(57)【要約】  脊椎動物、より詳しくは、ヒトおよび動物のウイルス感染の処置、予防および診断のための方法、試薬、および組成物を記載する。本発明は、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5およびCCR8受容体が、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（RSV）感染に関与しているという証拠を提供する。したがって、本発明は、細胞のウイルス感染のモジュレーションの方法であって、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8受容体と、ウイルスの表面タンパク質との間の結合相互作用をモジュレーションすることによる方法を記載する。本発明は、更に、細胞のウイルス感染を減少させる方法；哺乳動物細胞を結合する肺炎ウイルスの能力を減衰させる方法；ヒトRSVによる気道疾患の開始または蔓延を減少させる方法；生物学的試料中の肺炎ウイルスの存在を検出する方法；遺伝子治療方法、および新規な抗ウイルスおよび抗炎症化合物を同定する方法を提供するために、このような結合相互作用を利用する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞のウイルス感染をモジュレーションする方法であって、細胞ケモカイン受容体と該ウイルスの表面タンパク質との間の結合相互作用をモジュレーションすることを含み、該細胞ケモカイン受容体は、SEQ ID NO: 6と少なくとも38％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、但し、該細胞ケモカイン受容体はCX3CR1ではないし、該ウイルスはHIVではないという条件付きである、前記方法。
【請求項２】
前記細胞ケモカイン受容体が、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5およびCCR8からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞ケモカイン受容体がCCR3からなる、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
細胞のウイルス感染をモジュレーションする方法であって、細胞ケモカイン受容体と該ウイルスの表面タンパク質との間の結合相互作用をモジュレーションすることを含み、ここにおいて、該細胞ケモカイン受容体は、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5およびCCR8からなる群より選択され、但し、該ウイルスはHIVではないという条件付きである、前記方法。
【請求項５】
前記ウイルス感染を、前記結合相互作用を阻害することによって減少させるかまたはブロックする、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞と、前記細胞ケモカイン受容体の少なくとも一つを認識するCCRリガンドとを接触させる工程を含み、該接触工程を、該CCRリガンドが該細胞ケモカイン受容体の少なくとも一つを結合するのに充分な条件下で行い、それによって、それに引き続いて該細胞を結合する該ウイルスの能力を減衰させる、請求項4または請求項5に記載の方法。
【請求項７】
前記CCRリガンドが、エオタキシン1、エオタキシン2、エオタキシン3、単球走化性タンパク質-1（monocyte chemoattractant protein-1：MCP-1）、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-5、MIP-1α、MIP-1β、I-309、RANTES（regulated on activation normal T-cell expressed and secreted）、TARC、一つまたは複数の前記細胞受容体を特異的に認識する抗体およびそれらのフラグメント、一つまたは複数の該受容体の細胞外ドメインへの結合活性を有するポリペプチドからなる群より選択される、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも一つの前記細胞ケモカイン受容体の細胞内レベルを減少させ、それによって前記細胞に感染するウイルスの能力を制限する工程を含む、請求項5に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞内レベルを、細胞中に導入されたまたは発現されたアンチセンス分子を用いて減少させる、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記ウイルスと、該ウイルスの表面タンパク質を認識する該ウイルスリガンドとを、該ウイルス表面タンパク質を結合した後に一つまたは複数の前記細胞ケモカイン受容体への該ウイルスの結合を減衰させるのに充分な条件下で接触させる工程を含む、請求項4に記載の方法。
【請求項１１】
前記ウイルスリガンドが、
-  前記ウイルス表面タンパク質を特異的に認識する抗体またはそのフラグメント；および
-  CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8受容体またはその機能性フラグメント
からなる群より選択される、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体またはそのフラグメントが、RSV-GまたはRSV-Fタンパク質に特異的に結合する、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
細胞のウイルス感染を増加させる方法であって、前記細胞の少なくとも一つのケモカイン受容体と該ウイルスの表面タンパク質との間の結合相互作用を可能にするかまたは増加させることを含み、ここにおいて、該ケモカイン受容体は、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5およびCCR8からなる群より選択される、前記方法。
【請求項１４】
細胞のウイルス感染を減少させる方法であって、前記細胞の少なくとも一つのケモカイン受容体と該ウイルスの表面タンパク質との間の結合相互作用を妨げることを含み、ここにおいて、該ケモカイン受容体は、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5およびCCR8からなる群より選択され、但し、該ウイルスはHIVではないという条件付きである、前記方法。
【請求項１５】
前記ウイルスが、モノネガウイルス目（Mononegavirales）のウイルスからなる、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ウイルスが、パラミクソウイルス科（Paramyxoviridae）のウイルスからなる、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ウイルスが、ニューモウイルス亜科（Pneumovirinae）のウイルスからなる、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ウイルスが、肺炎ウイルス（Pneumoviruses）種のウイルスからなる、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ウイルスが、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（Human Respiratory Syncytial Virus：HRSV）からなる、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ウイルスタンパク質が、HRSV G糖タンパク質からなる、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
CCR1陽性細胞の肺炎ウイルス感染を減少させる方法であって、該細胞の一つまたは複数のCCR1受容体への肺炎ウイルスの結合を妨げることを含む、前記方法。
【請求項２２】
CCR2陽性細胞の肺炎ウイルス感染を減少させる方法であって、該細胞の一つまたは複数のCCR2受容体への肺炎ウイルスの結合を妨げることを含む、前記方法。
【請求項２３】
CCR3陽性細胞の肺炎ウイルス感染を減少させる方法であって、該細胞の一つまたは複数のCCR3受容体への肺炎ウイルスの結合を妨げることを含む、前記方法。
【請求項２４】
CCR4陽性細胞の肺炎ウイルス感染を減少させる方法であって、該細胞の一つまたは複数のCCR4受容体への肺炎ウイルスの結合を妨げることを含む、前記方法。
【請求項２５】
CCR5陽性細胞の肺炎ウイルス感染を減少させる方法であって、該細胞の一つまたは複数のCCR5受容体への肺炎ウイルスの結合を妨げることを含む、前記方法。
【請求項２６】
CCR8陽性細胞の肺炎ウイルス感染を減少させる方法であって、該細胞の一つまたは複数のCCR8受容体への肺炎ウイルスの結合を妨げることを含む、前記方法。
【請求項２７】
細胞の肺炎ウイルス感染をモジュレーションする方法であって、細胞ケモカイン受容体と該肺炎ウイルスの表面タンパク質との間の結合相互作用をモジュレーションすることを含み、ここにおいて、該細胞ケモカイン受容体は、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5およびCCR8からなる群より選択される、前記方法。
【請求項２８】
前記細胞がCCR3陽性細胞からなる、請求項27に記載の方法であって、該CCR3陽性細胞と、CCR3を認識するCCR3リガンドとを接触させる工程を含み、該接触工程を、該リガンドが該CCR3を結合するのに充分な条件下で行い、それによって、それに引き続いて該細胞を結合する該肺炎ウイルスの能力を減衰させる、前記方法。
【請求項２９】
前記CCR3リガンドが、エオタキシン1、エオタキシン2、エオタキシン3、単球走化性タンパク質-3（MCP-3）、MCP-4；RANTES（regulated on activation normal T-cell expressed and secreted）、CCR3を特異的に認識する抗体またはそのフラグメント、およびCCR3結合性細胞外ドメインへの結合活性を有するポリペプチドからなる群より選択される、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞がCCR3陽性細胞から成り、前記方法が、該CCR3陽性細胞のCCR3細胞内レベルを減少させ、それによって肺炎ウイルスが該細胞に感染する能力を制限する工程を含む、請求項27に記載の方法。
【請求項３１】
CCR3細胞内レベルを、前記CCR3陽性細胞中にCCR3アンチセンス分子を導入することによって減少させる、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
前記肺炎ウイルスと、該肺炎ウイルスの表面タンパク質を認識するウイルスリガンドとを接触させる工程を含み、該接触工程を、該ウイルスリガンドが該肺炎ウイルス表面タンパク質を結合し、それに引き続いてCCR3への該肺炎ウイルスの結合を減衰させるのに充分な条件下で行う、請求項27に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞がCCR1陽性細胞からなる、請求項27に記載の方法であって、該CCR1陽性細胞と、CCR1を認識するCCR1リガンドとを接触させる工程を含み、該接触工程を、該リガンドが該CCR1を結合するのに充分な条件下で行い、それによって、それに引き続いて該細胞を結合する該肺炎ウイルスの能力を減衰させる、前記方法。
【請求項３４】
前記CCR1リガンドが、RANTES、MIP-1αおよびMCP-3からなる群より選択される、請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞がCCR1陽性細胞から成り、前記方法が、該CCR1陽性細胞のCCR1細胞内レベルを減少させ、それによって該細胞に感染する肺炎ウイルスの能力を制限する工程を含む、請求項27に記載の方法。
【請求項３６】
CCR1細胞内レベルを、前記CCR1陽性細胞中にCCR1アンチセンス分子を導入することによって減少させる、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
前記肺炎ウイルスと、該肺炎ウイルスの表面タンパク質を認識するウイルスリガンドとを接触させる工程を含み、該接触工程を、該ウイルスリガンドが該肺炎ウイルス表面タンパク質を結合しそれに引き続いてCCR1への該肺炎ウイルスの結合を減衰させるのに充分な条件下で行う、請求項27に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞がCCR2陽性細胞からなる、請求項27に記載の方法であって、該CCR2陽性細胞と、CCR2を認識するCCR2リガンドとを接触させる工程を含み、該接触工程を、該リガンドが該CCR2を結合するのに充分な条件下で行い、それによって、それに引き続いて該肺炎ウイルスが該細胞を結合する能力を減衰させる、前記方法。
【請求項３９】
前記CCR2リガンドが、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4およびMCP-5からなる群より選択される、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞がCCR2陽性細胞から成り、前記方法が、該CCR2陽性細胞のCCR2細胞内レベルを減少させ、それによって該細胞に感染する肺炎ウイルスの能力を制限する工程を含む、請求項27に記載の方法。
【請求項４１】
CCR2細胞内レベルを、前記CCR2陽性細胞中にCCR2アンチセンス分子を導入することによって減少させる、請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
前記肺炎ウイルスと、該肺炎ウイルスの表面タンパク質を認識するウイルスリガンドとを接触させる工程を含み、該接触工程を、該ウイルスリガンドが該肺炎ウイルス表面タンパク質を結合しその後CCR2への該肺炎ウイルスの結合を減衰させるのに充分な条件下で行う、請求項27に記載の方法。
【請求項４３】
前記細胞がCCR4陽性細胞からなる、請求項27に記載の方法であって、該CCR4陽性細胞と、CCR4を認識するCCR4リガンドとを接触させる工程を含み、該接触工程を、該リガンドが該CCR4を結合するのに充分な条件下で行い、それによって、それに引き続いて該細胞を結合する該肺炎ウイルスの能力を減衰させる、前記方法。
【請求項４４】
前記CCR4リガンドが、MCP-1、RANTES、MIP-1αおよびTARCからなる群より選択される、請求項43に記載の方法。
【請求項４５】
前記細胞がCCR4陽性細胞から成り、前記方法が、該CCR4陽性細胞のCCR4細胞内レベルを減少させ、それによって該細胞に感染する肺炎ウイルスの能力を制限する工程を含む、請求項27に記載の方法。
【請求項４６】
CCR4細胞内レベルを、前記CCR4陽性細胞中にCCR4アンチセンス分子を導入することによって減少させる、請求項45に記載の方法。
【請求項４７】
前記肺炎ウイルスと、該肺炎ウイルスの表面タンパク質を認識するウイルスリガンドとを接触させる工程を含み、該接触工程を、該ウイルスリガンドが該肺炎ウイルス表面タンパク質を結合しその後CCR4への該肺炎ウイルスの結合を減衰させるのに充分な条件下で行う、請求項27に記載の方法。
【請求項４８】
前記細胞がCCR5陽性細胞からなる、請求項27に記載の方法であって、該CCR5陽性細胞と、CCR5を認識するCCR5リガンドとを接触させる工程を含み、該接触工程を、該リガンドが該CCR5を結合するのに充分な条件下で行い、それによって、それに引き続いて該細胞を結合する該肺炎ウイルスの能力を減衰させる、前記方法。
【請求項４９】
前記CCR5リガンドが、MIP-1α、MIP-1βおよびRANTESからなる群より選択される、請求項48に記載の方法。
【請求項５０】
前記細胞がCCR5陽性細胞から成り、前記方法が、該CCR5陽性細胞のCCR5細胞内レベルを減少させ、それによって該細胞に感染する肺炎ウイルスの能力を制限する工程を含む、請求項27に記載の方法。
【請求項５１】
CCR5細胞内レベルを、前記CCR5陽性細胞中にCCR5アンチセンス分子を導入することによって減少させる、請求項50に記載の方法。
【請求項５２】
前記肺炎ウイルスと、該肺炎ウイルスの表面タンパク質を認識するウイルスリガンドとを接触させる工程を含み、該接触工程を、該ウイルスリガンドが該肺炎ウイルス表面タンパク質を結合しその後CCR5への該肺炎ウイルスの結合を減衰させるのに充分な条件下で行う、請求項27に記載の方法。
【請求項５３】
前記細胞がCCR8陽性細胞からなる、請求項27に記載の方法であって、該CCR8陽性細胞と、CCR8を認識するCCR8リガンドとを接触させる工程を含み、該接触工程を、該リガンドが該CCR8を結合するのに充分な条件下で行い、それによって、それに引き続いて該細胞を結合する該肺炎ウイルスの能力を減衰させる、前記方法。
【請求項５４】
前記CCR8リガンドがI-309からなる、請求項53に記載の方法。
【請求項５５】
前記細胞がCCR8陽性細胞からなり、前記方法が、該CCR8陽性細胞のCCR8細胞内レベルを減少させ、それによって該細胞に感染する肺炎ウイルスの能力を制限する工程を含む、請求項27に記載の方法。
【請求項５６】
CCR8細胞内レベルを、前記CCR8陽性細胞中にCCR8アンチセンス分子を導入することによって減少させる、請求項55に記載の方法。
【請求項５７】
前記肺炎ウイルスと、該肺炎ウイルスの表面タンパク質を認識するウイルスリガンドとを接触させる工程を含み、該接触工程を、該ウイルスリガンドが該肺炎ウイルス表面タンパク質を結合しその後CCR8への該肺炎ウイルスの結合を減衰させるのに充分な条件下で行う、請求項27に記載の方法。
【請求項５８】
哺乳動物細胞を結合する肺炎ウイルスの能力を減衰させる方法であって、
-  CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5およびCCR8からなる群より選択される少なくとも一つの細胞ケモカイン受容体を認識するCCRリガンドに該細胞を暴露し、該暴露を、該CCRリガンドが該細胞受容体を結合するのに充分な条件下で行うこと；
