(57)【要約】本発明は、一つまたはそれ以上の第二の薬物標的を同定する組成物および方法、ならびに、特に癌または細胞複製障害の治療のための薬物または薬物候補の同定におけるその利用に関する。酵母に基づく合成致死スクリーニングを用いて、細胞周期経路に欠損を有する細胞を殺すために、新しい遺伝子標的を機能的に同定および確認する。これらの新しく同定された遺伝子標的を用いて、癌、良性細胞増殖、および酵母感染症を治療するための新しい治療物質を開発することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、変異MEC1遺伝子またはその類似体もしくは相同体を有する細胞の増殖または複製を阻害する薬物を同定する方法：
（a）変異MEC1遺伝子またはその類似体もしくは相同体を有する細胞を薬物に接触させる段階；
（b）それが変異して、変異MEC1遺伝子またはその類似体もしくは相同体と組み合わせて存在すると合成的に致死となる野生型の第二の遺伝子の活性を薬物が調節するか否かを決定する段階。
【請求項２】
細胞が腫瘍細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
段階（b）の結果を薬物なしで増殖した対照細胞と比較するさらなる段階を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
対照細胞が正常細胞である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
対照細胞が腫瘍細胞である、請求項３記載の方法。
【請求項６】
対照細胞が変異MEC1遺伝子またはその類似体もしくは相同体を有する、請求項３記載の方法。
【請求項７】
第二の遺伝子が、CDC8、RAD27、MBP1、SLM1/YOR080w、RNR1、RNR2、RNR4、CDC21、PRI1、POL1、141/154、87、および240、ならびにその類似体および相同体からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項８】
以下を含む、候補薬物を同定するためのスクリーニングアッセイ系：
（a）その変異型において、MEC1、その類似体または相同体の欠失と組み合わせると合成的に致死となる、MEC1遺伝子、その類似体もしくは相同体および野生型の第二の遺伝子に欠失を有する酵母細胞；
（b）酵母細胞と接触する候補薬物を含む試験酵母細胞系；および
（c）薬物の非存在下で酵母細胞を含む対照系と比較した試験系において、試験細胞系の生存率が減少することで薬物候補が陽性であると同定する、酵母細胞の生存率を比較するための検出器。
【請求項９】
以下の段階を含む、組織試料において良性または悪性細胞増殖の有無をスクリーニングする方法：
a）癌を有することが疑われる個体から組織試料を提供する段階；
b）組織試料の細胞におけるMEC1遺伝子または遺伝子産物、その類似体または相同体の発現を評価する段階；および
c）対照試料における発現と比較して、試験試料においてMEC1遺伝子または遺伝子産物、その類似体または相同体の異常な発現が存在することで癌が存在することを示す、組織試料におけるMEC1遺伝子または遺伝子産物、その類似体または相同体の発現を、対照試料におけるMEC1遺伝子または遺伝子産物、その類似体もしくは相同体の発現と比較する段階。
【請求項１０】
以下の段階を含む、腫瘍細胞の治療において有用な化合物を同定する方法：
（a）その変異型において、変異MEC1遺伝子、またはその相同体もしくは類似体と組み合わせて合成的に致死となる第二の遺伝子産物を試験化合物に接触させる段階；および
（b）第二の遺伝子産物の活性を決定する段階。
【請求項１１】
試験化合物の存在下での第二の遺伝子産物の活性を、第二の遺伝子産物の非存在下での遺伝子産物の活性と比較するさらなる段階を含む、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
第二の遺伝子が、CDC8、RAD27、MBP1、SLM1/YOR080w、RNR1、RNR2、RNR4、CDC21、PRI1、POL1、141/154、87、および240の類似体および相同体、ならびにその組み合わせからなる群より選択される、請求項10記載の方法。
【請求項１３】
第一のMEC1遺伝子または遺伝子産物を含む標的細胞において、少なくとも一つの第二の遺伝子または遺伝子産物と選択的に相互作用することができる薬物であって、標的細胞を薬物に暴露し、細胞分裂を停止させるか、または該標的細胞を選択的に殺す、該薬物の有効量と、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む薬学的組成物。
【請求項１４】
薬物が、オリゴヌクレオチド、遺伝子産物、オリゴヌクレオチドもしくは遺伝子産物の相同体もしくは類似体、低分子、またはペプチド模倣体を含む、請求項13記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
請求項12記載の薬学的組成物を提供する段階、および薬学的組成物の有効量によってヒトもしくは動物を治療する段階を含む、MEC1遺伝子、その類似体もしくは相同体における変異に関連した疾患を有する、または有することが疑われるヒトもしくは動物を治療する方法。
【請求項１６】
疾患が、アプドーマ（apudoma）、分離腫、鰓腫、悪性カルチノイド症候群、カルチノイド心疾患、癌（例えば、ウォーカー癌、基底細胞癌、基底有棘細胞癌、ブラウン-ピアース（Brown-Pearce）癌、腺管癌、エールリッヒ腫瘍、クレブス2腫瘍、メルケル細胞腫、粘液性癌腫、非小細胞肺癌、燕麦細胞癌、乳頭状癌、硬性癌、細気管支癌、気管支原性癌、扁平上皮細胞癌、および移行上皮癌）、組織球障害、白血病（例えば、B細胞白血病、混合細胞白血病、ヌル細胞白血病、T細胞白血病、慢性T細胞白血病、HTLV-II関連白血病、急性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、肥満細胞性白血病、および骨髄性白血病）、悪性組織球増殖症、ホジキン病、免疫増殖性小（immunoproliferative small）、非ホジキンリンパ腫、形質細胞腫、細網内皮増殖症、黒色腫、軟骨芽細胞腫、軟骨腫、軟骨肉腫、線維腫、線維肉腫、巨細胞腫、組織球腫、脂肪腫、脂肪肉腫、中皮腫、粘液腫、粘液肉腫、骨腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、滑膜腫、腺線維腫、腺リンパ腫、癌肉腫、脊索腫、頭蓋咽頭腫、未分化胚細胞腫、過誤腫、間葉腫、中腎腫、筋肉腫、エナメル上皮腫、セメント質腫、歯牙腫、奇形種、胸腺腫、栄養膜腫（trophoblastic tumor）、腺癌、腺腫、胆管腫、コレステリン腫、円柱腫、嚢胞腺癌、嚢胞腺腫、顆粒膜細胞腫、男性胚細胞腫、肝腫、汗腺腫、島細胞腫（islet cell tumor）、ライディヒ細胞腫（Leydig cell tumor）、乳頭腫、セルトリ細胞腫、卵胞膜細胞腫、平滑筋腫、平滑筋肉腫、筋原細胞腫、筋腫、筋肉腫、横紋筋腫、横紋筋肉腫、脳室上衣細胞腫、神経節細胞腫、神経膠腫、髄芽細胞腫、髄膜腫、神経鞘腫（neurilemmoma）、神経芽腫、神経上皮腫、神経線維腫、神経腫、傍神経節腫、非クロム親和性傍神経節腫（paraganglioma nonchromaffin）、被角血管腫、好酸球増多随伴性血管類リンパ組織増殖症、硬化性血管腫（angioma sclerosing）、血管腫症、グロムス腫瘍、血管内皮腫、血管腫、血管外皮細胞腫、血管肉腫、リンパ管腫、リンパ管筋腫（lymphangiomyoma）、リンパ管肉腫、松果体腫、癌肉腫、軟骨肉腫、葉状嚢肉腫、線維肉腫、血管肉腫、平滑筋肉腫、白血肉腫症、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、筋肉腫、粘液肉腫、卵巣癌、横紋筋肉腫、肉腫、神経線維腫症、頚部異形成、線維症、良性前立腺過形成、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、糸球体硬化症、ケロイド、乾癬、黒子、角化症、線維性軟疣（achrochordon）、伝染性軟属腫、性病いぼ、皮脂腺過形成（sebaceous hyperplasia）、尖圭コンジローム、血管腫、静脈湖、軟骨皮膚炎（chondrodermatitis）、化膿性肉芽腫、化膿性汗腺炎、ケロイド、角化棘細胞腫、白斑症、多発性脂腺嚢腫、睫毛乱生症、表層上皮母斑（superficial epithelial nevus）、ポリープ、接合部母斑（junctional nevus）、化膿性肉芽腫、結節性痒疹、皮膚線維腫、脂腺腫、乳頭腫、およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
疾患が酵母感染を含む、請求項15記載の方法。
【請求項１８】
第二の遺伝子の上方制御、下方制御、消失、または破壊によって、合成致死を生じるように、第一の遺伝子が変異している、少なくとも一つの第二の遺伝子と、MEC1またはその類似体もしくは相同体である少なくとも一つの第一の遺伝子とを含む組換え真核細胞。
【請求項１９】
変異した第一の遺伝子MEC1が欠損MEC1である、請求項18記載の組換え真核細胞。
【請求項２０】
第二の遺伝子が、CDC8、RAD27、MBP1、SLM1/YOR080w、RNR1、RNR2、RNR4、CDC21、PRI1、POL1、141/154、87、および240ならびにその類似体および相同体からなる群より選択される、請求項18記載の組換え真核細胞。
【請求項２１】
第一の遺伝子が消失または破壊される、請求項18記載の組換え真核細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
1.発明の分野
本発明は、細胞の生命周期（cell life cycle）において重要である組成物および真核細胞遺伝子を同定する方法に関する。より具体的には、本発明は酵母遺伝子ならびに、細胞増殖および細胞死において必須であるヒト遺伝子のような哺乳類相対物（counterparts）とに関する。悪性疾患および関連する他の疾患のような疾患および臨床状態が起こる、細胞周期関連遺伝子機能障害を同定および治療するための方法および組成物が提供される。
【０００２】
2.発明の背景
酵母ゲノムの遺伝子操作は、真核細胞の複製、増殖および死にとって必要な必須の遺伝子を同定するための便利なモデルを提供する。サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces serevisiae）株S288Cの完全なDNA配列は、1996年4月に100カ所以上の研究所による国際協力によって決定された。一般情報および遺伝子約6000個の酵母ゲノムを含むデータベースは公開されており、例えば：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Yeast；http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces/のような公開ウェブサイト上で見出されることができる。その他のデータベースも同様に存在し、これらのデータベースおよび他のウェブサイトへのリンクは、本発明の目的に関して等しく適している。例として、参照として本明細書に組み入れられる、Yeast GenBank（サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces serevisiae）に由来する全てのゲンバンク配列の集まり）；Yeast Swiss-Prot（サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces serevisiae）に由来するスイスプロットタンパク質配列の集まり）；YPD（Proteome, Inc. が管理する酵母タンパク質データベース）、およびその定期的な更新版が含まれるが、これらに限定されない。酵母を操作する方法は十分に確立されており、当業者に公知であって、適当なキーワード、例えば中でも酵母およびプロトコールというキーワードを用いることによって、公開されているウェブサイト上で見出されることができる。
【０００３】
全ての酵母遺伝子の大部分の配列は公知であって、そのそれぞれの染色体上に位置づけられているが、これらの遺伝子の多く、特に他の種に相対物が存在しない遺伝子、または公知の遺伝子との十分な配列相同性を示さない遺伝子の生物学的機能を予測することはなお困難である。言い換えれば、遺伝子の配列を決定する段階は、遺伝子に意味のある機能を帰する段階より容易である。酵母の遺伝子6000個のうちごく半数の機能が公知であるに過ぎない。さらに、公知の機能を有する遺伝子でさえも、そのような遺伝子の機能または調節が、別の遺伝子の調節機構または産物と組み合わされるとどのように改変されるかは明確でない。このように、他の遺伝子と組み合わせた場合の、ある遺伝子の公知または未知の機能を同定する問題に関しては、当技術は依然として非常に予測不可能である。
【０００４】
これまでこの作業は一件一件成し遂げられ、それによって研究者は公知の遺伝子操作技術およびスクリーニング方法を用いて、そのような方法または技術をそれぞれの関心対象の特異的遺伝子またはそれぞれの特定の遺伝子の組み合わせに応用した。操作の簡易さおよび、比較的短期間で多数の候補をスクリーニングすることが可能であることから、酵母はしばしばモデルとして選択される。酵母は調べられた生物の中で最も高い組換え率および遺伝子変換率を有し、哺乳類より数桁高い。ゲノム以降の時期では、酵母における連続的な遺伝子ノックアウト計画（四分子（tetrad）分析によって示すことができる、例えば、http://bioinformatics.weizmann.ac.il/pub/software/mac/mactetrad69.readme）によって、調べた条件では遺伝子産物6個中約1個がその細胞の生命にとって必須である（それらの遺伝子産物の欠失が致死的である）ことが確認されている。調べた遺伝子産物の道理にかなった一部（a reasonable fraction）が酵素であるが、他の遺伝子は未知の機能を有するか、またはその機能が演繹的仮定に適合しないかのいずれかである。
【０００５】
