(57)【要約】本発明は、ヒト癌において差次的に発現される新規のヒト遺伝子に関する。より詳細には、本発明は、ヒト乳癌および膀胱癌において過剰発現されるC35と命名された新規のヒトポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、C35ポリペプチド、特にC35ペプチドエピトープおよびC35ペプチドエピトープアナログ、ならびにベクター、宿主細胞、C35ポリペプチドに指向する抗体、ならびにこれを産生するための組換え方法に関する。本発明はさらに、ヒト乳癌を含む、癌を検出するための診断方法に関する。本発明はさらに、C35遺伝子を発現する標的細胞（例えば、腫瘍細胞）に対する抗体または細胞媒介性免疫を誘導するための、免疫原性組成物またはワクチンにおけるC35遺伝子およびポリペプチド、特にC35ペプチドエピトープおよびC35ペプチドエピトープアナログの処方物ならびに使用に関する。本発明はさらに、C35活性のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のC35ペプチドエピトープを含むペプチドを含む単離されたポリペプチドであって、配列番号:2のアミノ酸T101〜V113、配列番号:2のE100〜V113、配列番号:2のG99〜V113、配列番号:2のI93〜V113、配列番号:2のD88〜V113、配列番号:2のP84〜V113、配列番号:2のK77〜V113、配列番号:2のQ72〜V113、配列番号:2のF65〜V113、および配列番号:2のL59〜V113からなる群より選択され、かつ配列番号:2、配列番号:153、配列番号:155、または配列番号:2のアミノ酸E100〜R109ではない、単離されたポリペプチド。
【請求項２】
少なくとも1つのC35ペプチドエピトープアナログを含む単離されたポリペプチドであって、該C35ペプチドエピトープアナログが以下からなる群より選択される、単離されたポリペプチド：
配列番号:2および図1BのペプチドエピトープG22〜C30については、第9番目のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンを有するアナログ；配列番号:2および図1BのペプチドエピトープI25〜C33については、第6番目のアミノ酸残基および/または第9番目のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有するアナログ；配列番号:2および図1BのペプチドエピトープK77〜Y85については、第9番目のアミノ酸残基におけるチロシンに代えて置換されたバリンを有するアナログ；配列番号:2および図1BのペプチドエピトープK104〜C112については、第9番目のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアラニン、グリシン、またはロイシンを有するアナログ；配列番号:2および図1BのペプチドエピトープK104〜V113については、第9番目のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアラニン、セリン、グリシン、またはロイシンを有するアナログ；配列番号:2および図1BのペプチドエピトープI105〜V113については、第2番目のアミノ酸残基におけるスレオニンに代えて置換されたロイシンもしくはメチオニンのいずれか、および/または第8番目のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアラニン、セリン、もしくはグリシンを有するアナログ；ならびに配列番号:2および図1BのペプチドエピトープN107〜L115については、第6番目のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有するアナログ。
【請求項３】
配列番号:2のアミノ酸T101〜V113である、請求項1記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４】
配列番号:2のアミノ酸E100〜V113である、請求項1記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５】
配列番号:2のアミノ酸G99〜V113である、請求項1記載の単離されたポリペプチド。
【請求項６】
配列番号:2のアミノ酸I93〜V113である、請求項1記載の単離されたポリペプチド。
【請求項７】
配列番号:2のアミノ酸D88〜V113である、請求項1記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８】
配列番号:2のアミノ酸P84〜V113である、請求項1記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９】
配列番号:2のアミノ酸K77〜V113である、請求項1記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号:2のアミノ酸Q72〜V113である、請求項1記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号:2のアミノ酸F65〜V113である、請求項1記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号:2のアミノ酸L59〜V113である、請求項1記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
C35ペプチドエピトープアナログが、配列番号:2および図1BのペプチドエピトープG22〜C30については、第9番目のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有するアナログである、請求項2記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１４】
C35ペプチドエピトープアナログが、配列番号:2および図1BのペプチドエピトープI25〜C33については、第6番目のアミノ酸残基および/または第9番目のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有するアナログである、請求項2記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１５】
C35ペプチドエピトープアナログが、配列番号:2および図1BのペプチドエピトープK77〜Y85については、第9番目のアミノ酸残基におけるチロシンに代えて置換されたバリンを有するアナログである、請求項2記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１６】
C35ペプチドエピトープアナログが、配列番号:2および図1BのペプチドエピトープK104〜C112については、第9番目のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアラニン、グリシン、またはロイシンを有するアナログである、請求項2記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１７】
C35ペプチドエピトープアナログが、配列番号:2および図1BのペプチドエピトープK104〜V113については、第9番目のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアラニン、グリシン、セリン、またはロイシンを有するアナログである、請求項2記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１８】
C35ペプチドエピトープアナログが、配列番号:2および図1BのペプチドエピトープI105〜V113については、第2番目のアミノ酸残基におけるスレオニンに代えて置換されたロイシンもしくはメチオニンのいずれか、および/または第8番目のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアラニン、セリン、もしくはグリシンを有するアナログである、請求項2記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１９】
C35ペプチドエピトープアナログが、配列番号:2および図1BのペプチドエピトープN107〜L115については、第6番目のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有するアナログである、請求項2記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２０】
長さが100アミノ酸以下である、請求項1〜12のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２１】
長さが95アミノ酸以下である、請求項1〜12のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２２】
長さが90アミノ酸以下である、請求項1〜12のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２３】
長さが85アミノ酸以下である、請求項1〜12のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２４】
長さが80アミノ酸以下である、請求項1〜12のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２５】
長さが75アミノ酸以下である、請求項1〜12のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２６】
長さが70アミノ酸以下である、請求項1〜12のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２７】
長さが65アミノ酸以下である、請求項1〜12のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２８】
長さが60アミノ酸以下である、請求項1〜12のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２９】
長さが55アミノ酸以下である、請求項1〜12のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３０】
長さが50アミノ酸以下である、請求項1〜12のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３１】
長さが45アミノ酸以下である、請求項1〜12のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３２】
長さが40アミノ酸以下である、請求項1〜12のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３３】
長さが35アミノ酸以下である、請求項1〜12のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３４】
複数のC35ペプチドエピトープを含む単離されたポリペプチドを含む融合タンパク質であって、該単離されたペプチドが配列番号:2のアミノ酸T101〜V113、配列番号:2のE100〜V113、配列番号:2のG99〜V113、配列番号:2のI93〜V113、配列番号:2のD88〜V113、配列番号:2のP84〜V113、配列番号:2のK77〜V113、配列番号:2のQ72〜V113、配列番号:2のF65〜V113、および配列番号:2のL59〜V113からなる群より選択される、融合タンパク質。
【請求項３５】
単離されたペプチドが配列番号:2のアミノ酸T101〜V113である、請求項34記載の融合タンパク質。
【請求項３６】
単離されたペプチドが配列番号:2のE100〜V113である、請求項34記載の融合タンパク質。
【請求項３７】
単離されたペプチドが配列番号:2のG99〜V113である、請求項34記載の融合タンパク質。
【請求項３８】
単離されたペプチドが配列番号:2のアミノ酸I93〜V113である、請求項34記載の融合タンパク質。
【請求項３９】
単離されたペプチドが配列番号:2のアミノ酸D88〜V113である、請求項34記載の融合タンパク質。
【請求項４０】
単離されたペプチドが配列番号:2のアミノ酸P84〜V113である、請求項34記載の融合タンパク質。
【請求項４１】
単離されたペプチドが配列番号:2のアミノ酸K77〜V113である、請求項34記載の融合タンパク質。
【請求項４２】
単離されたペプチドが配列番号:2のアミノ酸Q72〜V113である、請求項34記載の融合タンパク質。
【請求項４３】
単離されたペプチドが配列番号:2のアミノ酸F65〜V113である、請求項34記載の融合タンパク質。
【請求項４４】
単離されたペプチドが配列番号:2のアミノ酸L59〜V113である、請求項34記載の融合タンパク質。
【請求項４５】
単離されたペプチドのホモポリマーを含む、請求項34記載の融合タンパク質。
【請求項４６】
ホモポリマーが配列番号:2のアミノ酸T101〜V113のホモポリマーである、請求項45記載の融合タンパク質。
【請求項４７】
ホモポリマーが配列番号:2のアミノ酸E100〜V113のホモポリマーである、請求項45記載の融合タンパク質。
【請求項４８】
ホモポリマーが配列番号:2のアミノ酸G99〜V113のホモポリマーである、請求項45記載の融合タンパク質。
【請求項４９】
ホモポリマーが配列番号:2のアミノ酸I93〜V113のホモポリマーである、請求項45記載の融合タンパク質。
【請求項５０】
ホモポリマーが配列番号:2のアミノ酸D88〜V113のホモポリマーである、請求項45記載の融合タンパク質。
【請求項５１】
ホモポリマーが配列番号:2のアミノ酸P84〜V113のホモポリマーである、請求項45記載の融合タンパク質。
【請求項５２】
ホモポリマーが配列番号:2のアミノ酸K77〜V113のホモポリマーである、請求項45記載の融合タンパク質。
【請求項５３】
ホモポリマーが配列番号:2のアミノ酸Q72〜V113のホモポリマーである、請求項45記載の融合タンパク質。
【請求項５４】
ホモポリマーが配列番号:2のアミノ酸F65〜V113のホモポリマーである、請求項45記載の融合タンパク質。
【請求項５５】
ホモポリマーが配列番号:2のアミノ酸L59〜V113のホモポリマーである、請求項45記載の融合タンパク質。
【請求項５６】
単離されたペプチドのヘテロポリマーを含む、請求項34記載の融合タンパク質。
【請求項５７】
ヘテロポリマーが、配列番号:2のE100〜V113、配列番号:2のG99〜V113、配列番号:2のI93〜V113、配列番号:2のD88〜V113、配列番号:2のP84〜V113、配列番号:2のK77〜V113、配列番号:2のQ72〜V113、配列番号:2のF65〜V113、および配列番号:2のL59〜V113のアミノ酸からなる群より選択される少なくとも1つの他の単離されたペプチドに連結した配列番号:2のアミノ酸T101〜V113のヘテロポリマーである、請求項56記載の融合タンパク質。
【請求項５８】
ヘテロポリマーが、配列番号:2のT101〜V113、配列番号:2のG99〜V113、配列番号:2のI93〜V113、配列番号:2のD88〜V113、配列番号:2のP84〜V113、配列番号:2のK77〜V113、配列番号:2のQ72〜V113、配列番号:2のF65〜V113、および配列番号:2のL59〜V113のアミノ酸からなる群より選択される少なくとも1つの他の単離されたペプチドに連結した配列番号:2のアミノ酸E100〜V113のヘテロポリマーである、請求項56記載の融合タンパク質。
【請求項５９】
ヘテロポリマーが、配列番号:2のT101〜V113、配列番号:2のE100〜V113、配列番号:2のI93〜V113、配列番号:2のD88〜V113、配列番号:2のP84〜V113、配列番号:2のK77〜V113、配列番号:2のQ72〜V113、配列番号:2のF65〜V113、および配列番号:2のL59〜V113のアミノ酸からなる群より選択される少なくとも1つの他の単離されたペプチドに連結された配列番号:2のアミノ酸G99〜V113のヘテロポリマーである、請求項56記載の融合タンパク質。
【請求項６０】
ヘテロポリマーが、配列番号:2のT101〜V113、配列番号:2のE100〜V113、配列番号:2のG99〜V113、配列番号:2のD88〜V113、配列番号:2のP84〜V113、配列番号:2のK77〜V113、配列番号:2のQ72〜V113、配列番号:2のF65〜V1135、および配列番号:2のL59〜V113のアミノ酸からなる群より選択される少なくとも1つの他の単離されたペプチドに連結した配列番号:2のアミノ酸I93〜V113のヘテロポリマーである、請求項56記載の融合タンパク質。
【請求項６１】
ヘテロポリマーが、配列番号:2のT101〜V113、配列番号:2のE100〜V113、配列番号:2のG99〜V113、配列番号:2のG193〜V113、配列番号:2のP84〜V113、配列番号:2のK77〜V113、配列番号:2のQ72〜V113、配列番号:2のF65〜V113、および配列番号:2のL59〜V113のアミノ酸からなる群より選択される少なくとも1つの他の単離されたペプチドに連結された配列番号:2のアミノ酸D88〜V113のヘテロポリマーである、請求項56記載の融合タンパク質。
【請求項６２】
ヘテロポリマーが、配列番号:2のT101〜V113、配列番号:2のE100〜V113、配列番号:2のG99〜V113、配列番号:2のI93〜V113、配列番号:2のD88〜V113、配列番号:2のK77〜V113、配列番号:2のQ72〜V113、配列番号:2のF65〜V113、および配列番号:2のL59〜V113のアミノ酸からなる群より選択される少なくとも1つの他の単離されたペプチドに連結された配列番号:2のアミノ酸P84〜V113のヘテロポリマーである、請求項56記載の融合タンパク質。
【請求項６３】
ヘテロポリマーが、配列番号:2のT101〜V113、配列番号:2のE100〜V113、配列番号:2のG99〜V113、配列番号:2のI93〜V113、配列番号:2のD88〜V113、配列番号:2のP84〜V113、配列番号:2のQ72〜V113、配列番号:2のF65〜V113、および配列番号:2のL59〜V113のアミノ酸からなる群より選択される少なくとも1つの他の単離されたペプチドに連結された配列番号:2のアミノ酸K77〜V113のヘテロポリマーである、請求項56記載の融合タンパク質。
【請求項６４】
ヘテロポリマーが、配列番号:2のT101〜V113、配列番号:2のE100〜V113、配列番号:2のG99〜V113、配列番号:2のI93〜V113、配列番号:2のD88〜V113、配列番号:2のP84〜V113、配列番号:2のK77〜V113、配列番号:2のF65〜V113、および配列番号:2のL59〜V113のアミノ酸からなる群より選択される少なくとも1つの他の単離されたペプチドに連結された配列番号:2のアミノ酸Q72〜V113のヘテロポリマーである、請求項56記載の融合タンパク質。
【請求項６５】
ヘテロポリマーが、配列番号:2のT101〜V113、配列番号:2のE100〜V113、配列番号:2のG99〜V113、配列番号:2のI93〜V113、配列番号:2のD88〜V113、配列番号:2のP84〜V113、配列番号:2のK77〜V113、配列番号:2のQ72〜V113、および配列番号:2のL59〜V113のアミノ酸からなる群より選択される少なくとも1つの他の単離されたペプチドに連結された配列番号:2のアミノ酸F65〜V113のヘテロポリマーである、請求項56記載の融合タンパク質。
【請求項６６】
ヘテロポリマーが、配列番号:2のT101〜V113、配列番号:2のE100〜V113、配列番号:2のG99〜V113、配列番号:2のI93〜V113、配列番号:2のD88〜V113、配列番号:2のP84〜V113、配列番号:2のK77〜V113、配列番号:2のF65〜V113、および配列番号:2のL59〜V113のアミノ酸からなる群より選択される少なくとも1つの他の単離されたペプチドに連結された配列番号:2のアミノ酸Q72〜V113のヘテロポリマーである、請求項56記載の融合タンパク質。
【請求項６７】
ヘテロポリマーが、配列番号:2のT101〜V113、配列番号:2のE100〜V113、配列番号:2のG99〜V113、配列番号:2のI93〜V113、配列番号:2のD88〜V113、配列番号:2のP84〜V113、配列番号:2のK77〜V113、配列番号:2のQ72〜V113、および配列番号:2のF65〜V113のアミノ酸からなる群より選択される少なくとも1つの他の単離されたペプチドに連結された配列番号:2のアミノ酸L59〜V113のヘテロポリマーである、請求項56記載の融合タンパク質。
【請求項６８】
Tヘルパーペプチドに融合した、請求項34記載の融合タンパク質。
【請求項６９】
担体に融合した、請求項34記載の融合タンパク質。
【請求項７０】
脂質に連結した、請求項34記載の融合タンパク質。
【請求項７１】
複数のC35ペプチドエピトープからなる単離されたポリペプチドであって、配列番号:2のアミノ酸T101〜V113、配列番号:2のE100〜V113、配列番号:2のG99〜V113、配列番号:2のI93〜V113、配列番号:2のD88〜V113、配列番号:2のP84〜V113、配列番号:2のK77〜V113、配列番号:2のQ72〜V113、配列番号:2のF65〜V113、および配列番号:2のL59〜V113からなる群より選択され、かつ配列番号:2、配列番号:153、配列番号:155、または配列番号:2のアミノ酸E100〜R109ではない、単離されたポリペプチド。
【請求項７２】
ポリペプチドが配列番号:2のアミノ酸T101〜V113である、請求項71記載の単離されたポリペプチド。
【請求項７３】
ポリペプチドが配列番号:2のアミノ酸E100〜V113である、請求項71記載の単離されたポリペプチド。
【請求項７４】
ポリペプチドが配列番号:2のアミノ酸G99〜V113である、請求項71記載の単離されたポリペプチド。
【請求項７５】
ポリペプチドが配列番号:2のアミノ酸I93〜V113である、請求項71記載の単離されたポリペプチド。
【請求項７６】
ポリペプチドが配列番号:2のアミノ酸D88〜V113である、請求項71記載の単離されたポリペプチド。
【請求項７７】
ポリペプチドが配列番号:2のアミノ酸P84〜V113である、請求項71記載の単離されたポリペプチド。
【請求項７８】
ポリペプチドが配列番号:2のアミノ酸K77〜V113である、請求項71記載の単離されたポリペプチド。
【請求項７９】
ポリペプチドが配列番号:2のアミノ酸Q72〜V113である、請求項71記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８０】
ポリペプチドが配列番号:2のアミノ酸F65〜V113である、請求項71記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８１】
ポリペプチドが配列番号:2のアミノ酸L59〜V113である、請求項71記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８２】
少なくとも1つのC35ペプチドエピトープアナログを含むペプチドを含む単離されたポリペプチドであって、該ペプチドが、第12番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有する配列番号:2のペプチドT101〜V113のアナログ、第13番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有する配列番号:2のペプチドE100〜V113のアナログ、第14番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有する配列番号:2のペプチドG99〜V113のアナログ、第20番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有する配列番号:2のペプチドI93〜V113のアナログ、第25番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有する配列番号:2のペプチドD88〜V113のアナログ、第29番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有する配列番号:2のペプチドP84〜V113のアナログ、第36番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有する配列番号:2のペプチドK77〜V113のアナログ、第41番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有する配列番号:2のペプチドQ72〜V113のアナログ、第48番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有する配列番号:2のペプチドF65〜V113のアナログ、および第54番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有する配列番号:2のペプチドL59〜V113のアナログからなる群より選択される、単離されたポリペプチド。
【請求項８３】
少なくとも1つのC35ペプチドエピトープアナログを含むペプチドが、第12番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有する配列番号:2のペプチドT101〜V113のアナログに対するペプチドT101のアナログである、請求項82記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８４】
少なくとも1つのC35ペプチドエピトープアナログを含むペプチドが、第13番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有する配列番号:2のペプチドE100〜V113のアナログである、請求項82記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８５】
少なくとも1つのC35ペプチドエピトープアナログを含むペプチドが、第14番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有する配列番号:2のペプチドG99〜V113のアナログである、請求項82記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８６】
少なくとも1つのC35ペプチドエピトープアナログを含むペプチドが、第20番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有する配列番号:2のペプチドI93〜V113のアナログである、請求項82記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８７】
少なくとも1つのC35ペプチドエピトープアナログを含むペプチドが、第25番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有する配列番号:2のペプチドD88〜V113のアナログである、請求項82記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８８】
少なくとも1つのC35ペプチドエピトープアナログを含むペプチドが、第29番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有する配列番号:2のペプチドP84〜V113のアナログである、請求項82記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８９】
少なくとも1つのC35ペプチドエピトープアナログを含むペプチドが、第36番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有する配列番号:2のペプチドK77〜V113のアナログである、請求項82記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９０】
少なくとも1つのC35ペプチドエピトープアナログを含むペプチドが、第41番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有する配列番号:2のペプチドQ72〜V113のアナログである、請求項82記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９１】
少なくとも1つのC35ペプチドエピトープアナログを含むペプチドが、第48番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有する配列番号:2のペプチドF65〜V113のアナログである、請求項82記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９２】
少なくとも1つのC35ペプチドエピトープアナログを含むペプチドが、第54番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有する配列番号:2のペプチドL59〜V113のアナログである、請求項82記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９３】
少なくとも1つのC35ペプチドエピトープアナログを含むペプチドを含む融合タンパク質であって、該ペプチドが、配列番号:2および図1BのペプチドエピトープG22〜C30については、第9番目のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有するアナログ；配列番号:2および図1BのペプチドエピトープI25〜C33については、第6番目のアミノ酸残基および/または第9番目のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有するアナログ；配列番号:2および図1BのペプチドエピトープK77〜Y85については、第9番目のアミノ酸残基におけるチロシンに代えて置換されたバリンを有するアナログ；配列番号:2および図1BのペプチドエピトープK104〜C112については、第9番目のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアラニン、グリシン、またはロイシンのいずれかを有するアナログ；配列番号:2および図1BのペプチドエピトープK104〜V113については、第9番目のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアラニン、グリシン、セリン、またはロイシンを有するアナログ；配列番号:2および図1BのペプチドエピトープI105〜V113については、第2番目のアミノ酸残基におけるスレオニンに代えて置換されたロイシンもしくはメチオニンのいずれか、および/または第8番目のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアラニン、セリン、もしくはグリシンを有するアナログ；ならびに配列番号:2および図1BのペプチドエピトープN107〜V113については、第6番目のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有するアナログ、第12番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有する配列番号:2のペプチドT101〜V113のアナログ、第13番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有する配列番号:2のペプチドE100〜V113のアナログ、第14番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有する配列番号:2のペプチドG99〜V113のアナログ、第20番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有する配列番号:2のペプチドI93〜V113のアナログ、第25番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有する配列番号:2のペプチドD88〜V113のアナログ、第29番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有する配列番号:2のペプチドP84〜V113のアナログ、第36番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有する配列番号:2のペプチドK77〜V113のアナログ、第41番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有する配列番号:2のペプチドQ72〜V113のアナログ、第48番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有する配列番号:2のペプチドF65〜V113のアナログ、および第54番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有する配列番号:2のペプチドL59〜V113のアナログからなる群より選択される、融合タンパク質。
【請求項９４】
少なくとも1つのC35ペプチドエピトープアナログを含むペプチドのホモポリマーを含む、請求項93記載の融合タンパク質。
【請求項９５】
少なくとも1つのC35ペプチドエピトープアナログを含むペプチドのヘテロポリマーを含む、請求項93記載の融合タンパク質。
【請求項９６】
請求項1〜33または71〜92のいずれか1項記載の単離されたポリペプチド、および薬学的に許容される担体を含む、組成物。
【請求項９７】
請求項34〜70または93〜95のいずれか1項記載の融合タンパク質、および薬学的に許容される担体を含む、組成物。
【請求項９８】
少なくとも1つのC35ペプチドエピトープアナログを含む単離されたペプチドであって、該ペプチドエピトープアナログが配列番号:2および図1BのK104〜V113であり、第9番目のアミノ酸残基におけるシステインがシステイニル化された、単離されたペプチド。
【請求項９９】
少なくとも1つのC35ペプチドエピトープアナログを含む単離されたペプチドであって、該ペプチドエピトープアナログが配列番号:2および図1BのI105〜V113であり、第8番目のアミノ酸残基におけるシステインがシステイニル化された、単離されたペプチド。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、ヒト乳房癌腫および膀胱癌腫において示差的に発現する、新規なヒト遺伝子に関する。より詳細には、本発明は、C35と名付けられた新規なヒトポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、C35ポリペプチド、およびベクター、宿主細胞、C35ポリペプチドを指向する抗体、ならびにこれらを産生するための組換え方法に関する。本発明はさらに、ヒト乳房癌腫および膀胱癌腫を含む癌腫の検出のための診断方法に関する。本発明はさらに、C35遺伝子を発現する標的細胞（例えば、腫瘍細胞）に対する抗体および細胞媒介性免疫を誘導するための、免疫原性組成物またはワクチンにおけるC35遺伝子およびポリペプチドの処方ならびに使用に関する。本発明はさらに、C35活性のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法に関する。
【０００２】
背景技術
癌は、年々、米国において約120万人を苦しめる。これらの癌の約50％は、手術、放射線療法、および化学療法で治癒可能である。これらの3つの型の処置における著しい技術の進歩にも関わらず、米国単独のみで、年々500，000人よりも多い人々が、癌で死亡する（Jaffee、E．M．，Ann．N．Y．Acad．Sci．886：67〜72（1999））。ほとんどの再発が、遠位の部位（例えば、肝臓、脳、骨および肺）であるので、改善された全身的な治療の緊急の必要性が存在する。
【０００３】
癌治療の目的は、腫瘍細胞を特異的に標的化し、これによって、正常細胞に対する不必要な副作用を避ける様式を開発することである。免疫療法は、癌のほとんどの型についての代替的な全身療法を提供するための可能性を有する。放射線および化学療法を超える免疫療法の利点は、この免疫療法が正常組織の損傷を引き起こすことなしに腫瘍に対して特異的に作用し得ることである。免疫療法の型の1つである、ワクチンは、特に魅力的である。なぜなら、ワクチンはまた、活性な免疫化を提供し得、これは免疫応答の増幅を可能にするからである。さらに、ワクチンは、記憶免疫応答を生成し得る。
【０００４】
変更された腫瘍細胞の特徴が、非自己として免疫系によって認識され、そして防御的免疫を誘導し得るという可能性は、癌ワクチンの開発するための試みの基礎である。これが実現的な戦略かどうかは、トランスフォーメーションされた細胞の特徴がどのように変更されるかということに依存する。腫瘍のトランスフォーメーションにおける変異の中心的役割の評価によって、遺伝的に不安定な細胞における無作為な変異の結果として腫瘍抗原が生じるという仮設が生じた。無作為な変異は免疫原性であると判明され得たが、これらは、それぞれの腫瘍に特有の特定の免疫を誘導することが予測される。これは、広く効果的な腫瘍ワクチンの開発に対して都合が悪い。しかし、代替的な仮説は、腫瘍抗原が、トランスフォーメーションプロセスに関連する全身性組織特異的遺伝子および生殖組織特異的遺伝子の調節解除の結果として生じ得るということである。これは、免疫治療に対して適切な標的であり得る腫瘍の特定の型において、共有された抗原の定性的または定量的な示差的発現を生じ得た。早期の結果は、いくつかの実験的な腫瘍の免疫原性が、無作為な変異に由来され得たことを実証し（De  Plaenら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA  85：2274〜2278（1988）；Srivastava，＆  Old、Immunol．Today  9：78（1989））、これはあきらかに最初の仮説を支持する。しかし、なぜ無作為な変異および全身的な遺伝子の調節解除が、両方とも腫瘍における新しい免疫原性発現を生じ得なかったことの論理に基づいた理由は、存在しない。実際、実験的腫瘍（Sahasrabudheら、J．Immunol．151：6202〜6310（1993）；Torigoeら、J．Immunol．147：3251（1991））、およびヒト黒色腫（van  Der  Bruggenら、Science  254：1643〜1647（1991）；Brichardら、J．Exp．Med．178：489〜495（1993）；Kawakamiら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA  91：3515〜3519（1994）；Boelら、Immunity  2：167〜175（1995）；Van  den  Eyndeら、J．Exp．Med．182：689〜698（1995））の両方における、より最近の研究は、調節解除された正常遺伝子によってコードされる、共有された腫瘍抗原の発現を、明らかに実証している。このMAGE-1および異なるヒト黒色腫に一般的である他の抗原の同定は、複数の腫瘍ワクチンの将来の開発のための大きな保証を保持する。
【０００５】
黒色腫における進歩にも関わらず、細胞傷害性T細胞によって認識される非常に少ない共有された抗原は、他のヒト腫瘍について記載されていない。主なチャレンジは技術的なものである。腫瘍細胞において特有に発現される免疫原性分子を同定する、最も広範かつ今日までで最も成功したアプローチは、腫瘍特異的なCTL（細胞傷害性Tリンパ球）でcDNAをスクリーニングすることである。この戦略の適用は、ヒト黒色腫において優勢に発現するいくつかの遺伝子ファミリーの同定を導いてきた。しかし、このアプローチの2つの主な限定は、以下である：（1）スクリーニングは、分離した標的集団への組換えDNAの多数の小プールの労働集約的トランスフェクションを必要とし、これはいくつかのプールの小さな成分によるT細胞刺激をアッセイするために、抗原提示に必要とされる1つ以上のMHC分子を発現するようにこれら自身が改変される必要性がしばしばある；ならびに（2）腎細胞癌腫をできる限り除いて、腫瘍特異的CTLは、腫瘍の他の型を有する患者の腫瘍浸潤リンパ球（TIL）またはPBL（特にヒト腫瘍の80％より多くを構成する上皮細胞癌腫）のいずれかから単離が非常に困難であること。黒色腫において隔離される腫瘍特異的CTLを生じる、組織特異的な特性が存在し得るようである。
【０００６】
腫瘍特異的遺伝子産物での直接的な免疫化は、いくつかの共有された腫瘍抗原に対する免疫応答を誘発するために必須であり得る。腫瘍が強い抗原を発現した場合、この腫瘍は、臨床的徴候の前に根絶されるべきであることが議論されている。その上、おそらく、腫瘍は弱い抗原しか発現しない。免疫学者は、何が抗原を弱くまたは強くするのかという問題に、長い間興味を持っていた。2つ主要な仮説がある。弱い抗原は、あまりプロセスされ得ず、そしてT細胞に効果的に提示され得ない。あるいは、適切な特異性を有する器官におけるT細胞の数は、力強い応答のためには不適切であり得る（いわゆる「レパートリー中の穴（hole  in  the  repertoire）」）。複合性細胞プロセス（これによって抗原ペプチドは、細胞表面への輸送およびT細胞への提示のためにMHC分子と関連する）の説明は、現代の免疫学の勝利の1つである。これらの実験は明らかに、プロセシングの欠損または他のペプチドからの競合に起因する提示の失敗が、特定のペプチドをより低い免疫原性にし得るということを確立した。対照的に、技術的な理由で、T細胞レパートリーにおけるクローンの提示の頻度が、低い応答性の重要な機構であるということを確立することは、より困難である。しかし、タンパク質抗原の免疫優勢ペプチドと潜在性ペプチドとの間の関係が、T細胞レセプタートランスジェニックマウスにおいて変化することを実証する現在の研究は、ペプチド特異的T細胞の相対的な頻度が、実際は、特定のペプチドがT細胞応答において潜在的または優勢的であるか否かという決定的要素であり得ることを示唆する。これは、ワクチンの開発についての潜在的な重要性を助長する。現在の方法に関して、腫瘍の抗原ペプチドがプロセスされ、そしてT細胞に提示される方法を改変の実行は、複雑かつ困難である。しかし、特異的T細胞集団の相対的な頻度は、先のワクチン接種によって直接的かつ効果的に増加され得る。従って、これは、別なふうに潜在的応答を免疫防御的にするために必要とされる重要な操作であり得る。これらの潜在的または亜優勢（sub-dominant）抗原の考慮は、寛容の誘導を介する腫瘍による可能性のある免疫回避に関連する、特別の関連性を有する。腫瘍保有宿主中における腫瘍特異的T細胞が、おそらく非プロフェッショナルAPC（non-professional  APC）上での抗原提示の結果として、アネルギーであることを示唆する証拠が示されている（Morgan，D．J．ら、J，Immunol．163：723〜27（1999）；Sotomayor，E．M．ら、Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．96：11476〜81（1999）；Lee，P．P．ら、Nature  Medicine  5：677〜85（1999））。従って、腫瘍の免疫優勢抗原に特異的なT細胞の先の寛容は、癌の免疫療法についての成功した戦略の開発における困難性の原因である。これらの観察は、免疫優勢腫瘍抗原に特異的なT細胞は、確立された腫瘍の免疫療法に関してあまり効果的でないことを示唆する。なぜなら、それらのT細胞は、おそらく寛容されるからである。従って、亜優勢抗原に特異的なT細胞またはより低い頻度で最初に提示されるT細胞は、より効果的であることを証明する。なぜならこれらは、増殖している腫瘍の影響の寛容化を逃れているからである。
【０００７】
広範に効果的なヒトワクチンの開発についての別の主な関心は、HLAクラスI分子の極端な多型である。クラスI  MHC：細胞性ペプチド複合体は、特異的なCD8＋CTLに対する標的抗原である。この細胞性ペプチド（内因的に合成されたタンパク質の分解によって誘導される）は、これらが細胞表面への輸送のためにクラスI  MHC分子に結合する場合、プレゴルジ（pre-Golgi）区分中に転位する。CD8分子は、クラスI重鎖のα3ドメインへの結合によるT細胞と標的との間の相互作用のアビディティに寄与する。全ての内因性タンパク質が代謝回転するので、任意の細胞質タンパク質または核タンパク質由来のペプチドは、MHC分子に結合し得、そして細胞表面における提示のために輸送される。これは、T細胞が、細胞膜で分泌されるかまたは取り込まれるかいずれかであるタンパク質のみのコンフォメーション決定基を認識することが限定される抗体よりも、細胞タンパク質のより大きな提示を探索することを可能にする。
【０００８】
T細胞レセプター抗原結合部位は、ペプチドおよび周囲のMHCの両方の決定基と相互作用する。従って、T細胞特異性は、MHC：ペプチド複合体に関して定義されなければならない。MHC分子に結合するペプチドの特異性は、非常に広く、そして特異的抗体の抗原結合部位と比較して、相対的に低い親和性の特異性である。クラスI結合ペプチドは、一般に8〜10残基長であり、そしてMHCペプチド結合部位におけるポケットと一致する特定の重要な位置で、制限された多様性のアミノ酸側鎖を適合させている。特定のMHC分子と結合するこれらの重要な特徴は、ペプチド結合モチーフを構成する。
【０００９】
それゆえ、ヒト腫瘍、癌、および感染された細胞に特異的なT細胞の誘導ならびに単離を促進する方法、ならびに適切なMHCの状況においてこれらのT細胞によって認識される主な標的抗原をコードする遺伝子を効率的に選択する方法についての必要性がある。
【発明の開示】
【００１０】
発明の簡単な概要
本発明は、新規のポリヌクレオチドであるC35に関し、これはヒト乳房癌腫および膀胱癌腫において示差的に発現され、そしてC35ポリペプチドをコードする。さらに、本発明はC35ポリペプチドおよびポリヌクレオチドを産生するためのベクター、宿主細胞、抗体ならびに組換え方法に関する。本発明はさらに、C35遺伝子産物を発現する標的細胞（例えば、腫瘍細胞）に対する抗体および細胞媒介性免疫を誘導するための、免疫原性組成物中のC35ポリペプチド、特にC35ペプチドエピトープおよびC35ペプチドエピトープアナログ、ならびにポリヌクレオチドの処方ならびに使用に関する。また、C35遺伝子およびポリペプチドに関する障害を検出するための診断方法（癌腫（例えば、ヒト乳房癌腫）のための予後マーカーとしての使用を含む）、およびこのような障害を処置するための治療的方法が提供される。本発明はさらに、C35の結合パートナーを同定するためのスクリーニング方法に関する。
【００１１】
従って、1つの態様において、本発明は複数のC35ペプチドエピトープを含むペプチドを含む単離されたポリペプチドに関し、ここで、前記ペプチドは配列番号:2のアミノ酸T101〜V113、配列番号:2のE100〜V113、配列番号:2のG99〜V113、配列番号:2のI93〜V113、配列番号:2のD88〜V113、配列番号:2のP84〜V113、配列番号:2のK77〜V113、配列番号:2のQ72〜V113、配列番号:2のF65〜V113、および配列番号:2のL59〜V113からなる群より選択され、前記単離されたポリペプチドは配列番号:2、配列番号:153、配列番号:155、または配列番号:2のアミノ酸E100〜R109ではない。
【００１２】
もう1つの態様において、本発明は少なくとも1つのC35ペプチドエピトープアナログを含む単離されたポリペプチドに関し、ここで、前記C35ペプチドエピトープアナログは、配列番号:2および図1BのペプチドエピトープG22〜C30については、第9番目のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有するアナログ；配列番号:2および図1BのペプチドエピトープI25〜C33については、第6番目のアミノ酸残基および/または第9番目のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有するアナログ；配列番号:2および図1BのペプチドエピトープK77〜Y85については、第9番目のアミノ酸残基におけるチロシンに代えて置換されたバリンを有するアナログ；配列番号:2および図1BのペプチドエピトープK104〜C112については、第9番目のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアラニン、グリシン、またはロイシンを有するアナログ；配列番号:2および図1BのペプチドエピトープK104〜V113については、第9番目のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアラニン、セリン、グリシン、またはロイシンを有するアナログ；配列番号:2および図1BのペプチドエピトープI105〜V113については、第2番目のアミノ酸残基におけるスレオニンに代えて置換されたロイシンもしくはメチオニンのいずれか、および/または第8番目のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアラニン、セリン、もしくはグリシンを有するアナログ；ならびに配列番号:2および図1BのペプチドエピトープN107〜L115については、第6番目のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有するアナログからなる群より選択される。
【００１３】
好ましくは、本発明の単離されたポリペプチドは長さが100以下のアミノ酸、または、長さが95以下のアミノ酸、または長さが90以下のアミノ酸、または長さが85以下のアミノ酸、または長さが80以下のアミノ酸、または長さが75以下のアミノ酸、または長さが70以下のアミノ酸、または長さが65以下のアミノ酸、または長さが60以下のアミノ酸、または長さが55以下のアミノ酸、または長さが50以下のアミノ酸、または長さが45以下のアミノ酸、または長さが40以下のアミノ酸、または長さが35以下のアミノ酸である。
【００１４】
もう1つの態様において、本発明は複数のC35ペプチドエピトープを含む単離されたペプチドを含む融合タンパク質に関し、ここで、前記単離されたペプチドは配列番号:2のアミノ酸T101〜V113、配列番号:2のE100〜V113、配列番号:2のG99〜V113、配列番号:2のI93〜V113、配列番号:2のD88〜V113、配列番号:2のP84〜V113、配列番号:2のK77〜V113、配列番号:2のQ72〜V113、配列番号:2のF65〜V113、および配列番号:2のL59〜V113からなる群より選択される。好ましい態様においては、融合タンパク質は前記単離されたペプチドのホモポリマーである。もう1つの好ましい態様においては、融合タンパク質は前記単離されたポリペプチドのヘテロポリマーである。なおもう1つの態様において、融合タンパク質はTヘルパーペプチドに融合している。さらにもう1つの態様において、融合タンパク質は担体に融合している。もう1つの態様において、融合タンパク質は脂質に連結されている。
【００１５】
もう1つの態様において、本発明は複数のC35ペプチドエピトープからなる単離されたポリペプチドに関し、ここで、前記単離されたポリペプチドは配列番号:2のアミノ酸T101〜V113、配列番号:2のE100〜V113、配列番号:2のG99〜V113、配列番号:2のI93〜V113、配列番号:2のD88〜V113、配列番号:2のP84〜V113、配列番号:2のK77〜V113、配列番号:2のQ72〜V113、配列番号:2のF65〜V113、および配列番号:2のL59〜V113からなる群より選択され、前記単離されたポリペプチドは配列番号:2、配列番号:153、配列番号:155、または配列番号:2のアミノ酸E100〜R109ではない。
【００１６】
もう1つの態様において、本発明は少なくとも1つのC35ペプチドエピトープアナログを含むペプチドを含む単離されたポリペプチドに関し、ここで、前記ペプチドは第12番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有する配列番号:2のペプチドT101〜V113のアナログ、第13番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有する配列番号:2のペプチドE100〜V113のアナログ、第14番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有する配列番号:2のペプチドG99〜V113のアナログ、第20番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有する配列番号:2のペプチドI93〜V113のアナログ、第25番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンいずれを有する配列番号:2のペプチドD88〜V113のアナログ、第29番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有する配列番号:2のペプチドP84〜V113のアナログ、第36番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有する配列番号:2のペプチドK77〜V113のアナログ、第41番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有する配列番号:2のペプチドQ72〜V113のアナログ、第48番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有する配列番号:2のペプチドF65〜V113のアナログ、および第54番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有する配列番号:2のペプチドL59〜V113のアナログからなる群より選択される。
【００１７】
もう1つの態様において、本発明は少なくとも1つのC35ペプチドエピトープアナログを含むペプチドを含む融合タンパク質に関し、ここで、前記ペプチドは、配列番号:2および図1BのペプチドエピトープG22〜C30については、第9番目のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有するアナログ；配列番号:2および図1BのペプチドエピトープI25〜C33にいついては、第6番目のアミノ酸残基および/または第9番目のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有するアナログ；配列番号:2および図1BのペプチドエピトープK77〜Y85については、第9番目のアミノ酸残基におけるチロシンに代えて置換されたバリンを有するアナログ；配列番号:2および図1BのペプチドエピトープK104〜C112については、第9番目のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアラニン、グリシンまたはロイシンを有するアナログ；配列番号:2および図1BのペプチドエピトープK104〜V113については、第9番目のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアラニン、グリシン、セリンまたはロイシンを有するアナログ；配列番号:2および図1BのペプチドエピトープI105〜V113については、第2番目のアミノ酸残基におけるスレオニンに代えて置換されたロイシン、セリンまたはメチオニンのいずれかおよび/または第8番目のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンを有するアナログ；および配列番号:2および図1BのペプチドエピトープN107〜V113については、第6番目のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンいずれを有するアナログ、第12番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有する配列番号:2のペプチドT101〜V113のアナログ、第13番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有する配列番号:2のペプチドE100〜V113のアナログ、第14番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有する配列番号:2のペプチドG99〜V113のアナログ、第20番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有する配列番号:2のペプチドI93〜V113のアナログ、第25番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有する配列番号:2のペプチドD88〜V113のアナログ、第29番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有する配列番号:2のペプチドP84〜V113のアナログ、第36番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有する配列番号:2のペプチドK77〜V113のアナログ、第41番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有する配列番号:2のペプチドQ72〜V113のアナログ、第48番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有する配列番号:2のペプチドF65〜V113のアナログ、および第54番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有する配列番号:2のペプチドL59〜V113のアナログからなる群より選択される。好ましい態様におい���、融合タンパク質は、少なくとも1つのC35ペプチドエピトープアナログを含む前記ペプチドのホモポリマーを含む。もう1つの好ましい態様において、融合タンパク質は、少なくとも1つのC35ペプチドエピトープアナログを含む前記ペプチドのヘテロポリマーを含む。
【００１８】
もう1つの態様において、本発明は、本発明の単離されたポリペプチドまたは融合タンパク質および薬学的に許容される担体を含む組成物に関する。
【００１９】
発明の詳細な説明
定義
以下の定義は、本明細書全体を通して用いられる特定の用語の理解を容易にするために提供される。
【００２０】
本発明において、「単離された」とは、物質のネイティブな環境（例えば、この物質が天然に存在する場合のその天然の環境）から取り出された、従って、その天然の状態から「人の手によって」変えられている物質のことをいう。例えば、単離されたポリヌクレオチドは、ベクターもしくは組成物の一部であり得るか、または細胞内に含まれ得、そしてそれらのベクター、組成物または特定の細胞がそのポリヌクレオチドの本来の環境にはないので、なお単離された状態にあり得る。
【００２１】
本発明において、「膜」C35タンパク質は、脂質二重層との直接的会合または間接的会合のいずれかにより（特に、カルボキシ末端アミノ酸モチーフのプレニル化を介する会合が挙げられる）細胞表面で発現されるものである。プレニル化は、ファルネシルイソプレノイドまたはゲラニルゲラニルイソプレノイドのいずれかの付加によるタンパク質の共有結合改変を含む。プレニル化は、タンパク質のカルボキシ末端付近に位置するシステイン残基で生じる。C35ポリペプチドは、112〜115位にアミノ酸Cys-Val-Ile-Leuを含み、このLeuは、このポリペプチドのC末端残基である。モチーフCys-X-X-Leu（ここで、Xは、任意の脂肪族アミノ酸を示す）は、Cys残基上に20炭素のゲラニルゲラニル基の付加を生じる。一般に、この脂質の付加後に、3つの末端アミノ酸残基がこのポリペプチドから切断され、そして脂質基がメチル化される。プレニル化は、大部分のタンパク質の膜局在を促進し、このポリペプチド中の配列モチーフは、細胞質膜、核膜、またはゴルジ膜へのプレニル化タンパク質の方向付けに関与する。プレニル化は、タンパク質間相互作用において役割を果たし、そして多くのプレニル化タンパク質は、シグナル伝達に関与する。プレニル化タンパク質の例としては、Rasおよび核ラミニンBが挙げられる（Zhang，F．L．およびCasey，P．J．，Ann．Rev．Biochem．65：241-269（1996））。C35タンパク質は、一次試薬としてマウス抗ヒトC35抗血清を用いる蛍光分析により、2つの乳房腫瘍細胞株の表面で検出された（図4A〜4C）。
【００２２】
本発明において、「分泌（された）」C35タンパク質とは、シグナル配列の結果として、ER、分泌小胞、または細胞外空間に方向付けられ得るタンパク質、ならびにシグナル配列を必ずしも含まなくても細胞外空間に放出されるC35タンパク質をいう。C35分泌タンパク質が細胞外空間に放出されると、C35分泌タンパク質は、「成熟」C35タンパク質を精製するように細胞外でプロセシングを受け得る。細胞外空間への放出は、エキソサイトーシスおよびタンパク質分解性切断を含む多くの機構により生じ得る。
【００２３】
本明細書中で用いられる場合、C35「ポリヌクレオチド」とは、配列番号:1に含まれる核酸配列を有する分子をいう。例えば、C35ポリヌクレオチドは、全長cDNA配列（5’および3’非翻訳配列を含む）、コード領域（シグナル配列ありまたはなし）、分泌タンパク質コード領域、ならびにこの核酸配列の断片、エピトープ、ドメイン、および改変体のヌクレオチド配列を含み得る。さらに、本明細書中で用いられる場合、C35「ポリペプチド」とは、広く定義されるように、このポリヌクレオチドから生成される翻訳されたアミノ酸配列を有する分子をいう。
【００２４】
特定の態様において、本発明のポリヌクレオチドは、長さが300nt、200nt、100nt、50nt、15nt、10nt、または7ntより短い。さらなる態様において、本発明のポリヌクレオチドは、C35コード配列の少なくとも15の連続するヌクレオチドを含むが、いずれかのC35イントロンの全てまたは一部分を含まない。別の態様において、C35コード配列を含む核酸は、ゲノム隣接遺伝子（すなわち、ゲノム中のC35遺伝子の5’側または3’側）のコード配列を含まない。
【００２５】
本発明において、全長C35コード配列は、配列番号:1として識別される。
【００２６】
C35「ポリヌクレオチド」とはまた、C35ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、およびこのポリヌクレオチドに密接に関連したポリヌクレオチドをいう。
【００２７】
C35「ポリヌクレオチド」とはまた、配列番号:2に示されるアミノ酸配列をコードする単離されたポリヌクレオチド、またはその生物学的に活性な断片をいう。
【００２８】
C35「ポリヌクレオチド」とはまた、配列番号:1に含まれる配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチド、その相補体、または寄託されたクローン内のcDNAをいう。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、50％ホルムアミド、5×SSC（750mM  NaCl、75mM  クエン酸ナトリウム）、50mMリン酸ナトリウム（pH7.6）、5×デンハルト溶液、10％  硫酸デキストラン、および20μg/ml変性剪断サケ精子DNAを含む溶液中、42℃での一晩のインキュベーション、続いて0.1×SSC中、約65℃でのフィルターの洗浄をいう。
【００２９】
当然のことながら、ポリA＋配列（例えば、cDNAの任意の3’末端ポリA＋トラクト（tract））にのみハイブリダイズするポリヌクレオチド、またはT（またはU）残基の相補的なストレッチは、「ポリヌクレオチド」の定義に含まれない。なぜなら、このようなポリヌクレオチドは、ポリ（A）ストレッチを含む任意の核酸分子またはその相補体（例えば、実際には、任意の2本鎖cDNAクローン）にハイブリダイズするからである。
【００３０】
C35ポリヌクレオチドは、任意のポリリボヌクレオチドもしくはポリデオキシリボヌクレオチドを含み得、改変されていないRNAもしくはDNA、または改変されたRNAもしくはDNAであり得る。例えば、C35ポリヌクレオチドは、1本鎖DNAおよび2本鎖DNA、ならびに1本鎖および2本鎖領域の混合物であるDNA、1本鎖RNAおよび2本鎖RNA、ならびに1本鎖および2本鎖領域の混合物であるRNA、1本鎖、（またはより代表的には）2本鎖であり得るDNAおよびRNAを含むハイブリッド分子、または1本鎖領域および2本鎖領域の混合物を含み得る。さらに、C35ポリヌクレオチドは、RNAもしくはDNA、またはRNAおよびDNAの両方を含む3本鎖領域から構成され得る。C35ポリヌクレオチドはまた、安定性または他の理由のために、1以上の改変された塩基または改変DNAもしくはRNA骨格を含み得る。「改変された」塩基としては、例えば、トリチル化塩基、およびイノシンのような通常でない塩基が挙げられる。DNAおよびRNAに対して種々の改変が行われ得る；従って、「ポリヌクレオチド」は、化学的に、酵素的に、または代謝的に改変された形態を含む。
【００３１】
C35ポリペプチドは、ペプチド結合、または改変されたペプチド結合により互いに結合されたアミノ酸（すなわち、ペプチドアイソスター（peptide  isoster））から構成され得、そして遺伝子によりコードされる20のアミノ酸以外のアミノ酸を含み得る。C35ポリペプチドは、天然のプロセス（例えば、翻訳後プロセシング）または当技術分野で周知の化学的改変技術のいずれかにより改変され得る。このような改変は、基本的教科書およびより詳細なモノグラフ、ならびに多量の研究文献に十分に記載されている。改変は、C35ポリペプチド（ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノ末端またはカルボキシ末端を含む）のいずれの場所においても生じ得る。同じ型の改変が所定のC35ポリペプチドにおけるいくつかの部位において同程度または種々の程度で存在し得ることが理解される。また、所定のC35ポリペプチドは、多くの型の改変を含み得る。C35ポリペプチドは、例えば、ユビキチン化の結果として分枝状態になり得、そして分枝ありまたはなしの環状であり得る。環状のC35ポリペプチド、分枝したC35ポリペプチド、および分枝した環状のC35ポリペプチドは、天然の翻訳後プロセスにより生じて得るか、合成方法により作製され得る。改変としては、以下が挙げられる：アセチル化、アシル化、ADPリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γカルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、水酸化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、PEG化、タンパク質分解性プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化（selenoylation）、硫酸化、アミノ酸のタンパク質への転移RNA媒介性付加（例えば、アルギニル化）、およびユビキチン化。例えば、Proteins-Structure  And  Molecular  Properties，2nd  Ed．，T．E．Creighton，W．H．FreemanおよびCompany，New  York（1993）；Posttranslational  Covalent  Modification  of  Proteins，B．C．Johnson，Ed．，Academic  Press，New  York，pgs．1-12（1983）；Seifterら、Meth  Enzymol  182：626-646（1990）；Rattanら、Ann  NY  Acad  Sci  663：48-62（1992）を参照のこと。
【００３２】
「配列番号:1」は、C35ポリヌクレオチド配列をさす一方、「配列番号:2」は、C35ポリペプチド配列をさす。
【００３３】
「生物学的活性を有する」C35ポリペプチドとは、特定の生物学的アッセイにおいて測定されるように、用量依存性か否かに拘らず、C35ポリペプチドの活性に類似の活性を示すが、必ずしもC35ポリペプチドの活性と同一ではないポリペプチド（成熟形態を含む）をいう。用量依存性が実際に存在する場合、これは、C35ポリペプチドの活性に同一である必要はなく、むしろC35ポリペプチドと比較して所定の活性における用量依存性に実質的に類似である（すなわち、候補ポリペプチドは、C35ポリペプチドに対して、約25分の1以上の活性、好ましくは10分の1以上の活性、そして最も好ましくは、3分の1以上の活性を示す）。
【００３４】
C35ポリヌクレオチドおよびポリペプチド