-  肺炎ウイルスの表面タンパク質を認識するウイルスリガンドに該ウイルスを暴露し、該暴露を、該ウイルスリガンドが該肺炎ウイルス表面タンパク質を結合後、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5およびCCR8からなる群より選択される少なくとも一つの細胞ケモカイン受容体への肺炎ウイルスの結合を減衰させるのに充分な条件下で行うこと；および
-  CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5およびCCR8からなる群より選択される少なくとも一つの細胞ケモカイン受容体の細胞内レベルを減少させること
からなる群より選択される工程を含み；
それによって、該哺乳動物細胞を結合する該肺炎ウイルスの能力を制限する、前記方法。
【請求項５９】
CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5およびCCR8からなる群より選択される少なくとも一つの細胞ケモカイン受容体を発現する哺乳動物細胞に感染する肺炎ウイルスの能力を減衰させる方法であって、該細胞ケモカイン受容体の少なくとも一つを認識するCCRリガンドに該細胞を暴露することを含み、該暴露を、該CCRリガンドが該細胞受容体の該少なくとも一つを結合するのに充分な条件下で行い、それによって、それに引き続いて該細胞に感染する該肺炎ウイルスの能力を減衰させる、前記方法。
【請求項６０】
前記CCRリガンドが、エオタキシン1、エオタキシン2、エオタキシン3、単球走化性タンパク質-1（MCP-1）、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-5、MIP-1α、MIP-1β、I-309；RANTES（regulated on activation normal T-cell expressed and secreted）、TARC、一つまたは複数の前記細胞受容体を特異的に認識する抗体およびそれらのフラグメント、一つまたは複数の該受容体の細胞外ドメインへの結合活性を有するポリペプチドからなる群より選択される、請求項59に記載の方法。
【請求項６１】
危険にさらされている脊椎動物の肺炎ウイルス予防方法であって、
（a）該肺炎ウイルスの表面タンパク質であって、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5およびCCR8からなる群より選択される少なくとも一つの細胞ケモカイン受容体への該肺炎ウイルスの結合に関与している該表面タンパク質に結合する能力を示すウイルスリガンドを含む組成物を提供し；そして
（b）該組成物を該脊椎動物に投与すること、
を含む、前記方法。
【請求項６２】
前記ウイルスリガンドが、
-  前記肺炎ウイルス表面タンパク質を特異的に認識する抗体またはそのフラグメント；および
-  CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8受容体またはその機能性フラグメント
からなる群より選択される、請求項58または請求項61に記載の方法。
【請求項６３】
肺炎ウィルスの感染性を減少させる方法であって、結合に好ましい条件下で該ウイルスと、ウイルスリガンドとを接触させることを含み、該ウイルスリガンドは、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5およびCCR8からなる群より選択される細胞ケモカイン受容体への該肺炎ウイルスの結合に関与しているウイルス表面タンパク質に結合する能力を示す、前記方法。
【請求項６４】
ヒトRSVによる気道疾患の開始または蔓延を減少させる方法であって、HRSVに結合しそしてその感染性を減少させる能力を示すウイルスリガンドを含む抗ウイルス薬をヒトに投与することを含み、該ウイルスリガンドは、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5およびCCR8からなる群より選択される細胞ケモカイン受容体への該HRSVの結合に関与しているHRSV表面タンパク質に結合する能力を示す、前記方法。
【請求項６５】
生物学的試料中の肺炎ウイルスの存在を検出する方法であって、
（a）該生物学的試料と、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5およびCCR8からなる群より選択される少なくとも一つの細胞ケモカイン受容体を発現する細胞とを接触させ、該接触工程を、該試料中に含有される一つまたは複数の肺炎ウイルスが該細胞に感染するのに充分な条件下で行い；
（b）該細胞中の一つまたは複数の肺炎ウイルスの存在を検出する工程、
を含む、前記方法。
【請求項６６】
前記生物学的試料が、粘膜分泌物、口腔分泌物、鼻腔分泌物、気道分泌物、眼分泌物、脳脊髄液、血清および血液からなる群より選択される、請求項65に記載の方法。
【請求項６７】
細胞中の肺炎ウイルスの存在の検出が、直接目視可視化、顕微鏡可視化、細胞の免疫染色、細胞のin situハイブリダイゼーション、および細胞から抽出されるウイルス遺伝物質についてのPCRまたは配列決定分析からなる群より選択される工程を含む、請求項65または請求項66に記載の方法。
【請求項６８】
前記細胞が、Hep-2細胞、A549細胞、およびCCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8受容体でトランスフェクションされたGHOST細胞からなる群より選択される、請求項65〜67のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６９】
前記細胞が、細胞表面上での一つまたは複数の前記ケモカイン受容体の発現を増加させるまたは可能にすることができる一つまたは複数の物質で前処理されている、請求項65〜68のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７０】
前記肺炎ウイルスが、ヒト呼吸器合胞体ウィルス（HRSV）からなる、請求項65〜69のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７１】
モノネガウィルス目のウイルスによる細胞のウイルス感染を減少させることができる抗ウイルス化合物を選択する方法であって、該細胞は、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5およびCCR8からなる群より選択される少なくとも一つの細胞ケモカイン受容体を発現し、
-  機能性ウイルスリガンドおよびウイルスの表面タンパク質を、潜在的抗ウイルス化合物の存在下で接触させ、該表面タンパク質は、該細胞によって発現される該ケモカイン受容体の少なくとも一つへのウイルスの結合に関与していて；
-  該ウイルスリガンドと該ウイルス表面タンパク質との間の結合相互作用を測定することを含み；
それによって、該結合相互作用が該潜在的抗ウイルス化合物の存在下において測定可能に減少する場合に抗ウイルス化合物を選択する、前記方法。
【請求項７２】
前記ウイルスリガンドが、
-  前記肺炎ウイルス表面タンパク質を特異的に認識する抗体またはそのフラグメント；および
-  CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8受容体またはその機能性フラグメント
からなる群より選択される、請求項71に記載の方法。
【請求項７３】
CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5およびCCR8からなる群より選択される少なくとも一つのケモカイン受容体を発現する細胞の肺炎ウイルス感染を減少させることができる抗ウイルス化合物を選択するin vitro方法であって、
（a）（i）該少なくとも一つのケモカイン受容体の機能性CCRリガンド、（ii）ウイルスリガンドを含む化合物または細胞、および（iii）少なくとも一つの潜在的抗ウイルス化合物、を含む試験管を提供し；
（b）該ウイルスリガンドと該機能性CCRリガンドとの間の結合相互作用を測定し；そして
（c）該測定値を対照値と比較することを含み；
それによって、該結合相互作用が、対照値と比較して測定可能に減少する場合に抗ウイルス化合物を選択する、前記方法。
【請求項７４】
前記結合相互作用の測定が、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）、フィルター結合アッセイ、FRETアッセイ、シンチレーション近接アッセイ、顕微鏡可視化、細胞の免疫染色、in situハイブリダイゼーション、およびウイルス遺伝物質についてのPCRまたは配列決定分析からなる群より選択される方法を行うことを含む、請求項71〜73のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７５】
CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5およびCCR8からなる群より選択される少なくとも一つの細胞受容体を発現する細胞のウイルス感染を減少させることができる抗ウイルス化合物を選択する方法であって、
（a）少なくとも一つの機能性CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8受容体を発現する宿主細胞を提供し；
（b）（a）に定義の一つまたは複数の受容体のための機能性リガンドを提供し；
（c）潜在的抗ウイルス化合物と該細胞とを接触させ；そして
（d）該少なくとも一つの機能性受容体と該機能性リガンドとの間の結合相互作用を測定することを含み；
それによって、該結合相互作用が、対照値と比較して測定可能に減少する場合に抗ウイルス化合物を選択する、前記方法。
【請求項７６】
前記抗ウイルス化合物が、肺炎ウィルスに対して有効である、請求項71〜75のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７７】
前記肺炎ウイルスが、ヒト呼吸器合胞体ウィルス（HRSV）からなる、請求項76に記載の方法。
【請求項７８】
請求項71〜77に記載の方法のいずれか一つによって選択される抗ウイルス化合物。
【請求項７９】
少なくとも一つの機能性CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8受容体を発現する細胞の肺炎ウイルス感染を減少させることができる抗ウイルス化合物を選択するためのキットであって、
-  一つまたは複数の該細胞受容体の機能性CCRリガンド；および
-  ウイルスリガンドを含む化合物または細胞を含み；
ここにおいて、該機能性CCRリガンドと該ウイルスリガンドとの結合がアッセイ可能であるキット。
【請求項８０】
変更されたウイルス感染の危険を有する細胞または非ヒト動物を生産する方法であって、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5およびCCR8からなる群より選択される少なくとも一つのケモカイン受容体の細胞発現レベルを変更し、それによって、該細胞または非ヒト動物のウイルス感染への感受性を変更することを含み、但し、該ウイルス感染はHIV感染ではないという条件付きである、前記方法。
【請求項８１】
CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5およびCCR8からなる群より選択される少なくとも一つのケモカイン受容体を発現する細胞中に外因性非ウイルス核酸分子を導入する方法であって、該外因性非ウイルス核酸分子を含む遺伝子修飾されたウイルスと該細胞を接触させることを含み、ここにおいて、該遺伝子修飾されたウイルスは、該細胞に感染することができる、前記方法。
【請求項８２】
前記外因性非ウイルス核酸分子が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、二本鎖RNA、および治療的遺伝子産物をコードする配列を含む核酸分子からなる群より選択される、請求項81に記載の方法。
【請求項８３】
CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5およびCCR8からなる群より選択される少なくとも一つのケモカイン受容体を発現する細胞中に外因性非ウイルス核酸分子を導入するための送達ビヒクルとしてのウイルス粒子の使用であって、該ウイルス粒子は該細胞に入ることができ、但し、該ウイルス粒子はHIV粒子ではないという条件付きである、前記使用。
【請求項８４】
肺炎ウイルスによる感染を処置するおよび／または予防するための組成物であって、CCRリガンドおよび薬学的に許容しうる担体を含み、該CCRリガンドは、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5およびCCR8からなる群より選択される少なくとも一つのケモカイン受容体に結合することによって、肺炎ウイルスの感染性を減少させる能力を示す、前記組成物。
【請求項８５】
前記組成物が、HRSVによる感染に感受性の気道組織への適用のためのスプレーからなる、請求項84に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本出願は、本明細書中にその開示がそのまま援用される2001年8月10日出願の米国予備特許出願第60／311,088号の優先権を主張する。
【０００２】
発明の背景
（a）発明の分野
本発明は、脊椎動物の呼吸器ウイルス感染、より詳しくは、ヒトおよび動物の呼吸器合胞体ウイルス（RSV）感染を処置するまたは予防するための方法、試薬および組成物に関する。本発明は、更に、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8受容体とウイルスの表面タンパク質との間の結合相互作用をモジュレーションすることによって細胞のウイルス感染をモジュレーションする方法に関する。本発明は、更に、細胞のウイルス感染を減少させる方法；哺乳動物細胞を結合する肺炎ウイルスの能力を減衰させる方法；ヒトRSVによる気道疾患の開始または蔓延を減少させる方法；生物学的試料中の肺炎ウイルスの存在を検出する方法；遺伝子治療方法、および新規な抗ウイルス化合物を同定する方法においてこのような結合相互作用を利用する。
【０００３】
（a）先行技術の簡単な説明
ヒト呼吸器合胞体ウイルス（Human Respiratory Syncytial Virus：HRSV）は、パラミクソウイルス科（Paramyxoviridae）の肺炎ウイルス亜科の非分節型のマイナス鎖ウイルスである。このウイルスは、Collins, P.ら（in the textbook by Fields,B. N. et al., (1996) Fields Virology, pp 1313-1351 (Raven Press, N. Y））により詳細に記載されている。このウイルスは、ヒト個体群に遍在し、約100％の乳児が3歳までに感染する。HRSV感染は、乳児および小児の重症の下気道疾患の主因である。すなわち、HRSVは、1年間に入院した乳児の内少なくとも50％の細気管支炎入院、25％の肺炎入院および2％の死亡率の原因である。約50％の細気管支炎患者は、喘息を発症する。60歳またはそれを超える成人の場合、HRSVは、普通感冒またはインフルエンザに似た症状を引き起こすが、しかしながら、それは、肺炎、気管支炎および致死を引き起こすこともありうる。HRSVは、世界的に年間100万人を超える死亡の原因であると考えられるが、現在のところ、有効でそして安全なHRSVワクチンは入手不能である。世界保健機関（The World Health Organization）および国立アレルギー・感染症研究所（National Institutes of Allergy and Infectious Diseases）のワクチン諮問委員会は、ワクチン開発についてHRSVをHIVの次に位置づけている。
【０００４】
ウイルスは、ウイルスが標的宿主細胞中に入るための侵入口としての、ウイルスのコリセプター（ウイルス受容体とも称される）として機能する一つまたはそれを超える特異的細胞受容体タンパク質と相互作用することによって細胞に感染する。HRSVは、呼吸器系のマクロファージおよび上皮細胞を含めた肺胞細胞タイプに特異的に感染するということが知られている。G糖タンパク質およびF糖タンパク質は、HRSV感染に関与することが知られているHRSVエンベロープの二つの主要タンパク質であり、付着（G）糖タンパク質は、部分的に、宿主細胞中へのウイルスの侵入の原因となっている。最近になって、HRSVは受容体CX3CR1（ケモカインフラクタルカインの特異的受容体）を結合するということおよびこの結合は細胞のRSV感染を容易にするということが示された（Tripp et al. (2001) Nature Immunology, 8: 732-738）。本発明は、RSV-Gタンパク質を認識しそして結合する追加の細胞受容体（CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5およびCCR8）を開示するが、これら追加の受容体は、細胞中へのHRSV侵入に関与している。
【０００５】
いくつかの脊椎動物細胞受容体は、ある種のウイルス、細菌および寄生生物感染の病原性に臨界的役割を果たし、コリセプター（coreceptorsまたはco-receptors）と称されてきている。例えば、ケモカイン受容体CCR2b、CCR3、CCR5およびCXCR4およびその他は、HIV感染に関与し、それらの対応するリガンド（ケモカイン）も、ウイルスの侵入および感染を阻害することができる（Pelchen-Mathews et al., (1999), Immunological Reviews 168: 33-49; Springer et al. (2001) J of Virol 75 : 3779-90；およびPCT特許出願WO99／06561号）。他のタイプの細胞受容体も、コリセプター／ウイルス受容体として機能する。例えば、細胞接着に関与するICAM-1受容体も、ヒトライノウイルスのコリセプターである（米国特許第5,589,453号）。CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5およびCCR8受容体は、周知であり、以前に詳細に記載されてきたが、これまで、RSVについても、同一の目（モノネガウイルス目（Mononegavirales））のいずれか他のウイルスについても、宿主細胞受容体として同定されたことはなかった。
【０００６】
上のことを考えると、Mononegaviralesのウイルス目、より具体的には、ヒトRSVなどの肺炎ウイルス（Pneumoviruses）についての一つまたは複数のウイルス細胞受容体を同定することが必要とされる。
