(57)【要約】本発明は蛋白質の空間構造を変えたコンセンサスインターフェロン（RecombinantSuperCompoundInterferon,rSIFN-co）をＢ型肝炎の表面抗原とｅ抗原の抑制剤とする応用に関連するものである。
2005508848.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本発明は、蛋白質の空間構造を変えたコンセンサスインターフェロンの応用に関するものである。この製剤はＢ型肝炎ウイルスＤＮＡに対してのみならず、またHBsAgとHBeAgに対しても抑制作用があるという特徴がある。
【請求項２】
請求項１に述べたコンセンサスインターフェロンの応用の特徴とは、一定の生産プロセスにより蛋白質の空間構造を変えたコンセンサスインターフェロンという点である。これはアメリカ特許番号4695623と4897471に記されたインターフェロンにはない効能であり、その他の毒性のあるＨＩＶウイルスなどの疾病治療への応用力を持つものである。
【請求項３】
請求項１または２に述べたコンセンサスインターフェロンの特徴とは、請求項の１または２に述べられた薬理作用によりできた蛋白質二級及び高級の空間構造を指す。
【請求項４】
請求項１または２に述べたコンセンサスインターフェロンの特徴とは、特定のプロモーターが構築するコンセンサスインターフェロンを応用して発現する系統を指し、これには大腸菌、酵母菌及びＣＨＯ発現系統が含まれる。
【請求項５】
請求項４に述べたコンセンサスインターフェロンの特徴とは、いわゆるプロモーターを指し、ＰBADがこれに含まれる。
【請求項６】
請求項４に述べたコンセンサスインターフェロンの特徴とは、このうちのコンセンサスインターフェロン遺伝子が人工合成されたｃＤＮＡである点を指す。またその遺伝子の配列については、宿主のコドンの偏りを考慮し相応の調節を行う。
【請求項７】
請求項１または２に述べたコンセンサスインターフェロンの生産プロセス。
【請求項８】
請求項７に述べたプロセスの特徴には、生産物からのコンセンサスインターフェロンの抽出方法、封入体の調合・変性・再生が含まれ、用いられている媒質のクロマトグラフィー分析及び分離純化条件、試剤及びその濃度等が含まれる。
【請求項９】
請求項７に述べたプロセスによれば、その特徴は変性したコンセンサスインターフェロンに安定性を回復させた点である。ここには請求項１または２に述べた薬理作用の蛋白質の空間構造を換える方法が記載されており、用いる試剤・試剤の濃度等がこれに含まれる。
【請求項１０】
請求項７に述べたプロセスの特徴には、コンセンサスインターフェロンの分離純化プロセスが含まれる。
【請求項１１】
請求項７に述べたプロセスの特徴には、当該プロセスの高度に純化されたコンセンサスインターフェロンの粉末調剤処方及びその製造プロセスが含まれる。
【請求項１２】
請求項７に述べられたプロセスの特徴には、当該プロセスの中に高度に純化したコンセンサスインターフェロンを用いた水溶液製剤の調剤処方とその製造プロセスが含まれる。
【請求項１３】
コンセンサスインターフェロン製剤は、Ｂ型肝炎ウイルスのＤＮＡ・HBeAg及びHBsAgを抑制する薬物を応用したものである。請求項１または２に述べたＢ型肝炎・ウイルス性疾患には、Ａ型肝炎・Ｂ型肝炎・Ｃ型肝炎・その他Ｂ型またはＣ型肝炎以外の非Ａ非Ｂ型肝炎・ＥＢウイルス感染・ＨＩＶ感染・ヘルペスウイルス（ＥＢ・ＣＭＬ・単純ヘルペスウイルス）・ヒト乳頭腫ウイルス・天然痘ウイルス・微小ＲＮＡウイルス・アデノウイルス・ライノウイルス・ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型・ヒトＴ細胞白血病ウイ
ルスＩＩ型及びロタウイルスが含まれる（ただしこの限りではない）。
【請求項１４】
