(57)【要約】本発明はヒト酸化還元酵素（ＯＸＩＲＤ）およびＯＸＩＲＤを同定し、コードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、発現ベクター、宿主細胞、抗体、アゴニストおよびアンタゴニストをも提供する。本発明はまた、ＯＸＲＤの異常発現に関連する疾患を診断、治療または予防する方法をも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）乃至（ｄ）からなる群から選択した単離されたポリペプチド。
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％が同一であるような天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片
（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片
【請求項２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
請求項１のポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項２のポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４−６を有する群から選択したポリヌクレオチド配列を含む請求項４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項３に記載のポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞。
【請求項８】
請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを含む遺伝形質転換体。
【請求項９】
請求項１のポリペプチドを生産する方法であって、
（ａ）前記ポリペプチドの発現に好適な条件下で、請求項１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーター配列を持つ組換えポリヌクレオチドで形質転換される細胞を培養する過程と、
（ｂ）そのように発現した前記ポリペプチドを回収する過程とからなり、前記組換えポリヌクレオチドが、請求項１に記載の前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーター配列を有することを特徴とする方法。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３からなる群から選択したアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に記載のポリペプチドと特異的に結合する単離された抗体。
【請求項１２】
以下の（ａ）乃至（ｅ）からなる群から選択した単離されたポリヌクレオチド。
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４−６からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４−６を有する群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％が同一であるような天然のポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｄ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のＲＮＡ等価物
【請求項１３】
請求項１２に記載のポリヌクレオチドの少なくとも６０の連続したヌクレオチドを持つ単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１２のポリヌクレオチドの配列を持つ標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
（ａ）前記サンプル中の前記標的ポリヌクレオチドに相補的な配列を持つ少なくとも２０の連続したヌクレオチドを持つプローブを用いて前記サンプルをハイブリダイズする過程と、前記プローブと前記標的ポリヌクレオチドあるいはその断片との間でハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で、プローブが前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズすることを特徴とする過程と、
（ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出し、該複合体が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程、とを含む方法。
【請求項１５】
前記プローブが少なくとも６０の連続したヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１２のポリヌクレオチドの配列を持つ標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、
（ｂ）前記の増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の存在・不存在を検出し、該標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１に記載のポリペプチドと、薬剤として許容できる賦形剤とを含む組成物。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１７の組成物。
【請求項１９】
機能的なＯＸＲＤの発現の低下に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療が必要な患者に請求項１７の組成物を投与することを含むことを特徴とする治療方法。
【請求項２０】
請求項１に記載のポリペプチドのアゴニストとして有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝すステップと、
（ｂ）前記サンプルにおいてアゴニスト活性を検出するステップとを含むことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法によって同定したアゴニスト化合物と薬剤として許容できる賦形剤とを含む組成物。
【請求項２２】
機能的なＯＸＲＤの発現の低下に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療が必要な患者に請求項２１の組成物を投与することを含むことを特徴とする治療方法。
【請求項２３】
請求項１に記載のポリペプチドのアンタゴニストとして有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝すステップと、
（ｂ）前記サンプルにおいてアンタゴニスト活性を検出するステップとを含むことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法によって同定したアンタゴニスト化合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを含む組成物。
【請求項２５】
機能的なＯＸＲＤの過剰な発現に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療が必要な患者に請求項２４の組成物を投与することを含むことを特徴とする治療方法。
【請求項２６】
請求項１に記載のポリペプチドに特異結合する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１のポリペプチドを適切な条件下で少なくとも１つの試験化合物に混合させる過程と、
（ｂ）請求項１のポリペプチドの試験化合物との結合を検出し、それによって請求項１のポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程を含む方法。
【請求項２７】
請求項１に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１のポリペプチドの活性が許容される条件下で、請求項１のポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物に混合させる過程と、
（ｂ）請求項１に記載のポリペプチドの活性を試験化合物の存在下で算定する過程と、
（ｃ）試験化合物の存在下での請求項１のポリペプチドの活性を、試験化合物の不存在下での請求項１のポリペプチドの活性と比較する過程を含み、試験化合物の存在下での請求項１のポリペプチドの活性の変化が、請求項１のポリペプチドの活性を調節する化合物を標示するような方法。
【請求項２８】
請求項５の配列を含む標的ポリヌクレオチドの発現を変化させるのに効果的な化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）前記標的ポリヌクレオチドの発現に好適な条件下で、該標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝露する過程と、
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドの発現改変を検出する過程と、
（ｃ）可変量の前記化合物の存在下と前記化合物の不存在下で、前記標的ポリヌクレオチドの発現を比較する過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項２９】
試験化合物の毒性を算定する方法であって、
（ａ）核酸を含む生物学的サンプルを前記試験化合物で処理する過程と、
（ｂ）処理した前記生物学的サンプルの核酸と、請求項１２のポリヌクレオチドの少なくとも２０の連続するヌクレオチドを持つプローブをハイブリダイズさせる過程であって、このハイブリダイゼーションゼーションが、前記プローブと前記生物学的サンプル中の標的ポリヌクレオチドとの間で特異的なハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で行われ、前記標的ポリヌクレオチドが、請求項１２のポリヌクレオチドまたはその断片のポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドである、前記過程と、
（ｃ）ハイブリダイゼーション複合体の収量を定量する過程と、
（ｄ）前記処理された生物学的サンプル中のハイブリタイゼーション複合体の量を、処理されていない生物学的サンプル中のハイブリタイゼーション複合体の量と比較する過程とを含み、前記処理された生物学的サンプル中のハイブリタイゼーション複合体の量の差が、前記試験化合物の毒性を標示するような方法。
【請求項３０】
生物学的サンプル中のＯＸＲＤ の発現に関連する症状または疾患に対する診断試験法であって、
（ａ）前記生物学的サンプルと請求項１１の抗体との混合を、前記抗体が前記ポリペプチドに結合し、抗体とポリペプチドとの複合体を形成するのに適した条件下で行う過程と、
（ｂ）前記複合体を検出する過程とを含み、前記複合体の存在が、前記生物学的サンプル中の前記ポリペプチドの存在と相関することを特徴とする方法。
【請求項３１】
前記抗体が、
（ａ）キメラ抗体
（ｂ）単鎖抗体
（ｃ）Ｆａｂ断片
（ｄ）Ｆ（ａｂ’）２ 断片
（ｅ）ヒト化抗体、のいずれかである抗体。
【請求項３２】
請求項１１に記載の抗体と、許容できる賦形剤とを含む組成物。
【請求項３３】
被検者のＯＸＲＤ の発現に関連する病状又は疾患の診断方法であって、請求項３２に記載の化合物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３４】
前記抗体が標識されることを特徴とする請求項３２に記載の組成物。
【請求項３５】
被検者のＯＸＲＤ の発現に関連する病状又は疾患の診断方法であって、請求項３４に記載の化合物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項１１に記載の抗体の特異性を有するポリクローナル抗体を調製する方法であって、
（ａ）抗体反応を誘発する条件下で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３を有する群から選択したアミノ酸配列またはその免疫原性断片を含むポリペプチドを用いて動物を免疫化する過程と、
（ｂ）前記動物から抗体を単離する過程と、
（ｃ）    前記単離された抗体を前記ポリペプチドでスクリーニングし、それによって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドに特異結合するポリクローナル抗体を同定する過程とを含むような方法。
【請求項３７】
請求項３６に記載の方法で産出したポリクローナル抗体。
【請求項３８】
請求項３７のポリクローナル抗体と好適なキャリアとを含む組成物。
【請求項３９】
請求項１１に記載の抗体の特異性を有するモノクローナル抗体を作製する方法であって、
（ａ）抗体反応を誘発する条件下で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３を有する群から選択したアミノ酸配列またはその免疫原性断片を含むポリペプチドを用いて動物を免疫化する過程と、
（ｂ）前記動物から抗体産出細胞を単離する過程と、
（ｃ）前記抗体産出細胞と不死化した細胞とを融合して、モノクローナル抗体を産出するハイブリドーマ細胞を形成する過程と、
（ｄ）前記ハイブリドーマ細胞を培養する過程と、
（ｅ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異結合するようなモノクローナル抗体を前記培養から単離する過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項３９に記載の方法で産出したモノクローナル抗体。
【請求項４１】
請求項４０に記載のモノクローナル抗体と適切なキャリアとを含む組成物。
【請求項４２】
Ｆａｂ発現ライブラリをスクリーニングすることにより産出されることを特徴とする請求項１１に記載の抗体。
【請求項４３】
組換え免疫グロブリンライブラリのスクリーニングにより前記抗体を産出することを特徴とする請求項１１に記載の抗体。
【請求項４４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドを検出する方法であって、
（ａ）請求項１１に記載の抗体と前記ポリペプチドとの特異結合を許容する条件下で、前記抗体と１サンプルとをインキュベートする過程と、
（ｂ）特異結合を検出する過程とを含み、該特異結合が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドがサンプル中に存在することを標示することを特徴とする方法。
【請求項４５】
或るサンプルからの、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドを精製する方法であって、
（ａ）請求項１１に記載の抗体と前記ポリペプチドとの特異結合を許容する条件下で、前記抗体と１サンプルとをインキュベートする過程と、
（ｂ）前記サンプルから前記抗体を分離し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３からなる群から選択したアミノ酸配列を有する精製ポリペプチドを得る過程、とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４６】
マイクロアレイの少なくとも１つのエレメントが請求項１３に記載のポリヌクレオチドであることを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項４７】
ポリヌクレオチドを含むサンプルの発現プロフィールを作成する方法であって、
（ａ）サンプル中のポリヌクレオチドを標識化する過程と、
（ｂ）ハイブリダイゼーション複合体が形成されるのに適した条件下で請求項４６のマイクロアレイのエレメントとサンプル中の標識化ポリヌクレオチドとを接触させる過程と、
（ｃ）サンプル中のポリヌクレオチドの発現を定量する過程とを含む方法。
【請求項４８】
固体基板上の固有の物理的位置に付着された種々のヌクレオチド分子を含むアレイであって、少なくとも１つの前記ヌクレオチド分子が、標的ポリヌクレオチドの少なくとも３０の連続したヌクレオチドと特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを有し、前記の標的ポリヌクレオチドが請求項１２に記載のポリヌクレオチドであることを特徴とするアレイ。
【請求項４９】
請求項４８に記載のアレイで、前記の最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの配列が前記の標的ポリヌクレオチドの少なくとも３０の連続したヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
【請求項５０】
請求項４８に記載のアレイで、前記の最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの配列が前記の標的ポリヌクレオチドの少なくとも６０の連続したヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
【請求項５１】
請求項４８に記載のアレイで、前記の最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの配列が前記の標的ポリヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
【請求項５２】
請求項４８に記載のアレイで、マイクロアレイであることを特徴とするアレイ。
【請求項５３】
請求項４８に記載のアレイで、前記のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの最初の配列を含むヌクレオチド分子にハイブリダイズした前記の標的ポリヌクレオチドを有することを特徴とするアレイ。
【請求項５４】
請求項４８に記載のアレイで、リンカーが少なくとも１つの前記のヌクレオチド分子と前記の固体基板を連結していることを特徴とするアレイ。
【請求項５５】
請求項４８に記載のアレイで、基板上の固有の物理的位置の各々が複数のヌクレオチド分子を含み、任意の単一の固有の物理的位置でのその複数のヌクレオチド分子は同一の配列を有し、基板上の固有の物理的位置の各々は、基板上の別の固有の物理的位置でのヌクレオチド分子の配列とは異なる配列を有するヌクレオチド分子を含むことを特徴とするアレイ。
【請求項５６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、オキシドレダクターゼの核酸配列及びアミノ酸配列に関する。 本発明はまた、これらの配列を利用した細胞増殖異常、神経疾患、代謝異常、および平滑筋疾患の診断・治療・予防に関する。 本発明はさらに、オキシドレダクターゼの核酸配列及びアミノ酸配列の発現における外来性化合物の効果についての評価に関する。
（発明の背景）
【０００２】
真核細胞は総称して好気的代謝と呼ばれる一連の複雑な酸化還元反応により、エネルギーの抽出を行い、高分子を合成する。好気的代謝の１つの結果は、スーパーオキシド（Ｏ２・−）とヒドロキシル・イオン（ＯＨ・）の形態のフリーラジカルの産生である。スーパーオキシドは、電子伝達鎖における正しい経路から電子の「漏出」がＯ２へ起こる結果として、ミトコンドリアと小胞体によって細胞内で産生される。ヒドロキシルイオンは、電離放射線及び鉄含有部位または銅含有部位でのＯ２・−と過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の反応により産生される。フリーラジカル、特にヒドロキシルイオンは極端に反応性があり、タンパク質、糖質、ＤＮＡ、脂質等ほとんどすべての分子と相互作用し得る。これらの相互作用により、リン脂質ヒドロペルオキシド等の非ラジカル・ヒドロペルオキシドの形成が可能となる。ヒドロキシルイオンとＤＮＡの相互作用は、年齢依存性の癌発生に重要な寄与を与え得る。細胞は、チトクロームＰ４５Ｏを介する酸化、平滑筋緊張状態の調節、およびマクロファージと顆粒球による微生物の死滅等の有益な方法でフリーラジカルとその誘導体を使用することもある（Ｂａｓｔ， Ａ．他 （１９９１） Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ． ９１（３Ｃ）：２Ｓ−１３Ｓ）。
【０００３】
細胞における酸化還元反応が関係する酵素（オキシドレダクターゼ）に欠陥が起こると、細胞内での酸化潜在性の不均衡を引き起こし、しばしば症状の発現をもたらす。例えば、スーパーオキシド化合物を解毒する酵素であるスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）の過剰は、ダウン症候群として知られる臨床症状に関連する。抗酸化物質のレベルが低くなったり、Ｏ２・−及びＨ２Ｏ２のレベルが高くなると、酸化ストレスを生む。慢性炎症の部位で食細胞により誘発される酸化ストレスは、関節におけるリウマチ様関節炎と腸における炎症性腸疾患を引き起こす。喘息も肺における炎症反応の症状であり、酸素フリーラジカル形成に関連する（Ｓｉｅｓ， Ｈ． （１９９１） Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ． ９１ （３Ｃ）：３１Ｓ−３８Ｓ）。
【０００４】
酸化と還元に関与するタンパク質は、細胞内の合成、触媒反応、回収、解毒において特定の機能をも有する。これらの酵素の欠陥によって、細胞内に有毒前駆物質分子の蓄積または細胞生存に重要な化合物の合成の失敗を引き起こす可能性がある（下記の実例参照）。天然の基質上での活性に加えて、オキシドレダクターゼも薬剤代謝と薬物動態に密接に関連する。薬剤代謝における遺伝的な差異が、個々の人間において薬剤効果および毒性のレベルの著しい違いを引き起こす。治療指数が狭い薬剤、またはコデイン等の生理活性を必要とする薬剤の場合、このような遺伝子多型は極めて重要である。更に、有望な新規の薬剤が、一部の患者群のみに副作用を引き起こすという毒性から臨床試験で排除されることがよくある。薬剤代謝酵素が重要な部分を占める薬理ゲノミックス研究が進歩すれば、薬剤の効果および毒性の疑問に耐え得るツールが発展し、そのような情報が拡大されるであろう（Ｅｖａｎｓ， Ｗ． Ｅ．およびＲ． Ｖ． Ｒｅｌｌｉｎｇ （１９９９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６ ：４８７−４９１を参照）。
【０００５】
先天性および後天性遺伝病と薬剤代謝に関連する選択されたオキシドレダクターゼ（すなわち、グルタチオン・ペルオキシダーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、グルタレドキシン、ペルオキシソームβ酸化酵素、タンパク質二硫化物イソメラーゼ、チオレドキシン、アルド／ケト還元酵素、アルデヒド・デヒドロゲナーゼ、アルコール・デヒドロゲナーゼ、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、リボヌクレオチドニリン酸還元酵素、ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ、１５−オキソプロスタグランジン １３−還元酵素、１５−ヒドロキシプロスタグランジンデヒドロゲナーゼ、グルコース−メタノール−コリンオキシドレダクターゼ、およびその他の分泌レドックス・タンパク質）の特性を下記に記載する。
【０００６】
グルタチオン・ペルオキシダーゼ
グルタチオン・ペルオキシダーゼのファミリーは、３つの四量体グルタチオン・ペルオキシダーゼ（ＧＰｘ１−３）と単量体リン脂質ヒドロペルオキシド・グルタチオン・ペルオキシダーゼ（ＰＨＧＰｘ／ＧＰｘ４）を含む。四量体酵素とＧＰｘ４の間の全体的な相同性は３０％未満であるが、活性部位に関連する著しい類似性をクラスタで検出した。また共通の触媒トライアッドを構造的及び運動データにより定義した（Ｅｐｐ， Ｏ．他 （１９８３） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １３３：５１−６９）。ファミリーメンバーは異なる組織分布を示す。ＧＰｘ１は細胞内に普遍的にに発現するが、ＧＰｘ２は肝臓と結腸に存在し、またＧＰｘ３は原形質に存在する。ＧＰｘ４はすべての組織で低レベルで見出されるが、精巣で高レベルで発現する。これらの組織局在性パターンは、グルタチオン・ペルオキシダーゼ活性のレベルと標的を調節するために重要になり得る（Ｕｒｓｉｎｉ， Ｆ 他 （１９９５） Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２５２：３８−５３）。
【０００７】
ＧＰｘ４は構造と活性の両者において固有である。ＧＰｘ４は哺乳動物で見出される、唯一の単量体グルタチオン・ペルオキシダーゼである。またリン脂質ヒドロペルオキシドとの強い親和性と反応性を示し、膜結合する唯一の哺乳動物のグルタチオン・ペルオキシダーゼでもある。ＧＰｘ４による脂質過酸化の阻害には、生理学的レベルのグルタチオンとビタミンＥが必要となり、ＧＰｘ４とビタミンＥの酸化防止活性のための連繋メカニズムと思われる。ＧＰｘ４はまた、細胞内局在性を決定する別の転写開始部位と翻訳開始部位を有する（Ｅｓｗｏｒｔｈｙ， Ｒ．Ｓ．他 （１９９４） Ｇｅｎｅ １４４：３１７−３１８、Ｍａｉｏｒｉｎｏ， Ｍ．ら． （１９９０） Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８６：４４８−４５０）。
【０００８】
グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）
グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）は、生体異物の生体内変化と解毒、薬剤代謝、過酸化損傷に対する組織保護における重要な生化学的機能を実施する、二重基質特異性を有する酵素の普遍的なファミリーである。これらの酵素によって触媒される基本的な反応は、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）と求電子体の抱合であり、その結果化学物質の活性化または不活性化／解毒のどちらかが起こる。還元型のＧＳＨが広範囲の化学物質に結合する絶対的な必要性があるため、様々な生物と細胞の種類でＧＳＴ構造の多様性を必要とする。
【０００９】
ＧＳＴはホモ二量体またはヘテロ二量体タンパク質であって、細胞サイトゾルに局在化する。主なイソ酵素は、共通の構造および触媒特性を共有し、イソ酵素は、主にα、μ、π、およびθの４つのクラスに分類される。２つの最も大きなクラスであるαおよびμは、それぞれの等電点（αはｐＩが７．５〜９．０まで、μはｐＩが約６．６）によって同定される。それぞれのＧＳＴは、ＧＳＨに対する共通の結合部位と異なる疎水性結合部位を有する。それぞれのイソ酵素における疎水性結合部位は、特定の求電子性基質に対して特異的である。ＧＳＴ内の特定のアミノ酸残基が、これらの結合部位および触媒活性に重要であると同定された。Ｑ６７、Ｔ６８、Ｄ１０１、Ｅ１０４、およびＲ１３１の各残基は、ＧＳＨの結合に重要である（Ｌｅｅ， Ｈ−Ｃ他 （１９９５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：９９−１０９）。Ｒ１３、Ｒ２０、およびＲ６９の各残基はＧＳＴの触媒活性に重要である（Ｓｔｅｎｂｅｒｇ Ｇ他（１９９１） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２７４：５４９−５５５）。
【００１０】
ＧＳＴは通常、潜在的な変異誘発性物質と発癌性の化学物質の不活性化と解毒において重要な機能を実施するが、ＧＳＴの機能障害または不適切な発現は有害である。ラットとヒトのＧＳＴの内には、信頼できる発癌の新生物発生前マーカーもある。変異誘発性を調べるための良く知られたエイムス試験に用いられるサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）などの細菌株におけるヒトＧＳＴの発現は、変異誘発におけるこれらの酵素の役割を決定するのに役立つ。マウスにおいて肝腫瘍を引き起こすジハロメタンは、ＧＳＴによって活性化されると考えられている。この考えは、ジハロメタンが非形質転換細胞よりもヒトＧＳＴを発現する形質転換した細菌細胞において突然変異誘発性が高いということから支持される（Ｔｈｉｅｒ， Ｒ．他 （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：８５６７−８０）。二臭化エチレンおよび二塩化エチレンの変異誘発性が、ヒトαＧＳＴ，Ａ１−１を発現する細菌細胞において上昇する一方、アフラトキシンＢ１の変異誘発がＧＳＴの発現が促進されることで実質的に減少する（Ｓｉｍｕｌａ， Ｔ． Ｐ．他（１９９３） Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ １４：１３７１−１３７６）。従って、ＧＳＴ活性の制御が、変異誘発および発癌の制御において有用であろう。
【００１１】
ＧＳＴは、多剤耐性（ＭＤＲ）として知られる現象である多くの癌の薬剤治療に対する耐性獲得に関係する。ＭＤＲは、シクロホスファミドなどの細胞毒で治療を受けた癌患者に起こり、その薬剤に対する耐性を有するようになった後、更にその他の様々な細胞毒に対しても耐性を有するようになる。ＧＳＴレベルの上昇は、これらの薬剤耐性癌に関係し、薬剤に応答してＧＳＴレベルが上昇した後、ＧＳＴによって触媒されたＧＳＨ抱合反応によりその薬剤が不活化されると考えられる。次に上昇したＧＳＴレベルにより癌細胞がＧＳＴが親和性を有する細胞毒剤から保護される。腫瘍におけるＡ１−１のレベルの上昇は、シクロホスファミド治療によって生じた薬剤耐性に関係する（Ｄｉｒｖｅｎ Ｈ． Ａ．他 （１９９４） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５４：６２１５−６２２０）。従って、癌組織におけるＧＳＴ活性の調節は、癌患者のＭＤＲ治療に有用であろう。
【００１２】
グルタレドキシン
細胞増殖中のＤＮＡ合成に必要な対応するデオキシリボヌクレオチドへのリボヌクレオチドの還元は、リボヌクレオチドニリン酸還元酵素によって触媒される。グルタレドキシンは、リボヌクレオチドニリン酸還元酵素のグルタチオン（ＧＳＨ）依存水素供与体であり、活性部位コンセンサス配列−Ｃ−Ｐ−Ｙ−Ｃ−を含む。この配列は、大腸菌、ワクシニアウイルス、酵母菌、植物、哺乳動物細胞等の異なる生物からのグルタレドキシンで保存されている。グルタレドキシンは、ＧＳＨ、ＮＡＤＰＨ、ＧＳＨ−レダクターゼとの共有系で固有のＧＳＨ−ジスルフィド・オキシドレダクターゼ（チオールトランスフェラーゼ）活性を有し、タンパク質の他に低分子量ジスルフィドの還元を触媒する。グルタレドキシンは、チオレドキシンに類似の効果的なタンパク質ジスルフィドレダクターゼとして、また特異なＧＳＨ−混合ジスルフィドレダクターゼとして共に作用することにより一般的なタンパク質活性のチオールレドックス調節を与えると提案されてきた（Ｐａｄｉｌｌａ， Ｃ．Ａ．他 （１９９６） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３７８：６９−７３）。
【００１３】
ＤＮＡ合成と細胞分裂における重要な役割に加えて、グルタレドキシンと他のチオプロテインは酸素ラジカルと過酸化水素に対する有効な酸化防止を提供する（Ｓｃｈａｌｌｒｅｕｔｅｒ， Ｋ．Ｕ．及びＪ．Ｍ． Ｗｏｏｄ （１９９１） Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｒｅｓ． １：１５９−１６７）。グルタレドキシンは、ｉｎ ｖｉｖｏでタンパク質の脱チオール化に関与する主な薬剤であり、正常なヒト好中球でデヒドロアスコルビン酸を還元する（Ｊｕｎｇ， Ｃ．Ｈ及びＪ．Ａ． Ｔｈｏｍａｓ （１９９６） Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ３３５：６１−７２、Ｐａｒｋ， Ｊ．Ｂ及びＭ． Ｌｅｖｉｎｅ （１９９６） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３１５：９３１−９３８）。
【００１４】
分泌されるレドックス・タンパク質
レドックス・ポリペプチドも細胞外環境に放出され、細胞内相同体と比較して類似または特有の機能を持ち得る。成人Ｔ細胞白血病由来因子、３Ｂ６−インターロイキン−１、Ｔ−ハイブリドーマ由来（ＭＰ−６） Ｂ細胞刺激因子、および早期妊娠因子などの複数のサイトカインまたは分泌性サイトカイン様因子がチオレドキシンと同一であると報告されてきた（Ｈｏｌｍｇｒｅｎ， Ａ． （１９８５） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５４：２３７−２７１、Ａｂａｔｅ， Ｃ 他（１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１１５７−１１６１、Ｔａｇａｙａ， Ｙ． 他（１９８９） ＥＭＢＯ Ｊ． ８：７５７−７６４、Ｗａｋａｓｕｇｉ， Ｈ． （１９８７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４：８０４−８０８、Ｒｏｓｅｎ， Ａ． 他 （１９９５） Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ７：６２５−６３３）。従って刺激したリンパ球により分泌されたチオレドキシン（Ｙｏｄｏｉ， Ｊ．及びＴ． Ｔｕｒｓｚ （１９９１） Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５７：３８１４１１、Ｔａｇａｙａ， Ｎ．他（１９９０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：８２８２８２８６）は、細胞成長の調節因子と免疫系のメディエーターとしての役割を含む細胞外活性を有する（Ｍｉｒａｎｄａ−Ｖｉｚｕｅｔｅ， Ａ．他 （１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：１９０９９−１９１０３、Ｙａｍａｕｃｈｉ， Ａ．他 （１９９２） Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２９：２６３−２７０）。
【００１５】
セレン含有タンパク質チオレドキシンレダクターゼは、正常また新生物性細胞の両者により分泌される。また成長因子としてそしてアポトーシスに関係するポリペプチドの両者として関与すると考えられている（Ｓｏｄｅｒｂｅｒｇ， Ａ．他 （２０００） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６０：２２８１２２８９）。ハムスター卵巣細胞（ＨＴ−１０８０）により分泌された細胞外プラスミンレダクターゼが、プラスミンからのアンギオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）の生成に関与することを示されている。この場合、プラスミンジスルフィド結合の還元は、血管形成阻害薬であるアンギオスタチンを産生するプラスミンのタンパク質分解切断を誘発する（Ｓｔａｔｈａｋｉｓ， Ｐ．他 （１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：２０６４１２０６４５）。原形質における低レベルの還元したスルフヒドリル基は、関節リューマチに関連付けられてきた。スルフヒドリル基が活性酸素の類（例えば活性化好中球により産生する過酸化水素）を除去できなくなると、周囲の組織に酸化的な傷害が起こり、結果として炎症を引き起こす（Ｈａｌｌ， Ｎ．Ｄ．他 （１９９４） Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ． Ｉｎｔ． ４：３５３８）。
【００１６】
タンパク質二硫化物イソメラーゼ、チオレドキシンおよびグルタレドキシン
細胞は、ジスルフィド結合の形成を調整することによりタンパク質２次及び３次構造の形成を助ける多数の特殊な分子を含む。還元されて折り畳まれていないタンパク質が、酸化されたチオールと還元されたチオールを所定の比で含むバッファー中でインキュベートされると生来のコンフォーメーションを引き起こすが、折り畳みの速度は遅く、生来のコンフォーメーションの達成度はサイズとタンパク質中のシステインの数に比例して減少する。真核生物の小胞体や原核生物のペリプラスム間隙などの特定の細胞区画は、周囲のサイトゾルよりも更に酸化した状態を維持する。正常なジスルフィド形成がこれらの区画で発生し得るが、正常な細胞プロセスには不十分な速度であり、分泌したタンパク質を合成するのに適切ではない。タンパク質二硫化物イソメラーゼ、チオレドキシン、グルタレドキシンは、ジスルフィド結合の形成を触媒することが可能であり、必要なチオール：ジスルフィド交換を可能とするために細胞の酸化還元環境を調節する（Ｌｏｆｅｒｅｒ， Ｈ． （１９９５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：２６１７８−２６１８３）．。
【００１７】
これらの各タンパク質は多少異なる機能を有するが、すべてが保存した活性部位配列を含むジスルフィド含有レドックス・タンパク質の群に属し、真核生物や原核生物に広範囲に分布する。タンパク質二硫化物イソメラーゼは真核生物の小胞体や原核生物のペリプラスム間隙に見出される。これらは、折り畳みペプチド鎖中のチオールを自らのジスルフィドと交換することにより機能する。対照的に、還元したチオレドキシンとグルタレドキシンは通常は細胞質に見出され、基質タンパク質で直接ジスルフィドを還元することにより機能する。
【００１８】
これらの触媒分子はジスルフィド形成を促進するだけでなく、多様な生理的プロセスを調節そして関与する。チオレドキシン系は、例えばリボヌクレオチド還元酵素のための水素供与体としてまた酸化還元調節による酵素の調節因子として役割を果たす。ＮＦ−κＢ、ＡＰ−１、ステロイド受容体等の転写因子の活性を調節する。
【００１９】
アルド／ケト還元酵素
アルド／ケト還元酵素は単量体ＮＡＤＰＨ依存性オキシドレダクターゼであって、幅広い基質特異性を有する（Ｂｏｈｒｅｎ， Ｋ．Ｍ．他 （１９８９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：９５４７−９５５１）。これらの酵素は、カルボニル含有糖および芳香族化合物を含むカルボニル含有化合物の対応するアルコールへの還元を触媒する。従って、様々なカルボニル含有薬剤および生体異物はこのクラスの酵素によって代謝されると思われる。
【００２０】
ファミリーメンバーであるアルドースレダクターゼによって触媒される既知の或る反応は、グルコースからソルビトールへの還元であり、ソルビトールは更にソルビトールデヒドロゲナーゼによってフルクトースに代謝される。通常の条件下で、グルコースのソルビトールへの還元は主な経路ではない。しかしながら、高血糖状態では、ソルビトールの蓄積は糖尿病合併症の発症に関係する（ＯＭＩＭ ＊１０３８８０ Ａｌｄｏ−ｋｅｔｏ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｆａｍｉｌｙ １， ｍｅｍｂｅｒ Ｂ１）。この酵素のファミリーのメンバーはまた、或る種の肝癌で高度に発現される（Ｃａｏ， Ｄ．他 （１９９８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：１１４２９−１１４３５）。
アルデヒドデヒドロゲナーゼ
アルデヒドデヒドロゲナーゼは、脂肪族アルデヒドと芳香族アルデヒドの酸化を触媒する。これらの酵素は多くの生命体に存在する。代表的酵素には下記が含まれる：（ｉ）コハク酸セミアルデヒドをコハク酸に還元する大腸菌のＮＡＤＰ＋依存性酵素であるコハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、（ｉｉ）乾燥状態に反応して蓄積する第四級アンモニウム化合物であるベタインの生合成に関係する植物と細菌に存在する酵素であるベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ、（ｉｉｉ）プロリンをグルタミン酸に転換する酵母菌に存在する酵素である、Δ−１−ピロリン−５−カルボン酸塩デヒドロゲナーゼ、（ｉｖ）バクテリアから哺乳動物まで多様な種に存在する酵素であり、バリン異化作用に関係するメチルマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、（ｖ）１０−ホルミルテトラヒドロ葉酸からテトラヒドロ葉酸と蟻酸塩へのＮＡＤＰ＋非依存性加水分解、さらに１０−ホルミルテトラヒドロ葉酸からテトラヒドロ葉酸と二酸化炭素へのＮＡＤＰ＋依存性脱カルボキシ還元反応に関与する哺乳動物のサイトゾル酵素であるホルミルテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼがある。ラットの肝臓１０ホルミルテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ（残基１２０３）のアミノ末端ドメインは、グリシンアミド・リボヌクレオチド・トランスホルミラーゼ（ＥＣ ２．１．２．１）の群に２４〜３０％の同一性を有する。これらの酵素の活性部位は、ファミリーのすべての酵素に保存されるグルタミン酸とシステイン残基を含む（Ｗｅｒｅｔｉｌｎｙｋ， Ｅ．Ａ及びＡ．Ｄ． Ｈａｎｓｏｎ （１９９０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：２７４５−２７４９、Ｃｏｏｋ， Ｒ．Ｊ．他（１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：４９６５−４９７３、Ｓｔｅｅｌｅ， Ｍ．Ｉ．他 （１９９２） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：１３５８５−１３５９２、Ｋｒｕｐｅｎｋｏ， Ｓ．Ａ．ら （１９９５） ２７０：５１９５２２）。
【００２１】
アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子ファミリーのメンバ−の欠陥は、ヒトの疾患と直接関連する。例えば、アルデヒドデヒドロゲナーゼ１０（脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼ）の欠陥は、常染色体性劣性神経皮膚疾患であるシェーグレン−ラルソン症候群（ＳＬＳ）を引き起こす。この病気は、通常誕生時に明らかになる重度の精神薄弱、痙性ニ肢麻痺または痙性四肢麻痺、および先天性魚鱗癬（角化の悪化）によって特徴付けられる。患者には、網膜上の白斑、発作、低身長症、言語障害も現われ得る（Ｄｅ Ｌａｕｒｅｎｚｉ， Ｖ．他 （１９９６） Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． １２：５２５７）。アルデヒドデヒドロゲナーゼ４（グルタミンガンマ−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ；ピロリン−５−カルボン酸塩デヒドロゲナーゼ）の欠陥は、高プロリン血症タイプＩＩ（原形質内プロリン（１０〜１５倍の過剰）の蓄積によって特徴付けられる常染色体性劣性疾患）を引き起こす。この疾患の臨床的表現型は、無症候性から発作と精神薄弱を含む神経系発症までの範囲に至る（Ｈｕ， Ｃ．Ａ．他 （１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：９７９５９８００）。
【００２２】
更に、ミトコンドリア酵素アルデヒドデヒドロゲナーゼ２はエタノール利用の第２ステップを触媒する。
ステップ１            エタノール＋ＮＡＤ＋ →アセトアルデヒド＋ＮＡＤＨ      （アルコールデヒドロゲナーゼ）
ステップ２            アセトアルデヒド＋ ＮＡＤ＋ →酢酸＋ ＮＡＤＨ        （アルデヒドデヒドロゲナーゼ）
【００２３】
アルデヒドデヒドロゲナーゼの欠陥は、急性アルコール中毒を引き起こす。この遺伝子欠損は、東南アジアと南米インディオの間で非常に多く発生しており、白人の間ではそれほどではない。不活性な変異体対立遺伝子は、１つのアミノ酸の置き換わりをコードする（Ｈｓｕ， Ｌ．Ｃ．他 （１９８８） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２：５７６５）。
【００２４】
アルコールデヒドロゲナーゼ
アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）は、単純アルコールを対応するアルデヒドに酸化する。ＡＤＨはサイトゾル酵素であって、補助因子ＮＡＤ＋を好み亜鉛イオンを結合させる。ＡＤＨのレベルは肝臓において最も高く、腎臓、肺、および胃粘膜においては低い。
【００２５】
既知のＡＤＨアイソフォームは、４０ ｋＤａのサブユニットからなる二量体タンパク質である。これらのサブユニット（ａ、ｂ、ｇ、ｐ、ｃ）をコードする５つの既知の遺伝子座が存在し、その内の幾つかは特徴的な対立遺伝子変異体（ｂ１、ｂ２、ｂ３、ｇ１、ｇ２）を有する。サブユニットはホモ二量体およびヘテロ二量体を形成することができ、サブユニットの構成によって活性な酵素の特異的特性が決定される。従って、ホロ酵素がクラスＩ（サブユニット構成、ａａ、ａｂ、ａｇ、ｂｇ、ｇｇ）、クラスＩＩ（ｐｐ）、およびクラスＩＩＩ（ｃｃ）として分類される。クラスＩ ＡＤＨイソ酵素はエタノールおよびその他の小さい脂肪族アルコールを酸化し、ピラゾールによって阻害される。クラスＩＩイソ酵素は長鎖の脂肪族アルコールおよび芳香族アルコールを好み、メタノールを酸化できない。 また、ピラゾールによって阻害されない。クラスＩＩＩイソ酵素は、更に長い長鎖脂肪族アルコール（５炭素およびそれ以上）および芳香族アルコールを好み、ピラゾールによって阻害されない。
【００２６】
ペルオキシソームβ酸化酵素
細胞代謝における酸化還元反応の重要性の別の例は、補酵素Ａ（ＣｏＡ）活性化脂肪酸から２個の炭素のユニットを次々に除くミトコンドリアとペルオキシソームのベータ酸化酵素による飽和及び不飽和脂肪酸の分解である。主要なベータ酸化経路は飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸の両方を分解するが、補助経路は不飽和脂肪酸の分解に必要な付加的ステップを行う。
【００２７】
ミトコンドリアとペルオキシソームのベータ酸化経路は同様の酵素を使用するが、異なる基質特異性と機能をもつ。ミトコンドリアは短鎖、中鎖、長鎖の脂肪酸を酸化して、細胞のエネルギーを産生する。ミトコンドリアのベータ酸化は心筋と骨格筋の主要なエネルギー源となっている。飢餓、持久運動、及び糖尿病の場合のようにグルコースレベルが低くなった時は、肝臓でのベータ酸化がケトン体を末梢の循環へ提供する（Ｅａｔｏｎ， Ｓ． 他（１９９６） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３２０：３４５−３５７）。ペルオキシソームは中鎖、長鎖、超長鎖の脂肪酸、ジカルボン脂肪酸、分岐脂肪酸、プロスタグランジン、生体異物、胆汁酸中間物を酸化する。ペルオキシソームのベータ酸化の主な役割は、毒性の脂肪親和性カルボン酸を短くしてそれらの分泌を促進し、ミトコンドリアのベータ酸化の前に超長鎖脂肪酸を短くすることにある（Ｍａｎｎａｅｒｔｓ， Ｇ．Ｐ． 及び Ｐ．Ｐ． Ｖａｎ Ｖｅｌｄｈｏｖｅｎ （１９９３） Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ７５：１４７−１５８）。