酵母の遺伝子およびそのそれぞれの機能をスクリーニングおよび同定する手段に洞察を提供する米国特許がいくつか存在する。例えば、参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5,916,752号および第5,698,686号は、テロメラーゼ組成物およびスクリーニング方法を開示する；米国特許第5,821,076号および第5,756,305号は、必須の生存遺伝子を開示する；ならびに米国特許第5,585,245号および第5,503,977号は、ユビキチンスプリットタンパク質センサーに関連する。一般的に用いられるアプローチは公知の遺伝子ノックアウトおよび相補性によるスクリーニングである。「相補性」という用語は本明細書において、本遺伝子要素が、細胞に導入された際に細胞を変異の影響から救出するように（例えば、米国特許第5,527,896号を参照）変異遺伝子要素と相同である（少なくとも40％は相同である）ことを意味すると意図される遺伝学用語である。。例えば、MEC-1 DNAは相補性過程を通じてmec-1、cdc9-8細胞におけるmec-1欠損を救出し、またはRAD9は相補性過程を通じてrad9、cdc9-8細胞におけるrad9欠損を救出し、かつそのような能力を持つMEC-1（またはRAD9）DNAは「相補的cDNA」と呼ばれる。同様に、ヒトのCDC34は酵母のCDC34と相同であり、単一の（または二重変異体）細胞、例えば酵母株cdc34の単一変異細胞における変異を相補することができる。さらなる詳細および例に関しては、参照として本明細書に組み入れられる、ハートウェル（Hartwell）らの米国特許第5,866,338号を参照されたい。酵母およびヒト遺伝子を交互参照する手段は現在達成可能であり、例えば参照として本明細書に組み入れられる、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/XREFdb/上で見出される「XREF2」プログラムを用いて行うことができる。これらの方法によって、例えば、DNAポリメラーゼαのような、酵母サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces serevisiae）由来のDNA複製付属因子（accessory factors）およびそのヒト相対物遺伝子が同定された。
【０００６】
抗癌剤の標的を同定する状況において、第一の欠損は、腫瘍においてしばしば調節が解除される（例えば、サイクリンの過剰発現）、酵母からヒトまで保存された遺伝子における変異であろう。第一の欠損を有する細胞を特異的に殺す変異を有する遺伝子産物は、腫瘍における不活性化により大きな治療上の利点を生じる可能性がある、推定の「第二の薬剤標的」（すなわち、第一の欠損の次の）を構成する。原則的に、単一の必須な生物学的経路に対して付加的な負の影響を及ぼす2つの変異が存在する場合、または変異が2つの異なるが機能的に重複する経路を不活性化する場合に、合成致死が起こりうる。
【０００７】
遺伝子的な方法を用いてDNA損傷を検出し、修復、複製、および細胞周期進行を調整するシグナル伝達系であるDNA損傷チェックポイントを同定する。
この経路におけるこれらの遺伝子の一つは、MEC1（MECは分裂開始チェックポイントを表す）である。ESR1としても知られるMEC1は、以下を必要とする：分裂増殖、DNA修復と分裂組換え、Rad53pの調節リン酸化、dmc1停止組換えおよび減数分裂組換え。MEC1遺伝子産物は、有糸分裂のG1期、S/M期、S期内、および分裂におけるG2/M期におけるDNA損傷がチェックポイント反応を誘導するために必要なホスファチジルイノシトール（PI）3-キナーゼと類似である。MEC1ヌル変異体は生存不能であるが、Rad53pが過剰産生されると、何らかのesr1対立遺伝子が救出される。MEC1は、ヒトATR遺伝子の相同体である（クリビー（Cliby）ら、EMBO J. 17：159〜169、1998）。ATRは、毛細血管拡張性運動失調患者では変異しているATMと相同なホスファチジルイノシトールキナーゼ関連（PIK関連）タンパク質である。
【０００８】
3.発明の概要
本発明は、少なくとも一つの第二の遺伝子と少なくとも一つの第一の遺伝子MEC1、その類似体または相同体とを含む組換え真核細胞を提供する。この組換え真核細胞では、少なくとも一つの第二の遺伝子が変異しており、少なくとも一つの第一の遺伝子が消失または破壊することで合成致死性が生じる。消失は、停止コドンを形成する変異によって切断する型を含む、いくつかの型のいずれの型をもとりうる。破壊は、遺伝子発現産物における機能または活性を喪失する型を含む、いくつかの型のいずれの型をもとりうる。
【０００９】
本発明の組換え真核細胞は、cdc8-1、rad27、mbp1-11t、slm1d/YOR080w、rnr1-77、rnr2-72、rnr4-106、cdc21-1、pril-62、pol1-101、141/154、87、240、およびその他から選択される第二の遺伝子を有しうる。
【００１０】
本発明の組換え真核細胞は、機能喪失を生じるように影響を受けるまたは変化する第一の遺伝子を有しうる。
【００１１】
本発明の組換え細胞は、他の細胞間でも、酵母細胞または酵母変異体およびヒト細胞またはヒト新生物細胞となりうる。本発明の一つの態様は、MEC1のキナーゼドメインに影響を及ぼすmec1遺伝子における点突然変異が原因である合成致死変異体である。本発明のもう一つの態様は、ラギング鎖DNA合成における欠損と組み合わせてmec1変異が原因で起こる合成致死である。本発明までは、先行技術においてMEC1がデオキシヌクレオチド合成経路において遺伝子の第二の遺伝子変異体と組み合わせて発現されていない場合、またはラギング鎖DNA合成に欠陥を有する場合に、酵母における合成致死性を示唆または教示する報告はない。
【００１２】
大量スクリーニングおよび遺伝子分析では、腫瘍細胞のような標的細胞を特異的に殺すことができる化合物または薬物標的を同定する。この状況で、見出された致死変異体の活性を刺激する化合物の例が提供される。従って、真核生物の必須遺伝子の同定から開発される治療物質が予想される。そのような同定された遺伝子またはその産物は、既存の薬物の機構とは異なるかまたは類似の機構に基づく治療に関して新規標的として役立つ。そのような化合物は、例えば、本来の変異体株において見出されたものと類似の表現型または形態を生じることによって、本明細書に開示の方法によって同定された遺伝子産物の機能を阻害する。
【００１３】
本発明の一つの局面に従って、変異体のコレクションを系統的にスクリーニングし、薬物の標的となる遺伝子および／または遺伝子産物を同定する。例えば、薬物は拮抗剤として作用してもよく、同定された遺伝子または遺伝子産物標的に対して可逆的に、好ましくは非可逆的に結合し、それによってその機能を障害する。遺伝子産物標的の機能（または合成または完全なプロセシング）の喪失によって、細胞増殖の阻害が起こり、好ましくは細胞の死に至る。この局面には、本明細書に開示の方法によって同定された変異体配列の野生型配列に対応する遺伝子産物を試験物質に暴露する段階；および遺伝子産物の機能を（好ましくは選択的に）障害する物質を選択する段階を含む、抗癌物質を同定する方法が含まれる。
【００１４】
本発明は、変異MEC1遺伝子またはその類似体もしくは相同体を有する細胞を薬物に接触させる段階；およびそれが変異して、変異MEC1遺伝子またはその類似体もしくは相同体と組み合わせて存在すると、合成致死となる野生型の第二の遺伝子の活性を薬物が調節するか否かを決定する段階によって、変異MEC1遺伝子またはその類似体もしくは相同体を有する細胞の増殖または複製を阻害する薬物を同定する方法を提供する。
【００１５】
本発明の特定の態様において、第一の遺伝子欠損は、好ましくは腫瘍細胞または細胞周期の調節が解除された細胞に見出される欠損、または関連する欠損である。または、本発明の方法によって提供される細胞において、第一の遺伝子欠損は、哺乳類またはヒトの腫瘍細胞または染色体異常細胞に見出される欠損、または関連する欠損と類似または相同である。「相同の」とは、特定の配列またはドメインがファミリーのメンバー間で強く保存されている遺伝子の「ファミリー」における直接関係を意味する。例えば、酵母のMEC1遺伝子はAT関連キナーゼをコードする哺乳類遺伝子と相同である（クリビー（Cliby）ら、同書、1998）。一方、「類似の」遺伝子は、同類または「類似の」機能を示す可能性があるが、それらは直接関係しない（すなわち、配列は類似の遺伝子間では保存されない）。この状況において、そのような「類似の」遺伝子は、「機能的相同」であると呼ばれ、その遺伝子産物は、哺乳類細胞における機能と類似の機能を酵母細胞において有する遺伝子産物のように、もう一つの系と類似の様式で機能する遺伝子産物を意味する。例えば、MEC1は、イノシトールキナーゼ関連キナーゼをコードする。MEC1の類似体には、キナーゼファミリーおよび特にホスファチジルイノシトールキナーゼが含まれる。
【００１６】
本発明の方法において、第一の遺伝子欠損によって、機能、例えば細胞機能が変化、喪失、または阻害されうる。しかしながら、また第一の遺伝子欠損によって、機能が増強または獲得されうる。
【００１７】
一般的に、影響を受ける機能は広く変化しうる。影響を受ける機能には、腫瘍増殖の抑制、DNA損傷チェックポイント、DNAミスマッチ修復、ヌクレオチド切除修復、O6-メチルグアニン逆転、二本鎖切断修復、DNAヘリカーゼ機能、シグナル伝達、細胞周期制御、またはアポトーシスが含まれるがこれらに限定されない。そのような欠損は、ショウジョウバエ（Drosophila）のような他の生物における第一の遺伝子欠損によって、有効にモデル化されてもよい。
【００１８】
本発明の方法によって、特定の第二の部位変異が影響を受ける可能性があること、そしてこれが第一の遺伝子欠損を有する細胞にとっては致死的となる可能性があることが判明した。そのような第二の部位変異は、例えばcdc8-1チミジンキナーゼ活性；デオキシチミジン一リン酸キナーゼ；rad27、エンドヌクレアーゼおよび5'エキソヌクレアーゼ；mbp1-11t、転写因子slmd/(YOR080w）；rnr1-77、リボヌクレオチドレダクターゼ大サブユニット；rnr2-72、リボヌクレオチドレダクターゼ小サブユニット；rnr4-106、リボヌクレオチドレダクターゼ小サブユニット；cdc21-1、チミジル酸シンターゼ；pril-62、DNAプライマーゼ；POLα、pol1-101、DNAポリメラーゼαからなる群より選択される遺伝子において影響を受ける可能性がある。
【００１９】
MEC1および第二の遺伝子および／またはORF（オープンリーディングフレーム）を含む二重変異体もまた、本発明の範囲内であると予想される。最も好ましくは、哺乳類モデルが酵母でなされた発見に基づいて構築できるように、哺乳類の類似体または相同体を有する遺伝子において酵母の二重変異体が影響を受ける。これらは、中でも酵母CDC8、RAD27、MBP1、SLM1、RNR1、RNR2、RNR4、CDC21、PRI1、POL1を含みうるが、これらに限定されない。本発明の好ましい態様において、相同（少なくとも40％）または類似の哺乳類遺伝子はこの群から選択される。
【００２０】
本発明のさらなる目的には、薬物または薬物候補の同定が含まれる。従って、第二の薬物標的が解明された後、例えばその生理活性を障害するために、第二の薬物標的と潜在的に相互作用しうる薬物または薬物候補に関して、第二の薬物標的を用いてスクリーニングすることができる。従って、本発明は、特定の遺伝子産物と相互作用する、結合する、または阻害する薬物、または薬物候補を提供しうる。そのような遺伝子産物は、上記の例を含みうるがこれらに限定されない。薬物または薬物候補は、ヒト腫瘍の増殖または良性新生物の増殖を阻害または停止する能力を示すことが望ましい。
【００２１】
薬物の好ましい薬学的組成は、オリゴヌクレオチド、遺伝子産物、オリゴヌクレオチドもしくは遺伝子産物の相同体もしくは類似体、低分子、またはペプチド模倣体を含む。
【００２２】
このように本発明の目的は、真核細胞の望まない増殖または分化を制御する手段を提供することである。「望ましくない増殖」という用語は、それが細胞の形質転換によるものであれ、望ましくない細胞の増殖、例えば新生物または過形成の増殖、例えば創傷治癒を目的とするケロイド、再狭窄の治療、真核生物の病原体による感染、およびその他の望ましくない平滑筋増殖、美容応用、糖尿病による網膜症等に適用される。同様に、「望ましくない分化」という用語は、分化した細胞がより初期の状態に戻り、不自然なまたは「望ましくない」方法で増殖能を回復または保持するような、細胞の分化における望ましくない変化に適用される。
【００２３】
本発明は、本薬物またはその薬学的に許容される誘導体の治療上の有効量を投与することによって、過形成病変、例えば良性前立腺過形成および乳頭腫と共に、前立腺癌、黒色種、成人癌および小児癌、例えば、グリア起源の脳腫瘍、星状細胞腫、カポジ肉腫、肺の腺癌、および白血病のような悪性病態を治療する方法を提供する。
【００２４】
最も好ましくは、薬物または薬物候補の投与が、腫瘍細胞の死、新生物組織の減少および癌の治療という結果になる。癌に制限されることなく、他の臨床疾患は、本発明の化合物によって治療可能であると予想される。これらの疾患には、例えば平滑筋細胞が血管形成術後の血管において過度に増殖し、血流の制限および死に至る可能性がある、再狭窄のような心血管疾患が含まれる。
【００２５】
上記の疾患に限定されることなく、本発明はまたカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・ステラトイデア（Candida stellatoidea）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、カンジダ・パラプシローシス（Candida parapsilosis）、カンジダ・クルセイ（Candida krusei）、カンジダ・シュードトロピカリス（Candida pseudotropicalis）、カンジダ・キラーモンディ（Candida quillermondii）、カンジダ・ルゴサ（Candida rugosa）、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・フラブス（Aspergillus flavus）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、リゾプス・アリズス（Rhizopus arrhizus）、リゾプス・オリザ（Rhizopus oryzae）、アブシジア・コリムビフェラ（Absidia corymbifera）、アブシジア・ラモサ（Absidia ramosa）、およびムコール・プシルス（Mucor pusillus）、またはその組み合わせからなる群より選択される様々な真菌または酵母の病原体を治療する手段を提供する。
【００２６】
このように、本発明の目的は、真核細胞の望ましくない増殖または分化を制御する手段を提供することである。「望ましくない増殖」という用語は、それが細胞の形質転換によるものであれ、望ましくない細胞の増殖を意味し、例えば、創傷治癒、再狭窄の治療、およびその他の望ましくない平滑筋増殖、美容適用などを目的とした新生物または過形成の増殖を意味する。同様に、「望ましくない分化」とは、老化のような細胞の分化における望ましくない変化を意味する。
【００２７】
本発明はまた、サイクリンタンパク質の発現または調節遺伝子もしくはその遺伝子産物の発現を検出することによって、異常の表現型および攻撃性を評価する診断および予後のアッセイ法を具体化する。
【００２８】
本発明の目的は、薬物が少なくとも一つの第一の遺伝子欠損を含む細胞集団において、少なくとも一つの遺伝子産物の産生と選択的に相互作用し、細胞集団を薬物に曝露すると、細胞集団における細胞分裂を選択的に停止させる、薬学的に許容される担体または希釈剤中に薬物を含む、薬学的組成物をさらに含む。そのような遺伝子産物は、酵母遺伝子に類似したまたは相同なヒト遺伝子によってコードまたは調節される。
【００２９】
