(57)【要約】少なくとも３個の二重結合を有している不飽和Ｃ１６脂肪酸好ましくはヘキサデカトリエン酸及び／またはその誘導体を含む組成物を外用塗布することから成る、老化肌、敏感肌、乾燥肌、剥落肌、しわ肌及び／または光損傷肌を治療する化粧方法が提供される。本発明はまたこのような化粧的治療効果を与えるための適当な組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）少なくとも３個の二重結合を有している高級不飽和Ｃ１６脂肪酸またはその誘導体の有効量と、および
（ｂ）皮膚科学的に許容されるビヒクルと、
を含む外用組成物。
【請求項２】
前記脂肪酸が３個、４個または５個の二重結合を有している請求項１に記載の化粧組成物。
【請求項３】
前記脂肪酸が３個の二重結合を有している請求項２に記載の化粧組成物。
【請求項４】
前記不飽和Ｃ１６脂肪酸が二重結合配置（ｃ７，ｃ１０，ｃ１３）、（ｃ６，ｃ９，ｃ１２）、（ｃ７，ｔ１１，ｃ１３）または（ｔ８，ｃ１０，ｃ１３）を有している請求項３に記載の化粧組成物。
【請求項５】
前記不飽和Ｃ１６脂肪酸がヘキサデカトリエン酸（Ｃ１６：３（ｃ７，ｃ１０，ｃ１３））である請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記不飽和Ｃ１６脂肪酸がヒドロキシＣ１６不飽和脂肪酸である請求項１から５のいずれか一項に記載の化粧組成物。
【請求項７】
前記組成物が、皮膚の上で加水分解して少なくとも３個の二重結合を有している高級不飽和Ｃ１６脂肪酸を生じ得る単糖または二糖のグリセリンエステルを含有している請求項１から６のいずれか一項に記載の化粧組成物。
【請求項８】
前記単糖または二糖のグリセリンエステルがモノ−またはジガラクトシルグリセリドである請求項７に記載の化粧組成物。
【請求項９】
しわ、たるみ、老化肌及び／または光損傷肌の治療／予防；皮膚中のコラーゲン沈着の増強、皮膚中のデコリン産生の増強、組織修復の増進；皮膚の明色化；障壁形成の増進による皮膚の状態及び弾力性の改善；乾燥肌及び剥落肌の治療；炎症肌、赤み肌及び／または敏感肌の鎮静；肌のきめ、滑らかさ及び／または緻密さの改善、から選択された少なくとも１つのスキンケア効果を提供するために、少なくとも３個の二重結合を有している高級不飽和Ｃ１６脂肪酸及び／またはその誘導体を含む外用組成物を皮膚に塗布することを含む化粧方法。
【請求項１０】
しわ、たるみ、老化肌及び／または光損傷肌の治療／予防；皮膚中のコラーゲン沈着の増強、皮膚中のデコリン産生の増強、組織修復の増進；皮膚の明色化；障壁形成の増進による皮膚の状態及び弾力性の改善；乾燥肌及び剥落肌の治療；炎症肌、赤み肌及び／または敏感肌の鎮静；肌のきめ、滑らかさ及び／または緻密さの改善、から選択された少なくとも１つのスキンケア効果を提供する外用組成物を製造するための少なくとも３個の二重結合を有している高級不飽和Ｃ１６脂肪酸及び／またはその誘導体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも３個の二重結合を有している高級不飽和Ｃ１６脂肪酸、特にヘキサデカトリエン酸の使用を含む皮膚の状態及び外観を改善する化粧組成物及び化粧方法に関する。本発明はまた、皮膚の状態及び外観を改善する外用組成物の製造に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、皮膚科学的異常や苛酷な環境（風、空調、セントラルヒーティング）によって、または、正常な老化過程（加齢老化）によって、衰えを生じ易い。老化は、皮膚を日光に曝すことによって加速される（光老化）。皮膚の外観及び状態を改善する化粧組成物及び化粧方法に対する要望が近年になって著しく増加した。
【０００３】
消費者は、しわ、みぞ、たるみ、色素沈着及び老人斑のような皮膚の加齢老化及び光老化の目に見える徴候を治療または遅延する“老化防止”化粧品を益々求めるようになっている。
【０００４】
消費者はまた、老化防止に加えて化粧品から別の有益な効果を頻りに求めるものである。“敏感肌”という概念も、敏感肌、乾燥肌及び／または剥落肌の外観及び状態を改善し、赤み肌及び／または炎症肌を鎮静する化粧品に対する消費者の要望を高めることになった。消費者はまた、あざ、吹出物、しみ、などを治療する化粧品を望んでいる。