【０００７】
ウイルス細胞感染をモジュレーションするための安全でそして有効なRSVワクチンおよび組成物も、長い間切実に必要とされている。
脊椎動物の肺炎ウイルス感染、より具体的には、哺乳動物の呼吸器合胞体ウイルス感染を処置するかまたは予防するための方法、試薬および組成物も必要とされている。
【０００８】
Mononegavirales目のウイルス、より具体的には、ヒトRSVなどのPneumovirusesについての新規な抗ウイルス化合物を同定する方法も必要とされている。
本発明は、これら必要性も、次の説明を読むことで当業者に明らかになるであろう他の必要性も満たす。
【０００９】
発明の概要
本発明は、ウイルス、より具体的には、ヒトRSVなどのPneumovirusesによる呼吸器感染を処置、予防および／または検出するための方法、組成物およびキットを提供する。
【００１０】
本発明は、更に、新規な抗ウイルス化合物、薬物およびワクチンをin vitro、in vivoおよびex vivoで同定／スクリーニングする方法および手段を提供する。
本発明は、更に、遺伝子治療およびトランスフェクションの方法であって、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8陽性細胞中に外因性遺伝子を導入するための送達ビヒクルとしてウイルスを用いる方法を提供する。
【００１１】
第一の側面により、本発明は、細胞ケモカイン受容体とウイルスの表面タンパク質との間の結合相互作用をモジュレーションすることを含む、細胞のウイルス感染をモジュレーションする方法であって、この細胞ケモカイン受容体は、SEQ ID NO: 6と少なくとも38％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、この細胞ケモカイン受容体は、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8からなる。
【００１２】
もう一つの側面により、本発明は、細胞ケモカイン受容体とウイルスの表面タンパク質との間の結合相互作用をモジュレーションすることを含む、細胞のそのウイルス感染をモジュレーションする方法に関する。本発明により、この細胞ケモカイン受容体は、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8であり、このウイルスはHIVではない。
【００１３】
更に別の側面により、本発明は、細胞の少なくとも一つのケモカイン受容体とウイルスの表面タンパク質との間の結合相互作用を可能にするまたは増加させることを含む、細胞のウイルス感染を増加させる方法に関する。関連する側面により、本発明は、細胞の少なくとも一つのケモカイン受容体とウイルスの表面タンパク質との間の結合相互作用を妨げることを含む、細胞のウイルス感染を減少させる方法に関する。どちらの場合も、ケモカイン受容体は、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5およびCCR8からなる群より選択される。
【００１４】
好ましくは、このウイルスは、Mononegavirales目のウイルスからなる。より好ましくは、ウイルスは、パラミクソウィルス（Paramyxoviridae）科のウイルスからなる。なお一層好ましくは、ウイルスは、ニューモウイルス亜科（Pneumovirinae）のウイルス、またはPneumoviruses種のウイルスからなる。最も好ましい態様において、このウイルスは、ヒト呼吸器合胞体ウィルス（Human Respiratory Syncytial Virus（HRSV））から成り、ウイルスタンパク質は、HRSV G糖タンパク質からなる。
【００１５】
より具体的な側面において、本発明は、
-  CCR1陽性細胞の一つまたは複数のCCR1受容体への肺炎ウイルスの結合を妨げることを含む、CCR1陽性細胞の肺炎ウイルス感染を減少させる方法；
-  CCR2陽性細胞の一つまたは複数のCCR2受容体への肺炎ウイルスの結合を妨げることを含む、CCR2陽性細胞の肺炎ウイルス感染を減少させる方法；
-  CCR3陽性細胞細胞の一つまたは複数のCCR3受容体への肺炎ウイルスの結合を妨げることを含む、CCR3陽性細胞の肺炎ウイルス感染を減少させる方法；
-  CCR4陽性細胞の一つまたは複数のCCR4受容体への肺炎ウイルスの結合を妨げることを含む、CCR4陽性細胞の肺炎ウイルス感染を減少させる方法；
-  CCR5陽性細胞の一つまたは複数のCCR5受容体への肺炎ウイルスの結合を妨げることを含む、CCR5陽性細胞の肺炎ウイルス感染を減少させる方法；および
-  CCR8陽性細胞の一つまたは複数のCCR8受容体への肺炎ウイルスの結合を妨げることを含む、CCR8陽性細胞の肺炎ウイルス感染を減少させる方法に関する。
【００１６】
もう一つの具体的な側面において、本発明は、細胞CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8受容体と、肺炎ウイルスの表面タンパク質との間の結合相互作用をモジュレーションすることを含む、細胞の肺炎ウイルス感染をモジュレーションする方法に関する。
【００１７】
したがって、本発明は、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8受容体と、ウイルスの表面タンパク質との間の結合相互作用をモジュレーションすることによる、細胞のウイルス感染をモジュレーションする方法を記載する。
【００１８】
本発明はまた、細胞のウイルス感染を減少させる方法；哺乳動物細胞を結合する肺炎ウイルスの能力を減衰させる方法；ヒトRSVによる気道疾患の開始または蔓延を減少させる方法；生物学的試料中の肺炎ウイルスの存在を検出する方法；遺伝子治療方法、および新規な抗ウイルス化合物を同定する方法；を提供するために、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8受容体と、ウイルスの一つまたは複数の表面タンパク質との間の結合相互作用を利用する。
【００１９】
CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5およびCCR8が、HRSVのコリセプターであると同定することは、それが、ウイルスの親和性（tropism）を決定する細胞受容体発現であり、したがって、ウイルス病原性を決定する場合に重要な役割を果たすということが知られているので、多数の利点を有する。更に、一つまたは複数のウイルス細胞受容体の特性決定は、感染を予防しうるし、感染を処置することもありうるワクチンおよび抗ウイルス治療薬の設計および同定を容易にする。
【００２０】
本発明の他の目的および利点は、添付する図面を参照して行われるいくつかの好ましい態様についての以下の非限定的な説明を読むことで明らかであろう。
【００２１】
発明の詳細な説明
本発明は、CCR3受容体、更には、CCR1、CCR2、CCR4、CCR5およびCCR8が、Paramyxoviridae科由来のウイルスの細胞コリセプター、より詳しくは、ニューモウイルス科（Pneumoviridae）亜科のメンバーであるヒト呼吸器合胞体ウイルス（HRSV）のコリセプターであるという発見に基づいている。
【００２２】
CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5およびCCR8が、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（RSV）の細胞受容体であり、そしてRSV-Gタンパク質が、これらケモカイン受容体の少なくとも一つに結合するという発見は、in vitroで、更には、in vivoおよびex vivoで多数の用途を有する。
【００２３】
（A）定義
本文中、「キロベース」という用語は、概して、「kb」と略記され、「デオキシリボ核酸」という用語は「DNA」として、「リボ核酸」という用語は「RNA」として、「相補的DNA」という用語は「cDNA」として、「ポリメラーゼ連鎖反応」という用語は「PCR」として、そして「逆転写」という用語は「RT」として略記される。ヌクレオチド配列は、特に断らない限り、5'〜3'方向に記載される。
【００２４】
本明細書中においてこのような用語に与えられる範囲を含めた明細書および請求の範囲をなお一層明確にそしてより一貫して理解するために、次の定義を提供する。
アンチセンス：ヒトおよび動物の該当する遺伝子の発現を制御することができる核酸分子を意味する。本明細書中で用いられるアンチセンス分子には、そのまたは別のプロモーターに相対して逆方向である構造ゲノム遺伝子、cDNA遺伝子またはその一部分を含む遺伝子コンストラクトも包含されてよい。典型的には、アンチセンス核酸配列は、タンパク質合成のための鋳型ではないが、他の分子（遺伝子またはRNAなど）中の相補的配列となお相互作用し、それによってそれら分子の機能に影響を及ぼす。
【００２５】
結合相互作用／結合親和性：二つの分子の互いの引力または接着性の性質、状態または過程を意味する。典型的には、結合は、それら分子表面の一部分の形状および化学的性状が相補的であるおよび／または互いの比較的高い引力または親和性を有するために起こる。本明細書中で用いられるように、それは、概して、ウイルスによる感染に感受性の宿主細胞受容体へのウイルス表面タンパク質の結合を意味する。
【００２６】
CCRリガンド：CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8受容体のいずれかに結合親和性を有するいずれかの分子を意味する。好ましくは、CCRリガンドの結合親和性は、それが、ウイルス表面タンパク質と、該当するCCR受容体との間の結合相互作用をブロックすることができるようなものである。CCRリガンドの具体的な例の非限定的なリストを以下に与える。
【００２７】
発現：遺伝子にコードされた情報が、細胞中に存在しそして機能する構造に変換される過程を意味する。cDNA、cDNAフラグメントおよびゲノムDNAフラグメントの場合、転写された核酸は、その後、もしあればその機能を果たすためにペプチドまたはタンパク質に翻訳される。
【００２８】
フラグメント：タンパク質、ポリペプチドまたは核酸などの分子部分を意味し、アミノ酸またはヌクレオチド配列のいずれかの部分を示す意味である。
ホモログ：DNAまたはタンパク質配列中で類似性を共有する核酸分子またはポリペプチドを意味する。
【００２９】
モジュレーション：ある与えられた変数がある比率に制御される過程を意味する。
特異的に結合する：タンパク質を認識し、結合するが、試料、例えば、天然にタンパク質を包含する生物学的試料中の他の分子を実質的に認識することも結合することもない抗体を意味する。
【００３０】
ウイルスリガンド：CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8受容体のいずれかを結合することができるウイルス表面タンパク質に結合親和性を有するいずれかの分子を意味する。好ましくは、ウイルスリガンドの結合親和性は、それが、あるウイルス表面タンパク質と、該当するCCR受容体との間の結合相互作用をブロックすることができるようなものである。ウイルスリガンドの具体的な例の非限定的なリストを以下に与える。
【００３１】
（B）ケモカイン受容体CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5およびCCR8は、HRSVの細胞コリセプターである
本出願の実施例部分に詳述されるように、RSV-Gタンパク質は、CCR3受容体に結合する（図1）。CCR3受容体を有する細胞は、RSVに感染しうるし（図3および図4）、可溶性エオタキシン（CCR3受容体のリガンド）は、細胞CCR3受容体へのウイルス結合について用量依存様式で拮抗する（図2および図3）。同様に、CCR3受容体に特異的な中和抗体も、RSVの感染および複製を阻害した（図4および図5）。
【００３２】
興味深いことに、本発明者は、CCR1、CCR2、CCR4、CCR5およびCCR8もまた、RSVの細胞コリセプターであるということを発見した。図7および図8に示されるように、ケモカイン受容体CCR1、CCR2、CCR4またはCCR5を発現するGHOST細胞系は、RSV感染を支持するが、ケモカイン受容体を発現しない親細胞は感染していない。相同性研究（以下を参照されたい）は、CCR8がもう一つのRSVコリセプターである可能性があると予測させる。
【００３３】
しかしながら、本出願がヒトRSVのみに限定されるわけではないということは理解されるべきである。実際、ヒトRSVは、ウシ呼吸器合胞体ウイルス（BRSV）、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（HRSV）、マウス肺炎ウイルス（PVM）および七面鳥鼻気管炎ウイルス（TRTV）を含めたPneumovirus属の種である。このPneumovirus属はそれ自体、より大きいParamyxoviridae科のメンバーであるPneumovirinae亜科のメンバーである。Paramyxoviridae科のメンバーウイルスは、Mononegavirales目の他の科、すなわち、ラブドウイルス科（Rhabdoviridae）およびフィロウイルス科（Filoviridae）のものと遺伝子発現および複製の類似した戦略および類似した遺伝子順序を有するということも理解される（Universal Virus Database, http://life.anu.edu.au/viruses/lctv/index.htmlより抜粋される）。したがって、本明細書中には示されなかったが、特定の場合、CCR3は、Mononegavirales目、より具体的には、Paramyxoviridae科、なお一層具体的には、Pneumovirinae亜科由来の他のウィルスまたはそれらは関連する他のウイルスの細胞コリセプターであるということが可能であるし、きわめて有望でもある。当業者は、過度の実験を伴うことなく、どのウイルスが、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8に結合する表面タンパク質を有するかを決定し、そしてもし存在する場合に、これら「CCR結合性」タンパク質が、宿主細胞中へのウイルス侵入に関与しているか否かを同定することができるであろう。
【００３４】
（1）ヒトケモカイン受容体の簡単な説明
これらケモカインは、特異的Gタンパク質に連結した7回膜貫通型受容体に結合することによって白血球トラフィッキングを媒介する走化性サイトカインのスーパーファミリーである。ケモカインは、最初の二つのシステインの一次配列に基づいて三群に、すなわち、C-X-C、C-CおよびCのファミリーに分けられる。C-X-CおよびCファミリーは、主に、それぞれ好中球およびリンパ球に対して活性であるが、C-Cファミリーメンバーは、マクロファージ、リンパ球、好塩基球および好酸球に対して活性である。本発明者は、いくつかのケモカイン受容体が上皮細胞上にも存在するということを発見しており、上皮細胞におけるケモカインの役割も示唆されている。50種類を超えるケモカインが存在するが、それらが一つの共通の前駆体に由来するということおよび経時的に分化があったということが大いに考えられる。ケモカインおよびそれらの受容体の一次、二次および三次構造に特定の相同性が保存されたということも大いに考えられる。これら相同性は、CCR3のようなケモカイン受容体が少なくとも6個のリガンドを有する理由およびCCR3に作用するRANTESのようなリガンドが他のケモカイン受容体にも作用する理由を説明することができる。更に、三次構造の相同性を有するために一次構造に相同性を有する必要はないことがありうる。実際、哺乳動物ディフェンシン（defensin）は、ケモカインとディフェンシンがアミノ酸レベルで一見したところ相同性を有していないとしても、いくつかのケモカインとの三次構造相同性および機能的活性（いくつかのケモカイン受容体を介して作用する）を有する（De Yang et al. Trends in Immunology ; 2002 vol 23, pp. 291-296）。
【００３５】
ケモカイン受容体CCR3は、最初、4個のエクソンを有する単一遺伝子によってコードされると記載されたが、この第四エクソンは、成熟タンパク質にプロセシングされ、これが細胞表面上で機能性になる。CCR3をコードするヌクレオチド配列は、ヒト（GenBank受託番号：AF262304、AF262303、AF262302、AF262301、AF262300、AF262299、AF247361、AF247360、AF247359、AB023887、AF224496、AF224497、AF224495、AF237380およびU51241）、ヒツジ（GenBank番号：AF266468）、マカク（GenBank番号：AY065647、AY065646、AF291671、AF017283、Y13776、Y13775）、ネコ（GenBank番号：AF226606）、ラット（GenBank番号：NM053958、AF003954）、マウス（GenBank 番号：XM 135270、NM 009914）およびモルモット（GenBank番号：AF060698）について知られている。CCR3受容体は、上皮細胞上に、または好塩基球、リンパ球および好酸球などの炎症性細胞上に存在し、それは、身体の炎症応答の一部分である。CCR3は、国際PCT特許出願WO99／66037号、WO97／41225号、WO97／41154号およびWO96／22371号にも詳細に記載されている。CCR3のヒトmRNA配列（cDNA）は、本明細書中にSEQ ID NO: 5として記載され、対応する予想アミノ酸配列は、本明細書中にSEQ ID NO: 5として記載される。
【００３６】
