(57)【要約】本発明のタンパク質は、細胞活性およびその血管の誘引能の調節に用いられるファミリーである。該タンパク質は、血管形成の阻害、細胞遊走の阻害およびアクチンフィラメント形成の阻害に用いられる。これに関連し、これらのタンパク質は、癌のごとき増殖性疾患の診断および治療に用いられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４または５６に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む組成物と接触させることを含む、細胞遊走の阻害方法。
【請求項２】
細胞をインビボ、インビトロまたはエクスビボにて接触させる、請求項１の方法。
【請求項３】
細胞が、内皮細胞、上皮細胞、神経細胞または間葉細胞からなる群より選択される、請求項１の方法。
【請求項４】
内皮細胞が、微小血管内皮細胞または臍帯静脈内皮細胞である、請求項３の方法。
【請求項５】
上皮細胞が、腎細胞または膵細胞である、請求項３の方法。
【請求項６】
神経細胞が、膠細胞、軸索細胞、および樹状細胞からなる群より選択される、請求項３の方法。
【請求項７】
細胞が癌細胞である、請求項１の方法。
【請求項８】
癌細胞が、神経芽細胞腫、腎臓癌腫細胞、線維肉腫細胞、横紋筋肉腫細胞または膵臓癌細胞である、請求項７の方法。
【請求項９】
配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３または５５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸を含む組成物を細胞に導入することを含む、細胞遊走の阻害方法。
【請求項１０】
核酸がインビボ、インビトロまたはエクスビボにて導入される、請求項９の方法。
【請求項１１】
細胞が、内皮細胞、上皮細胞、神経細胞または間葉細胞からなる群より選択される、請求項９の方法。
【請求項１２】
内皮細胞が、微小血管内皮細胞または臍帯静脈内皮細胞である、請求項１１の方法。
【請求項１３】
上皮細胞が、腎細胞または膵細胞である、請求項１１の方法。
【請求項１４】
神経細胞が、膠細胞、軸索細胞、および樹状細胞からなる群より選択される、請求項１１の方法。
【請求項１５】
細胞が癌細胞である、請求項９の方法。
【請求項１６】
癌細胞が、神経芽細胞腫、腎臓癌腫細胞、線維肉腫細胞、横紋筋肉腫細胞または膵臓癌細胞である、請求項１５の方法。
【請求項１７】
組織を、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４または５６に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む組成物と接触させることを含む、組織の血管形成の阻害方法。
【請求項１８】
組織が、内皮組織、上皮組織、神経組織または間葉組織からなる群より選択される、請求項１７の方法。
【請求項１９】
内皮組織が、静脈組織、動脈組織または微小血管系である、請求項１８の方法。
【請求項２０】
上皮組織が、腎臓組織、膵組織または腎組織である、請求項１８の方法。
【請求項２１】
神経組織が、神経膠組織である、請求項１８の方法。
【請求項２２】
組織が腫瘍である、請求項１７の方法。
【請求項２３】
腫瘍が癌性である、請求項２２の方法。
【請求項２４】
癌が、神経芽細胞腫、腎臓癌腫、線維肉腫、横紋筋肉腫または膵臓癌である、請求項２３の方法。
【請求項２５】
配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３または５５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸を含む組成物を細胞に導入することを含む、組織の血管形成の阻害方法。
【請求項２６】
核酸がインビボ、インビトロまたはエクスビボにて導入される、請求項２５の方法。
【請求項２７】
組織が、内皮組織、上皮組織、神経組織または間葉組織からなる群より選択される、請求項２５の方法。
【請求項２８】
内皮組織が、静脈組織、動脈組織または微小血管系である、請求項２７の方法。
【請求項２９】
上皮組織が、腎臓組織、膵組織または腎組織である、請求項２７の方法。
【請求項３０】
神経組織が、神経膠組織である、請求項２７の方法。
【請求項３１】
組織が腫瘍である、請求項２５の方法。
【請求項３２】
腫瘍が癌性である、請求項３１の方法。
【請求項３３】
癌が、神経芽細胞腫、腎臓癌腫、線維肉腫、横紋筋肉腫または膵臓癌である、請求項３２の方法。
【請求項３４】
細胞を、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４または５６に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む組成物と接触させることによる、細胞におけるアクチンフィラメント形成の阻害方法。
【請求項３５】
細胞をインビボ、インビトロまたはエクスビボにて接触させる、請求項３４の方法。
【請求項３６】
細胞が、内皮細胞、上皮細胞、神経細胞または間葉細胞からなる群より選択される、請求項３４の方法。
【請求項３７】
内皮細胞が、微小血管内皮細胞または臍帯静脈内皮細胞である、請求項３６の方法。
【請求項３８】
上皮細胞が、腎細胞または膵細胞である、請求項３６の方法。
【請求項３９】
神経細胞が、膠細胞、軸索細胞、および樹状細胞からなる群より選択される、請求項３６の方法。
【請求項４０】
細胞が癌細胞である、請求項３４の方法。
【請求項４１】
癌細胞が、神経芽細胞腫、腎臓癌腫細胞、線維肉腫細胞、横紋筋肉腫細胞または膵臓癌細胞である、請求項４０の方法。
【請求項４２】
配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３または５５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸を含む組成物を細胞に導入することを含む、アクチンフィラメント形成の阻害方法。
【請求項４３】
核酸がインビボ、インビトロまたはエクスビボにて導入される、請求項４２の方法。
【請求項４４】
細胞が、内皮細胞、上皮細胞、神経細胞または間葉細胞からなる群より選択される、請求項４２の方法。
【請求項４５】
内皮細胞が、微小血管内皮細胞または臍帯静脈内皮細胞である、請求項４４の方法。
【請求項４６】
上皮細胞が、腎細胞または膵細胞である、請求項４４の方法。
【請求項４７】
神経細胞が、膠細胞、軸索細胞、および樹状細胞からなる群より選択される、請求項４４の方法。
【請求項４８】
細胞が癌細胞である、請求項４２の方法。
【請求項４９】
癌細胞が、神経芽細胞腫、腎臓癌腫細胞、線維肉腫細胞、横紋筋肉腫細胞または膵臓癌細胞である、請求項４８の方法。
【請求項５０】
血管形成関連障害の症状を抑制または軽減する方法であって、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４または５６に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む方法。
【請求項５１】
血管形成関連障害が癌である、請求項５０の方法。
【請求項５２】
癌が膵臓癌、腎臓癌または神経芽細胞腫である、請求項５１の方法。
【請求項５３】
ＮＯＶＸポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含むキメラタンパク質。
【請求項５４】
第２のポリペプチドが少なくとも免疫グロブリン分子の一部である、請求項５３のキメラタンパク質。
【請求項５５】
第２のポリペプチドが免疫グロブリン分子のＦｃ領域を含む、請求項５３のキメラタンパク質。
【請求項５６】
配列番号５０または５４を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、細胞、組織、器官または生物における生化学的応答または生理学的応答を刺激することに関連づけられる抗血管形成的性質を有するセマフォリン様の新規ポリペプチド、およびこれらをコードする核酸に関する。より詳細には、本発明の新規なポリペプチドは新規な遺伝子の遺伝子産物であるか、またはその特定の生物学的に活性なフラグメントもしくは誘導体である。使用方法には、診断アッセイ法および予後アッセイ法、ならびに抗血管形成的治療法が包含され、これには、様々な腎臓癌（renal cancers）、神経膠芽細胞腫（glioblastoma）および様々な膵臓癌（pancreatic cancers）を処置する方法が含まれるが、これらに限定されない。
【０００２】
（発明の背景）
発達時において、種々の細胞表面分子は、細胞の遊走、増殖、分化およびアポトーシスの各プロセスのために不可欠な、細胞と細胞外マトリクスとの相互作用を調節している（Shima, D.T. and C. Mailhos、2000、Curr Opin Genet Dev., 10:536-42）。これらの空間的および時間的に協調した相互作用は、始原細胞が適切な環境で確実に分化するためには不可欠である。これに関して、セマフォリンファミリーのタンパク質は中枢神経系（CNS）の発達の際には重要かつ決定的な役割を果たしている。セマフォリンは、当初、神経系において、軸索誘導分子として特徴づけられており（Kolodkin, A.L., 1998, Prog Brain Res., 117:115-32）、これは、ノックアウトマウスでのいくつかの研究から支持される知見である（Behar, et al., 1996, Nature, 383:525-528；Taniguchi, et al., 1997, Neuron, 19:519-530）。セマフォリンはまた、心臓および骨格の発達（Behar, et al., 1996, Nature, 383:525-528）、免疫応答（Hall, et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 93:11780-5）、血管形成の調節（Miao, et al., 1999, J Cell Biol., 146:233-242）、ならびに腫瘍の成長および転移（Christensen, et al., 1998, Cancer Res., 58:1238-44）にも関わっている。これらのセマフォリンは、8つの異なるクラスに分類される分泌型糖タンパク質および膜貫通糖型タンパク質の（25個を超える遺伝子の）大きなファミリーを構成している（Kolodkin, A.L., 1998, Prog Brain Res., 117:115-32）。これらのセマフォリンは、約500アミノ酸の細胞外Semaドメインを有し、その後には、17個の非常に保存されたシステイン残基を含有する短い膜貫通ドメインが続く。最近の研究では、Sema 3Aが、様々な肺癌において頻繁に不活性化される腫瘍抑制遺伝子（TSG）として同定されている（Tomizawa, et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 98:13954-9）。非常に広範囲に研究されているセマフォリンの中で、Sema 3Bは、軸索に対する反発因子として作用し、内皮細胞の遊走を阻害することも示されている。この観察結果は、誘導分子（Sema 3A）と血管形成因子（VEGF）とのバランスにより、神経始原細胞の遊走、アポトーシスおよび増殖が、共有される受容体を介して調節され得るという仮説に繋がる（Miao, et al., 1999, J Cell Biol., 146:233-242）。
【０００３】
セマフォリン6A-1は膜貫通型のセマフォリンであり、その発現は胚の神経系の発達における機能を示唆している（Xu, et al., 2000, J. Neuroscie., 20:2638-2648）。ネズミのSema 6A-1オルソログもまた単離されており（Xu, et al., 2000, J. Neuroscie., 20:2638-48）、その可溶性エクトドメインが交感神経ニューロンおよび後根神経節成長円錐崩壊を生じさせることが報告されていた。Klostermannらは、Sema 6A-1のシグナル伝達を、Ena/VASPのごとき細胞骨格エレメント結合タンパク質に間接的に関係づけ、それにより、逆行性シグナル伝達および細胞骨格再配置におけるその役割を示唆された（Klostermann, et al., 2000, J Biol Chem., 275:39647-53）。さらなる研究（Klostermann, et al., 2000, J Biol Chem., 275:39647-53）では、Sema 6A-1が、運動性、成長および接着に関連した細胞部位にフィラメント合成装置を標的化する際に重要なエレメントとして機能することが示唆された。
【０００４】
最近の研究では、セマフォリンが、プレキシンとの複合体を形成することによりシグナル伝達をするNP-1と相互作用することが示されている（Kolodkin, A.L., 1998, Prog Brain Res., 117:115-32）。受容体複合体で同時に発現する特異的なプレキシンに依存して、細胞は反発または引き寄せのいずれかを示し得る（Chen, et al., 1997, Neuron, 19:547-559）。以前の研究では、NP-1が内皮細胞表面で発現し、そしてまた、いくつかの腫瘍細胞（乳房および前立腺）では明らかに過剰発現する（Soker, S., 2001, J Biochem Cell Biol., 33:433-7）。セマフォリン／コラプシンに対するNP-1の結合は軸索の運動性を阻害するが、VEGF165への結合は内皮細胞区画における走化性を増強した（Soker, S., 2001, J Biochem Cell Biol., 33:433-7）。プレキシンは、細胞外の事象を細胞質のシグナル伝達カスケードに変換する、すべてのニューロンにおける不可欠なセマフォリン受容体成分である。プレキシンに基づくシグナル伝達機能のために必須のリガンド結合性の共受容体としてニューロピリン類を要求するクラス3セマフォリンを除くプレキシン受容体に対して、多数のセマフォリンは直接的に結合する（Liu, B.P. and S.M. Strittmatter, 2001, Curr Opin Cell Biol., 13:619-26）。
【０００５】
研究により、rhoファミリーのGTPaseがセマフォリンのシグナル伝達に関連づけられている（Rohm, et al., 2000, FEBS Lett., 486:68-72）。セマフォリンにより誘導される成長円錐崩壊では、f-アクチン再組織化およびエンドサイトーシスの両方が利用される。小さいGTPaseはアクチン動力学のよく知られた調節因子であり、ストレス線維形成、フォーカルアドヒージョンアセンブリー、および細胞遊走にも関与している（Sanders, et al., 1999, Science, 283:2083-2085）。協調した遊走は、収縮状態と非収縮状態との間での切り換えを可能にする、rhoに対するracの作用によって制御される。同様に、内皮細胞においてVEGFにより誘導される遊走は、細胞の収縮状態および非収縮状態の厳密な調節が要求される血管形成の不可欠な構成要素である。最近の研究では、アクチンの組織化および動力学を調節することによって内皮細胞の収縮力を調節する、VEGFR2の下流側の主要なシグナル伝達経路が同定されている（Rousseau, et al., 2000, J Biol. Chem., 275:10661-19672）。NP-1が2つの異なるリガンドに結合することにより、運動性が示差的に影響されることが研究により示されている。これらの研究のすべてにより、内皮細胞と神経細胞間で類似した発達における役割分担が明らかとなった。
【０００６】
本発明は、新規セマフォリン様ヌクレオチドおよびポリペプチド、ならびに腎臓癌腫および神経膠芽細胞腫を含むが、これらに限定されない様々な癌の処置における、抗血管形成剤としてのそれらの治療的使用に関する。
【０００７】
（発明の要約）
本発明は、細胞遊走、血管形成およびアクチンフィラメント形成を阻害したタンパク質および核酸の発見に基づいている。従って、本発明は、細胞または身体組織における血管形成、細胞運動性およびアクチンフィラメント形成を調節（すなわち、抑制、阻害または促進）する方法を特徴とする。
【０００８】
細胞遊走、血管形成またはアクチンフィラメント形成は、ＮＯＶＸポリペプチド（例えば、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４または５６）またはＮＯＶＸ核酸（例えば、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３または５５）を含有する組成物を細胞または組織に接触または導入することによって阻害される。あるいは、該組成物は、ＮＯＶＸポリペプチドまたはＮＯＶＸ核酸に対して少なくとも95％の配列同一性を有するポリペプチドまたは核酸を含有する。本発明はまた、細胞遊走／血管形成に関連した障害に罹患している対象、または細胞遊走／血管形成に関連した障害を発症する危険性がある対象を同定し、その対象にＮＯＶＸポリペプチドまたはＮＯＶＸ核酸を投与することによって、対象における細胞遊走／血管形成に関連した障害の症状を抑制または軽減する方法を特徴とする。
【０００９】
これらの細胞または組織は、インビボ、インビトロまたはエクスビボで接触させられる。細胞または組織は正常型または癌性である。細胞は、内皮細胞、上皮細胞、神経細胞または間葉細胞である。例えば、細胞は、神経芽細胞腫（neuroblastoma）細胞、腎臓癌腫（renal carcinoma）細胞、線維肉腫（fibrosarcoma）細胞、横紋筋肉腫（rhabdosarcoma）細胞または膵臓癌細胞である。組織は、例えば、内皮組織、上皮組織、ニューロン組織または間葉組織である。内皮組織には、例えば、静脈、動脈および微小血管系が含まれる。上皮組織には、例えば、腎臓組織、膵臓組織および腎組織が含まれる。ニューロン組織には、例えば、神経膠組織が含まれる。
【００１０】
対象は哺乳動物、例えば、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタである。対象は、細胞遊走／血管形成に関連した障害に罹患しているか、または細胞遊走／血管形成に関連した障害を発症する危険性がある。細胞遊走／血管形成に関連した障害には、例えば、神経芽細胞腫、腎臓癌腫、線維肉腫、横紋筋肉腫および膵臓癌のごとき癌、創傷治癒、または組織再生が含まれる。細胞遊走／血管形成に関連した障害に罹患している対象、または細胞遊走／血管形成に関連した障害を発症する危険性がある対象は、当該分野で知られている様々な方法によって、例えば、組織の全体的な検査または腫瘍の検出によって同定される。
【００１１】
本発明はさらにキメラタンパク質を提供する。キメラタンパク質は第1および第2のポリペプチドを含む。第1のポリペプチドには、ＮＯＶＸポリペプチドが含まれ、これには、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４または５６が含まれる。第2のポリペプチドは免疫グロブリン分子の一部である。免疫グロブリン分子の一部には、例えば、免疫グロブリン分子のeFc領域が含まれる。例えば、キメラタンパク質は配列番号50または配列番号54を含む。
【００１２】
（発明の詳細な記載）
本発明は、新規セマフォリンヌクレオチド、およびそれによりコードされるポリペプチドを提供する。本発明には、新規核酸配列、そのコードされるポリペプチド、抗体および他の関連した化合物、ならびに抗血管形成化合物としてのそれらの使用が含まれる。該配列はまとめて、本明細書中では「ＮＯＶＸ核酸」または「ＮＯＶＸポリヌクレオチド」として示され、対応するコードされるポリペプチドは「ＮＯＶＸポリペプチド」または「ＮＯＶＸタンパク質」として示される。別途示されない限り、「ＮＯＶＸ」は、本明細書中に開示される新規な配列のいずれかを示すことが意図される。表1には、ＮＯＶＸ核酸およびそのコードされるポリペプチドのまとめが示される。
【００１３】
表1．配列および対応する配列番号
【表１−１】
2005528434.tif 000002
【表１−２】
2005528434.tif 000003
【００１４】
本発明のタンパク質は、細胞遊走、アクチンフィラメント形成および血管形成を調節（すなわち、阻害または促進）することにおいて有用である。
【００１５】
細胞遊走、アクチンフィラメント形成または血管形成は、細胞または組織をＮＯＶＸポリペプチドまたはＮＯＶＸ核酸と接触させることによって阻害される。あるいは、細胞または組織は、ＮＯＶＸポリペプチドまたはＮＯＶＸ核酸の発現または活性を増大させる化合物と接触させられる。一方、細胞遊走、アクチンフィラメント形成は、細胞または組織を、ＮＯＶＸポリペプチドまたはＮＯＶＸ核酸の発現または活性を阻害する化合物と接触させることによって促進される。ＮＯＶＸポリペプチドまたはＮＯＶＸ核酸の発現を阻害する化合物には、例えば、ＮＯＶＸ特異的抗体またはそのフラグメントが含まれる。
【００１６】
ＮＯＶＸポリペプチドまたはＮＯＶＸ核酸は全長である。あるいは、ＮＯＶＸポリペプチドまたはＮＯＶＸ核酸は全長よりも短く（すなわち、フラグメントであり）、しかし、全長ポリペプチドの生物学的活性（例えば、細胞遊走阻害、抗血管形成性）を保持している。場合により、ＮＯＶＸポリペプチドまたはＮＯＶＸ核酸またはそのフラグメントは、ＮＯＶＸポリペプチドまたはＮＯＶＸ核酸の半減期を増大させる化合物に（例えば、共有結合的に）結合する。インビボでのポリペプチドの半減期を増大させる様々な化合物が当該分野では知られており、これらには、例えば、免疫グロブリン分子のFc部分が含まれる。
【００１７】
細胞または組織は、インビボで、またはエクスビボで、またはインビトロで接触させられる。あるいは、細胞または組織は間接的に（例えば、全身的に）接触させられる。
【００１８】
細胞または組織は正常、すなわち、非悪性である。あるいは、細胞または組織は癌性、すなわち、悪性である。細胞または組織は化合物と直接的に接触させられる。細胞は、細胞遊走またはアクチンフィラメント形成を調節することが所望される任意の細胞である。細胞は、内皮細胞、上皮細胞、神経細胞または間葉細胞である。内皮細胞は、例えば、微小血管内皮細胞または臍帯静脈内皮細胞である。上皮細胞は、例えば、腎細胞または膵臓細胞である。神経細胞は、神経膠細胞、軸索細胞または樹状細胞である。癌細胞は、例えば、神経芽細胞腫細胞、腎臓癌腫細胞、線維肉腫細胞、横紋筋肉腫細胞または膵臓癌細胞である。
【００１９】
組織は、血管形成の調節が所望される任意の組織である。組織は、内皮組織（例えば、静脈、動脈または微小血管系）、上皮組織（例えば、腎臓、膵臓組織または腎臓組織）、ニューロン組織（例えば、神経膠組織、軸索組織または樹状組織）、または間葉組織である。
【００２０】
細胞遊走は、当該分野で知られている様々な方法により測定される。例えば、細胞遊走は、走化性因子を使用して膜の下部表面に上部表面から細胞を引き寄せて測定される。遊走する細胞の数が、細胞の遊走する能力の変化を測定するために使用される。細胞遊走はまた、後根神経節における成長円錐崩壊をアッセイすることによって測定される。成長円錐崩壊は、蛍光顕微鏡を用いて後根神経節を調べることによって測定される。
【００２１】
血管形成は、当該分野で知られている様々な方法により測定される。例えば、血管形成は、マトリゲル（Matrigel）プラグを使用してインビボで測定される。癌細胞株（例えば、786-0細胞）含有または非含有マトリゲルプラグがヌードマウスの体内に置かれる。一定期間後、プラグが取り出され、微小血管系が含まれるかどうかを確認するために検査される。あるいは、血管形成は、ヌードマウスに神経膠芽細胞腫を移植することによって測定される。その場合、本発明のタンパク質の存在下または非存在下での増大した脈管形成について腫瘍をモニターする。
【００２２】
アクチンフィラメント形成は、当該分野で知られている様々な方法によって、例えば、顕微鏡観察によって測定される。
【００２３】
処置方法
本発明は、細胞遊走および／または血管形成の調節に関連した障害の危険性を有する（またはそのような障害を受けやすい）対象における症状を処置または軽減する予防的方法および治療的方法の両方を提供する。ＮＯＶＸポリペプチドまたはＮＯＶＸ核酸を用いて、対象における細胞遊走または血管形成を阻害する。あるいは、ＮＯＶＸポリペプチドまたはＮＯＶＸ核酸の阻害剤を用いて、細胞遊走および血管形成を促進させる。
【００２４】
細胞遊走および血管形成に関連づけられる様々な障害が、ＮＯＶＸポリペプチド、ＮＯＶＸ核酸またはその阻害剤を対象に投与することによって処置される。対象は、ヒト、マウスまたはラットのごとき哺乳動物である。投与は局所的または全身的のいずれかである。
【００２５】
細胞遊走および／または血管形成の阻害が所望される障害には、例えば、神経芽細胞腫、腎臓癌腫、線維肉腫、横紋筋肉腫および膵臓癌のごとき癌が含まれるが、これらに限定されない。細胞遊走および／または血管形成の促進が所望される障害には、例えば、創傷治癒、組織再生、特に神経組織再生、および、巨核球を含むある種の免疫細胞の管外遊出を含む細胞運動性を伴う免疫機能を促進することが含まれる。
【００２６】
処置の有効性は、細胞遊走または血管形成に関連づけられる特定の障害を診断または処置するための任意の既知の方法に関連して決定される。そのような障害の1つ以上の症状の軽減は、化合物により、臨床的利益がもたらされていることを示す。細胞遊走および血管形成に関連した障害の症状には、均衡の喪失、体重減少、ゆっくりした話し方、黄疸、疲労、痛み、血尿、貧血、または膨張した骨が含まれる。
【００２７】
本明細書中に記載される方法は、本明細書中に記載されるような細胞遊走／血管形成に関連した障害の1つ以上の症状の重篤度の低下またはそのような症状の軽減をもたらす。細胞遊走／血管形成に関連した障害は、典型的には、医師によって、標準的な方法論を使用して診断および／またはモニターされる。
【００２８】
ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチド
本発明の一つの態様は、ＮＯＶＸポリペプチドまたはそれらの生物学的に活性な部分をコードする単離核酸分子に関する。また、本発明は、ＮＯＶＸをコードする核酸(例えば、ＮＯＶＸのｍＲＮＡ)を同定するためのハイブリダーゼーションプローブとしての使用に十分な核酸フラグメント、およびＮＯＶＸ核酸分子の増幅および／または変異用のＰＣＲプライマーとしての使用のためのフラグメントを含む。本明細書において使用する用語「核酸分子」とは、ＤＮＡ分子(例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ)、ＲＮＡ分子(例えば、ｍＲＮＡ)、ヌクレオチド類似体を用いて生成されたＤＮＡ類似体またはＲＮＡ類似体、およびそれらの誘導体、フラグメントおよび相同体を含むことを意図する。核酸分子は一本鎖でも二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００２９】
ＮＯＶＸ核酸は成熟ＮＯＶＸポリペプチドをコードし得る。本明細書において使用するように、本発明に開示するポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」型とは、天然に存在するポリペプチド、または前駆体、またはプロタンパク質の産物である。天然に存在するポリペプチド、前駆体またはプロタンパク質は、限定されない例として、対応する遺伝子によりコードされる全長遺伝子産物を含む。これに代えて、本明細書に説明するＯＲＦによりコードするポリペプチド、前駆体またはプロタンパク質として定義し得る。産物の「成熟」型は、限定されない例として、遺伝子産物を生じる細胞(例えば、宿主細胞)内で起こり得る一つまたはそれ以上の天然に存在するプロセシングステップの結果として生じる。ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」型を導くそのようなプロセシングステップの例として、ＯＲＦの開始コドンによりコードされるＮ末端メチオニン残基の切断、またはシグナルペプチドまたはリーダー配列のタンパク質分解的切断を挙げる。従って、残基１がＮ末端メチオニンである１〜Ｎの残基を有する前駆ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟型は、Ｎ末端メチオニン除去後に残存する残基２〜Ｎを有する。これに代えて、残基１〜残基ＭからＮ末端シグナル配列を切断する、残基１〜Ｎを有する前駆ポリペプチドまたはタンパク質より生じる成熟型は、残存する残基Ｍ＋１〜残基Ｎからの残基を有する。さらに本明細書において使用するように、ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」型はタンパク質分解による切断事象以外の翻訳後の工程により生じ得る。そのようなさらに別な方法は、限定されない例として、グリコシル化、ミリストイル化、またはリン酸化を含む。一般に、成熟ポリペプチドまたはタンパク質を、これらの方法のただ一つ、またはそれらのいずれかの組合せの操作によりもたらし得る。
【００３０】
本明細書において使用する用語「プローブ」は、好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド(ｎｔ)から約１００ｎｔの間、または特定の使用によっては約、例えば６０００ｎｔもの長さである可変的長さの核酸配列を指す。プローブを、同一、類似、または相補的な核酸配列の検出に使用し得る。より長いプローブを天然または組換え供給源から一般的に得る。より長いプローブは、特異性が高くより短い長さのオリゴマーのプローブよりハイブリダイズするのが遅い。プローブは、一本鎖または二本鎖でもよく、そしてＰＣＲ、メンブレン−ベースのハイブリダイゼーション技術、またはＥＬＩＳＡ様技術において特異性を有するようにデザインされ得る。
【００３１】
本明細書において使用する用語「単離」核酸分子は、核酸の天然供給源に存在する他の核酸分子から分離された核酸である。好ましくは、「単離」核酸は、核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中で核酸に天然に隣接する配列(即ち核酸の５'末端および３'末端に位置する配列)を有しない。例えば、種々の実施形態において、単離ＮＯＶＸ核酸分子は、核酸が由来する細胞／組織(例えば、脳、心臓、肝臓、脾臓等)のゲノムＤＮＡ中の核酸分子に天然に隣接する約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０.５ｋｂ、０.１ｋｂ以下、またはそれ未満のヌクレオチド配列を含有し得る。さらに、ｃＤＮＡ分子のような「単離」核酸分子は、他の細胞性物質、培地、または化学的前駆物質または他の化学物質を実質的に含まなくてもよい。
【００３２】
本発明の核酸分子、例えば、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３または５５のヌクレオチド配列を有する核酸分子、またはこのヌクレオチド配列の相補物を、標準的分子生物学の技術および本明細書に示す配列情報を用いて単離し得る。配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３または５５の核酸配列の全てまたは一部をハイブリダイゼーションプローブとして用いて、標準的ハイブリダイゼーション技術およびクローニング技術(例えば、Sambrook, et al., (eds.), MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; および Ausubel, et al., (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, NY, 1993に記載されるように)を用いてＮＯＶＸ分子を単離し得る。
【００３３】
本発明の核酸は、鋳型としてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはこれに代えてゲノムＤＮＡを使用して標準的ＰＣＲ増幅技術にしたがって適切なオリゴヌクレオチドプライマーで増幅し得る。そのように増幅した核酸を、適切なベクターにクローニングし、ＤＮＡ配列分析により特徴づけ得る。さらに、ＮＯＶＸヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドを、標準合成技術、例えば自動ＤＮＡ合成装置の使用、により調製し得る。
【００３４】
本明細書において使用する用語「オリゴヌクレオチド」は、一連の連結するヌクレオチド残基を指す。短いオリゴヌクレオチド配列は、ゲノム配列またはｃＤＮＡ配列に基づき得るし、またはそれらからデザインし得る。そして短いオリゴヌクレオチド配列を使用して、特定の細胞または組織の同一、類似、または相補的ＤＮＡまたはＲＮＡの存在を増幅し、確認し、または明らかにする。オリゴヌクレオチドは、長さ約１０ｎｔ、５０ｎｔ、または１００ｎｔ、好ましくは長さ約１５ｎｔ〜３０ｎｔの核酸配列を含む。本発明の一つの実施形態では、長さ１００ｎｔ未満の核酸分子を含むオリゴヌクレオチドは、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３または５５の少なくとも６個の連続したヌクレオチド、またはそれらの相補物をさらに含む。オリゴヌクレオチドを、化学的に合成し、プローブとして使用し得る。
【００３５】
もう一つの実施形態では、本発明の単離核酸分子は、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３または５５に示すヌクレオチド配列、またはこのヌクレオチド配列の一部(例えば、ＮＯＶＸポリペプチドの生物学的に活性な部分をコードするプローブ、プライマー、またはフラグメントとして使用し得るフラグメント)の相補物である核酸分子を含む。配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３または５５を示すヌクレオチド配列に相補的である核酸分子は、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３または５５を示すヌクレオチド配列に十分に相補的であるものであり、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３または５５を示すヌクレオチド配列と殆どミスマッチなしでまたは全くミスマッチ無しで水素結合し得る。そのため核酸分子は安定な二本鎖を形成する。
【００３６】
本明細書において使用する用語「相補的」は、核酸分子のヌクレオチド単位間のWatson-CrickまたはHoogsteen塩基対形成を指し、用語「結合」は、２個のポリペプチドまたは化合物、または関連するポリペプチドまたは化合物またはそれらの組合せ間の物理的相互作用または化学的相互作用を意味する。結合は、イオン、非イオン、ファン・デル・ワールス、疎水性相互作用等を含む。物理的相互作用は直接的または間接的であり得る。間接的相互作用は、他のポリペプチドまたは化合物の作用を介したまたはこれに因るものであり得る。直接的結合は、他のポリペプチドまたは化合物の作用を介したまたはこれに因り起こるのではなく、代わりに他の実質的な化学的仲介物無しで起こる相互作用を指す。
【００３７】
本明細書で提供する「フラグメント」は、核酸の場合特異的ハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な長さ、アミノ酸の場合にはエピトープの特異的認識に十分な長さである、少なくとも６個の(連続した)核酸または少なくとも４個の(連続した)アミノ酸の配列として定義され、そして全長より短いほとんどの或る一部である。フラグメントは、選択した核酸またはアミノ酸配列の任意の連続した部分から由来するものであり得る。
【００３８】
全長ＮＯＶＸのクローンを、ＡＴＧ翻訳開始コドンおよびインフレームの停止コドンを含有するとして同定する。ＡＴＧ開始コドンを欠く任意の開示するＮＯＶＸヌクレオチド配列は、それ故にれぞれのＮＯＶＸポリペプチドの切断（truncated）型Ｃ末端フラグメントをコードし、対応する全長ｃＤＮＡが開示する配列の５'方向へ伸長することを要求する。インフレームの停止コドンを欠く任意の開示するＮＯＶＸヌクレオチド配列は、同様にそれぞれのＮＯＶＸポリペプチドの切断型Ｎ末端フラグメントをコードし、対応する全長ｃＤＮＡが開示する配列の３'方向へ伸長することを要求する。
誘導体は、もとの化合物から直接、修飾によりまたは部分的置換によるいずれかで生成した核酸配列またはアミノ酸配列である。類似体は、もとの化合物に類似しているが同一ではない構造を有する核酸配列またはアミノ酸配列であり、例えば、それらは特定の成分または側鎖に関して天然化合物と異なっている。類似体は、合成であり得るし異なる進化起源を由来とし得るし、野生型と比較して類似または反対の代謝活性を有し得る。相同体は、異なる種を由来とする特定の遺伝子の核酸配列またはアミノ酸配列である。
【００３９】
誘導体および類似体は全長または全長以外であり得る。本発明の核酸またはタンパク質の誘導体または類似体は、同一サイズの核酸またはアミノ酸配列に亘って、または当該分野において公知のコンピューター相同性プログラムによりアラインメントしたアラインメント配列と比較した際、種々の実施形態において、少なくとも約７０％、８０％、または９５％の同一性(好ましくは、８０〜９５％の同一性)で本発明の核酸またはタンパク質に実質的に相同である領域を含む分子、またはそれらのコードする核酸が本発明のタンパク質をコードする配列の相補物に厳密、中等度に厳密、または低い厳密度の条件下でハイブリダイズ可能である分子を含むが、これらに限定されない。例えば、Ausubel, et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, NY, 1993および以下を参照されたい。
【００４０】
「相同な核酸配列」または「相同なアミノ酸配列」またはそれらの変異体は、上述のようにヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルでの相同性を特徴とする配列を指す。相同なヌクレオチド配列は、ＮＯＶＸポリペプチドのアイソフォームをコードするこれらの配列を含む。アイソフォームを、例えばＲＮＡの選択的スプライシングの結果として同じ生物の異なる組織において発現し得る。これに代えて、アイソフォームを、異なる遺伝子によりコードし得る。本発明では、相同なヌクレオチド配列は、ヒト以外の種のＮＯＶＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、脊椎動物を含むが脊椎動物に限定されない。よって例えば、カエル、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、および他の生物を含む。相同なヌクレオチド配列はまた、本明細書に示すヌクレオチド配列の天然に存在する対立遺伝子変異体および突然変異体を含むが、これらに限定しない。しかしながら、相同なヌクレオチド配列は、ヒトＮＯＶＸタンパク質をコードする正確なヌクレオチド配列を含まない。相同な核酸配列は、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３または５５の保存的アミノ酸置換(下記参照)をコードする核酸配列ならびにＮＯＶＸの生物活性を有するポリペプチドを含む。ＮＯＶＸタンパク質の種々の生物学的活性を、以下に説明する。
【００４１】
ＮＯＶＸポリペプチドは、ＮＯＶＸ核酸のオープンリーディングフレーム(「ＯＲＦ」)によりコードされる。ＯＲＦは、ポリペプチドに潜在的に翻訳し得るヌクレオチドに対応する。ＯＲＦを含む一連の核酸を、停止コドンにより中断しない。全長タンパク質をコードする配列を表すＯＲＦは、ＡＴＧ「開始」コドンで始まり、３種の「停止」コドン即ちＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡの一つで終わる。本発明の目的のため、ＯＲＦは、開始コドン、停止コドン、またはその両方があってもなくてもよい、コード化配列の任意の部分であり得る。ＯＲＦを真正の細胞性タンパク質をコードする良好な候補として考えるために、最小限の要件、例えば、５０個のアミノ酸またはそれ以上をコードする一連のＤＮＡ、がしばしば定められる。
【００４２】
ヒトＮＯＶＸ遺伝子のクローニングから決定するヌクレオチド配列は、他の細胞タイプ、例えば他の組織由来のＮＯＶＸ相同体、ならびに他の脊椎動物由来のＮＯＶＸ相同体を同定および／またはクローニングする際の使用のためにデザインするプローブおよびプライマーの作成を可能にする。プローブ／プライマーは、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを典型的に含む。オリゴヌクレオチドは、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３または５５の少なくとも約１２、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０または４００個の連続したセンス鎖のヌクレオチド配列；または配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３または５５のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列；または配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３または５５の天然に存在する変異体に厳密な条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を典型的に含む。
【００４３】
ヒトＮＯＶＸヌクレオチド配列に基づくプローブを、同じタンパク質または相同タンパク質をコードする転写体またはゲノム配列を検出するのに使用し得る。種々の実施形態において、プローブは検出可能な標識がつけられており、例えば、標識は放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、または酵素のコファクターであり得る。かかるプローブは、対象由来の細胞試料中のあるＮＯＶＸコード化核酸のレベルを測定することによるように、あるＮＯＶＸタンパク質を誤って発現している細胞または組織を同定するための診断試験キットの一部として使用し得る、例えば、ＮＯＶＸのｍＲＮＡを検出するかまたはゲノムＮＯＶＸ遺伝子が変異または欠失をしたか否かを測定する。
【００４４】
「ＮＯＶＸポリペプチドの生物学的に活性な部分を有するポリペプチド」は、特定の生物学的分析において測定するような成熟型を含み、本発明のポリペプチドの活性に類似な、しかし必ずしも同一ではない活性を用量依存性の有無を問わず発揮するポリペプチドを指す。「ＮＯＶＸの生物学的に活性な部分」をコードする核酸フラグメントを、あるＮＯＶＸの生物活性(ＮＯＶＸタンパク質の生物活性を以下に説明する)を有するポリペプチドをコードする配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３または５５の一部を単離し、ＮＯＶＸタンパク質のコードする部分を発現し(例えば、インビトロ組換え発現により)、ＮＯＶＸのコードする部分の活性を評価するすることにより調製し得る。
【００４５】
ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチド変異体
本発明はさらに、遺伝子コードの縮重により配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３または５５に示すヌクレオチド配列と異なっており、従って配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３または５５に示すヌクレオチド配列によりコードするのと同じＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸分子を包含する。もう一つの実施形態では、本発明の単離核酸分子は、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４または５６に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【００４６】
