐｎ４−／−マウス（白抜き三角形）内のＰＫ２ｍＲＮＡの一時的プロフィルも実験した。Ｏｐｎ４−／−マウスでのＰＫ２の発振プロフィルは、野生型マウスで観測されたものと類似しており、明暗周期下でのＯｐｎ４−／−マウス内の正常自発運動行動と整合性があった。図１６Ｂでは、各値は、４匹の動物の平均±標準偏差を表す。＊＊ｐ＜０．０１、スチューデント（Ｓｔｕｄｅｎｔ）のｔ検定。  
【０２２３】
これらの結果によって、メラノプシンは、ＰＫ２の光誘導性に対する入力メカニズムであるが、光同調の１つ以上の他の光感知メカニズムも伴われることが示される。
【０２２４】
実施例ＸＩ
明期情報をコード化する上でのＰＫ２発現の役割
この実施例によって、ＳＣＮでのＰＫ２ｍＲＮＡリズムに対する明期の効果を示す。
【０２２５】
ＳＣＮ内のＰＫ２の分子リズムが明期情報をコード化するかどうかを決定するために、動物を正常１２時間明期：１２時間暗期（ＬＤ）周期下で同調させ、その後、異なる明期、すなわち８時間明期：１６時間暗期（８Ｌ：１６Ｄ）、１６時間明期：８時間暗期（１６Ｌ：８Ｄ）、または２０時間明期：４時間暗期（２０Ｌ：４Ｄ）に４週間置く。２０時間明期：４時間暗期（２０Ｌ：４Ｄ）に関しては、動物を、初めに１４Ｌ：１０Ｄに１週間置き、１６Ｌ：８Ｄに次の１週間移し、その後、２週間の２０Ｌ：４Ｄが続く。ＳＣＮ内のＰＫ２ｍＲＮＡ値を決定するために用いられるサンプルを２４時間周期にわたって２時間毎に採取する。この研究の結果を図１７に示す。白抜きおよび塗りつぶし棒はそれぞれ、明期および暗期期間を示す。
【０２２６】
図１７Ａは、８Ｌ：１６Ｄ条件下でのＰＫ２ｍＲＮＡ値を示す。図１７Ｂは、１６Ｌ：８Ｄ条件下でのＰＫ２ｍＲＮＡ値を示す。図１７Ｃは、２０Ｌ：４Ｄ条件下でのＰＫ２値を示す。図１７Ｄは、上述の異なる明期下でのＳＣＮ内のＰＫ２ｍＲＮＡの代表的なオートラジオグラムを示す。スケール・バー＝１ｍｍ。各値は、３〜４匹の動物の平均±標準誤差を表す。
【０２２７】
図１７ＣおよびＤで示されるように、動物をさらにより長い明期期間（２０Ｌ：４Ｄ）に同調させるとき、ＰＫ２ｍＲＮＡも明期期間に従い、全２０時間明期期間中で検出された。しかし、短い明期（８Ｌ：１６Ｄ）中では、図１７Ａに示されるように、ＰＫ２ｍＲＮＡは、明期が開始される前に上昇し、明期停止後も持続した。短い明期でのＰＫ２ｍＲＮＡの一時的プロフィルは、正常ＬＤまたは恒暗（２ＤＤ）で観測されたものと類似している。したがって、短縮された明期期間では、概日ループは、ＰＫ２に対して優勢な支配を有する。これらのことをまとめて考えると、これらの結果によって、明期情報は、ＰＫ２発現の持続期間によってコード化されるらしいことが示される。
【０２２８】
興味深いことに、ＰＫ２ｍＲＮＡ発現のピークは、短い日中（８Ｌ：１６Ｄ）または正常ＬＤよりも、長い日中（１６Ｌ：８Ｄ）でより高い。しかし、明期期間（２０Ｌ：４Ｄ）での更なる増加は、ピークＰＫ２値を抑制した（図１７Ｃ）。
【０２２９】
図１７Ｂに示されるように、明期長さ（１６Ｌ：８Ｄ）が増加するにつれて、ＰＫ２ｍＲＮＡ発現は、図１６Ｂに示される結果と比較して、完全な１６時間明期位相に拡大され、これによって、正常ＬＤ周期中では、ＰＫ２ｍＲＮＡは、ＺＴ４でピーク値である１２時間明期位相中に高度に発現したことが示される。
【０２３０】
要約すると、この実施例によって、ＰＫ２ｍＲＮＡ発現が明期によって調節されることが示される。
【０２３１】
この明細書を通して、様々な刊行物が括弧内で参照されている。これらの刊行物の開示は、本発明が属する技術状態をより完全に説明するために全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【０２３２】
