(57)【要約】本発明は、少なくとも１つの試料中の関心ある核酸を検出する方法を提供し、この方法は、前記試料を少なくとも部分的に吸収可能な固体担体に対して、前記試料を投与し、前記担体の少なくとも代表部分を核酸単離溶液に供給し、前記核酸の代表量を、前記担体から抽出し、前記核酸の前記代表量を検出することを含む。本発明の方法によって、試料、たとえば体液試料は、通常の物流手段によって、たとえば通常の郵便サービスによって、取得した場所（たとえば、発展途上国の病院または研究所）から輸送するとともに、世界の他の場所のサービス試験研究所に送るという方法で、安定化される。関心ある低力価の核酸を検出するために、好ましくは、少なくとも１００μＬ、より好ましくは少なくとも２５０μＬの試料が、前記担体に投与される。試料中の関心ある核酸を検出し、同定し、および／または定量化する部品のキットがまた、前記試料を少なくとも部分的に吸収可能な固体担体と、核酸単離溶液とを含み、このようにして提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの試料中の関心ある核酸を検出する方法であって、
前記試料を少なくとも部分的に吸収可能な固体担体に対して、前記試料を投与し、
前記担体を乾燥させ、
前記担体の少なくとも代表部分を、核酸単離溶液に供給し、前記核酸の代表量を、前記担体から抽出し、
前記核酸の前記代表量を検出することを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
少なくとも１つの試料中の関心ある核酸を検出して定量化する方法であって、
前記試料を少なくとも部分的に吸収可能な固体担体に対して、前記試料を投与し、
前記担体を乾燥させ、
前記担体の少なくとも代表部分を、核酸単離溶液に供給し、前記核酸の代表量を、前記担体から抽出し、
前記核酸の前記代表量を検出することを含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
少なくとも１００μＬの試料が前記担体に投与されることを特徴とする請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
少なくとも２５０μＬの試料が前記担体に投与されることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記核酸を同定することを含むことを特徴とする請求項１〜４のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記固体担体は、少なくとも２つの試料を備えることを特徴とする請求項１〜５のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記固体担体に対して、既知量の参照核酸を投与することを含むことを特徴とする請求項１〜６のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記代表部分は、前記少なくとも１つの試料の全体を本質的に含むことを特徴とする請求項１〜７のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記代表部分は、前記固体担体の全体を本質的に含むことを特徴とする請求項１〜８のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記代表部分は、前記試料のうち１つを含むことを特徴とする請求項６または７記載の方法。
【請求項１１】
前記核酸単離溶液は、カオトロピック核酸単離溶解緩衝液を含むことを特徴とする請求項１〜１０のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記核酸は、ＲＮＡを含むことを特徴とする請求項１〜１１のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＲＮＡは、ミトコンドリアＲＮＡ、ウイルスＲＮＡおよび／またはメッセンジャーＲＮＡを含むことを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
ウイルス核酸が検出されることを特徴とする請求項１〜１３のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ウイルス核酸は、レトロウイルス核酸を含むことを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記ウイルス核酸は、ＨＩＶおよび／またはＨＴＬＶを含むことを特徴とする請求項１３または１４記載の方法。
【請求項１７】
前記ウイルス核酸は、ＨＩＶ−１を含むことを特徴とする請求項１３〜１６のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記担体は、濾紙を含むことを特徴とする請求項１〜１７のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
変異体の遺伝子型を特定することを含むことを特徴とする請求項１〜１８のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記試料は、貴重な体液を含むことを特徴とする請求項１〜１９のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記試料は、血液、血漿、母乳、痰、髄液、唾液、および／または尿を含むことを特徴とする請求項１〜２０のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記試料は、指または踵穿刺からの全血の小滴を含むことを特徴とする請求項１〜２１のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記試料は、血漿試料であることを特徴とする請求項１〜２１のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記核酸検出および／または定量化は、増幅ステップを含むことを特徴とする請求項１〜２３のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記増幅は、リアルタイム監視増幅を含むことを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記核酸検出および／または定量化は、エンドポイント読み取りシステムで実行されることを特徴とする請求項１〜２５のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
