(57)【要約】本発明はアクリル酸及び／又はメタクリル酸単位  ２０〜６５質量％及び（メタ）アクリル酸のＣ１−〜Ｃ１８−アルキルエステルの単位  ８０〜３５質量％から構成される（メタ）アクリレートコポリマーであるｐＨ−感受性ポリマーに関するものであり、前記ポリマーは、１ ０００〜５０ ０００g/molの範囲内の分子量を有し、かつヒト赤血球を用いる細胞毒性試験において１５０μｇ／ｍｌの濃度で、ｐＨ ５．５で少なくとも６０％の溶血、及びｐＨ ７．４で５％未満の溶血を引き起こす。本発明はさらに、薬剤学的に有効な生分子又は活性薬剤学的成分のための担体として及び相応する投与形の成分としてのｐＨ−感受性ポリマーの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
メタクリル酸単位  ２０〜６５質量％及び
（メタ）アクリル酸のＣ１−〜Ｃ１８−アルキルエステルの単位  ８０〜３５質量％
から構成される（メタ）アクリレートコポリマーであるｐＨ−感受性ポリマーにおいて、
１ ０００〜５０ ０００g/molの範囲内の分子量を有し、
かつヒト赤血球を用いる細胞毒性試験において１５０μｇ／ｍｌの濃度で、ｐＨ ５．５で少なくとも６０％の溶血及びｐＨ ７．４で５％未満の溶血を引き起こす
ことを特徴とする、ｐＨ−感受性ポリマー。
【請求項２】
メタクリル酸単位  ４０〜６０質量％及び
アクリル酸エチル単位  ６０〜４０質量％
から構成される（メタ）アクリレートコポリマーである、請求項１記載のｐＨ−感受性ポリマー。
【請求項３】
メタクリル酸単位  ２０〜４０質量％及び
アクリル酸メチル単位  ２５〜４５質量％、
アクリル酸エチル単位  ２５〜４５質量％
から構成される（メタ）アクリレートコポリマーである、請求項１記載のｐＨ−感受性ポリマー。
【請求項４】
メタクリル酸単位  ４０〜６０質量％、
アクリル酸エチル単位  ６０〜３０質量％及び
ブチルメタクリレート  ２〜２０質量％
から構成される（メタ）アクリレートコポリマーである、請求項１記載のｐＨ−感受性ポリマー。
【請求項５】
メタクリル酸単位  ４０〜６０質量％、
アクリル酸エチル単位  ６０〜４０質量％及び
アクリル酸又はメタクリル酸のＣ８−〜Ｃ１６−アルキルエステル単位  ０．１〜２質量％から構成される（メタ）アクリレートコポリマーである、請求項１記載のｐＨ−感受性ポリマー。
【請求項６】
０．０３１２５ｍｇ／ｍｌの濃度で、マウスマクロファージ様の細胞タイプJ774A.1(ATCC TI3-67)を用いるＭＴＴ試験において、対照実験における１００％生存率に対して少なくとも２５％の細胞生存の百分率の値を生じさせる、請求項１から５までのいずれか１項記載のｐＨ−感受性ポリマー。
【請求項７】
０．０３１２５ｍｇ／ｍｌの濃度で、マウスマクロファージ様の細胞タイプJ774A.1(ATCC TIB-67)を用いるＬＤＨ試験において、対照実験における１００％細胞崩壊（毒性）に対して４０％以下のＬＤＨ放出−値を生じさせる、請求項１から５までのいずれか１項記載のｐＨ−感受性ポリマー。
【請求項８】
薬剤学的に有効な天然又は合成の生分子又は活性薬剤学的成分との複合体又は錯体の形である、請求項１から７までのいずれか１項記載のｐＨ−感受性ポリマー。
【請求項９】
配座−変更剤に結合されている、請求項１から７までのいずれか１項記載のｐＨ−感受性ポリマー。
【請求項１０】
化学変性後に核酸を介して架橋される錯体の成分である、請求項１から７までのいずれか１項記載のｐＨ−感受性ポリマー。
【請求項１１】
ブロック、ビード又は乳化重合、基移動重合（ＧＴＰ）、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）及びポリマーの排出により重合開始剤及び分子量調節剤の存在でのモノマーのフリー−ラジカル重合による請求項１から１０までのいずれか１項記載のｐＨ−感受性ポリマーを製造する方法において、ポリマーを溶解させ、精製し、ついで乾燥させることを特徴とする、ｐＨ−感受性ポリマーの製造方法。
【請求項１２】
ドデシルメルカプタン及び／又は２−エチルヘキシルチオグリコレートを分子量調節剤として使用する、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
天然又は合成の生分子又は活性薬剤学的成分を有する担体、複合体又は錯体として、適切な場合にはミクロ粒子、ナノ粒子、リポソーム、エマルジョン及び／又は脂質小胞体の成分としての、請求項１から１０までのいずれか１項記載のｐＨ−感受性ポリマーの使用。
【請求項１４】
脂質、タンパク質、ペプチド、核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）、特にオリゴヌクレオチド、ヌクレオシド、アンチセンスＤＮＡ又はアンチセンスＲＮＡ、ヌクレオチド、毒素、免疫毒素複合体、抗体又は抗体のフラグメント又はその組合せ物と組み合わされる担体、複合体又は錯体としての、請求項１３記載の使用。
【請求項１５】
鎮痛薬、抗アレルギー薬、抗リウマチ薬、抗生物質、抗感染薬、抗パーキンソン病薬、抗乾癬薬、抗ガン剤、皮膚用薬、痛風治療薬、免疫調整薬、胃腸薬、神経親和性剤、眼科用薬、細胞増殖抑制剤の活性成分のクラスからの活性薬剤学的成分と組み合わされる担体、複合体又は錯体としての、請求項１３記載の使用。
【請求項１６】
皮膚、経皮、腸管外、鼻、肺、膣又は経口の投与形の成分としての、請求項１から１０までのいずれか１項記載のｐＨ−感受性ポリマーの使用。
【請求項１７】
ガン、感染（ＨＩＶを含めて）、心臓血管性障害（例えば動脈硬化症）、関節炎、神経変質性障害（パーキンソン症候群、多発性硬化症、アルツハイマー病）、遺伝関連性酵素欠損性障害、Ｂ及びＣ型肝炎、膵臓線維症、高コレステロール血症、ダウン症候群、筋ジストロフィー、自己免疫疾患、帯状疱疹及びヘルペス、乾癬、ＣＭＶ網膜炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、糖尿病の治療のための薬剤形における、請求項１６記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、６．５未満のｐＨ値で細胞毒性又は膜溶解性を有し、かつ天然又は合成の生分子又は活性薬剤学的成分のための担体として使用されることができるｐＨ−感受性ポリマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
刺激に応答するポリマーは近年重要性が増大している。相応するポリマーは、化学的又は物理的な作用、例えば２〜３だけを挙げると、温度、溶剤又はｐＨに暴露した後に修正された性質を示す。この点についてｐＨ−感受性ポリマーに特に関心がある。ゆえに、例えば、高いｐＨで親水性のコイル構造を形成するカルボキシル基含有のポリマーは低いｐＨ値で疎水性の小球状構造へ変換されうる（例えば、（１）参照）。
【０００３】
医薬物質の投与に関連して、ｐＨ−感受性ポリマーに研究が集中している。多くの生理学的及び病理学的な過程、例えばエンドサイトーシス、腫瘍成長及び炎症はｐＨ条件の変化に付随される。医薬物質の投与に関連して調査されているｐＨ−感受性ポリマーの例は、例えば、α−アルキルアクリル酸、例えばポリ（２−エチルアクリル酸）及びポリ（プロピルアクリル酸）（２参照）、ポリ（アミドアミン）（３、４参照）及びポリ（エチレンイミン）、ポリ（Ｌ−リシンイソフタルアミド）（（５）参照）である。ｐＨシフトにより誘導される配座の変化はポリマー及び細胞膜の相互作用に影響を及ぼすので、不安定化が起こりうる。多数の天然又は合成の生分子との、輸送するための手段としての錯体又は複合体のｐＨ−感受性ポリマーを使用することが可能である。それらは、脂質（６、７、８、１４参照）、タンパク質及びペプチド（９、１０参照）、ＤＮＡ（４、１１）、免疫毒素複合体（１２）、抗体（１３）及び／又は活性成分（３）と、錯化されることができるか又は複合体化されることができる。
上記で引用された文献のリスト
