(57)【要約】【課題】  骨組織の局所的な治療及び修復の際に有用な種類の生体材料を提供する。【解決手段】  骨組織の局所的な成長及び／又は修復を引き起こすために有用な生体材料が記載されている。前記生体材料には細胞介在酸性化(cell-mediatedacidification)の阻害剤がドープされた適切なマトリックスを混合し、生体内で該マトリックスが再吸収される速度を調節する。実施態様において、前記マトリックスはほぼ周囲温度(near-ambient)のＣＡＰセメントであり、そして前記阻害剤は、マクロライド−ベースの抗生物質(macrolide-basedantibiotic)、とりわけバフィロマイシン(bafilomycin)のようなプロトンポンプ阻害剤(protonpumpinhibitor)である。
2005514972.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
局所の骨再造形環境に移植されたとき、骨組織の局所的な成長及び／又は修復を促進するために適する種類の生体材料であって、
骨適合性マトリックス材料と、前記生体材料が移植される骨再造形環境における細胞介在酸性化(cell-mediated acidification) を低減するために有効な量の細胞介在酸性化の阻害剤、を含む生体材料。
【請求項２】
前記細胞介在酸性化の阻害剤が、新しい骨の成長を促進するために有効な量で存在する請求項１記載の生体材料。
【請求項３】
局所的な骨の治療及び／又は修復に使用するために適する種類の生体材料であって、
吸収され得る骨適合性マトリックス材料と、前記マトリックスが生体内で吸収される速度を低減するために有効な量の細胞介在酸性化(cell-mediated acidification) の阻害剤、を含む生体材料。
【請求項４】
前記吸収され得るマトリックス材料が、ほぼ周囲温度(near-ambient)のリン酸カルシウムマトリックス材料である請求項１ないし３の何れか一項記載の生体材料。
【請求項５】
前記細胞介在酸性化の阻害剤がプロトンポンプ阻害剤(proton pump inhibitor) である請求項１ないし４の何れか一項記載の生体材料。
【請求項６】
リン酸カルシウムマトリックス材料がリン酸カルシウムセメントである請求項１ないし５の何れか一項記載の生体材料。
【請求項７】
前記プロトンポンプ阻害剤がマクロライド−ベースの抗生物質(macrolide-based antibiotic)である請求項１ないし６の何れか一項記載の生体材料。
【請求項８】
前記プロトンポンプ阻害剤がバフィロマイシン(bafilomycin) Ａ１である請求項１ないし７の何れか一項記載の生体材料。
【請求項９】
前記バフィロマイシンが、マトリックス５００ｍｇ当たり２５μｇ〜１００μｇの範囲内の濃度で生体材料中に存在する請求項８記載の生体材料。
【請求項１０】
成形され、硬化されたセメント又はペーストの形態にある請求項１ないし９の何れか一項記載の生体材料。
【請求項１１】
骨組織の成長又は修復を引き起こすために被検体を処置する方法であって、
骨の成長又は修復が望まれる部位に、請求項１ないし１０の何れか一項記載の生体材料を移植する段階を含む方法。
【請求項１２】
局所的な骨の環境における骨組織の成長を引き起こすために被検体を処置するための請求項１１記載の方法であって、
骨の成長が望まれる部位に、請求項１、２及び請求項４ないし１０の何れか一項記載の生体材料を適用する段階を含む方法。
【請求項１３】
局所的な骨の環境における骨組織の修復を引き起こすために被検体を処置するための請求項１１記載の方法であって、
骨の修復が望まれる部位に、請求項１及び請求項３ないし１０の何れか一項記載の生体材料を適用する段階を含む方法。
【請求項１４】
前記生体材料が、感染症が存在しない部位に適用される請求項１１ないし１３の何れか一項記載の方法。
【請求項１５】
骨組織の局所的な成長及び／又は修復を促進するための、請求項１ないし１０の何れか一項記載の生体材料の使用。
【請求項１６】
骨折の修復のための請求項１５記載の使用。
【請求項１７】
骨移植の修復のための請求項１５記載の使用。
【請求項１８】
骨粗鬆症の処置のための請求項１５記載の使用。
【請求項１９】
骨組織の成長及び／又は修復を引き起こすために有用な種類の生体材料を製造する方法であって、
吸収され得るマトリックス材料を形成することが可能な物質と、前記マトリックス材料が生体内で吸収される速度を調節するために有効な量の細胞介在酸性化(cell-mediated acidification) の阻害剤を混合する段階を含む方法。
【請求項２０】
骨組織の成長及び／又は修復を引き起こすために有用な種類の生体材料を製造する方法であって、
硬化し得るリン酸カルシウムセメントに、生体材料が移植される骨再造形環境における細胞介在酸性化(cell-mediated acidification) を低減するために有効な投与量でバフィロマイシン(bafilomycin) Ａ１を混合する段階を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨組織の局所的な治療及び修復に有用な種類の生体材料に関するものである。より特別には、本発明は、骨適合性マトリックスとプロトンポンプ阻害剤(proton pump
inhibitor) として有効なドーパントを含む生体材料であって、該生体材料が移植された局所的な骨の周囲環境を調節するための生体材料に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
骨折部位並びに、外科的処置の後に残った及び骨移植に伴う空洞内に新しい骨を形成する臨床治療の目的のために、種々の生体材料が開発された。これらの生体材料は適用前又は適用中に成形されて、治療過程の間に骨の適用部位を充填し且つ保護することが可能なマトリックス材料から形成される。経時的に、望ましくは前記生体材料が吸収され、そして新しい骨組織により置換されて、前記治療過程が完結する。
【０００３】
リン酸カルシウム（ＣＡＰ）セメント又は自己硬化性セメントは、ブラウン(Brown) とチョウ(Chow)により最初に記載され且つ特許された１９８３年以降、有望な歯科インプラント材料、骨代替材料及び薬剤配送ビヒクルとして大きな注意を引き付けた。リン酸カルシウムセメントの硬化は、粉末と液体出発成分の間の酸−塩基反応により起こり、前記成分は、混合することにより室温又は体温で最終的には硬化するペーストを形成する。多数のＣＡＰ粉末及び液体が化学反応することができ、そして硬化後に得られた中間生成物及び最終生成物は、生体適合性（骨適合性）及び骨細胞伝導性(osteoconductive) であることが知られている。
【０００４】
骨組織修復部位において、ＣＡＰマトリックスは、修復過程の間、一時的で且つ保護的な構造及び、前記ＣＡＰマトリックスを最終的には置換する骨組織を形成する骨再造形細胞の補充及び付着のための表面を提供する。臨床的な用途において、ＣＡＰインプラントは、治療期間が経過した後、新しい骨組織により完全に吸収され且つ置換されるべきである。しかしながら、異なる解剖学的部位において骨再造形速度は変化し、そして治療期間は、典型的には、解剖学的部位及び骨損傷の性質に応じて変化するので、これらのインプラントが吸収される速度を調節する技術に対する要求が存在する。
【０００５】
現在の文献では、ＣＡＰの化学的性質及び相の組成を微調節することによってのみ、ＣＡＰ生体材料の分解の調節に対処している。例えば、米国特許第６，１１７，４５６号明細書において、リー(Lee) らは、マトリックス吸収を調節することの望ましさを報告しており、そして、これは密度、多孔率、反応成分、粒径分布、最終結晶化度のような物理的パラメーター及び結晶化阻害剤を変更することによって達成され得ることを示唆している。この化学的アプローチの結果、非常に不溶性であるばかりか吸収不可能であるＣＡＰ材料、又は、非常に可溶性で且つ高度に吸収可能であるＣＡＰ材料がもたらされる。これらのＣＡＰ材料は何れも、該材料の臨床的性質を決定する最終的で且つ最も重要な因子である破骨細胞による吸収(osteoclastic resorption) に対する如何なる調節もすることができない。
