(57)【要約】本発明は、新規SNPsを含むIFNα−21遺伝子のヌクレオチド配列由来の新規ポリヌクレオチド、及び本発明のSNPの少なくとも1つにより引き起こされる少なくとも1つの変異を含む天然の野生型IFNα−21タンパク質由来の新規ポリペプチド、並びにそれらの治療のための使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の：
a)  ヌクレオチド配列、配列番号1、
ただし、上記ヌクレオチド配列は、c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g及びt1265cから成る群から選ばれる少なくとも1つのSNPを含む；又は
b)  a)によるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
の全部又は一部を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号1の第670〜第1239ヌクレオチドを含む、請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、
ただし、上記ヌクレオチド配列は、c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a及びa1204gから成る群から選ばれる少なくとも1つのコーディングSNPを含む、上記単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドが、少なくとも10のヌクレオチドから構成される、請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
アミノ酸配列、配列番号2の全部又は一部を含み、かつ、A42G、Q102K、Q114H、V127D、C162stop及びK179Eから成る群から選ばれる少なくとも1つのコーディングSNPをもつポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
アミノ酸配列、配列番号2の全部又は一部を含み、かつ、2つのコーディングSNPs、Q114H及びV127Dをもつポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
アミノ酸配列、配列番号2の全部又は一部を含み、かつ、コーディングSNP、K179Eをもつポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
ヌクレオチド配列、配列番号1に80〜100%の同一性をもつポリヌクレオチドの全部又は一部の同定又は増幅方法であって、適当なハイブリダイゼーション条件下、請求項1に記載のポリヌクレオチドと、上記ポリヌクレオチドとをハイブリダイズさせることを含む上記方法。
【請求項８】
ヌクレオチド配列、配列番号1に80〜100%の同一性をもつポリヌクレオチドの全部又は一部の遺伝子型解析方法であって、患者又は患者集団のゲノムDNA内の着目の領域を増幅し、そして794位、973位、1011位、1049位、1155位、1204位及び1265位から成る群から選ばれるヌクレオチド配列、配列番号1内の少なくとも1ヶ所の対立遺伝子を測定するステップを含む、上記遺伝子型解析方法。
【請求項９】
前記遺伝子型解析がミニ配列決定法によって実行される、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
請求項1に記載のポリヌクレオチドを含む組み換えベクター。
【請求項１１】
請求項10に記載の組み換えベクターを含む宿主細胞。
【請求項１２】
ポリペプチドの分離方法であって、培地中で請求項11に記載の宿主細胞を培養し、上記培地から上記ポリペプチドを分離することを含む上記方法。
【請求項１３】
請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド。
【請求項１４】
アミノ酸配列、配列番号2の全部又は一部を含み、かつ、A42G、Q102K、Q114H、V127D、C162stop及びK179Eから成る群から選ばれる少なくとも1つのコーディングSNPをもつ単離されたポリペプチド。
【請求項１５】
アミノ酸配列、配列番号2の第24〜第189アミノ酸を含み、かつ、A42G、Q102K、Q114H、V127D、C162stop及びK179Eから成る群から選ばれる少なくとも1つのコーディングSNPをもつ、請求項13に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
アミノ酸配列、配列番号2の第24〜第189アミノ酸を含み、かつ、2つのコーディングSNPs Q114H及びV127Dをもつ、請求項13に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
アミノ酸配列、配列番号2の第24〜第189アミノ酸を含み、かつ、コーディングSNP K179Eをもつ、請求項13に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
免疫特異的抗体の獲得方法であって、請求項13に記載のポリペプチドにより動物を免疫し、そして上記抗体を上記動物から回収することを含む上記方法。
【請求項１９】
請求項18に記載の方法によって生じる免疫特異的抗体。
【請求項２０】
アミノ酸配列、配列番号2の全部又は一部を含み、かつ、A42G、Q102K、Q114H、V127D、C162stop及びK179Eから成る群から選ばれる少なくとも1つのコーディングSNPをもつ単離されたポリペプチドの活性を活性化又は抑制する、1以上の試験すべき化合物の中の作用物質の同定方法であって、以下のステップ：
a)  請求項10に記載の組み換えベクターを含む宿主細胞を準備し；
b)  上記宿主細胞と、上記試験すべき化合物を接触させ；そして
c)  上記ポリペプチドの活性に対する活性化又は抑制効果を測定し、それにより上記活性化又は抑制作用物質を同定する、
を含む上記方法。
【請求項２１】
アミノ酸配列、配列番号2の全部又は一部を含み、かつ、A42G、Q102K、Q114H、V127D、C162stop及びK179Eから成る群から選ばれる少なくとも1つのコーディングSNPをもつ単離されたポリペプチドによりその活性が増強又は抑制される、1以上の試験すべき化合物の中の作用物質の同定方法であって、以下のステップ：
a)  請求項10に記載の組み換えベクターを含む宿主細胞を準備し；
b)  上記宿主細胞と、上記試験すべき化合物を接触させ；そして
c)  上記作用物質の活性に対する増強又は抑制効果を測定し、それにより上記増強又は抑制される作用物質を同定する、
を含む上記方法。
【請求項２２】
患者の生物学的特徴の分析方法であって、以下のステップ：
a)  患者のゲノム内の請求項1に記載のポリヌクレオチドの存在又は不存在を測定すること；
b)  患者の請求項1に記載のポリヌクレオチドの発現レベルを測定すること；
c)  患者の請求項13に記載のポリペプチドの存在又は不存在を測定すること；
d)  患者の請求項13に記載のポリペプチドの濃度を測定すること；又は
e)  患者の請求項13に記載のポリペプチドの機能性を測定すること、
の少なくとも1つを実施することを含む上記方法。
【請求項２３】
ヌクレオチド配列、配列番号1の全部又は一部を含む単離されたポリヌクレオチド(ただし、上記ヌクレオチド配列は、c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g及びt1265cから成る群から選ばれる少なくとも1つのSNPを含む)又は上記ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列；上記ポリヌクレオチドを含む組み換えベクター；上記組み換えベクターを含む宿主細胞；アミノ酸配列、配列番号2の全部又は一部を含み、かつ、A42G、Q102K、Q114H、V127D、C162stop及びK179Eから成る群から選ばれる少なくとも1つのコーディングSNPをもつ単離された単離されたポリペプチド；上記ポリペプチドに特異的な抗体から成る群から選ばれる1以上の化合物を含む治療薬。
【請求項２４】
癌及び腫瘍、感染症、免疫学的及び自己免疫学的に関連する病気、心血管系の病気、代謝系の病気、中枢神経系の病気、並びに化学療法治療に関係した障害から成る群から選ばれる病気の個体における予防又は治療方法であって、治療として有効量の請求項23に記載の作用物質及び医薬として許容される賦形剤を上記個体に投与することを含む上記方法。
【請求項２５】
前記癌及び腫瘍が、転移性腎癌、メラノーマ、濾胞性リンパ腫及び皮膚T細胞型リンパ腫を含むリンパ腫、毛様細胞性白血病、慢性リンパ球性白血病及び慢性骨髄性白血病を含む白血病、肝臓、頸部、頭部及び腎臓の癌、多発性骨髄腫、カルチノイド腫瘍、並びにAIDSの場合のカポジ肉腫を含む、免疫欠陥に続いて現れる腫瘍を含む、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
前記代謝系の病気が、肥満症のような免疫に関係しない病気を含む、請求項24に記載の方法。
【請求項２７】
前記感染症が、慢性B及びC型肝炎、並びにHIV/AIDSを含むウイルス感染、感染性肺炎、そして性病、例えば陰部疣贅を含む、請求項24に記載の方法。
【請求項２８】
前記中枢神経系の病気が、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症、及びうつ病を含む、請求項24に記載の方法。
【請求項２９】
前記の免疫学的及び自己免疫学的に関連する病気が、組織又は臓器移植片の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病、並びに潰瘍性大腸炎を含む、請求項24に記載の方法。
【請求項３０】
外傷の治癒、透析患者の貧血、及び/又は骨粗鬆症から成る群から選ばれる病気の個体における予防又は治療方法であって、治療として有効量の請求項23に記載の作用物質及び医薬として許容される賦形剤を上記個体に投与することを含む上記方法。
【請求項３１】
患者の請求項13に記載のポリペプチドの活性を増加又は減少させる方法であって、治療として有効量の：ヌクレオチド配列、配列番号1の全部又は一部を含む単離されたポリヌクレオチド(ただし、上記ヌクレオチド配列は、c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g及びt1265cから成る群から選ばれる少なくとも1つのSNPを含む)又は上記ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列；上記ポリヌクレオチドを含む組み換えベクター；上記組み換えベクターを含む宿主細胞、ここで、上記宿主細胞は上記治療すべき患者から得られる；アミノ酸配列、配列番号2の全部又は一部を含み、かつ、A42G、Q102K、Q114H、V127D、C162stop及びK179Eから成る群から選ばれる少なくとも1つのコーディングSNPをもつ単離されたポリペプチド；上記ポリペプチドに特異的な抗体；並びに医薬として許容される賦形剤の1以上を投与することを含む上記方法。
【請求項３２】
個体のゲノム内における請求項1に記載のポリヌクレオチドの存在に関係した上記個体の障害又は病気の予防又は治療方法であって、治療として有効量の：ヌクレオチド配列、配列番号1の全部又は一部を含み、かつ、c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g及びt1265cから成る群から選ばれる少なくとも1つのSNPをもつ単離されたポリヌクレオチド又は上記ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列；上記ポリヌクレオチドの1つを含む組み換えベクター；上記組み換えベクターを含む宿主細胞；アミノ酸配列、配列番号2の全部又は一部を含み、かつ、A42G、Q102K、Q114H、V127D、C162stop及びK179Eから成る群から選ばれる少なくとも1つのコーディングSNPをもつ単離されたポリペプチド；上記ポリペプチドの1つに特異的な抗体；並びに医薬として許容される賦形剤の1以上を投与することを含む上記方法。
【請求項３３】
IFNα−21遺伝子内のc794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g及びt1265cから成る群から選ばれる少なくとも1つのSNPと、病気又は病気に対する耐性の間の統計的に関連性のある組み合わせの決定方法であって、以下の：
a)  個体群を遺伝子型解析し；
b)  上記個体群内の病気又は病気に対する耐性の分布を測定し；
c)  上記遺伝子型データを病気又は病気に対する耐性の分布と比較し；そして
d)  統計的に関連性のある組み合わせについて上記比較を分析する、
を含む上記方法。
【請求項３４】
IFNα−21遺伝子内のc794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g及びt1265cから成る群から選ばれる少なくとも1のSNPを検出することを含む、病気又は病気に対する耐性の診断又は予後徴候の決定方法。
【請求項３５】
Q114H/V127D変異IFNα−21遺伝子産物の活性と実質的に類似した生物学的活性を有する、試験すべき1以上の化合物の中の化合物の同定方法であって、以下のステップ：
a)  上記化合物の生物学的活性、例えば樹状細胞の成熟、CD4＋又はCD8＋ Tリンパ球によるサイトカイン放出、単球によるサイトカイン放出、インビトロ又はインビボにおける抗ウイルス活性、Daudiバーキット細胞系に対する細胞抗増殖性活性、TF−1細胞系に対する細胞抗増殖活性を測定し、
b)  上記化合物のステップa)で測定された活性と、Q114H/V127D変異IFNα−21遺伝子産物の活性を比較し；そして
c)  ステップb)で実行された比較を基準として、上記化合物が、Q114H/V127D変異IFNα−21遺伝子産物のそれと比較して実質的に類似した活性を有するかどうかを決定する、
を含む上記方法。
【請求項３６】
前記試験すべき化合物が、配列番号2のポリペプチド、又はアミノ酸配列、配列番号2の24位と189位の間に包含されるアミノ酸を含むアミノ酸配列のそれと同じ3次元構造をもつように、合成ペプチド・コンビナトリアル・ライブラリー、高性能スクリーニングから同定されるか、あるいはコンピューターを用いたドラッグデザインによって設計される、ただし、上記アミノ酸配列はQ114H及びV127D SNPsを含む、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
請求項35に記載の方法によって同定された化合物。
【請求項３８】
K179E変異IFNα−21遺伝子産物の活性と実質的に類似した生物学的活性を有する、試験すべき1以上の化合物の中の化合物の同定方法であって、以下のステップ：
a)  上記化合物の生物学的活性、例えば樹状細胞の成熟、CD4＋又はCD8＋ Tリンパ球によるサイトカイン放出、単球によるサイトカイン放出、インビトロ又はインビボにおける抗ウイルス活性、Daudiバーキット細胞系に対する細胞抗増殖性活性、TF−1細胞系に対する細胞抗増殖活性を測定し、
b)  上記化合物のステップa)で測定された活性と、K179E変異IFNα−21遺伝子産物の活性を比較し；そして
c)  ステップb)で実行された比較を基準として、上記化合物が、K179E変異IFNα−21遺伝子産物のそれと比較して実質的に類似した活性を有するかどうかを決定する、
を含む上記方法。
【請求項３９】
前記試験すべき化合物が、配列番号2のポリペプチド、又はアミノ酸配列、配列番号2の24位と189位の間に包含されるアミノ酸を含むアミノ酸配列のそれと同じ3次元構造をもつように、合成ペプチド・コンビナトリアル・ライブラリー、高性能スクリーニングから同定されるか、あるいはコンピューターを用いたドラッグデザインによって設計される、ただし、上記アミノ酸配列はK179E SNPを含む、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
請求項38に記載の方法によって同定された化合物。
【請求項４１】
癌及び腫瘍、感染症、免疫学的及び自己免疫学的に関連する病気、心血管系の病気、代謝系の病気、中枢神経系の病気、並びに化学療法治療に関係した障害から成る群から選ばれる病気の個体における予防又は治療方法であって、治療として有効量の請求項37又は40に記載の作用物質及び医薬として許容される賦形剤を上記個体に投与することを含む上記方法。
【請求項４２】
前記癌及び腫瘍が、転移性腎癌、メラノーマ、濾胞性リンパ腫及び皮膚T細胞型リンパ腫を含むリンパ腫、毛様細胞性白血病、慢性リンパ球性白血病及び慢性骨髄性白血病を含む白血病、肝臓、頸部、頭部及び腎臓の癌、多発性骨髄腫、カルチノイド腫瘍、並びにAIDSの場合のカポジ肉腫を含む、免疫欠陥に続いて現れる腫瘍を含む、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
前記感染症が、慢性B及びC型肝炎、並びにHIV/AIDSを含むウイルス感染、感染性肺炎、そして性病、例えば陰部疣贅を含む、請求項41に記載の方法。
【請求項４４】
前記の免疫学的及び自己免疫学的に関連する病気が、組織又は臓器移植片の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病、並びに潰瘍性大腸炎を含む、請求項41に記載の方法。
