(57)【要約】異所性細胞生存、異所性細胞増殖、異常細胞移動、異常血管形成、異常エストロゲン／アンドロゲンバランス、機能障害性又は異常ステロイド発生、血管壁内の変性変化を含む変性、炎症あるいは免疫学的不均衡に関連した疾患の、一般式（II）のイソフラブ−３−エン及びイソフラバン化合物を利用する、治療のための方法を記載する。イソフラブ−３−エン及びイソフラバン化合物を含む組成物及び用途もまた記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式IIの化合物（本明細書中に記載されている）又はその薬学的に許容可能な塩あるいは誘導体を対象に投与することを含む、異所性細胞生存、異所性細胞増殖、異常細胞移動、異常血管形成、異常エストロゲン／アンドロゲンバランス、機能障害性又は異常ステロイド発生、血管壁内の変性変化を含む変性、炎症あるいは免疫学的不均衡に関連した疾患の治療、予防又は改善のための方法。
【請求項２】
異所性細胞生存、異所性細胞増殖、異常細胞移動、異常血管形成、異常エストロゲン／アンドロゲンバランス、機能障害性又は異常ステロイド発生、血管壁内の変性変化を含む変性、炎症あるいは免疫学的不均衡に関連した疾患の治療、予防又は改善のための薬剤の製造における、その薬学的に許容可能な塩及び誘導体を含む式IIの化合物の使用。
【請求項３】
異常細胞生存表現型を発現する細胞を、薬学的に許容可能な塩を含む式IIの化合物と、所望により担体又は賦形剤とともに、接触させることを含む、前記細胞においてアポトーシスを誘導する方法。
【請求項４】
異常細胞移動表現型を有する細胞を、薬学的に許容可能な塩を含む式IIの化合物と、所望により担体又は賦形剤とともに、接触させることを含む、前記細胞の移動を抑制する方法。
【請求項５】
異所性血管形成表現型を発現する組織を、薬学的に許容可能な塩を含む式IIの化合物と、所望により担体又は賦形剤とともに、接触させることを含む、前記組織において血管形成を抑制する方法。
【請求項６】
治療的有効量の式IIの化合物又はその薬学的に許容可能な塩又は誘導体を哺乳類に投与する段階を含む、哺乳類におけるトポイソメラーゼIIを抑制する方法。
【請求項７】
癌性組織において新生物の発達が遅延されるか又は停止されるように、式IIの化合物あるいは又はその薬学的に許容可能な塩あるいは誘導体を腫瘍に罹患している哺乳類において癌性組織と接触する段階を含む、哺乳類の癌の治療、予防又は改善のための方法。
【請求項８】
新生物の発達が、ＤＮＡトポイソメラーゼIIの切断複合体を安定化する式IIの化合物により遅延又は停止される請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＤＮＡトポイソメラーゼIIを発現する細胞を、式IIの１種以上の化合物と、所望により担体又は賦形剤とともに、接触することを含む、前記細胞においてアポトーシスを誘導する方法。
【請求項１０】
ＤＮＡトポイソメラーゼ切断複合体を式IIの化合物又はその薬学的に許容可能な塩あるいは誘導体と接触させて、前記切断複合体を安定化することによるＤＮＡトポイソメラーゼIIを抑制する方法。
【請求項１１】
哺乳類における癌の治療のための薬剤の製造における、式IIの化合物又はその薬学的に許容可能な塩あるいは誘導体の使用。
【請求項１２】
ＤＮＡトポイソメラーゼII毒としての式IIの化合物又はその薬学的に許容可能な塩あるいは誘導体の使用。
【請求項１３】
式IIの化合物又はその薬学的に許容可能な塩あるいは誘導体を薬学的に許容可能な担体及び／又は希釈剤とともに含む癌の治療のための薬学的組成物。
【請求項１４】
別の化学療法的活性作用物質、好ましくは別のトポII毒との混和物中に式IIの化合物を含む相乗的（synergistic）薬学的組成物。
【請求項１５】
式IIの化合物及び別の化学療法的活性作用物質、好ましくは別のトポII毒を含むキット。
【請求項１６】
式IIの化合物がデヒドロエクオールである請求項１及び３〜１０のいずれか一項に記載の方法、又は請求項２、１１及び１２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
式IIの化合物がデヒドロエクオールである請求項１３又は１４に記載の薬学的組成物、あるいは請求項１５に記載のキット。
【請求項１８】
式IIの化合物又はその薬学的に許容可能な塩あるいは誘導体を、腫瘍に罹患している哺乳類の癌性組織と接触させる段階を含む、哺乳類における癌の治療、予防又は改善のための方法であって、
式IIの化合物は、前記癌性組織における新生物発達が遅延されるか又は停止されるように前記癌性組織に関連したｔＮＯＸを抑制するものである、
哺乳類における癌の治療、予防又は改善のための方法。
【請求項１９】
ｔＮＯＸ阻害剤としての式IIの化合物又はその薬学的に許容可能な塩あるいは誘導体の使用。
【請求項２０】
腫瘍細胞と関連したｔＮＯＸの抑制のための薬剤製造における式IIの化合物の使用。
【請求項２１】
式IIの化合物を１つ以上の他の薬学的に活性な作用物質と一緒に含む薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イソフラブ−３−エン又はイソフラバン構造に基づいた化合物及びそれらの誘導体による細胞メカニズムの調節に関する。特に本発明は、イソフラブ−３−エン又はイソフラバン構造に基づいた化合物を含む、哺乳類細胞におけるシグナル伝達プロセスに密接に関与する一連の分子標的の調節方法、細胞メカニズムの調節のための薬剤の製造におけるこれらの化合物の使用、及びこれらの化合物を含む細胞メカニズム調節組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
デヒドロエクオールは、化合物４’,７−ジヒドロキシイソフラブ−３−エン（３−（４−ヒドロキシフェニル）−７−ヒドロキシ２Ｈ−１−ベンゾピラン及びハギニン（Haginin）Ｅとしても既知である）、天然イソフラブ−３−エン及びイソフラボン代謝産物に対する一般名である。その化学構造は、下記の式Ｉで示される：
【０００３】
【化１】
2005528391.tif 000002
【０００４】
デヒドロエクオールは、イソフラボンの細菌発酵の推定産物（putative product）であるダイゼインとして、Joannouらにより１９９５年に初めて記載された（非特許文献１参照）。デヒドロエクオールの存在は、全く推論的で、その存在は確証されておらず、その化合物は単離されていないし、化学的に特性化もされていなかった。
【０００５】
その後、デヒドロエクオールは植物ツクシハギ（Lespedeza homoloba）中に天然に存在すると記載され、「ハギニンＥ」と呼ばれた（非特許文献２参照）。
【０００６】
デヒドロエクオールは、イソフラボンを含む治療方法及び組成物（Therapeutic methods and compositions involving isoflavones）と表題した特許文献１で、１９９７年にヒトを含む動物において健康に良い点を有するとして最初に認識された。該特許明細書は、デヒドロエクオールが第１級イソフラボノイド環構造に基づく化合物の一ファミリーに属し、そのいくつかのメンバーは、動物においてエストロゲン様、抗癌性、心臓血管性及び抗炎症性の健康利点を種々表示する、と教示している。このファミリーの多数のメンバーはまた、動物における未知の生物活性を示し、あるいは悪性、毒性の生物学的特性を示すため、イソフラボノイド環構造は、動物に固有の生物活性構造であるとは見られていなかった。
【０００７】
デヒドロエクオール、さらに言えば、特許文献１に引用された化学的ファミリーの他のメンバーの生物学的活性の生化学的基礎は、依然として未解決である。生化学的活性の十分な理解がなければ、その他の植物性エストロゲン及びそれらの代謝産物又は誘導体の提示された活性又は既知の活性にもかかわらず、デヒドロエクオールの潜在的な健康に良い点の範囲は必然的に未知のままである。
【特許文献１】国際公開第９８／０８５０３号パンフレット
【非特許文献１】Joannou, GE, Kelly, GE, Reeder, AY, Waring, M, Nelson, C.  A Urinary profile Study of Dietary Phytoestrogens.  The Identification and Mode of Metabolism of New Isoflavonoids.  Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, 1995, 54, 176-184.
【非特許文献２】Miyase, T, Sano, M.  Antioxidant from Lespedeza holoba.  Phytochemistry 1999, 52(2), 303-310.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、デヒドロエクオール等の生化学的活性に着目し、デヒドロエクオール等の潜在的に健康に良い点の範囲を解明し、本化合物及びそれらの誘導体による細胞メカニズムの調節方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この出願は、イソフラブ−３−エン及びイソフラバン成分、特にデヒドロエクオールに関する新規の治療的指示を記載し、こうしてイソフラブ−３−エン、イソフラバン及びそれらの誘導体の既知の生物学的作用及び健康に良い点を拡張する。本発明は、デヒドロエクオール及びその誘導体が、哺乳類細胞において一連の分子標的を調節することを、そしてこれらの分子標的が細胞増殖、分化、移動及び死といった重要な細胞プロセスに基礎を成すシグナル伝達プロセスに密接に関与することを本出願人らが意外にも見出した全体的に予想外の生物学的活性に基づいている。したがってこれらの意外な生化学的作用は、ヒトを含む動物の健康に関する広範なそして重要な示唆を有することが分かる。本発明のこれらの及びその他の好ましい対象をここに記載する。
【００１０】
本特許は、デヒドロエクオール及びその誘導体の生物学的作用及び健康に良い点を拡張する。
【００１１】
本発明は、特にイソフラブ−３−エン及びイソフラバン化合物に関し、とりわけ４’，７−ジヒドロキシイソフラブ−３−エンに関する。これらの化合物は意外にも、動物細胞内の広範な種々のシグナル伝達プロセスを調節し、そしてこれらのシグナル伝達プロセスは、全動物細胞の生存及び機能に極めて重要である広範な一連の機能に関与し、したがって、これらの化合物はヒトを含む動物において広範囲かつ重要な健康に良い点を有することが見出されている。
【００１２】
本発明の特定の利点は、（ａ）該化合物により標的化される広範囲のシグナル伝達プロセス、（ｂ）これらの種々のプロセスの調節が、いくつかのプロセスの上向き調節と他のプロセスの下向き調節の両方を包含する事実、及び（ｃ）シグナル伝達プロセスに及ぼすこのような広範かつ種々の作用が、代謝及びステロイド産生の基礎を成す一連の重要な酵素に及ぼす個々の作用も伴うということにある。
【００１３】
本発明の化合物、特にデヒドロエクオールが、動物の健康に関するこのような可能性、特に重要なかつ一般的なヒトの疾患、障害及び機能を予防し、かつ治療する可能性を有するこのような広範囲の生化学的作用を有する、ということは極めて意外である。
【００１４】
本発明の種々の態様に従った化合物は、一般式IIのイソフラブ−３−エン及びイソフラバン化合物であり、その薬学的に許容可能な塩及び誘導体を含む：
【００１５】
【化２】
2005528391.tif 000003
【００１６】
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は独立して、水素、ヒドロキシ、ＯＲ９、ＯＣ（Ｏ）Ｒ１０、ＯＳ（Ｏ）Ｒ１０、ＣＨＯ、Ｃ（Ｏ）Ｒ１０、ＣＯＯＨ、ＣＯ２Ｒ１０、ＣＯＮＲ１１Ｒ１２、アルキル、ハロアルキル、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリール、アルコキシアリール、チオ、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ニトロ又はハロであり、あるいは
Ｒ３及びＲ４は先に定義したとおりであり、そして
Ｒ１及びＲ２は、それらが結合される炭素原子と一緒になって、以下から選択される５員環を形成し：
【００１７】
【化３】
2005528391.tif 000004
【００１８】
Ｒ１及びＲ４は先に定義したとおりであり、そしてＲ２及びＲ３は、それらが結合される炭素原子と一緒になって、以下から選択される５員環を形成し：
【００１９】
【化４】
2005528391.tif 000005
【００２０】
Ｒ１及びＲ２は先に定義したとおりであり、そしてＲ３及びＲ４は、それらが結合される炭素原子と一緒になって以下から選択される５員環を形成し：
【００２１】
【化５】
2005528391.tif 000006
【００２２】
そして、ここで、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、独立して、水素、ヒドロキシ、ＯＲ９、ＯＣ（Ｏ）Ｒ１０、ＯＳ（Ｏ）Ｒ１０、ＣＨＯ、Ｃ（Ｏ）Ｒ１０、ＣＯＯＨ、ＣＯ２Ｒ１０、ＣＯＮＲ１１Ｒ１２、アルキル、ハロアルキル、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、チオ、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ニトロ又はハロであり、
Ｒ８は、水素、ヒドロキシ、アルキル、アリール、アミノ、チオ、ＮＲ１１Ｒ１２、ＣＯＮＲ１１Ｒ１２、Ｃ（Ｏ）Ｒ１３（ここで、Ｒ１３は水素、アルキル、アリール、アリールアルキル又はアミノ酸である）、又はＣＯ２Ｒ１４（ここで、Ｒ１４は水素、アルキル、ハロアルキル、アリール又はアリールアルキルである）であり、
Ｒ９は、アルキル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ１３（ここでＲ１３は先に定義したとおりである）又はＳｉ（Ｒ１５）３（ここで、Ｒ１５は各々独立して、水素、アルキル又はアリールである）であり、
Ｒ１０は、水素、アルキル、ハロアルキル、アミノ、アリール、アリールアルキル、アミノ酸、アルキルアミノ又はジアルキルアミノであり、
Ｒ１１は、水素、アルキル、アリールアルキル、アルケニル、アリール、アミノ酸、Ｃ（Ｏ）Ｒ１３（ここで、Ｒ１３は先に定義したとおりである）又はＣＯ２Ｒ１４（ここで、Ｒ１４は先に定義したとおりである）であり、
Ｒ１２は、水素、アルキル又はアリールであり、又は