【特許文献１】米国特許第６，１１７，４５６号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
生体内での骨組織の成長及び／又は修復のために有用な生体材料を提供することが本発明の目的である。
【０００７】
生体内での骨組織の成長及び／又は修復を促進するため骨の環境における酸性化を調節するために有用な生体材料を提供することが本発明の目的である。
【０００８】
生体内での骨組織の局所化された修復及び／又は治療のために有用であり、生体内でのマトリックス吸収速度を調節するために適するドーパントを含む生体材料を提供することが本発明の目的である。
【０００９】
治療及び／又は修復が望まれる骨部位に本発明の生体材料を適用する段階を含む、骨を修復及び／又は治療する方法を提供することが本発明の別の目的である。
【００１０】
適するマトリックス材料に、生体内での該材料の吸収速度を調節するために適するドーパントを混合する段階を含む、ＣＡＰ材料を製造するための方法を提供することが本発明の更なる目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、生体内での骨組織の局所化された成長、修復及び／又は治療のために有用な生体材料を提供する。本発明の生体材料には、該生体材料が移植される局所の骨再造形環境内における細胞介在酸性化(cell-mediated acidification) の阻害剤として有効なドーパントを放出するためのキャリアとして役立つ骨適合性マトリックス材料が混合されている。
【００１２】
一般的な観点において、本発明は、局所の骨再造形環境に移植されたとき、骨組織の局所的な成長及び／又は修復を促進するために適する種類の生体材料であって、
骨適合性マトリックス材料と、前記生体材料が移植される骨再造形環境における細胞介在酸性化を低減するために有効な量の細胞介在酸性化の阻害剤、を含む生体材料を提供する。
【００１３】
好ましい実施態様において、本発明の生体材料には、該生体材料が適用された環境における細胞プロセスにより経時的に吸収される種類のマトリックス材料が混合されている。特に、前記生体材料には、マトリックスとして、破骨細胞、活性化されたマクロファージ及び異物巨細胞により骨の再造形過程の間に生じる酸性環境により吸収される材料、が混合されている。本発明の生体材料には更に、ドーパントとして、治療及び／又は修復過程の間にマトリックスが吸収される速度を調節するために有効な量で細胞介在酸性化の阻害剤が混合されている。ドーパントの混合により、マトリックス組成物が吸収される速度は、このようなマトリックス材料が有用な種々の臨床用途によって要求される治療方式及び修復方式に合わせて、調節され得る。
【００１４】
それ故、本発明の観点の一つに従うと、本発明は、骨の成長、治療及び／又は修復に使用するために適する種類の生体材料であって、生体内で吸収されるマトリックス材料と、前記マトリックスが生体内で吸収される速度を調節するために有効な量の細胞介在酸性化の阻害剤、を含む生体材料を提供する。
【００１５】
本発明の別の観点に従うと、本発明は、骨組織の成長又は修復を引き起こすために被検体を処置する方法であって、骨の成長又は修復が望まれる部位に、本発明の生体材料を適用する段階を含む方法を提供する。
【００１６】
本発明の別の観点において、本発明は、骨組織の成長及び／又は修復を引き起こすために有用な種類の生体材料を製造する方法であって、吸収可能なマトリックス材料と、前記マトリックス材料が生体内で吸収される速度を調節するために有効な量の細胞介在酸性化の阻害剤を混合する段階を含む方法を提供する。
【００１７】
本発明の実施態様において、マトリックス材料は、ほぼ周囲温度(near-ambient)のリン酸カルシウムセメントを含む。本発明の他の実施態様において、酸性化の阻害剤は、バフィロマイシン(bafilomycin) を包含するマクロライド(macrolide) 抗生物質のようなプロトンポンプ阻害剤である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下に、添付図面を参照して、本発明の前記の及び他の観点をより詳細に記載する。
【００１９】
図１．移植１０日後の予備硬化ＣＡＰセメントロッドを含むラット大腿骨の断面図：（Ａ）対照ＣＡＰ、（Ｂ）バフィロマイシンＡ１により変性されたＣＡＰ。領域幅３．４ｍｍ。ヘマトキシリン及びエオシン染色。
図２．（Ａ）対照ＣＡＰ、（Ｂ）バフィロマイシンＡ１により変性されたＣＡＰの組織／材料境界面における相違を示す、図１に示される領域を大きく拡大した図。領域幅０．５５ｍｍ。ヘマトキシリン及びエオシン染色。
図３．組織／材料境界面における破骨細胞のＴＲＡＰ染色：（Ａ）対照ＣＡＰ、（Ｂ）バフィロマイシンＡ１により変性されたＣＡＰ。領域幅０．０９７ｍｍ。
図４．移植１４日後の注射可能なＣＡＰセメントペーストを含むラット大腿骨の断面図：（Ａ）対照ＣＡＰ、（Ｂ）バフィロマイシンＡ１により変性されたＣＡＰ。領域幅３．４ｍｍ。マッソンのトリクローム(masson's trichrome)染色。
図５．インプラントを取り囲む局所的な骨量の相違を示している、移植１０日後の予備硬化ＣＡＰセメントロッドを含むラット大腿骨の断面図：（Ａ）対照ＣＡＰ、（Ｂ）バフィロマイシンＡ１により変性されたＣＡＰ。領域幅９．１ｍｍ。ヘマトキシリン及びエオシン染色。
図６．加齢ＯＶＸラットへの移植１０日後の予備硬化ＣＡＰセメントロッドを含むラット大腿骨の断面図：（Ａ）対照ＣＡＰ、（Ｂ）バフィロマイシンＡ１により変性されたＣＡＰ。マッソンのトリクローム染色。
図７．加齢ＯＶＸラットへの移植４カ月後の予備硬化ＣＡＰセメントロッドを含むラット大腿骨の断面図：（Ａ）対照ＣＡＰ、（Ｂ）バフィロマイシンＡ１により変性されたＣＡＰ。マッソンのトリクローム染色。
図８．幼齢ウィスター(Wistar)ラットへの移植１０日後の予備硬化ＣＡＰセメントロッドを含むラット大腿骨の断面図：（Ａ）対照ＣＡＰ、（Ｂ）ＰＡＮＴＯ  ＩＶにより変性されたＣＡＰ。マッソンのトリクローム染色。
【００２０】
本発明は、骨組織の局所的な成長、修復及び／又は治療を引き起こすために有用な生体材料を提供する。本発明の生体材料には、骨の成長、治療及び／又は修復が望まれる部位に適用するために成形され得る骨適合性マトリックス材料が混合されている。このような部位は代表的には、欠損により、骨折により、骨病変の外科的除去により、移植骨の移植により創成された空洞並びに、骨が破砕され得る脊椎内の空洞のような自然の空洞を含むものを包含する。
【００２１】
生体材料が骨の成長を促進するために使用される本発明の実施態様において、細胞介在酸性化の阻害剤が、以下により詳細に記載するような経時的に吸収可能な種類の、又は、実質的に恒久的な、それ故、実質的に吸収不可能な構造に構築される種類の骨適合性マトリックスと共に混合される。これらの恒久的な構造は、典型的には、長期間にわたり骨の代替をするために充分な構造的完全性を有する長持ちする骨充填材を提供することを意図している。このようなマトリックスに包含されるものは、特にアクリルポリマーを含むプラスチック、とりわけポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）である。
【００２２】
本発明の他の実施態様において、マトリックスは、生体内で吸収されて、自然の骨によ