開示される実施形態を参照して本発明を記載してきたが、当業者には、詳述される特定の実験は本発明を説明するためのみのものであることが容易に認識される。本発明の精神から逸脱しない程度に様々な変更が可能であることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０２３３】
【図１】図１は、ＳＣＮでのＰＫ２ｍＲＮＡのリズム性発現を示す。図１ａは、マウス脳の冠状縫合切断（２０μｍ）でのＰＫ２ｍＲＮＡ発現を示す。図１ｂは、視交差上核（ＳＣＮ）でのＰＫ２ｍＲＮＡの時間的プロフィルを示す。図１ｃは、図１ｂに示したＰＫ２ｍＲＮＡ発現の代表的な形を示す。
【図２】図２は、マウスＰＫ２遺伝子のインビトロ転写分析を示す。図２ａは、マウスＰＫ２遺伝子の５’フランキング領域内のＥボックス（Ｅ）とｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）との境界を示す。図２ｂは、マウスＰＫ２遺伝子の５’フランキング領域の２．８ｋｂ（ＰＫ２．８−Ｌｕｃ）および２００ｂｐ（ＰＫ０．２−Ｌｕｃ）を含むルシフェラーゼ・レポーターの転写活性化を示す。図２ｃは、７２ｂｐの４つのＥボックス全てと互いに連結したそれらの隣接フランキング配列とを含むＳＶ４０駆動ルシフェラーゼ・レポーター（ｐＧＬ３プロモーター）の転写活性を示す。図２ｄは、ｍＰｅｒｓおよびｍＣｒｙｓによるＰＫ２．８−ＬｕｃからのＣＬＯＣＫ：ＢＭＡＬ１媒介転写を示す。図２ｅは、ＰＫ２遺伝子のＣＬＯＣＫ：ＢＭＡＬ１媒介転写に対するＰＫ２レセプターのプラス効果を示す。
【図３】図３は、  時計欠損（Ｃｌｋ／Ｃｌｋ）またはクリプトクローム欠損（Ｃｒｙ／Ｃｒｙ）マウスのｐＫ２ｍＲＮＡのリズム性発現を示す。図３ａは、Ｃｌｋ／ＣｌｋマウスのＳＣＮ内ＰＫ２ｍＲＮＡの一時的プロフィルを示す。図３ｂは、ＣＴ６およびＣＴ１８でのＣｒｙ／ＣｒｙマウスのＳＣＮ内ＰＫ２ｍＲＮＡの発現を示す。
【図４】図４は、動物がＣＴ１４（図４ａ）またはＣＴ２３（図４ｂ）で１５分間光パルスにさらされた場合の光同調（光同調）にＳＣＮ内のＰＫ２リズムが応答することを示す。図４ｃは、光パルスに応じたＳＣＮ内での変位ＰＫ２リズムである。図４ｄは、図４ｃに示した位相変位の定量化を示す。
【図５】図５は、マウス脳内でのＰＫ２レセプター（ＰＫＲ２）ｍＲＮＡの発現を示す。図５のａないしｅは、外側中隔（ＬＳ）、脳室周囲視床（ＰＶＴ）、および視床下部核（ＰＶＮ）、視交叉上核（ＳＣＮ）、終末傍核（ｐａｒａｔｅｎｉａｌ  ｎｕｃｌｅｕｓ）（ＰＴ）、中心傍核(ＰＣ）、外側手綱（ＬＨｂ）、背内側視床下部核（ＤＭＨ）、および弓状核（Ａｒｃ）のＰＫＲ２  ｍＲＮＡのオートラジオグラフィー像を示す。図５のｆないしｊは、上側パネル（ａないしｅ）の線で囲んだ領域から得たＰＫＲ２ｍＲＮＡの暗視野顕微鏡像を示す。図５ｋおよび図５ｌは、ＰＫ２の顕微鏡像を示し、図５ｍおよび図５ｎは、ＳＣＮ内のＰＫＲ２ｍＲＮＡを高倍率で示す。
【図６】図６は、マウス脳でのＰＫ２レセプター（ＰＫＲ２）ｍＲＮＡ発現を示す。図６ａは、中心傍核(ＰＣ）、脳室周囲視床核（ＰＶＴ）、視床下部室傍核背帽（ＰａＤＣ）、視交叉上核（ＳＣＮ）内でのＰＫＲ２ｍＲＮＡ発現を示す。図６ｂは、外側手綱(ＬＨｂ）、背側淡蒼球(ＬＧＰ）、扁桃体(Ａｍｇ）、脳室周囲視床核（ＰＶＴ）、背側視床下部核(ＤＭＨ）、および弓状核(Ａｒｃ）でのＰＫＲ２ｍＲＮＡ発現を示す。図６ｃ、ｄ、ｅ、およびｆは、図６ａおよび図６ｂの線で囲んだ領域から得たＰＫＲ２ｍＲＮＡの暗視野顕微鏡像を示す。