配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３または５５に示すヒトＮＯＶＸヌクレオチド配列に加えて、ＮＯＶＸポリペプチドのアミノ酸配列に変化をもたらすＤＮＡ配列の多型が、集団(例えばヒトの集団)中に存在し得ることを当業者は理解する。ＮＯＶＸ遺伝子のかかる遺伝子多型は、天然の対立遺伝子変異に因り集団の中の個体間に存在し得る。本明細書において使用する用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」は、ＮＯＶＸタンパク質、好ましくは脊椎動物のＮＯＶＸタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)を含む核酸分子を指す。かかる天然の対立遺伝子変異は、ＮＯＶＸ遺伝子のヌクレオチド配列中に１〜５％の変異を典型的にもたらす。天然の対立遺伝子変異の結果でありＮＯＶＸポリペプチドの機能活性を変化しない任意のおよび全てのかかるヌクレオチド変異およびそこで得られるＮＯＶＸポリペプチド中のアミノ酸多型は、本発明の範囲内にあるものとする。
【００４７】
さらに、他の種由来のＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸分子、および従ってヒト配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３または５５とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、本発明の範囲内にあるものとする。本発明のＮＯＶＸｃＤＮＡの天然の対立遺伝子変異体および相同体に対応する核酸分子は、厳密なハイブリダイゼーション条件下で標準的なハイブリダイゼーション技術に従うハイブリダイゼーションプローブとしてヒトｃＤＮＡまたはその一部を用いて、本明細書に開示するヒトＮＯＶＸ核酸との相同性に基づいて単離し得る。
【００４８】
従って、もう一つの実施形態では、本発明の単離核酸分子は少なくとも６ヌクレオチド長であり、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３または５５のヌクレオチド配列を含む核酸分子に厳密な条件下でハイブリダイズする。もう一つの実施形態では、核酸は少なくとも１０、２５、５０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、２０００またはそれ以上のヌクレオチド長である。なおもう一つの実施形態では、本発明の単離核酸分子はコード化領域にハイブリダイズする。本明細書において用いる用語「厳密な条件下でハイブリダイズする」は、お互いに少なくとも約６５％相同なヌクレオチド配列がお互いに典型的にハイブリダイズしたままであるハイブリダイゼーション条件および洗滌条件を記載することを意図する。
【００４９】
相同体(即ち、ヒト以外の生物種由来のＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸)または他の関連配列(例えばパラログ)を、核酸のハイブリダイゼーションおよびクローニングの当該分野において周知の方法を用いて特定のヒト配列の全部または一部をプローブとし、低度、中度、または高度に厳密なハイブリダイゼーションにより得られる。
【００５０】
本明細書において使用する用語「厳密なハイブリダイゼーション条件」は、プローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドが標的配列にハイブリダイズするが他の配列にはハイブリダイズしない条件を指す。厳密な条件は配列依存性であり、異なる環境で差がある。より長い配列は、より短い配列よりもより高温で特異的にハイブリダイズする。一般的に、厳密な条件を、一定のイオン強度およびｐＨにおいて、特定の配列の融解温度(Ｔｍ)より約５℃低いように選択する。Ｔｍは、標的配列と相補的なプローブの５０％が平衡時に標的配列にハイブリダイズする温度(規定のイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下で)である。標的配列はＴｍにおいて一般的に過剰に存在するので、プローブの５０％を平衡時に占める。典型的に、厳密な条件はｐＨ７.０〜８.３で塩濃度が約１.０Ｍナトリウムイオン未満、典型的には約０.０１〜１.０Ｍナトリウムイオン(または他の塩)であり、温度は短いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチド(例えば、１０ｎｔ〜５０ｎｔ)に対して少なくとも約３０℃であり、より長いプローブ、プライマーおよびオリゴヌクレオチドに対して少なくとも約６０℃である。厳密な条件を、フォルムアミドのような不安定化剤の添加によっても達成し得る。
【００５１】
厳密な条件は当業者に公知であり、Ausubel, et al., (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.に見出すことができる。好ましくは、条件は、互いに少なくとも６５％、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同な配列が互いに典型的にハイブリダイズしたままであるようなものである。厳密なハイブリダイゼーションの限定されない例は、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.５)、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０.０２％ＰＶＰ、０.０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０.０２％ＢＳＡおよび５００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む高塩緩衝液中６５℃でハイブリダイゼーションを行い、引き次いで０.２×ＳＳＣ、０.０１％ＢＳＡ中５０℃で１回またはそれ以上洗滌する。配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３または５５の配列に厳密な条件下でハイブリダイズする本発明の単離核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。本明細書において使用する用語「天然に存在する」核酸分子は、天然に(例えば、天然のタンパク質をコードする)存在する核酸配列を有するＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子を指す。
【００５２】
第２の実施形態では、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３または５５のヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはそれらのフラグメント、類似体または誘導体と中度に厳密な条件下でハイブリダイズする核酸配列を提供する。中度に厳密なハイブリダイゼーション条件の限定されない例は、６×ＳＳＣ、５×Reinhardtの溶液、０.５％ＳＤＳおよび１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ中５５℃でハイブリダイゼーションを行い、引き次いで１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中３７℃で１回またはそれ以上洗滌することである。使用され得る他の中度に厳密な条件は当該分野内で周知である。例えば、Ausubel, et al. (eds.), 1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY, および Krieger, 1990; GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY.を参照されたい。
【００５３】
第３の実施形態では、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３または５５のヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはそれらのフラグメント、類似体または誘導体と低度に厳密な条件下でハイブリダイズする核酸配列を提供する。低度に厳密なハイブリダイゼーション条件の限定されない例は、３５％フォルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.５)、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０.０２％ＰＶＰ、０.０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０.２％ＢＳＡ、１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、１０％(ｗｔ／ｖｏｌ)硫酸デキストラン中４０℃でハイブリダイゼーションを行い、引き次いで２×ＳＳＣ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.４)、５ｍＭ ＥＤＴＡ、および０.１％ＳＤＳ中５０℃で１回またはそれ以上洗滌することである。使用し得る他の低度に厳密な条件(例えば種間ハイブリダイゼーションに使用する)は当該分野において周知である。例えば、Ausubel, et al. (eds.), 1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY, and Kriegler, 1990; GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY.；Shilo and Weinberg, 1981. Proc Natl Acad Sci USA 78: 6789-6792を参照されたい。
【００５４】
保存的変異
集団中に存在し得るＮＯＶＸ配列の天然に存在する対立遺伝子変異に加えて、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３または５５のヌクレオチド配列中に変異により変換を導入することができ、それによってＮＯＶＸタンパク質の機能活性を変えること無しに、コードするＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列の変化を導くことができることを当業者はさらに理解する。例えば、「非必須」アミノ酸残基でアミノ酸置換に導くヌクレオチド置換を、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３または５５の配列中で行い得る。「非必須」アミノ酸残基は、ＮＯＶＸタンパク質の野生型の配列をそれらの生物活性を変化させることなく変えることのできる残基であるが、一方で「必須」アミノ酸残基をそのような生物活性に必要とする。例えば、本発明のＮＯＶＸタンパク質中で保存するアミノ酸残基を、特に変換に耐えられないと予想する。保存的置換が行われ得るアミノ酸は当該分野内で周知である。
【００５５】
本発明のもう一つの態様は、活性に必須でないアミノ酸残基中に変化を含有するＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸分子に関する。かかるＮＯＶＸタンパク質は、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３または５５とアミノ酸配列において異なっているが、生物活性を依然保持している。一つの実施形態では、単離核酸分子はタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここでタンパク質は、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４または５６のアミノ酸配列と少なくとも約５０％相同であるアミノ酸配列を含む。好ましくは、核酸分子によりコードするタンパク質は、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４または５６に少なくとも約６０％相同であり；より好ましくは、核酸分子によりコードするタンパク質は、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４または５６に少なくとも約７０％相同であり；さらに好ましくは、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４または５６に少なくとも約８０％相同であり；それよりさらにより好ましくは、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４または５６に少なくとも約９０％相同であり；最も好ましくは、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４または５６に少なくとも約９５％相同である。
【００５６】
配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４または５６のタンパク質に相同なあるＮＯＶＸタンパク質をコードする単離核酸分子を、１個またはそれ以上のアミノ酸の置換、付加または欠失をコードするタンパク質内に導入するように配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３または５５のヌクレオチド配列の中に１個またはそれ以上のヌクレオチドの置換、付加または欠失を導入することにより創成し得る。
【００５７】
突然変異を、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３または５５の中に、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ仲介性突然変異誘発のような、標準的技術により導入し得る。好ましくは、保存的アミノ酸置換を、予想する１個またはそれ以上の非必須アミノ酸残基において行う。「保存的アミノ酸置換」は、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えるアミノ酸残基中の一つである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該分野内で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖をもつアミノ酸(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖をもつアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、電荷のない側鎖をもつアミノ酸(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、無極性側鎖をもつアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ位側鎖をもつアミノ酸(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)、ならびに芳香族側鎖をもつアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を含む。従って、ＮＯＶＸタンパク質中に予想する非必須アミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基で置換する。これに代えて、もう一つの実施形態では、突然変異を、飽和突然変異誘発のように、あるＮＯＶＸコード化配列の全部または一部に沿って無作為に導入し得るし、得られた突然変異体をＮＯＶＸの生物学的活性についてスクリーニングして活性を保持する変異体を同定し得る。配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３または５５の突然変異誘発に引き続いて、コードされたタンパク質を当該分野において公知の任意の組換え技術で発現し、タンパク質の活性を測定し得る。
【００５８】
アミノ酸ファミリーの関連性を、側鎖の相互作用に基づいても決定し得る。置換したアミノ酸は、十分に保存された「強い」残基または十分に保存された「弱い」残基であり得る。保存したアミノ酸残基の「強い」群は、次の群のいずれか一つであり得る：ＳＴＡ、ＮＥＱＫ、ＮＨＱＫ、ＮＤＥＱ、ＱＨＲＫ、ＭＩＬＶ、ＭＩＬＦ、ＨＹ、ＦＹＷであり、ここでアミノ酸の一文字表記は、互いに置換し得るアミノ酸でグル−プ分けする。同様に、保存した残基の「弱い」群は、次のいずれか一つであり得る：ＣＳＡ、ＡＴＶ、ＳＡＧ、ＳＴＮＫ、ＳＴＰＡ、ＳＧＮＤ、ＳＮＤＥＱＫ、ＮＤＥＱＨＫ、ＮＥＱＨＲＫ、ＨＦＹであり、ここでそれぞれの群の文字はアミノ酸の一文字表記を表す。
【００５９】
一つの実施形態では、変異ＮＯＶＸタンパク質を、(i)他のＮＯＶＸタンパク質、他の細胞表面タンパク質またはそれらの生物学的活性部位と相互作用するタンパク質：タンパク質を形成する活性、(ii)変異ＮＯＶＸタンパク質とあるＮＯＶＸリガンド間の複合体形成、または(iii)細胞内標的タンパク質またはそれらの生物学的活性部位に結合する変異ＮＯＶＸタンパク質の活性についてアッセイし得る；(例えば、アビジンタンパク質)。
なおもう一つの実施形態では、変異ＮＯＶＸタンパク質を、特定の生物学的機能を調節する活性(例えば、インスリン分泌の調節)についてアッセイし得る。
【００６０】
妨害性ＲＮＡ
本発明の１の態様において、ＮＯＶＸ遺伝子発現をＲＮＡ妨害により弱めることができる。当該分野においてよく知られた１のアプローチは、短い妨害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）により媒介される遺伝子サイレント化であり、該アプローチにおいて、ＮＯＶＸ遺伝子転写物の少なくとも１９ないし２５ヌクレオチドの長さのセグメントに対して相補的であり、５’非翻訳（ＵＴ）領域、ＯＲＦ、または３’ＵＴ領域を含む、特異的な２本鎖ＮＯＶＸ由来のｓｉＲＮＡヌクレオチド配列により、ＮＯＶＸ遺伝子発現産物が標的とされる。例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ００／４４８９５、ＷＯ９９／３２６１９、ＷＯ０１／７５１６４、ＷＯ０１／９２５１３、ＷＯ０１／２９０５８、ＷＯ０１／８９３０４、ＷＯ０２／１６６２０、およびＷＯ０２／２９８５８参照（それぞれを参照により本明細書に一体化させる）。標的化される遺伝子はＮＯＶＸ遺伝子であってもよく、あるいはＮＯＶＸ遺伝子の上流または下流モジュレーターであってもよい。ＮＯＶＸ遺伝子の上流または下流モジュレーターの非限定的な例は、例えば、ＮＯＶＸ遺伝子プロモーターに結合する転写因子ＮＯＶＸポリペプチドと相互作用するキナーゼまたはホスファターゼ、ならびにＮＯＶＸ調節経路に含まれるポリペプチドである。
【００６１】
本発明の方法によれば、妨害性ＲＮＡを用いてＮＯＶＸ遺伝子発現がサイレント化される。本発明のＮＯＶＸポリヌクレオチドはｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを包含する。ＮＯＶＸポリヌクレオチド配列を用いて、例えば、ショウジョウバエ抽出物（これに限らない）のごとき無細胞系でＮＯＶＸポリヌクレオチド配列をプロセッシングすることにより、あるいは組み換え型２本鎖ＮＯＶＸ ＲＮＡの転写により、あるいはＮＯＶＸ配列に相同的なヌクレオチド配列を合成することにより、かかるＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡを得ることができる。例えば、Tuschul, Zamire, Lehmann, Bartel and Sharp (1999), Genes & Dev. 13: 3191-3197参照（参照により本発明系に一体化させる）。合成する場合、典型的な０．２マイクロモラースケールのＲＮＡ合成により約１ミリグラムのｓｉＲＮＡが得られ、それは２４ウェルの組織培養プレートフォーマットを用いる１０００回のトランスフェクション実験に十分なものである。
【００６２】
最も効率的なサイレント化は、一般的には、２ヌクレオチドの３’オーバーハングを有するように対合された２１ヌクレオチドのセンス鎖および２１ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ２本鎖を用いて観察される。２ヌクレオチドの３’オーバーハングの配列は、ｓｉＲＮＡの標的認識の特異性にさらなる小さな貢献をする。特異性に対する貢献は最初に対合した塩基に隣接した未対合ヌクレオチドに局在化される。１の実施形態において、３’オーバーハング中のヌクレオチドはリブヌクレオチドである。別の実施形態において、３’オーバーハング中のヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドである。３’オーバーハング中の２’−デオキシリボヌクレオチドを用いることはリボヌクレオチドの使用として有効であるが、デオキシリボヌクレオチドはしばしば合成費用が安く、よりヌクレアーゼ耐性である可能性が最も高い。
【００６３】
本発明の企図される組み換え型発現ベクターは、両方の鎖の発現（ＤＮＡ分子の転写による）を可能にするような様式でＮＯＶＸ配列に作動可能に連結された近接調節配列を含む発現ベクター中に組み込まれたＮＯＶＸ ＤＮＡ分子を含む。ＮＯＶＸ ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子は第１のプロモーター（例えば、クローン化ＤＮＡの３’プロモーター配列）により転写され、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡに対してセンス鎖であるＲＮＡ分子が第２のプロモーター（クローン化ＤＮＡの５’プロモーター配列）により転写される。センスおよびアンチセンス鎖はインビボでハイブリダイゼーションして、ＮＯＶＸ遺伝子のサイレント化のためのｓｉＲＮＡ構築物を生じる。別法として、２つの構築物を用いて、ｓｉＲＮＡ構築物のセンスおよびアンチセンス鎖を作成することもできる。結局、クローン化ＤＮＡは第２の構造を有する構築物をコードするものであり得、単一の転写物は、標的遺伝子（複数も可）由来のセンスおよび相補的アンチセンス配列を有するものである。この実施形態の一例において、ヘアピンＲＮＡｉ産物は標的遺伝子のすべてまたは一部に対して相同的である。もう１つの例において、ヘアピンＲＮＡｉ産物はｓｉＲＮＡである。ＮＯＶＸ配列に近接した調節配列は、それらの発現が独立してモジュレーションされ、あるいは時間的または位置的にモジュレーションされうるならば、同一であってもよく、異なっていてもよい。
【００６４】
特別な実施形態において、例えば、より小型の核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）Ｕ６またはヒトＲＮａｓｅ Ｐ ＲＮＡ Ｈ１に由来するＲＮＡｐｏｌ ＩＩＩ転写ユニットを含むベクター中にＮＯＶＸ遺伝子鋳型を組み込むことにより、ｓｉＲＮＡは細胞内で転写される。ベクター系の１例はGeneSuppressor(商標)RNA Interference kit （Imgenexから市販されている）である。Ｕ６およびＨ１プロモーターはｐｏｌ ＩＩＩプロモーターのタイプＩＩＩクラスのメンバーである。Ｕ６様プロモーターの＋１ヌクレオチドは常にグアノシンであるが、Ｈ１プロモーターの＋１はアデノシンである。これらのプロモーターのターミネーションシグナルは５個の連続したチミジンにより定義される。典型的には、転写物を２つ目のウリジンの後ろで開裂させる。この位置での開裂は、発現されたｓｉＲＮＡ中に３’ＵＵオーバーハングを生じさせ、それは合成ｓｉＲＮＡの３’オーバーハングと類似である。長さ４００ヌクレオチド未満の配列をこれらのプロモーターにより転写させることができ、それゆえ、それらは約２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡを例えば約５０ヌクレオチドのＲＮＡステムループ転写物中に発現させることに理想的に適したものである。
【００６５】
長時間の発現ノックダウンが必要な場合に、ｓｉＲＮＡベクターは合成ｓｉＲＮＡよりも有利であると考えられる。ｓｉＲＮＡ発現ベクターでトランスフェクションされた細胞は安定で、長時間のｍＲＮＡ阻害をこうむるであろう。対照的に、外来性合成ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされた細胞は、典型的には７日以内あるいは１０ラウンドの細胞分裂の間にｍＲＮＡサプレッションから回復する。ｓｉＲＮＡ発現ベクターの長時間の遺伝子サイレント化能は遺伝子治療への適用を可能にしうる。
【００６６】
一般的には、ｓｉＲＮＡは、ＤＩＣＥＲと呼ばれるＡＴＰ依存性リボヌクレアーゼにより、より長いｄｓＲＮＡから切断される。ＤＩＣＥＲは２本鎖ＲＮＡ特異的エンドヌクレアーゼのＲＮａｓｅＩＩＩファミリーのメンバーである。ｓｉＲＮＡは細胞蛋白とともに集合してエンドヌクレアーゼ複合体となる。ショウジョウバエにおけるインビトロでの研究は、ｓｉＲＮＡ／蛋白複合体（ｓｉＲＮＰ）がその後ＤＩＥＣＲとは異なるエンドリボヌクレアーゼを含むＲＮＡ誘導サイレンス化複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれる第２の酵素複合体に転移されることを示唆している。ＲＩＳＣはｓｉＲＮＡ鎖によりコードされる配列を用いて相補的配列のｍＲＮＡを見つけて破壊する。かくしてｓｉＲＮＡはガイドとして作用し、２本のｓｉＲＮＡ鎖の一方に相補的なｍＲＮＡのみを開裂するようにリボヌクレアーゼを制限する。
【００６７】
ｓｉＲＮＡにより標的化されるべきＮＯＶＸ ｍＲＮＡ領域は、一般的には、スタートコドンの５０ないし１００ヌクレオチド下流から開始する所望ＮＯＶＸ配列から選択される。別法として、５’または３’ＵＴＲおよびスタートコドン付近の領域を用いることができるが、一般的には避けられる。なぜならこれらは調節蛋白結合部位において豊富だからである。ＵＴＲ結合蛋白および／または翻訳開始複合体はｓｉＲＮＰまたはＲＩＳＣエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨害しうる。選択されたｓｉＲＮＡ配列に関する最初のＢＬＡＳＴ相同性サーチを利用可能なヌクレオチド配列ライブラリーに対して行って、ただ１つの遺伝子が標的化されることを確実にする。ｓｉＲＮＡ２本鎖による標的認識特異性は、ｓｉＲＮＡの対合領域に存在する単一の点突然変異が標的ｍＲＮＡの分解を妨げるに十分であることを示す。Elbashir et al. 2001 EMBO J. 20(23):6877-88参照。それゆえ、所望遺伝子を標的化する場合、ＳＮＰ、多型、対立遺伝子変種または種特異的変化をうまく考慮すべきである。
【００６８】
１の実施形態において、完全なＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡ実験は正しい負の対照を用いるものである。一般的には、負の対照ｓｉＲＮＡはＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡと同じヌクレオチド組成を有するが、ゲノムに対して有意な配列相同性を欠いている。典型的には、ＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列をスクランブルし、相同性検索を行って、それが他のいすれの遺伝子とも相同性を欠いていることを確認する。
【００６９】
２つの独立したＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡ２本鎖を用いて標的ＮＯＶＸ遺伝子をノックダウンすることができる。このことはサイレント化効果の特異性を制御することを助ける。さらに、等しい濃度の異なるＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡ２本鎖、例えば、ＮＯＶＸ遺伝子またはポリペプチドのレギュレーターに関するＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡを用いることにより、２つの独立した遺伝子の発現を同時にノックダウンすることができる。ｓｉＲＮＡ結合蛋白の利用可能性は標的ｍＲＮＡアクセス可能性よりも限定的であると考えられる。
【００７０】
典型的には、標的化されたＮＯＶＸ領域は、１９個（Ｎ１９）の残基のスペーサー領域により分けられた２個のアデニン（ＡＡ）および２個のチミジン（ＴＴ）である（例えば、ＡＡ（Ｎ１９）ＴＴ）。望ましいスペーサー領域は約３０〜７０％、より好ましくは約５０％のＧ／Ｃ−含量を有する。配列ＡＡ（Ｎ１９）ＴＴが標的配列中に存在しない場合、別の標的領域はＡＡ（Ｎ２１）であろう。ＮＯＶＸセンスｓｉＲＮＡの配列は（Ｎ１９）ＴＴまたはＮ２１にそれぞれ対応する。後者の場合、かかる配列が本質的にＮＯＶＸポリヌクレオチド中に存在しないならば、センスｓｉＲＮＡの３’末端のＴＴへの変換を行うことができる。この配列変換の論理的解釈は、センスおよびアンチセンス３’オーバーハングの配列組成に関して対称な２本鎖を生じさせることである。対称な３’オーバーハングは、センスおよびアンチセンス標的ＲＮＡ−開裂ｓｉＲＮＰの適切な等しい割合でｓｉＲＮＰが形成されることを確実ならしめることを助けることができる。例えば、Elbashir, Lendeckel and Tuschl (2001). Genes & Dev. 15: 188-200参照（参照により本明細書に一体化させる）。ｓｉＲＮＡ２本鎖のセンス配列のオーバーハングの修飾が標的化されたｍＲＮＡの認識に影響するとは考えられない。なぜならアンチセンスｓｉＲＮＡ鎖は標的認識をガイドするからである。
【００７１】
別法として、ＮＯＶＸ標的ｍＲＮＡが適当なＡＡ（Ｎ２１）配列を含まない場合、配列ＮＡ（Ｎ２１）をサーチしてもよい。さらに、センス鎖およびアンチセンス鎖の配列を５’（Ｎ１９）ＴＴとして合成してもよい。なぜならアンチセンスｓｉＲＮＡの３’側の大部分のヌクレオチドの配列は特異性に貢献しないからである。アンチセンスまたはリボザイム法とは違って、標的ｍＲＮＡの２次構造はサイレンス化に強く影響するとは考えられない。Harborth, et al. (2001) J. Cell Science 114: 4557-4565参照（参照により本明細書に一体化させる）。
【００７２】
標準的な核酸トランスフェクション法、例えば、OLIGOFECTAMINE Reagent（Invitrogenから市販されている）を用いてＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡ２本鎖のトランスフェクションを行うことができる。一般的には、ＮＯＶＸ遺伝子サイレンシングに関するアッセイをトランスフェクションから約２日後に行う。トランスフェクション試薬の不存在下において、ＮＯＶＸ遺伝子サイレント化は観察されず、野生型およびサイレント化ＮＯＶＸ表現型の比較分析が可能であった。特別な実施形態において、２４ウェルプレートの１つのウェルには通常約０．８４μｇのｓｉＲＮＡ２本鎖で十分である。典型的には、細胞を前日に撒き、約５０％集密になったところでトランスフェクションする。細胞培地および培養条件の選択は等業者が通常行うことであり、細胞タイプの選択により変更されるであろう。トランスフェクションの効率は細胞タイプのみならず細胞の継代数および集密度に依存する。ｓｉＲＮＡ−リポソーム複合体の形成時間および方法（例えば、倒置かボルテックスか）も重要である。低いトランスフェクション効率はＮＯＶＸサイレント化の不成功の最大の原因である。使用する新たな細胞系に関してトランスフェクション効率を注意深く調べることが必要である。好ましい細胞は哺乳動物由来であり、より好ましくはラットまたはマウスのごときげっ歯類由来であり、最も好ましくはヒト由来である。治療的処置に使用する場合、好ましくは細胞は自己由来のものであるが、非−自己由来の細胞ソースも本発明の範囲内とされる。
【００７３】
対照実験に関し、０．８４μｇの１本鎖センスＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡのトランスフェクションはＮＯＶＸサイレント化に影響せず、０．８４μｇのアンチセンス ｓｉＲＮＡは、０．８４μｇの２本鎖ｓｉＲＮＡと比較すると弱いサイレント化効果を有する。対照実験はさらに野生型およびサイレント化ＮＯＶＸ表現型の比較分析を可能にする。トランスフェクション効率を制御するために、典型的には通常蛋白の標的化を行う。例えば、ラミンＡ／Ｃの標的化あるいはＣＭＶにより駆動されるＥＧＦＰ発現プラスミド（例えば、Clontechから市販されている）のトランスフェクションを行う。上例において、イムノフルオレッセンス、ウェスタンブロット、ノーザンブロットあるいは蛋白発現または遺伝子発現に関する他の類似のアッセイのごとき方法により、細胞中のラミンＡ／Ｃノックダウンのフラグメントを翌日に行う。ラミンＡ／Ｃモノクローナル抗体をSanta Cruz Biotechnologyから得た。
【００７４】
細胞中の標的化ＮＯＶＸポリヌクレオチドの豊富さおよび半減期（またはターンオーバー）にもよるが、１〜３日後あるいはその後にノックダウン表現型が明らかにされうる。ＮＯＶＸノックダウン表現型が観察されない場合には、トランスフェクションされたｓｉＲＮＡ２本鎖により標的ｍＲＮＡ（ＮＯＶＸまたはＮＯＶＸ上流または下流遺伝子）が効果的に破壊されたかどうかを分析することが望ましいかもしれない。トランスフェクションから２日後、全ＲＮＡを調製し、標的特異的プライマーを用いて逆転写し、少なくとも１つのエキソン−エキソンジャンクションを変換するプライマーペアーを用いてＰＣＲ増幅を行ってプレ−ｍＲＮＡの増幅を制御する。非標的化ｍＲＮＡのＲＴ／ＰＣＲも対照として必要である。ｍＲＮＡの効果的な枯渇であるが検出できない標的蛋白の減少は、安定なＮＯＶＸ蛋白の大きなリザーバーが細胞中に存在することを示しうる。標的蛋白が最終的に枯渇して表現型が明らかにされうるに至るには、十分に長いインターバルでの複数回のトランスフェクションが必要であるかもしれない。複数回のトランスフェクション工程が必要な場合、トランスフェクションから２〜３日後に細胞を分ける。分けた直後に細胞をトランスフェクションしてもよい。
【００７５】
本発明の治療方法は、増加あるいは逸脱したＮＯＶＸ発現または活性を補正するための治療としてＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡ構築物を投与することを企図する。上記のごとく、ＮＯＶＸリボポリヌクレオチドを得て、ｓｉＲＮＡフラグメントにプロセッシングするか、あるいはＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡを合成する。上記のごとく、既知の核酸トランスフェクション法を用いてＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡを細胞または組織に投与する。ＮＯＶＸ遺伝子に特異的なＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡはＮＯＶＸ転写産物を減少またはノックダウンし、そのことはＮＯＶＸポリペプチド生成を減少させ、細胞または組織中のＮＯＶＸポリペプチド活性を低下させる。
【００７６】
また本発明は、個体におけるＮＯＶＸ蛋白の存在に関連する疾病または症状の治療方法を包含し、該方法は、分解されるべき蛋白のｍＲＮＡ（該蛋白をコードするｍＲＮＡ）を標的化するＲＮＡｉ構築物を個体に投与することを特徴とする。特別なＲＮＡｉ構築物はｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡにプロセッシングされる２本鎖遺伝子転写物を含む。治療により、標的蛋白が産生されなくなるか、あるいは治療を行わない場合よりも産生の程度が低下する。
【００７７】
ＮＯＶＸ遺伝子機能が既知表現型と相関関係を有しない場合、健康個体由来の細胞または組織の対照試料により、ＮＯＶＸ発現レベルを決定するためのリファレンス標準が提供される。説明したアッセイ、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロッティング、ＥＬＩＳＡ等を用いて発現レベルを検出する。疾病状態にある哺乳動物、好ましくはヒト対象から細胞または組織の試料を採取する。細胞または組織中への核酸のトランスフェクションに関して説明した方法によりＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡを細胞または組織に投与することによってこれらの細胞または組織を処理し、説明したアッセイを用いて対象試料中のＮＯＶＸポリペプチドまたはポリヌクレオチド発現の変化を観察し、対照試料のものと比較する。このＮＯＶＸ遺伝子ノックダウン法は、治療対象試料中のＮＯＶＸマイナス（ＮＯＶＸ−）表現型を決定するための迅速法を提供する。かくして、治療対象試料中において観察されたＮＯＶＸ−表現型は、治療中の疾病状態の経過観察のためのマーカーとして役立つ。
【００７８】
特別な実施形態において、ＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡを治療に用いる。ＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡの生成および使用方法は等業者に知られている。方法の例を以下に示す。
【００７９】
ＲＮＡの生成
ＲＮＡ発現ベクターにおける転写のごとき既知方法を用いてＮＯＶＸのセンスＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）およびアンチセンス（ａｓＲＮＡ）を得る。最初の実験において、センスおよびアンチセンスＲＮＡはそれぞれ約５００塩基の長さである。得られたｓｓＲＮＡおよびａｓＲＮＡ（０．５μＭ）を２０ｍＭのＮａＣｌを含有する１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中で９５℃にて１分間加熱し、次いで、冷却し、室温で１２ないし１６時間アニーリングさせる。ＲＮＡを沈殿させ、溶解バッファー（下記）中に再懸濁させる。アニーリングをモニターするために、ＴＢＥバッファー中の２％アガロースゲル中でＲＮＡを電気泳動させ、臭化エチジウムで染色する。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.(1989)参照。
【００８０】
溶解物の調製
製造者（Ambion）の指示に従って未処理ウサギ網状赤血球溶解物を集める。ｄｓＲＮＡを溶解物中３０℃で１０分間インキュベーションし、次いで、ｍＲＮＡを添加する。その後、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡを添加し、さらに６０分インキュベーションを続ける。２本鎖ＲＮＡとｍＲＮＡとのモル比は約２００：１である。ＮＯＶＸ ｍＲＮＡを放射性標識し（既知方法を用いて）、その安定性をゲル電気泳動によりモニターする。
【００８１】
同じ条件で平行して行う実験において、３２Ｐ−ＡＴＰを用いて２本鎖ＲＮＡを内部で放射性標識する。２ＸプロテイナーゼＫバッファーにより反応を停止させ、すでに記載されているようにして（Tuschl et al., Genes Dev., 13: 3191-3197）脱蛋白する。適当なＲＮＡ標準を用いて１５％または１８％ポリアクリルアミド配列決定用ゲル中での電気泳動により生成物を分析する。ゲルを放射活性についてモニターすることにより、２本鎖ＲＮＡからの１０ないし２５ヌクレオチドのＲＮＡの自然な生成を調べることができる。
【００８２】
約２１〜２３ｂｐの２本鎖ＲＮＡのバンドを溶出する。これらの２１〜２３量体ＮＯＶＸ転写抑制の有効性を、各アッセイにつき５０ナノモラーの２本鎖２１〜２３量体を用いて上記と同じウサギ網状赤血球を用いてインビトロにてアッセイする。次いで、これらの２１〜２３量体の配列を標準的な核酸配列決定法を用いて決定する。
【００８３】
ＲＮＡの調製
上で決定された配列に基づいて、Expedite RNA phosphoramidites and thymidine phosphoramidite（Proligo, Germany）２１を用いてヌクレオチドのＲＮＡを化学合成する。合成オリゴヌクレオチドを脱保護し、ゲル精製（Elbashir, Lendeckel, & Tuschl, Genes & Dev. 15, 188-200 (2001)）し、次いで、Sep-Pak C18 cartridge（Waters, Milford, Mass., USA）で精製（Tuschl, et al., Biochemistry, 32:11658-11668 (1993)）する。
これらのＲＮＡ（２０μＭ）１本鎖をアニーリングバッファー中、９０℃で１分間インキュベーションし、次いで、３７℃で１時間インキュベーションする。
【００８４】
細胞培養
ＮＯＶＸを規則的に発現させるための当該分野において知られた細胞培養を、標準的条件を用いて行う。トランスフェクションの２４時間前に、約８０％集密において、細胞をトリプシン処理し、抗生物質不含の新鮮培地で１：５に希釈（１〜３ｘ１０５個／ｍｌ）し、２４ウェルプレートに移す（５００ｍｌ／ウェル）。市販リポフェクションキットを用いてトランスフェクションを行い、陽性および陰性対照を付して標準的方法を用いてＮＯＶＸ発現をモニターする。陽性対照は本来的にＮＯＶＸを発現する細胞であり、陰性対照はＮＯＶＸを発現しない細胞である。オーバーハング３’を有する塩基対合した２１および２２ヌクレオチドのｓｉＲＮＡは、溶解物および細胞培養において、効果的な配列特異的ｍＲＮＡ分解を媒介する。異なる濃度のｓｉＲＮＡを用いる。哺乳動物細胞培養の場合のインビトロでのサプレッションに効果的な濃度は２５ｎＭないし１００ｎＭの最終濃度である。このことは、慣用的なアンチセンスまたはリボザイム遺伝子標的化実験に用いる濃度よりも数オーダー低い濃度のｓｉＲＮＡが有効であることを示す。
【００８５】
上記方法は、ＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡ配列の推論およびかかるｓｉＲＮＡのイオンビトロサプレッションへの使用の両方のための方法を提供する。よく知られたインビボトランスフェクションまたは遺伝子治療トランスフェクション法を用い、同じｓｉＲＮＡを用いてインビボサプレッションを行ってもよい。
【００８６】
アンチセンス核酸
本発明のもう一つの態様は、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３または５５のヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはそれらのフラグメント、相同体または誘導体、とハイブリダイズ可能なまたは相補的な単離アンチセンス核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的な(例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード化鎖に相補的な、またはｍＲＮＡ配列に相補的な)ヌクレオチド配列を含む。特別な態様では、少なくとも約１０、２５、５０、１００、２５０、または５００のヌクレオチドまたは全ＮＯＶＸコード化鎖に相補的な配列、またはそれらの一部のみにを含むアンチセンス核酸分子を提供する。配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４または５６のあるＮＯＶＸタンパク質のフラグメント、相同体、誘導体および類似体をコードする核酸分子、または配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３または５５のあるＮＯＶＸ核酸配列に相補的なアンチセンス核酸を加えて提供する。
【００８７】