Ｒ１１及びＲ１２は、それらが結合される窒素と一緒になって、ピロリジニル又はピペリジニルを構成し、
描画「---」は、単結合又は二重結合、好ましくは二重結合を表し、
Ｔは独立して水素、アルキル又はアリールであり、そして
Ｘは、Ｏ、ＮＲ１２又はＳ、好ましくはＯである。
【００２３】
本発明の一態様に従って、式IIの１つ以上の化合物を、所望により担体及び／又は賦形剤とともに対象に投与することを含む、異所性細胞生存、異所性細胞増殖、異常細胞移動、異常血管形成、異常エストロゲン／アンドロゲンバランス、機能障害性又は異常ステロイド発生、血管壁内の変性変化を含む変性、炎症、及び免疫学的不均衡に関連した疾患の治療、予防又は改善のための方法が提供される。
【００２４】
本発明の別の態様に従って、異所性細胞生存、異所性細胞増殖、異常細胞移動、異常血管形成、異常エストロゲン／アンドロゲンバランス、機能障害性又は異常ステロイド発生、血管壁内の変性変化を含む変性、炎症、及び免疫学的不均衡に関連した疾患の治療、予防又は改善のための薬剤の製造における式IIの化合物の使用が提供される。
【００２５】
本発明の別の態様に従って、異常生存表現型（abnormal prosurvival phenotype）を発現する細胞を、所望により担体又は賦形剤とともに１つ以上の式IIの化合物と接触させることを含む、前記細胞においてアポトーシスを誘導する方法が提供される。
【００２６】
本発明の別の態様に従って、異常細胞移動表現型（abnormal cellular migration phenotype）を有する細胞を、所望により担体又は賦形剤とともに式IIの化合物と接触させることを含む、前記細胞の移動を抑制する方法が提供される。
【００２７】
本発明の別の態様に従って、異所性血管形成表現型を発現する組織を、所望により担体又は賦形剤とともに式IIの化合物と接触させることを含む前記組織において血管形成を抑制する方法が提供される。
【００２８】
本発明の別の態様に従って、治療的有効量の式IIの化合物又はその薬学的に許容可能な塩又は誘導体を、所望により担体又は賦形剤とともに、哺乳類に投与する段階を含む、哺乳類においてトポイソメラーゼIIを抑制する方法が提供される。
【００２９】
本発明の別の態様に従って、腫瘍に罹患している哺乳類の癌性組織において新生物発達（neoplastic development）が遅延されるか又は停止されるよう、式IIの化合物又はその薬学的に許容可能な塩あるいは誘導体を前記癌性組織と接触させる段階を含む、哺乳類における癌の治療、予防又は改善のための方法が提供される。
【００３０】
好ましい実施態様では、新生物の発達がＤＮＡトポイソメラーゼIIの切断複合体を安定化する式IIの化合物により遅延又は停止される。
【００３１】
本発明の別の態様に従って、腫瘍に罹患している哺乳類の癌性組織において新生物発達が遅延されるか又は停止されるよう、式IIの化合物又はその薬学的に許容可能な塩あるいは誘導体を前記癌性組織と接触させ、式IIの化合物は前記癌性組織に関連したｔＮＯＸを抑制する段階を含む、哺乳類における癌の治療、予防又は改善のための方法が提供される。好ましくは、デヒドロエクオールなどの式IIの化合物は、ｔＮＯＸの抑制を通してアポトーシスを誘導する。
【００３２】
別の好ましい実施態様では、式IIの化合物は、既知のトポII毒とシナジー的に同時投与される。代替的な実施態様では、式IIの化合物は、別のトポII毒、あるいはその他の化学療法的活性作用物質に対して耐容性又は抵抗性を発症した対象に投与される。
【００３３】
本発明の別の態様に従って、ＤＮＡトポイソメラーゼIIを発現する細胞を、所望により担体又は賦形剤とともに１つ以上の式IIの化合物と接触させることによりなる、前記細胞においてアポトーシスを誘導する方法が提供される。
【００３４】
本発明の別の態様に従って、ＤＮＡトポイソメラーゼ切断複合体を式IIの化合物又はその薬学的に許容可能な塩あるいは誘導体と接触させ、切断できる複合体を安定化することによって、ＤＮＡトポイソメラーゼIIの抑制方法が提供される。
【００３５】
本発明の別の態様に従って、哺乳類における癌の治療のための薬剤の製造において式IIの化合物又はその薬学的に許容可能な塩あるいは誘導体の使用が提供される。
【００３６】
本発明の別の態様に従って、ＤＮＡトポイソメラーゼII毒として、式IIの化合物又はその薬学的に許容可能な塩あるいは誘導体の使用が提供される。
【００３７】
本発明の別の態様に従って、ｔＮＯＸ阻害剤として、式IIの化合物又はその薬学的に許容可能な塩あるいは誘導体の使用が提供される。式IIの化合物は、腫瘍細胞に関連したｔＮＯＸの抑制のための薬剤の製造に用いられ得る。
【００３８】
本発明の別の態様に従って、式IIの化合物又はその薬学的に許容可能な塩あるいは誘導体を、薬学的に許容可能な担体及び／又は希釈剤とともに含む癌の治療のための薬学的組成物が提供される。
【００３９】
本発明の別の態様に従って、式IIの化合物を、別の化学療法的活性作用物質、好ましくは別のトポII毒との混和物中に含むシナジー的薬学的組成物が提供される。一実施態様では、式IIの化合物は、別のトポII毒とともにキット内に存在する。
【００４０】
本発明の別の態様に従って、式（II）の化合物を、１つ以上の他の薬学的に活性な作用物質とともに含む薬学的組成物が提供される。
【００４１】
本明細書及び特許請求の範囲を通して、文脈が他の意味を要求しない限り、「含む（comprise）」という用語及び「含む（comprises）」又は「含んでいる（comprising）」という変形語は、記述された完全体又は段階、あるいは完全体又は段階のグループを示唆するが、しかし如何なるその他の完全体又は段階あるいは完全体又は段階のグループの排除を示唆するものではないと理解される。
【発明の効果】
【００４２】
本発明は、イソフラブ−３−エン又はイソフラバン構造に基づいた化合物を含む細胞メカニズム調節組成物等を提供することができ、異所性細胞生存、異所性細胞増殖、異常細胞移動、異常血管形成、異常エストロゲン／アンドロゲンバランス、機能障害性又は異常ステロイド発生、血管壁内の変性変化を含む変性、炎症あるいは免疫学的不均衡に関連した疾患の治療、予防又は改善に貢献することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
［発明の詳細な説明］
全細胞機能は、遠位細胞（内分泌シグナル）、隣接細胞（傍分泌シグナル）、あるいは同一細胞（自己分泌シグナル）に由来するおびただしい数のシグナルの制御下にある。これらの異なるシグナルは、適切な細胞応答が開始される細胞のゲノム（ＤＮＡ）を刺激することにより、大いに働く。シグナルがゲノムに伝達されるプロセスは、シグナル伝達として知られている。これにより、異なるタンパク質を主に包含する経路を本発明者らは意味するが、この場合、一タンパク質の活性化は別のタンパク質の応答を触媒し、最後に特定の遺伝子又は特定の一組の遺伝子の転写で終わる。良好な健康をもたらす細胞、組織及び器官の統合機能化を意味する恒常性は、継続的に身体の細胞に入る数百の、おそらくは数千の異なるシグナルの最終産物である。
【００４４】
このシグナル伝達環境から、シグナルを任意に「特殊化された機能」に関連するものと、存在し、機能する細胞の基本的能力に関連するものに分けることができる。「特殊化された機能」の例は、神経細胞による疼痛知覚、免疫細胞による抗体の産生、肝細胞による解毒反応、あるいは腎細胞による尿の生成である。「基本的機能」の例は、細胞生存又は細胞死、細胞増殖、細胞移動及び血管形成である。細胞が「特殊化された機能」を実施し得るか否かを調節する鍵は、細胞の「基本的機能」の調節である、ということが分かる。
【００４５】
意外なかつ偉大な発見において、本出願人らは、式IIの化合物、特にデヒドロエクオールは、細胞の多数の「基本的機能」を調節することを見出した。この発見は、（ａ）今日まで、単一化合物が、細胞における基本的調節メカニズムに関与するそのように多数の標的に対してこのような包括的作用を有し得るとは考えられておらず、そして（ｂ）デヒドロエクオールがこれらの分子標的を調節する作用様式が、全く新規であり、それらが機能不全である場合にのみこれらの標的の作用を修正するために、意外である。さらに、それは大きな発見であり、このような生物学的作用を有する化合物は、それらの全範囲の活性にわたり機能する細胞の能力に対する明瞭かつ重要な意味を有し、同様にこれは動物の一般的健康に対する実質的意味を有する。
【００４６】
以下の説明では、デヒドロエクオールに特に言及する。しかしながらこの説明は、式IIのその他の化合物にも当てはまると理解されるべきである。
【００４７】
以下は、本発明者らが意外にも見出した、デヒドロエクオール及び式IIのその他の化合物により調節される「基本的機能」のいくつかの例である。
【００４８】
１．細胞生存／死
特化された機能に対して応答する能力を含めて機能し続けるために、細胞は前生存シグナル伝達メカニズムを継続的に活性化する必要がある。前生存メカニズムは、２つの主要なレベルで、すなわち生存を活発に促進するレベルと、細胞死（アポトーシス）を活発に抑制するレベルで作用する。
【００４９】
前生存メカニズムは、その最終産物が細胞生存を促進するある種の遺伝子の転写を最終的に引き起こす多数の異なるシグナル伝達プロセスを包含する。これらの異なるプロセスとしては、ＭＥＫ、ＥＲＫ及びＮＦκＢのような分子標的が挙げられるが、これらに限定されない。デヒドロエクオールは、一連のこれらのプロセスを通して機能することが判明した。特に、１つ例としては、酵素スフィンゴシンキナーゼである。スフィンゴシンキナーゼは基質スフィンゴシンをスフィンゴシン−１−ホスフェートにリン酸化する。スフィンゴシン−１−ホスフェートは前生存メカニズムの重要な刺激物質であり、細胞の寿命増大により特性化される一連の疾患状態において過剰発現される。デヒドロエクオールは、スフィンゴシンキナーゼ活性を下向き調節する。
【００５０】
アポトーシスは、以下のような多数のメカニズムにより達成され得る。
（ａ）このような一メカニズムは、「死受容体」として既知の受容体を含む。これらの例としては、Ｆａｓ／Ｍｏｒｔ、ＴＧＦ及びＴＮＲＦなどの受容体が挙げられる。受容体の活性化は普通、Ｃ−フリップなどの遮断タンパク質の産生により抑制される。デヒドロエクオールは、Ｃ−フリップの産生を遮断し、そのようにすることで、細胞の死を促進することが見出された。
（ｂ）別のメカニズムは、カスパーゼとして既知のタンパク質分解酵素の活性化を包含する。一旦活性化されると、これらの酵素は細胞を自己融解する。デヒドロエクオールは、カスパーゼの活性を上向き調節することが判明した。
（ｃ）別のメカニズムは、種々の前死因子の産生をもたらすミトコンドリアの崩壊を包含する。デヒドロエクオールは、ミトコンドリアに及ぼす直接的かつ新規の作用を通してこのような崩壊を促すことが判明した。
【００５１】
デヒドロエクオールは、多数の異なる経路を介して包括的方法で細胞死を誘導し得ることが上記の説明から分かる。このような広範なかつ相補的な作用を有する単一化合物の能力は新規である。しかし、かなり意外なことは、デヒドロエクオールが異常細胞のみにこのような前死作用を発揮するという知見である。
【００５２】
すなわち、正常健常細胞では、デヒドロエクオールは、これらの調節プロセスに及ぼす識別可能な作用を有さない。これらの調節プロセスの異常活性を示す細胞としては、癌、心臓血管性疾患、自己免疫疾患及び免疫学的、炎症性又は過増殖性構成成分を有する疾患のような疾患状態に関与する細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
２．細胞増殖
増殖シグナルに応答して分裂する能力は、正常で健常な細胞に必要な別の基本的機能である。スフィンゴシン−１−ホスフェートは、細胞の分裂する能力を促すのに重要な役割を果たすと思われる。細胞分裂の行為は、以下のような多数の異なる酵素を包含する：
（ａ）有糸分裂前にＤＮＡを体系化することがその仕事であるトポイソメラーゼ（Ｉ及びII）の活性化；
（ｂ）有糸分裂の異なる段階を通してゲノムを動かすのがその仕事であるサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）の活性化；
（ｃ）ＣＤＫの抑制を通して有糸分裂を抑制することがその仕事であるサイクリン依存性キナーゼ阻害剤（ＣＤＫＩ）の不活化。
【００５４】
デヒドロエクオールは意外にも、３つの上記の成分、すなわちトポイソメラーゼII、ＣＫＤ及びＣＤＫＩの全てを抑制する。これらの構成成分の各々を別個に抑制する種々の薬剤が記載されているが、単一薬剤が３つの異なる酵素系全てを抑制し得るという概念は新規でありかつ意外である。
【００５５】
新規性及び意外性に寄与するのは、デヒドロエクオールが、異常に行動している細胞、特に、異常前生存表現型又は異所性細胞増殖を発現する細胞中のこれらの酵素系を抑制するに過ぎない、という事実である。
【００５６】
３．細胞移動
移動し、そしてその隣接細胞と相互作用する細胞の能力が、健康及び疾患に対する基本である、ということは十分に理解されている。スフィンゴシンキナーゼ及びマトリックス−メタロプロテイナーゼは、この重要な細胞機能の重要な調節物質である。デヒドロエクオールはこれらの酵素系の両方を独特に下向き調節し、したがって移動する疾患状態の細胞の能力を縮小する。
【００５７】
４．血管形成
新規の血管を形成する能力は、過形成に関連した多数の疾患状態に内在する重要な事象である、ということは知られている。スフィンゴシンキナーゼは、この事象の重要な促進物質である。デヒドロエクオールは、この酵素を下向き調節することにより、それが健常組織中でなく、疾患に関連して起こる場合、血管形成を選択的に減じる。
【００５８】
シグナル伝達メカニズムに及ぼすデヒドロエクオールのこれらの広範囲の作用は、広範な酵素に及ぼす抑制作用により意外にも補足され、このような酵素は普通はシグナル伝達プロセスの一部とみなされないが、しかしより一般的には、身体の生理学の一部とみなされる。これら作用には、以下のものも含まれる：
【００５９】
５．ステロイド産生
デヒドロエクオールは、ステロイド産生に関与する多数の酵素を抑制する。これらの例としては、ステロイドデヒドロゲナーゼ、５−α−レダクターゼ及びアロマターゼが挙げられるが、これらに限定されない。このような作用は、アンドロゲン、エストロゲン及びコルチコステロイドなどのステロイドホルモンの産生に大きな影響を及ぼす、と当業者は認識する。このような作用は、乳房、卵巣、子宮、子宮内膜、子宮頸部、膣、前立腺及び陰茎など男性及び女性の生殖組織の正常機能に影響を及ぼすと、当業者によりみなされる。
【００６０】