本発明のさらなる目的には、MEC1またはその相同体もしくは類似体のような第一の遺伝子に少なくとも一つの欠損を含む細胞において、合成致死性を誘導するために、遺伝子治療を用いる手段が含まれる。本発明の状況において、合成致死性を誘導する方法には、MEC1またはその相同体もしくは類似体のような第一の遺伝子に少なくとも一つの欠損を含む細胞に対し、ポリヌクレオチドを導入することが含まれ、ポリヌクレオチドの作用または発現によって、第二の遺伝子に乱れ（perturbation）が起こり、細胞の合成致死性が生じる。第二の遺伝子の乱れには、第二の遺伝子の上方制御、下方制御、消失、または破壊が含まれるがこれらに限定されない。本発明の用途に適したポリヌクレオチドには、三本鎖形成オリゴヌクレオチド、アンチセンスポリヌクレオチド、RNA-I（総評に関しては、その全文が参照として本明細書に組み入れられる、Nature 402：128〜129、1999を参照のこと）、および第二の遺伝子を特異的に標的とするリボザイムが含まれるがこれらに限定されない。この点において有用な第二の遺伝子には、CDC8、RAD27、MBP1、SLM1/YOR080w、RNR1、RNR2、RNR4、CDC21、PRI1、POL1、141/154、87、240の類似体および相同体、ならびにその組み合わせが含まれる。酵母における知見は、多くの酵母遺伝子がヒト相対物と相同であることから、ヒト遺伝子（複数）の調節に容易に翻訳可能であることに注意しなければならない。酵母とヒト遺伝子とを相互に参照する手段は現在利用可能であり、例えば、参照として本明細書に組み入れられる、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/XREFdb/上で見つけられる「XREF2」プログラムを用いて行うことができる。
【００３０】
アンチセンスポリヌクレオチドの使用およびその応用は、例えば、その全体が参照として本明細書に組み入れられる、モル（Mol）およびファンデルクルル（Van der Krul）編、「アンチセンス核酸およびタンパク質の基本および応用（Antisense Nucleic Acids and Proteins Fundamentals and Applications）」、ニューヨーク、ニューヨーク州、（1992）に一般的に記載されている。適したアンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも15ヌクレオチド、および15ヌクレオチドまでであり、かつより抜きの第二の遺伝子の上流の非翻訳コード配列および関連するコード配列を含む。当業者に明らかであるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドの最適な長さは、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびmRNA上のその相補的配列との相互作用の強さ、翻訳が起こる温度およびイオン環境、アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列、mRNAおよび／またはアンチセンスオリゴヌクレオチドにおける二次構造および三次構造の存在、ならびに好ましい送達様式に依存する。例えば、可溶性のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的遺伝子の転写／翻訳を阻害するために用いられてきた（それぞれ参照として本明細書に組み入れられる、チン（Ching）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA86：10006〜10010、1989；Broderら、Ann. Int. Med. 113：604〜618（1990）；ロリュー（Loreau）ら、FEBS Letters 274：53〜56、1990；ホルセンバーグ（Holcenberg）ら、国際公開公報第91/11535号；国際公開公報第91/09865号；国際公開公報第91/04753号；国際公開公報第90/13641号；および欧州特許第386563号）。アンチセンスポリヌクレオチドにとって適した標的配列には、イントロン-エキソン接合部（適当なスプライシングを防止するため）、DNA/RNAハイブリッドが核から細胞質へのmRNAの輸送を防止する領域、開始因子結合部位、リボソーム結合部位、およびリボソームの進行を妨害する部位が含まれる。アンチセンスポリヌクレオチドにとって特に好ましい標的領域は、選択される第二の遺伝子の5'非翻訳領域である。
【００３１】
より抜きの第二の遺伝子を標的にしたアンチセンスポリヌクレオチドはまた、DNA分子が遺伝子そのものと比較して逆方向にプロモーターの下流に挿入されるような、適した発現ベクターに、標的ポリヌクレオチド配列を含むDNA分子を挿入することによって、調製されうる。次に発現ベクターを適した細胞に形質導入、形質転換、またはトランスフェクトして、アンチセンスポリヌクレオチドを発現をさせることができる。または、アンチセンスオリゴヌクレオチドを、標準的な手動のもしくは自動の合成技法を用いて合成してもよい。合成されたオリゴヌクレオチドを、エレクトロポレーション（例えば、Yangら、Nucl. Acids. Res. 23：2803〜2810、1995）、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、ポリ-L-オルニチン/DMSO（Dongら、Nucle. Acids. Res. 21：771〜772、1993）を含む様々な手段によって、適した細胞に導入してもよい。適したアンチセンスオリゴヌクレオチド投与法の選択は、当業者に明らかであると考えられる。合成されたオリゴヌクレオチドに関して、アンチセンスオリゴヌクレオチド-mRNAハイブリッドの安定性は、安定化剤をオリゴヌクレオチドに添加することによって増大されうる。安定化剤には、オリゴヌクレオチドの一端または両端に共有結合するインターカレート（intercalete）剤が含まれる。オリゴヌクレオチドは、例えば、ホスホトリエステル、ホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロアミデート、またはホスホロジチオエートを導入することによってホスホジエステル骨格の改変によって、ヌクレアーゼに対して抵抗性になりうる。オリゴヌクレオチドはまた、モル（Mol）およびファンデルクルル（Van der Krul）（同書）に一般的に記載されるように、デオキシリボヌクレオチドのαアノマーと共にオリゴヌクレオチドを合成することによってヌクレアーゼ抵抗性になりうる。
【００３２】
もう一つの態様において、本発明のポリヌクレオチドを基にした阻害剤には、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、標的遺伝子の転写を妨害する配列特異的DNA結合剤が含まれる。三重鎖形成オリゴヌクレオチドは一般的に、それぞれその全体が、参照として本明細書に組み入れられる、マエール（Maher）、Bioessays 14：807〜815、1992；ジー（Gee）ら、Gene 149：109〜114、1994；ヌーンバーグ（Noonberg）ら、Gene 149：123〜126、1994）；ソン（Song）ら、Ann. NY Acad. Sci. 761：97〜108、1995；ウェスティン（Westin）ら、Nuc. Acids. Res. 23：2184〜2191、1995）；ならびにワンド（Wand）およびグレイザー（Glazer）、J. Biol. Chem. 207：22595〜22901、1995）に記載されている。これらのオリゴヌクレオチドは、二本鎖DNA上において生理的条件で三重鎖ヘリックス複合体を形成し、DNA鋳型へのRNAポリメラーゼまたは転写因子の接触を物理的に妨害することによって、遺伝子の転写を選択的に阻害する。また、例えば、それぞれが参照として本明細書に組み入れられる、国際公開公報第95/25818号；国際公開公報第95/20404号；国際公開公報第94/15616号；国際公開公報第94/04550号；および国際公開公報第93/09788号を参照されたい。三重鎖形成オリゴヌクレオチドは、転写因子の結合の阻害を促進するために、ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドのテール（tail）のいずれかを含みうる。一つの例として、三重鎖形成オリゴヌクレオチドは、以下の第二の遺伝子を標的とする：CDC8、RAD27、MBP1、SLM1/YOR080w、RNR1、RNR2、RNR4、CDC21、PRI1、POL1、141/154、87、および240ならびにそれぞれの類似体および相同体。
【００３３】
ポリヌクレオチドを基にした阻害剤に関して、適した配列の選択は、例えば、阻害剤の種類（すなわち、三重鎖形成オリゴヌクレオチドまたはアンチセンスポリヌクレオチド）、および処理される種によって左右されると考えられる。容易に利用可能な動物モデルにおいて用いることができるように、種の間で保存された配列を選択することが好ましいであろう。
【００３４】
本発明はまた、第二の遺伝子発現を阻害するための、リボザイム阻害剤の使用に関する組成物および方法を提供する。リボザイムは、所望の細胞を標的とする遺伝子治療による場合を含む、多様な様式で投与されることができる。本発明のリボザイムは、関心対象の遺伝子のRNA転写物の、配列特異的な標的でありうる。例えば、第二の遺伝子の転写を特異的に阻害するようにリボザイムを設計しうる。それぞれのリボザイム分子は、第二の遺伝子RNAを切断することができる触媒的に活性な部分を含むように設計され、標的にされるRNAの一部と相補的なヌクレオチド配列を有する隣接配列をさらに含む。標的配列に対して隣接配列は完全に相補的である必要はないが、しかしながら隣接配列は、二重鎖を形成し、かつリボザイムの触媒活性セグメントが標的部位を切断するのに十分なだけは相補的である必要がある。このように、隣接配列は、生理学的条件下でリボザイムが標的RNAとハイブリッド形成が可能であるよう許容するのに十分なだけは相補的である必要がある。
【００３５】
本明細書において用いられるように、「リボザイム」という用語は、ヌクレオチド塩基配列特異的に、他の別個のRNA分子を切断または結び合わせる（splice）ことができる酵素活性を有する、RNA分子を意味する。触媒RNA分子または酵素RNA分子という用語は、特異的なRNA標的（例えば、CDC8、RAD27、MBP1、SLM1/YOR080w、RNR1、RNR2、RNR4、CDC21、PRI1、POL1、141/154、87、または240RNA）に対する基質結合領域において相補性を有し、かつその標的においてRNAを切断および／または結び合わせるために活性である酵素活性を有し、それによって標的分子を変化させるRNA分子を意味する。本発明の好ましい態様において、酵素RNA分子はハンマーヘッド（hammer head）モチーフにおいて形成されるが、リボザイムはまた、ヘアピンのモチーフ、δ型肝炎ウイルス、グループIイントロンまたはRNA分解酵素P RNA（RNAガイド配列に関連して）において形成されうる。ハンマーヘッドモチーフの例は、Rossiら、AIDS Res. Hum. Retrovir. 8：183、（1992）に記載されており、ヘアピンモチーフはHampelら、Biochem. 28：4929、（1989）、およびHampelら、Nucl. Acids. Res. 18：299、（1990）に記載され、δ型肝炎ウイルスモチーフは、PerrottaおよびBeen、Biochem. 31：16、（1992）において例示されており、RNA分解酵素PモチーフはGuerrier-Takadaら、Cell 35：849、（1983）に記載されており、かつグループIイントロンモチーフの例は、Cechら、米国特許第4,987,071号に記載されており、上記の開示はそれぞれ参照として本明細書に組み入れられる。これらの特異的モチーフは本発明において限定的ではなく、当業者は本発明の酵素RNA分子が一つまたは複数の標的RNA領域と相補的である、特異的な基質結合部位を有し、これが分子にRNA切断活性を付与する基質結合部位内または周辺にヌクレオチド配列を有することを認めるであろう。リボザイム触媒部位の上流および下流の隣接配列は、リボザイムに対する望ましい程度の標的特異性を有効に付与する任意の長さの部分を含んでもよい。好ましくは隣接配列はヌクレオチド約4個〜約24個を含み、より好ましくはヌクレオチド約6個〜約15個、一般的にヌクレオチド約9個〜12個を含み、その結果、切断部位を含むRNA配列のすぐ上流およびすぐ下流で基質配列との塩基対形成が起こる。
【００３６】
標的DNAまたは対応するRNAの異なる部分を標的とした、ポリヌクレオチド阻害剤、例えば、三重鎖形成オリゴヌクレオチド阻害剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤、リボザイム阻害剤等、またはそのような阻害剤の組み合わせを、標的とした細胞に広く多様な方法で送達させて、関心対象の遺伝子の阻害を促進することができる。オリゴヌクレオチドは、合成オリゴヌクレオチドとして投与するか、または発現ベクターから発現させることができる。オリゴヌクレオチドを、エキソビボで投与することができる、すなわち、個体あるいは他の細胞源から採取した標的細胞と接触させて、処理して、戻すか、またはオリゴヌクレオチドをインビボで投与することができる。エキソビボで投与する場合、特定の細胞集団に依存して、一般的に標的細胞を有糸分裂促進物質、例えば血清の有糸分裂促進物質（SCF、IL-3、EPO、TPO等）または類似物に曝露する。
【００３７】
関心対象の第一の遺伝子、ならびに変異体型で存在して第一の遺伝子の変異と組み合わせると細胞増殖および細胞死の調節を決定する第二の標的遺伝子、において変異を有する、酵母変異体の致死性に基づく合成致死スクリーニング方法を開示する。本発明のスクリーニングアッセイ法では、関心対象の第一の遺伝子の機能を相補する、または抑制することができる単変異体および二重変異体を利用する。ヒトの細胞周期制御に関係する新規遺伝子を同定する、本発明を可能にする実験的な実施例を提供する。これらの遺伝子には、CDC8、RAD27、MBP1、SLM1/YOR080w、RNR1、RNR2、RNR4、CDC21、PRI1、POL1、141/154、87、240、およびその他の遺伝子が含まれるがこれらに限定されず、同様に、これらの遺伝子の類似体および相同体が含まれる。これらの遺伝子は、限定はされないがDNA複製、DNA修復、転写の制御およびヌクレオチドサイクリングの局面を含む、細胞周期の局面に関係するタンパク質をコードする。例えば、POL1は、有糸分裂のDNA合成、減数分裂前のDNA合成、組換え、および完全な発芽にとって必要であり、そのヌル変異体は生存できない。Pol1（ts）変異体は、36℃で細胞分裂の阻害を示す。CD8ならびにその相同体および類似体はチミジル酸キナーゼ活性を有するタンパク質をコードする。RAD27およびその相同体および類似体は、エンドヌクレアーゼおよび5'エキソヌクレアーゼ活性を有するタンパク質をコードする。MBP1ならびにその相同体および類似体は、転写因子として作用するタンパク質をコードする。RNRタンパク質はリボヌクレアーゼレダクターゼのサブユニットとして作用する。CDC21ならびにその相同体および類似体はチミジル酸シンターゼとして作用するタンパク質をコードする。PRI1ならびにその相同体および類似体は、DNAプライマーゼとして作用するタンパク質をコードする。
【００３８】
