(57)【要約】  本発明は、治療を必要とする患者において精神疾患を治療する能力について被試験薬剤を同定するための方法を提供する。本発明は、抗精神病薬について候補薬剤をスクリーニングするための方法を提供し、この方法は、細胞又は組織を候補薬剤と接触させること、該細胞又は組織中の、細胞内シグナル伝達蛋白質DARPP-32、ERK1、ERK2及びCREBのリン酸化レベルを測定すること、並びに、該蛋白質のリン酸化のレベルを決定することを含む。ある特定の実施態様では、DARPP-32、ERK1、ERK2及びCREBのリン酸化レベルのパターンが、非定型抗精神病薬の存在下でのDARPP-32、ERK1、ERK2及びCREBのリン酸化レベルのパターンと比較される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療を必要とする患者の精神疾患を治療する能力について被試験薬剤を同定するための方法であって、
(a)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr-75脱リン酸化DARPP-32とを接触させて、Thr-75脱リン酸化DARPP-32のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(b)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr-75リン酸化DARPP-32とを接触させて、Thr-75リン酸化DARPP-32の脱リン酸化量を検出する段階、あるいは、
(c)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr202-脱リン酸化ERK1とを接触させて、Thr202-脱リン酸化ERK1のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(d)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr202-リン酸化ERK1とを接触させて、Thr202-リン酸化ERK1の脱リン酸化量を検出する段階、あるいは、
(e)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とTyr204-脱リン酸化ERK1とを接触させて、Tyr204-脱リン酸化ERK1のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(f)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とTyr204-リン酸化ERK1とを接触させて、Tyr204-リン酸化ERK1の脱リン酸化量を検出する段階、あるいは、
(g)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr185-脱リン酸化ERK2とを接触させて、Thr185-脱リン酸化ERK2のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(h)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr185-リン酸化ERK2とを接触させて、Thr185-リン酸化ERK2の脱リン酸化量を検出する段階、あるいは、
(i)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とTyr187-脱リン酸化ERK2とを接触させて、Tyr187-脱リン酸化ERK2のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(j)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とTyr187-リン酸化ERK2とを接触させて、Tyr187-リン酸化ERK2の脱リン酸化量を検出する段階、あるいは、
(k)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とSer133-脱リン酸化CREBとを接触させて、Ser133-脱リン酸化CREBのリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(l)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とSer133-リン酸化CREBとを接触させて、Ser133-リン酸化CREBの脱リン酸化量を検出する段階、
を含み、ここで、該潜在的薬剤の存在下で対照レベルに対して、もしそれぞれ、
(i)  Thr-75脱リン酸化DARPP-32のリン酸化レベルの増加が段階(a)で検出されるか、あるいは、
(ii)  Thr-75リン酸化DARPP-32の脱リン酸化レベルの減少が段階(b)で検出されるか、あるいは、
(iii)  Thr202-脱リン酸化ERK1のリン酸化レベルの減少が段階(c)で検出されるか、あるいは、
(iv)   Thr202-リン酸化ERK1の脱リン酸化レベルの増加が段階(d)で検出されるか、あるいは、
(v)   Tyr204-脱リン酸化ERK1のリン酸化レベルの減少が段階(e)で検出されるか、あるいは、
(vi)  Tyr204-リン酸化ERK1の脱リン酸化レベルの増加が段階(f)で検出されるか、あるいは、
(vii)  Thr185-脱リン酸化ERK2のリン酸化レベルの減少が段階(g)で検出されるか、あるいは、
(viii)  Thr185-リン酸化ERK2の脱リン酸化レベルの増加が段階(h)で検出されるか、あるいは、
(ix)  Tyr187-脱リン酸化ERK2のリン酸化レベルの減少が段階(i)で検出されるか、あるいは、
(x)  Tyr187-リン酸化ERK2の脱リン酸化レベルの増加が段階(j)で検出されるか、あるいは、
(xi)  Ser133-脱リン酸化CREBのリン酸化レベルの減少が段階(k)で検出されるか、あるいは、
(xii)  Ser133-リン酸化CREBの脱リン酸化レベルの増加が段階(l)で検出される、
場合に、該薬剤が潜在的非定型抗精神病化合物として同定される、上記方法。
【請求項２】
段階(a)から(l)のいずれか１つをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
段階(a)から(l)のいずれか2つをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
段階(a)から(l)のいずれか3つをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
段階(a)から(l)のいずれか4つをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
段階(a)から(l)のいずれか5つをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
段階(a)から(l)のいずれか6つをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
下記の更なる段階、すなわち、
(m)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr34-脱リン酸化DARPP-32とを接触させて、Thr34-脱リン酸化DARPP-32のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(n)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr34-リン酸化DARPP-32とを接触させて、Thr34-リン酸化DARPP-32の脱リン酸化量を検出する段階、
を含み、ここで該潜在的薬剤の存在下で対照レベルに対して、もし、
(xiii)  Thr34-脱リン酸化DARPP-32のリン酸化の増加が段階(m)で検出されるか、あるいは、
(xix)  Thr34-リン酸化DARPP-32の脱リン酸化の減少が段階(n)で検出される、
場合に、該薬剤が潜在的非定型抗精神病化合物として同定される、
請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記精神疾患を治療する能力が試験され、もし前記化合物が該精神疾患を改善する場合、非定型抗精神病化合物が同定される、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
前記精神疾患が統合失調症である、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
前記精神疾患を治療する能力が統合失調症モデル動物で試験される、請求項9に記載の方法。
【請求項１２】
前記検出段階が、前記接触段階後15分以上30分以下に実施される、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
前記検出段階が、前記接触段階後30分以上60分以下に実施される、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４】
前記検出段階が、前記接触段階後30分以上60分以下に実施される、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１５】
治療を必要とする患者の精神疾患を治療する能力について被試験薬剤を同定するための方法であって、
(a)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr-75脱リン酸化DARPP-32とを接触させて、Thr-75脱リン酸化DARPP-32のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(b)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr-75リン酸化DARPP-32とを接触させて、Thr-75リン酸化DARPP-32の脱リン酸化量を検出する段階、あるいは、
(c)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr202-脱リン酸化ERK1とを接触させて、Thr202-脱リン酸化ERK1のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(d)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr202-リン酸化ERK1とを接触させて、Thr202-リン酸化ERK1の脱リン酸化量を検出する段階、あるいは、
(e)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とTyr204-脱リン酸化ERK1とを接触させて、Tyr204-脱リン酸化ERK1のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(f)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とTyr204-リン酸化ERK1とを接触させて、Tyr204-リン酸化ERK1の脱リン酸化量を検出する段階、あるいは、
(g)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr185-脱リン酸化ERK2とを接触させて、Thr185-脱リン酸化ERK2のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(h)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr185-リン酸化ERK2とを接触させて、Thr185-リン酸化ERK2の脱リン酸化量を検出する段階、あるいは、
(i)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とTyr187-脱リン酸化ERK2とを接触させて、Tyr187-脱リン酸化ERK2のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(j)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とTyr187-リン酸化ERK2とを接触させて、Tyr187-リン酸化ERK2の脱リン酸化量を検出する段階、あるいは、
(k)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とSer133-脱リン酸化CREBとを接触させて、Ser133-脱リン酸化CREBのリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(l)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とSer133-リン酸化CREBとを接触させて、Ser133-リン酸化CREBの脱リン酸化量を検出する段階、
を含み、ここで、該潜在的薬剤の存在下で対照レベルに対して、もしそれぞれ、
(i)  Thr-75脱リン酸化DARPP-32のリン酸化レベルの増加が段階(a)で検出されるか、あるいは、
(ii)  Thr-75リン酸化DARPP-32の脱リン酸化レベルの減少が段階(b)で検出されるか、あるいは、
(iii)  Thr202-脱リン酸化ERK1のリン酸化レベルの減少が段階(c)で検出されるか、あるいは、
(iv)   Thr202-リン酸化ERK1の脱リン酸化レベルの増加が段階(d)で検出されるか、あるいは、
(v)   Tyr204-脱リン酸化ERK1のリン酸化レベルの減少が段階(e)で検出されるか、あるいは、
(vi)  Tyr204-リン酸化ERK1の脱リン酸化レベルの増加が段階(f)で検出されるか、あるいは、
(vii)  Thr185-脱リン酸化ERK2のリン酸化レベルの減少が段階(g)で検出されるか、あるいは、
(viii)  Thr185-リン酸化ERK2の脱リン酸化レベルの増加が段階(h)で検出されるか、あるいは、
(ix)  Tyr187-脱リン酸化ERK2のリン酸化レベルの減少が段階(i)で検出されるか、あるいは、
(x)  Tyr187-リン酸化ERK2の脱リン酸化レベルの増加が段階(j)で検出されるか、あるいは、
(xi)  Ser133-脱リン酸化CREBのリン酸化レベルの減少が段階(k)で検出されるか、あるいは、
(xii)  Ser133-リン酸化CREBの脱リン酸化レベルの増加が段階(l)で検出される、
場合に、該薬剤が潜在的非定型抗精神病化合物として同定される、上記方法。
【請求項１６】
下記の更なる段階、すなわち、
(m)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr34-脱リン酸化DARPP-32とを接触させて、Thr34-脱リン酸化DARPP-32のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(n)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr34-リン酸化DARPP-32とを接触させて、Thr34-リン酸化DARPP-32の脱リン酸化量を検出する段階、
を含み、ここで該潜在的薬剤の存在下で対照レベルに対して、もし、
(xiii)  Thr34-脱リン酸化DARPP-32のリン酸化の増加が段階(m)で検出されるか、あるいは、
(xix)  Thr34-リン酸化DARPP-32の脱リン酸化の減少が段階(n)で検出される、
場合に、該薬剤が潜在的非定型抗精神病化合物として同定される、
請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
前記精神疾患を治療する能力が試験され、もし前記化合物が該精神疾患を改善する場合、非定型抗精神病化合物が同定される、請求項15又は16に記載の方法。
【請求項１８】
前記精神疾患が統合失調症である、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
前記精神疾患を治療する能力が統合失調症モデル動物で試験される、請求項17に記載の方法。
【請求項２０】
前記検出段階が、前記接触段階後15分以上30分以下に実施される、請求項15又は16に記載の方法。
【請求項２１】
前記検出段階が、前記接触段階後30分以上60分以下に実施される、請求項15又は16に記載の方法。
【請求項２２】
前記検出段階が、前記接触段階後30分以上60分以下に実施される、請求項15又は16に記載の方法。
【請求項２３】
治療を必要とする患者の精神疾患を治療する能力について被試験薬剤を同定するための方法であって、
(a)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr-75脱リン酸化DARPP-32とを接触させて、Thr-75脱リン酸化DARPP-32のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(b)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr-75リン酸化DARPP-32とを接触させて、Thr-75リン酸化DARPP-32の脱リン酸化量を検出する段階、あるいは、
(c)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr202-脱リン酸化ERK1とを接触させて、Thr202-脱リン酸化ERK1のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(d)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr202-リン酸化ERK1とを接触させて、Thr202-リン酸化ERK1の脱リン酸化量を検出する段階、あるいは、
(e)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とTyr204-脱リン酸化ERK1とを接触させて、Tyr204-脱リン酸化ERK1のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(f)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とTyr204-リン酸化ERK1とを接触させて、Tyr204-リン酸化ERK1の脱リン酸化量を検出する段階、あるいは、
(g)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr185-脱リン酸化ERK2とを接触させて、Thr185-脱リン酸化ERK2のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(h)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr185-リン酸化ERK2とを接触させて、Thr185-リン酸化ERK2の脱リン酸化量を検出する段階、あるいは、
(i)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とTyr187-脱リン酸化ERK2とを接触させて、Tyr187-脱リン酸化ERK2のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(j)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とTyr187-リン酸化ERK2とを接触させて、Tyr187-リン酸化ERK2の脱リン酸化量を検出する段階、あるいは、
(k)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とSer133-脱リン酸化CREBとを接触させて、Ser133-脱リン酸化CREBのリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(l)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とSer133-リン酸化CREBとを接触させて、Ser133-リン酸化CREBの脱リン酸化量を検出する段階、
を含み、ここで、該潜在的薬剤の存在下で対照レベルに対して、もしそれぞれ、
(i)  Thr-75脱リン酸化DARPP-32のリン酸化レベルの未変化又は減少が段階(a)で検出されるか、あるいは、
(ii)  Thr-75リン酸化DARPP-32の脱リン酸化レベルの未変化又は増加が段階(b)で検出されるか、あるいは、
(iii)  Thr202-脱リン酸化ERK1のリン酸化レベルの増加が段階(c)で検出されるか、あるいは、
(iv)   Thr202-リン酸化ERK1の脱リン酸化レベルの減少が段階(d)で検出されるか、あるいは、
(v)   Tyr204-脱リン酸化ERK1のリン酸化レベルの増加が段階(e)で検出されるか、あるいは、
(vi)  Tyr204-リン酸化ERK1の脱リン酸化レベルの減少が段階(f)で検出されるか、あるいは、
(vii)  Thr185-脱リン酸化ERK2のリン酸化レベルの増加が段階(g)で検出されるか、あるいは、
(viii)  Thr185-リン酸化ERK2の脱リン酸化レベルの減少が段階(h)で検出されるか、あるいは、
(ix)  Tyr187-脱リン酸化ERK2のリン酸化レベルの増加が段階(i)で検出されるか、あるいは、
(x)  Tyr187-リン酸化ERK2の脱リン酸化レベルの減少が段階(j)で検出されるか、あるいは、
(xi)  Ser133-脱リン酸化CREBのリン酸化レベルの増加が段階(k)で検出されるか、あるいは、
(xii)  Ser133-リン酸化CREBの脱リン酸化レベルの減少が段階(l)で検出される、
場合に、該薬剤が潜在的定型抗精神病化合物として同定される、上記方法。
【請求項２４】
下記の更なる段階、すなわち、
(m)  潜在的薬剤とThr34-脱リン酸化DARPP-32とを接触させて、Thr34-脱リン酸化DARPP-32のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(n)  潜在的薬剤とThr34-リン酸化DARPP-32とを接触させて、Thr34-リン酸化DARPP-32の脱リン酸化量を検出する段階、
を含み、ここで該潜在的薬剤の存在下で対照レベルに対して、もし、
(xiii)  Thr34-脱リン酸化DARPP-32のリン酸化の増加が段階(m)で検出されるか、あるいは、
(xix)  Thr34-リン酸化DARPP-32の脱リン酸化の減少が段階(n)で検出される、
場合に、該薬剤が潜在的定型抗精神病化合物として同定される、
請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
前記精神疾患を治療する能力が試験され、もし前記化合物が該精神疾患を改善する場合、定型抗精神病化合物が同定される、請求項23又は24に記載の方法。
【請求項２６】
前記精神疾患が統合失調症である、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
前記精神疾患を治療する能力が統合失調症モデル動物で試験される、請求項25に記載の方法。
【請求項２８】
前記検出段階が、前記接触段階後15分以上30分以下に実施される、請求項23又は24に記載の方法。
【請求項２９】
前記検出段階が、前記接触段階後30分以上60分以下に実施される、請求項23又は24に記載の方法。
【請求項３０】
前記検出段階が、前記接触段階後30分以上60分以下に実施される、請求項23又は24に記載の方法。
【請求項３１】
前記リン酸化レベル又は脱リン酸化レベルがリン酸特異抗体を用いて検出される、請求項1〜8、15、16、23及び24のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３２】
前記リン酸化レベル又は脱リン酸化レベルがキナーゼ活性の測定により検出される、請求項1〜8、15、16、23及び24のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３３】