【０００５】
多くの人々が皮膚の色素沈着の程度を気に懸けている。例えば、老人斑または雀斑のある人々は、このような色素沈着斑が目立たないようにと望む。日光に曝されることによって生じた皮膚のくすみを少なくしたり生来の皮膚の色を明るくしたりすることを望む人々もいる。このような要望に応えるために、メラノサイト中の色素産生を抑制する製品を開発する研究が数多く行われてきた。しかしながら、これまでに同定された物質は、例えば、皮膚の刺激のような望ましくない副作用を有する傾向がある。
【０００６】
従って、このような物質は化粧品用途には適していないか、または、皮膚明色化効果が所望の程度に達しないような濃度でしか塗布することができない。異なる種類の皮膚明色化物質の組合せを使用すると、副作用を軽減することはできるが、このような組合せを使用することによって競合作用が生じて皮膚明色化効果も低下するという危険性がかなりある。従って、皮膚明色化用化粧品の有効性を改善すること、特にこのような製品が皮膚を刺激しないようにすることが必要とされている。
【０００７】
最も広い観点から見れば、我々は、好ましくは少なくとも３個の二重結合を有しており、４個または５個の二重結合を有していてもよい高級不飽和Ｃ１６脂肪酸の使用が外用組成物にスキンケア効果を与えるために有効であることを知見した。
【０００８】
我々はここに、しわ、みぞ、たるみ、色素沈着及び老人斑のような加齢老化または光老化による正常な皮膚状態の有効な治療及び予防が、少なくとも３個の二重結合を有している高級不飽和Ｃ１６脂肪酸またはその誘導体を含む化粧組成物を皮膚に塗布することによって得られることを知見した。我々はまた、好ましい態様では少なくとも３個の二重結合を有し得る高級不飽和Ｃ１６脂肪酸を化粧組成物中に使用すると、老化防止に加えて別の効果、敏感肌及び／または炎症肌の鎮静、弾力性の改善、乾燥／剥落の抑制、皮膚の明色化のような別の皮膚有益効果が得られることを知見した。
【発明の開示】
【０００９】
従って本発明の第一の目的によれば、ヒトの皮膚に塗布するための、少なくとも３個の二重結合を有している高級不飽和Ｃ１６脂肪酸を有効量で含む外用組成物が提供される。
【００１０】
本発明に使用するための適当な高級不飽和脂肪酸は、少なくとも３個の二重結合を有しているＣ１６脂肪酸である。４個または５個の二重結合が存在してもよい。
【００１１】
好ましいＣ１６：３脂肪酸はヘキサデカトリエン酸（Ｃ１６：３（ｃ７，ｃ１０，ｃ１３））であり、これはまたヒラゴン酸として知られている。この酸は、例えば、セイヨウアブラナの葉、シダの脂質、イチョウの葉、ジャガイモの葉、トマトの葉及びホウレン草のような光合成を行う葉で産生されることが知られている。また、西洋ワサビ、キャベツ、カブ、中国カラシ、カリフラワー及びクレソンのようなアブラナ科植物の葉で産生され得る。
【００１２】
その他の適当な高級不飽和Ｃ１６脂肪酸として以下の脂肪酸が挙げられる：
ヘキサデカトリエン酸（Ｃ１６：３（ｃ６，ｃ９，ｃ１２））。これは微小藻類Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ  Ｃｏｓｔａｔｕｍから得られる（Ｖｉｒｒｏｎら；Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ４０９（２００），２５７−２６６）；
ヘキサデカテトラエン酸（Ｃ１６：４（ｃ４，ｃ７，ｃ１０，ｃ１３））。この材料はオーストラリア産の海綿Ｃａｌｌｙｓｐｏｎｇｉａ  ｓｐ．から得られる（Ｕｒｂａｎ  ａｎｄ  Ｃａｐａｎ，Ｌｉｐｉｄｓ  ３２（１９９７），６，６７５−７７）；
１０−ヒドロキシヘキサデカトリエン酸（ｃ７，ｔ１１，ｃ１３）。これはＬｅｍｎａ  Ｍｉｎｏｒ（ウキクサ）から得られる（Ｐｒｅｖｉｔｅｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｎａｃｏ，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２２（１９８３），１４４５−１４４６）；