【００２８】
補助ベータ酸化酵素２，４−ジエノイルＣｏＡ還元酵素は、下記の反応を触媒する：
トランス−２， シス／トランス−４−−ジエノイル−ＣｏＡ＋ＮＡＤＰＨ ＋ Ｈ＋ → トランス−３−−エノイル−ＣｏＡ＋ ＮＡＤＰ＋
【００２９】
この反応は、主要なベータ酸化経路に入る前に不飽和脂肪酸から偶数の二重結合を取り除く（Ｋｏｉｖｕｒａｎｔａ， Ｋ．Ｔ．他（１９９４） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３０４：７８７−７９２）。これらの酵素はまた、不飽和脂肪酸から奇数の二重結合をも取り除くことができる（Ｓｍｅｌａｎｄ， Ｔ．Ｅ．他 （１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：６６７３−６６７７）。
【００３０】
ラット２，４−ジエノイル−ＣｏＡ還元酵素は、ミトコンドリアとペルオキシソームの両方に存在する（Ｄｏｍｍｅｓ， Ｖ．他． （１９８１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５６：８２５９−８２６２）。ラットのミトコンドリア酵素の２つの免疫学的に異なる型は、その分子量が６０ ｋＤａと１２０ ｋＤａである（Ｈａｋｋｏｌａ， Ｅ．Ｈ．及びＪ．Ｋ． Ｈｉｌｔｕｎｅｎ （１９９３） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２１５：１９９−２０４）。１２０ ｋＤａのラットのミトコンドリア酵素は、２９アミノ酸Ｎ−末端リーダーペプチドの付いた３３５アミノ酸前駆体として合成され、これは切断されて成熟酵素を形成する（Ｈｉｒｏｓｅ， Ａ．他 （１９９０） Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １０４９：３４６−３４９）。ラットの酵素に８３％類似であるヒトのミトコンドリア酵素は、１９アミノ酸Ｎ−末端リーダーペプチドの付いた３３５アミノ酸残基前駆体として合成される（前出のＫｏｉｖｕｒａｎｔａ）。これらのクローニングされたヒトとラットのミトコンドリア酵素はホモ四量体として機能する（前出のＫｏｉｖｕｒａｎｔａ）。出芽酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｖｉｓｉａｅ）のペルオキシソーム２，４−ジエノイル−ＣｏＡ還元酵素は長さが２９５アミノ酸であり、Ｃ−末端のペルオキシソーム標的シグナルを含む。またホモ二量体として機能する（Ｃｏｅ， Ｊ．Ｇ．Ｓ 他． （１９９４） Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２４４：６６１−６７２、Ｇｕｒｖｉｔｚ， Ａ．他 （１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：２２１４０−２２１４７）。すべての２，４−ジエノイル−ＣｏＡ還元酵素は、かなりのよく保存された配列のＮＡＤＰＨ結合部位モチーフを有する（前出のＫｏｉｖｕｒａｎｔａ）。
【００３１】
主要経路ベータ酸化酵素エノイルＣｏＡヒドラターゼは、下記の反応を触媒する：
２−トランス−エノイル−ＣｏＡ ＋ Ｈ２Ｏ ←→ ３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ
【００３２】
この反応は、２−トランス−エノイル−ＣｏＡのＣ−２とＣ−３間の二重結合を水酸化するが、この二重結合は飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸から生成される（Ｅｎｇｅｌ， Ｃ．Ｋ．他 （１９９６） ＥＭＢＯ Ｊ． １５：５１３５−５１４５）。このステップは、２，４−ジエノイル還元酵素によって触媒するステップからの下流である。異なるエノイル−ＣｏＡヒドラターゼは、短鎖、中鎖、および長鎖の脂肪酸に作用する（前出のＥａｔｏｎ）。ミトコンドリアとペルオキシソームエノイル−ＣｏＡヒドラターゼは、単一機能酵素及び多機能酵素複合体の一部の両方として存在する。ヒトの肝臓ミトコンドリア短鎖エノイル−ＣｏＡヒドラターゼは、２９アミノ酸Ｎ−末端リーダーペプチドの付いた２９０アミノ酸前駆体として合成される（Ｋａｎａｚａｗａ， Ｍ 他 （１９９３） Ｅｎｚｙｍｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ４７：９−１３、Ｊａｎｓｓｅｎ， Ｕ．他 （１９９７） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４０：４７０−４７５）。ラットの短鎖エノイル−ＣｏＡヒドラターゼは、タンパク質の成熟領域においてヒトの配列と８７％同一であり、ホモ六量体として機能する（前出のＫａｎａｚａｗａ、前出のＥｎｇｅｌ）。ミトコンドリアの三機能タンパク質は、長鎖エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ、３ヒドロキシアシルＣｏＡ脱水素酵素、長鎖３−オキソチオラーゼ活性を有するものとして存在する（前出のＥａｔｏｎ）。ヒトのペルオキシソームでは、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性が３２７アミノ酸残基の単一機能酵素、及びニ機能酵素としても知られる多機能酵素化合物の一部の両者に見出される。ニ機能酵素はエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ、エノイル−ＣｏＡイソメラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡヒドロゲナーゼ活性を有する（ＦｉｔｚＰａｔｒｉｃｋ， Ｄ．Ｒ． 他 （１９９５） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２７：４５７−４６６、Ｈｏｅｆｌｅｒ， Ｇ 他 （１９９４） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １９：６０−６７）。短鎖エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性を伴う３３９アミノ酸残基のヒトタンパク質もＡＵ−特異的ＲＮＡ結合タンパク質として作用する（Ｎａｋａｇａｗａ， Ｊ 他 （１９９５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：２０５１−２０５５）。全てのエノイル−ＣｏＡヒドラターゼは、高度に保存された１７アミノ酸残基を伴う２つの活性部位グルタミン酸残基付近の相同性を共有する（Ｗｕ， Ｗ．−Ｊ．他 （１９９７） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：２２１１−２２２０）。
【００３３】
ミトコンドリアとペルオキシソームのベータ酸化酵素における先天的欠陥は、誕生後まもなく発現して数年以内に死亡につながる重度の疾患と関連する。ミトコンドリアのベータ酸化酵素は欠乏症と関連する。そのような欠乏症には例えば、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼおよびカルニチン欠乏症、超長鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠乏症、中鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠乏症、短鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠乏症、電子伝達フラビンタンパク質および電子伝達フラビンタンパク質：ユビキノンオキシドレダクターゼ欠乏症、三機能タンパク質欠乏症および短鎖３ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠乏症が含まれる（前出のＥａｔｏｎ）。ミトコンドリア三機能タンパク質（エノイル−ＣｏＡヒドラターゼを含む）欠損患者は、長鎖エノイル−ＣｏＡ還元酵素活性が下がっている。そして非ケトン性低血糖症、乳幼児突然死症候群、心筋症、肝機能障害、筋衰弱を患い、若死にする可能性もある（前出のＥａｔｏｎ）。ミトコンドリア２，４−ジエノイル−ＣｏＡ還元酵素を欠損する患者は、誕生後間もなく衰弱し、摂食が困難になり、呼吸性アシドーシスから４ヶ月で死亡する（Ｒｏｅ， Ｃ．Ｒ．他． （１９９０） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ８５：１７０３−１７０７）。
【００３４】
ミトコンドリアのベータ酸化の欠陥は、ライ症候群（肝機能障害、および子供の場合ウイルス感染後の脳障害により特徴付けられる疾患）と関連する。ライ症候群患者は、遊離の脂肪酸の血中濃度が上昇し得る（Ｃｏｔｒａｎ， Ｒ．Ｓ．他 （１９９４） Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ、Ｗ．Ｂ． Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ ＰＡ， ．８６６ページ）。ミトコンドリア短鎖３ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠乏症と中鎖３ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠乏症を患う患者もまた、ライ症候群様病態を示す（前出のＥａｔｏｎ及びＥｇｉｄｉｏ， Ｒ．Ｊ．他 （１９８９） Ａｍ． Ｆａｍ． Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ ３９：２２１−２２６）。
【００３５】
ペルオキシソームのベータ酸化と関連する遺伝性病態には、ツェルウェガー症候群、新生児副腎脳白質ジストロフィー、小児レフサム症候群、アシルＣｏＡオキシダーゼ欠乏症、ペルオキシソームチオラーゼ欠乏症、二機能タンパク質欠乏症がある（Ｓｕｚｕｋｉ， Ｙ他（１９９４） Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ． ５４：３６−４３、前出のＨｏｅｆｌｅｒ）。エノイルＣｏＡヒドラターゼの欠損症を含むペルオキシソーム二機能酵素欠乏症患者は、低血圧症、発作、精神運動欠陥、欠陥神経移動を患い、超長鎖の脂肪酸を蓄積し、通常は誕生後数年で死亡する（Ｗａｔｋｉｎｓ， Ｐ．Ａ．他 （１９８９） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ８３：７７１−７７７）。
【００３６】
ペルオキシソームのベータ酸化は、癌性組織で十分に機能しなくなる。新生物ヒト乳房上皮細胞は正常な細胞と同数のペルオキシソームを有するが、脂肪アシルＣｏＡオキシダーゼ活性は対照組織より低い（ｅｌ Ｂｏｕｈｔｏｕｒｙ， Ｆ．他 （１９９２） Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １６６：２７−３５）。ヒト大腸癌は正常大腸〈結腸〉組織よりも少ないペルオキシソームを有し、正常組織よりも脂肪アシルＣｏＡオキシダーゼとニ機能酵素（エノイルＣｏＡヒドラターゼを含む）活性が低い（Ｃａｂｌｅ， Ｓ．他 （１９９２） Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ． Ｂ Ｃｅｌｌ Ｐａｔｈｏｌ． Ｉｎｃｌ． Ｍｏｌ． Ｐａｔｈｏｌ． ６２：２２１−２２６）。
【００３７】
アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ
アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼファミリーは、少なくとも７つのメンバ−からなる。そのうち４つは脂肪酸のベータ酸化と関連する（上記参照）。超長鎖脂肪酸、ジカルボン脂肪酸、幾つかのプロスタノイド、プリスタン酸、胆汁酸中間物、生体異物化合物は、哺乳動物のペルオキシソームのベータ酸化により分解される （Ｖａｎ Ｖｅｌｄｈｏｖｅｎ， Ｐ．Ｐ．他 （１９９９） Ａｄｖ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． ４６６：２６１２７２）。例えば、７０ｋＤａミトコンドリア膜関連タンパク質のホモ二量体である超長鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＶＬＣＡＤ）（Ｓｏｕｒｉ， Ｍ．他 （１９９８） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４２６：１８７１９０）は、ミトコンドリアのアシル−ＣｏＡ脂肪酸の初期フラビン依存性酸化を触媒する。その過程で電子は電子伝達フラビンタンパク質に移される。ＶＬＣＡＤ欠損症を患う患者は、早発性心筋症を示し、その結果、高発生率で低ケトン性低血糖症と乳児死亡が起こる。これらの症状は、ＶＬＣＡＤ発現の欠陥あるいはＶＬＣＡＤの変化した形態の発現の結果である可能性がある。少なくとも１つの症例で、ＶＬＣＡＤの遺伝子のヌクレオチドの変異によりｍＲＮＡの不正確なスプライシングと欠損タンパク質の合成が起こっていた（Ｗａｔａｎａｂｅ， Ｈ．他 （２０００） Ｈｕｍ． Ｍｕｔａｔ． １５：４３０４３８）。アミノ酸置換を起こすエキソン１０と１２の突然変異またはナンセンス突然変異が報告されている（Ｈｅ， Ｇ．他 （１９９９） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２６４：４８３４８７）。致死的な遺伝疾患はまた、中鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼでの単一アミノ酸置換と関連する（Ｙａｎｇ， Ｂ．Ｚ． （２０００） Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ． Ｍｅｔａｂ． ６９：２５９２６２）。
【００３８】
アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼファミリ−の残りの３つの酵素は、アミノ酸の異化に関与する（即ちイソバレリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、短／分岐鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、グルタリルＣｏＡ デヒドロゲナーゼ）。例えば、イソバレリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＩＶＤ）は、ロイシン異化経路におけるイソバレリル−ＣｏＡからメチルクロトニル−ＣｏＡ への変換を触媒する。ＩＶＤは１７５ｋＤａのホモ四量体であり、サブユニット毎に１つのＦＡＤ補欠分子族を含む。サブユニットは、成熟ポリペプチドを形成するためにタンパク質分解して処理される２ ｋＤａのＮ末端リーダー配列が付いて合成される。ＩＶＤをコードする遺伝子はヒト染色体１５にマップされ、１５キロベースにまたがり、１２のエキソンと１１のイントロンからなる。変異体の５つの異なるクラスが、ＩＶＤの欠損により引き起こされる疾患であるイソ吉草酸血症の患者の細胞株で同定されてきた（Ｖｏｌｃｈｅｎｂｏｕｍ， Ｓ．Ｌ．及びＪ． Ｖｏｃｋｌｅｙ （２０００） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５：７９５８７９６３、Ｒｅｉｎａｒｄ， Ｔ．他 （２０００） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５：３３７３８−３３７４３）。
【００３９】
６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ
６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（６ＰＧＤＨ）は、ＮＡＤＰＨの産生を伴うリブロース５−リン酸への６−ホスホグルコン酸のＮＡＤＰ＋依存性酸化脱炭酸反応を触媒する。６−ＰＧＤＨが存在しなかったり、阻害があると、真核細胞での６−ホスホグルコン酸が有毒レベルまで蓄積する。６−ＰＧＤＨは、ペントースリン酸経路（ＰＰＰ）の３番目の酵素であり、遍在性である。あるヘテロ型発酵種では、ＮＡＤ＋は補助因子として使用され、続いてＮＡＤＨの生成が起こる。
【００４０】
反応は、３−ケト中間物質を介して進み、これが脱カルボキシ化されてリブロース５−リン酸のエノールを与える。次いでエノールの互変異性化後にケト生成物に変換する（Ｂｅｒｄｉｓ Ａ．Ｊ．及びＰ．Ｆ． Ｃｏｏｋ （１９９３） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：２０４１２０４６）。６−ＰＧＤＨ活性は、ＮＡＤＰＨの阻害作用そして６−ホスホグルコン酸の活性作用により調節される（Ｒｉｐｐａ， Ｍ．他 （１９９８） Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １４２９：８３９２）。６−ＰＧＤＨ活性の欠乏は、慢性的溶血性貧血に関連すると考えられている。
【００４１】
６−ＰＧＤＨの特定タイプ（例えばトリパノソームに見出される酵素）の標的は、寄生虫感染を制御するための手段と思われてきた（Ｔｅｔａｕｄ， Ｅ．他 （１９９９） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３３８：５５−６０）。例えばブルーストリパノソーマの酵素は、哺乳動物酵素に比べて基質類似体６ホスホ２デオキシグルコン酸と補酵素類似体アデノシン２’，５’２リン酸による阻害に対して際立って感受性が高い（Ｈａｎａｕ， Ｓ 他 （１９９６） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２４０：５９２５９９）。
【００４２】
リボヌクレオチドニリン酸還元酵素
リボヌクレオチドニリン酸還元酵素は、リボヌクレオチド二リン酸（即ち、ＡＤＰ、ＧＤＰ、ＣＤＰ、ＵＤＰ）を対応するデオキシリボヌクレオチド二リン酸（即ちｄＡＤＰ、ｄＧＤＰ、ｄＣＤＰ、ｄＵＤＰ）への還元を触媒する。これらのデオキシリボヌクレオチド二リン酸は、ＤＮＡの合成に使用される。それによってリボヌクレオチドニリン酸還元酵素は、デオキシヌクレオチド前駆体の新規合成において重要な役割を果たす。デオキシヌクレオチドはまた、サルベージ経路経由でヌクレオシドキナーゼによりデオキシヌクレオシドから生成する。
【００４３】
哺乳動物リボヌクレオチドニリン酸還元酵素は、エフェクター結合成分（Ｅ）と非ヘム鉄成分（Ｆ）の２つの成分から成る。成分Ｆは触媒に必要な鉄ラジカルを含むが、成分Ｅはヌクレオチド三リン酸エフェクターを結合する。ホロ酵素でも見られるようにに、ＥとＦ成分の分子量の決定は、タンパク質の精製で用いられる方法とその特定の研究所に応じて変わる。成分Ｅは約９０〜１００ ｋＤａであり、成分Ｆは約１００〜１２０ ｋＤａ、ホロ酵素は２００〜２５０ ｋＤａである。
【００４４】
リボヌクレオチド二リン酸還元酵素活性は、ＥＤＴＡと共にチオセミカルバゾン等の鉄キレートにより悪影響を受ける。デオキシリボヌクレオチド二リン酸も、リボヌクレオチド二リン酸還元酵素の負のアロステリック・エフェクターのようである。ヌクレオチド三リン酸（リボ−とデオキシリボ−の両者）はこの酵素の活性を刺激すると考えられる。広く使用される有機リン農薬の代謝産物である３−メチル−４−ニトロフェノールは、哺乳動物細胞のリボヌクレオチド二リン酸還元酵素の強力なインヒビターである。ＤＮＡウイルス（例えばヘルペスウイルス）で感染した細胞と癌細胞のリボヌクレオチド二リン酸還元酵素活性は、アロステリック制御因子による調節に対して感受性が低く、高レベルのリボヌクレオチド二リン酸還元酵素活性と高速度の細胞増殖（例えば肝臓癌）との間には相関が存在することを示す証拠がある。この観察によると、ウイルスがコードしたリボヌクレオチド二リン酸還元酵素とがん細胞に存在するリボヌクレオチド二リン酸還元酵素は、ウイルスのゲノムの生成用またはがん細胞を特徴付けるＤＮＡ合成増加ためにデオキシリボヌクレオチドのプールの供給増加を維持することが可能であることが示唆される。したがって、リボヌクレオチド二リン酸還元酵素は、治療処置の標的である（Ｎｕｔｔｅｒ， Ｌ．Ｍ．及びＹ．−Ｃ． Ｃｈｅｎｇ （１９８４） Ｐｈａｒｍａｃ． Ｔｈｅｒ． ２６：１９１−２０７、Ｗｒｉｇｈｔ， Ｊ．Ａ． （１９８３） Ｐｈａｒｍａｃ． Ｔｈｅｒ． ２２：８１−１０２）。
【００４５】
ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ
ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ（ＤＤ）は、ＮＡＤ（Ｐ）＋−依存性で、単量体形の３４〜３７ ｋＤａの酵素であり、ベンゾ［α］イレン、ベンゾ［α］アントラセン、７−メチル−ベンゾ［α］アントラセン、７，１２−ジメチル−ベンゾ［α］アントラセン、クリセン、５−メチルークリセン等の多環式芳香族炭化水素（ＰＡＨ）のトランス−ジヒドロジオールおよびアンチジオールエポキシド代謝産物の解毒に関与する。哺乳動物細胞では、ベンゾ［α］イレン等の環境的ＰＡＨ毒素はミクロソームチトクロームＰ４５０によりまずエポキシ化されて７Ｒ，８Ｒ−アレーン−オキシドを産生し、続いて（−）−７Ｒ，８Ｒ−ジヒドロジオール（（−）−トランス−７，８−ジヒドロキシ−７，８−ジヒドロベンゾ［α］ピレンまたは（−）−トランス−Ｂ［α］Ｐ−ジオール）を産生する。後者の化合物は更に種によって異なる酵素の同じ酵素によりベンゾ［α］ピレンの抗ジオールエポキシド（即ち（±）アンチ−７β，８α−ジヒドロキシ−９α，１０α−エポキシ−７，８，９，１０−テトラヒドロベンゾ［α］ピレン）に転換する。この結果として生じるベンゾ［α］ピレンのアンチ−ジオールエポキシドまたは別のＰＡＨ化合物からの対応する誘導体は、突然変異誘発性が高い。
【００４６】
ＤＤは、効果的にアンチ−ジオールエポキシドの前駆体（即ちトランス−ジヒドロジオール）を一過性カテコールに酸化し、一過性カテコールはキノンに自己酸化し、過酸化水素とセミキノンラジカルをも生成する。この反応は発癌性の高いアンチ−ジオールの形成を妨げる。アンチ−ジオールはそれ自体はＤＤの基質ではないが、アンチ−ジオール化合物を含むサンプルへのＤＤの添加はエイムス試験で観察される誘導された突然変異誘発率の際立った減少へとつながる。この場合、ＤＤはアンチ−ジオールを酸化しなくても、抗ジオールに結合し隔離することができる。酸化または隔離によるものであろうと、ＤＤは生体異物多環化合物の代謝産物の解毒において重要な役割を果たす（Ｐｅｎｎｉｎｇ， Ｔ．Ｍ． （１９９３） Ｃｈｅｍｉｃｏ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ８９：１−３４）。
【００４７】
１５−オキソプロスタグランジン １３−還元酵素
１５−オキソプロスタグランジン １３−還元酵素（ＰＧＲ）と１５−ヒドロキシプロスタグランジン・デヒドロゲナーゼ（１５−ＰＧＤＨ）は、循環するプロスタグランジンの分解に関与する肺に存在する酵素である。肺システムの通過による酸化異化は、循環するプロスタグランジンの濃度を減少する一般的な手段である。１５−ＰＧＤＨは、対応する１５−オキソ化合物を生成するために多様なプロスタグランジンの１５―ヒドロキシ基を酸化する。１５―オキソ誘導体は通常、１５−ヒドロキシル分子に比べて減少した生物学的活性を有する。ＰＧＲは更に、１５−オキソ化合物の１３、１４二重結合を還元し、これは通常、その生物学的活性を更に減らす。ＰＧＲは約３６ ｋＤａの分子量を有する単量体である。この酵素には、補助因子としてＮＡＤＨかＮＡＤＰＨが必要であるが、ＮＡＤＨの方がより好まれる。プロスタグランジンの１５−オキソ誘導体であるＰＧＥ１、 ＰＧＥ２およびＰＧＥ２α はすべてＰＧＲの基質であるが、非誘導体のプロスタグランジン（すなわち、ＰＧＥ１、 ＰＧＥ２ およびＰＧＥ２α）は基質ではない（Ｅｎｓｏｒ， Ｃ．Ｍ． 他（１９９８） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３３０：１０３−１０８）。
【００４８】
１５−ＰＧＤＨとＰＧＲもリポキシンＡ４（ＬＸＡ４）の代謝を触媒する。リポキシン（ＬＸ）は、オータコイド（局在性の炎症の部位で生成される脂質）であり、多形核白血球（ＰＭＮ）機能を下方調節して、局在した外傷の分解を促進する。リポキシン生成は、アスピリンによりアセチル化されたシクロオキシゲナーゼＩＩ（ＣＯＸ ＩＩ）を現す細胞、また相互作用してリポキシンを生成する５−リポキシゲナーゼ（５ＬＯ）を有する細胞でアスピリンの投与により刺激される。１５−ＰＧＤＨは、ＰＧＲと共に１５オキソＬＸＡ４を産出し、更にその１５−オキソ化合物を１３，１４ジヒドロ１５オキソＬＸＡ４に転換する（Ｃｌｉｓｈ， Ｃ．Ｂ．他 （２０００） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５：２５３７２２５３８０）。この発見は、プロスタグランジン・デヒドロゲナーゼの幅広い基質特異性を示唆する。また薬剤代謝、そして炎症を調節するための治療のための標的としての潜在的重要性を示す。
【００４９】
ＧＭＣ オキシドレダクターゼ
ＧＭＣ（グルコースメタノールコリン）オキシドレダクターゼ酵素ファミリーは、ショウジョウバエのグルコースデヒドロゲナーゼ、大腸菌のコリンデヒドロゲナーゼ、黒色麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）のグルコースオキシダーゼ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ のメタノールオキシダーゼの配列アラインメントに基づいて定義される。異なる源泉と異なる基質特異性にもかかわらず、これらの４つのフラビンタンパク質は相同であり、幾つかの独特の配列と構造的特徴の存在により特徴付けられる。各分子は、アミノ末端に近い正準なＡＤＰ結合、β−α−βモノヌクレオチド結合モチーフを含む。この折り畳みは、３ストランド逆並行ベータシートとアルファヘリックスに挟まれた４ストランド並列ベータシートから成る。ヌクレオチドは、この鎖折り畳みに対して類似の位置に結合する（Ｃａｖｅｎｅｒ， Ｄ．Ｒ． （１９９２） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２３：８１１−８１４、Ｗｉｅｒｅｎｇａ， Ｒ．Ｋ．他 （１９８６） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １８７：１０１−１０７）。ＧＭＣオキシドレダクターゼファミリーのメンバーは、また、ポリペプチドの中央領域近傍にコンセンサス配列を共有する。ＧＭＣオキシドレダクターゼファミリーのさらなるメンバーにはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｅｒｏｌｉｃｕｍとストレプトマイセスのコレステロール・オキシダーゼ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓのアルコールデヒドロゲナーゼが含まれる（前出のＣａｖｅｎｅｒ， Ｄ．Ｒ．、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， Ｓ．及びＪ．Ｇ． Ｈｅｎｉｋｏｆｆ （１９９４） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １９：９７−１０７、ｖａｎ Ｂｅｉｌｅｎ， Ｊ．Ｂ．他． （１９９２） Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６：３１２１−３１３６）。
【００５０】
ＩＭＰデヒドロゲナーゼ／ＧＭＰレダクターゼ
ＩＭＰデヒドロゲナーゼとＧＭＰレダクターゼは、配列類似性の多くの領域を共有する２つのオキシドレダクターゼ（酸化還元酵素）である。ＩＭＰデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．２０５）は、新規なＧＴＰ生合成の一部としてＩＭＰ（イノシン１リン酸）からＸＭＰ（キサンチンモノリン酸塩）へののＮＡＤ依存性の還元を触媒する（Ｃｏｌｌａｒｔ， Ｆ．Ｒ．及びＥ． Ｈｕｂｅｒｍａｎ （１９８８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３：１５７６９−１５７７２）。ＧＭＰレダクターゼは、ＧＭＰからＩＭＰへのＮＡＤＰＨ依存性還元的脱アミノ反応を触媒し、アデニンとグアニンのヌクレオチドの細胞内バランスの維持を助ける（Ａｎｄｒｅｗｓ， Ｓ．Ｃ．及びＪ．Ｒ． Ｇｕｅｓｔ （１９８８） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２５５：３５−４３）。
【００５１】
ピリジンヌクレオチドジスルフィドオキシドレダクターゼ
ピリジンヌクレオチドジスルフィドオキシドレダクターゼは、ＦＡＤから基質への還元当量の転移に関与するＦＡＤフラビン蛋白質である。これらのフラビン蛋白質は、このタンパク質ファミリーの特徴であるコンセンサス配列内に含まれる対のレドックス活性システインを含む（Ｋｕｒｌｙａｎ， Ｊ． 他（１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３５２：１７２−１７４）。オキシドレダクターゼのこのファミリーのメンバーには、グルタチオンレダクターゼ（ＥＣ １．６．４．２）、高等な真核生物のチオレドキシンレダクターゼ（ＥＣ １．６．４．５）、トリパノチオン（ｔｒｙｐａｎｏｔｈｉｏｎｅ） レダクターゼ（ＥＣ １．６．４．８）、リポアミド・デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．８．１．４）、αケト酸デヒドロゲナーゼ化合物のＥ３成分、水銀還元酵素（ＥＣ １．１６．１．１）が含まれる。
【００５２】
チロシン触媒作用に関与する酵素
コハク酸とピルビン酸か、或いはフマル酸とアセト酢酸へのアミノ酸チロシンの分解には多数の酵素が必要であり、多数の中間化合物が生成される。加えて、多くの生体異物化合物は、チロシン分解経路の一部である１つ以上の反応が用いられて代謝され得る。この経路は初め細菌で研究されたが、チロシン分解は様々な生物において起こることが知られ、多数の同様の生物学的反応が関係すると思われる。チロシンからフマル酸塩とアセト酢酸塩への分解に関与する酵素には、オキシドレダクターゼの４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼとホモゲンチシン酸−１，２−ジオキシゲナーゼが含まれる。
【００５３】
ヒトにおいて、チロシン分解経路の酵素における後天性或いは先天性の遺伝的欠陥が、遺伝性チロシン血症Ｉ型を引き起こし得る。この疾患の１つの型である遺伝性チロシン血症Ｉ型（ＨＴ１）は、チロシンをフマル酸とアセテート酢酸に代謝する生物における経路の最後の酵素である酵素フルマリルアセトアセターゼヒドロラーゼの欠損によって引き起こされ得る。ＨＴ１は幼児期に始まる進行性の肝傷害によって特徴づけられ、肝癌のリスクが高い（Ｅｎｄｏ， Ｆ．他（１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：２４４２６−２４４３２）。
【００５４】
新規のオキシドレダクターゼ（酸化還元酵素）およびそれらをコードするポリヌクレオチドの発見により、新規の組成物を提供することで当分野の要望に応えることができる。 この新規の組成物は、細胞増殖異常、神経疾患、代謝異常および平滑筋障害の診断・予防・治療において有用であり、また、オキシドレダクターゼの核酸配列及びアミノ酸配列の発現における外来性化合物の効果についての評価にも有用である。
【００５５】
（発明の要約）
本発明は、総称して「ＯＸＲＤ」、個別にはそれぞれ「ＯＸＲＤ−１」、「ＯＸＲＤ−２」、および「ＯＸＲＤ−３」と呼ぶオキシドレダクターゼ〈酸化還元酵素〉である精製されたポリペプチドを提供する。或る実施態様において本発明は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３を有する群から選択したアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％が同一性のある天然のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片を含む群から選択した単離されたポリペプチドを提供する。 一実施態様では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。
【００５６】
また、本発明は（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３を有する群から選択したアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％が同一性のある天然のアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片、を含む群から選択されたポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。 一実施態様では、ポリヌクレオチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３を有する群から選択したポリペプチドをコードする。 別の実施態様では、ポリヌクレオチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４−６を有する群から選択される。
【００５７】
本発明は更に、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３を有する群から選択したアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性のある天然のアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片を有する群から選択したポリペプチドをコードするようなポリヌクレオチドと機能的に連結したプロモーター配列を有する組換えポリヌクレオチドを提供する。 一実施態様では、本発明は組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞を提供する。別の実施態様では、本発明は組換えポリヌクレオチドを含む遺伝形質転換体を提供する。
【００５８】
更に本発明は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３からなる群から選択されたアミノ酸配列からなるポリペプチドと、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３からなる群から選択されたアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有する天然のアミノ酸配列からなるポリペプチドと、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的に活性な断片と、（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３とからなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片とで構成される群から選択されたポリペプチドを製造する方法を提供する。製造方法は、（ａ）組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞をポリペプチドの発現に適した条件下で培養する過程と、（ｂ）そのように発現したポリペプチドを回収する過程とを有し、組換えポリヌクレオチドはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーター配列を有する。
【００５９】
本発明は更に、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片から構成される群から選択されたポリペプチドに特異結合するような単離された抗体を提供する。
【００６０】
本発明は更に、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４−６からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４−６からなる群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）に相補的なポリヌクレオチド配列、（ｄ）（ｂ）に相補的なポリヌクレオチド配列、および（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のＲＮＡ等価物からなる群から選択された単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施態様では、ポリヌクレオチドは少なくとも６０の連続したヌクレオチドを有する。
【００６１】
本発明は更に、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法を提供する。ここで、標的ポリヌクレオチドは（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４−６からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４−６からなる群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）に相補的なポリヌクレオチド、（ｄ）（ｂ）に相補的なポリヌクレオチド配列、および（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のＲＮＡ等価物からなる群から選択されたポリヌクレオチド配列を含む。  検出方法は、（ａ）サンプル中の上記標的ポリヌクレオチドに相補的な或る配列からなる少なくとも２０の連続したヌクレオチド群からなる或るプローブを用いて該サンプルをハイブリダイズする過程と、（ｂ）該ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出し、複合体が存在すればオプションでその量を検出する過程とからなる。該プローブと該標的ポリヌクレオチドあるいはその断片との間でハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で、プローブは、該標的ポリヌクレオチドに対し特異的にハイブリダイズする。一実施態様では、プローブは少なくとも６０の連続したヌクレオチドを含む。
【００６２】
本発明はまた、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する一方法を提供する。ここで、標的ポリヌクレオチドは、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４−６からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４−６からなる群から選択したポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（ｄ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、および（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のＲＮＡ等価物、からなる群から選択した、或るポリヌクレオチドの配列を持つ。検出方法は、（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、（ｂ）増幅された標的ポリヌクレオチドまたはその断片の存在・不存在を検出し、該標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程を含む。
【００６３】
本発明は更に、有効量のポリペプチドと薬剤として許容できる賦形剤とを含む組成物を提供する。有効量のポリペプチドは、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３からなる群から選択したアミノ酸配列の免疫原性断片からなる群から選択される。一実施例で、組成物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３からなる群から選択された或るアミノ酸配列を持つ。更に、本発明は、この組成物を、機能的ＯＸＲＤの発現の低下に関連した疾患や症状の治療を要する患者に投与する方法を提供する。
【００６４】
本発明はまた、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片からなる群から選択されたポリペプチドのアゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法を提供する。 スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝す過程と、（ｂ）サンプル中のアゴニスト活性を検出する過程とを含む。別法では、本発明は、この方法によって同定されたアゴニスト化合物と好適な医薬用賦形剤とを含む組成物を提供する。更なる別法では、本発明は、機能的ＯＸＲＤの発現の低下に関連した疾患やその症状の治療方法を提供するが、その方法にはこのような治療を必要とする患者にこの組成物を投与することを含む。
【００６５】
本発明は更に、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択したポリペプチドのアンタゴニストとしての有効性のために、或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）該ポリペプチドを含むサンプルを或る化合物に曝す過程と、（ｂ）サンプル中のアンタゴニスト活性を検出する過程とからなる。一実施態様で本発明は、この方法によって同定したアンタゴニスト化合物と薬剤として許容できる賦形剤とを含む組成物を提供する。更なる別法では、本発明は、この組成物の患者への投与を含む、機能的ＯＸＲＤの過剰な発現に関連した疾患やその症状の治療方法を提供する。
【００６６】
本発明は更に、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドに特異結合する或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）該ポリペプチドを適切な条件下で少なくとも１つの試験化合物に混合する過程と、（ｂ）この試験化合物と該ポリペプチドとの結合を検出し、それにより該ポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程とからなる。
【００６７】
本発明は更に、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３を有する群から選択したアミノ酸配列から成るポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のアミノ酸配列から成るポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫抗原性断片を含む群から選択したポリペプチドの活性を調節する化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプチドの活性が許容された条件下で、ポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物と混合させる過程と、（ｂ）ポリペプチドの活性を試験化合物の存在下で算定する過程と、（ｃ）試験化合物の存在下でのポリペプチドの活性を試験化合物の不存在下でのポリペプチドの活性と比較する過程とを含み、試験化合物の存在下でのポリペプチドの活性の変化は、ポリペプチドの活性を調節する化合物であることを意味する。
【００６８】
更に本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４−６からなる群から選択されたポリヌクレオチド配列を含む標的ポリヌクレオチドの発現を変化させるのに効果的な化合物をスクリーニングする方法であって、（ａ）この標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップと、（ｂ）この標的ポリヌクレオチドの発現の変化を検出するステップと、ｃ）化合物の存在下での異なる量の標的ポリヌクレオチドの発現を化合物の不存在下での発現と比較するステップを含む、該スクリーニング方法を提供する。
【００６９】
本発明は更に、試験化合物の毒性の算定方法を提供する。この方法には、以下の過程がある。（ａ）核酸群を有する生物学的サンプルを試験化合物で処理する過程。（ｂ）処理済み生物学的サンプルの核酸群をハイブリダイズする過程。この過程には、次のようなプローブを用いる。（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４−６からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４−６からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を持つ天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）（ｉ）に相補的な配列を持つポリヌクレオチド、（ｉｖ）（ｉｉ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）のＲＮＡ等価物、からなる群から選択した或るポリヌクレオチドの少なくとも２０の連続したヌクレオチド群からなるプローブである。ハイブリダイゼーションは、上記プローブと生物学的サンプル中の標的ポリヌクレオチドの間に特定のハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で発生し、上記標的ポリヌクレオチドは、（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４−６からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４−６からなる群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）（ｉ）のポリヌクレオチドに相補的な配列を有するポリヌクレオチド、（ｉｖ）（ｉｉ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、および（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）のＲＮＡ等価物からなる群から選択する。或いは、標的ポリヌクレオチドは、上記（ｉ）〜（ｖ）からなる群から選択したポリヌクレオチド配列の断片と、（ｃ）ハイブリダイゼーション複合体の量を定量する過程と、（ｄ）処理した生物学的サンプルのハイブリダイゼーション複合体の量を、非処理の生物学的サンプルのハイブリダイゼーション複合体の量と比較する過程を含み、処理した生物学的サンプルのハイブリダイゼーション複合体の量の差は、試験化合物の毒性を示す。
