(57)【要約】病変組織または損傷組織の修復に使用するための組織移植片構成物を提供する。本組織移植片構成物は、膀胱粘膜下組織および胃粘膜下組織、ならびにそれらの抽出物および水解物からなる群から選択されるマトリックス組成物、追加の内皮細胞、該移植片構成物における血管様構造の形成の開始を増強する少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を含む。予め選択した細胞集団は、非角化上皮細胞集団もしくは角化上皮胞集団であってもよいし、あるいは、線維芽細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、多能性を有する前駆細胞、周皮細胞、骨形成原細胞または他の適切な細胞タイプからなる群から選択される中胚葉由来の細胞集団であってもよいが、修復対象の組織に基づいて選択されることが好ましい。これらの組織移植片構成物の血管新生をin vivoで促進する方法およびこれらの移植片構成物の調製方法もまた提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
病変組織または損傷組織の修復に使用するための組織移植片構成物であって、
膀胱粘膜下組織および胃粘膜下組織、ならびにそれらの抽出物および水解物からなる群から選択されるマトリックス組成物を含み、
追加の内皮細胞および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を含む組織移植片構成物。
【請求項２】
前記少なくとも一つの追加の細胞集団が、角化上皮細胞、非角化上皮細胞、および中胚葉由来細胞からなる群から選択される細胞集団を含む、請求項１に記載の移植片構成物。
【請求項３】
前記少なくとも一つの追加の細胞集団が、平滑筋細胞の集団を含む、請求項１に記載の移植片構成物。
【請求項４】
前記少なくとも一つの追加の細胞集団が、平滑筋細胞前駆細胞の集団を含む、請求項１に記載の移植片構成物。
【請求項５】
前記膀胱粘膜下組織または胃粘膜下組織が、該粘膜下組織の筋層および少なくとも粘膜層の管腔部分から剥離されることを特徴とする、請求項１に記載の移植構成物。
【請求項６】
さらにヘパリナーゼを含むことを特徴とする、請求項１に記載の移植片構成物。
【請求項７】
血管内皮細胞由来増殖因子、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子様分子、トランスフォーミング成長因子β、および血清増殖因子からなる群から選択される増殖因子をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の移植片構成物。
【請求項８】
前記マトリックス組成物に前記内皮細胞を接種した後に、該マトリックス組成物に前記予め選択した追加の細胞集団を接種すること特徴とする、請求項１に記載の移植片構成物。
【請求項９】
前記マトリックス組成物に前記予め選択した追加の細胞集団を接種した後に、該マトリックス組成物に前記内皮細胞を接種することを特徴とする、請求項１に記載の移植片構成物。
【請求項１０】
前記マトリックス組成物に、前記内皮細胞と前記予め選択した追加の細胞集団とを同時にまたはほぼ同時に接種することを特徴とする、請求項１に記載の移植片構成物。
【請求項１１】
組織移植片構成物の血管新生をin vivoで促進する方法であって、
膀胱粘膜下組織および胃粘膜下組織、ならびにその抽出物および水解物からなる群から選択されるマトリックス組成物に、内皮細胞集団および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団をin vitroで接種し該移植片構成物を形成する工程と、
脊椎動物の修復が必要な部位に前記移植片構成物を移植する工程と、
を包含する方法。
【請求項１２】
前記少なくとも一つの追加の細胞集団が、角化上皮細胞、非角化上皮細胞、および中胚葉由来細胞からなる群から選択される細胞集団を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも一つの追加の細胞集団が、平滑筋細胞集団を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも一つの追加の細胞集団が、平滑筋細胞前駆細胞集団を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記膀胱粘膜下組織または胃粘膜下組織が、該粘膜下組織の筋層および少なくとも粘膜層の管腔部分から剥離されることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記移植片構成物が、さらにヘパリナーゼを含むことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記移植片構成物が、さらに血管内皮細胞由来増殖因子、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子様分子、トランスフォーミング成長因子β、および血清増殖因子からなる群から選択される増殖因子を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記移植片構成物を前記脊椎動物に移植する前に、in vitroで血管または血管様構造を形成させるのに十分な時間にわたって、前記マトリックス組成物上で前記内皮細胞を培養する工程をさらに包含する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記マトリックス組成物に前記内皮細胞を接種した後に、該マトリックス組成物に前記予め選択した追加の細胞集団を接種することを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
前記マトリックス組成物に前記予め選択した追加の細胞集団を接種した後に、該マトリックス組成物に該内皮細胞を接種することを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
前記マトリックス組成物に、前記内皮細胞と前記予め選択した追加の細胞集団とを同時にまたはほぼ同時に接種することを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項２２】
前記マトリックス組成物に前記内皮細胞を接種した後に、該マトリックス組成物に前記予め選択した追加の細胞集団を接種することを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記マトリックス組成物に前記予め選択した追加の細胞集団を接種した後に、該マトリックス組成物に前記内皮細胞を接種することを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記マトリックス組成物に、前記内皮細胞と前記予め選択した追加の細胞集団とを同時に接種することを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
前記移植片構成物を移植する前に、前記内皮細胞も前記予め選択した追加の細胞集団も拡大（expand）させないことを特徴とする、請求項１９、２０または２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
in vitroで血管も血管様構造も形成しないで、前記内皮細胞を拡大させる（expand）のに十分な時間にわたって、前記マトリックス組成物上で該内皮細胞培養する工程と、
前記移植片構成物を前記脊椎動物に移植する前に、前記予め選択した追加の細胞集団を拡大させるのに十分な時間にわたって、該予め選択した追加の細胞集団を該マトリックス組成物上で培養する工程と、
をさらに包含する、請求項１９、２０または２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