本発明のこれらおよびその他の目的は、本明細書に提供する開示から明らかとなると考えられる。
【００３９】
4.発明の詳細な説明
科学者は、細胞が分裂することを何世紀も前から知っているが、研究者が分裂機構の研究に関して実際に進歩し始めたのはごく最近である。関連駆動機構とその化学調節物質とを理解することは、このプロセスが時に悪い方向に進む（癌細胞の増殖の場合のように）理由を決定するために役立ち、そのような機能障害を予防および逆転させるための方法の開発に役立つと考えられる。
【００４０】
本発明は、生存のためにMEC1機能を必要とする変異体を発見するために、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces serevisiae）株A364aにおいて実施した合成致死スクリーニング方法を教示する。スクリーニング方法には、ADE3遺伝子およびURA3遺伝子を含むMEC1プラスミド（pEF208）を有するMEC1欠失株（yEF611）を最初に変異誘発することが含まれた。ADE3遺伝子が存在すれば、用いる株のバックグラウンドにおいて、最初の赤／白色選択を行うことができ、プラスミドがURA3を維持すれば、プラスミド依存的増殖に関する二次試験を行うことができる。第三の試験には、HIS3を含むもう一つのMEC1プラスミドによって、mec1Δ合成致死変異体（MSL）を形質転換することが含まれた。
【００４１】
第一の遺伝子MEC1における変異と組み合わせて合成致死となる遺伝子を同定することによって、第二の遺伝子変異を模倣することができる物質に関するスクリーニング法を開発することができる。そのような物質は、異常な増殖に関連する疾患の治療のために、本発明の状況において有用な治療である。例えば、MEC1またはその類似体もしくは相同体での変異のような、第一の遺伝子における変異を特徴とする、癌のような増殖性疾患を治療する治療物質を同定するためのアッセイ法において、本発明の第二の遺伝子は用いられる。本発明のこれらの局面で、スクリーニングアッセイ法を行い、第二の遺伝子または第二の遺伝子産物またはその類似体もしくは相同体の活性を調節し、そのような調節によって、第二の遺伝子産物の活性を阻害もしくは減少させ、第二の遺伝子を上方制御、下方制御、消失または破壊するような、候補薬物を含む物質を同定してもよい。この状況においてアッセイ法は、標的遺伝子を発現する細胞全体、標的遺伝子産物を含む細胞溶解物を利用してもよく、または精製された標的遺伝子産物を用いてもよい。本発明の特定のアッセイ法では、試験物質が標的遺伝子産物の活性を調節するために適した条件下、および十分な時間で、試験物質を標的遺伝子発現細胞を含む反応混合物と共にインキュベートし、かつ試験物質の非存在下、同一の条件で、対照試料をインキュベートする。本明細書で用いられる通り、標的遺伝子産物の活性を調節するには、例えば、遺伝子産物への直接結合によって標的遺伝子産物の活性を増加または減少させる段階、および標的遺伝子産物の転写または翻訳を上方制御または下方制御することによって標的遺伝子産物の活性を増加または減少させる段階、が含まれるがこれらに限定されない。本発明の局面には、標的遺伝子産物の調節物質を同定するために設計されたハイスループットなスクリーニングアッセイ法が含まれる。
【００４２】
本発明の一つのアッセイ法において、候補薬物は、以下の方法によって同定される；a）MEC1のような第一の遺伝子に欠失または変異を有する細胞を含む試験細胞系を候補薬物に暴露する段階；b）対照細胞系はMEC1またはその類似体もしくは相同体のような第一の遺伝子と、変異型ではMEC1またはその類似体もしくは相同体のような第一の変異を組み合わせることで合成致死となる第二の遺伝子とに欠失または変異を有する細胞を含み、そのような対照細胞系と比較して、試験細胞系に、より低い生存率をもたらす薬物が治療薬物候補であり、試験細胞系の生存率を対照細胞系の生存率と比較する段階。本発明の状況において、生存率は細胞自身の再生能として測定する。非生存細胞とは、分裂することができない細胞、細胞周期のいかなる期においても停止する細胞、アポトーシスを受ける、またはアポトーシス経路に沿って進行する細胞、および死細胞である。生存細胞と非生存細胞の有無を決定する手段は当業者に明らかであり、生体色素染色法（vital dye staining）、染色体濃縮の測定等が含まれる。
【００４３】
もう一つの態様は、以下の段階を含む、MEC1遺伝子またはその類似体もしくは相同体における変異を特徴とする癌のような増殖疾患の治療において有用な化合物を同定する方法である：1）その変異型において変異体MEC1遺伝子またはその類似体もしくは相同体と組み合わせると合成致死となる第二の遺伝子の野生型遺伝子産物を、試験化合物が第二の遺伝子産物に影響を及ぼすために十分な条件および時間、試験化合物に接触させる段階；2）試験化合物の存在下での遺伝子産物の活性を試験化合物の非存在下での第二の遺伝子産物の活性と比較する段階。この例示的アッセイ法において、第二の遺伝子産物またはその類似体もしくは相同体の活性を減少させることができる化合物は、MEC1遺伝子またはその類似体もしくは相同体における変異を特徴とする癌または他の増殖疾患の治療にとって有用であると同定される。本発明のもう一つの態様において、野生型の第二の遺伝子またはその類似体もしくは相同体を有する細胞を試験化合物と接触させて、第二の遺伝子産物またはその類似体もしくは相同体の発現および／または活性を評価して、試験化合物に暴露していない細胞における第二の遺伝子産物の発現および／または活性と比較する、細胞全体のアッセイ法を実施する。この局面において、遺伝子産物の発現または活性の減少が起こる化合物は、MEC1遺伝子またはその類似体もしくは相同体における変異を特徴とする癌または他の増殖性疾患の治療にとって有用である。
【００４４】
本明細書に記載したアッセイ法の目的に関して、第二の遺伝子の遺伝子産物の調節に関するアッセイ法は当業者に既知である。当業者に明らかであるが、遺伝子およびそのそれぞれの変異を特徴付けするために用いられるアッセイ法を当業者は周知しているため、タンパク質活性の調節を測定するための適当なアッセイ法は第二の遺伝子標的によって決定されると考えられる。例えば、テランダーら（Thelander、J. Biol. Chem. 255：7426〜7432、1980）およびエングストロムら（Engstrom、Biochemistry 18：2941〜2948、1979）の方法を用いると、リボヌクレオチドからデオキシリボヌクレオチドへ直接還元することによって、リボヌクレオチドレダクターゼ（RNR1およびRNR2の遺伝子産物）の酵素活性が増加または減少し、例えばヨン＆キャンベル（Yong and Campbell、J. Biol. Chem. 259：14394〜14398、1984）によって記載されたように、リン酸化またはデオキシチミジン一リン酸を測定することによってチミジル酸キナーゼ（CDC8の遺伝子産物）活性の測定が行うことができ、そしてRAD27タンパク質のエンドヌクレアーゼおよび5'エキソヌクレアーゼ活性、ならびにPOL1に関連したポリメラーゼ活性は、ヌクレアーゼおよびポリメラーゼ活性を追跡するようなアッセイ法を用いて決定することができる。タンパク質の活性は、例えば抗体染色を用いた可視化、または免疫沈降によってそのリガンドまたは基質に対する遺伝子産物の結合の増加または減少を測定することにより、決定することができる。チューブリン（TUB1およびTUB2の遺伝子産物）のような構造タンパク質は、細胞によって産生されたチューブリンの質および量を測定することによって測定することができる。
【００４５】
mec1Δ依存的な合成致死性が証明された後、変異体を、変異体のプールに存在する特異的遺伝子の多くの対立遺伝子の通常良好な指標である相補性群に分類する。これは、整合している多くのMSLの型を切り替えること、およびそれらを他のMSLと整合させることによって行われる。相補性が成功すれば、MEC1 ADE3 URA3プラスミドを消失させることができ、二倍体株は表現型的に白色または扇状であり、ウラシルを欠損する培地上で部分的または完全に増殖できない。
【００４６】
相補性の成功は、MSLが対立遺伝子的でない変異を維持することを示すが、相補性の不成功は、ほとんどの場合、同じ遺伝子に変異が起こることを示している。MSLが相補性群に分類されると、合成的相互作用を軽減する酵母ORF/遺伝子を見出すため、ゲノムライブラリを含むプラスミドを、選択されたMSLに形質転換する。候補遺伝子が見出されれば、対立性は少なくとも以下を行うことによって証明される：
（1）MSL変異が候補ORFと連鎖している（例えば、減数分裂の際にORFと共に分離する）ことを決定する
（2）候補ORFが低コピー数プラスミドの合成的表現型を単純に相補できることを示す。
【００４７】
最後の確認として、MSLを野生型株と３〜４回戻し交配させて、MEC1キナーゼ不活性変異体と交配させる。
【００４８】
一つのMSL変異体がCDC17/POL1/POLαに変異を含む。この対立遺伝子は、pol1-101（株yPP210）と呼ばれる。pol1-101変異体は、30℃〜36℃の間でMEC1機能を必要とする。しかし、pol1-101 med1d二重変異体は、28℃未満で増殖することができる。このように、温度感受性特性が損傷しているために、pol1-101機能がおそらくは損なわれている温度で合成致死相互作用が起こる。
【００４９】
本発明は、癌ならびに、細胞増殖および複製の調節解除に関連する他の疾患のモデルとして、真核生物細胞、例えば酵母変異体を提供する。酵母は、ヒト疾患を研究するために極めて有用なモデルである。例えば、1996年1月20日現在、以下のヒト疾患および臨床的に重要な病態が、ヒト遺伝子と酵母サッカロミセス・セレビジエ（S. serevisiae）遺伝子／タンパク質との間に一致があるとして同定されている：遺伝性非ポリポーシス結腸癌；嚢胞性線維症；ウィルソン病；グリセロールキナーゼ欠損症；副腎白質萎縮症；毛細血管拡張性運動失調；筋萎縮性側索硬化症；筋緊張性ジストロフィー；ローウェ症候群；1型神経線維腫症；先天性脈絡膜欠如；構造異常性異形成；脳回欠損；トムゼン病；ウィルムス腫瘍；軟骨形成不全症；メンケス症候群；多発性内分泌腺新形成2A；ウィスコット-アルドリッチ症候群；デュシェンヌ型筋ジストロフィー；無虹彩症；性腺形成異常；早期発症型乳癌および卵巣癌；慢性肉芽腫症；表皮剥離性掌しょ角皮症；ワーデンブルグ症候群；腺腫様多発結腸ポリープ；2型神経線維腫症；カルマン症候群；結節硬化症；腎嚢胞；アールスコグ-スコット症候群；マルファン症候群；ハンチントン病；脊髄小脳性運動失調；1型遺伝性QT延長症候群；脆弱X症候群；エメリー-ドライフス型筋ジストロフィー；網膜芽細胞腫；マクラウド症候群；ノリエ病；フォンヒッペル-リンダウ病；アルツハイマー病；反射亢進；X連鎖無γグロブリン血症（詳細な情報に関しては、参照として本明細書に組み入れられる、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Bassett/Yeast/およびその更新版を参照のこと）。酵母とヒト遺伝子を交互参照する手段は現在利用可能であり、例えば、参照として本明細書に組み入れられる、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/XREFdbに見出される「XREF2」プログラムを用いて行うことができる。細胞周期監視系の成分における異常は、ヒト癌および上記のような他の疾患において同定されている。これらの異常には、サイクリンの変化（腫瘍の80％〜90％）、p53の変化（腫瘍の50％〜60％）、およびDNAミスマッチ修復（結腸および膵臓のようないくつかの種類の腫瘍の10％〜20％）が含まれる。第一の遺伝子変化とは機能の喪失であることが多く、そのため、これらの欠損に重点を置いた医薬品探索プログラムは、失われた機能の回復を必要とする。もう一つのアプローチは、阻害された場合に、他のどのタンパク質（または複数）が第一の欠損を有する細胞を選択的に殺すかを同定することである。
【００５０】
一般的な情報および、酵母ゲノムを含むデータベースは公式に利用可能であり、例えば、その内容およびリンクが参照として本明細書に組み入れられる、以下のような公式ウェブサイトにおいて見出される：http://bioinformayics.weizmann.ac.il；http://ourworld.compuserve.com/homepages/C Velten/yeast.htm；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Yeast；http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces/；genome-ftp.stanford.edu（directory/yeast/genome_seq）；http://vectordb.atcg.com/vectordb/；http://www.mpimg-berlin-dahlem.mpg.de/~andy/GN/S.cerevisiae/；またはhttp://www.mips.biochem.mpg.de/proj/yeast。他のデータベースも同様に存在し、これらのデータベースおよび他のウェブサイトへのリンクも、本発明の目的にとって等しく適している。例として、その内容が参照として本明細書に組み入れられるYeast GenBank（サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces serevisiae）に由来する全てのGenBank配列の集まり）；Yeast Swiss-Prot（サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces serevisiae）に由来するSwiss-Protタンパク質配列のコレクション）；YPD（Proteome, Inc. が管理する酵母タンパク質データベース）、およびその定期的な更新版が含まれるが、これらに限定されない。酵母を操作する方法は十分に確立されており、かつ当業者に公知であり、中でも例えば、www.goshen.edu/bio/yeast、www.fhcrc.org/~gottschling、およびwww.sacs.ucsf.edu/home/HerskowitzLab/protocols/protocolのような公式ウェブサイトにおいて見出される。
【００５１】
本発明は、条件感受性致死性変異を有する変異体生物を同定する方法およびその後の遺伝子産物を特徴とする。開示された方法は、生存にとって必須である遺伝子および対応する遺伝子産物を迅速に同定するための、ゲノムライブラリーまたは変異体ライブラリーのハイスループット（high-throughput）スクリーニングのために有用である。致死性変異によって、限定的条件下（すなわち、腫瘍細胞において）では機能的でない遺伝子またはタンパク質がもたらされる。非機能的遺伝子は、プロモーター内に欠損を有する可能性があり、遺伝子発現の減少または異常をもたらす可能性がある。非機能的タンパク質は、不適切なタンパク質の折り畳みまたは異常なタンパク質分解を引き起こす構造的欠陥を有しうる。不適切なタンパク質折り畳みの結果、折り畳み、本来の基質の認識、ならびに／または基質の結合および放出は部分的または完全に失敗する。