る再造形過程に伴い自然の骨により置換される材料から作られる。特に、用語“吸収可能なマトリックス材料”は、骨の再造形過程の間に自然に創成される酸性環境に生体内で暴露されたとき、吸収される材料を言う。この酸性環境は、破骨細胞により、そして幾分かは、活性化されたマクロファージ及びおそらく再造形部位に補充された異物巨細胞によっても創成され、そして、これらの細胞種内で活性化するプロトンポンプからのＨ+ の放出から引き起こされ得る。
【００２３】
従って、吸収可能なマトリックス材料は、生分解性でない又は吸収されず、その代わり、移植者の存命中、移植部位に保持されるべき負荷耐久性の構造的理由のために設計されている骨移植材料を含まない。実施態様において、本発明の生体材料で使用するために適するマトリックス材料はむしろ適用後に吸収され、そして、通常、数日ないし複数カ月の範囲の期間において自然の骨により置換されるように設計されたものである。マトリックス材料のこの吸収性は、本明細書中に例示された分析を包含する、この分野で現在一般に確立されているマトリックス吸収についての複数の分析の何れか一つ又はそれより多くを使用することにより、決定することができる。
【００２４】
特に適するマトリックス材料は、生分解性のリン酸カルシウム（ＣＡＰ）をベースとするセメント及びペーストである。自然に吸収されることを可能にするように変性し得る範囲で、ＣＡＰをベースとするマトリックスは、ＣＡＰセラミックも包含する。ＣＡＰ注射可能セメント、ＣＡＰリトモルフ(lithomorphs) 並びに、カルシボン（登録商標）（Calcibon) の名前で販売されている遅延生分解性ＣＡＰ材料を包含する、これらの材料と他の物質との組み合わせが適している。特に有用なＣＡＰマトリックスは、典型的には、リン酸二カルシウム、リン酸三カルシウム、リン酸四カルシウム及びヒドロキシアパタイト並びに、これらの二種又はそれより多くのブレンドを含む。本発明に従い適するＣＡＰマトリックス材料は、米国特許第６，１１７，４５６号明細書（この文献は、参照として本明細書中に取り込まれている。）に記載された非晶質リン酸カルシウム（Ｃａ／Ｐは約１．５）から形成された結晶性に乏しいヒドロキシアパタイト成分を有するものを包含する。本発明の一実施態様において、ＣＡＰマトリックスは、リン酸二カルシウムとリン酸四カルシウムの組み合わせを含む。
【００２５】
吸収され得るマトリックス材料として適するものは更に、例えば、ポリラクチド及びポリグリコライド及びそれらのコポリマー（ＰＬＧＡｓ）を包含し得るもの、を包含するポリエステルをベースとする二次元又は三次元形態のポリマー状マトリックス組成物である。このようなマトリックス材料は、例えば、ホリー(Holy)らにより、「生体材料(Biomaterials)」、１９９９年、第２０巻（第１３号）、第１１７７〜８５頁に記載されたコポリマーを包含する。この材料はオステオフォーム（登録商標）(Osteofoam) とも呼ばれるが、ポリ（ラクチド−コ−グリコライド）ＰＬＧＡ７５／２５コポリマーから作られたマクロ多孔性(macroporous) 、生分解性及び生体適合性組織エンジニアリングスカフォルド(engineering scaffold)である。オステオフォーム（登録商標）(Osteofoam) のマクロ多孔性の相互結合した多孔性構造は、小柱骨(trabecular bone) の多孔性構造に類似しており、そして前記スカフォルド外表面上のみでなく前記スカフォルド全体にわたり組織侵入を可能にする。このスカフォルドの化学的構造は、非細胞傷害性の分解生成物への前記スカフォルドの生体内分解を可能にする。前記ポリマーは酸性環境下で分解され、従って、破骨細胞又はマクロファージにより創成された酸性環境により、生体内で分解され得る。
【００２６】
吸収され得るマトリックス材料は更に、開発されている種々の組織エンジニアリングスカフォルドの何れかから選択することができ、その幾つかは有機合成ポリマー並びにフィブリンのような天然産ポリマーを含むが、但し、このようなマトリックス材料の吸収は、再造形環境における破骨細胞／マクロファージ介在酸性化により、少なくとも部分的に調節される。更に、マトリックス材料は、従来技術において用途が充分に確立している、鉱
物質が除去された骨マトリックスを含むこともできる。
【００２７】
先行技術においては、適用部位でマトリックスが吸収される速度に対する調節は、該マトリックスの物理化学的性質を変更することにより達成された。これに対して、本発明は、マトリックス吸収を調節するために生物学的／生化学的物質の使用を必要とする。より特別には、本発明の生体材料において、マトリックスには、適用部位でマトリックス材料が吸収されるか、或いは、酸性分解を経由して生分解される速度を低減する手段としての細胞介在酸性化の阻害剤が混合又はドープされる。従って、このような阻害剤を混合することにより、全ての吸収され得るマトリックスの寿命を、特定の処置部位における要求に合致させることができる。
【００２８】
マトリックスが吸収される速度を調節するために有効な量で酸性化阻害剤がドープされるとき、全く驚くべきことに、移植部位において、新しい骨のネット形成(net formation) があることが発見された。従って、本発明の生体材料は、移植部位における新しい骨の成長を促進する投与量の酸性化阻害剤を含むものを包含する。本発明は更に、吸収され得る骨適合性マトリックスと、新しい骨の成長の促進に使用するための細胞介在酸性化の阻害剤を含む、本発明の生体材料を包含する。
【００２９】
酸性化阻害剤は、再造形過程の間に生体内で骨再造形環境が酸性化されるレベルを低減する性質を有する。適する酸性化阻害剤は、典型的には、破骨細胞における細胞外への(exocytic)及び／又は細胞内への(endocytic) 膜経由移送過程に影響を及ぼすことにより、破骨細胞及び活性化されたマクロファージのようなリソービング細胞(resorbing cells) が再造形環境内にプロトンを放出するレベル又は速度を低減するために機械的に機能するものであると理解される。用語“酸性化阻害剤”は、破骨細胞の数又は生存能力を低減するために生物学的に機能する薬剤を包含することを意図していない。より特別には、酸性化阻害剤は、リソービング細胞からプロトンが放出される生化学的カスケイド(cascade) を阻害し、それにより、再造形環境が酸性化するレベル及び／又は速度を低減するために直接的又は間接的に機能する化合物又は薬剤である。
【００３０】
このような酸性化阻害剤を同定するために適する分析法は、デービス(Davies)らにより、「細胞及び材料(Cells and Materials) 」、１９９３年、第３巻、第２４５〜２５６頁に記載され、また、米国特許第５，７６６，６６９号明細書、米国特許第５，８４９，５６９号明細書及び米国特許第５，８６１，３０６号明細書に記載されており、これらの開示は、参照として本明細書中に取り込まれている。要するに、前記分析法では、ＣＡＰのようなマトリックス材料でコートされた二次元表面を用い、その後、該表面上で、吸収阻害剤(resorption inhibitors) の存在下又は非存在下で破骨細胞を培養する。この分析法により、細胞介在酸性化の阻害剤は、未処置の対照と比較して破骨細胞の生存能力に関して又は付着した破骨細胞の数に関して実質的な影響を与えないにもかかわらず、酸性化阻害剤の不存在下で前記表面上で培養された破骨細胞を有するネガティブ対照と比較して、破骨細胞によりマトリックスコーティングが溶解される程度の減少により示される、破骨細胞介在ＣＡＰ吸収(osteoclast-mediated CAP resorption)の減少を起こす化合物として同定される。この分析を行うために適する試薬は、現在市販品が入手可能であり、例えば、オステオロジック（登録商標）（Osteologic) の名前で、ディスクとして又はマルチテストスライド(MultTest slides) として、ベクトンディッキンソン(Becton Dickinson)社から販売されている。