in vitroで血管も血管様構造も形成しないで、前記内皮細胞を拡大させる（expand）のに十分な時間にわたって、該内皮細胞を前記マトリックス組成物上で培養する工程をさらに包含する、請求項１９、２０または２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記移植片構成物を移植する前に、前記予め選択した追加の細胞集団を拡大（expand）させないことを特徴とする、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記移植片構成物を移植する前に、前記予め選択した細胞集団を拡大させる（expand）のに十分な時間にわたって、マトリックス組成物上で該予め選択した追加の細胞集団を培養する工程をさらに包含する、請求項１９、２０または２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記移植片構成物を移植する前に、前記内皮細胞を拡大（expand）させないことを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記移植片構成物を移植する前に、前記予め選択した追加の細胞集団を拡大させる（expand）ことを特徴とする、請求項２２、２３または２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記移植片構成物を移植する前に、前記予め選択した追加の細胞集団を拡大（expand）させないことを特徴とする、請求項２２、２３または２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
病変組織または損傷組織の修復に使用するための組織移植片構成物を調製する方法であって、
膀胱粘膜下組織および胃粘膜下組織、ならびにその抽出物および水解物からなる群から選択されるマトリックス組成物に、内皮細胞集団および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団をin vitroで接種する工程を包含する方法。
【請求項３４】
前記移植片構成物を脊椎動物に移植する前に、in vitroで血管または血管様構造を形成させるのに十分な時間にわたって、前記内皮細胞を前記マトリックス組成物上で培養する工程をさらに包含する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
移植片構成物の血管新生をin vivoで促進する方法であって、
膀胱粘膜下組織および胃粘膜下組織、ならびにその抽出物および水解物からなる群から選択されるマトリックス組成物に、内皮細胞集団および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団をin vitroで接種する工程と、
血管または血管様構造の形成を誘導するのに十分な時間にわたって、該内皮細胞を該マトリックス組成物上でin vitroで培養する工程と、
脊椎動物の修復が必要な部位に前記移植片構成物を移植する工程と、
を包含する方法。
【請求項３６】
前記少なくとも一つの追加の細胞集団が、角化上皮細胞、非角化上皮細胞、および中胚葉由来細胞からなる群から選択される細胞集団を含むことを特徴とする、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記少なくとも一つの追加の細胞集団が、平滑筋細胞集団を含むことを特徴とする、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記少なくとも一つの追加の細胞集団が、平滑筋細胞前駆細胞の集団を含むことを特徴とする、請求３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記マトリックス組成物に前記内皮細胞を接種した後に、該マトリックス組成物に前記予め選択した追加の細胞集団を接種することを特徴とする、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記マトリックス組成物に前記予め選択した追加の細胞集団を接種した後に、該マトリックス組成物に前記内皮細胞を接種することを特徴とする、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
前記マトリックス組成物に、前記内皮細胞と前記予め選択した追加の細胞集団とを同時に接種することを特徴とする、請求項３５に記載の方法。
【請求項４２】
病変組織または損傷組織の修復に使用するための血管新生した組織移植片構成物であって、
膀胱粘膜下組織および胃粘膜下組織、ならびにそれらの抽出物および水解物からなる群から選択されるマトリックス組成物を含み、
追加の内皮細胞および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を含み、
in vitroで血管または血管様構造を形成させるのに十分な時間にわたって、該内皮細胞を該マトリックス組成物上で培養したことを特徴とする、組織移植片構成物。
【請求項４３】
病変組織または損傷組織の修復に使用するための血管様構造を有する組織移植片構成物であって、
膀胱粘膜下組織および胃粘膜下組織、ならびにそれらの抽出物および水解物からなる群から選択されるマトリックス組成物を含み、
追加の内皮細胞、および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を含み、
該付加的な細胞集団が、該移植片構成物における該血管様構造の形成の開始を増強することを特徴とする、組織移植片構成物。
【請求項４４】
病変組織または損傷組織の修復に使用するための血管様構造を有する組織移植片構成物の調製方法であって、
膀胱粘膜下組織および胃粘膜下組織、ならびにそれらの抽出物および水解物からなる群から選択されるマトリックス組成物に、内皮細胞集団および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団をin vitroで接種する工程で、
該付加的な細胞集団が、該移植片構成物における該血管様構造の形成の開始を増強することを特徴とする調製方法。
【請求項４５】
患者の病変組織または損傷組織を治療する方法であって、該病変組織もしくは損傷組織を請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、４２または４３のいずれか１項に記載の組織移植片構成物で修復する工程を包含する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マトリックス組成物由来の血管新生が促進された組織移植片、および病変組織または損傷組織を修復するためにその組織移植片を使用する方法に関する。特に、本発明は、組織移植片構成物の修復能を高めるために、内皮細胞および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を接種した胃粘膜下組織または膀胱由来のマトリックス組成物を含む、血管新生が促進された組織移植片を目的とする。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、損傷組織または病変組織の修復に使用するための、内皮細胞および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を接種したマトリックス組成物を含む組織移植片構成物を目的とする。本発明に従って使用するマトリックス組成物は、膀胱粘膜下組織および胃粘膜下組織、ならびにその抽出物および水解物からなる群から選択される。このマトリックス組成物は、好ましくは、高度に保存されたコラーゲン、糖タンパク質、プロテオグリカンおよびグリコサミノグリカンを含む。本発明において使用するマトリックス組成物は、温血脊椎動物の膀胱もしくは胃組織由来である。
【０００３】
本発明の組織移植片構成物の粘膜下組織成分は実質的に細胞を持たないマトリックスであり、これは、in vivoで見出されたマトリックス環境に類似する優れた細胞成長を提供する。このマトリックス組成物の天然の組成および立体構造は、in vitroにおける細胞の付着および増殖を促進し、また、移植片構成物がin vivoで移植される際の組織再構築を誘導する、細胞成長のためのユニークな基質を提供する。
【０００４】
