(57)【要約】  インビボまたはエキソビボで核酸を送達するリポソーム組成物が記述されている。該組成物中のリポソームは、以下の（ｉ）および（ｉｉ）から構成される：（ｉ）脂質であって、該脂質は、生理学的ｐＨで電荷が中性であるが生理学的ｐＨより低いｐＨ値で正に荷電している。および（ｉｉ）ジチオベンジル結合により親水性重合体に接合した脂質；該リポソームは、細胞に送達するための核酸と会合している。本発明は、ｐＨ応答性脂質と、核酸を投与するための遊離可能親水性重合体の表面被覆とを含有するリポソーム組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸投与用の組成物であって、該組成物は、以下（ａ）および（ｂ）：
（ａ）以下の（ｉ）および（ｉｉ）から構成されるリポソーム：
（ｉ）次式を有する脂質：
【化１】
2005514392.tif 000054
ここで、Ｒ１およびＲ２の各々は、８個〜２４個の間の炭素原子を有するアルキルまたはアルケニル鎖である；
ｎ＝０〜２０である；
Ｌは、（１）−Ｘ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｙ、（２）−Ｘ−（Ｃ＝Ｏ）−および（３）−Ｘからなる群から選択され、ここで、ＸおよびＹは、別個に、酸素、ＮＨおよび直接結合から選択される；
Ｚは、弱塩基部分であり、該弱塩基部分は、約４．０より大きく７．４未満のｐＫを有する；および
（ｉｉ）以下の一般式を有する化合物：
【化２】
2005514392.tif 000055
ここで、Ｒ３は、親水性重合体であり、該親水性重合体は、そのジチオベンジル部分に結合する結合を含む；Ｒ４は、Ｈ、アルキルおよびアリールからなる群から選択される；Ｒ５は、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ７、Ｓ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ７およびＯ（Ｃ＝Ｓ）Ｒ７からなる群から選択される；Ｒ７は、アミン含有脂質を含む；そしてＲ６は、Ｈ、アルキルおよびアリールからなる群から選択される；ここで、ＣＨ２−Ｒ５の配向は、オルト位置およびパラ位置から選択される；および
（ｂ）該リポソームに会合した核酸、
を含有する、組成物。
【請求項２】
Ｘが、ＮＨであり、そしてＹが、酸素である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
Ｌが、カルバメート結合、エステル結合またはカーボネート結合である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
Ｌが、ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
Ｚが、イミダゾールである、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
１〜８０モルパーセントの前記脂質を含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
Ｚが、５．０〜６．５の間のｐＫ値を有する部分である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
Ｒ１およびＲ２の各々が、８個〜２４個の間の炭素原子を有する非分枝アルキルまたはアルケニル鎖である、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
Ｒ１およびＲ２の各々が、Ｃ１７Ｈ３５である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
ｎが、１〜１０の間である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
Ｒ６が、Ｈであり、そしてＲ４が、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５およびＣ３Ｈ８からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記アミン含有脂質が、単一炭化水素尾部または二重炭化水素尾部のいずれかを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記アミン含有脂質が、二重炭化水素尾部を有するリン脂質である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
Ｒ４およびＲ６が、アルキルである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
Ｒ３が、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピル−メタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチル−アクリルアミド、ポリメタクリル酸ヒドロキシプロピル、ポリアクリル酸ヒドロキシエチル、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリアスパルトアミド、それらの共重合体、およびポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシドからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
Ｒ３が、ポリエチレングリコールである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
Ｒ６が、Ｈであり、そしてＲ４が、ＣＨ３またはＣ２Ｈ５である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記リポソームが、５〜２０モルパーセントの間の前記化合物を含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
さらに、前記リポソームに取り込まれた治療化合物を含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
前記核酸が、前記リポソームの少なくとも一部に取り込まれている、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
前記核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらのフラグメントおよびオリゴヌクレオチドから選択される、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
さらに、前記リポソームを標的部位に標的化するリガンドを含有し、該リガンドが、前記化合物上の前記親水性重合体Ｒ３の遠位末端に共有結合している、請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記リガンドが、内皮腫瘍細胞により内部移行するための該細胞に対する結合親和性を有する、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記リガンドが、Ｅ−セレクチン、Ｈｅｒ−２およびＦＧＦからなる群から選択される、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
前記リガンドが、ＨＥＲ２／ｎｅｕ発癌遺伝子のｃ−ｅｒｂＢ−２タンパク質生成物、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）レセプター、塩基性線維芽細胞成長レセプター（塩基性ＦＧＦレセプター）、血管内皮成長因子レセプター、Ｅ−セレクチンレセプター、Ｌ−セレクチンレセプター、Ｐ−セレクチンレセプター、葉酸レセプター、ＣＤ４レセプター、ＣＤ１９レセプター、αβインテグリンレセプターおよびケモカインレセプターからなる群から選択される、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２６】
前記リポソームが、さらに、カチオン性脂質を含有する、請求項１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、核酸送達用のリポソーム組成物に関する。さらに特定すると、本発明は、ｐＨ応答性脂質と、核酸を投与するための遊離可能親水性重合体の表面被覆とを含有するリポソーム組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
特定の細胞への遺伝子物質の移動を促進するために、種々の方法が開発されている。これらの方法は、インビボおよびエキソビボの両方の遺伝子移動に有用である。前者では、遺伝子は、（静脈内、腹腔内、エアロゾルなどで）、被験体に直接導入される。エキソビボ（またはインビトロ）遺伝子移動では、遺伝子は、個体の特定組織から細胞を除去した後、細胞に導入される。次いで、形質移入された細胞を被験体に戻して導入される。
【０００３】
インビボおよびエキソビボの遺伝子療法を達成する送達系には、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクターまたはアデノウイルスベクター）、微量注入、エレクトロポレーション、プロトプラストフュージョン、リン酸カルシウムおよびリポソームが挙げられる（Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１７（１９８７）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｓ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３）；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ，Ｒ．，ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２５８０−２５８５（１９９３））。
【０００４】
リポソームキャリアを使用する細胞への遺伝子物質の送達は、広く研究されている。一般に、リポソーム小胞は、エンドサイトーシスを介して細胞により吸収され、そしてリソソーム分解経路に入る。それゆえ、分解を回避するリポソームを設計することに向けたいくらかの試みがなされている。
【０００５】
リポソーム脂質二重層成分として、負荷電生体分子（例えば、オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡフラグメント）を送達するために、カチオン性脂質（例えば、ヘッド基を含む正荷電アンモニウムイオンまたはスルホニウムイオンを備えた糖脂質の誘導体）を使用することは、広く報告されている。この脂質の正荷電ヘッド基は、負荷電細胞表面と相互作用して、その生体分子の細胞への接触および送達を促進する。このカチオン性脂質の正電荷は、核酸の錯化にさらに重要である。
【０００６】
しかしながら、このようなカチオン性リポソーム／核酸複合体を全身に投与すると、それらが容易に肺に取り込まれる。この肺への局在化は、通常のカチオン性複合体の強力な正の表面電荷により引き起こされる。レポーター遺伝子を備えた通常のカチオン性複合体のインビボ遺伝子発現は、静脈内投与に続いて、肺、心臓、肝臓、腎臓および脾臓で実証されている。しかしながら、形態学的な検査により、その発現の大部分が肺の血管を裏打ちする内皮細胞にあることが明らかとなっている。この所見の説明としては、おそらく、静脈注射後にカチオン性リポソーム／核酸複合体が遭遇する最初の臓器が肺であることがある。さらに、肺には、大きな表面積の内皮細胞があり、これは、これらのカチオン性リポソーム／核酸複合体に容易にアクセスできる標的を提供する。
【０００７】
初期の結果は有望であるものの、簡単なカチオン性リポソームを静脈内注射しても、疾患（例えば、肺癌以外の固形腫瘍）の全身部位または臨床関連遺伝子発現（例えば、ｐ５３またはＨＳＶ−ｔｋ）の所望部位への遺伝子の送達に有用であるとは判明していない。カチオン性リポソームは、あまりに急速に取り除かれ、多くの安全性の問題が生じる。
【０００８】
他のアプローチには、リポソームに、ｐＨ感受性脂質（例えば、パルミトイルホモシステイン）を含有させることがある（Ｃｏｎｎｏｒ，Ｊ．，ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：１７１５（１９８４）；Ｃｈｕ，Ｃ．−Ｊ．ａｎｄ  Ｓｚｏｋａ，Ｆ．，Ｊ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．４（１）：３６１（１９９４））。このようなｐＨ感受性脂質は、中性ｐＨでは、負に荷電しており、リポソーム脂質二重層に安全に取り込まれる。しかしながら、弱酸性のｐＨ（ｐＨ＜６．８）では、この脂質は、電荷が中性となり、リポソーム二重層を不安定化するのに十分な構造に変わる。この脂質は、エンドソーム入ったリポソームに取り込まれたとき、そのｐＨが５．０〜６．０の間であると報告されている場合、不安定化して、リポソーム内容物の放出を引き起こす。
【０００９】
それに加えて、腫瘍細胞に向かう標的化は、血管形成内皮細胞標的化よりもずっと難しい。腫瘍血管系の血管形成内皮細胞が血液コンパートメントで直接露出されるので、リポソーム／ＤＮＡ複合体は、これらの細胞に比較的に容易にアクセスする。腫瘍細胞を標的化するために、リポソーム／ＤＮＡ複合体は、漏れやすい腫瘍血管を通って血管外遊出する必要があり、次いで、腫瘍細胞に到達できる。それゆえ、その複合体の安定性、サイズ、表面電荷、血液循環時間、および複合体の形質移入効率は、全て、腫瘍細胞の形質移入および発現の因子である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
従って、本発明の目的は、核酸を細胞に全身送達する組成物を提供することにある。
【００１１】
本発明の他の目的は、中性カチオン性脂質（遊離可能親水性重合体）を含有するリポソームを提供することにある。このリポソームは、核酸を細胞または組織に引き続いて送達するために、核酸と会合している。
【００１２】
従って、１局面では、本発明は、核酸投与用の組成物を包含し、該組成物は、以下を含有する：
（ａ）（ｉ）次式を有する脂質から構成されるリポソーム：
【００１３】
【化３】
2005514392.tif 000002
ここで、Ｒ１およびＲ２の各々は、８個〜２４個の間の炭素原子を有するアルキルまたはアルケニル鎖である；ｎ＝０〜２０である；Ｌは、（１）−Ｘ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｙ、（２）−Ｘ−（Ｃ＝Ｏ）−および（３）−Ｘからなる群から選択され、ここで、ＸおよびＹは、別個に、酸素、ＮＨおよび直接結合から選択される；Ｚは、弱塩基部分であり、該弱塩基部分は、約４．０より大きく７．４未満のｐＫを有する。
【００１４】
該リポソームはまた、（ｉｉ）以下の一般式を有する化合物から構成される：
【００１５】
【化４】
2005514392.tif 000003
ここで、Ｒ３は、親水性重合体であり、該親水性重合体は、そのジチオベンジル部分に結合する結合を含む；Ｒ４は、Ｈ、アルキルおよびアリールからなる群から選択される；Ｒ５は、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ７、Ｓ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ７およびＯ（Ｃ＝Ｓ）Ｒ７からなる群から選択される；Ｒ７は、アミン含有脂質を含む；そしてＲ６は、Ｈ、アルキルおよびアリールからなる群から選択される；ここで、ＣＨ２−Ｒ５の配向は、オルト位置およびパラ位置から選択される。
【００１６】
該リポソームはまた、（ｂ）該リポソームに会合した核酸を含有する。
【００１７】
１実施形態では、Ｘは、ＮＨであり、そしてＹは、酸素である。他の実施形態では、Ｌは、カルバメート結合、エステル結合またはカーボネート結合である。さらに他の実施形態では、Ｌは、ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏである。