【００３１】
最も望ましくは、選択された酸性化阻害剤は、該阻害剤が適用される環境においてマトリックス材料又は骨組織に過度に強くは結合しないものである。適する阻害剤は、例えば、ＰＢＳ又は前記阻害剤に適する他の溶媒で洗浄することにより、マトリックスマトリックスから検出可能な量が放出され得るものである。前記阻害剤はまた、それでドーピング
した後、活性を保持すべきでもある。従って、適する阻害剤は、マトリックスからそれらを抽出した後、前記分析法において活性を保持するであろう。
【００３２】
適する酸性化阻害剤は、単離された破骨細胞の裂孔環境(lacunae environment) を形成するために、破骨細胞がマトリックス表面に付着することを可能にする性質も有する。望ましく破骨細胞が広がった形態を与える阻害剤は、前記化合物の存在下吸収ピット(resorptive pits) が形成されるが、但し、未処置の対照に比較して減少した容積及び数で形成されることを確認するために、破骨細胞分析法(Osteologic assay)を使用して更に検査することができる。更にまた、プレート化された破骨細胞の下の裂孔領域及び破骨細胞自体を、３−（２，４−ジニトロアニリノ）−３’−アミノ−Ｎ−メチルジプロピルアミン（ＤＡＭＰ）のような向酸性型の染料(acidotropic dye) を用いてマークすることができる。従って、例えば蛍光により測定される染色強度は、望ましい酸性化阻害剤が、特に破骨細胞が撹乱された境界において及び裂孔の下のマトリックス表面において酸性化の減少を引き起こす化合物であることを明らかにするのに役立つ。このような分析法は、例えば、アキサカ(Akisaka) らにより、「細胞組織解像(Cell Tissue Res.)、１９９９年、第２９８巻（第３号）、第５２７〜５３７頁」に記載されており、前記文献は参照として本明細書中に取り込まれている。
【００３３】
また別の分析形式が、細胞介在酸性化の阻害剤を同定するために適している。これらは、酸性化阻害剤候補の存在下及び非存在下において骨吸収(bone resorption) が評価される生体内バイオアッセイを包含する。例えば、チャンバース(Chambers)らにより、「内分泌学(Endocrinology) 」、１９８６年、第１１６巻、第２３４頁（この文献は、参照として本明細書中に取り込まれている。）に記載されたように、破骨細胞は、新生児ラット長骨からヘペス緩衝化媒体(Hepes-buffered medium) １９９内に、機械的に瓦解する。懸濁液を撹拌し、そして大きいフラグメントを沈殿させる。その後、細胞を、骨スライスを含むマルチウェル皿の二つのウェルに添加し、３７℃で１５分間保持した後、骨スライスを除去し、媒体で洗浄し、そして個別のウェル内に置く。ｖＰＰＩ候補を含むか又は含まないハンクス(Hanks) 緩衝化ＭＥＭ中１０％ＦＣＳ中で２４時間培養した後、破骨細胞及び骨吸収の数を、カコジル酸塩緩衝剤中２％グルタルアルデヒドを用いて固定し、そして酒石酸塩耐久性の酸ホスファターゼ(tartrate-resistant acid phosphatase) （ＴＲＡＰ）を染色することにより、共焦点レーザー顕微鏡により定量する。大きい多核の赤く染色された細胞の数を計測した後、骨スライスを１０％次亜塩素酸ナトリウム中に６０分間浸漬して細胞を除去し、蒸留水で洗浄し、そして金をスパッタコートし、その後、顕微鏡により再検査する。破骨細胞陥凹(osteoclast excavations)の数及び寸法、吸収された骨の平坦な領域及び容積を記録する。この分析法により、酸性化阻害剤は、（１）破骨細胞の生存能力に又は、補修部位に結合した破骨細胞の数に、実質的に影響を及ぼさず、そして（２）破骨細胞当たりの平均ピット数、及び／又は破骨細胞当たりの平均面積、及び／又は破骨細胞当たりの平均容積において、対照を越える低減を引き起こす、として同定される。
【００３４】
本発明の生体材料において使用するために適する、細胞介在酸性化の阻害剤は、特に、いわゆるプロトンポンプ阻害剤又はＰＰＩを包含する。前記ＰＰＩは空胞プロトンポンプ阻害剤である化合物を包含し、これは、哺乳類の破骨細胞に特異的であると信じられている。空胞プロトンポンプ阻害剤ｖＰＰＩは、破骨細胞中に存在するｖＡＴＰａｓｅの活性を阻害し、次いでｖＡＴＰａｓｅのサブユニットＣへの“結合”によりプロトンの放出を妨げ、その結果、破骨細胞が機能して骨を分解する酸性環境の創成を抑制する、その能力により特徴付けられる［ビー．ボウマン(B.Bowman)、イー．ボウマン(E.Bowman)、ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー(J.Biol.Chem.)、第２７７巻（第６号）、第３９６５頁、２００２年参照］。従って、本発明の生体材料には、酸性化阻害剤として、ｖＡＴＰａｓｅそして、特に、哺乳類の破骨細胞ｖＡＴＰａｓｅ（Ｈ+ −ＡＴＰａｓｅと
も呼ばれる）の活性を阻害する全てのｖＰＰＩを混合し得る。前記ｖＡＴＰａｓｅの構造は、例えば、国際特許公開第９３／０１２８０号パンフレット及び、ハル(Hall)らにより、「骨及びミネラル解像(Bone and Mineral Res.) 、１９９４年、第２７巻、第１５９頁」に記載されており、前記文献は参照として本明細書中に取り込まれている。前記ｖＰＰＩは、例えば、前記参考文献に記載されたような確立された生物学的分析法を使用することにより、同定することができる。
【００３５】
本発明の生体材料において有用な酸性化阻害剤は、多数のマクロライド抗生物質を含む他のプロトンポンプ阻害剤を包含する。従って、有用なｖＰＰＩは、コンカナマイシンＡ，Ｂ及びＣ、３’，９−ジ−Ｏ−アセチルコンカナマイシンＡを含むその類似物質並びに、コンカノライドＡ及びＢを含む対応するコンカノライド並びに、２１−デオキシコンカノライドＡ又はＢ、２３−Ｏ−メチルコンカノライドＡ、１６−ジメチル−２１−デオキシコンカノライドＡ、２１，２３−ジデオキシ−２３−エピアジドコンカノライドＡ、２３−Ｏ−（ｐ−ニトロベンゼンスルホニル）−２１−デオキシコンカノライドＡ、２１−デオキシコンカノライドＡ−２３−ケトン及び対応する９，２３−ジケトン及び、２１，２３−ジデオキシ−２３−エピクロロコンカノライドＡを含む特定の類似物質を包含する。
【００３６】
酸性化阻害剤として有用なものはまた、米国特許第５，９８５，９０５号明細書及び米国特許第６，０２５，３９０号明細書にそれぞれ開示されたプロトンポンプ阻害性インドール誘導体及びヘテロ芳香族ペンタジエン酸誘導体であり、前記文献は参照として本明細書中に取り込まれている。
【００３７】
有用な酸性化阻害剤はまた、特にバフィロマイシン、例えばバフィロマイシンＡ１，Ａ２，Ｂ１，Ｂ２，Ｃ１，Ｃ２及びＤ、ヒグロリジン、ヒグロリジンアミド、デフマリルヒグロリジンを含むオキソヒドロリジン及びヒグロリジン類並びに、例えば米国特許第５，３５４，７７３号明細書に記載された１６−員のジエンマクロライドを包含する。本発明の実施態様において、ｖＰＰＩはバフィロマイシンＣ１又は、より好ましくは、バフィロマイシンＡ１である。
【００３８】
また他のマクロライドＰＰＩ並びに特定の非マクロライドＰＰＩ、例えばパントプラゾール及び、オメプラゾールを含む構造的に関連があるベンズイミダゾールも、それらがプロトンポンプ阻害活性を示し、或いは本明細書の上記の生物学的基準に合致するとき、本発明において使用し得る。
【００３９】