前記リン酸化レベル又は脱リン酸化レベルがホスファターゼ活性の測定により検出される、請求項1〜8、15、16、23及び24のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞又は組織がヒト細胞又はヒト組織である、請求項1〜8、15、16、23及び24のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞又は組織が細胞である、請求項1〜8、15、16、23及び24のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞又は組織が組織である、請求項1〜8、15、16、23及び24のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞又は組織が全動物である、請求項1〜8、15、16、23及び24のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞又は組織がヒトである、請求項1〜8、15、16、23及び24のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３９】
DARPP-32がヒトDARPP-32である、請求項1〜8、15、16、23及び24のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４０】
CREBがヒトCREBである、請求項1〜8、15、16、23及び24のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４１】
ERK1がヒトERK1である、請求項1〜8、15、16、23及び24のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４２】
ERK2がヒトERK2である、請求項1〜8、15、16、23及び24のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４３】
DARPP-32がマウスDARPP-32である、請求項1〜8、15、16、23及び24のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４４】
CREBがマウスCREBである、請求項1〜8、15、16、23及び24のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４５】
ERK1がマウスERK1である、請求項1〜8、15、16、23及び24のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４６】
ERK2がマウスERK2である、請求項1〜8、15、16、23及び24のいずれか1項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、国立精神健康研究所によって付与されたグラント番号MH40899下、政府支援でなされた。米国政府は本発明に特定の権利を有している。
【０００２】
関連出願
本出願は、2001年8月31日出願の米国仮出願60/316,338の、35 U.S.C. §119(e)による利益を請求する。この仮出願の全体を参考として本明細書中に取り入れるものとする。
【０００３】
1.技術分野
本発明は、治療を必要とする患者の精神疾患を治療する能力について被試験薬剤を同定するための方法に関する。本発明はまた、抗精神病薬活性、好ましくは非定型抗精神病薬活性について候補薬剤をスクリーニングする方法であって、細胞又は組織と候補薬剤とを接触させ、該細胞又は組織内で細胞内シグナル伝達蛋白質、即ちDARPP-32、ERK1、ERK2及びCREBのリン酸化レベルを測定し、該蛋白質のリン酸化レベルのパターンを決定することを含む方法に関する。本発明の１つの態様において、候補薬剤に対する応答におけるDARPP-32、ERK1、ERK2及びCREBのリン酸化レベルのパターンを、既知の非定型抗精神病薬に対する応答におけるDARPP-32、ERK1、ERK2及びCREBのリン酸化レベルのパターンと比較する。
【背景技術】
【０００４】
2．発明の背景
脳組織にはいくつかの重要な細胞内シグナル伝達蛋白質が存在し、これらの蛋白質は、うつ病、統合失調症（精神分裂病）及びパーキンソン病などの神経学的疾患に関連する神経伝達物質の調節と関わりを有している。これらの細胞内シグナル伝達蛋白質には、DARPP-32（ドーパミン及びcAMP調節ホスホプロテイン、Mr 32,000）、ERK1及びERK2(細胞外シグナル調節プロテインキナーゼ１及び2)、並びにCREB（cAMP応答要素結合蛋白質）が含まれる。
【０００５】
2.1. DARPP-32
DARPP-32は、脳内のドーパミン（DA）とcAMPの主要な標的として見出された(Walaasら, 1983, Nature 301:69-71)。DARPP-32は、ドーパミン作動性ニューロンの２つの主要な突出領域、即ち前頭葉前部大脳皮質及び線条体に豊富に存在しており、ドーパミンの生物学的、電気生理学的、転写及び行動作用において必須の役割を演じている(Greengard, P.ら, 1999, Neuron 23:435-447)。ある研究によって、DARPP-32のレベルと、ある特定の抗うつ病薬化合物の薬理学的活性とが結び付けられた(Guitart, X.とE.J. Nestler, 1992, J. Neurochem. 59:1164-1167)。その研究者らは、ラットにリチウム、イミプラミン及びトラニルシプロミンを慢性投与すると、前頭葉前部大脳皮質においてDARPP-32の免疫反応性レベルが有意に増大するのに対して、ハロペリドール、モルヒネ及びコカインを投与してもDARPP-32の免疫反応性には全く影響が現れなかったことを実証した。リチウムは、躁うつ病の治療に使用されるが、一方、イミプラミンとトラニルシプロミンは抗うつ剤である。イミプラミンはノルエピネフリンの再取込みを阻害することによって作用するが、一方トラニルシプロミンはモノアミンオキシダーゼ阻害剤である。
【０００６】
2.2. cAMP応答要素結合蛋白質(CREB)
ニューロンでは、種々のカルシウムチャネルを通してCa2+が流入すると、c-fosプロモーター内の血清応答因子(SRE)又はカルシウム応答要素(「CaRE」又は「CRE」)のいずれかを標的とする種々のシグナル伝達経路が活性化される(Ghoshら, J. Neurobiol, 1994, Mar; 25(3):294-303)。CREを介する転写は、cAMP応答要素結合蛋白質(CREB)のSer133での誘導リン酸化を必要とする。CREBは塩基性ドメイン/ロイシンジッパーモチーフを含み、二量体となってCREに結合する(De Cesareら, Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 2000; 64:343-69)。CREBなどのCRE結合蛋白質の活性化機能は、いくつかのキナーゼによるリン酸化によって調節され、またCBPやp300などの共活性化因子によって仲介される(De Cesareら, Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 2000; 64:343-69)。
【０００７】
このようにCa2+は、転写因子CREBのCa(2+)依存性リン酸化に関与する経路を含む複数のシグナル伝達経路による遺伝子発現を調節している(Ghoshら, J. Neurobiol, 1994 Mar; 25(3):294-303)。CREBは、広範な生物における記憶の形成に関与するとともに、長期記憶（LTM）の整理など、種々の脳構造体を利用する様々な種類の仕事の記憶形成を調節している(Lamprecht, Cell Mol Life Sci, 1999 Apr; 55(4):554-63; Huang ら, Essays Biochem, 1998; 33:165-78)。
【０００８】
2.3. ERK1とERK2
細胞外シグナル調節キナーゼ１（ERK1）及び細胞外シグナル調節キナーゼ2（ERK2）は、有糸分裂誘導物質活性化キナーゼ（MAPキナーゼ、MAPK）スーパーファミリーの一部である。シグナル伝達カスケードのMAPKスーパーファミリーは、細胞分裂と分化の重要な調節因子(Sweatt, 2001, J. Neurochem. (Jan.) 76(1):1-10)であり、また学習と記憶にも関与している(Sweatt, 2001, J. Neurochem. (Jan.) 76(1):1-10)。MAPKカスケードは、連続リン酸化によって互いに調節する、３つの連続的に結合されたキナーゼのモチーフを共有するシグナル伝達カスケードのファミリーの一部である(Sweatt, 2001, J. Neurochem. (Jan.) 76(1):1-10)。MAPKシグナル伝達カスケードのスーパーファミリーには、細胞外シグナル調節キナーゼ（ERK）、JNK、及びp38ストレス活性化プロテインキナーゼが含まれる(Sweatt, 2001, J. Neurochem. (Jan.) 76(1):1-10)。
【０００９】
脳中で最も豊富なERKはp44 MAPK(ERK1)とp42 MAPK(ERK2)である。ERK1とERK2は、下流の細胞内シグナル伝達事象においてセリン/トレオニンリン酸化を調節する中間体として働く(例えばBoultonら, 1991, Cell 65(4):663-75参照)。ERKは、（ERK1については）Thr202とTyr204、（ERK2については）Thr185とTyr187、の２つの部位でのリン酸化により活性化される。
【００１０】
ERKはまた、成熟中枢神経系のニューロン内で豊富に発現され、ERKシグナル伝達系が成熟ニューロン内で明らかに同時選択されてシナプス可塑性と記憶において機能する(Sweatt, 2001, J. Neurochem. (Jan.) 76(1):1-10)。さらにERKは、ニューロン内で細胞外シグナルに対する応答を統制するための生化学的シグナルインテグレーター及び分子同時発生検出体(molecular coincidence detectors)として働く（Sweatt, 2001, J. Neurochem. (Jan.) 76(1):1-10）。ERK1とERK2はCREBのリン酸化と活性化を介するc-fosの誘導に関与する(Sweatt, 2001, J. Neurochem. (Jan.) 76(1):1-10)。
【００１１】
2.4. 抗精神病薬の分類
抗精神病薬は定型(typical)及び非定型(atypical)の２つの種類に分類される。定型抗精神病薬にはハロペリドールが含まれ、この薬剤は30年以上にわたって使用されている。しかし、定型抗精神病薬の効能は制限的であり、それらの副作用もまた、それら薬剤の使用を制限することが多い。その副作用には、急性の錐体外路副作用(extrapyramidal effects)、例えば急性筋失調症（異常な筋痙攣及び体位）、偽パーキンソン症候群及び静座不能が含まれる。定型抗精神病薬は、ドーパミンD2受容体でアンタゴニストとして作用することを通じて少なくとも部分的にそれら薬剤の薬理学的効果を生むように思われる(例えばSilverstone T., Acta Psychiatr Scand Suppl, 1990. 358:88-91)。
【００１２】
非定型抗精神病薬はごく近年に開発されたもので、古い定型抗精神病化合物の制限のいくつかを解消している。そのような薬剤の１つがクロザピンであり、この薬剤は、錐体外路副作用をほとんど回避するため、ハロペリドールなどの薬剤の改良薬である。しかし、非定型抗精神病薬の作用機序はよく分かっていない。製薬業界はクロザピンに類似の活性をもつ他の薬剤を開発しようとしたが、そのような定型抗精神病薬の作用機序に関する理解不足が開発努力を妨げてきた。
【００１３】
抗精神病薬は通常、モデル動物で試験されるが、例えば妄想や幻聴などの「正」の精神病症状、あるいは例えば意気消沈した感情やアボリッション(avolition)などの「負」の症状、を制御することにおいて臨床効能を予言できるモデルは全くない。近年、「非定型」抗精神病薬が広く使用されるようになったが、これは主に、それらの薬剤が偽パーキンソン症候群などの錐体外路副作用や他の動作障害を大きく減退させるか、あるいは、ほぼ取除く利益を提供するからである。そのような非定型抗精神病薬の１つであるクロザピンは、負の症状を改善することが示されており、錐体外路副作用をほとんど回避する。しかしながら、クロザピンの常連使用者には顆粒球減少症、血液細胞の致死的破壊の危険があり、高価な実験室試験により白血球数を連続的に監視する必要がある。費用に加えてこのことが重大となるし、またこの面の治療可能性を制限する。
【００１４】
したがって、類似の非精神病薬特性をもつ改良化合物を見出すために相当の努力が払われてきた。これらの薬剤の作用機序の見透しが比較的不足していることが妨げとなって、研究者らは、多くの種々の行動及び生化学的パラメータを用いて候補抗精神病薬をクロザピンに当てはめようとしている。例えばMillanら(2000, J Pharmacological and Experimental Therapeutics 292, 54-66)は、14匹の異なるモデル動物と９通りの異なる受容体結合アッセイを用いて、見込みのある抗精神病化合物S18327（1-{2-[4-(6-フルオロ-1,2-ベンゾイソキサゾール-3-イル)ピペリジ-1-イル]エチル}3-フェニルイミダゾリン-2-オン）をクロザピンと比較した。
【００１５】
抗精神病薬を区別するために用いられた別の試験は、即時型遺伝子c-fosを誘導する能力を比較することである。定型及び非定型抗精神病薬は別々に、動作の制御に関与する脳領域である背部線条体（dorsal striatum）において即時型遺伝子c-fosの発現に影響する(Robertson, G.S.ら, 1994, J. Pharmacol. Exp. Ther. 271:1058-1066)。定型抗精神病薬であるハロペリドールは、非定型抗精神病薬のクロザピンと比べてc-fos発現の誘導にはるかに有効である(Robertson, G.S.ら, 1994, J. Pharmacol. Exp. Ther. 271:1058-1066)。２つの有糸分裂誘導物質活性化プロテインキナーゼERK1及びERK2は、転写因子CREBのリン酸化と活性化を介してc-fosの誘導に関与することを示した研究がある(Sweatt, J.D., 2001, J. Neurochem. 76:1-10)。一方クロザピンは、背部線条体では弱いc-fos誘導活性をもつのに対して、中間前頭葉前部大脳皮質ではc-fos発現を強く誘導する。この作用は、負の精神症状を緩和するクロザピンの能力と結び付いている可能性があるが、やはり、このような誘導を行う機序が不明である。
【００１６】
Wettsteinら(1999, Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry Apr; 23(3):533-44)は、薬剤種である定型及び非定型抗精神病薬がハルシノーゲン1-[2,5-ジメトキシ-4-ヨードフェニル]-2-アミノプロパン（DOI）の作用を有効に遮断することを開示している。DOIは、5-HT2A/2C受容体においてアゴニストとして高い親和性と選択性をもつハルシノーゲンである。抗精神病化合物を同定するために、ラットにおいてDOIで誘導される行動のアンタゴニストとして化合物を評価する。DOI(0.3〜10.0 mg/kg; i.p.)により、頭と体の揺すり、前足の軽打、及び皮膚をぴくぴくさせることを含む用量関連の行動作用が生じる。抗精神病薬及び他の化合物の作用（30分前処理；i.p.）は、一定の用量のDOI(3.0mg/kg)に対して試験された。M100907 (MDL100,907)、リスペリドン、ハロペリドール、クロザピン、アイロペリドン、オランザピン、アムペロジド、レモキシプリド、リタンセリン及びニューロテンシン作動薬NT1(NαMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu)は、DOIの３つの行動作用の各々に拮抗する。しかしながらこの方法の欠点は、それが定型抗精神病薬と非定型抗精神病薬とを区別しないことである。
【００１７】
潜在的な抗精神病化合物を同定するために通常使用される他の方法には、Braffら(1992, 統合失調症患者での驚き反射のゲイティングと常習性（Gating and habituation of the startle reflex in schizophrenic patients）, Arch Gen Psychiatry, 49:206-215)やSwerdlowとGeyer(1993, 統合失調症における知覚運動ゲイティング欠損のモデル動物でのクロザピンとハロペリドール（Clozapin and haloperidol in an animal model of sensorimotor gating deficits in schizophrenia）, Pharmacol Biochem Behav, 44:741-744)が開示したアッセイのような前パルス阻害アッセイが含まれる。これらの方法の欠点はやはり、それらが定型抗精神病薬と非定型抗精神病薬とを区別しないことである。また、そのような行動試験の更なる欠点は、それらの方法が労力を増大させることである。
【００１８】
しかし驚いたことに、非典型抗精神病薬の作用機序についてほとんど分かっていない。他の非定型抗精神病薬を開発するための開発努力は、この理解の不足によって妨げられてきた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
したがって、精神病又は精神疾患の治療に使用できる新規の医薬又は組成物を開発するために使用できる新しいスクリーニング法を提供することが、この業界で求められている。さらに、細胞内での抗精神病作用結果を簡単に試験するためのニーズがある。全ての抗精神病薬が、症状や望ましくない副作用の有効な緩和に関して広範な種々の下流作用を伴いながら複数の受容体に作用するため、これらのシグナルの細胞内統制の分析が、次世代の治療薬の開発に有用な、分かり易く、費用効果のある、機序に基づく比較を提供する。少なくとも一部は、DARPP-32、ERK1、ERK2及び/又はCREBによって調節される細胞内シグナル伝達経路の異常又は調節不全に原因がある前記精神病又は精神疾患の治療を開発するためのニーズもある。本発明は、そのような方法及び組成物を提供する。
【００２０】
本願の第２節又は他の節に記載の参照文献の引用又は同定は、そのような参照文献が本発明の従来技術となり得ることを承認したものではない。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
3．発明の概要
本発明は、治療を必要とする患者の精神疾患を治療する能力について被試験薬剤を同定するための方法であって、
(a)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr-75脱リン酸化DARPP-32とを接触させて、Thr-75脱リン酸化DARPP-32のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(b)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr-75リン酸化DARPP-32とを接触させて、Thr-75リン酸化DARPP-32の脱リン酸化量を検出する段階、あるいは、
(c)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr202-脱リン酸化ERK1とを接触させて、Thr202-脱リン酸化ERK1のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(d)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr202-リン酸化ERK1とを接触させて、Thr202-リン酸化ERK1の脱リン酸化量を検出する段階、あるいは、
(e)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とTyr204-脱リン酸化ERK1とを接触させて、Tyr204-脱リン酸化ERK1のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(f)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とTyr204-リン酸化ERK1とを接触させて、Tyr204-リン酸化ERK1の脱リン酸化量を検出する段階、あるいは、
(g)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr185-脱リン酸化ERK2とを接触させて、Thr185-脱リン酸化ERK2のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(h)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr185-リン酸化ERK2とを接触させて、Thr185-リン酸化ERK2の脱リン酸化量を検出する段階、あるいは、
(i)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とTyr187-脱リン酸化ERK2とを接触させて、Tyr187-脱リン酸化ERK2のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(j)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とTyr187-リン酸化ERK2とを接触させて、Tyr187-リン酸化ERK2の脱リン酸化量を検出する段階、あるいは、
(k)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とSer133-脱リン酸化CREBとを接触させて、Ser133-脱リン酸化CREBのリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(l)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とSer133-リン酸化CREBとを接触させて、Ser133-リン酸化CREBの脱リン酸化量を検出する段階、
を含み、ここで、該潜在的薬剤の存在下で対照レベルに対して、もしそれぞれ、
(i)  Thr-75脱リン酸化DARPP-32のリン酸化レベルの増加が段階(a)で検出されるか、あるいは、
(ii)  Thr-75リン酸化DARPP-32の脱リン酸化レベルの減少が段階(b)で検出されるか、あるいは、
(iii)  Thr202-脱リン酸化ERK1のリン酸化レベルの減少が段階(c)で検出されるか、あるいは、
(iv)   Thr202-リン酸化ERK1の脱リン酸化レベルの増加が段階(d)で検出されるか、あるいは、
(v)   Tyr204-脱リン酸化ERK1のリン酸化レベルの減少が段階(e)で検出されるか、あるいは、
(vi)  Tyr204-リン酸化ERK1の脱リン酸化レベルの増加が段階(f)で検出されるか、あるいは、
(vii)  Thr185-脱リン酸化ERK2のリン酸化レベルの減少が段階(g)で検出されるか、あるいは、
(viii)  Thr185-リン酸化ERK2の脱リン酸化レベルの増加が段階(h)で検出されるか、あるいは、
(ix)  Tyr187-脱リン酸化ERK2のリン酸化レベルの減少が段階(i)で検出されるか、あるいは、
(x)  Tyr187-リン酸化ERK2の脱リン酸化レベルの増加が段階(j)で検出されるか、あるいは、
(xi)  Ser133-脱リン酸化CREBのリン酸化レベルの減少が段階(k)で検出されるか、あるいは、
(xii)  Ser133-リン酸化CREBの脱リン酸化レベルの増加が段階(l)で検出される、
場合に、該薬剤が潜在的非定型抗精神病化合物として同定される、上記方法を提供する。
【００２２】
一の実施態様において、本発明は段階(a)から(l)のいずれか１つを含む方法を提供する。
【００２３】
別の実施態様において、本発明は、段階(a)から(l)のいずれか2つを含む方法を提供する。
【００２４】
別の実施態様において、本発明は、段階(a)から(l)のいずれか3つを含む方法を提供する。
【００２５】