【請求項４５】
前記中枢神経系の病気が、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症、及びうつ病を含む、請求項41に記載の方法。
【請求項４６】
前記代謝系の病気が、肥満症のような免疫に関係しない病気を含む、請求項41に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願：
本発明は、≪Nouveaux polynucleotides comportant des polymorphismes de type SNP fonctionnels dans la sequence nucleique du gene IFNαlpha21 ainsi que de nouveaux polypeptides codes par ces polynucleotides et leurs utilisations therapeutiques.≫と題する2001年3月30日に出願されたフランス特許出願番号第0104404号に対する優先権を主張する。
【０００２】
本発明の分野
本発明は、新規SNPsを含むIFNα−21遺伝子のヌクレオチド配列由来の新規ポリヌクレオチド、及びこれらのSNPsによって引き起こされた変異を含む天然の野生型IFNα−21タンパク質由来の新規ポリペプチド、並びにそれらの、治療のための使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
関連技術
インターフェロンα21遺伝子(以下、IFNα−21と呼ぶ)は、刊行物中に記載されている：
−  Goeddel, D. V., Leung, D. W；「8つの特徴的なクローン化されたヒト白血球インターフェロンcDNAの構造」； Nature, 290 (5801), 20−26(1981)。
−  Olopade OI., Bohlander SK.；「ヒトの腫瘍症に関係する第9染色体短腕の欠失の重複部分からの最短領域のマッピング」； Genomics 14 (2), 437−443(1992)。
【０００４】
この遺伝子のヌクレオチド配列は、登録番号AC009445下、ジーンバンク・データベースのHTGの項で入手可能である。
IFNα−21のメッセンジャーRNAの配列は、登録コードNM-002175下、NCBIのデータベースに記載されている。
IFNα−21は、ヒト・インターフェロンα(IFNα)、特にIFNα−2のそれに近い構造的及び機能的な相同性を有する遺伝子である。
【０００５】
IFNαは、それらの細胞の抗増殖効果、並びに抗ウイルス性及び抗寄生生物性応答へのそれらの関与について知られている。
IFNαは、造血幹細胞のレベルでいくつかの他のサイトカインの発現を抑制すること、そして特定の腫瘍の細胞増殖を抑制することも知られている。
【０００６】
IFNαは、腎癌のEGFに対する受容体の発現を減少させ、ミトコンドリア遺伝子の発現を抑え、特に生体外において線維芽細胞、単球及びBリンパ球の増殖を抑え、そしてBリンパ球による抗体の合成を妨げることも知られている。
【０００７】
IFNαは、腫瘍細胞表面上の腫瘍特異抗原の発現を誘発し、そしてこれらのISREの特定の転写因子に従いISRE型(インターフェロン刺激応答因子)のプロモーター領域の制御下に置かれた遺伝子をも誘発することが知られてもいる。
【０００８】
IFNαが様々な障害及び/又はヒトの病気、例えば様々な癌の類(例えば、癌腫、メラノーマ、リンパ腫、白血病、並びに肝臓、頸部、頭部及び腎臓の癌)、心血管系の病気、代謝系の病気(例えば免疫系の類と関連しないもの、例えば肥満症)、感染症(例えば、B及びC型肝炎並びにAIDS)、肺炎、潰瘍性大腸炎の類、中枢神経系の病気(例えば、アルツハイマー病、統合失調症及びうつ病)、組織又は臓器移植片の拒絶、外傷の治癒、透析患者の貧血、アレルギー、喘息、多発性硬化症、骨粗鬆症、乾癬、関節リウマチ、クローン病、自己免疫疾患及び障害、胃腸の障害、あるいは化学療法の治療に関連した障害にさえ係わっていることが知られている。
【０００９】
IFNαは、特に特定の白血病の治療、転移した腎癌、及び免疫不全に続いて現れる腫瘍、例えばAIDSの場合におけるカポジ肉腫に使用される。IFNαは、他のタイプの癌、及び特定のウイルス感染に対しても有効である。IFNαは、陰部疣贅又は性病の治療のためにFDA(食品医薬品局)によって承認されてもいる。
【００１０】
より特に、IFNα−21は、in situハイブリダイゼーションによりパーキンソン病又はアルツハイマー病に冒された患者の脳に発見された。
【００１１】
他の細胞と比べて、ミクログリア細胞は大量のIFNα−21を発現する。
アルツハイマー病に冒された患者で、IFNα−21の存在が、頭頂葉のニューロンに示され、IFNα−21がこの病変に係わっていることを示唆する(例えば、Kawaguchi N, Yamada T, Yoshiyama Y. No To Shinkei. 1997 Jan.; 49(1): 69−73を参照のこと)。
【００１２】
しかし、IFNα、特にIFNα−21が、医薬組成物、例えば急性過敏症(じんましん、気管支収縮、アナフィラキシーショックなど)の反応、心不整脈、低血圧、てんかん発作、甲状腺の機能の問題、インフルエンザ様症候群(発熱、発汗、筋肉痛)などに使用される場合、多数の副作用を有する。
【００１３】
さらに、IFNαにより治療された患者は、これらの分子を中和する抗体を生み出す可能性があり、それによりそれらの有効性を減少させることができる。
【００１４】
本発明者は、天然の野生型IFNα−21タンパク質と、異なる機能性をもつことが可能なIFNα−21遺伝子に対する新規ポリペプチド及び新規ポリヌクレオチド・アナログを発見した。
【００１５】
これらの新しいポリペプチド及びポリヌクレオチドは、とりわけ、先に触れた障害又は病気を治療又は予防するため使用することができて、それらに密接に結び付けられる問題点の全て又は一部を回避することができる。
【発明の開示】
【００１６】
本発明の簡単な概要
本発明は、その最初の目的として、1つ又は複数のSNPs(一塩基多型)を含む基準野生型IFNα−21遺伝子のヌクレオチド配列と異なる新規ポリヌクレオチドを有する。
【００１７】
ヒトの基準野生型IFNα−21遺伝子のヌクレオチド配列、配列番号1は、2001のヌクレオチドから構成されて、第670ヌクレオチド(開始コドン)から第1239ヌクレオチド(停止コドン)までの570のヌクレオチドから成るコード配列を含む。
【００１８】
出願人は、基準野生型IFNα−21遺伝子のヌクレオチド配列中に8つのSNPsを同定した。これらの8つのSNPsは、以下の：c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g、t1265c、t1277cである。
【００１９】
本発明の意味において、先に定義されたSNPの位置付けに対応する番号付けは、ヌクレオチド配列、配列番号1の番号付けと関連することが理解される。
【００２０】
文字a、t、c及びgは、それぞれ窒素含有塩基、アデニン、チミン、シトシン及びグアニンに対応する。
最初の文字は野生型ヌクレオチドに相当し、一方最後の文字は、変異ヌクレオチドに相当する。
【００２１】
よって、例えば、SNP c794gは、基準野生型IFNα−21遺伝子のヌクレオチド配列、配列番号1の794位で、ヌクレオチド、シトシン(c)の、ヌクレオチド、グアニン(g)への変異に相当する。
【００２２】
これらのSNPsは、「前もって選ばれた機能的候補遺伝子のヌクレオチド配列中の1つ又は複数の機能的多型性の同定方法並びにその適用」と題された、そして2000年12月6日に出願された、当該出願人の特許出願FR 00 22894に記載された測定方法を使って出願人によって同定された、ここで上記文献を本明細書中に援用する。
【００２３】
当該特許出願に記載された方法は、個体のランダム集団からの少なくとも1の個体における1つの(又はいくつかの)先在するSNP(s)の同定を可能にする。
【００２４】
本発明の範囲で、例えばコード配列を含んでいるIFNα−21遺伝子のヌクレオチド配列の断片は、ランダムなやり方で選ばれた個体集団内の異なる個体から単離された。
次に、これらの断片の配列決定を、DHPLC(「変性−高速液体クロマトグラフィー」)による解析後に、ヘテロ2本鎖特性(すなわち、基準野生型IFNα−21遺伝子配列のそれと異なる特性)を有するこれらのサンプルを確認するために実行した。
次に、この方法により配列決定された断片を、基準野生型IFNα−21遺伝子の断片のヌクレオチド配列と比べて、本発明に従ってSNPsを同定した。
このように、SNPsは天然のものであり、それらの各々が世界人口の特定の個体に存在する。
【００２５】
基準野生型IFNα−21遺伝子は、アミノ酸配列順序配列番号2に相当する189のアミノ酸の未成熟型タンパク質をコードし、それは、最初の23のアミノ酸を含むシグナルペプチドの切断により166のアミノ酸の成熟型タンパク質に変換される。
【００２６】
本発明のコーディングSNPs、すなわち：ｃ794ｇ、ｃ973ａ、ｇ1011ｃ、ｔ1049ａ、ｔ1155ａ、ａ1204ｇの各々は、IFNα−21遺伝子のヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列のレベルでの変更を引き起こす。
【００２７】
アミノ酸配列のこれらの変更は、以下のとおりである：
SNP c794gは、アミノ酸配列、配列番号2に相当するIFNα−21遺伝子の未成熟型タンパク質の42位、かつ、成熟型タンパク質の19位でのアミノ酸、アラニン(A)のグリシン(G)への変異を引き起こす。本発明の記載において、当業者は、成熟型タンパク質を参照するか又は未成熟型タンパク質を参照するかにより、このSNPによってコードされた変異をそれぞれ、A19G又はA42Gと呼ぶ。
【００２８】
SNP ｃ973ａは、アミノ酸配列、配列番号2に相当するIFNα−21遺伝子の未成熟型タンパク質の102位、かつ、成熟型タンパク質の79位でのアミノ酸、グルタミン(Q)のリジン(K)への変異を引き起こす。本発明の記載において、当業者は、成熟型タンパク質を参照するか又は未成熟型タンパク質を参照するかにより、このSNPによってコードされた変異をそれぞれ、Q79K又はQ102Kと呼ぶ。
【００２９】
SNP g1011cは、アミノ酸配列、配列番号2に相当するIFNα−21遺伝子の未成熟型タンパク質の114位、かつ、成熟型タンパク質の91位でのアミノ酸、グルタミン(Q)のヒスチジン(H)への変異を引き起こす。本発明の記載において、当業者は、成熟型タンパク質を参照するか又は未成熟型タンパク質を参照するかにより、このSNPによってコードされた変異をそれぞれ、Q91H又はQ114Hと呼ぶ。
【００３０】
SNP t1049aは、アミノ酸配列、配列番号2に相当するIFNα−21遺伝子の未成熟型タンパク質の127位、かつ、成熟型タンパク質の104位でのアミノ酸、バリン(V)のアスパラギン酸(D)への変異を引き起こす。本発明の記載において、当業者は、成熟型タンパク質を参照するか又は未成熟型タンパク質を参照するかにより、このSNPによってコードされた変異をそれぞれ、V104D又はV127Dと呼ぶ。
【００３１】
SNP t1155aは、アミノ酸配列、配列番号2に相当するIFNα−21遺伝子の未成熟型タンパク質の162位、かつ、成熟型タンパク質の139位でのアミノ酸、システイン(C)の終止コドン(stop)への変異を引き起こす。本発明の記載において、当業者は、成熟型タンパク質を参照するか又は未成熟型タンパク質を参照するかにより、このSNPによってコードされた変異をそれぞれ、C139stop又はC162stopと呼ぶ。
【００３２】
SNP ａ1204ｇは、アミノ酸配列、配列番号2に相当するIFNα−21遺伝子の未成熟型タンパク質の179位、かつ、成熟型タンパク質の156位でのアミノ酸、リジン(K)のグルタミン酸(E)への変異を引き起こす。本発明の記載において、当業者は、成熟型タンパク質を参照するか又は未成熟型タンパク質を参照するかにより、このSNPによってコードされた変異をそれぞれ、K156E又はK179Eと呼ぶ。
【００３３】
SNPs ｃ794ｇ、ｃ973ａ、ｇ1011ｃ、ｔ1049ａ、ｔ1155ａ、ａ1204ｇは、野生型基準IFNα−21遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドと比べて、本発明に従ってポリペプチド空間的構造の変更を引き起こす。
【００３４】
これらの変更は、例えば、デノボ・モデリング・ツール(例えば、SEQFOLD/MSI)、相同性(例えば、MODELER/MSI)、力場の最小化(例えば、DISCOVER、Delphi/MSI)、及び/又は分子力学(例えば、CFF/MSI)を使用する、当業者に周知の方法に従い、コンピューターを利用した分子モデリングによって観察される。
【００３５】
そのようなモデルの例を、以下の実験の項で挙げる。
コンピューターを利用した分子のモデリングは、成熟型変異タンパク質上の変異Q79Kが図1A及び1Bに示されるような水素結合障害により野生型IFNα−21タンパク質のヘリックスCのN−末端の置き換えを伴うことを示す。
【００３６】
実際に、野生型IFNα−21タンパク質のQ79残基の側鎖の酸素原子、E83残基の酸性基、及びヘリックスCの間の水素結合は、Q79K変異IFNα−21タンパク質で消失する。
よって、Q79K変異タンパク質は、その構造及び機能の著しい変化を伴う、天然の野生型IFNα−21タンパク質と異なる3次元構造を有する。
【００３７】
コンピューターを利用した分子のモデリングは、成熟型変異タンパク質上の変異Q91Hが図2A及び2Bに示されるような変異位置でヘリックスCの置き換えを伴うことを示す。ヘリックスをより強固にするいくつかの水素結合及び塩橋、特に、H91とD76アミノ酸側鎖の間に現れる。
よって、Q91H変異タンパク質は、その構造及び機能の著しい変化を伴う、天然の野生型IFNα−21タンパク質と異なる3次元構造を有する。
【００３８】
コンピューターを利用した分子のモデリングは、成熟型変異タンパク質上の変異V104Dが図3A及び3Bに示されるような変異位置でのヘリックスCとヘリックスDの間のループ構造の変更を伴うことを示す。変異構造において、ヘリックスCとDの間のループをより強固にするいくつかの水素結合が(一方の手のQ102及びG105と、他方の手のQ5、E107及びT109の間に)現れる。さらに、へリックスBのN末端の置き換えも観察される。
【００３９】
これらの空間的変更は、その受容体へのIFNα−21の結合に関係している残基に影響する。
よって、V104D変異タンパク質は、その構造及び機能の著しい変化を伴う、天然の野生型IFNα−21タンパク質と異なる3次元構造を有する。
【００４０】
コンピューターを利用した分子のモデリングは、成熟型変異タンパク質上の変異C139stopが図4に示されるような野生型IFNα−21タンパク質内のヘリックスEに通常含まれているポリペプチド断片の消失をもたらすタンパク質翻訳の早すぎる停止を引き起こす。
【００４１】
ヘリックスEは、その受容体にIFNα−21が結合するために不可欠である。ヘリックスEの不存在は、変異タンパク質の不正確な折り畳みを引き起こし、そしてタンパク質の疎水性コアが親水性の外部媒体と接触するタンパク質の3次元構造の変更に引き起こす。このように、変異タンパク質は、親水性の外部媒体との接触を回避するためにその疎水性のコアが親水性残基で覆われるようにその3次元構造を修飾しなければならない。
よって、C139stop変異タンパク質は、その構造及び機能の著しい変化を伴う、天然の野生型IFNα−21タンパク質と異なる3次元構造を有する。
【００４２】
コンピューターを利用した分子のモデリングは、成熟型変異タンパク質上の変異K156Eが図5A及び5Bに示されるようなヘリックスEのC末端の変性(unfolding)、及びC末端ループ形状の変更を伴うことを示す。
【００４３】
この変異は、水素結合ネットワークを増やし、そしてE156とR161残基の間の塩橋を作り出す。これらの変更は、この領域におけるIFNα−21タンパク質構造をより強固にする。タンパク質のこの領域は、その抗ウイルス活性に関係していることが知られている。よって、K156E変異IFNα−21タンパク質の抗ウイルス活性が、劇的に阻害され、そして156位のグルタミン酸が成熟型IFNα−21の構造及び機能の変更を引き起こすことが予言されうる。
【００４４】
本発明による他のSNPs、すなわち：t1265c、t1277cは、アミノ酸配列、配列番号2のレベルでのIFNα−21遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされたタンパク質の変更を伴わない。前記SNPs t1265c、t1277cは、何もコードしていない。
【００４５】
本発明によるポリヌクレオチドの遺伝子型解析は、集団中のこれらのポリヌクレオチドの対立遺伝子頻度を測定するといったやり方で実行されることができる。以下の実験の項で、遺伝子型解析の例を挙げる。
【００４６】
本発明のポリペプチドの機能性の定量は、それらの生物活性の試験によって一様に実行されることができる。
この件に関して、例えば天然の野生型IFNα−21タンパク質に比べた本発明によるポリペプチドのダウディ細胞系に対する抗増殖性効果を計測することが可能である(Pielher et al. J. Biol. Chem. Vol. 275, Issue 51, 40425−40433, December 22, 2000；「結合接点の分かりやすい変異的解析によって明らかにされたI型インターフェロン受容体相互作用の新しい構造的及び機能的側面」)。