1. M. Watanabe, Y. Kosaka, K. Sanui, N. Ogata, K. Ogushi及びT. Yoden. On the mechanism of polyelectrolyte-induced structural reorganization in thin molecular films. Macromolecules, 20: 454-456 (1987)。
2. N. Murthy, J.R. Robichaud, D.A. Tirrell, P.S. Stayton及びS. Hoffmann. The design and synthesis of polymers for eukaryotic membrane disruption. J. Controlled Release, 61: 137-143 (1999)。
3. R. Duncan, P. Ferruti, D. Sgouras, A. Tuboku-Metzger, E. Ranucci及びF. Bignotti. A polymer-Triton X-100 conjugate capable of pH-dependent red blood cell lysis: A model system illustrating the possibility of drug delivery within acidic intracellular compartments. J. Drug Targeting, 2: 341-347 (1994)。
4. S.C. Richardson, N.G. Pattrick, Y.K. Stella Man, P. Ferruti及びR. Duncan. Poly(amidoamine)s as potential nonviral vectors: ability to form interpolyelectrolyte complexes and to mediate transfection in vitro. Biomacromolecules, in press (2001)。
5. M.E. Eccleston, M. Kuiper, F.M. Gilchrist及びN.K.H. Slater. pH-responsive pseudo-peptides for cell membrane disruption. J. Controlled Release, 69: 297-307 (2000)。
6. T. Chen, L.S. Choi, S. Einstein, M.A. Klippenstein, P. Scherrer及びP.R. Cullis. Proton-induced permeability and fusion of large unilamellar vesicles by covalently conjugated poly(2-ethylacrylic acid). J. Liposome Res., 9: 387-405 (1999)。
7. J.L. Thomas及びD.A. Tirrell. Polyelectrolyte-sensitized phospholipid vesicles. Acc. Chem. Res., 35: 336-342 (1992)。
8. X. Guo及びF.C. Szoka Jr. Steric stabilization of fusogenic liposomes by a low-pH sensitive PEG-diortho ester-lipid conjugate. Bioconjugate Chem., 12: 291-300 (2001)。
9. C.A. Lackey, N. Murthy, O.W. Press, D.A. Tirrell, A.S. Hoffmann及びP.S. Stayton. Hemolytic activity of pH-responsive polymer-streptavidin bioconjugates. Bioconjugate Chem., 10: 401-405 (1999)。
10. V. Bulmus, Z. Ding, C.J. Long, P.S. Stayton及びA.S. Hoffman. Site-specific polymer-streptavidin bioconjugate for pH-controlled binding and triggered release of biotin. Bioconjugate Chem., 11: 78-83 (2000)。
11. P.S. Stayton, N. Murthy, C. Lackey, C. Cheung, R. To, O. Press及びA.S. Hoffman. Bioinspired polymers designed to enhance intracellular delivery of biotherapeutics. Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., 27: 7330 (2000)。
12. C.A. Lackey, N. Murthy, P.S. Stayton, O.W. Press, A.S. Hoffman及びD.A. Tirrell. Enhancement of endosomal release and toxic activity of ricin A chain by a pH-sensitive polymer. Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., 26: 815-816 (1999)。
13. C.A. Lackey, O.W. Press, A.S. Hoffman及びP.S. Stayton. pH-sensitive polymer-protein complexes for control of intracellular trafficking of biomolecular therapeutics. Polym. Mater. Sci. Eng., 84 (2001)。
14. K.M. Eum, K.H. Langley及びD.A. Tirrell. Quasi-elastic and electrophoretic light scattering studies of the reorganization of dioleoylphosphatidylcholine vesicle membranes by poly(2-ethylacrylic acid). Macromolecules, 22: 2755-2760. (1989) 。
【０００４】
WO 97/09068には、相互作用する分子複合体が記載されている。これらは特に、刺激に応答しかつ細胞のターゲット領域に結合する能力を有する分子であり、その際に刺激はそしてまた結合能力に影響を及ぼす。刺激は温度、ｐＨ、特にイオン又はイオン強度、電場又は溶剤により与えられうる。
【０００５】
刺激に応答する分子は、例えば、リガンド、例えば抗原、抗体又は活性薬剤学的成分に結合する分子と組み合わされるｐＨ−感受性ポリマーであってよい。分子複合体は、変更された環境条件に、例えば細胞外体液の近辺で、例えば血流中でｐＨ ７．０を上回る値から、例えばエンドサイトーシスによる生きている細胞中への取り込みに付随されるｐＨ ６．５未満の値へのｐＨの変更に応答することができる。
【０００６】
一般的に挙げられたポリマーはフリーラジカル重合を受けており、かつ１ ０００〜３０ ０００の範囲内の分子量を有するビニル型のモノマーを基礎としている。反応性側基、例えば−ＯＨ、−ＣＯＯＨ又は好ましくは−ＮＨ２を有するポリマーは、タンパク質又はペプチドを結合させるために提案される。
【０００７】
メタクリル酸単位及びコモノマー、例えば（メタ）アクリル酸のＣ１−〜Ｃ１２−アルキルエステルから構成される（メタ）アクリレートコポリマーは、原則として公知であり、かつ特に薬剤形のためのコーティング剤及びバインダーとして使用される。
【０００８】
公知の例は、メタクリル酸５０質量％及びメタクリル酸メチル５０質量％(EUDRAGIT（Ｒ） L)、メタクリル酸５０質量％及びアクリル酸エチル５０質量％(EUDRAGIT（Ｒ） L100-55)、メタクリル酸３０質量％及びメタクリル酸メチル７０質量％(EUDRAGIT（Ｒ） S)から構成されるコポリマーである。商業的に入手可能なコポリマーは約２００ ０００g/molの近辺の分子量を有する。
