(57)【要約】滑液または関節組織中の骨形成性タンパク質−１（ＯＰ−１）のタンパク質レベルおよび／またはｍＲＮＡレベルを測定することによって、患者中の間接組織における軟骨変性または軟骨再生を決定するための方法が、提供される。本発明に従う方法は、炎症性関節疾患または加齢関連障害を含む患者中の関節組織変性および関節組織再生に対する素因を、検出、診断、予測、決定すること、ならびに炎症性関節疾患または加齢関連障害を含む患者中の関節組織変性および関節組織再生をモニタリングすることに有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者中の炎症性疾患の存在を決定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該患者由来の関節組織サンプル中に存在するＯＰ−１タンパク質の量を決定する工程；および
（ｂ）該ＯＰ−１タンパク質の量と予め決定された標準とを比較する工程、
を包含し、
ここで、該サンプル中に存在するＯＰ−１タンパク質の量と予め決定された標準との差異が、炎症性疾患の存在を示す、方法。
【請求項２】
患者中の炎症性疾患の存在を決定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該患者由来の関節組織サンプル中に存在するＯＰ−１  ｍＲＮＡの量を決定する工程；および
（ｂ）該ＯＰ−１  ｍＲＮＡの量と予め決定された標準とを比較する工程、
を包含し、
ここで、該サンプル中に存在するＯＰ−１  ｍＲＮＡの量と予め決定された標準との差異が、炎症性疾患の存在を示す、方法。
【請求項３】
患者中の炎症性疾患の臨床的重篤度を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）関節組織サンプル中に存在するＯＰ−１  タンパク質の量を決定する工程；および
（ｂ）該量に予め決定された統計学的な関係を適用する工程であって、該統計学的な関係は、該炎症性疾患を有する集団のメンバーから得られた関節組織サンプル中に存在するＯＰ−１タンパク質の量の範囲を該疾患の臨床的重篤度と相関付ける、工程、
を包含し、
これによって該患者中の該炎症性疾患の臨床的重篤度を決定する、方法。
【請求項４】
患者中の炎症性疾患の臨床的重篤度を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）関節組織サンプル中に存在するＯＰ−１  ｍＲＮＡの量を決定する工程；および
（ｂ）該量に予め決定された統計学的な関係を適用する工程であって、該統計学的な関係は、該炎症性疾患を有する集団のメンバーから得られた関節組織サンプル中に存在するＯＰ−１  ｍＲＮＡの量の範囲を該疾患の臨床的重篤度と相関付ける、工程、
を包含し、
これによって該患者中の該炎症性疾患の臨床的重篤度を決定する、方法。
【請求項５】
前記関節組織サンプルが、軟骨、靭帯、半月板、腱、滑膜、滑液、および椎間円板組織からなる群より選択される組織を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記関節組織サンプルが、滑液を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記関節組織サンプル中に存在するＯＰ−１タンパク質の量を決定する工程が、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）を実行する工程を包含する、請求項１または３に記載の方法。
【請求項８】
前記炎症性疾患が、慢性関節リウマチ、エリテマトーデス、痛風、結合組織炎症候群、リウマチ性多発性筋痛、乾癬、細菌感染、ウイルス感染および真菌感染からなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
患者中の加齢関連組織障害の存在を決定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該患者由来の関節組織サンプル中に存在するＯＰ−１タンパク質の量を決定する工程；および
（ｂ）該ＯＰ−１タンパク質の量と予め決定された標準とを比較する工程、
を包含し、
ここで、該サンプル中に存在するＯＰ−１タンパク質の量と予め決定された標準との差異が、加齢関連組織障害を示す、方法。
【請求項１０】
患者中の加齢関連組織障害の存在を決定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該患者由来の関節組織サンプル中に存在するＯＰ−１  ｍＲＮＡの量を決定する工程；および
（ｂ）該ＯＰ−１  ｍＲＮＡの量と予め決定された標準とを比較する工程、
を包含し、
ここで、該サンプル中に存在するＯＰ−１  ｍＲＮＡの量と予め決定された標準との差異が、加齢関連組織障害を示す、方法。
【請求項１１】
患者中の加速した組織加齢または異常な組織加齢によって特徴付けられる障害の存在を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該患者由来の関節組織サンプル中に存在するＯＰ−１タンパク質の量を決定する工程；および
（ｂ）該ＯＰ−１タンパク質の量と予め決定された標準とを比較する工程、
を包含し、
ここで、該サンプル中に存在するＯＰ−１タンパク質の量と予め決定された標準との差異が、加速した組織加齢または異常な組織加齢によって特徴付けられる障害を示す、方法。
【請求項１２】
患者中の加速した組織加齢または異常な組織加齢によって特徴付けられる障害の存在を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該患者由来の関節組織サンプル中に存在するＯＰ−１  ｍＲＮＡの量を決定する工程；および
（ｂ）該ＯＰ−１  ｍＲＮＡの量と予め決定された標準とを比較する工程、
を包含し、
ここで、該サンプル中に存在するＯＰ−１  ｍＲＮＡの量と予め決定された標準との差異が、加速した組織加齢または異常な組織加齢によって特徴付けられる障害を示す、方法。
【請求項１３】
患者中の加齢関連組織障害の臨床的重篤度を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）関節組織サンプル中に存在するＯＰ−１タンパク質の量を決定する工程；および
（ｂ）該量に予め決定された統計学的な関係を適用する工程であって、該統計学的な関係は、該加齢関連組織障害を有する集団のメンバーから得られた関節組織サンプル中に存在するＯＰ−１タンパク質の量の範囲を該障害の臨床的重篤度と相関付ける、工程、
を包含し、
これによって該患者中の該加齢関連組織障害の臨床的重篤度を決定する、方法。
【請求項１４】
患者中の加齢関連組織障害の臨床的重篤度を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）関節組織サンプル中に存在するＯＰ−１  ｍＲＮＡの量を決定する工程；および
（ｂ）該量に予め決定された統計学的な関係を適用する工程であって、該統計学的な関係は、該加齢関連組織障害を有する集団のメンバーから得られた関節組織サンプル中に存在するＯＰ−１  ｍＲＮＡの量の範囲を該障害の臨床的重篤度と相関付ける、工程、
を包含し、
これによって該患者中の該加齢関連組織障害の臨床的重篤度を決定する、方法。
【請求項１５】
患者中の加速された組織加齢または異常な組織加齢によって特徴付けられる障害の臨床的重篤度を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）関節組織サンプル中に存在するＯＰ−１タンパク質の量を決定する工程；および
（ｂ）該量に予め決定された統計学的な関係を適用する工程であって、該統計学的な関係は、該加齢関連組織障害を有する集団のメンバーから得られた関節組織サンプル中に存在するＯＰ−１タンパク質の量の範囲を該障害の臨床的重篤度と相関付ける、工程、
を包含し、
これによって該患者中の加速された組織加齢または異常な組織加齢によって特徴付けられる障害の臨床的重篤度を決定する、方法。
【請求項１６】
患者中の異常な組織加齢によって特徴付けられる障害の臨床的重篤度を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）関節組織サンプル中に存在するＯＰ−１  ｍＲＮＡの量を決定する工程；および
（ｂ）該量に予め決定された統計学的な関係を適用する工程であって、該統計学的な関係は、該加齢関連組織障害を有する集団のメンバーから得られた関節組織サンプル中に存在するＯＰ−１  ｍＲＮＡの量の範囲を該障害の臨床的重篤度と相関付ける、工程、
を包含し、
これによって該患者中の異常な組織加齢によって特徴付けられる障害の臨床的重篤度を決定する、方法。
【請求項１７】
前記関節組織サンプルが、軟骨、靭帯、半月板、腱、滑膜、滑液、および椎間円板組織からなる群より選択される組織を含む、請求項９〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記関節組織サンプルが、滑液を含む、請求項９〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記関節組織中に存在するＯＰ−１タンパク質の量を決定する工程が、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）を実行する工程を包含する、請求項９、１１、１３、または１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記加齢関連組織障害が、暦年齢と無関係である、請求項９、１０、１３または１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記加齢関連組織障害が、変形性関節症および骨粗鬆症からなる群より選択される疾患を示す、請求項９、１０、１３または１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記異常な組織加齢によって特徴付けられる障害が、変性障害である、請求項１１、１２、１５または１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記予め決定された標準が、年齢に相関する標準である、請求項９、１０、１１、または１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
患者中の自己免疫疾患の存在を決定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該患者由来の関節組織サンプル中に存在するＯＰ−１タンパク質の量を決定する工程；および
（ｂ）該ＯＰ−１タンパク質の量と予め決定された標準とを比較する工程、
を包含し、
ここで、該サンプル中に存在するＯＰ−１タンパク質の量と予め決定された標準との差異が、自己免疫疾患の存在を示す、方法。
【請求項２５】
患者中の自己免疫疾患の存在を決定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該患者由来の関節組織サンプル中に存在するＯＰ−１  ｍＲＮＡの量を決定する工程；および
（ｂ）該ＯＰ−１  ｍＲＮＡの量と予め決定された標準とを比較する工程、
を包含し、
ここで、該サンプル中に存在するＯＰ−１  ｍＲＮＡの量と予め決定された標準との差異が、自己免疫疾患の存在を示す、方法。
【請求項２６】
患者中の自己免疫疾患の臨床的重篤度を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）関節組織サンプル中に存在するＯＰ−１  タンパク質の量を決定する工程；および
（ｂ）該量に予め決定された統計学的な関係を適用する工程であって、該統計学的な関係は、該自己免疫疾患を有する集団のメンバーから得られた関節組織サンプル中に存在するＯＰ−１タンパク質の量の範囲を該疾患の臨床的重篤度と相関付ける、工程、
を包含し、
これによって該患者中の該自己免疫疾患の臨床的重篤度を決定する、方法。
【請求項２７】
患者中の自己免疫疾患の臨床的重篤度を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）関節組織サンプル中に存在するＯＰ−１  ｍＲＮＡの量を決定する工程；および
（ｂ）該量に予め決定された統計学的な関係を適用する工程であって、該統計学的な関係は、該自己免疫疾患を有する集団のメンバーから得られた関節組織サンプル中に存在するＯＰ−１  ｍＲＮＡの量の範囲を該疾患の臨床的重篤度と相関付ける、工程、
を包含し、
これによって該患者中の該自己免疫疾患の臨床的重篤度を決定する、方法。
【請求項２８】
前記自己免疫疾患が、関節組織中の組織形態学的変化と関連する、請求項２４〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記関節組織サンプルが、軟骨、靭帯、半月板、腱、滑膜、滑液、および椎間円板組織からなる群より選択される組織を含む、請求項２４〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記関節組織サンプルが、滑液を含む、請求項２４〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記関節組織サンプル中に存在するＯＰ−１タンパク質の量を決定する工程が、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）を実行する工程を包含する、請求項２４または２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記自己免疫疾患が、慢性関節リウマチ、エリテマトーデスおよび非炎症性単関節炎、および乾癬からなる群より選択される、請求項２４〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記予め決定された標準が、平均値を含む、請求項１、２、９、１０、１１、１２、２４、または２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記予め決定された標準が、加齢調整標準である、請求項１、２、９、１０、１１、１２、２４、または２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