一つの実施形態では、アンチセンス核酸分子は、あるＮＯＶＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコード化鎖の「コード化領域」に対するアンチセンスである。用語「コード化領域」は、アミノ酸残基に翻訳するコドンを含むヌクレオチド配列の領域を指す。もう一つの実施形態では、アンチセンス核酸分子は、ＮＯＶＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコード化鎖の「非コード化領域」に対するアンチセンスである。用語「非コード化領域」は、アミノ酸に翻訳しないコード化領域に隣接する５'配列および３'配列を指す(即ち、５'非翻訳領域および３'非翻訳領域とも呼ぶ)。
【００８８】
本明細書に開示するＮＯＶＸタンパク質をコードするコード化鎖の配列を与えると、本発明のアンチセンス核酸をWatsonとCrickまたはHoogsteenの塩基対の規則にしたがってデザインし得る。アンチセンス核酸分子は、ＮＯＶＸのｍＲＮＡの全コード化領域と相補的であり得るが、さらに好ましくは、ＮＯＶＸのｍＲＮＡのコード化または非コード化領域の一部のみに対するアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＮＯＶＸのｍＲＮＡの翻訳開始部位を囲む領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、長さ約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ヌクレオチドであり得る。本発明のアンチセンス核酸を、当該分野において公知の手順を用いる化学合成または酵素ライゲーション反応を用いて構築し得る。例えば、アンチセンス核酸(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド)は、天然に存在するヌクレオチドまたは分子の生物学的安定性を増加またはアンチセンス核酸とセンス核酸の間で形成する二本鎖の物理的安定性を増加するようデザインした様々に修飾したヌクレオチドを用いて、化学合成し得る(例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジンで置換したヌクレオチドを使用しうる)。
【００８９】
アンチセンス核酸を作成に使用し得る修飾ヌクレオチドの例として以下のものを挙げる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルクエノシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２,２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、５−メトキシウラシル、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸(ｖ)、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、ウラシル−５−オキシ酢酸(ｖ)、５−メチル−２−チオウラシル、３−(３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル)ウラシル、(ａｃｐ３)ｗ、および２、６−ジアミノプリン。これに代えて、アンチセンス核酸を、核酸がアンチセンスの配向(即ち、挿入した核酸から転写したＲＮＡが、興味ある標的核酸に対するアンチセンスの配向であり、以下の小節でさらに説明する)においてサブクローニングする発現ベクターを使用して生物学的に生産し得る。
【００９０】
本発明のアンチセンス核酸分子を、それらがあるＮＯＶＸタンパク質をコードする細胞性ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズまたは結合し、それにより(例えば、転写および／または翻訳を阻害することにより)タンパク質発現を阻害するように典型的に対象に投与するか、または組織で作成する。ハイブリダイゼーションは、安定な二本鎖を形成する従来のヌクレオチドの相補性によるものでもあり得る。または、例えば、ＤＮＡ二本鎖に結合するアンチセンス核酸の場合には、二本鎖の大溝での特異的相互作用を介するものであり得る。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例として、組織部位への直接の注射を挙げる。これに代えて、アンチセンス核酸分子を、選択した細胞標的へ修飾しそこで全身性に投与し得る。例えば、全身性投与のために、アンチセンス分子を、選択した細胞表面上に発現する受容体または抗原に特異的に結合するように(例えば、ペプチドにアンチセンス核酸分子を連結させることまたは細胞表面受容体または抗原に結合する抗体により)修飾し得る。アンチセンス核酸分子をまた、本明細書に説明するベクターを用いて細胞に送達し得る。十分な核酸分子を送達するために、アンチセンス核酸分子を強力なｐｏｌＩＩプロモーターまたはｐｏｌＩＩＩプロモーターの調節下に置くベクター構造が好ましい。
【００９１】
なおもう一つの実施形態では、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補的ＲＮＡと特異的二本鎖ハイブリッドを形成し、これは通常のβユニットとは反対で鎖が互いに並行に走行する。例えば、Gaultier, et al., 1987. Nucl. Acids Res. 15: 6625-6641を参照されたい。アンチセンス核酸分子はまた、２'−ｏ−メチルリボヌクレオチド(例えば、Inoue, et al. 1987. Nucl. Acids Res. 15: 6131-6148を参照)またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体(例えば、Inoue, et al., 1987. FEBS Lett. 215: 327-330を参照)を含み得る。
【００９２】
リボザイムおよびＰＮＡ部分
核酸の修飾は、非限定的な例として、修飾した塩基、および糖リン酸主鎖を修飾または誘導した核酸を挙げる。これらの修飾を少なくとも部分的に行い、例えば対象への治療応用において核酸へ結合するアンチセンスとして使用し得るように修飾した核酸の化学的安定性を増強する。
【００９３】
１の実施形態では、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、それらが相補的領域を有するｍＲＮＡのような一本鎖核酸を切断する能力のあるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒活性ＲＮＡ分子である。従って、リボザイム(例えば、Haselhoff and Gerlach 1988. Nature 334: 585-591に記載されているようなハンマーヘッドリボザイム)を使用して、ＮＯＶＸのｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断し、それによりＮＯＶＸのｍＲＮＡの翻訳を阻害し得る。ＮＯＶＸをコードする核酸に対する特異性を有するリボゾームは、本明細書に開示するあるＮＯＶＸｃＤＮＡのヌクレオチド配列(即ち、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３または５５)に基づいてデザインし得る。例えば、その中で活性部位のヌクレオチド配列がＮＯＶＸをコードするｍＲＮＡ中で切断し得るヌクレオチド配列に相補的であるTetrahymenaＬ−１９ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体を構築し得る。例えば、Cech, et al.の米国特許第４,９８７,０７１号およびCech, et al.の米国特許第５,１１６,７４２号を参照されたい。ＮＯＶＸ ｍＲＮＡをまた、ＲＮＡ分子のプールから特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡを選択するのに使用し得る。例えば、Bartel et al., (1993) Science 261:1411-1418を参照されたい。
【００９４】
一方、ＮＯＶＸ遺伝子発現は、ＮＯＶＸ核酸の調節領域(例えば、ＮＯＶＸプロモーターおよび／またはエンハンサー)に相補的なヌクレオチド配列を標的とすることで阻害し、標的細胞中のＮＯＶＸ遺伝子の転写を阻止するトリプルヘリカル構造を形成し得る。例えば、Helene, 1991. Anticancer Drug Des. 6: 569-84; Helene, et al. 1992. Ann. N.Y. Acad. Sci. 660: 27-36; Maher, 1992. Bioassays 14: 807-15を参照されたい。
【００９５】
種々の実施形態において、ＮＯＶＸ核酸を塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格部分において修飾し、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは溶解度を改善し得る。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸骨格を修飾して、ペプチド核酸を生成し得る。例えば、Hyrup, et al., 1996. Bioorg Med Chem 4: 5-23を参照されたい。本明細書において使用する用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、デオキシリボースリン酸骨格を擬似ペプチド骨格で置換し、４個の核酸塩基のみを保持する核酸模倣体(例えばＤＮＡ模倣体)を指す。ＰＮＡの中性骨格は、低イオン強度の条件下でＤＮＡおよびＲＮＡへの特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることを示す。ＰＮＡオリゴマーの合成を、Hyrup, et al., 1996. supra; Perry-O'Keefe, et al., 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 14670-14675に記載されているように、標準固相ペプチド合成プロトコールを用いて実施し得る。
【００９６】
ＮＯＶＸのＰＮＡを治療的応用および診断的応用に使用し得る。例えば、ＰＮＡを、例えば転写または翻訳停止を誘導することまたは複製を阻害することにより、遺伝子発現の配列特異的調整のためのアンチセンスまたは抗原薬剤として使用し得る。ＮＯＶＸのＰＮＡはまた、例えば、遺伝子中の単塩基対変異の分析(例えば、ＰＣＲ固定を指示するＰＮＡ；他の酵素、例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ、との組合せで使用し得る人工的制限酵素として(Hyrup, et al., 1996.supraを参照)；またはＤＮＡ配列およびハイブリダイゼーションのプローブまたはプライマーとして(Hyrup, et al., 1996, supra; Perry-O'Keefe, et al., 1996. supraを参照))にも使用し得る。
【００９７】
もう一つの実施形態では、ＮＯＶＸのＰＮＡを修飾して、例えば、ＰＮＡに親油性なまたは他の補助的な基をＰＮＡに結合することにより、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの生成により、またはリポソームまたは当該分野において公知の他の薬剤送達技術の使用によりそれらの安定性または細胞への取り込みを増強し得る。例えば、ＰＮＡとＤＮＡの有益な性質を結合し得るＮＯＶＸのＰＮＡ−ＤＮＡキメラを生成し得る。かかるキメラは、ＤＮＡ認識酵素(例えば、ＲＮａｓｅ ＨおよびＤＮＡポリメラーゼ)がＤＮＡ部分と相互作用し、一方でＰＮＡ部分が結合高親和性および結合高特異性を提供することを可能にする。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基結合、ヌクレオチド塩基間の結合数および配向について選択した適当な長さのリンカーを使用して結合し得る(Hyrup, et al., 1996. supraを参照)。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成を、Hyrup, et al., 1996. supra および Finn, et al., 1996. Nucl Acids Res 24: 3357-3363に記載のように実施し得る。例えば、ＤＮＡ鎖を、標準ホスホラミダイトカップリング化学反応を使用して固相支持体上で合成し得る。そして修飾したヌクレオシド類似体、例えば、5'-(4-メトキシトリチル)アミノ-5'-デオキシチミジンホスホラミダイトをＰＮＡとＤＮＡの５'末端間で使用し得る。例えば、Mag, et al., 1989. Nucl Acid Res 17: 5973-5988を参照されたい。次いで、ＰＮＡモノマーを段階的にカップリングし、５'ＰＮＡセグメントおよび３'ＤＮＡセグメントを有するキメラ分子を生成する。例えば、Finn, et al., 1996. supraを参照されたい。これに代えて、キメラ分子を５'ＤＮＡセグメントおよび３'ＰＮＡセグメントで合成することもできる。例えば、Petersen, et al., 1975. Bioorg. Med. Chem. Lett. 5: 1119-11124を参照されたい。
【００９８】
他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ペプチドのような添付群(例えば、インビボにおいて宿主細胞レセプターを標的とするため)、または細胞膜(例えば、Letsinger, et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 6553-6556; Lemaitre, et al., 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 648-652; ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０を参照)または血液脳関門(例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４を参照)を横切る輸送を促進する薬剤を含み得る。加えて、オリゴヌクレオチドを、ハイブリダイゼーション誘発性切断剤(例えば、Krol, et al., 1988. BioTechniques 6:958-976を参照)または挿入剤(例えば、Zon, 1988. Pharm. Res. 5: 539-549を参照)で修飾し得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドを、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発性架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発性切断剤等と複合し得る。
【００９９】
ＮＯＶＸポリペプチド
本発明に従うポリペプチドは、配列が配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４または５６において提供するＮＯＶＸポリペプチドのアミノ酸配列を含有するポリペプチドを含む。本発明はまた、その任意の残基が、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４または５６に示す対応する残基から変換し得る一方で、そのＮＯＶＸ活性および生理機能を保持するタンパク質、またはそれらの機能的フラグメントを依然コードする変異タンパク質または変種タンパク質を含む。
【０１００】
一般に、ＮＯＶＸ様機能を保持するあるＮＯＶＸ変異体は、配列中の特定部位の残基を他のアミノ酸で置換する任意の変異体を含み、親タンパク質の２個の残基間にもう一残基または複数残基を挿入する可能性ならびに親配列から１個またはそれ以上の残基を欠失する可能性をさらに含む。任意のアミノ酸の置換、挿入または欠失を本発明に包含する。好ましい状況では、置換は上で定義した保存的置換である。
【０１０１】
本発明の一つの態様は、単離ＮＯＶＸタンパク質およびそれらの生物活性部分、またはそれらの誘導体、フラグメント、類似体、または相同体に関する。また、抗ＮＯＶＸ抗体産生用の免疫源としての使用に適当なポリペプチドフラグメントも提供し得る。一つの実施形態では、細胞または組織供給源から標準タンパク質精製技術を使用する適当な精製スキームにより天然のＮＯＶＸタンパク質を単離し得る。もう一つの実施形態では、ＮＯＶＸタンパク質を、組換えＤＮＡ技術により生産する。組換え発現に代えて、あるＮＯＶＸタンパク質またはポリペプチドを、標準ペプチド合成技術を使用して化学的に合成し得る。
【０１０２】
「単離」または「精製」ポリペプチドまたはタンパク質またはそれらの生物活性部分は、ＮＯＶＸタンパク質の由来する細胞供給源または組織供給源の細胞性物質または他の混入タンパク質を実質的に含まず、または化学的に合成したと際化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。「細胞性物質が実質的に含まれていない」という用語は、タンパク質を単離または組換え的に生産した元の細胞の細胞成分からタンパク質を分離したＮＯＶＸタンパク質の標本を含む。一つの実施形態では、「細胞原料が実質的に含まれていない」という用語は、約３０％(乾燥重量比)未満の非ＮＯＶＸタンパク質(ここでは「混入タンパク質」とも言う)、さらに好ましくは約２０％未満の非ＮＯＶＸタンパク質、なおさらに好ましくは約１０％未満の非ＮＯＶＸタンパク質、そして最も好ましくは約５％未満の非ＮＯＶＸタンパク質を有するＮＯＶＸタンパク質の標本を含む。ＮＯＶＸタンパク質またはそれらの生物活性部分を組換え的に生産する際には、それはまた、好ましくは培地を実質的に含まず、即ち、培地はＮＯＶＸタンパク質標本の容積の約２０％未満、さらに好ましくは約１０％未満、そして最も好ましくは５％未満を表す。
【０１０３】
「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という用語は、ＮＯＶＸタンパク質の標本を含み、ここでタンパク質を、タンパク質の合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質から分離する。一つの実施形態では、「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という用語は、約３０％未満(乾燥重量比)の化学的前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質、さらに好ましくは約２０％未満の化学的前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質、なおさらに好ましくは約１０％未満の化学的前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質、および最も好ましくは約５％未満の化学的前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質を有するＮＯＶＸタンパク質の標本を含む。
【０１０４】
ＮＯＶＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、全長ＮＯＶＸタンパク質より少ないアミノ酸を含有しＮＯＶＸタンパク質の少なくとも一つの活性を示すＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列(例えば、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４または５６に十分相同なアミノ酸配列またはＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列)に由来するアミノ酸配列を含むペプチドを含む。典型的に、生物学的に活性な部分は、ＮＯＶＸタンパク質の少なくとも一つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。あるＮＯＶＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば１０、２５、５０、１００またはそれ以上のアミノ酸残基の長さのポリペプチドであり得る。
さらに、タンパク質の他の領域が欠失した他の生物学的に活性な部分を、組換え技術で調製しそして天然のＮＯＶＸタンパク質の機能活性の一つまたはそれ以上について評価し得る。
【０１０５】
一つの実施形態では、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４または５６に示すアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４または５６に実質的に相同であり、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４または５６のタンパク質の機能活性を保持するが、なお以下に詳述するように天然の対立遺伝子の変異体または変異に因りアミノ酸配列を異にする。従って、もう一つの実施形態では、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４または５６のアミノ酸配列と少なくとも約４５％相同なアミノ酸配列を含み、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４または５６のＮＯＶＸタンパク質の機能活性を保持するタンパク質である。
【０１０６】
２個またはそれ以上の配列間の相同性の測定
２個のアミノ酸配列または２個の核酸の相同性の割合を測定するために、配列を至適な比較目的でアラインメント(例えば、ギャップを、２番目のアミノ酸または核酸配列と至適なアラインメントになるように第１のアミノ酸配列または核酸配列の中に入れ得る)。対応するアミノ酸部位または核酸部位におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを次いで比較する。第１の配列の部位を、第２の配列の対応する部位と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占めると、両分子はその部位において相同である(即ち、本明細書において使用するように、アミノ酸または核酸の「相同性」はアミノ酸または核酸の「同一性」と同等である)。
【０１０７】
核酸配列の相同性を、２個の配列間の同一性の程度として測定し得る。相同性は、ＧＣＧプログラムパッケージに提供されるＧＡＰソフトウエアのような、当該分野において公知のコンピュータープログラムを使用して測定し得る。Needleman and Wunsch, 1970. J Mol Biol 48: 443-453を参照されたい。以下のセッティング：ＧＡＰ生成ペナルティー５．０またはＧＡＰ伸長ペナルティー０．３で、ＧＣＧ ＧＡＰソフトウエアを使用して、上述の類似核酸配列のコード化領域は、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３または５５に示すＤＮＡ配列のＣＤＳ(コード化)部分と好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性の程度を示す。
【０１０８】
用語「配列同一性」は、２個のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列が比較の特定領域に亘って残基毎に同一である程度を指す。用語「配列同一性の百分率」を、比較の領域に亘って至適にアラインメントした２個の配列を比較し、一致部位の数を求め同一の核酸塩基(例えば、核酸の場合には、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ)が両方の配列中に存在する部位数を測定して、一致部位の数を比較領域の部位の総数(即ち、ウインドウサイズ)で除し、商を１００倍して、配列同一性の百分率を得ることにより計算しうる。本明細書において使用する用語「実質的同一性」は、ポリヌクレオチド配列の特性を意味する。ここでポリヌクレオチドは、比較領域に亘って標準配列と比較して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、およびしばしば９０〜９５％の配列同一性、さらに通常には少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。
【０１０９】
キメラタンパク質または融合タンパク質
本発明はまた、ＮＯＶＸキメラタンパク質または融合タンパク質を提供する。本明細書において使用するように、あるＮＯＶＸ「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、非ＮＯＶＸポリペプチドに作動し得るように連結したあるＮＯＶＸポリペプチドを含む。「ＮＯＶＸポリペプチド」は、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４または５６のあるＮＯＶＸタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す一方で、「非ＮＯＶＸポリペプチド」は、ＮＯＶＸタンパク質と実質的に相同でないタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチド、例えば、ＮＯＶＸタンパク質と異なり同一または異なる生物由来であるタンパク質を指す。あるＮＯＶＸ融合タンパク質内では、ＮＯＶＸポリペプチドはあるＮＯＶＸタンパク質の全部または一部に対応し得る。一つの実施形態では、あるＮＯＶＸ融合タンパク質はあるＮＯＶＸタンパク質の少なくとも一つの生物学的に活性な部分を含む。もう一つの実施形態では、あるＮＯＶＸ融合タンパク質は、あるＮＯＶＸタンパク質の少なくとも二つの生物学的に活性な部分を含む。なおもう一つの実施形態では、あるＮＯＶＸ融合タンパク質は、あるＮＯＶＸタンパク質の少なくとも三つの生物学的に活性な部分を含む。融合タンパク質内では、用語「作動し得るように連結した」は、ＮＯＶＸポリペプチドおよび非ＮＯＶＸポリペプチドがお互いにインフレームで融合していることを示すものとする。非ＮＯＶＸポリペプチドを、ＮＯＶＸポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合し得る。
【０１１０】
一つの実施形態では、融合タンパク質は、ＧＳＴ−ＮＯＶＸ融合タンパク質である。ここでＮＯＶＸ配列がＧＳＴ(グルタチオンＳ転移酵素)のＣ末端に融合する。そのような融合タンパク質は、組換えＮＯＶＸポリペプチドの精製を容易にし得る。
【０１１１】
もう一つの実施形態では、融合タンパク質は、そのＮ末端に異種のシグナル配列を含有するあるＮＯＶＸタンパク質である。特定の宿主細胞(例えば、哺乳動物の宿主細胞)において、ＮＯＶＸの発現および／または分泌を異種シグナル配列の使用を介して増強し得る。
【０１１２】
なおもう一つの実施形態では、融合タンパク質は、ＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質である。ここでＮＯＶＸ配列は、免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバー由来の配列と融合している。この実施形態の１つの態様において、免疫グロブリン融合タンパク質は、免疫グロブリンのＦｃ部分である。該Ｆｃ部分はＮＯＶＸのＮ末端またはＣ末端に融合している。特定の実施形態において、該融合タンパク質は、例えば、配列番号５０および５４である。本発明のＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質を、医薬組成物中に組み入れ、対象に投与し、細胞上でのＮＯＶＸリガンドとあるＮＯＶＸタンパク質との相互作用を阻害し、それによりインビボでのＮＯＶＸ仲介性の情報伝達を抑制し得る。ＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質を使用して、あるＮＯＶＸと同種のリガンドの生物学的利用性に影響を及ぼし得る。ＮＯＶＸリガンド／ＮＯＶＸ相互作用の阻害は、増殖および分化障害の処置ならびに細胞生存を調整(例えば増強または阻害)のために治療上有用であり得る。さらに、本発明のＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質を使用して、対象中で抗ＮＯＶＸ抗体を生産し、ＮＯＶＸリガンドを精製し、そしてスクリーニングアッセイにおいて、ＮＯＶＸのあるＮＯＶＸリガンドとの相互作用を阻害する分子を同定し得る。
【０１１３】
本発明のＮＯＶＸキメラタンパク質または融合タンパク質を、標準組換えＤＮＡ技術により生産し得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを、例えば、連結のための平滑末端化または互い違い末端を用いること、適切な末端を提供するための制限酵素による切断、適切に粘着末端の充填、望ましくない結合を防止するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的結合などの従来の方法にしたがってインフレームで一緒に連結する。もう一つの実施形態では、融合遺伝子を、自動ＤＮＡ合成機を含む従来の技術により合成し得る。これに代えて、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を、２個の連続する遺伝子フラグメント間で相補的なオーバーハングを生じるアンカープライマーを用いて行い、それらを引き続いてアニールし、再増幅して、キメラ遺伝子配列を生成し得る(例えば、Ausubel, et al. (eds.) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, 1992を参照)。さらに、融合部分を既にコードする多くの発現ベクター(例えば、ＧＳＴポリペプチド)が市販されている。ＮＯＶＸをコードする核酸を、融合部分がＮＯＶＸタンパク質にインフレームで結合するように、そのような発現ベクターの中にクローン化することができる。
【０１１４】
ＮＯＶＸアゴニストおよびアンタゴニスト
本発明はまた、ＮＯＶＸアゴニスト(即ち、ミメティクス)またはＮＯＶＸアンタゴニストのいずれかとして機能するＮＯＶＸタンパク質の変異体を含む。ＮＯＶＸタンパク質の変異体は、突然変異(例えば、ＮＯＶＸタンパク質の点突然変異または切断)により生成し得る。ＮＯＶＸタンパク質のアゴニストは、天然に存在する形のＮＯＶＸタンパク質と実質的に同一な生物学的諸活性またはそのサブセットを保持する。ＮＯＶＸタンパク質のアゴニストは、例えば、ＮＯＶＸタンパク質を含む、細胞の情報伝達カスケードの下流または上流メンバーに拮抗的に結合することにより、天然に存在する形のＮＯＶＸタンパク質の一つまたはそれ以上の活性を阻害し得る。従って、特異的な生物学的作用を、限定された機能を有する変異体での処置により発揮することができる。一つの実施形態では、天然に存在する形のタンパク質の生物学的活性のサブセットを有する変異体による対象の処置は、天然に存在する形のＮＯＶＸタンパク質による処置と比べて対象における副作用がより少ない。
【０１１５】
ＮＯＶＸアゴニスト(即ちミメティック)またはＮＯＶＸアンタゴニストのどちらかとして機能するＮＯＶＸタンパク質の変異体は、ＮＯＶＸタンパク質の突然変異体(例えば切断突然変異体)の組換えライブラリーをＮＯＶＸタンパク質アゴニストまたはアンタゴニスト活性についてスクリーニングすることにより同定し得る。一つの実施形態では、ＮＯＶＸ変異体の変化に富むライブラリーを、核酸レベルでの組換え（コンビナトリアル）変異誘発によって生成し、そして変化に富む遺伝子ライブラリーによりコードする。ＮＯＶＸ変異体の変化に富むライブラリーは、例えば、潜在的ＮＯＶＸ配列の縮重したセットが個別のポリペプチドとして発現可能であるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素的に連結することにより、またはこれに代えて、その中にＮＯＶＸ配列のセットを含有するさらに大きい融合タンパク質(例えば、ファージディスプレー用に)のセットとして、生成し得る。縮重したオリゴヌクレオチド配列から潜在的ＮＯＶＸ変異体のライブラリーを使用して生成し得る種々の方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成を自動ＤＮＡ合成機により行い、次いで、合成遺伝子を適切な発現ベクター内に連結し得る。遺伝子の縮重セットの使用は、潜在的ＮＯＶＸ配列の所望のセットをコードする配列の全ての、一つの混合物の提供を可能にする。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は当該分野内において周知である。例えば、Narang, 1983. Tetrahedron 39: 3; Itakura, et al., 1984. Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura, et al., 1984. Science 198: 1056; Ike, et al., 1983. Nucl. Acids Res. 11: 477を参照されたい。
【０１１６】
ポリペプチドライブラリー
加えて、ＮＯＶＸタンパク質コード化配列のフラグメントライブラリーを用いて、ＮＯＶＸタンパク質の変異体のスクリーニングおよびそれに続く選択のためにＮＯＶＸフラグメントの変化に富む集団を生成し得る。一つの実施形態では、コード化配列フラグメントのライブラリーを、あるＮＯＶＸコード化配列の二本鎖ＰＣＲ断片を、ニッキングが分子あたりたった約１回生じる条件でヌクレアーゼ処置し、二本鎖ＤＮＡを変性させ、ＤＮＡを異なるニッキング産物由来のセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成し、Ｓ１ヌクレアーゼの処理で再生成した二重らせんから単鎖部分を除去し、そして得られたフラグメントライブラリーを発現ベクターに連結することにより、生成し得る。この方法によって、ＮＯＶＸタンパク質の種々のサイズのＮ末端または内部フラグメントをコードする発現ライブラリーを誘導し得る。
【０１１７】
点突然変異または切断により作成した組換え（コンビナトリアル）ライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングする、および選択した性質を有する遺伝子産物のためにｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする種々の技術は、当該分野において公知である。かかる技術は、ＮＯＶＸタンパク質の組換え（コンビナトリアル）突然変異誘発により生成した遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適用可能である。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするハイスループット分析に適用可能な最も広く使用する技術は、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングし、得られたベクターライブラリーで適切な細胞を形質転換すること、そして、所望の活性の検出がその生産物を検出する遺伝子をコードするベクターの単離を容易する条件で、組換え（コンビナトリアル）遺伝子を発現することを典型的に含む。ライブラリー中の機能的変異の頻度を増大する新しい技術である繰り返しアンサンブル変異誘発(ＲＥＭ)をスクリーニングアッセイと組み合わせて使用して、ＮＯＶＸ変異体を同定し得る。例えば、Arkin and Yourvan, 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7811-7815; Delgrave, et al., 1993. Protein Engineering 6:327-331を参照されたい。
【０１１８】
抗ＮＯＶＸ抗体
ＮＯＶＸタンパク質、またはＮＯＶＸタンパク質のフラグメントに対する抗体は本発明に含まれる。本明細書において使用する用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン(Ｉｇ)分子の免疫学的に活性な部分、即ち、抗原に特異的に結合する(と免疫学的に反応する)抗原結合部位を含有する分子を指す。かかる抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ' およびＦ(ａｂ')2フラグメントならびにＦａｂ発現ライブラリーが挙げるが、これらに限定しない。一般に、ヒトから得る抗体分子は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤのクラスのいずれかに関し、これらは分子中に存在するＨ鎖の性質によりお互いに異なる。特定のクラスは、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2およびその他のような、サブクラスを同様に有する。さらに、ヒトにおいて、Ｌ鎖は、ｋ鎖またはλ鎖であり得る。本明細書における抗体への参照は、ヒト抗体種の全てのそのようなクラス、サブクラスおよびタイプへの参照を含む。
【０１１９】
抗原として使用することを意図した本発明の単離タンパク質、またはその部分またはフラグメントを免疫源として使用しポリクローナルおよびモノクローナル抗体調製の標準的技術を使用し、抗原に免疫特異的に結合する抗体を生成し得る。全長のタンパク質を使用し得るが、またはこれに代えて、本発明は、免疫源として使用するための抗原の抗原性ペプチドフラグメントを提供する。抗原性ペプチドフラグメントは、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４または５６に示すアミノ酸配列のような全長タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも６個のアミノ酸残基を含み、そしてペプチドに対して育成した抗体が、エピトープを含有する全長タンパク質または任意のフラグメントと特異的な免疫複合体を形成するようそのエピトープを包含する。好ましくは、抗原性ペプチドは、少なくとも１０個のアミノ酸残基、または少なくとも１５個のアミノ酸残基、または少なくとも２０個のアミノ酸残基、または少なくとも３０個のアミノ酸残基を含む。抗原性ペプチドにより包含する好ましいエピトープは、表面に局在するタンパク質領域であり；これらは通常親水性領域である。
【０１２０】
本発明の特定の実施形態において、抗原性ペプチドにより包含される少なくとも一つのエピトープは、タンパク質の表面に局在するＮＯＶＸ領域、例えば、親水性領域である。ヒトＮＯＶＸタンパク質配列の疎水性分析は、ＮＯＶＸポリペプチドのどの領域が特に親水性であり、したがって抗体生産を目標とするために有用な表面残基をコードする可能性が高いかを示す。抗体生産を目標とするための手段として、親水性および疎水性領域を示すハイドロパシープロットを、例えば、どちらもフーリエ変換を用いるかまたは用いないで、Kyte DoolittleまたはHopp Woods方法を含む当該分野において周知の任意の方法で生成し得る。例えば、Hopp and Woods, 1981, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78: 3824-3828; Kyte and Doolittle 1982, J. Mol. Biol. 157: 105-142(いずれも全体的な出典明示により本明細書の一部とする)を参照されたい。抗原性タンパク質またはその誘導体、フラグメント、類似体または相同体内の一つまたはそれ以上のドメインに特異的である、抗体はまた、本明細書において提供する。
【０１２１】
用語「エピトープ」には、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合し得る全てのタンパク質決定基(部位）が含まれる。エピトープ様決定基（部位）は、通常、化学的に活性な分子（例えば、アミノ酸もしくは糖側鎖など）表面群を含み、通常、特定の三次元的構造特性、に加えて特定電荷特性を示す。あるＮＯＶＸポリペプチドまたはそれらのフラグメントは、少なくとも１つの抗原エピトープを持つ。アッセイ（例えば、当業者には既知のラジオリガンド結合アッセイまたは類似のアッセイ）によって測定されるような、平衡結合定数ＫＤが、＜１μＭ、好ましくは＜１００ｎＭ、より好ましくは＜１０ｎＭ、もっとも好ましくは＜１００ｐＭ〜約１ｐＭである場合、本発明の抗ＮＯＶＸ抗体は、抗原ＮＯＶＸに特異的に結合するという。
【０１２２】
本発明のタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、類似体、相同体、またはオーソログを、これらのタンパク質成分に免疫特異的に結合する抗体の生成において免疫源として利用することができる。
【０１２３】
当該分野内において公知の種々の方法を、本発明のタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、類似体、相同体、またはオーソログ、に対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体の生産に使用し得る(例えば、Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E, and Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYを出典明示により本明細書の一部とする)を参照されたい。これらの抗体の幾つかについて以下に考察する。
【０１２４】
ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体の生産には、種々の適当な宿主動物(例えばウサギ、ヤギ、マウス、または他の哺乳動物)を、天然タンパク質、その合成変異体、または前述の誘導体を1回またはそれ以上注射して免疫を行い得る。適切な免疫原性製剤としては、例えば、天然に存在する免疫原性タンパク質、免疫原性タンパク質を代表する化学的に合成したポリペプチド、または組換え的に発現した免疫原性タンパク質を挙げ得る。さらに、タンパク質を、免疫する哺乳動物において免疫原性であることが知られている第２のタンパク質と複合体を形成してもよい。かかる免疫原性タンパク質の例としては、キーホールリンペットヘモシニアン、血清アルブミン、ウシサイログロブリンおよび大豆トリプシン阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。製剤はさらにアジュバントを含有し得る。免疫応答を増大するために使用する種々のアジュバントとしては、フロイントの(完全および不完全)アジュバント、鉱物ゲル(例えば水酸化アルミニウム)、界面活性剤(例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、ジニトロフェノール等)、カルメット-ゲラン杆菌およびコリネバクテリウム-パルヴムのようなヒトに使用可能なアジュバント、または類似の免疫促進剤が挙げられるが、これらに限定されない。使用し得るアジュバントのさらに別な例としては、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント(モノホスホリルリピドＡ、合成ジコリノミコール酸トレハロース)を挙げ得る。
【０１２５】
免疫原性タンパク質に対するポリクローナル抗体を、哺乳動物から(例えば、血液から)単離して、免疫血清中の主としてＩｇＧ画分を提供するプロテインＡまたはプロテインＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーのような、公知の技術を用いてさらに精製し得る。引き続いて、またはこれに代えて、求める免疫グロブリンの標的である特異的抗原、またはそのエピトープ、をカラム上に固相化して、イムノアフィニティークロマトグラフィーにより免疫特異的抗体を精製し得る。免疫グロブリンの精製を、例えば、D. Wilkinson (The Scientist, published by The Scientist, Inc., Philadelphia PA, Vol. 14, No. 8 (April 17, 2000), pp. 25-28)により考察する。