C35の348塩基対断片を、原発性かつ浸潤性の管内乳癌（intraductal  mammary  carcinoma）を有する同じ患者から得た腫瘍および正常乳腺上皮細胞株由来のポリRNAの差し引きハイブリダイゼーション（subtractive  hybridization）により、最初に単離した。Band，V．ら、Cancer  Res．50：7351-7357（1990）。次いで、この配列および重複EST配列（登録番号W57569）の配列に基づくプライマーを用いて、全長C35コード配列を含むcDNAを増幅し、BT-20乳房腫瘍細胞株（ATCC，HTB-19）からクローニングした。このC35  cDNAは、配列番号:1として識別されるコード領域全体を含む。C35クローンは、348bpのコード配列に加えて、3’非翻訳領域の167bpを含む。このオープンリーディングフレームは、ヌクレオチドの1位に位置するN末端メチオニンで始まり、ヌクレオチドの348位の終止コドンで終わる（図1A）。配列番号:1の配列の全てまたは大部分を含む代表的なクローンを、アメリカンタイプカルチャーコレクション（「ATCC」）に2000年8月1日に寄託し、ATCC受託番号PTA-2310を与えられた。ATCCは、10801  University  Boulevard，Manassas，VA  20110-2209，USAに位置する。ATCCへの寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項に従って行われた。
【００３５】
従って、配列番号:1および翻訳された配列番号:2は十分正確であり、そうでない場合は、当技術分野で周知および以下にさらに記載される種々の使用に適切である。例えば、配列番号:1は、配列番号:1に含まれる核酸配列または寄託されたクローンに含まれるcDNAを検出する核酸ハイブリダイゼーションプローブを設計するために有用である。これらのプローブはまた、生物学的試料中の核酸分子にハイブリダイズし、それにより本発明の種々の法医学的方法および診断方法が可能になる。同様に、配列番号:2から同定されるポリペプチドは、C35に特異的に結合する抗体を生成するため、または細胞表面上のMHC分子と会合したC35由来のペプチドに特異的なT細胞を刺激するために用いられ得る。
【００３６】
それにも拘らず、配列決定反応により生成されたDNA配列は、配列決定誤差を含み得る。この誤差は、間違って認識されたヌクレオチドとして存在するか、または生成されたDNA配列におけるヌクレオチドの挿入もしくは欠失として存在する。間違って挿入または欠失されたヌクレオチドは、推定アミノ酸配列のリーディングフレームにおいてフレームシフトを生じる。これらの場合、推定アミノ酸配列は、生成されたDNA配列が実際のDNA配列と99.9％を超えて同一であり得る（例えば、1000塩基を超えるオープンリーディングフレームにおける1つの塩基挿入または欠失）としても、実際のアミノ酸配列から多様化する。
【００３７】
従って、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列において正確さが必要とされる適用については、本発明は、配列番号:1として同定される生成されたヌクレオチド配列および配列番号:2として同定される推定の翻訳されたポリペプチド配列のみを提供するのではない。寄託されたC35クローンのヌクレオチド配列は、公知の方法に従って、寄託されたクローンを配列決定することにより容易に決定され得る。次いで、推定C35アミノ酸配列は、このような寄託物から確かめられ得る。さらに、寄託されたクローンによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列はまた、ペプチド配列決定により、または寄託されたヒトC35  cDNAを含む適切な宿主細胞においてこのタンパク質を発現させ、このタンパク質を収集し、その配列を決定することにより直接決定され得る。
【００３８】
本発明はまた、配列番号:1に対応するC35遺伝子または寄託されたクローンに関する。C35遺伝子は、本明細書中に開示される配列情報を用いて公知の方法に従って単離され得る。このような方法は、開示された配列からプローブまたはプライマーを調製する工程、およびゲノム材料の適切な供給源からC35遺伝子を同定または増幅する工程を包含する。
【００３９】
C35の種ホモログもまた、本発明において提供される。種ホモログは、本明細書中に提供される配列から適切なプローブまたはプライマーを作製し、そして所望のホモログについての適切な核酸供給源をスクリーニングすることにより単離および同定され得る。
【００４０】
「C35ポリペプチド」により、本明細書中に記載のC35タンパク質およびポリペプチドの全ての形態が意味される。C35ポリペプチドは、任意の適切な様式において調製され得る。このようなポリペプチドとしては、単離された天然に存在するポリペプチド、組換え生成されたポリペプチド、合成により生成されたポリペプチド、またはこれらの方法の組み合わせにより生成されたポリペプチドが挙げられる。このようなポリペプチドを調製するための手段は、当技術分野で十分に理解されている。
【００４１】
C35ポリペプチドは、膜タンパク質または分泌タンパク質の形態（成熟形態を含む）であり得るか、あるいはより大きなタンパク質（例えば、融合タンパク質）の一部であり得る（以下を参照のこと）。分泌配列またはリーダー配列、プロ配列、精製を補助する配列（例えば、複数のヒスチジン残基）を含むさらなるアミノ酸配列、または組換え生成の間の安定性のためのさらなる配列を含めることはしばしば有利である。
【００４２】
C35ポリペプチドは、好ましくは単離された形態で提供され、そして好ましくは実質的に精製されている。組換え生成バージョンのC35ポリペプチド（分泌ポリペプチドを含む）は、SmithおよびJohnson，Gene  67：31-40（1988）に記載される1工程の方法により実質的に精製され得る。C35ポリペプチドはまた、当技術分野で周知の方法で、C35タンパク質に対して惹起された本発明の抗体を用いて、天然の供給源または組換え供給源から精製され得る。
【００４３】
1つの態様において、本発明は、ヒト対象において細胞傷害性Tリンパ球および/またはヘルパーTリンパ球応答を誘発することができる単離されたポリペプチドに指向され、前記単離されたポリペプチドは一つまたは複数のC35ペプチドエピトープまたはC35ペプチドエピトープアナログを含むか、またはそれからなる。好ましい態様において、前記一つまたは複数のC35ペプチドエピトープは、配列番号:2のアミノ酸E4〜P12、配列番号:2のアミノ酸S9〜V17、配列番号:2のアミノ酸S21〜Y29、配列番号:2のG22〜C30、配列番号:2のアミノ酸I25〜C33、配列番号:2のアミノ酸T38〜V46、配列番号:2のアミノ酸G61〜I69、配列番号:2のアミノ酸T62〜N70、配列番号:2のアミノ酸G63〜G71、配列番号:2のアミノ酸F65〜L73、配列番号:2のアミノ酸I67〜F75、配列番号:2のアミノ酸K77〜Y85、配列番号:2のアミノ酸Q72〜E86、配列番号:2のアミノ酸G81〜L89、配列番号:2のアミノ酸K104〜C112、配列番号:2のアミノ酸K104〜V113、配列番号:2のアミノ酸I105〜V113、および配列番号:2のアミノ酸N107〜L115からなる群より選択される。好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープ（例えば、表1〜3または5〜6中の一つまたは複数の8量体、9量体、10量体、15量体、または20量体）またはC35ペプチドエピトープアナログ（例えば、表4に列挙されたアナログ）を含む単離されたポリペプチドは長さが114以下のアミノ酸、より好ましくは長さが110以下のアミノ酸、より好ましくは長さが105以下のアミノ酸、より好ましくは長さが100以下のアミノ酸、より好ましくは長さが95以下のアミノ酸、より好ましくは長さが90以下のアミノ酸、より好ましくは長さが85以下のアミノ酸、より好ましくは長さが80以下のアミノ酸、より好ましくは長さが75以下のアミノ酸、より好ましくは長さが70以下のアミノ酸、より好ましくは長さが65以下のアミノ酸、より好ましくは長さが60以下のアミノ酸、より好ましくは長さが55以下のアミノ酸、より好ましくは長さが50以下のアミノ酸、より好ましくは長さが45以下のアミノ酸、より好ましくは長さが40以下のアミノ酸、より好ましくは長さが35以下のアミノ酸、より好ましくは長さが30以下のアミノ酸、より好ましくは長さが25以下のアミノ酸、より好ましくは長さが20のアミノ酸、より好ましくは長さが15のアミノ酸、より好ましくは長さが14、13、12、11、10、9、または8のアミノ酸である。もちろん、本明細書中で明示的に列挙しないが、C35ペプチドエピトープまたはC35ペプチドエピトープアナログを含む、例えば、8および100アミノ酸の間のいずれの長さの単離されたポリペプチドも同様に本発明では考えられる。好ましい態様においては、単離されたポリペプチドは配列番号:2および図1Bに示されたC35ポリペプチドの断片である。もう1つの態様において、本発明は、ヒト対象において細胞傷害性Tリンパ球および/またはヘルパーTリンパ球応答を誘発することができる単離されたポリペプチドに指向され、前記単離されたポリペプチドは複数のC35ペプチドエピトープを含むか、またはそれからなる。特に好ましい態様においては、前記複数エピトープポリペプチドは、配列番号:2のアミノ酸T101〜V113、配列番号:2のアミノ酸E100〜V113、配列番号:2のアミノ酸G99〜V113、配列番号:2のアミノ酸I93〜V113、配列番号:2のアミノ酸D88〜V113、配列番号:2のアミノ酸P84〜V113、配列番号:2のア��ノ酸K77〜V113、配列番号:2のアミノ酸Q72〜V113、配列番号:2のアミノ酸F65〜V113、および配列番号:2のアミノ酸L59〜V113からなる群より選択される。もう1つの好ましい態様において、本発明は表1〜3または5〜6に列挙された少なくとも1つのC35ペプチドエピトープ、または表4に列挙されたC35ペプチドエピトープアナログを含む融合タンパク質に指向される。1つの態様において、前記少なくとも1つのC35ペプチドエピトープまたはC35ペプチドエピトープアナログは異種（すなわち、非C35）ポリペプチドに融合されている。もう1つの好ましい態様において、前記融合タンパク質は、ホモポリマーまたはヘテロポリマーのいずれかとして、複数のC35ペプチドエピトープまたは複数のC35ペプチドエピトープアナログを含む。もう1つの好ましい態様において、本発明の融合タンパク質は、少なくとも1つのC35ペプチドエピトープに連結された少なくとも1つのC35ペプチドエピトープアナログを含む。さらなる態様において、エピトープ/アナログはアミノ酸スペーサーまたはリンカーによって連結される。
【００４４】
本発明は、さらに、そのような単離されたポリペプチドおよび融合タンパク質を含むワクチンとして使用される薬学的組成物に指向される。
【００４５】
本発明は、さらに、免疫学的に有効な量の本発明の薬学的組成物をヒト患者に投与することを含む、前記患者において細胞傷害性Tリンパ球および/またはヘルパーTリンパ球応答を刺激する方法に指向される。
【００４６】
ポリヌクレオチドおよびポリペプチド改変体
「改変体」とは、C35ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるが、その本質的な特性を保持しているポリヌクレオチドまたはポリペプチドをいう。一般に、改変体は、C35ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに全体として密接に類似しており、そして多くの領域において、C35ポリヌクレオチドまたはポリペプチドと同一である。
【００４７】
例えば、本発明の参照ヌクレオチド配列に少なくとも95％「同一」のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにより、このポリヌクレオチド配列がC35ポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列の各100ヌクレオチドあたり5つまでの点変異を含み得ることを除いて、このポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、参照配列に同一であることが意図される。言い換えると、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも95％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列におけるヌクレオチドの5％までが欠失または別のヌクレオチドと置換され得るか、あるいは参照ヌクレオチド配列における総ヌクレオチドの5％までの多くのヌクレオチドが参照配列に挿入され得る。問い合わせ配列は、配列番号:1に示される配列全体、ORF（オープンリーディングフレーム）、または本明細書中に記載のように特定される任意の断片であり得る。
【００４８】
実際問題として、任意の特定の核酸分子またはポリペプチドが、本発明のヌクレオチド配列に対して少なくとも90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であるか否かが、公知のコンピュータープログラムを用いて従来どおり決定され得る。問い合わせ配列（本発明の配列）と対象配列との間の最も良好な全体の適合を決定するための好ましい方法（グローバル配列アラインメントといわれる）はまた、Brutlagら、Comp．App．Biosci．6：237-245（1990）のアルゴリズムに基づいたFASTDBコンピュータープログラムを用いて決定され得る。配列アラインメントにおいて、問い合わせ配列および対象配列は、両方がDNA配列である。RNA配列はUをTに変換することにより比較され得る。この汎用性配列アラインメントの結果は、％同一性である。％同一性を計算するために、DNA配列のFASTDBアラインメントにおいて用いられる好ましいパラメーターは、以下である：Matrix＝Unitary、k-tuple＝4、Mismatch  Penalty＝1、Joining  Penalty＝30、Randomization  Group  Length＝0、Cutoff  Score＝1、Gap  Penalty＝5、Gap  Size  Penalty  0.05、Window  Size＝500または対象ヌクレオチド配列の長さ（いずれか長い方）。
【００４９】
対象配列が、5’または3’の欠失が原因で（内部欠失が原因ではない）問い合わせ配列より短い場合、結果に対して手動による較正が行われなければならない。これは、FASTDBプログラムが、％同一性を計算する際に対象配列の5’短縮および3’短縮を考慮していないからである。問い合わせ配列に対して、5’末端または3’末端で短縮された対象配列については、％同一性は、問い合わせ配列の総塩基の％として、対象配列（適合/整列化しない）の5’側および3’側にある問い合わせ配列の塩基数を計算することにより較正される。ヌクレオチドが適合/整列化するか否かは、FASTDB配列アラインメントの結果により決定される。次いで、このパーセンテージは、％同一性から差し引きされ、特定のパラメーターを用いて上記のFASTDBプログラムにより計算されて、最終的な％同一性スコアに達する。この較正されたスコアは、本発明の目的のために用いられるものである。FASTDBアラインメントにより示される対象配列（問い合わせ配列と適合/整列化しない）の5’塩基および3’塩基の外側にある塩基のみが％同一性スコアを手動で調節する目的で計算される。
【００５０】
例えば、90塩基の対象配列は、100塩基の問い合わせ配列と整列させて、同一性パーセントを決定する。欠失は、対象配列の5’末端で起こり、従って、FASTDB整列化は、5’末端の最初の10塩基との一致/整列化を示さない。10個の不対塩基は、配列の10％（5’末端および3’末端の塩基の数は、問い合わせ配列における塩基の全数と一致しない）を示すので、10％は、FASTDBプログラムによって計算される同一性パーセントスコアから減算される。残存する90塩基が、完全に一致した場合、最終同一性パーセントは、90％である。別の例において、90塩基の対象配列は、100塩基の問い合わせ配列と比較される。この時、欠失は、内部欠失であり、その結果、問い合わせと一致/整列化しない対象配列の5’および3’において塩基が存在しない。この場合、FASTDBによって計算される同一性パーセントは、手動で訂正されない。もう1度、問い合わせ配列と一致/整列化しない対象配列の5’および3’の塩基のみ、手動で訂正される。他の手動の訂正以外に、本発明の目的に合ったものはない。
【００５１】
本発明の問い合わせ配列に少なくとも、例えば、95％「同一な」アミノ酸配列を有するポリペプチドによって、問い合わせ配列に同一であることが意図される。対象ポリペプチドのアミノ酸配列が、対象ポリペプチドが、問い合わせアミノ酸配列の各100アミノ酸あたり5個のアミノ酸改変を含み得ることは除く。言い換えれば、問い合わせアミノ酸配列に少なくとも95％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、対象配列における5％までのアミノ酸残基が、挿入、欠失または別のアミノ酸と置換され得る。参照配列のこれらの改変は、参照アミノ酸配列のアミノ末端の位置またはカルボキシ末端の位置あるいはこれらの末端の位置間のどこか（参照配列における残基間に独立してか、もしくは参照配列内の1つ以上の連続基においてかのいずれかに分散される）において起き得る。
【００５２】
実際問題として、任意の特定のポリペプチドが、例えば、配列番号:2に示されるアミノ酸配列または寄託されたDNAクローンによってコードされるアミノ酸配列に少なくとも90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であるかどうかは、公知のコンピュータープログラムを従来的に使用して決定され得る。問い合わせ配列（本発明の配列）と対象配列との間の最高の全体的な一致を決定するための好ましい方法はまた、全体的な配列整列化として称され、Brutlagら，Comp．App．Biosci．6：237-245（1990）のアルゴリズムに基づくFASTDBコンピュータープログラムを使用して決定され得る。配列整列化において、問い合わせ配列および対象配列は、両ヌクレオチド配列かまたは両アミノ酸配列かのいずれかである。この全体的な配列整列化の結果は、同一性パーセントにおいてである。FASTDBアミノ酸配列化において使用される好ましいパラメーターは、マトリクス＝PAM  0、kタプル＝2、不一致ペナルティー＝1、連結（joining）ペナルティー＝20、無作為化基長（Randomaization  Group  Length）＝0、カットオフスコア＝1、ウィンドウサイズ＝配列長、ギャップペナルティー＝5、ギャップサイズペナルティー＝0.05、ウィンドウサイズ＝500また対象アミノ酸配列の長さ（どちらか短い方）である。
【００５３】
対象配列が、N末端欠失またはC末端欠失のせいで（内部欠失のせいではない）問い合わせ配列より短い場合、手動の訂正は、結果において行なわなければならない。これは、全体的な同一性パーセントを計算する場合、FASTDBプログラムが、対象配列のN末端切断およびC末端切断を考慮しないからである。N末端およびC末端において切断された対象配列に関して、問い合わせ配列に対する、同一性パーセントは、対象配列のN末端およびC末端である問い合わせ配列の残基の数を計算することによって訂正される。この対象配列のN末端およびC末端は、問い合わせ配列の全塩基のパーセントのように、対応する対象残基と一致/整列しない。残基が、一致/整列するか否かは、FASTDB配列整列化の結果によって決定される。次いで、このパーセントは、特定のパラメーターを使用する上記のFASTDBプログラムによって計算される、同一性パーセントから減算されて、最終同一性パーセントスコアに達する。この最終同一性パーセントスコアは、本発明の目的のために使用されるものである。対象配列のN末端およびC末端の残基のみ（問い合わせ配列に一致/整列化しない）が、同一性パーセントスコアを手動で調節する目的のために考えられる。すなわち、問い合わせ残基のみが、対象配列の最遠のN末端残基およびC末端残基の外側に位置する。
【００５４】
例えば、90個のアミノ酸残基対象配列は、100残基の問い合わせ配列と整列させて、同一性パーセントを決定する。欠失は、対象配列のN末端において起こり、従って、FASTDB整列化は、N末端における第1の10個の残基と一致/整列を示さない。10個の不対塩基は、配列の10％（N末端およびC末端の残基の数は、問い合わせ配列における残基の全数と一致しない）を示すので、10％が、FASTDBプログラムによって計算される同一性パーセントスコアから減算される。残りの90塩基が、完全に一致した場合、最終同一性パーセントは、90％である。別の例において、90塩基の対象配列は、100塩基の問い合わせ配列と比較される。この時、欠失は、内部欠失であり、その結果、問い合わせと一致/整列しない対象配列のN末端およびC末端において残基が存在しない。この場合、FASTDBによって計算される同一性パーセントは、手動で訂正されない。もう1度、FASTDB整列において示される場合、対象配列のN末端およびC末端の外側に位置する残基のみが、手動で訂正される問い合わせ配列と一致/整列されない。手動の訂正以外に、本発明の目的に合ったものはない。
【００５５】
C35改変体は、コード領域、非コード領域または両方における改変を含み得る。サイレント置換、付加または欠失を生じるが、コードされるポリペプチドの性質または活性を改変しない改変を含むポリヌクレオチド改変体が、特に好ましい。遺伝的なコードの縮重に起因するサイレント置換によって生成されるヌクレオチド改変体が、好ましい。さらに、5〜10個、1〜5個または1〜2個のアミノ酸が、任意の組み合わせにおいて置換、欠失または付加された改変体はまた、好ましい。C35ポリヌクレオチド改変体は、種々の理由（例えば、特定の宿主に関してコドン発現を最適化するために（細菌の宿主（例えば、大腸菌）によってヒトmRNAにおけるコドンを好ましいコドンに改変する））のために産生され得る。
【００５６】
天然に存在するC35改変体は、「対立遺伝子改変体」と呼ばれ、そして生物体の染色体における所定の座位を占める遺伝子のいくつかの改変形態の1つと称される（Genes  II，Lewin，B．，編，John  Wiley＆Sons，New  York（1985））。また、対立遺伝子改変体は、生物体の染色体における異なる座位において存在する非常に相同的な配列である「タンデム対立遺伝子」として存在する。これらの対立遺伝子改変体は、ポリヌクレオチドレベルおよび/またはポリペプチドレベルのいずれかにおいて改変し得る。あるいは、天然に存在しない改変体は、変異誘発技術によってかまたは直接合成によって産生され得る。
【００５７】
タンパク質操作および組換えDNA技術の公知の方法を使用して、改変体は、C35ポリヌクレオチドの特性を改善または改変するために産生され得る。例えば、1つ以上のアミノ酸は、生物学的な機能の本質的な消失なしに、分泌タンパク質のN末端またはC末端から欠失され得る。Ronら，J．Biol．Chem．268：2984〜2988（1993）の著者らは、3個、8個または27個のアミノ酸末端アミノ酸残基を欠失した後でさえ、ヘパリン結合活性を有する改変体KGFタンパク質を報告した。同様に、インターフェロンγは、このタンパク質のカルボキシ末端から8〜10個のアミノ酸残基を欠失した後、10倍高い活性を示した（Dobeliら，J．Biotechnology  7：199-216（1988））。
【００５８】
さらに、十分な証拠は、改変体が、しばしば、天然に存在するタンパク質の生物学的活性と類似の生物学活性を保持することを実証する。例えば、Gayleおよび共同研究者ら（J．Biol．Chem．268：22105〜22111（1993））は、ヒトサイトカインIL-1aの大規模な変異分析を行なった。かれらは、ランダム突然変異誘発を使用して、3，500を超える個々のIL-1a変異体を産生した。これらの変異体は、分子の全長にわたり、改変体あたり平均2.5個のアミノ酸を改変した。複数の変異が、できる限りのアミノ酸位置において試験された。研究者らは、「分子の［多く］が（［m］ost  of  molecule）、［結合活性または生物学的活性］のいずれかにほとんど影響を与えず改変され得る」ことを見出した。（要約を参照のこと）。事実、試験された3，500個より多いヌクレオチド配列から、23個の固有のアミノ酸配列のみが、野生型とは活性において有意に異なるタンパク質を産生した。
【００５９】
さらに、ポリヌクレオチドのN末端またはC末端から1つ以上のアミノ酸を欠失することが、1つ以上の生物学的機能の改変または消失を生じるとしても、他の生物学的活性は、なお保持され得る。例えば、分泌形態の残基の大多数未満が、N末端またはC末端から除去される場合、分泌形態を認識する抗体を誘導または結合する欠失改変体の能力は、保持されるようである。タンパク質のN末端残基またはC末端残基を欠いた特定のポリペプチドが、このような免疫原性活性を保持するかどうかは、本明細書中に記載される慣用的な方法および当技術分野で公知の他の慣用的な方法によって容易に決定され得る。
【００６０】
従って、本発明は、実質的な生物学的活性を示すC35ポリペプチド改変体をさらに含む。このような改変体は、活性においてわずかな影響を有するように、当技術分野で公知の一般的な法則に従って選択された欠失、挿入、転位、反復および置換を含む。例えば、サイレントなアミノ酸置換を表現型的に作製する方法に関するガイダンスは、Bowie，J．U．ら，Science  247：1306〜1310（1990）に提供され、ここで著者らは、アミノ酸配列の変化に対する寛容を研究するための2つの主要な戦略が存在することを示す。
【００６１】
第1の戦略は、進化の過程の間、天然の選択によるアミノ酸置換の寛容性を開発する。異なる種のアミノ酸配列を比較することによって、保存されたアミノ酸を同定し得る。これらの保存されたアミノ酸は、タンパク質機能に重要であるようである。対照的に、置換が、天然の選択によって寛容化されるアミノ酸位置は、これらの位置が、タンパク質機能に重要でないこと示す。従って、アミノ酸置換に寛容性を示す位置は、改変され得るが、なおタンパク質の生物学的な活性を維持する。
【００６２】
第2の戦略は、遺伝子操作を使用して、クローニングされた遺伝子の特定の位置にアミノ酸変化を導入して、タンパク質機能に重要な領域を同定する。例えば、部位指向性突然変異誘発またはアラニン走査突然変異誘発（分子中の各残基における単一のアラニン変異の誘導）が、使用され得る。（CunnighamおよびWells，Science  244：1081〜1085（1989））。次いで、得られた変異分子は、生物的活性に対して試験され得る。
【００６３】
著者らが、言うことには、これらの2つの戦略は、驚いたことに、タンパク質が、アミノ酸置換に寛容性があることを明かにした。著者らは、さらに、アミノ酸変化が、タンパク質において特定のアミノ酸位置において許容的であるようであることを示す。例えば、多くの埋没した（タンパク質の三次構造内に）アミノ酸残基は、非極性側鎖を必要とするが、表面側鎖のわずかな特徴は、一般に保存されている。さらに、寛容性の保存的アミノ酸置換としては、脂肪族または疎水性のアミノ酸  Ala、Val、LeuおよびIleの置換；ヒドロキル残基  SerおよびThrの置換；酸性残基  AspおよびGluの置換；アミド残基  AsnおよびGlnの置換；塩基性残基  Lys、ArgおよびHisの置換；芳香族残基  Phe  TyrおよびTrpの置換ならびに小サイズアミノ酸  Ala、Ser、Thr、MetおよびGlyの置換が挙げられる。
【００６４】
保存的アミノ酸置換に加えて、C35の改変体は、以下を含む：（i）1つ以上の非保存的アミノ酸との置換、ここで、この置換されたアミノ酸残基は、遺伝的コードによってコードされる1つであってもよいし、なくてもよい、あるいは（ii）置換基を有する1つ以上のアミノ酸残基との置換、あるいは（iii）別の化合物（例えば、ポリペプチド（例えば、ポリエチレングリコール）の安定性および/または可溶性を増大した化合物）と成熟タンパク質との融合、あるいは（iv）さらなるアミノ酸（例えば、IgG  Fc融合領域ペプチドまたはリーダー配列もしくは分泌配列または精製を促進する配列）とこのポリペプチドとの融合。このような改変体ポリペプチドは、本明細書中での教示から当技術分野の範囲であると考えられる。
【００６５】
例えば、荷電したアミノ酸が、他の荷電したアミノ酸または天然のアミノ酸とアミノ酸置換されたC35ポリペプチド改変体は、改善された特性を有するタンパク質（例えば、低い凝集性）を産生し得る。薬学的処方物の凝集は、凝集体の免疫原活性に起因する、活性の減少およびクリアランスを増大の両方を起こす。（Pinckardら，Clin．Exp．Immunol．2：331〜340（1967）；Robbinsら，Diabetes  36：838〜845（1987）；Clelandら，Crit．Rev．Therapeutic  Drug  Carrier  Systems  10：307〜377（1993））。
【００６６】
ポリヌクレオチド断片およびポリペプチド断片
本発明において、「ポリヌクレオチド断片」は、寄託クローンに含まれる核酸配列また配列番号:1に示される核酸配列を有する短いポリヌクレオチドをいう。短いヌクレオチド断片は、好ましくは、少なくとも約15ヌクレオチド長およびさらに好ましくは少なくとも約20ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約30ヌクレオチド長、およびなお好ましくは少なくとも約40ヌクレオチド長である。例えば、断片「少なくとも20ヌクレオチド長」は、寄託クローンに含まれるcDNA配列または配列番号:1に示されるヌクレオチド配列由来の20個以上の連続塩基を含むことを意図する。これらのヌクレオチド断片は、本明細書中で議論される診断プローブおよびプライマーとして有用である。もちろん、より大きなポリヌクレオチド（例えば、少なくとも50、100、150、200、250、300ヌクレオチド）が、好ましい。
【００６７】
さらに、C35ポリヌクレオチド断片の代表的な例としては、例えば、約1〜50、51〜100、101〜150、151〜200、201〜250、251〜300もしくは301のヌクレオチド番号から配列番号:1の末端までの配列または寄託クローンに含まれるcDNAを含む断片を含む。文脈において「約」は、末端かまたは両末端のいずれかにおける特定の列挙される範囲（いくつかの（5、4、3、2または1）ヌクレオチドより多きいかまたは小さい）を含む。好ましくは、これらの断片は、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする。さらに好ましくは、これらのポリヌクレオチドは、本明細書中で議論されるようにプローブまたはプライマーとして使用され得る。
【００６８】
本発明において、「ポリペプチド断片」は、配列番号:2に含まれる短いアミノ酸配列または寄託クローンに含まれるcDNAによってコードされる短いアミノ酸配列を言う。タンパク質断片は、「自由本位（free  standing）」であり得、またはより大きなポリペプチドの一部または領域（最も好ましくは単一の連続領域として）を形成する断片内に含まれ得る。本発明のポリペプチド断片の代表的な例は、例えば、約1〜20、21〜40、41〜60、61〜80、81〜100または101のアミノ酸番号からコード領域の末端までの断片を含む。さらに、ポリペプチド断片は、9、15、20、30、40、50、60、70、80、90または100アミノ酸長を含み得る。文脈において、「約」は、極端かまたは両極端かのいずれかにおいて特に列挙される範囲（幾つかの（5、4、3、2または1）アミノ酸より大きいまたは小さい）を含む。
【００６９】
好ましいポリペプチド断片は、分泌C35タンパク質および成熟形態を含む。さらに好ましいポリペプチド断片は、アミノ末端もしくはカルボキシ末端または両末端からの連続した一連の欠失残基を有する分泌C35タンパク質または成熟形態を含む。さらに好ましいポリペプチド断片は、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含むC35ポリペプチドの断片を含む
【００７０】
上記されるように、タンパク質のN末端からの1つ以上のアミノ酸の欠失が、タンパク質の1つ以上の生物学的な機能の改変または消失を生じるとしても、他の生物学的活性は、なお保持され得る。従って、完全ポリペプチドまたは成熟ポリペプチドの大部分の残基未満はN末端から除去される場合、ポリペプチドの完全形態または成熟形態を認識する抗体を誘導および/または結合する短縮化C35ムテインの能力は、保持される。完全ポリペプチドのN末端残基を欠く特定のポリペプチドが、このような生物学的活性を保持するかどうかは、本明細書中に記載される慣用的な方法および当技術分野の他の慣用的な方法によって容易に決定され得る。多数の欠失したN末端アミノ酸残基を有するC35ムテインは、幾らかの生物学的活性または免疫原活性を保持し得ないようである。事実、9個程にわずかなC35アミノ酸残基を含むペプチドは、しばしば、免疫応答を惹起し得る。
【００７１】
従って、本発明は、さらに、配列番号:2に示されるC35アミノ酸配列のアミノ末端から105番位のスレオニン残基までを欠いた1つ以上の残基を有するポリペプチドおよびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００７２】
また、上記されるように、タンパク質のC末端から1つ以上のアミノ酸の欠失が、タンパク質の1つ以上の生物学的機能の改変または消失を生じるとしても、他の生物学的活性は、なお保持され得る。従って、完全ポリペプチドまたは成熟ポリペプチドの大部分の残基未満がC末端から除去される場合、ポリペプチドの完全形態または成熟形態を認識する抗体を誘導および/または結合する短縮化C35ムテインの能力は、一般的に保持される。完全ポリペプチドのC末端残基を欠く特定のポリペプチドが、このような生物学的活性を保持するかどうかは、本明細書中に記載される慣用的な方法および当技術分野で公知の他の慣用的な方法によって容易に決定され得る。多数の欠失C末端アミノ酸残基を有するC35ムテインは、幾らかの生物学的活性または免疫原活性を保持し得ないようである。
【００７３】
従って、本発明は、さらに、配列番号:2に示されるC35アミノ酸配列のカルボキシ末端から10番位のバリン残基までを欠いた1つ以上の残基を有するポリペプチドおよびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００７４】
さらに、本発明はまた、アミノ末端とカルボキシ末端の両方を欠失した1つ以上のアミノ酸を有するポリペプチドを提供する。好ましい態様において、本発明は、以下の残基を有するポリペプチドおよびこのようなポリペプチドにコードされるポリヌクレオチドに関する：配列番号:2のE4〜P12；S9〜V17；V10〜V17；E16〜V23；E16〜R24；E16〜I25；S21〜Y29；S21〜F35；G22〜C30；I25〜C33；C30〜T38；E31〜Y39；E36〜A43；A37〜A45；A37〜V46；T38〜V46；Y39〜V46；S44〜I53；A45〜I53；G52〜L59；E54〜T62；S57〜F75；R58〜I67；L59〜V113；G61〜I69；T62〜N70；G63〜G71；G63〜F83；F65〜L73；F65〜V113；E66〜L73；E66〜V74；I67〜F75；K77〜Y85；K77〜V113；Q72〜E86；Q72〜V113；G81〜L89；F83〜E103；P84〜V113；D88〜A96；D88〜V113；L89〜A96；A92〜T101；I93〜V113；R95〜L102；A96〜K104；G99〜V113；E100〜V113；T101〜V113；K104〜C112；K104〜V113；I105〜V113；I105〜I114；またはN107〜L115。
【００７５】
多くのポリヌクレオチド配列（例えば、EST配列）は、配列データベースを介して公的に利用可能かつアクセス可能である。
【００７６】
以下に言及されるヒトEST配列は、ESTデータベースのBLAST検索において同定された。これらの配列は、列挙されるGenBank受付番号において同定されるcDNAインサートの部分的配列であると考えられる。相同的配列は、注釈されるGenBankデータベースの検索において同定されなかった。この期待値（E）は、特定のサイズのデータベースを検索する場合、偶然によってすぐ見られることが「期待」し得るヒットの数を記載するパラメーターである。2つの配列間での一致を割り当てられるスコア（S）と共に指数関数的に減少する。基本的に、E値は、配列間の一致に存在する無作為なバックグランドノイズを示す。BLAST2.0において、期待値はまた、一致の有意さを示すP値（確立）の代わりに使用される。例えば、ヒットに割り当てられる1のE値は、現在のサイズのデータベースにおいて、単に偶然による類似のスコアとの1つの一致をみることを期待し得る意味として解釈され得る。
【００７７】
例えば、以下の配列は配列番号:1に関する：
2005528914.tif 000002
【００７８】
従って、1つの態様において、本発明は、1つ以上の上に列挙されるESTを除いて、本明細書中に記載されるポリヌクレオチド断片および全長ポリヌクレオチド（例えば、コード領域）を含むポリヌクレオチドに関する。また、配列番号:152、配列番号:154、および配列番号:156中のヌクレオチド配列は本発明から除外される。
【００７９】
構造的ドメインまたは機能的ドメインによって特徴付けられるC35ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド断片もまた好ましい。本発明の好ましい態様は、MHC結合エピトープおよびプレニル化部位を含む断片を含む。
【００８０】
他の好ましい断片は、生物学的活性C35断片である。生物学的活性断片は、同様の活性を示す生物学的活性断片であるが、C35ポリペプチドの活性と同一である必要はない。断片の生物学的活性は、改善された所望の活性または減少した所望しない活性を含み得る。
【００８１】
エピトープおよび抗体
内因的に合成されたタンパク質の分解によって誘導される細胞性ペプチドは、プレゴルジ画分に転座され、ここで、細胞性ペプチドは、細胞表面への移動のためにクラスI  MHC分子に結合する。これらのクラスI  MHC：ペプチド複合体は、特異的なCD8＋細胞傷害性T細胞に対する標的抗原である。全ての内因性タンパク質は、「回転する」ので、任意の細胞質タンパク質または核タンパク質に由来するペプチドは、MHC分子に結合し得、そして細胞表面における提示のために移動され得る。これは、T細胞が、抗体よりも細胞のタンパク質の大きな提示を調査することを可能にする。この抗体は、細胞膜で分泌されるかまたは組み込まれるかのいずれかでこれらのタンパク質のみの立体配座的な決定因子を認識することを制限される。T細胞レセプター抗原結合部位は、ペプチドとMHCの周りの両方の決定因子に相互作用する。従って、T細胞の特異性は、MHC：ペプチド複合体によって規定される。MHC分子に結合するペプチドの特異性は、非常に広く、そして特異的な抗体の抗原結合部位と比較して相対的に低親和性である。クラスI結合ペプチドは、一般に、8〜10残基長である。これは、MHCペプチド結合部位におけるポケットに一致する特定のキー位置における制限された多様性のアミノ酸側鎖に適応する。特定のMHC分子に結合するペプチドのこれらの重要な特徴は、ペプチド結合モチーフを構成する。
【００８２】
ペプチドエピトープを議論するのに用いる場合、用語「誘導される」は、「調製される」と同義である。誘導されたエピトープは天然源から単離することができるか、あるいは当技術分野において標準的なプロトコルに従って合成することができる。合成エピトープは天然に生じるLアミノ酸のD異性体のような人工アミノ酸「アミノ酸ミメティック」、またはシクロヘキシルアラニンのような非天然アミノ酸を含むことができる。誘導された/調製されたエピトープは天然エピトープのアナログであり得る。
【００８３】
「エピトープ」は、一緒になって免疫グロブリン、T細胞受容体またはHLA分子によって認識される部位を形成する、一次、二次、および三次ペプチド構造、ならびに電荷のような分子の集合的特徴である。または、エピトープは、特定の免疫グロブリンによる認識に関与する、またはT細胞との関係におけるアミノ酸残基T細胞受容体タンパク質および/もしくは主要組織適合性複合体（MHC）受容体による認識に必要な残基の組と定義することができる。エピトープは天然に存在し、ヒトによって単離され、精製され、またはそうでなければ調製/誘導され得る。例えば、エピトープは天然源からの単離によって調製することができるか、あるいは当技術分野において標準的なプロトコルに従って合成することができる。合成エピトープは天然に生じるLアミノ酸のD異生体のような人工アミノ酸「アミノ酸ミメティック」、またはシクロヘキシルアラニンのような非天然アミノ酸を含むことができる。本開示を通じて、用語エピトープおよびペプチドはしばしば相互交換的に用いる。また、本明細書中で用いられる用語エピトープは、一般に、前記エピトープのアナログを含むと理解される。
【００８４】
本発明の一つまたは複数のC35ペプチドエピトープならびにさらなるアミノ酸を含むタンパク質またはポリペプチド分子は依然として本発明の境界内にあることが理解されるべきである。ある態様において、例えば、114以下のアミノ酸、110以下のアミノ酸、100以下のアミノ酸、95以下のアミノ酸、90以下のアミノ酸、85以下のアミノ酸、80以下のアミノ酸、75以下のアミノ酸、70以下のアミノ酸、65以下のアミノ酸、60以下のアミノ酸、55以下のアミノ酸、50以下のアミノ酸、45以下のアミノ酸、40以下のアミノ酸、35以下のアミノ酸、30以下のアミノ酸、25以下のアミノ酸、20のアミノ酸、15のアミノ酸、または14、13、12、11、10、9、もしくは8のアミノ酸の本発明のポリペプチドの長さに対する制限がある。いくつかの場合、本発明のエピトープを含むタンパク質/ポリペプチドが天然配列に対して100％同一性を有する領域（すなわち、アミノ酸の連続シリーズ）を含む場合に長さが制限される態様が生じる。例えば、全天然分子から読めるエピトープの定義を回避するために、天然ポリペプチド配列に対して100％同一性を有するいずれの領域の長さに対しても制限がある。従って、本発明のエピトープおよび天然C35ポリペプチド配列に対して100％同一性を有する領域を含むポリペプチドについては、天然配列に対して100％同一性を有する領域は、一般に、114アミノ酸以下で、よりしばしばは、100アミノ酸以下で、しばしばは85アミノ酸以下で、しばしばは、75アミノ酸以下で、しばしばは、65アミノ酸以下で、しばしばは、50アミノ酸以下の長さを有する。ある態様においては、本発明のC35ポリペプチドは、5アミノ酸まで減らすアミノ酸（すなわち、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5）のいずれの増分においても、天然ペプチド配列に対して100％同一性を有する50未満のアミノ酸を有する領域を有するペプチドを含む。好ましくは、そのようなC35ポリペプチドは一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む。
【００８５】
従って、100アミノ酸よりも長いポリペプチドまたはタンパク質の配列は、それが、天然ポリペプチド配列に対して100％同一性を有する114より多くのアミノ酸のいずれの連続配列も含まない限り本発明の範囲内にある。天然配列に対応する5連続残基以下を有するいずれのポリペプチドについても、本発明の範囲内になるためには、そのポリペプチドの最大長さについて制限はない。1つの態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む本発明のポリペプチドは8アミノ酸残基まで減らすいずれの増分においても、60残基未満の長さである。
【００８６】
「免疫原性ペプチド」または「ペプチドエピトープ」は、HLA分子に結合し、細胞傷害性Tリンパ球（CTL）応答および/またはヘルパーTリンパ球（HTL）応答を誘導するペプチドである。従って、本発明の免疫原性ペプチドは、適当なHLA分子に結合し、その後、前記ペプチドに対して、細胞傷害性Tリンパ球（CTL）応答、またはヘルパーTリンパ球（HTL）応答を誘導することができる。
【００８７】
用語「モチーフ」とは、規定された長さのアミノ酸配列における残基のパターン、通常、クラスIのHLAモチーフについては約8〜約13アミノ酸、およびクラスIIのHLAモチーフについては約16〜約25アミノ酸のペプチドをいい、これは特定のHLA分子によって認識される。モチーフは、典型的には、所与のヒトHLA対立遺伝子によってコードされる各HLAタンパク質について異なる。これらのモチーフは、しばしば、一次および二次アンカー残基のそのパターンが異なる。
【００８８】
「保護免疫応答」または「治療免疫応答」とは、病原性抗原（例えば、感染因子からの抗原または腫瘍抗原）から誘導される抗原に対する細胞傷害性Tリンパ球（CTL）および/またはヘルパーTリンパ球（HTL）応答をいい、これは、何らかの方法で病気兆候、副作用または進行を妨げるが、あるいは少なくとも部分的には阻止する。前記免疫応答は、ヘルパT細胞の刺激によって促進された抗体応答も含むことができる。
【００８９】
用語「残基」とは、アミド結合またはアミド結合ミメティックによってペプチドまたはタンパク質に取り込まれたアミノ酸またはアミノ酸ミメティックをいう。
【００９０】
「合成ペプチド」とは、天然には生じないが、化学合成または組換えDNA技術のような方法を用いてヒトが作成するペプチドをいう。
【００９１】
本明細書で用いるように、「ワクチン」は、ペプチドE-100〜R-109を除いた、本発明の一つまたは複数のペプチドエピトープ（例えば、表1〜3および5〜6参照）、および薬学的に許容される担体を含有する組成物である。一つまたは複数のペプチドのカクテル；本発明の一つまたは複数のペプチドを含むポリエピトープ性ペプチド；またはそのようなペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸、例えば、ポリエピトープ性ペプチドをコードするミニ遺伝子のような、本発明によるワクチンの多数の態様がある。前記「一つまたは複数のペプチド」または「一つまたは複数のエピトープ」は例えば、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または100以上の本発明のペプチドまたはエピトープを含むことができる。前記ペプチドまたはポリペプチドは、任意で、脂質化、標的または他の配列の付加によるなどして修飾することができる。本発明のHLAクラスI-結合性ペプチドをHLAクラスII-結合性ペプチドに連結させて、細胞傷害性Tリンパ球およびヘルパーTリンパ球双方の活性化を促進することができる。ワクチンはペプチドパルス抗原提示細胞、例えば、樹状細胞を含むことができる。
【００９２】
好ましい態様において、本発明の単離されたポリペプチドは以下のC35ペプチドエピトープ:配列番号:2のアミノ酸E4〜P12、配列番号:2のアミノ酸S9〜V17、配列番号:2のアミノ酸S21〜Y29、配列番号:2のアミノ酸G22〜C30、配列番号:2のアミノ酸I25〜C33、配列番号:2のアミノ酸T38〜V46、配列番号:2のアミノ酸G61〜I69、配列番号:2のアミノ酸T62〜N70、配列番号:2のアミノ酸G63〜G71、配列番号:2のアミノ酸F65〜L73、配列番号:2のアミノ酸I67〜F75、配列番号:2のアミノ酸K77〜Y85、配列番号:2のアミノ酸Q72〜E86、配列番号:2のアミノ酸G81〜L89、配列番号:2のアミノ酸K104〜C112、配列番号:2のアミノ酸のK104〜V113、配列番号:2のアミノ酸I105〜V113、または配列番号:2のアミノ酸N107〜L115の一または複数を含むか、あるいはそれからなる。もう1つの態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含むか、あるいはそれからなる前記ポリペプチドは、配列番号:2のT101〜V113、配列番号:2のG99〜V113、配列番号:2のE100〜V113、配列番号:2のI93〜V113、配列番号:2のD88〜V113、配列番号:2のP84〜V113、配列番号:2のK77〜V113、配列番号:2のQ72〜V113、配列番号:2のF65〜V113、および配列番号:2のL59〜V113からなる群より選択される。C35ペプチドエピトープの断片、および本発明のC35ペプチドエピトープの断片を含むポリペプチドも、ある場合には、傷害性Tリンパ球応答を刺激するのに有用であると考えられる。従って、本発明は、提供されたペプチド配列の1、2、3、4、5、またはそれ以上のアミノ酸がペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかから欠失されているC35ペプチドエピトープの断片を含む。加えて、本発明のペプチドエピトープの一つまたは複数を含むC35ポリペプチドのより長い断片を用いて、患者においてCTL応答を刺激することもできると考えられる。さらに、異種、すなわち非C35フランキング配列に加えて本発明の一つまたは複数のペプチドエピトープを含むポリペプチドを用いて、CTL応答を刺激することもできると考えられる。
【００９３】
具体的に前記で列挙した特異的C35ペプチドエピトープに加えて、多くの他のペプチドエピトープが本発明で考えられる。従って、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の8量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000003
【００９４】
さらなる態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の9量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000004
【００９５】
さらなる態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の10量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000005
【００９６】
さらなる態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の11量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000006
【００９７】
もう1つの好ましい態様において、C35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の12量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000007
【００９８】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の13量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000008
【００９９】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の14量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000009
【０１００】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の15量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000010
【０１０１】
さらなる好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の16量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000011
【０１０２】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の17量体を含む:
2005528914.tif 000012
【０１０３】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の18量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000013
【０１０４】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の19量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000014
【０１０５】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の20量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000015
【０１０６】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の21量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000016
【０１０７】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の22量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000017
【０１０８】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の23量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000018
【０１０９】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の24量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000019
【０１１０】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の25量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000020
【０１１１】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の26量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000021
【０１１２】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の27量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000022
【０１１３】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の28量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000023
【０１１４】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の29量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000024
【０１１５】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の30量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000025
【０１１６】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の31量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000026
【０１１７】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の32量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000027
【０１１８】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の33量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000028
【０１１９】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の34量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000029
【０１２０】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の35量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000030
【０１２１】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の36量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000031
【０１２２】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の37量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000032
【０１２３】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の38量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000033
【０１２４】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の39量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000034
【０１２５】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の40量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000035
【０１２６】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の41量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000036
【０１２７】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の42量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000037
【０１２８】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の43量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000038
【０１２９】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の44量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000039
【０１３０】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の45量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000040
【０１３１】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の46量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000041
【０１３２】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の47量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000042
【０１３３】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の48量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000043
【０１３４】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の49量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000044
【０１３５】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の50量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000045
【０１３６】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の51量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000046
【０１３７】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の52量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000047
【０１３８】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の53量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000048
【０１３９】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の54量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000049
【０１４０】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の55量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000050
【０１４１】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の56量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000051
【０１４２】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の57量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000052
【０１４３】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の58量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000053
【０１４４】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の59量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000054
【０１４５】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の60量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000055
【０１４６】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の61量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000056
【０１４７】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の62量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000057
【０１４８】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の63量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000058
【０１４９】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の64量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000059
【０１５０】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の65量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000060
【０１５１】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の66量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000061
【０１５２】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の67量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000062
【０１５３】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の68量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000063
【０１５４】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の69量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000064
【０１５５】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の70量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000065
【０１５６】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の71量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000066
【０１５７】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の72量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000067
【０１５８】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の73量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000068
【０１５９】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の74量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000069
【０１６０】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の75量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000070
【０１６１】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の76量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000071
【０１６２】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の77量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000072
【０１６３】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の78量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000073
【０１６４】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の79量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000074