患者中で軟骨分解または軟骨変性を生じる疾患についての素因を決定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該患者由来の関節組織サンプル中に存在するＯＰ−１タンパク質の量を決定する工程；および
（ｂ）該ＯＰ−１タンパク質の量と予め決定された標準とを比較する工程、
を包含し、
ここで、該サンプル中に存在するＯＰ−１タンパク質の量と予め決定された標準との差異が、炎症性疾患、患者中の異常な組織加齢によって特徴付けられる障害、自己免疫疾患、関節変性疾患、および／または関節の外傷誘導性疾患についての素因を示す、方法。
【請求項３６】
患者の関節領域の臨床状態を決定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）患者の関節領域から得られた組織サンプル中に存在するＯＰ−１タンパク質の量を決定する工程；および
（ｂ）該量と予め決定された標準とを比較し、それによって該量の該標準での偏差を示す値を決定する、工程、
を包含し、
ここで、該値は、該関節領域の臨床状態を示す、方法。
【請求項３７】
前記予め決定された標準は、前記患者の年齢と関連付けられ、臨床的に正常な関節領域中に存在することが予想されるＯＰ−１タンパク質の量を示す、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記予め決定された標準は、ある範囲の値を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
患者の関節領域内での再生活性または変性活性をモニタリングする方法であって、該方法は、以下：
該患者の関節領域から得られた少なくとも１つの組織サンプル中に存在するＯＰ−１タンパク質の相対量を決定し、ここで、該少なくとも１つの組織サンプルは、ＯＰ−１タンパク質量が既に決定された最初の最も早い組織サンプルよりも後の時点のものに対応する、工程
を包含し、
ここで、該後期組織サンプル中に存在するＯＰ−１タンパク質量における増加は、該関節領域における再生活性の発症もしくは再生活性の増加を示し、一方、該後期組織サンプル中に存在するＯＰ−１タンパク質量における低下は、該関節領域における再生活性の停止もしくは再生活性の低下を示す、方法。
【請求項４０】
患者の関節領域の臨床状態を決定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）患者の関節領域から得られた組織サンプル中に存在するＯＰ−１タンパク質の量を決定する工程；および
（ｂ）該量、臨床的に正常な関節領域に存在することが予想されるＯＰ−１タンパク質の量を示す予め決定された標準とを比較する工程、
を包含し、
ここで、該標準に対してほぼ等しい工程（ａ）において決定した量は、該患者の該関節領域の正常な臨床状態を示し、そして該標準とあまり等しくない量は、該患者の該関節領域の異常な臨床状態を示す、方法。
【請求項４１】
患者における抗炎症薬剤の有効量を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ある用量の抗炎症薬剤が先に投与された被験体から、組織サンプル、体液サンプル、または細胞サンプルを得る工程；
（ｂ）該サンプル中のＯＰ−１タンパク質濃度またはＯＰ−１  ｍＲＮＡ濃度を決定する工程；
（ｃ）その発現が炎症によって変化していない第２の遺伝子によってコードされるタンパク質またはｍＲＮＡの濃度を該同じサンプル中で決定する工程；および
（ｄ）該ＯＰ−１タンパク質濃度または該ＯＰ−１  ｍＲＮＡ濃度を、該第２の遺伝子のタンパク質濃度または該第２の遺伝子のｍＲＮＡ濃度と比較する工程であって、ここで、該ＯＰ−１タンパク質濃度または該ＯＰ−１  ｍＲＮＡ濃度と、該第２の遺伝子のタンパク質濃度または該第２の遺伝子のｍＲＮＡ濃度との間の差異は、該患者における該抗炎症薬剤の有効量を示す、工程、
を包含する、方法。
【請求項４２】
抗炎症薬剤に応答する患者の能力を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ある用量の抗炎症薬剤が先に投与された被験体から、組織サンプル、体液サンプル、または細胞サンプルを得る工程；
（ｂ）該サンプル中のＯＰ−１タンパク質濃度またはＯＰ−１  ｍＲＮＡ濃度を決定する工程；
（ｃ）その発現が炎症によって変化していない第２の遺伝子によってコードされるタンパク質またはｍＲＮＡの濃度を該同じサンプル中で決定する工程；および
（ｄ）該ＯＰ−１タンパク質濃度または該ＯＰ−１  ｍＲＮＡ濃度を、該第２の遺伝子のタンパク質濃度または該第２の遺伝子のｍＲＮＡ濃度と比較して、比率を作製する工程であって、ここで、該比率が、未処理の被験体もしくは非応答性の被験体について予め決定されたコントロール比率よりも高いか、または該被験体が応答性であることが以前に決定されていた場合は、該被験体について以前の比率と類似する場合、該被験体は、抗炎症薬剤に応答性である、工程、
を包含する、方法。
【請求項４３】
該炎症性疾患が、慢性関節リウマチである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記加齢関連組織障害が、変形性関節症である、請求項９、１０、１３、または１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記自己免疫性疾患が、慢性関節リウマチである、請求項２４〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
関節組織の変質を決定する方法であって、該変質は、疾患または加齢に関連する変質を含み、該方法は、以下：
（ａ）ＯＰ−１に関連するタンパク質またはＯＰ−１に関連するタンパク質をコードするｍＲＮＡの量を、関節組織サンプル中で決定する工程；および
（ｂ）該タンパク質の量または該ｍＲＮＡの量を、予め決定された標準と比較する工程、
を包含し、
ここで、該サンプル中の該タンパク質量または該ｍＲＮＡ量と、予め決定された標準との差異は、関節組織の変質を示す、方法。
【請求項４７】
関節組織の加齢を決定する方法であって、該加齢は、疾患に早熟の加齢を含み、該方法は、以下：
（ａ）ＯＰ−１に関連する骨形態形成タンパク質の量またはＯＰ−１に関連するタンパク質をコードするｍＲＮＡの量を、関節組織サンプル中で決定する工程；および
（ｂ）該タンパク質の量または該ｍＲＮＡの量を、予め決定された標準と比較する工程、
を包含し、
ここで、該サンプル中の該タンパク質量または該ｍＲＮＡ量と、予め決定された標準との差異は、関節組織の加齢を示す、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、組織完全性または劣化の生体マーカーとしてのＯＰ−１および他の骨形態形成タンパク質の使用に関連し、そして、より具体的には、炎症性疾患および加齢に関連する軟骨変性の診断および／またはモニターリングを行うための方法に関する。
【０００２】
（関連出願）
本願は、ＵＳＳＮ６０／３４８，１１１（２００１年１１月９日出願）およびＵＳＳＮ６０／２７０，５２８（２００１年２月２１日出願）（これらの内容は、本明細書中で、参考として援用される）に関連し、そしてこの利益を主張する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
多数の因子は、外傷および炎症性疾患を含む、哺乳動物における軟骨変性を生じ得るか、または、それに寄与し得る。炎症性応答の影響から生じる細胞に対する損傷は、減少した軟骨機能または関節の疾患（例えば、慢性関節リウマチ（ＲＡ）および変形性関節症（ＯＡ））における軟骨機能の消失の原因として関連付けられている。さらに、自己免疫疾患（例えば、全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｉｓ：ＳＬＥ）および強皮症はまた、結合組織の分解によって特徴付けられ得る。いくつかの軟骨変性疾患（例えば、変形性関節症（ＯＡ））の場合、関節性軟骨の通常の老化を、病的な状態のＯＡ過程へと変える機構は、現在未だに知られていない。
【０００４】
ＯＡは、主に老齢期の人を襲う消耗性関節疾患である。ＯＡは、若年成人においては、稀であり、４０歳代後半および５０歳代までの成人において症状およびＸ線像によってみたときに、発症し始めており、次いで、６０歳代〜７０歳代で有病率において急激に上昇する（Ｈａｍｅｒｍａｎ（１９９３）Ｊ．Ａｍ．Ｇｅｒｉａｔｒ．Ｓｏｃ．４１：７６０）。しかし、概して、任意の生物学的な組織または器官は加齢するに従い、機能は次第に低下し、そして、疾患および損傷に対する罹病性は増大する（Ｂｕｃｋｗａｌｔｅｒら（１９９３）ＪＢＪＳ  ７５−Ａ：１５３３）。組織生合成における加齢関連の変化としては、以下が挙げられる：１）ＩＩ型コラーゲン変性の増加（Ｈｏｌｌａｎｄｅｒら（１９９５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９６（６）：２８５９）；２）ＤＮＡ（Ｒｉｂａｕｌｔら（１９９８）Ｍｅｃｈａｎ．Ａｇｅｉｎｇ  ＆  Ｄｅｖｅｌ．１００（１）：２５）、プロテオグリカン、および結合タンパク質（ＤｅＧｒｏｏｔら（１９９９）Ａｒｔｈｒｉｔ．Ｒｈｅｕｍ．４２（５）：１００３；Ｉｑｂａｌら（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７４（２）：４６７；Ｖｅｒｂｒｕｇｇｅｎら（２０００）Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒ．Ｃａｒｔｉｌ．８（３）：１７０；Ｂｏｌｔｏｎら（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３７（Ｐｔ  ｌ）：７７）の合成の低下；３）コンドロイチンサルフェートの硫酸化の増大（Ｂｒｏｗｎら（１９９８）Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．５９（６）：７８６）；４）ヒアルロン酸（Ｐｌａｔｔら（１９９８）Ｅｑｕｉｎｅ  Ｖｅｔ．Ｊ．３０（１）：４３）および軟骨中間層タンパク質（Ｌｏｒｅｎｚｏら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（３６）：２３４６３）の蓄積；５）フィブロモジュリン（ｆｉｂｒｏｍｏｄｕｌｉｎ）における構造変化（Ｒｏｕｇｈｌｅｙら（１９９６）Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒ．Ｃａｒｔｉｌ．４（３）：１５３）；６）高分子サイズ凝集物を会合させる能力の減少（Ｖｅｒｂｒｕｇｇｅｎら２０００）；７）上昇したレベルのトランスグルタミナーゼ（ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ）活性（この活性によって、病態的な基質無機質化および軟骨変性が促進される）（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌら（１９９７）Ａｒｔｈｒｉｔ．Ｒｈｅｕｍ．４０：９６６）；ならびに８）アポトーシスの増大（ＡｄａｍｓおよびＨｏｒｔｏｎ（１９９８）Ａｎａｔｏｍ．Ｒｅｃ．２５０（４）：４１８）。
【０００５】
重要なことに、加齢とともに、異なる増殖因子（例えば、トラスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）（Ｉｑｂａｌら２０００；Ｇｕｅｍｅら（１９９５）Ａｒｔｈｒｉｔ．Ｒｈｅｕｍ．３８（７）：９６０）、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）（Ｍｅｓｓａｉら（２０００）Ｍｅｃｈａｎ．Ａｇｅｉｎｇ＆Ｄｅｖｅｌ．１１５（１２）：２１）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）（Ｒｉｂａｕｌｔら１９９８）、骨形成タンパク質−１（ＯＰ−１）（Ｆｌｅｃｈｔｅｎｍａｃｈｅｒら（１９９６）Ａｒｔｈｒｉｔ．Ｒｈｅｕｍ．３９：１８９６））などに対する関節軟骨の対応性がまた、変更され得る。
【０００６】