CCR1受容体は周知であり、多数の刊行物に詳細に記載されている（概説については、Murdoch and Finn, Blood, 2000,95, 3032-3043を参照されたい）。CCR1をコードするヌクレオチド配列は、ヒト（GenBankTMNo：NM 001293、NM 001295、AF051305）；マウス（GenBankTM No：NM009912）；マーモセット（GenBankTM No：AF127928）；ウサギ（GenBankTM No：AF127527）およびマカク（GenBankTMNo：AF017282）について知られている。CCR1のヒトmRNA配列（cDNA）は、本明細書中にSEQ ID NO: 1、NM 001295として記載され、対応する予想アミノ酸配列は、本明細書中にSEQ ID NO: 2、NP 001286として記載される。受容体CCR1は、高親和性RANTES（Regulated on T-cell Activation Normal T cell expressed and Secreted）およびMIP-1α（マクロファージ炎症性タンパク質、Macrophage Inflammatory Protein）受容体である。ケモカインMCP-3（Monocytes Chemoattractant Protein）は、CCR1に中程度の親和性で結合するが、それはCCR1リガンドとみなされる。IL-2およびIL-5は、活性化T細胞上でのCCR1の発現を引き起こすが、Il-10は、ヒト単球上でのCCR1の発現を選択的に亢進制御する。
【００３７】
CCR2受容体は周知であり、多数の刊行物に詳細に記載されている（概説については、Murdoch and Finn, Blood, 2000,95, 3032-3043を参照されたい）。CCR2をコードするヌクレオチド配列は、ヒト（GenBankTMNo：NM 000647、NM 000648、NM 003965、U95626）、ラット（GenBankTMNo：NM 021866、U77349）；マウス（GenBankTM No：XM 125240）、オランウータン（GenBankTMNo：AF354631）；ゴリラ（GenBankTM No：AF354630）；マカク（GenBankTM No：AF124381）について知られている。CCR2のヒトmRNA配列（cDNA）は、本明細書中にSEQ ID NO: 3、U95626として記載され、対応する予想アミノ酸配列は、本明細書中にSEQ ID NO: 4、NP 000639として記載される。CCR2aおよびCCR2bは双方とも、同一の5'非翻訳領域および膜貫通領域を有するが、それらは、オルタナティブスプライシングされたカルボキシル末端が異なる。結果として、CCR2bのカルボキシ末端は、CCR1中の対応する領域に36％相同であるが、CCR2aのカルボキシ末端は、他の既知のケモカイン受容体のいずれにも類似性をもたない。MCP-1、2、3、4、5は、CCR2bリガンドである。単球におけるCCR2発現は、IFNγおよびリポ多糖類双方によって減少するが、IL-2は、Tリンパ球の発現を引き起こす。
【００３８】
CCR4受容体は周知であり、多数の刊行物に詳細に記載されている（概説については、Murdoch and Finn, Blood, 2000,95, 3032-3043を参照されたい）。CCR4をコードするヌクレオチド配列は、ヒト（GenBankTMNo：AB023889、NM 005508）、マウス（GenBankTM No：XM 135257、BG277031）；ラット（GenBankTM No：）およびゼブラフィッシュ（GenBankTM No：）について知られている。CCR4のヒトmRNA配列（cDNA）は、本明細書中にSEQ ID NO: 7、NM 005508として記載され、対応する予想アミノ酸配列は、本明細書中にSEQ ID NO: 8、P51679として記載される。受容体CCR4は、Th2細胞および血小板において高度に発現されるが、他の末梢単核細胞においては弱く発現される。RANTES、MIP-1aおよびMCP-1は、CCR4のリガンドとして報告されたが、TARC（Thymus and Activation Regulated Chemokine）は、CCR4発現性細胞の選択的化学誘引物質リガンドであることが分かっている。
【００３９】
CCR5受容体は周知であり、多数の刊行物に詳細に記載されている（概説については、Murdoch and Finn, Blood, 2000,95, 3032-3043を参照されたい）。CCR5をコードするヌクレオチド配列は、ヒト（GenBankTMNo：AF161909〜AF161921、U54994、NM 000579、AF082742）、マウス（GenBankTMNo：NM 009917）およびマカク（GenBankTM No：AF252565〜AF252568）について知られている。CCR5のヒトmRNA配列（cDNA）は、本明細書中にSEQ ID NO: 9、NM 000579として記載され、対応する予想アミノ酸配列は、本明細書中にSEQ ID NO: 10、AAB65737として記載される。受容体CCR5は、ケモカインMIP-1β、RANTES、MIP-1αおよびMCP-2を特異的に結合することが判明した。CCR5は、許容細胞へのマクロファージ向性（R5）HIV-1株侵入についてCD4と関連がある主なコリセプターであることが分かっている。
【００４０】
CCR6受容体は周知であり、多数の刊行物に詳細に記載されている（概説については、Murdoch and Finn, Blood, 2000,95, 3032-3043を参照されたい）。CCR6をコードするヌクレオチド配列は、ヒト（GenBankTMNo：XM 033838、U45984）、マウス（GenBankTM No：NM 009835、AJ222714）について知られている。CCR6のヒトmRNA配列（cDNA）は、本明細書中にSEQ ID NO: 11、U45984として記載され、対応する予想アミノ酸配列は、本明細書中にSEQ ID NO: 12、P51684として記載される。受容体CCR6は、記憶T細胞、Bリンパ球および樹状細胞上で検出されているが、他の末梢血白血球では全く検出されていない。
【００４１】
CCR7受容体は周知であり、多数の刊行物に詳細に記載されている（概説については、Murdoch and Finn, Blood, 2000,95, 3032-3043を参照されたい）。CCR7をコードするヌクレオチド配列は、ヒト（GenBankTMNo：XM 049959、NM 001838）、マウス（GenBankTM No：XM 122359）およびラット（GenBankTMNo：AF 121670）について知られている。CCR7のヒトmRNA配列（cDNA）は、本明細書中にSEQ ID NO: 13、XM 049959として記載され、対応する予想アミノ酸配列は、本明細書中にSEQ ID NO: 14、NP 001829として記載される。受容体CCR7は、活性TおよびBリンパ球および樹状細胞上で発現されることが知られ、エプスタイン・バーウイルスに感染したB細胞およびヘルペスウイルス6または7に感染したT細胞において強く亢進制御される。この受容体は、ケモカインELC（EBl1リガンドケモカイン）およびSLC（二次リンパ組織ケモカイン）を結合する。
【００４２】
CCR8受容体は周知であり、多数の刊行物に詳細に記載されている（概説については、Murdoch and Finn, Blood, 2000,95, 3032-3043を参照されたい）。CCR8をコードするヌクレオチド配列は、ヒト（GenBankTMNo：XM 041048、AF005210、U45983）およびマウス（GenBankTM No：NM 007720、AF100201、Z98206）について知られている。CCR8のヒトmRNA配列（cDNA）は、本明細書中にSEQ ID NO: 15、U45983として記載され、対応する予想アミノ酸配列は、本明細書中にSEQ ID NO: 16、NP 005192として記載される。CCR8受容体は、強力な単球化学誘引物質であるケモカインI-309を結合し、Th2細胞上で選択的に発現されるCCR8に特異的に結合する。
【００４３】
CX3CR1受容体は周知であり、多数の刊行物に詳細に記載されている（概説については、Murdoch and Finn, Blood, 2000,95, 3032-3043を参照されたい）。CX3CR1をコードするヌクレオチド配列は、ヒト（GenBankTMNo：XM 047502、NM 001337）およびマウス（GenBankTM No：NM 009987、XM147339、AF074912、AF0102269）について知られている。CX3CR1のヒトmRNA配列（cDNA）は、本明細書中にSEQ ID NO: 17、XM 047502として記載され、対応する予想アミノ酸配列は、本明細書中にSEQ ID NO: 18、NP 001328として記載される。CX3CR1受容体は、内皮細胞、上皮細胞および樹状細胞への単球、NK細胞およびTリンパ球の接着を促進するフラクタルカインの天然受容体である。
【００４４】
CXCR4受容体は周知であり、多数の刊行物に詳細に記載されている（概説については、Murdoch and Finn, Blood, 2000,95, 3032-3043を参照されたい）。CXCR4をコードするヌクレオチド配列は、ヒト（GenBankTMNo：NM 003467、AF025375、NM 003467、AF348491、AF005058、AF052572）、マウス（GenBankTMNo：NM 009911、Y14739）、ヒヒ（GenBankTM No：AF031089）、ネコ（GenBankTMNo：U63558）およびマカク（U93311）について知られている。CXCR4のヒトmRNA配列（cDNA）は、本明細書中にSEQ ID NO: 19、NM003467として記載され、対応する予想アミノ酸配列は、本明細書中にSEQ ID NO: 20、NP 003458として記載される。受容体CXCR4は、SDF-1（Stromal Derived Factor）の天然受容体である。この受容体は、T向性（X4）HIV-1およびHIV-2型株に必須の補因子（cofactor）として同定された。SDF-1は、きわめて効果的なリンパ球化学誘引物質であり、それは、許容CD4＋細胞のHIV-1感染を阻害する。CXCR4遺伝子を欠いたマウスは、Bリンパ球産生障害、骨髄造血障害、造血障害、逸脱した小脳ニューロン移動、および胃腸管に供給する大血管の欠陥形成を示す。
【００４５】
（2）ケモカイン受容体配列間の類似性研究
CX3CR1は、細胞のHRSV感染を促進する（Tripp et al. (2001) Nature Immunology, 8: 732-738）ということが最近示されたこと、および本出願の実施例部分に与えられる結果が、明らかに、CCR3が細胞中へのHRSV侵入に関与したことを示したということを考慮して、双方の受容体へのHRSV結合の原因でありうる一つまたは複数のいずれかのコンセンサス配列または領域を見つけるために、一次構造の類似性研究（アミノ酸配列アラインメント）を行った。配列アラインメントには、HRSVへの一つまたは複数の追加の細胞受容体を予想するために、他のケモカイン受容体の配列も組み込まれた。
【００４６】
以下の表1は、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CX3CR1およびCXCR4ヒト受容体各々のアミノ酸配列同一性を与える。理解されうるように、CX3CR1アミノ酸配列は、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5およびCCR8受容体と最高レベルの同一性および類似性を共有する。興味深いことに、CCR3アミノ酸配列も、これら同じ受容体と最高レベルの同一性および類似性を共有する。これら結果は、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5およびCCR8受容体も、CX3CR1およびCCR3と同様に、HRSV結合活性を有することがありうるということを強く示唆する。
【００４７】
【表１】
2005509408.tif 000002
【００４８】
本発明者は、いろいろなケモカイン受容体でトランスフェクションされているGHOST細胞の感染性を評価することによってin vitroでこの仮説を確かめた。図7および図8で分かるように、CCR1、CCR2b、CCR3、CCR4かまたはCCR5でトランスフェクションされているGHOST細胞は、感染後72時間にグリコシル化RSV-Gタンパク質を生じるが、親細胞は生じない（示されていない）。
【００４９】
本発明者は、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5およびCX3CR1間の一次構造のコンセンサス領域を探した。図6で分かるように、これらケモカイン受容体の間には、アミノ酸配列に多数のコンセンサス領域が存在する。細胞内／膜貫通ドメイン（示されていない）において多数見出される。N末端領域および細胞外ドメインでも、いくつかのコンセンサス領域が見出される。興味深いことに、アミノ酸の類似性および保存的変化は、N末端領域および全3種類の細胞外ドメインで見出される。CCR3をCX3CR1と比較すると、N末端領域と、細胞外ドメイン1および3に相同性がある。一次構造比較の結果は、全ての細胞外ドメインがHRSVへの結合に関与しているかもしれないが、N末端領域および最初の細胞外ドメインは、この受容体を発現する細胞中へのHRSV侵入に、より重要であるらしいということを示唆すると考えられる。
【００５０】
HRSVは、上皮細胞に感染する傾向がある。本発明者は、ケモカイン受容体CCR3、CCR5、CXCR3およびCXCR4が、上皮細胞系A549上かまたはヒト気道の生検中に存在する上皮細胞上に存在するということを発見した。更に、本発明者が上皮細胞系上で発見したケモカイン受容体は機能性である。多数の他のケモカイン受容体は、他のグループによって上皮細胞上で報告された。ディフェンシンについて前に述べられたように（De Yang et al. Trends in Immunology ; 2002 vol 23, pp. 291-296）、RSVと、ケモカイン受容体上のその相補的構造との間の相同性は、上皮細胞のみならず炎症性細胞にも機能的作用を引き起こす（したがって、炎症性細胞の走化性および活性化を引き起こす）のに充分であるということが考えられる。この仮説は、HRSV感染について記載された主な知見を説明しうると考えられる。実際、細気管支炎は、HRSVによって大部分引き起こされ、小気道または細気管支中への炎症性細胞流入として組織学的に記載される乳児の普通の気道感染である。概して、HRSVへの免疫応答は、細気管支中への炎症性細胞の補充をもたらすと考えられる。しかしながら、本出願に与えられた知見は、HRSVが、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5およびCCR8受容体との相同性によって細気管支中への炎症性細胞の補充をもたらすことに直接的に関与しているということを示唆する。CCR3受容体を有する細胞のRSV感染をエオタキシンが阻害しうるということを示している図2および図3に与えられた結果は、HRSVが、細胞中で機能的に作用する部位においてCCR3受容体に付着するということを示唆する。興味深いことに、CCR3受容体は、大部分は好酸球走化性に関与し、好酸球は、細気管支炎の乳児の気道に優先的に存在する炎症性細胞である。
【００５１】
CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5およびCCR8受容体の間の一次および三次コンセンサス配列の情報は、RSVのそのコリセプターへの付着の拮抗剤または阻害剤を設計することによってRSV感染をブロックするまたは処置する物質を生じるのに役立ちうる。更に、これら物質は、いくつかのケモカイン受容体への阻害作用を潜在的に有することによって広範囲の抗炎症可能性を有することができると考えられる。コリセプターおよびそのRSV上のエピトープの三次構造の情報は、新規なワクチン接種戦略の設計にも用いうると考えられる。
【００５２】
（C）細胞のウイルス感染をモジュレーションするための方法、試薬および組成物
上のことを考えて、本発明の一つの側面は、細胞のウイルス感染をモジュレーションする方法に関する。この方法は、細胞ケモカイン受容体とウイルスの表面タンパク質との間の結合相互作用をモジュレーションすることを含む。この細胞ケモカイン受容体は、SEQ ID NO: 5（CCR3）のヌクレオチド4015〜5082と少なくとも75％、85％または95％同一の配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む。より好ましくは、この細胞ケモカイン受容体は、SEQ ID NO: 6（CCR3）と少なくとも50％、65％、75％、85％、90％または95％の類似性、なお一層好ましくは、SEQ ID NO: 6（CCR3）と少なくとも38％、40％、50％、60％、65％、75％、85％、90％または95％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。具体的な態様において、この細胞ケモカイン受容体は、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8からなる。
【００５３】
本発明の最も具体的な側面は、細胞ケモカイン受容体と表面タンパク質との間の結合相互作用をモジュレーションすることを含む、細胞の肺炎ウイルス感染をモジュレーションする方法に関する。より好ましくは、この細胞ケモカイン受容体は、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8からなる。したがって、本発明のもう一つの側面は、この細胞の一つまたは複数のCCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8受容体への肺炎ウイルスの結合を妨げることを含む、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8に陽性の細胞の肺炎ウイルス感染を減少させる方法に関する。
【００５４】
本発明の具体的な側面により、ウイルス感染は、細胞受容体とウイルスの表面タンパク質との間に起こりうる結合相互作用を阻害するまたはブロックすることによって減少するまたはブロックされる。以下に記載のように、これは、いろいろな手段を用いることによって達成されうる。したがって、本発明の具体的な側面は、哺乳動物細胞を結合する肺炎ウイルスの能力を減衰させる方法、危険にさらされている哺乳動物の肺炎ウイルス予防方法、Pneumovirusesの感染性を減少させる方法、およびヒトRSVによる気道疾患の開始または蔓延を減少させる方法に関する。
【００５５】
（1）CCRリガンド
細胞を結合するウイルスの能力を減衰させる一つの方法は、CCR受容体を認識するCCRリガンドに、このリガンドがこの受容体を結合するのに充分な条件下において細胞を暴露することである。結合したCCRリガンドは、ウイルスと受容体との間のその後の相互作用を妨げる。したがって、このような処置により、その後細胞を結合しそして細胞に感染するウイルスの能力は減衰し、ブロックもされる。
