(57)【要約】  生体分子の高速処理及びデポジットに利用可能な装置及び方法。この方法は下記ステップ、すなわち：分析されるべき第1検体セットを受容するステップと；アレイ形式で検体が、前記生体分子が固相手段に付着する抽出手段を通るようにするステップと；前記固相手段を洗浄液で洗浄し、前記生体分子だけを残すステップと；有機溶剤の部分がそれぞれの前記固相を通るようにすることにより、溶出を行い、前記溶出の結果として、前記生体分子を含有する第2検体セットを構成する溶出液を形成するステップと；ミクロ分配アレイを使用して、アレイ形式で前記第2検体セットを分配するステップと；前記第2検体セットのそれぞれ1つの検体の正確な量を、標的プレートの標的領域上に分配するように、前記アレイを制御するステップとを含む。
2005513472.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子を処理してデポジットするのに利用可能な方法であって、下記ステップ：
分析されるべき第1検体セットを並列に受容するステップと；
前記検体のそれぞれ1つが、前記生体分子が固相手段に付着する抽出手段を通るようにするステップと；
前記固相手段を洗浄液で洗浄し、前記生体分子だけを残すステップと；
有機溶剤の部分がそれぞれの前記固相を通るようにすることにより、溶出を行い、前記溶出の結果として、前記生体分子を含有する第2検体セットを構成する溶出液を形成するステップと；
前記第2検体セットのそれぞれ1つの検体をミクロ分配アレイに導くステップと；
画分から成る前記第2セットのそれぞれ1つの画分の正確な量を、標的プレートの標的領域上に分配するステップと；
該ディスペンサーからの液滴分配間の時間を制御するステップと；
該プレートの温度を制御するステップと；
標的領域内に配置された消化酵素によって、前記タンパク質を消化してペプチドにするステップと
を含むことを特徴とする、生体分子を処理してデポジットするのに利用可能な方法。
【請求項２】
各スポット内の蒸発により検体が富化されるように、前記正確な量の分配間の時間を制御するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
効率的な蒸発が可能になるように、該プレートの温度を制御するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
標的プレートに配置された消化酵素によって、前記生体分子を消化して生体分子画分にするステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
該消化プロセスの消化速度が最適化されるように、前記プレートの温度を制御するステップをさらに含む、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
該ディスペンサー・アレイに新しい標的領域列が利用可能になるように、該標的プレートを機械的に移動するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
該標的プレートを質量分析計に機械的に移動するステップと；
該受容プレートの各標的領域上で質量分析を行い、ペプチド・シグネチャーを測定するステップと；
前記ペプチド・シグネチャーを記録するステップと；
各標的領域内の種々異なるタンパク質の存在及び含量を決定するために、既知のタンパク質のペプチド・シグネチャーのライブラリに、前記測定されたペプチド・シグネチャーをマッチングするステップと
をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
前記分配が、アレイ形式の圧電分配を用いて実施される、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
前記分配が、アレイ形式のエレクトロスプレイ法を用いて実施される、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
1つ以上の細長いチャネル又は溝(101)を含む抽出装置であって、前記溝が、第1及び第2のポートを備えた第1の端部(102)と第2の端部(103)とを有しており、格子手段によって該溝内部に保持された有孔床(201)を備えており、前記有孔床(201)がタンパク質付着ユニットを備えており、前記抽出装置がさらにドッキング手段を含み、該ドッキング手段が、該抽出装置がフィード装置から取り外され、そして洗浄装置又は溶出装置と接触させられるのを可能にすることを特徴とする、抽出装置。
【請求項１１】
該抽出装置が2つ以上の溝を含み、前記溝のそれぞれが、ケイ素プレート内にトレンチを含み、各トレンチが、(各側の)隔壁によって隣のトレンチから隔離されており；前記装置がまた、該入口及び出口を除いて、前記トレンチのシーラントとして役立つガラス層を含み、前記層が前記ケイ素プレートに化学的に結合されている、請求項10に記載の装置。
【請求項１２】
前記ドッキング手段が、漏れ発生を防止するポリマー・フィルムを含む、請求項10に記載の装置。
【請求項１３】
前記ドッキング手段が多数のOリングを含み、該Oリングが漏れ発生を防止する、請求項10に記載の装置。
【請求項１４】
1つ以上の細長いチャネル又は溝(101)を含む抽出装置であって、前記溝が、第1及び第2のポートを備えた第1の端部(102)と第2の端部(103)とを有しており、前記溝が有孔壁又は有孔面を有しており、前記有孔壁又は有孔面が生体分子付着ユニットを備えており、前記抽出装置がさらにドッキング手段を含み、該ドッキング手段が、該抽出装置がフィード装置から取り外され、そして洗浄装置又は溶出装置と接触させられるのを可能にすることを特徴とする、抽出装置。
【請求項１５】
該抽出装置が、ディスペンサー・ノズルを含むディスペンサー、槽、並びに、該ノズルと整列されたフレキシブルな膜及び圧電素子をさらに含み、前記圧電素子が、該膜を制御可能に押し下げるように配置されており、これにより正確な量の液体を分配させる、請求項14に記載の装置。
【請求項１６】
前記隔壁が、前記ディスペンサーへの進路の一部にわたって延びている、請求項11に記載の装置。
【請求項１７】