【００７０】
（本発明の記載について）
本発明のタンパク質、ヌクレオチド配列及び方法について説明する前に、説明した特定の装置、材料及び方法に本発明が限定されるものではなく、改変し得ることを理解されたい。また、ここで使用する専門用語は特定の実施例を説明する目的で用いたものに過ぎず、特許請求の範囲にのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図したものではないことも併せて理解されたい。
【００７１】
請求の範囲及び明細書中で用いている単数形の「或る」及び「その（この）」の表記は、文脈から明らかにそうでないとされる場合を除いて複数のものを指す場合もあることに注意しなければならない。従って、例えば「或る宿主細胞」と記されている場合にはそのような宿主細胞が複数あることもあり、「或る抗体」と記されている場合には単数または複数の抗体、及び、当業者に公知の抗体の等価物等についても言及しているのである。
【００７２】
本明細書中で用いる全ての専門用語及び科学用語は、特に定義されている場合を除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書で説明するものと類似あるいは同等の任意の装置、材料及び方法を用いて本発明の実施または試験を行うことができるが、ここでは好適な装置、材料、方法について説明する。本発明で言及する全ての刊行物は、刊行物中で報告されていて且つ本発明に関係があるであろう細胞株、プロトコル、試薬及びベクターについて説明及び開示する目的で引用しているものである。本明細書のいかなる開示内容も、本発明が先行技術の効力によってこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【００７３】
（定義）
用語「ＯＸＲＤ」は、天然、合成、半合成或いは組換え体など全ての種（特にウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ及びヒトを含む哺乳動物）から得られる実質的に精製されたＯＸＲＤのアミノ酸配列を指す。
【００７４】
用語「アゴニスト」は、ＯＸＲＤの生物学的活性を強めたり、模倣する分子を指す。このアゴニストは、ＯＸＲＤ に直接相互作用するか、或いはＯＸＲＤ が関与する生物学的経路の成分と作用して、ＯＸＲＤ の活性を調節するタンパク質、核酸、糖質、小分子、任意の他の化合物や組成物を含み得る。
【００７５】
用語「対立遺伝子変異配列」は、ＯＸＲＤをコードする遺伝子の別の形を指す。対立遺伝子変異体は、核酸配列における少なくとも１つの突然変異から作製し得る。 また、変異ｍＲＮＡまたはポリペプチドを作製し得る。その構造または機能は、変異することもしないこともある。遺伝子は、天然の対立遺伝子変異体を全く有しないか、１個若しくは数個の天然の対立遺伝子変異体を有し得る。一般に対立遺伝子変異体を生じさせる通常の突然変異性変化は、ヌクレオチドの自然欠失、付加または置換に帰するものである。これら各変化は、単独或いは他の変化と共に、所定の配列内で１回若しくは数回生じ得る。
【００７６】
ＯＸＲＤをコードする「変異（ａｌｔｅｒｅｄ）」核酸配列は、種々のヌクレオチドを欠失、挿入または置換する核酸配列を有し、ＯＸＲＤと同一またはＯＸＲＤの機能的特徴を少なくとも１つ有するポリペプチドを産出する。この定義には、ＯＸＲＤをコードするポリヌクレオチド配列の正常な染色体の遺伝子座ではない位置での対立遺伝子変異配列との不適当あるいは予期しないハイブリダイゼーション、並びにＯＸＲＤをコードするポリヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可能なあるいは検出困難な多型性を含む。コードされたタンパク質も「変異」し得るものであり、サイレント変化を生ぜしめて結果的に機能的に等価なＯＸＲＤとなるようなアミノ酸残基の欠失、挿入または置換を含み得る。意図的なアミノ酸置換は、生物学的或いは免疫学的にＯＸＲＤ   の活性が保持される範囲で、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／または両親媒性についての類似性に基づいて成され得る。例えば、負に帯電したアミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸があり、正に帯電したアミノ酸にはリジン及びアルギニンがある。親水性値が近似している非荷電極性側鎖を有するアミノ酸には、アスパラギンとグルタミン、セリンとトレオニンがある。親水性値が近似している非荷電側鎖を有するアミノ酸には、ロイシンとイソロイシンとバリン、グリシンとアラニン、フェニルアラニンとチロシンがある。
【００７７】
「アミノ酸」または「アミノ酸配列」の語は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド若しくはタンパク質の配列またはその断片を指し、天然または合成分子を指す。ここで「アミノ酸配列」は天然のタンパク質分子のアミノ酸配列を指すものであり、「アミノ酸配列」及び類似の語は、アミノ酸配列を、列挙したタンパク質分子に関連する完全な本来のアミノ酸配列に限定しようとするものではない。
【００７８】
「増幅」は、核酸配列の追加複製に関連する。増幅は通常、当業者によく知られたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて行う。
用語「アンタゴニスト」は、ＯＸＲＤの生物学的活性を阻害或いは減弱する分子である。アンタゴニストは、ＯＸＲＤ に直接相互作用するか、或いはＯＸＲＤ が関与する生物学的経路の成分と作用して、ＯＸＲＤ の活性を調節する抗体、核酸、糖質、小分子、任意の他の化合物や組成物などのタンパク質を含み得る。
【００７９】
「抗体」の語は、抗原決定基と結合することができる、そのままの免疫グロブリン分子やその断片、例えばＦａｂ，、Ｆ（ａｂ’）２ 及びＦｖ断片を指す。ＯＸＲＤ  ポリペプチドと結合する抗体は、抗体を免疫する小ペプチドを含む無傷の分子またはその断片を用いて作製可能である。動物（マウス、ラット、ウサギ等）を免疫化するために用いるポリペプチドまたはオリゴペプチドは、ＲＮＡの翻訳、または化学合成によって得られるポリペプチドまたはオリゴペプチドに由来し得るもので、好みに応じてキャリアタンパク質に抱合することも可能である。通常用いられるキャリアであってペプチドと化学結合するものは、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン及びスカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）等がある。結合ペプチドは、動物を免疫化するために用いる。
【００８０】
「抗原決定基」の語は、特定の抗体と接触している分子の領域（即ちエピトープ）を指す。タンパク質またはタンパク質断片を用いて宿主動物を免疫化する場合、タンパク質の多数の領域が、抗原決定基（タンパク質の特定の領域または３次元構造）に特異結合する抗体の産生を誘導し得る。抗原決定基は、抗体への結合において無損傷抗原（即ち免疫応答を誘発するために用いられる免疫原）と競合し得る。
【００８１】
用語「アプタマー」は、特定の分子標的に結合する核酸またはオリゴヌクレオチドを指す。アプタマーはｉｎ ｖｉｔｒｏの進化過程（例えば米国特許番号第５，２７０，１６３号に記載されたＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔの略、試験管内選択法））から由来するもので、そのような過程は大きな組み合わせライブラリから標的特異的なアプタマー配列を選択する。アプタマー組成は、２本鎖または１本鎖であってもよく、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体、または他のヌクレオチド様分子を含み得る。アプタマーのヌクレオチド構成要素は修飾された糖基（例えば、リボヌクレオチドの２’−ＯＨ 基が２’−Ｆ または ２’−ＮＨ２で置換されている）を有することが可能で、これらの糖基は、例えば、ヌクレアーゼに対する耐性あるいは血中でのより長い生存期間などの望ましい性質を改善する。循環系からアプタマーが除去される速度を遅くするために、アプタマーを高分子量キャリアー等の分子に抱合させることができる。アプタマー類は、例えば或る架橋剤の光活性化によって、それらの同種リガンド群と特異的に架橋させ得る（Ｂｒｏｄｙ， Ｅ．Ｎ． および Ｌ． Ｇｏｌｄ （２０００） Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ７４：５−１３等を参照。）
【００８２】
「ｉｎｔｒａｍｅｒ」の用語はｉｎ ｖｉｖｏで発現されるアプタマーを意味するたとえば、ワクシニアウィルスに基づくＲＮＡ発現系は、白血球の細胞質で特定のＲＮＡ アプタマーが高レベルで発現するために使用されている（Ｂｌｉｎｄ， Ｍ． 他 （１９９９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６：３６０６−３６１０）。
【００８３】
「ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ」の語はＬ−ＤＮＡ、Ｌ−ＲＮＡその他の左旋性ヌクレオチド誘導体またはヌクレオチド様分子を含むアプタマーを指す。左旋性ヌクレオチドを含むアプタマーは、右旋性のヌクレオチドを含む基質に通常作用する天然の酵素による分解に耐性がある。
【００８４】
「アンチセンス」の語は、特定の核酸配列の「センス」（コーディング）鎖と塩基対を形成することが可能な任意の組成物を指す。アンチセンス組成物の例には、ＤＮＡや、ＲＮＡや、ペプチド核酸（ＰＮＡ）や、修飾されたバックボーン連鎖たとえばホスホロチオ酸、メチルホスホン酸またはベンジルホスホン酸などを有するオリゴヌクレオチドや、修飾された糖基たとえば２’−メトキシエチル糖または２’−メトキシエトキシ糖などを有するオリゴヌクレオチドや、あるいは修飾された塩基たとえば５−メチルシトシン、２−デオキシウラシルまたは７−デアザ−２’−デオキシグアノシンなどを有するオリゴヌクレオチドがあり得る。アンチセンス分子は、化学合成または転写を含む任意の方法で製造することができる。相補的アンチセンス分子は、ひとたび細胞に導入されたら、細胞が形成した天然の核酸配列と塩基対を形成し、転写または翻訳を阻止する二重鎖を形成する。「負」または「マイナス」という表現は、或る参考ＤＮＡ分子のアンチセンス鎖を指すことがあり、「正」または「プラス」という表現は、或る参考ＤＮＡ分子のセンス鎖を意味し得る。
【００８５】
「生物学的に活性」の語は、天然分子の構造的機能、調節機能または生化学的機能を有するタンパク質を指す。同様に、用語「免疫学的に活性」または「免疫原性」は、天然或いは組換え体のＯＸＲＤ、合成のＯＸＲＤまたはそれらの任意のオリゴペプチドが、適当な動物或いは細胞の特定の免疫応答を誘発して特定の抗体と結合する能力を指す。
【００８６】
「相補（的）」または「相補性」の語は、塩基対形成によってアニーリングする２つの一本鎖核酸の間の関係を指す。例えば、配列「５’Ａ−Ｇ−Ｔ３’」は、相補配列「３’Ｔ−Ｃ−Ａ５’」に結合する。
【００８７】
「所定のポリヌクレオチド配列を含む組成物」及び「所定のアミノ酸配列を含む組成物」は、所定のポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を含む広範囲の任意の成分を指す。この組成物には、乾燥製剤または水溶液が含まれ得る。ＯＸＲＤ若しくはＯＸＲＤの断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。このプローブは、凍結乾燥状態で保存可能であり、糖質などの安定化剤と結合させることが可能である。ハイブリダイゼーションにおいては、塩（例えばＮａＣｌ）、界面活性剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム；ＳＤＳ）及びその他の構成要素（例えばデンハート液、脱脂粉乳、サケの精子のＤＮＡ等）を含む水溶液中にプローブを分散させることができる。
【００８８】
「コンセンサス配列」は、不要な塩基を分離するためにＤＮＡ配列の解析を繰り返し行い、ＸＬ−ＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ）を用いて５’及び／または３’の方向に伸長され、再度シークエンシングされた核酸配列、またはＧＥＬＶＩＥＷ 断片構築システム（ＧＣＧ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）か、あるいはＰｈｒａｐ （Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｓｅａｔｔｌｅ ＷＡ）等の断片構築用のコンピュータプログラムを用いて１つ或いはそれ以上のオーバーラップするｃＤＮＡやＥＳＴ、またはゲノムＤＮＡ断片から構築された核酸配列を指す。伸長及び構築の両方を行ってコンセンサス配列を作製する配列もある。
【００８９】
「保存的なアミノ酸置換」は、置換がなされた時に元のタンパク質の特性を殆ど損なわないと予測されるような置換、即ちタンパク質の構造と特に機能が保存され、そのような置換による大きな変化がない置換を指す。下表は、タンパク質中で元のアミノ酸と置換可能で、保存アミノ酸置換と認められるアミノ酸を示している。
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【００９０】
保存アミノ酸置換では通常、（ａ）置換領域におけるポリペプチドのバックボーン構造、例えばβシートやαヘリックス構造、（ｂ）置換部位における分子の電荷または疎水性、及び／または（ｃ）側鎖の大部分が保持される。
「欠失」は、結果的に１個若しくは数個のアミノ酸残基またはヌクレオチドが失われてなくなるようなアミノ酸またはヌクレオチド配列における変化を指す。
【００９１】
「誘導体」の語は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの化学修飾を指す。例えば、アルキル基、アシル基、ヒドロキシル基またはアミノ基による水素の置換は、ポリヌクレオチド配列の化学修飾に含まれ得る。ポリヌクレオチド誘導体は、天然分子の生物学的または免疫学的機能を少なくとも１つは保持しているポリペプチドをコードする。ポリペプチド誘導体は、グリコシル化、ポリエチレングリコール化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、或いは任意の同様なプロセスであって誘導起源のポリペプチドから少なくとも１つの生物学的若しくは免疫学的機能を保持しているプロセスによって、修飾されたポリペプチドである。
【００９２】
「検出可能な標識」は、測定可能な信号を生成することができ、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに共有結合または非共有結合するようなレポーター分子または酵素を指す。
【００９３】
「示差発現」は少なくとも２つの異なったサンプルを比較することによって決められる、増加（上方調節）、あるいは減少（下方調節）、または欠損遺伝子またはタンパク発現の欠損を指す。このような比較は例えば、治療後サンプルと未治療のサンプルまたは病態のサンプルと正常サンプルの間で行われ得る。
【００９４】
「エキソンシャフリング」は、異なるコード領域（エキソン）の組換えを意味する。１つのエキソンがコードされたタンパク質の１つの構造的または機能的ドメインを代表し得るため、安定したサブストラクチャーを再分類することによって、新しいタンパク質が組立てられることが可能であり、新しいタンパク質機能の進化を促進できる。
【００９５】
用語「断片」は、ＯＸＲＤ またはＯＸＲＤ をコードするポリヌクレオチドの固有の部分であって、その親配列（ｐａｒｅｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）と同一であるがその配列より長さが短いものを指す。断片は、画定された配列の全長から１ヌクレオチド／アミノ酸残基を差し引いた長さよりも短い長さを有し得る。例えば或る断片は、５〜１０００の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有し得る。プローブ、プライマー、抗原、治療用分子として、或いはその他の目的のために用いられる断片は、少なくとも５、１０、１５、１６、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、１００、１５０、２５０若しくは５００の連続したヌクレオチド或いはアミノ酸残基長さであり得る。断片は、或る分子の特定領域から優先的に選択し得る。例えば、ポリペプチド断片は、所定の配列に示すような最初の２５０または５００アミノ酸（またはポリペプチドの最初の２５％または５０％）から選択された或る長さの連続したアミノ酸を有し得る。これらの長さは明らかに例として挙げているものであり、本発明の実施例では、配列表、表及び図面を含む明細書に裏付けされた任意の長さであってよい。
【００９６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４−６ の断片は、例えば、この断片を得たゲノム内の他の配列とは異なる、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４−６ を明確に同定する固有のポリヌクレオチド配列の領域を含む。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４−６のある断片は、例えば、ハイブリダイゼーションや増幅技術、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４−６を関連ポリヌクレオチド配列から区別する類似の方法に有用である。ある断片と一致するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４−６の正確な断片の長さや領域は、その断片の目的に基づいて当分野で一般的な技術によって日常的に測定できる。
【００９７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３ の断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４−６の断片によってコードされる。 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３ の断片には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３を特異的に同定する固有のアミノ酸配列領域が含まれている。 例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３ の断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３を特異認識する抗体を産出するための免疫抗原性ペプチドとして有用である。 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３ の断片及び断片に対応するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３ の領域の正確な長さは、断片に対する意図した目的に基づき当業者が慣例的に決定することが可能である。
【００９８】
「完全長」ポリヌクレオチド配列とは、少なくとも１つの翻訳開始コドン（例えばメチオニン）、オープンリーディングフレーム及び翻訳終止コドンを有する配列である。「完全長」ポリヌクレオチド配列は、「完全長」ポリペプチド配列をコードする。
【００９９】
「相同性」の語は、２つ以上のポリヌクレオチド配列または２つ以上のポリペプチド配列の配列類似性、または配列同一性を意味する。
ポリヌクレオチド配列に適用される「一致率」または「一致％」の語は、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされた少なくとも２つ以上のポリヌクレオチド配列間で一致する残基の割合を意味する。このようなアルゴリズムは、２配列間のアラインメントを最適化するために比較する配列において、標準化された再現性のある方法でギャップを挿入するので、２つの配列をより有意に比較できる。
【０１００】
ポリヌクレオチド配列間の一致率は、ＭＥＧＡＬＩＧＮ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１２ｅ配列アラインメントプログラムに組込まれているようなＣＬＵＳＴＡＬ Ｖアルゴリズムのデフォルトのパラメータを用いて決定できる。このプログラムは、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ ソフトウエアパッケージ（一組の分子生物学的分析プログラム）（ＤＮＡＳＴＡＲ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）の一部である。このＣＬＵＳＴＡＬ Ｖは、Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ．Ｇ． 及び Ｐ．Ｍ． Ｓｈａｒｐ （１９８９） ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３、Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ．Ｇ． 他 （１９９２） ＣＡＢＩＯＳ ８：１８９−１９１に記載されている。ポリヌクレオチド配列をペアワイズでアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ｋｔｕｐｌｅ＝２、ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝５、ｗｉｎｄｏｗ＝４、「ｄｉａｇｏｎａｌｓ ｓａｖｅｄ」＝４と設定する。「重み付けされた」残基重み付け表が、デフォルトとして選択された。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖは、アラインメントされたポリヌクレオチド配列対間の「類似率」として一致率を報告する。
【０１０１】
或いは、米国国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）が一般的に用いられ、且つ、無料で入手可能な配列比較アルゴリズム一式を提供している（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ． 他 （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０）。 このアルゴリズムは、幾つかの情報源から入手可能であり、メリーランド州ベセスダにあるＮＣＢＩ及びインターネット（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）からも入手可能である。ＢＬＡＳＴソフトウェア一式には様々な配列分析プログラムが含まれており、既知のポリヌクレオチド配列を種々のデータベースから得た別のポリヌクレオチド配列とアラインメントする「ｂｌａｓｔｎ」もその１つである。その他にも、２つのヌクレオチド配列をペアワイズで直接比較するために用いる「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」と称されるツールも利用可能である。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｂｌ２．ｈｔｍｌにアクセスして対話形式で利用することが可能である。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールは、ｂｌａｓｔｎ 及び ｂｌａｓｔｐ（以下に記載）の両方に用いることができる。ＢＬＡＳＴプログラムは、一般的には、ギャップ及びデフォルト設定に設定された他のパラメータと共に用いる。例えば、２つのヌクレオチド配列を比較するために、デフォルトパラメータとして設定された「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．１２（２０００年４月２１日）を用いてｂｌａｓｔｎを実行してもよい。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
【０１０２】
2005501507.tif 000003
【０１０３】
一致率は、ある定義された配列の全長（例えば特定のＳＥＱ ＩＤナンバーで定義された配列）で測定し得る。或いは、より短い長さ、例えば、定義された、より大きな配列から得られた断片（例えば少なくとも２０、３０、４０、５０、７０、１００または２００の連続したヌクレオチドの断片）の長さと比較して一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図及び配列リストを含めた本明細書に記載された配列に裏付けられた任意の配列長さの断片を用いて、一致率を測定し得る長さを説明し得ることを理解されたい。
高度の相同性を示さない核酸配列が、それにもかかわらず遺伝子コードの縮重が原因で類似のアミノ酸配列をコードする場合がある。この縮重を利用して核酸配列内で変化を生じさせて、全ての核酸配列が実質上同一のタンパク質をコードするような多数の核酸配列を生成し得ることを理解されたい。
【０１０４】
ポリペプチド配列に用いられる用語「一致率」または「一致性％」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる２つ以上のポリペプチド配列間の一致する残基の百分率のことである。ポリペプチド配列アラインメントの方法は公知である。保存的アミノ酸置換を考慮するアラインメント方法もある。既に詳述したこのような保存的置換は通常、置換部位の酸性度及び疎水性を保存するので、ポリペプチドの構造を（従って機能も）保存する。
【０１０５】
ポリペプチド配列間の一致率は、ＭＥＧＡＬＩＧＮ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１２ｅ配列アラインメントプログラムに組込まれているようなＣＬＵＳＴＡＬ Ｖアルゴリズムのデフォルトのパラメータを用いて決定できる（既に説明したのでそれを参照されたい）。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖを用いて、ポリペプチド配列をペアワイズでアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ｋｔｕｐｌｅ＝１、ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝３、ｗｉｎｄｏｗ＝５、「ｄｉａｇｏｎａｌｓ ｓａｖｅｄ」＝５と設定する。デフォルトの残基重み付け表としてＰＡＭ２５０マトリクスを選択する。ポリヌクレオチドアラインメントと同様に、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖは、アラインメントされたポリペプチド配列対間の「類似率」として一致率を報告する。
【０１０６】
或いは、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴソフトウェア一式を用いてもよい。例えば、２つのポリペプチド配列をペアワイズで比較をする場合、ある者は、デフォルトパラメータで設定された「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．１２ （Ａｐｒ−２１−２０００）でｂｌａｓｔｐを使用するであろう。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
2005501507.tif 000004
【０１０７】
一致率は、完全に画定された（例えば特定の配列番号で画定された）ポリペプチド配列の長さと比較して測定し得る。 一致率は、配列或いは、より短い長さ、例えばより大きな画定されたポリペプチド配列から得られた断片（例えば少なくとも１５、２０、３０、４０、５０、７０または１５０の連続した残基の断片）の長さと比較して一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図及び配列リストを含めた本明細書に記載された配列に裏付けられた任意の配列長さの断片を用いて、或る長さであってその長さに対して一致率を測定し得る長さを説明し得ることを理解されたい。
【０１０８】
「ヒト人工染色体（ＨＡＣ）」は、約６ｋｂ（キロベース）〜１０ＭｂのサイズのＤＮＡ配列を含み得る、染色体の複製、分離及び維持に必要な全ての要素を含む直鎖状の微小染色体である。
用語「ヒト化抗体」は、もとの結合能力を保持しつつよりヒトの抗体に似せるために、非抗原結合領域のアミノ酸配列が変えられた抗体分子を指す。
【０１０９】
「ハイブリダイゼーション」とは、所定のハイブリダイゼーション条件下で、ある一本鎖ポリヌクレオチドがある相補的な一本鎖と塩基対を形成するアニーリングのプロセスである。特異的ハイブリダイゼーションは、２つの核酸配列が高い相補性を共有することの指標である。特異的ハイブリダイゼーション複合体は許容されるアニーリング条件下で形成され、「洗浄」ステップ後もハイブリダイズされたままである。洗浄ステップは、ハイブリダイゼーションプロセスのストリンジェンシーを決定する際に特に重要であり、更にストリンジェントな条件では、非特異結合（即ち完全には一致しない核酸鎖間の対の結合）が減少する。核酸配列のアニーリングに対する許容条件は、本技術分野における当業者が慣例的に決定する。 許容条件はハイブリダイゼーション実験の間は一定でよいが、洗浄条件は所望のストリンジェンシーを得るように、従ってハイブリダイゼーション特異性も得るように実験中に変更することができる。アニーリングが許容される条件は、例えば、温度が６８℃で、約６×ＳＳＣ、約１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、並びに約１００μｇ／ｍｌのせん断して変性したサケ精子ＤＮＡが含まれる。
【０１１０】
一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは或る程度、洗浄ステップを実行する温度を基準にして表すことができる。このような洗浄温度は通常、所定のイオン強度及びｐＨにおける特定の配列の融点（Ｔｍ）より約５〜２０℃低くなるように選択する。このＴｍは、所定のイオン強度及びｐＨの下で、完全に一致するプローブに標的配列の５０％がハイブリダイズする温度である。Ｔｍを計算する式及び核酸のハイブリダイゼーション条件はよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ 他 （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版， １−３巻， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹに記載されており、特に２巻の９章を参照されたい。
【０１１１】
本発明の、ポリヌクレオチドとポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションに対する高ストリンジェンシー条件には、約０．２×ＳＳＣ及び約１％のＳＤＳ存在下で約６８℃において１時間の洗浄条件が含まれる。或いは、６５℃、６０℃、５５℃または４２℃の温度で行ってもよい。ＳＳＣ濃度は、約０．１％のＳＤＳ存在下で、約０．１〜２×ＳＳＣの範囲で変化し得る。通常は、ブロッキング剤を用いて非特異ハイブリダイゼーションを阻止する。このようなブロッキング剤には、例えば、約１００〜２００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡがある。特定条件下で、例えばＲＮＡとＤＮＡのハイブリダイゼーションに有機溶剤、例えば約３５〜５０％ｖ／ｖの濃度のホルムアミドを用いることもできる。洗浄条件の有用なバリエーションは、当業者には自明であろう。ハイブリダイゼーションは、特に高ストリンジェント条件下では、ヌクレオチド間の進化的な類似性を示唆し得る。このような類似性は、ヌクレオチド及びヌクレオチドにコードされるポリペプチドに対する類似の役割を強く示唆している。
【０１１２】
用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基間の水素結合によって、形成された２つの核酸配列の複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体は、溶解状態で形成し得る（Ｃ０ｔまたはＲ０ｔ解析等）。或いは、一方の核酸配列が溶解状態で存在し、もう一方の核酸配列が固体支持体（例えば紙、膜、フィルタ、チップ、ピンまたはガラススライド、或いは他の適切な基板であって細胞若しくはその核酸が固定される基板）に固定されているような２つの核酸配列間に形成され得る。
【０１１３】
用語「挿入」或いは「付加」は、１個以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチドがそれぞれ追加されるアミノ酸配列或いは核酸配列の変化を指す。
「免疫応答」は、炎症、外傷、免疫異常症、伝染性疾患または遺伝性疾患に関連する症状を指し得る。これらの症状は、細胞及び全身の防御系に作用し得る種々の因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、その他のシグナル伝達分子の発現によって特徴づけることができる。
【０１１４】
用語「免疫原性断片」は、例えば哺乳動物などの生きている動物に導入すると、免疫反応を引き起こすＯＸＲＤ のポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片を指す。用語「免疫原性断片」はまた、本明細書で開示するまたは当分野で周知のあらゆる抗体生産方法に有用なＯＸＲＤ  のポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片を含む。
【０１１５】
用語「マイクロアレイ」は、基板上の複数のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物の構成を指す。
【０１１６】
用語「エレメント」または「アレイエレメント」は、マイクロアレイ上に固有の指定された位置を有する、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物を指す。
【０１１７】
用語「調節」は、ＯＸＲＤの活性の変化を指す。調節することによって例えば、ＯＸＲＤのタンパク質活性、結合特性その他の生物学的、機能的または免疫学的特性が増大または低下し得る。
【０１１８】
「核酸」及び「核酸配列」の語は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはこれらの断片を指す。「核酸」及び「核酸配列」の語は、ゲノム起源または合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡであって一本鎖または二本鎖であるか或いはセンス鎖またはアンチセンス鎖を表し得るようなＤＮＡまたはＲＮＡや、ペプチド核酸（ＰＮＡ）や、任意のＤＮＡ様またはＲＮＡ様物質を指すこともある。
【０１１９】
「機能的に連結した」は、第１の核酸配列と第２の核酸配列が機能的な関係にある状態を指す。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合には、そのプロモーターはそのコード配列に機能的に連結している。同一のリーディングフレーム内で２つのタンパク質コード領域を接続する必要がある場合、一般に、機能的に連結したＤＮＡ配列は非常に近接するか、或いは連続的に隣接し得る。
【０１２０】
「ペプチド核酸（ＰＮＡ）」は、末端がリシンで終わるアミノ酸残基のペプチドのバックボーンに結合した、少なくとも約５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを含む、アンチセンス分子または抗遺伝子剤を指す。末端のリシンは、この組成物に溶解性を与える。ＰＮＡは、相補的一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡに優先的に結合して転写の伸長を停止するものであり、ポリエチレングリコール化して細胞におけるＰＮＡの寿命を延長し得る。
【０１２１】
ＯＸＲＤ の「翻訳後修飾」には、脂質化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ラセミ化、蛋白分解性切断及びその他の当分野で既知の修飾を含まれ得る。 これらのプロセスは、合成或いは生化学的に生じ得る。生化学的修飾は、ＯＸＲＤの酵素環境に依存し、細胞の種類によって異なり得る。
【０１２２】
「プローブ」とは、同一配列或いは対立遺伝子核酸配列、関連する核酸配列の検出に用いる、ＯＸＲＤやそれらの相補配列、またはそれらの断片をコードする核酸配列のことである。プローブは、単離されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであって、検出可能な標識またはレポーター分子に結合したものである。典型的な標識には、放射性アイソトープ、リガンド、化学発光試薬及び酵素がある。「プライマー」は、短い核酸、通常はＤＮＡオリゴヌクレオチドであり、相補的塩基対を形成することで標的ポリヌクレオチドにアニーリングされ得る。プライマーは次に、ＤＮＡポリメラーゼ酵素によって標的ＤＮＡ鎖に沿って伸長し得る。プライマー対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による核酸配列の増幅（及び同定）に用い得る。
【０１２３】
本発明に用いるようなプローブ及びプライマーは通常、既知の配列の少なくとも１５の連続したヌクレオチドを含んでいる。特異性を高めるために長めのプローブ及びプライマー、例えば開示した核酸配列の少なくとも２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または１５０の連続したヌクレオチドからなるようなプローブ及びプライマーを用いてもよい。これよりもかなり長いプローブ及びプライマーもある。表、図面及び配列リストを含む本明細書に裏付けされた任意の長さのヌクレオチドを用いることができるものと理解されたい。
【０１２４】
プローブ及びプライマーの調製及び使用方法については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． 他 （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版， １−３巻， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹ、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． 他， （１９８７） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌ． Ａｓｓｏｃ． ＆ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ、Ｉｎｎｉｓ他 （１９９０） ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ等を参照されたい。ＰＣＲプライマー対は、その目的のためのコンピュータプログラム、例えばＰｒｉｍｅｒ（Ｖｅｒｓｉｏｎ ０．５， １９９１， Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ）を用いるなどして既知の配列から得ることができる。
【０１２５】
プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの選択は、そのような目的のために本技術分野でよく知られているソフトウェアを用いて行う。例えばＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウェアは、各１００ヌクレオチドまでのＰＣＲプライマー対の選択に有用であり、オリゴヌクレオチド及び最大５，０００までの大きめのポリヌクレオチドであって３２キロベースまでのインプットポリヌクレオチド配列から得たものを分析するのにも有用である。類似のプライマー選択プログラムには、拡張能力のための追加機能が組込まれている。例えば、ＰｒｉｍＯＵプライマー選択プログラム（テキサス州ダラスにあるテキサス大学南西部医療センターのゲノムセンターから一般向けに入手可能）は、メガベース配列から特定のプライマーを選択することが可能であり、従ってゲノム全体の範囲でプライマーを設計するのに有用である。Ｐｒｉｍｅｒ３プライマー選択プログラム（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／ＭＩＴ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）より入手可能）によって、ユーザーは、プライマー結合部位として避けたい配列を指定できる「非プライミングライブラリ（ｍｉｓｐｒｉｍｉｎｇ ｌｉｂｒａｒｙ）」を入力できる。Ｐｒｉｍｅｒ３は特に、マイクロアレイのためのオリゴヌクレオチドの選択に有用である（後二者のプライマー選択プログラムのソースコードは、それぞれの情報源から得てユーザー固有のニーズを満たすように修正し得る）。ＰｒｉｍｅｒＧｅｎプログラム（英国ケンブリッジ市の英国ヒトゲノムマッピングプロジェクト−リソースセンターから一般向けに入手可能）は、多数の配列アラインメントに基づいてプライマーを設計し、それによって、アラインメントされた核酸配列の最大保存領域または最小保存領域の何れかとハイブリダイズするようなプライマーの選択を可能にする。従って、このプログラムは、固有であって保存されたオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの断片の同定に有用である。上記選択方法のいずれかによって同定したオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの断片は、ハイブリダイゼーション技術において、例えばＰＣＲまたはシークエンシングプライマーとして、マイクロアレイエレメントとして、或いは核酸のサンプルにおいて完全または部分的相補的ポリヌクレオチドを同定する特異プローブとして有用である。オリゴヌクレオチドの選択方法は、上記の方法に限定されるものではない。
【０１２６】
本明細書における「組換え核酸」は天然の配列ではなく、２つ以上の配列の離れたセグメントを人工的に組み合わせた配列である。この人為的組合せはしばしば化学合成によって達成するが、より一般的には核酸の単離セグメントの人為的操作によって、例えばのＳａｍｂｒｏｏｋらの文献（前出）に記載されているような遺伝子工学的手法によって達成する。組換え核酸の語は、単に核酸の一部を付加、置換または欠失した変異核酸も含む。しばしば組換え核酸には、プロモーター配列に機能的に連結した核酸配列が含まれる。このような組換え核酸は、例えばある細胞を形質転換するために使用されるベクターの一部とすることが可能である。
【０１２７】
或いはこのような組換え核酸は、ウイルスベクターの一部であって、例えばワクシニアウイルスに基づくものであり得る。そのようなワクシニアウイルスは哺乳動物に接種され、その組換え核酸が発現されて、その哺乳動物ないで防御免疫応答を誘導するように使用することができる。
【０１２８】
「調節因子」は、通常は遺伝子の非翻訳領域に由来する核酸配列であり、エンハンサー、プロモーター、イントロン及び５’及び３’の非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。調節因子は、転写、翻訳またはＲＮＡ安定性を調節する宿主タンパク質またはウイルスタンパク質と相互作用する。
【０１２９】
「レポーター分子」は、核酸、アミノ酸または抗体の標識に用いられる化学的または生化学的な部分である。レポーター分子には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤、基質、補助因子、阻害因子、磁気粒子及びその他の当分野で既知の成分がある。
【０１３０】
本明細書において、ＤＮＡ配列に対する「ＲＮＡ等価物」とは、基準となるＤＮＡ配列と同じ直鎖の核酸配列から構成されるが、窒素性塩基のチミンがウラシルに置換され、糖鎖のバックボーンがデオキシリボースではなくリボースからなる。
【０１３１】
用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられている。ＯＸＲＤ、ＯＸＲＤをコードする核酸、またはその断片を含むと推定されるサンプルは、体液と、細胞からの抽出物や細胞から単離された染色体や細胞内小器官、膜と、細胞と、溶液中に存在するまたは基板に固定されたゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡと、組織と、組織プリント等を含み得る。
【０１３２】
用語「特異的結合」及び「特異的に結合する」は、タンパク質若しくはペプチドと、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、若しくは任意の天然若しくは合成の結合組成物との間の相互作用を指す。この相互作用は、タンパク質の特定の構造（例えば抗原決定基即ちエピトープ）であって結合分子が認識するものが存在するか否かに依存していることを意味している。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、遊離した標識Ａ及びその抗体を含む反応において、エピトープＡ（つまり遊離した、標識されていないＡ）を含むポリペプチドの存在が、抗体に結合する標識されたＡの量を低減させる。
【０１３３】
「実質上精製された」の語は、自然環境から取り除かれ、或いは単離または分離された核酸またはアミノ酸配列であって、自然に会合する他の構成要素の少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７５％、最も好ましいのは少なくとも約９０％が無いものを指す。
【０１３４】
「置換」とは、一つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドをそれぞれ別のアミノ酸またはヌクレオチドに置き換えることである。
【０１３５】
用語「基板」は、任意の好適な固体或いは半固体の支持物を指し、膜及びフィルター、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁気または非磁気ビード、ゲル、チューブ、プレート、ポリマー、微小粒子、毛細管が含まれる。基板は、壁、溝、ピン、チャネル、孔等、様々な表面形態を有することができ、基板表面にはポリヌクレオチドやポリペプチドが結合する。
【０１３６】
「転写イメージ」または「発現プロファイル」は、所定条件下での所定時間における特定の細胞の種類または組織による集合的遺伝子発現のパターンを指す。