異なる核酸間の割合が測定されることを特徴とする請求項１〜２６のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
試料中の関心ある核酸を検出し、同定し、および／または定量化するための、前記試料を備える乾燥された固体担体の使用。
【請求項２９】
前記固体担体は少なくとも、１００μＬの血液またはその誘導体の均等物を、乾燥された形態で含むことを特徴とする請求項２８記載の使用。
【請求項３０】
試料中の関心ある核酸を検出し、同定し、および／または定量化する部品のキットであって、
前記試料を少なくとも部分的に吸収可能な固体担体と、
核酸単離溶液とを含むことを特徴とするキット。
【請求項３１】
核酸増幅手段をさらに含むことを特徴とする請求項３０記載のキット。
【請求項３２】
乾燥された形態で、５００μＬの血液またはその誘導体の均等物を少なくとも含むことを特徴とする固体担体。
【請求項３３】
少なくとも２つの試料を含むことを特徴とする請求項３２記載の固体担体。
【請求項３４】
異なるデータで得られた一連の試料を含むことを特徴とする請求項３２または３３記載の固体担体。
【請求項３５】
既知量の参照核酸を含むことを特徴とする請求項３２〜３４のうちいずれか１項に記載の固体担体。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、医薬品の分野に関する。特に、本発明は、診断に関する。さらに、本発明は、試料中の関心ある核酸の検出および／または定量化に関する。
【０００２】
病原体による感染症は、世界中で広く観察されている。かかる感染症は、たとえばウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、および寄生虫病を含む。感染症の早期診断は、有効な治療のためにしばしば好まれ、これは深刻な病的症状を防ぐことができる。時々、早期診断は、治療の可能性、寿命の延長、および／または生活の質の向上のために、必須条件である。かかる感染症の例は、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、結核、マラリアおよびＨＩＶ、たとえばＨＩＶ−１を含む。
【０００３】
ＨＩＶ−１の流行は、世界中でにわかに拡大し、このウイルスの拡大によって、ＨＩＶ−１ウイルスの循環している亜型は、もはや、地球上において地理的な一箇所に制限されない。この開発は、等しい精度で全ての亜型のＨＩＶウイルスを検出することができる（核酸）診断テストの適用を必要とする。
【０００４】
この流行の世界化、および特に資源の乏しい国々（サハラ以南アフリカおよび東南アジア）における重大性は、先進国世界に、医薬へのアクセスプログラムによって、発展途上国における感染症に対する格闘を支援するよう促した。しかしながら、発展途上国世界におけるＨＩＶ−１に感染した人々を有効に救うために、適所に適切な診断が存在しなければならず、たとえば、治療の効果を監視しなければならない。かかる適切な診断は、特に、感染された個体の体液中、たとえば血液、血漿、母乳、精液、リンパ液、痰(sputum)、髄液(liquor)唾液(saliva)および／または尿中のＨＩＶ−１ＲＮＡの量を測定するウイルス負荷アッセイ(viral load assay)である。同様に、適切な核酸負荷アッセイが、他の感染関連疾患のために望まれる。
【０００５】
高度の技術標準である適切な核酸負荷アッセイは、これらが、たとえばサハラ以南アフリカおよび／または東南アジアにおける、技術資源が著しく相違する地域に対して、容易に移転されないという現状にある。これは、経済基盤上著しい投資を必要とし、これらの地域の環境においては不可能である。代替的な解決法は、先進国世界（たとえば、欧州および北米）の研究所における患者試料の分析である。しかしながら、この代替法は、物流問題に起因して、実行することは不可能である。個体の血液または血漿試料のような体液試料は、０℃未満の好適な温度で、冷凍状態で、通常はドライアイス入りの箱において、研究所に輸送されなければならない。臨床材料を送るこの方法は、非常に高価であり、積荷の場所においてドライアイスが入手可能であることを必要とする。後者は、発展途上国世界の国々においてほとんどない。コストおよびドライアイスの入手困難が原因で、研究所における試料の遠隔試験（「サービス試験」）は、これらの国々にとって、これらの国々において感染した人々にとって、選択肢とならない。発展途上国のための医薬アクセスプログラムは、診断が最適化される場合に限って、功を奏することができる。
【０００６】
本発明は、少なくとも１つの試料中の関心ある核酸を検出する方法であって、
前記試料を少なくとも部分的に吸収可能な固体担体に対して、前記試料を投与し、
前記担体を乾燥させ、
前記担体の少なくとも代表部分を、核酸単離溶液に供給し、前記核酸の代表量を前記担体から抽出し、
前記核酸の前記代表量を検出することを含む方法である。
【０００７】
本発明の方法に従えば、体液試料のような試料は、通常の物流手段によって、たとえば通常の郵便サービスによって、取得した場所（たとえば、発展途上国の病院または研究所）から輸送するとともに、世界の他の場所のサービス試験研究所に送るという方法で、安定化される。前記方法は、試料中に存在する関心ある核酸の検出のために、遠隔地の研究所に対して、船便によって乾燥された試料を輸送することを可能とする。
【０００８】
