(57)【要約】  ＥＲＲγと相互作用し、且つ、ＥＲＲγ及びＥＲにより媒介される疾患、危険因子、及び症状の治療に有用な化合物を特定する方法が提供される。ＥＲＲγと直接相互作用する化合物を含む医薬組成物、及び、ＥＲＲγ及びＥＲにより媒介される疾患、危険因子、及び症状の治療においてこれらの組成物を使用する方法もまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物がＥＲＲγと相互作用するか否かを評価する工程を含む、ＥＲＲγ及びＥＲにより媒介される疾患、危険因子、及び症状の治療に有用な化合物を特定する方法。
【請求項２】
特定される化合物が骨粗鬆症、癌、月経閉止、又は心臓血管疾患の治療のために有用である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
化合物がＥＲＲγと相互作用するか否かを評価する工程がＥＲＲγ：コアクチベーターＦＲＥＴアッセイ又はＥＲＲγ直接結合アッセイを含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＦＲＥＴアッセイにおけるコアクチベーターがＲＩＰ１４０である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法により特定された化合物を治療上有効量投与することを含む、ＥＲＲγ又はＥＲにより媒介される疾患、危険因子、及び症状の治療方法。
【請求項６】
ＥＲＲγ又はＥＲにより媒介される疾患、危険因子、及び症状が、骨粗鬆症、癌、月経閉止、又は心臓血管疾患である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
化合物がフェノール基を含む請求項５に記載の方法。
【請求項８】
化合物がタモキシフェン、３−ヒドロキシタモキシフェン又は４−ヒドロキシタモキシフェンである請求項５に記載の方法。
【請求項９】
化合物が４−ヒドロキシタモキシフェンである請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法によりＥＲＲγと相互作用すると特定された化合物、及び、１種以上の薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１１】
化合物がタモキシフェン又は４−ヒドロキシタモキシフェンではない請求項１０に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エストロゲン関連受容体γ（ＥＲＲγ）と直接相互作用する、次のものには限られないが骨粗鬆症、癌、月経閉止、心臓血管疾患等の、ＥＲＲγにより媒介される疾患、危険因子、及び症状の治療に有用な化合物及びその化合物を特定する方法に関する。これらの化合物はまた、エストロゲン受容体シグナル伝達系にも影響を与えることができ、次のものには限られないが骨粗鬆症、癌、月経閉止、心臓血管疾患等の、エストロゲン受容体（ＥＲ）により媒介される疾患、危険因子、及び症状の治療に有用である。
【背景技術】
【０００２】
エストロゲン関連受容体γ（ＥＲＲγ：ＮＲ３Ｂ３）はオーファン核内受容体である。ＥＲＲγはクローニングされているエストロゲン関連受容体ファミリーのうち第三のオーファン核内受容体である。ＥＲＲサブファミリーには他に二種類の受容体（ＥＲＲα及びＥＲＲβ）が存在する。ＥＲＲγとＥＲＲβのリガンド結合ドメインにおける配列相同性は７７％である（Johnston et. al. Mol. Endo. 1997 11:342-52）。ＥＲＲγは、イーストツーハイブリッドシステムにおいてグルココルチコイド受容体相互作用タンパク質１（ＧＲＩＰ１）を「餌」として用いることにより見出された。
【０００３】
ＥＲＲγは脳、骨格筋、心臓、腎臓及び網膜等の成人の組織において高度に発現される。ＥＲＲγはまた、胎盤、脳、心臓、骨格筋、腎臓及び肺等の胎児の組織においても発現される（Bonnelye et. al. Mol. Endo.  1997 11:905-16）。
【０００４】
ＥＲＲサブファミリーに属する受容体は、ＤＮＡ結合ドメインにおいてエストロゲン受容体α（ＥＲα）と６８％のアミノ酸相同性があり、リガンド結合ドメインにおいてＥＲαと３６％のアミノ酸相同性がある。このためＥＲＲサブファミリーに属する受容体はエストロゲン応答エレメント（ＥＲＥ）に結合することができる。しかしながら、ＥＲＲ類及びＥＲ類との間の類似性にもかかわらず、これまで、エストラジオール又はステロイド様エストロゲン化合物のＥＲＲγへの結合は検出されていない。更にまた、マウス脳において発現されたＥＲＲγが全体的に分布していることが、ＥＲＲγとＥＲ類とが機能的に相違することを示している（Lorke et al. Molecular Brain Research 2000 77:277-280）。