組織移植片の物質として、膀胱粘膜下組織および胃粘膜下組織は、宿主内の移植表面に内因性組織の成長を誘導する（すなわち、移植片物質は再構築を誘導する）。この組織移植片構成物は、そのように利用すれば、この移植片構成物で置換された組織の成長または再生のためのマトリックスとして役立つだけでなく、内因性組織のそのような成長または再生を促進したり誘導したりすると考えられる。これらの移植片物質は、内因性組織の再生を誘導するため、移植可能なシート形態、または注入可能な流体形態もしくはゲル形態で使用し得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、膀胱粘膜下組織および胃粘膜下組織、ならびにそれらの抽出物および水解物からなる群から選択されるマトリックス組成物を含み、さらに、追加の内皮細胞および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団も含む組織移植片構成物を目的とする。本発明はまた、組織移植片構成物の血管新生をin vivoで促進する方法を目的とする。この血管新生が促進された組織移植片構成物は、組織移植片組成物を宿主へ移植または注入する前に、内皮細胞または内皮細胞前駆体（例えば前駆細胞または幹細胞）および少なくとも一つの予め選択した追加の細胞タイプもしくは指定された細胞タイプを、in vitroでマトリックス組成物に接種することによって調製する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一つの実施形態は、病変組織または損傷組織の修復のために使用する組織移植片構成物を提供する。この組織移植片構成物は、膀胱粘膜下組織および胃粘膜下組織、ならびにそれらの抽出物および水解物からなる群から選択されるマトリックス組成物、追加の内皮細胞および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を含む。
【０００７】
別の実施形態において、病変組織または損傷組織の修復に使用するために、血管新生した組織移植片構成物を提供する。この組織移植片構成物は、膀胱粘膜下組織および胃粘膜下組織、ならびにそれらの抽出物および水解物からなる群から選択されるマトリックス組成物、追加の内皮細胞および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を含む（in vitroで血管または血管様構造を形成させるために、十分な時間、この内皮細胞をこのマトリックス組成物上で培養した）。
【０００８】
別の実施形態において、in vivoで組織移植片構成物の血管新生を促進する方法を提供する。本方法は、移植片構成物を形成させるために、膀胱粘膜下組織および胃粘膜下組織、ならびにその抽出物および水解物からなる群から選択されるマトリックス組成物に、内皮細胞集団および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団をin vitroで接種する工程、および脊椎動物の修復が必要な部位にこの移植片構成物を移植する工程を包含する。
【０００９】
また別の実施形態において、in vivoで組織移植片構成物の血管新生を促進する方法を提供する。本方法は、膀胱粘膜下組織および胃粘膜下組織、ならびにその抽出物および水解物からなる群から選択されるマトリックス組成物に、内皮細胞集団および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団をin vitroで接種する工程と、血管もしくは血管様構造の形成または成分を誘導するのに十分な時間にわたってこの内皮細胞をin vitroで培養する工程と、脊椎動物の修復が必要な部位にこの移植片構成物を移植する工程を包含する。
【００１０】
これらの方法の実施形態のいずれにおいても、内皮細胞をマトリックス組成物に接種した後に、予め選択した追加の細胞集団を接種し得、または内皮細胞をマトリックス組成物に接種する前に、予め選択した追加の細胞集団を接種し得、あるいは内皮細胞と予め選択した追加の細胞集団とを同時にもしくはほぼ同時に接種し得る。
【００１１】
この内皮細胞は、血管または血管様構造の形成を誘導するのに十分な時間にわたって、in vitroにおいてマトリックス組成物上で培養し得る。あるいは、この内皮細胞は、in vitroで血管または血管様構造を形成しないで内皮細胞を拡大する（すなわち、この内皮細胞が少なくとも１回分裂させる）のに十分な時間にわたって、マトリックス組成物上で培養し得る。あるいは、この移植片構成物は、内皮細胞を拡大させないで移植し得る。これらの実施形態のうちのいずれにおいても、予め選択した追加の細胞集団は、移植片構成物を注入する前に拡大させてもよいし、拡大させ（すなわち、少なくとも1回の細胞分裂周期を経て発達させ）なくてもよい。
【００１２】
また別の実施形態では、病変組織または損傷組織を修復するために使用する組織移植片構成物を調製する方法を提供する。本方法は、移植構成物を形成するために、膀胱粘膜下組織および胃粘膜下組織、ならびにその抽出物および水解物からなる群から選択されるマトリックス組成物に、内皮細胞集団および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団をin vitroで接種する工程を包含する。本方法はさらに、血管または血管様構造の形成を誘導するのに十分な時間にわたって、in vitroにおいてマトリックス組成物上で内皮細胞を培養する工程を包含し得る。
【００１３】
これらの実施形態のうちいずれにおいても、少なくとも一つの追加の細胞集団は、非角化の上皮細胞集団もしくは角化上皮細胞集団、または線維芽細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、多能性を有する前駆細胞（例えば、幹細胞）、周皮細胞、および骨形成原細胞からなる群から選択される中胚葉由来細胞の集団を含み得る。様々な実施形態において、マトリックス組成物には、内皮細胞およびこれらの付加的な細胞タイプの１種以上を接種し得る。（すなわち、マトリックス組成物には、内皮細胞とともに、これらの付加的な細胞タイプの１種、２種、３種等を接種し得る。）
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、膀胱粘膜下組織および胃粘膜下組織、ならびにそれらの抽出物および水解物からなる群から選択されるマトリックス組成物を含み、さらに追加の内皮細胞および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を含む組織移植片構成物を目的とする。このマトリックス組成物に、内皮細胞および予め選択した外因性細胞集団を接種し、病変組織または損傷組織を修復するために使用する。本発明によれば、「損傷組織」とは、損傷し、裂傷し、切断され、または外科的に切除され、あるいは修復を必要とする部位を欠落している（例えば先天的欠損または先天的奇形）組織を意味する。このマトリックス組成物は、膀胱粘膜下組織および胃粘膜下組織、ならびにそれらの抽出物および水解物からなる群から選択される組織に由来する細胞外マトリックス組成物から調製することが好ましい。本発明に従って使用する内皮細胞は、大血管内皮細胞、微小血管内皮細胞、動脈内皮細胞および静脈内皮細胞を含む、任意のタイプの内皮細胞集団由来であり得る。本発明によれば、成熟内皮細胞（例えば、器官または血管から採取されたもの）または内皮細胞前駆細胞（例えば、前駆細胞または幹細胞）のいずれも使用し得る。さらに、この内皮細胞は、幼若動物からでも老齢動物からでも採取し得るが、幼若動物から採取された内皮細胞が好ましい。
【００１５】
一つの実施形態において、予め選択した追加の外因性細胞集団は、非角化上皮細胞集団もしくは角化上皮胞集団であってもよいし、または、線維芽細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、多能性を有する前駆細胞、周皮細胞、骨形成原細胞もしくは他の任意の適切な細胞タイプからなる群から選択される中胚葉由来細胞集団であってもよい。
【００１６】