酸性化阻害剤は、結果的に破骨細胞及び／又は活性化されたマクロファージからのプロトン放出を生じる生化学的カスケイドに直接的又は間接的に作用することにより、生体材料が適用される骨再造形環境の酸性を低減するように機能する全ての化合物を包含し得ることが判る。例えば、本発明の実施態様において、酸性化阻害剤は、ポンプの上流で、結果として特定の細胞種からのプロトン放出を生じる生化学的カスケイドを阻害するように作用する化合物を包含し得る。このような化合物は、例えば、シュレジンガー(Schlesinger) らによりマイナー．電解質代謝(Miner.Electrolyte Metab.)、１９９４年、第２０巻、第３１〜３９頁（この文献は、参照として本明細書中に取り込まれている。）で報告された、確立された分析法により同定される。要するに、前記分析法は、プロトンポンプ以外のチャネルを通って破骨細胞に入り得る潜在的な吸収阻害剤化合物を同定する。このようなチャネルが、破骨細胞の先端膜（細胞外の環境に暴露される）上に、並びに、破骨細胞陥凹を細胞外の環境に体面させ且つ該環境から隔離している、撹乱された境界上に見出される。前記刊行物に記載された化合物は内部破骨細胞経路に影響を及ぼすことが示され、該経路は、破骨細胞の、破骨細胞陥凹内の隔離されたミクロ環境を酸性化する能力に影響を及ぼす。培養されたトリの破骨細胞が、最終的な酸性化経路に潜在的に影響を及ぼし
得る多数の化合物を検査するために使用された。前記検査のために使用された基材は、 3Ｈ−プロリンを用いて生体内で最初に標識化されたラット骨粒であった。破骨細胞は最初に、前記の標識化された骨粒に付着され、そして、培養された破骨細胞が骨を吸収するとき、 3Ｈ−プロリン標識の放出（μｇ）を測定することにより、骨吸収ベースラインが確立された。トレーサー標識の存在は、活性な吸収が示された通り、骨粒への破骨細胞の付着を妨げなかった。次いで、阻害剤化合物候補を培養媒体に添加し、そして放出された標識の量を再測定した。放出された標識の量の減少は、吸収の減少と相関関係があり、そして、阻害剤候補を酸性化阻害剤として本発明で使用する阻害剤として示す。
【００４０】
このような酸性化阻害剤に包含されるものは、スマリン、ジイソチオシアナト−スチベン−ジスルホン酸（ＤＩＰＳ）のようなクロライドポンプ阻害剤及び、炭酸脱水酵素阻害剤である。
【００４１】
従って、本発明によると、前記マトリックス材料の生体内吸収の原因である破骨細胞／マクロファージ介在酸性化過程の阻害剤を混合することにより、与えられたマトリックス材料の吸収が生物学的に調節される。
【００４２】
本発明に従い望ましい吸収調節を提供するため、望ましい骨組織の治療及び／又は修復過程を維持しながら、生体内で再造形過程の間にマトリックス材料が吸収される速度を低減するために有効な量で、選択された酸性化阻害剤を、吸収され得るマトリックス材料に混合する。この阻害活性を与えるために有効な阻害剤量は、化合物の効能、生体材料の適用部位、処置される状態及び、重要なこととして、マトリックスの構造的完全性が処置のために要求される望ましい期間、を包含する多数のパラメーターに応じて変化するであろう。
【００４３】
バフィロマイシンＡ１を用いた実験結果は、ＣＡＰマトリックス吸収に対する調節を達成するために最も適するＰＰＩ濃度範囲が存在することを示している。本明細書中の実施例に示されるように、投与範囲の検討は、バフィロマイシン濃度が、それを越すと骨治療過程に有害である極大に達することを示しており、該極大は、インプラント近傍の外側への阻害剤の拡散に伴う他の細胞種による妨害からくるものと思われる。また、ある閾値以下のバフィロマイシン濃度は、ＣＡＰマトリックスが吸収された速度における変化を全く示さない。更に、バフィロマイシンがＣＡＰマトリックス分解に対する調節をする投与ウィンドウは、該バフィロマイシンの抗生物質としての使用のために有効であることが示唆された遥かに広い投与範囲と無関係である。従って、抗生物質としてのバフィロマイシンの効果的な使用と、マトリックスが吸収される速度を調節するための手段としての該バフィロマイシンの使用の間には、生物学的に引き起こされた異なるバランスが明らかに存在する。
【００４４】
本発明の特別な観点によると、ＣＡＰマトリックス材料及び、酸性化阻害剤として、生体内でＣＡＰマトリックス材料が吸収される速度を調節するために有効な量で、プロトンポンプ阻害剤を含む、骨を成長させ、修復し及び／又は治療するために有用な生体材料が提供される。
【００４５】
与えられたマトリックスの生体内吸収を調節するために有効な与えられたＰＰＩの量は、本明細書中に例示される生物学的分析法を使用して都合良く決定することができる。要するに、与えられたＣＡＰマトリックスは、様々な量の与えられたＰＰＩ、例えば、マトリックスのミリグラム当たり、ナノグラムないしミリグラムの重量範囲のＰＰＩでドープされる。試料調製は、常法により、ＣＡＰマトリックス物質を、典型的には調製溶液としての、選択された量の阻害剤と一緒に混合することにより達成される。最も適切には、固相のＣＡＰ物質を添加する前に、阻害剤を最初に液相中で混合して、結果として、ペース
トを形成する。ＰＰＩがドープされたペーストとして、ＣＡＰ生体材料を、硬化の間に、ロッド（注射可能な材料、リトモルフ等）に成形し、その後、実験動物の大腿骨中に作られた欠損部に移植することができる。望ましい処置期間の後前記大腿骨（調製されたその組織切片）を取り出し、その後、インプラント分解及びインプラントゾーンにおける破骨細胞コロニーの存在について顕微鏡下で検査する。与えられたＰＰＩの有効な量／濃度は、マトリックス材料と組み合わせて骨組織の向上した成長、治療及び／又は修復のために有用であり、そして、非ドープの対照に比較してマトリックスの損傷を低減する、量／濃度として明らかになる。生物学的用語において、与えられた酸性化阻害剤についての有効投与範囲は、隣接する切断コーンの数及びマトリックス内への吸収細胞の侵入を許容するがしかし低減する最小量並びに、向上した成長、治療及び／又は修復過程を維持するために、即ち、初期に形成された繊維組織又は繊維カプセルが何れも分解することを許容するために及びマトリックス適用部位への炎症性細胞の補充を制限するために有効な最大量として示される。
【００４６】
一実施態様において、本発明は、ほぼ周囲温度のＣＡＰマトリックスと、前記マトリックスが生体内で分解される速度を低減するために有効な量のバフィロマイシンＡ１を含むＣＡＰ生体材料を提供する。特別な態様において、ほぼ周囲温度のＣＡＰマトリックスは、リン酸二カルシウム及びリン酸四カルシウムを含む。他の実施態様において、バフィロマイシンＡ１は、セメントを調製するために使用する液相中に０．５〜６．５×１０-4Ｍ、例えば１．０〜３．０×１０-4Ｍ、そして特別には１．４〜１．８×１０-4Ｍの量で存在する。重量で表現すると、バフィロマイシンＡ１は、適切には、ＣＡＰマトリックス５００ｍｇ当たり、健常ラット及び骨減少症ラットにおいて、約２５〜１００μｇ、望ましくは３０〜７０μｇ、より望ましくは３５〜６５μｇ、そして最も望ましくは４０〜６０μｇの範囲の量で、例えば、ほぼ周囲温度のＣＡＰマトリックス５００ｍｇ当たり約４０μｇ混合される。重量比で表現すると、バフィロマイシンＡ１：ＣＡＰマトリックス比（ｍｇＰＰＩ：ｍｇＣＡＰ）は、望ましくは、約１：２００００ないし約１：５０００、望ましくは１：１７０００ないし１：７０００、より望ましくは１：１５０００ないし１：７５００、そして最も望ましくは１：１２５００ないし１：８０００の範囲内にある。
【００４７】
マトリックスの吸収の調節に有用な酸性化阻害剤の特定の投与量は、勿論、特定の阻害剤の効能、選択されたマトリックス材料の種類、及び阻害剤がドープされたマトリックス材料を製造するために使用される技術に依存することが判る。バフィロマイシン／ＣＡＰの組み合わせ並びに、パントプラゾールとの及びカルシボン（登録商標）との他の注目される組み合わせに対して、本明細書で提供された結果と一緒に本明細書中に記載された分析法は、同一原理に基づき機能する他の生体材料を製造するための最適なパラメーターを決定するに充分なガイダンスを提供することも判る。
【００４８】