【０００５】
ＥＲＲ類同士の比較及びＥＲＲ類とＥＲとの比較を行う仕事が分子レベルで数多く行われてきたが（Heard et. al. Mol. Endo. 2000 14:382-92; Bonnelye et. al. Mol. Endo. 1997 11:905-16; Johnston et. al. Mol. Endo. 1997 11:342-52; Vanacker et. al. Mol. Endo.  1999 13:764-73）、ＥＲＲ類（特にＥＲＲγ）のリガンドに関しては生化学的な情報は殆ど得られていない。
【０００６】
酵母を用いたアッセイにおけるＥＲＲαのアンタゴニストとして２種類の有機塩素剤が報告されている（Yang et al. Cancer Research 59 (1999) 4519-4524）。
【０００７】
ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）がＥＲＲβのリガンドとして栄養膜幹細胞の分化を制御することが報告されている（Tremblay et al. Genes & Development 2001 15:333-338）。これらの研究では、ＤＥＳがＥＲＲα、ＥＲＲβ及びＥＲＲγと相互作用してコアクチベーターの結合を抑制するとともに、蛍光共鳴発光転移法（FRET; Zhou et al. Mol. Endocrinol. 1998 12:1594-1604）を用いた核内受容体−コアクチベーター相互作用アッセイにおいてレポーター遺伝子からの転写を抑制する。
【０００８】
ＰＣＴ／ＪＰ９９／０６０９７には、ヒト脳起源ｃＤＮＡライブラリーをクローニングすることにより得られた、ＥＲＲγとされる４５８アミノ酸のタンパク質、及びそれをコードする１３７７ｂｐの遺伝子が開示されている。
【０００９】
本発明は、ＥＲＲγと相互作用する化合物を特定する方法を提供する。本発明の方法により特定された化合物は骨粗鬆症、癌、月経閉止、心臓血管疾患等の疾患及び症状の治療に有用であると考えられる。
【発明の開示】
【００１０】
発明の概要
本発明の目的は、化合物がＥＲＲγと相互作用するか否かを評価する工程を含む、骨粗鬆症、癌、月経閉止、心臓血管疾患の治療に有用な化合物を特定する方法を提供することである。
【００１１】
本発明の別の目的は、骨粗鬆症、癌、月経閉止、心臓血管疾患、及びＥＲＲγ又はＥＲにより媒介されるその他の症状又は障害を、ＥＲＲγと相互作用する化合物を投与することにより治療する方法を提供することである。
【００１２】
本発明の更に別の目的は、ＥＲＲγと相互作用する化合物及び１種以上の薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む、骨粗鬆症、癌、月経閉止、心臓血管疾患、及びＥＲＲγ又はＥＲにより媒介されるその他の症状又は障害を治療するために使用するための組成物を提供することである。
【００１３】
発明の詳細な説明
エストロゲン関連受容体γ（ＥＲＲγ）は、ＥＲＲα及びＥＲＲβと近縁の、転写調節因子の核内受容体ファミリーのメンバーである。ヒトにおいて、ＥＲＲγは、組織分布が異なる３種類の各々特徴があるスプライス変異体として存在する。ＥＲＲγ１は脳、胎盤、心臓、網膜において発現される。ＥＲＲγ２は腎臓及び膵臓において発現される。ＥＲＲγ３は骨格筋のみで発現される（Heard et al. Mol. Endo. 2000 14:382-392）。３種類のＥＲＲγスプライス変異体は何れもそのリガンド結合ドメインが同一であるので、ＥＲＲγのリガンド結合ドメインに選択的に結合する化合物は、別のＥＲＲサブタイプよりもＥＲＲγ活性を選択的に制御することになる。
【００１４】