マトリックス組成物と内皮細胞とを結合させる、予め選択した追加の外因性細胞集団は、修復対象の組織の細胞タイプに基づいて選択し得る。例えば、皮膚が修復されることになっている場合、予め選択した外因性細胞集団は、非角化上皮細胞であってよいし、心臓組織が修復されることになっている場合は、予め選択した外因性細胞集団は心筋細胞であってよい。別の実施形態において、治療される患者から単離された自家細胞をこのマトリックス組成物に接種する。
【００１７】
一つの実施形態において、マトリックス組成物と内皮細胞とを結合させる少なくとも一つの予め選択した追加の細胞集団は、平滑筋細胞および／または平滑筋細胞への分化能を有する前駆細胞を含む。都合のよいことに、平滑筋細胞および／または平滑筋前駆細胞は、内皮細胞と共に、移植片構成物中の血管または血管様構造の形成を促進し得る。別の実施形態において、内皮細胞、平滑筋細胞および／または平滑筋細胞前駆細胞と共に、付加的な細胞タイプを添加し得る。
【００１８】
また別の実施形態において、少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団は、多能性を有する前駆細胞集団を含む。マトリックス組成物は、損傷組織の修復を助ける細胞の中へ、これらの多能性を有する前駆細胞の分化を誘導し得る。都合のよいことに、内皮細胞集団および多能性を有する前駆細胞集団を接種したマトリックス組成物は、様々な異なるin vivo部位に移植し得、この前駆細胞は、特定の環境に対して適切な細胞タイプへ分化する。例えば、腱または靭帯部位に内皮細胞および多能性を有する前駆細胞を含む組成物を移植すると、この移植片構成物は腱または靭帯へと再構築する。
【００１９】
マトリックス組成物、内皮細胞、および予め選択した追加の外因性細胞集団を組み合わせることにより、in vitroおよび／またはin vivoにおいて血管新生が驚異的に増強し、マトリックス組成物のみと内皮細胞のみとの組み合わせ、またはマトリックス組成物のみと内皮細胞以外の治療因子としての細胞タイプとの組み合わせのいずれかの使用と比較して、組織機能のより高い創傷治癒能および優れた回復を有する組織移植片構成物を提供する。
【００２０】
様々な実施形態において、マトリックス組成物に内皮細胞を接種した後に、マトリックス組成物に予め選択した追加の細胞集団を接種し得るか、またはマトリックス組成物に内皮細胞を接種する前に、マトリックス組成物に予め選択した追加の細胞集団を接種し得るか、または内皮細胞および予め選択した追加の細胞集団を同時にもしくはほぼ同時に接種し得る（様々な典型的な実施形態については、図１を参照）。
【００２１】
そのような一つの実施形態において、マトリックス組成物に内皮細胞を接種し得、そして、構成物を病変部位へ移植する前に、血管または血管様構造の形成を誘導するのに十分な時間にわたって、マトリックス組成物上でこの内皮細胞を培養し得る。マトリックス組成物に内皮細胞を接種した後において、またin vivoで移植片構成物を移植する直前までの任意の時点において、このマトリックス組成物に少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を接種し得る。従って、移植片構成物の移植の前にマトリックス組成物上で予め選択した細胞を培養するのに許容する時間によって、予め選択した追加の細胞集団は、移植片構成物の病変部位への移植の前に拡大させ（すなわち、少なくとも１回の細胞分裂周期を経て発達させ）てもよいし、拡大させなくてもよい。
【００２２】
あるいは、マトリックス組成物に内皮細胞を接種した後に、このマトリックス組成物に少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を接種し得、そして、移植片を移植する前に、血管もしくは血管様構造の形成または成分を誘導しないで内皮細胞を拡大させるために、マトリックス組成物上でその内皮細胞を培養し得る。本実施形態において、移植片構成物の移植の前にマトリックス組成物上で予め選択した細胞集団を培養するのに許容する時間によって、予め選択した追加の細胞集団は、移植片構成物の病変部位への移植前に拡大させてもよいし、拡大させなくてもよい。
【００２３】
別の実施形態において、マトリックス組成物に内皮細胞を接種した後に、このマトリックス組成物に少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を接種し得、その後直ちに、内皮細胞も予め選択した追加の外因性細胞集団のいずれも拡大させることなく、このマトリックス組成物を移植し得る。
【００２４】
代替的な実施形態において、マトリックス組成物に予め選択した追加の外因性細胞集団を接種し得、移植片構成物を移植する前に予め選択した細胞集団を拡大させる（すなわち、この細胞を少なくとも１回分裂させる）ために、この予め選択した細胞集団をマトリックス上で培養し得る。この実施形態において、マトリックス組成物に予め選択した外因性細胞集団を接種した後において、また、in vivoで移植片を移植する直前までの任意の時点において、このマトリックス組成物に内皮細胞を接種し得る。従って、移植片の移植の前にマトリックス組成物上で内皮細胞を培養するのに許容する時間によって、移植片構成物の病変部位への移植の前にこの内皮細胞を拡大させてもよいし、拡大させなくてもよい。内皮細胞を拡大させる場合、内皮細胞の拡大は、血管または血管様構造の形成を含んでもよいし、含まなくてもよい。
【００２５】
別の実施形態において、マトリックス組成物に少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を接種した後に、このマトリックス組成物に内皮細胞を接種し得、その後直ちに、内皮細胞も予め選択した追加の外因性細胞集団のいずれも拡大させることなく、移植片を移植し得る。
【００２６】
また別の実施形態において、マトリックス組成物に内皮細胞および予め選択した追加の外因性細胞集団を同時にまたはほぼ同時に接種し得る。本実施形態において、内皮細胞および予め選択した追加の外因性細胞集団をマトリックス組成物上で培養し、これら２つの細胞集団を拡大させることもできるし、２つの細胞集団を拡大させないで移植片を移植することもできる。内皮細胞を拡大させる場合、内皮細胞の拡大は、血管または血管様構造の形成を含んでもよいし、含まなくてもよい。
【００２７】
膀胱粘膜下組織および胃粘膜下組織、ならびにその抽出物および水解物からなる群から選択されるマトリックス組成物は、in vitroにおいてマトリックス組成物上で培養される細胞の増殖および分化を支える生理的環境を有利に提供する。従って、マトリックス組成物上に細胞を接種し得、以下に記述するように、当業者に公知の標準的な細胞培養技術を用いて細胞を培養し、移植用組織移植片を作成してそれを必要としている宿主に移植し得る。
【００２８】
膀胱粘膜下組織および胃粘膜下組織ならびにその抽出物および水解物からなる群から選択されるマトリックス組成物が、細胞の成長を支える基質となれる能力は、宿主への移植の前に、内皮細胞集団および／または予め選択した追加の外因性細胞集団を拡大させる機会を提供する。内皮細胞を拡大させる場合、そのような拡大は、移植前に、血管または血管様構造の形成（すなわち、in vitroにおける移植片構成物の潜在的な血管新生）をもたらし得、移植片構成物が移植されると、移植片の創傷治癒能を向上させる。移植片構成物を移植する前に、血管または血管様構造を形成させること、あるいは、移植片構成物を移植する前に内皮細胞を拡大させることにより、移植片を移植したときの創傷治癒能が高められる。それは例えば、膀胱もしくは胃粘膜下組織層の管腔から離れた（abluminal）組織層側で増殖する細胞の分化および遊走を促進し、さらにこれらの細胞が粘膜下組織そのものの中での増殖を促進するという作用によるものである。
【００２９】
移植の前に、追加の内皮細胞および予め選択した追加の外因性細胞集団をマトリックス組成物上で培養する実施形態において、細胞成長を寄与する条件下で、マトリックス組成物上でこれらの細胞を培養する。培養細胞は、マトリックス組成物と直接的に接触するかまたは間接的に接触（例えば、液性の伝達）し得る。細胞成長に寄与する条件とは、組織および細胞培養について現在認められている手順の下で、細胞増殖に最適であると考えられる無菌技術、温度（例えば、約３７℃）、および栄養供給量などの環境要因である。最適の培養条件は特定の細胞タイプに依存するが、一般に細胞成長の条件は、当技術分野で周知である。