請求項１または２に述べた応用の特徴とは、コンセンサスインターフェロンが各種のα・β・γ型インターフェロン（1ａ・2ｂなど）またはその他の突然変異体である点を指す。
【請求項１５】
請求項13に述べた応用の特徴とは、コンセンサスインターフェロンが経口・静脈注射、筋肉注射、皮下注射、鼻腔内、粘膜などを経由した投薬ができる点を指す。
【請求項１６】
請求項13に述べた応用の特徴とは、コンセンサスインターフェロンが注射方式の場合、薬剤量は9μｌまたは15μｌで、週３回投与、投与期間は24週間である点を指す。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛋白質の空間構造を変えたコンセンサスインターフェロンの応用に関連するものである。コンセンサスインターフェロンは、Ｂ型肝炎ウイルスのＤＮＡに対する抑制作用があるばかりでなく、HBsAgやHBeAgのいずれに対しても抑制作用を持つという特徴を持つ。
【背景技術】
【０００２】
コンセンサスインターフェロンとは、数種の天然ヒトαインターフェロンのサブタイプ中で最もよく見られる保守的アミノ酸構造を遺伝子工学の手法により組み替えた、全く新しいインターフェロン分子である。アメリカ特許4695623、4897471において、既にこの種のインターフェロンについての記述が見られ、rSIFN-coは広域スペクトルのインターフェロン活性を持ち、強力な抗ウイルス・抗腫瘍・NK細胞活性作用を有することが証明されている。
【０００３】
アメリカ特許5372808では、コンセンサスインターフェロンを用いた病気治療方法が公開されている。中国特許97193506.8では、コンセンサスインターフェロンを応用してＣ型肝炎を再治療する方法が公開されている。中国特許98114663.5では、コンセンサスインターフェロンの調合方法とＢ型肝炎、Ｃ型肝炎の治療用途についての内容が公開されている。アメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）は、1997年年末の時点で、既にアメリカのアムジェン（Ａｍｇｅｎ）社が大腸菌を用いて生産するrSIFN-coをＣ型肝炎患者の臨床治療に用いることを許可している。
【０００４】
Ｂ型肝炎患者の確定診断に際しては、表面抗原（HBsAg）とｅ抗原（HBeAg）がともに陽性の場合、Ｂ型肝炎患者であると判定されている。現在臨床上では、各種の類型のαインターフェロンを用いて、慢性Ｂ型肝炎患者の治療を行っている。αインターフェロンの作用のメカニズムとは、インターフェロンと細胞表面の特殊膜の受容体とが結合し、その抗ＤＮＡとＲＮＡ作用を発揮させるというものである。ある種の酵素に対する誘導作用もまた、細胞中のウイルス感染細胞におけるウイルスの複製を阻止することができる。ただし、全てのインターフェロンはウイルスのＤＮＡとＲＮＡの抑制のみが可能だが、ｅ抗原とｓ抗原を抑制することは不可能である。
【０００５】
本発明では、蛋白質空間構造を変えたコンセンサスインターフェロンを偶然に発見した。このインターフェロンは、Ｂ型肝炎ウイルスのＤＮＡに対してだけでなく、HBsAgとHBeAgのいずれに対しても抑制作用がある製剤である。このことにより、コンセンサスインターフェロンは、Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡとＢ型肝炎HBsAg抗原とHBeAg抗原の抑制により、Ｂ型肝炎治療の目的を果たすことができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、Ｂ型肝炎の治療に用いるコンセンサスインターフェロンを提供することにある。この種の薬物の使用によって、ウイルスのＤＮＡを抑制するばかりでなく、Ｂ型肝炎の表面抗原とｅ抗原を抑制してこれらを正常レベルにまで引き下げ、治療の目的を達することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は以下の方式により実施されるものである。本発明では、まず遺伝子組み替え技術によって、図１の配列を持つコンセンサスインターフェロンを調合する。本発明の遺伝子組み替え技術では、大腸菌を利用して優先的にコドンを発現させるが、アミノ酸の配列が不変という状況のもとで、ＤＮＡコード配列を改めて設計し直し、その後人工的にrSIFN-coの全長にわたるｃＤＮＡ遺伝子を人工的に合成する。