要するに、デヒドロエクオールが、全身代謝（general metabolism）及び生理学的機能の両方に、及び細胞生存、細胞増殖、細胞分化並びに炎症及び免疫モデュレータに対する細胞応答において極めて重要な役割を果たすシグナル伝達経路に関与する酵素の独特の収集を調節する、ということを本発明者等は意外にも見出した。この群の酵素の調節により、本発明の化合物は、（ａ）その疾患の原因又は病原に関係なく多数の形態の疾患を予防するか又は治療する、そして（ｂ）身体の組織の全範囲の生物学的活性に、及び疾患、年齢、環境が影響を及ぼす、及びその他の薬剤がそれらの活性に影響を及ぼす方法に影響する能力を有する。
【００６１】
さらに、ヒト乳癌細胞にアポトーシス及び死をもたらすことができる化合物が、また、高血圧を相殺し、炎症性腸疾患の根底にある免疫学的及び炎症性不均衡を矯正し、１型糖尿病を改善し、男性型禿頭症を改善するような多様な効能を有し得ることを見出したことは非常に意外でありかつ新規である。何らかの又は全てのこれらの障害間に既知の原因的又は病原的連関は認められず、デヒドロエクオールがこのような健康に良い点を示すに違いないことを全く予測できない。
【００６２】
身体における広範囲な生物学的活性全体におけるデヒドロエクオールの大きな重要性に偏見を持たずに、この化合物は、以下のような種々の疾患状態及び障害の予防及び治療に特別な関連性を有することが容易に分かる。
【００６３】
Ａ．増殖シグナルに対する異常応答、異常細胞増殖、機能不全性アポトーシス及び異常移動パターン（転移）に関連した疾患及び障害
これらの例としては以下のものが挙げられる：
１．身体の全組織における癌の全形態（前癌、良性及び悪性）。この点で、化合物は唯一の形態の抗癌療法として、又は他の形態の抗癌療法、例えば放射線療法及び化学療法（これらに限定されない）と組合せて用いられ得る；
２．丘疹膿疱性皮膚病変（papulonodular skin lesions）、例えばサルコイドーシス、血管肉腫、カポジ肉腫、ファブリー病（これらに限定されない）；
３．丘疹鱗屑性皮膚病変（papulosquamous skin lesions）、例えば乾癬、ボーエン病及びライター病（これらに限定されない）；
４．骨髄の増殖性障害、例えば巨赤芽球性疾患、脊髄形成異常性症候群、真性赤血球増加症、血小板増加症及び骨髄線維症（これらに限定されない）；
５．生殖路の過形成性疾患、例えば良性前立腺肥大症、子宮内膜症、子宮類線維腫及び多嚢胞性卵巣疾患（これらに限定されない）。
【００６４】
Ｂ．異常血管形成に関連した疾患及び障害
これらの例としては、以下のものが挙げられる：
１．身体内のどんな組織にも影響を及ぼす異常血管形成に関連した疾患及び障害、例えば転移性癌、乾癬、血管腫及び毛細血管拡張症（これらに限定されない）。
【００６５】
Ｃ．異常炎症性／免疫学的応答に関連した疾患及び障害
これらの例としては、以下のものが挙げられる：
１．身体組織のいずれかにおける異常又は遅延性の炎症反応に関連した疾患及び障害、例えば関節リウマチ、腱炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、硬化性胆管炎（これらに限定されない）；
２．血管の壁内の変性変化に関連した疾患及び障害、例えば通常心臓血管性疾患として既知の症候群（アテローム性動脈硬化症、アテローム、冠動脈疾患、卒中、心筋梗塞、血管形成術後再狭窄（post-angioplasty restenosis）、高血圧性血管疾患、悪性高血圧、閉塞性血栓性血管炎、線維筋性過形成症
を包含する）、これらに限定されない；
３．異常免疫学的応答に関連した疾患及び障害、例えば皮膚筋炎及び強皮症（これらに限定されない）。
４．免疫学的不均衡、例えばＨ．Ｉ．Ｖ．又はその他のウイルス感染作因又は細菌感染作因に関連した免疫不全、及び未成熟又は加齢に関連した免疫不全。
【００６６】
Ｄ．細胞機能低減、例えば増殖シグナルに対する応答低減及び細胞死の比率増大に関連した疾患及び障害
これらの例としては、以下のものが挙げられる：
１．皮膚における変性変化により特性化される光線性損傷、例えば日光性角化症、光過敏性疾患及び皺（これらに限定されない）；
２．異常免疫学的応答により特性化される自己免疫疾患、例えば多発性硬化症、１型糖尿病、全身性紅斑性狼瘡及び胆汁性肝硬変（これらに限定されない）；
３．神経系の構造において変性変化により特性化される神経変性疾患及び障害、例えばパーキンソン病、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、ルー−ゲーリック病、運動ニューロン病（これらに限定されない）；
４．眼内の変性変化に関連した疾患及び障害、例えば白内障、黄斑変性症、網膜萎縮症（これらに限定されない）。
【００６７】
Ｅ．機能障害性又は異常ステロイド産生及び性ホルモンの機能に関連した疾患及び障害
これらの例としては、以下のものが挙げられる：
１．異常なエストロゲン／アンドロゲンバランスに関連した女性における症状、例えば周期性乳腺痛、座瘡、月経困難症、子宮類線維症、子宮内膜症、卵巣嚢胞、月経前症候群、急性閉経期症候群、骨粗鬆症、老人性痴呆症、不妊症（これらに限定されない）；
２．異常エストロゲン／アンドロゲンバランスに関連した男性における症状、例えば良性前立腺肥大、不妊、女性化乳房、遺伝性脱毛症及び種々のその他の形態の禿頭症（これらに限定されない）。
【００６８】
試験の重要な分野において、本発明者等は、細胞増殖、及び有糸分裂により分裂する細胞の能力に影響を及ぼす因子を調べた。有糸分裂に関与する重要なクラスの酵素の１つは、トポイソメラーゼで、その仕事は、有糸分裂前にＤＮＡを体系化することである。
【００６９】
特にＤＮＡトポイソメラーゼは、ＤＮＡ複製転写及び組換え中のトポロジーの問題を解決する保存必須酵素の一ファミリーを構成する。哺乳類Ｉ型酵素（又はトポＩ）は、主に転写中に機能するＡＴＰ非依存性ＤＮＡ一本鎖エンドヌクレアーゼ及びリガーゼである。哺乳類II型酵素（又はトポII）は、ＡＴＰ依存性ＤＮＡ二本鎖エンドヌクレアーゼ及びリガーゼである２つのアイソフォーム（α及びβ）により代表される。トポIIαは、複製中の二本鎖ＤＮＡを脱鎖化する染色体マトリックスの主要構成成分である。トポIIαの発現は、細胞周期調節性及び増殖依存性であり、一方、トポＩ及びトポIIβの発現は、細胞周期を通して相対的に一定であり、増殖に依存しない（参考文献３参照）。
【００７０】
トポIIの抑制は、一般に、（ａ）トポII酵素とＤＮＡとの間の一過性反応中間産物（切断複合体と呼ばれる）を安定化するか、あるいは（ｂ）その形成を妨げることにより起こり得る（参考文献４参照）。切断複合体を安定化するトポII阻害剤は、トポII毒と呼ばれ、抗腫瘍薬、例えばＶＰ−１６（エトポシド）及びドキソルビシンにより代表される。切断複合体を安定化しないトポII阻害剤は、触媒性阻害剤と呼ばれ、癌治療薬としての用途を見出し得るか、又は見出し得ないこともあるアクラルビシン及びメルバロンのような作用物質により代表される。
【００７１】
トポII毒は、修復プロセスを免れ得る二本鎖切断の生成のために、細胞毒である。高レベルのトポIIを含有する腫瘍細胞は、一般に非常に低いトポIIレベルを含有する正常非分裂性細胞よりトポII毒の細胞毒作用に対してより感受性である［５〜８］。
【００７２】
従来、ダイズイソフラボンゲニステインは、それがトポIIの触媒的活性を抑制し、切断複合体を安定化するので、トポII毒として同定されてきた（参考文献４、９〜１３参照）。この点で、ゲニステインは、高濃度で導入された場合、抗腫瘍薬として作用し得る（参考文献１４参照）が、しかし多数のその他の抗腫瘍薬と同様に、それはヒト白血病の促進に関与すると考えられる（参考文献１５参照）。
【００７３】
したがって、哺乳類、特にヒトの健康及び福利に重要な生理学的特性を示す新規の又は改良された化合物及び組成物を見出すこと、及び疾患の治療、改善及び予防のためにこれらの特性を利用する新規の方法を見出すことが、引き続き必要である。
【００７４】
本発明は、デヒドロエクオールが、トポイソメラーゼ／ＤＮＡ切断複合体上の新規の部位に結合する強力なトポII毒である、という意外な発見をなした。これは、癌の化学療法における、及び既知のトポII毒の抗腫瘍作用を強化するに際しての新規な応用において、デヒドロエクオール及びその誘導体の使用を提供する。
【００７５】
本発明のイソフラブ−３−エン及びイソフラバン化合物、特にデヒドロエクオールは、関連する哺乳類の疾患、障害及び機能の予防及び治療におけるそれらの可能性を強調するために、切断複合体との新規な結合配置を介してこのような特異性及び有用性を有するＤＮＡトポイソメラーゼIIを抑制する、ということは極めて予測不可能である。
【００７６】
デヒドロエクオールはトポII特異毒である、ということを出願人らはここに始めて示した。デヒドロエクオールは、トポＩ触媒活性を抑制しないことが見出されたし、トポＩ−切断複合体を遮断しないことも見出された。トポIIに対するデヒドロエクオールの特異性は、トポIIを標的化する最も広範に処方される抗新生物薬と同一の範疇にそれを入れる（参考文献１６参照）。トポＩレベルは、正常細胞と腫瘍細胞との間で相対的に類似している。それとは反対に、トポIIレベルは、腫瘍細胞の急速な分裂中においては非常に高い。その結果、トポII毒として作用する作用物質は、主に腫瘍細胞に対してそれらの細胞傷害性作用を向けるが、一方、トポＩ及びII毒の両方として作用するものは、正常細胞に対しても細胞傷害性であり得る。この観察は、本出願人らにより発見された正常健常組織中でのデヒドロエクオールの観察された低毒性と一致する。
【００７７】
切断複合体を安定化することによりin vitroでのトポII媒介性ＤＮＡ切断を促すデヒドロエクオールの能力は、癌化学療法に一般に用いられるその他のトポII毒の能力に匹敵する。このような一薬剤は、小細胞肺癌の治療に用いられるＶＰ−１６であり、これは７０％の患者において寛解をもたらし、「純」トポII毒であると考えられる（参考文献１７参照）。
【００７８】
デヒドロエクオールは、検出可能なトポII媒介性線状プラスミドＤＮＡを２０μｇ／ｍｌの濃度で生成する、ということを本出願人らは意外にも見出した。これは、匹敵するＤＮＡ切断を生じたゲニステインの濃度（３０μｇ／ｍｌ）より低い。デヒドロエクオールの作用はＶＰ−１６の作用と同様であった。
【００７９】
トポII毒、例えばＶＭ−２６、ＶＰ−１６、ドキソルビシン、アムサクリン及びいくつかの食物バイオフラボノイドは、正常酵素（トポII）を細胞毒に転化するトポII阻害剤の一クラスを代表する。トポII、ＤＮＡ及び薬剤間に形成される三元複合体は、ＤＮＡリライゲーション又はＤＮＡ修復により当初は可逆性である［４］。累積三元複合体（accumulating ternary complexes）の細胞プロセシングは、３００〜６００ｋｂのサイズのタンパク質会合ＤＮＡ断片をもたらす不可逆的段階を活性化する（参考文献１８参照）。この不可逆的段階後、カスパーゼ３は活性化されるようになり、これがアポトーシスの特徴であるヌクレオ鎖切断性ＤＮＡ切断を生じる。したがってＤＮＡ複製又は転写後、これらのトポII毒は、切断複合体を致死性病変に転化する（参考文献１７，１９参照）。トポII阻害剤に対する腫瘍細胞の感受性は、核内トポIIレベルと強く関連する［５、７、８］。急速に分裂中の肺癌、乳癌、卵巣癌及び悪性リンパ腫細胞は、一般に正常非分裂中の細胞よりはるかに高いレベルのトポIIを発現するため、前者はトポII毒の有害作用に対してより敏感である。さらにトポII活性低減は、細胞分化に関連している［４、９］。トポII活性に及ぼすデヒドロエクオールの作用に基づいて、この作用物質は腫瘍細胞分化を誘導し、アポトーシス経路を活性化すると予測される。デヒドロエクオールのこれらの生物学的作用は、トポIIを抑制し、二本鎖ＤＮＡ切断を生じるその能力と一致する。
【００８０】
トポIIの触媒周期は、６つの異なる段階に分けられ得る。これらは次のとおりである：１）ＤＮＡとのトポIIの結合、２）二本鎖ＤＮＡ切断、３）切断による二本鎖継代、４）切断ＤＮＡの再結繋（リライゲーション）、５）ＡＴＰ加水分解、及び６）酵素代謝回転（enzyme turnover）（参考文献２０参照）。
【００８１】
トポII毒の臨床的適用は、抑制される触媒周期の的確な段階に依存している。デヒドロエクオールは切断複合体を捕捉するが、しかしながらこれが切断段階を強化することにより遂げられるか、再結繋段階を抑制することにより遂げられるか、又は両方の段階の何らかの組合せによるかは明らかでない、ということが本特許において本出願人らにより確立された。すなわち、デヒドロエクオールがトポIIに結合するか、ＤＮＡに結合するか、又はトポII／ＤＮＡ複合体に結合するかは未だ明らかでない。
【００８２】
トポII毒、例えばダウノルビシン、ドキソルビシン、アムサクリン、エリプチシン及びミトキサントロンは、ＤＮＡインターカレーターである（参考文献２１参照）。その他のトポII毒、例えばＶＰ−１６、ＶＭ−２６、クレロシジン及びサルビシンは、ＤＮＡに挿入されない（参考文献２１，２２参照）。デヒドロエクオール及びその誘導体の臨床的適用としては、その他の化学療法薬とのシナジー的組成物、及び現在投与される化学療法薬に対する耐性が現れた患者の治療におけるその使用が挙げられる。すなわち、デヒドロエクオールが既知のトポII毒、例えばＶＰ−１６以外の異なるトポII部位と結合する場合、それは既知のトポII毒とは結合しないトポIIの突然変異体形態を発現し、したがってその細胞傷害性作用を免れる癌の治療に用途を見出す。
【００８３】
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ（ＮＯＸ）タンパク質は、例えばMorre et al (2002) Biochemistry, Vol.41 No.40, pages 11941-11945に記載されている（参考文献２４参照）。動物細胞の外表面でのこのようなＮＡＤＨオキシダーゼは、２４分間のクロック関連同調性及び温度補償期間で振動の安定かつ循環パターンを示す。これらのタンパク質は、交互に起こる２つの異なる生化学的活性、すなわちヒドロキノン（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ）酸化及びタンパク質ジスルフィド−チオール交換を有するという、生化学文献中で先例となっていない特性により特性化される（Morre et al、上記）。このようなタンパク質は、それらの細胞表面位置のために、ＥＣＴＯ−ＮＯＸタンパク質と呼ばれる（Morre, D.J. (1995) Biochim. Biophys. Acta. 1240, 201-208（参考文献２５参照））。構成性ＥＣＴＯ−ＮＯＸ（ＣＮＯＸと呼ばれる）は、キノン部位阻害剤に応答性及び不応性のホルモンである。腫瘍細胞に関連するＮＯＸ（ｔＮＯＸ）は、非調節性であり、ホルモン及び増殖因子に不応性で、そして阻害剤に応答する（Morre, D.J. (1998) in Plasma Membrane Redox Systems and Their Role in Biological Stress and Disease (Asard et al editors), pp 121-156, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, the Netherlands（参考文献２６参照））。ＣＮＯＸタンパク質は広範に分布し、２４分の期間長で活性振動を示す。他方でｔＮＯＸは癌細胞特異的であり、約２２分の期間長で振動を示し、すなわちＣＮＯＸの場合より２分短い（Wang et al (2001) Biochim. Biophys. Acta. 1539, 192-204（参考文献２７参照））。