【００４７】
本発明は、目的のために、特に特定のヒトの障害及び/又は病気の予防及び治療のための、本発明によるポリペプチド及びポリヌクレオチドの使用、並びにこれらのポリヌクレオチド及びポリペプチドから開始して得られた及び/又は同定された治療のための分子をも使用する。
【００４８】
本発明の詳細な説明
定義
「基準野生型遺伝子のヌクレオチド配列」は、ヒトIFNα−21遺伝子のヌクレオチド配列、配列番号1と理解される。
この配列は、登録番号AC009445下、ジーンバンクで入手可能であり、そしてIFNα−21メッセンジャーRNAの配列は、登録コードNM-002175下、NCBIデータベースに記載される。しかも、ヒトIFNα−21遺伝子は、Goeddel, D. V., Leung, D. W "The structure of eight distinct cloned human leukocyte interferon cDNAs"; Nature 290 (5801), 20−26 (1981) 、及びOlopade OI., Bohlander SK. "Mapping of the shortest region of overlap of deletions of the short arm of chromosome 9 associated with human neoplasia"; Genomics 14 (2), 437−443 (1992)中に記載されている。
【００４９】
「天然の野生型IFNα−21タンパク質」は、基準野生型IFNα−21遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされた成熟型タンパク質と理解されている。天然の野生型の未成熟型タンパク質IFNα−21は配列番号2で示されたペプチド配列と一致する。
【００５０】
「ポリヌクレオチド」は、修飾又は非修飾DNA又はRNAであるかもしれないポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドと理解されている。
用語ポリヌクレオチドは、例えば1本鎖又は2本鎖DNA、1又はいくつかの1本鎖領域及び1又はいくつかの2本鎖領域の混合物から構成されたDNA、1本鎖又は2本鎖RNA、1又はいくつかの1本鎖領域及び1又はいくつかの2本鎖領域の混合物から構成されたRNAを含む。用語ポリヌクレオチドは、1つ又はいくつかの3本鎖領域を含むRNA及び/又はDNAをも含むことができる。ポリヌクレオチドに関しては、同様に、安定性の理由のために又は他の理由のために修飾された骨格をもつように修飾された1つ又はいくつかの塩基を含むDNA及びRNAと理解される。修飾された塩基に関しては、例えばイノシンのような例外的な塩基と理解される。
【００５１】
「ポリペプチド」は、例えば等配電子ペプチドの場合、通常の又は修飾されたペプチド結合によって互いに結合された少なくとも2つのアミノ酸を含むペプチド、オリゴペプチド、オリゴマー又はタンパク質と理解される。
ポリペプチドは遺伝コードによって定義された20のアミノ酸以外のアミノ酸から構成されることができる。同様に、ポリペプチドは、天然の方法、例えば翻訳後成熟過程によって、又は当業者に周知の化学過程により修飾されたアミノ酸からも構成される。そのような修飾が、文献に十分に詳細に説明されている。これらの修飾は、ポリペプチド内：ペプチド骨格内、アミノ酸鎖内のどこででも、あるいはカルボキシ−又はアミノ−末端にさえ現れうる。
【００５２】
ポリペプチドは、ユビキチン化を受けて分岐するか、又は分岐の有無に係わらず環状になるかもしれない。この種の修飾は、当業者に周知の自然又は人工の翻訳後過程の結果であるかもしれない。
【００５３】
例えば、ポリペプチドの修飾は、アセチル化、アシル化、ADP−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合性固定、ヘムの共有結合性固定、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体、脂質又は脂質誘導体の共有結合性固定、ホスファチジルイノシトールの共有結合性又は非共有結合性架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル基、システイン形成、ピログルタミン酸形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシ化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ化、メチル化、ミリスチル化、酸化、タンパク質分解過程、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セネロイル化(seneloylation)、硫酸化、アルギニン化又はユビキチン化のようにアミノ酸付加を含んでいると理解される。そのような修飾は、文献中に十分に詳細に記載されている：PROTEINS−STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T. E. Creighton, New York, 1993, POST−TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, 1983, Seifter et al. "Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors", Meth. Enzymol. (1990) 182:626−646, and Rattan et al. "Protein Synthesis: Post−translational Modifications and Aging", Ann NY Acad Sci (1992) 663: 48−62。
【００５４】
「単離されたポリヌクレオチド」又は「単離されたポリペプチド」は、例えば人体から単離された、又は専門的な方法によって別な方法で製造された先に定義された、それぞれポリペプチド又はポリヌクレオチドと理解される。
【００５５】
「同一性」は、ヌクレオチド又はポリペプチド配列の同一性の測定値と理解される。
同一性は、当業者に周知であり、文献中によく記載される用語である。COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, A.M., Ed., Oxford University Press, New York, 1998; BIOCOMPUTING IFNORMATICS AND GENOME PROJECT, Smith, D.W., Ed., Academic Press, New York, 1993; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PART I, Griffin, A.M. and Griffin H.G., Ed, Humana Press, New Jersey, 1994;及びSEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, von Heinje, G., Academic Press, 1987を参照のこと。
【００５６】
同様に、2つの配列間の同一性及び類似性を測定するために一般に使われる方法は、文献中に十分記載されている。GUIDE TO HUGE COMPUTER, Martin J. Bishop, Ed, Academic Press, San Diego, 1994, and Carillo H. and Lipton D., Siam J Applied Math (1988) 48: 1073を参照のこと。
【００５７】
例えば、ヌクレオチド配列、配列番号1に少なくとも95%の同一性をもつポリヌクレオチドは、上記配列と比べて100のヌクレオチド上に多くとも5点の変異を含んでいるポリヌクレオチドである。
これらの変異点は、1つ(又はいくつかの)置換、付加及び/又は1つ(又はいくつかの)ヌクレオチドの欠失であるかもしれない。
【００５８】
同様に、例えば、アミノ酸配列、配列番号1に少なくとも95%の同一性をもつポリペプチドは、上記配列と比べて100のアミノ酸上に多くとも5点の変異を含んでいるポリペプチドである。
これらの変異点は、1つ(又はいくつかの)置換、付加及び/又は1つ(又はいくつかの)アミノ酸の欠失であるかもしれない。
【００５９】
これらの配列が少なくとも1つの本発明のSNPsを含んでいることが理解される、それぞれ、ヌクレオチド配列、配列番号1又はアミノ酸配列、配列番号2と完全に同一でない本発明によるポリヌクレオチド及びポリペプチドが、これらの配列の変異型と考えられる。
通常、本発明によるポリヌクレオチドは、本発明のSNPsの少なくとも1つを含み、ヌクレオチド配列、配列番号1と同じか又は実質的に同じものは同じ生物活性を有する。
同様に、通常、本発明によるポリペプチドは、本発明のコーディングSNPsの少なくとも1つを含み、アミノ酸配列、配列番号2と同じか又は実質的に同じものは同じ生物活性を有する。
本発明による変異型は、例えば部位特異的変異誘発法又は直接的な合成によって得ることができる。
【００６０】
「SNP」に関しては、ヌクレオチド配列内の塩基のいずれかの天然の変化と理解される。ヌクレオチド配列上のSNPは、コーディング、サイレント又は非コーディングであるかもしれない。
コーディングSNPは、このヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列中のアミノ酸の変更を伴うヌクレオチド配列のコード配列に含まれる多型性である。この場合、用語SNPは、意味が拡大されて、アミノ酸配列の変異に同様に使用される。
【００６１】
サイレントSNPは、このヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列中のアミノ酸の変更を伴わないヌクレオチド配列のコード配列に含まれる多型性である。
非コーディングSNPは、ヌクレオチド配列の非コード配列に含まれている多型性である。この多型性は、特にイントロン、スプライシング領域、転写プロモーター又は部位エンハンサー配列中に見ることができる。
【００６２】
「機能的SNP」に関しては、機能性をもっているヌクレオチド配列又はアミノ酸配列に含まれる、例えば先に定義のSNPと理解される。
「機能性」は、ポリペプチド又はポリヌクレオチドの生物活性と理解される。
本発明によるポリペプチド又はポリヌクレオチドの機能性は、野生型基準遺伝子のヌクレオチド配列又はこの後者のヌクレオチド配列よってコードされたポリペプチドの生物活性の保存、増加、削減又は抑制にある。
【００６３】
同様に、本発明によるポリペプチド又はポリヌクレオチドの機能性は、基準野生型遺伝子のヌクレオチド配列又はこの後者のヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドの生物活性の性質の変化にある。
生物活性は、特に受容体と、本発明によるポリペプチドの親和性又は親和性の不存在に関連する可能性がある。
【００６４】
ポリヌクレオチド
本発明は、最初の目的のために、以下の：
a)  配列、配列番号1又はそのコード配列(第670ヌクレオチドから第1239ヌクレオチド)と、少なくとも80%の同一性、好ましくは少なくとも90%の同一性、より好ましくは少なくとも95%の同一性、さらにより好ましくは少なくとも99%の同一性をもつヌクレオチド配列、ここで、このヌクレオチド配列が以下のコーディングSNPs c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204gの少なくとも1つを含むことは理解される、あるいは
【００６５】
b)  a)下のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
を含む単離されたポリヌクレオチドを含む。
本発明の意味では、番号付けがヌクレオチド配列、配列番号1のSNPsの位置決めと一致することが理解される。
【００６６】
同様に、本発明は以下の：
a)  ヌクレオチド配列、配列番号1又はそのコード配列、ここで、これらのヌクレオチド配列が以下のコーディングSNPs c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204gの少なくとも1つを含むことは理解される、あるいは
b)  a)下のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
を含む単離されたポリヌクレオチドに関する。
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、配列、配列番号1又はそのコード配列から成り、ここで、これらのヌクレオチド配列の各々が以下のコーディングSNPs：c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204gの少なくとも1つを含むことが理解される。
【００６７】
本発明によると、先に定義されたポリヌクレオチドは、以下のｃ794ｇ、ｃ973ａ、ｇ1011ｃ、ｔ1049ａ、ｔ1155ａ及びａ1204ｇから成る群から選ばれる1つのコーディングSNPを含む。
同様に、例えば、先に定義されたポリヌクレオチドは、以下の非コーディングSNPs：t1265c、t1277cの少なくとも1つを含むことができる。
【００６８】
同様に、本発明は、その目的のために、以下の：
a)  ヌクレオチド配列、配列番号1又はそのコード配列、ここで、これらの配列の各々が以下の非コーディングSNPs：t1265c、t1277cの少なくとも1つを含むことは理解される、あるいは
b)  a)下のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
を含む又はそれらから成る単離されたポリヌクレオチドを有する。
【００６９】
本発明は、以下の：
a)  ヌクレオチド配列、配列番号1又はそのコード配列、ここで、これらの配列の各々が以下のSNPs：c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g、t1265c、t1277cの少なくとも1つを含むことは理解される、あるいは
b)  a)下のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
の一部から成る単離されたポリヌクレオチドに関係し、上記単離されたポリヌクレオチドは、少なくとも10のヌクレオチドから構成される。
【００７０】
好ましくは、先に定義された単離されたポリヌクレオチドは、10〜40のヌクレオチドから構成される。
【００７１】
本発明は、その目的のために、以下の：
a)  アミノ酸配列、配列番号2、又は
b)  アミノ酸配列、配列番号2の24位と189位の間に包含されるアミノ酸を含むアミノ酸配列、
ここで、a)及びb)下のアミノ酸配列の各々がコーディングSNPs：A42G、Q102K、Q114H、V127D、C162stop、K179Eの少なくとも1つを含むことは理解されている、
を含むポリペプチドをコードするための単離されたポリヌクレオチドをも有する。
本発明の意味において、A42G、Q102K、Q114H、V127D、C162stop、K179E SNPsの位置付けに対応する番号付けが、アミノ酸配列、配列番号2の番号付けと関連することは理解される。
【００７２】
本発明の好ましい目的によると、先に定義されたポリペプチドは、1つの、先に定義されたようなコーディングSNPを含む。
好ましくは、本発明によるポリヌクレオチドは、DNA又はRNA分子から構成される。
本発明によるポリヌクレオチドは、標準的なDNA又はRNA合成法によって得ることができる。
同様に、本発明によるポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列、配列番号1上の各々のSNPに関する変異ヌクレオチドにより野生型ヌクレオチドを修飾することによってIFNα−21遺伝子のヌクレオチド配列から開始した部位特異的変異誘発法によって得ることができる。
【００７３】
例えば、SNP c794gを含む本発明によるポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列、配列番号1上の794位でヌクレオチド、グアニン(g)によりヌクレオチド、シトシン(c)を修飾することによってIFNα−21遺伝子のヌクレオチド配列から開始した部位特異的変異誘発法によって得ることができる。
【００７４】
この方法により実行されうる部位特異的変異誘発法の方法は、当業者に周知である。1985年の「Proc. Natl. Acad. Sci. USA」82: 488中のTA Kunkelの発表を特に記載する。
同様に、単離されたポリヌクレオチドは、例えばプレ−、プロ−又はプレ−プロ−タンパク質アミノ酸配列又はヘキサ−ヒスチジン・ペプチドのようなマーカー・アミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列を含むことができる。
同様に、本発明のポリヌクレオチドは、融合タンパク質又は他の精製産物を得るために他のタンパク質又はタンパク質断片をコードするヌクレオチド配列に関係しうる。
【００７５】