【００１８】
他の実施形態では、Ｚは、イミダゾールである。さらに他の実施形態では、Ｚは、５．０〜６．５の間のｐＫ値を有する部分である。
【００１９】
前記リポソーム組成物は、１〜８０モルパーセントの間の前記脂質を、代表的には含有する。
【００２０】
他の実施形態では、Ｒ１およびＲ２の各々は、８個〜２４個の間の炭素原子を有する非分枝アルキルまたはアルケニル鎖である。例えば、Ｒ１およびＲ２の各々は、Ｃ１７Ｈ３５であり得る。
【００２１】
他の実施形態では、ｎは、１〜２０の間、または０〜１０の間、または１〜１０の間である。
【００２２】
さらに他の実施形態では、Ｒ６は、Ｈであり、そしてＲ４は、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５およびＣ３Ｈ８からなる群から選択される。他の実施形態では、Ｒ４およびＲ６は、アルキルである。
【００２３】
前記アミン含有脂質は、１実施形態では、単一炭化水素尾部または二重炭化水素尾部のいずれかを含む。他の実施形態では、前記アミン含有脂質は、二重炭化水素尾部を有するリン脂質である。
【００２４】
前記部分Ｒ３は、１実施形態では、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピル−メタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチル−アクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリアスパルトアミド、それらの共重合体、およびポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシドからなる群から選択される。
【００２５】
好ましい実施形態では、Ｒ３は、ポリエチレングリコールであり、Ｒ６は、Ｈであり、そしてＲ４は、ＣＨ３またはＣ２Ｈ５である。
【００２６】
典型的には、前記リポソームは、５〜２０モルパーセントの間の前記化合物を含有する。
【００２７】
前記リポソームは、核酸に会合していることに加えて、さらに、該リポソームに取り込まれた治療化合物を含有できることが分かる。前記核酸は、前記リポソームの少なくとも一部に取り込まれ得るか、またはリポソームと外見的には会合し得る。前記核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらのフラグメントおよびＤＮＡオリゴヌクレオチドもしくはＲＮＡオリゴヌクレオチドから選択される。
【００２８】
他の実施形態では、前記リポソームは、さらに、該リポソームを標的部位に標的化するリガンドを含有する。典型的には、該リガンドは、前記化合物上の前記親水性重合体Ｒ３の遠位末端に共有結合している。１実施形態では、前記リガンドは、内皮腫瘍細胞により内部移行するための該細胞に対する結合親和性を有する。代表的なリガンドには、以下のレセプターに結合するのに適当なリガンドが挙げられる：ＨＥＲ２／ｎｅｕ発癌遺伝子のｃ−ｅｒｂＢ−２タンパク質生成物用のレセプター、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）レセプター、塩基性線維芽細胞成長レセプター（塩基性ＦＧＦレセプター）、血管内皮成長因子レセプター、Ｅ−セレクチンレセプター、Ｌ−セレクチンレセプター、Ｐ−セレクチンレセプター、葉酸塩レセプター、ＣＤ４レセプター、ＣＤ１９レセプター、αβインテグリンレセプターおよびケモカインレセプター。好ましい実施形態では、前記リガンドは、ｈｅｒ２、ＦＧＦ、葉酸塩およびＥ−セレクチンである。前記リポソームは、１種類より多いリガンドを含有できることが分かる。
【００２９】
別の実施形態では、前記リポソームは、記載されるように、カチオン性脂質をさらに含有できることが分かる。
【００３０】
本発明のこれらの目的および他の目的ならびに特徴は、添付の図面と関連して、本発明の以下の詳細な説明を読むと、さらに十分に理解できる。
【００３１】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
以下の用語は、特に明記しない限り、以下の意味を有する。
【００３２】
本明細書中で使用する「中性」脂質とは、荷電されておらずイオン性を有しないものである。
【００３３】
「荷電」脂質とは、正または負に荷電してイオン性を有するものである。
【００３４】
「小疱形成脂質」とは、疎水性部分および極性ヘッド基部分を有する両親媒性脂質であって、リン脂質で例示されるように、水中で自然に二重層に形成できるか、脂質二重層に安定に取り込まれるものを意味し、これは、その内部と接触する親水性部分、その二重層膜の親水性領域、および膜の外部極性表面に向かって配向された極性ヘッド基部分を備えている。この種の小胞形成脂質は、典型的には、１個または２個の親水性アシル炭化水素鎖またはステロイド基を含み、その極性ヘッド基にて、化学反応性基（例えば、アミン、酸、エステル、アルデヒドまたはアルコール）を含有し得る。この種類には、リン脂質（例えば、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）およびスフィンゴミエリン（ＳＭ））が含まれ、この場合、それらの２個の炭化水素鎖は、典型的には、長さが約１４個〜２２個の間の炭素原子であり、不飽和度が変わる。また、用語「小疱形成脂質」の範囲内には、糖脂質（例えば、セレブロシドおよびガングリオシドならびにステロール（例えば、コレステロール））が含まれる。
【００３５】
「アルキル」とは、炭素および水素を含有する完全に飽和した一価ラジカルを意味し、これは、分枝または直鎖であり得る。アルキル基の例には、メチル、エチル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ヘプチルおよびイソプロピルがある。「低級アルキル」とは、メチル、エチル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチル、イソアミル、ｎ−ペンチルおよびイソペンチルで例示されるように、１個〜６個の炭素原子のアルキルラジカルを意味する。
【００３６】
「アルケニル」とは、炭素および水素を含有する一価ラジカルを意味し、これは、分枝または直鎖であり得、そして１個またはそれ以上の二重結合を含有する。
【００３７】
本明細書中で使用する「親水性重合体」とは、水溶性部分を有する重合体を意味し、この部分は、その重合体に、室温で、一定程度の水溶性を与える。代表的な親水性重合体には、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピル−メタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチル−アクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリアスパルトアミド、上で列挙した重合体の共重合体、およびポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシド共重合体が挙げられる。これらの重合体の多くの特性および反応は、米国特許第５，３９５，６１９号および第５，６３１，０１８号で記述されている。
【００３８】
「反応性官能基を含む重合体」または「結合用の結合を含む重合体」とは、典型的には（必ずしもそうではないが）、他の化合物と反応して共有結合を形成する末端基部分で変性された重合体を意味する。このような反応性官能基の部分を有するように重合体を官能化する反応スキームは、当業者に容易に決定されるか、および／または例えば、米国特許第５，６１３，０１８号または例えば、Ｚａｌｉｐｓｋｙら、Ｅｕｒ．Ｐｏｌｙｍｅｒ．Ｊ．，１９（１２）：１１７７−１１８３（１９８３）；Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，４（４）：２９６−２９９（１９９３）において記述されている。
【００３９】
「迅速開裂ＰＥＧ」とは、ｍＰＥＧ−ＤＴＢ−脂質であって、Ｒ４およびＲ６（以下のＩＩＢ節の構造を参照）が水素であるものを意味する。
【００４０】
「緩慢開裂可能ＰＥＧ」とは、ｍＰＥＧ−ＤＴＢ−脂質であって、そのジチオベンジル部分がＲ４および／またはＲ６（以下のＩＩＢ節の構造を参照）でアルキル部分に結合することにより妨害されたものを意味する。
【００４１】
「脂肪族ジスルフィド」結合とは、Ｒ’−Ｓ−Ｓ−Ｒ”の形状の結合を意味し、この場合、Ｒ’およびＲ”は、直鎖または分枝アルキル鎖であり、これは、さらに置換され得る。
【００４２】
略語：ＰＥＧ：ポリエチレングリコール；ｍＰＥＧ：メトキシ末端ポリエチレングリコール；Ｃｈｏｌ：コレステロール；ＰＣ：ホスファチジルコリン；ＰＨＰＣ：部分水素化ホスファチジルコリン；ＰＨＥＰＣ：部分水素化卵ホスファチジルコリン；ＰＨＳＰＣ：部分水素化大豆ホスファチジルコリン；ＤＳＰＥ：ジステアリルホスファチジルエタノールアミン；ＡＰＤ：１−アミノ−２，３−プロパンジオール；ＤＴＰＡ：ジエチレンテトラミン五酢酸；Ｂｎ：ベンジル；ＮＣＬ：中性カチオン性リポソーム；ＦＧＦ：線維芽細胞成長因子；ＨＤＳＧ；ヒスタミンジステアリルグリセロール；ＤＯＴＡＰ：１，２−ジオレイルオキシ−３−（トリメチルアミノ）プロパン；ＤＴＢ：ジチオベンジル；ＦＣ−ＰＥＧ：迅速開裂可能ＰＥＧ；ＳＣ−ＰＥＧ：緩慢開裂可能ＰＥＧ；ＤＤＡＢ：ジメチルジオクタデシルアンモニウム；ＧＣ３３：Ｎ２−［Ｎ２，Ｎ５−ビス（３−アミノプロピル）−Ｌ−オルミチル］−Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｌ−グルタミンテトラヒドロトリフルオロアセテート；ＥｔＤＴＢ、エチル−ジチオベンジル；ＤＯＰＥ、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン。
【００４３】
（ＩＩ．リポソーム成分）
１局面では、本発明は、リポソームおよび核酸から構成されたリポソーム組成物を包含する。これらのリポソームは、「カチオン性−中性脂質」、および遊離可能結合を介して親水性重合体で誘導体化した脂質である。これらのリポソーム成分は、今ここで記述する。
【００４４】
（Ａ．カチオン性−中性脂質）
本発明のリポソームに含まれるカチオン性−中性脂質は、一般に、以下の構造により表わされる脂質である：
【００４５】
【化５】
2005514392.tif 000004
ここで、Ｒ１およびＲ２の各々は、８個〜２４個の間の炭素原子を有するアルキルまたはアルケニル鎖である；ｎ＝１〜２０、好ましい実施形態では、１〜１０の間である；Ｌは、（ｉ）−Ｘ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｙ、（ｉｉ）−Ｘ−（Ｃ＝Ｏ）−および（ｉｉｉ）−Ｘからなる群から選択され、ここで、ＸおよびＹは、別個に、酸素、ＮＨおよび直接結合から選択される；そしてＺは、弱塩基性部分であり、該弱塩基部分は、約４．０より大きく７．４未満のｐＫを有する。
【００４６】
他の実施形態では、Ｚは、４．５〜７．０の間、さらに好ましくは、５〜６．５の間、最も好ましくは、５〜６の間のｐＫ値を有する部分である。
【００４７】
この弱塩基性部分Ｚは、７．４の生理学的ｐＨで主に（例えば、５０％より高く）電荷が中性であるが生理学的ｐＨより低い選択ｐＨ値で正電荷を有する傾向にある脂質である。一例として、好ましい実施形態では、Ｚは、イミダゾール部分であり、これは、約６．０のｐＫを有する。７．４の生理学的ｐＨでは、この部分は、主に中性であるが、６．０より低いｐＨ値では、その部分は、主に正電荷になる。本発明を支持して、以下で述べるように、イミダゾール部分を有する脂質を調製し、リポソームの調製で使用した。
【００４８】
イミダゾールに加えて、置換イミダゾールだけでなく、ベンズイミダゾールおよびナフトイミダゾールもまた、その置換がｐＫａを所望範囲外の値に変えない限り、上で示した構造内のＺ部分として、使用できる。適当な置換基は、典型的には、アルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アリール、ハロゲン、ハロアルキル、アミノおよびアミノアルキルが挙げられる。ｐＫが５．０〜６．０の範囲であると報告されたこのような化合物の例には、種々のメチル置換イミダゾールおよびベンズイミダゾール、ヒスタミン、ナフト［１，２−ｄ］イミダゾール、１Ｈ−ナフト［２，３−ｄ］イミダゾール、２−フェニルイミダゾール、２−ベンジルベンズイミダゾール、２，４−ジフェニル−１Ｈ−イミダゾール、４，５−ジフェニル−１Ｈ−イミダゾール、３−メチル−４（５）−クロロ−１Ｈ−イミダゾール、５（６）−フルオロ−１Ｈ−ベンズイミダゾールおよび５−クロロ−２−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾールが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
他の窒素含有ヘテロ芳香族化合物（例えば、ピリジン、キノリン、イソキノリン、ピリミジン、フェナントロリンおよびピラゾール）もまた、Ｚ基として使用できる。この場合もやはり、アルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アリール、ハロ、アルキル、アミノ、アミノアルキルおよびヒドロキシから選択される置換基を有する多くのこのような化合物は、所望範囲のｐＫを有することが報告されている。これらには、ピリジン類のうちで、２−ベンジルピリジン、種々のメチル−およびジメチルピリジンだけでなく、他の低級アルキルおよびヒドロキシルアルキルピリジン、３−アミノピリジン、４−（４−アミノフェニル）ピリジン，２−（２−メトキシエチル）ピリジン、２−（４−アミノフェニル）ピリジン、２−アミノ−４−クロロピリジン、４−（３−フラニル）ピリジン、４−ビニルピリジンおよび４，４’−ジアミノ−２，２’−ビピリジンが挙げられ、これらの全ては、５．０と６．０の間のｐＫを有することが報告されている。所望範囲のｐＫを有することが報告されているキノリノイド化合物には、３−，４−，５−，６−，７−および８−アミノイソキノリン、種々の低級アルキル−およびヒドロキシ−置換キノリンおよびイソキノリン、４−，５−，７−および８−イソキノリノール、５−，６−，７−および８−キノリノール、８−ヒドラジノキノリン、２−アミノ−４−メチルキナゾリン、１，２，３，４−テトラヒドロ−８−キノリノール、１，３−イソキノリンジアミン、２，４−キノリンジオール、５−アミノ−８−ヒドロキシキノリンおよびキヌクリジンが挙げられるが、これらに限定されない。また、所望範囲のｐＫを有するものには、いくつかのアミン置換ピリミジン、例えば、４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリミジン、４−（Ｎ−メチルアミノ）ピリミジン、４，５−ピリミジンジアミン、２−アミノ−４−メトキシピリミジン、２，４−ジアミノ−５−クロロピリミジン、４−アミノ−６−メチルピリミジン、４−アミノピリミジンおよび４，６−ピリミジンジアミンだけでなく、４，６−ピリミジンジオールがある。種々のフェナントロリン（例えば、１，１０−、１，８−、１，９−、２，８−、２，９−および３，７−フェナントロリン）は、それらの低級アルキル−、ヒドロキシル−およびアリール−置換した誘導体の大部分と同様に、所望範囲のｐＫを有する。使用され得るピラゾールには、４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール、４，５−ジヒドロ−４−メチル−３Ｈ−ピラゾール、１−ヒドロキシ−１Ｈ−ピラゾールおよび４−アミノピラゾールが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
多くの窒素含有芳香族化合物（例えば、アニリンおよびナフチルアミン）もまた、Ｚ基の適当な実施形態である。メチルまたは他の低級アルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、ヒドロキシル、追加アミン基、アミノアルキル、ハロゲンおよびハロアルキルから選択された基でさらに置換されたアニリンおよびナフチルアミンは、一般に、所望範囲のｐＫａを有すると報告されている。使用できる他のアミン置換芳香族化合物には、２−アミノフェナジン、２，３−ピラジンジアミン、４−および５−アミノアセナフテン、３−および４−アミノピリダジン、２−アミノ−４−メチルキナゾリン、５−アミノインダン、５−アミノインダゾール、３，３’，４，４’−ビフェニルテトラミンおよび１，２−および２，３−ジアミノアントラキノンが挙げられる。