【００３０】
本発明に従ったマトリックス組成物は、移植片物質として様々な形態で使用し得、また、移植片構成物を移植する前に、in vitroにおいて内皮細胞およびその他の細胞タイプを培養するために使用し得る。これらの形態としては、シート型構造、ゲル形態、（例えば、組織の粉砕または消化による）流動組成物、および当業者に公知の細胞／組織培養液に添加するための抽出物が挙げられる。このマトリックス組成物またはその成分は、細胞接着のための表面を提供し、かつ／または細胞分化および／または細胞増殖を誘導し得る。このマトリックス組成物は、組織培養／細胞培養として適用する前に滅菌することが好ましい。しかし、抗生物質が細胞培養液に含まれている場合、滅菌していない組成物を使用し得る。
【００３１】
本発明の一つの実施形態に従って、膀胱粘膜下組織もしくは胃粘膜下組織の植片構成物を提供する（粘膜下組織は筋層から剥離し、少なくとも粘膜下組織の粘膜層の管腔部分は、移植片物質として使用されかつ移植片構成物を移植する前にin vitroにおいて内皮細胞および他の細胞タイプを培養するために使用する）。この方法で剥離された膀胱粘膜下組織もしくは胃粘膜下組織は、シート形態、ゲル形態、または消化物や抽出物などの流動組成物として本発明に従って使用し得る。
【００３２】
一つの実施形態において、移植片構成物を移植する前に、細胞培養のために細胞増殖に寄与する条件下で、膀胱粘膜下組織もしくは胃粘膜下組織の層の上に細胞を直接接種する。これらの組織は多孔性であるため、細胞の栄養素がマトリックス全体に拡散し得る。従って、膀胱粘膜下組織層もしくは胃粘膜下組織層の管腔面および／または管腔から離れた面に細胞を接種し得、かつそこで培養し得る。膀胱粘膜下組織もしくは胃粘膜下組織の管腔面とは、器官の管腔に面している表面で、典型的には、in vivoで内側の粘膜層に隣接している。これに対し、管腔から離れた面とは、器官の管腔から離れている表面で、典型的には、器官供給源における平滑筋組織と接している。
【００３３】
粘膜下組織層のどの側面で細胞が成長するかによって、粘膜下組織の固形層上で培養した細胞は、異なる成長パターンを示し、粘膜下組織の成長のための基質と様々な相互作用を示す。粘膜下組織層上で培養された内皮細胞の組織学的な検査により、管腔から離れた面に接種された内皮細胞は、粘膜下組織表面に沿って成長／増殖するだけでなく、より容易に粘膜下組織自体へと遊走し、その中で増殖することが明らかにされている。粘膜下組織の管腔面は、管腔から離れた側面よりマトリックスの密度が高い。従って、細胞が管腔面を貫通することはほとんどない。粘膜下組織の管腔面上に接種された細胞は、マトリックスに付着するが、通常は、マトリックスの表面を貫通しない。
【００３４】
移植片構成物の移植前に培養するために、マトリックス組成物上に接種された内皮細胞および／または予め選択した追加の外因性細胞集団は、無機物、アミノ酸、糖、ペプチド、タンパク質、もしくはラミニンやフィブロネクチンなどの糖タンパク質を含む栄養素、および／または上皮細胞増殖因子、血管内皮細胞由来増殖因子、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子様分子、トランスフォーミング成長因子β、線維芽細胞増殖因子、あるいは別の血清増殖因子などの増殖因子の存在下で成長させることができる。一つの実施形態において、in vitroでの細胞増殖を持続させ誘導する能力を高め、さらにin vivoでの再構築を誘導するため、流動形態または粉末形態のマトリックス組成物を、標準的な細胞培地に補充するために用いることができる。市販の細胞培地体培地（血清含有でも無血清でもよい）の存在下において、マトリックス組成物上でこの細胞を成長させることができる。
【００３５】
一つの実施形態において、マトリックス組成物および内皮細胞を組み合わせるために、少なくとも一つの予め選択した追加の細胞集団は、内皮細胞とともに移植片構成物の血管または血管様構造の形成を促進するための、平滑筋細胞および／または平滑筋細胞への分化能を有する前駆細胞であってよい。平滑筋細胞をヘパリナーゼで処理すると、増殖細胞に特徴的な表現型の変化を誘導し得ることが知られている。このため、マトリックス組成物に、内皮細胞および平滑筋細胞集団および／または平滑筋細胞前駆細胞集団を含む少なくとも一つの予め選択した外因性細胞集団を接種する実施形態においては、ヘパリナーゼが細胞培地中に含まれ得る。例えば、フラボバテリウム・ヘパリナム（Flavobaterium heparinum）由来の4単位/mlのヘパリナーゼは、短時間（例えば、6時間）培地に含有させ得るか、または、培地に常に存在させ得る。
【００３６】
また、サブコンフルエントな細胞単層としての基質上に接種された平滑筋細胞には、分裂能による表現型の変化が起こることが知られている。平滑筋細胞が内皮細胞のコンフルエントな単層で共培養されると、表現型の変化が阻害される。このため、マトリックス組成物に内皮細胞および平滑筋細胞集団および／または平滑筋細胞前駆細胞集団を含む少なくとも一つの予め選択した外因性細胞集団を接種する実施形態においては、この細胞がサブコンフルエントな細胞単層としてマトリックス組成物に付着するように、追加の内皮細胞をマトリックス組成物上に接種し得る。別の実施形態において、細胞がサブコンフルエントな細胞単層としてのマトリックス組成物に付着するように、内皮細胞、平滑筋細胞および／または平滑筋前駆細胞をマトリックス組成物上に接種し得る。
【００３７】
粘膜下組織は、in vivoにおいて多くの微小環境（例えば、腱、靭帯、骨、関節軟骨、動脈、および静脈）中に移植される際、宿主の組織の増殖や適切な組織構造の再構築および再生を誘導する能力をもつことが、これまでにも十分に立証されてきた。内因性組織の形成を誘導するために、シート形態および流動形態における膀胱粘膜下組織および胃粘膜下組織の使用については、米国特許第5,554,389号、同第6,099,567号、および同第6,264,992号に記載され特許請求されている（これらの開示は、参考として特に援用される）。従って、本発明の膀胱粘膜下組織移植片もしくは胃粘膜下組織移植片は、修復を必要とする損傷組織の再構築を誘導するためにin vivoで移植される。
【００３８】
一つの実施形態において、マトリックス組成物、追加の内皮細胞、および予め選択した追加の外因性細胞集団を含有する特許請求されている組成物を、宿主の中への移植するための生体適合性マトリックス中に被包し得る。この被包マトリックスは、栄養素を被包された細胞に拡散させ、さらにこの被包された細胞の産物を、被包された細胞から宿主の細胞へと拡散させるように構成し得る。生細胞を被包するのに適する生体適合性ポリマーは当業者に知られている。例えば、ポリリシン／アルギン酸塩封入法（polylysine/alginate encapsulation process）が、F.LimとA.Sunによって既に記載されている（Science,Vol.210,pp.908-910）。実際に、人工臓器として移植するために、本発明のマトリックス上の細胞を被包すれば、膀胱粘膜下組織もしくは胃粘膜下組織それ自体を有利に使用することができる。
【００３９】
一つの実施形態において、in vivoにおいて組織移植片構成物の血管新生を促進する方法を提供する。この方法は、膀胱粘膜下組織および胃粘膜下組織、ならびにその抽出物および水解物からなる群から選択されるマトリックス組成物に、内皮細胞集団および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団をin vitroで接種して移植片構成物を形成する工程と、脊椎動物の修復の必要な部位にこの移植片構成物を移植する工程とを包含する。この方法の一つの実施形態において、マトリックス組成物に内皮細胞を接種し、構成物を病変部位に移植する前に、血管または血管様構造の形成を誘導するのに十分な時間にわたって、マトリックス組成物上でその内皮細胞を培養し得る。移植片構成物に内皮細胞を接種した後において、またin vivoで移植片構成物を移植する直前までの任意の時点において、マトリックス組成物に少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を接種し得る。従って、移植片構成物の移植の前に、マトリックス組成物上で予め選択した細胞集団を培養するのに許容する時間によって、予め選択した追加の細胞集団を、移植片構成物の病変部位への移植の前に拡大させてもよいし、拡大させなくてもよい。