前記隔壁が前記ディスペンサーへの進路全体にわたって延びており、各溝からの流れを機械的に隔離する、請求項11に記載の装置。
【請求項１８】
溶出強度が異なる例えば3種の溶出溶剤中の「ステップ溶出」に際して、試料をディスペンサーに輸送するための手段を備えている、請求項14に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は化学分析のための方法及び装置に関する。より具体的には本発明は、生体試験片を処理する装置に関する。さらにより具体的には、本発明は、例えばマトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型 (MALDI-TOF)質量分析計を使用した質量分析によって後続の分析を行うための、生体分子、例えばタンパク質を含有する試料の無人調製装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
化学分析、及び具体的には生体試験片内の例えばタンパク質の生体分子分析のスピード及び精度に対する要求が高まっている。増大しつつある試験片取扱い時間、試験片の異なる部分の分離、抽出及び調製に対応する様々な技術が提案されている。
【０００３】
マトリックス支援レーザー脱離(MALDI)によるイオン化を伴う質量分析は、大型分子を有する生体物質の分析のための標準的な手順として確立されている。これを目的として、飛行時間型質量分析型(TOF-MS)が通常採用されるが、フーリエ変換イオン・サイクロトロン共鳴質量分析計(FT-ICR)又は4重極イオントラップ質量分析計(略してイオントラップ)も利用されている。
【０００４】
以下、被験生体物質の分子を単に「検体(analyte分析物)分子」又は「生体分子」と呼ぶ。全ての場合において、検体分子は、水溶液中の極めて希薄な形、純粋形、又は有機溶剤との混合形で存在する。これらの分析溶液は極めて複雑であり、例えば体液の場合、分析手順の要件に関して高度の不純物を含有することがある。
【０００５】
生体物質は、全ての生体高分子並びに前記生体高分子とその他の分子との相互作用の結果を含む。「生体高分子」はオリゴヌクレオチド(すなわちDNA又はRNAのような種々の形の遺伝物質のフラグメント)、ペプチド、多糖及びタンパク質(生物界の主要ビルディング・ブロック)、並びに、これらの特別な類似体及び複合体、例えばグリコタンパク質又はリポタンパク質、及び、消化酵素の作用から生じるペプチドを含む。
【０００６】
MALDIのためのマトリックス物質の選択は、検体分子のタイプに依存する。100種を上回る様々なマトリクス物質が知られており、今日知られている。マトリックス物質の仕事の1つは、検体分子を可能な限り互いに隔離し、これらを試料キャリヤ・プレートに結合し、レーザー照射中に蒸気雲を形成することにより分子を気相に転移し、そして最終的に、プロトン付加又は脱プロトンにより生体分子をイオン化し、すなわち1又は2つ以上のプロトンを付加又は除去することである。このような仕事にとって、検体分子をこれらの結晶化中にマトリックス物質の結晶内に個別に組み入れること、又は、少なくとも、結晶間の境界領域内にこれらを細かく分配することが有用であるのが判っている。この場合、検体分子を互いに分離することが重要であると考えられる。すなわち、調製されたマトリックス結晶試料中には検体分子群が放置されないことが望ましい。
【０００７】
検体及びマトリックスを付着させるための種々の手順が知られている。これらのうち最もシンプルな手順は、検体及びマトリックスの両方を含有する溶液を、清浄化された金属試料支持体上にピペットにより載置することを必要とする。溶液の液滴は、金属面(又はその酸化物層)の特定領域を湿潤する。親水性面上のこの領域のサイズは、液滴の直径よりも数倍大きい。このサイズは、金属面の親水性及びミクロ構造、並びに、液滴の特性、具体的には溶剤の特性に依存する。溶液の乾燥後、小さなマトリックス結晶から成る試料スポットが形成される。この試料スポットは、最初に湿潤された表面領域と同じサイズである。マトリックス結晶は通常、予め湿潤された領域全体にわたって均一には分配されていない。普通、マトリックスの結晶は、金属プレート上の湿潤面の内縁で成長し始める。次いでこれらの結晶は湿潤面の内部に向かって成長する。これらの結晶は、しばしば使用されるマトリックス、5-ジヒドロキシ安息香酸(DHB)又は3-ヒドロキシピコリン酸(HPA)の場合のように、細い針状の結晶を形成する。これらの結晶はしばしば、スポット内部でキャリヤ・プレートから突出する。スポットの中心は空であるか、又は微結晶で覆われていることが多いが、これらの微結晶は、MALDIイオン化には使用されない。なぜならば、これらはアルカリ塩濃度が高いからである。結晶への生体分子のローディングはまた、極めて不均一である。従って、このようなタイプのローディングは、ビデオ顕微鏡によってMALDIイオン化中に試料キャリヤ表面を観察することを必要とする。ビデオ顕微鏡は、このタイプの分析に使用される商業的に入手可能な任意の質量分析計において見出すことができる。イオン収量及び質量分解能は、試料スポットにおいて場所間で変動する。申し分のない検体イオン収量及び質量分解能を有する、試料スポット上の好適な位置を見出すことは、しばしば骨の折れるプロセスであり、経験及び試行錯誤のみに頼らざるを得ず、このことは改善の余地を残す。
【０００８】
MALDIイオン化のための最良のスポットを自動的に検索するためのアルゴリズムを備えた質量分析計用の制御プログラムがあるものの、このような手順は多くの試行及び評価を伴い、必然的に極めて時間がかかる。
【０００９】
他のローディング手順では、マトリックス物質は、溶剤液滴付着前にキャリヤ・プレート上に既に存在する。溶剤液滴はこの場合、検体分子しか含有しない。
【００１０】
試料キャリヤ・プレートの表面が親水性ではなく疎水性である場合、より小さな結晶集塊が形成されるが、しかし、液滴は乾燥中、制御不能な状態で移動する傾向がある。従って、結晶集塊の局在化は予測することができず、MALDIプロセス中に探さなければならない。さらに、液滴が集塊化し、ひいては試料の個々の分析を不可能にしてしまうというかなり大きなリスクがある。
【００１１】
