(57)【要約】胚性幹細胞を内分泌細胞に分化させる方法を提供する。本方法は、未分化胚性幹細胞の培養物から胚様体を作製する工程と、内分泌前駆細胞を選択する工程と、成長因子を含む拡大培地中での内分泌細胞の培養によって内分泌前駆細胞を拡大する工程と、拡大内分泌前駆細胞を分化培地中で分化内分泌細胞に分化させる工程とを含む。本方法によって産生された内分泌細胞もまた提供する。人工島ならびに膵臓内分泌細胞および前記人工島の使用方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロで胚性幹細胞から分化し、膵臓ホルモンを分泌する、単離膵臓内分泌細胞。
【請求項２】
前記膵臓内分泌細胞が、β細胞、α細胞、δ細胞、PP細胞、またはそれらの組み合わせを含む、請求項1記載の単離膵臓内分泌細胞。
【請求項３】
前記膵臓内分泌細胞がβ細胞である、請求項1記載の単離膵臓内分泌細胞。
【請求項４】
前記膵臓内分泌細胞がマウス細胞である、請求項1記載の単離膵臓内分泌細胞。
【請求項５】
前記膵臓内分泌細胞がヒト細胞である、請求項1記載の単離膵臓内分泌細胞。
【請求項６】
膵臓ホルモンが、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、または膵臓ポリペプチドである、請求項1記載の単離膵臓内分泌細胞。
【請求項７】
胚性幹細胞または該胚性幹細胞から分化した胚様体から内分泌前駆細胞を選択する工程、
成長因子を含む拡大培地中での内分泌細胞の培養によって該内分泌前駆細胞を拡大させる工程、および
拡大した該内分泌前駆細胞を分化培地中で分化内分泌細胞に分化させる工程を含む、胚性幹細胞の内分泌細胞への分化方法。
【請求項８】
前記内分泌前駆細胞を選択する工程が、ネスチンを発現する細胞を選択する工程を含む、請求項7記載の方法。
【請求項９】
前記拡大培地がB27培地補足物質を含むN2培地である、請求項7記載の方法。
【請求項１０】
前記成長因子がbFGFである、請求項7記載の方法。
【請求項１１】
前記分化培地が、成長因子の非存在下でB27培地およびニコチンアミドを含むN2培地を含む、請求項7記載の方法。
【請求項１２】
前記内分泌細胞が、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド、またはそれらの組み合わせを分泌する、請求項7記載の方法。
【請求項１３】
前記胚性幹細胞が、ネズミ、ブタ、またはヒトの胚性幹細胞を含む、請求項7記載の方法。
【請求項１４】
前記胚性幹細胞がヒト胚性幹細胞である、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
前記内分泌細胞が膵臓内分泌細胞である、請求項7記載の方法。
【請求項１６】
前記膵臓内分泌細胞が、β細胞、α細胞、δ細胞、PP細胞、またはそれらの組み合わせを含む、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
前記内分泌前駆細胞が胚様体から選択される、請求項7記載の方法。
【請求項１８】
前記胚様体の作製が、懸濁液中で拡大した未分化胚性幹細胞を培養する工程を含む、請求項7記載の方法。
【請求項１９】
前記内分泌前駆細胞を選択するための前記胚様体の培養工程が、無血清培地中で胚様体を培養する工程を含む、請求項7記載の方法。
【請求項２０】
前記内分泌前駆細胞を選択するための前記胚様体の培養工程が、フィブロネクチン被覆表面上で胚様体を培養する工程を含む、請求項7記載の方法。
【請求項２１】
前記内分泌前駆細胞を選択するための前記胚様体の培養工程が、約6〜約8日間胚様体を培養する工程を含む、請求項7記載の方法。
【請求項２２】
前記分化内分泌細胞を凝集させる工程をさらに含む、請求項7記載の方法。
【請求項２３】
請求項7記載の方法によって産生された分化内分泌細胞。
【請求項２４】
前記内分泌細胞が、膵臓内分泌細胞である、請求項23記載の内分泌細胞。
【請求項２５】
前記膵臓内分泌細胞が、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド、またはそれらの組み合わせを分泌する、請求項23記載の内分泌細胞。
【請求項２６】
請求項23記載の方法によって産生された膵臓内分泌細胞を含む、人工ランゲルハンス島。
【請求項２７】
未分化胚性幹細胞培地から胚様体を作製する工程、
膵臓内分泌前駆細胞を選択する工程、
成長因子を含む拡大培地中での膵臓内分泌細胞の培養によって該膵臓内分泌前駆細胞を拡大する工程、および
拡大した該膵臓内分泌前駆細胞を分化培地中で分化させて膵臓内分泌細胞を形成させ、前記分化により人工島を産生する工程を含む、人工ランゲルハンス島の産生方法。
【請求項２８】
前記内分泌前駆細胞を選択する工程がネスチンを発現する細胞を選択する工程を含む、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
前記拡大培地がB27培地補足物質を含むN2培地である、請求項27記載の方法。
【請求項３０】
前記成長因子がbFGFである、請求項27記載の方法。
【請求項３１】
前記分化培地が、成長因子の非存在下でB27培地を含むN2培地を含む、請求項27記載の方法。
【請求項３２】
前記内分泌細胞がインスリンを分泌する、請求項27記載の方法。
【請求項３３】
前記内分泌細胞が、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド、またはそれらの組み合わせを分泌する、請求項27記載の方法。
【請求項３４】
前記胚性幹細胞が、ネズミ、ブタ、またはヒトの胚性幹細胞である、請求項27記載の方法。
【請求項３５】
前記胚性幹細胞がヒト胚性幹細胞である、請求項27記載の方法。
【請求項３６】
前記胚様体の作製が、約4〜約7日間拡大胚性幹細胞を培養する工程を含む、請求項27記載の方法。
【請求項３７】
前記胚様体の作製が、懸濁液中で拡大した未分化胚性幹細胞を培養する工程を含む、請求項27記載の方法。
【請求項３８】
前記内分泌前駆細胞を選択するための前記胚様体の培養工程が、無血清培地中で胚様体を培養する工程を含む、請求項27記載の方法。
【請求項３９】
前記内分泌前駆細胞を選択するための前記胚様体の培養工程が、フィブロネクチン被覆表面上で胚様体を培養する工程を含む、請求項27記載の方法。
【請求項４０】
前記内分泌前駆細胞を選択するための前記胚様体の培養工程が、約6〜約8日間胚様体を培養する工程を含む、請求項27記載の方法。
【請求項４１】
胚性幹細胞から分化した膵臓内分泌細胞を薬剤と接触させる工程、および
該膵臓内分泌細胞のパラメータをアッセイし、膵臓ホルモンの分泌または発現に対する該薬剤の効果を決定する工程とを含む、膵臓ホルモンの分泌または発現に対する該薬剤の効果を決定するための薬剤の試験方法。
【請求項４２】
前記膵臓内分泌ホルモンがインスリンである、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
治療有効量の請求項7記載の方法によって産生した膵臓内分泌細胞を被験体に投与する工程を含む、被験体のインスリン産生を増強する方法。
【請求項４４】
前記被験体が糖尿病である、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
請求項7記載の方法によって産生された膵臓内分泌細胞および薬理学的に許容される担体とを含む、薬理学的組成物。
【請求項４６】
胚性幹細胞または胚性幹細胞から分化した胚様体からの内分泌前駆細胞を選択する工程が、外因的に添加したLIFの非存在下で行われる、請求項7記載の方法。
【請求項４７】
前記膵臓内分泌前駆細胞を選択する工程が、外因的に添加したLIFの非存在下で胚様体を培養する工程を含む、請求項27記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、糖尿病治療分野、より詳細には、ランゲルハンス島のインビトロモデルの産生、およびインスリン産生細胞の産生に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
哺乳動物の膵臓は、腺房組織の外分泌細胞およびランゲルハンス島の内分泌細胞の2つの組織のサブクラスから構成されている。外分泌細胞は、膵管から腸に分泌される消化酵素を産生する。島細胞は、炭水化物代謝に関連するポリペプチドホルモンを産生する。成体哺乳動物の膵臓内に存在する内分泌組織島を、ランゲルハンス島という。成体哺乳動物の島は、それぞれグルカゴン、インスリン、ソマトスタチン、および膵臓ポリペプチドを産生する4つの主要な細胞型α、β、δ、およびPP細胞から構成される。
【０００３】
糖尿病は、インスリンの内因性の欠損症またはインスリン受容体の欠陥のいずれかによる細胞の、その膜を介した内因性グルコース輸送の不全と定義されている。I型糖尿病（または、インスリン依存性真性糖尿病（IDDM））は、β細胞が破壊され内因性インスリンレベルが不十分となることにより発症する。II型糖尿病（または、インスリン非依存性糖尿病）は、インスリン受容体自体もしくはインスリン受容体の存在数、またはインスリンシグナルとグルカゴンシグナルとの間の平衡の欠陥と考えられる。糖尿病は家族間で発症し、この疾患の発症には遺伝子が関与しているようであるが、この病態を担う遺伝子マーカーは１つとして同定されていない。
【０００４】
糖尿病が臨床的に発症した個体の現在の治療法は、非糖尿病個体中の膵臓β細胞の役割を模倣することである。正常なβ細胞機能を有する個体は、血流に分泌されるインスリンの量が厳格に調節されている。この調節は、通常は正常の限度を超える血糖値の糖分を防止するβ細胞に存在するフィードバック機構による。血糖値が適切に調節されない場合、危険、さらには致命的なレベルになり得る。したがって、糖尿病個体の治療には、毎日のウシ、ブタ、またはクローニングしたヒトインスリンの注射が含まれる。
【０００５】
注射したインスリンおよび食事制限によって、発症から数年間の生存し、多くの症例において生活の質の向上が可能になる。しかし、糖尿病患者の、不可避の糖の血中グルコース濃度（高濃度および低濃度の両方）によって血管系が損傷し、糖尿病患者の健康が徐々に害される場合がしばしばある。簡単に述べれば、インスリン注射で治療した糖尿病は、グルコースが正常範囲を超えた場合の一時的な糖の回避に十分な、量およびタイミングの正確さで炭水化物の取り込みおよびインスリン注射を調節することができない。これらの糖は、正常な視力、腎臓、さらに歩行機能を損なう種々の血管障害および微小血管障害を引き起こすとかんがえられる。
【０００６】
これらの病態（すなわち、I型およびII型糖尿病）は共に合衆国のみで数百万人存在する。明らかに、疾患の過程を研究し、新規の可能な治療法を調査するための良好なインビトロランゲルハンス島モデルを得る必要がある。さらに、移植用の島細胞の産生を含む、新規の糖尿病治療法を生み出す必要がある（米国特許第4,439,521号、同第5,510,263号、同第5,646,035号、同第5,961,972号を参照のこと）。例えば、単離した島全体の移植が、例えば動物およびヒトで成功している。しかし、この方法では、糖尿病の症状の長期解決に至っていない（Robertson、New  England  J．Med．、327：1861〜1863、1992）。自系、または免疫系に認識されない大量の島細胞を産生する必要がある。
【０００７】
ES細胞は、未分化状態で無限に増殖することができる。さらに、胚性幹（ES）細胞は、全能性細胞（体内に存在する全ての細胞（骨細胞、筋細胞、脳細胞など）を作製することができることを意味する）である。ES細胞は、成長中のマウス胚盤胞の内細胞塊から単離されている（Evansら、Nature、292：154〜156、1981；Martinら、Proc．Natl．Acad．Sci．、78：7634〜7636、1981；Robertsonら、Nature、323：445〜448、1986；Doetschmanら、Nature、330：576〜578、1987；およびThomasら、Cell、51：503〜512、1987；米国特許第5,670,372号）。さらに、最近、ESの性質を有するヒト細胞が、内胚盤胞細胞塊（Thomsonら、Science、282：1145〜1147、1998）および成長中の生殖細胞（Shamblottら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、95：13726〜13731、1998）から単離されている（米国特許第6,090,622号、国際公開広報第00／70021号、および同第00／27995も参照のこと）。
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
単離膵臓内分泌細胞を提供する。この細胞は、インビトロで胚性幹細胞から分化している。
【０００９】
胚性幹細胞を内分泌細胞に分化する方法を提供する。本方法は、未分化胚性幹細胞の培養物から胚様体を作製する工程、内分泌前駆細胞を選択する工程、成長因子を含む拡大培地中での内分泌細胞の培養によって内分泌前駆細胞を拡大する工程、および分化培地中で拡大した内分泌前駆細胞を分化内分泌細胞に分化する工程を含む。
【００１０】
人工島の産生方法も提供する。本方法は、胚性幹細胞を拡大し、未分化胚性幹細胞の培養物から胚様体を作製する工程、膵臓内分泌前駆細胞を選択する工程、成長因子を含む拡大培地中での膵臓内分泌細胞の培養によって膵臓内分泌前駆細胞を拡大する工程、拡大した膵臓内分泌前駆細胞を分化培地中で分化させ、膵臓内分泌細胞を形成させる工程（この分化により人工島が産生される）含む。この人工島は、糖尿病患者などの島活性の増強が必要な被験体に移植することができる。
【００１１】
胚性幹細胞から分化した膵臓内分泌細胞と薬剤とを接触させる工程、および膵臓内分泌細胞のパラメータをアッセイし、膵臓ホルモンの分泌もしくは発現、または膵臓中の内分泌細胞の分化の程度に対する薬剤の効果を決定する工程とを含む、膵臓ホルモンの分泌または発現に対する前記薬剤の効果を決定するための薬剤の試験方法を提供する。
【００１２】
本発明の上記および他の目的、特徴、ならびに利点は、添付の図面を参照して進行する以下のいくつかの態様の詳細な説明から明らかとなる。
【００１３】
態様の詳細な説明
本発明をより良好に定義し、本発明の実施に際して当業者をガイドするために以下の定義および方法を提供する。一般用語の定義は、Riegerら、「Glossary of Genetics : Classical and Molecular」、第5版、Springer-Verlag：New  York、1991；およびLewin、「Genes V」、Oxford  University  Press：New  York、1994でも見出すことができる。アミノ酸残基に関しては標準的な一文字表記および三文字表記を使用する。
【００１４】