【０１３７】
「形質転換」とは、外来ＤＮＡが受容細胞に導入されるプロセスのことである。形質転換は、本技術分野で知られている種々の方法に従って自然条件または人工条件下で生じ得るものであり、外来性の核酸配列を原核宿主細胞または真核宿主細胞に挿入する任意の既知の方法を基にし得る。形質転換の方法は、形質転換する宿主細胞の種類によって選択する。限定するものではないが形質転換方法には、ウイルス感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、熱ショック、リポフェクション及び微粒子銃を用いる方法がある。「形質転換された細胞」には、導入されたＤＮＡが自律的に複製するプラスミドとして或いは宿主染色体の一部として複製可能である安定的に形質転換された細胞が含まれる。さらに、限られた時間に一過的に導入ＤＮＡ若しくは導入ＲＮＡを発現する細胞も含まれる。
【０１３８】
ここで用いる「遺伝形質転換体」とは任意の生物体であり、限定するものではないが動植物を含み、生物体の１個若しくは数個の細胞が、ヒトの関与によって、例えば本技術分野でよく知られている形質転換技術によって導入された異種核酸を有する。核酸の細胞への導入は、直接または間接的に、細胞の前駆物質に導入することによって、計画的な遺伝子操作によって、例えば微量注射法によって或いは組換えウイルスの導入によって行う。遺伝子操作の語は、古典的な交雑育種或いは試験管内受精を指すものではなく、組換えＤＮＡ分子の導入を指すものである。本発明に基づいて予期される遺伝形質転換体には、バクテリア、シアノバクテリア、真菌及び動植物がある。本発明の単離されたＤＮＡは、本技術分野で知られている方法、例えば感染、形質移入、形質転換またはトランス接合（ｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）によって宿主に導入することができる。本発明のＤＮＡをこのような生物体に移入する技術はよく知られており、前出のＳａｍｂｒｏｏｋ 他 （１９８９） 等の参考文献に与えられている。
【０１３９】
特定の核酸配列の「変異体」は、核酸配列１本全部の長さに対して特定の核酸配列と少なくとも４０％の同一性を有する核酸配列であると定義する。 その際、デフォルトパラメータに設定した「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．９（１９９９年５月７日）を用いてｂｌａｓｔｎを実行する。このような核酸対は、所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性を示し得る。或る変異体は、例えば「対立遺伝子」変異体（前述）、「スプライス」変異体、「種」変異体または「多型性」変異体として説明し得る。スプライス変異体は参照分子とかなりの同一性を有し得るが、ｍＲＮＡプロセッシング中のエキソンの選択的スプライシングによって通常、より多くまたはより少数のポリヌクレオチドを有することになる。対応するポリペプチドは、追加機能ドメインを有するか或いは参照分子に存在するドメインが欠落していることがある。種変異体は、種相互に異なるポリヌクレオチド配列である。結果的に生じるポリペプチドは通常、相互にかなりのアミノ酸同一性を有する。多型性変異体は、与えられた種の個体間で特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列が異なる。多型変異配列はまた、ポリヌクレオチド配列の１つのヌクレオチドが異なる「１塩基多型性」（ＳＮＰ）も含み得る。ＳＮＰの存在は、例えば特定の個体群、病状または病状性向を示し得る。
【０１４０】
特定のポリペプチド配列の「変異体」は、ポリペプチド配列の１本の長さ全体で特定のポリペプチド配列に対して少なくとも４０％の同一性を有するポリペプチド配列として画定される。 ここで、デフォルトパラメータに設定した「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．９（１９９９年５月７日）を用いてｂｌａｓｔｐを実行する。このようなポリペプチド対は、所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示し得る。
【０１４１】
（発明）
本発明は、新規のヒトオキシドレダクターゼ（ＯＸＲＤ）及びＯＸＲＤをコードするポリヌクレオチドの発見に基づき、これらの組成物を利用した細胞増殖異常、神経疾患、代謝異常および平滑筋障害の診断、治療、及び予防に関する。
【０１４２】
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の命名の概略である。各ポリヌクレオチド及びその対応するポリペプチドは、１つのＩｎｃｙｔｅプロジェクト識別番号（ＩｎｃｙｔｅプロジェクトＩＤ）と相関する。各ポリペプチド配列は、ポリペプチド配列識別番号（ポリペプチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）とＩｎｃｙｔｅポリペプチド配列番号（ＩｎｃｙｔｅポリペプチドＩＤ）によって表示した。各ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）とＩｎｃｙｔｅポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（ＩｎｃｙｔｅポリヌクレオチドＩＤ）によって表示した。
【０１４３】
表２は、ＧｅｎＢａｎｋタンパク質（ｇｅｎｐｅｐｔ）データベースに対するＢＬＡＳＴ分析によって同定されたような、本発明のポリペプチドとの相同性を有する配列を示している。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド配列識別番号（ポリペプチド ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：）およびそれに対応するＩｎｃｙｔｅ ポリペプチド配列番号（Ｉｎｃｙｔｅ ポリペプチド ＩＤ）を示す。列３は、ＧｅｎＢａｎｋの最も近い相同体のＧｅｎＢａｎｋの識別番号（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＮＯ ：）を示す。列４は、各ポリペプチドとその相同体との間の一致を表す確率スコアを示す。列５は、該当箇所には適当な引用を示すとともにＧｅｎＢａｎｋ相同体１つ以上の注釈（ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ）を示し、これらはすべて本明細書では参考文献に含まれる。
【０１４４】
表３は、本発明のポリペプチドの様々な構造的特徴を示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドのポリペプチド配列識別番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：）およびそれに対応するＩｎｃｙｔｅ ポリペプチド配列番号（Ｉｎｃｙｔｅ ポリペプチド ＩＤ）を示す。列３は、各ポリペプチドのアミノ酸残基数を示す。列４および列５はそれぞれ、ＧＣＧ配列分析ソフトウェアパッケージのＭＯＴＩＦＳプログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）によって決定された、リン酸化およびグリコシル化の可能性のある部位を示す。列６は、シグネチャ配列、ドメイン、およびモチーフを含むアミノ酸残基を示す。列７は、タンパク質の構造／機能の分析のための分析方法を示し、該当箇所にはさらに分析方法に利用した検索可能なデータベースを示す。
【０１４５】
表２及び３は共に、本発明の各々のポリペプチドの特性を要約しており、それら特性が請求の範囲に記載されたポリペプチドがオキシドレダクターゼであることを確立している。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１はヒトの ＩＭＰデヒドロゲナーゼ １ 型 （ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ３０７０６７） と９３％の同一性を有することがＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によって示された。（表２参照）ＢＬＡＳＴ確率スコアは２．７ｅ−２４８であり、これは観測されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１はまた、ＩＭＰ デヒドロゲナーゼ／ＧＭＰ レダクターゼ Ｃ−末端ドメイン を有するが、 これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。 （表３参照）ＢＬＩＭＰＳ、ＭＯＴＩＦＳ、及びＰＲＯＦＩＬＥＳＣＡＮ解析のデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ がＩＭＰデヒドロゲナーゼであるさらに実証的な証拠を提供する。別の例において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３ はマウス ４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ （ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ８４９０５３） に２８％の同一性を有していることが、ＢＬＡＳＴによって確率スコア９．１ｅ−２２で確認された（表２参照）。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３はまた、４−４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ Ｃ 末端ドメインを有するが、 これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。 （表３参照）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２は、同様に解析され注釈が付けられた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３の解析のためのアルゴリズム及びパラメータが表７で記述されている。
【０１４６】
表４に示すように、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡ配列、またはゲノムＤＮＡ由来のコード（エキソン）配列、或いはこれらの２種類の配列のあらゆる組み合わせを用いて組み立てた。列１は本発明の各ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）および対応するＩｎｃｙｔｅポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（Ｉｎｃｙｔｅ ＩＤ）、および塩基対の各ポリヌクレオチド配列の長さを示している。列２は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列の構築に用いられるｃＤＮＡ配列および／またはゲノム配列、並びにポリヌクレオチドの断片の開始ヌクレオチド（５’）位置および終了ヌクレオチド（３’）位置を示しており、このポリヌクレオチド配列の断片は、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４−６ を同定するか、あるいはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４−６ と関連するポリヌクレオチド配列とを区別するハイブリダイゼーションまたは増幅技術に有用なポリヌクレオチド配列の断片である。
【０１４７】
表４の列２に記載したポリヌクレオチド断片は、特に、例えば組織特異的ｃＤＮＡライブラリから由来する、あるいはプールされたｃＤＮＡライブラリから由来するＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡを指す。或いは列２のポリヌクレオチド断片は、完全長ポリヌクレオチド配列のアセンブリに寄与するＧｅｎＢａｎｋ ｃＤＮＡまたはＥＳＴを指す場合もある。さらに、列２のポリヌクレオチド断片は、ＥＮＳＥＭＢＬ（Ｔｈｅ Ｓａｎｇｅｒ Ｃｅｎｔｒｅ、英国ケンブリッジ）データベース（即ち「ＥＮＳＴ」命名を含む配列）から由来した配列を同定し得る。或いは、列２のポリヌクレオチド断片は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｃｏｒｄｓ データベースから由来する場合もあり（即ち「ＮＭ」または「ＮＴ」の命名を含む配列）、またＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｃｏｒｄｓ（即ち「ＮＰ」の命名を含む配列）から由来する場合もある。または列２のポリヌクレオチド断片は、「エキソンスティッチング（ｅｘｏｎ−ｓｔｉｔｃｈｉｎｇ）」アルゴリズムにより結び合わせたｃＤＮＡ及びＧｅｎｓｃａｎ予想エキソンの両方の集合を指す場合もある。例えば、ＦＬ＿ＸＸＸＸＸＸ＿Ｎ１＿Ｎ２＿ＹＹＹＹＹ＿Ｎ３＿Ｎ４ として同定されるポリヌクレオチド配列は「スティッチされた」配列であり、その内、ＸＸＸＸＸＸは該アルゴリズムが適用される配列のクラスターの識別番号であり、ＹＹＹＹＹは該アルゴリズムが生成する予測の数であり、Ｎ１，２，３．．．がある場合には、解析中に手動で編集された特定のエキソン群を表す（実施例５参照）。または列２のポリヌクレオチド断片は、「エキソンストレッチング（ｅｘｏｎ−ｓｔｒｅｔｃｈｉｎｇ）」アルゴリズムにより結び合わせたエキソンの集合を指す。例えば、ＦＬＸＸＸＸＸＸ＿ｇＡＡＡＡＡ＿ｇＢＢＢＢＢ＿１＿Ｎとして同定されるポリヌクレオチド配列は、「ストレッチ」配列である。ここでＸＸＸＸＸＸはＩｎｃｙｔｅプロジェクト識別番号、ｇＡＡＡＡＡは「エキソンストレッチング」アルゴリズムを適用したヒトゲノム配列のＧｅｎＢａｎｋ識別番号、ｇＢＢＢＢＢは一番近いＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体のＧｅｎＢａｎｋ識別番号またはＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ識別番号、Ｎ は特定のエキソンである（実施例５を参照）。ＲｅｆＳｅｑ 配列が「エキソンストレッチング」アルゴリズムのタンパク質相同体として使われた場合は、ＲｅｆＳｅｑ 識別子（「ＮＭ 」、「ＮＰ」または「 ＮＴ」と表示された）はＧｅｎＢａｎｋ 識別子（すなわち、ｇＢＢＢＢＢ）の代わりに使われる場合もある。
【０１４８】
あるいは、接頭コードは手で編集されたか、ゲノムＤＮＡ配列から予測されたか、または配列解析方法の組み合わせから由来している構成配列を識別する。次の表は構成配列の接頭コードと、接頭コードと関連する同じ配列の分析方法の例を列記する（実施例４と５を参照）。
2005501507.tif 000005
【０１４９】
場合によっては、最終コンセンサスポリヌクレオチド配列を確認するために表４に示すような配列の適用範囲と重複するＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡの適用範囲が得られたが、それに関連するＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ識別番号は示さなかった。
【０１５０】
表５はＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列を用いて構築された完全長ポリヌクレオチド配列のための代表的なｃＤＮＡライブラリを示している。代表的なｃＤＮＡライブラリは、上記のポリヌクレオチド配列を構築及び確認するために用いられるＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列によって最も頻繁に代表されるＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡライブラリである。ｃＤＮＡライブラリを作製するために用いた組織及びベクターを表５に示し、表６で説明している。
【０１５１】
本発明はまた、ＯＸＲＤ の変異体も含む。好適なＯＸＲＤ の変異体は、ＯＸＲＤ の機能的或いは構造的特徴の少なくとも一つを有し、かつＯＸＲＤ アミノ酸配列に対して少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、更には少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０１５２】
本発明はまた、ＯＸＲＤをコードするポリヌクレオチドを提供する。特定の実施例において、本発明は、ＯＸＲＤをコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４−６からなる一群から選択された配列を含むポリヌクレオチド配列を提供する。ＳＥＱ ＮＯ ＩＤ：４−６のポリヌクレオチド配列は、配列表に示すように等価ＲＮＡ配列を有しているが、窒素塩基チミンの出現はウラシルに置換され、糖のバックボーンはデオキシリボースではなくリボースから構成されている。
【０１５３】
本発明には、ＯＸＲＤをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列も含まれる。詳細には、このようなポリヌクレオチド配列の変異配列は、ＯＸＲＤをコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％のポリヌクレオチド配列同一性、あるいは少なくとも約８５％のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも約９５％ものポリヌクレオチド配列同一性を有する。本発明の特定の実施形態は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４−６からなる一群から選択された核酸配列と少なくとも約７０％のポリヌクレオチド配列同一性、或いは少なくとも約８５％のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも約９５％ものポリヌクレオチド配列同一性を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４−６からなる一群から選択された配列を含むポリヌクレオチド配列の変異配列を提供する。 上記したポリヌクレオチド変異配列は何れも、ＯＸＲＤの機能的或いは構造的特徴の少なくとも１つを有するアミノ酸配列をコードする。
【０１５４】
更にあるいは別法では、本発明のポリヌクレオチドの変異体はＯＸＲＤをコ−ドするポリヌクレオチド配列のスプライス変異体である。スプライス変異体は、ＯＸＲＤをコードするポリヌクレオチド配列に対して有意な配列同一性を有する部分を有し得るが、ｍＲＮＡプロセッシング中のエキソンの選択的スプライシングによって配列の阻害の追加と削除により、通常より多くまたはより少数のポリヌクレオチドを有することになる。スプライス変異体は、ＯＸＲＤ をコードするポリヌクレオチド配列に対してその全長の約７０％未満、或いは約６０％未満、更には約５０％未満のポリヌクレオチド配列同一性を有し得る。しかしスプライス変異体の部分は、ＯＸＲＤ をコードするポリヌクレオチド配列の部分と少なくとも約７０％、或いは少なくとも約８５％、更には少なくとも約９５％、なお更には少なくとも１００％のポリヌクレオチド配列同一性を有する。上記したスプライス変異配列は何れも、ＯＸＲＤの機能的或いは構造的特徴の少なくとも１つを有するアミノ酸配列をコードする。
【０１５５】
遺伝暗号の縮重により作り出され得るＯＸＲＤをコードする種々のポリヌクレオチド配列には、自然発生する任意の既知の遺伝子のポリヌクレオチド配列と最小の類似性しか有しないものも含まれることを、当業者は理解するであろう。したがって本発明は、可能コドン選択に基づく組合せの選択によって産出し得るようなありとあらゆる可能性のあるポリヌクレオチド配列変異体を網羅し得る。これらの組み合わせは、天然のＯＸＲＤのポリヌクレオチド配列に適用される標準的なトリプレット遺伝暗号を基に作られ、全ての変異が明確に開示されているとみなす。
【０１５６】
ＯＸＲＤ  をコードするヌクレオチド配列及びその変異配列は一般に、適切に選択されたストリンジェントな条件下で、天然のＯＸＲＤ  のヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能であるが、例えば、非天然のコドンを含めるなどの実質的に異なった使い方のコドンを有するＯＸＲＤ  或いはその誘導体をコードするヌクレオチド配列を作ることは有利となり得る。宿主が特定のコドンを利用する頻度に基づいて、特定の真核又は原核宿主に発生するペプチドの発現率を高めるようにコドンを選択することが可能である。コードされたアミノ酸配列を変えないで、ＯＸＲＤ 及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に変更する別の理由は、天然の配列から作られる転写物より例えば長い半減期など好ましい特性を備えるＲＮＡ転写物を作ることにある。
【０１５７】
本発明はまた、ＯＸＲＤ  及びその誘導体をコードするＤＮＡ配列またはそれらの断片を完全に合成化学によって作り出すことも含む。作製後、当分野でよく知られている試薬を用いて、この合成配列を任意の様々な入手可能な発現ベクター及び細胞系中に挿入し得る。 更に、合成化学を用いてＯＸＲＤ またはその任意の断片をコードする配列に突然変異を誘導し得る。
【０１５８】
更に本発明には、種々のストリンジェントな条件下で、請求項に記載されたポリヌクレオチド配列、特に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４−６ 及びそれらの断片とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列が含まれる（例えば、Ｗａｈｌ， Ｇ．Ｍ．及びＳ．Ｌ． Ｂｅｒｇｅｒ （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３９９−４０７、Ｋｉｍｍｅｌ， Ａ．Ｒ． （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２：５０７−５１１等を参照）。アニーリング及び洗浄条件を含むハイブリダイゼーションの条件は、「定義」に記載されている。
【０１５９】
ＤＮＡシークエンシングの方法は当分野では公知であり、本発明のいずれの実施例もＤＮＡシークエンシング方法を用いて実施可能である。ＤＮＡシークエンシング方法には酵素を用いることができ、例えばＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ（ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ ＯＨ）、Ｔａｑポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、熱安定性Ｔ７ポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）を用いることができる。或いは、例えばＥＬＯＮＧＡＳＥ増幅システム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）において見られるように、ポリメラーゼと校正エキソヌクレアーゼを併用することができる。好適には、ＭＩＣＲＯＬＡＢ２２００液体転移システム（Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｒｅｎｏ， ＮＶ）、ＰＴＣ２００サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ ＭＡ）及びＡＢＩ ＣＡＴＡＬＹＳＴ ８００サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）等の装置を用いて配列の準備を自動化する。次に、ＡＢＩ ３７３ 或いは ３７７ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＭＥＧＡＢＡＣＥ １０００ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ）または当分野でよく知られている他の方法を用いてシークエンシングを行う。結果として得られた配列を当分野でよく知られている種々のアルゴリズムを用いて分析する（Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． （１９９７） Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ｕｎｉｔ ７．７、Ｍｅｙｅｒｓ， Ｒ．Ａ． （１９９５） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ ＶＣＨ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ８５６−８５３ページ等を参照）。 ８５６−８５３．）
【０１６０】
当分野で周知のＰＣＲ法をベースにした種々の方法で、部分的なヌクレオチド配列を利用して、ＯＸＲＤ をコードする核酸配列を伸長し、プロモーターや調節エレメントなどの上流にある配列を検出する。例えば、使用し得る方法の１つである制限部位ＰＣＲ法は、ユニバーサルプライマー及びネステッドプライマーを用いてクローニングベクター内のゲノムＤＮＡから未知の配列を増幅する方法である（例えば、 Ｓａｒｋａｒ， Ｇ． （１９９３） ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ． ２：３１８３２２を参照。）別の方法に逆ＰＣＲ法があり、これは広範な方向に伸長させたプライマーを用いて環状化した鋳型から未知の配列を増幅する方法である。鋳型は、既知のゲノム遺伝子座及びその周辺の配列を含む制限酵素断片から得る（例えば、Ｔｒｉｇｌｉａ， Ｔ． 他 （１９８８） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：８１８６。）第３の方法としてキャプチャＰＣＲ法があり、これはヒト及び酵母菌人工染色体ＤＮＡの既知の配列に隣接するＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅する方法に関与している。（Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｍ， Ｍ．他（１９９１） ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ １：１１１−１１９等を参照）。この方法では、ＰＣＲを行う前に複数の制限酵素の消化及びライゲーション反応を用いて未知の配列領域内に組換え二本鎖配列を挿入することが可能である。また、未知の配列を検索するために用い得る別の方法については当分野で知られている（Ｐａｒｋｅｒ， Ｊ．Ｄ．他 （１９９１） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９：３０５５−３０６０等を参照）。更に、ＰＣＲ、ネステッドプライマー及びＰｒｏｍｏｔｅｒＦｉｎｄｅｒ（商標）ライブラリ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）を用いてゲノムＤＮＡをウォーキングすることができる。この手順は、ライブラリをスクリーニングする必要がなく、イントロン／エキソン接合部を見付けるのに有用である。全てのＰＣＲベースの方法に対して、市販されているソフトウェア、例えばＯＬＩＧＯ ４．０６プライマー分析ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｐｌｙｍｏｕｔｈ ＭＮ）或いは別の好適なプログラムを用いて、長さが約２２〜３０ヌクレオチド、ＧＣ含有率が約５０％以上、温度約６８℃〜７２℃で鋳型に対してアニーリングするようにプライマーを設計し得る。
【０１６１】
完全長ｃＤＮＡをスクリーニングする際は、より大きなｃＤＮＡを含むようにサイズ選択されたライブラリを用いるのが好ましい。更に、ランダムプライマーのライブラリは、しばしば遺伝子の５’領域を有する配列を含み、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリが完全長ｃＤＮＡを作製できない状況に対して好適である。ゲノムライブラリは、５’非転写調節領域への配列の伸長に有用であろう。
【０１６２】
市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシングまたはＰＣＲ産物のサイズを分析し、またはそのヌクレオチド配列を確認することができる。具体的には、キャピラリーシークエンシングは、電気泳動による分離のための流動性ポリマーと、４つの異なるヌクレオチドに特異的であるような、レーザで活性化される蛍光色素と、発光された波長の検出に利用するＣＣＤカメラとを有し得る。出力／光の強度は、適切なソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＧＥＮＯＴＹＰＥＲ、ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＮＡＶＩＧＡＴＯＲ等）を用いて電気信号に変換し得る。サンプルのロードからコンピュータ分析及び電子データ表示までの全プロセスがコンピュータ制御可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しないようなＤＮＡ小断片のシークエンシングに特に適している。
【０１６３】
本発明の別の実施例では、ＯＸＲＤ をコードするポリヌクレオチド配列またはその断片を組換えＤＮＡ分子にクローニングして、適切な宿主細胞内にＯＸＲＤ、その断片または機能的等価物を発現させることが可能である。遺伝暗号固有の縮重により、実質的に同じ或いは機能的に等価のアミノ酸配列をコードする別のＤＮＡ配列が作られ得り、これらの配列をＯＸＲＤのクローン化及び発現に利用可能である。
【０１６４】
種々の目的でＯＸＲＤをコードする配列を変えるために、当分野で一般的に知られている方法を用いて、本発明のヌクレオチド配列を組換えることができる。この目的には、遺伝子産物のクローン化、プロセッシング及び／または発現の調節が含まれるが、これらに限定されるものではない。遺伝子断片及び合成オリゴヌクレオチドのランダムなフラグメンテーション及びＰＣＲ再アセンブリによるＤＮＡシャッフリングを用い、ヌクレオチド配列を組み換えることが可能である。例えば、オリゴヌクレオチドを介した部位特異的変異誘導を利用して、新規な制限部位の作製、グリコシル化パターンの変更、コドン優先の変更、スプライス変異体の生成等を起こす突然変異を導入し得る。
【０１６５】
本発明のヌクレオチドは、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＲＥＥＤＩＮＧ（Ｍａｘｙｇｅｎ Ｉｎｃ．， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ ＣＡ。 米国特許第５，８３７，４５８号、Ｃｈａｎｇ， Ｃ．−Ｃ．他 （１９９９） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：７９３−７９７、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓ， Ｆ．Ｃ．他 （１９９９） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：２５９−２６４、Ｃｒａｍｅｒｉ， Ａ． 他 （１９９６） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １４：３１５−３１９に記載）等のＤＮＡシャッフリング技術の対象となり、ＯＸＲＤの生物学的特性、例えば生物活性、酵素力、或いは他の分子や化合物との結合力等を変更または向上させ得る。ＤＮＡシャッフリングは、遺伝子断片のＰＣＲを介する組換えを用いて遺伝子変異体のライブラリを作製するプロセスである。ライブラリはその後、その遺伝子変異体を所望の特性に同定するような選択またはスクリーニングにかける。次にこれらの好適な変異体をプールし、更に反復してＤＮＡシャッフリング及び選択／スクリーニングを行ってもよい。従って、人工的な育種及び急速な分子の進化によって多様な遺伝子が作られる。例えば、ランダムポイント突然変異を有する単一の遺伝子の断片を組み換えて、スクリーニングし、その後所望の特性が最適化されるまでシャッフリングすることができる。或いは、所定の遺伝子を同種または異種のいずれかから得た同一遺伝子ファミリーの相同遺伝子と組み換え、それによって天然に存在する複数の遺伝子の遺伝多様性を、指示された制御可能な方法で最大化させることができる。
【０１６６】
別の実施例によれば、ＯＸＲＤ をコードする配列は、当分野で周知の化学的方法を用いて、全体或いは一部が合成可能である（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ． Ｍ．Ｈ．ら（１９８０）Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ ７：２１５−２２３； 及びＨｏｒｎ， Ｔ．他（１９８０）Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ．２２５−２３２を参照）。別法として、化学的方法を用いてＯＸＲＤ 自体またはその断片を合成することが可能である。例えば、種々の液相または固相技術を用いてペプチド合成を行うことができる（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｔ． （１９８４） Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ５５−６０頁、Ｒｏｂｅｒｇｅ， Ｊ．Ｙ．他 （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：２０２２０４等を参照）。自動合成はＡＢＩ ４３１Ａペプチドシンセサイザ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて達成し得る。更にＯＸＲＤのアミノ酸配列または任意のその一部は、直接的な合成の際の改変により、および／または他のタンパク質群または任意のその一部からの配列群との組み合わせにより、変異配列ポリペプチドを、または、天然のポリペプチド配列を有するポリペプチドを作製することが可能である。
【０１６７】
このペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィーを用いて実質的に精製し得る（Ｃｈｉｅｚ， Ｒ．Ｍ．およびＦ．Ｚ． Ｒｅｇｎｉｅｒ （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２：３９２−４２１などを参照）。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析またはシークエンシングによって確認することができる（前出のＣｒｅｉｇｈｔｏｎ， ２８−５３ページなどを参照）。
【０１６８】
生物学的に活性なＯＸＲＤを発現させるために、ＯＸＲＤをコードするヌクレオチド配列またはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入する。 この発現ベクターは、好適な宿主に挿入されたコーディング配列の転写および翻訳の制御に必要なエレメントを含む。これらのエレメントには、ベクター及びＯＸＲＤをコードするポリヌクレオチド配列におけるエンハンサー、構成型及び発現誘導型のプロモーター、５’及び３’の非翻訳領域などの調節配列が含まれる。このような要素は、長さ及び特異性が様々である。特定の開始シグナルによって、ＯＸＲＤをコードする配列のより効果的な翻訳を達成することが可能である。このようなシグナルには、ＡＴＧ開始コドンと、コザック配列などの近傍の配列が含まれる。ＯＸＲＤ をコードする配列及びその開始コドン、上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入された場合は、更なる転写調節シグナルや翻訳調節シグナルは必要なくなるであろう。しかしながら、コーディング配列或いはその断片のみが挿入された場合は、インフレームのＡＴＧ開始コドンを含む外来性の翻訳調節シグナルが発現ベクターに含まれるようにすべきである。外来性の翻訳要素及び開始コドンは、様々な天然物及び合成物を起源とし得る。用いる特定の宿主細胞系に適したエンハンサー類を含めることにより、発現の効率を高めることが可能である（例えば、Ｓｃｈａｒｆ， Ｄ． 他 （１９９４） Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． ２０１−１８−１６２．を参照）。
【０１６９】
当業者に周知の方法を用いて、ＯＸＲＤ をコードする配列、好適な転写及び翻訳調節エレメントを含む発現ベクターを作製することが可能である。これらの方法には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組換え技術が含まれる（例えば、 Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． 他． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ． Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹ， ４章及び８章， および１６−１７章； およびＡｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． 他． （１９９５） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ｃｈ． ９章、１３章および１６章を参照）。
【０１７０】
種々の発現ベクター／宿主系を利用して、ＯＸＲＤをコードする配列の保持および発現が可能である。限定するものではないがこのような発現ベクター／宿主系には、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換させた細菌や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌など微生物や、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶまたはタバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えばＴｉプラスミドまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換させた植物細胞系、動物細胞系がある（前出のＳａｍｂｒｏｏｋ、前出のＡｕｓｕｂｅｌ、Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ， Ｇ． ａｎｄ Ｓ．Ｍ． Ｓｃｈｕｓｔｅｒ （１９８９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：５５０３−５５０９、； Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ、Ｅ．Ｋ． ら （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：３２２４−３２２７、Ｓａｎｄｉｇ， Ｖ． ら （１９９６） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：１９３７−１９４５、Ｔａｋａｍａｔｓｕ， Ｎ． （１９８７） ＥＭＢＯＪ． ６：３０７−３１１、；『マグローヒル科学技術年鑑』（Ｔｈｅ ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｙｅａｒｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） （１９９２） ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， １９１−１９６ページ、Ｌｏｇａｎ， Ｊ． ａｎｄ Ｔ． Ｓｈｅｎｋ （１９８４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：３６５５−３６５９、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｊ．Ｊ． ら （１９９７） Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． １５：３４５−３５５等を参照）レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルス由来の発現ベクター、または種々の細菌性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的器官、組織または細胞集団へ輸送することができる（Ｄｉ Ｎｉｃｏｌａ， Ｍ． 他 （１９９８） Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎ． Ｔｈｅｒ． ５（６）：３５０−３５６、Ｙｕ， Ｍ． 他 （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０（１３）：６３４０−６３４４、Ｂｕｌｌｅｒ， Ｒ．Ｍ． 他 （１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１７（６０４０）：８１３−８１５； ＭｃＧｒｅｇｏｒ， Ｄ．Ｐ． 他 （１９９４） Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３１（３）：２１９−２２６、Ｖｅｒｍａ， Ｉ．Ｍ． 及び Ｎ． Ｓｏｍｉａ （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ ３８９：２３９−２４２等を参照）。本発明は使用される宿主細胞によって限定されるものではない。
【０１７１】
細菌系では、多数のクローニングベクター及び発現ベクターが、ＯＸＲＤをコードするポリヌクレオチド配列の使用目的に応じて選択可能である。例えば、ＯＸＲＤ をコードするポリヌクレオチド配列の日常的なクローニング、サブクローニング、増殖には、ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）またはｐＳＰＯＲＴ１プラスミド（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）などの多機能の大腸菌ベクターを用いることができる。ベクターのマルチクローニング部位にＯＸＲＤ  をコードする配列をライゲーションするとｌａｃＺ遺伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌の同定のための比色スクリーニング法が可能となる。更にこれらのベクターは、クローニングされた配列におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ転写、ジデオキシのシークエンシング、ヘルパーファージによる一本鎖のレスキュー、入れ子状態の欠失の生成にも有用であろう（例えば、Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ， Ｇ． および Ｓ．Ｍ． Ｓｃｈｕｓｔｅｒ （１９８９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：５５０３５５０９を参照）。例えば、抗体の産生のためなどに多量のＯＸＲＤ が必要な場合は、ＯＸＲＤ の発現をハイレベルで誘導するベクターが使用できる。例えば、強力な誘導ＳＰ６バクテリオファージプロモーターまたは誘導Ｔ７バクテリオファージプロモーターを含むベクターが使用できる。
【０１７２】
酵母の発現系を使用してＯＸＲＤを産出し得る。α因子、アルコールオキシダーゼ、ＰＧＨプロモーター等の構成型或いは誘導型のプロモーターを含む多数のベクターが、発芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはピキア酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）に使用可能である。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質の分泌か細胞内への保持のどちらかを誘導し、安定した増殖のために宿主ゲノムの中に外来配列を組み込む（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， １９９５、前出、Ｂｉｔｔｅｒ， Ｇ．Ａ． ら （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−５４４、及びＳｃｏｒｅｒ． Ｃ． Ａ． ら （１９９４） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２１−１８１−１８４を参照）。
【０１７３】
植物系を使用してＯＸＲＤを発現することも可能である。ＯＸＲＤ  をコードする配列の転写は、ウイルスプロモーター、例えば単独或いはＴＭＶ（Ｔａｋａｍａｔｓｕ， Ｎ． （１９８７） ＥＭＢＯ Ｊ ６：３０７−３１１）由来のオメガリーダー配列と組み合わせて用いられるようなＣａＭＶ由来の３５Ｓ及び１９Ｓプロモーターによって促進される。或いは、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニット等の植物プロモーターまたは熱ショックプロモーターを用いてもよい（例えば、Ｃｏｒｕｚｚｉ， Ｇ． 他 （１９８４） ＥＭＢＯ Ｊ． ３ ： １６７１−１６８０ ； Ｂｒｏｇｌｉｅ， Ｒ． 他 （１９８４） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４ ： ８３８−８４３ ； および Ｗｉｎｔｅｒ， Ｊ． 他 （１９９１） Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． １７ ： ８５−１０５を参照）これらの構成物は、直接ＤＮＡ形質転換または病原体を媒介とする形質移入によって、植物細胞内に導入可能である。（『マグローヒル科学技術年鑑』（Ｔｈｅ ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｙｅａｒｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） （１９９２） ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ，１９１−１９６ページなどを参照）。
【０１７４】