【０００８】
本発明では、ＤＮＡ遺伝子組み替え技術により、上記のrSIFN-co全長のｃＤＮＡ配列を大腸菌上に効率的にクローニングして、担体中に発現させる。その後L-アラビノースの誘導・活性化を利用して調節メカニズムを発現させ、担体中の強ＰBADプロモーターを活性化させて下流のrSIFN-co遺伝子を高効率で発現させる。このアラビノースの誘導・活性化の調節系統における発現は、通常の遺伝子工学の生産において採用されている温度調節・ｐH調節・ＩＰＴＧ誘導などのシステムに比べても、明らかに優れている。
【０００９】
（１）通常採用される数種の調節系統はいずれも「抑制除去」の方式で遺伝子プロモーターの抑制作用を解除している。これにより、プロモーターは下流の遺伝子の発現を導くことができる。温度調節・ｐH値調節・ＩＰＴＧ誘導物の添加などはいずれも、プロモーターに対する直接の活性化作用はない。われわれの採用した系統において、アラビノースと蛋白合成阻害剤（ＡｒａＣ）が結合した後、ＰBADプロモーターの抑制作用の解除と同時に、「アラビノース−ＡｒａＣ複合物」もまた直接ＰBADプロモーターを活性化させ、下流の遺伝子を発現させることができる。そのためアラビノースの誘導・活性化調節系統はその他の数種の系統に比べ、より有効な大腸菌高効率発現系統であるということができる。
【００１０】
（２）ＰBADプロモーターの活性化の程度と添加するL-アラビノースの薬剤量とは、比例の関係にある。つまり、直接アラビノースの濃度を変えることによって、遺伝子組み替え生産物の発現量を調節することができる。この特性は、封入体の形成状況を変える上で大きな意味を持つ。アラビノースの添加は、温度・ｐHなどを変えるより、遺伝子組み替え生産物の大腸菌における発現を簡単かつ直接的に抑制することができる。（３）L-アラビノースは豊富な供給源を持ち、安価で毒性もない。このことはＩＰＴＧなどのその他の誘導物の価格や毒性の面における欠点を克服したものであると言える。
【００１１】
本発明はアラビノースを用いて、誘導・活性化系統に高効率で安定的なrSIFN-coを大腸菌のプロセス菌株上に発現させたものである。この菌株が適切な条件のもとで培養発酵され、菌体を収穫した後、これを超音波により破砕し、繰り返し洗浄して封入体ができる。この封入体が変性・再生・分離・純化などのプロセスを経て、高純度で空間構造を変えたrSIFN-co蛋白を大量に得ることが可能となる。これを本発明の研究と臨床治療に用いることができる。
【００１２】
本発明の応用方法とは、患者が使用するコンセンサスインターフェロンを通じて治療目的を達成するものである。患者が使用するコンセンサスインターフェロンは各種の薬剤形式として調剤することが可能である。例としては、錠剤・カプセル剤・水薬・湿布剤・注射剤・噴霧剤・座薬・溶液製剤などがある。調剤形式としては注射剤が望ましく、皮下または静脈注射により薬剤を投入するのがよい。薬物の組み合わせにおける担体としては、受容できる薬物担体なら何でも使用することが可能である。担体の例としては、糖類・セルロース製品・粘着剤・崩壊剤・潤滑剤・充填剤・可溶化剤・緩衝剤・防腐剤・増粘剤・配合剤及びその他の補助剤を用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明では以下の実験によって、空間構造を変えたコンセンサスインターフェロンが、Ｂ型肝炎ウイルスのＤＮＡや表面抗原やｅ抗原に対し抑制作用を持つことが証明されている。実験方法は以下の通りである。