分子遺伝学で一般的に使用されている用語のさらなる定義は、Benjamin  Lewin、「Genes V」、Oxford  University  Press、1994（ISBN 0-19-854287-9）；Kendrewら編、「The Encyclopedia of Molecular Biology」、Blackwell  Science  Ltd．、1994（ISBN 0-632-02182-9）；およびRobert  A．Meyers編、「Molecular Biology and Biotechnology : a Comprehensive Desk Reference」、VCH  Publishers,Inc．、1995（ISBN 1-56081-569-8）で見出すことができる。
【００１５】
用語
「α細胞」は、成熟グルカゴン産生細胞である。インビボにおいて、これらの細胞は、膵臓ランゲルハンス島で見出される。
【００１６】
「β細胞」は、成熟インスリン産生細胞である。インビボにおいて、これらの細胞は、膵臓ランゲルハンス島で見出される。
【００１７】
「δ細胞」は、成熟ソマトスタチン産生細胞である。インビボにおいて、これらの細胞は、膵臓ランゲルハンス島で見出される。
【００１８】
「PP細胞」は、成熟膵臓ポリペプチド（PP）産生細胞である。インビボにおいて、これらの細胞は、膵臓ランゲルハンス島で見出される。
【００１９】
「動物」：生きている多細胞脊椎生物（例えば、哺乳動物および鳥類を含むカテゴリー）。用語「哺乳動物」には、ヒトおよび非ヒト哺乳動物の両方が含まれる。同様に、用語「被験体」には、ヒトおよび獣医学的被験体の両方が含まれる。
【００２０】
「人工島」は、インビトロにおけるES細胞の分化によって形成された膵臓内分泌細胞のクラスター、インビトロにおけるES細胞から分化した膵臓内分泌細胞の取り除かれたクラスター、またはインビトロにおける膵臓内分泌細胞の凝集によるものである。
【００２１】
「分化」は、比較的特定されていない細胞（例えば、胚細胞）が成熟細胞で特徴的な、特定の構造的および／または機能的特徴を獲得する過程をいう。同様に、「分化する」は、この過程をいう。典型的には、分化の際に、細胞構造が変化し、組織特異的タンパク質が出現する。用語「分化した膵臓内分泌細胞」は、特定の膵臓内分泌細胞型に特有のタンパク質を発現する細胞をいう。分化した膵臓内分泌細胞には、それぞれグルカゴン、インスリン、ソマトスタチン、および膵臓ポリペプチドを発現するα細胞、β細胞、δ細胞、およびPP細胞が含まれる。
【００２２】
「分化培地」は、微生物または培養細胞の成長または生存の補助に必要な栄養素を含み、幹細胞を分化細胞に分化させる培養条件の合成セットである。
【００２３】
「成長因子」：細胞の成長、生存、および／または分化を促進する物質。成長因子には、成長刺激物質として機能する分子（マイトジェン）、成長阻害物質として機能する分子（例えば、負の成長因子）、細胞移動を刺激する因子、走化薬として機能する、または細胞移動もしくは腫瘍細胞の侵襲を阻害する因子、細胞の分化機能を調整する因子、アポトーシスに関連する因子、または成長および分化に影響を与えることなく細胞の生存を促進する因子が含まれる。成長因子の例は、bFGF、EGF、CNTF、HGF、NGF、およびアクチビンAである。
【００２４】
「成長培地または拡大培地」は、特定の細胞集団の成長（拡大）の補助に必要な栄養素を含む培養条件の合成セットである。1つの態様では、細胞はES細胞である。この態様では、成長培地は、ES細胞を増殖させるES成長培地である。別の態様では、細胞は、膵臓内分泌前駆細胞である。この態様では、拡大培地は、膵臓内分泌細胞前駆体を増殖させる膵臓内分泌前駆細胞拡大培地である。
【００２５】
成長培地は、一般に、炭素源、窒素源、およびpHを維持するための緩衝液を含む。1つの態様では、ES成長培地は、ES細胞成長を増強するための種々の栄養素を補足したDMEMなどの基礎培地を含む。さらに、基礎培地に、ウマ、ウシ、またはウシの胎児血清などの添加物を補足することができる。
【００２６】
「有効量または治療有効量」は、任意の障害または疾患の症状および／または根本的原因の予防、治療、軽減、および／または緩和に十分な薬剤の量である。1つの態様では、「有効量」は、疾患の症状の軽減または排除に十分である。別の態様では、有効量は、疾患自体の克服に十分な量である。
【００２７】
「胚様体」は、ES細胞をES細胞の接着および分化を防止する非接着表面上に播種した場合に作製されるES細胞の凝集体である。一般に、胚様体は、原始内胚葉に囲まれた未分化幹細胞の内部中心を含む。
【００２８】
「胚性幹（ES）細胞」は、成長中の胚盤胞の内細胞塊から単離された多能性細胞である。「ES細胞」は、任意の生物に由来し得る。ES細胞は、哺乳動物に由来し得る。1つの態様では、ES細胞は、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヤギ、ブタ、ウシ、およびヒトから産生される。ヒトおよびマウス由来のES細胞が好ましい。ES細胞は、全能性細胞（体内に存在する全ての細胞（骨細胞、筋細胞、脳細胞など）を作製することができることを意味する）である。マウスES細胞の産生方法は、米国特許第5,670,372号（参照として本明細書に組み入れられる）に見出すことができる。ヒトES細胞の産生方法は、米国特許第6,090,622号、国際公開広報第00／70021号、および国際公開広報第00／27995号（参照として本明細書に組み入れられる）に見出すことができる。
【００２９】
「拡大する（expand）」は、細胞培養物中の細胞の数または量が細胞分裂のために増加する過程をいう。同様に、用語「拡大（expansion）」または「拡大した（expanded）」は、この過程をいう。用語「増殖する」、「増殖」、または「増殖した」は、用語「拡大する」、「拡大」、または「拡大した」と交換可能に使用することができる。典型的には、拡大期の際、細胞は成熟細胞形成のための分化をしない。
【００３０】
「線維芽細胞成長因子」または「FGF」は、任意の動物由来の任意の適切な線維芽細胞成長因子およびその機能的断片をいう。種々のFGFが公知であり、FGF-1（酸性線維芽細胞成長因子）、FGF-2（塩基性線維芽細胞成長因子であるbFGF）、FGF-3（int-2）、FGF-4（hst／K-FGF）、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9、およびFGF-98が含まれるが、これらに限定されない。「FGF」は、FGF-1、FGF-2、FGF-4、FGF-6、FGF-8、FGF-9、もしくはFGF-98などの線維芽細胞成長因子タンパク質、またはそれらの生物学的に活性な断片もしくは変異体をいう。任意の動物種からFGFを形成することができる。1つの態様では、FGFは、哺乳動物（げっ歯類、鳥類、イヌ、ウシ、ブタ、ウマ、およびヒトが含まれるが、これらに限定されない）のFGFである。多数のFGFのアミノ酸配列および作製方法が当技術分野で周知である。
【００３１】
ヒトFGF-1のアミノ酸配列およびその組換え発現方法は、米国特許5,604,293号で開示されている。ヒトFGF-2のアミノ酸配列およびその組換え発現方法は、米国特許第5,439,818号（参照として本明細書に組み入れられる）で開示されている。ウシFGF-2のアミノ酸配列およびその組換え発現の種々の方法は、米国特許第5,155,214号（これも参照として本明細書に組み入れられる）に開示されている。146残基の形態を比較した場合、そのアミノ酸配列は、ほぼ同一（2つの残基のみが異なる）である。
【００３２】
FGF-3のアミノ酸配列（Dicksonら、Nature、326：833、1987）およびヒトFGF-4（Yoshidaら、PHAS  USA、84：7305〜7309、1987）が公知である。ヒトFGF-4、FGF-1、FGF-2、およびマウスFGF-3のアミノ酸配列を比較した場合、ヒトFGF-4の残基72〜204位はヒトFGF-2と43％相同であり、残基79〜204位はヒトFGF-1と38％相同であり、残基72〜174位はマウスFGF-3と40％相同である。ヒトFGF-5（Zhanら、Molec．And  Cell．Biol．、8（8）：3487〜3495、1988）、ヒトFGF-6（Coulierら、Oncogene、6：1437〜1444、1991）、ヒトFGF-7（Miyamotoら、Mol．  And  Cell．Biol．、13（7）：4251〜4259、1993）のcDNAおよび推定アミノ酸配列も公知である。マウスFGRF-8（Tanakaら、A．PNAS  USA、89：8928〜8932、1992）、ヒトおよびマウスFGF-9（Santos-Ocampら、J．Biol．Chem．、271（3）：1726〜1731、1996）、ならびにヒトFGF-98（米国特許仮出願第60／083,553（その全体が参照として本明細書に組み入れられる））のcDNAおよび推定アミノ酸配列もまた公知である。
【００３３】
米国特許第5,155,214号（「214特許」）に記載のようにbFGF-2および他のFGFを作製することができる。組換えbFGF-2および他のFGFを、米国特許第4,956,455号に詳述されている技術を使用して、薬学的品質（純度98以上）に精製することができる。
【００３４】
FGFの生物学的に活性な変異型はまた、本明細書中に開示の方法で有用である。このような変異型は、FGF活性、特にFGF受容体部位に結合する能力を保持しているはずである。FGF活性を、当業者に公知の標準的なFGFバイオアッセイ法を使用して測定することができる。代表的アッセイ法には、膜を使用した公知の放射性受容体アッセイ法、分子の用量依存的様式での細胞のDNAへのトリチウム化チミジン取り込みを増強する能力を測定するバイオアッセイ法などが含まれる。好ましくは、変異型は、天然の分子と少なくとも同一の活性を有する。
【００３５】
上記のFGFに加えて、有用な薬剤には、上記FGFの任意の1つの活性断片もまた含まれる。最も簡単な形態では、メチオニンアミノペプチダーゼでの処理などの周知のN末端Met除去技術を使用したN末端メチオニンの除去によって、活性断片を作製する。第2の望ましい切断には、そのリーダー配列を含まないFGFが含まれる。当業者は、細胞膜の通過を促進するが活性には必要なく、成熟タンパク質では見出されないタンパク質N末端の一連の疎水性残基としてリーダー配列を認識する。
【００３６】
146個の残基を有する成熟FGF-2と比較して好ましいFGFの切断を決定する。一般的な規則として、FGFのアミノ酸配列をFGF-2と配列比較して最大相同性を得る。配列比較したFGF-2の対応するN末端を越えて伸長するFGF部分は、一般に副作用を与えない欠失に適切である。同様に、配列比較したFGF-2のC末端を越えて伸長するFGF部分を、副作用を与えずに欠失させることもできる。
【００３７】
記載の断片よりも小さなFGF断片もまた本発明で使用することができる。
【００３８】
適切な生物学的に活性な変異型は、FGF類似体または誘導体であり得る。「類似体」は、天然のFGF配列および1つまたは複数のアミノ酸の置換、挿入、または欠失を有する構造を含む、FGFまたはFGF断片のいずれかの類似体であることが意図される。1つまたは複数のペプトイド配列（ペプチド模倣配列）を有する類似体もまた含まれる（例えば、国際公開広報第91／04282を参照のこと）。「誘導体」は、FGF活性が保持されている限り、FGF、FGF断片、またはその各類似体の任意の適切な修飾（グリコシル化、リン酸化、または他の外来部分の付加）であることが意図される。FGFの断片、類似体、および誘導体の作製方法は、当技術分野で利用可能である。
【００３９】
上記FGFに加えて、本発明の方法は、その活性な変異体または変異型も使用することができる。FGFと共に使用される、用語「活性変異体」は、天然に存在するFGFの変異形態を意味する。FGF変異体または変異型は、一般に、基準FGF分子のアミノ酸配列と少なくとも70％、好ましくは80％、より好ましくは85％、さらにより好ましくは90％〜95％またはそれ以上（例えば、98％またはそれ以上）のアミノ酸配列同一性を有する。変異体または変異型は、例えば、わずか1〜10個のアミノ酸残基（6〜10個など）、わずか5残基、わずか4残基、3残基、2残基、または1アミノ酸残基の差異であり得る。
【００４０】
本明細書中に記載のように配列同一性を決定することができる。FGFについては、1つの配列同一性決定方法は、検索パラメータ（ギャップオープンペナルティー：12、ギャップ伸長ペナルティー：1）を使用したアフィンギャップ検索を使用したMSPRCHプログラム（Oxford  Molecular）で実行されるSmith-Waterman相同性検索アルゴリズム（Meth．Mol．Biol．、70：173〜187、1997）を使用する。1つの態様では、変異は、1つのアミノ酸を別の生物学的に類似のアミノ酸で置換する、Lアミノ酸を使用した「保存的アミノ酸置換」である。保存的アミノ酸置換は、置換されるアミノ酸の全体的な電荷、疎水性、親水性、および／または立体的かさを保存するものである。
【００４１】
当業者は、公知の技術を使用して、任意のFGFをコードするDNAの1つまたは複数の点変異を作製して、本明細書中に開示の方法で使用するための脈管形成活性を有するFGFポリペプチド変異体（またはその断片変異体）を発現させることができる。FGFの生物学的に活性な変異体を調製するために、当技術分野で公知であり、および／またはGilmanら、Gene、8：81、1979またはRobertsら、Nature、328：731、1987で教示される標準的な部位特異的変異誘発技術を使用して、FGFをコードするcDNAに1つまたは複数の点変異を導入する。
【００４２】
「異種」：異種配列は、通常は（すなわち、野生型配列において）第2の配列に隣接して見出されない配列である。1つの態様では、この配列は、第2の配列よりむしろ異なる遺伝子供給源（ウイルスまたは生物）に由来する。
【００４３】
「ハイブリダイゼーション」は、オリゴヌクレオチドおよびその類似体が、相補塩基間のWatson-Crick、Hoogsteen、または逆Hoogsteen水素結合を含む、水素結合によって結合する過程である。一般に、核酸は、ピリミジン（シトシン（C）、ウラシル（U）、およびチミン（T））またはプリン（アデニン（A）およびグアニン（G））のいずれかである窒素性塩基からなる。これらの窒素性塩基は、プリンに結合したピリミジンからなる水素結合を形成し、プリンへのピリミジンの結合を、「塩基対合」という。より詳細には、AはTまたはUに結合し、GはCに結合する。「相補性」は、2つの異なる核酸配列間または同一の核酸配列の2つの異なる領域間で起こる塩基対合をいう。例えば、M-CSFアンタゴニストは、M-CSFをコードするmRNAまたはMS-CSFをコードするdsDNAに相補的なオリゴヌクレオチドであり得る。
【００４４】