哺乳動物細胞においては、多数のウイルスベースの発現系を利用し得る。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、後発プロモーター及び３連リーダー配列からなるアデノウイルス転写物／翻訳複合体にＯＸＲＤ をコードする配列を結合し得る。ウイルスのゲノムの非必須のＥ１またはＥ３領域への挿入により、宿主細胞にＯＸＲＤ を発現する感染性ウイルスを得ることが可能である（Ｌｏｇａｎ， Ｊ．及びＳｈｅｎｋ， Ｔ．（１９８４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１：３６５５−３６５９を参照）。更に、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサー等の転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させ得る。ＳＶ４０またはＥＢＶをベースにしたベクターを用いてタンパク質を高レベルで発現させることもできる。
【０１７５】
ヒト人工染色体（ＨＡＣ）を用いて、プラスミドに含まれ且つプラスミドから発現するものより大きなＤＮＡの断片を輸送することもできる。治療のために、約６ｋｂ〜１０ＭｂのＨＡＣが作製され、従来の送達方法（リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、またはベシクル）で送達されている（例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ． Ｊ．Ｊ． 他 （１９９７） Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１５：３４５−３５５．を参照）。
【０１７６】
長期にわたり哺乳動物系内で組換えタンパク質を生成するためには、細胞株内のＯＸＲＤ の安定発現が望ましい。例えば、発現ベクター群を用いて、ＯＸＲＤ をコードする配列群を株化細胞群に形質転換することが可能である。このような発現ベクターは、複製因子および／または内因性の発現因子のウイルス性の起源や、或る選択可能マーカー遺伝子を、同じベクター上あるいは別のベクター上に有し得る。ベクターの導入後、選択培地に移す前に強化培地で約１〜２日間細胞を増殖させることができる。選択可能マーカーの目的は選択培地への抵抗性を与えることであり、選択可能マーカーが存在することにより、導入された配列をうまく発現するような細胞の成長及び回収が可能となる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖可能である。
【０１７７】
任意の数の選択系を用いて、形質転換細胞株を回収できる。限定するものではないがこのような選択系には、ｔｋ−細胞のために用いられる単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子と、ａｐｒ−細胞のために用いられる単純ヘルペスウイルスのアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子がある（例えば、Ｗｉｇｌｅｒ， Ｍ． 他 （１９７７） Ｃｅｌｌ １１：２２３−２３２； 及びＬｏｗｙ， Ｉ． 他（１９８０） Ｃｅｌｌ ２２：８１７−８２３を参照）。また、選択の基礎として代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を用いることができる。例えばｄｈｆｒはメトトレキセートに対する耐性を与え、ｎｅｏはアミノグリコシッドネオマイシン及びＧ−４１８に対する耐性を与え、ａｌｓはクロルスルフロンに対する耐性を、ｐａｔはホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を各々与える（ Ｗｉｇｌｅｒ， Ｍ． 他（１９８０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：３５６７３５７０； ＣｏｌｂｅｒｅＧａｒａｐｉｎ， Ｆ． 他（１９８１） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０：１１４ 等を参照。）この他の選択可能な遺伝子、例えば、代謝のための細胞の必要条件を変えるｔｒｐＢ及びｈｉｓＤは、文献に記載されている（例えば、 Ｈａｒｔｍａｎ， Ｓ．Ｃ． 及びＲ．Ｃ． Ｍｕｌｌｉｇａｎ （１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：８０４７８０５１参照。）可視マーカー、例えばアントシアニン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、βグルクロニダーゼ及びその基質βグルクロニド、またはルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリン等を用いてもよい。これらのマーカーを用いて、トランスフォーマントを特定するだけでなく、特定のベクター系に起因する一過性或いは安定したタンパク質発現を定量することが可能である（Ｒｈｏｄｅｓ， Ｃ．Ａ． （１９９５） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５５：１２１１３１等を参照）。
【０１７８】
マーカー遺伝子発現の存在／不存在によって目的の遺伝子の存在が示唆されても、その遺伝子の存在及び発現の確認が必要な場合もある。例えば、ＯＸＲＤ をコードする配列がマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、ＯＸＲＤ をコードする配列を含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により同定可能である。または、１つのプロモーターの制御下でマーカー遺伝子をＯＸＲＤ をコードする配列とタンデムに配置することも可能である。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は通常、タンデム遺伝子の発現も示す。
【０１７９】
一般に、ＯＸＲＤ をコードする核酸配列を含み、ＯＸＲＤ を発現する宿主細胞は、当業者に周知の種々の方法を用いて同定することが可能である。 これらの方法には、ＤＮＡ−ＤＮＡあるいはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションや、ＰＣＲ法、核酸あるいはタンパク質の検出および／または数量化のための膜系、溶液ベース、あるいはチップベースの技術を含むタンパク質生物学的試験法または免疫学的アッセイが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１８０】
特異的ポリクローナル抗体または特異的モノクローナル抗体を用いてＯＸＲＤ の発現の検出及び計測を行うための免疫学的方法は、当分野で公知である。 このような技術の例としては、酵素に結合したイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）などが挙げられる。ＯＸＲＤ 上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、２部位のモノクローナルベースイムノアッセイ（ｔｗｏ−ｓｉｔｅ， ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ−ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）が好ましいが、競合の結合アッセイも用いることもできる。これらのアッセイ及びこれ以外のアッセイは、当分野で公知である（Ｈａｍｐｔｏｎ． Ｒ． 他 （１９９０） Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ＡＰＳ Ｐｒｅｓｓ． Ｓｔ Ｐａｕｌ． ＭＮ， Ｓｅｃｔ． ＩＶ、Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ． Ｅ． 他 （１９９７） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ、Ｐｏｕｎｄ， Ｊ．Ｄ． （１９９８） Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｈｕｍａｎｓ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ ＮＪ等を参照）。
【０１８１】
多岐にわたる標識方法及び抱合方法が、当業者に知られており、様々な核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイにこれらの方法を用い得る。ＰＣＲ  をコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ或いはＰＣＲプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅が含まれる。別法として、ＯＸＲＤをコードする配列、またはその任意の断片をｍＲＮＡプローブを生成するためのベクターにクローニングすることも可能である。このようなベクターは、当分野において知られており、市販もされており、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６等の好適なＲＮＡポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドを加えて、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブの合成に用いることができる。このような方法は、例えばＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）、Ｕ．Ｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ等から市販されている種々のキットを用いて実行することができる。検出を容易にするために用い得る好適なレポーター分子或いは標識には、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子のほか、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤等がある。
【０１８２】
ＯＸＲＤ  をコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培地でのこのタンパク質の発現及び回収に好適な条件下で培養される。形質転換細胞から製造されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用される配列、ベクター、或いはその両者に依存する。ＯＸＲＤ をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜及び真核細胞膜を透過するＯＸＲＤ の分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理解されよう。
【０１８３】
更に、宿主細胞株の選択は、挿入した配列の発現を調節する能力または発現したタンパク質を所望の形に処理する能力によって行い得る。限定するものではないがこのようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化及びアシル化がある。タンパク質の「プレプロ」または「プロ」形を切断する翻訳後のプロセシングを利用して、タンパク質の標的への誘導、折りたたみ及び／または活性を特定することが可能である。翻訳後の活性のための固有の細胞装置及び特徴のある機構を有する種々の宿主細胞（例えばＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＭＥＫ２９３、ＷＩ３８等）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）から入手可能であり、外来タンパク質の正しい修飾及び処理を確実にするように選択し得る。
【０１８４】
本発明の別の実施例では、ＯＸＲＤ  をコードする天然核酸配列、変更された核酸配列、または組換えの核酸配列を上記した任意の宿主系の融合タンパク質の翻訳を生じるような異種配列に結合させる。例えば、市販の抗体によって認識される異種部分を含むキメラＯＸＲＤ  タンパク質が、ＯＸＲＤ  活性のインヒビターに対するペプチドライブラリのスクリーニングを容易にする。また、異種タンパク質部分及び異種ペプチド部分も、市販されている親和性基質を用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。限定されるものではないがこのような部分には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（Ｔｒｘ）、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、６−Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃ、赤血球凝集素（ＨＡ）がある。ＧＳＴは固定化グルタチオン上で、ＭＢＰはマルトース上で、Ｔｒｘはフェニルアルシンオキシド上で、ＣＢＰはカルモジュリン上で、そして６−Ｈｉｓは金属キレート樹脂上で、同族の融合タンパク質の精製を可能にする。ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃ及び赤血球凝集素（ＨＡ）は、これらのエピトープ標識を特異的に認識する市販されているモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を用いて、融合タンパク質の免疫親和性精製を可能にする。また、ＯＸＲＤ  をコードする配列と異種タンパク質配列との間にあるタンパク質分解切断部位を融合タンパク質が含むように遺伝子操作すると、ＯＸＲＤ  が精製の後に異種部分から切断され得る。融合タンパク質の発現及び精製方法は、前出のＡｕｓｕｂｅｌ （１９９５） １０章に記載されている。市販されている種々のキットを用いて融合タンパク質の発現及び精製を促進することもできる。
【０１８５】
本発明の別の実施例では、ＴＮＴウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽抽出系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで放射能標識したＯＸＲＤ の合成が可能である。これらの系は、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６プロモーターと機能的に連結したタンパク質コード配列の転写及び翻訳をカップルさせる。翻訳は、例えば３５Ｓメチオニンのような放射能標識したアミノ酸前駆体の存在下で起こる。
【０１８６】
本発明のＯＸＲＤ またはその断片を用いて、ＯＸＲＤ に特異結合する化合物をスクリーニングすることができる。少なくとも１つまたは複数の試験化合物を用いて、ＯＸＲＤへの特異的な結合をスクリーニングすることが可能である。試験化合物の例には、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば受容体）または小分子が挙げられる。
【０１８７】
一実施例では、このように同定された化合物は、例えばリガンドやその断片などのＯＸＲＤの天然のリガンド、または天然の基質、構造的または機能的な擬態性または自然結合パートナーに密接に関連している（Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ．Ｅ． 他 （１９９１） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １（２）の５章等を参照）。同様に、化合物は、ＯＸＲＤ が結合する天然受容体、或いは例えばリガンド結合部位などの少なくとも受容体のある断片に密接に関連し得る。何れの場合も、既知の技術を用いてこの化合物を合理的に設計することができる。一実施例では、このような化合物に対するスクリーニングには、分泌タンパク質或いは細胞膜上のタンパク質の何れか一方としてＯＸＲＤを発現する好適な細胞の作製が含まれる。好適な細胞には、哺乳動物、酵母、ショウジョウバエ、または大腸菌からの細胞が含まれる。ＯＸＲＤ を発現する細胞またはＯＸＲＤ を含有する細胞膜断片を試験化合物と接触させて、ＯＸＲＤ または化合物の何れかの結合、刺激または阻害を分析する。
【０１８８】
あるアッセイは、単に試験化合物をポリペプチドに実験的に結合させ、蛍光色素、放射性同位体、酵素抱合体またはその他の検出可能な標識によりその結合を検出することができる。例えば、このアッセイは、少なくとも１つの試験化合物を、溶液中のあるいは固体支持物に固定されたＯＸＲＤ と混合するステップと、ＯＸＲＤ とこの化合物との結合を検出するステップを含む場合がある。別法では、標識された競合物の存在下での試験化合物の結合の検出及び測定を行うことができる。更にこのアッセイでは、無細胞再構成標本、化学ライブラリまたは天然の生成混合物を用いて実施することができ、試験化合物は、溶液中で遊離させるか固体支持体に固定させる。
【０１８９】
本発明のＯＸＲＤまたはその断片を用いて、ＯＸＲＤの活性を調整する化合物をスクリーニングすることが可能である。このような化合物には、アゴニスト、アンタゴニスト、部分的アゴニスト、または逆アゴニスト等が含まれる。ある実施態様では、ＯＸＲＤ の活性が許容される条件下でアッセイを実施し、そのアッセイでは少なくとも１つの試験化合物をＯＸＲＤ と混合し、試験化合物の存在下でＯＸＲＤ の活性を試験化合物不在下でのＯＸＲＤ の活性と比較する。試験化合物の存在下でのＯＸＲＤ の活性の変化は、ＯＸＲＤ の活性を調整する化合物の存在を示唆する。別の実施態様において、試験化合物をＯＸＲＤ 活性に適した条件下でＯＸＲＤ を含むｉｎ ｖｉｔｒｏまたは無細胞再構成系と混合させてアッセイを実施する。これらアッセイの何れかにおいて、ＯＸＲＤ  の活性を調整する試験化合物は間接的に結合することが可能であり、試験化合物と直接接触する必要はない。少なくとも１つ、または複数の試験化合物をスクリーニングできる。
【０１９０】
別の実施態様では、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）における相同組み換えを用いて動物モデル系内で、ＯＸＲＤ またはその哺乳動物相同体をコードするポリヌクレオチドを「ノックアウト」する。このような技術は当技術分野において周知であり、ヒト疾患動物モデルの作製に有用である（米国特許第５，１７５，３８３号及び第５，７６７，３３７号等を参照）。例えば１２９／ＳｖＪ細胞株等のマウスＥＳ細胞は初期のマウス胚に由来し、培地で増殖させることができる。このＥＳ細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ： Ｃａｐｅｃｃｈｉ， Ｍ．Ｒ． （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８−１２９２）等のマーカー遺伝子で破壊された目的の遺伝子を含むベクターで形質転換する。このベクターは、相同組換えにより宿主ゲノムの対応する領域に組み込まれる。別法では、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系を用いて相同組換えを行い、組織特異的または発生段階特異的に目的遺伝子をノックアウトする（Ｍａｒｔｈ， Ｊ．Ｄ． （１９９６） Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９７：１９９９−２００２； Ｗａｇｎｅｒ， Ｋ．Ｕ． 他 （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：４３２３−４３３０）。形質転換したＥＳ細胞を同定し、例えばＣ５７ＢＬ／６マウス系等から採取したマウス細胞胚盤胞に微量注入する。胚盤胞を偽妊娠メスに外科的に導入し、得られるキメラ子孫の遺伝形質を決め、これを交配させてヘテロ接合性系またはホモ接合性系を作製する。このようにして作製した遺伝子組換え動物は、可能性のある治療薬や毒性物質で検査することができる。
【０１９１】
ＯＸＲＤ をコードするポリヌクレオチドをｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト胚盤胞由来のＥＳ細胞において操作することが可能である。ヒトＥＳ細胞は、内胚葉、中胚葉及び外胚葉の細胞の種類を含む少なくとも８つの別々の細胞系統に分化する可能性を有する。これらの細胞系統は、例えば神経細胞、造血系統及び心筋細胞に分化する（Ｔｈｏｍｓｏｎ， Ｊ．Ａ． 他 （１９９８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５−１ １４７）。
【０１９２】
ＯＸＲＤ をコードするポリヌクレオチドを用いて、ヒト疾患をモデルとした「ノックイン」ヒト化動物（ブタ）または遺伝子組み換え動物（マウスまたはラット）を作製することが可能である。ノックイン技術を用いて、ＯＸＲＤ をコードするポリヌクレオチドのある領域を動物ＥＳ細胞に注入し、注入した配列を動物細胞ゲノムに組み込ませる。形質転換細胞を胞胚に注入し、胞胚を上記のように移植する。遺伝子組換え子孫または近交系について研究し、可能性のある医薬品を用いて処理し、ヒトの疾患の治療に関する情報を得る。別法では、例えばＯＸＲＤを乳汁内に分泌するなどＯＸＲＤを過剰に発現する哺乳動物近交系は、便利なタンパク質源ともなり得る（Ｊａｎｎｅ， Ｊ． 他 （１９９８） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． ４：５５−７４）。
【０１９３】
（治療）
ＯＸＲＤ の領域とオキシドレダクターゼの領域との間に、例えば配列およびモチーフの内容における化学的および構造的類似性が存在する。ＯＸＲＤ を発現する組織はまた、表６にも見られる。したがって、ＯＸＲＤ は細胞増殖異常、自己免疫、発生および生殖系疾患に関与していると考えられる。ＯＸＲＤ の発現または活性の増大に関連する疾患の治療においては、ＯＸＲＤ の発現または活性を低下させることが望ましい。また、ＯＸＲＤの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、ＯＸＲＤの発現または活性を増大させることが望ましい。
【０１９４】
従って、或る実施例において、ＯＸＲＤ の発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、患者にＯＸＲＤ またはその断片や誘導体を投与することが可能である。限定されるものではないが、そのような疾患として、細胞増殖異常には日光性角化症、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（ＭＣＴＤ）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌が含まれ、神経の疾患の中には、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキソン病及びその他の錐体外路障害、筋萎縮性側策硬化及びその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、クールー及びクロイツフェルト‐ヤコブ病、Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ症候群を含むプリオン病と、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管芽腫（ｃｅｒｅｂｅｌｌｏｒｅｔｉｎａｌ ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔｏｍａｔｏｓｉｓ）、脳３叉神経血管症候群、ダウン症を含む中枢神経系性精神遅滞及び他の発達障害、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、脳神経疾患、脊髄疾患筋ジストロフィー、および他の神経筋障害、末梢神経系疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性、及び中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺と、気分性及び不安性の障害、分裂病性疾患を含む精神病と、季節性障害（ＳＡＤ）と、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群（遅発性ジスキネジア）、ジストニー、分裂病性精神障害、帯状疱疹後神経痛、及びトゥーレット病と、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性症及び家族性前頭側頭性健忘症が含まれ、代謝疾患としてはシェーグレン−ラルソン症候群（ＳＬＳ）、過剰増殖、ＩＩ型、急性アルコール中毒症、副腎白質萎縮症、アルポート症候群、先天性脈絡膜欠如、デュシェンヌ‐ベッカー型筋ジストロフィー、ダウン症候群、嚢胞性線維症、慢性肉芽腫症、ゴーシェ病、ハンチントン舞踏病、マルファン症候群、筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィー、ピクノディスオストーシス、Ｒｅｆｓｕｍ症候群、網膜芽細胞種、鎌状赤血球貧血、サラセミア、ウェルナー症候群、ヴォン・ヴィレブランド病、ウィルムス腫瘍、ツェルヴェーガー症候群、ペルオキシソームアシルＣｏＡオキシダーゼ欠乏症、ペルオキシソームチオラーゼ欠乏症、ペルオキシソーム二価性タンパク質欠乏症、ミトコンドリアカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼおよびカルニチン欠乏症、ミトコンドリア長鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠乏症、ミトコンドリア中鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠乏症、ミトコンドリア短鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠乏症、ミトコンドリア電子伝達フラビンタンパク質および電子伝達フラビンタンパク質：ユービキノンオキシドレダクターゼ欠乏症、ミトコンドリア三価性タンパク質欠乏症およびミトコンドリア短鎖３ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠乏症が含まれ、平滑筋疾患の中には、．狭心症、アナフィラキシー性ショック、不整脈、喘息、心臓血管性ショック、クッシング症候群、高血圧、低血糖症、心筋梗塞、偏頭痛、およびクロム親和細胞腫（褐色細胞腫）、および心筋症、脳疾患、癲癇、カーンズ・セイヤー症候群、乳酸アシドーシス、筋クローヌス性疾患、および眼筋麻痺などのミオパシー、高アンモニア血症、トリメチルアミン尿症〈魚臭症候群〉、３−ヒドロキシジカルボン酸性尿、ジカルボン酸性尿、キサンチン尿症、先天性リポイド副腎過形成 （ＣＬＡＨ）、白化症３型、高インスリン症−高アンモニア血症候群（ＨＨＳ）、グルタル酸血症Ｉ型（ＧＡ−Ｉ）、家族性反復ミオグロビン尿症、インスリン抵抗性、先天性チミンウラシル尿症（家族性ピリミジン血症）、突発性鉄芽球性貧血（ＡＩＳＡ）、新生児型副腎白質ジストロフィー、低酸素症、外傷による組織への損壊悪化、被曝と紫外線照射、肝機能障害、著しい肥満症、メトヘモグロビン血症（ＨＭ１、ＨＭ２、ＨＭ３）、無月経を伴う肥厚性多毛症、ハーマンスキー−プゥドラック症候群、ライ症候群、低ケトーシス型低血糖症、イソ吉草酸血症および慢性溶血性貧血が含まれる。
【０１９５】
別の実施例では、ＯＸＲＤ またはその断片や誘導体を発現し得るベクターを患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むＯＸＲＤ の発現または活性の低下に関連した疾患を治療または予防することも可能である。
【０１９６】
更に別の実施例では、限定するものではないが上記した疾患を含む、ＯＸＲＤ の発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、実質的に精製されたＯＸＲＤ を含む組成物を好適な医薬用担体と共に患者に投与することも可能である。
【０１９７】
更に別の実施例では、ＯＸＲＤ の活性を調節するアゴニストを患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むＯＸＲＤ の発現または活性の低下に関連した疾患を治療または予防することも可能である。
【０１９８】
更なる実施例では、ＯＸＲＤ の発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、患者にＯＸＲＤ のアンタゴニストを投与することが可能である。限定するものではないが、このような疾患の例には、上記した細胞増殖異常、神経疾患代謝異常および平滑筋疾患が含まれる。一実施態様では、ＯＸＲＤ  と特異的に結合する抗体が直接アンタゴニストとして、或いはＯＸＲＤ  を発現する細胞または組織に薬剤を運ぶターゲッティング或いは運搬機構として間接的に用いられ得る。
【０１９９】
別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むＯＸＲＤ の発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、ＯＸＲＤ をコードするポリヌクレオチドの相補配列を発現するベクターを患者に投与することも可能である。
【０２００】
別の実施例では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、相補配列、またはベクターを、別の好適な治療薬と組み合わせて投与することもできる。併用療法で用いる好適な治療薬は、当業者が従来の医薬原理に従って選択し得る。治療薬と組み合わせることにより、上記した種々の疾患の治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法を用いることにより少量の各薬剤で医薬効果をあげることが可能となり、それによって副作用の可能性を低減し得る。
【０２０１】
ＯＸＲＤ のアンタゴニストは、本技術分野で一般的に知られている方法を用いて製造し得る。 具体的には、精製されたＯＸＲＤ を用いて抗体を作るか、治療薬のライブラリをスクリーニングして、ＯＸＲＤ と特異結合するものを同定することが可能である。ＯＸＲＤの抗体も、本技術分野で一般的に知られている方法を用いて製造することが可能である。 限定するものではないがこのような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片及びＦａｂ発現ライブラリによって作られた断片が含まれ得る。中和抗体（即ち二量体の形成を阻害する抗体）は通常、治療用に好適である。
【０２０２】
抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト及びその他のものを含む種々の宿主が、ＯＸＲＤ または任意の断片、または免疫原性の特性を備えるそのオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。限定するものではないがこのようなアジュバントには、フロイントアジュバントと、水酸化アルミニウム等のミネラルゲルアジュバントと、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、スカシガイのヘモシニアン、ジニトロフェノール等の界面活性剤とがある。ヒトに用いられるアジュバントの中では、ＢＣＧ（カルメット‐ゲラン杆菌）及びコリネバクテリウム‐パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）が特に好ましい。
【０２０３】
ＯＸＲＤ  に対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド、または断片は、少なくとも約５個のアミノ酸からなり、一般的には約１０個以上のアミノ酸からなるものが好ましい。これらのオリゴペプチド、ペプチドまたは断片は、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であることが望ましい。ＯＸＲＤのアミノ酸群の短い区間を、ＫＬＨなどの別のタンパク質の配列と融合し、キメラ分子に対する抗体を産生し得る。
【０２０４】
ＯＸＲＤ に対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって、抗体分子を産生する任意の技術を用いて作製することが可能である。限定するものではないがこのような技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術がある（Ｋｏｈｌｅｒ， Ｇ． 他． （１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７、Ｋｏｚｂｏｒ， Ｄ． 他 （１９８５） ．Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ８１：３１−４２、Ｃｏｔｅ， Ｒ．Ｊ． 他 （１９８３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０：２０２６−２０３０、Ｃｏｌｅ， Ｓ．Ｐ． 他 （１９８４） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ６２：１０９−１２０等を参照）。
【０２０５】
更に、、ヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺伝子をスプライシングするなどの「キメラ抗体」作製のために開発された技術が、好適な抗原特異性および生物学的活性を備える分子を得るために用いることができる。（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓ．Ｌ．他． （１９８４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１：６８５１６８５５； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ， Ｍ．Ｓ．他． （１９８４） Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８； Ｔａｋｅｄａ， Ｓ．他． （１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−４５４を参照）。別法では、当分野で周知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して、ＯＸＲＤ特異性一本鎖抗体を生成する。関連特異性を有するがイディオタイプ組成が異なるような抗体を、ランダムな組合せの免疫グロブリンライブラリからチェーンシャッフリングによって産生することもできる（Ｂｕｒｔｏｎ Ｄ．Ｒ． （１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：１０１３４−１０１３７等を参照）。
【０２０６】
抗体の産生は、リンパ球集団におけるｉｎ ｖｉｖｏ産生の誘導によって、或いは文献に開示されているように非常に特異的な結合試薬の免疫グロブリンのライブラリまたはパネルのスクリーニングによっても行い得る。（Ｏｒｌａｎｄｉ， Ｒ． 他 （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６： ３８３３−３８３７、Ｗｉｎｔｅｒ， Ｇ． 他 （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３−２９９等を参照）。
【０２０７】
ＯＸＲＤ のための特異結合部位を有する抗体断片を産生することもできる。例えば、限定するものではないが、このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって作製されるＦ（ａｂ’）２ 断片と、Ｆ（ａｂ’）２ 断片のジスルフィド架橋を還元することによって作製されるＦａｂ断片とがある。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリを作製することによって、所望の特異性を持つモノクローナルＦａｂ断片を迅速且つ容易に同定することが可能となる（Ｈｕｓｅ， Ｗ．Ｄ． 他 （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１等を参照）。
【０２０８】
種々のイムノアッセイを用いてスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体を同定することができる。確立された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の何れかを用いる競合結合アッセイ、または免疫放射定量測定法のための数々のプロトコルが、当分野では周知である。 通常このようなイムノアッセイには、ＯＸＲＤ  とその特異性抗体との間の複合体形成の計測が含まれる。二つの非干渉性ＯＸＲＤ エピトープに対して反応性のモノクローナル抗体を用いる、２部位モノクローナルベースのイムノアッセイが一般に利用されるが、競合的結合アッセイも利用することができる（Ｐｏｕｎｄ、前出）。
【０２０９】
ラジオイムノアッセイ技術と共にＳｃａｔｃｈａｒｄ分析などの様々な方法を用いて、ＯＸＲＤに対する抗体の親和性を評価する。親和性を結合定数Ｋａで表すが、このＫａは、平衡状態の下でＯＸＲＤ抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモル濃度で除して得られる値である。多数のＯＸＲＤ エピトープに対して親和性が不均一なポリクローナル抗体医薬のＫａは、ＯＸＲＤ に対する抗体の平均親和性または結合活性を表す。特定のＯＸＲＤ エピトープに単一特異的なモノクローナル抗体試薬のＫａは、親和性の真の測定値を表す。Ｋａ値が１０９〜１０１２ｌｉｔｅｒ／ｍｏｌの高親和性抗体医薬は、ＯＸＲＤ抗体複合体が激しい操作に耐えなければならないイムノアッセイに用いるのが好ましい。Ｋａ値が１０６〜１０７ｌｉｔｅｒ／ｍｏｌの低親和性抗体試薬は、ＯＸＲＤが抗体から最終的に活性化状態で解離する必要がある免疫精製及び類似の処理に用いるのが好ましい（Ｃａｔｔｙ， Ｄ． （１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｖｏｌｕｍｅ Ｉ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ． ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ； Ｌｉｄｄｅｌｌ， Ｊ． Ｅ． 及び Ｃｒｙｅｒ， Ａ． （１９９１） Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ）。
【０２１０】
ポリクローナル抗体試薬の抗体価及び結合活性を更に評価して、後に使う或る適用例に対するこのような試薬の品質及び適性を決定することができる。例えば、少なくとも１〜２ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体、好ましくは５〜１０ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体を含むポリクローナル抗体医薬は一般に、ＯＸＲＤ抗体複合体を沈殿させなければならない処理に用いられる。抗体の特異性、抗体価、結合活性、様々な適用例における抗体の品質や使用に対する指針については、一般に入手可能である（前出のＣａｔｔｙの文献、同Ｃｏｌｉｇａｎ 他の文献等を参照）。
【０２１１】
本発明の別の実施例では、ＯＸＲＤをコードするポリヌクレオチド、またはその任意の断片や相補配列が、治療目的で使用することができる。ある実施態様では、ＯＸＲＤをコードする遺伝子のコーディング領域や調節領域に相補的な配列やアンチセンス分子（ＤＮＡ及びＲＮＡ、ＰＮＡ、修飾ヌクレオチド）を設計して遺伝子発現を変更することができる。このような技術は当分野では周知であり、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはより大きな断片が、ＯＸＲＤをコードする配列の制御領域から、またはコード領域に沿ったさまざまな位置から設計可能である。（Ａｇｒａｗａｌ， Ｓ．， ｅｄ． （１９９６） Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， Ｔｏｔａｗａ ＮＪを参照。）
【０２１２】
治療に用いる場合、アンチセンス配列を好適な標的細胞に導入するのに好適な任意の遺伝子送達系を用いることができる。アンチセンス配列は、転写時に標的タンパク質をコードする細胞配列の少なくとも一部に相補的な配列を作製する発現プラスミドの形で、細胞内に送達し得る（Ｓｌａｔｅｒ， Ｊ．Ｅ． 他 （１９９８） Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０２（３）：４６９−４７５ 及び Ｓｃａｎｌｏｎ， Ｋ．Ｊ． 他 （１９９５）９（１３）：１２８８−１２９６．等を参照）アンチセンス配列はまた、例えばレトロウイルスやアデノ関連ウイルスベクター等のウイルスベクターを用いて細胞内に導入することもできる（Ｍｉｌｌｅｒ， Ａ．Ｄ． （１９９０） Ｂｌｏｏｄ ７６：２７１、前出のＡｕｓｕｂｅｌ、Ｕｃｋｅｒｔ， Ｗ． ａｎｄ Ｗ． Ｗａｌｔｈｅｒ （１９９４） Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ． ６３（３）：３２３−３４７等を参照）。その他の遺伝送達機構には、リポソーム系、人工的なウイルスエンベロープ及び当分野で公知のその他のシステムが含まれる（Ｒｏｓｓｉ， Ｊ．Ｊ． （１９９５） Ｂｒ． Ｍｅｄ． Ｂｕｌｌ． ５１（１）：２１７−２２５； Ｂｏａｄｏ、Ｒ．Ｊ．他 （１９９８） Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． ８７（１１）：１３０８−１３１５、Ｍｏｒｒｉｓ， Ｍ．Ｃ． 他 （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５（１４）：２７３０−２７３６． 等を参照）。
【０２１３】
本発明の別の実施例では、ＯＸＲＤ をコードするポリヌクレオチドを体細胞若しくは生殖細胞の遺伝子治療に用いることが可能である。遺伝子治療を行うことにより、（ｉ）遺伝子欠損症（例えばＸ染色体鎖遺伝（Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏ， Ｍ． ら （２０００） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８：６６９−６７２）により特徴付けられる重度の複合型免疫欠損（ＳＣＩＤ）−Ｘ１の場合）、先天性アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症に関連する重度の複合型免疫欠損（Ｂｌａｅｓｅ， Ｒ．Ｍ． ら （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７５−４８０、Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ， Ｃ． ら （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７０−４７５）、嚢胞性繊維症（Ｚａｂｎｅｒ， Ｊ． ら （１９９３） Ｃｅｌｌ ７５：２０７−２１６： Ｃｒｙｓｔａｌ、Ｒ．Ｇ． ら （１９９５） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ ６：６４３−６６６、Ｃｒｙｓｔａｌ， Ｒ．Ｇ． ら． （１９９５） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：６６７−７０３）、サラセミア（ｔｈａｌａｓｓａｍｉａ）、家族性高コレステロール血症、第ＶＩＩＩ因子若しくは第ＩＸ因子欠損に起因する血友病（Ｃｒｙｓｔａｌ， ３５  Ｒ．Ｇ． （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４−４１０、Ｖｅｒｍａ， Ｉ．Ｍ． および Ｎ． Ｓｏｍｉａ （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ ３８９：２３９−２４２）を治療し、（ｉｉ）条件的致死性遺伝子産物を発現させ（例えば制御不能な細胞増殖に起因する癌の場合）、（ｉｉｉ）細胞内の寄生虫（例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， Ｄ． （１９８８） Ｎａｔｕｒｅ ３３５：３９５−３９６、Ｐｏｅｓｃｂｌａ， Ｅ． ら （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ９３：１１３９５−１１３９９）、Ｂ型若しくはＣ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ、ＨＣＶ）、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ及びＰａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ等の真菌寄生虫、並びにＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ及びＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａｃｒｕｚｉ等の原虫寄生体に対する防御機能を有するタンパク質を発現させることができる。ＯＸＲＤ の発現若しくは調節に必要な遺伝子の欠損が疾患を引き起こす場合、導入した細胞の好適な集団からＯＸＲＤ を発現させて、遺伝子欠損によって起こる症状の発現を緩和することが可能である。
【０２１４】
本発明の更なる実施例では、ＯＸＲＤの欠損による疾患や異常症を、ＯＸＲＤをコードする哺乳動物発現ベクターを作製して、これらのベクターを機械的手段によってＯＸＲＤ欠損細胞に導入することによって治療する。ｉｎ ｖｉｖｏ或いはｅｘ ｖｉｔｒｏの細胞に用いる機械的導入技術には、（ｉ）個々の細胞内への直接的なＤＮＡ微量注射法、（ｉｉ）遺伝子銃、（ｉｉｉ）リポソームを介した形質移入、（ｉｖ）受容体を介した遺伝子導入、及び（ｖ）ＤＮＡトランスポソンの使用がある（Ｍｏｒｇａｎ， Ｒ．Ａ． 及び Ｗ．Ｆ． Ａｎｄｅｒｓｏｎ （１９９３） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６２：１９１−２１７、Ｉｖｉｃｓ， Ｚ． （１９９７） Ｃｅｌｌ ９１：５０１−５１０； Ｂｏｕｌａｙ， Ｊ−Ｌ． 及びＨ． Ｒｅｃｉｐｏｎ （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９：４４５−４５０）。
【０２１５】