７−ヒドロキシヘキサデカトリエン酸（ｔ８，ｃ１０，ｃ１３）。Ｅｌｏｄｅａ  Ｃａｎｏｄｅｎｓｉｓから得られる（Ｐｒｅｖｉｔｅｒｅら，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４（１９８５），１８３８−１８４０）。この材料はまた１０−ヒドロキシヘキサデカトリエン酸のソースになり得る（上記参照）；
ヘキサデカテトラエン酸（Ｃ１６：４（ｃ６，ｃ９，ｃ１２，ｃ１５））。これは南極海の氷の珪藻類Ｓｔａｕｒｏｎｅｉｓ  ａｍｐｈｉｏｘｙｓから得られる（Ｇｉｌｌｉｎら，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０（１９８１），１９３５−３７）。この材料はまたＣ１６：３（ｃ６，ｃ９，ｃ１２）のソースになり得る；
ヘキサデカペンタエン酸（Ｃ１６：５（ｃ４，ｃ７，ｔ９，ｔ１１，ｃ１３））。これは海中の微小緑藻類Ａｎａｄｙｏｍｅｎｅ  ｓｔｅｌｌａｔａ中に見出される（Ｍｉｋｈａｉｌｏｖａ  ＭＶら，Ｌｉｐｉｄｓ  １９９５，３０，５８３）。
【００１３】
海中の植物プランクトン（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ  ａｎｄ  Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉｕｍ  ｍｉｋｉｍｏｔｏｉ）もまた１２位に二重結合を有している適切なＣ１６：３不飽和脂肪酸を含有すると記載されている（例えばＣ１６：３（ｃ６，ｃ９，ｃ１２），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎｉｐｐｏｎ  Ｓｈｏｋｕｈｉｎ  Ｋａｇａｋｕ  Ｋｏｇａｋｕ  Ｋａｉｓｈｉ  ４６：（１），２９−３３，１９９９）。
【００１４】
適切なＣ１６：３オメガ３脂肪酸（例えば、Ｃ１６：３（ｃ７，ｃ１０，ｃ１３））はまたＣｏｄｉｕｍ  ｓｐ．（微小緑藻類）中に見出される（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４８：（８）１３３５−１３３９，Ａｕｇ．１９９８）。
【００１５】
窒素を固定する遊走生物体であるアナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）及びネンジュモ属（Ｎｏｓｔｏｃ）のシアノバクテリアもＣ１６：４  ｃｉｓ−４及びＣ１６：３  ｃｉｓ−６の脂肪酸の公知のソースである（“Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｒｅｅ  ｌｉｖｉｎｇ  Ａｎａｂａｅｎａ  ａｎｄ  Ｍｏｓｔｏｃ  Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ”，Ｃａｕｄａｌｅｓ  Ｒ．，  Ｗｅｌｌ  Ｊ．Ｍ．，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  ４２：（２）２４６−２５１，Ａｐｒｉｌ  １９９２）。
【００１６】
本発明に使用するための好ましい材料は３個の二重結合を有しているＣ１６脂肪酸である。本発明の組成物に使用するための特に好ましい材料はヘキサデカトリエン酸（Ｃ１６：３（ｃ７，ｃ１０，ｃ１３））である。
【００１７】
本発明の別の目的によれば、しわ、たるみ、老化肌及び／または光損傷肌の治療／予防；皮膚中のコラーゲン沈着の増強、皮膚中のデコリン産生の増強、組織修復の増進；皮膚の明色化；障壁形成の増進による皮膚の状態及び弾力性の改善；乾燥肌及び剥落肌の治療；炎症肌、赤み肌及び／または敏感肌の鎮静；肌のきめ、滑らかさ及び／または緻密さの改善、から選択された少なくとも１つのスキンケア効果を与えるために、高級不飽和Ｃ１６脂肪酸及び／またはその誘導体を含む外用組成物を皮膚に塗布することを含む化粧方法が提供される。
【００１８】