【０１６５】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の80量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000075
【０１６６】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の81量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000076
【０１６７】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の82量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000077
【０１６８】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の83量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000078
【０１６９】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の84量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000079
【０１７０】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の85量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000080
【０１７１】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の86量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000081
【０１７２】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の87量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000082
【０１７３】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の88量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000083
【０１７４】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の89量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000084
【０１７５】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の90量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000085
【０１７６】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の91量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000086
【０１７７】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の92量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000087
【０１７８】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の93量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000088
【０１７９】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の94量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000089
【０１８０】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の95量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000090
【０１８１】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の96量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000091
【０１８２】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の97量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000092
【０１８３】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の98量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000093
【０１８４】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の99量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000094
【０１８５】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の100量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000095
【０１８６】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の101量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000096
【０１８７】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の102量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000097
【０１８８】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の103量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000098
【０１８９】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の104量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000099
【０１９０】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の105量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000100
【０１９１】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の106量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000101
【０１９２】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の107量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000102
【０１９３】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の108量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
2005528914.tif 000103
【０１９４】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の109量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
M1〜R109；S2〜P110；G3〜P111；E4〜C112；P5〜V113；G6〜I114；Q7〜L115。
【０１９５】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の110量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
M1〜P110；S2〜P111；G3〜C112；E4〜V113；P5〜I114；G6〜L115。
【０１９６】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の111量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
M1〜P111；S2〜C112；G3〜V113；E4〜I114；P5〜L115。
【０１９７】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の112量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
M1〜C112；S2〜V113；G3〜I114；E4〜L115。
【０１９８】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の113量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
M1〜V113；S2〜I114；G3〜L115。
【０１９９】
もう1つの好ましい態様において、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含む、あるいはそれからなる本発明の単離されたポリペプチドは以下の114量体（残基は配列番号:2および図1Bに対応する）を含む:
M1〜I114；S2〜L115。
【０２００】
CTLおよびHTL応答の刺激
過去10年の間にT細胞が抗原を認識するメカニズムについてかなり解明された。免疫系のこの理解に従い、本発明者らは、種々の当技術分野において認められた様式を介して投与した場合に、ある腫瘍関連抗原に対する治療的または予防的免疫応答を誘導する効果的なペプチドエピトープ組成物を開発した。さらに、本発明のペプチドエピトープを用いることによって、または本明細書中に開示した原理に従ってペプチドエピトープの組合せを用いることによって、非遺伝的に偏った世界的集団のかなりの割合において応答を達成することができる。特許請求する組成物の価値および効率の理解のために、免疫学関連技術の簡単なレビューを掲げる。
【０２０１】
HLA分子およびペプチド性抗原の複合体はHLA-制限T細胞によって認識されるリガンドとして作用する（Buus,S.ら、Cell 47:1071、1986；Babbitt、B.P.ら、Nature 317:359、1985；Townsend、A.およびBodmer,H.,Annu.Rev.Immunol.7:601、1989；Germain,R.N.,Annu.Rev.Immunol.11:403、1993）。単一アミノ酸置換抗原アナログの研究および内因的に結合した天然でプロセッシングされたペプチドの配列決定を介して、HLA抗原分子に対する特異的な結合に必要なモチーフに対応する臨界的な残基が同定された。
【０２０２】
さらに、HLA-ペプチド複合体のX線結晶学的分析により、しばしば、対立遺伝子-特異的ベースに基づき、ペプチドリガンドが有する残基を収容するHLA分子のペプチド結合溝内のポケットが明らかとされた；これらの残基は、今度は、それらが存在するペプチドのHLA結合能力を決定する。
2005528914.tif 000104
従って、クラスIおよびクラスIIの対立遺伝子-特異的HLA結合モチーフ、またはクラスIまたはクラスIIスーパーモチーフの規定は、特定のHLA抗原に結合する予測された能力を有するタンパク質内の領域の同定を可能とする。
【０２０３】
さらに、本明細書中で開示される結合親和性と免疫原性との相関は、候補ペプチドを評価する場合に考慮すべき重要な因子である。従って、抗原配列のモチーフのサーチの組合わせによって、およびHLA-ペプチド結合アッセイによって、エピトープ-ベースのワクチンが同定された。当業者によって理解されるように、その結合親和性を決定した後に、さらなる仕事を行って、これらのワクチンペプチドの中から選択することができ、例えば、集団の網羅、抗原性、および免疫原性等の点で任意の特徴を有するエピトープを選択することができる。
【０２０４】
以下のものを含めた種々の戦略を利用して免疫原性を評価することができる:
1）正常な個体からの一次T細胞培養の評価
2005528914.tif 000105
この手法は、インビトロにて抗原提示細胞の存在下で、数週間にわたって、正常な対象からの末梢血液リンパ球（PBL）を試験ペプチドで刺激することを含む。前記ペプチドに特異的なT細胞はこの間に活性化されるようになり、例えば、ペプチド感作標的細胞、および/または内因的に抗原を生じさせる標的細胞が関連する51Cr-放出アッセイを用いて検出される。
2）HLAトランスジェニックマウスの免疫化（例えば、Wentworth,P.A.ら、J.Immunol.26:97、1996；Wentworth,P.A.ら、Int.Immunol.8:651、1996；Alexander,J.ら、J.Immunol.159:4753、1997参照）；この方法においては、不完全フロイントアジュバント中のペプチドをHLAトランスジェニックマウスに皮下投与する。免疫化から数週間後、脾臓細胞を摘出し、試験ペプチドの存在下でインビトロにてほぼ1週間培養する。例えば、ペプチド感作標的細胞および生成した抗原を内因的に発現する標的細胞が関連する51Cr-放出アッセイを用いてペプチド-特異的T細胞を検出する。
3）効果的に治療され、病気から回復した免疫個体のような病気に暴露された個体、および/または能動的に病気の患者からの想起T細胞応答の証明
2005528914.tif 000106
この戦略を適用する際には、想起応答は、試験ペプチド＋抗原提示細胞（APC）の存在下でインビトロにて1〜2週間対象からのPBLを培養して、「ナイーブ」T細胞と比較して、「記憶」T細胞の活性化を可能とすることによって検出される。培養期間の最後において、ペプチド-感作標的、T細胞増殖、またはリンホカイン放出が関連する51Cr放出を含めたT細胞活性についてのアッセイを用いてT細胞活性を検出する。
【０２０５】
以下に、本発明のペプチドエピトープおよび対応する核酸をより詳細に記載する。
【０２０６】
HLA分子についてのペプチドエピトープの結合親和性
本明細書中に示すように、かなりの程度のHLA多形は、ワクチン開発に対するエピトープ-ベースのアプローチで考慮すべき重量な因子である。この因子に取り組むためには、複数のHLA分子に高いまたは中程度の親和性で結合できるペプチドの同定を含めたエピトープ選択が好ましく利用され、最も好ましくは、これらのエピトープは複数の対立遺伝子-特異的HLA分子に高いまたは中程度の親和性で結合する。
【０２０７】
ワクチン組成物についての対象となるCTL-誘導ペプチドエピトープは、好ましくは、500nMまたはそれよりも良好なクラスIのHLA分子に対するIC50または結合親和性値（すなわち、前記値は≦500nMである）を有するものを含む。HTL-誘導ペプチドエピトープは、好ましくは、1000nMまたはそれよりも良好なクラスIIのHLA分子に対するIC50または結合親和性値（すなわち、前記値は≦1,000nMである）を有するものを含む。例えば、ペプチド結合は、インビトロで精製されたHLA分子に結合する候補ペプチドの能力を試験することによって評価される。次いで、高いまたは中程度の親和性を呈するペプチドをさらなる分析で考慮する。選択されたペプチドは、一般に、スーパータイプのファミリーの他のメンバーについて試験される。好ましい態様において、次いで、交差-反応性結合を呈するペプチドを、細胞スクリーニング分析またはワクチンで用いる。
【０２０８】
HLAクラスI分子に対する結合親和性および結合した抗原上の区別されるペプチドエピトープの免疫原性の間の関係は決定されている。本明細書中にてかなり詳細に開示するように、より高いHLA結合親和性はより大きな免疫原性に相関する。
【０２０９】
より大きな免疫原性はいくつかの異なる方法で発現させることができる。免疫原性は、免疫応答が全く誘導されるか否か、およびいずれかの特定の応答の激しさ、ならびに応答が誘導される集団の程度に対応する。例えば、ペプチドエピトープは集団の多様なアレイ免疫応答を誘導するであろうが、激しい応答を生じる場合はない。これらの原理に従い、90％近い高い結合ペプチドが、中程度の親和性でもって結合するペプチドの約50％とは対照的に、応答を誘導し、従って、「免疫原性」であることが判明している。（例えば、Schaefferら、PNAS 1988参照）。さらに、より高い結合親和性を有するペプチドは免疫応答を生じさせる増大した確率を有するのみならず、生じた応答は、より弱い結合ペプチドで観察された応答よりもかなり激しい傾向がある。その結果、もしより低い親和性のものよりはむしろ高い親和性の結合ペプチドを用いれば、同様な生物学的効果を誘導するのに必要なペプチドは少なくて済む。従って、本発明の好ましい態様においては、高い親和性の結合エピトープを用いる。
【０２１０】
結合親和性および免疫原性の間の相関を2つの異なる実験アプローチによって分析した（例えば、Setteら、J.Immunol.153:5586-5592、1994参照）。第一のアプローチにおいて、10,000倍の範囲にわたるHLA結合親和性の範囲の潜在的エピトープの免疫原性をHLA-A＊0201トランスジェニックマウスで分析した。第二のアプローチにおいては、全てがA＊0201結合モチーフを運ぶ、ほぼ100の異なるB型肝炎ウィルス（HBV）由来の潜在的エピトープの抗原性を、急性肝炎患者からのPBLを用いることによって評価した。これらのアプローチによると、ほぼ500nM（好ましくは、50nM以下）の親和性閾値が、CTL応答を誘導するペプチドエピトープの能力を決定すると判断された。これらのデータは、天然でプロセッシングされたペプチドエピトープ、および合成されたT細胞エピトープについてのクラスI結合親和性測定についても当てはまる。また、これらのデータもやはりT細胞応答の具体化において決定基選択の重要な役割を示す（例えば、Schaefferら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:4649-4653、1989参照）。
【０２１１】
HLAクラスII（すなわち、HLA DR）分子との関係で免疫原性に関連する親和性閾値も記載されている（例えば、Southwoodら、J.Immunology 160:3363-3373、1998参照）。HLAクラスII結合親和性の生物学的に有意な閾値を規定するために、それらの制限要素（すなわち、エピトープを結合するHLA分子）に対する32DR-制限エピトープに結合親和性のデータベースが編集された。前記ケースのほぼ半分（32エピトープのうちの15）において、DR制限が高い結合親和性、すなわち、100nM以下の結合親和性値に関連した。前記ケースの他の半分（32のうち16）において、DR制限は中程度の親和性（100〜1000nM範囲の結合親和性値）に関連した。32ケースのうちの唯1つにおいて、1000nM以上のIC50に関連したDR制限があった。従って、1000nMは、DR分子との関係で免疫原性に関連する親和性閾値と定義される。
【０２１２】
また、本発明のワクチンは、MHCクラスIIのDR分子に結合するエピトープを含むこともできる。ペプチドのNおよびC末端に対するモチーフのサイズおよび結合フレーム位置双方におけるより大きな程度の不均一性が、クラスIIペプチドリガンドで存在する。HLAクラスIIペプチドリガンドのこの増大した不均一性は、そのクラスIカウンターパートとは異なり、両端において物理的により制限されてはいないHLAクラスII分子の結合溝の構造によるものである。
【０２１３】
A2スーパーモチーフおよびA2.1-対立遺伝子特異的モチーフに加えて、多数のさらなるスーパーモチーフおよびモチーフがある。他のモチーフまたはスーパーモチーフからの一つまたは複数のエピトープを含めることによって、主要な世界的民族性についての増大した集団網羅を得ることができる。
【０２１４】
ペプチドアナログ
一般に、CTLおよびHTL応答は全ての可能なエピトープに対して向けられない。むしろ、それらは少数の「免疫優性」決定基に制限される（Zinkernagelら、Adv.Immunol.27:5159、1979；Benninkら、J.Exp.Med.168:19351939、1988；Rawleら、J.Immunol.146:3977-3984、1991）。免疫優性（Benacerrafら、Science 175:273-279、1972）は、特定のHLAタンパク質に選択的に結合する（決定基選択説）（Vitielloら、J.Immunol.131:1635、1983）；Rosenthalら、Nature 267:156-158、1977）、または存在するTCR（T細胞受容体）特異性によって選択的に認識される（レパートリー説）（Klein、J.,IMMUNOLOGY、THE SCIENCE OF SELFNONSELF DISCRIMINATION、John Wiley ＆ Sons、New York、pp.270-310、1982）所与のエピトープのいずれかの能力によって説明することができるのが認識されている。ほとんどがプロセッシング事象に連結したさらなる因子もまた、厳格な免疫原性を超えて、多くの潜在的決定基のいずれが免疫優性として提示されるかを指令する際に鍵となる役割を演じることができることが証明されている（Sercarzら、Annu.Rev.Immunol.11:729-766、1993）。
【０２１５】
優性および亜優性の概念は、感染病および悪性疾患双方の免疫療法に関連する。例えば、慢性ウィルス病の進行において、亜優性エピトープの動員は、特に、もし優性CTLまたはHTL特異性が機能的トレランス、抑制、ウィルスの成熟および他のメカニズムによって不活化されているならば、感染の成功したクリアランスで重要であり得る（Francoら、Curr.Opin.Immunol.7:524-531、1995）。癌および腫瘍抗原の場合には、最高の結合親和性ペプチドの少なくとも幾らかを認識するCTLは機能的に不活化されるであろう。より低い結合親和性のペプチドは、これらの時点で優先的に認識され、従って、治療的または予防的抗癌ワクチンで好ましいであろう。
【０２１６】
特に、公知の非ウィルス腫瘍関連抗原（TAA）に由来するかなり多数のエピトープが、高い親和性（50nM未満のIC50）よりはむしろ中程度の親和性（50〜500nM範囲のIC50）でHLAクラスIに結合することが記載されている。
【０２１７】
例えば、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）またはCTLによって認識される15の公知のTAAペプチドのうちの8つが50〜500nM範囲で結合したことが見出されている。（これらのデータは、公知のウィルス抗原のうちの90％が50nM以下のIC50でHLAクラスI分子によって結合され、他方、ほぼ10％のみが50〜500nM範囲で結合したという見積りとは対照的である（Setteら、J.Immunol.、153:558-5592、1994））。癌の状況において、この現象は、恐らくはT細胞寛容事象のため、最高結合ペプチドのいくつかを認識するCTLの排除または機能的阻害に恐らくはよるものであろう。
【０２１８】
理論に拘束されるつもりはないが、優性エピトープに対するT細胞はクローン的に欠失され得るので、亜優性エピトープの選択は現存T細胞が動員されるのを可能とすることができ、次いで、これは治療的または予防的応答に至ると考えられる。しかしながら、亜優性エピトープへのHLA分子の結合は、しばしば、優性エピトープに対するものよりも激しくはない。
【０２１９】
従って、一つまたは複数のHLA分子に対する特定の免疫原性エピトープの結合親和性を変調でき、それにより、ペプチドによって誘導される免疫応答を変調でき、例えば、より激しい応答を誘導するアナログペプチドを調製できる要望が存在する。これらの原理に従って結合親和性および結果としての免疫応答双方を変調するその能力は、ペプチドエピトープ-ベースのワクチンおよび治療剤の有用性を大いに増強させる。
【０２２０】
スーパーファミリーの全ての単一遺伝子の中で適当な交差-反応性を有するペプチドは前記したスクリーニング手法によって同定されるが、交差-反応性は常には可能な限り完全であるというのではなく、ある場合には、ペプチドの交差-反応性を増大させる手法は有用であり得る；さらに、そのような手法を用いて、結合親和性またはペプチド安定性のようなペプチドの他の特性を修飾することもできる。所与のモチーフまたはスーパーモチーフ内のHLA対立遺伝子に対するペプチドの交差-反応性を支配する一般的な規則が確立されたので、より広い（またはそうでなければ修飾された）HLA結合能力を達成するための特に対象となるペプチドの構造の修飾（すなわち、アナロギング）を行うことができる。より詳細には、最も広い交差-反応性パターンを呈するペプチドは、本明細書中の教示に従って生じさせることができる。
【０２２１】
簡単に述べれば、アナロギング戦略は、ある種のHLA分子への結合に相関するモチーフまたはスーパーモチーフを利用する。アナログペプチドは、一次アンカー、二次アンカー、または一次および二次アンカー位置におけるアミノ酸残基を置換することによって作り出すことができる。一般に、既にモチーフまたはスーパーモチーフを担うペプチドに対してアナログは作成される。多数のモチーフまたはスーパーモチーフに対して、各モチーフまたはスーパーモチーフに結合する対立遺伝子-特異的HLA分子またはHLAスーパータイプのメンバーへの結合に有害な残基が規定される。従って、結合に有害なそのような残基の除去を行うことができる。例えば、A3スーパータイプの場合には、そのような有害な残基を有する全てのペプチドが分析で用いられるペプチドの集団から除去されると、交差-反応性の発生率は22％から37％に増加した（例えば、Sidney,J.ら、Hu.Immunol.45:79、1996参照）。本発明のC35ペプチドエピトープアナログの例は表4に見出される。特に好ましい態様において、本発明の単離されたポリペプチドは以下のC35ペプチドエピトープアナログ:配列番号:2および図1BのペプチドエピトープG22〜C30（すなわち、GVRIVVEYC）については、第9番目のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有するアナログ（すなわち、GVRIVVEYAまたはGVRIVVEYG）；配列番号:2および図1BのペプチドエピトープI25〜C33（すなわち、IVVEYCEPC）については、第6番目のアミノ酸残基および/または第9番目のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有するアナログ
2005528914.tif 000107
；配列番号:2および図1BのペプチドエピトープK77〜Y85（すなわち、KLENGGFPY）については、第9番目のアミノ酸残基におけるチロシンに代えて置換されたバリンを有するアナログ（すなわち、KLENGGFPV）；配列番号:2および図1BのペプチドエピトープK104〜C112（すなわち、KITNSRPPC）については、第9番目のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアラニン、グリシンまたはロイシンを有するアナログ（すなわち、KITNSRPPL、KITNSRPPA、KITNSRPPG）；配列番号:2および図1BのペプチドエピトープK104〜V113（すなわち、KITNSRPPCV）については、第9番目のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアラニン、グリシン、セリンまたはロイシンを有するアナログ（すなわち、KITNSRPPLV、KITNSRPPAV、KITNSRPPGV、KITNSRPPSV）；配列番号:2および図1BのペプチドエピトープI105〜V113（すなわち、ITNSRPPCV）については、ロイシンまたはメチオニンのいずれかが第2のアミノ酸残基におけるスレオニンに代えて置換されたおよび/またはアラニン、セリンまたはグリシンが第8のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアナログ
2005528914.tif 000108
、配列番号:2および図1BのペプチドエピトープN107〜L115（すなわち、NSRPPCVIL）については、第6番目のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有するアナログ（すなわち、NSRPPAVIL、NSRPPGVIL）を含むか、あるいはそれからなる。本発明は、さらに、一つまたは複数のC35エピトープアナログを含む、あるいはそれからなるポリペプチドに指向される。好ましい態様において、本発明は、一つまたは複数のC35エピトープアナログおよび、加えて、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含むポリペプチドに指向される。特に好ましい態様において、本発明は、配列番号:2および図1BのペプチドエピトープG22〜C30（すなわち、GVRIVVEYC）については、第9番目のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有するアナログ（すなわち、GVRIVVEYAまたはGVRIVVEYG）；配列番号:2および図1BのペプチドエピトープI25〜C33（すなわち、IVVEYCEPC）については、第6番目のアミノ酸残基および/または第9番目のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有するアナログ
2005528914.tif 000109
；配列番号:2および図1BのペプチドエピトープK77〜Y85（すなわち、KLENGGFPY）については、第9番目のアミノ酸残基におけるチオシンに代えて置換されたバリンを有するアナログ（すなわち、KLENGGFPV）；配列番号:2および図1BのペプチドエピトープK104〜C112（すなわち、KITNSRPPC）については、第9番目のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアラニン、グリシンまたはロイシンを有するアナログ（すなわち、KITNSRPPL、KITNSRPPA、KITNSRPPG）；配列番号:2および図1BのペプチドエピトープK104〜V113（すなわち、KITNSRPPCV）については、第9番目のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアラニン、グリシン、セリンまたはロイシンを有するアナログ（すなわち、KITNSRPPLV、KITNSRPPAV、KITNSRPPGV、KITNSRPPSV）；配列番号:2および図1BのペプチドエトープI105〜V113（すなわち、ITNSRPPCV）については、ロイシンまたはメチオニンのいずれかが第2のアミノ酸残基におけるスレオニンに代えて置換されおよび/またはアラニン、セリンまたはグリシンが第8のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアナログ
2005528914.tif 000110
、配列番号:2および図1BのペプチドエピトープN107〜L115（すなわち、NSRPPCVIL）については、第6番目のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有するアナログ（すなわち、NSRPPAVIL、NSRPPGVIL）からなる群より選択される少なくとも1つのC35ペプチドエピトープアナログ、および:配列番号:2のアミノ酸E4〜P12、配列番号:2のS9〜V17、配列番号:2のS21〜Y29、配列番号:2のG22〜C30、配列番号:2のI25〜C33、配列番号:2のT38〜V46、配列番号:2のG61〜I69、配列番号:2のT62〜N70、配列番号:2のG63〜G71、配列番号:2のF65〜L73、配列番号:2のI67〜F75、配列番号:2のK77〜Y85、配列番号:2のQ72〜E86、配列番号:2のG81〜L89、配列番号:2のG99〜V113、配列番号:2のE100〜V113、配列番号:2のK104〜C112、配列番号:2のK104〜V113、配列番号:2のI105〜V113、および配列番号:2のN107〜L115からなる群より選択される少なくとも1つのC35ペプチドエピトープを含む融合タンパク質に指向される。
【０２２２】
従って、所与のスーパーモチーフ内でペプチドの交差-反応性を改良するための1つの戦略は、単に、ペプチド内に存在する有害な残基の一つまたは複数を欠失させ、かつ（ペプチドのT細胞認識に影響しないであろう）Alaのような小さな「中性」残基を置換することである。もし、ペプチド内の有害な残基の排除と共に、対立遺伝子-特異的HLA分子への、またはスーパーファミリー内の複数HLA分子への高い結合親和性に関連する「好ましい」残基が挿入されれば、交差-反応性の増強された確率が期待される。
【０２２３】
アナログペプチドは、ワクチンとして使用される場合、インビボにて天然エピトープへのCTL応答を現実に誘導する（または、クラスIIエピトープの場合には、野生型ペプチドと交差-反応するヘルパT細胞を誘導する）ことを確認するためには、アナログペプチドを用いて、適当なHLA対立遺伝子の個体からインビトロにてT細胞を誘導することができる。その後、野生型ペプチド感作標的細胞を溶解させる免疫化細胞の能力を評価する。または、細胞の活性の評価はIFN放出をモニタリングすることによって評価することができる。これらの細胞モニタリング戦略の各々は、CTLによるAPCの認識を評価する。抗原提示細胞として、感染された、または適当な遺伝子でトランスフェクトされた細胞、または（一般的には、クラスIIエピトープについてのみ、HLAクラスIIについての異なるペプチドプロセッシング経路のため）、全タンパク質抗原でパルスして、内因的に生じた抗原もまたアナログペプチドによって誘導されたT細胞によって認識されるか否かが確立された細胞を用いるのが望ましいであろう。ペプチド/タンパク質-パルス樹状細胞を用いて、HLAクラスIおよびクラスII双方につき全タンパク質抗原を提示することができることに注意されたい。
【０２２４】
本発明のもう1つの態様は、弱い結合ペプチドのアナログを作り出し、それにより、適切な数の細胞バインダーを確保することである。500〜5000nMの結合親和性を呈し、かつ一方または双方の位置における許容されるが最適下の一次アンカー残基を運ぶクラスI結合ペプチドは、各スーパータイプに従って好ましいアンカー残基を置換することによって「固定」することができる。次いで、アナログペプチドを結合および/または交差-結合能力につき試験することができる。
【０２２５】
本発明のもう1つの態様は、既に交差-反応性バインダーであって、ワクチン候補であるが、スーパータイプの一つまたは複数の対立遺伝子に弱く結合するペプチドのアナログを作り出すことである。もし交差-反応性バインダーが一次または二次アンカー位置において最適下残基（余り好ましくないかまたは有害）を運ぶならば、ペプチドは、有害な残基を置換し、それを好ましいまたはより好ましくはないもので置き換えることによって、あるいはより好ましくない残基を置換し、それを好ましいものに置き換えることによってアナログ化することができる。次いで、アナログペプチドを交差-結合能力につき試験することができる。
【０２２６】
効果的なペプチドアナログを作り出すためのもう1つの態様は、例えば、液体環境中でペプチド安定性または可溶性に対して有害なインパクトを有する残基の置換を含む。この置換はペプチドエピトープのいずれの位置においても起こり得る。例えば、システイン（C）はα-アミノ酪酸に好都合に置換することができる。その化学的性質のため、システインは、ジスルフィドブリッジを形成し、ペプチドを構造的に十分に改変して、結合能力を低下させる傾向を有する。Cに代えてα-アミノ酪酸で置き換えることは、この問題を経験するのみならず、ある種の状況において結合および交差結合能力を現実に改良する（例えば、Persistent Viral Infections、R.AhmedおよびI.Chen編、John Wiley ＆ Sons、England、1999においてSetteらによるレビュー参照）。システインのα-アミノ酪酸での置換は、ペプチドエピトープのいずれの残基においても、すなわち、アンカーまたは非アンカー位置いずれにおいても起こり得る。
【０２２７】
さらに、いずれの有害な二次アンカー残基の存在も回避しつつ、少なくとも1つの好ましい二次アンカー残基を含有するA＊0201モチーフ-担持ペプチドの組において、ペプチドの69％は500nM未満のIC50にてA＊0201に結合するであろうことが示されている（Ruppert,J.ら、Cell 74:929、1993）。Ruppertにおいて何が好ましいまたは有害な残基であるかの決定を用いて、アルゴリズムを作り出すことができる（例えば、22参照）。そのようなアルゴリズムは、カット-オフスコアを調整して、望ましいならば、より大きなまたはより低い予測された結合特性を有するペプチドの組を選択することができる点で柔軟性がある。
【０２２８】
システイン残基を含有するC35エピトープは、他のシステイン含有ペプチドとで二量体化する傾向を有する。従って、本発明の態様は、本発明のペプチドエピトープ（例えば、配列番号:2のE100〜R109を除いて、表1〜3または5〜6のいずれかに列挙されたC35ペプチドエピトープ）、およびシステイン残基の遊離スルフヒドリル基を保護するが、そうでなければ、エピトープ結合を阻害する適当な還元剤を含む組成物である。好ましい態様においては、前記組成物は、適当な還元剤と組合わせたペプチドエピトープITNSRPPCVまたはKITNSRPPCVを含む。適当な還元剤は、限定されるものではないが、TCEPおよびジチオスレイトール（DTT）を含む。
【０２２９】
本発明のもう1つの態様は、ペプチドエピトープ（例えば、配列番号:2のE100〜R109を除いて表1〜3または5〜6のいずれかに列挙されたC35ペプチドエピトープ）のシステイン残基がいずれかの他のアミノ酸で置換されて合成を促進するペプチドエピトープアナログを作り出すことである（Zarling,A.L.ら、J.Exp.Med.192（12）:1755-1762（2000）参照）。好ましくは、そのような置換がMHCへの結合またはT細胞による認識に負に影響しないことを条件に、いずれのアミノ酸を置換することもできるが、システイン残基はアラニン、セリンまたはグリシン残基のいずれかで置換される。従って、特に好ましい態様においては、本発明の単離されたポリペプチドは以下のC35ペプチドエピトープアナログ:配列番号:2および図1BのペプチドエピトープG22〜C30（すなわち、GVRIVVEYC）については、第9番目のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有するアナログ（すなわち、GVRIVVEYAまたはGVRIVVEYG）；配列番号:2および図1BのペプチドエピトープI25〜C33（すなわち、IVVEYCEPC）については、第6番目のアミノ酸残基および/または第9番目のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有するアナログ（すなわち、IVVEYAEPCまたはIVVEYGEPCまたはIVVEYCEPAまたはIVVEYCEPGまたはIVVEYAEPAまたはIVVEYAEPGまたはIVVEYGEPAまたはIVVEYGEPG）；配列番号:2および図1BのK104〜C112のペプチドエピトープ（すなわち、KITNSRPPC）については、第9番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有するアナログ（すなわち、KITNSRPPAまたはKITNSRPPG）；配列番号:2および図1BのペプチドエピトープK104〜V113（すなわち、KITNSRPPCV）については、第9番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニン、セリンまたはグリシンのいずれかを有するアナログ（すなわち、KITNSRPPAV、KITNSRPPSVまたはKITNSRPPGV）；配列番号:2および図1BのペプチドエピトープI105〜V113（すなわち、ITNSRPPCV）については、第8番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニン、セリンまたはグリシンのいずれかを有するアナログ（すなわち、ITNSRPPAV、ITNSRPPSV、またはITNSRPPGV）；ペプチドエピトープN107〜L115（すなわち、NSRPPCVIL）については、第6番目のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有するアナログ（すなわち、NSRPPAVIL、NSRPPGVIL）；配列番号:2および図1BのマルチエピトープペプチドT101〜V113（すなわち、TLEKITNSRPPCV）については、第12番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有するアナログ（すなわち、TLEKITNSRPPAVまたはTLEKITNSRPPGV）；配列番号:2および図1BのマルチエピトープペプチドE100〜V113（すなわち、ETLEKITNSRPPCV）については、第13番目のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有するアナログ（すなわち、ETLEKITNSRPPAV、ETLEKITNSRPPGV）、配列番号:2および図1BのマルチエピトープペプチドG99〜V113（すなわち、GETLEKITNSRPPCV）については、第14番目のアミノ酸残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有するアナログ
2005528914.tif 000111
、配列番号:2および図1BのマルチエピトープペプチドI93〜V113
2005528914.tif 000112
については、第12番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有するアナログ
2005528914.tif 000113
；配列番号:2および図1BのマルチエピトープペプチドD88〜V113
2005528914.tif 000114
については、第25番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有するアナログ
2005528914.tif 000115
；配列番号:2および図1BのマルチエピトープペプチドP84〜V113
2005528914.tif 000116
については、第29番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有するアナログ
2005528914.tif 000117
；配列番号:2および図1BのマルチエピトープペプチドK77〜L115
2005528914.tif 000118
については、第36番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有するアナログ
2005528914.tif 000119
；配列番号:2および図1BのマルチエピトープペプチドQ72〜L115
2005528914.tif 000120
については、第41番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンを有するアナログ
2005528914.tif 000121
；配列番号:2および図1BのマルチエピトープペプチドF65〜L115
2005528914.tif 000122
については、第48番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有するアナログ
2005528914.tif 000123
；配列番号:2および図1BのマルチエピトープペプチドL59〜L115
2005528914.tif 000124
については、第54番目の残基におけるシステインに代えて置換されたアラニンまたはグリシンのいずれかを有するアナログ
2005528914.tif 000125
を含むか、あるいはそれからなる。
【０２３０】
本発明のもう1つの態様は、ペプチドエピトープ（例えば、一つまたは複数のシステイン残基を有する、配列番号:2のE100〜R109を除いて表1〜3または5〜6のいずれかに列挙されたC35ペプチドエピトープ）のシステイン残基が「システイニル化」されている（すなわち、第二のシステイン残基と反応した）ペプチドエピトープアナログを作り出すことである（Pierce,R.A.ら、J.Immunol.163（12）:6360-6364（1999））。本明細書中で用いるように、用語「システイニル化」は、遊離スルフヒドリル基における第二の遊離システイン、すなわち、より大きなペプチドの一部ではないシステインと反応し、それにより、ジスルフィド結合（-SH＋HS-＝-S-S-）を生じた、本発明のペプチド（例えば、ペプチドエピトープ）内のシステイン残基を記載する。
【０２３１】
従って、特に好ましい態様において、本発明の単離されたポリペプチドは以下のC35ペプチドエピトープアナログ:配列番号:2および図1BのK104〜V113のペプチドエピトープ（すなわち、KITNSRPPCV）については、第9番目の残基におけるシステインがシステイニル化されているアナログ、および配列番号:2および図1BのI105〜V113のペプチドエピトープ（すなわち、ITNSRPPCV）については、第8番目の残基におけるシステインがシステイニル化されているアナログを含むか、あるいはそれからなる。
【０２３２】
本発明のもう1つの態様は、ペプチドエピトープ（例えば、配列番号:2のE100〜R109を除いて表1〜3または5〜6のいずれかに列挙されたC35ペプチドエピトープ）のセリン、スレオニンおよび/またはチロシン残基がリン酸化されているペプチドエピトープアナログを作り出すことである。従って、特に好ましい態様においては、本発明の単離されたポリペプチドは以下のC35ペプチドエピトープアナログ:配列番号:2および図1BのペプチドエピトープE4〜P12（すなわち、EPGQTSVAP）については、T8におけるスレオニンおよび/またはS9におけるセリンがリン酸化されているアナログ；配列番号:2および図1BのペプチドエピトープS9〜V17（すなわち、SVAPPPEEV）については、S9におけるセリンがリン酸化されているアナログ；配列番号:2および図1BのペプチドエピトープS21〜Y29（すなわち、SGVRIVVEY）については、S21におけるセリンおよび/またはY29におけるチロシンがリン酸化されているアナログ；配列番号:2および図1BのペプチドエピトープG22〜C30（すなわち、GVRIVVEYC）については、Y29におけるチロシンがリン酸化されているアナログ；配列番号:2および図1BのペプチドエピトープT38〜V46（すなわち、TYLELASAV）については、T38におけるスレオニン、Y39におけるチロシン、および/またはS44におけるセリンがリン酸化されているアナログ；ペプチドエピトープG61〜I69（すなわち、GTGAFEIEI）については、T62におけるスレオニンがリン酸化されているアナログ；配列番号:2および図1BのペプチドエピトープT62〜N70（すなわち、TGAFEIEIN）については、T62におけるスレオニンがリン酸化されているアナログ；配列番号:2および図1BのペプチドエピトープK77〜Y85（すなわち、KLENGGFPY）については、Y85におけるチロシンがリン酸化されているアナログ；配列番号:2および図1BのペプチドエピトープQ72〜E86（すなわち、QLVFSKLENGGFPYE）については、S76におけるセリンおよび/またはY85におけるチロシンがリン酸化されているアナログ；配列番号:2または図1BのペプチドエピトープG81〜L89（すなわち、GGFPYEKDL）については、Y85におけるチロシンがリン酸化されているアナログ；配列番号:2および図1BのペプチドエピトープK104〜C112（すなわち、KITNSRPPC）については、T106におけるスレオニンおよび/またはS108におけるセリンがリン酸化されているアナログ；配列番号:2および図1BのペプチドエピトープK104〜V113（すなわち、KITNSRPPCV）については、T106におけるスレオニンおよび/またはS108におけるセリンがリン酸化されたアナログ；ペプチドエピトープI105〜V113（すなわち、ITNSRPPCV）については、T106におけるスレオニンおよび/またはS108におけるセリンがリン酸化されているアナログ；ペプチドエピトープN107〜L115（すなわち、NSRPPCVIL）については、S108におけるセリンがリン酸化されているアナログ；配列番号:2および図1Bのポリエピトープ性ペプチドT101〜V113（すなわち、TLEKITNSRPPCV）については、T101およびT106におけるスレオニンおよび/またはS108におけるセリンがリン酸化されているアナログ；配列番号:2および図1Bのポリエピトープ性ペプチドI93〜V113
2005528914.tif 000126
については、S97におけるセリンおよび/またはT101におけるスレオニンおよび/またはT106におけるスレオニンおよび/またはS108におけるセリンがリン酸化されているアナログ；配列番号:2および図1Bのポリエピトープ性ペプチドD88〜V113
2005528914.tif 000127
については、S97におけるセリンおよび/またはT101におけるスレオニンおよび/またはT106におけるスレオニンおよび/またはS108におけるセリンがリン酸化されているアナログ；配列番号:2および図1Bのポリエピトープ性ペプチドP84〜V113
2005528914.tif 000128
については、Y85におけるチロシンおよび/またはS97におけるセリンおよび/またはT101におけるスレオニンおよび/またはT106におけるスレオニンおよび/またはS108におけるセリンがリン酸化されているアナログ；配列番号:2および図1Bのポリエピトープ性ペプチドK77〜V113
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については、Y85におけるチロシンおよび/またはS97におけるセリンおよび/またはT101におけるスレオニンおよび/またはT106におけるスレオニンおよび/またはS108におけるセリンがリン酸化されているアナログ；配列番号:2および図1Bのポリエピトープ性ペプチドQ72〜V113
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については、S76におけるセリンおよび/またはY85におけるチロシンおよび/またはS97におけるセリンおよび/またはT101におけるスレオニンおよび/またはT106におけるスレオニンおよび/またはS108におけるセリンがリン酸化されているアナログ；配列番号:2および図1Bのポリエピトープ性ペプチドF65〜V113
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については、S76におけるセリンおよび/またはY85におけるチロシンおよび/またはS97におけるセリンおよび/またはT101におけるスレオニンおよび/またはT106におけるスレオニンおよび/またはS108におけるセリンがリン酸化されているアナログ；配列番号:2および図1Bのポリエピトープ性ペプチドL59〜V113
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については、T62におけるスレオニンおよび/またはS76におけるセリンおよび/またはY85におけるチロシンおよび/またはS97におけるセリンおよび/またはT101におけるスレオニンおよび/またはT106におけるスレオニンおよび/またはS108におけるセリンがリン酸化されているアナログを含むか、あるいはそれからなる。
【０２３３】
本発明のもう1つの態様は、ペプチドエピトープ（例えば、配列番号:2のE100〜R109を除いて表1〜3または5〜6のいずれかに列挙されたC35ペプチドエピトープ）のアスパラギン残基が翻訳後にアスパラギン酸に変換されているペプチドエピトープアナログを作り出すことである（Skipper,J.C.ら、J.Exp.Med.183（2）:527-534（1996）参照）。
【０２３４】
好ましい態様において、本発明のC35ペプチドエピトープアナログは、複数の修飾を含み、但し、そのような修飾はMHC分子への結合またはT細胞による認識を阻害しないものとする。従って、好ましいアナログは、一つまたは複数の残基が本明細書中に記載されるように修飾されて、MHC分子への結合親和性が増加し、一つまたは複数のシステイン残基がアラニンまたはグリシン残基で置き換えられて合成を容易とし、かつ一つまたは複数のセリン、スレオニンまたはチロシン残基がリン酸化されているC35ペプチドエピトープを含む。
【０２３５】
さらに、ペプチドエピトープを相互に連結させる容易性、担体支持体またはより大きなポリペプチドへのカップリング、ペプチドまたはオリゴペプチドの物理的または化学的特性の修飾等を提供するために、さらなるアミノ酸をペプチドエピトープの末端に付加させることができる。チロシン、システイン、リシン、グルタミン酸またはアスパラギン酸などのようなアミノ酸を、ペプチドまたはオリゴペプチド、特にクラスIペプチドのC-またはN-末端に導入することができる。CTLエピトープのカルボキシル末端における修飾は、ある場合には、ペプチドの結合特徴を改変し得ることに注意されたい。加えて、ペプチドまたはオリゴペプチド配列は、末端-NH2アシル化によって、例えば、アルカノイル（C1-C20）またはチオグリコリルアシル化、末端-カルボキシルアミド化、例えば、C-末端のアンモニア、メチルアミンなどのポリエチレン-グリコール修飾（すなわち、PEG化）、およびT細胞への提示または免疫原性を増強させるための脂質テイル（例えば、パルミトイル-リシン鎖）の付加によって修飾されることにより天然配列とは異なり得る。（Brinckerhoff,L.H.ら、Int.J.Cancer 83（3）:326-334（1999）；Le Gal,F.A.ら、Int.J.Cancer 98（2）:221-227（2002）参照）。N-末端アミドは、特に、ある種のペプチダーゼに対してより抵抗性であり、従って、認識に影響することなくインサイチューにてペプチドエピトープの破壊を妨げる。これは、ペプチドエピトープの半減期を効果的に延長し、免疫細胞を刺激するその能力を増強させる。いくつかの場合において、これらの修飾は、支持体または他の分子に連結させるための部位を提供することができる。
【０２３６】
ペプチドエピトープの調製
本発明によるペプチドエピトープは合成により、組換えDNA技術または化学合成によって、または天然腫瘍または病原性生物のような天然源から調製することができる。ペプチドエピトープは個々に、またはポリエピトープ性ポリペプチドとして（例えば、ホモポリマーまたはヘテロポリマー）合成することができる。ペプチドは好ましくは他の天然に生じる宿主細胞タンパク質およびその断片を実質的に含まないが、いくつかの態様においては、ペプチドは天然断片または粒子に合成によりコンジュゲートさせることができる。
【０２３７】
加えて、一つまたは複数の非C35腫瘍関連ペプチドは一つまたは複数のC35ペプチドエピトープおよび/またはC35ペプチドエピトープアナログに連結させて、HLAクラスIおよび/またはクラスIIを介して免疫応答を増加させることができる。特に好ましいのは「ポリトープ」として知られた一連のエピトープを含むポリペプチド、およびそれをコードする核酸である。エピトープは天然のフランキング配列と共に、またはそれ無くして、順次にまたは重複して配置することができ（例えば、Thomsonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:5845-5849（1995）；Gilbertら、Nature/Biotechnology 15:1280-1284（1997）参照）、望ましいならば、無関係なリンカー配列によって分離することができる。ポリトープは、免疫応答の発生のための免疫系によって認識される個々のエピトープを生じさせるようにプロセッシングされる。
【０２３８】
従って、例えば、C35ペプチドエピトープおよびC35ペプチドエピトープアナログは、（例えば、ハイブリッド核酸またはポリペプチドの調製によって）他の腫瘍拒絶抗原からのペプチドと組合わせて、「ポリトープ」を形成させることができる（Zeng,G.ら、Pro.Natl.Acad.Sci.98（7）:3964-3969（2001）；Zeng,G.ら、J.Immunol.165:1153-1159（2000）；Mancini,S.ら、J.Exp.Med.189（5）:871-876（1999））。免疫応答を誘導または増強させるために投与することができる例示的な腫瘍関連抗原は、
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を含めた、腫瘍関連遺伝子およびコードされたタンパク質に由来する。例えば、腫瘍に特徴的な特異的抗原性ペプチドは表Aに列挙したものを含む。
【０２３９】
（表Ａ）
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【０２４０】
非C35HLAクラスIおよびHLAクラスII結合ペプチドの他の例は当業者に知られており、本明細書中に開示したのと同様に本発明で用いることができる。当業者であれば、分子生物学における標準的な手法に従い、一つまたは複数のC35ペプチドエピトープまたはC35ペプチドエピトープアナログ、および一つまたは複数の前記した腫瘍拒絶ペプチドを含むポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコードする核酸を調製することができる。本発明のC35ペプチドエピトープまたはC35ペプチドエピトープアナログを含む例示的なポリトープ、および種々の腫瘍拒絶抗原性ペプチドを以下の表BおよびCに記載する。
【０２４１】
従って、ポリトープは、種々の配置（例えば、鎖状、重複）にて一緒に連結することができる複数の潜在的に免疫原性または免疫応答刺激ペプチドの群である。ポリトープ（または前記ポリトープをコードする核酸）は標準的な免疫化プロトコルにより、例えば、動物に投与して、免疫応答を刺激、増強および/または惹起する際にポリトープの有効性を試験することができる。ペプチドは直接的に、またはフランキング配列の使用を介して連結して、ポリトープを形成することができ、ワクチンとしてのポリトープの使用は当技術分野において周知である。
【０２４２】
好ましい態様において、本発明の単離されたポリペプチドは一つまたは複数の腫瘍拒絶ペプチドに連結された一つまたは複数のC35ペプチドエピトープまたはC35ペプチドエピトープアナログを含む。特に好ましい態様において、前記一つまたは複数のC35ペプチドエピトープは、配列番号:2のアミノ酸E4〜P12、配列番号:2のアミノ酸S9〜V17、配列番号:2のアミノ酸S21〜Y29、配列番号:2のアミノ酸G22〜C30、配列番号:2のアミノ酸I25〜C33、配列番号:2のアミノ酸T38〜V46、配列番号:2のアミノ酸G61〜I69、配列番号:2のアミノ酸T62〜N70、配列番号:2のアミノ酸G63〜G71、配列番号:2のアミノ酸F65〜L73、配列番号:2のアミノ酸I67〜F75、配列番号:2のアミノ酸K77〜Y85、配列番号:2のアミノ酸Q72〜E86、配列番号:2のアミノ酸G81〜L89、配列番号:2のアミノ酸K104〜C112、配列番号:2のアミノ酸K104〜V113、配列番号:2のアミノ酸I105〜V113、配列番号:2のアミノ酸N107〜L115、配列番号:2のアミノ酸T101〜V113、配列番号:2のアミノ酸E100〜V113、配列番号:2のアミノ酸G99〜V113、配列番号:2のアミノ酸I93〜V113、配列番号:2のアミノ酸D88〜V113、配列番号:2のアミノ酸P84〜V113、配列番号:2のアミノ酸K77〜V113、配列番号:2のアミノ酸Q72〜V113、配列番号:2のアミノ酸F65〜V113、および配列番号:2のL57〜V113からなる群より選択され；および前記一つまたは複数の腫瘍拒絶ペプチドは表Aに示された抗原性ペプチドからなる群より選択される。
【０２４３】
もう1つの態様において、一つまたは複数の非C35細胞貫通ペプチドは一つまたは複数のC35ペプチドエピトープおよび/またはC35ペプチドエピトープアナログに連結して、細胞、例えば、樹状細胞へのC35ペプチドエピトープの送達を増強させることができる。特に好ましいのは、一連のC35ペプチドエピトープまたはC35ペプチドエピトープアナログおよび細胞貫通ペプチドを含むポリペプチド、およびそれをコードする核酸である。エピトープおよびペプチドは、天然のフランキング配列と共に、またはそれ無くして、順次にまたは重複様式で配置することができ、望ましいならば、無関係なリンカー配列によって分離することができる。ポリペプチドは、免疫応答の発生のために免疫系によって認識される個々のC35エピトープを生じさせるようにプロセッシングされる。
【０２４４】
従って、例えば、C35ペプチドエピトープおよびC35ペプチドエピトープアナログは細胞-貫通ペプチドと組み合わせることができる。（Wang,R.F.ら、Nature Biotechnology 20（2）:149-154（2002）；Frankel,A.D.ら、Cell 55:1189-1193（1988）；Elliott,G.ら、Cell 88（2）:223-233（1997）；Phelan,A.ら、Nature Biotechnology 16（5）:440-443（1998）；Lin,Y.Z.ら、J.Biol.Chem.270（24）:14255-14258（1995）；Rojas,M.ら、Nature Biotechnology 16（4）:370-375（1998））。樹状細胞のような細胞へのC35ペプチドの送達を増強させるために投与することができる例示的な細胞貫通ペプチドはヒト免疫不全ウィルスのTatタンパク質、HSV-1構造タンパク質VP22、およびカポジ線維芽細胞成長因子のシグナル配列の16-残基h領域から修飾された12-残基膜-移動配列（MTS）を含む。
【０２４５】
一つまたは複数のC35ペプチドエピトープ/アナログおよび一つまたは複数の細胞貫通ペプチドは種々の配置にて（例えば、鎖状、重複）一緒に連結することができる。得られたポリペプチド（または前記ポリペプチドをコードする核酸）は標準的な免疫化プロトコルにより、例えば、動物に投与して、免疫応答を刺激し、増強させおよび/または惹起する際にポリペプチドの有効性を試験することができる。C35ペプチドエピトープ/アナログおよび一つまたは複数の細胞貫通ペプチドは直接的に、またはフランキング配列の使用を介して連結させて、ポリペプチドを形成させることができ、そのようなポリペプチドのワクチンとしての使用は当技術分野において周知である。本発明のC35ペプチドエピトープまたはC35ペプチドエピトープアナログを含むポリペプチド、および種々の細胞貫通ペプチドの例は以下の表DおよびEに記載する。
【０２４６】
（表Ｂ）
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【０２４７】
（表Ｃ）
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【０２４８】
（表Ｄ）
2005528914.tif 000212
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【０２４９】
（表Ｅ）
2005528914.tif 000236
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【０２５０】
本発明によるペプチドは種々の長さであって、その中性（未荷電）形態または塩である形態のいずれかとすることができる。本発明によるペプチドは一般に、ペプチドの生物学的活性を修飾が破壊しないという条件に供し、グリコシル化、側鎖酸化またはリン酸化のような修飾を含むことができる。
【０２５１】
本発明のペプチドは種々の方法で調製することができる。好ましい比較的短いサイズでは、ペプチドは、慣用的な技術に従って溶液中で、または固体支持体上で合成することができる。種々の自動合成器が商業的に入手可能であって、公知のプロトコルに従って用いることができる。（例えば、Stewart ＆ Young,SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS,2D編,Pierce Chemical Co.,1984を参照）。さらに、個々のC35ペプチドエピトープおよびC35ペプチドエピトープアナログは化学的連結を用いて連結させて、依然として本発明の境界内にあるより大きなホモポリマーまたはヘテロポリマーポリペプチドを生じさせることができる。
【０２５２】
または、組換えDNA技術を使用することができ、ここで、対象となる免疫原性ペプチドをコードするヌクレオチド配列は発現ベクターに挿入され、形質転換され、または適当な宿主細胞にトランスフェクトされ、発現に適した条件下で培養することができる。これらの手法は、一般に、Sambrookら、 MOLECULAR CLONING,A LABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,New York（1989）に記載されているように、一般に当技術分野において公知である。従って、本発明の一つまたは複数のペプチドエピトープ配列を含む組換えポリペプチドを用いて、適当なT細胞エピトープを提示することができる。
【０２５３】
本明細書中で考えられる好ましい長さのC35ペプチドエピトープまたはC35ペプチドエピトープアナログについてのヌクレオチドコード配列は化学技術、例えば、Matteucciら、J.Am.Chem.Soc.103:3185（1981）のホスホトリエステル方法によって合成することができる。ペプチドアナログは、単に、天然ペプチド配列をコードするものに代えて適当な所望の核酸塩基を置換することによって作成することができ；例示的な核酸置換は、モチーフ/スーパーモチーフによってここに規定されるアミノ酸をコードするものである。次いで、コード配列に適当なリンカーを提供し、当技術分野において通常入手可能な発現ベクターに連結することができ、前記ベクターを用いて適当な宿主を形質転換し、所望の融合タンパク質を得る。多数のそのようなベクターおよび適当な宿主系が現在入手可能である。融合タンパク質の発現のためには、コード配列に操作可能に連結した開始および停止コドン、プロモーターおよびターミネーター領域および、通常は、所望の細胞宿主における発現用の発現ベクターを提供するための複製系を設ける。例えば、細菌宿主に適合するプロモーター配列を、所望のコード配列の挿入用の便宜な制限部位を含むプラスミドに設ける。得られた発現ベクターを適当な細菌宿主に形質転換する。もちろん、酵母、昆虫または哺乳動物細胞宿主を用いることもでき、適切なベクターおよび対照配列を使用する。
【０２５４】
天然タンパク質の免疫学的活性の実質的な全てを依然として維持しつつ、ペプチドエピトープはできる限り小さいのが一般に好ましい。可能な場合には、本発明のHLAクラスI結合ペプチドエピトープを約8〜約13アミノ酸残基、好ましくは9〜10の長さに最適化するのが望ましいであろう。より長いポリペプチド、例えば、C35ポリペプチド断片または合成ポリペプチドはこのサイズ範囲の一つまたは複数のC35ペプチドエピトープまたはC35ペプチドエピトープアナログを含むことができる（ペプチドの長さのさらなる議論のための用語「エピトープ」については定義の段落を参照）。HLAクラスII結合エピトープは、好ましくは、長さが約6〜約30アミノ酸、好ましくは約13と約20残基の間の長さまで好ましくは最適化される。好ましくは、エピトープは、関連HLA分子に結合する内因的に保有される病原体由来ペプチドまたは腫瘍細胞ペプチドとサイズが釣り合っている。種々の長さのペプチドの同定および調製は、本明細書中に記載する技術を用いて行うことができる。
【０２５５】
本発明の別の好ましい態様はポリエピトープ性ポリペプチド、例えば、ホモポリマーまたはヘテロポリマーとして、またはポリエピトープ性ポリペプチドをコードするミニ遺伝子として連結した本発明のペプチドの投与を含む。
【０２５６】
もう1つの好ましい態様は、高濃度のクラスIおよび/またはクラスIIのC35ペプチドエピトープを含む天然C35ポリペプチド領域を同定することによって得られる。そのような配列は、一般に、それがアミノ酸長さ当たり最大数のC35エピトープを含むことを基礎として一般には選択される。エピトープはフレーム-シフト様式で存在させることができることが認識されるべきであり、例えば、10アミノ酸長ペプチドは2つの9アミノ酸長エピトープおよび1つのアミノ酸長エピトープを含むことができ；細胞内プロセッシングに際して、各エピトープを暴露し、そのようなペプチドの投与に際してHLA分子によって結合され得る。従って、より大きな好ましくはマルチエピトープ性ポリペプチドは合成により、組換えにより、または天然源からの切断を介して生じさせることができる。