【００５１】
Ｚの実施形態としては、ある種の非環式アミン化合物、例えば、Ｎ，Ｎ’−ジメチルグアニジンおよび種々の置換ヒドラジン類（例えば、トリメチルヒドラジン、テトラメチルヒドラジン、１−メチル−１−フェニルヒドラジン、１−ナフタレニルヒドラジンおよび２−、３−および４−メチルフェニルヒドラジン）があり、これらの全ては、４．５と７．０の間のｐＫａを有することが報告されている。この範囲のｐＫａを有する非環式化合物には、１−ピロリジンエタンアミン、１−ピペリジンエタンアミン、ヘキサメチレンテトラミンおよび１，５−ジアザビシクロ［３．３．３］ウンデカンが挙げられる。
【００５２】
また、上で示した構造内のＺ部分としては、以下で述べる図３Ｃ〜３Ｄに関して記述したように、ある種のアミノ糖が適切である。
【００５３】
上記リストは、４．５と７．０の間のｐＫａを有する化合物の例を示し、これらは、本発明の脂質結合体にて、ｐＨ応答性基として使用され得る；これらのリストは、限定であるとは解釈されない。選択した実施形態では、Ｚ基は、インダゾール、アニリン、アミノ糖またはそれらの誘導体である。好ましくは、Ｚ基の有効ｐＫａは、その脂質基との結合により著しく影響を受けない。連結した結合体の例は、以下で示す。
【００５４】
本発明の脂質は、中性結合Ｌを含み、これは、Ｚ部分および脂質尾部を接合する。結合Ｌは、可変であり、好ましい実施形態では、カルバメート、エステル、アミド、カーボネート、尿素、アミンおよびエーテルから選択される。本発明を支持して調製した好ましい脂質では、カルバメート結合（ここで、Ｌは、−Ｘ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｙであり、Ｘは、ＮＨであり、そしてＹは、酸素である）を調製した。
【００５５】
この脂質の尾部では、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なり、８個〜２４個の間の炭素原子を有する非分枝のアルキル鎖またはアルケニル鎖であり得る。さらに好ましくは、Ｒ１基およびＲ２基は、長さが１２個〜２２個の間の炭素原子であり、Ｒ１＝Ｒ２＝Ｃ１７Ｈ３５（この基がステアリル基であるように）またはＲ１＝Ｒ２＝Ｃ１７Ｈ３３（この基がオレオイル基であるように）である。
【００５６】
本発明の脂質は、標準的な合成方法を使用して調製できる。上述のように、本発明を支持して実行した研究では、上で示した構造を有する脂質（ここで、Ｚは、イミダゾールであり、Ｎ＝２であり、Ｌは、カルバメートであり、そしてＲ１＝Ｒ２＝Ｃ１７Ｈ３５である）を調製した。代表的な脂質を調製する反応スキームは、図１で図示しており、その合成の詳細は、実施例１で提供する。要約すると、１，２−ジステアロイルグリセロール（化合物ＩＩＩ）の炭酸パラ−ニトロフェニルを、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロール（化合物Ｉ）およびクロロギ酸パラ−ニトロフェニル（化合物ＩＩ）から調製し、そしてヒスチジン（化合物ＩＶ）と反応させて、カルバメート結合を介してジステアリル尾部に連結したイミダゾール部分を有する脂質（化合物Ｖ）を得た。１−アミノ−２，３−プロパンジオールの代わりにグリセロールを使用する類似の経路は、カーボネート連結生成物（Ｌ＝−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−）を生成するのに使用できる。
【００５７】
他の結合を有する脂質の調製は、通常の方法を使用して、当業者に容易に行われる。他の結合には、エーテル（Ｌ＝−Ｏ−ＣＨ２−）およびエステル結合（Ｌ＝−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−）だけでなく、尿素、アミドおよびアミン結合（すなわち、ここで、Ｌ＝−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）または−ＮＨ−である）が挙げられる。ケト結合（ここで、Ｘは、直接結合である）もまた、可能である。図２Ａ〜２Ｂは、アミン連結脂質（図２Ａ）およびＮＨ−含有結合を有する脂質（図２Ｂ）の調製を図示している。図２Ａでは、ヒスタミンの末端アミンは、グリシジルクロライドと反応され、得られたエポキシドは、加水分解され、得られたジオールは、アシル化される。
【００５８】
図２Ｂでは、ＮＨ−含有結合を有する脂質は、例えば、図示しているように、ヒスタミンとグリセリン酸アセトニド（２，２−ジメチル−１，３−ジオキサラン−４−カルボン酸）またはその４炭素同族体である２，２−ジメチル−１，３−ジオキサラン−４−酢酸の活性化誘導体と反応させることにより、調製される。このジオールは、次いで、脱保護されアシル化される。
【００５９】
図２Ｃおよび２Ｄは、本発明に従ってｐＨ−応答性脂質を調製する他の反応スキームを示す。図２Ｃでは、４−ニトロ安息香酸は、１−アミノ−２，３−プロパンジオールで縮合されて、アミド結合を生じる；このジオールは、アシル化され、そのニトロ基は、アミンに還元されて、その生成物である脂質−アニリン結合体を生じる。図２Ｄでは、その初期縮合反応は、アルコール（ジアシルグリセロール）とイソシアネートとの間であり、その生成物中でカルバメート結合を生じる。
【００６０】
図３Ａ〜３Ｄは、本発明によるｐＨ−応答性脂質の種々の構造を示し、ここで、図３Ａ〜３Ｂは、その「Ｚ」部分として芳香族アミンを有するさらに別の脂質を示し、また、図３Ｃ〜３Ｄは、アミノ糖を結合した脂質を示す。これらの脂質の合成は、市販の出発物質を使用して、当業者に容易に実行できる。例えば、図３Ａの生成物は、臭化ｍ−ニトロベンジルとジアシルグリセロールとが反応してエーテル結合が生じ、続いて、そのニトロ基を還元することにより、調製され得る。図３Ｂの生成物は、そのジオールをアシル化してニトロ基を還元することにより、市販の（２−ニトロフェニル）−１，２−エタンジオールから調製される。図３Ｃで示したアミノ糖−脂質結合体を調製するために、Ｄ−グルコース（フラノース形状）は、アセトン２分子と反応することにより保護され、その遊離水酸基は、ＴｓＣｌ、アジ化ナトリウムおよびヨウ素と連続的に反応されて、中間体ニトロ化合物を生じる。この環外ジオールは、脱保護されアシル化され、そのニトロ基は、アミンに還元される。図３Ｄの化合物は、Ｄ−ガラクトースから、類似の様式で調製できる。
【００６１】
好ましい実施形態では、このｐＨ−依存性脂質は、ヒスタミン−ジステアロイルグリセロール（ＨＤＳＧ）である。ヒスタミンのイミダゾールは、６のｐＫａを有する。ＨＤＳＧは、生理学的ｐＨ（ｐＨ７．４）で中性である傾向にあり、また、６より低いｐＨで、主に、正に荷電している。
【００６２】
ＨＤＳＧを取り込んだリポソームは、通常のカチオン性リポソームと類似して、約ｐＨ４〜５で、ＤＮＡをカプセル化する。このＨＤＳＧリポソーム／複合体の表面電荷は、血流中にて、生理学的ｐＨで、低下される。ＨＤＳＧの表面電荷は、主に、それらの複合体とリソソーム膜との間の相互作用および核酸内容物の細胞質への放出を促進するために、ｐＨ５〜６（エンドソームおよびリソソームでのコンセンサスｐＨ）で、正電荷である。
【００６３】
（Ｂ．脂質−ＤＴＢ−重合体）
本発明のリポソームはまた、遊離可能結合（例えば、ジチオベンジル部分）を介して親水性重合体で誘導体化した脂質を含む。この脂質−重合体成分は、以下の一般構造を有する：
【００６４】
【化６】
2005514392.tif 000005
ここで、Ｒ３は、その重合体をジチオベンジル部分に共有結合するのに適当な官能基を含む親水性重合体を含有する。Ｒ４およびＲ６は、別個に、Ｈ、アルキルまたはアリールであるように選択され、そしてジスルフィド開裂速度を合わせるように、変えることができる。例えば、より速い開裂速度を得るためには、Ｒ４およびＲ６は、水素である。より遅い開裂速度は、Ｒ４およびＲ６の一方または両方についてアルキルまたはアリールを選択することによって、そのジスルフィドを立体的に妨害することにより、得られる。Ｒ５は、Ｒ７に接合される連結部分を含み、これは、アミン含有脂質を含む。この連結部分は、好ましい実施形態では、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）、Ｓ（Ｃ＝Ｏ）またはＯ（Ｃ＝Ｏ）である。このアミン含有脂質Ｒ７は、第一級または第二級アミンであり得、そして任意数の脂質（下記のものを含めて）から選択できる。ＣＨ２−Ｒ５基の配向は、オルトまたはパラのいずれかであり得る。
【００６５】
このアミン含有脂質Ｒ７は、典型的には、水不溶性分子であり、これは、少なくとも約８個の炭素原子を含有する少なくとも１個のアシル鎖、さらに好ましくは、約８個〜２４個の間の炭素原子を含有するアシル鎖を有する。好ましい脂質は、アミン含有極性ヘッド基およびアシル鎖を有する脂質である。代表的な脂質は、単一アシル鎖（例えば、ステアロイルアミン）または２個のアシル鎖を有するリン脂質である。アミン含有ヘッド基を備えた好ましいリン脂質には、ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルセリンが挙げられる。その脂質尾部は、約１２個〜約２４個の間の炭素原子を有し得、そして完全に飽和または不飽和であり得る。１つの好ましい脂質は、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）であるが、しかしながら、当業者は、この記述の範囲内入る広範囲の脂質を認識している。また、この脂質は、天然には、アミン基を含有できるか、アミン基を含有するように誘導体化できることが分かる。アシル尾部を有さない他の脂質部分（例えば、コレステロールアミン）もまた、適当である。
【００６６】
重合体−ＤＴＢ−脂質化合物の合成は、図４で概略的に描写されている。メトキシカルボニルジチオアルキル末端基を有するｍＰＥＧ誘導体（ＭＷ  ２０００および５０００ダルトン）は、２−（メトキシカルボニルジチオ）エタンアミンをクロロギ酸ｍＰＥＧ（これは、乾燥ｍＰＥＧ−ＯＨ溶液のホスゲン化により、容易に調製した）と反応させることにより、調製した（Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．，ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５：１００−１１４（１９９２））。前者の化合物は、公開された手順（Ｂｒｏｉｓ，Ｓ．Ｊ．，ら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９２：７６２９−７６３１（１９７０）；Ｋｏｎｅｋｏ，Ｔ．，ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２：１３３−１４１（１９９１））に従って、等量のメトキシカルボニルスルフェニルクロライドとの２−アミノエタンチオール塩酸塩反応により、得た。メルカプトベンジルアルコールのパラおよびオルト異性体の両方（Ｇｒｉｃｅ，Ｒ．，ら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９４７−１９５４（１９６３））は、得られたＰＥＧ−連結アシルジスルフィドとうまくカップリングされて、ジチオベンジルアルコール末端基を有するｍＰＥＧを得た。非誘導体化ｍＰＥＧ−ＯＨと同様に、活性カーボネート導入が進行して、その炭酸パラ−ニトロフェニルを得た。エタノールアミン中のＤＳＰＥを加えると、所望のｍＰＥＧ−ＤＴＢ−ＤＳＰＥ生成物が形成された。オルトおよびパラ−ＤＴＢ−脂質化合物の両方が調製され、シリカゲルクロマトグラフィーで精製され、そしてＮＭＲおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで特性付けた（それらの詳細は、実施例２で示す）。
【００６７】
図５は、ｍＰＥＧ−ＤＴＢ−ＤＳＰＥ結合体のチオール分解開裂の機構を示す。開裂すると、このホスファチジルエタノールアミン脂質は、その天然の未変性形状で、再生される。
【００６８】
図６Ａ〜６Ｂは、ジスルフィド結合（例えば、より障害のあるジスルフィド結合）に隣接したアルキル基を有するｍＰＥＧ−ＤＴＢ−ＤＳＰＥ結合体の合成の反応スキームを示す。実施例３Ａでさらに詳細に記述するように、ｍＰＥＧ−ＯＨは、ジクロロメタン中にて、トリエチルアミン（ＴＥＡ）の存在下で、クロロギ酸ｐ−ニトロフェニルと反応されて、炭酸ｍＰＥＧ−ニトロフェニルを形成した。アミノアルコール（例えば、１−アミノ−２−プロパノールまたは１−アミノ−２−ブタノール）は、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中にて、ＴＥＡの存在下で、この炭酸ｍＰＥＧ−ニトロフェニルと反応されて、ＰＥＧに結合した第二級アルコールを形成した。この第二級アルコールは、次いで、図６Ａで図示され実施例３Ａで詳述するように、所望のｍＰＥＧ−ＤＴＢ−ＤＳＰＥに変換された。
【００６９】
この反応スキームでは、クロロギ酸ｍＰＥＧ−メチル−ジチオベンジル−ニトロフェニルは、ＤＳＰＥと反応されて、所望化合物を形成した。このクロロギ酸ｍＰＥＧ−メチル−ジチオベンジル−ニトロフェニル化合物のクロロギ酸ニトロフェニル部分は、脱離基として作用して、選択した脂質と反応すると、所望生成物を生じる。この化合物はまた、ｍＰＥＧ−メチル−ジチオベンジル−Ｒ３のような化合物（ここで、Ｒ３は、連結部分を介してベンゼン環に結合した脱離基を表わす）と反応することにより、生成できる。この脱離基は、反応すると、アミン含有リガンド（例えば、ＤＳＰＥ、ポリペプチドまたはアミン含有薬剤）で置き換えられる。この脱離基は、そのリガンド中のアミンの反応性に従って選択され、好ましくは、ヒドロキシまたはオキシ含有脱離基を有する種々の酸性アルコールから誘導される。これらには、塩化物、ｐ−ニトロフェノール、ｏ−ニトロフェノール、Ｎ−ヒドロキシ−テトラヒドロフタルイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシ−グルタルイミド、Ｎ−ヒドロキシノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、３−ヒドロキシピリジン、４−ヒドロキシピリジン、２−ヒドロキシピリジン、１−ヒドロキシ−６−トリフルオロメチルベンゾトリアゾール、イミダゾール、トリアゾール、Ｎ−メチル−イミダゾール、ペンタフルオロフェノール、トリフルオロフェノールおよびトリクロロフェノールが挙げられる。
【００７０】
図３Ｂは、ｍＰＥＧ−ＥｔＤＴＢ−脂質結合体の調製を記述しており、ここで、そのジスルフィド結合は、エチル部分で妨害される。
【００７１】
図７は、本発明に従ってｍＰＥＧ−ＤＴＢ−リガンド化合物を調製する他の合成反応スキームを示す。その反応手順の詳細は、図４Ａ〜４Ｂで示されている。要約すると、冷１−アミノ−２−プロパノールは、硫酸と反応されて、硫酸２−アミノ−１−メチルエチル水素を形成した。この生成物は、水性エタノール中にて、二硫化炭素および水酸化ナトリウムと反応されて、５−メチルチアゾリジン−２−チオンを生じた。この５−メチルチアゾリジン−２−チオンに塩酸水溶液を加え、加熱した。１週間還流した後、その生成物である１−メルカプト（メチル）エチルアンモニウムクロライドが結晶化され、そして回収された。この生成物は、メトキシカルボニルスルフェニルクロライドと反応されて、２−（メトキシカルボニルジチオ）エタンアミンが得られた。図４に関して上で記述した手順を使用して、この２−（メトキシカルボニルジチオ）エタンアミンをクロロギ酸ｍＰＥＧ−と反応させると、選択したアミン含有脂質との反応に適当な所望のｍＰＥＧ−ＤＴＢ−ニトロフェニル化合物を生じる。
【００７２】
実施例４Ｂは、ｍＰＥＧ−（エチル）ＤＴＢ−ニトロフェニルを合成する反応を記述している。
【００７３】