【００５６】
好ましい態様において、CCRリガンドは減衰する、より好ましくは、CCR3陽性細胞、より具体的には、ヒト上皮細胞、および好塩基球、リンパ球および好酸球などのヒト炎症性細胞、そしておそらくは他の哺乳動物細胞を結合するHRSVの能力をブロックする。
【００５７】
例えば、in vitroで培養された細胞について、CCRリガンドは、これら細胞上の一つまたは複数の該当するCCR受容体をそれが結合するのに充分な時間、細胞培養物に加えることができる。in vivo細胞については、CCRリガンドは、薬理学的に許容しうる担体（例えば、溶液、ゲル、マグマまたは膏薬）中で供給することができる。この点で、CCRリガンドは、別々の器官または組織内の細胞に対して局所的にまたは全身的に送達されて、より広範な規模でウイルス感染を減衰させることができる。CCRリガンドは、それが細胞を結合するのに充分な条件下で細胞に暴露される。CCRリガンドの濃度、更には、有効な結合に必要な条件は、用いられるリガンドのタイプ、標的とされる一つまたは複数の受容体のタイプおよび送達場所に依存するであろう。しかしながら、このようなリガンドの速度論的プロフィールを適用に先立って研究することは、当該技術分野における常套技術の範囲内である。このCCRリガンドは、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5およびCCR8受容体について以下に与えられるリガンドより選択されてよい。
【００５８】
この文脈中、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5およびCCR8のリガンドは、ウイルスと、対応するCCR受容体との間の相互作用をブロックするのに適したいずれかの分子上に存在する。
【００５９】
周知のCCR1リガンドには、RANTES（regulated on activation normal T-cell expressed and secreted）；Macrophage Inflammatory Protein-1α（MIP-1α）およびMCP-3が含まれる。周知のCCR2リガンドには、単球走化性タンパク質-1（monocyte chemoattractant protein-1、MCP-1）、MCP-2、MCP-3、MCP-4およびMCP-5が含まれる。周知のCCR3リガンドには、エオタキシン1、エオタキシン2またはエオタキシン3、MCP-3およびMCP-4、およびRANTESが含まれる。周知のCCR4リガンドには、MCP-1、RANTES、MIP-1αおよびTARC（Thymus and Activation Regulated Chemokine）が含まれる。周知のCCR5リガンドには、MIP-1α、MIP-1βおよびRANTESが含まれる。周知のCCR8リガンドはI-309である。上のCCRリガンドリストは完全なものではなく、いずれか他の適当なCCRリガンドも、本発明によって用いうると考えられる。
【００６０】
化学的または生物学的ないずれの分子も、CCRリガンドとして役立ちうるしまたはCCRリガンドを提供しうるが、このCCRリガンドは、概して、タンパク質の一部分として存在する。例えば、CCRリガンドは、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8受容体上のエピトープを認識する抗体でありうる。他の態様において、CCRリガンドは、ウイルスエンベロープの外部ドメインを含むタンパク質（例えば、RSV-G、RSV-F、またはCCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8受容体を結合することができるRSV-GまたはRSV-Fの可溶性機能性誘導体またはフラグメント）上にある。しかしながら、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8受容体に結合することができるいずれの化合物も、いずれかの化学薬品、核酸、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、ケモカイン、ホルモン、受容体、抗体、抗原、核酸、炭水化物、多糖、脂質、病原体、ウイルス、化学物質、阻害剤、補因子、基質、増殖因子、代謝産物、類似体、薬物、色素、それらの模擬分子が含まれるが、これに限定されるわけではない、CCRリガンドとしてみなすことができる。
【００６１】
以下に例示される好ましい態様において、CCR3リガンドは、エオタキシン1などの可溶性タンパク質およびCCR3受容体に特異的な中和抗体である。好ましい態様において、CCR1リガンドは、RANTESおよびCCR1受容体に特異的な中和抗体である。好ましいCCR2リガンドには、MCP類およびCCR2受容体に特異的な中和抗体が含まれる。好ましい態様において、CCR4リガンドは、MIP-1αおよびCCR4受容体に特異的な中和抗体である。好ましい態様において、CCR5リガンドは、MIP-1βおよびCCR5受容体に特異的な中和抗体である。好ましい態様において、CCR8リガンドは、I-309およびCCR8受容体に特異的な中和抗体である。
【００６２】
他の好ましいCCRリガンドには、細胞ケモカイン受容体へのウイルス結合（好ましくは、HRSV）について競合することによって、ウイルス感染、より具体的には、細気管支炎、気管支炎、肺炎および喘息などのHRSV関連疾患を予防、阻害するまたは処置すると考えられる可溶性ウイルス表面分子、それらのフラグメントおよび類似体並びにいずれかの他の分子が含まれる。
【００６３】
（2）ウイルスリガンド
細胞を結合するウイルスの能力を減衰させるもう一つのアプローチは、一つまたは複数のウイルス細胞表面分子を認識するウイルスリガンドに、このウイルスリガンドがこの一つまたは複数のウイルス細胞表面分子を結合するのに充分な条件下において、ウイルスまたはその一部分を暴露して、結合したリガンドが、ウイルスとCCR受容体との間のその後の相互作用を妨げるようにすることである。したがって、このような処置により、その後細胞を結合するウイルスの能力は減衰し、ブロックもされる。いずれかのウイルス細胞表面分子も、標的とすることができるが、このウイルスリガンドは、好ましくは、細胞のCCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8受容体を結合するウイルスタンパク質を認識する。
【００６４】
この文脈中、ウイルスリガンドは、ウイルス細胞表面分子と相互作用し、しかも一つまたは複数のウイルス細胞表面分子と、細胞のCCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8受容体またはCCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8の機能性フラグメントまたは類似体との間の相互作用を妨げるまたはブロックするのに適しているいずれかの分子からなる（またはその上に存在する）。本明細書中の上に定義されたCCRリガンドについては、いずれかの合成または天然の物質または分子が、ウイルスリガンドとして役目を果たすことができ、その使用方法は、CCRリガンドの場合と同様である。例えば、ある程度まで、CCR3ウイルスリガンドは、CCR3陽性細胞であってよいし、またはCCR3陽性細胞を有する動物であってよい。
【００６５】
本発明により、好ましいウイルスリガンドには、ウイルス細胞表面分子を、より好ましくは、HRSV-GまたはHRSV-Fタンパク質に結合することができるモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体およびそれらのフラグメントまたは機能性類似体が含まれる。
【００６６】
他の好ましいウイルスリガンドには、一つまたは複数の正常の細胞CCR受容体を模倣するかまたはそれと競合することによって、感染、より具体的には、細気管支炎、気管支炎、肺炎および喘息などのHRSV関連疾患を予防、阻害または処置すると考えられる可溶性のCCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8受容体またはそれらのフラグメントおよびいずれかの他の分子または薬物が含まれる。
【００６７】
（3）一つまたは複数のケモカイン受容体細胞レベルのモジュレーション
これまでのところ、ウイルス感染を予防する強力な薬学的戦略は、細胞のウイルス受容体に、それらの機能、合成または発現を阻害するために、薬学的に活性な化合物を標的化させることであった（例えば、ヘルペスウイルス受容体についてはWO00142300号、テナガザル白血病ウイルス受容体についてはEP0414035号を参照されたい）。
【００６８】
したがって、本発明のもう一つの側面により、ウイルス細胞受容体、好ましくは、パラミクソウイルス受容体、より好ましくは、肺炎ウイルス受容体、なお一層好ましくは、ヒトRSV受容体の発現を阻害して、細胞当たりの受容体分子数を減少させ、それによって、細胞および／または宿主を結合し、それに感染するウイルスの能力を限定する方法を提供する。
【００６９】
多数の化合物および方法を使用して、細胞受容体発現を阻害／減少させることができる。化合物の例には、受容体ポリペプチド、融合タンパク質、抗原性ペプチド、抗受容体抗体、これらのペプチド模倣体、および受容体mRNAに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。
【００７０】
好ましい態様により、これら方法／化合物は、細胞当たりのCCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8受容体の機能、合成、発現または数を阻害する。適当な化合物は、一つまたは複数のCCR受容体、その該当するタンパク質前駆体またはその該当する核酸（RNA、mRNAまたはDNA遺伝子）に特異的なそしてそれを阻害する分子の群の中から選択される。これらには、
（a）CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8受容体に結合する抗体、CCRリガンドおよび他の化合物；および
（b）CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8遺伝子配列、RNAまたはmRNAに結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムおよび他の化合物が含まれる。CCR3について、好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドには、本明細書中に援用されるWO99／66037号に記載のものが含まれる。
【００７１】
これら化合物は、ウイルス感染、より具体的には、細気管支炎、気管支炎、肺炎および喘息などのHRSV関連疾患を処置、阻害または予防するために、好ましくは、ウイルス感染に感受性の未感染のヒトまたは動物に、またはウイルスに感染した患者に投与される医薬組成物中に包含される。CCRアンチセンス分子について、これらは、当業者に知られているいずれか適当な手段を用いることによって細胞中に導入されるかまたは発現されてよい。
【００７２】
好ましい態様により、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8の発現は、減少し、沈黙もするので、細胞を結合しそして細胞に感染するHRSVの能力は減少し、完全にブロックもされる。
【００７３】
したがって、本発明の更に別の側面は、哺乳動物細胞を結合する肺炎ウイルスの能力を減衰させる方法、危険にさらされている哺乳動物の肺炎ウイルス予防方法、肺炎ウィルスの感染性を減少させる方法、およびヒトRSVによる気道疾患の開始または蔓延を減少させる方法に関する。本質的には、これら方法は、細胞を結合しそして細胞に感染するHRSVなどの肺炎ウイルスの能力を減衰させそしてブロックもするためのCCRリガンド、ウイルスリガンドまたはアンチセンス分子（好ましくは、有効な治療的組成物中に包含される）の使用に基づいている。
【００７４】
哺乳動物細胞を結合する肺炎ウイルスの能力を減衰させる方法は、好ましくは、
-  少なくとも一つのCCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5およびCCR8ケモカイン受容体を認識するCCRリガンドに、このCCRリガンドが一つまたは複数の細胞受容体を結合するのに充分な条件下で、細胞を暴露すること；
-  肺炎ウイルスの表面タンパク質を認識するウイルスリガンドに、このウイルスリガンドがこの肺炎ウイルス表面タンパク質を結合後、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8ケモカイン受容体の少なくとも一つへの肺炎ウイルスの結合を減衰させるのに充分な条件下で、ウイルスを暴露すること；および／または
-  CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8ケモカイン受容体の細胞内レベルを減少させること
からなる工程を含み；
それによって、哺乳動物細胞を結合する肺炎ウイルスの能力を限定する。
【００７５】
一つまたは複数のCCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8ケモカイン受容体を発現する哺乳動物細胞に感染する肺炎ウイルスの能力を減衰させる方法は、この細胞ケモカイン受容体の少なくとも一つを認識するCCRリガンドに対して、CCRリガンドがこれら細胞受容体のこの少なくとも一つを結合し、それによって、その後、この細胞に感染するこの肺炎ウイルスの能力を減衰させるするのに充分な条件下で、細胞を暴露することを含む。
【００７６】
危険にさらされている脊椎動物の肺炎ウイルス予防方法は、
（a）肺炎ウイルスの表面タンパク質（CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8受容体への肺炎ウイルスの結合に関与している表面タンパク質）に結合する能力を示すウイルスリガンドを含む組成物を提供し；そして
（b）危険にさらされている脊椎動物にこの組成物を投与すること
を含む。
【００７７】
肺炎ウィルスの感染性を減少させる方法は、結合に好ましい条件下でウイルスと、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8ケモカイン受容体への肺炎ウイルスの結合に関与しているウイルス表面タンパク質に結合する能力を示すウイルスリガンドとを接触させることを含む。
【００７８】
ヒトRSVによる気道疾患の開始または蔓延を減少させる方法は、HRSVに結合しそしてその感染性を減少させる能力を示すウイルスリガンドを含む抗ウイルス薬をヒトに投与することを含み、このウイルスリガンドは、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8細胞ケモカイン受容体へのHRSVの結合に関与しているHRSV表面タンパク質に結合する能力を示す。
【００７９】
前述のように、細胞に感染する肺炎ウイルスの能力は、細胞中でCCRアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入するまたは発現させることによって、一つまたは複数のCCR受容体の細胞内レベルを減少させることによって限定することができる。好ましい態様により、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、呼吸器系に直接的に投与される。好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは、前に定義のオリゴヌクレオチドの少なくとも一つと薬学的に許容しうる担体を含む医薬組成物中に包含される。
【００８０】
本発明の組成物中に存在するオリゴヌクレオチドの量は、治療的有効量である。オリゴヌクレオチドの治療的有効量は、組成物が投与される宿主に過度の負の作用を引き起こすことなく、オリゴヌクレオチドがその生物学的機能を果たすのに必要な量である。用いられるオリゴヌクレオチドおよび投与される組成物の正確な量は、オリゴヌクレオチドの生物学的活性、処置される状態のタイプ、投与方式、更には、組成物中の他の成分などの因子によって異なるであろう。典型的には、この組成物は、約1％〜約90％の一つまたは複数のオリゴヌクレオチドで構成され、約20μg〜約20 mgのオリゴヌクレオチドが投与されるであろう。このような医薬組成物を製造しそして投与するためには、当該技術分野において周知の方法を用いることができる。
【００８１】
（4）宿主防御機構の刺激
細胞を結合するヒトRSVウイルスなどのウイルスの能力を減衰させるもう一つの方法は、一つまたは複数のウイルス細胞表面分子に対する、好ましくは、ウイルスCCR結合性タンパク質に対する宿主免疫応答を引き起こし／刺激して、その宿主免疫応答が、一つまたは複数のCCR受容体と相互作用するウイルスの能力を妨げるようにすることである。
【００８２】
したがって、感染しているまたは感染しやすい宿主は、ウイルス細胞表面分子に対して免疫感作されうると考えられるので、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8受容体と相互作用するウイルスの能力を妨げるであろう免疫応答を生じる。例えば、HRSVについては、ヒトのウイルス感染への細胞媒介性応答が、RSV Fタンパク質、マトリックス（M）タンパク質、SHおよび非構造タンパク質lbを認識する細胞傷害性T細胞を生じるということが知られている。
【００８３】
したがって、本発明はまた、宿主免疫応答を引き起こす／刺激するためのウイルス表面タンパク質（HRSV-Gタンパク質など）、そのフラグメントおよび類似体の使用であって、その免疫応答が、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8受容体と相互作用しそしてこのようなCCR陽性細胞に感染するウイルスの能力を妨げる使用に関する。
【００８４】
免疫応答を引き起こす方法は、当該技術分野において周知であり、典型的には、担体、アジュバントまたは免疫モジュレーターを含むまたは含まない、免疫応答を生じさせるウイルス抗原またはエピトープを宿主に投与することからなる。これらウイルス抗原は、精製されてよいし（RSVタンパク質の製造例を与える米国特許出願第08／679060号および国際PCT出願WO9801257号を参照されたい）、または化学的技術若しくは組換え技術を用いて製造されてよい。同様に、RSV-Gまたは-F抗原を発現するワクシニアまたは他のウイルスリコンビナントを動物に接種することが考えられうる。当業者は、一つまたは複数のウイルス細胞表面分子に対する有効な宿主免疫応答を引き起こす／刺激するために、適当な抗原を選択しそして使用する方法を知るであろう。