同様に、本発明によるとポリヌクレオチドは、例えば5'及び/又は3'非コード配列、例えば転写又は非転写配列、翻訳又は非翻訳配列、スプライシング・シグナル配列、ポリアデニル化配列、リボソーム結合配列、あるいはメッセンジャーRNAを安定化する配列を含みうる。
【００７６】
ヌクレオチド又はポリヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列は、ストリンジェント条件下で、このヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができるものと定義される。ヌクレオチド配列を含むことができる。
【００７７】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、一般的に、しかし必ずしもそうではなく、ヌクレオチド配列が少なくとも80%、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上、そして最も好ましくは97%以上の同一性をもつときにハイブリダイゼーションを可能にする化学的条件と理解される。
【００７８】
ストリンジェント条件は、当業者に周知の方法に従い、そして、例えばポリヌクレオチドを50%のホルムアミド、5xSSC(150 mMのNaCl、15 mMのクエン酸3ナトリウム)、50mMのリン酸ナトリウム(pH7.6)、5xのデンハート溶液、10%の硫酸デキストラン、20 μgの変性サケ精子DNAを含む溶液中、42℃でインキュベートし、続いて65℃で、O.1xSSCによりフィルターを洗浄することにより得ることができる。
【００７９】
本発明の範囲内において、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が100%に匹敵する同一性をもつヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを可能にするとき、そのヌクレオチド配列は、例えばa)の下で記載されたヌクレオチド配列に対し厳密に相補的であるとみなされる。
ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列が本発明によるアンチセンスSNPの少なくとも1つを含むことは、本発明の意味の範囲内において理解される。
【００８０】
よって、例えばヌクレオチド配列がSNP c794gを含む場合、その相補的なヌクレオチド配列は794位に相当する位置にヌクレオチド、シトシン(c)を含む。
【００８１】
SNPを含むポリヌクレオチドの同定、ハイブリダイゼーション及び/又は増幅
本発明は、その目的のために、以下：
a)  ヌクレオチド配列、配列番号1と80〜100%の同一性(好ましくは少なくとも90%の同一性、より好ましくは95%の同一性、そして特に100%の同一性)をもつポリヌクレオチド、及び/又は
b)  ヌクレオチド配列、配列番号1と80〜100%の同一性(好ましくは少なくとも90%の同一性、より好ましくは95%の同一性、そして特に100%の同一性)をもつポリヌクレオチドの全体又は一部の同定、ハイブリダイズ及び/又は増幅のために少なくとも1つのSNPを含むこと本発明によるポリヌクレオチド、必要であればその(第670ヌクレオチド〜第1239ヌクレオチドの)コード配列、
の全て又は一部をも使用し、ここで、これらの配列の各々が以下のSNPs：c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g、t1265c、t1277cの少なくとも1つを含むことは理解される。
【００８２】
遺伝子型解析及びSNP頻度の測定
同様に、本発明は、その目的のために、以下：
a)  ヌクレオチド配列、配列番号1と80〜100%の同一性(好ましくは少なくとも90%の同一性、より好ましくは95%の同一性、そして特に100%の同一性)をもつポリヌクレオチド、及び/又は
b)  ヌクレオチド配列、配列番号1と80〜100%の同一性(好ましくは少なくとも90%の同一性、より好ましくは95%の同一性、そして特に100%の同一性)をもつポリヌクレオチドの全体又は一部の遺伝子型解析のために少なくとも1つのSNPを含むこと本発明によるポリヌクレオチド、
の全て又は一部を使用し、ここで、これらの配列の各々が以下のSNPs：c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g、t1265c、t1277cの少なくとも1つを含むことは理解される。
【００８３】
本発明により、遺伝子型解析は、個体又は個体集団において実行されうる。
本発明の意味の範囲内において、遺伝子型解析は、個体又は個体集団の遺伝子型の測定方法と定義される。遺伝子型は、1以上の特定座位に存在する対立因子から成る。
【００８４】
「個体集団」は、ランダムな又は非ランダムな方法で選ばれた個体の群と理解される。これらの個体は、ヒト、動物、微生物又は植物であるかもしれない。
【００８５】
通常、前記個体群は、少なくとも10人、好ましくは100〜300人を含む。
個体は、それらの民族性によるか又はそれらの表現型により、特に以下の障害及び/又は病気：癌腫、メラノーマ、リンパ腫、白血病、並びに肝臓、頸部、頭部及び腎臓の癌；心血管系の病気；代謝系の病気、例えば免疫系の類と関連しないもの、例えば肥満症；感染症、例えば、B及びC型肝炎及びAIDSのようなウイルス感染症；肺炎；潰瘍性大腸炎の類；中枢神経系の類の病気、例えば、アルツハイマー病、統合失調症及びうつ病；組織又は臓器移植片の拒絶；外傷の治癒；透析患者の貧血；アレルギー；喘息；多発性硬化症；骨粗鬆症；乾癬；関節リウマチ；クローン病；自己免疫疾患及び障害；胃腸の障害；あるいはさらに化学療法の治療に関連した障害に影響を受ける人が選ばれうる。
【００８６】
本発明による機能的なSNPは、好ましくは個体集団で遺伝子型解析される。
SNPs遺伝子型を同定するために実行されることができるいくつかの技術が存在する(特に、Kwok Pharmacogenomics, 2000, vol 1, pp 95-100. "High-throughput genotyping assay approaches"を参照のこと)。これらの技術は、以下の4つの原理：対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド・ハイブリダイゼーション、場合によりデオキシヌクレオチドの存在下で、ジデオキシヌクレオチドによるオリゴヌクレオチド伸長、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドの連結又は対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド切断、のいずれか1つに基づく。これらの技術の各々は、直接的であるか、又は蛍光偏光、若しくは質量分析法のような検出システムと組み合わせることができる。
【００８７】
遺伝子型解析は、蛍光偏光スキャナーと組み合わせて、ホットddNTPs(異なるフルオロフォアによって標識された2つの異なるddNTPs)とコールドddNTPs(2つの異なる非標識ddNTPs)を用いたミニ配列決定によって特に実行することができる。蛍光偏光(FPTDI技術又は蛍光偏光鋳型に対する染料−ターミネーターの取り込み)の読取値によるミニ配列決定プロトコールが、当業者に周知である。
【００８８】
それは、各々の個体からのDNAのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による増幅後に得られた産物において実行することができる。このPCR産物は、検討されるSNPを含むポリヌクレオチド遺伝子領域をカバーするように選ばれる。PCRサーモサイクラーの最後のステップの後、次に、フルオロフォアの特異的励起と放射フィルター使うことによって標識された塩基の読取のために、プレートを蛍光偏光スキャナー上に置く。標識された塩基の強度の値はグラフで記録される。
【００８９】
PCR増幅のために、本発明のSNPの場合、センス及びアンチセンス・プライマーは、それぞれ、本発明のSNPsの位置に従って当業者によって容易に選択されることができる。
【００９０】
例えば、PCR増幅プライマーのためのセンス及びアンチセンス・ヌクレオチド配列は、それぞれ：
配列番号3：センス・プライマー：GGTTCAAGGTTACCCATCTC
配列番号4：アンチセンス・プライマー：TTTGAAATGGCAGAAGTCAT、
である。
このヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列、配列番号1の第620ヌクレオチドから第1315ヌクレオチドの、696ヌクレオチドの長さがある断片の増幅を可能にする。
【００９１】
次に、個体集団内のSNPを含む遺伝子によってコードされる各々の対立遺伝子の頻度(対立遺伝子頻度)の統計分析が得られ、それは、異なる亜群、そして特に、必要ならば、この個体集団を構成する様々な民族群におけるそれらの影響とそれらの分布の重要性の決定を可能にする。
【００９２】
遺伝子型解析データは、検討された集団において観察した異なる対立遺伝子の分布度数を評価するために分析される。対立遺伝子頻度の計算は、SAS−suite(登録商標)(SAS)又はSPLUS(登録商標)(MathSoft)のようなソフトウェアを用いて実行することができる。個体集団の異なる民族群にまたがる本発明のSNPの対立遺伝子分布の比較は、ソフトウェアARLEQUIN(登録商標)とSAS−suite(登録商標)によって実行することができる。
【００９３】
遺伝子標識としての本発明のSNPs
遺伝子の機能的配列(例えば、プロモーター、スプライシング部位、コード領域)を修飾しているSNPsは、病気の感受性又は耐性に直接的に関係している可能性があるが、(機能的な又は機能的でない)全てのSNPsがこれらの病状に関与する1つ又はいくつかの遺伝子の同定のために有用なマーカーを提供し、その結果、これらの病状と間接的に関係があるかもしれない(Cargill et al. (1999). Nature Genetics 22:231-238; Riley et al. (2000). Pharmacogenomics 1:39-47; Roberts L. (2000). Science 287: 1898-1899を参照のこと)。
【００９４】
このように、本発明は、IFNα−21遺伝子のポリヌクレオチド中に以下のSNPs：c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g、t1265c、t1277cの少なくとも1つを含むデータバンクにも関する。
前記SNPsは、ヌクレオチド配列、配列番号1に従って番号付けされることは、十分理解される。
【００９５】
このデータバンクは、以下の：
(i)IFNα−21遺伝子のポリヌクレオチド中の以下のSNPs：c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g、t1265c、t1277cの少なくとも1つ、と
(ii)病気又は病気への耐性、
の間の統計的に関係性のある組み合わせを測定するために分析されうる。
本発明は、病気又は病気への耐性に関する診断/予後診断キットの開発のために、IFNα−21遺伝子のポリヌクレオチド中の以下のSNPs：c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g、t1265c、t1277cの少なくとも1つの使用にも関する。
【００９６】
例えば、先に定義されている、本発明のSNPは、病気又は病気への耐性に直接的に又は間接的に関係する。
好ましくは、これらの病気は、先に触れたとおり定義されたものである。
【００９７】
発現ベクター及び宿主細胞
本発明は、その目的のために、本発明による少なくとも1つのポリヌクレオチドを含む組み換えベクターをも有する。
【００９８】
これだけに制限されることなく、染色体、エピソーム、及び誘導ウイルス(derived viruses)を含む多数の発現システムを使用することができる。より特に、使用される組み換えベクターは、細菌プラスミド、トランスポゾン、酵母のエピソーム、挿入要素、酵母染色体要素、ウイルス、例えばバキュロウイルス、SV40のようなパピローマウイルス、ワクチニアウイルス、アデノウイルス、キツネ疱瘡ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス由来でありうる。
【００９９】
同様に、これらの組み換えベクターは、コスミド又はファージミド誘導体であるかもしれない。ヌクレオチド配列は、当業者に周知の方法、MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Sambrook et al, 4th Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001中に記載の方法による組み換え発現ベクター内に挿入されることができる。
【０１００】
組み換えベクターは、ポリヌクレオチド発現の調節を制御するヌクレオチド配列、並びに本発明のポリヌクレオチドの発現と転写、及び本発明のポリペプチドの翻訳を可能にするヌクレオチド配列を含むことができ、これらの配列は、使用される宿主細胞に従って選ばれる。
【０１０１】
このように、例えば、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが、小胞体の管腔に、膜上の細胞膜周辺腔に又は細胞外環境に向けられるように、適切な分泌シグナルが組み換えのベクター内に統合されることができる。
【０１０２】
本発明は、その目的のために、本発明による組み換えベクターを含む宿主細胞をも有する。
宿主細胞への組み換えベクターの導入は、当業者に周知の方法、例えばBASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Davis et al, 2nd ed., McGraw-Hill Professional Publishing, 1995、及びMOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL、前記の中に記載される方法、例えばリン酸カルシウムによるトランスフェクション、DEAEデキストランによるトランスフェクション、マイクロインジェクション、カチオン性脂質によるトランスフェクション、電気穿孔法、形質導入、又は注入に従って実行されうる。
【０１０３】
宿主細胞は、例えば連鎖球菌(streptococci)、ブドウ球菌(staphylococci)、E.コリ(E.coli)又はバシルス・サブチリス(Bacillus subtilis)の細胞のような細菌の細胞、酵母細胞及びアスペルギルス属(Aspergillus)、ストレプトマイセス属(Streptomyces)の細胞のような真菌の細胞、ショウジョウバエS2(Drosophila S2)及びヤトウガSf9(Spodoptera Sf9)の細胞のような昆虫の細胞、CHO、COS、HeLa、C127、BHK、HEK293細胞のような動物細胞及び治療対象のヒト細胞、あるいはさらに植物細胞でありうる。
宿主細胞は、例えば、以下に見られるように、本発明のポリペプチド又は医薬組成物中の活性な産物の発現のために使用されうる。
【０１０４】
ポリペプチド
本発明は、その目的のために、以下の：
a)  アミノ酸配列、配列番号2、又は
b)  アミノ酸配列、配列番号2の24位と189位の間に包含されるアミノ酸を含むアミノ酸配列、
と少なくとも80%の同一性、好ましくは少なくとも90%の同一性、より好ましくは少なくとも95%の同一性、さらにより好ましくは少なくとも99%の同一性をもつアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドをも有し、ここで、a)及びb)下のアミノ酸配列の各々がコーディングSNPs：A42G、Q102K、Q114H、V127D、C162stop、K179Eの少なくとも1つを含むことは理解される。
【０１０５】
同様に、本発明のポリペプチドは以下の：
a)  アミノ酸配列、配列番号2、又は
b)  アミノ酸配列、配列番号2の24位と189位の間に包含されるアミノ酸を含むアミノ酸配列、
を含むことができ、ここで、a)及びb)下のアミノ酸配列の各々がコーディングSNPs：A42G、Q102K、Q114H、V127D、C162stop、K179Eの少なくとも1つを含むことは理解される。
【０１０６】
より好ましくは、本発明のポリペプチドは以下の：
a)  アミノ酸配列、配列番号2、又は
b)  アミノ酸配列、配列番号2の24位と189位の間に包含されるアミノ酸を含むアミノ酸配列、
から成ることができ、ここで、a)及びb)下のアミノ酸配列の各々がコーディングSNPs：A42G、Q102K、Q114H、V127D、C162stop、K179Eの少なくとも1つを含むことは理解される。
【０１０７】
好ましくは、本発明によるポリペプチドは、以下の：A42G、Q102K、Q114H、V127D、C162stop及びK179Eから成る群から選ばれる1つのコーディングSNPを含む。
【０１０８】
同様に、本発明は、その目的のために、先に定義された宿主細胞を培地中で培養し、そして上記ポリペプチドを培地から単離する、先に記載されたポリペプチドの製造方法を有する。
【０１０９】