【０２５７】
T細胞応答を検出するためのアッセイ
一旦HLA結合ペプチドが同定されれば、それを、T細胞応答を誘発する能力につき試験することができる。調製およびモチーフ担持ペプチドの評価は、例えば、その全内容を参照として本明細書に組み入れられるPCT公開国際公開公報第94/20127号および国際公開公報第94/03205号に記載されている。簡単に述べれば、特定の抗原からのエピトープを含むペプチドを合成し、関連HLAタンパク質に結合するその能力につき試験する。これらのアッセイは、放射性ヨウ素化参照ペプチドの結合に対する精製されたHLAクラスI分子へのペプチド結合の評価を含むことができる。または、空のクラスI分子（すなわち、いずれの結合ペプチドも欠く細胞表面HLA分子）を発現する細胞は、免疫蛍光染色およびフローマイクロフルオリメトリーによってペプチド結合につき評価することができる。ペプチド結合を評価するのに用いることができる他のアッセイはペプチド依存性クラスIアセンブリーアッセイおよび/またはペプチド競合によるCTL認識の阻害を含む。典型的には、500nM以下の親和性でもって、HLAクラスI分子に結合するペプチドは、さらに、感染したまたは免疫化された個体から誘導されるCTLについての標的として働くその能力、ならびに病理学に関連する選択された標的細胞と反応することができるCTL集団を生起させることができる一次インビトロまたはインビボCTL応答を誘導するその能力につき評価される。
【０２５８】
類似のアッセイが、HLAクラスII結合ペプチドの評価で用いられる。典型的には、1000nM以下の親和性にて、結合することが示されたHLAクラスIIモチーフ担持ペプチドは、さらに、HTL応答を刺激する能力につき評価する。
【０２５９】
T細胞応答を検出するのに利用される慣用的アッセイは増殖アッセイ、リンホカイン分泌アッセイ、直接的細胞傷害性アッセイ、および限界希釈アッセイを含む。例えば、ペプチドとインキュベートされた抗原提示細胞を、応答個体細胞集団においてCTL応答を誘導する能力につきアッセイすることができる。抗原提示細胞は末梢血液単核細胞または樹状細胞のような正常細胞であり得る。または、ヒトクラスI MHC遺伝子でトランスフェクトされた、および内部プロセッシングされたペプチドをクラスI分子に負荷するその能力が欠乏した突然変異体非哺乳動物細胞系を用いて、インビトロ初代CTL応答を誘導するペプチドの能力を評価する。末梢血液単核細胞（PBMC）をCTL前駆体の源として用いることができる。抗原提示細胞をペプチドと共にインキュベートし、その後、ペプチド-負荷抗原提示細胞を、次いで、最適培養条件下で応答個体細胞集団と共にインキュベートする。陽性CTL活性化は、放射性標識標的細胞、特異的ペプチドがそれから由来する内因的にプロセッシングされた抗原を発現する特異的なペプチド-パルス標的または標的細胞のいずれかを溶解させるCTLの存在につき培養をアッセイすることによって測定することができる。または、エピトープ-特異的CTLの存在はIFNγインサイチューELISAによって測定することができる。
【０２６０】
加えて、フルオレセイン-標識HLA四量体複合体で染色することによって抗原-特異的T細胞の直接的定量を可能とする方法が工夫されている（Altman,J.D.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:10330,1993；Altman,J.D.ら、Science 274:94,1996）。他のオプションは、細胞内リンホカイン用の染色、およびインターフェロン放出アッセイまたはELISPOTアッセイを含む。四量体染色、細胞内リンホカイン染色およびELISPOTアッセイは、全て、より慣用的なアッセイよりも少なくとも10倍感受性が高いように見える（Lalvani,A.ら、J.Exp.Med.186:859,1997；Dunbar,P.R.ら、Curr.Biol.8:413,1998；Murali-Krishma,K.ら、Immunity 8:177,1998）。
【０２６１】
また、T細胞増殖またはリンホカイン分泌のような当業者に知られた技術を用い、ヘルパーTリンパ球（HTL）活性化を評価することもできる（例えば、Alexanderら、Immunity 1:751-761,1994参照）。
【０２６２】
または、HLAトランスジェニックマウスの免疫化を用いて、ペプチドエピトープの免疫原性を測定することができる。いくつかのトランスジェニックマウス株、例えば（加えて、HLA-A3エピトープを分析するのに用いることができる）ヒトA2.1、A11、およびB7対立遺伝子を有するマウスが特徴付けられている。他のトランスジェニックマウス株（例えば、HLA-A1およびA24についてのトランスジェニックマウス）は開発されつつある。さらに、HLA-DR1およびHLA-DR3マウスモデルが開発されている。当技術分野においての原理に従えば、他のHLA対立遺伝子を有するさらなるトランスジェニックマウスモデルは必要に応じて作り出される。
【０２６３】
そのようなマウスは不完全フロイントアジュバント中に乳化させたペプチドで免疫化することができ；その後、いずれかの得られたT細胞を、ペプチド-パルス処理された、または対象となるペプチドをコードする遺伝子でトランスフェクトされた標的細胞を認識するその能力につき試験することができる。CTL応答は、前記した細胞傷害性アッセイを用いて分析することができる。同様に、例えばT細胞増殖またはリンホカイン分泌アッセイを用いて分析することができる。
【０２６４】
ワクチン組成物
本発明の免疫学的有効量の一つまたは複数のC35ペプチドエピトープおよび/またはC35ペプチドエピトープアナログを含有するワクチンは、本発明のさらなる態様である。前記ペプチドは、全て集合的に「ワクチン」組成物という種々の手段または処方によって送達することができる。そのようなワクチン組成物および/または投与の様式は、例えば、カチオン性脂質処方における裸のcDNA；リポペプチド（例えば、Vitiello,A.ら、J.Clin.Invest.95:341,1995）、例えば、ポリ（DL-ラクチド-コ-グリコリド）（「PLG」）ミクロスフェア中にカプセル化された裸のcDNAまたはペプチド（例えば、Eldridgeら、Molec.Immunol.28:287-294,1991:Alonsoら、Vaccine 12:299-306,1994；Jonesら、Vaccine 13:675-681,1995参照）；免疫刺激複合体（ISCOMS）に含有されたペプチド組成物（例えば、Takahashiら、Nature 344:873-875,1990；Huら、Clin Exp Immunol.113:235-243,1998参照）；複数抗原ペプチド系（MAP）（例えば、Tam,J.P.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:5409-5413,1988；Tam,J.P.,J.Immunol Methods 196:17-32,1996参照）；ウイルス、細菌または真菌送達ベクター（Perkus,M.E.ら、In:Concepts in vaccine development,Kaufmann,S.H.E.編, p.379,1996；Chakrabarti,S.ら、 Nature 320:535,1986；Hu,S.L.ら、Natuer 320:537,1986；Kieny,M.P.ら、 AIDS Bio/Technology 4:790,1986；Top,F.H.ら、J.Infect.Dis.124:148,1971；Chanda,P.K.ら、Virology 175:535,1990）；ウイルスまたは合成起源の粒子（例えば、Kofler,N.ら、J.Immunol.Methods 192:25,1996；Eldridge,J.H.ら、Sem.Hematol.30:16,1993；Falo,L.D.,Jr.ら、Nature Med.7:649,1995）；アジュバント（Warren,H.S.,Vogel,F.R.およびChedid,L.A.Annu.Rev.Immunol.4:369,1986；Gupta,R.K.ら、Vaccine 11:293,1993）；リポソーム（Reddy,R.ら、J.Immunol.148:1585,1992；Rock,K.L.,Immunol.Today 17:131,1996）；または粒子-吸収cDNA（Ulmer,J.B.ら、Science 259:1754,1993；Robinson,H.L.,Hunt,L.A.およびWebstr,R.G.,Vaccine 11:957,1993；Shiver,J.W.ら、In:Concepts in vaccine development,Kaufmann,S.H.E.編,p.423,1996；Cease,K.B.およびBerzofski,J.A.,Annu.Rev.Immunol.12:923,1994およびEldridge,J.H.ら、Sem.Hematol.30:16,1993）などを含む。Avant Immunotherapeutics,Inc.（Needham,Massachusetts）のもののような受容体媒介標的化としても知られた、またはストレスタンパク質に付着したトキシン-標的化送達技術、例えば、HSP 96（Stressgen Biotechnologies Corp.,Victoria, BC,カナダ国）を用いることもできる。
【０２６５】
本発明のワクチンは核酸媒介様式を含む。本発明のポリペプチドの一つまたは複数をコードするDNAまたはRNAを患者に投与することができる。このアプローチは、例えば、Wolffら、Science 247,1465（1990）ならびに米国特許第5,580,859号；第5,589,466号；第5,804,566号；第5,739,118号；第5,736,524号；第5,679,647号；および国際公開公報第98/04720号に記載されている。DNA-ベースの送達技術の例は「裸のDNA」、促進された（ブピビカイン、ポリマー、ペプチド-媒介）送達、カチオン性脂質複合体、および粒子-媒介（「遺伝子銃」）または圧力-媒介送達を含む（例えば、米国特許第5,922,687号参照）。従って、本発明のペプチドワクチンはウイルスまたは細菌ベクターによって発現され得る。発現ベクターの例は、ワクシニアまたは鶏痘のような減弱化ウイルス宿主を含む。例えば、ワクシニアウイルスは、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現させるためのベクターとして用いられる。急性または慢性感染宿主への、または非感染宿主への導入に際して、組換えワクシニアウイルスは免疫原性ペプチドを発現し、それにより、免疫応答を誘発する。免疫化プロトコルで有用なワクシニアベクターおよび方法は、例えば、米国特許第4,722,848号に記載されている。もう1つのベクターはBCG（Bacille Calmette Guerin）である。BCGベクターはStoverら、Nature 351:456-460（1991）に記載されている。本発明のペプチドの治療的投与または免疫化で有用な広く種々の他のベクター、例えば、アデノおよびアデノ随伴ウイルスベクター、αウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌ベクター、解毒された炭疽トキシンベクター等は本明細書中の記載から当業者に明らかである。
【０２６６】
さらに、本発明によるワクチンは本発明の一つまたは複数のC35ペプチドエピトープを含むことができる。従って、C35ペプチドエピトープまたはC35ペプチドエピトープアナログを個々にワクチンに存在させることができるか；または、ペプチドエピトープまたはアナログは同一ペプチドエピトープまたはアナログの複数コピーとして（ヘテロポリマー）、または複数の異なるペプチドエピトープまたはアナログとして（ヘテロポリマー）存在させることができる。ポリマーは免疫学的反応に対する増大した確率を有し、および異なるペプチドエピトープまたはアナログを用いてポリマーを作成する場合、免疫応答のために標的化された抗原の異なる抗原決定基と反応する抗体および/またはT細胞を誘導する能力の利点を有する。組成物は天然に生じる抗原の領域であり得るか、あるいは例えば組換えにより、または化学合成により調製することができる。
【０２６７】
本発明のワクチンで用いることができる担体は当技術分野において周知であり、例えば、チログロブリン、ヒト血清アルブミンのようなアルブミン、破傷風トキソイド、ポリL-リシン、ポリL-グルタミン酸のようなポリアミノ酸、インフルエンザウイルスタンパク質、B型肝炎ウイルスコアタンパク質などを含む。前記ワクチンは水または生理食塩水、好ましくはリン酸緩衝化生理食塩水のような生理学的に許容される希釈剤を含むことができる。一般に、ワクチンはアジュバントも含む。不完全フロイントアジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウムまたはミョウバンのようなアジュバントは当技術分野において周知の物質の例である。加えて、本明細書中に開示するように、本発明のペプチドをトリパルミトイル-S-グリセリル-システイニル-セリル-セリン（P3CSS）のような脂質にコンジュゲートさせることによってCTLの応答の起点とすることができる。
【０２６８】
注射（例えば、皮下、皮内、筋肉内、エアロゾル、経口、経皮、経粘膜、腔内、鞘内）、または他の適当な経路を介する本発明によるペプチド組成物での免疫化に際し、宿主の免疫系は、所望の抗原に対して特異的な抗体、CTLおよび/またはHTLを生じさせることによってワクチンに応答する。その結果、宿主はTAAへの引き続いての暴露に対して少なくとも部分的に免疫となり、あるいは腫瘍関連抗原-担持細胞のさらなる発生に対して少なくとも部分的に抵抗性となり、それにより、予防または治療利点を駆動する。
【０２６９】
ある種の態様においてT細胞応答を誘導する成分を、対象となる標的抗原に対する抗体応答を誘導する成分と組み合わせる。そのような組成物の好ましい態様は本発明によるクラスIおよびクラスIIエピトープを含む。または、組成物は、PADRE（商標）分子（Epimmune,San Diego,CA）と共に、本発明によるクラスIおよび/またはクラスIIエピトープを含む。
【０２７０】
本発明のワクチン組成物は、本発明のペプチドを提示するための溶剤として樹状細胞のような抗原提示細胞を含むことができる。例えば、樹状細胞は、例えば、本発明によるミニ遺伝子構築体でトランスフェクトされて、免疫応答を誘発する。ミニ遺伝子は以下の段落でより詳細に議論する。ワクチン組成物は、樹状細胞動員および収穫に続いてインビトロで作り出すことができ、それにより、樹状細胞の負荷がインビトロで起こる。
【０２７１】
本発明のワクチン組成物は、インターフェロン-αのような抗ウイルス薬物、またはIL-12、GM-CSF等のような免疫アジュバントと組み合わせて用いることもできる。
【０２７２】
好ましくは、ワクチンに含めるエピトープを選択する場合（ペプチドベースまたは核酸-ベースの処方のいずれか）を選択する場合、以下の原理が利用される。以下の原理の各々は選択をなすためにバランスさせることができる。複数エピトープをワクチンで用いるべき場合、エピトープは、エピトープが由来する天然抗原において配列が連続させることができるが、必ずしも必要でない。
【０２７３】
1）投与に際し、TAA-発現腫瘍の予防またはクリアランスに相関することが観察されている免疫応答を模倣するエピトープが選択される。HLAクラスIについては、これは、一般に、少なくとも1つのTAAに由来する3〜4のエピトープを含む。
【０２７４】
2）免疫原性に相関することが確立された必要な結合親和性:HLAクラスIでは、500nM以下のIC50、またはクラスIIについては、1000nM以下のIC50を有するエピトープが選択される。HLAクラスIについては、200nM以下のIC50を有するペプチドを選択するのが現在好ましい。というのは、これは、免疫応答の誘導のみならず、同様にインビトロ腫瘍細胞殺傷に良好に相関すると信じられているからである。
【０２７５】
3）スーパーモチーフ担持-ペプチド、または対立遺伝子-特異的モチーフ-担持ペプチドの十分なアレイを選択して、広い集団網羅を与える。一般に、少なくとも80％の集団網羅を有するのが好ましい。モンテカルロ分析、当技術分野において知られた統計学的評価を使用して、集団網羅の幅を評価することができる。
【０２７６】
4）癌関連抗原からエピトープを選択する場合、選択においてアナログペプチドを含めるのが好ましくあり得る。なぜならば、患者は天然エピトープに対して発生した寛容を有し得るからである。感染病関連抗原についてのエピトープを選択する場合、天然またはアナログエピトープのいずれかを選択するのが現在好ましい。
【０２７７】
5）特に関連するのは「ネステッドエピトープ」である。ネステッドエピトープ（エピトープアナログ）、少なくとも2つのエピトープまたはアナログ（またはエピトープおよびアナログ）が与えられたポリペプチド配列と重複する場合に起こる。「卓越したネステッドエピトープ」を含むポリペプチドは、その中にHLAクラスIおよびHLAクラスIIエピトープおよび/またはアナログを共に有するポリペプチドである。ネステッドエピトープを提供する場合、提供された配列当たり最大数のエピトープまたはアナログを有する配列を提供するのが好ましい。好ましくは、ペプチドエピトープまたはアナログの組み合わされた長さよりも長いポリペプチドを提供するのを避ける。ネステッドエピトープを含むポリペプチドを提供する場合、ポリペプチドを評価して、それが病理学的または他の有害な生物学的特性を有さないことを保証するのが重要である；これは感染性生物に向けられたワクチンで特に重要である。従って、好ましい態様において、本発明のワクチン組成物は、配列番号:2および図1BのI105〜V113、配列番号:2および図1BのT101〜V113、配列番号:2および図1BのE100〜V113、配列番号:2およびず1BのG99〜V113、配列番号:2および図1BのI93〜V113、配列番号:2および図1BのD88〜V113、配列番号:2および図1BのP84〜V113、配列番号:2および図1BのK77〜V113、配列番号:2および図1BのQ72〜V113、配列番号:2および図1BのF65〜V113、および配列番号:2および図1BのL59〜V113からなる群より選択される一つまたは複数のマルチエピトープポリペプチドを含む。
【０２７８】
6）もし1より多くのC35ペプチドエピトープまたはC35ペプチドエピトープアナログを含むポリペプチドが作られれば、またはミニ遺伝子を作る場合、目的は、対象となるエピトープ/アナログを含む最小のポリペプチドを作ることである。もしネステッドエピトープを含むポリペプチドを選択する場合に使用されるのと同一でなければ、この原理は同様である。しかしながら、人工ポリエピトープ性ポリペプチドに関しては、サイズの最小化の目的は、ポリエピトープ性ポリペプチドにおけるエピトープ間のいずれかのスペーサー配列を一体化させる必要性に対してバランスさせることである。スペーサーまたはリンカーアミノ酸残基を導入して、連結エピトープ（免疫系によって認識され、標的抗原に存在せず、かつエピトープのヒトが作成した並列によって作り出されるに過ぎないエピトープ）を回避し、あるいはエピトープの間の切断を促進し、それにより、エピトープ提示を増強させることができる。連結エピトープは一般には回避されるべきである。なぜならば、受容者は免疫応答をその非天然エピトープに対して生じさせることができるからである。特に関心があるのは「優性エピトープ」である連結エピトープである。優性エピトープは、他のエピトープに対する免疫応答が減少するか、または抑制されるそのような熱望する応答に至り得る。
【０２７９】
ミニ遺伝子ワクチン
複数エピトープの同時送達を可能にする多数の異なるアプローチが利用できる。複数C35ペプチドエピトープまたはアナログをコードする核酸は本発明の有用な態様である；区別されるエピトープ/アナログまたはポリエピトープ性ポリペプチドをコードすることができる。ミニ遺伝子に含めるべきエピトープまたはアナログは、好ましくは、上記の段落に記載したガイドラインに従って選択される。ミニ遺伝子に含めることができるアミノ酸配列の例は、HLAクラスIエピトープまたはアナログ、HLAクラスIIエピトープまたはアナログ、ユビキチン化シグナル配列、および/または得られるペプチドの小胞体への移動を促進するための小胞体（ER）シグナル配列のような標的化配列を含む。
【０２８０】
複数-エピトープミニ遺伝子の使用は、例えば、Ishiokaら、J.Immunol.162:3915-3925,1999；An,L.およびWhitton,J.L.,J.Virol.71:2292,1997；Thomson,S.A.ら、J.Immunol.157:822,1996；Whitton,J.L.ら、J.Virol.67:348,1993；Hanke,R.ら、Vaccine 16:426,1998にも記載されている。同様なアプローチを用いて、TAAエピトープをコードするミニ遺伝子を開発することができる。
【０２８１】
例えば、ヒト細胞における発現用の選択されたエピトープ（ミニ遺伝子）をコードするDNA配列を作るためには、エピトープのアミノ酸配列を逆翻訳することができる。ヒトコドン用法の表を用いて、各アミノ酸についてのコドン選択をガイドすることができる。これらのエピトープ-コード化DNA配列は、翻訳された場合に、連続したポリペプチド配列が作られるように、直接隣接させることができる。しかしながら、発現および/または免疫原性を最適化させるためには、エピトープの間の一つまたは複数のスペーサーまたはリンカーアミノ酸残基のようなさらなるエレメントをミニ遺伝子デザインに取り込むことができる。CTLおよびHTLエピトープのHLA提示は、CTLまたはHTLエピトープに隣接する合成（例えば、ポリ-アラニン）または天然に生じるフランキング配列を含めることによって改良することができる；エピトープ/アナログを含むこれらのより大きなポリペプチドは本発明の範囲内のものである。
【０２８２】
ミニ遺伝子配列は、ミニ遺伝子のプラスおよびマイナスストランドをコードするオリゴヌクレオチドを組み立てることによってDNAに変換することができる。重複オリゴヌクレオチド（30〜100塩基長）を合成し、リン酸化し、精製し、周知の技術を用いて適当な条件下でアニールすることができる。オリゴヌクレオチドの末端は、例えば、T4DNAリガーゼを用いて連結することができる。次いで、エピトープポリペプチドをコードするこの合成ミニ遺伝子を所望の発現ベクターにクローニングすることができる。
【０２８３】
当業者に周知の標準調節配列を好ましくはベクターに含めて、標的細胞における発現を確実とする。いくつかのベクターエレメントが望ましい。ミニ遺伝子挿入用の下流クローニング部位を有するプロモーター；効果的な転写終結用のポリアデニル化シグナル；大腸菌複製起点；および大腸菌選択マーカー（例えば、アンピシリンまたはカナマイシン抵抗性）。多数のプロモーター、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（hCMV）プロモーターをこの目的で用いることができる。例えば、他の適当なプロモーター配列については、米国特許第5,580,859号および第5,589,466号参照。
【０２８４】
最適化されたペプチド発現および免疫原生は、ミニ遺伝子構築体に対するある種の修飾によって達成することができる。例えば、いくつかの場合において、イントロンは効果的な遺伝子発現を促進し、従って、一つまたは複数の合成または天然に生じるイントロンをミニ遺伝子の転写された領域に取り込むことができる。mRNA安定化配列、および哺乳動物細胞における複製用の配列を含めることも、ミニ遺伝子の発現を増加させるのに考慮することができる。
【０２８５】
一旦発現ベクターが選択されれば、ミニ遺伝子をプロモーターの下流のポリリンカー領域にクローニングする。このプラスミドを適当な細菌株に形質転換し、標準的な技術を用いてDNAを調製する。ミニ遺伝子の向きおよびDNA配列、ならびにベクターに含まれた全ての他のエレメントは、制限マッピングおよびDNA配列分析を用いて確認される。正しいプラスミドを保有する細菌細胞はセルバンクとして貯蔵することができる。
【０２８６】
加えて、免疫刺激配列（ISSまたはCpGs）は、DNAワクチンの免疫原性で役割を演じているようである。これらの配列は、免疫原性を増強するためのミニ遺伝子コード配列の外部で、ベクターに含めることができる。
【０２８７】
いくつかの態様において、ミニ遺伝子がコードするエピトープおよび第二のタンパク質（例えば、免疫原性を変調するもの）双方の産生を可能とするビ-シストロニック発現ベクターを用いることができる。もしエピトープと共に発現されれば、免疫応答を増強することができるタンパク質またはポリペプチドの例はサイトカイン（例えば、IL-2、IL-12、GM-CSF）、サイトカイン-誘導分子（例えば、LeIF）、共刺激性分子、または汎-DR結合タンパク質（PADRE（商標）,Epimmune,San Diego,CA）を含む。PADRE（商標）分子のようなヘルパT細胞（HTL）エピトープを細胞内標的化シグナルに連結し、発現されたCTLエピトープとは別に発現させることができる。これを行って、HTLエピトープを、CTLエピトープ、HLAクラスII経路へのHTLエピトープのより効果的な侵入を提供するもののそれとは異なる細胞区画に向け、それにより、HTL誘導を改良することができる。HTLまたはCTL誘導とは対照的に、免疫抑制分子（例えば、TGF-β）の共発現による免疫応答の特異的減少はある種の病気において有益であろう。
【０２８８】
治療量のプラスミドDNAは、例えば、大腸菌における発酵、続いての精製によって作成することができる。活動しているセルバンクからのアリコットを用いて増殖培地を接種し、これを、周知の技術に従い、シェーカーフラスコまたはバイオリアクター中で飽和するまで増殖させる。プラスミドDNAは、例えば、QIAGEN,Inc.（Valencia,California）から入手可能な固相アニオン交換樹脂のような一般的なバイオ分離技術を用いて精製される。必要であれば、スーパーコイルドDNAは、ゲル電気泳動または他の方法を用い、開いた環状および線状形態から単離することができる。
【０２８９】
精製されたプラスミドDNAは、種々の処方を用いて注射用に調製することができる。これらのうち最も単純なのは、滅菌リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）中での凍結乾燥DNAの復元である。「裸のDNA」として知られたこのアプローチは、現在、臨床試験において筋肉内（IM）投与で用いられている。ミニ遺伝子ワクチンの免疫療法効果を最大化するためには、精製されたプラスミドDNAを処方する別の方法を用いることができる。種々のそのような方法が記載されており、新しい技術が利用できるようになるであろう。カチオン性脂質、糖脂質および融合誘導リポソームを前記処方で用いることもできる（例えば、国際公開公報第93/24640号；Mannino ＆ Gould-Fogerite,BioTechniques 6（7）:682（1988）；米国特許第5,279,833号；国際公開公報第91/06309号；およびFelgnerら、Proc.Nat's Acad.Sci.USA84:7413（1987）参照）。加えて、集合的に保護的な、相互作用性の非縮合化合物（PINC）というペプチドおよび化合物を精製されたプラスミドDNAに複合体化して、安定性、筋肉内分散、または特異的器官または細胞型への輸送のような変数に影響させることもできる。
【０２９０】
標的細胞感作は、ミニ遺伝子がコードするエピトープの発現およびHLAクラスI提示の機能的アッセイとして用いることができる。例えば、プラスミドDNAは、標準的CTLクロム放出アッセイ用の適当な標的である哺乳動物細胞系に導入される。用いるトランスフェクション方法は最終処方に依存し、エレクトロポレーションを「裸の」DNAで用いることができ、他方、カチオン性脂質は直接的インビトロトランスフェクションを可能とする。緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するプラスミドを共トランスフェクトして、蛍光活性化細胞ソーティング（FACS）を用いるトランスフェクト細胞の濃縮を可能とすることができる。次いで、トランスフェクトされた細胞をクロム-51（51Cr）標識し、エピト-プ特異的CTL用の標的として用いる。51Cr放出によって検出される標的細胞の細胞溶解は、ミニ遺伝子にコードされたCTLエピトープの生成およびHLA提示双方を示す。HTLエピトープの発現は、HTL活性を評価するためのアッセイを用いて同様に見積もることができる。
【０２９１】
インビボ免疫原性は、ミニ遺伝子DNA処方の機能的試験のための第二のアプローチである。適当なヒトHLAタンパク質を発現するトランスジェニックマウスをDNA産物で免疫化する。投与の容量および経路は処方に依存する（例えば、PBS中のDNAについては筋肉内、脂質-複合体化DNAについては腹腔内（IP））。免疫化から11日または21日後、脾臓細胞を収穫し、試験すべき各エピトープをコードするペプチドの存在下で1週間再度刺激する。その後、CTLについては、標準アッセイを行って、ペプチド-負荷51Cr-標識標的細胞の細胞溶解があるかを測定する。もう一度、ミニ遺伝子におけるものに対応するエピトープに暴露された標的細胞の溶解は、DNAワクチンの機能およびCTLの誘導を示す。HTLエピトープの免疫原性は、類似の方法でトランスジェニックマウスで見積もられる。
【０２９２】
または、例えば、米国特許第5,204,253号に記載されているような弾道送達を用いて投与することができる。この技術を用い、DNAだけからなる粒子を投与する。弾道送達についてのさらなる別の態様において、DNAを金粒子のような粒子に付着させることができる。
【０２９３】
CTLペプチドとヘルパーペプチドとの組合せ
本発明のCTLペプチドを含むワクチン組成物は、改良された血清半減期、広がった集団網羅または増強された免疫原性のような所望の属性を提供するように修飾することができる。
【０２９４】
例えば、CTL活性を誘導するペプチドの能力は、少なくとも1つのHTLエピトープを含む配列にCTLペプチドを連結することによって増強させることができる。
【０２９５】
CTLペプチドはTヘルパーペプチドに直接連結することができるが、特に好ましいCTLエピプトープ/HTLエピトープコンジュゲートはスペーサー分子によって連結される。前記スペーサーは、典型的には、生理学的条件下で実質的に非荷電である比較的小さな中性分子、例えば、アミノ酸またはアミノ酸ミメティックからなる。スペーサーは、典型的には、例えば、Ala、Gly、または非極性アミノ酸または中性極性アミノ酸の他の中性スペーサーから選択される。任意のスペーサーは同一残基からなる必要が無く、従って、ヘテロ-またはホモ-オリゴマーであり得ることは理解されるであろう。存在すれば、スペーサーは、通常、少なくとも1または2の残基、通常は3〜13、より頻繁には3〜6残基であろう。CTLペプチドエピトープは、そのアミノまたはカルボキシル末端のいずれかにおいて直接的にまたはスペーサーを介してTヘルパーペプチドエピトープに連結させることができる。CTLペプチドまたはHTLペプチドのいずれかのアミノ末端をアセチル化することができる。
【０２９６】
ある態様においては、Tヘルパーペプチドは、集団の大部分に存在するTヘルパー細胞によって認識されるものである。これは、HLAクラスII分子の多く、ほとんどまたは全てに結合するアミノ酸配列を選択することによって達成することができる。これらは「緩くHLA-制限」または「乱交雑」Tヘルパー配列として知られている。乱交雑であるアミノ酸配列の例は、位置830-843
2005528914.tif 000246
における破傷風トキソイド、位置378-398
2005528914.tif 000247
における熱帯熱マラリア原虫CSタンパク質、および位置116
2005528914.tif 000248
における連鎖球菌18kDタンパク質のような抗原からの配列を含む。他の例はDR1-4-7スーパーモチーフを担うペプチド、またはDR3モチーフのいずれかを含む。
【０２９７】
または、天然には見出すことができないアミノ酸配列を用い、緩くHLA-制限された様式で、Tヘルパーリンパ球を刺激することができる合成ペプチドを調製することが可能である。合成化合物は、汎-DR-結合エピトープ（例えば、PADRE（商標）,Epimmune Inc.,San Diego,CA）と呼ばれる分子のファミリー内にある。PADRE（商標）ペプチドは、複数HLA-DR（ヒトHLAクラスII）分子に結合するように設計される。例えば、式:
2005528914.tif 000249
（式中、「X」はシクロヘキシルアラニン、フェニルアラニンまたはチロシンのいずれかであり；「Z」はトリプトファン、チロシン、ヒスチジンまたはアスパラギンのいずれかであり；および「a」はD-アラニンまたはL-アラニンである）を有する汎-DR-結合エピトープペプチドは、多数の対立遺伝子-特異的HLA-DR分子に結合することが判明している。従って、これらの分子が、そのHLAタイプに拘わらず、ほとんどの個体からのTヘルパーリンパ球応答を刺激する。ある種の汎-DR結合エピトープは、全て、「L」天然アミノ酸を含み；これらの分子はペプチドとして、またはペプチドをコードする核酸の形態で提供することができる。
【０２９８】
HTLペプチドエピトープは、その生物学的特性を改変するように修飾することができる。HTLペプチドエピトープはCTLペプチドと同一の方法で修飾することができる。例えば、それは、D-アミノ酸を含むように、または脂質、タンパク質、糖等のような他の分子にコンジュゲートするように修飾することができる。D-アミノ酸を含むペプチドは、一般に、プロテアーゼに対する増大した抵抗性を有し、従って、延長された血清半減期を有する。
【０２９９】
加えて、本発明の一つまたは複数のペプチドエピトープを含むポリペプチドは、脂質、タンパク質または糖、またはいずれかの他の合成化合物のような他の分子にコンジュゲートさせて、その生物学的活性を増加させることができる。例えば、Tヘルパーペプチドは、アミノまたはカルボキシル末端のいずれかの一つまたは複数のパルミチン酸鎖にコンジュゲートさせることができる。
【０３００】
CTLペプチドとT細胞プライミング材料との組合せ
幾つかの態様においては、細胞傷害性Tリンパ球を初回免疫する少なくとも1つの成分を本発明の薬学的組成物に含めるのが望ましいであろう。脂質は、ウイルス抗原に対するインビトロCTL応答をプライミングするのを容易とすることができる剤と特定されてきた。例えば、パルミチン酸残基をリシン残基のε-およびα-アミノ基に付着させ、次いで免疫原生ペプチドに連結させることができる。Gly、Gly-Gly-、Ser、Ser-Ser等のような一つまたは複数の連結部位を用いることができる。次いで、脂質化ペプチドをミセルまたは粒子に直接投与し、リポソームに取り込み、またはアジュバント、例えば、不完全フロイントアジュバント中に乳化させることができる。好ましい免疫原性組成物は、免疫原性ペプチドのアミノ末端に付加された連結部位、例えば、Ser-Serを介してLysのε-およびα-アミノ基に付着されたパルミチン酸を含む。
【０３０１】
CTL応答の脂質-促進プライミングのもう1つの態様において、トリパルミトイル-S-グリセリル-システイニル-セリル-セリン（P3CSS）のような大腸菌リポタンパク質を用いて、適当なペプチドに共有結合している場合にCTLをプライムすることができる（例えば、Deresら、Nature 342:561,1989参照）。従って、本発明のペプチドをP3CSSにカップリングさせることができ、前記リポペプチドを個体に投与して、標的抗原に対するCTL応答を特異的にプライムすることができる。さらに、抗体を中和する誘導はP3CSS-コンジュゲーテッドエピトープでプライムすることができる故に、2つのそのような組成物を組み合わせて、液性および細胞媒介応答双方を誘発することができる。
【０３０２】
CTLおよび/またはHTLペプチドでパルスされた樹状細胞を含むワクチン組成物
本発明によるワクチン組成物の態様は、患者の血液からのPBMC、またはそれから単離されたDCへ、エピトープ-担持ペプチドのカクテルをエキソビボ投与することを含む。Progenipoietin（商標）（Monsanto,St.Louis,MO）またはGM-CSF/IL-4のような、DCの収穫を促進するための医薬品を用いることができる。ペプチドでDCをパルスした後、患者への再注入に先立ち、DCを洗浄して未結合ペプチドを除去する。この態様においては、ワクチンは、HLA分子におけるパルスペプチドエピトープをその表面に提示するペプチド-パルスDCを含む。
【０３０３】
その幾つかは対象となる一つまたは複数の抗原、例えば、HER2/neu、p53、MAGE2、MAGE3、および/または癌胚性抗原（CEA）のような腫瘍関連抗原（TAA）に対するCTL応答を刺激するペプチドのカクテルでDCをエキソビボにてパルスすることができる。集合的に、これらのTAAを乳癌、結腸癌および肺癌と関係付ける。任意で、PADRE（商標）のようなヘルパT細胞（HTL）ペプチドを含めて、CTL応答を促進することができる。従って、HER2/neu、p53、MAGE2、MAGE3、および癌胚性抗原（CEA）からのエピトープを含む本発明によるワクチンを用いて、乳癌、結腸癌または肺癌のような悪性疾患を有する患者において最小または残存病を治療し；これらのTAAのいずれかを担ういずれの悪性疾患も前記ワクチンで治療することができる。TAAワクチンは、外科処置、放射線療法または化学療法のようなデバルキング手法に従って用いることができ、その際、前記ワクチンは、受容者において病気のない生存および全体的な生存を増加させる利点を提供する。
【０３０４】
従って、好ましい態様において、本発明のワクチンは、多数の異なる腫瘍タイプにわたって患者の大部分を治療する製品である。複数のエピトープ、好ましくはスーパーモチーフ-担持エピトープを含むワクチンはそのような利点を供する。
【０３０５】
療法または予防目的のためのワクチンの投与
その薬学的およびワクチン組成物を含めた本発明の一つまたは複数のペプチドエピトープを含むポリペプチドは、病気を治療および/または予防するために哺乳動物、特にヒトに投与するのに有用である。1つの態様において、本発明のワクチン組成物（ペプチドまたは核酸）を、一つまたは複数のTAAの発現に関連する悪性疾患を有する患者に、またはTAA関連病に罹患性であり、またはそうでなければ前記病気を発症する危険性がある個人に投与される。投与に際して、TAAに対して免疫応答が誘発され、それにより、患者自身の免疫応答能力を増強させる。治療的適用においては、ペプチドおよび/または核酸組成物を、TAA-発現細胞に対して効果的な免疫応答を誘発し、それにより、兆候および/または合併症を治癒し、阻止し、または遅らせるのに十分な量で患者に投与される。これを達成するのに適切な量は「治療上有効な用量」と定義される。この用途で効果的な量は、例えば、投与される特定の組成物、投与の方法、治療すべき病気の段階および重傷度、患者の体重および健康の一般的な状態、主治医の判断に依存するであろう。
【０３０６】
本発明のワクチン組成物は、予防剤として純粋に用いることができる。一般に、初期予防免疫化のための用量は、一般に、単位用量範囲にて生じ、そこでは、より低い値は約1、5、50、500または1000μgのペプチドであり、より高い値は約10,000；20,000；30,000；または50,000μgのペプチドである。ヒトについての用量の値は、典型的には、70キログラムの患者当たり約500μg〜約50,000μgのペプチドの範囲である。これに続いて、約1.0μg〜約50,000μgのペプチドの間のブースター用量が投与され、これは、ワクチンの初期投与から約4週間〜6ヶ月後に規定された間隔で投与される。ワクチンの免疫原生は、患者の血液試料から得られたCTLおよびHTLの特定の活性を測定することによって評価することができる。
【０３０７】
前記したように、本発明のCTLおよび/またはHTLエピトープを含むポリペプチドは、HLA分子によって提示され、前記ペプチドに含まれるエピトープに特異的なCTLまたはHTLと接触すると、免疫応答を誘導する。ペプチドをCTLまたはHTLと接触させる方法は本発明では臨界的ではない。例えば、前記ペプチドはインビトロまたはインビボのいずれかでCTLまたはHTLと接触させることができる。もし接触がインビボで起これば、本明細書中で記載するように、ペプチドは直接的に、または他の形態溶剤、例えば、一つまたは複数のペプチドをコードするDNAベクター、前記ペプチドをコードするウイルスベクター、およびリポソーム、樹状細胞のような抗原提示細胞等にて投与される。
【０３０８】
従って、ペプチドまたはポリペプチドの形態の薬学的組成物では、ペプチドまたはポリペプチドは直接的に投与することができる。または、前記ペプチド/ポリペプチドは間接的に投与し、APCに提示され、またはそれをコードするDNAとして投与することができる。さらに、ポリペプチド、ペプチドエピトープまたはそれをコードするDNAを個々にまたは一つまたは複数のペプチド配列の融合として投与することができる。
【０３０９】
治療的使用では、投与は、一般に、TAA関連病の初期診断の時点で開始すべきである。これに続いて、少なくとも兆候が実質的に軽減するまでブースター用量をその後ある期間投与する。慢性病気状態においては、負荷用量、続いてのブースター用量が必要であろう。
【０３１０】
初期治療免疫化のための用量は、一般に単位用量範囲で起こり、そこでは、より低い値は約1、5、50、500、または1,000μgのペプチドであり、より高い値は約10,000、20,000、30,000、または50,000μgのペプチドである。ヒトについての用量の値は、典型的には、70キログラムの患者当たり約500μg〜約50,000μgのペプチドの範囲である。数週間〜数ヶ月にわたるブースター投与計画に従って投与される約1.0μg〜約50,000μgのペプチド間のブースター用量は、患者の応答および状態に依存して投与することができる。患者の応答は、患者の血液から得られたCTLおよびHTLの特異的活性を測定することによって決定することができる。
【０３１１】
ある態様において、本発明のポリペプチド、ペプチドおよび組成物は深刻な病気状態で用いられる。そのような場合、最小量の外来性物質およびペプチドの相対的非毒性性質の結果として、これらの述べられた投与量に対して実質的に過剰なこれらのペプチド組成物を投与するのが可能であり、かつ望ましいであろう。
【０３１２】
慢性病の治療では、代表的な用量は前記開示の範囲にあり、すなわち、そこでは、より低い値は70キログラムの患者当たり約1、5、50、500、または1,000μgのペプチドであって、より高い値は約10,000、20,000、30,000、または50,000μgのペプチド、好ましくは約500μg〜約50,000μgのペプチドである。初期用量、続いての確立された間隔での、例えば、4週間〜6ヶ月でのブースター用量が、恐らくは、個体を効果的に免疫化するために長期間必要であろう。慢性病の場合には、投与は、少なくとも臨床兆候または実験室的試験が、前記病気が排除され、または実質的に軽減されることを示すまで、およびその後追跡期間の間継続すべきである。用量、投与経路および投与スケジュールは当技術分野において知られた方法に従って調整される。
【０３１３】
治療的処置のための薬学的組成物は非経口、局所、経口、鞘内または局所的投与で意図される。好ましくは、薬学的組成物は非経口、例えば、静脈内、皮下、皮内または筋肉内に投与される。
【０３１４】
従って、好ましい態様においては、本発明は、許容される担体、好ましくは水性担体に溶解または懸濁させた免疫原性ペプチドの溶液を含む非経口投与用の組成物を提供する。種々の水性担体、例えば、水、緩衝化水、0.8％生理食塩水、0.3％グリシン、ヒアルロン酸等を用いることができる。これらの組成物は慣用的な周知の滅菌技術によって滅菌することができるか、あるいは滅菌濾過することができる。得られた水性溶液はそのままで用いるために包装するか、あるいは凍結乾燥することができ、凍結乾燥された製剤は投与に先立って滅菌溶液と組み合わされる。組成物は、pH-調整および緩衝化剤、等張性調整剤、湿潤剤、保存剤等、例えば、酢酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート等のような、生理学的条件を近似するのに必要であろう薬学的に許容される補助物質または薬学的賦形剤を含むことができる。
【０３１５】
薬学的処方中の本発明のペプチドおよびポリペプチドの濃度は、広く、すなわち、約0.1％未満、通常は、または少なくとも約2％から20重量％〜50重量％以上と多くまで変化させることができ、選択された特定の投与様式に従い、これは、流体容量、粘度等によって一義的に選択される。
【０３１６】
ペプチドおよびポリペプチド組成物のヒト単位投与形態は、典型的には、やはりヒト単位用量の許容される担体、好ましくは水性担体を含み、ヒトへのそのような組成物の投与で用いるべき当業者に知られた流体の用量で投与される薬学的組成物に含ませる（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences,第17版,A.Gennaro編,Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania,1985参照）。
【０３１７】
本発明のペプチドおよびポリペプチドはリポソームを介して投与することもでき、これは、ペプチドおよびポリペプチドをリンパ組織のような特定の組織に標的化し、または感染された細胞に選択的に標的化して、同様に、ペプチド組成物の半減期を増大させるように働く。リポソームはエマルジョン、フォーム、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散液、ラメラ層を含む。これらの製剤において、送達すべきペプチドおよびポリペプチドは、単独で、または（CD45抗原に結合するモノクローナル抗体のような）リンパ系細胞の中でも広く用いられている受容体に結合する分子と、または他の治療または免疫原性組成物と組み合わせてリポソームの一部として一体化させる。従って、本発明の所望のペプチドを充填した、またはそれで修飾したリポソームはリンパ系細胞の部位に向けることができ、そこでは、リポソームは次いでペプチド組成物を送達する。本発明で用いられるリポソームは、一般に、中性および負に荷電したリン脂質およびコレステロールのようなステロールを含む標準的な小胞-形成性脂質から形成される。脂質の選択は、一般には、例えば、リポソームのサイズ、酸不安定性および血流におけるリポソームの安定性を考慮することによってガイドされる。例えば、Szokaら、Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467（1980）、および米国特許第4,235,871号、第4,501,728号、第4,837,028号、および第5,019,369号に記載された、種々の方法がリポソームを調製するのに利用できる。
【０３１８】
免疫系の細胞に対して本発明の組成物を標的化するためには、リガンド、例えば、所望の免疫系細胞の細胞表面決定基に特異的な抗体またはその断片をリポソームに一体化させることができる。ペプチドを含有するリポソーム懸濁液は、とりわけ、投与の方法、送達されるべきペプチド、および治療すべき病気の段階に従って変化する用量にて、静脈内、局所、局所的等にて投与することができる。
【０３１９】
固体組成物では、慣用的な非毒性固体担体を用いることができ、これは、例えば、薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等を含む。経口投与では、薬学的に許容される非毒性組成物はこれまでに列挙した担体のような通常使用される賦形剤のいずれか、および一般に10〜95％の有効成分、すなわち、本発明の一つまたは複数のペプチド（しばしば25％〜75％の濃度）を配合することによって形成される。
【０３２０】
エアロゾル投与では、免疫原性ペプチドは、好ましくは、界面活性剤および噴霧剤と共に微粉砕形態で提供される。ペプチドの典型的な割合は0.01重量％〜20重量％、しばしば1％〜10％である。界面活性剤は、もちろん、薬学的に許容されるものであって、好ましくは噴霧剤に可溶性でなければならない。そのような剤の代表は、脂肪族多価アルコールまたはその環状アンヒドリドと共にカプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、ハルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリン酸およびオレイン酸のような6〜22個の炭素原子を含む脂肪酸のエステルまたは部分エステルである。混合または天然グリセリドのような混合エステルを使用することができる。界面活性剤は組成物の0.1重量％〜20重量％、好ましくは0.25〜5％を構成することができる。組成物の残りは通常は噴霧剤であるが、噴霧剤が必要ではなく、従って、他の割合を調整するアトマイザを用いることができる。また、担体、例えば、鼻孔内送達用のレシチンを含めることもできる。
【０３２１】
本発明の抗原性ペプチドはCTLおよび/またはHTL応答を同様にエキソビボで誘発するのに用いられてきた。得られたCTLまたはHTLを用いて、他の慣用的な療法形態には応答しない、または治療ペプチドまたは核酸ワクチンに応答しない患者において慢性感染または腫瘍を本発明に従って治療することができる。特定の抗原（感染性または腫瘍関連）に対するエキソビボCTLまたはHTL応答は、その組織培養にて樹状細胞のような抗原提示細胞（APC）の源、および適当な免疫原性ペプチドと共に、患者のまたは遺伝的に適合するCTLまたはHTL前駆体細胞をインキュベートすることによって誘導される。前駆体細胞が活性化され、増殖されてエフェクター細胞となる適当なインキュベーション時間（典型的には約7〜28日）後に、前記細胞を患者に注入して戻し、そこで、細胞はその特異的標的細胞（感染細胞または腫瘍細胞）を破壊し（CTL）またはその破壊を促進する（HTL）。
【０３２２】
多くのコンピューターアルゴリズムは、より大きなタンパク質におけるペプチドの同定に関し記載されている。これは、特定のMHCクラスI分子またはMHCクラスII分子に対するペプチド結合モチーフの必要性を満たし得る。MHC分子の過剰な多形性のために、異なるペプチドは、しばしば、異なるMHC分子に結合する。表1〜3は、3つの異なるアルゴリズムを使用してMHC結合ペプチドであることが推定されるC35ペプチドを列挙する。詳細には、表1および表5は、SYFPEITHIウェブサイト（wysiwyg：//35/http：//134.2.96.221/scripts/hlaserver.dll/EpPredict.htm）において見られ、そしてRammensee,H.G., Bachmann,J.およびStevanovic,S.による本「MHC  Ligands  and  Peptide  Motifs」（Chapman＆Hall, New York、1997）に基づく法則を使用して推定されたC35  HLAクラスIエピトープおよびC35  HLAクラスIIエピトープを列挙する。表2は、ウェブ（http：//bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform）において利用可能なNIH  BIMASプログラムを使用するC35配列由来の推定MHC結合ペプチドを列挙する。最後に、表3および6は、Tエピトーププログラムによって同定されたC35ペプチドを列挙し、これは、複数の異なるMHCクラスII分子に結合し得るペプチドの推定のためのプログラムである。Tエピトープを使用して、4つのC35ペプチドは、種々のHLAクラスII分子に結合する候補であるようだとして同定された。一般に、これらのペプチドは、HLAクラスIに結合するペプチドよりも長く、そして複数のHLAクラスII分子への結合の点で、さらに重複する。
【０３２３】
（表１）SYFPEITHIウェブサイトで予測されるC35ペプチド（スコアは連結強度を示す）
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【０３２４】
（表２）HLAペプチドモチーフ検索結果
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エコーされたユーザーペプチド配列
（長さ＝115残基）
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エコーされたユーザーペプチド配列
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エコーされたユーザーペプチド配列
（長さ＝115残基）
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（長さ＝115残基）
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（長さ＝115残基）
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（長さ＝115残基）
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（長さ＝115残基）
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（長さ＝115残基）
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（長さ＝115残基）
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（長さ＝115残基）
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（長さ＝115残基）
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（長さ＝115残基）
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（長さ＝115残基）
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（長さ＝115残基）
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（長さ＝115残基）
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（長さ＝115残基）
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（長さ＝115残基）
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（長さ＝115残基）
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（長さ＝115残基）
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（長さ＝115残基）
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（長さ＝115残基）
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（長さ＝115残基）
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（長さ＝115残基）
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（長さ＝115残基）
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（長さ＝115残基）
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（長さ＝115残基）
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（長さ＝115残基）
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（長さ＝115残基）
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（長さ＝115残基）
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（長さ＝115残基）
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（長さ＝115残基）
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エコーされたユーザーペプチド配列
（長さ＝115残基）
【０３２５】
（表３）
重要：Tエピトープを、Cys残基をAlaとして評価するようプログラムした。なぜならば、合成およびアッセイの制限のために、Cysを含むペプチドを系統的に試験することが不可能であったからである。予想配列がCys残基を含む場合は常にCys残基をAla残基と置き換えてしてこれらを合成することを、本発明者らは提案する。
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【０３２６】
変化したペプチドリガンド
特定のヒトT細胞株を用いるMHCクラスI抗原についてのC35の免疫優性エピトープの同定は、癌ワクチンにおけるそれらの首尾良い使用に対する重要な工程である。MHC結合残基でのアミノ酸置換を含む改変したC35ペプチドエピトープは、免疫機能を増強するために用いられる可能性を有する。このような変化したペプチドリガンド、または不規則変化の（heteroclitic）ペプチドは、本来のペプチドの濃度の100倍低い濃度でさえ、強力なT細胞アゴニストとなり得る（Dressel、A．ら、「Autoantigen  recognition  by  human  CD8  T  Cell  clones：enhanced  agonist  response  induced  by  altered  peptide  ligand」、J．Immunol．159：4943-51（1997））。これらの変化したペプチドリガンドは、2つの形態のリガンドであり得る：ペプチドとのT細胞レセプターの接触を増加させる（実験により決定されなければならない）形態の改変、およびアンカー残基を改良することによりペプチドのHLA結合を増大する形態。表4は、好適なアンカー残基を導入することか、または有害な残基を置換することにより、HLAクラスI結合を増大させる改変を明記する。
【０３２７】
（表４）HLAクラスI結合を増大させる改変
（他に示さない限り、例は、9アミノ酸残基のペプチドに適用する；10量体について、5位のアミノ酸を無視し、そして得られた9量体を評価する（http：//bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/hla_coefficient  viewing_page）。以下に列挙する改変を、既存のデータベースにおける現在のデータに基づく例として提供し、そして現在のところ公知および未知の両方の、全ての潜在的HLA分子を結合するペプチドの全ての潜在的変化の排他的リストであることは全く意図しない。）
【０３２８】
HLA  A＊0101
2位にSまたはTを有する任意の変化したペプチド
3位にDまたはEを有する任意の変化したペプチド
4位にPを有する任意の変化したペプチド
7位にA、F、I、L、M、P、V、またはYを有する任意の変化したペプチド
9位のアンカーにF、K、R、またはYを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド：
P1：P
P2：D、E、F、G、H、K、M、N、P、Q、R、W、Y
P3：E、K、R、W
P4：K、R
P7：D、E、G、R
P9：D、E、P。
【０３２９】
HLA  A＊0201
1位にF、I、K、L、M、V、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
2位のアンカーにI、L、M、Q、またはVを有する任意の変化したペプチド
3位にF、L、M、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
4位にDまたはEを有する任意の変化したペプチド
5位にFを有する任意の変化したペプチド
6位の補助アンカーにF、I、L、M、V、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
7位にFまたはWを有する任意の変化したペプチド
8位にF、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
9位のアンカーにI、L、T、またはVを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド：
P1：D、E、H、P
P2：C、F、H、K、N、P、R、S、W、Y
P3：D、E、K、R
P7：D、E、G、R
P8：I、V
P9：D、E、F、G、H、K、N、P、Q、R、S、W、Y。
【０３３０】
HLA-A＊0205
1位にF、I、K、L、M、V、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
2位のアンカーにE、I、L、M、Q、またはVを有する任意の変化したペプチド
3位にF、L、M、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
4位にDまたはEを有する任意の変化したペプチド
5位にF、Yを有する任意の変化したペプチド
6位の補助アンカーにF、I、L、M、V、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
7位にFまたはWを有する任意の変化したペプチド
8位にF、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
9位のアンカーにI、L、T、またはVを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド：
P1：D、E、P
P2：C、D、F、G、H、K、N、P、R、S、W、Y
P3：D、E、K、R
P7：D、E、R
P9：D、E、F、G、H、K、N、P、Q、R、S、W、Y。
【０３３１】
HLA-A＊03
1位にGまたはKを有する任意の変化したペプチド
2位のアンカーにI、L、M、Q、T、またはVを有する任意の変化したペプチド
3位にF、I、L、M、V、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
4位にE、G、またはPを有する任意の変化したペプチド
5位にF、I、P、V、W、Yを有する任意の変化したペプチド
6位にF、I、L、M、またはVを有する任意の変化したペプチド
7位にF、I、L、M、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
9位のアンカーにF、I、K、L、Q、またはYを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド：
P1：D、E、P
P2：D、E、F、G、H、K、N、R、S、W、Y
P7：G、K、R
P9：D、E、G、H、N、P、Q、S、T。
【０３３２】
HLA-A＊1101
1位にG、K、またはRを有する任意の変化したペプチド
2位のアンカーにI、L、M、Q、T、V、Yを有する任意の変化したペプチド
3位にF、I、L、M、V、W、Yを有する任意の変化したペプチド
7位にF、I、L、M、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
9位のアンカーにKまたはRを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド：
P1：D、E、P
P2：D、E、G、H、K、N、R、S、W
P7：K、R
P9：C、D、E、G、N、P、Q、S、T。
【０３３３】
HLA-A24
1位にKまたはRを有する任意の変化したペプチド
2位のアンカーにFまたはYを有する任意の変化したペプチド
3位にE、I、L、M、N、P、Q、またはVを有する任意の変化したペプチド
4位にD、E、またはPを有する任意の変化したペプチド
5位にI、L、またはVを有する任意の変化したペプチド
6位にFを有する任意の変化したペプチド
7位にNまたはQを有する任意の変化したペプチド
8位にEまたはKを有する任意の変化したペプチド
9位のアンカーにF、I、L、またはMを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド：
P1：P
P2：D、E、H、K、R
P9：D、E、G、H、K、P、Q、R。
【０３３４】
HLA-A＊3101
1位にKまたはRを有する任意の変化したペプチド
2位のアンカーにF、I、L、M、Q、T、V、またはYを有する任意の変化したペプチド
3位にF、I、L、M、V、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
6位にF、I、L、M、またはVを有する任意の変化したペプチド
7位にF、I、L、M、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
9位のアンカーにKまたはRを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド：
P1：D、E、P
P2：D、E、G、H、K、N、R、S
P7：K、R
P9：C、G、N、P、Q、S、T。
【０３３５】
HLA-A＊3302
1位にDまたはEを有する任意の変化したペプチド
2位のアンカーにI、L、M、S、V、またはYを有する任意の変化したペプチド
9位のアンカーにRを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド：
P1：K、P、R
P2：D、E、K、R
P9：D、E、F、G、N、P、W、Y。
【０３３６】
HLA-B7
1位にAを有する任意の変化したペプチド
2位のアンカーにA、P、またはVを有する任意の変化したペプチド
3位にMまたはRを有する任意の変化したペプチド
5位にPを有する任意の変化したペプチド
6位にRを有する任意の変化したペプチド
9位のアンカーにI、L、M、またはVを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド：
P1：P
P2：D、E、F、H、K、R、W、Y
P3：D、E
P9：D、E、F、G、H、K、N、P、Q、R、S、W、Y。
【０３３７】
HLA-B8
1位にDまたはEを有する任意の変化したペプチド
2位のアンカーにA、C、L、またはPを有する任意の変化したペプチド
3位にKまたはRを有する任意の変化したペプチド
4位にDまたはEを有する任意の変化したペプチド
5位にKまたはRを有する任意の変化したペプチド
9位のアンカーにI、L、M、またはVを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド：
P1：K、P、R
P2：D、E、F、G、H、K、Q、R、W、またはY
P3：D、E
P5：D、E
P9：D、E、F、G、H、K、N、P、Q、R、S、W、Y。
【０３３８】
HLA-B8（8量体ペプチド）
1位にDまたはEを有する任意の変化したペプチド
2位のアンカーにA、C、L、またはPを有する任意の変化したペプチド
3位にKまたはRを有する任意の変化したペプチド
4位にDまたはEを有する任意の変化したペプチド
5位にKまたはRを有する任意の変化したペプチド
8位にI、L、M、またはVを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド：
P1：K、P、R
P2：D、E、F、G、H、K、Q、R、W、またはY
P3：D、E
P5：D、E
P9：D、E、F、G、H、K、N、P、Q、R、S、W、Y。
【０３３９】
HLA-B14
1位にDまたはEを有する任意の変化したペプチド
2位のアンカーにKまたはRを有する任意の変化したペプチド
3位にF、I、L、M、P、V、W、Yを有する任意の変化したペプチド
5位にHまたはRを有する任意の変化したペプチド
6位にI、L、M、RまたはVを有する任意の変化したペプチド
7位にTを有する任意の変化したペプチド
9位のアンカーにI、L、M、またはVを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド：
P1：P
P2：D、E、F、W、またはY
P3：E、R
P5：E、W、Y
P9：D、E、G、H、K、N、P、Q、R。
【０３４０】
HLA-B＊2702
1位にKまたはRを有する任意の変化したペプチド
2位のアンカーにE、L、M、N、Q、またはRを有する任意の変化したペプチド