本発明はまた、しわ、たるみ、老化肌及び／または光損傷肌の治療／予防；皮膚中のコラーゲン沈着の増強、皮膚中のデコリン産生の増強、組織修復の増進；皮膚の明色化；障壁形成の増進による皮膚の状態及び弾力性の改善；乾燥肌及び剥落肌の治療；炎症肌、赤み肌及び／または敏感肌の鎮静；肌のきめ、滑らかさ及び／または緻密さの改善、から選択された少なくとも１つのスキンケア効果を与える外用組成物を製造するための高級不飽和Ｃ１６脂肪酸及び／またはその誘導体の使用を包含する。
【００１９】
従って、本発明の方法及び高級不飽和Ｃ１６脂肪酸の使用によって老化防止効果が与えられ、その結果として、弾力性が改善された滑らかで柔軟な皮膚の形成が促進され、しわ及び老化肌の出現が抑制または遅延され、皮膚の色が改善される。外観、きめ及び状態が全般的に改善され、特に、明るい肌、透き通った肌、全体として若々しい外観の肌が得られる。本発明の方法及び使用はまた、敏感肌及び／または炎症肌の鎮静及び緩和に有効である。高級不飽和Ｃ１６脂肪酸はまた、メラニン産生を抑制するためにヒトの皮膚に対して外用塗布で使用でき、塗布された皮膚の色を明るくする。即ち本発明方法は、広範囲のスキンケア効果を有利に提供する。
【００２０】
本文中で使用された“治療する”という用語は、しわ肌、老化肌、光損傷肌及び／または炎症肌のような上述の皮膚状態を抑制、遅延及び／または予防すること、及び、皮膚の質を全般的に強化すること、しわの予防または抑制によって皮膚の外観及びきめを改善すること、及び、皮膚の撓やかさ、緻密さ、滑らかさ、柔軟性及び弾力性を向上させること、皮膚の色を明るくすることをその意味範囲に包含する。本発明による化粧方法及び不飽和脂肪酸及び／またはその誘導体の使用は、しわ、老化、光損傷、炎症などの状態を既に生じている皮膚の治療に役立ち、若い皮膚に対しては正常な老化／光老化過程に起因する上述の衰退性変化を予防または抑制するために役立つであろう。
【００２１】
本発明はまた遊離高級不飽和（例えばｃ１６：３）脂肪酸の誘導体、特にモノヒドロキシ誘導体を包含する。
【００２２】
１つの実施態様において、本発明の脂肪酸部分は、７位、１０位及び１３位に二重結合を有するのが好都合である。好ましい誘導体は、酸のカルボキシル基の置換から誘導されるもの、例えば、エステル（例えば、レチニルエステル、トリグリセリドエステル、モノグリセリドエステル、ジグリセリドエステル、ホスホエステル）、アミド（例えば、セラミド誘導体）、塩（例えば、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩）であるか、及び／または、Ｃ１８炭素鎖の置換から誘導されるもの、例えば、アルファヒドロキシ誘導体及び／またはベータヒドロキシ誘導体である。
【００２３】
加水分解されると本発明の目的である高級不飽和脂肪酸を生じるトリグリセリドエステル誘導体の場合、グリセロール主鎖の不飽和Ｃ１６脂肪酸置換基のすべての位置異性体が包含される。トリグリセリドは、少なくとも１つの高級不飽和脂肪酸部分を有していなければならない。例えば、グリセロール主鎖の３つのエステル化可能位置のうちで、１位及び２位が高級不飽和Ｃ１６脂肪酸によってエステル化され、３位が別の脂質によってエステル化されていてもよく、あるいは、グリセロール主鎖の１位及び３位でＣ１６脂肪酸によってエステル化され、２位が別の脂質でエステル化されていてもよい。
【００２４】
従って、不飽和脂肪酸トリグリセリドに富む油も本発明に使用するために適当であろう。
【００２５】
高級不飽和脂肪酸の適当な資源はモノ−及びジガラクトシルジグリセリドであり、これらはもっと広い形態ではグリセロールの単糖及び二糖のエステルのクラスであり、これらは様々な植物資源中に見出される。
【００２６】
本明細書中で高級不飽和脂肪酸という用語が使用されている場合、これらの用語は常に、高級不飽和Ｃ１６脂肪酸部分を含むその誘導体も包含することを理解されたい。“高級不飽和脂肪酸部分”という用語は、脂肪酸誘導体の（１つまたは複数の）高級不飽和脂肪アシル部分を意味する。
【００２７】
本発明に従って使用される高級不飽和脂肪酸は外用組成物中に有効量で存在する。トランス−７−オクタデカン酸は極めて低レベルでも有効であることが知見された。通常は有効成分の総量が組成物の０．０００１重量％−５０重量％の範囲の量で存在する。より好ましくは総量が０．０１重量％−１０重量％の範囲であり、最小コストで最大効果を得るために最も好ましくは０．１重量％−５重量％の範囲である。