別の実施態様において、本発明は、段階(a)から(l)のいずれか4つを含む方法を提供する。
【００２６】
別の実施態様において、本発明は、段階(a)から(l)のいずれか5つを含む方法を提供する。
【００２７】
別の実施態様において、本発明は、段階(a)から(l)のいずれか6つを含む方法を提供する。
【００２８】
別の実施態様において、本発明は、下記の更なる段階、すなわち、
(m)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr34-脱リン酸化DARPP-32とを接触させて、Thr34-脱リン酸化DARPP-32のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(n)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr34-リン酸化DARPP-32とを接触させて、Thr34-リン酸化DARPP-32の脱リン酸化量を検出する段階、
を含み、ここで該潜在的薬剤の存在下で対照レベルに対して、もし、
(xiii)  Thr34-脱リン酸化DARPP-32のリン酸化の増加が段階(m)で検出されるか、あるいは、
(xix)  Thr34-リン酸化DARPP-32の脱リン酸化の減少が段階(n)で検出される、
場合に、該薬剤が潜在的非定型抗精神病薬化合物として同定される、
方法を提供する。
【００２９】
別の実施態様において、前記精神疾患を治療する能力が試験され、もし前記化合物が該精神疾患を改善する場合、非定型抗精神病化合物が同定される。別の実施態様において、前記精神疾患が統合失調症である。別の実施態様において、前記精神疾患を治療する能力が統合失調症モデル動物で試験される。
【００３０】
別の実施態様において、前記検出段階が、前記接触段階後15分以上30分以下に実施される。
【００３１】
別の実施態様において、前記検出段階が、前記接触段階後30分以上60分以下に実施される。
【００３２】
別の実施態様において、前記検出段階が、前記接触段階後60分で実施される。
【００３３】
別の実施態様において、本発明は、治療を必要とする患者の精神疾患を治療する能力について被試験薬剤を同定するための方法であって、
(a)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr-75脱リン酸化DARPP-32とを接触させて、Thr-75脱リン酸化DARPP-32のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(b)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr-75リン酸化DARPP-32とを接触させて、Thr-75リン酸化DARPP-32の脱リン酸化量を検出する段階、あるいは、
(c)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr202-脱リン酸化ERK1とを接触させて、Thr202-脱リン酸化ERK1のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(d)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr202-リン酸化ERK1とを接触させて、Thr202-リン酸化ERK1の脱リン酸化量を検出する段階、あるいは、
(e)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とTyr204-脱リン酸化ERK1とを接触させて、Tyr204-脱リン酸化ERK1のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(f)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とTyr204-リン酸化ERK1とを接触させて、Tyr204-リン酸化ERK1の脱リン酸化量を検出する段階、あるいは、
(g)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr185-脱リン酸化ERK2とを接触させて、Thr185-脱リン酸化ERK2のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(h)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr185-リン酸化ERK2とを接触させて、Thr185-リン酸化ERK2の脱リン酸化量を検出する段階、あるいは、
(i)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とTyr187-脱リン酸化ERK2とを接触させて、Tyr187-脱リン酸化ERK2のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(j)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とTyr187-リン酸化ERK2とを接触させて、Tyr187-リン酸化ERK2の脱リン酸化量を検出する段階、あるいは、
(k)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とSer133-脱リン酸化CREBとを接触させて、Ser133-脱リン酸化CREBのリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(l)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とSer133-リン酸化CREBとを接触させて、Ser133-リン酸化CREBの脱リン酸化量を検出する段階、
を含み、ここで、該潜在的薬剤の存在下で対照レベルに対して、もしそれぞれ、
(i)  Thr-75脱リン酸化DARPP-32のリン酸化レベルの増加が段階(a)で検出されるか、あるいは、
(ii)  Thr-75リン酸化DARPP-32の脱リン酸化レベルの減少が段階(b)で検出されるか、あるいは、
(iii)  Thr202-脱リン酸化ERK1のリン酸化レベルの減少が段階(c)で検出されるか、あるいは、
(iv)   Thr202-リン酸化ERK1の脱リン酸化レベルの増加が段階(d)で検出されるか、あるいは、
(v)   Tyr204-脱リン酸化ERK1のリン酸化レベルの減少が段階(e)で検出されるか、あるいは、
(vi)  Tyr204-リン酸化ERK1の脱リン酸化レベルの増加が段階(f)で検出されるか、あるいは、
(vii)  Thr185-脱リン酸化ERK2のリン酸化レベルの減少が段階(g)で検出されるか、あるいは、
(viii)  Thr185-リン酸化ERK2の脱リン酸化レベルの増加が段階(h)で検出されるか、あるいは、
(ix)  Tyr187-脱リン酸化ERK2のリン酸化レベルの減少が段階(i)で検出されるか、あるいは、
(x)  Tyr187-リン酸化ERK2の脱リン酸化レベルの増加が段階(j)で検出されるか、あるいは、
(xi)  Ser133-脱リン酸化CREBのリン酸化レベルの減少が段階(k)で検出されるか、あるいは、
(xii)  Ser133-リン酸化CREBの脱リン酸化レベルの増加が段階(l)で検出される、
場合に、該薬剤が潜在的非定型抗精神病化合物として同定される、上記方法を提供する。
【００３４】
別の実施態様において、本発明の方法は、下記の更なる段階、すなわち、
(m)細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr34-脱リン酸化DARPP-32とを接触させて、Thr34-脱リン酸化DARPP-32のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(n)細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr34-リン酸化DARPP-32とを接触させて、Thr34-リン酸化DARPP-32の脱リン酸化量を検出する段階、
を含み、ここで該潜在的薬剤の存在下で対照レベルに対して、もし、
(xiii)  Thr34-脱リン酸化DARPP-32のリン酸化の増加が段階(m)で検出されるか、あるいは、
(xix)  Thr34-リン酸化DARPP-32の脱リン酸化の減少が段階(n)で検出される、
場合に、該薬剤が潜在的非定型抗精神病化合物として同定される。
【００３５】
一実施態様において、前記精神疾患を治療する能力が試験され、もし前記化合物が該精神疾患を改善する場合、非定型抗精神病化合物が同定される。別の実施態様において、前記精神疾患が統合失調症である。別の実施態様において、前記精神疾患を治療する能力が統合失調症モデル動物で試験される。
【００３６】
別の実施態様において、前記検出段階が、前記接触段階後15分以上30分以下に実施される。
【００３７】
別の実施態様において、前記検出段階が、前記接触段階後30分以上60分以下に実施される。
【００３８】
別の実施態様において、前記検出段階が、前記接触段階後60分で実施される。
【００３９】
本発明はさらに、治療を必要とする患者の精神疾患を治療する能力について被試験薬剤を同定するための方法であって、
(a)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr-75脱リン酸化DARPP-32とを接触させて、Thr-75脱リン酸化DARPP-32のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(b)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr-75リン酸化DARPP-32とを接触させて、Thr-75リン酸化DARPP-32の脱リン酸化量を検出する段階、あるいは、
(c)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr202-脱リン酸化ERK1とを接触させて、Thr202-脱リン酸化ERK1のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(d)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr202-リン酸化ERK1とを接触させて、Thr202-リン酸化ERK1の脱リン酸化量を検出する段階、あるいは、
(e)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とTyr204-脱リン酸化ERK1とを接触させて、Tyr204-脱リン酸化ERK1のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(f)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とTyr204-リン酸化ERK1とを接触させて、Tyr204-リン酸化ERK1の脱リン酸化量を検出する段階、あるいは、
(g)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr185-脱リン酸化ERK2とを接触させて、Thr185-脱リン酸化ERK2のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(h)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr185-リン酸化ERK2とを接触させて、Thr185-リン酸化ERK2の脱リン酸化量を検出する段階、あるいは、
(i)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とTyr187-脱リン酸化ERK2とを接触させて、Tyr187-脱リン酸化ERK2のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(j)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とTyr187-リン酸化ERK2とを接触させて、Tyr187-リン酸化ERK2の脱リン酸化量を検出する段階、あるいは、
(k)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とSer133-脱リン酸化CREBとを接触させて、Ser133-脱リン酸化CREBのリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(l)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とSer133-リン酸化CREBとを接触させて、Ser133-リン酸化CREBの脱リン酸化量を検出する段階、
を含み、ここで、該潜在的薬剤の存在下で対照レベルに対して、もしそれぞれ、
(i)  Thr-75脱リン酸化DARPP-32のリン酸化レベルの未変化又は減少が段階(a)で検出されるか、あるいは、
(ii)  Thr-75リン酸化DARPP-32の脱リン酸化レベルの未変化又は増加が段階(b)で検出されるか、あるいは、
(iii)  Thr202-脱リン酸化ERK1のリン酸化レベルの増加が段階(c)で検出されるか、あるいは、
(iv)   Thr202-リン酸化ERK1の脱リン酸化レベルの減少が段階(d)で検出されるか、あるいは、
(v)   Tyr204-脱リン酸化ERK1のリン酸化レベルの増加が段階(e)で検出されるか、あるいは、
(vi)  Tyr204-リン酸化ERK1の脱リン酸化レベルの減少が段階(f)で検出されるか、あるいは、
(vii)  Thr185-脱リン酸化ERK2のリン酸化レベルの増加が段階(g)で検出されるか、あるいは、
(viii)  Thr185-リン酸化ERK2の脱リン酸化レベルの減少が段階(h)で検出されるか、あるいは、
(ix)  Tyr187-脱リン酸化ERK2のリン酸化レベルの増加が段階(i)で検出されるか、あるいは、
(x)  Tyr187-リン酸化ERK2の脱リン酸化レベルの減少が段階(j)で検出されるか、あるいは、
(xi)  Ser133-脱リン酸化CREBのリン酸化レベルの増加が段階(k)で検出されるか、あるいは、
(xii)  Ser133-リン酸化CREBの脱リン酸化レベルの減少が段階(l)で検出される、
場合に、該薬剤が潜在的定型抗精神病化合物として同定される、上記方法を提供する。
【００４０】
別の実施態様において、本発明の方法は、下記の更なる段階、すなわち、
(m)  潜在的薬剤とThr34-脱リン酸化DARPP-32とを接触させて、Thr34-脱リン酸化DARPP-32のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(n)  潜在的薬剤とThr34-リン酸化DARPP-32とを接触させて、Thr34-リン酸化DARPP-32の脱リン酸化量を検出する段階、
を含み、ここで該潜在的薬剤の存在下で対照レベルに対して、もし、
(xiii)  Thr34-脱リン酸化DARPP-32のリン酸化の増加が段階(m)で検出されるか、あるいは、
(xix)  Thr34-リン酸化DARPP-32の脱リン酸化の減少が段階(n)で検出される、
場合に、該薬剤が潜在的定型抗精神病化合物として同定される。
【００４１】
別の実施態様において、前記精神疾患を治療する能力が試験され、もし前記化合物が該精神疾患を改善する場合、定型抗精神病化合物が同定される。別の実施態様において、前記精神疾患が統合失調症である。別の実施態様において、前記精神疾患を治療する能力が統合失調症モデル動物で試験される。
【００４２】
別の実施態様において、前記検出段階が、前記接触段階後15分以上30分以下に実施される。
【００４３】
別の実施態様において、前記検出段階が、前記接触段階後30分以上60分以下に実施される。
【００４４】
別の実施態様において、前記検出段階が、前記接触段階後60分で実施される。
【００４５】
潜在的な非定型又は定型抗精神病化合物として薬剤を同定するための上記方法の特定の実施態様において、前記リン酸化レベル又は脱リン酸化レベルがリン酸特異(phospho specific)抗体を用いて検出される。
【００４６】
潜在的な非定型又は定型抗精神病化合物として薬剤を同定するための上記方法の特定の実施態様において、前記リン酸化レベル又は脱リン酸化レベルがキナーゼ活性の測定により検出される。
【００４７】
潜在的な非定型又は定型抗精神病薬化合物として薬剤を同定するための上記方法のある特定の実施態様において、前記リン酸化レベル又は脱リン酸化レベルがホスファターゼ活性の測定により検出される。
【００４８】
潜在的な非定型又は定型抗精神病化合物として薬剤を同定するための上記方法の特定の実施態様において、前記細胞又は組織がヒト細胞又はヒト組織である。
【００４９】
潜在的な非定型又は定型抗精神病化合物として薬剤を同定するための上記方法の特定の実施態様において、前記細胞又は組織が細胞である。
【００５０】
潜在的な非定型又は定型抗精神病化合物として薬剤を同定するための上記方法の特定の実施態様において、前記細胞又は組織が組織である。
【００５１】
潜在的な非定型又は定型抗精神病化合物として薬剤を同定するための上記方法の特定の実施態様において、前記細胞又は組織が全動物(whole animal)である。
【００５２】
潜在的な非定型又は定型抗精神病化合物として薬剤を同定するための上記方法の特定の実施態様において、前記細胞又は組織がヒトである。
【００５３】
潜在的な非定型又は定型抗精神病化合物として薬剤を同定するための上記方法の特定の実施態様において、DARPP-32がヒトDARPP-32である。
【００５４】
潜在的な非定型又は定型抗精神病化合物として薬剤を同定するための上記方法の特定の実施態様において、CREBがヒトCREBである。
【００５５】
潜在的な非定型又は定型抗精神病化合物として薬剤を同定するための上記方法の特定の実施態様において、ERK1がヒトERK1である。
【００５６】
潜在的な非定型又は定型抗精神病化合物として薬剤を同定するための上記方法の特定の実施態様において、ERK2がヒトERK2である。
【００５７】
潜在的な非定型又は定型抗精神病化合物として薬剤を同定するための上記方法の特定の実施態様において、DARPP-32がマウスDARPP-32である。
【００５８】
潜在的な非定型又は定型抗精神病化合物として薬剤を同定するための上記方法の特定の実施態様において、CREBがマウスCREBである。
【００５９】
潜在的な非定型又は定型抗精神病化合物として薬剤を同定するための上記方法の特定の実施態様において、ERK1がマウスERK1である。
【００６０】
潜在的な非定型又は定型抗精神病化合物として薬剤を同定するための上記方法の特定の実施態様において、ERK2がマウスERK2である。
【００６１】
別の実施態様において、本発明はさらに、治療を必要とする患者において精神疾患を治療するための能力について被試験薬剤を同定するためのコンピュータシステムを提供し、ここで該コンピュータシステムは、プロセッサーと、該プロセッサーに結合された1以上のプログラムをコードするメモリーとを含み、該1以上のプログラムは、潜在的な非定型又は定型抗精神病化合物として薬剤を同定するための上記方法のいずれか１つを該プロセッサーに実行させる。特定の実施態様において、該コンピュータシステムはデータベースを含み、該データベースは、目的の特定の潜在化合物で観察されたリン酸化パターンに関する情報を含む複数の記録を含む。
【００６２】
3.1. 定義
本明細書中で使用される「調節する」又は「調節」なる用語は、その通常の意味を有するとともに、「増強する」、「阻害する」及び「摸倣する」なる用語の意味も包含する。活性の「調節」は、活性の増加又は減少のいずれかであるとし得る。
【００６３】
本明細書中で使用される「アゴニスト」は、受容体を介して間接的に、あるいは受容体に直接的に、作用して薬理学的効果を生じさせる任意の化合物であり、一方「アンタゴニスト」は、受容体の刺激、そしてその結果生じる薬理学的効果を遮断する任意の化合物である。
【００６４】
本明細書中で使用される調節化合物の「有効量」は、本明細書に開示されるものなどの分析方法を用いて実験からのデータに基づいて当業者が決定できる量である。そのようなデータには、下記において議論するようなIC50測定値からの結果が含まれるが、これらに限定されない。
【００６５】
本明細書中で使用される「DARPP-32」なる用語は、「ドーパミン及び環状AMP(cAMP)-調節ホスホプロテイン」や「DARPP32」と相互に交換可能に使用され、この蛋白質は、新生線条体(neostriatum)中の中間サイズの棘ニューロン(spiny neurons)に選択的に豊富に存在する32キロダルトンの細胞質蛋白質である。ヒト、マウス、ラット及びウシDARPP-32のアミノ酸配列が、Bibbらにより1999年10月15日に出願された「ドーパミンシグナル伝達においてリン酸化/脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法(Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling)」を発明の名称とする米国特許出願09/419,379に、またBibbらにより2000年10月13日に出願された「ドーパミンシグナル伝達においてリン酸化/脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法(Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling)」を発明の名称とする米国特許出願09/687,959に開示されており、これら出願の全体を参考として本明細書中に取り入れるものとする（それぞれ配列番号1〜4参照）。
【００６６】
本明細書中の「Thr75DAROO-32」なる用語は、「Thr75DARPP32」、「thr75DARPP-32」、「トレオニン-75DARPP-32」及び「トレオニン-75DARPP-32」並びに類似の略語と相互に交換可能に使用される。一実施態様において、本明細書中に開示されるとおり、Breneら(J. Neurosci. 14:985-998 (1994))に開示される、ジーンバンク受託番号AAB30129.1をもつDARPP-32アミノ酸配列中の75番目のアミノ酸残基即ちトレオニン残基はCdk5によってリン酸化され得ることが示されている(例えばGreengardら, Neuron 23:435-447 (1999); Bibbら, Proc. Natl. Acad. Sci. 97:6809-6814 (2000);及びBibbらにより1999年10月15日に出願された「ドーパミンシグナル伝達においてリン酸化/脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法(Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling)」を発明の名称とする米国特許出願09/419,379、またBibbらにより2000年10月13日に出願された「ドーパミンシグナル伝達においてリン酸化/脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法(Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling)」を発明の名称とする米国特許出願09/687,959参照。これらの各々はその全体を参考として本明細書に取り入れるものとする)。
【００６７】
本明細書中で使用される「Thr75DARPP-32」なる用語は、ヒトDARPP-32のアミノ酸配列中の75番目のアミノ酸残基を示す。特に断らない限り、この用語はまた、例えばマウス、ウシなどの別の種に由来するDARPP-32中の対応するアミノ酸残基を指すこともできる。これらの配列は当業者によく知られており、日常的方法を用いて対応するアミノ酸残基を同定することが可能である。
【００６８】
本明細書中で使用される「ホスホ-Thr75DARPP-32」又は上記のような類似の略語は、Thr75DARPP-32のリン酸化形態を示す。
【００６９】