【００８４】
ＮＯＸタンパク質のジスルフィド−チオール交換活性は、細胞拡張を駆動し、これは、抑制されると、アポトーシスを生じる。式IIの化合物、例えばデヒドロエクオールは、ｔＮＯＸを遮断することにより、ｔＮＯＸのジスルフィド−チオール交換の、したがって細胞拡張の強力な阻害剤である、ということを本発明者等は示した。その結果生じた分裂することができない小細胞は、Ｇ１細胞周期停止を受け、これがアポトーシスを引き起こす。式（II）の化合物、例えばデヒドロエクオールは、ｔＮＯＸを選択的に抑制するが、一方、ｔＮＯＸはそのように抑制されない。この選択性は、固形腫瘍及び転移を含む癌の治療において特別な治療的意味を有すると考えられる。
【００８５】
式（II）の化合物、例えばデヒドロエクオールは、マトリックス分解酵素、例えばメタロプロテアーゼ、特にマトリックス−メタロプロテアーゼを抑制することが本出願人らにより見出された。腫瘍増殖及び炎症などの疾患状態に伴う血管形成は、マトリックス−メタロプロテアーゼの合成及び分泌に依存する。したがって本発明の化合物を用いて、血管形成及び炎症を伴う疾患の治療においてマトリックス−メタロプロテアーゼを抑制し得る。
【００８６】
本発明のイソフラブ−３−エン及びイソフラバン化合物は、上記の一般式IIで示される。本発明の好ましい化合物は、以下の一般式IIIの化合物であり、その薬学的に許容可能な塩及び誘導体を含む：
【００８７】
【化６】
2005528391.tif 000007
【００８８】
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は上記定義したとおりであり、
さらに好ましくは
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、独立して、水素、ヒドロキシ、ＯＲ９、ＯＣ（Ｏ）Ｒ１０、Ｃ（Ｏ）Ｒ１０、ＣＯＯＨ、ＣＯ２Ｒ１０、アルキル、ハロアルキル、アリールアルキル、アリール、チオ、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ニトロ又はハロであり、
Ｒ８は、水素、ヒドロキシ、アルキル、アリール、ＣＯＲ１３（ここで、Ｒ１３は先に定義したとおりである）、又はＣＯ２Ｒ１４（ここで、Ｒ１４は先に定義したとおりである）であり、
Ｒ９は、アルキル、ハロアルキル、アリールアルキル又はＣ（Ｏ）Ｒ１３（ここでＲ１３は先に定義したとおりである）であり、そして
Ｒ１０は、水素、アルキル、アミノ、アリール、アミノ酸、アルキルアミノ又はジアルキルアミノであり、
さらに好ましくは、
Ｒ２は、ヒドロキシ、ＯＲ９、ＯＣ（Ｏ）Ｒ１０又はハロであり、
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、独立して、水素、ヒドロキシ、ＯＲ９、ＯＣ（Ｏ）Ｒ１０、Ｃ（Ｏ）Ｒ１０、ＣＯＯＨ、ＣＯ２Ｒ１０、アルキル、ハロアルキル又はハロであり、
Ｒ８は水素であり、
Ｒ９は、アルキル、アリールアルキル又はＣ（Ｏ）Ｒ１３（ここで、Ｒ１３は先に定義したとおりである）であり、そして
Ｒ１０は、水素又はアルキルであり、
そしてさらに好ましくは、
Ｒ２は、ヒドロキシ、メトキシ、ベンジルオキシ、アセチルオキシ又はクロロであり、
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、独立して、水素、ヒドロキシ、メトキシ、ベンジルオキシ、アセチルオキシ、メチル、トリフルオロメチル又はクロロであり、そして
Ｒ８は水素である。
【００８９】
本発明のさらに特に好ましい化合物は、以下のイソフラブ−３−エン化合物１〜４０から選択される：
【００９０】
【化７】
2005528391.tif 000008
2005528391.tif 000009
2005528391.tif 000010
2005528391.tif 000011
2005528391.tif 000012
2005528391.tif 000013
【００９１】
本発明のもっとも好ましい実施態様で、その化合物は化合物１のデヒドロエクオールである。
【００９２】
本発明のさらに好ましい化合物は、以下の一般式IVである：
【００９３】
【化８】
2005528391.tif 000014
【００９４】
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は上記に定義したとおりである。
【００９５】
さらに特に好ましい実施態様では、本発明の化合物は、それらのイソフラブ−３−エンの上記対応物に直接対応する一般式IVのイソフラバン化合物である。これらの化合物４１〜８０では、化合物１〜４０の３−エンピラン環二重結合はそれぞれ、ここでは単結合である。
【００９６】
本発明の好ましい化合物は、イソフラベン、イソフラバン又はそれが結合される誘導体分子からｉｎ  ｖｉｖｏで切断され得る生理学的に切断可能な脱離基を有する全ての誘導体及びプロドラッグも包含する。脱離基としては、アシル、ホスフェート、スルフェート、スルホネートが挙げられ、そして好ましくはモノ−、ジ−及びペル−アシルオキシ置換化合物であって、この場合、１つ以上のペンダントヒドロキシ基はアシル基、好ましくはアセチル基により保護される。典型的には、アシルオキシ置換イソフラベン及びその誘導体は、対応するヒドロキシ置換化合物に容易に切断可能である。さらに、本発明のイソフラベン化合物及び誘導体上の官能基の保護は、当該技術分野で十分に確立された方法、例えば、T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1981に記載されているような方法により実行され得る。
【００９７】
本発明の化合物に言及することは、１つ以上の化合物への言及を包含する。本発明の化合物の使用に言及することは、賦形剤及び／又は希釈剤と関連して、及び／又は１つ以上のさらなる活性作用物質と関連して、その化合物それ自体の使用に言及することを包含する。
【００９８】
「アルキル」という用語は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ペンチル、シクロペンチル等の炭素数１〜１０、好ましくは炭素数１〜６の直鎖、分枝鎖及び環状（炭素数５以上の場合）飽和アルキル基を包含すると理解される。アルキル基は、より好ましくはメチル、エチル、プロピル又はイソプロピルである。アルキル基は、１つ以上のフッ素、塩素、臭素、ヨウ素、カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ４−アルコキシカルボニル、Ｃ１〜Ｃ４−アルキルアミノカルボニル、ジ−（Ｃ１〜Ｃ４−アルキル）−アミノ−カルボニル、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ４−アルコキシ、ホルミルオキシ、Ｃ１〜Ｃ４−アルキル−カルボニルオキシ、Ｃ１〜Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ３〜Ｃ６−シクロアルキル又はフェニルにより所望により置換され得る。
【００９９】
「アルケニル」という用語は、
エテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、２−メチル−１−ペオペニル、２−メチル−２−プロペニル等の少なくとも１つの二重結合を有する炭素数２〜１０、好ましくは２〜６の直鎖、分枝鎖及び環状（炭素数５以上の場合）炭化水素を包含すると理解される。アルケニル基は、より好ましくはエテニル、１−プロペニル又は２−プロペニルである。アルケニル基は、１つ以上のフッ素、塩素、臭素、ヨウ素、カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ４−アルコキシカルボニル、Ｃ１〜Ｃ４−アルキルアミノカルボニル、ジ−（Ｃ１〜Ｃ４−アルキル）−アミノ−カルボニル、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ４−アルコキシ、ホルミルオキシ、Ｃ１〜Ｃ４−アルキル−カルボニルオキシ、Ｃ１〜Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ３〜Ｃ６−シクロアルキル又はフェニルにより所望により置換され得る。
【０１００】
「アルケニル」という用語は、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル等の少なくとも１つの三重結合を有する炭素数２〜１０、好ましくは２〜６の直鎖及び分枝鎖炭化水素を包含すると理解される。アルキニル基は、より好ましくはエチニル、１−プロピニル又は２−プロピニルである。アルキニル基は、１つ以上のフッ素、塩素、臭素、ヨウ素、カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ４−アルコキシカルボニル、Ｃ１〜Ｃ４−アルキルアミノカルボニル、ジ−（Ｃ１〜Ｃ４−アルキル）−アミノ−カルボニル、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ４−アルコキシ、ホルミルオキシ、Ｃ１〜Ｃ４−アルキル−カルボニルオキシ、Ｃ１〜Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ３〜Ｃ６−シクロアルキル又はフェニルにより所望により置換され得る。
【０１０１】
「アリール」という用語は、フェニル、ビフェニル及びナフチルを包含すると理解され、そして１つ以上のＣ１〜Ｃ４−アルキル、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ４−アルコキシ、カルボニル、Ｃ１〜Ｃ４−アルコキシカルボニル、Ｃ１〜Ｃ４−アルキルカルボニルオキシ又はハロによって所望により置換できる。
【０１０２】
「ヘテロアリール」という用語は、環中に少なくとも１つの酸素、イオウ又は窒素を含む５員及び６員環を包含すると理解され、この環は、フリル、ピリジル、ピリミジル、チエニル、イミダゾリル、テトラゾリル、ピラジニル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、キノリル、イソキノリル、プリニル、モルホリニル、オキサゾリル、チアゾリル、ピロリル、キサンチニル、プリン、チミン、シトシン、ウラシル及びイソキサゾリルを含む他のアリール又はヘテロアリール環と所望により縮合され得るが、これらに限定されない。ヘテロ芳香族基は、１つ以上のフッ素、塩素、臭素、ヨウ素、カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ４−アルコキシカルボニル、Ｃ１〜Ｃ４−アルキルアミノカルボニル、ジ−（Ｃ１〜Ｃ４−アルキル）−アミノ−カルボニル、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ４−アルコキシ、ホルミルオキシ、Ｃ１〜Ｃ４−アルキル−カルボニルオキシ、Ｃ１〜Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ３〜Ｃ６−シクロアルキル又はフェニルにより所望により置換され得る。ヘテロ芳香族は、所望により一部又は全部、水素化され得る。
【０１０３】
「ハロ」という用語は、フルオロ、クロロ、ブロモ及びヨード、好ましくはフルオロ及びクロロ、さらに好ましくはフルオロを包含すると理解される。例えば「ハロアルキル」に言及することは、モノ−ハロゲン化アルキル基、ジ−ハロゲン化アルキル基及びペルハロゲン化アルキル基までを包含する。好ましいハロアルキル基は、トリフルオロメチル及びペンタフルオロエチルである。
【０１０４】
本明細書中で用いられる「薬学的に許容可能な塩」という用語は、電荷を運び、薬学的作用物質とともに、例えば塩中のカウンターカチオン又はカウンターアニオンとして投与され得る有機又は無機部分を指す。薬学的に許容可能な陽イオンは当業者に既知であり、ナトリウム、カリウム、カルシウム、亜鉛及び第四級アミンが挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に許容可能な陰イオンは当業者に既知であり、塩化物、酢酸塩、クエン酸塩、重炭酸塩及び炭酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０５】
「薬学的に許容可能な誘導体」又は「プロドラッグ」という用語は、患者への投与時に、直接又は間接的に提供し得る活性化合物の誘導体、親化合物又は代謝産物を、あるいはそれ自体活性を示す活性化合物の誘導体を指す。
【０１０６】
本明細書中で用いる場合、「治療」、「予防（prophylaxis）」又は「防止（prevention）」、「改善（amelioration）」等の用語は、それらのもっとも広い文脈で考えられるべきものである。特に「治療」という用語は、動物が全体的回復まで治療されることを必ずしも意味しない。したがって「治療」は、特定の症状の症候又は重症度の改善、あるいは特定の症状を発症する危険を防止するかそうでなければ低減することを包含する。
【０１０７】