【００２８】
本発明に使用される組成物はまた、有効成分である高級不飽和脂肪酸またはその誘導体の希釈剤、分散剤または担体として作用する皮膚科学的／化粧品的に許容されるビヒクルを含有する。ビヒクルは、水、液体状または固体状の皮膚緩和剤、シリコーン油、乳化剤、溶媒、保湿剤、増粘剤、粉末、噴射剤などのようなスキンケア製品に常用の材料を含み得る。
【００２９】
ビヒクルは一般には、組成物の５−９９．９重量％、好ましくは２５−８０重量％を形成し、その他の化粧品補助剤が存在しない場合には、組成物のバランス量を形成し得る。
【００３０】
有効成分である高級不飽和脂肪酸に加えて、日光遮断剤、別の皮膚明色化剤、皮膚褐色化剤のような別の特定皮膚効果をもつ有効成分を含有させてもよい。ビヒクルは更に、香料、乳白剤、保存剤、色素及び緩衝剤のような補助剤も含有し得る。その他の好ましい補助剤としては、皮膚状態を改善することが知られている別の公知のスキンケア有効物質、湿潤化剤、特に、ＢＨＴ、トコフェロール、アスコルビルアセテート、クエルセチン及び緑茶ポリフェノールのような抗酸化剤がある。
【００３１】
本発明の方法に使用される外用組成物を調製するために、スキンケア製品の常用の調製方法を使用し得る。一般には皮膚科学的に許容される担体に有効成分を慣用の方法で加える。組成物に加えるべき水または別の溶媒または液体の一部に有効成分を先ず溶解または分散させるのが簡便である。好ましい組成物は水中油型エマルジョンまたは油中水型エマルジョンである。
【００３２】
組成物は、クリーム、ジェルまたはローションなどのような慣用のスキンケア製品の形態でよい。組成物はまた、いわゆる“ウォッシュオフ”製品、例えば、浴用ジェルまたはシャワージェルの形態でもよく、これらのジェルはすすぎ中に有効成分が皮膚に付着することを促進するデリバリー系を含有してもよい。最も好ましくは、製品が“リーブオン”製品、即ち、皮膚に塗布され皮膚に塗布直後に予定されるすすぎ段階が不要な製品の形態である。
【００３３】
組成物は、ジャー、ボトル、チューブ、ロールボールなどのような任意の適当な容器に慣用の方法で包装され得る。
【００３４】
本発明の方法は治療を要する皮膚に対して１日に１回または複数回の割合で行うとよい。皮膚の外観の改善は、皮膚の状態、本発明の方法に使用される有効成分の濃度、組成物の使用量、組成物の塗布頻度、要求される皮膚有益効果次第で、通常は２週−６か月後に明らかになる。一般には、少量、例えば０．１−５ｍｌの組成物を適当な容器またはアプリケーターから皮膚に塗布し、手、指または適当なデバイスを使用して皮膚に塗り延ばし及び／または擦り込む。組成物が“リーブオン”製品として配合されているかまたは“リンスオフ”製品として配合されているかに従って、場合によってはその後ですすぎ段階を行うとよい。
【００３５】
本発明をいっそう容易に理解できるように、以下に非限定実施例を示す。
【００３６】
以下に説明する実施例は本発明の代表例にすぎない。
【００３７】
（実施例）
以下の実施例は、ヘキサデカトリエン酸（Ｃ１６：３（ｃ７，ｃ１０，ｃ１３））の老化防止効果を証明する。
【００３８】
ｉｎ  ｖｉｖｏでプロコラーゲンＩ及びデコリンの上方調節を惹起するためにレチノイン酸の外用トリートメントを使用できることは我々の同時係属欧州出願９９９０８９５６．８から公知である。このために該出願中の“比較目的のレチノイン酸の外用トリートメント後のｉｎ  ｖｉｖｏ皮膚中のプロコラーゲンＩ及びデコリンの上方調節（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉ  ａｎｄ  ｄｅｃｏｒｉｎ  ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｋｉｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｔｏｐｉｃａｌ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｐｕｒｐｏｓｅｓ”という標題の文章全体が参照によって本発明に含まれるものとする。