【００１４】
材料
溶剤及び調合方法：試薬の調合の際に、原料瓶ごとに１ｍｌの生理食塩水を添加する。溶解後、あらかじめ設定されているさまざまな組み合わせの薬剤量濃度に基づき、薬剤をＭＥＭ培養液で調合する。試薬はその場で取り出しその場で使い切ることとする。
【００１５】
対照薬品：ドイツのシェリング社生産はＩＦＮ−α２ｂ（イントロンＡ）をフリーズドライ製剤にしたもので、１本３×106Ｕのものを実験時に培養液で３×106ＩＵ／ｍｌ溶液とする。アムジェン社生産のInfergenを注射液とする。１本９μｇで0.3ｍｌであり、９×106ＩＵ／本に相当する。実験の際は培養液を９×106ＩＵ／ｍｌ溶液に調合し、４℃の冷蔵庫に保存する。2.2.15細胞：Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のＤＮＡを、ヒト肝臓ガン細胞（Hep  G2）の2.2.15細胞系にクローニングし転移させる。この方法はアメリカのMount  Sinai医学センターが樹立したものである。
【００１６】
試薬：Eagles  MEM  粉末を用いる。アメリカGibco社製品。牛胎児血清は、アメリカHyclone  Lab社製品：Ｇ−418（Geneticin）について、ＭＥＭ調剤を行う。アメリカGibco社製品：Ｌ−グルタミン酸は、京科化学試剤公司が輸入分包したものを用いる。：HBsAg、HBeAgクロマトグラフィー放射免疫測定器、中国同位素公司北方免疫試剤研究所より購入：カナマイシン、華北製薬工場製品：Lipofectin、アメリカGibco社製品。
【００１７】
実験用品及び測定機器：培養瓶、デンマークTunclon  TM；培養板96孔板、24孔、アメリカCorning社製品：二酸化炭素培養器、アメリカShel−Lab製品。
【００１８】
ＭＥＭ培養液100ｍｌ：牛胎児血清10％、３％グルタミン酸１％含有、Ｇ418 380μｇ／ｍｌ、カナマイシン50Ｕ／ｍｌ。
【００１９】
試験方法
2.2.15細胞の培養：2.2.15細胞を成長させた培養瓶の中に0.25％のパンクレアチンを加え、37℃で３分間消化する。培養液を吹き付けても、１：３代生育させるのに10日かかる。
【００２０】
薬物の細胞に対する毒性試験：実験は、薬物を使用しない細胞の対照グループと薬物濃度を段階的に変えた薬物使用グループに分けて行う。細胞の消化については、１ｍｌごとに10万個の細胞を調合する。培養板に接種し、96孔板の孔ごとに200μｌ、37℃、５％のＣＯ2の環境で24時間培養し、細胞が単層にまで成長した後、実験を行う。コンセンサスインターフェロンには1.8×107ＩＵ／ｍｌ溶液の培養液を調合し、これを２倍に希釈して96孔の細胞培養板に添加する。同一濃度につき３孔、4日に１回同一濃度の薬液を換え、細胞病変の観察を指標とし、８日間顕微鏡下で細胞の病変を観察する。完全に破壊されたものを４；75％が破壊されたものを３；50％が破壊されたものを２；25％が破壊されたものを１；病変がないものを０と分類する。各濃度の薬液の平均細胞病変程度と抑制百分率を計算する。Reed  Muench法に基づき、半数の有毒濃度（TC50）と最大無毒濃度（TC０）を計算する。
【００２１】
５０−B
TC50=Antilog（B＋─────  × C）
A−B
Ａ＝log＞50％薬物濃度      Ｂ＝log＜50％薬物濃度      Ｃ＝log希釈倍数