ＰＰＩがドープされたＣＡＰ生体材料は、ＣＡＰ生体材料について既に確立された前記方法を適用して、但し、プロセスにおける何れかの都合の良いポイントにおいてＣＡＰマトリックス内にＰＰＩを混合する付加的な段階を伴って、製造することができる。好適には、ＰＰＩは、液相のＣＡＰ試薬に充分可溶性であり、そして最終的なペーストが形成される前に、前記相に望ましい量で導入される。もう一つの方法として、撹拌しながら固相試薬にＰＰＩを添加し、その後、一緒に溶解して液体試薬相にすることができる。更に別の方法として、ＰＰＩを予め形成されたＣＡＰマトリックスにコーティングとして使用することもでき、そしてマトリックス表面上に噴霧することにより、又は、マトリックスをＰＰＩの溶液に浸漬してマトリックス内の細孔に含浸することにより、適用することもできる。従って、マトリックスの吸収又は生分解の間にマトリックスからＰＰＩを溶出又は滲出させる、或いは、侵入する破骨細胞と対決するためＰＰＩをマトリックスに結合させ残存させる、広範なＣＡＰマトリックス材料のために、ドーパントとしてＰＰＩを使用することができることも判る。好適には、ＣＡＰマトリックスは、ほぼ周囲温度で硬化する
利点を有し、且つ僅かな発熱エネルギーを用いて硬化する、ほぼ周囲温度のＣＡＰマトリックスである。
【００４９】
同様に、酸性化阻害剤は、ＰＬＧＡを包含する他のマトリックス材料に混合することができる。例えば、ＰＬＧＡは、平坦な表面上で硬化させることにより、二次元形態で形成することができる。得られた二次元ポリマーはその後、選択された酸性化阻害剤を含む溶液に該ポリマーを浸漬することにより、又は、該ポリマーの表面に前記溶液を噴霧することにより、酸性化阻害剤を簡単にドープすることができ、望ましい投与量の前記阻害剤を該ポリマーの破骨細胞接触表面上に提供する。例えば、このような表面の製造のために必要な段階は、ＰＬＧＡのようなポリマー［例えば、ＰＬＧＡ７５：２５、固有粘度０．８７ｄＬ／ｇ、アラバマ州のバーミンガムポリマー株式会社(Birmingham Polymer Inc.) 製］を、例えばクロロホルムのような揮発性溶液に２％（ｗ／ｖ）溶解することを包含する。ポリマー溶液の粘度は、必要に応じて調節することができる。ＰＰＩは適当な溶液に溶解してポリマー溶液に混合することもできるし、又は、ＰＰＩはポリマーペレットを溶解するために必要な初期溶媒に溶解することもできる。
【００５０】
二次元のポリマー−阻害剤表面を創成するために、得られたポリマー−阻害剤溶液を、スピンコーティングと呼ばれる手法を使用して、滅菌ガラスカバースリップ［ニュージャージー州のベルコ(Bellco)製］に塗布する。ホトリトグラフィースピナー［テキサス州のヘッドウェイリサーチ社製］を使用してカバースリップを５５００ｒｐｍでスピンさせながら、２％ポリマー−阻害剤溶液０．５ｍＬを、ピペットを使用して１２０秒間にわたってスピンしているカバースリップに滴下して適用する。スピンコーティングの後、カバースリップを空気乾燥し、そしてα−最小基本媒体（α−ＭＥＭ）（細胞供給溶液）で洗浄する。対照ポリマー表面は、前記阻害剤を含まないこと以外は同様の方式にて調製すべきである。
【００５１】
得られたポリマー−阻害剤がコートされたカバースリップ及び対照カバースリップも、例えば、デービス(Davies)らにより記載されたような破骨細胞群に対して使用することができる。ポリマー−阻害剤がコートされたカバースリップも、破骨細胞を含まない組織培養媒体に浸漬し、そしてポリマー分解及びポリマーマトリックスからの阻害剤溶解に対するネガティブ対照として使用すべきである。
【００５２】
更に、ポリマーを適する溶剤に、例えばＰＬＧＡをクロロホルム中に溶解することができ、そしてＰＰＩ（固体形態又は液体形態にある）をポリマー溶液に混合することができ、これをその後、液体として投与するか又は、硬化させて固体インプラントとして使用する。
【００５３】
ＣＡＰマトリックス自体がそうであるように、本発明の生体材料を広範な臨床的環境で用いることができ、種々の解剖学的部位における骨組織の成長、治療及び修復を引き起こす。このような最終用途は、如何なる制約も無く、歯科用途、骨折修復、関節形成、頭蓋−顔面プラスチック復元、空洞隆起充填剤(sinus lift filler) 及び脊椎形成並びに、骨減少症、骨粗鬆症等のような骨の疾患及び症状の次に来る前記症状の局所的処置をも包含する。本発明のＣＡＰ生体材料は、有効なＰＰＩ量の添加によって、ＣＡＰマトリックスを望ましい治療のためにより高度に且つより適切に調節された処置期間の間維持できるという付加的な利点を提供する。抗生物質ＰＰＩをベースとする生体材料は、通常、感染が存在する骨部位に適用することができ、それにより、そこに存在するＰＰＩの抗生物質的性質の利点を得ることが更に判る。しかしながら、同一生体材料は、通常、適用部位の感染状態に関係なく適用され、そして、感染又は生物汚染が存在しない部位に有効に使用することができることも判る。
【００５４】
本発明の生体材料は、骨部位に有効に移送され治療などを促進し得る、骨成長因子、有機ポリマー例えばフィブリン等のような、他の成分を更に混合することができることも判る。
【実施例】
【００５５】
実施例１
材料及び方法
化学薬品
リン酸二カルシウム無水物（ＣａＨＰＯ4 、ＤＣＰＡ）及びバフィロマイシンＡ１、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及びメタノール（ＭｅＯＨ）を、シグマ−アルドリッチ社(Sigma-Aldrich Inc.)（カナダ国、オンタリオ州、オークビル）から購入した。リン酸四カルシウム（Ｃａ4 （ＰＯ4 ）2 Ｏ）、ＴＴＣＰ）を、クラークソンクロマトグラフィープロダクツ社(Clarkson Chromatography Products Inc.) （米国、ペンシルベニア州、サウスウィリアムポート）から購入した。液相の調製のために使用する化合物であるリン酸水素二ナトリウム（Ｎａ2 ＨＰＯ4 ）及びリン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ2 ＰＯ4 ）を、ＢＤＨ社（カナダ国、オンタリオ州、トロント）から購入した。
【００５６】
ＣＡＰペースト及び予備硬化セメントロッドの製造
リン酸カルシウム前駆体粉末は、ガンマ線照射（２０ｋＧｙ）により滅菌されたＤＣＰＡとＴＴＣＰの当モル混合物からなる。脱イオン化二回蒸留水を、抵抗１８ＭΩで操作されたミリポア社（米国、マサチューセッツ州、ベッドフォード）製ミリ−ＲＯ  １０プラス及びミル−Ｑ  ＵＦプラスシステム(Millipore Milli-RO 10 Plus and Mill-Q UF Plus
systems）から得た。液相はｐＨ７．４の中性リン酸水素ナトリウム溶液であり、これを、０．２２μｍフィルター［米国、マサチューセッツ州、ベッドフォードのミリポア社(Millipore Corp.) 製］を通す濾過により滅菌した。
【００５７】
バフィロマイシンＡ１を最初にＤＭＳＯ溶液（使用し得る他の溶液は、メタノール及びエタノールである。）に溶解し、次いでＮａ2 ＨＰＯ4 及びＮａＨ2 ＰＯ4 から調製した中性リン酸塩溶液に分散させた。
【００５８】
バフィロマイシンＡ１の三つの濃度を調べた：１．６１×１０-5Ｍ（ＤＭＳＯ溶剤）、１．６１×１０-4Ｍ（ＤＭＳＯ溶剤）及び２．０×１０-3Ｍ（ＤＭＳＯへのバフィロマイシンＡ１の溶解度を超過したので、メタノール溶剤を使用した。）。
【００５９】
最も低い濃度を持つセメントは組織において異ならなかった（対照及びバフィロマイシンＡ１を含むセメントの両方で吸収が起こった）。最も高い濃度を持つものもまた機能しなかた（骨はインプラントの周囲で治療されない）。
【００６０】
濃度１．６１×１０-4Ｍが非常に良く機能することが見出され、従って、全ての実験に対する標準濃度として選択された。
【００６１】