本発明に従った療法的処置に必要とされる式IIの１つ以上の化合物の量は、多数の因子に依存し、例えば、特定の用途、用いられる特定の化合物の性質、処置されている症状、投与方式及び患者の症状が挙げられる。式IIの化合物は、慣用的に実行されるような方式及び量で投与され得る。例えば、Goodman and Gilman, et al. (1995) The Pharmacological Basis of Therapeutics 8thEdition参照。用いられる特定投薬量は、処置される症状、対象の状態、投与経路及び上記のようなその他の既知の因子に依っている。一般的に、患者１人あたりの１日の用量は、０．１ｍｇ〜５ｇ、典型的には０．５ｍｇ〜１ｇ、好ましくは５０ｍｇ〜２００ｍｇの範囲であり得る。投与の長さは、治療されるか又は軽減される症状の重症度によって、毎日又は隔日投与される単一投与から、１週間〜数ヶ月から、必要ならば数年までのコースに亘って投与される１日２回又は３回用量までの範囲であり得る。さらに、任意の特定の対象に関しては、個体の必要性及び組成物を投与するか又は組成物の投与を指示する人の専門的判断に従って長時間に亘って特定の投与量レジメンが調整される必要がある、と理解される。
【０１０８】
活性化合物による相対的に短期間の治療を用いて、血管形成術又は外科手術により治療され得ない冠動脈疾患病変の安定化又は縮化を生じ得る。より長期の治療は、高リスク患者における進行病変の発達を防止するために用いられ得る。
【０１０９】
ここに記載された療法的適応症の治療のための薬学的組成物の製造は、典型的には、本発明の化合物（便宜上、以後「活性化合物」と呼ぶ）を当該技術分野で既知であるような１つ以上の薬学的又は獣医学的に許容可能な担体及び／又は賦形剤と混和することにより調製される。
【０１１０】
担体は、もちろん、処方物中の任意のその他の成分とコンパチブルであるという意味で許容可能でなければならず、そして対象に対して有害であってはならない。担体又は賦形剤は、固体又は液体あるいはその両方であってもよく、１００重量％までの活性化合物、好ましくは０．５〜５９重量％の活性化合物を含有し得る好ましくは単位用量の例えば錠剤として化合物とともに処方される。所望により１つ以上の補助成分を含む構成成分を混和することから本質的になる調剤の既知の技法のいずれかにより調製され得る１つ以上の活性化合物が本発明の処方物中に組み込まれ得る。薬剤組成物中で活性化合物の好ましい濃度は、薬剤の吸収、分散、不活化及び排出率、及び当業者に既知のその他の因子に依存している。
【０１１１】
本発明の処方物は、経口、直腸、眼、頬（例えば舌下）、非経口的（例えば皮下、筋内、皮内又は静脈内）及び経皮投与に適したものを含むが、如何なる所与のケースにおいても最も適切な経路は、治療されている症状の性質及び重症度に、そして使用されている特定の活性化合物の性質に依っている。
【０１１２】
経口投与に適した処方物は、離散単位（discrete units）で、例えばカプセル、サッシェ、ロゼンジ又は錠剤で提供され、各々が所定量の活性化合物を、粉末又は顆粒として、水溶液又は非水溶液中の溶液又は懸濁液として、あるいは水中油又は油中水エマルションとして含有する。このような処方物は、活性化合物及び適切な担体（上記のような１つ以上の補助成分を含有し得る）を会合させる段階を含む調剤の任意の適切な方法により調製され得る。概して本発明の処方物は、活性化合物を液体又は微粉砕固体担体又はその両方と均一にかつしっかり混合し、次いで必要ならば、得られた混合物を例えば単位服用量剤形を形成するように成形することにより調製される。例えば、錠剤は、活性化合物を、所望により１つ以上の補助成分とともに含有する粉末又は顆粒を圧縮するか又はモールディングすることにより調製され得る。圧縮錠剤は、所望により結合剤、滑剤、不活性希釈剤及び／又は界面活性剤／分散剤（単数複数）と混合された粉末又は顆粒などの易流動性の化合物を、適切な機械で圧縮することにより調製され得る。鋳型成形錠剤は、不活性液体結合剤で湿潤化された粉末化化合物を適切な機械でモールディングすることにより製造され得る。
【０１１３】
バッカル（舌下）投与に適した処方物としては、風味剤処理基剤、通常はスクロース及びアカシア又はトラガカント中に活性化合物を含むロゼンジ、及びゼラチン及びグリセリン又はスクロース及びアラビアゴムなどの不活性基剤中に該化合物を含むトローチ（pastilles）が挙げられる。
【０１１４】
非経口投与に適した本発明の組成物は、便宜上活性化合物の滅菌水溶液製剤を含むが、この製剤は好ましくは対象とするレシピエントの血液と等張である。これらの製剤は好ましくは静脈内に投与されるが、投与は、皮下、筋内又は皮内の注射によっても効果的である。このような製剤は、化合物を水又はグリセリン緩衝液と混和し、そして得られた溶液を滅菌し、血液と等張にすることによって簡便に調製できる。本発明に従った注射用処方物は、一般に、０．１〜６０％ｗ／ｖの活性化合物を含有し、０．１ｍｌ／分／ｋｇの比率で投与される。
【０１１５】
直腸投与に適した処方物は、好ましくは単位用量の座薬として提供される。これらは、活性化合物を１つ以上の常套的な固体担体、例えばカカオバターと混和し、次に得られた混合物を成形することにより調製され得る。
【０１１６】
皮膚への局所投与に適した処方物又は組成物は、好ましくは軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、スプレー、エーロゾル又はオイルの形態をとる。用いられ得る担体としては、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール類、アルコール類及びそれらの２つ以上の組合せが挙げられる。活性化合物は、一般に、０．１〜５％ｗ／ｗの濃度、特に０．５〜２％ｗ／ｗの濃度で提供される。このような組成物の例としては、化粧用スキンクリームが挙げられる。
【０１１７】
経皮投与に適した処方物は、長時間に亘ってレシピエントの表皮との密接な接触を保つよう適合された個別的なパッチとして提供される。このようなパッチは適切には、上記活性化合物に関して例えば０．１〜０．２Ｍの濃度の所望により緩衝された水溶液として活性化合物を含有する。
【０１１８】
経皮投与に適した処方物は、イオン導入法（iontophoresis）（例えば、Panchagnula R, et al., 2000 Transdermal iontophoresis revisited Current Opinion Chemical Biology Vol 4, Issue 4, pp 468-473参照）によっても供給され、典型的には活性化合物の所望により緩衝化された水溶液の形態をとる。適切な処方物は、クエン酸塩又はＢｉｓ／トリス緩衝液（ｐＨ６）又はエタノール／水を含み、そして０．１〜０．２Ｍの活性成分を含有する。
【０１１９】
吸入に適した処方物は、溶液、懸濁液又はエマルションの形態のスプレー組成物として供給され得る。吸入噴霧組成物はさらに、薬学的に許容可能な噴射剤、例えば二酸化炭素又は亜酸化窒素を含み得る。
【０１２０】
活性化合物は、食品の形態で、例えば添加され、混ぜ込まれ、被覆され、結合され、又は別の方法で食品に添加されて提供され得る。食品という用語は、その考えられる最も広い意味で用いられ、乳製品及びその他の食品を含む飲料や、健康バー、デザート等の液体処方物が挙げられる。本発明の化合物を含有する食品処方物は、標準的な技法に従って容易に調製され得る。
【０１２１】
治療方法、用途及び組成物は、ヒト又は動物、例えば哺乳類、例えばコンパニオンアニマル及び家庭動物（例えば、イヌ及びネコ）及び家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ及びヤギ）、鳥類（例えばニワトリ、シチメンチョウ、アヒル）等への投与のためのものである。
【０１２２】
活性化合物又はその薬学的に許容可能な誘導体プロドラッグ又は塩は、所望の作用を減損しないその他の薬学的活性物質と、あるいは所望の作用を補足する物質、例えば抗生物質、抗真菌薬、抗炎症薬又は抗ウイルス化合物とも同時投与され得る。活性作用物質は、２つ以上のイソフラボン又はその誘導体を、組合せ又はシナジー的混合物中に含み得る。活性化合物は、プロブコール及びニコチン酸などの脂質低下剤；アスピリンなどの血小板凝集阻害剤；クマジンなどの抗血栓薬；ベラパミル、ジルチアゼム及びニフェジピンなどのカルシウムチャンネル遮断薬；カプトプリル及びエナラプリルなどのアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬、及びプロパノロール、テルブタロール及びラベタロールなどのβ−遮断薬とともにも投与され得る。前記化合物は、非ステロイド系抗炎症薬、例えばイブプロフェン、インドメタシン、アスピリン、フェノプロフェン、メフェナミン酸、フルフェナミン酸及びスリンダクと組み合わせても投与され得る。化合物はまた、コルチコステロイドとともに投与され得る。
【０１２３】
本発明の重要な一態様では、式IIの化合物は、別の細胞毒素又は化学療法薬、特に切断複合体を安定化するか又はその形成を妨げる作用物質と調合される。好ましい作用物質は、ＶＰ−１６（エトポシド）及びドキソルビシンであるが、本発明のこの態様は、これら２つの既知の作用物質に必ずしも限定されない。
これらの化合物は、癌性細胞及び腫瘍に対してシナジー的活性を示す、と考えられる。理論に限定されることを望まないが、シナジー作用は、新規のトポII部位に結合する本発明の化合物の能力に基づいていると思われる。したがって式IIの化合物は、既存のトポII毒に対して耐性を示す、細胞が突然変異形態のトポIIを発現する癌療法に用途を見出す。
【０１２４】
同時投与は、同時的でも又は逐次的でもよい。同時的投与は、同一時間又は類似時間に投与される同一単位用量中に又は個別のかつ分離した単位用量中に化合物が存在することにより実行され得る。逐次投与は、必要に応じて如何なる順序であってもよく、第２の又はその後の活性作用物質が投与される場合、特に累積的又はシナジー的作用が所望される場合、現行で用いられている第１の又は最初の活性作用物質の進行中の生理学的作用を要する。
【０１２５】
合成
式IIの化合物の合成は、多数の経路で達成され得る。国際公開第００／４９００９号パンフレット及びそこに引用された参考文献（それはそっくりそのまま、参照により本明細書に援用される）に特に言及される。該国際出願は、単純な容易に入手可能な出発物質からのイソフラベンの改良型製造方法を記載する。便利な出発物質は、確立された経路により容易に入手されるダイゼインである。
【０１２６】
一般的合成では、ダイゼインはその二酢酸塩として保護され、次にほぼ定量的収率でテトラヒドロダイゼイン二酢酸塩に脱水素化される。この一般合成方法は、対応するイソフラボンの水素化によって、その他のイソフラバン−４−オール化合物の純粋なかつほぼ定量的収率に近づくことを可能にする。
【０１２７】
強酸又はＰ２Ｏ５等の標準試薬でイソフラバン−４−オールを脱水して、本発明の不飽和イソフラブ−３−エンを得る。脱水反応は、直接水素化産物に、又はその脱保護化された誘導体に実行することができる。
【０１２８】
デヒドロエクオール（Ｉ）の合成は、穏やかな条件下での保護アセトキシ基の除去により達成された。その他のイソフラブ−３−エン誘導体は、同様の方法により調製され得る。
【０１２９】
本発明に用いるためのイソフラバンは、イソフラブ−３−エン又はイソフラボンの水素化により、あるいは当該技術分野で既知のその他の手法により容易に調製され得る。
【０１３０】
本発明に用いるためのイソフラブ−３−エンは、当業者に容易に同定可能な任意数の供給源由来のイソフラボンからも合成され得る。好ましくは、それらは植物供給源からの濃縮物又は抽出物の形態で得られる。さらにまた、当業者は適切な植物種を容易に同定可能であるが、しかしながら例えば本発明において特に用いられる植物としては、マメ科植物が挙げられる。さらに好ましくはイソフラボン抽出物は、ヒヨコマメ、レンズマメ、エンドウ、レッド・クローバー又はサブタレニアン・クローバ種等から得られる。
【０１３１】
以下の実施例を参照しながらここで本発明を説明するが、本発明はそれらに限定されない。
【実施例１】
【０１３２】
材料及び方法
トポＩ阻害剤を同定し得る弛緩及びニッキング検定、及びトポII阻害剤を同定し得る結び目解消及びＤＮＡ切断検定を用いて、トポイソメラーゼの潜在的阻害剤として、デヒドロエクオールを評価した。デヒドロエクオールは、用量依存的方法でトポIIの触媒活性を抑制し、そしてそれはトポII媒介性切断複合体を安定化し、このことは、この作用物質がトポII毒であることを実証した。デヒドロエクオールのトポII抑制作用を、他の抗腫瘍薬、例えばＶＰ−１６の作用に匹敵し、ゲニステインの作用より強かった。デヒドロエクオールはトポＩ触媒活性を抑制しないし、トポＩ媒介性切断複合体も安定化しなかった。これらの結果は、デヒドロエクオールがトポII特異的毒であり、癌化学療法におけるその適用を支持する、ということを実証する。
【０１３３】
デヒドロエクオールによる、トポＩではなく、トポIIの触媒活性の抑制
ＤＮＡノットの段階的除去（結び目解消：unknotting）は、一過性二本鎖切断を要し、その後の鎖継代及び再結繋する。トポIIトポイソメラーゼはこの反応を独特に触媒する。トポII触媒活性に及ぼすデヒドロエクオールの作用を、図１に示す。突然変異体バクテリオファージ（P4 Vir１ del１Ｏ）からの結び目解消ＤＮＡを、スメアとして移動する反応基質として用いる（可変数のノットのために）。トポIIの存在下で、位相幾何学的ＤＮＡノットを除去し、反応産物（結び目解消ＤＮＡ）が単一バンドとして移動する。図１に示すように、デヒドロエクオールは用量依存的方法でこの反応を抑制した。完全抑制は１００μｇ／ｍｌデヒドロエクオールで明白であった。５０％抑制（ＩＣ５０）が約２０μｇ／ｍｌデヒドロエクオールで認められた結び目解消バンドの濃度測定から、それを確定した。デヒドロエクオールの作用は、陽性対照として用いたＶＰ−１６の作用に匹敵した。
【０１３４】
デヒドロエクオールがトポIIの選択的阻害剤であるかを確定するために、その作用をＡＴＰの非存在下でプラスミドＤＮＡのトポＩ媒介性弛緩において評価した。トポIIは、スーパーコイル化プラスミドＤＮＡも弛緩し得るが、しかしそれはＡＴＰを要する。図２は、精製ヒトトポＩがスーパーコイル化プラスミドＤＮＡを弛緩することを示す（レーン２）。既知のトポＩ阻害剤であるカンプトテシンは、ｐＵＣ８  ＤＮＡ弛緩を防止する（レーン３）。しかし１００μｇ／ｍｌまでの濃度のデヒドロエクオールはこのトポＩ触媒性反応を抑制しなかった（レーン４〜８）。これらの結果は、デヒドロエクオールがトポＩを抑制せず、したがってトポII特異的阻害剤であることを示す。
【０１３５】
デヒドロエクオールによる、トポＩ媒介性ＤＮＡ一本鎖切断の誘導でなく、トポII媒介性二本鎖ＤＮＡ切断の誘導