図８Ａは、本発明に従って他のｍＰＥＧ−ＤＴＢ−脂質化合物を調製する反応スキームを示す。この反応の詳細は、実施例５で提供されている。脂質１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロールは、ｍＰＥＧ−ＤＴＢ−ニトロフェニル（これは、図６Ａまたは図７で記述したように調製した）との反応のために、活性化される。得られたｍＰＥＧ−ＤＴＢ−脂質は、ホスフェートヘッド基が存在しない点で、上記化合物とは異なる。図８ＡのｍＰＥＧ−ＤＴＢ−脂質は、開裂前には、中性である。図８Ｂで示すように、そのジスルフィド結合をチオール分解還元すると、その化合物は、分解して、カチオン性脂質を生じる。この正に荷電した脂質は、インビボでの静電相互作用およびインビボ標的化での相応の利点を与える。
【００７４】
上記反応スキームでは、請求化合物のＲ６は、Ｈである。しかしながら、他の実施形態では、Ｒ６は、アルキルまたはアリール部分である。このアプローチでは、例えば、Ｒ４およびＲ６が共にＣＨ３部分である場合、α，β−不飽和アシルクロライド（Ｒ’Ｒ”Ｃ＝ＣＨＣＯＣｌであって、ここで、Ｒ’は、例えば、ＣＨ３であり、そしてＲ”は、ＣＨ３であるが、しかしながら、任意のアルキルまたはアリールが考慮される）は、アミン末端ＰＥＧと反応されて、対応するＮ−ＰＥＧ−置換したα，β−不飽和アミドを生じる。この化合物は、チオール酢酸と反応されて、そのＣ＝Ｃ結合への共役付加を介して、対応するＮ−ＰＥＧ−置換β−（アセチルチオ）アミドが得られる。このアセチルチオ基（−ＳＣＯＣＨ３）は、チオール基（−ＳＨ）に加水分解され、これは、次いで、ギ酸メチル（クロロスルフェニル）（ＣｌＳＣＯＯＣＨ３）と反応され、メトキシカルボニルジチオ基（−ＳＳＣＯＯＣＨ３）が生じる；この中間体は、次いで、ｐ−メルカプトベンジルアルコールと反応されて、Ｎ−ＰＥＧ−置換β−（ジチオベンジルアルコール）アミド（これは、ＰＥＧ−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２ＣＲ’Ｒ”−ＳＳ−ｐ−フェニル−ＣＨ２ＯＨの構造を有する）を生じる。そのベンジルアルコール部分は、次いで、上記のように、クロロギ酸ニトロフェニルと反応されて、ニトロフェニルカーボネート脱離基を生じる。
【００７５】
下記のように、このカチオン性−中性脂質および重合体−ＤＴＢ−脂質から構成されたリポソームは、本発明を支持した研究で調製された。
【００７６】
（Ｃ．核酸）
本発明の好ましい実施形態において、上記脂質から形成されるリポソームは、核酸と会合する。「会合する」とは、治療剤（例えば、核酸）が、リポソームの中心要素および／または脂質二重膜空間にトラップされるか、外部リポソーム表面と会合するか、あるいはリポソームの内部にトラップされ、かつ外側でリポソームと会合する両方であることを意味する。治療剤は、核酸または薬物化合物であり得ることが理解される。薬物化合物は、リポソーム中にトラップされ、そして核酸は、外側でリポソームに会合し得ること、またはその逆もまた、理解される。
【００７７】
本発明の好ましい実施形態において、核酸は、リポソームと会合する。この核酸は、種々のＤＮＡベースの核酸およびＲＮＡベースの核酸（これらのフラグメントおよびアナログが挙げられる）から選択され得る。種々の条件の処置のための種々の遺伝子が記載されており、そして目的の特定の遺伝子に対するコード配列は、ＤＮＡ配列データバンク（例えば、ＧｅｎＢａｎｋまたはＥＭＢＬ）から検索され得る。例えば、ウイルス性、悪性または炎症性の疾患および状態（例えば、嚢胞性線維症、アデノシンデアミナーゼ欠損、およびＡＩＤＳ）を処置するためのポリヌクレオチドが記載されている。腫瘍サプレッサ遺伝子（例えば、ＡＰＣ、ＤＰＣ４、ＮＦ−１、ＮＦ−２、ＭＴＳ１、ＲＢ、ｐ５３、ＷＴ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、およびＶＨＬ）の投与による癌の処置が、企図される。
【００７８】
示される状態の処置のための特定の核酸の例としては、以下が挙げられる：ＨＬＡ−Ｂ７、腫瘍、結腸直腸癌腫、黒色腫；ＩＬ−２、癌、特に、乳癌、肺癌、および腫瘍；ＩＬ−４、癌；ＴＮＦ、癌；ＩＧＦ−１アンチセンス、脳腫瘍；ＩＦＮ、神経芽細胞腫；ＧＭ−ＣＳＦ、腎細胞癌；ＭＤＲ−１、癌、特に、進行した癌、乳癌および卵巣癌；ならびにＨＳＶチミジンキナーゼ、脳腫瘍、頭部および頸部の腫瘍、中皮腫、卵巣癌。
【００７９】
ポリヌクレオチドは、その標的（通常、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはｍＲＮＡ前駆体）に相補的な配列からなる、アンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドであり得る。ｍＲＮＡは、機能的な（すなわち、センス）方向で、遺伝情報を含み、そしてアンチセンスオリゴヌクレオチドの結合は、意図されるｍＲＮＡを不活性化し、そしてそのタンパク質への翻訳を防止する。このようなアンチセンス分子は、生化学的実験に基づいて決定され、タンパク質が、特定のＲＮＡから翻訳されることを示し、そして、一旦、ＲＮＡの配列が既知になると、相補的なワトソン−クリック塩基対合を介してそのＲＮＡに結合するアンチセンス分子が設計され得る。このようなアンチセンス分子は、代表的に、１０〜３０の間の塩基対、より好ましくは、１０〜２５の間の塩基対、そして最も好ましくは、１５〜２０の間の塩基対を含む。
【００８０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ加水分解に対する改善された耐性のために改変され得、そしてこのようなアナログとしては、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホジエステルおよびｐ−エトキシオリゴヌクレオチドが挙げられる（ＷＯ９７／０７７８４）。
【００８１】
トラップされる薬剤はまた、リボザイム、ＤＮＡｚｙｍｅ、または触媒ＲＮＡであり得る。
【００８２】
核酸または遺伝子は、別の実施形態において、プラスミド（好ましくは、５〜４０ｋｂｐ（キロ塩基対）の範囲のサイズを好ましくは有する、環化したかまたは閉じた二本鎖分子であるプラスミド）に挿入され得る。このようなプラスミドは、周知の方法に従って構築され、そして治療剤（すなわち、適切なプロモーターおよびエンハンサーの制御下で遺伝子療法において発現される遺伝子）、ならびに宿主細胞内での複製および／または宿主細胞ゲノムへの取り込みのために必要な他のエレメントを含む。遺伝子療法のために有用なプラスミドを調製するための方法は、広く公知であり、そして参照される。
【００８３】
ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、他の核酸（例えば、ＤＮＡプラスミド）は、脂質フィルムの水和の間の受動的トラップによって、リポソームにトラップされ得る。ポリヌクレオチドをトラップするための他の手順としては、核酸を単一分子の形態に縮合することが挙げられ、ここで、この核酸は、この核酸を小さい粒子に縮合させるために効果的な条件下で、硫酸プロタミン、スペルミン、スペルミジン、ヒストン、リジン、これらの混合物、または他の適切なポリカチオン性縮合剤を含有する水性媒体中に懸濁される。縮合した核酸分子の溶液は、乾燥した脂質フィルムを再水和して、トラップされた形態の縮合核酸を有するリポソームを形成する。
【００８４】
（Ｄ．標的化リガンド）
リポソームは、特定の細胞集団に対する所望の標的結合特性を達成するために、必要に応じて、表面基（例えば、抗体または抗体フラグメント、細胞表面レセプターと相互作用するための小さいエフェクター分子、抗原、および他の類似の化合物）を含むように調製され得る。このようなリガンドは、リポソーム脂質に、標的分子で誘導体化された脂質、または予め形成されたリポソームにおいて標的分子で誘導体化され得る、極性ヘッド化学基を有する脂質を含めることによって、リポソームに含まれ得る。あるいは、標的化部分は、予め形成されたリポソームをリガンド−ポリマー−脂質結合体と共にインキュベートすることによって、予め形成されたリポソーム内に挿入され得る。
【００８５】
脂質は、リガンドを、親水性ポリマー鎖（これは、その近位端において、小胞形成脂質に付着する）の遠位自由端に共有結合させることによって、標的化リガンドで誘導体化され得る。選択された親水性ポリマーを選択された脂質に付着させ、そしてポリマーの遊離した、付着していない末端を、選択されたリガンドとの反応のために活性化させるための、広範な種々の技術が存在し、そして具体的には、親水性ポリマーであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が、広範に研究されている（Ａｌｌｅｎ，Ｔ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃｉａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １２３７：９９−１０８（１９９５）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，４（４）：２９６−２９９（１９９３）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３５３：７１−７４（１９９４）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７０５−７０８（１９９５）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．，ＳＴＥＡＬＴＨ  ＬＩＰＯＳＯＭＥＳ（Ｄ．ＬａｓｓｉｃおよびＦ．Ｍａｒｔｉｎ編）第９章、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９９５））。
【００８６】
標的化リガンドは、当業者に周知であり、そして本発明の好ましい実施形態において、リガンドは、内皮腫瘍細胞に対する結合親和性を有するリガンドであり、そしてより好ましくは、細胞によって内在化されている。このようなリガンドは、しばしば、増殖因子レセプターの細胞外ドメインに結合する。例示的なレセプターとしては、ＨＥＲ２／ｎｅｕ癌遺伝子、上皮増殖因子（ＥＧＦ）レセプター、塩基性線維芽細胞増殖レセプター（塩基性ＦＧＦ）レセプターおよび脈管内皮増殖因子レセプター、Ｅ−セレクチンレセプター、Ｌ−セレクチンレセプターおよびＰ−セレクチンレセプター、葉酸レセプター、ＣＤ４レセプター、ＣＤ１９レセプター、αβインテグリンレセプターおよびケモカインレセプターの、ｃ−ｅｒｂＢ−２タンパク質産物が挙げられる。
【００８７】
（ＩＩＩ．組成物の調製）
（Ａ．リポソーム成分）
上記脂質（すなわち、カチオン性−中性脂質およびポリマー−ＤＴＢ−脂質）を含むリポソームは、種々の技術（例えば、Ｓｚｏｋａ，Ｆ．Ｊｒ．ら、Ａｎｎ，Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７（１９８０）に記載される技術）によって調製され得、そして本発明を支持して調製されるリポソームの具体的な例が、以下に記載される。代表的に、リポソームは、多重ラメラ小胞（ＭＬＶ）であり、これは、単純な脂質フィルム水和技術によって形成され得る。この手順において、以下に詳述される型のリポソーム形成脂質の混合物が、適切な有機溶媒に溶解され、次いで、これが容器内でエバポレートされて、薄膜を形成する。次いで、この脂質フィルムは、水性媒体で覆われ、水和して、代表的に約０．１〜１０ミクロンの間のサイズを有するＭＳＶを形成する。
【００８８】
本発明の組成物において使用するためのリポソームは、（ｉ）中性−カチオン性脂質および（ｉｉ）ＤＴＢ結合を介して親水性ポリマーに共有結合する脂質を含有する。リポソームはまた、他の成分（例えば、小胞形成脂質またはリポソーム脂質二重膜に安定に組み込まれる脂質（例えば、ジアシルグリセロール、リソ−リン脂質、脂肪酸、糖脂質、セレブロシドおよびステロール（例えば、コレステロール）））を含有し得る。
【００８９】
代表的に、リポソームは、約１０〜９０モル％の間の中性−カチオン性脂質、より好ましくは、約２０〜８０モル％の間、そしてなおより好ましくは、約３０〜７０モル％の間の中性−カチオン性脂質から構成される。ポリマー−ＤＴＢ−脂質は、代表的に、約１〜２０の間のモル％、より好ましくは、約２〜１５モル％の間、そしてなおより好ましくは、約４〜１２モル％の間で含まれる。本発明を支持して実施される研究（以下に記載される）において、リポソームは、６０モル％の中性−カチオン性脂質および５モル％のポリマー−ＤＴＢ−脂質から構成される。
【００９０】
本発明に従って調製されるリポソームは、選択されるサイズの範囲内（代表的に、約０．０１〜０．５ミクロンの間、より好ましくは、０．０３から０．４０ミクロンの間）で実質的に均質なサイズを有するようなサイズにされ得る。ＲＥＶおよびＭＬＶのための効果的なサイズ決め方法は、リポソームの水性懸濁液を、選択された均質な穴サイズ（０．０３〜０．２ミクロンの範囲、代表的に、０．０５ミクロン、０．０８ミクロン、０．１ミクロン、または０．２ミクロンを有する一連のポリカーボネート膜を通して押し出すことを包含する。この膜の穴サイズは、この膜を通して押し出すことによって生成されるリポソームの最大のサイズにおよそ対応する（特に、調製物が同じ膜を通して２回以上押し出される場合）。均質化方法もまた、リポソームのサイズを１００ｎｍ以下のサイズに減少させるために有用である（Ｍａｒｔｉｎ，Ｆ．Ｊ．，ＳＰＥＣＩＡＬＩＺＥＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ−ＭＡＮＵＦＡＣＴＵＲＩＮＧ  ＡＮＤ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，（Ｐ．Ｔｙｌｅ編）、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２６７−３１６頁（１９９０））。
【００９１】
（Ｂ．例示的な組成物の調製および特徴付け）
本発明を支持して実施される研究において、ＣＭＶプロモーターを有するｐＮＳＬルシフェラーゼ血漿ＤＮＡが、中性−カチオン性脂質およびポリマー−ＤＴＢ−脂質から構成されるリポソーム中にトラップされた。複合体の標的は、葉酸またはＦＧＦのいずれかを標的化リガンドとして含めることによって、達成された。代表的に、標的化リガンドは、当該分野において公知であり、そして例えば、米国特許第６，１８０，１３４号に記載される、従来の化学技術に従って、ポリマー−ＤＴＢ−脂質結合体のＰＥＧ鎖の遠位端に共有結合された。
【００９２】
実施例７は、Ｌｅｗｉｓ肺癌腫細胞腫瘍を保有するマウスに投与するための、処方物番号（７−１）、（７−２）、（７−３）、（７−４）、および（７−５）の調製を記載する。処方物番号２および３は、図１において上に記載される中性カチオン性脂質（化合物Ｖ）および図４に記載されるｍＰＥＧ−ＤＴＢ−脂質を含み、ここで、Ｒは、Ｈであった（本明細書中で、「ＦＣ  ＰＥＧ」または「迅速切断可能ＰＥＧ」ともまた称される）。この処方物はまた、ＦＧＦ標的化リガンドを含む。処方物番号１、４および５は、比較コントロールとして働く。
【００９３】
リポソーム−ＤＮＡ複合体は、試験マウスに静脈内投与された。２４時間後、腫瘍組織および他の組織を収集し、そしてルシフェラーゼ発現について分析した。これらの結果を、表１に示す。
【００９４】
【表１】
2005514392.tif 000006
ＤＤＡＢからなるリポソーム（処方物番号５）（これは、カチオン性リポソームである）についての、肺におけるルシフェラーゼ発現は、他の処方物よりほぼ１００倍高い。このことは、肺における大きい表面積および正に荷電したプラスミド−リポソーム複合体と負に荷電した肺中の内皮細胞表面との間の、静電荷相互作用に起因する。カチオン性脂質よりむしろ中性−カチオン性脂質が使用される、本発明によるリポソーム組成物は、この問題を克服する。処方物１〜４は、全て、ＨＤＳＧ中性−カチオン性脂質（図１の化合物Ｖ）を含む。脂質は、生理学的ｐＨ（７．４）において中性であるので、リポソームは、肺の表面に固着せず、これらのリポソームが全身に分布することを可能にする。この改善された生体分布は、処方物１および２について、腫瘍組織における、より高いルシフェラーゼ発現に反映される。