前記ポリペプチドは、当業者に周知の方法、例えばカオトロピック剤、例えば塩、特に硫酸アンモニウム、エタノールアセトン又はトリクロロ酢酸を用いた沈殿；酸性抽出；イオン交換クロマトグラフィー；リン酸セルロース・クロマトグラフィー；疎水性相互作用クロマトグラフィー；アフィニティー・クロマトグラフィー；ヒドロキシアパタイト・クロマトグラフィー、あるいは圧排クロマトグラフィーにより、宿主細胞の培地から開始して精製することができる。
【０１１０】
「培地」は、本発明のポリペプチドを単離又は精製する培地と理解される。この培地は、細胞外培地及び/又は細胞ライセートから構成されうる。同様に、前記ポリペプチドの立体構造が単離又は精製中に変わったとき、当業者に周知の技術は、活性な立体構造をポリペプチドに取り戻すことができる。
【０１１１】
抗体
本発明は、その目的のために、免疫特異的抗体を得る方法をも有する。
「抗体」は、モノクローナル、ポリクローナル、キメラ、１本鎖及びヒト化抗体、並びにFab又は免疫グロブリン発現産物ライブラリを含むFab断片を含むと理解される。
【０１１２】
免疫特異的抗体は、本発明によるポリペプチドを用いた動物の免疫処置によって得ることができる。
【０１１３】
本発明は、先に定義されたような本発明によるポリペプチドに対する免疫特異的抗体にも関する。
【０１１４】
本発明によるポリペプチド、その断片の1つ、アナログ、その変異型の1つ、又はこのポリペプチドを発現する細胞を、免疫特異的抗体を産生するために使用することもできる。
【０１１５】
用語「免疫特異的」は、抗体が本発明のポリペプチドに対して先行技術で知られている他のポリペプチドより優れた親和性を有することを意味する。
免疫特異的抗体は、当業者に周知の方法に従って、本発明のポリペプチド、その断片の1つ、アナログ又はエピトープ断片、あるいは哺乳動物の、好ましくは非ヒトの細胞内にこのポリヌクレオチドを発現する細胞を投与することによって得ることができる。
【０１１６】
モノクローナル抗体の準備のために、細胞系から始まる、抗体産生の典型的な方法、例えばハイブリドーマ技術(Kohler et al.5 Nature (1975) 256: 495-497)、トリオーマ(trioma)技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor et al., Immunology Today (1983) 4:72)、そしてEBVハイブリドーマ技術(Cole et al., "The EBV-hybridoma technique and its application to human lung cancer," in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (Vol. 27, UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, New Series) (eds. R.A. Reisfeld and S. Sell), pp. 77-96, Alan R. Liss, 社 N.Y., 1985, pp. 77-96)を使用することができる。
【０１１７】
同様に、例えば、米国特許番号第4,946,778号に記載の単一鎖抗体産生の技術を使用することができる。
同様に、トランスジェニック動物、例えばマウスを、例えばヒト化抗体を産生するために使用することができる。
【０１１８】
本発明のポリペプチドと相互作用する作用物質
同様に、本発明は、その目的のために、以下の：
a)  少なくとも1のコーディングSNPを包含する本発明によるポリヌクレオチドを含む組み換えベクターを準備し、
b)  a)による組み換えベクターを含む宿主細胞を準備し、
c)  b)による宿主細胞と、試験すべき作用物質とを接触させ、そして
d)  上記試験すべき作用物質によって引き起こされた活性化又は抑制効果を測定する、
を含む、本発明によるポリペプチドを活性化するか又は抑制する作用物質の同定方法を有する。
【０１１９】
本発明によるポリペプチドは、それと相互作用する化合物のスクリーニング方法のために使用されることもできる。
【０１２０】
これらの化合物は、本発明によるポリペプチドの内因活性を活性化する(アゴニスト)又は抑制する作用物質(アンタゴニスト)でありうる。同様に、これらの化合物は、本発明のポリペプチドのリガンド又は基質であるかもしれない。Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1 (2), Chapter 5 (1991)を参照のこと。
【０１２１】
一般的に、そのような方法を実行するために、本発明によるポリペプチドを発現する適当な宿主細胞を産生することが何よりも望ましい。そのような細胞は、例えば哺乳動物の細胞、酵母細胞、ショウジョウバエのような昆虫の細胞、又はE.コリのような細菌の細胞であるかもしれない。次に、これらの細胞又はこれらの細胞の膜抽出物を、試験すべき化合物の存在下に加える。
【０１２２】
次に、本発明のポリペプチドと、検討された化合物の結合能力、及び機能的応答の抑制又は活性化を、観察することができる。
【０１２３】
前記方法のステップd)は、直接的に又は間接的に標識された、試験すべき作用物質を使うことによって実行することができる。それは、標識又は無標識作用物質と標識拮抗物質を使用することによる競合試験を含むこともできる。
【０１２４】
検討すべき作用物質が本発明のポリペプチドを発現する細胞の活性化又は抑制シグナルを生じる場合、検出すべきシグナルに従って選ばれる検出手段を使用することによって、同様に測定される。
【０１２５】
そのような活性化又は抑制作用物質は、ポリヌクレオチド、そして特定の場合において、例えばオリゴヌクレオチド又はポリペプチド、例えばタンパク質若しくは抗体であるかもしれない。
【０１２６】
本発明は、その目的のために、以下の：
a)  少なくとも1のコーディングSNPを包含する本発明によるポリヌクレオチドを含む組み換えベクターの準備、
b)  a)による組み換えベクターを含む宿主細胞の準備、
c)  b)による宿主細胞の、試験すべき作用物質の存在下への添加、そして
d)  上記試験すべき作用物質に対する上記ポリペプチドによって引き起こされた活性化又は抑制効果の測定、
を含む、本発明によるポリペプチドにより活性化するか又は抑制される作用物質の同定方法をも有する。
【０１２７】
本発明のポリペプチドによって活性化又は抑制される作用物質は、それぞれ、このポリペプチドの存在下で活性化又は抑制により応答する作用物質である。本発明のポリペプチドによって直接的に又は間接的に活性化又は抑制される作用物質は、ポリペプチド、例えば、膜又は核内の受容体、キナーゼ、より好ましくはチロシンキナーゼ、転写因子、又はポリヌクレオチドから成る可能性がある。
【０１２８】
病気の検出
本発明は、目的のために、以下の：
a)  患者のゲノム中の本発明によるポリヌクレオチドの存在又は不存在の測定；
b)  患者における本発明によるポリヌクレオチドの発現レベルの測定；
c)  患者における本発明によるポリペプチドの存在又は不存在の測定；
d)  患者における本発明によるポリペプチドの濃度の測定；及び/又は
e)  患者における本発明によるポリペプチドの機能性の測定、
の少なくとも1つを含む、患者のにおける本発明によるポリヌクレオチド及び/又は本発明によるポリペプチドの生物学的な特性の分析方法をも有する。
【０１２９】
これらの生物学的な特性は、患者又は患者由来のサンプルにおいて分析されうる。
これらの生物学的な特性は、遺伝子診断を実行すること、及び患者が病気に冒されるか又冒される危険にさらされているかどうかを判断すること、あるいは、逆に、本発明によるポリヌクレオチド及び/又は本発明によるポリペプチドの存在と結び付いた病気、軽い病気又は障害の進行に対する部分的な耐性を与えることを可能にするかもしれない。
【０１３０】
これらの病気は、障害及び/又はヒトの病気、例えば癌及び腫瘍、感染症、性病、免疫に関連する病気及び/又は自己免疫疾患及び障害、心血管系の病気、代謝系の病気、中枢神経系の病気、並びに化学療法治療に関係した障害であるかもしれない。
【０１３１】
前記癌及び腫瘍は、転移性腎癌を含む癌腫、メラノーマ、濾胞性リンパ腫及び皮膚T細胞型リンパ腫を含むリンパ腫、毛様細胞性白血病、慢性リンパ球性白血病及び慢性骨髄性白血病を含む白血病、肝臓、頸部、頭部及び腎臓の癌、多発性骨髄腫、カルチノイド腫瘍、並びにAIDSの場合のカポジ肉腫を含む、免疫欠陥に続いて現れる腫瘍を含む。
【０１３２】
前記感染症は、慢性B及びC型肝炎及びHIV/AIDSを含むウイルス感染、感染性肺炎、並びに、例えば陰部疣贅を含む性病を含む。
前記の免疫学的及び自己免疫学的に関連する病気は、組織又は臓器移植片の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病、並びに潰瘍性大腸炎を含む。
【０１３３】
前記代謝系の病気は、肥満症のような免疫に関係しない病気を含む。
前記中枢神経系の病気は、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症及びうつ病を含む。
【０１３４】
前記の病気及び障害は、外傷の治癒、透析患者の貧血及び骨粗鬆症をも含む。
当該方法は、患者における本発明によるSNPによってコードされた変異型対立遺伝子の存在と関連する病気又はその病気への耐性に対する遺伝子診断をも可能にする。
好ましくは、ステップa)において、例えば先に定義したコーディングSNPの少なくとも1つを含むポリヌクレオチドの存在又は不存在が検出されるはずである。
【０１３５】
前記ポリヌクレオチドの検出は、検討すべき患者からの生物学的サンプル、例えば細胞、血液、尿、唾液から、あるいは検討すべき患者の生検又は検死解剖から開始して実行される。例えば、ゲノムDNAは、検出のために直接的に又はPCR増幅後に使用されうる。同様に、RNA又はcDNAも類似した方法で使用されうる。
【０１３６】
次に、本発明によるポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を、患者のゲノムで検出されたヌクレオチド配列と比較することが可能である。
ヌクレオチド配列の比較は、配列決定、DNAハイブリダイゼーション法、変性剤あり又はなしでの電気泳動ゲル上DNA断片の移動度の相違、あるいは融解温度の相違により実行することができる。Myers et al, Science (1985) 230: 1242を参照のこと。同様に、明確な位置でのヌクレオチド配列の構造のそのような変更は、ヌクレアーゼ・プロテクション試験、例えばRNaseとS1ヌクレアーゼにより、あるいは化学的切断剤によっても明らかにされることができる。Cotton et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1985) 85:4397−4401を参照のこと。同様に、本発明のポリヌクレオチド断片を含むオリゴヌクレオチド・プローブは、スクリーニングを行うために使用することができる。
【０１３７】
当業者に周知の多くの方法が、本発明のポリヌクレオチドの発現を測定するために、そして当該ポリヌクレオチドの遺伝子の変異性の同定のために使用されることができる(Chee et al., Science(1996), Vol 274, pp610−613を参照のこと)。
【０１３８】
ステップb)において、ポリヌクレオチドの発現レベルは、当業者に周知の方法、例えばPCR、RT−PCR、RNaseプロテクション、ノーザンブロット及び他のハイブリダイゼーション法に従って、ポリヌクレオチドによってコードされた(そしてポリペプチドをコードする)RNAレベルを定量することにより計測されうる。
【０１３９】
ステップc)及びd)において、患者又は患者由来のサンプル中の本発明によるポリペプチドの存在又は不存在は、周知の方法、例えばラジオイムノアッセイ、拮抗結合試験、ウェスタンブロット及びELISA試験により実行されうる。
ステップd)に続いて、本発明によるポリペプチドの測定された濃度は、患者で通常見られている天然の野生型タンパク質濃度と比較されるかもしれない。
【０１４０】
当業者は、先行技術刊行物の助けを借りるか又は慣例の試験若しくはアッセイ、例えば先に触れた方法により、先に示された感受性又は、反対に、病気、軽い病気若しくは障害に対する耐性を確認できる、閾値超又は未満を確認することができる。
【０１４１】
ステップe)において、本発明によるポリペプチドの機能性の測定は、当業者に周知の方法、例えば先に触れたインビトロ検査によるか、又は上記ポリペプチドを発現する宿主細胞の使用により実行されうる。
【０１４２】
治療用化合物及び病気の治療
本発明は、その目的のために、活性な作用物質として本発明によるポリペプチドを含む治療用化合物をも有する。
【０１４３】
本発明は、様々なヒトの障害及び/又は病気の予防又は治療を対象とした、治療用化合物の製造のための本発明によるポリペプチドの使用にも関する。これらの病気は、障害及び/又はヒトの病気、例えば癌及び腫瘍、感染症、性病、免疫に関連する病気及び/又は自己免疫疾患及び障害、心血管系の病気、代謝系の病気、中枢神経系の病気、並びに化学療法治療に関係した障害であるかもしれない。
【０１４４】
前記癌及び腫瘍は、転移性腎癌を含む癌腫、メラノーマ、濾胞性リンパ腫及び皮膚T細胞型リンパ腫を含むリンパ腫、毛様細胞性白血病、慢性リンパ球性白血病及び慢性骨髄性白血病を含む白血病、肝臓、頸部、頭部及び腎臓の癌、多発性骨髄腫、カルチノイド腫瘍、並びにAIDSの場合のカポジ肉腫を含む、免疫欠陥に続いて現れる腫瘍を含む。
【０１４５】
前記感染症は、慢性B及びC型肝炎及びHIV/AIDSを含むウイルス感染、感染性肺炎、並びに、例えば陰部疣贅を含む性病を含む。
【０１４６】
前記の免疫学的及び自己免疫学的に関連する病気は、組織又は臓器移植片の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病、並びに潰瘍性大腸炎を含む。
前記代謝系の病気は、肥満症のような免疫に関係しない病気を含む。
前記中枢神経系の病気は、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症及びうつ病を含む。
【０１４７】
前記の病気及び障害は、外傷の治癒、透析患者の貧血及び骨粗鬆症をも含む。
好ましくは、本発明によるポリペプチドは、様々なヒトの障害及び/又は病気、例えば慢性B及びC型肝炎のような特定のウイルス感染症、毛様細胞性白血病及び慢性骨髄性白血病のような白血病、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、カルチノイド腫瘍、悪性黒色腫、転移性腎癌、アルツハイマー病、パーキンソン病、並びにAIDSの場合に免疫欠陥に続いて現れる腫瘍、例えばカポジ肉腫、そして陰部疣贅又は性病の予防又は治療を対象とした治療用化合物の製造のために使用することもできる。
【０１４８】
本発明によるポリペプチドを得ることを可能にする特定の化合物、並びに当該ポリペプチドから得られる又はそれにより同定される化合物は、同じく、すなわち治療用化合物として、人体の治療のための処置に使用することができる。
【０１４９】
こういうわけで、本発明は、目的のために、活性作用物質として先に定義されたコーディングSNPの少なくとも1つを含む本発明によるポリヌクレオチド、先に定義された組み換えベクター、先に定義された宿主細胞、及び/又は先に定義された抗体を含む薬剤をも有する。
【０１５０】
本発明は、様々なヒトの障害及び/又は病気の予防又は治療を対象とした薬剤の製造のための、先に定義されたコーディングSNPの少なくとも1つを含む本発明によるポリヌクレオチド、先に定義された組み換えベクター、先に定義された宿主細胞、及び/又は先に定義された抗体の使用にも関する。これらの病気は、障害及び/又はヒトの病気、例えば癌及び腫瘍、感染症、性病、免疫に関連する病気及び/又は自己免疫疾患及び障害、心血管系の病気、代謝系の病気、中枢神経系の病気、並びに化学療法治療に関係した障害であるかもしれない。
【０１５１】
前記癌及び腫瘍は、転移性腎癌を含む癌腫、メラノーマ、濾胞性リンパ腫及び皮膚T細胞型リンパ腫を含むリンパ腫、毛様細胞性白血病、慢性リンパ球性白血病及び慢性骨髄性白血病を含む白血病、肝臓、頸部、頭部及び腎臓の癌、多発性骨髄腫、カルチノイド腫瘍、並びにAIDSの場合のカポジ肉腫を含む、免疫欠陥に続いて現れる腫瘍を含む。
【０１５２】
前記感染症は、慢性B及びC型肝炎及びHIV/AIDSを含むウイルス感染、感染性肺炎、並びに、例えば陰部疣贅を含む性病を含む。
前記の免疫学的及び自己免疫学的に関連する病気は、組織又は臓器移植片の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病、並びに潰瘍性大腸炎を含む。
【０１５３】
前記代謝系の病気は、肥満症のような免疫に関係しない病気を含む。
前記中枢神経系の病気は、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症及びうつ病を含む。
【０１５４】
前記の病気及び障害は、外傷の治癒、透析患者の貧血及び骨粗鬆症をも含む。
好ましくは、本発明は、様々なヒトの障害及び/又は病気、例えば慢性B及びC型肝炎のような特定のウイルス感染症、毛様細胞性白血病及び慢性骨髄性白血病のような白血病、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、カルチノイド腫瘍、悪性黒色腫、転移性腎癌、アルツハイマー病、パーキンソン病、並びにAIDSの場合に免疫欠陥に続いて現れる腫瘍、例えばカポジ肉腫、そして陰部疣贅又は性病の予防又は治療を対象とした薬剤の製造のための、先に定義されたコーディングSNPの少なくとも1つを含む本発明によるポリヌクレオチド、先に定義された組み換えベクター、先に定義された宿主細胞、及び/又は先に定義された抗体の使用に関係する。