本明細書中で使用される「Thr34DARPP-32」は、「Thr34DARPP32」、「thr34DARPP-32」、「トレオニン(Threonine)-34DARPP-32」及び「トレオニン(threonine)-34DARPP-32」並びに同類の略語と相互に交換可能に使用される。一実施態様において、この用語は、本明細書中に開示されるとおり、Breneら(J. Neurosci. 14:985-998 (1994))に開示される、ジーンバンク受託番号AAB30129.1をもつDARPP-32アミノ酸配列中の34番目のアミノ酸残基即ち環状AMP依存性プロテインキナーゼ（PKA）によってリン酸化され得るトレオニン残基を示す(例えばGreengardら, Neuron 23:435-447 (1999); Bibbら, Proc. Natl. Acad. Sci. 97:6809-6814 (2000);及びBibbらにより1999年10月15日に出願された「ドーパミンシグナル伝達においてリン酸化/脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法(Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling)」を発明の名称とする米国特許出願09/419,379、またBibbらにより2000年10月13日に出願された「ドーパミンシグナル伝達においてリン酸化/脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法(Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling)」を発明の名称とする米国特許出願09/687,959参照。これらの各々はその全体を参考として本明細書に取り入れるものとする)。
【００７０】
本明細書中で使用される「Thr34DARPP-32」なる用語は、ヒトDARPP-32のアミノ酸配列中の34番目のアミノ酸残基を示す。特に断らない限り、この用語はまた、例えばマウス、ウシなどの別の種に由来するDARPP-32中の対応するアミノ酸残基を指すこともできる。これらの配列は当業者によく知られており、日常的方法を用いて対応するアミノ酸残基を同定することが可能である。
【００７１】
本明細書中で使用する「ホスホ-Thr34DARPP-32」なる用語又は本明細書に開示される類似の略語は、Thr34DARPP-32のリン酸化形態を示す。
【００７２】
本明細書中で使用されるCREBなる用語は、「cAMP応答要素結合蛋白質(cAMP response element binding protein)」と相互に交換可能に使用される。CREBはCREBファミリーのメンバーを含むが、これらに限定されない。カルシウム応答要素（CRE, calcium response element）を介する転写は、cAMP応答要素結合蛋白質のSer133での誘導リン酸化を必要とする。
【００７３】
本明細書中で使用される「CREBの類似体」は、「CREBの同族体」と相互に交換可能に使用され、この蛋白質は、CREBのようにCREに結合し、CREBのSer133に対応するセリンのリン酸化によって活性化される結合蛋白質である。
【００７４】
本明細書中で使用される「Ser133CREB」なる用語は、「セリン133CREB」及び類似の略語と相互に交換可能に使用される。一実施態様において、この用語は、Hoefflerら(1988, 環状AMP反応性DNA結合蛋白質：クローン化胎盤ｃDNAに基づく構造(Cyclic AMP-responsive DNA-binding protein: structure based on a cloned placental cDNA), Science 242(4884), 1430-1433)によって開示され、ジ−ンバンク受託番号NP-604391を有するヒトCREBのアミノ酸配列(配列番号６)の133番目のアミノ酸残基即ちPKA又はカルシウム-カルモジュリン依存性プロテインキナーゼによってリン酸化される得るセリン残基を示す。
【００７５】
本明細書中で使用される「Ser133CREB」なる用語は、ヒトCREBのアミノ酸配列の133番目のアミノ酸残基を示す。特に断らない限り、この用語はまた、例えばマウス、ウシなどの別の種に由来するCREB中の対応するアミノ酸残基を指すこともできる。これらの配列は当業者によく知られており、日常的方法を用いて対応するアミノ酸残基を同定することが可能である。
【００７６】
本明細書中で使用される「ホスホ-Ser133CREB」なる用語又は上記のような類似の略語は、Ser133CREBのリン酸化形態を示す。
【００７７】
本明細書中で使用されるERK1なる用語は、「ERK1」及び「細胞外シグナル調節キナーゼ1」と相互に交換可能に使用される。ERK1にはERK1(p44-MAPK)ファミリーのメンバーが含まれるが、これらに限定されない。ERK1はThr202とTyr204の2つの部位でのリン酸化を介して活性化される。
【００７８】
本明細書中で使用される「ERK1の類似体」は、「ERK1の同族体」と相互に交換可能に用いられ、またこの蛋白質は、ERK1のように、ERK1のThr202に対応するトレオニンとTyr204に対応するチロシンのリン酸化によって活性化され、転写因子CREBのリン酸化と活性化を介してc-fosを誘導する。
【００７９】
本明細書中で使用される「Thr202ERK1」なる用語は、「トレオニン202ERK1」および類似の略語と相互に交換可能に用いられる。一実施態様において、この用語は、Charestら(1993, 「ヒト有糸分裂誘導物質活性化プロテインキナーゼp44erk1の分子クローニング、発現及び特徴付け」(Molecular cloning, expression, and characterization of the human mitogen-activated protein kinase p44erk1), Mol. Cell. Biol. 13(8), 4679-4690)によって開示され、ジーンバンク受託番号P27361をもつヒトERK1のアミノ酸配列(配列番号7)の202番目のアミノ酸残基即ちMAPキナーゼ/ERKキナーゼ1（「MEK1」）によりリン酸化され得るトレオニン残基を示す。
【００８０】
本明細書中で使用される「Thr202ERK1」は、ヒトERK1のアミノ酸配列の202番目のアミノ酸残基を示す。特に断らない限り、この用語はまた、例えばマウス、ウシなどの別の種に由来するERK1中の対応するアミノ酸残基を指すこともできる。これらの配列は当業者によく知られており、日常的方法を用いて対応するアミノ酸残基を同定することが可能である。
【００８１】
本明細書中で使用される「ホスホ-Thr202ERK1」又は上記したような類似の略語は、Thr202ERK1のリン酸化形態を示す。
【００８２】
本明細書中で使用される「Tyr204ERK1」なる用語は、「チロシン204ERK1」及び類似の略語と相互に交換可能に使用される。一実施態様において、この用語は、Charestら(1993, 「ヒト有糸分裂誘導物質活性化プロテインキナーゼp44erk1の分子クローニング、発現及び特徴付け」(Molecular cloning, expression, and characterization of the human mitogen-activated protein kinase p44erk1), Mol. Cell. Biol. 13(8), 4679-4690)によって開示され、ジーンバンク受託番号P27361をもつERK1のアミノ酸配列(配列番号7)の204番目のアミノ酸残基即ちMAPキナーゼ/ERKキナーゼ1（「MEK1」）によりリン酸化され得るトレオニン残基を示す。
【００８３】
本明細書中で使用される「Tyr204ERK1」は、ヒトERK1のアミノ酸配列の204番目のアミノ酸残基を示す。特に断らない限り、この用語はまた、例えばマウス、ウシなどの別の種に由来するERK1中の対応するアミノ酸残基を指すこともできる。これらの配列は当業者によく知られており、日常的方法を用いて対応するアミノ酸残基を同定することが可能である。
【００８４】
本明細書中で使用される「ホスホ-Tyr204ERK1」又は上記のような類似の略語は、Tyr204ERK1のリン酸化形態を示す。
【００８５】
本明細書中で使用されるERK2なる用語は、「ERK-2」及び「細胞外シグナル調節キナーゼ2」と相互に交換可能に使用される。ERK2には、ERK2ファミリーのメンバーが含まれるが、これらに限定されない。ERK2は、Thr185とTyr187の2つの部位のリン酸化を介して活性化される。
【００８６】
本明細書中で使用される「ERK2の類似体」は、「ERK2の同族体」と相互に交換可能に用いられ、またこの蛋白質は、ERK2のように、ERK2のThr185に対応するトレオニンとTyr187に対応するチロシンのリン酸化によって活性化され、転写因子CREBのリン酸化と活性化を介してc-fosを誘導する。
【００８７】
本明細書中で使用される「Thr185ERK2」なる用語は、「トレオニン185ERK2」及び類似の略語と相互に交換可能に使用される。一実施態様において、この用語は、Boultonら(1991, 「ERKs:インスリンやNGFとの反応において活性化及びチロシンリン酸化されるプロテイン-セリン/トレオニンキナーゼのファミリー」(ERKs: a family of protein-serine/threonine kinases that are activated and tyrosine phosphorylated in response to insulin and NGF), Cell 65(4), 663-675)によって開示され、ジーンバンク受託番号NP-620407をもつERK2のアミノ酸配列(配列番号8)の185番目のアミノ酸残基即ちMAPキナーゼ/ERKキナーゼ2（「MEK2」）によりリン酸化され得るトレオニン残基を示す。
【００８８】
本明細書中で使用される「Thr185ERK2」は、ヒトERK2のアミノ酸配列の185番目のアミノ酸残基を示す。特に断らない限り、この用語はまた、例えばマウス、ウシなどの別の種に由来するERK2中の対応するアミノ酸残基を指すこともできる。これらの配列は当業者によく知られており、日常的方法を用いて対応するアミノ酸残基を同定することが可能である。
【００８９】
本明細書中で使用される「ホスホ-Thr185ERK2」なる用語又は上記したような類似の略語は、Thr185ERK2のリン酸化形態を示す。
【００９０】
本明細書中で使用される「Tyr187ERK2」なる用語は、「チロシン187ERK2」及び類似の略語と相互に交換可能に用いられる。一実施態様において、この用語は、Boultonら(1991, 「ERKs:インスリンやNGFとの反応において活性化及びチロシンリン酸化されるプロテイン-セリン/トレオニンキナーゼのファミリー」(ERKs: a family of protein-serine/threonine kinases that are activated and tyrosine phosphorylated in response to insulin and NGF), Cell 65(4), 663-675)によって開示され、ジーンバンク受託番号NP-620407をもつERK2のアミノ酸配列(配列番号8)の187番目のアミノ酸残基即ちMAPキナーゼ/ERKキナーゼ2（「MEK2」）によりリン酸化され得るチロシンン残基を示す。
【００９１】
本明細書中で使用される「Tyr187ERK2」は、ヒトERK2のアミノ酸配列の187番目のアミノ酸残基を示す。特に断らない限り、この用語はまた、例えばマウス、ウシなどの別の種に由来するERK2中の対応するアミノ酸残基を指すこともできる。これらの配列は当業者によく知られており、日常的方法を用いて対応するアミノ酸残基を同定することが可能である。
【００９２】
本明細書中で使用される「ホスホ-Tyr187ERK2」なる用語又は上記したような類似の略語は、Tyr187ERK2のリン酸化形態を示す。
【００９３】
本明細書中で使用される、キナーゼ反応における上記のようなDARPP-32(又はDARPP-32のリン酸化可能断片)、ERK1(又はERK1のリン酸化可能断片)、ERK2(又はERK2のリン酸化可能断片)あるいはCREB(又はCREBのリン酸化可能断片)のリン酸化量及び/又はリン酸化率は、DARPP-32(又はDARPP-32のリン酸化可能断片)、ERK1(又はERK1のリン酸化可能断片) 、ERK2(又はERK2のリン酸化可能断片)あるいはCREB(又はCREBのリン酸化可能断片)のリン酸化量及び/又はリン酸化率がそれぞれ、当業界で一般に既知の統計方法又は以下に記載される統計方法によって測定される、対照反応に対する統計的に有意な量で増加あるいは減少するとき、「有意に変化」する。好ましくは、潜在的調節剤の存在下で観察されるDARPP-32(又はDARPP-32のリン酸化可能断片) 、ERK1(又はERK1のリン酸化可能断片) 、ERK2(又はERK2のリン酸化可能断片)あるいはCREB(又はCREBのリン酸化可能断片)のリン酸化率の有意な変化は、同じ反応のミカエリス(Michaelis)定数(例えばVmax又はKm)を用いていくつかの点で補正されるのがよい。例えば、阻害剤の場合、KIを測定できる。従って特定の実施態様において、潜在的調節剤を調節剤として同定可能にするために、反応混合物中種々の濃度の調節剤を調べることが好ましいかもしれない。
【００９４】
本明細書中で使用される、リン酸化反応における上記のようなDARPP-32(又はDARPP-32のリン酸化可能断片)、ERK1(又はERK1のリン酸化可能断片) 、ERK2(又はERK2のリン酸化可能断片)あるいはCREB(又はCREBのリン酸化可能断片)のリン酸化量及び/又はリン酸化率は、DARPP-32(又はDARPP-32のリン酸化可能断片)、ERK1(又はERK1のリン酸化可能断片)、ERK2（又はERK2のリン酸化可能断片）あるいはCREB(又はCREBのリン酸化可能断片)のリン酸化量及び/又はリン酸化率が、当業界で一般に既知の統計方法又は以下に記載される統計方法によって測定される、対照反応に対する統計的に有意な量で増加あるいは減少するとき、「有意に変化」する。好ましくは、潜在的調節剤の存在下で観察される、目的の分子(例えばPP2C、PP2B又はPP2A)によるDARPP-32の脱リン酸化率の有意な変化は、同じ反応のミカエリス(Michaelis)定数(例えばVmax又はKm)を用いていくつかの点で補正されるのがよい。例えば、阻害剤の場合、KIを測定できる。従って特定の実施態様において、潜在的調節剤を調節剤として同定可能にするために、反応混合物中種々の濃度の調節剤を調べることが好ましいかもしれない。
【００９５】
本明細書中で使用される、例えばDARPP-32、ERK1、ERK2又はCREBなどの細胞内シグナル伝達分子の「リン酸化可能断片」なる用語は、脱リン酸化形態であるときキナーゼによってリン酸化され得るリン酸化可能残基を含む分子の蛋白質断片である。そのような断片は約5〜約100残基、又はより好ましくは約10〜約50残基であり得る。例えば、特定の実施態様では、DARPP-32のリン酸化可能断片は、配列番号1からのThr34を含む連続する5個のアミノ酸を含む。この種の別の実施態様では、ペプチド断片は、配列番号1からのThr34を含む連続する7個のアミノ酸を含む。さらに別の実施態様では、ペプチド断片は、配列番号1からのThr34を含む連続する10〜25個のアミノ酸を含む。
【００９６】
DARPP-32(ホスホ-Thr75を含む)、ERK1（ホスホ-Thr202及び/又はホスホ-Tyr204を含む）、ERK2（ホスホ-Thr185及び/又はホスホ-Tyr187を含む）及び/又はCREB（ホスホ-Ser133を含む）のリン酸化可能断片が同様にして構築可能であることは当業者に明らかであろう。
【００９７】
本発明が含むペプチド断片のすべてが、融合ペプチド又は蛋白質の一部とし得る。本発明により、例えばDARPP-32、ERK1、ERK2又はCREBなどの細胞内シグナル伝達分子のリン酸化可能断片は、当業界で一般に既知のあらゆる方法、例えばリン酸化蛋白質の大断片又は全長のリン酸化蛋白質からリン酸化断片を(例えばプロテアーゼを用いて)切り出して脱リン酸化すること、によって作製できる。このように、これらの断片は、下記の標準ペプチド合成によって合成されるか、あるいは組換えDNA技術又は古典的蛋白質分解によって作製できる。
【００９８】
本明細書中で使用される「精神疾患」なる用語は、「精神病(psychosis)」、「精神症状」なる用語又は類似の用語と相互に交換可能に用いられる。精神疾患には、以下のものに限定されないが、精神性うつ病、産後のうつ病、情緒障害、分裂感情性障害、分裂病性(schizophreniform)障害、統合失調症（精神分裂病)、妄想性障害、一時的精神(brief psychotic)障害、共有性精神(shared psychotic)障害、境界線的人格(borderline personality)障害、躁うつ障害、強迫障害、ハンチントン病、トウレット症候群(Tourette’s syndrome)、及びチック障害が含まれる。
【００９９】
本明細書中で使用される「小有機分子」は、3キロダルトン未満、好ましくは1.5キロダルトン以下、の分子量をもつ有機化合物(又は金属などの無機化合物と複合体形成した有機化合物)である。好ましくは、小有機分子は血液脳関門を通過できるものである。
【０１００】
本明細書中で使用される「約」なる用語は、10〜15％以内、好ましくは5〜10％以内を意味する。例えば、約60アミノ酸残基を含むアミノ酸配列は、51〜69アミノ酸残基、より好ましくは57〜63アミノ酸残基を含むことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１０１】
4. 発明の詳細な説明
本発明は、定型及び非定型抗精神病薬がDARPP-32、CREB並びにERK1及びERK2を含む細胞内シグナル伝達蛋白質のリン酸化状態に示差的に影響を及ぼすという驚くべき知見に基づいている。この示差的なリン酸化パターンは、医薬開発の際に候補非定型抗精神病薬をスクリーニング、分類及び同定するための方法に使用できる。
【０１０２】
説明を明瞭にするために、また制限なしに、本発明の詳細な説明は以下のとおり分節されている。
【０１０３】
4.1. DARPP-32、ERK1、ERK2及びCREBのリン酸化パターンを調節する化合物のスクリーニング法
一実施態様において、本発明は、非定型抗精神病薬活性について候補薬剤をスクリーニングする方法を提供し、該方法は、細胞又は組織と候補薬剤とを接触させ、該細胞又は組織中の細胞内シグナル伝達蛋白質DARPP-32、ERK1、ERK2及びCREBのリン酸化レベルを測定し、これら蛋白質のリン酸化レベルのパターンを決定することを含む。特定の実施態様では、DARPP-32、ERK1、ERK2及びCREBのリン酸化レベルのパターンは、非定型抗精神病薬の存在下のDARPP-32、ERK1、ERK2及びCREBのリン酸化レベルのパターンと比較される。非定型抗精神病薬には、クロザピン(clozapine)、リスペリドン(risperidone)、アイロペリドン(iloperidone)、オランザピン(olanzapine)、ケチアピン(quetiapine)、ゾテピン(zotepine)、ペロスピロン(perospirone)及びジプラシドン(ziprasidone)が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０４】
本発明は、治療を必要とする患者において精神疾患を治療するための能力について被試験薬剤、医薬又は化合物を同定するin vivo、in situ及びin vitro方法を提供する。そのような方法は単独であるいは互いに組み合わせて使用できる。好適実施態様において、本発明は、候補非定型抗精神病薬を同定するための方法を提供する。
【０１０５】
本発明は、治療を必要とする患者の精神疾患を治療する能力について被試験薬剤を同定するための方法であって、
(a)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr-75脱リン酸化DARPP-32とを接触させて、Thr-75脱リン酸化DARPP-32のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(b)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr-75リン酸化DARPP-32とを接触させて、Thr-75リン酸化DARPP-32の脱リン酸化量を検出する段階、あるいは、
(c)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr202-脱リン酸化ERK1とを接触させて、Thr202-脱リン酸化ERK1のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(d)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr202-リン酸化ERK1とを接触させて、Thr202-リン酸化ERK1の脱リン酸化量を検出する段階、あるいは、
(e)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とTyr204-脱リン酸化ERK1とを接触させて、Tyr204-脱リン酸化ERK1のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(f)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とTyr204-リン酸化ERK1とを接触させて、Tyr204-リン酸化ERK1の脱リン酸化量を検出する段階、あるいは、
(g)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr185-脱リン酸化ERK2とを接触させて、Thr185-脱リン酸化ERK2のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(h)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr185-リン酸化ERK2とを接触させて、Thr185-リン酸化ERK2の脱リン酸化量を検出する段階、あるいは、
(i)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とTyr187-脱リン酸化ERK2とを接触させて、Tyr187-脱リン酸化ERK2のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(j)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とTyr187-リン酸化ERK2とを接触させて、Tyr187-リン酸化ERK2の脱リン酸化量を検出する段階、あるいは、
(k)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とSer133-脱リン酸化CREBとを接触させて、Ser133-脱リン酸化CREBのリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(l)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とSer133-リン酸化CREBとを接触させて、Ser133-リン酸化CREBの脱リン酸化量を検出する段階、
を含み、ここで、該潜在的薬剤の存在下で対照レベルに対して、もしそれぞれ、
(i)  Thr-75脱リン酸化DARPP-32のリン酸化レベルの増加が段階(a)で検出されるか、あるいは、
(ii)  Thr-75リン酸化DARPP-32の脱リン酸化レベルの減少が段階(b)で検出されるか、あるいは、
(iii)  Thr202-脱リン酸化ERK1のリン酸化レベルの減少が段階(c)で検出されるか、あるいは、
(iv)   Thr202-リン酸化ERK1の脱リン酸化レベルの増加が段階(d)で検出されるか、あるいは、
(v)   Tyr204-脱リン酸化ERK1のリン酸化レベルの減少が段階(e)で検出されるか、あるいは、
(vi)  Tyr204-リン酸化ERK1の脱リン酸化レベルの増加が段階(f)で検出されるか、あるいは、