【００５２】
本発明の化合物が治療利益を提供することができる多様な病的な細胞増殖条件が存在し、一般的な戦略は異常な細胞増殖の阻害である。説明すると、病的または異常な増殖を示す細胞タイプには、様々な癌、白血病、乾せん、骨疾患、結合組織を巻き込むような繊維増殖障害、アテローム性動脈硬化症、およびその他の平滑筋増殖障害と共に慢性炎症が含まれる。
【００５３】
増殖異常に加えて、例えば、組織の脱分化が原因で起こる分化異常の治療は、（任意に）有糸分裂への頓挫性再入を伴いうる。そのような変性性障害には、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症等、および脊髄小脳変性を含む神経系の慢性的な神経変性疾患が含まれる。他の分化異常には、例えば、軟骨細胞または骨細胞の脱分化によって起こりうるような、結合組織に関連した異常ならびに、内皮組織および平滑筋細胞の脱分化を伴う血管異常、腺細胞における変性変化を特徴とする胃潰瘍、および分化不全を特徴とする腎疾患、例えばウィルムス腫瘍が含まれる。
【００５４】
治療的な適用（例えば、ヒトおよび獣医学的用途の両方で）に加えて、対象化合物がインビトロの細胞の増殖状態および／または分化状態を制御するために細胞培養添加物として使用されうることは明白であろう。
【００５５】
同様に、ディファレンシャル（differential）スクリーニングアッセイ法を用いて、非ヒト酵母酵素に対して特異性を有する本発明の化合物を選択することができる。したがって、真核細胞病原体に対して特異的に作用する化合物、例えば抗真菌剤、または抗寄生虫剤を、本発明の阻害剤から選択することができる。説明すると、本発明の阻害剤は、衰弱した免疫抑制患者において一般的に起こる日和見感染症であるカンジダ症の治療に用いることができる。これらの同じ阻害剤を用いて、白血病およびリンパ腫患者、免疫抑制治療を受けている人々、および真菌感染症が特に問題となる真性糖尿病またはAIDSのような素因を有する患者におけるこれらの感染症を治療することができる。
【００５６】
説明のために、本明細書に記載したアッセイ法を用いて、カンジダ症、アスペルギルス症、ムコール菌症、分芽菌症、ゲオトリクム症、クリプトコッカス症、色素酵母菌症、コクシジウム症、分生胞子症（conidiosporosis）、ヒストプラスマ症、マズラミコーシス、リノスポリジウム症、ノカルディア症、パラアクチノミセス症、ペニシリウム症、モニリア症、またはスポロトリクム症のような真菌症に関係する少なくとも一種の真菌を阻害するために最終的に有用でありうる薬剤をスクリーニングすることができる。
【００５７】
このような治療的用途に加えて、ディファレンシャルスクリーニングアッセイ法で開発された抗真菌剤を、例えば、食用色素中の保存料、家畜の体重増加を促進する飼料補充物、または非生物の処置、例えば病院設備や病室の汚染除去のための消毒薬製剤として用いることができる。
【００５８】
同様にして、哺乳類遺伝子およびショウジョウバエ（Drosophila）のような昆虫遺伝子の阻害を並べて比較すると、本発明の誘導体の中からヒト／哺乳類の酵素および昆虫酵素とを識別する阻害剤を選択することが可能となると考えられる。したがって、本発明は、ショウジョウバエ（Drosophila）のような昆虫の管理のために用いられるように、殺虫剤における本発明の用途および製剤を広く意図する。
【００５９】
さらにもう一つの態様において、本発明の阻害剤化合物のいくつかを、哺乳類の相対物と比較して植物遺伝子に対する阻害特異性に基づいて選択することができる。例えば、植物酵素を阻害するための最大の選択性を有する化合物を選択するために、一つまたは複数のヒト酵素によるディファレンシャルスクリーニングにおいて、植物遺伝子を配置することができる。したがって、本発明は枯葉剤等の形態など農業的応用のための本発明の阻害剤の製剤を特に意図している。
【００６０】
もう一つの局面において、本発明は、一つまたは複数の薬学的に許容されうる担体（添加剤）および／または希釈剤と共に製剤化した、一つまたは複数の治療的有効量の上記の化合物を含む、薬学的に許容されうる組成物を提供する。以下に詳細に説明するように、本発明の薬学的組成物を、以下に関して適合させたものを含む、固体状または液体状での投与のため特に製剤化してもよい：（1）経口投与、例えば飲薬（水溶液もしくは非水溶液、または懸濁液）、錠剤、巨丸剤、粉剤、顆粒、舌に適用するためのペースト；（2）非経口投与としては、例えば滅菌溶液または懸濁液としての皮下注射、筋肉内注射、または静脈内注射；（3）局所適用、例えば、皮膚に適用されるクリーム、軟膏、もしくはスプレーとして；または（4）膣内もしくは直腸内、例えば、ペッサリー、クリーム、もしくはフォームとして。
【００６１】
本明細書において用いられる「治療的有効量」という用語は、第一の遺伝子（MEC1、またはその類似体もしくは相同体）に変異を含む動物における細胞の少なくとも一つの亜集団において標的の第二の遺伝子の発現活性を調節し、それによる処理細胞における該タンパク質活性の生物学的帰結を、任意の医学的処置に応用可能な妥当な恩典／リスク比で、妨害することによって、何らかの所望の治療効果を得るために有効である本発明の化合物を含む、化合物、材料、または組成物の量を意味する。
【００６２】
「薬学的に許容される」という用語は、本明細書において、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、またはその他の問題もしくは合併症がなく、妥当な利益／リスク比に比例して、ヒトおよび動物の組織と接触して用いることに適している化合物、材料、組成物および／または剤形を意味するために用いられる。
【００６３】
本明細書において用いられる「薬学的に許容される担体」という用語は、一つの臓器、または体内の一部分から体内の他の臓器または他の部分に対象の薬剤を運ぶまたは輸送することに関係する、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒または封入材料のような、薬学的に許容される材料、組成物、または媒体を意味する。それぞれの担体は、製剤の他の成分と適合性があり、患者に対して有害でないという意味において「許容され」なければならない。薬学的に許容される担体として役立ちうる材料のいくつかの例には：（1）乳糖、ブドウ糖、およびショ糖のような糖；（2）コーンスターチおよびジャガイモデンプンのようなデンプン；（3）セルロースおよび、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロースのようなその誘導体；（4）粉末トラガカント；（5）麦芽；（6）ゼラチン；（7）タルク；（8）カカオバターおよび坐剤ロウのような賦形剤；（9）ピーナッツ油、綿実油、ひまわり油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、および大豆油のような油脂；（10）プロピレングリコールのようなグリコール；（11）グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールのようなポリオール；（12）オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルのようなエステル；（13）寒天；（14）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムのような緩衝剤；（15）アルギン酸；（16）発熱物質不含水；（17）等張生理食塩水；（18）リンゲル液；（19）エチルアルコール；（20）リン酸緩衝液；ならびに（21）薬学的製剤において用いられる他の非毒性適合性物質が含まれる。
【００６４】
上記のように、本発明の薬物または作用物質の特定の態様は、アミノ基またはアルキルアミノ基のような塩基性官能基を含んでもよく、したがって、薬学的に許容される酸によって薬学的に許容される塩を形成することができる。この点において、「薬学的に許容される塩」という用語は、本発明の化合物の比較的非毒性の無機酸付加塩および有機酸付加塩を意味する。これらの塩を、本発明の化合物の最終的な単離および精製の際にインサイチューで、または遊離状態の本発明の精製化合物を適切な有機酸または無機酸と個々に反応させ、形成された塩を単離することによって、調製することができる。代表的な塩には、臭化水素塩、塩化水素塩、硫酸塩、亜硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシラート、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩、メシレート、グルコヘプト酸塩、ラクトビオネート、およびラウリルスルホン酸塩等が含まれる。
【００６５】
他の例において、本発明の化合物は、一つまたは複数の酸性官能基を含んでもよく、したがって、薬学的に許容される塩基によって薬学的に許容される塩を形成することができる。これらの例において「薬学的に許容される塩」という用語は、本発明の化合物の比較的非毒性の無機塩基付加塩および有機塩基付加塩を意味する。これらの塩はさらに、化合物の最終的な単離および精製の際にインサイチューで調製することができ、または酸解離状態の精製化合物を、薬学的に許容される金属陽イオンの水酸化物、炭酸塩または炭酸水素塩のような適した塩基と、アンモニアと、または薬学的に許容される有機一級アミン、二級アミン、もしくは三級アミンと個々に反応させることによって、調製することができる。代表的なアルカリ塩類またはアルカリ土類塩には、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、およびアルミニウム塩等が含まれる。塩基付加塩の形成にとって有用な代表的な有機アミンには、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジン等が含まれる。ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムのような湿潤剤、乳化剤、および潤滑剤、ならびに着色剤、放出剤、コート剤、甘味料、香料、保存剤および抗酸化剤も同様に組成物中に存在しうる。
【００６６】
薬学的に許容される抗酸化剤の例にはいかが含まれる：（1）アスコルビン酸、水酸化システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等のような水溶性抗酸化剤；（2）アスコルビン酸・パルミテート、ブチルヒドロキシアニソール（BHA）、ブチルヒドロキシトルエン（BHT）、レシチン、没食子酸プロピル、α-トコフェロール等のような脂溶性抗酸化剤；および（3）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等のような金属キレート剤が含まれる。
【００６７】
本発明の製剤には、経口投与、鼻腔内投与、局所投与（頬および舌下を含む）、直腸投与、膣投与、および／または非経口投与に適した製剤が含まれる。製剤は、便宜上単位剤形で存在してもよく、薬学の技術分野において公知の任意の方法によって調製されうる。単一の剤形を生成するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、治療される宿主、特定の投与様式に応じて変化すると考えられる。単一の剤形を作製するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、一般的に治療効果を生じる化合物の量であると考えられる。一般的に、100％のうち、この量は活性成分の約1％〜約99％、好ましくは約5％〜約70％、最も好ましくは約10％〜約30％の範囲内であろう。これらの製剤または組成物を調製する方法には、本発明の化合物を担体と、および任意で一つまたは複数の付属成分と結合させる段階が含まれる。一般的に、本発明の化合物を液体担体、または細粒固体担体またはその双方と均一に完全に結合させ、次に必要であれば産物を成形することによって、製剤が調製される。
【００６８】
経口投与に適した本発明の製剤は、活性成分として本発明の化合物の規定量をそれぞれ含む、カプセル剤、カシェ剤、丸剤、錠剤、（香料基剤、通常、ショ糖およびアカシアゴムまたはトラガカントを用いる）ロゼンジ、粉剤、顆粒剤の形状で、または水溶液もしくは非水溶液中での溶液もしくは懸濁液として、または水中油型もしくは油中水型の乳剤として、またはエリキシル剤もしくはシロップ剤として、または（ゼラチンおよびグリセリン、またはショ糖およびアカシアゴムなどの不活性基材を用いる）トローチとしておよび／またはマウスウオッシュ等としての形状であってもよい。本発明の化合物はまた、ボーラス、舐剤、またはペーストとして投与されうる。
【００６９】
経口投与のための本発明の固体剤形（カプセル剤、錠剤、丸剤、糖衣丸、粉剤、顆粒等）において、活性成分を、クエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウム、および／または以下のいずれかのような、一つまたは複数の薬学的に許容される担体と混合する：（1）デンプン、乳糖、ショ糖、ブドウ糖、マンニトール、および／またはケイ酸のような充填剤または増量剤；（2）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ショ糖および／またはアカシアゴムのような結合剤；（3）グリセロールのような湿潤剤；（4）寒天-寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩、および炭酸ナトリウムのような崩壊剤；（5）パラフィンのような溶液遅延剤；（6）四級アンモニウム化合物のような吸収加速剤；（7）例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロールのような湿潤剤；（8）カオリンおよびベントナイト粘土のような吸収剤；（9）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびその混合物などの潤滑剤；ならびに（10）着色剤。カプセル、錠剤、および丸剤の場合、薬学的組成物はまた緩衝剤を含んでもよい。類似のタイプの固体組成物も同様に、乳糖または牛乳の糖と共に、高分子量ポリエチレングリコール等のような賦形剤を用いて軟および硬充填ゼラチンカプセルにおいて充填剤として用いられうる。
【００７０】
錠剤を、任意に一つまたは複数の補助成分と共に、圧縮または成型によって作製してもよい。圧縮錠剤を、結合剤（例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、潤滑剤、不活性希釈剤、保存剤、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウムもしくは架橋したカルボキシメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤または分散剤を用いて調製してもよい。成型錠剤を、適切な機械において不活性液体希釈剤によって湿らせた粉末化合物の混合物を成型することによって作製してもよい。本発明の薬学的組成物の錠剤、ならびに糖衣丸、カプセル剤、丸剤および顆粒のようなその他の固体剤形を、任意に、腸溶コーティングおよび製薬技術分野で公知の他のコーティングのようなコーティングおよび外被と共に得ることができる、または調製することができる。それらをまた、例えば、所望の放出プロフィールを提供するための様々な比率のヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリクス、リポソームおよび／またはミクロスフェアを用いることによって、その中の活性成分の遅いまたは制御された放出を提供するように製剤化してもよい。それらを例えば、細菌残留フィルターによる濾過によって、または使用直前に滅菌水または他の滅菌注射可能媒体に溶解することができる滅菌固体組成物の形で滅菌物質を組み入れることによって、滅菌してもよい。これらの組成物はまた、任意に不透明化物質を含んでもよく、そして胃腸管の特定の部位に限って、またはそれらの部位に選択的に、ゆっくりと活性成分を放出する組成物であってもよい。用いることができる包埋組成物の例には、ポリマー物質およびロウが含まれる。活性成分はまた、適当であれば、上記の賦形剤の一つまたは複数を有する、微小封入体の形状でありうる。