HBeAgとHBsAgに対する抑制試験：試験ではHBeAgとHBsAgの陽性対照グループと陰性対照グループと細胞の対照グループ及び異なる濃度の薬物投与グループを設定する。１ｍｌ中の70万個の2.2.15細胞を６孔細胞培養板に１孔３ｍｌ接種し、37℃５％ＣＯ2の環境に置き、24時間培養する。これに無毒濃度以下の３倍の希釈試験薬液を添加し、５段階の希釈濃度をそれぞれ4.5×106ＩＵ／ｍｌ、1.5×106ＩＵ／ｍｌ、0.5×106ＩＵ／ｍｌ,0.17×106ＩＵ／ｍｌ、0.056×106ＩＵ／ｍｌとし、１濃度段階に付き１孔として37℃５％ＣＯ2の環境に置いて培養する。４日ごとにもとの濃度の薬液を換え、８日目に培養液を収穫して−20℃でこれを凍結保存する。試験は3回繰り返して行い、HBeAgとHBsAgをそれぞれ測定する。HBeAgとHBsAgの測定に際しては、中国同位素公司北方免疫試剤研究所の製品を用い、ラジオアイソトープ免疫測定器により測定する。その方法については説明書を参照の上、γ−計数機器を用い各孔ごとのcpm値を測定する。
【００２２】
薬物効果の計算：細胞対照及び各濃度のcpmの平均値及び標準偏差、Ｐ/Ｎ値については抑制百分率（％）で示し、また半数の有効濃度（IC50）及び選択指数（SI）を計算する。
（１）                       細胞対照ク゛ルーフ゜cpm−薬物投与ク゛ルーフ゜cpm
抗原抑制百分率（％）＝─────────────────────×100
細胞対照cpm
（２）薬物の抑制抗原の半数の有効濃度（IC50）：
５０−B
IC50=Antilog（B＋  ───── × C）
A−B
Ａ＝log＞50％薬物濃度      Ｂ＝log＜50％薬物濃度      Ｃ＝log希釈倍数
（３）空間構造を変えたコンセンサスインターフェロンの2.2.15細胞の培養においては、HBsAgとHBeAgの選択指数（SI）とその細胞毒性の指標細胞の病変（SI）に基づき計算する。
細胞病変毒TC50
SI＝───────────────
IC50
（４）ｔ検査法を用いて、各希釈度のHBsAgとHBeAgと対照グループ間のcpmの差を計算する。
【００２３】
Southern blot：（１）  2.2.15細胞内のＨＢＶ  ＤＮＡ抽出： 2.2.15細胞は薬品添加後8日間の培養を行う。培養液が細胞に吸い取られたところで細胞分裂液を添加し、細胞を分裂させる。これと等しい体積のフェノール：クロロフォルム：イソアミルアルコールで２回抽出し、高速10,000gで遠心分離を行って上澄みを取る。無水エタノールを加えて核酸を沈殿させ、これを真空状態に置いて乾燥させ、さらにこれを20μｌのＴＥ緩衝液に溶かす。（２）電気泳動：６ＸＤＮＡサンプル緩衝液を添加し、サンプルを全多糖濃度1.5％の混合ゲル上で電気泳動させる。ＩＶ／cm、恒圧14−18時間。（３）変性・交雑：
混合ゲルをＨＣｌ・変性液、・中和液中にそれぞれ浸漬させる。（４）膜転写：プロセスに基づきＤＮＡをHydron-Nナイロン膜に転写する。スポット交雑と同時に加熱・交雑・感光を行う。スキャナーに感光部をスキャンさせ、gel-proゲル画像定量解析ソフトを用いて相対密度を解析する。抑制率及びIC50を計算する。
【００２４】
統計と分析方法：各グループの計量資料結果は、算術平均数（ｘ）±標準偏差(Ｓ)を用いて示す。中国の「新薬（西洋医薬）臨床前研究指導原則資料集」の新薬薬効学研究の項目に統計処理指導原則の記載がある。ここでは、計数資料にはFisherを用いて正確に検査し、計量資料はStudent tを選択し、各グループの平均数の顕著な差異を検証すること、とある。
【００２５】
結果
本発明では、数回にわたる実験の結果（表一、表二、表三を参照）により、以下のことが明らかとなった。サンプルの最大無毒濃度のものを2.2.15細胞に添加し８日間培養した結果、コンセンサスインターフェロン最大無毒濃度9.0±０×106ＩＵ／ｍｌ、HBeAgに対する平均抑制率は46.0±5.25％（Ｐ＜0.001）、ＩＣ50は4.54±1.32×106ＩＵ／ｍｌ、選択指数SIは3.96であった。また、HBsAgに対する平均抑制率は44.8±6.6％、ＩＣ50は6.49±0.42×106ＩＵ／ｍｌ、選択指数SIは2.77であった。これにより、コンセンサスインターフェロンにはＢ型肝炎表面抗原とｅ抗原に対する明らかな抑制効果が認められ、対照グループのインターフェロンとInfergenには上記のような活性は認められなかった。臨床例においても慢性活動性Ｂ型肝炎の患者に対し、コンセンサスインターフェロンの投与をすることにより、Ｂ型肝炎の表面抗原とｅ抗原の陽性の程度が低減され、正常レベルまで回復することが実証されている。