【００４０】
あるいは、マトリックス組成物に内皮細胞を接種した後に、このマトリックス組成物に少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を接種することができ、移植片を移植する前に、血管または血管様構造の形成を誘導しないでマトリックス組成物上でその内皮細胞を培養して、内皮細胞を拡大させることもできる。本実施形態において、移植片構成物の移植の前に、マトリックス組成物上で内皮細胞を培養するのに許容する時間によって、移植片構成物の病変部位への移植の前に、予め選択した追加の細胞集団を拡大させてもよいし、拡大させなくてもよい。
【００４１】
別の実施形態において、マトリックス組成物に内皮細胞を接種した後に、このマトリックス組成物に少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を接種し得、その後直ちに、この組織片構成物は内皮細胞も予め選択した追加の外因性細胞集団のいずれも拡大させることなく、移植し得る。
【００４２】
本方法の代替的な実施形態において、マトリックス組成物に予め選択した追加の外因性細胞集団を接種し得、移植片構成物を移植する前に、予め選択した細胞集団を拡大させるために、マトリックス組成物上でこの予め選択した細胞集団を培養し得る。この実施形態において、マトリックス組成物に予め選択した細胞集団を接種した後において、またin vivoで移植片構成物を移植する直前までの任意の時点において、このマトリックス組成物に内皮細胞を接種し得る。従って、移植片構成物を移植する前に、マトリックス組成物上で内皮細胞を培養することによってこの細胞を拡大させるのに許容する時間によって、移植片構成物の病変部位への移植の前に、この内皮細胞を拡大させてもよいし、拡大させなくてもよい。この内皮細胞を拡大させる場合、内皮細胞の拡大は、血管または血管様構造の形成を含んでもよいし、含まなくてもよい。
【００４３】
別の実施形態において、マトリックス組成物に少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を接種した後に、このマトリックス組成物に内皮細胞を接種し得、その後直ちに、内皮細胞も予め選択した追加の外因性細胞集団のいずれも拡大させることなく、この移植片構成物を移植し得る。
【００４４】
また別の実施形態において、マトリックス組成物に内皮細胞と予め選択した追加の外因性細胞集団とを同時にまたはほぼ同時に接種し得る。この実施形態において、内皮細胞と予め選択した追加の外因性細胞集団とをマトリックス組成物上で培養し、これら２つの細胞集団を拡大させることもできるし、２つの細胞集団を拡大させないで移植片構成物を移植することもできる。この内皮細胞を拡大させる場合、内皮細胞の拡大は、血管または血管様構造の形成を含んでもよいし、含まなくてもよい。
【００４５】
本発明に従って、病変組織または損傷組織の修復に使用するために、血管新生した組織移植片構成物もまた提供する。この血管新生した移植片構成物は、膀胱粘膜下組織および胃粘膜下組織、ならびにそれらの抽出物および水解物からなる群から選択されるマトリックス組成物を含有し、さらに追加の内皮細胞および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を含み、ここでこの内皮細胞は、in vitroにおいて血管または血管様構造を形成させるのに十分な時間にわたって、マトリックス組成物上で培養した。
【００４６】
別の実施形態において、in vivoにおける組織移植片構成物の血管新生を促進する方法を提供する。この方法は、膀胱粘膜下組織および胃粘膜下組織、ならびにその抽出物および水解物からなる群から選択されるマトリックス組成物に、内皮細胞集団および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団をin vitroで接種する工程と、in vitroにおいて血管または血管様構造の形成を誘導するのに十分な時間にわたって、内皮細胞と付加的な細胞集団とを該マトリックス組成物上で培養する工程と、脊椎動物の修復の必要な部位に移植片構成物を移植する工程を包含する。
【００４７】
本発明のマトリックス組成物は、移植の前に、初めは小さな細胞集団（in vitroで拡大し得る）を接種し得る。都合のよいことに、in vitroにおいて内皮細胞をマトリックス組成物上で培養すると、この内皮細胞を接種することによって、in vitroでこの移植片の血管新生を誘導し得る。このマトリックス組成物はさらに、血管新生を促進するために、平滑筋細胞もしくは平滑筋細胞前駆細胞、または線維芽細胞などの別の細胞タイプを接種し得る。
【００４８】
この実施形態において、マトリックス組成物に内皮細胞を接種し、構成物を病変部位に移植する前に、血管または血管様構造の形成を誘導するのに十分な時間にわたって、その内皮細胞をマトリックス組成物上で培養し得る。マトリックス組成物に内皮細胞を接種した後において、またin vivoで移植片構成物を移植する直前までの任意の時点において、このマトリックス組成物に少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を接種し得る。従って、移植片構成物を移植する前に、マトリックス組成物上で予め選択した細胞集団を培養するのに許容する時間によって、移植片構成物の病変部位への移植の前に、予め選択した追加の細胞集団を拡大させてもよいし、拡大させなくてもよい。
【００４９】
代替的な実施形態において、マトリックス組成物に予め選択した追加の外因性細胞集団を接種し得、移植片構成物を移植する前に、この予め選択した細胞集団をマトリックス上で培養して、予め選択した細胞集団を拡大させ得る。この実施形態において、マトリックス組成物に予め選択した細胞集団を接種した後に、このマトリックス組成物に内皮細胞を接種する。この実施形態において、移植片構成物を病変部位に移植する前に、血管または血管様構造を形成するために内皮細胞を拡大するのに十分な時間にわたって、内皮細胞をマトリックス組成物上で培養する。
【００５０】
別の実施形態において、マトリックス組成物に内皮細胞と予め選択した追加の外因性細胞集団とを同時にまたはほぼ同時に接種し得る。この実施形態において、移植片構成物を移植する前に、予め選択した追加の外因性細胞集団と内皮細胞とをマトリックス組成物上で培養し、これら２つの細胞集団を拡大させる。
【００５１】
病変組織または損傷組織を修復するのに使用する組織移植片構成物を調製する方法もまた提供する。この方法は、移植片構成物を形成するために、膀胱粘膜下組織および胃粘膜下組織、ならびにその抽出物および水解物からなる群から選択されるマトリックス組成物に、内皮細胞集団および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団をin vitroで接種する工程を包含する。この方法はさらに、移植片構成物を病変部位に移植する前に、血管または血管様構造の形成を誘導するのに十分な時間にわたって、内皮細胞をマトリックス組成物上で培養する工程を包含し得る。
【００５２】
本発明に従って使用するために、膀胱粘膜下組織および胃粘膜下組織の調製については、例えば、米国特許第5,554,389号（膀胱粘膜下組織）および同第6,099、567号（胃粘膜下組織）に記載されている。要約すると、粘膜下組織は脊椎動物の膀胱または胃から調製し、ブタ、ヒツジ、またはウシから採取するのが好ましいが、それ以外の種からでも可能である。この点で、粘膜下組織は典型的には異種（すなわち、異なる種に由来する）ものであるが、同種異系（すなわち、同じ種の異なる種類に由来する）あるいは自家（すなわち、同じ動物または個体に由来する）のものであってもよい。
【００５３】