「特異的にハイブリダイズ可能な」および「特異的に相補的な」は、安定且つ特異的な結合がオリゴヌクレオチド（またはその類似体）とDNAまたはRNA標的との間で起こるために十分な程度の相補性を示す用語である。オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体は、特異的にハイブリダイズ可能であるためにその標的配列と100％相補的である必要はない。オリゴヌクレオチドまたは類似体は、標的DNAまたはRNA分子へのオリゴヌクレオチドまたは類似体の結合が標的DNAまたはRNAの正常な機能を妨害しない場合に特異的にハイブリダイズ可能であり、例えば、インビボアッセイ法の場合における生理学的条件下で、特異的結合が望ましい条件下で非標的配列へのオリゴヌクレオチドまたは類似体の非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性が存在する。このような結合を、「特異的ハイブリダイゼーション」という。
【００４５】
特定の程度のストリンジェンシーが得られるハイブリダイゼーション条件は、選択したハイブリダイゼーション方法の性質、ならびにハイブリダイゼーション核酸配列の組成および長さに依存して変化する。一般に、ハイブリダイゼーション温度およびハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度（特にNa+濃度）により、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する。
【００４６】
核酸二重鎖またはハイブリッドの安定性を、プローブが標的DNAから解離する温度である融解温度（または、Tm）として示す。この融解温度を使用して、必要なストリンジェンシー条件を定義する。プローブに対して同一であるよりも、むしろ関連し実質的に同一な配列が同定される場合、この配列は特定の塩濃度（例えば、SSCまたはSSPE）でのみ相同性ハイブリダイゼーションが起こる最も低い温度の最初の確立に有用である。次いで、1％のミスマッチによりTmが1℃低下するので、ハイブリダイゼーション反応における最終洗浄温度は減少する（例えば、プローブと95％を超える同一性を有する配列を求める場合、最終洗浄温度は、5℃減少する）。実際には、Tmの変化は、1％のミスマッチあたり0.5℃と1.5℃との間であり得る。塩濃度および温度のパラメータを変化させて、プローブと標的核酸との間の最適な同一性レベルを達成することができる。特定の程度のストリンジェンシーを実現するハイブリダイゼーション条件に関する計算は、Sambrookら編、「Molecular Cloning : A Laboratory Manual」、第2版、第1〜3巻、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Cold  Spring  Harbor、NY、1989、第9章および第11章（参照として本明細書に組み入れられる）で考察されている。
【００４７】
本発明の目的のために、「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーション分子と標的配列との間のミスマッチが30％未満である場合のみハイブリダイゼーションが起こる条件を含む。より正確な定義のために、「ストリンジェント条件」を特定のストリンジェンシーレベルにさらに分類することができる。したがって、本明細書中で使用される、「穏やかなストリンジェンシー」条件は配列ミスマッチが30％を超える分子がハイブリダイズしない条件であり、「中程度のストリンジェンシー」条件はミスマッチが20％を超える分子がハイブリダイズしない条件であり、「高ストリンジェンシー」条件はミスマッチが10％を超える配列がハイブリダイズしない条件である。
【００４８】
Watson-Crick、Hoogsteen、または逆Hoogsteen塩基対合の形成によって鎖が互いに結合またはハイブリダイズする場合、相補核酸を有する分子は安定な二重鎖または三重鎖を形成する。オリゴヌクレオチドが必要な条件下で標的核酸配列に検出可能に結合したままである場合、安定に結合する。「相補性」は、1つの核酸鎖の塩基が第2の核酸鎖中の塩基と対合する程度である。相補性は、百分率（すなわち、2つの鎖または2つの鎖の特定の領域もしくはドメインの間で塩基対を形成するヌクレオチドの比率）で記載するのが都合がよい。例えば、15個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドの10個のヌクレオチドがDNA分子の標的領域と塩基対を形成する場合、オリゴヌクレオチドは標的化されたDNA領域に66.67％相補的であるという。
【００４９】
本開示では、「十分な相補性」は、オリゴヌクレオチドと標的配列との間に、検出可能な結合および遺伝子産物（M-CSFなど）の発現の破壊に十分な数の塩基対が存在することを意味する。形成された塩基対の百分率によって表示または測定した場合、この目的を満たす相補性％は、わずか約50％相補性から完全な（100％）相補性までの範囲であり得る。一般に、十分な相補性は、少なくとも約50％である。1つの態様では、十分な相補性は少なくとも75％相補性である。別の態様では、十分な相補性は、少なくとも約90％または約95％相補性である。さらに別の態様では、十分な相補性は、少なくとも約98％または100％相補性である。
【００５０】
当業者が所望の条件下で使用するための適切なオリゴヌクレオチドをデザインすることを可能にする結合条件の確立に関連する質的および量的検討材料の完全な処理は、Beltzら、Methods  Enzymol、100：266〜285、1983およびSambrookら編、「Molecular Cloning : A Laboratory Manual」、第2版、第1巻〜第3巻、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Cold  Spring  Harbor、NY、1989に記載されている。
【００５１】
「ランゲルハンス島」は、膵臓内分泌組織の小さな個別のクラスターである。インビボにおいて、成体哺乳動物では、ランゲルハンス島は、膵臓外分泌（または腺房）組織に囲まれた膵臓内分泌組織の個別のクラスター（島）として膵臓中で見出される。インビボでは、ランゲルハンス島は、α細胞、β細胞、δ細胞、およびPP細胞からなる。組織学的には、ランゲルハンス島は、α細胞、δ細胞、およびPP細胞の外層に囲まれたβ細胞の中心コアからなる。ランゲルハンス島を、本明細書中でしばしば「島」と呼ぶ。
【００５２】
「単離された」：「単離された」生体成分（核酸、ペプチド、またはタンパク質など）は、この成分が天然に存在する（すなわち、他の染色体および染色体外DNAおよびRNAならびにタンパク質）生物の細胞中の他の生体成分から実質的に分離しているか、別に産生されるか、または精製されている。したがって、「単離された」核酸、ペプチド、およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。この用語はまた、宿主細胞での組換え発現および化学合成された核酸によって調製された核酸、ペプチド、およびタンパク質を含む。
【００５３】
「LIF（白血病阻害因子）」は、ES細胞の分化を防止する成長因子である。LIFは、179アミノ酸長の重度且つ様々にグリコシル化された58kDaタンパク質である。グリコシル化は、生物活性に必須ではないようである。2つの異なるグリコシル化変異型は、LIF-AおよびLIF-Bと呼ばれている。マウスおよびヒト因子は、アミノ酸レベルで79％の相同性を示す。両因子は、保存的アミノ酸交換の程度が高い。
【００５４】
「ヌクレオチド」には、ピリミジン、プリン、もしくはそれらの合成類似体などの糖に結合した塩基、またはペプチド核酸（PNA）のようなアミノ酸に結合した塩基が含まれる単量体が含まれる。ヌクレオチドは、ポリヌクレオチド中の1つの単量体である。ヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド中の塩基配列をいう。
【００５５】
「機能的に連結された」：第1の核酸配列が第2の核酸配列と機能的関係に置かれた場合、第1の核酸配列は第2の核酸配列に機能的に連結される。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を与える場合、プロモーターはコード配列に機能的に連結される。一般に、機能的に連結されたDNA配列は連続的であり、2つのタンパク質コード領域を連結する必要がある場合、同一の読み取り枠中に存在する。
【００５６】
「ポリペプチド」は、単量体がアミド結合を介して互いに連結したアミノ酸残基であるポリマーをいう。アミノ酸がαアミノ酸である場合、L型光学異性体またはD型光学異性体を使用することができ、L型異性体が好ましい。本明細書中で使用される、用語「ポリペプチド」または「タンパク質」は、任意のアミノ酸配列を含み、これには糖タンパク質などの修飾配列が含まれることが意図される。用語「ポリペプチド」は、特に、天然に存在するタンパク質および組換えまたは合成によって産生されたタンパク質を対象とすることが意図される。
【００５７】
用語「ポリペプチド断片」は、少なくとも1つの有用なエピトープを示すポリペプチドの一部をいう。用語「ポリペプチドの機能的断片」は、ポリペプチド活性を保持したポリペプチドの全ての断片をいう。生物学的に機能的な断片は、例えば、ポリペプチド断片および抗体分子に結合することができるエピトープから細胞内での表現型変化の特徴的誘導またはプログラミングに関与することができる巨大ポリペプチドまでのサイズで変化することができる。「エピトープ」は、抗原との接触に応答して作製される免疫グロブリンに結合することができるポリペプチド領域である。したがって、インスリンの生物活性を含むより小さなペプチド、またはインスリンの保存的変異型の使用が含まれる。
【００５８】
用語「可溶性」は、細胞膜に挿入されないポリペプチドの形態をいう。
【００５９】
本明細書中で使用される、用語「実質的に精製されたポリペプチド」は、それが天然に会合した他のタンパク質、脂質、炭水化物、または他の物質を実質的に含まないポリペプチドをいう。1つの態様では、ポリペプチドは、それが天然に会合した他のタンパク質、脂質、炭水化物、または他の物質を少なくとも50％、例えば少なくとも80％含まない。別の態様では、ポリペプチドは、それが天然に会合した他のタンパク質、脂質、炭水化物、または他の物質を少なくとも90％含まない。さらに別の態様では、ポリペプチドは、それが天然に会合した他のタンパク質、脂質、炭水化物、または他の物質を少なくとも95％含まない。
【００６０】
保存的置換により、あるアミノ酸がサイズ、疎水性などが類似した別のアミノ酸に置換される。保存的置換の例を以下に示す。
2005503759.tif 000002
【００６１】
コードしたタンパク質の機能および免疫学的同一性を保存するために、保存的であるか保存的であるかに関わらずアミノ酸を変化させるcDNA配列の変型を最小にすべきである。タンパク質の免疫学的同一性は、それがタンパク質が抗体によって認識されるかどうか（このような抗体によって認識される変異型が免疫学的に保存されているかどうか）の決定によって評価することができる。任意のcDNA配列変異型は、20個未満、好ましくは10個未満のアミノ酸の置換をコードされたポリペプチドへ導入する。変異型アミノ酸配列は、例えば、天然のアミノ酸配列と80、90、さらに95％または98％同一であり得る。
【００６２】
「薬学的に許容される担体」：本発明で有用な薬学的に許容される担体従来のものである。「Remington's Pharmaceutical Sciences」、E．W．Martin、Mack  Publishing  Co．、Easton、PA、第15版、1975は、本明細書中に開示の融合タンパク質の薬学的送達に適切な組成物および処方物を記載している。
【００６３】
一般に、担体の性質は、使用された特定の投与様式に依存する。例えば、非経口処方物は、通常、薬学的および生理学的に許容される流動物（賦形剤としての水、生理学的食塩水、平衡化塩溶液、デキストロース水溶液、グリセロールなど）を含む注射液を含む。固体組成物（例えば、粉末、丸薬、錠剤、またはカプセル形態）のために、従来の無毒性固体担体には、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを含み得る。生物学的に中性の担体に加えて、投与される薬学的組成物は、少量の無毒性補助物質（湿潤剤または乳化剤、防腐剤、およびpH緩衝剤など（例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレート））を含むことができる。
【００６４】
「医薬品」または「薬物」は、被験体または細胞に適切に投与した場合に所望の治療効果または予防効果を誘導することができる化合物または組成物をいう。「インキュベートする」は、薬物を細胞と相互作用させるための十分な時間を含む。「接触させる」は、固体中または液体形態中における薬物の細胞とのインキュベーションを含む。
【００６５】
「ポリヌクレオチド」は、任意の長さの核酸配列（線状配列など）である。したがって、ポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドおよび染色体中に含まれる遺伝子配列も含まれる。「オリゴヌクレオチド」は、天然のホスホジエステル結合によって連結した複数の連結ヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、6ヌクレオチド長〜300ヌクレオチド長のポリヌクレオチドである。オリゴヌクレオチド類似体は、オリゴヌクレオチドと同様に機能するが、天然に存在する部分を含まない部分をいう。例えば、オリゴヌクレオチド類似体は、天然に存在しない部分（変化した糖部分または内部糖結合（ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドなど））を含み得る。天然に存在するポリヌクレオチドの機能的類似体は、RNAまたはDNAに結合することができ、これにはペプチド核酸（PNA）分子が含まれる。
【００６６】
「プライマー」：核酸ハイブリダイゼーションによって相補標的DNA配列にアニーリングしてプライマーと標的DNAとの間にハイブリッドを形成し、その後DNAポリメラーゼによって標的DNA鎖に沿って伸長する、例えば10ヌクレオチド長以上のDNAオリゴヌクレオチドのような短い核酸。プライマー対を、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）または当技術分野で公知の他の核酸増幅方法による核酸配列の増幅で使用することができる。
【００６７】