(vii)  Thr185-脱リン酸化ERK2のリン酸化レベルの減少が段階(g)で検出されるか、あるいは、
(viii)  Thr185-リン酸化ERK2の脱リン酸化レベルの増加が段階(h)で検出されるか、あるいは、
(ix)  Tyr187-脱リン酸化ERK2のリン酸化レベルの減少が段階(i)で検出されるか、あるいは、
(x)  Tyr187-リン酸化ERK2の脱リン酸化レベルの増加が段階(j)で検出されるか、あるいは、
(xi)  Ser133-脱リン酸化CREBのリン酸化レベルの減少が段階(k)で検出されるか、あるいは、
(xii)  Ser133-リン酸化CREBの脱リン酸化レベルの増加が段階(l)で検出される、
場合に、該薬剤が潜在的非定型抗精神病化合物として同定される、上記方法を提供する。
【０１０６】
一の実施態様において、本発明は段階(a)から(l)のいずれか１つを含む方法を提供する。
【０１０７】
別の実施態様において、本発明は、段階(a)から(l)のいずれか2つを含む方法を提供する。
【０１０８】
別の実施態様において、本発明は、段階(a)から(l)のいずれか3つを含む方法を提供する。
【０１０９】
別の実施態様において、本発明は、段階(a)から(l)のいずれか4つを含む方法を提供する。
【０１１０】
別の実施態様において、本発明は、段階(a)から(l)のいずれか5つを含む方法を提供する。
【０１１１】
別の実施態様において、本発明は、段階(a)から(l)のいずれか6つを含む方法を提供する。
【０１１２】
別の実施態様において、本発明は、下記の更なる段階、すなわち、
(m)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr34-脱リン酸化DARPP-32とを接触させて、Thr34-脱リン酸化DARPP-32のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(n)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr34-リン酸化DARPP-32とを接触させて、Thr34-リン酸化DARPP-32の脱リン酸化量を検出する段階、
を含み、ここで該潜在的薬剤の存在下で対照レベルに対して、もし、
(xiii)  Thr34-脱リン酸化DARPP-32のリン酸化の増加が段階(m)で検出されるか、あるいは、
(xix)  Thr34-リン酸化DARPP-32の脱リン酸化の減少が段階(n)で検出される、
場合に、該薬剤が潜在的非定型抗精神病化合物として同定される、
方法を提供する。
【０１１３】
別の実施態様において、前記精神疾患を治療する能力が試験され、もし前記化合物が該精神疾患を改善する場合、非定型抗精神病化合物が同定される。別の実施態様において、前記精神疾患が統合失調症である。別の実施態様において、前記精神疾患を治療する能力が統合失調症モデル動物で試験される。
【０１１４】
別の実施態様において、前記検出段階が、前記接触段階後15分以上30分以下に実施される。
【０１１５】
別の実施態様において、前記検出段階が、前記接触段階後30分以上60分以下に実施される。
【０１１６】
別の実施態様において、前記検出段階が、前記接触段階後60分で実施される。
【０１１７】
別の実施態様において、本発明は、治療を必要とする患者の精神疾患を治療する能力について被試験薬剤を同定するための方法であって、
(a)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr-75脱リン酸化DARPP-32とを接触させて、Thr-75脱リン酸化DARPP-32のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(b)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr-75リン酸化DARPP-32とを接触させて、Thr-75リン酸化DARPP-32の脱リン酸化量を検出する段階、あるいは、
(c)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr202-脱リン酸化ERK1とを接触させて、Thr202-脱リン酸化ERK1のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(d)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr202-リン酸化ERK1とを接触させて、Thr202-リン酸化ERK1の脱リン酸化量を検出する段階、あるいは、
(e)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とTyr204-脱リン酸化ERK1とを接触させて、Tyr204-脱リン酸化ERK1のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(f)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とTyr204-リン酸化ERK1とを接触させて、Tyr204-リン酸化ERK1の脱リン酸化量を検出する段階、あるいは、
(g)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr185-脱リン酸化ERK2とを接触させて、Thr185-脱リン酸化ERK2のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(h)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr185-リン酸化ERK2とを接触させて、Thr185-リン酸化ERK2の脱リン酸化量を検出する段階、あるいは、
(i)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とTyr187-脱リン酸化ERK2とを接触させて、Tyr187-脱リン酸化ERK2のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(j)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とTyr187-リン酸化ERK2とを接触させて、Tyr187-リン酸化ERK2の脱リン酸化量を検出する段階、あるいは、
(k)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とSer133-脱リン酸化CREBとを接触させて、Ser133-脱リン酸化CREBのリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(l)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とSer133-リン酸化CREBとを接触させて、Ser133-リン酸化CREBの脱リン酸化量を検出する段階、
を含み、ここで、該潜在的薬剤の存在下で対照レベルに対して、もしそれぞれ、
(i)  Thr-75脱リン酸化DARPP-32のリン酸化レベルの増加が段階(a)で検出されるか、あるいは、
(ii)  Thr-75リン酸化DARPP-32の脱リン酸化レベルの減少が段階(b)で検出されるか、あるいは、
(iii)  Thr202-脱リン酸化ERK1のリン酸化レベルの減少が段階(c)で検出されるか、あるいは、
(iv)   Thr202-リン酸化ERK1の脱リン酸化レベルの増加が段階(d)で検出されるか、あるいは、
(v)   Tyr204-脱リン酸化ERK1のリン酸化レベルの減少が段階(e)で検出されるか、あるいは、
(vi)  Tyr204-リン酸化ERK1の脱リン酸化レベルの増加が段階(f)で検出されるか、あるいは、
(vii)  Thr185-脱リン酸化ERK2のリン酸化レベルの減少が段階(g)で検出されるか、あるいは、
(viii)  Thr185-リン酸化ERK2の脱リン酸化レベルの増加が段階(h)で検出されるか、あるいは、
(ix)  Tyr187-脱リン酸化ERK2のリン酸化レベルの減少が段階(i)で検出されるか、あるいは、
(x)  Tyr187-リン酸化ERK2の脱リン酸化レベルの増加が段階(j)で検出されるか、あるいは、
(xi)  Ser133-脱リン酸化CREBのリン酸化レベルの減少が段階(k)で検出されるか、あるいは、
(xii)  Ser133-リン酸化CREBの脱リン酸化レベルの増加が段階(l)で検出される、
場合に、該薬剤が潜在的非定型抗精神病化合物として同定される、上記方法を提供する。
【０１１８】
別の実施態様において、本発明の方法は、下記の更なる段階、すなわち、
(m)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr34-脱リン酸化DARPP-32とを接触させて、Thr34-脱リン酸化DARPP-32のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(n)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr34-リン酸化DARPP-32とを接触させて、Thr34-リン酸化DARPP-32の脱リン酸化量を検出する段階、
を含み、ここで該潜在的薬剤の存在下で対照レベルに対して、もし、
(xiii)  Thr34-脱リン酸化DARPP-32のリン酸化の増加が段階(m)で検出されるか、あるいは、
(xix)  Thr34-リン酸化DARPP-32の脱リン酸化の減少が段階(n)で検出される、
場合に、該薬剤が潜在的非定型抗精神病化合物として同定される。
【０１１９】
一実施態様において、前記精神疾患を治療する能力が試験され、もし前記化合物が該精神疾患を改善する場合、非定型抗精神病化合物が同定される。別の実施態様において、前記精神疾患が統合失調症である。別の実施態様において、前記精神疾患を治療する能力が統合失調症モデル動物で試験される。
【０１２０】
別の実施態様において、前記検出段階が、前記接触段階後15分以上30分以下に実施される。
【０１２１】
別の実施態様において、前記検出段階が、前記接触段階後30分以上60分以下に実施される。
【０１２２】
別の実施態様において、前記検出段階が、前記接触段階後60分で実施される。
【０１２３】
本発明はさらに、治療を必要とする患者の精神疾患を治療する能力について被試験薬剤を同定するための方法であって、
(a)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr-75脱リン酸化DARPP-32とを接触させて、Thr-75脱リン酸化DARPP-32のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(b)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr-75リン酸化DARPP-32とを接触させて、Thr-75リン酸化DARPP-32の脱リン酸化量を検出する段階、あるいは、
(c)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr202-脱リン酸化ERK1とを接触させて、Thr202-脱リン酸化ERK1のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(d)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr202-リン酸化ERK1とを接触させて、Thr202-リン酸化ERK1の脱リン酸化量を検出する段階、あるいは、
(e)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とTyr204-脱リン酸化ERK1とを接触させて、Tyr204-脱リン酸化ERK1のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(f)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とTyr204-リン酸化ERK1とを接触させて、Tyr204-リン酸化ERK1の脱リン酸化量を検出する段階、あるいは、
(g)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr185-脱リン酸化ERK2とを接触させて、Thr185-脱リン酸化ERK2のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(h)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とThr185-リン酸化ERK2とを接触させて、Thr185-リン酸化ERK2の脱リン酸化量を検出する段階、あるいは、
(i)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とTyr187-脱リン酸化ERK2とを接触させて、Tyr187-脱リン酸化ERK2のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(j)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とTyr187-リン酸化ERK2とを接触させて、Tyr187-リン酸化ERK2の脱リン酸化量を検出する段階、あるいは、
(k)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とSer133-脱リン酸化CREBとを接触させて、Ser133-脱リン酸化CREBのリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(l)  細胞又は組織内で潜在的薬剤とSer133-リン酸化CREBとを接触させて、Ser133-リン酸化CREBの脱リン酸化量を検出する段階、
を含み、ここで、該潜在的薬剤の存在下で対照レベルに対して、もしそれぞれ、
(i)  Thr-75脱リン酸化DARPP-32のリン酸化レベルの未変化又は減少が段階(a)で検出されるか、あるいは、
(ii)  Thr-75リン酸化DARPP-32の脱リン酸化レベルの未変化又は増加が段階(b)で検出されるか、あるいは、
(iii)  Thr202-脱リン酸化ERK1のリン酸化レベルの増加が段階(c)で検出されるか、あるいは、
(iv)   Thr202-リン酸化ERK1の脱リン酸化レベルの減少が段階(d)で検出されるか、あるいは、
(v)   Tyr204-脱リン酸化ERK1のリン酸化レベルの増加が段階(e)で検出されるか、あるいは、
(vi)  Tyr204-リン酸化ERK1の脱リン酸化レベルの減少が段階(f)で検出されるか、あるいは、
(vii)  Thr185-脱リン酸化ERK2のリン酸化レベルの増加が段階(g)で検出されるか、あるいは、
(viii)  Thr185-リン酸化ERK2の脱リン酸化レベルの減少が段階(h)で検出されるか、あるいは、
(ix)  Tyr187-脱リン酸化ERK2のリン酸化レベルの増加が段階(i)で検出されるか、あるいは、
(x)  Tyr187-リン酸化ERK2の脱リン酸化レベルの減少が段階(j)で検出されるか、あるいは、
(xi)  Ser133-脱リン酸化CREBのリン酸化レベルの増加が段階(k)で検出されるか、あるいは、
(xii)  Ser133-リン酸化CREBの脱リン酸化レベルの減少が段階(l)で検出される、
場合に、該薬剤が潜在的定型抗精神病化合物として同定される、上記方法を提供する。
【０１２４】
別の実施態様において、本発明の方法は、下記の更なる段階、すなわち、
(m)  潜在的薬剤とThr34-脱リン酸化DARPP-32とを接触させて、Thr34-脱リン酸化DARPP-32のリン酸化量を検出する段階、あるいは、
(n)  潜在的薬剤とThr34-リン酸化DARPP-32とを接触させて、Thr34-リン酸化DARPP-32の脱リン酸化量を検出する段階、
を含み、ここで該潜在的薬剤の存在下で対照レベルに対して、もし、
(xiii)  Thr34-脱リン酸化DARPP-32のリン酸化の増加が段階(m)で検出されるか、あるいは、
(xix)  Thr34-リン酸化DARPP-32の脱リン酸化の減少が段階(n)で検出される、
場合に、該薬剤が潜在的定型抗精神病化合物として同定される。
【０１２５】
別の実施態様において、前記精神疾患を治療する能力が試験され、もし前記化合物が該精神疾患を改善する場合、定型抗精神病化合物が同定される。別の実施態様において、前記精神疾患が統合失調症である。別の実施態様において、前記精神疾患を治療する能力が統合失調症モデル動物で試験される。
【０１２６】
別の実施態様において、前記検出段階が、前記接触段階後15分以上30分以下に実施される。
【０１２７】
別の実施態様において、前記検出段階が、前記接触段階後30分以上60分以下に実施される。
【０１２８】
別の実施態様において、前記検出段階が、前記接触段階後60分で実施される。
【０１２９】
別の実施態様において、本発明は、未知の薬理学的活性をもつ薬剤（医薬）を分類するための方法を提供し、該方法は、in vitro又はin vivoで細胞又は組織と、未知の薬理学的活性をもつ薬剤とを接触させ、該細胞又は組織中の蛋白質のリン酸化レベルを測定し、該蛋白質のリン酸化レベルのパターンを、既知のリン酸化パターンと既知の薬理学的活性をもつ薬剤の存在下の該蛋白質のリン酸化レベルのパターンと比較することを含み、ここで、既知の薬理学的活性をもつ薬剤のリン酸化のパターンと類似する、未知の薬剤のリン酸化のパターンを同定し、その結果として未知の薬剤を分類する。
【０１３０】
本発明により、上記細胞又は組織には、興奮細胞、例えば感覚ニューロン、運動ニューロン又は介在ニューロン；グリア細胞；ニューロン又はグリア細胞の初代培養物；ニューロン又はグリア細胞系に由来する細胞；分離細胞；全細胞(whole cell)；浸透細胞(permeabilized cell)；細胞抽出物又は精製酵素調製物；及び組織又は器官、例えば脳、脳構造体、脳切片、脊髄、脊髄切片、中枢神経系、末梢神経系、又は神経が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３１】
特定の実施態様において、脳構造体は、線条体、脳幹神経節、中核側座核(nucleus accumbens)、あるいは、これらに対応する他の哺乳動物種の解剖学的及び/又は機能的同等物である。
【０１３２】
特定の実施態様において、前記細胞又は組織がヒト細胞又はヒト組織である。
【０１３３】
特定の実施態様において、前記細胞又は組織が細胞である。
【０１３４】
特定の実施態様において、前記細胞又は組織が組織である。
【０１３５】
特定の実施態様において、前記細胞又は組織が全動物である。
【０１３６】
特定の実施態様において、前記細胞又は組織がヒトである。
【０１３７】
本発明により、抗精神病薬として使用するための潜在的薬剤を用いてin vivoで被験者を処置すると、細胞内シグナル伝達蛋白質の異なるリン酸化パターン、即ちDARPP-32では２つの部位（Thr34とThr75）、ERK1では２つの部位（Thr202とTyr204）、ERK2では２つの部位（Thr185とTyr187）、及びCREBでは１つの部位（Ser133）でのリン酸化パターンが生じる。
【０１３８】
例えば、定型抗精神病薬例えばハロペリドール(例えば0.2 mg/kgの投与量)、又は選択的ドーパミンD2受容体アンタゴニスト例えばエピクロプリド(例えば0.5 mg/kgの投与量)は好ましくは、ホスホ-ERK1(即ちホスホ-Thr202及びホスホ-Tyr204)及びホスホ-ERK2(即ちホスホ-Thr185及びホスホ-Tyr187)、並びにホスホ-CREB(即ちホスホ-Ser133)のレベルの有意な増加を生じさせる。特定の実施態様では、蛋白質リン酸化は、潜在的薬剤の投与後約15分で最大に増加する。ホスホ-ERK2のレベルは、定型抗精神病薬例えばハロペリドールの投与後30分で対照レベルに戻る。ホスホ-CREBのレベルは、定型抗精神病薬（例えばハロペリドール）の投与後30分で対照レベルに戻る。ホスホ-ERK1の量は、60分で対照レベルより依然として有意に高い。
【０１３９】
これに対して、非定型抗精神病薬例えばクロザピン(例えば5.0 mg/kgの投与量)での治療により、15分、30分及び60分でホスホ-ERK2及びホスホ-CREBのレベルの急速な減少が生じる。ホスホ-ERK1のレベルは、非定型抗精神病薬の投与後60分で減少する。
【０１４０】
DARPP-32リン酸化では、３つのカテゴリーの医薬(定型抗精神病薬、非定型抗精神病薬、及び選択的ドーパミンD2受容体アンタゴニスト)のすべてが好ましくは、DARPP-32のThr34部位でのリン酸化を増加させる。ハロペリドールなどの定型抗精神病薬の投与により、最大30分間でThr34のリン酸化が増加するが、60分で対照と統計的な差はない。しかしながら、DARPP-32のThr-75のリン酸化の場合、好ましくは非定型抗精神病薬例えばクロザピンでの治療だけで、15分、30分及び60分でDARPP-32のリン酸化量が有意に増加する。選択的ドーパミンD2受容体アンタゴニスト例えばエチクロプリドは好ましくは、投与後30分でDARPP-32のThr75でのDARPP-32リン酸化を減少させるのに対し、定型抗精神病薬例えばハロペリドールは好ましくは全く影響を与えない。
【０１４１】
一実施態様において、実験動物(好ましくはマウス)に、例えば腹腔内注射によって潜在的薬剤を投与する。注射後、例えば注射後15分、30分又は60分で、首を切って動物を犠牲にする。その後、頭部をすぐに、全ての蛋白質活性を不活性にするのに十分な時間の間、液体窒素中に浸漬する。さらにその後、（好ましくは融解を妨げるか最小にする条件下で）脳を切開し、目的の脳の一部、例えば線条体、を取り出し、適切な当業界既知の培地例えば１％SDS中で、標準方法、好ましくは音波処理で均質化し、好ましくは煮沸する。リン酸化されたDARPP-32、CREB並びにERK1及びERK2のレベルは、その後本明細書に記載の方法に従って測定される。
【０１４２】
別の実施態様において、培養細胞、例えば培養線条体ニューロンを潜在的薬剤と接触させたのち、該細胞を均質化し、リン酸化DARPP-32、CREB並びにERK1及びERK2のレベルを、本明細書に記載の方法に従って測定する。
【０１４３】
細胞又は組織、例えば脳組織又は培養ニューロン細胞中のホスホプロテインのレベルを測定するために、脳ホモジネート又は培養細胞ホモジネートのアリコートを、標準方法に準じたSDS/PAGE分析、例えば10％ポリアクリルアミドゲルを用いるSDS/PAGE分析によって分離し、その分離された蛋白質を当業界既知の任意の方法で分析することができる。一実施態様では、蛋白質はイムノブロット分析によって分析される。特定の実施態様では、分離後さらに分析するために、蛋白質をTowbinら(Towbin, H.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350-4354)が記載するようなポリ（ビニリデンジフルオライド）膜に転写する。
【０１４４】
DARPP-32の２つの部位（Thr34及び/又はThr75）のいずれかで、ERK1の２つの部位（Thr202及び/又はTyr204）のいずれかで、ERK2の２つの部位（Thr185及び/又はTyr187）のいずれかで、及び/又はCREBの１つの部位（Ser133）でのリン酸化に対する上記薬剤の影響を、標準法に従う、例えばリン酸化状態特異抗体を用いてアッセイすることができる。
【０１４５】
特定の実施態様において、DARPP-32はヒトDARPP-32である。
【０１４６】
潜在的な非定型又は定型抗精神病化合物として薬剤を同定するための上記方法の特定の実施態様において、CREBがヒトCREBである。
【０１４７】
潜在的な非定型又は定型抗精神病化合物として薬剤を同定するための上記方法の特定の実施態様において、ERK1がヒトERK1である。
【０１４８】
潜在的な非定型又は定型抗精神病化合物として薬剤を同定するための上記方法の特定の実施態様において、ERK2がヒトERK2である。
【０１４９】
潜在的な非定型又は定型抗精神病化合物として薬剤を同定するための上記方法の特定の実施態様において、DARPP-32がマウスDARPP-32である。
【０１５０】
潜在的な非定型又は定型抗精神病化合物として薬剤を同定するための上記方法の特定の実施態様において、CREBがマウスCREBである。