加齢に伴って見られるかまたは、炎症性疾患に起因する、関節軟骨変性の根底にある原因は、これまで同定されてこなかったが、増殖因子（特に、軟骨において内因的に発現される増殖因子）およびサイトカインが重要な介在的役割を担っていることの証拠がますます存在する。例えば、増殖因子の骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）ファミリーは、特定の変性過程をまた阻害し得る基質産生の重要な調節因子である。ＢＭＰは、もともと、皮下移植において異所性軟骨内骨形成を誘導し得るタンパク質として同定された（Ｕｒｉｓｔら（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：１８２８；ＳａｍｐａｔｈおよびＲｅｄｄｉ（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８；７５９９）。その後の分子クローニングによって、ＢＭＰファミリーは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する多数の関連分子からなることが明らかになった。ＢＭＰは、骨基質においてはじめに見出されたが、現在では、これらは、種々の組織において発現されることが明らかである。
【０００７】
骨形成タンパク質１（ＯＰ−１）は、ＢＭＰファミリーの７番目のメンバー（ＢＭＰ−７）である。これは、成熟タンパク質の約３倍である、分子量の大きい前駆体として合成され、そして、最終的には、Ｃ末端領域でタンパク質分解的にプロセシングされ、成熟ジスルフィド結合ダイマーを産生する。ＯＰ−１は、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−５に最も近く関連しており（それぞれ、８８％相同性および８７％相同性）、そして、より低い程度で、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４に関連しており（それぞれ、６０％相同性および５８％相同性）、そして、ＢＭＰ−３（４２％相同性）およびＴＧＦ−β（約３０％相同性）に対して幾分、相同性である（ＣｏｏｋおよびＲｕｅｇｅｒ（１９９６）Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐｅｄ．Ｒｅｌ．Ｒｅｓ．３２４：２９；ＳａｍｐａｔｈおよびＲｕｅｇｅｒ（１９９４）Ｃｏｍｐｌｉｃａｔ．Ｏｒｔｈｏｐｅｄ．Ｗｉｎｔｅｒ：ｌ０１）。もともとは、ＯＰ−１は、ウシの鉱物質除去骨から精製され（Ｓａｍｐａｔｈら（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５（２２）：１３１９８）、その後、その組換え形態は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中で、ヒトｃＤＮＡライブラリーからクローニングされた（Ｏｚｋａｙｎａｋら（１９９０）ＥＭＢＯ  Ｊ．９：２０８５）。
【０００８】
軟骨形成および骨形成についてのＢＭＰのおおきな重要性は、トランスジェニックアプローチを使用して実証された：いくつかのＢＭＰ遺伝子の欠損は、骨格異常を引き起こし、そして最終的には、マウス胚の死亡に至る（Ｄｕｄｌｅｙら（１９９５）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．９：２７９５；Ｌｕｏら（１９９５）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．９：２８０８）。近年の研究は、ヒトおよびウシの軟骨の恒常性および修復における外因性ＯＰ−１の潜在的な役割に焦点がおかれている（Ｆｌｅｃｈｔｅｎｍａｃｈｅｒら１９９６；Ｈｕｃｈら（１９９７）Ａｒｔｈｒｉｔ．Ｒｈｅｕｍ．４０：２１５７；Ｋｏｅｐｐら（１９９９）Ｉｎｆｌａｍｍ．Ｒｅｓ．４７：１；Ｎｉｓｈｉｄａら（２０００）Ａｒｔｈｒｉｔ．Ｒｈｅｕｎｎ．４３：２０６）。これらの研究によって、ヒト組換えＯＰ−１（ｒｈＯＰ−１）が、関節軟骨において有意な同化応答を引き起こすことが示された。これは、軟骨細胞表現型の連続した発現を伴う異なる年齢のヒト軟骨における主要な基質成分であるアグリカン（ａｇｇｒｅｃａｎ）およびＩＩ型コラーゲンの合成を誘導する（Ｆｌｅｃｈｅｎｍａｃｈｅｒら１９９６；Ｈｕｃｈら１９９７）。さらに、ＯＰ−１は、ヒアルロン酸、そのレセプターＣＤ４４およびヒアルロン酸シンダーゼ−２の合成を誘導し、細胞外マトリックスの形成および保持を促進し（Ｎｉｓｈｉｄａら  ２０００）、異化事象（例えば、インターロイキンー１（ＩＬ−１）、フィブロネクチン（ＦＮ−ｆ）およびコラーゲンフラグメント誘導性軟骨分解）を妨げることが示されている（Ｈｕｃｈら，１９９７；Ｋｏｅｐｐら，１９９９；Ｊｅｎｎｉｎｇｓら（２００１）Ｃｏｎｎｅｃｔ．Ｔｉｓｓ．Ｒｅｓ．４２（ｌ）：７１−８６）。ＦＮ−ｆでチャレンジした軟骨におけるＯＰ−１の効果が、ＴＧＦ−βの効果と比較されたとき、ＴＧＦ−βは、ＦＮ−ｆ媒介性プロテオグリカン（ＰＧ）消耗を遮断するだけではなく、それ自体で軟骨ＰＧ含有量の低下を促進することが見出された（Ｋｏｅｐｐら、１９９９）。重要なことに、ｒｈＯＰ−１は、ヒトおよびウシの成体関節軟骨細胞における軟骨の増殖および分化に至らなかった（Ｆｌｅｃｈｔｅｎｍａｃｈｅｒら．１９９６  Ｃｈｅｎら（１９９３）ら  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９７；１２５３）。
【０００９】
近年、ヒト成体関節軟骨細胞において、ＯＰ−１が内因的に発現されることが実証された（Ｃｈｕｂｉｎｓｋａｙａら（２０００）Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４８（２）：２３９）。さらに、ヒトの関節軟骨において、ＯＰ−１は以下の２形態で存在する：プロセシングを受けていない、プロ形態およびプロセシングを受けた、成熟形態。成熟ＯＰ−１は、主に軟骨の表層に免疫局所化（ｉｍｍｕｎｏｌｏｃａｌｉｚｅｄ）しているが、プロＯＰ−１は、深い層で検出された。関節軟骨細胞によるＯＰ−１の内因性発現は、関節軟骨が修復能を有していることを示し、そして組織保護および組織再生におけるこのＢＭＰの独特の役割を示唆し得る。これは、マウスにおけるＯＰ−１の過剰発現が、基質の高分子である、ＩＩ型コラーゲンおよびＰＧの増大した合成に至ることを実証する近年のデータによって支持される（Ｈｉｄａｋａら（２０００）Ｔｒａｎｓ．ＯＲＳ  ４６：４１）。
【００１０】
ＲＡについての診断アッセイとしては、リウマチ様因子の検出に基づくＲｏｓｅの方法、Ｈｅｌｌｅｒによる改変Ｒｏｓｅ法、ＲＡＨＡ試験、およびＲＡ試験が挙げられる。しかし、これらの方法は、血液リウマチ様因子が、ＲＡを有する患者に特異的ではないという点で、不利益を保持する。このような方法に基づくリウマチ様因子アッセイキットはまた乏しい精度および再現性を有する。
【００１１】
赤血球の沈降速度（ＥＳＲ）またはＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）についてのアッセイは、ＲＡのような炎症性疾患の活性を決定するのに有用であるが、これらの診断において使用するには適切ではない。抗核抗体およびＬＥ細胞の検出を使用して、ＲＡを検出し得るが、これらの方法がＲＡについて特異的でなく、そしてこのような抗体または細胞が、他のコラーゲン性疾患において、頻繁に検出され得るので、正確にＲＡを診断することは困難である。さらに、これらの方法は、ＲＡに関連する軟骨変性を特異的に検出しない。
【００１２】
したがって、後天性の、軟骨分解および軟骨崩壊の存在、または素因を特異的かつ再現性をもって検出するために使用され得る生体マーカーに対する必要性が存在する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
本発明は、一般的に、生体マーカーとして、骨形態形成タンパク質（例えば、ＯＰ−１）を使用する、組織完全性を決定するための方法に関連する。具体的には、本発明は、患者の組織サンプル中のＯＰ−１タンパク質および／またはＯＰ−１  ｍＲＮＡのレベルを測定することによって、患者における軟骨のような組織の健康または不健康（例えば、変性、劣化または再生）を決定するための方法に関する。特に、本発明は、ＯＰ−１が炎症関連、自己免疫、および加齢関連の組織変化（例えば、軟骨の劣化）についての生体マーカーであるという発見に基づく。
【００１４】
１つの局面において、本発明は、炎症に起因する患者における軟骨変性を、検出するか、診断するか、それについての素因を決定するか、または、モニターリングするための方法に関する。１つの実施形態おいて、本発明は、患者の関節組織サンプル中に存在する、ＯＰ−１タンパク質および／またはＯＰ−１  ｍＲＮＡの量を決定し、そして、この量を予め決定した基準に対して比較することによって、患者における炎症性疾患の存在を決定する方法を提供する。この予め決定した基準は、ある範囲のＯＰ−１タンパク質および／またはＯＰ−１  ｍＲＮＡの濃度値を含み得、かつ年齢により調節された基準であり得る。サンプル中の、ＯＰ−１タンパク質またはＯＰ−１  ｍＲＮＡレベルと、予め決定されたＯＰ−１タンパク質またはＯＰ−１  ｍＲＮＡの基準との差異は、炎症性疾患の存在（または非存在）を示し得る。試験される関節組織サンプルは、例えば、軟骨、靭帯、関節間軟骨、腱、滑膜、滑液、または椎間円板組織であり得る。ＯＰ−１タンパク質は、好ましくは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して測定され得る。ＯＰ−１  ｍＲＮＡは、好ましくは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、測定され得る。好ましい実施形態において、本発明に従う方法を使用して、例えば、以下のような炎症性疾患の存在を決定する：自己免疫疾患（例えば、慢性関節リウマチ、エリテマトーデスおよび非炎症性関節炎（ｍｏｎｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、痛風、結合組織炎、およびリウマチ性多発性筋痛。１つの実施形態において、疾患は、関節組織における組織形態学的な変化に関連する。関節組織における組織形態学的変化は、変性疾患、自己免疫疾患、炎症性結合組織疾患、または外傷誘導性疾患を示し得る。関節組織における組織形態形成学的変化はまた、関節における再生過程および修復過程を示し得る。
【００１５】
別の実施形態において、本発明は、関節サンプル中に存在するＯＰ−１タンパク質および／またはＯＰ−１  ｍＲＮＡの量を決定し、そして、この量を予め決定された統計的な関係と比較することによって、患者における炎症性疾患の臨床的重篤度を決定する方法を提供する。予め決定された統計関係は、異なる臨床的重篤度の炎症性疾患を有する集団のメンバーから取得した、ＯＰ−１タンパク質および／またはＯＰ−１  ｍＲＮＡのレベルの比較に基づく。ＯＰ−１タンパク質および／またはＯＰ−１  ｍＲＮＡによって測定されるような疾患の重篤度は、臨床的な知見と相関しても、相関しなくともよく、すなわち、例えば、患者は、正常であるように見える得るが、変更されたＯＰ−１タンパク質および／またはｍＲＮＡのレベルを表し得、これによって、炎症性疾患の存在または素因を示す。同様に、加齢関連性疾患の存在または素因も決定され得る。
【００１６】
別の実施形態において、本発明は、患者の関節組織サンプル中に存在する、ＯＰ−１タンパク質および／またはＯＰ−１  ｍＲＮＡの量を決定し、この量を予め決定された基準と比較することによって、患者における炎症性（例えば、自己免疫性）疾患についての素因を決定する方法を提供する。予め決定された基準は、ある範囲のＯＰ−１タンパク質および／またはＯＰ−１  ｍＲＮＡの濃度値が含み得、かつ年齢より調節された基準であり得る。サンプルにおけるＯＰ−１タンパク質および／またはＯＰ−１  ｍＲＮＡのレベルと、予め決定された基準との差異は、炎症性（例えば、自己免疫性）疾患の発症についての素因を示す。
【００１７】
別の局面において、本発明は、加齢関連組織障害または加速されたか、または異常な組織の老化によって特徴付けられる障害に起因する患者における軟骨変性を、検出するか、診断するか、それについての素因を決定するか、または、モニターリングするための方法に関する。１つの実施形態おいて、本発明は、関節組織サンプル中に存在する、ＯＰ−１タンパク質および／またはＯＰ−１  ｍＲＮＡの量を決定し、し、そして、この量を予め決定した基準に対して比較することによって、患者における加齢関連組織障害または加速されたか、または異常な組織の老化によって特徴付けられる障害の存在を決定する方法を提供する。サンプル中の、ＯＰ−１タンパク質および／またはＯＰ−１  ｍＲＮＡレベルと予め決定された基準との差異は、加齢関連障害または異常な組織老化によって特徴付けられる障害の存在を示す。試験された関節組織サンプルは、例えば、軟骨、靭帯、関節間軟骨、腱、滑膜、滑液、または椎間円板組織であり得る。ＯＰ−１タンパク質は、好ましくは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して測定され得る。ＯＰ−１  ｍＲＮＡは、好ましくは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、測定される。好ましい実施形態において、本発明に従う方法を使用して、例えば、骨粗しょう症または変形性関節炎のような炎症性疾患の存在を決定する。１つの実施形態において、加齢関連組織障害は、暦年齢とは独立している。別の実施形態において、予め決定された基準は、年齢に相関する。
【００１８】
別の実施形態において、本発明は、関節組織サンプル中に存在する、ＯＰ−１タンパク質および／またはＯＰ−１  ｍＲＮＡの量を決定し、そしてこの量を予め決定された統計的関係と比較することによって、加齢関連性組織障害または加速されたか、または異常である組織老化によって特徴付けられる障害の臨床的重篤度を決定する方法を提供する。予め決定された統計的関係は、加齢関連性組織障害または異常組織老化によって特徴付けられる障害の異なる臨床的重篤度を有する集団のメンバーから取得されたＯＰ−１タンパク質および／またはＯＰ−１  ｍＲＮＡのレベルの比較に基づく。