本発明で使用されるプローブおよびプライマーは、例えば、特定のタンパク質をコードすることが示された少なくとも10個のヌクレオチドの核酸配列を含み得る。特異性を増強するために、より長いプローブおよびプライマー（開示の核酸配列の15、20、30、40、50、60、70、80、90、または100個の連続するヌクレオチドを含むプローブおよびプライマーなど）も使用することもできる。プローブおよびプライマーの調製方法および使用方法は、参考文献（例えば、Sambrookら、1989、「Molecular Cloning : A Laboratory Manual」、Cold  Spring  Harbor、New  York；Ausubelら、1987、「Current Protocols in Molecular Biology」、Greene  Publ．Assoc．＆  Wiley-Intersciences；Innisら、1990、「PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications」、Innisら編、Academic  Press、San  Diego、CA）に記載されている。PCRプライマー対は、例えば、Primer（バージョン0.5、1991、Whitehead  Institute  for  Biomedical  Research、Cambridge、MA）などその目的を意図するコンピュータプログラムの使用によって既知の配列に由来し得る。
【００６８】
プローブまたはプライマーをいう場合、用語「（標的配列）に特異的な」は、プローブまたはプライマーがストリンジェントな条件下で標的配列を含む所与のサンプル中で実質的に標的配列のみとハイブリダイズすることを示す。
【００６９】
「プロモーター」：プロモーターは、核酸の転写を指示する核酸制御配列のアレイである。プロモーターは、ポリメラーゼII型プロモーターTATA要素の場合などにおける転写開始部位付近の核酸配列を含む。プロモーターはまた、任意選択的に、転写開始部位から数千塩基対も離れて存在することができる遠位エンハンサーまたはリプレッサー要素を含む。
【００７０】
「組換え」：組換え核酸は、天然に存在しない配列を有するか、または配列中の2つの別の離れたセグメントの人工的な組み合わせによって作製された配列を有する核酸である。この人工的組み合わせは、しばしば化学合成、またはより一般的には、核酸の単離セグメントの人為的操作（例えば、遺伝子操作技術）によって行われる。
【００７１】
同様に、組換えタンパク質は、組換え核酸分子によってコードされるタンパク質である。
【００７２】
「幹細胞」は、複数の所与の細胞型の完全に分化した機能的細胞を作製することができる細胞をいう。インビボでの幹細胞の役割は、動物の正常な生活の間で破壊される細胞を置換することである。一般に、幹細胞は、無制限に分裂することができる。分裂後、幹細胞は、幹細胞として保持される、前駆細胞となる、または最終的な分化に進行することができる。形態的に特化されないようであるが、さらなる分化の可能性が制限される場合、幹細胞は分化したとみなすことができる。前駆細胞は、少なくとも1つの所与の細胞型の完全に分化した機能的細胞を作製することができる細胞である。一般に、前駆細胞は分裂することができる。分裂後、前駆細胞は、前駆細胞を維持するか、または最終的な分化に進行することができる。「膵臓幹細胞」は、膵臓の幹細胞である。1つの態様では、膵臓幹細胞は、全ての膵臓内分泌細胞（例えばα細胞、β細胞、δ細胞、およびPP細胞）を産生するが、膵臓外分泌細胞などの他の細胞を産生しない。「膵臓前駆細胞」は、膵臓の前駆細胞である。1つの態様では、膵臓前駆細胞は、複数の膵臓内分泌細胞型を産生する。1つの特定の非限定的な膵臓前駆細胞の例は、αおよびβ細胞を産生する細胞である。
【００７３】
「被験体」は、特定の治療のレシピエントであるヒト、非ヒト霊長類、ブタ、ヒツジ、ウシ、げっ歯類などの任意の哺乳動物をいう。1つの態様では、被験体は、ヒト被験体またはマウス被験体である。
【００７４】
「治療薬」：遺伝的意味で使用する場合、治療薬には、治療薬、予防薬、および置換薬が含まれる。
【００７５】
「形質導入または形質転換」：ウイルスまたはベクターは、核酸を細胞に輸送した場合に細胞に「形質導入」する。DNAが細胞によって安定に複製された場合に細胞に形質導入された核酸、細胞ゲノムへの核酸の組み込み、またはエピソーム複製によって、細胞は、「形質転換」または「トランスフェクト」される。
【００７６】
多数のトランスフェクション法（化学的方法（例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション）、物理的方法（例えば、エレクトロポレーション、微量注入、微粒子銃）、融合（例えば、リポソーム）、受容体媒介エンドサイトーシス（例えば、DNA-タンパク質複合体、ウイルスエンベロープ／キャプシド-DNA複合体）、および組換えウイルスなどのウイルスによる生物学的感染など）（Wolff，J．A．編、「Gene  Therapeutics」、Birkhauser、Boston、USA、1994）が当業者に公知である。レトロウイルスによる感染の場合、感染したレトロウイルス粒子が標的細胞に吸着し、レトロウイルスRNAゲノムが逆転写され、得られたプロウイルスが細胞DNAに組み込まれる。膵臓内分泌細胞への遺伝子の導入方法は公知である（例えば、米国特許第6,110,743号（参照として本明細書に組み入れられる）を参照のこと）。これらの方法を使用して、本明細書中に記載の方法によって産生した膵臓内分泌細胞または本明細書中に記載の方法によって産生した人工島に形質導入することができる。
【００７７】
標的細胞の遺伝子の改変は、有効なトランスフェクションの特徴である。「遺伝子改変細胞」は、トランスフェクションによる外因性ヌクレオチド配列の細胞取り込みの結果として遺伝子型が変化した細胞をいう。トランスフェクトした細胞または遺伝子改変細胞の基準は、ベクターまたはポリヌクレオチドが導入された特定の細胞およびその細胞の子孫の両方を含む。
【００７８】
「導入遺伝子」：ベクターによって供給される外因性遺伝子。
【００７９】
「ベクター」：宿主細胞に導入されて形質転換宿主細胞を産生する核酸分子。ベクターは、宿主細胞で複製可能な核酸配列（複製起点など）を含み得る。ベクターはまた、1つまたは複数の治療遺伝子および／または選択マーカー遺伝子、および当技術分野で公知の他の遺伝子要素を含み得る。ベクターが細胞に形質導入、形質転換、または感染し、それにより細胞が細胞にとって天然のもの以外の核酸および／またはタンパク質を発現することができる。ベクターは、任意選択的に、細胞（ウイルス粒子、リポソーム、タンパク質コーティングなど）への核酸の侵入を補助する物質を含む。
【００８０】
膵臓内分泌細胞の産生方法
本明細書中に記載の方法および細胞は、胚性幹細胞をインビトロで分化させて任意の目的の組織を形成することができるという発見に基づく。したがって、膵臓胚性幹細胞を分化させて、内分泌細胞を形成することができる。1つの態様では、胚性幹細胞を膵臓内分泌細胞に分化する方法を提供する。
【００８１】
本方法は、未分化胚性幹細胞のクラスターから胚様体を作製する工程と、内分泌前駆細胞を選択する工程と、成長因子を含む拡大培地中での内分泌細胞の培養により内分泌前駆細胞を拡大する工程と、拡大した内分泌前駆細胞を分化培地中で分化内分泌細胞に分化させる工程とを含む。この方法の例を、以下に概説する。
【００８２】
未分化胚幹（ES）細胞の拡大
分化前のES細胞の拡大は、本明細書中に開示の方法の実施に必要ない。しかし、膵臓内分泌細胞の形成数を増加させるために、胚様体形成前にES細胞を拡大することができる。未分化胚性幹（ES）細胞をES増殖培地で培養して細胞数を拡大する。理論に拘束されないが、ES細胞を多能性を喪失することなく少なくとも約1000倍に拡大することができると考えられる。1つの態様では、ES細胞は哺乳動物ES細胞である。1つの特異的で制限されない例では、細胞は非ヒトES細胞（例えば、霊長類、ヒツジ、ウシ、ブタ、ラット、またはマウスのES細胞）である。別の態様では、ES細胞はH9.1もしくはH9.1（Amitら、Devel．Bio．、227、271〜8、2000；Thomsonら、Science、282、5391、1998）などのようなヒトES細胞またはヒト胚性生殖細胞（EG細胞）（Shamblotら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、95、13726、1998）などのヒトES細胞である。1つの特定の限定されない例では、細胞は、E14.1細胞、R1細胞、B5細胞（Hadjantonakisら、Mech．Dev．、76、79、1998；Kaoら、Ophthalmol．Vis．Sci．、37、2572、1996）などのマウスES細胞である。
【００８３】
一般に炭素源、窒素源、およびpHを維持する緩衝液を含むES成長培地中でES細胞を培養する。1つの態様では、ES成長培地は、ES細胞成長を増強するための種々の栄養素を補足したDMEMなどの基礎培地を含む。さらに、基礎培地に、ウマ、ウシ、またはウシ胎児の血清（例えば、約10体積％〜約20体積％または約15体積％）などの添加物を補足することができ、非必須アミノ酸L-グルタミン、および抗生物質（ストレプトマイシン、ペニシリン、およびそれらの組み合わせなど）を補足することができる。さらに、培地に2-メルカプトエタノールを含めることもできる。ES成長培地は、例えば、KO-DMEM（Life-Techカタログ番号10829-018）として市販されている。
【００８４】
胚性幹細胞を入手および培養するための他の方法および培地が公知であり、使用に適切である（Evansら、Nature、292：154〜156、1981；Martinら、Proc．Natl．Acad．Sci．、78：7634〜7636、1981；Robertsonら、Nature、323：445〜448、1986；Doetschmanら、Nature、330：576〜578、1987；Thomasら、Cell、51：503〜512、1987；Thomsonら、Science、282：1145〜1147、1998；およびShamblottら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、95：13726〜13731、1998）。これらの引例の開示は、参照として本明細書に組み入れられる。
【００８５】
1つの特定の制限されない例では、ES細胞をES細胞の分化を防止するプレート上で培養する。適切なプレートには、ゼラチン被覆組織培養プレートまたは線維芽細胞支持細胞層（例えば、共に紫外線またはマイトマイシンCなどの抗増殖薬で処理したマウス胚性細胞系統（STO-1）または一次マウス胚性線維芽細胞）などの支持細胞層を含むプレートが含まれる。ES細胞を、LIF（白血病抑制因子（Leukemia  Inhibitory  Factor））（ES細胞の分化を防止する成長因子）の存在下で培養する。1つの態様では、ES細胞を約4日間〜約8日間培養する。別の態様では、ES細胞を約6〜約7日間培養する。ES細胞を、酸素および約1％〜約10％もしくは約1％〜5％のCO2、または約5％のCO2を含む大気下で約35℃〜約40℃、または約37℃の温度で培養する。1つの態様では、約1日〜2日毎に培地を交換する（米国特許第5,670,372号（参照として本明細書に組み入れられる）を参照のこと）。
【００８６】
胚様体の作製
1つの態様では、胚様体を、懸濁培養で作製する。簡単に述べれば、胚様体を形成するために、ES細胞のクラスターを、組織培養プレートから剥離する。組織培養プレートからの細胞の剥離方法は公知であり、トリプシンまたはパパインなどの酵素、および／またはEDTAもしくはEGTAなどのメチルイオンキレート剤または市販の調製物の使用が含まれる（例えば、国際公開広報第00／27995を参照のこと）。
【００８７】
一般に、クラスター中（例えば10個またはそれ以上のES細胞、典型的には50個またはそれ以上の細胞の凝集体）のES細胞を、組織培養プレートから剥離する。次いで、ES細胞のクラスターを解離して、多数（例えば、約50％〜約70％、約75％〜約90％、または約80％〜約100％）の各細胞を含む細胞集団を得る。細胞クラスターの解離方法は、同様に公知である。1つの細胞の解離方法には、例えば、ピペットによる細胞培養物の吸引繰り返しによる細胞の機械的分離が含まれる。1つの態様では、ES細胞は、過剰成長培養で起こる傾向がある自発的分化を回避するために、解離の時期は指数関数的成長期にある。
【００８８】
次いで、解離ES細胞を、ES増殖培地で培養する。しかし、ES細胞増殖（組織培養皿表面上で細胞が成長する）と対照的に、胚様体は懸濁液中で作製される。例えば、胚様体を形成させるために、細胞を非接着性細菌培養皿上で培養することができる。1つの態様では、細胞を約4〜約7日間、または最長約8日間までインキュベートする。1つの態様では、1〜2日毎に培地を交換する（Martinら、Proc．Natl．Acad．Sci．、72、1441〜1445、1975；米国特許第5,014,268号（参照として本明細書に組み入れられる）を参照のこと）。
【００８９】
別の態様では、下記のように、胚様体を作製せず、ネスチン陽性膵臓幹細胞または膵臓前駆細胞の選択のために未分化ES細胞を直接無血清培地に播種する。
【００９０】
膵臓内分泌幹細胞の選択
胚様体細胞を培養して、膵臓内分泌幹細胞または膵臓内分泌細胞前駆体を選択する。1つの態様では、膵臓内分泌幹細胞または前駆細胞を選択するために、EB細胞を、膵臓内分泌幹細胞または前駆細胞が接着する表面上（例えば、フィブロネクチン、ラミニン、またはビトロネクチンを被覆した表面）に播種する。別の態様では、胚様体は作製されないが、ES細胞を表面に直接播種する。
【００９１】
さらに、膵臓内分泌幹細胞前駆細胞を選択する培地を使用して細胞を培養する。1つの態様では、培地は、DMEMもしくはF12などの無血清基礎培地またはDMEMとF12との組み合わせである。無血清培地を、栄養素で補足する。特定の限定的でない栄養素の例は、インスリン、塩化セレン、トランスフェリン、およびフィブロネクチンである。無血清培地の例は、約1μg／ml〜約10μg／mlのインスリン、約20nM〜約40nMの塩化セレン、約40μg／ml〜約60μg／mlのトランスフェリン、および約1μg／ml〜10μg／mlのフィブロネクチンを補足したDMEMとF12とを0.1：1〜10：1の比で含むITSFn培地である。1つの態様では、細胞を、無血清培地中で約6日間〜約8日間、約35℃〜約40℃の温度でインキュベートする。別の態様では、細胞を、約1％〜10％のCO2の大気下、または約5％〜約10％のCO2もしくは約5％のCO2大気下にて約37℃でインキュベートする。この態様では、1〜2日毎に培地を交換する。
【００９２】