【０１５１】
潜在的な非定型又は定型抗精神病化合物として薬剤を同定するための上記方法の特定の実施態様において、ERK1がマウスERK1である。
【０１５２】
潜在的な非定型又は定型抗精神病化合物として薬剤を同定するための上記方法の特定の実施態様において、ERK2がマウスERK2である。
【０１５３】
別の実施態様において、本発明は、in vitro又はin vivoで非定型抗精神病活性を生じることができる化合物を同定する方法を提供する。この方法は、細胞又は組織を試験化合物で処理する前後におけるDARPP-32、ERK1、ERK2及びCREBリン酸化レベルのパターンを決定することに基づく。in vitro及びin vivo施用には、全動物(whole animal)、組織切片、破壊細胞調製物、無傷の細胞（細胞系や初代培養細胞を含む）、及び単離精製された細胞調製物における試験化合物による処理を含むが、これらに限定されない。その結果、本発明はまた、この方法によって同定される組成物も含む。一旦、既知の非定型抗精神病化合物に類似の、変化したDARPP-32、ERK1、ERK2及びCREBリン酸化レベルパターンが生じ得ると判定されると、この化合物を用いて抗精神疾患を治療することが可能であることは、当業者が理解していることである。そのような障害には、精神性うつ病、産後のうつ病、情緒障害、分裂感情性障害、分裂病性障害、統合失調症、妄想性障害、一時的精神疾患、共有性精神疾患、境界線的人格障害、躁うつ障害、強迫障害、ハンチントン病、トウレット症候群、及びチック障害が含まれるが、これらに限定されない。本発明との関連において、同定される化合物は、本明細書に提示されるような実験からのデータに基づいて当業者が決定できる有効投与量又は有効量として投与される。そのようなデータにはIC50測定からの結果が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５４】
当業者が明らかに理解しているように、既知の非定型抗精神病化合物に類似の、変化したDARPP-32、ERK1、ERK2及びCREBリン酸化レベルパターンが生じ得る薬剤、医薬又は化合物を同定するための本明細書に記載の実施態様のいずれか及び/又はすべて（例えば本明細書に記載の合理的なドラッグデザインを取り入れた手法など）は、すべて本発明に包含される追加の医薬スクリーニングやアッセイの構築のために組み合わせることができる。
【０１５５】
他の実施態様において、薬剤は、既知の非定型精神病化合物、例えばクロザピン、リスペリドン、アイロペリドン、オランザピン、ケチアピン、ゾテピン、ペロスピロン及びジプラシドンと一緒に同時投与してもよい。次いで、DARPP-32、ERK1、ERK2及びCREBリン酸化の調節量（及び/又は率）が決定される。薬剤の不在下での非定型抗精神病化合物の投与の結果、Thr34-DARPP-32及びThr75-DARPP-32のリン酸化の増加、及び、ホスホ-Thr202ERK1、ホスホ-Tyr204ERK1、ホスホ-Thr185ERK2、ホスホ-Tyr187ERK2及びホスホ-Ser133CREBのリン酸化の減少が生じるので、薬剤は、リン酸化量（及び/又は率）が 該薬剤の不在下でのものに対して該薬剤の存在下で有意に増加又は減少する場合、DARPP-32、ERK1、ERK2及びCREBのリン酸化を調節することが可能なものとして同定される。
【０１５６】
上記in vivo方法はさらに、該薬剤を非ヒト哺乳動物に投与することを含むことができる。特定の好ましい実施態様では、非ヒト哺乳動物は疾患又は障害用モデル動物であったよい。
【０１５７】
特定の実施態様において、モデル動物はホモ接合体DARPP-32ノックアウトマウス（Fienbergらによる、1998年7月7日発行の米国特許5,777,195；Nishiらによる、2000年1月11日発行の米国特許6,013,621；及びFienbergら, 1998, Science 281:838-842参照。これらの各々はその全体を参考として本明細書に取り込むものとする。）。一実施態様において、ホモ接合体DARPP-32ノックアウトマウスをさらなる試験又はアッセイに使用して、候補薬剤がThr34-及びThr75DARPP32リン酸化を調節することを確定又は確認することができる。一実施態様において、このノックアウトマウスに候補抗精神病薬を投与し、マウスの行動に対する該薬剤の効果を分析して、野生型マウスへの該薬剤の投与時に認められる効果がノックアウトマウスには認められないことを確認する。特定の実施態様において、この有効性はNishiら（2000年1月11日に発行の米国特許6,013,621）に記載の方法によって行うことができる。Thr34-及びThr75DARPP32リン酸化を調節するような薬剤が同定される場合、DARPP-32ノックアウトマウス内に該薬剤が存在しても又は該マウスへ該薬剤を投与しても、該薬剤の不在又は非投与時に対するAMPA受容体のリン酸化依存活性の量（及び/又は率）は有意に増加したり減少したりすべきでない。
【０１５８】
特定の実施態様において、種々の構造骨格（例えばプリン類）に基づく合成化合物の(chemical compounds)コンビナトリアルライブラリーを、それと無関係の天然化合物とともに、医薬候補として試験に供することができる。この種の好適実施態様では、本明細書に記載の自動ロボット技術と一緒にハイスループット技術を用いてアッセイが実施される。陽性結果（「ヒット(hits)」）は、（アッセイに医薬候補が含まれない）対照反応と比較して、Thr34-DARPP-32及びThr75-DARPP-32のリン酸化の増加、及び、ホスホ-Thr202ERK1、ホスホ-Tyr204ERK1、ホスホ-Thr185ERK2、ホスホ-Tyr187ERK2及びホスホ-Ser133CREBのリン酸化の減少を示す。
【０１５９】
特定の実施態様において、本発明は、治療を必要とする患者において精神疾患を治療するための能力について被試験薬剤を同定するためのコンピュータシステムを提供し、ここで該コンピュータシステムは、プロセッサーと、該プロセッサーに結合された1以上のプログラムをコードするメモリーとを含み、該1以上のプログラムは、潜在的な非定型又は定型抗精神病化合物として薬剤を同定するための上記方法のいずれか１つを該プロセッサーに実行させる。特定の実施態様において、該コンピュータシステムはデータベースを含み、該データベースは、目的の特定の潜在化合物で観察されたリン酸化パターンに関する情報を含む複数の記録を含む。そのような関連データベースは当業界でよく知られている。
【０１６０】
一旦医薬候補が選択されると、医薬候補の構造変異体の試験が可能である。これらの化合物もまた綿密に検討され、例えば膜透過性、作用の特異性、及び毒性などのパラメータを用いて改変できる。次いで、この二次スクリーニングから選択された（例えば最も強力な）化合物をin situで及びモデル動物（4.3節参照）で評価し、選択された化合物がThr34-DARPP-32及びThr75-DARPP-32のリン酸化を増加させる、及び、ホスホ-Thr202ERK1、ホスホ-Tyr204ERK1、ホスホ-Thr185ERK2、ホスホ-Tyr187ERK2及びホスホ-Ser133CREBのリン酸化を減少させる、及び/又は最小の副作用か若しくは副作用のない状態で、予測された行動変化を誘導する、かどうかを決定する。そのような行動異常には、運動活性を試験すること、例えば医薬候補をマウスに投与して、増加又は減少した運動活性を観察すること（例えばKostenら, J. Pharmacol., Exp. Ther. 269:137-144 (1994);Bibbらによる、「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化/脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法」(Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling)を発明の名称とする1999年10月15日発行の米国特許09/419,379；並びにBibbらによる、「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化/脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法」(Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling)を発明の名称とする1999年10月13日発行の米国特許09/687,959参照。これらの各々は、その全体を参考として本明細書に取り入れるものとする。）；及び/又は選択された医薬の自己投与若しくはプレパルス抑制（例えば1998年7月7日発行の米国特許5,777,195参照。その全体を本明細書に取り入れるものとする。）が含まれるが、これらに限定されない。これらの試験のあとで、臨床試験でのヒトへの試験を実施できる。あるいは、特定の実施態様において、臨床試験でのヒトへの試験を動物試験を行わずに実施できる。
【０１６１】
あるいは、Thr34-DARPP-32及びThr75-DARPP-32、ホスホ-Thr202ERK1、ホスホ-Tyr204ERK1、ホスホ-Thr185ERK2、ホスホ-Tyr187ERK2、並びにホスホ-Ser133CREBのリン酸化の調節剤は、例えば組換えバクテリオファージによって産生されるランダムペプチドライブラリー（例えばScottとSmith, Science 249:386-390 (1990); Cwirlaら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382 (1990); Devlinら, Science 249:404-406 (1990)参照）、又は化合物ライブラリー(chemical library)をスクリーニングすることにより得ることができる。「ファージ法」を使用して、非常に多くのライブラリー（106〜108の化学物質）を構築できる。第2の手法として、化学的方法、例えばゲイセン法(Geysenら, Molecular Immunology 23:709-715 (1986); Geysenら, J. Immunologic Method 102:259-274 (1987))及びフォダーらの方法(Science 251:767-773 (1991))を用いることも可能である。Furkaら（14回国際生化学会議、5巻、要旨集FR:013 (1988); Furka, Int. J. Peptide Protein Res. 37:487-493 (1991)）、Houghton（1986年12月発行の米国特許4,631,211）、及びRutterら（1991年4月23日発行の米国特許5,010,175）には、例えばCK1、Cdk5、AMPA受容体、PKA、PKG、PP-1、PP2C、PP2B及び/又はPP2A活性の調節剤として試験可能なペプチド混合物を作るための方法が開示されている。
【０１６２】
別の態様において、合成ライブラリー（Needelsら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
90:10700-4 (1993); Ohlmeyerら, Proc Natl. Acd. Sci. USA 90:10922-10926 (1993); Lamら, 国際特許公開WO92/00252; Kocisら, 国際特許公開WO94/28028。これらの各々はその全体を参考として本明細書に取り入れるものとする。）及びそれらに類するものを用いて、本発明に従い、Thr34-DARPP-32及びThr75-DARPP-32、ホスホ-Thr202ERK1、ホスホ-Tyr204ERK1、ホスホ-Thr185ERK2、ホスホ-Tyr187ERK2、並びにホスホ-Ser133CREBのリン酸化の調節剤についてスクリーニングすることができる。一旦潜在的調節剤が同定されると、化学類似体を、市販の化成品ライブラリー（例えばカリフォルニア州サンジエゴのChembridge Corporation又は英国アービンドンのEvotec OAIから入手可能）から選択するか、又はde novoで合成することができる。見込みのある薬剤（医薬）を標準アッセイにかけて、その薬剤がThr34-DARPP-32及びThr75-DARPP-32、ホスホ-Thr202ERK1、ホスホ-Tyr204ERK1、ホスホ-Thr185ERK2、ホスホ-Tyr187ERK2、並びにホスホ-Ser133CREBのリン酸化に及ぼす作用を試験する。その後、Thr34-DARPP-32及びThr75-DARPP-32のリン酸化を増加させ、かつ、ホスホ-Thr202ERK1、ホスホ-Tyr204ERK1、ホスホ-Thr185ERK2、ホスホ-Tyr187ERK2及びホスホ-Ser133CREBのリン酸化を減少させる非定型抗精神病薬として医薬を選択する。
【０１６３】
本発明はまた、小分子、その類似体のスクリーニング、並びに、Thr34-DARPP-32及びThr75-DARPP-32 、ホスホ-Thr202ERK1、ホスホ-Tyr204ERK1、ホスホ-Thr185ERK2、ホスホ-Tyr187ERK2、及びホスホ-Ser133CREBのリン酸化の天然調節剤、例えばDARPP-32、ERK1、ERK2及びCREBにin vivoで結合してそれらを阻害又は活性化する分子、のスクリーニングを包含する。あるいは、DARPP-32、ERK1、ERK2及びCREBリン酸化を調節する分子を本発明のアッセイを用いて天然物ライブラリーをスクリーニングすることができる。
【０１６４】
１つの特定のアッセイでは、標的（ターゲット）、例えばDARPP-32、ERK1、ERK2及びCREB、を固体支持体に結合させることができる。固体支持体上にそのような標的を配置するための方法は当業界で周知されており、例えば標的にビオチンを結合させることや固体支持体にアビジンを結合せることを含む。固体支持体を洗浄して未反応種を除き、標識した潜在的調節剤(例えば阻害剤)の溶液を固体支持体と接触させることができる。再度固体支持体を洗浄して、支持体に未結合の潜在的調節剤を除く。固体支持体に残り、これによって標的に結合した、標識された潜在的調節剤の量を測定することができる。あるいは、又はそれに加えて、例えば標識した潜在的調節剤と標的との間の解離定数を測定してもよい。標的か潜在的調節剤に適する標識は、本明細書に記載されている。
【０１６５】
別の実施態様において、後述するモデル動物を用いて、精神症状への潜在的薬剤の効果を評価することができる。精神症状を改善する潜在調節剤を選択することができる。例えば、薬剤の存在又は不在下で、動物の運動行動反応を測定することができる。特定の実施態様では、例えばマウスのような動物の運動活性を活性モニターで測定することができる。
【０１６６】
モデル動物での潜在的治療剤(例えば候補薬剤、潜在的調節剤など)を試験する方法は、当業界で周知されている。したがって、潜在的治療剤を用いて全動物を治療することができる。潜在的調節剤は、提案する用途に応じて局所的に、経口的に、皮下に、又は腹腔内に、を含む種々の方法(例えば腹腔内注射)によって投与しうる。最適投与量は経験的に定められるだろう。斬首、焦点マイクロ波ビーム照射もしくは他の標準法によって動物を犠牲にしうる。
【０１６７】
一実施態様では、動物疾患モデルを用いて、精神病の病理学的症状を軽減する潜在的効能を上記化合物について評価することができる。例えば、ヒトにおいて病因となるハンチントン病（HD）遺伝子型を異所性に発現する動物は、HD患者に類似の神経病理学的症状を示す。このようなモデルを用いて、すべての潜在的治療剤の効能を評価することができる(4.3節参照)。一般に、２以上の動物群をアッセイで使用し、また少なくとも1群を対照群とし、対照群には潜在的調節剤を含有しない投与ビヒクルが投与される。
【０１６８】
4.1.1.  リン酸化アッセイ
潜在的非定型又は定型抗精神病化合物として薬剤を同定するための上記方法の特定の実施態様において、リン酸化又は脱リン酸化のレベルがリン酸特異抗体を用いて検出される。ペプチド基質のリン酸化は、リン酸化状態特異（「リン酸特異」）抗体の直接的結合によって、あるいは、競合体ホスホペプチドからのリン酸特異抗体の置換を測定することによって検出されうる(例えばParker, Lawら、2000, 「蛍光偏光法を使用するハイスループットスクリーニングアッセイ：核受容体-リガンド結合及びキナーゼ/ホスファターゼアッセイの開発」(Development of high throughput screening assays using fluorescence polarization: nuclear receptor-ligand-binding and kinase/phosphatase assays), J.  Biomolec. Screening  5(2)：77-88参照)。リン酸化ペプチドはまた、Baderらの方法（2001, 「時間分解蛍光共鳴エネルギー移動に基づいたハイスループットスクリーニングのためのｃGMP依存性プロテインキナーゼアッセイ」(A cGMP-dependent protein kinase assay for high throughput screening based on time-resolved fluorescence resonance energy transfer), Journal of Biomolecular Screening  6(4):255-64）を用いて検出されうる。
【０１６９】
リン酸特異抗体を製造する方法は当業界で周知である。１つの実施態様において、Bibbらによる1999年10月15日出願の米国特許09/419,379(名称：ドーパミンシグナル伝達においてリン酸化/脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法(Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling))及びBibbらによる2000年10月13日出願の米国特許09/687,959（名称：ドーパミンシグナル伝達においてリン酸化/脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法(Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling)）（これら特許の各々はその全体を参考として本明細書に取り入れるものとする。）に開示される方法を用いてThr34-リン酸化及びThr75-リン酸化DARPP-32に対し特異性をもつリン酸化状態特異抗体が作製される。
【０１７０】
ホスフォセリン、ホスフォトレオニン、ホスフォチロシンに対するリン酸化状態特異的抗体は商業的に入手可能である。これらの抗体は、タンパクが一般にリン酸化されるかどうか、及びどの残基がリン酸化されるか、を決定するために有用である。そのような抗体は市販品から入手できる(例えば、Santa Cruz Biotechnology Inc., Sigma RBI, Stratagene, Upstate Biotechnology, Zymedを含む市販品リストについてのSmith, The Scientist 15[4]:24, 2001年2月19日参照)。
【０１７１】
蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)又は蛍光偏光法（FP）のような蛍光法（例えばParker, Lawら、2000, 蛍光偏光法を使用するハイスループットスクリーニングアッセイ：核受容体-リガンド結合及びキナーゼ/ホスファターゼアッセイの開発(Development of high throughput screening assays using fluorescence polarization: nuclear receptor-ligand-binding and kinase/phosphatase assays), J.  Biomolec. Screening  5(2)：77-88参照）を用いて特定のホスホペプチド-抗体複合体を検出することができる。これらの方法には、被結合種の単離に依存せず、むしろ溶液中の特異的結合のため生じる蛍光の変化に依存する「均質」検出法を使用するという利点がある。
【０１７２】
蛍光共鳴エネルギー移動即ちFRETは、巨大分子の特異的結合の検出を可能にする均質アッセイのために広く用いられている。FRETは、励起された「ドナー」蛍光分子（蛍光団）がそれらのエネルギーを発光ではなくむしろ近傍の「アクセプター」蛍光団に移動させる能力に依存する。したがって、2個の蛍光団が基質標的に結合することによってともに空間にもたらされるとき、通常のドナー波長で放出される蛍光が減少し、アクセプター蛍光団が放出する蛍光が増加する。ドナー蛍光の減少又はアクセプター蛍光の増加のいずれか一方を用いて結合事象を測定することができる。
【０１７３】
蛍光団対、例えばクマリンとフルオレセインイソチオシアネート、が使用できる。蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）に関わるような分子の対は、FRET対と呼ばれる。エネルギー移動が起こるために、ドナー分子とアクセプター分子が一般に非常に近接していなければならない（70から100オングストローム以下（Clegg, 1992, Methods Enzymol. 211:353-388; Selvin, 1995, Methods Enzymol. 246:300-334））。エネルギー移動の効率は、ドナー分子とアクセプター分子との間の距離に伴って急速に減退する。FRETで通常使用される分子には、フルオレセイン、5-カルボキシフルオレセイン（FAM）、2’,7’-ジメトキシ-4’,5’-ジクロロ-6-カルボキシフルオロセイン（JOE）、ローダミン、6-カルボキシローダミン（R6G）、N,N,N’,N’-テトラメチル-6-カルボキシローダミン（TAMRA）、6-カルボキシ-X-ローダミン（ROX）、4-(4’-ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸（DABCYL）、及び5-(2’-アミノエチル)アミノナフタレン-1-スルフォン酸（EDANS）が含まれる。蛍光団がドナーであるかアクセプターであるかは、その励起スペクトルと発光スペクトル及びそれらと対をなす蛍光団によって定まる。例えば、FAMは、488nmの波長の光によって最も効率的に励起され、500〜650nmのスペクトル、最大発光波長525nmの光を放出する。FAMは、JOE、TAMRA及びROX（これらのすべてが最大励起波長514nmをもつ。）と一緒に使用するのに適したドナー蛍光団である。
【０１７４】
蛍光偏光測定法もまた、ペプチド又はタンパクのリン酸化状態を測定するために用いることができる（例えば、Parker, Lawら、2000, 「蛍光偏光法を使用するハイスループットスクリーニングアッセイ：核受容体-リガンド結合及びキナーゼ/ホスファターゼアッセイの開発」(Development of high throughput screening assays using fluorescence polarization: nuclear receptor-ligand-binding and kinase/phosphatase assays), J.  Biomolec. Screening  5(2)：77-88、Turekら, 2001, Anal. Biochem. 299:45-53参照）。大きな特異抗体と小さな蛍光ホスホペプチドとの結合は、そのタンブリング速度を遅くし、蛍光偏光シグナルを増加させる。したがって、蛍光偏光は、結合した蛍光ホスホペプチドの量に比例する。このアッセイは競合様式で使用され、この様式では一定濃度の蛍光ペプチドと抗体が生物学的試料に加えられる。そして、非蛍光ホスホプロテイン又はホスホペプチドの存在がシグナルの減少として記録される。アッセイはまた、直接結合様式でも使用できる。この様式では、（キナーゼによる）リン酸付加又は（ホスファターゼによる）リン酸除去が抗体結合、したがって偏光シグナルを調節する。特定の実施態様では、蛍光偏光アッセイはTurekら（2001, Anal. Biochem. 299:45-53）の方法を用いて実施される。この方法では、生成物特異的な抗リン酸化ペプチド特異的（例えば抗ホスフォセリン）抗体が使用される。