本発明は骨粗鬆症、癌、月経閉止、及び心臓血管疾患の治療に有用な、ＥＲＲγと相互作用する化合物、及びその化合物を特定する方法に関する。本明細書では、これらの化合物を、ＥＲＲγリガンドと称することもある。本発明の目的において「相互作用する」とは、化合物がこの受容体に結合することを意味する。より好ましくは、化合物が結合して、ＥＲＲγ発現及び／又はＥＲＲγ活性を調節することを意味する。化合物が受容体のリガンド結合ドメインにおいて受容体と直接結合して、それによって受容体が他のリガンドと結合する能力を阻害することが好ましい。「調節」は、ＥＲＲγの発現をアップレギュレート又はダウンレギュレートすること、及び／又は、ＥＲＲγの活性を増大又は低下させることを意味する。ＥＲＲγの発現をアップレギュレートする、及び／又はＥＲＲγの活性を増大させる化合物はＥＲＲγアゴニストと称され、ＥＲＲγの発現をダウンレギュレートする、及び／又はＥＲＲγの活性を低下させる化合物はＥＲＲγアンタゴニストと称される。
【００１５】
本発明はまた、ＥＲＲγにより媒介される疾患、危険因子又は症状の治療において、ＥＲＲγと直接相互作用する化合物を用いる方法に関する。ＥＲＲγにより媒介される疾患、危険因子及び症状の例としては、次のものに限定されないが骨粗鬆症、癌、月経閉止、及び心臓血管疾患が挙げられる。更にまた、当該技術分野における当業者がこの開示を読めば理解するように、ＥＲＲγにより媒介される更なる疾患、危険因子又は症状を、この核内受容体の組織分布及び本発明によりＥＲＲγと相互作用することが特定され得る既知の化合物についての現在ある治療方法に基づいて特定することができる。本発明の化合物はまたエストロゲン受容体（ＥＲ）シグナル伝達系に影響を及ぼし得る。すなわち、本発明はまた、次のものに限定されないが、骨粗鬆症、癌、月経閉止、及び心臓血管疾患等のＥＲにより媒介される疾患、危険因子又は症状を治療する方法に関する。
【００１６】
ＥＲＲγと直接相互作用する化合物（本明細書中では「ＥＲＲγリガンド」と称することがある）を特定するために、ＥＲＲγのための蛍光共鳴発光転移（FRET）アッセイ（Parks et al.  Science 1999 284:1365-1368）が開発された。ＦＲＥＴアッセイは、第１の位置にあるドナーと第２の位置にあるアクセプターとを含むサンプル部分を、ドナー中で最初の電子遷移を誘導することができる第一の波長の光に当てる工程を含む。ここで、ドナーは、ランタニドキレートとこのキレートに結合することができるランタニドとの複合体を含んでおり、ドナーによる発光とアクセプターによる吸収とのスペクトルの重複は、アクセプターの発光における検出可能な増加により測定される、ドナーからアクセプターへのエネルギー移動が起こることを可能にするのに十分なものである。ＦＲＥＴアッセイに使用するための種々のコアクチベーターが記載されている。例としては、次のものに限定されないが、ステロイド受容体複合体（ＳＲＣ１）、ＣＲＥＢ結合タンパク質（ＣＢＰ）、及びレチノイド相互作用タンパク質（ＲＩＰ１４０）が挙げられる。リガンドが受容体のリガンドポケットに結合すると、コアクチベーターは受容体−コアクチベーター複合体を形成する。コアクチベーターに関する最新のモデルは、リガンドがリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）に結合することによって、活性化機能２（ＡＦ−２）が所定の位置に折り畳まれ、リガンドがリガンドポケット内にトラップされるというものである。リガンドがトラップされることにより新たなインターフェース（ＬＸＸＬＬモチーフ）が形成され、コアクチベーターがＡＦ−２と相互作用することが可能になる。このように、ＡＦ−２はリガンドに依存するトランス活性化において重要である。アゴニストが結合すると、それは転写活性である。これに対してアンタゴニストが結合すると受容体−コファクター相互作用が妨害される。
【００１７】
本発明のＥＲＲγＦＲＥＴアッセイではＲＩＰ１４０（３７２−３９２）がコアクチベーターとして作用する。ＲＩＰ１４０を選択したのは、ほ乳類ツーハイブリッド実験及びＢｉａｃｏｒｅ実験の両方においてＥＲＲγとＲＩＰ１４０とがナノモル濃度レベルで相互作用することが示されたからである。しかしながら、当該技術分野における当業者がこの開示を読めば理解するように、ＥＲＲγとの相互作用を同様に示す他のコアクチベーターもまた、アフィニティリガンドを特定するために使用することができる。アッセイでは受容体とコアクチベーターとの比を１：１に設定した。しかしながら、当該技術分野における当業者がこの開示を読めば理解するように、他の比もまた使用し得る。また、ＥＲＲγの配列分析とＥＲα骨格とからホモロジーモデルが構築された。このモデルによれば、ＥＲ類のフェノール結合部位がＥＲＲ類にも保存されていることが示され、これによりフェノールを含む化合物がＥＲＲγに対するリガンドとして作用し得ることが示された。