今や数千もの生体試料分析が行われ、自動高処理量手順を必要とする状況となっている。視覚的な処理又は検索、又は自動検索でさえも、このような高処理量手順を妨げるおそれがある。
【００１２】
最近の先行技術に含まれる1手順は、その他の部分では疎水性の表面内の直径範囲100〜800μmの小さな親水性アンカー上に、局所的なサイズ規定された結晶化フィールドをもたらす(独国特許第197 54 978号明細書)。水性液滴は親水性アンカーによって固定され、これらの液滴が初めは周囲の疎溶媒性領域に載置される場合でも移動を防止される。乾燥中、液滴はアンカー上に回収され、比較的濃密な、均質に分配された結晶集塊がこれらのアンカーの正確な位置上に生じる(マトリックス物質のタイプ及び濃度如何では、単一のコンパクトな結晶性ブロックとして構成されることさえある)。検体分子のための検出限界は、湿潤面の表面積を低減することにより改善される。このように、試料調製中には、より少量の検体と共に、より希釈された溶液をもたらすことができる。このような利点は、生化学調製手順の実施を改善し、化学材料コストを低減する上で期待される。好適に調製された場合には、試料表面全体にわたる分析感度は極めて均一である。従って、イオン化プロセスに際して、好都合な部位に対する視覚的又は自動的な検索を実施する必要はなく、その代わりに、脱離レーザー光による結晶集塊への「ブラインド」照射を用いることができる。等しい感度を有する前配置スポットのこのような調製方法は、分析プロセスを加速する。
【００１３】
親水性アンカー表面上に形成される結晶集塊は、MALDI法に適したミクロ結晶性構造を示す。乾燥プロセスの速度が上昇するのに伴って、結晶構造はより微細になる。
【００１４】
「疎水性」面は、撥水面、すなわち水溶液による湿潤に対して抵抗性の表面と理解される。これに相応して、「親水性」面は、水によって簡単に湿潤することができる表面と理解される。「疎油性」及び「親油性」とは、それぞれ油を弾く表面、又は油によって湿潤することができる表面を意味する。水と混和できない有機溶剤は通常、このような湿潤性という意味において油性の性質を有する。すなわち、これらの有機溶剤は親油性面を湿潤することができる。これらの有機溶剤は原則として油と混和可能である。水、例えばメタノール、アセトン又はアセトニトリルと混和可能な有機溶剤は、親油性面及び親水性面の両方を純粋な状態で湿潤することができる。しかし、含水量が増加するのに伴って、親油性面の湿潤性は低減する。
【００１５】
長い間、疎水性面は常に親油性であり、そして疎油性面は常に親水性であると考えられていた。しかし、ここ数年、疎水性且つ疎油性である表面が存在することが判った。これらの表面は、ペルフルオロ化炭化水素、例えばポリテトラフルオロエチレン(PTFE)から成る平滑面を含む。このような表面は本明細書中で「疎溶媒性」と呼ばれる。これは、コロイド科学から採用された用語である。
【００１６】
最近、表面の湿潤特性又は撥液特性は、そのミクロ構造に依存することも判ってきた。この一例は、いわゆる「ロータス効果」(植物の蓮にちなんで命名)である。
【００１７】
疎水性(疎油性、疎溶媒性)は本質的には、標準化された条件下において、液体が湿潤面のエッジで固体面と成す接触角を測定することにより、測定される。当該材料から構成された毛管内のそれぞれの液面の接触角が90°を超えると、絶対的な意味で、その材料の表面は疎水性、疎油性又は疎溶媒性と呼ばれる。このような定義は平らな面上に載置する液滴の接触角に当てはめるのは難しい。それというのも、液滴サイズが実際にこの事例においてより大きな役割を果たすからである。以下に、親水性及び疎水性という用語は絶対的な意味では使用せず、相対的な意味で使用する。接触角が大きければ、表面は、別の表面よりも液体に対してより疎水性である。一般に、接触角が90℃未満ではあるが、しかし液滴が大きな湿潤面を形成するように表面上を走行しない場合には、表面はすでに疎水性と見なされる。
【００１８】
液滴が乾燥中又はピペットによる吸引中に表面上で収縮し、湿潤された表面を低減し、サイズを低減して乾燥面を残す場合、表面は特に「疎水性」と呼ばれる(いわゆる動的疎水性)。
【００１９】
原則として、生体分子は水中に最良に溶解される。この場合、水溶性有機溶剤、例えばアルコール、アセトン又はアセトニトリルが添加されることがある。生体分子の分析溶液は、これらの調製に応じて、その他の物質、例えばグリコール、グルー状の緩衝剤、塩、酸又は塩基を含有することもある。MALDI法は、或る時にはプロトン化の妨害により、また或る時には付加物の形成により、これらの不純物の存在によって著しく混乱させられる。具体的には、アルカリイオンは、種々のサイズの検体分子と付加物を形成し、正確な質量決定を妨げる。試料調製物中のアルカリイオンの濃度、並びに、その他の不純物物質の濃度は、注意深い精製手順によって極度に低く保たれなければならない。
【００２０】
生体分子の精製及び同時富化に際しては、アフィニティ・クロマトグラフィに使用されるのと同様の、いわゆるアフィニティ吸着媒質を使用することができる。アフィニティ・クロマトグラフィの場合には、高度に生体選択的なアフィニティ吸着剤が使用されるのに対して、特定タイプの生体分子を損失することなしに、最初は未知の生体高分子混合物を精製するのに際しては、非特異的吸着剤が必要となる。これらの非特異的吸着剤は、混合物の全ての生体分子成分にできる限り同程度に結合することができる。
【００２１】
ペプチド、タンパク質又はDNA混合物に対しては、吸着剤材料のスポンジ状ミクロ球体(例えばPOROS、Applied Biosystems, Inc.の登録商標POROS)、スポンジ状吸着剤が充填されたピペット・チップ(例えばMillipore Corporationの登録商標ZIPTP)、又はC18でコーティングされた磁化球体(例えばBruker Daltonics, Inc.の製品GenoPure)が、今までのところ有用であることが判っている。これらの材料は全て強親油性であり、疎水性結合を介してペプチド又はオリゴヌクレオチドに結合する。原則として、生体分子は水性メタノール又はアセトニトリル溶液を使用して溶出することができ、溶出はpH値を変えることによりしばしば助成することができる。しかし、これらの材料による精製は手間がかかる。それというのも、この精製は付加的な材料と付加的な手順ステップとを必要とするからである。