ＯＸＲＤ の発現に影響を及ぼし得る発現ベクターには、限定するものではないが、ＰＣＤＮＡ ３．１、ＥＰＩＴＡＧ、ＰＲＣＣＭＶ２、ＰＲＥＰ、ＰＶＡＸ、ＰＣＲ２−ＴＯＰＯＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）、ＰＣＭＶ−ＳＣＲＩＰＴ、ＰＣＭＶ−ＴＡＧ、ＰＥＧＳＨ／ＰＥＲＶ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）、ＰＴＥＴ−ＯＦＦ、ＰＴＥＴ−ＯＮ、ＰＴＲＥ２、ＰＴＲＥ２−ＬＵＣ、ＰＴＫ−ＨＹＧ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）が含まれる。ＯＸＲＤ を発現させるために、（ｉ）恒常的に活性なプロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ＳＶ４０ウイルス、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、若しくはβ−アクチン遺伝子等）、（ｉｉ）誘導性プロモーター（例えば、市販のＴ−ＲＥＸプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に含まれている、テトラサイクリン調節性プロモーター（Ｇｏｓｓｅｎ， Ｍ． ａｎｄ Ｈ． Ｂｕｊａｒｄ （１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８９：５５４７−５５５１； Ｇｏｓｓｅｎ， Ｍ． 他 （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：１７６６−１７６９； Ｒｏｓｓｉ， Ｆ．Ｍ．Ｖ． 及び Ｈ．Ｍ． Ｂｌａｕ （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９：４５１−４５６））、エクジソン誘導性プロモーター（市販のプラスミドＰＶＧＲＸＲ及びＰＩＮＤに含まれている：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＦＫ５０６／ラパマイシン誘導性プロモーター、またはＲＵ４８６／ミフェプリストーン誘導性プロモーター（Ｒｏｓｓｉ， Ｆ．Ｍ．Ｖ． ａｎｄ Ｈ．Ｍ． Ｂｌａｕ， 前出）、または（ｉｉｉ）正常な個体に由来するＯＸＲＤ をコードする内因性遺伝子の天然のプロモーター若しくは組織特異的プロモーターを用いることが可能である。
【０２１６】
市販のリポソーム形質転換キット（例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＰＥＲＦＥＣＴ ＬＩＰＩＤ ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＩＯＮ ＫＩＴ）を用いれば、当業者は経験にそれほど頼らないでもポリヌクレオチドを培養中の標的細胞に導入することが可能になる。別法では、リン酸カルシウム法（Ｇｒａｈａｍ． Ｆ．Ｌ． 及び Ａ．Ｊ． Ｅｂ （１９７３） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６−４６７）若しくは電気穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ， Ｂ． 他 （１９８２） ＥＭＢＯ Ｊ． １：８４１−８４５）を用いて形質転換を行う。初代培養細胞にＤＮＡを導入するためには、標準化された哺乳動物の形質移入プロトコルの修飾が必要である。
【０２１７】
本発明の別の実施例では、ＯＸＲＤ の発現に関連する遺伝子欠損によって起こる疾患や異常症は、（ｉ）レトロウイルス末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター若しくは独立したプロモーターのコントロール下でＡＴＲＳ をコードするポリヌクレオチドと、（ｉｉ）好適なＲＮＡパッケージングシグナルと、（ｉｉｉ）追加のレトロウイルス・シス作用性ＲＮＡ配列及び効率的なベクターの増殖に必要なコーディング配列を伴うＲｅｖ応答性エレメント（ＲＲＥ）とからなるレトロウイルスベクターを作製して治療することができる。レトロウイルスベクター（例えばＰＦＢ及びＰＦＢＮＥＯ）はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社から市販されており、刊行データ（Ｒｉｖｉｅｒｅ， Ｉ． 他 （１９９５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９２：６７３３−６７３７）に基づいている。上記データを引用することをもって本明細書の一部とする。ベクターは、好適なベクター産生細胞株（ＶＰＣＬ）において増殖され、ＶＰＣＬは、標的細胞上の受容体に対する親和性を有するエンベロープ遺伝子またはＶＳＶｇ等の汎親和性エンベロープタンパク質を発現する（Ａｒｍｅｎｔａｎｏ， Ｄ． 他 （１９８７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６１：１６４７−１６５０、Ｂｅｎｄｅｒ， Ｍ．Ａ． 他 （１９８７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６１：１６３９−１６４６、Ａｄａｍ， Ｍ．Ａ． および Ａ．Ｄ． Ｍｉｌｌｅｒ （１９８８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６２：３８０２−３８０６、Ｄｕｌｌ， Ｔ． 他 （１９９８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：８４６３−８４７１、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ， Ｒ． 他 （１９９８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：９８７３−９８８０）。ＲＩＧＧに付与された米国特許第５，９１０，４３４号（「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｏｂｔａｉｎｉｎｇ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｈｉｇｈ ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ」）において、レトロウイルスパッケージング細胞系を得るための方法が開示されており、引用することをもって本明細書の一部とする。レトロウイルスベクターの増殖、細胞集団（例えばＣＤ４＋ Ｔ細胞）の形質導入、及び形質導入した細胞の患者への戻しは、遺伝子治療の分野では当業者に公知の方法であり、多数の文献に記載されている（Ｒａｎｇａ， Ｕ． 他 （１９９７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１：７０２０−７０２９、Ｂａｕｅｒ， Ｇ． 他 （１９９７） Ｂｌｏｏｄ ８９：２２５９−２２６７、Ｂｏｎｙｈａｄｉ， Ｍ．Ｌ． （１９９７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１：４７０７−４７１６、Ｒａｎｇａ， Ｕ． 他 （１９９８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９５：１２０１−１２０６、Ｓｕ， Ｌ． （１９９７） Ｂｌｏｏｄ ８９：２２８３−２２９０）。
【０２１８】
別法では、アデノウイルス系遺伝子治療の送達系を用いて、ＯＸＲＤの発現に関連する１つ或いは複数の遺伝子異常を有する細胞にＯＸＲＤをコードするポリヌクレオチドを送達する。アデノウイルス系ベクターの作製及びパッケージングについては、当業者に公知である。 複製欠損型アデノウイルスベクターは、免疫調節タンパク質をコードする遺伝子を膵臓の無損傷の膵島内に導入するために融通のきくことが証明された（Ｃｓｅｔｅ， Ｍ．Ｅ． 他 （１９９５） Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ２７：２６３−２６８）。使用できる可能性のあるアデノウイルスベクターは、Ａｒｍｅｎｔａｎｏに付与された米国特許第５，７０７，６１８号（”Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ”）に記載されており、引用することをもって本明細書の一部とする。アデノウイルスベクターについては、Ａｎｔｉｎｏｚｚｉ， Ｐ．Ａ． 他 （１９９９） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｎｕｔｒ． １９：５１１−５４４ 及び Ｖｅｒｍａ， Ｉ．Ｍ． 及び Ｎ． Ｓｏｍｉａ （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ １８：３８９：２３９−２４２も参照されたい。両文献は、引用することをもって本明細書の一部とする。
【０２１９】
別法では、ヘルペス系遺伝子治療の送達系を用いて、ＯＸＲＤ の発現に関連する１つあるいは複数の遺伝子異常を有する標的細胞にＯＸＲＤ をコードするポリヌクレオチドを送達する。単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）系のベクターは、ＨＳＶ親和性の中枢神経細胞にＯＸＲＤ を導入する際に特に有用である。ヘルペス系ベクターの作製及びパッケージングは、当業者に公知である。 複製適格性単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）Ｉ型系のベクターは、レポーター遺伝子を霊長類の眼に送達するために用いられてきた（Ｌｉｕ， Ｘ． 他 （１９９９） Ｅｘｐ． Ｅｙｅ Ｒｅｓ．１６９：３８５−３９５）。ＨＳＶ−１ウイルスベクターの作製についても、ＤｅＬｕｃａに付与された米国特許第５，８０４，４１３号（”Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｓｗａｉｎｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ”）に開示されており、該特許の引用をもって本明細書の一部とする。 米国特許第５，８０４，４１３号には、ヒト遺伝子治療を含む目的のために好適なプロモーターの制御下において細胞に導入される少なくとも１つの外来性遺伝子を有するゲノムを含む組換えＨＳＶ ｄ９２についての記載がある。上記特許はまた、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７及びＩＣＰ２２のために除去される組換えＨＳＶ系統の作製及び使用について開示している。ＨＳＶベクターについては、Ｇｏｉｎｓ， Ｗ．Ｆ． 他 （１９９９） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７３：５１９−５３２ 及び Ｘｕ， Ｈ． 他 （１９９４） Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． １６３：１５２−１６１も参照されたい。両文献は、引用をもって本明細書の一部とする。クローン化ヘルペスウイルス配列の操作、巨大ヘルペスウイルスのゲノムの異なった部分を含む多数のプラスミドを形質移入した後の組換えウイルスの産生、ヘルペスウイルスの成長及び増殖、並びにヘルペスウイルスの細胞への感染は、当業者に公知の技術である。
【０２２０】
別法では、αウイルス（正の一本鎖ＲＮＡウイルス）ベクターを用いてＯＸＲＤ  をコードするポリヌクレオチドを標的細胞に送達する。プロトタイプのαウイルスであるセムリキ森林熱ウイルス（Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔ Ｖｉｒｕｓ， ＳＦＶ）の生物学的研究が広範に行われており、遺伝子導入ベクターがＳＦＶゲノムに基づいていることが分かった（Ｇａｒｏｆｆ， Ｈ． 及び Ｋ．−Ｊ． Ｌｉ （１９９８） Ｃｕｎ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ９：４６４−４６９）。αウイルスＲＮＡの複製中に、通常はウイルスのキャプシッドタンパク質をコードするサブゲノムＲＮＡが作り出される。このサブゲノムＲＮＡは、完全長のゲノムＲＮＡより高いレベルに複製されるため、酵素活性（例えばプロテアーゼ及びポリメラーゼ）を有するウイルスタンパク質に比べてキャプシッドタンパク質が過剰産生される。同様に、ＯＸＲＤ をコードする配列をキャプシッドをコードする領域の代わりにαウイルスゲノムに導入することによって、ベクター導入細胞において多数のＯＸＲＤ をコードするＲＮＡが産生され、高いレベルでＯＸＲＤ が合成される。通常はαウイルスの感染が数日以内での細胞溶解に関係する一方で、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）の変異体を有するハムスター正常腎臓細胞（ＢＨＫ−２１）の持続的な感染を確立する能力は、αウイルスの溶解複製を遺伝子治療に適用できるように好適に変更可能であることを示唆している（Ｄｒｙｇａ， Ｓ．Ａ． 他 （１９９７） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２８ ：７４−８３）。様々な宿主にαウイルスを導入できることから、様々なタイプの細胞にＯＸＲＤ を導入することできる。或る集団におけるサブセットの細胞の特定形質導入は、形質導入前に細胞の選別を必要とし得る。αウイルスの感染性ｃＤＮＡクローンの処置方法、αウイルスのｃＤＮＡ及びＲＮＡの形質移入方法及びαウイルスの感染方法は、当業者に公知である。
【０２２１】
転写開始部位由来のオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子発現を阻害することも可能である。転写開始部位とは例えば開始部位から数えて約−１０と約＋１０の間である。同様に、三重らせん塩基対の形成方法を用いて阻害が可能となる。三重らせん塩基対形成は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合のために十分に開くような二重らせんの能力を阻害するので、三重らせん塩基対形成は有用である。三重らせんＤＮＡを用いる最近の治療の進歩については文献に記載がある（Ｇｅｅ， Ｊ．Ｅ． 他 （１９９４） ｉｎ： Ｈｕｂｅｒ， Ｂ．Ｅ．及びＢ．Ｉ． Ｃａｒｒ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ， Ｆｕｔｕｒａ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｍｔ． Ｋｉｓｃｏ， ＮＹ， １６３−１７７頁等を参照）。相補配列またはアンチセンス分子もまた、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってｍＲＮＡの翻訳を阻止するべく設計することができる。
【０２２２】
リボザイムは酵素性ＲＮＡ分子であり、ＲＮＡの特異的切断を触媒するためにリボザイムを用いることもできる。リボザイム作用のメカニズムは、相補的標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションと、その後に起こる内ヌクレオチド鎖切断に関与している。例えば、遺伝子操作で作られたハンマーヘッド型リボザイム分子が、ＯＸＲＤをコードする配列の内ヌクレオチド鎖分解性の切断を特異的且つ効果的に触媒できる可能性がある。
【０２２３】
任意のＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、ＧＵＡ、ＧＵＵ、ＧＵＣ配列を含めたリボザイム切断部位に対して標的分子をスキャンすることによって先ず同定される。一度同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０リボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列が、そのオリゴヌクレオチドを機能不全にするような２次構造の特徴をもっていないかを評価することが可能になる。候補標的の適合性の評価も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのアクセス可能性をテストすることによって行うことができる。
【０２２４】
本発明の相補リボ核酸分子及びリボザイムは、核酸分子合成のために当分野でよく知られている任意の方法を用いて作製し得る。任意の方法には、固相フォスフォアミダイト化学合成等のオリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法がある。或いは、ＯＸＲＤをコードするＤＮＡ配列のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ転写によってＲＮＡ分子を産出し得る。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７やＳＰ６等の好適なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを用いて多様なベクター内に取り込むことが可能である。或いは、相補的ＲＮＡを構成的或いは誘導的に合成するようなこれらｃＤＮＡ産物を、細胞系、細胞または組織内に導入することができる。
【０２２５】
細胞内の安定性を高め、半減期を長くするためにＲＮＡ分子を修飾することができる。限定するものではないが可能な修飾には、分子の５’末端、３’末端、あるいはその両方においてフランキング配列を追加したり、分子の主鎖内においてホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオネートまたは２’ Ｏ−メチルを使用したりすることが含まれる。この概念は、ＰＮＡの産出に固有のものであり、これら全ての分子に拡大することができる。それには、内因性エンドヌクレアーゼによって容易には認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、及びウリジンにアセチル−、メチル−、チオ−及び同様の修飾をしたものの他、非従来型塩基、例えばイノシン、クエオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、ワイブトシン（ｗｙｂｕｔｏｓｉｎｅ）等を加えることでできる。
【０２２６】
本発明の更なる実施例は、ＯＸＲＤをコードするポリヌクレオチドの発現の変化に有効な化合物をスクリーニングする方法を含む。限定するものではないが特異ポリヌクレオチドの発現変化を起こすのに有効な化合物には、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、転写因子その他のポリペプチド転写制御因子、及び特異ポリヌクレオチド配列と相互作用し得る非高分子化学的実体がある。有効な化合物は、ポリヌクレオチド発現のインヒビターまたはエンハンサーのいずれかとして作用することによりポリヌクレオチド発現を変異し得る。従って、ＯＸＲＤ の発現または活性の増加に関連する疾患の治療においては、ＯＸＲＤ をコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害する化合物が治療上有用であり、ＯＸＲＤ の発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、ＯＸＲＤ をコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に促進する化合物が治療上有用であり得る。
【０２２７】
特異ポリヌクレオチドの変異発現における有効性に対して、少なくとも１個から複数個の試験化合物をスクリーニングし得る。試験化合物は、当分野で通常知られている任意の方法により得られる。このような方法には、ポリヌクレオチドの発現を変異させる場合と、既存の、市販のまたは専売の、天然または非天然の化合物ライブラリから選択する場合と、標的ポリヌクレオチドの化学的及び／または構造的特性に基づく化合物を合理的にデザインする場合と、組合せ的にまたは無作為に生成した化合物のライブラリから選択する場合に有効であることが知られているような化合物の化学修飾がある。ＯＸＲＤ をコードするポリヌクレオチドを含むサンプルは、このようにして得られた試験化合物の少なくとも１つに曝露する。サンプルには例えば、無傷細胞、透過化処理した細胞、無細胞再構成系または再構成生化学系があり得る。ＯＸＲＤ をコードするポリヌクレオチドの発現における変化は、当分野で通常知られている任意の方法でアッセイする。通常、ＯＸＲＤ をコードするポリヌクレオチドの配列に相補的なヌクレオチド配列を有するプローブを用いたハイブリダイゼーションにより、特異ヌクレオチドの発現を検出する。ハイブリダイゼーション量を定量し、それによって１つ若しくは複数の試験化合物に曝露される及び曝露されないポリヌクレオチドの発現の比較に対する基礎を形成し得る。試験化合物に曝露されるポリヌクレオチドの発現における変化の検出は、ポリヌクレオチドの発現を変異する際に試験化合物が有効であることを示している。特異ポリヌクレオチドの変異発現に有効な化合物に対して、例えば分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）遺伝子発現系（Ａｔｋｉｎｓ， Ｄ． 他 （１９９９） 米国特許第５，９３２，４３５号、Ａｒｎｄｔ， Ｇ．Ｍ． 他 （２０００） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２８：Ｅ１５）またはＨｅＬａ細胞等のヒト細胞系（Ｃｌａｒｋｅ， Ｍ．Ｌ． 他 （２０００） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２６８：８−１３）を用いてスクリーニングを実行する。本発明の特定の実施例は、特異的ポリヌクレオチド配列に対するアンチセンス活性についてオリゴヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸、修飾オリゴヌクレオチド）の組み合わせライブラリをスクリーニングすることに関与している（Ｂｒｕｉｃｅ， Ｔ．Ｗ． 他 （１９９７） 米国特許第５，６８６，２４２号、Ｂｒｕｉｃｅ， Ｔ．Ｗ． 他 （２０００） 米国特許第６，０２２，６９１号）。
【０２２８】
ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が利用可能であり、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｅｘ ｖｉｖｏの使用に対して同程度に適している。ｅｘ ｖｉｖｏ治療の場合、ベクターを患者から採取した幹細胞内に導入し、クローニング増殖して同一患者に自家移植で戻すことができる。トランスフェクション、リボソーム注入またはポリカチオンアミノポリマーによる送達は、当分野でよく知られている方法を用いて実行することができる（Ｇｏｌｄｍａｎ， Ｃ．Ｋ． 他 （１９９７） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５：４６２−４６６．等を参照）。
【０２２９】
上記の治療方法はいずれも、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル等の哺乳動物を含めて治療が必要な全ての対象に適用できる。
【０２３０】
本発明の追加実施例は、通常薬剤として許容できる賦形剤で処方される活性成分を有する組成物の投与に関連する。賦形剤には例えば、糖、でんぷん、セルロース、ゴム及びタンパク質がある。様々な処方が通常知られており、詳細はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ）の最新版に記載されている。このような組成物は、ＯＸＲＤ、ＯＸＲＤの抗体、擬態物質、アゴニスト、アンタゴニスト、またはＯＸＲＤのインヒビターなどからなる。
【０２３１】
本発明に用いられる組成物は、任意の数の経路によって投与することができ、限定するものではないが経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸がある。
肺から投与する組成物は、液状または乾燥粉末状で調製し得る。このような組成物は通常、患者が吸入する直前にエアロゾル化する。小分子（例えば従来の低分子量有機薬）の場合には、速効製剤のエアロゾル送達は当分野で公知である。高分子（例えばより大きなペプチド及びタンパク質）の場合には、当該分野において肺の肺胞領域を介しての肺送達が最近向上したことにより、インスリン等の薬剤を実質的に血液循環へ輸送することを可能にした（Ｐａｔｔｏｎ， Ｊ．Ｓ． 他， 米国特許第５，９９７，８４８号等を参照）。肺送達は、針注射なしに投与する点で優れており、有毒な可能性のある浸透エンハンサーの必要性をなくす。
【０２３２】
本発明での使用に適した組成物には、所定の目的を達成するために必要なだけの量の活性成分を含有する成分が含まれる。有効投与量の決定は、当業者の能力の範囲内で行う。
【０２３３】
ＯＸＲＤ またはその断片を含む高分子を直接細胞内に送達するべく、特殊な形態に組成物が調製されるのが好ましい。例えば、細胞不透過性高分子を含むリポソーム製剤は、細胞融合及び高分子の細胞内送達を促進し得る。或いは、ＯＸＲＤ またはその断片をＨＩＶ Ｔａｔ−１タンパク質から陽イオンＮ末端部に結合することもできる。このようにして生成された融合タンパク質は、マウスモデル系の脳を含む全ての組織の細胞に形質導入することがわかっている（Ｓｃｈｗａｒｚｅ， Ｓ．Ｒ． 他 （１９９９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１５６９−１５７２）。
【０２３４】
任意の化合物に対して、細胞培養アッセイ、例えば新生物性細胞の細胞培養アッセイにおいて、或いは、動物モデル、例えばマウス、ウサギ、イヌ、サルまたはブタ等において、先ず治療有効投与量を推定することができる。動物モデルはまた、好適な濃度範囲及び投与経路を決定するためにも用い得る。このような情報を用いて、次にヒトに対する有益な投与量及び投与経路を決定することができる。
【０２３５】
治療有効量は、症状や容態を回復させる活性処方成分（たとえばＯＸＲＤ またはその断片、ＯＸＲＤ の抗体、ＯＸＲＤ のアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターなど）の量を意味する。治療有効度及び毒性は、細胞培養または動物実験における標準的な薬剤手法によって、例えばＥＤ５０（集団の５０％の治療有効量）またはＬＤ５０（集団の５０％の致死量）を測定するなどして決定することができる。毒性効果の治療効果に対する投与量の比は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。高い治療指数を示すような組成物が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータは、ヒトに用いるための投与量の範囲を調剤するのに用いられる。このような組成物が含まれる投与量は、毒性を殆ど或いは全く含まず、ＥＤ５０を含むような血中濃度の範囲にあることが好ましい。用いられる投与形態、患者の感受性及び投与の経路によって、投与量はこの範囲内で様々に変わる。
【０２３６】
正確な投与量は、治療が必要な被験者に関する要素を考慮して、現場の医者が決定することになる。効果的なレベルの活性成分を与え、或いは所望の効果を維持するべく、投与量及び投与を調節する。被験者に関する要素としては、疾患の重症度、患者の通常の健康状態、患者の年齢、体重及び性別、投与の時間及び頻度、薬剤の配合、反応感受性及び治療に対する応答等を考慮する。作用期間が長い組成物は、特定の製剤の半減期及びクリアランス率によって３〜４日毎に１度、１週間に１度、或いは２週間に１度の間隔で投与し得る。
【０２３７】
通常の投与量は、投与の経路にもよるが約０．１〜１００，０００μｇであり、合計で約１ｇまでとする。特定の投与量及び送達方法に関するガイダンスは文献に記載されており、現場の医者は通常それを利用することができる。当業者は、タンパク質またはインヒビターに対する処方とは異なる、ヌクレオチドに対する処方を利用することになる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、状態、位置等に特異的なものとなる。
【０２３８】
（診断）
別の実施例では、ＯＸＲＤ に特異的に結合する抗体が、ＯＸＲＤ の発現によって特徴付けられる疾患の診断、またはＯＸＲＤ やＯＸＲＤ のアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターで治療を受けている患者をモニターするためのアッセイに用いられる。診断目的に有用な抗体は、上記の治療の箇所で記載した方法と同じ方法で調合される。ＯＸＲＤ の診断アッセイには、抗体および標識を用いてヒトの体液あるいは細胞や組織から採取されたものからＯＸＲＤ を検出する方法が含まれる。この抗体は修飾されたものも、されていないものも可能であり、レポーター分子との共有結合または非共有結合で標識化できる。レポーター分子としては広くさまざまな種類が本分野で知られており、また使用可能であるが、そのうちのいくつかは上記で説明されている。
【０２３９】
ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ及びＦＡＣＳを含むＯＸＲＤを測定する種々のプロトコルは、当分野では周知であり、変わった或いは異常なレベルのＯＸＲＤの発現を診断する元となるものを提供する。正常或いは標準的なＯＸＲＤ の発現の値は、複合体の形成に適した条件下で、正常な哺乳動物、例えばヒトなどの被験者から採取した体液または細胞とＯＸＲＤ に対する抗体とを結合させることによって決定する。標準複合体形成量は、種々の方法、例えば測光法で定量できる。被験者、対照、及び疾患生検組織からの各サンプルのＯＸＲＤ の発現の量が基準値と比較される。標準値と被験者との偏差が疾患を診断するパラメータとなる。
【０２４０】
本発明の別の実施例によれば、ＯＸＲＤ をコードするポリヌクレオチドを診断のために用いることもできる。用いられることができるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、相補的ＲＮＡ及びＤＮＡ分子、そしてＰＮＡが含まれる。このポリヌクレオチドを用いて、疾患と相関し得るＯＸＲＤ  を発現する生検組織における遺伝子の発現を検出し定量する。この診断アッセイを用いて、ＯＸＲＤ の存在の有無、更に過剰な発現を調べ、治療中のＯＸＲＤ  値の調節を監視する。
【０２４１】
一実施形態では、ＯＸＲＤ  または近縁の分子をコードする遺伝子配列を含むポリヌクレオチド配列を検出可能なＰＣＲプローブを用いたハイブリダイゼーションによって、ＯＸＲＤ  をコードする核酸配列を同定することが可能である。プローブが高度に特異的な領域（例えば５’調節領域）から作られているか、或いはやや特異性の低い領域（例えば保存されたモチーフ）から作られているかにかかわらず、そのプローブの特異性とハイブリダイゼーション或いは増幅のストリンジェントによって、そのプローブがＣＳＡＰをコードする自然界の配列のみを同定するかどうか、或いは対立遺伝子や関連配列コードする自然界の配列のみを同定するかどうかが決まるであろう。
【０２４２】
プローブはまた、関連する配列の検出に利用され、ＯＸＲＤ  をコードする任意の配列と少なくとも５０％の配列同一性を有し得る。本発明のハイブリダイゼーションプローブには、ＤＮＡあるいはＲＮＡが可能であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４−６の配列、或いはＯＸＲＤ 遺伝子のプロモーター、エンハンサー、およびイントロンを含むゲノム配列に由来し得る。
【０２４３】
ＯＸＲＤをコードするＤＮＡに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブの作製方法には、ＯＸＲＤ  及びＯＸＲＤ  誘導体をコードするポリヌクレオチド配列をｍＲＮＡプローブの作製のためのベクターにクローニングする方法がある。ｍＲＮＡプローブ作製のためのベクターは、当業者に知られており、市販されており、好適なＲＮＡポリメラーゼ及び好適な標識されたヌクレオチドを加えることによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成するために用いられ得る。ハイブリダイゼーションプローブは、種々のレポーターの集団によって標識され得る。レポーター集団の例としては、３２Ｐまたは３５Ｓ等の放射性核種、或いはアビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合されたアルカリホスファターゼ等の酵素標識などが挙げられる。
【０２４４】
ＯＸＲＤをコードするポリヌクレオチド配列を用いて、ＯＸＲＤ  の発現に関連する疾患を診断することが可能である。限定されるものではないが、そのような疾患として、細胞増殖異常には日光性角化症、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（ＭＣＴＤ）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌が含まれ、神経の疾患の中には、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキソン病及びその他の錐体外路障害、筋萎縮性側策硬化及びその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、クールー及びクロイツフェルト‐ヤコブ病、Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ−  Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ症候群を含むプリオン病と、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管芽腫（ｃｅｒｅｂｅｌｌｏｒｅｔｉｎａｌ ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔｏｍａｔｏｓｉｓ）、脳３叉神経血管症候群、ダウン症を含む中枢神経系性精神遅滞及び他の発達障害、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、脳神経疾患、脊髄疾患筋ジストロフィー、および他の神経筋障害、末梢神経系疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性、及び中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺と、気分性及び不安性の障害、分裂病性疾患を含む精神病と、季節性障害（ＳＡＤ）と、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群（遅発性ジスキネジア）、ジストニー、分裂病性精神障害、帯状疱疹後神経痛、及びトゥーレット病と、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性症及び家族性前頭側頭性健忘症が含まれ、代謝疾患としてはシェーグレン−ラルソン症候群（ＳＬＳ）、過剰増殖、ＩＩ型、急性アルコール中毒症、副腎白質萎縮症、アルポート症候群、先天性脈絡膜欠如、デュシェンヌ‐ベッカー型筋ジストロフィー、ダウン症候群、嚢胞性線維症、慢性肉芽腫症、ゴーシェ病、ハンチントン舞踏病、マルファン症候群、筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィー、ピクノディスオストーシス、Ｒｅｆｓｕｍ症候群、網膜芽細胞種、鎌状赤血球貧血、サラセミア、ウェルナー症候群、ヴォン・ヴィレブランド病、ウィルムス腫瘍、ツェルヴェーガー症候群、ペルオキシソームアシルＣｏＡオキシダーゼ欠乏症、ペルオキシソームチオラーゼ欠乏症、ペルオキシソーム二価性タンパク質欠乏症、ミトコンドリアカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼおよびカルニチン欠乏症、ミトコンドリア長鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠乏症、ミトコンドリア中鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナー���欠乏症、ミトコンドリア短鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠乏症、ミトコンドリア電子伝達フラビンタンパク質および電子伝達フラビンタンパク質：ユービキノンオキシドレダクターゼ欠乏症、ミトコンドリア三価性タンパク質欠乏症およびミトコンドリア短鎖３ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠乏症が含まれ、また平滑筋疾患の中には、．狭心症、アナフィラキシー性ショック、不整脈、喘息、心臓血管性ショック、クッシング症候群、高血圧、低血糖症、心筋梗塞、偏頭痛、およびクロム親和細胞腫（褐色細胞腫）、および心筋症、脳疾患、癲癇、カーンズ・セイヤー症候群、乳酸アシドーシス、筋クローヌス性疾患、および眼筋麻痺などのミオパシー、高アンモニア血症、トリメチルアミン尿症〈魚臭症候群〉、３−ヒドロキシジカルボン酸性尿、ジカルボン酸性尿、キサンチン尿症、先天性リポイド副腎過形成 （ＣＬＡＨ）、白化症３型、高インスリン症−高アンモニア血症候群（ＨＨＳ）、グルタル酸血症Ｉ型（ＧＡ−Ｉ）、家族性反復ミオグロビン尿症、インスリン抵抗性、先天性チミンウラシル尿症（家族性ピリミジン血症）、突発性鉄芽球性貧血（ＡＩＳＡ）、新生児型副腎白質ジストロフィー、低酸素症、外傷による組織への損壊悪化、被曝と紫外線照射、肝機能障害、著しい肥満症、メトヘモグロビン血症（ＨＭ１、ＨＭ２、ＨＭ３）、無月経を伴う肥厚性多毛症、ハーマンスキー−プゥドラック症候群、ライ症候群、低ケトーシス型低血糖症、イソ吉草酸血症および慢性溶血性貧血が含まれる。ＯＸＲＤ  をコードするポリヌクレオチド配列は、サザーン法やノーザン法、ドットブロット法、或いはその他の膜系の技術、ＰＣＲ法、ディップスティック（ｄｉｐｓｔｉｃｋ）、ピン（ｐｉｎ）、ＥＬＩＳＡ式アッセイ、及び変異ＯＸＲＤ  の発現を検出するために患者から採取した体液或いは組織を利用するマイクロアレイに使用することが可能である。このような定性方法または定量方法は、当分野で公知である。
【０２４５】
ある実施態様では、ＯＸＲＤ  をコードするヌクレオチド配列は、関連する疾患、特に上記した疾患を検出するアッセイにおいて有用であろう。ＯＸＲＤ  をコードするヌクレオチド配列は、標準的な方法で標識化され、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件下で、患者から採取した体液或いは組織のサンプルに加えることができるであろう。好適なインキュベーション期間が経過したらサンプルを洗浄し、シグナルを定量して標準値と比較する。患者のサンプルのシグナルの量が、対照サンプルと較べて著しく変わっている場合は、サンプル内のＯＸＲＤ  をコードするヌクレオチド配列の変異レベルにより、関連する疾患の存在が明らかになる。このようなアッセイは、動物実験、臨床試験における特定の治療効果を推定するため、或いは個々の患者の治療をモニターするために用いることもできる。
【０２４６】
ＯＸＲＤの発現に関連する疾患の診断の基準となるものを提供するために、発現の正常すなわち標準的なプロファイルが確立される。これは、ハイブリダイゼーション或いは増幅に好適な条件下で、動物或いはヒトの何れかの正常な被験者から抽出された体液或いは細胞と、ＯＸＲＤをコードする配列或いはその断片とを結合させることにより達成され得る。実質的に精製されたポリヌクレオチドを既知量用いて行った実験から得た値を正常な被験者から得た値と比較することにより、標準ハイブリダイゼーションを定量することができる。このようにして得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得たサンプルから得た値と比較することができる。標準値からの偏差を用いて疾患の存在を確定する。
【０２４７】
疾患の存在が確定されて治療プロトコルが開始されると、患者の発現レベルが正常な被検者に観察されるレベルに近づき始めたかどうかを測定するため、ハイブリダイゼーションアッセイを通常ベースで繰り返し得る。連続アッセイから得られた結果を用いて、数日から数ヶ月の期間にわたる治療の効果を示し得る。
癌に関しては、個体からの生体組織における異常な量の転写物（過少発現または過剰発現）の存在は、疾患の発生素質を示したり、実際に臨床的症状が現れる前に疾患を検出する方法を提供したりし得る。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防方法または積極的な治療法を早くから利用し、それによって癌の発生または更なる進行を防止することが可能となる。
【０２４８】
ＯＸＲＤ  をコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドのさらなる診断への利用には、ＰＣＲの利用が含まれ得る。これらのオリゴマーは、化学的に合成するか、酵素により生産するか、或いはｉｎ ｖｉｔｒｏで産出し得る。オリゴマーは、好ましくはＯＸＲＤをコードするポリヌクレオチドの断片、或いはＯＸＲＤをコードするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、最適な条件下で、特定の遺伝子や条件を識別するために利用される。また、オリゴマーは、やや緩いストリンジェント条件下で、近縁のＤＮＡ或いはＲＮＡ配列の検出、定量、或いはその両方のため用いることが可能である。
【０２４９】
或る実施態様において、ＯＸＲＤ  をコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、一塩基多型（ＳＮＰ）を検出し得る。ＳＮＰは、多くの場合にヒトの先天性または後天性遺伝病の原因となるような置換、挿入及び欠失である。限定するものではないがＳＮＰの検出方法には、ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）及び蛍光ＳＳＣＰ（ｆＳＳＣＰ）がある。ＳＳＣＰでは、ＯＸＲＤ  をコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でＤＮＡを増幅する。ＤＮＡは例えば、病変組織または正常組織、生検サンプル、体液その他に由来し得る。ＤＮＡ内のＳＮＰは、一本鎖形状のＰＣＲ生成物の２次及び３次構造に差異を生じさせる。差異は非変性ゲル中でのゲル電気泳動法を用いて検出可能である。ｆＳＣＣＰでは、オリゴヌクレオチドプライマーを蛍光性に標識する。それによってＤＮＡシークエンシング機などの高処理機器でアンプリマー（ａｍｐｌｉｍｅｒ）の検出が可能になる。更に、インシリコＳＮＰ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ＳＮＰ， ｉｓＳＮＰ）と呼ばれる配列データベース分析法は、一般的なコンセンサス配列に配列されるような個々のオーバーラップするＤＮＡ断片の配列を比較することにより、多型性を同定し得る。これらのコンピュータベースの方法は、ＤＮＡの実験室での調整及び統計モデル及びＤＮＡ配列クロマトグラムの自動分析を用いたシークエンシングのエラーに起因する配列の変異をフィルタリングして除去する。別の態様では、例えば高処理ＭＡＳＳＡＲＲＡＹシステム（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）を用いた質量分析によりＳＮＰを検出し、特徴付ける。
【０２５０】
ＯＸＲＤ の発現を定量するために用い得る方法には、ヌクレオチドの放射標識またはビオチン標識、調節核酸の相互増幅（ｃｏａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）及び標準曲線から得た結果の補間もある（例えば、 Ｍｅｌｂｙ， Ｐ．Ｃ． 他 （１９９３） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １５９：２３５２４４； Ｄｕｐｌａａ， Ｃ． 他 （１９９３） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２１２：２２９２３６を参照。）目的のオリゴマーまたはポリヌクレオチドが種々の希釈液中に存在し、分光光度法または比色反応によって定量が迅速になるような高処理フォーマットのアッセイを行うことによって、複数のサンプルの定量速度を加速することができる。
更に別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドまたはより長い断片を、マイクロアレイにおけるエレメントとして用いることができる。多数の遺伝子の関連発現レベルを同時にモニターする転写イメージング技術にマイクロアレイを用いることが可能である。これについては、以下に記載する。マイクロアレイはまた、遺伝変異体、突然変異及び多型性の同定に用いることができる。この情報を用いることで、遺伝子機能を決定し、疾患の遺伝的根拠を理解し、疾患を診断し、遺伝子発現の機能としての疾病の進行／後退をモニターし、疾病治療における薬剤の活性を開発及びモニターすることができる。特に、患者にとって最もふさわしく、有効的な治療法を選択するために、この情報を用いて患者の薬理ゲノムプロフィールを開発することができる。例えば、患者の薬理ゲノムプロフィールに基づき、患者に対して高度に有効的で副作用を殆ど示さない治療薬を選択することができる。
【０２５１】
別の実施例では、ＯＸＲＤ、ＯＸＲＤの断片、ＯＸＲＤに特異的な抗体をマイクロアレイ上のエレメントとして用いることができる。マイクロアレイを用いて、上記のようなタンパク質−タンパク質相互作用、薬剤−標的相互作用及び遺伝子発現プロフィールをモニターまたは測定することが可能である。
【０２５２】
或る実施例は、或る組織または細胞タイプの転写イメージを生成するような本発明のポリヌクレオチドの使用に関連する。転写イメージは、特定の組織または細胞タイプにより遺伝子発現の包括的パターンを表す。包括的遺伝子発現パターンは、所定の条件下で所定の時間に発現した遺伝子の数及び相対存在量を定量することにより分析される（Ｓｅｉｌｈａｍｅｒ 他、米国特許第５，８４０，４８４号の「Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ」を参照。これらを引用することを以って本明細書の一部とする）。従って、特定の組織または細胞タイプの転写または逆転写全体に本発明のポリヌクレオチドまたはその補体をハイブリダイズすることにより、転写イメージを生成し得る。或る実施例では、本発明のポリヌクレオチドまたはその補体がマイクロアレイ上のエレメントのサブセットを複数含むような高処理フォーマットでハイブリダイゼーションを発生させる。結果として得られる転写イメージは、遺伝子活性のプロフィールを提供し得る。
【０２５３】
転写イメージは、組織、株化細胞、生検またはその生物学的サンプルから単離した転写物を用いて生成し得る。転写イメージは従って、組織または生検サンプルの場合にはｉｎ ｖｉｖｏ、または株化細胞の場合にはｉｎ ｖｉｔｒｏでの遺伝子発現を反映する。
【０２５４】