本発明で使用される、膀胱粘膜下組織および胃粘膜下組織を調製する一つの方法では、縦方向に拭き取ることで組織を剥離し、平滑筋組織を含む外側層および最も内側の層（すなわち、少なくとも粘膜の管腔部分）を除去する。従って、粘膜下組織は、筋層および少なくとも粘膜の管腔部分から剥離される。別の実施形態において、膀胱組織または胃組織は、国際公開第01/45765号パンフレット（援用することにより、本明細書中に組み込むものとする）に記載されているSpievackの方法に従って調製し得る。この方法によれば、１Ｎ生理食塩水などの脱上皮する（de-epithelializing）溶液に膀胱組織または胃組織を浸漬して上皮細胞層を除去し、上皮基底膜を含む準隣接層(subadjacent layer)がすべて残される。あるいは、１Ｎ生理食塩水中に膀胱組織または胃組織を浸漬し、粘膜下組織層の近くに隣接している付加的な層またはその部分を除去するために、酵素的な剥離工程および機械的な剥離工程にかけることができる。これらの方法のいずれかを行うことによって、膀胱粘膜下組織層もしくは胃粘膜下組織層、および上皮基底膜を含む調製物が得られる。
【００５４】
次いで、粘膜下組織を生理食塩水ですすぎ、必要に応じて滅菌する。これにより、水和状態または脱水状態で保存し得る。凍結乾燥または風乾した粘膜下組織は、再水和し、生物活性を欠失しないで本発明に従って使用し得る。開始物質としての天然の粘膜下組織は、比較的細胞を持たないコラーゲンマトリックスである。また、上記の通り調製された好ましいコラーゲンマトリックス組成物は、無傷細胞のないコラーゲンマトリックスである（すなわち、粘膜下組織のコラーゲンマトリックス組成物は細胞がない）。
【００５５】
粘膜下組織の多層シートを形成するために、粘膜下組織の複数の層を互いにオーバーラップさせることができる。個々の層は、縫合およびコラーゲン結合ペースト剤（collagen binder paste）などの生体適合性接着剤の使用を含む、当業者に公知の標準的な技術を用いて、互いに対して固定し得る。あるいは、脱水条件下で、オーバーラップした領域を圧縮することにより各層を融合してもよい。必要に応じて、米国特許第5,711,969号に記載されているように、加熱してもよい（この開示は、特別に本明細書中に組み込むものとする）。
【００５６】
脊椎動物の膀胱粘膜下組織もしくは胃粘膜下組織は、グルタルアルデヒドによるなめし処理、酸性ｐＨにおけるホルムアルデヒドによるなめし処理、エチレンオキシド処理、プロピレンオキシド処理、ガスプラズマ滅菌、γ線照射、電子ビームおよび過酢酸滅菌を含む従来の滅菌技術を用いて殺菌し得る。好ましい滅菌技術は、粘膜下組織を、過酢酸、１〜４ミリラドのγ線照射（より好ましくは1〜2.5ミリラドのγ線照射）、またはガスプラズマ滅菌に曝露させることであるが、なかでも過酢酸滅菌が最も好ましい滅菌法である。代表的に、粘膜下組織には、２つ以上の滅菌過程が供される。粘膜下組織は、例えば化学処理によって滅菌した後、電子ビーム滅菌法またはγ線照射滅菌法を用いて再度殺菌することができる。代表的に、移植片への細胞の添加は、移植片の滅菌後に行う。米国特許第6,206,931号に記載されているような滅菌技術を使用してもよい（本明細書中において参考として援用される）。本発明の移植片構成物を移植する前に、in vitroにおいて内皮細胞および予め選択した細胞集団を培養するために、滅菌した膀胱粘膜下組織もしくは胃粘膜下組織を使用し得る。
【００５７】
脊椎動物の膀胱粘膜下組織もしくは胃粘膜下組織はまた、粉砕および／または酵素による消化により生物活性を欠失しないで流動化し得ることが知られている。米国特許第6,264,992 B1号を参照されたい（この開示は、特に援用することにより本明細書中に組み込むものとする）。より詳細には、粘膜下組織成分全体またはその大部分を可溶化するのに十分な時間にわたって、天然の粘膜下組織または流動化された粘膜下組織の組成物は、酵素で処理し得る。好ましくは、粘膜下組織成分の懸濁液または均質な溶液を得るために、粘膜下組織の構造成分を加水分解する酵素で粘膜下組織を消化する。粘膜下組織は、プロテアーゼ（例えば、コラゲナーゼ、またはトリプシンもしくはペプシン）、グリコサミノグリカナーゼ（glycosaminoglycanase）またはプロテアーゼとグリコサミノグリカナーゼとの組み合わせで酵素的に処理し得る。必要に応じて、他の適切な酵素を単独で、あるいはプロテアーゼとグリコサミノグリカナーゼとを組み合わせて使用し得る。組織消化物は、部分的に可溶化された粘膜下組織の均質な溶液を得るために、必要に応じて濾過し得る。
【００５８】
粘膜下組織成分の濃度および水和化の程度をコントロールすることにより、流動化された粘膜下組織の粘性を操作し得る。粘性は、25℃で、約2〜約300,000cpsの範囲に調節し得る。消化した物質を透析した後、粘膜下組織消化溶液のｐＨを約5.0〜約9.0に調節することにより、より高い粘性を有する配合物（例えば、ゲル剤）を粘膜下組織消化溶液から調製し得る。
【００５９】
膀胱粘膜下組織もしくは胃粘膜下組織はまた、抽出物の形態をとり得る。例えば、粘膜下組織抽出物の調製については、1998年6月18日に国際公開第98/25964号パンフレットとして公開された国際特許出願第PCT/US97/22721号の明細書に記載されている（本明細書中に援用することにより組み込むものとする）。簡潔に述べると、膀胱粘膜下組織もしくは胃粘膜下組織を4℃で約24時間攪拌しながら抽出バッファー（実施例１を参照のこと）で懸濁し得る。抽出混合液を4℃で約30分間、12,000×gで遠心し、上清を回収し得る。次いで、不溶性の物質を抽出バッファーで洗浄し、遠心分離の工程を繰り返し、回収しておいた上清を洗浄液と併せる。この上清を脱イオン水で十分に透析し（MWCO 約3500）、透析物をさらに12,000×gで遠心する。この上清は直ちに使用することもできるし、または保管用に凍結乾燥することもできる。流動形態およびゲル形態の膀胱粘膜下組織もしくは胃粘膜下組織、ならびにこれらの粘膜下組織抽出物は、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）β、ＴＧＦ−β関連タンパク質、線維芽細胞増殖因子を含む増殖因子などの生理活性物質を保持してもよい。流動形態またはゲル形態における膀胱粘膜下組織もしくは胃粘膜下組織（抽出物または粉末形態）は、本発明の移植片構成物を移植する前にin vitroにおいて内皮細胞および予め選択した細胞集団を培養するために使用し得る。
【００６０】
本発明はまた、粘膜下組織の粉末形態での使用を考慮する。一つの実施形態において、粘膜下組織を液体窒素下で微粉砕し、粒径0.1〜1ｍｍ２の範囲の粒子を形成することによって、粉末形態の粘膜下組織を調製し得る。次いで、この粒子状組成物を一晩凍結乾燥し滅菌して、固形状の実質的に無水の粒子状組成物を形成する。あるいは、粉末形態の粘膜下組織は、粉砕された粘膜下組織の懸濁液または溶液を乾燥させることにより、流動化した粘膜下組織から形成し得る。
【実施例】
【００６１】
＜実施例１＞
＝＝＝膀胱粘膜下組織組成物および胃粘膜下組織組成物の調製＝＝＝
＝＝膀胱粘膜下組織の調製＝＝
地域の食肉加工工場から入手したブタの膀胱から、膀胱粘膜下組織を調製した。切除した膀胱をすすぎ、内容物を除去し、裏返しにして、粘膜の表層を機械的な剥離によって除去した。組織を元の方向に戻し、外側の筋肉層を除去した。粘膜下組織マトリックスに結合したあらゆる細胞を溶解し、細胞分解産物を除去するために、調製した膀胱を水中で開け、十分にすすいだ。
【００６２】
または、粘膜下組織層および上皮の基底膜の両方を保持する膀胱組織は、国際公開第01/45765号パンフレットに記述されているSpievackの方法によって調製し得る（本明細書中に援用することにより組み込むものとする）。この方法によれば、上皮の基底膜を保持する膀胱粘膜下組織は、脱上皮させる溶液（例えば、１Ｎ生理食塩水）中にこの組織を浸漬することにより調製し得る。別の実施形態において、膀胱組織を１Ｎ生理食塩水に浸漬し、粘膜下組織層の近くに隣接している付加的な層またはその一部を除去するために、酵素処理および機械的な剥離工程を供し得る。これらの方法のいずれかを行うことにより、膀胱粘膜下組織層もしくは胃粘膜下組織層、および上皮の基底膜を含む調製物が得られる。
【００６３】