【００１８】
更にまた、このリガンドセンシングアッセイ（ＬｉＳＡ）を行なうことによって、受容体：コファクター相互作用を解離させる化合物が特定された。具体的には、タモキシフェン及び４−ヒドロキシタモキシフェンがこの解離を起こすことが見出された。これらのデータは、これらの化合物が、おそらくはＥＲＲγリガンド結合部位を通じて、ＥＲＲγ：ＲＩＰ１４０複合体に直接結合することを示している。そこで、化合物が実際に結合部位において結合しているのか、異なる様式でＬｉＳＡを妨害しているのかを評価するために、結合アッセイもまた開発された。
【００１９】
結合アッセイはＬｉＳＡアッセイのパラメーターのセットとは異なるパラメーターのセットを用いて開発された。全ての核内受容体に適用できる共通のアッセイ条件のセットはない。したがって、最適化すべきパラメーターとして、ｐＨ、界面活性剤、担体及びビーズ濃度があった。様々な変数を同時に変化させることにより、ＪＭＰという名のプログラム（SAS Institute, Cary NC）の統計の能力により、数多くの条件を試験することができる。次のものには限定されないがバッファー、界面活性剤、担体等の複数の変数を、特異的なカウントは増大させつつ非特異的なカウントは低下させることを目標として、上記プログラムに同時に入力した。プログラムにより示されたパラメーター（すなわち、ＭＯＰ類、ｐＨ７、Ｔｗｅｅｎ２０、担体なし、及び、０．１２５ｍｇ／ｍｌビーズ）を結合アッセイに用いた。このアッセイでは、結合は、３Ｈタモキシフェンと、未標識４−ヒドロキシタモキシフェン及び／又はタモキシフェンとの間の競合により決定された。
【００２０】
ＦＲＥＴアッセイ及び直接結合アッセイをホモロジーモデルとともに用いることで、タモキシフェン（式１）の類似体がＥＲＲγに対するリガンドであることが見出された。特に、タモキシフェン（式１）、３−ヒドロキシタモキシフェン（式２）、及び４−ヒドロキシタモキシフェン（式３）がＥＲＲγに対するリガンドであり、なかでも最も好ましい類似体は４−ヒドロキシタモキシフェン（式３）であることが見出された。
【化１】
2005509628.tif 000002
式１
【００２１】
【化２】
2005509628.tif 000003
式２
【００２２】
【化３】
2005509628.tif 000004
式３
【００２３】
これらのアッセイにおけるスクリーニングのために好適な他の化合物としては、次のものに限定されないがコンビナトリアルライブラリ、明確な化学物質及び化合物、ペプチド及びペプチド模擬物、オリゴヌクレオチド、並びに、ディスプレイ（例えばファージディスプレイライブラリ）及び抗体産物のような天然物のライブラリが挙げられる。好ましい実施形態では、試験物質は、有機分子、好ましくは５０〜２５００ダルトンの分子量を有する小さな有機分子からなる。候補化合物は、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、それらの誘導体及び構造類似体又はそれらの組み合わせ等の生体分子からなってもよい。これらの化合物は、合成化合物又は天然化合物のライブラリを始めとする様々な起源から得られる。加えて、既知の薬剤を指向性の又はランダムな化学修飾（例えばアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化（amidification）等）に供して、スクリーニングのための構造類似体を製造することもできる。
【００２４】
例えば反応あたり１０種の異なる化合物を最初のスクリーニングに使用することができる。続いて、阻害又は活性化を示す化合物を個別に試験する。化合物は、１ｎＭ〜１０００μＭ、好ましくは１μＭ〜１００μＭ、より好ましくは１μＭ〜１０μＭの濃度で用いることができる。好ましい実施形態では、化合物の活性を、ＥＲＲγの既知のアクチベーター又はインヒビターにより示される活性と比較する。インヒビターとして作用する化合物は、ＥＲＲγ活性を５０％阻害することができる。あるいは、アクチベーターとして作用する化合物は、ＥＲＲγの既知のアクチベーターを用いたときに生じる最大の活性の５０％を生じさせることができる。
【００２５】