【発明の開示】
【００２２】
概要
本発明の目的は、生体高分子を分析するための装置及び方法を提供することであり、より具体的な目的は、小さな容積の多数の試料中のタンパク質の分析に特に適したこのような装置及び方法を提供することである。
【００２３】
骨の折れる手動による相互作用の量を低減することにより、分析の処理時間を短くすることが1つの目標である。4時間未満で試料を処理することができる装置を提供することが1つの目標である。また、信頼性の高い分析結果を確立するのに必要な容積流及び生体高分子量を最小化することが1つの目標である。さらに、微視的な容積中で好適な温度で作業することにより、酵素反応時間及びその他の反応時間をスピードアップすることが1つの目標である。機械への典型的な入力は1又は2つ以上のタンパク質試料であり、機械からの典型的な出力は、高密度のタンパク質スポットを備えたMALDI標的プレートである。上述のこれらの目的及び目標の多くは、ミクロ構造及びマイクロマシン技術を適用すること、そして分析プロセス中の大部分のステップを実施するのに自動装置及びロボットを適用することにより達成される。
【００２４】
本発明による装置の好ましい実施態様に入る前に、タンパク質試料を生化学的及び化学的な前処理によって取扱い、これによりタンパク質の3次元構造を展開し、酵素開裂されやすくし、その結果、タンパク質に対応するペプチド組成物を得る。湿式実験室内試験部分の全てをロボットによって行うことができる。第1のインタフェイスは、本発明の実施態様によるタンパク質分析機内への試料導入の間に発生する。試料導入は、並列に延びる多数のプロセス・ラインに対して並列に実施することができる。
こうして試料はタンパク質分析機に移され、このタンパク質分析機内部で、試料の全自動処理が行われる。試料の同時富化と、試料内に存在する妨害成分の排除とによって、試料が調製される。こうして、例えばディスペンサー・セル要素のミクロ抽出床の固相上には、純粋な試料が保持される。試料容積はこうして10〜1000倍だけ富化され、これにより、分析時の試料は、分析の最終信号読み出し値を増幅させる。第2のインタフェイスは、タンパク質分析機内のミクロ抽出床から、試料がデポジットされる標的プレート上へ試料が溶出される間に生じる。
【００２５】
プロセス作業全体は、タンパク質分析機の全自動作業によって無人モードで制御することができる。ロジスティクス及びプロセス・サイクルはロボット・ソフトウェアによって制御される。
【００２６】
本発明の好ましい実施態様は有利には、ドッキング可能な1又は2つ以上のミクロ抽出チップ・ユニット、単一試料処理方法(アレイ分配ではない)、及び、生化学分析のための化学物質によって使用するためのアレイを含む。
図面
下記図面を用いて本発明を以下に開示し説明する。
【００２７】
説明
方法
図1に示すように、本発明による方法の実施態様は、タンパク質試料が分析機内に導入されることを含む。蛋白質試料は、幾つかの異なる生体源に由来していてよい。試料は分析プラットフォーム内に導入されるのに先立って、前分離される。この前分離は、例えば下記の技術による分離によって行われる：
-1次元ゲル電気泳動法
-2次元ゲル電気泳動法
-単次元液体クロマトグラフィ
-多次元クロマトグラフィ
-キャピラリー電気泳動法
-限外膜濾過
-透析
-アフィニティ・プローブ分離
【００２８】
試料中の検体は典型的には、蛋白質配列分析に対する妨害物質を保持するミクロ環境内に存在するので、質量分析を用いた蛋白質配列決定によって高品質蛋白質同定を生じさせるために、最適な試料調製プロトコルが予め必要となる。試料は溶液中の無傷の蛋白質、又は溶液中のペプチド・フィンガープリント形の消化済蛋白質となる。典型的な実施態様は下記ステップを含む：
【００２９】
1/  2mlの酸性水、2mlのアセトニトリル/水、仕上げに2mlの酸性水でフラッシュ洗浄することにより、試料導入前にミクロ抽出床を活性化する(150)。
2/  適切な溶離液改質剤によって試料140を希釈するか、圧電ディスペンサー・セル、すなわちディスペンサー内に配置された、予め活性化された流動ミクロ抽出床内に試料140を直接的に導入する(152)。典型的には試料容積は1〜500μlの範囲にある。
3/  蛋白質が結合されて富化されたミクロ抽出床を、2mlの酸性水を使用して洗浄し(154)、これにより試料マトリックスから多くの妨害物質を排除する。
【００３０】
4/  次に、有機改質剤比60:30のアセトニトリル/蟻酸(2%)0.5〜5.0μl mlを使用して、富化された蛋白質を溶出する(156)。
5/  連続流が蛋白質試料を圧電ディスペンサー・セルのオリフィスに輸送する(158)。
【００３１】
6/  高密度蛋白質スポットを標的プレート上に形成する不連続的な液滴として、試料を駆出する。
【００３２】
本発明による方法の別の実施態様は下記ステップ：
-分析されるべき試験片を受容するステップと；
-前記試験片を分離手段に輸送するステップと；
-前記試験片を分離して画分(第1セット)にするステップと；
-前記画分のそれぞれ1つが、タンパク質が固体面手段に付着する抽出手段を通るようにするステップと；
-試験片を、タンパク質が固体面手段に付着する抽出手段に渡すステップと；
-前記固体面手段を洗浄液で洗浄し、前記タンパク質だけを残すステップと；
-有機溶剤の部分がそれぞれの前記固相を通るようにすることにより、溶出を行い、前記溶出の結果として、前記タンパク質を含有する第2画分セットを構成する溶出液を形成するステップと；
-前記第2画分セットのそれぞれ1つの画分をミクロ分配アレイに導くステップと；
-分配のために圧電アレイ又はエレクトロスプレイ・アレイを使用して、前記第2画分セットのそれぞれ1つの画分の正確な量を、標的プレートの標的領域上に分配するステップと；
-該ディスペンサーからの液滴分配間の時間を制御するステップと；
-該プレート及び該プレートの周囲の温度を制御するステップと；
-標的領域内に配置された消化酵素によって、前記タンパク質を消化してペプチドにするステップと；
-新たな標的領域列がディスペンサー・アレイに利用可能になるように、該標的プレートを機械的に移動するステップと；