本発明のポリヌクレオチドの発現のプロフィールを作製する転写イメージはまた、工業的または天然の環境化合物の毒性試験のみならず、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデル系及び薬剤の前臨床評価に関連して使用し得る。全ての化合物は、作用及び毒性のメカニズムを暗示する、しばしば分子フィンガープリントまたは毒性シグネチャと称されるような特徴的な遺伝子発現パターンを惹起する（Ｎｕｗａｙｓｉｒ， Ｅ．Ｆ． 他 （１９９９） Ｍｏｌ． Ｃａｒｃｉｎｏｇ． ２４：１５ ３−１５９、Ｓｔｅｉｎｅｒ， Ｓ． 及び Ｎ．Ｌ． Ａｎｄｅｒｓｏｎ （２０００） Ｔｏｘｉｃｏｌ． Ｌｅｔｔ． １１２−１１３：４６７−４７１、該文献は特に引用することを以って本明細書の一部となす）。試験化合物が、既知の毒性を有する化合物のシグネチャと同一のシグネチャを有する場合には、毒性特性を共有している可能性がある。フィンガープリントまたはシグネチャは、多数の遺伝子及び遺伝子ファミリーからの発現情報を含んでいる場合には、最も有用且つ正確である。理想的には、発現のゲノム全域にわたる測定が最高品質のシグネチャを提供する。たとえ、発現が任意の試験された化合物によって変化しない遺伝子があったとしても、それらの発現レベルを残りの発現データを標準化するために使用できるため、それらの遺伝子は重要である。標準化手順は、異なる化合物で処理した後の発現データの比較に有用である。毒性シグネチャの要素に遺伝子機能を割り当てることが毒性メカニズムの解釈に役立つが、毒性の予測につながるシグネチャの統計的に一致させるのに遺伝子機能の知識は必要とされない（例えば２０００年２月２９日に米国国立環境健康科学研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）より発行されたＰｒｅｓｓ Ｒｅｌｅａｓｅ ００−０２を参照されたい。これについてはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｅｈｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｏｃ／ｎｅｗｓ／ｔｏｘｃｈｉｐ．ｈｔｍで入手可能である）。従って、毒性シグネチャを用いる中毒学的スクリーニングの際に、全ての発現した遺伝子配列を含めることは重要且つ望ましいことである。
【０２５５】
或る実施例では、核酸を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。処理した生物学的サンプル中で発現した核酸は、本発明のポリヌクレオチドに特異的な１つ若しくは複数のプローブでハイブリダイズし、それによって本発明のポリヌクレオチドに対応する転写レベルを定量し得る。処理した生物学的サンプル中の転写レベルを、未処理生物学的サンプル中のレベルと比較する。両サンプルの転写レベルの差は、処理されたサンプル中で試験化合物が引き起こす毒性反応を示す。
【０２５６】
別の実施例は、本発明のポリペプチド配列を用いて組織または細胞タイプのプロテオームを分析することに関連する。プロテオームの語は、特定の組織または細胞タイプでのタンパク質発現の包括的パターンを指す。プロテオームの各タンパク質成分は、個々に更に分析の対象とすることができる。プロテオーム発現パターン即ちプロフィールは、所与の条件下で所与の時間に発現したタンパク質の数及び相対存在量を定量することにより分析し得る。従って細胞のプロテオームのプロフィールは、特定の組織または細胞タイプのポリペプチドを分離及び分析することにより作成し得る。或る実施例では、１次元等電点電気泳動によりサンプルからタンパク質を分離し、２次元ドデシル硫酸ナトリウムスラブゲル電気泳動により分子量に応じて分離するような２次元ゲル電気泳動により分離が達成される（前出のＳｔｅｉｎｅｒ および Ａｎｄｅｒｓｏｎ）。タンパク質は、通常はクーマシーブルー、あるいは銀染色液または蛍光染色液などの物質を用いてゲルを染色することにより、分散した、独自の位置にある点としてゲル中で可視化される。各タンパク質スポットの光学密度は、通常サンプル中のタンパク質レベルに比例する。異なるサンプル、例えば試験化合物または治療薬で処理または未処理のいずれかの生物学的サンプルから得られるタンパク質スポットの光学密度を比較し、処理に関連するタンパク質スポット密度の変化を同定する。スポット内のタンパク質は、例えば化学的または酵素的切断とそれに続く質量分析を用いる標準的な方法を用いて部分的にシークエンシングする。スポット内のタンパク質の同一性は、その部分配列を、好適には少なくとも５個の連続するアミノ酸残基を、本発明のポリペプチド配列と比較することにより決定し得る。場合によっては、決定的なタンパク質同定のための更なる配列が得られる。
【０２５７】
プロテオームのプロファイルは、ＯＸＲＤ に特異的な抗体を用いてＯＸＲＤ 発現レベルを定量することによっても作成可能である。或る実施例では、マイクロアレイ上でエレメントとして抗体を用い、マイクロアレイをサンプルに曝して各アレイ要素へのタンパク質結合レベルを検出することによりタンパク質発現レベルを定量する（Ｌｕｅｋｉｎｇ， Ａ． 他 （１９９９） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｒｎ． ２７０：１０３−１１１、Ｍｅｎｄｏｚｅ， Ｌ．Ｇ． 他 （１９９９） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２７：７７８−７８８）。検出は当分野で既知の様々な方法で行うことができ、例えば、チオールまたはアミノ反応性蛍光化合物を用いてサンプル中のタンパク質を反応させ、各アレイのエレメントにおける蛍光結合の量を検出し得る。
【０２５８】
プロテオームレベルでの毒性シグネチャも中毒学的スクリーニングに有用であり、転写レベルでの毒性シグネチャと並行に分析するべきである。或る組織の或るタンパク質に対しては、転写とタンパク質の存在量の相関が乏しいこともあるので（Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｎ．Ｌ． 及び Ｊ． Ｓｅｉｌｈａｍｅｒ （１９９７） Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １８：５３３−５３７）、転写イメージにはそれ程影響しないがプロテオームのプロフィールを変化させるような化合物の分析においてプロテオーム毒性シグネチャは有用たり得る。更に、体液中での転写の分析はｍＲＮＡ急速な分解により困難であるので、プロテオームのプロフィール作成はこのような場合により信頼でき、情報価値がある。
別の実施例では、タンパク質を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。処理された生物学的サンプル中で発現したタンパク質は、各タンパク質の量を定量し得るように分離する。各タンパク質の量を、未処理生物学的サンプル中の対応するタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する反応を示す。個々のタンパク質は、個々のタンパク質のアミノ酸残基をシークエンシングし、これら部分配列を本発明のポリペプチドと比較することにより同定する。別の実施例では、タンパク質を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。生物学的サンプルから得たタンパク質は、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を用いてインキュベートする。抗体により認識されたタンパク質の量を定量する。処理された生物学的サンプル中のタンパク質の量を、未処理生物学的サンプル中のタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する反応を示す。
【０２５９】
マイクロアレイは、本技術分野でよく知られている方法を用いて調製し、使用し、そして分析する（Ｂｒｅｎｎａｎ， Ｔ．Ｍ． 他 （１９９５） の米国特許第５，４７４，７９６号、Ｓｃｈｅｎａ， Ｍ． 他 （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１０６１４−１０６１９、Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒ 他の （１９９５） ＰＣＴ出願第ＷＯ９５／２５１１１６号、Ｓｈａｌｏｎ， Ｄ．他の （１９９５） ＰＣＴ出願第ＷＯ９５／３５５０５号、Ｈｅｌｌｅｒ， Ｒ．Ａ． 他 （１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４：２１５０−２１５５、Ｈｅｌｌｅｒ， Ｍ．Ｊ． 他の （１９９７） 米国特許第５，６０５，６６２号等を参照）。様々なタイプのマイクロアレイが公知であり、詳細については、ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｍ． Ｓｃｈｅｎａ， 編集． （１９９９） Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎに記載されている。 該文献は、特に引用することを以って本明細書の一部となす。
【０２６０】
本発明の別の実施例ではまた、ＯＸＲＤ をコードする核酸配列を用いて、天然のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを作製することが可能である。コード配列または非コード配列のいずれかを用いることができ、或る例では、コード配列より非コード配列の方が好ましい。例えば、多重遺伝子ファミリーのメンバー内でのコード配列の保存により、染色体マッピング中に望ましくないクロスハイブリダイゼーションが生じる可能性がある。核酸配列は、特定の染色体、染色体の特定領域または人工形成の染色体、例えば、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、細菌Ｐ１産物、或いは単一染色体ｃＤＮＡライブラリに対してマッピングされる（例えば、 Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｊ．Ｊ． 他 （１９９７） Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． １５：３４５−３５５； Ｐｒｉｃｅ， Ｃ．Ｍ． （１９９３） Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ． ７：１２７１３４； ａｎｄ Ｔｒａｓｋ， Ｂ．Ｊ． （１９９１） Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． ７：１４９１５４を参照。）一度マッピングすると、本発明の核酸配列を用いて例えば病状の遺伝を特定の染色体領域の遺伝または制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）と相関させるような遺伝子連鎖地図を作製できる。（例えば、 Ｌａｎｄｅｒ， Ｅ．Ｓ． および Ｄ． Ｂｏｔｓｔｅｉｎ （１９８６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：７３５３−７３５７を参照。）
【０２６１】
蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成法（ＦＩＳＨ）は、他の物理的及び遺伝地図データと相関し得る（前出のＨｅｉｎｚ−Ｕｌｒｉｃｈ， 他 （１９９５） ｉｎ Ｍｅｙｅｒｓ， ９６５−９６８頁等を参照）遺伝地図データの例は、種々の科学雑誌あるいはＯｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（ＯＭＩＭ）のウェブサイトに見ることができる。物理的な染色体地図上のＯＸＲＤをコードする遺伝子の位置と、特定の疾患との相関性、あるいは特定の疾患に対する素因との相関性は、この疾患と関連するＤＮＡの領域の決定に役立ち得るため、位置を決定するクローニングの作業を促進し得る。
【０２６２】
確定した染色体マーカーを用いた連鎖分析等の物理的マッピング技術及び染色体標本原位置ハイブリッド形成法を用いて、遺伝地図を拡張することができる。例えばマウスなど別の哺乳動物の染色体上に遺伝子を配置することにより、正確な染色体上の遺伝子座が未知でも、関連するマーカー類をしばしば明らかにし得る。この情報は、位置クローニングその他の遺伝子発見技術を用いて遺伝的疾患を探す研究者にとって価値がある。疾患または症候群に関与する遺伝子が、血管拡張性失調症の１１ｑ２２−２３領域等、特定の遺伝子領域への遺伝的結合によって大まかに位置決めがなされると、該領域に対するいかなる配列マッピングも、更なる調査のための関連遺伝子或いは調節遺伝子を表すことができる（Ｇａｔｔｉ， Ｒ．Ａ．他 （１９８８） Ｎａｔｕｒｅ ３３６：５７７−５８０等を参照）転座、反転等に起因する、健常者、保有者、感染者の三者間における染色体位置の相違を発見するために本発明のヌクレオチド配列を用いてもよい。
【０２６３】
本発明の別の実施例では、ＯＸＲＤ、その触媒作用断片或いは免疫原断片またはそのオリゴペプチドを、種々の任意の薬剤スクリーニング技術における化合物のライブラリのスクリーニングに用いることができる。薬剤スクリーニングに用いる断片は、溶液中に遊離しているか、固体支持物に固定されるか、細胞表面上に保持されるか、細胞内に位置することになろう。ＯＸＲＤ と検査する薬剤との結合による複合体の形成を測定してもよい。
【０２６４】
別の薬剤スクリーニング方法は、目的のタンパク質に対して好適な結合親和性を有する化合物を高い処理能力でスクリーニングするために用いられる（Ｇｅｙｓｅｎ， 他 （１９８４） ＰＣＴ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＯ８４／０３５６４等を参照。）この方法においては、多数の異なる小さな試験用化合物を固体基板上で合成する。試験用化合物は、ＯＸＲＤ、或いはその断片と反応してから洗浄される。次に、本技術分野でよく知られている方法で、結合したＯＸＲＤ を検出する。 精製したＯＸＲＤ はまた、上記した薬剤のスクリーニング技術において用いるプレート上で直接コーティングすることもできる。別法では、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持物に固定することもできる。
【０２６５】
別の実施例では、ＯＸＲＤ と特異結合可能な中和抗体がＯＸＲＤ との結合について試験用化合物競合する、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる。この方法では、抗体が、ＯＸＲＤと１つ以上の抗原決定因子を共有するどのペプチドの存在も検出する。
【０２６６】
別の実施例では、将来に開発される分子生物学技術が、現在知られているヌクレオチド配列の特性（限定はされないが、トリプレット遺伝コード、特異的な塩基対相互作用等を含む）に依存しているならば、ＯＸＲＤをコードするヌクレオチド配列をその新技術に用い得る。
【０２６７】
更に詳細説明をしなくとも、当業者であれば以上の説明を以って本発明を最大限に利用できるであろう。従って、これ以下に記載する実施例は単なる例示目的にすぎず、いかようにも本発明を限定するものではない。
【０２６８】
前述した及び以下に記載する全ての特許出願、特許、刊行物、特に米国特許出願第６０／２５７．８０２号、および同第６０／２６２．９０１号に言及することをもって本明細書の一部とする。
【０２６９】
（実施例）
１  ｃＤＮＡライブラリの作製
Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡは、ＬＩＦＥＳＥＱ ＧＯＬＤデータベース（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）に記載されたｃＤＮＡライブラリに由来するものである。ホモジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネート溶液に溶解した組織もあり、また、ホモジナイズしてフェノールまたは好適な変性剤の混合液に溶解した組織もある。変性剤の混合液は、例えばフェノールとグアニジニウムイソチオシアネートの単相溶液であるＴＲＩＺＯＬ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等である。結果として得られた溶解物は、塩化セシウムにおいて遠心分離するかクロロホルムで抽出した。イソプロパノールか、酢酸ナトリウムとエタノールか、いずれか一方、或いは別の方法を用いて、溶解物からＲＮＡを沈殿させた。
【０２７０】
ＲＮＡの純度を高めるため、ＲＮＡのフェノールによる抽出及び沈殿を必要な回数繰り返した。場合によっては、ＤＮＡ分解酵素でＲＮＡを処理した。殆どのライブラリでは、オリゴｄ（Ｔ）連結常磁性粒子（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＯＬＩＧＯＴＥＸラテックス粒子（ＱＩＡＧＥＮ， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ ＣＡ）またはＯＬＩＧＯＴＥＸ ｍＲＮＡ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、ポリ（Ａ＋） ＲＮＡを単離した。別法では、別のＲＮＡ単離キット、例えばＰＯＬＹ（Ａ）ＰＵＲＥ ｍＲＮＡ精製キット（Ａｍｂｉｏｎ， Ａｕｓｔｉｎ ＴＸ）を用いて組織溶解物からＲＮＡを直接単離した。
【０２７１】
場合によってはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社へのＲＮＡ提供を行い、対応するｃＤＮＡライブラリをＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社が作製することもあった。そうでない場合は、ＵＮＩＺＡＰベクターシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）またはＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴプラスミドシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて本技術分野で既知の推奨方法または類似の方法でｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡライブラリを作製した（前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９７， ５．１−６．６ユニットなどを参照）。逆転写は、オリゴｄ（Ｔ）またはランダムプライマーを用いて開始した。合成オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖ｃＤＮＡに連結反応させ、好適な制限酵素でｃＤＮＡを消化した。殆どのライブラリに対して、ｃＤＮＡのサイズの選択（３００〜１０００ｂｐ）は、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ Ｓ１０００、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＣＬ２ＢまたはＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＣＬ４Ｂカラムクロマトグラフィー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、或いは調製用アガロースゲル電気泳動法を用いて行った。ｃＤＮＡは好適なプラスミドのポリリンカーの適合する制限酵素部位に結合させた。 好適なプラスミドは例えば、ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ プラスミド （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＰＳＰＯＲＴ１ プラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＰＣＤＮＡ２．１ プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）、ＰＢＫ−ＣＭＶ プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、 ＰＣＲ２−ＴＯＰＯＴＡ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、 ＰＣＭＶ−ＩＣＩＳプラスミド （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＩＧＥＮ （Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）、ｐＲＡＲＥ （Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）または ｐＩＮＣＹ （Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、あるいはその誘導体である。組換えプラスミドは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＸＬ１−ＢＩｕｅＭＲＦまたはＳＯＬＲ、或いはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＤＨ５α、ＤＨ１０ＢまたはＥＬＥＣＴＲＯＭＡＸ ＤＨ１０Ｂを含む大腸菌細胞に形質転換した。
【０２７２】
２  ｃＤＮＡクローンの単離
ＵＮＩＺＡＰベクターシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いたｉｎ ｖｉｖｏ切除によって、或いは細胞溶解によって、実施例１のようにして得たプラスミドを宿主細胞から回収した。プラスミドを精製する方法は、ＭａｇｉｃまたはＷＩＺＡＲＤ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＡＧＴＣ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ精製キット（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）、ＱＩＡＧＥＮ社のＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｐｌａｓｍｉｄ、ＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｐｌｕｓ ＰｌａｓｍｉｄおよびＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｕｌｔｒａ Ｐｌａｓｍｉｄ 精製システム、Ｒ．Ｅ．Ａ．Ｌ． Ｐｒｅｐ ９６プラスミド精製キットの中から少なくとも１つを用いた。プラスミドは、沈殿させた後、０．１ｍｌの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥しないで４℃で保管した。
別法では、高処理フォーマットにおいて直接結合ＰＣＲ法を用いて宿主細胞溶解物からプラスミドＤＮＡを増幅した（Ｒａｏ， Ｖ．Ｂ． （１９９４） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２１６：１−１４）。宿主細胞の溶解及び熱サイクリング過程は、単一反応混合液中で行った。サンプルを処理し、それを３８４穴プレート内で保管し、増幅したプラスミドＤＮＡの濃度をＰＩＣＯＧＲＥＥＮ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）及びＦＬＵＯＲＯＳＫＡＮＩＩ蛍光スキャナ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｏｙ， Ｈｅｌｓｉｎｋｉ， Ｆｉｎｌａｎｄ）を用いて蛍光分析的に定量した。
【０２７３】
３  シークエンシング及び分析
実施例２に記載したようにプラスミドから回収したＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡを、以下に示すようにシークエンシングした。ｃＤＮＡのシークエンス反応は、標準的方法或いは高処理装置、例えばＡＢＩ ＣＡＴＡＬＹＳＴ ８００ サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）またはＰＴＣ−２００ サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）をＨＹＤＲＡマイクロディスペンサー（Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはＭＩＣＲＯＬＡＢ ２２００（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）液体転移システムと併用して処理した。ｃＤＮＡのシークエンス反応は、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社が提供する試薬、またはＡＢＩシークエンシングキット、例えばＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢＩＧＤＹＥ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の試薬を用いて準備した。ｃＤＮＡのシークエンス反応の電気泳動的分離及び標識したポリヌクレオチドの検出には、ＭＥＧＡＢＡＣＥ １０００ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）か、標準ＡＢＩプロトコル及び塩基対呼び出しソフトウェアを用いるＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７３または３７７シークエンシングシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）か、或いはその他の本技術分野でよく知られている配列解析システムを用いた。ｃＤＮＡ配列内のリーディングフレームは、標準的方法（前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９７， ７．７ユニットに概説）を用いて決定した。ｃＤＮＡ配列の幾つかを選択して、実施例８に記載した方法で配列を伸長させた。
【０２７４】
Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列に由来するポリヌクレオチド配列は、ベクター、リンカー及びポリ（Ａ）配列を除去し、あいまいな塩基対をマスクすることによって有効性を確認した。 その際、ＢＬＡＳＴ、動的プログラミング及び隣接ジヌクレオチド頻度分析に基づくアルゴリズム及びプログラムを用いた。次に、Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列またはそれらの翻訳の問い合わせを、以下のデータベース群より選択した１つに対して行った。すなわち、公共のデータベース群（例えばＧｅｎＢａｎｋの霊長類およびげっ歯類、哺乳動物、脊椎動物、真核生物のデータベースと、ＢＬＯＣＫＳ、ＰＲＩＮＴＳ、ＤＯＭＯ、ＰＲＯＤＯＭ）、ＰＲＯＴＥＯＭＥの、ヒト、ラット、マウス、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）およびＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）からの配列群を持つデータベース群、および、ＰＦＡＭ等の、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）ベースのタンパク質ファミリーデータベース群である（ＨＭＭは、遺伝子ファミリーのコンセンサス１次構造を分析する確率的アプローチである。例えば、Ｅｄｄｙ， Ｓ．Ｒ． （１９９６） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ６：３６１−３６５を参照のこと）。Ｅｄｄｙ， Ｓ．Ｒ． （１９９６） Ｃｕｆｆ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ６：３６１−３６５等を参照）の選択に対するＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列またはその翻訳を問い合わせた。問合せは、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＩＭＰＳ及びＨＭＭＥＲに基づくプログラムを用いて行った。Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列は、完全長のポリヌクレオチド配列を産出するように構築した。或いは、ＧｅｎＢａｎｋ ｃＤＮＡ、ＧｅｎＢａｎｋ ＥＳＴ、ステッチされた配列、ストレッチされた配列またはＧｅｎｓｃａｎ予測コード配列（実施例４及び５を参照）を用いてＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡの集団を完全長まで伸長させた。Ｐｈｒｅｄ、Ｐｈｒａｐ及びＣｏｎｓｅｄに基づくプログラムを用いて構築し、ＧｅｎＭａｒｋ、ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡに基づくプログラムを用いてｃＤＮＡの集団をオープンリーディングフレームに対してスクリーニングした。対応する完全長ポリペプチド配列を誘導するべく完全長ポリヌクレオチド配列を翻訳した。或いは、本発明のポリペプチドは完全長翻訳ポリペプチドの任意のメチオニン残基で開始し得る。引き続いて、ＧｅｎＢａｎｋタンパク質データベース（ｇｅｎｐｅｐｔ）、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＲＯＴＥＯＭＥデータベース、ＢＬＯＣＫＳ、ＰＲＩＮＴＳ、ＤＯＭＯ、ＰＲＯＤＯＭ及びＰｒｏｓｉｔｅ等のデータベース、ＰＦＡＭ等の隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）に基づいた、タンパク質ファミリーデータベースに対する問合せによって完全長ポリペプチド配列を分析した。完全長ポリヌクレオチド配列はまた、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウェア（日立ソフトウェアエンジニアリング， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）及びＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて分析した。ポリヌク���オチド及びポリペプチド配列アラインメントは、アラインメントした配列と配列の一致率も計算するＭＥＧＡＬＩＧＮマルチシークエンスアラインメントプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ）に組み込まれているようなＣＬＵＳＴＡＬアルゴリズムによって特定されるデフォルトパラメータを用いて作製する。
【０２７５】
Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ及び完全長配列の分析及びアセンブリに利用したツール、プログラム及びアルゴリズムの概略と、適用可能な説明、引用文献、閾値パラメータを表７に示す。用いたツール、プログラムおよびアルゴリズムを表７の列１に、それらの簡単な説明を列２に示す。列３は好適な参照文献であり、全ての文献は引用を以って全文を本明細書の一部となす。適用可能な場合には、列４は、２つの配列が一致する強さを評価するために用いた、スコア、確率値その他のパラメータを示す（スコアが高いほど、または確率値が低いほど、２配列間の同一性が高い）。
【０２７６】
完全長ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の組み立て及び分析に用いる上記のプログラムは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４−６のポリヌクレオチド配列断片の同定にも利用できる。 ハイブリダイゼーション及び増幅技術に有用である約２０〜約４０００ヌクレオチドの断片を表２の列４に示した。
【０２７７】
４  ゲノムＤＮＡからのコード配列の同定及び編集
推定上のオキシドレダクターゼは、公共のゲノム配列データベース（例えば、ｇｂｐｒｉやｇｂｈｔｇ）においてＧｅｎｓｃａｎ遺伝子同定プログラムを実行して初めに同定された。Ｇｅｎｓｃａｎは、様々な生物からゲノムＤＮＡ配列を分析する汎用遺伝子同定プログラムである（Ｂｕｒｇｅ， Ｃ． および Ｓ． Ｋａｒｌｉｎ （１９９７） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６８：７８−９４ 及びＢｕｒｇｅ， Ｃ． 及び Ｓ． Ｋａｒｌｉｎ （１９９８） Ｃｕｆｆ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ８：３４６−３５４参照）。プログラムは予測エキソンを連結し、メチオニンから停止コドンに及ぶ構築されたｃＤＮＡ配列を形成する。Ｇｅｎｓｃａｎの出力は、ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列のＦＡＳＴＡデータベースである。Ｇｅｎｓｃａｎが一度に分析する配列の最大範囲は、３０ｋｂに設定した。これらのＧｅｎｓｃａｎ予測ｃＤＮＡ配列の内、どの配列がオキシドレダクターゼをコードするかを決定するために、コードされたポリペプチドをＰＦＡＭモデルにおいてオキシドレダクターゼについて問合せて分析した。潜在的なオキシドレダクターゼは、またオキシドレダクターゼとして注釈が付けられたＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列に対する相同性を基に同定した。こうして選択されたＧｅｎｓｃａｎ予測配列は、次にＢＬＡＳＴ分析により公共データベースｇｅｎｐｅｐｔ及びｇｂｐｒｉと比較した。必要であれば、ｇｅｎｐｅｐｔからのトップのＢＬＡＳＴヒットと比較することによりＧｅｎｓｃａｎ予測配列を編集し、余分なまたは取り除かれたエキソンなどのＧｅｎｓｃａｎにより予測された配列のエラーを修正する。ＢＬＡＳＴ分析はまた、任意のＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡまたはＧｅｎｓｃａｎ予測配列の公共ｃＤＮＡ適用範囲の発見に用いられるので、転写の証拠を提供する。Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ適用範囲が利用できる場合には、この情報を用いてＧｅｎｓｃａｎ予測配列を修正または確認した。完全長ポリヌクレオチド配列は、実施例３に記載された構築プロセスを用いて、Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列及び／または公共のｃＤＮＡ配列でＧｅｎｓｃａｎ予測コード配列を構築することにより得た。或いは、完全長ポリヌクレオチド配列は編集または非編集のＧｅｎｓｃａｎ予測コード配列に完全に由来する。
【０２７８】
５ ｃＤＮＡ配列データを使ったゲノム配列データの構築
ステッチ配列（Ｓｔｉｃｈｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）
部分ｃＤＮＡ配列は、実施例４に記載のＧｅｎｓｃａｎ遺伝子同定プログラムにより予測されたエキソンを用いて伸長させた。実施例３に記載されたように構築された部分ｃＤＮＡは、ゲノムＤＮＡにマッピングし、関連するｃＤＮＡ及び１つ若しくは複数のゲノム配列から予測されたＧｅｎｓｃａｎエキソンを含むクラスタに分解した。ｃＤＮＡ及びゲノム情報を統合するべくグラフ理論及び動的プログラミングに基づくアルゴリズムを用いて各クラスタを分析し、引き続いて確認、編集または伸長して完全長配列を産出するような潜在的スプライス変異体を生成した。間隔全体の長さがクラスタ中の２以上の配列に存在するような配列を同定し、そのように同定された間隔は推移により等しいと考えられた。例えば、１つのｃＤＮＡ及び２つのゲノム配列に間隔が存在する場合、３つの間隔は全て等しいと考えられる。このプロセスは、無関係であるが連続したゲノム配列をｃＤＮＡ配列により結び合わせて架橋し得る。このようにして同定された区間を、親配列（ｐａｒｅｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に沿って現われるようにステッチアルゴリズムで縫い合わせ、可能な最も長い配列および変異配列を作製する。１種類の親配列に沿って発生した間隔と間隔との連鎖（ｃＤＮＡ−ｃＤＮＡまたはゲノム配列−ゲノム配列）は、親の種類を変える連鎖（ｃＤＮＡ−ゲノム配列）に優先した。結果として得られるステッチ配列は、ＢＬＡＳＴ分析により公共データベースｇｅｎｐｅｐｔ及びｇｂｐｒｉに翻訳されて比較された。Ｇｅｎｓｃａｎにより予測された不正確なエキソンは、ｇｅｎｐｅｐｔからのトップのＢＬＡＳＴヒットと比較することにより修正した。必要な場合には、追加ｃＤＮＡ配列を用いるかゲノムＤＮＡの検査により配列を更に伸長させた。
【０２７９】
ストレッチ配列（Ｓｔｒｅｔｃｈｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）
部分ＤＮＡ配列は、ＢＬＡＳＴ分析に基づくアルゴリズムにより完全長まで伸長された。先ず、ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、ＧｅｎＢａｎｋの霊長類、げっ歯類、哺乳動物、脊椎動物及び真核生物のデータベースなどの公共データベースに対し、実施例３に記載されたように構築された部分ｃＤＮＡを問い合わせた。次に、最も近いＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体をＢＬＡＳＴ分析によりＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列または実施例４に記載のＧｅｎＳｃａｎエキソン予測配列のいずれかと比較した。結果として得られる高スコアリングセグメント対（ＨＳＰ）を用いてキメラタンパク質を産出し、翻訳した配列をＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体上にマッピングした。元のＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体に関連して、キメラタンパク質内で挿入または削除が起こり得る。ＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体、キメラタンパク質またはその両方をプローブとして用い、公共のヒトゲノムデータベースから相同ゲノム配列を検索した。このようにして、部分的なＤＮＡ配列を相同ゲノム配列の付加によりストレッチすなわち伸長した。結果として得られるストレッチ配列を検査し、完全遺伝子を含んでいるか否かを決定した。
【０２８０】
６  ＯＸＲＤ をコードするポリヌクレオチドの染色体マッピング
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４−６を構築するために用いた配列を、ＢＬＡＳＴ及びＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いて、Ｉｎｃｙｔｅ ＬＩＦＥＳＥＱデータベース及び公共のドメインデータベースの配列と比較した。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４−６と一致するこれらのデータベースの配列を、Ｐｈｒａｐ（表７）などの構築アルゴリズムを使用して、連続的配列及びオーバーラップした配列のクラスターに組み入れた。スタンフォード・ヒトゲノムセンター（ＳＨＧＣ）、ホワイトヘッド・ゲノム研究所（ＷＩＧＲ）、Ｇｅｎｅｔｈｏｎ等の公的な情報源から入手可能な放射線ハイブリッド及び遺伝地図データを用いて、クラスタ化された配列が前にマッピングされていたかを確認した。マッピングされた配列がクラスタに含まれている場合は、個々の配列番号を含めてそのクラスタの全配列が地図上の位置に割り当てられた。
【０２８１】
地図上の位置は、ヒト染色体の範囲または間隔として表される。センチモルガン間隔の地図上の位置は、染色体のｐアームの末端に関して測定する。（センチモルガン（ｃＭ）は、染色体マーカー間の組換え頻度に基づく計測単位である。平均して、１ｃＭは、ヒト中のＤＮＡの１メガベース（Ｍｂ）にほぼ等しい。 尤も、この値は、組換えのホットスポット及びコールドスポットによって広範囲に変化する。）ｃＭ距離は、配列が各クラスタ内に含まれるような放射線ハイブリッドマーカーに対して境界を提供するようなＧｅｎｅｔｈｏｎによってマッピングされた遺伝マーカーに基づく。ＮＣＢＩ「ＧｅｎｅＭａｐ９９」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｐｖ／ｇｅｎｅｍａｐ）などの一般個人が入手可能なヒト遺伝子マップおよびその他の情報源を用いて、上記した区間が既に同定されている疾患遺伝子マップ内若しくは近傍に位置するかを決定できる。
【０２８２】
７  ポリヌクレオチド発現の分析
ノーザン分析は、転写された遺伝情報の存在を検出するために用いられる実験技術であり、特定の細胞種または組織からのＲＮＡが結合される膜への標識されたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションに関与している。（前出のＳａｍｂｒｏｏｋ， ７章、同Ａｕｓｕｂｅｌ． Ｆ．Ｍ． 他， ４章及び１６章等を参照。）
【０２８３】
ＢＬＡＳＴに適用する類似のコンピュータ技術を用いて、ＧｅｎＢａｎｋやＬｉｆｅＳｅｑ（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）等のヌクレオチドデータベースにおいて同一または関連分子を検索する。ノーザン分析は、多数膜系ハイブリダイゼーションよりも非常に速い。更に、特定の一致を厳密な一致、或いは類似的な一致として分類するか否かを決定するため、コンピュータ検索の感度を変更することができる。検索の基準は積スコアであり、次式で定義される。
【０２８４】
【数１】
2005501507.tif 000006
【０２８５】
積スコアは、２つの配列間の類似度及び配列が一致する長さの両方を考慮している。積スコアは、０〜１００の規準化された値であり、次のようにして求める。ＢＬＡＳＴスコアにヌクレオチドの配列一致率を乗じ、その積を２つの配列の短い方の長さの５倍で除する。高スコアリングセグメント対（ＨＳＰ）に一致する各塩基に＋５のスコアを割り当て、各不適性塩基対に−４を割り当てることにより、ＢＬＡＳＴスコアを計算する。２つの配列は、２以上のＨＳＰを共有し得る（ギャップにより隔離され得る）。２以上のＨＳＰがある場合には、最高ＢＬＡＳＴスコアの塩基対を用いて積スコアを計算する。積スコアは、断片的オーバーラップとＢＬＡＳＴアラインメントの質とのバランスを表す。例えば積スコア１００は、比較した２つの配列の短い方の長さ全体にわたって１００％一致する場合のみ得られる。積スコア７０は、一端が１００％一致し、７０％オーバーラップしているか、他端が８８％一致し、１００％オーバーラップしているかのいずれかの場合に得られる。積スコア５０は、一端が１００％一致し、５０％オーバーラップしているか、他端が７９％一致し、１００％オーバーラップしているかのいずれかの場合に得られる。
【０２８６】
或いは、ＯＸＲＤ をコードするポリヌクレオチド配列を、ポリヌクレオチド配列が派生した組織源に関連して分析した。例えば或る完全長配列は、Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列（実施例３を参照）と少なくとも一部はオーバーラップするように構築される。各ｃＤＮＡ配列は、ヒト組織から作製されたｃＤＮＡライブラリに由来する。各ｃＤＮＡ配列は、ヒト組織から作製されたｃＤＮＡライブラリに由来する。各ヒト組織は、以下の生物／組織カテゴリー即ち心血管系、結合組織、消化器系、胎芽構造、内分泌系、外分泌腺、女性生殖器、男性生殖器、生殖細胞、血液及び免疫系、肝、筋骨格系、神経系、膵臓、呼吸器系、感覚器、皮膚、顎口腔系、非分類性／混合性または尿路の１つに分類される。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。同様に、各ヒト組織は、以下の疾患／病状カテゴリー即ち癌、細胞系、発達、炎症、神経性、外傷、心血管、プール、その他の１つに分類される。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。得られるパーセンテージは、ＯＸＲＤをコードするｃＤＮＡの疾患特異的な発現を反映する。 ｃＤＮＡ配列およびｃＤＮＡライブラリ／組織の情報は、ＬＩＦＥＳＥＱ ＧＯＬＤ データベース（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）から得ることができる。
【０２８７】
８  ＯＸＲＤ   をコードするポリヌクレオチドの伸長
完全長のポリヌクレオチド配列もまた、完全長分子の適切な断片から設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて該断片を伸長させて生成した。一方のプライマーは既知の断片の５’伸長を開始するべく合成し、他方のプライマーは既知の断片の３’伸長を開始するべく合成した。開始プライマーは、長さが約２２〜３０ヌクレオチド、ＧＣ含有率が約５０％以上となり、約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニーリングするように、ＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）或いは別の適切なプログラムを用いて、ｃＤＮＡから設計した。 ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体を生ずるようなヌクレオチドの伸長は全て回避した。
【０２８８】
配列を伸長するために、選択されたヒトｃＤＮＡライブラリを用いた。２段階以上の伸長が必要または望ましい場合には、付加的プライマー或いはプライマーのネステッドセットを設計した。
【０２８９】
高忠実度の増幅が、当業者によく知られている方法を利用したＰＣＲ法によって得られた。 ＰＣＲは、ＰＴＣ−２００ サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ．）を用いて９６穴プレート内で行った。反応混合液は、鋳型ＤＮＡ及び２００ ｎｍｏｌの各プライマー、Ｍｇ２＋と（ＮＨ４）２ＳＯ４と２−メルカプトエタノールを含むバッファー、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＥＬＯＮＧＡＳＥ酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含む。 プライマーの組、ＰＣＩ ＡとＰＣＩ Ｂに対して以下のパラメータで増幅を行った。｝ ステップ１： ９４℃， ３分、 ステップ ２： ９４℃， １５ 秒、ステップ ３： ６０℃， １ 分、ステップ ４： ６８℃， ２ 分、 ステップ ５： ステップ２、３および ４を２０回反復する。  ステップ６： ６８℃， ５ 分、ステップ７：  ４℃で保存する。別法では、プライマーの組、Ｔ７とＳＫ＋に対して以下のパラメータで増幅を行った。ステップ１： ９４℃， ３分、 ステップ ２： ９４℃， １５ 秒、ステップ ３： ５７℃， １ 分、ステップ ４： ６８℃， ２ 分、 ステップ ５： ステップ２、３および ４を２０回反復する。  ステップ６： ６８℃、５ 分、ステップ７：  ４℃で保存する。
【０２９０】