選択終了時に、細胞培養物は、約50％を超える膵臓内分泌幹細胞または前駆細胞を含む。別の態様では、細胞培養物は、約80％を超える膵臓内分泌幹細胞もしくは前駆細胞、または約90％を超える膵臓内分泌幹細胞もしくは前駆細胞を含む。1つの態様では、膵臓内分泌幹細胞または前駆細胞を、ネスチンの発現によって同定する。さらに、膵臓内分泌細胞に典型的な他のポリペプチドまたは転写レギュレーターを同定することができる。1つの特定の限定されないこのような転写レギュレーターの例は、PDX-1である。1つの態様では、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチドの発現を評価する。他の態様では、NKX2.2、NKX6.1、IAPP、glut-2、ISL1、ニューロゲニン3、PAX4、PAX6、ニューロD、LIMホメオドメイン転写因子ファミリーのメンバーを同定する（概説として、Sender および German、J．Molec．Med．、75：327〜40、1997；Senderら、Develop、127：5533〜5540、2000を参照のこと、図4もまた参照のこと）。
【００９３】
膵臓幹細胞の拡大
1つの態様では、膵臓幹細胞または前駆細胞を、細胞量が約10倍に増加するまで拡大する。別の態様では、膵臓幹細胞または前駆細胞を、細胞量が約10倍〜約100倍に増加するまで拡大した。1つの特定の制限されない例では、ネスチン陽性細胞を、成長因子の存在下で拡大する。別の特定の限定されない例では、膵臓幹細胞または前駆体を成長因子の存在下で約6〜約7日間拡大する。
【００９４】
種々の培養培地が公知であり、この工程での使用に適切である。一般に、増殖培地には、基礎培地が含まれる。1つの態様では、培地は、DMEMおよび／もしくはF12、またはDMEMとF12との組み合わせ（比率約0.1：1〜約10：1）である。別の態様では、培養培地はN2培地を含む。
【００９５】
1つの態様では、基礎培地に、B27培地補足物質（Gibco  BRL、Gaithersburg、MA）およびニコチンアミド（Sigma、St．Louis、MO）を補足する。1つの態様では、B27を、50倍濃縮物として得る。次いで、B27を基礎培地で約0.5倍〜約2倍の最終濃度に希釈する。別の態様では、1倍の最終濃度の基礎培地にB27を添加する。B27は、インビトロでニューロンの生存に効果を有することが明らかとなっている補足物質である（Brewerら、J．Neurosci．Res．、35：567、1993（参照として本明細書に組み入れられる））。
【００９６】
1つの態様では、基礎培地にニコチンアミドを添加する。1つの特定の限定されない例では、ニコチンアミドを約1mM〜約50mMの濃度で添加する。別の特定の限定されない例では、ニコチンアミドを少なくとも約5mMおよび最大で約50mMの濃度で添加する。さらなる態様では、ニコチンアミドを約5mM〜約10mMの濃度で添加する。さらに別の特定の限定されない例では、ニコチンアミドを約10mMの濃度で添加する。
【００９７】
1つの態様では、培地は、1つまたは複数の栄養素などのさらなる添加物を含む。特定の限定されない例を、以下の表に示す。
2005503759.tif 000003
【００９８】
したがって、1つの態様では、培地は、約0.05mg／ml〜約5.0mg／mlの重炭酸ナトリウムを含む。別の態様では、培地は、約1.0mg／ml〜約2.0mg／mlの重炭酸ナトリウムを含む。別の態様では、培地は、4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジン-エタンスルホン酸（HEPES）を含まない。
【００９９】
膵臓幹細胞増殖培地に、成長因子を補足することができる。1つの特定の限定されない例では、増殖培地は、塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）を含む。1つの態様では、培養培地は、約5ng／ml〜約30ng／mlのbFGFを含む。別の態様では、培地は、約10ng／ml〜約20ng／mlのbFGFを含む。さらに別の態様では、増殖培地は、約10ng／ml〜約20ng／mlのbFGFを含む。
【０１００】
別の特定の限定されない例では、増殖培地は、上皮成長因子（EGF）を含む。1つの態様では、培養培地は約5ng／ml〜約30ng／mlのEGFを含む。別の態様では、培地は、約10ng／ml〜約20ng／mlのEGFを含む。さらに別の態様では、増殖培地は、約10ng／ml〜約20ng／mlのEGFを含む。培養培地に、膵臓内分泌細胞の作製効率を増加させるさらなる薬剤を補足することもできる。
【０１０１】
さらに別の態様では、他の生物活性分子または成長因子を添加する。成長因子には、繊毛様神経栄養成長因子（CNGF、Gupta  SKら、J．Neurobio．、23：481〜90、1992）、ニューロトロフィン（ニューロトロフィン3、ニューロトロフィン4など）、神経成長因子（NCF）（Kaplan および Miller、Curr．Opin．Neurobiol．、10：381〜391、2000）、ならびにグリア由来神経栄養因子（GDNF）、肝細胞成長因子（HGF）、βセルリン、アクチビンA、アクチビンB、骨形態形成タンパク質（BMP-2、BMP-4）、形質転換成長因子β（TGF-β）、ノギン（noggin）（Itohら、Eur．J．Biochem．、267：6954〜6967、2000を参照のこと）が含まれるが、これらに限定されない。生物活性薬剤には、アスコルビン酸、サイクリックAMP（cAMP）、およびレチノイン酸（例えば、トランスレチノイン酸）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０２】
さらなる特定の限定されない例では、増殖培地は、エリスロポイエチン（EPO）を含む。例えば、培地に、約10ng／ml〜約50ng／ml、約0.1U／ml〜約5U／ml、または約0.5U／ml〜約5U／mlを含めることができる（Studerら、J．Neurosci．、20：7377〜7383、2000）。
【０１０３】
1つの態様では、約20％の酸素濃度条件下（周辺大気の酸素）で細胞を培養する。別の態様では、低大気酸素濃度条件下で細胞を培養する（Studerら、J．Neurosci．、20：7377〜7383、2000）。特定の限定されない低大気酸素濃度は、約1％〜約5％の酸素である。別の特定の限定されない例では、細胞を、約1％〜約20％の酸素で培養する。別の態様では、細胞を、約37℃、約1％〜10％のCO2、または約5％〜約10％のCO2もしくは5％のCO2下でインキュベートする。特定の限定されない例では、1〜2日毎に培地を交換する。
【０１０４】
拡大した膵臓内分泌幹細胞または前駆体の分化
成熟内分泌細胞を形成させるための拡大した膵臓内分泌幹細胞または膵臓内分泌前駆細胞の分化を、bFGFまたはEGFなどの少なくとも1つの成長因子の除去により誘導する（上記の膵臓内分泌幹細胞の拡大を参照のこと）。1つの態様では、培養培地に類似しているが少なくとも1つの薬剤（例えば、bFGFまたはEGF）を含まない培地中での細胞の培養によって分化を誘導する。1つの態様では、培地は、B27補足物質およびニコチンアミドを含む。さらに、培地は、膵臓内分泌細胞の収率を増加させるための因子を含み得る。1つの態様では、拡大した細胞集団は依然としてネスチンを発現する。
【０１０５】
さらに別の態様では、培地中に他の生物活性分子を含む。これらの因子には、繊毛様神経栄養成長因子（CNGF、Gupta  SKら、J．Neurobio．、23、481〜90、1992）、ニューロトロフィン（ニューロトロフィン3、ニューロトロフィン4など）、神経成長因子（NCF）（Kaplan および Miller、Curr．Opin．Neurobiol．、10：381〜391、2000）、およびグリア由来神経栄養因子（GDNF）、肝細胞成長因子（HGF）、βセルリン、アクチビンA、アクチビンB、骨形態形成タンパク質（BMP-2、BMP-4）、形質転換成長因子β（TGF-β）、ノギン（Itohら、Eur．J．Biochem．、267：6954〜6967、2000を参照のこと）を含み得るが、これらに限定されない。生物活性薬剤には、アスコルビン酸、サイクリックAMP（cAMP）、およびレチノイン酸（例えば、トランスレチノイン酸）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０６】
さらなる特定の限定されない例では、増殖培地は、エリスロポイエチン（EPO）を含む。例えば、培地に、約10ng／ml〜約50ng／ml、約0.1U／ml〜約5U／ml、または約0.5U／ml〜約5U／mlを含めることができる（Studerら、J．Neurosci．、20：7377〜7383、2000）。
【０１０７】
1つの態様では、約20％の酸素濃度条件下（周辺大気の酸素）で細胞を培養する。別の態様では、低大気酸素濃度条件下で細胞を培養する（Studerら、J．Neurosci．、20：7377〜7383、2000）。特定の限定されない低大気酸素濃度は、約1％〜約5％の酸素である。別の特定の限定されない例では、細胞を、約1％〜約20％の酸素で培養する。別の態様では、細胞を、約37℃、約1％〜10％のCO2、約5％〜約10％のCO2、または5％のCO2下でインキュベートする。特定の限定されない例では、1〜2日毎に培地を交換する。
【０１０８】
膵臓幹細胞の膵臓内分泌細胞への分化を、当業者に公知の任意の手段によって測定することができる。特定の限定されない例は、膵臓内分泌ポリペプチド（例えば、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、または膵臓ポリペプチド）を検出するための免疫組織化学的分析、膵臓内分泌ポリペプチドの分泌を検出するアッセイ法（例えば、米国特許第5,993,799号；Csernusら、Cell．Mol．Life  Sci．、54、733、1998；Alpert、Cell、53：295〜308、1998を参照のこと）、またはELISAアッセイ法およびウェスタンブロット分析などのアッセイ法である。細胞の分化を、ノーザンブロット、RNアーゼ保護、およびRT-PCRなどの膵臓内分泌ポリペプチドをコードするmRNAレベルの測定によって測定することもできる（Clarkら、Diabetes、46：958〜967、1997；Hebrokら、Genes  and  Dev．、12：1705〜1713、1998）。
【０１０９】
人工島の産生方法
1つの態様では、膵臓内分泌細胞を上記のように産生し、人工島を作製する。1つの態様では、人工島を、上記の培養方法によって産生する。この態様では、上記のように作製した膵臓内分泌細胞を直接使用する。別の態様では、膵臓内分泌細胞を、剥離する。別の態様では、膵臓内分泌細胞をインビトロで産生して解離し、細胞懸濁液を作製し、細胞を凝集させる。
【０１１０】
人工膵島は、少なくとも1つの膵臓内分泌細胞型を含む。1つの態様では、人工島は、膵臓β細胞を含む。別の態様では、人工島はα細胞を含む。さらに別の態様では、人工島はδ細胞を含む。さらなる態様では、人工島は複数の膵臓内分泌細胞型を含む。特定の制限されない例では、人工島は、別の膵臓内分泌細胞型（膵臓α細胞が含まれるが、これに限定されない）に加えて膵臓β細胞を含む。特定の制限されない例では、人工島は、別の膵臓内分泌細胞型（膵臓δ細胞が含まれるが、これに限定されない）に加えて膵臓β細胞を含む。
【０１１１】
本明細書中に記載の方法によって産生された膵臓内分泌細胞または本明細書中に記載の方法によって産生された人工島を、目的の核酸配列によって形質導入またはトランスフェクトすることができる。トランスフェクションは、任意のコード配列が最終的に発現されるかにかかわらず、哺乳動物標的細胞の場合におけるDNAベクターなどの外因性ヌクレオチド配列の、標的細胞への導入をいう。
【０１１２】
島および／または膵臓内分泌ホルモンの分泌に影響を与える薬剤を研究するために産生した膵臓内分泌細胞の使用
本発明の別の局面は、膵臓内分泌細胞に対する物質の効果を評価するアッセイ法を提供する。このアッセイ法を使用して、膵臓内分泌細胞の生存、増殖、または発生を調節することができる薬剤を試験することができる。本発明のこの局面によれば、膵臓内分泌細胞またはその前駆体の集団を上記のように産生する。細胞集団を、目的の物質に接触させ、細胞集団に対する効果をアッセイする。
【０１１３】
1つの特定の限定されない例では、胚性幹細胞から分化した膵臓内分泌細胞を、目的の薬剤に接触させる。次いで、パラメータをアッセイして、薬剤が膵臓内分泌細胞に影響を与えるかどうかを決定する。1つの特定の限定されない例では、膵臓内分泌ホルモンの分泌または発現を分析する。特に、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、または膵臓ペプチドの分泌または発現を分析することができる。あるいは、膵臓内分泌細胞をレポーター遺伝子をコードする核酸構築物によってトランスフェクトした場合、レポーター遺伝子発現の増減を分析することができる（以下を参照のこと）。この分析は、膵臓内分泌細胞中に存在するタンパク質もしくはRNAレベルの検出またはレポーター遺伝子の生物活性の検出を含み得る。
【０１１４】
目的の物質には、組織または細胞由来の抽出物、初代細胞または細胞系統の馴化培地、天然または組換えのポリペプチド、ヌクレオチド（DNAまたはRNA）、および天然または化学合成された非タンパク質分子が含まれる。
【０１１５】
胚性幹細胞から分化した膵臓内分泌細胞をモデル系として使用して、膵島の生物学を研究することもできる。特定の限定されない例は、インスリン分泌のインビトロ研究、膵臓内分泌細胞の増殖、および膵臓内分泌細胞の悪性形質転換である。
【０１１６】
ES細胞から分化した膵臓内分泌細胞を使用して、分化膵臓内分泌細胞における種々の遺伝子の役割を評価することもできる。例えば、ES細胞中の特定の遺伝子を「ノックアウト（knock out）」することができる。遺伝子のノックアウトは、当業者に周知の任意のトランスジェニックテクノロジーによって達成された機能の完全な喪失によるインビボでの遺伝子の標的破壊である。1つの態様では、遺伝子ノックアウトを有する動物は、相同組換えによって機能させないようにする遺伝子に標的化した挿入により、標的遺伝子が機能しなくなった動物である。ノックアウト変異型の産生方法は公知である（例えば、Shastry、Mol．Cell  Biochem．、181：163〜179、1998）。ノックアウト遺伝子（例えば、ホモ接合性ヌル変異体）を含むES細胞を培養して、遺伝子産物が不完全な分化膵臓内分泌細胞を形成することができる。
【０１１７】
別の態様では、トランスジェニック動物を、ポリヌクレオチドが成熟動物の生殖系列細胞のDNAに安定に組み込まれて正常なメンデル様式で遺伝するような様式での胚（embryos（例えば、単数ではembryoと呼ぶ））へのポリヌクレオチドの導入によって産生することができる。胚顕微鏡操作のためのテクノロジーの進歩により、現在、異種DNAの受精哺乳動物卵子への導入が可能である。例えば、全能性または多能性幹細胞を、微量注入、リン酸カルシウム媒介沈殿、リポソーム融合、ウイルス感染、または他の手段によって形質転換することができ、次いで、トランスフェクトした細胞を胚に導入し、胚をトランスジェニック動物に成長させる。