【００９５】
実施例８〜１２は、本発明を支持して実施される、他の研究を記載し、ここで、ＦＧＦ標的化リポソーム／ＤＮＡ複合体は、Ｌｅｗｉｓ肺腫瘍を接種されたマウス、またはＭａｔｒｉｇｅｌ（腫瘍脈管標的化のためのＦＧＦ脈管形成内皮細胞モデル）を注射されたマウスに投与された。これらの研究において、本発明によるリポソームは、中性−カチオン性脂質ＨＤＳＧ（図１の化合物Ｖ）およびコレステロールまたはＰＨＳＰＣのいずれかから構成された。ＰＥＧ−ＤＴＢ−脂質もまた、本発明による処方物に含まれた。カチオン性脂質もまた、複合体安定性およびトランスフェクション効率に対するカチオン性脂質の影響を決定するために、複合体に含まれた。２つのカチオン性脂質（ＤＯＴＡＰおよびＮ２−［Ｎ２，Ｎ５−ビス（３−アミノプロピル）−Ｌ−オルミチル］−Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｌ−グルタミンテトラヒドロトリフルオロアセテート（本明細書中で「ＧＣ３３」と称する）が利用された。
【００９６】
この処方物を、腫瘍保有マウスまたはＭａｔｒｉｇｅｌ保有マウスに静脈内投与し、そしてルシフェラーゼ発現を、Ｍａｔｒｉｇｅｌまたは腫瘍において、肺で、および肝臓で、投与の２４時間後に測定した。１つの研究（実施例１０）において、腫瘍細胞およびＭａｔｒｉｇｅｌは、同じマウスに反対側の側腹部で移植された。これらの結果を、表２〜６に示す。
【００９７】
【表２】
2005514392.tif 000007
【００９８】
【表３】
2005514392.tif 000008
【００９９】
【表４】
2005514392.tif 000009
【０１００】
【表５】
2005514392.tif 000010
【０１０１】
【表６】
2005514392.tif 000011
１発現を、処方物番号１２−１、１２−３および１２−５のリポソーム投与の２４時間後、ならびに処方物番号１２−２および１２−４の投与の５日後に測定した。
【０１０２】
表２〜６のデータは、従来のカチオン性脂質よりむしろ、ＨＤＳＧ中性−カチオン性脂質を使用することにより、ＤＮＡ−リポソーム複合体の拡張した生体分布が達成されることを示す。この特徴は、例えば、処方物番号９−１および９−２について、肺および腫瘍におけるルシフェラーゼ発現を比較することによって、見られ得る。この増強された生体分布は、処方物番号１０−１および１０−２についての結果が比較される場合に見られるように、中性カチオン性脂質が、カチオン性リポソームが中性−カチオン性脂質に加えて存在する場合でさえも、リポソーム中に含まれた場合に達成された。
【０１０３】
インビボ遺伝子発現に対するＦＧＦ標的化リガンドの効果は、処方物番号９−２を処方物番号９−３と比較し、そして処方物番号９−５を処方物番号９−６と比較し、そして処方物番号１０−３を処方物番号１０−４と比較することによって、見られ得る。これらの処方物において、ルシフェラーゼ発現は、複合体がＦＧＦ標的化リガンドを含む場合に、より高く、そして時々、有意により高かった。
【０１０４】
処方物番号９−７、９−８、および９−９の、処方物番号１０−５、１０−６、および１０−７との比較は、ＧＣ３３の量を、２２．５モル％から１１．２５モル％に減少させることは、ルシフェラーゼ発現を、肺から腫瘍またはＭａｔｒｉｇｅｌへとシフトされることを示す。この発現レベルのシフトは、リポソーム−ＤＮＡ複合体の表面電荷の減少に起因し、このことは、生理学的ｐＨにおける表面電荷の非存在が、血液保持時間を増加させ、そして全身投与後の複合体の組織分布を変化させることを示す。
【０１０５】
実施例１３〜１５は、ＫＢ腫瘍を保有するマウスへの、種々のリポソーム処方物のインビボ投与を記載する。これらの研究において、複合体は、葉酸発現腫瘍細胞を標的にするために、葉酸リガンドを含んだ。これらの処方物は、実施例１３〜１５に記載されており、そして静脈内投与後の腫瘍肺および肝臓におけるルシフェラーゼ発現を、表７〜９に示す。
【０１０６】
【表７】
2005514392.tif 000012
【０１０７】
【表８】
2005514392.tif 000013
【０１０８】
【表９】
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表７〜９は、中性−カチオン性脂質を含めることが、カチオン性脂質を用いて調製されるリポソーム（処方物番号１３−１、１４−１、１５−１）について観察されるものと比較して、生体分布を変化させることを示す。最も高いトランスフェクションは、処方物番号１３−５について観察され、これは、中性−カチオン性脂質、ＰＥＧ−ＤＴＢ−脂質および葉酸標的化リガンドから構成されるリポソームのものである。
【実施例】
【０１０９】
（ＶＩ．実施例）
以下の実施例は、本発明を説明するが、決して、本発明を限定するとは解釈されない。
【０１１０】
物質：以下の物質は、指示した供給源から得た：部分水素化大豆ホスファチジルコリン（Ｖｅｒｎｏｎ  Ｗａｌｄｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｇｒｅｅｎ  Ｖｉｌｌａｇｅ，ＮＪ）；コレステロール（Ｓｏｌｖａｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）；ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）およびジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）。
【０１１１】
方法：ダイナミック光散乱は、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｎ４−ＭＤ（Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｍｉａｍｉ  ＦＬ）を使用して、実行した。
【０１１２】
ゼータ電位：ゼータ電位は、Ｍａｌｖｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈｂｏｒｏｕｇｈ  ＭＡ）製のＺＥＴＡＳＩＺＥＲ  ２０００を使用して、測定した。この機器は、以下のようにして操作した：測定数：３；測定間の遅延：５秒；温度：２５℃；粘度：０．８９ｃＰ；比誘電率：７９；セル型：毛細管流れ；ゼータ限界：−１５０ｍＶ〜１５０ｍＶ。
【０１１３】
（実施例１）
（代表的な中性−カチオン性脂質の調製）
Ａ．ジステアロイルグリセロールの炭酸パラ−ニトロフェニルの調製
図１で図示しているように、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロール（５００ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ；化合物Ｉ）をベンゼンと共沸乾燥した（ロータリーエバポレータで３回）。クロロギ酸パラ−ニトロフェニル（２４２ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ、１．５当量；化合物ＩＩ）、４−ジメチルアミノピリジン（１０ｍｇ、０．０８ｍｏｌ、０．１当量）およびトリエチルアミン（３３４μｌ、２０４ｍｍｏｌ、３当量）を、ＣＨＣｌ３（５ｍｌ）中にて、１，２−ジステアロイルグリセロールに加えた。その反応混合物を、室温で、２時間攪拌した。ＴＬＣにより、この反応が完結したことが明らかとなった。この混合物をＣＨＣｌ３（５０ｍＬ）で希釈し、そして１０％クエン酸（３×１５ｍＬ）で抽出した。その有機層を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、そして蒸発させて、固形物を得た。この固形物（淡橙色）をアセトニトリル（４×３ｍＬ）で洗浄して、過剰のクロロギ酸ｐ−ニトロフェニルを除去した。その生成物であるジステアリルグリセロールの炭酸パラ−ニトロフェニル（化合物ＩＩＩ）を、減圧下にて、Ｐ２Ｏ５で乾燥した。収量：５５７ｍｇ（８８％）。
【０１１４】
【化７】
2005514392.tif 000015
Ｂ．ヒスタミンおよびジステアリルグリセロールのカルバメートの調製
１，２−ジステアリルグリセロールの炭酸パラ−ニトロフェニル（３５０ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ、化合物ＩＩＩ）を、ＣＨＣｌ３（１ｍＬ）中にて、ＤＭＳＯ（２００μｌ）と共に、ヒスタミン（４６ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ、０．９当量；化合物ＩＶ）に加えた。その溶液に、ピリジン（３００μｌ；化合物Ｖ）を加えた。その反応混合物を、室温で、一晩（約２０時間）攪拌した。ＴＬＣ（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝９０：１０）により、この反応が完結したことが明らかとなった。溶媒を蒸発させた。その生成物（化合物ＶＩ）をＣＨＣｌ３に溶解し、シリカゲル（Ａｌｄｒｉｃｈ、２３０〜４００メッシュ、６０Å）カラムに注ぎ、そして以下の溶媒で溶出した：ＣＨＣｌ３：ＣＨ３ＣＯＣＨ３＝９０：１０、４０ｍＬ（上部スポットを溶出した）；ＣＨＣｌ３：ＩＰＡ＝８０：２０、４０ｍｌ（生成物を溶出した）；ＣＨＣｌ３：ＩＰＡ＝７０：３０、４０ｍｌ（さらに多くの生成物を溶出した）。純粋生成物の画分を合わせ、そして蒸発させた。この生成物を、減圧下にて、Ｐ２Ｏ５で乾燥し、そして白色固形物（２３６ｍｇ、収率８０％）を得た。
【０１１５】
【化８】
2005514392.tif 000016
（実施例２）
（ｍＰＥＧ−ＤＴＢ−ＤＳＰＥの合成）
この反応スキームは、図４で図示されている。
【０１１６】
炭酸ｍＰＥＧ−ＭｅＤＴＢ−ニトロフェニル（３００ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ、１．２９当量）を、ＣＨＣｌ３（３ｍＬ）に溶解した。ＤＳＰＥ（７０ｍｇ、０．０９３ｍｏｌ）およびＴＥＡ（５８．５μＬ、０．４２ｍｍｏｌ、４．５当量）をＰＥＧ−溶液に加え、そして５０℃（油浴温度）で攪拌した。１５分後、ＴＬＣにより、この反応が完結しなかったことが明らかとなった。次いで、２部分のＴＥＡ（１０μＬおよび２０μＬ）および数部分の炭酸ｍＰＥＧ−ＭｅＤＴＢ−ニトロフェニル（５０ｍｇ、３０ｍｇ、１０ｍｇ）を、この反応が完結するまで、１０分ごとに加えた。溶媒を蒸発させた。生成物混合物をＭｅＯＨに溶解し、そして１ｇのＣ８シリカを加えた。再度、溶媒を蒸発させた。そのカラムの上部に、Ｃ８シリカを含有する生成物を加え、そしてＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ勾配（圧力）、ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝３０：７０、６０ｍＬ；ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝５０：５０、６０ｍＬ；ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝７０：３０、１４０ｍＬ（出発物質を溶出した）；ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝７５：２５＝４０ｍＬ；ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝８０：２０、８０ｍＬ（生成物を溶出した）；ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝８５：１５、４０ｍＬ；ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝９０：１０、４０ｍＬ；ＭｅＯＨ＝４０ｍＬ；ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝９０：１８：１０、４０ｍＬで溶出した。純粋生成物を含有する画分を合わせ、そして蒸発させて、無色濃厚液として、生成物を得た。それに、第三級ブタノール（５ｍＬ）を加え、凍結乾燥し、そして減圧中で、Ｐ２Ｏ５で乾燥して、白色綿毛固形物（２５２ｍｇ、収率８９％）として、生成物を得た。
【０１１７】
これらのオルト−およびパラ−ＤＴＢ−ＤＳＰＥ化合物を、シリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム中のメタノール勾配０〜１０％、約７０％の単離収率）で精製し、それらの構造を、ＮＭＲおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで確認した。パラ結合体についての１Ｈ−ＮＭＲ：（ｄ６−ＤＭＳＯ、３６０ＭＨｚ）δ０．８６（ｔ、ＣＨ３、６Ｈ）、１．２２（ｓ、脂質のＣＨ２、５６Ｈ）、１．５７（ｍ、ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２、４Ｈ）、２．５０（２×ｔ、ＣＨ２ＣＯ２、４Ｈ）、２．８２（ｔ、ＣＨ２Ｓ、２Ｈ）、３．３２（ｓ、ＯＣＨ３、３Ｈ）、３．５１（ｍ、ＰＥＧ、約１８０Ｈ）、４．０７（ｔ、ＰＥＧ−ＣＨ２ＯＣＯＮＨ、２Ｈ）、４．１１および４．２８（２×ｄｄ  グリセロールのＣＨ２ＣＨ、２Ｈ）、４．９８（ｓ、ベンジル−ＣＨ２、２Ｈ）、５．０９（ｍ、脂質のＣＨＣＨ２）、７．３５および７．５３（２×ｄ、芳香族、４Ｈ）ｐｐｍ。このオルト結合体は、ベンジルおよび芳香族信号においてのみ、５．１１（ｓ，ＣＨ２，２Ｈ）および７．３１（ｄ，１Ｈ）、７．３９（ｍ，２Ｈ）７．７５（ｄ，１Ｈ）ｐｐｍで異なっていた。
【０１１８】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳは、等しい４４Ｄａ間隔を開けたイオンの分布を生じ、これは、エチレンオキシド繰り返し単位に対応していた。これらの化合物の平均分子量は、パラおよびオルト異性体について、それぞれ、３１２７および３１３９Ｄａであった（理論分子量約３１００Ｄａ）。
【０１１９】
（実施例３）
（ｍＰＥＧ−ＤＴＢ−ＤＳＰＥの合成）
Ａ．ｍＰＥＧ−ＭｅＤＴＢ−ＤＳＰＥ
この反応スキームは、図６Ａ〜６Ｂで図示している。
【０１２０】
ｍＰＥＧ（５Ｋ）−ＯＨ（４０ｇ、８ｍｍｏｌ）を、トルエン（全容量は、２７０ｍＬであり、２５０ｍＬは、ディーン−スタークで留去した）で共沸乾燥した。ｍＰＥＧ−ＯＨに、ジクロロメタン（１００ｍＬ）を加えた。湿気に注意しつつ、ＰＥＧ溶液に、４℃（氷水）で、クロロギ酸ｐ−ニトロフェニル（２．４２ｇ、１２ｍｍｏｌ、１．５当量）およびＴＥＡ（３．３ｍＬ、２４ｍｍｏｌ、３当量）を加えた。淡黄色のＴＥＡ塩酸塩が形成された。１５分後、冷却浴を取り除き、その反応混合物を、室温で、一晩攪拌した。ＴＬＣ（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝９０：１８：２）により、この反応が完結したことが明らかとなった。溶媒を蒸発させた。その残留物を酢酸エチル（約５０℃）に溶解した。ＴＥＡ塩酸塩を濾過により除き、そして温い酢酸エチルで洗浄した。溶媒を蒸発させ、その生成物をイソプロパノール（３回）で再結晶した。収率３８．２ｇ（９２％）。
【０１２１】
【化９】
2005514392.tif 000017
ＤＭＦ（６０ｍＬ）およびＣＨ２Ｃｌ２（４０ｍＬ）中の炭酸ｍＰＥＧ（５Ｋ）−ニトロフェニル（２５ｇ、４．８４ｍｍｏｌ）に、１−アミノ−２−プロパノール（１．１ｍＬ、１４．５２ｍｍｏｌ、３当量）およびＴＥＡ（２．０２ｍＬ、１４．５２ｍｍｏｌ、３当量）を加えた。それは、黄色透明溶液であった。その反応混合物を、室温で、３０分間攪拌した。ＴＬＣ（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝９０：１０）により、この反応が完結したことが明らかとなった。溶媒（ジクロロメタン）を蒸発させた。ＤＭＦ（６０ｍＬ）中の生成物混合物に、イソプロパール（２５０ｍＬ）を加えた。直ちに生成物が沈殿し、次いで、ｉＰｒＯＨ（３回）から再結晶した。収量：２２．１２ｇ（９０％）。
【０１２２】