【０１５５】
活性な作用物質として有用な、本発明のポリペプチド及び他の化合物の投与量は、化合物の選択、治療のための適応、投与方式、製剤の性質、患者の性質及び医者の判断に依存する。
【０１５６】
活性な作用物質として使用される時、本発明によるポリペプチドは、一般に1〜100 μg/kg患者の範囲の服用量で投与される。
【０１５７】
本発明は、目的として、活性な作用物質として、先に触れた化合物、例えば本発明によるポリペプチド、先に定義されたSNPの少なくとも1つを含む本発明によるポリヌクレオチド、先に定義された組み換えベクター、先に定義された宿主細胞、及び/又は先に定義された抗体の少なくとも1つ、並びに医薬として許容される賦形剤を含む医薬組成物をも有する。
【０１５８】
これらの医薬組成物において、活性な作用物質は、有利には生理学的に有効な服用量で存在する。
【０１５９】
これらの医薬組成物は、例えば固体又は液体でありことができ、そしてヒトの薬剤に現在使用されている医薬形態、例えば単純な又は表面を覆われている錠剤、ゲルカプセル、顆粒剤、カラメル、坐剤、及び、好ましくは注射可能な製剤及び注射可能な粉末であることができる。これらの医薬形態は、通常の方法に従って調製されることができる。
【０１６０】
活性な作用物質は、通常医薬組成物に使用される賦形剤、例えば滑石、アラビアゴム、ラクトース、スターチ、デキストロース、グリセロール、エタノール、ステアリン酸マグネシウム、ココアバター、水性又は非水性溶媒、動物又は野菜起源の脂肪質物質、パラフィン系誘導体、グリコール、様々な湿潤剤、分散剤又は乳化剤、保存剤に組み込むことができる。
【０１６１】
本発明による活性な作用物質は、単独で、あるいは、例えば治療用化合物、例えば他のサイトカイン、例えばインターロイキン又はインターフェロンのような他の化合物との組み合わせ物として使用することができる。
【０１６２】
医薬組成物の様々な製剤が、投与の方式に従って適合させられる。
医薬組成物は、当業者に知られる様々な投与経路によって投与されうる。
同様に、本発明は、目的のために、活性な作用物質として、先に触れた化合物、例えば本発明によるポリヌクレオチド、本発明によるポリペプチドの全体又は一部、先に定義された組み換えベクター、先に定義された宿主細胞、及び/又は先に定義された抗体の少なくとも1つ、並びに好適な医薬として許容される賦形剤を含む診断用組成物を有する。
【０１６３】
当該診断用組成物は、例えば診断用組成物で一般に使用されるもの、例えば緩衝剤及び保存剤のような好適な賦形剤を含むかもしれない。
【０１６４】
同様に、本発明は、目的のために、患者における本発明によるポリペプチドの発現又は活性の増加を意図した治療用化合物を調製するための、以下の：
a)  治療として有効な量の本発明によるポリペプチド、及び/又は
b)  本発明によるポリヌクレオチド、及び/又は
c)  先に定義された治療すべき患者からの宿主細胞、
の使用を有する。
よって、本発明のポリペプチドの発現又は活性の増加を必要としている患者を治療するために、いくつかの方法が可能である。
【０１６５】
医薬として許容される賦形剤と一緒に、本発明のポリペプチドの治療としての有効量を患者に投与することが可能である。
【０１６６】
患者への本発明によるポリヌクレオチドの投与によって、本発明のポリペプチドの内性産生を増やすことが同様に可能である。例えば、このポリヌクレオチドは、レトロウイルス発現ベクターに挿入することができる。形質導入された細胞が着目の遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する方法により、本発明のポリペプチドをコードするRNAを含むレトロウイルス・プラスミドベクターに感染した細胞から開始され、そのようなベクターを単離されることができる。Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches, Chapter 20, in Human Molecular Genetics, Strachan and Read, BIOS Scientifics Publishers Ltd (1996)を参照のこと。
【０１６７】
本発明において、好ましくは、例えば先に定義されたコーディングSNPの少なくとも1つを含むポリヌクレオチドが使用される。
【０１６８】
あらかじめ採取され、そして先に記載される本発明によるポリペプチドを発現するために修飾された、彼に帰属するこれらの宿主細胞を、患者に投与することが同様に可能である。
【０１６９】
同様に、本発明は、目的のために、患者における本発明によるポリペプチドの発現又は活性の減少を意図した治療用化合物を調製するための、以下の：
a)  治療として有効量の先に定義された免疫特異的抗体、及び/又は
b)  本発明によるポリペプチドの発現の抑制を可能にするポリヌクレオチド、の使用に関する。
【０１７０】
このように、あるいは医薬として許容される賦形剤との組み合わせ物として、治療として有効量の抑制作用物質及び/又は例えば先に定義された抗体を患者に投与することが可能である。
【０１７１】
同様に、患者への、本発明のポリヌクレオチドの発現を抑制することができる本発明による相補的なポリヌクレオチドの投与によって、本発明のポリペプチドの内性産生を減少させることが可能である。
【０１７２】
好ましくは、例えば先に定義されたコーディングSNPの少なくとも1つを含む相補的なポリヌクレオチドを使用することができる。
【０１７３】
本発明は、患者の予防又は治療向けの薬剤の製造のためのIFNα−21タンパク質の使用にも関係し、上記患者は、上記患者のゲノム中の、ヌクレオチド配列、配列番号1と少なくとも95%の同一性(好ましくは、97%の同一性、より好ましくは99%の同一性、そして特に100%の同一性)をもち、以下のSNPs：c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g、t1265c、t1277cの1つを含む上記ヌクレオチド配列を提供するヌクレオチド配列の存在に結び付いたIFNα−21変異型によって引き起こされた障害又は病気を患っている。
【０１７４】
好ましくは、前記薬剤は、癌及び腫瘍、感染症、性病、免疫に関連する病気及び/又は自己免疫疾患及び障害、心血管系の病気、代謝系の病気、中枢神経系の病気、並びに化学療法治療に関係した障害から成る群から選ばれる病気の1つを予防又は治療するために使用される。
【０１７５】
前記癌及び腫瘍は、転移性腎癌を含む癌腫、メラノーマ、濾胞性リンパ腫及び皮膚T細胞型リンパ腫を含むリンパ腫、毛様細胞性白血病、慢性リンパ球性白血病及び慢性骨髄性白血病を含む白血病、肝臓、頸部、頭部及び腎臓の癌、多発性骨髄腫、カルチノイド腫瘍、並びにAIDSの場合のカポジ肉腫を含む、免疫欠陥に続いて現れる腫瘍を含む。
【０１７６】
前記感染症は、慢性B及びC型肝炎及びHIV/AIDSを含むウイルス感染、感染性肺炎、並びに、例えば陰部疣贅を含む性病を含む。
【０１７７】
前記の免疫学的及び自己免疫学的に関連する病気は、組織又は臓器移植片の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病、並びに潰瘍性大腸炎を含む。
【０１７８】
前記代謝系の病気は、肥満症のような免疫に関係しない病気を含む。
前記中枢神経系の病気は、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症及びうつ病を含む。
前記の病気及び障害は、外傷の治癒、透析患者の貧血及び骨粗鬆症をも含む。
【０１７９】
本発明のSNPsを含む、IFNα−21ポリペプチドの模倣化合物
本発明は、以下のポリペプチド：
a)  アミノ酸配列、配列番号2、又は
b)  アミノ酸配列、配列番号2の24位と189位の間に包含されるアミノ酸を含むアミノ酸配列；
のそれと実質的に類似した生物活性をもつ新しい化合物とも関係する、
ただし、a)及びb)下のアミノ酸配列はSNP K179Eを含む。
前記生物活性は、実験の項に記載されるとおり、例えば樹状細胞成熟を刺激する能力、CD4＋又はCD8＋ Tリンパ球によるサイトカイン放出、単球によるサイトカイン放出、インビトロ又はインビボにおける抗ウイルス活性、Daudiバーキット細胞系に対する細胞抗増殖性活性、TF−1細胞系に対する細胞抗増殖性活性を計測することによって評価されうる。
【０１８０】
実験の項で触れられるように、K179E変異IFNα−21は、以下の点：
・  K179E変異IFNα−21は、樹状細胞成熟を刺激するより高い能力を有する；
・  K179E変異IFNα−21は、CD4＋又はCD8＋ Tリンパ球によるIFN−ガンマ放出を刺激するより高い能力を有する；
・  K179E変異IFNα−21は、野生型IFNα−2のそれより低い、VSVに感染した細胞培養における抗ウイルス活性を有する、
で野生型IFNα−2と異なる。
実験の項で触れられるとおり、K179E変異IFNα−21は、天然の野生型IFNα−21のそれよりわずかに低い、Daudiバーキット細胞系に対する細胞抗増殖性活性を有する。
【０１８１】
同様に実験の項で触れられるとおり、K179E変異IFNα−21は、野生型IFNα−2のそれと類似したTF−1細胞系に対する細胞抗増殖性活性を有し、そして野生型IFNα−2のそれと類似したEMCVマウス・モデルの抗ウイルス活性を有する。
例えば先に定義されるような本発明の新しい化合物は、K179E変異IFNα−21のそれと実質的に類似した生物活性を有する。
【０１８２】
前記化合物は、検討された生物活性の種類に従い、K179E変異IFNα−21のそれより低いか又は高くても生物活性を有するかもしれない。
例えば、前記化合物は、生化学的化合物、例えばポリペプチド又はペプチド、例えば有機化合物、例えば合成ペプチド模倣体であるかもしれない。
本発明は、先に定義されている化合物の同定のための、K179E SNPを含む本発明のポリペプチドの使用にも関係する。
【０１８３】
本発明は、以下のステップ：
a)  例えば、試験すべき化合物の生物活性、例えば樹状細胞の成熟、CD4＋又はCD8＋ Tリンパ球によるサイトカイン放出、単球によるサイトカイン放出、インビトロ又はインビボにおける抗ウイルス活性、Daudiバーキット細胞系に対する細胞抗増殖性活性を測定し、
b)  以下の：
i)  試験すべき化合物のステップa)で測定された活性、と
ii)  アミノ酸配列、配列番号2又はアミノ酸配列、配列番号2の24位と189位の間に包含されるアミノ酸を含むアミノ酸配列のポリペプチドの活性；
ただし、上記アミノ酸配列はK179E SNPを含む；
を比較し、そして
c)  ステップb)で実行された比較を基礎として、試験すべき化合物が、アミノ酸配列、配列番号2のポリペプチド又はアミノ酸配列、配列番号2の24位と189位の間に包含されるアミノ酸を含むアミノ酸配列のそれと比較して実質的に類似しているか、又は高い若しくは低い活性を有するかどうかを決定する；
ただし、上記アミノ酸配列はK179E SNPを含む、
を含む本発明の化合物の同定方法にも関係する。
【０１８４】
好ましくは、試験すべき化合物は、アミノ酸配列、配列番号2のポリペプチド、又はアミノ酸配列、配列番号2の24位と189位の間に包含されるアミノ酸を含むアミノ酸配列のそれと同じ3次元構造をもつように、合成ペプチド・コンビナトリアル・ライブラリー、高性能スクリーニングから前もって同定されるか、あるいはコンピューターを用いたドラッグデザインによって設計される；ただし、上記アミノ酸配列はK179E SNPを含む。
【０１８５】
本発明は、以下のポリペプチド：
a)  アミノ酸配列、配列番号2、又は
b)  アミノ酸配列、配列番号2の24位と189位の間に包含されるアミノ酸を含むアミノ酸配列；
のそれと実質的に類似した生物活性をもつ新しい化合物とも関係する、
ただし、a)及びb)下のアミノ酸配列はSNP Q114H及びV127Dを含む。
前記生物活性は、実験の項に記載されるとおり、例えば樹状細胞成熟を刺激する能力、CD4＋又はCD8＋ Tリンパ球によるサイトカイン放出、単球によるサイトカイン放出、インビトロ又はインビボにおける抗ウイルス活性、Daudiバーキット細胞系に対する細胞抗増殖性活性、TF−1細胞系に対する細胞抗増殖性活性を計測することによって評価されうる。
【０１８６】
実験の項で触れられるように、SNPs Q114H及びV127Dの両者を含むIFNα−21(この二重変異を以降「Q114H/V127D」と呼ぶ)は、以下の点：
・  Q114H/V127D変異IFNα−21は、CD4＋又はCD8＋ Tリンパ球によるIFN−ガンマ放出を刺激するより高い能力を有する；
・  Q114H/V127D変異IFNα−21は、VSVに感染した細胞培養におけるより低い抗ウイルス活性を有する、
で野生型IFNα−2と異なる。
【０１８７】
実験の項で触れられるとおり、Q114H/V127D変異IFNα−21は、天然の野生型IFNα−21のそれよりも低い、Daudiバーキット細胞系に対する細胞抗増殖性活性を有する。
同様に実験の項で触れられるとおり、Q114H/V127D変異IFNα−21は、野生型IFNα−2のそれと類似したEMCVマウス・モデルの抗ウイルス活性、野生型IFNα−2のそれと類似したIL−10、IL−12及びTNF−α放出を刺激する能力、並びに野生型IFNα−2のそれと類似したTF−1細胞系に対する細胞抗増殖性活性を有する。
例えば先に定義されるような本発明の新しい化合物は、Q114H/V127D変異IFNα−21のそれと実質的に類似した生物活性を有する。
【０１８８】
前記化合物は、検討された生物活性の種類に従い、Q114H/V127D変異IFNα−21のそれより低いか又は高くても生物活性を有するかもしれない。
例えば、前記化合物は、生化学的化合物、例えばポリペプチド又はペプチド、例えば有機化合物、例えば合成ペプチド模倣体であるかもしれない。
本発明は、先に定義されている化合物の同定のための、Q114H/V127D SNPを含む本発明のポリペプチドの使用にも関係する。
【０１８９】
本発明は、以下のステップ：
a)  例えば、生物活性、例えば樹状細胞の成熟、CD4＋又はCD8＋ Tリンパ球によるサイトカイン放出、単球によるサイトカイン放出、インビトロ又はインビボにおける抗ウイルス活性、Daudiバーキット細胞系に対する細胞抗増殖性活性を測定し、
b)  以下の：
i)  試験すべき化合物のステップa)で測定された活性、と
ii)  アミノ酸配列、配列番号2又はアミノ酸配列、配列番号2の24位と189位の間に包含されるアミノ酸を含むアミノ酸配列のポリペプチドの活性；
ただし、上記アミノ酸配列はQ114H/V127D SNPを含む；
を比較し、そして
c)  ステップb)で実行された比較を基礎として、試験すべき化合物が、アミノ酸配列、配列番号2のポリペプチド又はアミノ酸配列、配列番号2の24位と189位の間に包含されるアミノ酸を含むアミノ酸配列のそれと比較して実質的に類似しているか、又は高い若しくは低い活性を有するかどうかを決定する；
ただし、上記アミノ酸配列はQ114H/V127D SNPを含む、
を含む本発明の化合物の同定方法にも関係する。
【０１９０】
好ましくは、試験すべき化合物は、アミノ酸配列、配列番号2のポリペプチド、又はアミノ酸配列、配列番号2の24位と189位の間に包含されるアミノ酸を含むアミノ酸配列のそれと同じ3次元構造をもつように、合成ペプチド・コンビナトリアル・ライブラリー、高性能スクリーニングから前もって同定されるか、あるいはコンピューターを用いたドラッグデザインによって設計される；ただし、上記アミノ酸配列はQ114H/V127D SNPを含む。
【０１９１】
化合物を同定及び設計する方法は、当業者に周知である。
これらの方法に言及する刊行物は、例えば以下のものである：
−  Silverman R.B. (1992). "Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action" Academic Press, 1st edition (January 15,1992).
【０１９２】
−  Anderson S and Chiplin J. (2002). "Structural genomics; shaping the future of drug  design" Drug Discov. Today. 7(2): 105-107.
【０１９３】
−  Selick HE, Beresford AP, Tarbit MH. (2002). "The emerging importance of predictive  ADME simulation in drug discovery". Drug Discov. Today. 7(2): 109-116.
【０１９４】
−  Burbidge R, Trotter M, Buxton B, Holden S. (2001). "Drug design by machine learning: support vector machines for pharmaceutical data analysis". Comput. Chem. 26(1): 5-14.
【０１９５】
−  Kauvar L.M. (1996). "Peptide mimetic drugs: a comment on progress and prospects" 14(6): 709.