【００７１】
本発明の化合物を経口投与するための液体剤形には、薬学的に許容される乳剤、微小乳剤、溶液、懸濁液、シロップ剤、およびエリキシル剤が含まれる。活性成分の他に、液体剤形は、例えば水および他の溶媒のような当技術分野で一般的に用いられる不活性希釈剤、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、ベンジル安息香酸、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、油脂（特に綿実油、落花生油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにそれらの混合物のような可溶化剤および乳化剤を含んでもよい。
【００７２】
不活性希釈剤の他に、経口組成物はまた、湿潤剤、乳化剤、および懸濁化剤、甘味料、着香料、着色料、香料ならびに保存剤のようなアジュバント（adjuvant）を含みうる。
【００７３】
懸濁剤は、活性化合物の他に、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール、およびソルビタンエステル、微結晶性（microcrystalline）セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天-寒天およびトラガカント、ならびにそれらの混合物などの、懸濁化剤を含んでもよい。
【００７４】
直腸投与または経膣投与のための本発明の薬学的組成物の製剤は、坐剤として示されうり、これは例えば、室温では固体であるが、体温では液体であり、したがって直腸または膣腔内で融解して活性化合物を放出するカカオバター、ポリエチレングリコール、坐剤用ロウ、またはサリチル酸塩を含む一つまたは複数の適切な非刺激性の賦形剤または担体と、本発明の一つまたは複数の化合物を混合することによって調製されうる。
【００７５】
経膣投与に適した本発明の製剤にはまた、当技術分野において適当であることが知られているような担体を含む、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム、またはスプレー製剤が含まれる。
【００７６】
本発明の化合物の局所投与または経皮投与のための剤形には、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ、および吸入剤質が含まれる。活性化合物を、滅菌条件下で、薬学的に許容される担体および必要でありうる任意の保存剤、緩衝剤、または噴射剤と共に混合してもよい。
【００７７】
軟膏、ペースト、クリームおよびゲルは、本発明の活性化合物に加えて、動物性脂肪および植物性脂肪、油脂、ロウ、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、ケイ酸、タルク、および酸化亜鉛、またはそれらの混合物のような賦形剤を含んでもよい。
【００７８】
粉剤およびスプレーは、本発明の化合物の他に、乳糖、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、およびポリアミド粉末、またはそれらの物質の混合物のような賦形剤を含みうる。スプレーは、クロロフルオロヒドロカーボン、ならびにブタンおよびプロパンのような揮発性の非置換炭化水素のような通常の噴射剤をさらに含みうる。
【００７９】
経皮パッチは、本発明の化合物の体内への制御された送達を提供する、さらなる長所を有する。そのような剤形は、適当な媒体に化合物を溶解または分散させることによって作製することができる。化合物の皮膚を介した流入を増加させるために吸収促進剤も同様に用いることができる。そのような流入の速度を、速度調節膜を提供することによって、またはポリマーマトリクスまたはゲル中に化合物を分散させることによって、制御することができる。
【００８０】
眼科用製剤、眼軟膏、点眼液、粉剤、移植片等も同様に、本発明の範囲内であることが意図されている。
【００８１】
非経口投与に適した本発明の薬学的組成物は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、意図されたレシピエントの血液と等張な製剤にする溶質、懸濁剤もしくは濃化剤を含んでもよい、一つもしくは複数の薬学的に許容される滅菌等張水溶液もしくは非水溶液、分散液、懸濁液、もしくは乳液、または使用直前に滅菌注射可能溶液または分散剤に戻してもよい滅菌粉末と組み合わせた、本発明の一つもしくは複数の化合物を含む。
【００８２】
本発明の薬学的組成物において用いられうる適切な水溶性担体または非水溶性担体の例には、水、エタノール、（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のような）ポリオール、およびそれらの適切な混合物、オリーブ油のような植物油、およびオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルが含まれる。適当な流動性を、例えば、レシチンのようなコーティング材料を用いることによって、分散剤の場合には必要な粒子径を維持することによって、および界面活性剤を用いることによって、維持することができる。
【００８３】
これらの組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤のようなアジュバントを含んでもよい。微生物の作用の阻害は、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸等のような様々な抗菌剤および抗真菌剤を含めることによって、確保されうる。同様に、糖、塩化ナトリウム等のような等張剤が組成物に望ましく含まれうる。さらに、注射可能な薬学的形態の持続的な吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅らせる物質を含めることによってもたらされうる。
【００８４】
場合によっては、薬物の効果を持続させるために、皮下注射または筋肉内注射からの薬物の吸収を遅らせることが望ましい。これは、水溶性が低い結晶またはアモルファス材料の液体懸濁液を用いることによって達成されうる。薬物の吸収速度はその溶解速度に依存し、その結果、結晶の大きさおよび結晶形に依存しうる。
【００８５】
または、非経口投与剤形の吸収の遅延は、油性媒体に薬物を溶解または懸濁することによって行われる。
【００８６】
注射可能デポー剤形は、本発明の化合物の微小封入マトリクスを、ポリラクチド-ポリグリコリドのような生体分解性のポリマーにおいて形成することによって作製される。ポリマーに対する薬物の比、および用いる特定のポリマーの特性に応じて、薬物の放出速度を制御することができる。その他の生体分解性ポリマーの例には、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が含まれる。デポー注射可能製剤はまた、生体組織と適合性であるリポソームまたは微小乳液中に薬物を捕獲することによって調製される。
【００８７】
本発明の化合物を医薬品としてヒトおよび動物に投与する場合、それ自体を投与するか、または例えば0.1％〜99.5％（より好ましくは0.5％〜90％）の活性成分を薬学的に許容される担体と組み合わせて含む、薬学的組成物として投与することができる。
【００８８】
本発明の調製物を、経口投与、非経口投与、局所投与、または直腸内投与してもよい。それらは当然、それぞれの投与経路に適した形状で投与される。例えば、それらは、錠剤、またはカプセル剤、注射剤、吸入剤、眼科用ローション、軟膏、坐剤等、注射、注入、または吸入投与；ローションまたは軟膏による局所投与；および坐剤による直腸内投与によって投与される。経口投与が好ましい。
【００８９】
本明細書において用いられる「非経口投与」および「非経口的に投与する」という用語は、腸内および局所投与以外の投与様式、通常注射による投与を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、および槽内の注射および注入が含まれるがこれらに限定されない。
【００９０】
本明細書において用いられる「全身投与」、「全身に投与する」、「末梢投与」、および「末梢に投与する」という用語は、本明細書において、これが患者の神経系に入って、したがって代謝および他の類似の過程に供されるように、中枢神経系に直接投与する以外の化合物、薬物、または他の材料を投与すること、例えば皮下投与を意味する。
【００９１】
これらのペプチドおよび化合物を、例えばスプレーによる経口投与、鼻腔内投与、直腸内投与、膣内投与、非経口投与、槽内投与、および粉末、軟膏、または点眼液のような、経頬投与および舌下投与を含む局所的投与を含む、任意の適切な経路によって治療するために、ヒトおよびその他の動物に投与してもよい。
【００９２】
選択した投与経路にかかわらず、適切な水和型で用いられうる本発明の化合物および／または本発明の薬学的組成物は、当業者に公知である従来の方法によって薬学的に許容される投与剤形に製剤化される。
【００９３】
本発明の薬学的組成物における活性成分の実際の投与レベルを、患者に対して毒性を示さずに、特定の患者、組成物および投与様式に対して所望の治療反応を得るために有効な活性成分の量を得るために変更してもよい。
【００９４】
選択した用量レベルは、用いる本発明の特定の化合物、もしくはそのエステル、塩、もしくはアミドの活性、投与経路、投与時期、用いられる特定の化合物の排泄速度、治療期間、他の薬物、用いられる特定の化合物と組み合わせて用いられる化合物および／もしくは材料、治療すべき患者の年齢、性別、体重、状態、全身健康、および既往、ならびに医学の技術分野において公知の類似の要因を含む、様々な要因に依存すると考えられる。
【００９５】
当技術分野において通常の技術を有する医師または獣医師は、必要とされる薬学的組成物の有効量を容易に決定して処方することができる。例えば、医師または獣医師は薬学的組成物において用いられる本発明の化合物の用量を、所望の効果を得るために必要な用量より低いレベルで開始して、所望の効果が得られるまで用量を徐々に増加させることができる。
【００９６】
一般的に、本発明の化合物の適切な一日量は、治療効果を生じるために有効な最低用量である化合物の量であると考えられる。そのような有効量は、一般的に上記の要因に依存すると考えられる。一般的に、示された鎮痛効果のために用いる場合、本発明の化合物の患者への静脈内投与量、脳室内投与量および皮下投与量は、1日あたり体重1キログラムあたり約0.0001mg〜約100mgの範囲であると考えられる。
【００９７】
望ましいならば、活性化合物の有効な一日量を、1日を通じて適当な間隔で個別に2回、3回、4回、5回、6回またはそれ以上に分けて、任意に単位剤形で投与してもよい。
【００９８】
本発明の化合物を単独で投与することができるが、薬学的製剤（組成物）として化合物を投与することが好ましい。本発明を全般的に記述したが、これは本発明の特定の局面および態様を説明する目的のために単に含まれるのであって本発明を制限することを意図していない、以下の実施例を参考にしてより容易に理解されるであろう。
【００９９】
実施例1．酵母取り扱い技法全般、材料および方法
株と培地：染色体外複製ベクターは、自己複製配列を含むベクター（arsベクターは通常、細胞において高いコピー数で存在するが、細胞分裂時にしばしば喪失する）、または細胞分裂時に動原体として作用するDNA配列を含むベクター（cenベクター、非常に安定であるが、細胞において数コピーしか存在しない）のいずれかである。全ての株の構築および形質転換と共に用いる培地に関して標準的な方法を用いる。栄養要求性に関する選択が必要である場合には、アミノ酸および硫酸アンモニウム（Sc）を含まない酵母窒素基本培地（USB Biologicals; USA）を用いる（GuthrieおよびFink、1991）。様々な酵母増殖およびドロップアウト（drop-out）培地は、当技術分野で既知である（例えば、www.clontech.comまたはwww.bio.101.com/yeast/を参照のこと）。YPD培地および２％グルコース（SD培地）、２％ガラクトース（SGAL培地）、または２％ラフィノース（SRAF培地）のいずれかを含むドロップアウト合成培地は、ローズ（Rose)ら、（「酵母遺伝子の手法（Methods in Yeast Genetics）」、1990、CSH研究所出版）の通りである。ヒドロキシ尿素（HU）プレートは、HUの適当量を培地（55℃）に直接溶解することによって調製する。ベノミル（BE）プレートは、BEをDMSOに最終濃度の100倍となるように溶解し（保存溶液）、保存溶液0.2mlを培地20mlに加える（55℃）。DMSOは、最終濃度１％を超えなかった。全ての実験は、特に明記していない限り、ウラシルおよびトリプトファンを欠損し、かつ適当な炭素源を含むドロップアウト合成培地において行う。
【０１００】
核酸方法：DNAクローニングは、サムブルック（Sambrook）ら、1989によって概要される標準的な技法によって実施する。制限分析およびプラスミド構築にも標準的な技法を用いる（Sambrookら、1989）。二本鎖プラスミドDNAは、シーケナーゼ（Sequenase）キット（United States Biochemical Corp.; USA）によって配列決定する。
【０１０１】
四分子分析：二倍体酵母菌（S. serevisiae）細胞が減数分裂を受ける場合、子嚢と呼ばれる嚢の中に封入される４つの半数体胞子が産生される。微小操作装置を用いて、胞子４個（「四分子」）を子嚢から「摘出」して、寒天プレート上に分離することができる。次に胞子が発芽して、生じるコロニーを、当初の二倍体株に存在する遺伝子マーカーの表現型特徴の有無に関して試験することができる。このようにして、遺伝子マーカーの分離パターンを評価することができ、マーカーの遺伝子連鎖とマーカー間の距離とを決定することができる。２つの遺伝子マーカーをこのようにして分析する場合、データを２点データと呼ぶ。
【０１０２】
形態分析：チューブリンを抗チューブリン抗体（200倍希釈）（Wenteら、1992）を用いて可視化した後、Cy-3ロバ結合抗ラットIgG（Jackson Immuno Research Laboratories; USA）を用いる。DNAは、DAPI（4'、6-ジアミノ-2-フェニルインドール）によって可視化する。対比と輝度は、アドビフォトショップ（Adobe PhotoShop）コンピュータープログラムによってさらに調節する。