ＥＲＲγのインヒビター又はアクチベーターとして特定される化合物は、この核内受容体の活性を調節するのに有用であると考えられる。したがって、これらの化合物は、ＥＲＲγ又はＥＲの活性化又は阻害が望まれる、ＥＲＲγ及びＥＲにより媒介される疾患、危険因子、障害、及び症状の予防及び／又は治療に用いることができる。タモキシフェン並びに３−ヒドロキシタモキシフェン及び４−ヒドロキシタモキシフェンのようなタモキシフェン類似体のようなフェノール含有化合物、並びに、ＥＲＲγ：ＲＩＰ１４０ＦＲＥＴアッセイ及び／又はＥＲＲγ直接結合アッセイにより特定された他の化合物は、次のものには限定されないが骨粗鬆症、癌、月経閉止、及び心臓血管疾患等のＥＲＲγ及びＥＲにより媒介される疾患、危険因子、及び症状の治療のために、好ましくは薬学的に許容される組成物として、化合物の治療上有効量が投与され得る。したがって、本発明はまた、ＥＲＲγリガンドとして特定された化合物を、１種以上の薬学的に許容される担体又は賦形剤とともに含む薬学的に許容される組成物に関する。本発明のこの側面に関しては、医薬組成物にはタモキシフェン又は４−ヒドロキシタモキシフェン以外の化合物が含まれていることが好ましい。担体又は賦形剤は、組成物の他の成分と適合性があるという意味において許容されるものでなければならず、且つ組成物の受容者に対して有害なものであってはならない。
【００２６】
ＥＲＲγリガンドとして特定される本発明の化合物は、ＥＲＲγ又はＥＲにより媒介される疾患を治療するのに好適ないかなる経路で投与されるように製剤化することもできる。好適な医薬製剤としては、次のものに限定されないが、経口投与、直腸投与、経鼻投与、局所投与（口内投与及び舌下投与を含む）、経膣投与又は非経口投与（筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与、及び罹患組織への直接投与を含む）のための製剤、又は、吸入（inhalation）又は吸引（insufflation）により投与するのに適した形態のものが挙げられる。製剤は、適宜、便利な小分けされた用量単位で提供することができ、薬学分野において知られた任意の手法により調製することもできる。何れの方法であっても、活性ＥＲＲγリガンドを、液体担体若しくは微粉砕された固体担体又はその両方と組み合わせる工程を含んでおり、必要であれば、引き続いて製品を所望の製剤の形に成型する工程を含んでいる。
【００２７】
経口投与に適した医薬製剤は便利な小分けされた単位で提供することができる。そのような単位としては、次のものに限定されないが、カプセル剤、カシェ剤又は錠剤が挙げられる。各単位は所定量のＥＲＲγリガンドを、粉末又は顆粒として、溶液として、懸濁液として又は乳化液として含んでいる。ＥＲＲγリガンドはまたボーラス剤、舐剤、又はペースト剤として提供することもできる。経口投与用の錠剤及びカプセル剤は、結合剤、充填剤、滑沢剤、崩壊剤、又は湿潤剤のような通常の賦形剤を含んでいてもよい。錠剤は当該技術分野において周知の方法によりコーティングされていてもよい。当該技術分野において知られている時限放出製剤もまた好適であり得る。経口用液体製剤は、例えば水性又は油性の懸濁剤、溶液剤、エマルション剤、シロップ剤又はエリキシル剤の形態であってよく、あるいは、水又は他の好適なビヒクルにより使用前に再生するための乾燥製品として提供されてもよい。このような液体製剤は懸濁化剤、食用油等の非水性ビヒクル又は保存剤のような、通常の添加物を含んでいてよい。
【００２８】
本発明のＥＲＲγリガンドはまた、注射（例えばボーラス注射又は連続的な点滴）のような非経口投与用に製剤化されていてもよく、アンプル、充填済みシリンジ、少量点滴に入れられた単位用量形態で提供されてもよく、又は添加された保存剤を含む多用量容器で提供されてもよい。ＥＲＲγリガンドを含む非経口投与のための薬学的に許容される組成物は、油性又は水性のビヒクル中の懸濁剤、溶液剤又はエマルション剤の形態であってよく、懸濁化剤、安定化剤、及び／又は分散剤のような製剤化用剤を含んでいてもよい。あるいは、活性成分は、無菌固体の無菌的な単離 (asceptic isolation) により得られる、又は溶液を凍結乾燥させて得られる、無菌のパイロジェンフリー水のような好適なビヒクルにより使用前に再生するための粉末の形態であってよい。
【００２９】