【実施例１】
【００３９】
ヒト皮膚繊維芽細胞中のプロコラーゲン−Ｉ及びデコリンの合成を測定する手順
皮膚繊維芽細胞のならし培地の調製
ヒト包皮の一次繊維芽細胞を継代２（Ｐ２）の段階で１２ウェルのプレートに１００００細胞／ｃｍ２で播種し、５％二酸化炭素及び４％酸素の雰囲気中、１０％のウシ胎仔血清を補充したダルベッコの改質イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で２４時間維持した。この時間の経過後、細胞を無血清ＤＭＥＭで洗浄し、次いで新しい無血清ＤＭＥＭ中で更に６０時間インキュベートした。次に繊維芽細胞単層を無血清ＤＭＥＭで再度洗浄した。被験試薬とビヒクル対照とを最終容量０．４ｍｌ／ウェルの新しい無血清ＤＭＥＭ中の細胞に三重複で添加し、更に２４時間インキュベートした。この繊維芽細胞ならし培地を直ちに分析するかまたは後で分析するために液体窒素中で瞬間冷凍し−７０℃で保存した。次にこの細胞をカウントし、その後にドット−ブロット分析から得られたデータを細胞数に標準化した。
【００４０】
皮膚繊維芽細胞ならし培地中のプロコラーゲン−Ｉ及びデコリンタンパク質のドットブロットアッセイ
ビヒクル（対照）または被験試薬で処理した皮膚繊維芽細胞から調製したならし培地のサンプルに２０ｍＭのジチオトレイトール（２００ｍＭの予製液を１：１０に希釈）及び０．１％のドデシル硫酸ナトリウム（１０％予製液を１：１００に希釈）を補充し、十分に混合し、次いで、７５℃で２分間インキュベートした。上述のように１７５ｃｍ２のフラスコに１００００細胞／ｃｍ２で播種し無血清ＤＭＥＭ中に維持した繊維芽細胞から得られた未希釈の繊維芽細胞ならし培地の系列希釈によってアッセイ標準を作製した。
【００４１】
次に、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社の９６−ウェルＢｉｏ−Ｄｏｔ装置を製造業者の使用説明書の記載通りに使用し、予め湿らせたＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ転移膜のシートにアッセイサンプルを三重複で塗布した。１つのウェルあたり約２００μｌの培地を塗布した。培地を重力下で膜濾過し（３０分）、その後、膜をＰＢＳ（２００μｌ）で２回洗浄した。これらのＰＢＳ洗浄液を重力下で膜濾過した（２×１５分）。次に、Ｂｉｏ−Ｄｏｔ装置を真空マニホルドにつなぎ、吸引下で３回目の最終ＰＢＳ洗浄を行った。装置を分解し、膜を取り外し、必要があれば速やかに裁断した後、ブロッキングバッファに入れて４℃で一夜維持した。
【００４２】
デコリン分析用に作製した膜はＰＢＳ中の３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／０．１％（ｖ／ｖ）トゥイーン２０でブロックし、プロコラーゲン−Ｉ分析用の膜はＰＢＳ中の脱脂粉末ドライミルク／０．０５％トゥイーン２０でブロックした。翌日、１：１００００に希釈したヒトのプロコラーゲン−Ｉに対する一次抗体（ＭＡＢ１９１２；ラットモノクローナル；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔ．Ｉｎｃ．，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）またはヒトのデコリンに対する一次抗体（ウサギポリクローナル；Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）によって膜を室温で２時間プローブした。その後、膜をＴＢＳ／０．０５％トゥイーン２０（３×５分）で洗浄し、次いで、１：１０００に希釈した１２５Ｉ−コンジュゲート抗−ラットまたは抗−ウサギＦ（ａｂ′）２フラグメント（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を必要に応じて加え、室温で１時間インキュベートした。
【００４３】