【００８５】
（5）医薬組成物およびワクチン
更に関連した具体的な側面により、本発明は、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8に陽性の細胞を結合するHRSVなどのウイルスの能力を減衰させる、より好ましくは、ブロックする、医薬組成物およびワクチンを提供する。好ましい組成物は、肺炎ウイルスによる感染を処置するおよび／または予防するための組成物である。
【００８６】
好ましい態様により、本発明の組成物／ワクチンは、（i）CCRリガンドと、（ii）薬学的に許容しうる担体を含む。このCCRリガンドは、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5およびCCR8ケモカイン受容体の少なくとも一つに結合する能力を示し、それによって、肺炎ウイルスの感染性を減少させる。
【００８７】
もう一つの好ましい態様により、本発明の組成物／ワクチンは、（i）ウイルスの一つまたは複数の細胞表面分子、好ましくは、ウイルスCCR結合性タンパク質を、一つまたは複数のウイルス細胞表面分子を結合しそしてCCR受容体と相互作用するウイルスの能力を妨げるのに充分な条件下において認識するウイルスリガンド、および（ii）薬学的に許容しうる担体を含む。
【００８８】
第三の側面により、本発明の組成物／ワクチンは、（i）ウイルスの一つまたは複数の細胞表面分子、好ましくは、ウイルスCCR結合性タンパク質に対する宿主免疫応答を引き起こし／刺激して、その宿主免疫応答が、CCR受容体と相互作用するウイルスの能力を妨げるようにする化合物、好ましくは、ウイルス抗原と、（ii）薬学的に許容しうる担体を含む。
【００８９】
本発明による免疫原性組成物またはワクチンは、0.1〜100容量／容量％の活性成分を含有する注射可能剤として、または液剤（水剤、懸濁剤または乳剤）として、または経口錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤または散剤、坐剤または皮膚貼付剤として製造することができる。これら免疫原性成分は、生理食塩水、水、アルコール、糖、湿潤剤および乳化剤、リポソーム、pH緩衝剤およびアジュバントなどの薬学的に許容しうる賦形剤と混合されてよい。免疫原性組成物またはワクチンは、注射（筋肉内、皮下、皮内）によって非経口で；鼻内、口内の粘膜表面上または下部気道中への噴霧または経口摂取（嚥下）によって投与することができる。坐剤による投与には、グリコールおよびトリグリセリドなどの結合剤および担体が含まれてよい。経口製剤には、セルロース、サッカリン、炭酸マグネシウムなどの担体が含まれてよい。より好ましくは、この組成物は、HRSVによる感染に感受性の気道組織への適用のためのスプレーからなる。
【００９０】
免疫原性は、ワクチンの活性な免疫原性成分がアジュバントと混合される場合に有意に増大することがありうる。アジュバントは、抗原を投与された場所で限局的に保持することによって作用し、したがって、免疫系に抗原を徐放させる。それらは、免疫細胞を抗原に引き付け、そして免疫細胞を刺激して抗原に応答させることもできる。ヒト用ワクチンの典型的なアジュバントには、ミョウバン（水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム）が含まれる。ワクチンの免疫原性を改善する他の方法には、ワクチンに直接的に連結されるかまたは独立して投与されうる、CpGオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、DNA、遺伝子治療などのより特異的な免疫モジュレーターの使用が含まれる。
【００９１】
本発明の組成物中に存在する活性成分の量は、治療的有効量である。活性成分の治療的有効量は、組成物が投与される宿主に過度の負の作用を引き起こすことなく、活性成分がそれらの所望の生物学的機能を果たすのに必要な量である。免疫原性標品およびワクチンの有効量は、典型的には、投与経路、および個々の患者の年齢、体重および医学的状態で異なる。適当な用量は、当業者によって容易に決定され、典型的には、各々の活性成分がマイクログラム〜ミリグラムの範囲内である。初回投与およびブースター投与のための投薬計画または方式は、当業者によって容易に決定され、そして更に、上記の変数に依存する。
【００９２】
（D）ウイルス感染の診断または予後のための方法およびキット
本発明のもう一つの側面により、肺炎ウイルスによって引き起こされる感染、より具体的には、ヒト呼吸器合胞体ウィルス（HRSV）による感染などのウイルス感染の診断または予後のための方法およびキットを提供する。
【００９３】
より詳しくは、本発明は、生物学的試料、例えば、粘膜、口腔、鼻腔、気道の分泌物、眼分泌物、脳脊髄液、血清または血液中の肺炎ウイルス（好ましくは、HRSV）の存在を検出する方法を提供する。一つの態様により、この方法は、
（a）生物学的試料と、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5およびCCR8ケモカイン受容体の少なくとも一つを発現する細胞とを接触させ、この接触工程を、存在する場合には試料中に含有される一つまたは複数の肺炎ウイルスが、細胞に感染するのに充分な条件下で行うこと；
（b）細胞中の一つまたは複数の肺炎ウイルスの存在を検出すること
を含む。
【００９４】
当業者は、用いるのに最良のタイプの細胞が何かを容易に決定するであろう。用いることができるCCR3陽性細胞の例には、Hep-2細胞、A549細胞、およびCCR3受容体でトランスフェクションされたGHOST細胞が含まれる。若干の時間（2〜48時間）後、このような細胞は、何千コピーものRSVウイルスを含有すると考えられる。感染した細胞中のRSVの存在を検出する方法の非限定的リストには、直接可視化、顕微鏡可視化、細胞の免疫染色、in situハイブリダイゼーション、ウイルス遺伝物質についてのPCRまたは配列決定分析が含まれる。
【００９５】
必要ならば、細胞を、細胞表面上での一つまたは複数のケモカイン受容体の発現を増加させるまたは可能にすることができる一つまたは複数の物質で前処理してよい（例えば、GHOST細胞は、一つまたは複数のCCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8受容体のいずれかでトランスフェクションされていてもよい）。細胞表面上での一つまたは複数のCCR受容体の発現を増加させることは、肺炎ウイルスの存在が、生物学的試料中でより速くまたはよりしばしば検出されるように、肺炎ウイルス感染への細胞の感受性を増加させることができる。細胞内での一つまたは複数のCCR受容体の発現を増加させるのに好ましい物質は、次の群、すなわち、メディエーター、サイトカイン、ケモカイン、レクチン、タンパク質、プロテオグリカンおよびイオン内で見出されるがこれに制限されるわけではない細胞刺激剤または活性化剤である。
【００９６】
生物学的試料中の肺炎ウィルスの存在を検出するもう一つの方法は、生物学的試料と、肺炎ウイルスの表面分子を結合することができる化合物、物質および細胞さえもを接触させて、肺炎ウイルスの存在が生物学的試料中で検出されるようにすることを含む。一つまたは複数の肺炎ウィルス表面分子を結合するのに好ましい物質には、本明細書中の前に定義のウイルスリガンドが含まれる。これらリガンドは、共有結合によって支持体に固定されまたは吸着されていてよいし、またはされていなくてよい。支持体は、天然のまたは合成の分子から製造されてよい。周知の合成巨大分子支持体には、ポリリシンおよびポリ（D-ポリ（D-L-アラニン）-ポリ（L-リシン）が含まれる。他のタイプの適当な支持体には、リポソーム、ミクロ粒子、およびラテックス、ポリホスホグリカン（PGLA）またはポリスチレンから製造されるミクロスフェア、が含まれる。
【００９７】
本発明による診断または予後用キットは、好ましくは、肺炎ウイルス表面分子を結合することができる化合物、物質または細胞と、指示書、アッセイチューブ、酵素または試薬を含み、それによりRSV表面分子の結合が検出されるようにする。RSV表面分子を結合するのに好ましい化合物または物質には、本明細書中の前に定義のウイルスリガンドが含まれる。これらウイルスリガンドは、前記のような支持体に共有結合によって固定されまたは吸着されていてよいし、またはされていなくてよい。
【００９８】
本発明によるウイルス感染の診断または予後のための方法およびキットは、潜在的に感染した体液、分泌物または組織から得られる検体についてヒトまたは動物の感染を検出し、アッセイの速度、感度および特異性を増加させるのに、そして細気管支炎、気管支炎、肺炎および喘息などの肺炎ウイルス感染および／または関連疾患の処置を助けるのにきわめて有用でありうる。
【００９９】
（E）スクリーニング方法およびキット
もう一つの側面により、本発明は、細胞CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8受容体とのウイルス結合相互作用を妨げることができる新しい抗ウイルス化合物（例えば、化学薬品、薬物、ワクチン等）をスクリーニングし、同定するおよび／または評価するための方法およびキットに関する。これら抗ウイルス化合物は、細胞、より具体的には、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8に陽性の細胞のモノネガウィルス目のウイルスによるウイルス感染を阻害、予防および／または減少させるのに用いうると考えられる。
【０１００】
好ましい態様において、この方法は、
-  機能性ウイルスリガンド（本明細書中の前に定義の）およびウイルスの表面タンパク質を、潜在的抗ウイルス化合物の存在下で接触させ、このウイルスの表面タンパク質は、細胞によって発現されるCCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8受容体へのウイルスの結合に関与していて；
-  このウイルスリガンドとウイルス表面タンパク質との間の結合相互作用を測定する工程を含み；
それによって、この結合相互作用が潜在的抗ウイルス化合物の存在下において測定可能に減少する場合に抗ウイルス化合物が選択される。
【０１０１】
もう一つの態様により、本発明の方法は、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8受容体を発現する細胞の肺炎ウイルス感染を減少させることができる抗ウイルス化合物を選択するin vitro方法からなる。この方法は、
（a）（i）少なくとも一つのケモカイン受容体の機能性CCRリガンド、（ii）ウイルスリガンドを含む化合物または細胞、および（iii）少なくとも一つの潜在的抗ウイルス化合物、を含む試験管を提供し；
（b）このウイルスリガンドと機能性CCRリガンドとの間の結合相互作用を測定し；そして
（c）得られた測定値を対照値と比較する工程を含み；
それによって、この結合相互作用が、対照値と比較して測定可能に減少する場合に、抗ウイルス化合物が選択される。
【０１０２】
更にもう一つの態様により、本発明の方法は、
（a）少なくとも一つの機能性CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8受容体を発現する宿主細胞を提供し；
（b）（a）に定義の一つまたは複数の受容体のための機能性リガンドを提供し；
（c）潜在的抗ウイルス化合物とこの細胞とを接触させ；そして
（d）一つまたは複数の機能性受容体とこの機能性リガンドとの間の結合相互作用を測定する工程を含み；
それによって、この結合相互作用が、対照値と比較して測定可能に減少する場合に、抗ウイルス化合物が選択される。
【０１０３】
当然ながら、「測定可能に減少した結合相互作用」および「対照値と比較して」の意味は、得られた結果が、試験される一つまたは複数の抗ウイルス化合物の不存在下においてこの方法を行われている、あるタイプの実験と間接的にまたは直接的に比較されることを意味している。しかしながら、これは、対照値などの「参照値」が、いずれか他の手段によって得られうるし、またはこれら方法を実施するのに適した自動装置に簡単に与えられまたは組み込まれうるので、必要条件ではない。
【０１０４】
本発明のもう一つの関連した側面は、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5およびCCR8に陽性の細胞の肺炎ウイルス感染を減少させることができる抗ウイルス化合物を選択するためのキットに関する。本発明のキットは、（i）一つまたは複数の細胞受容体の機能性CCRリガンドと、（ii）ウイルスリガンドを含む化合物または細胞を含み；この機能性CCRリガンドとウイルスリガンドとの結合はアッセイ可能である。
【０１０５】
機能性CCRリガンドを含む好ましい化合物または物質には、本明細書中の前の定義のものが含まれる。好ましくは、このCCRリガンドは、HRSVのGタンパク質またはその機能性フラグメントまたは類似体である。CCRリガンドは、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8受容体を結合することができる表面分子を有するウイルスまたは細胞によって与えられてもよい。
【０１０６】
好ましいウイルスリガンドには、本明細書中の前の定義のものが含まれる。これらウイルスリガンドは、前記のような支持体に共有結合によって固定されまたは吸着されていてよいし、またはされていなくてよい。それらは、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8受容体を発現する細胞または動物によって与えられてもよい。
【０１０７】
試験される抗ウイルス化合物、ウイルスリガンドおよび／またはCCRリガンドの性状に依存して、この結合相互作用は、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）、フィルター結合アッセイ、FRETアッセイ、シンチレーション近接アッセイ、顕微鏡可視化、細胞の免疫染色、in situハイブリダイゼーション、ウイルス遺伝物質についてのPCRまたは配列決定分析が含まれるが、これらに限定されるわけではない、周知の方法を用いて測定することができる。
【０１０８】
本発明によるアッセイキットは、好ましくは、指示書、アッセイチューブ、酵素、試薬または細胞を更に含み、CCRリガンドへのウイルスリガンドの結合（または逆の場合も）がアッセイされるまたは検出されるようにする。
【０１０９】
本発明によるスクリーニング方法およびキットは、CCR受容体とのウイルス結合相互作用妨げることができる新しい化合物、薬物およびワクチンをスクリーニングしそして評価し、そしてそれによって、いろいろなウイルス（肺炎ウィルスなど）に対して有効な、およびウイルス感染、細気管支炎、気管支炎、肺炎および喘息、より具体的には、ヒト呼吸器合胞体ウィルス（HRSV）による感染を処置する／予防するのに有効な、新しい薬剤を発見するのにきわめて有用でありうる。したがって、本発明は、前に定義の方法またはキットのいずれか一つによって同定可能な全ての抗ウイルス化合物を包含する。この同じスクリーニング方法は、いくつかのケモカイン受容体（CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5およびCCR8）へのリガンドの結合を阻害することができる新規な抗炎症化合物の探求にも応用可能でありうると考えられる。
【０１１０】
（F）増加したまたは低下したウイルス感染の危険を有する細胞およびトランスジェニック動物
もう一つの側面により、本発明は、増加したまたは低下したウイルス感染の危険を有する細胞およびトランスジェニック動物の使用に関する。実際、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5およびCCR8受容体は、RSVの細胞コリセプターであるということが判明しているので、細胞および動物中のこれらケモカイン受容体のレベルをモジュレーションすることは、これら細胞／動物のウイルス感染への感受性を結果的に変更するために有用でありうる。
【０１１１】
例えば、より低いまたはより高いレベルのCCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8を有する細胞または動物を使用して、（i）ウイルス感染の機構をin vitro、ex vivoまたはin vivoで研究し、（ii）CCR受容体とのウイルス結合相互作用を妨げることができる新しい化合物、ワクチンおよび薬物をスクリーニングしそして評価し、（iii）一つまたは複数の所定のCCR受容体を発現するかまたはしない細胞を用いることによって、感染しているウイルスが実際に特定のウイルス（例えば、RSV）であるということを確かめることができた。
【０１１２】
更に、減少したレベルのCCR受容体を有するかまたはCCR受容体を全く有していない非ヒトトランスジェニック動物は、家畜および生産動物にとって特に重要な経済的利点であるが、ウイルス感染、より具体的には、肺炎ウィルスの感染にはるかに感受性が少ないと考えられる。したがって、本発明は、増加したまたは低下したウイルス感染の危険を有する遺伝子修飾された細胞および動物を包含する。
【０１１３】
したがって、本発明は、変更されたウイルス感染の危険を有する細胞または非ヒト動物を生産する方法を提供する。この方法は、少なくとも一つのCCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8ケモカイン受容体の細胞発現レベルを変更し、それによって、この細胞または非ヒト動物のウイルス感染への感受性を結果的に変更する工程を含む。
【０１１４】
本発明のもう一つの具体的な側面は、細胞のウイルス感染を増加させる方法に関する。この方法は、細胞の少なくとも一つのCCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8ケモカイン受容体と、ウイルスの表面タンパク質との結合相互作用を可能にするまたは増加させる工程を含む。
【０１１５】