表皮への局所投与用には、本発明のＥＲＲγリガンドは軟膏剤、クリーム剤又はローション剤として、又は皮膚貼付薬として製剤化され得る。例えば軟膏剤及びクリーム剤は、好適な増粘剤及び／又はゲル化剤が添加された水性基剤又は油性基剤を用いて製剤化され得る。ローション剤は水性又は油性の基剤を用いて製剤化されることができ、一般的には、１種以上の乳化剤、安定化剤、懸濁化剤、増粘剤、又は着色剤をも含む。口内に局所投与するのに好適な製剤としては、通常はスクロース及びアラビアガム又はトラガカントガムである着香された基剤中にＥＲＲγリガンドを含むロゼンジ；ゼラチン及びグリセリン又はスクロース及びアラビアガムのような不活性基剤中に活性成分を含むトローチ剤；及び、好適な液体担体中に活性成分を含むうがい薬が挙げられる。目への局所投与のためには、本発明のＥＲＲγリガンドは、好適な無菌の水性又は非水性のビヒクル中の溶液又は懸濁液の形態とすることができる。バッファー剤（例えばメタ重亜硫酸ナトリウム又はエデト酸二ナトリウム(disodium edeate)）のような添加物及びヒプロメロース (hypromellose) のような増粘剤もまた含まれていてよい。
【００３０】
担体が固体である直腸投与に好適な医薬製剤は、好ましくは単位用量の座薬として提供される。好適な担体としてはココアバター及び当該技術分野で通常用いられる他の素材が挙げられる。座薬は好都合には、ＥＲＲγリガンドを軟化又は融解した１種又は複数種の担体とともに混合し、続いて冷却し、モールド中で成型することにより作られる。
【００３１】
経膣投与のために好適な製剤は、ＥＲＲγリガンドに加えて当該技術分野において適切であることが知られている担体を含むペッサリー、タンポン、クリーム剤、ジェル剤、ペースト剤、フォーム剤又はスプレー剤として提供され得る。
【００３２】
鼻内投与のためには、本発明のＥＲＲγリガンドは液体スプレー又は分散可能な粉末として、又はドロップの形態で使用することができる。ドロップは、１種以上の分散剤、可溶化剤又は懸濁化剤をも含む水性又は非水性の基剤を用いて製剤化され得る。液体スプレーは好都合には加圧容器から送達される。
【００３３】
吸入（inhalation）による投与のためには、本発明のＥＲＲγリガンドは吸入器、ネビュライザー若しくは加圧容器、又はエアロゾルスプレーを送達するための他の好都合な手段により送達されてよい。加圧容器は、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の好適なガスのような好適な噴射剤を含んでいてよい。加圧エアロゾルの場合には、所定量を送達するバルブを提供することにより、用量単位を決定することができる。
【００３４】
或いは、吸入（inhalation）又は吸引（insufflation）による投与のためには、本発明のＥＲＲγリガンドは、例えばＥＲＲγリガンドとラクトース又はデンプンのような好適な粉末基剤との混合粉末である、乾燥粉末組成物の形態をとることができる。粉末組成物は例えばカプセル、カートリッジ、又はゼラチンのブリスターパックなどの、単位用量形態で提供されることができ、その形態から吸入器（inhalator）又は吸引器（insufflator）の補助により粉末が投与される。
【００３５】
所望であれば、上記の製剤の何れであっても、ＥＲＲγリガンドを徐放できるようにすることができる。
【００３６】
ＥＲＲγリガンドを含む本発明の医薬組成物は、他の治療用薬剤と組み合わせて使用されることもできる。
【００３７】
治療に用いるのに必要な本発明のＥＲＲγリガンドの量は、当然ながら、選択された特定のＥＲＲγリガンドによって変動するだけでなく、投与経路、治療される症状の性質、及び患者の年齢及び症状に応じて変動する。本明細書において「治療上有効量又は治療上有効濃度」と称される、かかる量の選択は、究極的には担当医師の決定による。しかしながら一般的にはＥＲＲγリガンドを治療上有効量提供する本発明の医薬組成物の好適な用量は、１日当たり約０．１〜３００ｍｇ／ｋｇ体重、特に約１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重である。経口投与のための適切な用量単位は一般的には約１〜約２５０ｍｇ、より好ましくは２５〜２５０ｍｇのＥＲＲγリガンドを含む。
【００３８】
次のものに限定されないが、骨粗鬆症、癌、月経閉止、及び心臓血管疾患等のＥＲＲγ及びＥＲにより媒介される疾患、危険因子及び症状の治療に使用するためには、ＥＲＲγリガンドを含む医薬組成物は上述の何れかの経路により、好ましくは経口経路又は注射により投与され得る。７０ｋｇのほ乳類における１日の用量は典型的には、本発明のＥＲＲγリガンド約５ｍｇ〜５グラムの範囲内である。
【００３９】
本発明を更に説明するために、以下の限定的ではない実施例を提供する。
【実施例】
【００４０】
実施例１：タンパク質の発現