これに続いて、ＩｍｍｏｂｉｌｏｎストリップをＴＢＳ／トゥイーン２０（３×５分）で再度洗浄した後、室温で風乾した。乾燥した膜をセロファンに包み、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓのリン光体貯蔵スクリーンに１６−１８時間露光した。この時間の経過後、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔＴＭソフトウェアを使用するリン光体造影装置（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ  ＳＦ）によって露光したスクリーンを走査した。ＩｍａｇｅＱｕａｎｔＴＭ中の定量化ツールを使用するコンピューター援用画像解析によってドット強度を評価し、細胞数に標準化し、デコリン及びプロコラーゲン−Ｉの合成に関する種々の被験試薬の効果をビヒクル処理対照の１００任意単位の値に対する相対値として決定した。
【００４４】
結果を標準化するために、被験物質の効果をビヒクル処理対照の１００任意単位の値に対する相対値として決定した。結果を表１に数値として示す。これらの結果は、ヘキサデカトリエン酸が対照に比較してヒト皮膚繊維芽細胞中のプロコラーゲン−Ｉ及びデコリンの双方の合成を有意に上方調節することを示す。
【００４５】
【表１】
2005503379.tif 000002
【実施例２】
【００４６】
ヒト包皮の継代３（Ｐ３）のケラチノサイトを０．０３ｍＭのカルシウムを加えたダルベッコの改質イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で９６ウェルのプレートに４０００細胞／ウェルで播種した。処理に先立って細胞を３日間増殖させた。処理ビヒクルはＤＭＳＯであった。４日間の処理後、細胞を採取し、１００μｌのリン酸塩緩衝生理的塩類溶液（ＰＢＳ）で３回洗浄した。次に細胞を１％のトリトンＸ１００、５０ｍＭのトリスｐＨ８．０、０．０２ｍＭのロイペプチン、０．０２ｍＭのペプスタチンに抽出した。６０μｌ／ウェルの抽出物を次にＰｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎ  ＤＮＡアッセイ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓにかけ、ＤＮＡ濃度（ｎｇ／ウェル）を検定した。
【００４７】
次に細胞を２００μｌのＰＢＳで洗浄し、次いで１００μｌの２％ＳＤＳ、２０ｍＭのＤＴＴを各ウェルに添加した。次いでプレートをＴｉｔｅｒｔｅｋプレートシーラー（ＩＣＮ）でシールし、気密性の湿潤環境（即ち、湿潤紙を敷きつめた密閉サンドイッチボックス）中で６０℃で一夜インキュベートした。次にＤｏｔ−Ｂｌｏｔ装置（Ｂｉｏ−ｒａｄ）を使用して、抽出物をＰＶＤＦ転移膜（Ｂｉｏ−ｒａｄ）で重力下で濾過した。次に膜を蒸留水で洗浄しその後に銀染色した（Ｂｉｏ−ｒａｄ銀染色キット）。染色したドットブロット膜を次に、Ｐｈｏｒｅｔｉｘアレイソフトウェア（Ｐｈｏｒｅｔｉｘ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用して分析した。
【００４８】
結果を表２及び３に示す。
【００４９】
【表２】
2005503379.tif 000003
【００５０】
【表３】
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結果は、１−１０μＭのヘキサデカトリエン酸の塗布に応答して角質化エンベロープの産生量がどれほど増加するかを示している。これは、ケラチノサイト分化の増進を表す指標であり、ヘキサデカトリエン酸がｉｎ  ｓｉｔｕの皮膚障壁形成及び弾力性を改善することを示唆する。
【実施例３】
【００５１】
以下の配合物は、本発明の方法及び使用に適した水中油型クリームを示す。表示のパーセンテージは組成物の重量基準の値である。
【００５２】
【表４】
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【実施例４】
【００５３】
以下の配合物は本発明のエマルジョンクリームを示す。