【００２６】
本発明で応用したコンセンサスインターフェロン製剤は以下の実施例により調剤することができる。
＜実施例１＞  フリーズドライ注射剤の調剤
ａ．コンセンサスインターフェロン              300万ＩＵ
ｂ．クエン酸                                  0.2mg
ｃ．リン酸ジナトリウム                        2.5mg
ｄ．塩化ナトリウム                            4.0mg
ｅ．デキストロース                            20mg
ｆ．ポリオキシンエチレン脱水ソルビットモノオレイン酸エステル
0.1ｍｌ
ｇ．注射用精製水                適量を加え全量1.0ｍｌまでとする。
【００２７】
調剤プロセス：処方に基づき薬剤を量り、無菌非加熱の状態で元の注射水を溶かす。除菌濾過には0.22ミクロン孔径の濾膜を用いて除菌濾過し、これを8±2℃で保存する。薬品を取り無菌と熱源の検査に合格後、それぞれシリンダーに入れる。単独薬剤量としては一瓶に1.0ｍｌを入れる。分け入れた後、凍結乾燥機に入れ、凍結乾燥する。
【００２８】
＜実施例２＞  水溶液注射剤の調剤
ａ．コンセンサスインターフェロン              300万ＩＵ
ｂ．クエン酸                                  0.2mg
ｃ．リン酸ジナトリウム                        2.5mg
ｄ．塩化ナトリウム                            4.0mg
ｅ．デキストロース                            20mg
ｆ．ポリオキシンエチレン脱水ソルビットモノオレイン酸エステル
0.1ｍｌ
ｇ．注射用精製水                適量を加え全量1.0ｍｌまでとする。
【００２９】
調剤プロセス：処方に基づき薬剤を量り、無菌非加熱の状態で元の注射水を溶かす。除菌濾過には0.22ミクロン孔径の濾膜を用い除菌濾過し、これを8±2℃で保存する。薬品を取り無菌と熱源の検査に合格後、それぞれ密封容器に入れる。シリンダーに分け入れたものは、単独薬剤量として一瓶に1.0ｍｌを入れる。分け入れた後の完成品を2−10度の冷暗所に保存する。
【００３０】
【表１】
2005508848.tif 000003
【００３１】
【表２】
2005508848.tif 000004
【００３２】
【表３】
2005508848.tif 000005
【００３３】
【表４】
2005508848.tif 000006
【００３４】
【表５】
2005508848.tif 000007
【００３５】
【表６】
2005508848.tif 000008
【００３６】
【表７】
2005508848.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１：rSIFN-coのＤＮＡコード配列及び推定されるアミノ酸配列
【図１】
2005508848.tif 000010
【国際調査報告】
2005508848.tif 000011
2005508848.tif 000012
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