【０００９】
US 2001/0007666 A1には、細胞、細胞区画又は脂質膜の間で、細胞膜を通しての物質の輸送又は放出を増大させるのに使用される組成物が記載されている。組成物はとりわけｐＨ−感受性ポリマーであってよい膜輸送剤及び膜輸送剤の効率を増大させるための物理的な手段、例えば超音波処理からなる。特に適しているｐＨ−感受性ポリマーはカルボキシル基含有ポリマー、例えばカルボキシル基を有するモノマー残基を５０％を上回り含有するポリマーである。挙げられた特別な例は６２ ０００の平均分子量を有するポリ（２−エチルアクリル酸）である。アクリル酸とエチル、プロピル及びブチルアクリレートとの５０：５０コポリマーも記載されている。製造はＡＩＢＮ開始剤の存在での塊状重合によることが述べられている。分子量調節剤は挙げられていない。コポリマーはエーテル沈殿によりさらに精製されるので、分子量が高いことが想定されるべきである。数μｇの低い濃度でさえ、コポリマーはｐＨ ５．５で広範囲に亘って及び少なくとも、ｐＨ ７．４でより少ない範囲で赤血球を溶解させる。
課題及び解決
生分子又は活性薬剤学的成分を細胞質へ、及びそこから場合によりエンドソームを経て細胞核へ導入することは、物質がリソソームへの通行（に進入すること）を防止する膜−不安定化（膜−破壊）剤を必要とし、そこでそれらは化学的に分解されうるか又は不活性化されうる。それゆえ興味深いポリマーは、エンドソーム中で優勢であるような、ｐＨ ６．５周辺又は未満の僅かに酸性のｐＨ値で細胞膜の不安定化（破壊）をまねくが、しかし細胞の外側で生じるような、ｐＨ ７．４周辺の生理学的なｐＨ値で実質的に膜溶解効果が欠けている（を有しない）。
【００１０】
US 2001/0007666 A1のアクリル酸／アルキルアクリレートコポリマーは極端に低い濃度でさえ細胞崩壊をまねきうるという欠点を有する。このことは、その用量を危機的にする。付加的な欠点は、一部の溶血がｐＨ ７．４でさえ生じうるので、記載されたコポリマーは全体として制御するのが困難であり、かつ、それらが極端に少ない量で使用される場合には、生分子又は活性薬剤学的成分での低い負荷のみが可能になることである。付加的な欠点は、腸管外の投与に続いて、それらが体内へ蓄積するかもしれないことである。ポリマーの分子量が高すぎる場合に、例えば６２，０００、糸球体濾過による排泄が防止される。
【００１１】
それゆえ、特に細胞タイプにおける、特異的にそれらの効果を示すことをねらった薬剤形の開発に関連して、適しているポリマー担体分子への連続的な需要が存在する。目的は高濃度でのみ細胞毒性又は膜溶解性を示すか又はｐＨ ７．０近辺又は僅かにより高いｐＨで少しも示さないが、しかしｐＨ ６．５未満で生体内での低い濃度でさえ細胞毒性効果、又は溶血効果又は膜溶解効果を有するｐＨ−感受性ポリマーを開発することであった。ポリマーは、エンドソーム中への取り込み及びその後のその不安定化又は溶解を介して細胞の内側へ放出されることになる天然又は合成の生分子又は活性薬剤学的成分のための担体（錯体及び複合体）として適していることが意図される。
【００１２】
さらに物質の腸管外の適用において排除の問題はヒト又は動物体内の蓄積、ひいてはそれゆえ毒性の副作用を回避するために考慮されなければならない。
【００１３】
それゆえ、例えば２０〜１５０μｇ／ｍｌの範囲内の濃度で容易に適用されることができ、かつ良好に装入可能であり、ひいては天然又は合成の起源の生分子のための担体（錯体及び複合体）として適しているｐＨ−感受性ポリマーが提供されるべきである。それらは濃度のこの範囲内で及びｐＨ ５．５及びｐＨ ６．５未満の範囲内で良好な溶血性を示すのに対して、ｐＨ ７．４で膜溶解の（溶血の）効果が存在しないべきである。さらにそれらは毒性になるか又は抑制していることによるマクロファージ細胞タイプに対して有効であるべきではない。ポリマーは腎臓を経て十分に排除され、ひいては腸管外の適用のためにも適しているべきである。
【００１４】
この課題は、
メタクリル酸単位  ２０〜６５質量％、２５〜６５質量％及び
（メタ）アクリル酸のＣ１−〜Ｃ１８−アルキルエステルの単位  ８０〜３５質量％、７５〜３５質量％
から構成される（メタ）アクリル酸コポリマーであるｐＨ−感受性ポリマーにより解決され、
前記ポリマーは１ ０００〜５０ ０００g/molの範囲内の分子量を有し、
かつヒト赤血球を用いる細胞毒性試験において１５０μｇ／ｍｌの濃度で、ｐＨ ５．５で少なくとも６０％の溶血及びｐＨ ７．４で５％未満の溶血を引き起こす
ことにより特徴付けられる。
【００１５】
ポリ（メタ）アクリレートが−他の薬剤学的に使用されるポリマーと対比して−生物学的に分解可能ではないので、排除は腎臓を経ての糸球体濾過により行われなければならない。しかしながらこのプロセスは分子量に関連して制限されている。腎臓を経て分泌されることができる分子の上限は５０，０００g/mol（ダルトン）で取り入れられる。意外にも本発明による低分子量を有するポリマーは、より高い分子量を有するものよりも高い溶血活性を示す。
発明の具現
（メタ）アクリレートコポリマー
本発明は
特にｐＨ ６．５未満のｐＨ値で膜溶解性、溶血性又は細胞毒性を有するｐＨ−感受性ポリマーに関するものであり、前記ポリマーは
メタクリル酸単位  ２０〜６５質量％及び
（メタ）アクリル酸のＣ１−〜Ｃ１８−アルキルエステルの単位  ８０〜３５質量％
から構成される（メタ）アクリレートコポリマーであり、
（メタ）アクリル酸のＣ１−〜Ｃ１８−アルキルエステル、特に（メタ）アクリル酸の線状又は分枝鎖状のＣ１−〜Ｃ１８−アルキルエステルは、例えば次のものである：
アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、ビニルアクリレート、プロピルアクリレート、ブチルアクリレート、ヘキシルアクリレート、オクチルアクリレート、デシルアクリレート、ドデシルアクリレート、ミリスチルアクリレート、ラウリルアクリレート、セチルアクリレート、ステアリルアクリレート、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、プロピルメタクリレート、ブチルメタクリレート、イソブチルメタクリレート、ヘキシルメタクリレート、２−エチルヘキシル−（メタ）アクリレート、フェニルメタクリレート、オクチルメタクリレート、デシルメタクリレート、ドデシルメタクリレート、ミリスチルメタクリレート、ラウリルメタクリレート、セチルメタクリレート、ステアリルメタクリレート。
【００１６】
エステル成分は、分枝鎖状又は環状であってよい。
【００１７】
アクリル酸又はメタクリル酸のＣ１−〜Ｃ８−アルキルエステル、特にメタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、ブチルメタクリレート、２−エチルヘキシルメタクリレート、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、ブチルアクリレート及び２−エチルヘキシルアクリレートが好ましい。
【００１８】
通例、述べられた含量は合計１００質量％になる。しかしながら、これが必ずしも本質的な性質の損傷又は変更をまねくことなく、必ずしも（メタ）アクリレートではない、他のビニル系共重合性モノマー０〜１０質量％、例えば０．１〜５質量％又は２．５質量％以下の範囲内の少量について、例えばブチルアクリレート、ブチルメタクリレート、アクリル酸メチル、ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、メタクリルアミド又はスチレンも存在することが可能である。架橋モノマーは通例存在しない。
（メタ）アクリレートコポリマー変型
本発明のために適しており、かつ好ましいのは、次のものから構成される（メタ） アクリレートコポリマーである：
メタクリル酸単位４０〜６０質量％、特に４５〜５５質量％、例えば５０質量％及びエチルアクリレート単位６０〜４０質量％、特に５５〜４５質量％、例えば５０質量％(EUDRAGIT（Ｒ） L100-55タイプ)。