-該受容プレートを質量分析計手段に機械的に移動するステップと；
-該受容プレートの各標的領域上で質量分析を実施し、ペプチド・シグネチャーを測定するステップと；
-前記ペプチド・シグネチャーを記録するステップと；
-各標的領域内の種々異なるタンパク質の存在及び含量を決定するために、既知のタンパク質のペプチド・シグネチャーのライブラリに、前記測定されたペプチド・シグネチャーをマッチングするステップと
を含む。
【００３３】
図1b及びcは、タンパク質分子の混合物上で富化作業を実施するのに適した装置を示す。
【００３４】
抽出器
図1b及び1cに示すように、本発明による装置の第2部分120が前記富化に適している。前記部分120は、多数の個別の溝又はチャネル101を含み、それぞれが有孔床(図1b及び1cには示していない)を含有している。この有孔床は、チャネルを貫流させられる前記混合物の成分の1つから、種を吸着することができる。前記床は例えば微視的なビードから成る床を含むことができる。チャネルの寸法は微視的である。チャネルの幅は典型的には0.1mm未満であり、これよりも小さいことがしばしばある。チャネルの深さも同規模である。
【００３５】
別の実施態様として、有孔床は省くことができ、分析されるべき種を吸着する機能は、チャネル/溝の有孔壁/面によって発揮することができる。
【００３６】
1方法ステップにおいて、吸着された種は、各成分の溶出液を形成する溶離液によって溶出される。すなわちこれは固相抽出SPEタイプの溶出である。
【００３７】
図1bに示すように、一体化されたディスペンサー部分130が抽出器部分120のチャネル101と直接的に流体連通するように配置されている。ディスペンサー部分130は、ディスペンサー槽132から成るアレイを含む。これらの槽はそれぞれ、ディスペンサー・ノズル開口134及び任意には出口開口(図示せず)を備えている。この出口開口は、例えば、ディスペンサー・ノズルを通して洗浄流体全てを供給することなしに、装置を効率的に洗浄するのに使用可能な貫流手段を提供する。図1cには、ディスペンサー槽132及びディスペンサー・ノズル開口134の断面図と一緒に、駆出された液滴138を受容するのに好適に配列された標的プレートが示されている。
【００３８】
ドッキング可能な抽出器
図2に示すように、抽出器207とも呼ばれる装置の別の変化実施態様がドッキング可能に構成されている。この用語は、前記抽出器がプレート、チップ・ユニット又は別の可動存在物のためのハウジング・チャネル111を含み、これらのチャネル111が有孔床201/有孔壁/面を備えており、抽出器が手動又は自動的に着脱できるように構成されており、他の装置230又は分析装置の他の部分に対して一時的に流体連通させることを意味している。前記抽出器207はまた、分析装置の同じ又は他の部分、例えば洗浄装置又は分配装置に再装着できるように構成されている。具体的にはこのような実施態様は、ドッキング手段205を含む。このドッキング手段によりドッキングが可能になり、そして分析装置の他の部分から抽出器の入口への液体の流通、及び、抽出器の出口から分析装置の他の部分への液体の流通が可能になる。このような部分は、フィード装置、洗浄装置及び溶出装置を含んでよい。
【００３９】
図3は、試料の導入(I)、洗浄(II)及び試料(III)の溶出及び分配のために、ドッキング可能な抽出器207がいかにして使用されるかを示している。アレイ・ディスペンサー301はディスペンサー・ユニットから成るアレイを含み、各ディスペンサー・ユニットは入口313と槽310とを含み、この槽310は入口313、出口314、及びディスペンサー・ノズル開口308を有するディスペンサー・ノズル307と流体連通する。槽310は、フレキシブルな膜315によって部分的に画定されている。この膜はアクチュエータ素子320との機械的な接点を有しており、これにより、槽310内の圧力が急上昇して、検体液滴をディスペンサー・ノズル開口308を通して標的プレート340に向かって駆出できるようになっている。
【００４０】
図4はドッキング可能な抽出器407の別の実施態様であって、試料の導入ステップ(I)、洗浄ステップ(II)、並びに溶出・分配ステップ(III)に使用されるのを示している。
【００４１】
図5は、一体化された抽出・分配手段を示している。図1において説明した装置と同様に、多数の抽出器チャネル527が多数の隔壁521〜525の間に配列されている。図1において説明した装置とは異なり、ディスペンサー部分540は1つの共通の槽510を含む。それぞれのディスペンサー・ノズル開口501〜506への溶離液の流れは、層流によって隣接する流れとの混合を防止される。すなわち、微視的な寸法と、層流特性と、所定の間隔を置いてノズル開口が配列されており、前記ノズル開口が主に層流の薄層の中央に配置されているという事実とに基づいて、特定の抽出器チャネル527から流れる検体は、1つの特定のディスペンサー・ノズル開口501〜506によってのみ取扱われることになる。
【００４２】
ドッキング可能な抽出器カートリッジ
ドッキング可能な抽出器の別の実施態様の場合(図6参照)、抽出器カートリッジは、多数の抽出器アレイを分離する切欠きを含む。カートリッジを切欠きにおいて曲げることにより、個々のアレイをディスペンサー・アレイにドッキングすることができる。なぜならば、先行の抽出器アレイが上向きに曲げられ、次の抽出器アレイのために利用可能なスペースが残されるからである。
【００４３】
液滴毛管ローディング、濾紙廃液
図10に示すように、前記溶液の液滴を液滴入口ゾーン1010にピペットにより供給することにより、本発明の実施態様による抽出器に検体溶液が供給される。前記ゾーンは、抽出器床への直接的な流体連通部1020を有している。続いて毛管力により抽出器が充填される。なぜならば、抽出器のチャネルの寸法が小さいからである。次いで、出口1030に濾紙を取り付けることにより、流体が抽出器を通って排出される。前記濾紙は、抽出器を通る流体全てを排出させるのに適した毛管特性を有しており、液滴入口ゾーンに液滴を残さないか、抽出器内部のより多量の流体を残すことはない。液滴ローディング及び濾紙廃液と同じ手順を洗浄及び溶出に用いることができる。