ヒトエストロゲン関連受容体γリガンド結合ドメイン（ＥＲＲγＬＢＤ）をアミノ末端ポリヒスチジンタグ付加融合タンパク質としてＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１株（ＤＥ３）中で発現させた。改変ポリヒスチジンタグ（MKKGHHHHHHG）（配列番号１）をコードする配列をＥＲＲγの残基２２９〜４５８をコードする配列中にフレームを合わせて融合させ、ｐＲＳＥＴａ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にサブクローニングした。ＥＲＲγＬＢＤのコーディング配列はＧｅｎＢａｎｋ（ＡＦ０９４５１８）から得た。こうして得られた、改変ポリヒスチジンタグ及びリガンド結合ドメインを含む完全なコード配列（配列番号２）は以下の通りである：
MKKGHHHHHH GPAKKPYNKI VSHLLVAEPE KIYAMPDPTV PDSDIKALTT
LCDLADRELV VIIGWAKHIP GFSTLSLADQ MSLLQSAWME ILILGVVYRS
LSFEDELVYA DDYIMDEDQS KLAGLLDLNN AILQLVKKYK SMKLEKEEFV
TLKAIALANS DSMHIEDVEA VQKLQDVLHE ALQDYEAGQH MEDPRRAGKM
LMTLPLLRQT STKAVQHFYN IKLEGKVPMH KLFLEMLEAK V
細胞を、１２個の１リットルフラスコ中で、２５℃にて、０．１ｍｇ／ｍＬカルベニシリン含有ＬＢ培地中で約２０時間増殖させた。細胞を遠心分離により回収し、濃縮細胞スラリーをＴＢＳ、ｐＨ８．０、中で−８０℃にて保存した。
【００４１】
実施例２：タンパク質の精製
約７０グラムの湿細胞ペーストを６００ｍＬのＴＢＳ、ｐＨ８．０（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）に再度懸濁させた。細胞を、ＡＰＶ  Ｒａｎｎｉｅ  ＭＩＮＩ−ｌａｂホモジェナイザーに３回通すことにより溶解させ、遠心分離（４５分間、２０，０００ｇ、４℃）により細胞残屑を除去した。清澄になった上清を粗いプレフィルターを通してろ過し、ＴＢＳ、ｐＨ８．０（５００ｍＭイミダゾール含有）を、イミダゾールの最終濃度が５０ｍＭとなるように添加した。この溶解物を、ＴＢＳ、ｐＨ８．０／５０ｍＭイミダゾールで予め平衡化させたＳｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｎｉ＋＋チャージ済み）キレート樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を充填したカラム（ＸＫ−２６，１０ｃｍ）に装填した。平衡化用バッファーを用いて基線の吸収になるまで洗浄した後に、カラムを凡そカラム１本分の容量のＴＢＳ、ｐＨ８．０（９５ｍＭ  イミダゾール含有）で洗浄した。ＥＲＲγＬＢＤ（２２９〜４５８）を、ＴＢＳ（ｐＨ８．０）中の５０〜５００ｍＭイミダゾールの直線的濃度勾配を用いて溶出させた。カラムのピーク画分を集め、直ちに２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０（５％  １，２−プロパンジオール、５ｍＭ  ＤＴＴ及び０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ含有）により５倍希釈した。続いて希釈後のタンパク質試料を、Ｐｏｒｏｓ  ＨＱ樹脂を充填したカラム（ＸＫ−１６，１０ｃｍ）に装填した。希釈用バッファーを用いて基線の吸収になるまで洗浄した後、タンパク質を、０〜５００ｍＭ  ＮａＣｌの濃度勾配を用いて溶出させた。ピーク画分を集め、Ｃｅｎｔｒｉ−ｐｒｅｐ１０Ｋ（Ａｍｉｃｏｎ）フィルター装置を用いて濃縮し、ＴＢＳ、ｐＨ８．０（５％  １，２−プロパンジオール、５ｍＭ  ＤＴＴ及び０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ含有）で予め平衡化させたＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を充填したカラム（ＸＫ−２６、９０ｃｍ）を用いるサイズ排除クロマトグラフィーに供した。
【００４２】
実施例３：タンパク質のビオチン化