【０１１８】
1つのDNA方法では、好ましくは一細胞期の胚の前核または細胞質に注射し、胚を成熟トランスジェニック動物に成長させた。これらの技術は周知である。例えば、哺乳動物（マウス、ブタ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ウシ）受精卵へ異種DNAを微量注入するための標準的な実験手順の概説には、以下が含まれる。Hoganら、「Manipulating the Mouse Embryo」、Cold  Spring  Harbor  Press、1986；Krimpenfortら、Bio／Technology、9：86、1991；Palmiterら、Cell、41：343、1985；Kraemerら、「Genetic Manipulation of the Early Mammalian Embryo」、Cold  Spring  Habor  Laboratory  Press、1985；Hammerら、Nature、315：680、1985；Purcelら、Science、244：1281、1986；Wagnerら、米国特許第5,175,385号；Krimpenfortら、米国特許第5,175,384号（各内容が参照として本明細書に組み入れられる）。トランスジェニックマウスを使用して、導入遺伝子を含むES細胞を作製することができ、これらの細胞を本明細書中に記載の方法によって膵臓内分泌細胞に分化させることができる。
【０１１９】
別の態様では、核導入技術を使用して、自家ヒトES細胞を誘導することができる（Coleman および Kind、Trends  Biotechnol．、18：192〜196、2000）。次いで、これらの細胞を使用して、免疫系によって拒絶される膵島細胞に分化させることができる。別の例では、骨髄幹細胞などの他の幹細胞を、多能性幹細胞に脱分化し、これらの多能性幹細胞をその後膵臓系列の細胞に分化させる（Jacksonら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、96：14482〜14486、1999）。
【０１２０】
胚性幹細胞から分化した膵臓内分泌細胞のトランスフェクション
本発明のさらなる態様では、ES細胞またはES細胞から分化した膵臓内分泌細胞を、異種核酸配列でトランスフェクトすることができる。1つの態様では、異種核酸配列は目的のポリペプチドをコードする。1つの態様では、目的のポリペプチドは、膵臓内分泌細胞の成長、発達、代謝、酵素、または分泌経路に関連する任意のポリペプチドまたはタンパク質をコードする。このようなポリペプチドは、天然に存在する膵臓ホルモン、タンパク質、もしくは酵素、またはその断片であり得る。別の態様では、ポリペプチドはマーカーをコードする。別の態様では、ポリペプチドは、プロドラッグの活性な薬剤への変換に関連する酵素である。
【０１２１】
本発明のこの局面によれば、本明細書中に記載のように細胞をインビトロで培養し、異種核酸をコードする外因性遺伝子を、例えばトランスフェクションによって細胞に導入する。トランスフェクトした培養細胞をインビトロで研究または被験体に投与することができる（下記を参照のこと）。
【０１２２】
核酸によってコードされるポリペプチドは、細胞と同一の種に由来するか（相同性）、または異なる種に由来し得る（異種）。例えば、欠損が特定の障害の症状の原因である、宿主の組織によって不十分なペプチド産生を補足または置換された核酸配列を使用することができる。この場合、細胞は、ペプチド源として作用する。1つの特定の限定しない例では、ポリペプチドはインスリンである。したがって、1つの特定の限定しない例では、ヒトインスリンをコードする核酸配列を、ヒト細胞に導入する。別の特定の限定しない例では、ヒトインスリンをコードする核酸を、マウス細胞に導入する。
【０１２３】
1つの態様では、目的の核酸は、内分泌細胞の成長の調節または新生物形質転換に関連するポリペプチドをコードする。目的の核酸配列の特定の限定しない例は、SV40  Tag、p53、myc、src、およびbcl-2である。別の態様では、目的の核酸配列は、酵素をコードする。酵素の特定の限定しない例は、プロドラッグの薬物への変換に関連するタンパク質、プレプロインスリンからプロインスリン、もしくはプロインスリンからインスリンへの変換に関連する酵素、または膵臓前駆細胞の拡大、分化、もしくは生存を促進する成長因子（ニューロトロフィン、bFGF、アクチビンA、およびアクチビンBなど）である。さらに別の態様では、目的の核酸配列は、転写レギュレーターをコードする。転写レギュレーターの特定の限定しない例は、PDX-1、PDX-4、ニューロゲニン3、およびNKX2.2である。理論に拘束されないが、転写レギュレーターをコードする核酸配列の導入により、初期前駆細胞を膵臓内分泌系列により有効に関係付けることができる。転写レギュレーターをコードする核酸配列の導入もまた、関連した膵臓前駆体をより有効に増殖および分化させることができる。さらに、転写レギュレーターをコードする核酸の導入により、インビトロでの培養中および／またはインビボでの細胞の移植後の膵臓前駆細胞の生存率を増加させることができる。
【０１２４】
さらに別の特定の限定されない例では、拒絶を減少させるために核酸配列を導入することができる。例えば、宿主によって「外来物」と認識されるタンパク質を産生する遺伝子の欠失（ノックアウト）、または宿主に対して天然であり、宿主免疫系によって「自己」タンパク質と認識されるタンパク質などのタンパク質を産生する遺伝子の導入によって、細胞の免疫原性を抑制することができる。
【０１２５】
1つの態様では、目的の核酸配列は、転写および／または翻訳調節要素などの調節要素に機能的に連結される。調節要素には、プロモーター、開始コドン、終止コドン、mRNA安定性調節要素、およびポリアデニル化シグナルなどの要素が含まれる。プロモーターは、構成プロモーターまたは誘導プロモーターであり得る。プロモーターの特定の限定されない例には、CMVプロモーター、インスリンプロモーター、および導入遺伝子の誘導発現のためのTET反応要素を含むプロモーターが含まれる。別の態様では、目的の核酸配列を、発現ベクターなどのベクターに挿入する。発現ベクター調製用の手順は当業者に公知であり、Sambrookら、「Molecular Cloning : A Laboratory Manual」、第2版、Cold  Spring  Harbor  Press、Cold  Spring  Harbor、NY、1989で見出すことができる。発現ベクターが適切な宿主細胞に導入された場合、目的の核酸が発現する。
【０１２６】
別の態様では、目的の遺伝子の機能を欠失または「ノックアウト」するようにデザインした核酸を使用してESをトランスフェクトすることができる。この方法では、目的の核酸は、相同組換えを行ってES細胞のゲノムに挿入される核酸である。ES細胞に「ノックアウト」を作製する方法は、当業者に公知である（例えば、米国特許第5,939,598号（参照として本明細書に組み入れられる）を参照のこと）。
【０１２７】
1つの態様では、トランスフェクション用の宿主細胞は、ES細胞である（Levinson-Dushnik および Benvenifty、Mol．Cell．Biol．、17：3817〜3822、1997）。したがって、分化の際、目的の核酸配列でトランスフェクトしたES細胞により、目的の核酸配列を含む膵臓幹細胞または前駆細胞が作製される。次いで、膵臓幹細胞または前駆細胞を、目的の核酸配列を含む膵臓内分泌細胞に分化させることができる。
【０１２８】
別の態様では、宿主細胞は、膵臓内分泌幹細胞または前駆細胞である。分化の際、膵臓内分泌幹細胞または前駆細胞を、目的の核酸配列を含む膵臓内分泌細胞に分化することができる。さらに別の態様では、宿主細胞は、人工島中の膵臓内分泌細胞などのES細胞から分化した膵臓内分泌細胞である。膵臓内分泌細胞または胚性幹細胞への核酸配列の導入方法は、当技術分野で公知である（例えば、米国特許第6,110,743号（参照として本明細書に組み入れられる）を参照のこと）。
【０１２９】
ES細胞から分化した膵臓内分泌細胞の移植
別の態様では、本発明は、本発明の方法にしたがって培養した細胞の被験体への投与によって、内分泌系障害などの疾患または障害を罹患した被験体を治療する方法またはこのような障害の症状を緩和する方法を提供する。内分泌疾患の例には、膵臓内分泌系障害（I型およびII型糖尿病など）が含まれる。
【０１３０】
1つの態様では、本明細書中に記載のように細胞を培養して、分化膵臓内分泌細胞または人工島を形成する。次いで、膵臓内分泌細胞または人工島を、被験体に投与する。
【０１３１】
処方物
先に記載の細胞培養方法にしたがって分化した膵臓内分泌細胞を分化した後、細胞または人工島を薬理学的に許容される担体に懸濁する。適切な担体の特定の制限されない例には、細胞培養培地（例えば、イーグル基礎培地）、リン酸緩衝化生理食塩水、クレブス-リンガー緩衝液、およびハンクス平衡化塩溶液＋／−グルコース（HBSS）が含まれる。
【０１３２】
被験体に投与される細胞懸濁液の体積は、被験体のサイズ、疾患または障害の重症度、および移植部位ならびに溶液中の細胞の量を含むパラメーターの数に依存して変化する。典型的には、被験体への細胞の投与量は、治療有効量である。
【０１３３】
糖尿病被験体には、移植により実質的に有益な効果を得るために、移植あたり少なくとも約1,000、1,000〜10,000、または1,000〜100,000個の生きたインスリン産生細胞が必要であると見積もられる。
【０１３４】
投与方法
胚性幹細胞から分化した膵臓内分泌細胞を、当業者に公知の任意の方法によって投与することができる。1つの特定の限定されない例では、皮下注射、または腎被膜下への移植、肝臓門脈を介した移植、もしくは脾臓への移植によって細胞を投与する。1つの態様では、約1,000〜約10,000個の細胞を移植する。投与方法に基づく場合、移植後の細胞の生存率は一般に低く（5〜10％）、100〜400万個の膵臓内分泌細胞を移植すると見積もられる。
【０１３５】
1つの態様では、注射によって移植を行う。一般に、18〜23ゲージのニードルを備えた滅菌シリンジを使用して注射することができる。正確なサイズのニードルは治療を受ける種および細胞懸濁液または人工島のいずれが移植されるかどうかに依存するが、ニードルはいかなる種においても直径1mm以下であるべきである。当業者に公知の任意の手段によって注射を行うことができる。特定の制限されない例には、皮下注射、腹腔内注射、腎被膜下への注射、門脈を介した注射、および脾臓への注射が含まれる。
【０１３６】
1つの態様では、細胞を被験体に直接投与する。別の態様では、当技術分野で公知の生体適合性基質との同時インキュベーションなどによって投与前に細胞をカプセル化する。種々のカプセル化技術が開発されている（例えば、Lacyら、Science、254：1782〜84、1991；Sullivanら、Science、252：7180712、1991；国際公開広報第91／10470；同第91／10425；米国特許第5,837,234号；同第5,011,472号；同第4,892,538号（それぞれ参照として本明細書に組み入れられる））。
【０１３７】
アルギン酸-ポリリジンカプセル化技術を使用して、膵臓内分泌細胞を移植することができる（O’Shea および Sum、Diabates、35：943〜946、1986；Frischyら、Diabates、40：37、1991）。この方法では、細胞を1.3％のアルギン酸ナトリウムに懸濁し、シリンジを使用したCaCl2への細胞／アルギン酸懸濁液の液滴の放出によってカプセル化する。数回の洗浄後、小滴をポリリジンに懸濁し再洗浄する。次いで、カプセル内のアルギン酸塩を、1mM  EGTAへの懸濁によって再溶解し、Krebs平衡化塩緩衝液で再洗浄する。各カプセルを、数百個の細胞を含み、且つ直径約1mmとなるようにデザインする。細胞を含むカプセルを腹腔内に移植し（約1,000〜10,000個／動物）、血中グルコースおよびインスリンをモニタリングするために血液サンプルを毎日採取する。
【０１３８】
哺乳動物への島組織の他の移植方法が記載されている（Lacyら、前記、1991；Sullivanら、前記、1991；米国特許第5,993,799号（それぞれ参照として本明細書に組み入れられる））。1つの特定の限定されない例では、島を、アクリル中空繊維にカプセル化し、アルギン酸ヒドロゲルに固定する。次いで、これらの中空繊維を、腹腔内または皮下移植する。
【０１３９】
別の態様では、胚性幹細胞由来の膵臓内分泌細胞を、選択的透過膜に島組織をカプセル化した生体ハイブリッド灌流「人工膵臓」の一部として投与することができる（Sullivanら、Science、252、718〜721、1991）。この方法では、管状半透膜を、保護ハウジングの内側に巻きつけて、島細胞区画を得る。次いで、膜の各末端をハウジングを超えて伸長する動脈ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）移植片に接続し、このデバイスを動静脈シャントとして血管系に連結する。他の適切な方法が当業者に公知である。
【０１４０】
さらなる詳述することなく、当業者は本説明を使用してその最も広い範囲で本発明を利用することができる。以下の実施例は例示のみを意図し、本開示の他の要素をいかなる方法によっても制限するものではない。
【０１４１】
実施例1
膵臓内分泌細胞の作製方法
実験ストラテジーを、図1Aで概説する。ネスチン陽性細胞集団を、無血清培地での選択（第3段階）によって胚様体（EB、第2段階）から作製した。次いで、ネスチン陽性細胞を、マイトジェン（塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF、第4段階））の存在下で拡大し、マイトジェン除去後にネスチン陽性前駆体を分化させた（第5段階）。
【０１４２】
膵臓内分泌細胞の収率を改善するために、図1Aに概説するように、B27培地補足物質（Brewerら、J．Neurosci．Res．、35：567、1993）およびニコチンアミド（Otonkoskiら、J．Clin．Invest．、92：1459、1993）を含めることによって培養系を改変した。詳細には、B27培地補足物質（Gibco  BRL、Gaithersburg、MA）を、製造者が推奨する濃度で添加し、ニコチンアミド（Sigma、St．Louis、MO）を、10mMの濃度で添加した。次いで、細胞から抽出した核酸に対してRT／PCR分析を行った。
【０１４３】
以前に記載のように（Leeら、Nat．Biotechnol．、18、675、2000）全細胞RNAの精製およびRT／PCRを行った。配列決定によってPCR産物の同一性を確認した。5’→3’方向の正方向および逆方向プライマー配列および増幅産物の長さを以下に示す。