【００４４】
典型的には、50μlの液滴が、3x3 mm及び300 μm深さの液滴入口ゾーンにピペットで供給される。
【００４５】
多重ミクロ抽出器アセンブリ
ドッキング可能な抽出器の別の実施態様の場合(図6,7,8及び9参照)、多数の抽出器アレイを含む抽出器アセンブリが構成されている。これらの抽出器アレイは、抽出器モジュールのロボット化された効率的な高速処理のための「アセンブリ・ライン」を提供する。
【００４６】
ストレート型リンク・チェーン
ドッキング可能な抽出器のこれらの別の実施態様のうちの1つの場合(図6及び図7a参照)、リンク・チェーン抽出器アセンブリは、チェーンの長軸に対して平行な多数の抽出器アレイ630,640と、1つの抽出器アレイを別の抽出器アレイから分離する、直角に延びる切欠き601とを含む。各抽出器アレイは多数の抽出器チャネル610,611を含む。特定の切欠きにおいてカートリッジを曲げることにより、個別のアレイのうちの1つを例えば後続のディスペンサー・アレイにドッキングすることができる。なぜならば先行の抽出器アレイが上向きに曲げられ、次の抽出器アレイに利用可能なスペースが残されるからである。別の切欠きで曲げることにより、前記ディスペンサー・アレイ690に別のアレイがドッキングすることができる。
【００４７】
直交型リンク・チェーン(フィルム・ストリップ)
図7bには、多数の抽出器アレイ(区分とも呼ばれる)を含む直交型リンク・チェーン抽出器アセンブリが示されている。抽出器アレイは、チェーンの長軸LAに対して直交方向に延びている。前記直交型リンク・チェーンは、チェーンの長い側でドッキング面710, 720を提供し、多くのミクロ抽出アレイに同時に容易にアクセスすることを可能にする。図9は、「アセンブリ・ライン」型取扱い装置に沿って移動するように構成された抽出アレイ930に、検体を供給するように配置されたピペット910を示しており、この抽出アレイは、下記のような処理法を実施する。
【００４８】
ディスク・ユニット(円形配列)
図8に示されたミクロ抽出器アセンブリの別の有利な実施態様は、円形ディスク又は「デイジー・ホイール」配置を含む。この配置において、多数の区分A, B, Cなどはそれぞれミクロ抽出アレイを含み、このアレイは、上述のようなミクロ抽出アレイのローディング及び排液のためのピペット/濾紙装置に位置決め/ドッキングされるか、又は、図9に概要を示すような別のタイプのローディング/排液装置にドッキングされるようになっている。
【００４９】
貯蔵機能
上述のミクロ抽出器の実施態様は、変更なしに、又は僅かな変更を加えるだけで貯蔵ユニットとして使用することができる。この貯蔵ユニットは、長い保存期間にわたって、例えばマイナス20℃で、ドッキング可能なマイクロチップ上にタンパク質試料を保持することができる。
【００５０】
エレクトロスプレイ
図11に示すように、本発明の別の実施態様は、上記のものとは異なる分配手段としてのエレクトロスプレイ・ノズル1101と、圧電アクチュエータの代わりの電源1105及び回路1110と、ディスペンサー・ノズルを含み、前記ドッキング可能な抽出チップを、エレクトロスプレイ、又はその他のタイプのイオン化を利用したタンデム質量分析と適合可能にする。
【００５１】
材料
装置はポリマー又はケイ素で製造されるのが好ましい。ポリマー装置の大量生産のためのマスターは、金属又はセラミック材料から形成されるのが好ましい。室温又は室温近くでタンパク質混合物を取扱う場合には、ケイ素は事実上不活性である。この材料は、マイクロマシン技術、例えば確立されているエッチング技術による材料部分のエッチング除去にも極めて適している。
【００５２】
図12aには、抽出器とディスペンサーとから成る複合装置が、側方から見た断面図で示されている。抽出器は、抽出ビード1220が抽出器部分1230を出て、ディスペンサー部分1240に入るのを防止するための拘束手段1206,1207を備えている。前記拘束手段は堰1206又は格子1207を含むことができる。前記格子は、前記ビード1220の直径よりも小さい空間によって分離された多数の直立した薄壁から成る。前記拘束手段は、図13に示すようなメッシュ1301を含むこともできる。
【００５３】
抽出原理
上述の技術のそれぞれは、圧力駆動式又は電気駆動式の装置又はその他の好適な技術によって実施することができる。
下記のような化学結合、親和性結合及び生化学結合のメカニズムを利用してクロマトグラフィ分離を行う：
【００５４】
化学結合
i/ゲル濾過-サイズに基づいて分画が必要とされる試料中で実施。
ii/疎水性相互作用-逆相分離メカニズムを利用することにより、ペプチド及びタンパク質をその疎水性によって分離する。
iii/極性相互作用-シラノール及びその他のタイプの極性官能基は、極性ペプチド/タンパク質と容易に相互作用し、極性クロマトグラフィ相互作用に基づいて分離することができる。
【００５５】
親和性結合：
i/キラル親和性-キラル小分子は、タンパク質/ペプチドが相互作用するための選択的なリガンドとして使用するように役立つことができ、これにより分離が達成される。
ii/金属親和性-アミン及び/又はカルボキシ-ヒドロキシ官能基の金属イオン相互作用によるキレート化、並びに、ニッケル・イオン-ヒスチジン・ペプチド残基、鉄イオン、ガリウム・イオンとペプチド上のリン酸官能基との強力な結合。
【００５６】
生化学結合：
i/抗体結合-伝統的な生化学結合である、結合定数範囲107〜109の弱、中及び強親和性を有する抗体-抗原免疫親和性結合。
ii/ビオチン・アビジン-ペプチドに結合されたアビジン又はビオチン、及び、固体支持体上のアビジン又はビオチンを利用した親和性試薬が、アビジン/ビオチン間の高親和性により、複合試料混合物からペプチドを選択的に分離する。
【００５７】
ディスペンサー
上述のように、それぞれの別個の溶出液流がディスペンサー・ノズルに導かれる第2作業の直後に、前記装置の一部内で第3作業が行われる。前記ノズルは互いに並んで配置され、ディスペンサー・ノズル・アレイを形成する。