【０１２６】
モノクローナル抗体
本明細書において使用する用語「モノクローナル抗体」(ＭＡｂ)または「モノクローナル抗体組成物」は、特徴的なＬ鎖遺伝子産物および特徴的なＨ鎖遺伝子産物より成る抗体分子の１分子種のみを含有する抗体分子の集団を指す。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域(ＣＤＲ)は、集団の全ての分子において同一である。従って、ＭＡｂは、それに対する特徴的な結合活性を特徴とする抗原の特定のエピトープと免疫反応する能力がある抗原結合部位を含有する。
【０１２７】
モノクローナル抗体を、Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)により記載するような、ハイブリドーマ方法を用いて調製し得る。ハイブリドーマ方法では、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物を典型的に免疫化剤で免疫することにより、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生産するかまたは生産する能力のあるリンパ球を誘発する。これに代えて、リンパ球をインビトロで免疫することができる。
【０１２８】
免疫化剤としては典型的に、タンパク質抗原、それらのフラグメントまたはその融合タンパク質が挙げられる。一般的に、ヒト由来の細胞を所望するならば、末梢血リンパ球を使用し、またはヒト以外の哺乳動物源を所望するならば、脾臓細胞またはリンパ節細胞を使用するかのいずれかである。次いで、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて不死化細胞株と融合し、ハイブリドーマ細胞を生成する（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103）。不死化細胞株は通常、形質転換した哺乳動物細胞、特にげっ歯類、ウシまたはヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラットまたはマウスの骨髄腫細胞株を使用し得る。ハイブリドーマ細胞を、融合していない不死化細胞の増殖または生存を阻害する一つまたはそれ以上の物質を好ましくは含有する適切な培地中で培養し得る。例えば、親細胞が、酵素ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ)を欠くならば、ハイブリドーマ用の培地は典型的に、その物質がＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を阻止する、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む(“ＨＡＴ培地”)。
【０１２９】
好ましい不死化細胞株は、効率的に融合し、選択した抗体生産細胞による抗体の高レベル発現を支持し、そしてＨＡＴ培地のような培地に感受性のあるものである。さらに好ましい不死化細胞株は、例えば、Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Californiaおよびthe American Type Culture Collection, Manassas, Virginiaから入手し得るマウス骨髄腫細胞株である。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株はまた、ヒトモノクローナル抗体の生産用に記載する（Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63）。
【０１３０】
ハイブリドーマが培養する培地を次いで、抗原に対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイし得る。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生産したモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降によりまたはラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)または酵素結合免疫吸着検査法(ＥＬＩＳＡ)のような、インビトロ結合アッセイによって測定する。そのような技術またはアッセイは当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性を、例えば、Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)のScatchard分析により測定し得る。標的抗原に対して高度の特異性および高い結合親和性を有する抗体を同定することは、モノクローナル抗体の治療的応用において特に重要な目的である。
【０１３１】
所望のハイブリドーマ細胞を同定した後、クローンを限界希釈法でサブクローン化して、標準方法で増殖し得る(Goding,1986)。この目的のための適当な培地としては、例えば、ダルベッコ変法イーグル培地(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)およびＲＰＭＩ−１６４０培地を挙げ得る。これに代えて、ハイブリドーマ細胞を哺乳動物中で腹水としてインビボで増殖し得る。
【０１３２】
サブクローンにより分泌したモノクローナル抗体を、培地または腹水から、例えば、プロテイン−Ａセファローズ、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーのような従来の免疫グロブリン精製手順により単離または精製し得る。
【０１３３】
モノクローナル抗体をまた、米国特許第４,８１６,５６７号に記載するような組換えＤＮＡ方法により作り得る。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡを、従来の手順を使用して(例えば、マウス抗体のＨ鎖およびＬ鎖をコードする遺伝子に特異的に結合する能力のある、オリゴヌクレオチドプローブを使用することにより)容易に単離し配列決定し得る。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。一旦単離すれば、ＤＮＡを発現ベクター中に配置し、それを次いでサルのＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、またはそうしなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞のような宿主細胞中に形質移入して、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を取得し得る。ＤＮＡをまた、例えば相同なマウスの配列の代わりにヒトのＨ鎖およびＬ鎖の通常ドメインに対するコード化配列を置換することにより(米国特許第４,８１６,５６７号; Morrison, Nature 368, 812-13 (1994))、または非免疫グロブリンペプチドに対するコード化配列の全部または一部を免疫グロブリンのコード化配列に共有結合することにより、修飾し得る。そのような非免疫グロブリンポリペプチドを、本発明の抗体の通常ドメインに対して置換することができるか、または本発明の抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインに対して置換して、キメラ２価抗体を創成することができる。
【０１３４】
ヒト化抗体
本発明のタンパク質抗原に対する抗体はさらに、ヒト化抗体またはヒト抗体を含む。これらの抗体は、投与した免疫グロブリンに対してヒトによる免疫応答を惹き起こすことなくヒトに投与するのに適している。抗体のヒト化型は、主としてヒト免疫グロブリンの配列より成って、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそれらのフラグメント(Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２または抗体の他の抗原結合サブ配列)である。ヒト化は、Winterまたは共同研究者(Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988))の方法にしたがって、げっ歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列で置換することにより、実施し得る。(また、米国特許第５,２２５,５３９号を参照)場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレーム枠の残基を対応する非ヒト残基により置換し得る。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体またはＣＤＲまたはフレーム枠配列にも見出さない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は少なくとも一つ、また典型的には二つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ここでＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、そしてフレーム枠領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体は至適にはまた、免疫グロブリンの通常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部を含む(Jones et al., 1986; Riechmann et al., 1988; および Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992))。
【０１３５】
ヒト抗体
完全なヒト抗体は、ＣＤＲを含むＬ鎖およびＨ鎖の全配列がヒトの遺伝子より生じる、抗体分子に本質的に関する。かかる抗体は本明細書では、「ヒト抗体」または「完全なヒト抗体」と呼称する。ヒトモノクローナル抗体を、トリオーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4: 72を参照)およびＥＢＶハイブリドーマ技術により調製し、ヒトモノクローナル抗体を生産し得る(Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96を参照)。ヒト化モノクローナル抗体を、本発明の実施に利用し得て、そしてヒトハイブリドーマを用いて(Cote, et al., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030を参照)またはヒトＢ細胞をインビトロでEpstein Barrウイルスにより形質転換することによって(Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96を参照)生産し得る。
【０１３６】
加えて、ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリー(Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991))を含むさらに別な技術を用いて生産し得る。同様に、ヒト抗体を、ヒト免疫グロブリンの遺伝子座をトランスジェニック動物、例えば、マウスに導入することによって作り得る。ここで内在性免疫グロブリン遺伝子を部分的にまたは完全に不活化する。チャレンジによって、遺伝子再配列、アセンブリー、および抗体レパトリ−を含む全ての面でヒトにおいて見られるのと非常に良く似たヒト抗体生産を観察する。このアプローチは、例えば、米国特許第５,５４５,８０７号; ５,５４５,８０６号; ５,５６９,８２５号; ５,６２５,１２６号; ５,６３３,４２５号; ５,６６１,０１６号、ならびに Marks et al. (Bio/Technology 10, 779-783 (1992))、Lonberg et al. (Nature 368 856-859 (1994))、Morrison ( Nature 368, 812-13 (1994))、Fishwild et al,( Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996))、Neuberger (Nature Biotechnology 14, 826 (1996))、 Lonberg and Huszar (Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995))に記載されている。
【０１３７】
ヒト抗体を、抗原によるチャレンジに応答して動物の内在性抗体ではなく完全なヒト抗体を生産するように修飾したトランスジェニック非ヒト動物を用いて、付加的に生産し得る(ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／０２６０２を参照)。非ヒト宿主中の免疫グロブリンＨ鎖およびＬ鎖をコードする内在性遺伝子を無能にし、そしてヒト免疫グロブリンのＨ鎖およびＬ鎖をコードする活性遺伝子座を宿主のゲノムの中に挿入する。ヒトの遺伝子を、例えば、必要なヒトＤＮＡセグメントを含有する酵母の人工染色体を用いて組み入れ得る。全ての所望の修飾を提供する動物は次いで、修飾の全相補物より少ない相補物を含有する中間トランスジェニック動物を交雑育種することにより子孫として得られる。そのような非ヒト動物の好ましい実施形態はマウスであり、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９６／３４０９６号に開示されているようにXenomouse[登録商標]と呼称する。この動物は、完全なヒト免疫グロブリンを分泌する、Ｂ細胞を生産する。抗体は、興味のある免疫原で免疫後、動物から、例えば、ポリクローナル抗体の標本として、直接得ることも、またはこれに代えて、モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマのような、動物由来の不死化Ｂ細胞から得ることもできる。これに加えて、ヒトの可変領域を持つ免疫グロブリンをコードする遺伝子を回収し、発現して、抗体を直接得ることもでき、またはさらに修飾して、例えば、単鎖Ｆｖ分子のような抗体の類似体を得ることができる。
【０１３８】
内在性免疫グロブリンのＨ鎖の発現を欠失する、マウスとして例証した、非ヒト宿主を生産する方法の実施例は、米国特許第５,９３９,５９８号、に開示されている。それは、遺伝子座の再配列を阻止するためにそして再配列した免疫グロブリンＨ鎖の遺伝子座の転写物生成を阻止するために、胚性幹細胞中の少なくとも一つの内在性Ｈ鎖の遺伝子座からＪセグメントを欠失させ、この欠失は選択マーカーをコードする遺伝子を含有するターゲティングベクターによりもたらされ、そして体細胞または胚細胞が選択マーカーをコードする遺伝子を含有するトランスジェニックマウスを胚性幹細胞から生産することを含む方法により得られる。
【０１３９】
ヒト抗体のような興味のある抗体を生産する方法は、米国特許第５,９１６,７７１号、に開示されている。それは、Ｈ鎖をコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを一つの培養哺乳動物宿主細胞に導入すること、Ｌ鎖をコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターをさらに別な哺乳動物宿主細胞に導入すること、および２個の細胞を融合してハイブリッド細胞を生成することを含む。ハイブリッド細胞は、Ｈ鎖およびＬ鎖を含有する抗体を発現する。
【０１４０】
この手順のさらなる改良において、免疫原上の臨床的に関係のあるエピトープを同定する方法、および関係のあるエピトープに高親和性で免疫特異的に結合する抗体を選択する相関的方法が、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／５３０４９に開示されている。
【０１４１】
Ｆａｂフラグメントおよび単鎖抗体
本発明にしたがって、技術を、本発明の抗原タンパク質に特異的な単鎖抗体の生産に適合することができる(例えば米国特許第４,９４６,７７８号を参照)。加えて、方法を、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築に適合し(例えば、Huse, et al., 1989 Science 246: 1275-1281、を参照)、タンパク質またはその誘導体、フラグメント、類似体または相同体に対して所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ効果的な同定を可能し得る。タンパク質抗原に対するイディオタイプを含有する抗体フラグメントを、当該分野において公知の技術により生産し得て、それは、(i)抗体分子のペプシン消化により生産するＦ(ａｂ')２フラグメント；(ii)Ｆ(ａｂ')２フラグメントのジスルフィド架橋を還元して得られるＦａｂフラグメント；(iii)抗体分子をパパインおよび還元剤で処置して生成するＦａｂフラグメント；ならびに(iv)Ｆｖフラグメントを含むが、これらに限定されない。
【０１４２】
二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる抗原に結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトのまたはヒト化の抗体である。本明細書においては、結合特異性の一つは本発明の抗原タンパク質に対するものである。２番目の結合標的は、任意の他の抗原であって、有利に細胞表面タンパク質または受容体または受容体サブユニットである。
【０１４３】
二重特異性抗体の作成方法は当該分野において公知である。伝統的に、二重特異性抗体の組換え生産は、２個のＨ鎖が異なる特異性を有する２個の免疫グロブリンＨ鎖／Ｌ鎖対の共発現に基づく(Milstein and Cuello, Nature, 305:537-539 (1983))。免疫グロブリンＨ鎖およびＬ鎖のランダムな組合せのため、これらのハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生産し、そのうちの一つだけが正しい２重特異性構造を有する。正しい分子の精製は通常、アフィニティークロマトグラフィーにより行う。類似の方法が、１９９３年５月に公開されたＷＯ９３／０８８２９およびTraunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)に開示されている。
【０１４４】
所望の結合特異性を持つ抗体の可変ドメイン(抗体−抗原結合部位)を、免疫グロブリンの通常ドメイン配列に融合し得る。融合は、好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリンＨ鎖の通常ドメインと共にある。少なくとも融合の一つの中に存在するＬ鎖結合に必要な部位を含有する第１のＨ鎖通常領域(ＣＨ１)を有することが好ましい。免疫グロブリンＨ鎖の融合をコードするＤＮＡ、および所望ならば、免疫グロブリンＬ鎖を別々の発現ベクター中に挿入し適当な宿主生物中に形質移入する。二重特異性抗体のさらなる詳細については、例えば、Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
【０１４５】
ＷＯ９６／２７０１１に記載されたもう一つのアプローチによれば、一対の抗体分子間の境界面を改変して、組換え細胞培地から回収するヘテロダイマーの百分率を最大にし得る。好ましい境界面は、抗体の通常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子の境界面の一つまたはそれ以上の小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖(例えばチロシンまたはトリプトファン)で置換する。大きな側鎖(複数を含む)と同一または類似のサイズの代償的な「空隙」を、大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの(例えばアラニンまたはスレオニン)で置換することにより第２の抗体分子の境界面に生成する。これは、ホモダイマーのような他の望ましくない最終産物以上にヘテロダイマーの収量を増加する機構を提供する。
【０１４６】
二重特異性抗体を、抗体の全長または抗体フラグメント(例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製することができる。抗体フラグメントから二重特異性抗体を生成する技術は文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体フラグメントを、化学的結合を用いて調製することができる。Brennan et al., Science 229:81 (1985)は、完全な抗体をタンパク質分解酵素で切断してＦ(ａｂ')２フラグメントを生成する手順を記載する。これらのフラグメントをジチオール錯化剤の亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元して、隣接するジチオールを安定化させて、分子間ジスルフィド形成を阻止する。次いで、生成したＦａｂ'フラグメントをチオニトロ安息香酸(ＴＮＢ)誘導体に変換する。次いで、Ｆａｂ'−ＴＮＢの一つをメルカプトエチルアミンとの還元によりＦａｂ'−チオールに再変換し、そして等量の他のＦａｂ'−ＴＮＢ誘導体と混合して、二重特異性抗体を生成する。生成した二重特異性抗体を酵素の選択的固定化剤として使用し得る。
【０１４７】
これに加えて、Ｆａｂ'フラグメントを大腸菌から直接回収して、化学的にカップリングして、二重特異性抗体を生成し得る。Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)は、完全にヒト化した二重特異性抗体のＦ(ａｂ')２分子の生産を記載している。それぞれのＦａｂ'フラグメントを大腸菌から別々に分泌し、インビトロで指向性化学カップリングに供して、二重特異性抗体を形成した。従って形成した二重特異性抗体を、ＥｒｂＢ２受容体を過剰発現する細胞および正常ヒトＴ細胞に結合することができ、ならびにヒト乳腺腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の溶解活性を誘発することができた。
【０１４８】
組換え細胞培地から直接二重特異性抗体を作成し単離する種々の技術をまた記載する。例えば、二重特異性抗体をロイシンジッパーを用いて生産する。Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓタンパク質およびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーを遺伝子融合により二つの異なる抗体のＦａｂ'部分に結合した。抗体のホモダイマーをヒンジ領域において還元して、モノマーを形成し、次いで再酸化して、抗体のヘテロダイマーを形成した。この方法をまた、抗体のホモダイマーの生産に利用することができる。Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)により記載されている「diabody」技術は、二重特異性抗体フラグメント作成のさらに別の機構を提供する。フラグメントは、リンカーによりＬ鎖可変領域(ＶＬ)に連結したＨ鎖可変領域(ＶＨ)を含むが、リンカーが短いため同じ鎖の上の２個のドメイン間での対形成を可能にしない。したがって、一つのフラグメントのＶＨおよびＶＬドメインは強制的にもう一つのフラグメントの相補的なＶＬおよびＶＨドメインと対を形成し、それにより二つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)のダイマーの使用による二重特異性抗体フラグメント作成のもう一つの戦略がまた報告されている。Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
【０１４９】
３価以上の結合価をもつ抗体も考得る。例えば、３重特異性抗体を調製し得る。例えば、Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)。
典型的な二重特異性抗体は、少なくとも一つが本発明のタンパク質抗原に由来する二つの異なるエピトープに結合し得る。これに代えて、免疫グロブリン分子の抗−抗原アームを、白血球上でＴ細胞受容体分子(例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８またはＢ７)またはＦｃγＲＩ(ＣＤ６４)、ＦｃγＲＩＩ(ＣＤ３２)およびＦｃγＲＩＩＩ(ＣＤ１６)のような、ＩｇＧに対するＦｃ受容体(Ｆｃγ)のような誘発性分子に結合するアームと組み合わせて、特定の抗原を発現する細胞に対する細胞性防御機構に焦点を当て得る。二重特異性抗体をまた使用して、特定の抗原を発現している細胞に細胞障害性物質を指向し得る。これらの抗体は、抗原結合アームおよび細胞障害性薬剤またはＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡまたはＴＥＴＡのような放射性核種キレート化剤と結合するアームを所有する。興味のあるもう一つの二重特異性抗体は、本明細書に説明するタンパク質抗原と結合して、さらに組織因子(ＴＦ)と結合する。
【０１５０】
ヘテロ複合抗体
ヘテロ複合抗体はまた本発明の範囲内にある。ヘテロ複合抗体は、共有結合で結合した二つの抗体より成る。そのような抗体は、例えば、好ましくない細胞に免疫系の細胞を標的化するため(米国特許第４,６７６,９８０号)、およびＨＩＶ感染の処置のため(ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９)に提案されている。これらの抗体を、架橋剤を伴うものを含むタンパク質合成化学の既知の方法を用いてインビトロで調製し得ると考えられている。例えば、ジスルフィド交換反応を使用してまたはチオエーテル結合を形成することより、イムノトキシンを構築することができる。この目的のために適当な試薬の例としては、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデートならびに、例えば、米国特許第４,６７６,９８０号に開示されているものを挙げ得る。
【０１５１】
エフェクター機能工学
例えば、がんの処置における抗体の有効性を増強するために、本発明の抗体をエフェクター機能に関して修飾することが望ましい。例えば、システイン残基(複数を含む)をＦｃ領域に導入し、それによりこの領域における鎖間ジスルフィド結合形成を可能にし得る。かくして生成したホモダイマーの抗体は、改善した内部移行能および／または増強した補体仲介性細胞殺害ならびに抗体依存性細胞障害作用(ＡＤＣＣ)を有し得る。Caron et al., J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992) および Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)を参照されたい。増強した抗腫瘍活性を持つホモダイマー抗体はまた、Wolff et al. Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993)に記載されているように、ヘテロ２機能性架橋剤を用いて調製し得る。これに代えて、２重のＦｃ領域を有して、それにより増強した補体依存性細胞溶解およびＡＤＣＣ能を有する抗体を工学操作することができる。Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989)を参照されたい。
【０１５２】
免疫複合体
本発明はまた、化学療法剤、毒素(例えば、細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素的に活性な毒素、またはそれらのフラグメント)または放射性同位体(即ち、放射性複合体)のような細胞毒性物質と複合した抗体を含む免疫複合体に関する。
【０１５３】
そのような免疫複合体の生成に有用な化学療法剤を上述する。使用できる酵素的に活性な毒素およびそれらのフラグメントとしては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性フラグメント、内毒素Ａ鎖(Pseudomonas aeruginosa由来)、リシンＡ鎖、アビリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファサルシン、Aleurites fordii(シナアブラギリ)タンパク質、ディアンティンタンパク質、Phytolaca americanaタンパク質(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ)、momoridica char抗a(ツルレイシ)阻害剤、クルシン、クロチン、sapaonaria officinalisc阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、リストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセンが挙げられる。種々の放射性核種を放射性複合抗体の生産に利用できる。例として、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙおよび１８６Ｒｅを挙げ得る。
【０１５４】
抗体と細胞障害性薬剤との複合体を、Ｎ−サクシンイミジル−３−(２−ピリジルジチオール)プロピオネート(ＳＰＤＰ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステルの２機能性誘導体(ジメチルアジピイミデートＨＣＬのような)、活性エステル(ジサクシンイミジルスベレートのような)、アルデヒド(グルタルアルデヒドのような)、ビスアジド誘導体(ビス−(ｐ−アジドベンゾイル)−ヘキサンジアミンのような)、ビスジアゾニウム誘導体(ビス−(ｐ−ジアゾニウムベンゾイル)−エチレンジアミンのような)、ジイソシアネート(トリエン２、６−ジイソシアネートのような)、およびビス活性フッ素化合物(１,５−ジフルオロ２,４−ジニトロベンゼンのような)のような種々の２機能性タンパク質カップリング剤を用いて作る。例えば、リシン免疫毒素を、Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987)に記載のように調製することができる。炭素１４で標識した１−イソチオシアナートベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸(ＭＸ−ＤＴＰＡ)は、放射性ヌクレオチドを抗体に結合するための典型的なキレート化剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。
【０１５５】
もう一つの実施形態では、抗体を、腫瘍をプレターゲティンブのための「受容体」(ストレプトアビジンのような)に結合することができて、そこでは抗体−受容体複合体を患者に投与し、引き続いて未結合の複合体を除去剤を用いて血液循環から除去し、次いで今度は細胞障害性薬剤に複合した「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
【０１５６】
イムノリポソーム
本明細書で開示される抗体をまた、イムノリポソームとして処方することができる。抗体を含有するリポソームリポソームは、Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl  Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); ならびに米国特許第４,４８５,０４５号および第４,５４４,５４５号に記載されているような、当該分野において公知の方法で調製する。増大した循環時間を持つリポソームリポソームは、米国特許第５,０１３,５５６号に開示されている。
【０１５７】
特に有用なリポソームリポソームを、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥＧ−ＰＥ)を含む脂質組成物を用いて逆相蒸発法により生成し得る。リポソームリポソームを定められた孔径のフィルターを通して押し出して、所望の直径のリポソームリポソームを得る。本発明の抗体のＦａｂ'フラグメントを、Martin et al ., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982)に記載されるように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームリポソームに結合し得る。化学療法剤(ドキソルビシンのような)を任意にリポソーム内に含有する。Gabizon et al., J. National cancer Inst., 81(19): 1484 (1989)を参照されたい。
【０１５８】
本発明のタンパク質に対して指向した抗体の診断応用
１実施形態では、所望の特異性を保有する抗体のスクリーニングのための方法は限定しないが、酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）および他の当業者既知免疫学的介在技法を含む。具体的実施形態では、ＮＯＶＸタンパク質の特定のドメインに特異的である抗体の選択は、そのようなドメインを保有するＮＯＶＸタンパク質のフラグメントに結合するハイブリドーマの生成によって容易化される。かくして、ＮＯＶＸタンパク質内の所望のドメイン、その誘導体、フラグメント、類似体、または相同物に特異的で合える抗体をまたここに提供する。
本発明のＮＯＶＸタンパク質に対して指向化された抗体を、ＮＯＶＸタンパク質の局在化及び／または定量に関する当業界内既知方法で使用し得る（例えば適当な生理学的サンプル内のＮＯＶＸタンパク質のレベルの測定における使用のため、診断方法における使用のため、タンパク質の画像化における使用のためなど）。所定の実施形態では、ＮＯＶＸタンパク質、その誘導体、フラグメント、類似体または相同物に特異的な抗体であって、抗体由来抗原結合ドメインを含むものは、薬理学的活性化合物として利用する（以後「治療剤」と称する）。
【０１５９】
本発明のＮＯＶＸタンパク質に対して特異的な抗体を（例えばモノクローナルまたはポリクローナル抗体）、イムノアフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降のような標準的な技術により、ＮＯＶＸポリペプチドを単離するために使用し得る。ＮＯＶＸポリペプチドへの抗体を、細胞由来の天然タンパク質および宿主細胞で発現する組換え的に生産したＮＯＶＸ抗原の精製を容易にし得る。さらに、そのような抗ＮＯＶＸ抗体を使用して、抗原性ＮＯＶＸタンパク質の存在量または発現パターンを評価するために抗原性ＮＯＶＸタンパク質(例えば、細胞溶解物または細胞上清中の)を検出することができる。ＮＯＶＸタンパク質に対して指向した抗体を診断的に使用して、例えば、与えられた処置法の有効性を測定するために臨床検査の手順の一環として組織中のタンパク質レベルをモニターすることができる。抗体を検出可能な物質にカップリング(即ち物理的に連結)することにより、検出を促進し得る。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、配合群、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質を挙げる。適当な酵素の例としては、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼおよびアセチルコリンエステラーゼを挙げ得る；適当な配合群の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを挙げ得る；適当な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレッセイン、フルオレッセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレッセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリスリンを挙げ得る；発光物質の例としては、ルミノールを挙げ得る；生物発光物質の例としてはルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンを挙うるし、適当な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈを挙げ得る。
【０１６０】
抗体治療法
ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化および完全なヒト抗体を含む本発明の抗体を治療薬として使用し得る。そのような薬剤を一般的に、対象の疾患または病変の治療または予防に使用する。抗体製剤、好ましくはその標的抗原に対して高い特異性および高い親和性を有するものを対象に投与して、一般的に標的への結合に因る効果を有する。そのような効果は、与えた抗体分子と問題とする標的抗原との間の相互作用の特異的性質に依存する２種類のうちの一つである。第１の場合では、抗体の投与は、標的の本来結合する内在性リガンドとの結合を阻止または阻害し得る。この場合には、抗体は標的に結合して、リガンドがエフェクター分子として作用する、天然に存在するリガンドの結合部位をマスクする。かくして、受容体はリガンドが役割を担う情報伝達経路を仲介する。
【０１６１】
これに代えて、作用は、抗体が標的分子上のエフェクター結合部位への結合により生理的結果を誘発するものであり得る。この場合には、疾患または病変においては存在しないかまたは欠陥のあり得る内在性リガンドを有する受容体である標的を、代替のエフェクターリガンドとしての抗体と結合して、受容体に基づく情報伝達事象を受容体により開始する。
【０１６２】
本発明の抗体の治療的に有効な量は一般的に、治療目的を達成するのに必要とされる量に関する。上述のように、これは、特定の場合には標的の機能を阻害し、そして他の場合には生理的応答を促進する抗体およびその標的抗原との間の結合相互作用であり得る。投与に必要な量はさらに、特定の抗原に対する抗体の結合親和性に依存するし、そしてまた投与した抗体が投与した対象の自由体積から除去し得る速度に依存する。本発明の抗体または抗体フラグメントの治療的に有効な投与量の通常の範囲は、限定されない例として、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。通常の投与回数は、例えば、１日２回から１週１回の範囲であり得る。
【０１６３】
抗体の医薬組成物
本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体、ならびに本明細書に開示するスクリーニングアッセイにより同定する他の分子を、医薬組成物の形で種々の障害の処置のために投与し得る。そのような組成物の調製に関与する原理および考慮事項、ならびに成分の選択の指針は、例えば、The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed. (Alfonso R. Gennaro, et al., editors) Mack Pub. Co., Easton, Pa. : 1995、Drug Absorption Enhancement : Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends,  Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994、および Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4), 1991, M. Dekker,  New Yorkに提供されている。
【０１６４】
抗原タンパク質が細胞内にあり、完全な抗体を阻害剤として使用するならば、内部移行性抗体が好ましい。しかしながら、リポソームを使用して、抗体または抗体フラグメントを細胞内に送達し得る。抗体フラグメントを使用する場合には、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最も小さな阻害フラグメントが好ましい。例えば、抗体の可変領域の配列に基づいて、標的タンパク質の配列に結合する能力を保持するペプチド分子をデザインし得る。そのようなペプチドを、化学的および／または組換えＤＮＡ技術により合成し得る。例えば、Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)を参照されたい。本明細書における処方はまた、処置する特定の適応のために必要なニつ以上の活性化合物、好ましくはお互いに悪影響を及ぼし合わない相補的活性を持つものを含有し得る。これに代えて、またはこれに加えて、組成物は、その機能を増強する薬剤、例えば、細胞障害性薬剤、サイトカイン、化学療法剤、または増殖阻害剤を含有していてもよい。そのような分子は好都合には、意図する目的にとって効果的な量で組み合わされて存在する。
【０１６５】
活性成分を、例えば、コアセルベーション技術または界面重合により調製したマイクロカプセル中で、例えば、ハイドロキシメチルセルローズまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−(メチルメタクリレート)マイクロカプセル中で、それぞれ、コロイド状薬送達システム(例えば、リポソーム、アルブミン小球体、ミクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル)中に、またはマクロエマルジョン中に閉じ込め得る。
【０１６６】
インビボ投与に使用する製剤は無菌でなければならない。このことを、無菌ろ過膜によるろ過により容易に達成する。
徐放性製剤を調製することができる。徐放性製剤の適当な例としては、抗体を含有する固相の疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、そのマトリックスは、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルのような造形品の形をしている。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ハイドロゲル(例えば、ポリ(２−ヒドロキシエチル−メタクリレート)、またはポリ(ビニルアルコール)、ポリラクチド(米国特許第３,７７３,９１９号)、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌグルタミン酸エステルの共重合体、非分解性エチレン−ビニルアセテート、LUPRON DEPOT[登録商標](乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸リュープロリドより成る注射用マイクロスフェア)のような分解性乳酸−グリコール酸共重合体が挙げられる。酢酸エチレンビニルおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーは１００日間に亘って分子を放出することができるが一方、特定のヒドロゲルはより短期間でタンパク質を放出する。
【０１６７】
ＥＬＩＳＡアッセイ