バフィロマイシンＡ１を二相性液相に分散させた後、前記液相を、ＣＡＰの固体成分の一つであるリン酸二カルシウム無水物（ＤＣＰＡ）に添加した。ＤＣＰＡを前記液相に溶解し、そして連続的に混合しながら２分間室温で放置した。
【００６２】
次いで、リン酸四カルシウム（ＴＴＣＰ）を、最初に溶解したＣＡＰ成分に徐々に添加
してペーストを製造した。最終ＣＡＰの粉末対液体比（Ｐ／Ｌ）は２．０（ｗｔ／ｗｔ）であった。
【００６３】
ペーストを移植するか又はロッドの製造のために使用した。充填されたＣＰＣペーストのアリクウォットを、カスタムメイドのテフロン（登録商標）フォーマー中、３７℃及び湿度１００％で２４時間、その後室温で４８時間硬化させることにより、セメントロッド（直径１．９ｍｍ、高さ２．３ｍｍ）を成形した。
【００６４】
移植手順
平均体重１２５ｇ〜１５０ｇの幼齢の雄のウィスターラットをチャールスリバー(Charles River) 社（カナダ、ケベック州）から購入し、光と温度を調節した部屋に収容し、そして標準ダイエットを与えた。動物の管理及び使用は、カナディアン  カウンシル  オブ
アニマルズ  ケア  ガイドラインズ(Canadian Council of Animal Care Guidelines)に従った。
【００６５】
骨欠損を、大腿骨の中央骨幹に穿孔した。多量の生理食塩水を流しながら、低速の歯科用ドリル（直径２．３ｍｍ）を使用して孔を作った。優しく押圧して、予備硬化したＣＰＣロッドを孔の中に置いた。全てのラットが、二つのインプラント：一方の大腿骨中の対照ロッド（ペースト）及び他方の大腿骨中のバフィロマイシンＡ１を含むロッド（ペースト）、を受容した。動物を移植期間中、毎日観察した。
【００６６】
組織学的プロセシング
生体内での望ましい時間の後、動物を犠牲にし、そして大腿骨を取り出した。その後、大腿骨を定着溶液に４８時間暴露し、４５％蟻酸と２０％クエン酸ナトリウムの１：１混合物中で石灰質を除き、脱水し、そして低融点パラフィン中に固定した。硬質組織スペンサー(Spencer) ８２０マイクロトームを使用して、インプラントの長手軸に垂直な連続切片（６μｍ）を得た。試料切片をヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）及びマッソンのトリクローム染料で染色した。代表的な切片も、破骨細胞に特徴的な酒石酸塩耐久性の酸ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）酵素の存在を検査し、材料／骨境界面の細胞の正体を決定した。
【００６７】
結果
Ａ．移植されたセメントロッドと骨−材料境界面の外観
図１Ａは、初期の円筒状の対照ロッドが変形し、そして周囲が不規則になったことを示す。周囲表面及び対照セメントのバルクマトリックスのより詳細な検査は、高度な細胞活性を示した（図２Ａ）。吸収の特徴を示す破骨細胞の“切断コーン(cutting cones) ”が明らかであった。前記“切断コーン”の先端の細胞は大きく、多核的で、且つ形態が不規則であった。
【００６８】
対照物とは異なり、バフィロマイシンＡ１を含むセメントロッドは変形されておらず、そして滑らかな周囲を有していた（図１Ｂ）。大きい、細長いそして多核の細胞が、ロッドの周囲を取り囲んでいた（図２Ｂ）。
【００６９】
Ｂ．インプラントを取り囲む新しい骨
新しい骨の層が、対照とバフィロマイシンＡ１により変性されたセメントの両方を取り
囲んだ（図１）。新しい骨の量は、バフィロマイシンＡ１により変性されたセメントにおけるよりも対照物においてより少なく、この事は、再造形の速度が異なったことを示唆している。ペーストとして移植されたＣＡＰ材料は、予備硬化されたセメントにおいて観察された応答と同様の応答を示した（図４）。
【００７０】
形態により説明されるように（図１、２、４及び５）、ＣＡＰセメント中のバフィロマイシンＡ１の存在は、この空胞プロトンポンプ阻害剤を含まない対照物に比較して、前記材料の吸収速度を低減した。バフィロマイシンＡ１を含む予備硬化セメントロッドは、検討された移植期間を通じて、それらの元の円筒状の形態保持した。 これに対して、対照セメントロッドの外観は幾分変形し、これは、材料マトリックスのエッジ部及び深部における高程度な細胞活性（破骨細胞による吸収）に起因するものであり得る。対照セメントにおいて、代謝が活性な骨に典型的に見られる“切断コーン”が、ロッドのマトリックス内に割り込んでいた。“切断コーン”の最前部における多核細胞の形態は、骨の吸収の原因である破骨細胞の特徴であった。これらの多核細胞は酵素ＴＲＡＰに対するポジティブな染色を示し（図３）、破骨細胞であるというそれらの身元を確認した。バフィロマイシンＡ１を含むセメントは、上記の典型的な吸収パターンを示さなかった。材料の周囲を取り囲んで並んでいる多核細胞は、細長く且つ平坦であった。これらの細胞は“切断コーン”を形成しなかったけれども、それらも確かにＴＲＡＰでポジティブに染色し、この事は再び、それらが破骨細胞であると同定した。しかしながら、これらの破骨細胞は、それらのプロトンポンプが阻害されたので材料を吸収せず、従って、材料の元の形状が保持された。
【００７１】
検討された全ての試験片において、バフィロマイシンＡ１を含むセメントは常に、対照セメントよりも多くの骨により取り囲まれていた。バフィロマイシンＡ１セメントを取り囲む新しい骨は、対照物を取り囲む骨よりも濃密であることが判り、この事は、破骨細胞の吸収活性が低減したことに起因するものであり得る。バフィロマイシンＡ１を含むＣＰＣを取り囲むより多くの骨は、空胞プロトンポンプ阻害剤により誘発された有利な“副次効果”であると考えられる。バフィロマイシンＡ１は材料の吸収を鈍化させるのみならず、インプラント周囲の環境内に滲出することにより、セメントを取り囲む新たに形成された骨の吸収をも鈍化させる。
【００７２】
従って、セメント内に空胞プロトンポンプ阻害剤を導入することにより、ほぼ周囲温度のＣＡＰ材料の吸収を生物学的に調節することができることが判る。破骨細胞の撹乱された境界に局在する空胞プロトンポンプの機能を妨げることにより、バフィロマイシンＡ１はＣＡＰセメント吸収を阻害したが、この阻害がなければ破骨細胞は該材料を吸収する。
【００７３】
実施例２
バフィロマイシンをドープしたインプラントの性能を、卵巣切除した加齢ラットを用いる骨粗鬆症のモデルにおいても評価した。ホスト骨への骨性インプラントの一体化の成功は、骨吸収過程と骨形成過程のバランスの撹乱に起因する骨減少症を引き起こす骨粗鬆症のような病的な骨の症状によって、悪影響を受け得る。従って、エストロゲン欠乏に起因する全身の骨欠損は、インプラントの周囲の骨の成長及び管理にも悪影響を及ぼし得る。全身骨折の阻止及び骨量を保持するために役立つ新規治療法の開発に関する分野に現在注目が集まってけれども、骨粗鬆症性の欠損部位へのインプラントの整骨一体化の向上は殆ど重要視されていない。
【００７４】
対照物と比較した骨組織形成及びプロトンポンプ阻害剤（バフィロマイシンＡ１）により変性された吸収され得るＣＡＰセメントインプラントの吸収に対する卵巣切除の影響を検討した。
【００７５】
移植手順
１０カ月齢の卵巣切除された（ｏｖｘ）バージンのブラウンノルウェイ(Brown Norway)ラットを、ナショナル  インスティチュート  オン  エイジング(National Institute on
Aging) （米国、メリーランド州、ベテスダ）から購入し、光と温度を調節した部屋に個別に収容し、そして制限されたダイエットを与えた（６ペレット／日）。これらの動物を、卵巣切除の後、更に４カ月飼った。その後、移植期間（１４カ月）における実験用ラットとして、同一年齢の非ｏｖｘブラウンノルウェイラットを、ｏｖｘ動物に対する対照群として使用した。インプラントの一体化及び吸収を評価するために、幼齢バージンの雌ブラウンノルウェイラット（３カ月齢）を別の比較群として使用した。動物の管理及び使用は、カナディアン  カウンシル  オブ  アニマルズ  ケア  ガイドラインズ(Canadian Council of Animal Care Guidelines)に従った。