2005503759.tif 000004
【０１４４】
第1段階および第5段階（図1B）での内分泌膵臓遺伝子発現のRT／PCR分析は、マウスインスリン（インスリンIおよびインスリンII）（Wentworthら、J．Mol．Evol．、23：305、1986）およびグルカゴン（Rothenbergら、J．Biol．Chem．270：10136、1995）の両形態が第5段階で発現したことを示した。島アミロイドポリペプチド（IAPP、Ekawaら、Mol．Endocrinol．、19：79、1997）およびβ細胞特異的グルコース輸送体（Glut2、Waeberら、J．Biol．Chem．、28：26912、1994）もまた誘導された。膵臓発達において重要な役割を果たすことが公知の膵臓転写因子PDX-1（Ohlssonら、EMBO  J．、12：4251、1993；Guzら、Development、121：11、1995）を、未分化ES細胞中で発現させた。RT／PCR分析の結果により、開発した分化条件は膵細胞の分化を支持することが示唆される。
【０１４５】
実施例2
膵臓内分泌細胞の同定
免疫細胞化学を使用して、ES細胞培養物中のネスチン陽性前駆体、ニューロン、およびインスリン陽性細胞を同定した。詳細には、細胞を、4％パラホルムアルデヒド／0.15％ピクリン酸のPBS溶液で固定した。免疫細胞化学は標準的なプロトコールを使用して行った。以下の一次抗体を、以下の希釈度で使用した：ネスチンウサギポリクローナル抗体（1:500）（本発明者らの研究室で作製）、TUJ1マウスモノクローナル抗体（1:500）、TUJ1ウサギポリクローナル抗体（1:2000）（共にBabco、Richmond、CA）、インスリンマウスモノクローナル抗体（1:1000）（Sigma、St．Louis、MO）、インスリンモルモットポリクローナル抗体（1:100）（DAKO、Carpinteria、CA）、グルカゴンウサギポリクローナル抗体（1:75）（DAKO）、ソマトスタチンウサギポリクローナル抗体（1:100）（DiaSorin、Stillwater、MN）、GFP（1:750）ポリクローナル抗体（Molecular  Probes、Eugine、OR、BRDUラットモノクローナル抗体（1:100）（Accurate、antibodies、Westbury、NY）。一次抗体の検出のために、製造者が推奨する方法に従って、蛍光標識二次抗体（Jackson  Immunoresearch  Laboratories、West  Grove、PAおよびMolecular  Probes）を使用した。
【０１４６】
第3段階の終わりに向かってネスチン特異的染色強度が増加した。第1段階および第2段階ではインスリン陽性細胞は検出されなかったが（図1Aを参照のこと）、第3段階の終わりまでにインスリン陽性細胞がわずかに認められた。第4段階の終わりには、bFGFの存在下で、多数のインスリンおよびTUJ1陽性（ニューロン特異的β-IIIチューブリン、31）細胞が存在した。マイトジェン除去後にインスリン染色を増加しつづけ、第5段階の終わりまでに多数の強力に染色されたインスリン陽性細胞が得られた。ニューロンの数および成熟状態もこの時期に増加し、第5段階の終わりまでにニューロンと密接に会合した固いクラスター中に大部分のインスリン陽性細胞が局在していた。
【０１４７】
共焦点顕微鏡を使用して、細胞クラスターの形態学を分析した。低出力画像は、クラスター中心の多数の細胞がインスリン陽性であり（図2A）、インスリン陽性細胞の周囲およびその上にニューロンが成長することを示す。この相対的なインスリン細胞およびニューロンの特殊な分布は、クラスターの側面図で特に明らかであった。共焦点画像では、いかなる発生段階であってもいかなるTUJ1／インスリン二重標識細胞を検出できなかった。
【０１４８】
分化を特徴付けるために、インスリンおよび他の3つの膵臓内分泌ホルモンのさらなる二重免疫染色を行った：グルカゴン、ソマトスタチン、および膵臓ポリペプチドは、島中で個別の細胞によって正常に産生された。3つの全ホルモンを、クラスター中の細胞によって作製した（例えば、図2）。大部分のグルカゴンおよびソマトスタチン細胞は、インスリン細胞を取り囲む。外分泌膵臓マーカーであるアミラーゼおよびカルボキシペプチダーゼAの発現はRT／PCRによって検出されず、免疫細胞化学によって検出されるアミラーゼの発現でもないことに留意することが重要である。この系におけるニューロンおよび内分泌細胞の相対的分布により、この系の、インビボでの膵島に形態学的に類似した多細胞構造を作製する顕著な能力が示される。
【０１４９】
実施例3
インビトロで作製された膵臓内分泌細胞：膵島細胞の研究のためのモデル系
上記の結果は、このES細胞由来の分化系により膵臓前駆体の個体発生および性質を調査するための強力なツールが得られることを示す。この系の分析能力を、以下の質問を行うことによって評価した：（i）ネスチン陽性細胞集団中に膵臓細胞および神経細胞の共通の前駆体は存在するか、（ii）インスリン陽性細胞は分裂するのか、および（iii）培養のどの段階でインスリン陰性前駆体はインスリン発現を開始するのか。
【０１５０】
第1の質問を、クローン分析を使用して評価した。第3段階のGFPトランスジェニックマウス由来のB5 ES細胞を、最終濃度1B5細胞／40,000野生型E14.5細胞／ウェルの第3段階のE14.5 ES細胞と共にポリオルニチン＋フィブロネクチン処理96ウェルプレート（Costar3603：透明で底の薄い黒色プレート）上でクローン密度で同時培養した。次いで、図1Aに記載のように、細胞を拡大させ、分化させた。分化6日目に、細胞を4％パラホルムアミドで固定し、その後三重免疫細胞化学およびレーザー共焦点分析を行った。免疫細胞化学のために、培養物を10％正常ヤギ血清／0.3％トリトン-X100で遮断した後、細胞を、インスリン（マウスIgG1）、GFP（マウスIgG2a）、およびTUJ1（ウサギ）に対する抗体で染色した。それぞれIgG1マウス、IgG2aマウス、およびIgGウサギに対するCy5、FITC、およびCy3結合ヤギ抗体を、二次抗体として使用した。1つの細胞由来のクローン細胞子孫を、GFPの発現によって同定した。1つの細胞由来のGFP標識クローンは、96ウェルプレートの18〜20％のウェルで同定した。ウェルあたり1つのGFP標識クローンのみが存在する。
【０１５１】
詳細には、緑色蛍光タンパク質（GFP、Hadjantonakisら、Mech．Dev．、76：79、1998）でタグ化したB5 ES細胞および野生型E14.1 ES細胞（Kaoら、Ophthalmol．Vis．Sci．、37：2572、1996）を第1段階〜第3段階で個々に培養してネスチン陽性集団を作製した。この後、第4段階および第5段階の間に2つのES細胞系統を同時培養して、非標識E14.1細胞の間で惹起したGFP標識B5細胞の各クローンを得た。インスリン陽性細胞は、インスリンが局在する領域の周辺にGFPを発現することが見出され、GFP発現は、分化細胞でしばしば下方制御された。第5段階でのGFP陽性クローンの分析は、大部分のクローンがニューロン細胞またはインスリン陽性細胞のいずれかを含むことを示す。しかし、インスリンおよびTUJ1標識細胞の両方を含むクローンは稀であり、これにより、同時培養開始時の第4段階の始まりにおいて細胞集団中にニューロン細胞および内分泌細胞の共通の前駆体が存在することが示唆される。
【０１５２】
第2の質問に答えるために、増殖細胞を、培養の間の異なる測定時点においてブロモデオキシウリジン（BrdU）で標識し、その直後に細胞を固定し、インスリンおよびBrdUに対する抗体で免疫染色した。細胞を、10μMの最終濃度で24時間BrdU（Boehringer  Mannheim、Indianapolis、IN）で標識した。標識後、特定の実験に依存して、直ちに細胞を4％パラホルムアミド／0.15％ピクリン酸で固定し、95％エタノール／5％氷酢酸にて室温で15分間処理し、免疫細胞化学に供するか、または種々な長さの培養後に免疫細胞化学によって分析した。細胞増殖のピークは、第4段階の終わりと一致し、BrdU／インスリン二重標識細胞はいかなる段階でも見出されなかった。これらの結果により、このES細胞系では、正常な膵臓前駆体のインビトロ培養物と同様に（Vinikら、Horm．Metab．Res．、29：278、1997）、インスリン発現の開始は、前駆体細胞増殖の阻害と一致することが示唆される。
【０１５３】
第3の質問には、最初に細胞をBrdUで標識し、その後異なる期間BrdUの非存在下でインキュベートするBrdUパルス／追跡プロトコール（この後にインスリンおよびBrdUの免疫染色が続く）を使用して取り組んだ。この実験物の定量分析により、増殖から分化への切り替えを定義する。これらの研究では、第4段階の2日目に増殖した8.8＋／−2.7％（n＝3）の細胞は、第4段階の6日目までにインスリンが陽性となる。それに対して、第4段階の5日目に増殖した42.2＋／−5.9％（n＝3）の細胞は、第5段階の3日目までにインスリンが陽性となった。これらの結果により、第4段階の終わりに膵臓前駆体が有意に拡大し、第4段階と第5段階との間の移行期に増殖から分化に劇的に移行することが確立された。
【０１５４】
実施例4
インビトロでの膵臓内分泌細胞：インスリン放出の速度論および薬理学を研究し、インスリン分泌に影響を与える薬剤を研究するためのツール
グルコース依存性インスリン放出の速度論および薬理学を測定するために、一連の実験を行った。120mM  NaCl、5mM  KCl、2.5mM  CaCl2、1.1mM  MgCl2、25mM  NaHCO3、および0.1％ウシ血清アルブミンを含む37℃のクレブス-リンガー重炭酸緩衝液中でインスリン分泌を測定した。プレインキュベーション（30分間）およびインキュベーション期間全体でインスリン分泌の阻害物質（ニフェジピンおよびジアゾキシド）を緩衝液に添加した。総細胞インスリン含有率検定のために、インスリンを4℃で一晩酸エタノール（10％氷酢酸の無水エタノール溶液）を使用して細胞から抽出し、その後細胞を超音波処理した。総細胞インスリンおよび分泌インスリンを、インスリンELISAキット（ALPCO、Windham、NH）を使用してアッセイした。タンパク質濃度を、DCタンパク質アッセイ系（Bio-Rad、Hercules、CA）を使用して決定した。
【０１５５】
第5段階の終わりに、細胞は、用量依存様式でグルコースに反応してインスリンを放出する（図3A）。インビトロでの一次膵島で類似の用量反応曲線が認められた（Csernusら、Cell．Mol．Life  Sci．、54：733、1998）。第4段階および第5段階の終わりでのインスリン含有量とインスリン放出の比較（以下の表1を参照のこと）は、インスリン分泌島クラスターの成熟が第5段階の間に進行して総インスリン細胞含有量が5倍になり、グルコース刺激インスリン放出が第4段階と第5段階との間に40倍以上増加することを示した。
【０１５６】
【表１】
2005503759.tif 000005
＊20mMグルコース刺激に反応し、5分以内に放出されたインスリン
【０１５７】
表1．ES細胞は、インスリンを貯蔵および放出するために段階的に分化する。拡大および分化段階の終わりに、細胞の性質が認められる。グルコース誘導性インスリン放出データは、20mMグルコース刺激から5分以内に分泌されたインスリン量に対応する。示したデータは、同一のES細胞培養物の三連のウェルの平均±SEMを意味する。この結果は、3回の独立した実験において再現された。
【０１５８】
島クラスターが生理学的グルコース媒介シグナル伝達経路を使用するかどうかを決定するために、いくつかの十分に特徴付けられたインスリン分泌のアゴニストおよびアンタゴニストとの効果を試験した。インビボでグルコースがインスリン分泌を刺激する機構は複雑である。図3Bに概説するように、グルコースの細胞への輸送およびその代謝によりATPが産生される（順に、ATP依存性K＋チャネルが阻害され、細胞膜が脱分極し、電位依存性Ca＋＋チャネルが開口し、細胞外Ca＋＋が細胞に流入する事象）。さらに、細胞内Ca＋＋を、他の機構を介した細胞内貯蔵物からのCa＋＋の放出によって上昇させることができる。遊離の細胞内Ca＋＋の上昇は、プロテインキナーゼC（PKC）およびプロテインキナーゼA（PKA）カスケード（最終的に細胞からインスリンを放出させる）によって調整される複数のリン酸化事象に関連している（McClenaghanら、J．Mol．Med．、77、235、1999）。
【０１５９】
インスリン分泌のアゴニストおよびアンタゴニストの効果の結果を図3Cおよび3Dに示す。試験した全アゴニスト（ATP依存性K＋チャネルのスルホニル尿素阻害物質（トルブタミド、Trubeら、Pfugers  Arch．、407：493、1986）、サイクリックAMP（cAMP）ホスホジエステラーゼの阻害物質（3-イソブチル-1-メチルキサンチン、IBMX、Montagueら、Biochem．J．、122、115、1971）、およびムスカリン様コリン作動性受容体（カルバコール、Ahrenら、Prog．Brain  Res．、84：209、1990））は、低濃度（5mM）のグルコースの存在下でインスリン分泌を刺激した。逆に、アンタゴニストスルホンアミド（ATP依存性K＋チャネルのジアゾキシド活性化因子（Trubeら、Pflugers  Arch．、407：493、1986））およびニフェジピン（L型Ca＋＋チャネルの遮断薬であって、Ca＋＋チャンネルの1つはβ細胞中に存在する）（Rojasら、FEBS  Lett．、26：265、1990）は、高グルコース濃度（20mM）の存在下でインスリン分泌を阻害した。これらの結果は、正常な膵臓機構がグルコース媒介インスリン放出に使用されていることを示す。
【０１６０】
実施例5
インスリン産生細胞の動物モデルへの移植
インビトロでの分化6日後のインスリン細胞クラスターを、トリプシンまたはEDTAによって組織培養プラスチックから剥離し、培養培地に懸濁し、ストレプトゾトシン誘導性糖尿病マウスに皮下移植した。島のクラスターを、組織培養プラスチックから剥離した。動物または約300万個から500万個の細胞あたり1つの6cmの集密的なプレートの内容物を動物の肩甲骨間または胸郭付近に皮下注射した。別の投与経路は、門脈、腎被膜下、または脾臓への注射である。
【０１６１】
これらの実験では、インスリン産生細胞の生存および移植片の脈管形成を試験した。細胞移植から2週間および6週間後に分析を行った。移植片の脈管形成の拡大および両測定時点でのインスリン細胞の良好な生存が認められた。
【０１６２】
細胞移植片を投与した糖尿病動物は、移植から6週間後（分析のために6週間で動物を屠殺した）に大きな体重減少も無く生存した。全ての偽移植動物は偽移植から4週間以内に死亡した。移植動物の糖血症状態を評価するために、動物の血中グルコース量を決定した。詳細には、糖度計を使用して、血中グルコース量を測定する。正常な動物のグルコースレベルは、約90mg／dl〜約150mg／dlであるが、糖尿病動物のグルコースレベルは約200mg／dl〜約600mg／dlである。細胞移植片の移植は、血中で認められるグルコースの量を正常レベルに修正する。