本発明の方法は、本技術分野において既知の技術を用いて実行されることができる。たとえば、定められた量の液体試料を、ピペットを用いて固体担体に投与することができる。前記固体担体は、重要ではなく、前記試料を少なくとも一部吸収することができる限り、本技術分野において既知のあらゆる固体担体を含み得る。たとえば、前記固体担体は、シリカを含む。しかしながら、好ましくは、前記固体担体は、濾紙を含む。濾紙は、液体試料を好ましく吸収すると同時に、軽量である。これは、郵送にとって非常に重要である。前記濾紙は、シュライヒャーアンドシュル(Schleicher and Schuell)社製の９０３紙のような無地の未処理濾紙、または迅速な精製のために核酸の流通を固定する処理済み濾紙を含み得る。この分野における２つの例は、シュライヒャーアンドシュル社製のＩＳＯコード紙、またはワットマン(Whatman)社製のＦＴＡ処理紙であり、これらは両方とも殺菌性、殺真菌性、および殺ウイルス性であり、細菌および真菌の成長を阻害し、マトリクスと接触するウイルスを殺すことによって、安全な試料の取扱いおよび試料の安定性を可能とする。乾燥した流体試料を保存かつ運搬するのに適切な担体の別の例は、ライフストック(Lifestock)社によって設計された装置である（米国特許第５１３９７４２号）。この装置は、キャピラリチューブが直接に付属される小さいナイフを含み、キャピタリチューブ内で乾燥する血液を採集、保存および運搬することを可能とし、これによって、濾紙を用いた方法に匹敵する。
【０００９】
前記担体は、本技術分野において既知の異なる技術によって乾燥されてもよい。好ましくは、前記試料は、空気によって乾燥される。これは、安価であり、かつ効果的である。
【００１０】
担体の代表部分とは、前記固体担体に投与された試料の量を示す部分を意味する。たとえば、前記代表部分は、前記試料の全体を含んでもよい。また、前記代表部分は、前記試料の半分の量を含んでもよい。この場合、他方の半分は、第２の実験を実行するために用いてもよい。前記第２の実験は、異なる実験であるか、あるいは類似の実験であってもよい。後者の場合、特定の結果が２回（in duplo）得られ、これは精度がより高い。
【００１１】
核酸の代表量とは、前記試料中に存在する核酸の量を示す量を意味する。前記代表量は、前記試料中に存在する前記核酸の全量を含んでもよい。代替的に、前記代表量は、前記試料中に存在する前記核酸の一部を含んでもよい。
【００１２】
好ましくは、提供される本発明の方法では、少なくとも１００μＬの試料が前記担体に投与される。より好ましくは、少なくとも２５０μＬの試料が、前記担体に投与される。最も好ましくは、少なくとも５００μＬの試料が前記担体に投与される。大きい試料体積によって、所望の低力価の核酸を、さらに検出することができる。現在の検出方法における主要な欠点は、ある閾値を越える濃度を有する核酸しか検出することができないということである。これは、低い負荷の病原核酸で感染された個体が、感染していると診断されず、したがって、適切な早期の時点で治療を得られないことを意味する。本発明に至るまで、多量の体液試料、たとえば、血液または血漿試料は、阻害効果が観察されたので、試験に適していなかった。たとえば、全血液に存在するヘモグロビンおよびカルボニックアンヒドラーゼが、ポリメラーゼ鎖反応と干渉することが報告された（４）。ＰＣＲ混合物は、フィルタブロッタからのヘムおよびその分解産生物の溶出が原因で、濃い茶色になった（５）。ＰＣＲ精製を向上させるために、試料を、ＰＣＥ反応前にメタノールで処理した（６）。これは、余分のステップを必要とし、汚染の危険性がありおよび信頼の低い試験結果となる。さらに、キレート金属イオンが、低いイオン強度によって高温でＤＮＡの破壊の触媒として作用することが報告される（７）。
【００１３】
驚くべきことに、本発明の方法によって、多量の試料を、乾燥した固体担体に保存し、続いて分析することができる。前述の阻害効果は、観察されず、予防策としてのメタノールによる処理も必要としない。本発明の方法によって、関心ある核酸の存在に関して、多量の試料を分析することが可能である。したがって、試料中の低濃度の関心ある核酸でも、検出が可能である。本発明の方法は、１または複数の特定の病原体、たとえばＨＩＶ−１の存在に関して、個体をスクリーニングするのに適切である。さらにまた、罹患している、あるいは罹患のおそれのある個体を、本発明の方法によって、詳細に調べることも可能である。１または複数の外来核酸が発見されると、それがどの種類の微生物に属するかを決定することができる。これは、たとえば、種々のプローブを用いて、ハイブリダイゼーションプロトコルによって行うことができる。さらにまた、核酸の配列を決定し、この配列をあらゆる既知の配列との相同性について分析する技術を実行することも可能である。したがって、ある実施形態において、本発明は、関心ある前記核酸を同定することを含む方法を提供する。
【００１４】
さらに別の実施形態において、提供される本発明の方法では、前記核酸が定量化される。驚くべきことに、本発明の方法によって、関心ある核酸を検出することが可能であるのみならず、前記試料に存在する前記核酸の量を測定することができる。本発明の方法によって、相当な量の核酸が、保存中に、ならびに／または単離および／もしくは検出手順中に、失われることも破壊されることもない。この例が示すものは、もし本発明の方法が用いられれば、固体担体に保存される乾燥された試料からの関心ある核酸の測定量が、前記試料が直接に分析を受けたときの関心ある前記核酸の測定量と同等であるということである。
【００１５】
固体担体における乾燥された試料は、存在する病原核酸の量に関して調査され得る。したがって、存在のみならず、疾患の段階をも決定することができる。資源の乏しい国の住民のような、不十分な設備しか有しない地域の個体を診断することができる。血液のような体液試料を、濾紙のような固体担体で採集することができる。前記濾紙は、たとえば西ヨーロッパの研究所に送ることができる。続いて、関心ある核酸の量が測定され、これによって、疾患の状態を決定することができる。また、前記核酸の量が長期に亘って減少しているかどうかを決定することによって、治療が効果的であるかどうかを決定することができる。
【００１６】
１つの局面において、本発明は、前記固体担体が少なくとも２つの試料を備える方法を提供する。好ましくは、前記試料は、同一の個体から得られる。より好ましくは、前記試料は、同一の個体の同一の体液から得られる。前記試料は、たとえば、血液の２つの部分標本を含んでもよい。前記血液試料それぞれは、本発明の方法によって個別に試験することができる。この方法によって、前記個体の血液中の関心ある核酸の存在および／または量を、２回（in duplo）試験することができる。これは、より精度の高い結果を生じさせる。さらに、各試料は、異なる人間／異なる研究所によって試験することができる。個体によって生じる誤差、および／または信頼性のない設備による誤差は、独立した第２の測定によって明らかにすることができる。