【００１９】
別の実施形態では、本発明は、以下により、患者における、加齢性組織障害、加速された組織加齢もしくは異常な組織加齢により特徴付けられる障害、炎症性疾患、自己免疫疾患、関節変性疾患、または関節損傷誘発性疾患についての素因を決定する方法を提供する：関節組織サンプルに存在するＯＰ−１タンパク質および／またはＯＰ−１  ｍＲＮＡの量を決定し、そして予め決定された標準に対して、この量を比較する。この予め決定された標準は、ある範囲の値を含み得、かつ／または、加齢調整標準であり得る。サンプルにおけるＯＰ−１タンパク質レベルおよび／またはＯＰ−１  ｍＲＮＡレベルと、予め決定された標準におけるＯＰ−１タンパク質レベルおよび／またはＯＰ−１  ｍＲＮＡレベルとの差異は、加齢性組織障害、または異常な組織加齢により特徴付けられる障害についての素因を示す。
【００２０】
別の局面では、本発明は、以下により、患者における、関節領域の臨床的状態または疾患状態を決定する方法を提供する：関節領域由来の患者組織サンプルに存在する、ＯＰ−１タンパク質および／またはＯＰ−１  ｍＲＮＡの量を決定し、そして予め決定された標準に対して、この量を比較する。この予め決定された標準は、ある範囲のＯＰ−１タンパク質および／もしくはＯＰ−１  ｍＲＮＡの濃度値を含み得、かつ／または、年齢で調整した標準であり得る。サンプルにおけるＯＰ−１タンパク質レベルおよび／またはＯＰ−１  ｍＲＮＡレベルは、予め決定された標準におけるＯＰ−１タンパク質および／またはＯＰ−１  ｍＲＮＡの量と比較されて、標準に対する患者レベルの偏差を示す値を決定する。この値は、患者の関節領域の臨床的状態を示す。ある実施形態では、予め決定された標準は、患者の年齢と関連し、そして臨床的に正常な関節領域に存在することが予想されるＯＰ−１タンパク質および／またはＯＰ−１  ｍＲＮＡの量を表す。別の実施形態では、予め決定された標準は、ある範囲の値を有する。
【００２１】
別の実施形態では、本発明は、以下により、患者の関節領域内の変性活性または再生活性をモニタリングする方法を提供する：特定の時点で、患者の関節領域から得られた組織サンプル中のＯＰ−１タンパク質レベルおよび／またはＯＰ−１  ｍＲＮＡレベルを決定し、第２のより遅い時点で、患者の関節領域から得られた組織サンプル中に存在するＯＰ−１タンパク質および／またはＯＰ−１  ｍＲＮＡの量を決定し、そして第２の時点でのＯＰ−１タンパク質レベルおよび／またはＯＰ−１  ｍＲＮＡレベルを、第１の時点のレベルと比較する。存在するＯＰ−１タンパク質および／またはＯＰ−１  ｍＲＮＡの量の増加は、関節領域における再生活性の発生もしくは増加を示し、そして関節領域に存在するＯＰ−１タンパク質および／またはＯＰ−１  ｍＲＮＡの量の減少は、関節領域における再生活性の休止または低下を示す。
【００２２】
別の実施形態では、本発明は、以下により、患者の関節領域の臨床的状態を決定する方法を提供する：患者の関節領域から得られた組織サンプル中に存在するＯＰ−１タンパク質および／またはＯＰ−１  ｍＲＮＡの量を決定し、そして、この量を、臨床的に正常な関節領域に存在すると予想されるＯＰ−１タンパク質レベルおよび／またはＯＰ−１ｍＲＮＡレベルを示す予め決定された標準と比較する。標準に対してほぼ等しい組織サンプルに存在するＯＰ−１タンパク質および／またはｍＲＮＡの量は、関節領域の正常な臨床的状態を示し、そして標準に対してあまり等しくない量は、この患者の関節領域の異常な臨床的状態を示す。
【００２３】
別の局面では、本発明は、以下により、被験体における抗炎症剤の有効量を決定するための方法を提供する：被験体にある用量の抗炎症剤を投与し、被験体から組織サンプル、体液サンプルまたは細胞サンプルを獲得し、このサンプルにおけるＯＰ−１タンパク質濃度またはＯＰ−１  ｍＲＮＡ濃度を決定し、第２の遺伝子（その発現は、炎症により変更されない）によりコードされるタンパク質またはｍＲＮＡの濃度を決定し；そして、ＯＰ−１タンパク質濃度またはＯＰ−１  ｍＲＮＡ濃度を、第２の遺伝子のＯＰ−１タンパク質濃度またはＯＰ−１  ｍＲＮＡ濃度と比較し、ここで、ＯＰ−１タンパク質濃度またはｍＲＮＡ濃度と、第２の遺伝子のタンパク質濃度またはＲＮＡ濃度との間の差異は、ＯＰ−１タンパク質濃度またはｍＲＮＡ濃度の有効な増加または減少（従って、患者における抗炎症剤用量の有効性）を示す。
【００２４】
別の実施形態では、本発明は、以下により、抗炎症剤に応答する患者の能力を決定するための方法を提供する：被験体にある用量の抗炎症剤を投与し、ある用量の抗炎症剤が以前に投与された被験体から組織サンプル、体液サンプルまたは細胞サンプルを獲得し、このサンプルにおける、ＯＰ−１タンパク質濃度またはＯＰ−１  ｍＲＮＡ濃度を決定し、この同じサンプルにおける、第２の遺伝子（その発現は、炎症により変更されない）によりコードされるタンパク質またはｍＲＮＡの濃度を決定し、そして、ＯＰ−１タンパク質濃度またはＯＰ−１  ｍＲＮＡ濃度を、第２の遺伝子のＯＰ−１タンパク質濃度またはＯＰ−１  ｍＲＮＡ濃度と比較して、割合を決め、ここで、被験体は、この割合が、未処置の被験体または非応答性の被験体についての予め決定されたコントロールの割合よりも高い場合か、あるいは、被験体が以前に応答性であると決定されていた時には、被験体についての以前の割合に類似する場合、抗炎症剤に応答性である。
【００２５】
（発明の詳細な説明）
本発明は、正常な加齢の結果としておよび炎症に応答して、ＯＰ−１タンパク質レベルおよびＯＰ−１  ｍＲＮＡレベルが低下するという発見に基づく。軟骨におけるＯＰ−１タンパク質レベルおよびＯＰ−１  ｍＲＮＡレベルは、観察可能な軟骨分解の存在に関わらず、患者の年齢の増加と共に減少する。さらに、ＯＰ−１タンパク質レベルおよびｍＲＮＡレベルは、炎症した組織（例えば、炎症した関節組織（例えば、軟骨組織））において低下する。類似の結果は、滑液が試験される場合に得られる。
【００２６】
本発明は、軟骨または滑液における例示的骨形態形成タンパク質（ＯＰ−１）、またはそのｍＲＮＡの濃度が、正常な加齢において、および炎症した組織（例えば、関節組織）の周りで減少されるという発見に基づく。２つの方法（サンドイッチＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット）を、これらのサンプルにおける内因性ＯＰ−１タンパク質のレベルの定量に適用した。しかし、タンパク質の定量について任意の方法が用いられ得る。軟骨組織を凍結乾燥し、そしてＯＰ−１タンパク質を抽出した。ヒト組換え成熟ＯＰ−１ならびにモノクローナルＯＰ−１抗体およびポリクローナルＯＰ−１抗体をＥＬＩＳＡに用い、そして結果を、組織サンプルの乾燥重量に対して正規化した。同じ抗体を、ウェスタンブロット分析に用いた。特定の免疫反応性のバンドの濃度測定を、Ｆｌｕｏｒ−Ｓ  ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒを用いて分析した。ウェスタンブロットの結果を、総タンパク質含有量に対して正規化した。
【００２７】
ＯＰ−１ｍＲＮＡ発現を、結合組織または滑液由来の総ＲＮＡに対する慣用的なネストＲＴ−ＰＣＲを用いて測定した；しかし、ＯＰ−１  ｍＲＮＡを定量化するための任意の方法が用いられ得、そして多数の組織のいずれか（例えば、罹患した位置（例えば、炎症している、そして／または軟骨が損傷している、膝関節、肘関節、または中手指節関節のような、整形外科的部位）に曝露されている結合組織）が、試験され得る。ＲＴ−ＰＣＲバンドの濃度を、Ｆｌｕｏｒ−Ｓ  ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒおよび添付のソフトウェアプログラムを用いて評価し、そしてコントロールＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡバンドの濃度に対して正規化した；しかし、ＯＰ−１  ｍＲＮＡの値は、任意のｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ産物に対して正規化され得、炎症または年齢により、その濃度は変化されない（すなわち、上方制御も下方制御もされない）。多数のＰＣＲ産物のいずれかは、ＯＰ−１  ｍＲＮＡまたは正規化のコントロールとして用いられる第２の遺伝子のｍＲＮＡを増幅し得る、異なるＰＣＲプライマーを用いて生成され得る。
【００２８】
好ましい実施形態では、ＲＮＡレベルは、ＲＮＡの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によるＲＮＡの増幅によって定量される。この反応産物は、例えば、ゲル電気泳動（例えば、スラブまたはキャピラリー）によって、分解／定量され得るか、あるいは非増幅ＲＮＡは、走査レーザー、ノーザンブロット分析によってか、または、プローブとの直接ハイブリダイゼーションによって、定量され得る。あるいは、ＲＮＡレベルは、インサイチュ検出により定量される。本発明の実施形態では、ＯＰ−１  ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズし得るプローブは、固相支持体（例えば、「チップ」または「ＤＮＡプローブアレイ」）に付着される。オリゴヌクレオチドは、リソグラフィーを含む種々のプロセスにより、固体支持体に結合され得る。例えば、チップは、約２５０，０００個のオリゴヌクレオチドまでを保持し得る。次いで、この固相支持体は、試験核酸と接触され、そして特定のプローブに対するハイブリダイゼーションが検出される。従って、多数のサンプル（例えば、同じ個体由来の異なる組織または異なる個体由来のサンプル）の定量は、単一のハイブリダイゼーション実験で実施され得る。
【００２９】
診断的タンパク質またはｍＲＮＡ手順はまた、生検サンプルの一部においてＯＰ−１タンパク質および／またはｍＲＮＡならびにコントロールタンパク質および／またはＲＮＡ（例えば、ＧＡＤＰＨ）の相対強度を観察することにより、生検または切除から得られた組織の切片（固定または凍結された）に対してインサイチュで直接実施され得、その結果、タンパク質または核酸の精製の必要がない。核酸試薬または抗体は、このようなインサイチュ手順のためのプローブおよび／またはプライマーとして用いられ得る。
【００３０】
ＲＮＡは、器官、体液、または有核細胞を含む、任意の組織から定量され得る。例えば、組織は、好ましくは、軟骨であり、そして体液は、好ましくは、滑液または血液である。組織が得られ、そして、好ましくは、安定化溶液中に保存されるか、または分析の前に、凍結保存されて、ｍＲＮＡおよびタンパク質の分解を最小にする。ある実施形態では、組織は、例えば、膝、肘、肩、股関節部、大腿、頚部、椎骨、中手指節関節、指、手首または足根関節の組織のような、関節（すなわち、関節組織または関節領域）に由来する。
【００３１】
本明細書中で意図されるように、組織は、それ自体、炎症し得るか、あるいは、炎症した組織に隣接する場合、または炎症した組織に生理学的に関連する場合、さもなければ、炎症した組織または炎症した解剖学的構造と接触される場合、体液が炎症したとみなされる。炎症は、数例を挙げると、潮紅（ｒｅｄｎｅｓｓ）、腫脹、熱、および／または疼痛、ならびに／あるいは傷害または損傷の部位への血漿の溢出および白血球の浸潤により類型化される。この炎症または炎症性疾患は、任意の傷害または損傷により生じ得、保護応答（例えば、免疫応答）を開始させることにより身体を応答させる。この保護応答は、潮紅、腫脹、熱、および／または疼痛、ならびに／または傷害または損傷の部位への血漿の溢出および白血球の浸潤を生じる。傷害または損傷は、例えば、外傷、感染、アレルギー、疾患または手術に起因し得る。特定の好ましい実施形態では、炎症または炎症性疾患を生じる傷害は、本質的に遺伝的であり得、従って、個体を炎症性疾患にかかりやすくするか、または個体を炎症性疾患に特にかかりやすくする。炎症または炎症性疾患は、超急性（ｈｙｐｅｒａｃｕｔｅ／ｐｅｒａｃｕｔｅ）炎症、急性炎症、亜急性炎症、または慢性炎症であり得る。組織損傷の程度は、特定の組織に対して表在性または深在性、非特異的または特異的であり得る。炎症の原因となる免疫病理学的機構は、例えば、細胞傷害性抗体により媒介されるアレルギー（反応体）に起因し得るか、免疫複合体により媒介されるアレルギー（反応体）に起因し得るか、または遅延型過敏性反応であり得る。
【００３２】
ＯＰ−１タンパク質および／またはＯＰ−１ｍＲＮＡのレベルは、予め決定された標準的なコントロールレベルに匹敵し得る。このレベルは、特定の疾患、疾患の特定の段階、疾患の特定の重篤度、または特定の組織グレード（例えば、Ｃｏｌｌｉｎｓグレード）に対応する。患者サンプルにおけるＯＰ−１タンパク質および／またはＯＰ−１  ｍＲＮＡのレベルと、疾患の特定の段階もしくは重篤度、または組織グレードでのＯＰ−１タンパク質および／またはＯＰ−１  ｍＲＮＡについての予め決められた基準値との比較は、それぞれ、段階、重篤度、または組織グレードを示す。あるいは、患者におけるＯＰ−１タンパク質レベルおよび／またはＯＰ−１  ｍＲＮＡレベルは、疾患の発症の前、または疾患の寛解の間に測定された患者のレベルと比較され得る。標準は、加齢調整標準（すなわち、特定の年齢群に由来する組織サンプルの測定から誘導され、そして値が、この年齢群を代表する標準）であり得る。
【００３３】