別の実施態様の場合、異なる画分を隔離する隔壁は、ディスペンサー・ノズルの近くで省略される。流れの速度が整えられていること、及び、層流を促進するように装置が構成されていることにより、成分/画分は、流動する液体の種々異なる層流部分中に隔離されたまま保持される。拡散は最小限に抑えられる。なぜならば、流体が隔壁/隔離面によって案内されない場合、液体が流れるべき時間/長さは比較的短いからである。
【００５８】
標的プレート
前記ノズル・アレイは、微視的な量の前記それぞれ個別の溶出液流をアレイに、すなわち例えば8 x 12ウェル・プレート内のウェル列に分配するように配置される。ディスペンサーの作用を混合物流及び溶離液流と同期する制御ユニットが設けられている。次のウェル列がディスペンサー・アレイの前面(下側)に配置されるようなウェル・プレートのステップ状の動作も、ディスペンサー・アレイの作用と同期される。
個別の溶出液からの液滴の分配は、溶離液の蒸発と調和するように行われるので、ウェル内にデポジットされるタンパク質の量は、同じウェル内により多くの液滴を分配することにより、時間とともに増大させることができる。
【００５９】
ウェルは酵素を備えている。タンパク質の寸法が小さく、温度が制御されており、そして濃度が高いため、酵素は前記タンパク質を消化して、高濃度のペプチドを形成する。
例えば質量分析によって更なる化学分析を行う場合には、高濃度のペプチドが好ましい。
【００６０】
装置はケイ素で製造されるのが好ましい。室温又は室温近くでタンパク質混合物を取扱う場合には、ケイ素は事実上不活性である。この材料は、マイクロマシン技術、例えば確立されているエッチング技術による材料部分のエッチング除去にも極めて適している。
別の利点は、前記エッチング技術を用いれば、寸法が極めて正確になることであり、マイクロメーターよりも遥かに良好な精度で表面をエッチングすることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１ａ】図1は、タンパク質分析プラットフォームのためのプロセス・ステップを示すフローチャートである。
【図１ｂ】図1bは、抽出器アレイとディスペンサー・アレイとを含む複合装置を示す図である。
【図１ｃ】図1cは、ディスペンサー・アレイと下方に配置された標的プレートとを示す断面図である。
【図２ａ】図2aは、本発明の実施態様によるドッキング可能な抽出器を示す図である。
【図２ｂ】図2bは、本発明の実施態様によるドッキング可能な抽出器を示す図である。
【図３】図3は、抽出(I)、洗浄(II) 及び溶出・分配(III)のプロセスを示す図である。
【００６２】
【図４】図4は、ドッキング可能な抽出器の別の実施態様、及び、この抽出器のドッキング方法を示す図である。
【図５ａ】図5aは、図1の複合装置の別の実施態様を示す図である。
【図５ｂ】図5bは、図1の複合装置の別の実施態様を示す図である。
【図６ａ】図6は、多重抽出器及び曲げ切欠きを含むドッキング可能な抽出器(抽出器カートリッジ)を示す図である。
【図６ｂ】図6は、多重抽出器及び曲げ切欠きを含むドッキング可能な抽出器(抽出器カートリッジ)を示す図である。
【図７ａ】図7aは、「2Dアレイ」型のドッキング可能なミクロ抽出チップの1実施態様を上から見た状態で示す図、及びその断面図である。
【図７ｂ】図7bは、「フィルム・ストリップ」型のドッキング可能なミクロ抽出チップの1実施態様を、上から見た状態で示す図である。
【００６３】
【図８】図8は、円形ディスクに配置されたドッキング可能なミクロ抽出チップの1実施態様を上から見て示す図、及びその詳細図である。
【図９ａ】図9は、試料のローディング、抽出及び溶出/分配のために、フィルム・ストリップ及び円形ディスクの実施態様を使用するステップを、所定の角度で見た状態で示す図である。
【図９ｂ】図9は、試料のローディング、抽出及び溶出/分配のために、フィルム・ストリップ及び円形ディスクの実施態様を使用するステップを、所定の角度で見た状態で示す図である。
【図１０ａ】図10aは、液滴入口ゾーンを有する実施態様を示す垂直断面図である。
【図１０ｂ】図10bは、図10aの実施態様を上から見た状態で示す図である。
【図１１】図11は、エレクトロスプレイ・ノズル及び電源を概略的に示す断面図である。
【図１２ａ】図12aは、抽出器とディスペンサとから成る複合装置を側方から見た状態で示す断面図である。
【図１２ｂ】図12bは、抽出ビードが抽出器から逃げるのを防止するための手段の1実施態様を示す図である。
【図１２ｃ】図12cは、抽出ビードが抽出器から逃げるのを防止するための手段の第2の別の実施態様を示す図である。
【図１３ａ】図13aは、抽出ビードが抽出器から逃げるのを防止するための手段の第3の別の実施態様を示す詳細図である。
【図１３ｂ】図13bは、抽出ビードが抽出器から逃げるのを防止するための手段の第3の別の実施態様を示す詳細図である。
【図１ａ】
2005513472.tif 000003
【図１ｂ】
2005513472.tif 000004
【図１ｃ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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2005513472.tif 000009
2005513472.tif 000010
【図４】
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2005513472.tif 000012
2005513472.tif 000013
【図５ａ】
2005513472.tif 000014
【図５ｂ】
2005513472.tif 000015
【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８】
2005513472.tif 000020
【図９ａ】
2005513472.tif 000021
【図９ｂ】
2005513472.tif 000022
【図１０ａ】
2005513472.tif 000023
【図１０ｂ】
2005513472.tif 000024
【図１１】
2005513472.tif 000025
【図１２ａ】
2005513472.tif 000026
【図１２ｂ】
2005513472.tif 000027
【図１２ｃ】
2005513472.tif 000028