【化１０】
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ｍＰＥＧ（５Ｋ）−ウレタン−２−メチルプロパノール（２２．１２ｇ、４．３４ｍｍｏｌ）をトルエン（４５ｍＬ）と共に共沸乾燥した。それに、ジクロロメタン（６０ｍＬ）を加えた。攪拌を維持し湿気に注意を払いつつ、０℃で、ｍＰＥＧ−溶液に、塩化メタンスルホニル（６０４．６μＬ、７．８１ｍｍｏｌ、１．８当量）およびＴＥＡ（３．９３ｍＬ、２８．２１ｍｍｏｌ、６．５当量）を加えた。３０分後、冷却浴を取り除き、その反応混合物を、室温で、１６時間攪拌した。溶媒を蒸発させた。酢酸エチルを加えて、ＴＥＡ塩を除去した。その生成物をイソプロパノール（３回）で再結晶した。収量：２０．２７ｇ（９０％）。
【０１２３】
【化１１】
2005514392.tif 000019
ｍＰＥＧ（５Ｋ）−ウレタン−２−メチル−メタンスルホン（１０．２７ｇ、１．９８ｍｍｏｌ）をトルエン（２０ｍＬ、それぞれ）と共に共沸乾燥した。無水トルエン（６０ｍＬ）中にて、０℃（氷水）で、水素化ナトリウム（３７７ｍｇ、９．４ｍｍｏｌ、４．７５当量）を加えた。５分後、その溶液に、トリフェニルメタンチオール（３．９２ｇ、１４．６ｍｍｏｌ、７．１５当量）を加えた。１０分後、その反応混合物に、ｍＰＥＧ−ウレタン−２−メチル−メタンスルホン（１０．２７ｇｍ、１．９８ｍｍｏｌ）を加えた。それは、黄色溶液になった。４５分後、ＴＬＣ（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝９０：１８：２）により、この反応が完結したことが明らかとなった。その反応混合物に、酢酸（４４５．５７μＬ、７．４２ｍｍｏｌ、３．７５当量）を加えて、過剰の水素化ナトリウムを中和した。この溶液は、濃厚で白っぽくなった。溶媒を蒸発させ、その固形物を酢酸エチル（３０ｍＬ）およびイソプロパノール（７０ｍＬ）で再結晶した。その生成物混合物は、沈殿物を濾過により除いている間、完全には溶解しなかった。次いで、この生成物混合物をイソプロパノール／第三級ブチルアルコール（１００ｍＬ／２０ｍＬ）で再結晶した。収量：８．８７ｇ（８４％）。
【０１２４】
【化１２】
2005514392.tif 000020
ｍＰＥＧ（５Ｋ）−ウレタン−２−メチル−トリフェニルメタンチオール（８．８７ｇ、１．６５ｍｍｏｌ）を、０℃で、ＴＦＡ／ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ／１０ｍＬ）に溶解した。激しい攪拌下にて、この溶液に、メトキシカルボニルスルフェニルクロライド（１８５．５μＬ、１．９９ｍｍｏｌ、１．２当量）を加えた。その反応混合物を、室温で、１５分間攪拌した。ＴＬＣ（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝９０：１０）により、この反応が完結したことが明らかとなった。溶媒を蒸発させた。その生成物混合物をイソプロパノール：第三級ブチルアルコール（８０ｍＬ：２０ｍＬ）で２回再結晶した。この生成物に第三級ブタノール（５ｍＬ）を加え、これを、次いで、凍結乾燥し、そして減圧中にてＰ２Ｏ５で乾燥して、白色綿毛状固形物（８．３２ｇ、収率９７％）として、生成物を得た。
【０１２５】
【化１３】
2005514392.tif 000021
ｍＰＥＧ（５Ｋ）−ウレタンエチル（メチル）ジチオカルボニルメトキシド（８．３２ｇ、１．６ｍｍｏｌ）を無水メタノール（２０ｍＬ）およびクロロホルム（２．５ｍＬ）に溶解した。このＰＥＧ溶液に、メルカプトベンジルアルコール（５９２ｍｇ、４ｍｍｏｌ、２．５当量）の無水メタノール（２ｍＬ）溶液を加えた。その反応混合物を、室温で、１８時間攪拌した。溶媒を蒸発させ、生成物混合物を酢酸エチル／イソプロパノール（３０ｍＬ／１００ｍＬ（３回））で再結晶した。ＮＭＲにより、約１６％の生成物が形成されたことが明らかとなった。この生成物混合物に、ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３（２４ｍＬ／１ｍＬ）中にて、０℃（氷水）で、ＭｅＯＨ（２ｍＬ）中のメルカプトベンジルアルコール（３２２ｍｇ、２．１８ｍｍｏｌ、１．８当量）の他の部分を滴下した。添加（約１０分間）の完了後、氷浴を取り除き、その反応混合物を、室温で、２４時間攪拌した。ＴＬＣ（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝９０：１８：２）により、この反応が完結したことが明らかとなった。溶媒を蒸発させ、次いで、生成物混合物を酢酸エチル／イソプロパノール（３０ｍＬ／１００ｍＬ）で再結晶した。収率：７．２５ｇ、（９４％）。
【０１２６】
【化１４】
2005514392.tif 000022
ｍＰＥＧ（５Ｋ）−ウレタン−エチル（メチル）−ジチオベンジルアルコール（６．７５ｇ、１．２７ｍｍｏｌ）をＣＨＣｌ３（３０ｍＬ）に溶解し、それに、０℃（氷水）で、クロロギ酸ｐ−ニトロフェニル（５１３ｍｇ、２．５４ｍｍｏｌ、２当量）を加えた。５分後、トリエチルアミン（５３１μＬ、３．８１ｍｍｏｌ、３当量）を加えた。３０分後、氷浴を取り除き、その反応混合物を、室温で、一晩攪拌した。溶媒を蒸発させた。その生成物混合物を酢酸エチルに溶解した。ＴＥＡ塩を濾過により除き、次いで、溶媒を蒸発させた。次いで、この生成物混合物を酢酸エチル／イソプロパノール（３０ｍＬ／１００ｍＬ（３回））で再結晶した。収量：６．５５ｇ（９４％）。
【０１２７】
【化１５】
2005514392.tif 000023
炭酸ｍＰＥＧ−ＭｅＤＴＢ−ニトロフェニル（７６６ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ、１．２９当量）をＣＨＣｌ３（５ｍＬ）に溶解し、ＰＥＧ−溶液に、ＤＳＰＥ（７０ｍｇ、０．０９３ｍｏｌ）およびＴＥＡ（５８．５μＬ、０．４２ｍｍｏｌ、４．５当量）を加え、そして、５０℃（油浴温度）で撹拌した。２０分後、ＴＬＣにより、この反応が完結していないことが明らかとなった。さらに多くの炭酸ｍＰＥＧ−ＭｅＤＴＢ−ニトロフェニル（全部で１２３９ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ、２．４７当量）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（２５ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ、２当量）を加えた。２０分後、ＴＬＣ（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝９０：１８：２、モリブデンおよびニンヒドリンと共に）により、この反応が完結したことが明らかとなった。溶媒を蒸発させた。生成物混合物を温（４２℃）酢酸エチルに溶解した。それは、濁った溶液（ＴＥＡ塩が沈殿した）。この溶液を濾過し、そして溶媒を蒸発させた。その生成物混合物に、ＭｅＯＨ、および２ｇのＣ８シリカを加えた。再度、溶媒を蒸発させた。そのカラムの上部にＣ８シリカを含有する生成物を加え、そしてＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ勾配（圧力）、ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝３０：７０、１００ｍＬ；ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝５０：５０、１００ｍＬ；ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝７０：３０、２５０ｍＬ（出発物質を溶出した）；ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝７５：２５＝４０ｍＬ；ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝８０：２０、２００ｍＬ（生成物を溶出した）；ＭｅＯＨ＝１００ｍＬ；ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝９０：１８：２、１００ｍＬ；ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝７５：３６：６、１００ｍＬで溶出した。純粋生成物を含有する画分を合わせ、そして蒸発させて、無色濃厚液として、生成物を得た。それに、第三級ブタノール（５ｍＬ）を加え、凍結乾燥し、次いで、減圧中で、Ｐ２Ｏ５で乾燥して、白色綿毛固形物（４６７ｍｇ、収率８３％）として、生成物を得た。
【０１２８】
【化１６】
2005514392.tif 000024
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳは、等しい４４Ｄａ間隔を開けたイオンのベル形分布を生じ、これは、エチレンオキシド繰り返し単位に対応していた。この結合体およびｍＰＥＧ−チオール（殆ど開裂したジスルフィド）の平均分子量は、６３７６および５３６８Ｄａであった（理論分子量約６０５３および５３０５ダルトン）。
【０１２９】
Ｂ．ｍＰＥＧ−エチルＤＴＢ−ＤＳＰＥ
ｍＰＥＧ−ウレタンエチル（エチル）ジチオカルボニルメトキシド（２ｇ、０．９０ｍｍｏｌ）を無水メタノール（８ｍＬ）に溶解した。開始時点では、その溶液は、濁っていたが、５分後、透明溶液になった。このＰＥＧ−溶液に、メルカプトベンジルアルコール（２６５．２ｍｇ、１．７９ｍｍｏｌ、２当量）を加えた。その反応混合物を、室温で、３０時間攪拌した。この反応溶液に、エーテル（７０ｍＬ）を加えて、その生成物を沈殿させ、そして４℃で、一晩保持した。その白色固形物を濾過し、そして酢酸エチル／エーテル（３０ｍＬ／７０ｍＬ）で再結晶した。収量：１．９６ｇ（９４％）。
【０１３０】
【化１７】
2005514392.tif 000025
Ｎ−ヒドロキシ−ｓ−ノルボルネン−２，３−ジカルボン酸イミド（ＨＯＮＢ）（４８ｍｇ、０．２６９ｍｍｏｌ）を、５０℃（油浴温度）で、ＣＨＣｌ３（３ｍＬ）中にて、ＤＳＰＥ（５５ｍｇ、０．０７３ｍｍｏｌ）に加えた。３〜４分後、それは、透明な溶液になった。次いで、クロロギ酸ｍＰＥＧ−ＥｔＤＴＢ−ニトロフェニル（３３４ｍｇ、０．１３４ｍｍｏｌ）を加え、続いて、トリエチルアミン（ＴＥＡ、４５μＬ、０．３２９ｍｍｏｌ）を加えた。２０分後、ＴＬＣ（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝９０：１８：２）により、この反応が完結したことが明らかとなった（モリブテンおよびニンヒドリン噴霧）。溶媒を蒸発させた。生成物混合物をメタノールに溶解し、Ｃ８シリカ（１ｇ）と混合し、そしてロータリーエバポレーションにより、溶媒をストリッピングした。そのＣ８−カラムの上部に、この固形残留物を加え、これを、次いで、ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ勾配（圧力）、ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝３０：７０、６０ｍＬ；ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝５０：５０、６０ｍＬ；ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝７０：３０、１４０ｍＬ；ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝７５：２５＝１４０ｍＬ（出発物質を溶出した）；ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝８０：２０、８０ｍＬ；ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝９０：１０、４０ｍＬ（生成物を溶出した）；ＭｅＯＨ＝４０ｍＬ；ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝９０：１８：２、４０ｍＬで溶出した。純粋生成物を含有する画分を合わせ、そして蒸発させて、無色濃厚液として、生成物を得た。それに、第三級ブタノール（５ｍＬ）を加え、次いで、減圧中で、Ｐ２Ｏ５で乾燥して、白色綿毛固形物（１７５ｍｇ、収率７８％）として、生成物を得た。
【０１３１】
【化１８】
2005514392.tif 000026
（実施例４）
（ｍＰＥＧ−ＤＴＢ−ニトロフェニルクロロフォーメートの合成）
この反応スキームは、図７で図示している。
【０１３２】
Ａ．１−（メルカプトメチル）エチルアンモニウムクロライドの合成手順
１．硫酸２−アミノ−１−メチルエチル水素
１−アミノ−２−プロパノール（２２．５３ｇ、０．３ｍｏｌ）を、氷浴中にて、激しく攪拌した。１時間のうちに、硫酸（１６．１０ｍＬ、０．３ｍｏｌ）を非常にゆっくりと加えた。フラスコ内では、濃厚な蒸気および非常に粘稠な溶液が形成された。添加が完了した後、その反応物を、減圧（ハウス真空に接続した）下にて、１７０℃と１８０℃の間で加熱した。加熱すると、この反応物は、淡褐色に変わった。全ての水を除去した後（約１時間）、それを室温まで冷却した。冷却すると、褐色でガラス状の固形物が形成され、これは、メタノールで倍散するとき、結晶化する。それを、６０℃で、水（５０ｍＬ）に溶解した。十分に温かいメタノールを加えて、その溶液を８０％メタノールにした。冷却すると、結晶が形成され、これを、次いで、濾過し、そしてＰ２Ｏ５で乾燥した。収量：１７．１７ｇ（３７％）。
【０１３３】
【化１９】
2005514392.tif 000027
２．５−メチルチアゾリジン−２−チオン
硫酸２−アミノ−１−メチルエチル水素（２３．０３ｇ、１４８ｍｍｏｌ）および二硫化炭素（１０．７１ｍＬ、１７８ｍｍｏｌ、１．２当量）を、２５０ｍＬ丸底フラスコにて、５０％エタノール水溶液（４０ｍＬ）中で、攪拌した。これに、５０％エタノール水溶液（５０ｍＬ）中の水酸化ナトリウム（１３．０６ｇ、３２７ｍｍｏｌ、２．２当量）を、非常にゆっくりと滴下した。水酸化ナトリウムを加えると、全ての出発物質が溶解し、その溶液は、橙色に変わった。その反応物を４０分間還流し（８５℃）、その時点の後、それは、淡黄色に変わり、濃厚な沈殿が形成された。エタノールを蒸発させ、次いで、その水溶液を温め、次いで、ブフナー漏斗で濾過して、全ての水溶性不純物を除去した。残留している結晶を温エタノールに溶解し、次いで、その溶液が８０％水になるまで、温水を加えた。その混合物を冷却させ、次いで、冷蔵して、長い針状の結晶を得た。収量：１４．６４ｇ（７５％）。
【０１３４】
【化２０】
2005514392.tif 000028
３．１−（メルカプトメチル）エチルアンモニウムクロライド
５−メチルチアゾリン−２−チオン（６．５ｇ、４９ｍｍｏｌ）を２５０ｍＬ丸底フラスコに入れた。塩酸水溶液（４０ｍＬ、Ｈ２Ｏ中で１８％）を加え、このフラスコを油浴中で加熱した。その反応物を１週間還流した（１２０℃）。その週の３回にわたって、濃塩酸１ｍＬを加えた。この反応を、溶離液として酢酸エチルを使うＴＬＣを使用して、モニターした。それらは、ＵＶ、ニンヒドリンおよびヨウ素蒸気を使用して視覚化した。その週の殆どにわたって、この反応物は、水よりも密度が高いオイルとしての出発物質との均一混合物であった。１週間後、このオイル出発物質がなくなった（ＴＬＣでは、依然として、現れたが）。この反応物を加熱から取り除き、そして室温まで冷却し、次いで、冷蔵して、出発物質を結晶化した。結晶化された出発物質をろ過した。濾液を蒸発させ、それを、Ｐ２Ｏ５およびＮａＯＨで乾燥して、全ての水およびＨＣｌを除去した。その粗生成物を２部分のジエチルエーテル（各５０ｍＬ）で洗浄して、全ての出発物質を除去した。それを、再度、Ｐ２Ｏ５で乾燥した。収量：２．８３ｇ（４５％）。
【０１３５】
【化２１】
2005514392.tif 000029
Ｂ．クロロギ酸ｍＰＥＧ−エチル−ＤＴＢ−ニトロフェニルの合成手順
１．硫酸２−アミノ−１−エチルエチル水素