【００１７】
他の実施形態において、前記２つの試料は、異なる目的で用いられる。たとえば、一方の試料が、ウイルスの核酸の量に関して試験されることができると同時に、他方の試料は、細菌の核酸の量に関して試験されることができる。両試料は、ウイルスの核酸と染色体ＤＮＡとの割合（ＣＭＶにとって重要）を得るために用いられ、または、ミトコンドリアと細胞ＤＮＡ／ＲＮＡとの割合に関して、もしくはｍＲＮＡ´ｓもしくはリボソームＲＮＡ´ｓに関する割合を測定するために、用いられる。しかしながら、これらの試験の多くは、１つだけの試料を用いて実行してもよい。
【００１８】
１つの実施形態において、前記固体担体は、異なる時点で採取された、一連の少なくとも２つの試料を含む。この方法によって、疾患の進行が長期に亘って追跡され得る。この実施形態は、特に、治療が効果的であるかどうかを決定することにも適している。たとえば、試料は、治療の開始時に、およびその後一定の時間間隔で、前記固体担体に投与することができる。このようにして、前記固体担体は、運搬装置として役立つことができるのみならず、関心ある核酸の劣化なしに、周囲温度で安定的な保存を果たすことができる。このような固体担体は、特定量の時間の後に適切な研究所に送付されることができる。本発明の方法を用いて、各試料中の病原核酸の量を定量化することによって、治療が効果的かどうかを定めることができる。前記量が長期に亘って減少しているかどうかを定めることができる。
【００１９】
同様に、試料は、一定の時間間隔で罹患した個体から採取することができる。各試料中の病原核酸の量が、続いて定量化されることができる。これは、たとえば、病原核酸の量が長期に亘って増加しているかどうかなど、前記疾患の進行に対するより深い洞察を提供する。
【００２０】
前記研究所に各試料を別々に送付する必要はない。多数の試料を、長期に亘って採集し、一気に送付してもよい。これは、時間と費用とを節約する。さらに、試料が一緒に送付されるので、別々に送付された試料の保存および仕分けを必要としない。試料が紛失する危険性も減少する。
【００２１】
本発明の方法によって、関心ある核酸の量をさらに正確に定量化するために、既知量の参照核酸が、前記固体担体に投与されることができる。前記参照核酸は、関心ある核酸とともに、定量化されることができる。関心ある核酸の定量化の精度は、前記参照核酸の測定された量を、前記参照核酸の投与された量と比較することによって、決定され得る。もし、前記測定された量が投与された量とわずかに異なる場合、同じことが、前記関心ある核酸についてもいえる可能性が高い。したがって、前記関心ある核酸の測定された量は、さらに正確な結果を得るために訂正することができる。
【００２２】
さらに、参照核酸によって、試料の一部を含む代表部分を決定することができる。もし、前記試料の一部を含む代表部分が、前記核酸単離緩衝液に供給され、参照核酸の測定された量が、投与された量の３分の１であれば、関心ある核酸の測定された量も、前記試料中に存在する量の約３分の１であることを示す。したがって、参照核酸は、これを原因として、もし前記試料の一部が前記核酸単離緩衝液に供給されれば、本発明の核酸の測定された量が増加されなければならないことを示す。参照核酸は、前記関心ある核酸と本質的に同じようにして、前記固体担体に沿って拡張するのが好ましい。この場合、前記固体担体の一部が本発明の方法において用いられる点で大きな相違はない。関心ある核酸の正確な定量化の別の方法は、それを、他の核酸の量と関係させることによる。このようにして、同一の反応または別々の反応のいずれかにおいて、同一の試料、またはその他の試料のうちの１つにおいて、あらゆるＤＮＡとＤＮＡとの割合、あらゆるＲＮＡとＤＮＡとの割合またはその逆、およびあらゆるＲＮＡとＲＮＡ標的物との割合を確立することが可能となる。本発明は、宿主からの核酸間の割合、たとえば、特定のＨＩＶ療法に対する応答の指標として、核ＤＮＡに対する染色体ＤＮＡの量、または病原からの核酸と宿主からの核酸との割合、たとえば、宿主核ＤＮＡに対するＣＭＶＤＮＡの量を測定する適用例を含み得る。その他の適用例は、遺伝子発現プロファイルの分野における、細胞当たりのｍＲＮＡの量を含み得る。
【００２３】
また、提供される本発明の方法において、前記代表部分は、本質的に、前記少なくとも１つの試料の全体を含む。本発明の発明者によって、大きい試料であっても、関心ある核酸の信頼性のある検出および／または定量化が、本発明の方法によって可能となることが示される。もし、大きい試料の全体が用いられる場合、低い濃度の核酸であっても、検出および定量化されることができる。
【００２４】
前記担体の代表部分は、濾紙などの固体担体から、可視のスポットを切り出すことによって提供され得る。この切り出しは、通常のはさみを用いてなされてもよいが、固体担体から等しい表面を打ち抜くために、たとえばワラック(Wallack)社製の装置を用いて、完全に自動化されてもよい。手で打ち抜くこのタイプを容易にする別の方法として、前記固体担体を予め打ち込み、その後に試料を与え、乾燥させてもよい。分析のために研究所に到着するときに、予め打ち込まれた部分は、特別に設計された装置によって、またはエッペンドロフ(Eppendorf)社製のセーフロックチューブを装置とすることによって、完全に容易に打ち抜かれ得る。また、前記スポットの代表部分が用いられてもよい。しかしながら、担体全体を使用することが好ましく、これによって試料全体の測定が確実にされる。本発明に従えば、濾紙などの固体担体は、関心ある核酸の検出および／または定量化に大きく影響しない。したがって、本発明の方法においては、前記代表部分が本質的に前記固体担体全体を含むことが好ましい。
【００２５】
もし、本発明の方法において、前記固体担体が少なくとも２つの試料を有する場合、前記代表部分は、好ましくは、前記試料のうち１つを含む。前記代表部分は、関心ある核酸を検出および／または定量化するために用いることができる。上述したように、前記第２試料を含む代表部分は、２回（in duplo）の測定のために用いることができる。代替的に、他の測定が実行されてもよい。
【００２６】