メタクリル酸単位４０〜６０質量％、特に４５〜５５質量％、例えば５０質量％及びエチルアクリレート単位６０〜３０質量％、特に４５〜３５質量％、例えば５０質量％及びブチルメタクリレート２〜２０質量％、例えば１０質量％。
メタクリル酸単位４０〜６０質量％、特に４５〜５５質量％、例えば５０質量％及びアクリル酸エチル単位６０〜４０質量％、特に５５〜４５質量％、例えば５０質量％及びアクリル酸又はメタクリル酸のＣ８−〜Ｃ１６、好ましくはＣ８〜Ｃ１２−アルキルエステル、好ましくはドデシルメタクリレート０．１〜２質量％。前記コポリマーは好ましくはドデシルメルカプタン５〜１５質量％又は２−エチルヘキシルチオグリコレート２〜１０質量％の存在で製造されることができ、従ってその性質は変化する。
【００１９】
メタクリル酸単位２０〜４０質量％、特に２５〜３５質量％、例えば３０質量％、メタクリル酸メチル単位２５〜４５質量％、特に３０〜４０質量％、例えば３５質量％、アクリル酸エチル単位２５〜４５質量％、特に３０〜４０質量％、例えば３５質量％。
【００２０】
通例、述べられた含量は合計１００質量％になる。しかしながら、これは必ずしも本質的な性質の損傷又は変更をまねくことなく、必ずしも（メタ）アクリレートではない、他のビニル系共重合性モノマー０〜１０質量％、例えば０．１〜５質量％又は２．５質量％以下の範囲内の少量について存在することが可能でもある。例えば、ブチルアクリレート、ブチルメタクリレート、アクリル酸メチル、ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、メタクリルアミド又はスチレンが挙げられうる。
分子量
分子量は例えば粘度測定法又はゲル排除クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により決定されることができる。
【００２１】
粘度法による値（極限粘度数）は、クロロホルム中又はＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）中２３℃で決定されることができ、かつ好ましくはｎｓｐｅｃ／ｃ（ｃｍ３／ｇ） １〜２５、好ましくは１０〜２０の範囲内であるべきである。粘度数は、例えばISO 1628-6に述べられたように測定されることができる。本発明による分子量は、溶剤としてＤＭＦで修正された、DIN 1628-6による粘度測定法により決定されるべきである。粘度数はポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）−標準を用いる分子量（質量平均、Ｍｗ）に相関される。（メタ）アクリレートコポリマーの分子量（質量平均）は１ ０００〜５０ ０００g/molの範囲内、好ましくは５ ０００〜４０ ０００g/molの範囲内、特に１０ ０００〜３０ ０００の範囲内又は最も好ましくは１５ ０００〜２５ ０００の範囲内である。
【００２２】
次の表は、一般式ＶＺ＝４．９７６ １０−３×Ｍｗ０．７９６による粘度値（ＶＺ）から計算された分子量に対する指標として使用されることができる：
【００２３】
【表１】
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溶血効果
溶血活性（溶血）が５％を上回る場合に、細胞毒性効果があると言われる。溶血活性は、ｐＨ ７．４で５％未満であるべきであり、かつｐＨ ５．５で高くかつ、例えば、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％又は少なくとも６０％であるべきである。この効果が１×１０８ＲＢＣ／ｍｌの赤血球濃度に対して、１ｍｌ当たりコポリマー２０〜３００、好ましくは５０〜２５０、特に１００〜２００μｇの容易に投薬されるコポリマー濃度で到達される場合に有益である。
【００２４】
１ｍｌ当たりコポリマー１０〜１５０、好ましくは１５〜１１０、特に２０〜８０μｇのコポリマー濃度が最も好ましい。
【００２５】
ヒト赤血球を用いる細胞毒性試験において、１５０μｇ／ｍｌの濃度での（メタ）アクリル酸コポリマーはｐＨ ５．５で少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８０％の溶血及びｐＨ ７．４で５％未満、好ましくは２．５％未満、特に好ましくは１％未満の溶血を引き起こす。
【００２６】
ヒト赤血球(erythrocytes)を用いる細胞毒性試験はMurthy他の方法に基づく方法により実施されることができる：N. Murthy, J.R. Robichaud, D.A. Tirrell, P.S. Stayton及びS. Hoffman. The design and synthesis of polymers for eukaryotic membrane disruption. J. Controlled Release, 61: 137-143 (1999)。
【００２７】
これは、Ｋ３ ＥＤＴＡの存在での遠心分離により分離されている新鮮な血液から得られたヒト赤血球（ＲＢＣ）を必要とする。細胞はこの場合に２００ｇ及び４℃で５min沈降され、その後に遠心分離が繰り返され、かつリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ緩衝液、３４ｍＭ、ｐＨ ７．４、０．９％ ＮａＣｌ 質量／体積（７５ｍＭ））中に取ることにより３回洗浄される。生じる懸濁液中の細胞数は血球計を用いて決定されることができる。
【００２８】
溶血試験は、特に培地中のヒト赤血球（ＲＢＣ）をコポリマー懸濁液に１×１０８ＲＢＣ／ｍｌの細胞濃度で添加することにより実施される。混合物は３７℃で２０min恒温保持される。
マクロファージタイプの細胞への細胞毒性効果
細胞崩壊がおそらく主としてコポリマーと外側細胞膜との相互作用を通して行われるであろう赤血球に対比して、マクロファージ様の細胞タイプはコポリマーの活性な取り込みが可能であるので、他の相互作用はこの場合に細胞崩壊を引き起こしうることが想定されるべきである。好ましい（メタ）アクリレートコポリマーは、マウスマクロファージ様の細胞タイプJ774A.1を用いるＭＴＴ試験又はＬＤＨ試験（乳酸デヒドロゲナーゼ試験）において（例５参照）、低い又はゼロの細胞崩壊又は毒性を示すものである。細胞系J774A.1は、例えば、菌株の公的収集機関ATCC(America Type Culture Collection、Manassas、VA 20108)からNo. TIB-67 (J774A.1 マウス細胞；不死化されたマクロファージ様細胞（腫瘍性ではない）のもとに入手可能である；次も参照：Ralph P他. Lysozyme synthesis by established human and murine histiocytic lymphoma cell lines. J. Exp. Med. 143: 1528-1533、1976 PubMed: 76192838。
ＭＴＴ試験（マクロファージタイプの細胞系の細胞の阻害）：
比色試験は黄色のＭＴＴ染料（ＭＴＴ＝３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）を暗青色のホルマザン生成物に還元する生きている細胞を検出する。試験は細胞毒性、細胞増殖及び細胞活性化を検出するのに適している(例えば、T. Mosmann. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays, J. Immunol. Meth. 65:55-63 (1983)参照)。
【００２９】
マクロファージ細胞の死滅の程度は、放出されたＬＤＨにより示される(NC. Phillips, L. Gagne, N. Ivanoff, g. Riveau. (1996) Vaccine 14(9), 898-904。放出されたLDHを測定する乳酸デヒドロゲナーゼ試験(P.G. Cabaud及びF. Wroblewski in Am J Clin Pathol (1958) 30、234-236参照)は商業的に入手可能な試験キット、例えばSigma キット(手法No. 500)を用いて実施されることができる。