線状化検定を用いて、デヒドロエクオールがトポII毒であるか否かを確定した。二本鎖切断は、線状ＤＮＡの出現を生じる。トポIIの存在下でのデヒドロエクオールは、その後のプロテイナーゼＫ／ＳＤＳによる処理をうけ、線状型のプラスミドＤＮＡを効果的に生成し（図３、レーン２〜４）、このことは、それが切断複合体を安定化することを示す。１０μｇ／ｍｌで明白になったこの作用は、３０μｇ／ｍｌでピークになった。トポII（レーン１）又はプロテイナーゼＫ／ＳＤＳ（図示せず）の非存在下では、デヒドロエクオールは線状ＤＮＡを生じなかった。トポII媒介性ＤＮＡ鎖切断に及ぼすデヒドロエクオールの作用は、予期せぬことにゲニステイン（レーン５）よりはるかに大きく、そして陽性対照として用いたＶＰ−１６（レーン６）に匹敵する。酵素変性及び消化はＤＮＡ切断を解除するために必要であるため、これらのデータはデヒドロエクオール誘導されたＤＮＡ切断がトポIIにより媒介されることを実証する。
【０１３６】
トポＩ毒は、酵素−ＤＮＡ反応中間体を遮断し、酵素の消化後に、一本鎖ＤＮＡ切断（ニック）を生成した。図４に示した実験に用いた電気泳動条件下で、共有的閉環（スーパーコイル化又は弛緩化された）プラスミドＤＮＡは、ゲルの底で移動する。切断複合体を安定化するトポＩ毒の存在下では、そしてプロテイナーゼＫ／ＳＤＳによる酵素の変性及び分解後、得られたニックＤＮＡはゲルの上部を移動する。２０μｇ／ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌのデヒドロエクオールは、ニックＤＮＡを生成できなかった（レーン３及び４）。既知のトポＩ毒であるカンプトテシンは、予測どおり、ニック化型のＤＮＡ（nicked form of DNA）の増大により示される一本鎖ＤＮＡ切断を生じた（レーン５及び６）。これらの結果は、デヒドロエクオールがトポＩ抑制作用を欠き、したがってトポII特異的毒であることを実証する。
【０１３７】
材料
前に記載したように、バクテリオファージＰ４ Vir１ del１Ｏを単離した［２３］。アルカリ溶解法により、ｐＵＣ８  ＤＮＡを大腸菌から単離した。試薬、検定緩衝液、ヒトトポＩ、ヒトトポII及びｐＲＹＧ  ＤＮＡをTopoGEN（Columbus, OH）から購入した。デヒドロエクオールはNovogen (North Ryde, NSW)により提供された。ゲニステインはIndofine Chemical Co. (Somerville, NJ)から購入した。他の試薬、化学物質及び薬剤は全て、Sigma Chem. Co. (St. Louis, MO) から購入した。ストック溶液をＤＭＳＯ中に２０ｍｇ／ｍｌで調製し、−２０℃で保存して、検定の直前に蒸留水で希釈した。
【０１３８】
トポＩ媒介性プラスミド弛緩検定
トポイソメラーゼ（トポ）Ｉ触媒活性の確定のために、ｐＵＣ８  ＤＮＡを、以下のものを含有する２０μｌの反応容積中の基質として用いた：１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．９、１ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡ、０．１ｍＭのスペルミジン、５％グリセロール及び２単位の精製ヒトトポＩ。阻害剤を、適用可能である場合、指示どおりに添加し、そして酵素の添加により反応を開始した。反応を３７℃で３０分間実行した。トリス−ホウ酸塩−ＥＤＴＡ緩衝液中で４Ｖ／ｃｍで５時間、ゲル電気泳動を実施した。トポＩ活性の定量のために、写真ネガを走査した。ゲルの底で単一バンドとして移動するスーパーコイル化ＤＮＡを表す区域を確定した。スーパーコイル化ＤＮＡの５０％を弛緩化ＤＮＡに転化されることから防止した阻害剤の濃度（ＩＣ５０値）を、少なくとも３つの実験からのデータを平均することにより確定した。
【０１３９】
トポＩ媒介性プラスミドニッキング検定
トポＩ毒は、酵素の供給元（TopoGEN, Inc.）により提供される反応条件下でトポＩ媒介性ｐＵＣ８  ＤＮＡ切断を増強する。要するに、２０μｌの反応混合物は、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１μｌの試験用作用物質（又は溶媒）、０．５μｇのｐＵＣ８及び１０単位のヒトトポＩ（最後に添加）を含有した。３７℃で３０分間のインキュベーション後、ＳＤＳ−プロテイナーゼＫを添加し、そして３７℃で３０分間インキュベーション後、試料をＣＨＣｌ３−イソプロパノールで抽出し、０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する１％アガロースゲル上で電気泳動処理した。ゲルを写真撮影し、写真ネガを走査した。
【０１４０】
トポII媒介性Ｐ４結び目解消検定（unknotting assay）
トポイソメラーゼ（トポ）II触媒活性を確定するために、バクテリオファージＰ４ Vir１ del１Ｏの無尾カプシドから単離された結び目ＤＮＡ（knotted DNA）を、基質として用いた。反応混合物は、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１２０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのＡＴＰ及び０．５ｍＭのジチオスレイトールを含有した。トポII阻害剤を添加した後、２単位のヒトトポIIを添加した。０．６μｇの結び目ＤＮＡを添加することにより反応（最終容積２０μｌ）を開始し、３７℃で３０分間実行した。５％ＳＤＳ、５０ｍＭのＥＤＴＡ、２５％フィコール及び０．０５ｍｇ／ｍｌのブロモフェノールブルーを含有する停止溶液５ｍｌの添加により、反応を終結させた。試料を０．８％アガロースゲル上に載せて、トリス−ホウ酸塩−ＥＤＴＡ緩衝液中で４Ｖ／ｃｍで５時間、電気泳動を実施した。ゲルを臭化エチジウムで染色し、脱染して、ＵＶ光源上で写真撮影した。トポII活性の定量のために、写真ネガを濃度測定的に（densitometrically）走査した。ゲルの上部で単一バンドとして移動する結び目解消ＤＮＡをこの方法で測定した。基質（結び目ＤＮＡ）の５０％を反応産物（結び目解消ＤＮＡ）に転化されることから防止した阻害剤の濃度を、標準曲線から確定した。３、４のこのような実験を平均することにより、ＩＣ５０値を確定した。
【０１４１】
トポII媒介性プラスミド線状化検定
トポII毒は、トポII媒介性ＤＮＡ切断を増強し、酵素の供給元（TopoGEN, Inc.）により提供される反応条件下で線状化検定を用いて同定され得る。要するに、２０μｌの反応混合物は、３０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、３ｍＭのＡＴＰ、１５ｍＭのβ−メルカプトエタノール、８ｍＭのＭｇＣｌ２、６０ｍＭのＮａＣｌ、１μｌの試験用作用物質（又は溶媒）、０．３μｇのｐＲＹＧ、及び１０単位のヒトトポII（最後に添加）を含有した。３７℃で１５分間インキュベーション後、ＳＤＳ−プロテイナーゼＫを添加し、そして３７℃で１５分間インキュベーション後、試料をＣＨＣｌ３−イソプロパノールで抽出し、臭化エチジウムを含有する１％アガロースゲル上で電気泳動処理した。ゲルを写真撮影し、写真ネガを走査した。
【実施例２】
【０１４２】
ｔＮＯＸ抑制、腫瘍細胞周期停止及びアポトーシス
ジチオジピリジン基質中にヒト子宮頸癌（ＨｅＬａ）を含有する９６ウエルプレート検定を用いた。１０μｍの濃度で存在するデヒドロエクオールは、ＨｅＬａ細胞アポトーシスを引き起こすｔＮＯＸ活性を抑制することが示された。
【０１４３】
その後の臨床試験を示し、式Ｉ及びIIの化合物の治療利点及び活性を実証する。
【実施例３】
【０１４４】
フェノキシジオール（デヒドロエクオール）の強力な抗腫瘍及び抗血管形成特性
本実施例は、式IIの代表的化合物として、デヒドロエクオールの強力な抗腫瘍／抗癌、抗血管形成活性、及び抗炎症活性を説明する。
【０１４５】
方法
細胞：ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を用意し、先に記したとおりに増殖させた３０。全ての実験に関して、継代２〜６の細胞を用いた。ヒト前立腺腺癌細胞株ＬＮＣａＰをAmerican Tissue Type Collectionから入手し、供給元の使用説明書に従って保存した。
【０１４６】
検定：
増殖検定：ＨＵＶＥＣを３×１０３細胞／ゼラチン被覆マイクロタイターウエルで播種し、完全培地中で３日間増殖させた。プレート化の３時間後に、デヒドロエクオール（Ｄｅ）を添加した。ＭＴＴ検定（Promega, WI, USA）を用いて増殖を測定し、各群に関して四重反復試験確定の３日間に亘る増殖率±ＳＥＭとして示す。ＬＮＣａＰ細胞の増殖をＭＴＴ検定を用いて確定した。細胞を、２．５×１０３細胞／マイクロタイターウエルで播種した。プレート化の４日後にＤｅを添加し、さらに５日間の増殖後、検定した。細胞の生死を対照非処理細胞のパーセンテージとして表す。
【０１４７】
移動検定：５×１０３細胞／ゼラチン被覆６ウエルディッシュでＨＵＶＥＣをプレート化し、４８時間かけて集密に増殖させた。単一層中に創傷を作り、細胞を３回洗浄して、Ｄｅ（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）を含有するか又は含有しない新鮮な完全培地を添加した。その後１８〜７２時間に亘って、移動を観察した。
【０１４８】
in vitro管検定：コラーゲンゲル中での毛細管形成を本質的にギャンブル（Gamble）等３０、３１の記載と同様に実施した。腫瘍プロモーターフォーボルミリステート酢酸塩（ＰＭＡ）及び抗β１インテグリン抗体ＲＭＡＣIIの存在下で、管を形成した。ゲル上に細胞をプレート化した時点で、Ｄｅ（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）を添加した。
【０１４９】
無胸腺マウス異種移植検定：ＬＮＣａＰヒト前立腺細胞を無胸腺Ｂａｌｂ／ｃマウスに皮下移殖し、Ｄｅ（２ｍｇ  ｕｉｄ）を、細胞接種の時点から週５日間、経口投与した。移植後５８日目に動物を屠殺し、ＮＣＩで用いられているように、式（幅２×長さ）／２から腫瘍質量（ｍｇ）を算定した。
【０１５０】
スフィンゴシンキナーゼ活性検定：上記に記載した（参考文献４２参照）ように、細胞質ゾル分画を１０μＭのスフィンゴシン−ＢＳＡ複合体及び［γ３２Ｐ］ＡＴＰ（１ｍＭ、０．５ｍＣｉ／ｍｌ）とともに３７℃で１５分間インキュベートすることにより、in vitroでＳＫ活性を測定した。刺激は、ＴＮＦα（１ｎｇ／ｍｌ）（ｒｈＴＮＦ−α； R & D Systems, Minneapolis MN USA）、ＰＭＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ−１β（１００単位／ｍｌ）（ｈｒＩＬ−１β；Immunex, Seattle WA USA）を１０分間用いた。細胞を、刺激前に、Ｄｅ又は対照としてのＤＭＳＯビヒクルで１８時間処理した。
【０１５１】
病巣形成検定：低継代ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞にヒトｒａｓ遺伝子（Ｒａｓ）又は空ベクター（Ｖｅｃｔ）対照をトランスフェクトさせた（参考文献１９参照）。２日後、トランスフェクト化細胞を６ウエルプレート中に植え付けた。集密（confluence）に達した後、細胞をビヒクルＤＭＳＯ又はＤｅ（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）中で３週間、培地を３〜４日ごとに変えながら（±Ｄｅ）培養した。０．５％クリスタルバイオレットで染色後、病巣をスコアした。実施した２つのうちの一実験を示す。
【０１５２】
ノーザンブロット分析：ＨＵＶＥＣを１×１０６細胞／２５ｃｍ２フラスコでプレート化し、４８時間増殖させた。ＤＭＳＯビヒクル又はＤｅ（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）で１８時間処理後、総ＲＮＡを収穫し、ＴＲＩＺＯＬ試薬（Invitrogen-Life Technologies, Groningen, Netherlands）を用いてメーカーのプロトコールに従って精製した。ハイボンド（Hybond）−Ｎ膜（Amersham Biosciences, Buckinghamshire, England）上に移した８μｇの総ＲＮＡを用いてノーザンブロット分析を実施し、Ｓｔｒｉｐ−ＥＺ  ＰＣＲ ｓｔｒｉｐ Ａｂｌｅ ＰＣＲプローブ合成及び除去キット（Ambion, TX, USA）を用いて、ヒトＭＭＰ−２及びＧＡＰＤＨ  ｃＤＮＡでプローブした。
【０１５３】
Ｅセレクチン及びＶＣＡＭ−１検定：ＨＵＶＥＣを５×１０５細胞／６ウエル皿でプレート化した。ＤＭＳＯビヒクル又はＤｅ（最終１０μｇ／ｍｌ）で１８時間細胞を処理した後、ＴＮＦα（１ｎｇ／ｍｌ）を添加した。４又は１８時間後、ＰＢＳで細胞を洗浄し、Ｅセレクチン（Ｍａｂ４９−１Ｂ１１）又はＶＣＡＭ−１（Ｍａｂ５１−１０Ｃ９）に対する抗体とともに３０分間インキュベートした。ヤギＦ（ａｂ’）２断片マウス−ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＦＩＴＣ抗体（Immunotech, Marseille, France）を次に３０分間付加した。次に細胞をトリプシン処理し、クールターエピクス（登録商標）ＸＬ−ＭＣＬ（Beckman Coulter）上でＦＡＣＳ分析した。結果をＦＩＴＣ蛍光の平均強度に関する独断的な単位（arbitrary units）として表す。
【０１５４】
ＩＬ−８検定：「クアンチカイン（Quantikine）ヒトＩＬ−８イムノアッセイ」（R & D Systems, Minneapolis, MN USA）を用いて、ＩＬ−８検定を実施した。
【０１５５】
結果
デヒドロエクオール（「Ｄｅ」）は、白血病細胞株Ｋ５６２及びＨＬ６０（それぞれ３．０及び１．５μｇ／ｍｌのＩＣ５０）、乳癌株ＭＣＦ７（１．５μｇ／ｍｌのＩＣ５０）、大腸癌株ＨＴ２９及びＣａＣｏ−２（それぞれ１５．０及び１．０μｇ／ｍｌのＩＣ５０）、及び前立腺癌株ＤＵ１４５、ＰＣ３及びＬＮＣａＰ（それぞれ３．０、２．０及び１．５μｇ／ｍｌのＩＣ５０）に及ぼす抗増殖作用を示した。Ｄｅは、細胞傷害性作用物質として、これらの細胞株に関してゲニステインの５〜２０倍強力である。ＬＮＣａＰに関するＤｅ及びゲニステインの比較データを、図１ａに示す。ＬｎＣａＰに対するＤｅのin vitro細胞傷害性査定は、４．４のＩＣ５０（μＭ）を示した（ｎ＝３、別個の実験）。前立腺癌株ＬＮＣａＰの増殖を測定する異種移殖検定は、Ｄｅが腫瘍増殖を抑制するのに有効であることを実証した（４９％腫瘍増殖抑制、ｐ＜０．０００３；Ｄｅ処理対対照群）（図５ｂ）。
【０１５６】