【０１９６】
好ましくは、本発明の化合物は、癌及び腫瘍、感染症、性病、免疫に関連する病気及び/又は自己免疫疾患及び障害、心血管系の病気、代謝系の病気、中枢神経系の病気、並びに化学療法治療に関係した障害から成る群から選ばれる病気の1つの予防又は治療を対象とした薬剤の製造のために使用される。
【０１９７】
前記癌及び腫瘍は、転移性腎癌を含む癌腫、メラノーマ、濾胞性リンパ腫及び皮膚T細胞型リンパ腫を含むリンパ腫、毛様細胞性白血病、慢性リンパ球性白血病及び慢性骨髄性白血病を含む白血病、肝臓、頸部、頭部及び腎臓の癌、多発性骨髄腫、カルチノイド腫瘍、並びにAIDSの場合のカポジ肉腫を含む、免疫欠陥に続いて現れる腫瘍を含む。
【０１９８】
前記感染症は、慢性B及びC型肝炎及びHIV/AIDSを含むウイルス感染、感染性肺炎、並びに、例えば陰部疣贅を含む性病を含む。
【０１９９】
前記の免疫学的及び自己免疫学的に関連する病気は、組織又は臓器移植片の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病、並びに潰瘍性大腸炎を含む。
【０２００】
前記代謝系の病気は、肥満症のような免疫に関係しない病気を含む。
前記中枢神経系の病気は、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症及びうつ病を含む。
【０２０１】
前記の病気及び障害は、外傷の治癒、透析患者の貧血及び骨粗鬆症をも含む。
本発明の化合物は、例えば慢性B及びC型肝炎のような特定のウイルス感染症、毛様細胞性白血病及び慢性骨髄性白血病のような白血病、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、カルチノイド腫瘍、悪性黒色腫、転移性腎癌、アルツハイマー病、パーキンソン病、並びにAIDSの場合に免疫欠陥に続いて現れる腫瘍、例えばカポジ肉腫、そして陰部疣贅又は性病から成る群から選ばれる病気の1つの予防又は治療を対象とした薬剤の製造のために使用される。
【実施例】
【０２０２】
実験の項
実施例1．SNP c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204gを含むヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチドによってコードされたタンパク質、及び野生型基準遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされたタンパク質のモデリング
【０２０３】
最初のステップにおいて、その構造体がPDBデータベース(コード1ITF)で入手可能なIFNα−2のそれから開始し、そしてソフトウェアModeler(MSI, San Diego, CA)を使用することによって、IFNα−21の3次元構造を構築した。
【０２０４】
次に、成熟ポリペプチド断片を、変異A19G、Q79K、Q91H、V104D、C139stop及びK156Eを再現するようなやり方で修飾した。
プログラムAMBER及びDISCOVER(MSI：Molecular Simulations 社)を使用することによってこの変異断片に対して1000分子の最小化ステップを行った。
2分子の動力的計算の実行を同じプログラム及び同じ力場を用いて実行した。
各々のケースにおいて、50,000のステップを300 °Kで計算し、そして300の平衡ステップで終わらせた。
このモデリングの結果を図1、2、3、4及び5に表す。
【０２０５】
実施例2．個体集団内のSNPs c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204gの遺伝子型解析
SNPsの遺伝子型解析は、産物を蛍光偏光の読み取りによって検出するミニ配列決定の原理に基づく。この技術は、蛍光性ミニ配列決定(FP-TDI Technology又はFluorescence Polarization Template-direct Dye-terminator Incorporation)から成る。
【０２０６】
ミニ配列決定を、集団の各々の個体のゲノムDNAからPCRによって増幅された産物に対して実施する。このPCR産物を、それが遺伝子型解析すべきSNPを含む遺伝子領域を網羅するようなやり方で選ぶ。使用されなかったPCRプライマー及び取り込まれなかったdNTPsの除去後に、ミニ配列決定を実行する。
【０２０７】
ミニ配列決定は、ポリメラーゼ酵素及び蛍光標識ジデオキシヌクレオチドを使用することによって、SNP部位のすぐ上流に配置されたオリゴヌクレオチド・プライマーを伸長することから成る。この伸長過程から得られた産物を、蛍光偏光の読み取りによって直接的に分析する。
【０２０８】
これらのステップの全て、並びに読み取りは、同じPCRプレート内で実行される。
このように、遺伝子型解析は、以下の5ステップ：
1)PCRによる増幅
2)酸素の消化によるPCR産物の精製
3)オリゴヌクレオチド・プライマーの伸長
4)読み取り
5)読み取りの解釈
を必要とする。
遺伝子型解析のステップ1及び2を、SNPs c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204gの各々について同じ条件で実行する。ステップ3、4及び5は、これらの多型の各々に特有である。
【０２０９】
1)IFNα−21遺伝子のヌクレオチド配列のPCR増幅を、民族的に様々な出身の268個体由来のゲノムDNAから開始し実行される。
これらのゲノムDNAは、アメリカ合衆国のCoriell Instituteによって提供された。
268の個体は、以下のとおり分類される：
【０２１０】
【表１】
2005503121.tif 000002
【０２１１】
これらの個体の各々から生じるゲノムDNAがサンプルを構成する。
全てのSNPsについて、以下のプライマーから開始して、PCR増幅を実行する：
配列番号5：センス・プライマー：GGTTCAAGGTTACCCATCTC
配列番号6：アンチセンス・プライマー：TTTGAAATGGCAGAAGTCAT
これらのヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列、配列番号1の第620ヌクレオチドから第1315ヌクレオチドまでの696ヌクレオチドの長さの断片の増幅をもたらす。
【０２１２】
各々のSNPについて、前記PCR産物が、ミニ配列決定のための鋳型の役割をする。
PCR反応の総反応量は、1点のサンプルにつき5 μlである。
この反応量は、以下の表に示された試薬から構成される：
【０２１３】
【表２】
2005503121.tif 000003
【０２１４】
これらの試薬を、ABGene製の384ウェルをもつ黒いPCRプレート(ref：TF−0384−k)中に分配する。このプレートを、シールし、遠心分離し、次に384ウェルプレートをサーモサイクラー(MJ ResearchのTetrad)に配置し、そして以下のインキュベーション：PCRサイクル：94℃で1分、続いて3ステップ(94℃で15秒、56℃で30秒、、68℃で1分)から成るサイクルを36サイクル、を受ける。
【０２１５】
2)次に、PCR増幅産物を、2つの酵素る：エビ・アルカリホスファターゼ(SAP)及びエキソヌクレアーゼI(Exo I) を使って精製す。これらの酵素の最初のものは、PCR増幅中に取り込まれなかったdNTPsの脱リン酸化をもたらすのに対し、2番目のものは、1本鎖DNA残基、特にPCR中に使用されなかったプライマーを除去する。
この消化を、PCRプレートの各々のウェルにサンプルにつき5 μlの反応混合物を加えることよって行う。この反応混合物は、以下の試薬から構成される：
【０２１６】
【表３】
2005503121.tif 000004
【０２１７】
添加後、プレートをシールし、遠心分離し、次に384ウェルプレートをサーモサイクラー(MJ ResearchのTetrad)に配置し、以下のインキュベーション：消化SAP−EXO：37℃で45分、80℃で15分、を受ける。
【０２１８】
次に、準備されたサンプルにつき5 μlの反応混合物の添加によって消化されたPCR産物による、伸長又はミニ配列決定ステップを実行する。
ミニ配列決定3)、及び読み取りステップ4)、及び読み取りの解釈5)は、SNP c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204gの各々に特有である。
これらのステップの全てを、これらの多型の各々のために使用した特有の条件を要約して以下に説明する。
【０２１９】
3)ミニ配列決定(Minisequencing)
遺伝子型解析に必要な2つのミニ配列決定プライマーの配列を、本発明によるSNP部位の上流に位置するヌクレオチド配列に相当するという手段により決定する。従って、2本鎖DNA産物である、SNPを含むPCR産物をの遺伝子型解析は、センス鎖又はアンチセンス鎖において行われる。選ばれたプライマーは、Life Technologies 社により製造される。
【０２２０】
以下の表は、各々のSNPに関する、検討したミニ配列決定プライマーの配列、及び遺伝子型解析のために維持された最適条件を示す：
【０２２１】
【表４】
2005503121.tif 000005
【０２２２】
最初に、SNPsのミニ配列決定は、16サンプルに関する正当性を立証し、その後の個体集団のセットに関する遺伝子型解析は268の個体及び10の対照から構成された。
次に、以下の表に示されるように、伸長又はミニ配列決定ステップを実行する：
【０２２３】
【表５】
2005503121.tif 000006
【０２２４】
添加後、プレートをシールし、遠心分離し、次に384ウェルプレートをサーモサイクラー(MJ ResearchのTetrad)に配置し、以下のインキュベーション：伸長サイクル：93℃で1分、続く2ステップ(93℃で10秒、55℃で30秒)から成るサイクルを35サイクル、を受ける。
【０２２５】
サーモサイクラーの最後のステップ後に、LJL Biosystems 社製のAnalyst(登録商標)HT型の蛍光偏光リーダー上に、このプレートを直接置く。2つの方法を使用することによってCriterion Host(登録商標)ソフトウェアを使ってプレートを読み取る。最初のものは、このフルオロフォア(励起550−10nm、発光580−10nm)に特有の発光及び励起フィルターを使用することによってTamra標識塩基の読み取りを可能にし、そして第2のものは、このフルオロフォア(励起490−10nm、発光520−10nm)に特有の励起及び発光フィルターを使用することによってR110標識塩基の読み取りを可能にする。2つの場合において、二色性ダブル・ミラー(R110/Tamra)が使用されて、他の読み取りパラメーターは以下のとおりである：
【０２２６】
Z−高：1.5 mm
アテニュエーター：アウト
積分時間：100,000 μsec.
未加工データ単位：カウント/秒
スイッチ偏光：ウェル単位
プレート修正時間：0 msec.
PMT設定：Smart Read(＋)、感度2
動的偏光子：発光
静的偏光子：S
【０２２７】
このように、Tamraフィルター及びR110フィルターに関するmP(ミリ偏光)の計算値を含むファイル結果を得る。これらのmP値を、以下の公式：
MP＝1000(//−g⊥)/(//＋g⊥)
に従い、平行面(//)及び垂直面(⊥)において得られた強度値から開始して計算する。
この計算において、値⊥は、因子gによって加重される。あらかじめ実験的に測定されなければならない設備パラメーターである。
【０２２８】
4)及び5)読み取りの解釈及び遺伝子型の決定。
mP値を、マイクロソフト社のExcelソフトウェア及び/又はLJL Biosystems社によって開発されたAllele Caller(登録商標)ソフトウェアを使ってグラフにより報告する。
【０２２９】
横軸によりTamra標識塩基のmP値を示し、縦軸によりR110標識塩基のmP値を示す。強いmP値は、このフルオロフォアにより標識された塩基が組み込まれていることを示して、逆に、弱いmP値は、この塩基の取り込みの不存在を明らかにする。
【０２３０】
異なる遺伝子型を有する3つまでの同構造群のヌクレオチド配列が得られる。
Allele Caller(登録商標)ソフトウェアの使用は、表の形式に各々の個体について定義された遺伝子型を直接抽出するために、一旦、様々な群の同定を実行することを可能にする。
【０２３１】
SNPs c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204gについてのミニ配列決定の結果
遺伝子型解析過程の完了後に、ここで検討されたSNPsについて個体集団からの個体の遺伝子型の決定を、先に記載のグラフを使って実行した。
【０２３２】
SNP c794gについて、検討された個体において、遺伝子型は、理論上はホモ接合体CC、又はヘテロ接合体CG、又はホモ接合体GGのいずれかである。実際には、また以下に示すとおり、ホモ接合体遺伝子型GGは個体集団内で検出されない。
【０２３３】
SNP c973aついて、検討された個体において、遺伝子型は、理論上はホモ接合体CC、又はヘテロ接合体CA、又はホモ接合体AAのいずれかである。実際には、また以下に示すとおり、ホモ接合体遺伝子型AAは個体集団内で検出されない。
【０２３４】
SNP g1011cついて、検討された個体において、遺伝子型は、理論上はホモ接合体GG、又はヘテロ接合体GC、又はホモ接合体CCのいずれかである。実際には、また以下に示すとおり、ホモ接合体遺伝子型CCは個体集団内で検出されない。
【０２３５】
SNP t1049aついて、検討された個体において、遺伝子型は、理論上はホモ接合体TT、又はヘテロ接合体TA、又はホモ接合体AAのいずれかである。実際には、また以下に示すとおり、ホモ接合体遺伝子型AAは個体集団内で検出されない。
【０２３６】
SNP t1155aついて、検討された個体において、遺伝子型は、理論上はホモ接合体TT、又はヘテロ接合体TA、又はホモ接合体AAのいずれかである。実際には、また以下に示すとおり、ホモ接合体遺伝子型AAは個体集団内で検出されない。
【０２３７】
SNP a1204gついて、検討された個体において、遺伝子型は、理論上はホモ接合体AA、又はヘテロ接合体AG、又はホモ接合体GGのいずれかである。実際には、また以下に示すとおり、ホモ接合体遺伝子型GGは個体集団内で検出されない。
【０２３８】
個体集団内の測定された遺伝子型分布、並びに検討した6つのSNPsについての異なる対立遺伝子頻度の計算の結果を、以下の表に示す：
【０２３９】
【表６】
2005503121.tif 000007
【０２４０】
【表７】
2005503121.tif 000008
【０２４１】
前述の表において、
−  Nは、個体数を表し、
−  %は、特定の小集団の個体の割合を表し、
−  対立遺伝子頻度は、特定の小集団の変異対立遺伝子の割合を表し、
−  95%ICは、信頼度95%の最小及び最大区間を表す。
SNP c973aについて、例えばアンチセンス鎖に読み込まれた対立遺伝子gは、センス鎖に読み込まれた対立遺伝子cに対応し、かつ、未熟成型IFNα−21タンパク質配列の102位のグルタミン(Q)の存在に関係する、そしてアンチセンス鎖に読み込まれた対立遺伝子tは、センス鎖に読み込まれた対立遺伝子aに対応し、対応するタンパク質の配列中のこの位置のリジン(K)に相当することを明確にすることが必要である。
【０２４２】
系統学的集団による、そしてSNPによるこれらの結果を検討することによって、以下のことに気付いた：
【０２４３】
−  SNP c794gについて、6人のヘテロ接合体個体、CGは、小集団、アフリカ系アメリカ人及び東南アジア人の出身である。
−  SNP c973aについて、4人ヘテロ接合体個体、CAは、小集団、ヨーロッパ系及び非ヨーロッパ系白人の出身である。
−  SNP g1011cについて、唯一のヘテロ接合体個体、GCは、小集団、ヨーロッパ系白人の出身である。
【０２４４】
−  SNP t1049aについて、唯一のヘテロ接合体個体、TAは、小集団、アフリカ系アメリカ人の出身である。
−  SNP t1155aについて、8人のヘテロ接合体個体、TAは、小集団、アフリカ系アメリカ人及びヨーロッパ系白人の出身である。
−  SNP a1204gについて、15人のヘテロ接合体個体、AGは、小集団、アメリカインディアン、ヨーロッパ系及び非ヨーロッパ系白人、メキシコ人、北東アジア人、並びに南アメリカ人の出身である。
【０２４５】
実施例3．酵母による天然の野生型IFNα−21及びA42G、Q102K、Q114H/V127D、K179E変異IFNα−21の発現
a)真核生物発現ベクターpPicZα−topo内への天然の野生型IFNα−21及び変異IFNα−21のクローニング
【０２４６】
天然の野生型IFNα−21及びA42G、Q102K、のQ114H/V127D、K179E変異IFNα−21の成熟部分をコードするヌクレオチド配列を、対応するSNP(s)に関してヘテロ接合体である個体由来のゲノムDNAを鋳型として使用したPCRによって増幅する。
【０２４７】
そのような増幅を可能にするPCRプライマーは以下の：
配列番号19：センス・プライマー：TGTGATCTGCCTCAGACCCAC
配列番号20：アンチセンス・プライマー：TCATTCCTTCCTCCTTAATCTTTCTTG、
である。
PCR産物を、メタノールにより誘導可能なハイブリッド・プロモーターAOX1(TOPO(商標)−cloning;Invitrogen社)の制御下にある真核生物発現ベクターpPicZα−TOPO内に挿入する。
【０２４８】
このベクターは、酵母ピチア・パストリス(Pichia pastoris)による真核生物タンパク質の異種発現を可能にする。
組み換えタンパク質をコードするベクターの領域のヌクレオチド配列の確認後に、このベクターを、Pme1制限酵素によって線状にし、そしてP.パストリス酵母菌株(Invitrogen)をこの組み換え発現ベクターにより形質転換する。
【０２４９】
b)P.パストリスによる異種発現、そして天然の野生型IFNα−21及び変異IFNα−21タンパク質の精製
【０２５０】
200回転/分(rpm)の撹拌、30℃、24〜48時間で、天然の野生型IFNα−21をコードするか、又はA42G、Q102K、Ql14H/V127D若しくはK179E変異IFNα−21をコードするクローンを含む50 mLのBMGY培地(2%のペプトン、1%の酵母エキス、1.34%のYNB、1%のグリセロール、100 mMのリン酸カリウム、0.4 mg/LのビオチンpH6.0)の2つの飽和状態の前培養を実行した。
【０２５１】
前記培養物が飽和細胞密度に達したとき(600 nmの波長で計測された吸光度12に相当する)、これを、5 OD/mLで、250 mLのBMMY培地(2%のペプトン、1%の酵母エキス、1.34%のYNB、0.5%のメタノール、100 mMのリン酸カリウム、0.4 mg/LのビオチンpH6.0)の接種に使用する。
【０２５２】
次に、前記タンパク質の発現を、180 rpmで培養フラスコを撹拌しながら、30℃で24時間、1%の終濃度のメタノールによって誘発する。
【０２５３】
コード配列の上流、「α因子」のシグナルペプチド配列の存在により、タンパク質は、酵母により培地中に分泌される。α因子は自然にプロセッシング中に切断される。
この懸濁液を遠心分離し、前記タンパク質を、得られた上清から開始するHPLCによって精製する。
開始準備ステップにおいて、透析が続く限外濾過(Labscale、5000 Da排除、Millipore)が、50 mMのTris−Cl pH9.0、25 mMのNaClのバッファー中への前記酵母上清の10倍濃縮を可能にする。
【０２５４】