【０１６３】
インスリン細胞培養物を、目的の遺伝子によってトランスフェクトすることもできる。この態様では、移植前に形質転換を行う。目的の遺伝子の例は、PDX-1である。
【０１６４】
別の態様では、異なる分化段階の膵臓前駆細胞を、胚または成体動物に導入して、インビボでの増殖、生存、および分化を研究する。
【０１６５】
インビトロでの分化から6日後のインスリン細胞クラスターを、トリプシンまたはEDTAによって組織培養プラスチックから剥離し、培養培地に懸濁し、糖尿病または非胚性動物に皮下移植した。動物は、成体動物または胚のいずれかである。成体動物への導入のために、島のクラスターを、組織培養プラスチックから剥離した。下記のように、細胞を成体動物に導入する。胚への導入のために、膵臓内分泌細胞のクラスターを子宮内で導入し、細胞の発達をモニタリングする（Pscheraら、J．Perinatal．Med．、28：346〜54、2000）。
【０１６６】
実施例6
インスリン細胞クラスターの解離および再会合
天然の解離膵島は、再会合して正常な島の構造を有する三次元凝集体を形成することができる（Halbanら、Diabetes、36、783〜90、1987）。ES細胞由来のインスリンクラスターの、類似した凝集体を形成する能力を調査した。分化から7日後の細胞クラスターを、カルシウムの非存在下およびEDTAの存在下で生理学的緩衝液中の組織培養プラスチックから剥離し、各細胞をクラスターの皮下注射針の通過によって得た。細胞は、種々な長さの時間で懸濁液中で凝集した。各細胞から、天然の膵島細胞に類似した速度および凝集形態の第2次細胞凝集体が直ちに形成された。これらのクラスターは、インビボでの移植および膵島形態発生機構の調査に有用である。
【０１６７】
本明細書中に記載の結果は、ES細胞はインスリン含有量が高い細胞に増殖および分化する内分泌前駆細胞を作製することができることを示す。グルコースに曝露した場合、これらの細胞は、生理学的に関連する機構を使用して速い速度でインスリンを放出する。重要なことには、この系で産生されるインスリン産生内分泌細胞および他のホルモン産生内分泌細胞は、正常な膵島の形態学的および機能的特徴を有する構造に自己組織化する。この利点は、いくつかの理由で特に重要であり得る。第1に、インビボで得ることが困難であるか不可能である初期の内分泌前駆細胞、および膵島の形態学を研究するためのアクセス可能なモデル系を提供する。第2に、このES細胞系により、インスリン分泌調節に重要な役割を果たすことが公知の他の島細胞型と関連させてインスリン分泌細胞を日常的に産生可能である（Ahren、Diabetologia、43：393、2000；Soriaら、Pflugers  Arch．、440：1、2000）。異なる細胞型の、組織化された構造への自己組織化により、グルコースホメオスタシスの繊細な制御に関連する機構の強力な分析系が得られる。第3に、ヒトES細胞に提供した場合、この分化系により、インスリン耐性が通常β細胞機能の減少およびインスリン欠損症によるI型およびII型糖尿病治療のための機能的膵島の制限のない供給源が得られる（Hammanら、Diabetes  Metab．Rev．、8：287、1992）。最近の研究により、死体から得た膵島は門脈への移植後に肝臓で機能することができることが示唆される（Shapiroら、N．Engl．J．Med．、27：230、2000）。しかし、島移植の広範な適用は、適切な組織の利用可能性および移植片の免疫学的拒絶によって制限される。一般に、拒絶の問題を低減または排除するようにES細胞を遺伝的に操作することができるので、ES細胞は免疫学的に適合する多数の膵島の供給源として非常に期待されている。
【０１６８】
実施例7
生体人工膵臓中のES細胞から分化した膵臓内分泌細胞の使用
インスリンを必要とする真性糖尿病患者の血中グルコースレベルを制御する目的でホルモンインスリンを供給することができる、ランゲルハンス島またはインスリン産生β細胞を含む生体適合性且つ移植不可能なデバイスを得ることが必要である。糖尿病患者の血中グルコースレベルの不十分な調節は、長期の健康上の問題（腎疾患、盲目、冠状動脈疾患、脳卒中、および結果として切断につながる壊疽）の発症に関連している。したがって、血中グルコースレベルをさらに正確に制御することができるデバイスを従来のインスリン注射と置き替える必要がある。
【０１６９】
真性糖尿病患者における罹患した膵臓β細胞機能を置換する多数の様式が現在利用可能である。電気機械的様式は、グルコースセンサーによって継続的に測定される血中グルコースレベルに反応してインスリンを放出するインスリン送達系を使用する。センサーでは困難であるので、連続灌流ポンプを介したプログラム化されたインスリン送達を開発する。しかし、このアプローチはまた、インビボでの調節（すなわち、グルコースによるインスリン分泌の調節ならびにいくつかのホルモンおよび神経因子によるその調整）が不十分である。
【０１７０】
膵臓移植は別のアプローチである（例えば、Shapiroら、N．Engl．J．Med．、343（4）：230〜8、2000を参照のこと）。不運なことに、このアプローチには、移植可能な組織の制限および免疫拒絶という問題がある。
【０１７１】
これらの問題を克服するために、生体人工膵臓を開発されている。これらの系は、人工的障壁によって移植組織を糖尿病レシピエントから分離して、免疫拒絶を減少させ、さらに血液から島細胞への血糖シグナルを伝達し、島細胞から血液に膵臓ホルモンを伝達することができる。人工膵蔵は、グルコースおよびインスリンを透過するが、免疫グロブリンおよび免疫細胞を透過しない選択的透過障壁を有することによってこれを克服する。人工膵臓デバイスは、膜を通した血液から膵臓内分泌細胞への血糖シグナルおよび膵臓内分泌細胞からレシピエントへのインスリンによる伝達に基づいて作用する。1つの態様では、膵臓内分泌細胞は、島の形態である。
【０１７２】
一般に、膜を介したある区画から他の区画への物質の移動を、拡散、透析、対流、限外濾過、またはこれらの方法の組み合わせのいずれかによって行うことができる。人工膵臓は、一般に、拡散機構を利用するもの、対流機構を利用するもの、または両機構の組み合わせを利用するものに分類される。拡散は、溶媒の移動を使用しない物質自体の移動を示す。それに対して、対流は、膜の孔よりも小さい限り、溶媒および溶媒に溶解した任意の分子の移動を含む。
【０１７３】
人工膵臓としての膵臓内分泌細胞用の適切なデバイスは、当技術分野で周知である。特定の制限されない例では、使用デバイスは、米国特許第5,741,334号、同第5,702,444号、同第5,855,616号、同第5,913,998号、同第6,023,009号、同第6,165,225号（その全てが参照として本明細書に組み入れられる）で開示されている。
【０１７４】
したがって、本明細書中に開示の方法を使用して、膵臓内分泌細胞、ES細胞から分化した人工島、またはES細胞から分化した再凝集膵臓内分泌細胞を作製することができる。次いで、これらの細胞は、生体人工膵臓としてデバイス中に含まれ、次いでこの生体人工膵臓を被験体に移植する。生体人工膵臓の移植により、障害が治療される。態様では、生体人工膵臓の移植により、糖尿病が治療される。
【０１７５】
実施例8
ES培養物の分化を調節するためのLIFの使用
転写因子PDX-1は、膵臓発達において重要な役割を果たし、成体内分泌膵臓遺伝子発現機構の基本的成分である（Ahlgrenら、Development、122（5）、1409〜16、1996；Jonssonら、Nature、371（6498）：606〜9、1994を参照のこと）。さらに、転写因子であるイングライルド（engrailed）-1（EN-1）は、CNSにおける神経発達の主要なレギュレーターの1つである（Simonら、J．Neurosci．、21：3126〜3134、2001）。
【０１７６】
本明細書中に開示の方法には、以下の5つの段階が含まれる。（1）ES細胞の拡大、（2）EBの作製、（3）CNS前駆細胞の選択、（4）膵臓（中枢神経系（CNS）に対する）前駆細胞の拡大、および（5）膵臓内分泌細胞の分化（神経細胞の分化に対する）。ES細胞の拡大およびEBの作製を、本明細書中に開示のように行った。DMEM／LIF（1000単位（U）／ml）を含む15％血清（ES培地）中で4日間2日毎に培地を交換しながらEBを培養した。4日後、EBを組織培養皿に移し、フィブロネクチンを含むITS培地中で10〜12日間培養した。第II段階でLIFの非存在下で維持されたEBは、第II段階でLIFの存在下で培養したEBと表現型的に異なっていた。第IV段階では、ES由来のCNS前駆体を、bFGF（20ng／ml）およびShh（500ng／ml）およびFGF8（100ng／ml）の存在下でのN2培地で4日間培養し、bFGF／SHH／FGF8の除去後、アスコルビン酸を含むN2培地中で10〜12日間これらの細胞を分化させた。詳細には、LIFの非存在下で培養したEBを、第III段階で散開させた。LIFで処理したEBは丸型を維持し、CNS前駆細胞は皿中のEBの接着点から移動した。したがって、CNS前駆体の選択を、LIFの存在下での培養によって行った。
【０１７７】
第2段階（EB形成）でLIFによるES細胞培養物の処理により、第4段階でのEN-1の発現が増加する。詳細には、第2段階でLIFが存在する場合、80％までの全ES細胞由来の細胞集団が第4段階でEN-1陽性となる。この処理の結果として、第5段階でのニューロンの総収率も増加する。これらの条件下で、ごく少数のPDX-1陽性細胞が作製された。
【０１７８】
逆に、第2段階でES細胞培養物にLIFを含めない場合、または非常に低濃度のLIFが含まれる場合、第4段階でのEN-1細胞数は、劇的に減少し、PDX-1陽性細胞数は増加する（図5を参照のこと）。これらの実験は、LIF処理を使用してES細胞培養物の発達を制御することができることを示す。したがって、1つの態様では、第2段階でLIFが存在しないことにより、インスリン産生細胞のPDX＋前駆体の産生が増加する。いくつかの態様では、インスリン産生細胞を作製するために、第2段階でES培養物を、500U／ml未満の外因的に添加したLIF、200U／ml未満の外因的に添加したLIF、100U／ml未満の外因的に添加したLIF、50U／ml未満の外因的に添加したLIF、10U／ml未満の外因的に添加したLIF、1U／ml未満の外因的に添加したLIFで処理するか、またはLIFを添加しない。
【０１７９】
参照
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【０１８０】
本発明の原理を適用することができる多数の可能な態様を考慮して、例示の態様は本発明の好ましい例のみであり、本発明の範囲を制限すると解釈すべきではないと認識すべきである。むしろ、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって定義される。したがって、本発明者らは、これらの特許請求の範囲の範囲内および精神の範囲内で起こる全てを本発明として主張する。
【図面の簡単な説明】
【０１８１】
【図１】ES細胞の膵臓内分泌細胞への分化についてのプロトコールの1つを示す図である。
【図２】胚性幹細胞から分化したインスリン産生細胞が異なるホルモン産生細胞型を含み、膵島の位相的組織化によって三次元クラスターに組織化されることを示すデジタル画像である。図2Aはグルカゴン産生細胞の外層（白色）に囲まれたインスリン細胞の内部中心（灰色）を示す。図2Bは、ソマトスタチン産生細胞の外層（白色）に囲まれたインスリン産生細胞の内部中心（灰色）を示すデジタル画像である。
【図３】島クラスターが正常な膵臓機能を使用し、グルコースに反応してインスリンを放出することを示すグラフおよび図のセットである。図3Aは、異なるグルコース濃度に反応したインスリン放出のグラフである。50mMのスクロースへの曝露を使用して、インスリン放出に対する高容積モル浸透圧濃度の潜在的な効果を試験した。図3Bは、インスリン分泌に対するグルコース、cAMP、K＋、およびCa2＋の作用を記述した概略図である。インスリン放出の既知の薬理学的調節因子の効果を示す。DAG、ジアシルグリセロール；PKA、プロテインキナーゼA；PKC、プロテインキナーゼC；PLC、ホスホリパーゼC。図3Cは、5mMのグルコースの存在下での種々の分泌促進物質に反応するインスリン放出の概略図である。図3Dは、インスリン放出の阻害物質の存在下または非存在下での20mMグルコースに反応したインスリン放出を示す棒グラフの組である。
【図４】膵臓内分泌幹細胞から分化したα細胞、β細胞、δ細胞、およびPP細胞までの膵臓内分泌細胞の分化の略図である。
【図５】ES細胞の神経細胞および膵臓細胞への分化を示すパネルのセットである。図5Aは、以前に記載のように（国際公開広報第01／83715号（参照として本明細書に組み入れられる）を参照のこと）ES細胞由来の中脳ドーパミン作動性ニューロンの誘導させる際の細胞を示すデジタル画像のセットである。簡単に述べれば、ES細胞は、5工程または段階を経た。第1段階では、未分化ES細胞を、LIF（1,400U／ml）の存在下でゼラチン被覆組織培養皿上で15％ウシ胎児血清（FCS）の存在下で5日間培養した。第2段階では、LIF（1,000U／ml）の存在下または非存在下で4日間FCSの存在下で胚様体（EB）を作製した。第3段階では、EBを、10日間にわたり細胞凝集体からネスチン＋細胞を移動させたITSFn培地（Okabeら、Mech．Dev．、59：89〜102、1996）に播種した。第4段階では、これらのネスチン＋細胞を再懸濁し、bFGF、ソニックヘッジホッグ（Shh）、および線維芽細胞成長因子8（FGF8）を含むN2培地中で4日間拡大した。第5段階では、培地を、bFGF、Shh、またはFGF8を含まないN2培地と交換した。これらの細胞は2週間にわたり効率的にニューロンおよび星状細胞に分化した。LIF（1000U／ml）の存在下（LIF＋）または非存在下（LIF-）で胚様体を作製し、分化した。TuJ1／GFAP（上のパネル、第5段階の8日目）およびPDX-1／En-1（下のパネル、第4段階の3日目）の二重免疫染色。第2段階でのLIF処理（EB形態）により、神経（TuJ1＋細胞、明灰色）が増加し、星状細胞（GFAP＋、暗灰色）集団が減少する。LIF処理により、中脳前駆細胞（En-1＋細胞、暗灰色）を効率よく増強し、膵臓前駆細胞（PDX-1＋細胞、明灰色）を下方制御する。図5Cは、En-1＋細胞およびPDX-1＋細胞の収率を第4段階での全細胞の比率として示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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