【０１７５】
4.1.2.  キナーゼ及びホスファターゼの酵素アッセイ
本発明のある特定の実施態様において、DARPP-32、ERK1、ERK2及び/又はCREBのリン酸化パターンにおける調節もまた、DARPP-32、ERK1、ERK2及び/又はCREBをリン酸化するキナーゼの活性、並びに/或いは、DARPP-32、ERK1、ERK2及び/又はCREBを脱リン酸化するホスファターゼの活性の変化を監視することによってアッセイしうる。特定の実施態様では、（Thr75をリン酸化する）Cdk5、（Thr34及びSer133CREBをリン酸化する）PKA、及び/又は（ERK1及びERK2をリン酸化する）p90リボソームS6キナーゼ（「p90RSK」）活性の変化が監視される。
【０１７６】
キナーゼ活性は当業者に公知の種々の方法によって監視可能である。例えば、Parker, Lawら、2000, 蛍光偏光法を使用するハイスループットスクリーニングアッセイ：核受容体-リガンド結合及びキナーゼ/ホスファターゼアッセイの開発(Development of high throughput screening assays using fluorescence polarization: nuclear receptor-ligand-binding and kinase/phosphatase assays), J.  Biomolec. Screening  5(2)：77-88、Baderら，2001, Journal of Biomolecular Screening 6(4):255-64、Liu, F., X.H. Maら（2001），「代謝好性グルタミン酸受容体によるサイクリン依存性キナーゼ5及びカゼインキナーゼ1の調節」（Regulation of cyclin-dependent kinase 5 and casein kinase 1 by metabotropic glutamate receptors）, Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America 98(20):11062-8、Evans, D.B., K.B. Rankら（2002），「96穴様式を使用するヒトtauプロテインキナーゼの阻害剤を研究するためのシンチレーション・プロキシミティ・アッセイ」(A scintillation proximity assay for studying inhibitors of human tau protein kinase II/Cdk5 using a 96-well format), Journal of Biochemical & Biophysical Methods 50(2-3):151-61に開示される方法が挙げられる。
【０１７７】
そのような方法を使用して、適当な条件下で目的のキナーゼを含有するサンプルを放射性ATPと、リン酸化部位を提供するのに適した組成の合成ペプチド基質とに暴露する。ついで、このペプチドと新たに会合する放射性リン酸を測定する。例えば基質ペプチドと共有結合するビオチンのような化学部分を付加することによって、ストレプトアビジン被覆ビーズと基質ペプチドとの結合が可能となる。ビーズに結合したペプチドを単離し、結合した放射能を測定するか、あるいは好ましくは、基質ペプチドと結合した放射能を、シンチレーション・プロキシミティ・アッセイに適したビーズを用いて直接測定できる。
【０１７８】
プロテインホスファターゼ活性は、当業者に公知の種々の方法、例えばCohenら（1988，「家兎骨格筋由来のプロテインホスファターゼ-1及びプロテインーゼ2A 」(Protein phosphatase-1 and protein phosphatase-2A from rabbit skeletal muscle), Methods Enzymol 159:390-408）又はStewartとCohen(1988, 「家兎骨格筋由来のプロテインホスファターゼ-2B：Ca2+依存性カルモジュリンによって刺激される酵素」（Protein phosphatase-2B from rabbit skeletal muscle: a Ca2+-dependent, calmodulin-stimulated enzyme）, Methods Enzymol 159:409-16)に記載される方法、によって監視可能である。
【０１７９】
DARPP-32リン酸化、即ちSer137DARPP-32リン酸化（CK1）、Thr75DARPP-32リン酸化（Cdk5）又はThr34DARPP-32リン酸化(PKA, PP2B, PP1)もまた、Bibbらによる1999年10月15日出願の米国特許09/419,379(名称：ドーパミンシグナル伝達においてリン酸化/脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法(Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling))、Bibbらによる2000年10月13日出願の米国特許09/687,959（名称：ドーパミンシグナル伝達においてリン酸化/脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法(Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling)）及びFienbergらによる1998年７月７日に発行された米国特許5,777,195（これら特許の各々はその全体を参考として本明細書に取り入れるものとする。）に開示される方法に従って測定しうる。
【０１８０】
ある特定の実施態様において、Cdk5の調節剤(例えば阻害剤)は、ベクターを用いた発現後に細菌から精製された組換えCdk5を使用するか、Cdk5を含有する細胞溶解物を使用するか、あるいは、脳組織溶解物を使用して、酵素アッセイにより同定可能である(例えば、Leostら，2000, Eur. J. Biochem. 267:5983-5994参照)。他の実施態様では、バキュロウイルスを用いた発現後に昆虫細胞(例えばSf9細胞)から精製された組換えCdk5を使用する酵素アッセイによって、Cdk5の調節剤を同定できる。このようなアッセイでは、酵素又は溶解物は、適当な緩衝液(500μM  ATP，50mM HEPES, pH7.5/10 mM MgCl2, 1 mM ジチオスレイトール)中、最終反応容量40〜60μl、30℃で、ペプチド基質ビオチン-DARPP-32(アミノ酸残基67〜82)と一緒にインキュベートされる。反応は、等容量の停止緩衝液（30 mM EDTA, pH 7.0）を加えて停止される。
【０１８１】
リン酸化ペプチドの検出のために、停止した反応のアリコート(20〜30μl)を、384穴ブラックマルチウエルプレートに三重に添加し、ついで、適当な緩衝液(リン酸緩衝塩水，pH 7.4中の0.1％BSA)中の、家兎ポリクローナル抗ホスホThr75-DARPP-32抗体（1nM）、ユーロピウム標識抗家兎IgG(1 nM)及びストレプトアビジン-アロフィコシアニン結合体(2μg/ml)を含有する抗体混合物の２容量を添加した。20℃で１〜24時間インキュベーションしたのち、Applied Biosystems Cytofluorを使用し、励起後50μsからスタートし200μsの時間にわたり、(励起フィルター波長340nm；発光フィルター波長660nmで)蛍光を測定した。他の抗体の組み合わせ、例えばマウス抗ホスホThr75DARPP-32とユーロピウム標識抗マウスIgGの組み合わせ、も本発明に包含され、同等の結果を提供することが期待される。
【０１８２】
上記のアッセイの１つの様式では、組換え酵素、組織からの単離酵素、又は組織もしくは細胞溶解物を、プロリン指向性リン酸化部位を提供するビオチン-ペプチド基質と一緒に30℃でインキュベーションする。ラット及びマウスDARPP-32のリン酸化部位と同じであるヒトDARPP-32のアミノ酸残基67〜82、即ちKRPNPCAYTPPSLKAV(配列番号５)が上記の基質を提供する。
【０１８３】
別の実施態様では、リン酸化用の細胞ベースアッセイが使用される。特定の実施態様では、蛋白質リン酸化に基づいたシグナル伝達が、例えばSatoら(2002,「単一生細胞中での蛋白質リン酸化を画像化するための蛍光指示薬 」(Fluorescence indicators for imaging protein phosphorilation in signal living cells), Nature Biotechnology 20(3): 287-94)に開示されるような方法を使用しながら、蛍光指示薬を用いて単一の生細胞中でin vivoで視覚化される。かようなセンサーは、可撓性リンカーを介して分離される２つの蛍光蛋白質分子からなる。このリンカーペプチドは、リン酸化部位とホスホプロテイン認識要素を含む。リンカーのリン酸化がコンフォメーション変化を引き起し、この変化が２つの蛍光蛋白質を蜜に接近させることによってFRETが生じ、この系での蛍光の発光量(output)を変化させる。
【０１８４】
4.2. DARPP-32、ERK1、ERK2及びCREBのリン酸化パターンを調節する化合物
本発明はさらに、DARPP-32、ERK1、ERK2及びCREBリン酸化の調節剤としての活性をもつ新規の化合物を設計するための方法を包含し、この方法では、これらの新規の化合物は、DARPP-32、ERK1、ERK2及びCREBリン酸化を刺激するか又は阻害するいずれかの能力をもつすべての化合物を含むが、これらに限定されないし、また、該化合物は、細胞内に送達可能な低分子量有機分子を包含するが、これらに限定されない。
【０１８５】
本発明はさらに、DARPP-32、ERK1、ERK2及びCREBリン酸化を調節し、これによって神経疾患を軽減することが可能な医薬を開発するために、合理的なドラッグデザインを行うための方法を提供する。かような合理的なドラッグデザインは、出発点として、DARPP-32、ERK1、ERK2又はCREBのアゴニスト又はアンタゴニストとして同定された化合物を用いて行うことができる。したがって、本発明は、より特異的な調節剤を同定するためのスクリーニング及びアッセイを提供する。合理的ドラッグデザインのかような方法は当業界で周知である。特定の実施態様では、合理的なドラッグデザインの方法として、、Bibbらによる1999年10月15日出願の米国特許09/419,379(名称：ドーパミンシグナル伝達においてリン酸化/脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法(Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling))、及びBibbらによる2000年10月13日出願の米国特許09/687,959（名称：ドーパミンシグナル伝達においてリン酸化/脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法(Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling)）に開示される方法が使用される。Bibbらのこれらの米国特許出願は、参考としてその全体を本明細書に取り入れるものとする。
【０１８６】
実際、例えばGRAM、DOCK又はAUTODOCK（Dunbrackら，Folding & Design 2:27-42 (1997)）を利用するコンピュータモデリングを使用して、例えばDARPP-32、ERK1、ERK2又はCREBリン酸化の潜在的調節剤を同定することを介して、潜在的調節剤を調べることができる。このあとで、DARPP-32、ERK1、ERK2又はCREBリン酸化に対する作用について、これらの調節剤を試験することができる。
【０１８７】
本明細書に開示されるスクリーニング方法によって同定される候補非定型抗精神薬、化合物又は組成物は、精神疾患の治療を可能にするような十分な量と十分な速さで血液脳関門を通過するのが好ましい。そのような１実施態様において、該薬剤は静脈内投与される。別の実施態様では、該薬剤は経口投与される。より好ましくは、該薬剤は、担体を含まずに血液脳関門を通過できるものがよい（投与法及び投与経路については、4.4節参照）。
【０１８８】
本発明はまた、DARPP-32、ERK1、ERK2又はCREBリン酸化を調節する、及び/又は、精神疾患を治療するための医薬組成物も包含する。正常な機能が失われた結果、上で列挙した疾患や障害の表現型の発症が起こるために、Thr34DARPP-32及び/又はThr75DARPP-32の
リン酸化の増加や、Thr202及び/又はTyr204ERK1、Thr185及び/又はTyr187ERK2及び/又はSer133-CREBのリン酸化の減少が、上記疾患の症状を示す個体において症状の軽減を促進する。
【０１８９】
4.3．モデル動物
本発明の方法によれば、精神疾患又は精神疾患のためのモデル動物は、以下のものに限定されないが、精神性うつ病、産後のうつ病、情緒障害、分裂感情性障害、分裂病性(schizophreniform)障害、統合失調症、妄想性障害、一時的精神(brief psychotic)障害、共有性精神(shared psychotic)障害、境界線的人格(borderline personality)障害、躁うつ障害、強迫障害、ハンチントン病、トウレット症候群(Tourette’s syndrome)、及びチック障害のモデル動物をアッセイに使用して、DARKK-32、ERK1、ERK2及びCREBの活性を調節する化合物について、あるいは精神疾患の症状を軽減する化合物について、スクリーニングすることができる。
【０１９０】
１の実施態様において、精神疾患のモデル動物は、本発明のスクリーニングアッセイに使用される。かような動物は、マウス、ラット、ハムスター、ヒツジ、ブタ、ウシなどであり、非ヒト哺乳類が好ましい。
【０１９１】
１の実施態様において、統合失調症のモデル動物が使用される（Sipesら，1995, 「ラットでのプレパルス抑制の8-OH-DPAT破壊：(+)WAY 100,135 による逆転及び作用部位の局在」(8-OH-DPAT disruption of prepulse inhibition in rats: reversal with (+)WAY 100,135 and localization of site of action), Psychopharmacology (Berl) 117(1):41-8; Caoら, 2002, Brain Research 937:32-40）。そのようなモデル動物を用いて統合失調症の治療に有用な化合物についてスクリーニングすることができる。
【０１９２】
別の実施態様において、「パーキンソン病のモデルマウスが使用される（Uhlら，1985, Lancet 1:956-57; Mokry, 1995, パーキンソン病の研究に使用される実験モデルと行動試験）(Experimental models and behavioral tests used in the study of Parkinson’s Disease), Physiol. Res. 44:143-50; Du, 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:14669-14674」。そのようなモデル動物系を用いて、5-HTR細胞内シグナル伝達経路に対する作用のためにパーキンソン病の治療に有用な化合物についてスクリーニングすることができる。 代替の実施態様では、パーキンソン病のモデルラットが使用される。特定の実施態様において、標準方法により、6-OHDA(6-ヒドロキシドーパミン；ドーパミン作動性ニューロトキシン)をラットの片側(すなわち一方の半球)に注射する。6-OHDAは、ドーパミン作動性ニューロンによって選択的に取り込まれ、そのニューロンを死滅させる。このように6-OHDAによる損傷を受けた動物がパーキンソン病のモデル動物とみなされる。
【０１９３】
特定の実施態様において、モデル動物は、ホモ接合体のDARPP-32ノックアウトマウスである(Fienbergらによる1998年7月7日発行の米国特許5,777,195；Nishiらによる2000年1月11日発行の米国特許6,013,621；及びFienbergら, 1998, Science 281:838-842;これらの各々は、その全体を参考として本明細書に取り入れるものとする。)。１つの実施態様では、ホモ接合体DARPP-32ノックアウトマウスは、候補薬剤がDARPP-32を調節することを有効にする又は確定するための追加の試験あるいはアッセイに使用できる。特定の実施態様では、有効性の確認は、Nishiら(2000年1月11日発行の米国特許6,013,621)に記載される方法にしたがって行うことができる。DARPP-32リン酸化の活性を調節するような薬剤が同定されるときには、DARPP-32ノックアウトマウス内の該薬剤の存在又は該マウス内への該薬剤の投与によって、当業者には明らかなように、リガンド作動及び/又は電位差作動のイオンチャネルの活性化の量（及び/又は率（又は速度））が、該薬剤の不在又は非投与の場合と比べて有意に増加されたり減少されるべきでない。
【０１９４】
4.4．医薬組成物
本発明は、上述の発明の薬剤、医薬又は化合物の医薬組成物を提供する。これらの薬剤、医薬又は化合物、あるいはそれらの医薬上許容可能な塩又は溶媒和物は、注射による投与、あるいは、経口、局所、鼻腔、吸入、(口もしくは鼻からの)吹き入れ、頬、非経口(腸管外)、直腸投与、又は他の投与剤型に製剤化されうる。本発明は、有効量の本発明の薬剤を、医薬上許容可能な希釈剤、保存剤、溶解剤、乳化剤、増強剤(アジュバント)、賦形剤及び/又は担体と一緒に含む医薬組成物を提供する。そのような組成物には、種々の緩衝剤成分(例えばTris-HCl、酢酸塩、リン酸塩)、ｐH及びイオン強度の希釈剤；海面活性剤や溶解剤(例えばTween80、ポリソルベート80)、酸化防止剤(例えばアスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム)、保存剤(例えばチメロサール、ベンジルアルコル)、及び増量剤(例えばラクトース、マンニトール)などの添加剤が含まれる。
【０１９５】
上記組成物はまた、ポリ乳酸、ポリグリコール酸などのポリマー化合物、あるいはリポソーム、の粒子状製剤の中に封入されてもよい。ヒアルロン酸もまた使用できる。生物適合性の吸収性ポリマーは、以下のものに限定されないが、（D-, L-乳酸、並びにD-, L-及びメソラクチドを含む）ラクチド、（グリコール酸を含む）グリコリド、ε-カプロラクトン、p-ジオキサノン（米国特許4,052,988に開示される1,4-ジオキサン-2-オン）、p‐ジオキサノンのアルキル置換誘導体（すなわち、米国特許5,703,200に開示される6,6-ジメチル-1,4-ジオキサン-2-オン）、トリエチレンカーボネート（1,3-ジオキサン-2-オン）、(米国特許5,412,068に開示される)1,3-ジオキサノンのアルキル置換誘導体、デルタ-バレロラクトン、β-ブチロラクトン、γ-ブチロラクトン、ε-デカラクトン、ヒドロキシブチレート、ヒドロキシバレレート、1,4-ジオキセパン-2-オン(米国特許4,052,988号に開示された。またそのダイマー1,5,8,12-テトラオキサシクロテトラデカン-7,14-ジオン)、1,5-ジオキセパン-2-オンなどのホモポリマー及びコポリマー,並びにそれらのポリマーブレンドを含む、脂肪族ポリエステル、コポリマー及びブレンドからなる群から選択可能である。
【０１９６】
そのような組成物は、本蛋白質及び誘導体の物理的状態、安定性、in vivo放出率（又は速度）及びin vivoクリアランス率（又は速度）に影響するかもしれない。例えば、Remingtons Pharmaceutical Sciences, 18版（1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042）1435-1712頁参照のこと。該組成物は、液体形態で製造されてもよいし、あるいは、乾燥粉末、例えば凍結乾燥形態であってもよい。
【０１９７】
本発明での使用には、経口固体製剤が包含され、このような製剤は一般に、Remingtons Pharmaceutical Sciences, 18版（1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042）89章に開示されている。固体製剤には、錠剤、カプセル剤、丸剤、トローチ剤もしくはドロップ剤、カシェ剤もしくはペレット剤が含まれる。さらに、リポソーム又はプロテイノイドカプセル封入を用いて、(例えば、米国特許4,925,673号に報告されたプロテイノイド微小球状体として)本組成物を製剤化することができる。リポソームカプセル封入を使用してもよいし、また、リポソームを種々のポリマー（例えば米国特許5,013,556号）を用いて誘導体化してもよい。治療のための可能な固体製剤の説明は、Marshall，K.，Modern Pharmaceutics, G.S. BankerとC.T. Rhodes編, 10章, 1979に提供されている。一般に、製剤には、胃の環境から保護したり、生物学的活性物質を腸内で放出することを可能にする）剤や不活性成分が含まれるであろう。
【０１９８】
十分な胃部耐性を保証するために、少なくともｐH5.0に対し不透過性の被覆が有用である。腸溶性被覆として用いられる、より一般的な不活性成分の具体例が、セルロースアセテートトリメリテート（CAT）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（HPMCP）、HPMCP50、HPMCP55、ポリビニルアセテートフタレート（PVAP）、ユードラジット(Eudragit)L3OD、アクアテリック(Aquateric)、セルロースアセテートフタレート（CAP）、ユードラジットL、ユードラジットS、及びシェラックである。これらの被覆剤は混合フィルムとして使用されてもよい。
【０１９９】
胃からの保護が意図されていない錠剤にも、被覆剤による1層又は2層以上の被覆を使用することができる。このような被覆には、糖衣、あるいは、錠剤を飲み込むのを容易にする被覆が含まれる。カプセル剤は、乾燥治療薬、すなわち粉末の送達用の硬質外皮（例えばゼラチン）からなってもよく、液体製剤には、軟質ゼラチン外皮が使用できる。カシェ剤の外皮材料は、濃厚澱粉又は他の食用ペーパーであってよい。丸剤、ドロップ剤、成型錠剤又は錠剤紛薬のためには、湿式圧密化(moist massing)技術が使用できる。
【０２００】
治療剤は、顆粒又はペレットの形態の微細な多重粒子として製剤中に含有させることができる。カプセル投与用に材料を製剤化する場合、粉末として、軽く圧縮したプラグとして、あるいは錠剤としてさえ、製剤化できる。治療剤はまた、圧縮によて製造可能である。
【０２０１】
着色剤や風味剤もすべて含有させることができる。例えば、蛋白質（又は誘導体）を、（例えばリポソーム又は微小球状体カプセル封入によって）製剤化したのち、例えば着色剤や風味剤をさらに含有する冷蔵された飲み物のような食品の中に含ませることも可能である。
【０２０２】
治療剤の容量は、不活性材料又は充填剤を用いて希釈したり、あるいは増やしたりすることができる。これらの希釈剤又は充填剤には、炭水化物、特にマンニトール、α-ラクトース、無水ラクトース、セルロース（例えば微結晶セルロース）、スクロース、リン酸水素カルシウム改質デキストラン及び澱粉が含まれる。三リン酸カルシウム、炭酸マグネシウム及び塩化ナトリウムを含むある特定の無機塩もまた充填剤として使用できる。市販の希釈剤のいくつかが、Fast-Flo、Emdex、STA-Rx1500、Emcompress及びAvicellである。
【０２０３】
崩壊剤も、治療剤を固体製剤に製剤化する際に含めることができる。崩壊剤として使用される材料には、澱粉（例えばジャガイモ澱粉、あるいは澱粉主成分の市販の崩壊剤Explotab）が含まれるが、これに限定されない。ナトリウム澱粉グリコレート、アンバーライト（Amberlite）、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ウルトラミロペクチン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジピール、酸カルボキシメチルセルロース、天然スポンジ及びベントナイトのすべてを使用しうる。別の形態の崩壊剤は、不溶性のカチオン交換樹脂である。粉末状ガムを崩壊剤や結合剤として使用できるし、また、崩壊剤や結合剤には、例えば寒天、カラヤ(Karaya)もしくはトラガカントのような粉末状ガムも含みうる。アルギン酸及びそのナトリウム塩もまた、崩壊剤として有用である。