Ｒａｓ癌遺伝子は、正常遺伝子における過剰発現又は突然変異により、多数のヒト癌の発生に関連づけられてきた（参考文献２８，２９参照）。Ｒａｓ形質転換化ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞のＤｅ処置は、コロニーの発達を完全に抑制したが、しかし正常ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞の生育可能性を依然として保持した（図５ｃ）。これは、Ｄｅが高増殖性Ｒａｓ形質転換化細胞を特異的に標的化し、正常細胞に対してはほとんど又は全く影響を与えないことを示唆する。
【０１５７】
固形腫瘍増殖は、細胞生存及び増殖を制御する正常メカニズムを回避する形質転換化細胞の能力に依存するだけでなく、血管形成を通して血管区画の拡張を刺激する細胞の能力にも依っている。Ｄｅが抗腫瘍形成活性のほかに抗血管形成活性を有するかを確定するために、内皮細胞（ＥＣ）増殖、移動及び毛管形成検定、血管形成のin vitro特質において、Ｄｅを試験した。その結果は、ＤｅがＥＣ機能のこれらの態様を全て抑制する、ということを実証する（図６ａ、図６ｂ及び図６ｃ）。示した結果は、単一実験のものであるが、Ｄｅは、実施した多数の実験全体でその抑制作用と一致した。例えば１０μｇ／ｍｌのＤｅは、実施した５つの実験において９１％±３％の増殖の抑制を示した。結果は、移動検定において、創傷の周辺にないＥＣは７２時間のＤｅの存在下でさえ依然として生育可能であったため、Ｄｅが正常ＥＣに対して細胞傷害性でない、ということも実証する。さらに増殖検定において、Ｄｅは細胞の増殖能力を抑制したが、細胞死を引き起こさなかった。
【０１５８】
コラーゲンゲル検定では、ビヒクル対照で処理した細胞は、本発明者らが以前報告した（参考文献３０，３１参照）ものと同様のゲルの全体にわたって異なる平面で生成する典型的な大型毛細管を示した。しかしながらＤｅで処理した細胞の形態学的査定は、何時間後でも細胞は依然として円形であり、そしてゲルの上部で観察されたため、Ｄｅがゲル中への細胞の侵入を抑制し得る、ということを示唆した。ゲル中へのＥＣの侵入及びin vivoでの新血管形成は、メタロプロテアーゼなどのマトリックス分解酵素の合成及び分泌に依存している（参考文献３２、３３参照）。マトリックスメタロプロテイナーゼＭＭＰ−２は、「血管形成スイッチ」に不可欠であり、その活性の抑制は血管形成を防止する（参考文献３４参照）。したがってＭＭＰ−２を検査のために標的化した。１０μｇ／ｍｌのＤｅで１８時間処理した内皮細胞のノーザンブロット分析は、ＭＭＰ−２に関するＲＮＡのレベルの抑制を示した（図６ｄ）。実施した２つの実験において、ＭＭＰ−２に関するｍＲＮＡのレベルで６８．３％及び４６．７％低減が認められた。
【０１５９】
血管形成は、普通は炎症に関連し、現在、ともに同格に調節されるようである（参考文献３５，３６参照）。炎症は、内皮上の接着分子の発現、及び循環からの炎症細胞の退出に関与する走化性サイトカインの分泌により例示される。好中球、リンパ球及び単球などの炎症細胞は、血管内皮細胞増殖因子などの多数の強力な血管形成因子の供給源である３５。Ｄｅは、内皮上のＴＮＦ及びＩＬ−１の両方への接着分子Ｅセレクチン及びＶＣＡＭ−１の誘導を抑制し、ＩＬ−８の分泌も抑制する（図７ａ及び図７ｂ）。しかしながら、Ｄｅ処理後フローサイトメトリー分析（データを示さず）により確定した場合、ＰＥＣＡＭ−１又はＶＥＧＦ受容体２の発現のレベルに変化は認められなかったため、ＤｅはＥＣに及ぼす一般的抑制作用を表示しなかった。したがってＤｅは、血管形成プロセスそれ自体を、そして血管形成状態を増幅する炎症性構成成分も抑制する。
【０１６０】
高度保存脂質キナーゼであり、スフィンゴシンをリン酸化して、スフィンゴシン−１−ホスフェートを生じるスフィンゴシンキナーゼ（ＳＫ）は、細胞の生存、増殖及び形質転換の促進に（参考文献３７−４０参照）、そしてＲａｓのような癌遺伝子の機能に（参考文献４１参照）関係していると見なされていた。ＳＫは、ＥＣ活性化及び増殖の調節における重要な媒介物質でもある（参考文献４２−４４参照）。スフィンゴシン−１−ホスフェートも血管形成プロセスに関与し（参考文献４５−４７参照）、そしてＶＥＧＦシグナル伝達経路に関与することが近年示された（参考文献４８参照）。ＤｅがＳＫ経路の抑制を通して少なくとも潜在的にその作用を発揮できるかを調べるために、Ｄｅの存在下又は非存在下で生成されるＳＫ活性を査定した。結果は、用量依存的方式で、Ｄｅが、ＴＮＦ（ａ）、腫瘍プロモーター、フォルボールミリステート酢酸塩（ＰＭＡ）（ｂ）及びＩＬ−１（ｃ）を用いたＥＣの刺激により生成されたＳＫを抑制する、ということを示す（図４）。Ｄｅは、その抑制において、ＳＫの阻害剤であるＮ，Ｎ−ジメチルスフィンゴシン（ＤＭＳ）と等しい効力を有する。ＤｅはＳＫ活性の基礎レベルに影響を及ぼさないが、これは、酵素の活性化相に及ぼす特異的作用を示唆する。ＤｅはＴＮＦ刺激性スフィンゴミエリナーゼ活性に影響を及ぼさず（データを示さず）、これは、Ｄｅがスフィンゴミエリン代謝経路に影響を及ぼさないことを示唆する。
【０１６１】
本実施例は、デヒドロエクオール（Ｄｅ）の強力な抗腫瘍作用及び抗血管形成作用を説明する。最も顕著な観察は、血管形成との関連性を有する内皮機能を測定する一連の検定におけるデヒドロエクオールの効能である。これらの例としては、マトリックス分解に必要な酵素の内皮移動及び発現、増殖、接着分子の発現、及びin vitro管形成が挙げられる。等しく顕著であるのは、休止内皮細胞に関する及び非形質転換化３Ｔ３細胞に関するデヒドロエクオールの、用いた用量での、毒性の欠如であった。薬剤のこれらの特性は、強力な、しかし限定された全身毒性を有する抗腫瘍作用を予測し得るし、実際、これらはこれらの試験において観察されている。
【０１６２】
この薬剤の多様な作用の基礎をなすメカニズムは、十分に解明されていない。しかしながら、それは、少なくとも３つの関連酵素系の強力な（直接又は間接的）阻害剤である（参考文献４９参照）。これらのうちの最初の２つ、すなわちタンパク質チロシンキナーゼ及びトポイソメラーゼは、長い間、細胞活性化及び増殖に関係していると見なされていた（参考文献１３，１５，４９参照）。近年、内皮活性化及び血管形成並びに発癌に関連づけられている第三の酵素系である脂質キナーゼスフィンゴシンキナーゼの抑制を、本発明者らはここに報告する。Ｄｅの主な作用は、ＴＮＦ及びＩＬ−１のような作用物質によるＳＫ活性化の抑制に関するものであり、一方、ＳＫの基本的活性に及ぼす作用をほとんど示さない、ということに本発明者らは留意している。この結果は、形質転換化腫瘍細胞に、及び血管形成のプロセスに関与するＥＣに関する劇的抑制を示す一方で、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞又はＥＣのような正常細胞の生育可能性にほとんど又は全く影響を及ぼさない作用物質の選択性を説明し得る。したがって、Ｄｅは、Ｒａｓ誘導性形質転換中に又は血管形成に必要なＥＣの活性化において起こるものなどのＳＫの活性化相を特異的に標的化し得る。これらの結果は、Ｄｅが有効かつ安全な抗癌薬でなり得るという予測を強調する。
【０１６３】
癌のための抗血管形成療法は、多くの刺激を伴うけれども、多数の試験の結果は、失望させられるものであり、このことは抗血管形成療法が他の抗癌療法と組み合わされるべきであることを示唆する。そういうわけで、Ｄｅがin vitro及びin vivoでのいくつかの型の癌細胞の増殖に及ぼす直接的抑制作用を有し、したがって一薬剤において、抗血管形成及び抗癌特性が組み合わされることを示す、ということに注目することは非常に興味深いことである。
【０１６４】
読者が不当な実験をすることなしに本発明を実行できるように、確かな好ましい実施態様を参照しながら、ここに本発明を説明してきた。しかしながら、多くの構成成分及びパラメーターは、本発明の範囲を逸脱することなくある程度まで変更又は修正され得るということを、当業者は容易に理解する。さらに表題、見出し等は、本文書についての読者の理解を深めるために提示したものであり、本発明の範囲を限定するものとして読むべきではない。
【０１６５】
ここに引用された全ての特許出願、特許及び出版物の開示内容は全て、参照によりここに組み込まれる。
【０１６６】
ここにに記載された本発明は、特定的に記載されたもの以外、変更及び修正可能である、と当業者は理解する。本発明は、このような変更及び修正の全てを包含すると理解されるべきである。本発明は、本明細書中に個別に又は集合的に言及され、又は示された全ての段階、特徴、組成物及び組成物、並びに前記の段階又は特徴の任意の２つ以上のあらゆる及び全ての組合せも包含する。
【０１６７】
本明細書中の如何なる先行技術に対する言及は、その先行技術が努力の領域における共通の一般的知識の一部を形成するという認識又はいかなる形態の示唆でもないし、そしてそのように解釈されるべきでない。
【０１６８】
参考文献
1.      Joannou, GE, Kelly, GE, Reeder, AY, Waring, M, Nelson, C.  A Urinary profile Study of Dietary Phytoestrogens.  The Identification and Mode of Metabolism of New Isoflavonoids.  Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, 1995, 54, 176-184.
2.      Miyase, T, Sano, M.  Antioxidant from Lespedeza holoba.  Phytochemistry 1999, 52(2), 303-310.
3.      Kellner, U, Rudolph P, Parwaresch R. Human DNA-Topoisomerases - Diagnostic and Therapeutic Implications for Cancer. Onkologie 2000, 23, 424-430.
4.      Liu, LF. DNA topoisomerase poisons as antitumor drugs. Annu Rev Biochem 1989, 58, 351-75.
5.      Heck, MM, Earnshaw WC. Topoisomerase II: A specific marker for cell proliferation. J Cell Biol 1986, 103, 2569-81.
6.      Heck, MM, Hittelman WN, Earnshaw WC. Differential expression of DNA topoisomerases I and II during the eukaryotic cell cycle. Proc Natl Acad Sci U S A 1988, 85, 1086-90.
7.      Davis, JN, Singh B, Bhuiyan M, Sarkar FH. Genistein-induced upregulation of p21WAF1, downregulation of cyclin B, and induction of apoptosis in prostate cancer cells. Nutr Cancer 1998, 32, 123-31.
8.      Deffie, AM, Bosman DJ, Goldenberg GJ. Evidence for a mutant allele of the gene for DNA topoisomerase II in adriamycin-resistant P388 murine leukemia cells. Cancer Res 1989, 49, 6879-82.
9.      Constantinou, A, Kiguchi K, Huberman E. Induction of differentiation and DNA strand breakage in human HL-60 and K-562 leukemia cells by genistein. Cancer Res 1990, 50, 2618-24.
10.     Kiguchi, K, Constantinou AI, Huberman E. Genistein-induced cell differentiation and protein-linked DNA strand breakage in human melanoma cells. Cancer Commun 1990, 2, 271-7.
11.     Okura, A, Arakawa H, Oka H, Yoshinari T, Monden Y. Effect of genistein on topoisomerase activity and on the growth of [Val 12]Ha-ras-transformed NIH 3T3 cells. Biochem Biophys Res Commun 1988, 157, 183-9.
12.     Constantinou, A, Mehta R, Runyan C, Rao K, Vaughan A, Moon R. Flavonoids as DNA topoisomerase antagonists and poisons: structure-activity relationships. J Nat Prod 1995, 58, 217-25.
13.     Markovits, J, Linassier C, Fosse P, Couprie J, Pierre J, Jacquemin-Sablon A, Saucier JM, Le Pecq JB, Larsen AK. Inhibitory effects of the tyrosine kinase inhibitor genistein on mammalian DNA topoisomerase II. Cancer Res 1989, 49, 5111-7.
14.     Uckun, FM, Messinger Y, Chen CL, O’Neill K, Myers DE, Goldman F, Hurvitz C, Casper JT, Levine A. Treatment of therapy-refractory B-lineage acute lymphoblastic leukemia with an apoptosis-inducing CD19-directed tyrosine kinase inhibitor. Clin Cancer Res 1999, 5, 3906-13.