１つの局面において、提供される本発明の方法では、前記核酸単離溶液は、カオトロピック核酸単離溶解緩衝液(chaotropic nucleic acid isolation lysis buffer)を含む。さらに好ましくは、Boom et alによって記載されるような核酸単離緩衝液が用いられる。好ましくは、前記固体担体は、濾紙を含む。なぜなら、濾紙は安価であり、液体試料を好ましく吸収可能であり、かつ軽量のため運搬を容易にするからである。通常、前記核酸の溶出は、室温で少なくとも３０分、または高温でさらに短い時間で行われるが、これに対して、溶解緩衝液に直接投与される体液からの核酸は、１０分以内で通常放出される。高温は、効率を高め、また、固体担体からの核酸の迅速な溶出を促進するであろう。
【００２７】
本発明の方法は、特に、ウイルス核酸、特にレトロウイルス核酸を検出するのに適している。ウイルス核酸は、潜伏段階で存在し得、相当の時間持続することができる。さらに、ＨＩＶ、ＨＴＬＶおよびＨＨＶなどのウイルスはしばしば、個体内で、この個体がいずれかの重大な症状を経験する前に、相当の期間中存在する。その期間中、前記ウイルスはしばしば、他の人間に対して、すでに感染し得る。さらに、早期段階での治療は、回復の可能性を高めることができ、寿命を延長し、かつ／または生活の質を向上させる。したがって、本発明の方法によってウイルス核酸の存在に関して個体を検査することは、特に重要である。検出されるべきウイルス核酸は、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、パルボウイルスなどからの配列を含む。好ましくは、前記ウイルス核酸は、ＨＩＶおよび／またはＨＴＬＶを含む。より好ましくは、前記ウイルス核酸は、ＨＩＶ−１を含む。
【００２８】
実施の一形態において、提供される本発明の方法では、前記方法は、変異体の遺伝子型を特定することを含む。これは、特に、（レトロ）ウイルスのように速く変化するゲノムを有する有機体にとって有用である。遺伝子型特定は、たとえば、特定の治療が、個々の患者に適していそうか否かを決定するために有用である。さらに、もし新しい変異体が発見される場合、既存の薬剤を採用することができるか、または新しい薬品を開発することができる。
【００２９】
本発明の方法は、特に、体液、たとえば血液、血漿、母乳、精液、リンパ液、血清、痰、髄液、唾液および／または尿中の関心ある核酸を検出するために適している。かかる体液の試料を得ることは容易である。かかる試料を得ることは、個体にそれほど不便を生じさせるものではなく、これらの場合、たとえば、生体検査法が採用される。さらに、体液試料を得ることは、発展途上国および遠隔地において欠如しているような特別な設備を必要としない。
【００３０】
好ましくは、提供される本発明の方法では、前記試料は、指または踵穿刺からの全血の小滴を含む。かかる指または踵穿刺は新生児から広く行われるので、前記物質はしばしば、個体にさらに手数をかけることなく入手可能である。別の好適な実施形態において、前記試料は、血漿試料である。血漿試料は、遊離ウイルス粒子の量のより正確な測定を可能とし、これに対して、たとえば、血液試料はまた、細胞内に一体化されたウイルス核酸を含む。細胞内に一体化されたウイルス核酸を本質的に有さずに行われる遊離ウイルス粒子の測定は特に、ウイルス毒性、ウイルス拡張などの特性に関して示す。したがって、血漿試料は、かかる特性が測定されるべき場合に好適である。
【００３１】
少なくとも、最低限必要な量の体液の採集を確実にするために、予め定められる表面が、固体担体に別の方法で印刷され、または貼付されることができる。これは、その表面が、所望の体液で完全に満たされることを意味する。等量の全血で覆われた表面は、類似量の体液、たとえば血清または母乳よりも小さいので、同一の固体担体に種々の体液についていくつかの表面を印刷する必要があり、または特定の体液に特有の担体を設計する必要がある。このようにして、正確な量の体液が最低限採集されるよう確実にされる。
【００３２】
関心ある核酸の検出のために、しばしば増幅ステップ（たとえばＰＣＲまたはＮＡＳＢＡ）が必要とされる。続いて、増幅された核酸は、本技術分野において知られている方法を用いて検出されることができる。したがって、本発明の方法は、好ましくは、増幅ステップを含む。好ましくは、前記増幅は、リアルタイム監視増幅を含む。産生された核酸は、かかる増幅反応の期間中、直接的に可視化される。これは、たとえば、分子ビーコンプローブまたはその他のタイプのプローブによって達成することができる。これらのプローブがテンプレートにアニーリングすると、蛍光信号を発生することができ、これは、増幅反応の期間中監視され得る。蛍光の輝度は、産生された核酸の量を示す。校正曲線を、既知量の核酸を用いて作成することができる。既知量の核酸を有する試料からの蛍光信号を、その後、前記校正曲線と比較することができる。このように、蛍光の輝度および核酸の量は互いに関連性を有するので、前記試料中の前記核酸の量を決定することができる。
【００３３】
別の実施形態において、前記核酸検出および／または定量化は、エンドポイント読み取りシステムによって実行される。かかるシステムは、たとえば、比色検出法、酵素アッセイ、および／またはディップスティックを含む。
【００３４】
本発明はまた、前記試料中の関心ある核酸を検出、同定、および／または定量化するための試料を備える乾燥された固体担体の使用を提供する。前述したように、前記乾燥された固体担体は、容易に保存および運搬されることができ、その後、信頼性のある核酸検出および定量化が実行されることができる。好ましくは、前記固体担体は少なくとも、１００μＬの血液またはその誘導体の均等物を、乾燥された形態で含む。前記担体は、より好ましくは少なくとも２５０μＬ、最も好ましくは少なくとも５００μＬの血液またはその誘導体を、乾燥された形態で含む。本発明の使用によって、多量の試料を調査することができ、低濃度の核酸の検出および／または定量化を可能とする。血液の誘導体とは、血液の成分、たとえば血清および／または血漿の少なくとも一部を意味する。人工的に変更された血液も、血液の誘導体の範囲内である。このように、固体担体は設計され、これは、体液をそれ自体吸収することができる担体を好ましく含むことができ、情報、たとえば患者、サンプリング日、もしくはサンプリングのより多くの日、治療計画、バーコード、ＩＤ番号などを書くか、あるいは印刷することができる紙または表面の一部と結合される。このような、このタイプの情報に関して特有の表面が、試料を有する担体に確かに結合されることによって、その情報は失われないように確実にされる。通常、このタイプの表面は、チューブが保持することができるものよりも相当多くの情報を含むことができる。理論的に、この趣旨のあらゆるバリエーションが可能である。