疾患の重篤度とは、疼痛、腫脹、水腫、潮紅、組織変性、関与する組織の生合成活性の変化（例えば、炎症媒介因子または他のタンパク質の合成の増加または低下）のような、疾患の症状または症状発現の強度をいう。疾患の重篤度はまた、種々の測定判定基準により確立した、診断群内の疾病の重篤度の予め決められたレベル（すなわち、広範に用いられているＣｏｌｌｉｎｓグレーディングシステム（ｇｒａｄｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）のような、疾病指標の重篤度）に相関し得る。臨床的疾患とは、特定の臨床的兆候および症状で存在する疾患をいい、この臨床的兆候および症状は、臨床的兆候を伴わない準臨床的疾病を除外して、認識可能である。疾患に対する素因とは、ストレス、年齢、または損傷によるような特定の条件下で活性化され得る疾患に対する潜在的感受性をいう。素因とは、疾患の臨床的症状の発症にかかわらず、時間のいくつかの点で、疾患の状態を獲得する可能性を言及し得る。素因は、遺伝的素因であり得、疾患は、若いときには存在しないが、人生の後になって発現し得る。
【００３４】
本発明は、以下により、抗炎症剤に対する被験体の応答をモニタリングするための方法を提供する：被験体に、ある用量の抗炎症剤を投与し、この被験体から組織サンプル、体液サンプル、または細胞サンプルを獲得し、ＯＰ−１遺伝子の発現レベル（タンパク質および／またはｍＲＮＡのいずれか）を決定し、そして処置前と後のＯＰ−１遺伝子発現を比較して、この被験体が、抗炎症剤に対して応答性である（例えば、正常なＯＰ−１遺伝子発現を有する）か否かを決定する。あるいは、本発明は、以下により、ＯＰ−１調節剤（例えば、ＯＰ−１  ＲＮＡおよび／またはＯＰ−１タンパク質の発現を調節する薬剤）に対する、被験体の応答をモニタリングするための方法を提供する：被験体にある用量のＯＰ−１調節剤を投与し、この被験体から組織サンプル、体液サンプル、または細胞サンプルを獲得し、ＯＰ−１遺伝子の発現のレベル（ＯＰ−１タンパク質および／またはＯＰ−１  ｍＲＮＡ）を決定し、そして処置の前と後のＯＰ−１遺伝子発現を比較して、この被験体がＯＰ−１調節剤に対して応答性であるか否かを決定する。
【００３５】
別の実施形態では、本発明は、抗炎症剤またはＯＰ−１調節薬物にインビトロで曝露した後、組織（体液または細胞を含む）における薬物応答性を決定するための方法を提供する。さらに別の実施形態では、本発明は、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヤギ、イヌ、ウシ、ウマ、ネコ）のような動物の、組織、体液、または細胞における、ＯＰ−１タンパク質レベルもしくはＯＰ−１  ｍＲＮＡレベル、または薬物応答性を決定するための方法を提供する。ある実施形態では、動物は、トランスジェニック動物または疾患モデル動物（例えば、慢性関節リウマチについてのヤギモデル）である。この動物は、この動物に、抗炎症剤またはＯＰ−１調節薬物を投与した後の、ＯＰ−１タンパク質レベルおよび／またはＯＰ−１  ｍＲＮＡレベルについて分析され得る。
【００３６】
ＢＭＰファミリーのタンパク質の他のメンバーが、例示的なメンバーであるＯＰ−１について本明細書中に開示されるように、骨格組織および関節組織の疾患または年齢状態についての生体マーカーとして用いられ得ることが意図される。ＲＴ−ＰＣＲ法は、他のＢＭＰ  ｍＲＮＡを増幅するためのプライマーを設計することにより変更され得る。ＯＰ−１に構造的および生化学的に関連した、ＢＭＰファミリーのタンパク質の他のメンバー、ならびにこれらの対応するアミノ酸配列およびそのヌクレオチド配列の詳細な記述は、当該分野において、例えば、米国特許第５，０１１，６９１号（１９９１年４月３０日発行）、米国特許第５，２５８，４９４号（１９９３年１１月２日発行）、米国特許第５，３２４，８１９号（１９９４年６月２８日発行）、米国特許第５，７５０，６５１号（１９９８年５月１２日発行）、米国特許第５，２６６，６８３号（１９９３年１１月３０日発行）、米国特許第５，８６３，７５８号（１９９９年１月２６日発行）、米国特許第６，２６２，８３５号（２００１年７月１７日発行）（これらの内容の全ては、本明細書中で参考として援用される）において見出され得る。さらに、本明細書中に記載されるＥＬＩＳＡ法およびウェスタンブロット法は、慣用的な実験を用いて、容易に適用され得、そして、他のＢＭＰタンパク質を測定するために用いられ得る。同様に、ＢＭＰを検出するための抗体に関する、ならびにこのような抗体を調製するための例示的教示は、米国特許第５，４６８，８４５号（１９９５年１１月２１日発行）および米国特許第５，７１４，５８９号（１９９８年２月３日発行）（これらの内容の全ては、本明細書中で参考として援用される）において見出され得る。
【００３７】
本発明の方法は、疾患（例えば、変形性関節症、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎または突発性関節炎）を罹患しているかまたは罹患しやすい被験体を、予知するか、決定するか、測定するか、またはモニターするために特に有用である。本発明に従う方法にはまた、自己免疫疾患（例えば、全身性エリテマトーデス）を罹患しているかまたは罹患しやすい被験体を、予知するか、決定するか、測定するか、またはモニターするために特に有用である。炎症性成分または帰結を有する他の疾患および状態としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：自己免疫関節炎、若年性関節リウマチ、乾癬性関節炎、歯肉炎、歯周疾患に起因する炎症、通風。炎症性成分を有する他の疾患としては、細菌感染、ウイルス感染および真菌感染が挙げられる。疾患組織および正常組織におけるＯＰ−１のタンパク質レベルとｍＲＮＡレベルとの間の差異は大きく変動し得るか、あるいは、ＯＰ−１のタンパク質レベルおよび／またはｍＲＮＡレベルは、疾患の型、疾患の重篤度または疾患の段階に依存して正常より高くあっても低くあってもよいようである。
【００３８】
上記にもかかわらず、本発明が、軟骨変性、または炎症に付随し得る分解のような組織変質と、軟骨変性、または炎症もしくは疾患に非依存的に生じ得る分解のような組織変質との間を区別することは、理解される。
【００３９】
すなわち、ＯＰ−１のタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルは、組織整合性または健康の指標であり得るが、組織変質または不健康の潜在的原因の指標である必要はない。例えば、本明細書中に開示されるように、ＯＰ−１は、炎症性の間接疾患、および疾患に非依存的な加齢関連軟骨変質に付随する軟骨変性の指標である。
【実施例】
【００４０】
（実施例１：ＯＰ−１のタンパク質レベルおよびｍＲＮＡレベルは、年齢の増加につれて減少する）
ヒト関節軟骨の加齢に伴う内因性ＯＰ−１（タンパク質およびｍＲＮＡ）の発現における変化を、研究した。軟骨抽出物中の総内因性ＯＰ−１タンパク質の濃度を定量的に評価するために、サンドイッチ酵素連結イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を開発し、そしてウエスタンブロット測定および逆転写ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）測定と比較した。結果は、増加した年齢を伴う、総ＯＰ−１タンパク質と成熟ＯＰ−１タンパク質との間、および総ＯＰ−１  ｍＲＮＡと成熟ＯＰ−１  ｍＲＮＡとの間の減少に相関が存在することを示す。
【００４１】
（材料および方法）
（試薬）
ヒト組換えプロＯＰ−１および成熟ＯＰ−１、ＢＭＰ−６、抗プロ（Ｒ２８５４）ＯＰ−１抗体および抗成熟（１Ｂ１２）ＯＰ−１抗体を、Ｓｔｒｙｋｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）より得た。他の２つの抗ＯＰ−１抗体（＃ＳＣ−９３０５および＃ＭＡＢ３５４）を、それぞれＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）およびＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）より購入した。電気泳動グレードの試薬を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）より購入した。薬品（試薬グレードまたは分子生物グレード）を、他で注意しない限り、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）より得た。ケラタナーゼ（ｋｅｒａｔａｎａｓｅ）（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．；ＥＣ３．２．１．１０３）、ケラタナーゼＩＩ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．Ｋｓ３６）およびコンドロイチナーゼＡＢＣ（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ；ＥＣ４．２．２．２）を、生化学（日本）より得た。ヒアルロニダーゼ（ウシ精巣）を、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）より購入した。
【００４２】
（組織獲得）
全層正常ヒト関節軟骨を、関節疾患の病歴を有さない、死後２４時間以内のドナーの大腿顆の圧力（ｌｏａｄ  ｂｅａｒｉｎｇ）領域より切開した。２０歳〜８０歳にわたる男女からのサンプルを、ｔｈｅ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｏｒｇａｎ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓを介する機関の承認を有してｔｈｅ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｏｒｇａｎ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓのプロトコルに従って得た。関節を開放した後、軟骨の表面を、グロス実験に供した。すべての軟骨サンプルを正常ドナーより得たが、これらの全てが正常ではないようである。いくつかのサンプルが、変性性の形態的変化を示した。全ての軟骨サンプルを、メッセンジャーＲＮＡ抽出またはタンパク質抽出のいずれかに処理した。
【００４３】
（ＯＰ−１抗体）
以下の抗体を使用した：ＯＰ−１のプロ形態に特異的なポリクローナル抗体（Ｒ２８５４（Ｓｔｒｙｋｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））（Ｃｈｕｂｉｎｓｋａｙａ  ｅｔ  ａｌ．２０００；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔ．１１．２１５；Ｈｅｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｄｅｎｔ．Ｒｅｓ．７７：５４５；Ｖｕｌｋｉｃｅｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９８：６９３）；ＯＰ−１の成熟ドメイン全体に特異的な２つのモノクローナル抗体（１Ｂ１２（Ｓｔｒｙｋｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）および＃ＭＡＢ３５４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ））；ならびに成熟ＯＰ−１のＮ末端由来の１５アミノ酸の合成ペプチドに特異的なポリクローナル抗体（＃ＳＣ９３０５（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ））。最初は、全ての抗体の特異性を、供給業者によって試験した。しかし、ＯＰ−１タンパク質とＢＭＰ−６タンパク質との間の高度な相同性、および抗ＯＰ−１抗体が産生された後にＢＭＰ−６がクローニングされた事実を考慮して、全ての抗体を試験して、ＢＭＰ−６との交差反応性がないことを確認した。抗プロＯＰ−１抗体（Ｒ２８５４）は、ＢＭＰ−６または成熟ＯＰ−１のいずれかに対する特異的結合がないことを示す。
【００４４】
（軟骨抽出）
５００ｍｇの新鮮なドナー軟骨を、一晩凍結乾燥し、そして組織の乾燥重量を測定した。サンプルを、液体窒素中で粉砕し、１５０ｍｇ（乾燥重量）の軟骨組織を、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓおよび１錠／１０ｍｌのプロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＃１８３６１５３，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を含有する、の３．５ｍｌの氷冷１Ｍ  ＧｕＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で抽出した。軟骨抽出物を、回転させながら４℃で４時間行った。上清を、２５００ｒｐｍにて４℃で１０分間遠心分離し、４℃で貯蔵した。上清を、水中で２日間透析（１２，０００〜１４，０００ＭＷカットオフ）し、そして４℃で保存した。抽出の効率を実証するために、軟骨組織を、上清を除去した後に、再度抽出し、抽出物をウエスタンブロットおよびＥＬＩＳＡによって分析した。
【００４５】