アナライトのタンパク質を検出する薬剤は、アナライトのタンパク質に結合する能力のある抗体、好ましくは検出可能な標識を持つ抗体である。抗体は、ポリクローナルでもよく、またはさらに好ましくはモノクローナルであり得る。完全な抗体またはそのフラグメント(例えば、ＦａｂまたはＦ(ａｂ)２)を使うことができる。用語「標識」とは、プローブまたは抗体に関して、プローブまたは抗体に検出可能な物質をカップリングする(即ち、物理的に連結する)ことによるプローブまたは抗体の直接標識、ならびに直接に標識するもう一つの薬剤との反応性によるプローブまたは抗体の間接標識を包含するものとする。間接標識の例としては、蛍光標識した第２抗体を用いた第１抗体の検出および蛍光標識ストレプトアビジンで検出できるようにＤＮＡプローブをビオチンで末端標識することが挙げられる。用語「生物学的試料」とは、対象から単離した組織、細胞および生物学的流体、ならびに対象内に存在する組織、細胞および流体を含むものとする。それ故に、用語「生物学的試料」の範囲には血液および血清、血漿、またはリンパ液を含む血液のフラクションまたは成分を含み得る。即ち、本発明の検出法を使用して、生物学的試料中のアナライトのｍＲＮＡ、タンパク質またはゲノムＤＮＡをインビトロならびにインビボで検出することができる。例えば、アナライトのｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイツハイブリダイゼーションを挙げ得る。アナライトのタンパク質のインビトロ検出技術としては、酵素結合免疫吸着検査法(ＥＬＩＳＡ)、ウエスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光を挙げ得る。アナライトのＤＮＡのインビトロ検出技術としては、サザンハイブリダイゼーションを挙げ得る。イムノアッセイを実施する手順は、例えば、「ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology」, Vol. 42, J. R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995、「Immunoassay」, E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996、および「Practice and Thory of Enzyme Immunoassays」, P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985に記載されている。さらに、アナライトのタンパク質のインビボ検出のための技術は、標識化した抗アナライトタンパク質抗体を対象に導入することを含む。例えば、対象中での存在または局在が標準的な造影技法で検出できる放射性マーカーで、抗体を標識し得る。
【０１６８】
ＮＯＶＸ組換え発現ベクターおよび宿主細胞
本発明のもう一つの態様は、ＮＯＶＸタンパク質またはその誘導体、フラグメント、類似体または相同体をコードする核酸を含有するベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書において使用する用語「ベクター」とは、それに結合しているもう一つの核酸を運搬する能力のある核酸分子を指す。ベクターの一つのタイプは「プラスミド」であり、これは、さらに別なＤＮＡセグメントが結合した環状の二重鎖ＤＮＡループを指す。ベクターのもう一つのタイプはウイルスベクターであり、ここではさらに別なＤＮＡセグメントをウイルスゲノムの中に結合し得る。特定のベクターは、それらを導入した宿主細胞中で自律増幅することができる(例えば、細菌の複製起点を持つ細菌のベクターおよび哺乳動物のエピゾームベクター)。他のベクター(例えば、哺乳動物の非エピゾームベクター)は、宿主細胞中への導入に際し宿主細胞のゲノム中に組み込まれて、それにより宿主ゲノムと一緒に複製し得る。さらに、特定のベクターは、それらが作動し得るように連結した遺伝子の発現を指示する能力がある。そのようなベクターを、本明細書において「発現ベクター」と呼称する。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターはしばしばプラスミドの形をしている。プラスミドはベクターの最も通常に使用する形態であるので、本明細書においては、「プラスミド」および「ベクター」は互換的に使用し得る。しかしながら、本発明は、同等の機能を有するウイルスベクター(例えば、複製能を欠いたレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)のような他の形の発現ベクターを含むこととする。
【０１６９】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中における核酸の発現に適した形での本発明の核酸を含み、これは組換え発現ウイルスを、発現に使用する宿主細胞に基づいて選択した発現すべき核酸配列に作動し得るように連結した一つまたはそれ以上の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクター内において、「作動し得るように連結した」とは、興味のある核酸配列が核酸配列の発現を可能にする様式で(例えばインビトロ転写／翻訳システムでまたはベクターを宿主細胞に導入する場合には宿主細胞中で)調節配列に結合していることを意味するものとする。
【０１７０】
用語「調節配列」とは、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御要素(例えば、ポリアデニル化シグナル)を含むものとする。そのような調節配列は、例えば、Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)に記載されている。調節配列としては、多くのタイプの宿主細胞中でヌクレオチド配列の構成的発現を指示するものおよび特定の宿主細胞中でのみヌクレオチド配列の発現を指示するもの(例えば、組織特異的調節配列)を挙げ得る。発現ベクターのデザインが、形質転換する宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベル等のような要因に依存し得ることを当業者は理解する。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入して、それにより本明細書に説明するように核酸によりコードする融合タンパク質またはペプチドを含むタンパク質またはペプチド(例えば、ＮＯＶＸタンパク質、ＮＯＶＸタンパク質の突然変異型、融合タンパク質等)を生産し得る。
【０１７１】
本発明の組換え発現ベクターを、原核のまたは真核の細胞中におけるＮＯＶＸタンパク質発現用にデザインし得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質を、Escherichia coliのような細菌細胞、昆虫細胞(バキュロウイルス発現ベクターを使用して)、酵母細胞または哺乳動物細胞中で発現し得る。適当な宿主細胞は、Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)においてさらに考察されている。これに代えて、組換え発現ベクターを、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いてインビトロで転写して、翻訳し得る。
【０１７２】
真核細胞中におけるタンパク質の発現は最もしばしば、Escherichia coli中で融合タンパク質または非融合タンパク質のどちらかの発現を指示する構成的または誘導性プロモーターを含有するベクターを用いて行われる。融合ベクターは、その中にコードしたタンパク質に多数のアミノ酸を、通常には組換えタンパク質のアミノ末端に付加する。そのような融合ベクターは典型的に三つの目的に役立つ：(i)組換えタンパク質の発現を増大するため；(ii)組換えタンパク質の溶解性を増加するため；および(iii)アフィニティークロマトグラフィーにおけるリガンドとして作用することにより組換えタンパク質の精製を助けるため。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解による切断部位を融合部分および組換えタンパク質の接合部に導入して、融合部分から組換えタンパク質の分離に引き続いて融合タンパク質の精製を可能にする。そのような酵素、およびそれらと同種の認識配列としては、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ、トロンビンおよびエンテロキナーゼを挙げ得る。典型的な融合発現ベクターとしては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡをそれぞれ標的組換えタンパク質に融合させるｐＧＥＸ(Pharmacia Biotech Inc; Smith and Johnson, 1988. Gene 67: 31-40)、ｐＭＡＬ (New England Biolabs, Beverly, Mass.)およびｐＲＩＴ５ (Pharmacia, Piscataway, N.J.) を挙げ得る。
【０１７３】
適当な誘導性非融合E. coli発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ(Amrann et al., (1988) Gene 69:301-315)およびｐＥＴ１１ｄ (Studier et al., GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89)を挙げ得る。
【０１７４】
E. coliにおけるタンパク質発現を最大にする一つの戦略は、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力を障害した宿主細胞中でタンパク質を発現することである。Gottesman, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 119-128を参照されたい。もう一つの戦略は、それぞれのアミノ酸に対する個別のコドンをE. coliで優先的に使用するものとなるように、発現ベクターに挿入する核酸の核酸配列を変更することである(例えば、Wada, et al., 1992. Nucl. Acids Res. 20: 2111-2118を参照)。本発明の核酸配列のそのような変更は標準的ＤＮＡ合成技法により行い得る。
【０１７５】
もう一つの実施形態では、ＮＯＶＸ発現ベクターは酵母の発現ベクターである。酵母のSaccharomyces cerivisae中の発現ベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１ (Baldari, et al., 1987. EMBO J. 6: 229-234)、ｐＭＦａ(Kurjan and Herskowitz, 1982. Cell 30: 933-943)、ｐＪＲＹ８８ (Schultz et al., 1987. Gene 54: 113-123)、ｐＹＥＳ２(Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.)、およびｐｉｃＺ(InVitrogen Corp, San Diego, Calif.)を挙げ得る。
【０１７６】
これに代えて、ＮＯＶＸをバキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞中で発現し得る。培養昆虫細胞(例えば、ＳＦ９細胞)中でのタンパク質発現に利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ(Smith, et al., 1983. Mol. Cell. Biol. 3: 2156-2165) およびｐＶＬシリーズ(Lucklow and Summers, 1989. Virology 170: 31-39)を挙げ得る。
【０１７７】
なおもう一つの実施形態では、本発明の核酸を、哺乳動物の発現ベクターを用いて哺乳動物細胞中で発現し得る。哺乳動物の発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８(Seed, 1987. Nature 329: 840)およびｐＭＴ２ＰＣ(Kaufman, et al., 1987. EMBO J. 6: 187-195)を挙げ得る。哺乳動物細胞中で使用するときには、発現ベクターの制御機能はしばしば、ウイルスの調節要素により提供される。例えば、普通に使用するプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０に由来する。原核のおよび真核の細胞両方にとって適当な他の発現系については、例えば、Chapters 16 and 17 of Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989を参照されたい。
【０１７８】
もう一つの実施形態では、組換え哺乳動物表現ベクターは、特定の細胞タイプ中で優先的に核酸の発現を指示する能力がある(例えば、組織特異的調節要素を核酸を発現するために使用する)。組織特異的調節要素は当該分野において公知である。適当な組織特異的プロモータの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター(肝臓特異的；Pinkert, et al., 1987. Genes Dev. 1: 268-277)、リンパ系特異的プロモーター(Calame and Eaton, 1988. Adv. Immunol. 43: 235-275)、特にT細胞受容体(Winoto and Baltimore, 1989. EMBO J. 8: 729-733)および免疫グロブリン (Banerji, et al., 1983. Cell 33: 729-740; Queen and Baltimore, 1983. Cell 33: 741-748)のプロモーター、ニューロン特異的プロモーター(例えば、ニューロフィラメントプロモーター; Byrne and Ruddle, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477)、膵臓特異的プロモーター(Edlund, et al., 1985. Science 230: 912-916)、ならびに乳腺特異的プロモーター(例えば、乳漿；米国特許第４,８７３,３１６号及びヨーロッパ出願公開第２６４,１６６号)を挙得る。例えば、マウスのｈｏｘプロモーター(Kessel and Gruss, 1990. Science 249: 374-379)およびα−フェトプロテインプロモーター(Campes and Tilghman, 1989. Genes Dev. 3: 537-546)の発生的に調節されるプロモーターも包含する。
【０１７９】
本発明はさらに、発現ベクターの中にアンチセンスの配向でクローン化した本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。即ち、ＤＮＡ分子は、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現(ＤＮＡ分子の転写による)を可能にするような様式で、調節配列に機能し得るように結合する。種々の細胞タイプ中のアンチセンスＲＮＡ分子の連続的発現を指示するアンチセンスの配向にクローン化した核酸に機能し得るように結合した調節配列、例えば、ウイルスのプロモーターおよび／またはエンハンサーを選択することができるか、またはアンチセンスＲＮＡの組織特異的または細胞タイプ特異的な構成的発現を指示する調節配列を選択することができる。アンチセンス発現ベクターは、ベクターを導入した細胞タイプにより活性を決定する高効率調節領域の制御下で、アンチセンス核酸を生産する組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒化ウイルスの形であり得る。アンチセンス遺伝子を用いた遺伝子発現の調節の考察については、例えば、Weintraub, et al., 「Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis」 Reviews-Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986を参照されたい。
【０１８０】
本発明のもう一つの態様は、本発明の組換え発現ベクターを導入する宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」を、本明細書においては互換的に使用する。そのような用語は、特定の対象の細胞のみならずそのような細胞の子孫または潜在的子孫をまた指すことを理解する。突然変異または環境の影響により後の世代に特定の修飾が生じるかもしれないため、そのような子孫は、実際には親細胞と同一ではないかもしれないが、本明細書において使用する用語の範囲内になお含まれる。
【０１８１】
宿主細胞は任意の原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質を、E. coliのような細菌細胞、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞(チャイニーズハムスター卵巣細胞(ＣＨＯ)またはＣＯＳ細胞)のような細菌の細胞中で発現することができる。他の適当な宿主細胞は当業者に周知である。
【０１８２】
ベクターＤＮＡを、従来の形質転換または形質移入技術により原核細胞または真核の細胞の中に導入することができる。本明細書において使用する用語「形質転換」および「形質移入」とは、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介性形質移入、リポフェクション、またはエレクトロポレーションを含む外来の核酸(例えばＤＮＡ)を宿主細胞に導入するために当該分野で認める種々の技術を指すものとする。宿主細胞を形質転換しまたは形質移入するための適当な方法は、MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)および他の実験室マニュアルに見出すことができる。
【０１８３】
哺乳動物細胞の安定的な形質移入については、使用される発現ベクターおよび形質移入の技法に依存して、細胞のごく小数のフラクションが外来性ＤＮＡをそのゲノムの中に組み込み得る。これらの組み込み体を同定し選択するために、選択可能なマーカー(例えば、抗生物質に対する抵抗性)が一般的に、興味のある遺伝子と一緒に宿主細胞に導入される。種々の選択可能なマーカーとしては、Ｇ４１８,ハイグロマイシンおよびメトトレキセートのような薬剤に抵抗性を与えるものが挙げられる。選択可能なマーカーをコードする核酸を、ＮＯＶＸをコードするものと同一のベクター上で宿主細胞に導入することができか、または別のベクター上で導入することもできる。導入された核酸で安定に形質移入された細胞は、薬剤選択により同定されることができる(例えば、選択可能なマーカーを組み込んでいる細胞は生き残る一方で、他の細胞は死ぬ)。
【０１８４】
培地中の原核細胞または真核細胞のような本発明の宿主細胞を用いて、ＮＯＶＸタンパク質を生産する(即ち、発現する)ことができる。したがって、本発明は、本発明の宿主細胞を用いるＮＯＶＸタンパク質の生産方法をさらに提供する。一つの実施形態では、その方法は、本発明の宿主細胞(その中にＮＯＶＸタンパク質をコードする組換え発現ベクターを導入する)を、ＮＯＶＸタンパク質を生産するような適当な培地中で培養することを含む。もう一つの実施形態では、その方法は、培地または宿主細胞からＮＯＶＸタンパク質を単離することをさらに含む。
【０１８５】
トランスジェニックＮＯＶＸ動物
本発明の宿主細胞をまた使用して、非ヒトトランスジェニック動物を生産し得る。例えば、一つの実施形態では、本発明の宿主細胞は、その中にＮＯＶＸタンパク質コード化配列を導入する受精卵母細胞または胚性幹細胞である。次いで、そのような宿主細胞を使用して、その中で外来性のＮＯＶＸ配列をゲノムの中に導入する非ヒトトランスジェニック動物、またはその中で内在性のＮＯＶＸ配列を変更する相同な組換え動物を創成することができる。そのような動物は、ＮＯＶＸタンパク質の機能および／または活性の研究にならびにＮＯＶＸタンパク質活性のモジュレーターの同定および／または評価に有用である。本明細書において使用する「トランスジェニック動物」とは、その中で動物の一つまたはそれ以上の細胞が導入遺伝子を含む非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはラットまたはマウスのようなげっ歯類である。トランスジェニック動物の他の例としては、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両棲類等を挙げ得る。導入遺伝子は、それからトランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムの中に取り込まれ、そして成熟動物のゲノム内に残存して、それによりトランスジェニック動物の一つまたはそれ以上の細胞タイプまたは組織中におけるコード化遺伝子産物の発現を指令する外来性ＤＮＡである。本明細書において使用する「相同の組換え動物」とは、その中で内在性ＮＯＶＸ遺伝子が内在性遺伝子および、動物の細胞、例えば、動物の胚細胞の中に動物の発生前に導入された外来性ＤＮＡ分子との間で相同組換えにより変更した非ヒト動物、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはマウスである。
【０１８６】
本発明のトランスジェニック動物は、ＮＯＶＸをコードする核酸を受精卵母細胞の雄性前核の中に(例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染により)導入して、卵母細胞を偽妊娠雌性仮親動物の体内で発生することを可能にすることにより、創成することができる。配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３または５５のヒトＮＯＶＸｃＤＮＡ配列を、非ヒト動物のゲノム内に導入遺伝子として導入することができる。これに代えて、マウスＮＯＶＸ遺伝子のようなヒトＮＯＶＸ遺伝子の非ヒト相同体を、ヒトＮＯＶＸのｃＤＮＡとのハイブリダイゼーション(上にさらに詳述)に基づいて単離して、導入遺伝子として使用し得る。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルもまた、導入遺伝子の発現効率を増加するために導入遺伝子中に含み得る。組織特異的調節配列をＮＯＶＸ導入遺伝子に機能し得るように結合して、特定の細胞にＮＯＶＸタンパク質の発現を指示し得る。胚の操作およびマイクロインジェクションによる、トランスジェニック動物、特にマウスのような動物の作成方法は当該分野において従来的となってきており、例えば、米国特許第４,７３６,８６６号; ４,８７０,００９号; および４,８７３,１９１号;ならびにHogan, 1986. In: MANIPULATING THE MOUSE EMBRYO, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.に記載されている。類似の方法を他のトランスジェニック動物の生産に用い得る。初代トランスジェニック動物を、ゲノム内のＮＯＶＸ導入遺伝子の存在および／または動物の組織または細胞中におけるＮＯＶＸ ｍＲＮＡの発現に基づいて、同定し得る。次いで、初代トランスジェニック動物を、導入遺伝子を保持する追加的動物の繁殖に使用し得る。さらに、ＮＯＶＸタンパク質をコードする導入遺伝子を保持するトランスジェニック動物を使用して、他の導入遺伝子を保持するさらに別なトランスジェニック動物を繁殖し得る。
【０１８７】
相同の組換え動物を創成するために、その中に欠失、付加または置換を導入していて、それによりＮＯＶＸ遺伝子を変化させる例えば機能的に破壊するあるＮＯＶＸ遺伝子の少なくとも一部を含有するベクターを調製する。ＮＯＶＸ遺伝子は、ヒト遺伝子(例えば配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３または５５のｃＤＮＡ)であり得るが、さらに好ましくはヒトＮＯＶＸ遺伝子の非ヒト相同体である。例えば、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３または５５のヒトＮＯＶＸ遺伝子のマウス相同体を使用して、マウスゲノム中の内在性ＮＯＶＸ遺伝子を変更するのに適する相同組換えベクターを構築することができる。一つの実施形態では、ベクターを、相同組換えにより、内在性遺伝子を機能的に破壊する(即ち、もはや機能的なタンパク質をコードしない；「ノックアウト」ベクターとも呼称する)ようにデザインする。
【０１８８】
これに代えて、ベクターは、相同組換えにより内在性ＮＯＶＸ遺伝子を変異するかまたは他のように変更するが、依然機能性タンパク質をコードする(例えば、上流の調節領域を変更してそれにより内在性ＮＯＶＸタンパク質の発現を変更する)ようにデザインし得る。相同組換えベクターでは、ＮＯＶＸ遺伝子の変更したタンパク質は、ＮＯＶＸ遺伝子のさらに別な核酸により５'末端または３'末端に隣接して、ベクターにより保持する外来性ＮＯＶＸ遺伝子および胚性幹細胞中の内在性ＮＯＶＸ遺伝子の間で相同組換えが起こることを可能にする。さらに別な隣接ＮＯＶＸ核酸は、内在性遺伝子と成功裏に相同組換えが起きるように十分な長さを持つ。典型的には、数キロ塩基の隣接ＤＮＡ(５'末端および３'末端の両方とも)をベクターに含み得る。相同組換えベクターの記載については、例えば、Thomas, et al., 1987. Cell 51: 503を参照されたい。次いで、ベクターを胚性幹細胞株に(例えば、エレクトロポレーションにより)導入し、そしてその中で導入したＮＯＶＸ遺伝子を内在性ＮＯＶＸ遺伝子と相同的に組み換えた細胞を選択する。例えば、Li, et al., 1992. Cell 69: 915を参照されたい。
【０１８９】
次いで、選択した細胞を動物(例えば、マウス)の胚盤胞の中に注入して、凝集キメラを形成する。例えば、Bradley, 1987. In: TERATOCARCINOMAS AND EMBRYONIC STEM CELLS: A PRACTICAL APPROACH, Robertson, ed. IRL, Oxford, pp. 113-152を参照されたい。次いで、キメラ胚を適当な偽妊娠雌性仮親動物に植え込んで、胚を満期出産する。生殖細胞内に相同組換えしたＤＮＡを保持している子孫を用いて、その中で動物の全ての細胞が、導入遺伝子の生殖系列を介した伝達により相同組換えＤＮＡを含有する動物を繁殖させることができる。相同組換えベクターおよび相同組換え動物を構築する方法は、Bradley, 1991. Curr. Opin. Biotechnol. 2: 823-829; ＰＣＴ国際公開第: ＷＯ９０／１１３５４号；ＷＯ９１／０１１４０号；ＷＯ９２／０９６８号;およびＷＯ９３／０４１６９号にさらに記載される。
【０１９０】
もう一つの実施形態では、導入遺伝子の調節発現を可能にする選択したシステムを含有する非ヒトトランスジェニック動物を生産し得る。そのようなシステムの一つの例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムである。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムの記載については、例えば、Lakso, et al., 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6232-6236を参照されたい。リコンビナーゼシステムのもう一つの例は、Saccharomyces cerevisiaeのＦＬＰリコンビナーゼシステムである。O'Gorman, et al., 1991. Science 251:1351-1355を参照されたい。もしｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムを用いて導入遺伝子の発現を調節するならば、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択したタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含有する動物が必要となる。そのような動物は、例えば、一つは選択したタンパク質をコードする導入遺伝子を含有し、他はリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含有する二つのトランスジェニック動物を交配させることによる「ダブル」トランスジェニック動物の構築により提供し得る。
【０１９１】
本明細書に説明した非ヒトトランスジェニック動物のクローンはまた、Wilmut, et al., 1997. Nature 385: 810-813に記載された方法にしたがって生産することができる。略述すれば、トランスジェニック動物から細胞(例えば体細胞)を単離し、誘導して、増殖サイクルから抜け出てＧ０期に入ることができる。次いで、静止細胞を、例えば、電気パルスの使用により静止細胞を単離したのと同じ種類の動物由来の脱核した卵母細胞と融合することができる。次いで、再構成した卵母細胞を、それを桑実胚または胚盤胞にまで発生させて、次いで擬妊娠雌性仮親動物に導入するように培養する。この雌性仮親動物から生まれた子孫は、細胞(例えば体細胞)を単離する動物のクローンである。
【０１９２】
医薬組成物
本発明のＮＯＶＸ核酸分子、ＮＯＶＸタンパク質、抗−ＮＯＶＸ抗体(本明細書では「活性化合物」ともいう)、ならびにそれらの誘導体、フラグメント、類似体および相同体を投与に適する医薬組成物の中に組込み得る。典型的に、そのような組成物は核酸分子、タンパク質または抗体およびおよび医薬的に許容され得る担体を含む。本明細書において使用する「医薬的に許容され得る担体」とは、医薬品投与に適合する任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌および抗かび剤、等張および吸収遅延剤等を含むことを意図する。適当な担体は、この分野で標準的な参照テキストであるRemingtonの薬剤学の最新版(出典明示により本明細書の一部とする)に記載されている。そのような担体または賦形剤の好ましい例としては、水、食塩水、フィンガー溶液、ブドウ糖溶液および５％ヒト血清アルブミンを挙げるが、それらに限定しない。リポソームおよび油脂のような非水溶性ビークルもまた使用する。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤は当該分野において周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物に適合しない限りでなければ、組成物内のそれらの使用を意図する。補助的な活性化合物をまた、組成物の中に組込み得る。
【０１９３】
本発明の医薬組成物を、その意図する投与経路に適合するように処方する。投与経路の例としては、非経口の、例えば、静脈の、皮内の、皮下の、経口の(例えば、吸入)、経皮の(即ち局所の)、経粘膜のおよび直腸の投与を挙げ得る。非経口の、皮内のまたは皮下の応用に使用する溶液または懸濁液としては、以下の成分を挙げることができる：注射用水のような無菌賦形剤、食塩水溶液、油脂、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)のようなキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩のような緩衝剤、ならびに塩化ナトリウムまたはブドウ糖のような等張性を調整する薬剤。塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基を用いてｐＨを調整することができる。非経口性製剤を、ガラスまたはプラスチックで作るアンプル、使い捨て注射器、または多回使用バイアルの中に封入し得る。
【０１９４】
注射用に適する医薬組成物としては、無菌水溶液(水溶性である場合)または分散液および無菌注射用の溶液または分散液の必要に応じて調合する製剤用の無菌粉末を挙げ得る。静脈投与のためには、適当な担体としては、生理食塩水、静菌性水、Cremophor EL[登録商標] (BASF, Parsippany, N.J.)またはリン酸緩衝食塩水(ＰＢＳ)を挙げ得る。全ての場合において、組成物は無菌でなければならず、容易に注射できる程度に流動性であるべきである。それは製造および保管の条件下で安定でなければならず、そして細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセリン、プロピレングリコールおよび液性ポリエチレングリコール等)ならびにそれらの適当な混合液を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性を、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散液の場合には必要な粒子径の維持により、および界面活性剤の使用により、保持し得る。微生物作用の保護は、種々の抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等、により達成される。多くの場合に、組成物中に、等張性薬剤、例えば、砂糖、マニトールのようなポリアルコール、ソルビトール、塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成剤の吸収の延長は、組成物中に吸収を遅延する薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含むことによりもたらせ得る。
【０１９５】
無菌注射用溶液を、適切な溶媒の中に一つまたは上で列挙した成分の組合せと共に必要な量で活性化合物(例えば、あるＮＯＶＸタンパク質または抗ＮＯＶＸ抗体)を組み込み、ついでろ過滅菌を行なうことにより調製することができる。一般的に、分散液は、基本的な分散媒体および上で列挙したものから必要な他の成分を含有する無菌ビークルの中に活性化合物を組み込むことにより調製することができる。無菌注射用溶液の調製のための無菌粉末の場合には、調製方法は、活性成分の粉末プラス前もって無菌ろ過されたその溶液からの任意のさらに別の望ましい成分の粉末を生成する真空乾燥および凍結乾燥である。
【０１９６】
一般的に、経口の組成物は、不活性賦形剤または食用の担体を含む。それらをゼラチンカプセル中に封入するかまたは錠剤に打錠することができる。経口治療投与の目的には、活性化合物を添加物と共に組込んで錠剤、トローチまたはカプセルの形状で使用することができる。経口の組成物をまた、うがい薬としての使用のために液体担体を用いて調製し得るが、そこでは液体担体中の化合物を経口的に塗布し、さっと取り除いて、吐き出すか飲み込む。薬学的に適合する結合剤、おおび／またはアジュバント材料を組成物の一部として含み得る。錠剤、丸剤、カプセル、トローチ等は任意の以下の成分または同様な性質を持つ化合物を含有し得る：微結晶セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンのような結合剤；デンプンまたは乳糖のような添加剤、アルギン酸、プリモゲルまたはコーンスターチのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはステロートのような滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素のような滑り剤；ショ糖またはサッカリンのような甘味剤；またはハッカ、サルチル酸メチル、オレンジ香料のような着香剤。
【０１９７】
吸入による投与のためには、化合物を、適当な噴射剤、例えば二酸化炭素のようなガスを含有する加圧容器またはディスペンザー、またはネブライザーからエアゾールスプレイの形式で送達し得る。
【０１９８】
全身的投与はまた、経粘液または経皮手段により得る。経粘液または経皮投与のためには、透過すべきバリアーに適切な浸透剤を処方に使用する。そのような浸透剤は当該分野において一般的に公知であり、そして、例えば、経粘液投与のためには、洗剤、胆汁酸塩、フシジン酸誘導体を挙げ得る。経粘液投与は鼻腔スプレーまたは坐剤の使用により達成され得る。経皮投与のためには、活性化合物は、当該分野において一般的に公知であるように、軟膏、軟膏剤、ゲルまたはクリームの中に処方される。
【０１９９】
化合物をまた、直腸送達のために坐薬(例えば、ココアバターおよび他のグリセリドのような従来の坐剤用基材と共に)または保持浣腸剤の形式で調製し得る。
【０２００】
一つの実施形態において、活性化合物を、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤のように、化合物を身体からの迅速な排泄から防止する担体と共に調製する。酢酸エチレンビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ酢酸のような、生物分解性で生体適合性のポリマーを使用し得る。そのような製剤を調製する方法は当業者に明らかである。材料はまた、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals, Inc.から市販で入手可能である。リポソームの懸濁液(モノクローナル抗体を持つ感染した細胞からウイルス抗体に至って標的化したリポソームを含む)をまた、医薬的に許容され得る担体として使用することができる。これらを、例えば米国特許第４,５２２,８１１号に記載のように、当業者に公知の方法に従い調製し得る。
【０２０１】
投与の容易さおよび投与量の均一性のために、経口性または非経口性の組成物を単位投与剤型で処方することが特に有益である。本明細書で使用する単位投与剤型とは、処置する対象に対して単一の投与量として適する物理学的に分離した単位を指し；それぞれの単位は、必要な薬学的な担体と一緒に望ましい治療効果を生じるように計算した予め決められた量の活性化合物を含有する。本発明の単位投与剤型の規格は、活性化合物の特異な特色および達成するべき特別な治療効果、ならびにそのような活性化合物を個体の処置のために配合する当該分野に固有の制限により指示されかつ直接に依存する。
【０２０２】
本発明の核酸分子をベクターの中に挿入して遺伝子治療ベクターとして使用することができる。遺伝子治療ベクターを、例えば、静脈注射、局所投与により(例えば、米国特許第５,３２８,４７０号を参照)または走触性注射(例えば、Chen, et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3054-3057を参照)により送達し得る。遺伝子治療ベクターの医薬製剤は、許容される賦形剤の中に遺伝子治療ベクターを含むか、またはその中に遺伝子治療ベクターを埋め込んだ持続性マトリックスを含み得る。これに代えて、完全な遺伝子治療ベクターを組換え細胞、例えばレテロウイルスベクターから無傷で生産し得る場合には、医薬製剤は遺伝子送達システムを生産する一つまたはそれ以上の細胞を含み得る。
医薬製剤を、投与指示書と共に、容器、パックまたはディスペンサーの中に含み得る。
【０２０３】
疾患および障害
増加したレベル(疾患または障害に罹患していない対象と比べて)または生物学的活性を特徴とする疾患および障害を、活性に拮抗する(即ち、低下するかまたは阻害する)治療薬で処置し得る。活性に拮抗する治療薬を、治療的様式または予防的様式で投与し得る。利用し得る治療薬としては、(i)前述のペプチド、またはその類似体、誘導体、フラグメントまたは相同体；(ii)前述のペプチドに対する抗体；(iii)前述のペプチドをコードする核酸；(iv)アンチセンス核酸および前述のペプチドの内在的機能を相同組換えにより「ノックアウト」するのに使用する「機能障害性」である核酸(即ち、前述のペプチドに対するコード化配列のコード化配列内への異種挿入に因る)の投与(例えば、Capecchi, 1989. Science 244: 1288-1292を参照)；または(v)前述のペプチドおよびその結合相手との相互作用を変化するモジュレータ(即ち、本発明のさらに別なペプチドのミメティックまたは本発明のペプチドに特異的な抗体を含む阻害剤、アゴニスト、アンタゴニスト)を挙げ得るが、これらに限定しない。
【０２０４】
減少したレベル(疾患または障害に罹患していない対象と比べて)または生物学的活性を特徴とする疾患および障害を、活性を増加する(即ち、アゴニストである)治療薬で処置し得る。活性を上方制御する治療薬を、治療的様式または予防的様式で投与し得る。利用し得る治療薬としては、前述のペプチド、またはその類似体、誘導体、フラグメント、または相同体；またはバイオアベイラビリティーを増加するアゴニストを挙げ得るが、これらに限定しない。
【０２０５】
増加または減少したレベルを、患者の組織試料(例えば、生検組織から)を得て、インビトロでＲＮＡまたはペプチドのレベル、発現したペプチド(または前述のペプチドのｍＲＮＡ)の構造および／または活性をアッセイすることにより、ペプチドおよび／またはＲＮＡを定量することにより容易に検出し得る。当該分野内で周知の方法としては、イムノアッセイ(例えば、ウエスタンブロット分析、免疫沈降とそれに引き続くドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)ポリアクリルアミドゲル電気泳動、免疫細胞化学、等)および／またはｍＲＮＡ発現を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイ(例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、インシツハイブリダイゼーション、等)を挙げ得るが、これらに限定しない。
【０２０６】
予防的方法
一つの態様では、異常なＮＯＶＸ発現または少なくともあるＮＯＶＸ活性を調整する薬剤を対象に投与することにより、本発明は、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または異常を、対象において予防する方法を提供する。異常なＮＯＶＸの発現または活性が原因または一因となって生じる疾患のリスクを有する対象を、例えば、本明細書で説明するように診断的アッセイまたは予後的アッセイのいずれかまたはそれらの組合せによって同定し得る。疾患または障害を予防し、または、これに代えて、その進行を遅らせるようにＮＯＶＸ異常に特徴的な症状の出現に先立って予防的薬剤の投与を行い得る。ＮＯＶＸ異常のタイプに依存して、例えば、あるＮＯＶＸアゴニストまたはＮＯＶＸアンタゴニストである薬剤を対象の処置に使用し得る。適切な薬剤を、本明細書で説明するスクリーニング法に基づいて決定することができる。本発明の予防的方法をさらに以下のサブセクションで考察する。
【０２０７】
治療的方法
本発明のもう一つの態様は、治療目的のためにＮＯＶＸの発現または活性を調整する方法に関する。本発明の調整方法は、細胞を細胞に関連するＮＯＶＸタンパク質活性の一つまたはそれ以上の活性を調整する薬剤と接触することを含む。ＮＯＶＸタンパク質活性を調整する薬剤は、核酸またはタンパク質、あるＮＯＶＸタンパク質の天然に存在する同属のリガンド、ペプチド、あるＮＯＶＸペプチドミメティック、または低分子のような本明細書に説明する薬剤であり得る。一つの実施形態では、薬剤は一つまたはそれ以上のＮＯＶＸタンパク質活性を促進する。そのような促進的薬剤の例としては、活性なＮＯＶＸタンパク質および細胞中に導入したＮＯＶＸをコードする核酸分子を挙げ得る。もう一つの実施形態では、薬剤は一つまたはそれ以上のＮＯＶＸタンパク質活性を阻害する。そのような阻害的薬剤の例としては、アンチセンスＮＯＶＸ核酸分子および抗−ＮＯＶＸ抗体を挙げ得る。これらの調整方法は、インビトロで(例えば、細胞を薬剤と共に培養することにより)または、これに代えて、インビボで(例えば、薬剤を対象に投与することにより)実施し得る。このように、本発明はあるＮＯＶＸタンパク質または核酸分子の異常な発現または活性を特徴とする疾患または障害に罹患した個体を処置する方法を提供する。一つの実施形態では、その方法は、薬剤(例えば、本明細書で説明するスクリーニングアッセイで同定した薬剤)またはＮＯＶＸの発現または活性を調整する(例えば、上方制御または下方制御する)薬剤の組合せを投与することを伴う。もう一つの実施形態では、その方法は減少または異常なＮＯＶＸの発現または活性を補償するための治療としてあるＮＯＶＸタンパク質または核酸分子を投与することを伴う。