１Ｘ ＴＥに溶解したＰＩＣＯＧＲＥＥＮ定量試薬（０．２５％（ｖ／ｖ） ＰＩＣＯＧＲＥＥＮ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）１００μｌと、希釈していないＰＣＲ産物０．５μｌとを不透明な蛍光光度計プレート（Ｃｏｍｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ， Ａｃｔｏｎ ＭＡ）の各穴に分配し、ＤＮＡを試薬と結合可能なようにさせることによって各穴内のＤＮＡ濃度の測定を行った。サンプルの蛍光を計測してＤＮＡの濃度を定量するためにプレートをＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ ＩＩ （Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｏｙ， Ｈｅｌｓｉｎｋｉ， Ｆｉｎｌａｎｄ）でスキャンした。反応混合物のアリコート５〜１０μｌを１％アガロースミニゲル上で電気泳動法によって解析し、どの反応が配列の伸長に成功したかを決定した。
【０２９１】
伸長させたヌクレオチドは、脱塩及び濃縮して３８４穴プレートに移し、ＣｖｉＪＩコレラウイルスエンドヌクレアーゼ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を用いて消化し、ｐＵＣ １８ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）への再連結反応前に音波処理またはせん断した。ショットガン・シークエンシングのために、消化したヌクレオチドを低濃度（０．６〜０．８％）のアガロースゲル上で分離し、断片を切除し、寒天をＡｇａｒ ＡＣＥ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で消化した。Ｔ４リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）を用いて伸長させたクローンをｐＵＣ １８ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に再連結し、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で処理して制限部位のオーバーハング部分を満たし、大腸菌細胞に形質移入した。形質移入した細胞を選択して抗生物質を含む培地に移し、それぞれのコロニーを切りとってＬＢ／２Ｘカルベニシリン培養液の３８４ウェルプレートに３７℃で一晩培養した。
【０２９２】
細胞を溶解して、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）及びＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて以下の手順でＤＮＡをＰＣＲ増幅した。ステップ１： ９４℃， ３分、 ステップ ２： ９４℃， １５ 秒、ステップ ３： ６０℃， １ 分、ステップ ４： ７２℃， ２ 分、 ステップ ５： ステップ２、３および ４を２９回反復する。  ステップ６： ７２℃， ５ 分、ステップ７：  ４℃で保存する。上記のようにＰＩＣＯＧＲＥＥＮ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）でＤＮＡを定量した。ＤＮＡの回収率が低いサンプルは、上記と同一の条件を用いて再増幅した。サンプルは２０％ジメチルスルホキシド（１：２， ｖ／ｖ）で希釈し、ＤＹＥＮＡＭＩＣ エネルギートランスファー シークエンシングプライマー、及びＤＹＥＮＡＭＩＣ ＤＩＲＥＣＴ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）またはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢＩＧＤＹＥ ターミネーターサイクル シークエンシング反応キット（Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてシークエンシングした。
【０２９３】
同様に、上記手順を用いて完全長ヌクレオチド配列を検証し、或いはそのような伸長のために設計されたオリゴヌクレオチド及び適切なゲノムライブラリを用いて５’調節配列を得る。
【０２９４】
９  個々のハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４−６由来のハイブリダイゼーションプローブを用いて、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡをスクリーニングする。約２０塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記載するが、より大きなヌクレオチド断片に対しても事実上同一の手順が用いられる。オリゴヌクレオチドは、ＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）等の最新ソフトウェアを用いて設計し、各オリゴマー５０ｐｍｏｌと、［γ−３２Ｐ］アデノシン３リン酸 （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）２５０μＣｉと、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ， Ｂｏｓｔｏｎ ＭＡ）を混合することにより標識する。標識したオリゴヌクレオチドは、ＳＥＰＨＡＤＥＸ Ｇ−２５超細繊分子サイズ排除デキストラン ビードカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて十分に精製する。Ａｓｅ Ｉ、Ｂｇｌ ＩＩ、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｐｓｔ Ｉ、Ｘｂａ１またはＰｖｕ ＩＩ（ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ）のいずれか１つのエンドヌクレアーゼで消化したヒトゲノムＤＮＡの典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析において、毎分１０７カウントの標識されたプローブを含むアリコットを用いる。
【０２９５】
各消化物から得たＤＮＡは、０．７％アガロースゲル上で分画してナイロン膜（Ｎｙｔｒａｎ Ｐｌｕｓ， Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ， Ｄｕｒｈａｍ ＮＨ）に移す。ハイブリダイゼーションは、４０℃で１６時間行う。 非特異的シグナルを除去するため、例えば０．１×クエン酸ナトリウム食塩水及び０．５％ドデシル硫酸ナトリウムに一致する条件下で、ブロットを室温で順次洗浄する。オートラジオグラフィーまたはそれに代わるイメージング手段を用いてハイブリダイゼーションパターンを視覚化し、比較する。
【０２９６】
１０  マイクロアレイ
マイクロアレイ上でアレイエレメントの結合または合成は、フォトリソグラフィ、圧電印刷（インクジェット印刷、前出のＢａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒ等を参照）、機械的マイクロスポッティング技術及びこれらから派生したものを用いて達成することが可能である。上記各技術において基板は、均一且つ非多孔性の固体とするべきである（Ｓｃｈｅｎａ （１９９９） 前出）。推奨する基板には、シリコン、シリカ、スライドガラス、ガラスチップ及びシリコンウエハがある。或いは、ドットブロット法またはスロットブロット法に類似のアレイを利用して、熱的、紫外線的、化学的または機械的結合手順を用いて基板の表面にエレメントを配置及び結合させてもよい。通常のアレイは、当業者に周知の利用可能な方法や機械を用いて作製でき、任意の適正数のエレメントを有し得る（Ｓｃｈｅｎａ， Ｍ． 他 （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４６７−４７０、Ｓｈａｌｏｎ． Ｄ． 他 （１９９６） Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ６：６３９−６４５、Ｍａｒｓｈａｌｌ， Ａ． および Ｊ． Ｈｏｄｇｓｏｎ （１９９８） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １６：２７−３１．を参照）。
【０２９７】
完全長ｃＤＮＡ、発現配列タグ（ＥＳＴ）、またはその断片またはオリゴマーは、マイクロアレイのエレメントと成り得る。ハイブリダイゼーションに好適な断片またはオリゴマーを、レーザＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）等の本技術分野で公知のソフトウェアを用いて選択することが可能である。アレイエレメントは、生物学的サンプル中でポリヌクレオチドを用いてハイブリダイズされる。生物学的サンプル中のポリヌクレオチドは、検出を容易にするために蛍光標識またはその他の分子タグに抱合される。ハイブリダイゼーション後、生物学的サンプルからハイブリダイズされていないヌクレオチドを除去し、蛍光スキャナを用いて各アレイエレメントにおいてハイブリダイゼーションを検出する。或いは、レーザ脱離及び質量スペクトロメトリを用いてもハイブリダイゼーションを検出し得る。マイクロアレイ上のエレメントにハイブリダイズする各ポリヌクレオチドの相補性の度合及び相対存在度は、算定し得る。 一実施例におけるマイクロアレイの調整及び使用について、以下に詳述する。
【０２９８】
組織または細胞サンプルの調製
グアニジウムチオシアネート法を用いて組織サンプルから全ＲＮＡを単離し、オリゴ（ｄＴ）セルロース法を用いてポリ（Ａ）＋ＲＮＡを精製する。各ポリ（Ａ）＋ＲＮＡサンプルは、ＭＭＬＶ逆転写酵素、０．０５ｐｇ／μｌのオリゴ（ｄＴ）プライマー（２１ｍｅｒ）、１Ｘ 第１鎖バッファ、０．０３ｕｎｉｔ／μｌのＲＮアーゼ阻害剤、５００μＭのｄＡＴＰ、５００μＭのｄＧＴＰ、５００μＭのｄＴＴＰ、４０μＭのｄＣＴＰ、４０μＭのｄＣＴＰ−Ｃｙ３（ＢＤＳ）またはｄＣＴＰ−Ｃｙ５（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて逆転写する。逆転写反応は、ＧＥＭＢＲＩＧＨＴキット（Ｉｎｃｙｔｅ）を用いてポリ（Ａ）＋ＲＮＡ含有の２５体積ｍｌ内で行う。特異的対照ポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、非コード酵母ゲノムＤＮＡからｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により合成する。３７℃で２時間インキュベートした後、各反応サンプル（１つはＣｙ３、もう１つはＣｙ５標識）は、２．５ｍｌの０．５Ｍ水酸化ナトリウムで処理し、８５℃で２０分間インキュベートし、反応を停止させてＲＮＡを分解させる。サンプルは、２つの連続するＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ ３０ゲル濾過スピンカラム（ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ． （ＣＬＯＮＴＥＣＨ）， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）を用いて精製する。 混合後、２つの反応サンプルは、１ｍｌのグリコーゲン（１ｍｇ／ｍｌ）、６０ｍｌの酢酸ナトリウム及び３００ｍｌの１００％エタノールを用いてエタノール沈殿させる。サンプルは次に、ＳｐｅｅｄＶＡＣ（Ｓａｖａｎｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．， Ｈｏｌｂｒｏｏｋ ＮＹ）を用いて乾燥して仕上げ、１４μｌの５×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ中で再懸濁する。
【０２９９】
マイクロアレイの調製
本発明の配列を用いて、アレイエレメントを生成する。各アレイエレメントは、クローン化ｃＤＮＡインサートによりベクター含有細菌性細胞から増幅する。ＰＣＲ増幅は、ｃＤＮＡインサートの側面に位置するベクター配列に相補的なプライマーを用いる。３０サイクルのＰＣＲで１〜２ｎｇの初期量から５μｇより大きい最終量までアレイエレメントを増幅する。増幅されたアレイエレメントは、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ−４００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて精製される。
【０３００】
精製したアレイエレメントは、ポリマーコートされたスライドグラス上に固定する。顕微鏡スライドグラス（Ｃｏｒｎｉｎｇ）は、処理中及び処理後に０．１％のＳＤＳ及びアセトン中で超音波をかけ、蒸留水で非常に良く洗って洗浄する。スライドグラスは、４％フッ化水素酸（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ （ＶＷＲ）， Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ ＰＡ）中でエッチングし、蒸留水中で広範囲にわたって洗浄し、９５％エタノール中で０．０５％アミノプロピルシラン（Ｓｉｇｍａ）を用いてコーティングする。コーティングしたスライドガラスは、１１０℃のオブンで硬化させる。
【０３０１】
米国特許第５，８０７，５２２号に記載されている方法を用いて、コーティングしたガラス基板にアレイエレメントを付加する。 この特許に引用することを以って本明細書の一部とする。平均濃度が１００ｎｇ／μｌのアレイエレメントＤＮＡ１μｌを高速機械装置により開放型キャピラリープリンティングエレメント（ｏｐｅｎ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｐｒｉｎｔｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ）に充填する。装置はここで、スライド毎に約５ｎｌのアレイエレメントサンプルを加える。
【０３０２】
マイクロアレイには、ＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲ ＵＶ架橋剤（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてＵＶ架橋する。マイクロアレイは、室温において０．２％ＳＤＳで１度洗浄し、蒸留水で３度洗浄する。リン酸緩衝生理食塩水 （ＰＢＳ）（Ｔｒｏｐｉｘ， Ｉｎｃ．， Ｂｅｄｆｏｒｄ ＭＡ）中の０．２％カゼイン中において６０℃で３０分間マイクロアレイをインキュベートした後、前に行ったように０．２％ＳＤＳ及び蒸留水で洗浄することにより、非特異結合部位をブロックする。
【０３０３】
ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション反応液は、５×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳハイブリダイゼーション緩衝液にＣｙ３及びＣｙ５標識したｃＤＮＡ合成産物を各０．２μｇ含む９μｌのサンプル混合体を含めたものである。サンプル混合体は、６５℃まで５分間加熱し、マイクロアレイ表面上で等分して１．８ｃｍ２ のカバーガラスで覆う。アレイは、顕微鏡スライドより僅かに大きい空洞を有する防水チェンバーに移す。チェンバーのコーナーに１４０μｌの５×ＳＳＣを加えることにより、チェンバー内部を湿度１００に保持する。アレイを含むチェンバーは、６０℃で約６．５時間インキュベートする。 アレイは、第１洗浄緩衝液中（１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）において４５℃で１０分間洗浄し、第２洗浄緩衝液中（０．１×ＳＳＣ）において４５℃で１０分間各々３度洗浄して乾燥させる。
【０３０４】
検出
レポーター標識されたハイブリダイゼーション複合体は、Ｃｙ３の励起のためには４８８ｎｍ、Ｃｙ５の励起のためには６３２ｎｍでスペクトル線を発生し得るＩｎｎｏｖａ ７０混合ガス１０ Ｗレーザ（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ ＣＡ）を備えた顕微鏡で検出する。２０×顕微鏡対物レンズ（Ｎｉｋｏｎ， Ｉｎｃ．， Ｍｅｌｖｉｌｌｅ ＮＹ）を用いて、アレイ上に励起レーザ光の焦点を当てる。アレイを含むスライドを顕微鏡のコンピュータ制御のＸ−Ｙステージに置き、対物レンズを通過してラスタースキャンする。本実施例で用いた１．８ｃｍ×１．８ｃｍのアレイは、２０μｍの解像度でスキャンした。  ２つの異なるスキャンのうち、混合ガスマルチラインレーザは２つの蛍光色素を連続的に励起する。発光された光は、波長に基づき分離され、２つの蛍光色素に対応する２つの光電子増倍管検出器（ＰＭＴ Ｒ１４７７， Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ ＮＪ）に送られる。アレイと光電子増倍管間に設置された好適なフィルターを用いて、シグナルをフィルターする。用いる蛍光色素の最大発光の波長は、Ｃｙ３では５６５ｎｍ、Ｃｙ５では６５０ｎｍである。装置は両方の蛍光色素からのスペクトルを同時に記録し得るが、レーザ源において好適なフィルターを用いて、蛍光色素１つにつき１度スキャンし、各アレイを通常２度スキャンする。
【０３０５】
スキャンの感度は通常、既知濃度のサンプル混合体に添加されるｃＤＮＡ対照種により生成されるシグナル強度を用いて較正する。アレイ上の特定の位置には相補的ＤＮＡ配列が含まれ、その位置におけるシグナルの強度を重量比１：１００，０００でハイブリダイゼーション種と相関させる。異なる源泉（例えば試験される細胞及び対照細胞など）からの２つのサンプルを、各々異なる蛍光色素で標識し、他と異なって発現した遺伝子を同定するために単一のアレイにハイブリダイズする場合には、２つの蛍光色素で較正するｃＤＮＡのサンプルを標識し、ハイブリダイゼーション混合液に各々等量を加えることによって較正を行う。
【０３０６】
光電子増倍管の出力は、ＩＢＭ互換性ＰＣコンピュータにインストールされた１２ビットＲＴＩ−８３５Ｈアナログ−ディジタル（Ａ／Ｄ）変換ボード（Ａｎａｌｏｇ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｏｒｗｏｏｄ ＭＡ）を用いてディジタル化される。ディジタル化されたデータは、青色（低シグナル）から赤色（高シグナル）までの擬似カラー範囲への直線的２０色変換を用いてシグナル強度がマッピングされたようなイメージとして表示される。データは、定量的にも分析される。２つの異なる蛍光色素を同時に励起及び測定する場合には、各蛍光色素の発光スペクトルを用いて、データは先ず蛍光色素間の光学的クロストーク（発光スペクトルの重なりに起因する）を補正する。
【０３０７】
グリッドが蛍光シグナルイメージ上に重ねられ、それによって各スポットからのシグナルはグリッドの各エレメントに集められる。各エレメント内の蛍光シグナルは統合され、シグナルの平均強度に応じた数値が得られる。シグナル分析に用いるソフトウェアは、ＧＥＭＴＯＯＬＳ遺伝子発現分析プログラム（Ｉｎｃｙｔｅ）である。
【０３０８】
１１  相補的ポリヌクレオチド
ＯＸＲＤをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的な配列は、天然のＯＸＲＤの発現を低下させるため即ち阻害するために用いられる。約１５〜３０塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、これより小さな或いは大きな配列の断片の場合でも本質的に同じ方法を用いることができる。Ｏｌｉｇｏ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＯＸＲＤのコーディング配列を用いて、適切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最も独特な５’ 配列から相補的オリゴヌクレオチドを設計し、これを用いてプロモーターがコーディング配列に結合するのを阻害する。翻訳を阻害するためには、相補的なオリゴヌクレオチドを設計して、リボソームがＯＸＲＤをコードする転写物に結合するのを阻害する。
【０３０９】
１２  ＯＸＲＤの発現
ＯＸＲＤ の発現及び精製は、細菌若しくはウイルスを基にした発現系を用いて行うことができる。細菌でＯＸＲＤ  が発現するために、抗生物質耐性及びｃＤＮＡの転写レベルを高める誘導性のプロモーターを含む好適なベクターにｃＤＮＡをサブクローニングする。このようなプロモーターには、ｌａｃオペレーター調節因子に関連するＴ５またはＴ７バクテリオファージプロモーター及びｔｒｐ−ｌａｃ（ｔａｃ）ハイブリッドプロモーターが含まれるが、これらに限定するものではない。組換えベクターを、ＢＬ２１（ＤＥ３）等の好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性をもつ細菌が、イソプロピルβ−Ｄチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘発されるとＯＸＲＤ を発現する。真核細胞でのＯＸＲＤ の発現は、一般にバキュロウイスルスとして知られているＡｕｔｏｇｒａｐｈｉｃａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）を昆虫細胞株または哺乳動物細胞株に感染させて行う。バキュロウイルスの非必須の多角体遺伝子を、相同組換え或いは転移プラスミドの媒介を伴う細菌の媒介による遺伝子転移のどちらかによって、ＯＸＲＤ  をコードするｃＤＮＡと置換する。ウイルスの感染力は維持され、強い多角体プロモーターによって高いレベルのｃＤＮＡの転写が行われる。組換えバキュロウイルスは、多くの場合はＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）昆虫細胞に感染に用いられるが、ヒト肝細胞の感染にも用いられることもある。後者の感染の場合は、バキュロウイルスの更なる遺伝的変更が必要になる。（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ． Ｅ． Ｋ．他 （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：３２２４−３２２７、Ｓａｎｄｉｇ， Ｖ． 他 （１９９６） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：１９３７−１９４５．等を参照）。
【０３１０】
殆どの発現系では、ＯＸＲＤ  が、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、またはＦＬＡＧや６−Ｈｉｓなどのペプチドエピトープ標識で合成された融合タンパク質となるため、未精製の細胞溶解物からの組換え融合タンパク質の親和性ベースの精製が素早く１回で行うことができる。ＧＳＴは日本住血吸虫からの２６ｋＤａの酵素であり、タンパク質の活性及び抗原性を維持した状態で、固定化グルタチオン上で融合タンパク質の精製を可能とする（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。精製の後、ＧＳＴ部分を特定の操作部位でＯＸＲＤ  からタンパク分解的に切断できる。ＦＬＡＧは８アミノ酸のペプチドであり、市販されているモノクローナル及びポリクローナル抗ＦＬＡＧ抗体（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ）を用いて免疫親和性精製を可能にする。６ヒスチジン残基が連続して伸長した６−Ｈｉｓは、金属キレート樹脂（ＱＩＡＧＥＮ）上での精製を可能にする。タンパク質の発現及び精製の方法は、前出のＡｕｓｕｂｅｌ（１９９５）１０章、１６章に記載されている。これらの方法で精製したＯＸＲＤ  を直接用いて以下の実施例１６、１７および１８のアッセイを行うことができる。
【０３１１】
１３  機能的アッセイ
ＯＸＲＤ 機能は、哺乳動物細胞培養系において生理学的に高められたレベルでのＯＸＲＤ をコードする配列の発現によって評価する。 ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡを高いレベルで発現する強いプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターにサブクローニングする。選択ベクターには、ＰＣＭＶ ＳＰＯＲＴプラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＰＣＲ ３．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれ、どちらもサイトメガロウイルスプロモーターを有する。リポソーム製剤或いは電気穿孔法を用いて、５〜１０μｇの組換えベクターをヒト細胞株、例えば内皮由来または造血由来の細胞株に一過的に形質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む１〜２μｇのプラスミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入細胞と非形質移入細胞を区別する手段が与えられる。 また、標識タンパク質の発現によって、ｃＤＮＡの組換えベクターからの発現を正確に予想できる。標識タンパク質は、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ＣＤ６４またはＣＤ６４−ＧＦＰ融合タンパク質から選択できる。自動化された、レーザー光学に基づく技術であるフローサイトメトリー（ＦＣＭ）を用いて、ＧＦＰまたはＣＤ６４−ＧＦＰを発現する形質移入された細胞を同定し、その細胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。ＦＣＭは、細胞死に先行するか或いは同時に発生する現象を診断する蛍光分子の取込を検出して計量する。このような現象として挙げられるのは、プロピジウムヨウ化物によるＤＮＡ染色によって計測される核ＤＮＡ内容物の変化、前方光散乱と９０°側方光散乱によって計測される細胞サイズと顆粒状性の変化、ブロモデオキシウリジンの取込量の低下によって計測されるＤＮＡ合成の下方調節、特異抗体との反応性によって計測される細胞表面及び細胞内におけるタンパンク質の発現の変化、及び蛍光複合アネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形質膜組成の変化とがある。フローサイトメトリー法については、Ｏｒｍｅｒｏｄ， Ｍ． Ｇ． （１９９４） Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｏｘｆｏｒｄ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ．に記述がある。
【０３１２】
遺伝子発現におけるＯＸＲＤ の影響は、ＯＸＲＤ をコードする配列とＣＤ６４またはＣＤ６４−ＧＦＰのどちらかが形質移入された高度に精製された細胞集団を用いて評価することができる。ＣＤ６４またはＣＤ６４−ＧＦＰは、形質転換された細胞表面で発現し、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の保存領域と結合する。形質転換された細胞と形質転換されない細胞とは、ヒトＩｇＧかＣＤ６４に対する抗体のどちらかで被覆された磁気ビードを用いて分離することができる（ＤＹＮＡＬ． Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ． ＮＹ）。ｍＲＮＡは、当分野で周知の方法で細胞から精製することができる。ＯＸＲＤ および目的の他の遺伝子をコードするｍＲＮＡの発現は、ノーザン分析やマイクロアレイ技術で分析することができる。
【０３１３】
１４  ＯＸＲＤ に特異的な抗体の作製
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ；例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｍ．Ｇ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８１６−３０８８−４９５を参照）または他の精製技術で実質的に精製されたＯＸＲＤ を用いて、標準的なプロトコルでウサギを免疫化して抗体を作り出す。
【０３１４】
或いは、レーザＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いてＯＸＲＤ アミノ酸配列を解析し、免疫原性の高い領域を決定する。 そして対応するオリゴペプチドを合成し、このオリゴペプチドを用いて当業者によく知られている方法で抗体を生成する。 適切なエピトープ、例えばＣ末端付近或いは隣接する親水性領域にあるエピトープの選択については、当分野で公知である（前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９５， １１章等を参照）。
【０３１５】
通常は、長さ約１５残基のオリゴペプチドを、Ｆｍｏｃケミストリを用いるＡＢＩ ４３１Ａ ペプチドシンセサイザ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて合成し、Ｎ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）を用いた反応によってＫＬＨ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）に結合させて、免疫原性を高める（前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９５ 等を参照）。完全フロイントアジュバントにおいてオリゴペプチド−ＫＬＨ複合体を用いてウサギを免疫化する。例えば、ペプチドまたはＯＸＲＤ を基板に結合し、１％ＢＳＡを用いてブロッキング処理し、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギＩｇＧと反応させて、得られた抗血清の抗ペプチド活性及び抗ＯＸＲＤ 活性を検査する。
【０３１６】
１５  特異的抗体を用いる天然ＯＸＲＤ  の精製
天然ＯＸＲＤ 或いは組換えＯＸＲＤ を、ＯＸＲＤ に特異的な抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィにより実質的に精製する。イムノアフィニティーカラムは、ＣＮＢｒ−活性化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）のような活性化クロマトグラフィー用レジンと抗ＯＸＲＤ 抗体とを共有結合させることにより形成する。結合後に、製造者の使用説明書に従って樹脂をブロックし、洗浄する。
ＯＸＲＤ を含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、ＯＸＲＤ を優先的に吸着できる条件で（例えば、界面活性剤の存在下において高イオン強度のバッファーで）そのカラムを洗浄する。そのカラムを、抗体とＯＸＲＤ との結合を切るような条件で（例えば、ｐＨ２〜３のバッファー、或いは高濃度の尿素またはチオシアン酸塩イオンのようなカオトロピックイオンで）溶出させ、ＯＸＲＤ を回収する。
【０３１７】
１６  ＯＸＲＤと相互作用する分子の同定
ＯＸＲＤまたは生物学的に活性であるＯＸＲＤ断片を、１２５Ｉボルトンハンター試薬で標識する。（例えば Ｂｏｌｔｏｎ Ａ．Ｅ． および Ｗ．Ｍ． Ｈｕｎｔｅｒ （１９７３） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １３３：５２９−５３９を参照。）マルチウェルプレートに予め配列しておいた候補の分子を、標識したＯＸＲＤと共にインキュベートし、洗浄して、標識したＯＸＲＤ複合体を有する全てのウェルをアッセイする。様々なＯＸＲＤ  濃度で得られたデータを用いて、候補分子と結合したＯＸＲＤ  の数量及び親和性、会合についての値を計算する。
【０３１８】
別法では、ＯＸＲＤ と相互作用する分子を、Ｆｉｅｌｄｓ， Ｓ．およびＯ． Ｓｏｎｇ（１９８９， Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−２４６）に記載の酵母２−ハイブリッドシステム（ｙｅａｓｔ ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ）やＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）などの２−ハイブリッドシステムに基づいた市販のキットを用いて分析する。
【０３１９】
ＯＸＲＤ はまた、ハイスループットな方法で酵母２ハイブリッドシステムを使用するＰＡＴＨＣＡＬＬＩＮＧプロセス（ＣｕｒａＧｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ ＣＴ）に用いて、遺伝子の２大ライブラリにコードされる遺伝子間の全ての相互作用を決定することができる（Ｎａｎｄａｂａｌａｎ， Ｋ． ら （２０００） 米国特許第６，０５７，１０１号）。（２０００） 米国特許第６，０５７，１０１号｝。
【０３２０】
１７  ＯＸＲＤ 活性の実証
ＯＸＲＤ のアルド／ケト還元酵素活性は、ＮＡＤＰＨが消費されるにつれ３４０ｎｍにおける吸光度の減少に比例する（あるいは、例えば逆反応が観察される場合のようにＮＡＤＰＨが生成されるなら吸収度は増加する）標準的な反応混合液は、１３５ｍＭのリン酸ナトリウムバッファ（酵素によりｐＨ６．２〜７．２の範囲）、０．２ｍＭ ＮＡＤＰＨ、０．３Ｍ硫酸リチウム、０．５〜２．５μｇＯＸＲＤ 、および好適なレベルの基質を含む。この混合液を３０℃でインキュベートし、反応を分光光度計で連続的に測定する。ＯＸＲＤ 活性は、ＯＸＲＤ １μｇ当たり消費されるＮＡＤＰＨのモル数として計算される。
【０３２１】
ＯＸＲＤ のアルコールデヒドロゲナーゼ活性は、ＮＡＤ＋がＮＡＤＨに還元される時の３４０ｎｍにおける吸光度の増大に比例する。標準的な反応混合液は、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、および０．２５ｍＭ ＥＤＴＡである。反応液を２５℃でインキュベートし、分光光度計でモニタリングする。ＯＸＲＤ 活性は、ＯＸＲＤ １μｇ当たり生成されるＮＡＤＰＨのモル数として計算される。
【０３２２】
ＯＸＲＤ のアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性を、嫌気性電子伝達フラビンタンパク質（ＥＴＦ）アッセイを用いて測定する。反応混合液は、３２℃に前もって加熱した５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ８．０）、０５．％ グルコースと５０ μＭ アシルＣｏＡ基質（即ちイソバレリルＣｏＡ）から成る。混合液は、反復して真空に曝露することにより酸素をなくし、その後アルゴンガスで覆われる。ブドウ糖酸化酵素とカタラーゼの添加によって微量の酸素を除去し、最終濃度１ μＭのＥＴＦを追加する。この反応は、精製したＯＸＲＤ またはＯＸＲＤ を含むサンプルを加え、３４２ｎｍで反応を刺激することによって開始した。基質からＥＴＦへの電子の転移により引き起こされる蛍光の消光（クエンチング）が、４９６ ｎｍにおいて観察される。アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性の１ユニットを、１分間にＥＴＦ１ μｍｏｌを減少するために必要な ＯＸＲＤ の量として定義する（Ｒｅｉｎａｒｄ， Ｔ．他 （２０００） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ２７５−Ｊｕｌｙ−２０００ ａｓ ＭＳ Ｎｏ： Ｍ００４１７８２００）。
【０３２３】
ＯＸＲＤ のアルコールデヒドロゲナーゼ活性は、０．１ Ｍ リン酸カリウム （ｐＨ ７．５）、 ０．１ Ｍ グリシン（ｐＨ １０．０）および２．４ ｍＭ ＮＡＤ＋中、２５℃で３４０ｎｍ（ε３４０ ＝ ６．２２ ｍＭ−１ ｃｍ−１） におけるＮＡＤ＋ からＮＡＤＨへの変換を行って測定される。次に、基質（例えば、エタノール）とＯＸＲＤ を反応液に加える。ＮＡＤＨの生成は、３４０ ｎｍにおける吸光度の増加を生じる。そしてこれは、アルコール基質の酸化、ＯＸＲＤ サンプル中のアルコールデヒドロゲナーゼ活性の量と相関する（Ｓｖｅｎｓｓｏｎ， Ｓ． （１９９９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：２９７１２２９７１９）。
【０３２４】
ＯＸＲＤ のアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性は、ＯＸＲＤ の総デヒドロゲナーゼ活性＋加水分解酵素活性の決定し、加水分解酵素活性を引くことにより測定する。加水分解酵素活性を、例えば１０ＨＣＯＨＰｔｅＧｌｕ （１０ホルミルテトラヒドロ葉酸、ＨＰｔｅＧｌｕ， テトラヒド葉酸）または１０ＦＤＤＦ （１０ホルミル５，８ｄｉｄｅａｚａｆｏｌａｔｅ）等の０．０５ Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌ （ｐＨ ７．８）、１００ ｍＭ ２ＭＥ、０．５１８ １′Ｍ 基質を含む反応混合液で最初に決定する。約１μｇのＯＸＲＤ を最終容量１．０ ｍｌに追加する。反応をモニターして、酵素以外のすべての成分を含むブランク対照のキュベットに比較して測定する。５，８ｄｉｄｅａｚａｆｏｌａｔｅで１．８９ｘ１０４、ＨｐｔｅＧｌｕで２．１７ｘ１０４のモル吸光係数を用いて５，８ｄｉｄｅａｚａｆｏｌａｔｅに対しては２９５ ｎｍあるいはＨｐｔｅＧｌｕに対しては３００ ｎｍで生成物を測定する。反応混合液へのＮＡＤＰ＋の添加により、デヒドロゲナーゼ活性と加水分解酵素活性の両者の測定が可能となる（アッセイはすでに記載されたように実施する）。ＮＡＤＰ＋の存在下での生成物の生成と補助因子の不存在下での生成物の生成に基づき、ＯＸＲＤのアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を計算する。別法では、プロパナールを基質として用いてアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性をアッセイする。反応混合液は、１ ｍｌ の総量に６０ ｍＭ ピロリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ ８．５） ５ ｍＭ プロパナール、１ ｍＭ ＮＡＤＰ＋、およびＯＸＲＤ を含む。ＮＡＤＰＨの生成による３４０ ｎｍにおける吸光度の増加により、活性を決定する。これはサンプル中のアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性と比例する（ Ｋｒｕｐｅｎｋｏ． Ｓ．Ａ．他． （１９９５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：５１９５２２）。
【０３２５】
ＯＸＲＤ の６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ活性を、１２０ ｍＭトリエタノールアミン（ｐＨ ７．５）、０．１ ｍＭ ＥＤＴＡ、 ０．５ ｍＭ ＮＡＤＰ＋、１０〜１５０ μＭの ６−ホスホグルコン酸の基質を含む溶液に精製したＯＸＲＤ またはＯＸＲＤ から成る組成物を２０〜２５℃でインキュベートして測定する。ＮＡＤＰＨの生成を蛍光的に測定し（３４０ ｎｍ 励起、４５０ ｎｍ 発光）、それは６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ活性を意味する。あるいは、ＮＡＤＰＨの生成物を吸光度３４０ ｎｍに基づいて光度測定する。反応で生成したＮＡＤＰＨのモル量は、サンプル中の６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ活性に比例する（Ｔｅｔａｕｄ， Ｅ 他 （１９９９） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３３８：５５−６０）。
【０３２６】
ＯＸＲＤ のリボヌクレオチドニリン酸還元酵素活性は、ジチオスレイトールと共に精製したＯＸＲＤ またはＯＸＲＤ から成る組成物、Ｍｇ＋＋、ＡＤＰ、ＧＤＰ、ＣＤＰ、およびＵＤＰの基質をインキュベートすることにより決定する。対応するデオキシリボヌクレオチドである反応の生成物は、薄層クロマトグラフィにより基質から分離される。反応生成物は、移動速度に基づいて反応物質から区別することが可能である。放射標識した基質の使用は、アッセイの感度を高めるための代替である。反応で生成したデオキシリボヌクレオチドの量は、サンプル中のリボヌクレオチドニリン酸還元酵素の活性量に比例する（酵素は生成物により負のフィードバック阻害されるので、リボヌクレオチドニリン酸還元酵素活性が定常状態に至る以前のみにあてはまることに注意）（Ｎｕｔｔｅｒ， Ｌ．Ｍ． 及びＹ．−Ｃ． Ｃｈｅｎｇ （１９８４） Ｐｈａｒｍａｃ． Ｔｈｅｒ． ２６：１９１−２０７）。
【０３２７】
ＯＸＲＤ のジヒドロジオールアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性は、限定するわけではないが（±）−トランス−ナフタリン−１，２−ジヒドロジオール、（±）−トランス−フェナントレン−１，２−ジヒドロジオール、（±）−トランス−クリセン−１，２−ジヒドロジオールを含むグループから選択したトランス−ジヒドロジオールの基質、５０ ｍＭグリシン（ｐＨ ９．０）、２．３ ｍＭ ＮＡＤＰ＋、８％ ＤＭＳＯから成る反応混合液において精製したＯＸＲＤ またはＯＸＲＤ から成る組成物をインキュベートして測定する。酸化反応をＮＡＤＰＨの形成を検出するために３４０ ｎｍにおいてモニターする。それは基質の酸化を示す。反応成分の立体化学を決定するために、またＯＸＲＤ により酸化するラセミ酸基質成分の光学異性体を決定するために円偏光二色性によりＯＸＲＤ の添加前後に、反応混合液を分析することもできる（Ｐｅｎｎｉｎｇ， Ｔ．Ｍ． （１９９３） Ｃｈｅｍｉｃｏ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ８９：１−３４）。
【０３２８】
多くのグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の共通基質である１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＣＤＮＢ）とＧＳＨとの抱合を触媒するＯＸＲＤ 活性測定により、ＯＸＲＤ のＧＳＴ活性を決定する。ＯＸＲＤ を０．１Ｍリン酸カリウムバッファ（ｐＨ ６．５）中で、１ ｍＭ ＣＤＮＢと２．５ ｍＭ ＧＳＨで共に２５℃でインキュベートする。紫外線分光光度計を用いて３４０ ｎｍにおいて抱合反応を吸光度の変化により測定する。ＯＸＲＤ 活性は、３４０ ｎｍでの吸光度の変化に比例する。
【０３２９】
ＯＸＲＤ の１５−オキソプロスタグランジン １３−還元酵素（ＰＧＲ）活性は、純粋でない１５−ＰＧＤＨ活性をＤＥＡＥクロマトグラフィにより分離した後に測定する。ＰＧＲを含む分画の分離（あるいは精製したＯＸＲＤの使用）後に、０．１ Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ ７．４）、１ ｍＭ ２−メルカプトエタノール、２０ μｇ基質（例えばプロスタグランジンＰＧＥ１、ＰＧＥ２、ＰＧＥ２αの１５−オキソ誘導体）と１ ｍＭ ＮＡＤＨ （あるいはより高濃度のＮＡＤＰＨ）から成る反応液で活性をアッセイする。ＯＸＲＤ を反応液に添加する。そして３７℃で１０分インキュベートする。この反応は０．２５ ｍｌ ２ Ｎ ＮａＯＨを加えて止める。サンプル中に残る１５−オキソ化合物の量は、停止した反応の５００ ｎｍでの最大吸光度の測定により決定する。そしてこの値を、ＯＸＲＤを入れなかった停止したコントロール反応液の測定値と比較する。１ユニットの酵素は、１分間に１μｍｏｌの基質の酸化を触媒するために必要な量と定義されており、サンプル中のＰＧＲ活性量に比例する。
【０３３０】
ＯＸＲＤ 発現ベクターで形質転換した大腸菌を、唯一の炭素源と窒素源としてコリンを含む培地で増殖させることにより、ＯＸＲＤ のコリンデヒドロゲナーゼ活性を同定する。形質転換したバクテリアの成長能力は、コリンデヒドロゲナーゼ活性を示す（Ｍａｇｎｅ Ｏｓｔｅｒａｓ， Ｍ． （１９９８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９５：１１３９４１１３９９）。
【０３３１】
１８  ＯＸＲＤインヒビターの同定
実施例１７のアッセイで説明したように、検査されるべき化合物を、好適なバッファーおよび基質と共に様々な濃度でマルチウェルプレートのウェルに注入する。ＯＸＲＤ  活性はそれぞれのウェルについて測定し、ＯＸＲＤ 活性を阻害するそれぞれの化合物の能力および用量反応動態（ｄｏｓｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を決定することができる。ＯＸＲＤ  活性を促進する分子の同定にも、このアッセイを用いることができる。
【０３３２】
当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本発明に記載した方法及びシステムの種々の改変を行い得る。本発明について説明するにあたり特定の好適実施例に関連して説明を行ったが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学または関連分野の専門家には明らかな、本明細書に記載されている本発明の実施方法の様々な改変は、特許請求の範囲内にあるものとする。
【０３３３】
（表の簡単な説明）
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の命名法の概略を示す。
表２は、ＧｅｎＢａｎｋ識別番号及び本発明のポリペプチドに最も近いＧｅｎＢａｎｋ相同体の注釈を示す。各ポリペプチドとそのＧｅｎＢａｎｋ相同体が一致する確率スコアも併せて示す。
【０３３４】
表３は、予測されるモチーフ及びドメインを含む本発明のポリヌクレオチド配列の構造的特徴を、ポリペプチドの分析に用いるための方法、アルゴリズム及び検索可能なデータベースと共に示す。
【０３３５】
表４は、本発明のポリヌクレオチド配列を構築するために用いたｃＤＮＡやゲノムＤＮＡ断片を、ポリヌクレオチド配列の選択した断片と共に示す。
【０３３６】
表５は、本発明のポリヌクレオチドの代表的なｃＤＮＡライブラリを示す。
【０３３７】
表６は、表５に示したｃＤＮＡライブラリの作製に用いた組織及びベクターを説明する付表である。
【０３３８】
表７は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの分析に用いたツール、プログラム、アルゴリズムを、適用可能な説明、引用文献及び閾値パラメータと共に示す。
【表１】
2005501507.tif 000007
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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