Ｃｏｌｌｉｎｓグレード０は、一般に、軟骨変性または骨増殖体がない軟骨に関する。Ｃｏｌｌｉｎｓグレード１は、一般に、関節表面および軽度の原線維性の限定された分裂が存在する軟骨に関する。Ｃｏｌｌｉｎｓグレード２は、一般に、裂を有する軟骨の原繊維性、およびおそらくいくつかの小さな骨増殖体が存在する軟骨に関する。Ｃｏｌｌｉｎｓグレード３は、一般に、約３０％以下の軟骨表面が肋軟骨下骨（病巣（ｆｏｃａｌ  ｌｅｓｉｏｎ））に侵食されておりかつ骨増殖体が存在する、広範な原線維性および裂形成（ｆｉｓｓｕｒｉｎｇ）が存在する軟骨に関する。Ｃｏｌｌｉｎグレード４は、一般に、３０％より多い軟骨表面が著しい幾何変化を伴う肋軟骨下骨に侵食され、かつ骨増殖体が存在する、軟骨に関する。
【００４６】
（ウエスタンブロット分析）
上記の抗プロ（Ｒ２８５４）ＯＰ−１抗体および抗成熟（１Ｂ１２）ＯＰ−１抗体を用いて、イムノブロット分析を行った。１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．５）、１％  ＳＤＳ、１０％グリセロールおよび０．０１６％ブロモフェノール青を含有する緩衝液中で、凍結乾燥サンプルを、可溶化した。このサンプルを、１０ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）で還元した。Ｍｉｃｒｏ  ＢＳＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）によって、タンパク質濃度を定量化した。３０μｇの各軟骨サンプルを、１２％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードし、電気泳動し、そして標準法に従ってウエスタンブロットした。非特異的結合部位を、５％ミルク（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を含有するブロッキング溶液で１時間ブロックした。このブロットを、以下の希釈での一次抗体とともにインキュベーションした：Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓより得た抗プロ−ＯＰ−１抗体（Ｒ２８５４）および抗成熟ＯＰ−１抗体（＃ＭＡＢ３５４）について１：２５０；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚより得た抗成熟ＯＰ−１抗体（＃ＳＣ−９３０５）について１：１００。西洋ワサビペルオキシダーゼと結合体化されたＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）またはＤｏｎｋｅｙ  Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）のいずれかを、１：１０，０００に希釈し、そして二次抗体として使用した。ＥＣＬ−ＰＬＵＳキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を使用して、ウエスタンブロットを、感光した。組換えプロＯＰ−１または成熟ＯＰ−１に対する抗体の結合特異性を、標準法に従って確認した。二次抗体をまた、標準法に従って、非特異的結合について試験した。
【００４７】
（化学発光ＯＰ−１サンドイッチＥＬＩＳＡ）
サンドイッチＥＬＩＳＡについて、２つの抗体（１つはポリクローナル＃ＳＣ−９３０５  （Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）および１つはモノクローナル１Ｂ１２（Ｓｔｒｙｋｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））を使用した。ポリクローナル抗ＯＰ−１抗体（＃ＳＣ−９３０５）を、プレートコーティング抗体として使用し、そして１Ｂ１２を、二次抗体として使用した。プレートを、Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）（ｐＨ７．５）中５０ｎｇ／ウェルの＃ＳＣ−９３０５でコートし、そして４℃で一晩インキュベートした。プレートを、ＴＢＳ／Ｔ（ＴＢＳ（ｐＨ７．５）中０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で４回洗浄した。５％  脱脂粉乳（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＃１７０−６４０４，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）をＴＢＳ／Ｔ（ｐＨ７．５）中に含有するブロッキング溶液２０μｌ／ウェルで、室温（ＲＴ）で２時間のインキュベーションによって、非特異的結合をブロックした。プレートを、ＴＢＳ／Ｔで４回洗浄した。
【００４８】
標準曲線を作製するために、成熟組換えＯＰ−１（Ｓｔｒｙｋｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を、１０ｎｇ／ｍｌ〜０．０１ｎｇ／ｍｌの範囲の種々の濃度にＴＢＳ／Ｔで希釈した。１００μｌのＯＰ−１溶液または軟骨抽出物のいずれかを、プレートウェルに（３連で）添加し、そして室温で１時間インキュベートした。プレートを、ＴＢＳ／Ｔで４回洗浄した。１００μｌの１Ｂ１２（ＴＢＳ／Ｔで１：１０００に希釈した）を、各ウェルに添加し、そして室温で１時間インキュベートした。プレートを、ＴＢＳ／Ｔで４回洗浄した。次いで、１００μｌのＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼ結合体化抗体（Ｐｉｅｒｃｅ，＃３１４３４）（ＴＢＳ／Ｔで１：１０，０００に希釈した）を、各ウェルに添加し、そして室温で１時間インキュベートした。プレートを、ＴＢＳ／Ｔで４回洗浄した。この反応を、１００μｌのＳｕｐｅｒｓｉｇａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ，＃３７０７５）（Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｆｅｍｔｏ  Ｌｕｍｉｎｏｌ／Ｅｎｈａｎｃｅｒ溶液とＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｆｅｍｔｏ安定ペルオキシド溶液とを等量で混合することによって調製した）を添加することによって展開し、そしてシェーカー上で１分間振盪した。化学発光ＥＬＩＳＡプレートリーダーＶｉｃｔｏｒ２（Ｗａｌｌａｃ）を使用して相対的光単位（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｕｎｉｔ）（ＲＬＵ）として、データを得た。
【００４９】
（逆転写ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ））
総ＲＮＡを、以前に記載された酸−グアニジニウムチオシアネート（Ｃｓ−Ｓｚａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ａｒｔｈｒｉｔ．Ｒｈｅｕｍ．４０：１０３７）を使用して軟骨組織より直接抽出した。ＯＰ−１に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー対（Ｃｈｕｂｉｎｓｋａｙａ  ｅｔ  ａｌ．２０００）およびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を合成した。これらのプライマー対を、異なるサイズのＰＣＲ産物を得るために設計した：ＧＡＰＤＨについて３１９塩基対（ｂｐ）およびＯＰ−１について３１３塩基対。ネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＲＴ−ＰＣＲについて使用したＯＰ−１プライマーは、以下である：ａ）２１マーのアンチセンス、１８１０〜１８３０の位置、５’−ＴＴＴＴＣＣＴＴＴＣＧＣＡＣＡＧＡＣＡＣＣ−３’（配列番号１）；ｂ）２０マーのセンス、１３２８〜１３４７の位置、５’−ＴＧＣＣＡＴＣＴＣＣＧＴＣＣＴＣＴＡＣＴ−３’（配列番号２）；およびｃ）２３マーのセンス、１５１８〜１５４０の位置、５’−ＴＴＣＣＣＣＴＣＣＣＴＡＴＣＣＣＣＡＡＣＴＴＴ−３’（配列番号３）。これらのプライマーの特異性は、以前に示された（Ｃｈｕｂｉｎｓｋａｙａ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。ＧＡＰＤＨプライマーは、としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：である：センスプライマー  ５’−ＧＧＴＡＴＣＧＴＧＧＡＡＧＧＡＣＴＣＡＴ−３’（配列番号４）およびアンチセンスプライマー５’−ＡＣＣＡＣＣＴＧＧＴＧＣＴＣＡＧＴＧＴＡ−３’（配列番号５）。Ｃｓ−Ｓｚａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）によって記載されるように、約１μｇの総ＲＮＡを、逆転写酵素を使用して転写した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、特定の上流プライマーおよび下流プライマー（各１５ｐＭ；ＯＰ−１  ｍＲＮＡについてのプライマー（ａ）および（ｂ））の存在下で、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、５μｌの生じたｃＤＮＡを増幅した。０．５μｌの第１増幅産物および第２センスプライマー（プライマー（ｃ）；ネステッドプライマー）を、引き続く増幅工程に使用した。最適な条件でＲＴ−ＰＣＲを行うために、そして対数的に直線な産物形成を持続するために、３０サイクル（使用したプライマーについて、９５℃で４５秒間、５７℃で３０秒間のアニーリング温度、および７２℃で４５秒間）、続いて７２℃で５分間の最終伸長を選択した。ＰＣＲ産物を、３％  Ｍｅｔａｐｈｏｒアガロースゲル（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ）中で分離し、そしてエチジウムブロミド染色によって可視化した。バンドの密度を、Ｆｌｕｏｒ−Ｓ  ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を添付のソフトウェアプログラムＱｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）とともに使用して測定した。ＯＰ−１バンドの密度を、サンプル中の可変性を制御するためにＧＡＰＤＨバンドの密度に対して正規化した。
【００５０】
（統計学的分析）
示した全ての結果は、少なくとも３つの別々の実験の平均±Ｓ．Ｅ．であり、各点について３連で決定した。共分散有意性を、正常データのＰｅａｒｓｏｎ相関によって決定した。
【００５１】
（結果）
（ＯＰ−１サンドイッチＥＬＩＳＡ）
ＯＰ−１についてのサンドイッチＥＬＩＳＡを最適化するために、いくつかのパラメータ（異なる抗ＯＰ−１抗体組み合わせ、アッセイの感受性に対するｐＨの効果、種々の抽出緩衝液および酵素の効果、ならびにＯＰ−１濃度の総タンパク質含有量または乾燥重量に対する正規化を含む）を試験した。ほとんどの感受性アッセイは、コーティング抗体としてのポリクローナル＃ＳＣ−９３０５（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）と二次抗体としてのモノクローナル１Ｂ１２（Ｓｔｒｙｋｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）との組み合わせを使用したアッセイであった。図１は、ヒト組換え成熟ＯＰ−１を種々の希釈（０．０１〜１０ｎｇ／ｍｌの範囲）で使用して調製した例示的標準曲線を図示する。図２は、アッセイにおいて使用したＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ緩衝液について広範な範囲のｐＨの効果を図示する。抽出緩衝液は、中性ｐＨを有し、そして中性ｐＨのＥＬＩＳＡリーディングは、真ん中の範囲であるので、このｐＨを、ＯＰ−１サンドイッチＥＬＩＳＡについての標準として選択した。ＥＬＩＳＡを使用する評価の前に、軟骨抽出物が透析されねばならないか否かを決定するために、２つの抽出緩衝液（１Ｍ  ＧｕＨＣｌおよび溶解緩衝液）を試験した。図３Ａに示されるように、１Ｍ  ＧｕＨＣｌ緩衝液は、ＯＰ−１の結合を５０％以上阻害したが、溶解緩衝液は、ＥＬＩＳＡ結果に影響しなかった（図３Ｂ）。しかし、同一の軟骨標本を両方の緩衝液で抽出し、次いでＥＬＩＳＡによって分析した場合、より多くの抗原性ＯＰ−１を、溶解緩衝液よりもＧｕＨＣｌ緩衝液で軟骨組織から抽出し得た。この問題を克服するために、ＧｕＨＣｌ緩衝液を、抽出緩衝液として選択したが、全てのサンプルを、さらなる分析に使用する前に透析した。
【００５２】