【００５４】
【表５】
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【００５５】
実施例３及び実施例４に示した外用組成物はいずれも、老化もしくは光老化によって衰えた皮膚に塗布されたときにはしわ肌、老化肌、光損傷肌及び／または炎症肌の外観を改善し、若い皮膚に塗布されたときにはこのような衰退性変化の予防または遅延の助けとなる有効な化粧的治療効果を与える。組成物は慣用の方法で加工することができる。
【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年5月28日(2003.5.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）３個、４個または５個の二重結合を有している高級不飽和Ｃ１６脂肪酸またはその誘導体の０．０００１重量％から５０重量％の量と、および
（ｂ）皮膚科学的に許容されるビヒクルと、
を含み、
前記誘導体はエステル、アミド、塩及び／またはアルファヒドロキシまたはベータヒドロキシ誘導体であり、４個または５個の二重結合を有している脂肪酸はヘキサデカトリエン酸またはヘキサデカペンタエン酸から選択される、外用組成物。
【請求項２】
前記不飽和Ｃ１６脂肪酸が二重結合配置（ｃ７，Ｃ１０，ｃ１３）、（ｃ６，ｃ９，ｃ１２）、（ｃ７，ｔ１１，ｃ１３）または（ｔ８，ｃ１０，ｃ１３）を有している請求項１に記載の化粧組成物。
【請求項３】
前記不飽和Ｃ１６脂肪酸がヘキサデカトリエン酸（Ｃ１６：３（ｃ７，ｃ１０，ｃ１３））である請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記不飽和Ｃ１６脂肪酸がヒドロキシＣ１６不飽和脂肪酸である請求項１から３のいずれか一項に記載の化粧組成物。
【請求項５】
前記組成物が、皮膚の上で加水分解して請求項１に記載の３個、４個または５個の二重結合を有している高級不飽和Ｃ１６脂肪酸を生じ得る単糖または二糖のグリセリンエステルを含有している請求項１から４のいずれか一項に記載の化粧組成物。
【請求項６】
前記単糖または二糖のグリセリンエステルがモノ−またはジガラクトシルグリセリドである請求項６に記載の化粧組成物。
【請求項７】
しわ、たるみ、老化肌及び／または光損傷肌の治療／予防；皮膚中のコラーゲン沈着の増強、皮膚中のデコリン産生の増強、組織修復の増進；皮膚の明色化；障壁形成の増進による皮膚の状態及び弾力性の改善；乾燥肌及び剥落肌の治療；炎症肌、赤み肌及び／または敏感肌の鎮静；肌のきめ、滑らかさ及び／または緻密さの改善、から選択された少なくとも１つのスキンケア効果を提供するために、請求項１に記載の外用組成物を皮膚に塗布することを含む化粧方法。
【請求項８】
しわ、たるみ、老化肌及び／または光損傷肌の治療／予防；皮膚中のコラーゲン沈着の増強、皮膚中のデコリン産生の増強、組織修復の増進；皮膚の明色化；障壁形成の増進による皮膚の状態及び弾力性の改善；乾燥肌及び剥落肌の治療；炎症肌、赤み肌及び／または敏感肌の鎮静；肌のきめ、滑らかさ及び／または緻密さの改善、から選択された少なくとも１つのスキンケア効果を提供するための、請求項１に記載の外用組成物の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
１つの実施態様において、本発明の脂肪酸部分は、７位、１０位及び１３位に二重結合を有するのが好都合である。好ましい誘導体は、酸のカルボキシル基の置換から誘導されるもの、例えば、エステル（例えば、レチニルエステル、トリグリセリドエステル、モノグリセリドエステル、ジグリセリドエステル、ホスホエステル）、アミド（例えば、セラミド誘導体）、塩（例えば、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩）であるか、及び／または、Ｃ１６炭素鎖の置換から誘導されるもの、例えば、アルファヒドロキシ誘導体及び／またはベータヒドロキシ誘導体である。




【国際調査報告】
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