【０２０８】
ＮＯＶＸが異常に下方制御されているかおよび／または増加したＮＯＶＸ活性が有益な効果を有すると思われる状況では、ＮＯＶＸ活性を促進することが望ましい。そのような状況の一つの例は、対象が異常な細胞増殖および／または分化(例えば、がんまたは免疫関連疾患)を特徴とする障害を有する場合である。そのような状況のもう一つの例は、対象が妊娠性疾患(例えば、子癇前症)を有する場合である。
【０２０９】
治療薬の生物学的効果の測定
本発明の種々の実施形態において、適切なインビトロまたはインビボアッセイを実施して、特定の治療薬の効果およびその投与を罹患している組織の処置に適応があるか否かを決定する。
【０２１０】
種々の特定の実施形態において、患者の障害に関与する代表的なタイプ(複数を含む)の細胞についてインビトロアッセイを実施して、投与した治療薬が細胞タイプに所望の効果を発揮するかどうかを測定し得る。治療に使用する化合物を、ヒト対象での試験に先立って、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギ等を限定することなく含む適切な動物モデルシステムで試験し得る。同様に、インビボ試験でも、ヒト対象への投与に先立って、当該分野において公知の動物モデルシステムのいずれかを使用し得る。
【０２１１】
本発明の組成物の予防的使用および治療的使用
本発明のＮＯＶＸ核酸およびタンパク質は、種々の障害に関連する潜在的で予防的応用および治療的応用に有用である。障害としては、限定しないが、例えば、前記の疾病、障害および状態を含み、特に、表Ａに要約するようなＮＯＶＸタンパク質の相同物と関連した疾病、障害および状態を含む。
【０２１２】
例として、本発明のＮＯＶＸタンパク質をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療に有用であり得、そしてタンパク質は、それを必要とする対象に投与する際に有用であり得る。非限定的な例として、本発明の組成物は、本明細書に挙げられたものを含むが、それらに限定されない疾病、障害、状態およびそれに類似するものに罹患する対象の処置のための効験を有するであろう。
【０２１３】
ＮＯＶＸタンパク質をコードする新規核酸、および本発明のＮＯＶＸタンパク質の両方、またはそれらのフラグメントはまた、核酸またはタンパク質の存在または量を評価する診断的応用にも有用であり得る。さらなる使用は、抗細菌分子(即ち、或るペプチドは抗細菌的性質を有することが見出されている)としてであるかもしれない。これらの物質は、治療的または診断的方法に使用するための本発明の新規物質に免疫特異的に結合する抗体の作成にさらに有用である。
本発明を、以下の実施例でさらに記載し、これらはクレームに記載の発明の範囲を限定しない。
【実施例】
【０２１４】
（実施例１）
NOV2クローンが分析された。そのヌクレオチド配列およびコードされるポリペプチド配列が表2Aに示される。
【０２１５】
【表２−１】
2005528434.tif 000004
【表２−２】
2005528434.tif 000005
【表３】
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【表４】
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【表５】
2005528434.tif 000008
【表６】
2005528434.tif 000009
【表７】
2005528434.tif 000010
【表８】
2005528434.tif 000011
【表９】
2005528434.tif 000012
【表１０】
2005528434.tif 000013
【表１１】
2005528434.tif 000014
【表１２】
2005528434.tif 000015
【表１３】
2005528434.tif 000016
【表１４】
2005528434.tif 000017
【表１５】
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【表１６】
2005528434.tif 000019
【表１７】
2005528434.tif 000020
【表１８】
2005528434.tif 000021
【表１９】
2005528434.tif 000022
【表２０−１】
2005528434.tif 000023
【表２０−２】
2005528434.tif 000024
【表２１】
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【表２２】
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【表２３】
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【表２４】
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【表２５】
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【表２６】
2005528434.tif 000030
【表２７】
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【表２８】
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【表２９】
2005528434.tif 000033
【表３０】
2005528434.tif 000034
【表３１】
2005528434.tif 000035
【表３２】
2005528434.tif 000036
【表３３】
2005528434.tif 000037
【表３４−１】
2005528434.tif 000038
【表３４−２】
2005528434.tif 000039
【表３５】
2005528434.tif 000040
【表３６】
2005528434.tif 000041
【表３７】
2005528434.tif 000042
【表３８】
2005528434.tif 000043
【表３９】
2005528434.tif 000044
【表４０】
2005528434.tif 000045
【表４１】
2005528434.tif 000046
【表４２】
2005528434.tif 000047
【表４３】
2005528434.tif 000048
【表４４】
2005528434.tif 000049
【表４５】
2005528434.tif 000050
【０２１６】
CG51896-11（配列番号50）およびCG51896-13（配列番号54）の説明
CG51896-11ポリペプチドは5'末端または3'末端のいずれかでFc領域に付加された。得られた変種を適切な発現ベクターにクローン化した。同様に、CG51896-13核酸およびタンパク質が（核酸配列における1〜705およびタンパク質配列における1〜235に及ぶ）5'末端においてFcに付加された。核酸およびポリペプチド中のFc領域は下記に（強調されて）示される：
【０２１７】
Fcで標識されたCG51896-13の核酸配列：
【表４６】
2005528434.tif 000051
【０２１８】
Fcで標識されたCG51896-13のタンパク質配列：
【表４７】
2005528434.tif 000052
【０２１９】
上記タンパク質配列のClustalW比較により、表2Bに示される下記の配列アラインメントが得られる。
【０２２０】
【表４８−１】
2005528434.tif 000053
【表４８−２】
2005528434.tif 000054
【表４８−３】
2005528434.tif 000055
【表４８−４】
2005528434.tif 000056
【表４８−５】
2005528434.tif 000057
【表４８−６】
2005528434.tif 000058
【表４８−７】
2005528434.tif 000059
【表４８−８】
2005528434.tif 000060
【表４８−９】
2005528434.tif 000061
【表４８−１０】
2005528434.tif 000062
【表４８−１１】
2005528434.tif 000063
【表４８−１２】
2005528434.tif 000064
【表４８−１３】
2005528434.tif 000065
【表４８−１４】
2005528434.tif 000066
【０２２１】
NOV2aタンパク質のさらなる分析により、表2Cに示される下記の特性が得られた。
【０２２２】
【表４９−１】
2005528434.tif 000067
【表４９−２】
2005528434.tif 000068
【表４９−３】
2005528434.tif 000069
【０２２３】
特許および特許公報中に公開された配列を含む特許データベース、Geneseqデータベースに対するNOV2aタンパク質の検索により、表2Dに示されるいくつかの相同タンパク質が得られた。
【０２２４】
【表５０】
2005528434.tif 000070
【０２２５】
公開配列データベースのBLAST検索において、NOV2aタンパク質は、表2EにおけるBLASTPデータに示されるタンパク質に対する相同性を有することが見出された。
【０２２６】
【表５１】
2005528434.tif 000071
【０２２７】
PFam分析により、NOV2aタンパク質は、表2Fに示されるドメインを含有することが予測される。
【０２２８】
【表５２】
2005528434.tif 000072
【０２２９】
（実施例２）
様々な細胞および組織におけるクローンの定量的発現分析
様々なクローンの量的発現が、様々な正常および病理学由来の細胞、細胞株および組織から得られたRNAサンプルを含有するマイクロタイタープレートを使用し、また、リアルタイム定量的PCR（RTQ PCR）を使用して評価された。RTQ PCRはApplied Biosystems ABI PRISM（登録商標）7700またはABI PRISM（登録商標）7900 HT Sequence Detection Systemで行われた。様々なサンプル収集物がプレートに集められ、これらは、パネル1（正常な組織および癌細胞株を含む）、パネル2（正常組織起源および癌組織起源の組織に由来するサンプルを含む）、パネル3（癌細胞株を含む）、パネル4（炎症状態に関連づけられる正常な組織および細胞から得られた細胞および細胞株を含む）、パネル5D/5I（代謝性疾患に重点が置かれたヒト組織およびヒト細胞株を含む）、AI包括的パネル（自己炎症性疾患から得られた正常な組織およびサンプルを含む）、パネルCNSD.01（正常な脳および疾患脳から得られたサンプルを含む）、CNS神経変性パネル（正常な脳およびアルツハイマー病疾患脳から得られたサンプルを含む）と呼ばれる。
【０２３０】
すべてのサンプルから得られたRNAの完全性は、指針としての28Sおよび18SのリボソームRNA染色強度比（2:1〜2.5:1の28s:18s）、また、分解産物を示すと考えられる低分子量RNAの非存在を使用したアガロースゲル電気泳動の目視評価により、品質について管理される。サンプルは、1つだけのエキソンの領域全体を増幅するために設計されたプローブおよびプライマーの組を使用して逆転写酵素の非存在下で操作されるRTQ PCR反応によってゲノムDNAの混入に対して管理される。
【０２３１】
最初に、RNAサンプルは、構成的に発現している遺伝子（例えば、β-アクチンおよびGAPDH）などの参照核酸に対して正規化された。正規化されたRNA（5ul）がcDNAに変換され、One Step RT-PCR Master Mix Reagents（Applied Biosystems；カタログ番号4309169）および遺伝子特異的プライマーを製造者の説明書に従って使用するRTQ-PCRによって分析された。
【０２３２】
他の場合には、非正規化RNAサンプルが、Superscript II（Invitrogen Corporation；カタログ番号18064-147）およびランダムヘキサマーを製造者の説明書に従って使用して一本鎖cDNA（sscDNA）に変換された。10μgまでの総RNAを含有する反応は20μlの容量で実施され、反応液は42℃で60分間インキュベーションされた。この反応は最終容量100μlにおいて50μgの全RNAまで増やすことができる。その後、sscDNAサンプルは、製造者の説明書に従って、1X TaqMan（登録商標）Universal Masterミックス（Applied Biosystems；カタログ番号4324020）を使用して以前に記載されたように参照核酸に対して正規化される。
【０２３３】
プローブおよびプライマーは、標的配列を入力として使用してApplied Biosystems Primer Express Softwareパッケージ（バージョンI、Apple Computer's Macintosh Power PC用）または類似するアルゴリズムに従ってそれぞれのアッセイのために設計された。初期設定の設定値が反応条件のために使用され、下記のパラメーターが、プライマーを選択する前に設定された：プライマー濃度＝250nM、プライマー融解温度（Tm）範囲＝58℃〜60℃、プライマー至適Tm＝59℃、最大プライマー差＝2℃、プローブは5'のGを有しない、プローブのTmはプライマーのTmよりも10℃高くなければならない、アンプリコンサイズ＝75bp〜100bp。選択されたプローブおよびプライマー（下記参照）をSynthegen（Houston、TX、米国）によって合成した。プローブは、非結合の色素を除去するためにHPLCによって2回精製され、また、レポーター色素および消光剤色素がプローブの5'末端および3'末端にそれぞれ結合していることを確認するために質量分析法によって評価された。それらの最終濃度は下記の通りであった：順方向プライマーおよび逆方向プライマー、それぞれ900nM；プローブ、200nM。
【０２３４】
PCR条件：RNAサンプルを用いて操作する際、それぞれの組織およびそれぞれの細胞株から得られた正規化RNAが96ウェルPCRプレートまたは384ウェルPCRプレート（Applied Biosystems）のいずれかの各ウェルにスポットされた。PCRカクテルには、1つの遺伝子だけに特異的なプローブおよびプライマーの1組、または、多重化されたプローブおよびプライマーの2つの組（標的クローンに対して特異的な1つの組、および標的クローンと多重化された別の遺伝子特異的な組）のいずれかが含まれた。PCR反応は、TaqMan(登録商標)ワンステップRT-PCR Master Mix (Applied Biosystems、カタログ番号4313803)を、製品使用説明書に従って用いて設定した。逆転写は48℃で30分間行われ、その後、増幅／PCRサイクルは下記のように行われた：95℃で10分、次いで、95℃で15秒、60℃で1分からなる40サイクル。結果は、対数スケールを使用してCT値（所与サンプルが蛍光の閾値レベルを超えるサイクル）として記録され、所与サンプルと最低CT値のサンプルとのRNA濃度差が2のデルタCT乗として表された。その場合、相対的な発現割合が、このRNA差の逆数を取り、100を乗ずることによって得られる。CT値が28未満である発現は高発現であると見なされ、28〜32の間のCT値は中程度であると見なされ、32〜35の間のCT値は低発現であると見なされる。CT値が35を超える相対的発現はすべて、有意な発現であるとは見なされない。
【０２３５】
sscDNAサンプルを用いて操作されるとき、正規化されたsscDNAを、RNAサンプルについて以前に記載したように使用した。1または2セットのプローブおよびプライマーを含むPCR反応を、1×TaqMan(登録商標)Universal Master mix(Applied Biosystems;カタログ番号4324020)を、製品使用説明書に従って用いて、上述の通り設定した。PCR増幅を以下のように実施した：95℃で10分、次いで、95℃で15秒、60℃で1分からなる40サイクル。結果は上述のように分析、処理された。
【０２３６】
パネル1、パネル1.1、パネル1.2およびパネル1.3D
パネル1、パネル1.1、パネル1.2およびパネル1.3Dに対するプレートには、2つの対照ウェル（ゲノムDNA対照および化学対照）と、様々なサンプルから得られたcDNAを含有する94個のウェルとが含まれる。これらのパネルにおけるサンプルは2つのクラスに分けられる：培養された細胞株に由来するサンプルおよび初代の正常組織に由来するサンプル。細胞株は以下の種類の癌に由来する：肺癌、乳癌、メラノーマ、結腸癌、前立腺癌、CNS癌、扁平上皮癌、卵巣癌、肝臓癌、腎臓癌、胃癌および膵臓癌。これらのパネルで使用された細胞株は、培養細胞株の保存機関である、American Type Culture Collection（ATCC）から広く入手することができ、ATCCにより推奨される条件を使用して培養された。これらのパネルについて見出される正常な組織は、1体の成体または胎児から得られたすべての主要な器官系に由来するサンプルから構成される。これらのサンプルは以下の器官に由来する：成体骨格筋、胎児骨格筋、成体心臓、胎児心臓、成体腎臓、胎児腎臓、成体肝臓、胎児肝臓、成体肺、胎児肺、脳の様々な領域、脾臓、骨髄、リンパ節、膵臓、唾液腺、下垂体、副腎、脊髄、胸腺、胃、小腸、結腸、膀胱、気管、乳房、卵巣、子宮、胎盤、前立腺、精巣および脂肪。
【０２３７】
パネル1、パネル1.1、パネル1.2およびパネル1.3Dに対する結果では、下記の略号が使用される：
ca.＝癌腫、
＊＝転移から確立されたもの、
met＝転移、
s cell var＝小細胞変種、
non-s＝non-sm＝非小、
squam＝扁平上皮の
pl. eff＝pl efflusion＝胸水
glio＝神経膠腫、
astro＝星状細胞腫、および
neuro＝神経芽細胞腫。
【０２３８】
一般スクリーニングパネルv1.4、v1.5、v1.6および1.7
パネル1.4、パネル1.5、パネル1.6およびパネル1.7に対するプレートには、2つの対照ウェル（ゲノムDNA対照および化学対照）と、様々なサンプルから得られたcDNAを含有する88個〜94個のウェルとが含まれる。パネル1.4、パネル1.5、パネル1.6およびパネル1.7におけるサンプルは2つのクラスに分けられる：培養細胞株に由来するサンプルおよび初代の正常組織に由来するサンプル。細胞株は以下の種類の癌に由来する：肺癌、乳癌、メラノーマ、結腸癌、前立腺癌、CNS癌、扁平上皮癌、卵巣癌、肝臓癌、腎臓癌、胃癌および膵臓癌。パネル1.4、パネル1.5、パネル1.6およびパネル1.7で使用された細胞株は、培養細胞株の保存機関であるAmerican Type Culture Collection（ATCC）から広く入手することができ、ATCCにより推奨される条件を使用して培養された。パネル1.4、パネル1.5、パネル1.6およびパネル1.7について見出される正常な組織は、2体〜5体の異なる成体または胎児から得られたすべての主要な器官系に由来するサンプルのプールから構成される。これらのサンプルは以下の器官に由来する：成体骨格筋、胎児骨格筋、成体心臓、胎児心臓、成体腎臓、胎児腎臓、成体肝臓、胎児肝臓、成体肺、胎児肺、脳の様々な領域、脾臓、骨髄、リンパ節、膵臓、唾液腺、下垂体、副腎、脊髄、胸腺、胃、小腸、結腸、膀胱、気管、乳房、卵巣、子宮、胎盤、前立腺、精巣および脂肪。略号は、パネル1、パネル1.1、パネル1.2およびパネル1.3Dについて記載された通りである。
【０２３９】
パネル2D、パネル2.2、パネル2.3およびパネル2.4
パネル2D、パネル2.2、パネル2.3およびパネル2.4に対するプレートは、一般には、2つの対照ウェルと、National Cancer Institute’s Cooperative Human Tissue Network（CHTN）またはthe National Disease Research Initiative（NDRI）と密接な協力関係を持つ医師により入手したか、あるいはArdaisまたはClinomicsから得たヒト組織から単離した、RNAまたはcDNAからなる94の試験サンプルが含まれる。組織はヒト悪性腫瘍に由来しており、示された場合、多くの悪性組織は、腫瘍にすぐ隣接する非癌性組織から得られた「対応縁部」を有する。これらは、下記の結果では、正常隣接組織と呼ばれ、「NAT」として示される。腫瘍組織および「対応縁部」は、2名の独立した病理学者によって(外科病理学者およびさらにNDRI/CHTN/Ardais/Clinomicsの病理学者によって)評価される。悪性腫瘍を有しない組織（正常な組織）から得られた非対応RNAサンプルもまた、ArdaisまたはClinomicsから得られた。この分析により、腫瘍分化進行度の全体的な組織病理学的評価がもたらされる。さらに、ほとんどのサンプルには、患者の臨床的段階に関する情報を提供する最初の外科病理学記録が含まれる。これら対応縁部は外科手術域を取り囲む(すなわち、最も近くに隣接する)組織(表RRでは正常隣接細胞という語から「NAT」と表す)から採取される。さらに、RNAサンプルおよびcDNAサンプルが、高齢者または突然死の死者（事故など）に対して行われた検死に由来する様々なヒト組織から得られた。これらの組織は、疾患を有しないことが確認され、また、様々な市販元から、例えば、Clontech（Palo Alto、CA）、Research GeneticsおよびInvitrogenから購入された。
【０２４０】
HASSパネルv1.0
HASSパネルv1.0プレートは、93個のcDNAプレートおよび2個の対照から構成される。具体的には、これらのサンプルのうちの81個が、血清飢餓、アシドーシスおよび酸素欠乏に種々の期間さらされていた培養ヒト癌細胞株、ならびにこれらの処置に対する対照に由来し、3個のサンプルがヒト初代細胞であり、9個のサンプルが悪性の脳癌（4つの髄芽細胞腫および5つの神経膠芽細胞腫）であり、2個が対照である。ヒト癌細胞株はATCC（American Type Culture Collection）から得られ、以下の組織群に含まれる：乳癌、前立腺癌、膀胱癌腫、膵臓癌およびCNS癌の細胞株。これらの癌細胞はすべて、標準的な推奨される条件のもとで培養される。使用された処置（血清飢餓、アシドーシスおよび酸素欠乏）は科学文献に以前に記載されている。初代ヒト細胞が、Clonetics（Walkersville、MD）から得られ、Cloneticsより推奨される培地および条件で成長させられた。悪性脳癌サンプルが共同研究（Henry Ford Cancer Center）の一環として得られ、これは、CuraGenがサンプルを受け取る前に病理学者によって評価されている。標準的な手順を用いてRNAをこれらのサンプルから調製した。ゲノム対照および化学対照ウェルについては既に記載した。
【０２４１】
パネル3D、パネル3.1およびパネル3.2
パネル3D、パネル3.1およびパネル3.2のプレートは、94個のcDNAサンプルおよび2個の対照サンプルから構成される。具体的には、これらのサンプルのうちの92個が培養ヒト癌細胞株に由来し、2個のサンプルがヒト初代小脳組織であり、2個が対照である。ヒト細胞株は、一般には、ATCC（American Type Culture Collection）、NCIまたはドイツ腫瘍細胞バンクから得られ、以下の組織群に含まれる：舌の扁平上皮癌、乳癌、前立腺癌、メラノーマ、類表皮癌、肉腫、膀胱癌腫、膵臓癌、腎臓癌、白血病／リンパ腫、卵巣／子宮／子宮頸部癌、胃癌、結腸癌、肺癌およびCNS癌の細胞株。さらに、小脳の2つの独立したサンプルが存在する。これらの細胞はすべてが、標準的な推奨される条件のもとで培養され、RNAが、標準的な手法を使用して抽出される。3D、3.1、3.2、1、1.1、1.2、1.3D、1.4、1.5および1.6の各パネルにおける細胞株は、科学文献において使用される非常に一般的な細胞株である。
【０２４２】
パネル4D、パネル4Rおよびパネル4.1D
パネル4はサンプルを96ウェルプレート（2個の対照ウェル、94個の試験サンプル）に含み、これらは、炎症状態に関連づけられる様々なヒト細胞株またはヒト組織から単離されたRNA（パネル4R）またはcDNA（パネル4D／パネル4.1D）から構成される。対照の正常組織から得られた総RNA、例えば、結腸および肺から得られた総RNA（Stratagene、La Jolla、CA）、ならびに胸腺および腎臓から得られた総RNA（Clontech）などが用いられた。肝硬変患者からの肝臓組織から得られた総RNA、および狼瘡患者からの腎臓から得られた総RNAがBioChain（Biochain Institute, Inc.、Hayward、CA）から得られた。クローン病および潰瘍性大腸炎を有すると診断された患者からRNAを調製するための小腸組織がNational Disease Research Interchange（NDRI）（Philadelphia、PA)から得られた。
【０２４３】
星状細胞、肺繊維芽細胞、皮膚繊維芽細胞、冠状動脈平滑筋細胞、小気道上皮、気管支上皮、微小血管表皮内皮細胞、微小血管肺内皮細胞、ヒト肺大動脈内皮細胞、ヒト臍帯静脈内皮細胞がすべて、Clonetics（Walkersville、MD）から購入され、Cloneticsによりこれらの細胞タイプのために供給される培地において成長させられた。これらの初代細胞タイプは、示されたように、6時間および／または12時間〜14時間、様々なサイトカインまたはサイトカインの組合せで活性化された。下記のサイトカインが使用された：IL-1β（約1ng/ml〜5ng/mlで）、TNFα（約5ng/ml〜10ng/mlで）、IFNγ（約20ng/ml〜50ng/mlで）、IL-4（約5ng/ml〜10ng/mlで）、IL-9（約5ng/ml〜10ng/mlで）、IL-13（約5ng/ml〜10ng/mlで）。内皮細胞には、0.1％の血清を含有するCloneticsからの基礎培地における培養によって様々な時間飢餓処理に供されるものもあった。
【０２４４】
単核細胞は、Ficollを使用してCuraGen Corporationの従業員の血液から調製された。LAK細胞は、DMEM、5％FCS（Hyclone）、100μM非必須アミノ酸（Gibco/Life Technologies、Rockville、MD）、1mMピルビン酸ナトリウム（Gibco）、メルカプトエタノール（5.5x10-5M）（Gibco）および10mMのHepes（Gibco）ならびにインターロイキン2において4日間〜6日間、培養することによってこれらの細胞から調製された。その後、細胞は、10ng/ml〜20ng/mlのPMAおよび1μg/ml〜2μg/mlのイオノマイシン、5ng/ml〜10ng/mlでのIL-12、20ng/ml〜50ng/mlでのIFNγおよび5ng/ml〜10ng/mlでのIL-18のいずれかで6時間にわたって活性化された。場合により、単核細胞は、約5μg/mlでのPHA（フィトヘマグルチニン）またはPWM(ポークウィードマイトジェン)とともに、DMEM、5％FCS（Hyclone）、100μM非必須アミノ酸（Gibco）、1mMピルビン酸ナトリウム（Gibco）、メルカプトエタノール（5.5x10-5M）（Gibco）および10mMのHepes（Gibco）において4日間〜5日間、培養された。サンプルは、RNA調製のために、24時間、48時間および72時間で採取された。MLR（混合リンパ球反応）サンプルは、2名の献血者から血液を採取し、Ficollを使用して単核細胞を単離し、そして、単離された単核細胞を、DMEM、5％FCS（Hyclone）、100μM非必須アミノ酸（Gibco）、1mMピルビン酸ナトリウム（Gibco）、メルカプトエタノール（5.5x10-5M）（Gibco）および10mMのHepes（Gibco）において約2x106細胞/mlの最終濃度で、1:1で混合することによって得られた。MLRは培養され、サンプルがRNA調製のために1日〜7日の範囲の様々な時点で採取された。
【０２４５】
単球が、CD14 Miltenyi Beads、ポジティブVS選択カラムおよびVario Magnetを製造者の説明書に従って使用して単核細胞から単離された。単球を、DMEM、5％ウシ胎児血清（FCS）（Hyclone、Logan、UT）、100μM非必須アミノ酸（Gibco）、1mMピルビン酸ナトリウム（Gibco）、メルカプトエタノール（5.5x10-5M）（Gibco）および10mMのHepes（Gibco）、50ng/mlのGMCSFおよび5ng/mlのIL-4において5日間〜7日間培養することによって樹状細胞に分化させた。マクロファージが、単球を、DMEM、5％FCS（Hyclone）、100μM非必須アミノ酸（Gibco）、1mMピルビン酸ナトリウム（Gibco）、メルカプトエタノール（5.5x10-5M）（Gibco）、10mMのHepes（Gibco）および10％のABヒト血清または約50ng/mlでのMCSFにおいて5日間〜7日間にわたって培養することによって調製された。単球、マクロファージおよび樹状細胞は、6時間および12時間〜14時間、100ng/mlでのリポ多糖（LPS）で刺激された。樹状細胞はまた、6時間および12時間〜14時間、10μg/mlでの抗CD40モノクローナル抗体（Pharmingen）で刺激された。
【０２４６】
CD4リンパ球、CD8リンパ球およびNK細胞もまた、CD4、CD8およびCD56のMiltenyiビーズ、陽性VS選択カラムおよびVario Magnetを製造者の説明書に従って使用して単核細胞から単離された。CD45RAおよびCD45ROのCD4リンパ球が、CD8、CD56、CD14およびCD14のMiltenyiビーズおよび陽性選択を使用してCD8細胞、CD56細胞、CD14細胞およびCD19細胞の単核細胞を枯渇することによって単離された。その後、CD45ROビーズを使用して、CD45RO CD4リンパ球が単離され、残った細胞はCD45RA CD4リンパ球であった。CD45RA CD4リンパ球、CD45RO CD4リンパ球およびCD8リンパ球を、DMEM、5％FCS（Hyclone）、100μM非必須アミノ酸（Gibco）、1mMピルビン酸ナトリウム（Gibco）、メルカプトエタノール（5.5x10-5M）（Gibco）および10mMのHepes（Gibco）に入れ、PBSにおける0.5μg/mlの抗CD28（Pharmingen）および3ug/mlの抗CD3（OKT3、ATCC）で一晩コーティングされたFalcon 6ウェル組織培養プレートに106細胞/mlでプレーティングした。6時間後および24時間後、細胞をRNA調製のために集めた。時間的に活性化されたCD8リンパ球を調製するために、本発明者らは、単離されたCD8リンパ球を、抗CD28および抗CD3でコーティングされたプレートで4日間にわたって活性化して、細胞を集め、その後、細胞を、DMEM、5％FCS（Hyclone）、100μM非必須アミノ酸（Gibco）、1mMピルビン酸ナトリウム（Gibco）、メルカプトエタノール（5.5x10-5M）（Gibco）および10mMのHepes（Gibco）ならびにIL-2において拡大培養した。拡大培養されたCD8細胞は、その後、抗CD3および抗CD28を結合させたプレートで4日間、再び活性化され、以前のように拡大培養された。RNAを、2回目の活性化の6時間後および24時間後に、そして、4日間の2回目の拡大培養の後で単離した。単離されたNK細胞は、DMEM、5％FCS（Hyclone）、100μM非必須アミノ酸（Gibco）、1mMピルビン酸ナトリウム（Gibco）、メルカプトエタノール（5.5x10-5M）（Gibco）および10mMのHepes（Gibco）ならびにIL-2において4日間〜6日間にわたって培養され、その後、RNAが調製された。
【０２４７】
B細胞を得るために、扁桃をNDRIから入手した。扁桃を滅菌した解剖用鋏で細かく切断した後、篩にかけた。その後、扁桃細胞を遠心分離して、DMEM、5％FCS（Hyclone）、100μM非必須アミノ酸（Gibco）、1mMピルビン酸ナトリウム（Gibco）、メルカプトエタノール（5.5x10-5M）（Gibco）および10mMのHepes（Gibco）に106細胞/mlで再懸濁した。細胞を活性化するために、本発明者らは、5μg/mlでのPWMまたは約10μg/mlでの抗CD40（Pharmingen）および5ng/ml〜10ng/mlのIL-4を使用した。RNA調製のために、細胞を24時間、48時間および72時間で集めた。
【０２４８】
初代および二次的なTh1/Th2細胞およびTr1細胞を調製するために、6ウェルのFalconプレートを10μg/mlの抗CD28（Parmingen）および2μg/mlのOKT3（ATCC）で一晩コーティングし、その後、PBSで2回洗浄した。臍帯血CD4リンパ球（Poietic Systems、German Town、MD）を、DMEM、5％FCS（Hyclone）、100μM非必須アミノ酸（Gibco）、1mMピルビン酸ナトリウム（Gibco）、メルカプトエタノール（5.5x10-5M）（Gibco）、10mMのHepes（Gibco）およびIL-2（4ng/ml）中で105〜106細胞/mlで培養した。IL-12（5ng/ml）および抗IL-4（1μg/ml）が、Th1に誘導するために使用され、一方、IL-4（5ng/ml）および抗INFγ（1μg/ml）が、Th2に誘導するために使用され、5ng/mlでのIL-10が、Tr1に誘導するために使用された。4日後〜5日後、活性化されたTh1リンパ球、Th2リンパ球およびTr1リンパ球はDMEMで1回洗浄され、そして、4日間〜7日間、DMEM、5％FCS（Hyclone）、100μM非必須アミノ酸（Gibco）、1mMピルビン酸ナトリウム（Gibco）、メルカプトエタノール（5.5x10-5M）（Gibco）、10mMのHepes（Gibco）およびIL-2（1ng/ml）において拡大培養された。この後、活性化されたTh1リンパ球、Th2リンパ球およびTr1リンパ球は、上述の通りではあるが、アポトーシスを防止するために抗CD95L（1μg/ml）の添加を伴って、抗CD28/OKT3およびサイトカインで5日間、再び刺激された。4日後〜5日後、Th1リンパ球、Th2リンパ球およびTr1リンパ球は洗浄され、その後、IL-2とともに4日間〜7日間、再び拡大培養された。活性化されたTh1リンパ球およびTh2リンパ球は、最大で3サイクルにわたってこのように維持された。抗CD3 mAbおよび抗CD28 mAbを結合させたプレートを用いた2回目および3回目の活性化の後の6時間後および24時間後、そして、インターロイキン2における2回目および3回目の拡大培養に入った4日後に、RNAを初代および二次的なTh1、Th2およびTr1から調製した。
【０２４９】
以下の白血球細胞株をATCCから得た：Ramos、EOL-1、KU-812。EOL細胞は、5x105細胞/mlで8日間にわたり0.1mMのdbcAMPにおいて培養し、培地を3日毎に交換し、細胞濃度を5x105細胞/mlに調製することによってさらに分化させた。これらの細胞の培養のために、本発明者らは、5％FCS（Hyclone）、100μM非必須アミノ酸（Gibco）、1mMピルビン酸ナトリウム（Gibco）、メルカプトエタノール（5.5x10-5M）（Gibco）、10mMのHepes（Gibco）を添加して、（ATCCにより推奨されるような）DMEMまたはRPMIを使用した。RNAを、休止細胞、または、10ng/mlでのPMAおよび1μg/mlでのイオノマイシンで6時間および14時間にわたって活性化された細胞のいずれかから調製した。ケラチノサイト株CCD106および気道上皮腫瘍株NCI-H292もまたATCCから得た。両者は、DMEM、5％FCS（Hyclone）、100μM非必須アミノ酸（Gibco）、1mMピルビン酸ナトリウム（Gibco）、メルカプトエタノール（5.5x10-5M）（Gibco）および10mMのHepes（Gibco）において培養された。CCD1106細胞は、約5ng/mlのTNFαおよび1ng/mlのIL-1βで6時間および14時間にわたり活性化され、一方、NCI-H292細胞は、以下のサイトカイン:5ng/ml IL-4、5ng/ml IL-9、5ng/ml IL-13および25ng/ml IFNγで、6および14時間活性化された。
【０２５０】
これらの細胞株および血液細胞の場合、RNAは、Trizol（Gibco BRL）を使用して約107細胞/mlを溶解することによって調製された。簡単に記載すると、1/10容量のブロモクロロプロパン（Molecular Research Corporation）をRNAサンプルに加え、激しく撹拌して、室温で10分後、チューブをSorvall SS34ローターにおいて14,000rpmで遠心分離した。水相を取り出し、15mlのFalconチューブに入れた。等容量のイソプロパノールを加えて、-20℃で一晩置いた。沈殿したRNAを、Sorvall SS34ローターにおいて15分間、9,000rpmで遠心分離し、70％エタノールで洗浄した。ペレットを300μlのRNAse非含有水に再溶解し、35μlの緩衝液（Promega）、5μlのDTT、7μlのRNAsinおよび8μlのDNAseを加えた。チューブを37℃で30分間インキュベーションして、混入しているゲノムDNAを除き、フェノールクロロホルムで1回抽出して、1/10容量の3M酢酸ナトリウムおよび2容量の100％エタノールを用いて再び沈殿させた。RNAを遠心分離し、RNAse非含有水に入れた。RNAは-80℃で保存された。
【０２５１】
表3A、表3Bおよび表3Cに記載のプライマー−プローブの組（Ag2772、Ag88およびAg6309）を使用して遺伝子CG51896-04の発現を評価した。RTQ-PCR処理の結果が、表3D、表3E、表3F、表3G、表3H、表3I、表3J、表3Kおよび表Lに示される。
【０２５２】
表3A．プローブ名Ag2772
【表５３】
2005528434.tif 000073
【０２５３】
表3B．プローブ名Ag88
【表５４】
2005528434.tif 000074
【０２５４】
表3C．プローブ名Ag6309
【表５５】
2005528434.tif 000075
【０２５５】
表3D．CNS神経変性v1.0
【表５６】
2005528434.tif 000076
【０２５６】
表3E．一般スクリーニングパネルv1.5
【表５７−１】
2005528434.tif 000077
【表５７−２】
2005528434.tif 000078
【０２５７】
表3F．HASSパネルv1.0
【表５８−１】
2005528434.tif 000079
【表５８−２】
2005528434.tif 000080
【０２５８】
表3G．パネル1
【表５９−１】
2005528434.tif 000081
【表５９−２】
2005528434.tif 000082
【０２５９】
表3H．パネル1.3D
【表６０−１】
2005528434.tif 000083
【表６０−２】
2005528434.tif 000084
【０２６０】
表3I．パネル2D
【表６１−１】
2005528434.tif 000085
【表６１−２】
2005528434.tif 000086
【０２６１】
表3J．パネル3D
【表６２−１】
2005528434.tif 000087
【表６２−２】
2005528434.tif 000088
【０２６２】
表3K．パネル4D
【表６３−１】
2005528434.tif 000089
【表６３−２】
2005528434.tif 000090
【０２６３】
表3L．一般オンコロジースクリーニングパネルv2.4
【表６４】
2005528434.tif 000091
【０２６４】
CNS神経変性v1.0の要約：Ag2772／Ag6309  このパネルにより、この遺伝子の発現は、無関係な個体群の脳において低いレベルにあることが確認される。
【０２６５】
一般スクリーニングパネルv1.5の要約：Ag6309  この遺伝子の最高発現が脊髄において検出される（CT＝29.4）。この遺伝子の中程度の発現が、小脳扁桃（扁桃）、海馬、黒質、視床、小脳、大脳皮質および脊髄を含む調べられた中枢神経系のすべての領域において主に認められる。この遺伝子はセマフォリン6Aタンパク質（Sema6A）をコードする。Sema6Aは、視床皮質ニューロンで発現し、その軸索が正しく突き出るために要求されることが示されている（Leighton PA, Mitchell KJ, Goodrich LV, Lu X, Pinson K, Scherz P, Skarnes WC, Tessier-Lavigne M, 2001, Nature, 410(6825):174-9）。従って、この遺伝子産物の治療的調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、てんかん、多発性硬化症、統合失調症およびうつ病などの中枢神経系の障害を処置することにおいて有用であり得る。
【０２６６】
この遺伝子の低い発現もまた、脳、卵巣、メラノーマおよび腎臓の癌に由来する多数の癌細胞株において認められる。従って、この遺伝子またはこの遺伝子によりコードされるSema6Aタンパク質の、小分子または抗体の使用による治療的調節は、これらの癌の処置において、特に、これらの癌細胞系統の遊走を阻害することにおいて有用であり得る。
【０２６７】
HASSパネルv1.0の要約：Ag2772  この遺伝子の最高発現が脳癌（487髄性）サンプルにおいて認められる（CT＝27.3）。この遺伝子の高〜中程度の発現が、髄芽細胞腫および神経膠腫の脳癌サンプルならびに前立腺癌（LuCAP）細胞株において認められる。この遺伝子の発現は、酸性および低酸素の環境のもとではLnCAP細胞においてダウンレギュレーションされる。さらに、この遺伝子の低い発現もまたMCF7細胞において認められる。従って、この遺伝子またはそのタンパク質産物の治療的調節は、脳癌、前立腺癌および乳癌の処置において有用であり得る。
【０２６８】
パネル1の要約：Ag88  この遺伝子の最高発現が小脳において認められる（CT＝24.5）。この遺伝子の高発現が、調べられた中枢神経系のすべての領域において主に認められる。この遺伝子のさらなる議論についてはパネル1.5を参照のこと。
【０２６９】
この遺伝子の高〜中程度の発現がまた、膵臓、甲状腺、副腎、下垂体、骨格筋、心臓、肝臓および胃腸管を含む、代謝／内分泌機能を有する組織において認められる。従って、この遺伝子の活性の治療的調節は、内分泌／代謝に関連する疾患、例えば、肥満および糖尿病などの処置において有用であり得る。
【０２７０】
この遺伝子の高〜中程度の発現がまた、メラノーマ、卵巣、腎臓、結腸、肝臓および脳癌に由来する多数の癌細胞株において認められる。従って、この遺伝子またはそのタンパク質産物の治療的調節はこれらの癌の処置において有用であり得る。
【０２７１】
パネル1.3Dの要約：Ag2772  この遺伝子の最高発現が胎児の骨格筋において認められる（CT＝27.4）。興味深いことに、この遺伝子は、成体の骨格筋（CT＝31.5）と比較した場合、胎児においてはるかにより大きいレベルで発現している（CT＝27.4）。この観察結果は、この遺伝子の発現が、成体の骨格筋から胎児の骨格筋を区別するために使用され得ることを示唆している。さらに、胎児組織におけるこの遺伝子の相対的な過剰発現により、そのタンパク質産物が胎児における筋肉の成長または発達を増強し、成体における再生能力においてもまた作用し得ることが示唆される。従って、この遺伝子によりコードされるタンパク質の治療的調節は、筋肉に関連する疾患の処置において有用であり得る。
【０２７２】
いくつかの発現パターンが、パネル1において認められたパターンと相関する（例えば、癌細胞株）。
【０２７３】