ＥＬＩＳＡ法を標準化し、そして細胞数の起こり得る減少、および加齢に伴う軟骨抽出能（ｅｘｔｒａｃｔａｂｉｌｉｔｙ）を影響するマトリクス分子の枯渇に指向するために、抽出の前に、５００ｍｇの組織湿重量を、（マトリクスの影響を避けるために）常に凍結乾燥し、液体窒素中で粉砕し、そして１Ｍ  ＧｕＨＣｌ（３．５ｍｌの緩衝液当たり１５０ｍｇ（乾燥重量）の組織の比で）を用いて抽出する。４Ｍ  ＧｕＨＣｌ緩衝液での反復した抽出によって残った組織は、ＥＬＩＳＡによって検出されるような抽出可能なＯＰ−１を残さないことを示した。１Ｍ  ＧｕＨＣｌ緩衝液がほとんどのＯＰ−１タンパク質を抽出することを定量的に確認するために、同一軟骨サンプルのアリコートを、以下の種々の抽出緩衝液で抽出した：１）１Ｍ  ＧｕＨＣｌ、０．００５Ｍ  ＥＤＴＡ、０．０５Ｍ  ＮａＣｌ；２）５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１Ｍ  ＧｕＨＣｌ；３）５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、４Ｍ  ＧｕＨＣｌ；４）５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４；５）５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１％  ＳＤＳ；６）５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ  β−メルカプトエタノール；７）５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、８Ｍ尿素；および８）５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１Ｍ  ＮａＣｌ、８Ｍ尿素。これらの緩衝液全てを、ＯＰ−１サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して定量的に分析した。１Ｍ  ＧｕＨＣｌ緩衝液は、ヒト成体関節軟骨からのＯＰ−１抽出について最も適切であった。
【００５３】
最も感受性のＥＬＩＳＡ条件を得るために、軟骨抽出物の異なる酵素処理を試験した。軟骨抽出物を、プロテイナーゼＫ、ヒアルロニダーゼ、コラーゲナーゼ、コンドロイチナーゼＡＢＣ（ＣＨａｓｅ）、ケラタナーゼ（Ｋｅｒ）、またはケラタナーゼＩＩ（ＫｅｒＩＩ）、あるいはこれらの酵素の組み合わせで処理し、そしてＯＰ−１サンドウィッチＥＬＩＳＡによって分析した。処置群のＥＬＩＳＡ値を、予備処理なしで得られた値と比較した（表１）。これらの群の間に有意な差異はなかった。従って、酵素消化は、ＥＬＩＳＡのための標準プロトコルに含まれない。
【００５４】
【表１】
2005528581.tif 000002
種々の年齢の正常な患者（コリンズ等級０〜２）由来の全ての軟骨サンプルからの抽出物を、上記のＯＰ−１サンドウィッチＥＬＩＳＡで分析した。図４Ａを参照すると、内因性ＯＰ−１タンパク質の含有量は、年齢が増加すると共に有意に減少した（ｐ＜０．０２）。ドナーの年齢およびＯＰ−１タンパク質のレベルは、有意な共変を示した（ピアソン相関ｐ＜０．０２）。重要なことに、これらのサンプルのうちでも、正常な組織形態学的外観を有する軟骨サンプル、および変質形態変化を有する軟骨サンプルであるが、これらの全ては、関節疾患の病歴のない器官ドナーから得られた。図４Ｂを参照すると、正常な組織形態学を有する軟骨サンプルが別のサブグループに単離され、そしてＯＰ−１タンパク質の含有量について分析される場合、同じ統計学的差異が検出された。正常軟骨の加齢を伴ってさえも、内因性ＯＰ−１の含有量の減少が存在した。成体組織において、ＯＰ−１タンパク質発現における変化は、線形回帰を有した。４０歳と７０歳との間には、少なくとも３〜４倍の、ＯＰ−１  ｍＲＮＡレベルの差異が存在した。
【００５５】
（ウェスタンブロット分析）
代表的なサンプルを、１０年の範囲の年齢（ａｇｅ  ｄｅｃａｄｅ）（２０歳、３２歳、４０歳、５８歳、６９歳および７５歳）の各々から採り、そして抗成熟ＯＰ−１抗体＃ＭＡＢ３５４を使用して、ウェスタンブロットによって分析した。標準的な方法に従って、ゲルを走査し、そしてデンシトメトリーを実施した。２つの主要なＯＰ−１バンドが、ドナーの年齢にかかわらず、試験した全ての軟骨において存在した（データは示さない）。これらのバンドは、完全にプロセスされた成熟ＯＰ−１（分子量約３６ｋＤ）および部分的にプロセスされたＯＰ−１タンパク質（分子量約７５ｋＤ）の中間体形態を表した。これらのバンドの各々の、半定量的デンシトメトリー分析は、年齢の増加に伴うこれらのバンドの強度の統計的減少を実証し、これは、ＥＬＩＳＡのデータと相関した（Ｐ＜０．０５）。活性な成熟ＯＰ−１の量は、年齢が増加すると共に有意に減少した。７５ｋＤのＯＰ−１および成熟ＯＰ−１（３６ｋＤおよび１７ｋＤ）のヘミダイマー形態を表すバンドは、変質した軟骨および加齢した軟骨において消失し、このことは、主要な変化が、プロセスされた成熟ＯＰ−１のレベルに対して起こり得ることを示唆する。図５は、プロセスされた成熟ＯＰ−１ダイマー（３６ｋＤ）およびＯＰ−１のヘミダイマー形態（７５ｋＤ）に対応する、ウェスタンブロットバンドの定量的画像分析を表す。図６を参照すると、同じ軟骨抽出物が、抗プロＯＰ−１抗体Ｒ２８５４を用いて分析され、そして画像分析器を使用して定量される場合、ヘミダイマー形態のプロＯＰ−１タンパク質に対応するバンドの増加が観察された。より低い分子量のバンド（プロＯＰ−１還元モノマーおよびプロＯＰ−１ドメイン）が、軟骨の加齢と共に消失した。
【００５６】
（ＲＴ−ＰＣＲ）
総ＲＮＡを、軟骨細胞の単離も培養もなしに、軟骨組織から直接抽出し、そしてＯＰ−１およびＧＡＰＤＨ特異的プライマーセットを使用する、ネスティッドＲＴ−ＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄ  ＲＴ−ＰＣＲ）分析に供した。両方のＰＣＲ産物を、同じサイクル数だけ増幅した。ＧＡＰＤＨを、標準化因子として選択した。なぜなら、これはハウスキーピング遺伝子であり、そして正常軟骨におけるＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ発現のレベルは、年齢によって１０％より大きくは変化しないからである。図７は、軟骨ドナーの年齢に対してプロットされた、ＯＰ−１／ＧＡＤＰＨ比を示す。関節軟骨におけるＯＰ−１  ｍＲＮＡレベルは、ドナーの年齢の増加と共に減少した（Ｐ＜０．００１）。最も高レベルのＯＰ−１  ｍＲＮＡは、新生児および若年成人のドナーにおいて検出され、一方で、ＯＰ−１発現は、加齢プロセスを通して顕著にダウンレギュレートされた。成人組織において、ＯＰ−１  ｍＲＮＡレベルの変化は、線形回帰を有した。３０歳と８０歳との間では、少なくとも４〜５倍のＯＰ−１  ｍＲＮＡレベルの差異が存在した。８０歳までに、ＯＰ−１  ｍＲＮＡレベルは、非常に低いかまたはかろうじて検出可能であり、いくらかのドナーは、検出限界より低いＯＰ−１  ｍＲＮＡレベルを有した。
【００５７】
（実施例２：慢性関節リウマチおよび変形性関節症におけるＯＰ−１タンパク質およびｍＲＮＡレベル）
上記ＯＰ−１サンドウィッチＥＬＩＳＡを使用して、ＯＰ−１タンパク質が滑液において検出され得るか否か、滑液におけるＯＰ−１タンパク質の評価に対して定量的アプローチが適合され得るか否か、ならびに正常ドナーと慢性関節リウマチ（ＲＡ）および変形性関節症（ＯＡ）に罹患する患者との間に、ＯＰ−１タンパク質のレベルの差異が存在するか否かを、決定した。これらの結果は、滑液ＯＰ−１が、ＲＡとＯＡとの両方に対する有用な診断および予後マーカーであることを示唆する。
【００５８】
滑液を、ＲＡおよびＯＡに罹患する被験体、ならびにヒト器官ドナーの正常関節から、標準的な方法に従って吸引した。７４個の関節（１３個の正常、２５個のＲＡ、２９個のＯＡおよび７個の他の炎症性疾患）からの軟骨標本もまた得た。滑液および軟骨を、抗プロＯＰ−１抗体および抗成熟ＯＰ−１抗体を用いるウェスタンブロットによって分析し、そしてＯＰ−１タンパク質の濃度を、実施例１に記載されるように、ＯＰ−１サンドウィッチＥＬＩＳＡを使用して測定した。サンプル中のＯＰ−１濃度を、５つのセットで定量し、そして少なくとも３〜５個について５回試験した。滑液を１：１００に希釈し、その後、ウェスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡを行った。
【００５９】
（結果）
（ＯＰ−１サンドウィッチＥＬＩＳＡ結果およびＲＴ−ＰＣＲ）
図８は、ＥＬＩＳＡについての代表的な標準曲線を示す。ＯＰ−１タンパク質のプロ形態および成熟形態は、試験した全てのサンプルに存在した。図９Ａは、軟骨中のＯＰ−１タンパク質濃度と、正常患者およびＯＡ患者における軟骨変質の進行との間の関係を示す。患者におけるコリンズ等級の増加またはＯＡの存在は、内因性ＯＰ−１タンパク質濃度の有意な減少に相関した。等級２および３の軟骨における内因性ＯＰ−１タンパク質のレベルは、等級０および１の軟骨と比較した場合に、２分の１に減少し（それぞれｐ＜０．０２およびｐ＜０．０５）、そして等級４およびＯＡ患者由来の軟骨において、４分の１から６分の１に減少した（ｐ＜０．００３）。
【００６０】
図９Ａにおいて、ＥＬＩＳＡによって分析した同じ軟骨サンプルを、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、ＯＰ−１  ｍＲＮＡ濃度について試験した。図９Ｂを参照すると、ＯＰ−１  ｍＲＮＡ発現は、等級０および１の軟骨と比較した場合、等級２および３の軟骨において、２分の１に減少した（ｐ＜０．０５）。しかし、ＯＡ軟骨において、ＯＰ−１  ｍＲＮＡのレベルは、正常組織（等級０および１）におけるレベルに匹敵した。これらの結果は、ＯＡ組織が、軟骨組織の再生のための同化作用の応答を引き起こすことを示唆する。顕著なことに、器官ドナー由来の滑液におけるＯＰ−１タンパク質の濃度は、同じドナーからの軟骨抽出物において検出された濃度に匹敵した。ＯＰ−１タンパク質濃度は、変質変化を有するドナーにおいてより、正常な膝関節を有するドナーにおいて高かった（ｐ＜０．０１５）。ＯＰ−１タンパク質濃度は、ＯＡ患者から得られた滑液よりも、ＲＡ患者から得られた滑液において高かった（ｐ＜０．０３）。
【００６１】
図１０は、正常患者、ＯＡ患者、およびＲＡ患者、ならびに他の種々の型の関節炎（例えば、痛風、線維筋痛症候群（ｆｉｂｒｏｍｙａｌｇｅａ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（ＦＭＳ）、およびリウマチ性多発性筋痛（ｐｏｌｙｍｙａｌｇｅａ  ｒｈｅｕｍａｔｉｃａ）（ＰＭＲ））に罹患する患者由来のヒト滑液における、ＯＰ−１タンパク質のレベルを示す。滑液中のＯＰ−１タンパク質は、ＯＡおよびＲＡに罹患する患者において増加し、そしてＯＰ−１タンパク質の濃度は、正常患者またはＯＡ患者と比較して、ＲＡ患者および組み合わせた他の全ての型の関節炎の群由来の滑液において、少なくとも２倍高い。
【００６２】
しかし、これらの増加が、滑液に存在する全タンパク質を考慮する場合、これらの結果は、ＯＡ患者およびＲＡ患者における、ＯＰ−１タンパク質の顕著な減少を示す。図１１は、ＯＡ、ＲＡおよび他の疾患に罹患する患者由来の滑液における全タンパク質の量を示す。全タンパク質は、全ての疾患組織において、増加する。
【００６３】
図１２を参照すると、滑液中のＯＰ−１タンパク質濃度が全タンパク質濃度に対して標準化される場合、ＯＰ−１タンパク質は、ＯＡ患者において劇的に減少する。ＯＰ−１タンパク質はまた、ＲＡ患者において減少するが、ＯＡ患者より少ない程度である；ＯＰ−１タンパク質の標準化された濃度もまた、ＲＡ患者由来の滑液において２倍高い。
【００６４】
ＯＰ−１タンパク質およびｍＲＮＡの発現を、膝関節由来の他の結合組織において試験した。靭帯、腱、半月板、および滑膜を、コリンズ等級２を有する正常ヒトドナーの膝組織から得た。ＥＬＩＳＡおよびＲＴ−ＰＣＲを、実施例１に記載されるように実施した。図１３Ａを参照すると、ＯＰ−１タンパク質は、全ての組織において検出され、最大レベルのＯＰ−１タンパク質は、靭帯、腱および滑膜において検出された。図１３Ｂを参照すると、ＯＰ−１  ｍＲＮＡは、全ての組織において類似のレベルで検出され、腱において最高レベルで検出された。
【００６５】
（ウェスタンブロット）
ウェスタンブロット分析は、滑液由来のＯＰ−１の免疫反応性バンドの分布が、ヒト関節軟骨について記載されたもの（図示せず）と類似であることを実証した。ヒアルロニダーゼおよび／またはコンドロイチナーゼで消化した滑液のウェスタンブロット分析は、これらの酵素が、抗ＯＰ−１抗体によって検出される免疫バンドのパターンを変化させなかった。これらの結果に基づいて、滑液は、ＥＬＩＳＡの前に、酵素消化に供されなかった。
【００６６】
（実施例３：変形性関節炎におけるＯＰ−１タンパク質およびｍＲＮＡレベルの減少）
証明された関節疾患の病歴を有さない、正常な新生児および正常な成人のドナー由来のヒト正常軟骨を、標準的な手順に従って得た。変形性関節症の軟骨（ＯＡ）を、膝の関節形成術を受けた、ＯＡに罹患すると診断された患者から取り出した。各型の３つのサンプルを試験した。ＯＰ−１およびＧＡＤＰＨ  ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲを、実施例１に記載されるように実施した。ＯＰ−１  ｍＲＮＡの、正常な新生児および正常な成人の軟骨におけるレベルは、類似であったが、ＯＡ軟骨におけるＯＰ−１  ｍＲＮＡ発現は、２〜３倍アップレギュレートされた（表２）。
【００６７】
【表２】
2005528581.tif 000003
ＯＰ−１タンパク質を、１ＭのＧｕＨＣｌを用いて、プロテアーゼインヒビターの存在下で組織から抽出し、凍結乾燥し、そして実施例１に記載されるように、非還元条件下でウェスタンブロットによって分析した。免疫反応性ＯＰ−１タンパク質のバンドの密度を、Ｆｌｕｏｒ−Ｓ  ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）に取り付けたＱｕａｎｔｉｆｙ  Ｏｎｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅで定量した。全てのデータを、全タンパク質含有量に対して標準化した。プロＯＰ−１タンパク質および成熟ＯＰ−１タンパク質の全密度は、ＯＡ軟骨における密度より正常軟骨において、統計的に高かった。このことは、ＯＡ組織と比較した場合、正常組織に存在するプロＯＰ−１タンパク質および成熟ＯＰ−１タンパク質の含有量が、より高いことを示す（表３）。これらの結果は、ＯＡ軟骨細胞が、ＯＰ−１  ｍＲＮＡ発現のアップレギュレーションによる組織変成のプロセスを代償するが、これはタンパク質レベルでは明らかではないことを示唆する。