【００３５】
本発明はまた、試料中の関心ある核酸を検出し、同定し、および／または定量化するための部品のキットを含み、
このキットは、
前記試料を少なくとも部分的に吸収することができる固体担体と、
核酸単離溶液とを含む。
【００３６】
好ましくは、前記キットは、核酸の増幅手段をさらに含む。前記手段は、たとえば、リアルタイム監視増幅手段、および／またはエンドポイント検出／定量化による増幅手段を含む。本発明の部品のキットは、たとえば、数箇所の病院しか有しない資源の乏しい国において有用である。かかる病院は、前記固体担体、たとえば濾紙を、遠隔地の居住者に配布することができる。試料が採集されると、これらを保存し、かかる病院に運搬することができる。前記病院が適切に整えば、前記試料を、前記核酸単離溶液を用いて、調査することができる。もちろん、先進国の病院でも試料を採集し、試験する本発明の部品のキットを使用することができる。検出し、同定し、および／または定量化するための部品のキットは、患者から体液を安全に引き出すのに必要な材料の集合を好ましく含む。理論的には、尿、母乳または唾液のような外部体液については、血液、血漿、血清またはリンパ液のような内部体液が試料である場合以外の安全予防策が採られる必要があろう。内部体液については、前記試料を少なくとも部分的に吸収することができる固体担体と、核酸単離溶液と、１対の試験グローブと、肌を清潔にするアルコールスワブと、指または踵穿刺装置と、包帯と、たとえば指定された病院の住所および識別番号または患者コードのためのスペースを有し、安全な郵送のために内部を覆う包装材料と、試料の乾燥を維持し、カビまたは細菌の成長を防止するデシケータとを含むキットを有する。その他の有り得る収集装置は、一時使用のために特別に設計された装置を含み、たとえば、米国特許第５１３９７４２号に記載されている装置、ライブストックコントロールホールディングＢ．Ｖ．社（アメルスフォート，オランダ）製の使い捨て液体試験装置である。これらの商品のあらゆる組合せが可能であり、あるいは、あらゆる核酸含有体液の保存および／または運搬に用いられる商品／装置との置換が可能である。
【００３７】
乾燥された形態で５００μＬの血液またはその誘導体の均等物を少なくとも有する固体担体がまた、このようにして提供される。好ましくは、前記固体担体は、少なくとも２つの試料を含む。前記試料が同種の場合、前記試料の両方を個別に試験することができ、結果として２回（in duplo）試験となる。さらに、第１の試験の結果を、他方の試料を独立に試験することによって、対照とすることができる。代替的に、前記試料は、異なる目的に使用される。
【００３８】
異なるデータで得られた一連の試料を含む本発明の固体担体がまた、このようにして提供される。前述したように、かかる固体担体は、長期間疾患の進行を見守り、および／または特定の治療が有効であるかどうかを試験するのに適している。好ましくは、本発明の固体担体は、既知量の参照核酸を含む。
【００３９】
本発明は、次の実施例においてさらに説明される。実施例は本発明を明らかにするためにのみ提供される。これは、本発明の範囲を決して限定するものではない。代替的な実施形態がまた、本発明の範囲内に属する。
【００４０】
実施例１
血液および血漿を、Ｓ＆Ｓ９０３紙（シュライヒャーアンドシュル社製）上に５０μＬの小滴でスポットして、空気中で乾燥させた。同時に、２００μＬの同じ血液および血漿試料を、Boom et al. (1990)によって述べられるように、溶解緩衝液に直接加えた。乾燥後、濾紙上のスポットを、３週間に至るまで周囲温度で維持したが、おそらく１ヶ月間周囲温度で維持され得る。濾紙上のスポットを、普通のはさみで切り取り、Boom et al. (1990)によって述べられるように、溶解緩衝液を含む管に投与した。５０μＬの血液または血漿の濾紙スポットを、３つの異なる管、すなわち１）９ｍＬの溶解緩衝液を含む５０ｍＬの管、２）１５ｍＬの溶解緩衝液を含む１５ｍＬの管、または３）１ｍＬの溶解緩衝液を１．５ｍＬのエッペンドルフ管に加えた。
【００４１】
これらの管を、周囲温度で３時間攪拌台において穏やかに攪拌した。インキュベーション中に、血液または血漿スポットは、濾紙から溶解緩衝液に溶解する。続いて、濾紙を清潔なピンセットで管から除去した。その後、管と管との間で、熱湯−塩素−熱湯−７０％アルコールで、ピンセットを消毒した。
【００４２】
溶解緩衝液および試料を有する管に対して、コピー数１×１０６のシステム制御ＲＮＡ分子を、誤った陰性の反応の同定を後の段階で可能とするために、加えた。システム制御ＲＮＡを、野生型ＨＩＶ−１と同じプライマーによって増幅し、反応中で識別可能なプローブによって検出する。長さが異なることに起因して、システム制御ＲＮＡは、野生型ＨＩＶ−１ＲＮＡの不存在下（または極少量）においてのみ、増幅して検出され得る。
【００４３】
溶解緩衝液に存在する核酸を、Boom et al. (1990)によって述べられた方法で、またはキアゲン社(Qiagen GmbH, Max Volmer Strasse 4, 40724 Hilden, ドイツ)またはビオメリュー社(Biomerieux, 以前はOrganon Teknika, Boseind 15, 5281 RM Boxtel, オランダ)から購入して、製造者のプロトコルに従って用いられた専用の単離キットでさらに精製した。単離された核酸を、さらなる分析まで−８０℃で保存した。通常、５μＬを、ＮＡＳＢＡ増幅反応において投入し、DeBaar et al. (1,2)によって述べられたように、ＨＩＶ−１ＲＮＡの量を測定した。
【００４４】