最初のクロマトグラフィー・ステップは、ブルー・セファロース・カラム(Amersham Pharmacia)における親和性によるタンパク質の回収を可能にする。回収した画分中のタンパク質の存在を、一方でSDS-PAGE型電気泳動により、そしてもう一方でIFNα−21タンパク質に対する特異的抗体による免疫検出によって確認する。このステップにおいて、着目のタンパク質の純度は75%より高かった。
【０２５５】
第2の精製ステップにおいて、ゲル濾過は、50 mMのTris pH9.0、25 mMのNaClに対してIFNα−21タンパク質に相当する回収された画分のバッファー交換を可能にする。
【０２５６】
精製の最後のステップは、イオン交換クロマトグラフィー・カラムによるタンパク質の分離から成る。
組み換えタンパク質を含む画分を、あらかじめ50 mMのTris pH9、25 mMのNaClバッファーにより平衡化した陰イオン交換カラム(ResourceQ 6.0 mL、Pharmacia)に投入する。タンパク質の溶出を、50 mMのTris pH9バッファー中の0,025〜1 MのNaClの濃度勾配の移動によって実行する。
着目のタンパク質の純度をSDS/PAGEゲルにより評価し、このタンパク質の濃度を、濃度測定(Quantity one, Biorad)、及びBCAアッセイ(ビシンコニン酸及び硫酸銅、Sigma)によって計測した。
【０２５７】
より大量のタンパク質を製造するために最終的にスケールアップされる、このプロトコールに従って得られた、精製された天然の野生型IFNα−21、並びにA42G、Q102K、Q114H/V127D又はK179E変異IFNα−21タンパク質を以下に記載の機能性の試験のために使用する。
【０２５８】
実施例4．天然の野生型IFNα−21及びA42G、Ql14H/V127D又はK179E変異IFNα−21の免疫調節性活性についての評価
【０２５９】
IFNsタイプI(IFNα及びIFNβ)は、免疫系の特定の機能を調節することができる。それらは、樹状細胞(DC)の成熟を増進させる：MHCクラスI(HLA-ABC)及びII(HLA-DR)分子の発現を高める、Tリンパ球、CD80、CD86及びCD83分子の共同刺激に関与する分子の発現を高める、並びにTリンパ球の刺激機能を高めることが証明された。
【０２６０】
a)  樹状細胞の成熟に対するA42G、Ql14H/V127D又はK179E変異IFNα−21の効果
A42G、Q114H/V127D又はK179E変異IFNα−21の免疫調節性活性を、まず、樹状細胞の成熟において調査し、そして商業的なイントロンA産物の代表として選ばれた野生型IFNα−2のそれと比較した。
【０２６１】
そのために、まず、樹状細胞を、GM-CSF及びIL−4サイトカインの存在下で培養した成熟型末梢血単球から産生した。CD14＋細胞精製キットを使った精製の後に、これらの樹状細胞を、100 ng/mLの野生型IFNα−2、又はA42G、Q114H/V127D若しくはK179E変異IFNα−21の存在下に移し、そしてそれらの表現型を、MHCクラスI及びII分子、並びにCD40、CD80、CD86、CD83及びCD1aマーカーの発現を捜すことを目的とするFACS分析によって測定した。これらの樹状細胞の成熟状態を、無刺激樹状細胞を提供するためにIFNα処理なしに得られたものとも比較した。
【０２６２】
各々のマーカー、及び任意の単位で表された3つの実験条件についての蛍光強度の計測値の中央値を以下の表に示す：
【０２６３】
【表８】
2005503121.tif 000009
【０２６４】
この試験の結果は、K179E変異IFNα−21タンパク質が樹状細胞の成熟を刺激する高い能力を有し、この刺激効果が野生型IFNα−2のそれより高いことを証明する。
【０２６５】
b)  Tリンパ球によるサイトカイン放出に対するQ114H/V127D又はK179E変異IFNα−21の効果
侵襲に対する免疫応答をまねるための強力な抗原(SEB)を伴うか又はそれなしに対応の変異IFNα−21タンパク質の存在下に置かれたTリンパ球によるサイトカイン放出を計測することによって、Q114H/V127D又はK179E変異IFNα−21の免疫調節性活性をも調査した。この試験を、対照として使用され、かつ、イントロンA商品の代表として選ばれた野生型IFNα−2の存在下でも実施した。
【０２６６】
そのために、末梢血単核細胞(PBMC)を健常なドナーから単離し、そして抗CD3及び抗CD28抗体又はSEBを含む好適な培地中で16時間の刺激した。各々の培養中に4 μg/mLの野生型IFNα−2、又はQ114H/V127D若しくはK179E変異IFNα−21を加えた。刺激の後に、Tリンパ球を、抗CD3、抗CD4及び抗CD69抗体、又は抗CD3、抗CD8及び抗CD69抗体により細胞外で標識し、そしてTh1型サイトカイン(IFN-γ)又はTh2型サイトカイン(IL−10)に対して特異的な抗体により細胞内で標識した。蛍光を発する細胞を、FACScalibur及びCellQuestソフトウェアを使って分析した。
【０２６７】
得られた結果は、変異IFNα−21タンパク質及び野生型IFNα−2がIL−10及びIFN-γの放出を刺激せず、したがってSEBの不存在下でTリンパ球を活性化しないことを示す。対照的に、以下の表で示されるように、変異IFNα−21タンパク質及び野生型IFNα−2は、SEBにより活性化されたTリンパ球によるサイトカイン(IL−10及びIFN−γ)の放出を刺激する。この表は、CD4＋Tリンパ球及びCD8＋Tリンパ球についての、それぞれCD4+、CD69＋細胞又はCD8+、CD69＋細胞の割合、並びに全細胞におけるCD69＋細胞の割合として表される、SEBの存在下でのTリンパ球によるサイトカインの放出を表す。
【０２６８】
【表９】
2005503121.tif 000010
【０２６９】
これらの結果は、Q114H/V127D変異IFNα−21及びK179E変異IFNα−21が強力に前もってSEB抗原により活性化されたCD4＋及びCD8＋T−リンパ球によるサイトカイン放出(IFN−γ及びIL−10)を強力に刺激することをはっきりと証明する。この試験において、Tリンパ球によるインターフェロンγ産生は、野生型IFNα−2の存在下よりもQ114H/V127D変異IFNα−21又はK179E変異IFNα−21の存在下でより高かった。
【０２７０】
c)  単球によるサイトカイン放出に対するQ114H/V127D又はK179E変異IFNα−21の効果
最後に、細菌毒性物質(LPS)の不存在下、又は存在下での単球によるサイトカイン放出を計測することによって、Q1I4H/VI27D又はK179E変異IFNα−21の免疫調節性活性を調査した。この試験を、対照として使用され、かつ、イントロンA商品の代表として選ばれた野生型IFNα−2の存在下でも実施した。
【０２７１】
そのために、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を健常なドナーから単離し、そしてそれらの発現型を、CD64+ CD4dim細胞(CD64及びCD4dimは、血中単球に関するマーカーである)の相対的な量を測定するために分析した。一晩の培養後に、これらのPBMCを、培地中、単独(刺激されていない細胞)又はLPSの存在下(刺激された細胞)でインキュベートした。各々の培養中に、4 μg/mLの野生型IFNα−2又は変異IFNα−21を加えた。培養後に、細胞を、抗CD64及び抗CD4dimにより細胞外で標識し、Th1型サイトカイン(TNF-α)、IL−12及びIL−10に対する特異的抗体により細胞内で標識した。
【０２７２】
蛍光を発する細胞を、FACScalibur及びCellQuestソフトウェアを使って分析した。
得られた結果は、LPSの不存在下において、変異IFNα−21タンパク質及び野生型IFNα−2がサイトカイン(IL−10、IL−12及びTNF−α)の放出を刺激しないことを示す。対照的に、以下の表で示されるように、LPSの存在下において、Q114H/V127D及びK179E変異IFNα−21タンパク質及び野生型IFNα−2は、単球によるサイトカイン(IL−10、IL−12及びTNF−α)の放出を刺激する。この表は、CD64＋ CD4dim細胞の割合、並びに全細胞におけるCD4dim CD64＋細胞の割合として表される、LPSの存在下での単球によるサイトカインの放出を表す。
【０２７３】
【表１０】
2005503121.tif 000011
【０２７４】
実施例5．A42G、Q102K、Q114H/V127D及びK179E変異IFNα−21の抗増殖性活性の評価
a)  ヒト・リンパ芽球のDaudiバーキット細胞系の増殖において
これらの試験を、A42G、Q102K、Q114H/V127D及びK179E変異IFNα−21タンパク質、並びに野生型IFNα−21タンパク質において実行する。あらかじめRPMI1640培地(10%の胎仔ウシ血清及び2 mMのL−グルタミンを補足)中で培養された細胞(ヒトDaudiバーキット・リンパ腫細胞系、以降「Daudi細胞」と呼ぶ)を、4.104の細胞/ウェルの細胞密度で96ウェルプレート中に接種する。
【０２７５】
各々のウェルにおいて、Daudi細胞を、高められた濃度の変異又は野生型IFNα−21タンパク質のいずれかとの接触状態に置く。特徴づけるべき各々のIFNα−21について、0.003 pM〜600 nMの終濃度を試験する。
【０２７６】
次に、Daudi細胞を5%のCO2下、37℃で66時間インキュベートし、その後Uptiblue試薬(Uptima)を前記培養物に加える。4時間のさらなるインキュベーション期間の後に、590 nm(励起560 nm)で、発光される蛍光を計測することによって細胞増殖速度を定量する。
変異又野生型IFNα−21の抗増殖性活性は、細胞成長の50%を抑えるIFNα−21濃度に相当するIC50の計測値に基づく。
【０２７７】
各々の実験条件について、少なくとも3つの実験を3重で実行し、それは、各々のIFNα−21に関する平均IC50値の測定を可能にする。変異タンパク質のIC50の値、割る野生型タンパク質の値に相当する比率が、比較を可能にする。結果を以下の表にまとめる(括弧内は標準偏差を意味する)：
【０２７８】
【表１１】
2005503121.tif 000012
【０２７９】
この試験は、Daudi細胞に対するA42G、Q114H/V127D及びK179E変異IFNα−21タンパク質の細胞抗増殖性活性が、野生型IFNα−21のそれより低いことを証明する。特にDaudi細胞に対する細胞抗増殖性活性は、野生型IFNα−21に比べてQ114H/V127D IFNα−21の存在下で、約10〜16倍低い。
【０２８０】
b)TF−1赤白血病細胞系において
TF−1赤白血病細胞系に対するA42G、Q114H/V127D及びK179E変異IFNα−21の効果をも評価した。この試験を、対照として使用され、かつ、イントロンA商品の代表として選ばれた野生型IFNα−2の存在下でも実施した。
そのために、TF−1細胞を、高められた濃度の変異IFNα−21又は野生型IFNα−2(0.001〜1000 ng/mL)との接触状態に置き、そして細胞増殖を計測した。
【０２８１】
前記結果を、細胞増殖の30%を抑制するIFN-α濃度に相当するIC30として表し、以下の表にでまとめる：
【０２８２】
【表１２】
2005503121.tif 000013
【０２８３】
これらのデータは、3つの変異IFNα−21がTF−1細胞に対して弱い抗増殖性効果を有し、そしてこの効果は、野生型IFNα−2のそれと類似していることを示し、A42G、Q114H/V127D及びK179E変異IFNα−21の血液毒性が野生型IFNα−2のそれより優れていないことを示唆する。
【０２８４】
実施例6．A42G、Q114H/V127D及びK179E変異IFNα−21の抗ウイルス活性についての評価
IFNsは、抗ウイルス防衛において重要な役割を担っている。以下のように、IFN抗ウイルス活性は、部分的に以下のIFNs誘導酸素系による：
【０２８５】
−  アデノシン・オリゴマー合成を触媒する酵素である、2'5'オリゴアデニレート・シンテターゼ。これらのオリゴマーは、一旦活性化するとウイルス性RNAを破壊するエンドリボヌクレアーゼであるRNase Lを活性化する。
−  ウイルス性転写物の合成及び/又は成熟を抑制するMxタンパク質(GTPases)。この活性は、主にインフルエンザウイルスに発揮される。
−  2本鎖RNAによって活性化されるPKRタンパク質(又はp68キナーゼ)。活性化されたPKRは、タンパク質合成を抑制する。
【０２８６】
IFNs抗ウイルス活性は、他の機構、例えばレトロウイルスの場合、細胞内へのウイルス粒子の侵入、複製、結合、粒子の退出、そしてウイルス粒子の感染力の抑制に関して誘発されもする。
【０２８７】
最後に、IFNsは、免疫系の特定の機能を調節することによって、特に細胞介在(特に、MHCクラスI及びII分子の増加、IL−12及びIFN-γ産生の増加、CTL活性の上昇を含む)への応答を助けることによって間接的な抗ウイルス活性を発揮する。
【０２８８】
A42G、Q114H/V127D及びK179E変異IFNα−21の抗ウイルス活性を、インビトロで細胞培養により、インビボでマウス・モデルにより評価した。両試験を、対照として使用され、かつ、イントロンA商品の代表として選ばれた野生型IFNα−2と平行して実行した。
【０２８９】
a)  細胞培養によるインビトロにおける抗ウイルス活性
このアッセイは、水疱性口内炎ウイルス(VSV)を使った細胞培養によりA42G、Q114H/V127D及びK179E変異IFNα−21、並びに野生型IFNα−2の抗ウイルス活性についての評価を可能にする。
【０２９０】
そのために、WISHヒト上皮細胞を、下げられた濃度の変異IFNα−21及び野生型IFNα−2の存在下で24時間培養する。次に、細胞をさらに24〜48時間、水疱性口内炎(VSV)ウイルスによって感染させ、そして細胞の溶解を計測する。
試験された様々なIFNαの抗ウイルス効果を、VSVによって誘発された細胞溶解の50%を抑制するIFN濃度に相当するIC50値を比較することによって測定する。
【０２９１】
類似の実験を2回実行し、そして計測された平均IC50値を以下の表に示す：
【０２９２】
【表１３】
2005503121.tif 000014
【０２９３】
このように、VSVに感染した細胞培養において、A42G、Q114H/V127D及びK179E変異IFNα−21は、野生型IFNα−2より低い抗ウイルス活性を有する。
【０２９４】
b)  マウス・モデルによるインビボにおける抗ウイルス活性
このインビボにおける試験を、EMCV(脳心筋炎ウイルス)マウス・モデルにより実施する。
ヒトIFNsは、マウスにおいて服用量依存的な抗ウイルス活性を示し、それは、同量のマウスIFNで示されたものよりおおむね100〜1,000倍少ない(Meister et al. (1986). J. Gen. Virol. 67, 1633-1644)。
【０２９５】
脳心筋炎ウイルス(EMCV)のマウス腹膜内注入は、中枢神経系関連及び脳炎にを特徴とする急速に進行する致命的な病気を発生させる(Finter NB(1973)Front Biol. 2：295−360)。マウス及びヒト・インターフェロン-αは、ともに致命的なEMCV感染に対抗してマウスの保護に有効であることが示された(Tovey and Maury (1999). J. IFN Cytokine Res. 19:145-155)。
【０２９６】
1群20匹の6週齢のスイス・マウスを、100×LD50のEMCVにより腹腔内への注入により(ip)感染させ、そして1時間後、及びその後3日間は1日1回、2μgのA42G、Q114H/V127D及びK179E変異IFNα−21又は野生型IFNα−2製剤により治療した。対照群を、賦形剤だけで治療した動物で行った。動物を、21日間、生存について毎日追跡した。
【０２９７】
結果は、図6に示され、そしてA42G、Q114H/V127D又はK179E変異IFNα−21により治療されたマウスの相対的な生存率は、治療を受けなかったマウスの生存率よりかなり高かったが、しかし野生型IFNα−2により治療されたマウスについて観察されたそれに依然として類似したままであることを示す。
これらの結果の全てが、A42G、Q114H/V127D及びK179E変異IFNα−21が独特の生物学的性質を有することを証明している。
【図面の簡単な説明】
【０２９８】
【図１】SNP c973a(Q79K)を含む本発明によるコード・タンパク質及び天然の野生型IFNα−21タンパク質のモデルを表す。図1Bは、図1Aに表された各々1つのタンパク質の下部についてのモデルの拡大図を表す。
図1A及び1Bにおいて、黒リボンは天然の野生型IFNα−21タンパク質の構造を表し、白リボンはQ79K変異IFNα−21タンパク質の構造を表す。
【図２】SNP g1011c(Q91H)を含む本発明によるコード・タンパク質及び天然の野生型IFNα−21タンパク質のモデルを表す。図2Bは、図2Aに表された各々1つのタンパク質の左部についてのモデルの拡大図を表す。
図2A及び2Bにおいて、黒リボンは天然の野生型IFNα−21タンパク質の構造を表し、白リボンはQ91H変異IFNα−21タンパク質の構造を表す。
【図３】SNP t1049a(V104D)を含む本発明によるコード・タンパク質及び天然の野生型IFNα−21タンパク質のモデルを表す。図3Bは、図3Aに表された各々1つのタンパク質の上部についてのモデルの拡大図を表す。
図3A及び3Bにおいて、黒リボンは天然の野生型IFNα−21タンパク質の構造を表し、白リボンはV104D変異IFNα−21タンパク質の構造を表す。
【図４】SNP t1155a(C139stop)(図4B)を含む本発明によるコード・タンパク質及び天然の野生型IFNα−21タンパク質(図4A)のモデルを表す。図4Cは、図4A及び4Bの2つのタンパク質の重ね合わせを表す。図4において、黒リボンは天然の野生型IFNα−21タンパク質の構造を表し、白リボンはC139stop変異IFNα−21タンパク質の構造を表す。
【図５】SNP a1204g(K156E)を含む本発明によるコード・タンパク質及び天然の野生型IFNα−21タンパク質のモデルを表す。図5Bは、図5Aに表された各タンパク質の上部についてのモデルの拡大図を表す。
図5において、黒リボンは天然の野生型IFNα−21タンパク質の構造を表し、白リボンはK156E変異IFNα−21タンパク質の構造を表す。
【図６】前もってVSVウイルスに感染させた、そしてA42G、Q114H/V127D又はK179E変異IFNα−21タンパク質により治療したマウスの、野生型IFNα−2で治療したもの又は治療していないものと比較した生存率を表す。
この図面において、横軸は生存時間(日間)に相当し、縦軸はVSV感染マウスの相対的な生存率に相当する。黒三角、十字形、黒ダイヤモンドは、それぞれA42G変異IFNα−21、Q114H/V127D変異IFNα−21、及びK179E変異IFNα−21により治療したVSV感染マウスに関するデータを表す。黒四角は、野生型IFNα−2により治療したVSV感染マウスに関するデータを表し、白三角は、治療していないVSV感染マウスに関するデータを表す。
【図６】
2005503121.tif 000015
【国際公開パンフレット】
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2005503121.tif 000017
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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