3位にF、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
9位のアンカーにF、I、L、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド：
P1：D、E、P
P2：D、F、G、H、K、W、またはY
P7：K
P9：D、E、G、K、N、P、Q、R、S。
【０３４１】
HLA-B＊27＊05（8量体ペプチド）
1位にKまたはRを有する任意の変化したペプチド
2位のアンカーにE、L、M、N、Q、またはRを有する任意の変化したペプチド
3位にF、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
8位のアンカーにF、I、K、L、M、R、V、またはYを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド：
P1：D、E、P
P2：D、F、G、H、K、W、またはY
P7：K
P9：D、E、G、K、N、P、Q、R、S。
【０３４２】
HLA-B＊3501（8量体ペプチド）
1位にKまたはRを有する任意の変化したペプチド
2位のアンカーにA、P、またはSを有する任意の変化したペプチド
3位にKまたはRを有する任意の変化したペプチド
4位にDまたはEを有する任意の変化したペプチド
5位にDまたはEを有する任意の変化したペプチド
8位のアンカーにF、I、L、M、V、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド：
P1：P
P2：D、E、F、H、K、R、W、Y
P3：D、E
P8：D、E、F、G、H、K、P、Q、R。
【０３４３】
HLA-B＊3701
2位のアンカーにDまたはEを有する任意の変化したペプチド
5位にIまたはVを有する任意の変化したペプチド
8位にF、L、またはMを有する任意の変化したペプチド
9位のアンカーにF、I、L、M、V、またはYを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド：
P1：P
P9：D、E、G、H、K、P、Q、R。
【０３４４】
HLA-B＊3801
2位のアンカーにF、H、P、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
3位にDまたはEを有する任意の変化したペプチド
4位にD、E、またはGを有する任意の変化したペプチド
5位にA、I、L、M、またはVを有する任意の変化したペプチド
8位にKまたはYを有する任意の変化したペプチド
9位のアンカーにF、I、L、M、またはVを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド：
P1：P
P2：D、E、K、R
P3：K、R
P9：D、E、G、H、K、P、Q、R。
【０３４５】
HLA-B＊3901（8量体ペプチド）
2位のアンカーにHまたはRを有する任意の変化したペプチド
3位にD、E、F、I、L、M、V、W、またはWを有する任意の変化したペプチド
4位にDまたはEを有する任意の変化したペプチド
6位にI、L、M、またはVを有する任意の変化したペプチド
8位のアンカーにI、L、M、またはVを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド：
P1：P
P2：D、E
P3：K、R
P6：D、E、K、R
P8：D、E、G、H、K、P、Q、R。
【０３４６】
HLA-B＊3902
2位のアンカーにKまたはQを有する任意の変化したペプチド
5位にF、I、L、M、V、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
9位のアンカーにF、L、またはMを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド：
P1：P
P2：D、E
P3：K、R
P9：D、E、G、H、K、P、Q、R。
【０３４７】
HLA-B40
1位にAまたはGを有する任意の変化したペプチド
2位のアンカーにDまたはEを有する任意の変化したペプチド
3位にA、F、I、L、M、V、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
4位にPを有する任意の変化したペプチド
5位にPを有する任意の変化したペプチド
9位のアンカーにA、L、M、またはWを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド：
P1：P
P2：F、H、I、K、L、M、Q、R、V、W、またはY
P3：D、E、K、R
P9：D、E、G、H、K、N、P、Q、R。
【０３４８】
HLA-B44＊03
1位にA、D、またはSを有する任意の変化したペプチド
2位のアンカーにDまたはEを有する任意の変化したペプチド
3位にA、I、L、M、またはVを有する任意の変化したペプチド
4位にF、I、またはPを有する任意の変化したペプチド
5位にA、K、またはVを有する任意の変化したペプチド
6位にA、L、T、またはVを有する任意の変化したペプチド
7位にF、K、またはTを有する任意の変化したペプチド
8位にKを有する任意の変化したペプチド
9位のアンカーにF、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド：
P1：P
P2：F、H、I、K、L、M、Q、R、V、W、Y
P9：D、E、G、H、K、N、P、Q、R。
【０３４９】
HLA-B＊5101（8量体ペプチド）
1位にD、E、F、I、L、M、V、またはYを有する任意の変化したペプチド
2位のアンカーにA、G、またはPを有する任意の変化したペプチド
3位にF、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
4位にD、E、G、I、K、またはVを有する任意の変化したペプチド
5位にA、G、I、S、T、またはVを有する任意の変化したペプチド
6位にI、K、L、N、またはQを有する任意の変化したペプチド
7位にD、K、Q、またはRを有する任意の変化したペプチド
8位のアンカーにI、L、M、またはVを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド：
P1：K、P、R
P2：D、E、H、K
P8：D、E、F、G、H、K、N、P、Q、R、S、W、Y。
【０３５０】
HLA-B＊5102
1位にFまたはYを有する任意の変化したペプチド
2位のアンカーにA、G、またはPを有する任意の変化したペプチド
3位にF、I、L、V、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
4位にE、G、H、K、L、N、Q、R、またはTを有する任意の変化したペプチド
5位にG、N、Q、T、またはVを有する任意の変化したペプチド
6位にI、N、Q、またはTを有する任意の変化したペプチド
7位にE、K、Q、またはRを有する任意の変化したペプチド
8位にK、R、T、またはYを有する任意の変化したペプチド
9位のアンカーにI、L、M、またはVを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド：
P1：P
P2：D、E、H、K、R
P3：D、E、K、R
P9：D、E、F、G、H、K、N、P、Q、R、S、W、Y。
【０３５１】
HLA-B＊5102（8量体ペプチド）
1位にFまたはYを有する任意の変化したペプチド
2位のアンカーにA、G、またはPを有する任意の変化したペプチド
3位にF、I、L、V、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
4位にE、G、H、K、L、V、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
5位にG、N、Q、T、Vを有する任意の変化したペプチド
6位にI、N、またはQを有する任意の変化したペプチド
7位にQまたはRを有する任意の変化したペプチド
8位にI、L、M、またはVを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド：
P1：P
P2：D、E、H、K、R
P3：D、E、K、R
P8：D、E、F、G、H、K、N、P、Q、R、S、W、Y。
【０３５２】
HLA-B＊5103
1位にD、T、またはVを有する任意の変化したペプチド
2位のアンカーにA、G、またはPを有する任意の変化したペプチド
3位にD、F、L、またはYを有する任意の変化したペプチド
4位にE、G、L、N、Q、R、T、またはVを有する任意の変化したペプチド
5位にA、G、M、N、Q、R、K、またはVを有する任意の変化したペプチド
6位にI、K、またはTを有する任意の変化したペプチド
7位にMまたはVを有する任意の変化したペプチド
9位のアンカーにI、L、M、またはVを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド：
P1：P
P2：D、E、H、K、R
P9：D、E、F、G、H、K、N、P、Q、R、S、W、Y。
【０３５３】
HLA-B＊5201（8量体ペプチド）
1位にI、L、M、またはVを有する任意の変化したペプチド
2位のアンカーにG、P、またはQを有する任意の変化したペプチド
3位にD、F、I、L、P、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
4位にA、E、I、K、L、P、またはVを有する任意の変化したペプチド
5位にA、F、G、I、L、M、T、またはVを有する任意の変化したペプチド
6位にK、L、N、S、またはTを有する任意の変化したペプチド
7位にE、K、Q、またはYを有する任意の変化したペプチド
8位のアンカーにF、I、L、M、またはVを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド：
P1：P
P2：H、K、R
P3：R
P8：D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S。
【０３５４】
HLA-B＊5801
1位にI、K、またはRを有する任意の変化したペプチド
2位のアンカーにA、S、またはTを有する任意の変化したペプチド
3位にDを有する任意の変化したペプチド
4位にE、K、またはPを有する任意の変化したペプチド
5位にF、I、L、M、またはVを有する任意の変化したペプチド
6位にF、I、L、またはVを有する任意の変化したペプチド
7位にL、M、N、またはYを有する任意の変化したペプチド
8位にK、N、R、またはTを有する任意の変化したペプチド
9位のアンカーにF、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド：
P1：D、E、P
P2：D、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、V、W、Y
P9：D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S。
【０３５５】
HLA-B＊60
2位のアンカーにDまたはEを有する任意の変化したペプチド
3位にA、I、L、M、S、またはVを有する任意の変化したペプチド
5位にL、I、またはVを有する任意の変化したペプチド
7位にI、L、M、V、またはYを有する任意の変化したペプチド
8位にK、Q、またはRを有する任意の変化したペプチド
9位のアンカーにI、L、M、またはVを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド：
P1：P
P2：F、H、I、K、L、M、Q、R、V、W、Y
P9：D、E、F、G、H、K、N、P、Q、R、S、W、Y。
【０３５６】
HLA-B＊61
1位にGまたはRを有する任意の変化したペプチド
2位のアンカーにDまたはEを有する任意の変化したペプチド
3位にA、F、I、L、M、T、V、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
6位にIを有する任意の変化したペプチド
7位にYを有する任意の変化したペプチド
9位のアンカーにA、I、L、M、またはVを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド：
P1：P
P2：F、H、I、K、L、M、Q、R、V、W、Y
P9：D、E、F、G、H、K、N、P、Q、R、S、W、Y。
【０３５７】
HLA-B＊61（8量体ペプチド）
1位にGまたはRを有する任意の変化したペプチド
2位のアンカーにDまたはEを有する任意の変化したペプチド
3位にA、F、I、L、M、T、V、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
6位にIを有する任意の変化したペプチド
7位にYを有する任意の変化したペプチド
8位のアンカーにA、I、L、M、またはVを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド：
P1：P
P2：F、H、I、K、L、M、Q、R、V、W、Y
P8：D、E、F、G、H、K、N、P、Q、R、S、W、Y。
【０３５８】
HLA-B＊62
1位にIを有する任意の変化したペプチド
2位のアンカーにI、L、Qを有する任意の変化したペプチド
3位にG、K、Rを有する任意の変化したペプチド
4位にD、E、G、またはPを有する任意の変化したペプチド
5位にF、G、I、L、またはVを有する任意の変化したペプチド
6位にI、L、T、Vを有する任意の変化したペプチド
7位にT、V、またはYを有する任意の変化したペプチド
9位のアンカーにF、W、Yを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド：
P1：P
P2：D、E、F、H、K、N、R、S、W、Y
P3：D、E
P6：D、E、K、R
P9：D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S。
【０３５９】
HLA-Cw0301
2位のアンカーにAまたはRを有する任意の変化したペプチド
3位にF、I、L、M、V、またはYを有する任意の変化したペプチド
4位にE、P、またはRを有する任意の変化したペプチド
5位にNを有する任意の変化したペプチド
6位にF、M、またはYを有する任意の変化したペプチド
7位にK、M、R、またはSを有する任意の変化したペプチド
8位にTを有する任意の変化したペプチド
9位のアンカーにF、I、L、Mを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド：
P1：P
P3：D、K、R
P6：D、E、K、R
P9：D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S。
【０３６０】
HLA-Cw0401
2位のアンカーにF、P、W、またはYを有する任意の変化したペプチド
3位にDまたはHを有する任意の変化したペプチド
4位にDまたはEを有する任意の変化したペプチド
5位にA、H、M、R、またはTを有する任意の変化したペプチド
6位にI、L、M、またはVを有する任意の変化したペプチド
7位にAを有する任意の変化したペプチド
8位にH、K、またはSを有する任意の変化したペプチド
9位のアンカーにF、I、L、M、V、またはYを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド：
P1：P
P2：D、E、H、K、R
P9：D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S。
【０３６１】
HLA-Cw0602
1位にF、I、K、またはYを有する任意の変化したペプチド
2位のアンカーにA、P、Q、またはRを有する任意の変化したペプチド
5位にF、I、K、L、またはMを有する任意の変化したペプチド
6位にI、L、またはVを有する任意の変化したペプチド
7位にK、N、Q、またはRを有する任意の変化したペプチド
9位のアンカーにI、L、M、V、またはYを有する任意の変化したペプチド
以下の位置の有害な残基が、置換される任意の変化したペプチド：
P1：P
P9：D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S。
【０３６２】
C35aa配列に由来する推定ヒトクラスI MHC結合ペプチドの例およびこれらの結合を改善させるための変化の様態
HLA-A＊0101
2005528914.tif 000355
2005528914.tif 000356
2005528914.tif 000357
2005528914.tif 000358
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2005528914.tif 000360
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2005528914.tif 000370
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2005528914.tif 000373
2005528914.tif 000374
2005528914.tif 000375
【０３６３】
（表５）推定C35 HLAクラスIエピトープ＊
2005528914.tif 000376
推定は、SYFPEITHIウェブサイト（wysiwyg://35/http://134.2.96.221/scripts/hlaserver.dll/EpPredict.htm）に記載され、「MHC Ligands and Peptide Motifs」（Rammensee,H.G.、Bachmann,J. およびS.Stevanovic、Chapman & Hall、New York, 1997）に基づく法則を使用して行った。
【０３６４】
（表６）推定C35 HLAクラスIIエピトープ＊
2005528914.tif 000377
2005528914.tif 000378
＊クラスII MHCエピトープはTEPITOPEソフトウェアを用いて推定した。Sturniolo,Tら、1999.  Generation of tissue-specific and promiscuous HLA ligand databases using DNA microarrays and virtual HLA class II matrices. Nature Biotechnology 17:555-571。
【０３６５】
本発明において、「エピトープ」は、動物、特にヒトにおいて、抗原性活性もしくは免疫原性活性を有するか、または動物、好ましくはヒトにおいて、Tリンパ球応答を誘発し得る、C35ポリペプチド断片をいう。本発明の好ましい態様は、エピトープを含むC35ポリペプチド断片、およびこの断片をコードするポリヌクレオチドに関する。本発明のさらに好ましい態様は、エピトープからなるC35ポリペプチド断片およびこの断片をコードするポリヌクレオチドに関する。本発明の特定の好ましい態様において、このエピトープは、表1〜6のいずれかに列挙したC35断片を含む。本発明の別の好ましい態様において、このエピトープは、表1〜6のいずれかに列挙したC35断片からなる。抗体が結合し得るタンパク質分子の領域は、「抗原性エピトープ」として定義される。対照的に、「免疫原性エピトープ」は、抗体応答を誘発するタンパク質の一部として定義される。（例えば、Geysenら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA  81：3998-4002（1983）を参照のこと）。従って、本発明のさらに好ましい態様は、MHC分子のペプチド結合溝（cleft）に結合した場合に、T細胞応答を誘発し得る免疫原性C35ペプチド断片である。特定の好ましい態様において、この免疫原性35ペプチド断片は、表1〜6のいずれかに列挙したエピトープを含む。別の好ましい態様において、この免疫原性C35ペプチド断片は、表1〜6のいずれかに列挙したエピトープからなる。本発明のさらなる態様は、これらの免疫原性C35ペプチド断片またはこれらをコードするポリヌクレオチドを含む、薬学的処方物およびワクチン組成物に関する。
【０３６６】
エピトープとして機能する断片は、任意の従来の手段によって作製され得る。（例えば、米国特許第4，631，211号にさらに記載されるHoughten，R．A．、Proc．Natl．Acad．Sci．USA  82：5131-5135（1985）を参照のこと）。
【０３６７】
特定のMCH分子に結合することが公知のペプチドエピトープの配列は、MHC結合親和性を増大させるように作用する予測可能な方法で、既知のペプチドアンカー位置で改変され得る。このような「エピトープ増強」は、多数の異なるMCHクラスIまたはMHCクラスII結合ペプチドエピトープの免疫原性を改善するために使用されてきた（Berzofsky，J．A．ら、Immunol．Rev．170：151-72（1999）；Ahlers，J．D．ら、Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．94：10856-61（1997）；Overwijkら、J．Exp．Med．188：277-86（1998）；Parkhurst，M．R．ら、J．Immunol．157：2539-48（1996））。従って、本発明のさらなる態様は、このような増強されたC35ペプチドエピトープアナログ、およびこのようなアナログをコードするポリヌクレオチドに関する。
【０３６８】
本発明において、抗原性エピトープは、好ましくは少なくとも7アミノ酸、より好ましくは少なくとも9アミノ酸、そして最も好ましくは約15〜約30アミノ酸の間の配列を含む。抗原性エピトープは、抗体（エピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体を含む）を惹起するために有用である（例えば、Wilsonら、Cell  37：767-778（1984）；Sutcliffe，J．G．ら、Science  219：660-666（1983）を参照のこと）。
【０３６９】
同様に、免疫原性エピトープは、当業者に公知の方法に従ってB細胞およびT細胞を誘導するために使用され得る。（例えば、Sutcliffeら、前出；Wilsonら、前出；Chow，M．ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA  82：910-914；およびBittle，F．J．ら、J．Gen．Virol．66：2347-2354（1985）を参照のこと）。好ましい免疫原性エピトープは、分泌タンパク質を含む。この免疫原性エピトープは、担体タンパク質（例えば、アルブミン）と共に動物系（例えば、ウサギまたはマウス）に提示され得るか、または十分に長い（少なくとも約25アミノ酸）場合には担体なしで提示され得る。しかし、9アミノ酸の少ないアミノ酸を含む免疫原性エピトープが、変性ポリペプチド（例えば、ウェスタンブロットにおける）における直線状エピトープに、まさに少なくとも結合し得る抗体を惹起するのに十分であることが示されている。
【０３７０】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」（Ab）または「モノクローナル抗体」（Mab）は、タンパク質に特異的に結合し得るインタクトな分子および抗体断片（例えば、FabおよびF（ab'）2断片のような）を含むと意味される。インタクトな抗体のFc断片を欠くFabおよびF（ab'）2断片は、循環からより迅速に除去され、そしてインタクトな抗体よりも非特異性の低い組織結合を有し得る。（Walhら、J．Nucl．Med．24：316-325（1983））。従って、いくつかの適用について、これらの断片およびFabまたは他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産物が好ましい。さらに、本発明の抗体は、キメラ、単鎖、およびヒト化抗体を含む。
【０３７１】
抗体の診断的使用および治療的使用
本発明は、C35抗体、C35抗体断片および抗体結合体ならびにヒト癌細胞、特にヒト乳癌細胞および膀胱癌細胞と反応性の単鎖免疫毒素にさらに関する。
【０３７２】
表7は、異なる適用における使用のために単離され特徴付けられたC35特異的モノクローナル抗体の表を提供する。
【０３７３】
（表７）C35特異的マウスモノクローナル抗体
2005528914.tif 000379
細菌合成C35におけるELISAアッセイ
空欄＝決定されていない
【０３７４】
本実施例において使用される場合、以下の単語または句は、特定の意味を有する。
【０３７５】
本実施例において使用される場合、「結合される（joined）」は、いずれかの手段によって（例えば、共有結合、非共有結合、イオン結合、非イオン結合によって）、1つの分子を一方の分子と直接的または間接的に連結することを意味する。共有結合は、種々のリンカー（例えば、チオエーテルリンカーまたはチオエステルリンカー）による結合を含む。直接的な連結は、目的の分子に結合される1つの分子を含む。非直接的な連結は、目的でない別の分子に結合され、次いで、目的の分子に直接的または間接的に連結された1つの分子を含む。
【０３７６】
本実施例において使用される場合、「組換え分子」は、遺伝子操作方法によって作製された分子を意味する。
【０３７７】
本実施例において使用される場合、「断片」は、標的（すなわち、抗原結合領域）に結合する免疫グロブリン分子の可変領域の少なくとも一部として定義される。免疫グロブリンの定常領域のいくらかは、含まれ得る。
【０３７８】
本実施例において使用される場合、「免疫結合体」は、細胞毒素、放射性因子、抗腫瘍薬物もしくは治療剤に化学的または生物学的に連結される抗体もしくは増殖因子のような、任意の分子またはリガンドを意味する。この抗体または増殖因子は、標的に結合し得る限り、分子に沿った任意の位置で細胞毒素、放射性因子、抗腫瘍薬物または治療剤に連結され得る。免疫結合体の例としては、免疫毒素および抗体結合体が挙げられる。
【０３７９】
本実施例において使用される場合、「選択的に殺す（こと）」は、抗体が結合した細胞を殺すことを意味する。
【０３８０】
本実施例において使用される場合、「癌」の例としては、膀胱癌、乳癌、結腸癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、および膵臓癌が挙げられる。
【０３８１】
本実施例において使用される場合、「免疫毒素」は、細胞毒素または細胞毒性因子に化学的または生物学的に結合された抗体または増殖因子を意味する。
【０３８２】
本実施例において使用される場合、「有効量」は、細胞を殺すかまたは細胞の増殖を阻害する抗体、免疫結合体、組換え分子の量である。
【０３８３】
本実施例において使用される場合、「競合的に阻害する」は、別の分子と同じ標的に結合し得ることを意味する。抗体に関して、競合的に阻害するとは、この抗体が、別の抗体が指向するのと同じ抗原結合領域を認識して結合し得ることを意味する。
【０３８４】
本実施例において使用される場合、「抗原結合領域」は、抗体、組換え分子、融合タンパク質、または標的もしくはその部分を認識する本発明の免疫結合体を意味する。
【０３８５】
本実施例において使用される場合、「治療剤」は、抗腫瘍薬物、細胞毒素、細胞毒性因子および放射性因子を含む、治療のために有用な任意の因子を意味する。
【０３８６】
本実施例において使用される場合、「抗腫瘍薬物」は、以下を含むがこれらに限定されない、癌と戦うために有用な任意の因子を意味する：細胞毒素ならびに抗代謝剤、アルキル化剤、アントラサイクリン（anthracycline）、抗生物質、抗有糸分裂剤、プロカルバジン、ヒドロキシウレア、アスパラギナーゼ、コルチコステロイド、ミトタン（O，P'-（DDD））、インターフェロンおよび放射性因子のような因子。
【０３８７】
本実施例において使用される場合、「細胞毒素または細胞毒性因子」は、細胞にとって有害な任意の因子を意味する。例としては、タキソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（tenoposide）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロパノロール（propranolol）、およびピューロマイシンならびにこれらのアナログまたはホモログが挙げられる。
【０３８８】
本実施例において使用される場合、「放射性同位体」は、腫瘍の破壊において効果的な任意の放射性同位体を含む。例としては、コバルト-60およびX線が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、代表的には放射性同位体の混合物を示す、ウラン、ラジウムおよびトリウムのような天然に存在する放射性元素が、放射性因子の適切な例である。
【０３８９】
本実施例において使用される場合、「投与する（こと）」は、被験体に対する、経口投与、坐剤としての投与、局所的接触、静脈内投与、腹膜内投与、筋内投与もしくは皮下投与、または徐放性デバイス（例えば、小浸透圧（miniosmotic）ポンプ）の移植を意味する。
【０３９０】
本実施例において使用される場合、「直接的に」は、標識に結合された抗体の使用を意味する。この検体は標識抗体と共にインキュベートされ、未標識の抗体は洗浄によって除去され、そしてこの検体は試験され得る。
【０３９１】
本実施例において使用される場合、「非直接的に」は、非結合体化抗体と共に検体をインキュベートし、洗浄し、そして蛍光色素結合体化抗体と共にインキュベートすることを意味する。従って、第二または「サンドイッチ」抗体は、第一の抗体の存在を明らかにする。
【０３９２】
本実施例において使用される場合、「反応する（こと）」は、標的を認識しかつ結合することを意味する。この結合は、非特異的であり得る。特異的な結合が好ましい。
【０３９３】
本実施例において使用される場合、「治癒する（こと）」は、実質的に完全な腫瘍の後退を提供し、その結果、この腫瘍がある期間（すなわち、＞/＝10腫瘍体積二倍化遅延（tumor  volume  doubling  delay）（TVDD＝コントロール腫瘍の大きさが二倍になる日数単位の時間）にわたって明白でなくなることを意味する。
【０３９４】
本実施例において使用される場合、「腫瘍標的化抗体」は、腫瘍（すなわち、癌）細胞上のC35抗原を認識する任意の抗体を意味する。
【０３９５】
本実施例において使用される場合、「増殖を阻害する」は、いずれかの手段によって細胞の増殖を妨害することを意味する。
【０３９６】
本実施例において使用される場合、「哺乳動物腫瘍細胞」は、動物（例えば、ヒト、ヒツジ、ブタ、マウス、ウシ動物）由来の細胞を含む。
【０３９７】
本実施例において使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、抗体の免疫原性を保持し、そして抗体と組み合わされた場合に被験体の免疫系と非反応性である任意の材料を含む。例としては、任意の標準的な薬学的担体（例えば、リン酸緩衝化生理食塩溶液、水、乳濁液（例えば、油/水乳濁液）および種々の型の加湿剤）が挙げられるが、これらに限定されない。他の担体はまた、滅菌溶液、錠剤（被覆錠剤およびカプセルを含む）を含み得る。
【０３９８】
代表的には、このような担体は、賦形剤（例えば、デンプン、乳、糖、特定の型の粘土、ゼラチン、ステアリン酸もしくはその塩、ステリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸カルシウム、タルク、植物性脂質もしくは植物性油脂、ゴム、グリコール、または他の公知の賦形剤）を含み得る。このような担体はまた、香料添加物および色素添加物または他の成分を含み得る。このような担体を含む組成物は、周知の従来の方法によって処方される。
【０３９９】
本発明は、癌細胞に非常に特異的なC35抗体に関する。より詳細には、この抗体は、癌（例えば、乳癌、膀胱癌、肺癌、卵巣癌および結腸癌）の範囲と反応するが、一方で、正常なヒト組織または他の型の腫瘍（例えば、肉腫またはリンパ腫）とは反応性を示さないかあるいは制限された反応性を示す。
【０４００】
本実施例において使用される場合、用語「C35抗体」は、全体のインタクトなポリクローナル抗体物質およびモノクローナル抗体物質、ならびにキメラ抗体分子を含む。上記のC35抗体は、当技術分野で十分確立された技術［例えば、Rousseauxら、「Optimal  Conditions  For  The  Preparation  of  Proteolytic  Fragments  From  Monoclonal  IgG  of  Different  Rat  IgG  Subclasses」、Methods  Enzymol．、121：663-69（Academic  Press  1986）を参照のこと］を使用した、抗体の活性な抗原結合領域（例えば、Fab、F（ab'）2およびFv断片）を含む、C35抗体の任意の断片を含む。本発明のC35抗体はまた、融合タンパク質を含む。
【０４０１】
本発明のC35抗体に対する抗イディオタイプ抗体がまた、本発明の範囲内に含まれる。これらの抗イディオタイプ抗体は、免疫原としてC35抗体および/またはその断片を使用して作製され得、腫瘍に対する体液性応答の検出および治療的適用において（例えば、患者において抗腫瘍応答を誘導するためのワクチンにおいて）診断目的のために有用である［例えば、Nepomら、「Anti-Idiotypic  Antibodies  And  The  Induction  Of  Specific  Tumor  Immunity」、Cancer  And  Metastasis  Reviews、6：487-501（1987）を参照のこと］。
【０４０２】
さらに、本発明は、C35抗体と同じ抗原決定基に結合し得、そしてこの部位での結合について抗体と競合し得る抗体を包含する。これらは、C35抗体と同じ抗原特異性を有するが、起源の種、アイソタイプ、結合親和性または生物学的機能（例えば、細胞毒性）が異なる抗体を含む。例えば、クラス、アイソタイプ、およびC35抗原の抗原結合領域を有する本発明の抗体の他の改変体は、当技術分野で公知の組換えクラススイッチ技術および融合技術［例えば、Thammanaら、「Immunoglobulin  Heavy  Chain  Class  Switch  From  IgM  to  IgG  In  A  Hybridoma」、Eur．J．Immunol．、13：614（1983）；Spiraら、「The  Identification  Of  Monoclonal  Class  Switch  Variants  By  Subselection  And  ELISA  Assay」、J．Immunol．Meth．74：307-15（1984）；Neubergerら、「Recombinant  Antibodies  Possessing  Novel  Effector  Functions」、Nature  312：614-608（1984）；およびOiら、「Chimeric  Antibodies」、Biotechniques  4（3）：214-21（1986）を参照のこと］を使用して構築され得る。従って、C35特異的抗体と同じ結合特異性を有する他のキメラ抗体または他の組換え抗体（例えば、抗体が、リンホカインまたは腫瘍阻害増殖因子のような第二のタンパク質と組み合わされる融合タンパク質）が、本発明の範囲内である。
【０４０３】
当技術分野で公知の遺伝子操作技術を、本明細書中に記載のように使用して、DNAレベルでの治療剤または細胞毒性因子に対する抗体C35の抗原結合領域を融合し、そしてキメラタンパク質のような細胞毒性分子を生成することによって生成される組換え免疫毒素を調製し得る。治療剤の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：抗代謝剤、アルキル化剤、アントラサイクリン、抗生物質および抗有糸分裂剤。抗代謝剤としては、メトトレキセート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシルデカルバジン（decarbazine）が挙げられる。アルキル化剤としては、メクロレタミン、チオエパ（thioepa）クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（BSNU）およびロムスチン（CCNU）、シクロホスファミド（cyclothosphamide）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン（streptozotocin）、マイトマイシンC、ならびにシス-ジクロロジアミンプラチナ（II）（DDP）シスプラチンが挙げられる。アントラサイクリンとしては、ダウノルビシン（以前にはダウノマイシン）およびドキソルビシン（本明細書中でアドリアマイシンとまたいう）が挙げられる。さらなる例としては、ミトザントロンおよびビサントレン（bisantrene）が挙げられる。抗生物質としては、ダクチノマイシン（以前にはアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（anthramycin）（AMC）が挙げられる。抗有糸分裂剤としては、ビンクリスチンおよびビンブラスチン（これらは一般に、ビンカアルカロイドといわれる）が挙げられる。他の細胞毒性因子としては、プロカルバジン、ヒドロキシウレア、アスパラギナーゼ、コルチコステロイド、ミトタン（O,P'-（DDD））、インターフェロンが挙げられる。細胞毒性因子のさらなる例としては、リシン、ドキソルビシン、タキソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エトポシド、テノポシド、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、1-デヒドロテストステロン、およびグルココルチコイドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４０４】
このような治療剤および細胞毒性因子のアナログおよびホモログは、明らかに本発明によって包含される。例えば、化学療法剤であるアミノプテリンは、相関関係のある改善されたアナログ、すなわち、メトトレキサートを有する。さらに、ドキソルビシンの改善されたアナログは、Feキレートである。また、1-メチルニトロソウレアについての改善されたアナログは、ロムスチンである。さらに、ビンブラスチンの改善されたアナログは、ビンクリスチンである。また、メクロレタミンの改善されたアナログは、シクロホスファミドである。
【０４０５】
組換え免疫毒素、特に、単鎖免疫毒素は、薬物/抗体結合体よりもより迅速に生成され、そして均一な分子の集団（すなわち、同じアミノ酸残基から構成される単一のペプチド）を生成するという点で、この結合体を超えた利点を有する。C35単鎖免疫毒素に対応するアミノ酸配列をコードするDNA配列をクローニングし、そして発現させるための技術（例えば、オリゴヌクレオチドの合成、PCR、形質転換細胞、構築ベクター、発現系など）は、当技術分野で十分確立され、そしてほとんどの実行者は、特定の条件および手順のための標準的な資源材料に通じている［例えば、Sambrookら、編、Molecular  Cloning、A  Laboratory  Manual、第二版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press（1989）を参照のこと］。
【０４０６】
以下は、本発明の免疫結合体の好ましい態様を含む。当技術分野で公知の他の態様は、本発明によって包含される。本発明は、これらの特定の免疫結合体に限定されないが、本発明に従う抗体および/または抗体断片を取り込む他の免疫結合体をまた含む。
【０４０７】
これらの結合体は、本発明のリンカーによって所望の標的細胞集団と反応する標的リガンド分子に連結された、少なくとも1つの薬物分子を含む。このリガンド分子は、免疫活性タンパク質（例えば、抗体またはその断片）、非免疫活性タンパク質またはペプチドリガンド（例えば、ボンベシン）あるいはレクチンまたはステロイド分子のような細胞関連レセプターを認識する結合リガンドであり得る。
【０４０８】
さらに、本発明の結合体が、所定の生物学的応答を改変するために使用され得ることから、この薬物部分は、古典的な化学的治療剤に限定されるとは解釈されるべきではない。例えば、この薬物部分は、所望の生物学的活性を保有するタンパク質またはポリペプチドであり得る。このようなタンパク質としては、例えば、毒素（例えば、アブリン、リシンA、シュードモナス体外毒素、またはジフテリア毒素）；タンパク質（例えば、腫瘍壊死因子、α-インターフェロン、β-インターフェロン、神経増殖因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノゲン活性化因子）、または生物学的応答改変因子（例えば、リンホカイン、インターロイキン-1（「IL-1」）、インターロイキン-2（IL-2」）、インターロイキン-6（「IL-6」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「GM-CSF」）、顆粒球コロニー刺激因子（「G-CSF」）または他の増殖因子）が挙げられ得る。
【０４０９】
本発明における使用のために好ましい薬物は、細胞毒性薬物、特に、癌治療に使用される細胞毒性薬物である。このような薬物としては、一般に、アルキル化剤、抗増殖剤、チューブリン結合剤などが挙げられる。好ましいクラスの細胞毒製剤としては、例えば、アントラサイクリンファミリーの薬物、ビンカ薬物、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞毒性ヌクレオシド、プテリジンファミリーの薬物、ジイネネス（diynenes）およびポドフィロトキシン（podophyllotoxine）が挙げられる。これらのクラスの特に有用なメンバーは、例えば、アドリアマイシン、カルミノマイシン（carminomycin）、ダウロルビシン、アミノプテリン、メトトレキサート、メトプテリン、ジクロロメトトレキサート、マイトマイシンC、ポルフィロマイシン（porfiromycin）、5-フルオロウラシル、6-メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、ポドフィロトキシンまたはポドフィロトキシン誘導体（例えば、エトポシドまたはリン酸エトポシド、メルファラン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、リューロシジン（leurosidine）、ビンデシン、リューロシン（leurosine）などが挙げられる。先に注目したように、当業者は、本発明の結合体を調製する目的のためにより簡便な化合物を反応させるために、所望の化合物に対する化学的改変をなし得る。
【０４１０】
注目したように、当業者は、本発明がまた抗原認識免疫グロブリン断片の使用を包含することを理解する。このような免疫グロブリン断片としては、例えば、Fab'、F（ab'）2、F［v］またはFab断片、あるいは他の抗原認識免疫グロブリン断片が挙げられる。このような免疫グロブリン断片は、例えば、タンパク質分解酵素消化（例えば、ペプシンまたはパパイン消化による）、還元的アルキル化、または組換え技術によって調製され得る。このような免疫グロブリン断片の調製のための材料および方法は、当業者に周知である。一般には、Parham、J．Immunology、131：2895（1983）；Lamoyiら、J．Immunological  Methods、56、235（1983）；Parham  id．、53、133（1982）；およびMatthewら、id．、50、239（1982）を参照のこと。
【０４１１】
この免疫グロブリンは、当技術分野で認識される用語同様の「キメラ抗体」であり得る。この免疫グロブリンはまた、「二機能性」または「ハイブリッド」抗体、すなわち、1つの免疫原性部位（例えば、腫瘍関連抗原）に対して特異性を有する1つのアームを有し得、一方、他のアームは、異なる標的（例えば、抗原保有腫瘍細胞にとって致死の因子であるかまたはこの因子に結合したハプテン）を認識する。あるいは、二機能性の抗体は、各アームが、治療的または生物学的に改変されるべき細胞の、腫瘍に関連する抗原の異なるエピトープに対して特異性を有するものであり得る。いずれの場合にも、ハイブリッド抗体は二重の特異性を有し、好ましくは、選択されたハプテンに対して特異的な1以上の結合部位を有するか、または標的抗原（例えば、腫瘍、感染性生物、または他の疾患状態に関連する抗原）に対して特異的な1以上の結合部位を有する。
【０４１２】
生物学的に二機能性の抗体は、例えば、欧州特許公開EPA  0  105  360（当業者はこれを参照する）に記載される。このようなハイブリッド抗体または二機能性の抗体は、記載したように、細胞融合技術によって生物学的にか、または特に架橋剤もしくはジスルフィド形成試薬を用いて化学的にかのいずれかで誘導され得、そしてそれらの抗体および/またはその断片から構成され得る。このようなハイブリッド抗体を得るための方法は、例えば、PCT公開W083/03679（1983年10月27日公開）、および公開された欧州出願EPA  0  217  577（1987年4月8日公開）に開示される。特に好ましい二機能性の抗体は、「ポリドーム（polydome）」または「クアドローマ（quadroma）」から生物学的に調製される抗体であるか、あるいはこれは、ビス-（マレイミド）-メチルエーテル（bis-（maleimideo）-methyl  ether）（「BMME」）のような架橋剤または当業者が精通した他の架橋剤を用いて合成的に調製される。
【０４１３】
さらに、免疫グロブリンは、単鎖抗体（「SCA」）であり得る。これらは、可変軽（「V［L］」）ドメインおよび可変重（「V［H］」）ドメインがペプチド結合またはジスルフィド結合によって連結された、単鎖Fv断片（「scFv」）からなり得る。また、免疫グロブリンは、抗原結合活性を保有する単一V［H］ドメイン（dAb）からなり得る。例えば、G．WinterおよびC．Milstein，Nature  349：295（1991）；R．Glockshuberら，Biochemistry  29：1362（1990）；ならびにE．S．Wardら，Nature  341：544（1989）を参照のこと。
【０４１４】
本発明における使用に特に好ましいのは、キメラモノクローナル抗体、好ましくは、腫瘍関連抗原に対して特異性を有するキメラ抗体である。この例で使用される場合、用語「キメラ抗体」は、1つの供給源または種由来の可変領域（すなわち、結合領域）と、異なる供給源もしくは種由来の定常領域の少なくとも一部を含む、通常は組み換えDNA技術によって調製されるモノクローナル抗体をいう。マウス可変領域およびヒト定常領域を含むキメラ抗体が、本発明の特定の適用（特に、ヒト治療）に好ましい。なぜなら、このような抗体は、容易に調製され、そして純粋にマウスのモノクローナル抗体よりも免疫原性が低いからであり得る。このようなマウス/ヒトキメラ抗体は、マウス免疫グロブリン可変領域をコードするDNAセグメントおよびヒト免疫グロブリン定常領域をコードするDNAセグメントを含む、発現された免疫グロブリン遺伝子の産物である。本発明によって含まれる他の形態のキメラ抗体は、本来の抗体のクラスまたはサブクラスから改変または変更されたクラスまたはサブクラスのキメラ抗体である。このような「キメラ」抗体はまた、「クラススイッチされた抗体」と呼ばれる。キメラ抗体を産生するための方法は、従来の組換えDNAおよび現在当技術分野で周知である遺伝子トランスフェクション技術を含む。例えば、Morrison，S．L．ら，Proc．Nat'l  Acad．Sci．，81，6851（1984）を参照のこと。
【０４１５】
用語「キメラ抗体」によって、「ヒト化抗体」の概念が含まれ、この「ヒト化抗体」は、フレームワークまたは「相補性」決定領域（「CDR」）が、親の免疫グロブリンの特異性と比較して異なる特異性の免疫グロブリンのCDRを含むように改変されている。好ましい態様において、マウスCDRは、「ヒト化抗体」を調製するためにヒト抗体のフレームワーク領域に移植される。例えば、L．Riechmannら，Nature  332：323（1988）；M．S．Neubergerら，Nature  314：268（1985）を参照のこと。特に好ましいCDRは、キメラ抗体および二機能性の抗体に関して上記される抗原を認識する配列を提示するCDRに対応する。読者は、CDR改変抗体のその教示に関して、EPA  0  239  400（1987年9月30日公開）の教示を参照する。
【０４１６】
当業者は、二機能性-キメラ抗体が、調製され得ることを認識する。この抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体のより低い免疫原性の利点、ならびに上記の二機能性抗体の柔軟性（特に、治療的な処置に関して）の利点を有する。このような二機能性-キメラ抗体は、例えば、架橋剤を用いた化学合成によっておよび/または上記の型の組み換え方法によって、合成され得る。いずれの場合も、本発明は、抗体（二機能性抗体、キメラ抗体、二機能性-キメラ抗体、ヒト化抗体、またはその抗原認識断片もしくは誘導体のいずれか）の任意の特定の産生方法によって範囲を限定されるとして解釈されるべきではない。
【０４１７】
さらに、本発明は、その範囲内に、免疫グロブリン（上記に規定されるような）または免疫グロブリン断片を含み、これらは、活性なタンパク質（例えば、Neubergerら，PCT出願W086/01533（1986年3月13日公開）に開示される型の酵素）を融合している。このような生成物の開示は、本明細書中に参考として援用される。
【０４１８】
上記のように「二機能性」抗体構築物、「融合」抗体構築物、「キメラ」（ヒト化を含む）抗体構築物、および「二機能性-キメラ」（ヒト化を含む）抗体構築物にはまた、その個々の状況内において、抗原認識断片を含む構築物が挙げられる。当業者が認識するように、このような断片は、インタクトな二機能性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはキメラ-二機能性抗体の従来の酵素学的切断によって、調製され得る。しかし、インタクトな抗体が、含まれる構築物の性質に起因してこのような切断を受けにくい場合、上記の構築物は、出発材料として使用された免疫グロブリン断片を用いて調製され得るか；あるいは、組換え技術が使用される場合、そのDNA配列はそれ自体、所望の「断片」（この断片は、発現される場合、最終的な所望のインタクトな免疫グロブリン「断片」を調製するために、化学手段または生物学的手段によって、インビボまたはインビトロで組み換えら得る）をコードするために調整され得る。従って、この状況において、用語「断片」が使用される。
【０４１９】
さらに、上記のように、本発明において使用される免疫グロブリン（抗体）またはその断片は、性質においてポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。しかし、モノクローナル抗体が、好ましい免疫グロブリンである。このようなポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の調製は、現在当業者に周知であり、当然、当業者は、本発明において使用され得る有用な免疫グロブリンを完全に産生し得る。例えば、G．KohlerおよびC．Milstein，Nature  256：495（1975）を参照のこと。さらに、ハイブリドーマおよび/またはこのようなハイブリドーマによって調製され、かつ本発明の実施において有用であるモノクローナル抗体は、American  Type  Culture  Collection（「ATCC」）10801  University  Blvd．，Manassas，VA．20110のような供給源から公に利用可能である。
【０４２０】
本発明における使用のための特に好ましいモノクローナル抗体は、腫瘍関連抗原を認識する抗体である。
【０４２１】
診断技術
血清学的診断技術は、癌腫を罹患していると考えられる患者の血清または他の生物学的流体中に分泌または「流出」された腫瘍関連抗原の、検出および定量を含む。このような抗原は、放射線免疫アッセイ（RIA）または酵素結合イムノソルベント検定法（ELISA）のような当技術分野で公知の技術を用いて、体液中で検出され得、ここで、「流出」された抗原と反応性の抗体が、流体試料中の抗原の存在を検出するために使用される［例えば、Uotilaら「Two-Site  Sandwich  ELISA  With  Monoclonal  Antibodies  To  Human  AFP」J．Immunol．Methods，42：11（1981）およびAllumら、前出、48-51頁を参照のこと］。従ってこれらのアッセイは、本明細書中に開示されるC35抗体を用いて、C35抗体が反応する抗原の生物学的流体中での検出のため、そして故に、患者中のヒト癌腫の検出に使用され得る。従って、上記より、本発明のC35抗体が、抗原-抗体反応を含むほとんどのアッセイにおいて使用され得ることが明らかである。これらのアッセイとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：標準的なRIA技術（液相および固相の両方）、ならびにELISAアッセイ、ELISPOT、免疫蛍光技術、および他の免疫細胞化学アッセイ［例えば、Sikoraら（編）Monoclonal  Antibodies，32-52頁（Blackwell  Scientific  Publications  1984）を参照のこと］。
【０４２２】
本発明はまた、上記のアッセイを実行するための診断キットを含む。1つの態様において、この診断キットは、C35モノクローナル抗体、その断片、本発明の融合タンパク質もしくはキメラ抗体、ならびにC35抗体に対して特異的な結合パートナーと検出可能なシグナルを生成し得る標識とを含む結合体を備える。これらの試薬はまた、緩衝剤およびタンパク質安定剤（例えば、多糖）のような補助的な薬剤を含み得る。診断キットはさらに、必要な場合、バックグラウンドの干渉を減少するための薬剤を含むシグナル生成系の他の成分、コントロール試薬または試験を実行するための装置もしくは容器を供え得る。
【０４２３】
別の態様において、この診断キットは、本発明のC35抗体と検出可能なシグナルを生成し得る標識との結合体を備える。上記のような補助的な薬剤がまた、存在し得る。
【０４２４】
本発明のC35抗体はまた、ヒト癌腫の検出のためのインビボ診断適用に有用である。このような手段の1つとしては、腫瘍画像化技術によるインビボでの腫瘍の検出が挙げられる。この手段に従って、C35抗体は、検出可能なシグナルを生成する適切な画像化試薬で標識される。使用され得る画像化試薬の例としては、以下のような試薬が挙げられるが、これらに限定されない：＜131＞I、＜111＞In、＜123＞I、＜99m＞Tc、＜32＞P、＜125＞I、＜3＞H、および＜14＞Cのような放射性標識、フルオレセインおよびローダミンのような蛍光標識、ならびにルシフェリンのような化学発光剤（chemiluninescer）。この抗体は、当技術分野で公知の技術を用いてこのような試薬で標識され得る。例えば、抗体の放射性標識に関する技術について、WenselおよびMeares，Radioimmunoimaging  And  Radioimmunotherapy，Elsevier，New  York（1983）を参照のこと［Colcherら「Use  Of  Monoclonal  Antibodies  As  Radiopharmaceuticals  For  The  Localization  Of  Human  Carcinoma  Xenografts  In  Athymic  Mice」Meth．Enzymol．121：802-16（1986）もまた参照のこと］。
【０４２５】
放射線標識した抗体の場合、この抗体は、患者に投与され、抗体が反応する抗原を保有する腫瘍に局在し、そして例えば、γカメラまたはエミッション断層撮影法を用いる放射線核走査のような公知の技術を用いてインビボで検出または「画像化」される［例えば、Bradwellら「Developments  In  Antibody  Imaging」Monoclonal  Antibodies  For  Cancer  Detection  And  Therapy，Baldwinら（編）65-85頁（Academic  Press  1985）を参照のこと］。この抗体は、水、生理食塩水、リンガー溶液、ハンクス溶液のような薬学的に許容される担体、または不揮発性油のような非水性の担体中で、患者に投与される。これらの担体はまた、抗体の等張性および化学安定性を増強する物質（例えば、緩衝剤または防腐剤）を含み得る。抗体処方物は、例えば、腫瘍標的部位の可視化を可能にする十分なγ線の放射を提供するのに十分な投薬量で、静脈内投与される。十分な時間が、腫瘍標的への局在を可能にするために、抗体の投与と検出との間に許容されるべきである。腫瘍画像化の一般的な議論に関しては、Allumら、前出、51-55頁を参照のこと。
【０４２６】
C35抗体の治療適用
C35抗体の特性によって、多数のインビボ治療適用が示唆される。
【０４２７】
最初に、C35抗体が単独で使用されて、インビボで腫瘍細胞を標的化し、そしてこの腫瘍細胞を殺傷し得る。この抗体はまた、ヒト癌腫を処置するために適切な治療剤と組合わせて使用され得る。例えば、抗体は、癌腫の部位への治療剤の送達のために、化学療法、放射線治療のような標準的または従来の処置方法と組合わせて使用され得るか、あるいは、治療薬物または毒素、ならびにリンホカインまたは腫瘍阻害増殖因子に結合体化または連結され得る。
【０４２８】
このような治療剤を抗体に結合体化するための技術は、周知である［例えば、Arnonら「Monoclonal  Antibodies  For  Immunotargeting  Of  Drugs  In  Cancer  Therapy」Monoclonal  Antibodies  And  Cancer  Therapy，Reisfeldら（編）243-56頁（Alan  R．Liss，Inc．1985）；Hellstromら「Antibodies  For  Drug  Delivery」Controlled  Drug  Delivery（第2版）Robinsonら（編）623-53頁（Marcel  Dekker，Inc．1987）；Thorpe「Antibody  Carriers  Of  Cytotoxic  Agents  In  Cancer  Therapy：A  Review」Monoclonal  Antibodies'84：Biological  And  Clinical  Applications，Pincheraら（編）475-506頁（1985）；ならびにThorpeら「The  Preparation  And  Cytotoxic  Properties  Of  Antibody-Toxin  Conjugates」Immunol．Rev．，62：119-58（1982）を参照のこと］。
【０４２９】
あるいは、C35抗体は、高エネルギー放射線（例えば、＜131＞Iのような放射線同位体）に結合され得、これは、腫瘍部位に局在した場合、いくらかの細胞直径の減少（killing）を引き起こす［例えば、Order「Analysis，Results，And  Future  Prospective  Of  The  Therapeutic  Use  Of  Radiolabeled  Antibody  In  Cancer  Therapy」Monoclonal  Antibodies  For  Cancer  Detection  And  Therapy，Baldwinら（編）303-16頁（Academic  Press  1985）を参照のこと］。さらに別の態様に従って、C35抗体は、米国特許第4，676，980号にSegalによって記載されるように、腫瘍細胞の処置のための抗体ヘテロ結合体を形成するために2次抗体に結合体化され得る。
【０４３０】
本発明のC35抗体のさらに他の治療適用としては、プロドラッグを細胞傷害性薬物に変換し得る酵素への結合体化または連結（例えば、組換えDNA技術による）、および腫瘍部位においてプロドラッグを細胞傷害性薬剤に変換するための、プロドラッグを組合わせた抗体-酵素結合体の使用が挙げられる［例えば、Senterら「Anti-Tumor  Effects  Of  Antibody-alkaline  Phosphatase」Proc．Natl．Acad．Sci．USA，85：4842-46（1988）；「Enhancement  of  the  in  vitro  and  in  vivo  Antitumor  Activites  of  Phosphorylated  Mitocycin  C  and  Etoposide  Derivatives  by  Monoclonal  Antibody-Alkaline  Phosphatase  Conjugates」Cancer  Research  49：5789-5792（1989）；およびSenter「Activation  of  Prodrugs  by  Antibody-Enzyme  Conjugates：A  New  Approach  to  Cancer  Therapy「FASEB  J．4：188-193（1990）を参照のこと］。
【０４３１】
C35抗体に関するさらに別の治療用途としては、補体または抗体-薬物結合体もしくは抗体-毒素結合体の一部のいずれかの存在下での、癌患者の骨髄から腫
瘍細胞を除去するための使用が挙げられる。この手段に従って、自家骨髄は、抗体を用いた処理によってエキソビボでパージされ得、そしてこの骨髄は患者に注入によって戻され得る［例えば、Ramsayら「Bone  Marrow  Purging  Using  Monoclonal  Antibodies」J．Clin．Immunol．，8（2）：81-88  （1988）を参照のこと］。
【０４３２】
さらに、前に記載したように、キメラC35、組み換え免疫毒素およびC35モノクローナル抗体の抗原結合領域の特異性を含む本発明の他の組み換え構築物は、治療的に使用され得る。例えば、本発明の単鎖免疫毒素は、インビボにおいてヒト癌腫を処置するために使用され得る。
【０４３３】
同様に、C35抗体の少なくとも抗原結合領域（これは、抗腫瘍活性を有する第2のタンパク質（例えば、リンホカインまたはオンコスタチン）の少なくとも機能的に活性な部分に連結されている）を含む融合タンパク質は、インビボにおいてヒト癌腫を処置するために使用され得る。さらに、当技術分野で公知の組み換え技術は、二重特異的抗体を構築するために使用され得、ここで、この抗体の結合特異性の1つは、C35の結合特異性であるが、この抗体の他の結合特異性は、C35以外の分子の特異性である。
【０４３４】
最後に、C35抗体の抗イディオタイプ抗体が、活性な腫瘍免疫化および腫瘍治療において治療的に使用され得る［例えば、Hellstromら「Immunological  Approaches  To  Tumor  Therapy：Monoclonal  Antibodies，Tumor  Vaccines，And  Anti-Idiotypes」Covalently  Modified  Antigens  And  Antibodies  In  Diagnosis  And  Therapy，前出，35-41頁を参照のこと］。
【０４３５】
本発明は、C35モノクローナル抗体または機能的等価物に特異的に結合する抗原を発現する腫瘍細胞を選択的に殺傷するための方法を提供する。この方法は、本発明の免疫結合体（例えば、免疫毒素）を上記の腫瘍細胞と反応させる工程を包含する。これらの腫瘍細胞は、ヒト癌腫由来の腫瘍細胞であり得る。
【０４３６】
さらに、本発明は、インビボにおいて癌腫（例えば、ヒト癌腫）を処置する方法を提供する。この方法は、本発明の免疫結合体（例えば、免疫毒素）の少なくとも1つを含む組成物の薬学的有効量を被験体に投与する工程を包含する。
【０４３７】
本発明の実施に従って、被験体は、ヒト被験体、ウマ被験体、ブタ被験体、ウシ被験体、マウス被験体、イヌ被験体、ネコ被験体、および鳥類被験体であり得る。他の温血動物もまた、本発明に含まれる。
【０４３８】
本発明はまた、癌を罹患する被験体を治癒させるための方法を提供する。この被験体は、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ニワトリであり得る。癌は、乳癌、膀胱癌、網膜芽細胞腫、卵巣の乳頭状嚢胞腺癌（papillary  cystadenocarcinoma）、ウィルムス腫瘍、または小細胞肺癌腫として同定され得、そして一般的に、その細胞表面上に腫瘍関連抗原を有する細胞の群として特徴付けられる。この方法は、細胞傷害性薬剤に結合された癌を殺傷する量の腫瘍標的化抗体を、被験体に投与する工程を包含する。一般的に、腫瘍標的化抗体の細胞傷害性薬剤との結合は、結合される抗体が細胞表面上のその標的に結合することを可能にする条件下でなされる。その標的を結合することによって、腫瘍標的化抗体は、直接的または間接的に、結合される細胞の殺傷を引き起こすかまたはこの殺傷に寄与するために作用し、それによって被験体を治癒させる。
【０４３９】
哺乳動物の腫瘍細胞の増殖を阻害する方法がまた提供され、この方法は、この哺乳動物の腫瘍細胞の増殖を阻害するように、この哺乳動物の腫瘍細胞を十分な濃度の本発明の免疫結合体と接触させる工程を包含する。
【０４４０】
本発明はさらに、ヒト腫瘍細胞の増殖を阻害するための方法、被験体において腫瘍を処置するための方法、および被験体において増殖型疾患を処置するための方法を提供する。これらの方法は、有効量の本発明の組成物を患者に投与する工程を包含する。
【０４４１】
従って、本発明がヒト癌腫を処置するための薬学的な組成物、組み合わせおよび方法を含むことは、明らかである。例えば、本発明は、薬学的有効量のC35抗体および薬学的に許容される担体を含む、ヒト癌腫の処置における使用のための薬学的組成物を含む。
【０４４２】
この組成物は、C35抗体もしくはその断片（これらは、改変されずに治療剤（例えば、薬物、毒素、酵素または第2の抗体）と結合されているか、または組換え形態（例えば、キメラC35、キメラC35の断片、二重特異的C35または単鎖免疫毒素C35）のいずれかである）を含み得る。この組成物は、癌腫を処置するための他の抗体または結合体（例えば、抗体カクテル）をさらに含み得る。
【０４４３】
本発明の抗体、抗体結合体および免疫毒素組成物は、以下の従来の投与形態を用いて投与され得るが、これらに限定されない：静脈内投与、腹腔内投与、経口投与、リンパ内投与または腫瘍中への直接的な投与。静脈内投与が、好ましい。
【０４４４】
本発明の組成物は、種々の投薬形態であり得、この投薬形態としては、液体溶液または懸濁液、錠剤、丸薬、粉剤、坐剤、ポリマー性マイクロカプセルもしくはポリマー性微小小胞、リポソーム、および注射可能な溶液もしくは注入可能な溶液が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい形態は、投与様式および治療適用に依存する。
【０４４５】
本発明の組成物はまた、好ましくは、当技術分野で公知の、従来の薬学的に許容される担体およびアジュバント（例えば、ヒト血清アルブミン、イオン交換体、アルミナ、レクチン、ホスフェートのような緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、および塩または電解質（例えば、硫酸プロタミン））を含む。
【０４４６】
投与の最も効果的な様式および本発明の組成物についての投薬量レジメンは、疾患の重篤度および経過、患者の健康、ならびに処置をする医師の処置に対する応答およびその医師の判断に依存する。従って、この組成物の投薬量は、個々の患者に対して滴定されるべきである。それにもかかわらず、本発明の組成物の有効用量は、約1〜約2000mg/kgの範囲であり得る。
【０４４７】
本明細書中に記載される分子は、種々の投薬形態であり得、この投薬形態としては、液体溶液または懸濁液、錠剤、丸薬、粉剤、坐剤、ポリマー性マイクロカプセルもしくはポリマー性微小小胞、リポソーム、および注射可能な溶液もしくは注入可能な溶液が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい形態は、投与様式および治療適用に依存する。
【０４４８】
投与の最も効果的な様式および本発明の分子についての投薬量レジメンは、処置される腫瘍の位置、癌の重篤度および経過、被験体の健康、ならびに処置をする医師の処置に対する応答およびその医師の判断に依存する。従って、この分子の投薬量は、個々の被験体に対して滴定されるべきである。
【０４４９】
表面積のmg/kgに基づく、種々のサイズおよび種の動物ならびにヒトに対する投薬量の相互関係は、Freireich，E．J．ら，Cancer  Chemother．，Rep．50（4）：219-244（1966）によって記載される。投薬量レジメンにおける調整は、応答を阻害および消滅させる腫瘍細胞増殖を最適化するためのなされ得、例えば、投与は、分割され、かつ毎日の基礎量（daily  basis）で投与され得るか、または投与は、状況に応じて比例的に減少される（例えば、いくつかの分割した投与は、毎日投与され得るか、または特定の治療状況に応じて比例的に減少される）。