標準のＮＡＳＢＡ核酸増幅反応を、２０μＬの反応体積中で実行し、４０ｍＭのＴｒｉｓ−ｐＨ８．５、７０ｍＭのＫＣｌ、１２ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのジチオトレイトール(dithiotreitol)、１ｍＭのｄＮＴＰ´ｓ（各々）、２ｍＭのｒＮＴＰ´ｓ（各々）、０．２μＭのプライマー（各々）、（Ｐ１：ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＧＧＧＧＣＧＣＣＡＣＴＧＣＴＡＧＡＧＡおよびＰ２：ＣＴＣＡＡＴＡＡＡＧＣＴＴＧＣＣＴＴＧＡ）、野生型ＨＩＶ−１配列（ＭＢ０４５：ＦＡＭ−ＣＧＡＣＧＴＡＧＴＡＧＴＧＴＧＴＧＣＣＣＧＴＣＴＧＴＡＣＧＴＣＧ−ｄａｂｃｙｌ）のための０．０５μＭの分子ビーコン、システム制御ＲＮＡ（ＭＢ０５４：ＲＯＸ−ＣＣＧＡＣＴＣＴＣＴＡＣＡＣＡＣＣＡＧＡＣＡＡＡＡＡＡＣＧＡＧＴＣＧＧ−ｄａｂｃｙｌ）のための０．０５μＭの分子ビーコン、野生型ＨＩＶ−１配列のための０．０５μＭの分子ビーコン、システム制御ＲＮＡのための０．０５μＭの分子ビーコン、３７５ｍＭのソルビトール、０．１０５μｇ／μＬのウシ血清アルブミン、６．４ユニットのＡＭＶ ＲＴ、３２ユニットのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、０．０８ユニットのＲＮａｓｅＨ、および投入される核酸が含まれる。酵素を除く完全な混合物を、酵素を加えるのに先立って、ＲＮＡ中のあらゆる二次構造を変性させるために６５℃まで加熱し、プライマーをアニーリング可能にした。混合液を４１℃まで冷却した後、酵素を加えた。増幅は、４１℃で９０分間、サーモスタット式の蛍光分光計(thermostated fluorimeter)（ＣｙｔｏＦｌｕｏｒ２０００またはＥａｓｙＱＲｅａｄｅｒ）において行い、分子ビーコンプローブの蛍光信号を毎分測定した。
【００４５】
定量化を達成するために、特定のプライマーセットの標的配列の希釈シリーズを増幅するとともに、反応が陽性になった時点（陽性までの時間，ＴＴＰ）を、核酸の投入量に対してプロットした。このようにして、校正曲線が作成され、これは、未知の投入量による反応のＴＴＰ値を読取り、投入量を推論するために用いることができる。
【００４６】
実施例１における測定の結果は、以下の表１に示す。システム制御ＲＮＡの結果によって、誤った陰性の結果が存在せず、表１において報告されたすべての陰性データが、ＨＩＶ−１配列の不存在、または試験の検出限界未満の濃度での存在によって生じる正しい陰性データであると考えられる。
【００４７】
【表１】
2005531751.tif 000002
【００４８】
表１におけるデータは、試料を紙上にまずスポットし、乾燥し、その後溶液緩衝液に対して投与した場合と比較した、溶解緩衝液に対して試料を直接投与したことで得た結果間での好ましい相関関係を明確に示す。
【００４９】
実施例２
４つの濃度における６つの異なる単離物からのウイルスを混ぜた１人の女性の母乳を、Ｓ＆Ｓ９０３紙（シュライヒャーアンドシュル社製）上に５０μＬ小滴で４回スポットし、空気中で乾燥させ、周囲温度で最低１週間保存した。乾燥後、濾紙上のスポットを、周囲温度で３週間に至るまで維持したが、おそらく周囲温度で数ヶ月維持し得る。同時に、２００μＬの同じ母乳試料を、Boom et al. (1990)によって述べられたように、溶解緩衝液に直接に加えた。濾紙上のスポットを、通常のはさみで切り取り、Boom et al. (1990)によって述べられたように、４ｍＬの溶解緩衝液を含有する管に投与した。
【００５０】
これらの管を、周囲温度で攪拌台で夜通し穏やかに攪拌した。このインキュベーション中に、乾燥されたスポットは、濾紙から溶解緩衝液に溶解する。続いて、濾紙を、清潔なピンセットで管から除去した。その後、管と管との間で、ピンセットを塩素‐熱湯‐７０％アルコールで消毒した。
【００５１】
溶解緩衝液および試料を有する管に対して、誤った陰性の反応の同定を後の段階で可能とするために、コピー数１，０００，０００のシステム制御ＲＮＡ分子を加えた。システム制御ＲＮＡを、野生型ＨＩＶ−１と同じプライマーで増殖し、反応中で区別可能なプローブによって検出する。長さの相違に起因して、システム制御ＲＮＡは、野生型ＨＩＶ−１ＲＮＡの不存在（または極小量）においてのみ増幅して、検出され得る。溶解緩衝液中に存在する核酸を、Boom et al. (1990)によって述べられた方法で、またはキアゲン社(Qiagen GmbH, Max Volmer Strasse 4, 40724 Hilden, ドイツ)またはビオメリュー社(以前はOrganon Teknika, Boseind 15, 5281 RM Boxtel, オランダ)から購入され、製造者のプロトコルに従って使用される専門の単離キットで精製した。単離された核酸を、さらなる分析まで−８０℃で保存した。通常５μＬを、ＮＡＳＢＡ増幅反応において投入し、DeBaar et al.によって述べられたように、ＨＩＶ−１ＲＮＡの量を測定した。
【００５２】
標準のＮＡＳＢＡ核酸増幅反応を、２０μＬの反応体積中で実行し、４０ｍＭのＴｒｉｓ−ｐＨ８．５、７０ｍＭのＫＣｌ、１２ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのジチオトレイトール(dithiotreitol)、１ｍＭのｄＮＴＰ´ｓ（各々）、２ｍＭのｒＮＴＰ´ｓ（各々）、０．２μＭのプライマー（各々）、（Ｐ１：ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＧＧＧＧＣＧＣＣＡＣＴＧＣＴＡＧＡＧＡおよびＰ２：ＣＴＣＡＡＴＡＡＡＧＣＴＴＧＣＣＴＴＧＡ）、野生型ＨＩＶ−１配列（ＭＢ０４５：ＦＡＭ−ＣＧＡＣＧＴＡＧＴＡＧＴＧＴＧＴＧＣＣＣＧＴＣＴＧＴＡＣＧＴＣＧ−ｄａｂｃｙｌ）のための０．０５μＭの分子ビーコン、システム制御ＲＮＡ（ＭＢ０５４：ＲＯＸ−ＣＣＧＡＣＴＣＴＣＴＡＣＡＣＡＣＣＡＧＡＣＡＡＡＡＡＡＣＧＡＧＴＣＧＧ−ｄａｂｃｙｌ）のための０．０５μＭの分子ビーコン、３７５ｍＭのソルビトール、０．１０５μｇ／μＬのウシ血清アルブミン、６．４ユニットのＡＭＶ ＲＴ、３２ユニットのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、０．０８ユニットのＲＮａｓｅＨおよび投入核酸が含まれる。酵素を除いて完全な混合物を、酵素を加えるのに先立って、ＲＮＡ中のあらゆる二次構造を変性させるために６５℃まで加熱し、プライマーをアニーリング可能にした。混合液を４１℃まで冷却した後、酵素を加えた。増幅は、４１℃で９０分間、サーモスタット式の蛍光分光計（ＣｙｔｏＦｌｕｏｒ２０００またはＥａｓｙＱＲｅａｄｅｒ）において行い、分子ビーコンプローブの蛍光信号を毎分測定した。