１−アミノ−２−ブタノール（１５ｍＬ、１５８ｍｍｏｌ）を、１００ｍＬ丸底フラスコにて、氷浴中で、激しく攪拌した。硫酸（８．４３ｍＬ、１５８ｍｍｏｌ）を、１時間のうちに、非常にゆっくりと加えた。フラスコ内では、濃厚な蒸気および非常に粘稠な溶液が形成された。添加が完了した後、その反応物を、減圧（ハウス真空に接続した）下にて、１７０℃と１８０℃の間で加熱した。加熱すると、この反応物は、淡褐色に変わった。全ての水を除去した後（約１時間）、それを室温まで冷却した。冷却すると、褐色でガラス状の固形物が形成された。それを温水（５０ｍＬ）に溶解し、次いで、冷蔵庫に一晩入れた。冷却すると、結晶が形成され、これを、次いで、濾過し、Ｐ２Ｏ５で乾燥した。収量：９．９８ｇ（３７％）。
【０１３６】
【化２２】
2005514392.tif 000030
２．５−エチルチアゾリジン−２−チオン
硫酸２−アミノ−１−エチル−エチル水素（９．９８ｇ、５９ｍｍｏｌ）および二硫化炭素（４．２６ｍＬ、７１ｍｍｏｌ、１．２当量）を、１００ｍＬ丸底フラスコにて、５０％エタノール水溶液（１５ｍＬ）中で、攪拌した。これに、５０％エタノール水溶液（２０ｍＬ）中の水酸化ナトリウム（５．２０ｇ、１３０ｍｍｏｌ、２．２当量）を、非常にゆっくりと滴下した。水酸化ナトリウムを加えると、全ての出発物質が溶解し、その溶液は、橙色に変わった。その反応物を４０分間還流し（８５℃）、その時点の後、それは、淡黄色に変わり、濃厚な沈殿が形成された。エタノールを蒸発させ、次いで、その水溶液を温め、次いで、ブフナー漏斗で濾過して、全ての水溶性不純物を除去した。残留している結晶を温エタノールに溶解し、次いで、その溶液が８０％水になるまで、温水を加えた。その混合物を冷却させ、次いで、冷蔵して、長い針状の結晶を得た。収量：７．２８ｇ（８６％）。
【０１３７】
【化２３】
2005514392.tif 000031
３．１−（メルカプトエチル）エチルアンモニウムクロライド
５−エチルチアゾリン−２−チオン（７．２４ｇ、５０ｍｍｏｌ）を２５０ｍＬ丸底フラスコに入れた。塩酸水溶液（４５ｍＬ、Ｈ２Ｏ中で１８％）を加え、このフラスコを油浴中で加熱した。加熱後、出発物質は、溶解し、全ての不均質混合物を形成した。その反応物を１週間還流した（１２０℃）。その週の４回にわたって、濃塩酸１ｍＬを加えた。この反応を、溶離液として酢酸エチルを使うＴＬＣを使用して、モニターした。それらは、ＵＶ、ニンヒドリンおよびヨウ素蒸気を使用して視覚化した。その週の殆どにわたって、この反応物は、水よりも密度が高いオイルとしての出発物質との不均質混合物であった。この反応物を加熱から取り除き、そして室温まで冷却し、次いで、冷蔵して、出発物質を結晶化した。結晶化した出発物質をろ過した。濾液を蒸発させ、それを、Ｐ２Ｏ５およびＮａＯＨで乾燥して、全ての水およびＨＣｌを除去した。その粗生成物を２部分のジエチルエーテル（各５０ｍＬ）で洗浄して、全ての出発物質を除去した。それを、再度、Ｐ２Ｏ５で乾燥した。収量：３．６６ｇ（５２％）。１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ６−ＤＭＳＯ）：
（実施例５）
（ｍＰＥＧ−ＤＴＢ−脂質の合成）
この反応スキームは、図８Ａで図示されている。
【０１３８】
１，２−ジステレオイル−ｓｎ−グリセロール（５００ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）を、ベンゼンと共に共沸蒸留した（３回）。ＣＨＣｌ３（５ｍＬ）中の１，２−ジステレオイルグリセロールに、クロロギ酸パラ−ニトロフェニル（２４２ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ、１．５当量）、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（１０ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ、０．１当量）およびＴＥＡ（３３４．５μＬ、２．４ｍｍｏｌ、３当量）を加えた。その反応混合物を、室温で、２時間攪拌した。ＴＬＣ（トルエン：酢酸エチル＝７：３）により、この反応が完結したことが明らかとなった。次いで、その生成物混合物を１０％クエン酸で抽出して、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を除去し、アセトニトリル（３ｍＬ、４回）で洗浄して、過剰のクロロギ酸ｐ−ニトロフェニルを除去した。純粋な生成物を、減圧中で、Ｐ２Ｏ５で乾燥した。収率：５５７ｍｇ（８８％）。
【０１３９】
【化２４】
2005514392.tif 000032
エチレンジアミン（４２μＬ、０．６３ｍｍｏｌ、５倍過剰）およびピリジン（２００μＬ）をＣＨＣｌ３（１ｍＬ）に加えた。炭酸２−ジステロイル−ｓｎ−ｐ−ニトロフェニル（１００ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）をＣＨＣｌ３（１ｍＬ）に溶解し、そして０℃（氷水）で、パスチャーピペットを使って、エチレンジアミン溶液に滴下し、そして一晩（１６時間）継続した。ＴＬＣ（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ  ９０：１８：２、およびＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝９０：１０）により、この反応が完結したことが明らかとなった。溶媒を蒸発させて、ピリジンを除去した。次いで、その生成物混合物をＣＨＣｌ３に溶解し、カラム（Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ、６０Å、２００〜４００メッシュ）に装填し、そしてＣＨＣｌ３：ＣＨ３ＣＯＣＨ３およびＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ勾配、ＣＨＣｌ３：ＣＨ３ＣＯＣＨ３＝９０：１０、６０ｍＬ（上部スポットを溶出した）；ＣＨＣｌ３：ＮｅＯＨ＝９０：１０、６０ｍＬ（生成物を溶出した）で溶出した。純粋生成物の画分を合わせ、そして蒸発させた。第三級ブタノールを加え、そして減圧下にて、Ｐ２Ｏ５で乾燥した。収量：６４ｍｇ（７５％）。
【０１４０】
【化２５】
2005514392.tif 000033
クロロギ酸ｍＰＥＧ−ＭｅＤＴＢ−ニトロフェニル（４００ｍｇ、０．１６２ｍｍｏｌ、２．２当量）をＣＨＣｌ３（２ｍＬ）に溶解した。その溶液に、１，２−ステロイル−ｓｎ−エチレンアミン（５１ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（３７μＬ、０．２６４ｍｍｏｌ、３．５２当量）を加えた。次いで、この反応混合物を、４５℃で、２０分間攪拌した。ＴＬＣ（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝９０：１８：２、およびＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝９０：１０）により、この反応が完結したことが明らかとなった。溶媒を蒸発させた。その生成物混合物をメタノールに溶解した。Ｃ８シリカ２ｇを加え、次いで、溶媒を蒸発させた。Ｃ８カラム（（Ｓｕｐｅｌｃｏ、Ｓｕｐｅｌ  ｃｌｅａｎ．Ｌｏｔ  ｎｏ．ＳＰ０８２４）の上部にＣ８シリカ含有生成物混合物を加え、そしてＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ勾配（圧力）、ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝６０：４０、４０ｍＬ；ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝７０：３０、８０ｍＬ（出発物質を溶出した）；ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝８０：２０、４０ｍＬ；ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝９０：１０＝２０ｍＬ；ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝５：８０：１５、２０ｍＬ；ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝９０：１８：１０、４０ｍＬ（生成物を溶出した）で溶出した。純粋生成物を含有する画分を合わせ、そして蒸発させて、無色濃厚液体として、生成物を得た。第三級ブタノール（５ｍＬ）を加え、その溶液を凍結乾燥し、次いで、減圧中で、Ｐ２Ｏ５で乾燥して、白色固形物（２００ｍｇ、収率８９％）として、生成物を得た。
【０１４１】
【化２６】
2005514392.tif 000034
（実施例６）
（核酸を含むリポソームの調製）
リポソームを、所望の脂質成分の、有機溶媒中の所望のモル比の溶液を調製することによって調製し、次いで、５％グルコース（ｐＨ４〜５）で水和させた。この脂質成分およびこの成分のモル比は、以下の実施例で特定されている。
【０１４２】
ルシフェラーゼをコードするｐＮＳＬプラスミドを、米国特許第５，８５１，８１８号に記載されるように、２つの市販のプラスミド（ｐＧＦＰ−Ｎ１プラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）およびｐＧＬ３−Ｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））から構築した。ルシフェラーゼレポータープラスミドＤＮＡ溶液を、酸性リポソーム溶液に、連続的に撹拌しながら１０分間にわたってゆっくりと添加した。
【０１４３】
ＦＧＦまたは葉酸リガンドを、マレイミド−ＰＥＧ−ＤＳＰＥに、当該分野において公知である手順（Ｇａｂｉｚｏｎ，Ａ．ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，１０：２８９（１９９９））に従って結合体化させた。ＤＮＡ−リポソーム複合体を、ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ、ＦＧＦ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥまたは葉酸−ＰＥＧ−ＤＳＰＥのミセル溶液と一緒に、連続的に撹拌しながら２０分間インキュベートして、予め形成されたリポソームへのリガンド−ＰＥＧ−脂質の挿入を達成した。
【０１４４】
（実施例７）
（腫瘍組織におけるインビボでのトランスフェクションおよび発現）
（Ａ．腫瘍モデル）
ＫＢ腫瘍細胞（１００万個の細胞）を、ヌードマウスの側腹部に皮下接種した。これらのマウスに、減少した葉酸食餌を与え、ＫＢ腫瘍細胞上での葉酸レセプターの発現をアップレギュレートした。このモデルを、葉酸結合体化リポソーム−ＤＮＡ複合体が腫瘍脈管構造脈管形成内皮細胞を標的にするように使用した。
【０１４５】
Ｌｅｗｉｓ肺癌腫細胞（１００万個の細胞）を、Ｂ６Ｃ３−Ｆ１マウスの側腹部に皮下接種した。ＦＧＦレセプターを、脈管形成内皮細胞の表面または腫瘍細胞の表面のいずれかで、発現させた。このモデルを、ＦＧＦ結合体化リポソーム−ＤＮＡ複合体が腫瘍脈管構造脈管形成内皮細胞を標的にするように使用した。
【０１４６】
（Ｂ．リポソーム処方物）
５種類のリポソーム処方物を、実施例６に記載されるように、以下の脂質成分を用いて調製した：
【０１４７】
【表１０】
2005514392.tif 000035
（Ｃ．インビボ投与）
Ｌｅｗｉｓ肺癌腫細胞を注射した１５匹の試験マウスを、４つの試験群に無作為に分割し、処方物１〜５のうちの１つを与えた。リポソーム−ＤＮＡ複合体を、２００μｇ  ＤＮＡプラスミドの用量で静脈内投与した。腫瘍組織および他の組織を、処置の２４時間後に収集し、そしてルシフェラーゼ発現を、組織抽出物からのルシフェラーゼアッセイによって決定した。これらの結果を、表１に示す。
【０１４８】
（実施例８）
（ＦＧＦ標的化リポソーム−ＤＮＡ複合体のインビボ投与）
（Ａ．Ｍａｔｒｉｇｅｌ腫瘍モデル）
マウスにおけるＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）モデルを、ＦＧＦ脈管形成内皮細胞の腫瘍脈管構造標的化のために使用した。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）における脈管形成内皮細胞は、腫瘍における脈管構造脈管形成内皮細胞と類似であり、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）中のこれらの内皮細胞（腫瘍細胞なしの、内皮細胞のみ）を使用して、インビボでのＦＧＦ標的化リポソーム／核酸複合体のトランスフェクションおよび発現の試験のための腫瘍において、内皮細胞を模倣した。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）は、マウスに皮下注射されると、固体のゲルを形成し、そして迅速かつ強力な脈管形成反応を誘導する。
【０１４９】
（Ｂ．リポソーム処方物）
９種類のリポソーム処方物を、実施例６に記載されるように、以下の脂質成分を用いて調製した：
【０１５０】
【表１１】
2005514392.tif 000036
2005514392.tif 000037
2005514392.tif 000038
（Ｃ．インビボ投与）
２７匹のマウスに、Ｍａｔｒｉｇｅｌを注射した。Ｍａｔｒｉｇｅｌの移植の６日後に、これらのマウスを、上記Ｂ節において記載される９種類の処方物のうちの１つでの処理のために、処置群（ｎ＝３）に無作為化した。リポソーム−ＤＮＡ複合体を、２００μｇのＤＮＡプラスミドの用量で、静脈内投与した。ＦＧＦ標的化リポソーム−ＤＮＡ複合体の投与の２４時間後、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、肺および肝臓におけるルシフェラーゼ発現を測定した。これらの結果を、表２に示す。
【０１５１】
（実施例９）
（ＦＧＦ標的化リポソーム−ＤＮＡ複合体のインビボ投与）
（Ａ．試験動物）
マウスを、実施例７Ａに記載されるように、Ｌｅｗｉｓ肺癌腫細胞で接種した。
【０１５２】
（Ｂ．リポソーム処方物）
９種類のリポソーム処方物を、実施例６に記載されるように、以下の脂質成分を用いて調製した：
【０１５３】
【表１２】
2005514392.tif 000039
2005514392.tif 000040
2005514392.tif 000041
（Ｃ．インビボ投与）
腫瘍細胞の接種の９日後、２７匹の腫瘍保有マウスを、９種類の処方物（処方物番号（９−１）〜処方物番号（９−９））のうちの１つでの処理のために、処置群（ｎ＝３）に無作為化した。リポソーム−ＤＮＡ複合体を、２００μｇのＤＮＡプラスミドの用量で静脈内投与した。ＦＧＦ標的化リポソーム−ＤＮＡ複合体の投与の２４時間後、腫瘍、肺、および肝臓におけるルシフェラーゼ発現を測定した。これらの結果を表３に示す。
【０１５４】
（実施例１０）
（ＦＧＦ標的化リポソーム−ＤＮＡ複合体のインビボ投与）
（Ａ．試験動物）
マウスを、実施例７Ａに記載されるように、Ｌｅｗｉｓ肺癌腫細胞で接種した。反対側の側腹部で、Ｍａｔｒｉｇｅｌを、実施例８Ａに記載されるように注射した。
【０１５５】
（Ｂ．リポソーム処方物）
７種類のリポソーム処方物を、実施例６に記載されるように、以下の脂質成分を用いて調製した：
【０１５６】
【表１３】
2005514392.tif 000042
2005514392.tif 000043
（Ｃ．インビボ投与）
腫瘍細胞の接種の９日後、２１匹の腫瘍保有マウスを、処方物（処方物番号（１０−１）〜処方物番号（１０−７））のうちの１つでの処理のために、処置群（ｎ＝３）に無作為化した。リポソーム−ＤＮＡ複合体を、２００μｇのＤＮＡプラスミドの用量で静脈内投与した。ＦＧＦ標的化リポソーム−ＤＮＡ複合体の投与の２４時間後、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、腫瘍、肺、および肝臓におけるルシフェラーゼ発現を測定した。これらの結果を表４に示す。
【０１５７】
（実施例１１）
（ＦＧＦ標的化リポソーム−ＤＮＡ複合体のインビボ投与）
（Ａ．試験動物）
マウスに、実施例８Ａに記載されるように、Ｍａｔｒｉｇｅｌを接種した。