【０１０３】
FACS（蛍光活性化細胞選別）分析：DNAフローサイトメトリーは、記載通りに実施する（EpsteinおよびCross、1992）。結果は常に、事象数（Y軸）に対して蛍光（X軸）をプロットすることによってグラフにし、かつそれらを異なる結果と並置して、比較するために重ね合わせる。
【０１０４】
細胞数：ホルマリン溶液（１×PBS（リン酸緩衝生理食塩液）および0.74％ホルムアルデヒド）３mlによって試料２mlを固定して、12秒間超音波処理し、コールターカウンター（Coulter Counter）において計数する。
【０１０５】
連続希釈：水中で作製した細胞の懸濁液から10×連続希釈液を調製して、５μlを播種し、かつ増殖させ、炭素源および温度の異なる条件において生存率を評価する。
【０１０６】
タンパク質抽出、免疫沈降および免疫ブロッティング：レビン（Levine）ら、1996の技法を改変する。酵母培養（660nmで光学密度0.9の100ml）を濾過によって回収し、氷冷TN（50mMトリス（pH 7.5）、250mM NaCl、５mM EDTA（エチレンジアミン四酢酸）、10％グリセロール）中に再懸濁する。細胞を、５％アプロチニン（Sigma; USA）、0.1mMフッ化フェニルメチルスルホニル、ロイペプチン10μg/ml、ペプスタチン10μg/ml、10mM NaPPi（ピロリン酸ナトリウム）（pH 7.4）、および10 mM NaFを含むTNN抽出緩衝液（TN緩衝液＋0.1％ノニデット（Nonidet）P-40）250 μl中に再懸濁する。酸洗浄ガラスビーズ（Sigma; USA）400μlを加えて、ボルテックス・ジェニー（Vortex-Genie）（VWR Scientific; USA）スリーブにおいて最高速度で２分間攪拌を２サイクル行うことによって細胞を破壊する。切断は４℃で行う。サイクルの間、抽出物を微量遠心管で短時間遠心して、泡を濃縮し、非破壊細胞をマイクロピペッターチップで攪拌して再懸濁する。抽出物を微量遠心して、250μlを除去し、かつ抽出緩衝液250μlをさらに細胞およびビーズに加える。１分間攪拌した後、試料を微量遠心して、抽出緩衝液を合わせる。抽出物を微量遠心２分間によって透明にし、モノクローナル抗体HA11の10倍希釈液（腹水; Babco; USA）と共に氷中で１時間インキュベートする。試料を２分間微量遠心して、上清を抽出緩衝液で洗浄したプロテイン-A-アガロース（Sigma; USA）のスラリー30μlに加える。試料を４℃で１時間回転させる。免疫沈降物を抽出緩衝液で３回洗浄し、HNN（TNN緩衝液＋250mM NaCl）で２分間につき１回洗浄して、２×SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）試料緩衝液60 μlに再懸濁し、95℃で５分間加熱して、イムノブロット分析に用いる。SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（10％および９％）およびイモビロン（Immobilon）（Millipore; USA）への移入は、前述に記載のように実施する（CrossおよびBlake、1993）。移入の後、0.5％ノニデットP-40、0.1％ツイーン20、0.5％ウシ血清アルブミンおよび５％乾燥粉末脱脂乳（Carnation; USA）を含むPBSにおいて、ブロットをブロックする。抗体のインキュベーションは、バックグラウンドを減少させるために１％牛乳を含むPBS-ツイーン（0.2％）中で行う。用いる抗体は、HAタグを検出するためのポリクローナルウサギ抗HAペプチド抗体（市販の抗体をPBS-ツイーン-牛乳緩衝液の15倍希釈液）（Babco; USA）であり、その後ポリクローナル抗体ヤギ抗ウサギ：HRP（Amersham; USA）（市販の抗体のPBS-ツイーン-牛乳緩衝液の10倍希釈液）と共にインキュベートする。検出は、ECLキットを用いて増強化学発光（ECL）によって行う。
【０１０７】
ホスファターゼ処理：免疫沈降は上記の通りに実施する。抽出緩衝液中で洗浄した後、試料をキナーゼ緩衝液（10mM HEPES（pH 7.4）、10mM MgCl2、10％グリセロール、１mMジチオスレイトール）で１回洗浄して、キナーゼアッセイ緩衝液60μlに再懸濁する。仔ウシ腸ホスファターゼ（CIP）５単位（Boehringer Mannheim; USA）、またはCIP＋阻害剤（５％アプロチニン（Sigma; USA））、0.1mMフッ化フェニルメチルスルホニル、10μg/mlロイペプチン、10μg/mlペプスタチン、10mM NaPPi（pH 7.4）、および10mM NaF）を懸濁液20μlに加え、37℃で１時間インキュベートする。２×SDS試料緩衝液20μlを加えて反応を停止させ、95℃で５分加熱して、かつ上記のようにイムノブロット分析に用いる。
【０１０８】
実施例2．分析された遺伝子の誘導型発現に基づく合成致死スクリーニング
GAL1遺伝子からの誘導型プロモーターの制御下で分析された遺伝子の野生型コピーを有する酵母株を構築する。次に、株を生存率が10〜30％となるように変異させる。変異は、紫外線、またはエチルメタンスルホネート（EMS）からなる群より選択される化学変異誘発物質のいずれかによって行う。他の変異誘発物質、すなわち、メチルメタンスルホネート、メチルニトロソグアニジン、4-ニトロキノリン-1-オキシド、2-アミノプリン、5-ブロモウラシル、ICR 191、アクリジン誘導体、エチジウムブロマイド、亜硝酸、および／またはN-メチル-N'-ニトロソ-N-ニトログアニジンも等しく適している。次に、変異した細胞の力価は、必要な塩、ビタミン、ならびにガラクトースおよび蔗糖を含む寒天基本培地に、120mmペトリ皿あたりコロニー形成単位500個を播種して決定する。２、３日の間にコロニーが増殖したら、変異したコロニーを含むペトリ皿を、炭素源としてグルコースまたはガラクトースのいずれかを有する同様のプレート２枚にレプリカ培養する。分析した遺伝子によって合成致死となる変異体を含むコロニーは、ガラクトースで増殖するが、グルコース含有培地では増殖しない。そのような単離体は、デキストロース含有培地で増殖しないことに関して再スクリーニングする。
【０１０９】
次に、合成致死変異を含むコロニーを、分析すべき遺伝子のコピーを有するプラスミドによって形質転換する。コロニーが実際に分析された遺伝子と共に合成致死変異を含む場合、そのようなプラスミドを細胞に導入すると、デキストロース含有培地で増殖するように細胞を形質転換させるはずである。次に、形質転換した細胞を反対整合型の野生型株と交配させる。ハイブリッド株がグルコースで増殖すれば、単離体における合成致死変異が劣勢であり、従って相補性によってクローニングできると結論される。ハイブリッド株がグルコースで増殖できなければ、変異は優性であり、その後の分析から除外する。
【０１１０】
劣性合成致死変異を含むハイブリッドを野生型株と交配させて、発芽させて摘出し、かつ胞子四分子を、合成致死表現型の分離に関する適当な単変異パターンに関してチェックする。そのような分離パターンを示す変異体を、相補性によってクローニングする。この変法およびその他の酵母スクリーニング法の変法は、既知であり（例えば、米国特許第5,912,154号；第5,908,752号；第5,876,951号；第5,869,287号；第5,866,338号；第5,789,184号；第5,674,996号；第5,578,477号；第5,527,896号；第5,352,581号；第5,175,091号；および第5,139,936号を参照のこと）、かつ特定の目的に関してどれを選択するかを当業者は容易に知っている。
【０１１１】
実施例3．mec1変異の生化学的特徴付け
様々な温度（28℃、30℃、32℃、34℃）での変異体の増殖に関してストリークアウトアッセイ法を行う。単離体をpol1-101（yPP888）とmec1キナーゼ死亡変異体（yPP175）との間の交配、およびpol1-101（yPP888）とdun 1d1-100d（yPP130）との間の交配から採取する。二重変異体を温度感受性およびヒドロキシ尿素に対する感受性から採点する。mec1またはdun1に単変異を含む株は、全ての温度において野生型と類似のように増殖する。さらに、mec1kd pol1-101変異体は、mec1の不可欠性を抑制するために必要であるSML1の欠失を含む。sml1の欠失は、調べたいかなる温度（19〜38℃）でも、pol1-101または野生型増殖の温度感受性プロフィールに影響を及ぼさない。
【０１１２】
このように、pol1-101変異体は、30℃で実施したmec1Δによる合成致死スクリーニングより単離する。野生型との戻し交配およびmec1Δとの再交配時に、遺伝子相互作用は28〜30℃の間で起こるが、より低い温度では起こらないことが判明する。このように、mec1Δは、pol1-101の最高許容温度を４〜５℃低下させ、pol1-101株は通常、33〜34℃の間で温度感受性となる。類似の相互作用は、mec1のキナーゼ不活性対立遺伝子およびrad53d変異について認められる。
【０１１３】
さらに、30℃でpol1-101変異体を維持するためにDUN1を必要とするか否かを知ることは重要である。結果は、いかなる温度でもpol1-101変異体を維持するために、DUN1が単独で重要ではないことを証明する。それによって、DUN1転写反応はPOL1変異体において活性であることが示されているが、それが存在しなくても、MEC1またはRAD53のpol1-101変異体を維持する能力に影響を及ぼさないように思われる。
【０１１４】
実施例4．MEC1によって合成致死となる変異体はMEC1/RAD53経路に関して明確な機能的要件を有する
生存のためにMEC1機能を必要とする一連の変異体を用い、２つの方法においてMEC1/RAD53経路の既知の成分間の機能的関係を遺伝子的に解析する。第一に、それぞれのmec1合成致死変異体を、rad9d、pol12-11、rad53、およびpds1dを含む一つまたはそれ以上のチェックポイント関連機能を欠損したチェックポイント変異体のパネルと交配させる。第二に、MEC1の下流であることが知られている経路の作用物質、すなわちRAD53、DUN1、およびPDS1を過剰産生させることによって、mec1合成致死変異体におけるMEC1依存性の回復を試みる。mec1合成致死変異は、遺伝子の変化がdNTP合成またはDNAラギング鎖合成に影響を及ぼすか否かに応じて、チェックポイント経路の上流および下流の成分にとって、必要性が異なる。dNTP合成が影響を受ける場合、細胞は、S期センサー、例えばPOL2、および少なくとも２つのRAD53機能を必要とする：一つはDUN1依存的であり、もう一つはDUN1およびPDS1の双方に非依存的である。ラギング鎖合成が影響を受ける場合、細胞はDNA損傷センサー、例えば、PDS1によって抑制可能なRAD9、PDS1、およびRAD53活性に依存する。このように、経路に及ぼす依存性が異なることによって、mEC1/RAD53経路の２つの機能的に異なる型、すなわち一つは複製ストレス条件下で指定される型、そしてもう一つはDNA損傷の存在下で指定される型が入力／反映される。
【０１１５】
実施例5．サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces serevisiae）におけるMEC1機能とチェックポイント反応に対する遺伝子的アプローチ
真核生物における重要な分子作用物質は、複製阻止およびDNA障害に反応した細胞の生存を維持するために重要である。出芽酵母における群の中に、チェックポイントトランスデューサーMEC1、ヒトチェックポイントキナーゼATMおよびATRの相同体が存在する。MEC1は、酵母における全てのDNA関連チェックポイント反応にとって必要である。チェックポイント反応におけるMEC1およびその他の遺伝子の役割に関しては多くのことがわかっていないが、驚くべきことに、MEC1経路の下流の機能のいくつかが同定されている。
【０１１６】
mec1変異体による合成致死スクリーニングによって、細胞が生存のためにMEC1機能を必要とする２つの基礎的なシナリオが明らかとなる：（a）細胞がおそらく慢性的な複製阻止を経験する場合のdNTP合成における欠損；および（b）細胞が慢性的なDNA損傷を生じる可能性がある場合のラギング鎖DNA合成における欠損。菌株のパネルに対するチェックポイント反応を部分的に欠損するmec1合成致死変異体の最初の試験は、転写調節因子DUN1がdNTP要件によって細胞を維持するために重要な役割を果たすが、DNA合成変異体の生存率にはほとんどまたは全く影響を及ぼさないことを示している。
【０１１７】
dNTPが限定的である場合に調節にとって重要であるMEC1の新しい標的を追求するために、ヒドロキシ尿素（dNTP合成阻害剤）の存在下において、またはRNR1（リボヌクレオチドレダクターゼの大サブユニット）の変異において、致死性を求める２つの過剰発現致死性スクリーニングを用いる。rnr1およびcdc8（dTMPキナーゼ）欠損に対して細胞を異なるように感作するが、cdc9（DNAリガーゼ）変異に対しては感作しないいくつかのプラスミドが同定されている。
【０１１８】
これらの３つのアプローチは、生物学的偶然性としてチェックポイントの重要な局面を明らかにし、同様にCdk1の調節を排除するチェックポイント停止に対する出芽酵母のアプローチに関してより多くのことを教示する。
【０１１９】
実施例6．酵母株のヒトcDNAライブラリとの相補性
本実施例において、MEC1タンパク質によって酵母における上記の合成致死性を置換するタンパク質をコードするヒトcDNAが同定される原理を提供する。GAL1プロモーターの制御下でMEC1遺伝子を含む酵母株を構築する。MEC1タンパク質はチェックポイントを通過するために必要であるため、この株は、GAL1プロモーターが誘導されるガラクトース上で増殖する；この株を例えばグルコース上で増殖させると、GAL1プロモーターが抑制され、MEC1タンパク質が作製されず、そして細胞は停止するかまたは死亡する。ヒト胎児線維芽細胞から調製したmRNAを用いるcDNAライブラリを、ヒトcDNAの発現に関してADHのような構成的酵母プロモーターを含むサッカロミセス・セレビジエ（S. serevisiae）ベクターにおいて構築する（詳しくは、米国特許第5,783,661号；第5,952,195号を参照のこと）。ライブラリを宿主MEC1酵母株にトランスフェクトして、かつグルコースまたはガラクトースでの増殖能に関して、独立した形質転換体105個をレプリカ平板法によってスクリーニングする。その増殖パターンがヒトcDNAの発現によって救出された結果、いくつかの形質転換体が単離される。それらのいくつかは既に既知の遺伝子である。
【０１２０】
実施例7．薬学的アンタゴニストおよびアゴニストのスクリーニング