【００５３】
定量化を達成するために、特定のプライマーセットの標的配列の希釈シリーズを増幅するとともに、反応が陽性になった時点（陽性までの時間，ＴＴＰ）を、核酸の投入量に対してプロットした。このようにして、校正曲線が作成され、これは、未知の投入量による反応のＴＴＰ値を読取り、投入量を推論するために用いることができる。
【００５４】
スポットされた試料の測定結果と、溶解緩衝液に直接に加えられた同一の試料の測定結果とを比較し、その分析は、以下の図１に示される。システム制御ＲＮＡの結果によって、誤った陰性の結果が存在せず、図１において報告されたすべての陰性データが、ＨＩＶ−１配列の不存在または試験の検出限界未満の濃度での存在によって生じた正しい陰性データであると考えられる。
【００５５】
実施例３
８８のＨＩＶ−１感染した個体の血漿を、Ｓ＆Ｓ９０３紙（シュライヒャーアンドシュル社製）上に２００μＬの小滴でスポットし、空気中で乾燥させ、周囲温度で最低２４時間保存した。同時に、２００μＬの同一の血漿を、Boom et al.(1990)によって述べられるように、溶解緩衝液に直接に加えた。濾紙上のスポットを、つまみ出し、Boom et al.(1990)によって述べられるように、４ｍＬの溶解緩衝液を含有する管に投与した。
【００５６】
これらの管を、周囲温度で３時間攪拌台で穏やかに攪拌した。このインキュベーション中乾燥されたスポットは、濾紙から溶解緩衝液に溶解する。続いて、濾紙を、管から清潔なピンセットで除去した。その後、管と管との間で、ピンセットを熱湯‐塩素‐熱湯‐７０％アルコールで消毒した。
【００５７】
溶解緩衝液中に存在する核酸を、Boom et al.(1990)によって述べられる方法でさらに精製し、またはキアゲン社(Qiagen GmbH, Max Volmer Strasse 4, 40724 Hilden, ドイツ)またはビオメリュー社(以前はOrganon Teknika, Boseind 15, 5281 RM Boxtel, オランダ)から購入され、製造者のプロトコルに従って使用される専門の単離キットで精製した。単離された核酸を、さらなる分析まで−８０℃で保存した、通常、５μＬを、ＮＡＳＢＡ増幅反応において投入し、De Baar et al.(2,3)によって述べられるように、ＨＩＶ−１ＲＮＡの量を測定した。
【００５８】
標準のＮＡＳＢＡ核酸増幅反応を、２０μＬの反応体積中で実行し、４０ｍＭのＴｒｉｓ−ｐＨ８．５、７０ｍＭのＫＣｌ、１２ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのジチオトレイトール(dithiotreitol)、１ｍＭのｄＮＴＰ´ｓ（各々）、２ｍＭのｒＮＴＰ´ｓ（各々）、０．２μＭのプライマー（各々）、野生型ＨＩＶ−１配列のための０．０５μＭの分子ビーコン、システム制御ＲＮＡのための０．０５μＭの分子ビーコン、３７５ｍＭのソルビトール、０．１０５μｇ／μＬのウシ血清アルブミン、６．４ユニットのＡＭＶ ＲＴ、３２ユニットのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、０．０８ユニットのＲＮａｓｅＨおよび投入核酸が含まれる。酵素を除いて完全な混合物を、酵素を加えるのに先立って、ＲＮＡ中のあらゆる二次構造を変性させるために６５℃まで加熱し、プライマーをアニーリング可能にした。混合液を４１℃まで冷却した後、酵素を加えた。増幅は、４１℃で９０分間、サーモスタット式の蛍光分光計（ＣｙｔｏＦｌｕｏｒ２０００またはＥａｓｙＱＲｅａｄｅｒ）において行い、分子ビーコンプローブの蛍光信号を毎分測定した。
【００５９】
定量化を達成するために、特定のプライマーセットの標的配列の希釈シリーズを増幅するとともに、反応が陽性になった時点（陽性までの時間，ＴＴＰ）を、核酸の投入量に対してプロットした。このようにして、校正曲線が作成され、これは、未知の投入量による反応のＴＴＰ値を読取り、投入量を推論するために用いることができる。
【００６０】
スポットされた試料の測定結果と、溶解緩衝液に直接加えられた同一の試料の測定結果とを比較し、その分析は、図２に示す。
【００６１】
図２におけるデータは、試料を紙上にまずスポットし、乾燥させ、その後溶解緩衝液に投与した場合と比較した、溶解緩衝液に対して試料を直接投与することで得た結果間での非常に好ましい相関関係を明確に示す。ピアソン相関関係試験による分析を行うと、直接の血漿について０．９１９の相関係数、および乾燥された血漿について０．９５９の相関係数が見出された。
【００６２】
2005531751.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】直接に分析された母乳試料、または濾紙上でまずスポットされ、乾燥された母乳試料において得られた定量的なＨＩＶ−１データの比較。このアッセイは、ｌｏｇ２で切断され、これはグラフにおいて実線で示される。軸上の数値は、試験において発見されたＨＩＶ−１ＲＮＡ分子のｌｏｇコピー数を示す。図１におけるデータは、試料を紙上でまずスポットし、乾燥させ、その後溶解緩衝液に投与した場合と比較した、溶解緩衝液に対して試料を直接投与したことで得た結果間での、非常に好ましい相関関係を明確に示す。
【図２】直接に分析された血漿試料、または濾紙上でまずスポットされ、乾燥された血漿試料において得られた定量的なＨＩＶ−１データの比較。このアッセイは、検出の下限値がｌｏｇ２であり、これはグラフにおいて実線で示される。軸上の数は、試験において発見されたＨＩＶ−１ＲＮＡ分子のｌｏｇコピー数を示す。
【図１】
2005531751.tif 000004
【図２】
2005531751.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】平成17年3月28日(2005.3.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2005531751000001.app
【国際調査報告】
2005531751.tif 000006
2005531751.tif 000007
2005531751.tif 000008