【００３０】
マクロファージ様の細胞に対してコポリマーにより誘導される毒性は生理学的な（中性の）ｐＨでできるだけ低いべきである。
【００３１】
好ましい（メタ）アクリレートコポリマーはそれゆえ、約０．０３１２５ｍｇ／ｍｌの濃度で、マクロファージ様の細胞タイプJ774A.1(ATCC TIB-67)を用いるＭＴＴ試験において対照実験における１００％生存率に対して少なくとも２５％、好ましくは少なくとも６０％の細胞生存の百分率値を生じさせるものである。
【００３２】
好ましい（メタ）アクリレートコポリマーはそれゆえ、ほぼ０．０３１２５ｍｇ／ｍｌの濃度で、マクロファージ様の細胞タイプJ774A.1(ATCC TIB-67)を用いるＬＤＨ試験において対照実験における１００％細胞崩壊（毒性）に対して４０％以下、好ましくは２０％以下のＬＤＨ放出値を生じさせるものである。
ｐＨ−感受性ポリマー又は（メタ）アクリレートコポリマーの製造
ｐＨ−感受性ポリマーはブロック、ビード又は乳化重合及びポリマーの排出により重合開始剤及び分子量調節剤の存在でのモノマーのフリー−ラジカル重合により製造される。原則として適している他の製造方法は基移動重合（ＧＴＰ）又は原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）でもある(例えば、Matyjaszewski, K.他, Chem. Rev. 2001, 101, 2921-2990参照)。生じるポリマー構造はランダムコポリマー又はブロックコポリマーである。
【００３３】
分子量調節剤２〜１５質量％、０．１〜２質量％の範囲内の乳化剤含量、０．０２〜０．４質量％の範囲内の重合開始剤の量の存在で及び６５〜９０℃の温度での乳化重合が好ましい。ラウリル硫酸ナトリウム、例えば０．１〜０．５質量％、及びポリオキシエチレン２０ソルビタンモノオレエート、例えば０．４〜１．５質量％から好ましくは構成される乳化剤混合物が好ましい。特に適している開始剤はペルオキソ二硫酸ナトリウム又はペルオキソ二硫酸アンモニウムである。このようにして、例えば、２０〜４０質量％の固体含量を有する分散液を製造することが可能であり、かつコポリマーは、好ましくは噴霧乾燥によるか又は凝固及び押出機中で水を噴出することにより単離されることができる。ポリマーはついで好ましくは有機溶剤中に、溶解され、好ましくは水に対する多重透析により、精製され、かつ乾燥され、好ましくは凍結乾燥される。
【００３４】
挙げられうる重合開始剤の例は次のものである：アゾ化合物、例えば２，２′−アゾビス（イソブチロニトリル）又は２，２′−アゾビス（２，４−ジメチル−バレロニトリル）、レドックス系、例えば、第三アミンとペルオキシドとの組合せ物又は、好ましくは、ペルオキシド（これに関連して、例えば、H. Rauch-Puntigam, Th. Voelker, "Acryl- und Methacrylverbindungen", Springer, Heidelberg, 1967又はKirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology, 1巻, 386頁以降, J. Wiley, New  York, 1978参照）。適しているペルオキシド重合開始剤の例はジラウロイルペルオキシド、ｔ−ブチルペルオクトエート、ｔ−ブチルペルイソノナノエート、ジシクロヘキシルペルオキシジカーボネート、過酸化ジベンゾイル又は２，２−ビス（ｔ−ブチルペルオキシ）ブタンである。
【００３５】
重合が、重合の間に及び異なる重合温度でフリーラジカルの流れを一定に維持するために、半減期の異なる多様な重合開始剤の混合物、例えば、ジラウロイルペルオキシド及び２，２−ビス（ｔ−ブチルペルオキシ）ブタンで実施されることも可能であり、かつ好ましい。使用される重合開始剤の量は一般にモノマー混合物に対して０．０１から最大１質量％までである。
【００３６】
コポリマー（ＣＰ）の分子量は、分子量調節剤、例えば、特に、このために公知であるメルカプタン、例えば、ｎ−ブチルメルカプタン、ｎ−ドデシルメルカプタン、２−メルカプトエタノール又は２−エチルヘキシルチオグリコレートの存在でモノマー混合物を重合し、一般に分子量調節剤をモノマー混合物に対して０．０５〜１５質量％の量、好ましくは０．１〜１０質量％の量で及び特に好ましくはモノマー混合物の２〜１２質量％の量で使用することにより調節される(例えば、H. Rauch-Puntigam, Th. Voelker, "Acryl- und Methacrylverbindungen", Springer, Heidelberg, 1967; Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Vol. XIV/1, 66頁, Georg Thieme, Stuttgart, 1961又はKirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology, 1巻, 296頁以降, J. Wiley, New York, 1978参照)。好ましくは使用される分子量調節剤はｎ−ドデシルメルカプタン又は２−エチルヘキシルチオグリコレートである。エチルヘキシルチオグリコレートは、（メタ）アクリレートコポリマーの疎水性に影響を及ぼすことができるという利点を有する、それというのも、調節剤は分子中に末端で含まれるからである。ドデシルメルカプタン５〜１５質量％又は２−エチルヘキシルチオグリコレート２〜１０質量％は、使用される好ましい量である。
複合体／錯体
ｐＨ−感受性ポリマーは薬剤学的に有効な天然又は合成の生分子又は活性薬剤学的成分との複合体又は錯体の形で意図される通りであってよい。複合体又は錯体は、化学結合により共有結合形でか又はファンデルワールス力、イオン結合、疎水性結合を介して副原子価を通して可逆的に又は不可逆的に製造されることができる。
使用
ｐＨ−感受性ポリマーはエンドソーム中への取り込み及びその後のその不安定化又は溶解を介して細胞の内部へ放出される天然又は合成の生分子又は活性な薬剤学的な成分のための担体、複合体／錯体として使用されることができる。
【００３７】
ｐＨ−感受性ポリマーは、脂質、タンパク質、ペプチド、核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）、特にオリゴヌクレオチド、アンチセンスＤＮＡ又はアンチセンスＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ヌクレオチド、ホルモン、毒素、免疫毒素複合体、抗体又はそのフラグメント又は活性薬剤学的成分との錯化のため又は複合体として使用されることができる。錯化又は複合体形成は化学結合により共有結合形でか又はファンデルワールス力、イオン結合、疎水性結合を介して副原子価を通して可逆的に又は不可逆的に行われることができる。生じる錯体は薬剤形、特に皮膚の、経皮の、腸管外の、鼻の、肺の、膣の又は経口の薬剤形を製造するための活性成分として使用されることができる。
【００３８】
ｐＨ−感受性ポリマー及び複合体は、適切な場合には、ミクロ粒子、ナノ粒子、リポソーム、エマルジョン及び／又は脂質小胞体の成分であってよい。
【００３９】
担体、複合体／錯体としての前記使用は、鎮痛薬、抗アレルギー薬、抗リウマチ薬、抗生物質、抗感染薬、抗パーキンソン病薬、抗乾癬薬(antipsoriatics)、抗ガン剤、皮膚用薬、痛風治療薬、免疫調整薬、胃腸薬(gastrointestinal agents)、神経親和性剤(neurotropic agents)、眼科用薬、細胞増殖抑制剤の活性成分のクラスからの活性薬剤学的成分が可能であり、かつ好ましい。
可能な障害：
ガン、感染（ＨＩＶを含めて）、心臓血管性障害（例えば動脈硬化症）、関節炎、神経変質性(neurodegenerative)障害（パーキンソン症候群、多発性硬化症、アルツハイマー病）、遺伝関連性酵素−欠損性障害、Ｂ及びＣ型肝炎、膵臓線維症、高コレステロール血症、ダウン症候群、筋ジストロフィー、自己免疫疾患、帯状疱疹及びヘルペス、乾癬、ＣＭＶ網膜炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、糖尿病。