【図７】図７は、明暗周期の急変に応じたＳＣＮ内でのＰＫ２ｍＲＮＡ発現を示す。図７ａは、実験計画を示す。図７ｂおよび図７ｃは、正常明暗周期でのＰＫ２ｍＲＮＡ発現を示す。
【図８】図８は、明暗周期の急変に応じたＳＣＮ内でのＰＫ２ｍＲＮＡの一時的プロファイルを示す。
【図９】図９は、組み換え型ヒトＰＫ２の側脳室内送達がホイール・ランニングに及ぼす効果を示す。図９ａおよび９ｂは、ＣＴ１４でＰＫ２（ａ）または食塩水（ｂ）を注射されたラットの代表的なアクトグラムを示す。図９ｃは、ＰＫ２（ｎ＝７）または食塩水（ｎ＝６）を送達させた後の夜間および日中の自発運動の定量化を示す。
【図１０】図１０は、ヒト（ＨＵＭＡＮ）ＰＫ２（配列番号５および６）、マウス（ＭＯＵＳＥ）ＰＫ２（配列番号７および８）、ヒト（ＨＵＭＡＮ）ＰＫ１（配列番号９）、マウスＰＫ１（配列番号１０）、カエル（ＦＲＯＧ）Ｂｖ８（配列番号１１）、ヒキガエル（ＴＯＡＤ）Ｂｖ８（配列番号１２）、およびヘビ（Ｓｎａｋｅ）ＭＩＴ１（配列番号１３）を示す。
【図１１】ＰＫ２レセプターに対するヨウ素標識ＰＫ２の結合を示す。
【図１２】ＰＫ２レセプターに対するＰＫ２結合によるカルシウムの移動を示す。
【図１３】ヒトＰＫ２遺伝子の５’−フランキング領域内にあるＥボックス（Ｅ）とｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）との境界を示す。
【図１４】明暗周期の急変に応じたＳＣＮ内でのＰＫ２ｍＲＮＡ発現の一時的プロフィルを示す。
【図１５】正常明暗または恒暗条件下でのｍＣｒｙ１，２−／−マウスのＳＣＮ内での分子リズムを示す。
【図１６】野生型マウスと比較した場合のＯｐｎ４−／−マウスのＳＣＮ内でのＰＫ２ｍＲＮＡの光誘導性の減少を示す。
【図１７】図１７は、ＳＣＮ内でのＰＫ２ｍＲＮＡ発現リズムに対する明期の効果を示す。
【図１】
2005538695.tif 000003
2005538695.tif 000004
2005538695.tif 000005
【図２】
2005538695.tif 000006
【図３】
2005538695.tif 000007
2005538695.tif 000008
【図４】
2005538695.tif 000009
【図５】
2005538695.tif 000010
【図６】
2005538695.tif 000011
2005538695.tif 000012
2005538695.tif 000013
2005538695.tif 000014
2005538695.tif 000015
2005538695.tif 000016
【図７】
2005538695.tif 000017
2005538695.tif 000018
2005538695.tif 000019
【図８】
2005538695.tif 000020
【図９】
2005538695.tif 000021
【図１０】
2005538695.tif 000022
【図１１】
2005538695.tif 000023
【図１２】
2005538695.tif 000024
【図１３】
2005538695.tif 000025
【図１４】
2005538695.tif 000026
【図１５】
2005538695.tif 000027
【図１６】
2005538695.tif 000028
【図１７】
2005538695.tif 000029
【配列表】
2005538695000001.app