精製されたＥＲＲγＬＢＤを、ＰＤ−１０ゲルろ過カラムを用いてＰＢＳ（１００ｍＭリン酸Ｎａ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）にバッファー交換した。ＥＲＲγＬＢＤをＰＢＳ中凡そ５０μＭに希釈し、最少量のＰＢＳ中の、５倍モル過剰量のＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ）を添加した。この溶液を室温で２時間穏やかに混合した。ビオチン化修飾反応を、２０００倍モル過剰量のＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を添加することにより停止させた。修飾されたＥＲＲγＬＢＤを、３回のバッファー交換（各回それぞれ少なくとも５０倍容量；ＴＢＳ、ｐＨ８．０、（５ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、及び２％スクロース含有））を行って透析した。この修飾されたタンパク質を分配してアリコートとし、ドライアイスにより凍結させ、−８０℃で貯蔵した。ビオチン化ＥＲＲγＬＢＤを質量スペクトル分析に供して、ビオチン化試薬による修飾の程度を明らかにした。一般的に、凡そ９５％のタンパク質がビオチン化された部位を少なくとも１箇所有しており、且つ、全体的なビオチン化の程度は、１〜５個の範囲において、ビオチン化された部位の数の正規分布に従った。
【００４３】
実施例４：ＬｉＳＡ
タンパク質−タンパク質相互作用をＦＲＥＴの検出によりアッセイした。ユーロピウム標識ストレプトアビジン（Ｗａｌｌａｃ  ＣＲ２８−１００）−ＥＲＲγ：ＡＰＣ標識ストレプトアビジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  ＃Ｓ−８６８）−ＲＩＰ１４０複合体の比が１：１となるようにタンパク質を準備した。ＲＩＰ１４０ペプチド（ＬＣＤ２、３７３−３９２）B-LERNNIKQAANNSLLLHLLKSQTIP-CONH2（配列番号３）はＳｙｎＰｅｐにより調製されたものである。この配列において、Ｂはビオチンを表し、CONH2はアミド化されたＣ−末端を指し、他の文字は、標準的な一文字アミノ酸コードを意味する。この系のためのバッファーは、１Ｌの脱イオン水中の５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡで調製した。続いてこのバッファーを、０，２２μｍセルロースアセテートフィルターを用いるＣｏｒｎｉｎｇ（４３１２０５）フィルターシステムによりろ過した。ろ過後、０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ（脂肪酸不含）及び２ｍＭ  Ｃｈａｐｓを添加した。アッセイにおいてバッファーを使用する前に、１０ｍＭ  ＤＴＴを適当量のバッファー中に添加した。タンパク質を３０分間インキュベートした後、過剰量のビオチンを添加して空（から）のストレプトアビジン（ＳＡ）部位を満足させた。タンパク質混合物を、調製されたプレートに添加した。続いて、Ｗａｌｌａｃ，Ｖｉｃｔｏｒを用いてカウントを行ない、カウント値を分析した。
【００４４】
実施例５：結合アッセイ
結合アッセイを［３Ｈ］−タモキシフェン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて行った。実施例４に用いたのと同一のＥＲＲγタンパク質を用いて結合アッセイを開発した。この系のためのバッファーは、１Ｌの脱イオン水中の５０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、及び１ｍＭ  ＥＤＴＡで調製した。続いてこのバッファーを、０，２２μｍセルロースアセテートフィルターを用いるＣｏｒｎｉｎｇ（４３１２０５）フィルターシステムによりろ過した。ろ過後、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０を添加した。アッセイにおいてバッファーを使用する前に、１０ｍＭ  ＤＴＴを適当量のバッファー中に添加した。凡そ０，１２５ｍｇ／ｍｌのＳＡ−ＳＰＡビーズ（Ｗａｌｌａｃ）を２０ｎＭビオチン化ＥＲＲγでコーティングした。これらのビーズを、１００ｎＭの３Ｈ−タモキシフェン及び１０μＭの関心のある化合物を含むプレートに添加した。続いてこれらのプレートをＷａｌｌａｃ Ｔｒｉｌｕｘシンチレーションカウンターを用いて読み取った。
【配列表】
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【国際調査報告】
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