【０１５８】
（Ｂ．リポソーム処方物）
８種類のリポソーム処方物を、実施例６に記載されるように、以下の脂質成分を用いて調製した：
【０１５９】
【表１４】
2005514392.tif 000044
2005514392.tif 000045
（Ｃ．インビボ投与）
Ｍａｔｒｉｇｅｌの接種の６日後、２４匹のマウスを、処方物（処方物番号（１１−１）〜処方物番号（１１−８））のうちの１つでの処理のために、処置群（ｎ＝３）に無作為化した。リポソーム−ＤＮＡ複合体を、２００μｇのＤＮＡプラスミドの用量で静脈内投与した。ＦＧＦ標的化リポソーム−ＤＮＡ複合体の投与の２４時間後、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、肺、および肝臓におけるルシフェラーゼ発現を測定した。これらの結果を表５に示す。
【０１６０】
（実施例１２）
（ＦＧＦ標的化リポソーム−ＤＮＡ複合体のインビボ投与）
（Ａ．試験動物）
マウスに、実施例７Ａに記載されるように、Ｌｅｗｉｓ肺癌腫細胞を接種した。
【０１６１】
（Ｂ．リポソーム処方物）
５種類のリポソーム処方物を、実施例６に記載されるように、以下の脂質成分を用いて調製した：
【０１６２】
【表１５】
2005514392.tif 000046
（Ｃ．インビボ投与）
腫瘍細胞の接種の９日後、１５匹の腫瘍保有マウスを、９種類の処方物（処方物番号（１２−１）〜処方物番号（１２−５））のうちの１つでの処理のために、処置群（ｎ＝３）に無作為化した。リポソーム−ＤＮＡ複合体を、１００μｇのＤＮＡプラスミドの用量で静脈内投与した。処方物番号１２−１、１２−３および１２−５の投与の２４時間後、ならびに処方物番号１２−２および１２−４の投与の５日後に、腫瘍、肺、および肝臓におけるルシフェラーゼ発現を測定した。これらの結果を表６に示す。ここで、発現を、処方物番号１２−１、１２−３および１２−５のリポソーム投与の２４時間後、ならびに処方物番号１２−２および１２−４の投与の５日後に測定した。
【０１６３】
（実施例１３）
（葉酸標的化リポソーム−ＤＮＡ複合体のインビボ投与）
（Ａ．試験動物）
マウスに、実施例７Ａに記載されるように、ＫＢ癌腫細胞を接種し、そして世話をした。
【０１６４】
（Ｂ．リポソーム処方物）
８種類のリポソーム処方物を、実施例６に記載されるように、以下の脂質成分を用いて調製した：
【０１６５】
【表１６】
2005514392.tif 000047
2005514392.tif 000048
2005514392.tif 000049
（Ｃ．インビボ投与）
腫瘍細胞の接種の９日後、２４匹の腫瘍保有マウスを、処方物番号（１３−１）〜処方物番号（１３−８）のうちの１つでの処理のために、処置群（ｎ＝３）に無作為化した。リポソーム−ＤＮＡ複合体を、１００μｇのＤＮＡプラスミドの用量で静脈内投与した。投与の２４時間後、腫瘍、肺、および肝臓におけるルシフェラーゼ発現を測定した。これらの結果を表７に示す。
【０１６６】
（実施例１４）
（葉酸標的化リポソーム−ＤＮＡ複合体のインビボ投与）
（Ａ．試験動物）
マウスに、実施例７Ａに記載されるように、ＫＢ癌腫細胞を接種し、そして世話をした。
【０１６７】
（Ｂ．リポソーム処方物）
６種類のリポソーム処方物を、実施例６に記載されるように、以下の脂質成分を用いて調製した：
【０１６８】
【表１７】
2005514392.tif 000050
2005514392.tif 000051
（Ｃ．インビボ投与）
腫瘍細胞の接種の９日後、１８匹の腫瘍保有マウスを、処方物番号（１４−１）〜処方物番号（１４−６）のうちの１つでの処理のために、処置群（ｎ＝３）に無作為化した。リポソーム−ＤＮＡ複合体を、１００μｇのＤＮＡプラスミドの用量で静脈内投与した。投与の２４時間後、腫瘍、肺、および肝臓におけるルシフェラーゼ発現を測定した。これらの結果を表８に示す。
【０１６９】
（実施例１５）
（葉酸標的化リポソーム−ＤＮＡ複合体のインビボ投与）
（Ａ．試験動物）
マウスに、実施例７Ａに記載されるように、ＫＢ癌腫細胞を接種し、そして世話をした。
【０１７０】
（Ｂ．リポソーム処方物）
７種類のリポソーム処方物を、実施例６に記載されるように、以下の脂質成分を用いて調製した：
【０１７１】
【表１８】
2005514392.tif 000052
2005514392.tif 000053
（Ｃ．インビボ投与）
腫瘍細胞の接種の９日後、２１匹の腫瘍保有マウスを、処方物番号（１５−１）〜処方物番号（１５−７）のうちの１つでの処理のために、処置群（ｎ＝３）に無作為化した。リポソーム−ＤＮＡ複合体を、１００μｇのＤＮＡプラスミドの用量で静脈内投与した。投与の２４時間後、腫瘍、肺、および肝臓におけるルシフェラーゼ発現を測定した。これらの結果を表９に示す。
【０１７２】
本発明を、特定の実施形態に関して記載したが、種々の変更および改変が、本発明から逸脱することなくなされ得ることが、当業者に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０１７３】
【図１】図１は、カルバメート結合およびイミダゾール「Ｚ」基を有する本発明の脂質を調製する合成スキームを示す。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明のｐＨ応答性脂質を調製する合成スキームを示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本発明のｐＨ応答性脂質を調製する合成スキームを示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、本発明のｐＨ応答性脂質を調製する合成スキームを示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、本発明のｐＨ応答性脂質を調製する合成スキームを示す。
【図３Ａ】図３Ａは、本発明のｐＨ応答性脂質の種々の構造を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、本発明のｐＨ応答性脂質の種々の構造を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、本発明のｐＨ応答性脂質の種々の構造を示す。
【図３Ｄ】図３Ｄは、本発明のｐＨ応答性脂質の種々の構造を示す。
【図４】図４は、ｍＰＥＧ−ＤＴＢ−アミン−脂質を合成する合成反応スキームを図示しており、ここで、そのアミン−リガンドは、脂質ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）である。
【図５】図５は、パラ−ジチオベンジルウレタン（ＤＴＢ）−連結ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ結合体のチオ分解開裂機構を図示している。
【図６Ａ】図６Ａは、本発明のｍＰＥＧ−ＤＴＢ−ＤＳＰＥ化合物を調製する合成反応スキームを示し、ここで、そのＤＴＢ結合は、アルキル基で立体的に妨害されている。
【図６Ｂ】図６Ｂは、本発明のｍＰＥＧ−ＤＴＢ−ＤＳＰＥ化合物を調製する合成反応スキームを示し、ここで、そのＤＴＢ結合は、アルキル基で立体的に妨害されている。
【図７】図７は、本発明のｍＰＥＧ−ＤＴＢ−リガンド化合物を調製する他の合成反応スキームを示す。
【図８Ａ】図８Ａは、チオ分解開裂するとカチオン性脂質を生じるｍＰＥＧ−ＤＴＢ−脂質を合成する合成反応スキームである。
【図８Ｂ】図８Ｂは、図８Ａの化合物をチオ分解開裂した後の生成物を示す。
【図１】
2005514392.tif 000056
【図２Ａ】
2005514392.tif 000057
【図２Ｂ】
2005514392.tif 000058
【図２Ｃ】
2005514392.tif 000059
【図２Ｄ】
2005514392.tif 000060
【図３Ａ】
2005514392.tif 000061
【図３Ｂ】
2005514392.tif 000062
【図３Ｃ】
2005514392.tif 000063
【図３Ｄ】
2005514392.tif 000064
【図４】
2005514392.tif 000065
【図５】
2005514392.tif 000066
【図６Ａ】
2005514392.tif 000067
【図６Ｂ】
2005514392.tif 000068
【図７】
2005514392.tif 000069
【図８Ａ】
2005514392.tif 000070
【図８Ｂ】
2005514392.tif 000071
【手続補正書】
【提出日】平成16年7月13日(2004.7.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸投与用の組成物であって、該組成物は、以下（ａ）および（ｂ）：
（ａ）以下の（ｉ）および（ｉｉ）から構成されるリポソーム：
（ｉ）次式を有する脂質：
【化１】
2005514392.tif 000072
ここで、Ｒ１およびＲ２の各々は、別個に、８個〜２４個の間の炭素原子を有するアルキルまたはアルケニル鎖である；
ｎ＝０〜２０である；
Ｌは、（１）−Ｘ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｙ、（２）−Ｘ−（Ｃ＝Ｏ）−および（３）−Ｘからなる群から選択され、ここで、ＸおよびＹは、別個に、酸素、ＮＨおよび直接結合から選択される；
Ｚは、弱塩基部分であり、該弱塩基部分は、約４．０より大きく７．４未満のｐＫを有する；および
（ｉｉ）以下の一般式を有する化合物：
【化２】
2005514392.tif 000073
ここで、Ｒ３は、親水性重合体であり、該親水性重合体は、そのジチオベンジル部分に結合する結合を含む；Ｒ４は、Ｈ、アルキルおよびアリールからなる群から選択される；Ｒ５は、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ７、Ｓ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ７およびＯ（Ｃ＝Ｓ）Ｒ７からなる群から選択される；Ｒ７は、アミン含有脂質を含む；そしてＲ６は、Ｈ、アルキルおよびアリールからなる群から選択される；ここで、ＣＨ２−Ｒ５の配向は、オルト位置およびパラ位置から選択される；および
（ｂ）該リポソームに会合した核酸、
、を含有する、組成物。
【請求項２】
Ｘが、ＮＨであり、そしてＹが、酸素である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
Ｌが、カルバメート結合、エステル結合またはカーボネート結合である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
Ｌが、ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
Ｚが、イミダゾールである、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
１〜８０モルパーセントの前記脂質を含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
Ｚが、５．０〜６．５の間のｐＫ値を有する部分である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
Ｒ１およびＲ２の各々が、８個〜２４個の間の炭素原子を有する非分枝アルキルまたはアルケニル鎖である、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
Ｒ１およびＲ２の各々が、Ｃ１７Ｈ３５である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
ｎが、１〜１０の間である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
Ｒ６が、Ｈであり、そしてＲ４が、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５およびＣ３Ｈ８からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記アミン含有脂質が、単一炭化水素尾部または二重炭化水素尾部のいずれかを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記アミン含有脂質が、二重炭化水素尾部を有するリン脂質である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
Ｒ４およびＲ６が、アルキルである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
Ｒ３が、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピル−メタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチル−アクリルアミド、ポリメタクリル酸ヒドロキシプロピル、ポリアクリル酸ヒドロキシエチル、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリアスパルトアミド、それらの共重合体、およびポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシドからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
Ｒ３が、ポリエチレングリコールである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
Ｒ６が、Ｈであり、そしてＲ４が、ＣＨ３またはＣ２Ｈ５である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記リポソームが、５〜２０モルパーセントの間の前記化合物を含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
さらに、前記リポソームに取り込まれた治療化合物を含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
前記核酸が、前記リポソームの少なくとも一部に取り込まれている、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
前記核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらのフラグメントおよびオリゴヌクレオチドから選択される、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
さらに、前記リポソームを標的部位に標的化するリガンドを含有し、該リガンドが、前記化合物上の前記親水性重合体Ｒ３の遠位末端に共有結合している、請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記リガンドが、内皮腫瘍細胞により内部移行するための該細胞に対する結合親和性を有する、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記リガンドが、Ｅ−セレクチン、Ｈｅｒ−２およびＦＧＦからなる群から選択される、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
前記リガンドが、ＨＥＲ２／ｎｅｕ発癌遺伝子のｃ−ｅｒｂＢ−２タンパク質生成物、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）受容体、塩基性線維芽細胞成長受容体（塩基性ＦＧＦ受容体）、血管内皮成長因子受容体、Ｅ−セレクチン受容体、Ｌ−セレクチン受容体、Ｐ−セレクチン受容体、葉酸受容体、ＣＤ４受容体、ＣＤ１９受容体、αβインテグリン受容体およびケモカイン受容体からなる群から選択される、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２６】
前記リポソームが、さらに、カチオン性脂質を含有する、請求項１に記載の組成物。
【国際調査報告】
2005514392.tif 000074