【００６８】
【表３】
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（実施例４：ＩＬ−１βを使用する、インビトロでのＯＰ−１発現の調節）
ＩＬ−１β（インビトロでの軟骨破壊に関連することが公知の異化作用の媒介物質）での処置に対するＯＰ−１遺伝子の応答を試験した。ＩＬ−１βを、炎症の間のヒト関節軟骨における最初の変化の異化作用モデルとして選択した。
【００６９】
正常軟骨を、証明された関節疾患の病歴を有さないヒト器官ドナー由来の膝関節の大腿顆から得た。軟骨スライスを調製し、そしてダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で短時間洗浄し、そして３〜５平方ｍｍの体外移植組織に切断し、そして以下の標準的な培養条件下で培養した：２５μｇ／ｍｌアスコルビン酸、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンおよび１０ｍｌ／Ｌのインスリン−トランスフェリン−セレンＡ（ＩＴＳ、Ｇｉｂｃｏ）を補充した５０％  ＤＭＥＭ、５０％  ハムＦ１２。ＦＢＳ中に存在する増殖因子の、内因性ＯＰ−１発現に対する影響を減少させるために、ＩＴＳを選択した。軟骨体外移植組織を、加湿雰囲気で７％ＣＯ２、３７℃で、１日おきに培地を交換しながらインキュベートした。ＩＬ−１βを、低用量の０．１ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１β〜高用量の１．０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１βで（それぞれ６のドナー）、体外移植組織培養物に添加した。ＩＬ−１βで処理する前に、組織スライスを４日間、標準的な培養条件（定常状態近くのＯＰ−１）に馴化させ、次いで、体外移植組織を、ＩＬ−１βで４８時間または９６時間処理した。１日おきに培地を交換し、そして収集した。培養後、体外移植組織をタンパク質抽出のためにプロセスし、そしてＯＰ−１タンパク質の含有量を、ウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡによって分析した。同じ組織抽出物を利用して、ＰＧレベル（硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の含有量）を、標準的なＤＭＭＢ法によって検出した。培養培地を、ＧＡＧおよびＯＰ−１の放出についてアッセイした。３人のさらなるドナー由来の正常軟骨を、コントロールと同じ条件下で培養し、そして低用量および高用量のＩＬ−１βで処理した。この組織を収集し、そしてＲＮＡ抽出のためにプロセスした。
【００７０】
（低用量のＩＬ−１βに対する応答）
６人の正常ドナー由来の軟骨を使用して、低用量のＩＬ−１βに対するＯＰ−１の応答を試験した。４日間の平衡化期間（培地のみの存在下での培養）の後に、体外移植組織を、０．１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１βで、４８時間または９６時間処理した。図１４を参照すると、低用量のＩＬ−１βの存在下での４８時間の培養は、内因性ＯＰ−１タンパク質の有意な蓄積を導いた（ｐ＜０．０１）；しかし、ＩＬ−１βへのより長い曝露（９６時間）は、内因性ＯＰ−１タンパク質のより少ない増加を誘導した。６つの軟骨抽出物のうちの５つにおいて、低用量のＩＬ−１βとの４８時間の培養は、培養されたコントロールより、内因性ＯＰ−１の濃度が２〜３倍増加した。９６時間後、ＯＰ−１タンパク質レベルは、ＩＬ−１β処置群において、１．５倍高かった（ｐ＜０．０１）。これらの結果は、低用量のＩＬ−１βでの処理に応答した内因性ＯＰ−１のレベルの、全体的な増加を示唆する。
【００７１】
放出されたＯＰ−１の含有量についての、培養培地のＥＬＩＳＡ分析は、検出可能なレベルのＯＰ−１タンパク質を、培地中に示さなかった。このことは、放出されたＯＰ−１の迅速な分解、またはこの培地中のＯＰ−１タンパク質の濃度がアッセイの検出限界未満であることのいずれかを示唆する。
【００７２】
ＩＬ−１βへのより長い曝露（９６時間）は、より短い培養（４８時間）と比較して、ＯＰ−１タンパク質のさらなる誘導を導かないことを見出した後に、ＩＬ−１βの除去後の内因性ＯＰ−１タンパク質レベルの変化を試験した。軟骨サンプルを、まず４８時間、０．１ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１βの存在下で培養し、このＩＬ−１βを除去し、そして軟骨を、培地のみで、さらに４８時間培養した。図１５を参照すると、ＥＬＩＳＡ分析は、ＩＬ−１βの除去後、内因性ＯＰ−１のレベルは、少なくともさらなる４８時間の間上昇したままであるが、回収後の絶対値は、（４８時間と９６時間との両方で）ＩＬ−１βの存在下より低かったことを示した。
【００７３】
ＯＰ−１免疫応答性バンドの出現を、ウェスタンブロットによって分析した。低用量のＩＬ−１βで処理した軟骨抽出物において、以下の３つの主要なバンドが検出された：成熟ＯＰ−１ダイマーに対応するバンド、ＯＰ−１の中間体型体、およびモノマーまたは分解フラグメント。低用量のＩＬ−１βでの、４８時間の処理と９６時間の処理の両方の後に、成熟ＯＰ−１に対応するバンドの強度は、未処理のコントロールにおいてよりも、ＩＬ−１βで処理された抽出物において強かった。ＯＰ−１の中間体形態に対応するＯＰ−１バンドにおいて、差異は検出されなかった。ＩＬ−１βで処理した培地から収集された培地もまた、ウェスタンブロットによって分析し、そしてＯＰ−１は検出されなかった。
【００７４】
ＯＰ−１  ｍＲＮＡのレベルを試験して、ＩＬ−１βによって誘導されたＯＰ−１タンパク質の上昇が、そのｍＲＮＡ発現の変化に関連するか否かを決定した。３つの別のドナー由来の軟骨サンプルを、同じ条件下で培養し、そしてＯＰ−１  ｍＲＮＡレベルを決定した。結果を、ＧＡＤＰＨ  ｍＲＮＡに対するＯＰ−１  ｍＲＮＡの比として報告した。同数のサイクルを使用して、両方の遺伝子産物を作製した。低用量のＩＬ−１βでの処理の４８時間後、ＩＬ−１βで処理した組織サンプルと未処理の（コントロール）組織サンプルとの間で、ＯＰ−１  ｍＲＮＡ発現の有意な差異は存在しなかった。しかし、ＩＬ−１βの存在下９６時間において、ＯＰ−１  ｍＲＮＡは、３０％高かった。
【００７５】
（高用量のＩＬ−１βに対する応答）
軟骨サンプルを、低用量での実験に関して上記したように得、そして代わりに高用量（１．０ｎｇ／ｍｌ）のＩＬ−１βで処理し、そしてＥＬＩＳＡによって分析した。図１６を参照すると、高用量のＩＬ−１βでの処理の４８時間後および９６時間後、６つの軟骨サンプルの各々からの抽出物は、ＯＰ−１タンパク質のレベルの類似の減少を示した。図１７を参照すると、ＩＬ−１βの除去後、かつ培養中の回収の４８時間後に、内因性ＯＰ−１タンパク質のレベルは、培養コントロールにおいて検出されたレベルに達しなかった。
【００７６】
高用量のＩＬ−１βに応答したＯＰ−１  ｍＲＮＡのレベルを、（実施例１に記載されるように）ＲＴ−ＰＣＲによって測定した。培養の４８時間後、ＯＰ−１  ｍＲＮＡ濃度の上昇が見られた（約４０％、ｐ＜０．０５）。
【００７７】
（均等物）
本発明は、本発明の精神または本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で実施され得る。従って、上述の実施形態は、本明細書中に記載される本発明を限定するのではなく、全ての局面において、例示であるとみなされるべきである。
【００７８】
本発明の前述および他の目的、特徴および利点、ならびに本発明自体は、添付の図面をともに参照すると、好ましい実施形態の前述の記載からより十分に理解される。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】図１は、ＯＰ−１サンドイッチＥＬＩＳＡ（０．０１〜１０ｎｇ／ｍｌの範囲の異なる希釈にて、ヒト組換え成熟ＯＰ−１を調製した）により作成された例示的標準曲線である。
【図２】図２は、ＯＰ−１サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて、ＯＰ−１の種々の濃度の測定値に対する、ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ緩衝液の広範なｐＨ範囲の効果を例示する。
【図３】図３は、ＯＰ−１サンドイッチＥＬＩＳＡにより作成した標準曲線に対する、１Ｍ  ＧｕＨＣｌ抽出緩衝液（Ａ）および溶解抽出緩衝液（Ｂ）の効果を例示する。黒四角は、ＴＢＳ緩衝液中で希釈したＯＰ−１を示し；白丸は、ＧｕＨＣｌ緩衝液（Ａ）中または溶解（Ｂ）緩衝液中のいずれかで希釈したＯＰ−１を示す。
【図４】図４Ａは、ＯＰ−１サンドイッチＥＬＩＳＡで分析した、異なる年齢の正常個体に由来する軟骨サンプル中のＯＰ−１タンパク質のレベルを示す。図４Ｂは、ＯＰ−１サンドイッチＥＬＩＳＡで分析した、さらに軟骨もまた正常な組織形態を有していた正常個体由来の軟骨サンプル中のＯＰ−１タンパク質のレベルを例示する。
【図５】図５は、成熟ＯＰ−１二量体（３６ｋＤ）およびＯＰ−１ヘミ二量体（７５ｋＤ）に対応するウェスタンブロットバンドの半定量的画像分析を示す。
【図６】図６は、プロＯＰ−１のヘミ二量体に対応するウェスタンブロットバンドの定量画像分析を示す。
【図７】図７は、ドナーの年齢に対してプロットした、軟骨サンプル由来のＯＰ−１  ｍＲＮＡ／ＧＡＤＰＨ  ｍＲＮＡ比の半定量的ＰＣＲを示す。
【図８】図８は、ＯＰ−１サンドイッチＥＬＩＳＡについての例示的な標準曲線を例示する。
【図９】図９Ａは、０〜４の軟骨コリンズ段階を有する患者および変形性関節症（ＯＡ）患者におけるＯＰ−１タンパク質濃度を例示する。図９Ｂは、０〜４の軟骨コリンズ段階を有する患者および変形性関節症（ＯＡ）患者におけるＯＰ−１  ｍＲＮＡ濃度を例示する。
【図１０】図１０は、正常、ＯＡ、および慢性関節リウマチ（ＲＡ）、ならびに種々の関節性疾患（例えば、痛風、線維筋痛症候群（ｆｉｂｒｏｍｙａｌｇｅａ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（ＦＭＳ）、およびリウマチ性多発性筋痛（ＰＭＲ））を有する他の患者からのヒト滑液中のＯＰ−１タンパク質のレベルを例示する。
【図１１】図１１は、正常、ＯＡ、ＲＡ、ならびに種々の関節性疾患（例えば、痛風、線維筋痛症候群（ＦＭＳ）、およびリウマチ性多発性筋痛（ＰＭＲ））を有する他の患者からの滑液中の総タンパク質の量を例示する。
【図１２】図１２は、正常、ＯＡ、およびＲＡならびに種々の関節性疾患（例えば、痛風、線維筋痛症候群（ＦＭＳ）、およびリウマチ性多発性筋痛（ＰＭＲ））を有する他の患者由来の滑液中の総タンパク質濃度に対して正規化したＯＰ−１タンパク質のレベルを例示する。
【図１３】図１３Ａは、正常軟骨、靱帯、腱、半月板、および滑膜中のＯＰ−１タンパク質のレベルを例示する。図１３Ｂは、正常軟骨、靱帯、腱、半月板、および滑膜中のＯＰ−１  ｍＲＮＡのレベルを例示する。
【図１４】図１４は、低用量のＩＬ−１βに応答した、正常ドナー由来の軟骨培養物中のＯＰ−１タンパク質発現のレベルを例示する。４日間の平衡期間（培地のみを存在させた場合の培養）の後、外植片を０．１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１βで４８時間または９６時間処理した。
【図１５】図１５は、低用量のＩＬ−１βの除去後に内因性ＯＰ−１タンパク質の回復を例示する。軟骨サンプルを、最初に、０．１ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１βの存在下で４８時間培養し、このＩＬ−１βを除去し、軟骨を培地のみの中でさらに４８時間培養した。
【図１６】図１６は、高用量のＩＬ−１βに応答した、正常ドナー由来の軟骨培養物中のＯＰ−１タンパク質発現のレベルを示す。４日間の平衡期間（培地のみを存在させた場合の培養）の後、外植片を１．０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１βで４８時間または９６時間処理した。
【図１７】図１７は、高用量のＩＬ−１βの除去後の軟骨培養物中の内因性ＯＰ−１タンパク質レベルの変化を例示する。軟骨サンプルを、最初に、１．０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１βの存在下で４８時間培養し、このＩＬ−１βを除去し、軟骨を培地のみの中でさらに４８時間培養した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年6月22日(2005.6.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2005528581000001.app
【国際調査報告】
2005528581.tif 000022
2005528581.tif 000023
2005528581.tif 000024
2005528581.tif 000025
2005528581.tif 000026
2005528581.tif 000027