【０２０４】
結合剤は、治療剤を一緒に保持して硬質錠剤を形成したり、例えばアラビアゴム、トラガカント、澱粉（例えば前ゼラチン化トウモロコシ澱粉）などの天然物からの材料を含有させるために用いることができる。他の結合剤には、メチルセルロース（MC）、エチルセルロース（EC）、及びカルボキシメチルセルロース（CMC）が含まれる。ポリビニルピロリドン（PVP）及びヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）をともにアルコール溶液中で使用して治療剤を顆粒化することができる。
【０２０５】
摩擦防止剤も治療剤の製剤中に含有させて、製剤工程中の粘着を防止することができる。滑沢剤は、治療剤とダイ壁との間の層として使用でき、マグネシウム塩及びカルシウム塩を含むステアリン酸、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）、液体パラフィン、植物油及び蝋、タルク、並びにシリカを含むことができるが、これらに限定されない。可溶性滑沢剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、種々の分子量のポリエチレングリコール、カーボワックス(Carbowax)4000及び6000なども使用できる。
【０２０６】
製剤中に薬剤の流動特性を改善したり、圧縮中に再配列を助けるための流動剤(glidant)を加えることができる。流動剤には、澱粉、タルク、発熱性シリカ、及び水和アルミノケイ酸塩(silicoaluminate)が含まれる。
【０２０７】
水性環境中への治療剤の溶解を助けるために、界面活性剤を湿潤剤として添加することもできる。界面活性剤には、アニオン性界面活性剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム、スルフォコハク酸ジオクチルナトリウム及びスルフォン酸ジオクチルナトリウムが含まれる。カチオン性界面活性剤を使用してもよく、これには、塩化ベンザルコニウム又は塩化ベンゼトミウムが含まれる。界面活性剤として製剤中に含めることができる可能な非イオン性界面活性剤のリストは、ラウロマクロゴール400、ポリオキシル40ステアレート、ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油10、50及び60、グリセロールモノステアレート、ポリソルベート40、60、65及び80、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロース、及びカルボキシメチルセルロースが含まれる。これらの界面活性剤は、蛋白質又は誘導体の製剤中に単独か或いは種々の割合の混合物として存在させることができる。
【０２０８】
薬剤の取込みを潜在的に増強する添加剤は、例えばオレイン酸、リノール酸及びリノレン酸などの脂肪酸である。
【０２０９】
制御放出性経口製剤も望ましいかもしれない。薬剤を、拡散又は漏出機構のいずれかによって放出を可能にする不活性マトリックス、例えばガム類、中に取り込むことができる。緩やかに縮退するマトリックスを製剤中に取り込んでもよい。腸溶性被覆剤の中には、徐放効果を有するものもある。
【０２１０】
本治療剤の別の徐放剤型は、オロス(Oros)治療剤系（Alza Corp.）に基づいた方法によるものであり、すなわち、この方法では、薬剤が半透性膜中に封入される。半透性膜は、浸透作用のために単一の小開口を介して水が入ったり、薬剤が押し出されたりするのを可能にする。
【０２１１】
他の被覆剤も製剤化に使用でき、これらには、被覆パン中に使用できる種々の糖類が含まれる。治療剤はまた、フィルムで被覆された錠剤中に含ませることも可能であり、この例で使用される材料は２つの群に分けられる。1群は、非腸溶性材料であり、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシ-エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピル-メチルセルロース、ナトリウムカルボキシ-メチルセルロース、プロビドン、及びポリエチレングリコール類を含む。2群は、腸溶性材料、通常フタール酸エステル、からなる。
【０２１２】
最適フィルム被覆を提供するために、材料の混合物を使用することもできる。フィルム被覆は、パン-コーター(pan-coater)又は流動床中で、あるいは、圧縮被覆によって実施可能である。
【０２１３】
経口投与用の液体製剤は、例えば溶液剤、シロップ剤又は懸濁剤の剤型をとってもよいし、あるいは、それらは、使用前に水又は他の適切なビヒクルで構成するための乾燥物として存在してもよい。そのような液体製剤は、医薬上許容可能な添加剤、例えば懸濁化剤(例えばソルビトールシロップ、セルロース誘導体又は水素化食用脂肪)；乳化剤(例えばレシチン又はアラビアゴム)；非水性ビヒクル(例えばアーモンド油、油性エステル、エチルアルコール又は分留植物油)；及び保存剤(例えばp-ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピル、又はソルビン酸)を用いて、慣用手段によって製造可能である。この製剤にはさらに、緩衝塩、風味剤、着色剤、及び甘味剤を適宜含ませることができる。
【０２１４】
薬剤の経鼻送達も包含し、これは、肺の中に治療剤を沈着させる必要なく、鼻に治療剤を投与したのち蛋白質を血流に直接送り込むことを可能にする。経鼻送達用の製剤は、デキストラン又はシクロデキストランを含む。
【０２１５】
吸入による投与については、本発明により使用するための化合物は、適当な推進剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素もしくは他の適当なガスを用いて加圧パック又はネブライザーからエーロゾルスプレイ製剤の形態で送達されるのが便利である。加圧エーロゾルの場合、用量単位は、計量された量を送達するためのバルブを設けることによって決定される。吸入器又は吹き入れ器で使用するための例えばゼラチンのカプセルやカートリッジが、該化合物と、ラクトース又は澱粉のような適当な粉末基剤との粉末状混合物を含有させて製剤化されうる。
【０２１６】
化合物は、注射、例えばボーラス注射もしくは連続注入による非経口投与用に製剤化されてもよい。注射用組成物は、単位投与剤型中に、例えばアンプルもしくは頻回投与容器中に、保存剤を添加しつつ存在させることができる。この組成物は、油性又は水性ビヒクル中の例えば懸濁液、溶液もしくは乳濁液のような剤型をとることができ、またそれらには、例えば懸濁化剤、安定化剤及び/又は分散剤のような処方用剤を含有させることができる。或いは、有効成分を、使用前に、例えば発熱物質を含まない滅菌水などの適当なビヒクルを用いて構成するための粉末剤型にすることも可能である。
【０２１７】
さらに、化合物は、例えばカカオバターもしくは他のグリセリドのような慣用の座剤用基剤を含有させた、座薬もしくは保持力浣腸のような直腸用組成物に製剤化されてもよい。
【０２１８】
上述した製剤に加えて、化合物をデポー製剤として製剤化することもできる。このような長時間作用する製剤は、移植(例えば皮下又は筋肉内)かあるいは筋肉内注射によって投与されうる。すなわち、例えば、化合物を、適当なポリマー材料もしくは疎水性材料(例えば許容可能な油中のエマルジョン)又はイオン交換樹脂を用いて製剤化するか、あるいは、難溶性誘導体、例えば難溶性塩として製剤化しうる。
【０２１９】
所望ならば、組成物は、有効成分を含有する1つ以上の単位投与剤型を含みうるパック又はジスペンサー装置中に存在させうる。パックは、例えば、金属もしくはプラスチック箔、例えば中が透けて見えるパック(blister pack)、を含むことができる。パック又はジスペンサー装置には、投与のための説明書が添付されてもよい。
【０２２０】
4.4.1. 用量決定
上記の化合物の毒性及び治療効能は、例えばLD50(集団の50％致死量)やED50(集団の50％治療有効量)を決定するために、培養細胞又は実験動物で標準医薬手法によって決定できる。毒性と治療効果との間の用量比は治療指数であり、LD50/ED50比として表される。大きい治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物を使用することもできるが、影響を受けた組織に該化合物をターゲットして、影響を受けていない細胞に対する潜在的損傷を最少にし、副作用を低下させるような送達系を設計するように注意が払われるべきである。
【０２２１】
培養細胞アッセイ及び動物試験から得られたデータが、ヒトにおいて使用する用量範囲を決める際に使用できる。そのような化合物の用量は、殆どもしくは全く毒性のないED50を含む循環濃度の範囲内にあるのが好ましい。用量は、この範囲内で、使用される剤型や利用される投与経路に応じて変化させうる。本発明の方法で使用されるすべての化合物について、治療上有効な用量は、初めに培養細胞アッセイから評価されうる。培養細胞で決定されたIC50（すなわち、症状の半最大阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するための用量は、モデル動物で決定できる。これらの情報を用いて、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定できる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定できる。
【０２２２】
4.4.2. 投与経路
本発明の治療組成物の単一又は複数成分は、非経口的に、局所的に、又は経粘膜的に（例えば経口的に、経鼻的に、もしくは経直腸的に）、あるいは経皮的に投与されうる。好ましい投与は、非経口投与、例えば静脈注射、であり、また以下のものに限定されないが、動脈内投与、筋内投与、皮内投与、経皮投与、腹腔内投与、経脳室投与、及び経頭蓋投与を含む。好適実施態様では、本発明の治療組成物の単一又は複数成分は、経口的に又は非経口的に投与される。
【０２２３】
本発明の好適実施態様において、薬剤(すなわち、医薬もしくは化合物)は、例えば経口投与、非経口投与又は静脈内投与を可能にするように、血液脳関門を越える、より好ましくは容易に通過することができるものである。あるいは、薬剤が血液脳関門を越えるか又はそれを越えて輸送可能なように、薬剤を修飾するか、さもなくば改質することもできる。当業界で既知の多くの戦術が、血液脳関門を越える分子のために利用可能であり、限定されないが、分子の疎水性を高めること；例えば血液脳関門内の受容体に移送もしくはターゲットされるような担体に、あるいはドコサヘキサエン酸などに、コンジュゲートとなるように分子を導入すること、を含む。
【０２２４】
別の実施態様において、本発明の薬剤は、それを投与するために頭骨に小さな穴をドリルで開けるといった標準方法を経て投与することもできる。
【０２２５】
別の実施態様では、分子を、経頭蓋的に、あるいはより好ましくは経脳室的に投与しうる。別の実施態様では、血液脳関門の浸透破壊を用いて脳への薬剤の送達を行うことができる（Nilaverら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9829-9833 (1995)）。さらに別の実施態様では、血液脳関門にターゲットされるリポソーム内に封入して薬剤を投与することができる。リポソーム中に封入した医薬の投与は知られている（Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Traetら, Liposomes in the Therapy of infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein とFidler編, Liss, New York, 317-327頁及び353-365頁(1989)参照）。このような方法の全てが、本発明において考慮されるものとする。
【０２２６】
血液脳関門を通過する分子の能力に関していくつかの予言がなされてきたが、これらの予言は精々思弁的なものである。脳内に化合物が入る速さや程度は一般に、分配係数、イオン化定数、及び分子サイズによって決定されると考えられる。脳侵入のために広汎に使用可能なモデルとして現出された単一の分配溶媒系はないが、オクタノール-水系が特に注目されており、Hanschらは、この系において約100の分配係数が中枢神経系（CNS）に入るのに最適であることを示している（GlaveとHansch, J. Pharm. Sci. 61-589 (1972); Hanschら, J. Pharma. Sci. 76:663 (1987)）。実際、オクタノール-水分配系のみが、血液脳関門を越える化合物の能力の定性的な指標を提供している。例えば、公知のヒスタミンH2受容体アンタゴニスト間での比較から、脳侵入とオクタノール-水分配係数との間にそのような単純な関係はないことが示されている（Youngら, J. Med. Chem. 31:656 (1988)）。オクタノール-水分配以外の他のファクターも、血液脳関門を越えるための性質に影響を与える。ヒスタミンH2受容体アンタゴニストについて血液脳関門を越える能力を比較すると、脳進入は、化合物全体の水素結合能が減少するにつれて脳侵入が増加する可能性があることが示される（Youngら, J. Med. Chem. 31:656 (1988)）。Begleyら(J. Neurochem. 55:1221-1230 (1990)) （その全体を参考として本明細書中に取り入れるものとする。）は、血液脳関門を越えるサイクロスポリンAの能力を開示している。Begleyらによって使用された方法は、(1)トリチウム化薬剤化合物についての下記の式：
BUI＝[（脳３H/脳14C）/(注射物３H/注射物14C)]X100
（式中、14C参照化合物が14Cブタノールまたは類似の溶媒である。）を用いて、脳取込み指数（BUI）を測定すること；(2)脳潅流実験；(3)静脈内ボーラス注射実験、及び(4)培養大脳毛細血管内皮を使用した実験、を含む。
【０２２７】
別の実施態様では、治療化合物は、ベシクル特にリポソーム内に封入して送達されうる（Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treatら, Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-BeresteinとFidler編, Liss: New York, 317-327頁及び353-327頁(1989)参照）。その全身副作用を低下させるために、これは薬剤を導入するための好ましい方法であり得る。
【０２２８】
別の実施態様では、治療化合物を制御放出系で送達しうる。例えば、静脈内注入、移植可能な浸透圧ポンプ、経皮パッチ、リポソーム、または他の投与様式を用いて薬剤を投与することができる。一実施態様において、ポンプを使用できる（Langer，上記；Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwaldら, Surgery 88:507 (1980); Saudekら, N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)参照）。別の」実施態様では、ポリマー材料を使用できる（Medical Applications of Controlled Release, LangerとWise編, CRC Press: Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, SmolenとBall編, Wiley: New York (1984); RangerとPeppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983)参照。さらに、Levyら, Science 228:190 (1985); Duringら, Ann. Neurol. 25:351 (1989); Howardら, J. Neurosurg. 71:105 (1989)参照）。さらに別の実施態様では、制御放出系を、全身投与の一部のみを必要とする治療ターゲット（すなわち脳）の近くに配置することもできる（例えばGoodson, Medical Applications of Controlled Release, 上記, 2巻, 115-138頁(1984)参照）。他の制御放出系はLanger（Science 249:1527-1533 (1990)）による総説のなかで議論されている。
【０２２９】
下記に実験例を提供するが、この実験例は例示であって限定ではない。
【実施例】
【０２３０】
5. 実施例１
ハロペリドール、クロザピン又はエチクロプリドを使用したin vivo治療はDARPP-32、CREB、ERK1及びERK2の異なるリン酸化を生じさせる
本実施例は、ハロペリドール、クロザピン又はエチクロプリドを使用したin vivo治療が、DARPP-32、CREB、ERK1及びERK2の異なるリン酸化を生じさせることを実証する。これらのデータは、定型及び非定型抗精神病薬が、細胞内シグナル伝達蛋白質のリン酸化パターンに基づいて識別又は区別できることを実証する。これらのデータにより、候補薬剤を、DARPP-32、CREB、ERK1及びERK2の特異のリン酸化パターンに基づいてスクリーニングして、それらの活性を定型又は非定型抗精神病薬として分類し、そして、さらなる試験と開発のために適当な候補を同定できることが示される。
【０２３１】
5.1. 材料と方法
雄C57/BL6マウス(6匹ずつの群)に、ハロペリドール（定型抗精神病薬）、クロザピン（非定型抗精神病薬）又はエチクロプリド(選択的ドーパミンD2受容体アンタゴニスト)の3種類の抗精神薬化合物の１つを腹腔内注射により投与した。注射の15分、30分又は60分後に、斬首によって全てのマウスを犠牲にした。斬首後、直ぐに頭を6秒間液体窒素に浸漬して、全ての蛋白質活性を不活化した。その後、氷冷した表面上で脳を切開し、線条体(striata)を取り出して750μlの1％SDS中で音波処理し、ついで10分間沸騰下に置いた。その後、リン酸化されたDARPP-32、CREB、ERK1及びERK2のレベルを測定した。
【０２３２】
脳組織におけるリン酸蛋白質のレベルを決定するために、脳ホモジネートのアリコートを10％ポリアクリルアミドゲル上に載せてSDS/PAGE分析によって蛋白質を分離し、Towbinら(Towbin, H.ら, 1979, Proc. Natl.  Acad. Sci. USA 76:4350-4354)によって記載されるとおりに、ポリ（ビニリデンジフルオライド）膜に転写した。DARPP-32の２つの部位（Thr34とThr75）でのリン酸化、ERK1の２つの部位（Thr202とTyr204）でのリン酸化、ERK2の２つの部位(Thr185とTyr187)でのリン酸化、及びCREBの１つの部位（Ser133）でのリン酸化に及ぼす各薬剤の影響を、標準方法によりリン酸化状態特異抗体を用いて評価した。抗ホスホERK1抗体及び抗ホスホERK2抗体は、Cell Signaling Technology (Beverly, MA)から入手された。抗ホスホCREB抗体は、Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY)から入手された。また、使用した抗ホスホDARPP-32抗体は、Bibbらによる1999年10月15日出願の米国特許09/419,379(名称：ドーパミンシグナル伝達においてリン酸化/脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法(Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling))及びBibbらによる2000年10月13日出願の米国特許09/687,959（名称：ドーパミンシグナル伝達においてリン酸化/脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法(Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling)）（これら特許出願の各々はその全体を参考として本明細書に取り入れるものとする。）に開示された方法にしたがって作製された。これらの方法は、Thr34リン酸化DARPP-32及びThr75リン酸化DARPP-32に対し特異性を有するリン酸化状態特異抗体を作製するために使用された。
【０２３３】
5.2. 結果
実験結果を表１に示す。
【表１−１】
2005508625.tif 000002
【表１−２】
2005508625.tif 000003
データは、平均±S.E.M.を示す。
【０２３４】
＊P,＜0.05, ＊＊P＜0.01対コントロール（時間「0」）；一方向(one-way)ANOVA、その後Dunnett試験。
【０２３５】
上記の結果は、種々の抗精神病薬によるin vivoでの動物の治療が、調べた細胞内シグナル伝達蛋白質の異なるリン酸化パターンを生じさせたことを示した。ハロペリドール(0.2mg/kg)(定型抗精神病薬)とエチクロプリド(0.5mg/kg)(選択的ドーパミンD2受容体アンタゴニスト)はともに、ホスホERK1及びホスホERK2並びにホスホCREBのレベルの有意な増加を与えた。薬剤の投与後15分で蛋白質リン酸化が最大に増加した。ホスホERK2レベルは、ハロペリドール又はエチクロプリドの投与後30分でコントロール(対照)レベルに戻った。ホスホCREBのレベルは、ハロペリドール投与後30分で、あるいはエチクロプリド投与後60分で、コントロール（対照）レベルに戻った。ホスホERK1レベルは、60分で、コントール（対照）レベルよりも依然として有意に高かった。
【０２３６】
これに対して、クロザピン(5.0mg/kg)(非定型抗精神病薬)での治療は、15分、30分及び60分で、ホスホERK2及びホスホCREBのレベルの急激な減少を生じさせた。さらに、ホスホERK1のレベルは、非定型抗精神病薬の投与後60分で減少した。
【０２３７】
DARPP-32リン酸化の場合には、3種類の薬剤の全てが、DARPP-32のThr34部位でのリン酸化を増加させた。ハロペリドールのような定型抗精神病薬の投与により、最高30分までの間、Thr34リン酸化が増加したが、60分の時点では、コントロール（対照）からの統計的な差はなかった。DARPP-32のThr75部位でのリン酸化の場合には、クロザピン治療だけが、15分、30分及び60分でリン酸化レベルを有意に増加させた。エチクロプリドは、30分でDARPP-32のThr75でのDARPP-32リン酸化を減少させたが、一方、ハロペリドールは影響を与えなかった。
【０２３８】
本発明は、本明細書に記載された特定の具体例によってその範囲を制限されるべきではない。実際、本明細書に記載されるものの他に、本発明の種々の変形が、上述の説明から当業者には明らかであろう。そのような変形は、特許請求の範囲中の発明の範囲内であることを意図している。
【０２３９】
あたかも個々の刊行物、特許又は特許出願の全体が、あらゆる目的で、参考として取り込まれることが特定的にかつ個別的に示されているかのように、本明細書中で引用された全ての参照文献は、その全体を、またあらゆる目的のために同じ程度に、参考として本明細書中に取り込むものとする。
【０２４０】
いずれの刊行物の引用も、本出願の出願日前の開示を目的としたものであり、本発明が先行発明によってそのような刊行物に先んじることを享受されていないという承認として解釈されるべきではない。
【配列表】
2005508625.tif 000004
2005508625.tif 000005
2005508625.tif 000006
2005508625.tif 000007
2005508625.tif 000008
2005508625.tif 000009
2005508625.tif 000010
2005508625.tif 000011
【国際調査報告】
2005508625.tif 000012
2005508625.tif 000013
2005508625.tif 000014
2005508625.tif 000015