【０４５０】
治癒を達成するために必要とされる本発明の組成物の用量が、スケジュールの最適化によってさらに減少され得ることは、明らかである。
【０４５１】
本発明の実施に従って、薬学的担体は、脂質担体であり得る。脂質担体は、リン脂質であり得る。さらに、脂質担体は、脂肪酸であり得る。また、脂質担体は、界面活性剤であり得る。本明細書中に使用される場合、界面活性剤は、液体の表面張力を変更（一般的には、液体の表面張力を低下）させる任意の物質である。
【０４５２】
本発明の1つの例において、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤であり得る。非イオン性界面活性剤の例としては、ポリソルベート80（Tween  80または（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートとしても公知）、Brij、およびTriton（例えば、Triton  WR-1339およびTriton  A-20）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４５３】
あるいは、界面活性剤は、イオン性界面活性剤であり得る。イオン性界面活性剤の例としては、アルキルトリメチルアンモニウムブロマイドが挙げられるが、これに限定されない。
【０４５４】
さらに、本発明に従って、脂質担体は、リポソームであり得る。この適用において使用される場合、「リポソーム」は、本発明の任意の分子またはその組み合わせを含む、任意の膜結合小胞である。
【０４５５】
ワクチン処方物
C35エピトープは、組換えDNA方法によって大量に産生され得、そして細胞媒介性免疫応答を促進するアジュバントと共に処方され得る。本発明は、真核生物組み換え発現ベクターまたは原核生物組み換え発現ベクターのいずれかにおける、C35ポリペプチド、またはC35エピトープ（エピトープを誘発する細胞傷害性T細胞またはヘルパーT細胞を含む）の発現；ならびに免疫原性組成物および/または抗原性組成物としてのこれらの処方物を含む。このような組成物は、例えば、米国特許出願番号第08/935，377号（この内容全体は、本明細書中に参考として援用される）に記載される。本発明に従って、組み換え発現されたC35エピトープは、サブユニットワクチンとして発現され、精製され、そして処方され得る。好ましくは、C35エピトープをコードするDNAはまた、ワクチンにおける使用のために、ウイルスベクター（好ましくはポックスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、およびアルファウイルスベクター）中に構築され得る。この点において、生きた組み換えウイルスワクチン、不活化された組み換えウイルスワクチン、または殺傷された組み換えウイルスワクチンのいずれかが、処方され得る。
【０４５６】
（i）原核および真核発現系におけるC35の発現
本発明は、真核および原核発現ベクターの両方の発現系を含み、これらは、C35エピトープを発現するために使用され得る。このC35エピトープは、短縮形態または全長形態の両方で、特にサブユニットワクチンの形成のために発現され得る。
【０４５７】
本発明は、C35ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列および免疫学的に等価な断片の発現を含む。このような免疫学的に等価な断片は、この配列の5’および/または3’末端で短縮され、そして/または1つ以上の内部欠損を有する、同定されたエピトープをコードするヌクレオチド配列のアナログを作製し、このアナログヌクレオチド配列を発現し、そして免疫学的に得られた断片が、エピトープ特異的Tリンパ球によって認識され、そして細胞媒介免疫応答を誘導するか否か、または体液免疫応答の誘導のためのエピトープ特異的Bリンパ球によって認識されるか否かを決定することによって、同定され得る。
【０４５８】
本発明は、コード配列の発現を指向する調節エレメントに作動可能に結合された上記のコード配列のいずれかを含むDNA発現ベクター、および宿主細胞中のコード配列の発現を指向する調節エレメントに作動可能に結合された上記のコード配列のいずれかを含む遺伝子操作された宿主細胞を含む。本明細書中で使用される場合、調節エレメントとしては、誘導性および非誘導性のプロモーター、エンハンサー、オペレーターおよび発現を駆動しそして調節することが当業者に公知の他のエレメントが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４５９】
C35エピトープ遺伝子産物またはそのペプチド断片は、当技術分野で周知の技術を使用して、組換えDNA技術によって生成され得る。従って、エピトープ遺伝子配列を含む核酸を発現することによって、本発明のC35エピトープ遺伝子ポリペプチドおよびペプチドを調製する方法が、本明細書中に記載される。当業者に周知の方法は、エピトープ遺伝子産物コード配列および適切な転写制御シグナルおよび翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築するために使用され得る。これらの方法としては、例えば、インビトロ組換えDNA技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えが挙げられる。例えば、Sambrookら，Molecular  Cloning：A  Laboratory  Manual，2nd  Ed．，（1989），Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、およびAusubelら，1989，前出に記載の技術を参照のこと。あるいは、糖タンパク質エピトープ遺伝子産物配列をコードし得るRNAは、例えば合成機を使用して、化学的に合成され得る。例えば、「Oligonucleotide  Synthesis」，1984，Gait，M．J．編，IRL  Press，Oxford（これは、本明細書中でその全体において参考として援用される）に記載の技術を参照のこと。
【０４６０】
本発明はまた、C35エピトープ遺伝子産物のペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を含む。例えば、C35エピトープの細胞外ドメインに対応するポリペプチドまたはペプチドは、分泌を促進する「溶解性」タンパク質として有用であり得、特に、サブユニットワクチンの生成において有用である。市販の抗体によって認識される異種エピトープに連結され得るこのC35エピトープ遺伝子産物またはそのペプチド断片もまた、本発明に含まれる。耐久性の融合タンパク質もまた、操作され得る；すなわち、選択されたC35が、この異種部分から切り離され得るように、C35エピトープ配列と異種タンパク質配列との間に位置する切断部位を有する融合タンパク質。例えば、コラゲナーゼ切断認識コンセンサス配列は、C35エピトープタンパク質またはペプチドと異種ペプチドまたはタンパク質との間で操作され得る。このエピトープドメインは、コラゲナーゼでの処置によって、この融合タンパク質から放出され得る。本発明の好ましい態様において、グルタチオン-S-トランスフェラーゼの融合タンパク質およびC35エピトープタンパク質は、操作され得る。
【０４６１】
ワクチンの調製（特に、サブユニットワクチンの調製）において使用するための本発明のC35エピトープタンパク質は、実質的に純粋かまたは均一である。このタンパク質は、この試料の少なくとも60〜75％が単一のポリペプチド配列を示す場合に、実質的に純粋であるかまたは均一であるとみなされる。実質的に純粋なタンパク質は、好ましくは、タンパク質試料の60〜90％、より好ましくは約95％、および最も好ましくは99％を構成する。当業者に周知の方法（例えば、試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動、続いて染色ゲル上での単一ポリペプチドバンドの可視化）は、タンパク質の純度または均一性を決定するために使用され得る。より高い分解能は、HPLCまたは当技術分野で周知の他の類似の方法によって決定され得る。
【０４６２】
本発明は、代表的には、これらのタンパク質をコードする組換えヌクレオチド配列を発現する宿主細胞から精製されるC35ポリペプチドを含む。このようなタンパク質の精製は、当技術分野で周知の種々の方法によって達成され得る。好ましい態様において、本発明のC35エピトープタンパク質は、グルタチオンS-トランスフェラーゼを有する融合タンパク質として発現される。アフィニティークロマトグラフィーによって精製された、得られた組換え融合タンパク質およびエピトープタンパク質ドメインは、この異種部分から切り離されて、実質的に純粋なタンパク質試料を生じる。当業者に公知の他の方法が、使用され得る；例えば、「Methods  In  Enzymology」，1990，Academic  Press，Inc．，San  Diego，「Protein  Purification：Principles  and  Practice」，1982，Springer  Verlag，New  York（これらは、本明細書中で、その全体において参考として援用される）に記載される技術を参照のこと。
【０４６３】
（ii）真核および原核発現ベクター
本発明は、真核および原核発現ベクターの両方の発現系を含み、これらは、C35エピトープを発現するために使用され得る。種々の宿主発現ベクター系が、本発明のC35エピトープ遺伝子を発現するために利用され得る。このような宿主発現系は、ビヒクルを表し、このビヒクルによって、C35コード配列が生成され得、そして引き続いて精製され得るが、C35ヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトされる場合に、インサイチュで本発明のC35エピトープ遺伝子産物を示し得る細胞もまた表す。これらとしては、微生物（例えば、C35エピトープ遺伝子産物コード配列を含む組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、大腸菌、枯草菌）；C35エピトープ遺伝子産物コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、Saccharomyces，Pichia）；C35エピトープ遺伝子産物コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；C35エピトープ遺伝子産物コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV；タバコモザイクウイルス、TMV）に感染したかまたは組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Tiプラスミド）で形質転換された植物細胞系；あるいは哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター）を含む組換え発現構築物を有する、哺乳動物細胞系（例えば、COS、CHO、BHK、293、3T3））が挙げられるがこれらに限定されない。
【０４６４】
（iii）宿主細胞
本発明は、動物および昆虫の細胞株におけるC35エピトープの発現を含む。本発明の好ましい態様において、C35エピトープは、昆虫細胞株中のバキュロウイルスベクターにおいて発現されて、グリコシル化されていない抗原を生成する。本発明の別の好ましい態様において、C35エピトープは、安定にトランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞（例えば、CHO細胞株）において発現されて、グリコシル化抗原を生成する。これらの細胞株によって組換え的に発現されるC35エピトープは、サブユニットワクチンとして処方され得る。本発明はさらに、C35遺伝子産物を過剰発現する宿主細胞に関する。この細胞は、任意の適切なベクター（これは、C35ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む）、ならびにC35遺伝子産物の過剰発現を指向する適切なプロモーターおよびエンハンサー配列で過渡的または安定にトランスフェクトされたかまたは形質転換された宿主細胞であり得る。しかし、この過剰発現細胞はまた、内因性のC35遺伝子の過剰発現を指向する異種のプロモーターまたはエンハンサーの挿入（例えば、相同組換えを介する）の産物であり得る。用語「過剰発現」とは、他の同一の条件下で所定の細胞を代表的に特徴付ける基礎的な発現レベルよりも高い発現レベルをいう。
【０４６５】
挿入された配列の発現を調節するか、または所望の特定の様式でC35遺伝子産物を改変およびプロセシングする宿主細胞菌株が、選択され得る。タンパク質産物のこのような改変（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断）は、このタンパク質の機能に重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび改変のための特性および特定の機構を有する。適切な細胞株または宿主系は、発現される外来タンパク質の正確な改変を保証するように選択され得る。このために、一次転写物の適切なプロセシング、C35遺伝子産物のグリコシル化、リン酸化、およびプレニル化のための細胞機構を有する真核宿主細胞が、使用され得る。このような哺乳動物宿主細胞としては、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3およびWI38細胞株が挙げられるがこれらに限定されない。
【０４６６】
長期にわたる、組換えタンパク質の高収率の産生、安定な発現が好ましい。例えば、C35標的エピトープを安定に発現する細胞株は、操作され得る。ウイルスの複製起源を含む発現ベクターの使用ではなく、宿主細胞が、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写終結因子、ポリアデニル化部位など）および選択マーカーによって制御されるDNAで形質転換され得る。外来DNAの導入後に、操作された細胞は、富化培地において1〜2日間増殖され得、次いで選択培地に切り替えられ得る。組換えプラスミドにおける選択マーカーは、この選択に対する耐性を付与し、そして細胞は、プラスミドをその染色体に安定に組み込み、そして増殖して病巣を形成し、そしてこの病巣は、次に、クローニングされ得、そして細胞株へと拡大され得る。この方法は、細胞株を操作するために有利に使用され得る。この方法は、C35エピトープ遺伝子産物を発現する細胞株を操作するために有利に使用され得る。このような細胞株は、C35エピトープ遺伝子産物の内因性の活性に影響する化合物のスクリーニングおよび評価において特に有用である。
【０４６７】
多くの選択系が使用され得、これらとしては、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（Wiglerら，1977，Cell  11：223）、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska  ＆  Szybalski，1962，Proc．Natl．Acad．Sci．USA  48：2026）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowyら，1980，Cell  22：817）が挙げられるがこれらに限定されず、遺伝子は、それぞれ、tk-、hgprt-またはaprt-細胞において利用され得る。また、代謝拮抗物質耐性は、以下の遺伝子の選択の基礎として使用され得る：dhfr（これは、メトトレキセートに対する耐性を付与する）（Wiglerら，1980，Proc．Natl．Acad．Sci．USA  77：3567；O'Hare，ら，1981，Proc．Natl．Acad．Sci．USA  78：1527）；gpt（これは、ミコフェノール酸に対する耐性を付与する）（Mulligan  ＆  Berg，1981，Proc．Natl．Acad．Sci．USA  78：2072）；neo（これは、アミノグリコシドG-418に対する耐性を付与する）（Colberre-Garapinら，1981，J．Mol．Biol．150：1）；およびhygro（これは、ハイグロマイシンに対する耐性を付与する）（Santerre，ら，1984，Gene  30：147）。
【０４６８】
あるいは、任意の融合タンパク質が、発現される融合タンパク質に特異的な抗体を利用して、容易に精製され得る。例えば、Janknechtらによって記載される系は、ヒト細胞株において発現する非変性融合タンパク質の容易な精製を可能にする（Janknechtら，1991，Proc．Natl．Acad．Sci．USA  88：8972-8976）。この系において、目的の遺伝子は、この遺伝子のオープンリーディングフレームが、6個のヒスチジン残基からなるアミノ末端タグに翻訳的に融合されるように、ワクシニア組換えプラスミド中にサブクローニングされる。組換えワクシニアウイルスで感染した細胞由来の抽出物は、Ni2＋ニトリロ酢酸-アガロースカラム上にロードされ、そしてヒスチジンでタグ化されたタンパク質が、イミダゾール含有緩衝液を用いて選択的に溶出される。
【０４６９】
（iv）組換えウイルスワクチン中でのC35エピトープの発現
本発明の別の態様において、C35エピトープを発現する生きている組換えウイルスワクチンまたは不活化組換えウイルスワクチンのいずれかが、操作され得る。生ワクチンが、好ましくあり得る。なぜなら、宿主における増殖が、天然の感染において生じるのと同様の種類および大きさの長期の刺激をもたらし、したがって、実質的な持続性の免疫を付与するからである。このような生きた組換えウイルスワクチン処方物の生成は、細胞培養物またはニワトリ胚の尿膜におけるウイルスの増殖、続く精製を含む従来の方法を使用して、達成され得る。
【０４７０】
この点について、種々のウイルスが、C35エピトープを発現するために遺伝的に操作され得る。ワクチンの目的のために、組換えウイルスが、弱毒化特性を示すことが要求され得る。ヒトにおける使用のための現在の生きているウイルスワクチン候補は、寒冷適応性であるか、温度感受性であるか、または弱毒化されたかのいずれかである。トランスフェクションのために使用されるテンプレートへの適切な変異（例えば、欠失）の導入は、弱毒化特性を有する新規なウイルスを提供し得る。例えば、温度感受性または寒冷適応性に関連する特定の複数のミスセンス変異が、欠失変異体になされ得、そして/または複数の変異が、個々のウイルス遺伝子に導入され得る。これらの変異体は、単一の点変異を含む寒冷または温度感受性の変異体よりもより安定であるはずであり、そして逆転の頻度は、非常に低いはずである。あるいは、「自殺」特性を有する組換えウイルスが、構築され得る。このようなウイルスは、宿主における1回または数回のみの複製を経る。
【０４７１】
本発明の目的のために、任意のウイルスが本発明に従って使用され得、このウイルスは、（a）弱毒化表現型を示すか、または弱毒化された特性を示すように操作さえれ得；（b）哺乳動物（特に、ヒト）についての向性を示すか、またはこのような向性を示すように操作され得；そして（c）本発明のC35エピトープを発現するように操作され得る。
【０４７２】
ワクシニアウイルスベクターは、DNAの大きな断片が、そのゲノム中に容易にクローニングされるので、本発明に従って使用され得、そして組換え弱毒化ワクシニア改変体が記載される（Meyerら，1991，J．Gen．Virol．72：1031-1038）。オルトミクソウイルス（インフルエンザを含む）；パラミクソウイルス（RSウイルスおよびセンダイウイルスを含む）；ならびにラブドウイルスは、弱毒化された表現型を生じる変異体を発現するために操作され得る（1996年11月26日発行の米国特許出願番号5，578，473を参照のこと）。これらのウイルスゲノムはまた、外来ヌクレオチド配列（例えば、本発明のC35エピトープ）を発現するように操作され得る（1992年11月24日発行の米国特許出願番号5，166，057（その全体において本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。逆転遺伝子技術は、インフルエンザウイルス、単純疱疹ウイルス、サイトメガロウイルスおよびエプスタイン-バーウイルス、シンドビスウイルスおよびポリオウイルスにおいて実証されるような、弱毒化表現型を生じる変異をネガティブおよびポジティブ鎖RNAウイルスゲノムに導入するよう操作するために適用され得る（Paleseら，1996，Proc．Natl．Acad．Sci．USA  93：11354-11358を参照のこと）。これらの技術はまた、本発明に従うワクチンとして使用される組換えウイルスベクターを生成するために、外来DNA（すなわち、C35エピトープ）に導入するために利用され得る。例えば、米国特許出願番号08/935，377を参照のこと（この内容全体は、本明細書中に参考として援用される）。さらに、弱毒化されたアデノウイルスおよびレトロウイルスは、C35エピトープを発現するように操作され得る。従って、広範な種々のウイルスが、本発明のワクチンを設計するために操作され得るが、例として、そして限定ではなく、ワクチンとして使用するためのC35エピトープを発現する組換え弱毒化ワクシニアベクターが、本明細書中に記載される。
【０４７３】
1つの態様において、組換え改変ワクシニア改変体、改変ウイルスAnkara（MVA）が、ワクチンの処方において使用される。この改変ウイルスは、鳥類細胞中で500サイクル継代され、そしてこれは哺乳動物細胞中での完全な感染性サイクルを起こし得ない（Meyerら，1991，J．Gen．Virol．72：1031-1038）。ワクチンとして使用される場合、この組換えウイルスは、単一の複製サイクルを経、そして十分なレベルの免疫応答を誘導するが、ヒト宿主においてはさらなる複製サイクルを経ず、そして疾患を引き起こす。必須ワクシニアウイルス遺伝子のうちの1つ以上を欠失する組換えウイルスは、連続的な複製の回転を起こし得ない。このような欠損ウイルスは、ウイルスの複製に必要な特定の遺伝子を欠失するワクシニアベクターを、この遺伝子を持続的に発現する細胞株に同時トランスフェクトすることによって生成され得る。必須遺伝子を欠失するウイルスは、これらの細胞株において複製されるが、ヒト宿主に投与される場合、複製の1回転を完了できない。このような調製物は、この不完全なサイクルにおいて、免疫応答を誘導するために十分な数の遺伝子を、転写および翻訳し得る。
【０４７４】
あるいは、より多量の菌株が投与され得、その結果、これらの調節物は、不活化（死亡した）ウイルス、ワクチンとして役立つ。不活化ワクチンについて、異種のC35遺伝子産物がウイルス成分として発現され、その結果、このC35遺伝子産物が、このビリオンに結合することが好ましい。このような調製物の利点は、これらがネイティブのタンパク質を含み、そしてホルマリンまたは死滅させたウイルスワクチンの製造において使用される他の因子での処置による不活化を起こさせない。
【０４７５】
本発明の別の態様において、不活化ワクチン処方物は、組換えウイルスを「死滅させる」ための従来の技術を使用して調製される。不活化ワクチンは、その感染力が破壊されているという意味で、「死滅して」いる。理想的には、このウイルスの感染力は、免疫原性に影響することなく破壊される。不活化ワクチンを調製するために、この組換えウイルスは、細胞培地またはニワトリ胚の尿膜において増殖され得、帯状超遠心分離によって精製され得、ホルムアルデヒドまたはβ-プロピオラクトンによって不活化され得、そしてプールされる。得られたワクチンは、通常、筋肉内接種される。
【０４７６】
不活化ウイルスは、免疫学的応答を増大するために、適切なアジュバントを用いて処方され得る。このようなアジュバントとしては、鉱物ゲル（例えば、水酸化アルミニウム）；界面活性剤（例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン）；ペプチド；オリゴヌクレオチド；油乳濁液；ならびに潜在的に有用なヒトアジュバント（例えば、BCGおよびCorynebacterium  parvum）が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【０４７７】
（v）処置および/またはワクチン接種の方法  
本発明のC35エピトープは、大量に生成され得るので、従って、生成および精製されたこの抗原は、ワクチン調製物における用途を有する。このC35エピトープは、サブユニットワクチン調製物に処方され得るか、またはウイルスベクターに操作され、そしてワクチン調製物へと処方され得る。あるいは、C35エピトープをコードするDNAは、ワクチン処方物として直接投与され得る。「裸の」プラスミドDNAは、一旦被験体に投与されると、細胞を侵襲し、発現され、ペプチド断片にプロセシングされ、このうちいくつかは、この侵襲された細胞の表面上のMHC分子に結合して示され得、そしてTリンパ球がこのC35エピトープを示す細胞を攻撃するように、細胞の免疫応答を誘発する。このC35エピトープはまた、例えば、被験体由来の体液の試料中の、C35を発現する腫瘍の存在、またはC35を発現する腫瘍によって誘導される抗体またはT細胞の存在を検出または測定するための、そして従って、癌および腫瘍を診断するための、そして/またはワクチン接種に続いて被験体の細胞免疫応答をモニターするための、診断における有用性を有する。
【０４７８】
本発明の組換えウイルスは、腫瘍細胞に対する免疫応答を生成するために、腫瘍保有哺乳動物（ヒトを含む）を処置するために使用され得る。適切かつ適正な免疫応答の生成は、インビボでの腫瘍の退行をもたらす。このような「ワクチン」は、単独で、または腫瘍の処置のための他の治療レジメン（化学療法、放射線療法、手術、骨髄移植などが挙げられるがこれらに限定されない）と組合せてのいずれかで、使用され得る。例えば、外科的技術または放射線技術は、腫瘍塊の体積を減らす（debulk）ために使用され得、この後、本発明のワクチン処方物は、身体における残りの腫瘍塊または微小転移巣の進行の退行および予防を保証ために、投与され得る。あるいは、「ワクチン」の投与は、このような外科的処置、放射線処置または化学療法処置に先行し得る。
【０４７９】
あるいは、本発明の組換えウイルスは、腫瘍の形成を予防するために、腫瘍を有さない被験体に免疫または「ワクチン接種」するために使用され得る。遺伝子検査の出現によって、特定の癌についての被験体の素因を予測することが現在では可能である。従って、このような被験体は、C35抗原を発現する組換えワクシニアウイルスを使用して免疫され得る。
【０４８０】
C35エピトープワクチン処方物の免疫力価は、免疫後の試験動物の免疫応答をモニターすることによって、または当技術分野で公知の任意のイムノアッセイを使用することによって、決定され得る。細胞媒介性および/または体液性の免疫応答の生成は、免疫応答の徴候として解され得る。試験動物としては、マウス、ハムスター、イヌ、ネコ、サル、ウサギ、チンパンジーなど、および最終的には、ヒト被験体が含まれ得る。
【０４８１】
このようなワクチンの適切な調製物としては、注入可能な、液体溶液または懸濁液のいずれかが含まれる；注射前の、液体中の溶液または懸濁液に適切な固体形態もまた、調製され得る。この調製物はまた、乳化され得るか、またはリポソーム中にカプセル化されたポリペプチドであり得る。この活性な免疫原性成分は、しばしば、賦形剤（これは、薬学的に許容され、かつこの活性成分と適合性である）と混合される。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノールなど、およびその組合せである。さらに、所望の場合、このワクチン調製物はまた、少量の補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝剤、および/またはアジュバント（これは、このワクチンの有効性を増大する））を含み得る。
【０４８２】
有効であり得るアジュバントの例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：水酸化アルミニウム、N-アセチル-ムラミル-L-スレオニル-D-イソグルタミン（thr-MDP）、N-アセチル-ノル-ムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン、N-アセチル-ムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミニル-L-アラニン-2-（1’-2’-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ヒドロキシホスホリルオキシ）-エチルアミン、GM-CSF、QS-21（治験の薬物、Progenics  Pharmaceuticals、Inc．）、DETOX（治験の薬物、Ribi  Pharmaceuticals）、BCG、およびCpG富化オリゴヌクレオチド。
【０４８３】
アジュバントの有効性は、C35エピトープ（epitome）に対する細胞免疫応答を誘導を測定することによって決定され得る。
【０４８４】
本発明のワクチンは、多価または一価であり得る。多価ワクチンは、1つより多い抗原の発現を指向する組換えウイルスから作製される。複数のT細胞エピトープ（epitome）（細胞傷害性およびヘルパーの両方）から構成される多価ワクチンが好ましい。
【０４８５】
所望ならば、この組成物はまた、少量の湿潤剤または乳化剤、あるいはpH緩衝化剤を含み得る。この組成物は、液体、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル、徐放性処方物、または粉末であり得る。経口処方物は、標準的な担体（例えば、医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムなど）を含み得る。
【０４８６】
一般に、これらの成分は、活性薬剤の量を示す密封容器（例えば、アンプルまたはサシェ）中の単位用量形態（例えば、凍結乾燥された乾燥粉末または水を含まない濃縮物）で、別個に供給されるか、または一緒に混合されるかのいずれかである。この組成物が、注入によって投与される場合、滅菌希釈剤のアンプルが、これらの成分が投与の前に混合され得るように提供され得る。
【０４８７】
特定の態様において、凍結乾燥された本発明のC35エピトープが、第一の容器に提供され；第二の容器は、50％グリセリンの水溶液、0.25％フェノール、および防腐薬（例えば、0.005％ブリリアントグリーン）からなる希釈剤を含む。
【０４８８】
精製されたC35抗原のワクチン調製物としての使用は、標準的な方法によって実施され得る。例えば、精製されたC35エピトープは、適切な濃度に調節され、任意の適切なワクチンアジュバントとともに処方され、そして使用のために包装されるべきである。適切なアジュバントとしては、以下が挙げられ得るが、これらに限定されない：鉱物ゲル（例えば、水酸化アルミニウム）；表面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニック（pluronic）ポリオール）；ポリアニオン；ペプチド；オイルエマルジョン；ミョウバンおよびMDP。免疫原がまた、ワクチン処方物における使用のために、リポソームに組み込まれるか、または多糖類および/または他のポリマーと結合され得る。例えば、組換え抗原がハプテン（すなわち、同族抗体と選択的に反応し得る点で抗原性であるが、免疫応答を惹起し得ないという点で免疫原性ではない、分子）である場合、このハプテンは、担体または免疫原性分子に共有結合され得る；例えば、血清アルブミンのような大きなタンパク質は、それに結合したハプテンに免疫原性を付与する。ハプテン-担体は、ワクチンとしての使用のために処方され得る。
【０４８９】
多くの方法が、上記のワクチン処方物を患者に導入するために使用され得る。これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されえない：経口、真皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、経皮、硬膜外、肺、胃、腸、直腸、腟または尿道経路。処置方法が本発明の生きたワクシニアワクチン処方物を使用する場合、ワクシニアウイルスの天然の感染経路（すなわち、粘膜または表面（例えば、経口、経鼻、胃、腸、直腸、膣または尿道経路あるいは皮膚を介して））を介して、処方物を導入することが所望され得る。CTL応答を誘導するために、粘膜投与経路は、口咽頭膜または鼻の膜を介し得る。あるいは、投与の筋肉内経路または腹腔内経路が使用され得る。好ましくは、106〜107PFU（プラーク形成単位）の用量の寒さに適合された組換えワクチンウイルスが、ヒト患者に与えられる。
【０４９０】
処方物に使用されるワクチン調製物の正確な用量はまた、投与経路および患者の性質に依存し、そして医師の判断および各患者の環境にしたがって標準的な臨床技術によって決定されるべきである。有効最小量は、このワクチン組成物が投与された宿主中で抗原に対する免疫応答を生成するに十分な量である。
【０４９１】
引く続く用量またはブースト用量が、必要とされる場合、改変されたワクチンウイルス（例えば、MVA）が、組換え体を生成するために使用される親ウイルスとして選択され得る。あるいは、他のウイルス（例えば、アデノウイルス、カナリア痘ウイルス）、またはサブユニット調製物が、ブーストするために使用され得る。免疫および/または癌免疫療法は、組み合わせた免疫レジメン（例えば、本発明の組換えワクシニアウイルスワクチンでの免疫および組換えアデノウイルスワクチンのブースト）を使用して達成され得る。このような態様において、強力な第二のCD8＋T細胞応答が、同じエピトープを発現する異なるウイルスを用いてプライミングおよびブーストした後に、誘導される（このような免疫およびブーストの方法については、例えば、Murataら、Cellular  Immunol．173：96-107を参照のこと）。例えば、患者を、最初に、エピトープ（例えば、選択された腫瘍関連抗原またはその断片）を発現する組換えワクチンを含む本発明のワクチン処方物でプライムされる。患者は、次いで、同じエピトープを発現するワクチン以外の組換えウイルスを含むワクチン組成物を用いて、例えば、21日後、ブーストする。このようなプライミング、続くブーストは、強力な二次T細胞応答を誘導する。このようなプライミングおよびブースト免疫レジメンは、好ましくは、腫瘍、転移または腫瘍会合体（例えば、C35抗原）を発現する腫瘍性増殖を有する患者を処置するために使用される。
【０４９２】
なお別の態様において、組換えワクシニアウイルスは、不活性型腫瘍細胞での1次免疫に続くブースト免疫として、C35抗原またはそのエピトープを含むサブユニットワクチンとして、または別の組換えウイルスワクチン（例えば、アデノウイルス、カナリア痘ウイルスまたはMVA）として使用され得る。
【０４９３】
代替の態様において、C35エピトープまたはその断片をコードする組換えワクシニアウイルスが、患者と組織適合性であり、そしてC35抗原に特異的であるTリンパ球の活性化のための関連する免疫療法において使用され得る（関連する免疫療法の方法については、例えば、Rosenberg、米国特許第4，690，915号、1987年9月1日発行；Zarlingら、米国特許第5，081，029号、1992年1月14日に発行を参照のこと）。このようなTリンパ球は、患者または組織適合性のドナーから単離され得る。これらのTリンパ球は、本発明の組換えワクシニウイルスに曝露することによって、インビトロで活性化され得る。活性化されたTリンパ球は、拡大され、そしてC35抗原エピトープ（epitome）に対するT細胞免疫性を移すために、患者に接種される。
【０４９４】
本発明はまた、本発明のワクチン処方物の成分の1つ以上を含む1つ以上の容器を備える、薬学的パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形態の通告が、このような容器にも適用され、この通告は、ヒト投与について、製造、使用または販売の機関による承認を反映する。
【０４９５】
癌診断および予後
腫瘍発達に影響を与える遺伝子の2つのクラスが存在する。DNAレベルでの変化（例えば、変異）の結果として直接作用する癌の表現型（例えば、BRCA1、BRCA2、およびp53）に影響を及ぼす遺伝子は、1つのクラスの遺伝子である。別のクラスの遺伝子は、発現レベルでの調節によって表現型に影響を与える。乳癌の発症および引く続く悪性進行は、両方のクラスの種々の遺伝子の改変に関係する。悪性乳腺において生じる遺伝子発現の定量的な変化の同定は、十分に特徴付けられる場合、ヒト乳癌の診断および処置において有用であり得る新規な分子マーカーを生じ得る。
【０４９６】
本発明は、新しい謬癌マーカーC35を同定し、このマーカーC35は、原発性浸潤管内乳房癌細胞において示差的に発現される。正常な乳房上皮細胞におけるC35の低い発現レベルは、C35の過剰発現が、乳癌の悪性進行を示すことを示唆する。おそらく、C35はまた、膀胱および肺を含む他の特定の組織型の腫瘍において過剰発現され得る。
【０４９７】
本発明は、癌を有する哺乳動物における特定の組織が、対応する「標準的な」哺乳動物（すなわち、癌を有さない同じ種の哺乳動物）と比較した場合に、有意に増加したレベルのC35タンパク質およびC35タンパク質をコードするmRNAを発現することを立証した。さらに、増加したレベルのC35タンパク質、またはC35タンパク質に特異的抗体もしくはリンパ球は、癌を有さない同じ腫の哺乳動物由来の血清と比較した場合、癌を有する哺乳動物由来の特定の体液（例えば、血清、血漿、尿、および脊髄液）において検出され得る。従って、本発明は、腫瘍診断に有用な診断方法を提供し、この方法は、哺乳動物細胞または体液中のC35タンパク質をコードする遺伝子のレベルをアッセイする工程およびこの遺伝子発現レベルを標準的なC35遺伝子発現レベルと比較する工程を包含し、それによって、標準を越えるこの遺伝子の発現レベルの増加が、特定の腫瘍の指標となる。あるいは、C35タンパク質またはC35ポリペプチドに特異的な抗体またはリンパ球の発現レベルが、血液または他の体液において決定され得、そしてC35特異的抗体またはリンパ球の発現の標準と比較され得ると考えられる。
【０４９８】
腫瘍診断が、従来の方法に従って既になされた場合、本発明は、予後指標として有用であり、それによって、増加したC35遺伝子発現を示す患者が、より低い発現レベルでこの遺伝子を発現する患者と比べて、より悪い臨床的な結果を経験し得る。
【０４９９】
「C35タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルをアッセイする」とは、直接的に（例えば、絶対的なタンパク質レベルまたはmRNAレベルを決定または評価することによって）か、または相対的に（例えば、第二の生物学的試料中のC35タンパク質レベルまたはmRNAレベルと比較することによって）かのいずれかで、第一の生物学的試料中の、C35タンパク質のレベルまたはC35タンパク質をコードするmRNAのレベルを、定性的にまたは定量的に、決定または評価することが意図される。
【０５００】
好ましくは、第一の生物学的試料中のC35タンパク質レベルまたはmRNAレベルが、測定または評価され、そして標準的なC35タンパク質レベルまたはmRNAレベルと比較され、ここで、この標準は、癌を有さない個体から得られた第二の生物学的試料から取られる。当技術分野で理解されるように、一旦、標準的なC35タンパク質レベルまたはmRNAレベルが知られると、これは、比較のための標準として繰返し使用され得る。
【０５０１】
「生物学的試料」は、個体、細胞株、組織培養物、またはC35タンパク質もしくはmRNAを含む他の供給源から得られた任意の生物学的試料を意図する。生物学的試料としては、哺乳動物の体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液および脊椎液）（これは、分泌成熟C35タンパク質を含む）、ならびに卵巣、前立腺、心臓、胎盤、膵臓、肝臓、脾臓、肺、乳房、膀胱および臍帯組織（これらは、C35の前駆体または成熟形態を含み得る）が挙げられる。
【０５０２】
本発明は、哺乳動物における癌を検出するために有用である。特に、本発明は、哺乳動物における以下の型の癌の診断の間に有用である：乳癌、膀胱癌、卵巣癌、前立腺癌、骨の癌、肝臓癌、肺癌、膵臓癌および脾臓癌。好ましい哺乳動物としては、サル（monkey）、サル（ape）、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、およびヒトが挙げられる。特に好ましいのは、ヒトである。
【０５０３】
総細胞RNAは、1工程のグアニジウム-チオシアネート-フェノール-クロロホルム法（ChomczynskiおよびSacchi、Anal．Biochem．162：156-159（1987）に記載される）を使用して、生物学的試料から単離され得る。次いで、C35タンパク質をコードするmRNAのレベルが、任意の適切な方法を使用して、アッセイされ得る。これらには、ノーザンブロット分析（Haradaら、Cell  63：303-312（1990））、S1ヌクレアーゼマッピング（Fujitaら、Cell  49：357-367（1987））、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写（RT-PCR）（Makinoら、Technique  2：295-301（1990））、およびリガーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写（RT-LCR）が挙げられる。
【０５０４】
生物学的試料中のC35タンパク質レベルをアッセイすることは、抗体ベースの技術を使用して行い得る。例えば、組織におけるC35タンパク質発現は、古典的な免疫組織学的方法を用いて研究され得る（Jalkanen、M．ら、J．Cell．Biol．101：976-985（1985）；Jalkanen、M．ら、J．Cell．Biol．105：3087-3096（1987））。
【０５０５】
C35タンパク質発現を検出するために有用な他の抗体ベースの方法としては、免疫アッセイ（例えば、酵素結合イムノソルベント検定法（ELISA）、ELISPOT、およびラジオイムノアッセイ（RIA））が挙げられる。
【０５０６】
適切な標識は当技術分野で公知であり、以下が挙げられる：酵素標識（例えば、グルコースオキシダー）、および放射性同位体（例えば、ヨウ素（125I、121I）、炭素（14C）、イオウ（35S）、トリチウム（3H）、インジウム（112In）、おおびテクネチウム（99mTc））、ならびに蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）、ならびにビオチン。
【０５０７】
C35特異的T細胞は、当技術分野で公知の方法に従う抗原提示細胞によって提示されるC35による活性化に続いて、種々の増殖アッセイおよびリンホカイン分泌アッセイにおいて検出され得る。可溶性MHC分子に結合するC35ペプチドエピトープのテトラマー複合体を使用して、細胞の集団中のC35特異的T細胞を直接染色し、そして数えることができる（Lee，P．P．ら、Nature  Medicine  5：677-85（1999）（この全内容が、本明細書中で参考として援用される））。
【０５０８】
生物学的試料中の分泌されたタンパク質のレベルをアッセイすることに加えて、タンパク質がまた、画像化によってインビボで検出され得る。タンパク質のインビボ画像化のための抗体標識またはマーカーとしては、X線撮影法、NMRまたはESRによって検出可能なものが挙げられる。X線撮影法について、適切な標識としては、バリウムまたはセシウムのような放射性同位体が挙げられ、これらは、検出可能な放射線を放射するが、被検体に対しては、明白に有害ではない。NMRおよびESRのために適切なマーカーとしては、検出可能で特徴的なスピンを有するマーカーが挙げられ、これには、重水素が挙げられ、これは、関連するハイブリドーマの栄養物の標識化によって抗体に組み込まれ得る。
【０５０９】
適切な検出可能な画像化部分（例えば、放射性同位体（例えば、131I、112In、99mTc）、放射線不透明物質または核磁気共鳴によって検出可能な物質）で標識されたタンパク質特異的抗体または抗体断片が、哺乳動物に導入される（例えば、非経口的に、皮下に、または腹腔内に）。被検体のサイズおよび使用される画像化システムによって、診断画像を生成するために必要とされる画像化部分の量が決定されることは、当技術分野で理解される。放射性同位体部分の場合において、ヒト被検体について、注入される放射線の量は、通常、約5〜20ミリキューリーの範囲の99mTcである。次いで、標識された抗体または抗体断片は、特定のタンパク質を含む細胞の位置に優先的に蓄積する。インビボ腫瘍画像化は、S．W．Burchielら、「Immunopharmacokinetics  of  Radiolabeled  Antibodies  and  Their  Fragments．」（Tumor  Imagingの第13章：The  Radiochemical  Detection  of  cancer、S．W．BurchielおよびB．A．Rhodes、編、Masson  Publishing  Inc．（1982））に記載される。
【０５１０】
融合タンパク質
任意のC35ポリペプチドは、融合タンパク質を生成するために使用され得る。例えば、このC35ポリペプチドは、第二のタンパク質に融合される場合、抗原性タグとして使用され得る。このC35ポリペプチドに対して惹起される抗体は、C35に結合することによって第二のタンパク質を間接的に検出するために使用され得る。さらに、分泌タンパク質は、輸送シグナルに基づいて細胞位置を標的化するので、このC35ポリペプチドは、一旦他のタンパク質に融合されると、標的化分子として使用され得る。本明細書で使用する「融合タンパク質」という用語は、C35ポリペプチド断片を意味しない。
【０５１１】
C35ポリペプチドに融合され得るドメインの例としては、異種シグナル配列だけでなく、他の異種の機能的領域もまた挙げられる。この融合は、必ずしも直接的である必要はないが、リンカー配列を介して生じ得る。好ましい態様において、本発明の融合タンパク質は、少なくとも1つのさらなるC35ペプチドエピトープまたはC35ペプチドエピトープアナログに連結された少なくとも1つのC35ペプチドエピトープまたはC35ペプチドエピトープアナログを含む。特に好ましい態様においては、本発明の融合タンパク質は、同一C35ペプチドエピトープまたはC35ペプチドエピトープアナログのホモポリマー、ならびに異なるC35ペプチドエピトープおよびC35ペプチドエピトープアナログのヘテロポリマーを含む。
【０５１２】
特定の好ましい態様において、さらなるN末端および/またはC末端のアミノ酸残基を含むC35融合ポリペプチドが構築され得る。特に、本明細書中に開示された任意のN末端またはC末端が欠失したC35ポリペプチドは、N末端でのさらなるアミノ酸残基の包含によって改変されて、C35融合ポリペプチドを生成し得る。さらに、上記のようなN末端欠失およびC末端欠失の任意の組み合せを含むC35ポリペプチドに融合されたさらなるN末端および/またはC末端アミノ酸残基を含む、C35融合ポリペプチドが、考慮される。
【０５１３】
さらに、融合タンパク質はまた、C35の特徴を改善するように操作され得る。例えば、さらなるアミノ酸（特に荷電したアミノ酸）の領域は、C35ポリペプチドのN末端に付加されて、宿主細胞からの精製または引き続く操作および保存の間の安定性および持続性を改善し得る。また、ペプチド部分が、C35ポリペプチドに付加されて、精製を容易にし得る。このような領域は、C35ポリペプチドの最終的な調製の前に、除去され得る。ポリペプチドの取り扱いを容易にするためのペプチド部分の付加は、当技術分野でよく知られた慣用的な技術である。
【０５１４】
さらに、C35ポリペプチド（断片を含む）、および特定のエピトープは、免疫グロブリン（IgG）の定常領域の一部分と組み合され得、キメラポリペプチドを生じる。これらの融合タンパク質は、精製を容易にし、そしてインビボでの増加した半減期を示す。1つの報告された例は、ヒトCD4ポリペプチドの最初の2つのドメインと、哺乳動物免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインとからなるキメラタンパク質を記載する（EP  A  394，827；Trauneckerら、Nature  331：84-86（1988））。ジスルフィド連結ダイマー構造（IgGに起因する）を有する融合タンパク質はまた、モノマー性分泌タンパク質またはタンパク質断片単独よりも、他の分子を結合および中和する際に効率であり得る。（Fountoulakisら、J．Biochem．270：3958-3964（1995））。
【０５１５】
同様に、EP-A-O  464  533（カナダの対応物2045869）は、別のヒトタンパク質またはその一部分とともに、免疫グロブリン分子の定常領域の種々の部分を含む融合タンパク質を開示する。多くの場合において、融合タンパク質中のFc部分は、治療および診断において有益であり、従って、例えば、改善された薬物動態学特性を生じ得る。（EP-A  0232  262）。あるいは、融合タンパク質が発現され、検出され、そして精製された後に、Fc部分を欠失することが、所望される。例えば、Fc部分は、融合タンパク質が、免疫のための抗原として使用される場合、治療および診断の妨げになり得る。薬物発見において、例えば、ヒトタンパク質（例えば、hIL^5）は、hIL-5のアンタゴニストを同定するためのハイスループットスクリーニングアッセイの目的のために、Fc部分と融合された。（D．Bennettら、J．Molecular  Recognition  8：52-58（1995）；K．Johansonら、J．Biol．Chem．270：9459-9471（1995）を参照のこと）。
【０５１６】
さらに、C35ポリペプチドは、マーカー配列（例えば、C35の精製を容易にするペプチド）に融合され得る。好ましい形態において、マーカーアミノ酸配列は、ヘキサヒスチジン配列（例えば、pQEベクター（QIAGEN，Inc．，9259  Eton  Avenue，Chatsworth，CA，91311）に提供されるタグ）であり、この中でも、これらの多くが市販されている。Gentzら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA  86：821-824（1989）に記載されるように、例えば、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の好都合な精製を提供する。精製のために有用な別のペプチドタグ（「HA」タグ）は、インフルエンザ血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する。（Wilsonら、Cell  37：767（1984））。
【０５１７】
従って、これらの上記の融合物のいずれかが、C35ポリヌクレオチドまたはC35ポリペプチドを使用して、操作され得る。
【０５１８】
ベクター、宿主細胞、およびタンパク質の産生
本発明はまた、C35ポリヌクレオチドを含むベクター、宿主細胞、および組換え技術によるC35ポリペプチドの産生に関する。このベクターは、例えば、ファージベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターであり得る。レトロウイルスベクターは、複製可能（replication  competent）であってもよいし、複製不完全性（replication  defective）であってもよい。後者の場合、ウイルス増殖は、一般に、相補宿主細胞においてのみ起こる。
【０５１９】
C35ポリヌクレオチドは、宿主における増殖のための選択マーカーを含むベクターに結合され得る。一般に、プラスミドベクターは、沈澱物（例えば、リン酸カルシウム沈澱）に導入されるか、または荷電した脂質との複合体に導入される。このベクターがウイルスである場合、このベクターは、適切なパッケージング細胞株を使用して、インビトロでパッケージングされ得、次いで宿主細胞に形質導入され得る。
【０５２０】
C35ポリヌクレオチド挿入物は、適切なプロモーター（多少列挙すると、例えばファージλPLプロモーター、大腸菌  lac、trp、phoAおよびtacプロモーター、SV40初期および後期プロモーター、ならびにレトロウイルスLTRのプロモーター）に作動可能に連結されるべきである。他の適切なプロモーターは、当業者に公知である。発現構築物は、さらに、転写開始、終結のための部位、ならびに転写された領域において、翻訳のためのリボソーム結合部位を含む。これらの構築物によって発現された転写物のコード部分は、好ましくは、翻訳されるポリペプチドの始めに翻訳開始コドンそして末端に適切に位置する終止コドン（UAA、UGA、またはUAG）を含む。
【０５２１】
示されたように、発現ベクターは、好ましくは、少なくとも1つの選択カーカーを含む。このような選択マーカーとしては、以下が挙げられる：真核生物細胞培養のための、ジヒドロ葉酸還元酵素、G418またはネオマイシン耐性、ならびに大腸菌および他の細菌を培養するための、テトラサイクリン、カナマイシンまたはアンピリシン耐性遺伝子。適切な宿主の代表的な例としては、以下が挙げられるがこれらの限定されない：細菌細胞（例えば、大腸菌、StreptomycesおよびSalmonella  typhimurium細胞）；真菌細胞（例えば、酵母細胞）；昆虫細胞（例えば、Drosophila  S2およびSpodoptera  Sf9細胞）；動物細胞（例えば、CHO、COS、293、およびBowes黒色腫細胞）；ならびに植物細胞。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は、当技術分野で公知である。
【０５２２】
細菌における使用のために好ましいベクターとしては、pHE-4（およびその改変体）；pQE70、pQE60およびpQE-9（QIAGEN，Inc．から入手可能）；pBluescriptベクター、Phagescriptベクター、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A（Stratagene  Cloning  Systems，Inc．から入手可能）；ならびにptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5（Pharmacia  Biotech，Inc．から入手可能）が挙げられる。中でも好ましい真核生物ベクターは、pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1およびpSG（Stratageneから入手可能）；ならびにpSVK3、pBPV、pMSGおよびpSVL（Pharmaciaから入手可能）である。他の適切なベクターが当業者に容易に明らかである。好ましいベクターは、ポックスウイルスベクター、特に、ワクシニアウイルスベクター（例えば、米国特許第08/935，577号（この内容は本明細書中で参考として援用される）に記載されるベクター）である。
【０５２３】
構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介性トランスフェクション、カチオン性脂質媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の方法によって行われ得る。このような方法は、多くの標準的な研究マニュアル（例えば、Davisら、Basic  Methods  In  Molecular  Biology（1986））に記載される。
【０５２４】
C35ポリペプチドは、周知の方法（硫酸アンモニウム沈降またはエタノール沈降、酸抽出、陰イオン交換クロマトグラフィーおよび陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ならびにレクチンクロマトグラフィーを含む）によって組換え細胞培養物から回収および精製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「HPLC」）が精製のために用いられる。
【０５２５】
C35ポリペプチドはまた、以下から回収され得る：天然の供給源（体液、組織および細胞を含む）から精製される産物（直接単離されていても培養されていても）；化学合成手順の産物；および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞を含む）から組み替え技術により産生される産物。組換え産生手順で用いられる宿主に依存して、C35ポリペプチドは、グリコシル化され得るかまたは非グリコシル化され得る。さらに、C35ポリペプチドはまた、いくつかの場合において、宿主媒介プロセスの結果として、初期改変メチオニン残基を含む。従って、翻訳開始コドンによりコードされるN末端メチオニンは、一般に、全ての真核生物細胞における翻訳後の任意のタンパク質から高効率で回収されることが当技術分野で周知である。ほとんどのタンパク質のN末端メチオニンはまた、ほとんどの原核生物において効率的に取り出されるが、いくつかのタンパク質について、この原核生物の取り出しプロセスは、N末端メチオニンが共有結合されるアミノ酸の特徴に依存して効果が小さい。
【０５２６】
本明細書中で議論されるベクター構築物を含む宿主細胞を含むことに加えて、本発明はまた、脊椎動物起源、特に、哺乳動物起源の一次、二次および不死化宿主細胞を含み、この動物起源は、内在性遺伝物質（例えば、C35コード配列）を欠失または置換するように操作され、そして/または本発明のC35ポリヌクレオチドに作動可能に連結される遺伝物質（例えば、異種ポリヌクレオチド配列）を含み、そして内在性C35ポリヌクレオチドを活性化、変更、および/または増幅する。例えば、当技術分野で公知の技術を使用して、相同組換えにより、異種制御領域（例えば、プロモーターおよび/またはエンハンサー）および内在性C35ポリヌクレオチド配列を作動可能に連結し得る（例えば、米国特許第5，641，670号（1997年6月24日発行）；国際公開公報第96/29411号（1996年9月26日公開）；国際公開公報第94/12650号（1994年8月4日公開）；Kollerら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA  86：8932〜8935（1989）；およびZijlstraら、Nature  342：435〜438（1989）（これら各々の開示は、本明細書中でその全体が参考として援用される）を参照のこと）。
【０５２７】
本発明を一般的に記載してきたが、本発明は、例示の目的であり制限することを意図しない以下の実施例を参照して容易に理解される。
【０５２８】
実施例
実施例1
ヒト乳癌におけるC35の差次的発現
本発明者らは、ヒト乳癌およびヒト膀胱癌において差次的に発現される遺伝子であるC35を提示する全長cDNAを特徴付けた（図1A）。C35の348塩基対DNA断片を、腫瘍および一次浸潤性管内乳癌を有する同じ患者由来の正常な乳房上皮細胞株から、ポリA  RNAの減法ハイブリダイゼーションによって初めに単離した（Band，V．ら、Cancer  Res．50：7351〜7357（1990））。この配列および重複EST配列（登録番号  W57569）の配列に基づくプライマーを用いて、全長C35コード配列を含むcDNAを、次いで、増幅し、そしてSKBR3乳房腫瘍細胞株（ATCC、HTB-19）からクローニングした。このC35  cDNAは、348bpコード配列に加えて、167bpの3’非翻訳領域を含む。
【０５２９】
C35配列の差次的発現は、図2Aに示され、これは、正常な乳房上皮由来の細胞株、2つの一次乳房腫瘍小節由来の細胞株、および同じ患者から約1年後に単離した2つの転移性肺腫瘍小節由来の細胞株、由来のポリA  RNAにおけるクローンC35の発現レベルを比較する（Band，V．ら、Cancer  Res．50：7351〜7357（1990））。定量分析は、この配列が、正常な乳房上皮のレベルより10倍高いレベルで腫瘍細胞において発現されることを示す。他の正常な組織のパネルにおける低い発現レベルは、図2Bのノーザンハイブリダイゼーション結果により示される。腫瘍細胞株より3倍多くのポリA  RNAが正常組織から負荷されたとしても、比較可能な15時間の暴露後には、C35に対して相同なRNAの発現はほとんどかまたは全く検出されなかった。延長した96時間の暴露後にのみ、いくつかの相同配列の低レベルの発現が、正常な脾臓組織および腎臓組織において検出された。異なる患者由来の3つの一次浸潤性管性乳癌由来のポリA  RNAならびに正常な乳房上皮の試料におけるC35相同配列の発現の分析を、図2Cに示す。正常な乳房上皮との比較において、C35に対して相同な配列は、3つの一次乳房腫瘍のうちの2つにおいて45倍および25倍多く過剰発現される。
【０５３０】
本発明者らは、いくつかの独立的に誘導されたマウス腫瘍において発現され、そして正常なマウス組織においてより減少したレベルで発現される免疫保護腫瘍抗原の分析を以前に行った（2000年3月28日に出願された、タイトル「Methods  of  Producing  a  Library  and  Methods  of  Directly  Selecting  Cells  Expressing  Inserts  of  Interest」の米国特許出願（この内容全体は、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。この場合、腫瘍組織および正常組織における発現レベル間の第9因子の差違は、免疫保護性腫瘍特異的応答の誘導に関連した。上で議論されるように、第9因子を越える正常組織に対するいくつかのヒト乳癌におけるC35の発現レベルは、C35もまた、これらの個体における乳癌に対して免疫保護性であり得ることを示唆する。
【０５３１】
実施例2
C35特異的CTLは、C35陽性乳房腫瘍細胞に対して細胞溶解性である
遺伝子産物は、C35の倍と同様に、腫瘍細胞において過剰発現され得るが、この遺伝子産物は、この遺伝子産物由来のペプチドが腫瘍細胞のMHC分子と関連して処理および提示され得る場合にのみ、免疫学的に関連する。任意の所定の遺伝子産物について、この腫瘍により発現されるMHC分子に結合するための要件を満たす細胞分解プロセスの間にペプチドが産生されないか、またはたとえこのようなペプチドが生成されても、他の腫瘍ペプチドによるMHC分子の輸送または競合における欠失が、この特定の遺伝子産物由来の任意のペプチドの提示を防止することが考えられる。たとえ関連の腫瘍ペプチドが、腫瘍細胞におけるヒトMHCに関連して処理および提示されても、全ての場合において、これらのペプチドと反応性のヒトT細胞が、レパートリーにおいて十分に示されるか否か、またはT細胞が、おそらくいくつかの他の非相同性正常組織における同一または関連の抗原の発現に起因して、耐性にされ得たか否かが決定されなければならない。従って、これら両方の理由のために、MHC制限されたヒト腫瘍抗原特異的T細胞が、C35によって誘導され得、そしてこの細胞が、ヒト腫瘍細胞において実際に交差反応性であることを確認することが重要である。この点についての関連の情報は、自系抗原提示細胞により提示される組換えC35またはC35ペプチドを用いる、ヒトT細胞応答のインビトロ刺激により得られ得る。
【０５３２】
組換え遺伝子産物に対するT細胞応答を評価する際の主な技術的問題点は、発現ベクターに対する強い免疫応答が組換え体特異的応答をブロックするかまたは分かりにくくし得ることである。これは、特に、複数のサイクルのインビトロ刺激を必要とし得る一次応答を伴う問題である。ベクター特異的応答を最小化するために、同じ遺伝子産物について異なるウイルスベクター組換え体を感染した抗原提示細胞による刺激を変更することが可能である。便利なベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルスおよびポックスウイルスが挙げられる。
【０５３３】
ヒトPBMCを、Ficoll-Paqueを使用して精製し、そしてノイラミニダーゼで処理したヒツジ赤血球を用いるロゼッティングに供して、単核細胞（赤血球ロゼット陰性、ER−）およびTリンパ球（ER＋）を単離した。樹状細胞を、新鮮培地を用いてrhGM-CSF（1000U/ml）およびrhIL-4（1000U/ml）中で、一日おきにサイトカインを添加しながら7日間培養することにより、ER−画分から生成した。7日目に、未熟樹状細胞を、ポリブレン（1μg/ml）の存在下で、レトロウイルス発現ヒトC35で6時間形質導入した。細胞を洗浄し、そして12.5％単核細胞馴化培地、1000U/mlのrhGM-CSFおよび1000rhU/mlのIL-4、ならびに1％自系血清の存在下で、4日間、成熟条件下でインキュベートした。この時点で、この樹状細胞を、自系Tリンパ球（凍結保存したER＋画分）と共に、1  CD：50  T細胞の比で、14日間インキュベートした。サイトカインIL-2（20U/ml）、IL-12（20U/ml）およびIL-18（10ng/ml）の存在下、一晩（16時間）の感染効率で、ワクシニア組換え発現ヒトC35で感染された自系の放射EBV-B  B細胞を用いて、生存T細胞を再刺激した。細胞を、IL-2およびIL-7（10ng/ml）の存在下、C35保有レトロウイルスで感染した自系EBV-B細胞で2回以上再刺激した。細胞毒性活性を、4時間のアッセイ中、5000標的/ウェルを使用する51Cr放出アッセイによる合計4回の刺激の後に測定した。以下の表8に示す結果は、正常な形質転換されていない上皮細胞と同じ低いレベルのC35を発現するMDA-MB-231腫瘍細胞に対してではなく、比較的高いレベルのC35を発現する21NT乳房腫瘍細胞に対する、C35刺激T細胞の特異的細胞毒性活性を示す。
【０５３４】
（表８）C35陽性乳房腫瘍細胞に対して細胞溶解性であるC35特異的CTL
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【０５３５】
実施例3
乳癌細胞の膜におけるC35発現
C35ポリペプチド産物が腫瘍細胞の表面で発現されるか否かを決定するために、C35特異的孔血清を調整した。BALB/cマウスを、レトロウイルスコードヒトC35で形質転換した同系株1のマウス腫瘍細胞で免疫した。一連の2回以上の免疫の後に、マウスを出血させた。免疫血清を用いて、ノーザンブロットにおいて、C35転写の高いレベル（21NT）、中程度のレベル（SKBR3）および低いレベル（MDA-MB-231）の発現を示す3つの乳房腫瘍細胞株について、フローサイトメトリーによりC35タンパク質の表面発現を検出した（図4A〜4Cを参照のこと）。1×105の乳房腫瘍細胞を、3.5マイクロリットルのC35特異的抗血清、またはコントロールの予め出血させたBALB/c血清で染色した。30分間のインキュベーションの後、細胞を染色緩衝液（PAB）で2回洗浄し、そしてFITC-ヤギ抗マウスIgG（1μg/試料）と共に30分間インキュベートした。試料を洗浄し、そしてEPICS  Eliteフローサイトメーターで分析した。図4A〜4Cに示される結果は、腫瘍株21NTについて高レベル（図4A）、腫瘍株SKBR3について中程度のレベル（図4B）、および腫瘍株MDA-MB-231について検出不能なレベル（図4C）の特定の免疫血清により認識されるC35抗原の膜発現を示す。高レベルのC35転写物を発現する腫瘍細胞の膜に対する抗体の高レベルの反応性は、C35特異的抗体が、この遺伝子産物を過剰発現する多数の乳癌に対して効果的な免疫治療因子として働き得ることを示唆する（図2A〜2Cおよび3を参照のこと）。
【０５３６】
実施例4
調節解除されたリボソームタンパク質L3遺伝子は、共有マウス腫瘍拒絶抗原をコードする
本発明者らは、ポックスウイルスにおいて構築されるcDNAライブラリ由来のCTLエピトープをコードする遺伝子の選択を可能にする、新規の抗原発見技術を開発した。この技術を使用して、本発明者らは、共有マウス腫瘍抗原がリボソームタンパク質L3遺伝子の代替の対立遺伝子によってコードされることを示した。免疫原性L3遺伝子は、胸腺を含む正常な組織において、有意に減少したレベルではあるが発現される。免疫原性L3  cDNAのワクシニア組換え体による免疫は、腫瘍チャレンジに対する保護免疫を誘導する。ハウスキーピング遺伝子の調節解除された対立遺伝子は、免疫予後抗原として働き得、そして胸腺の発現はアップレギュレートされた腫瘍産物の免疫原性を阻止しないことに特に興味が持たれる。これらの知見は、自己タンパク質に対する耐性は絶対的ではないが、発現の定量的レベルに関して規定されなければならないことを強調する。記載されるリボソームタンパク質は、正常組織に対する免疫耐性を損なうことなく、自己タンパク質の調節解除された発現の結果として生じる共有腫瘍抗原のクラスを示し得る。このような抗原は、重要な器官の癌の免疫治療に適切である。
【０５３７】
方法
総RNAを、Perfect  RNA  Total  RNA  Isolation  Kit（5  Prime  3  Prime，Inc．、Boulder、CO）を使用して、BCA  39腫瘍細胞から単離した。ポリA＋mRNAを、Dynabead（Dynal、Lake  Success、NY）を使用して、この総RNAから単離した。2μgのポリA＋mRNAを、Great  Lengths  cDNA  Synthesis  Kit（Clontech，Palo  Alto、CA）を使用して、二本鎖cDNAに変換した。次いで、この二本鎖cDNAを、ワクシニアウイルスベクターv7.5/tkに挿入した。