ある遺伝子の減少した／増加した発現を有する遺伝子修飾された細胞または動物（例えば、トランスジェニック動物）を生産する方法も、当該技術分野において周知である。細胞中のケモカイン受容体のレベルを低下させる／排除するいくつかの方法は、本明細書中の前に記載されている。細胞および／またはほ乳動物中のCCRのレベルを増加させる方法について、これらは、当業者の技術の範囲内である。これらには、例えば、細胞刺激剤または活性化剤（例えば、サイトカイン、ケモカイン、メディエーター、タンパク質、プロテオグリカン、レクチン）などの薬物または化合物、そしてさらに他のウイルス、分子生物学技術（遺伝子のトランスフェクション、過剰発現）の使用が含まれうる。
【０１１６】
（G）遺伝子治療のための遺伝子導入の方法
ヒトおよび動物において、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5およびCCR8受容体は、限られた数の特定の細胞上で発現されるので、本発明は、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8に陽性の細胞中に外因性非ウイルス核酸分子を導入するための送達ビヒクルとしての、細胞に入ることができるウイルス粒子の使用を包含する。この外因性非ウイルス核酸分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、二本鎖RNA、および治療的遺伝子産物をコードする配列を含む核酸分子から成ってよい。例えば、遺伝子修飾されたHRSVは、遺伝子治療方法において遺伝子導入のためのビヒクルとして用いうると考えられる。
【０１１７】
本発明は、したがって、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5および／またはCCR8に陽性の細胞中に外因性非ウイルス核酸分子を導入するための送達ビヒクルとしての遺伝子治療およびトランスフェクション方法に関する。この方法は、細胞と、外因性非ウイルス核酸分子を含む遺伝子修飾されたウイルスとを接触させることを含み、この遺伝子修飾されたウイルスは、細胞に感染することができる。必要ならば、所定のCCR陽性細胞は、CCR受容体の一つまたは複数の遺伝子をそこに導入しそして発現させることによって得ることができる。
【０１１８】
実施例：
本明細書中に記載のものに類似したまたは同等の方法および材料はいずれも、本発明の実施または試験に用いることができるが、好ましい方法および材料を記載する。
【０１１９】
目的
呼吸器合胞体ウイルス（RSV）は、全ての乳児に3歳までに感染し、普通は、小児、成人、免疫抑制された者および年配者に再感染する。このウイルスは、上皮細胞に感染する傾向を有する。乳児の重症RSV感染は、細気管支炎と称され、喘息の発症の素因をつくる。興味深いことに、喘息の患者は、RSVのような気道のウイルス感染に冒された場合、彼らの疾患が悪化する。ケモカイン受容体は、HIVのようなある種のウイルス感染に重要であることが分かっているので、本発明者は、いくつかのケモカイン受容体が喘息患者の気道中に存在したか否かを評価した。
【０１２０】
（B）試薬および方法
L-グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、ハンクスの平衡塩類溶液（HBSS）、トリプシンエチレンジアミン四酢酸（EDTA）は、Sigma chemical Coより購入した。ダルベッコ修飾最少必須培地（DMEM）、ウシ胎児血清（FCS）、ウシ血清アルブミン（BSA）、Superscript II、Taqポリメラーゼ、dNTP、TRIzol試薬は、Life technologies（Gaithersburg, MD）より購入した。ラット抗ヒトCCR3（クローン61828.111）、マウス抗ヒトCCR-5（クローン45502.111）、マウス抗ヒトCXCR-3（クローン49801.111）、マウス抗ヒトCXCR-4（クローン12G5）、リコンビナントストロマ由来因子-1α（SDF-1a）、エオタキシン、マクロファージ炎症性タンパク質1β（MIP-1β）およびIP-10は、R＆D systems （Minneapolis, US）より購入した。RSV-Gタンパク質へのモノクローナル抗体（Mab858-2）および抗RSV Fタンパク質モノクローナル（Mab858-1）抗体は、Chemicon International, Temecula, CA製であった。HRP結合抗マウス抗体（Santa Cruz Biotechnology,  California, USA）。ビオチンと複合したウマ抗マウスIgG抗体（Dako）、ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼ（AP）コンジュゲート（Dako）、APのFast Red基質（Sigma）。A549II型肺胞上皮細胞およびHep2上皮細胞は、ATCCより購入した。GHOST細胞は、NIH AIDS reagentsプログラムからの寄贈であった。
【０１２１】
この研究で用いられた細胞タイプは全て、プラスチック組織培養フラスコ中において37℃、5％CO2で単層として成長させた。肺胞II型細胞表現型を有する肺腺癌に由来するA549細胞（ATCC）は、10％熱失活FBS含有F12K培地（Life Technologies, Gibco BRL）中で培養し、GHOST細胞（NIH AIDS reagents）は、10％熱失活ウシ胎児血清を補足したDMEM中で培養し；Hep-2細胞は、10％ウシ胎児血清を補足したEagleの修飾必須培地EMEM（Life Technologies, Gibco BRL）中で成長させた。これら培地には、細胞を維持するために、2 mM L-グルタミン、100 U／mlペニシリンおよび100μg／mlストレプトマイシンを補足し、そしてGHOST細胞培地には、ピューロマイシン（トランスフェクションされた細胞にはG418含有）を加えた。これら細胞を、トリプシン／EDTAでの簡単な処理にしたがって継代培養した。
【０１２２】
RSVのA2株は、ATCCより購入した。このRSVを、コンフルエント未満のHep-2細胞単層中に接種した。37℃で2時間吸着後、10％EMEMを加え、そしてこの単層全体が細胞変性効果を示すまで、感染を3日間進行させた。フラスコの内容物を1 mlアリコート中に再懸濁させ、アルコール／ドライアイスで急速凍結し、-80℃で貯蔵した。RSVのウイルス力価を、定量的プラーク形成アッセイによって評価し、そして106〜108pfu／mlの範囲内の力価を-70℃で6ヶ月間を超えて維持した。
【０１２３】
RSV-Gタンパク質は、呼吸器上皮細胞と物理的に相互作用するので、本発明者は、CCR3受容体と相互作用するその能力を調べ、そしてSteven A. Feldman（Feldman, S. et al. 1999. J.Virol. 73: 6610-17）からの改変された阻害、免疫沈降およびウェスタンブロッティングの技術の組合せを用いることによってその相互作用の特異性を証明した。A549、Hep2またはGHOST細胞に、RSV A2株をいろいろな感染多重度（MOI）で感染させた。この研究で示された結果は、1：0.1のMOIで行われた。この1：0.1のMOIは、許容および制限の感染カットオフである。ケモカイン受容体CCR3を発現するこれら細胞（Ghost-CCR3＋、Hep2およびA549）は、1：0.1のMOIでの許容が判明したので、ケモカイン受容体CCR3は、RSV感染への高親和性コリセプターとみなされる。次のケモカイン受容体、CCR1、CCR2b、CCR4、CCR5、CCR8またはCXCR4の内一つだけを発現するGHOST細胞について試みる感染実験を、1：2のMOIで行った。これらGHOST細胞（CCR1、CCR-2b、CCR-4、CCR-5、CCR-8およびCXCR4）は、1：0.1および1：1のMOIで感染しなかった。ケモカイン受容体CCR1、CCR2、CCR4、CCR5、CCR8は、その後、RSV感染に関して低親和性コリセプターとみなされた。いずれのケモカイン受容体も発現しないGHOST親細胞は、これら実験の全てにおいて常に対照として用いた。これら細胞は、1：5およびそれより小さい（1：4、1：3、1：2、1：1および1：0.1）のMOIでRSVに感染しなかった。
【０１２４】
細胞を、2μg／mlのエオタキシンまたはPBS溶液の存在下または不存在下において、RSVに2時間感染させ、3日間培養した。細胞を冷PBS中で3回洗浄し、0.5％Triton X-100、150 mM NaCl、200 mMホウ酸（pH 8）、5 mM EDTA、5 mMフッ化ナトリウムおよび1 mMバナジン酸ナトリウムを含有するRIPA緩衝液中において、溶解緩衝液1 mLにつき3000〜5000万個の細胞比率で溶解させた。溶解産物をミクロ遠心機において14000 RPMで30分間回転させて、免疫沈降の前に細胞核を除去した。免疫沈降は、抗CCR3抗体をプロテインAまたはG-セファロースビーズ（Pharmacia Biotechnology Inc.）に結合させ、これらビーズを溶解緩衝液で2回洗浄後、ビーズを細胞溶解物と一緒に4℃で振動しながら2〜14時間インキュベートすることによって行った。次に、ビーズを溶解緩衝液で5回洗浄し、2×Laemmli試料緩衝液（1 M Tris、25％グリセロール、0.5％SDS、15％ 2-メルカプトエタノール、0.1 mg／mlブロモフェノールブルー）中に再懸濁させ、70℃で10分間沸騰させ、10％SDS-PAGEで分離した。SDS-PAGEおよびウェスタン転移は、標準法を用いて行った。ウェスタン転移は全て、Immobilon PVDF膜（Millipore）へ行った。イムノブロッティングは、強化化学発光検出キット（Boehringer）と一緒に供給されたプロトコールにしたがって行った。これらブロットを、5％BSA（Sigma）、0.05％ Tween 20TMを含有するTBS中において室温で90分間ブロックし、そして抗RSV-Gタンパク質抗体を、同緩衝液中に4℃で12時間加えた（1：1000希釈）。HRP結合抗マウス抗体（1：1000）を更に1時間加え、0.05％ Tween 20を含有するTBS中で3回洗浄した。これらブロットを、強化化学発光（Boehringer）で発色させ、X線フィルム（Kodak）に露光させた。
【０１２５】
（C）結果および考察
ここで、本発明者は、ケモカイン受容体CCR3が、RSV-Gタンパク質と物理的に連結し、細胞の侵入および感染性へのウイルスコリセプターとして機能するということを示す。
【０１２６】
パラミクソウイルス（Paramyxovirus）科の肺炎ウィルス（Pneumovirus）属に属するRSVは、乳児および幼児の急性下部気道疾患の主な原因である。RSVエンベロープは、2種類の糖タンパク質GおよびFを含有し、それぞれは細胞へのウイルス付着および細胞融合の原因となる。SHと称される第三のタンパク質は、機能はまだ知られていない。RSV-Gタンパク質は、他のパラミクソウイルス糖タンパク質と比較して異例な特徴を有する。RSV-Gタンパク質は、30 kDaの前駆体として合成されるが、これは、N結合型糖の付加によって修飾されて、45 kDaの中間体を形成する。これら糖は、複合型へと変換し、O結合型糖が加えられて、約90 kDaの成熟分子を生じる。RSV-Gタンパク質は、RSV疾患の病原性に関連していると考えられるが、マウスにおいては、Th2サイトカインの誘導および好酸球性肺浸潤の発生に関連していた。RSV-Gタンパク質は、変化した腫瘍壊死因子（TNF）およびインターフェロンγ（INF-g）発現；変化した肺多型好中球（PMN）およびナチュラルキラー（NK）細胞トラフィッキング；気管支肺胞白血球によるマクロファージ炎症性タンパク質1-αおよびMIP-2、単球走化性タンパク質1（MCP-1）およびIFN誘導タンパク質10（IP-10）の変化したケモカインmRNA発現にも関連していた（Tripp et al., Nature Immunol., 2001,2, 732-738）。上の免疫応答は、ケモカイン機能を示唆するものであり、RSV-Gタンパク質の構造的特徴は、ケモカインへの顕著な類似性を有する。興味深いのは、全てのケモカインと同様に、RSV-Gは、細胞上のグリコサミノグリカン（GAG）と相互作用するヘパリン結合ドメイン（HBD）（アミノ酸182〜186位）を有する（Feldman et al., 1999, G. J. Virol., 73,6610-6617）。機能へのGAG必要条件についてRSV-Gとケモカインとの間に顕著な一致があると仮定して、本発明者は、RSV感染へのコリセプターとして可能なケモカイン受容体の使用を調べた。
【０１２７】
Hep2細胞は、RSV感染の許容標的細胞であることが知られており、これら細胞は、いくつかのケモカイン受容体を発現する。連続した感染ラウンドを、Hep-2細胞で、1：5〜1：0.1のいろいろなMOIにおいて実施した。Hep-2細胞を、これらの範囲のMOIで系統的に感染させた。その後のRSVでのHep-2細胞の実験的感染は、1：0.1のMOIで実現した。本発明者は、RSV感染を支持する場合のケモカイン受容体CCR3の役割を研究した。免疫沈降法後、免疫沈降した複合体のSDS-PAGEによる分析を、RSV-Gタンパク質とCCR3受容体との間の物理的接触を洞察するために行った。免疫複合体の免疫沈降は、SDS-PAGEと、RSV-Gタンパク質に特異的な抗体を用いて、ウイルス糖タンパク質と細胞受容体との接触が生じたか否かを評価することを可能にするであろう。図1に示された結果は、RSV-G mAbが、抗CCR3 mAbで免疫沈降したタンパク質複合体の中にRSV-Gタンパク質を検出するということを示した（図1、第4レーン）。これら結果は、Hep-2細胞におけるCCR3受容体とRSV-Gタンパク質との間の物理的接触に対する証拠の初めての情報である。実際、RSV-G mAbは、2μg／mlのエオタキシンの存在下でRSVに感染したHep2細胞からの抽出物中でRSV-Gタンパク質を認識できなかったので（図1、第3レーン）、この相互作用は、CCR3受容体に特異的であることが判明した。CCR3特異的リガンドであるエオタキシンは、宿主細胞侵入へのコリセプターとしてRSVによって用いられると考えられるその特異的受容体への結合後、RSV感染を阻害することができたということが示唆される。本発明者は、ここで、RSV-Gタンパク質へのモノクローナル抗体は、1：5000に希釈されたが、この研究で用いられた非感染または対照の全ての細胞タイプにおいて43〜45 kDaの決定基となお交差反応したということに注目した（図1、第2レーンを参照）。しかしながら、全ての細胞抽出物は、同量のタンパク質に正規化された後にSDS-PAGEに充填されたということに留意する。したがって、抗RSV-Gによって認識される、RSV-Gタンパク質前駆体に該当するバンドの高い強度は、現実の感染と、交差反応性によるバックグラウンドとを区別することを可能にした。本発明者は、上記のRSV感染性阻害試験を行うことによって、CCR3受容体が、上皮細胞のウイルス感染性に関与したかどうかを評価した。RSV A2を、0.01〜1.0μg／mlのいろいろな濃度のエオタキシン、または対照PBS溶液の存在下において反復Hep-2細胞培養物上にプレーティングした（図2）。これら培養物を、予め温められたPBSで3回洗浄し、そして10％ウシ胎児血清および0.75％メチルセルロースを含有するRPMI栄養培地を上層して、拡散によるウイルス移動を妨げた。感染後3日目に、これら培養物を、4％パラホルムアルデヒド中に固定し、1％クリスタルバイオレットで染色した。プラーク（ウイルス感染が成功したことを示す細胞のカーペット内部全体によって示されそして局所的に死滅した細胞から流出しているウイルス粒子によって生じるRSV最終細胞変性効果）を肉眼で計数し、そしてPBS処理された細胞培養物と比較されるエオタキシン処理された細胞培養物のウイルスプラーク形成阻害％を決定した。0.5μg／mlに等しいまたはそれを超える濃度のエオタキシンは、RSVプラーク形成を80％阻害したが（図2）、試験された各々のエオタキシン濃度において、PBS対照と比較して統計的により少ないRSV���ラークが存在した（スチューデントt検定を用いてp＜0.05）。この結果は、CCR3が、特定の標的細胞を選択しそしてそれに付着後、ウイルス細胞侵入過程を達成するためのRSV-Gタンパク質に特異的な必要条件を確証した。更に、本発明者の発見は、エオタキシンが、CCR3へのRSV-G結合に特異的な拮抗剤であるということを示唆したが、それは、CCR3の天然リガンドであることが知られているこのケモカインが、RSV感染の付着作用、侵入作用および細胞病理学的作用を阻害することが判明したからである。
【０１２８】
本発明者は、CCR3でトランスフェクションされたGHOST細胞が、RSV感染を支持して、感染性ウイルスを生じるか否かも評価した。本発明者は、図3に記載されたのと同様の方法を用いることによってこれを行った。RSVタンパク質の存在は、感染後72時間に免疫染色によって示した。免疫染色の方法は、Lamkhioued, et al.（J. Immuno. 1997, 159 (9): 4593-4601）によって記載の通りであったが；細胞を、逐次的に、（a）抗RSV Fタンパク質モノクローナル抗体（1：1000；第一抗体）、（b）ビオチンと複合したウマ抗マウスIgG抗体（1：5000；第二抗体）、（c）ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼ（AP）コンジュゲート（検出用分子）、および（d）APのFast Red基質と一緒にインキュベートした。RSVに陽性の反応は、赤色生成物の存在によって示され、多数の赤色ドットは、図3Aに見られる。パネルAは、CCR3受容体でトランスフェクションされたGHOST細胞はRSVに感染するが、CCR3受容体を含有しない親細胞は感染しないということを示している（パネルC）。パネルBは、GHOST／CCR3細胞へのエオタキシンの添加が、RSVによる感染を阻害するということを示している（パネルD：対照）。
【０１２９】
同様に、図4のパネルBは、未感染のHep-2細胞を示すが（これらもCCR3陽性である）、パネルAは、RSVに感染したHep-2細胞を示す（上と同じ条件）。細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）中の4％パラホルムアルデヒド中に固定後、ウイルスの存在を免疫染色によって検出した。同様の実験を、抗CCR3中和抗体（2μg、パネルD）または対照PBS溶液と一緒にインキュベート後、RSVを感染させたCCR3＋GHOST細胞で繰り返した場合（パネルC）、これら抗体は、パネルD対パネルCに見られるはるかに少ない赤色のドットによって示されるように、ウイルス感染を約80％阻害した。
【０１３０】