【００７６】
材料及び方法
バフィロマイシンがドープされたＣＡＰインプラント、即ち、ＴＴＣＰ及びＤＣＰＡの化学的性質に基づく吸収され得るＣＡＰ、の製造を上記のように行った。ＣＡＰ５００ｍｇ当たり液体の中性リン酸塩相２５０μＬ当たり７５μｇ〜１００μｇの濃度のバフィロマイシンを使用した。対照物は、前記プロトンポンプ阻害剤を含まなかった。
【００７７】
インプラントを硬化せしめて、予備硬化したインプラントロッドを形成した。このインプラントを、手術後１０日、１カ月、２カ月及び４カ月に取り出した。
【００７８】
結果
図６及び図７は、ｏｖｘ加齢ラットにおいて短期間移植（１０日）及び長期間移植（４カ月）でそれぞれ得られた試料結果を示す。幼齢対照群及び非ｏｖｘ加齢群について得られた結果の傾向は、 ＰＰＩをドープした材料の低減した吸収及び、ＰＰＩをドープした材料を取り囲む向上した骨形成の傾向に関して同様であり、それは生体内で４カ月後でさえも観察された。
【００７９】
これらの結果は、対照材料と比較した実験試料の吸収の低減により説明されるように、ＣＡＰマトリックス中に捕捉されたＰＰＩは、生体内での４カ月の期間を通じて活性であることを示している。更に、これらの結果は、ＰＰＩをドープしたＣＡＰインプラントは、局所的な骨量の増加の結果として、制約の有る骨組織環境へのインプラントのより効果的な取り込みを可能にするために使用することができることも示している。
【００８０】
実施例３
市販品を入手可能なプロトンポンプ阻害剤、パントＩＶ（登録商標）(PantoIV) として購入したナトリウムパントプラゾール、を用いた実験を、健常な幼齢ウィスターラットについて行った。
【００８１】
パントＩＶ、即ち、オメパラゾール及びランソパラゾールも包含する置換ベンズイミダゾールの化学的類似体に属する５−ジフルオロメトキシ−２−［（３，４−ジメトキシ−２−ピリジニル）メチル］−１Ｈ−ベンズイミダゾール［オメパラゾールも包含するもの：ロセック（登録商標）(Losec) 、ランソパラゾールも包含するもの：プレバシッド（登録商標）(Prevacid)］を、消化器官の潰瘍を治療するために臨床的に使用した。この種類の化合物は、それらが胃のＨ+ ，Ｋ+ −ＡＴＰａｓｅと相互作用し得る前に、活性スルフ
ェナミンを形成するために酸性ｐＨにより活性化されることが必要なプロドラッグ(pro-drugs) として存在する。前記化合物は中性ｐＨで化学的に安定であり、そしてそれらが壁細胞（胃）に到達したとき、前記化合物のプロトン化が分子転換を引き起こし、その後、活性スルホンアミド化合物の形成を引き起こす。活性化された化合物はその後、Ｈ+ ，Ｋ+ −ＡＴＰａｓｅの表面上のスルフヒドリル基と共有結合的に反応する。
【００８２】
パントＩＶは壁細胞のプロトンポンプに対して非常に特異的であるけれども、破骨細胞のプロトンポンプを包含する他のプロトンポンプに非特異的に影響を及ぼし得ると仮定された。市販品を入手可能なリン酸カルシウム材料、先に使用されたＣＡＰよりも吸収され難いカルシボンも、他の材料を用いて局所の骨量を刺激するための方法を使用し得るかどうかを決定するために使用された。
【００８３】
材料及び方法
使用したＣＡＰ材料は、メルクバイオマテリアルズ／バイオメット社(Merck Biomaterials/Biomet company) により提供されたカルシボンであった。使用した濃度は、セメントを調製するために使用されたＣＡＰ粉末５００ｍｇ当たり、４ｍｇパントＩＶ／中性リン酸塩溶液ｍＬであった。ＰＰＩをドープしたセメントをその後、前記のように硬化せしめた。前記手順と同じ手順により、予備硬化ロッドを幼齢ウィスターラットに移植した。
【００８４】
結果
カルシボンは容易に吸収され得るリン酸カルシウムセメントではなく、従って、予想された通り、生体内で１０日目のセメントロッドの吸収は観察されなかった。しかしながら、図８に示されるように、実験試料は、対照物よりもより多くの修復された骨量により取り囲まれ、この事は、マクロライドＰＰＩが使用されたときに観察された傾向と一致する。パントＩＶはＨ+ ，Ｋ+ −ＡＴＰａｓｅに対して特異的であり、そして破骨細胞プロトンポンプに対して非特異的なので、破骨細胞プロトンポンプの特異的阻害剤であるバフィロマイシンＡ１を用いて得られた結果と同様の結果を達成するためには、より多い投与量が必要とされる。この実施例は、本発明は、マクロライド抗生物質の種類からのプロトンポンプ阻害剤化合物以外のプロトンポンプ阻害剤化合物と共に適用し得ることを説明している。
【００８５】
従って、骨適合性マトリックス材料から形成されたインプラント材料は、骨再造形環境の細胞介在酸性化の阻害剤を混合することにより、移植後にそれらが生分解される速度を調節するためにドープされ得ることが判る。適する阻害剤は、プロトンポンプ阻害剤及び、特に、破骨細胞プロトンポンプの阻害剤を包含する。これらのドーパントを使用して、骨の治療環境に有用であるためには、通常、あまりにも迅速に分解されるマトリックス材料を、分解速度をより遅くするために、酸性化阻害剤を混合することにより、前記用途のためにより適するようにすることができる。更に、マトリックスの分解速度を調節することにより、酸性化阻害剤は結局、マトリックスからそれ自身が放出される速度を低下させ、従って、酸性化環境の長期の調節を提供する。加えて、阻害剤を混合することにより、本発明のインプラントは、酸性化阻害剤に暴露された領域内において新しい骨の形成が促進されるという、付加的な医療上の利点も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】図１は、移植１０日後の予備硬化ＣＡＰセメントロッドを含むラット大腿骨の断面図であり、図１（Ａ）は対照ＣＡＰを示す図、図１（Ｂ）はバフィロマイシンＡ１により変性されたＣＡＰを示す図である。
【図２】図２は、図１に示される領域の拡大図であり、図２（Ａ）は対照ＣＡＰを示す図、図２（Ｂ）はバフィロマイシンＡ１により変性されたＣＡＰの組織／材料境界面における相違を示す図である。
【図３】図３は、組織／材料境界面における破骨細胞のＴＲＡＰ染色を示す図であり、図３（Ａ）は対照ＣＡＰを示す図、図３（Ｂ）はバフィロマイシンＡ１により変性されたＣＡＰを示す図である。
【図４】図４は、移植１４日後の注射可能なＣＡＰセメントペーストを含むラット大腿骨の断面図であり、図４（Ａ）は対照ＣＡＰを示す図、図４（Ｂ）はバフィロマイシンＡ１により変性されたＣＡＰを示す図である。
【図５】図５は、インプラントを取り囲む局所的な骨量の相違を示している、移植１０日後の予備硬化ＣＡＰセメントロッドを含むラット大腿骨の断面図であり、図５（Ａ）は対照ＣＡＰを示す図、図５（Ｂ）はバフィロマイシンＡ１により変性されたＣＡＰを示す図である。
【図６】図６は、加齢ＯＶＸラットへの移植１０日後の予備硬化ＣＡＰセメントロッドを含むラット大腿骨の断面図であり、図６（Ａ）は対照ＣＡＰを示す図、図６（Ｂ）はバフィロマイシンＡ１により変性されたＣＡＰを示す図である。
【図７】図７は、加齢ＯＶＸラットへの移植４カ月後の予備硬化ＣＡＰセメントロッドを含むラット大腿骨の断面図であり、図７（Ａ）は対照ＣＡＰを示す図、図７（Ｂ）はバフィロマイシンＡ１により変性されたＣＡＰを示す図である。
【図８】図８は、幼齢ウィスターラットへの移植１０日後の予備硬化ＣＡＰセメントロッドを含むラット大腿骨の断面図であり、図８（Ａ）は対照ＣＡＰを示す図、図８（Ｂ）はＰＡＮＴＯ  ＩＶにより変性されたＣＡＰを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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