【０５３８】
Balb/cByJ（Jackson  Labs）マウスを、2×106の照射した（6，500cGy）BCA34細胞で腹腔内免疫した。2週間後、このマウスを、2×106の照射BCA34細胞の皮下注射によりブーストした。2回目の免疫の1週間後、脾細胞を収集し、12個に分け、そして1ウェルにつき6×105の照射した（10，000cGy）マイトマイシンC処理したBCA34細胞と共に1ウェルプレート中で培養した。1週間間隔で、生存T細胞を、Lympholyte-M（Accurate  Chemical、Westbury、NY）を使用して精製し、そして1ウェルにつき1.5×106のT細胞で、12のウェルプレート中で培養した。各ウェルに、6×105の照射したマイトマイシンCで処理したBCA34細胞と共に、4×106の照射した（5000cGy）Balb/c脾臓もまた添加した。
【０５３９】
H-2Kbに関連して免疫優性であるウェルの特徴的なオボアルブミン257-264ペプチド（SIINFEKL）をコードする特定のワクシニア組換え体を、この組換え体が全ウイルスpfuの0.2％、0.01％または0.001％のいずれかを最初に較正するように、非組換えウイルスで希釈した。MC57G細胞（H-2b）の接着性単層を、m.o.i.＝1（約5×105細胞/ウェル）で、このウイルスミックスで感染させた。感染の12時間後、オボアルブミンペプチド特異的CTL（免疫優性SIINFEKLペプチドでのオボアルブミンプライム化脾臓T細胞の反復インビトロ刺激によって誘導される）を添加した。このインキュベーションの間、オボアルブミンペプチドを発現する組換え体粒子に感染し、T細胞を単層から放出させる溶解現象を受ける接着性細胞を、特定の細胞障害性T細胞で標的化する。CTLでのインキュベーションの後、この単層を穏やかに洗浄し、そして移動性細胞および残りの接着性細胞の両方を、別々に収集する。各細胞集団から抽出したウイルスを、組換え（BRdU耐性）ウイルスpfuの頻度について力価測定した。移動性細胞から抽出したウイルスを、次いで、新鮮な接着性MC57C細胞およびオボアルブミンペプチド特異性CTLを用いる、別の濃縮サイクルへのインプットとして使用した。全ウイルスの10％を越えるまでのVV卵子の濃縮後、次のサイクルの際に、m.o.i.が1から0.1に減少する場合、組換えウイルスのさらなる濃縮が早められることが観察された。
【０５４０】
12ウェルプレートのウェル内のBCNの融合性単層を、moi＝1.0のワクシニアBCA39  cDNAライブラリで感染した。感染の12時間後、この単層を培養液で3回洗浄し、そして2.5×106のCTLを、250μlの容量でこのウェルに添加した。T細胞および標的を、37℃で4時間インキュベートした。インキュベーション後、上清を収集し、そして単層を250μlの培養液で3回穏やかに洗浄した。ウイルスを、凍結/解凍により細胞から放出し、そしてBSC1細胞についてのプラークアッセイによって力価を決定した。選択したウイルス集団（特定のT細胞を受けた培養物中の移動性細胞）を、12ウェルプレートの1ウェル中、2日間、BSC1細胞上で増幅した。次いで、このウイルスを収集し、そして力価測定した。このウイルスストックを、3つのさらなる濃縮サイクルに供した。選択したウイルス集団は、次のサイクルの前には増幅しなかった。
【０５４１】
第4の濃縮サイクル由来のウイルスを、それぞれ5pfuの40のプールに分けた。各プールを、1プール/ウェルで、96ウェルプレート中、BSC1細胞上で増幅した。4日後、このウイルスを回収し（P1）、そしてmoi＝5、1プール/ウェルで、96ウェルプレート中にてBCNの単層を感染するために使用した。コントロールとして、BCNの単層を、moi＝5のvNotI/tk（Merschlinskyら、Virology  190：522（1992））で感染した。感染の5時間後、2×104の洗浄したCTLを各ウェルに添加した。各ウェルの最終容量は、225μlであった。これらの細胞を、37℃で18時間インキュベートした。次いで、これらの細胞を、遠心分離によってペレット化し、150μlの上清を収集し、そしてELISAによって、IFNgについて試験した。5pfuの40のプールのうち27個が、CTLを刺激する能力について陽性であった。Poisson分析によって、特定の組換え体は、20％より大きく濃縮されたことが示唆された。個々のクローンを、5個の陽性プールから選択し、そして上記のようにアッセイした。
【０５４２】
6ウェルプレートのB/C．Nの単層を、moi＝1．0のv7.5/tk、vF5.8、またはvH2.16で感染した。感染の14時間後、細胞を、コントロール標的：B/C．N、BCA  34およびBCA  39と共に収集した。この標的細胞を、100マイクロキュリーの51クロム（Dupont、Boston、MA）で、37℃で1時間標識し、そして104の細胞を、4つ組の96ウェル丸底プレートに添加した。指定された比で、腫瘍特異性CTLをこの標的細胞に添加した。細胞を37℃で4時間インキュベートした。上清を収集し、51Cr放出を決定した。標的細胞を培地のみと共にインキュベートすることによって、自発的な放出を誘導した。標的細胞を5％Triton×100と共にインキュベーションすることによって、最大放出を決定した。特異的溶解の割合は、以下の式を使用して計算した：％特異的溶解＝（（実験的放出-自発的放出）/最大放出−自発的放出））×100。各場合において、4つ組ウェルの平均値を、上記の式において使用した。
【０５４３】
2μgの総RNAを、dTプライマーおよびSuperscript  II  Reverse  Transcriptase（BRL、Gaithersburg、MD）を使用して、cDNAに変換した。cDNAを、L3特異的プライマー；
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；および20μlの最終容量のKlentaq  DNA  Polymerase  Mix（Clontech）を使用するPCRのテンプレートとして使用した。反応条件は、94℃で3分間の最初の変性工程、続いて、94℃で30秒間、60℃で30秒間、68℃で2分間の30回のサイクルを含んだ。これらのPCR産物は、3位と1252位との間にL3の領域を含んだ。PCR産物を、Centricon  100カラム（Amicon、Beverly、MA）を使用して精製し、Sau3AIで消化し、そして3％アガロース/エチジウムブロミドゲルで分離した。
【０５４４】
成体雌性Balb/cByJマウス（1グループにつき2匹のマウス）を、5×106pfuのvH2.16またはv7.5/tkの皮下注射によって免疫した。免疫の7日後、脾細胞を収集し、そして1μmolのペプチドL348-56（I54）と共に、12ウェルプレート中で培養した。7日後、生存T細胞を、リンパ球Mを使用して精製し、そして1×106のT細胞を、1ウェルあたり1μmolのペプチドおよび4×106の照射した（5000cGy）Balb/c脾臓細胞と共に、12ウェルプレートのウェルに添加した。
【０５４５】
成体雌性Balb/cByJマウスを、10×106pfuのvH2.16、vPKIa、v7.5/tkまたはリン酸緩衝化生理食塩水を皮下注射することに持って免疫した。第2の免疫は、21日後に行った。2×105のBCA  34細胞を、免疫の21日後（一次免疫のみ）または14日後に皮下注射することによりマウスを腫瘍でチャレンジした。
【０５４６】
結果および考察
広範に有効な腫瘍ワクチンの開発のための予測は、いくつかの自己タンパク質が、免疫T細胞により腫瘍抗原として認識され得るという証拠により進歩してきた
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。このような正常な変異していない遺伝子産物は、異なる個体において生じる特定のタイプの腫瘍における共通の標的抗原として働き得る。このような共有腫瘍抗原でのワクチン化の後の保護免疫性の誘発についての臨床的証拠は、現在非常に限定されている（Marchandら、Int．J．Cancer  80：219（1999）；Rosenbergら、Nat．Med．4：321（1998）；Overwijkら、Proc．Natl．Acad．Sci．96：2982（1999）；Brandleら、Eur．J．Immunol．28：4010（1998））。さらに、これらの自己タンパク質に対するT細胞応答が、免疫学的耐性の驚くべき崩壊を示すか、または腫瘍細胞における自己タンパク質の発現の定性的または定量的な変化の結果であるかは、ほとんど明らかではない。後者の場合、正常組織の耐性は維持され、そして自己タンパク質（この発現は、腫瘍において系統的に変更される）に対するワクチン誘導性免疫性は、重要な器官の癌に対してさらに適用可能であり得る。
【０５４７】
本発明者らは、形質転換プロセスの間に複数のマウスの腫瘍中で系統的に調節解除されるリボソームタンパク質対立遺伝子が腫瘍拒絶抗原であること、および免疫原性の重要な相関が正常な組織および胸腺に関連する腫瘍中での定量的な発現の劇的な変化であることを示す。
【０５４８】
以前に、本発明者らは、交差保護免疫が、3匹の独立して誘導されたマウス腫瘍細胞株中で誘導されることを報告した（Sahasrabudheら、J．Immunology  151：6302（1993））。これらの腫瘍（BCA22、BCA34およびBCA39）は、B/C．N株（Balb/c胎芽から誘導された、クローンニングされ、不朽化され、足場依存性の、接触阻止された、非腫瘍形成性の細胞株）の独立した継代培養のインビトロ変異誘発により誘導される（Collinsら、Nature  299：169（1982）；Linら、JNCI  74：1025（1985））。これらの腫瘍細胞株のいずれかを用いるが、B/C．Nを用いない著しい免疫により、同種組織腫瘍でのチャレンジだけでなく、異種組織腫瘍株でのチャレンジに対する保護を提供した。これらの3種の腫瘍細胞株を用いる免疫に続いて、これらが誘導される非腫瘍形成性B/C．N細胞に対してでなく、同一の三種の腫瘍に対して特異的な交差反応をインビトロで示す、CD8＋細胞傷害性Tリンパ球（CTL）株およびクローンを産生し得る。
【０５４９】
免疫学的規定から共有腫瘍抗原の分子規定に移動するために、本発明は、CTL標的エピトープをコードする遺伝子の識別のための新規な方法および効果的な方法を開発した。このアプローチにおいて、BCA39腫瘍細胞株由来のcDNAライブラリは、改変されたワクチンウイルス発現ベクターにおいて構築された（Merchlinskyら、Virology238：444（1997）；E．Smithら、原稿作成中）。本ライブラリの50万個のプラーク形成ユニット（pfu）を使用して、1の感染効率（moi）で、抗原ネガティブB/N．N細胞の単層を感染した。12時間の感染後、BCA34腫瘍に特異的なCTLを、標準的な51Cr放出アッセイにおいて、約50％の溶解を与える標的に対するエフェクターの比で標的細胞の単層に添加した。異種BCA34腫瘍細胞株に対するCTLを、これらの2種の腫瘍細胞株間で共有される、抗原の識別を容易にするために使用した。粘着性はエネルギー依存性プロセスであるので、CTL媒介溶解事象を起こす細胞が、単層から除去され、そして上清中で回収された。浮遊している細胞からウイルスを収集し、次いで、細胞媒介性リンパ球傷害反応（CML）により、宿主細胞を溶解物に感作させたウイルス組換え体を富化することが可能であった。この手順の本質的な特徴は、この手順自体で複製するのに役立つことである。富化の1サイクル後に収集したウイルスは、所望のレベルの富化が達成されるまで、新鮮な単層および新鮮なCTLを使用する選択のさらなるサイクルのための入力として使用され得る。公知の組換え体に特異的なCTLを用いるモデル実験において、特定の組換え体が、0.001％の初期希釈から、選択の6サイクルにおいて約20％（表9）に富化され得る特定の組換え体を実施することが可能であった。このレベルにおいて、さらなる特異性に対する、個々のプラークを選び取るために単一の様式である。
【０５５０】
（表９）VVovaのための濃縮複数サイクル
示された濃度のVVova（tk−）でスパイクされた野生型vNotl/tk（tk＋）から構成されるワクチンカクテルをCML選択に供した（12）。
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％VVova＝（BudRを含む滴定濃度/BudRを含まない滴定濃度）×100
nd＝検出されない
【０５５１】
ポックスウイルス発現ライブラリは、腫瘍特異的CTLを用いる4サイクルの選択に供した。選択されたウイルス組換えの個々のプラークを、B/C．N細胞の別個の培養物を感染するために拡張し、そして使用した。これらの細胞を、インターフェロンγ（IFN-γ）を分泌するのに特異的なCTLを刺激するための能力（図5A）について、または腫瘍特異的なCTLによって溶解するための感作（図5B）について、アッセイした。10種のウイルスクローンを単離し、これらの全てについて、B/C．N上において、IFNγを分泌するのに腫瘍特異的なCTLの株を刺激するための能力を与えた。全て十種のクローンは、同一サイズ（1，300bp）の挿入物を含んだ（Smithら、未公開のデータ）。配列分析により、クローンF5.8およびH2.16が同一の全長cDNAを含むことを確認した。従って、全ての十種のクローンが、同一のcDNAの組換え体であるようであった。BCA34で免疫することで産生された6種のCTL株の全6種が、この抗原に対して特異的であることを実証した。
【０５５２】
GenBankの検索により、このcDNAが、マウスのリボソームタンパク質L3遺伝子に対して高い相同性を有することを明らかにした（Peckhamら、Genes  and  Development  3：2062（1989））。H2.16クローンの全体の配列決定は、単一のヌクレオチド置換のみを示した。この置換は、刊行されたL3遺伝子配列と比較した場合、1つのアミノ酸の変化をコードした。このC170T置換は、アミノ酸位54でのトレオニンからイソロイシンへの置換を産生した。F5.8クローンはまた、このヌクレオチド置換を含んだ。
【０５５３】
CTLは、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）分子によって提示されるペプチドとして、抗原を認識するので、これらのクラスI  MHC制限腫瘍特異的CD8＋T細胞によって認識されるペプチドエピトープを同定することが、目的であった。改変されたアミノ酸（Ile54）が、CTLによって認識されたペプチド中に含まれることが、恐らく考えられた。この仮説が、H2.16（vH2199）の第1の199bp（63個のアミノ酸）に対してのみ、ワクチンウイルスクローン組換え体が、腫瘍特異的CTL（Smithら、未公開のデータ）によって溶解するために、B/C．Nを感作し得たことを、実証により支持された。ペプチド結合モチーフのコンピュータスクリーニングにより、クラスI  MHC分子に対して高い親和性で結合し得る（Kd）（図12）、この領域内でコードされた2つのエピトープが存在することを提案した（Parkerら、J．Immunology  152：163（1994））。これらの2つのペプチドであるL345-54（I54）およびL348-56（I54）を合成し、そして腫瘍特異的CTLによって溶解するようにB/C．Nを感作するための能力について試験した。図7Aに示されるように、ペプチドL348-56（I54）を、溶解するようにB/C．Nを感作する一方で、L345-54（I54）および野生型L348-56（T54）は、感作しなかった。10nMのL348-56（I54）は、CTLによって溶解するように標的を感作するのに十分である一方で、100mMのL348-56（T54）は、そうではないことを決定した（図7B）。これらの結果により、ペプチドL348-56（I54）は、腫瘍特異的CTLによって認識される標的エピトープであることを実証する。
【０５５４】
異なるL3遺伝子産物の発現を分析するために、オリゴdTプライム化cDNAを、腫瘍およびそれらから誘導されたB/C．N細胞株の、RNAから合成した。第1鎖cDNAを、1対のプライマーを使用するPCR増幅に供し、このプライマーを、全マウスL3mRNA近傍で増幅した。これらのPCR産物の配列分析により、B/C．NおよびBCB13  L3  cDNAが170位にCを含むことを示した（公開された配列と同一）。BCB13は、B/C．N細胞株から誘導された腫瘍細胞株であるが、このBCB13は、BCA腫瘍細胞株で免疫学的に交差保護されていない（Sahasrabudheら、J．Immunology  151：6302（1993））。交差反応性BCA39、BCA34、およびBCA22腫瘍由来のPCR産物の配列分析により、これらの細胞株がL3mRNAの2種の異なる種を発現することを提案した。1方の種は170にCを含み、そしてH2.16クローンにおけるように、他方の種は170にTを含む。全てのL3  cDNAの配列は、この1つの塩基置換を除いて同一であった。
【０５５５】
腫瘍細胞中の新規なL3RNAの方向について説明するために、2つの可能な方法が存在する。これらの腫瘍において発現されたL3（C170T）遺伝子のいずれかは、野生型遺伝子の体細胞性変異体であり、L3の複数の生殖系列対立遺伝子が存在し、これらの少なくとも1つは、腫瘍形質転換のプロセスの間に調節解除される場合、免疫原性産物を生じる。意外にも、交差反応性BCA39、BCA34、およびBCA22腫瘍は、独立して誘導されるので、本研究者は、第1の仮説を考えた。同一の変異エピトープが全ての3つの腫瘍において産生された場合、注目すべきである。一方で、BCA39およびB/C．N由来のゲノムDNAの異なる制限消化のサザンブロットにより、マウスの遺伝子中にL3遺伝子の複数のコピーが存在することを示した（Smithら、未公開のデータ）。L3遺伝子がまた、ラットおよびウシの両方において、複数の対立遺伝子であると報告されている（Kuwanoら、Biochemical  and  Biophysical  Reaearch  Communications  187：58（1992）；Simonicら  Biochmica  et  Biophysica  Acta1219：706（1994））。この仮説を試験するために必要とされるさらなる分析は、生殖系列中の異なるL3対立遺伝子が腫瘍細胞および正常細胞中のことなる制御に供せられることである。
【０５５６】
公開されたL3の168位から171位のヌクレオチド配列は、GACCである。この同一の領域中のH2.16の配列は、GATC（図8A）である。この新規なパリンドロームは、Sau3AIを含む、多数の制限エンドヌクレアーゼに対する制限配列である。図8Aの制限マップにおいて示されるように、L3のSau3A  Iの消化により、200、355、348、289および84塩基対の断片を産生すると期待される一方で、H2.16のSau  3A  Iの消化により、200bp断片の変わりに168bp断片を産生する。Sau  3AIの消化産物の違いを使用して、これらのBCA細胞株が少なくとも2つの異なるL3対立遺伝子を発現することを確認した。全5つの細胞株および胸腺RNA由来のL3  RT-PCR産物を、Sau  3AIで消化し、そしてアガロースゲルで分析した。図8Bにおいて示されるように、全3つのBCA株は、L3の両方のバージョンを発現する。驚くべきことには、このアッセイを、より多くの量の出発材料を使用して繰り返す場合、168bpの断片はまた、B/C．N、BCB13、および正常の胸腺cDNAの消化において検出可能であった（Smithら、未公開のデータ）。このアッセイの感度を増強するために、PCRを、P32末端標識5’L3特異的プライマーを使用して繰り返した。放射標識したPCR産物を、Sau3AIで消化し、そしてアガロースゲル上に溶解した。図8C、B/C．N、BCB13および胸腺において示されるように、168bp断片を含む。定量的な分析により、BCA腫瘍中の200bp：168bp断片の比が、2：1である一方で、B/C．N、BCB13、および胸腺において検出された同一の断片は、約20：1であることを示す。この免疫原性L3対立遺伝子の低いレベルの発現がまた、腎臓、心臓および骨格筋由来のRNAが分析される場合に観測された（Smithら、未公開のデータ）。これらの結果は、交差反応性腫瘍における形質転換プロセスに関連する遺伝子の調節解除は、より高いレベルのこの生殖系列L3（C170T）対立遺伝子の発現に導き、そしてこの改変されたL3遺伝子は、正常の組織において優先的に発現されるL3遺伝子の体細胞変異によって産生されないことを示唆する。本発明者らは、この新規なL3対立遺伝子（C170T）を、免疫原性L3対立遺伝子（iL3）と呼んだ。
【０５５７】
免疫原性L3対立遺伝子がまた、例えば、10倍減少したレベルにおいてでも、正常な胸腺において発現されることが特に興味深い。このレベルの発現は、いくつかの腫瘍において発現される、調節解除されたiL3のレベルについて、機能活性を用いて全てのT細胞を寛容化するのに明らかに十分ではない。しかし、B/C．NおよびBCB13が、低レベルのiL3を発現するが、これらは、腫瘍特異的なCTLによって溶解するのに感受性でないという観測は、より高度な親和性T細胞が寛容化されたことを示唆する。このことは、腫瘍抗原が胸腺中で発現されると報告された最初の報告であるようだ。これらの観測は、自己タンパク質に対する寛容性が絶対ではないが、発現の定量的なレベルに相関して規定されるべきであることを強調する（Targoniら、J．Exp．Med．187：2055（1988）；C．J．Harringtonら、Immunity  8：571（1998））。
【０５５８】
広範に有効なワクチンが、共有の腫瘍抗原の発現に基づいて開発される場合、このような抗原が免疫保護され得ることを実証することは、重要である。最も多くの数の共有抗原が、ヒトの腫瘍について同定されているが、これらの抗原を使用する免疫治療の臨床試験は、最適なワクチン戦略に関する一部の不特定さのために、これまで確証的ではなかった（Pardoll，D．M．，Nat．Med．4：525（1998））。マウスにおいて、免疫治療戦略がより全体的に調査されて得る場合、非常にわずかな共有腫瘍抗原が同定される。従って、iL3組換えワクチンウイルスでの免疫で、腫瘍特異的CTLを誘導し、そして腫瘍チャレンジ由来のマウスを保護するかどうかを決定することは注目すべき目的である（Overwijkら、Proc．Natl．Acad．Sci．96：2982（1999）；Moss，B．，Science  252：1662（1991）；Irvineら、J．Immunology  154：4651（1995）；McCabeら、Cancer  Research  55：1741（1995）；Estinら、Proc．Natl．Acad．Sci．85：1052（1988）；J．Kantorら、JNCI84：1084（1992）；V．Bronteら、Proc．Natl．Acad．Sci．94：3183（1997））。iL3遺伝子（H2．16）についてワクチンウイルス組換え体でのBalb/cマウスの免疫により、インビトロにおいて、BCA34およびBCA39腫瘍細胞の両方を溶解し得るが、B/C．Nを溶解し得ないCTLを産生した（図9A）。iL3について、ワクチンウイルス組換え体で2回またはさらに1回免疫したマウスは、BCA34腫瘍細胞でのチャレンジを拒絶し得た（図9Bおよび9C）。空きウイルスベクター、またはcAMP依存性タンパク質キナーゼ（PKIa）のインヒビタタンパク質についての制御ワクチン組換えで免疫されたマウスは、この腫瘍チャレンジを拒絶し得なかった（Olsen，S．R．およびUhler，M．D．，J．Biol．Chem．266：11158（1991）；Muellerら，原稿作成中）。これらの結果により、iL3自己タンパク質が免疫保護腫瘍抗原であることを実証した。
【０５５９】
本発明者は、改変されたワクチンウイルスベクター中の腫瘍cDNAライブラリ由来のCTL-媒介選択に基づくCTLエピトープをコードする遺伝子を同定するための、新規な戦略を開発した（Merchlinskyら、Virology238：444（1997）；E．Smithら、原稿作成中）。本発明者は、3種の独立して誘導されたマウスの腫瘍によって共有される腫瘍拒絶抗原をコードする、調節解除されたハウスキーピング遺伝子を同定するための戦略を適用した。このリボソームタンパク質は、代表的なより大きなクラスの免疫保護共有腫瘍抗原であり得、この抗原は、正常な組織に対して免疫耐性を含まない自己タンパク質の調節解除された発現の結果として免疫原性となる。このような抗原は、ウイルス性の器官中の癌の免疫治療に十分適している。
【０５６０】
実施例5
C35腫瘍抗原の発現および免疫原性
新規なC35腫瘍遺伝子のRNA転写は、正常なヒト組織における発現と比較した場合、試験された原発性ヒト乳癌の70％（12/17）において、そして試験された膀胱癌の50％（5/10）において過剰発現する。全長遺伝子は、未知の機能の新規な115個のアミノ酸タンパク質をコードする。フローサイトメトリー分析によって、C35を発現する細胞の表面膜を染色する、モノクローナル抗体（2C3）を選択した。さらに、C35＋乳癌および膀胱癌を特異的に溶解する、ヒト細胞傷害性Tリンパ球（CTL）を、インビトロで産生した。インビトロにおいて、正常なヒトドナー由来のC35特異的CTLを産生するための能力は、過剰に発現したタンパク質に対する寛容性の欠如を示唆する。異なる固体の腫瘍におけるC35の過剰な発現ならびに体液性免疫応答および細胞性免疫応答を誘導するための能力は、C35（免疫治療のための有望な候補物）を作製する。
【０５６１】
材料および方法
細胞株：
ヒト乳癌細胞株（BT20、BT474、MCF7、MDA-MD231、SKBR3、T47D（ATCCにより供給される））を、10％のウシ胎児血清（Biofluids，Rockville，MD）で補充された、RPMI-1640（BioWhitaker，Walkersville，MD）中で増殖した。正常な胸部の上皮由来の不死化株、H16N2、2種の転移性腫瘍、21-MT1および21-MT2、ならびに全て同一の患者由来で、DFCI培地中で増殖した2種の原発性腫瘍（21-NTおよび21-PT）（Band，V．およびSanger，R．，「Tumor  Progression  in  Breast  Cancer」in  Neoplastic  Transformation  in  Human  Cell  Culture，J．S．RhimおよびA．Dritschilo編、The  Human  Press  Inc．，Totowa，NJ．（1991）、第169から78頁）は、Dr．Vimla  Band，New  England-Tufts  Medical  Centerによって豊富に提供された。膀胱腫瘍細胞株ppT11A3を、免疫化非腫瘍化細胞株SV-HUCから誘導した。これらの膀胱細胞株は、Dr．Catherine  Reznikoff，University  of  Wisconsin  Clinical  Cancer  Centerによって豊富に提供され、そして500ml中に、1％のFBS、0.025ユニットのインシュリン、1μgのヒドロコルチゾン、5μgのトランスフェリン、2.7gのデキストロース、0.1μMの非必須アミノ酸、2mMのL-グルタミン、100ユニットのペニシリン、および100μgのストレプトマイシンを充填した、F12培地中で増殖した。正常に増殖する胸部上皮細胞（MEC）を、Clonetics（BioWhittaker）から購入し、そして供給者の指示に従って維持した。
【０５６２】
RNAの抽出およびノーザンブロット分析：
細胞株を、約80％のコンフルエンシーでRNA抽出のために収集した。細胞を収集し、そしてQiagen  RNAeasyキットのQG緩衝液中に溶解した。総RNAを、製造業者のプロトコールにより抽出し、そしてGITCおよびアルコールと共に沈殿物として−80度で貯蔵した。組織試料を、スナップ凍結試料としてCooperative  Human  Tissue  Networkによって提供され、この試料を、RNAeasyプロトコールでの使用のために溶解緩衝液中でホモジェナイズした。ノーザンブロットのために、mRNAを、Dynal（Lake  Success，NY）オリゴdT25磁性ビーズを使用する総RNAから抽出し（30μg  総RNA/ウェル）、そして3％のホルムアルデヒドを含む0.8％のSeaKemLE（FMC  Bioproducts）中で電気泳動した。mRNAを、Genescreen  Plus（NEN）（10×SSC中）上にキャピラリーブロットによって一晩かけてブロットし、次いで80℃で2時間ベーキングした。膜を、製造業者のプロトコールにより、68℃、106cpm/mlのQuickhyb溶液（Stratagene）で、ランダムにプライム化した32P標識cDNAプローブ（Prime-It，Stratagene，LaJolla，CA）を用いてプローブした。ブロットをX線フィルムおよび/または光現像（phosphorimage）スクリーンに一晩曝した。全てのブロット上での発現を、ハウスキーピング遺伝子（例えば、GAPDHまたはβアクチン）に規格化した。
【０５６３】
差引きハイブリダイゼーション：
Lisitsynらによって最初に記載（Lisitsyn，NおよびWigler，N．M．，Science  259：946-51（1993））されたようなRepresentational  Difference  Analysisに基づく、PCR  Select  cDNA  Subtraction  Kit（Clontech，Palo  Alto，CA）を、製造業者のプロトコールを使用して、正常な胸部細胞株と比較して、腫瘍で過剰発現した遺伝子に対して富化されたcDNAを産生した。簡潔には、オリゴ-dTプライム化二重鎖cDNAを、腫瘍細胞および正常な細胞由来の、高質のDNase処理したmRNA（2μg）から合成した。アダプターを、短い平滑末端（Rsalで消化した）腫瘍配列に連結して、そして過剰のRsalで消化した正常な断片でハイブリダイズした。32時間のハイブリダイゼーション後に、抑圧（suppression）PCR（Clontech）により、プライマーとしてアダプター配列を使用して、過剰発現した腫瘍配列の優先的な増殖を可能にした。PCR増幅の産物を、pT7Blue3（Novagen，Madison，WI）中にクローニングして、差引きされたライブラリを産生した。クローンを、96ウェルフォーマット中でLB/アンピシリン（100μg/ml）において増殖し、挿入物を、一晩の培養物からPCR増幅し、そしてPCR産物を、BioDotマニホルド（BioRad，Hercules，CA）を使用するGenescreen  Plus上にスポットした。次いで、二連のドットプロットを、ランダムにプライム化した腫瘍または正常なcDNAまたは順方向および逆方向の差引きハイブリダイゼーションのPCR産物でプローブした。腫瘍cDNAと順方向cDNAとを差し引いた物（腫瘍-正常）において過剰発現したようであるクローンを、ノーザンブロットによって（上記のように）分析し、ディファレンシャル遺伝子発現を確認した。
【０５６４】
cDNAライブラリおよび全長遺伝子：
オリゴ-dTでプライム化した二重鎖cDNAを、SMART  cDNA合成を使用する、SKBR3細胞株（Clontech  Laboratories）から産生し、続いて、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールで抽出した。プライマーを合成し
2005528914.tif 000384
、特にESTホモログ，登録番号W57569から推論されるオープンリーディングフレームに基づいて、C35のコード領域を増幅した。PCR産物を、pT7Blue3（Novagen）中にクローニングした。
【０５６５】
ワクシニアおよびレトロウイルスのC35組換え体：
C35のクローニング配列を、BamHI/SalI部位において、ライブラリからワクシニアトランスファープラスミド（pVTK0）に、規定された方向にサブクローニングした。組換えウイルスを、NotIおよびApaIで消化したV7.5/TKウイルスDNAと共にpVTK0.C35の、鶏痘ウイルスで感染させたBSC-1細胞へのトランスフェクションによって産生した。他（米国特許出願08/935，377；PCT/US98/24029；標的抗原およびそれに基づくワクチン）に記載される場合、これは、ワクチンウイルス組換え構築のための有効な方法である。このC35遺伝子をまた、レトロウイルスベクターpLXSNにクローニングし、そしてウイルスストックを、偽型のためにpVSVgを用いて293-GP細胞と同時トランスフェクションすることによって産生した。感染ウイルスを含む上清を、48時間後に収集した。
【０５６６】
C35特異的2C3モノクローナル抗体の産生およびFACS分析：
ライン1のマウスの小細胞の肺癌細胞を、C35レトロウイルスで感染し、そして103〜2×104の細胞を、3匹のBALB/cByJマウスに注射した。21日後に、血清を、レトロオービタル（retro-orbital）血液から採取し、そして低いレベルのC35mRNA（MDA-MD-231）または非常に高いレベルのC35mRNA（21NT）を発現することが公知のヒト腫瘍細胞との反応性をチェックした。脾臓をまた、標準的なマウスハイブリドーマ技術を使用するP3黒色腫細胞での脾臓細胞の融合により、ハイブリドーマの産物を採取した。ELISAを使用して、Igの存在について、HAT耐性クローンをスクリーニングした。大量の産物を、アイソタイプ化し、定量し、そしてフローサイトメトリーによってC35＋細胞株およびC35-細胞株をスクリーングした。1μgのIgGを含むハイブリドーマクローンの上清を、PAB（PBS、1％のBSA、0.1％のアジド）中の106個の細胞を、氷上で30分間インキュベートし、続いて、PABを用いて3回洗浄し、そしてFITC（Southern  Biotechnology，Birmingham，AL）に結合体化したヤギ抗マウスIgGと共に、氷上で30分間インキュベートした。一つのハイブリドーマクローン（2C3）を、免疫血清に見られる表面染色を再利用し（図14Aおよび14B）、そして展開および抗体精製のために選択した（BioExpress，West  Lebanon，NY）。
【０５６７】
ヒトC35特異的T細胞株の生成：
健康な女性ドナー由来の末梢血（HLA  A2、11、B35、44）は、赤血球ロゼット陽性画分（全Tリンパ球の供給源）および陰性画分（単球の供給源）に分離した。Tリンパ球は、単球が樹状細胞（DC）を生成するための条件下でインキュベートされる間、後の使用のために凍結保存された。DCの変異は、いくらか改変して、Bhardwajおよび同僚（Bender，A．ら、J．Immunol．Meth．196：121-35（1996）；Reddy，A．ら、Blood  90：3640-46（1997）；Engelmayer，J．ら、J．Immunology  163：6762-68（1999））によって記載されるように誘導した。hGM-CSFおよびhIL-4（1000U/ml）を一日おきに加えた。7日目に、非粘着性未成熟DCをGM-CSFおよびIL-4の存在下で6時間、C35についてレトロウイルス組換え体とともにインキュベートした。この時点で、レトロウイルス上清を洗浄し、そして未成熟樹状細胞を変異条件（これは、再び、GM-CSF、IL-4ならびに12.5％単球馴化培地（MCM）を含んだ）に供された。4日後、これらの成熟C35発現DCを使用して自己T細胞を14日間、1DC：50  T細胞の比で刺激した。自己DCの新鮮なプールを、T細胞の再刺激のために生成したが、このとき、これらは、C35についてのワクシニアウイルス組換え体とともにMCM中で、48時間の成熟の後に感染した。サイトカインIL-2（20U/ml）、IL-12（20U/ml）およびIL-18（10ng/ml）を加え、そして1：50の比のDC：T細胞を維持した。12日間の培養に続いて、T細胞をさらに7日間、C35組換えレトロウイルスに感染したEBV-B細胞とともに、IL-2（20U/ml）およびIL-7（10ng/ml）を添加して、刺激した。サイトカインをすべてR＆D  Systems（Minneapolis，MN）から購入した。この時点で、細胞は＞90％のCD8＋であり、そして標準的な51Cr放出アッセイで活性について試験した。手短には、百万の標的細胞を100μCiの51Crとともにインキュベートし、洗浄し、次いで、RPMI-1640中で4時間、CTLエフェクターとともにインキュベートし、10％ヒトAB血清（BioWittaker）を補充した。CTLの活性は、（CTLによって標識標的の溶解時に上清に放出された51Cr-自発的放出）/（最大放出−自発的放出）として測定された特異的放出の割合として表現された。
【０５６８】
結果
C35の特徴付け：
クローンC35の配列は、ヒト乳房腫瘍細胞において差次的に発現され、Genbankにおいていずれの公知配列とも相同ではないが、相同なEST配列（プロトタイプ寄託番号W57569）が同定された。相同なヒトEST断片は、脳、肺および腎臓（A＃  AA954696）、Soares  卵巣（A＃  AA285089）および副甲状腺腫瘍（A＃  W37432）、子宮内膜腫瘍（A＃AA337071）、および結腸癌腫（A＃  AA313422）を含む、NCI  CGAP  （Cancer  Genome  Anatomy  Project）ライブラリーに存在する。115アミノ酸タンパク質（図10A）をコードするオープンリーディングフレームを同定した。全長遺伝子を、乳房線腫細胞株SKBR3のcDNAライブラリーから単離した。細胞株SKBR3、21MT2-D、およびH16N2由来の全長転写物の配列決定は、cDNAに点変異がないこと；転写物がC35hi細胞株ならびにC35lo細胞株において100％相同であることを確認した。C35遺伝子は、ヒト染色体17q12（A＃  AC040933）およびマウス染色体11（A＃  AC064803）に整列する。エキソンは、cDNA  EST配列との相同性、ならびにGRAIL予測から推定した。興味深いことに、C35の遺伝子は、Her2/neu発癌遺伝子の1000塩基対以内であり、成長因子レセプター結合タンパク質7（GRB7）（細胞サイクルを活性化することに関与し、そして食道癌腫において過剰発現されるチロシンキナーゼ）についての遺伝子の2000bp以内である（Tanaka，S．ら、J．Clin．Invest．102：821-27（1998））（図10B）。Her2/neuタンパク質過剰発現は、30％乳房腫瘍における遺伝子増幅と相関しており、そして乏しい臨床的予後と関連する（Slamon，D．J．ら、Science  235：177-82（1987））。
【０５６９】
C35アミノ酸配列における推定タンパク質モチーフとしては、以下が挙げられる：アミノ酸38〜41（TYLE）におけるカゼインキナーゼIIリン酸化部位、76〜79（SKLE）、および97〜100（SNGE）；アミノ酸60〜65（GGTGAF）におけるN-ミリストイル化部位；ならびにアミノ酸94〜97（RRAS）におけるcAMP-およびcGMP-依存性タンパク質キナーゼリン酸化部位。最後に、C35タンパク質は、COOH末端におけるプレニル化モチーフ、アミノ酸112〜115（CVIL）を含む。プレニル化（疎水性イソプレノイド部分の共有結合）は、膜会合を促進する翻訳後修飾であり、タンパク質-タンパク質相互作用を媒介することが明かである（Fu，H．-W．およびCasey，P．J．，Recent  Progress  in  Hormone  Research  54：315-43（1999））。プレニル化は、細胞表面への発癌遺伝子Rasファミリータンパク質の可能性を局在化および形質転換するために必要とされることが示された（Jackson，J．H．ら、Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．87：3042-46（1990）；Hancock，J．F．ら、Cell  57：1167-77（1989））。プレニル化のインヒビターは、腫瘍増殖を遅らせること（Garcia，A．M．ら、J．Biol．Chem．268：18415-18（1993））および動物モデルにおける拒絶を促進すること（Kohl，N．E．ら、Nature  Med．1：792-97（1995））のような抗腫瘍活性を有することが示された。3つのOグリコシル化部位は、アミノ末端（NetOGlyc2.0を使用してthr8、ser2、およびser9）において推定される。
【０５７０】
C35転写物は、乳房癌腫および膀胱癌腫において過剰発現される：
腫瘍免疫療法に対する理想的な標的抗原は、複数の独立した癌腫において豊富に発現され、そして正常な増殖する生きた組織において存在しないかまたは最小に発現される。C35の差次的発現は、ノザンブロット分析によって確認された。C35は、7/10ヒト腫瘍細胞株において、正常な不死化乳房上皮細胞株H16N2（図11A）における発現よりも10〜25倍高いレベルで発現する。重要なことに、C35発現は、一次（21NT、21PT）病変および転移性（21MT1、21MT2）病変との両方に由来する株の間で共有され、これは、その発現が腫瘍形質転換のプロセスにおいて初期の事象と関連し得ることを示唆する。さらに、C35の過剰発現は、独立して誘導されるヒト哺乳動物癌腫細胞株（SKBR3、T47D、およびBT474を含む）の間で共有される。興味深いことに、SKBR3、MDA  MB231、H16N2および同じ患者由来の腫瘍におけるC35発現パターンは、Her2/neu発現と相関し、これは、2つの遺伝子の密接なゲノム近さおよびHER2/neu遺伝子増幅の発生と関連し得る。
【０５７１】
患者由来の腫瘍におけるC35発現が癌ワクチンの発生に臨床的に関連するかいなかを調査するために、mRNAを、Cooperative  Human  Tissue  Network（CHTN）から得たスナップ凍結ヒト組織から抽出した。一次乳房腫瘍試料の70％は、C35転写物を過剰発現し（図11B）、そしてこれらの乳房腺腫の35％（7/20）が正常な乳房の10〜70倍高いレベルで過剰発現する。C35の過剰発現はまた、試験された膀胱腺腫一次試料の50％において観察され（図12）、一方、一次膀胱癌腫の20％（3/14）は、正常な膀胱よりも10倍高いレベルでよりも高く発現する。C35の過剰発現（9倍以上のレベル）は、卵巣（0/7）、前立腺（0/5）、または結腸（0/15）癌腫において検出されなかった（データは示さない）。
【０５７２】
2C3モノクローナル抗体はC35＋細胞と反応する：
C35によってコードされる遺伝子産物の差次的発現を確認するために、共有される腫瘍抗原に対するモノクローナル抗体が選択される。ハイブリドーマを、乏しい免疫原性BALB/cByJ腫瘍細胞株（これは、レトロウイルスヒトC35組換え体を用いて形質導入されている）を用いてマウスを免疫することによって産生した。ハイブリドーマクローンを、それらがC35＋＋乳房腫瘍細胞株および膀胱腫瘍細胞株（図13Aおよび13B）を染色する能力についてスクリーニングした。非腫瘍形成性の乳房H16N2上皮細胞株および膀胱SV-HUC上皮細胞株は、アイソタイプコントロールと比較した場合、蛍光強度の有意な移動を示さなかった。対照的に、2C3モノクローナル抗体は、C35＋乳房腫瘍、SKBR3および21-NT-D、および膀胱腫瘍ppT11A3を特異的に染色した。染色は、固定も透過もされなかった細胞で行われ、これは、2C3抗体が表面分子を認識することを示す。
【０５７３】
C35抗体を用いる腫瘍増殖の阻害：
抗体は、癌の診断マーカーを検出するための有用なツールであるが、これらはまた、治療的適用についての可能な使用を有し得る。ヒト化Her2/neu特異的抗体（Herceptin）は、いくつかの乳癌の処置のために首尾良く使用されている。Herceptinは、HER2/neuに結合し、そして増殖因子レセプターからの信号伝達を下方調節する。増殖阻害研究は、C35特異的2C3抗体を用いて行われた。21NT-D乳房腫瘍およびH16N2「正常」乳房細胞株は、種々の抗体濃度の存在下でインビトロで増殖した。72時間で細胞増殖を評価するためにXTTアッセイを行った。図14Aおよび14Bに示される結果は、2C3が、1μg/ml程度の低い濃度で約50％、21NT腫瘍細胞の増殖を阻害することを示す。
【０５７４】
C35クラスIエピトープはHLA-A2制限される：
自己寛容の確立は、自己タンパク質に基づくワクチンの開発に対する主要な障害である。しかし、寛容は、定量的レベルの発現の点で規定されなければならない。高い親和性抗原特異的T細胞が寛容化される場合でさえ、低い濃度の抗原に対する機能的アビディティを有さない低い親和性レセプターを有するT細胞が寛容誘導を逃れることが可能である。しかし、これらの同じT細胞は、引き続いて、標的抗原の過剰発現と関連する顕著な増加したアビディティ-がある場合、機能的に有意になり得る。これらが数が少ない場合でさえ、このようなT細胞は、免疫学的操作、ワクチン接種の大部分の基礎によって増殖され得る。
【０５７５】
C35は、正常なヒト組織において低い基礎的なレベルで発現される自己タンパク質である。従って、ヒトT細胞が癌腫に特徴的な発現のレベルにおいてヒトT細胞がC35に対して耐性がある場合に決定することが必要であった。寛容を排除するための唯一の方法は、応答を示すことにより、そして臨床試験の短い応答を示すための唯一の方法は、インビトロ刺激による。ヒトT細胞および自己樹状細胞は、正常なドナー由来のPBLから誘導された。T細胞を、C35  cDNAのレトロウイルスまたはポックスウイルス組換え体に感染した自己樹状細胞を用いた代替の刺激によってプライムされた。刺激のいくつかのサイクルに続くインビトロで回収されるCTLを、それらがC35＋標的腫瘍細胞を溶解する能力について（図15Aおよび15B）、または抗原誘導活性化に応答してサイトカインを分泌する能力について（図16Aまたは16B）分析される。標的は、C35および/またはHLA-A2.1を内因的に発現するか、またはC35組換え哺乳動物発現ベクターを用いた標準的なトランスフェクションによって、またはC35組換えワクシニアウイルスで感染によってこれらのタンパク質を発現するように操作されたかのいずれかである。以前の研究は、ワクシニアウイルスによるタンパク質発現が、ペプチドをMHC-Iプロセシング経路に標的化させる効率的な手段であることを示した（Moss，B．，Science  252：1662-67（1991）。
【０５７６】
いくつかの回の刺激に続いて、51Cr放出アッセイ（図15Aおよび15B）におけるC35loH16N2正常乳房上皮細胞株に対するC35＋腫瘍細胞を差次的に溶解するバルクT細胞株およびT細胞クローンの両方が選択される。HLA-A2制限C35特異的CTLクローン10G3は、HLA-A2トランスフェクト腫瘍形成細胞株、21-NT-A2（これは、H16N2よりも15倍高いレベルでC35抗原を発現し、そして2C3モノクローナル抗体で染色される）を効率的に溶解した。特異的溶解はまた、HLA-A2＋膀胱腫瘍細胞株ppT11A3が誘導される非腫瘍形成性膀胱細胞株SV-HUCに比較した、そのHLA-A2＋膀胱腫瘍細胞株ppT11A3を用いてであった（図15B）。このデータは、C35lo非腫瘍形成性不死化細胞株の最小の溶解を有する高レベルのC35を発現する腫瘍のC35CTL感受性を示す。重要なことには、同じCTLは、MEC、有意なレベルでC35を発現しない非不死化、非形質転換HLA-A2＋乳房上皮細胞と反応性ではない。T細胞によるC35＋腫瘍認識を支持するためのさらなる証拠は、図16Aおよび16Bに示される。T細胞は、C35＋、HLA-A2＋刺激物質に応答するIFNγおよびTNFαを分泌する。再び、非腫瘍形成性C35lo細胞株H16N2.A2は、C35特異的T細胞によるサイトカイン分泌を誘導しなかった。しかし、C35に対するワクシニアウイルス組換え体を用いるこの株の感染は、T細胞を活性化する能力を与える。T細胞が無関係なタンパク質L3を用いて形質導入されたH16N2.A2に応答してIFNγまたはTNFαを分泌しないので、これは、この応答が、C35タンパク質発現に特異的であることを示す（図16Aおよび16B）。
【０５７７】
いくつかの回の刺激に続いて、51Cr放出アッセイにおいてC35＋、HLA-A2＋腫瘍細胞を差次的に溶解するバルクT細胞株およびT細胞クローンの両方が、選択された。C35特異的CTLは、HLA-A2トランスフェクトされた非腫瘍形成性乳房上皮細胞株、H16N2.A2を溶解しなかったが（図15Aおよび15B）、この細胞株は、図11Aに示されるノザンブロットデータに基づいて低いレベルでC35を発現する。しかし、C35特異的CTLは、HLA-A2トランスフェクトされた腫瘍形成性細胞株、21-NT.A2（H16N2の15倍より高いレベルでC35抗原を発現し、そして2C3モノクローナル抗体で染色される）を効果的に溶解した。C35＋腫瘍特異的溶解はまた、膀胱腫瘍細胞株ppT11A3が誘導される非腫瘍形成性膀胱細胞株SV-HUCと比較して、膀胱腫瘍細胞株ppT11A3を用いて示された。このデータは、C35lo非腫瘍形成性不死化細胞株の最小の溶解を伴う高レベルのC35を発現する腫瘍のCTL感受性を示す。重要なことには、同じCTLは、MEC、有意なレベルでC35を発現しない非不死化非形質転換HLA-A2＋乳房上皮細胞の一次培養物と反応性ではない。T細胞によるC35＋腫瘍認識を支持するためのさらなる証拠を、図16AおよびBに示す。T細胞は、C35＋、HLA-A2＋刺激物質に応答してIFNγおよびTNFαを分泌する。また、非腫瘍形成性C35lo細胞株H16N2.A2は、C35特異的T細胞によるサイトカイン分泌を誘導しなかった。しかし、C35に対するワクシニアウイルス組換え体を用いるこの株の感染は、T細胞を活性化する能力を与える。T細胞が無関係なタンパク質L3を用いて形質導入されたH16N2.A2に応答してIFNγまたはTNFαを分泌しないので、これは、この応答が、C35タンパク質発現に特異的であることを示す。
【０５７８】
C35特異的T細胞は、HLAハプロタイプA2、A11、B8、B35を用いてドナーから生成された。膀胱細胞株、SV-HUCおよびppT11A3は、ハプロタイプHLA-A2、B18、B44を用いてドナーから誘導された。しかし、H16N2不死化乳房上皮細胞株ならびに21-NTおよび21-MT乳房腫瘍細胞株が同じHLA-A2陰性ドナーから誘導されたので、これら細胞株は、HLA-A2制限10G3  T細胞クローンによる認識のための必要とされるMHC制限エレメントを提供するためにHLA-A2.1をトランスフェクトされなければならなかった（図16AおよびB）。T細胞は、C35およびHLA-A2の両方を発現する乳房株によってこれらのリンホカインを分泌するために強力に刺激された（21-MT2を21-MT2.vvA2と比較する）。このデータは、C35の少なくとも1つのHLA-A2.1規定エピトープがあることを示す。
【０５７９】
C35コード領域の欠失変異は、CTLによって認識されるペプチドエピトープをコードするcDNAセグメントを同定するために構築された。図15Aおよび15Bは、全長C35または最初の50個のアミノ酸のみを含む短縮変異体を用いて刺激されたT細胞による、ほとんど等価なIFNγおよびTNFα分泌を示す。
【０５８０】
考察
C35は、乳房癌腫および膀胱癌腫において過剰発現される新規な腫瘍抗原である。この遺伝子は、それを腫瘍免疫療法に対する有望な候補にする性質を有する。この遺伝子は、異なる個体から誘導される有意な数の腫瘍において発現される。生きた正常な組織における発現は、比較的低く、自己免疫反応の危険を減少させ、そして等しく重要であり、免疫細胞が遺伝子産物に対して寛容にされないようにする。C35は、「腫瘍抗原」として特徴付けられる。なぜなら、C35発現樹状細胞が、インビトロで自己腫瘍特異的ヒト細胞傷害性Tリンパ球を誘導するからである。
【０５８１】
C35は、未知の機能の新規な遺伝子産物である。しかし、モノクローナル抗体を用いた本発明者らの研究は、タンパク質の局在化に対するいくつかの見識を提供した。C35免疫マウスから誘導される血清およびモノクローナル抗体の両方が、C35を発現する非固定細胞を非特異的に染色する。これは、この抗体が腫瘍表面膜タンパク質を認識することを示唆する。タンパク質配列が疎水性に基づいた公知の膜貫通モチーフと適合しないが、COOH末端のプレニル化部位の存在が、膜への挿入を示唆する。プレニル化は、膜に対して高い親和性を有する、実質的により疎水性のタンパク質を産生する翻訳後脂質改変である（Fu，H．-W．およびCasey，P．J．，Recent  Progress  in  Hormone  Research  54：315-43（1999））。プレニル化部位を含む他のタンパク質は、Ras発癌遺伝子ファミリーを含む。Ras  GTPaseが、細胞分裂および増殖を誘導するためにMAPKを用いるシグナル伝達カスケードで作用する。Rasタンパク質は、プレニル化を介して形質膜に係留されるが、タンパク質は、膜の細胞質表面に残る。従って、C35がまた膜の細胞質側に残るが、特異的抗体で検出されるのに十分な、外側表面への十分な輸送が存在し得る。
【０５８２】
C35特異的抗体は、ノザンブロットを実証するため、およびウェスタンブロットおよび免疫組織化学のようなアッセイにおける使用のためのC35のタンパク質発現を研究するための価値のあるツールである。さらに、これらの抗体は、治療的利益を有し得、例えば、最近、Herceptin（Baselga，J．ら、J．Clin．Oncol．14：737-44（1996）；Pegram，M．D．ら、J．Clin．Oncol．16：2659-71（1998））、腫瘍関連抗原HER2-neu（c-erB-2）に対する抗体（Schechter，A．L．ら、Nature  312：513-16（1984）について示された。Herceptinの抗腫瘍効果は、腫瘍増殖を阻害する上皮増殖因子レセプターを結合すること、および抗体依存性細胞媒介細胞傷害を誘発することを包含する（Dillman，R．O．，Cancer  Biotherapy  ＆  Radiopharmaceuticals  14：5-10（1999）。
【０５８３】
実施例6
腫瘍の標的抗原に特異的な細胞傷害性T細胞の誘導
ヒト腫瘍特異的T細胞は、腫瘍溶解物を用いてパルスされた自己腫瘍または自己抗原提示細胞を用いるPBLの刺激によりインビトロで誘導された（van  Der  Bruggen，P．ら、Science  254：1643-1647（1991）；Yasumura，S．ら、Cancer  Res．53：1461-68（1993）；Yasumura，S．ら、Int．J．Cancer  57：297-305（1994）；Simons，J．W．ら、Cancer  Res．57：1537-46（1997）；Jacob，L．ら、Int．J．Cancer  71：325-332（1997）；Chaux，P．ら、J．Immunol．163：2928-2936（1999））。PBLは、腫瘍を用いて、免疫原性を増強するように改変された腫瘍を用いて、または腫瘍抽出物を用いて故意に免疫された患者あるいは先の刺激のみが疾患の自然な過程にある患者のいずれかから誘導された。感染性因子に対する反応性を有するT細胞は、感染性因子に対する曝露の自然な過程の間、インビトロで感染されたか、またはインビボで感染されたかのいずれかである自己細胞を用いてT細胞のインビトロ刺激によって同様に誘導され得る。腫瘍細胞またはウイルス、真菌、もしくはミコバクテリアのいずれかに感染した細胞または自己免疫疾患の標的抗原に特異的なT細胞もしくは抗体のいずれかに特異的なこれらまたは他の条件下で選択されたCD4＋およびCD8＋T細胞または抗体は、これらの標的抗原をコードし、そして代表的なcDNAライブラリーに組み込まれたcDNAを検出しそして単離するために、本発明の選択およびスクリーニング方法において使用され得る。
【０５８４】
腫瘍および感染細胞の多くの抗原に対するインビトロでのヒトT細胞応答の誘導における示された成功にもかかわらず、これらがインビボで誘導され得る応答の完全なレポーターを表すことは確かではない。安全性の考慮は、人々における実験的免疫化の可能性を制限し、ヒト疾患抗原に対する免疫応答を研究するための代替の動物モデルの必要性がある。このようなモデルを開発するための障害は、正常なヒト細胞において発現される多くの分子が他の種において強力な免疫原であることである。従って、任意のヒト疾患特異的抗原に対する免疫応答を明かにするために別の種における正常なヒト抗原に対する寛容を誘導する手段を考え出すことが必要である。ここで、抗原特異的Tリンパ球の活性化が2つのシグナル（1つがT細胞抗原に対する特異的抗原性複合体の提示を含み、そして第2が抗原提示細胞の表面上のB7ファミリーの分子とT細胞膜上のCD28分子との相互作用によって通常媒介される独立した同時刺激因子シグナルである）を必要とする。同時刺激因子シグナルの非存在下での抗原特異的シグナルの送達は、T細胞免疫を誘導しないだけでなく、引き続く刺激に対するT細胞非応答性を生じる（Lenschow，D．J．ら、Ann．Rev．Immunol．14：233-258（1996））。さらなる研究は、抗原提示細胞上のCD40分子とT細胞上のCD40リガンドとの間の相互作用の別の対についての重要な役割を明かにした。この相互作用は、B7同時刺激因子分子の上方制御を生じる（Roy，M．ら、Eur．J．Immunol．25：596-603（1995））。インビボまたはインビトロのいずれかで、抗CD40リガンド抗体の存在下で、CD40との相互作用は、遮断され、B7同時刺激因子は、上方制御されず、そして特異的抗原性複合体での刺激は、T細胞免疫よりもT細胞寛容性を生じる（Bluestone，J．A．ら、Immunol．Rev．165：5-12（1998））。CD40/CD40リガンド相互作用およびB7/CD28相互作用のいずれかまたは両方を遮断するための種々のプロトコルは、移植寛容性を効果的に導入することが示されている（Larsen，C．ら、Nature  381：434-438（1996）；Kirk  ら、Nature  Medicine  5：686-693（1999））。特異的移植抗原に対するマウスT細胞の反応性を遮断する際の抗CD40リガンド抗体（抗CD154）の効果の例は、図17Aおよび17Bに示される。DBA/2（H-2d）マウスは、107C57Bl/6（H-2b）脾細胞で腹腔内で免疫され、そしてさらに、生理食塩水または0.5mgモノクローナル抗CD40リガンド抗体（MR1、抗CD154、Pharmingen  09021D）のいずれかを用いて注射し、免疫の時および二日後の両方に投与した。免疫の10日後に、これらのマウス由来の脾細胞を取り除き、そしてC57Bl/6またはコントロール同種異系C3H（H-2k）脾細胞（照射された（20Gy）のいずれかでインビトロで刺激した。インビトロ刺激の5日後、C57Bl/6およびC3H特異的細胞溶解性応答が、特異的標識化標的からの51Cr放出アッセイ（この場合、同系の細胞溶解物でパルスされたC3H樹状細胞またはC57Bl/6樹状細胞のいずれか）による種々のエフェクター：標的の比でアッセイされた。図17Aおよび17Bの結果は、有意な細胞傷害性が生理食塩水と抗CD154処理マウスとの両方でコントロールC3H同種抗原に対して誘導されたが、C57B1/6に対する細胞傷害性応答が生理食塩水処理されたマウスで誘導されたが、抗CD154処理されたマウスでは誘導されなかったことを示す。これは、CD40/CD40リガンド相互作用が抗CD154によって���断された時点での免疫刺激に使用される抗原に対する特異的な寛容性誘導を示す。
【０５８５】
抗CD154単独、または抗CD154および抗B7もしくは抗CD28の組み合わせのいずれかを使用する、上記と類似の寛容化プロトコールを使用して、ヒト腫瘍での免疫の前に、マウスにおいて正常なヒト異種抗原に対する寛容を誘導し得る。1つの態様において、この正常な抗原は、腫瘍細胞株が由来するのと同じ個体および組織由来の不死化された正常細胞上で発現される。別の態様において、正常抗原および腫瘍抗原は、インビボおよびインビトロの両方で、同系マウスT細胞への提示のために、抗原提示細胞上に各々溶解物でパルスした、同じ個体の正常組織および腫瘍組織の細胞溶解物由来である。好ましい態様において、腫瘍は、不死化され、接触阻害された、足場依存性の、非腫瘍形成細胞株から、インビトロ変異誘発または癌遺伝子形質転換によって誘導され、その結果、寛容誘導のために、非常によく適合した非腫瘍形成性細胞が利用可能である。
【０５８６】
寛容化プロトコールに対する別の方法は、腫瘍での免疫の前に、正常な抗原によって活性化されるT細胞を枯渇することである。活性化T細胞は、刺激後24時間〜48時間の間にピーク発現としてCD69およびCD25を一過性に発現する。正常細胞または正常細胞溶解物を用いた活性化後、これらのマーカーを発現するT細胞を、磁気ビーズのようなマトリックスに直接または間接的に結合された抗CD69抗体および抗CD25抗体を用いて枯渇し得る。養子移入後、インビトロまたはインビボのいずれかで腫瘍細胞または腫瘍細胞溶解物を用いる、残りのT細胞の引き続く免疫によって、優先的に腫瘍特異的応答を生じる。
【０５８７】
1つの態様において、正常ヒト細胞または溶解物に対して寛容化され、引き続いて腫瘍細胞または溶解物で免疫されるべきマウスは、種々の市販されている、近交系、または非近交系のいずれかである。マウスT細胞は、ヒト細胞によっては発現されないマウスMHC分子に会合するペプチド抗原を認識するように拘束されているので、有効な寛容化または刺激には、マウスMHC分子を用いたヒト細胞のトランスフェクション、またはマウスの抗原提示細胞によるヒト正常抗原および腫瘍抗原の再提示のどちらかが必要である。樹状細胞は、クラスIおよびクラスIIの両方のMHC経路において、抗原性ペプチドを再提示する能力のおかげで、抗原提示細胞として特に好ましい（Huangら、Science  264：961〜965（1994）；Inabaら、J．Exp．Med．176：1702（1992）；Inabaら、J．Exp．Med．178：479〜488（1993））。別の態様において、ヒトHLAおよびヒトCD8またはCD4について二重にトランスジェニックであるマウスを使用する。HLA導入遺伝子によって、マウス胸腺においてHLA拘束T細胞レパートリーの高い親和性の選択が可能になる。さらに、ヒトCD8またはCD4導入遺伝子が、必要である。なぜなら、マウスCD8およびCD4は、同属のヒトクラスIまたはクラスII  MHC分子と効率的に相互作用しないからである。ヒト腫瘍特異的T細胞を生成するための非トランスジェニックマウスの使用によって、マウスMHC分子と会合してプロセシングされ得る任意のヒト腫瘍抗原の同定がもたらされる。多様なMHC分子を有する複数のマウス系統が利用可能であるので、これは広範な抗原を包含し得る。しかし、これらの腫瘍特異的抗原がまた、ヒトHLAに会合してプロセシングされ、そして提示され得るペプチドを発現するか否かは、自系の抗原提示細胞を用いたヒトT細胞の刺激によって別々に決定されなければならない。このようなペプチドは、マウスMHC分子と会合して最初に検出されたペプチドと重複しても重複しなくてもよいが、同じセットのタンパク質に由来する。HLAトランスジェニックマウスを使用することによって、ヒトMHCに対する抗原性ペプチドの関連性にさらに直接的に取り組むことが可能である。しかし、ペプチドプロセシングが、マウスおよびヒトの抗原提示細胞において同一であることは保証できない。従って、HLA拘束されたヒト腫瘍抗原特異的T細胞が、実際にまた、ヒト腫瘍細胞上で交差反応性であることを確認することが重要である。結局、ヒトHLAに会合した状態でのプロセシングおよび提示の問題にどんなに取り組んでも、どんな場合においても、ヒトT細胞が同定された抗原に反応性であるか否か、またはヒト細胞が、おそらく、いくつかの他の同種でない正常組織における同じもしくは関連の抗原の発現に起因して、寛容性を付与されたか否かが決定されなければならない。この点における関連の情報は、自系の抗原提示細胞によって提示された、同定された抗原または抗原性ペプチドを用いた、ヒトT細胞応答のインビトロ刺激を通じて得られ得る。理想的には、抗原陽性の腫瘍を有する患者では、腫瘍特異的抗原と言われている抗原と反応性のT細胞の頻度が増大していることが示される。誘導された抗原特異的ヒトT細胞が、腫瘍を根絶するのに有効であり得ることを実証するため、選択されたヒトT細胞を、Renner、Cら、Science  264：833〜835（1994）に記載のような、ヒト腫瘍異種移植片を保有するSCIDマウス中に養子移入し得る。しかし、臨床上の関連に関する決定的な証拠は、ヒト臨床試験の結果を待つものである。
【０５８８】
初代ヒトT細胞応答のインビトロ刺激のための条件は、実施例2に記載されており、そしてCD4＋およびCD8＋応答の両方に対して適用可能である。ヒト腫瘍に特異的なヒトT細胞または抗体の応答の誘導に関して記載された戦略は、ウイルス、真菌、またはミコバクテリアのいずれかで感染されたヒト細胞の標的抗原に対するT細胞または抗体の応答の誘導に、等しく適用可能である。実際に、この場合、同じ感染していない細胞集団が、寛容誘導のために、そして感染特異性を確認するために、直ちに利用可能な正常コントロール集団を提供する。
【０５８９】
トランスジェニックマウスの構築は、当技術分野で周知であり、そして例えば、Manipulating  the  Mouse  Embroy：A  laboratory  Manual，Hoganら、Cold  Spring  Harbor  Press，第二版（1994）に記載されている。ヒトCD8トランスジェニックマウスは、LaFaceら、J．Exp．Med．182：1315〜25（1995）の方法によって構築され得る。ヒトCD8αおよびCD8βのサブユニットを発現する、新しい系列のトランスジェニックマウスの構築は、対応するヒトcDNAを、トランスジェニックマウスにおけるT細胞特異的発現のための、ヒトCD2ミニ遺伝子ベースのベクター中に挿入することによってなされ得る（Zhumabekovら、J．Immunol．Methods  185：133〜140（1995））。HLAクラスIトランスジェニックマウスは、Chamberlainら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA  85：7690〜7694（1988）、またはBernhardら、J．Exp．Med．168：1157〜1162（1988）、またはVitielloら、J．Exp．Med．173：1007〜1015（1991）、またはBarraら、J．Immunol．150：3681〜3689（1993）の方法によって構築され得る。
【０５９０】
さらなるHLAクラスIトランスジェニックマウスの構築は、遺伝子調節に以前に関与した最初の2つのイントロンと一緒に2kbの上流調節領域を含むH-2Kbカセットの構築によって達成され得る（Kralovaら、1992、EMBO  J．11：4591〜4600）。内因性翻訳開始部位を、この領域から排除し、そしてHLA  cDNAの挿入のための制限部位を、第3エキソン、それに続くポリA付加部位に導入する。この構築物の3’末端でゲノムH-2Kb配列のさらなる3kbを含むことにより、このクラスI遺伝子を、胚性幹細胞におけるH-2Kb遺伝子座で相同組み換えのために標的し得る。これは、導入遺伝子が、マウスのクラスI発現と適合性であることが公知の規定された遺伝子座で発現される可能性が高いという利点、およびこれらのマウスが細胞膜でのH-2Kb発現による可能性のある競合について不十分である可能性が高いという利点を有する。これによって同じ構築物に導入された多様なヒトHLAクラスI  cDNAの比較的再現可能な発現が生じると考えられる。
【０５９１】
実施例7
C35ペプチドエピトープで刺激された系4T細胞によるGM-CSF分泌の誘導
T細胞株4は、各々、自家樹状細胞（DC）および、次いで、C35組換え体ワクシニアウイルスで感染させた自家単球で12日間正常ドナT細胞を刺激することによって生じさせた。週刺激をアロPBL、およびHLA-A2/Kb（21NT-A2）でトランスフェクトされた21NT腫瘍で継続した。実験の結果を図18に示す。この実験ではT細胞を、インビトロにて、ウェル当たり1ug/mlのC35ペプチドエピトープ9〜17、77〜85、104〜112、または105〜113でパルスした5×104照射（2500ラド）H16N2-A2/Kbで106T細胞にて、およびウェル当たりAIM-V/5％ヒトAB血清中のIL2（20U/ml）およびIL-7（10ng/ml）で105照射アロPBLにて再度刺激した。2回の7日間の刺激の後T細胞を、1ug/mlのペプチドでパルスした、またはパルスしていない、あるいはMOI＝1にてvvC35またはvv野生型で感染させた異なるシミュレーターでのインキュベーションに続いてGM-CSF分泌の誘導につき試験した。T細胞（5000）を、三連にて、AIM-V/5％ヒトAB血清中にて25000の種々のスティミュレーター細胞と共に一晩インキュベートした。
【０５９２】