パネル2Dの要約：Ag2772/Ag88  異なるプローブ−プライマーの組を用いた2つの実験は優れた一致を示し、この遺伝子の最高発現が肝臓癌（ODO4310）サンプルにおいて認められる（CT＝25〜28）。この遺伝子は、このパネルでは広範囲の発現を示しており、高〜中程度の発現が、胃、卵巣、膀胱、結腸、肝臓、肺、転移メラノーマ、腎臓、子宮、甲状腺および乳房から得られた正常サンプルおよび癌サンプルにおいて認められる。興味深いことに、この遺伝子の発現は、転移メラノーマ、胃癌、肝臓癌および腎臓癌ではアップレギュレーションされている。従って、この遺伝子の発現は、転移メラノーマ、胃癌、肝臓癌および腎臓癌の存在を検出するためのマーカーとして使用することができ、さらに、この遺伝子またはそのタンパク質産物の治療的調節はこれらの癌の処置において有用であり得る。
【０２７４】
パネル3Dの要約：Ag88  この遺伝子の最高発現が腎臓癌細胞株において検出される（CT＝30）。この遺伝子の中程度の発現がまた、脳癌、肺癌、結腸癌、胃癌、腎臓癌および骨癌に由来する多数の癌細胞株において認められる。従って、この遺伝子またはそのタンパク質産物の治療的調節はこれらの癌の処置において有用であり得る。
【０２７５】
パネル4Dの要約：Ag2772/Ag88  異なるプローブ−プライマーの組を用いた2つの実験は優れた一致を示し、この遺伝子の非常に大きい発現が結腸および胸腺において認められる（CT＝27〜30）。この遺伝子は、このパネルではほとんどのサンプルにおいて中程度〜低い発現を示す。この遺伝子の発現は、活性化された気管支および小気道上皮、好塩基球、肝硬変および狼瘡腎臓ではアップレギュレーションされている。従って、この遺伝子またはそのタンパク質産物の治療的調節は、喘息、アレルギー、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、肝硬変および紅斑性狼瘡の処置において有用であり得る。
【０２７６】
一般オンコロジースクリーニングパネルv2.4の要約：Ag6309/Ag88  この遺伝子の非常に大きい発現が肺癌サンプルにおいて認められる（CT＝27〜34.7）。この遺伝子の中程度〜低い発現が、肺、結腸、転移メラノーマ、前立腺および腎臓から得られた正常サンプルおよび癌サンプルにおいて認められる。この遺伝子の発現は、腎臓癌、転移メラノーマおよび肺癌ではアップレギュレーションされており、このことは、パネル2Dで認められた発現と一致している。この遺伝子のさらなる議論についてはパネル2Dを参照のこと。
【０２７７】
（実施例３）
ＮＯＶＸ核酸配列における単一ヌクレオチド多型の同定
変種配列もまた本出願では含まれる。変種配列は単一ヌクレオチド多型（SNP）を含み得る。SNPは、場合により、SNPを含有するヌクレオチド配列がcDNAとして生じることを示すために「cSNP」として示され得る。SNPはいくつかの方法で生じ得る。例えば、SNPは、1つのヌクレオチドが多型位置において別のヌクレオチドに置換されたためであり得る。そのような置換はトランジションまたはトランスバージョンのいずれかであり得る。SNPはまた、基準となる対立遺伝子に対して、ヌクレオチドの欠失またはヌクレオチドの挿入から生じ得る。この場合、多型部位は、1つの対立遺伝子が別の対立遺伝子における特定のヌクレオチドに関してギャップを有する部位である。遺伝子内に存在するSNPは、そのSNPの位置において遺伝子によりコードされるアミノ酸の変化を生じさせる場合がある。遺伝子内のSNPはまた、SNPを含むコドンが遺伝暗号の冗長性の結果として同じアミノ酸をコードするとき、サイレントになり得る。遺伝子の領域の外側に存在するSNP、または遺伝子内のイントロンに存在するSNPは、タンパク質のアミノ酸配列の変化を何ら生じさせないが、発現パターンの変化した調節をもたらす場合がある。例には、時間的発現、生理学的応答調節、細胞タイプ発現調節、発現の強さ、および転写メッセージの安定性の変化が含まれる。
【０２７８】
エキソン連結プロセスにより得られるSeqCallingアセンブリーが、下記の判断基準を使用して選択および伸張された。最初の配列または伸張された配列のすべてまたは一部に対する同一性が98％である領域を有するゲノムクローンを、BLASTN検索によって関連配列を用いてヒトゲノムデータベースを調べ、同定した。得られたゲノムクローンは、この同一性により、これらのクローンがこれらのSeqCallingアセンブリーに対するゲノム遺伝子座を含有することが示されたので、さらなる分析のために選択された。これらの配列は、推定されるコード領域について、ならびに、知られているDNA配列およびタンパク質配列に対する類似性について分析された。これらの分析のために使用されたプログラムには、Grail、Genscan、BLAST、HMMER、FASTA、Hybrid、および他の関連するプログラムが含まれる。
【０２７９】
選択されたSeqCallingアセンブリーはこれらの領域に位置するため、いくつかのさらなるゲノム領域もまた同定され得る。そのようなSeqCalling配列は、相同性またはエキソン予測によって定義される領域と重複している場合がある。それらもまた、フラグメントの存在位置が、最初の予測された配列に含まれていた相同性またはエキソン予測により同定されるゲノム領域の近くに存在していたので含まれ得る。そのようにして同定された配列は手作業により組み立てられ、その後、CuraGen CorporationのヒトSeqCallingデータベースから得られた1つ以上のさらなる配列を使用して伸張され得る。含めるために好適なSeqCallingフラグメントが、CuraTools（商標）プログラムSeqExtendによって、または、分析されたゲノムクローンの適切な領域にマッピングしてSeqCallingフラグメントを同定することによって同定された。
【０２８０】
上記の手順によって定義される領域は、本明細書中に開示されている最終的な配列を得るために、その後、手作業により統合され、そして、例えば、最初のフラグメントにおける間違って呼ばれた塩基から、または、予測されたエキソン接合、EST存在位置、および配列類似性を有する領域の間での不一致から生じていると考えられる明らかな矛盾について補正された。必要な場合には、SeqCallingアセンブリーおよびゲノムクローンを同定および分析するためのプロセスが、全長配列を得るために繰り返された（Alderborn, et al., Determination of Single Nucleotide Polymorphisms by Real-time Pyrophosphate DNA Sequencing, Genome Research, 10(8) 1249-1265, 2000）。様々な変種が個々に報告されているが、変種のすべてまたは選択されたサブセットの任意の組合せもまた、本発明の意図されるＮＯＶＸ実施形態として含まれる。
【０２８１】
CG51896-04の9個の多型変種が同定されており、表4に示される。
【０２８２】
表4：CG51896-04に対するSNP変種
【表６５】
2005528434.tif 000092
【０２８３】
（実施例４）
CG51896-02、CG51896-11およびCG51896-13の分子クローニング
CG51896-02のオープンリーディングフレームは、セマフォリン6Aの、626アミノ酸長の細胞外ドメインをコードする。オリゴヌクレオチドプライマーが、CG51896-02をコードするORFを表すDNAセグメントをPCR増幅するために設計された。さらなるサブクローニング目的のために、順方向プライマーはBamHI制限部位を含み、一方、逆方向プライマーは、イン・フレームにてXhoI制限部位を含有する。
【０２８４】
CG51896-11のオープンリーディングフレームは、セマフォリン6Aの、649アミノ酸長の細胞外ドメインをコードする。オリゴヌクレオチドプライマーが、CG51896-11をコードするORFを表すDNAセグメントをPCR増幅するために設計された。さらなるサブクローニング目的のために、順方向プライマーはSalI制限部位を含み、一方、逆方向プライマーは、イン・フレームにてBamHI制限部位を含有する。
【０２８５】
CG51896-13のオープンリーディングフレームは、セマフォリン6Aの、878アミノ酸長の細胞外ドメインをコードする。オリゴヌクレオチドプライマーが、CG51896-13をコードするORFを表すDNAセグメントをPCR増幅するために設計された。さらなるサブクローニング目的のために、順方向プライマーはBamHI制限部位を含み、一方、逆方向プライマーは、イン・フレームにてXhoI制限部位を含有する。
【０２８６】
CG51896-02、CG51896-11、CG51896-13のそれぞれに対する特異的なプライマーを使用するPCR反応液が、50μlの体積において、ヒト精巣、ヒト乳房、ヒト骨格筋および胎児脳に由来するcDNAサンプルの等しい割合を含有する合計で5ngのcDNAテンプレート、それぞれ1μMのSem6A FORWプライマーおよびSem6A FL-REVプライマー、5マイクロモルのdNTPs（Clontech Laboratories、Palo Alto、CA）、および1μlの50xAdvantage-HF 2ポリメラーゼ（Clontech Laboratories、Palo Alto、CA）を使用してセットアップされた。約1kbpの大きい増幅産物がアガロースゲルから単離され、pCR2.1ベクター（Invitrogen、Carlsbad、CA）に連結された。クローン化された挿入物が、ベクター特異的なM13 フォワード(-40)プライマーおよびM13 リバースプライマーを使用して配列決定され、CG51896-02、CG51896-11またはCG51896-13をコードするオープンリーディングフレームとして確認された。
【０２８７】
（実施例５）
CG51896-02の発現
大腸菌E281株におけるCG51896-02の発現
CG51896-02配列を含有する1.8kbのBamHI-XhoIフラグメントを、BamHI-XhoI消化されたpET32a（Invitrogen）にサブクローン化して、プラスミド1954を作製した。得られたプラスミド1954を、標準的な形質転換プロトコルを使用して大腸菌に形質転換した。細胞ペレットおよび上清をIPTGによる誘導の2時間後に集め、抗HIS抗体を使用するウエスタンブロット（還元条件）によってCG51896-02の発現について調べた。
【０２８８】
ヒト胚腎臓293細胞におけるCG51896-02の発現
CG51896-02配列を含有する1.8kbのBamHI-XhoIフラグメントを、BamHI-XhoI消化されたpCEP4/Secにサブクローン化して、プラスミド169を作製した。得られたプラスミド169を、製造者の説明書（Gibco/BRL）に従って、LipofectaminePlus試薬を使用して293細胞にトランスフェクションした。細胞ペレットおよび上清をトランスフェクションの72時間後に集め、抗V5抗体を使用するウエスタンブロット（還元条件）によってCG51896-02の発現について調べた。CG51896-02は、293細胞により分泌される約95kDaのタンパク質として発現する。
【０２８９】
安定なCHO-K1細胞におけるCG51896-02の発現
CG51896-02配列を含有する1.8kbのBamHI-XhoIフラグメントを、BamHI-XhoI消化されたpEE14.4Secにサブクローン化して、プラスミド1610を作製した。得られたプラスミド1610を、製造者の説明書（Invitrogen/Gibco）に従って、LipofectaminePlus試薬を使用してCHO-K1細胞にトランスフェクションした。安定なクローンを、メチオニンスルホキシミンに対する抵抗性に基づいて選択した。選択されたクローンの発現レベルおよび分泌レベルを、HRPコンジュゲート化V5抗体を使用するウエスタンブロット分析によって評価した。（V5エピトープは、pEE14.4Secベクターにおいて、Cterで目的とする遺伝子に融合される）。CG51896-02は、CHO細胞により分泌される約98kDaのタンパク質として発現する。
【０２９０】
（実施例６）
CG51896-11の発現
安定なCHO-K1細胞におけるCG51896-11の発現
CG51896-11配列を含有する1.9kbのSalI-BamHIフラグメントを、BamHI-XhoI消化されたpEE14.4Secにサブクローン化して、プラスミド2797を作製した。得られたプラスミド2797を、製造者の説明書（Invitrogen/Gibco）に従って、LipofectaminePlus試薬を使用してCHO-K1細胞にトランスフェクションした。安定なクローンを、メチオニンスルホキシミンに対する抵抗性に基づいて選択した。選択されたクローンの発現レベルおよび分泌レベルを、HRPコンジュゲート化V5抗体を使用するウエスタンブロット分析によって評価した。（V5エピトープは、pEE14.4Secベクターにおいて、Cterで目的とする遺伝子に融合される）。CG51896-11は、CHO細胞により分泌される116kDaのタンパク質として発現する。
【０２９１】
ヒト胚腎臓293細胞におけるCG51896-11の発現
CG51896-11配列を含有する1.9kbのSalI-BamHIフラグメントを、BamHI-XhoI消化されたpCEP4/Secにサブクローン化して、プラスミド2282を作製した。得られたプラスミド2282を、製造者の説明書（Gibco/BRL）に従って、LipofectaminePlus試薬を使用して293細胞にトランスフェクションした。細胞ペレットおよび上清をトランスフェクションの72時間後に集め、抗V5抗体を使用するウエスタンブロット（還元条件）によってCG51896-11の発現について調べた。CG51896-11は、293細胞により分泌される100kDaのタンパク質として発現する。
【０２９２】
（実施例７）
ヒト胚腎臓293細胞におけるCG51896-13の発現
CG51896-13配列を含有する2.6kbのBamHI-XhoIフラグメントを、BamHI-XhoI消化されたpCEP4/Secにサブクローン化して、プラスミド3128を作製した。得られたプラスミド3128を、製造者の説明書（Gibco/BRL）に従って、LipofectaminePlus試薬を使用して293細胞にトランスフェクションした。細胞ペレットおよび上清をトランスフェクションの72時間後に集め、抗V5抗体を使用するウエスタンブロット（還元条件）によってCG51896-13の発現について調べた。CG51896-13は、293細胞により分泌される130kDaのタンパク質として発現する。
【０２９３】
（実施例８）
関連する経路
PathCalling（商標）技術：アクセション番号CG51896-02の配列は、ツーハイブリッド法によるcDNAライブラリーの実験室でのスクリーニングによって得られた。全長のcDNA配列または配列の一部または両方のいずれかを含むcDNAフラグメントが配列決定された。インシリコ予測は、CuraGen Corporation社所有の配列データベースまたは公開されているヒト配列データベースにおいて得ることができる配列に基づいており、全長DNA配列またはその特定部分のいずれかをもたらした。
【０２９４】
cDNAライブラリーは、種々の提供者から得られた、多数の組織タイプ、正常状態および疾患状態、生理学的状態、ならびに発達状態を表す様々なヒトサンプルに由来した。サンプルは、組織全体、一次細胞、または組織培養された一次細胞もしくは細胞株として得られた。細胞および細胞株は、遺伝子発現を調節する生物学的薬剤または化学的薬剤で、例えば、増殖因子、ケモカインまたはステロイドで処理されている場合がある。そのようにして得られたcDNAは、その後、適切なツーハイブリッドベクター（Gal4活性化ドメイン（Gal4-AD）融合体）に一方向的にクローン化された。そのようなcDNAライブラリー（ならびに、Clontech（Palo Alto、CA）から得られる市販のcDNAライブラリー）は、その後、大腸菌から、（米国特許第6,057,101号および同第6,083,693号（これらはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）に開示される）CuraGen Corporation社所有の酵母株に移された。
【０２９５】
ヒト配列のCuraGen Corporation社所有ライブラリーのGal4結合ドメイン（Gal4-BD）融合体を使用して、多数のGal4-AD融合cDNAライブラリーがスクリーニングされ、これにより、Gal4-AD融合体が個々のcDNAをそのそれぞれにおいて含有する酵母ハイブリッド二倍体の選択がもたらされた。各サンプルが、cDNA挿入体の境界における非特異的なプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用して増幅された。そのようなPCR産物が配列決定され、配列トレースが手作業により評価され、適する場合には修正のために編集された。すべてのサンプルから得られたcDNA配列が、公開されているヒト配列を場合により含んで、それぞれのアセンブリーについてコンセンサス配列を生じさせるためにバイオインフォマティクスプログラムを使用してまとめられた。それぞれのアセンブリーがCuraGen Corporation社のデータベースに含められる。様々な配列が、別の構成要素との同一性の程度が50bpにわたって少なくとも95％であったとき、アセンブリーのための構成要素として含められた。それぞれのアセンブリーは遺伝子またはその一部分を表しており、また、変種に関する情報、例えば、スプライス形態、単一ヌクレオチド多型（SNP）、挿入、欠失および他の配列変化などを含む。
【０２９６】
物理的クローン：このスクリーニング法により得られるcDNAフラグメントは、オープンリーディングフレーム全体を含むとき、cDNAライブラリーを作製するために使用されるpACT2プラスミド（Clontech）に組換えDNAとしてクローン化される。組換えプラスミドは宿主に挿入され、そして、CuraGen Corporation社所有酵母のN106'株およびYULH株（米国特許第6,057,101号および同第6,083,693号）の両方を接合することによりスクリーニング手順のときに作製された酵母ハイブリッド二倍体によって選択される。
【０２９７】
相互作用するタンパク質対がCuraGen's PathCalling（商標）Protein Interaction Databaseに加えられる。このデータベースは、病理学的に関連づけられるシグナル変換経路におけるそれらの相互作用および／または存在のためによる新規な医薬用薬物標的の発見を可能にする。タンパク質相互作用は、続いて、二元のタンパク質相互作用、タンパク質複合体形成、ならびに完全な細胞シグナル伝達経路を可視化する手段を提供するGeneScape（商標）に含まれるバイオインフォマティクスツールを使用して分析される。具体的には、図1および図2に示されるように、これらの配列は、タンパク質のCG51896-01（セマフォリン6A）、VWF（フォンビルブランド因子）、NCK2、HIP-55およびARGBP2aの各タンパク質をコードする一方で、相互作用することが見出されていたが、また、タンパク質複合体の形成を生じさせることができるか、または、疾患病理学に生理学的に関連する細胞シグナルを伝えるために形成される一連の複合体を構成する場合がある。特異的な相互作用（これにより、特異的な複合体が構成される）もまた、組換えタンパク質療法もしくは抗体療法、小分子薬物、または遺伝子治療法を使用することによる治療的介入のために有用であり得る。
【０２９８】
様々なタンパク質相互作用が、PathCalling（商標）データベースを調べることによって同定される一方で、様々なタンパク質相互作用を、発現、機能、生化学および表現型に関する情報を得るためにインビトロおよびインビボでスクリーニングすることができる。様々なアッセイを単独または組合せで使用することができ、そのようなアッセイには、下記の様々な技術が含まれるが、それらに限定されない：RTQ-PCR、組換えタンパク質のトランスフェクション、免疫共沈降および質量分析法、FRET、アフィニティークロマトグラフィー、免疫組織化学もしくは免疫細胞化学、遺伝子CHIPハイブリダイゼーション、アンチセンス（すなわち、ノックダウン、ノックアップ）、GeneCalling実験、および／または生化学的アッセイ（リン酸化、脱リン酸化、プロテアーゼ他）。
【０２９９】
マトリックス接合  PathCallingマトリックス接合アッセイのための半数体細胞が、選択的な液体培地を使用して384ウェルプレートにおいて個々に成長させられる。1日〜2日後、接合が富栄養培地において完全に行われる。得られた二倍体細胞が、その後、選択的な液体培地を使用して選択される。二倍体細胞の光学密度（O.D.）が、測定するための分光光度計を使用して測定され、その後、細胞はBeta-galアッセイのために新しいプレートに移される。このアッセイは、試験されている2つのタンパク質の間に相互作用が存在するかどうかを明らかにするために行われる。Beta-galアッセイは下記のように行われる：
【０３００】
1．30マイクロリットル（μl）の二倍体細胞が、GenMate96ウェルピペットを使用して新しいプレート（384ウェルの平底プレート）に移される。
2．β-gal緩衝液が、（1枚の384ウェルプレートあたり）、7.1mlのSigma水、7.5mlの4X Z緩衝液、0.3mlの20％IGEPAL、30mgのCPRG、75μlのリチケース（10,000U/ml）を使用して作製される。3.30μlのβ-gal緩衝液が、マルチドロップ384を使用して、工程1で作製されたプレートの各ウェルに加えられる。
3．プレートを30℃のインキュベーターに24時間入れる。
4．24時間のインキュベーション期間の後、各プレートを660nmおよび580nmの波長においてBio-Tekプレートリーダーで読み取る。
5．デルタOD（660-580）が、陽性の相互作用（黄色から赤色への色の変化）を明らかにするためにを目視検査と一緒に使用される。
【０３０１】
図1に示されるように、PathCallingデータは、CG51896-01の細胞外ドメインがフォンビルブランド因子（VWF）（血液凝固系において抗血友病因子キャリアおよび血小板−血管壁媒介因子の両方として機能する糖タンパク質）と相互作用することを示している。表5には、この新規な相互作用を検出するために7回の独立した実験において使用されたおとりおよび餌食のアミノ酸配列がまとめられている。Lianらは、糖タンパク質Ibαがフォンビルブランド因子含有基質表面での内皮細胞の遊走を媒介すること、および、この遊走活性がTNFα処理の内皮細胞では一層大きくなっていることを示している（Lian, et al., Exp Cell Res, 1999, 252(1):114-22）。CG51896-01は、TNFαで処理されたときにはアップレギュレーションされるので、遊走活性の増大を媒介し得る。
【０３０２】
図2に示されるように、PathCallingデータは、CG51896-01の細胞質ドメインが、HIP-55（SH3アクチン結合タンパク質）、および、c-Abl経路に存在する2つのSH3含有タンパク質（NCK2およびARGBP2a）と相互作用することを示している。表6には、スクリーニングおよびマトリックス1x1アッセイにおける細胞内相互作用を検出するために使用されたドメインがまとめられている。検出された陽性相互作用の数、および酵母ツーハイブリッド融合タンパク質に関して両方の方向でのそれらの検出により、CG51896-01と2つのSH3含有タンパク質との間における新規な相互作用の発見が確認される。NCK2は、受容体チロシンキナーゼと会合し、フォーカルアドヒージョンキナーゼと相互作用し、かつ、細胞の運動性を調節するSH2/SH3アダプタータンパク質である。NCK2はまた、c-Ablを活性化し、Ablの形質転換活性を調節する。ARGBP2aはArg/Abl相互作用タンパク質であり、Ablファミリーのキナーゼを細胞骨格に連結することにより、細胞接着、細胞骨格組織化および増殖因子シグナル伝達を調節するアダプタータンパク質のファミリーに属する。CG51896-01の別のおとりはまた、2つのc-Abl相互作用タンパク質（ABI-1およびABI-2）と相互作用することを示していた。これらの2つのタンパク質は、アクチン組織化および細胞運動性を調節し、かつ、c-Ablの形質転換活性を調節するSH3含有タンパク質である。これらの相互作用は、CG51896-01の細胞内シグナル伝達経路が、細胞遊走を調節するためにc-Abl経路を伴い得ることを明らかにしている。
【０３０３】
表5．酵母ツーハイブリッドによる細胞外相互作用の情報
【表６６】
2005528434.tif 000093
【０３０４】
表6．細胞内スクリーニングおよびマトリックスアッセイの結果のまとめ
【表６７】
2005528434.tif 000094
【０３０５】
（実施例９）
遊走および侵入
CG51896-02は多数の組織で発現していた。最も大きい発現レベルが、脈管形成した組織および正常な脳において見出された。CG51896-02のmRNA発現プロフィル（実施例2）は、腎臓および肺の腫瘍組織において、ならびにHUVECにおいて、また、腎臓の明細胞癌（RCC）細胞株の大部分において上昇していたという点で際立っていた。CG51896-02はまた、多数のメラノーマ細胞株において上昇している。これらの観測結果から、CG51896-02が内皮細胞の様々なプロセスおよび潜在的には腫瘍の血管新生において役割を果たしていることが示唆された。内皮細胞の遊走は血管形成カスケードにおける重要なプロセスの1つである。従って、遊走プロセスに対するCG51896-02ポリペプチドの役割が下記のように試験された。
【０３０６】
遊走アッセイ
セマフォリンタンパク質のCG51896-02およびCG51896-11が細胞遊走に影響を及ぼすかどうかを明らかにするために、様々な細胞株が、様々な処置に対する応答での細胞運動性についてスクリーニングされた。試験された細胞株には、HUVEC（ヒト臍帯静脈内皮細胞）、HMVEC-d（ヒト微小血管内皮細胞）、U87MG（神経芽細胞腫）、786-0（腎臓癌腫、上皮性）、HT1080（線維肉腫）、SJCRH30（横紋筋肉腫）、SK-N-SH（神経芽細胞腫）およびCAKI-2（腎臓癌腫）が含まれる。24ウェルの透明ウェル（BD Biosciences、Bedford、MA）遊走チャンバー（8μmの細孔サイズ）が使用された。簡単に記載すると、0.1％のBSAを含有する無血清培地（HUVECについては培地200、HMVEC-dについては培地131、および癌細胞株についてはDMEM高グルコース／1％ペニシリン／ストレプトマイシン／10％FBS）における4x104個の細胞が上部チャンバー内のウェルに加えられた（300μl）。チャンバーは、37℃で1時間、10μg/mlでのI型コラーゲンでプレコーティングされた。下部チャンバーは走化性因子（10ng/mlのVEGFが補充された1％FBS）で満たされた。1ng/ml〜100ng/mlの範囲にある様々な濃度でCG51896-02またはCG51896-11が上部チャンバーに加えられ、細胞が37℃で遊走させられた。インキュベーション後、メンブランの上部表面上の細胞（非遊走細胞）が綿棒で掻き取られた。メンブランの下部側の細胞（遊走細胞）が、30分間、70％エタノールでの0.2％クリスタルバイオレット色素（Fisher Scientific、Springfield、NJ）で染色された。その後、細胞をPBS（pH7.4）中で脱染色し、メンブランを室温で風乾させた。遊走細胞が、Zeiss Axiovert 100倒立型顕微鏡を使用して計数された。フィルターあたり3つの独立した領域が計数され、遊走細胞の平均数が計算された。アミノ酸配列「GRGDSP」を有するRGD対照ペプチド（Invitrogen；カタログ番号12135-018）が内皮細胞株に対する陽性対照として使用され、（細胞株に依存して、VEGFの存在下または非存在下で）0.5％〜2％の範囲でのウシ胎児血清（FBS）が癌細胞株に対する陽性対照として使用された。無血清培地（SFM）が陰性対照として使用された。
【０３０７】
結果および結論
内皮細胞の遊走は血管形成カスケードにおける重要なプロセスの1つであり、従って、遊走の阻害は、CG51896-02ポリペプチドが新しい血管の成長を阻害し、従って、抗血管形成治療のための理想的な候補であることを示している。下記に詳述される結果から、神経膠芽細胞腫および腎臓癌に対する治療剤としてのCG51896-02ポリペプチドの使用が提案される。
【０３０８】
可溶性のセマフォリンは、内皮細胞のVEGF誘導される遊走を用量依存的な様式で著しく阻害した。このような遊走阻害はヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）ならびに微小血管内皮細胞（HMVEC-d）において認められた。50ng/mlの濃度のセマフォリンはHUVEC細胞およびHMVEC-d細胞の遊走の約60％の阻害をもたらした（図3）。これらの結果から、セマフォリンの細胞外ドメインが内皮細胞のVEGF媒介による遊走を特異的に阻害することが明らかにされる。さらに、CG51896-02はまた、ヒト腎臓癌腫細胞株（786-0）、横紋筋肉腫細胞株（SJCRH30）、ならびに神経芽細胞腫細胞株（SK-N-SH、U87MG）およびCaki-2細胞株の遊走を阻害した（図4〜図8）。新規なスプライス変種CG51896-11の活性は、SK-N-SH神経芽細胞腫細胞株を使用したとき、CG51896-02変種に対する基準となった。図9は、CG51896-11（新規なスプライス変種）が、CG51896-02変種に匹敵し得る活性を伴って用量依存的な様式で腫瘍細胞の遊走を阻害したことを明らかにしている。図10〜図13はさらに、CG51896-11が、線維肉腫、腎臓癌腫、内皮細胞株および神経芽細胞腫細胞株における遊走を阻害したことを明らかにしている。さらに、CG51896-11はPanc-1細胞株の遊走を阻害した。このことから、膵臓癌におけるこのタンパク質の抗血管形成的な役割が示唆される（図14）。
【０３０９】
表7には、遊走の阻害に関して様々な細胞株に対するCG51896-02またはCG51896-11の作用のまとめが示される。
【０３１０】
表7  CG51896-02およびCG51896-11による遊走阻害
【表６８】
2005528434.tif 000095
−  遊走阻害が認められなかった
＋  遊走阻害が認められた
N/A  実験が行われなかった
【０３１１】
侵入アッセイ
マトリゲル被覆侵入挿入物（Becton, Dickinson）が400μlのPBS緩衝液で再水和され、室温で1時間インキュベーションされた。細胞を、0.1％BSAを含有する10mlの基礎培地（DMEM基礎培地＋2.5％FBS、GIBCO-BRL）（希釈剤）に懸濁し、1000RPMで5分間、遠心分離した。細胞を希釈剤に再懸濁し、計数して、希釈剤で6X104細胞/mlまたは1x105細胞/mlに希釈した。CG51896-02の10Xストック液を含有する馴化培地の0.02mlが、適切な密度での0.18mlの細胞とともにマイクロチューブに加えられた。サンプルは四連で分析された。0.2mlの細胞懸濁物が、精製されたタンパク質と一緒にそれぞれの挿入物の内部に入れられ（180μlのアッセイ培地での40,000個の細胞＋20μlの10X濃度の精製タンパク質）、20時間インキュベーションされた。VEGF（10ng/ml）（R & D Systems）が内皮細胞に対する陽性の対照運動性因子として作用した。非特異的な侵入を明らかにするために、0.1％のBSAを含有する基礎培地が下部チャンバーに加えられた。必要な増殖因子のすべてを含有する完全培地が陽性対照として使用された。20時間のインキュベーション期間の後、細胞が、綿棒を使用して挿入物の上部側から除かれた。フィルターの裏面に接着している細胞が、室温で30分間、70％エタノールでの0.2％クリスタルバイオレットで染色され、蒸留水で洗浄された。接着（侵入）細胞が顕微鏡下で計数された。3つのランダムな異なる視野が選ばれ、その領域に遊走した細胞の数が計数された。CG51896-02は用量依存的な様式で786-0細胞の侵入に影響を及ぼした（図15）。
【０３１２】
（実施例１０）
セマフォリンは細胞骨格再組織化を阻害する
遊走アッセイ（実施例9）で得られた結果から、CG51896-02ポリペプチドが内皮細胞株および786-0 RCC腫瘍細胞株の両方の遊走に影響を及ぼしたことは明らかである。文献からは、遊走中の細胞は遊走時にその細胞骨格を再組織化することが知られている。従って、アクチン細胞骨格再組織化に対するCG51896-02の影響が、遊走の阻害に対する生化学的機構を示すために調べられた。
【０３１３】
ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）が、Mioaら（Miao, et al., J Cell Biol., 146:233-42、1999）に記載される手順を使用してFアクチンの組織化を調べるために固定された。簡単に記載すると、4x104個の細胞が、10μg/mlでのフィブロネクチンでプレコーティングされた8チャンバーのNuncガラス製スライド（Fisher Scientific、Springfield、NJ）に播種され、37℃で一晩の血清飢餓に供された。細胞は、30分間、VEGF165の存在下または非存在下、0.1ug/mlから10μg/mlまでの範囲にある様々な濃度のCG51896-02で処理された。VEGF＋サイトカラシンD（アクチンフィラメントおよび収縮ミクロフィラメントの強力な阻害剤として作用する菌類代謝産物）が陰性対照として使用された。細胞を、加温された無血清培地で洗浄し、3.7％パラホルムアルデヒドで固定し、0.1％Triton-X100で透過処理した。PBS（pH7.4）で3回洗浄した後、細胞を、室温で30分間、熱不活性化BSA（1％）でブロッキングした。細胞のアクチン細胞骨格をローダミンファロイジン（Molecular Plobe、Eugene、OR）で染色し、Sytoxグリーン核染色（Molecular Plobe、Eugene、OR）で対比染色した。染色後、細胞をPBS（pH7.4）で洗浄し、フルオロマウント（Fisher Scientific、Springfield、NJ）を使用して固定した。サンプルを、Kodakカメラを備えるZeiss Axiovert 100顕微鏡で調べた。デジタル画像を取り込み、Photoshop 5.5プログラムを使用して分析した。
【０３１４】
結果および結論
図16は、刺激されていない対照の内皮細胞（A）におけるフィラメント状アクチンが、VEGFで刺激された細胞（B）と比較して、より少ないことを示している。CG51896-02で処理された細胞におけるアクチンストレスファイバーの形成は、刺激がない場合、刺激されていない細胞に匹敵した（データは示されず）。10ng/mlでのVEGFはアクチンフィラメントの形成の増大を刺激し、特に、細胞を横切る横のフィラメント束の数を増大させ（写真B）、これに対して、VEGF＋サイトカラシンDはこのプロセスを効果的に阻害した（D）。しかしながら、CG51896-02（10μg/ml）の存在下（写真D）では、アクチンフィラメントの縮退が顕著であった。
【０３１５】
これらの結果は、CG51896-02がアクチンフィラメントの形成を阻害し、また、細胞骨格再組織化における役割を有することを示している。ABI-1、ABI-2、NCK2、DAB2およびArgBP1のタンパク質（これらはCG51896-02と相互作用することが示されている；実施例8、pathcallingデータ）は、アクチン細胞骨格組織化および遊走に関与することに留意することもまた重要である。
【０３１６】
（実施例１１）
セマフォリンはSrcチロシンキナーゼ（Src）およびフォーカルアドヒージョンキナーゼ（FAK）のリン酸化を阻害する
シグナル伝達経路におけるCG51896-02タンパク質の役割を理解するために、受容体活性化が、ホスホチロシンの取り込みを測定することによって調べられた。コンフルエンスな内皮細胞を0.1％FBS中での一晩の飢餓処理に供し、1μg/mlまたは10μg/mlのCG51896-02で30分間にわたって前処理し、その後、細胞を10ng/mlでの組換えVEGF165で刺激した。その後、コンフルエンスな内皮細胞をトリプシン処理し、10μg/mlでのフィブロネクチンでコーティングされた10cm2のペトリ皿に置床した。無血清培地における100万個の細胞を、プレコーティングされたプレートに、10μg/mlでのVEGFの存在下で30分間、可溶性CG51896-02の各濃度と一緒に接種した。細胞はVEGF165で10分間刺激され、その後、集められた。対照として、100万個の細胞が無血清培地で懸濁状態に保たれ、VEGF165で10分間刺激され、その後、集められた。非接着細胞を除き、付着した細胞を、溶解緩衝液（10mM Tris（pH7.4）、150mM NaCl、1％Triton X-100、0.5％NP-40、これには、プロテアーゼ阻害剤のカクテル（Roche Molecular Biochemicals、Indianapolis、IN）が、1mMのオルトバナジン酸ナトリウムおよび1mMのNaFと一緒に補充された）を用いてプレート上で可溶化した。細胞を4℃で30分間溶解した。溶解物を、12,000xgで20分間、4℃で遠心分離した。同じ細胞数に対応する上清が下記抗体のいずれかとの免疫沈降に供された：p-Src（これはSrcキナーゼに対して特異的である；Calbiochem、San Diego、California）、p-Src-TYR-416（Calbiochem）、p-FAK（これはフォーカルアドヒージョンキナーゼに対して特異的である；Santa Cruz Biotechnology、California）、p-FAK-Tyr-397（これはリン酸化チロシン347に対して特異的である；Santa Cruz Biotechnology）、p-FAK-Tyr-861（これはリン酸化チロシン861に対して特異的である；Santa Cruz Biotechnology）。免疫沈降は、事前に清澄化された溶解物を、適切な抗体（上記参照）が加えられているプロテインA Sepharoseビーズ（Amersham Pharmacia、Piscataway、NJ）に加えることによって行われた。絶えず混合しながら4℃で2時間インキュベーションした後、Sepharoseに結合した免疫複合体を溶解緩衝液で4回洗浄し、その後、還元性のサンプル緩衝液中で煮沸して、SDS-PAGEおよび免疫ブロッティングによって分析した。
【０３１７】
全細胞抽出物または免疫沈降タンパク質（VEGF受容体）をSDS-PAGE（4〜20％）ゲルによって分離し、ニトロセルロースメンブランに転写し、0.1％Tween-20を含有するPBS（pH7.4）における5％脱脂粉乳でブロッキングした。その後、メンブランを適切な一次抗体とインキュベーションした（室温で1時間または4℃で一晩）。免疫反応性のバンドが、ペルオキシダーゼとコンジュゲート化された二次抗体およびECLウエスタンブロット検出システム（Amersham）によって可視化された。
【０３１８】
結果および結論：
図17Aは、（上記に記載されたように）フィブロネクチンに接着した細胞から調製された細胞溶解物のウエスタンブロットであり、レーンは、左から右に、未処理の溶解物、VEGF処理後の溶解物、CG51896-02による溶解物、そして、VEGFおよびCG51896-02の両方による溶解物を含有する。これらの結果から、VEGFは、SrcY416のチロシンリン酸化によりアッセイされたとき、Srcの活性化を刺激し、これに対して、CG51896-02（100ng/ml）による細胞の処理はSrcY416リン酸化の著しい減少をもたらすことが明らかにされる（A、上段パネル）。Srcタンパク質の総濃度は、panSrc抗体によって測定されたとき、これらの条件のもとでは変化しないままであった（A、下段パネル）。これらの結果は、CG51896-02がVEGF媒介のSrc活性化を阻止することを示唆している。
【０３１９】
さらに、別の実験（図17B）では、VEGFがpFAK397およびpFAK861のリン酸化の顕著な増大を生じさせたことが示された（B、上段パネルおよび中段パネル）。対照的に、SemaECD（100ng/ml）による処理はFAKリン酸化の顕著な減少を生じさせた。FAKリン酸化に対するこの阻害作用は、上記で認められたSrcリン酸化の阻害の結果である。これらの作用は、Srcにより媒介されるFAKリン酸化を阻害するPP2（2μM）と匹敵していた。そのうえ、FAKタンパク質の総量はこれらの条件のもとでは変化しないままであった（B、下段パネル）。上記のデータは、CG51896-02がSrcおよびFAKの両方のVEGF媒介によるリン酸化を阻害することを示している。
【０３２０】
（実施例１２）
CG51896-02およびプレキシンA1の免疫共沈降
受容体の二量体化または複合体形成は受容体活性化の尺度であり、二成分での相互作用を示すことが多い。CG51896-02応答細胞が血清飢餓に供され、CG51896-02で10分間にわたって刺激された。細胞を、PBS、100μMオルトバナジン酸ナトリウムで1回洗浄した。全細胞溶解物を、RIPA緩衝液［50mM Tris（pH7.4）、50mM NaCl、1.0％Triton X-100、5mM EDTA、10mMピロリン酸ナトリウム、50mMフッ化ナトリウム、1mMオルトバナジン酸ナトリウム、1mMフェニルメチルスルホニルフルオリド、ロイペプチン（10μg/mL）、ペプスタチン（10μg/mL）およびアプロチニン（1μg/mL）］における可溶化、超音波処理、および氷上での30分間のインキュベーションによって調製した。溶解物を14,000rpmでの10分間の遠心分離によって清澄化した。等量の総タンパク質を含有する溶解物を抗受容体抗体と2時間インキュベーションした。次いで、プロテインG Sepharoseの1:1スラリーの100μLを2時間加えた。免疫複合体をRIPA緩衝液で3回洗浄した。非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）サンプル緩衝液を加え、サンプルを、煮沸することなく4〜15％ポリアクリルアミドゲルで分画化した。
【０３２１】
Immobilon Pメンブランへの電気泳動転写の後、フィルターをTTBS（20mM Tris（pH7.4）、150mM NaCl、0.05％Tween 20）、3％脱脂乳でブロッキングした。その後、メンブランを、TTBS、1％BSAにおいて、抗受容体血清（1:1000）または抗ホスホチロシン（1:1000）と1時間〜2時間インキュベーションして、TTBSで4回洗浄した。結合した抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲート化された抗ウサギ抗体（1:10,000）または抗マウス抗体（1:10,000）（Amersham、Arlington Heights、IL）と30分間インキュベーションし、続いて、TTBSで4回洗浄することによって検出した。増強化学発光（Amersham）を製造者のプロトコルに従って行った。
【０３２２】
結果および結論
免疫共沈降実験により、CG51896-02およびプレキシンA1が互いに相互作用することが明らかにされる。CG51896-02はV5-Hisエピトープを伴って合成され、プレキシンA1はc-mycエピトープを有する。図18のパネルAにおいて、CG51896-02およびプレキシンA1の両方の同時トランスフェクションは、c-myc抗体による免疫沈降およびV5-his抗体による免疫ブロッティングが行われたとき、CG51896-02の検出をもたらす。複合体の可視化により、CG51896-02とプレキシンA1との間での相互作用が明らかにされる。図18のパネルBは、免疫沈降が抗V5-his抗体を用いて行われ、c-myc抗体で免疫ブロッティングされたときの結果を明らかにしている。図18のパネルCは、関連性のない抗体を示し、陰性対照である。2つの異なる免疫沈降から得られた結果は、CG51896-02がプレキシンA1と物理的に相互作用することを明瞭に明らかにしている。
【０３２３】
（実施例１３）
メンブランに結合したCG51896-02タンパク質のフローサイトメトリーによる定量