【００４０】
本発明のために使用される医薬物質は、次のためにヒト又は動物の体に又はヒト又は動物体内に使用されることを目的とする：
１．障害、状態、物理的な損傷又は病理学的な徴候を、治癒するか、軽減するか、防止するか又は診断するため。
２．体又は精神的な状態の条件、体質又は機能を明らかにするため。
３．ヒト又は動物の体により産生される活性物質又は体液を置き換えるため。
４．病原、寄生虫又は外因性物質を撃退するか、排除するか又は無害にするため、又は
５．体又は精神的な状態の条件、体質又は機能に影響を及ぼすため。
【００４１】
医薬物質は参考図書、例えば、the Rote Liste又はthe Merck Index中に見出されるものが使用される。
【００４２】
活性成分であるアンホテリシンＢ、シトシンアラボノシドアドリアマイシン(cytosine arabonoside Adriamycin)が特に挙げられるべきである。アドリアマイシンのリポソーム形は良好なモデルでもありうる、それというのも、エンドソーム中のその迅速な放出は多剤耐性を克服するのに使用されることができるからである。興味深い他の活性成分はアンチセンスオリゴヌクレオチド、プラスミドＤＮＡ及びペプチド（ロイプロリド(leuprolide)、カルシトニン等）であってよい。
【００４３】
薬剤形は例えば腫瘍、心臓血管性障害又は慢性関節リウマチの治療に使用されることができる。適切な薬剤形の成分としての本発明によるｐＨ−感受性ポリマーを用いて遺伝性障害の遺伝子治療又はそのような障害の予防治療は同様に今後考えられる。生きている細胞へ核酸を導入するウイルス系と比較して、非ウイルス系は、それらがより簡単に調製されることができ、ベクターの複製が含まれず、かつ免疫反応のリスクがより低いという一般的な利点を有する。
性質の修正
ａ）他の分子を結合させることによる配座への影響
赤血球及び／又はマクロファージタイプの細胞又はその物理的な性質に関する（メタ）アクリレートコポリマーの性質、例えば毒性又は膜溶解の活性は、共有結合形か又は他の分子、特に配座−変更剤、例えば染料、特に疎水性染料、例えばローダミンＢとの副原子価結合により変性されることができる。カルボキシル基含有（メタ）アクリレートコポリマーのための適している結合方法は当業者に公知である。
【００４４】
例えば、
メタクリル酸単位  ２５〜６５質量％及び
（メタ）アクリル酸のＣ１−〜Ｃ１２−アルキルエステルの単位  ７５〜３５質量％、
から構成され、染料と、好ましくは疎水性染料と、特にローダミンＢで変性されたか又は結合された（メタ）アクリレートコポリマーを得ることが可能である。
【００４５】
メタクリル酸単位４０〜６０質量％及び
アクリル酸エチル単位６０〜４０質量％
から構成され、染料、好ましくは特に疎水性染料、特にローダミンＢで変性された（メタ）アクリレートコポリマーが好ましい。
【００４６】
コポリマー分子の５〜１００％、好ましくは５〜２０％が、染料分子と結合される理論的に決定される結合比が好ましい。
【００４７】
結合は、例えば溶解度特性が修正されることができるという利点を有する。例えば、ｐＨ ６．５未満の範囲、例えばｐＨ ６．０〜ｐＨ ５．０の範囲内で不溶解度の急上昇を達成することが可能である（例６参照）。
ｂ）分子間架橋による錯体の製造
（メタ）アクリレートコポリマーのカルボキシル基は化学的に反応性であり、かつ分子間架橋により錯体を製造することを用いる変性に適している。ゆえに、例えば、ＳＨ基はＮＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＳＨでの化学変性による（メタ）アクリレートコポリマー中へ相対的に簡単に導入されることができる。
【００４８】
ＳＨ基を、ＣＯＯＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＳＨを用いて核酸の５′−及び３′−末端のＯＨ基を介してＤＮＡ及びＲＮＡ、特にオリゴヌクレオチド、アンチセンスＤＮＡ又はアンチセンスＲＮＡへ導入することも同様に簡単である。
【００４９】
ＳＨ−変性（メタ）アクリレートコポリマー及びＳＨ−変性核酸はＳ−Ｓ橋を形成して錯体を得ることにより架橋されることができる。分子量の増大及び減少された溶解度は、特に、特定の病理学的状態、例えば、（自己）免疫疾患の処置において有利でありうる食菌性(phagocytotic)細胞に対して顆粒形で錯体を入手可能にする。
【００５０】
生体内のジスルフィド橋の還元は担持された分子の活性形を放出する。錯体は適切なターゲッティングリガンドをグラフトした後に他の細胞タイプにより内在化されることもできる。
【００５１】
本発明によるポリマーは、活性成分と組み合わされて使用され、かつ通例微粒子であるドラッグデリバリーシステムを形成する。このために、活性成分を生分解可能なスペーサーを介してポリマーに結合させることを可能にする。しかしながら、カチオン性の低分子量又は高分子の物質及び薬理学的活性剤との複合体／錯体も好ましい。カチオン性脂質、例えばリポフェクチン(Lipofectin)、ポリリシン、ポリエチレンイミン、ポリアミノ（メタ）アクリレート又はスペルミン及びスペルミジン及びその誘導体が挙げられるべきである。この錯体はカチオン性又はアニオン性のリポソームであってもよい。ポリマー及び活性剤はカプセル封入されてもよく、又はカチオン性、アニオン性又は中性のリポソームに結合されてもよい。
【００５２】
本来公知である錯化剤は多様な様式で作用−増強効果を示すことができる（例えばポリエチレンイミン）。
【００５３】
錯体のさらなる成分は、親水性ポリマー（ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリラクチド、ポリグリコリド(Polyglycolides)、多糖類及びその誘導体）であってよい。これらの物質は血液の成分との相互作用から活性成分を保護し、かつ血液中の循環を引き延ばす。
【００５４】
ターゲッティングリガンド、例えば細胞−特異性抗原に対する抗体は、細胞−特異性ターゲッティングに使用されることができる。
【００５５】
微粒子の放出系は常用の技術により、例えば溶液中での直接錯化、脂質含有溶液の乾燥及び適切な場合には超音波又は均質化を用いる、水中への再分散により製造される。
【００５６】
所期の使用の通常の技術に相当する薬剤形の成分は、許容される治療下での安全性を可能にする。安定性は薬剤形の凍結−又は噴霧−乾燥により広げられることができる。
【実施例】
【００５７】
１．例１〜７のコポリマー
コポリマーＡ：
メタクリル酸        ５０質量％及び
メタクリル酸メチル  ５０質量％
のコポリマー。
質量平均分子量＝Ｍｗ約２５ ０００。
コポリマーＢ：
メタクリル酸      ５０質量％及び
アクリル酸エチル  ５０質量％
のコポリマー。
質量平均分子量＝Ｍｗ約２５ ０００。
コポリマーＣ：
メタクリル酸      ３０質量％、
アクリル酸エチル  ３５質量％及び
アクリル酸メチル  ３５質量％
のコポリマー。
質量平均分子量＝Ｍｗ約２５ ０００。
コポリマーＤ：
メタクリル酸        ３０質量％、
メタクリル酸メチル  ７０質量％
のコポリマー。
質量平均分子量＝Ｍｗ約２５ ０００。
コポリマーＥ（本発明によらない）
メタクリル酸        １０質量％、
メタクリル酸メチル  ４５質量％及び
アクリル酸メチル    ４５質量％
のコポリマー。
質量平均分子量＝Ｍｗ約２５ ０００。
コポリマーＬ−１００（EUDRAGIT（Ｒ） L、本発明によらない）
メタクリル酸        ５０質量％及び
メタクリル酸メチル  ５０質量％
のコポリマー。
質量平均分子量＝Ｍｗ約１００ ０００。
コポリマーＬ−１００−５５（EUDRAGIT（Ｒ） L100-55、本発明によらない）
メタクリル酸      ５０質量％及び
アクリル酸エチル  ５０質量％
のコポリマー。
質量平均分子量＝Ｍｗ約２５０ ０００。
コポリマーＳ−１００（EUDRAGIT（Ｒ） S100、本発明によらない）
メタクリル酸        ３０質量％及び
メタクリル酸メチル  ７０質量％
のコポリマー。