以下に記述するように、このような調製物を、本発明の移植片構成物において使用する。流動形態もしくはゲル形態の膀胱粘膜下組織の調製または膀胱粘膜下組織の抽出物の調製については、代表的に、膀胱粘膜下組織をすすいだ後直ちに、まず液体窒素中で凍結し、‐８０℃で保存する。凍結組織を1cmの立方体にスライスし、液体窒素下で工業用ブレンダーを用いて2mm2未満の粒子に粉砕し、使用するまで−80℃で保存した。流動形態もしくはゲル形態の膀胱粘膜下組織の調製、または膀胱粘膜下組織の抽出物の調製について、以下に記述する。
【００６４】
＝＝胃粘膜下組織織の調製＝＝
まず、胃の噴門部および幽門部でそれぞれ食道と小腸とを離断することにより、胃をブタから切除した。過剰の腸間膜組織または脂肪を胃の管腔表面から除去し、胃の内容物を排出し、流水（水道水）ですすいで胃の内側から残存している残留物を全て除去した。次いで、胃を裏返しにして胃の内側（管腔）表面を露出し、食道が終わる括約筋と胃の幽門部を形成する括約筋（幽門括約筋）の末端を切り取った。普通は、胃を全体のままにしておくが、不要な組織を除去する前に切断したり平らにしたりすることもできる。少なくとも粘膜の管腔部分を含む胃の内層を除去するために、鈍器または止血鉗子を使用して胃の管腔の表面を剥離した。胃組織を再び裏返し、移植片構成物の内側に胃の管腔面を戻した。次いで、外側の筋繊維層に小さい切り込みを入れた後、粘膜下組織から機械的にまたは酵素学的によって、筋肉層を剥離した。残存する組織は薄桃色を帯びている。または、上記で説明したSpievackらが記述している方法によって、上皮の基底膜を保持する胃粘膜下組織を調製し得る。
【００６５】
胃組織の調製中は、組織を定期的に水に浸すことにより組織の水和を維持するよう留意した。胃粘膜下組織を約２時間流水（水道水）ですすぎ、血液や小さな組織剥離物をすべて除去した。すすいだ後、組織は白く見えるはずであるが、依然として薄桃色である場合、白く見えるようになるまで流水下でこする。すすぎが完了したら、手を用いるかまたは機械的なリンガー（mechanical ringer）を用いて組織をリンガー液に通すことにより過剰な水を除去した。本発明の移植片構成物に、このような調製物を使用する。流動形態もしくはゲル形態の胃粘膜下組織、または胃粘膜下組織の抽出物を調製するには、この胃粘膜下組織をすすいだ後直ちに、まず液体窒素中で凍結し、−８０℃で保存するのが普通である。凍結組織を1cmの立方体にスライスし、液体窒素下で、工業用ブレンダーを用いて2mm2未満の粒子状物質に粉砕し、使用するまで−８０℃で保存する。流動形態もしくはゲル形態の胃粘膜下組織、または胃粘膜下組織の抽出物の調製については、以下に記述する。
【００６６】
＝＝流動化された膀胱もしくは胃粘膜下組織の調製＝＝
0.5Mの酢酸溶液（0.1％ペプシン含有）100ｍｌに５ｇの粉末状組織を加え、４℃で７２時間消化することにより、微粉砕した物質を部分的に消化した。部分的に消化した後、この懸濁液を4℃で20分間遠心（12,000rpm）し、不溶性のペレットを捨てた。この上清を、4℃で、0.01M酢酸を数回取り換えながら透析し（MWCO  3,500）、透析水解物にクロロホルム（900mlの0.01M酢酸に対し5mlのクロロホルム）を加えることにより、この溶液を滅菌した。無菌の０．０１Ｍ酢酸をさらに２度取り換えて水解物の透析を続け、クロロホルムを除去した。その後、透析バッグの内容物を、無菌的な容器に無菌操作で移した。得られた流動組成物を４℃で保存した。
【００６７】
＝＝膀胱粘膜下組織のゲル組成物および胃粘膜下組織のゲル組成物の調製＝＝
ゲル形態の膀胱粘膜下組織もしくは胃粘膜下組織を調製するために、８mlの流動化粘膜下組織を、1.2mlの10×PBSバッファー（5mg/Lフェノールレッドを含む10×リン酸緩衝生理食塩水）（0.04N HCl（約1.6ml）を加え、pHを6.6〜7.4に調節し、pHが>8にシフトするまで0.05N NaOH（約1.2ml）を加えた）と混合した。最終量を水で12mlに調節した。
【００６８】
＝＝膀胱粘膜下組織もしくは胃粘膜下組織の抽出物の調製＝＝
これらの研究に使用した抽出バッファーには、4Mグアニジン、2M尿素、2M MgCl2および2M NaCIを含んだ（それぞれ、50mM  Tris-HCl、pH7.4で調製）。膀胱粘膜下組織もしくは胃粘膜下組織の粉末を、フッ化フェニルメチルスルフォニル（ＰＭＳＦ）、Ｎ−エチルマレイミド、およびベンザミジン（プロテアーゼ阻害剤）を含む（それぞれ1mM）抽出バッファー（25%  w/v）で懸濁し、4℃で24時間激しく撹拌した。その後、抽出混合液を4℃で30分間遠心（12,000×g）し、上清を回収した。不溶性の物質を、抽出バッファーで簡単に洗浄し、遠心し、この洗浄液を元の上清と併せた。この上清を、30倍量の脱イオン水（72時間にわたり9回取替える）でSpectrapor（MWCO  3,500、スペクトラム・メディカル・インダストリーズ（Spectrum Medical Industries）、ロサンゼルス、カリフォルニア州）のチューブで十分に透析した。不溶性の物質を除去するために、透析物を12,000×gで遠心し、上清を直ちに使用するか、凍結乾燥して保存した。
【００６９】
＜実施例２＞
＝＝内皮細胞の成長＝＝
上記の通り、新たに安楽死させたブタから膀胱粘膜下組織もしくは胃粘膜下組織を採取し調製する。様々な方法（γ線照射、過酢酸等）により滅菌した後、細胞増殖のための平坦な表面（50mm2）を作るために、この組織をポリプロピレンフレーム内に固定する。培地栄養素が、膀胱粘膜下組織もしくは胃粘膜下組織の両方の表面へ届くように、このフレームを組織培養液に浸す。内皮細胞および平滑筋細胞を粘膜下組織に接種し、（3×104細胞／組織片）、次いで、37℃、5％  CO2の95％エアインキュベーターに入れる。様々な時間培養した後、細胞を接種した膀胱粘膜下組織もしくは胃粘膜下組織を、10％の中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋して切片（6μｍ）を作成する。細胞増殖の特性を明らかにするために、様々な組織学染色および免疫組織化学的染色を実施する。これらの方法を用いて血管または血管様構造を観察する。
【００７０】
＜実施例３＞
＝＝内皮細胞の増殖＝＝
上記の通り、新たに安楽死させたブタから膀胱粘膜下組織を採取し調製した。様々な方法（γ線照射、過酢酸等）により滅菌した後、細胞増殖のための平坦な表面（50mm2）を作るために、この組織をポリプロピレンフレーム内に固定した。培地栄養素が、膀胱粘膜下組織の両方の表面へ届くように、このフレームを組織培養液に浸した。ヒト微小血管の内皮細胞を膀胱粘膜下組織の片面に接種し、また、３Ｔ３細胞をもう一方の面に接種し、（どちらの細胞型も1×106細胞／組織片で接種）、次いで、この組織片を37℃、5％Ｃ０２の95％エアインキュベーターに入れた。増殖７日後に、細胞を接種した膀胱膜下組織を、10％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋して切片（6μｍ）を作成した。細胞増殖の特性を明らかにするため、様々な組織学染色および免疫組織化学的染色を実施した。図２に示す通り、任意の付加的な細胞タイプの非存在下において、膀胱粘膜下組織のみに接種した内皮細胞は、マトリックスに侵入することなく、膀胱粘膜下組織表面で増殖した。図３に示す通り、組織の反対側に３Ｔ３細胞を接種すると、細胞はマトリックスに侵入し、血管または血管様構造を形成した。以上の結果より、内皮細胞が、移植片物質において血管または血管様構造を形成する能力は、別の細胞タイプが存在する移植片物質上で内皮細胞が移植片物質上で成長する場合に、増強することが明らかにされた。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】本発明の移植片構成物の代替的な調製を示すフローチャートである。
【図２】内皮細胞を接種した組織移植片の組織切片を示す顕微鏡写真である。
【図３】内皮細胞および３Ｔ３細胞を接種した組織移植片の組織切片を示す顕微鏡写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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