【図１３ａ】
2005513472.tif 000029
【図１３ｂ】
2005513472.tif 000030
【手続補正書】
【提出日】平成16年1月20日(2004.1.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子を処理してデポジットするのに利用可能な方法であって、下記ステップ：
分析されるべき第1検体セットを並列に受容するステップと；
前記検体のそれぞれ1つが、前記生体分子が固相手段に付着する抽出手段を通るようにするステップと；
前記固相手段を洗浄液で洗浄し、前記生体分子だけを残すステップと；
有機溶剤の部分がそれぞれの前記固相を通るようにすることにより、溶出を行い、前記溶出の結果として、前記生体分子を含有する第2検体セットを構成する溶出液を形成するステップと；
前記第2検体セットのそれぞれ1つの検体をミクロ分配アレイに導くステップと；
画分から成る前記第2セットのそれぞれ1つの画分の正確な量を、標的プレートの標的領域上に分配するステップと；
該ディスペンサーからの液滴分配間の時間を制御するステップと；
該プレートの温度を制御するステップと；
標的領域内に配置された消化酵素によって、前記タンパク質を消化してペプチドにするステップと
を含むことを特徴とする、生体分子を処理してデポジットするのに利用可能な方法。
【請求項２】
各スポット内の蒸発により検体が富化されるように、前記正確な量の分配間の時間を制御するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
効率的な蒸発が可能になるように、該プレートの温度を制御するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
標的プレートに配置された消化酵素によって、前記生体分子を消化して生体分子画分にするステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
該消化プロセスの消化速度が最適化されるように、前記プレートの温度を制御するステップをさらに含む、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
該ディスペンサー・アレイに新しい標的領域列が利用可能になるように、該標的プレートを機械的に移動するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
該標的プレートを質量分析計に機械的に移動するステップと；
該受容プレートの各標的領域上で質量分析を行い、ペプチド・シグネチャーを測定するステップと；
前記ペプチド・シグネチャーを記録するステップと；
各標的領域内の種々異なるタンパク質の存在及び含量を決定するために、既知のタンパク質のペプチド・シグネチャーのライブラリに、前記測定されたペプチド・シグネチャーをマッチングするステップと
をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
前記分配が、アレイ形式の圧電分配を用いて実施される、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
前記分配が、アレイ形式のエレクトロスプレイ法を用いて実施される、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
2つ以上の細長いチャネル又は溝(101)を含む抽出装置であって、前記溝がプレート内のトレンチを含み、各トレンチが隔壁によって隣のトレンチから隔離されており；前記装置がまた、前記トレンチのシーラントとして役立つシーリング層を含み、前記溝のそれぞれが、第1及び第2のポートを備えた第1の端部(102)と第2の端部(103)とを有しており、格子手段によって該溝内部に保持された有孔床(201)を備えており、前記有孔床(201)がタンパク質付着ユニットを備えており、前記抽出装置がさらにドッキング手段を含み、該ドッキング手段が、該抽出装置がフィード装置から取り外され、そして洗浄装置又は溶出装置と接触させられるのを可能にすることを特徴とする、抽出装置。
【請求項１１】
前記プレートがケイ素プレートであり、前記シーリング層がガラス層であり、前記層が前記ケイ素プレートに化学的に結合されている、請求項10に記載の装置。
【請求項１２】
前記ドッキング手段が、漏れ発生を防止するポリマー・フィルムを含む、請求項10に記載の装置。
【請求項１３】
前記ドッキング手段が多数のOリングを含み、該Oリングが漏れ発生を防止する、請求項10に記載の装置。
【請求項１４】
2つ以上の細長いチャネル又は溝(101)を含む抽出装置であって、前記溝がプレート内のトレンチを含み、各トレンチが隔壁によって隣のトレンチから隔離されており；前記装置がまた、前記トレンチのシーラントとして役立つシーリング層を含み、前記溝のそれぞれが、第1及び第2のポートを備えた第1の端部(102)と第2の端部(103)とを有しており、前記溝が有孔壁又は有孔面を有しており、前記有孔壁又は有孔面が生体分子付着ユニットを備えており、前記抽出装置がさらにドッキング手段を含み、該ドッキング手段が、該抽出装置がフィード装置から取り外され、そして洗浄装置又は溶出装置と接触させられるのを可能にすることを特徴とする、抽出装置。
【請求項１５】
該抽出装置が、ディスペンサー・ノズルを含むディスペンサー、槽、並びに、該ノズルと整列されたフレキシブルな膜及び圧電素子をさらに含み、前記圧電素子が、該膜を制御可能に押し下げるように配置されており、これにより正確な量の液体を分配させる、請求項14に記載の装置。
【請求項１６】
前記隔壁が、前記ディスペンサーへの進路の一部にわたって延びている、請求項11に記載の装置。
【請求項１７】
前記隔壁が前記ディスペンサーへの進路全体にわたって延びており、各溝からの流れを機械的に隔離する、請求項11に記載の装置。
【請求項１８】
溶出強度が異なる例えば3種の溶出溶剤中の「ステップ溶出」に際して、試料をディスペンサーに輸送するための手段を備えている、請求項14に記載の装置。
【国際調査報告】
2005513472.tif 000031
2005513472.tif 000032