抗CCR3中和抗体での同様の実験を、A549細胞において繰り返した（図5）。図5A（非感染）および5B（感染）は、感染後72時間に免疫染色によって示されるように、A549上皮細胞がRSV感染を支持し、感染性ウイルスを生じるということを示している。図5Cは、エオタキシン受容体（2μg）に対して向けられた抗体のRSV感染への中和作用を示す。RSVによるA549細胞の感染は、CCR3に特異的である抗体を中和することによってブロックされた（図5C）。しかしながら、RSVによるA549細胞の感染は、CCR5に特異的である抗体を中和することによってブロックされなかった（2μg、図5D）。
【０１３１】
他のケモカイン受容体のスクリーニング
RSV-Gタンパク質の注意深い分析は、ウイルス糖タンパク質が、ヒトケモカインフラクタルカインのN末端領域であるケモカインドメイン（FCD）に相同の短縮されたケモカインモチーフを含有するということを示している。図6Aは、ケモカイン受容体CX3CR1の天然リガンドであるヒトケモカインフラクタルカインとRSV-G中の荷電しそして親水性のアミノ酸の配列分布を示す。ヒトフラクタルカインドメイン配列（humFKN）（Harrison et al., J. Biol. Chem. , 2001,276, 21632-21641）を、ヘパリン結合ドメイン（Feldman et al., J. Virol, 1999,73, 6610-6617）を含有するRSV-G A2タンパク質セグメント（A2RSV-G）と並列させる。極性残基は大文字であり、無極性残基は小文字である。フラクタルカインケモカインモチーフ（FCM）はイタリック体であり、humFKN配列中の潜在的N-グリコシル化部位（NGS：コンセンサス配列：NxTまたはS）（NIT）がFCMと重複しているという注意を、太字と下線で示している。ヘパリン結合モチーフ（HBM）（コンセンサス配列：XBBXBX、但し、Xは各々のアミノ酸であり、Bは、好ましくは、塩基性アミノ酸である）は、細字で下線が施されている。マウス、ラットおよびヒトのフラクタルカインケモカイン中に保存される塩基性残基（K7、K14、K36、R37、R47、K54およびR74）は星印である。RSV-Gケモカインドメインと、ヒトフラクタルカインドメインとのアラインメントは、約42％の配列相同性を示す（図6A）。ウイルス糖タンパク質とケモカインフラクタルカインとの間に共有される構造的特徴は、図6Aに強調されている。特に興味深いのは、CX3Cという特徴配列、ヘパリン結合ドメイン、N-グリコシル化部位である。興味深いことに、最近、RSV-Gタンパク質は、ケモカイン受容体CX3CR1に接触しうるということが示され、この相互作用は、おそらく、RSV感染の生物学においてある役割を果たしているということが示唆された（Tripp et al., 2001, Nature Immunol., 2,732-738）。しかしながら、RSVは、気道細胞に感染することが知られ、CX3CR1は、肺のT細胞および内皮細胞中で発現されるが、それが上皮細胞上で発現されるか否かは、まだ決定されていない。CCR3がRSV感染を支持するという本発明者の知見は、CCR3が気管支上皮細胞中で発現されるという事実（Stellato et al., J Immunol. 2001,166, 1457-1461）と一致する。
【０１３２】
これまでに同定されたケモカイン受容体は全て、7回膜貫通ドメインから構成されそしてGタンパク質に共役した膜結合タンパク質である。これら受容体の主な特徴は、次の通りである。それらは、約350アミノ酸長さであり、他のケモカイン受容体と並列させるためには、一次配列中への少数のギャップの導入を必要とする。これら受容体の短い細胞外N末端領域は、きわめて酸性であり、チロシン残基上に硫酸塩化されてよく（配列コンセンサス：NXT／S、但し、N＝アスパラギン、X＝各々のアミノ酸、T＝トレオニンまたはS＝セリン）、そしてN結合型グリコシル化部位を含有する（コンセンサス配列：AYD、但し、A＝親水性（hydropathic）アミノ酸：ヒスチジン、アルギニン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、トレオニン、チロシンまたはセリン；D＝アスパラギン酸）。これらケモカイン受容体のC末端領域は、受容体調節のためのリン酸化部位として作用するセリン残基およびトレオニン残基を含有する。これら受容体の残り部分は、7個のαヘリックス膜貫通ドメインから構成されるが、3個の細胞内および3個の細胞外（EC）連結ループは、親水性（E、D、R、K、H、N、Q、T、S）アミノ酸から構成されていて、ジスルフィド結合は、EC1およびEC2中に高度に保存されたシステインを連結し；Gタンパク質は、C末端セグメントによって、そしてあるいは第三細胞内ループによって共役している（Murdoch and Finn for review, Blood, 2000, 95,3032-3043）。
【０１３３】
本発明者は、CCR3と、いろいろなケモカイン受容体（CCR1、CCR2、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8；CX3CR1およびCXCR4）との間で、CCR3への配列相同性を共有するこれら受容体のセグメントを正確に示すために、タンパク質配列アラインメント調査を行った。本発明者は、これら受容体のN末端領域を分析したが、それは、ケモカイン受容体CCR5、CCR2、CCR1およびCX3CR1のN末端部分が、HIV-1のためのおよび特異的ケモカイン結合のためのコリセプターとして作用するということが分かったからである。更に、ケモカインフラクタルカインの交換および突然変異誘発分析は、フラクタルカインケモカインドメインに局在する陽電荷アミノ酸が、CX3CR1相互作用に関与しているということを示した（Mizoue et al., Biochem., 1999,38, 1402-1414; Dragic, J. G.Virol., 2001,82, 1807-1814）（図6A）。
【０１３４】
図6Bは、各々の受容体の最初のメチオニンで始まるケモカイン受容体N末端領域のアラインメントを示す。受容体CCR3のN末端セグメント中に存在する極性アミノ酸は、（¶）で強調され、潜在的N-グリコシル化部位（NxTまたはS）は、イタリック体に下線を施されている。推定上のヘパリン結合ドメインは、細字に下線を施し、ケモカイン受容体のグループを規定するアミノ酸サブドメインは、I、II、III、IVおよびVと記されている。CCR3スルフェート化（sulfatation）チロシン残基（Y17）は星印である。図6Bに示されるアラインメントは、極性アミノ酸残基（E、D、T、S、Q、N）の分布に配慮しているが、それは、このような残基が親水性であり、陽電荷アミノ酸（K、R、H）と安定な相互作用を形成することができるからである。このアラインメントは、受容体CCR3、CX3CR1、CCR5、CCR8（以下、グループAと記述する）の間で保存された構造的相同性を示し、より低い程度で、CCR1（グループB）、CCR4およびCCR2b（グループC）の間で保存された構造的相同性を示す。実際、アミノ酸の組成および分布、すなわち、極性残基は、これら受容体グループの間で充分に保存されている。CCR1の配列は、CCR3、CX3CR1、CCR5およびCCR8において見出されなかったN-グリコシル化部位を含み、その後、グループA受容体に対する相同性スコアを減少させた。受容体CCR4およびCCR2bは、長いアミノ酸伸長（ブロックIV）を有し、しかもCXCR4はN-グリコシル化部位を有し、CCR2bはHBDを含有し、これが、それらをグループAおよびBと相違させる。受容体CCR6、CCR7およびCXCR4は、極性アミノ酸の分布パターンが、ブロックI、II、IIIおよびIVにおいて異なるので、残りの受容体とは完全に相違することが判明した（グループD）。
【０１３５】
その後、本発明者は、これら受容体の細胞外ドメインを分析したが、それは、これらドメインが、タンパク質-タンパク質相互作用に関与しているからである。図6Cは、ケモカイン受容体の最初の細胞外（EC1）ドメインのアラインメントを示す。極性アミノ酸は大文字である。ヘパリン結合部位（XBBXBX）には下線が施されているが、CCR6の推定上のN-グリコシル化部位（NXTまたはS）は、下線を施したイタリック体である。理解されうるように、CCR3-EC1およびCX3CR1-EC1は、塩基性アミノ酸が多く、しかもHBDを含有し、これが、再度それらを、高度に保存されたアミノ酸組成受容体としている。CCR1-EC1配列は、推定上のHBDを含有するが、塩基性アミノ酸の豊富さで、それはCCR3およびCX3CR1とあまり近縁でなくなる。CCR5、CCR4、CCR8およびCCR2bは、中間のグループを形成するが、この場合のアミノ酸配列は、少数の塩基性アミノ酸を示した。最後に、CCR6、CCR7およびCXCR4は、互いに異なると考えられるが、それらは、N-グリコシル化部位を含有し（CCR6およびCCR7）、少数の極性アミノ酸を含有する。
【０１３６】
図6Dは、ケモカイン受容体EC2ドメインの配列アラインメントを示す。ヘパリン結合モチーフは、細字に下線を施されている。N-グリコシル化部位は、イタリック体に下線を施されている。CCR4-EC2中のヘパリン結合モチーフは、N-グリコシル化部位と重複しているということに注目することは興味深い。更に理解されうるように、CCR3-EC2は、酸性アミノ酸がきわめて多く、そしてHBDもN-グリコシル化部位も含有しないので、それは独特のドメインとされる。CX3CR1およびCCR5の構造およびアミノ酸組成は、HBDの局在および並置、並びに酸性残基の量を考慮すると、きわめて類似している。もう一方において、CCR1、CCR6およびCCR8は、EC2のC末端にHBDを含有する。CCR4は、中間の位置にあるが、CCR5およびCX3CRのように、EC2のN末端部分にHBDを含有し、EC2のC末端領域にはN-グリコシル化部位を含有する。最後に、CCR2b、CCR7およびCXCR4は、EC2領域中のいずれの述べられたグループとも適合しない別のグループを形成する。
【０１３７】
図6Eは、ケモカイン受容体EC3のアラインメントを示す。極性アミノ酸は大文字であり、推定上のN-グリコシル化部位は、イタリック体に下線を施されている。この細胞外領域の配列相同性をより正確に示すために、本発明者は、EC3のちょうどC末端部分を考察したが、それは、このセグメントのN末端がきわめて異なっているからである。CX3CR1、CCR3、CCR1、CCR7、CCR4およびCCR6は、塩基性および酸性の残基の多いEC2-C末端領域を有し、それが、これら受容体を同じ相同グループにしている。最後に、CXCR4、CCR2b、CCR5およびCCR8は、あったとしても少数の荷電アミノ酸を含有し、これが、それらのためにもう一つの相同グループになっている。
【０１３８】
全体の分析は、いくつかの構造的特徴が、CCR3、CCR1、CCR2b、CCR4、CCR5、CCR8およびCX3CR1の間で共有されていることを示し、これら受容体間に保存された機能が示唆される。これは、若干のこれら受容体が、共有されるケモカインへの特異的結合を共有するということが周知であるので（前述のケモカイン受容体リガンドを参照されたい）、驚くべきことではない。
【０１３９】
図7は、ケモカイン受容体CCR4またはCCR5を発現する細胞が、RSV感染を支持することができたかどうかを評価するために行ったウェスタンブロットを示す。本発明者は、GHOST細胞感染を1：2、1：1、1：0.1のMOIで行ったが、これにより、1：2のMOIだけが妥当であり、結果として細胞感染した。図8のウェスタンブロットは、本発明者が、RSV-Gへの抗体を用いてRSV-Gタンパク質を検出することができたことから、細胞が感染したということを示した。同様の実験を、CCR1またはCCR2bを発現するGHOST細胞で行ったが（図8）、ここでも、1：2のMOIでの感染が妥当であったし、そして本発明者は、細胞抽出物中のRSV-Gタンパク質の存在をウェスタンブロットによって検出することができた。
【０１４０】
（D）結論
これら実験結果は、細胞CCR3受容体をRSVのウイルスコリセプターとして同定する。抗CCR3抗体は、CCR3受容体に結合し、そしてこの受容体へのその後のRSV結合を、おそらくは立体障害によって妨げることにより、RSVの感染を特異的に阻害した。更に、本発明者は、配列相同性分析により、RSVについて可能性のある他のコリセプター、すなわち、CCR1、CCR2、CCR4、CCR5およびCCR8が存在するということを発見した。これら結果は、これら受容体を有するGHOST細胞の感染の目視検査によっても、転移およびウェスタン分析で評価された場合に、CCR1、CCR2、CCR4およびCCR5でトランスフェクションされたGHPST細胞において実際にRSVタンパクが見出されたということを示すことによっても確認された。
【０１４１】
ケモカイン受容体とウイルスとの間の相互作用は、他の微生物によって用いられそしてそれら宿主の免疫系を免れるのにゲノムの柔軟性を利用する、より一般的な戦略の一部分でありうる。更に、ここで示されたように、一つのウイルスは、いろいろな細胞タイプまたは宿主種類に感染するのに異なった受容体を用いることができる。ケモカイン受容体を介して結合することにより、RSVは、炎症細胞の走化性をもたらすことによって炎症反応を亢進制御する可能性を有する。公衆衛生関与（気道上皮へのRSVの結合および／または融合をブロックすることによるウイルス感染の予防）は重要である。更に、RSVは、大部分は、呼吸器上皮に感染すると考えられるので、RSVのその一つまたは複数の受容体への付着を妨げることによってRSV感染を予防するまたは処置するためのエアゾール化薬物を設計することは可能であろう。
【０１４２】
本発明のいくつかの態様を記載してきたが、本発明に更に別の態様が可能であるということ、そして本出願が、概して、本発明の理論にしたがう、しかも本発明が関する技術分野における知識または慣例の範囲内となるような、および本明細書中の前に記載されそして発明の範囲またはクレイムの制限の範囲内にある本質的な特徴に当てはめることができるような本開示からの逸脱を含めた、本発明のいずれの変更、用途または応用も包含するものであるということは理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１】図1は、免疫沈降法を用いたRSV-Gタンパク質およびCCR3受容体タンパク質の共沈降後、ウェスタンブロット法によって示されるように、CCR3が、Hep-2細胞中のRSV-Gタンパク質の受容体であるということを示している。
【図２】図2は、培地へのエオタキシン（CCR3のリガンド）の添加が、Hep-2細胞へのウイルス吸着の際の感染初期に最も効果的にRSV感染を阻害したということを示している。
【図３】図3A、3B、3Cおよび3Dは、CCR3でトランスフェクションされたGHOST細胞が、免疫染色によって感染後48時間に示されるように、RSV感染を支持し、感染性ウイルスを生じるということを示している。図3Aは、CCR3受容体でトランスフェクションされているGHOST細胞がRSVに感染しているということを示している。図3Bは、CCR3受容体でトランスフェクションされているGHOST細胞へのエオタキシン（1μg／ml）の添加が、RSVによる細胞感染を阻害するということを示している。図3Cおよび3Dは、いずれのケモカイン受容体でもトランスフェクションされていないGHOST細胞は、ウイルス感染を支持しないということを示している。これらデータは、RSVとこれら細胞との最初の接触が、CCR3受容体への結合によって特異的に生じるということを示している。
【図４】図4Aおよび4B（それぞれ、感染および非感染対照）は、免疫染色によって示されるように、Hep-2細胞でもRSV感染が起こり、感染後48時間に感染性ウイルスを生じるということを示している。図4Cおよび4Dは、エオタキシン受容体（CCR3）に対して向けられた抗体のRSV感染への中和作用を示す。CCR3受容体でトランスフェクションされたGHOST細胞のRSVによる感染（図4C）は、CCR3に特異的な抗体を中和することによってブロックされた（図4D）。
【図５】図5A（非感染）および5B（感染）は、感染後48時間に免疫染色によって示されるように、A549上皮細胞がRSV感染を支持し、感染性ウイルスを生じるということを示している。図5Cおよび5Dは、エオタキシン受容体（CCR3）に対して向けられた抗体のRSV感染への中和作用を示す。RSVによるA549細胞の感染は、CCR3受容体に対する抗体を中和することによってブロックされたが（図5C）、CCR5受容体に対する抗体を中和することによってブロックされなかった（図5D）。
【図６Ａ】図6Aは、RSV-Gケモカインドメインと、ヒトケモカインフラクタルカインドメインとの配列アラインメントである。
【図６Ｂ】図6Bは、ケモカイン受容体のN末端領域の配列アラインメントである。
【図６Ｃ】図6Cは、ケモカイン受容体の細胞外ドメイン1（EC1）の配列アラインメントである。
【図６Ｄ】図6Dは、ケモカイン受容体の細胞外2ドメイン（EC2）の配列アラインメントである。
【図６Ｅ】図6Eは、ケモカイン受容体の細胞外ドメイン3（EC3）の配列アラインメントである。
【図７】図7は、ケモカイン受容体CCR4またはCCR5を発現するGHOST細胞系がRSV感染を支持するということを示すウェスタンブロットの画像である。MW：分子量；CCR4cまたはCCR5c：非感染細胞；CCR4iまたはCCR5i：感染細胞。矢印は、実験に用いられた抗体によって認識されるRSV-Gタンパク質の45 kDaグリコシル化型の位置を示している。
【図８】図8は、ケモカイン受容体CCR1、CCR2またはCCR3を発現するGHOST細胞系がRSV感染を支持するということを示すウェスタンブロットの画像である。レーン1：分子量；レーン2：CCR3（感染細胞）；レーン3：CCR3（対照）；レーン4：CCR1（感染細胞）；レーン5：CCR1（対照）；レーン6：CCR2b（感染細胞）；レーン7：CCR2b（対照）。矢印は、実験に用いられた抗体によって認識されるRSV-Gタンパク質の45 kDaグリコシル化型の位置を示している。
【配列表】
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【図２】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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