FACS分析が、セマフォリンに応答するものとして以前に同定された細胞株（表7、実施例9）に対する外因性CG51896-02の結合を定量するために行われた。分析は2つの細胞株（U87-MG（神経芽細胞腫）および786-0（腎臓癌腫））について行われた。細胞を、Verseneまたは細胞スクレイパーを使用して培養ディッシュから取り出した。細胞をPBS緩衝液で洗浄し、10％ヤギ血清を含有するFACS結合緩衝液において氷上で1時間ブロッキングした。ブロッキング後、細胞を遠心分離し、FACS結合緩衝液に再懸濁した。それぞれの結合反応のために、少なくとも100,000個の細胞が使用された。細胞を、氷上で1時間、0.1μg/mL〜60μg/mLの範囲の様々な濃度でCG51896-02またはCG51896-11（3'末端で標識されたFc）とインキュベーションした（表8）。インキュベーション期間の後、細胞をFACS結合緩衝液で洗浄し、抗体（対照：V5His mAbまたはヒトFc特異的抗体、Jackson Immunochemical）と4℃で1時間インキュベーションした。洗浄工程の後、細胞を、フィコエルトレイン蛍光基にコンジュゲート化された二次抗体と1時間インキュベーションした。インキュベーションが終了したとき、細胞をFACS結合緩衝液で洗浄し、1％パラホルムアルデヒドにおいて固定し、FACS Caliburを使用して分析した。表8には、結果がまとめられており、786-0およびU87-MGの両方の細胞株が濃度依存的な様式でCG51896-02またはCG51896-16と結合することが示されている。
【０３２４】
表8  CG51896の2つのイソ型の細胞表面結合のまとめ
【表６９】
2005528434.tif 000096
この場合に使用されたはCG51896-11は3'末端でFcに標識された。
【０３２５】
（実施例１４）
抗CG51896-02ポリクローナル抗体および抗CG51896-11ポリクローナル抗体の作製
ヒトCG51896-02またはCG51896-11に対する、ペプチドに基づく抗体が、キャリアKLH分子にコンジュゲート化された後の15アミノ酸〜18アミノ酸のペプチドを使用することによって作製された。このコンジュゲート化ペプチドが、標準的なプロトコルを使用して免疫化された。コンジュゲート化ペプチドによる2回の追加免疫注射が施された後に、ウサギからの最後の採血が行われた。生じたポリクローナル抗体を、プロテインAアフィニティーカラムを使用して血清から精製した。精製されたポリクローナル抗体が、インビトロスクリーニング、FACS染色および免疫ブロットで使用された。
【０３２６】
1）N27-N40：VGHK PGRNTTQRHRC（配列番号9）
2）I327-I340：CRFKE QKSPDSTWTP（配列番号10）
3）S562-S578：CNDISTPLPDN EMSYNTVYG（配列番号11）
4）C624-C640：CSHNHQ DKKGVIRESY（配列番号12）
【０３２７】
図19は、N40血清、I340血清およびC640血清の混合物が、10μg/mlの濃度でコーティングされたCG51896-02、CG51896-11およびCG51896-12を阻止したことを示している（ELISAにより読み取られる）。ポリクローナルS578は、図20Aおよび図20Bにより示されるように、スプライス変種CG51896-11（およびCG51896-12）に対して特異的であった。
【０３２８】
（実施例１５）
成長円錐崩壊
CG51896-02タンパク質が、後根神経節について7日目の外植されたニワトリ胚（E7）に対する成長円錐崩壊活性についてアッセイされた。簡単に記載すると、外植片をニワトリの胚から切開し、ラミニンでプレコーティングされた8ウェルチャンバースライドにおいて神経増殖因子（NGF）補充の培養培地でインキュベーションした。翌日、精製されたCG51896-02タンパク質を外植培養物に加えた。1時間のインキュベーションの後、外植片を、室温で30分間、4％パラホルムアルデヒドにおいて固定した。その後、外植片をPBSで洗浄し、室温で1時間、PBSにおける3U/mlのローダミンファロイジン（Molecular Probes、Eugene、OR）で染色した。成長円錐を蛍光顕微鏡で可視化し、正常であるか、または崩壊しているかのいずれかとしてスコア化した。崩壊した成長円錐の割合が、培養された外植片に添加された精製タンパク質の濃度に対してプロットされた。
【０３２９】
対照のE7外植片は成長円錐の存在を示す。しかしながら、CG51896-02の存在下では、成長円錐の数の著しい減少が認められる（図21）。図22は、CG51896-02が約50nMのIC50値で成長円錐崩壊を誘導できることを示している。
【０３３０】
（実施例１６）
CG51896-02に対する受容体の脱オーファン化（予言的実施例）
セマフォリン6Aの細胞外ドメインが腫瘍細胞の遊走および血管形成を阻害する機構を明らかにするために、応答体および非応答体の細胞株を、インビトロ分析後の結合およびFACS分析によって同定した。CG51896-02が細胞遊走を阻害し、血管形成を阻止し、かつ、抗腫瘍形成作用を発揮する機構は、セマフォリン6Aが特異的な細胞表面受容体に結合すること、および、その後のおそらくは細胞遊走における受容体機能の阻害によるためであり得る。あるいは、セマフォリン6Aの細胞外ドメインは、通常の場合には遊走するために細胞にシグナル伝達するリガンドと結合し、そのリガンドを封鎖することができる。発現分析が、Sema6A-ECDが、内因性セマフォリンのシグナル伝達を打ち消すことによって、または、未だ特定されていない細胞表面受容体に結合することによってその作用を発揮しているかどうかを明らかにするために行われた。
【０３３１】
発現データの分析
Sema6A-ECDが内因性セマフォリンのシグナル伝達に対する優勢な負の作用を発揮しているならば、ECDの阻害作用に応答する細胞は、セマフォリンのシグナル伝達に関与する細胞表面タンパク質を発現している可能性がある。対照的に、ECDに応答しない細胞は非常に重要な分子を失っている。発現データが、失われている分子を同定するために行われる。ミクロアレイおよびRTQ-PCRの両方のデータがこの分析では使用される。この経路におけるシグナル伝達タンパク質の完全なリストが表9に示される。シグナル伝達タンパク質の集中した調査と併せて、すべての細胞表面タンパク質の示差的な発現の分析が、推定される新規な結合パートナーを同定するために行われるべきである。
【０３３２】
【表７０】
2005528434.tif 000097
【０３３３】
細胞株の選択
細胞アッセイ（遊走の阻害、実施例9）の結果に基づいて、セマフォリン6A ECDに対して正の応答および負の応答を示す細胞株のリストがまとめられている（表10）。総RNAが発現分析のためにこれらの細胞株から調製される。
【０３３４】
【表７１】
2005528434.tif 000098
【０３３５】
酵母ツーハイブリッド分析
酵母ツーハイブリッドアッセイが、セマフォリン6A ECDと、セマフォリンのシグナル伝達に関与する既知の表面受容体との間で設計される。応答体細胞におけるセマフォリン経路の受容体およびリガンドの発現パターンに基づいて、シグナル伝達タンパク質の細胞外ドメインがcDNAライブラリーからクローン化され、実験で使用される。さらに、応答細胞から調製された特注ライブラリーをスクリーニングすることにより、新規な結合性パートナーを同定することができる。最後に、スクリーニングから得られる相互作用因子がマトリックスアッセイに投入されて、相互作用が確認され、その特異性が決定され、経路が拡張される。マトリックスアッセイが、特異性および機能の疑問に取り組むためのゲノム法により同定されたリガンド／受容体ファミリーの他のメンバーを含むように設計される。
【０３３６】
受容体の相同性調査
受容体についての調査は、様々なリガンド−受容体対が異なるファミリーに組織化され、その結果、あるファミリーに属するリガンドが、別のファミリーのメンバーである受容体と相互作用するという一般的な観測結果に基づいて始めなければならない。そのような組織化は、受容体−リガンド結合表面の三次元立体配座が保存され、だが、遺伝子自体は進化時に多様化している場合があることを示唆している。
【０３３７】
上記の発現分析により同定された推定される受容体は、それらが何らかの知られている受容体ファミリーに属するかどうかを明らかにするために分析される。文献データおよび発現データから得られる情報は、このタンパク質に関連する疾患原理を満たす潜在的なファミリーを同定するためにそれぞれの受容体ファミリーのメンバーに付け加えられる。そのような厳しい制限の適用により、探索空間が大きく減少し、かつ、ツーハイブリッド実験およびノックダウン実験による受容体タンパク質のサブセットの詳細な分析および特徴づけが可能になる。
【０３３８】
架橋および免疫沈降
応答体および非応答体の細胞株を同定した後、標的細胞の細胞表面、またはタンパク質が、その後の結合研究のためにビオチンまたは蛍光基で標識される。最初の結合研究が切断可能なリンカーまたは非架橋リンカーによって追跡され、架橋された複合体が、標的特異的な抗体を使用して取り出される。応答体細胞株だけにおいて損なわれる特異的な複合体が、非標識CG51896-02との競合によって、CG51896-02に対して特異的な受容体としてさらに確認される。競合的置換が観測される場合、結合性および特異性が確認される。応答体細胞株が、LC/MSシステムによって、または従来のN末端配列決定によって同定される。
【０３３９】
発現クローニング
発現クローニングにより、クローン化された受容体が、機能的応答を誘発するその能力に基づいてスクリーニングされる。発現クローニング技術では、mRNAまたはcDNAのいずれかを、通常の場合には標的受容体を発現しない細胞に導入することが要求される。十分な時間を転写および翻訳のために与えた後、トランスフェクションされた細胞が、受容体の性質または機能的特徴について試験される。機能的分析には、非応答体細胞株における受容体の存在により誘導されるリガンド結合または生物学的応答が含まれ得る。RNAまたはcDNAの導入が所望の機能をもたらすことが明らかにされた後、そのクローンが得られ、配列が決定される。最初に、高品質のポリ(A)RNAが、機能的受容体を含有することが知られている細胞から単離される。その後、この物質はいくつかのプールに分けられ、それぞれのプールが機能的応答について試験される。
【０３４０】
同時沈殿および質量分析法
発現タグ化タンパク質（エントリー点）の免疫沈降、それに続く、質量分析法（IP/MS）によるエントリー点との複合体化タンパク質の同定に基づく方法は広範囲に適用することができ、そのような方法により、低い親和性および一時的な相互作用が測定され、また、複雑な非二成分相互作用が測定され、また、すべての細胞区画の内部における相互作用が捕捉され、また、関連する細胞環境における相互作用が測定される。
【０３４１】
目的とする遺伝子（おとり）が、FLAGまたはHISなどのタグ配列にN末端またはC末端のいずれかで融合されて、哺乳物発現ベクターにクローン化される。関連する細胞株におけるタグ化タンパク質のトランスフェクションおよび発現の後、細胞は、負のタンパク質−タンパク質相互作用を妨害することなく細胞を可溶化するために、非イオン性界面活性剤の存在下などの穏和な条件のもとで溶解される。続いて、おとりタンパク質が、例えば、抗FLAG抗体結合ビーズまたは抗HIS抗体結合ビーズを使用するアフィニティー精製によって捕捉され、複合体が、潜在的な非特異的相互作用因子を除くために洗浄される。おとりタンパク質の性質および分析されている分子間相互作用の強さに依存して、1組の溶解条件、免疫共沈降条件および洗浄条件が、典型的には、真の生理学的相互作用因子について濃縮するためにこの段階で利用される。ビーズからの免疫複合体の溶出が、典型的には、おとりタンパク質およびその相互作用因子を特異的に遊離させる溶出試薬を使用して行われるか、あるいは、回収を増大させることができ、しかし、通常の場合には、非特異的に結合したタンパク質の存在をも増大させる、より一般的な試薬（例えば、低いpHまたは界面活性剤など）を用いて行われる。免疫捕捉の成功を評価するために、複合体が銀染色と組み合わせられたSDS-PAGEによって最初に分析されて、免疫複合体の複雑性および各構成要素の存在量が明らかにされる。
【０３４２】
免疫複合体に捕捉されたタンパク質が質量分析法により同定される。2つの方法が、免疫沈降物の複雑性を減少させるために使用される：SDS-PAGE電気泳動、それに続くゲルバンドのタンパク質分解的消化、または、得られたペプチド画分の2Dクロマトグラフィー。SDS-PAGE法の場合、免疫複合体がゲルで泳動され、染色後、バンドが切り出され、トリプシンを使用して消化される。得られるペプチド混合物が、その後、液体クロマトグラフィー−エレクトロスプレイイオン化−イオントラップ質量分析法（LC/ESI/IT/MS）を使用して分析される。ペプチド混合物から得られる分子量およびアミノ酸配列の情報が、その後、注釈付きのデータベースと比較することによって免疫複合体タンパク質を同定するために使用される。この目的のために利用される検索エンジンにはMASCOT（Matrix Technologies）がある。2Dクロマトグラフィー分画法の場合、免疫複合体が、トリプシンを使用して溶液中で消化され、2本の直列接続されたクロマトグラフィーカラム（例えば、強カチオン交換−逆相）を使用して分離される。直列接続されたカラムからの溶出物がESI/IT/MSシステムに導かれる。分子量および配列の情報が、その後、タンパク質を同定するために使用される。
【０３４３】
（実施例１７）
無胸腺ヌードマウス（N-208）でのマトリゲルプラグ786-0腎臓癌腫により誘導される血管形成におけるCG51896-02の影響
無胸腺マウスモデルにおけるマトリゲルプラグアッセイでのCG51896-02ポリペプチドの作用が、増殖因子により媒介される血管形成応答の定量可能な計測を最適化するために行われた。
【０３４４】
この研究の具体的な目標は、マトリゲルプラグアッセイでの786-0腎臓癌腫細胞により誘導される血管形成に対するCG51896-02の影響を評価することであった。786-0（2x106個/ml）を含有するストック用マトリゲル調製物が50mlの滅菌培養チューブにおいて作製された。ストック溶液から、マウスあたり0.5mlの懸濁物が無菌条件下で皮下に注射された。対照群には、等体積のマトリゲル＋ビヒクル単独が与えられた。8週齢のメス無胸腺ヌードマウス（nu/nu）がこの研究では使用された。各群は5匹のマウスを有した。実験計画が表11に示される。
【０３４５】
表11：無胸腺ヌードマウスにおける786-0腎臓癌腫により誘導される血管形成に対するCG51896-02についての実験計画
【表７２】
2005528434.tif 000099
【０３４６】
7日目の最後に、マウスはケタミンおよびキシラジンの混合物で麻酔され、マトリゲルプラグが、顕微手術装置を使用して慎重に取り出された。ゲルを透過照射下で写真撮影した。その後、パラフィン包埋切片作製のために、ゲルの一部分が、一晩、緩衝化10％ホルムアルデヒド（Sigma Chemicals）において固定化され、処理された。切片を3つの異なるレベルで切断し、H/Eで染色した。ゲルの別の一部分を液体窒素で急速冷凍して、10μmの切片を調製した。凍結切片は、フィコエリトリンとコンジュゲート化されたマウスCD31抗原に対するラットモノクローナル抗体を用いた免疫細胞化学染色のために使用された。DAPI染色が、Matrilgelプラグに浸潤している有核細胞を同定するために使用された。H+E染色スライドは、内皮で裏打ちされた明確な毛細管の形成について評価された。抗CD31-PE染色スライドは、適切なフィルターを使用して蛍光顕微鏡で観察された。画像が、Metamorphソフトウエアプログラムを使用してデジタル画像として取り込まれた。同じ領域が、CD31-PEおよびDAPIでの染色からの画像を取得するために赤色フィルターおよびUVフィルターのもとで写真撮影された。微小血管密度が、Wildら（Wild, et al., 2000, Microvasc. Res., 59(3):368-376）により発表された方法によって測定された。DAPI画像が、血管の位置を突き止めるためにそれぞれのCD31-PE画像と重ね合わせられた
【０３４７】
結果および結論
マトリゲルプラグの肉眼的形態学は、無胸腺ヌードマウスにおける786-0腎臓癌腫により誘導される血管形成の阻害がCG51896-02の存在下で認められることを示している（図23）。10mg/kgのCG51896-02で処理されたE群から得られたマトリゲルの組織学（図23、E）は、領域の大部分には脈管構造が全くないことを示しており、このことは、本発明のポリペプチドが抗血管形成性であり、腎臓癌に対する治療剤として使用され得ることを示している。
【０３４８】
図24は、マトリゲルプラグのCD31染色から、CG51896-02とともに投与されたとき、786-0による血管新生のインビボでの阻害が明らかにされることを示している。DAPI（青色）染色は、浸潤している有核細胞を示している。赤色の染色はCD31陽性の内皮細胞に対応する。これらの結果はさらに、3つの用量レベル（1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg）のすべてにおいて、血管の著しい減少が認められたことを示していた。さらに、用量応答が処置群の間には存在するようである。
【０３４９】
形態計測解析から得られたデータが図25、図26および図27にまとめられている。図25には、それぞれの群から得られた血管の相対的な長さが示される。対照群と比較したとき、786-0癌細胞を含有するゲルは総血管長の27倍の増大を示した（0.81対21.94）。CG51896-02で処置されたマウスは総血管長の顕著な阻害を示した。CG51896-02は、1.0mg/kgでは、陽性の対照と比較したとき、血管長を62.76％減少させた。より大きい用量では血管長をさらに減少させた。最大の作用が10.0mg/kgの用量で認められた（71.85％の阻害）。
【０３５０】
図26におけるデータは、個々の群におけるかなりの血管形成性応答（節の数）を示している。対照群（マトリゲル単独）は単位面積あたり1.96個の節の平均数を示した。786-0細胞をゲルに含ませると、血管新生が刺激された。節の数が62.58個に増大した（31.92倍の増大）。CG51896-02がマウスに投与されたとき、癌細胞により誘導される脈管形成が著しく阻害された。1.0mg/kgおよび5.0mg/kgの用量では、陽性対照と比較したとき、節の数の70.3％および70.7％の減少がそれぞれ認められた。10mg/kgの用量において、最大の阻害が認められた（86.63％）。
【０３５１】
図27におけるデータは血管末端の相対的な数を示している。対照ゲル（ゲル単独）は13.86個の血管末端の平均数を有していた。786-0細胞は血管末端の数を17.67倍増大させた（244.92）。CG51896-02による処置は血管末端の数を著しく減少させた。1.0mg/kgの用量では、血管末端は85.46に減少し、5.0mg/kgの用量では、70.92個の血管末端が視野あたり認められた。試験された最高濃度では、43.14個の血管末端が認められた。これは、陽性の対照群と比較したとき、血管形成の約87.33％の阻害に対応する。血管末端の阻害は3つの処置群のすべてにおいて統計学的に有意であった。
【０３５２】
無胸腺ヌードマウスでのマトリゲルプラグ786-0腎臓癌腫により誘導される血管形成におけるCG51896-11タンパク質（配列番号50）（新規なスプライス変種）の影響により、インビボでの血管新生の阻害、CD31-PE染色および形態計測解析において、CG51896-02に対する匹敵し得る結果が明らかにされた（データは示されず）。従って、マトリゲルプラグでの786-0腎臓癌腫により誘導される血管形成の結果により、CG51896-02ポリペプチドおよびCG51896-11ポリペプチドの抗血管形成的性質ならびに腎臓癌に対する治療剤としてのそれらの使用が明らかにされる。
【０３５３】
（実施例１８）
無胸腺ヌードマウス（N-207）でのマトリゲルプラグVEGF/bFGFにより誘導される血管形成におけるCG51896-02の影響
増殖因子を含有するマトリゲル調製のプロトコル、および無胸腺マウスに対する投与は実施例17に記載される通りであった。表12には、従った研究計画が記載される。CD31抗体による免疫細胞化学染色、DAPI染色およびH/E染色が、実施例17に記載された通りに行われた。
【０３５４】
表12：無胸腺ヌードマウスでのマトリゲルプラグVEGF/bFGFにより誘導される血管形成における実験計画
【表７３】
2005528434.tif 000100
【０３５５】
結果および結論
VEGF/bFGFは、明確な脈管形成領域から明らかにされるように著しい血管形成を誘導した。プラグの肉眼的形態学は、CG51896-02処置（1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg）により、VEGF/bFGF誘導の血管形成が阻害されたことを示している（図28）。
【０３５６】
CD31染色では、より大きいレベルのCD31染色を示す陽性対照と比較したとき、試験された3つの用量レベル（1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、図29）のすべてで、血管の著しい減少が、まばらな内皮細胞を伴って明らかにされた。
【０３５７】
図30には、それぞれの群から得られた血管の相対的な長さが示される。対照群と比較して、VEGF/bFGF含有ゲルは総血管長の16.7倍の増大を示した（0.79対13.18）。CG51896-02で処置されたマウスは総血管長の顕著な減少を示した。例えば、CG51896-02の1.0mg/kgでの注射は、陽性対照（VEGF/bFGF処置）と比較したとき、血管長を85％減少させた。より大きい用量では、血管長をさらに減少させた。最大の作用が5.0mg/kgの用量で認められた（96％の阻害）。
【０３５８】
図31におけるデータは、血管形成性の応答（節の数）が個々の群において匹敵し得ることを示している。対照群は単位面積あたり1.11個の節の平均数を示した。VEGF/bFGFをゲルに含ませると、節形成における30倍の増大（33.56）によって明らかにされるように、血管新生が刺激された。CG51896-02がマウスに投与されたとき、VEGF/bFGFにより誘導される脈管形成が著しく弱められた。1.0mg/kgの用量では、節の数の87％の減少が認められた。用量を5.0mg/kgまたは10mg/kgに増大すると、節の数の約96.5％のさらなる減少が認められた。
【０３５９】
図32におけるデータは血管末端の相対的な数を示している。対照ゲル（群A）は12.34個の血管末端の平均数を有していた。VEGF/bFGFは血管末端の数を10.3倍増大させた（127.3）。血管末端の数は、マウスがCG51896-02ポリペプチドで処置されたとき、著しく減少した。1.0mg/kgの用量では、血管末端は18.72に減少し、5.0mg/kgの用量では、118.2個の血管末端が視野あたり認められた。試験された最高濃度では、わずかに13.26個の血管末端が認められただけであった。これは、VEGF/bFGFで処置された陽性対照群（B）と比較したとき、血管形成の約99.2％の阻害に対応する。血管末端の阻害は3つの処置群のすべてにおいて統計学的に有意であった。
【０３６０】
（実施例１９）
ヌードマウス（N-223）における異種移植片として成長させられたU87MGヒト神経膠腫株に対するCG51896-02の効力評価
無胸腺マウスの皮下に移植されたヒトU87MG神経膠芽細胞腫が腫瘍モデルとして選択された。これらの腫瘍は、増大した組織脈管化、ならびにアンギオポエチン-1およびアンギオポエチン-2の増大した発現によって特徴づけられる（Audero, E., et al., 2001, Arterioscler Thromb Vasc Biol 21, 536-41）。
【０３６１】
CG51896-02（これは本研究ではGU1と呼ばれる）が3つの服薬レベルで試験された：1mg/kg、5mg/kgおよび10mg/kgが、14日間連続して1日に2回（BIDx14）、腹腔内（i.p.）に投与された。カルムスチン（神経膠芽細胞腫を処置するために使用される標準的な化学療法剤）が15mg/kgのi.p.での単独療法として試験された。3つの用量が1日おきに1日に1回（QODx3）与えられた。15mg/kgのカルムスチンおよび5mg/kgのGU1の処置が混合療法のために使用された。
【０３６２】
方法
メス無胸腺ヌードマウス（nu/nu、Charles River）は研究の1日目において13週齢〜14週齢であった。ヒトU87MG神経膠芽細胞腫が無胸腺ヌードマウスにおいて維持された。腫瘍断片（1mm3）がそれぞれの試験マウスの右脇腹に皮下移植された。腫瘍は1週間に2回モニターされ、その後、腫瘍が60mg〜100mgのサイズに近づくにつれて毎日モニターされた。研究の1日目に、動物は、62.5mg〜126.0mgの腫瘍サイズおよび70.0mg〜71.4mgの群平均腫瘍サイズを有する10匹のマウスからなる6群に分けられた。腫瘍重量は、1mgが1mm3の腫瘍体積に等しいという仮定を用いて推定された。体積は、下記の式を使用して計算された：
腫瘍体積（mm3）＝（w2 x l）/2
（式中、w＝U87MG腫瘍の幅（mm）およびl＝U87MG腫瘍の長さ（mm））。
【０３６３】
薬物
凍結GU1投薬溶液およびGUIビヒクルがCuraGenから得られ、使用されるまで-20℃で保存された。各バイアルには、2回分の用量について十分な投薬溶液が含有された。解凍された溶液は、投薬間は4℃で保存され、2回目の投薬後に廃棄された。
【０３６４】
処置
GU1（CG51896-02）に対するビヒクルは、50mMのNaClを含有する20mM Tris-HCl（pH7.4）であった。カルムスチン（BCNU、1,3-ビス(2-クロロエチル)-1-ニトロソウレア、Bristol Laboratories）は無水エタノールに溶解され、4℃で保存された。それぞれの投薬日に、エタノール溶液の一部が滅菌水で10倍に希釈され、その後、5％デキストロース水（D5W）で適切な投薬濃度に希釈された。
【０３６５】
マウスは、それぞれが10匹のマウスを含有する6群に分けられ、表13におけるプロトコルに従って処置された。対照群1のマウスには、GU1ビヒクルが1日目〜14日目に1日に2回（BIDx14）i.p.投与された。群2には、カルムスチンが、1日目から始まり3日毎に1日に1回（QODx3）、15mg/kgでi.p.投与された。群3および群4には、GU1が、BIDx14で、1mg/kgおよび5mg/kgでそれぞれi.p.投与された。群5には、群2および群4の両方に施された処置からなるGU1−カルムスチンの混合療法が与えられた。群6には、GU1が、b.i.d.x14で、10mg/kgでi.p.投与された。0.2mL/20g体重の投薬体積が各動物の体重に対して決められた。
【０３６６】
表13．研究計画
【表７４】
2005528434.tif 000101
【０３６７】
終点
処置の効力が、対照群と比較して処置群における終点までのメジアン時間（TTE）の増大として定義される腫瘍成長遅延（TGD）から決定された。各動物は、その新生物が所定の終点サイズ（1.5g）に達したときに安楽死させられた。TTE値は、研究終点体積を超える最初の観測結果と、終点体積に達成する直前の3回の連続した観測結果とからなるlog変換された腫瘍成長データ組の線形回帰に基づいて、それぞれの群における各動物について計算された。TTEは下記の式から計算される：
y1 ＝ mx1 + b           （1）
x2 ＝ (y2  b)/m         （2）
（式中：
y1 ＝ 縦軸、log10（腫瘍体積、mm3）
x1 ＝ 観測日
y2 ＝ log10（終点体積、mm3）
x2 ＝ 横軸＝TTE（日数）
b ＝ 切片
m ＝ 傾き）。
この場合、腫瘍体積の誤差は日数の誤差よりも実質的に大きく、また、近似された回帰線からの腫瘍体積のずれは類似しているという仮定が用いられている。終点に達しない動物には、研究の最終日に等しいTTE値が与えられる。TR（処置関連）死またはNTRM（処置に関連しない転移）死として分類される動物には、死亡日に等しいTTE値が与えられる。NTR（処置に関連しない）死として分類される動物はTTEの計算から除外される。各群のメジアンTTEは、処置の効力を決定するための基礎である。腫瘍成長遅延（TGD）が、日数で表されたとき、処置群に対するメジアンTTEと対照群のメジアンTTEとの差として：
（3）    TGD ＝ T  C
または、対照群のメジアンTTEの百分率として：
（4）    ％TCD ＝ (T  C)/C ＝ x 100
計算され、この場合、
T ＝ 処置群に対するメジアンTTE、
C ＝ 対照群1に対するメジアンTTE
である。
【０３６８】
処置により、動物における腫瘍の部分的な後退（PR）または完全な後退（CR）が生じることがある。PR応答では、腫瘍重量は、研究の経過期間中の3回の連続した測定について、1日目のその重量の50％以下であるが、0mgよりも大きい。CR応答では、研究の経過期間中の3回の連続した測定について測定可能な腫瘍塊が認められない。研究の終了時にCR応答（3回の連続した測定について測定可能な腫瘍塊を有しない）を有するとして分類された動物はさらに、長期の腫瘍非保持生存体（LTTFS）として分類される。
【０３６９】
毒性
動物は、1日目〜5日目に毎日、その後、研究が完了するまで1週間2回、体重が測定された。マウスは、何らかの有害な薬物関連副作用の明白な症候について頻繁に調べられた。マウスにおける癌薬物について許容され得る毒性は、試験期間中における20％未満の群平均体重減少、および10匹の処置された動物における1匹以下の毒性死としてNCIによって定義されている。
【０３７０】
統計学的解析およびグラフによる解析
ログランク（logrank）検定が、ビヒクル処置対照群に対する処置群のメジアンTTEの違いを分析するために用いられた。ログランク検定では、NTR死として記録された動物を除くすべての動物に対するデータが分析される。統計学による両側解析がP＝0.05で行われた。結果は、0.01≦P＜0.05で有意であると見なされ、P＜0.01で非常に有意であると見なされた。群メジアン腫瘍成長曲線では、メジアン腫瘍体積が時間の関数として示される。動物が、腫瘍サイズ、処置関連死または処置非関連の死のために研究から外れたとき、その動物について記録された最後の腫瘍体積は、その後の時点でのメジアン体積を計算するために使用されたデータに含められた。カプラン−マイヤープロットが、時間に対して研究での残存動物の割合を示すために作製された。カプラン−マイヤープロットでは、ログランク検定と同じデータ組が使用される。
【０３７１】
結果
U87MG-e11研究が表13におけるプロトコルに従って行われた。65日間の研究では、十分に確立された（約71mg）U87MG神経膠芽細胞腫を1日目に保有する10匹の無胸腺ヌードマウスからなる6群が利用された。研究の16日目に、群あたり3匹の動物が組織サンプリングのために安楽死させられた。処置結果は、各群における残る7匹のマウスに基づいている。表14には、比較されている群に対するメジアンTTE値の処置応答のまとめが示される。図33には、すべての処置群における個々のマウスについてのTTE値の散布図が示される。ログランク検定が、処置群対ビヒクル処置対照群に対するメジアンTTEにおける何らかの増大の有意性を明らかにするために使用された。
【０３７２】
表14：処置応答のまとめ
【表７５】
2005528434.tif 000102
【０３７３】
群1のマウスには、GU1ビヒクルが1日目〜14日目に1日に2回（BIDx14）i.p.投与された。
【０３７４】
7匹のビヒクル処置マウスのすべてにおける腫瘍は1.5gの終点重量に成長し、これは23.0日のメジアンTTEをもたらした（表14）。65日間の生存体が存在しないことは、群あたりゼロの十分でない腫瘍生着の潜在的なバックグラウンドレベルを示している。対照マウスに対するメジアン腫瘍成長曲線が図34の上段パネルに含まれる。時間に対する研究での残存対照動物の割合が図34の下段パネルにカプラン−マイヤープロットで示される。
【０３７５】
腹腔内カルムスチンに対するU87MG異種移植片の応答
群2のマウスには、カルムスチンが15mg/kgでi.p.投与された。カルムスチンは、1日目から始まって3日毎に1日に1回（QODx3）投与された。1匹の処置関連死が記録された。群2のマウスでは、26.3日のメジアンTTEが達成された。これは、対照マウスに対して、有意でない3.3日のT-Cおよび14％の腫瘍成長遅延（TGD）に対応する（P＞0.05）。65日目のメジアン腫瘍負荷量は0mgであった（n＝1匹のマウス）。この処置は1匹の長期の腫瘍非保持生存体（LTTFS）をもたらした。群2に対するメジアン腫瘍成長曲線およびカプラン−マイヤー曲線は、群1に対する曲線と比較した場合、わずかに右側に移動している（図34）。
【０３７６】
腹腔内CG51896-02（GU1）に対するU87MG異種移植片の応答
GU1が、群3、群4および群6に対して、それぞれ、1mg/kg、5mg/kgおよび10mg/kgで、b.i.dx14でi.p.投与された。1匹の処置非関連（NTR）死が群3において記録された。群3のマウスに対するメジアンTTEは22.0日であった。このTTE値は、ビヒクルで処置された群1のマウスのTTE値よりも低く、しかしながら、低下は有意ではない（P＞0.05）。後退応答は記録されなかった。群4に対するメジアンTTEは、ビヒクルで処置された群1のマウスのメジアンTTEと同一であった（23.0日）。65日目のメジアン腫瘍負荷量は0mgであった（n＝1）。1匹の65日生存体における処置応答は、腫瘍が最終日に初めて触診できないほどになったので、PR応答として分類された。群6では、32.6日のメジアンTTEが達成された。これは9.6日のT-Cおよび42％のTGDに対応する。10mg/kgのGU1での処置はこの研究では最も有効であった一方で、群6のメジアンTTEは、ビヒクルで処置された群1のマウスのメジアンTTEよりも著しく大きくなかった（P＝0.0576）。65日目のメジアン腫瘍負荷量は0mgであった（n＝3）。1匹のPR応答および2匹のLTTFSが記録された。群3、群4および群6に対するメジアン腫瘍成長曲線およびカプラン−マイヤー曲線は、7つの腫瘍のうちの4つが32日以内に1.5gの終点重量に達したので、後退応答を反映していない（図33および図34）。
【０３７７】
GU1−カルムスチンの混合治療に対するU87MG異種移植片の応答
群5は、5mg/kgでのGU1（i.p.、b.i.d.x14）および15mg/kgでのカルムスチン（i.p.、qodx3）からなる混合療法を受けた。群5に対するメジアンTTEは26.8日であった。これは、対照マウスに対して3.6日のT-Cおよび17％のTGDに対応する（P＞0.05）。後退応答は全く認められなかった。群5に対するメジアン腫瘍成長曲線およびカプラン−マイヤー曲線を（対応する単独療法を受けた）群2および群4に対する曲線と比較した場合、抗腫瘍効力の増強は何ら明らかにされない（図34）。
【０３７８】
結論
本研究では、CG51896-02が、ヒトU87MG神経膠芽細胞腫を有する無胸腺マウスにおいて評価された。7匹の対照マウスのすべてにおける腫瘍は、類似する速度で1.5gの終点重量に成長し、23日のメジアンTTEをもたらした。図1に示されるように、どの処置群でも腫瘍の大部分が、ビヒクルで処置された腫瘍のTTE値に類似するTTE値で終点に達した。従って、試験療法はどれも、メジアンTTEの統計学的に有意な増大をもたらさなかった。GU1の最高用量は最大のTGD（42％）をもたらし、これはほぼ有意であった（P＝0.0576）。終点に達しなかった腫瘍の数は、何らかの処置効力の証拠を提供した。カルムスチンの単独療法は1匹のLTTFSをもたらし、5mg/kgのGU1は1匹のPR応答をもたらし（65日目の腫瘍重量が0mgである）、10mg/kgのGU1は1匹のPRおよび2匹のLTFFSをもたらした。15mg/kgのカルムスチンおよび5mg/kgのGU1を用いた混合療法は後退応答をもたらさなかった。このことは、このGU1治療法とアルキル化剤処置との間には正の相互作用がないことを示している。
【０３７９】
まとめると、10mg/kgの用量のGU1（CG51896-02）は、0mgのメジアン腫瘍重量を伴って3匹の65日生存体をもたらした。このことは、10mg/kgにおいて、CG51896-02は、神経膠芽細胞腫の後退を誘導し得る効果的なタンパク質治療剤として使用され得ることを示唆している。
【０３８０】
他の実施形態
様々な特定の実施形態が本明細書中に詳しく開示されているが、これは、例示目的のために例として行われているにすぎず、従って、下記の添付された請求項の範囲に関して限定であることを意図しない。特に、様々な置換、変化および改変が、請求項によって定義されるような本発明の精神および範囲から逸脱することなく本発明に対してなされ得ることが本発明者らによって意図される。核酸出発物質、目的とするクローン、またはタンパク質送達方法の選択は、本明細書中に記載された実施形態の知識を有する当業者にとっては日常的な事項であると考えられる。様々な他の局面、利点および改変が下記の請求項の範囲に含まれると見なされる。示された請求項により、本明細書中に開示された発明が表される。請求項に記載されていない他の発明もまた意図される。出願人は、そのような発明を後の請求項において続ける権利を留保する。
【図面の簡単な説明】
【０３８１】
【図１】図1は、CG51896-01（セマフォリン6A）の細胞外ドメインとのタンパク質のパスコーリング（Pathcalling）相互作用を示す概略図である。
【図２】図2は、CG51896-10の細胞質ドメインとのタンパク質のパスコーリング相互作用を示す概略図である。
【図３】図3は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）およびヒト微小血管内皮細胞（HMCEC-d）の遊走に対するCG51896-02の影響を示すグラフである。
【図４】図4は、786-0細胞（腎臓癌腫）の遊走に対するCG51896-02の影響を示す棒グラフである。
【図５】図5は、SJCRH30細胞（横紋筋肉腫）の遊走に対するCG51896-02の影響を示す棒グラフである。
【図６】図6は、SK-N-SH細胞（神経芽細胞腫）の遊走に対するCG51896-02の影響を示す棒グラフである。
【図７】図7は、U87-MG細胞（神経芽細胞腫）の遊走に対するCG51896-02の影響を示す棒グラフである。
【図８】図8は、CAKI-2細胞（腎臓癌腫）の遊走に対するCG51896-02の影響を示す棒グラフである。
【図９】図9は、SK-N-SH細胞（神経芽細胞腫）の遊走に対するCG51896-11の影響を示す棒グラフである。
【図１０】図10は、HT1080細胞（線維肉腫）の遊走に対するCG51896-11の影響を示す棒グラフである。
【図１１】図11は、U87-MG細胞（神経芽細胞腫）の遊走に対するCG51896-11の影響を示す棒グラフである。
【図１２】図12は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）の遊走に対するCG51896-11の影響を示す棒グラフである。
【図１３】図13は、CAKI-2細胞（腎臓癌腫）の遊走に対するCG51896-11の影響を示す棒グラフである。
【図１４】図14は、Panc-1細胞（腎臓癌腫）の遊走に対するCG51896-11の影響を示す棒グラフである。
【図１５】図15は、786-0細胞（腎臓癌腫）の侵入に対するCG51896-02の影響を示す棒グラフである。
【図１６】図16は、アクチン細胞骨格に対するCG51896-02の影響を示すヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）の一連の光学顕微鏡写真である。図16Aは未刺激細胞を示す。図16Bは、VEGF（10ng/ml）で処理された細胞を示す。図16Cは、VEGF＋CG51896-02（セマフォリン6A細胞外ドメイン）で処理された細胞を示す。図16Dは、VEGF＋サイトカラシンD（アクチンフィラメントの阻害剤）を示す。
【図１７】図17は、VEGFで刺激されたSrcリン酸化およびFAKリン酸化に対するCG51896-02の影響を示すウエスタンブロットである。
【図１８】図18は、CG51896-02およびプレキシンA1の免疫共沈降を示すウエスタンブロットである。
【図１９】図19は、CG51896-02、CG51896-11およびCG51896-12に対するポリクローナル抗体（N-40、I340およびC640）の影響を示す棒グラフである。
【図２０】図20Aは、CG51896-02に対するポリクローナル抗体（S578）の影響を示す棒グラフである。図20Bは、CG51896-11およびCG51896-12に対するポリクローナル抗体（S578）の影響を示す棒グラフである。
【図２１】図21は、成長円錐崩壊に対するCG51896-02の影響を示す顕微鏡写真である。
【図２２】図22は、CG51896-02の存在下での成長円錐崩壊の定量的分析を示す棒グラフである。
【図２３】図23は、無胸腺ヌードマウスにおけるマトリゲルプラグでの786-0により誘導される血管形成に対するCG51896-02の影響を示す顕微鏡写真である（肉眼的形態学）。
【図２４】図24は、CG51896-02投与後のマトリゲルプラグ（786-0により誘導される血管形成）のCD31染色を示す顕微鏡写真である。
【図２５】図25は、CG51896-02投与後の血管長さの相対的な数を示す形態計測解析を示す棒グラフである（786-0により誘導される血管形成）。
【図２６】図26は、CG51896-02投与後の節の相対的な数を示す形態計測解析を示す棒グラフである（786-0により誘導される血管形成）。
【図２７】図27は、CG51896-02投与後の血管末端の相対的な数を示す形態計測解析を示す棒グラフである（786-0により誘導される血管形成）。
【図２８】図28は、無胸腺ヌードマウスにおけるマトリゲルプラグでのVEGF/bFGFにより誘導される血管形成に対するCG51896-02の影響を示す顕微鏡写真である（肉眼的形態学）。
【図２９】図29は、CG51896-02投与後のマトリゲルプラグ（VEGF/bFGFにより誘導される血管形成）のCD31染色を示す顕微鏡写真である。
【図３０】図30は、CG51896-02投与後の血管長さの相対的な数を示す形態計測解析を示す棒グラフである（VEGF/bFGFにより誘導される血管形成）。
【図３１】図31は、CG51896-02投与後の節の相対的な数を示す形態計測解析を示す棒グラフである（VEGF/bFGFにより誘導される血管形成）。
【図３２】図32は、CG51896-02投与後の血管末端の相対的な数を示す形態計測解析を示す棒グラフである（VEGF/bFGFにより誘導される血管形成）。
【図３３】図33は、ヌードマウス体内での異種移植片として成長させられたU87MGヒト神経膠腫系統に対するCG51896-02の効力評価のためのすべての処置群における個々のマウスについて終点を示す散布図である。
【図３４】図34は、ヌードマウス体内での異種移植片として成長させられたU87MGヒト神経膠腫系統に対するCG51896-02の効力評価を示すグラフである。上段パネルは各処置群に対するメジアン腫瘍成長曲線を示す。下段パネルは各処置群に対するカプラン・マイヤープロットを示す。
【図１】
2005528434.tif 000103
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図２３】
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【図２４】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年2月1日(2005.2.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2005528434000001.app
【国際調査報告】
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