質量平均分子量＝Ｍｗ約１００ ０００。
例１：
ｐＨ転移範囲（可溶性ないし不溶性）。
【００５８】
目的は、リン酸緩衝液中３．０〜７．５のｐＨ値で３７℃での散乱光を測定することにより、コポリマーが不溶性の形で存在するｐＨ範囲を調査することであった。光散乱の強度は、ポリマーが沈殿すると増大する。
【００５９】
結果は以下の第１表に示されている。
【００６０】
【表２】
2005531649.tif 000003
結果：
（メタ）アクリレートコポリマーは、コポリマーＥを除いて、ｐＨ単位０．４〜０．７の相対的に狭い転移範囲を示す。
【００６１】
コポリマーＥは、カルボキシル基残基を有するモノマー１０質量％のその低い含量のために、ｐＨ単位２．５のより幅広いｐＨ転移範囲を有するように思われる。
【００６２】
分子量はコポリマーの溶解度特性に事実上影響を及ぼさないように思われる。
例２：
ｐＨ ７．４での濃度依存性の溶血活性
ヒト赤血球での細胞毒性試験はMurthy他による方法に基づく方法により実施した(N. Murthy, J.R. Robichaud, D.A. Tirrell, P.S. Stayton及びS. Hoffman. The design and synthesis of polymers for eukaryotic membrane disruption. J. Controlled Release, 61: 137-143 (1999))。
【００６３】
これはＫ３ ＥＤＴＡの存在での遠心分離により分離されているヒト赤血球（ＲＢＣ）を必要とする。細胞を、この場合に２００ｇ及び４℃で５min沈降させ、ついで遠心分離を繰り返し、かつリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ緩衝液、３４ｍＭ、ｐＨ ７．４、０．９％ＮａＣｌ質量／体積（７５ｍＭ））中に取ることにより３回洗浄する。生じる懸濁液中の細胞数は血球計を用いて決定することができる。
【００６４】
溶血試験は、特に培地中のヒト赤血球（ＲＢＣ）をコポリマー懸濁液に１×１０８ ＲＢＣ／ｍｌの細胞濃度で添加することにより実施される。混合物を３７℃で２０分間恒温保持する。溶血度は、遠心分離上澄み液中の溶解された細胞から放出されるヘモグロビンの５４１ｎｍでの分光測定により測定した。
【００６５】
結果は以下の第２表に示されている。
【００６６】
【表３】
2005531649.tif 000004
結果：
コポリマーＢ及びＣは、ｐＨ ７．４で５００μｇ／ｍｌ及びそれ以上で５％又はそれ以上の溶血活性（毒性しきい値）を示す。コポリマーＢ、Ｃ、Ｄ及びＥは２，５００μｇ／ｍｌで５％以上の溶血活性を示す。コポリマーＢの溶血活性はこの場合にＣ及びＤの溶血活性よりも少ない。
【００６７】
コポリマーＡ、Ｌ−１００、Ｌ−１００−５５及びＳ−１００は１０ ０００μｇ／ｍｌまでの高い濃度でさえ溶血活性を示さない。その分子量以外がコポリマーＢに同じであるコポリマーＬ−１００−５５及びコポリマーＥは１０ ０００μｇ／ｍｌで僅かな溶血活性を示す。
【００６８】
コポリマーＡ及びＢは、同じメタクリル酸含量５０質量％を有し、かつコモノマーのみが異なる−それぞれメタクリル酸メチル及びアクリル酸エチル。ややより疎水性のコポリマーＢは２５０μｇ／ｍｌでさえ溶血性である。対照してみると、コポリマーＡは１０ ０００μｇ／ｍｌでさえ溶血性ではない。
例３：
ｐＨ ５．０及びｐＨ ５．５での異なる濃度のコポリマーＢ及びＣの溶血効果。
【００６９】
結果は以下の第３表に示されている。
【００７０】
【表４】
2005531649.tif 000005
結果：
コポリマーＢはｐＨ ５．０で及びｐＨ ５．５で、ことのほか２５及び５０μｇ／ｍｌの低い濃度でコポリマーＣよりも溶血性である。双方のコポリマーはｐＨ ５．５及び１５０μｇ／ｍｌで極めて活性である。
【００７１】
コポリマーＬ−１００−５５はそのより高い分子量によりコポリマーＢとは異なる。コポリマーＢの溶血活性はｐＨ ５．０及びｐＨ ５．５で２５及び５０μｇ／ｍｌで並びにｐＨ ５．５及び１００μｇ／ｍｌでコポリマーＬ−１００−５５の溶血活性よりも高い。
例４：
１５０μｇ／ｍｌのコポリマー濃度及び多様なｐＨ値での溶血効果。
【００７２】
結果は以下の第４表に示されている。
【００７３】
【表５】
2005531649.tif 000006
結果：
コポリマーＢ、Ｃ及びＬ１００−５５は、５．５〜６．０のｐＨ範囲内で１５０μｇ／ｍｌの濃度で強い溶血活性を示す。コポリマーの全てが、コモノマーとしてアクリル酸エチルを含有する。しかしながら、Ｌ１００-５５のＭｗは適用のためには高すぎる。
例５：
目的はマクロファージ細胞タイプへのコポリマーの効果を調査することであった。細胞崩壊がおそらくコポリマーと外側の細胞膜との相互作用を通して主として行われるであろう赤血球と対比して、マクロファージ細胞タイプはコポリマーの活性な取り込みを可能にするので、他の相互作用がこの場合に細胞崩壊又は他の毒性効果を引き起こすことができることが想定されなければならない。細胞崩壊又は他の毒性効果の決定が相対的に不正確なので、２つの試験系が組み合わされる：細胞増殖を評価するためのＭＴＴアッセイ及び細胞の壊死を評価するためのＬＤＨアッセイ（生存している細胞についてのＭＴＴ試験及び死んだ細胞についてのＬＤＨ試験）。
ＭＴＴ試験
ＭＴＴ試験（マクロファージタイプの細胞系の細胞増殖の阻害）。
【００７４】
比色試験は黄色のＭＴＴ染料を暗青色のホルマザン生成物に還元する生きている細胞を検出する。前記試験は細胞毒性、細胞増殖及び細胞活性化を検出するのに適している（例えば、T. Mosmann. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays, J. Immunol. Meth. 65: 55-63 (1983)参照）。
【００７５】
J 774マウスマクロファージタイプの細胞を、１０体積／体積％ウシ胎児血清（５６℃で３０min予熱される）及びペニシリンＧ １００Ｕ／ｍｌ及びストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを含有しているＤＭＥＭ培地中に懸濁させる。細胞を、９６ウェルを有するマイクロタイタープレート中に細胞５×１０３個を含有している１００μｌの部分で分配し、５％ＣＯ２を含有しているＨ２Ｏ−飽和雰囲気下で３７℃で２４ｈ恒温保持する。リン酸緩衝液中の無菌コポリマー溶液２０μｌを添加し、０．５から０．００３１２５ｍｇ／ｍｌへの連続希釈を実施する（対照はコポリマーなしのリン酸緩衝液を受け入れる）。恒温保持はついで４８ｈ続ける。
【００７６】
リン酸緩衝液中の無菌のＭＴＴ溶液１０μｇ（ＭＴＴ＝３−（４，５−ジメチル−チアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）（５ｍｇ／ｍｌ）を各ウェル中に入れ、３７℃でさらに３ｈ恒温保持する。ついで、０．０１Ｍ ＨＣｌ中の１０質量／体積％ドデシル硫酸ナトリウム溶液（ＳＤＳ）１００μｌを、還元されたＭＴＴを安定化するために添加する。５７０ｎｍでの吸収は２４ｈ後に分光計中で測定し、コポリマーの添加なしでの対照実験における１００％生存率に関して評価される。
ＬＤＨ試験
比色試験は死んだ細胞により放出された乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性を検出する。前記試験はマイクロタイタープレート中でJ774細胞を用いるＭＴＴ試験に類似して実施される。４８ｈ恒温保持後、上澄み液の４μｌの部分を商業的に入手可能なＬＤＨ試験キットでＬＤＨ活性について試験する。評価はコポリマーの添加なしでの対照実験における１００％細胞崩壊（毒性）に関して行う。１００％値はTriton X-100の存在での細胞アリコートの恒温保持後にこの場合に完全な細胞崩壊が測定される。
【００７７】
結果は以下の第５表に示されている。
【００７８】
【表６】
2005531649.tif 000007
結果：