本発明において同定された細胞周期またはDNA複製障害を治療するために有用な薬物を、現在では上記の確立された酵母モデルを用いてスクリーニングすることができる。化学化合物、有機化合物および無機化合物、ペプチド、またはペプチド模倣物、アンチセンス分子、抗体等のようないくつかの種類の薬物をスクリーニングすることができる。化学ライブラリーのハイスループットスクリーニングを作製および実施する方法は十分に確立されており、当業者に公知である。細胞周期調節において得られた見通しを用いて、酵母に基づくアッセイ法において選択された候補物質をスクリーニングするため、かつ哺乳類細胞または細胞株をさらに調べることによってその治療的可能性を評価するための薬物発見プログラムを確立する。これらの薬学的薬剤は、予測可能的に細胞周期の局面を理想的に阻害して、それによって癌またはその他の細胞周期関連臨床状態における有望性の決定を可能にすると考えられた。
【０１２１】
試験した化合物のいくつかは、薬学的に許容される濃度で活性であることが判明する。これらには、トリブチレート（4-フェニル酪酸ナトリウム塩、またはナトリウムフェニルブチレート）、当技術分野で公知の手段によって調製される様々なベンゾピラン誘導体が含まれるが、これらに限定されない。例えば、米国特許第5,359,115号；第5,362,899号；第5,288,514号；第5,733,920号または国際公開公報第94/08051号；国際公開公報第92/10092号；国際公開公報第93/09668号；国際公開公報第91/07087号；国際公開公報第93/20242号を参照のこと。したがって、本発明の化合物の1000個〜100,000個以上のオーダーのディバーソマー（diversomer）の多様なライブラリーを合成することができ、PCT国際公開公報第94/09135号に記載のように、阻害剤を検出するためのハイスループットアッセイ法を用いることによって、生物活性を迅速にスクリーニングすることができる。組み合わせ（combinatorial）合成方法の概論、ならびにライブラリースクリーニングおよび脱重畳積分解析方法に関しては、例えばE. M. ゴードン（Gordon)ら、（1994）J. Med. Chem. 37：1385〜1401、およびそれらに引用された参考文献を参照されたい。
【０１２２】
実施例8．良性細胞増殖または悪性細胞増殖による臨床病態の治療
次に、酵母に基づくアッセイ法において陽性とスクリーニングされた薬物を、過度の細胞増殖によって引き起こされる疾患の治療について試験する。そのような疾患のほとんどが悪性疾患、すなわち多様な種類の癌であり、以下のような固形腫瘍および白血病であるが、これらに限定されない：アプドーマ、分離腫、鰓腫、悪性カルチノイド症候群、カルチノイド心疾患、癌（例えば、ウォーカー癌、基底細胞癌、基底有棘細胞癌、ブラウン-ピアース（Brown-Pearce）癌、腺管癌、エールリッヒ腫瘍、クレブス2腫瘍、メルケル細胞腫、粘液性癌腫、非小細胞肺癌、燕麦細胞癌、乳頭状癌、硬性癌、細気管支癌、気管支原生癌、扁平上皮細胞癌、および移行上皮癌）、組織球障害、白血病（例えば、B細胞白血病、混合型白血病、ヌル細胞白血病、T細胞白血病、慢性T細胞白血病、HTLV-II関連白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、肥満細胞性白血病、および骨髄性白血病）、悪性組織球増殖症、ホジキン病、免疫増殖性小（immunoproliferative small）、非ホジキンリンパ腫、形質細胞腫、細網組織増殖症、黒色腫、軟骨芽細胞腫、軟骨腫、軟骨肉腫、線維腫、線維肉腫、巨細胞腫、組織球腫、脂肪腫、脂肪肉腫、中皮腫、粘液腫、粘液肉腫、骨腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、滑膜腫、腺線維腫、腺リンパ腫、癌肉腫、脊索腫、頭蓋咽頭腫、未分化胚細胞腫、過誤腫、間葉腫、中腎腫、筋肉腫、エナメル上皮腫、セメント質腫、歯牙腫、奇形種、胸腺腫、栄養膜腫（trophoblastic tumor）、腺癌、腺腫、胆管腫、コレステリン腫、円柱腫、嚢胞腺癌、嚢胞腺腫、顆粒膜細胞腫、男性胚細胞腫、肝癌、汗腺腫、島細胞腫（islet cell tumor）、ライディヒ細胞腫（Leydig cell tumor）、乳頭腫、セルトリ細胞腫、卵胞膜細胞腫、平滑筋腫、平滑筋肉腫、筋原細胞腫、筋腫、筋肉腫、横紋筋腫、横紋筋肉腫、脳室上皮腫、神経節細胞腫、神経膠腫、髄芽細胞腫、髄膜腫、神経鞘腫（neurilemmoma）、神経芽腫、神経上皮腫、神経線維腫、神経腫、傍神経節腫、非クロム親和性傍神経節腫（paraganglioma nonchromaffin）、被角血管腫、好酸球増多随伴性血管類リンパ組織増殖症、硬化性血管腫（angioma sclerosing）、血管腫症、グロムス血管腫、血管内皮腫、血管腫、血管外皮細胞腫、血管肉腫、リンパ管腫、リンパ管筋腫（lymphangiomyoma）、リンパ管肉腫、松果体腫、癌肉腫、軟骨肉腫、葉状嚢肉腫、線維肉腫、血管肉腫、平滑筋肉腫、白血肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、筋肉腫、粘液肉腫、卵巣癌、横紋筋肉腫、肉腫、新生物（例えば、骨新生物、胸部新生物、消化器系新生物、結腸直腸新生物、肝臓新生物、膵臓新生物、下垂体新生物、精巣新生物、眼窩新生物、頭頸部新生物、中枢神経新生物、耳道（acoustic）新生物、骨盤新生物、気道新生物、および尿性器新生物）、神経線維腫症、子宮頸部異形成。
【０１２３】
いくつかの疾患は、過度だが良性の細胞増殖（すなわち、非悪性）によって起こる。そのような疾患の例は、以下である：線維症、良性前立腺過形成、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、糸球体硬化症、ケロイド、乾せん、黒子、角化症、線維性軟疣、伝染性軟属腫、性病いぼ、皮脂腺過形成（sebaceous hyperplasia）、尖圭コンジローム、血管腫、静脈湖、軟骨皮膚炎（chondrodermatitis）、化膿性肉芽腫、化膿性汗腺炎、ケロイド、角化棘細胞腫、白斑症、多発性皮脂嚢腫、睫毛乱生症、表層上皮母斑（superficial epithelial nevus）、ポリープ、接合部母斑（junctional nevus）、化膿性肉芽腫、結節性痒疹、皮膚線維腫、脂腺腫、およびその他の皮膚疾患、ならびに例えばカポジ肉腫、乳頭腫のような非悪性新生物疾患。
【０１２４】
次に、ナトリウムフェニルブチレートまたはベンゾピラン誘導体の効果を、インビボにおけるヒト神経膠芽細胞腫細胞の腫瘍発生表現型について決定する。フィッシャー344系ラットの右脳半球の深部白質に同系9L神経膠肉腫細胞（4×104個）を接種した。その後、皮下に移植した浸透圧ミニポンプを用いて、動物をナトリウムフェニルブチレート（550 mg/kg/日、皮下投与）による2週間連続治療に供した。対照のラットにおいてはミニポンプを生理食塩水で満たした。データの統計分析には、フィッシャーの正確検定（Fisher's Exact Test）を用いた。薬物による神経膠芽腫細胞の処理によって、時間および用量依存的な増殖の停止が起こり、これに付随して同様にDNA合成も減少した。4mMフェニルブチレートによる連続的な処理を4日〜6日行うと、増殖が約50％阻害される。フェニルアセテートの中間代謝物であるフェニルブチレートは腫瘍細胞複製を阻害したが、最終代謝物であるフェニルアセチルグルタミンは不活性である。選択的な腫瘍の細胞分裂の停止に加えて、フェニルアセテートとフェニルブチレートはいずれも、無胸腺マウスにおける細胞骨格中間体フィラメントのパターンの変化、接着独立性の喪失、および腫瘍形成性の減少によって明らかになるように、細胞の成熟および非悪性表現型への変換を促進した。腫瘍の挙動におけるこれらの顕著な変化は、増殖制御、血管新生、および免疫抑制に関係するサイクリン遺伝子の発現の変化を伴う。
【０１２５】
実施例9．酵母感染症を治療する方法
上記のように、これらの化合物は、膣のマイクロフローラバランスを混乱させることなく、女性が酵母感染症を制御するために有効に用いることができる。化合物は、創傷周辺のカンジダ菌を制御するために用いてもよい。その他の酵母菌は、限定されないが、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・ステラトイデア（Candida stellatoidea）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、カンジダ・パラシローシス（Candida parapsilosis）、カンジダ・クルセイ（Candida krusei）、カンジダ・シュードトロピカリス（Candida pseudotropicalis）、カンジダ・キラーモンディ（Candida quillermondii）、カンジダ・ルゴサ（Candida rugosa）、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・フラブス（Aspergillus flavus）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、リゾプス・アリズス（Rhizopus arrhizus）、リゾプス・オリザ（Rhizopus oryzae）、アブシジア・コリムビフェラ（Absidia corymbifera）、アブシジア・ラモサ（Absidia ramosa）、およびムコール・プシルス（Mucor pusillus）、またはその組み合わせを含む治療標的として、等しく適している。
【０１２６】
本研究において、罹患患者５人に薬剤を含む膣坐剤を１日５回局所投与した。その結果、３日後にはいかなる患者にも酵母感染症が認められない。同様に、これらの患者のいずれにもいかなる種類の不都合な反応も認められなかった。この点に関して、本発明による局所的投与が、治療される領域には限定されないことを理解されるべきである。本発明の薬学的組成物は、その他の手段、例えば経口、静脈内等によって送達された場合に、酵母感染症を治療または予防するために、等しく適している。
【０１２７】
実施例10．第二の遺伝子の単離
第二の遺伝子の単離および特徴付けを記載する下記の実施例は、本発明の遺伝子を単離するための一般的アプローチの例である。遺伝子の単離によって、当業者は酵母およびその他の微生物種における相同的な遺伝子を容易に単離することができる。次に、単離された遺伝子を用いて、関心対象の遺伝子を変化させるために組換えベクターを構築することができる。
【０１２８】
一般的に、下記の組換えDNA技術における学術用語および実験技法は、当技術分野で周知であり、一般的に用いられている。クローニング、DNAおよびRNAの単離、増幅および精製に関して、標準的な技術を用いる。一般的に、DNAリガーゼ、DNAポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、シークエンシング等を含む酵素反応を製造元の仕様に従って行う。これらの技術および様々なその他の技術は、一般的にサムブルックら（Sambrook、「分子のクローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning：A Laboratry Manual）」、コールドスプリングハーバー研究所、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（1989））に従って行われる。
【０１２９】
第二の遺伝子の単離は、多くの技術によって行ってもよい。例えば、標的遺伝子のトランスポゾン標識法は、関連する遺伝子の単離を補助することができる。トランスポゾン標識法は、トランスポゾンを宿主に導入することを含み、それによって標的遺伝子の変異および宿主における検出可能な表現型の変化が起こる。トランスポゾンのプローブを用いて、変異遺伝子を単離することができる。単離した変異体遺伝子におけるトランスポゾンに隣接するDNAをプローブとして用いて、標的遺伝子の正常な野生型対立遺伝子を単離することができる。特に有用なトランスポゾン標識系は、例えば米国特許第5,013,658号に開示されている。
【０１３０】
もう一つの方法は、cDNAまたはゲノムDNAライブラリにおいて、所望の遺伝子を同定するためにオリゴヌクレオチドプローブを用いる。ゲノムライブラリを構築するために、ランダムな断片化によって、例えば、制限エンドヌクレアーゼを用いて、ゲノムDNAの大きいセグメントを作製し、ベクターDNAにライゲーションして、適当なベクターにパッケージングすることができるコンカテマーを形成する。cDNAライブラリを調製するためにmRNAを単離し、遺伝子転写物を含むcDNAライブラリをmRNAから調製する。または、cDNAを第二の遺伝子または相同体が発現されるその他の細胞から抽出したmRNAから調製してもよい。
【０１３１】
cDNAまたはゲノムライブラリは、酵母の遺伝子バンクデータベースにおいて示されるように、クローニングした第二の遺伝子の配列に基づいてプローブを用いてスクリーニングすることができる。プローブを用いてゲノムDNAまたはcDNA配列とハイブリダイズさせ、同じかまたは異なる植物種において、相同的な遺伝子を単離してもよい。相同的な遺伝子を同定するためにそのようなハイブリダイゼーション技術を用いることは、当技術分野で周知であり、さらに記述する必要はない。
【０１３２】
または、技術的な論文に記載されるように、周知の技術によってポリヌクレオチドを合成してもよい。相補鎖を合成し、かつ適当な条件で鎖をアニーリングすることによって、または適当なプライマー配列でDNAポリメラーゼを用いて相補鎖を付加することによって、二本鎖DNA断片を得てもよい。
【０１３３】
適当なポリペプチド発現が望ましい場合、コード領域の3'末端にポリアデニル化領域を含めなければならない。ポリアデニル化領域は、天然の遺伝子またはその他の多様な遺伝子から由来することができる。
【０１３４】
第二の遺伝子からの配列を含むベクターは典型的に、酵母細胞に選択可能な表現型を付与するマーカー遺伝子を含むと考えられる。例えば、マーカーは、生物駆除剤（biocide）抵抗性、特に、カナマイシン、G418、ブレオマイシン、ヒグロマイシンに対する抵抗性のような抗生物質抵抗性、またはその他の従来の抵抗性をコードしてもよい。そのようなDNA構築物は、多様な従来の技術によって所望の宿主のゲノムに導入してもよい。例えば、DNA構築物を、電気穿孔法およびマイクロインジェクションのような技術を用いて宿主細胞のゲノムDNAに直接導入してもよく、またはDNA構築物は、DNA微粒子銃のような弾道的な方法を用いて直接導入することができる。または、DNA構築物は、適したDNA隣接領域と組み合わせて、かつ従来の宿主ベクターに導入してもよい。マイクロインジェクション技術は当技術分野で既知であり、科学文献および特許文献に十分に記載されている。
【０１３５】
実施例10  MEC1合成致死スクリーニング：代表的な対立遺伝子
【表１】
2005509425.tif 000002
遺伝子＝mec1Δ合成致死スクリーニングに由来
交配＝候補交配に由来
文献＝これまでに公表されたmec1変異との相互作用
【０１３６】
上記に引用したインターネットの典拠、特許、出版物、およびその中に含まれる引用文献は全て、それぞれの全体を参照するために特に参照として本明細書に組み入れられる。
【０１３７】
以上のように本発明を説明したが、これが様々に変化させられうることは明らかであろう。そのような変更は、本発明の趣旨および範囲から逸脱しないと見なされ、そのような改変は全て、添付の特許請求の範囲に含まれると解釈される。
【国際調査報告】
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