図18に示すように、GM-CSF刺激は、HLA-A2/Kb（H16N2-A2）でトランスフェクトされた正常な乳房上皮細胞で観察されなかった。しかしながら、C35ペプチドでパルスされた同一細胞は有意な刺激を生じた（A16N2-A2＋ペプチド）。刺激は各ペプチドでパルスされた細胞で観察され、ペプチド77〜85は最大刺激を示した。加えて、有意な刺激が、HLA-A2/Kb（21NT-A2）でトランスフェクトされたが、C35ペプチドでパルスされていない21NT腫瘍細胞で、ならびにHLA-A2/Kbでトランスフェクトされ、かつC35組換え体ワクシニアウイルス（H16N2-A2 vvC35）で感染された正常な乳房上皮細胞で観察された。予測されたように、HLA-A2/Kbでトランスフェクトされ、かつ野生型ワクシニアウイルスで感染させた正常乳房上皮細胞で刺激は観察されなかった。
【０５９３】
C35ペプチドのいずれかでパルスされなかったH16N2-A2細胞で最小の刺激が観察されたが、ペプチドでパルスされた同一の細胞では実質的な刺激が観察されたという事実により、試験されたC35ペプチドの各々がHLA2と関連することが確認される。さらに、21NT-A2腫瘍細胞はいずれかのC35ペプチドでパルスされていなかったにもかかわらず、それもまた刺激を示したという事実により、35ペプチドは腫瘍細胞によって産生された（すなわち、プロセッシングされた）ことが確認される。最後に、C35組換え体ワクシニアウイルスで感染されたH16N2-A2細胞では刺激が観察されたという事実により、組換えにより導入された全長C35ポリペプチドは細胞でプロセッシングされることが確認される。
【０５９４】
実施例8
ペプチド特異的CD8＋T細胞の生成
CD8＋T細胞の選択
抗凝集ヒト血液の標準的なFicoll-Hypaque分離を用いてPBMCを収穫した。全血液を50ml遠心管でHBSS（w/o Ca2＋/Mg2＋）で2:1希釈した。次いで、30mlの血液を12mlのフィコール上に重ねた。血液をブレーキをかけずに18℃、400×gにて30分間遠心した。PBMCを含有する界面層を取り出し、HBSSで2回洗浄した。
【０５９５】
CD8陽性細胞を、Miltenyi Biotec,Auburn,CAによって製造された磁気活性化細胞ソーティング（MACS）を介して選択した。具体的には、PBMCをペレット化し、107全細胞当たり80μlのMACS緩衝液（0.5％BSAおよび2mM EDTAで補足された、脱気された氷冷PBSpH7.2）に再懸濁させた。20μlのMACS CD8マイクロビーズを107細胞当たり添加し、よく混合し、6〜12℃にて15分間インキュベートした。次いで、12mlのMACS緩衝液を添加することによって細胞を洗浄し、4℃にて10分間300×gにおいて遠心し、上澄みを完全に除去し、ペレットを1〜2mlのMACS緩衝液に再懸濁させた。陽性選択VS＋MACSカラムをセパレーターの磁場に入れた。3mlのMACS緩衝液で洗浄することによってカラムを調製した。細胞懸濁液をカラムに適用し、細胞を完全にカラムに入れた。次いで、カラムを3×3mlのMACS緩衝液ですすいだ。
【０５９６】
カラムをセパラーターから取り出し、収集チューブに入れた。次いで、5mlのMACS緩衝液をピペットでカラム上に入れ、細胞を供給されたプランジャーでしっかりとフラッシュした。CD8＋細胞型をフローサイトメトリーを介して確認した。細胞を10％ヒトAB血清（Gemini Bioproducts,Woodland,CA）を含むAIM-V培地（Gibco,Carlsbad,CA）中で培養を維持するか、あるいは後の使用のために-80℃にて10％DMSOおよび90％ヒトAB血清中で凍結させた。
【０５９７】
樹状細胞（DC）の生成および成熟化
PBMCからのDC選択
PBMCを、全てのPBLを含めて、またはCD8＋および/またはCD4＋細胞選択に続いて平板培養した。Miltenyi Biotec MACS CD4マイクロビーズを用い、CD4＋細胞をCD8＋細胞（前記）と同様に選択した。PBLの不存在または存在はDC選択に差を生じさせない。次いで、RPMI無血清培地の6ウェルプレート中で5〜7×106細胞/ウェルにて、PBMCを37℃で2時間平板培養した。非接着性細胞を除去し、接着性層をHBSSで3回洗浄した。接着性細胞を、未成熟DCの生成のために、1％ヒトAB血清、1000U/mlのGM-CSFおよび1000UmlのIL-4を含むStemSpan（StemCell Technologies,Vancouver,BC,Canada）中で、37℃、7％CO2にて7日間インキュベートした。培地およびサイトカインを1日おきに補充した。
【０５９８】
DC成熟化
第7日に、非接着性細胞を収穫することによって未成熟DCを収集した。1％ヒトAB血清、1000U/mlのGM-CSF、1000U/mlのIL-4、10ng/mlのTNFαおよび1μg/mlのCD40Lを含むStemSpan中で、DCを37℃、7％CO2にて24〜48時間インキュベートして成熟させた。
【０５９９】
ペプチドパルスAPCを用いたCD8＋細胞刺激
第1の刺激は、ペプチドパルス自家DCを利用して行った。用いたCD8＋細胞は新鮮なものであるか、または最小で刺激から24時間前に-80℃から培養に戻したのかいずれかであった。新鮮な成熟したDCをAIM-V培地中の96ウェルU底プレートのウェル当たり1×104細胞にて平板培養した。10μg/mlのペプチドおよび3μg/mlのβ2-ミクログロブリンを37℃、7％CO2の4時間のパルスのために個々のウェルに添加した。
【０６００】
示された場合に、ウェルをペプチドパルスDCのプールのために組み合わせた。次いで、細胞を15mlの円錐チューブに移し、AIM-V培地で容量を12mlとした。ペレットを遠心し、AIM-V培地に再懸濁させ、2500ラドにて照射した。第0日に、1×105ペプチドパルスDCを、刺激のために、1DCに対する20のT細胞の比率にて24ウェルプレート中の2×106CD8＋細胞に添加した。5％ヒトAB血清および10ng/mlのIL-7を含むAIM-Vに細胞を維持した。第1日に、20IU/mlのIL-2を各ウェルに添加した。次いで、ウェルを37℃、7％CO2にて12日間インキュベートし、必要であれば、培地を新鮮なものに交換した。
【０６０１】
第2番目および第3番目の刺激
第2番目および第3番目の刺激のためのプロトコルは、以下の例外を除き第1番目の刺激のためのプロトコルと同様であった。培養に戻し、成熟させることによって、凍結されたDCを利用した。DCを1〜10μg/mlペプチド（実験的に依存）で2〜4時間パルスした。DCを2500ラドで照射し、洗浄工程を省略した。従って、いずれの未結合ペプチドも培地に残った。細胞を12または24ウェルプレート中で20:1の比率（CD8:CD）にて維持し、1×106CD8＋細胞/ウェルを平板培養した。第3番目の刺激から7〜12日後に、細胞傷害性および/またはサイトカイン放出アッセイを介してT細胞を標的細胞認識についてアッセイした。
【０６０２】
第4番目の刺激およびそれ以上
種々の細胞型をAPC、すなわち、DC、単球、EBV-Bおよび腫瘍として用いることができる。自家単球を例として掲げる。PBMCを2500ラドで照射し、次いで、RPMI中の12ウェルプレートのウェル当たり4〜6×106細胞にて平板培養し、37℃、7％CO2にて2時間インキュベートした。非接着性細胞を除去し、接着性単球をHBSSで2回洗浄した。
【０６０３】
次いで、単球をAIM-V培地中、1〜10μg/mlにおいて、37℃、7％CO2で2時間ペプチドでパルスする。CD8＋細胞が既にプール中のペプチドパルスAPCで刺激されている場合、単球を同一プールにパルスする時に、ペプチドを組み合わせる。1〜10μg/mlの各ペプチドを加える。CD8＋細胞を各パルス単球に添加し、20:1比率を維持する。
【０６０４】
第0日に、10ng/mlのIL-7を添加し、第1日に、20IU/mlのIL-2を添加する。次いで、細胞を37℃、7％CO2にて7日間インキュベートし、必要であれば、培地を新鮮なものと交換する。一般に、各刺激から5〜7日後に、細胞傷害性および/またはサイトカイン放出アッセイを介してT細胞を標的細胞認識につきアッセイする。
【０６０５】
クローナルCD8＋細胞集団
細胞を限界希釈によってクローニングした。96ウェルのU底プレートのウェルに1〜10のCD8＋細胞、1×104混合照射同種異型フィーダー細胞（2500ラド）、1000ペプチドパルス自家照射EBV-B細胞（2500ラド）、および5％ヒトAB血清を含むAIM-V培地中の10ng/mlのIL-7を添加した。第1日に、20IU/mlのIL-2を添加した。50％の培地を交換し、新鮮なサイトカインおよび照射されたフィーダーおよびペプチドパルスβ細胞を加えることによって、クローンを毎週リフレッシュした。限界希釈のクローン性を示す＜30％増殖を示すプレートから、クローンを、標的細胞認識アッセイ、細胞傷害性および/またはサイトカイン放出、および増殖につき選択した。
【０６０６】
迅速増殖プロトコル
このプロトコルは、溶解活性を示すクローンで利用した。（個人的な通信を介してSteven Rosenberg博士（NCI）から頂いたプロトコル）
【０６０７】
第0日に、同種異型混合PBMCを照射し（2500ラド）、10％ヒトAB血清を含む25mlのAIM-V中の25cm2フラスコ（4×107細胞/フラスコ）に添加した。OKT3を30ng/mlで添加し、続いて、1×105生存クローニングCD8＋細胞を添加した。第2日に、IL-2を300IU/mlで添加した。第5日に、フラスコ当たり20ml培地を交換し、300IU/mlの新鮮なIL-2を添加した。REPから8〜11日後に、免疫活性を細胞傷害性またはサイトカイン放出アッセイによって試験した。
【０６０８】
細胞傷害性51Cr放出アッセイ
CD8＋細胞を選択された標的細胞に対する活性につきスクリーニングした。APCをペプチドでパルスし、細胞を形質導入して、レトロウイルスまたはワクシニアウイルス、腫瘍、正常対照等を発現させた。フラスコから細胞を15ml円錐管に除去し、12mlのHBSSを添加し、細胞を再懸濁させ、遠心することによって、標的を洗浄した。次いで、上澄みを〜200μl注いだ。これに、100uCi51Cr/1×106細胞を添加した。次いで、標的を37℃、7％CO2にて1時間インキュベートし、次いで、2×12mlのHBSSで洗浄した。
【０６０９】
標的を5％ヒトAB血清を含むAIM-Vに再懸濁させ、96ウェルU底プレートのウェルに添加した。次に、実験に依存して；一晩、51Crの添加に先立ち、または51Crインキュベーションに続いて、1〜20ug/mlのペプチドを種々の時点で標的にパルスした。CD8＋エフェクター細胞を、5％ヒトAB血清を含むAIM-Vに添加した。E:T比率は5:1〜50:1の範囲である。試料は三連にて200μlの最終容量であった。対照は51Crの培地への自然放出、最大放出（5％トリトンX100でのインキュベーション）および未パルス標的を含んだ。プレートを700RPM/5分で回転させ、37℃、7％CO2にて4〜6時間インキュベートした。上澄みを収穫し、51Cr放出をγカウンターを介して測定した。
【０６１０】
GM-CSFまたはγIFN放出を測定するサイトカインELISAアッセイ
用いたPharmingen（San Diego,CA）キットは、製造業者の指令に従う必要で変化させることができる。一般に、プロトコルは以下の通りであった:
【０６１１】
第1日に、ELISAプレートを、コーティング緩衝液（0.1MのCarbonate,pH9.5）中にて、ウェル当たり100μlの希釈された捕獲抗体でコートする。次いで、プレートをシールし、ホイルで包み、4℃にて一晩インキュベートする。次いで、5％ヒトAB血清を含むAIM-V培地中、96ウェルU底プレートにて、CD8＋細胞と一晩標的をインキュベートする。試料は三連である。
【０６１２】
第2日に、ELISAプレートのウェルを吸引し、300μl/ウェルの洗浄緩衝液（PBS、0.05％Tween20）で3回洗浄した（Bio-Tekプレート洗浄器、Winooski,VT）。次いで、プレートを200μl/ウェルのアッセイ希釈剤でブロックし、室温で1時間インキュベートし、プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄した。
【０６１３】
100μlの標準または各未知試料からの培養上澄みをそれらの各ウェルに添加し、室温にて2時間インキュベートした。
【０６１４】
プレートを洗浄緩衝液で5回洗浄し、100μlの作業ディテクターを各ウェルに添加し、プレートを室温にて1時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄緩衝液で7回洗浄し、100μlの基質溶液を各ウェルに添加し、プレートを室温にて暗所で15〜30分間インキュベートした。50μlの2N硫酸を各ウェルに添加して、反応を停止させた。次いで、プレートをλ修正570nmにて450nmにて30分以内読んだ。
【０６１５】
実施例9
C35ペプチド媒介T細胞溶解
C35ペプチドエピトープでパルスされたEBV細胞に対するT細胞活性を分析した。具体的には、異なるHLA特異性を発現する2つの別々のヒトドナーから得られたT細胞を、C35ペプチドエピトープでパルスされたEBV-B標的細胞と共にインキュベートした。結果を表10に示す
【０６１６】
（表１０）T細胞ドナーSB、HLAハプロタイプ:A2、A3；B18、B44
2005528914.tif 000385
ペプチド17〜31  VEPGSGVRIVVEYAE
ペプチド22〜30  GVRIVVEYA
ペプチド72〜86  QLVFSKLENGGFPYE
ペプチド77〜85  KLENGGFPY
T細胞ドナーLE、HLAハプロタイプ:A3、A66；B8、B41
2005528914.tif 000386
ペプチド67〜75  IEINGQLVF
ペプチド81〜89  GGFPYEKDL
T細胞ドナーAH、HLAハプロタイプ:A2、A11；B8、B35
ペプチド9〜17（SVAPPPEEV）；77〜85（KLENGGFPY）；104〜112（KITNSRPPC）；105〜113（ITNSRPPCV）で刺激された系4T細胞によるGM-CSF分泌の誘導を参照
【０６１７】
表10に示すように、C35のアミノ酸残基72〜86に対応する15量体またはアミノ酸77〜85に対応する9量体に対して刺激されたA2、A3、B18およびB44HLAハプロタイプを発現するドナーからのT細胞クローンは、いずれかのペプチドでパルスされていないEBV-B標的細胞に対して最小の溶解活性を示した。しかしながら、高レベルの溶解活性が、いずれかのペプチドでパルスされたEBV-B細胞で観察された（各々、ペプチド72〜86およびペプチド77〜85につき75.8％および97.1％）。同様に、C35のアミノ酸22〜30に対応する9量体に対して生起した同一ドナーからのT細胞は、ペプチドでパルスされていない標的細胞を溶解させないが、ペプチドでパルスされた標的細胞を溶解させる際に非常に活性であった。しかしながら、注目すべきことには、C35のアミノ酸17〜31に対応する15量体でパルスされた標的細胞は、それが9量体22〜30を含むに拘わらず、最小の溶解を呈した。C35のアミノ酸67〜75および81〜89に対応する9量体に対して刺激されたA3、A66、B8およびB41のHLAハプロタイプを発現するもう1つのドナーからのT細胞クローンは、これらのペプチドでパルスされたEBV-B標的細胞に対して中程度の溶解活性を呈した（各々、54.9％および40.3％）。
【０６１８】
9量体p77〜85または15量体p72〜86いずれかでパルスされたEBV-B細胞で観察された高レベルの溶解活性は、ある場合には、C35ペプチドエピトープを含むより大きなペプチドが、現実のエピトープで達成されたのと同様のT細胞応答を刺激する際に効果的であることを示す。しかしながら、それが、有意な溶解活性をトリガーするC35ペプチドエピトープp22〜30を含むのにかかわらず、最小の溶解がp17〜31で観察されたという事実は、この効果が全ての例で観察されないことを示す。
【０６１９】
実施例10
C35に特異的なモノクローナル抗体
免疫化プロトコル:
C35に特異的なモノクローナル抗体を生じさせるために、3つの方法のうちの1つを用いて、BALB/cByJマウスを免疫化した。
【０６２０】
1. C35組換えレトロウイルスで細胞を感染させることによって、同系間マウス線維肉腫細胞株BCA34を形質導入して、ヒトC35を発現させた。安定なC35発現細胞をG418に対する抵抗性につき選択した。当業者に周知の方法を用い、200万個の細胞をマウス当たり注射し、NS1マウス骨髄腫細胞との融合のために23日後に脾臓を摘出した。
【０６２１】
2. Linel、貧弱な免疫原性マウス小細胞肺癌腫を形質導入して、BCA34につき前記したようにC35を発現させた。マウスを20,000細胞で免疫化し、NS1マウス骨髄腫細胞との融合のために20日後に脾臓を摘出した。
【０６２２】
3. ヒトC35、VV.hC35につき1000万pfuのワクシニアウイルス組換え体の腹腔内注射をマウスに与えた。NS1マウス骨髄腫細胞との融合のために、15日後に脾臓を摘出した。
【０６２３】
ELISAによるハイブリドーマクローンのスクリーニング
ELISAアッセイを用いて、C35についての反応性および特異性につき、各融合からの500〜1000のハイブリドーマクローンによって分泌された抗体をスクリーニングした。ELISAプレートをC35タンパク質または陰性対照としてのβガラクトシダーゼでコートした。双方のタンパク質を生じさせ、選択タグの切断を含めて同様に大腸菌から精製した。次いで、ハイブリドーマクローンからの上澄みを、コートしたプレート上でインキュベートし、続いて、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）で標識された抗マウス抗体とでインキュベーションを行い、およびOPD基質で検出した。C35タンパク質と強く反応するが、β-ガラクトシダーゼとは反応しなかったクローンをさらなる特徴付けのために選択した。各選択されたハイブリドーマクローンを数回サブクローンして、安定な抗体産生細胞株を開発した。表11はC35についての確認された特異性を有するクローンを列挙する。いくつかの場合において、抗体の特異性は、後記するようにC35タンパク質ゲルのウェスタンブロットによって、または免疫組織化学染色によって確認した。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖遺伝子をクローニングし、そのうち2つが同一であると判断された3つのC35ペプチドハイブリドーマから配列決定した。
【０６２４】
（表１１）C35に対する示された特異性を有するハイブリドーマクローン
2005528914.tif 000387
※抗体1B3は配列が抗体3E10と同一である。
【０６２５】
図19は代表的なELISA実験を示す。全てのクローンは少なくとも3つの別々の場合に三連で試験した。
【０６２６】
III.ウェスタンブロット免疫検出
ウェスタンブロット免疫検出は、選択されたハイブリドーマクローンからの上澄みで行った。4ハイブリドーマ（1B3、1F2、3E10、11B10）からの抗体は、このアッセイでhC35タンパク質と特異的に反応した。これらの実験において、100ngの精製された組換えC35タンパク質または対照β-ガラクトシダーゼタンパク質を18％SDSポリアクリルアミドゲルの各レーンに負荷した。ゲルを、当業者によく知られているように、PVDF膜に移した。膜を、Tween-20および5％脱脂乾燥乳を含むトリス緩衝化生理食塩水（TBS）でブロックした。各ブロットを一次抗体としてのハイブリドーマ上澄みの種々の希釈物と共にインキュベートし、続いて、二次抗体、HRPにコンジュゲートしたヤギ抗マウスIgGと共にインキュベートし、ケミルミネセント基質ECLで検出した。抗体1B3、1F2、および3E10についての結果を図20に示す。同様の結果が11B10で得られた（図示せず）。
【０６２７】
IV.免疫組織化学
ELISAおよびウェスタンブロットデータは、これらのモノクローナル抗体が組換えC35タンパク質と反応することを示す。加えて、モノクローナル抗体1F2は、一次乳癌切片の免疫組織化学染色で利用性を有することが示された。図21は、モノクローナル抗体1F2がヒト乳癌における高レベルの内因性C35発現を検出できることを示し、正常乳房組織はほとんどまたは全く染色されない。抗体は1F2ハイブリドーマ上澄みからアフィニティー精製した。パラフィン包埋スライドをキシレンで脱パラフィンし、グレードアルコールにより再度水和させた。標的の検索は蒸気および高いpH処理を介して達成された。切片を正常血清でブロックし、アフィニティー精製された1F2（5mg/ml）と共にインキュベートし、続いて、ベクターABCユニバーサル検出キットと共にインキュベートし、DAB基質で展開した。スライドをヘマトキシリンで逆染色し、EtOH/キシレンで脱水し、カバーグラスを載せた。
【０６２８】
図21は、患者01A6からの侵入性乳腺癌腫の切片の強い染色を示し、他方、同一患者からの正常な乳房組織は陰性である。抗体での染色は可溶性C35タンパク質と競合するが、無関係なタンパク質β-ガラクトシダーゼとは競合せず（データは示さず）、これは、染色がC35に特異的であることを示す。
【０６２９】
V.モノクローナル抗体の可変領域遺伝子のクローニング
一旦個々のクローンの特異性が確認されれば、ハイブリドーマクローンおよび融合パートナーNS1の細胞ペレットを、可変領域遺伝子の後のクローニングのために-80℃でスナップ凍結させた。RNAを細胞ペレットから抽出し、InvitrogenのGeneracerキットを用いて全長cDNAを生じさせた。簡単に述べれば、RNAの5'末端のキャップを除き、次いで、Generacer5'オリゴに連結する。オリゴ-dTプライマーおよび逆転写酵素を用いて逆ストランドcDNAを生じさせる。前記5'プライマー、およびIgG1定常領域における保存された配列から設計された3'プライマーとして遺伝子レーサーオリゴを用いるPCRによって、二本鎖cDNAを増幅させた。PCR産物をクローニングし、配列決定した。融合パートナーのそれと比較した場合にユニークな配列を有するクローンを同定した。前記配列をNCBIデータベースのIgBLASTに提出して、可変領域フレームワークおよび相補的な決定領域（CDR）をマッピングした。これらのV-遺伝子がC35に特異的であることを確認するために、これらの配列をコードする組換え抗体を生じさせ、インビトロで発現させ、ELISAおよびウェスタンによって分析した（データは示さず）。
【０６３０】
2つのユニークなモノクローナル抗体V-遺伝子の配列を以下に示す。クローン1F2および1E11は同一のV-遺伝子を有する。太線はCDR領域を示す。下線はフレームワーク領域を示す。
【０６３１】
1E11/1F2V-遺伝子:
2005528914.tif 000388
3E10V-遺伝子:
2005528914.tif 000389
【０６３２】
実施例11
正常な乳房上皮細胞についてのオンコジーンであるC35
C35は、本発明者らが、ヒト乳癌および膀胱癌の大きな割合において過剰発現されることを以前に示した未知の機能の遺伝子である。C35に対する抗体はインビトロでC35陽性腫瘍細胞の増殖を阻害する。これは、C35遺伝子産物が腫瘍細胞膜上でシグナル変換で役割を演じることを示唆し、C35がオンコジーンである確率を生起させる。軟寒天におけるコロニーの増殖は足場依存性（正常細胞からの腫瘍トランスフォーメーションを受けた細胞を区別する特性）の認められた尺度である。C35のオンコジーン活性をアッセイするために、不滅化非腫瘍形成性乳房上皮細胞（H16N2）の系列を、全長C35遺伝子についてのpTag.hC35組換え体で、空のpTagベクター単独（pCMV-タグ哺乳動物発現ベクター、Stratagene Corporation,LaJolla,CA）で、または既知のオンコジーンであるrasでトランスフェクトした。トランスフォーメーションを示す軟寒天におけるコロニーの形成を強化し、21-MT1乳房腫瘍細胞と比較した（以下の表12参照）。結果は、C35でのトランスフェクションに続いて形成された軟寒天コロニーの数の10倍増加を示す。これは、rasでのトランスフェクションに続いて形成されたコロニーの頻度、または21-MT1腫瘍系が軟寒天で平板培養された場合の結果に匹敵する。
【０６３３】
形質転換されたコロニーを軟寒天から拾い、それを24ウェルプレート中の液体培地で増殖させることを試みた。ベクター対照でのトランスフェクションに続いて回収された少数の明らかなコロニーは、液体培養で首尾よく増殖できなかった。対照的に、C35またはrasでのトランスフェクションに続いて回収されたコロニーは細胞株として首尾よく確立された。少数の軟寒天から回収された対照コロニーでさえ不全型増殖を表すようである。
【０６３４】
（表１２）C35はヒト乳房上皮細胞を形質転換する。
2005528914.tif 000390
【０６３５】
C35は腫瘍細胞の形質転換された表現型に貢献するようであるという事実は、乳癌および膀胱癌のための治療剤としてのC35-ベースの癌ワクチンまたはC35特異的抗体の潜在的利用性を増強させる。腫瘍細胞におけるC35遺伝子発現の下降調節または腫瘍表面膜におけるC35発現の下降調節による免疫侵入は、もしC35遺伝子産物が腫瘍表現型を維持するのに必要であれば、成功したC35-ベースの免疫療法に対して障害とはならない可能性が高い。
【０６３６】
実施例12
溶液中でMHC-ペプチド相互作用をモニターするための蛍光偏光
蛍光は1つの波長における入射放射線の吸収のプロセス、引き続いてのもう1つの波長における放射線の発光によって特徴付けられる。この挙動は、まず、蛍光のストークスの法則の形態でG.G.Stokes（1852）によって記載され、そこでは、彼は、蛍光（発光）は、常に、入射（励起）放射線の波長よりも大きな波長で出現すると述べた。
【０６３７】
この挙動はプランクの量子仮説を用いてA.Einstein（1905）によって首尾よく説明された。Eexcitのエネルギーを有する入射光線の量子は蛍光分子によって吸収され、そのエネルギーをEexcitまで上昇させる。これに迅速に続いて、基底状態における振動レベルのうちの1つEemissまで分子が下方移動し、光の量子の発光を伴う。
【０６３８】
小分子を標識するために蛍光色素を用いることによって、同等またはより大きなサイズのもう1つの分子へのその結合は、蛍光偏光（FP）を用いてモニターすることができる。FPは、小さな分子が大きな分子よりも速く回転するという原理に基づいて作動する。もし分子がフルオロフォアで標識されれば、この回転は、面偏光を有するフルオロフォアを励起させ、次いで、励起の面に対して平行および垂直な偏光子で発せられた光を測定して、それが励起された場合にそうであったのと同一面に依然として向くかを決定することによって測定することができる。もしフルオロフォアを小分子に標識すれば、それは励起および発光の間の時間に回転し、発せられた光は偏りが無くなる。もし標識された分子が大きな分子に結合して（その総じてのサイズを効果的に増加させるならば）、前記分子は励起および発光の間の時間に回転せず、発せられた光は偏光し、その結果、遊離および結合形態の間で偏光の変化が生じる。便宜のために、単位は通常1000mP＝Pである。
【０６３９】
HLA-A＊0201および特異的蛍光-標識ペプチドの間の会合の動態は、100μMの試験競合体ペプチドの存在下で測定された。特異的結合はYmaxにおいて平衡に到達した場合にそれがプラトーとなるまで、結合は経時的に増加する。もし加えられた試験-競合体が競合することが可能であれば、平衡は結合は低いがより速く到達する。もし系が無関係な競合体（0％）および関連競合体（100％）で較正されれば、Ymaxを用いて％阻害を計算することができる。この場合、無関係競合体はHLA-B＊2705結合（非HLA-A＊0201結合）ペプチドGRAFVTIGKであり、他方、関連競合体は既知のHLA-A＊0201結合ペプチドKLGEFYNQMMであった。Ymaxを得るためには、非線形回帰を用いて、曲線をモノ-指数会合モデルに適合させる。
【０６４０】
（配列番号:2のアミノ酸配列に基づく）以下の8つのペプチドは、関連競合体の結合の相対的阻害によって反映されるように、HLA-A＊0201に対して高い〜中程度の結合能力を有することが判明した。
2005528914.tif 000391
【０６４１】
蛍光標識HLA-B＊0702結合標準および適当な関連するおよび無関係なペプチドを使用して、可溶性HLA-B＊0702に結合するC35ペプチドで同様の分析を行って、試験ペプチドによる結合の阻害を較正した。これらの阻害の値は、同一アッセイ条件下で、MHC分子および特異的蛍光ペプチド双方の選択および濃度に敏感であることに注意されたい。しかしながら、HLA-A＊0201およびHLA-B＊0702阻害値を比較するのは意義あることではない。以下に示すように、長さが6つのC35由来ペプチド9アミノ酸は、HLA-B＊0702に対して高いまたは中程度の相対的結合親和性を有することが判明した。
2005528914.tif 000392
【０６４２】
実施例13
N末端欠失変異体および/またはC末端欠失変異体の構築
以下の一般的アプローチを用いて、N末端欠失またはC末端欠失のC35欠失変異体をクローニングし得る。一般に、約15〜25ヌクレオチドの2つのオリゴヌクレオチドプライマーを、配列番号:1のポリヌクレオチドの所望の5’位および3’位から誘導する。このプライマーの5’および3’位置を、所望のC35ポリヌクレオチド断片に基づいて決定する。開始コドンおよび終止コドンを、必要な場合、それぞれ5’プライマーおよび3’プライマーに付加して、このポリヌクレオチド断片によってコードされた、C35ポリヌクレオチド断片を発現する。好ましいC35ポリヌクレオチド断片は、本明細書の「ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの断片」の節において上記で開示された候補のMHCクラスIおよびMHCクラスII結合ペプチドをコードするポリヌクレオチド断片である。
【０６４３】
所望のベクターにおけるC35ポリヌクレオチド断片のクローニングを容易にするために制限部位を含むさらなるヌクレオチドをまた、この5’プライマーおよび3’プライマーの配列に付加し得る。このC35ポリヌクレオチド断片を、本明細書中で考察されるかまたは当技術分野で公知の、適切なPCRオリゴヌクレオチドプライマーおよび条件を用いて、ゲノムDNAから、またはcDNAクローンから増幅する。本発明のC35ポリヌクレオチド断片によってコードされるC35ポリペプチド断片は、全長ポリペプチドと同じ一般的様式で発現および精製され得るが、特定の断片と全長ポリペプチドとの間の化学的な特性および物理的な特性における差異に起因して、慣用的な改変が必要であり得る。
【０６４４】
本発明の例示であって限定ではない手段として、C35ポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを、以下のように増幅し、クローニングする：5’プライマーを生成し、これは、制限酵素部位、それに続いて、表1〜6のいずれかに挙げられるMHC結合ペプチドエピトープのN末端部分をコードするポリヌクレオチド配列とインフレームで、開始コドンを含む。相補的な3’プライマーを生成し、これは、制限酵素部位、それに続いて、表1〜6のいずれかに挙げられるC35  MHC結合ペプチドエピトープのC末端部分をコードするポリヌクレオチド配列とインフレームで、停止コドンを含む。
【０６４５】
増幅されたポリヌクレオチド断片および発現ベクターを、このプライマー中の部位を認識する制限酵素で消化する。次いで消化されたポリヌクレオチドは一緒に連結される。好ましくは、プロモーターの下流にC35ポリペプチド断片コード領域を配置する様式で、C35ポリヌクレオチド断片を、制限された発現ベクター中に挿入する。このライゲーションミックス（連結混合物）を標準的な手順および本明細書の実施例に記載の手順を用いて、コンピテントな大腸菌細胞中に形質転換する。プラスミドDNAを、耐性コロニーから単離し、そしてクローニングしたDNAの同一性を、制限分析、PCR、およびDNA配列決定によって確認する。
【０６４６】
実施例14
C35のタンパク質融合
C35ポリペプチドを、好ましくは他のタンパク質に融合する。これらの融合タンパク質を種々の適用に用い得る。例えば、His-タグ、HA-タグ、プロテインA、IgGドメイン、およびマルトース結合タンパク質へのC35ポリペプチドの融合によって精製が容易になる。（実施例5を参照のこと；また、EP  A  394，827；Trauneckerら、Nature  331：84〜86（1988）を参照のこと）。同様に、IgG-1、IgG-3およびアルブミンに対する融合によって、インビボでの半減期が延びる。C35ポリペプチドに融合された核局在化シグナルは、このタンパク質を特定の細胞下位置に標的し得るが、共有的異種二量体または同種二量体が、融合タンパク質の活性を増大または減少し得る。融合タンパク質はまた、複数の機能を有するキメラ分子を作製し得る。結局、融合タンパク質は、融合されていないタンパク質に比べて、融合したタンパク質の可溶性および/または安定性を増大し得る。上記のこのタイプの融合タンパク質の全てが、以下のプロトコールを改変することによってなされ得る。以下のプロトコールは、IgG分子へのポリペプチドの融合を概説する。
【０６４７】
要するに、IgG分子のヒトFc部分は、以下に記載される配列の5’末端および3’末端にまたがるプライマーを用いて、PCR増幅され得る。これらのプライマーはまた、発現ベクター、好ましくは哺乳動物発現ベクター中へのクローニングを容易にする、好都合の制限酵素部位を有するべきである。
【０６４８】
例えば、pC4（登録番号209646）を用いる場合、ヒトFc部分を、BamHIクローニング部位中に連結し得る。3’BamHI部位は、破壊されるべきであることに注意のこと。次に、ヒトFc部分を含むベクターを、BamHIで再度制限消化し、このベクターを直線化し、そして実施例1に記載のPCRプロトコールによって単離したC35ポリヌクレオチドを、このBamHI部位に連結する。このC35ポリヌクレオチドが、終止コドンなしにクローニングされ、そうでなければ融合タンパク質は精製されないことに注意のこと。
【０６４９】
天然に存在するシグナル配列が、分泌されたタンパク質を生成するために用いられる場合、pC4は、第二のシグナルペプチドを必要としない。あるいは、天然に存在するシグナル配列が用いられない場合、このベクターは、異種シグナル配列を含むように改変され得る。（例えば、国際公開公報第96/34891号を参照のこと）。
【０６５０】
ヒトIgG  Fc領域
2005528914.tif 000393
【０６５１】
好ましい融合産物は、MHC分子のアミノ末端へのC35ペプチドの融合物であり、この融合は、このペプチドがMHCペプチド結合グルーブ（溝）を天然に占有するような様式である。Kang，Xら、Cancer  Res．57：202〜5（1997）は、このような融合タンパク質が、特定のT細胞の刺激に特に有効であるワクチン組成物において使用され得ることを報告している。
【０６５２】
実施例15
生物学的試料におけるC35の異常なレベルを検出する方法
C35ポリペプチドは、生物学的試料において検出され得る、そしてC35のレベルの上昇および低下が検出される場合、このポリペプチドは、特定の表現型のマーカーである。検出の方法は多いので、当業者は以下のアッセイを改変して、特定のニーズに適合し得ることが理解される。
【０６５３】
例えば、抗体サンドッチELISAを用いて、試料、好ましくは生物学的試料中のC35を検出する。マイクロタータープレートのウェルを、C35に対する特定の抗体を、0.2〜10μg/mlの最終濃度で用いてコーティングする。抗体はモノクローナル抗体か、またはポリクローナル抗体のいずれかである。このウェルに対するC35の非特異的結合が低下するように、このウェルをブロックする。
【０６５４】
次いで、このコートされたウェルを、C35を含有する試料とともにRT（室温）で＞2時間インキュベートする。好ましくは、この試料の階段希釈を用いて、結果を確証（バリデート）すべきである。次いで、このプレートを生理食塩水で3回洗浄して、未結合のC35を除去する。
【０６５５】
次に、50μlの特異的な、プレート結合抗体によって認識されたものとは重複しない、C35抗原決定基を認識する、抗体-アルカリホスファターゼ結合体を、25〜400ngの濃度で添加し、そして室温で2時間インキュベートする。このプレートを、再度、脱イオン水または蒸留水で3回洗浄して未結合の結合体を除去する。
【０６５６】
75μlの4-メチルウンベリフェリルホスフェート（MUP）またはp-ニトロフェニルホスフェート（NPP）の基質溶液を、各ウェルに添加し、そして室温で1時間インキュベートする。マイクロタイタープレートリーダーによって反応を測定する。コントロール試料の階段希釈を用いて標準曲線を作成して、C35ポリペプチド濃度をX軸（対数目盛）上に、そして、Y軸上（均等目盛）上に蛍光または吸光度をプロットする。標準曲線を用いて試料中のC35の濃度を補間する。
【０６５７】
実施例16
ポリペプチドの処方
C35組成物は、個々の患者の臨床状態（特に、C35ポリペプチド単独を用いた処置の副作用）、送達部位、投与の方法、投与の計画、ならびに開業医に公知の他の因子を考慮に入れて、良好な医療実施基準（good  medical  practice）と一致した様式において、処方および投薬される。従って、本明細書中での目的のための「有効量」は、このような考慮によって、決定される。
【０６５８】
一般的な提案として、一用量あたりに非経口的に投与されるC35ポリペプチドの薬学的に有効な総量は、患者の体重の約1μg/kg/日〜10mg/kg/日の範囲であるが、上記で述べたように、これは治療上の裁量を受ける。より好ましくは、この用量は、少なくとも0.01mg/kg/日であり、そしてヒトに関して最も好ましくは、約0.01mg/kg/日と1mg/kg/日との間である。連続して投与される場合、C35は、代表的に、1日あたり1〜4回の注射によるか、または、例えば、ミニポンプを使用する連続皮下注入のいずれかにより、約1μg/kg/時間〜約50μg/kg/時間の投薬速度で投与される。静脈内バッグ溶液もまた、使用され得る。変化を観察するために必要である処置の長さ、および応答が生じるための処置後の間隔は、所望の効果に依存して変動するようである。
【０６５９】
C35を含有する薬学的組成物は、経口的に、直腸に、非経口的に、槽内に（intracistemally）、膣内に、腹腔内に、局所的に（粉末、軟膏、ゲル、ドロップまたは経皮性パッチによるように）、頬側に（bucally）、または経口スプレーもしくは鼻内スプレーとして投与され得る。「薬学的に許容される担体」とは、非毒性の固体、半固体または液状充填剤、希釈剤、カプセル化材料または任意の型の処方補助物を意味する。本明細書中で使用される場合、用語「非経口的（な）」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内（intrasternal）、皮下および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。
【０６６０】
C35はまた、持続放出系によって適切に投与される。持続放出性の組成物の適切な例としては、成形品の形態（例えば、フィルム、またはマイクロカプセル）の半透性のポリマーマトリクスが挙げられる。持続放出マトリクスとしては、ポリラクチド（米国特許第3，773，919号、EP  58，481）、L-グルタミン酸とγ-エチル-L-グルタメートとの共重合体（Sidman，Uら、Biopolymers  22：547-556（1983））、ポリ（2-ヒドロキシエチルメタクリレート）（R．Langerら、J．Biomed．Mater．Res．15：167-277（1981）およびR．Langer，Chem．Tech．12：98-105（1982））、エチレンビニルアセテート（R．Langerら）またはポリ-D-（−）-3-ヒドロキシ酪酸（EP  133，988）が挙げられる。持続放出性組成物また、リポソームに封入された（liposomally  entrapped）C35ポリペプチドを含む。C35を含むリポソームは、それ自体、公知の方法により調製される：DE3，218，121；Epsteinら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，82：3688-3692（1985）；Hwangら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，77：4030-4034（1980）；EP  52，322；EP  36，676；EP  88，046；EP  143，949；EP  142，641；日本国特許出願83-118008；米国特許第4，485，045号および同第4，544，545号；およびEP  102，324。通常、リポソームは、脂質含有量が約30molパーセントコレステロールより多い小さな（約200〜800Å）単層型であり、選択された割合は、最適な分泌ポリペプチド療法について調整される。
【０６６１】
非経口的な投与に関して、1つの態様において、C35は、一般に、薬学的に許容される担体（すなわち、使用される投薬量および濃度でレシピエントに非毒性であり、そしてこの処方の他の成分と適合性であるもの）と共に単位投薬量注入可能形態（溶液、懸濁液または乳濁液）において、所望の程度の純度でそれらをそれぞれ混合することによって処方される。例えば、処方物は、好ましくは、酸化剤およびポリペプチドに対して有害であることが公知である他の化合物を含まない。
【０６６２】
一般に、処方物は、C35を、液体担体もしくは細かく粉砕した固体担体または両方と、均一およびじかに接触させることにより調製される。次いで、必要である場合、産物は、所望の処方物へと成形される。好ましくは、この担体は、非経口的な担体であり、より好ましくは、レシピエントの血液と等張である溶液である。このような担体ビヒクルの例としては、水、生理食塩水、リンガー溶液、およびデキストロース溶液が挙げられる。非水溶性ビヒクル（例えば、不揮発性油およびオレイン酸エチル）はまた、リポソームと同様に、本明細書中で有用である。
【０６６３】
担体は、微量の添加物（例えば、等張性および化学的安定性を増強する物質）を適宜含む。このような物質は、使用される投薬量および濃度において、レシピエントに非毒性であり、そして緩衝剤（例えば、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸、および他の有機酸またはそれらの塩類）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）；低分子量（約10残基よりも小さい）のポリペプチド（例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド）；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニン）；単糖、二糖、および他の糖質（セルロースもしくはその誘導体、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、EDTA）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに/あるいは非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート、ポロキサマー（poloxamers）、またはPEG）を含む。
【０６６４】
C35は、このようなビヒクル中で、約3〜8のpHで、代表的に、約0.1mg/ml〜100mg/mlの濃度、好ましくは1〜10mg/mlの濃度で処方される。上記の賦形剤、担体、または安定化剤の特定のものの使用は、ポリペプチド塩の形成をもたらすことが理解される。
【０６６５】
治療的な投与のために使用されるC35は、無菌であり得る。無菌性は、滅菌濾過膜（例えば、0.2ミクロン膜）による濾過により容易に達成される。治療ポリペプチド組成物は、一般に、無菌（滅菌）アクセスポートを有する容器（例えば、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する点滴溶液バッグまたはバイアル）に配置される。
【０６６６】
C35ポリペプチドは、通常、単位用量容器または多用量容器（例えば、密封アンプルまたは密封バイアル）中に水溶液としてか、または再構成のための凍結乾燥した処方物として保存される。凍結乾燥した処方物の例として、10mlバイアルを、5mlの滅菌濾過した1％（w/v）水性C35ポリペプチド溶液で満たし、そして得られる混合物を凍結乾燥する。その注入溶液は、静菌注射用水を使用して、凍結乾燥したC35ポリペプチドを再構成することにより調製される。
【０６６７】
本発明はまた、本発明の薬学的組成物の1つ以上の成分で満たされた1つ以上の容器を含む薬学的パックまたはキットを提供する。薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制している政府機関により規定される形式における通告が、このような容器に伴い得る。この通告は、ヒトの投与のための製造、使用または販売の、この機関による認可を反映する。さらに、C35は、他の治療的化合物とともに使用され得る。
【０６６８】
実施例17
C35ペプチド媒介細胞溶解
種々の細胞株に対するT細胞活性を分析した。具体的には、ペプチドパルスDCで刺激した1つのヒトドナーから得られたT細胞を異なる細胞株標的と共にインキュベートした。結果を表13および14に示す。
【０６６９】
実施例8に記載したように、DCおよびパルス自家DCを用いてCD8＋細胞を刺激した。DCを、TCEP（K104〜V113）、ペプチドに含まれるシステインを保護するための還元剤と共にC35のK104〜V113ペプチド断片でパルスした。DCを、アミノ酸位置112においてアラニンまたはセリン置換を含むK104〜V113ペプチド断片（K104〜V113-AlaおよびK104〜V113-Ser）でもパルスした。DCを、アミノ酸位置112においてシステイニル化システインを含むC35のK104〜V113ペプチド断片（K104〜V113-cys-cys）でもパルスした。
【０６７０】
実験で用いた標的細胞は以下の通りであった、:HLA-A2陽性であって、低レベルのC35発現を有する正常な胸上皮細胞株（H16.A2）；HLA-A2陰性であって、高レベルのC35発現を有する乳癌細胞株（21NT）；HLA-A2陽性であって、高レベルのC35発現を有する乳癌細胞株（21NT.A2）；NK細胞による非特異的殺傷に対して感受性である細胞株（K562）；HLA-A2陽性であって、C35を発現しない頭部および首癌細胞株（PCI-13）；およびアミノ酸位置112においてセリン置換を有するC35の104〜113ペプチド断片でパルスされたPC1-13細胞株（PC1-13 K104〜V113-Ser）。
【０６７１】
細胞溶解は、実施例8に記載されたように、細胞傷害性51Cr放出アッセイで測定した。実験で用いた標的細胞からの上澄みから測定された生のクロム値を表13に示す。自然発生はCD8＋細胞を加えていない培地中でインキュベートされた標的細胞からのものである。最大値は、全ての細胞が溶解されるように、HCl中でインキュベートした標的細胞からのものである。細胞溶解データの割合は表14に示す。
【０６７２】
（表１３）T細胞ドナーSB、HLAハプロタイプ:A2、A3；B18、B44
生のクロム値
2005528914.tif 000394
【０６７３】
（表１４）T細胞ドナーSB、HLAハプロタイプ:A2、A3；B18、B44
溶解した標的細胞の割合
2005528914.tif 000395
【０６７４】
細胞傷害性51Cr放出アッセイを、前記および実施例8に記載されたC35ペプチドを用いて、インビトロ刺激体を受けた同一CD8＋細胞で反復した。前記した細胞株に加えて、アミノ酸位置112においてセリン置換を含むK104〜V113 C35ペプチド断片でパルスされた21NT.A2乳癌細胞株（21NT.A2-Ser）を用いた。また、種々のメラノーマ細胞株も標的細胞として用いた。メラノーマ細胞株1700（Mel 1700）、501（Mel 501）、およびF002（Mel F002）はHLA-A2陽性であって、C35を発現する。メラノーマ細胞株1359（Mel 1359）はHLA-A2陰性であって、C35を発現する。標的細胞に対するエフェクターの比率はこの実験では30:1であった。実験で用いたCD8＋細胞を、第4番目の刺激後12日間、IL-2で維持した。実験で用いた標的細胞からの上澄みから測定された生のクロム値を表15に示す。溶解した細胞の割合を表16に示す。
【０６７５】
（表１５）T細胞ドナーSB、HLAハプロタイプ:A2、A3；B18、B44
生のクロム値
2005528914.tif 000396
【０６７６】
（表１６）T細胞ドナーSB、HLAハプロタイプ:A2、A3；B18、B44
溶解された標的細胞の割合
2005528914.tif 000397
【０６７７】
本発明を、前述の説明および実施例に詳細に記載された以外の方法で実施し得ることは、明らかである。本発明の多数の改変およびバリエーションが、上記の教示を考慮して可能であり、従って、それは、添付の特許請求の範囲の範囲内にあり、本発明は、特に記載された以外の方法で実施され得る。
【０６７８】
発明の背景、詳細な説明、実施例、および配列表において引用された各文書の全開示（特許、特許出願、学術文献、要約、実験マニュアル、書籍または他の開示を含む）は、本明細書中に参考として援用される。
【０６７９】
本発明を、前述の説明および実施例に詳細に記載された以外の方法で実施し得ることは、明らかである。本発明の多数の改変およびバリエーションが、上記の教示を考慮して可能であり、従って、それは、添付の特許請求の範囲の範囲内にあり、本発明は、特に記載された以外の方法で実施され得る。
【０６８０】
発明の背景、詳細な説明、実施例、および配列表において引用された各文書の全開示（特許、特許出願、学術文献、要約、実験マニュアル、書籍または他の開示を含む）は、本明細書中に参考として援用される。
【０６８１】
2005528914.tif 000398
2005528914.tif 000399
【図面の簡単な説明】
【０６８２】
【図１】図1Aは、C35のDNAコード配列（配列番号:1）を示す。推定ATG開始コドンの直ぐ上流の配列を小文字で示し、そしてこれは、Kozak,M.、J.Biol.Chem.266（30）：19867〜19870（1991）によって記載される、予期される特徴に一致する。図1Bは、C35の推定アミノ酸配列（配列番号:2）を示す。
【図２】図2A：C35は、乳癌細胞株において過剰発現される。上部パネル：3週齢のヒト胸腺、患者21由来の正常乳房上皮細胞株H16N2、および同じ患者21由来の1年離れた原発性小節または転移性小節から誘導された4つの乳癌細胞株（21NT、21PT、21MT1および21MT2）由来の300ngのポリA-RNAを、1％アガロース/ホルムアルデヒドゲルで分離し、そしてGeneScreen膜に転写した。このブロットを32P標識C35プローブでハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションを、15時間フィルムにブロットを曝露することによって検出した。下部パネル：RNA充填量を定量するために、同じブロットをストリッピングし、そしてグリセルアルデヒド-3リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）についての32P標識プローブで再ハイブリダイズした。それぞれの試料について、C35シグナルをGAPDHシグナルで標準化した。数値は、それぞれの試料においてH16N2と比較した、C35の発現の倍数を示す。図2B：C35は、正常細胞において低いレベルで発現される。それぞれの示された成体正常組織由来の1μgのポリA-RNAを含むブロット（Clontech）を、32P標識C35プローブでハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションを、15時間（上部パネル）または96時間（下部パネル）フィルムにブロットを曝露することによって検出した。図2C：C35は、原発性乳癌において過剰発現される。3つの原性浸潤乳管癌腫（ductal  mammary  carcinoma）、T1、T2、T3および1つの正常乳房上皮、N由来の2μgのポリA  RNAを含むブロット（Invitrogen）を、32P標識C35プローブでハイブリダイズした。充填量を標準化するために、32P標識β-アクチンプローブをハイブリダイゼーションミックス中に含めた。ハイブリダイゼーションを、6時間フィルムにブロットを曝露することによって検出した。数値は、それぞれの試料において正常乳房上皮と比較した、C35の発現の倍数を示す。
【図３】乳癌細胞株におけるC35の発現を示す。C35は、異なる乳癌細胞株において、過剰発現される。上部パネル：BT474（ATCC  HYB-20、乳管癌腫）、SKBR3（ATCC  HTB-30、乳房腺癌）、T47D（ATCC  HTB-133、乳管癌腫）、患者21由来の正常乳房上皮細胞株H16N2、および同じ患者21由来の原発性腫瘍小節由来の21-NT乳癌細胞株由来の、300ngのポリA  RNAを、1％アガロース/ホルムアルデヒドゲルで分離し、そしてGeneScreen膜に転写した。このブロットを32P標識C35プローブでハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションを、15時間フィルムにブロットを曝露することによって検出した。下部パネル：RNA充填量を定量するために、同じブロットをストリッピングし、そしてβ-アクチンについての32P標識プローブで再ハイブリダイズした。それぞれの試料について、C35シグナルをアクチンシグナルで標準化した。数値は、それぞれの試料においてH16N2と比較した、C35の発現の倍数を示す。
【図４】図4A〜4Cは、フローサイトメトリーによって検出したC35タンパク質の表面発現を示す。1×105乳癌細胞を、ヒトC35をコードするレトロウイルスで形質転換された系統1マウス腫瘍細胞に対してBALB/cマウスにおいて惹起された3.5μlの抗血清またはコントロール（採血前BALB/c血清）を用いて染色した。30分間のインキュベーションの後、細胞を2回、染色緩衝液（PAB）を用いて洗浄し、そしてFITC-ヤギ抗マウスIgG（1μg/試料）を用いて30分間インキュベートした。試料を洗浄し、そしてEPICS  Eliteフローサイトメーターで分析した。図4A：21NT。図4B：SKBR3。図4C：MDA-MB-231。これらの3つの乳癌株を選択して、高い、中間、そして低いレベルのC35  RNAを発現する腫瘍細胞を、ノーザンブロットにおいて示した（図3を参照のこと）。省略：nms、ns；正常マウス血清；C35；C35免疫血清。
【図５】図5Aおよび5Bは、CML選択された組換えワクシニアcDNAクローンによる腫瘍特異的CTLの刺激を示す。図5A：CML選択されたワクシニアクローンを、B/C．Nの感染後にその能力についてアッセイし、腫瘍特異的CTLがインターフェロンγを分泌することを刺激した。サイトカインの量をELISAによって測定し、そしてOD490として示す（14）。1.4のOD490は、4ng/mlのIFNgとおよそ等しく、そして0.65のOD490は、1ng/mlのIFNgとおよそ等しい。図5B：CML選択されたクローンを、宿主細胞に感作して、腫瘍特異的CTLによって溶解させた。6ウェルプレートのウェル中のB/C．Nの単層を、moi＝1の示されたワクシニアウイルスクローンで感染させた。感染の14時間後、感染した細胞を、51Crで標識した示したコントロールと共に収集した。標的細胞を、腫瘍特異的細胞傷害性Tリンパ細胞の示した割合で、4時間37℃でインキュベートし、そして特異的溶解の割合を決定した（15）。この実験を少なくとも3回繰り返し、同様の結果を伴なった。
【図６】図6Aおよび6B：腫瘍抗原は、リボソームタンパク質L3遺伝子によってコードされる。45位〜56位のアミノ酸由来のH2.16およびrpL3の配列。図6A：cDNAクローンrpL3のアミノ酸（1文字コード）およびヌクレオチド配列（GenBank登録番号Y00225）。図6B：H2.16腫瘍cDNAのC170Tでの単一ヌクレオチド置換は、公開されたL3リボソーム対立遺伝子と比較して単に配列の変化である。この置換は、タンパク質におけるT54Iアミノ酸置換を生じる。
【図７】図7Aおよび7Bは、腫瘍特異的CTLによって認識されるペプチドエピトープの同定を示す。図7A：腫瘍特異的CTLによって認識されるペプチドを同定するためのCMLアッセイ。標的細胞を51Crで標識した（15）。51Crインキュベーションの間、B/C．N細胞の試料を1μMのペプチドL348〜56（I54）、100μMのL348-56（T54）または100μMのペプチドL345-54（I54）とインキュベートした。標的細胞を腫瘍特異的細胞傷害性Tリンパ球の示した割合で、4時間37℃でインキュベートし、そして特異的な溶解の割合を決定した。この実験を少なくとも3回繰り返し、類似の結果を伴なった。図7B：ペプチドL348-56（I54）の滴定。標的細胞を、51Crで標識した。51Crインキュベーションの間に、B/C．N細胞の試料を、ペプチドを加えないか（D）、または示した濃度（1μM、10nM、1nM）のL348-56（I54）（黒四角）を加えてかのいずれかでインキュベートし、BCA39細胞を陽性コントロールとして含んだ（黒三角）。標的細胞を、腫瘍特異的細胞傷害性リンパ球の示した割合で、4時間37℃でインキュベートし、そして特異的な溶解の割合を決定した。この実験を2回繰り返し、同様の結果を伴なった。
【図８】図8A〜8Cは、それぞれの細胞株によって発現されるL3の分析を示す。図8A：公開されたrpL3およびH2.16のSau3AI地図。上に示すのは、公開されたリボソームタンパク質L3遺伝子（頂部）、およびH2.16（下部）についてのSau3AI制限地図である。公開されたL3配列についてのcDNA消化は、200、355、348、289および84bpの断片を産生する。H2.16についてのパターンは、C170Tによって引き起こされる168位での超過のSauAi部位以外は、同一である。これは、200bp断片の代わりに、168bp消化産物を生じる。図8B：BCA腫瘍は両方のL3対立遺伝子を発現する。それぞれの細胞株またはvH2.16から産生したRT-PCR産物を、L3特異的プライマーを使用して生成し、次いでSau3AIで消化し、そして3％アガロースゲルに、2時間80ボルトで分離した。図8C：免疫原性L3対立遺伝子は、B/C．N、BCB13および胸腺において大きく減少したレベルで発現した。それぞれ同定された試料由来のL3特異的RT-PCR産物を、32P末端標識5プライムPCRプライマーを使用して生成した。それぞれの試料についてのRNAがcDNAの合成無しにPCRの鋳型として使用される場合、PCR産物は、観察されず、これはゲノムDNAで夾雑された試料がないことを示す。このPCR産物を、ゲル精製して純度を確実にし、Sau3AIで消化し、そして3％アガロースゲルで15時間60ボルトで分離した。鋳型を添加しないコントールPCR試料において、PCR産物は観察されなかった。この結果を合計3回再現した。
【図９】図9A〜9Cは、iL3での免疫が免疫防御的であることを示す。図9A：H2.16での免疫は、腫瘍特異的CTLを誘導する。Balb/cマウス（2匹/群）を5×106pfuのvH2.16またはコントロールベクターv7.5/tkでの皮下注射により免疫した。7日間後に、脾細胞を採取し、そしてペプチドL348-56（I54）で再刺激した（26）。2回目に再刺激して5日間後に、図11に記載のように、リンパ球をクロム放出アッセイにおいて試験した。L348-56（I54）ペプチドを1μM濃度で用い、そしてL348-56（T54）ペプチドを100μM濃度で用いた。免疫実験を繰り返すと、同様の結果が観察された。図9Bおよび9C：雌性Balb/cByJマウスを示されたように免疫した（27）。このマウスを、200，000の生存可能なBCA34腫瘍細胞を腹壁にSC注射することによりチャレンジした。データは、チャレンジして35日後のものである。これらのデータは、4回の独立した実験の代表である。
【図１０】図10Aは、翻訳を伴ったC35コード配列である；5’および3’非翻訳領域を小文字で示す。3’末端における推定プレニル化部位（CVIL）をボックスで囲む。図10Bは、第17染色体上のC35遺伝子のゲノムアラインメントである。
【図１１】図11Aおよび11Bは、乳房癌腫におけるC35発現である。C35をランダムプライミング反応で32Pを用いて標識し、106cpm/mlでノーザンブロットにハイブリダイズさせた。各ブロットを細片にし、GAPDHまたはβ-アクチンで再プローブして、mRNAの量（load）を正規化した。数字は、GAPDH/β-アクチンに対して正規化したデンシトメトリー比を示す。値1を、正常細胞株H16N2に割り当て、全ての値は正常細胞株における発現のレベルとの相対である。図11A：乳房上皮細胞株におけるC35発現である。図11B：原発性乳房組織/腫瘍におけるC35発現である。300ngのmRNAを0.8％アルカリ性アガロースゲル上で電気泳動し、次いで、Genescreen  Plusにブロットした（Bの最も左のパネルに、3つの原発性腫瘍および1つの正常組織コントロール（Real  Tumor  Blots，Invitrogen）に由来する1μg  mRNAをロードしたことを除く）。同様の曝露を、全てのブロットについて示す。
【図１２】膀胱癌腫におけるC35発現である。C35をランダムプライミング反応で32Pを用いて標識し、106cpm/mlで腫瘍および正常RNAのノーザンブロットにハイブリダイズさせた。このブロットを細片にし、β-アクチンで再プローブして、mRNAの量を正規化した。数字は、β-アクチンに対して正規化したデンシトメトリー比を示す。値は、正常膀胱試料における発現のレベルとの相対である。300ngのmRNAを、0.8％アルカリ性アガロースゲル上で電気泳動し、次いで、Genescreen  Plusにブロットした。
【図１３】図13Aおよび13Bは、抗C35抗体を用いたFACS分析である。図13A：乳房細胞株を、C35組換えレトロウイルスに感染させたLine1細胞で免疫したマウスに由来する血清（上部パネル）、および2C3精製モノクローナル抗体またはアイソタイプコントロール（下部パネル）で染色した。図13B：膀胱細胞株を2C3精製モノクローナル抗体またはアイソタイプコントロールで染色した。
【図１４】図14Aおよび14Bは、2C3抗体の存在下での腫瘍増殖の阻害を示す。21NT乳房腫瘍細胞（図14A）またはH16N2正常乳房上皮細胞（図14B）を、示された濃度の2C3抗C35モノクローナル抗体または非特異的アイソタイプコントロール抗体とともにインキュベートした。細胞増殖を、抗体の存在下および非存在下で72時間インキュベートした後に、XTTアッセイにより測定した。
【図１５】図15Aおよび15Bは、C35発現樹状細胞で刺激したCTLが、C35＋乳房腫瘍細胞株（21NT）および膀胱腫瘍細胞株（ppT11A3）を特異的に溶解し、正常乳房（MBC）、不死化した非腫瘍形成性乳房細胞株（H16N2）および膀胱細胞株（SV-HUC）またはNK感受性細胞株（K562）に対しては、最小の活性であることを示す。図15A：T細胞株4を正常ヒトPBLから生成した。図15B：T細胞クローン10G3を、C35特異的活性について株4から選択した。標的細胞株MEC、ppT11A3およびSV-HUCは、天然にHLA-A2陽性である。標的細胞株21NTおよびH16N2を、HLA-A2でトランスフェクト（transect）し、必要なMHC拘束エレメントを提供した。
【図１６】図16Aおよび16Bは、標的での刺激に際するT細胞クローン10G3からのサイトカイン放出を示す。図16A：IFN-γ分泌。乳房および膀胱標的細胞株を、HLA-A2およびC35腫瘍抗原、C35のアミノ末端の50アミノ酸断片（C35-50aa）または無関係のマウスL3リボソームタンパク質の発現の存在および非存在により区別した。各マーカーは、内因的に発現されたか、またはHLA-A2.1構築物（pSV2.A2）、もしくはC35（vv.C35、vv.C35-50aa）、L3（vv.L3）もしくはHLA-A2（vv.A2）の組換えワクシニアの感染により導入されたかのいずれかであった。図16B：TNF-α分泌。乳房および膀胱標的細胞株を、HLA-A2およびC35腫瘍抗原、C35のアミノ末端の50アミノ酸断片（C35-50aa）または無関係のマウスL3リボソームタンパク質の発現の存在および非存在により区別した。各マーカーは、内因的に発現されたか、またはHLA-A2.1構築物（pSV2.A2）、もしくはC35（vv.C35、vv.C35-50aa）、L3（vvL3）もしくはHLA-A2（vv.A2）の組換えワクシニアの感染により導入されたかのいずれかであった。
【図１７】図17Aおよび17Bは、特異的移植抗原に対するマウスT細胞の反応性をブロックするにおける抗CD40リガンド抗体（抗CD154）の効果。DBA/2（H-2d）マウスを107C57B1/6（H-2b）脾臓細胞で腹腔内免疫化し、加えて、免疫化の時点、および2日後の双方で投与される生理食塩水または0.5mgモノクローナル抗CD40リガンド抗体（MR1、抗CD154、Pharmingen 09021D）いずれかを注射した。免疫化の後第10日に、これらのマウスからの脾臓細胞を摘出し、照射された（20 Gy）C57B1/6または対照同種異系C3H（H-2k）脾臓細胞いずれかでインビトロにて刺激した。インビトロ刺激から5日後に、C57B1/6およびC3H特異的細胞溶解応答を、特異的標識標的、この場合、同系間脾臓細胞溶解物でパルスされたC3HまたはC57B1/6樹状細胞いずれかからの51Cr放出アッセイによって、種々のエフェクター:標的比率にてアッセイした。生理食塩水および抗CD154処理マウス双方において、対照C3Hアロ抗原に対して有意な細胞傷害性が誘導され（図17A）、他方、生理食塩水処理マウスにおいてC57B1/6に対する細胞傷害性応答が誘導されたが、抗CD154処理マウスでは誘導されなかった（図17B）。
【図１８】天然21NT-A2腫瘍、異なるC35ペプチドでパルスされたH16N2-A2、またはC35組換え体ワクシニアウィルスで感染させたH16N2-A2での刺激後における系4によるGM-CSF産生。T細胞株4は、各々、自家樹状細胞（DC）、次いで、C35組換え体ワクシニアウィルスで感染させた自家単球で12日間正常ドナT細胞を刺激することによって生じさせた。週刺激はアロPBL、およびHLA-A2/Kbでトランスフェクトされた21NT腫瘍（21NT-A2）で継続した。ここに記載する実験では、ウェル当たり1ug/mlのC35ペプチド9〜17、77〜85、104〜112、または105〜113でパルスされた5×104照射（2500ラド）H16N2-A2/Kbで106T細胞にて、またはウェル当たりAIM-V/5％ヒトAB血清中のIL2（20U/ml）およびIL-7（10ng/ml）で105照射アロPBLにてインビトロでT細胞を再度刺激した。2回の7日間の刺激の後T細胞を、1ug/mlのペプチドでパルスされた、またはパルスされない、あるいはMOI＝1にてvvC35またはvv野生型で感染させた異なるスティミュレーターでのインキュベーションに続き、GM-CSF分泌の誘導につき試験したT細胞（5000）を、三連にて、AIM-V/5％ヒトAB血清中、25000の種々のスティミュレーター細胞と共に一晩インキュベートした。
【図１９】ハイブリドーマ上澄みのC35-特異的ELISA。C35に対する特異性が示されたハイブリドーマクローンが関連する代表的ELISA実験の結果。
【図２０】C35特異的抗体でのウェスタンブロット。選択されたハイブリドーマクローンからの上澄みで、ウェスタンブロット免疫検出を行った。4つのハイブリドーマ（1B3、1F2、3E10、11B10）からの抗体はこのアッセイでhC35タンパク質と特異的に反応した。抗体1B3、1F2、および3E10についての結果を示す。
【図２１】1F2抗体での免疫組織化学。モノクローナル抗体1F2は、一次乳癌切片の免疫組織化学染色についての利用性を有することが示された。この図面は、モノクローナル抗体1F2がヒト乳癌において高レベルの内因性C35発現を検出できることを示し、正常な乳房組織はほとんどまたは全く染色されない。具体的には、この図面は、患者01A6からの浸入性胸腺癌腫の切片の強い染色を示し、他方、同一患者からの正常な乳房組織は陰性である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ−１】
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【図１３Ａ−２】
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【図１３Ａ−３】
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【図１３Ａ−４】
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【図１３Ｂ−１】
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【図１３Ｂ−２】
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【図１３Ｂ−３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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