ＭＴＴ試験及びＬＤＨ試験において得られた測定結果は定性的に一致する。コポリマーＢは低い濃度においてでさえJ774について最も毒性である。毒性効果はコポリマーＡ及びＤについて検出可能ではなかった。例４において赤血球の制限された溶血を引き起こすコポリマーＥは、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度のJ774細胞について毒性であることを証明する。コポリマーＣは０．５ｍｇ／ｍｌの濃度のJ774細胞について僅かに毒性であることを証明する。
例６
コポリマーＡ〜ＥのｐＨ依存性の配座の変化（転移）。
ピレン蛍光
蛍光染料ピレンは異なるｐＨ値でのｐＨ−感受性ポリマーの転移を追うために使用されることができる（例えば: K. Kalyanasundaram及びJ.K. Thomas. Environmental effects on vibronic band intensities in pyrene monomer fluorescence and their application in studies of micellar systems. J. Am. Chem. Soc. 99:2039-2044 (1977)参照）。
【００７９】
親水性のコイル構造（コイル）から疎水性の小球状構造への転移は、発光スペクトルの第一の（３７２ｎｍ）及び第三の（３８３ｎｍ）ピークの比（Ｉ１／Ｉ３比）の減少に付随される。測定のために、ピレンはコポリマー溶液に単純に添加される。
【００８０】
結果は以下の第６表に示されている。
【００８１】
【表７】
2005531649.tif 000008
結果：
コポリマーＡ及びＢ（メタクリル酸５０質量％）はｐＨ ７．４〜ｐＨ ５．５の最も著しい転移を示し、コポリマーＣ及びＤ（メタクリル酸３０質量％）が続く。コポリマーＥ（メタクリル酸１０質量％）は、事実上転移挙動を示さない。転移挙動は、コポリマーのメタクリル酸含量とは相関するがコポリマーの溶血活性（例２及び４参照）とは相関しないように思われる。
例７
コポリマーＢと染料Lissamine（Ｒ）（ローダミンＢ）との結合
試験を、K. Abdellaoui, M. Boustta, M. Vert, H. Morjani, M. Manfait. (1998) Eur J Pharm Sci 6, 61-73に記載されているようにして、次の修正を伴い実施する。カルボキシル基−活性剤Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）を、１，３−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）により置換した。４−（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）及びトリエチルアミンを触媒量で添加する。反応を４日間実施する。
【００８２】
コポリマーＢ ２５０ｍｇを、予め蒸留されたテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）１ｍｌ中に溶解させた。ついで１，３−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）０．５ｍｇ／ｍｌ（３×１０−３mmol）をカルボキシル基を活性化するのに添加した。３０min後、触媒量のトリエチルアミン及び４−（ジメチルアミノ）ピリジン及びLissamine（Ｒ）ローダミンＢエチレンジアミン（１ｍｇ／ｍｌ、１．５×１０−３mmol）を、無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中に溶解させた。反応混合物を室温で暗所でアルゴン下で９６ｈ恒温保持した。
【００８３】
反応混合物を、沈殿したＤＩＰＣ副生物を除去するために０．２μｍフィルターに通した。存在するＴＨＦを真空内でストリッピングした。依然としてＴＨＦを含有している粗生成物にクロロホルム／メタノール（８５／１５体積／体積）の混合物を添加し、溶液を、遊離ローダミンを排除するためにシリカゲルカラム上で溶離させた。溶離過程はこの場合に薄層クロマトグラフィーにより監視した。適切なフラクションを組み合わせ、溶剤を真空内でストリッピングした。残留物をＴＨＦ中に取り、非共有結合形で結合されたローダミンＢの残留物を除去するために、３ ５００ダルトン膜を用いて水／メタノール（５０／５０）に対して３日間透析した。ついで透析を、リン酸緩衝液ｐＨ ９に対して２日間、蒸留水に対してさらに２日間続けた。生じる生成物を７２ｈ凍結乾燥した。
【００８４】
コポリマー中のローダミンＢ含量は、室温でメタノール中での分光蛍光計により決定した（λｅｘｃ＝５６０ｎｍ、λｅｍ＝５８０ｎｍ）。
【００８５】
深紅色のコポリマーの収率は８３％であった。ローダミンＢ結合は、０．０４mol％であることが見出され、これは、理論的にコポリマー分子９個のうち１個がローダミン分子に結合されることを意味する。
【００８６】
ローダミンＢに結合されなかったコポリマーＢと比較して、多様なｐＨ値での溶解度特性を試験することを目的としていた。
【００８７】
結果は以下の第７表に示されている。
【００８８】
【表８】
2005531649.tif 000009
結果：
コポリマーＢへのローダミン結合は溶解度特性の顕著な変化を引き起こす。約ｐＨ ５．６からｐＨ ５．３での１００％不溶解度への急上昇が存在する。これとは異なり、結合されていないコポリマーＢはｐＨが４．２であるまで１００％不溶解度を示さない。この範囲内の上昇は約ｐＨ ５．３からあまり急激ではなく明確に行われる。
例８
製造方法：一例は製造方法１及び２のそれぞれについて与えられる。比例した量を、以下の［表９］に示されるように変化させることができる。
【００８９】
質量平均分子量（Ｍｗ）は、２５℃でＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）中のポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）の粘度に関連して粘度ｎｓｐｅｃ／ｃ（ｃｍ３／ｇ）についての測定から近似的に計算されることができる。経験的に見出された次の式がこのために使用される：
【００９０】
【数１】
2005531649.tif 000010
製造方法１
蒸留水１ ４３０ｇ、ラウリル硫酸ナトリウム３．７８ｇ、ポリオキシエチレン２０ソルビタンモノオレエート１２．６ｇ及び蒸留水２０ｇ中に溶解させたペルオキソ二硫酸アンモニウム１．２６ｇを、還流冷却器、撹拌機及び供給容器を備えた２ ｌの容積を有する反応容器中へ導入した。８１℃で、
アクリル酸エチル  ２７０ｇ
メタクリル酸  ２７０ｇ
２−エチルヘキシルチオグリコレート  ２７ｇ
からなるモノマー混合物を、２．５時間に亘って溶液中へ計量供給した。
【００９１】
供給が完了した後、混合物を８１℃でさらに２時間保持し、ＳＥ−２ＭＣシリコーン消泡剤エマルジョン０．１７６ｇ及び蒸留水１０ｇの混合物を添加し、蒸留水９５．４２ｇを真空内で約３００mbarでストリッピングし、室温に冷却した。分散液は３０％の固体含量を有していた。
製造方法２
蒸留水７７４ｇ、ラウリル硫酸ナトリウム１．０９２ｇ及び蒸留水１０ｇ中に溶解させたペルオキソ二硫酸ナトリウム１．４ｇを、還流冷却器、撹拌機及び供給容器を備えた２ ｌの容積を有する反応容器中へ導入した。７５℃で、
アクリル酸メチル  ３９０ｇ
メタクリル酸メチル  １５０ｇ
メタクリル酸  ６０ｇ
ラウリル硫酸ナトリウム  １．００８ｇ
ポリオキシエチレン２０ソルビタンモノオレエート  ７ｇ
２−エチルヘキシルチオグリコレート  ３０ｇ
蒸留水  ８２０．９９ｇ
からなるエマルジョンをこの溶液中へ４時間に亘って計量供給した。
【００９２】
供給が完了した後、混合物を７５℃でさらに２時間保持し、ＳＥ−２ＭＣシリコーン消泡剤エマルジョン０．２１ｇ及び蒸留水１０ｇの混合物を添加し、蒸留水１２０ｇを約３００mbar下でストリッピングし、室温に冷却した。分散液は３０％の固体含量を有していた。
【００９３】
【表９】
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【国際調査報告】
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