15      Strick, R, Strissel PL, Borgers S, Smith SL, Rowley JD. Dietary bioflavonoids induce cleavage in the MLL gene and may contribute to infant leukemia. Proc Natl Acad Sci U S A 2000, 97, 4790-5.
16      Burden, DA, Osheroff N. Mechanism of action of eukaryotic topoisomerase II and drugs targeted to the enzyme. Biochim Biophys Acta 1998, 1400, 139-54.
17.     Hansen, HH. Management of small-cell cancer of the lung. Lancet 1992, 339, 846-9.
18.     Beere, HM, Chresta CM, Alejo-Herberg A, Skladanowski A, Dive C, Larsen AK, Hickman JA. Investigation of the mechanism of higher or der chromatin fragmentation observed in drug-induced apoptosis. Mol Pharmacol 1995, 47, 986-96.
19.     Snapka, RM, Kwok K, Bernard JA, Harling OK, Varshavsky A. Post-separation detection of nucleic acids and proteins by neutron activation. Proc Natl Acad Sci U S A 1986, 83, 8939-42.
20.     Fortune, JM, Osheroff N. Topoisomerase II as a target for anticancer drugs: when enzymes stop being nice. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 2000, 64, 221-53.
21.     Jensen, PB, Sehested M. DNA topoisomerase II rescue by catalytic inhibitors: a new strategy to improve the antitumor selectivity of etoposide. Biochem Pharmacol 1997, 54, 755-9.
22.     Meng, LH, Zhang JS, Ding J. Salvicine, a novel DNA topoisomerase II inhibitor, exerting its effects by trapping enzyme-DNA cleavage complexes. Biochem Pharmacol 2001, 62, 733-41
23.     Liu, LF, Davis JL, Calendar R. Novel topologically knotted DNA from bacteriophage P4 capsids: studies with DNA topoisomerases. Nucleic Acids Res 1981, 9, 3979-89.
24.     Morre et al (2002) Biochemistry, Vol. 41 No. 40, pages 11941-11945.
25.     Morre, D.J. (1995) Biochim. Biophys. Acta. 1240, 201-208.
26.     Morre, D.J. (1998) in Plasma Membrane Redox Systems and Their Role in Biological Stress and Disease (Asard et al editors), pp 121-156, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, the Netherlands.
27.     Wang et al (2001) Biochim. Biophys. Acta. 1539, 192-204
28.     Przybojewska, B., Jagiello, A. &Jalmuzna, P. H-RAS, K-RAS, and N-RAS gene activation in human bladder cancers. Cancer Genet. Cytogenet. 121, 73-77 (2000).
29.     Bos, J.L. ras oncogenes in human cancer: a review. Cancer Res. 49, 4682-4689 (1989).
30.     Gamble, J.R. et al. Regulation of in vitro capillary tube formation by anti-integrin antibodies. J. Cell Biol. 121, 931-943 (1993).
31.     Gamble, J. et al. B1 integrin activation inhibits in vitro tube formation: effects on cell migration, vacuole coalescence and lumen formation. Endothelium 7, 23-34 (1999).
32.     Naglich, J.G. et al. Inhibition of angiogenesis and metastasis in two murine models by the matrix metalloproteinase inhibitor, BMS-275291. Cancer Res. 61, 8480-8485 (2001).
33.     Haas, T.L., Davis, S.J. &Madri, J.A. Three-dimensional type I collagen lattices induce coordinate expression of matrix metalloproteinases MT1-MMP and MMP-2 in microvascular endothelial cells. J Biol Chem 273, 3604-3610 (1998).
34.     Fang, J. et al. Matrix metalloproteinase-2 is required for the switch to the angiogenic phenotype in a tumor model. Proc Natl Acad Sci U S A 97, 3884-3889 (2000).
35.     Salven, P., Hattori, K., Heissig, B. &Rafii, S. Interleukin-1alpha promotes angiogenesis in vivo via VEGFR-2 pathway by inducing inflammatory cell VEGF synthesis and secretion. FASEB J 16, 1471-1473 (2002).
36.     Klein, S. et al. Alpha 5 beta 1 integrin activates an NF-kappa B-dependent program of gene expression important for angiogenesis and inflammation. Mol Cell Biol 22, 5912-5922 (2002).
37.     Olivera, A. & Spiegel, S. Sphingosine-1-phosphate as second messenger in cell proliferation induced by PDGF and FCS mitogens. Nature 365, 557-560 (1993).
38.     Van Brocklyn, J.R. et al. Dual actions of sphingosine-1-phosphate: extracellular through the Gi- coupled receptor Edg-1 and intracellular to regulate proliferation and survival. J Cell Biol. 142, 229-240 (1998).
39.     Olivera, A. et al. Sphingosine kinase expression increases intracellular sphingosine-1- phosphate and promotes cell growth and survival [In Process Citation]. J Cell Biol. 147, 545-558 (1999).
40.     Hong, G., Baudhuin, L.M. &Xu, Y. Sphingosine-1-phosphate modulates growth and adhesion of ovarian cancer cells. FEBS Lett. 460, 513-518 (1999).
41.     Xia, P. et al. An oncogenic role of sphingosine kinase. Curr. Biol 10, 1527-1530 (2000).
42.     Xia, P. et al. Tumor necrosis factor-alpha induces adhesion molecule expression through the sphingosine kinase pathway. Proc Natl Acad Sci U. S. A 95, 14196-14201 (1998).
43.     Xia, P., Wang, L., Gamble, J.R. &Vadas, M.A. Activation of sphingosine kinase by tumor necrosis factor-alpha inhibits apoptosis in human endothelial cells. J Biol. Chem. 274, 34499-34505 (1999).
44.     Xia, P., Vadas, M.A., Rye, K.A., Barter, P.J. & Gamble, J.R. High density lipoproteins (HDL) interrupt the sphingosine kinase signaling pathway. A possible mechanism for protection against atherosclerosis by HDL. J Biol. Chem. 274, 33143-33147 (1999).
45.     Ancellin, N. et al. Extracellular export of sphingosine kinase-1 enzyme. Sphingosine 1- phosphate generation and the induction of angiogenic vascular maturation. J Biol Chem 277, 6667-6675 (2002).
46.     English, D. et al. Induction of endothelial cell chemotaxis by sphingosine 1-phosphate and stabilization of endothelial monolayer barrier function by lysophosphatidic acid, potential mediators of hematopoietic angiogenesis. J Hematother. Stem Cell Res. 8, 627-634 (1999).
47.     Lee, O.H. et al. Sphingosine 1-phosphate induces angiogenesis: its angiogenic action and signaling mechanism in human umbilical vein endothelial cells. Biochem Biophys. Res. Commun. 264, 743-750 (1999).
48.     Shu, X., Wu, W., Mosteller, R.D. &Broek, D. Sphingosine kinase mediates vascular endothelial growth factor-induced activation of ras and mitogen-activated protein kinases. Mol Cell Biol 22, 7758-7768 (2002)
49.     Constantinou, A.I. & Husband, A.  Phenoxodiol (2H-1-Benzopyran-7-0,1,3-(4-hydroxyphenyl), a Novel Isoflavone Derivative, Inhibits DNA Topoisomerase II by Stabilizing the Cleavable Complex.  Anticancer Research (in press).
【図面の簡単な説明】
【０１６９】
【図１】トポII触媒活性に及ぼすデヒドロエクオールの作用を確定するための結び目解消検定を示す。基質Ｐ４  ＤＮＡは、デヒドロエクオールの非存在下（レーン１）又は１００、８０、６０、４０、２０及び１０μｇ／ｍｌのデヒドロエクオールの存在下（レーン３〜８）で、２単位の精製トポIIとともにインキュベートした。レーン２：１０μｇ／ｍｌのＶＰ−１６（陽性対照）。ノット化Ｐ４  ＤＮＡ（Ｋ）を非ノット化（Ｕ）形態に転化することにより、トポII活性を確定した。
【図２】トポＩ触媒活性に及ぼすデヒドロエクオールの作用を確定するための弛緩検定を示す。基質スーパーコイル化ｐＵＣ８  ＤＮＡを２単位の精製トポＩ（レーン２〜８）＋カンプトテシン（レーン３）又は種々の濃度のデヒドロエクオール（レーン４〜８）とともにインキュベートした；レーン１：スーパーコイル化ｐＵＣ８  ＤＮＡ、対照（無トポＩ）；レーン２：弛緩ｐＵＣ８  ＤＮＡ；レーン３：１０μｇ／ｍｌカンプトテシン（陽性対照）；レーン４：１００μｇ／ｍｌデヒドロエクオール；レーン５：８０μｇ／ｍｌデヒドロエクオール；レーン６：６０μｇ／ｍｌデヒドロエクオール；レーン７：４０μｇ／ｍｌデヒドロエクオール；レーン８：２０μｇ／ｍｌデヒドロエクオール。スーパーコイル化ｐＵＣ８  ＤＮＡ（ＳＣ）をその弛緩形態（ＲＥＬ）に転化することにより、トポＩ活性を確定した。
【図３】二本鎖ＤＮＡ切断に及ぼすデヒドロエクオールの作用を確定するための検定を示す。ｐＲＹＧ  ＤＮＡを、１０単位のヒトトポII（レーン２〜６）とともに、デヒドロエクオールの非存在下（レーン１）、又は１０、３０又は１００μｇ／ｍｌのデヒドロエクオールの存在下（レーン２〜４）、又は３０μｇ／ｍｌのゲニステイン（レーン５）又は１０μｇ／ｍｌのＶＰ−１６（レーン６）の存在下で、インキュベートした。レーン７：線状ｐＵＣ８ＤＮＡマーカー。二本鎖ＤＮＡ切断を、弛緩化（ＲＥＬ）又はスーパーコイル化（ＳＣ）ｐＲＹＧ  ＤＮＡを線状（ＬＩＮ）形態に転化することにより、確定した。
【図４】一本鎖ＤＮＡ切断に及ぼすデヒドロエクオールの作用を確定するための検定を示す。ｐＵＣＳ  ＤＮＡを、下記の項の方法に記述された条件下で、ヒトトポＩを用いずに（レーン１）又は１０単位のヒトトポＩを用いて（レーン２〜６）、インキュベートした。レーン２：無阻害剤；レーン３：１０μｇ／ｍｌのデヒドロエクオール；レーン４：１００μｇ／ｍｌのデヒドロエクオール；レーン５：１０μｇ／ｍｌのカンプトテシン；レーン６：１００μｇ／ｍｌのカンプトテシン。一本鎖ＤＮＡ切断を、弛緩化（ＲＥＬ）又はスーパーコイル化（ＳＣ）ｐＵＣ８  ＤＮＡをニック形態（ＮＩＣ）に転化することにより、確定した。
【図５ａ】デヒドロエクオール（□）及びゲニステイン（■）はＬＮＣａＰ細胞の増殖能力を抑制する。
【図５ｂ】デヒドロエクオール（Ｄｅ）はマウスにおけるヒト異種移植片の増殖を抑制する。ＬＮＣａＰ細胞の接種時点から週５日間、Ｄｅ（■）又はビヒクル（□）を経口投与し、腫瘍質量を５８日間にわたって査定した。
【図５ｃ】デヒドロエクオールは、in vitroで対照ウエル（Ｃ）と比較して、Ｒａｓ形質転換化ＮＩＨ３Ｔ３細胞の病巣形成を抑制する。
【図６ａ】図６ａから図６ｄは、内皮細胞増殖、移動及びin vitro血管形成のデヒドロエクオール抑制を示し、図６ａは、種々の濃度のデヒドロエクオール（■）又はＤＭＳＯビヒクル（▲）の存在下でのＥＣ増殖を示す。一実験の結果を示すが、この場合、各群は四重反復実験で実施され、そして４つのこのような実験を代表する。平均±ＳＥＭを示す。
【図６ｂ】ＤＭＳＯ（Ｃ）又はデヒドロエクオール（Ｄｅ）の存在下での１８時間にわたる創傷前面（白色バー）からのＥＣ移動を示す。実施された２つを代表する一実験からの各群で実施された二重反復実験ウエル（duplicate wells）の一ウエルについての結果を示す。
【図６ｃ】ＤＭＳＯ（Ｃ）又はデヒドロエクオール（Ｄｅ）の存在下でのin vitro血管形成を示す。実施された３つを代表する一実験に関する各群において実施された二重反復実験ウエルの一ウエルについての結果を示す。
【図６ｄ】デヒドロエクオール（Ｄｅ）又はＤＭＳＯ対照（Ｃ）で１８時間処置したＥＣにおけるマトリックスメタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰ−２）のｍＲＮＡに関するノーザンブロットを示す。上方パネルはＭＭＰ−２であり、下方パネルはＧＡＰＤＨである。
【図７ａ】内皮細胞におけるＥセレクチンの発現を示す。群１：非刺激；２：４時間ＴＮＦ刺激；３：ＴＮＦ刺激前に１８時間ＤＭＳＯ処置；４：ＴＮＦ刺激前に１８時間Ｄｅ処置。
【図７ｂ】内皮細胞におけるＶＣＡＭ−１発現を示す。群１：非刺激；２：４時間又は１８時間ＴＮＦ刺激；３：ＴＮＦ刺激前に１８時間ＤＭＳＯ処置；４：ＴＮＦ刺激前１８時間Ｄｅ処置細胞。  それぞれの一実験を示し、それぞれ実施した３〜６の実験を代表する。
【図７ｃ】ビヒクルＤＭＳＯ又はデヒドロエクオール（Ｄｅ）の存在下での非刺激（ＮＩＬ）又はＴＮＦ刺激された内皮細胞からのＩＬ−８分泌。実施された３つのうちの１つにおける三重反復実験確定（triplicate determinations）の平均±ＳＥＭ。＊ｐ＜０．０１。
【図８】デヒドロエクオール（Ｄｅ）は、対照（Ｃ）処置ウエルと比較して、ＴＮＦ（ａ、ｂ）、ＰＭＡ（ｂ）又はＩＬ−１（ｃ）による刺激後の内皮細胞のスフィンゴシンキナーゼ（ＳＫ）活性を抑制する。ＳＫ活性を独断的な単位で示す。各群を二重反復実験で実施した１〜３の実験の結果を示す（平均±ＳＥＭ）。＊ｐ＜０．０１。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図８】
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【国際調査報告】
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